(57)【要約】  高い効力でＴＧＦβ１を選択的に阻害することができるモノクローナル抗体およびその抗原結合断片を、本明細書中に開示する。関連組成物、方法、および治療的使用も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液平衡滴定に基づくアッセイによって測定して、以下の抗原複合体のそれぞれ：
ｉ）ヒトＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉ）ヒトＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉｉ）ヒトＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および
ｉｖ）ヒトＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１
と≦１０ｎＭのＫＤで結合し、完全ヒトもしくはヒト化抗体またはその断片であり、任意選択で≦１ｎＭのＫＤで結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
複合体の潜在型ラッソと結合し、任意選択で成長因子ドメインの一部分とさらに結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
ヒトＩｇＧ４またはＩｇＧ１の亜型のものである、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と賦形剤とを含む組成物。
【請求項５】
対象におけるＴＧＦβ１適応症の処置において使用するための、請求項１から３に記載の抗体またはその抗原結合断片または請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＴＧＦβ１適応症が癌である、請求項５に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合断片または組成物。
【請求項７】
ＴＧＦβ１適応症が骨髄線維症である、請求項５に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合断片または組成物。
【請求項８】
対象が癌治療に対して応答性が乏しく、癌治療がチェックポイント阻害療法、化学療法、および／または放射線療法であってもよい、請求項６に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合断片または組成物。
【請求項９】
処置が、請求項４に記載の組成物を、チェックポイント阻害剤、化学療法および放射線療法、ならびに／または癌ワクチンからなる群から選択される追加の癌治療と併せて投与するステップを含む、請求項８に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合断片または組成物。
【請求項１０】
ｉ）ヒトＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ヒトＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ヒトＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびヒトＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと≦１ｎＭのＫＤで特異的に結合する抗体を提供するステップと、
ｉｉ）ＴＧＦβ１に偏った発現を含む前臨床モデルにおいて有効性を達成するために有効な抗体の量を決定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究を実施するステップと、
ｉｉｉ）抗体の最大耐用量および／または最小毒性量を決定するために、ＴＧＦβ阻害に対して感受性であることが知られている前臨床モデルにおいて毒性学研究を実施するステップと、
ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に基づいて、十分な治療ウィンドウが得られる場合に抗体を治療剤候補として選択するステップと
を含む、治療的使用に適したアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉｉ）の有効性を達成するために有効な量が約１〜３０ｍｇ／ｋｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｉｉｉ）の最大耐用量または最小毒性量が少なくとも１００ｍｇ／ｋｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
治療ウィンドウが少なくとも６倍である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｉ）請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法によって選択された抗体を提供するステップと、
ｉｉ）抗体を、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤を含む医薬組成物内に配合するステップと
を含む、医薬組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、それぞれの題名が「親和性のコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤およびその使用」であり、そのそれぞれの内容が全体で本明細書中に参考として明白に組み込まれている、２０１８年７月１１日に出願の米国仮特許出願第６２／６９６，７５２号、２０１８年８月１３日に出願の第６２／７１８，１９６号、２０１８年９月２７日に出願の第６２／７３７，５３４号、２０１８年１１月９日に出願の第６２／７５８，１８０号、２０１９年２月２５日に出願の第６２／８１０，２６３号、および２０１９年４月１日に出願の第６２／８２７，５５２号の優先権を主張するものである。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている配列表を含む。２０１９年７月１１日に作成の前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称が１２７０３６−０３５２０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、２６１，２５２バイトのサイズである。
【０００３】
トランスフォーミング成長因子ベータ１（ＴＧＦβ１）は、そのそれぞれが別々の遺伝子によってコードされている２つの他の構造的に関連するアイソフォーム、すなわちＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３と共に、ＴＧＦβ成長因子スーパーファミリーのメンバーである。これらのＴＧＦβアイソフォームは、恒常性および疾患のコンテキストのどちらにおいても細胞増殖、分化、免疫調節（たとえば適応免疫応答）、および他の多様な生物学的プロセスを調節する多面発現サイトカインとして機能を果たす。３つのＴＧＦβアイソフォームは同じ細胞表面受容体を通してシグナル伝達し、ＳＭＡＤ２／３経路を含めた同様のカノニカルな下流シグナル伝達事象を始動させる。しかし、マウスにおける遺伝子ノックアウト研究は多様な表現型を示し、それぞれのアイソフォームがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて別個の役割を果たすことを示唆している。これは３つのアイソフォームの示差的な発現パターンによって部分的に達成し得る。
【０００４】
免疫系内において、Ｔ細胞はＴＧＦβの主要な直接標的として認識されている。ＴＧＦβシグナル伝達は、エフェクター細胞の増殖ならびにエフェクターおよび調節性Ｔ細胞の分化の調節において重要である。たとえば、ＴＧＦβはＴｈ１およびＴｈ２エフェクターＴ細胞の強力な抑制因子である。細胞毒性Ｔ細胞のエフェクター機能は、複数の機構を通じてＴＧＦβによって抑制されることも示されている。さらに、ランゲルハンス細胞などの樹状細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等の免疫系の他の細胞種もＴＧＦβシグナル伝達経路によって調節されることが、証拠によって示されている。ＴＧＦβ調節不全は、癌、線維症、および免疫障害などのいくつかの病状に関連づけられている。
【０００５】
細胞外マトリックスが役割を果たす多くの生物学的プロセスがＴＧＦβシグナル伝達に関連している。いくつか挙げると、ＴＧＦβは、創傷治癒、腫瘍の侵襲および転移、ならびに線維症の進行に結び付けられている。
【０００６】
これらおよび他の理由のため、ＴＧＦβは免疫障害、様々な増殖性障害、および線維性状態を処置するための魅力的な治療標的である。しかし、ラットおよびイヌを含めた前臨床研究からの観察により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴＧＦβの全身性阻害に関連する重大な毒性が明らかとなっている。さらに、いくつかのＴＧＦβ阻害剤が現在までに開発されているが、ＴＧＦβを標的とするほとんどの臨床プログラムは重大な副作用の危険性が原因で中断されている（たとえばＷＯ２０１７／１５６５００号に要約）。したがって、癌および線維症などの疾患の進行におけるＴＧＦβシグナル伝達の関与を指し示す一連の直接的および間接的な証拠にもかかわらず、安全かつ効果的とみなされるＴＧＦβ治療剤は現在までに市販されていない。
【０００７】
以前に、本出願人は、新規作用機構で機能して成長因子のシグナル伝達を変調するモノクローナル抗体のクラスを記載している（たとえばＷＯ２０１４／１８２６７６号を参照）。これらの抗体は、ＴＧＦβ１がプロドメインおよび成長因子からなる潜在型前駆タンパク質複合体として発現され、成長因子を潜在型複合体から放出させる活性化ステップを必要とすることを活用するように設計された。成熟成長因子自体を活性化後に直接標的とする従来の手法をとる代わりに（中和抗体など）、阻害性抗体の新規クラスは、活性化ステップをリガンド−受容体の相互作用の上流で先制して遮断するために、不活性の前駆前駆タンパク質複合体自体を特異的に標的とする。このユニークな作用機構は、根源で作用するという点で、すなわち疾患微小環境内で活性化が起こる前に潜在型前駆ＴＧＦβ１（ｐｒｏＴＧＦβ１）複合体を標的化することによって、空間的および時間的な利益をどちらも達成するという利点を提供するはずであると推論された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
この手法を使用して、アイソフォーム選択的な様式でＴＧＦβ１と結合してその活性化ステップ（すなわち潜在型複合体からの成熟成長因子の放出）を阻害するモノクローナル抗体を作製した（ＷＯ２０１７／１５６５００号を参照）。それ中に提示されるデータは、ＴＧＦβのアイソフォーム特異的阻害（汎阻害の対照として）が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＧＦβを拮抗する改善された安全性プロフィールを与え得るという見方を支持している。その後、このことを考慮に入れて、本出願人は、ｉ）アイソフォーム特異的でもあり、ｉｉ）異なる提示分子に関連する複数のＴＧＦβ１シグナル伝達複合体を広範に標的化することもできるＴＧＦβ１阻害剤を、多面的ＴＧＦβ１効果およびその調節不全によって駆動される状態の治療剤として開発することを追求した。
【０００９】
そのような抗体は、その後にＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０１号（２０１８年１月５日に出願）に記載されている。実際、それ中に記載されているアイソフォーム特異的阻害剤は、ＥＣＭ関連ＴＧＦβ１および免疫細胞関連ＴＧＦβ１をどちらも標的化し、それによってアイソフォーム特異性を維持したままで複数の生物学的コンテキストにおける複数のＴＧＦβ１源を遮断することができた。アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１活性化阻害剤の有効性および安全性を示すいくつかのｉｎ  ｖｉｖｏモデルからのデータが開示されており、そのような阻害剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＣＭ関連ＴＧＦβ１および免疫細胞関連ＴＧＦβ１の両方の調節不全に関与する疾患の処置に有用であることが実証されている。
【００１０】
上記に引用した初期の研究では、既知の前駆ＴＧＦβ１複合体および阻害活性のそれぞれを標的とすることができる抗体の有用性が実証されているが、さらにより高いｉｎ  ｖｉｖｏ効力を有する改善されたアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、高い効力でＴＧＦβ１の活性化を阻害することができる、高親和性のアイソフォーム選択的抗体の新規クラスを提供する。これらには、高い親和性で複数の提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体（「大型潜在型複合体」または「ＬＬＣ」と呼ばれる）を標的化することができる抗体（免疫グロブリンおよび抗原結合断片またはその一部分、ならびにそのような断片を取り込んだ操作した分子を含む）が含まれる。これらの抗体は、不可欠な選択性および安全性プロフィールを保持しており、複数の前臨床モデルにおいて、ヒト条件への翻訳可能性を有して、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を達成することが示されている。ＴＧＦβ１阻害剤のこれらの特質は、ＴＧＦβ１調節不全に関与する疾患を処置するための安全かつ有効なＴＧＦβ１治療剤を開発する機会を開く。
【００１２】
本開示の前駆ＴＧＦβ１抗体を作製する際には以下の選択基準を考慮に入れた：１）アイソフォーム選択性、２）ヒトＬＬＣ、たとえば、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１に対する高い親和性、３）頑強な阻害効力、４）好都合なｉｎ  ｖｉｖｏ安全性／毒性学プロフィール、ならびに５）ヒト疾患を概括する前臨床（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃｎａｌ）モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。さらに、組合せ療法（たとえば付加型治療）として使用するＴＧＦβ１阻害剤の有効性を評価するにあたって、相乗効果（単なる相加効果の対照として）を達成する能力を検討するべきである。これらの基準に基づいて、本開示の発明者らは、前駆ＴＧＦβ１複合体を特異的に標的化し、ＴＧＦβ１の活性化を強力に遮断することができる、高親和性モノクローナル抗体のクラスおよびその断片を同定した。一部の実施形態では、本明細書中に開示されている新規抗体は、すべての標的ＬＬＣにわたって高い親和性を示す（たとえばナノモーラーからナノモーラー以下の範囲のＫＤ）。好ましい実施形態では、そのような抗体は、抗体がすべての標的複合体に対して等しい親和性を有するように、様々な前駆ＴＧＦβ１複合体にわたって不偏的である。関連組成物、治療的使用、調製物、配合物、工程、および方法が本発明によって包含される。
【００１３】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、溶液平衡滴定によって測定して、以下のヒトＬＬＣ複合体のそれぞれと≦１０ｎＭのＫＤで結合することができるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む：ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと≦１ｎＭのＫＤで結合する。好ましくは、抗体は４つのヒトＬＬＣのそれぞれに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。
【００１４】
一部の実施形態では、抗体または断片は前駆ＴＧＦβ１の潜在型ラッソ（Ｌａｔｅｎｃｙ  Ｌａｓｓｏ）またはその一部分と結合する。一部の実施形態では、抗体または断片はフィンガー−１およびフィンガー−２などの成長因子ドメインの一部分とさらに結合する。たとえば、抗体または断片は、潜在型ラッソの１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープと結合し得る。任意選択で、エピトープは成長因子ドメインの１つまたは複数のアミノ酸残基をさらに含み得る。したがって、そのようなエピトープはコンビナトリアルエピトープであり得る。好ましい実施形態では、抗体は、前駆ＴＧＦβ１複合体と会合していない遊離ＴＧＦβ１成長因子と結合しない。
【００１５】
本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、ＴＧＦβ１に対して阻害活性を有するという点において機能的抗体である。そのような抗体の効力は、本明細書中に記載の細胞に基づくレポーターアッセイなどの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイによって測定して、アイソフォーム特異的である。したがって、抗体はＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３対応物と結合しない、またはそれを阻害しない。
【００１６】
本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、潜在型ＬＬＣ複合体からの成熟成長因子の放出を遮断することができる。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、ＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化および／またはＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化を阻害することができる。一部の実施形態では、プロテアーゼは、カリクレイン、プラスミン、またはＭＭＰプロテアーゼである。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、インテグリンとＬＬＣとの結合を遮断せずにインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｇ）依存性ＴＧＦβ１の活性化を遮断する。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、細胞関連ＬＬＣ（たとえばＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）に対する二重阻害性の作用機構を通じて機能し得る。第１の機構では、そのような阻害剤は、膜に固定されたＧＡＲＰおよび／またはＬＲＲＣ３３に関連するＴＧＦβ１の活性化ステップを遮断する。第２の機構では、そのような阻害剤は、標的会合の際に、細胞表面からのＬＬＣの抗体依存性内部移行（したがって除去）を誘導し、それによってニッチでのＴＧＦβ１シグナル伝達を低下させ得る。一部の実施形態では、抗体は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨにおいてより高い親和性で前駆ＴＧＦβ１複合体と結合することを特徴とする、ｐＨ感受性（ｓｅｎｅｉｔｉｖｅ）抗体である。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、ＴＧＦＢ１、Ａｃｔａ２、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｆｎ１、Ｉｔｇａ１１、Ｌｏｘ、Ｌｏｘｌ２、ＣＣＬ２、およびＭｍｐ２などの疾患関連遺伝子の発現を低下させるために有効である。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて下流エフェクターＳＭＡＤ２／３のリン酸化を低下させるために有効である。
【００２０】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、ＴＧＦβ１関連の適応症を処置するために有効である。そのような適応症は、異常な遺伝子発現に関与する疾患、ＥＣＭ調節不全に関与する疾患、免疫抑制細胞（たとえば、Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ、および／またはＭ２マクロファージ）の増加によって特徴づけられる疾患、間葉転換に関与する疾患、プロテアーゼに関与する疾患、異常な幹細胞の増殖および／または分化に関連する疾患などを含む一方で、これらの疾患カテゴリーは相互排他的であることを意図しない。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１関連の適応症は、骨髄増殖性疾患および固形腫瘍を有する癌などの増殖性障害である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１関連の適応症は、臓器線維症などの線維性障害である。癌は進行癌であってよく、これは局所進行性腫瘍／癌および転移癌を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、腫瘍微小環境および線維性微小環境などの疾患部位での免疫抑制細胞集団の数を減らすことができる。一部の実施形態では、免疫抑制細胞集団は、Ｍ２−極性化マクロファージおよび／またはＭＤＳＣを含み得る。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、腫瘍制御（たとえば部分応答および完全応答）を達成するために有効であり、ここで、腫瘍は任意選択で免疫抑制性（たとえば免疫排除）の表現型である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、チェックポイント遮断療法、化学療法、および放射線療法などの癌治療と併せて使用した場合に相乗的な抗腫瘍効果を達成し得る。チェックポイント遮断療法は、たとえば抗ＰＤ−（Ｌ）１抗体を含み得る。そのような組合せ療法では、ＴＧＦβ１阻害剤は処置耐性（たとえば一次耐性）を克服し、それによって癌が癌治療に対してより感受性となり得る。したがって、ＴＧＦβ１阻害剤は、対象における免疫抑制腫瘍を含む癌の処置に使用し得る。対象は、ｉ）チェックポイント阻害剤などの癌治療に対する一次非応答者、またはｉｉ）その少なくとも１つのチェックポイント阻害剤が規制当局によって治療として認可されている癌を診断された者であり得る。その少なくとも１つのチェックポイント阻害剤が認可されている癌の応答率（治療を受けた者のうちの、部分応答者および完全応答者を合わせたもの）は１００％未満である。典型的には、応答率は約１０〜６０％である。ＴＧＦβ１阻害剤は患者集団間の応答率を増加させ得る。さらに、一次応答者の中の部分応答群内において、ＴＧＦβ１阻害剤は改善された臨床上の利点を提供し得る。一部の実施形態では、一次応答者群の中で、ＴＧＦβ１阻害剤は癌治療に対する獲得耐性率を低下させ得る。免疫抑制腫瘍は局所進行性の癌／腫瘍または転移癌であり得る。一部の実施形態では、癌治療は、たとえば、チェックポイント阻害剤療法、化学療法、および／または放射線療法を含み得る。
【００２３】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、任意選択で局所進行性または転移性の癌である固形腫瘍を有する対象において、延命効果を達成するために有効である。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、Ｔ細胞記憶機能を誘導することによって永続的抗腫瘍効果を達成するために有効である。したがって、ＴＧＦβ１阻害剤は疾患の再発を低下または遅延させ得る。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、ＴＧＦＢ１および／またはＴＧＦｂ３を優性に発現する腫瘍において抗腫瘍効果を達成するために有効である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を同時発現する腫瘍は癌腫である。
【００２６】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、癌治療に対する腫瘍の一次耐性を克服することができる。一部の実施形態では、そのような腫瘍は、調節性Ｔ細胞、Ｍ２型マクロファージ、および／または骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）などの免疫抑制細胞種が浸潤している。処置の際、腫瘍関連免疫抑制細胞の数の低下、および抗腫瘍エフェクターＴ細胞の数の対応する増加が存在する。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、腫瘍内へのエフェクター細胞の浸潤を促進する。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、腫瘍の血管構造を介して腫瘍内に入り得る。一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤はエフェクター細胞の拡大（たとえば増殖）を促進する。これは、ＧＡＲＰ陽性（ｐｏｓｉｔｉｅ）調節性Ｔ細胞の阻害によって少なくとも部分的に媒介され得る。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、骨髄線維症を処置するために有効である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、骨髄線維症を有する対象の骨髄の抗線維性効果を達成する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、特定の血液学的パラメータを正規化するために有効である。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗線維性効果を達成するために有効である。抗線維性効果は確立された線維症逆転を含んでよく、これは部分逆転または完全逆転であり得る。
【００３０】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、前臨床の安全性／毒性学的研究において、１００、２００、または３００ｍｇ／ｋｇまでの用量で、週に１回、少なくとも４週間投薬した場合に、良好に耐用されている。そのような研究は、ラットおよび非ヒト霊長類などのＴＧＦβ阻害に感受性があることが知られている動物モデルにおいて実施し得る。一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、心血管毒性（たとえば弁膜症）および上皮過形成ならびに当技術分野で知られている他の毒性などの、ＴＧＦβの汎阻害に関連する観察可能な毒性を引き起こさない。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究によって示される阻害剤の有効量が、観察可能な毒性を引き起こす量または濃度よりもだいぶん低い（少なくとも３倍、少なくとも６倍、または少なくとも１０倍など）という点で、十分な治療ウィンドウを達成する。一部の実施形態では、阻害剤の治療上有効な量は１週間あたり約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ＬＮ２２９アッセイにおけるＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβの活性化の阻害を示すグラフである。
【図２】図２は、ＬＮ２２９アッセイにおける前駆ＴＧＦβ１複合体の活性化の阻害を示すグラフである。
【図３】図３は、ＳＷ４８０β６アッセイにおけるＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１の活性化の阻害を示すグラフである。
【図４】図４は、ＳＷ４８０β６アッセイにおけるＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１の活性化の阻害を示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＧＦβ１のカリクレイン誘導性活性化に対するＡｂ３およびＡｂ６の阻害効果を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＧＦβ１のプラスミン誘導性活性化に対するＡｂ３およびＡｂ６の阻害効果を示す図である。
【図６】図６は、ＬＲＲＣ３３および前駆ＴＧＦβ１を形質移入した異種細胞における、Ａｂ６結合の際のＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦｂ１の迅速な内部移行を示すグラフを提供する。
【図７】図７は、ＵＵＯマウスにおける、コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１）の発現に対するＡｂ６またはＡｂ３の効果を示す２つのグラフを提供する。マウスを３、１０、もしくは３０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ３または３もしくは１０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ６で処置した。ＩｇＧ単独を対照として使用した。
【図８】図８は、ＵＵＯマウスにおける、Ｆｎ１およびＬｏｘｌ２遺伝子の発現に対するＡｂ３またはＡｂ６の効果を示す２つのグラフを提供する。マウスを３、１０、もしくは３０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ３または３もしくは１０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ６で処置した。ＩｇＧ単独を対照として使用した。
【図９】図９は、ＵＵＯモデルにおける、処置後の遺伝子発現の変化（対ＵＵＯ＋ＩｇＧ）の統計的有意性を要約する図である。
【図１０】図１０は、クラウドマンＳ９１黒色腫モデルにおいて、Ａｂ３を３０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで、抗ＰＤ−１と組み合わせて投与した後の、経時的（日）なパーセント生存を示すグラフである。抗ＰＤ−１単独、抗ＳＲ−ＡＢ３を対照として使用した。
【図１１Ａ】図１１Ａは、クラウドマンＳ９１黒色腫モデルにおいて、Ａｂ３またはＡｂ６を３０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ抗ＰＤ−１と組み合わせて投与した後の、経時的（日）に測定した腫瘍進行中央値として表す腫瘍成長の変化（腫瘍体積ｍｍ３）を示す、５つのグラフを提供する。抗ＰＤ−１単独を対照として使用した。破線は、腫瘍潰瘍形成が原因で２０００ｍｍ３のエンドポイント基準に達する前に屠殺しなければならなかった動物を表す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ａｂ３（左）またはＡｂ６（右）を３０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで、抗ＰＤ−１と組み合わせて投与した後の、時間の関数としてのクラウドマンＳ９１の腫瘍体積中央値を示す２つのグラフを提供する。抗ＰＤ−１単独、Ａｂ３単独、Ａｂ６単独、およびＩｇＧ単独を対照として使用した。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、（１）対照ＩｇＧ、（２）Ａｂ６のみ、（３）抗ＰＤ１のみ、（４）抗ＰＤ１／Ａｂ６（３ｍｇ／ｋｇ）、（５）抗ＰＤ１／Ａｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）、および（６）抗ＰＤ１／Ａｂ６（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおける、時間の関数としてのＳ９１の腫瘍体積の変化を示す６つのグラフを提供する。２，０００ｍｍ３のエンドポイント腫瘍体積を上部の点線で示し、５００ｍｍ３の２５％閾値体積を下部の点線で示す。応答者は、エンドポイント体積の２５％未満の腫瘍サイズを達成したものとして定義した。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、抗ＰＤ−１とＡｂ６との組合せを用いて３つの用量レベル（３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおける、時間の関数としてのＳ９１の腫瘍体積の変化を示す３つのグラフを提供する。永続的抗腫瘍効果が処置後に示される。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、図１１Ｃからの腫瘍体積中央値として表したデータを要約するグラフを提供する。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、図１１Ｃからのそれぞれの処置群における経時的な動物の生存を示すグラフを提供する。
【図１２】図１２は、ＭＢＴ２膀胱癌モデルにおけるリン酸化対総ＳＭＡＤ２／３比（ｐＳＭＡＤ／ＳＭＡＤ）を示すグラフである。動物を以下のように処置した：（１）抗ＰＤ−１抗体のみ、（２）抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ５（３ｍｇ／ｋｇ）、（３）抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ５（１０ｍｇ／ｋｇ）、（４）抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３（１０ｍｇ／ｋｇ）、（５）抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３（３０ｍｇ／ｋｇ）。
【図１３Ａ−３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは、Ａｂ３を３０ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇで、またはＡｂ６を３ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇで、抗ＰＤ−１と組み合わせて投与した後の、経時的（日）に測定したＭＢＴ２腫瘍成長（腫瘍体積ｍｍ３）の変化を示す、５つのグラフを二組提供する。抗ＰＤ−１単独を対照として使用した。時間の関数としての腫瘍体積の変化を対数スケール（図１３Ａ）および線形スケール（図１３Ｂ）で表す。破線は、腫瘍潰瘍形成が原因で１２００ｍｍ３のエンドポイント基準に達する前に屠殺しなければならなかった動物を表す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＭＢＴ２同系膀胱癌モデルにおける、Ａｂ３（左上）を３０ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇで、またはＡｂ６（右上）を１０ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇで、抗ＰＤ−１と組み合わせて投与した後の、時間の関数としての腫瘍体積中央値を示すグラフを提供する。抗ＰＤ−１単独、Ａｂ３単独、Ａｂ６単独、およびＩｇＧ単独を対照として使用した。１５日目での腫瘍体積中央値を下のグラフに要約する。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＭＢＴ２同系膀胱癌モデルにおける、抗ＰＤ−１と組み合わせたＡｂ６の効果を示す５つのグラフを提供する。応答者は、研究の終わりにエンドポイント体積の２５％未満の腫瘍サイズを達成したものとして定義する。
【図１４】図１４は、ＭＢＴ２同系膀胱癌モデルにおいて、Ａｂ３を１０ｍｇ／ｋｇでまたはＡｂ６を３ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇで、抗ＰＤ−１と組み合わせて投与した後の、経時的（日）なパーセント生存を示すグラフである。抗ＰＤ−１単独を対照として使用した。
【図１５】図１５は、腫瘍再誘発研究において経時的（日）に測定した腫瘍成長の変化（腫瘍体積ｍｍ３）を示す一組のグラフを提供する。以前に抗ＰＤ−１／Ａｂ３または抗ＰＤ−１／Ａｂ６で処置し、腫瘍が除去された動物（完全回帰を達成した完全応答者）を、ＭＢＴ２腫瘍細胞で再誘発した。ナイーブな未処置の動物を対照として使用した。破線は、腫瘍潰瘍形成が原因で１２００ｍｍ３のエンドポイント基準に達する前に屠殺しなければならなかった動物を表す。
【図１６】図１６は、Ａｂ５  Ｆａｂ結合が、前駆ＴＧＦβ１の領域（領域１および領域２）におけるＨＤＸ保護をもたらすことを示すヒートマップである。
【図１７】図１７は、Ａｂ５結合の際にＨＤＸによって測定された（図１６を参照）、溶媒交換から保護されている前駆ＴＧＦβ１複合体の領域を例示する図である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、前駆ＴＧＦβ１（Ｃ４Ｓ）とのＡｂ６  Ｆａｂ結合の保護効果を示すヒートマップである。抗体−抗原の相互作用によって影響を受ける領域を赤色の四角によって示す（１、２ａ、２ｂ、２ｃ、３、４、５ａ、５ｂ、６ａ、および６ｂ）。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＴＧＦβ１の結晶構造に重ね合わせたＨＤＸデータを提供する。図１８Ａにおいて同定した領域を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、統計分析後の３つの結合領域（領域１、領域２、および領域３）の同定を例示する図である。領域１は前駆ＴＧＦβ１のプロドメイン内のいわゆる「潜在型ラッソ」と重複する一方で、領域２および３は成長因子ドメイン内にある。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、Ａｂ６結合に関与する３つの結合領域と比較した、前駆ＴＧＦβ１の様々なドメインおよびモチーフを示す図である。３つのアイソフォーム間の配列アラインメントも提供する。
【図２０Ａ−２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｄは、様々な組織および細胞におけるＴＧＦβアイソフォームの相対的ＲＮＡ発現を示す図である。図２０Ａは、様々なヒト癌組織対正常な比較対象（癌種ごと）におけるＴＧＦβアイソフォーム発現を示す。図２０Ｂは、３３個の腫瘍種の１０，０００個を超える試料からの分析に基づく、ヒト癌種ごとのＴＧＦβアイソフォーム発現の頻度を示す。図２０Ｃは、癌種ごとの個々の腫瘍試料におけるＴＧＦβアイソフォーム発現を示す。図２０Ｄは、マウス同系癌細胞モデル系におけるＴＧＦβアイソフォーム発現を示す。
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、すべての提示分子（ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、およびＬＲＲＣ３３）がほとんどのヒト癌種において高度に発現されていることを示す４つの遺伝子発現パネルを提供する。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、同系マウス腫瘍モデルであるクラウドマンＳ９１、ＭＢＴ−２、およびＥＭＴ−６からの、ＴＧＦβおよび関連シグナル伝達経路の遺伝子の発現の分析を提供する図である。
【図２０Ｇ】図２０Ｇは、クラウドマンＳ９１、ＭＢＴ−２、およびＥＭＴ−６腫瘍モデルにおける、ＥＬＩＳＡによって３つのＴＧＦβアイソフォームのタンパク質発現を比較する３つのグラフを提供する。
【図２０Ｈ】図２０Ｈは、クラウドマンＳ９１、ＭＢＴ−２、およびＥＭＴ−６腫瘍モデルにおける、提示分子の全腫瘍溶解物ｑｐＣＲによってＲＮＡ発現レベルを比較するグラフを提供する。
【図２１Ａ】図２１Ａは、１週間の毒性学研究からの汎ＴＧＦβ抗体からの微視的な心臓の所見を示す図である。図２１Ｂは、ＡＬＫ５阻害剤または４週間のラット毒性学研究からの汎ＴＧＦβ抗体と比較した、Ａｂ３からの微視的な心臓の所見を示す図である。図２１Ｃは、ＡＬＫ５阻害剤または４週間のラット毒性学研究からの汎ＴＧＦβ抗体と比較した、Ａｂ６からの微視的な所見を示す図である。
【図２２】図２２は、時間の関数としてのＳ９１の腫瘍体積中央値を示すグラフを提供する。組合せアームは、２つの用量レベルで、それぞれ抗ＰＤ−１処置と組み合わせた、４つの異なるアイソフォーム選択的なコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を表す。
【図２３Ａ−２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｂは、ＣＤ８＋細胞マーカーで染色した、Ｓ９１腫瘍の代表的な免疫組織化学的切片を提供する。図２３Ａは、抗ＰＤ−１単独で処置した動物からの腫瘍切片である。図２３Ｂは、抗ＰＤ−１および代表的なコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤の両方で処置した動物からの腫瘍切片である。
【図２４Ａ−２４Ｄ】図２４Ａ〜２４Ｄは、マクロファージマーカーで染色した、Ｓ９１腫瘍の代表的な免疫組織化学的切片を提供する。図２４Ａは、抗ＰＤ−１単独で処置した動物からの腫瘍切片である。図２４Ｂは、抗ＰＤ−１および代表的なコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤の両方で処置した動物からの腫瘍切片である。図２４Ｃは、抗Ｆ４／８０をマクロファージマーカーとして使用した、抗ＰＤ−１およびＡｂ３（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置した動物からの腫瘍切片である。図２４Ｄは、抗ＣＤ１６３をＭ２マクロファージマーカーとして使用した切片であり、ほとんどの細胞がＣＤ１６３陰性であることを示している。
【図２５】図２５は、抗ＰＤ−１で処置した動物単独と比較して、ＭＢＴ２腫瘍において抗ＰＤ−１／Ａｂ３で１週間処置した後の、ＣＤ８＋Ｔリンパ球遺伝子（ＣＤ８α、パーフォリン、およびグランザイムＢ）におけるｌｏｇ２倍の変化を示すグラフである。
【図２６Ａ】図２６Ａは、末梢ヒト調節性Ｔ細胞におけるＧＡＲＰのＣＤ３／ＣＤ２８誘導性アップレギュレーションを示すＦＡＣＳデータを提供する。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、Ｔｅｆｆ増殖のＴｒｅｇ媒介性阻害に対するＡｂ３またはＡｂ６の効果を示すグラフである。ＩｇＧを対照として使用した。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ＭＢＴ２腫瘍においてＴ細胞部分集団を分別するためのゲーティング戦略を示す図である。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ＣＤ４５＋細胞のパーセントとして表す、１３日目のＴ細胞部分集団を示す一組のグラフを提供する。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ＭＢＴ２腫瘍において骨髄部分集団を分別するためのゲーティング戦略を提供する。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、１３日目の骨髄細胞部分集団を示す一組のグラフを提供する。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、ＭＢＴ−２における腫瘍関連マクロファージが細胞表面ＬＲＲＣ３３を発現することを示すＦＡＣＳデータを提供する。
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、ＭＢＴ−２腫瘍浸潤性ＭＤＳＣが細胞表面ＬＲＲＣ３３を発現することを示す図である。
【図２９Ａ−２９Ｃ】図２９Ａ〜２９Ｃは、ＭＢＴ２腫瘍におけるＡｂ６および抗ＰＤ−１処置の効果を示す追加のＦＡＣＳデータ分析を提供する。
【図３０Ａ−３０Ｄ】図３０Ａ〜３０Ｄは、腫瘍内ＣＤ８陽性Ｔ細胞を示す代表的なＭＢＴ２腫瘍切片のＩＨＣ画像を提供する。
【図３０Ｅ】図３０Ｅは、それぞれの処置群におけるＣＤ８陽性細胞の割合として表す、図３０Ａ〜３０ＤからのＩＨＣデータの定量を提供する。切片の壊死領域は分析から排除した。
【図３０Ｆ】図３０Ｆは、ＭＢＴ２腫瘍におけるＡｂ６および抗ＰＤ−１処置の効果の免疫組織化学的（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｉｅｍｉｃａｌ）分析を提供する。示した３つの処置群からの動物において、腫瘍切片をホスホ−ＳＭＡＤ３（上部パネル）またはＣＤ８およびＣＤ３１（下部パネル）について可視化した。
【図３０Ｇ】図３０Ｇは、Ａｂ６と抗ＰＤ−１とが組み合わせてＣＤ３１＋血管からのＣＤ８＋Ｔ細胞の動員およびＭＢＴ２腫瘍内への浸潤を始動すると思われることを実証するデータを提供する。
【図３１Ａ−３１Ｄ】図３１Ａ〜３１Ｄは、示した４つの処置群からのＭＢＴ２腫瘍から収集した免疫応答マーカー、Ｐｔｐｒｃ（図３１Ａ）、ＣＤ８ａ（図３１Ｂ）、ＣＤ４（図３１Ｃ）、およびＦｏｘｐ３（図３１Ｄ）の遺伝子発現を提供する。
【図３２Ａ−３２Ｃ】図３２Ａ〜３２Ｃは、示したように１０日目および／または１３日目でのエフェクター機能マーカー、Ｉｆｎｇ（図３２Ａ）、Ｇｚｍｂ（図３２Ｂ）、およびＰｒｆ１（図３２Ｃ）の遺伝子発現を提供する。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、ＭＢＴ２腫瘍試料において１０日目にｑｐＣＲによって測定した、４つの遺伝子マーカー（グランザイムＢ、パーフォリン、ＩＦＮγ、およびＫｌｒｋ１）の発現を示す一組のグラフを提供する。それぞれのグラフは、３つの処置群：抗ＰＤ−１単独（左）、Ａｂ６単独（中央）、および抗ＰＤ−１とＡｂ６との組合せ（右）における発現の変化の倍数を提供する。
【図３３Ａ】図３３Ａは、溶液平衡滴定に基づくアッセイ（ＭＳＤ−ＳＥＴ）によって測定した、示した４つの大型潜在型複合体に対するＡｂ６のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を示す図である。測定されたＫＤ値（ピコモーラーで）を右に示す。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、ＬＮ２２９細胞に基づく効力アッセイを例示し、示した４つの大型潜在型複合体に対するＡｂ６の濃度依存性効力を示すグラフを提供する。これはまた、Ａｂ６が前駆ＴＧＦβ３を阻害しないことも示す。
【図３４Ａ】図３４Ａは、ＥＭＴ６における経時的な腫瘍成長／回帰に対する、抗ＰＤ１および／または抗ＴＧＦβ３と組み合わせたまたは組み合わせないＡｂ６の効果を示す、一組の９つのグラフを提供する（研究１）。それぞれのグラフ内の上部の点線は２０００ｍｍ３のエンドポイント腫瘍体積を表す一方で、それぞれのグラフにおける下部の点線はエンドポイント体積の２５％（すなわち５００ｍｍ３）を表す。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、ＥＭＴ６における経時的（処置開始後の日数）なパーセント生存を示すグラフを提供する（研究１）。抗ＰＤ−１およびＡｂ６をどちらも含む処置群は、抗ＰＤ−１単独と比較して有意な延命効果を示した。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、ＥＭＴ６における経時的（処置開始後の日数）なパーセント生存を示すデータを提供する（研究２）。抗ＰＤ−１およびＡｂ６をどちらも含む処置群は、抗ＰＤ−１単独と比較して有意な延命効果を示し、抗腫瘍効果は処置が終わった後に永続性があった。
【図３４Ｄ】図３４Ｄは、ＥＭＴ６乳癌モデルにおける生存に対する抗ＰＤ−１とＡｂ６との組合せの効果を提供する。
【図３５】図３５は、ｍＲＮＡレベル（左）およびタンパク質レベル（右）で測定した、ＥＭＴ６腫瘍における３つのＴＧＦβアイソフォームの相対的発現を示す２つのグラフを提供する。
【図３６Ａ】図３６Ａは、ネズミ骨髄増殖性疾患モデルにおける骨髄の線維性表現型のマーカーとしてのレチクリンの銀染色を示す、一組の組織学的画像を提供する。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、骨髄線維症の組織病理学的分析および２つの別々の反復研究からの高い疾患の負担を有するＭＰＬＷ５１５ＬマウスにおけるＴＧＦβ１阻害の効果を示す２つのグラフを提供する。
【図３６Ｃ】図３６Ｃは、Ａｂ６または対照ＩｇＧで処置したＭＰＬＷ５１５Ｌマウスにおける血液学的パラメータを示す一組のグラフを提供する。
【図３６Ｄ】図３６Ｄは、Ａｂ６または対照ＩｇＧで処置したＭＰＬＷ５１５Ｌマウスにおける追加の血液学的パラメータを示す一組のグラフを提供する。
【図３７Ａ】図３７Ａは、ＴＧＦβアイソフォーム発現とＩＰＲＥＳ遺伝子組との間の相関を示す遺伝子組差異分析（ＧＳＶＡ）を提供する。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、ＴＧＦβアイソフォーム発現とＰｌａｓａｒｉ遺伝子組との間の相関を示す遺伝子組差異分析（ＧＳＶＡ）を提供する。ＴＧＦｂ１アイソフォームの発現はＴＧＦβ経路の活性化と相関している。ＴＧＦβ応答性遺伝子のＰｌａｓａｒｉ遺伝子組は、多くのＴＣＧＡ注釈付きの腫瘍種にわたって、ＴＧＦｂ１のＲＮＡアイソフォームの発現と有意にかつ強く相関している。ＴＧＦＢ１のｍＲＮＡとＴＧＦβシグナル伝達との相関のシグネチャ
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
本開示をより容易に理解し得るように、特定の用語をまず定義する。これらの定義は、本開示の残りの部分に鑑みて、かつ当業者に理解されるように読むべきである。別段に定義しない限りは、本明細書において使用するすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。追加の定義は、詳細な説明の全体にわたって記載されている。
【００３４】
進行癌、進行悪性腫瘍：本明細書中で使用する用語「進行癌」または「進行悪性腫瘍」は、関連分野において理解される、たとえば癌を有する対象／患者を診断または処置するコンテキストにおいて、腫瘍学者によって理解される意味を有する。固形腫瘍を有する進行悪性腫瘍は局所進行性または転移性である場合がある。用語「局所進行癌」とは、それが始まった臓器の外側に成長しているが、身体の遠位部までは未だ拡がっていない癌（たとえば腫瘍）を説明するために使用する。したがって、この用語は、それが始まった場所から付近の組織またはリンパ節へと拡大した癌を含む。対照的に、「転移癌」とは、それが始まった身体の部分（原発部位）から身体の他の部分（たとえば遠位部）へと拡がった癌である。
【００３５】
親和性：親和性とは、分子（抗体など）とそのリガンド（抗原など）との結合の強度である。典型的には、これは平衡解離定数（ＫＤ）によって測定および報告される。抗体−抗原の相互作用のコンテキストにおいて、ＫＤは、抗体解離速度（「オフ速度」またはＫオフ、どれだけ速くその抗原と解離するか）対抗体の抗体会合速度（「オン速度」またはＫオン、どれだけ速くその抗原と結合するか）の比である。たとえば、≦５ｎＭの親和性を有する抗体は、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定して、５ｎＭ以下であるＫＤ値（すなわち５ｎＭ以上の親和性）を有する。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）および溶液平衡滴定（たとえばＭＳＤ−ＳＥＴ）などの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、抗体のその抗原に対するＫＤ値を測定することができる。
【００３６】
抗体：用語「抗体」とは、本明細書中の他の箇所にさらに記載するように、任意の天然に存在する、組換え、修飾された、または操作した免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン様構造またはその抗原結合断片もしくは一部分、あるいはその誘導体を包含する。したがって、この用語は、標的抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子をいい、たとえば、キメラ、ヒト化、完全ヒト、および二重特異性の抗体を含む。インタクト抗体は一般に少なくとも２本の完全長重鎖および２本の完全長軽鎖を含むが、一部の例では、重鎖のみを含むことができるラクダ中に天然に存在する抗体など、より少ない鎖を含むことができる。抗体は、単一源からのみに由来することができるか、または「キメラ」であることができる、すなわち抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来することができる。抗体またはその抗原結合部分は、ハイブリドーマにおいて、組換えＤＮＡ技法によって、またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。本明細書中で使用する用語抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書中で「抗体模倣体」と呼ぶ場合もある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（本明細書中で「抗体コンジュゲート」と呼ぶ場合もある）をそれぞれ含む。一部の実施形態では、この用語はペプチボディも包含する。
【００３７】
抗原：用語「抗原」用語「抗原」とは、抗体または断片が特異的に結合する結合領域内に抗原決定基を含む任意の分子を広く含む。抗原は、単一単位の分子（タンパク質単量体もしくは断片など）または複数の構成要素からなる複合体であることができる。抗原は、抗原結合タンパク質（たとえば抗体を含む）などの選択的結合剤によって結合されることができるエピトープ、たとえば、分子もしくは分子の一部分、または分子もしくは分子の一部分の複合体を提供する。したがって、選択的結合剤は、複合体中の２つ以上の構成要素によって形成される抗原と特異的に結合し得る。一部の実施形態では、抗原は、動物において使用して、その抗原と結合することができる抗体を産生させることができる。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、たとえば抗体と相互作用することができる、１つまたは複数のエピトープを保有することができる。本開示のコンテキストにおいて、適切な抗原は、提示分子と会合した前駆ＴＧＦ二量体を含有する複合体（たとえば会合した複数の構成要素からなる多量体の複合体）である。前駆ＴＧＦ二量体のそれぞれの単量体は、フューリン切断配列によって隔てられたプロドメインおよび成長因子ドメインを含む。２つのそのような単量体が前駆ＴＧＦ二量体複合体を形成する（図１９を参照）。立ち代ってこれは、それぞれの前駆ＴＧＦ単量体のＮ末端付近に存在するシステイン残基を含むジスルフィド結合を介して、提示分子と共有結合している。提示分子と結合した前駆ＴＧＦ二量体によって形成されたこのマルチ複合体は、一般に大型潜在型複合体と呼ばれる。たとえば、抗体または抗原結合断片をスクリーニングするために適した抗原複合体は、大型潜在型複合体の提示分子構成要素を含む。そのような提示分子構成要素は、完全長提示分子またはその断片であり得る。提示分子の最小必要部分は、典型的には少なくとも５０個のアミノ酸を含有するが、より好ましくは、前駆ＴＧＦβ１二量体と共有結合を形成することができる２つのシステイン残基を含む、提示分子ポリペプチドの少なくとも１００個のアミノ酸を含有する。
【００３８】
抗原結合部分／断片：本明細書中で使用する抗体の用語「抗原結合部分」または「抗原結合断片」とは、抗原（たとえばＴＧＦβ１）と特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片をいう。抗原結合部分は、それだけには限定されないが、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に入手可能、合成、または遺伝子操作したポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。一部の実施形態では、抗体の抗原結合部分は、たとえば、完全抗体分子から、タンパク質分解性消化、または、抗体の可変ドメインおよび任意選択で定常ドメインをコードしているＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子操作技法などの、任意の適切な標準技法を使用して誘導し得る。抗原結合部分の非限定的な例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子（たとえば、Ｂｉｒｄら、（１９８８年）、ＳＣＩＥＮＣＥ、２４２：４２３〜４２６頁およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８年）、ＰＲＯＣ．ＮＡＴ’Ｌ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３頁を参照）、（ｖｉ）ｄＡｂ断片（たとえばＷａｒｄら、（１９８９年）、ＮＡＴＵＲＥ、３４１：５４４〜５４６頁を参照）、ならびに（ｖｉｉ）最小限の認識単位を含む。ジアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含される。抗体の抗原結合部分という用語は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、およびリンカーを含む、「ｓｃＦａｂ」としても知られる「単鎖Ｆａｂ断片」であって、前記抗体ドメインおよび前記リンカーが、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、またはｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬの順序のうちの１つを有し、前記リンカーが、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸のポリペプチドである、単鎖Ｆａｂ断片を含む。
【００３９】
偏り：本開示のコンテキストにおいて、用語「偏り」とは、抗体が特異的に結合することができる抗原の部分組に向かうまたは対する歪んだまたは不均等な親和性をいう。たとえば、１つの抗原複合体に対する親和性と別の抗原複合体に対する親和性が等価でない場合に、抗体は偏りを有すると言われる。本開示によるコンテキスト非依存性抗体はそのような抗原複合体に対して等価な親和性（すなわち不偏性）を有する。
【００４０】
結合領域：本明細書中で使用する「結合領域」とは、抗体またはその断片と結合した際に、抗体−抗原の相互作用の界面を形成することができる抗原の一部分である。抗体結合の際、結合領域は表面曝露から保護され、これはＨＤＸ−ＭＳなどの適切な技法によって検出することができる。抗体−抗原の相互作用は、複数（たとえば２つ以上）の結合領域を介して媒介され得る。結合領域は、抗原決定基、またはエピトープを含むことができる。
【００４１】
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）：ＢＬＩとは、生体分子の相互作用、たとえば、バイオセンサーの先端表面上に固定したリガンドと溶液中の分析物との間のものを光学測定するための無標識技術である。ＢＬＩは、結合特異性、会合および解離の速度、または濃度を、精度および正確さをもってモニタリングする能力を提供する。ＢＬＩプラットフォーム機器は、たとえばＦｏｒｔｅＢｉｏから販売されており、一般的にＯｃｔｅｔ（登録商標）システムと呼ばれている。
【００４２】
癌：本明細書中で使用する用語「癌」とは、典型的には非調節の細胞増殖および悪性腫瘍によって特徴づけられる、多細胞真核生物における生理的条件をいう。この用語は、腫瘍、血液癌（たとえば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫）を含めた固形および液性の悪性腫瘍、ならびに骨髄線維症を広く包含する。
【００４３】
細胞関連前駆ＴＧＦβ１：この用語は、膜結合している（たとえば細胞表面に繋留されている）ＴＧＦβ１またはそのシグナル伝達複合体（たとえば前駆／潜在型ＴＧＦβ１）をいう。典型的には、そのような細胞は免疫細胞である。ＧＡＲＰまたはＬＲＲＣ３３によって提示されるＴＧＦβ１は、細胞関連ＴＧＦβ１である。ＧＡＲＰおよびＬＲＲＣ３３は、特定の細胞の細胞表面上に発現される膜貫通提示分子である。ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−は、細胞の前駆ＴＧＦβ１関連（たとえば免疫細胞関連）のＴＧＦβ１の活性化／シグナル伝達を媒介する、「細胞関連」（または「細胞表面」）前駆ＴＧＦβ１複合体と総称し得る。また、この用語は、細胞膜に物理的に付着していない、溶液中の組換えの精製したＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）も含む。ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体に対する抗体（またはその断片）の平均ＫＤ値は、細胞関連（たとえば免疫細胞関連）前駆ＴＧＦβ１複合体の親和性を総合的に表すように計算し得る。たとえば、表８の（Ｇ）列を参照されたい。提示分子または提示分子複合体のヒト対応物は、タンパク質またはタンパク質複合体の前に「ｈ」を置くことによって示してよく、たとえば、「ｈＧＡＲＰ」、「ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１」、ｈＬＲＲＣ３３」、および「ｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１」である。細胞に繋留されている複合体からの活性ＴＧＦβ１成長因子の放出を遮断することに加えて、細胞関連前駆ＴＧＦβ１は、内部移行（たとえばエンドサイトーシス）および／または細胞死滅、たとえば、そのような細胞表面複合体を発現する標的細胞のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、もしくはＡＤＣ媒介性枯渇の標的であり得る。
【００４４】
チェックポイント阻害剤：本開示のコンテキストにおいて、チェックポイント阻害剤とは免疫チェックポイント阻害剤をいい、当技術分野において理解される意味を保有する。典型的には、標的は、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞上の受容体分子、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）もしくは腫瘍細胞上の対応する細胞表面リガンドである。免疫チェックポイントは、「自己」に対して発生する炎症性免疫を防止するために、免疫細胞において活性化される。したがって、チェックポイント阻害を介して免疫系のバランスを変えることで、これが完全に活性化されて、癌を検出および排除することが可能になるはずである。免疫応答の制御に結び付けられている、最もよく知られている阻害性受容体は、細胞毒性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、ＰＤ−Ｌ１、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン−３（ＴＩＭ３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン（Ｉｇ）含有抑制因子（ＶＩＳＴＡ）である。チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＩＭＰ−３２１、ＢＭＳ−９８６０１６、およびリリルマブが挙げられる。Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）はＰＤ−１阻害剤の一例である。免疫チェックポイント阻害剤のうちの１つまたは複数を用いる治療は、チェックポイント遮断療法（ＣＢＴ）と呼び得る。
【００４５】
臨床上の利点：本明細書中で使用する用語「臨床上の利点」とは、治療の有効性および安全性をどちらも含むことを意図する。したがって、望ましい臨床上の利点を達成する治療処置は、効果的（たとえば治療上有益な効果を達成する）および安全（たとえば耐用または許容されるレベルの毒性または有害事象を有する）の両方である。
【００４６】
組合せ療法：「組合せ療法」とは、２つ以上の治療剤を含む臨床的適応症の治療レジメンをいう。したがって、この用語は、第１の組成物（たとえば活性成分）を含む第１の治療を、同じまたは重複する疾患または臨床状態を処置することを意図する第２の組成物（活性成分）を含む第２の治療と併せて患者に投与する、治療レジメンをいう。第１および第２の組成物はどちらも同じ細胞標的または別個の細胞標的に作用し得る。組合せ療法のコンテキストにおいて、語句「と併せて」とは、組合せ療法を受けている対象において、第１の治療の治療効果が第２の治療の治療効果と時間的および／または空間的に重複することを意味する。したがって、組合せ療法は、同時投与のための単一配合物として、または治療を連続的に投与するための別々の配合物として配合し得る。疾患を処置するための第１の治療で処置された対象に、同じ疾患を処置するための第２の治療を投与した場合、第２の治療は付加型治療または補助療法と呼び得る。
【００４７】
コンビナトリまたはコンビナトリアルエピトープ：コンビナトリアルエピトープとは、三次元構造下では近接近して一緒に集合してエピトープを形成する、抗原の１つまたは複数の構成要素の非隣接部分によって形成される部位（すなわち抗原決定基）において、コンビナトリアル抗体によって認識および結合されるエピトープである。したがって、本発明の抗体は、前駆／潜在型ＴＧＦβ１複合体の２つ以上の構成要素（たとえば部分またはセグメント）によって形成されるエピトープと結合し得る。コンビナトリエピトープは、複合体の第１の構成要素からのアミノ酸残基、および複合体の第２の構成要素からのアミノ酸残基、などを含み得る。それぞれの構成要素は抗原複合体の単一のタンパク質または２つ以上のタンパク質のものであり得る。コンビナトリエピトープは、抗原または抗原複合体の２つ以上の構成要素（たとえば部分またはセグメント、たとえばアミノ酸残基）からの構造的貢献で形成される。
【００４８】
競合または交差競合する、交差遮断する：同じエピトープについて競合する抗原結合タンパク質（たとえば抗体またはその抗原結合部分）のコンテキストにおいて使用する場合に、用語「競合する」とは、試験する抗原結合タンパク質が参照抗原結合タンパク質と共通抗原（たとえばＴＧＦβ１またはその断片）との特異的結合を防止または阻害する（たとえば低下させる）アッセイによって決定した、抗原結合タンパク質間の競合を意味する。数々の種類の競合的結合アッセイを使用して、１つの抗原結合タンパク質が別のものと競合するかどうかを決定することができ、たとえば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ、固相直接標識アッセイ、および固相直接標識サンドイッチアッセイが挙げられる。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、これは参照抗原結合タンパク質と共通抗原との特異的結合を少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、または７５％以上阻害する（たとえば低下させる）。一部の例では、結合は少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、または９７％以上阻害される。
【００４９】
一部の実施形態では、たとえば、ＢｉａｃｏｒまたはＯｃｔｅｔ（登録商標）によって、標準の試験条件を使用して、たとえば製造者の指示に従ってアッセイして（たとえば、室温、約２０〜２５℃で結合のアッセイを行う）、第１の抗体またはその抗原結合部分および第２の抗体またはその抗原結合部分は、同じ抗原に関して互いに「交差遮断する」。一部の実施形態では、第１の抗体またはその断片および第２の抗体またはその断片は同じエピトープを有し得る。他の実施形態では、第１の抗体またはその断片および第２の抗体またはその断片は、同一ではないが重複するエピトープを有し得る。さらなる実施形態では、第１の抗体またはその断片および第２の抗体またはその断片は、抗体結合が立体障害によって交差遮断されるように三次元空間下で近接近している、別々の（異なる）エピトープを有し得る。「交差遮断する」とは、第１の抗体と抗原との結合が第２の抗体と同じ抗原との結合を妨げ、同様に、第２の抗体と抗原との結合が第１の抗体と同じ抗原との結合を妨げることを意味する。
【００５０】
抗体ビニング（エピトープビニングまたはエピトープマッピングと呼ぶ場合もある）は、標的タンパク質またはタンパク質複合体（すなわち抗原）に対して作製されたモノクローナル抗体の組（たとえば「ライブラリ」）を特徴づけるおよび選別するために実施し得る。同じ標的に対するそのような抗体を、対の様式でライブラリ中のすべての他の抗体に対して試験して、抗体が抗原に対する互いの結合を遮断するかどうかを評価する。密に関連するビニングプロフィールは、抗体が同じまたは密に関連する（たとえば重複する）エピトープを有することを示し、一緒に「ビニング」される。抗体とその標的との結合によってもたらされる生物活性（たとえば、介入、効力）は、同じビンの別の抗体に持ち越される可能性が高いため、ビニングは、同じ抗原内で類似の結合領域を共有する抗体の有用な構造−機能プロフィールを提供する。したがって、同じエピトープビン内の抗体の中では、より高い親和性（より低いＫＤ）を有するものが、典型的にはより高い効力を有する。
【００５１】
相補性決定領域：本明細書中で使用する用語「ＣＤＲ」とは、抗体可変配列内の相補性決定領域をいう。重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに３つのＣＤＲが存在し、可変領域のそれぞれについてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と命名されている。本明細書中で使用する用語「ＣＤＲ組」とは、抗原と結合することができる単一の可変領域中に生じる３つのＣＤＲの群をいう。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従って異なって定義されている。Ｋａｂａｔによって記載されたシステム（Ｋａｂａｔら、（１９８７年、１９９１年）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）は、抗体の任意の可変領域に適用可能な明白な残基付番システムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲはＫａｂａｔ  ＣＤＲと呼び得る。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者ら（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７頁ならびにＣｈｏｔｈｉａら、（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８８３頁）は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ内の特定の下位部分が、アミノ酸配列のレベルでは高い多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド主鎖コンホメーションを採ることを見出した。これらの下位部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３もしくはＨ１、Ｈ２、およびＨ３、または、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３もしくはＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３と命名し、「Ｌ」および「Ｈ」はそれぞれ軽鎖および重鎖の領域を指定している。これらの領域はＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲと呼んでよく、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複する境界を有する。Ｋａｂａｔ  ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（１９９５年）、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、９：１３３〜１３９頁およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（１９９６年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２（５）：７３２〜４５頁によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界定義は、本明細書中に記載のシステムのうちの１つに厳密に従わない場合があるにもかかわらずＫａｂａｔ  ＣＤＲと重複するであろうが、ただし、特定の残基もしくは残基群またはＣＤＲ全体さえもが抗原結合に有意な影響を与えないという予測または実験による発見に鑑みて、短くまたは長くし得る（たとえばＬｕ  Ｘら、ＭＡｂｓ．、２０１９年１月、１１（１）：４５〜５７頁を参照）。本明細書において使用する方法は、これらのシステムのうちの任意のものに従って定義したＣＤＲを利用し得るが、特定の実施形態はＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａの定義のＣＤＲを使用する。
【００５２】
コンフォメーションエピトープ：コンフォメーションエピトープとは、三次元コンホメーションではコンホメーション抗体によって認識および結合されるが、同じアミノ酸配列の折り畳まれていないペプチドではそうされないエピトープである。コンフォメーションエピトープは、コンホメーション特異的エピトープ、コンホメーション依存性エピトープ、またはコンホメーション感受性エピトープと呼び得る。そのようなエピトープと特異的に結合する対応する抗体またはその断片は、コンホメーション特異的抗体、コンホメーション選択的抗体、またはコンホメーション依存性抗体と呼び得る。抗原とコンフォメーションエピトープとの結合は抗原または抗原複合体の三次元構造（コンホメーション）に依存する。
【００５３】
定常領域：免疫グロブリン定常ドメインとは重鎖または軽鎖定常ドメインをいう。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は当技術分野で知られている。
【００５４】
コンテキストに偏った：本明細書中で使用する「コンテキストに偏った抗体」とは、抗原が相互作用タンパク質またはその断片に関連している（すなわち結合しているまたは付着している）場合に、示差的な親和性で抗原と結合するコンホメーション抗体の一種をいう。したがって、前駆ＴＧＦβ１内のエピトープと特異的に結合する、コンテキストに偏った抗体は、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１と異なる親和性で結合し得る。たとえば、細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体（たとえばＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）に対するよりも、マトリックス関連前駆ＴＧＦβ１複合体（たとえばＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１）に対する親和性の方が高い場合に、抗体は「マトリックスに偏っている」と言われる。［マトリックス関連複合体］：［細胞関連複合体］の相対的親和性は、本明細書中に例示するように、前者の平均ＫＤ値をとり、後者の平均ＫＤ値をとり、両者の比を計算することによって得られ得る。
【００５５】
コンテキスト非依存性：本開示によれば、前駆ＴＧＦβ１と結合する「コンテキスト非依存性抗体」は、４つの既知の提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体、すなわち、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１にわたって等価の親和性を有する。本出願において開示されているコンテキスト非依存性抗体は不偏性としても特徴づけ得る。典型的には、コンテキスト非依存性抗体は、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、および／または溶液平衡滴定（ＭＳＤ−ＳＥＴなど）等の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって測定して、マトリックス関連複合体と細胞関連複合体との間の測定されたＫＤ値の相対比が５を超えないであるような、等価な（すなわちその偏りが５倍以下である）親和性を示す。
【００５６】
ＥＣＭ関連ＴＧＦβ１／前駆ＴＧＦβ１：この用語は、細胞外マトリックスの（たとえばそれ内に蓄積される）構成要素であるＴＧＦβ１またはそのシグナル伝達複合体（たとえば前駆／潜在型ＴＧＦβ１）をいう。ＬＴＢＰ１またはＬＴＢＰ３によって提示されるＴＧＦβ１は、ＥＣＭ関連ＴＧＦβ１、すなわち、それぞれＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１である。ＬＴＢＰはＥＣＭにおけるＴＧＦβの正しい蓄積および続く生体利用度にとって重大であり、ここで、フィブリリン（Ｆｂｎ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）がＬＴＢＰとＥＣＭとの会合を司っている主な基質タンパク質であると考えられている。そのようなマトリックス関連潜在型複合体は、結合組織、ならびに腫瘍間質および線維性組織などの特定の疾患関連組織において富化されている。提示分子または提示分子複合体のヒト対応物は、タンパク質またはタンパク質複合体の前に「ｈ」を置くことによって示してよく、たとえば、「ｈＬＴＢＰ１」、「ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１」、ｈＬＴＢＰ３」、および「ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１」が挙げられる。
【００５７】
有効量：「有効量」（または治療上有効な量、または治療的用量）とは、患者集団において統計的に有意な臨床上の利点（たとえば有効性）を達成する投薬量または投薬レジメンである。たとえば、Ａｂ６は、前臨床モデルにおいて３ｍｇ／ｋｇまで低い用量および３０ｍｇ／ｋｇまで高い用量で効果的であることが示されている。したがって、Ａｂ６の有効量は約３〜３０ｍｇ／ｋｇであると言ってよい。
【００５８】
有効な腫瘍制御：用語「有効な腫瘍制御」とは、処置に応答して達成された腫瘍回帰の度合をいうために使用してよく、ここで、たとえば、腫瘍はエンドポイント腫瘍体積の定義された割合（＜２５％など）回帰している。たとえば、特定のモデルにおいて、エンドポイント腫瘍体積が２，０００ｍｍ３に設定されている場合、＜２５％の閾値を仮定して、５００ｍｍ３未満まで低下した場合に有効な腫瘍制御が達成される。したがって、有効な腫瘍制御は完全回帰を包含する。臨床的には、有効な腫瘍制御は、ＲＥＣＩＳＴ１．１および対応するｉＲＥＣＩＳＴなどの当技術分野で理解されている基準に基づいて、部分応答（ＰＲ）および完全応答（ＣＲ）を含む。一部の実施形態では、臨床（ｃｌｎｉｃａｌ）設定における有効な腫瘍制御は、特定の速度で成長すると典型的には予想される腫瘍が、縮小は達成されないにしても処置によってそのような成長が防止される、安定疾患も含む。
【００５９】
エフェクターＴ細胞：本明細書中で使用するエフェクターＴ細胞とは、同時刺激などの刺激に対して即座に積極応答するＴリンパ球であり、それだけには限定されないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴヘルパーまたはＴｈ細胞とも呼ばれる）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞毒性Ｔ細胞とも呼ばれる）が挙げられる。Ｔｈ細胞は、Ｂ細胞から形質細胞および記憶Ｂ細胞への成熟、ならびに細胞毒性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含めた免疫学的プロセスにおいて他の白血球を支援する。これらの細胞は、その表面上にＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示された際に活性化される。活性化された後、これらは迅速に分裂し、サイトカインと呼ばれる、活性免疫応答を調節または支援する小さなタンパク質を分泌する。これらの細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、またはＴＦｈを含めたいくつかの亜型のうちの１つへと分化することができ、これらは異なるサイトカインを分泌して異なる種類の免疫応答を促進する。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を特定の亜型へと方向づける。細胞毒性（キラー）。他方では、細胞毒性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、ＣＴＬ、Ｔキラー細胞、キラーＴ細胞）は、ウイルスに感染した細胞および癌細胞を破壊し、また、移植片拒絶にも結び付けられている。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原と結合することによってその標的を認識する。細胞毒性エフェクター細胞（たとえばＣＤ８＋細胞）としては、たとえばパーフォリンおよびグランザイムＢが挙げられる。
【００６０】
エピトープ：用語「エピトープ」は抗原決定基とも呼ばれる場合があり、結合剤、免疫グロブリン、またはＴ細胞受容体によって特異的に結合されることができる分子決定因子（たとえばポリペプチド決定因子）である。エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの化学活性のある分子の表面グループを含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴および／または特定の電荷特徴を有し得る。抗体または抗体の抗原結合断片によって認識されるエピトープは、抗体または断片のＣＤＲ（たとえば相補的部位）と相互作用する抗原の構造要素である。エピトープは、抗体のＣＤＲと相互作用して特異性を生じる、いくつかのアミノ酸残基からの貢献によって形成され得る。抗原性断片は複数のエピトープを含有することができる。特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を認識する場合に、抗原と特異的に結合する。たとえば、抗体が交差競合する（一方が他方の結合を防止するまたはその効果を変調する）場合に、抗体は「同じエピトープと結合する」と言われる
【００６１】
等価な親和性：本開示のコンテキストにおいて、用語「等価な親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ／ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ）」とは、ｉ）溶液平衡滴定（ＭＳＤ−ＳＥＴなど）、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）など）、もしくは表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍなど等の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって測定して、５倍未満の親和性の偏りで、抗体がマトリックス関連前駆ＴＧＦｂ１複合体および細胞関連前駆ＴＧＦｂ１複合体と結合すること、ならびに／または、ｉｉ）４つの抗原複合体間で抗体が示す最低の親和性（最高のＫＤ数値）が、残りの３つの親和性から計算した平均値よりも５倍以下低い、もしくは、４つの抗原複合体間で抗体が示す最高の親和性（最低のＫＤ数値）が、残りの３つの親和性から計算した平均よりも５倍以下高いという点のいずれかで、４つの複合体に対する抗体の相対的親和性が均一であることを意味することを意図する。等価な親和性を有する抗体は、前駆ＴＧＦβ１複合体に関連する具体的な提示分子とは無関係に、より均一な阻害効果を達成し得る（それ故「コンテキスト非依存性」）。特に好ましい実施形態では、マトリックス関連複合体と細胞関連複合体との間の平均親和性において観察される偏りは３倍以下である。
【００６２】
拡張（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ）潜在型ラッソ：本明細書中で使用する用語「拡張潜在型ラッソ」とは、潜在型ラッソおよびアルファ−２ヘリックスを含むプロドメインの一部分、たとえばＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬＹＮＳＴＲ（配列番号１５４）をいう。一部の実施形態では、拡張潜在型ラッソは、アルファ−１ヘリックスの一部分、たとえばＬＶＫＲＫＲＩＥＡ（配列番号１５９）またはその一部分をさらに含む。
【００６３】
線維症：用語「線維症」または「線維性状態／障害」とは、コラーゲンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）構成要素の、組織または臓器内における病理学的蓄積によって特徴づけられるプロセスまたは徴候をいう。
【００６４】
線維性微小環境：用語「線維性微小環境」とは、線維症がｉｎ  ｖｉｖｏで起こる、組織内の局所的な疾患ニッチをいう。線維性微小環境は、疾患関連の分子署名（ケモカイン、サイトカインの組など）、疾患関連の細胞集団（活性化マクロファージ、ＭＤＳＣなど）、ならびに疾患関連のＥＣＭ環境（ＥＣＭの構成要素および／または構造の変更）を含み得る。線維性微小環境は、ＴＧＦβ依存性の様式での線維芽細胞からα−平滑筋アクチン陽性筋線維芽細胞への移行を支援すると考えられている。線維性微小環境は特定の免疫細胞（マクロファージおよびＭＤＳＣなど）の浸潤によってさらに特徴づけられ得る。
【００６５】
フィンガー−１（ＴＧＦβ１成長因子のもの）：本明細書中で使用する「フィンガー−１」とは、ＴＧＦβ１成長因子ドメイン内のドメインである。その未変異の形態では、ヒト前駆ＴＧＦβ１のフィンガー−１は以下のアミノ酸配列を含有する：ＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣ（配列番号１５１）。３Ｄ構造では、フィンガー−１ドメイン（一部分を図１８および１９中で領域「５ａ」として示す）は潜在型ラッソと近接近する。
【００６６】
フィンガー−２（ＴＧＦβ１成長因子のもの）：本明細書中で使用する「フィンガー−２」とは、ＴＧＦβ１成長因子ドメイン内のドメインである。その未変異の形態では、ヒト前駆ＴＧＦβ１のフィンガー−２は以下のアミノ酸配列を含有する：ＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ（配列番号１５２）。フィンガー−２は、潜在型ラッソに近接近して空間的に位置する、図１８および１９中に図示する「結合領域６」（すなわち「６ａ」および「６ｂ」）を含む。
【００６７】
ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体：本明細書中で使用する用語「ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体」とは、トランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦβ１）タンパク質の前駆タンパク質形態または潜在形と糖タンパク質Ａ反復優性タンパク質（ＧＡＲＰ）またはその断片もしくは変異体とを含む、タンパク質複合体をいう。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１タンパク質の前駆タンパク質形態または潜在形は「前駆／潜在型ＴＧＦβ１タンパク質」と呼び得る。一部の実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体は１つまたは複数のジスルフィド結合を介して前駆／潜在型ＴＧＦβ１と共有結合したＧＡＲＰを含む。自然においては、そのような共有結合は前駆ＴＧＦβ１二量体複合体のＮ末端付近（たとえばアミノ酸位置４）に存在するシステイン残基を用いて形成される。他の実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体は前駆／潜在型ＴＧＦβ１と非共有結合したＧＡＲＰを含む。一部の実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体は天然に存在する複合体、たとえば細胞中のＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体である。用語「ｈＧＡＲＰ」とはヒトＧＡＲＰを示す。
【００６８】
高親和性：「高親和性前駆ＴＧＦβ１抗体」などのように本明細書中で使用する用語「高親和性」とは、≦５ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭのＫＤ値を有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合活性をいう。したがって、本発明によって本明細書中に包含される高親和性のコンテキスト非依存性前駆ＴＧＦβ１抗体は、以下の抗原複合体、すなわち、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれに対して≦５ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭのＫＤ値を有する。
【００６９】
ヒト抗体：本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によってまたはｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を、たとえばＣＤＲ中に、特にＣＤＲ３中に含み得る。しかし、本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列上に移植した抗体を含むことを意図しない。
【００７０】
ヒト化抗体：用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト種（たとえばマウス）からの重鎖および軽鎖の可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部分が、より「ヒト様」となるように、すなわちヒト生殖系列の可変配列とより類似となるように変更されている抗体をいう。ヒト化抗体の一種はＣＤＲ移植抗体であり、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨおよびＶＬ配列内に導入されて対応する非ヒトＣＤＲ配列を置き換えている。また、「ヒト化抗体」とは、目的の抗原と免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するＦＲ領域と実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有するＣＤＲ領域とを含む、抗体、またはその変異体、誘導体、類似体、もしくは断片である。ＣＤＲのコンテキストにおいて本明細書中で使用する用語「実質的に」とは、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲをいう。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン（すなわちドナー抗体）のそれと対応しており、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。一実施形態では、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンＦｃ領域、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分も含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は軽鎖および少なくとも重鎖の可変ドメインを含有する。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域も含み得る。一部の実施形態では、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含有する。一部の実施形態では、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含有する。具体的な実施形態では、ヒト化抗体は軽鎖のヒト化可変ドメインおよび／またはヒト化重鎖のみを含有する。
【００７１】
水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）：ＨＤＸ−ＭＳは、溶媒接近可能性の度合を測定することによって溶液中のタンパク質の確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）およびタンパク質−タンパク質の相互作用を調べるために用いる、周知の技法である。たとえばＷｅｉら、（２０１４年）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ、１９（１）：９５〜１０２頁、「Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ｈｉｇｈｅｒ  ｏｒｄｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」を参照されたい。ＨＤＸ−ＭＳ技法は、抗体によって結合される抗原の１つまたは複数の領域（すなわち「結合領域」）を決定するために用い得る。したがって、そのような結合領域はエピトープを含有し得るまたは形成し得る。
【００７２】
免疫排除（ｉｍｍｕｎｅ−ｅｘｃｌｕｄｅｄまたはｉｍｍｕｎｏ−ｅｘｃｌｕｄｅｄ）された腫瘍：本明細書中で使用する、「免疫排除された」として特徴付けられた腫瘍は、腫瘍内抗腫瘍リンパ球を欠くまたは実質的に欠く。たとえば、Ｔ細胞の浸潤が乏しい腫瘍は、腫瘍を取り囲む、たとえば腫瘍塊の外周および／または腫瘍の血管構造の近傍（「血管周囲」）にあるＴ細胞を有し得るが、それにもかかわらず、腫瘍内に有効に押し寄せて癌細胞に対して細胞毒性機能を発揮することに失敗する。他の状況では、わずかなＴ細胞が腫瘍環境付近およびそれ中に存在するように、腫瘍は強力な免疫応答を誘発することに失敗する（いわゆる「冷たい」または「免疫砂漠」腫瘍）。免疫排除腫瘍とは対照的に、抗腫瘍リンパ球が浸潤している腫瘍は「熱い」または「炎症性」腫瘍として特徴づけられる場合がある。そのような腫瘍はより応答性である傾向があり、したがって免疫チェックポイント遮断療法（「ＣＢＴ」）の標的である。しかし、典型的には、腫瘍をＣＢＴに対して耐性にする免疫排除が原因で、患者のほんの一部しかＣＢＴに応答しない。
【００７３】
免疫抑制、免疫抑制性：この用語は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞などの免疫細胞を抑制する能力をいう。免疫抑制機能を評価するための至適基準はＴ細胞活性の阻害であり、これは抗原に特異的な抑制および非特異的な抑制を含み得る。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびＭＤＳＣは免疫抑制細胞とみなされ得る。Ｍ２−極性化マクロファージ（たとえばＴＡＭおよびＦＡＭなどの疾患に局在性のマクロファージ）も免疫抑制性として特徴づけられ得る。
【００７４】
免疫記憶：免疫記憶とは、身体が以前に遭遇した抗原を素早くかつ特異的に認識して対応する免疫応答開始する、免疫系の能力をいう。一般に、これらは同じ抗原に対する二次、三次、および他の続く免疫応答である。免疫記憶は、免疫系の適応構成要素である特殊なＴ細胞およびＢ細胞、いわゆる記憶Ｔ細胞およびＢ細胞の原因である。抗原−ナイーブＴ細胞は拡大し、プロフェッショナル抗原提示細胞（たとえば樹状細胞）の表面上のＭＨＣ分子のコンテキスト内においてその同族抗原と遭遇した後に記憶およびエフェクターＴ細胞へと分化する。すべての記憶Ｔ細胞の亜型の唯一の統一的テーマは、これらが長寿であり、その同族抗原に再曝露された際に多数のエフェクターＴ細胞へと素早く拡大できることである。この機構によって、これらは、以前に遭遇した病原体に対する「記憶」を免疫系に提供する。記憶Ｔ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋のどちらかであってよく、通常はＣＤ４５ＲＯを発現する。前臨床設定では、免疫記憶を腫瘍再誘発パラダイムにおいて試験し得る。
【００７５】
アイソフォーム特異的：用語「アイソフォーム特異性」とは、１つのアイソフォームを他の構造的に関連するアイソフォームより優先して区別する薬剤の能力をいう（すなわち選択性）。アイソフォーム特異的ＴＧＦβ阻害剤は、所定の濃度においてＴＧＦβの１つのアイソフォームに対してその阻害活性を発揮するが、ＴＧＦβの他のアイソフォームに対しては発揮しない。たとえば、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１抗体はＴＧＦβ１と選択的に結合する。ＴＧＦβ１特異的阻害剤（抗体）は、実質的により高い親和性で、ＴＧＦβ１アイソフォームをＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３よりも優先的に標的とする（結合し、それによって阻害する）。たとえば、このコンテキストにおける選択性は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）およびＢｉａｃｏｒなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって測定して、それぞれの親和性の少なくとも５００〜１０００倍の差異を指し得る。一部の実施形態では、選択性は、ＴＧＦβ１をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害するために有効な投薬量で阻害剤を使用した場合に、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３が阻害されないようなものである。そのような阻害剤が治療剤として有効となるために、望ましい効果を達成するための投薬量（たとえば治療上有効な量）は、阻害剤がＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３を阻害せずにＴＧＦβ１アイソフォームを有効に阻害することができるウィンドウの範囲内に入らなければならない。
【００７６】
単離した：本明細書中で使用する「単離した」抗体とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう。一部の実施形態では、単離した抗体は他の意図しない細胞物質および／または化学薬品を実質的に含まない。
【００７７】
大型潜在型複合体：本開示のコンテキストにおける用語「大型潜在型複合体」（「ＬＬＣ」）とは、いわゆる提示分子と結合した前駆ＴＧＦβ１二量体からなる複合体をいう。したがって、大型潜在型複合体は、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１などの提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体である。そのような複合体は、複合体を形成することができる組換えの精製した構成要素を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成し得る。スクリーニング目的のために、そのようなＬＬＣを形成するために使用する提示分子は完全長ポリペプチドである必要はない。しかし、そのＮ末端領域付近のシステイン残基を介して前駆ＴＧＦβ１二量体複合体とジスルフィド結合を形成することができるタンパク質部分が典型的には必要である。
【００７８】
潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）：ＬＡＰとは、前駆ＴＧＦβ１のいわゆる「プロドメイン」である。本明細書中により詳述されているように、ＬＡＰは「ストレートジャケット（Ｓｔｒａｉｇｈｔ  Ｊａｃｋｅｔ）」ドメインおよび「アーム」ドメインからなる。ストレートジャケット自体は、アルファ−１ヘリックスおよび潜在型ラッソドメインへとさらに分割される。
【００７９】
潜在型ラッソ：本明細書中で使用する「潜在型ラッソ」とは、潜在型ループとも呼ばれる場合があり、前駆ＴＧＦｂ１のプロドメイン内のアルファ−１ヘリックスおよびアームが隣接するドメインである。その未変異の形態では、ヒト前駆ＴＧＦβ１の潜在型ラッソはアミノ酸配列ＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬ（配列番号１５３）を含み、図１８Ａに示す領域「２ａ」および「２ｂ」に実質的に対応し、図１９Ａ中で同定した領域１がまたがっている。本明細書中で使用する用語拡張潜在型ラッソ領域」とは、潜在型ラッソと、プロドメインのアルファ−２ヘリックス（α２−ヘリックス）と呼ばれるそのすぐＣ末端側のモチーフとを一緒にしたものをいう。潜在型ラッソのＣ末端にあるプロリン残基は、ラッソループをα２−ヘリックスと接続させる、「肘」のような垂直な「ターン」を提供する。拡張潜在型ラッソは、図１８および１９中に「２ａ」、「２ｂ」、および「２ｃ」として示す領域を含む。特定の高親和性のＴＧＦβ１活性化阻害剤は、潜在型ラッソまたはその一部分と少なくとも部分的に結合して阻害効力（たとえば活性化を遮断する能力）を与え、ここで、任意選択で、潜在型ラッソの一部分はＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬ（配列番号２６６）である。一部の実施形態では、本開示の抗体（ａｎｔｉｂｏｉｄｅｓ）は、ＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬ（配列番号２６６）またはその一部分において前駆ＴＧＦβ１複合体と結合する。特定の高親和性のＴＧＦβ１活性化阻害剤は、拡張潜在型ラッソまたはその一部分と少なくとも部分的に結合して阻害効力（たとえば活性化を遮断する能力）を与え、ここで、任意選択で、拡張潜在型ラッソの一部分はＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号１６９）である。
【００８０】
局在化された（局在性）：本開示のコンテキストにおいて、用語「局在化された（局在性）」（「局在性腫瘍」、「疾患に局在性の」などのように）とは、全身病の対照として、解剖学的に単離されたまたは単離可能な異常、たとえば固形悪性腫瘍をいう。特定の白血病は、たとえば、疾患に関して局在化された構成要素（たとえば骨髄）および全身性の構成要素（たとえば循環血液細胞）の両方を有し得る。
【００８１】
ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体：本明細書中で使用する用語「ＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体」とは、トランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦβ１）タンパク質の前駆タンパク質形態または潜在形とロイシンに富んだ反復含有タンパク質３３（ＬＲＲＣ３３、活性酸素種の負の調節因子もしくはＮＲＲＯＳとしても知られる）またはその断片もしくは変異体との間の複合体をいう。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して前駆／潜在型ＴＧＦβ１と共有結合したＬＲＲＣ３３を含む。自然においては、そのような共有結合は、前駆ＴＧＦβ１二量体複合体のＮ末端付近（たとえばアミノ酸位置４）に存在するシステイン残基を用いて形成される。他の実施形態では、ＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体は、前駆／潜在型ＴＧＦβ１と非共有結合したＬＲＲＣ３３を含む。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体は天然に存在する複合体、たとえば細胞中のＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体である。用語「ｈＬＲＲＣ３３」とはヒトＬＲＲＣ３３を示す。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、細胞表面上のＬＲＲＣ３３およびＬＲＲＣ３３を含有する複合体を内部移行させ得る。ＬＲＲＣ３３は、Ｍ２−極性化マクロファージ（ＴＡＭなど）およびＭＤＳＣを含めた骨髄細胞の部分組上において発現される。
【００８２】
ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体：本明細書中で使用する用語「ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体」とは、トランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦβ１）タンパク質の前駆タンパク質形態または潜在形と潜在型ＴＧＦ−ベータ結合タンパク質１（ＬＴＢＰ１）またはその断片もしくは変異体とを含むタンパク質複合体をいう。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して前駆／潜在型ＴＧＦβ１と共有結合したＬＴＢＰ１を含む。自然においては、そのような共有結合は、前駆ＴＧＦβ１二量体複合体のＮ末端付近（たとえばアミノ酸位置４）に存在するシステイン残基を用いて形成される。他の実施形態では、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体は、前駆／潜在型ＴＧＦβ１と非共有結合したＬＴＢＰ１を含む。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体は天然に存在する複合体、たとえば細胞中のＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体である。用語「ｈＬＴＢＰ１」とはヒトＬＴＢＰ１を示す。
【００８３】
ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体：本明細書中で使用する用語「ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体」とは、トランスフォーミング成長因子−β１（ＴＧＦβ１）タンパク質の前駆タンパク質形態または潜在形と潜在型ＴＧＦ−ベータ結合タンパク質３（ＬＴＢＰ３）またはその断片もしくは変異体とを含むタンパク質複合体をいう。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して前駆／潜在型ＴＧＦβ１と共有結合したＬＴＢＰ３を含む。自然においては、そのような共有結合は、前駆ＴＧＦβ１二量体複合体のＮ末端付近（たとえばアミノ酸位置４）に存在するシステイン残基を用いて形成される。他の実施形態では、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体は、前駆／潜在型ＴＧＦβ１と非共有結合したＬＴＢＰ１を含む。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体は天然に存在する複合体、たとえば細胞中のＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体である。用語「ｈＬＴＢＰ３」とはヒトＬＴＢＰ３を示す。
【００８４】
Ｍ２またはＭ２様マクロファージ：Ｍ２マクロファージは活性化または極性化マクロファージの部分組を表し、線維性および腫瘍の微小環境の両方における疾患関連マクロファージを含む。Ｍ２−極性化マクロファージの細胞表面マーカーとしては、典型的には、ＣＤ２０６およびＣＤ１６３（すなわちＣＤ２０６＋／ＣＤ１６３＋）が挙げられる。Ｍ２−極性化マクロファージは細胞表面ＬＲＲＣ３３も発現し得る。Ｍ２マクロファージの活性化は、主にＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、およびＴＧＦβによって促進される。これらは、それを活性化させるものと同じサイトカインを分泌する（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、およびＴＧＦβ）。これらの細胞は高い食作用能力を有しており、ＥＣＭ構成要素、血管形成および化学走性因子を産生する。マクロファージによるＴＧＦβの放出は、筋線維芽細胞の活性化、線維性組織および腫瘍間質などの疾患組織におけるＥＭＴおよびＥｎｄＭＴの誘導を永続化させ得る。たとえば、Ｍ２マクロファージはＴＧＦβ駆動の肺線維症に必須であり、いくつかの腫瘍においても豊富になっている。
【００８５】
マトリックス関連前駆ＴＧＦβ１：ＬＴＢＰ１およびＬＴＢＰ３は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成要素である提示分子である。ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１は、ＥＣＭ関連ＴＧＦβ１の活性化／シグナル伝達を媒介する「ＥＣＭ関連」（または「マトリックス関連」）前駆ＴＧＦβ１複合体と総称し得る。また、この用語は、マトリックスまたは基質に物理的に付着していない、溶液中の組換えの精製したＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ）も含む。
【００８６】
最大耐用用量（ＭＴＤ）：用語ＭＴＤとは、一般に、安全性／毒性学の考慮のコンテキストにおいて、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）を用いて評価した被験物質（ＴＧＦβ１阻害剤など）の最高量をいう。たとえば、ラットにおけるＡｂ６のＮＯＡＥＬは評価した最高用量（１００ｍｇ／ｋｇ）であり、これは、４週間の毒性学研究に基づいてＡｂ６のＭＴＤが＞１００ｍｇ／ｋｇであることを示唆している。非ヒト霊長類におけるＡｂ６のＮＯＡＥＬは評価した最高用量（３００ｍｇ／ｋｇ）であり、これは、４週間の毒性学研究に基づいて非ヒト霊長類におけるＡｂ６のＭＴＤが＞３００ｍｇ／ｋｇであることを示唆している。
【００８７】
メソスケールディスカバリー：「メソスケールディスカバリー」または「ＭＳＤ」とは、検出技法として電気化学発光（ＥＣＬ）を用いる免疫アッセイの一種である。典型的には、高結合の炭素電極を使用してタンパク質（たとえば抗体）を捕捉する。抗体を特定の抗原とインキュベートすることができ、その結合は電気化学発光標識とコンジュゲートさせた二次抗体を用いて検出することができる。電気シグナルの際、光強度を測定して試料中の分析物を定量することができる。
【００８８】
骨髄線維症：骨骨髄線維症（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）としても知られる「骨髄線維症」とは、骨髄増殖性疾患と呼ばれる疾患群に属する比較的稀な骨髄増殖性障害（たとえば癌）である。骨髄線維症は骨髄増殖性新生物のフィラデルフィア染色体陰性（−）部門に分類される。骨髄線維症は、骨髄および他の部位における造血幹細胞の異常クローンの増殖により、線維症または髄の瘢痕組織での置き換えがもたらされることによって特徴づけられる。骨髄線維症という用語は、慢性特発性骨髄線維症（ｃＩＭＦ）とも呼ばれる原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）（特発性および原発性という用語は、これらの事例において疾患が未知または自発性の起源のものであることを意味する）、ならびに骨髄線維症の二次性の型、たとえば真性赤血球増加症（ＰＶ）または本態性血小板血症（ＥＴ）に二次的に発生する髄線維症を包含する。骨髄線維症は、骨髄の血液形成組織中の細胞種における変化を指す骨髄化生の一形態であり、２つの用語はしばしば同義に使用される。特発性骨髄化生および骨髄化生（ＭＭＭ）を伴った骨髄線維症という用語も、原発性骨髄線維症を指すために使用する。骨髄線維症は、下流のＪＡＫ経路のアップレギュレーションまたは過剰活性化を引き起こす突然変異によって特徴づけられている。
【００８９】
骨髄細胞：造血において、骨髄細胞は、顆粒球、単球、赤血球、もしくは血小板の前駆細胞（共通の骨髄前駆体、すなわちＣＭＰもしくはＣＦＵ−ＧＥＭＭ）から生じる血液細胞であるか、またはやはり頻繁に使用されるより狭い意味では、明確に、リンパ球細胞、すなわち、Ｂ細胞およびＴ細胞を生じさせる共通のリンパ系前駆細胞に由来するリンパ球から識別される、骨髄芽球の系列（骨髄球、単球、およびその娘型）からのものである。マウスおよびヒトの両方における具体的な骨髄細胞の種類、その一般的形態、典型的な細胞表面マーカー、およびその免疫抑制能力を以下に要約する。
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【００９０】
骨髄由来抑制因子細胞：骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）とは、様々な病理状態中に生成される細胞の異種集団であり、単球および比較的未成熟な好中球の活性化の病理状況を表すと考えられている。ＭＤＳＣは、ｉ）表現型的および形態学的に好中球と類似の「顆粒球性」（Ｇ−ＭＤＳＣ）または多形核性（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）、ならびにｉｉ）表現型的および形態学的に単球と類似の単球性（Ｍ−ＭＤＳＣ）と名付けられた、少なくとも２つのカテゴリーの細胞を含む。ＭＤＳＣは、ゲノムおよび生化学的特長の明白に異なる組によって特徴づけられており、特定の表面分子によって識別することができる。たとえば、ヒトＧ−ＭＤＳＣ／ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、典型的には細胞表面マーカーＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５、およびＣＤ６６を発現する。さらに、ヒトＧ−ＭＤＳＣ／ＰＭＮ−ＭＤＳＣはＨＬＡ−ＤＲおよび／またはアルギナーゼも発現し得る。比較すると、ヒトＭ−ＭＤＳＣは、典型的には細胞表面マーカーＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、およびＣＤ１４を発現する。さらに、ヒトＭ−ＭＤＳＣはＨＬＡ−ＤＲも発現し得る。そのような細胞表面マーカーに加えて、ＭＤＳＣはＴ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞などの免疫細胞を抑制する能力によって特徴づけられている。ＭＤＳＣの免疫抑制機能は、抗原非特異的機能の阻害および抗原特異的機能の阻害を含み得る。ＭＤＳＣは、細胞表面ＬＲＲＣ３３および／またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１を発現することができる。
【００９１】
筋線維芽細胞：筋線維芽細胞とは、線維芽細胞および平滑筋細胞の特定の表現型を有する細胞であり、一般に、ビメンチン、アルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、ヒト遺伝子ＡＣＴＡ２）、およびパラディンを発現する。細胞外マトリックスの調節不全（マトリックスの硬直の増加など）に関与する多くの病状において、正常な繊維芽細胞がＴＧＦβ依存性の様式で筋線維芽細胞へと脱分化される。ＴＧＦβの異常な過剰発現は筋線維芽細胞駆動の病理学でよくみられる。ＴＧＦβは、筋線維芽細胞の分化、細胞増殖、およびマトリックス生成を促進することが知られている。線維性微小環境内の筋線維芽細胞または筋線維芽細胞様細胞は線維症関連線維芽細胞（または「ＦＡＦ」）と呼んでもよく、腫瘍微小環境内の筋線維芽細胞または筋線維芽細胞様細胞は癌関連線維芽細胞（または「ＣＡＦ」）と呼んでもよい。
【００９２】
汎ＴＧＦβ阻害剤／ＴＧＦβの汎阻害：用語「汎ＴＧＦβ阻害剤」とは、ＴＧＦβの３つすべてのアイソフォームを阻害または拮抗することができる任意の薬剤である。そのような阻害剤は、当技術分野で知られているものなどの、ＴＧＦβアイソフォームの小分子阻害剤であり得る。この用語は、ＴＧＦβアイソフォームのそれぞれ、すなわち、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３と結合することができる任意の抗体を指す汎ＴＧＦβ抗体を含む。一部の実施形態では、汎ＴＧＦβ抗体は、３つすべてのアイソフォーム、すなわち、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３と結合してその活性を中和する。抗体１Ｄ１１（またはヒト類似体フレソリムマブ（ＧＣ１００８））は、ＴＧＦβの３つすべてのアイソフォームを中和する汎ＴＧＦβ抗体の周知の例である。小分子汎ＴＧＦβ阻害剤の例としては、３つすべてのＴＧＦβアイソフォームのシグナル伝達を媒介するＴＧＦβ受容体Ｉキナーゼ／ＡＬＫ５の拮抗剤であるガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９一水和物）が挙げられる。
【００９３】
血管周囲（浸潤）：接頭辞「ｐｅｒｉ−」とは「周り」、「取り囲む」、または「付近」を意味し、それ故、「血管周囲（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ）」は文字通りに血管の周りと解釈される。腫瘍細胞浸潤のコンテキストにおいて本明細書中で使用する用語「血管周囲の浸潤」とは、固形腫瘍の血管構造を介した腫瘍浸潤性免疫細胞（たとえばリンパ球）の進入機序をいう。
【００９４】
効力：本明細書中で使用する用語「効力」とは、定義された効果を生じさせるための薬物の濃度または量に関して、阻害活性を有する阻害性抗体（または断片）などの薬物の活性をいう。たとえば、所定の投薬量で特定の効果を生じることができる抗体は、等価な効果を生じるために２倍の量（投薬量）を必要とする別の抗体よりも強力である。効力は、ＴＧＦβの活性化／阻害アッセイなどの細胞に基づくアッセイにおいて測定してよく、それによって、インテグリン結合によって始動される活性化などのＴＧＦβの活性化の度合を、細胞に基づく系において被験物質（たとえば阻害性抗体）の存在下または非存在下で測定することができる。典型的には、抗原の同じまたは重複する結合領域と結合することができるものの中で（たとえば交差遮断抗体）、より高い親和性（より低いＫＤ値）を有する抗体は、より低い親和性（より高いＫＤ値）を有する抗体よりも高い効力を示す傾向にある。
【００９５】
提示分子：本開示のコンテキストにおける提示分子とは、潜在型前駆タンパク質（たとえば前駆ＴＧＦβ１）と共有結合を形成し、不活性の複合体を細胞外ニッチ（ＥＣＭまたは免疫細胞表面など）に繋留（「提示」）し、それによって活性化事象が起こるまでその潜在性を維持するタンパク質をいう。前駆ＴＧＦβ１の既知の提示分子としては、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、およびＬＲＲＣ３３が挙げられ、そのそれぞれが提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体（すなわちＬＬＣ）、すなわち、それぞれＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１を形成することができる。自然においては、ＬＴＢＰ１およびＬＴＢＰ３は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構成要素であり、したがって、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１はＥＣＭ関連ＴＧＦβ１シグナル伝達／活性を媒介する「ＥＣＭ関連」（または「マトリックス関連」）前駆ＴＧＦβ１複合体と総称し得る。他方では、ＧＡＲＰおよびＬＲＲＣ３３は特定の細胞の細胞表面上に発現される膜貫通タンパク質であり、したがって、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１は細胞関連（たとえば免疫細胞関連）のＴＧＦβ１シグナル伝達／活性を媒介する「細胞関連」（または「細胞表面」）前駆ＴＧＦβ１複合体と総称し得る。
【００９６】
保護（溶媒曝露から）：抗体−抗原結合などのタンパク質−タンパク質の相互作用のＨＤＸ−ＭＳに基づく評価のコンテキストにおいて、タンパク質（たとえばエピトープを含有するタンパク質の領域）が溶媒に曝露され、それによってプロトン交換が起こることを可能にする度合は、結合／相互作用の度合と逆相関する。したがって、タンパク質−タンパク質の相互作用は結合領域が取り囲む溶媒によって接近可能となることを除外するため、本明細書中に記載の抗体が抗原の領域と結合した場合、結合領域は溶媒に曝露されることから「保護」される。したがって、保護された領域は相互作用の部位の指標である。典型的には、適切な溶媒は生理的緩衝液である。
【００９７】
前駆ＴＧＦβ１：本明細書中で使用する用語「前駆ＴＧＦβ１」とは、複合体内のＴＧＦβ１のプロドメイン配列を含む不活性ＴＧＦβ１複合体の前駆形態を包含することを意図する。したがって、この用語は、ＴＧＦβ１の前駆型形態および潜在型形態を含むことができる。表現「前駆／潜在型ＴＧＦβ１」は互換性があるように使用され得る。ＴＧＦβ１の「前駆型」形態はフューリン部位でのタンパク質分解的切断の前に存在する。切断された後、生じる形態はＴＧＦβ１の「潜在型」形態であると言われる。「潜在型」複合体は、インテグリン駆動の活性化事象などのさらなる活性化が始動されるまで非共有的に会合されたまま保たれる。前駆ＴＧＦβ１複合体は、ジスルフィド結合で連結された二量体ＴＧＦβ１前駆タンパク質ポリペプチドからなる。潜在型二量体複合体は、４位のシステイン残基（Ｃｙｓ４）を介して単一の提示分子と共有結合している。形容詞「潜在型」は、インテグリン媒介性または他の活性化事象の前の、ＴＧＦβ１の「不活性」状態を説明するために一般に／広く使用し得る。前駆ＴＧＦβ１ポリペプチドはプロドメイン（ＬＡＰ）および成長因子ドメイン（配列番号１４６）を含有する。
【００９８】
回帰（腫瘍回帰）：腫瘍または腫瘍成長の回帰はｉｎ  ｖｉｖｏの有効性の尺度として使用することができる。たとえば、前臨床設定では、腫瘍体積中央値（ＭＴＶ）および回帰応答処置の有効性の基準を、最終日に研究に残っている動物の腫瘍体積から決定し得る。また、処置の有効性は、研究中に観察された回帰応答の発生率および規模からも決定し得る。処置は、動物において腫瘍の部分回帰（ＰＲ）または完全回帰（ＣＲ）を引き起こし得る。治療（たとえば薬物の投与）に応答して達成された完全回帰は「完全応答」と呼んでもよく、完全応答を達成する対象は「完全応答者」と呼んでよい。したがって、完全応答は自発的な完全回帰を排除する。前臨床腫瘍モデルの一部の実施形態では、ＰＲ応答は、研究の経過中、３つの連続した測定についてその１日目の体積の５０％以下であり、かつこれら３つの測定のうちの１つまたは複数について１３．５ｍｍ３以上である腫瘍体積として定義する。一部の実施形態では、ＣＲ応答は、研究の経過中、３つの連続した測定について１３．５ｍｍ３未満である腫瘍体積として定義する。前臨床モデルでは、研究の終わりにＣＲ応答を有する動物は、腫瘍のない生存者（ＴＦＳ）としてさらに分類し得る。用語「有効な腫瘍制御」とは、処置に応答して達成された腫瘍回帰の度合をいうために使用してよく、ここで、たとえば、腫瘍体積は、処置に応答してエンドポイント腫瘍体積の＜２５％まで低下している。たとえば、特定のモデルにおいて、エンドポイント腫瘍体積が２，０００ｍｍ３である場合、腫瘍が５００ｍｍ３未満まで低下した場合に有効な腫瘍制御が達成される。したがって、有効な腫瘍制御は、完全回帰、および閾値の低下に達する部分回帰を包含する。
【００９９】
調節性Ｔ細胞：「調節性Ｔ細胞」またはＴｒｅｇとは、バイオマーカーＣＤ４、ＦＯＸＰ３、およびＣＤ２５の発現によって特徴づけられる免疫細胞の一種である。Ｔｒｅｇは抑制因子Ｔ細胞と呼ぶ場合もあり、免疫系を変調し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を防止するＴ細胞の部分集団を表す。Ｔｒｅｇは免疫抑制性であり、一般に、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞の誘導および増殖を抑制またはダウンレギュレーションする。Ｔｒｅｇは、胸腺中に発生するか（いわゆるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋「天然」Ｔｒｅｇ）、または末梢中のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から、たとえばＴＧＦβもしくはレチノイン酸への曝露後に文化することができる。Ｔｒｅｇは細胞表面ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１を発現することができる。
【０１００】
耐性（治療に対する）：特定の治療（ＣＢＴなど）に対する耐性は、癌などの疾患の生得的な特徴（「一次耐性」）が原因である、または処置後に時間と共に発生する獲得された表現型（「獲得耐性」）が原因である場合がある。治療に対して治療反応を示さない患者（たとえば治療に対して非応答者であるまたは応答性が乏しい者）は、治療に対して一次耐性を有すると言われる。最初は治療に対して治療反応を示すが、後に効果を失う（たとえば治療の継続にもかかわらず進行または再発する）患者は、治療に対して獲得耐性を有すると言われる。
【０１０１】
固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）およびｉＲＥＣＩＳＴ：ＲＥＣＩＳＴとは、癌患者における腫瘍が処置中にいつ改善されるか（「応答」）、同じままであるか（「安定化」）、または悪化するか（「進行」）を定義する、一組の公開されたルールである。この基準は、欧州癌研究治療機構（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、ＥＯＲＴＣ）、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、およびカナダ国立癌研究所の臨床治験グループ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｇｒｏｕｐ）を含む国際共同研究によって２０００年２月に公開された。その後に、ＲＥＣＩＳＴ指針の改訂版（ＲＥＣＩＳＴ  ｖ１．１）が広く適応されている（本明細書中に組み込まれているＥｉｓｅｎｈａｕｅｒａら、（２００９年）、「Ｎｅｗ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｕｒｓ：Ｒｅｖｉｓｅｄ  ＲＥＣＩＳＴ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（バージョン１．１）」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、４５：２２８〜２４７頁を参照）。
【０１０２】
応答基準は以下のとおりである：完全応答（ＣＲ）：すべての標的病変の消失、部分応答（ＰＲ）：ベースライン合計ＬＤを参照として、標的病変のＬＤの合計の少なくとも３０％の減少、安定疾患（ＳＤ）：処置開始からの最小の合計ＬＤを参照として、ＰＲに認定されるほど十分な縮小もＰＤに認定されるほど十分な増加もない、進行性疾患（ＰＤ）：処置開始から記録された最小の合計ＬＤまたは１つもしくは複数の新しい病変の出現を参照として、標的病変のＬＤの合計の少なくとも２０％の増加。
【０１０３】
他方では、ｉＲＥＣＩＳＴは、免疫関連応答を考慮する、改変された基準組を提供する（その内容が本明細書中に参考として組み込まれているｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ５６４８５４４／を参照）。ＲＥＣＩＳＴおよびｉＲＥＣＩＳＴの基準は標準化されており、さらなるデータが利用可能になるに伴って時々改訂されてもよく、当技術分野において十分理解されている。
【０１０４】
固形腫瘍：用語「固形腫瘍」とは、通常は嚢胞または液体領域を含有しない異常成長または組織塊を生じる、増殖性障害をいう。固形腫瘍は良性（非癌性）または悪性（癌性）であり得る。固形腫瘍は、局所進行性の固形腫瘍および転移癌などの、進行悪性腫瘍の腫瘍を含む。固形腫瘍は、それだけには限定されないが、癌性（悪性）細胞、ＣＡＦなどの間質細胞、ならびにマクロファージ、ＭＤＳＣ、およびリンパ球などの浸潤性白血球を含む複数の細胞種から典型的になる。本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤で処置する固形腫瘍は、典型的には、ＴＧＦβ１を産生する複数の細胞種を含み得るＴＧＦβ１陽性（ＴＧＦβ１＋）腫瘍である。特定の実施形態では、ＴＧＦβ１＋腫瘍はＴＧＦβ３も同時発現し得る（すなわちＴＧＦβ３陽性である）。たとえば、特定の腫瘍はＴＧＦβ１／３共優性である。一部の実施形態では、そのような腫瘍は上皮細胞の癌、たとえば癌腫によって引き起こされる。
【０１０５】
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）：ＳＥＴとは、２つの分子間の結合（抗原および抗原と結合する抗体など）を溶液中、平衡状態で測定することができるアッセイである。たとえば、メソスケールディスカバリー（「ＭＳＤ」）に基づくＳＥＴ、またはＭＳＤ−ＳＥＴは、ピコモーラーの親和性の抗体とその抗原との結合などの、特に高親和性のタンパク質−タンパク質の相互作用の平衡状態での解離定数を決定するために有用な様式である（たとえばＤｕｃａｔａら、（２０１５年）、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２０（１０）：１２５６〜１２６７頁を参照）。ＳＥＴに基づくアッセイは、ナノモーラー以下（たとえばピコモーラー）の親和性を有する抗体のＫＤ値を決定するために特に有用である。
【０１０６】
特異的結合：本明細書中で使用する用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、抗体またはその抗原結合部分と抗原との相互作用が特定の構造（たとえば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。たとえば、抗体またはその抗原結合部分は、タンパク質一般とよりもむしろ特異的なタンパク質と結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、標的に対するＫＤが少なくとも約１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、またはそれ未満である場合に、標的、たとえばＴＧＦβ１と特異的に結合する。一部の実施形態では、本明細書中で使用する用語「前駆ＴＧＦβ１のエピトープとの特異的結合」、「前駆ＴＧＦβ１のエピトープと特異的に結合する」、「前駆ＴＧＦβ１との特異的結合」、または「前駆ＴＧＦβ１と特異的に結合する」とは、前駆ＴＧＦβ１と結合し、表面プラズモン共鳴およびバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）などの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定して１．０×１０−８Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を有する、抗体またはその抗原結合部分をいう。一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、前駆ＴＧＦβ１のヒトおよび非ヒト（たとえばマウス）の両方の相同分子種と特異的に結合することができる。
【０１０７】
対象：治療的応用のコンテキストにおける用語「対象」とは、処置、診断などの臨床ケアまたは介入を受ける個体をいう。適切な対象は脊椎動物を含み、それだけには限定されないが、哺乳動物（たとえばヒトおよび非ヒト哺乳動物）が挙げられる。対象がヒト対象である場合、用語「患者」を互換性があるように使用し得る。臨床的コンテキストにおいて、用語「患者集団」または「患者部分集団」とは、臨床基準（たとえば、疾患の提示、疾患のステージ、特定の条件に対する感受性、治療に対する応答性など）、病歴、健康状態、性別、年齢層、遺伝的基準（たとえば、特定の突然変異の保有者、多型性、遺伝子重複、ＤＮＡ配列反復など）、および生活習慣要因（たとえば、喫煙、飲酒、運動など）等の基準組の範囲内に入る個体群をいうために使用する。
【０１０８】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：表面プラズモン共鳴とは、未標識の相互作用物をリアルタイムで検出することを可能にする光学現象である。Ｂｉａｃｏｒｅから販売されているものなどのＳＰＲに基づくバイオセンサーを用いて、抗原−抗体結合などのタンパク質−タンパク質の相互作用を含む生体分子の相互作用を測定することができる。この技術は当技術分野で広く知られており、結合親和性、運動速度定数、および熱力学などのパラメータの決定に有用である。
【０１０９】
ＴＧＦβ１関連の適応症：「ＴＧＦβ１関連の適応症」はＴＧＦβ１関連の障害であり、病因および／または進行の少なくとも一部がＴＧＦβ１シグナル伝達またはその調節不全に起因し得る、任意の疾患もしくは障害および／または状態を意味する。特定のＴＧＦβ１関連障害はＴＧＦβ１アイソフォームによって優性に駆動される。ＴＧＦβ１関連の適応症を有する対象は、ＴＧＦβ１の活性および／またはレベルの阻害から利益を受ける場合がある。特定のＴＧＦβ１関連の適応症はＴＧＦβ１アイソフォームによって優性に駆動される。ＴＧＦβ１関連の適応症としては、それだけには限定されないが、線維性状態（臓器線維症、および慢性炎症に関与する組織の線維症など）、増殖性障害（癌、たとえば固形腫瘍および骨髄線維症など）、ＥＣＭ調節不全に関連する疾患（マトリックスの硬化およびリモデリングに関与する状態など）、間葉転換に関与する疾患（たとえばＥｎｄＭＴおよび／またはＥＭＴ）、プロテアーゼに関与する疾患、本明細書中に記載の特定のマーカーの異常な遺伝子発現を有する疾患が挙げられる。これらの疾患カテゴリーは相互排他的であることを意図しない。
【０１１０】
ＴＧＦβ阻害剤：用語「ＴＧＦβ阻害剤」とは、ＴＧＦβ成長因子（たとえば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３）の生物活性、シグナル伝達、または機能を拮抗することができる任意の薬剤をいう。この用語はその作用機構を限定することを意図せず、たとえば、中和性阻害剤、受容体拮抗剤、可溶性リガンド捕捉剤、およびＴＧＦβの活性化阻害剤が挙げられる。ＴＧＦβ阻害剤としては、たとえば抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞性貪食（ＡＤＰＣ）を誘導することによって、ニッチにおいて活性化させることができる潜在型前駆ＴＧＦβの利用可能度を低下させることができる抗体、ならびに、潜在型前駆ＴＧＦβを含む細胞表面複合体内部移行をもたらすことによって、細胞自体を枯渇させずに前駆体を形質膜から取り除くことができる抗体も挙げられる。内部移行は、細胞表面上にＬＲＲＣ３３含有タンパク質複合体を発現する細胞のレベルの低下をもたらす、ＬＲＲＣ３３含有タンパク質複合体（ヒトＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１など）の適切な作用機構であり得る。
【０１１１】
「ＴＧＦβファミリー」とは、ＴＧＦβスーパーファミリー内のクラスであり、ヒトでは、構造的に類似している３つのメンバー、すなわち、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３を含有する。３つの成長因子は、同じ受容体を介してシグナル伝達することが知られている。
【０１１２】
ＴＧＦβ１陽性癌／腫瘍：本明細書中で使用するこの用語は、異常なＴＧＦβ１発現（過剰発現）を有する癌／腫瘍をいう。多くのヒト癌／腫瘍種は、ＴＧＦβ１（タンパク質の対照として遺伝子を指すために「ＴＧＦＢ」を使用する場合があることに注意されたい）アイソフォームの優性発現を示す。一部の事例では、そのような癌／腫瘍はＴＧＦβ３などの別のアイソフォームの共優性発現を示し得る。いくつかの上皮癌（たとえば癌腫）は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を同時発現し得る。ＴＧＦβ１陽性腫瘍の腫瘍環境内において、ＴＧＦβ１は複数の供給源から生じる場合があり、その例としては、たとえば、癌細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）、および周囲の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が挙げられる。本開示のコンテキストにおいて、ヒト条件を概括する前臨床癌／腫瘍モデルはＴＧＦβ１陽性癌／腫瘍である。
【０１１３】
治療ウィンドウ：用語「治療ウィンドウ」とは、対象において有意な／観察可能な／許容されない有害作用（たとえば許容または耐用される有害作用の範囲内）を引き起こさずに治療反応を生じる投薬量の範囲をいう。治療ウィンドウは、最小有効濃度（ＭＥＣ）と最小毒性濃度（ＭＴＣ）との間の比として計算し得る。例えると、１０ｍｇ／ｋｇの投薬量でｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を達成し、１００ｍｇ／ｋｇで許容性または許容毒性を示すＴＧＦβ１阻害剤は、少なくとも１０倍（たとえば１０×）の治療ウィンドウを提供する。対照的に、１０ｍｇ／ｋｇで効果的であるが、有効用量未満で有害作用を引き起こすＴＧＦβの汎阻害剤は、「用量規制毒性」を有すると言われる。一般に、最大耐用用量（ＭＴＤ）が治療ウィンドウの上限を設定し得る。
【０１１４】
たとえば、Ａｂ６は、ラットまたは非ヒト霊長類において４週間、約３〜３０ｍｇ／ｋｇ／週の範囲の投薬量で効果的であることが示され、少なくとも１００または３００ｍｇ／ｋｇ／週の投薬量でＴＧＦβの汎阻害に関連する観察可能な毒性がないことも示された。これに基づいて、Ａｂ６は最小でも３．３倍で、１００倍までの治療ウィンドウを示す。
【０１１５】
毒性：本明細書中で使用する用語「毒性」または「複数の毒性」とは、望ましくない副作用および有害事象などの、対象（たとえば患者）に投与した治療に関連する、対象（たとえば患者）における望まないｉｎ  ｖｉｖｏ効果をいう。「許容性」とは、毒性が原因で治療を中断せずに、患者によって適度に耐用されることができる、治療または治療レジメンに関連する毒性のレベルをいう。典型的には、毒性／毒性学研究は、薬物候補（たとえばモノクローナル抗体治療）の安全性プロフィールを評価するために、臨床開発の前に１つまたは複数の前臨床モデルにおいて実施する。毒性／毒性学研究は、被験物質の「無毒性量（ＮＯＡＥＬ）」および「最大耐用用量（ＭＴＤ）」の決定を助ける場合があり、それに基づいて治療ウィンドウを推定し得る。好ましくは、特定の介入に対して感受性であることが示されている種を、安全性／毒性研究を実施する前臨床動物モデルとして選択するべきである。ＴＧＦβ阻害の場合、適切な種としては、ラット、イヌ、およびカニクイザルが挙げられる。マウスは、ＴＧＦβの薬理学的阻害に対する感受性がより低いことが報告されており、ヒトを含めた他の種において潜在的に危険な毒性を明らかにしない場合があるが、特定の研究はマウスにおいてＴＧＦβの汎阻害で観察された毒性を報告している。例えると、本開示のコンテキストにおいて、ラットにおけるＡｂ６のＮＯＡＥＬは評価した最高用量（１００ｍｇ／ｋｇ）であり、これは、４週間の毒性学研究に基づいてＭＴＤが＞１００ｍｇ／ｋｇであることを示唆している。非ヒト霊長類におけるＡｂ６のＭＴＤは４週間の毒性学研究に基づいて＞３００ｍｇ／ｋｇである。
【０１１６】
ＮＯＡＥＬおよびＭＴＤを決定するために、好ましくは、特定の介入に対して感受性であることが示されている種を、安全性／毒性学的研究を実施する前臨床動物モデルとして選択するべきである。ＴＧＦβ阻害の場合、適切な種としては、それだけには限定されないが、ラット、イヌ、およびカニクイザルが挙げられる。マウスは、ＴＧＦβの薬理学的阻害に対する感受性がより低いことが報告されており、ヒトを含めた他の種において潜在的に重大または危険な毒性を明らかにしない場合がある。
【０１１７】
翻訳可能性：創薬および臨床開発のコンテキストにおいて、用語「翻訳可能性」または「翻訳可能」とは、ヒト条件を概括する前臨床モデルまたはデータの特定の品質または特性をいう。本明細書中で使用する、ＴＧＦβ１適応症を概括する前臨床モデルは、典型的には、ＴＧＦＢ２（またはＴＧＦβ２）およびＴＧＦＢ３（またはＴＧＦβ３）と比較してＴＧＦＢ１（またはＴＧＦβ１）の優性発現を示す。組合せ療法パラダイムでは、たとえば、翻訳可能性は、モデルにおいて実現されるために、活性剤（ａｃｔｉｖｅｓ）の組合せが目的とするものと同じ根底の（ｕｎｄｅｒｌｉｎｉｎｇ）作用機構を必要とし得る。一例として、多くのヒト腫瘍が免疫排除されたＴＧＦβ１陽性腫瘍はチェックポイント遮断療法（ＣＢＴ）に対して一次耐性を示す。ＣＢＴに対する耐性を克服するために第２の治療（ＴＧＦβ１阻害剤など）を併用し得る。このシナリオでは、適切な翻訳可能な前臨床モデルはチェックポイント遮断療法（ＣＢＴ）に対して一次耐性を示すＴＧＦβ１陽性腫瘍を含む。
【０１１８】
処置する／処置：用語「処置する」または「処置」は、治療的処置、予防的処置、および、対象が障害または他の危険因子を発生する危険性を低下させる応用を含む。したがって、この用語は、たとえば、身体の免疫を増強もしくはブーストすること、免疫抑制を低下もしくは逆転させること、有害な細胞もしくは物質を身体から低下させる、除去する、もしくは根絶させること、疾患の負担（たとえば腫瘍量）を減らすこと、再発もしくは再熱を防止すること、不応性の期間を延長させること、および／または他の様式で生存を改善させることによって、患者において治療上の利点を引き起こすことを広く意味することを意図する。この用語は、治療的処置、予防的処置、および、対象が障害または他の危険因子を発生する危険性を低下させる応用を含む。処置は障害の完全治癒を必要とせず、症状または根底にある危険因子を低下させる実施形態を包含する。組合せ療法のコンテキストにおいて、この用語は、ｉ）第１の治療剤の有効投薬量を減らして副作用を低下させ許容性を増加させる、第２の治療剤の能力、ｉｉ）患者を第１の治療に対してより応答性にする、第２の治療の能力、および／またはｉｉｉ）相加的または相乗的な臨床上の利点を実現する能力も指し得る。
【０１１９】
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）：ＴＡＭは、腫瘍促進（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒ）表現型を有する極性化／活性化マクロファージである（Ｍ２様マクロファージ）。ＴＡＭは、腫瘍部位に動員された髄由来の単球／マクロファージであるか、または赤血球骨髄前駆体に由来する組織常在マクロファージのどちらかであることができる。単球／マクロファージのＴＡＭへの分化は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、およびリガンドとして作用する他の分子等の局所的化学シグナル、ならびにニッチ（腫瘍微小環境）中に存在する単球／マクロファージ間の細胞間相互作用を含めたいくつかの要因によって影響を受ける。一般に、単球／マクロファージは、いわゆる「Ｍ１」または「Ｍ２」亜型へと極性化されることができ、後者はより腫瘍促進の表現型と関連している。固形腫瘍では、腫瘍塊の５０％までがマクロファージに対応してよく、これらは優先的にＭ２極性化である。腫瘍関連単球および骨髄細胞集団のうち、Ｍ１マクロファージは、典型的には細胞表面ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６８、およびＣＤ８６を発現する一方で、Ｍ２マクロファージは、典型的には細胞表面ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、およびＣＤ２０６を発現する。腫瘍関連のＭ２様マクロファージ（Ｍ２ｃおよびＭ２ｄ亜型など）は、細胞表面ＬＲＲＣ３３および／またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１を発現することができる。
【０１２０】
腫瘍微小環境：用語「腫瘍微小環境（ＴＭＥ）」とは、腫瘍（たとえば固形腫瘍）がｉｎ  ｖｉｖｏで常在する局所的な疾患ニッチをいう。ＴＭＥは、疾患関連の分子署名（ケモカイン、サイトカインの組など）、疾患関連の細胞集団（ＴＡＭ、ＣＡＦ、ＭＤＳＣなど）、ならびに疾患関連のＥＣＭ環境（ＥＣＭの構成要素および／または構造の変更）を含み得る。
【０１２１】
可変領域：用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の軽鎖および／または重鎖の一部分をいい、典型的には重鎖中のアミノ末端の約１２０〜１３０個のアミノ酸および軽鎖中の約１００〜１１０個のアミノ末端のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体間でさえもアミノ酸配列が大規模に異なる。典型的には、抗体の可変領域が、特定の抗体のその標的に対する特異性を決定する。
【０１２２】
操作例（ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｅｘａｍｐｌｅｓ）中または別段に指定した場合以外は、本明細書中で使用する成分の量または反応条件を表すすべての数字は、すべての場合において用語「約」で修飾されていると理解されるべきである。百分率に関連して使用する場合、用語「約」は±１％を意味することができる。
【０１２３】
本明細書中、明細書および特許請求の範囲において使用する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、そうでないと明白に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１２４】
本明細書中、明細書および特許請求の範囲において使用する語句「および／または」は、そのように等位結合された要素の「どちらかまたは両方」を意味する、すなわち、要素は一部の事例では接続的に存在し、他の事例では離接的に存在すると理解されるべきである。「および／または」節によって具体的に同定された要素以外の他の要素が、そうでないと明白に示されていない限り、具体的に同定した要素に関連しているまたは関連していないにかかわらず、任意選択で存在してよい。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの開放型の言葉と併せて使用した場合に、一実施形態ではＢなしのＡ（任意選択でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態ではＡなしのＢ（任意選択でＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態ではＡおよびＢの両方（任意選択で他の要素を含む）などを指すことができる。
【０１２５】
本明細書中、明細書および特許請求の範囲において使用する、１つまたは複数の要素のリストに言及する語句「少なくとも１つの」とは、要素リスト中の要素のうちの任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素リスト内に具体的に列挙したありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを含む必要はなく、また、要素リスト中の要素の任意の組合せを排除しない。この定義は、語句「少なくとも１つの」が指す要素リスト内で具体的に同定した要素以外の要素も、具体的に同定した要素に関連しているまたは関連していないにかかわらず、任意選択で存在し得ることも許可する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（あるいは同等に「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、あるいは同等に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態では、少なくとも１つのＡを（任意選択で複数のＡを含む）を指し、Ｂは存在しない（かつ任意選択でＢ以外の要素を含む）こと、別の実施形態では、少なくとも１つのＢ（任意選択で複数のＢを含む）を指し、Ａは存在しないこと（かつ任意選択でＡ以外の要素を含む）こと、さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＡ（任意選択で複数のＡを含む）および少なくとも１つのＢ（任意選択で複数のＢを含む）を指す（かつ任意選択で他の要素を含む）ことなどを指すことができる。
【０１２６】
クレーム要素を修飾するために特許請求の範囲において使用する、「第１」、「第２」、「第３」などの順序を示す用語の使用は、それ自体では、１つのクレーム要素が別のものに対していかなる優先、先行、もしくは順序を有すること、または方法の行為が行われる時間的順序を暗示するものではなく、クレーム要素を識別するために、特定の名称を有する１つのクレーム要素を（順序を示す用語の使用以外は）同じ名称を有する別の要素から識別するための単なる標識として使用される。
【０１２７】
本明細書中に提供する範囲は、その範囲内のすべての値の略記であると理解される。たとえば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲、たとえば、１０〜２０、１〜１０、３０〜４０などを含むと理解される。
【０１２８】
トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）
トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）の活性および続く可溶性成長因子の部分精製は、１９７０年代後期から１９８０年代初期に最初に記載されており、これをもってＴＧＦβ分野がおよそ４０年前に始まった。現在までに、大きなＴＧＦβスーパーファミリーを構成する３３個の遺伝子産物が同定されている。ＴＧＦβスーパーファミリーは、構造的類似性によって少なくとも３つのサブクラス、すなわち、ＴＧＦβ、成長分化因子（ＧＤＦ）、および骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ）へと分類することができる。ＴＧＦβサブクラスは、ヒトにおいて３つの別々の遺伝子によってコードされている、３つの高度に保存されたアイソフォーム、すなわち、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３からなる。
【０１２９】
ＴＧＦβは、細胞増殖の阻害、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリング、および免疫恒常性などの多様なプロセスにおいて主要な役割を果たすと考えられている。Ｔ細胞恒常性におけるＴＧＦβ１の重要性は、ＴＧＦβ１−／−マウスが３〜４週間しか生存せず、大規模な免疫活性化が原因で多臓器不全に屈するという観察によって実証されている（Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ａ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９９３年、９０（２）：７７０〜４頁、Ｓｈｕｌｌ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２年、３５９（６３９７）：６９３〜９頁）。ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の役割はそれほど明確ではない。３つのＴＧＦβアイソフォームは明白に異なる時間的および空間的な発現パターンを有する一方で、これらは同じ受容体、ＴＧＦβＲＩおよびＴＧＦβＲＩＩを通してシグナル伝達する。とはいえ、一部の事例では、たとえばＴＧＦβ２シグナル伝達では、ベータグリカンなどのＩＩＩ型受容体も必要である（Ｆｅｎｇ，Ｘ．Ｈ．およびＲ．Ｄｅｒｙｎｃｋ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２００５年、２１：６５９〜９３頁、Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９９８年、６７：７５３〜９１頁）。ＴＧＦβＲＩ／ＩＩのリガンド誘導性オリゴマー化がＳＭＡＤ転写因子のリン酸化を始動し、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、ＡＣＴＡ２、およびセルピン（ＳＥＲＰＩＮＥ）１などの標的遺伝子の転写をもたらす（Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．、Ｊ．Ｓｅｏａｎｅ、およびＤ．Ｗｏｔｔｏｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、２００５年、１９（２３）：２７８３〜８１０頁）。ＳＭＡＤ非依存性ＴＧＦβシグナル伝達経路も、たとえば癌またはマルファンマウスの大動脈病変において記載されている（Ｄｅｒｙｎｃｋ，Ｒ．およびＹ．Ｅ．Ｚｈａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ、２００３年、４２５（６９５８）：５７７〜８４頁、Ｈｏｌｍ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１１年、３３２（６０２７）：３５８〜６１頁）。
【０１３０】
ヒトにおけるＴＧＦβ経路の生物学的重要性は遺伝病によって妥当性確認されている。カムラチ−エンゲルマン病はＴＧＦＢ１遺伝子における常染色体優性突然変異が原因で骨異形成をもたらし、ＴＧＦβ１シグナル伝達の構成的活性化を引き起こす（Ｊａｎｓｓｅｎｓ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２００６年、４３（１）：１〜１１頁）。ロイス／ディーツ症候群を有する患者はＴＧＦβシグナル伝達経路の構成要素中に常染色体優性突然変異を保有しており、これは大動脈瘤、両眼隔離症、および二分口蓋垂を引き起こす（Ｖａｎ  Ｌａｅｒ，Ｌ．、Ｈ．Ｄｉｅｔｚ、およびＢ．Ｌｏｅｙｓ、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、２０１４年、８０２：９５〜１０５頁）。ＴＧＦβ経路の調節不全は複数の疾患に結び付けられているため、ＴＧＦβ経路を標的とするいくつかの薬物が開発され患者において試験されているが、成功は限られていた。
【０１３１】
ＴＧＦβシグナル伝達の調節不全は広範囲のヒト疾患に関連づけられている。実際、いくつかの病状では、そのような調節不全はＴＧＦβ機能の複数の様相に関与し得る。線維性および／または炎症性の組織および腫瘍などの患部組織は、ＴＧＦβの活性化が疾患の増悪または進行を引き起こすことができる局所的環境を作る場合があり、これは、自己分泌および／またはパラ分泌様式で、特定の疾患設定において役割を果たすいくつかの他のサイトカイン、ケモカイン、および成長因子と共に、複数のＴＧＦβ応答性細胞間の相互作用によって少なくとも部分的に媒介され得る。
【０１３２】
たとえば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、癌（すなわち悪性）細胞に加えて活性化筋線維芽細胞様線維芽細胞、間質細胞、浸潤性マクロファージ、ＭＤＳＣ、および他の免疫細胞などの、ＴＧＦβ１を発現する複数の細胞種を含有する。したがって、ＴＭＥは、ＴＧＦβ１を発現するおよび／またはそれに対して応答性であるが、ニッチ内において複数種の提示分子、たとえば、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＬＲＲＣ３３、およびＧＡＲＰと会合している、細胞の異種集団を表す。
【０１３３】
免疫療法における進歩は、増加し続ける癌患者の有効な処置展望を一変している。最も顕著なのは、現在では増加しつつある癌の標準治療レジメンの一部となったチェックポイント遮断療法（ＣＢＴ）である。ＣＢＴに対する著しい永続的応答が増加し続ける癌種にわたって観察されているが、有意な割合の腫瘍が処置の着手時においてさえもＣＢＴに不応性であると思われることが現在明らかとなっており、それ故、一次耐性が、多くの患者の免疫系が腫瘍細胞を標的として排除することを可能にすることに対する、大きな課題として指摘されている。より多数の患者において処置の有効性を広げるために、ＣＢＴに対する一次耐性を与えることの根底にある機構を理解してそれに対処するための努力が試みられている。しかし、この熱意は、ＣＢＴを、同じ腫瘍種に影響を与えるまたは免疫系の一見関連している構成要素を変調することが知られている薬剤と組み合わせた場合のさえない臨床治験結果および失敗によって抑えられている。あり得る理由は、所定の組合せの明確な機構的理論的根拠が多くの場合臨床由来のデータに根付いておらず、したがって、認可されている単一薬剤療法を増強することを意図する治験において不確定かつ困惑させる結果をもたらしている。組合せ免疫療法の設計は、根底にある腫瘍および免疫系の生物学との関連性の科学的証拠に根付いているべきであることが明らかとなっている。
【０１３４】
近年、抗腫瘍エフェクターＴ細胞（たとえばＣＤ８＋Ｔ細胞）が免疫抑制性局所キューによってそれから遠ざけられている（それ故「排除されている」）腫瘍環境を説明するために、「免疫排除」と呼ばれる現象が案出された。より最近では、臨床由来の腫瘍のいくつかの遡及的分析が、ＴＧＦβ経路の活性化をＣＢＴに対する一次耐性を媒介することに結び付けている。たとえば、転写プロファイリングおよび前処置黒色腫生検の分析により、抗ＰＤ−１  ＣＢＴに非応答性の腫瘍におけるＴＧＦβ関連経路および生物学的プロセスの富化が明らかとなった。免疫排除腫瘍では、そうでなければ細胞表面腫瘍抗原を認識することによって癌細胞を攻撃することができるエフェクター細胞が、癌細胞の部位に接近することが妨げられる。このようにして、癌細胞は、宿主免疫およびそのような免疫を活用してそれに頼るチェックポイント阻害剤などの免疫腫瘍学的治療剤を回避する。実際、そのような腫瘍は、恐らくは標的Ｔ細胞が腫瘍に入ることを遮断され、それ故抗癌効果を発揮することに失敗ため、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体などのチェックポイント阻害に対して耐性を示す。
【０１３５】
臨床由来の腫瘍のいくつかの遡及的分析は、ＣＢＴに対する一次耐性を媒介することにおいてＴＧＦβ経路の活性化を指摘している。たとえば、転写プロファイリングおよび前処置黒色腫生検の分析により、抗ＰＤ−１  ＣＢＴに非応答性の腫瘍におけるＴＧＦβ関連経路および生物学的プロセスの富化が明らかとなった。より最近では、転移性尿路上皮癌患者からの腫瘍の類似の分析により、アテゾリズマブを用いたＰＤ−Ｌ１遮断に対する応答の欠如が、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍内に入ることから排除されていると思われる腫瘍において、ＴＧＦβシグナル伝達の転写シグネチャに関連したいたことが明らかとなった。免疫排除を媒介して抗ＰＤ−（Ｌ）１耐性をもたらすことにおけるＴＧＦβシグナル伝達の重大な役割は、乳癌のＥＭＴ−６同系マウスモデルにおいて確認されている。ＥＭＴ−６腫瘍は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた処置に対する応答性が弱いが、このチェックポイント阻害剤を、すべてのＴＧＦβアイソフォームの活性を遮断する抗体である１Ｄ１１と組み合わせることで、個々の阻害剤を用いた処置と比較して、完全応答の頻度の著しい増加がもたらされた。相乗的な抗腫瘍活性は、腫瘍内への活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤をもたらす、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）表現型の変化および免疫排除された表現型の崩壊が原因であることが提案されている。同様の結果が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＩ型ＴＧＦβ受容体ＡＬＫ５キナーゼの小分子阻害剤であるガルニセルチブとの組合せを使用して、結腸直腸癌および転移のネズミモデルにおいて見出された。まとめると、これらの発見は、ＣＢＴ耐性腫瘍におけるＴＧＦβ経路の阻害は、ＣＢＴに対する臨床反応を改善させるまたはその数を増加させるために有望な手法である可能性があることを示唆している。最近の研究はＴＧＦβ経路の活性化と一次ＣＢＴ耐性との間に関係性を結び付けているが、ＴＧＦβシグナル伝達は長年、癌の病因の特長に関連づけられてきた。強力な免疫抑制因子として、ＴＧＦβは抗腫瘍Ｔ細胞活性を妨げ、免疫抑制マクロファージを促進する。悪性細胞は、その成長および腫瘍抑制効果を回避する機構として、しばしばＴＧＦβシグナル伝達に対して耐性となる。ＴＧＦβはＣＡＦを活性化させ、細胞外マトリックスの生成および腫瘍進行の促進を誘導する。最後に、ＴＧＦβはＥＭＴ、したがって支持組織の侵襲および腫瘍転移を誘導する。
【０１３６】
哺乳動物は、すべて同じヘテロマーＴＧＦβ受容体複合体を通じてシグナル伝達する３つのＴＧＦβ成長因子、すなわち、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３をコードして発現する明白に異なる遺伝子を有する。共通のシグナル伝達経路にもかかわらず、それぞれのＴＧＦβアイソフォームは、重複しないＴＧＦβノックアウトマウスの表現型によって証明されるように、明白に異なる生物学的機能を有すると思われる。３つすべてのＴＧＦβアイソフォームは、潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）とも呼ばれるＴＧＦβプロドメインがその成長因子の周りに巻かれ、それを潜在型の非シグナル伝達状態に保つ、不活性プロドメイン−成長因子複合体として発現される。さらに、潜在型ＴＧＦβは潜在型ＴＧＦβ−結合タンパク質と同時発現され、ジスルフィド結合を通じて大型潜在型複合体（ＬＬＣ）を形成する。潜在型ＴＧＦβと潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質−１（ＬＴＢＰ１）またはＬＴＢＰ３との会合は細胞外マトリックスへの繋留を可能にし、膜貫通タンパク質ＧＡＲＰまたはＬＲＲＣ３３との会合は、それぞれＴｒｅｇまたはマクロファージの表面上での同化を可能にする。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、潜在型ＴＧＦβ１および潜在型ＴＧＦβ３は、ＬＡＰ上のコンセンサスＲＧＤ配列と結合し、コンホメーション変化を始動して成長因子を放出する、αＶインテグリンの部分組によって活性化される。潜在型ＴＧＦβ２が活性化される機構、それがコンセンサスＲＧＤモチーフを欠くため、それほど明確ではない。ＬＡＰのタンパク質分解的切断によるＴＧＦβ１放出も活性化機構に結び付けられているが、その生物学的関連性はそれほど明確ではない。
【０１３７】
ＴＧＦβの活性化の病原的役割はいくつかの病状においては明らかであるが、ＴＧＦβ経路の治療的標的化が、広範かつ持続的な経路阻害から生じる多面発現効果が原因で困難であったことも同等に明らかである。たとえば、いくつかの研究は、ＴＧＦβ  Ｉ型受容体キナーゼＡＬＫ５（ＴＧＦΒＲ１）の小分子媒介性阻害または高親和性抗体を用いた３つすべての高度に関連するＴＧＦβ成長因子の遮断が、マウス、ラット、およびイヌにおいて重篤な心臓弁膜症をもたらしたことを示している。っしたがって、すべてのＴＧＦβシグナル伝達を遮断するこれらの「汎」ＴＧＦβ手法は非常に狭い治療ウィンドウを有しており、これは、非常に高い、満たされていない医療的要求を有するいくつかの疾患関連プロセスの処置に対する障害であることが判明している。現在までに認可されているＴＧＦβ標的化療法は存在せず、そのような様式を有する臨床治験結果は、安全性の懸念を受け入れるために必要であった、効果のない投薬レジメンであると判明したものの使用が恐らく原因で、大部分が期待外れであった。
【０１３８】
広範なＴＧＦβ阻害に伴う安全性の懸念は、複数の疾患プロセスにおけるこの経路の重大な役割の有力な証拠と一緒になって、疾患病理学において１つまたは複数のＴＧＦβファミリーメンバーによって果たされる具体的な役割のより良好な理解が治療行為の実行可能な手段をもたらし得ることを示唆している。ＴＧＦβおよびＣＢＴに対する応答に関して、本発明者らは、本明細書中において多くのヒト腫瘍においてＴＧＦβ１の広く普及した発現を観察しており、このファミリーメンバーが一次耐性に対するこの経路の貢献の主要な駆動因子であり得ることを示唆している。
【０１３９】
上述のように、増えつつある証拠が、ＴＧＦβが、免疫排除腫瘍環境を含めた疾患組織において免疫抑制を生じさせるおよび／または維持することにおける主要な役者であり得ることを示唆している。したがって、ＴＧＦβ阻害は、免疫抑制を遮断解除し、エフェクターＴ細胞（特に細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞）が標的癌細胞に接近して死滅させることを可能にし得る。腫瘍浸潤に加えて、ＴＧＦβ阻害はＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大も促進し得る。そのような拡大は、リンパ節においておよび／または腫瘍において（腫瘍内で）起こり得る。このプロセスの根底にある（ｕｎｄｅｒｌｉｎｉｎｇ）正確な機構は未だ解明されていないが、免疫抑制が、調節性Ｔ細胞および活性化マクロファージに関与する免疫細胞関連ＴＧＦβ１の活性化によって少なくとも部分的に媒介されることが企図される。ＴＧＦβがＣＤ４＋Ｔ細胞においてＦｏｘｐ３発現を直接促進し、それによってこれらを調節性（免疫抑制性）の表現型（すなわちＴｒｅｇ）へと変換することが報告されている。さらに、ＴｒｅｇはエフェクターＴ細胞の増殖を抑制し（たとえば図２６Ｂを参照）、それによって免疫応答を低下させる。このプロセスはＴＧＦβ１依存性であることが示されており、ＧＡＲＰ関連ＴＧＦβ１シグナル伝達に関与する可能性が高い。ヒトおよび動物モデルの両方における観察により、ＴＭＥにおけるＴｒｅｇの増加が複数種の癌における予後不良に関連していることが示されている。さらに、本出願人は、Ｍ−ＣＳＦなどの腫瘍由来因子に曝露されたＭ２−極性化マクロファージが、ＴＧＦβ１の提示分子であるＬＲＲＣ３３の細胞表面発現を劇的にアップレギュレーションすることを以前に示している（たとえばＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３１７５９号を参照）。これらのいわゆる腫瘍関連マクロファージ（またはＴＡＭ）は、ＴＭＥにおける観察されたＴＧＦβ１依存性免疫抑制に寄与し、腫瘍成長を促進すると考えられている。
【０１４０】
いくつかの固形腫瘍は、筋線維芽細胞または筋線維芽細胞様細胞が富化された腫瘍間質を有することによって特徴づけられている。これらの細胞は腫瘍を取り囲むまたは包み込むコラーゲン性マトリックス（線維形成など）を生じ、これは、過活動のＴＧＦβ１シグナル伝達によって少なくとも部分的に引き起こされ得る。ＴＧＦβ１の活性化は、ＥＣＭ関連提示分子、たとえば腫瘍間質におけるＬＴＢＰ１およびＬＴＢＰ３を介して媒介されることが企図される。
【０１４１】
本出願人は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において有望な効果を示した、これらの生物学的コンテキストの多くにおいてＴＧＦβ１の活性化を阻害することができる抗体を以前に開示している（たとえばＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０１号を参照）。しかし、ｉ）疾患関連ＴＧＦβ１が常在する様々な生物学的コンテキストまたはニッチにわたって均一に阻害性の効果を確実にするために、様々な抗原複合体に対して示す親和性の型よりがより少ない、改善された抗体を開発すること、および／または、ｉｉ）以前に記載されている対応物よりもさらに高い効力を提供する抗体を開発することの課題は残されたままであった。
【０１４２】
本明細書中に提示した研究において、改善された抗体が、以下の特長のすべてまたはほとんどを具現化するべきであることが想定された：１）汎阻害に関連する望まない毒性を最小限にするために、ＴＧＦβ１に対する選択性を維持するべきである（「アイソフォーム選択性」）（たとえばＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２１９７２号を参照）、２）様々な生物学的コンテキストまたはマトリックス関連および細胞関連のカテゴリーの両方にわたって、広範な結合活性を示すべきである（「コンテキスト非依存性」）、３）複数の抗原複合体にわたってより均等または不偏の親和性を達成するべきである（「均一性」）、４）抗原複合体のそれぞれについて強力な結合活性を示すべきである（「高親和性」）、ならびに５）それぞれのコンテキストについて頑強な阻害活性を有するべきである（「効力」）。さらに、好ましい作用機構は、可溶性／遊離成長因子を直接標的するより、むしろ下流の活性化事象を先制して防止して永続的効果を達成するように、組織に繋留されている潜在型ＴＧＦβ１複合体を阻害剤が標的とすることができるように活性化ステップを阻害することである（「永続性」）。本明細書中にさらに詳細に開示するように、本開示の新規の改善されたＴＧＦβ１阻害剤は、潜在型ＴＧＦβ１の活性化の非常に強力かつ選択性の高い阻害剤である。本明細書中に提示するデータは、とりわけ、アイソフォーム特異的阻害のこの機構が、ヒト癌において見つかるＣＢＴに対する一次耐性の特長の一部をよく概括している同系マウスモデルにおける、抗ＰＤ−１に対する一次耐性を克服するために十分であることを実証している。「汎」ＴＧＦβ阻害剤と比較したそのような抗体の改善された前臨床安全性プロフィールと一緒になって、これらの有効性データは、癌免疫療法におけるチェックポイント遮断に対する臨床反応を広げるおよび増強するため、ならびにいくつかの追加のＴＧＦβ１関連の適応症を処置するために、選択的ＴＧＦβ１阻害の治療的使用を探求するための理論的根拠を提供する。
【０１４３】
前駆ＴＧＦβ１の新規の高親和性のアイソフォーム選択的抗体
一般的特徴
ＴＧＦβ１の高親和性の改善された阻害剤が本明細書中に開示されており、これらの抗体は、初期の開示ＴＧＦβ１選択的阻害剤と比較して、増強された結合（ｂｉｄｉｎｇ）特性、増加した阻害効力を有し、望ましい安全性プロフィールおよびアイソフォーム選択性を維持することを特徴とする。本開示のこれらのＴＧＦβ１選択的阻害剤は、潜在型前駆ＴＧＦβ１複合体のプロドメイン（「ＬＡＰ」と呼ぶ場合もある）の少なくとも一部分と特異的に結合し、ＴＧＦβ１に対してアイソフォーム選択的阻害活性を有するモノクローナル抗体（たとえば、免疫グロブリン、操作した免疫グロブリン様分子、抗原結合断片、またはその一部分）である（表１の「コア特性」を参照）。
【０１４４】
本開示による抗体の増強された結合特性は、平衡状態で測定して増加した親和性を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ヒトＬＬＣ複合体（ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および／またはｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）のうちの少なくとも１つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１から選択されるヒトＬＬＣ複合体のうちの２つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１から選択されるヒトＬＬＣ複合体のうちの３つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。好ましい実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ヒトＬＬＣ複合体のそれぞれ、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１に対して≦１ｎＭのＫＤを有する。本開示によれば、高親和性抗体は、平衡状態で１ｎＭ以下、たとえば、≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２００ｐＭ、および≦１００ｐＭである、特定の抗原（たとえば抗原複合体）に対するＫＤ値を有し得る。
【０１４５】
本発明は、ＭＳＤ−ＳＥＴなどの平衡状態で測定して、ヒトＬＬＣ複合体のそれぞれ（ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）と≦１０ｎＭのＫＤ（たとえば、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、および≦０．１ｎＭ）の特異的に結合することができる、抗体またはその抗原結合断片も含む。一部の実施形態では、抗体は、溶液平衡滴定に基づく方法によって測定して、前述のＬＬＣ複合体のそれぞれと≦５ｎＭのＫＤで結合する。一部の実施形態では、抗体は、溶液平衡滴定に基づく方法によって測定して、前述のＬＬＣ複合体のそれぞれと≦１ｎＭのＫＤで結合する。
【０１４６】
細胞外マトリックスおよび免疫構成要素の両方の調節不全に関与する、ＴＧＦβ１関連の適応症を処置するための治療的使用のためには、両方のコンテキストにおいて阻害効果を発揮するために（たとえば、ＥＣＭで、および免疫細胞に引き付けられる）、ＥＣＭ関連前駆ＴＧＦβ１複合体のうちの少なくとも１つ（ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１および／またはｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１）ならびにさらには細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体のうちの少なくとも１つ（ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１および／またはｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）に対して高い親和性（たとえば≦１ｎＭのＫＤ）を有する抗体を選択することが有利である。一部の実施形態では、抗体は、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１の両方ならびにさらには細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体のうちの少なくとも１つ（ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１またはｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）に対して高い親和性（たとえば≦１ｎＭのＫＤ）を有する。さらに他の実施形態では、抗体は、前述の複合体のそれぞれ（ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）に対して高い親和性（たとえば≦１ｎＭのＫＤ）を有する。好ましい実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴなどの溶液平衡滴定に基づく方法によって測定して、ヒト複合体のそれぞれに対して≦２００ｐＭのＫＤ、たとえば≦１００ｐＭを有する。
【０１４７】
本開示の実施形態は高親和性コンテキスト非依存性抗体を含む。そのような抗体は、４つの既知の提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体、すなわち、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１と等価な親和性で結合することができる。等価な親和性とは、４つの抗原複合体間で抗体が示す最低の親和性（最高のＫＤ数値）が、残りの３つの親和性から計算した平均値よりも５倍以下低いこと、または、４つの抗原複合体間で抗体が示す最高の親和性（最低のＫＤ数値）が、残りの３つの親和性から計算した平均よりも５倍以下高いことのいずれかを意味し得る。一部の実施形態では、２つのＥＣＭ関連複合体の平均ＫＤ値と２つの細胞関連複合体の平均ＫＤ値との比が３倍以下である場合に、そのような抗体は等価な親和性を有すると言い得る。
【０１４８】
等価な親和性を有する抗体は、前駆ＴＧＦβ１複合体に関連する具体的な提示分子とは無関係に、より均一（たとえば不偏）な阻害効果を達成し得る（それ故「コンテキスト非依存性」）。特に好ましい実施形態では、抗体は、４つのヒトＬＬＣのそれぞれに対する親和性が、溶液平衡滴定に基づく方法によって測定して１ｎＭ以下（たとえば２００ｐＭ以下）であり、抗体が上述の４つのすべてヒトＬＬＣに対して等価な親和性を有する点において、高親和性のコンテキスト非依存性抗体である。たとえば、マトリックス関連複合体と細胞関連複合体との間の平均親和性において観察される偏りは３倍以下である。
【０１４９】
一部の実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴなどの溶液平衡滴定に基づく方法によって測定して、前述の複合体のそれぞれ（ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）と≦１０ｎＭのＫＤ（たとえば、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、および≦０．１ｎＭ）で特異的に結合する。
【０１５０】
本明細書中に包含する阻害性抗体のうちの任意の１つは、前駆ＴＧＦβ１複合体のプロドメイン内に潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む結合領域で、前述の大型潜在型複合体のそれぞれ（ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）と結合し得る。そのような結合領域は、成長因子ドメインの少なくとも一部分をさらに含み得る。特に好ましい実施形態では、そのような抗体は、潜在型ラッソの少なくとも一部分および成長因子ドメインの少なくとも一部分を含むＬＬＣ複合体内の結合領域で、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと≦２００ｐＭ（≦１５０ｐＭおよび≦１００ｐＭなど）のＫＤ値で結合する。
【０１５１】
一部の実施形態では、ＴＧＦβ１を選択的に阻害することができる高親和性のコンテキスト非依存性抗体は、活性化の様式に関係なく、活性化されたＴＧＦβ１を阻害することができる。たとえば、特定のインテグリンは、ＬＬＣのプロドメイン内のＲＧＤモチーフと直接結合し、ケージ様プロドメイン構造を機械的に「引き開け」、それによってＴＧＦβ１成長因子が潜在型複合体から解放されることを引き起こすことが知られている。それとは別に、細胞外環境中に存在する特定のプロテアーゼは、インテグリン非依存性様式でＴＧＦβ１を活性化することが示されている。ＲＧＤモチーフを直接標的とし、それによってインテグリン結合と干渉する抗体は、ＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化を阻害しない場合がある。逆に、プロテアーゼ認識または切断部位のうちの１つまたは複数を直接標的とする抗体は、ＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化を阻害しない場合がある。対照的に、本発明の好ましい実施形態では、高親和性のコンテキスト非依存性抗体はＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化およびＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化を阻害することができる。
【０１５２】
標的ヒトタンパク質との高親和性結合は抗体治療剤の必須の特長であるが、追加の種の対応物と交差反応する能力が有利である。特に、ほとんどの前臨床薬理学的モデルがげっ歯動物におけるものであることを考慮すると、ネズミ／ラットタンパク質との種交差反応性は前臨床研究の代理抗体として好都合なツールを提供する。したがって、一部の実施形態では、本開示の高親和性抗体は、マウス、ラット、および／または非ヒト霊長類などの他の哺乳動物対応物と有利に交差反応する。
【０１５３】
本開示によって包含される新規抗体のうち、特に好ましい抗体のクラスおよびその特長を以下に分類して記述する。
【０１５４】
好ましい特長
一部の実施形態では、コア特性の特長に加えて、本明細書中に開示されている好ましい抗体は、本明細書中の表１に記載するカテゴリー１〜５のうちの１つまたは複数の抗体基準をさらに満たす。
【０１５５】
一部の実施形態では、本発明の抗体の追加の所要基準は、その結合特性、たとえば抗原に対する抗体の親和性によって定義する。このコンテキストにおける「抗原」は、少なくとも４つのタンパク質複合体、すなわちＴＧＦβ１のヒトの大型潜在型複合体（ＬＬＣ）を含み、それらはｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と呼ばれる。本開示の発明によれば、抗体は、これらの複合体のそれぞれと、典型的にはＫＤ値として測定される特定の親和性で結合することができる。カテゴリー１およびカテゴリー２の抗体はこれらの実施形態の範囲内に入る。結合特性に基づく基準（たとえばカテゴリー１および２）を定義する目的のために、抗体の親和性は、動力学的アッセイ（ＢＬＩなど）ではなく平衡状態で決定する。
【０１５６】
それに加えてまたはその代わりに、本発明の抗体の追加の所要基準はそのアミノ酸配列によって定義する。カテゴリー３およびカテゴリー４の抗体は抗体のＣＤＲ配列によって定義される一方で、カテゴリー５の抗体はその重鎖および軽鎖の可変ドメイン配列によって定義する。
表１．本発明の新規の高親和性のＴＧＦβ１選択的阻害剤の好ましい特長
2021531254.tif 000004
2021531254.tif 000005
【０１５７】
それぞれのカテゴリーの非限定的な実施形態を以下に提供する。
【０１５８】
カテゴリー１抗体
本明細書中に開示されている抗体は、ＴＧＦβ１のヒトの潜在型の大型複合体を特異的に標的化することができる高親和性のアイソフォーム選択的抗体である。
【０１５９】
一態様では、本発明は、≦２００ｐＭのＫＤで以下のヒトＬＬＣのそれぞれ、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、親和性は溶液平衡滴定に基づくアッセイなどの適切なアッセイを使用して平衡状態で測定した。
【０１６０】
そのような抗体または断片は、溶液平衡滴定によって測定して、≦１５０ｐＭのＫＤでｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと結合し得る。より好ましくは、そのような抗体または断片は、溶液平衡滴定によって測定して、≦１００ｐＭのＫＤでｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと結合し得る。たとえば、本明細書中の他の箇所により詳述されているＭＳＤ−ＳＥＴを含めた、平衡状態で抗体のＫＤ値を決定することができる任意の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性アッセイを用い得る。カテゴリー１の好ましい抗体の抗体基準を満たす、本明細書中に開示されている抗体の非限定的な例としては、Ａｂ６、Ａｂ２２、Ａｂ２４、Ａｂ２６、Ａｂ２９、Ａｂ３０、Ａｂ３１、Ａｂ３２、およびＡｂ３３が挙げられる。
【０１６１】
また、抗体は、さらなる種の対応するＬＬＣとも高い特異性および高い親和性で結合し得る。好ましい実施形態では、抗体はネズミ対応物に対して種交差反応性を示す。
【０１６２】
カテゴリー２抗体
本明細書中に開示されている抗体は、ＴＧＦβ１のヒトの潜在型の大型複合体を特異的に標的化することができる高親和性のアイソフォーム選択的抗体である。
【０１６３】
別の態様では、本発明は、≦１ｎＭのＫＤで以下のヒトＬＬＣのそれぞれ、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、親和性は溶液平衡滴定に基づくアッセイなどの適切なアッセイを使用して平衡状態で測定し、抗体または断片は、潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む結合領域でヒトＬＬＣと結合する。潜在型ラッソとは、プロドメインのいわゆる「ストレートジャケット」の一部を形成するタンパク質ドメインである。そのネイティブ形態では、ヒト前駆ＴＧＦβ１ポリペプチドの潜在型ラッソはアミノ酸配列ＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬ（配列番号１５３）を有する。任意の適切な技法を用いて、抗体が潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む領域でヒトＴＧＦβ１  ＬＬＣと結合するかどうかを決定し得る。たとえば、対応するポリペプチドを利用する競合アッセイを実施し得る。一部の実施形態では、結合領域はＨＤ−ＸまたはＸ線結晶構造解析によって決定し得る。
【０１６４】
一部の実施形態では、そのような抗体または断片は、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと、溶液平衡滴定によって測定して≦５００ｐＭ（任意選択で≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２００ｐＭ、または≦１００ｐＭ）のＫＤで結合してよく、ここで、抗体または断片は、潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む結合領域でヒトＬＬＣと結合する。カテゴリー２の好ましい抗体の抗体基準を満たす、本明細書中に開示されている抗体の非限定的な例としては、Ａｂ５およびＡｂ６が挙げられる。
【０１６５】
一部の実施形態では、そのような抗体は、前駆ＴＧＦβ１複合体内の成長因子ドメインの少なくとも一部分を含む追加の結合領域で、ヒトＬＬＣとさらに結合し得る。一部の実施形態では、抗体がプロドメイン複合体と会合していない遊離成長因子と特異的に結合しないように、追加の結合は潜在性複合体のコンテキストにおいてのみ起こる。ＬＬＣの成長因子ドメイン内の追加の結合領域は、「フィンガー−１」および／または「フィンガー−２」と呼ばれるタンパク質ドメインの少なくとも一部を含み得る。したがって、そのような抗体は、潜在型ラッソの少なくとも１つのアミノ酸残基および成長因子ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基を含むコンビナトリアルエピトープと結合し得る。
【０１６６】
また、抗体は、さらなる種の対応するＬＬＣとも高い特異性および高い親和性で結合し得る。好ましい実施形態では、抗体はネズミ対応物に対して種交差反応性を示す。
【０１６７】
カテゴリー３抗体
本明細書中に開示されている抗体は、ＴＧＦβ１のヒトの潜在型の大型複合体を特異的に標的化することができる高親和性のアイソフォーム選択的抗体である。
【０１６８】
さらなる一態様では、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、ＣＤＲ−Ｈ１はＦＴＦ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｍ（Ｘ５）（配列番号１４３）によって表されるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、任意の組合せで、Ｘ１はＳ、Ｇ、もしくはＡであってよく、Ｘ２はＳもしくはＦであってよく、Ｘ３はＦもしくはＹであってよく、Ｘ４はＳもしくはＡであってよく、および／または、Ｘ５はＤ、Ｎ、もしくはＹであってよい。一部の実施形態では、Ｈ−ＣＤＲ１が少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する場合、Ｘ１位はＳで置き換えてもよく、Ｘ２位はＳで置き換えてもよく、Ｘ３位はＦで置き換えてもよく、Ｘ４位はＳで置き換えてもよく、および／または、Ｘ５位はＤで置き換えてもよい。
【０１６９】
抗体のＣＤＲ−Ｈ２はＹＩ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）Ａ（Ｘ４）ＴＩＹＹＡ（Ｘ５）ＳＶＫＧ（配列番号１４４）によって表されるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、任意の組合せで、Ｘ１はＳもしくはＨであってよく、Ｘ２はＰもしくはＳであってよく、Ｘ３はＳもしくはＤであってよく、Ｘ４はＤもしくはＳであってよく、および／または、Ｘ５はＤもしくはＧであってよい。一部の実施形態では、Ｈ−ＣＤＲ２が少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する場合、Ｘ１位はＳで置き換えてもよく、Ｘ２位はＰで置き換えてもよく、Ｘ３位はＤで置き換えてもよく、Ｘ４位はＳで置き換えてもよく、および／または、Ｘ５位はＤで置き換えてもよい。
【０１７０】
抗体のＣＤＲ−Ｈ３は（Ｘ１）Ｒ（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｄ（Ｘ５）ＧＤＭＬ（Ｘ６）Ｐ（配列番号１４５）によって表されるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、任意の組合せで、Ｘ１はＡもしくはＶであってよく、Ｘ２はＧもしくはＡであってよく、Ｘ３はＶもしくはＴであってよく、Ｘ４はＬもしくはＷであってよく、Ｘ５はＹもしくはＭであってよく、および／または、Ｘ６はＭもしくはＤであってよい。一部の実施形態では、Ｈ−ＣＤＲ３が少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する場合、Ｘ１位はＡで置き換えてもよく、Ｘ２位はＧで置き換えてもよく、Ｘ３位はＶで置き換えてもよく、Ｘ４位はＬで置き換えてもよく、Ｘ５位はＹで置き換えてもよく、および／または、Ｘ６位はＤで置き換えてもよい。
【０１７１】
ＣＤＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号１０５）を有し、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有する。
【０１７２】
ＣＤＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１０６）を有し、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有する。
【０１７３】
ＣＤＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴ（配列番号１２）を有し、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有する。
【０１７４】
カテゴリー３の好ましい抗体の抗体基準を満たす、本明細書中に開示されている抗体の非限定的な例としては、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２３、Ａｂ２４、Ａｂ２５、Ａｂ２６、Ａｂ２７、Ａｂ２８、Ａｂ２９、Ａｂ３０、Ａｂ３１、Ａｂ３２、およびＡｂ３４が挙げられる。
【０１７５】
以下の表２はカテゴリー３抗体のＣＤＲコンセンサス配列を要約する。一部の実施形態では、ＣＤＲ配列のそれぞれは、以下に記載したアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を任意選択で含有し得る。
表２．重鎖および軽鎖のコンセンサスＣＤＲ配列ならびに好ましいアミノ酸置換
2021531254.tif 000006
【０１７６】
一部の実施形態では、カテゴリー３抗体またはその抗原結合断片は、≦１ｎＭのＫＤで以下のヒトＬＬＣのそれぞれ、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合し、ここで、親和性は溶液平衡滴定に基づくアッセイなどの適切なアッセイを使用して平衡状態で測定した。
【０１７７】
一部の実施形態では、抗体または断片は、潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む結合領域でヒトＬＬＣと結合する。潜在型ラッソとは、プロドメインのいわゆる「ストレートジャケット」の一部を形成するタンパク質ドメインである。そのネイティブ形態では、ヒト前駆ＴＧＦβ１ポリペプチドの潜在型ラッソはアミノ酸配列ＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬ（配列番号１５３）を有する。任意の適切な技法を用いて、抗体が潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む領域でヒトＴＧＦβ１  ＬＬＣと結合するかどうかを決定し得る。たとえば、対応するポリペプチドを利用する競合アッセイを実施し得る。一部の実施形態では、結合領域はＨＤ−ＸまたはＸ線結晶構造解析によって決定し得る。
【０１７８】
一部の実施形態では、そのような抗体または断片は、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと、溶液平衡滴定によって測定して≦５００ｐＭ（任意選択で≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２００ｐＭ、または≦１００ｐＭ）のＫＤで結合してよく、ここで、抗体または断片は、潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む結合領域でヒトＬＬＣと結合する。
【０１７９】
一部の実施形態では、そのような抗体は、前駆ＴＧＦβ１複合体内の成長因子ドメインの少なくとも一部分を含む追加の結合領域で、ヒトＬＬＣとさらに結合し得る。一部の実施形態では、抗体がプロドメイン複合体と会合していない遊離成長因子と特異的に結合しないように、追加の結合は潜在性複合体のコンテキストにおいてのみ起こる。ＬＬＣの成長因子ドメイン内の追加の結合領域は、「フィンガー−１」および／または「フィンガー−２」と呼ばれるタンパク質ドメインの少なくとも一部を含み得る。したがって、そのような抗体は、潜在型ラッソの少なくとも１つのアミノ酸残基および成長因子ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基を含むコンビナトリアルエピトープと結合し得る。
【０１８０】
また、抗体は、さらなる種の対応するＬＬＣとも高い特異性および高い親和性で結合し得る。好ましい実施形態では、抗体はネズミ対応物に対して種交差反応性を示す。
【０１８１】
本明細書中には交差遮断抗体またはその抗原結合断片も含まれる。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、カテゴリー３抗体のうちの１つと交差遮断するまたは交差競合し、ここで、抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ヒトＬＬＣ複合体（ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および／またはｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）のうちの少なくとも１つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１から選択されるヒトＬＬＣ複合体のうちの２つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１から選択されるヒトＬＬＣ複合体のうちの３つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。好ましい実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ヒトＬＬＣ複合体のそれぞれ、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１に対して≦１ｎＭのＫＤを有する。本開示によれば、高親和性抗体は、平衡状態で１ｎＭ以下、たとえば、≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２００ｐＭ、および≦１００ｐＭである、特定の抗原（たとえば抗原複合体）に対するＫＤ値を有し得る。
【０１８２】
カテゴリー４抗体
本明細書中に開示されている抗体は、ＴＧＦβ１のヒトの潜在型の大型複合体を特異的に標的化することができる高親和性のアイソフォーム選択的抗体である。
【０１８３】
さらなる一態様では、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、Ｈ−ＣＤＲ１はＦＴＦＳＳＦＳＭＤ（配列番号１０７）またはＦＴＦＳＳＦＳＭＮ（配列番号１１４）を含み、任意選択でそれぞれは４個までのアミノ酸変化（任意選択で４個まで、３個まで、２個まで、または１個のアミノ酸変化）を含有してよく、Ｈ−ＣＤＲ２はＹＩＳＰＤＡＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１１）を含み、任意選択でＨ−ＣＤＲ２は４個までのアミノ酸変化（任意選択で４個まで、３個まで、２個まで、または１個のアミノ酸変化）を含有してよく、Ｈ−ＣＤＲ３はＡＲＧＶＬＤＹＧＤＭＬＤＰ（配列番号１１０）を含み、任意選択でＨ−ＣＤＲ３は３個までのアミノ酸変化（任意選択で３個まで、２個まで、または１個のアミノ酸変化）を含有してよく、Ｌ−ＣＤＲ１はＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号１０５）を含み、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有し、Ｌ−ＣＤＲ２はＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１０６）を含み、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有し、Ｌ−ＣＤＲ３はＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴ（配列番号１２）を含み、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有する。
【０１８４】
カテゴリー４の好ましい抗体の抗体基準を満たす、本明細書中に開示されている抗体の非限定的な例としては、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２３、Ａｂ２４、Ａｂ２５、Ａｂ２６、Ａｂ２７、Ａｂ２８、Ａｂ２９、Ａｂ３０、Ａｂ３１、Ａｂ３２、Ａｂ３３、およびＡｂ３４が挙げられる。
【０１８５】
以下の表３はカテゴリー４抗体のＣＤＲ配列を要約する。一部の実施形態では、ＣＤＲ配列のそれぞれは、以下に記載したアミノ酸置換のうちの１つまたは複数を任意選択で含有し得る。
表３．ＣＤＲ配列および変異体
2021531254.tif 000007
【０１８６】
一部の実施形態では、カテゴリー４抗体またはその抗原結合断片は、≦１ｎＭのＫＤで以下のヒトＬＬＣのそれぞれ、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合し、ここで、親和性は溶液平衡滴定に基づくアッセイなどの適切なアッセイを使用して平衡状態で測定した。
【０１８７】
一部の実施形態では、抗体または断片は、潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む結合領域でヒトＬＬＣと結合する。潜在型ラッソとは、プロドメインのいわゆる「ストレートジャケット」の一部を形成するタンパク質ドメインである。そのネイティブ形態では、ヒト前駆ＴＧＦβ１ポリペプチドの潜在型ラッソはアミノ酸配列ＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬ（配列番号１５３）を有する。任意の適切な技法を用いて、抗体が潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む領域でヒトＴＧＦβ１  ＬＬＣと結合するかどうかを決定し得る。たとえば、対応するポリペプチドを利用する競合アッセイを実施し得る。一部の実施形態では、結合領域はＨＤ−ＸまたはＸ線結晶構造解析によって決定し得る。
【０１８８】
一部の実施形態では、そのような抗体または断片は、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと、溶液平衡滴定によって測定して≦５００ｐＭ（任意選択で≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２００ｐＭ、または≦１００ｐＭ）のＫＤで結合してよく、ここで、抗体または断片は、潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む結合領域でヒトＬＬＣと結合する。
【０１８９】
一部の実施形態では、そのような抗体は、前駆ＴＧＦβ１複合体内の成長因子ドメインの少なくとも一部分を含む追加の結合領域で、ヒトＬＬＣとさらに結合し得る。一部の実施形態では、抗体がプロドメイン複合体と会合していない遊離成長因子と特異的に結合しないように、追加の結合は潜在性複合体のコンテキストにおいてのみ起こる。ＬＬＣの成長因子ドメイン内の追加の結合領域は、「フィンガー−１」および／または「フィンガー−２」と呼ばれるタンパク質ドメインの少なくとも一部を含み得る。したがって、そのような抗体は、潜在型ラッソの少なくとも１つのアミノ酸残基および成長因子ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基を含むコンビナトリアルエピトープと結合し得る。
【０１９０】
また、抗体は、さらなる種の対応するＬＬＣとも高い特異性および高い親和性で結合し得る。好ましい実施形態では、抗体はネズミ対応物に対して種交差反応性を示す。
【０１９１】
本明細書中には交差遮断抗体またはその抗原結合断片も含まれる。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、カテゴリー４抗体のうちの１つと交差遮断するまたは交差競合し、ここで、抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ヒトＬＬＣ複合体（ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および／またはｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）のうちの少なくとも１つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１から選択されるヒトＬＬＣ複合体のうちの２つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１から選択されるヒトＬＬＣ複合体のうちの３つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。好ましい実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ヒトＬＬＣ複合体のそれぞれ、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１に対して≦１ｎＭのＫＤを有する。本開示によれば、高親和性抗体は、平衡状態で１ｎＭ以下、たとえば、≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２００ｐＭ、および≦１００ｐＭである、特定の抗原（たとえば抗原複合体）に対するＫＤ値を有し得る。
【０１９２】
カテゴリー５抗体
本明細書中に開示されている抗体は、ＴＧＦβ１のヒトの潜在型の大型複合体を特異的に標的化することができる高親和性のアイソフォーム選択的抗体である。
【０１９３】
さらなる一態様では、本発明は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＰＳＡＤＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＬＤＹＧＤＭＬＭＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０１９４】
一部の実施形態では、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号１３に記載のＶＨ配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【０１９５】
一部の実施形態では、抗体の重鎖可変ドメインは上記ＶＨ配列と少なくとも９５％同一である。
【０１９６】
一部の実施形態では、抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号１５に記載のＶＬ配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【０１９７】
一部の実施形態では、抗体の軽鎖可変ドメインは上記ＶＬ配列と少なくとも９５％同一である。
【０１９８】
カテゴリー５の好ましい抗体の抗体基準を満たす、本明細書中に開示されている抗体の非限定的な例としては、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２３、Ａｂ２４、Ａｂ２５、Ａｂ２６、Ａｂ２７、Ａｂ２８、Ａｂ２９、Ａｂ３０、Ａｂ３１、Ａｂ３２、Ａｂ３３、およびＡｂ３４が挙げられる。
【０１９９】
一部の実施形態では、カテゴリー５抗体またはその抗原結合断片は、≦１ｎＭのＫＤで以下のヒトＬＬＣのそれぞれ、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合し、ここで、親和性は溶液平衡滴定に基づくアッセイなどの適切なアッセイを使用して平衡状態で測定した。
【０２００】
一部の実施形態では、抗体または断片は、潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む結合領域でヒトＬＬＣと結合する。潜在型ラッソとは、プロドメインのいわゆる「ストレートジャケット」の一部を形成するタンパク質ドメインである。そのネイティブ形態では、ヒト前駆ＴＧＦβ１ポリペプチドの潜在型ラッソはアミノ酸配列ＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬ（配列番号１５３）を有する。任意の適切な技法を用いて、抗体が潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む領域でヒトＴＧＦβ１  ＬＬＣと結合するかどうかを決定し得る。たとえば、対応するポリペプチドを利用する競合アッセイを実施し得る。一部の実施形態では、結合領域はＨＤ−ＸまたはＸ線結晶構造解析によって決定し得る。
【０２０１】
一部の実施形態では、そのような抗体または断片は、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと、溶液平衡滴定によって測定して≦５００ｐＭ（任意選択で≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２００ｐＭ、または≦１００ｐＭ）のＫＤで結合してよく、ここで、抗体または断片は、潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む結合領域でヒトＬＬＣと結合する。
【０２０２】
一部の実施形態では、そのような抗体は、前駆ＴＧＦβ１複合体内の成長因子ドメインの少なくとも一部分を含む追加の結合領域で、ヒトＬＬＣとさらに結合し得る。一部の実施形態では、抗体がプロドメイン複合体と会合していない遊離成長因子と特異的に結合しないように、追加の結合は潜在性複合体のコンテキストにおいてのみ起こる。ＬＬＣの成長因子ドメイン内の追加の結合領域は、「フィンガー−１」および／または「フィンガー−２」と呼ばれるタンパク質ドメインの少なくとも一部を含み得る。したがって、そのような抗体は、潜在型ラッソの少なくとも１つのアミノ酸残基および成長因子ドメインの少なくとも１つのアミノ酸残基を含むコンビナトリアルエピトープと結合し得る。
【０２０３】
また、抗体は、さらなる種の対応するＬＬＣとも高い特異性および高い親和性で結合し得る。好ましい実施形態では、抗体はネズミ対応物に対して種交差反応性を示す。
【０２０４】
本明細書中には交差遮断抗体またはその抗原結合断片も含まれる。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、カテゴリー５抗体のうちの１つと交差遮断するまたは交差競合し、ここで、抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ヒトＬＬＣ複合体（ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および／またはｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）のうちの少なくとも１つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１から選択されるヒトＬＬＣ複合体のうちの２つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１から選択されるヒトＬＬＣ複合体のうちの３つに対して≦１ｎＭのＫＤを有する。好ましい実施形態では、そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、ヒトＬＬＣ複合体のそれぞれ、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１に対して≦１ｎＭのＫＤを有する。本開示によれば、高親和性抗体は、平衡状態で１ｎＭ以下、たとえば、≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦４００ｐＭ、≦３００ｐＭ、≦２００ｐＭ、および≦１００ｐＭである、特定の抗原（たとえば抗原複合体）に対するＫＤ値を有し得る。
【０２０５】
本発明の例示的な抗体
本発明を実施するために有用な例示的な抗体およびそのような抗体をコードしている対応する核酸配列としては、表４および５に示すＣＤＲアミノ酸配列のうちの１つまたは複数が挙げられる。表５に列挙したＨ−ＣＤＲ（Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３）のそれぞれの組を表５に提供するＬ−ＣＤＲ（Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３）と組み合わせることができる。
【０２０６】
したがって、本発明は、６つのＣＤＲ（たとえば、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３）を含む単離した抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３は、表４に列挙した抗体のＨ−ＣＤＲの組から選択され、Ｌ−ＣＤＲ１はＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号１０５）を含み、Ｌ−ＣＤＲ２はＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１０６）を含み、Ｌ−ＣＤＲ３はＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴ（配列番号１２）を含む［式中、任意選択で、Ｈ−ＣＤＲ１はＦＴＦＳＳＦＳＭＤ（配列番号１０７）を含んでよく、Ｈ−ＣＤＲ−２はＹＩＳＰＳＡＤＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０３）を含んでよく、および／またはＨ−ＣＤＲ３はＡＲＧＶＬＤＹＧＤＭＬＭＰ（配列番号６）を含んでよい］。一部の実施形態では、抗体または断片は、アミノ酸配列ＦＴＦＳＳＦＳＭＤ（配列番号１０７）を有するＨ−ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＩＳＰＳＡＤＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０３）を有するＨ−ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＡＲＧＶＬＤＹＧＤＭＬＭＰ（配列番号６）を有するＨ−ＣＤＲ−３、アミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号１０５）を有するＬ−ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１０６）を有するＬ−ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴ（配列番号１２）を有するＬ−ＣＤＲ３を含む。
表４．Ｌｕらに記載の付番スキームを使用して決定した例示的な抗体の重鎖の相補性決定領域
2021531254.tif 000008
2021531254.tif 000009
表５．Ｋａｂａｔ付番スキームまたはＬｕらの付番システムを使用して決定した例示的な抗体の軽鎖の相補性決定領域
2021531254.tif 000010
【０２０７】
抗体内のＣＤＲ配列の決定は、用いられる特定の付番スキームに依存する。一般的に使用されるシステムとしては、それだけには限定されないが、Ｋａｂａｔ付番システム、ＩＭＴＧ付番システム、Ｃｈｏｔｈｉａ付番システム、およびＬｕら（Ｌｕ  Ｘら、ＭＡｂｓ．、２０１９年１月、１１（１）：４５〜５７頁）によって記載された付番スキームなどの他のものが挙げられる。例えると、４つの異なる付番システムによって定義したＡｂ６の６つのＣＤＲ配列を以下に例示する。当技術分野で理解されている任意のＣＤＲ付番システムを使用して本開示の抗体のＣＤＲ配列を定義し得る。
表６．４つの付番スキームに基づいた例示的な抗体（Ａｂ６）の６つのＣＤＲ
2021531254.tif 000011
【０２０８】
本開示の例示的な抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を表７に提供する。したがって、一部の実施形態（ｅｍｏｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）では、本開示の高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片であってよく、ここで、ＶＨおよびＶＬ配列は、以下の表７に列挙したＶＨおよびＶＬ配列の組のうちの任意の１つから選択される。
表７．例示的な抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン
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【０２０９】
したがって、本発明は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、重鎖可変ドメインは、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２３、Ａｂ２４、Ａｂ２５、Ａｂ２６、Ａｂ２７、Ａｂ２８、Ａｂ２９、Ａｂ３０、Ａｂ３１、Ａｂ３２、Ａｂ３３、およびＡｂ３４からなる群から選択される配列のうちの任意の１つと少なくとも９０％（たとえば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％）の配列同一性を有し、軽鎖可変ドメインは、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２３、Ａｂ２４、Ａｂ２５、Ａｂ２６、Ａｂ２７、Ａｂ２８、Ａｂ２９、Ａｂ３０、Ａｂ３１、Ａｂ３２、Ａｂ３３、およびＡｂ３４から選択される配列のうちの任意の１つと少なくとも９０％の同一性を有し、任意選択で、重鎖可変ドメインは任意選択で少なくとも９５％の配列同一性を有してよく、ならびに／または、軽鎖可変ドメインは、少なくとも９５％（たとえば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％）の配列同一性を有してよい。一部の実施形態では、抗体または断片の重鎖可変ドメインは配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性を有し、任意選択で、抗体または断片の軽鎖可変ドメイン配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、抗体または断片の重鎖可変ドメインは配列番号１３と少なくとも９５％の配列同一性を有し、任意選択で、抗体または断片の軽鎖可変ドメイン配列番号１５と少なくとも９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、抗体または断片の重鎖可変ドメインは配列番号１３と少なくとも９８％の配列同一性を有し、任意選択で、抗体または断片の軽鎖可変ドメイン配列番号１５と少なくとも９８％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、抗体または断片の重鎖可変ドメインは配列番号１３と１００％の配列同一性、任意選択で、抗体または断片の軽鎖可変ドメインは配列番号１５と１００％の配列同一性を有する。
【０２１０】
一部の実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１４に記載の核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列によってコードされている重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、配列番号１６に記載の核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列によってコードされている軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１４に記載の核酸配列によってコードされている重鎖可変ドメインアミノ酸配列と、配列番号１６に記載の核酸配列によってコードされている軽鎖可変ドメインアミノ酸配列とを含む。
【０２１１】
一部の例では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する本開示の抗体のうちの任意のものは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３と実質的に類似の１つまたは複数のＣＤＲ（たとえばＣＤＲＨまたはＣＤＲＬ）配列を有する任意の抗体（その抗原結合部分を含む）を含む。たとえば、抗体は、配列番号６、１２、１０３、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、および１２６のうちの任意の１つにおける対応するＣＤＲ領域と比較して、５、４、３、２、または１個までのアミノ酸残基の変化を含有する、表４に示す１つまたは複数のＣＤＲ配列を含み得る。一部の実施形態では、６つのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、表４に提供する配列と比較して３個までのアミノ酸変化を含有する。ＣＤＲ１つあたり３個までのアミノ酸変化を含むそのような抗体変異体は本発明によって包含される。一部の実施形態では、そのような変異抗体は、親和性成熟などの最適化の工程によって作製される。表７に列挙した抗体（たとえばＡｂ６）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の完全なアミノ酸配列、ならびに特定の抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードしている核酸配列を以下に提供する：
Ａｂ３−重鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＮＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＧＳＧＧＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＳＳＧＨＷＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９５）
Ａｂ６−重鎖可変領域アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＰＳＡＤＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＬＤＹＧＤＭＬＭＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）
Ａｂ６−軽鎖可変領域アミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１５）
Ａｂ６−重鎖アミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＰＳＡＤＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＬＤＹＧＤＭＬＭＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１７）
Ａｂ６−重鎖核酸配列
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＧＧＧＴＧＣＴＣＧＡＣＴＡＣＧＧＡＧＡＣＡＴＧＴＴＡＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＧＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣ（配列番号１８）
Ａｂ６−軽鎖アミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１９）
Ａｂ６−軽鎖核酸配列（ヒトカッパ）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＣＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＡＣＡＡＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴＴＧＧＡＣＴＴＴＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ（配列番号２０）
【０２１２】
一部の実施形態では、２つのアミノ酸配列「パーセント同一性」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５８７３〜７７頁、１９９３年のように改変した、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：２２６４〜６８頁、１９９０年のアルゴリズムを使用して決定する。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜１０頁、１９９０年のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行って、目的のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。ギャップが２つの配列間に存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５（１７）：３３８９〜３４０２頁、１９９７年に記載のようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。
【０２１３】
本明細書中に記載の抗体または抗原結合断片のうちの任意のものにおいて、１つまたは複数の保存的突然変異を、残基が抗体−抗原の相互作用に関与していない可能性が高い位置で、ＣＤＲまたはフレームワーク配列内に導入することができる。一部の実施形態では、そのような保存的突然変異を、結晶構造に基づいて決定してＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、およびＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体との相互作用に関与してない可能性が高い位置で、ＣＤＲまたはフレームワーク配列内に導入することができる。一部の実施形態では、可能な界面（たとえば抗原−抗体の相互作用に関与している残基）は、構造的類似性を共有する別の抗原に関する既知の構造情報から推定し得る。
【０２１４】
本明細書中で使用する「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的電荷または大きさの特徴を変更しないアミノ酸置をいう換。変異体は、そのような方法を編集した参考文献、たとえば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９年またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク中に見つかるものなどの、当業者に知られているポリペプチド配列を変更する方法に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換としては、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換が挙げられる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【０２１５】
一部の実施形態では、本明細書中に提供する抗体は、抗体に望ましい特性を与える突然変異を含む。たとえば、ネイティブＩｇＧ４  ｍＡｂで起こることが知られているＦａｂアーム交換が原因の潜在的な合併症を回避するために、本明細書中に提供する抗体は、セリン２２８（ＥＵ付番、Ｋａｂａｔ付番では残基２４１）をプロリンに変換してＩｇＧ１様（ＣＰＰＣＰ（配列番号５４））ヒンジ配列をもたらす安定化「アデア（Ａｄａｉｒ）」突然変異（Ａｎｇａｌら、「Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ（ＩｇＧ４）  ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、３０、１０５〜１０８頁、１９９３年）を含み得る。したがって、抗体のうちの任意のものが安定化「アデア」突然変異またはアミノ酸配列ＣＰＰＣＰ（配列番号５４）を含み得る。
【０２１６】
本開示のＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤は、抗体定常領域またはその部分を任意選択で含み得る。たとえば、ＶＬドメインがそのＣ末端で、ＣκまたはＣλなどの軽鎖定常ドメインに付着していてよい。同様に、ＶＨドメインまたはその一部分が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、ならびに任意のアイソタイプサブクラスなどの重鎖の全体または一部に付着していてよい。抗体は適切な定常領域を含み得る（たとえばＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第９１−３２４２号、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ（１９９１年）を参照）。したがって、本開示の範囲内にある抗体は、任意の適切な定常領域と組み合わせたＶＨおよびＶＬドメインまたはその抗原結合部分を含み得る。
【０２１７】
それに加えてまたはその代わりに、そのような抗体は、配列番号１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、および１５の抗体のフレームワーク領域を含んでいてもいなくてもよい。一部の実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、およびＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体はネズミ抗体であり、ネズミフレームワーク領域配列を含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、そのような抗体は、比較的高い親和性、たとえば、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、またはそれより低いＫＤでＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、およびＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と結合する。たとえば、そのような抗体は、５ｐＭ〜１ｎＭ、たとえば１０ｐＭ〜１ｎＭ、たとえば１０ｐＭ〜１００ｐＭの親和性でＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と結合し得る。本開示は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体との結合について本明細書中に記載の抗体のうちの任意のものと競合し、１ｎＭ以下（たとえば、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下）のＫＤ値を有する抗体または抗原結合断片も含む。ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体の親和性および結合動力学は、それだけには限定されないが、バイオセンサーに基づく技術（たとえばＯＣＴＥＴ（登録商標）またはＢＩＡＣＯＲＥ）および溶液平衡滴定に基づく技術（たとえばＭＳＤ−ＳＥＴ）を含めた任意の適切な方法を使用して試験することができる。
【０２１９】
一部の実施形態では、本発明による細胞関連ＴＧＦβ１（たとえばＧＡＲＰ提示ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３提示ＴＧＦβ１）の阻害剤は、そのような複合体（たとえばＧＡＲＰ−前駆／潜在型ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆／潜在型ＴＧＦβ１）と特異的に結合して複合体の内部移行を始動させる、抗体またはその断片を含む。この作用機構は、不活性ＴＧＦβ１複合体（たとえばＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）の細胞表面（たとえば、Ｔｒｅｇ、マクロファージなど）からの除去または枯渇を引き起こし、それ故、活性化に利用可能なＴＧＦβ１が低下する。一部の実施形態では、そのような抗体またはその断片は、結合は中性または生理的ｐＨで起こるが酸性ｐＨで抗体がその抗原から解離する、または、中性ｐＨよりも酸性ｐＨで解離速度がより高いような、ｐＨ依存性の様式で標的複合体と結合する。そのような抗体またはその断片はリサイクリング抗体として機能し得る。
【０２２０】
ＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム特異的阻害性抗体と競合する抗体
本開示の態様は、本明細書中に提供する抗体のうちの任意のものと競合または交差競合する抗体に関する。抗体に関して本明細書中で使用する用語「競合する」とは、第１の抗体が、第１の抗体とそのエピトープとの結合の結果が第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して第２の抗体の存在下で検出可能に減少しているような、第２の抗体の結合と十分に類似または重複する様式で、エピトープ（たとえば、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のエピトープ）と結合することを意味する。第２の抗体とそのエピトープとの結合も第１の抗体の存在下で検出可能に減少しているという代替は、そうであることはできるが、そうである必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体とその対応するエピトープとの結合を阻害しなくても、その第２の抗体とそのエピトープとの結合を阻害することができる。しかし、それぞれの抗体が、同じ、より高い、またはより低い程度にかかわらず他方の抗体とそのエピトープまたはリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合、抗体はその対応するエピトープの結語について互いに「交差競合する」と言われる。競合および交差競合抗体はどちらも本開示の範囲内にある。そのような競合または交差競合が起こる機構（たとえば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその一部分との結合）にかかわらず、当業者には、そのような競合および／または交差競合抗体が包含され、本明細書中に提供する方法および／または組成物に有用となることができることが理解されよう。用語「交差遮断すること」を互換性があるように使用し得る。
【０２２１】
同じ抗原と結合する２つの異なるモノクローナル抗体（または抗原結合断片）は、それぞれの結合が他方の結合を干渉しないように結合部位が三次元空間下で十分に離れている場合に、抗原と同時に結合することが可能であり得る。対照的に、２つの異なるモノクローナル抗体は、同じまたは重複する抗原の結合領域を有する場合があり、その場合、第１の抗体の結合は第２の抗体が抗原と結合できることを防止し得る、または逆も同様である。後者の場合、２つの抗体は同じ抗原に関して互いに「交差遮断する」と言われる。
【０２２２】
抗体「ビニング」実験は、同じ抗原に対して作製された複数の抗体を、相対的交差遮断活性に基づいて様々な「ビン」へと分類するために有用である。したがって、それぞれの「ビン」は抗原の別個の結合領域を表す。同じビンの抗体は、定義上は互いに交差遮断する。ビニングは、ＢｉａｃｏｒまたはＯｃｔｅｔ（登録商標）などの標準のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって、標準の試験条件を使用して、たとえば製造者の指示に従って検査することができる（たとえば、室温、約２０〜２５℃で結合のアッセイを行う）。
【０２２３】
本開示の態様は、本明細書中に提供する特定の抗体のうちの任意のものまたはその抗原結合部分と競合または交差競合する抗体に関する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、本明細書中に提供する抗体のうちの任意のものと同じエピトープで、またはその付近で結合する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、エピトープの１５個以下のアミノ酸残基以内に結合する場合に、エピトープの付近で結合する。一部の実施形態では、本明細書中に提供する抗体のうちの任意のものまたはその抗原結合部分は、本明細書中に提供する抗体のうちの任意のものによって結合されるエピトープの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸残基以内に結合する。
【０２２４】
別の実施形態では、本明細書中に提供する抗原のうちの任意のもの（たとえば、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体）との結合について、１０−８Ｍ以下の抗体とタンパク質との間の平衡解離定数、ＫＤで競合または交差競合する抗体またはその抗原結合部分を、本明細書中に提供する。他の実施形態では、抗体は、本明細書中に提供する抗原のうちの任意のものとの結合について、１０−１２Ｍ〜１０−９Ｍの範囲のＫＤで競合または交差競合する。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分との結合について競合する抗ＴＧＦβ１抗体またはその抗原結合部分を、本明細書中に提供する。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分と同じエピトープと結合する抗ＴＧＦβ１抗体またはその抗原結合部分を本明細書中に提供する。
【０２２５】
本明細書中に提供する抗体のうちの任意のものは、任意の適切な方法を使用して特徴づけることができる。たとえば、１つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴づけするための多くの適切な方法が存在し、たとえばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９９９年の第１１章に記載されている、抗体−抗原複合体の結晶構造の解析、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイが挙げられる。追加の例では、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、直線状エピトープ、すなわち単一のアミノ酸ストレッチに含有されるものであるか、または、必ずしも単一のストレッチ（一次構造の直鎖配列）に含有されていなくてもよいアミノ酸の三次元相互作用によって形成されるコンフォメーションエピトープであることができる。一部の実施形態では、エピトープは、ＴＧＦβ１がＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体中にある場合に、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分による結合においてのみ利用可能なＴＧＦβ１エピトープである。様々な長さ（たとえば少なくとも４〜６個のアミノ酸の長さ）のペプチドを単離または合成し（たとえば組換えによって）、抗体との結合アッセイに使用することができる。別の例では、抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗体による結合を決定することによる、系統的なスクリーニングにおいて決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、標的抗原をコードしているオープンリーディングフレームをランダムにまたは特定の遺伝的構造によって断片化し、発現された抗原の断片と試験する抗体との反応性を決定する。遺伝子断片は、たとえばＰＣＲによって生成し、その後、放射性アミノ酸の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質へと転写および翻訳し得る。その後、抗体と放射標識した抗原断片との結合を免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定する。特定のエピトープは、ファージ粒子の表面上に表示されるランダムペプチド配列の大きなライブラリ（ファージライブラリ）を使用することによっても同定することができる。あるいは、重複ペプチド断片の定義されたライブラリを、単純な結合アッセイにおいて試験抗体との結合について試験することができる。追加の例では、抗原結合ドメインの突然変異誘発、ドメイン交換実験、およびアラニンスキャニング突然変異誘発を行って、エピトープ結合に必要、十分、および／または必然の残基を同定することができる。たとえば、ドメイン交換実験は、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、および／または前駆ＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体の様々な断片が、密に��連するが抗原性的に明白に異なるタンパク質、たとえばＴＧＦβタンパク質ファミリーの別のメンバー（たとえばＧＤＦ１１）からの配列で置き換えられている（交換されている）、標的抗原の突然変異体を使用して行うことができる。
【０２２６】
あるいは、競合アッセイを、同じ抗原と結合することが知られている他の抗体を使用して行って、ある抗体が他の抗体と同じエピトープと結合するかどうかを決定することができる。競合アッセイは当業者に周知である。
【０２２７】
一部の実施形態では、本発明は、カテゴリー１、カテゴリー２、カテゴリー３、カテゴリー４、および／またはカテゴリー５抗体のうちの任意の１つと交差遮断（交差競合）する抗体（たとえば、免疫グロブリン、抗原結合断片など）を含む。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は、カテゴリー１抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片を選択し、抗体を医薬組成物へと配合するステップを含む工程によって作製し得る。
【０２２８】
一部の実施形態では、医薬組成物は、カテゴリー２抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片を選択し、抗体を医薬組成物へと配合するステップを含む工程によって作製し得る。
【０２２９】
一部の実施形態では、医薬組成物は、カテゴリー３抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片を選択し、抗体を医薬組成物へと配合するステップを含む工程によって作製し得る。
【０２３０】
一部の実施形態では、医薬組成物は、カテゴリー４抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片を選択し、抗体を医薬組成物へと配合するステップを含む工程によって作製し得る。
【０２３１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、カテゴリー５抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片を選択し、抗体を医薬組成物へと配合するステップを含む工程によって作製し得る。
【０２３２】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ２１、Ａｂ２２、Ａｂ２３、Ａｂ２４、Ａｂ２５、Ａｂ２６、Ａｂ２７、Ａｂ２８、Ａｂ２９、Ａｂ３０、Ａｂ３１、Ａｂ３２、Ａｂ３３、およびＡｂ３４からなる群から選択される抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片を選択し、抗体を医薬組成物へと配合するステップを含む工程によって作製し得る。
【０２３３】
好ましくは、工程によって選択された抗体は、抗体または抗原結合断片が、溶液平衡滴定によって測定して、≦５ｎＭのＫＤでヒトＬＬＣ（たとえば、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）のそれぞれと結合することができることを特徴とする、高親和性結合剤である。一部の実施形態では、抗体は、カテゴリー１、カテゴリー２、カテゴリー３、カテゴリー４、およびカテゴリー５のうちの１つまたは複数の基準を満たす。そのような交差競合抗体は、本開示に従って、対象におけるＴＧＦβ１関連の適応症の処置に使用し得る。
【０２３４】
抗体の様々な修飾および変形
本開示によって包含される抗体またはその抗原結合断片のうちの任意のものの非限定的な変形、修飾、および特長を以下に手短に記述する。関連する分析方法の実施形態も提供する。
【０２３５】
天然に存在する抗体構造単位は、典型的には四量体を含む。それぞれのそのような四量体は、典型的には２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、それぞれの対は１本の完全長「軽」鎖（特定の実施形態では約２５ｋＤａ）および１本の完全長「重」鎖（特定の実施形態では約５０〜７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、典型的には、典型的には抗原認識を司っている約１００〜１１０個またはそれより多くのアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能を司っている場合がある定常領域を定義する。ヒト抗体軽鎖は、典型的にはカッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、典型的にはミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプを定義する。抗体は任意の種類（たとえば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、およびＩｇＥ）ならびにクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のものであることができる。完全長の軽鎖および重鎖内において、典型的には、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はさらに約１０個（ａｂｏｕｔ  １０  ｍｏｒｅ）のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む（たとえばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９年）を参照）（その全体で参考として組み込まれている））。それぞれの軽鎖／重鎖対の可変領域が、典型的には抗原結合部位を形成する。
【０２３６】
可変領域は、典型的には、３つの超可変領域、ＣＤＲとも呼ばれる相補性決定領域によって連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ全体構造を示す。それぞれの対の２つの鎖からのＣＤＲは、典型的にはフレームワーク領域によってアラインメントされ、特異的なエピトープとの結合を可能にすることができる。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖および重鎖の可変領域はどちらも、典型的にはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４ドメインを含む。それぞれのドメインへのアミノ酸の割当ては、典型的にはＫａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ（１９８７年および１９９１年））、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７頁、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７８〜８８３頁の定義に従っている。軽鎖のＣＤＲはＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３と呼ぶこともでき、重鎖のＣＤＲはＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３と呼ぶこともできる。一部の実施形態では、抗体は、重鎖のカルボキシ末端から少数のアミノ酸の欠失を含むことができる。一部の実施形態では、抗体は、重鎖のカルボキシ末端において１〜５個のアミノ酸欠失を有する重鎖を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲの決定的な描写および抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造の解析および／または抗体−リガンド複合体の構造の解析によって達成される。特定の実施形態では、Ｘ線結晶構造解析などの当業者に知られている様々な技法のうちの任意のものによって達成することができる。一部の実施形態では、様々な分析方法を用いてＣＤＲ領域を同定または概算することができる。そのような方法の例としては、それだけには限定されないが、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、Ｌｕらに記載されている定義（上記参照）、および接触定義が含まれる。
【０２３７】
「親和性成熟した」抗体とは、その１つまたは複数のＣＤＲ中に１つまたは複数の変更を有する抗体であって、それらの変更を保有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体である。例示的な親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモーラーまたはさらにはピコモーラーの親和性（たとえば約１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍの範囲のＫＤ）を有する。親和性成熟した抗体は当技術分野で知られている手順によって生成される。Ｍａｒｋｓら、（１９９２年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３頁は、ＶＨおよびＶＬのドメインシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Ｂａｒｂａｓら、（１９９４年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３頁、Ｓｃｈｉｅｒら、（１９９５年）、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５頁、Ｙｅｌｔｏｎら、（１９９５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４年〜２００４年、Ｊａｃｋｓｏｎら、（１９９５年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９頁、およびＨａｗｋｉｎｓら、（１９９２年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６頁によって記載されており、活性増強アミノ酸残基を用いた選択的突然変異誘発の位置、接触または高頻度突然変異の位置での選択的突然変異は、米国特許第６，９１４，１２８号に記載されている。典型的には、親抗体およびその親和性成熟した子孫（たとえば誘導体）は抗原内の同じ結合領域を保つが、親和性成熟によって導入されたアミノ酸残基の変更が原因で分子レベルでの特定の相互作用が変更されている場合がある。
【０２３８】
用語「ＣＤＲ移植抗体」とは、１つの種からの重鎖および軽鎖の可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域のうちの１つまたは複数の配列が別の種のＣＤＲ配列で置き換えられている抗体をいい、たとえば、ネズミの重鎖および軽鎖の可変領域を有し、ネズミＣＤＲのうちの１つまたは複数（たとえばＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置き換えられている抗体である。
【０２３９】
用語「キメラ抗体」とは、１つの種からの重鎖および軽鎖の可変領域配列ならびに別の種からの定常領域配列を含む抗体をいい、たとえば、ヒト定常領域と連結されたネズミの重鎖および軽鎖の可変領域を有する抗体である。
【０２４０】
本明細書中で使用する用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」とは、ＣＤＲを除いた可変領域の残りの配列をいう。ＣＤＲ配列の正確な定義は様々なシステムによって決定されるため、フレームワーク配列の意味は対応して様々な解釈に左右される。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、および−Ｌ３ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、および−Ｈ３）も、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域をそれぞれの鎖上の４つの部分領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）へと分割し、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２の間、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３の間、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４の間に配置される。具体的な下位領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、またはＦＲ４として指定しない場合、他者が言及するフレームワーク領域とは、単一の天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内の合わせたＦＲを表す。本明細書中で使用するＦＲとは、４つの下位領域のうちの１つを表し、ＦＲｓとはフレームワーク領域を構成する４つの下位領域のうちの２つ以上を表す。
【０２４１】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、任意選択で１、２、または３個のアミノ酸変化を有する以下のアミノ酸配列を有する重鎖フレームワーク領域１（Ｈ−ＦＲ１）を含む：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ（配列番号１７４）。たとえば、１６位のＧｌｙ残基はＡｒｇ（Ｒ）で置き換えてもよく、および／または、２３位のＡｌａ残基はＴｈｒ（Ｔ）で置き換えてもよい。
【０２４２】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、任意選択で１、２、または３個のアミノ酸変化を有する以下のアミノ酸配列を有する重鎖フレームワーク領域２（Ｈ−ＦＲ２）を含む：ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号１７５）。
【０２４３】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、任意選択で１、２、または３個のアミノ酸変化を有する以下のアミノ酸配列を有する重鎖フレームワーク領域３（Ｈ−ＦＲ３）を含む：ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ（配列番号１７６）。たとえば、１２位Ｓｅｒ残基はＴｈｒ（Ｔ）で置き換えてもよい。
【０２４４】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、任意選択で１、２、または３個のアミノ酸変化を有する以下のアミノ酸配列を有する重鎖フレームワーク領域４（Ｈ−ＦＲ４）を含む：ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１７７）。
【０２４５】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、任意選択で１、２、または３個のアミノ酸変化を有する以下のアミノ酸配列を有する軽鎖フレームワーク領域１（Ｌ−ＦＲ１）を含む：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号１７８）。
【０２４６】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、任意選択で１、２、または３個のアミノ酸変化を有する以下のアミノ酸配列を有する軽鎖フレームワーク領域２（Ｌ−ＦＲ２）を含む：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１７９）。
【０２４７】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、任意選択で１、２、または３個のアミノ酸変化を有する以下のアミノ酸配列を有する軽鎖フレームワーク領域３（Ｌ−ＦＲ３）を含む：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（配列番号１８０）。
【０２４８】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、任意選択で１、２、または３個のアミノ酸変化を有する以下のアミノ酸配列を有する軽鎖フレームワーク領域４（Ｌ−ＦＲ４）を含む：ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１８１）。
【０２４９】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２Ａ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２Ｂ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＡ定常ドメイン、ヒトＩｇＡ１定常ドメイン、ヒトＩｇＡ２定常ドメイン、ヒトＩｇＤ定常ドメイン、またはヒトＩｇＥ定常ドメインの重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１定常ドメインまたはヒトＩｇＧ４定常ドメインの重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ４定常ドメインの重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１様ヒンジを生じ、鎖間ジスルフィド結合の形成を許可するＳｅｒからＰｒｏへの主鎖置換を有する、ヒトＩｇＧ４定常ドメインの重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。
【０２５０】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇラムダ定常ドメインまたはヒトＩｇカッパ定常ドメインを含む軽鎖免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む。
【０２５１】
一部の実施形態では、抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖である４本のポリペプチド鎖を有するＩｇＧである。
【０２５２】
一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ジアボディ、またはキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒト生殖系列アミノ酸配列を有するフレームワークを含む。
【０２５３】
一部の実施形態では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦａｂ断片、またはｓｃＦｖ断片である。
【０２５４】
本明細書中で使用する用語「生殖系列抗体遺伝子」または「遺伝子断片」とは、特定の免疫グロブリンの発現についての遺伝子の再編成および突然変異をもたらす成熟プロセスを受けていない非リンパ球細胞によってコードされている免疫グロブリン配列をいう（たとえば、Ｓｈａｐｉｒｏら、（２００２年）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２（３）：１８３〜２００頁、Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら、（２００１年）、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、４８４：１３〜３０頁を参照）。本開示の様々な実施形態によって提供される利点のうちの１つは、生殖系列抗体遺伝子が、種において個体に特徴的な必須アミノ酸配列構造を保存している可能性が成熟抗体遺伝子よりも高く、それ故、その種において治療的に使用した場合に外来源として認識される可能性がより低いという認識に端を発する。
【０２５５】
本明細書中で使用する用語「中和性」とは、結合タンパク質が抗原と特異的に結合する際の、対抗する抗原（たとえば標的タンパク質）の生物活性をいう。一実施形態では、中和性結合タンパク質は、抗原／標的、たとえば、サイトカイン、キナーゼ、成長因子、細胞表面タンパク質、可溶性タンパク質、ホスファターゼ、または受容体リガンドと結合し、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多く低下させる。一部の実施形態では、成長因子に対する中和抗体は、潜在型複合体から放出された、成熟した可溶性成長因子と特異的に結合し、それによってその受容体と結合して下流シグナル伝達を誘発するその能力を妨げる。一部の実施形態では、成熟成長因子はＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３である。
【０２５６】
本明細書中で使用する用語「結合タンパク質」とは、抗原（たとえばＴＧＦβ１）と特異的に結合する任意のポリペプチドを含み、それだけには限定されないが、抗体またはその抗原結合部分、ＤＶＤ−ＩｇＴＭ、ＴＶＤ−Ｉｇ、ＲＡｂ−Ｉｇ、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、および二重特異的（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が挙げられる。
【０２５７】
用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、それを含む組成物のコンテキストにおいて使用した場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体調製物を言い得る、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原に対して向けられている。さらに、典型的には様々な決定因子（エピトープ）に対して向けられている様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのｍＡｂは抗原上の単一の決定因子に対して向けられている。修飾語句「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の生成を要すると解釈されるべきでない。
【０２５８】
本明細書中で使用する用語「組換えヒト抗体」とは、組換え手段によって調製、発現、作製、もしくは単離されたすべてのヒト抗体、たとえば宿主細胞内に形質移入した組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体（以下のセクションＩＩ  Ｃにさらに記載）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離した抗体（本明細書中に参考として組み込まれているＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．（１９９７年）、ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．、１５：６２〜７０頁、Ａｚｚａｚｙ，Ｈ．およびＨｉｇｈｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｅ．（２００２年）、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３５：４２５〜４４５頁、Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，Ｊ．Ｖ．およびＬａｒｒｉｃｋ，  Ｊ．Ｗ．（２００２年）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２９：１２８〜１４５頁、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．およびＣｈａｍｅｓ，Ｐ．（２０００年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２１：３７１〜３７８頁）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物（たとえばマウス）から単離した抗体（Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら、（１９９２年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：６２８７〜６２９５頁、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｓ−Ａ．およびＧｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．（２００２年）、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３：５９３〜５９７頁、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．ら、（２０００年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２１：３６４〜３７０頁を参照）、または、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関与する任意の他の手段によって調製、発現、作製、もしくは単離した抗体を含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。特定の実施形態では、しかし、そのような組換えヒト抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用した場合はｉｎ  ｖｉｖｏの体性突然変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来しそれに関連しているが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しない場合がある配列である。
【０２５９】
本明細書中で使用する「二重可変ドメイン免疫グロブリン」または「ＤＶＤ−ＩｇＴＭ」などとは、対合した重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含み、それぞれの対合した重鎖および軽鎖が２つの抗原結合部位を提供する、結合タンパク質を含む。それぞれの結合部位は、１つの抗原結合部位あたり合計６つのＣＤＲを含む。ＤＶＤ−ＩｇＴＭは、典型的には、少なくとも部分的にＣＨ３ドメインの二量体化によって互いに結合した２つのアームを有しており、ＤＶＤのそれぞれのアームが二重特異性であり、免疫グロブリンに４つの結合部位を提供する。ＤＶＤ−ＩｇＴＭは、配列表を含めてそのそれぞれが本明細書中に参考として組み込まれている米国特許公開第２０１０／０２６０６６８号および第２００９／０３０４６９３号に提供されている。
【０２６０】
本明細書中で使用する「三重可変ドメイン免疫グロブリン」または「ＴＶＤ−Ｉｇ」などとは、対合した重鎖ＴＶＤ結合タンパク質ポリペプチドおよび軽鎖ＴＶＤ結合タンパク質ポリペプチドを含み、それぞれの対合した重鎖および軽鎖が３つの抗原結合部位を提供する、結合タンパク質を含む。それぞれの結合部位は、１つの抗原結合部位あたり合計６つのＣＤＲを含む。ＴＶＤ結合タンパク質は、少なくとも部分的にＣＨ３ドメインの二量体化によって互いに結合した２つのアームを有していてよく、ＴＶＤ結合タンパク質のそれぞれのアームが三重特異性であり、結合タンパク質に６つの結合部位を提供する。
【０２６１】
本明細書中で使用する「受容体抗体免疫グロブリン」または「ＲＡｂ−Ｉｇ」などとは、一緒になって合計３つの抗原結合部位を形成する重鎖ＲＡｂポリペプチドおよび軽鎖ＲＡｂポリペプチドを含む、結合タンパク質である。１つの抗原結合部位は、重鎖ＲＡｂポリペプチドおよび軽鎖ＲＡｂポリペプチドのそれぞれ中に存在する重鎖および軽鎖の抗体可変ドメインが対合して単一の結合部位を形成することによって形成され、合計６つのＣＤＲが第１の抗原結合部位を提供する。重鎖ＲＡｂポリペプチドおよび軽鎖ＲＡｂポリペプチドのそれぞれは、独立してリガンドと結合して第２および第３の「抗原」結合部位を提供する受容体配列を含む。ＲＡｂ−Ｉｇは、典型的には、少なくとも部分的にＣＨ３ドメインの二量体化によって互いに結合した２つのアームを有しており、ＲＡｂ−Ｉｇのそれぞれのアームが三重特異性であり、免疫グロブリンに６つの結合部位を提供する。ＲＡｂ−Ｉｇは、配列表を含むその内容の全体が本明細書中に参考として組み込まれている）米国特許出願公開第２００２／０１２７２３１号に記載されている。
【０２６２】
本明細書中で使用する用語「二重特異性抗体」とは、「二重特異性半Ｉｇ結合タンパク質」または「二重特異性（半Ｉｇ）結合タンパク質」とは区別され、クアドローマ技術（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．（１９８３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３０５（５９３４）：５３７〜５４０頁を参照）によって、２つの異なるモノクローナル抗体の化学的コンジュゲーション（Ｓｔａｅｒｚ，Ｕ．Ｄ．ら、（１９８５年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１４（６０１２）：６２８〜６３１頁を参照）によって、または、Ｆｃ領域中にＣＨ３−ＣＨ３の二量体化を阻害しない突然変異を導入し（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０（１４）：６４４４〜６４４８頁を参照）、複数の異なる免疫グロブリン種をもたらし、そのうちの１つのみが機能的な二重特異性抗体である、ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）もしくは類似の手法によって作製された完全長抗体をいう。分子機能によると、二重特異性抗体は、その２つの結合アーム（一対のＨＣ／ＬＣ）のうちの１つ上の１つの抗原（またはエピトープ）と結合し、その第２のアーム（ＨＣ／ＬＣの異なる対）上の異なる抗原（またはエピトープ）と結合する。この定義によると、二重特異性抗体は２つの明白に異なる抗原結合アーム（特異性およびＣＤＲ配列の両方において）を有し、それが結合するそれぞれの抗原について一価である。
【０２６３】
本明細書中で使用する用語「二重特異的抗体」とは、二重特異性半Ｉｇ結合タンパク質または二重特異性結合タンパク質とは区別され、その２つの結合アーム（一対のＨＣ／ＬＣ）のそれぞれにおいて２つの異なる抗原（またはエピトープ）と結合することができる、完全長抗体をいう（ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０２７７３号を参照）。したがって、二重特異的結合タンパク質は、同一の特異性および同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有し、それが結合するそれぞれの抗原について二価である。
【０２６４】
本明細書中で使用する用語「Ｋオン」とは、結合タンパク質（たとえば抗体）が抗原と会合してたとえば当技術分野で知られている抗体／抗原複合体を形成することにおけるオン速度定数を指すことを意図する。「Ｋオン」は、本明細書中で互換性があるように使用される用語「会合速度定数」または「ｋａ」によっても知られる。抗体のその標的抗原との結合速度または抗体と抗原との間の複合体形成の速度を示すこの値は、方程式：抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）→Ａｂ−Ａｇによっても示される。
【０２６５】
本明細書中で使用する用語「Ｋオフ」とは、結合タンパク質（たとえば抗体）がたとえば当技術分野で知られている抗体／抗原複合体から解離することにおけるオフ速度定数を指すことを意図する。「Ｋオフ」は、本明細書中で互換性があるように使用される用語「解離速度定数」または「ｋｄ」によっても知られる。この値は、方程式：Ａｂ＋Ａｇ←Ａｂ−Ａｇによって示される、抗体のその標的抗原からの解離速度、または、ｂ−Ａｇ複合体の、遊離抗体および抗原への経時的な分離を示す。
【０２６６】
本明細書中で互換性があるように使用される用語「平衡解離定数」または「ＫＤ」とは、平衡状態での滴定測定において得られた、または解離速度定数（ｋオフ）を会合速度定数（ｋオン）で割ることによって得られた値をいう。会合速度定数、解離速度定数、および平衡解離定数は、結合タンパク質、たとえば抗体と抗原との結合親和性を表すために使用する。会合および解離の速度定数を決定する方法は当技術分野で周知である。蛍光に基づく技法の使用は、高い感度および試料を生理的緩衝液中、平衡状態で検査する能力を提供する。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験手法および機器を使用することができる（たとえば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの会社であるＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、スウェーデン、ウプサラから入手可能な機器）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（アイダホ州Ｂｏｉｓｅ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（動力学的排除アッセイ）アッセイも使用することができる。
【０２６７】
本明細書中で使用する用語「結晶」および「結晶化した」とは、結晶の形態で存在する結合タンパク質（たとえば抗体）またはその抗原結合部分をいう。結晶は物質の固形状態の一形態であり、非晶質固形状態または液晶状態などの他の形態とは明白に異なる。結晶は、原子、イオン、分子（たとえば抗体などのタンパク質）、または分子アセンブリ（たとえば抗原／抗体複合体）の規則的な反復する三次元アレイからなる。これらの三次元アレイは、当技術分野において十分に理解されている特定の数学的関係に従って配置されている。結晶において反復される基本的な単位、または構成単位は不斉ユニットと呼ばれる。所定の明確に定義された結晶学的対称性に従う配置での不斉ユニットの反復が、結晶の「単位格子」を提供する。３つすべての次元における、規則的翻訳による格子単位の翻訳により結晶を提供する。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．およびＤｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、２０１〜１６頁、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９９年）を参照されたい。用語「リンカー」とは、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸残基を含み、１つまたは複数の抗原結合部分を連結させるために使用するポリペプチドを表示するために使用する。そのようなリンカーポリペプチドは当技術分野で周知である（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８頁、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、（１９９４年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１〜１１２３頁を参照）。例示的なリンカーとしては、それだけには限定されないが、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号５５）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号５６）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号５７）、ＴＶＡＡＰ（配列番号５８）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号５９）、ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号６０）、ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号６１）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号６２）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号６３）、ＲＡＤＡＡＰ（配列番号６４）、ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号６５）、ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号６６）、ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号６７）、ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号６８）、ＡＤＡＡＰ（配列番号６９）、ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号７０）、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号７１）、ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号７２）、ＡＫＴＴＰＰ（配列番号７３）、ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号７４）、ＡＫＴＴＡＰ（配列番号７５）、ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７７）、ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号７８）、ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号７９）、ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号８０）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号８１）、およびＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ���配列番号８２）が挙げられる。
【０２６８】
「標識」および「検出可能な標識」または「検出可能な部分」とは、たとえば、抗体および分析物などの特異的結合対のメンバー間の反応を検出可能にするために、抗体または分析物などの特異的結合パートナーに付着した部分を意味し、そのように標識された特異的結合パートナー、たとえば抗体または分析物は、「検出可能に標識した」という。したがって、本明細書中で使用する用語「標識した結合タンパク質」とは、結合タンパク質の同定を提供する、取り込まれた標識を有するタンパク質をいう。一実施形態では、標識は、視覚的または機器的手段、たとえば、放射標識したアミノ酸の取り込み、または、標識したアビジンにより検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付着（たとえば光学的もしくは比色方法によって検出することができる蛍光マーカーもしくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出可能なシグナルを生じることができる、検出可能なマーカーである。ポリペプチドの標識の例としては、それだけには限定されないが、以下が挙げられる：放射性同位元素または放射性核種（たとえば、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、６８Ｇａ、１８Ｆ、８９Ｚｒ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、および１５３Ｓｍ）、色素原、蛍光標識（たとえば、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびランタニドリン光体）、酵素標識（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーター（たとえば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、およびエピトープタグ）によって認識される事前に決定されたポリペプチドエピトープ、ならびにガドリニウムキレートなどの磁気剤。免疫アッセイに一般的に用いられる標識の代表的な例としては、光を生じる部分、たとえばアクリジニウム化合物、および蛍光を生じる部分、たとえばフルオレセインが挙げられる。他の標識が本明細書中に記載されている。この観点から、部分自体は検出可能に標識されていなくてもよいが、さらに別の部分と反応した際に検出可能になり得る。「検出可能に標識した」の使用は、後者の種類の検出可能な標識を包含することを意図する。
【０２６９】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分と、提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体などの抗原（たとえばタンパク質複合体）との結合親和性は、Ｏｃｔｅｔアッセイを使用して決定する。一部の実施形態では、Ｏｃｔｅｔアッセイとは、抗体と抗原との間の結合の指標である１つまたは複数の動力学的パラメータを決定するアッセイである。一部の実施形態では、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カリフォルニア州Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）を使用して、抗体またはその抗原結合部分と提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体との結合親和性を決定する。たとえば、抗体の結合親和性は、バイオレイヤー干渉法を利用したｆｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅ  ｄｉｐ  ａｎｄ  ｒｅａｄ無標識アッセイシステムを使用して決定し得る。一部の実施形態では、抗原をバイオセンサーに固定し（たとえばストレプトアビジンでコーティングしたバイオセンサー）、抗体および複合体（たとえばビオチン標識した提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体）を高濃度（５０μｇ／ｍＬ）の溶液中で提示して、結合相互作用を測定する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分と提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体との結合親和性は、本明細書中に概要を示したプロトコルを使用して決定する。
【０２７０】
前駆ＴＧＦβ１の新規の高親和性のコンテキスト非依存性抗体の特徴づけ
結合プロフィール
本明細書中に開示されている抗体は増強された結合活性を有する。ＴＧＦβ１の活性化を選択的に阻害することができる、高親和性のコンテキスト非依存性抗体のクラスが挙げられる。本明細書中で使用する用語「コンテキスト非依存性」とは、以前のより一般的な用法と比較してより高い厳密性の度合を有することに注意されたい。本開示によれば、この用語、抗体が様々な抗原複合体に対して発揮することができる相対的親和性において、一定レベルの均一性（すなわち不偏性）を与える。したがって、本発明のコンテキスト非依存性抗体は、複数種のＴＧＦβ１前駆体複合体（たとえば提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体）を標的化し、また、たとえばＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、それぞれのそのような複合体と等価な親和性（すなわち複合体にわたって相対的親和性が３倍を超えない差異）で、１０ｎＭ未満、好ましくは５ｎＭ未満、より好ましくは１ｎＭ未満、さらにより好ましくは１００ｐＭ未満のＫＤ値で結合することができる。以下に提示するように、本発明によって包含される多くの抗体はナノモーラー以下の範囲のＫＤ値を有する。
【０２７１】
したがって、抗体は、ヒト提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体（「大型潜在性複合体」と呼ぶ場合もあり、単一の提示分子とカップリングされた前駆ＴＧＦβ１二量体からなる三元複合体である）のそれぞれ、すなわち、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１と特異的に結合することができる。典型的には、組換えによって生成し、精製したタンパク質複合体を抗原（たとえば抗原複合体）として使用して、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおいて抗原複合体と結合する抗体の能力を評価または確認する。そのようなアッセイは当技術分野で周知であり、それだけには限定されないが、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくアッセイ（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）など）および溶液平衡滴定に基づくアッセイ（ＭＳＤ−ＳＥＴなど）が挙げられる。
【０２７２】
ＢＬＩに基づく結合アッセイは、抗原に対する抗体の親和性および動力学を測定するために、当技術分野において幅広く使用されている。これは、光学的干渉に基づいて生体分子の相互作用を分析する無標識技術である。タンパク質のうちの一方、たとえば試験する抗体、バイオセンサーの先端上に固定することができる。溶液中の他方のタンパク質、たとえば抗原が固定した抗体に結合された場合、干渉パターンのシフトが引き起こされ、これをリアルタイムで測定することができる。これにより、結合特異性、会合および解離の速度、ならびに濃度依存性のモニタリングが可能となる。したがって、ＢＬＩは、システムの動態を明らかにする動力学的尺度である。その使用の容易さおよび素早い結果が原因で、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州Ｆｒｅｍｏｎｔから入手可能）などのＢＬＩに基づくアッセイが、スクリーニング工程において、「結合剤」のプール同定して「非結合剤」または「弱い結合剤」のプールから分離するための初期スクリーニン方法として使用した場合に特に好都合である。
【０２７３】
ＢＬＩに基づく結合アッセイにより、結合親和性をＯｃｔｅｔ（登録商標）によって測定したした場合に、新規抗体が「コンテキストバランス型／コンテキスト非依存性」抗体として特徴づけられることが明らかとなった。抗体の非限定的な例のＢＬＩに基づく結合プロフィールを要約する表８に見られるように、これらの抗体は、４つの標的複合体にわたってナノモーラー以下の範囲において比較的均一のＫＤ値を示し、マトリックス対細胞の差異は比較的低かった（５倍を超えない偏り）（（Ｈ）列を参照）。これは、細胞関連複合体よりもマトリックス関連複合体に対して有意により高い（２７＋偏りの倍数）相対的親和性を示す、参照抗体として提供する以前に同定した抗体Ａｂ３と対比することができる。
【０２７４】
以下の表８は、本発明によって包含される高親和性のコンテキスト非依存性前駆ＴＧＦβ１抗体の非限定的な例を提供する。表は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）によって測定したｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイからの代表的な結果を提供する。同様の結果がＳＰＲに基づく技法（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）によっても得られる。
【０２７５】
表の（Ａ）列は、別個のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を列挙する。Ａｂ３（太字で示す）は、細胞に基づくアッセイにおいて強力であり、様々な動物モデルにおいて効果的であり、クリーンな毒性学プロフィールを有することが示された、以前に同定した参照抗体である（ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０１号に開示）。（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）列は、ＫＤで測定した、列挙した抗体のそれぞれの親和性を提供する。抗体のそれぞれについて、（Ｂ）列は組換えヒトＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体に対する親和性を示し、（Ｃ）列は組換えヒトＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体に対する親和性を示し、（Ｅ）は組換えヒトＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体に対する親和性を示し、（Ｆ）は組換えヒトＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体に対する親和性を示す。（Ｂ）および（Ｃ）の平均ＫＤ値を対応する（Ｄ）列に示し、これは、ＥＣＭまたはマトリックス関連前駆ＴＧＦβ１複合体に対する抗体の親和性を総合的に表す。同様に、（Ｅ）および（Ｆ）の平均ＫＤ値を対応する（Ｇ）列に示し、これは、細胞表面または細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体に対する抗体の親和性を総合的に表す。最後に、（Ｄ）および（Ｇ）列からの平均ＫＤ値間の相対比を、（Ｈ）列において「偏りの倍数」として表す。したがって、抗体のマトリックス関連複合体および細胞表面複合体に対する結合優先度を比較した場合に、（Ｈ）列の数が高ければ高いほど、その特定の抗体に対して存在する偏りがより大きい。これは、抗体のその標的複合体に対する生来の偏りを定量的に表し比較する１つの方法である。具体的な治療的使用のための候補抗体の選択工程を導くことにおいて、そのような分析は有用であり得る。
表８．コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１抗体の非限定的な例およびＢＬＩによって測定したＫＤ値
2021531254.tif 000016
【０２７６】
本発明は、そのそれぞれが４つの既知の提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体、すなわち、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと等価な親和性で結合することができる、高親和性のコンテキスト非依存性抗体のクラスを提供する。一部の実施形態では、抗体は、提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと、以前に記載した参照抗体Ａｂ３と比較して等価またはより高い親和性で結合する。本発明によれば、そのような抗体は、バイオレイヤー干渉法および表面プラズモン共鳴などの適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって測定して、前述の複合体のそれぞれと≦５ｎＭの親和性（ＫＤによって決定）で特異的に結合する。一部の実施形態では、抗体または断片はヒトＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体と≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦５ｎＭ、または≦０．５ｎＭの親和性で結合する。一部の実施形態では、抗体または断片はヒトＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体と≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦５ｎＭ、または≦０．５ｎＭの親和性で結合する。一部の実施形態では、抗体または断片はヒトＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体と≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦５ｎＭ、または≦０．５ｎＭの親和性で結合する。一部の実施形態では、抗体または断片はヒトＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭの親和性で結合する。
【０２７７】
好ましい実施形態では、そのような抗体はヒトおよびネズミ交差反応性である。したがって、一部の実施形態では、抗体または断片はネズミＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体と≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦５ｎＭ、または≦０．５ｎＭの親和性で結合する。一部の実施形態では、抗体または断片はネズミＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体と≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭの親和性で結合する。一部の実施形態では、抗体または断片はネズミＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体と≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭの親和性で結合する。一部の実施形態では、抗体または断片はネズミＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．５ｎＭの親和性で結合する。
【０２７８】
示すように、本開示の前駆ＴＧＦβ１抗体はマトリックス関連前駆ＴＧＦβ１複合体に対して特に高い親和性を有する。一部の実施形態では、マトリックス関連複合体（すなわちＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１）の平均ＫＤ値は≦１ｎＭまたは≦０．５ｎＭである。
【０２７９】
示すように、本開示の前駆ＴＧＦβ１抗体は細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体に対して高い親和性を有する。一部の実施形態では、細胞関連複合体（すなわちＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）の平均ＫＤ値は≦２ｎＭまたは≦１ｎＭである。
【０２８０】
本開示の高親和性前駆ＴＧＦβ１抗体は、４つのすべて抗原複合体に対するその均一（不偏）な親和性によって特徴づけられている（たとえばＡｂ３と比較）。本明細書中に記載の４つの既知の提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体のうち、どの１つの抗原複合体もＫＤが有意に逸脱しない。言い換えれば、そのような抗体のそれぞれが４つの抗原複合体にわたって等価な親和性を示すという点で、以前に記載した前駆ＴＧＦβ１抗体（Ａｂ３を含む）と比較して、より均一な結合活性が本開示によって達成されている。一部の実施形態では、抗体または断片は、４つの前駆ＴＧＦβ１抗原複合体にわたる抗体または断片の親和性の差異（または範囲）が、最低および最高のＫＤ値の間で５倍以下であることを特徴とする、不偏または均一な結合プロフィールを示す。一部の実施形態では、親和性の相対的差異（または範囲）は３倍以下である。
【０２８１】
「均一性」または偏りの欠如の概念を表８にさらに例示する。２つのマトリックス関連および細胞関連の複合体の間の平均ＫＤ値をそれぞれ計算した（（Ｄ）および（Ｇ）列を参照）。その後、これらの平均ＫＤ値を使用して、マトリックスに関連する複合体対細胞表面（たとえば免疫細胞）に関連する複合体の間に結合活性の偏りが存在するかどうかを求めることができる。表８に例示するように、偏りは平均ＫＤ値の「差異の倍数」として表し得る。以前に記載した抗体Ａｂ３と比較して、本開示によって包含される高親和性のコンテキスト非依存性前駆ＴＧＦβ１抗体は、マトリックスおよび細胞関連の複合体の間で多くが３倍以下の平均ＫＤ値の差異を示すという点で、著しく不偏である（これをＡｂ３における２５＋偏りの倍数と比較）。
【０２８２】
したがって、バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴によって測定して、そのそれぞれが≦１ｎＭの親和性で以下の提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体、すなわち、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと等価な親和性で結合することができる、コンテキスト非依存性モノクローナル抗体のクラスまたは断片を提供する。そのような抗体は、バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴によって測定して、前述の複合体のそれぞれと≦５ｎＭの親和性で特異的に結合し、ここで、モノクローナル抗体または断片は、上記複合体のうちの任意の１つに対して他方の複合体と比較して３倍を超えない親和性の偏りを示し、モノクローナル抗体または断片は、前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれからの成熟ＴＧＦβ１成長因子の放出を阻害するが、前駆ＴＧＦβ２または前駆ＴＧＦβ３複合体からのものは阻害しない。
【０２８３】
ＢＬＩに基づくアッセイから得ることができる結合プロフィールの動力学（たとえば「オン」および「オフ」速度）は有用な情報を提供する一方で、本開示の本出願人は、本明細書中に開示されている活性化阻害剤の作用機構、すなわち、繋留されている（たとえば組織に局在性の）不活性（たとえば潜在型）の標的と結合することによってそれが活性化されることを妨げることによって働く抗体に基づいて、平衡状態で測定した結合特性がそのｉｎ  ｖｉｖｏの挙動および効力をより正確に反映している可能性があることを企図した。これを秩序立ててみると、一例として、ＢＬＩによって得られる結合測定値に反映されるであろう速い「オン」速度（「Ｋオン」）を有する抗体は、中和抗体（たとえば、それらが有効な阻害剤として機能するために活性な可溶性成長因子自体を直接標的とし、それを迅速に隔離しなければならない抗体）を評価するための関連するパラメータを提供し得る。しかし、同じことは、本明細書中に開示されているものなどの活性化阻害剤として機能する抗体には必ずしも適用されない場合がある。記載のように、本発明の新規ＴＧＦβ１阻害剤の作用機構は、活性化ステップの阻害を介するものであり、これは、可溶性の活性化後の成長因子の隔離の対照として、組織／細胞に繋留されている潜在型複合体の標的化によって達成される。その理由は、ＴＧＦβ１の活性化阻害剤はそれぞれの組織（たとえば、ＥＣＭ内、免疫細胞表面など）に局在性の不活性の前駆体を標的とし、それによって成熟成長因子が複合体から放出されることを先制して妨げるためである。この作用機構は、従来の中和性阻害剤によって必要とされる、一過性の成長因子分子について内在性受容体に対して迅速に競合する必要なしに、阻害剤が標的飽和（たとえば平衡）をｉｎ  ｖｉｖｏで達成することを可能にすると考えられている。
【０２８４】
この作用機構の差異を考慮に入れて、平衡状態での親和性の決定を可能にする別のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ様式を使用することによって、結合特性のさらなる評価を実施した。
【０２８５】
これに鑑みて、そのような抗体の平衡状態での結合親和性を測定するアッセイが、ｉｎ  ｖｉｖｏの標的会合様式をより正確に表し得ることが企図される。したがって、以下の表９に例示するように、ＭＳＤ−ＳＥＴに基づく結合アッセイ（または他の適切なアッセイ）を行い得る。
【０２８６】
溶液平衡滴定（「ＳＥＴ」）とは、２つの分子間の結合（抗原および抗原と結合する抗体など）を溶液中、平衡状態で測定することができるアッセイである。たとえば、メソスケールディスカバリー（「ＭＳＤ」）に基づくＳＥＴ、またはＭＳＤ−ＳＥＴは、特に高親和性のタンパク質−タンパク質の相互作用の平衡状態での解離定数を決定するために有用な様式である（たとえばＤｕｃａｔａら、（２０１５年）、Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、２０（１０）：１２５６〜１２６７頁を参照）。ＳＥＴに基づくアッセイは、ナノモーラー以下（たとえばピコモーラー）の親和性を有する抗体のＫＤ値を決定するために特に有用である。
表９．高親和性コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１抗体（ｈＩｇＧ４）の非限定的な例およびＭＳＤ−ＳＥＴによって測定したＫＤ値（「ｈ」はヒト複合体を示す）
2021531254.tif 000017
【０２８７】
表９は、３つの以前に記載したＴＧＦβ１選択的抗体（Ｃ１、Ｃ２、およびＡｂ３）も参照抗体として含む。Ｃ１およびＣ２はＷＯ２０１７／１５６５００号として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２１９７２号に最初に開示され、Ａｂ３はＷＯ２０１８／１２９３２９号として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０１号に記載されていた。
【０２８８】
表９に提供する親和性データから見ることができるように、本開示による新規抗体の結合活性は以前に同定した参照抗体よりも有意に高い。さらに、新規ＴＧＦβ１抗体は、ヒトＬＬＣ複合体のそれぞれと等価な親和性（たとえば約ナノモーラー以下の範囲、たとえば＜１ｎＭのＫＤを有する）で結合するという点で「コンテキスト非依存性」である。高親和性のコンテキスト非依存性結合プロフィールは、これらの抗体が、癌などのＥＣＭ関連および免疫構成要素の両方の調節不全に関与するＴＧＦβ１関連の適応症の処置における使用に有利であり得ることを示唆している。
【０２８９】
溶液平衡滴定に基づく結合アッセイには、上に示したものなどの提示分子のうちの１つを含むタンパク質複合体を抗原として用い得る（提示分子−ＴＧＦβ１複合体、またはＬＬＣ）。試験抗体は、溶液中で抗原−抗体複合体を形成する。抗原−抗体反応混合物をインキュベートして平衡を達成させる。アッセイ反応中に存在する抗原−抗体複合体の量は当技術分野で周知の適切な手段によって測定することができる。ＢＬＩに基づくアッセイと比較して、ＳＥＴに基づくアッセイは抗原−抗体複合体のオン／オフ速度による影響をより受けにくく、非常に高い親和性の相互作用の感受性のある検出が可能となる。表９に示すように、本開示では、ＴＧＦβ１の好ましい高親和性阻害剤は、ＳＥＴに基づくアッセイによって決定して、試験したすべての大型潜在型複合体にわたってナノモーラー以下（たとえばピコモーラー）の範囲の親和性を示す。
【０２９０】
したがって、ＭＳＤ−ＳＥＴなどの溶液平衡滴定アッセイによって測定して、そのそれぞれが≦１ｎＭのＫＤ以下のヒト提示分子−前駆ＴＧＦβ１複合体、すなわち、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと等価な親和性で結合することができる、コンテキスト非依存性モノクローナル抗体のクラスまたは断片を提供する。そのような抗体は、ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して、前述の複合体のそれぞれと≦１ｎＭのＫＤで特異的に結合し、ここで、モノクローナル抗体または断片は、前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれからの成熟ＴＧＦβ１成長因子の放出を阻害するが、前駆ＴＧＦβ２または前駆ＴＧＦβ３複合体からのものは阻害しない。好ましい実施形態では、そのような抗体または断片は、５００ｐＭ以下（すなわち≦５００ｐＭ）、２５０ｐＭ以下（すなわち≦２５０ｐＭ）、または２００ｐＭ以下（すなわち≦２００ｐＭ）のＫＤで前述の複合体のそれぞれと結合する。さらにより好ましくは、そのような抗体または断片は、１００ｐＭ以下（すなわち≦１００ｐＭ）のＫＤで前述の複合体のそれぞれと結合する。一部の実施形態では、抗体または断片は、プロドメイン複合体と会合していない遊離ＴＧＦβ１成長因子と結合しない。これは、バイオレイヤー干渉法などの当技術分野で知られている適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって試験または確認することができる。
【０２９１】
さらなる好ましい実施形態では、そのような抗体または断片は、ネズミ（たとえばラットおよび／もしくはマウス）ならびに／または非ヒト霊長類（たとえばカニクイザル）対応物とも交差反応性である。一例のみを挙げると、以下の表１０および実施例９に例示するように、Ａｂ６は、高い親和性でヒト、ネズミ、ラット、およびカニクイザルを含む複数の種の大型潜在型複合体のそれぞれと結合することができる。
表１０．ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定して異種間反応性を有する高親和性コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１抗体の非限定的な例（「ｈ」はヒトを示し、「ｍ」はネズミを示す）
2021531254.tif 000018
【０２９２】
効力
本明細書中に開示されている抗体は、ＴＧＦβ１シグナル伝達を阻害するその能力について「機能的抗体」として広く特徴づけられ得る。本明細書中で使用する「機能的抗体」は、その機能を変調するような方法で標的タンパク質（たとえば抗原）と結合するその能力のおかげで、１つまたは複数の生物活性を与える。したがって、機能的抗体は、標的分子（すなわち抗原）の活性／機能を変調させることができるものを広く含む。そのような変調抗体としては阻害抗体（または阻害性抗体）および活性化抗体が挙げられる。本開示は、ＴＧＦβ１の複数のコンテキストに関連するＴＧＦβ１シグナル伝達によって媒介される生物学的プロセスを阻害することができる抗体に注目している。本明細書中に記載の抗体などの、本発明を実施するために使用する阻害剤は、ＴＧＦβ１選択的であることを意図し、治療上有効な用量（許容毒性レベル内で十分な有効性が達成される用量）で投与した場合にＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を標的化またはそれと干渉しない。本開示の新規抗体は、以前に同定したＴＧＦβ１の活性化阻害剤と比較して増強された阻害活性（効力）を有する。
【０２９３】
一部の実施形態では、阻害性抗体の効力は、本明細書中に記載のＣＡＧＡレポーター細胞アッセイなどの適切な細胞に基づくアッセイにおいて測定し得る。一般に、細胞に基づく効力アッセイを実施するために異種細胞および初代細胞などの培養細胞を使用し得る。内在性ＴＧＦβ１ならびに／またはＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、およびＬＲＲＣ３３などの目的の提示分子を発現する細胞を使用し得る。あるいは、ＴＧＦβ１などの目的のタンパク質ならびに／またはＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、およびＬＲＲＣ３３などの目的の提示分子をコードしている外因性核酸を、たとえば形質移入によって（たとえば安定形質移入もしくは一過性の形質移入）またはウイルスベクターに基づく感染によって、発現のためにそのような細胞内に導入し得る。一部の実施形態では、ＬＮ２２９細胞をそのようなアッセイに用いる。ＴＧＦβ１および目的の提示分子（たとえば、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰまたはＬＲＲＣ３３）を発現する細胞は、自然において成長させ、これらは、大型潜在型複合体を細胞表面上に（ＧＡＲＰもしくはＬＲＲＣ３３と会合している場合）またはＥＣＭ内に蓄積して（ＬＴＢＰと会合している場合）のいずれかに「提示」する。ＴＧＦβ１の活性化は、別の細胞表面上に発現されたインテグリンによって始動され得る。インテグリン発現細胞は、大型潜在型複合体を同時発現する同じ細胞または別々の細胞種であり得る。ＴＧＦβ応答性要素を取り込むレポーター細胞をアッセイシステムに加える。このようにして、ＴＧＦβの活性化の度合を、ＴＧＦβの活性化の際のレポーター細胞（たとえば、ＴＧＦβ応答性プロモーター要素とカップリングされたルシフェラーゼなどのＴＧＦβ応答性レポーター遺伝子）からのシグナルを検出することによって測定し得る。そのような細胞に基づくアッセイシステムを使用して、抗体の阻害活性は、試験抗体の存在下または非存在下においてレポーターシグナル（たとえば蛍光読取値によって測定したルシフェラーゼ活性）における変化（低下）または差異を測定することによって決定することができる。そのようなアッセイを本明細書中の実施例２に例示する。
【０２９４】
したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ１の活性化を測定するための細胞に基づくレポーターアッセイ（本明細書中の他の箇所に記載のＬＮ２２９細胞アッセイなど）に基づいて計算した本開示の新規抗体の阻害効力（ＩＣ５０）は、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれに対して測定して５ｎＭ以下であり得る。一部の実施形態では、抗体は、ＬＬＣのそれぞれに対して滴定して、２ｎＭ以下（すなわち≦２ｎＭ）のＩＣ５０を有する。好ましい実施形態では、ＬＬＣ複合体のそれぞれに対して測定した抗体のＩＣ５０は１ｎＭ以下である。一部の実施形態では、抗体は、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれに対して１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。
表１１．レポーター細胞アッセイによって測定した選択抗体の阻害効力（ＩＣ５０）
2021531254.tif 000019
【０２９５】
ＴＧＦβ１の活性化は、インテグリン依存性機構またはプロテアーゼ依存性機構によって始動され得る。本開示による抗体の阻害活性（たとえば効力）は、一方または両方の活性化様式によって誘導された、ＴＧＦβ１の活性化を遮断する能力ついて評価し得る。上述のレポーター細胞アッセイは、ＴＧＦβ１の活性化のインテグリン依存性活性化を遮断または阻害する抗体の能力を測定するために設計されている。阻害効力は、ＴＧＦβ１のプロテアーゼ誘導性活性化を遮断する抗体の能力を測定するためにも評価し得る。本開示の実施例３は、そのようなアッセイの非限定的な実施形態を提供する。結果を図５Ａおよび５Ｂに要約する。したがって、本発明の一部の実施形態では、本開示によるアイソフォーム選択的阻害剤は、ＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化およびＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化を阻害することができる。そのような阻害剤は、プロテアーゼ活性に関与するＥＤＭ調節不全によって特徴づけられたＴＧＦβ１関連の適応症を処置するために使用し得る。たとえば、そのようなＴＧＦβ１関連の適応症は、筋線維芽細胞の上昇、ＥＣＭの硬直の増加、過剰もしくは異常なコラーゲン沈着、またはその任意の組合せに関連している場合がある。そのような状態としては、たとえば、固形腫瘍（転移性癌腫など）を含む線維性障害および癌または骨髄線維症が挙げられる。
【０２９６】
一部の実施形態では、効力を、適切なｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて有効性および／または薬力学的効果の尺度として評価し得る。たとえば、第１の抗体がｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて特定の濃度で効果的であり、第２の抗体が同じｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて第１の抗体よりも低い濃度で同等に効果的である場合、第２の抗体は第１の抗体よりも強力であると言うことができる。具体的な目的の適応症、たとえば癌モデルおよび線維症モデルに応じて、当技術分野で知られている任意の適切な疾患モデルを使用してＴＧＦβ１阻害剤の相対的効力を評価し得る。好ましくは、それぞれの試験抗体の複数の用量または濃度がそのような研究に含まれる。
【０２９７】
同様に、薬力学（ＰＤ）的効果を測定して阻害性抗体の相対的効力を決定し得る。一般的に使用されるＴＧＦβシグナル伝達経路のＰＤの尺度としては、それだけには限定されないが、ＴＧＦβ応答性プロモーター要素（たとえばＳｍａｄ結合要素）を有するものなどの、その転写がＴＧＦβの活性化に感受性であるＳＭＡＤ２／３のリン酸化および下流エフェクター遺伝子の発現が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、動物に３ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与した場合に、前臨床線維症モデルにおいて疾患誘導性ＳＭＡＤ２／３リン酸化を完全に遮断することができる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、腎線維症のＵＵＯモデルにおいて動物に１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与した場合に、Ａｃｔａ２、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、Ｆｎ１、Ｉｔｇａ１１、Ｌｏｘ、Ｌｏｘｌ２を含めたマーカー遺伝子のパネルの線維症誘導性発現を有意に抑制することができる。
【０２９８】
したがって、一部の実施形態では、治療的使用のための抗体またはその抗原結合断片の選択工程は、十分な阻害効力を示す抗体または断片を同定することを含み得る。たとえば、選択工程は、１つまたは複数の試験抗体またはその断片の効力（たとえばＩＣ５０）を測定するために細胞に基づくＴＧＦβ１の活性化アッセイを実施し、望ましい効力を示す候補の抗体またはその断片を選択するステップを含み得る。一部の実施形態では、ヒトＬＬＣのそれぞれのＩＣ５０は５ｎＭ以下である。その後、選択された抗体または断片を本明細書中に記載のＴＧＦβ１関連の適応症の処置に使用し得る。
【０２９９】
結合領域
本開示のコンテキストにおいて、抗原の「結合領域」は抗体−抗原の相互作用の構造的基礎を提供する。本明細書中で使用する「結合領域」とは、水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）などの適切な技法によって決定して、生理溶液中で前駆ＴＧＦβ１複合体（「抗原」）と結合した場合に、抗体または断片が結合領域を溶媒曝露から保護するような、抗体と抗原との間の界面の領域をいう。結合領域の同定は、抗原−抗体の相互作用および具体的な抗体の作用機構の見識を得ることにおいて有用である。類似のまたは重複する結合領域を有する追加の抗体の同定は、エピトープビニングを可能にする交差遮断実験によって容易になり得る。任意選択で、Ｘ線結晶構造解析を用いて抗原−抗体の相互作用を媒介するエピトープの正確なアミノ酸残基を同定し得る。
【０３００】
当技術分野はＨＤＸ−ＭＳに精通しており、これは、溶液中のタンパク質のコンホメーションまたはタンパク質−タンパク質の相互作用を探求するために幅広く使用されている技法である。この方法は、タンパク質主鎖アミド中の水素を溶液中に存在する重水素で交換することに依存する。水素−重水素の交換率を測定することによって、タンパク質の動態およびコンホメーションに関する情報を得ることができる（参考として組み込まれているＷｅｉら、（２０１４年）、「Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ｈｉｇｈｅｒ  ｏｒｄｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」。Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏ  Ｔｏｄａｙ．、１９（１）：９５〜１０２頁に総説）。この技法の適用は、抗体−抗原複合体が形成される際、結合パートナー間の界面が溶媒を吸蔵し、それによって溶媒の立体排除が原因で交換率を低下させるまたは妨げる場合があるという仮定に基づいている。
【０３０１】
本開示は、潜在型ラッソまたはその一部分を含む領域（「結合領域」）でヒトＬＬＣと結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。潜在型ラッソはプロドメイン内のタンパク質モジュールである。抗体結合が成長因子を「ロックイン」し、それによってその放出を防止するであろう様式で、多数の強力な活性化阻害剤が前駆ＴＧＦβ１複合体のこの領域と結合し得ることが企図される。興味深いことに、ここが、成長因子のバタフライ様の細長い領域（たとえばフィンガー−１およびフィンガー−２などに対応する）がプロドメインのケージ様構造と密に相互作用する複合体の区分である。
【０３０２】
図１８Ｂに図示するように、潜在型ラッソは、プロドメインの一部である２ａと２ｂの一部として標識した領域を含む。潜在型ラッソに直接隣接して、５ａと標識した領域は成長因子ドメイン内のいわゆるフィンガー−１に対応しており、逆側に周った６ｂと標識した領域は成長因子ドメイン内のフィンガー−２の一部であることに注意されたい。これに基づいて、これらの領域の周りに密に巻き付く抗体が、前駆ＴＧＦβ１複合体が解離することを有効に防止し、それによって活性化を遮断できることを想定するのは難しくない。
【０３０３】
ＨＤＸ−ＭＳ技法を使用して、前駆ＴＧＦβ１の結合領域を決定することができる。一部の実施形態では、抗体または断片との結合において重要であると同定された前駆ＴＧＦβ１の部分は、プロドメインの少なくとも一部分および成長因子ドメインの少なくとも一部分を含む。潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む第１の結合領域（図１９Ａ中の「領域１」）と結合する抗体または断片が好ましい。より好ましくは、そのような抗体または断片は、成長因子ドメインのフィンガー−１で成長因子ドメインの少なくとも一部分を含む第２の結合領域（図１９Ａ中の「領域２」）とさらに結合する。そのような抗体または断片は、成長因子ドメインのフィンガー−２の少なくとも一部分を含む第３の結合領域（図１９Ａ中の「領域３」）とさらに結合し得る。
【０３０４】
前駆ＴＧＦβ１内の追加の領域は、本明細書中に開示されているこれら抗体の高親和性の相互作用にも直接または間接的に寄与し得る。抗体と前駆ＴＧＦβ１複合体との高親和性結合の媒介に重要であるとみなされている領域（図１８Ａを参照）としては、それだけには限定されないが、ＬＶＫＲＫＲＩＥＡ（配列番号１５９）、ＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰ（配列番号１６０）、ＰＧＰＬＰＥＡＶ（配列番号１６１）、ＬＡＬＹＮＳＴＲ（配列番号１６２）、ＲＥＡＶＰＥＰＶＬ（配列番号１６３）、ＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲ（配列番号１６４）、ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号１６５）、ＬＧＰＣＰＹＩＷＳ（配列番号１６６）、ＡＬＥＰＬＰＩＶ（配列番号１６７）、およびＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬ（配列番号１６８）を挙げ得る（ヒト前駆ＴＧＦβ１のネイティブ配列に基づく）。
【０３０５】
抗体−抗原の相互作用に寄与し得る領域のうち、一部の実施形態では、本開示の高親和性抗体は、アミノ酸配列ＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（「領域１」）（配列番号１６９）の少なくとも１つの残基を含むエピトープと結合し得る。
【０３０６】
一部の実施形態では、本開示の高親和性抗体は、アミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（「領域２」）（配列番号１６５）の少なくとも１つの残基を含むエピトープと結合し得る。
【０３０７】
一部の実施形態では、本開示の高親和性抗体は、アミノ酸配列ＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬ（「領域３」）（配列番号１６８）の少なくとも１つの残基を含むエピトープと結合し得る。
【０３０８】
一部の実施形態では、本開示の高親和性抗体は、アミノ酸配列ＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（「領域１」）（配列番号１６９）の少なくとも１つの残基およびアミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（「領域２」）（配列番号１６５）の少なくとも１つの残基を含むエピトープと結合し得る。
【０３０９】
一部の実施形態では、本開示の高親和性抗体は、アミノ酸配列ＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（「領域１」）（配列番号１６９）の少なくとも１つの残基およびアミノ酸配列ＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬ（「領域３」）（配列番号１６８）の少なくとも１つの残基を含むエピトープと結合し得る。
【０３１０】
一部の実施形態では、本開示の高親和性抗体は、アミノ酸配列ＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（「領域１」）（配列番号１６９）の少なくとも１つの残基、アミノ酸配列ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（「領域２」）（配列番号１６５）の少なくとも１つの残基、およびアミノ酸配列ＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬ（「領域３」）（配列番号１６８）の少なくとも１つの残基を含むエピトープと結合し得る。
【０３１１】
領域１、２、および／または３からの貢献に加えて、そのようなエピトープは、以下からなる群から選択される配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基をさらに含み得る：ＬＶＫＲＫＲＩＥＡ（配列番号１５９）、ＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰ（配列番号１６０）、ＰＧＰＬＰＥＡＶ（配列番号１６１）、ＬＡＬＹＮＳＴＲ（配列番号１６２）、ＲＥＡＶＰＥＰＶＬ（配列番号１６３）、ＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲ（配列番号１６４）、ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号１６５）、ＬＧＰＣＰＹＩＷＳ（配列番号１６６）、ＡＬＥＰＬＰＩＶ（配列番号１６７）、およびＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬ（配列番号１６８）。
【０３１２】
注目すべきは、４つの代表的なアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１抗体を使用した構造研究において同定された結合領域の多くが重複していると判明している点であり、これは、前駆ＴＧＦβ１複合体の潜在性の維持に特に重要であり得る前駆ＴＧＦβ１複合体内の特定の領域を指し示している。したがって、有利には、抗体またはその断片は、本明細書中に記載の複数の阻害剤にわたって同定された重複部分を含むその結合領域に少なくとも部分的に基づいて選択し得る。結合領域のこれらの重複部分としては、たとえば、ＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号２０１）、ＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号２０２）、およびＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号２０３）が挙げられる。したがって、本開示による高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、ＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号２０１）、ＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号２０２）、および／またはＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号２０３）の１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープで前駆ＴＧＦβ１複合体（たとえばヒトＬＬＣ）と結合し得る。
【０３１３】
したがって、本明細書中に開示されているカテゴリー１〜５の抗体または断片など、本開示によって包含される抗体または抗原結合断片のうちの任意のものは、本明細書中で同定した結合領域のうちの１つまたは複数と結合し得る。そのような抗体は、本明細書中に記載のように、対象におけるＴＧＦβ１適応症の処置に使用し得る。したがって、本開示による治療的使用に適した抗体またはその抗原結合断片の選択は、ＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号２０１）、ＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号２０２）、ＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号２０３）、またはその任意の一部分と結合する抗体またはその断片を同定または選択することを含み得る。
【０３１４】
以前に記載されている（ＷＯ２０１４／１８２６７６号）ヒト前駆ＴＧＦβ１のタンパク質ドメインまたはモチーフの非限定的な例を表１２中に提供する。
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【０３１５】
安全性／毒性学
複数のアイソフォームを拮抗することができるＴＧＦβの慣用の汎阻害剤は、たとえば、イヌおよびラットを含む複数の種にわたって報告されている心血管毒性（心臓病変、最も注目すべきは弁膜症）を含むいくつかの毒性を引き起こすことが知られている。これらとしては、大動脈弁、右ＡＶ弁、および左ＡＶ弁における過形成、大動脈弁、左ＡＶ弁、および上行大動脈における炎症、上行大動脈、大動脈弁、および左ＡＶ弁における出血、上行大動脈における結合組織変性が挙げられる（たとえばＳｔｒａｕｂｅｒら、（２０１４年）、「Ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  β  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ３４４  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｂｅａｇｌｅ  ｄｏｇｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ、４（３）：１０００１９６を参照）。図２１Ａも参照されたい。
【０３１６】
さらに、３つすべてのＴＧＦβアイソフォームと結合する中和抗体は、複数の種にわたって観察された特定の上皮毒性に関連づけられており、その一部を以下に要約する。
表１３．ＴＧＦβの汎阻害剤に関連する上皮毒性
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【０３１７】
慣用のＴＧＦβ拮抗剤のアイソフォーム特異性の欠如がＴＧＦβ阻害に関連する毒性の源の根底にあり得るという本開示の出願人による初期の認識（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２１９７２号を参照）を踏まえて、本発明者は、多面的ＴＧＦβ１調節不全を顕在化させる様々な疾患を処置する一方で、アイソフォーム選択的阻害剤の安全性／許容性の側面を維持する、広域のＴＧＦβ１阻害さらに達成することを追求した。
【０３１８】
臨床設定では、薬物（たとえばモノクローナル抗体）の最小有効濃度（ＭＥＣ）が薬物の最小毒性濃度（ＭＴＣ）未満である場合にのみ、治療上の利点が達成される。これは、実際には用量規制毒性を引き起こすように思われた、全てではないがほとんどの慣用のＴＧＦβの汎阻害剤で達成されていなかった。本出願人の以前の研究は、小分子受容体拮抗剤および中和抗体などの慣用の汎阻害剤と比較して著しく改善された安全性プロフィールを示したＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤を記載した。ＷＯ２０１７／１５６５００号は、１週間あたり１００ｍｇ／ｋｇまでの用量で４週間ラットに投与した場合に被験物質関連の毒性が観察されず、抗体のＮＯＡＥＬを試験した最高用量、すなわち１００ｍｇ／ｋｇで確立した、ＴＧＦβ１の活性化のアイソフォーム選択的阻害剤開示した。本出願人の続く研究は、増強された機能を有する抗体も等価な安全性プロフィールを示したことも示した。ここで、目的の１つは、さらにより高い親和性および効力を有するが、少なくとも同じまたは等価なレベルの安全性を有する抗体を同定することであった。
【０３１９】
４週間のラット毒性学研究からの結果を図２１Ｂおよび２１Ｃに提供する。２つのアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤（Ａｂ３およびＡｂ６）を別々の研究において、対照として小分子ＡＬＫ５阻害剤およびモノクローナル中和抗体と一緒に試験した。どちらのアイソフォーム選択的抗体でも被験物質関連の毒性は留意されなかった一方で、非選択的阻害剤は予想通り、公開されている研究と一貫した様々な有害事象を引き起こした。さらに、Ａｂ６は、カニクイザルにおいて週に１回、４週間投薬した場合に３００ｍｇ／ｋｇと高い用量レベルで安全（たとえば観察された有害事象なし）であることが示された。Ａｂ６は、いくつかのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて３ｍｇ／ｋｇと低い用量で効果的であることが示されているため、これは１００倍までの治療ウィンドウを提供する。重要なことに、このことは、高い効力が、必ずしもより高い毒性の危険性を意味しなくてもよいことを実証している。特定の理論に束縛されることを望まずに、本明細書中に開示されている抗体の高度に選択的な性質が観察された毒性の欠如を説明する可能性が高いことが企図される。
【０３２０】
したがって、一部の実施形態では、本開示による新規抗体は、週に１回、少なくとも４週間投薬した場合に＞１００ｍｇ／ｋｇの最大耐用用量（ＭＴＤ）を有する。一部の実施形態では、本開示による新規抗体は、週に１回、少なくとも４週間投薬した場合に１００ｍｇ／ｋｇまでの無毒性量（ＮＯＡＥＬ）を有する。ＴＧＦβ阻害剤およびＴＧＦβ１阻害剤の安全性／毒性学的研究を実施するために使用する適切な動物モデルとしては、それだけには限定されないが、ラット、イヌ、カニクイザル、およびマウスが挙げられる。好ましい実施形態では、適切な前臨床有効性研究に基づいた抗体の最小有効量はＮＯＡＥＬ未満である。より好ましくは、抗体の最小有効量はＮＯＡＥＬの約３分の１以下である。特に好ましい実施形態では、抗体の最小有効量はＮＯＡＥＬの約６分の１以下である。一部の実施形態では、抗体の最小有効量はＮＯＡＥＬの約１０分の１以下である。
【０３２１】
一部の実施形態では、本発明は、対象に投与した場合に、ＴＧＦβ１関連の適応症を処置するために有効な用量で心血管または既知の上皮毒性を引き起こさない、ＴＧＦβ１シグナル伝達を阻害することができるアイソフォーム選択的抗体を包含する。一部の実施形態では、抗体は、週に１回、隔週、または月に１回投与した場合に約３〜１０ｍｇ／ｋｇの最小有効量を有する。好ましくは、抗体は、最小有効量の少なくとも６倍である用量（たとえば６倍の治療ウィンドウ）でゼロから最小限の毒性しか引き起こさない。より好ましくは、抗体は、最小有効量の少なくとも１０倍である用量（たとえば１０倍の治療ウィンドウ）でゼロから最小限の毒性しか引き起こさない。さらにより好ましくは、抗体は、最小有効量の少なくとも１５倍である用量（たとえば１５倍の治療ウィンドウ）でゼロから最小限の毒性しか引き起こさない。
【０３２２】
したがって、治療的使用のための抗体またはその抗原結合断片の選択は、本明細書中に記載のカテゴリー１〜５のうちの１つまたは複数の基準を満たす抗体または抗原結合断片を選択すること、抗体または断片の有効量を決定するために適切な前臨床モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究を実施すること、安全または毒性がある抗体の量を決定するために適切なモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ安全性／毒性学的研究を実施すること（たとえば、ＭＴＤ、ＮＯＡＥＬ、または安全性／毒性を評価するための当技術分野で理解されている任意のパラメータ）、ならびに少なくとも３倍の治療ウィンドウ（好ましくは６倍、より好ましくは１０倍の治療ウィンドウ、さらにより好ましくは１５倍の治療ウィンドウ）を提供する抗体または断片を選択することを含み得る。好ましい実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究は、ヒト条件を概括する２つ以上の適切な前臨床モデルにおいて実施する。一部の実施形態では、そのような前臨床モデルは、任意選択で免疫抑制腫瘍を含み得るＴＧＦβ１陽性癌を含む。免疫抑制腫瘍は、ＣＢＴ、化学療法、および放射線療法などの癌治療に対して耐性であり得る。一部の実施形態では、前臨床モデルはＭＢＴ−２、クラウドマンＳ９１、およびＥＭＴ６腫瘍モデルから選択される。
【０３２３】
選択された抗体または断片は、抗体または断片を含む医薬組成物の製造において使用し得る。そのような医薬組成物は、本明細書中に記載のように対象におけるＴＧＦβ１適応症の処置において使用し得る。たとえば、ＴＧＦβ１適応症は増殖性障害および／または線維性障害であり得る。
【０３２４】
作用機構
治療剤として有用な本発明の抗体はＴＧＦβ１の阻害性抗体である。さらに、抗体は活性化阻害剤である、すなわち、抗体は、既に活性化された成長因子の後を直接追いかけるのではなくＴＧＦβ１の活性化ステップを遮断する。
【０３２５】
広義では、用語「阻害抗体」とは、標的機能、たとえば成長因子活性を拮抗または中和する抗体をいう。有利には、本開示の好ましい阻害性抗体は、潜在型複合体からの成熟成長因子の放出を阻害し、それによって成長因子のシグナル伝達を低下させることができる。阻害抗体としては、それと会合した際に成長因子の放出または活性を低下させる任意のエピトープを標的とする、抗体が挙げられる。そのようなエピトープは、ＴＧＦβタンパク質（たとえばＴＧＦβ１）、成長因子、または抗体によって結合された際に成長因子活性の低下をもたらす他のエピトープのプロドメイン上に位置し得る。本発明の阻害抗体としては、それだけには限定されないがＴＧＦβ１−阻害抗体が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の阻害性抗体は、コンビナトリエピトープ、すなわち抗原または抗原複合体の２つ以上の構成要素／部分によって形成されたエピトープと特異的に結合する。たとえば、コンビナトリアルエピトープは、単一タンパク質の複数の部分からの貢献、すなわち同じタンパク質の複数の非隣接セグメントからのアミノ酸残基によって形成され得る。あるいは、コンビナトリアルエピトープは、抗原複合体の複数のタンパク質構成要素からの貢献によって形成され得る。一部の実施形態では、本開示の阻害性抗体は、コンフォメーションエピトープ（またはコンホメーション特異的エピトープ）、たとえば、抗原または抗原複合体の三次元構造（すなわちコンホメーション）に感受性のあるエピトープと特異的に結合する。
【０３２６】
ＴＧＦβシグナル伝達を拮抗するための従来の手法は、ｉ）既に活性となった後に成熟成長因子を直接中和して、受容体結合に利用可能な遊離リガンド（たとえばその潜在型前駆体複合体から放出されたもの）を枯渇させること、ｉｉ）遊離リガンドを隔離することができる可溶性受容体断片を用いること（たとえばいわゆるリガンド捕捉）、または、ｉｉｉ）その細胞表面受容体を、リガンド−受容体の相互作用を遮断するように標的化させることであった。これらの慣用の手法のそれぞれは、内在性対応物と競合するために拮抗剤を必要とする。さらに、上記の最初の２つの手法（ｉおよびｉｉ）は、一過性の種である活性リガンドを標的とする。したがって、そのような拮抗剤は、短い時間ウィンドウの間に内在性受容体と動力学的に競合して勝つことができなければならない。３つ目の手法は比較するとより永続的な効果を提供し得るが、多くの成長因子（たとえば２０個まで）が同じ受容体を介してシグナル伝達を行うため、故意ではなく望まない阻害効果（それ故、場合によっては毒性）をもたらす。
【０３２７】
これらの欠点に対する解決策を提供するために、かつより高い選択性および局在化された作用をさらに可能にするために、本明細書中に記載のものなどの阻害性抗体の根底にある（ｕｎｄｅｒｌｉｎｉｎｇ）好ましい作用機構は、ＴＧＦβ１の活性化およびリガンド−受容体の相互作用の上流で作用する。したがって、本発明を実施するために適切な高親和性のＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤は、活性化ステップをその根源（疾患微小環境、たとえばＴＭＥにおいてなど）で遮断するために、好ましくは、不活性（たとえば潜在型）前駆体ＴＧＦβ１複合体（たとえば前駆／潜在型ＴＧＦβ１を含む複合体）を、その活性化の前に標的とするべきであることが企図される。本発明の好ましい実施形態によれば、そのような阻害剤は、受容体結合に一過的に利用可能な遊離リガンドではなく、ＥＣＭ関連および細胞表面に繋留されている前駆／潜在型ＴＧＦβ１複合体の両方を等価な親和性で標的とする。
【０３２８】
可溶性の活性種（すなわち供給源から放出された後の成熟成長因子）の対照として、組織／細胞に繋留されている複合体を根源で局所的に標的化することの利点は、最近の研究によってさらに支持されている。Ｉｓｈｉｈａｒａら、（Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、１１、ｅａａｕ３２５９（２０１９年）、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ」）は、全身投与した薬物を、コラーゲン結合部分とコンジュゲートさせることによって腫瘍部位に標的化させた場合、これらは、標的化されていない対応物と比較して、抗腫瘍免疫を増強させ、処置関連の毒性を低下させることができたことを報告している。
【０３２９】
本開示の抗体によって達成される作用機構は、増強された効果の永続性、ならびに全体的により高い効力および安全性にさらに寄与し得る。
【０３３０】
興味深いことに、これらの抗体は、細胞関連ＴＧＦβ１（ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１およびＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１）に対して追加の阻害活性を発揮し得る。本出願人は、ＬＲＲＣ３３結合抗体は細胞表面ＬＲＲＣ３３と結合した際に内部移行される傾向にあることを見出した。内部移行が抗体結合によって能動的に誘導されるものであるか、あるいは、この現象がマクロファージの天然の（たとえば受動的な）エンドサイトーシス活性からもたらされるものであるかは、不明確である。しかし、高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤、Ａｂ６は、ＬＲＲＣ３３および前駆ＴＧＦβ１を形質移入した細胞において迅速に内部移行されることができ、Ａｂ６で達成される内部移行率は、細胞表面ＬＲＲＣ３３を認識する参照抗体で達成されるものよりも有意に高い（図６）。同様の結果が初代ヒトマクロファージから得られている。これらの観察は、Ａｂ６が、その標的、ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１と結合した際に内部移行を誘導し、それによってＬＲＲＣ３３含有複合体を細胞表面から除去することができるという可能性を高める。疾患座位では、これは、活性化可能な潜在型ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１レベルの利用可能度を低下させ得る。したがって、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、２つの平行した作用機構を介してＴＧＦβ１のＬＲＲＣ３３アームを阻害し得る：ｉ）潜在型複合体からの成熟成長因子の放出を遮断すること、および、ｉｉ）内部移行を介してＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体を細胞表面から除去すること。類似の阻害性の作用機構がＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１に適用され得ることが可能である。
【０３３１】
一部の実施形態では、抗体は、酸性ｐＨ（約５のｐＨなど）でよりも中性ｐＨ（約７のｐＨなど）で、より高い親和性でその抗原と結合する、ｐＨ感受性抗体である。そのような抗体は、中性または生理的条件よりも酸性条件で、より高い解離速度を有し得る。たとえば、酸性ｐＨで測定された解離速度と中性ｐＨで測定された解離速度との比（たとえばｐＨ５でのＫオフ／ｐＨ７でのＫオフ）は、少なくとも１．２であり得る。任意選択で（Ｏｐｏｔｏｉｎａｌｌｙ）、比は少なくとも１．５である。一部の実施形態では、比は少なくとも２である。そのようなｐＨ感受性抗体はリサイクリング抗体として有用であり得る。細胞表面上での標的会合の際、抗体は、膜結合前駆ＴＧＦβ１複合体（ＬＲＲＣ３３またはＧＡＲＰと会合）の抗体依存性（ｄｅｐｅｎｄｎｅｔ）内部移行（それ故、その除去）を始動させ得る。続いて、リソソームなどの酸性の細胞内区画においては、抗体−抗原（ａｎｉｔｇｅｎ）複合体が解離し、遊離抗体が細胞外ドメインへと輸送し戻され得る。
【０３３２】
したがって、一部の実施形態では、治療的使用のための抗体または抗原結合断片の選択は、抗体依存性内部移行および／または抗体のｐＨ依存性を誘導する能力に部分的に基づき得る。
【０３３３】
抗原複合体およびその構成要素
本開示の新規抗体は、ＴＧＦβ１の活性化を選択的に阻害する、４つの既知のヒトの大型潜在性複合体（たとえば、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）のそれぞれと特異的に結合する。好ましい抗体は、表１に記載のカテゴリー１〜５のうちの１つまたは複数の基準をさらに満たす。
【０３３４】
そのような抗体のスクリーニング（たとえば同定および選択）は、典型的には組換えによって生成される、適切な抗原複合体の使用を含む。そのような抗原複合体を含み得る有用なタンパク質構成要素を提供し、ＴＧＦβアイソフォームならびに関連するポリペプチド、断片、および変異体、提示分子（たとえば、ＬＴＢＰ、ＧＡＲＰ、ＬＲＲＣ３３）ならびに関連するポリペプチド、断片、および変異体が挙げられる。これらの構成要素を、発現させ、精製し、タンパク質複合体（大型潜在型複合体など）を形成させてよく、これを抗体スクリーニングの工程において使用することができる。スクリーニングとしては、望ましい結合剤が結合剤および非結合剤のプールまたはライブラリから選択される陽性選択、および望ましくない結合剤がプールから除去される陰性選択を挙げ得る。典型的には、選択される結合剤が両方のそのような生物学的コンテキストに親和性を有することを確実にするために、少なくとも１つのマトリックス関連複合体（たとえば、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１および／またはＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１）ならびに少なくとも１つの細胞関連複合体（たとえばＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１および／またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）を陽性スクリーニングに含めた。
【０３３５】
一部の実施形態では、ＴＧＦβ１は天然に存在する哺乳動物アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１は天然に存在するヒトアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１は、ヒト、サル、ラット、またはマウスのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分はＴＧＦβ２と特異的に結合しない。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分はＴＧＦβ３と特異的に結合しない。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分はＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３と特異的に結合しない。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含むＴＧＦβ１と特異的に結合する。ＴＧＦβ２のアミノ酸配列、およびＴＧＦβ３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３８および３２に記載されている。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、天然に存在しないアミノ酸配列（本明細書中で別名天然に存在しないＴＧＦβ１とも呼ばれる）を含むＴＧＦβ１と特異的に結合する。たとえば、天然に存在しないＴＧＦβ１は、天然に存在するＴＧＦβ１アミノ酸配列と比べて、１つまたは複数の組換えによって作製された突然変異を含み得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ３アミノ酸配列は、表１４に示す配列番号２４〜３５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ３アミノ酸配列は、表１５に示す配列番号３６〜４３に記載のアミノ酸配列を含む。
【０３３６】
ＴＧＦβ１（プロドメイン＋成長因子ドメイン）  ＬＳＴＣＫＴＩＤＭＥＬＶＫＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬＡＬＹＮＳＴＲＤＲＶＡＧＥＳＡＥＰＥＰＥＰＥＡＤＹＹＡＫＥＶＴＲＶＬＭＶＥＴＨＮＥＩＹＤＫＦＫＱＳＴＨＳＩＹＭＦＦＮＴＳＥＬＲＥＡＶＰＥＰＶＬＬＳＲＡＥＬＲＬＬＲＬＫＬＫＶＥＱＨＶＥＬＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲＹＬＳＮＲＬＬＡＰＳＤＳＰＥＷＬＳＦＤＶＴＧＶＶＲＱＷＬＳＲＧＧＥＩＥＧＦＲＬＳＡＨＣＳＣＤＳＲＤＮＴＬＱＶＤＩＮＧＦＴＴＧＲＲＧＤＬＡＴＩＨＧＭＮＲＰＦＬＬＬＭＡＴＰＬＥＲＡＱＨＬＱＳＳＲＨＲＲＡＬＤＴＮＹＣＦＳＳＴＥＫＮＣＣＶＲＱＬＹＩＤＦＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴＱＹＳＫＶＬＡＬＹＮＱＨＮＰＧＡＳＡＡＰＣＣＶＰＱＡＬＥＰＬＰＩＶＹＹＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬＳＮＭＩＶＲＳＣＫＣＳ（配列番号２４）
【０３３７】
ＴＧＦβ２（プロドメイン＋成長因子ドメイン）ＳＬＳＴＣＳＴＬＤＭＤＱＦＭＲＫＲＩＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＫＬＴＳＰＰＥＤＹＰＥＰＥＥＶＰＰＥＶＩＳＩＹＮＳＴＲＤＬＬＱＥＫＡＳＲＲＡＡＡＣＥＲＥＲＳＤＥＥＹＹＡＫＥＶＹＫＩＤＭＰＰＦＦＰＳＥＮＡＩＰＰＴＦＹＲＰＹＦＲＩＶＲＦＤＶＳＡＭＥＫＮＡＳＮＬＶＫＡＥＦＲＶＦＲＬＱＮＰＫＡＲＶＰＥＱＲＩＥＬＹＱＩＬＫＳＫＤＬＴＳＰＴＱＲＹＩＤＳＫＶＶＫＴＲＡＥＧＥＷＬＳＦＤＶＴＤＡＶＨＥＷＬＨＨＫＤＲＮＬＧＦＫＩＳＬＨＣＰＣＣＴＦＶＰＳＮＮＹＩＩＰＮＫＳＥＥＬＥＡＲＦＡＧＩＤＧＴＳＴＹＴＳＧＤＱＫＴＩＫＳＴＲＫＫＮＳＧＫＴＰＨＬＬＬＭＬＬＰＳＹＲＬＥＳＱＱＴＮＲＲＫＫＲＡＬＤＡＡＹＣＦＲＮＶＱＤＮＣＣＬＲＰＬＹＩＤＦＫＲＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＮＡＮＦＣＡＧＡＣＰＹＬＷＳＳＤＴＱＨＳＲＶＬＳＬＹＮＴＩＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＳＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＩＧＫＴＰＫＩＥＱＬＳＮＭＩＶＫＳＣＫＣＳ（配列番号２８）
【０３３８】
ＴＧＦβ３（プロドメイン＋成長因子ドメイン）ＳＬＳＬＳＴＣＴＴＬＤＦＧＨＩＫＫＫＲＶＥＡＩＲＧＱＩＬＳＫＬＲＬＴＳＰＰＥＰＴＶＭＴＨＶＰＹＱＶＬＡＬＹＮＳＴＲＥＬＬＥＥＭＨＧＥＲＥＥＧＣＴＱＥＮＴＥＳＥＹＹＡＫＥＩＨＫＦＤＭＩＱＧＬＡＥＨＮＥＬＡＶＣＰＫＧＩＴＳＫＶＦＲＦＮＶＳＳＶＥＫＮＲＴＮＬＦＲＡＥＦＲＶＬＲＶＰＮＰＳＳＫＲＮＥＱＲＩＥＬＦＱＩＬＲＰＤＥＨＩＡＫＱＲＹＩＧＧＫＮＬＰＴＲＧＴＡＥＷＬＳＦＤＶＴＤＴＶＲＥＷＬＬＲＲＥＳＮＬＧＬＥＩＳＩＨＣＰＣＨＴＦＱＰＮＧＤＩＬＥＮＩＨＥＶＭＥＩＫＦＫＧＶＤＮＥＤＤＨＧＲＧＤＬＧＲＬＫＫＱＫＤＨＨＮＰＨＬＩＬＭＭＩＰＰＨＲＬＤＮＰＧＱＧＧＱＲＫＫＲＡＬＤＴＮＹＣＦＲＮＬＥＥＮＣＣＶＲＰＬＹＩＤＦＲＱＤＬＧＷＫＷＶＨＥＰＫＧＹＹＡＮＦＣＳＧＰＣＰＹＬＲＳＡＤＴＴＨＳＴＶＬＧＬＹＮＴＬＮＰＥＡＳＡＳＰＣＣＶＰＱＤＬＥＰＬＴＩＬＹＹＶＧＲＴＰＫＶＥＱＬＳＮＭＶＶＫＳＣＫＣＳ（配列番号３２）
表１４．例示的なＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３のアミノ酸配列
2021531254.tif 000022
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表１５．例示的な非ヒトアミノ酸配列
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【０３３９】
一部の実施形態では、抗原タンパク質複合体（たとえばＬＴＢＰ−ＴＧＦβ１複合体）は、ＬＴＢＰタンパク質（たとえば、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ２、ＬＴＢＰ３、およびＬＴＢＰ４）、ＧＡＲＰタンパク質、ＬＲＲＣ３３タンパク質、またはその断片などの１つまたは複数の提示分子を含み得る。典型的には、本明細書中に開示されている実施形態を実施するために適切な最小所要断片は、前駆ＴＧＦβ１複合体とジスルフィド結合を形成することができる少なくとも２つのシステイン残基を含む提示分子タンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む。具体的には、これらのＣｙｓ残基は、前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれの単量体のＮ末端付近に存在するシステイン残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）と共有結合を形成する。前駆ＴＧＦβ１二量体複合体の三次元構造において、それぞれの単量体のＮ末端のいわゆる「アルファ−１ヘリックス」は互いに近接近し（たとえば、図１８Ｂ、構造の下部付近のグレーの２つのヘリックスを参照）、提示分子中に存在する対応するシステインの対と生産的な共有結合を形成するために必要な２つのシステイン残基（それぞれのヘリックスから１つずつ）間の距離を設定する（たとえばＣｕｅｎｄｅら、（２０１５年）、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．、７：２８４ｒａ５６を参照）。したがって、提示分子の断片を使用してスクリーニング工程（たとえば、免疫化、ライブラリスクリーニング、同定、および選択）におけるＬＬＣを形成する場合、そのような断片は、生じるＬＬＣの正しいコンホメーションを保存するために、前駆ＴＧＦβ１複合体との適切なジスルフィド結合形成を可能にする、正しい距離によって隔てられたシステイン残基を含むべきである。たとえば、ＬＴＢＰ（たとえば、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、およびＴＢＰ４）は、前駆ＴＧＦβ１との共有的相互作用を媒介するために「システインに富んだドメイン」を含有し得る。
【０３４０】
本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体と結合することができる。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質は天然に存在するタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質は天然に存在しないタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質は組換えタンパク質である。そのような組換えＬＴＢＰ１タンパク質は、ＬＴＢＰ１、その選択的スプライシングされた変異体、および／またはその断片を含み得る。組換えＬＴＢＰ１タンパク質は、１つまたは複数の検出可能な標識を含むように修飾されていてもよい。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質はリーダー配列（たとえばネイティブまたは非ネイティブのリーダー配列）を含む。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質はリーダー配列を含まない（すなわちリーダー配列はプロセッシングまたは切断されている）。そのような検出可能な標識としては、それだけには限定されないが、ビオチン標識、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、および／または蛍光タグを挙げ得る。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質は哺乳動物ＬＴＢＰ１タンパク質である。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質はヒト、サル、マウス、またはラットのＬＴＢＰ１タンパク質である。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質は、表１５中の配列番号４６および４７に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質は、表１７中の配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含む。
【０３４１】
本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体と結合することができる。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３タンパク質は天然に存在するタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３タンパク質は天然に存在しないタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３タンパク質は組換えタンパク質である。そのような組換えＬＴＢＰ３タンパク質は、ＬＴＢＰ３、その選択的スプライシングされた変異体、および／またはその断片を含み得る。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３タンパク質はリーダー配列（たとえばネイティブまたは非ネイティブのリーダー配列）を含む。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３タンパク質はリーダー配列を含まない（すなわちリーダー配列はプロセッシングまたは切断されている）。組換えＬＴＢＰ３タンパク質は、１つまたは複数の検出可能な標識を含むように修飾されていてもよい。そのような検出可能な標識としては、それだけには限定されないが、ビオチン標識、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、および／または蛍光タグを挙げ得る。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３タンパク質は哺乳動物ＬＴＢＰ３タンパク質である。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３タンパク質はヒト、サル、マウス、またはラットのＬＴＢＰ３タンパク質である。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ３タンパク質は、表１５中の配列番号４４および４５に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１タンパク質は、表１７中の配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む。
【０３４２】
本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体と結合することができる。一部の実施形態では、ＧＡＲＰタンパク質は天然に存在するタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、ＧＡＲＰタンパク質は天然に存在しないタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、ＧＡＲＰタンパク質は組換えタンパク質である。そのようなＧＡＲＰは組換えであってよく、本明細書中で組換えＧＡＲＰと呼ぶ。一部の組換えＧＡＲＰは、野生型ＧＡＲＰと比較して１つまたは複数の修飾、切断、および／または突然変異を含み得る。組換えＧＡＲＰは可溶性となるように修飾し得る。一部の実施形態では、ＧＡＲＰタンパク質はリーダー配列（たとえばネイティブまたは非ネイティブのリーダー配列）を含む。一部の実施形態では、ＧＡＲＰタンパク質はリーダー配列を含まない（すなわちリーダー配列はプロセッシングまたは切断されている）。他の実施形態では、組換えＧＡＲＰは、１つまたは複数の検出可能な標識を含むように修飾されている。さらなる実施形態では、そのような検出可能な標識としては、それだけには限定されないが、ビオチン標識、ポリヒスチジンタグ、フラグタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、および／または蛍光タグを挙げ得る。一部の実施形態では、ＧＡＲＰタンパク質は哺乳動物ＧＡＲＰタンパク質である。一部の実施形態では、ＧＡＲＰタンパク質はヒト、サル、マウス、またはラットのＧＡＲＰタンパク質である。一部の実施形態では、ＧＡＲＰタンパク質は、表１５中の配列番号４８〜４９に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＧＡＲＰタンパク質は、表１８中の配列番号５２および５３に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、コンテキスト依存性の様式でＴＧＦβ１と結合しない、たとえば、ＴＧＦβ１との結合は、ＴＧＦβ１分子がＧＡＲＰなどの特定の提示分子と複合体形成した場合にのみ起こる。その代わりに、抗体およびその抗原結合部分は、ＴＧＦβ１とコンテキスト非依存性の様式で結合する。言い換えれば、抗体またはその抗原結合部分は、任意の提示分子、すなわち、ＧＡＲＰ、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、および／またはＬＲＣＣ３３と結合している場合に、ＴＧＦβ１と結合する。
【０３４３】
本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、ＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と結合することができる。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３タンパク質は天然に存在するタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３タンパク質は天然に存在しないタンパク質またはその断片である。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３タンパク質は組換えタンパク質である。そのようなＬＲＲＣ３３は組換えであってよく、本明細書中で組換えＬＲＲＣ３３と呼ぶ。一部の組換えＬＲＲＣ３３タンパク質は、野生型ＬＲＲＣ３３と比較して１つまたは複数の修飾、切断、および／または突然変異を含み得る。組換えＬＲＲＣ３３タンパク質は可溶性となるように修飾し得る。たとえば、一部の実施形態では、可溶性ＬＲＲＣ３３タンパク質を発現させるために、ＬＲＲＣ３３の外部ドメインをＣ末端Ｈｉｓタグと共に発現させ得る（ｓＬＲＲＣ３３、たとえば配列番号８４を参照）。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３タンパク質はリーダー配列（たとえばネイティブまたは非ネイティブのリーダー配列）を含む。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３タンパク質はリーダー配列を含まない（すなわちリーダー配列はプロセッシングまたは切断されている）。他の実施形態では、組換えＬＲＲＣ３３タンパク質は、１つまたは複数の検出可能な標識を含むように修飾されている。さらなる実施形態では、そのような検出可能な標識としては、それだけには限定されないが、ビオチン標識、ポリヒスチジンタグ、フラグタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、および／または蛍光タグを挙げ得る。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３タンパク質は哺乳動物ＬＲＲＣ３３タンパク質である。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３タンパク質はヒト、サル、マウス、またはラットのＬＲＲＣ３３タンパク質である。一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３タンパク質は、表１８中の配列番号８３、８４、および１０１に記載のアミノ酸配列を含む。
表１７．例示的なＬＴＢＰアミノ酸配列
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表１８．例示的なＧＡＲＰおよびＬＲＲＣ３３アミノ酸配列
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【０３４４】
医薬組成物および配合物
本発明は、ヒトおよび非ヒト対象における投与に適切な医薬品として使用する医薬組成物をさらに提供する。本発明によって包含される１つまたは複数の高親和性のコンテキスト非依存性抗体を、たとえば緩衝剤を含めた薬学的に許容される担体（賦形剤）と共に配合または混合して、医薬組成物を形成することができる。そのような配合物は、ＴＧＦβシグナル伝達に関与する疾患または障害の処置に使用し得る。特に好ましい実施形態では、そのような配合物は、免疫腫瘍学的応用に使用し得る。
【０３４５】
本発明の医薬組成物は、ＴＧＦβ関連の適応症（たとえば、線維症、免疫障害、および／または癌）を緩和させるために患者に投与し得る。「許容される」とは、担体が、組成物の活性成分と適合性があり（かつ、好ましくは、活性成分を安定化させることができる）、処置する対象に対して有害でないことを意味する。緩衝剤を含めた薬学的に許容される賦形剤（担体）の例は当業者には明らかであろうし、または以前に記載されているであろう。たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（２０００年）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編を参照。一例では、本明細書中に記載の医薬組成物は、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する複数の抗体を含有し、抗体は複合体の異なるエピトープ／残基を認識する。
【０３４６】
本方法において使用する医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤を含むことができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版（２０００年）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０個未満の残基）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属錯体（たとえばＺｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。薬学的に許容される賦形剤は本明細書中にさらに記載されている。
【０３４７】
本発明は、本発明による抗体またはその断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も含む。
【０３４８】
したがって、抗体またはそのような抗体の抗原結合断片を含む分子を、ヒト投与に適切な医薬組成物へと配合することができる。
【０３４９】
医薬配合物は１つまたは複数の賦形剤を含み得る。一部の実施形態では、賦形剤は以下に提供するリストから選択し得る：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｃｄｅｒ／ｉｉｇ／ｉｎｄｅｘ．Ｃｆｍ？ｅｖｅｎｔ＝ｂｒｏｗｓｅＢｙＬｅｔｔｅｒ．ｐａｇｅ＆Ｌｅｔｔｅｒ＝Ａ
【０３５０】
医薬組成物は、典型的には、活性生物剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）（たとえば、モノクローナル抗体、抗原結合断片を含む操作した結合分子など）の最終濃度が約２ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬとなるように配合する。たとえば、配合物の最終濃度（重量／体積）は、約２〜２００、２〜１８０、２〜１６０、２〜１５０、２〜１２０、２〜１００、２〜８０、２〜７０、２〜６０、２〜５０、２〜４０、５〜２００、５〜１８０、５〜１６０、５〜１５０、５〜１２０、５〜１００、５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、１０〜２００、１０〜１８０、１０〜１６０、１０〜１５０、１０〜１２０、１０〜１００、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、２０〜２００、２０〜１８０、２０〜１６０、２０〜１５０、２０〜１２０、２０〜１００、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、３０〜２００、３０〜１８０、３０〜１６０、３０〜１５０、３０〜１２０、３０〜１００、３０〜８０、３０〜７０、３０〜６０、３０〜５０、３０〜４０、４０〜２００、４０〜１８０、４０〜１６０、４０〜１５０、４０〜１２０、４０〜１００、４０〜８０、４０〜７０、４０〜６０、４０〜５０、５０〜２００、５０〜１８０、５０〜１６０、５０〜１５０、５０〜１２０、５０〜１００、５０〜８０、５０〜７０、５０〜６０、６０〜２００、６０〜１８０、６０〜１６０、６０〜１５０、６０〜１２０、６０〜１００、６０〜８０、６０〜７０、７０〜２００、７０〜１８０、７０〜１６０、７０〜１５０、７０〜１２０、７０〜１００、７０〜８０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。一部の実施形態では、配合物中の生物剤の最終濃度は、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｍｇ／ｍＬである。
【０３５１】
本発明の医薬組成物は、好ましくは適切な緩衝剤を用いて配合する。適切な緩衝剤としては、それだけには限定されないが、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、およびヒスチジン緩衝剤が挙げられる。
【０３５２】
配合物の最終ｐＨは典型的にはｐＨ５．０〜８．０である。たとえば、医薬組成物のｐＨは約５．０、５．２、５．５、６．０、６．２、６．５、６．８、７．０、７．２、７．４、７．５、７．６、または７．８であり得る。
【０３５３】
本開示の医薬組成物は、非イオン性洗剤などの、医薬配合物における使用について認可されている界面活性剤を含み得る。そのような界面活性剤としては、たとえば、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）、およびＮＰ−４０などのポリソルベートが挙げられる。
【０３５４】
本開示の医薬組成物は安定化剤を含み得る。液状タンパク質調製物では、ｐＨ緩衝塩を選択することによって安定性を増強させることができ、多くの場合、アミノ酸を使用することもできる。タンパク質の吸着およびアンフォールディングの後に凝集をもたらすのは、多くの場合は液体／空気の界面または液体／固体の界面（梱包材との界面）での相互作用である。適切な安定化剤としては、それだけには限定されないが、スクロース、マルトース、ソルビトール、ならびにヒスチジン、グリシン、メチオニン、およびアルギニンなどの特定のアミノ酸が挙げられる。
【０３５５】
本開示の医薬組成物は、以下の賦形剤のうちの１つまたは任意の組合せを含有し得る：リン酸ナトリウム、アルギニン、スクロース、塩化ナトリウム、トロメタミン、マンニトール、ベンジルアルコール、ヒスチジン、スクロース、ポリソルベート８０、クエン酸ナトリウム、グリシン、ポリソルベート２０、トレハロース、ポロキサマー１８８、メチオニン、トレハロース、ｒｈヒアルロニダーゼ、コハク酸ナトリウム、リン酸カリウム、エデト酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マルトース、酢酸ヒスチジン、ソルビトール、ペンテト酸、ヒト血清アルブミン、ペンテト酸。
【０３５６】
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は保存料を含有し得る。
【０３５７】
本開示の医薬組成物は、典型的には液体または凍結乾燥形態として提示する。典型的には、生成物はバイアル（たとえばガラスバイアル）中で提示することができる。シリンジ、ペン、または自動注入器中で利用可能な生成物は、これらの容器／閉鎖系中の事前に満たされた液体として提示し得る。
【０３５８】
一部の例では、本明細書中に記載の医薬組成物は、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８頁（１９８５年）、Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０頁（１９８０年）、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されているものなどの任意の適切な方法によって調製することができる、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体を含有するリポソームを含む。増強された循環時間を有するリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、逆相蒸発方法によって、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて作製することができる。リポソームは、定義された孔径のフィルターを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームが得られる。
【０３５９】
一部の実施形態では、医薬組成物を特定の組織または細胞種に優先的に送達するまたは局在化させるために、標的化特性を有するリポソームを選択する。たとえば、骨髄標的化特性を有する特定のナノ粒子に基づく担体を用いてよく、たとえば脂質に基づくナノ粒子またはリポソームである。たとえばＳｏｕ（２０１２年）、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ」、ＲｅｓｅａｒｃｈＧａｔｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、２３２７２５１０９を参照されたい。
【０３６０】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、アジュバントを含み得るまたはそれと併せて使用し得る。特定のアジュバントが、たとえば腫瘍抗原に対する対象の免疫応答をブーストし、Ｔエフェクター機能、単球からのＤＣ分化、ＡＰＣによる増強された抗原の取り込みおよび提示などを容易にすることができることが企図される。適切なアジュバントとしては、それだけには限定されないが、レチノイン酸に基づくアジュバントおよびその誘導体、ＭＦ５９および他のスクアレン含有アジュバントなどの水中油乳濁液に基づくアジュバント、トール様受容体（ＴＲＬ）リガンド（たとえばＣｐＧ）、α−トコフェロール（ビタミンＥ）およびその誘導体が挙げられる。
【０３６１】
本明細書中に記載の抗体は、たとえばコアセルベーション技法もしくは界面重合によって調製したマイクロカプセル、たとえばそれぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマイクロエマルジョン中に封入させてもよい。例示的な技法は以前に記載されており、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）を参照されたい。
【０３６２】
他の例では、本明細書中に記載の医薬組成物は持続放出様式で配合することができる。持続放出調製物の適切な例としては、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、造形品、たとえば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態であるマトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、酢酸スクロースイソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０３６３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する医薬組成物は無菌的でなければならない。これは、たとえば無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。治療的抗体組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器、たとえば、静脈内注射溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアル内に配置する。
【０３６４】
本明細書中に記載の医薬組成物は、経口、非経口、もしくは直腸投与、または吸入もしくはガス注入による投与のための、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、顆粒、液剤もしくは懸濁剤、または坐薬などの単位剤形であることができる。
【０３６５】
適切な界面活性剤としては、特に、ポリオキシエチレンソルビタン（たとえば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）ならびに他のソルビタン（たとえば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）などの非イオン性薬剤が挙げられる。界面活性剤を有する組成物は、好都合には０．０５〜５％の界面活性剤を含み、０．１〜２．５％であることができる。必要な場合は、他の成分、たとえば、マンニトールまたは他の薬学的に許容されるビヒクルを加え得ることが理解されよう。
【０３６６】
適切な乳濁液は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの市販の脂肪乳濁液を使用して調製し得る。活性成分は、事前混合した乳濁液組成物中に溶けていてもよく、あるいは、これは油（たとえば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、またはアーモンド油）中に溶けており、リン脂質（たとえば、卵リン脂質、ダイズリン脂質、またはダイズレシチン）および水と混合した際に乳濁液が形成されてもよいかのどちらかである。乳濁液の等張性を調節するために、他の成分、たとえば、グリセロールまたはグルコースを加え得るが理解されよう。適切な乳濁液は、典型的には２０％までの油、たとえば５〜２０％を含有する。
【０３６７】
乳濁液組成物は、本発明の抗体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその構成要素（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製したものであることができる。
【０３６８】
ＴＧＦβ関連の適応症の検出、モニタリング、および緩和のために使用するキット
本開示は、ＴＧＦβ関連の適応症に関連する疾患／障害を緩和させることにおいて使用するためのキットも提供する。そのようなキットとしては、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分、たとえば本明細書中に記載したもののうちの任意のものを含む、１つまたは複数の容器を挙げることができる。
【０３６９】
一部の実施形態では、キットは、本明細書中に記載の方法のうちの任意のものに従った使用説明書を含むことができる。含まれる説明書は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合して、本明細書中に記載のものなどの標的疾患を処置する、その発症を遅延させる、または緩和させるための、抗体またはその抗原結合部分の投与の説明を含むことができる。キットは、その個体が標的疾患を有するかどうかを同定することに基づいて、処置に適した個体を選択することの説明をさらに含み得る。さらに他の実施形態では、説明書は、抗体またはその抗原結合部分を、標的疾患の危険性にある個体に投与することの説明を含む。
【０３７０】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分の使用に関する説明書は、一般に、意図する処置のための投薬量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルク梱包（たとえば複数用量梱包）、または部分単位用量であり得る。本開示のキット中に供給する説明書は、典型的にはラベルまたは添付文書（たとえばキット中に含まれる紙のシート）上の書面の説明書であるが、機器で読み取り可能な説明書（たとえば磁気または光学記憶ディスク上に保持される説明書）も許容される。
【０３７１】
ラベルまたは添付文書は、組成物を、ＴＧＦβ関連の適応症に関連する疾患または障害を処置する、その発症を遅延させる、および／または緩和させるために使用することを示す。説明書は、本明細書中に記載の方法のうちの任意のものを実施するために提供し得る。
【０３７２】
本開示のキットは適切な梱包材中にある。適切な梱包材としては、それだけには限定されないが、バイアル、ボトル、広口瓶、柔軟な梱包材（たとえば密封したマイラーまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。吸入器、経鼻投与装置（たとえば噴霧器）、またはミニポンプなどの輸液装置等の特定の装置と組み合わせて使用するための梱包も企図される。キットは無菌アクセスポートを有し得る（たとえば、容器は静脈内注射溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであり得る）。容器も無菌アクセスポートを有し得る（たとえば、容器は静脈内注射溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書中に記載のものなどのＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分である。
【０３７３】
キットは、緩衝剤および解釈情報などの追加の構成要素を任意選択で提供し得る。通常、キットは、容器と容器上またはそれに付随するラベルまたは添付文書とを含む。一部の実施形態では、本開示は、上述のキットの内容物を含む製品を提供する。
【０３７４】
ＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム特異的阻害剤のスクリーニング、同定、および製造の工程
本発明は、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと等価な親和性で結合することができる抗体またはその断片のスクリーニング／選択方法、生成方法、および製造工程、ならびに医薬組成物およびそれを含む関連キットを包含する。スクリーニング目的のために、ＥＣＭ関連複合体および細胞関連の複合体の両方に対して広範な結合特異性を有する望ましい抗体を同定する確率を最大限にするためにＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体のうちの少なくとも１つならびにＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のうちの少なくとも１つが含まれることが好ましい。スクリーニング工程で同定された抗体またはその断片を、好ましくはさらに試験して、目的のＬＬＣのそれぞれと高い親和性で結合するその能力を確認した。
【０３７５】
数々の方法を、本開示の抗体またはその抗原結合断片を得るために使用し得る。たとえば、抗体は、組換えＤＮＡ方法を使用して生成することができる。モノクローナル抗体も、既知の方法に従ったハイブリドーマの作製によって生成し得る（たとえばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９９頁を参照）。その後、このような様式で形成されたハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（たとえばＯＣＴＥＴ（登録商標）またはＢＩＡＣＯＲＥ）分析などの標準方法を使用してスクリーニングして、指定した抗原と特異的に結合する抗体を生成する１つまたは複数のハイブリドーマを同定する。指定した抗原の任意の形態を免疫原として使用してよく、たとえば、組換え抗原、天然に存在する形態、その任意の変異体または断片、ならびにその抗原ペプチド（たとえば、直線状エピトープとして本明細書中に記載されている、またはコンフォメーションエピトープとして足場内にあるエピトープのうちの任意のもの）である。抗体を作製する１つの例示的な方法としては、抗体またはその断片（たとえばｓｃＦｖ）を発現するタンパク質発現ライブラリ、たとえば、ファージまたはリボソームディスプレイライブラリをスクリーニングすることが挙げられる。ファージディスプレイは、たとえば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号、Ｓｍｉｔｈ（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８：１３１５〜１３１７頁、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８頁、Ｍａｒｋｓら、（１９９１年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７頁、ＷＯ９２／１８６１９号、ＷＯ９１／１７２７１号、ＷＯ９２／２０７９１号、ＷＯ９２／１５６７９号、ＷＯ９３／０１２８８号、ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／０９６９０号、およびＷＯ９０／０２８０９号に記載されている。
【０３７６】
ディスプレイライブラリの使用に加えて、指定した抗原（たとえば提示分子−ＴＧＦβ１複合体）を使用して非ヒト宿主、たとえば、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ラクダ、およびサメなどの非哺乳動物宿主を免疫化することができる。一実施形態では、非ヒト動物はマウスである。
【０３７７】
非ヒト宿主の免疫化は、提示分子（またはその断片）がそれに会合したまたは会合していない前駆ＴＧＦβ１などの免疫原を精製した組換えタンパク質複合体として使用して実施し得る。これらとしては、それだけには限定されないが、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１が挙げられる。会合した提示分子は必ずしも完全長の対応物である必要はないが、好ましくは、前駆ＴＧＦβ１二量体複合体と共有結合を形成する２つのシステイン残基を含む。
【０３７８】
あるいは、非ヒト宿主の免疫化は、細胞に基づく抗原を使用して実施し得る。細胞に基づく抗原という用語とは、前駆ＴＧＦβ１タンパク質複合体を発現する細胞（たとえば異種細胞）をいう。これは、好ましい提示分子の同時発現を任意選択で伴う、前駆ＴＧＦβ１の過剰発現によって達成され得る。一部の実施形態では、内在性対応物を細胞に基づく抗原として利用し得る。前駆ＴＧＦβ１含有タンパク質複合体を形成するタンパク質の細胞表面発現は、ＦＡＣＳなどの周知の方法によって確認し得る。そのような細胞（細胞に基づく抗原）を用いて宿主を免疫化した際、抗原に対する免疫応答が宿主において誘発され、抗体の生成および続くスクリーニングが可能となる。一部の実施形態では、適切なノックアウト動物を使用して、抗原に対するより強力な免疫応答を促進する。あるいは、様々な種間の構造的差異が、宿主において抗体生成を始動させるために十分であり得る。
【０３７９】
別の実施形態では、モノクローナル抗体が非ヒト動物から得られ、その後、適切な組換えＤＮＡ技法を使用して修飾される、たとえばキメラ化される。キメラ抗体を作製するための様々な手法が記載されている。たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：６８５１頁、１９８５年、Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２頁、１９８５年、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号、Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許出願ＥＰ１７１４９６号、欧州特許出願０１７３４９４号、英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂ号を参照されたい。
【０３８０】
追加の抗体生成技法には、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照されたい。本開示は、抗体の任意の特定の供給源、生成方法、または他の特別な特徴に必ずしも限定されない。
【０３８１】
本開示の一部の態様は、ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換させた宿主細胞に関する。宿主細胞は原核または真核細胞であり得る。宿主細胞中に存在するポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得るか、または染色体外に維持され得るかのどちらかである。宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物、またはヒト細胞などの、任意の原核または真核細胞であることができる。一部の実施形態では、真菌細胞は、たとえば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のもの、特に出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種のものである。用語「原核」は、抗体または対応する免疫グロブリン鎖を発現させるためのＤＮＡまたはＲＮＡ分子を用いて形質転換させるまたは形質移入することができる、すべての細菌を含む。原核宿主としては、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのグラム陰性およびグラム陽性細菌を挙げ得る。用語「真核」は、酵母、高等植物、昆虫、および脊椎動物細胞、たとえば、ＮＳＯおよびＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を含む。組換え産生手順に用いる宿主に応じて、ポリヌクレオチドによってコードされている抗体または免疫グロブリン鎖は、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。抗体または対応する免疫グロブリン鎖は、最初のメチオニンアミノ酸残基も含み得る。
【０３８２】
一部の実施形態では、ベクターが適切な宿主内に取り込まれた後、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持してよく、所望する場合は、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体、もしくはインタクト抗体、抗原結合断片または他の免疫グロブリン形態の収集および精製が続き得る。Ｂｅｙｃｈｏｋ、Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、（１９７９年）を参照されたい。したがって、ポリヌクレオチドまたはベクターを細胞内に導入し、立ち代ってこれは抗体または抗原結合断片を生成する。さらに、前述の宿主細胞を含むトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物を、抗体または抗体断片の大スケール生成に使用し得る。
【０３８３】
形質転換させた宿主細胞は、最適な細胞成長を達成するための任意の適切な技法を使用して、発酵槽中で増殖させ、培養することができる。発現された後、全抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、他の免疫グロブリン形態、または抗原結合断片を、硫安塩析、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含めた、当技術分野の標準手順に従って精製することができる。Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９８２年）を参照されたい。その後、抗体または抗原結合断片を成長培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離することができる。たとえば微生物によって発現させた抗体または抗原結合断片の単離および精製は、たとえば、調製用クロマトグラフィー分離、および、たとえば抗体の定常領域に対して向けられているモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の使用に関与するものなどの免疫学的分離等の、任意の慣用の手段によるものであり得る。
【０３８４】
本開示の態様は、無期限に延長されたモノクローナル抗体の供給源を提供するハイブリドーマに関する。免疫グロブリンをハイブリドーマの培養物から直接得ることの代替として、不死化ハイブリドーマ細胞を、続く発現および／または遺伝子操作のための、再編成された重鎖および軽鎖の座位の供給源として使用することができる。再編成された抗体遺伝子は、適切なｍＲＮＡから逆転写してｃＤＮＡを生成することができる。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、異なるアイソタイプのものと交換するか、または完全に排除することができる。可変領域を連結させて単鎖Ｆｖ領域をコードさせることができる。複数のＦｖ領域を連結させて複数の標的に対する結合能力を与えることができるか、またはキメラの重鎖および軽鎖の組合せを用いることができる。任意の適切な方法を抗体可変領域のクローニングおよび組換え抗体の作製に使用し得る。
【０３８５】
一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする適切な核酸を得て、標準の組換え宿主細胞内に形質移入させることができる発現ベクター内に挿入する。様々なそのような宿主細胞を使用し得る。一部の実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、効率的なプロセッシングおよび生成に有利であり得る。この目的に有用な典型的な哺乳動物細胞系としては、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、またはＮＳＯ細胞が挙げられる。抗体または抗原結合断片の生成は、改変された組換え宿主を、宿主細胞の成長およびコード配列の発現に適した培養条件下で培養することによって企て得る。抗体または抗原結合断片は、それらを培養物から単離することによって回収し得る。発現系は、生じる抗体が培地内へと分泌されるようにシグナルペプチドを含むよう設計し得るが、細胞内生成も可能である。
【０３８６】
本開示は、本明細書中に記載の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードしているポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされている可変領域は、上述のハイブリドーマのうちの任意の１つによって生成された、抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【０３８７】
抗体または抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドは、たとえば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成によって生成したＤＮＡもしくはＲＮＡ、あるいは、これらのポリヌクレオチドのうちの任意のものを単独でまたは組み合わせてのどちらかで含む、組換えによって生成したキメラ核酸分子であり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはベクターの一部である。そのようなベクターは、適切な宿主細胞および適切な条件下におけるベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含み得る。
【０３８８】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、原核または真核細胞発現を可能にする発現制御配列と作動可能に連結している。ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドから翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞における発現を確実にする調節要素は当業者に周知である。これには、転写の開始を促進する調節配列、ならびに、任意選択で、転写の終結および転写物の安定化を促進するポリＡシグナルを挙げ得る。追加の調節要素としては、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサー、ならびに／または自然で関与しているもしくは異種のプロモーター領域を挙げ得る。原核宿主細胞中での発現を許可する可能な調節要素としては、たとえば、大腸菌におけるＰＬ、Ｌａｃ、Ｔｒｐ、またはＴａｃプロモーターが挙げられ、真核宿主細胞中での発現を許可する調節要素の例は、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーター、または哺乳動物および他の動物細胞におけるＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、もしくはグロビンイントロンである。
【０３８９】
転写の開始を司っている要素の他に、そのような調節要素としては、ポリヌクレオチドの下流のＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位などの転写終結シグナルも挙げ得る。さらに、用いる発現系に応じて、ポリペプチドを細胞区画に向かわせるまたはそれを培地内に分泌させることができるリーダー配列をポリヌクレオチドのコード配列に付加してもよく、以前に記載されている。リーダー配列は、適切な段階において翻訳、開始、および終結配列と共に、好ましくは、翻訳されたタンパク質またはその一部分のたとえば細胞外培地への分泌を指示することができるリーダー配列と共にアセンブルされる。任意選択で、所望の特徴、たとえば、発現された組換え産物の安定化または簡易化された精製を与えるＣまたはＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードしている、異種ポリヌクレオチド配列を使用することができる。
【０３９０】
一部の実施形態では、軽鎖および／または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードしているポリヌクレオチドが、両方の免疫グロブリン鎖または一方のみの可変ドメインをコードしていてよい。同様に、ポリヌクレオチドは、同じプロモーターの制御下にあり得る、または発現のために別々に制御され得る。さらに、一部の態様は、抗体または抗原結合断片の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードしているポリヌクレオチドを、抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードしているポリヌクレオチドと任意選択で組み合わせて含む、遺伝子操作において慣習的に使用されているベクター、特に、プラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージに関する。
【０３９１】
一部の実施形態では、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換させるまたは形質移入することができるベクターにおける真核プロモーターシステムとして提供するが、原核宿主の制御配列も使用し得る。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターを、標的細胞集団内へのポリヌクレオチドまたはベクターの送達に使用し得る（たとえば抗体または抗原結合断片を発現するように細胞を操作するため）。様々な適切な方法を使用して、組換えウイルスベクターを構築することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびベクターを、標的細胞に送達するためのリポソーム内へと再構成することができる。ポリヌクレオチド（たとえば免疫グロブリン鎖コード配列の重鎖および／または軽鎖可変ドメインならびに発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて変動する適切な方法によって、宿主細胞内に移動させることができる。
【０３９２】
スクリーニング方法は、抗体またはその断片の所望の活性を評価または確認するステップを含み得る。一部の実施形態では、このステップは、標的機能を阻害する能力、たとえば、潜在型複合体からの成熟／可溶性成長因子（たとえばＴＧＦβ１）の放出の阻害について選択することを含む。好ましい実施形態では、そのようなステップは、前駆ＴＧＦβ複合体が細胞表面上に発現されている場合に、１つまたは複数の試験抗体の阻害活性を、活性化の際に培地（たとえばアッセイ溶液）中に放出される成長因子のレベルを速成することによってアッセイする、細胞に基づく効力アッセイを含む。培地／溶液中に放出される成長因子のレベルは、たとえばＴＧＦβ活性を測定することによってアッセイすることができる。有用な細胞に基づく効力アッセイの非限定的な例は、本明細書中の実施例２に記載されている。
【０３９３】
一部の実施形態では、望ましい抗体または断片をスクリーニングするステップは、内部移行および続く抗体−抗原複合体の細胞表面からの除去を促進する抗体またはその断片について選択することを含む。一部の実施形態では、このステップは、ＡＤＣＣを誘導する抗体またはその断片について選択することを含む。一部の実施形態では、このステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏで所望の部位（たとえば、細胞種、組織、または臓器）に蓄積する抗体またはその断片について選択することを含む。一部の実施形態では、このステップは、血液脳関門を横切る能力を有する抗体またはその断片について選択することを含む。この方法は、１つまたは複数の抗体またはその断片を最適化して、安定性、結合親和性、機能性（たとえば、阻害活性、Ｆｃ機能など）、免疫原性、ｐＨ感度、および開発性（たとえば、高い溶解度、低い自己会合など）などの基準によって決定して望ましいプロフィールを保有する変異体対応物を提供するステップを任意選択で含む。
【０３９４】
本発明による抗体または断片を含む組成物を作製する工程は、望ましい結合および機能（たとえば阻害）特性を保有すると同定された１つまたは複数の抗体の最適化を含み得る。最適化は抗体またはその断片の親和性成熟を含み得る。さらなる最適化ステップを実施して、治療組成物に有利な物理化学的特性を提供し得る。そのようなステップは、それだけには限定されないが、改善された溶解度、自己凝集の欠如、安定性、ｐＨ感度、Ｆｃ機能などをもたらすために突然変異誘発または操作することを含み得る。生じる最適化された抗体は、好ましくはヒト投与に適切な完全ヒト抗体またはヒト化抗体である。
【０３９５】
そのような抗体またはその断片を含む医薬組成物の製造工程は精製、配合物、無菌濾過、梱包などのステップを含み得る。たとえば、無菌濾過などの特定のステップは、ＦＤＡなどの関連規制当局によって定められた指針に従って行う。そのような組成物は、事前に満たされたシリンジなどの単回使用の容器またはバイアルなどの複数投薬量の容器の形態で入手できるようにされ得る。
【０３９６】
修飾
本開示の抗体またはその抗原結合部分は、それだけには限定されないが、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体を検出および単離するための酵素、補欠分子族、蛍光材料、ルミネセント材料、生物発光性材料、放射性物質、陽電子放出金属、非放射性常磁性金属イオン、および親和性標識を含む、検出可能な標識または検出可能な部分で修飾し得る。検出可能な物質または部分は、適切な技法を使用して、本開示のポリペプチドと直接、または中間体（たとえばリンカー（たとえば切断可能なリンカー）など）を介して間接的にのいずれかで、カップリングまたはコンジュゲートさせ得る。適切な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光材料の非限定的な例としては、ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリスリンが挙げられ、ルミネセント材料の一例としてはルミノールが挙げられ、生物発光性材料の非限定的な例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射性物質の例としては、放射性金属イオン、たとえば、アルファ放射体または他の放射性同位元素、たとえば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、Ｌｕ（１７７Ｌｕ）、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、８６Ｒ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、ジルコニウム（８９Ｚｒ）、ならびにスズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）などが挙げられる。一部の実施形態では、放射標識は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、６８Ｇａ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、および８９Ｚｒからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、有用な標識は、陽電子放出断層撮影によって検出し得る陽電子放出同位体である。検出可能な物質は、適切な技法を使用して、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する本開示の抗体と直接、または中間体（たとえばリンカーなど）を介して間接的にのいずれかで、カップリングまたはコンジュゲートさせ得る。検出可能な物質とコンジュゲートされた本明細書中に提供する抗体のうちの任意のものを、本明細書中に記載のものなどの任意の適切な診断的アッセイに使用し得る。
【０３９７】
さらに、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、薬物を用いて修飾してもよい。薬物は、適切な技法を使用して、本開示のポリペプチドと直接、または中間体（たとえばリンカー（たとえば切断可能なリンカー）など）を介して間接的にのいずれかで、カップリングまたはコンジュゲートさせ得る。
【０３９８】
標的化剤
一部の実施形態では、本開示の方法は、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体からの成熟ＴＧＦβの放出を変調する目的で、本明細書中に開示されている抗体またはその抗原結合部分を、対象における特定の部位に標的化させるための、１つまたは複数の標的化剤の使用を含む。たとえば、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体は、典型的には細胞外マトリックスに局在している。したがって、一部の実施形態では、本明細書中に開示されている抗体は、抗体をＬＴＢＰ関連ＴＧＦβ１複合体が常在する部位に局在化させる目的で、細胞外マトリックス標的化剤とコンジュゲートさせることができる。そのような実施形態では、抗体の選択的標的化はＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体の選択的変調をもたらす。一部の実施形態では、細胞外マトリックス標的化剤としては、ヘパリン結合剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ結合剤、リジルオキシダーゼ結合ドメイン、フィブリリン結合剤、ヒアルロン酸結合剤などが挙げられる。
【０３９９】
同様に、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体は、典型的には細胞の表面に局在化および固定されている。前者は活性化ＦＯＸＰ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上で発現される一方で、後者は特定の骨髄細胞およびＡＭＬなどの一部の癌細胞上で発現される。したがって、一部の実施形態では、本明細書中に開示されている抗体は、抗体をこれらの細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体が常在する部位に局在化させる目的で、免疫細胞（たとえば、Ｔｒｅｇ細胞、活性化マクロファージなど）結合剤とコンジュゲートさせることができる。そのような実施形態では、抗体の選択的標的化は細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体の選択的阻害（たとえば、免疫変調の目的、たとえば癌の処置における成熟ＴＧＦβ１の放出の選択的阻害）をもたらす。そのような実施形態では、免疫細胞標的化剤としては、たとえば、ＣＣＬ２２およびＣＸＣＬ１２タンパク質またはその断片を挙げ得る。
【０４００】
一部の実施形態では、前駆ＴＧＦβ１複合体と選択的に結合する第１の部分および標的部位の構成要素と選択的に結合する第２の部分、たとえば、ＥＣＭの構成要素（たとえばフィブリリン）またはＴｒｅｇ細胞の構成要素（たとえばＣＴＬＡ−４）を有する二重特異性抗体を使用し得る。
【０４０１】
本明細書中にさらに詳述するように、本発明は、本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤を、骨髄において造血を促進または回復させるために使用し得ることを企図する。したがって、一部の実施形態では、そのような阻害剤（たとえばＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤）を含む組成物は骨髄を標的にし得る。骨髄標的化を達成する一様式は、骨髄の局在化または蓄積を優先的に標的とする特定の担体の使用である。たとえば、骨髄標的化特性を有する特定のナノ粒子に基づく担体を用いてよく、たとえば、脂質に基づくナノ粒子またはリポソームである。たとえばＳｏｕ（２０１２年）、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ」、ＲｅｓｅａｒｃｈＧａｔｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、２３２７２５１０９を参照されたい。
【０４０２】
一部の実施形態では、標的化剤は、スクアレンおよび／またはα−トコフェロールを含むアジュバントならびにＴＬＲリガンド／作用剤（ＴＬＲ３リガンド／作用剤など）を含むアジュバント等の免疫増強剤を含む。たとえば、スクアレン含有アジュバントは、単球、マクロファージ、および抗原提示細胞などの特定の免疫細胞を優先的に標的化して、プライミング、抗原プロセッシング、および／または免疫細胞分化を増強させ、宿主免疫をブーストし得る。一部の実施形態では、そのようなアジュバントは、Ｔ細胞活性化についてのネオエピトープに対する宿主免疫応答を刺激し得る。
【０４０３】
治療標的およびｉｎ  ｖｉｖｏ作用機構
したがって、本明細書中に開示されている高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏシステムなどの任意の適切な生物系においてＴＧＦβ１を阻害するために使用し得る。関連方法は、生物系をＴＧＦβ１阻害剤と接触させることを含み得る。生物系は、アッセイシステム、生体試料、細胞培養物などであり得る。一部の事例では、これらの方法は、生物系における遊離成長因子のレベルの修正を含む。
【０４０４】
したがって、そのような医薬組成物および配合物を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで阻害剤によって接近可能なＴＧＦβ含有潜在型複合体を標的化し得る。したがって、本発明の抗体は、疾患部位（たとえばＴＭＥ）における以下の複合体を標的化することを目的とし、ここで抗体は潜在型複合体と先制して結合し、それによって成長因子が放出されることを防ぐ：ｉ）ＧＡＲＰによって提示される前駆ＴＧＦβ１、ｉｉ）ＬＲＲＣ３３によって提示される前駆ＴＧＦβ１、ｉｉｉ）ＬＴＢＰ１によって提示される前駆ＴＧＦβ１、およびｉｖ）ＬＴＢＰ３によって提示される前駆ＴＧＦβ１。典型的には、上記複合体（ｉ）および（ｉｉ）は、ＧＡＲＰおよびＬＲＲＣ３３はどちらも、ＬＲＲＣ３３を発現する細胞の細胞外面上に潜在型前駆ＴＧＦβ１を固定または繋留することができる膜貫通タンパク質であるため、細胞表面上に存在する一方で、複合体（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は細胞外マトリックスの構成要素である。このようにして、本明細書中で具現化した阻害剤では、阻害効果を発揮するために内在性高親和性受容体との結合を完了（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）する必要性が排除される。さらに、リガンド／受容体の相互作用の上流を標的化することは、より永続的な効果を可能にする場合があり、これは、標的接近可能性のウィンドウは、潜在型複合体から放出された後にのみ一過性の可溶性成長因子を標的とする慣用の阻害剤よりも長く、より関連組織に局在しているためである。したがって、特定のニッチに繋留されている潜在型複合体の標的化は、可溶性（遊離）成長因子としてのその短い半減期、たとえば潜在型複合体が放出された後の約２分間の間に、内在性受容体との結合について競合しなければならない慣用の中和抗体と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて改善された標的会合を促進し得る。
【０４０５】
いくつかの研究がＴＧＦβ１の活性化の機構に光明を投じている。３つのインテグリン、すなわちαＶβ６、αＶβ８、およびαＶβ１が、潜在型ＴＧＦβ１の主要な活性化剤であることが実証されている（Ｒｅｅｄ，Ｎ．Ｉ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１５年、７（２８８）：２８８ｒａ７９頁、Ｔｒａｖｉｓ，Ｍ．Ａ．およびＤ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１４年、３２：５１〜８２頁、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９９年、９６（３）：３１９〜２８頁）。αＶインテグリンは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ１  ＬＡＰに存在するＲＧＤ配列と高い親和性で結合する（Ｄｏｎｇ，Ｘ．ら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０１４年、２１（１２）：１０９１〜６頁）。インテグリン結合を防止するが分泌は防止しないＴＧＦβ１  ＲＧＤ部位における突然変異を有するトランスジェニックマウスは、ＴＧＦβ１−／−マウスを表現型模写する（Ｙａｎｇ，Ｚ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００７年、１７６（６）：７８７〜９３頁）。β６およびβ８インテグリンをどちらも欠くマウスは、多臓器炎症および口蓋裂を含めたＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３ノックアウトマウスのすべての必須表現型を概括し、発生および恒常性におけるＴＧＦβ１の活性化のための、これらの２つのインテグリンの必須の役割を裏付けている（Ａｌｕｗｉｈａｒｅ，Ｐ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ、２００９年、１２２（第２部）：２２７〜３２頁）。潜在型ＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化に重要なのは、提示分子への共有的繋留である。突然変異誘発によるＧＡＲＰとＴＧＦβ１  ＬＡＰとの間のジスルフィド結合の破壊は、複合体形成を損なわせないが、αＶβ６によるＴＧＦβ１の活性化を完全に無効にする（Ｗａｎｇ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、２０１２年、２３（６）：１１２９〜３９頁）。潜在型ＴＧＦβ１の最近の構造研究は、インテグリンがどのように潜在型複合体からの活性ＴＧＦβ１の放出を可能にするかを解明している：潜在型ＴＧＦβ１とその提示分子との共有結合は、潜在型ＴＧＦβ１を、ＬＴＢＰを介してＥＣＭに、またはＧＡＲＰもしくはＬＲＲＣ３３を介して細胞骨格にのどちらかに固定する。ＲＧＤ配列とのインテグリン結合は、ＬＡＰの構造の力依存性変化をもたらし、それにより活性ＴＧＦβ１が放出されて付近の受容体と結合することが可能となる（Ｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、４７４（７３５１）：３４３〜９頁）。疾患におけるインテグリン依存性ＴＧＦβ１の活性化の重要性も十分に妥当性確認されている。αＶβ１の小分子阻害剤はブレオマイシン誘導性肺線維症および四塩化炭素誘導性肝線維症に対して保護し（Ｒｅｅｄ，Ｎ．Ｉ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１５年、７（２８８）：２８８ｒａ７９頁）、抗体を用いたαＶβ６遮断またはインテグリンβ６発現の損失は、ブレオマイシン誘導性肺線維症および放射線誘導性線維症を抑制する（Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ、１９９９年、９６（３）：３１９〜２８頁）、Ｈｏｒａｎ，Ｇ．Ｓ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、２００８年、１７７（１）：５６〜６５頁）。
【０４０６】
インテグリンに加えて、ＴＧＦβ１の活性化の他の機構が結び付けられており、トロンボスポンジン−１、ならびに、プラスミン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ、たとえば、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１２）、カテプシンＤ、カリクレイン、亜鉛プロテアーゼのＡＤＡＭファミリー（たとえば、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、およびＡＤＡＭ１７）などのプロテアーゼによる活性化が挙げられる。トロンボスポンジン−１のノックアウトは、一部の組織におけるＴＧＦβ１−／−表現型の一部の側面を概括するが、ＴＧＦβ依存性であることが知られているブレオマイシン誘導性肺線維症において保護的でない（Ｅｚｚｉｅ，Ｍ．Ｅ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０１１年、４４（４）：５５６〜６１頁）。さらに、候補プロテアーゼのノックアウトはＴＧＦβ１表現型をもたらさなかった（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｊ．Ｊ．、Ｊ．Ｅ．Ｋｌｅｍｅｎｔｏｗｉｃｚ、およびＭ．Ａ．Ｔｒａｖｉｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ、２０１１年、３６（１）：４７〜５４頁）。このことは、冗長性によって、またはこれらの機構が発生および恒常性よりもむしろ特定の疾患において重大であることによって説明することができる。
【０４０７】
したがって、本明細書中に記載のＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム特異的阻害剤は、ＴＧＦβ１の活性化のステップを妨げることによって働く阻害剤を含む。一部の実施形態では、そのような阻害剤は、ＴＧＦβ１のインテグリン依存性（たとえば機械的または力駆動）の活性化を阻害することができる。一部の実施形態では、そのような阻害剤は、ＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性またはプロテアーゼ誘導性活性化を阻害することができる。後者は、インテグリン非依存性様式でＴＧＦβ１の活性化ステップを阻害する阻害剤を含む。一部の実施形態では、そのような阻害剤は、活性化の様式にかかわらずＴＧＦβ１の活性化を阻害することができる、たとえば、ＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化およびプロテアーゼ依存性活性化をどちらも阻害する。ＴＧＦβ１を活性化し得るプロテアーゼの非限定的な例としては、カリクレイン、ケモトリプシン（Ｃｈｅｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、トリプシン、エラスターゼ、プラスミンなどのセリンプロテアーゼ、ならびにＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−１３などの亜鉛メタロプロテアーゼ（ＭＭＰファミリー）が挙げられる。カリクレインとしては、ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ９、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、およびＫＬＫ１５などの血漿カリクレインおよび組織カリクレインが挙げられる。本明細書中に提示するデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＧＦβ１のカリクレイン依存性活性化を阻害することができるアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤の例を実証している。一部の実施形態では、本発明の阻害剤は、潜在型複合体からの活性（成熟）ＴＧＦβ１成長因子の放出または解離を妨げる。一部の実施形態では、そのような阻害剤は、複合体の不活性（たとえば潜在型）コンホメーションを安定化させることによって働き得る。データは、高親和性のコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤（Ａｂ６）は、プラスミン依存性ＴＧＦβ１の活性化も阻害することができることをさらに実証している。しかし、驚くべきことに、コンテキストに偏ったＴＧＦβ１阻害剤（Ａｂ３）このプロセスを阻害することに失敗した。Ａｂ３およびＡｂ６はどちらもマトリックス関連前駆ＴＧＦβ１複合体に対して類似の親和性を有する。しかし、Ａｂ３は、細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体に対して有意により弱い結合親和性を有する。２つのカテゴリー間の相対的差異は２０倍を超える（「偏り」）。比較すると、Ａｂ６は、抗原複合体の両方のカテゴリーに対して等価な高親和性を示す。１つの可能な説明は、観察された機能的差異がＡｂ３の偏り特長に由来し得るということである。別の可能な説明は、これがエピトープまたは結合領域における差異によって媒介されるということである。
【０４０８】
本発明は、ＴＧＦβ１機能の単一のコンテキストに限定されないＴＧＦβ１シグナル伝達の複数の生物学的役割に関連する特定の疾患のための治療的使用に、特に有用である。そのような状況においては、複数のコンテキストにわたってＴＧＦβ１の効果を阻害することが有益であり得る。したがって、本開示は、コンテキストに特異的な様式ではなく、アイソフォームに特異的な様式でＴＧＦβ１を標的化および阻害する方法を提供する。そのような薬剤は、「アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性」ＴＧＦβ１モジュレーターと呼び得る。
【０４０９】
一連の証拠が、多くの疾患が、いわゆる提示分子とのその相互作用によって媒介されるＴＧＦβ機能の様々な効果を与える不均一な細胞種の参加に関与する可能性の高い、ＴＧＦβシグナル伝達の複雑な攪乱を顕在化させるという見方を支持している。様々な細胞外ニッチにおいてＴＧＦβを「提示」して、局所刺激に応答してその活性化を可能にすることができる、少なくとも４つのそのような提示分子が同定されている。１つのカテゴリーでは、ＴＧＦβは、ＥＣＭ関連ＴＧＦβ活性を媒介するＬＴＢＰ１およびＬＴＢＰ３などのＥＣＭ関連提示分子と会合して、ＥＣＭ内に蓄積される。別のカテゴリーでは、ＴＧＦβは、特定の免疫機能を媒介するＧＡＲＰおよびＬＲＲＣ３３などの提示分子を介して、免疫細胞の表面上に繋留されている。これらの提示分子は、様々な組織および細胞種において示差的な発現、局在化、および／または機能を示し、これは、ＴＧＦβの活性化の始動事象および成果は微小環境に応じて変動することを示している。多くのＴＧＦβ効果が相互作用して疾患進行に寄与し得るという見方に基づいて、ＴＧＦβ機能の複数の様相を拮抗することができる治療剤がより高い有効性を提供し得る。
【０４１０】
特定の疾患（本明細書中にさらに詳述する）を処置するための治療剤としての、ＴＧＦβ１のコンテキストに偏った阻害剤を超えるＴＧＦβ１のコンテキスト非依存性阻害剤の有利な使用の理論的根拠としては、以下が挙げられる。
【０４１１】
本明細書中に開示されている研究は、疾患環境における不均一なＴＧＦβ１複合体の関与を確認しており、根底にある（ｕｎｄｅｒｌｉｎｉｎｇ）機構の理解を与え、いくつかの疾患のための改善された治療手法への見識を提供する。
【０４１２】
様々な疾患が、疾患の病因および／または進行に集合的に寄与するＴＧＦβ１源として細胞の異種集団に関与していることが認識されている。複数種のＴＧＦβ１含有複合体（「コンテキスト」）が同じ疾患微小環境内に共存する可能性が高い。特に、そのような疾患は、ＴＧＦβ１シグナル伝達のＥＣＭ（または「マトリックス」）構成要素およびＴＧＦβ１シグナル伝達の免疫構成要素の両方に関与し得る。そのような状況においては、単一のＴＧＦβ１コンテキスト（たとえば１つの特定の種類の提示分子に関連するＴＧＦβ１）のみを選択的に標的化することは、限定的な緩和を提供し得る。したがって、広範に阻害性のＴＧＦβ１拮抗剤が治療的使用には望ましい。ＴＧＦβ１の複数の潜在型複合体を広範に標的とした、以前に記載した阻害性抗体は、標的複合体の中で歪んだ結合プロフィールを示した。したがって、本発明者らは、それに連結された特定の提示分子にかかわらず、ＴＧＦβ１の活性化を選択的に阻害するより均一に阻害性の抗体を同定することを試みた。特に免疫−腫瘍学の応用では、マトリックス関連ＴＧＦβ１および免疫細胞関連ＴＧＦβ１の両方を強力に阻害することが有利であると推論された。
【０４１３】
第２に、組織／細胞の特徴における著しい類似性が腫瘍間質と線維性組織との間で観察され、様々な適応症の根底にある（ｕｎｄｅｒｌｉｎｉｎｇ）共通機構が強調される。いくつかの病的状態において観察されるｉ）ＴＧＦβ１依存性線維性促進表現型、ｉｉ）ＴＧＦβ１依存性腫瘍促進表現型、およびｉｉｉ）ＴＧＦβ依存性免疫抑制性の表現型の間およびその中での掛け合い応答を示している。したがって、これらの構成物に対して等価な効力で広範に作用するコンテキスト非依存性阻害剤の使用は、多様な種類の病状にわたって最適な治療効果を提供し得る。たとえば、原発性骨髄線維症の臨床徴候としては、特定の細胞集団の異常増殖および骨髄における線維症が挙げられる。
【０４１４】
第３に、いくつかの証拠が、ＴＧＦβ１が多くの種類の癌（癌患者）において観察された抗癌治療（免疫チェックポイント阻害剤、癌ワクチン、操作した免疫細胞による治療、化学療法、放射線療法など）に対する薬物耐性の少なくとも部分的な原因であり得るという可能性を高めている。一部の事例では、そのような耐性は、患者の背景に対して特定の癌／腫瘍種に内因性であるように思われる（典型的には生得的な耐性、一次耐性、内因性の耐性、または生来の耐性と呼ばれ、これらの用語は本明細書中で互換性があるように使用される）。そのような耐性は、免疫チェックポイント阻害剤などの癌治療に対する応答性が乏しい患者の部分組において表される場合があり、免疫排除環境を反映している可能性がある。これは、ＴＧＦβ１依存性経路によって少なくとも部分的に媒介される可能性が高い。したがって、本明細書中に記載のアイソフォーム選択的阻害剤は、耐性癌をそのような治療に対してより応答性にさせ得る。特に、治療に対する耐性が疾患部位（腫瘍など）での免疫排除に関連している状況においては、ＴＧＦβ１阻害は免疫抑制を遮断解除し、エフェクター細胞がその標的（たとえば癌細胞）に接近することを許可し得る。同じ作用機構が、治療の効果が処置する疾患または保証される（ｉｎｓｕｒｅｄ）組織と接触しなければならないいくつかの治療パラダイムにおいて適用可能である。本発明の高親和性のコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤は、ＴＧＦβ１機能の複数のアーム、たとえば、Ｔｒｅｇの阻害、マクロファージの変調、およびＥＣＭの調節と折り合いをつけることによってこのプロセスを容易にし、それによって薬物耐性を克服すると考えられている。
【０４１５】
あるいは、耐性は、処置に対して実質的な臨床応答性を示す患者が経時的に応答性が乏しくなるよう、時間と共に発生し得る（すなわち適応または獲得耐性）。たとえば、ＰＤ−１治療は、他のＴ細胞抗原（たとえばＴＣＲ構成要素）のアップレギュレーションに相関する適応耐性をもたらす可能性があることが報告されており、これは、癌細胞が進化して別の機構を介してＰＤ−１遮断を回避することを示唆している。続いて、ＴＩＭ３などの異なるＴ細胞受容体構成要素を標的とする第２のチェックポイント阻害剤が、免疫療法に対する応答性を回復させることができる。これらの観察は、癌細胞の適応応答に反撃するために複数の経路を遮断することが、宿主免疫を回避する癌細胞の能力の可能性を低下させ得ることを示唆している。複数のＴＧＦβ１コンテキストを標的化することができるＴＧＦβ１の阻害剤は、ＴＧＦβ１機能の複数の点で遮断を提供することによって、獲得された薬物耐性を有利に回避し得る。
【０４１６】
最後に、様々な提示分子の発現が経時的に、たとえば局所キュー（たとえば、サイトカイン、ケモカイン、ＥＣＭ環境など）に応答して、および／または疾患微小環境において変化に伴って変動し得るという見方に基づいて、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤を使用して、そのような柔軟性に耐え、提示分子の発現において異常な変化が起こった場合でさえも広範な永続的阻害効果を提供し得ることが推論される。
【０４１７】
これらのシナリオの任意のものにおいて、ＴＧＦβ１のコンテキスト非依存性阻害剤は、そのすべてまたはその様々な組合せが疾患微小環境中に存在する様々な提示分子と会合したＴＧＦβ１の前駆／潜在形を標的とすることを、有利に目的としている。より詳細には、一様式では、阻害剤はＥＣＭ関連ＴＧＦβ１（ＬＴＢＰ１／３−ＴＧＦβ１複合体）を標的とする。別の様式では、阻害剤は免疫細胞関連ＴＧＦβ１を標的とする。これには、Ｔｒｅｇ細胞上に発現されるＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体ならびにマクロファージおよび他の骨髄／リンパ球細胞、特定の癌細胞上に発現されるＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体などのＧＡＲＰ提示ＴＧＦβ１が挙げられる。
【０４１８】
そのような抗体は、抗体が複数種の提示分子に関連するＴＧＦβ１の活性化（または放出）を阻害することができるように、コンテキスト非依存性の様式で前駆／潜在型ＴＧＦβ１複合体からの成熟ＴＧＦβ１成長因子の活性化（または放出）と結合してそれを妨げる、ＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤を含む。特に、本発明は、ＥＣＭ関連ＴＧＦβ１（ＬＴＢＰ提示およびＬＴＢＰ３提示複合体）ならびに細胞関連ＴＧＦβ１（ＧＡＲＰ提示およびＬＲＲＣ３３提示複合体）を遮断することができる抗体を提供する。
【０４１９】
様々な病状が寄与要因としてＴＧＦβシグナル伝達の調節不全に関与することが示唆されている。実際、特定のヒト条件の病因および／または進行は、ＴＧＦβ１活性に優性に駆動されるまたはそれに依存すると思われる。特に、多くのそのような疾患および障害は、ＴＧＦβ１機能のＥＣＭ構成要素および免疫構成要素の両方に関与し、複数のコンテキスト（たとえば複数種の提示分子によって媒介される）においてＴＧＦβ１の活性化が関与していることが示唆される。さらに、ＴＧＦβ１応答性細胞間に掛け合い応答が存在することが企図される。一部の事例では、ＴＧＦβ１軸の多面的活性間の相互作用は、疾患進行、悪化、および／または疾患と闘う宿主の能力の抑制をもたらす事象のカスケードを始動させ得る。たとえば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）および線維性微小環境（ＦＭＥ）などの特定の疾患微小環境は、複数の異なる提示分子によって提示されるＴＧＦβ１、たとえば、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１、およびその任意の組合せに関連している場合がある。１つのコンテキストにおけるＴＧＦβ１活性は、立ち代って別のコンテキストのＴＧＦβ１活性を調節するまたはそれに影響を与える場合があり、調節不全である場合、これは病状の増悪をもたらし得るという可能性が高められる。したがって、ＴＧＦβ１アイソフォームに対するそのような阻害効果を選択的に限定する一方で、複数のＴＧＦβ１機能の様式（すなわち複数のコンテキスト）にわたって広範に阻害することが望ましい。目的は、創傷（ｗｏｕｌｄ）治癒において重要な役割を果たすＴＧＦβ３を含めた他のアイソフォームによって媒介される恒常性ＴＧＦβシグナル伝達を攪乱させないことである。
【０４２０】
ＴＧＦβ１活性の免疫構成要素は、細胞関連ＴＧＦβ１（たとえばＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）によって大部分が媒介される。ＴＧＦβ１機能のＧＡＲＰおよびＬＲＲＣ３３アームの両方が、多くの疾患の進行に寄与する免疫抑制特長に関連する。したがって、高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤を使用して、免疫抑制細胞に関連するＴＧＦβ１を阻害し得る。免疫抑制細胞としては、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｍ２マクロファージ（ｍａｃｒｏｐａｈｇｅ）、およびＭＤＳＣが挙げられる。したがって、ＴＧＦβ１阻害剤は、疾患部位、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＭＥおよびＦＭＥでの免疫抑制性の表現型を阻害し得るまたは逆転させ得る。
【０４２１】
一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体を発現する細胞に関連するＴＧＦβ１を阻害し、任意選択で、細胞は、Ｔ細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、抗原提示細胞、好中球、骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）、リンパ球、肥満細胞、またはミクログリアであり得る。Ｔ細胞は調節性Ｔ細胞（たとえば免疫抑制性Ｔ細胞）であり得る。好中球は活性化好中球であり得る。マクロファージは、線維性促進および／または腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、たとえば、Ｍ２ｃ亜型およびＭ２ｄ亜型マクロファージを含めた、活性化（たとえば極性化）マクロファージであり得る。一部の実施形態では、マクロファージを、マクロファージにおいて癌促進表現型をさらに誘導し得る腫瘍由来因子（たとえば、サイトカイン、成長因子など）へと曝露させる。一部の実施形態では、そのような腫瘍由来因子はＣＳＦ−１／Ｍ−ＣＳＦである。
【０４２２】
一部の実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体を発現する細胞は、癌細胞、たとえば、循環癌細胞および腫瘍細胞である。
【０４２３】
標的としてのＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ４陽性Ｔリンパ球の小さな部分組を表し、免疫応答の勢いを弱めて恒常性を維持することにおける「休み（ｂｒｅａｋ）」として作用する重要な役割を果たす。病状（癌など）においてＴｒｅｇレベルの上昇が報告されており、これはより乏しい予後診断に関連している。ドナーの末梢血細胞から単離したヒトＴｒｅｇは、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激によって活性化することができる。Ｔｒｅｇ活性化は、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１細胞表面発現の著しい増加を誘導することが示されている（図２６Ａ）。以前に報告されているように、Ｔｒｅｇは免疫抑制活性を発揮し、これはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増殖の強力な抑制を含む。本明細書中に示すように（図２６Ｂ）、ほとんどのＴｅｆｆが細胞分裂を受ける標準の実験条件下では、同時培養したＴｒｅｇはこれをほんのわずかにまで低下させる。また、このＴｅｆｆ増殖のＴｒｅｇ阻害は、ＴｅｆｆおよびＴｒｅｇの同時培養物をＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤で処理することによって有効に克服（すなわち脱抑制）することができ、これは、本明細書中に開示されているアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１が、ＴＧＦβ１機能のＧＡＲＰアームの阻害において有効であることを実証している。疾患環境（腫瘍微小環境および線維性環境など）では、これは、Ｔｒｅｇ媒介性免疫抑制を遮断するこれらの阻害剤の能力に翻訳されるであろう。これは、立ち代って、エフェクターＴ細胞の増殖を増強させて免疫のブーストをもたらすであろう。ＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤のＧＡＲＰアームは、ＴＧＦβ１機能のこの様相を標的とし得る。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制活性を低下させ得る。
【０４２４】
標的としてのＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１
ＬＲＲＣ３３は、選択的細胞種、特に単球およびマクロファージを含めた骨髄系列のものにおいて発現される。単球は、骨髄中の前駆体から生じ、血流中を循環し、末梢組織に到達する。その後、循環単球は組織内に遊走することができ、ここで、サイトカインおよびケモカインなどの様々な因子のパネルを含む局所的環境（たとえば、組織特異的、疾患関連など）に曝露され、単球からマクロファージ、樹状細胞などへの分化が始動される。これらとしては、たとえば、肺における肺胞マクロファージ、骨髄における破骨細胞、ＣＮＳにおけるミクログリア、結合組織における組織球、肝臓におけるクッパー細胞、および褐色脂肪組織における褐色脂肪組織マクロファージが挙げられる。固形腫瘍では、浸潤マクロファージは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、および骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）などであり得る。そのようなマクロファージは、活性であってもよい、および／あるいは癌腫関連（もしくは癌関連）線維芽細胞（ＣＡＦ）および／または間質などの活性化線維芽細胞に関連していてもよい。したがって、ＬＲＲＣ３３含有複合体からの成熟ＴＧＦβ１の放出を阻害する本明細書中に記載のＴＧＦβ１の活性化の阻害剤は、ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１を細胞表面上に発現するこれら細胞のうちの任意のものを標的とすることができる。線維性微小環境では、ＬＲＲＣ３３発現細胞は、Ｍ２マクロファージ（ｍａｃｒｏｐａｈｇｅ）、組織常在マクロファージ、および／またはＭＤＳＣを含み得る。
【０４２５】
一部の実施形態では、ＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体は線維性促進（Ｍ２様）マクロファージの外表面に存在する。一部の実施形態では、線維性促進（Ｍ２様）マクロファージは線維性微小環境中に存在する。一部の実施形態では、線維性促進（Ｍ２様）マクロファージの外表面でのＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体の標的化は、単独で標的化されたＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１および／またはＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体と比較して優れた効果を提供する。一部の実施形態では、Ｍ２様マクロファージは、示差的な表現型を有する複数の亜型、たとえば、Ｍ２ｃおよびＭ２ｄ  ＴＡＭ様マクロファージへとさらに極性化される。一部の実施形態では、マクロファージは、腫瘍微小環境中に存在する様々な因子（たとえば、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、およびＥＣＭリモデリング分子）によって活性化されてよく、それだけには限定されないが、ＴＧＦβ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ２２、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２、Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＣＸＣＲ４、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、アラキドン酸およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）などのプロスタグランジン調節剤、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）、ＲＵＮＸ２、ＨＩＦ１α、ならびにメタロプロテイナーゼが挙げられる。そのような因子のうちの１つまたは複数への曝露は、単球／マクロファージを腫瘍促進表現型へとさらに駆動し得る。一例のみを挙げると、腫瘍におけるＣＣＬ２およびＶＥＧＦの同時発現は、増加したＴＡＭおよび乏しい診断に相関していることが示されている。立ち代って、活性化腫瘍関連細胞は、動員および／または他の細胞の腫瘍促進細胞、たとえば、ＣＡＦ、ＴＡＮ、ＭＤＳＣなどへの分化も促進し得る。また、間質細胞は、マクロファージ活性化に応答し、ＥＣＭリモデリング、最終的には血管化、侵襲、および転移にも影響を与え得る。たとえば、ＣＣＬ２は単球誘引物質として機能するだけでなく、活性化内皮において発現されるＩＣＡＭ−１の受容体であるＭＡＣ−１をアップレギュレーションすることによって細胞接着も促進する。このことは、ＣＣＬ２依存性動脈形成および癌進行をもたらし得る。したがって、本明細書中に記載のＴＧＦβ１阻害剤は、ＣＣＬ２シグナル伝達軸と干渉することによって動脈形成を阻害する方法において使用し得る。
【０４２６】
どちらも免疫抑制性の表現型を有しており、疾患環境（たとえばＴＭＥおよびＦＭＥ）で富化されている、Ｍ２−極性化マクロファージおよび骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）を含めた骨髄細胞の部分組が、細胞表面ＬＲＲＣ３３を発現する。骨髄由来循環単球は細胞表面ＬＲＲＣ３３を発現するようには思われない。ＬＲＲＣ３３の制限的発現により、これが特に魅力的な治療標的となる。文献中で利用可能な研究の大多数が癌におけるエフェクターＴ細胞生物学（たとえばＣＤ８＋細胞毒性細胞）に注目している一方で、増加する証拠（本明細書中に提示するデータなど）が疾患における抑制性骨髄細胞集団の重要な役割を指し示している。重要なことに、本明細書中に開示されている高度に選択的なＴＧＦβ１阻害性抗体は、ＴＧＦβ１機能のこのアームをｉｎ  ｖｉｖｏで標的化することができる。より詳細には、本明細書中に提示するデータは、腫瘍関連Ｍ２マクロファージおよびＭＤＳＣが、疾患進行と強い相関をもって細胞表面ＬＲＲＣ３３を発現することを示している。本明細書中に開示されている高親和性のＴＧＦβ１選択的抗体は、複数の薬理学的モデルにおいて腫瘍のチェックポイント遮断療法（ＣＢＴ）に対する一次耐性を克服することができる。実際、抗腫瘍有効性は腫瘍関連マクロファージおよびＭＤＳＣレベルの有意な減少と合致し、ＴＧＦβ１機能のこの様相の標的化は治療上有益な効果に寄与し得ることを示唆している。このことは、これらの免疫抑制細胞が富化されている他の疾患に適用可能である可能性が高い。いくつかの線維性状態も、これらの細胞集団の局所頻度の上昇に関連している。したがって、高親和性のＴＧＦβ１選択的抗体はそのような適応症において類似のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を発揮することが予想される。
【０４２７】
標的としてのＬＴＢＰ１／３−前駆ＴＧＦβ１
細胞外マトリックスとは、細胞、組織、臓器、および全身レベルでの複合体シグナル伝達事象が編成される部位である。ＥＣＭの調節不全がいくつかの病理学において観察される。ＴＧＦβ１成長因子のリザーバーは、ＥＣＭ中に潜在型前駆ＴＧＦβ１複合体の形態で存在する。潜在型前駆ＴＧＦβ１複合体は、ＥＣＭ構成要素、ＬＴＢＰ１、および／またはＬＴＢＰ３との共有的相互作用を介してマトリックスに固定されている。フィブロネクチンおよびフィブリリン（たとえばフィブリリン−１）などの他のＥＣＭタンパク質は、ＥＣＭの蓄積およびＬＴＢＰの局在化の媒介において重要であると考えられている。ＬＬＣをＥＣＭに標的化することは、ＴＧＦβ１の活性化プロセスにおいて必須のステップである。全てではないがほとんどのＴＧＦβ１関連の適応症がＴＧＦβ１依存性であるＥＣＭ機能の何らかの側面に関与している可能性が高いため、治療剤として検討されるＴＧＦβ阻害剤がこのＴＧＦβ１シグナル伝達のプールを標的化できるべきであることが避けられない。実際、本開示によるＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤は、ヒトＬＴＢＰ１／３−前駆ＴＧＦβ１複合体に対して著しく高い親和性および効力を示す。これらの抗体は、その活性化前の状態のＥＣＭに局在性の複合体を直接標的とするため、この作用機構では、リガンド結合について内在性高親和性受容体と競合する必要性が排除されるであろう。さらに、これらの抗体の阻害活性は、増加したＴＧＦβ１活性化に関連する疾患の部位（たとえばＥＣＭ内の調節不全のニッチ）に局在しているため、これらの抗体は、副作用を制限する一方で増強された有効性を達成するであろうことが想定される。
【０４２８】
一部の実施形態では、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体またはＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体は細胞外マトリックスの構成要素である。ＬＴＢＰのＮ末端は、その形成がトランスグルタミナーゼによって触媒され得るイソペプチド結合を介してＥＣＭと共有結合していてよい。ＥＣＭの構造的完全性がＬＴＢＰ関連ＴＧＦβ１活性の媒介に重要であると考えられている。たとえば、マトリックスの硬直がＴＧＦβ１の活性化に有意な影響を与える場合がある。さらに、フィブロネクチンおよび／またはフィブリリンを足場中に取り込ませることで、ＬＴＢＰ媒介性ＴＧＦβ１の活性化が有意に増加し得る。同様に（Ｓｉｍｉａｒｌｙ）、ＬＴＢＰアッセイ（たとえば細胞に基づく効力アッセイ）におけるフィブロネクチンおよび／またはフィブリリンの存在がアッセイウィンドウを増加させ得る。一部の実施形態では、細胞外マトリックスはフィブリリンおよび／またはフィブロネクチンを含む。一部の実施形態では、細胞外マトリックスはＲＧＤモチーフを含むタンパク質を含む。
【０４２９】
したがって、本明細書中に提供するＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤は、ＴＧＦβ１機能の生物学的コンテキストのそれぞれ、すなわち、ＧＡＲＰアーム、ＬＲＲＣ３３アーム、およびＬＴＢＰ１／３アームの強力な阻害を可能にする。
【０４３０】
治療的適応症および／またはＴＧＦβ１選択的な高い親和性の広範に阻害する薬剤を含む治療に応答する可能性が高い対象の選択
本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム特異的阻害剤が有利な治療上の利点を有する可能性が高い、適切な適応症および／または患者集団の同定／スクリーニング／選択に関して、３つの調査を行い得る：ｉ）疾患がヒトにおいて他のアイソフォームよりもＴＧＦβ１アイソフォームによって優性に駆動されるもしくはそれに依存性であるか（または少なくとも共優性）、ｉｉ）状態（または患部組織）が免疫抑制性の表現型に関連しているかどうか、ならびにｉｉｉ）疾患がマトリックス関連および細胞関連のＴＧＦβ１機能の両方に関与しているかどうか。
【０４３１】
３つの既知のＴＧＦβアイソフォーム、すなわち、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の示差的な発現が、様々な組織において正常下（健康、恒常性）および病状下で観察されている。それにもかかわらず、アイソフォーム選択性の概念は、複数のアイソフォームにわたってＴＧＦβの汎阻害を優遇する慣用の手法では、完全に活用されても確実に達成されてもいない。さらに、アイソフォームの発現パターンは、正常（恒常性）対異常（病的）条件においてだけでなく、患者の異なる部分集団においても示差的に調節され得る。ほとんどの前臨床研究が、ヒト条件を概括していても概括していなくてもよい限定数の動物モデルにおいて実施されるため、そのようなモデルを使用して得られたデータは偏っており、治療剤を開発する目的での翻訳可能性に関して、データの誤った解釈または誤解を招く結論をもたらす場合がある。
【０４３２】
したがって、本発明は、特定の薬物候補（たとえばＴＧＦβ１阻害剤）の有効性を予測することにおいて、および前臨床データをヒト条件への翻訳可能性に関して解釈することにおいて、前臨床動物モデルにおけるＴＧＦβアイソフォームの示差的な発現を考慮すべきであるという認識を含む。
【０４３３】
ヒト腫瘍試料の以前の分析は、ＴＧＦβシグナル伝達を、疾患進行および様々な種類の悪性腫瘍のためのチェックポイント遮断療法（「ＣＢＴ」）を含む処置応答に対する一次耐性への重要な寄与要因として結び付けている。文献中に報告されている研究は、ＴＧＦＢ遺伝子発現が処置耐性に特に関連し得ることを明らかにしており、このアイソフォームの活性がこれらの疾患においてＴＧＦβシグナル伝達を駆動し得ることを示唆している。実施例１１に詳述するように、癌ゲノムアトラス（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ、ＴＣＧＡ）にプロファイリングされたヒト腫瘍種の大多数にわたって、ＴＧＦＢ１発現が最も広く普及していると思われ、ＴＧＦβアイソフォームのヒト疾患発現パターンをより厳密に概括する前臨床モデルの選択が有益であり得ることを示唆している。
【０４３４】
本明細書中に例示するように、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３は、前臨床研究において幅広く使用されている特定のネズミ同系癌モデル（たとえばＥＭＴ−６および４Ｔ１）において共優である（類似のレベルで同時発現される）（図２０Ｄを参照）。対照的に、数々の他の癌モデル（たとえば、Ｓ９１、Ｂ１６、およびＭＢＴ−２）は、ＴＧＦβ１がより頻繁にＴＧＦβ２／３よりも優性のアイソフォームであると考えられる多くのヒト腫瘍において観察されるものと同様に、ほぼ排他的にＴＧＦβ１を発現する（図２０Ｂおよび２０Ｃを参照）。さらに、恒常性条件下で優性に発現されるＴＧＦβアイソフォームは、疾患関連アイソフォームでない場合がある。たとえば、正常な肺組織および健康なラットにおいて、持続性ＴＧＦβシグナル伝達は主にＴＧＦβ３によって媒介されると思われる。しかし、ＴＧＦβ１は肺線維症などの病状において著しくアップレギュレーションされると思われる。総合すると、必須条件ではないが、患者が応答する可能性が高い適切な治療剤を選択するために、臨床試料中のＴＧＦβアイソフォームの相対的発現を試験または確認することが有益であり得る。一部の実施形態では、相対的アイソフォーム発現の決定は処置後に行い得る。そのような状況においては、ＴＧＦβ１阻害療法に応答した患者の応答性（たとえば臨床反応／利益）をＴＧＦβアイソフォームの相対的発現レベルと相関させ得る。一部の実施形態では、事後に示されるＴＧＦβ１アイソフォームの過剰発現は、処置に対してより高い応答性で相関する。
【０４３５】
本明細書中に記載のように、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、ＴＧＦβ１アイソフォームが他のアイソフォームと比較して優性に発現されている疾患の処置に特に有利である（たとえばＴＧＦβ１優性と呼ぶ）。一例として、ヒト癌臨床試料の非限定的なリストならびにＴＧＦＢ１（左）、ＴＧＦＢ２（中央）、およびＴＧＦＢ３（右）の相対的発現レベルを図２０Ｂおよび２０Ｃに提供する。３つのアイソフォームを横切るそれぞれの水平ライム（ｌｉｍｅ）は単一の患者を表す。見ることができるように、これらのヒト腫瘍／癌のほとんどにおいて全体的なＴＧＦβ１発現（ＴＧＦＢ１）が多くの腫瘍／癌種にわたって他の２つのアイソフォームよりも有意に高く、これは、ＴＧＦβ１選択的阻害がこれらの疾患の種類において有益であり得ることを示唆している。総合すると、これらの証拠は、ＴＧＦβ１活性の選択的阻害がＣＢＴに対する一次耐性を克服し得るという見方を支持する。高度に選択的なＴＧＦβ１阻害剤の作製は、そのような手法が、汎ＴＧＦβ阻害で観察される主要な安全性の問題に対処するかどうかの評価も可能にし、このことはその治療的有用性の評価に重要となるであろう。
【０４３６】
しかし、特定の例外にも注目すべきである。第１に、そのような傾向は、疾患の種類内の特定の個々の患者に必ずしも適用されない。すなわち、図２０Ｃに表すように、全体的にはほぼ均一にＴＧＦβ２／３よりもＴＧＦβ１の優位を示す癌の種類においてさえも、この通則に従わない数人の個体が存在する。したがって、少数派の部分集団に入る患者は、患者の大多数で効くような様式でＴＧＦβ１アイソフォーム特異的阻害剤療法に応答しない場合がある。第２に、ＴＧＦβ１が別のアイソフォームと共優性である、またはＴＧＦβ２および／もしくはＴＧＦβ３の発現がＴＧＦβ１よりも有意に高い癌腫がいくつか存在する。これらの状況においては、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１選択的阻害剤は単独で使用した場合に効果的でない可能性が高い。むしろ、他のアイソフォームを標的とする適切な追加の阻害剤を組み合わせて用い得る（たとえばＷＯ２０１６／２０１２８２号を参照）。しかし、潜在的に重大な毒性を管理するために、汎ＴＧＦβ阻害剤ならびにＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３をどちらも拮抗する阻害剤は回避するべきである。
【０４３７】
たとえば、ＴＧＦβ１がＴＧＦβ３と共優性である（たとえば類似のレベルで同時発現される）疾患（特定の種類の癌腫および肉腫など）または個々の患者において（たとえば生検分析によって示される）、適切な治療レジメンはＴＧＦβ１阻害剤およびＴＧＦβ３阻害剤をどちらも含み得る。好ましくは、阻害剤のそれぞれは、すべてのＴＧＦβアイソフォームの汎阻害に関連する望まない副作用または毒性を回避するために、アイソフォーム選択的阻害剤である。一部の実施形態では、アイソフォーム選択的阻害剤の一方または両方は、ＴＧＦβアイソフォーム（たとえばＴＧＦβ１および／またはＴＧＦβ３）の活性化ステップを阻害する。好ましい実施形態では、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、本明細書中に記載のものなどの高親和性のコンテキスト非依存性活性化阻害剤である。一部の実施形態では、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ３阻害剤は、前駆ＴＧＦβ３複合体と特異的に結合する抗体または抗原結合断片を選択するステップを含む工程によって作製する、ＴＧＦβ３のコンテキスト非依存性活性化阻害剤である。典型的には、そのような工程は、複数の抗原複合体、たとえば、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ３、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ３、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ３、および／またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ３と結合する能力について抗体または断片を選択または確認するステップをさらに含む。好ましくは、そのような工程は、潜在型複合体からの成長因子（ＴＧＦβ３）の放出を阻害する能力（すなわち活性化阻害）について抗体または断片を選択または確認するステップをさらに含む。
【０４３８】
適切な治療レジメンがＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３などの（上記の例のように）２つのアイソフォーム選択的ＴＧＦβ阻害剤を含む場合、そのような治療は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３阻害剤をどちらも含む単一の配合物を含み得る。そのような配合物は、たとえば、１０〜５０ｍｇ／ｍＬのそれぞれの阻害と１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含有し得る。
【０４３９】
あるいは、そのような治療は、それぞれが患者または患者集団に投与するための単一の阻害剤を含む、２つの別々の配合物の使用を含み得る。これは、患者または患者集団から収集した１つまたは複数の生体試料中に存在することが示されている２つのＴＧＦβアイソフォームの相対的発現レベル（健康なレベルを超える）に応じて（かつそれにあつらえて）、患者または患者集団に投与する２つの阻害剤の投薬量の比の調節において追加の柔軟性を提供する。たとえば、ＴＧＦβ１陽性、ＴＧＦβ３陽性の癌／腫瘍（乳癌など）の処置における使用では（前者が後者と比較して優性の疾患関連アイソフォームである）、ＴＧＦβ１阻害剤を治療レジメンの一部として、より高い用量および／またはより長い持続期間で使用し得る。
【０４４０】
したがって、個々の患者から収集した臨床試料中の３つのＴＧＦβアイソフォーム（すなわち、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）の相対的発現レベルを試験または確認することが有益である。そのような情報は、個々の患者または患者集団における特定の治療の有効性に関してより良好な予測を提供する場合があり、これは、臨床反応の見込みを増加させるために適切な治療レジメン（たとえば個別化／個人化された処置）の選択を確実にすることを、助けることができる。
【０４４１】
より最近では、本出願の発明者らは、チェックポイント阻害剤（たとえば抗ＰＤ−１抗体）と併せて使用した高親和性のＴＧＦβ１選択的阻害剤（たとえばＡｂ６）は、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３をどちらも類似のレベルで発現することが知られているＥＭＴ−６モデルにおいて有意な腫瘍回帰を引き起こすことができるという予想外の発見をした。共優性はＲＮＡ測定およびＥＬＩＳＡアッセイの両方によって確認された（図３５を参照）。チェックポイント遮断コンテキストにおいてＴＧＦβ１陽性、ＴＧＦβ３陽性の腫瘍で実質的な有効性を達成するためには、共優性アイソフォームの両方を特異的に阻害しなければならないと以前に仮定されていたため、この観察は驚くべきである。しかし、予想外に、ＴＧＦβ３選択的阻害剤を用いないＴＧＦβ１選択的阻害剤単独（抗ＰＤ−１と併せて）が、ＣＢＴに対する一次耐性を克服し、腫瘍体積を低下させて延命効果を増強させることにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を達成するために十分である（実施例１８を参照）。特定の理論に束縛されずに、これは、ＴＧＦ３が腫瘍中で同時発現されているにしても、ＴＧＦβ１が真の疾患駆動アイソフォームであることが原因であり得る。別の可能性は、ＴＧＦβ１の阻害が下流でＴＧＦβ３のダウンレギュレーションを引き起こすことである。２つのアイソフォームが示差的な時間的および／または空間的な調節を受けやすいという可能性もある。たとえば、２つのアイソフォームは、別個の細胞または組織区画に局在し得る。それに加えてまたはその代わりに、チェックポイント阻害剤と併せて使用したＴＧＦβ１の強力な阻害剤が、免疫抑制の閾値を克服するために十分であり得る可能性が依然としてある。したがって、本発明は、腫瘍がＴＧＦβ１＋／ＴＧＦβ３＋である、腫瘍回帰を促進するためのＴＧＦβ１阻害剤の使用を含む。そのような腫瘍としては、たとえば、上皮起源の癌、すなわち癌腫（たとえば、基底細胞癌、扁平細胞癌、腎細胞癌、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、浸潤性腺管癌、および腺癌）を挙げ得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１が優性に疾患関連アイソフォームである一方で、ＴＧＦβ３は上皮などの組織において恒常性機能を支援する。
【０４４２】
様々な癌腫などの特定の腫瘍は、低突然変異負荷腫瘍（ＭＢＴ）として特徴づけられ得る。そのような腫瘍は多くの場合免疫原性が乏しく、十分なＴ細胞応答の誘発に失敗する。化学療法、放射線療法、癌ワクチン、および／または腫瘍退縮ウイルスを含めた癌治療は、そのような腫瘍においてＴ細胞免疫を誘発するために役立ち得る。したがって、本明細書中に詳述したＴＧＦβ１阻害療法を、これらの癌治療のうちの１つまたは複数と併せて使用して、抗腫瘍効果を増加させることができる。本質的に、そのような組合せ療法は、ネオアンチゲンを促進し、エフェクター細胞が腫瘍を攻撃することを促進することによって、「冷たい」腫瘍（たとえば免疫原性の乏しい腫瘍）を「熱い」腫瘍へと変換することを目的とする。そのような腫瘍の例としては、乳癌、卵巣癌、および膵癌、たとえば、膵臓導管腺癌（ＰＤＡＣ）が挙げられる。したがって、本明細書中に記載の抗体またはその断片のうちの任意の１つまたは複数を使用して、Ｔ細胞免疫を促進することを目的とした癌治療で感作させた免疫原性の乏しい腫瘍（「冷たい腫瘍」）を処置し得る。
【０４４３】
エフェクターＴ細胞が腫瘍部位から遠ざけられている（それ故「排除されている」）免疫排除腫瘍では、免疫抑制腫瘍環境はＴＧＦβ１依存性の様式で媒介され得る。これらは典型的には免疫原性である腫瘍である。しかし、Ｔ細胞は、免疫抑制された環境が原因でその細胞毒性効果を十分に浸潤、増殖、および誘発することができない。典型的には、そのような腫瘍はＣＢＴなどの癌治療に対して応答性が乏しい。本明細書中に提供するデータが示唆するように、ＴＧＦβ１阻害剤を含む補助療法は、免疫抑制性の表現型を克服し、Ｔ細胞の浸潤、増殖、および抗腫瘍機能を許可し、それによって、そのような腫瘍をＣＢＴなどの癌治療に対してより応答性にし得る。
【０４４４】
したがって、第２の調査は、免疫抑制腫瘍を有する、ＴＧＦβ１阻害剤療法からから利益を受ける可能性の高い患者の同定または選択に注目している。腫瘍におけるエフェクターＴ細胞の存在または頻度の度合は抗腫瘍免疫の指標である。したがって、腫瘍中のＣＤ８＋細胞などの抗腫瘍細胞の検出は、患者がＣＢＴおよび／またはＴＧＦβ１阻害剤療法から利益を受け得るかどうかを評価するための有用な情報を提供する。
【０４４５】
検出は、腫瘍生検試料の免疫組織化学的分析などの既知の方法によって実施し得る。より最近では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの目的の細胞（たとえば細胞毒性Ｔ細胞）の検出を許可する非侵襲性イメージング方法が開発されている。たとえば、そのそれぞれが本明細書中に参考として組み込まれている、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍａｇｉｎａｂ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／、Ｔａｖａｒｅら、（２０１４年）、ＰＮＡＳ、１１１（３）：１１０８〜１１１３頁、Ｔａｖａｒｅら、（２０１５年）、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ、５６（８）：１２５８〜１２６４頁、Ｒａｓｈｉｄｉａｎら、（２０１７年）、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２１４（８）：２２４３〜２２５５頁、Ｂｅｃｋｆｏｒｄ  Ｖｅｒａら、（２０１８年）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、１３（３）：ｅ０１９３８３２、およびＴａｖａｒｅら、（２０１５年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７６（１）：７３〜８２頁を参照されたい。典型的には、検出部分（たとえば放射標識）を用いて操作した抗体または抗体様分子を患者内に注射することができ、その後これは特定のマーカー（たとえばＣＤ８＋）の部位へと分配され局在化する。このようにして、腫瘍が免疫排除の表現型を有するかどうかを決定することが可能である。腫瘍が免疫排除の表現型を有すると決定された場合、腫瘍が腫瘍環境内において十分な細胞毒性細胞を欠くため、癌治療（ＣＢＴなど）単独では効果的でない場合がある。本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１阻害剤を用いた付加型治療は、免疫抑制を低下させ、それによって癌治療耐性腫瘍を癌治療に対してより応答性にし得る。
【０４４６】
非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法は、患者を診断すること、ＴＧＦβ１阻害剤療法から利益を受ける可能性が高い患者を選択もしくは同定すること、および／または、患者を処置の際の治療反応についてモニタリングすることの目的で、様々な適切な方法において適用し得る。既知の細胞表面マーカーを有する任意の細胞を、細胞マーカーと特異的に結合する抗体または類似の分子を用いることのおかげで検出／位置特定し得る。典型的には、そのような技法を使用することによって検出する細胞は、細胞毒性Ｔリンパ球、調節性Ｔ細胞、ＭＤＳＣ、腫瘍関連マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞、および好中球などの免疫細胞である。そのようなマーカーを認識する抗体または操作した抗体様分子を検出部分とカップリングさせることができる。
【０４４７】
適切な免疫細胞マーカーの非限定的な例としては、単球マーカー、マクロファージマーカー（たとえばＭ１および／またはＭ２マクロファージマーカー）、ＣＴＬマーカー、抑制性免疫細胞マーカー、ＭＤＳＣマーカー（たとえばＧおよび／またはＭ−ＭＤＳＣのマーカー）が挙げられ、それだけには限定されないが、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ６６、ＣＤ３４、ＣＤ２５、およびＣＤ４７が挙げられる。
【０４４８】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、細胞毒性ＣＤ８陽性Ｔ細胞などのＴ細胞の追跡を含む。したがって、本開示のＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤の任意の１つを、固形腫瘍を有する対象における癌の処置に使用してよく、ここで、処置は、ｉ）対象においてＴ細胞を検出するためにｉｎ  ｖｉｖｏイメージング分析を実施するステップであって、任意選択でＴ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、また、ステップ（ｉ）のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング分析に基づいて固形腫瘍が免疫排除固形腫瘍であると決定された場合は、対象に治療上有効な量のＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤を投与するステップ  を含む。一部の実施形態では、対象はＣＢＴを受けており、任意選択で固形腫瘍はＣＢＴに対して耐性である。一部の実施形態では、対象には、組合せ療法としてＣＢＴをＴＧＦβ１阻害剤と併せて投与する。組合せは、チェックポイント阻害剤およびＴＧＦβ１阻害剤をどちらも含む単一の配合物の投与を含み得る。あるいは、組合せ療法は、チェックポイント阻害剤を含む第１の配合物およびＴＧＦβ１阻害剤を含む第２の配合物の投与を含み得る。
【０４４９】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、Ｇ−ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣとしても知られる）およびＭ−ＭＤＳＣなどのＭＤＳＣの追跡を含む。たとえば、ＭＤＳＣは、ベースラインにおいて疾患部位（線維性組織および固形腫瘍など）で富化されていてもよい。治療の際（たとえばＴＧＦβ１阻害剤療法）、治療効果の指標である標識（放射性同位元素および蛍光など）の強度の低下によって測定して、より少ないＭＤＳＣが観察され得る。
【０４５０】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、ＬＲＲＣ３３陽性細胞の追跡または位置特定を含む。ＬＲＲＣ３３陽性細胞としては、たとえば、ＭＤＳＣならびに活性化Ｍ２様マクロファージ（たとえばＴＡＭおよび線維性組織に関連する活性化マクロファージ）が挙げられる。たとえば、ＬＲＲＣ３３陽性細胞は、ベースラインにおいて疾患部位（線維性組織および固形腫瘍など）で富化されていてもよい。治療の際（たとえばＴＧＦβ１阻害剤療法）、治療効果の指標である標識（放射性同位元素および蛍光など）の強度の低下によって測定して、より少ない数の、細胞表面ＬＲＲＣ３３を発現する細胞が観察され得る。
【０４５１】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、目的の標的（たとえば、適切なマーカーを発現する細胞および組織などの、標識した試薬によって結合させることができる分子または実体）を検出するための、ＰＥＴ−ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ、および／または光学的蛍光／生物発光の使用を含む。
【０４５２】
一部の実施形態では、検出部分を用いた抗体または抗体様分子の標識は、直接標識または間接標識を含み得る。
【０４５３】
一部の実施形態では、検出部分はトレーサーであり得る。一部の実施形態では、トレーサーは放射性同位元素であってよく、任意選択で放射性同位元素は陽電子放出同位体であり得る。一部の実施形態では、放射性同位元素は、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、６８Ｇａ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、および８９Ｚｒからなる群から選択される。
【０４５４】
したがって、そのような方法を用いて、免疫−ＰＥＴにおいて、標識した抗体を使用してｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを実施し得る。
【０４５５】
一部の実施形態では、そのようなｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、対象におけるＴＧＦβ１阻害療法に対する治療反応をモニタリングするために行う。たとえば、治療反応は免疫排除された腫瘍から炎症性腫瘍への変換を含んでいてよく、これは腫瘍内への免疫細胞浸潤の増加と相関する。これは、腫瘍内免疫細胞の頻度または放射標識および蛍光などの検出シグナルの度合の増加によって可視化し得る。
【０４５６】
したがって、本発明は、ｉ）固形腫瘍を含む癌を診断された患者を選択するステップであって、固形腫瘍は免疫排除された腫瘍である、またはそう疑われるステップと、ｉｉ）患者に、本明細書中に包含される抗体または断片を、癌を処置するために有効な量で投与するステップとを含み得る、癌を処置する方法を含む。一部の実施形態では、患者は、免疫チェックポイント阻害療法（たとえばＰＤ−（Ｌ）１抗体）、化学療法、放射線療法、操作した免疫細胞による治療、および癌ワクチン療法などの癌治療を受けていた、または受ける候補である。一部の実施形態では、選択ステップ（ｉ）は免疫細胞またはその１つもしくは複数のマーカーの検出を含み、任意選択で、検出は、腫瘍生検分析、血清マーカー分析、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを含む。
【０４５７】
一部の実施形態では、患者は、そのＣＢＴが認可されている癌を診断されており、任意選択で、特定の癌を有する統計的に類似の患者集団は、認可されているＣＢＴに対して比較的低い、たとえば２５％未満の応答率を示す。たとえば、ＣＢＴへの応答率は約１０〜２５％、たとえば約１０〜１５％であり得る。そのような癌としては、たとえば、卵巣癌、胃癌、および三重陰性乳癌を挙げ得る。本開示の高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤をそのような癌の処置において使用してよく、対象は未だＣＢＴを受けていない。ＴＧＦβ１阻害剤をＣＢＴと組み合わせて対象に投与し得る。一部の実施形態では、対象は、化学療法および放射線療法などの追加の癌治療を受けてもよい、または受けていてもよい。
【０４５８】
癌および線維症などのＴＧＦβ１関連の疾患を診断された患者において特定のＭＤＳＣを検出、位置特定、および／または追跡するために、上述のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を用い得る。健康な個体は、循環中のＭＤＳＣが存在しないまたは低頻度である。そのような疾患の発症または進行に伴って、循環中および／または疾患に局在性のＭＤＳＣレベルの上昇が検出され得る。たとえば、ＣＣＲ２陽性Ｍ−ＭＤＳＣは炎症を有する組織に蓄積されることが報告されており、組織における線維症（肺線維症など）の進行を引き起こす場合があり、これはＴＧＦβ１の発現に相関していることが示されている。同様に、ＭＤＳＣはいくつかの固形腫瘍（三重陰性乳癌を含む）において富化されており、ＴＭＥの免疫抑制性の表現型に部分的に寄与する。したがって、ＭＤＳＣを位置特定または追跡することによって、本開示によるＴＧＦβ１阻害療法に対する処置応答をモニタリングし得る。検出可能なＭＤＳＣの低下または低頻度は、典型的には治療上の利点またはより良好な予後診断の指標である。
【０４５９】
したがって、ＴＧＦβ１の活性化の高親和性のコンテキスト非依存性阻害剤を対象における癌の処置に使用してよく、癌は免疫抑制によって特徴づけられており、癌はＴＧＦβ１陽性およびＴＧＦβ３陽性である固形腫瘍を任意選択で含む。そのような対象は癌腫が診断されていてよい。一部の実施形態では、癌腫は乳癌であり、任意選択で乳癌は三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）である。そのような処置は、それだけには限定されないが、化学療法、放射線療法、癌ワクチン、操作した免疫細胞による治療（ＣＡＲ−Ｔなど）、および抗ＰＤ（Ｌ）−１抗体などの免疫チェックポイント遮断療法を含めた癌治療をさらに含むことができる。
【０４６０】
一部の実施形態では、数個のエフェクター細胞が存在する、または免疫原性が乏しいとして特徴づけられた癌の一種であることが知られている、冷たい腫瘍を同定した。腫瘍抗原（たとえばネオアンチゲン）に対するより強力なＴ細胞応答を誘発させるために、そのような腫瘍を有する対象／患者を、化学療法、放射線療法、腫瘍退縮ウイルス療法、および癌ワクチンなどの免疫感作させる癌治療で処置する。このステップは、冷たい腫瘍を「免疫排除された」腫瘍へと変換し得る。対象は、抗ＰＤ−（Ｌ）１などのＣＢＴを任意選択でさらに受ける。対象を、本明細書中に開示されている抗体などのＴＧＦβ１阻害剤でさらに処置する。これは、冷たいまたは免疫排除された腫瘍を、免疫療法に対する応答性を与え得る「炎症性」または「熱い」腫瘍へと変換し得る。免疫原性の乏しい癌の非限定的な例としては、乳癌（ＴＮＢＣなど）、前立腺癌（性腺摘除耐性前立腺癌（ＣＲＰＣ）など）、および膵癌（膵腺癌（ＰＤＡＣ）など）が挙げられる。
【０４６１】
図５Ｂに示すように、Ａｂ６などの本発明のＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤は、ＴＧＦβ１のプラスミン誘導性活性化を阻害することができる。プラスミン−プラスミノーゲン軸は、様々な癌種、特に乳癌などの癌腫の特定の腫瘍化、侵襲、および／または転移に結び付けられている。したがって、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤が、上皮に関与する腫瘍またはＥＭＴ６などの腫瘍モデルにおいて、この機構を介して阻害効果を発揮し得ることが可能である。実際、上皮のプラスミン依存性破壊またはリモデリングは、上皮の傷害および癌腫の侵襲／内転移に関与する状態の病因に寄与し得る。後者は上皮間葉転換（「ＥＭＴ」）によって始動され得る。プラスミノーゲン活性化およびプラスミノーゲン依存性侵襲は上皮様細胞においてより顕著であり、Ｓ１００Ａ１０およびＰＡＩ−１の発現によって部分的に指示されたことが報告されている（Ｂｙｄｏｕｎら、（２０１８年）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、８：１４０９１頁）。
【０４６２】
本発明は、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を含む治療に応答する可能性が高い患者集団または対象を選択する方法を含む。そのような方法は、対象から収集した生体試料（たとえば臨床試料）を提供するステップと、試料中のＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の相対的レベルを決定する（たとえば測定またはアッセイする）ステップと、ＴＧＦβ１がＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を超える優性アイソフォームである場合は、ならびに／または、ＴＧＦβ１が対照と比較して有意に過剰発現もしくはアップレギュレーションされている場合は、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を含む組成物を対象に投与するステップとを含み得る。一部の実施形態では、そのような方法は、事前に決定された、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の相対的発現レベルに関する情報を得るステップと、対象を、ＴＧＦβ１陽性、好ましくはＴＧＦβ１優性の疾患を有すると同定するステップと、対象にアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を含む組成物を投与するステップとを含む。一部の実施形態では、そのような対象は治療（癌治療など）に耐性である疾患（癌など）を有する。一部の実施形態では、そのような対象は治療に対して不耐性を示し、したがって治療を中断しているまたは中断する可能性が高い。ＴＧＦβ１阻害剤を治療レジメンに追加することは、第１の治療の投薬量を低下させ、それでも臨床上の利点を組み合わせて達成することを可能にし得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、手術の必要性を遅延または低下させ得る。
【０４６３】
アイソフォームの相対的レベルは、当技術分野で周知であるＲＮＡに基づくアッセイおよび／またはタンパク質に基づくアッセイによって決定し得る。一部の実施形態では、投与ステップは、免疫チェックポイント阻害剤などの別の治療、または本明細書中の他の箇所に提供される他の薬剤も含み得る。そのような方法は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の相対的レベルの変化を２つ以上の時点でモニタリングすることによって、治療反応を評価するステップを任意選択で含み得る。一部の実施形態では、臨床試料（生検など）は投与の前および後の両方に収集する。一部の実施形態では、臨床試料（生検など）は、経時的なｉｎ  ｖｉｖｏ効果を評価するために処置後に複数回収集する。
【０４６４】
上記の調査に加えて、第３の調査は、特定の疾患に関与するＴＧＦβ１機能の幅を調べる。これは、ＴＧＦβ１コンテキストの数、すなわち、どの提示分子が疾患関連ＴＧＦβ１機能を媒介するかによって表し得る。コンテキスト非依存性阻害剤などの、ＴＧＦβ１に特異的な広範なコンテキストの阻害剤が、ＴＧＦβ１機能のＥＣＭ構成要素および免疫構成要素の両方に関与する疾患の処置に有利である。そのような疾患は、ＥＣＭにおける調節不全、および免疫細胞機能または免疫応答における攪乱に関連している場合がある。したがって、本明細書中に記載のＴＧＦβ１阻害剤は、ＥＣＭ関連ＴＧＦβ１（たとえばＬＴＢＰ１またはＬＴＢＰ３によって提示される）および免疫細胞関連ＴＧＦβ１（たとえばＧＡＲＰまたはＬＲＲＣ３３によって提示される）を標的化することができる。そのような阻害剤は、４つすべての治療標的（たとえば「コンテキスト非依存性」阻害剤）、すなわち、ＧＡＲＰ関連前駆／潜在型ＴＧＦβ１、ＬＲＲＣ３３関連前駆／潜在型ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ１関連前駆／潜在型ＴＧＦβ１、およびＬＴＢＰ３関連前駆／潜在型ＴＧＦβ１を阻害して、これらのコンテキストにおいてＴＧＦβ１機能を広範に阻害する。
【０４６５】
患者の特定の状態がＴＧＦβ１機能の複数の側面に関与するまたはそれによって駆動されるかどうかは、患者から収集した臨床試料中の提示分子の発現プロフィールを評価することによって査定し得る。ＲＮＡに基づくアッセイおよびタンパク質に基づくアッセイを含めた様々なアッセイが当技術分野で知られており、発現プロフィールを得るためにこれらを行い得る。試料中のＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、およびＬＲＲＣ３３相対的発現レベル（および／またはその変化／変更）は、状態に関連するＴＧＦβ１活性の供給源および／またはコンテキストを示し得る。たとえば、固形腫瘍から採った生検試料は、４つのすべて提示分子の高い発現を示し得る。たとえば、ＬＴＢＰ１およびＬＴＢＰ３は腫瘍間質内のＣＡＦにおいて高度に発現され得る一方で、ＧＡＲＰおよびＬＲＲＣ３３はそれぞれＴｒｅｇおよび白血球浸潤物などの腫瘍関連免疫細胞によって高度に発現され得る。
【０４６６】
したがって、本発明は、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に相対的な、疾患におけるＴＧＦβ１の関与を決定する（たとえば試験または確認する）方法を含む。一部の実施形態では、この方法は、疾患関連ＴＧＦβ１の供給源（コンテキスト）を同定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、供給源／コンテキストは、患者から採った臨床試料中のＴＧＦβ提示分子、たとえば、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、およびＬＲＲＣ３３の発現を決定することによって評価する。一部の実施形態では、そのような方法は事後に行う。
【０４６７】
ＬＲＲＣ３３陽性細胞に関して、本開示の出願人は、ＬＲＲＣ３３のＲＮＡ発現とタンパク質発現との間に有意な不一致が存在する場合があることを認識した。特に、選定された細胞種がＲＮＡレベルでＬＲＲＣ３３を発現すると思われる一方で、そのような細胞の部分組のみが細胞表面上にＬＲＲＣ３３タンパク質を発現する。ＬＲＲＣ３３発現がタンパク質輸送／局在化を介して、たとえば、形質膜挿入および迅速な内部移行に関して高度に調節され得ることが企図される。したがって、好ましい実施形態では、ＬＲＲＣ３３タンパク質発現を、たとえば活性化／Ｍ２様マクロファージおよびＭＤＳＣが富化された、患部組織（腫瘍および線維性組織など）に関連するマーカーとして使用し得る。
【０４６８】
ＴＧＦβ１関連の適応症
ＴＧＦβ１関連の適応症の一般的特徴
本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、ヒト対象においてＴＧＦβ１調節不全に関連する幅広い種類の疾患、障害、および／または状態（すなわち「ＴＧＦβ１関連の適応症」）を処置するために使用し得る。本明細書中で使用する「ＴＧＦβ１調節不全に関連する疾患（障害もしくは状態）」または「ＴＧＦβ１関連の適応症」とは、ＴＧＦβ１の発現、活性、および／もしくは代謝に関連する任意の疾患、障害、および／もしくは状態、またはＴＧＦβ１の活性および／もしくはレベルの阻害から利益を受け得る任意の疾患、障害、および／もしくは状態を意味する。
【０４６９】
したがって、本発明は、ヒト対象においてＴＧＦβ１関連の適応症を処置する方法における、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤の使用を含む。そのような阻害剤は、典型的には、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む医薬組成物へと配合する。有利には、阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥＣＭ関連ＴＧＦβ１および免疫細胞関連ＴＧＦβ１をどちらも標的とするが、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３を標的としない。一部の実施形態では、阻害剤はＴＧＦβ１の活性化ステップを阻害する。疾患は、以下の特質のうちの少なくとも２つにおける調節不全または機能障害によって特徴づけられ得る：ａ）調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ｂ）エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増殖または機能、ｃ）骨髄細胞の増殖または分化、ｄ）単球の動員または分化、ｅ）マクロファージ機能、ｆ）上皮間葉転換（ＥＭＴ）および／または内皮間葉転換（ＥｎｄＭＴ）、ｇ）ＰＡＩ−１、ＡＣＴＡ２、ＣＣＬ２、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、ＦＮ−１、ＣＴＧＦ、およびＴＧＦＢ１からなる群から選択されるマーカー遺伝子のうちの１つまたは複数における遺伝子発現、ｈ）ＥＣＭ構成要素または機能、ｉ）線維芽細胞の分化。治療上有効な量のそのような阻害剤を、疾患を患っているまたは診断された対象に投与する。
【０４７０】
一部の実施形態では、ＥＣＭ構成要素または機能の調節不全または機能障害に関与する疾患は、Ｉ型コラーゲンの蓄積の増加を示す。一部の実施形態では、ＥＣＭの調節不全はマトリックスの硬直の増加を含む。一部の実施形態では、ＥＣＭの調節不全はフィブロネクチンおよび／またはフィブリリンに関与する。
【０４７１】
一部の実施形態では、線維芽細胞の分化の調節不全または機能障害は筋線維芽細胞または筋線維芽細胞様細胞の増加を含む。一部の実施形態では、筋線維芽細胞または筋線維芽細胞様細胞は癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）である。一部の実施形態では、ＣＡＦは腫瘍間質に関連しており、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１および／またはＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１を生じ得る。一部の実施形態では、筋線維芽細胞または筋線維芽細胞様細胞は線維性組織に局在している。
【０４７２】
一部の実施形態では、調節性Ｔ細胞の調節不全または機能障害はＴｒｅｇ活性の増加を含む。
【０４７３】
一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増殖または機能の調節不全または機能障害はＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の増殖の抑制を含む。
【０４７４】
一部の実施形態では、骨髄細胞の増殖または分化の調節不全または機能障害は骨髄前駆細胞の増殖の増加を含む。骨髄細胞の増殖の増加は骨髄において起こり得る。
【０４７５】
一部の実施形態では、単球の分化の調節不全または機能障害は、線維性組織および／または固形腫瘍などの疾患部位での、骨髄由来および／または組織常在の単球のマクロファージへの分化の増殖を含む。
【０４７６】
一部の実施形態では、単球の動員の調節不全または機能障害は、骨髄由来単球の、ＴＭＥなどの疾患部位内への動員の増加を含み、マクロファージの分化およびＭ２極性化の増加、続いてＴＡＭの増加をもたらす。
【０４７７】
一部の実施形態では、マクロファージ機能の調節不全または機能障害は、マクロファージのＭ２表現型への極性化の増加を含む。
【０４７８】
一部の実施形態では、骨髄細胞の増殖または分化の調節不全または機能障害は、Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ、および／またはＴＡＮの数の増加を含む。
【０４７９】
ＴＧＦβ関連の適応症は、部分的にはエフェクター免疫細胞（たとえばＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を排除することによって身体の正常な防御機構／免疫を抑制する、腫瘍または癌組織などの免疫排除された疾患微小環境を含む状態を含み得る。一部の実施形態では、そのような免疫排除状態は、処置（たとえば癌治療）に対する乏しい応答性に関連する。患者がそれに対する応答性が乏しい癌治療の非限定的な例としては、それだけには限定されないが、チェックポイント阻害剤療法、癌ワクチン、化学療法、および放射線療法が挙げられる。特定の理論に束縛されることを意図せずに、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ阻害剤が、Ｔ細胞の拡大および／または腫瘍内への浸潤を促進することによって免疫細胞のアクセス、たとえば、Ｔ細胞（たとえばＣＤ８＋細胞）およびマクロファージ（たとえば、Ｆ４／８０＋細胞、Ｍ１−極性化マクロファージ）のアクセスを回復させることにより抗癌免疫を回避または排除する、腫瘍の能力に反撃することを助け得ることが企図される。
【０４８０】
したがって、ＴＧＦβ阻害は、エフェクターＴ細胞のアクセスおよび細胞毒性があるエフェクター機能を遮断解除および回復させることによって、免疫排除された疾患環境（ＴＭＥなど）において処置耐性（たとえば、免疫チェックポイント耐性、癌ワクチン耐性、ＣＡＲ−Ｔ耐性、化学療法耐性、放射線療法耐性など）を克服し得る。ＴＧＦβ阻害のそのような効果は、たとえばＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される、長期にわたる免疫記憶をさらに提供し得る。
【０４８１】
一部の実施形態では、腫瘍は免疫原性が乏しい（たとえば「砂漠」または「冷たい」腫瘍）。患者は、ネオアンチゲンを始動させるまたは免疫応答を促進する癌治療から利益を受け得る。そのような治療としては、それだけには限定されないが、化学療法、放射線療法、腫瘍退縮ウイルス療法、腫瘍退縮ペプチド、チロシンキナーゼ阻害剤、ネオエピトープワクチン、抗ＣＴＬＡ４、不安定誘導因子、ＤＤＲ剤、ＮＫ細胞活性化剤、およびＴＬＲリガンド／作用剤などの様々なアジュバントが挙げられる。本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１阻害剤を組み合わせて使用して、癌治療の効果をブーストすることができる。ＴＧＦβ１阻害剤の１つの作用機構は、ＭＨＣ発現を正常化または回復させ、それによってＴ細胞免疫を促進することによって行い得る。
【０４８２】
ＴＧＦβ関連の適応症の非限定的な例としては、臓器線維症（たとえば、腎線維症、肝線維症、心臓／心血管線維症、筋線維症、皮膚線維症、子宮線維症／子宮内膜症、および肺線維症）を含めた線維症、強皮症、アルポート症候群、癌（それだけには限定されないが、白血病などの血液癌、骨髄線維症、多発性骨髄腫、結腸癌、腎臓癌、乳癌、悪性黒色腫、膠芽細胞腫を含む）、固形腫瘍に関連する線維症（たとえば、線維形成性黒色腫、膵癌関連線維形成、および乳癌線維形成などの癌線維形成）、間質線維症（たとえば乳房の間質線維症）、放射線誘導性線維症（たとえば放射線線維症症候群）、化学療法後の迅速な造血の促進、骨治癒、創傷治癒、認知症、骨髄線維症、骨髄異形成（たとえば骨髄異形成（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｉｃ）症候群またはＭＤＳ）、腎臓病（たとえば末期腎臓病またはＥＳＲＤ）、片側性尿管閉塞（ＵＵＯ）、歯牙の欠損および／または変性、内皮増殖症候群、喘息およびアレルギー、胃腸管系障害、加齢の貧血、大動脈瘤、オーファン適応症（マルファン症候群およびカムラチ−エンゲルマン病など）、肥満症、糖尿病、関節炎、多発性硬化症、筋ジストロフィー、骨障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、骨粗鬆症、骨関節炎、骨減少症、代謝症候群、栄養障害、臓器萎縮、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ならびに無食欲症が挙げられる。
【０４８３】
証拠は、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３が病状におけるアデノシンレベルの上昇に少なくとも部分的に寄与し得ることを示唆している。注目すべきは、ＣＤ３９／ＣＤ７３−ＴＧＦβ軸は、ＴｒｅｇおよびＭＤＳＣを含めた、ＴＧＦβシグナル伝達に結び付けられている免疫細胞を変調させることにおいて役割を果たし得る。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）はどちらも一般に免疫抑制性の表現型を示す。多くの病理状態（たとえば、癌、線維症）において、これらの細胞は疾患部位で富化されており、免疫抑制環境を作成および／または維持することに寄与し得る。これは、一緒になってＡＴＰからヌクレオシドアデノシンへの分解に参加して、腫瘍微小環境および線維性環境などの疾患環境におけるアデノシンの局所濃度の上昇をもたらす、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３によって少なくとも部分的に媒介され得る。アデノシンは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの標的細胞上に発現されるその受容体と結合することができ、立ち代ってこれは、これらの標的細胞の抗腫瘍機能を抑制する。
【０４８４】
異常な遺伝子発現を有する疾患、バイオマーカー
様々な病状におけるＴＧＦβ１シグナル伝達経路の異常な活性化が、いくつかのマーカーの変更された遺伝子発現に関連していることが観察されている。これらの遺伝子発現マーカー（たとえばｍＲＮＡによって測定）としては、それだけには限定されないが、セルピン（Ｓｅｒｐｉｎｅ）１（ＰＡＩ−１をコードしている）、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２としても知られる）、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、ＦＮ１、ＴＧＦＢ１、ＣＴＧＦ、ＡＣＴＡ２（α−ＳＭＡをコードしている）、ＳＮＡＩ１（Ｅカドヘリン（Ｃｄｈ１）をダウンレギュレーションすることによって、線維症および転移においてＥＭＴを駆動する、ＭＭＰ２（ＥＭＴに関連するマトリックスメタロプロテアーゼ）、ＭＭＰ９（ＥＭＴに関連するマトリックスメタロプロテアーゼ）、ＴＩＭＰ１（ＥＭＴに関連するマトリックスメタロプロテアーゼ）、ＦＯＸＰ３（Ｔｒｅｇ誘導のマーカー）、ＣＤＨ１（ＴＧＦβによってダウンレギュレーションされるＥカドヘリン（上皮細胞のマーカー））、および、ＣＤＨ２（ＴＧＦβによってアップレギュレーションされるＮカドヘリン（間葉細胞のマーカー））が挙げられる。興味深いことに、これらの遺伝子の多くが、様々な種類の臓器線維症を含めた病状の多様な組および骨髄線維症を含めた多くの癌において役割を果たすと暗示されている。実際、線維性状態と異常細胞増殖、腫瘍化、および転移との間の病態生理学的な連関が示唆されている。たとえば、その内容が本明細書中に参考として組み込まれているＣｏｘおよびＥｒｌｅｒ（２０１４年）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０（１４）：３６３７〜４３頁「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」、Ｓｈｉｇａら、（２０１５年）、Ｃａｎｃｅｒｓ、７：２４４３〜２４５８頁「Ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ｔｈｅｉｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ」、ＷｙｎｎおよびＢａｒｒｏｎ（２０１０年）、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．、３０（３）：２４５〜２５７頁「Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」を参照されたい。特定の理論に束縛されることを望まずに、本開示の発明者らは、ＴＧＦβ１シグナル伝達経路が実際にはこれらの広範な病理学間の主要な連関であり得ることを企図している。
【０４８５】
損傷組織または疾患組織への白血球動員（たとえば単球／マクロファージ）を媒介する化学走性サイトカイン（またはケモカイン）の能力は、疾患の進行において重大な結果を有する。ＣＣＬ２としても知られる単球化学誘引物質タンパク質１（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３としても知られるマクロファージ炎症性タンパク質１−アルファ（ＭＩＰ−１α）、およびＣＣＬ４としても知られるＭＩＰ−１β、ならびにＣＸＣＬ２としても知られるＭＩＰ−２αなどのＣ−Ｃケモカインファミリーのメンバーがこのプロセスに結び付けられている。
【０４８６】
たとえば、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２は線維症および癌の両方において役割を果たすと考えられている。ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２は線維性促進ケモカインとして特徴づけられており、単球化学誘引物質であり、証拠は、これが癌の開始および進行の両方に関与している可能性があることを示唆している。線維症では、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２は線維症の炎症期において重要な役割を果たすことが示されている。たとえば、ＭＣＰ−１の中和は、糸球体半月の形成およびＩ型コラーゲンの蓄積に劇的な減少をもたらした。同様に、抗ＭＣＰ−１または抗ＭＩＰ−１アルファ抗体のどちらかを用いた受動免疫療法は、ブレオマイシンで誘発したマウスにおいて単核食細胞の蓄積を有意に低下させることが示されており、これはＭＩＰ−１アルファおよびＭＣＰ−１が肺の炎症反応中に白血球の動員に寄与することを示唆している（Ｓｍｉｔｈ、Ｂｉｏｌ  Ｓｉｇｎａｌｓ．、１９９６年７月〜８月、５（４）：２２３〜３１頁、「Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ」）。嚢胞性線維症および多発性骨髄腫を有する患者におけるＭＩＰ−１アルファレベルの上昇が報告されており（たとえばＭｒｕｇａｃｚら、Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．、２００７年６月、２７（６）：４９１〜５頁を参照）、ＭＩＰ−１αが局在的または全身性の炎症反応に関連しているという見方を支持している。
【０４８７】
いくつかの証拠が腫瘍進行／転移におけるＣ−Ｃケモカインの関与を指し示している。たとえば、腫瘍由来ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２は、マクロファージにおいて「癌促進」の表現型を促進することができる。たとえば、肺癌では、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２が間質細胞によって産生され、転移を促進することが示されている。ヒト膵癌では、腫瘍はＣＣＬ２を分泌し、免疫抑制ＣＣＲ２陽性マクロファージがこれらの腫瘍を浸潤する。高いＣＣＬ２発現／低いＣＤ８Ｔ細胞浸潤を示す腫瘍を有する患者は、生存が有意に減少している。特定の理論に束縛されることを望まずに、損傷組織または患部組織環境へと動員される単球は、続いて、局所キューに応答して（たとえば腫瘍由来のサイトカインに応答して）極性化となり、それによって疾患進行にさらに寄与し得ることが企図される。これらのＭ２様マクロファージは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞などのエフェクター細胞を抑制することによって免疫回避に寄与している可能性が高い。一部の実施形態では、このプロセスは、活性化マクロファージによって発現されるＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１によって部分的に媒介される。一部の実施形態では、プロセスは、Ｔｒｅｇによって発現されるＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１によって部分的に媒介される。
【０４８８】
同様に、乳癌（たとえばトリプルネガティブ乳癌）などの特定の癌腫においては、ＭＤＳＣのＣＸＣＬ２／ＣＣＬ２２媒介性動員が血管形成および転移を促進することが示されている（たとえばＫｕｍａｒら、（２０１８年）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１２８（１１）：５０９５〜５１０９頁を参照）。したがって、このプロセスがＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１などのＴＧＦβ１によって少なくとも部分的に媒介されることが企図される。さらに、ＭＭＰ９などのプロテアーゼが、腫瘍の侵襲および転移に寄与するマトリックスリモデリングのプロセスに結び付けられているため、同じまたは重複するシグナル伝達経路が線維症においても役割を果たし得る。
【０４８９】
ＰＡＩ−１／セルピン（Ｓｅｒｐｉｎｅ）１の関与は、様々な線維性状態、癌、血管形成、炎症、および神経変性疾患（たとえばアルツハイマー病）に結び付けられている。腫瘍および／または血清におけるＰＡＩ−１の発現の上昇は、乳癌および膀胱癌（たとえば移行細胞癌）などの様々な癌ならびに骨髄線維症において予後不良（たとえば、より短い生存、増加した転移）に相関されている。線維性状態のコンテキストにおいては、ＰＡＩ−１はＴＧＦβ１誘導性線維症の重要な下流エフェクターとして認識されており、ＰＡＩ−１発現の増加が肺線維症（ＩＰＦなど）、腎線維症、肝線維症、および強皮症を含めた組織線維症の様々な形態において観察されている。一部の実施形態では、このプロセスはＥＣＭ関連ＴＧＦβ１によって、たとえば、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１および／またはＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１を介して部分的に媒介されている。
【０４９０】
一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤療法のｉｎ  ｖｉｖｏ効果は、適切な遺伝子マーカーの発現レベルの変化を測定することによって評価し得る。適切なマーカーとしては、ＴＧＦβ（たとえば、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、およびＴＧＦＢ３）が挙げられる。適切なマーカーとしては、ＴＧＦβの１つまたは複数の提示分子（たとえば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３）、たとえば、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ（またはＬＲＲＣ３２）、およびＬＲＲＣ３３も挙げ得る。一部の実施形態では、適切なマーカーとしては、間葉転換遺伝子（たとえば、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＷＮＴ５Ａ、ＬＯＸＬ２、ＴＷＩＳＴ２、ＴＡＧＬＮ、および／またはＦＡＰ）、免疫抑制遺伝子（たとえば、ＩＬ１０、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＣ）、単球およびマクロファージ化学走性遺伝子（たとえば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、およびＣＣＬ２２）、ならびに／または本明細書中に記述した様々な線維性マーカーが挙げられる。好ましいマーカーは血漿／血清マーカーである。
【０４９１】
本明細書中の実施例に示すように、本明細書中に記載のＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤を使用して、ＴＧＦβ１依存性であることが示されているＵＵＯなどの機構的動物モデルを含めた適切な前臨床モデルにおいてこれらのマーカーの多くの発現レベルを低下させることができる。したがって、そのような阻害剤を使用して、疾患の遺伝子発現マーカーのうちの１つまたは複数の異常発現（たとえば過剰発現／アップレギュレーションまたは過少発現／ダウンレギュレーション）によって特徴づけられた疾患または障害を処置し得る。
【０４９２】
したがって、一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤を、ＰＡＩ−１（セルピン（Ｓｅｒｐｉｎｅ）１によってコードされている）、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２としても知られる）、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、ＦＮ１、ＴＧＦＢ１、ＣＴＧＦ、α−ＳＭＡ、ＩＴＧＡ１１、およびＡＣＴＡ２のうちの１つまたは複数の過剰発現に関連する疾患の処置において使用し、ここで、処置は、阻害剤を、疾患を患っている対象に、疾患を処置するために有効な量で投与することを含む。一部の実施形態では、阻害剤は、ＰＡＩ−１、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２、ＣＴＧＦ、および／またはα−ＳＭＡの過剰発現に関連する疾患を処置するために使用する。一部の実施形態では、疾患は骨髄線維症である。一部の実施形態では、疾患は癌、たとえば固形腫瘍を含む癌である。一部の実施形態では、疾患は臓器線維症、たとえば、肝臓（たとえばＮＡＳＨに関連する）、腎臓、肺、筋肉、皮膚、および／または心臓もしくは心血管組織の線維症である。
【０４９３】
ＥＣＭおよび免疫構成要素の両方の主要な様相を制御することにおけるＴＧＦβ１経路の関与は、著しい数の調節不全遺伝子が増殖性障害および線維性障害などの広範囲の病理学にわたって共有されているという観察を説明している可能性がある。これは、ＴＧＦβ１シグナル伝達に関与する遺伝子の異常な発現パターンが、恐らくは一般化できる現象であるという見方を支持する。これらのマーカー遺伝子は、間葉転換に関与する遺伝子（たとえばＥｎｄＭＴおよびＥＭＴ）、血管形成に関与する遺伝子、低酸素症に関与する遺伝子、創傷治癒に関与する遺伝子、ならびに組織傷害で始動される炎症反応に関与する遺伝子などのいくつかのカテゴリーへと分類し得る。
【０４９４】
Ｈｕｇｏら、（Ｃｅｌｌ、１６５（１）：３５〜４４頁）によって実施された包括的な研究は、転移性黒色腫におけるこれらのマーカークラスの示差的な遺伝子発現パターンとチェックポイント遮断療法（ＣＢＴ）に対する応答性との相関を簡潔に実証した。著者らは、「ＩＰＲＥＳシグネチャ」と案出された遺伝子の組の同時富化が、黒色腫内のみならず、分析したすべての主要な一般的なヒト悪性腫瘍内にもトランスクリプトミクス部分組を定義したことを見出した。実際、この研究は、腫瘍細胞表現型の柔軟性（すなわち間葉転換）および微小環境に対して生じる影響（たとえば、ＥＣＭリモデリング、細胞接着、および免疫抑制性創傷治癒の血管形成特長）をＣＢＴ耐性に連関させる。
【０４９５】
これらのＩＰＲＥＳ遺伝子カテゴリーのそれぞれがＴＧＦβ調節不全に関与する疾患に結び付けられていることを認識し、本出願人は、特にＴＧＦβ１アイソフォームがこれらのプロセスを病状において媒介し得ることを以前に企図していた（たとえばＷＯ２０１７／１５６５００号を参照）。本明細書中に開示されている研究はこの見方をさらに支持し（たとえば、実施例１１、図３７Ａ）、ＴＧＦβ１を選択的に標的とする治療（非選択的な代替物の対照として）が有効性および安全性の観点の両方で利点を提供し得ることがさらに確認される。
【０４９６】
したがって、本開示は、ＴＧＦβ１阻害療法に応答する可能性の高い候補の患者または患者集団を選択または同定し、患者に有効量のＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤を投与する方法／工程を含む。患者のＣＢＴに対する応答性の欠如（たとえば耐性）の観察は、患者が本明細書中に記載のＴＧＦβ１阻害療法の候補であることを示し得る。したがって、本明細書中に開示されているものなどのＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤を、ＣＢＴに対する応答性が乏しい対象における癌の処置において使用し得る。対象は、局所進行性固形腫瘍または転移癌などの進行癌を有し得る。特定の治療の有意義な治療効果を示すために十分であると予想される一定期間の後に、達成される有意義な治療効果がないまたはわずかである（たとえばＲＥＣＩＳＴおよびｉＲＥＣＩＳＴなどの標準指針に基づいた部分応答または競合応答の基準を満たさない）場合に、患者は「応答性が乏しい」と言われる。典型的には、ＣＢＴのそのような一定期間は、化学療法などの追加の治療を用いてまたは用いずにのどちらかで、少なくとも約３カ月間の処置である。そのような患者は「非応答者」と呼び得る。そのような患者が初期のＣＢＴに対する応答性が乏しい場合、患者は「一次非応答者」と呼び得る。このカテゴリーにおける癌（またはそのような癌を有する患者）は、ＣＢＴに対する「一次耐性」を有すると特徴づけ得る。一部の実施形態では、対象は、少なくとも約３カ月間のＣＢＴ処置を受けた後に、任意選択で少なくとも約４カ月間のＣＢＴ処置の後に一次非応答者である。一部の実施形態では、対象はＣＢＴと組み合わせて化学療法などの追加の治療も受けた。
【０４９７】
対象をＣＢＴの非応答者として同定した後、ＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤を対象に、対象が応答することができなかった第１のＣＢＴと同じチェックポイント阻害剤を含んでいても含んでいなくてもよいＣＢＴと併せて投与し得る。任意の適切な免疫チェックポイント阻害剤、たとえば認可されたチェックポイント阻害剤を使用し得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤を対象に、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むＣＢＴと併せて投与する。ＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤は、癌をＣＢＴに対してより感受性にさせることによって、耐性を克服することを目的とする。
【０４９８】
ＴＧＦβ１阻害療法に応答する可能性が高い候補の患者または患者集団を選択または同定する工程は、生検試料などの患者（または患者集団）から収集した生体試料を、本明細書中に記述したマーカーのうちの１つまたは複数の発現について試験するステップを含み得る。同様に、そのような遺伝子マーカーは、治療に対する患者の応答性をモニタリングする目的で使用し得る。モニタリングは、患者から、たとえば治療の投与の前および後ならびに治療レジメンの過程中に経時的に収集した２つ以上の生体試料を試験して、治療反応または有効性の指標であるマーカーのうちの１つまたは複数の遺伝子発現レベルの変化を評価することを含み得る。一部の実施形態では、液体生検を使用し得る。
【０４９９】
一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害療法に応答する可能性が高い候補の患者または患者集団を選択する方法は、本明細書中に記載のものなどの遺伝子マーカーについて以前に試験した、その異常な発現を示した患者または患者集団を同定するステップを含み得る。これらの同じ方法が、治療に対する患者の応答を後に確認するまたはそれと相関させるためにも適用可能である。
【０５００】
一部の実施形態では、異常なマーカー発現は、ＴＧＦβ１、ＬＲＲＣ３３、ＧＡＲＰ、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＰＡＩ−１／セルピン（Ｓｅｒｐｉｎｅ）１のうちの少なくとも１つのレベルの上昇を含む。一部の実施形態では、患者または患者集団（たとえばそれから収集した生体試料）は、上昇したＴＧＦβ１の活性化、ホスホ−Ｓｍａｄ２／３、またはその組合せを示す。一部の実施形態では、患者または患者集団（たとえばそれから収集した生体試料）は、上昇したＭＤＳＣを示す。一部の実施形態では、そのような患者または患者集団は、ＴＧＦβ１陽性である固形腫瘍を含み得る癌を有する。固形腫瘍は、他のアイソフォームと比較してＴＧＦβ１が腫瘍中で発現される優性アイソフォームである、ＴＧＦβ１優性腫瘍であり得る。一部の実施形態では、固形腫瘍は、ＴＧＦβ１が腫瘍中で発現される共優性アイソフォームであるＴＧＦβ１共優性腫瘍、たとえばＴＧＦβ１＋／ＴＧＦβ３＋であり得る。一部の実施形態では、そのような患者または患者集団は、化学療法、放射線療法、および／または免疫チェックポイント治療、たとえば、抗ＰＤ−１（たとえばペンブロリズマブおよびニボルマブ）、抗ＰＤ−Ｌ１（たとえばアテゾリズマブ）、抗ＣＴＬＡ４（たとえばイピリムマブ）、操作した免疫細胞による治療（たとえばＣＡＲ−Ｔ）、ならびに癌ワクチンなどの癌治療に対して耐性を示す。本発明によれば、本明細書中に開示されているものなどの高親和性のコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤は、エフェクター細胞が癌細胞へのアクセスを得ることによって抗腫瘍効果を達成することを許可するために免疫抑制を遮断解除することによって、耐性を克服する。したがって、ＴＧＦβ１阻害剤療法は、腫瘍におけるエフェクター細胞の浸潤および／または拡大を促進し得る。さらに、ＴＧＦβ１阻害剤療法は、腫瘍中のＴｒｅｇおよびＭＤＳＣなどの免疫抑制免疫細胞の頻度を低下させ得る。
【０５０１】
一部の実施形態では、異常なマーカー発現は遺伝子の１つまたは複数のパネルを含む：間葉転換マーカー（たとえば、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＷＮＴ５Ａ、ＬＯＸＬ２、ＴＷＩＳＴ２、ＴＡＧＬＮ、ＦＡＰ）、免疫抑制遺伝子（たとえば、ＩＬ１０、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＣ）、単球およびマクロファージ化学走性遺伝子（たとえば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３）、血管形成および創傷治癒に関与する遺伝子（たとえばＴ細胞抑制性）、細胞接着マーカー、ＥＣＭリモデリング、骨格システムおよび骨発生マーカー、ならびに組織傷害で始動される炎症反応に関与する遺伝子。
【０５０２】
一部の実施形態では、ＭＨＣ発現（ＭＨＣクラス１など）の欠如またはダウンレギュレーションが、本開示によって包含される抗体または抗原結合断片を治療として使用し得るＴＧＦβ１関連状態のバイオマーカーとして役割を果たし得る。ＭＨＣレベルの低下は免疫回避をシグナルする可能性があり、これは、ＣＢＴなどの免疫治療に対する患者の乏しい応答性に相関している場合がある。したがって、ＴＧＦβ１の選択的阻害はエフェクター細胞機能を少なくとも部分的に回復させ得る。
【０５０３】
間葉転換に関与する疾患
間葉転換とは、上皮細胞および内皮細胞などの細胞の、間葉表現型（筋線維芽細胞など）に向かう表現型シフトのプロセスである。間葉転換を示す遺伝子マーカーの例としては、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＷＮＴ５、ＬＯＸＬ２、ＴＷＩＳＴ２、ＴＡＧＬＮ、およびＦＡＰが挙げられる。癌では、たとえば、間葉転換（たとえばＥｎｄＭＴおよびＥＭＴのシグネチャの増加）は腫瘍細胞表現型の柔軟性を示す。したがって、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム特異的阻害剤は、ＥＭＴおよびＥｎｄＭＴなどの間葉転換によって開始または駆動される疾患を処置するために使用し得る。
【０５０４】
ＥＭＴ（上皮間葉転換）とは、密着帯を有する上皮細胞が緩い細胞−細胞接触などの間葉特性（表現型）に切り替わるプロセスである。このプロセスは、いくつかの正常な生物学的プロセス、ならびに胚形成、創傷治癒、癌転移、および線維症を含めた病理学的状況において観察される（たとえばＳｈｉｇａら、（２０１５年）、「Ｃａｎｃｅｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：Ｔｈｅｉｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ」。Ｃａｎｃｅｒｓ、７：２４４３〜２４５８頁に総説）。一般に、ＥＭＴシグナルは主にＴＧＦβによって誘導されると考えられている。たとえば、多くの種類の癌が、より乏しい予後診断と相関する、細胞の間葉表現型（筋線維芽細胞およびＣＡＦなど）に向かう分化転換に関与すると思われる。したがって、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤は、ＥＭＴによって開始または駆動される疾患を処置するために使用し得る。実際、本明細書中に例示するデータ（たとえば図７〜９）は、そのような阻害剤が、α−ＳＭＡ、ＬＯＸＬ２、Ｃｏｌ１（Ｉ型コラーゲン）、およびＦＮ（フィブロネクチン）などの筋線維芽細胞／ＣＡＦマーカーの発現をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制する能力を有することを示す。したがって、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム特異的阻害剤は、ＥＭＴによって特徴づけられた疾患の処置に使用し得る。治療上有効な量の阻害剤は、α−ＳＭＡ／ＡＣＴＡ２、ＬＯＸＬ２Ｃｏｌ１（Ｉ型コラーゲン）、およびＦＮ（フィブロネクチン）などのマーカーの発現を低下させるために十分な量であり得る。一部の実施形態では、疾患は線維性障害である。一部の実施形態では、疾患は癌などの増殖性障害である。
【０５０５】
同様に、ＴＧＦβは、心臓形成などの正常な発生において観察される、内皮間葉転換（ＥｎｄＭＴ）の主要な調節因子でもある。しかし、同じまたは類似の現象が、癌の間質および線維性の部位などの多くの疾患関連組織でも見られる。一部の疾患プロセスでは、ＣＤ３１などの内皮マーカーはＴＧＦβ１曝露の際にダウンレギュレーションされ、その代わりに、ＦＳＰ−１、α−ＳＭＡ／ＡＣＴＡ２、およびフィブロネクチンなどの間葉マーカーの発現が誘導される。実際、間質ＣＡＦは血管内皮細胞に由来し得る。したがって、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム特異的阻害剤は、ＥｎｄＭＴによって特徴づけられた疾患の処置に使用し得る。治療上有効な量の阻害剤は、ＦＳＰ−１、α−ＳＭＡ／ＡＣＴＡ２、およびフィブロネクチンなどのマーカーの発現を低下させるために十分な量であり得る。一部の実施形態では、疾患は線維性障害である。一部の実施形態では、疾患は癌などの増殖性障害である。
【０５０６】
マトリックスの硬化およびリモデリングに関与する疾患
線維性状態および癌などの様々なＴＧＦβ１関連の適応症の進行は、ＥＣＭ内に蓄積される基質成分のレベルの増加および／またはＥＣＭの維持／リモデリングに関与する。コラーゲンなどのＥＣＭ構成要素の蓄積の増加がＥＣＭの機械物理特性（たとえばマトリックス／基質の硬直）を変更することができ、この現象がＴＧＦβ１シグナル伝達に関連していることが報告されている。本出願人は、前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ１を形質移入し、定義された硬直（たとえば、５ｋＰａ、１５ｋＰａ、または１００ｋＰａ）を有するケイ素に基づく基質上で成長させた初代線維芽細胞を使用して、ＴＧＦβのインテグリン依存性活性化に対するマトリックスの硬直の役割を以前に実証している。ＷＯ２０１８／１２９３２９号に開示されているように、より高い硬直を有するマトリックスがＴＧＦβ１の活性化を増強させ、これはＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤によって抑制することができる。これらの観察は、ＴＧＦβ１がＥＣＭの特性（硬直など）に影響を与え、立ち代ってこれは、疾患の進行を反映してＴＧＦβ１の活性化をさらに誘導する場合があることを示唆している。
【０５０７】
したがって、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム特異的阻害剤を使用してのプロセスを遮断して、線維症、腫瘍成長、侵襲、転移、および線維形成などのＥＣＭの変更に関与する疾患の進行に反撃し得る。そのような阻害剤のＬＴＢＰアームは、ＬＴＢＰ１および／またはＬＴＢＰ３によって提示されるＥＣＭ関連の前駆／潜在型ＴＧＦβ１複合体を直接遮断し、それによって、疾患ニッチにおける複合体からの成長因子の活性化／放出を防止することができる。一部の実施形態では、高親和性のアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤はＥＣＭの硬直を正常化させて、インテグリン依存性シグナル伝達に関与する疾患を処置し得る。一部の実施形態では、インテグリンはα１１鎖、β１鎖、または両方を含む。ＥＣＭの構造、たとえばＥＣＭ構成要素および組織化も、マトリックス関連プロテアーゼによって変更される場合がある。
【０５０８】
ＬａｍｐｉおよびＲｅｉｎｈａｒｔ−Ｋｉｎｇ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０（４２２）：ｅａａｏ０４７５、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ  ｔｏ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｆｒｏｍ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ」）に総説されるように、組織ＥＣＭの硬直の増加が癌、線維症、および心血管病の病理学的進行中に起こる。このプロセスに関連する機械的特性は、表現型が変換された筋線維芽細胞、ＴＧＦβ、およびマトリックス架橋結合に関与する。癌および線維性疾患中のＥＣＭの硬直の増加の主要な原因は、脱筋線維芽細胞へと脱分化した活性化線維芽細胞（たとえばＣＡＦおよびＦＡＦ）による調節不全のマトリックス合成およびリモデリングである。腫瘍間質および臓器線維症のリモデリングは、病理学的状態では応答が持続していること以外は、創傷治癒の応答に著しい類似性を示す。筋線維芽細胞（Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｓ）は、骨髄由来および組織常在の細胞などの複数の細胞源に由来する病理学に特異的な前駆細胞を有する、不均一な細胞集団である。一般的に使用される筋線維芽細胞マーカーとしてはアルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）が挙げられる。本明細書中に示すように、高親和性のアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究においてＡＣＴＡ２の発現（α−ＳＭＡをコードする）、コラーゲン、およびＦＮ（フィブロネクチン）を低下させることができる。フィブロネクチンはＬＴＢＰ関連前駆ＴＧＦβ１複合体をマトリックス構造上に固定することにおいて重要である。
【０５０９】
ＥＣＭ調節におけるＴＧＦβ経路の重要性は十分に確立されている。ＴＧＦβ１（およびＴＧＦβ３）は、特定のインテグリン（たとえばαＶインテグリン）によって機械的に活性化させることができるため、インテグリン−ＴＧＦβ１相互作用が治療標的となっている。たとえば、αＶβ６に対するモノクローナル抗体が特発性肺線維症について調査されている。しかし、そのような手法は、同じインテグリン結合モチーフであるＲＧＤを共有するＴＧＦβ３シグナル伝達とも干渉する場合があり、さらに、そのような抗体は、プロテアーゼ誘導性活性化などの他の様式を介して活性化されたＴＧＦβ１の遮断には有効とならなり。それに比べて、高親和性のアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤は、ＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化（図５Ａおよび５Ｂ）ならびにＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化（図１〜４および３３Ｂ）を遮断することができる。したがって、ＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤は優れた特質を提供し得る。本明細書中に提示するデータは、本出願人の以前の研究と一緒になって、ＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤がＥＣＭの硬化に関連する疾患の処置において有効であり得ることを支持する。
【０５１０】
したがって、本発明は、対象におけるマトリックスの硬化に関連する疾患の処置またはマトリックスの硬直を低下させるための方法における、ＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤の治療的使用を含む。そのような使用は、治療上有効な量のＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤の投与を含む。
【０５１１】
プロテアーゼに関与する疾患
ＴＧＦβのその潜在型複合体からの活性化は、インテグリンによって力依存性の様式で、および／またはプロテアーゼによって始動され得る。証拠は、特定のプロテアーゼクラスがプロセスに関与し得ることを示唆しており、それだけには限定されないが、カリクレイン、ケモトリプシン（Ｃｈｅｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、エラスターゼ、プラスミンなどのＳｅｒ／Ｔｈｒプロテアーゼ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−１３などのＭＭＰファミリーの亜鉛メタロプロテアーゼ、ならびにＡｄａｍ１０およびＡｄａｍ１７などのプロテアーゼのＡｄａｍファミリーが挙げられる。ＭＭＰ−２は最も豊富な基底膜の構成要素であるＩＶ型コラーゲンを分解し、これがＥＣＭ関連ＴＧＦβ１調節において役割を果たし得るという可能性が持ち上がる。ＭＭＰ−９は、乳癌などの癌腫におけるものを含めて、腫瘍進行、血管形成、間質リモデリング、および転移において中心的な役割を果たすことが暗示されている。したがって、ＥＣＭにおけるＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化が癌の処置に重要であり得る。
【０５１２】
カリクレイン（ＫＬＫ）とは、トリプシンまたはキモトリプシン様セリンプロテアーゼであり、血漿カリクレインおよび組織カリクレインが挙げられる。ＥＣＭは、悪性増殖を抑制するための構造およびシグナル伝達の足場および障壁として作用して、組織の恒常性において役割を果たす。ＫＬＫは、腫瘍の拡大および侵襲を促進し得るＥＣＭタンパク質および他の構成要素の分解において役割を果たし得る。たとえば、ＫＬＫ１は特定の乳癌において高度にアップレギュレーションされており、ＭＭＰ−２前駆体およびＭＭＰ−９前駆体を活性化させることができる。ＫＬＫ２は潜在型ＴＧＦβ１を活性化させ、線維芽細胞に隣接する前立腺癌を癌成長許容状態にする。ＫＬＫ３は前立腺癌（ＰＳＡ）の診断的マーカーとして広く研究されている。ＫＬＫ３は、プラスミノーゲンを、タンパク質分解的にＬＡＰを切断することによってＴＧＦβ１成長因子が潜在型複合体から放出されることを引き起こすプラスミンへとプロセッシングすることによって、ＴＧＦβ１を直接活性化し得る。ＫＬＫ６はアルツハイマー病の潜在的なマーカーであり得る。
【０５１３】
さらに、実施例８に提供するデータは、そのようなプロテアーゼがカリクレインであり得ることを示す。したがって、本発明は、カリクレインまたはカリクレイン様プロテアーゼに関連する疾患を処置するための方法における、ＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤の使用を包含する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤はＡｂ３、Ａｂ６、またはその誘導体である。
【０５１４】
プラスミン、ＴＳＰ−１、およびαＶβ６インテグリンなどのＴＧＦβ１の既知の活性化剤は、すべてＬＡＰと直接相互作用する。ＬＡＰのタンパク質分解的切断がＬＡＰ−ＴＧＦβの相互作用を不安定化させ、それによって活性ＴＧＦβ１が放出され得ることが推論される。５４−ＬＳＫＬＲＬ−５９を含有する領域が、ＴＧＦβ１の潜在性を維持するために重要であることが示唆されている。したがって、相互作用を安定化させる、またはＬＡＰのタンパク質分解的切断を遮断する薬剤（たとえば抗体）がＴＧＦβ１の活性化を防止し得る。
【０５１５】
病的状態（たとえば癌）に関連するこれらのプロテアーゼの多くは、明白に異なる作用機構を通じて機能する。したがって、特定のプロテアーゼまたはプロテアーゼの組合せの標的化された阻害は、プロテアーゼ−ＴＧＦβ軸に関与する状態の処置に対して治療上の利点を提供し得る。したがって、ＴＧＦβ１のプロテアーゼ誘導性活性化を選択的に阻害する阻害剤（たとえばＴＧＦβ１抗体）がそのような疾患（たとえば癌）の処置において有利であり得ることが企図される。同様に、処置する状態に応じて、１つのプロテアーゼによる別のプロテアーゼを超えるＴＧＦβ１の活性化の選択的阻害も好ましい場合がある。
【０５１６】
プラスミンは、プラスミノーゲンと呼ばれる前駆形態として生成されるセリンプロテアーゼである。放出の際、プラスミンは循環に入り、したがって血清中に検出される。血清プラスミンレベルの上昇は、恐らくは、腫瘍細胞の運動性、侵襲、および転移を促進する細胞外マトリックス（たとえば基底膜および間質障壁）の破壊に関与する機構を通じて、癌進行と相関していると思われる。プラスミンは、接着、増殖、アポトーシス、癌の栄養摂取、酸素供給、血管の形成、およびＶＥＧＦの活性化にも影響を与え得る（Ｄｉｄｉａｓｏｖａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ、２０１４年、１５、２１２２９〜２１２５２頁）。さらに、プラスミンはマクロファージの腫瘍微小環境内への遊走を促進し得る（Ｐｈｉｌｉｐｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０１１年１１月１日、７１（２１）：６６７６〜８３頁およびＣｈｏｏｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．、２００３年、４１５Ｓ、Ｓ４６〜Ｓ５８頁）。実際、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、腫瘍成長、侵襲、転移、および血管形成を促進するその能力を通じた腫瘍化の十分に特徴づけられた駆動因子。
【０５１７】
プラスミン活性はＥＣＭの破壊と主に結ばれている。しかし、プラスミンが下流のＭＭＰおよびＴＧＦβの活性化も調節するという、ますます増える証拠も存在する。具体的には、プラスミンは、ＴＧＦβ遺伝子産物のＮ末端領域に由来する潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）のタンパク質分解的切断を通じてＴＧＦβの活性化を引き起こし（Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０１２年１０月、１５２（４）：３２１〜９頁）、その結果、活性成長因子の放出をもたらすことが示唆されている。ＴＧＦβ１は癌進行を促進し得るため、このことによりＴＧＦβのプラスミン誘導性活性化がこのプロセスを少なくとも部分的に媒介し得るという可能性が持ち上がる。
【０５１８】
ＴＧＦβ１は、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換における重大な役者であるｕＰＡの発現を調節することも示されている（Ｓａｎｔｉｂａｎｅｚ，Ｊｕａｎ  Ｆ．、ＩＳＲＮ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１３年：５９７９２７）。ｕＰＡは、その細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）と結合し、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を促進することによって、独立して癌進行（たとえば、接着、増殖、および遊走）を促進することが示されている。さらに、研究により、ｕＰＡおよび／またはプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）の発現が、結腸直腸癌（Ｄ．Ｑ．Ｓｅｅｔｏｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第８２巻、第３号、１８４〜１９３頁、２００３年）、乳癌（Ｎ．Ｈａｒｂｅｃｋら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ、第５巻、第５号、３４８〜３５２頁、２００４年）、および皮膚癌（Ｓａｎｔｉｂａｎｅｚ，Ｊｕａｎ  Ｆ．、ＩＳＲＮ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１３年：５９７９２７）における予後不良を予知するものであることが示されている。したがって、特定の理論に束縛されることを望まずに、プラスミン、ＴＧＦβ１、およびｕＰＡの間の相互作用は、癌進行を促進することに向かった正のフィードバックループを作成し得る。したがって、プラスミン依存性ＴＧＦβ１の活性化を選択的に阻害する阻害剤が、プラスミン／ＴＧＦβ１シグナル伝達軸に依存する癌の処置に特に適切であり得る。
【０５１９】
本発明の一態様では、本明細書中に記載のＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤は、ＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化を阻害することができる阻害剤を含む。一部の実施形態では、阻害剤は、プロテアーゼ依存性ＴＧＦβ１の活性化をインテグリン非依存性様式で阻害することができる。一部の実施形態では、そのような阻害剤は、ＴＧＦβ１の活性化を活性化の様式とは無関係に阻害することができ、たとえば、インテグリン依存性活性化およびＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化の両方を阻害する。一部の実施形態では、プロテアーゼは、カリクレイン、ケモトリプシン（Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、トリプシン、エラスターゼ、プラスミンなどのセリンプロテアーゼ、ならびにＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびＭＭＰ−１３などの亜鉛メタロプロテアーゼ（ＭＭＰファミリー）からなる群から選択される。
【０５２０】
一部の実施形態では、阻害剤は、ＴＧＦβ１のプラスミン誘導性活性化を阻害することができる。一部の実施形態では、阻害剤は、プラスミンおよびインテグリン誘導性ＴＧＦβ１の活性化を阻害することができる。一部の実施形態では、抗体は、前駆ＴＧＦβ１と特異的に結合するモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は潜在型前駆ＴＧＦβ１と結合し、それによって潜在型複合体からの成熟成長因子の放出を阻害する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のプラスミン依存性活性化を阻害する方法において使用するために適したＴＧＦβ１の活性化の高親和性のコンテキスト非依存性阻害剤は、Ａｂ６またはその誘導体もしくは変異体である。
【０５２１】
一部の実施形態では、阻害剤（たとえばＴＧＦβ１抗体）は癌細胞の遊走を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤はマクロファージの遊走を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤はＴＡＭの蓄積を阻害する。
【０５２２】
別の態様では、対象に有効量のＴＧＦβ１阻害剤（たとえばＴＧＦβ１抗体）を投与するステップを含む、それを必要としている対象において癌を処置する方法であって、阻害剤がＴＧＦβ１のプロテアーゼ誘導性活性化（たとえばプラスミン）を阻害し、それによって対象における癌を処置する方法を本明細書中に提供する。
【０５２３】
別の態様では、対象に有効量のＴＧＦβ１阻害剤（たとえばＴＧＦβ１抗体）を投与するステップを含む、それを必要としている対象において腫瘍成長を低下させる方法であって、阻害剤がＴＧＦβ１のプロテアーゼ誘導性活性化（たとえばプラスミン）を阻害し、それによって対象における腫瘍成長を低下させる方法を本明細書中に提供する。
【０５２４】
癌／悪性腫瘍
様々な癌がＴＧＦβ１活性に関与しており、本開示の抗体および／または組成物で処置し得る。本明細書中で使用する用語「癌」とは、ＴＧＦβ１陽性細胞に関連する様々な悪性新生物のうちの任意のものをいう。そのような悪性新生物は、周囲の組織に侵入して新しい身体部位へと転移する傾向がある未分化細胞の増殖によって特徴づけられており、そのような悪性新生物成長によって特徴づけられた病的状態も言う。ＴＧＦβ１の供給源は多様な場合があり、悪性（癌）細胞自体、ならびに、たとえば、細胞外マトリックス、様々な免疫細胞、およびその任意の組合せを含めたその周囲または支持細胞／組織を挙げ得る。
【０５２５】
癌の「ＴＧＦβ１陽性」としての肯定的同定は、本明細書中に記載の治療方法を実施するために必須ではない。典型的には、特定の癌種は、信頼できる証拠に基づいて、ＴＧＦβ１シグナル伝達に関連していることが知られているまたはそう疑われる。
【０５２６】
癌は局在性（たとえば固形腫瘍）または全身性であり得る。本開示のコンテキストにおいて、用語「局在化された（局在性）」（「局在性腫瘍」などのように）とは、全身病（たとえばいわゆる液性腫瘍または血液癌）の対称として、解剖学的に単離されたまたは単離可能な異常／病変、たとえば固形悪性腫瘍をいう。特定の種類の白血病（たとえば骨髄線維症）および多発性骨髄腫などの特定の癌は、たとえば、疾患に関して局在化された構成要素（たとえば骨髄）および全身性の構成要素（たとえば循環血液細胞）の両方を有し得る。一部の実施形態では、癌は血液学的悪性腫瘍などの全身性であり得る。本開示に従って処置し得る癌はＴＧＦβ１陽性であり、それだけには限定されないが、すべての種類のリンパ腫／白血病、癌腫、および肉腫、たとえば、肛門、膀胱、胆管、骨、脳、乳房、子宮頸部、結腸／直腸、子宮内膜、食道、眼、胆嚢、頭頸部、肝臓、腎臓、喉頭、肺、縦隔（胸部）、口、卵巣、膵臓、陰茎、前立腺、皮膚、小腸、胃、脊髄、尾骨、精巣、甲状腺、および子宮において見つかる癌または腫瘍が挙げられる。一部の実施形態では、癌は局所進行性固形腫瘍および転移癌などの進行癌であり得る。
【０５２７】
本開示によって包含される抗体またはその抗原結合断片は、それだけには限定されないが、骨髄線維症、黒色腫、アジュバント黒色腫、腎細胞癌（ＲＣＣ）、膀胱癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、結腸癌、直腸癌、肛門癌、乳癌、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、ＨＥＲ２陰性乳癌、ＢＲＣＡで突然変異させた乳癌、血液悪性腫瘍、非小細胞がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、拡張期小細胞肺癌（ＥＳ−ＳＣＬＣ）、リンパ腫（古典的ホジキンおよび非ホジキン）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）、Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、組織球性肉腫、濾胞樹状細胞肉腫、指状嵌入樹状細胞肉腫、骨髄腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、頭頸部癌、尿路上皮癌、メルケル細胞癌腫、メルケル細胞皮膚癌、マイクロサテライト不安定性を有する癌（ＭＳＩ−Ｈ）、ミスマッチ修復欠損を有する癌（ｄＭＭＲ）、中皮腫、胃癌、胃食道接合部癌（ＧＥＪ）、胃腺癌、神経内分泌腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胃噴門部腺癌、腎臓癌、胆汁癌、胆管癌、膵癌、前立腺癌、腺癌、扁平細胞癌、非扁平細胞癌、皮膚扁平細胞癌（ＣＳＣＣ）、卵巣癌、子宮内膜癌、輸卵管癌、子宮頸癌、腹膜癌、胃癌、脳癌、悪性神経膠腫、膠芽細胞腫、神経膠肉腫、神経芽細胞腫、甲状腺癌、副腎皮質癌、口腔上皮内新形成、食道癌、鼻腔および副鼻腔扁平細胞癌、上咽頭癌腫、唾液腺癌、肝臓癌、ならびに肝細胞癌（ＨＣＣ）を含めた癌の処置において使用し得る。しかし、たとえば生検によって決定してＴＧＦβ１が過剰発現されているまたは少なくとも優性のアイソフォームである任意の癌（たとえばそのような癌を有する患者）を、本開示によるＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤で処置し得る。
【０５２８】
癌において、ＴＧＦβ（たとえばＴＧＦβ１）は成長促進性または成長阻害性のどちらかであり得る。一例として、膵癌において、ＳＭＡＤ４野生型腫瘍はＴＧＦβに応答して成長の阻害を経験し得るが、疾患が進行するにつれて、後成的に活性化されたＩＩ型受容体が典型的には存在する。さらに、ＳＭＡＤ４ヌル膵癌が存在する。一部の実施形態では、本開示の抗体、その抗原結合部分、および／または組成物は、癌の１つまたは複数の形態においてユニークに機能するＴＧＦβシグナル伝達経路の構成要素を選択的に標的とするように設計されている。白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）、すなわち白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）の異常増殖によって特徴づけられる白血病、または血液もしくは骨髄の癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病または急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病（ＡＭＬ）（１０番と１１番染色体［ｔ（１０、１１）］、８番と２１番染色体［ｔ（８；２１）］、１５番と１７番染色体［ｔ（１５；１７）］との間の転座、および１６番染色体の逆転［ｉｎｖ（１６）］を有するＡＭＬと、以前に脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）またはＡＭＬへと変換される骨髄増殖性疾患を有していた患者を含めた、多系列異形成を有するＡＭＬと、以前に化学療法および／または放射線照射を有しており、続いてＡＭＬまたはＭＤＳを発症する患者を含めた、ＡＭＬおよび脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）、治療関連のカテゴリーと、ｄ）上記カテゴリーに該当しないＡＭＬの亜型を含めた、他に分類されないＡＭＬと、ｅ）白血病細胞を骨髄もしくはリンパ球細胞のどちらかとして分類することができない、または両方の種類の細胞が存在する場合に起こる、不明瞭な系列の急性白血病）、ならびに慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含めた４つの主な分類へと分けることができる。
【０５２９】
一部の実施形態では、上記で言及したＴＧＦβ１陽性癌のうちの任意の１つはＴＧＦβ３陽性でもあり得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１陽性およびＴＧＦβ３陽性の両方である腫瘍は、ＴＧＦβ１／ＴＧＦβ３共優性であり得る。一部の実施形態では、そのような癌は固形腫瘍を含む癌腫である。一部の実施形態では、そのような腫瘍は乳癌である。一部の実施形態では、乳癌は三重陰性遺伝子型（三重陰性乳癌）のものであり得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１陽性癌を有する対象はＭＤＳＣレベルの上昇を有する。たとえば、そのような腫瘍は、ＭＤＳＣ浸潤の数の増加をもたらす、腫瘍部位に動員されたＭＤＳＣを含み得る。一部の実施形態では、乳癌を有する対象は、再発および予後不良に関連する炎症性マーカーであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルの上昇を示す。一部の実施形態では、乳癌を有する対象はＩＬ−６レベルの上昇を示す。
【０５３０】
本発明のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、ＢＣＲ／ＡＢＬ腫瘍性タンパク質が新生細胞の異常成長および蓄積に必須であるとみなされる幹細胞疾患である慢性骨髄性白血病を患っている患者を処置するために使用し得る。イマチニブはこの状態を処置するための認可された治療であるが、有意な割合の骨髄性白血病患者がイマチニブ耐性を示す。本明細書中に記載のものなどの阻害剤によって達成されるＴＧＦβ１阻害は、ＢＣＲ／ＡＢＬ駆動の新生細胞の異常成長および蓄積に反撃するために再増殖／拡大を強化し、それによって臨床上の利点を提供し得る。
【０５３１】
本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤を使用して多発性骨髄腫を処置し得る。多発性骨髄腫は、骨髄において発生および拡大し、破壊的な骨病変（すなわち骨溶性病変）を引き起こす、Ｂリンパ球（たとえば、形質細胞、形質芽細胞、記憶Ｂ細胞）の癌である。典型的には、疾患は、骨溶性病変、骨減少症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、ならびに形質細胞腫、血小板減少症、好中球減少症、および神経障害によって部分的に特徴づけられた、破骨細胞骨吸収の増強、骨芽細胞分化の抑制（たとえば分化の停止）、および骨形成の障害を顕在化させる。本明細書中に記載のＴＧＦβ１選択的なコンテキスト非依存性阻害剤療法は、患者において１つまたは複数のそのような臨床徴候または症状を寛解させるために有効であり得る。ＴＧＦβ１阻害剤は、本明細書中の他の箇所に列挙したものを含めて、多発性骨髄腫を処置するために１つまたは複数の追加の治療を受ける患者に投与し得る。一部の実施形態では、多発性骨髄腫は、ミオスタチン阻害剤またはＩＬ−６阻害剤と組み合わせたＴＧＦβ１阻害剤（アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤など）で処置し得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、ボルテゾミブ、レナミドマイド、カルフィルゾミブ、ポマリドミド、サリドマイド、ドキソルビシン、コルチコステロイド（たとえばデキサメタゾンおよびプレドニゾン）、化学療法（たとえばメルファラン）、放射線療法、幹細胞移植、プリチデプシン、エロツズマブ、イキサゾミブ、マシチニブ、および／またはパノビノスタットなどの従来の多発性骨髄腫治療と併せて使用し得る。
【０５３２】
本発明の方法によって処置し得る癌腫の種類としては、それだけには限定されないが、乳頭腫／癌腫、絨毛癌、内胚葉洞腫瘍、奇形腫、腺腫／腺癌、黒色腫、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫、血管腫、骨腫、軟骨腫、神経膠腫、リンパ腫／白血病、扁平細胞癌、小細胞がん、大細胞未分化癌腫、基底細胞癌、および副鼻腔未分化癌腫が挙げられる。
【０５３３】
肉腫の種類としては、それだけには限定されないが、胞状軟部肉腫、血管肉腫、皮膚線維肉腫、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、およびアスキン腫瘍などの軟組織肉腫、ユーイング肉腫（原始神経外胚葉性腫瘍）、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、ならびに軟骨肉腫が挙げられる。
【０５３４】
本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１の活性化のアイソフォーム選択的なコンテキスト非依存性阻害剤は、神経堤起源の細胞に関与する悪性腫瘍の処置に適切であり得る。神経堤系列の癌（すなわち神経堤由来の腫瘍）としては、それだけには限定されないが、黒色腫（メラニン形成細胞の癌）、神経芽細胞腫（交感神経副腎前駆体の癌）、神経節神経腫（末梢神経系結節腫の癌）、甲状腺髄様癌（甲状腺Ｃ細胞の癌）、褐色細胞腫（副腎髄質のクロム親和性細胞の癌）、およびＭＰＮＳＴ（シュワン細胞の癌）が挙げられる。一部の実施形態では、本開示の抗体および方法は、癌または癌関連状態のうちの１つまたは複数種を処置するために使用してよく、これには、それだけには限定されないが、結腸癌、腎臓癌、乳癌、悪性黒色腫、および膠芽細胞腫を挙げ得る（Ｓｃｈｌｉｎｇｅｎｓｉｅｐｅｎら、２００８年、Ｏｕｈｔｉｔら、２０１３年）。
【０５３５】
正常な条件下では、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は全体的なＣＤ４陽性リンパ球集団の小さな部分組を表し、免疫系を恒常性に維持するために主要な役割を果たす。しかし、ほぼすべての癌において、Ｔｒｅｇの数は著しく増加している。Ｔｒｅｇは、健康な個体では免疫応答の勢いを弱めることにおいて重要な役割を果たす一方で、癌におけるＴｒｅｇ数の上昇は予後不良に関連づけられている。癌において上昇したＴｒｅｇは、宿主の抗癌免疫の勢いを弱める場合があり、腫瘍進行、転移、腫瘍再発、および／または処置耐性に寄与する場合がある。たとえば、ヒト卵巣癌腹水にはＦｏｘｐ３＋ＧＡＲＰ＋Ｔｒｅｇが浸潤している（Ｄｏｗｎｓ−Ｃａｎｎｅｒら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１７年、８：１４６４９）。同様に、Ｔｒｅｇは、進行肝細胞癌におけるより免疫抑制性かつより攻撃的な表現型と正に相関していた（Ｋａｌａｔｈｉｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０１３年、７３（８）：２４３５〜４４頁）。Ｔｒｅｇは、エフェクターＴ細胞の増殖を抑制することができる（図２６Ｂ）。さらに、Ｔｒｅｇは、ＴＧＦβ１の生成を通して免疫細胞（たとえばナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞）の接触依存性阻害を発揮する（たとえば図２６Ａを参照）。したがって、腫瘍と闘うためには、抗腫瘍効果を発揮するために十分なエフェクターＴ細胞が利用可能となることができるように、Ｔｒｅｇを阻害することが有利であろう。
【０５３６】
ますます増えるいくつかの証拠が腫瘍／癌進行におけるマクロファージの役割を示唆している。本発明は、ＴＭＥなどの疾患環境におけるＴＧＦβ１の活性化によって部分的に媒介されるという見方を包含する。骨髄由来単球（たとえばＣＤ１１ｂ＋）が腫瘍由来のサイトカイン／ケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、およびＣＣＬ４など）に応答して腫瘍部位に動員され、ここで単球が分化および極性化を受けて癌促進表現型を獲得する（たとえば、Ｍ２に偏ったまたはＭ２様マクロファージ、ＴＡＭ）。以前に実証されているように（ＷＯ２０１８／１２９３２９号）、ヒトＰＢＭＣから単離した単球を誘導させて、マクロファージの様々な亜型、たとえば、Ｍ１（線維性促進、抗癌）およびＭ２（癌促進）へと極性化させることができる。多くの腫瘍における大多数のＴＡＭがＭ２に偏っている。Ｍ２様マクロファージのうち、Ｍ２ｃおよびＭ２ｄ亜型は細胞表面上で上昇したＬＲＲＣ３３を発現することが見出されているが、Ｍ１ではそうではない。さらに、マクロファージは、Ｍ−ＣＳＦなどの特定のサイトカインの曝露によってさらに湾曲または活性化させることができ、ＴＧＦβ１発現と合致するＬＲＲＣ３３発現の著しい増加をもたらす。骨髄増殖性疾患（たとえば骨髄線維症）を有する患者における循環Ｍ−ＣＳＦ（すなわち血清Ｍ−ＣＳＦ濃度）のレベルの増加も観察されている。一般に、高いマクロファージ（ＴＡＭ）および／またはＭＤＳＣ浸潤を有する腫瘍が予後不良に関連している。同様に、Ｍ−ＣＳＦレベルの上昇も予後不良の指標である。したがって、本明細書中に包含したものなどの高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、癌促進マクロファージおよび／またはＭＤＳＣのレベルの上昇によって特徴づけられた癌の処置において使用することができる。阻害剤のＬＲＲＣ３３アームは、疾患関連免疫抑制骨髄細胞、たとえば、Ｍ２−マクロファージおよびＭＤＳＣに対するその阻害効果を少なくとも部分的に媒介し得る。
【０５３７】
腫瘍関連Ｍ２様マクロファージの高い有病率が本明細書中に記載のネズミ同系腫瘍モデルにおいて概括されている。たとえば、ＭＢＴ−２腫瘍では、確立された腫瘍から単離されたＣＤ４５陽性細胞のうちの約４０％がＭ２マクロファージである（図２８Ｂ）。これは、高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１と抗ＰＤ−１との組合せで処置した動物においては半分に低下していた。比較すると、同じ動物において腫瘍関連Ｍ１マクロファージの数の有意な変化は観察されなかった。Ｍ２マクロファージと同様、腫瘍関連ＭＤＳＣも、確立された腫瘍において上昇しており（ＣＤ４５＋細胞の約１０〜１２％）、処置した動物においてＰＤ−１およびＴＧＦβ１の両方を阻害することによって著しく低下している（無視できるレベルまで）（図２８Ｂ）。本明細書中に開示されているように、大多数の腫瘍浸潤性Ｍ２マクロファージおよびＭＤＳＣは、細胞表面ＬＲＲＣ３３および／またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体を発現する（図２８Ｃおよび２８Ｄ）。興味深いことに、ＬＲＲＣ３３（またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体）の細胞表面発現は高度に調節されているように思われる。高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤、Ａｂ６は、ＬＲＲＣ３３および前駆ＴＧＦβ１を発現する細胞において迅速に内部移行されることができ、Ａｂ６で達成される内部移行率は、細胞表面ＬＲＲＣ３３を認識する参照抗体で達成されるものよりも有意に高い（図６）。同様の結果が初代ヒトマクロファージから得られている。これらの観察は、Ａｂ６が、その標的、ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１と結合した際に内部移行を促進し、それによってＬＲＲＣ３３含有複合体を細胞表面から除去することができることを示す。したがって、高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤（Ａｂ６など）による標的会合は、標的タンパク質（たとえば細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体）の抗体依存性ダウンレギュレーションを誘導し得る。疾患座位では、これは、活性化可能な潜在型ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１レベルの利用可能度を低下させ得る。したがって、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、二重の作用機構を介してＴＧＦβ１のＬＲＲＣ３３アームを阻害し得る：ｉ）潜在型複合体からの成熟成長因子の放出を遮断すること、および、ｉｉ）内部移行を介してＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体を細胞表面から除去すること。腫瘍微小環境おいては、抗体は細胞関連潜在型前駆ＴＧＦβ１複合体を標的としてよく、Ｍ２マクロファージ（たとえばＴＡＭ）、ＭＤＳＣ、およびＴｒｅｇなどの標的細胞に対する阻害効果を増大させている。表現型的には、これらは免疫抑制細胞であり、ＴＧＦβ１経路によって少なくとも部分的に媒介される免疫抑制腫瘍微小環境に寄与しする。多くの腫瘍がこれらの細胞で富化されていることを考慮すると、ＴＧＦβ１機能の複数のアームを標的化することができる抗体は機能的利点を提供するはずである。
【０５３８】
多くのヒト癌は、健康な対照と比較して患者においてＭＤＳＣレベルの上昇を引き起こすことが知られている（たとえばＥｌｌｉｏｔｔら、（２０１７年）、「Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ：ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８巻、論文第８６号に総説）。これらのヒト癌としては、それだけには限定されないが、膀胱癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、膠芽細胞腫、肝細胞癌、頭頸部扁平細胞癌、肺癌、黒色腫、ＮＳＣＬ、卵巣癌、膵癌、および腎細胞癌が挙げられる。ＭＤＳＣレベルの上昇は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および組織試料（たとえば腫瘍生検）などの生体試料において検出され得る。たとえば、ＭＤＳＣの頻度またはその数の変化は、適切な細胞表面マーカー（表現型）を使用して、全ＰＢＭＣのパーセント（％）、ＣＤ１４＋細胞のパーセント（％）、ＣＤ４５＋細胞のパーセント（％）、単核細胞のパーセント（％）、全細胞のパーセント（％）、ＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセント（％）、単球のパーセント（％）、非リンパ球性ＭＮＣのパーセント（％）、ＫＬＡ−ＤＲ細胞のパーセント（％）として測定し得る。
【０５３９】
他方では、腫瘍内へのマクロファージ浸潤も治療の有効性を知らせ得る。図２３、２４、および２７Ｂに例示したように、チェックポイント阻害剤とコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤との組合せを用いた処置の後に、エフェクターＴ細胞（たとえばＣＤ８＋Ｔ細胞）によって有効に貫通される腫瘍。腫瘍内エフェクターＴ細胞は、細胞細片を掃除する食作用性単球／マクロファージの動員をもたらし得る。
【０５４０】
図２３から明らかなように、抗ＰＤ−１とＴＧＦβ１阻害剤との組合せは、抗ＰＤ−１処置単独と比較して、腫瘍全体にわたる頑強なＣＤ８Ｔ細胞の流入／拡大をもたらした。それに対応して、ＣＤ８エフェクター遺伝子の頑強な増加が組合せ処置によって達成され得る。したがって、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、腫瘍内へのエフェクターＴ細胞の浸潤を促進するために使用し得る。
【０５４１】
さらに、Ｆ４／８０陽性マクロファージによる腫瘍の大規模な浸潤／拡大が間サルされている（図２４を参照）。これは、Ｍ１（抗腫瘍）マクロファージが細胞毒性細胞によって生成された癌細胞細片を一掃していることの指標である場合があり、恐らくはＴＧＦβ１阻害の直接の結果である。本明細書中の実施例にさらに詳述されているように、これらの腫瘍浸潤性マクロファージはそのＣＤ１６３発現の欠如ために非Ｍ２マクロファージとして主に同定されており、これは、チェックポイント阻害剤およびＴＧＦβ１阻害剤の処置の際に循環単球が腫瘍部位へと動員されてＭ１マクロファージへと分化されることを示しており、この観察は腫瘍部位内へのＣＤ８＋Ｔ細胞の著しい流入を伴う。したがって、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、腫瘍に関連する非Ｍ２マクロファージ（ｍａｃｒｏｐａｈｇｅ）を増加させるために使用し得る。
【０５４２】
最近、チェックポイント遮断療法（ＣＢＴ）はいくつかの癌種を処置するための標準治療となっている（たとえば図２０Ｂを参照）。癌免疫療法の著しい進歩にもかかわらず、ＣＢＴに対する一次耐性は、未だ患者にとって主要な満たされていない要求であり、患者の癌の大多数が依然としてＰＤ−（Ｌ）１阻害に応答していない。尿路上皮癌および黒色腫腫瘍の遡及的分析は最近、ＴＧＦβの活性化を一次耐性の潜在的な駆動因子として結び付けており、これは、腫瘍からの細胞毒性Ｔ細胞の排除および腫瘍微小環境内でのその拡大（免疫排除）を含めた複数の機構を介している可能性が非常に高い。これらの観察および続く前臨床妥当性確認は、ＴＧＦβ経路阻害をＣＢＴに対する一次耐性を克服するための有望な手段として指摘している。しかし、恐らくは１つまたは複数のＴＧＦβアイソフォームからのシグナル伝達の阻害が原因で、ＴＧＦβ経路の治療的標的化は用量規制前臨床心毒性によって妨害されている。
【０５４３】
多くの腫瘍がＣＢＴに対する一次応答を欠く。このシナリオでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が一般的に腫瘍実質から排除され、腫瘍がＴＧＦβシグナル伝達の免疫調節機能を選出して免疫抑制微小環境を生じ得ることが示唆される。遡及的な臨床的腫瘍試料分析からのこれらの見識は、ＣＢＴに対する一次耐性におけるＴＧＦβシグナル伝達の役割を調査するための理論的根拠を提供した。
【０５４４】
本研究からの結果に基づいていくつかの主要な結論を下すことができる。第１に、ＴＣＧＡデータの遺伝子発現分析は、ＴＧＦβ１がほとんどのヒト腫瘍種において最も広く普及したアイソフォームであり、したがってＴＧＦβシグナル伝達の最も可能性の高い駆動因子であり、それ故、これらの腫瘍においてＣＢＴに対する一次耐性を駆動する免疫抑制の原因であることを示す。
【０５４５】
第２に、ＴＧＦβ１の活性化の選択的阻害は、ＣＢＴに対する一次耐性を克服するために十分であると思われる。潜在型ＴＧＦβ１のプロドメインを標的化することによって、ＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤は精巧なアイソフォーム特異性を達成し、すべての知られている分子学的コンテキストにおいて潜在型ＴＧＦβ１の活性化を阻害する。同系腫瘍モデルにおける１つのそのような抗体の薬理学的評価は、この抗体を用いた処置が、抗ＰＤ−１耐性腫瘍をチェックポイント遮断療法に感受性にさせるために十分であることを実証している。重要なことに、抗ＰＤ−１／ＴＧＦβ１阻害剤の組合せの抗腫瘍有効性が、ＴＧＦβ１が腫瘍中に存在する唯一のＴＧＦβアイソフォームではなかった１つのモデルを含めてが３つの異なる腫瘍種において示された。このことは、腫瘍微小環境内において、ＴＧＦβ１は免疫調節性の役割を果たすように配置されている可能性が高い一方で、他のアイソフォームはこの生物学に無関連であり得ることを示唆している。この観察は、選択的ＴＧＦβ１阻害が、他のＴＧＦβアイソフォームの発現とは無関係に広範囲の癌にわたってＣＢＴに対する一次耐性を克服することにおける治療的潜在性を有し得るという可能性を開く。
【０５４６】
第３に、ＴＧＦβ１駆動の経路の活性の選択的阻害は、すべてのアイソフォーム活性の広範な阻害に対して有意に改善された前臨床安全性をもたらす。広範なＴＧＦβ経路阻害に関連する多面発現効果がＴＧＦβ経路の治療的標的化を妨害している。現在までのほとんどの実験的治療剤（たとえば、ガルニセルチブ、ＬＹ３２００８８２、フレソリムマブ）は、単一のＴＧＦβアイソフォームに対する選択性を欠いており、非臨床的および臨床的研究において観察される用量規制毒性に潜在的に寄与する。ノックアウトマウスおよびＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３遺伝子中のヒト機能喪失型突然変異からの遺伝的データは、非特異的ＴＧＦβ阻害剤で観察される心毒性が、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３の阻害が原因であり得ることを示唆している。本開示は、そのような抗体を用いたＴＧＦβ１の活性化の選択的阻害が改善された安全性プロフィールを有しており、ＰＤ−１遮断と組み合わせた場合に頑強な抗腫瘍応答を誘発するために十分であり、臨床的に扱いやすい用量レベルでのＴＧＦβ１阻害剤の有効性の評価を可能にすることを教示している。
【０５４７】
ＴＧＦβ１阻害剤／抗ＰＤ−１の組合せ処置中の抗腫瘍免疫に関連する免疫学的プロセスを細かく分析するために、ＭＢＴ−２膀胱癌モデルにおける応答のより詳細な分析を実施した。ＰＤ−１およびＴＧＦβ１活性の同時遮断は、大部分がＣＤ８＋Ｔ細胞の１０倍の増加によって駆動される腫瘍内免疫構成における著しい変化を誘導した。主要な細胞溶解遺伝子であるパーフォリンおよびグランザイムＢも組合せ処置によって腫瘍においてアップレギュレーションされていたため、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は腫瘍細胞死滅に関連していた可能性が高い。注目すべきことに、末梢Ｔｒｅｇの維持におけるＴＧＦβシグナル伝達の重要性を考慮すると、抗ＰＤ−１／ＴＧＦβ１阻害剤を用いた組合せ処置によるＴｒｅｇ細胞の有意な富化が幾分か予想外であった。しかし、Ｔｒｅｇ細胞が炎症部位に動員されるにつれて、その数的な増加は頑強な免疫応答のマーカーとして解釈することができる。それでもなお、Ｔｒｅｇ細胞数の増加にもかかわらずＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化表現型を採用し、強力な抗腫瘍応答を誘発することができた。潜在的な説明は、Ｔｒｅｇ細胞は免疫抑制性ＭＢＴ−２腫瘍微小環境に有意に寄与せず、他の抑制性免疫細胞集団、たとえば骨髄細胞がより重要な役割を果たすという可能性がある。あるいは、この可能性を相互排他せずに、ＴＧＦβ１がＴｒｅｇ駆動の免疫抑制の主要な媒介因子であることを考慮すると、ＴＧＦβ１阻害剤の存在もＴｒｅｇ数の増加にもかかわらずこの活性を抑止し得る。
【０５４８】
本明細書中に提供する驚くべき発見は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ３１＋腫瘍血管構造との密接な関連の組織学的な観察を含む。この富化パターンは、Ｔ細胞が腫瘍内に入ることの主要な経路が腫瘍血管構造を通るものであり、細胞が腫瘍血管から血管外遊出した後は外側に放射状に腫瘍内へと遊走し始めるという仮説を支持する。Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎらは、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＥＭＴ−６乳癌モデルにおいてコラーゲン性マトリックスおよび腫瘍の前縁の線維芽細胞富化層に沿って蓄積されると思われることを見出し、このマトリックスがＴ細胞排除に寄与するという推測をもたらした。この観察とは対照的に、ＭＢＴ−２腫瘍の前縁の付近に高密度の線維芽細胞領域を一貫して検出することは可能でなかった。本出願人の、血管構造に近接近したＴ細胞富化の観察（たとえば血管周囲の富化）は、癌関連線維芽細胞層に加えて、免疫排除がＴＧＦβ１応答性血管内皮細胞によって、または内皮に近接近した他の細胞によっても課され得ることを示唆している。ＴＧＦβ１シグナル伝達が内皮機能に影響を与え得るという可能性と一貫して、本出願人の観察は、対照腫瘍におけるホスホ−ＳＭＡＤ３染色が、腫瘍血管内皮細胞であると思われるもの内の核中において最も強力であったことを含む。この染色は選択的ＴＧＦβ１阻害に感受性であり、これらの細胞がＴＧＦβ１に応答しており、恐らくは血管障壁完全性の性能を調節することを介してＴ細胞の血管外遊走に影響を与えることを通じて、免疫排除を強制することにおいて重要であり得ることを示唆している。さらに、腫瘍関連マクロファージは腫瘍血管構造に近接近しているとも記載されており、ＴＧＦβ１の活性化によって、または他の免疫抑制表面タンパク質もしくは分泌因子を血管構造でもしくはその付近で放出することによってのいずれかで、免疫排除腫瘍微小環境を生じさせることに関与していてもよい。Ｔ細胞が腫瘍内に入るための複数の経路が登場しており、これらの機構のより良好な理解が、新規治療標的の同定を助ける、または可能な腫瘍耐性機構に関して報告するであろう可能性が高い。
【０５４９】
腫瘍内の細胞毒性Ｔ細胞の配置に対する予想および観察された影響に加えて、ＴＧＦβ１阻害剤／抗ＰＤ−１の組合せ処置は免疫抑制骨髄区画にも有利な影響を与える。ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞は、未処置のＭＢＴ−２腫瘍において免疫浸潤の約８０％を構成していたが、その提示は組合せ処置の際に４０％未満まで低下された。これは、Ｍ２様免疫抑制マクロファージの損失およびＭＤＳＣのさらにより著しい低下によって完全に駆動されていた一方で、炎症誘発性Ｍ１様マクロファージ集団は提示中に変化なく保たれた。組合せ処置が免疫抑制骨髄細胞の特異的な低下を駆動する機構は不明確であり、腫瘍微小環境中におけるこれらの細胞の動員、発生、または維持におけるＴＧＦβ１シグナル伝達の役割も不明確である。ＴＧＦβシグナル伝達は、他の因子の中で、マクロファージをＭ２様へと極性化させることが知られている。さらに、ＴＧＦβがＭＤＳＣの発生および抑制性機能の獲得を部分的に司っていることを示唆する証拠が存在する。さらに、変更された腫瘍微小環境と対にしたＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の流入が、再極性化および免疫抑制骨髄細胞の輸送の低下の両方に寄与すした可能性が高い。この細胞集団の存在は、患者の乏しい予後診断およびチェックポイント遮断療法に対する耐性と相関しているため、根底にある機構にかかわらず、腫瘍内免疫抑制骨髄細胞の低下は、腫瘍免疫療法手法の一部として非常に望まれるであろう。したがって、これらの重要な免疫抑制細胞種の標的化を含む治療戦略は、腫瘍微小環境中の単一の免疫抑制細胞種（すなわちＴｒｅｇ細胞のみ）を標的化するよりも高い効果を有し得る。したがって、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、Ｍ２マクロファージおよびＭＤＳＣなどの腫瘍関連免疫抑制細胞を低下させるために使用し得る。
【０５５０】
すでに言及したように、ＴＧＦβ１が、Ｔｒｅｇ細胞、抑制性骨髄細胞、線維芽細胞、および腫瘍細胞を含めた腫瘍微小環境中の複数の細胞種によって発現される可能性が高いことに注目することが重要である。これらの細胞源のそれぞれは、様々なＬＬＣにおいてＴＧＦβ１を生じる。活性化Ｔｒｅｇ細胞はその表面上にＧＡＲＰ  ＬＬＣを発現し、抑制性骨髄細胞はその表面上にＬＲＲＣ３３  ＬＬＣを発現し、線維芽細胞はＬＴＢＰ  ＬＬＣを周囲の細胞外マトリックスないに発現して蓄積する可能性が高い。これらの「活性化可能な」ＴＧＦβ１の供給源のそれぞれが、腫瘍における免疫排除および免疫抑制の促進において役割を果たすことができ、それぞれの供給源の相対的貢献が様々な腫瘍種にわたって変動することができる可能性が高い。興味深いことに、これらの研究において使用したＭＢＴ−２およびＥＭＴ６腫瘍のｍＲＮＡプロファイリングは、ＬＲＲＣ３３およびＬＴＢＰ１がＬＬＣ構成要素を最も高く発現し、クラウドマンＳ９１腫瘍がＬＲＲＣ３３を排他的に発現するように思えることを示した（図２０Ｈ）。したがって、これらのモデルにおけるＴＧＦβ１選択的阻害剤／抗ＰＤ−１の組合せ著しい抗腫瘍効果は、全ての知られているＬＬＣコンテキストにおいてＴＧＦβ１の活性化を強力に遮断する本明細書中に開示されているＴＧＦβ１阻害剤の実証された能力と共に、特定のＬＬＣ（たとえばＴｒｅｇ細胞上のＧＡＲＰ）の選択的阻害が、一部の腫瘍において最大の抗腫瘍応答を生じさせるために十分でない可能性があることを強く示唆している。
【０５５１】
したがって、本明細書中に提示する前臨床研究および結果は、ＴＧＦβ１の活性化の特異性の高い阻害が、宿主免疫系がチェックポイント遮断療法に対する一次耐性の主要な機構を克服する一方で、臨床応用の主な制限であった、より広範なＴＧＦβ阻害の以前に認識された毒性を回避することを可能にできることを実証している。本明細書中に開示されている結果は、高親和性ＴＧＦβ１阻害剤を用いた処置が、チェックポイント遮断療法から利益を受けることができる患者の数を有意義に拡大させ得ることを示唆している。
【０５５２】
したがって、本明細書中の実施例中に実証するように、ＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤を使用して、ＣＢＴに対する一次耐性に反撃し、それによって腫瘍／癌をＣＢＴに対してより感受性にさせることができる。そのような効果は、癌／腫瘍がＴＧＦβ１陽性である広範囲の悪性腫瘍種の処置に適用可能であり得る。一部の実施形態では、そのような腫瘍／癌は、ＴＧＦβ３などの追加のアイソフォームをさらに発現し得る。後者の非限定的な例とては、乳癌などの特定の種類の癌腫を挙げ得る。
【０５５３】
したがって、本発明は、ＴＧＦβ１の高親和性のコンテキスト非依存性阻害剤が臨床上の利点を達成する可能性が高い患者または患者集団／部分集団を同定または選択するための好ましい選択基準を提供する。一部の実施形態では、ヒト腫瘍の適切な表現型としては、ｉ）部分組がＣＢＴに対して応答性であると示されること（たとえばＰＤ−（Ｌ）１軸遮断）、ｉｉ）免疫排除の証拠、ならびに／または、ｉｉｉ）ＴＧＦＢ１発現および／もしくはＴＧＦβシグナル伝達の証拠が挙げられる。たとえば黒色腫および膀胱癌を含めた様々な癌種がプロフィールに当てはまる。
【０５５４】
上述のように、ＴＧＦβ１の活性化のコンテキスト非依存性阻害剤を黒色腫の処置において使用し得る。そのような阻害剤を用いて処置し得る黒色腫の種類としては、それだけには限定されないが、悪性黒子、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、末端性黒子性黒色腫、粘膜黒色腫、結節性黒色腫、ポリープ状黒色腫、および線維形成性黒色腫が挙げられる。一部の実施形態では、黒色腫は転移性黒色腫である。
【０５５５】
より最近では、免疫チェックポイント阻害剤が、進行黒色腫患者を有効に処置するために使用されている。特に、抗プログラム死（ＰＤ）−１抗体（たとえばニボルマブおよびペンブロリズマブ）は、現在では進行黒色腫などの特定の種類の癌の標準治療となっており、管理可能な毒性プロフィールで有意な活性および永続的な応答を実証している。しかし、ＰＤ−１拮抗剤の有効な臨床応用は高い率の生得的な耐性（約６０〜７０％）によって妨げられており（Ｈｕｇｏら、（２０１６年）、Ｃｅｌｌ、１６５：３５〜４４頁を参照）、継続的挑戦が患者選択および応答や耐性の予知因子の調査、ならびに組合せ戦略の最適化を含み続けることを例示している（Ｐｅｒｒｏｔら、（２０１３年）、Ａｎｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２５（２）：１３５〜１４４頁）。さらに、研究は、最初は抗ＰＤ−１治療に応答した黒色腫患者の約２５％が最終的には獲得耐性を生じたことを示唆している（Ｒｉｂａｓら、（２０１６年）、ＪＡＭＡ、３１５：１６００〜９頁）。
【０５５６】
ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４を発現する腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の数はチェックポイント阻害での成功の主要な指標であると思われ、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の両方の遮断が浸潤性Ｔ細胞を増加させ得る。しかし、より多くの腫瘍関連マクロファージの存在を有する患者においては、ＣＤ８細胞の抗癌効果は抑制され得る。
【０５５７】
骨髄前駆体、ＭＤＳＣ、およびＴＡＭを含めた骨髄細胞などのＬＲＲＣ３３発現細胞は、ＣＤ４および／またはＣＤ８  Ｔ細胞などのＴ細胞を阻害することによって（たとえばＴ細胞枯渇）、免疫抑制環境（ＴＭＥおよび骨髄線維性骨髄など）を作るまたは支援してもよく、これは、特定の患者集団において観察された抗ＰＤ−１耐性を少なくとも部分的に強調し得ることが企図される。実際、証拠は、抗ＰＤ−１単独療法に対する耐性がＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の蓄積の失敗およびＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比の低下によって特徴づけられていたことを示唆している。注目すべきは、本発明者らは、黒色腫患者集団などの特定の癌患者間に、ＬＲＲＣ３３発現レベルに関して分岐が存在することを理解している。１つの群は高いＬＲＲＣ３３発現（ＬＲＲＣ３３高）を示す一方で、他方の群は比較的低いＬＲＲＣ３３発現（ＬＲＲＣ３３低）を示す。したがって、本発明は、ＬＲＲＣ３３高の患者集団が免疫チェックポイント阻害剤療法に対して応答性が乏しいまたは耐性がある者を表し得るという見方を含む。したがって、本明細書中に記載のものなどのＬＲＲＣ３３を阻害する薬剤は、チェックポイント阻害剤療法（たとえば抗ＰＤ−１）に対して耐性である黒色腫、リンパ腫、および骨髄増殖性疾患などの癌の処置に特に有益であり得る。
【０５５８】
一部の実施形態では、癌／腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤に対して内因的に耐性であるまたは不応性である（たとえば一次耐性）。一例のみを挙げると、特定のリンパ腫は抗ＰＤ−１治療などの免疫チェックポイント阻害に対して応答性が乏しいと思われる。同様に、黒色腫患者集団の部分組は免疫チェックポイント阻害剤に対して耐性を示すことが知られている。特定の理論に束縛されることを意図せずに、本開示の発明者らは、これはＴＧＦβ１シグナル伝達経路のアップレギュレーションが少なくとも部分的に原因である場合があり、チェックポイント阻害剤がその効果を発揮することに失敗する免疫抑制微小環境を生じ得ることを企図する。ＴＧＦβ１阻害は、そのような癌をチェックポイント阻害剤療法に対してより応答性にさせ得る。免疫チェックポイント阻害剤とＴＧＦβ１阻害剤との組合せから利益を受け得る癌種の非限定的な例としては、骨髄線維症、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、結腸癌、血液悪性腫瘍、非小細胞がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、リンパ腫（古典的ホジキンおよび非ホジキン）、頭頸部癌、尿路上皮癌、マイクロサテライト不安定性を有する癌、ミスマッチ修復欠損を有する癌、胃癌、腎臓癌、および肝細胞癌が挙げられる。しかし、たとえば生検によって決定して、ＴＧＦβ１が過剰発現されているまたはＴＧＦβ２／３よりも優性のアイソフォームである任意の癌（たとえばそのような癌を有する患者）を、本開示によるＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤で処置し得る。
【０５５９】
一部の実施形態では、癌／腫瘍は経時的に耐性となる。この現象は獲得耐性と呼ばれる。一次耐性と同様、一部の実施形態では、獲得耐性はＴＧＦβ１依存性経路によって少なくとも部分的に媒介されており、これらの事例において本明細書中に記載のアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤が抗癌免疫を回復させることにおいて有効であり得る。本発明のＴＧＦβ１阻害剤を使用して腫瘍の再発を低下させ得る。本発明のＴＧＦβ１阻害剤を使用して、ＣＢＴなどの癌治療の永続性を増強させ得る。治療のコンテキストにおいて使用する用語「永続性」とは、臨床的効果（たとえば腫瘍制御）と腫瘍の再成長（たとえば再発）との間の時間をいう。恐らくは、永続性および再発は、患者が最初は応答した治療が働かなくなる二次または獲得耐性と相関している場合がある。したがって、本発明のＴＧＦβ１阻害剤を使用して、癌治療が有効に保たれる持続期間を増加させ得る。本発明のＴＧＦβ１阻害剤を使用して、治療の応答者の中で獲得耐性を発生する確率を低下させ得る。本発明のＴＧＦβ１阻害剤を使用して、患者において進行のない生存を増強させ得る。
【０５６０】
一部の実施形態では、本発明のＴＧＦβ１阻害剤を使用して、癌治療の応答者の中で完全応答対部分応答の率または比を改善させ得る。典型的には、癌治療（ＣＢＴなど）に対する応答率が比較的高い（たとえば≧３５％）癌種においてさえも、ＣＲ率はかなり低い。したがって、本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、応答者集団内の完全応答者の割合を増加させるために使用する。
【０５６１】
さらに、阻害剤は、部分応答者の中で部分応答の度合を増強または増大させるためにも有効であり得る。
【０５６２】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤およびＬＲＲＣ３３阻害剤（本明細書中に記載のものなどの）を含む組合せ療法が、そのような癌を処置するために有効であり得る。さらに、腫瘍、またはそうでなくても異常な細胞増殖を有する部位／組織における、高いＬＲＲＣ３３陽性細胞浸潤が、宿主免疫抑制および免疫チェックポイント耐性のバイオマーカーとして役割を果たし得る。同様に、エフェクターＴ細胞を、癌と闘う身体の能力を制限する免疫抑制ニッチから除外し得る。さらに、以下の実施例セクション中に実証するように、ＧＡＲＰ提示ＴＧＦβ１を発現するＴｒｅｇはエフェクターＴ細胞の増殖を抑制する。合わせると、ＴＧＦβ１が免疫阻害性の疾患微小環境（ＴＭＥなど）の発生および維持における主要な駆動因子である可能性が高く、複数のＴＧＦβ１提示のコンテキストが腫瘍に関連している。一部の実施形態では、組合せ療法は、より好都合なＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比を達成し得る。
【０５６３】
一部の実施形態では、本明細書中に記載のＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を、それを必要としている対象において癌を処置する方法において使用してよく、前記方法は、癌が処置されるように、抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、癌は結腸癌である。特定の実施形態では、癌は黒色腫である。特定の実施形態では、癌は膀胱癌である。特定の実施形態では、癌は頭頸部癌である。特定の実施形態では、癌は肺癌である。
【０５６４】
一部の実施形態では、本明細書中に記載のＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を、固形腫瘍を処置する方法において使用し得る。一部の実施形態では、固形腫瘍は、典型的には、治療的分子が貫通するには高密度かつ硬い、線維形成性腫瘍であり得る。そのような腫瘍のＥＣＭ構成要素を標的化することによって、そのような抗体は、高密度な腫瘍組織を「緩め」て崩壊させ、治療的アクセスを容易にしてその抗癌効果を発揮し得る。したがって、任意の既知の抗腫瘍薬などの追加の治療剤を併用し得る。
【０５６５】
それに加えてまたはその代わりに、本明細書中に開示されているものなどの、ＴＧＦβ１の活性化を阻害することができるアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性抗体または（ｆｏｒ）その断片を、癌と闘うための癌免疫療法などの細胞に基づく免疫療法として、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（「ＣＡＲ−Ｔ」）技術と併せて使用し得る。
【０５６６】
一部の実施形態では、本明細書中に記載のＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を、固形腫瘍を有する対象において固形腫瘍成長を阻害または減少させる方法において使用してよく、前記方法は、固形腫瘍成長が阻害または減少されるように、抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、固形腫瘍は結腸癌腫瘍である。一部の実施形態では、癌の処置に有用な抗体またはその抗原結合部分は、ＴＧＦβ１の活性化のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤である。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、およびＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体を標的とする。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、およびＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体を標的とする。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、およびＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体を標的とする。一部の実施形態では、そのような抗体はＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体およびＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体を標的とする。
【０５６７】
本発明は、対象における固形腫瘍を含む癌の処置における、ＴＧＦβ１のコンテキスト非依存性のアイソフォーム特異的阻害剤の使用を含む。一部の実施形態では、そのようなコンテキスト非依存性のアイソフォーム特異的阻害剤はＴＧＦβ１の活性化を阻害し得る。好ましい実施形態では、そのような活性化阻害剤は、前駆ＴＧＦβ１複合体と結合する抗体またはその抗原結合部分である。結合は、複合体が提示分子のうちの任意の１つ、たとえば、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、またはＬＲＲＣ３３と会合している場合に起こることができ、それによって複合体からの成熟ＴＧＦβ１成長因子の放出が阻害される。一部の実施形態では、固形腫瘍は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が富化された間質がＣＡＦおよびコラーゲン線維と直接接触することによって特徴づけられている。そのような腫瘍は、抗腫瘍免疫細胞（たとえばエフェクターＴ細胞）が腫瘍に有効に浸潤することを妨げ、癌と闘う身体の能力を制限する免疫抑制環境を生じ得る。その代わりに、そのような細胞は、腫瘍間質内またはその付近に蓄積され得る。これらの特長は、そのような腫瘍を、免疫チェックポイント阻害剤療法に対する応答性を乏しくさせ得る。以下にさらに詳述するように、本明細書中に開示されているＴＧＦβ１阻害剤は、たとえば免疫チェックポイント阻害剤と併せて使用して、エフェクター細胞が癌細胞に到達して死滅させることを許可するように、抑制を遮断解除し得る。
【０５６８】
ＴＧＦβ１は、腫瘍成長、宿主免疫抑制、悪性細胞増殖、血管増生、血管形成、遊走、侵襲、転移、および化学療法耐性を含めて、腫瘍微小環境において多面的な役割を果たすことが企図される。したがって、環境中のＴＧＦβ１の提示のそれぞれの「コンテキスト」は、疾患進行の調節（または調節不全）に参加し得る。たとえば、ＧＡＲＰ軸は、宿主免疫応答を媒介して癌細胞と闘うためにエフェクターＴ細胞応答を調節するＴｒｅｇ応答において特に重要である。ＬＴＢＰ１／３軸は、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）が癌の病因および進行において役割を果たす間質を含めたＥＣＭを調節し得る。ＬＲＲＣ３３軸は、循環単球の腫瘍微小環境への動員、続く腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）への分化、腫瘍組織内への浸潤、および疾患の増悪において重大な役割を果たし得る。
【０５６９】
一部の実施形態では、ＴＧＦβ１発現細胞は腫瘍に浸潤し、免疫抑制性の局所的環境を生じるまたはそれに寄与する。そのような浸潤が観察される度合は、より悪い予後診断に相関する場合がある。一部の実施形態では、より高い浸潤は、免疫チェックポイント阻害剤などの別の癌治療に対するより乏しい処置応答の指標である。一部の実施形態では、腫瘍微小環境中のＴＧＦβ１発現細胞は、Ｔｒｅｇおよび／または骨髄細胞などの免疫抑制免疫細胞を含む。一部の実施形態では、骨髄細胞としては、それだけには限定されないが、マクロファージ、単球（組織常在または骨髄由来）、およびＭＤＳＣが挙げられる。
【０５７０】
一部の実施形態では、ＴＭＥ中のＬＲＲＣ３３発現細胞は骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）である。ＭＤＳＣ浸潤（たとえば固形腫瘍浸潤）は、宿主の抗腫瘍免疫細胞がそれから排除される免疫抑制ニッチを作ることによって、免疫回避の少なくとも１つの機構を強調し得る。証拠は、ＭＤＳＣが腫瘍関連炎症性因子などの炎症関連シグナルによって動員されることを示唆している。動員の際、ＭＤＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの疾患と闘う細胞を損なわせることによって、免疫抑制効果に影響を与えることができる。さらに、ＭＤＳＣは、ＴＧＦβおよびＩＬ−１０を分泌することによってＴｒｅｇの分化を誘導し、免疫抑制効果をさらに高め得る。したがって、本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤を、免疫回避（たとえば損なわれた免疫監視）を有する患者に投与して、疾患（腫瘍など）と闘う身体の能力を回復またはブーストし得る。本明細書中により詳述されているように、これは、癌治療などの別の治療に対する身体の応答性または感度をさらに増強（たとえば回復または強化）させ得る。
【０５７１】
一部の実施形態では、患者における循環ＭＤＳＣの頻度（たとえば数）の上昇は、ＰＤ−１拮抗剤およびＰＤ−Ｌ１拮抗剤などのチェックポイント遮断療法に対する乏しい応答性を予測するものである。たとえば、バイオマーカー研究は、循環中の処置前のＨＬＡ−ＤＲ  ｌｏ／ＣＤ１４＋／ＣＤ１１ｂ＋骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）が進行およびより悪いＯＳに関連していたことを示している（ｐ＝０．０００１および０．０００９）。さらに、炎症性頭頸部癌腫（ＨＮＣ）におけるＰＤ−１チェックポイント遮断に対する耐性は、ＧＭ−ＣＳＦおよび骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）マーカーの発現に関連する。この観察は、化学療法などのＭＤＳＣを枯渇させるための戦略は、抗ＰＤ−１と組み合わせてまたは連続して考慮すべきであることを示唆している。ＬＲＲＣ３３またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ複合体は、免疫抑制骨髄細胞上での選択的発現が原因で、癌免疫療法の新規標的を表す。したがって、特定の理論に束縛されることを意図せずに、この複合体の標的化は、患者集団における標準治療チェックポイント阻害剤療法の有効性を増強させ得る。
【０５７２】
したがって、本発明は、固形腫瘍を含む癌を処置するための、本明細書中に記載の高親和性のアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤の使用を提供する。そのような処置は、ＴＧＦβ１阻害剤を、少なくとも１つの局在化された腫瘍（固形腫瘍）を含む癌を診断された対象に、癌を処置するために有効な量で投与することを含む。好ましくは、対象をＣＢＴ、化学療法、および／または放射線療法などの癌治療でさらに処置する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、癌治療に対する一次応答者の患者集団の率／割合を増加させる。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、癌治療に対する一次応答者の応答性の度合を増加させる。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、癌治療に対する完全応答者対部分応答者の比を増加させる。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、再発前および／または癌治療が無効となる前の持続期間が延長されるように、癌治療の永続性を増加させる。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、一次応答者の中で癌治療に対する獲得耐性の発生率（ｏｃｃｕｒｅｎｃｅ）または確率を低下させる。
【０５７３】
証拠は、癌進行（たとえば、腫瘍の増殖／成長、侵襲、血管形成、および転移）が腫瘍−間質の相互作用によって少なくとも部分的に駆動され得ることを示唆している。特に、ＣＡＦは、様々なサイトカインおよび成長因子の分泌ならびにＥＣＭリモデリングによってこのプロセスに寄与し得る。このプロセスに関与する因子としては、それだけには限定されないが、間質細胞由来因子１（ＳＣＤ−１）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ３、ＭＭＰ−１３、ＴＮＦ−α、ＴＧＦβ１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、Ｍ−ＣＳＦが挙げられる。さらに、ＣＡＦは、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１およびＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２などの因子を腫瘍部位に分泌することによってＴＡＭを動員し得る。続いて、ＴＡＭが優先的に付着するプロＴＡＭニッチ（たとえばヒアルロナン富化の間質領域）が作られる。ＴＧＦβ１は、正常な線維芽細胞の筋線維芽細胞様ＣＡＦへの活性化を促進することが示唆されているため、本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤の投与は、ＣＡＦの癌促進活性に反撃するために有効であり得る。実際、本明細書中に提示するデータは、ＴＧＦβ１の活性化を遮断するアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性抗体が、はやり多くの癌に結び付けられているＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、α−ＳＭＡ、ＦＮ１、およびＣｏｌ１などのマーカー（ｍａｋｅｒ）遺伝子のＵＵＯ誘導性アップレギュレーションを阻害することができることを示唆している。
【０５７４】
特定の実施形態では、本明細書中に記載のＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を、癌または腫瘍を有する対象に、単独で、または追加の薬剤、たとえば抗ＰＤ−１抗体（たとえば抗ＰＤ−１拮抗剤）と組み合わせてのどちらかで投与する。本発明に含まれる他の組合せ療法は、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分を放射線照射（放射線療法）または化学療法剤（化学療法）と共に投与することである。例示的な追加の薬剤としては、それだけには限定されないが、ＰＤ−１拮抗剤、ＰＤＬ１拮抗剤、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２融合タンパク質、ＣＴＬＡ４拮抗剤、ＧＩＴＲ作用剤、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＩＣＯＳＬ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＯＸ４０抗体（ＯＸ４０作用剤）、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＤ２０抗体、ＣＤＫ阻害剤、腫瘍退縮ウイルス、およびＰＡＲＰ阻害剤が挙げられる。有用な腫瘍退縮ウイルスの例としては、アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、単純ヘルペス、ニューカッスル病ウイルス、セネカウイルス、エンテロウイルス、およびワクシニアが挙げられる。好ましい実施形態では、腫瘍退縮ウイルスは腫瘍選択性について操作されている。
【０５７５】
一部の実施形態では、特定の癌種または患者集団に適する組合せ療法のための治療手法の決定または選択は以下を含み得る：ａ）標準治療が利用可能である癌種（たとえば免疫療法が認可された適応症）に関する考慮、ｂ）処置耐性部分集団（たとえば免疫排除された／冷たい腫瘍）に関する考慮、およびｃ）「ＴＧＦβ１経路が活性」またはそうでなくても少なくとも部分的にＴＧＦβ１依存性（たとえばＴＧＦβ１阻害感受性）である、または一般にそう疑われる癌／腫瘍に関する考慮。たとえば、多くの癌試料が、たとえばＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑ分析によって、ＴＧＦβ１が優性アイソフォームであることを示す。一部の実施形態では、それぞれの腫瘍種からの５０％を超える（たとえば、５０％、６０％、７０％、８０％、および９０％を超える）試料がＴＧＦβ１アイソフォーム発現について陽性である。一部の実施形態では、「ＴＧＦβ１経路が活性」またはそうでなくても少なくとも部分的にＴＧＦβ１依存性（たとえばＴＧＦβ１阻害感受性）である癌／腫瘍は、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、および／またはＨ−ｒａｓ中の突然変異などの少なくとも１つのＲａｓ突然変異を含有する。一部の実施形態では、癌／腫瘍は少なくとも１つのＫ−ｒａｓ突然変異を含む。
【０５７６】
特定の状態がＴＧＦβ経路に関与すると一般に知られているまたは疑われる場合に、患者から収集した臨床試料（生検試料など）におけるＴＧＦβ１発現の確認は、ＴＧＦβ１阻害療法に必須条件ではない。
【０５７７】
一部の実施形態では、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を、チェックポイント阻害療法と併せて、その１つまたは複数のチェックポイント阻害剤療法が認可されているまたは有効であると示されている癌を診断された患者に投与する。これらとしては、それだけには限定されないが、膀胱尿路上皮癌腫、扁平細胞癌（頭部および頸部など）、腎臓明細胞癌、腎臓乳頭細胞癌腫、肝細胞癌、肺腺癌、皮膚黒色腫、および胃腺癌が挙げられる。好ましい実施形態では、そのような患者はチェックポイント阻害剤療法に対して応答性が乏しいまたは非応答性である。一部の実施形態では、乏しい応答性は一次耐性が原因である。一部の実施形態では、チェックポイント遮断に対して耐性である癌はＴＣＦ７発現のダウンレギュレーションを示す。一部の実施形態では、チェックポイント阻害耐性腫瘍におけるＴＣＦ７ダウンレギュレーションは低い数の腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞に相関し得る。
【０５７８】
アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤は、化学療法または放射線療法耐性癌の処置において使用し得る。したがって、一部の実施形態では、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を癌を診断された患者に投与し、患者はその化学療法および／または放射線療法を受けているまたは受けた。特に、ＴＧＦβ１阻害剤の使用は、癌（患者）がそのような治療に対して耐性である場合に有利である。一部の実施形態では、そのような癌は、休止状態の腫瘍伝播癌細胞（ＴＰＣ）を含み、ＴＧＦβシグナル伝達が成長停止状態へのその可逆的な進入を制御し、これはＴＰＣを化学療法または放射線療法から保護する。ＴＧＦβ１の薬理学的阻害の際、損なわれたＴＰＣ（ＴＰＣｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）は休止状態に入ることに失敗し、したがって化学療法および／または放射線療法に感受性となることが企図される。そのような癌は様々な癌腫、たとえば扁平細胞癌を含む。たとえばＢｒｏｗｎら、（２０１７年）、「ＴＧＦ−β−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ−Ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」。Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．、２１（５）：６５０〜６６４頁を参照されたい。
【０５７９】
一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤で処置するＴＧＦβ１陽性癌はＴＧＦβ３陽性でもあり（すなわちＴＧＦβ１＋／ＴＧＦβ３＋癌）、疾患組織（たとえば腫瘍）が両方のアイソフォームを同時発現することを特徴とする。一部の実施形態では、そのような腫瘍はＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３アイソフォームの両方で共優性である。したがって、本発明は、そのような状態の処置における、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ３阻害剤と併せたアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤の使用を含む。ＴＧＦβ１＋／ＴＧＦβ３＋癌の非限定的な例としては、それだけには限定されないが、乳癌（たとえば乳房浸潤癌腫）、胆管癌、多形成膠芽細胞腫、頭頸部扁平細胞癌、腎臓明細胞癌、肺扁平細胞癌、中皮腫、膵腺癌、前立腺腺癌、肉腫、胸腺腫、および子宮癌肉腫が挙げられる。
【０５８０】
骨髄増殖性疾患／骨髄線維症
本開示は、骨髄増殖性疾患の処置における、本明細書中に開示されているものなどのＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤の治療的使用を提供する。これらとしては、たとえば、脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）ならびに骨髄線維症（たとえば原発性骨髄線維症および後続性骨髄線維症）が挙げられる。
【０５８１】
骨骨髄線維症としても知られる骨髄線維症とは、骨髄増殖性疾患と呼ばれる疾患群に属する比較的稀な骨髄増殖性障害（癌）である。骨髄線維症は、骨髄増殖性新生物のフィラデルフィア染色体陰性（−）部門に分類される。骨髄線維症は、クローン性骨髄増殖、異常サイトカイン生成、髄外造血、および骨髄線維症によって特徴づけられている。骨髄および他の部位における造血幹細胞の異常クローンの増殖は、線維症、または髄の瘢痕組織との置き換えをもたらす。骨髄線維症という用語は、別段に指定しない限りは原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）をいう。これは、慢性特発性骨髄線維症（ｃＩＭＦ）とも呼び得る（特発性および原発性という用語は、これらの事例において疾患が未知または自発性の起源のものであることを意味する）。これは、真性赤血球増加症または本態性血小板血症に二次的に発生する骨髄線維症と対照的である。骨髄線維症は、骨髄の血液形成組織中の細胞種における変化を指す骨髄化生の一形態であり、２つの用語はしばしば同義に使用される。特発性骨髄化生および骨髄化生（ＭＭＭ）を伴った骨髄線維症という用語も、原発性骨髄線維症を指すために使用する。一部の実施形態では、本発明に従って処置し得る血液学的増殖性障害としては、骨髄線維症などの骨髄増殖性疾患が挙げられる。いわゆる「古典的」なＢＣＲ−ＡＢＬ（Ｐｈ）陰性の慢性骨髄増殖性疾患の群としては、本態性血小板血症（ＥＴ）、真性赤血球増加症（ＰＶ）、および原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）が挙げられる。
【０５８２】
骨髄線維症は身体の正常な血液細胞生成を乱す。その結果は骨髄における大規模な瘢痕であり、重篤な貧血、脱力感、疲労、およびしばしば脾腫をもたらす。異常な造血細胞クローンによる（特に巨核球による）繊維芽細胞成長因子などのサイトカインの生成は、コラーゲン線維症を介した結合組織による骨髄の造血組織の置き換えをもたらす。造血組織の減少は、新しい血液細胞を生じる患者の能力を損なわせ、すべての血液細胞種の不足である進行性汎血球減少症をもたらす。しかし、線維芽細胞の増殖およびコラーゲンの蓄積は二次現象であると考えられており、線維芽細胞自体は異常細胞クローンの一部ではない可能性がある。
【０５８３】
骨髄線維症は骨髄中の異常な血液幹細胞によって引き起こされ得る。異常な幹細胞は、素早く成長して骨髄を乗っ取り、線維症（瘢痕組織の形成）および慢性炎症をどちらも引き起こす、成熟かつ不十分に分化した細胞を生じる。
【０５８４】
原発性骨髄線維症は、ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）、トロンボポエチン受容体（ＭＰＬ）、およびカルレティキュリン（ＣＡＬＲ）における突然変異に関連しており、これは骨髄のＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路、進行性瘢痕、または線維症の構成的活性化が起こることをもたらす場合がある。造血（ｈａｅｍｏｐｏｅｔｉｃ）細胞が他の領域、特に肝臓および脾臓へと遊走することが強制されるため、患者は、髄外造血、すなわち骨髄以外の部位で起こる血液細胞の形成を発生し得る。これはこれらの臓器の肥大を引き起こす。肝臓では、異常な大きさは肝肥大と呼ばれる。脾臓の肥大は脾腫大と呼ばれ、これは汎血球減少症、特に血小板減少症および貧血を引き起こすことにも寄与する。髄外造血の別の合併症は変形赤血球症または異常形状の赤血球の存在である。
【０５８５】
骨髄線維症における髄外造血の主な部位は脾臓であり、これは、骨髄線維症を患っている患者において通常は著しく肥大している。脾臓の大規模な肥大の結果、複数の被膜下梗塞が脾臓においてしばしば起こり、これは、脾臓への酸素供給の中断が原因で、部分的または完全な組織死が起こることを意味する。細胞レベルでは、脾臓は赤血球前駆体、顆粒球前駆体、および巨核球を含有しており、巨核球はその数およびその異常な形状が顕著である。巨核球は、この状態において見られる後続性線維症を引き起こすことに関与し得る。
【０５８６】
ＴＧＦβが骨髄線維症の病因の線維性側面に関与し得ることが示唆されている（たとえばＡｇａｒｗａｌら、「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＴＧＦβ」（２０１６年）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、３：５頁を参照）。原発性骨髄線維症における骨髄の病理学は線維症、血管新生（ｎｅｏａｎｇｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）、および骨硬化症によって特徴づけられており、線維症はＥＣＭ中に蓄積されるコラーゲンの生成の増加に関連づけられている。
【０５８７】
いくつかのバイオマーカーが記載されており、その交替（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）が疾患の指標である、またはそれと相関している。一部の実施形態では、バイオマーカーは細胞マーカーである。そのような疾患関連バイオマーカーは、疾患の進行および治療の有効性（たとえば治療に対する患者の応答性）の診断および／またはモニタリングに有用である。これらのバイオマーカーとしては、いくつかの線維性マーカーおよび細胞マーカーが挙げられる。たとえば、肺癌では、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中のＴＧＦβ１の濃度は、良性疾患を有する患者と比較して肺癌を有する患者において有意により高いことが報告されており（約２＋倍の増加）、肺癌の進行または処置効果を診断および／またはモニタリングするためのバイオマーカーとしても役割を果たし得る。
【０５８８】
骨髄線維症は異常な巨核球発生に関連しているため、巨核球および幹細胞系列のその前駆体の特定の細胞マーカーが、疾患の進行および治療の有効性を診断および／またはモニタリングするためのマーカーとして役割を果たし得る。一部の実施形態では、有用なマーカーとしては、それだけには限定されないが、分化した巨核球の細胞マーカー（たとえば、ＣＤ４１、ＣＤ４２、およびＴｐｏ  Ｒ）、巨核球−赤血球前駆細胞の細胞マーカー（たとえば、ＣＤ３４、ＣＤ３８、およびＣＤ４５ＲＡ−）、一般的な骨髄前駆細胞の細胞マーカー（たとえば、ＩＬ−３α／ＣＤ１２７、ＣＤ３４、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、およびＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２）、ならびに造血幹細胞の細胞マーカー（たとえば、ＣＤ３４、ＣＤ３８−、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２）が挙げられる。一部の実施形態では、有用なバイオマーカーは線維性マーカーを含む。これらとしては、それだけには限定されないが、ＴＧＦβ１／ＴＧＦＢ１、ＰＡＩ−１（セルピン（Ｓｅｒｐｉｎｅ）１としても知られる）、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２としても知られる）、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、ＦＮ１、ＣＴＧＦ、α−ＳＭＡ、ＡＣＴＡ２、Ｔｉｍｐ１、Ｍｍｐ８、およびＭｍｐ９が挙げられる。一部の実施形態では、有用なバイオマーカーは血清マーカー（たとえば血清試料中に見つかり検出されるタンパク質または断片）である。
【０５８９】
ＴＧＦβが白血病性骨髄ニッチの構成要素であるという発見に基づいて、ＴＧＦβ阻害剤を用いた骨髄微小環境の標的化が、達成される（ｅｆｆｅｃｔｅｄ）組織における局所的なＴＧＦβの利用可能度を調節する提示分子を発現する白血病細胞を低下させるための有望な手法であり得ることが企図される。
【０５９０】
実際、（用語「骨髄線維症」自体が示唆するように）骨髄増殖性および線維性の側面の両方においてＴＧＦβ依存性調節不全を顕在化させる病理学の多面的性質が原因で、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤、骨髄線維症を患っている患者に特に有利な治療効果を提供し得る。そのような阻害剤のＬＴＢＰアームは骨髄中のＥＣＭ関連ＴＧＦβ１複合体を標的とすることができる一方で、阻害剤のＬＲＲＣ３３アームは骨髄細胞関連ＴＧＦβ１を遮断することができることが企図される。さらに、骨髄線維症に関連する異常な巨核球の生物学は、ＧＡＲＰおよびＬＴＢＰ媒介性ＴＧＦβ１活性のどちらにも関与し得る。ＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤は、そのような複合体を標的化し、それによってニッチ中の活性ＴＧＦβ１の放出を阻害することができる。
【０５９１】
したがって、そのようなＴＧＦβ１阻害剤は、不十分な応答を有していた、またはヒドロキシ尿素およびＪＡＫ阻害剤などの他の（もしくは標準治療の）処置に不耐性である、原発性および後続性骨髄線維症を有する患者の処置に有用である。そのような阻害剤は、原発性ＭＦ、真性赤血球増加症後のＭＦおよび本態性血小板血症後のＭＦを含めた中等度または高リスクの骨髄線維症（ＭＦ）を有する患者の処置にも有用である。
【０５９２】
したがって、本発明の一態様は、原発性骨髄線維症を処置する方法に関する。この方法は、原発性骨髄線維症を患っている患者に、治療上有効な量の、ＴＧＦβの利用可能度の低下を引き起こすＴＧＦβ阻害剤を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１の活性化のアイソフォームに特異的なコンテキスト−コンテキスト非依存性モノクローナル抗体阻害剤を、骨髄線維症を有する患者に投与する。そのような抗体は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば１〜３０ｍｇの範囲、たとえば、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇなどの投薬量で投与し得る。たとえば、適切な投薬レジメンとしては、週に１回投与する１〜３０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は１週間あたり約１０ｍｇ／ｋｇで投薬する。任意選択で、投与の頻度は、初期段階の後に、たとえば週に約１回（初期段階中）から月に１回（維持段階中）へと調節し得る。
【０５９３】
抗体を含む医薬組成物の好ましい投与経路は静脈内または皮下の投与である。組成物を静脈内投与する場合、患者に、治療剤を、適切な持続期間、たとえば、１回の処置あたり約３０〜１２０分間（たとえば、３０分間、６０分間、７５分間、９０分間、および１２０分間）にわたって与え、その後、たとえば、３週間、４週間、６週間などの数週間毎に反復して、合計して数サイクル、たとえば、４サイクル、６サイクル、８サイクル、１０サイクル、１２サイクルなどとし得る。一部の実施形態では、患者は、阻害性抗体を含む組成物を用いて、１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量レベル（たとえば１回の投薬あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇ）で、２８日間（４週間）毎の静脈内投与を介して、６サイクルまたは１２サイクルの間処置する。一部の実施形態では、そのような処置は、設定した数の投与サイクル後に中断する代わりに、慢性（長期的）治療として（たとえば有益とみなされる限りは無期限に継続して）投与する。
【０５９４】
骨髄線維症は、白血病の一種であるとみなされる一方で、線維症の徴候によっても特徴づけられる。ＴＧＦβはＥＣＭ恒常性の側面を調節することが知られており、その調節不全が組織線維症をもたらす場合があるため、ＥＣＭに関連するＴＧＦβ活性を阻害することが望ましい。したがって、ＬＴＢＰ（ＬＴＢＰ１およびＬＴＢＰ３など）によって提示される前駆ＴＧＦβを結合および阻害する抗体またはその断片が本発明によって包含される。一部の実施形態では、骨髄線維症の処置に適切な抗体またはその断片は、ＬＲＲＣ３３、ＧＡＲＰ、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、またはその任意の組合せに関連するものなどの、前駆ＴＧＦβ複合体の複数のコンテキストを結合することができるという点で「コンテキスト非依存性」である。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＴＧＦβの活性化のコンテキスト非依存性阻害剤であり、抗体は、以下の潜在型複合体、すなわち、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβのうちの任意のものを結合および阻害することを特徴とする。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＴＧＦβの１つのアイソフォームを含むが他のアイソフォームは含まない潜在型複合体を結合および阻害する、アイソフォーム特異的抗体である。これらとしては、たとえば、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１が挙げられる。一部の実施形態では、そのような抗体は、高い親和性で優先的に結合してＴＧＦβ１シグナル伝達を阻害するアイソフォーム選択的抗体である。
【０５９５】
初期のｉｎ  ｖｉｖｏデータは、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的なコンテキスト非依存性阻害剤を、原発性骨髄線維症の翻訳可能なネズミモデルにおいて骨髄線維症を処置するために使用できることを示す。症状の緩和のみを提供するが臨床効果または延命効果を提供しない現在の標準治療であるＪＡＫ２阻害剤とは異なり、ＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的なコンテキスト非依存性阻害剤は疾患マウスの骨髄において有意な抗線維性効果を達成し、生存も延長させる可能性があり、ＴＧＦβ１阻害剤がヒト患者において骨髄増殖性疾患を処置するために有効であり得るという見方を支持している。
【０５９６】
本明細書中に記載の組成物および方法で処置し得る、骨髄増殖性新生物の適切な患者集団としては、それだけには限定されないが、ａ）フィラデルフィア（＋）である患者集団、ｂ）フィラデルフィア（−）である患者集団、ｃ）「古典的」と分類される患者集団（ＰＶ、ＥＴ、およびＰＭＦ）、ｄ）突然変異ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ（＋）を保有する患者集団、ｅ）ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ（−）を保有する患者集団、ｆ）ＪＡＫ２エクソン１２（＋）を有する患者集団、ｇ）ＭＰＬ（＋）を有する患者集団、ならびにｈ）ＣＡＬＲ（＋）を有する患者集団を挙げ得る。
【０５９７】
一部の実施形態では、患者集団は、中等度−２または高リスクの骨髄線維症を有する患者を含む。一部の実施形態では、患者集団は、利用可能な治療に対して不応性である、またはその候補ではない、骨髄線維症を有する対象を含む。一部の実施形態では、対象は１００〜２００×１０９個の／Ｌの血小板数を有する。一部の実施形態では、対象は、処置を受ける前に血小板数＞２００×１０９個／Ｌを有する。
【０５９８】
一部の実施形態では、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤療法を受ける（かつ受けることから利益を受け得る）対象は、中等度−１以上の原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）、または真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｍｉａ  ｖｅｒａ）／本態性血小板血症後の骨髄線維症（ＰＶ／ＥＴ後ＭＦ）を診断されている。一部の実施形態では、対象は処置の前に骨髄線維症が確認されている。一部の実施形態では、対象は、処置の前に、欧州コンセンサス等級付け（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｇｒａｄｉｎｇ）スコアによって評価してＭＦ−２以上を有し、修正バウアーマイスタースケール（Ｂａｕｅｒｍｅｉｓｔｅｒ）によって等級３以上を有する。一部の実施形態では、対象は処置の前にＥＣＯＧパフォーマンスステータスが１である。一部の実施形態では、対象は処置の前に５〜１２０の範囲の白血球数（１０９個／Ｌ）を有する。一部の実施形態では、対象は１０〜１００％の範囲のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ対立遺伝子負荷を有する。
【０５９９】
一部の実施形態では、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤療法を受ける（かつ受けることから利益を受け得る）対象は輸血依存性（処置前）であり、対象は、過去一カ月中に、８．５ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンレベルのために臨床的に明白な出血に関連していない、少なくとも２単位の赤血球輸血の病歴を有することを特徴とする。
【０６００】
一部の実施形態では、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤療法を受ける（かつ受けることから利益を受け得る）対象は、骨髄線維症を処置するための治療を以前に受けている。一部の実施形態では、対象は、それだけには限定されないが、ＡＺＤ１４８０、パノビノスタット、ＥＰＯ、ＩＦＮα、ヒドロキシ尿素、ペグ化インターフェロン、サリドマイド、プレドニゾン、およびＪＡＫ２阻害剤（たとえば、レスタウルチニブ、ＣＥＰ−７０１）を含めた１つまたは複数の治療剤で処置されている。
【０６０１】
一部の実施形態では、患者は髄外造血を有する。一部の実施形態では、髄外造血は、肝臓、肺、脾臓、および／またはリンパ節中におけるものである。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、疾患徴候の局在化された部位のうちの１つまたは複数に、局所的に投与する。
【０６０２】
アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤は、骨髄線維症を処置するために有効な量で患者に投与する。治療上有効な量は、患者において、それだけには限定されないが、骨髄間質中のＥＣＭの過剰蓄積（骨髄の線維症）、血管新生、骨硬化症、脾腫大、肝腫大（ｈｅｍａｔｏｍｅｇａｌｙ）、貧血、出血、骨痛および他の骨関連の病的状態、髄外造血、血小板増加症、白血球減少症、悪液質、感染症、血栓症、ならびに死を含めた骨髄線維症１つまたは複数の症状および／または合併症を軽減させるために、十分な量である。したがって、本開示の抗体または抗原結合断片を含むＴＧＦβ１阻害療法は、とりわけ抗線維性効果および／または血液細胞数の正常化を含む臨床上の利点を達成し得る。そのような治療は、生存を延長させ得るおよび／または骨髄移植の必要性を低下させ得る。
【０６０３】
一部の実施形態では、量は、患者においてＴＧＦβ１の発現および／または分泌（巨核球細胞など）を低下させるために有効である。したがって、そのような阻害剤は、処置した患者においてＴＧＦβ１のｍＲＮＡレベルを低下させ得る。一部の実施形態では、そのような阻害剤は、単核細胞中などの骨髄中のＴＧＦβ１のｍＲＮＡレベルを低下させる。ＰＭＦ患者は、典型的には、約２，５００ｐｇ／ｍＬを超える、たとえば、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、および１０，０００ｐｇ／ｍＬを超える（ＥＬＩＳＡによって測定して、約６００〜２，０００ｐｇ／ｍＬの正常な範囲と対比）、上昇した血漿ＴＧＦβ１レベルを示す（たとえばＭａｓｃａｒｅｍｈａｓら、（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ＆  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、２０１４年、５５（２）：４５０〜４５２頁）を参照）。Ｚｉｎｇａｒｉｅｌｌｏ（Ｂｌｏｏｄ、２０１３年、１２１（１７）：３３４５〜３３６３頁）は、ＰＭＦ患者および対照個体の血漿中の生物活性および総ＴＧＦβ１含有量を定量した。この参考文献によると、ＰＭＦ患者におけるＴＧＦβ１生物活性中央値は４３ｎｇ／ｍＬ（４〜２１８ｎｇ／ｍＬの範囲）であり、総ＴＧＦβ１は１５３ｎｇ／ｍＬ（３２〜１０００ｎｇ／ｍＬ）であった一方で、対照対応物では、値はそれぞれ１８（０．０５〜１４４）および５２（８〜８６０）であった。したがって、これらの報告に基づいて、ＰＭＦ患者における血漿ＴＧＦβ１含有量は、対照または健康な血漿試料と比較して数倍、たとえば、２倍、３倍、４倍、５倍など上昇している。本明細書中に記載の、阻害剤を用いた処置は、たとえば、たとえば４週間毎に０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば１〜３０ｍｇ／ｋｇのモノクローナル抗体）の投薬量の、４〜１２サイクルの投与（たとえば、２、４、６、８、１０、１２サイクル）または慢性もしくは長期的な処置の後に、血漿ＴＧＦβ１レベルを、対応するベースライン（処置前）と比較して少なくとも１０％、たとえば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、および５０％低下させ得る。
【０６０４】
治療効果の一部は、処置の開始後、たとえば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間後に比較的迅速に観察され得る。たとえば、阻害剤は、阻害剤で処置した患者の骨髄内の幹細胞および／または前駆細胞の数を、１〜８週間以内に有効に増加させ得る。これらは造血幹細胞および血液前駆細胞を含む。骨髄生検を行って、髄細胞の頻度／数の変化を評価し得る。それに対応して、患者は骨痛および疲労などの症状の改善を示し得る。
【０６０５】
骨髄増殖性疾患（たとえば骨髄線維症）を患っている対象は、白血球数レベルの上昇を顕在化させ得る（たとえば白血病性）。一部の実施形態では、治療上有効な量のＴＧＦβ１阻害剤は、血液細胞数を正常化させるために有効な量である。一部の実施形態では、量は、処置前と比較して対象における総白血球数を低下させるために有効である。一部の実施形態では、量は、処置前と比較して対象における総血小板数を低下させるために有効である。一部の実施形態では、量は、処置前と比較して対象におけるヘモグロビンレベルを増加（たとえば正常化または回復）させるために有効である。一部の実施形態では、量は、処置前と比較して対象におけるヘマトクリットレベルを増加（たとえば正常化または回復）させるために有効である。
【０６０６】
骨髄線維症の形態学的に顕著な特徴のうちの１つは、異常なＥＣＭによって部分的に特徴づけられる、骨髄（たとえば髄間質）における線維症である。一部の実施形態では、量は、たとえば間葉間質細胞による過剰なコラーゲン沈着によって特徴づけられた線維症を低下させるために有効である。一部の実施形態では、阻害剤は、処置を受けない対照対象と比較して、処置した対象においてＣＤ４１陽性細胞、たとえば巨核球の数を低下させるために有効である。一部の実施形態では、ランダムに選択された切片を用いて決定して、ＰＭＦ骨髄中の巨核球のベースライン頻度は２００〜７００個の細胞／平方ミリメートル（ｍｍ２）、ＰＭＦ脾臓中では４０〜３００個の巨核球（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｉｔｅ）／平方ミリメートル（ｍｍ２）の範囲であり得る。対照的に、正常なドナーの骨髄および脾臓中の巨核球の頻度はそれぞれ１４０個未満および１０個未満であった。阻害剤を用いた処置は、骨髄および／または脾臓中の巨核球の数（たとえば頻度）を低下させ得る。一部の実施形態では、阻害剤を用いた処置は、ＳＭＡＤ２／３のリン酸化などの下流のエフェクターシグナル伝達のレベルの低下を引き起こす可能性ばある。一部の実施形態では、阻害剤は、本明細書中に記載のものなどの線維性マーカーの発現レベルを低下させるために有効である。
【０６０７】
骨髄線維症を有する患者は脾腫を患っている場合がある。したがって、治療剤の臨床的効果は、脾臓の大きさの変化をモニタリングすることによって評価し得る。脾臓の大きさは、触診による脾臓長の評価および／または超音波による脾臓体積の評価などの既知の技法によって検査し得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤で処置する対象は、触診によって評価して５ｃｍ以上、たとえば５〜３０ｃｍの範囲のベースライン脾臓長（処置前）を有する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤で処置する対象は、超音波によって評価して３００ｍＬ以上、たとえば３００〜１５００ｍＬの範囲のベースライン脾臓体積（処置前）を有する。本明細書中に記載の、阻害剤を用いた処置は、たとえば、たとえば４週間毎に０．１〜３０ｍｇ／ｋｇのモノクローナル抗体）の投薬量の、４〜１２サイクルの投与（たとえば、２、４、６、８、１０、１２サイクル）の後に、対象における脾臓の大きさを低下させ得る。一部の実施形態では、有効量の阻害剤は、対応するベースライン値と比較して、阻害剤処置を受ける患者集団における脾臓の大きさを、少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、５０％、および６０％低下させるために十分である。たとえば、処置は、プラセボ対照と比較して、ＭＲＩまたはＣＴスキャンによって測定して、１２〜２４週間以内に脾臓体積においてベースラインからの≧３５％の低下を達成するために有効である。一部の実施形態では、処置は、最良の利用可能な治療対照と比較して、ＭＲＩまたはＣＴスキャンによって測定して、２４〜４８週間以内に脾臓体積においてベースラインからの≧３５％の低下を達成するために有効である。最良の利用可能な治療としては、ヒドロキシ尿素、糖質コルチコイド、ならびに医薬品なし、アナグレリド、エポエチンアルファ、サリドマイド、レナミドマイド、メルカプトプリン、チオグアニン、ダナゾール、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロン−α、メルファラン、アセチルサリチル酸、シタラビン、およびコルヒチンを挙げ得る。
【０６０８】
一部の実施形態では、本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤で処置した患者集団は、たとえば、骨髄線維症の研究および処置のための国際ワーキンググループ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  Ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ＩＷＧ−ＭＲＴ）の基準によって評価した統計的に改善された処置応答、処置（たとえば、４、６、８、または１２サイクル）後に修正バウアーマイスタースケールおよび欧州コンセンサス等級付けシステムによって測定した骨髄線維症の等級の変化の度合、骨髄増殖性新生物症状評価フォーム（Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｏｐｌａｓｍ  Ｓｙｍｐｔｏｍ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｆｏｒｍ、ＭＰＮ−ＳＡＦ）を使用した症状応答を示す。
【０６０９】
一部の実施形態では、本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を用いた処置は、たとえば修正骨髄線維症症状評価フォーム（ＭＦＳＡＦ）によって評価して、統計的に改善された処置応答を達成し、ここで、症状は、０から１０のスケール（０が存在しない、１０が想像できる最悪）を使用して衰弱させる骨髄線維症の症状（腹部不快感、早期の満腹感、左肋骨下の疼痛、そう痒症、寝汗、および骨／筋肉痛）を捉えるｄａｕｋｔダイアリー（ｄａｕｋｔ  ｄｉａｒｙ）であるＭＦＳＡＦツール（ｖ２．０など）によって測定する。一部の実施形態では、処置は、たとえば１２〜２４週間以内に、ベースラインから総ＭＦＳＡＦスコアの５０％≧の低下を達成するために有効である。一部の実施形態では、プラセボを摂取している患者と比較して、治療を受けている患者の有意な割合が総症状スコアの≧５０％の改善を達成する。たとえば、≧５０％の改善を達成する患者プールの割合は、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％より多くであり得る。
【０６１０】
一部の実施形態では、治療上有効な量の阻害剤は、貧血応答によって評価して臨床的改善を果たすために十分な量である。たとえば、改善された貧血応答は、４〜１２サイクル、たとえば６サイクルの処置の後に、たとえば８週間以上のより長い輸血非依存性の持続期間を含み得る。
【０６１１】
一部の実施形態では、治療上有効な量の阻害剤は、一定期間、たとえば、６週間、８週間、１２週間、６カ月間などの間、安定疾患を維持するために十分な量である。一部の実施形態では、疾患の進行は、全体的な骨髄細胞充実性の変化、レチクリンもしくはコラーゲン線維症の度合、および／またはＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ対立遺伝子負荷の変化によって評価し得る。
【０６１２】
一部の実施形態では、本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤で処置した患者集団は、処置を受けない対照集団と比較して、統計的に改善された（延長された）生存を示す。たとえば、対照群では、ＰＭＦ患者の生存期間中央値は約６年間であり（高リスク患者では約１６カ月間）、患者の２０％未満が診断の後に１０年以上生存すると予想される。本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を用いた処置は、生存期間を少なくとも６カ月間、１２カ月間、１８カ月間、２４カ月間、３０カ月間、３６カ月間、または４８カ月間延長させ得る。一部の実施形態では、処置は、プラセボを受ける患者と比較して、２６週間、５２週間、７８週間、１０４週間、１３０週間、１４４週間、または１５６週間での改善された全生存を達成するために有効である。
【０６１３】
上記に例示したものなどの治療の臨床上の利点は、初発の貧血を有するまたは有さない患者において見られ得る。
【０６１４】
アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤の有利な特長のうちの１つは、これらが、アイソフォーム選択性によって可能となる、選択性を欠く慣用のＴＧＦβ拮抗剤と比較して改善された安全性プロフィールを維持することである。したがって、本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤を用いた処置が、慣用のＴＧＦβ拮抗剤で処置した等価の患者集団と比較して、患者集団における有害事象の頻度および／または重篤度に関してそのような事象を低下させ得ることが予測される。したがって、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤は、投薬量および／または処置の持続期間に関してより大きな治療ウィンドウを提供し得る。
【０６１５】
有害事象は、有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）バージョン４などの当技術分野で理解されている適切な方法によって等級付けし得る。ＧＣ１００８などのＴＧＦβ拮抗剤を受けたヒト患者において以前に報告されている有害事象としては、白血球増加（等級３）、疲労（等級３）、低酸素症（等級３）、心停止（等級５）、白血球減少症（等級１）、再発性、一過性、圧痛性、紅斑性、結節状の皮膚病変、化膿性皮膚炎、および帯状疱疹が挙げられる。
【０６１６】
アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤療法は、骨髄線維症患者において、たとえば、貧血、血小板減少症、好中球減少症、高コレステロール血症、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の上昇、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の上昇、挫傷、眩暈、および頭痛に関して、ＪＡＫ阻害剤療法と比較してより頻度の低いおよび／またはより重篤度の低い有害事象（副作用）を引き起こし、したがってより安全な処置の選択肢を提供し得る。
【０６１７】
ＴＧＦβ１シグナル伝達の阻害剤を、組合せ（たとえば「付加型」）療法として、骨髄線維症の処置の１つまたは複数の治療剤と併せて使用し得ることが企図される。一部の実施形態では、本明細書中に記載のＴＧＦβ１の活性化の阻害剤を、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、またはＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤を受けたまたは受ける候補である、骨髄線維症を患っている患者に投与する。一部の実施形態では、そのような患者はＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、またはＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤療法に対して応答性である一方で、他の実施形態では、そのような患者は、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、またはＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤療法に対して応答性が乏しいまたは非応答性である。一部の実施形態では、本明細書中に記載のＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤の使用は、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、またはＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤療法に対して応答性が乏しいまたは非応答性である者をより応答性にし得る。一部の実施形態では、本明細書中に記載のＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤の使用は、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、またはＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤の投薬量の低下を許可してよく、これは、患者において等価または有意義な臨床的な有効性または利益を依然として生じるが、薬物関連の毒性または有害事象（上記に列挙したものなど）の数または度合がより少ない。一部の実施形態では、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、またはＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤療法と併せて使用した、本明細書中に記載のＴＧＦβ１の活性化の阻害剤を用いた処置は、患者において相乗的または相加的な治療効果を生じ得る。一部の実施形態では、本明細書中に記載のＴＧＦβ１の活性化の阻害剤を用いた処置は、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、もしくはＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤または骨髄線維症を処置するために与える他の治療の利益をブーストし得る。一部の実施形態では、患者は、骨髄線維症に関連する貧血に対処するために治療剤をさらに受け得る。
【０６１８】
線維性状態
物理的損傷／外傷が原因の組織傷害、毒性物質、および／または感染症に応答して、線維芽細胞を含めたいくつかの細胞種、いくつかの異なる種類の免疫細胞、ならびに常在上皮および内皮細胞に関与する、天然の修復プロセスが開始される。しかし、無検査のままでいると、このプロセスは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰蓄積および線維症をもたらす場合があり、立ち代ってこれは組織機能の進行性損失および臓器不全をもたらす場合がある（Ｃａｊａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、２０１８年、１９、１２９４頁）。
【０６１９】
線維症は、肺、腎臓、肝臓、心臓、および皮膚を含めたいくつかの臓器において起こることができる。臓器とは独立して、線維性応答は、炎症、変更された上皮−間葉の相互作用、および線維芽細胞の増殖によって特徴づけられている。線維症の顕著な特徴のうちの１つは、線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化であり、これはＥＣＭの調節不全に大きく寄与する。しかし、筋線維芽細胞は他の細胞源（たとえば、内皮細胞、上皮細胞、および間葉系幹細胞に由来することも提案されている（Ｋｉｍ，Ｋ．Ｋ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２０１７年、Ｏｋａｂｅ，Ｈ．、Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐｈａｔｈｏｌ．、２０１６年、３１、１４１〜１４８頁、およびＬｉ，Ｃら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１６年、７、１１４５５頁および）。さらに、免疫細胞は、筋線維芽細胞の分化を促進し、ＥＣＭ蓄積を刺激し、追加の免疫細胞を損傷組織へと動員するサイトカインおよびケモカインを分泌することによって、プロセスにおいて重要な役割を果たす（Ｃａｊａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．、２０１８年、１９、１２９４頁）。
【０６２０】
線維性組織と同様、癌関連線維芽細胞の活性化は、過剰量のＥＣＭを生じる腫瘍環境において起こる場合がある。ＥＣＭは、他の細胞（たとえば腫瘍促進原性免疫細胞）の浸潤のための足場および細胞遊走の基質を提供する。他の事例では、過剰なＥＣＭは抗腫瘍原性免疫細胞に対する障壁として作用し得る。
【０６２１】
ＴＧＦβは線維性応答の中心的な編成者として認識されている。ＴＧＦβは、筋線維芽細胞の分化を促進し、免疫細胞を動員し、上皮および内皮細胞の分化に影響を与えることができる。特に、ＴＧＦβは、ＥＣＭ、およびフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、オステオポンチン、テネイシン、エラスチン、デコリンなどの基底膜タンパク質の生成をアップレギュレーションする。ＴＧＦβ誘導性筋線維芽細胞の分化は、ＥＣＭタンパク質のさらなる蓄積、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の分泌、および筋線維芽細胞の増殖をもたらす場合がある（Ｆａｂｒｅｇａｔら、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２０１６年、２８３、２２１９〜２２３２頁、Ｍｅｎｇら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、２０１６年、１２、３２５〜３３８頁、およびＫｕｌｋａｒｎｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０１６年、５４、７５１〜７６０頁）。さらに、ＴＧＦβは表現型の変化を媒介して、血管平滑筋細胞（ＶＳＣＭ）中の収縮性タンパク質およびＩ型コラーゲンに影響を与え、マトリックスリモデリング酵素のリジルオキシダーゼ（ＬＯＸ）ファミリーなどのコラーゲン架橋結合タンパク質の合成を増強するよう、筋線維芽細胞および他の間質細胞を活性化させることができる（Ｂｕｓｎａｄｉｅｇｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０１３年、３３、２３８８〜２４０１頁）。さらに、ＴＧＦβは、筋線維芽細胞およびＣＡＦなどの線維性促進細胞種の分化に寄与するＥＭＴおよびＥｎｄＭＴをどちらも調節することが示されている。さらに、ＴＧＦβは、他の組織の中でとりわけ肺および肝線維症を促進することができる上皮アポトーシスを誘導することが示されている（Ｂａｒｂａｓ−Ｆｉｌｈｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００１年、５４、１３２〜１３８頁およびＷａｎｇら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．、２０１７年、２４７、４９２〜５０８頁）。
【０６２２】
生得的であるか動員されたかにかかわらず、マクロファージは、組織損傷への応答および修復において重要な役割を果たす。しかし、特定のシグナルの際に、これらは線維性促進性となる場合がある。他のサイトカインの中でとりわけＴＧＦβは、炎症誘発性であるＭ２マクロファージを活性化させることも示されている。活性化の際、これらのマクロファージは、ＴＧＦβ、ＥＣＭ構成要素、血管形成因子、および化学走性因子を含めたそれ自身のサイトカインを分泌する。Ｍ２マクロファージはＴＧＦβ駆動の肺線維症に必須であることが示されている（Ｍｕｒｒａｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２０１１年、４３、１５４〜１６２頁）。
【０６２３】
したがって、本発明によれば、本明細書中に記載のものなどのアイソフォーム特異的阻害剤ＴＧＦβ１は、対象における線維症（たとえば、線維性適応症、線維性状態）の処置において使用する。本発明を実施するための適切な阻害剤は、線維症を変更または寛解させるために有用であり得る本開示による抗体および／または組成物を含む。より詳細には、そのような抗体および／または組成物は、様々な種類の提示分子によって提示されるＴＧＦβ１を標的化することができるＴＧＦβ１の選択的拮抗剤である。
【０６２４】
ＴＧＦβを標的とする抗体は数々の前臨床モデルにおいて線維症を減少させる。そのような抗体および／または抗体に基づく化合物としてはＬＹ２３８２７７０（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）が挙げられる。そのそれぞれの内容が本明細書中にその全体で参考として組み込まれている米国特許第６，４９２，４９７号、米国特許第７，１５１，１６９号、米国特許第７，７２３，４８６号、および米国出願公開第２０１１／０００８３６４号に記載されているものも挙げられる。従来技術のＴＧＦβ拮抗剤としては、たとえば、ＴＧＦβのインテグリン依存性活性化を標的化および遮断する薬剤が挙げられる。
【０６２５】
しかし、証拠は、そのような従来技術の薬剤がアイソフォーム特異的阻害を媒介しない場合があり、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３の正常な機能を故意ではなく遮断することによって望まない効果を引き起こし得ることを示唆している。実際、本出願人は、正常な（無疾患の）肺組織は、比較的低いが測定可能なレベルのＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３を含有するが、著しくより少ないＴＧＦβ１を含有するを含有することに以前に注目している。それに比べて、線維症などの特定の病状では、ＴＧＦβ１は他のアイソフォームと比較して優先的にアップレギュレーションされる（ＷＯ２０１８／１２９３２９号）。好ましくは、そのような状態の処置において使用するためのＴＧＦβ拮抗剤は、疾患誘導性または疾患関連のアイソフォームに対してのみその阻害活性を発揮する一方で、正常に発現されて組織における持続性シグナル伝達を媒介する他のアイソフォームの機能を保存する。従来技術阻害剤（小分子ＴＧＦβ受容体拮抗剤であるＬＹ２１０９７６１およびαＶβ６インテグリンを標的とするモノクローナル抗体）はどちらも、疾患のないラットのＢＡＬ中でＴＧＦβの下流持続性シグナル伝達を阻害することが示されており、これらの阻害剤が望まない副作用を引き起こし得る可能性をもたらしている。その代わりにまたはそれに加えて、ＴＧＦβのインテグリン依存性活性化を標的化および遮断する薬剤は、様々な細胞種によって発現され、病因において役割を果たす数々のインテグリンの種類の中で、疾患関連ＴＧＦβ１の活性化を司っているインテグリンの部分組のみを遮断することが可能であり得る。さらに、そのような拮抗剤がＴＧＦβ１アイソフォームのインテグリン媒介性活性化を選択的に遮断し得る場合でさえも、これはプロテアーゼ依存性活性化などの他の様式によって始動されたＴＧＦβ１の活性化の遮断においては無効であり得る。対照的に、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤は、アイソフォーム選択性を維持しつつ、具体的な活性化の様式にかかわらずＴＧＦβ１の活性化ステップを防止することを目的としている。
【０６２６】
アイソフォーム特異的ＴＧＦβ３阻害剤は特定の病状において治療上の利点を提供し得ることがさらに企図される。たとえば、ＴＧＦβ１阻害剤で処置する特定の線維性疾患は、疾患組織（たとえば線維性組織）が両方のアイソフォームを発現することをことを特徴とするＴＧＦβ３陽性（すなわちＴＧＦβ１＋／ＴＧＦβ３＋線維性組織）でもあり得る。したがって、本発明は、そのような状態の処置における、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ３阻害剤と併せたアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤の使用を含む。そのようなＴＧＦβ３阻害剤はコンテキスト非依存性またはコンテキストに偏ったものであり得る。
【０６２７】
本開示の抗体および／または組成物を治療的に使用し得る線維性適応症としては、それだけには限定されないが、肺の適応症（たとえば、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、アレルギー性喘息、急性肺傷害、好酸球性食道炎、肺動脈高血圧、および化学ガス傷害）、腎臓の適応症（たとえば、糖尿病性糸球体硬化症、巣状分節性糸球体硬化症（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ＦＳＧＳ）、慢性腎臓病（ＣＫＤ）、腎臓移植および慢性拒絶に関連する線維症、ＩｇＡ腎症、溶血性尿毒症症候群）、肝線維症（たとえば、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、慢性ウイルス性肝炎、寄生虫血症、先天性代謝異常、アルコール線維症などの素媒介性線維症、非アルコール性脂肪性肝炎肝細胞癌（ＮＡＳＨ−ＨＣＣ）、原発性胆汁性肝硬変、および硬化性胆管炎に関連するまたはそれによって引き起こされるもの）、心血管線維症（たとえば、心筋症、肥大性心筋症、アテローム性動脈硬化症、および再狭窄）、全身性硬化症、皮膚線維症（たとえば、全身性硬化症における皮膚線維症、びまん性皮膚全身性硬化症、強皮症、病理学的皮膚瘢痕、ケロイド、手術後瘢痕、瘢痕形成手術、放射線誘導性瘢痕、および慢性創傷）、眼関連の状態、たとえば、網膜下線維症、ブドウ膜炎症候群、特発性後腹膜線維症に関連するブドウ膜炎、外眼筋線維症、主要組織適合複合体（ＭＨＣクラスＩ）または組織適合抗原に関連する眼疾患、黄斑変性症（たとえば加齢黄斑変性症）における網膜下線維症、ならびに癌または後続性線維症（たとえば、骨髄線維症、頭頸部癌、Ｍ７急性巨核芽球性白血病、および粘膜炎）が挙げられる。本開示の化合物および／または組成物を使用して処置し得る、線維症（変性疾患を含む）に関連する他の疾患、障害、または状態としては、それだけには限定されないが、腺筋症、子宮内膜症、マルファン症候群、硬い皮膚症候群、強皮症、関節リウマチ、骨髄線維症、クローン病、潰瘍性結腸炎、全身性エリテマトーデス、筋ジストロフィー（ＤＭＤなど）、パーキンソン病、ＡＬＳ、デュピュイトラン拘縮、カムラチ−エンゲルマン病、神経瘢痕、認知症、増殖性硝子体網膜症、角膜傷害、緑内障排液手術後の合併症、および多発性硬化症（ＭＳ）が挙げられる。
【０６２８】
多くの線維性適応症が患部組織の炎症にも関連しており、免疫構成要素の関与を示している。そのような炎症には、Ｔｈ１７細胞数の増加、Ｔｒｅｇ細胞数の低下、および／または両方などの異常な免疫細胞集団が伴い得る。それぞれの事例において、罹患した患者はＴｈ１７／Ｔｒｅｇ細胞比の増加を示し得る。アイソフォーム選択的抗体のＧＡＲＰ−および／またはＬＲＲＣ３３標的化活性は、これらのコンテキストに対する阻害効果を提供し得る。
【０６２９】
一部の実施形態では、本明細書中に記載の組成物および／または方法を用いて処置し得る線維性適応症としては、肺の線維症（たとえばＩＰＦ）、腎臓の線維症（たとえばＣＫＤに関連する線維症）、肝臓の線維症（たとえばＮＡＳＨに関連するまたはそれが原因である）、心臓または心組織の線維症、皮膚の線維症（たとえば強皮症）、子宮（たとえば、子宮内膜、子宮筋層）の線維症、筋肉（たとえば骨格筋）の線維症、および骨髄の線維症などの臓器線維症が挙げられる。一部の実施形態では、そのような治療は、患者における臓器移植の必要性を低下または遅延させ得る。一部の実施形態では、そのような治療は患者の生存を延長させ得る。
【０６３０】
ＩＰＦを処置するために、処置から利益を受け得る患者としては、家族性ＩＰＦを有する者および散発性ＩＰＦを有する者が挙げられる。治療上有効な量のＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤の投与は、肺組織における筋線維芽細胞の蓄積の低下、コラーゲン蓄積の低下、ＩＰＦ症状の低下、肺機能の改善または維持、および生存の延長を行い得る。一部の実施形態では、阻害剤は、ＩＰＦの線維性環境内のＥＣＭ関連ＴＧＦβ１（たとえばＬＴＢＰ１／３によって提示される前駆／潜在型ＴＧＦβ１）の活性化を遮断する。阻害剤は、マクロファージ関連ＴＧＦβ１（たとえばＬＲＲＣ３３によって提示される前駆／潜在型ＴＧＦβ１）、たとえば肺胞マクロファージの活性化を任意選択でさらに遮断し得る。その結果、阻害剤はフィブロネクチンの放出および他の線維症関連因子を抑制し得る。一部の実施形態では、阻害剤は肝星細胞活性化を遮断する。
【０６３１】
肝星細胞（ＨＳＣ）の活性化が肝臓傷害において線維症の中心的な駆動因子であることが十分に確立されている。このプロセスでは、休止状態のビタミンＡ貯蔵細胞が、増殖性、線維形成性の筋線維芽細胞（細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質蓄積の主源）へと分化形質転換した。しかし、このプロセスは、自己貪食、小胞体ストレス、酸化的ストレス、レチノールおよびコレステロール代謝、後成学、ならびに受容体媒介性シグナルを含めた多くの異なる経路によって媒介されることが示されている。さらに、マクロファージ、肝細胞、肝臓類洞内皮細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、血小板、およびＢ細胞を含めた炎症細胞も、ＨＳＣ活性化を変調することが示されている（ＴｓｕｃｈｉｄａおよびＦｒｉｅｄｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ＆Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第１４巻、３９７〜４１１頁（２０１７年））。１つのみの具体的な例では、Ｓｅｋｉらは、ＴＬＲ４（細菌によって提示されたＬＰＳを認識する）の活性化がケモカイン分泌のアップレギュレーションをもたらし、クッパー細胞の化学走性を誘導し、また、ＨＳＣをＴＧＦβ誘導性シグナルに対して感作させてクッパー細胞の無制限の活性化を許可することを実証した（Ｓｅｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１３巻の１３２４〜１３３２頁（２００７年））。
【０６３２】
炎症が肝線維症の発生および進行において主要な役割を果たすは周知である。具体的には、肝臓傷害は炎症ならびに単球／マクロファージ（およびリンパ球、好酸球、形質細胞）の動員をもたらし、これはＴＧＦβを含めた線維性促進因子を生じる。さらに、研究により、肝臓組織の常在マクロファージ（クッパー細胞）および骨髄由来の動員されたマクロファージがどちらも肝線維症の進行において重要な役割を果たし、ＴＧＦβ経路が肝線維症中にマクロファージの極性化および線維性促進機能を促進することができることが示されている。実際、ＴＧＦβを含めて、クッパー細胞および動員されたマクロファージがどちらもＨＳＣを活性化して、パラ分泌機構による筋線維芽細胞へのその分化転換を誘導することができることが示されている。立ち代って、筋線維芽細胞がＥＣＭ構成要素を生成および蓄積して線維症をもたらす（ＦａｂｒｅｇａｔおよびＣａｂａｌｌｅｒｏ−Ｄｉａｚ、Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．、２０１８年、８：３５７）。
【０６３３】
しかし、筋線維芽細胞は、門脈および常在の線維芽細胞、骨髄由来線維細胞、ＥＭＴを受ける肝臓上皮細胞、ＥｎｄＭＴを受ける内皮細胞、ならびに血管平滑筋細胞および周皮細胞を含めた他の供給源からも由来し得る。実際、ＴＧＦβは、ＥｎｄＭＴおよびＥＭＴをどちらも調節し、肝線維症を駆動する筋線維芽細胞の増加をもたらすことも示されている。（Ｐａｒｄａｌｉら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．、２０１７年１０月、１８（１０）：２１５７）。したがって、ＴＧＦβの標的化は線維性状態の処置の魅力的な治療標的である。
【０６３４】
ＴＧＦβは、肝線維症および疾患の進行において多くの役割を果たすことが示されている。たとえば、ＴＧＦβは、ＨＳＣの筋線維芽細胞への活性化を司っていることが示されている。ＴＧＦβは肝細胞における上皮間葉転換（ＥＭＴ）を媒介することも示されており、これは筋線維芽細胞集団の増加に寄与し得る。さらに、ＴＧＦβは、腫瘍細胞の柔軟性に変化を誘導することが示されている（ＦａｂｒｅｇａｔおよびＣａｂａｌｌｅｒｏ−Ｄｉａｚ、Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．、２０１８年、８：３５７）。
【０６３５】
ＴＧＦβは線維性および／または腫瘍微小環境中の多くの異なる細胞源上に見つけることができ、したがって複数の異なる提示分子（たとえば、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、および／またはＬＲＲＣ３３）によるＴＧＦｂの提示を示唆しているが、特定の状況においては、ＴＧＦβの特定の供給源を、他のものを超えて標的化することが有益であり得る。たとえば、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎらは、ＨＳＣ中のαｖインテグリンを欠失させることで、マウスをＣＣＬ４誘導性肝線維症から保護したことを示している（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２０１３年、１９、１６１７〜１６２４頁）。インテグリンがＬＴＢＰ提示ＴＧＦβの主な活性化剤であるため、この結果は、ＬＴＢＰ提示ＴＧＦβを標的化することが、特定の状況において線維症を処置するために十分であり得ることを示唆している。しかし、免疫細胞が線維性応答において重要な役割を果たすため、提示分子ＴＧＦβ複合体のほとんどまたはすべてによって提示されるＴＧＦβを標的とするＴＧＦβ阻害剤が有益であり得る。
【０６３６】
近年では、世界中でその有病率が増加していることが原因で、肝線維症の処置は関心が増加している領域となっている。たとえば、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、肥満症、インスリン耐性、絶食高血糖症、異脂肪血症、および変更されたアディポカインプロフィールなどの代謝異常に関連づけられている。ＮＡＦＬＤは肝細胞における過剰な脂質蓄積によって特徴づけられており、脂肪肝（肝細胞中の脂質／脂肪小滴の蓄積）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝線維症、最も重篤な事例では最終的には硬変まで進行する疾患スペクトルである。線維症または硬変を伴うＮＡＳＨは、肝細胞癌（ＨＣＣ）を発生する危険性を増加させる（Ｓｔａｒｌｅｙ  ＢＱら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１０年、５１：１８２０〜１８３２頁）。脂肪症からＮＡＳＨへの進行は、「多打撃」モデルによって調節されると提案されており、ここで、第１の打撃はインスリン耐性および代謝障害であり、脂肪肝、続いて、酸化的ストレス、炎症誘発性サイトカイン媒介性肝細胞傷害、変更された脂質分画、ならびに遊離脂肪酸、異常な肝臓内コレステロール負荷、高インスリン血症、高レプチン血症、および低アディポネクチン血症によって媒介される肝毒性をもたらす（Ｔｉｌｇ  Ｈ、Ｍｏｓｃｈｅｎ  ＡＲ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２０１０年、５２：１８３６〜１８４６頁およびＹｉｌｍａｚ  Ｙ．、Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、２０１２年、３６：８１５〜８２３頁）。
【０６３７】
多くの動物モデルが肝線維症を研究するために開発されている一方で、任意の適切な前臨床モデルを用い得る。たとえば、マウスにおける高脂肪食は、ヒトＮＡＦＬＤの組織病理学および病因をどちらも模倣することが示されている。さらに、ｄｂ／ｄｂおよびｏｂ／ｏｂマウスモデルなどの一部の遺伝的モデルはヒト代謝症候群およびＮＡＦＬＤの特長も表示する。それだけには限定されないが、メチオニンおよびコリン欠乏食（ＭＣＤ）、高コレステロール食（ＨＣＤ）、コリン欠乏高脂肪食（ＣＤＨＦＤ）、コリン欠乏Ｌ−アミノ酸欠乏食、コリン欠乏Ｌ−アミノ酸欠乏食＋四塩化炭素、高脂肪食＋ストレプトゾトシン、高脂肪＋高コレステロール食（ＨＦＨＣ）、高フルクトース食（ＨＦＤ）、および高フルクトース高脂肪食（ＨＦＨＦ）を含めた、様々な食餌誘導性のモデルから主になる、ＮＡＳＨを研究するための動物モデルも存在する。ＮＡＳＨの研究のための遺伝的マウスモデルとしては、それだけには限定されないが、ｆｏｚ／ｆｏｚマウス、肝細胞特異的ＰＴＥＮ欠乏マウス、Ｄｂ／ｄｂマウス＋ジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）、およびｄｂ／ｄｂマウス＋ＭＣＤが挙げられる。これらすべてのモデルのそれぞれのプラスとマイナスを含めた詳細は、その内容が本明細書中に参考として組み込まれているＪｅｎｎｉｅ  Ｋａ  Ｃｈｉｎｇ  Ｌａｕら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２０１７年、２４１：３６〜４４頁に概要が示されている。
【０６３８】
肝線維症におけるアイソフォーム特異的ＴＧＦβ阻害剤の有効性を試験するために有用な別のモデルとしては、（ＣＣＬ４）モデルが挙げられる。肝線維症におけるアイソフォーム特異的ＴＧＦβ阻害剤の有効性を試験するために有用な別のモデルとしては、胆管結紮（ＢＤＬ）モデルが挙げられる（たとえばＴａｇら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．、２０１５年、（９６）：５２４３８を参照されたい）。
【０６３９】
本明細書中に提供するものなどのアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤を使用して、脂肪肝（たとえば非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝臓の線維性状態を処置し得る。脂肪肝は炎症性であってもなくてもよい。脂肪肝（すなわち脂肪性肝炎）が原因の肝臓の炎症は瘢痕（線維症）へと発達する場合があり、その後、これはしばしば硬変（肝臓構造を歪ませてその機能を損なせる瘢痕）へと進行する。したがって、阻害剤を使用してそのような状態を処置し得る。一部の実施形態では、阻害剤は、肝臓の線維性環境内のＥＣＭ関連ＴＧＦβ１（たとえばＬＴＢＰ１／３によって提示される前駆／潜在型ＴＧＦβ１）の活性化を遮断する。阻害剤は、マクロファージ関連ＴＧＦβ１（たとえばＬＲＲＣ３３によって提示される前駆／潜在型ＴＧＦβ１）、たとえば、クッパー細胞（星状マクロファージとしても知られる）ならびに浸潤性単球由来マクロファージおよびＭＤＳＣの活性化を任意選択でさらに遮断し得る。その結果、阻害剤は線維症関連因子（たとえば本明細書中に記載の線維性マーカー）を抑制し得る。そのような状態を有する対象における阻害剤の投与は、１つもしくは複数の症状を低下させ得る、疾患の進行防止もしくは遅延させ得る、肝臓における脂肪蓄積を低下もしくは安定化させ得る、疾患関連バイオマーカー（血清コラーゲン断片など）を低下させ得る、肝臓瘢痕を低下させ得る、肝臓硬直を低下させ得る、および／またはそうでなくても、阻害剤で処置していない対照集団と比較して、阻害剤で処置した患者集団において臨床的に有意義な成果を生じ得る。一部の実施形態では、有効量の阻害剤は、ＮＡＳＨ患者において肝臓脂肪の低下および線維症（たとえば瘢痕）の低下をどちらも達成し得る。一部の実施形態では、有効量の阻害剤は、ＮＡＳＨ患者において悪化する脂肪性肝炎のない少なくとも１つのステージの、線維症の改善を達成し得る。一部の実施形態では、有効量の阻害剤は、ＮＡＳＨ患者において肝不全および／または肝臓癌の発生率を低下させ得る。
【０６４０】
一部の実施形態では、有効量の阻害剤は、治療開始後、たとえば１２〜３６週間目に評価して、複数の炎症性または線維性血清バイオマーカーのレベルを対照に比較して正常化し得る。一部の実施形態では、炎症性または線維性バイオマーカーは、ＮＡＦＬＤの重篤度を評価する（肝脂肪症のレベルを測定することによる）、処置するのための患者を選択する、および／または疾患の進行もしくは処置応答をモニタリングするために使用し得る。たとえば、血液バイオマーカーおよびパネルとしては、それだけには限定されないが以下のものを挙げ得る：
ｉ）脂肪肝インデックス（ＢＭＩ、胴囲、血清トリグリセリド、およびガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、
ｉｉ）脂肪肝（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｉｓｉｓ）インデックス（血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）比、ＢＭＩ、性別、および真性糖尿病の存在）、
ｉ）ＮＡＦＬＤ肝臓脂肪スコア（血清ＡＬＴ、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド、ヘモグロビンＡ１ｃ、および白血球数）、
ｉｉ）ＳｔｅａｔｏＴｅｓｔ（ＢｉｏＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅ）（総ビリルビン、ＧＧＴ、α２−マクログロビン、ハプトグロビン、ＡＬＴ、アポリポタンパク質ＡＩ、総コレステロール、トリグリセリド、グルコース（年齢と性別について調節）の血清レベル、およびＢＭＩ）、ならびに
ｉｉｉ）ＮＡＦＬＤリッジスコア（ＡＬＴ、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド、ヘモグロビンＡ１ｃの血清レベル、白血球数、併存症データ（および高血圧の存在））。
【０６４１】
一部の実施形態では、イメージングバイオマーカーを使用して肝脂肪症のレベルを評価することができる。たとえば、イメージングバイオマーカーとしては、それだけには限定されないが、超音波検査、制御減衰パラメータ（ＣＡＰ）、ＭＲＩで推定した陽子密度脂肪割合（ＭＲＩ−ＰＤＦＦ）、および磁気共鳴分光分析（ＭＲＳ）を挙げ得る。
【０６４２】
肝臓生検がＮＡＳＨを診断するための現在の標準であるが、病理学者間でのばらつきがそのような診断方法の有効性を制限している。したがって、脂肪肝進行阻害（ＦＬＩＰ）アルゴリズム（組織学的脂肪症、活性、および線維症のスコアを含む）の使用を使用して、生検によるＮＡＳＨ診断の一貫性を改善させ得る。さらに、多くの非侵襲性バイオマーカーが疾患の診断およびモニタリングにも有用であり得る。したがって、一部の実施形態では、炎症性または線維性バイオマーカーは、ＮＡＳＨの重篤度を評価する、処置するための患者を選択する、および／または疾患の進行もしくは処置応答をモニタリングするために使用し得る。血液バイオマーカーとしては以下のものを挙げ得る：
ｉ）ＣＫ１８断片、総サイトケラチン、およびｓＦＡＳなどのアポトーシスマーカー、
ｉｉ）ＣＲＰ、ＴＮＦ、ＩＬ−８、およびＣＸＣＬ１０などの炎症性マーカー、
ｉｉｉ）１１−ＨＥＴＥ、９−ＨＯＤＥ、１３−ＨＯＤＥ、１２−オキソ−ＯＤＥ、ＬＡ−１３−ＨＯＤＥ（ｏｘＮＡＳＨスコア）、および１１，１２−ジＨＥＴｒＥなどの脂質酸化生成物、
ｉｖ）カテプシンＤなどのリソソーム酵素、ならびに
ｖ）ＮＡＳＨ試験（ＢｉｏＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅ）、ＮＡＳＨ診断学パネル（真性糖尿病の存在、性別、ＢＭＩ、ならびにトリグリセリド、ＣＫ１８断片、および総ＣＫ１８の血清レベルを含む）などの組合せパネル。
【０６４３】
一部の実施形態では、バイオマーカーおよび関連パネルは、線維症および／または硬変のレベルの診断、処置するための患者の選択、および／または疾患の進行もしくは処置応答のモニタリングにおいて有用であり得る。たとえば、肝線維症および硬変の非侵襲性試験としては、それだけには限定されないが、ＡＳＴ：ＡＬＴ比、ＡＳＴ：血小板比インデックス、線維症−４インデックス（年齢、ＡＳＴ、ＡＬＴ、および血小板数）、ＮＡＦＬＤ線維症スコア（年齢、ＢＭＩ、空腹時血糖異常および／または糖尿病、ＡＳＴ  ＡＬＴ、血小板数、およびアルブミン）、ＢＡＲＤスコア（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＢＭＩ、および糖尿病）が挙げられる。
【０６４４】
特定の線維症マーカーおよびパネルも有用な場合があり、それだけには限定されないが、ヒアルロン酸、ＰＩＩＰＮＰ、Ｐｒｏ−Ｃ３、ＴＩＭＰ１、ラミニン、強化肝線維症（ＥＬＦ）パネル（ＰＩＩＮＰ、ヒアルロン酸、ＴＩＭＰ１）、ＦｉｂｒｏＴｅｓｔ（ＧＧＴ、総ビリルビン、α２ｍ、アポリポタンパク質ＡＩ、およびハプトグロビン）、ならびにＦｉｂｒｏＭｅｔｅｒ  ＮＡＦＬＤ（体重、プロトロンビンインデックス、ＡＬＴ、ＡＳＴ、フェリチン、および空腹時血糖）が挙げられる。肝線維症のイメージングバイオマーカーとしては、それだけには限定されないが、ＦｉｂｒｏＳｃａｎ（ＴＥ）、点剪断波エラストグラフィー（ｐＳＷＥ）（音響放射力インパルス（ＡＲＦＩ）としても知られる）、２Ｄ−３Ｄ  ＳＷＥ、磁気共鳴エラストグラフィー（ＭＲＥ）、および多パラメータＭＲＩを挙げ得る。
【０６４５】
一部の実施形態では、遺伝的バイオマーカーおよびゲノムバイオマーカーは、様々なＳＮＰ、無細胞ｎｃＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡの評価を含むＮＡＦＬＤの危険性および重篤度の評価において有用であり得る。既知の遺伝的バイオマーカーおよびゲノムバイオマーカー、ならびに上述の血液バイオマーカー、パネル、イメージングバイオマーカー、および試験の包括的な総説は、その内容が本明細書中に参考として組み込まれているＶＷＳ  Ｗｏｎｇら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．、２０１８年８月、１５（８）：４６１〜４７８頁中に要約されている。
【０６４６】
一部の実施形態では、ＮＡＳＨ患者において、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤を、ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤを含めた代謝症候群の臨床徴候を有する患者において一般に代謝調節を増強させ得る、それだけには限定されないがミオスタチン阻害剤を含めた１つまたは複数の追加の治療を受ける患者に投与し得る。
【０６４７】
一部の実施形態では、追加の治療はＴＧＦβ３阻害剤を含み得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３阻害剤はアイソフォーム特異的ＴＧＦβ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ３阻害剤はコンテキスト非依存性またはコンテキストに偏ったＴＧＦβ３阻害剤である。一部の実施形態では、ＮＡＳＨ患者はＴＧＦβ１陽性およびＴＧＦβ３陽性の線維性組織を有する。一部の実施形態では、ＮＡＳＨ患者は、ＴＧＦβ１阻害剤療法に対して部分的に応答性であると決定される、または決定されている。
【０６４８】
一部の実施形態では、ＮＡＳＨ患者において、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤を、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤（ＡＣＣｉ）（たとえばフィルソコスタット（ＧＳ−０９７６）またはＰＦ−０５２２１３０４）を受ける患者に投与し得る。改善された本明細書中に記載のアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤と組み合わせて有用であり得る他の治療剤としては、それだけには限定されないが、ＧＬＰ−１受容体作用剤もしくは類似体（たとえばセマグルチド）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）作用剤（たとえばＧＳ−９６７４、クリオフェクソル（Ｃｉｌｏｆｅｘｏｒ）としても知られる）、ＡＳＫ１阻害剤（たとえばセロンセルチブ）、オベチコール酸、ＰＰＡＲ作用剤（たとえばＧＦＴ５０５、エラフィブラノールとしても知られる）、ニタゾキサニド、ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）阻害剤（たとえばＰＦ−０６８３５９１９）、および／またはジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）阻害剤（たとえばＰＦ−０６８６５５７１）が挙げられる。一部の実施形態では、上述の治療剤のうちの任意の１つまたは複数を本開示のアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤と併用することができ、たとえば、ＦＸＲ作用剤、ＡＣＣ阻害剤、および／またはＧＬＰ−１類似体と組み合わせたアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤である。一部の実施形態では、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、ミオスタチン活性化阻害剤などのミオスタチン阻害剤と併用し得る（たとえばＳＲＫ−０１５、たとえば、ＷＯ２０１６／０７３８５３号およびＷＯ２０１７／０４９０１１号）。一部の実施形態では、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、ＧＤＦ１１活性化阻害剤などのＧＤＦ１１阻害剤と併用し得る（たとえばＷＯ２０１７／０１５６２２号）。
【０６４９】
一部の実施形態では、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤の、単独でまたは１つもしくは複数の追加の治療剤と組み合わせた処置は、ＭＲＩ−ＰＤＦＦによって測定して、肝臓脂肪を低下させる。一部の実施形態では、肝臓脂肪の低下は、少なくとも２０％、たとえば、≧２０％、≧２５％、≧３０％、≧３５％、≧４０％、≧４５％、または≧５０％である。一部の実施形態では、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤の、単独でまたは１つもしくは複数の追加の治療剤と組み合わせた処置は、血清ＡＬＴおよび／またはＧＧＴを、少なくとも２０％、たとえば、≧２０％、≧２５％、≧３０％、≧３５％、≧４０％、≧４５％、または≧５０％低下させる。一部の実施形態では、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤の、単独でまたは１つもしくは複数の追加の治療剤と組み合わせた処置は、胆汁酸の合成を低下させる。
【０６５０】
一部の実施形態では、ＮＡＳＨ患者は進行肝線維症（ステージＦ３／Ｆ４）を有し得る。一部の実施形態では、そのような患者はステージＦ３進行肝線維症を有する。一部の実施形態では、そのような患者は、硬変によって特徴づけられたステージＦ４肝線維症を有する。一部の実施形態では、ＮＡＳＨ患者は、肝細胞癌および／または食道静脈瘤を発生するまたは発生する危険性にある。
【０６５１】
非アルコール性脂肪性肝炎臨床研究ネットワーク（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）の病理学委員会によって導き出された分類による、非アルコール性脂肪肝疾患における線維症のステージ決定を以下に提供する：
2021531254.tif 000039
【０６５２】
治療中の様々な組織学的特長の評価を可能にし、ＮＡＦＬＤのスペクトル全体を包含するために、ＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク（ＣＲＮ）病理学委員会は、ＮＡＳＨにおいて観察される様々な組織学的特長と病理学委員会によるＮＡＳＨの診断との関連に関して、徹底的な一変量および多変量の分析を行った。結果は、ＮＡＳＨ活性（等級）およびコラーゲン沈着＋構造リモデリング（ステージ）の両方の採点システムであった。この等級付けシステム、ＮＡＳＨ活性スコア（ＮＡＳ）は、３つの組織学的な構成要素、すなわち、脂肪症（０〜３）、小葉炎症（０〜３）、および風船様変性（０〜２）の重みづけしていない和であった。これは０〜８の範囲であった。ＮＡＳは、潜在的に可逆的である活性傷害の特長を含む。さらに、Ｂｒｕｎｔらの線維症ステージ決定システムをさらに発展させた。ＮＡＳＨ  ＣＲＮシステムでは、ステージ１の線維症スコアを繊細（１Ａ）および高密度（１Ｂ）な類洞周囲線維症へと細分類した一方で、ステージ１Ｃは随伴性の類洞周囲線維症のない門脈線維症として定義された（本明細書中に参考として組み込まれているＳｔａｌ、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、２０１５年１０月２１日、２１（３９）：１１０７７〜１１０８７頁によって総説）。
【０６５３】
本明細書中に提供するものなどのアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤を使用して、腎臓の線維性状態、たとえば、糸球体および尿細管間質におけるＴＧＦβの有意に増加した発現が観察されている、細胞外マトリックス蓄積によって特徴づけられた疾患（ＩｇＡ腎症、巣状および分節性糸球体硬化症、半月体糸球体腎炎、ループス腎炎、および糖尿病性腎症）を処置し得る。ＴＧＦβによって誘導される２つの基質成分、フィブロネクチンＥＤＡ＋およびＰＡＩ−１の糸球体および尿細管間質での蓄積は、マトリックス蓄積を有するすべての疾患において有意に上昇していたが、相関分析により、主にＴＧＦβ１アイソフォームとの密な関係性が明らかとなった。したがって、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤は、ＴＧＦβが細胞外マトリックスの病理学的蓄積と関連しているヒト糸球体障害のスペクトルの治療剤として有用である。
【０６５４】
一部の実施形態では、腎臓の線維性状態は慢性腎臓病（ＣＫＤ）と関連している。ＣＫＤは高血圧および糖尿病によって主に引き起こされ、毎年百万を超える人の命を奪っている。ＣＫＤ患者は、厳格な食習慣および医薬品から透析および移植の範囲にわたる、生涯の医療ケアを必要とする。一部の実施形態では、本明細書中に記載のＴＧＦβ１阻害剤療法は、透析および／または移植の必要性を低下または遅延させ得る。一部の実施形態では、そのような治療は、他の処置の必要性（たとえば、投薬量、頻度）を低下させ得る。一部の実施形態では、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤は、ＣＫＤを有する患者において一般に代謝調節を増強させ得る、それだけには限定されないがミオスタチン阻害剤を含めた１つまたは複数の追加の治療を受ける患者に投与し得る。
【０６５５】
本開示のＴＧＦβ１阻害剤で処置し得る線維性状態としては、線維症および／または慢性炎症に関与する状態が挙げられる。そのような状態は、それだけには限定されないがデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を含めた神経筋障害、ならびに多発性硬化症（ＭＳ）および嚢胞性線維症（ＣＦ）などの他の遺伝子障害であり得る。ＥＣＭおよび免疫細胞関連ＴＧＦβ１アームの両方の阻害を通じて、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１阻害剤は、線維性進行を抑制し、Ｍ１／Ｍ２マクロファージの極性化を回復させると考えられている。
【０６５６】
ＣＫＤおよび腎線維症の研究に有用なモデルとしては、それだけには限定されないが、ＮＺＢ／Ｗ、ＭＲＬ／ｌｐｒ、およびＢＸＳＢマウス株、抗ＧＢＭモデル、抗Ｔｈｙ１モデル、５／６腎摘除術、放射線照射腎症、ピューロマイシンアミノヌクレオシドネフローゼ（ＰＡＮ）およびアドリアマイシン腎症、葉酸腎症、ＣｙＡ腎症、ＤＯＣＡ塩腎症、ＨＩＶ関連腎症（ＨＩＶＡＮ）トランスジェニックマウスモデル、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）、バッファロー／ｍｎａラット、ミュンヘンＷｉｓｔａｒ  Ｆｒｏｍｔｅｒ（ＭＷＦ）ラット、片側性尿管閉塞（ＵＵＯ）、Ｃｏｌ４Ａノックアウトマウス（アルポート症候群）が挙げられる（その内容が本明細書中に参考として組み込まれているＹａｎｇら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌｓ．、２０１０年、７（１〜２）：１３〜１９頁を参照）。
【０６５７】
本明細書中に提供する方法で処置し得る臓器線維症としては心臓（たとえば心血管）線維症が挙げられる。一部の実施形態では、心線維症は心不全、たとえば慢性心不全（ＣＨＦ）に関連している。一部の実施形態では、心不全は、心筋疾患および／または代謝性疾患に関連している場合がある。一部の実施形態では、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤は、それだけには限定されないが心線維症および代謝障害に関与する心機能不全を有する患者におけるミオスタチン阻害剤を含めた、１つまたは複数の追加の治療を受ける患者に投与し得る。
【０６５８】
心線維症の研究に有用な遺伝的モデルとしては、それだけには限定されないが、心筋細胞特異的ＦＡＫ−ＫＯマウス、遺伝子改変したＳＲ−ＢＩ／ａｐｏＥ二重ＫＯ（ｄＫＯ）マウス、シンデカン−１ヌルマウス、ＥＣ−ＳＯＤ過剰発現マウス、ＰＫＣ−δノックアウトマウスが挙げられる。心線維症の研究に有用な外科的マウスモデルとしては、それだけには限定されないが、冠状動脈結紮、虚血性再灌流モデル（開胸および閉胸）、慢性虚血モデル、虚血性プレコンディショニングモデルを用いた虚血再灌流、ランゲンドルフモデル、横断大動脈狭窄（ＴＡＣ）、上行大動脈狭窄、腹部大動脈狭窄、肺動脈絞扼術、遠位左前側冠血管結紮を有するＴＡＣ、大動静脈瘻（ＡＣＦ）モデル、ならびに大動脈弁閉鎖不全モデルが挙げられる（その内容が本明細書中に参考として組み込まれているＲａｉら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０１７年１月、４２４（１〜２）：１２３〜１４５頁を参照）。
【０６５９】
一部の実施形態では、本明細書中に記載の組成物および／または方法を用いて処置し得る線維性状態としては線維形成が挙げられる。線維形成は新生物の周りで起こり、腫瘍の周りの高密度の線維症（たとえば線維形成性間質）または腹部手術後の腹部内の瘢痕組織を引き起こし得る。一部の実施形態では、線維形成は悪性腫瘍に関連する。悪性腫瘍を取り囲むその高密度の形成が原因で、慣用の抗癌治療剤（たとえば化学療法）は、臨床的効果のために有効に貫通して癌細胞に達しない場合がある。本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤は、線維性形成を緩めて抗癌治療の効果を助けることができるように、線維形成を乱すために使用し得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤は単独療法として使用することができる（以下にさらに記す）。
【０６６０】
一部の実施形態では、患者は線維性固形腫瘍（たとえば線維形成）を有しており、線維性固形腫瘍が切除不可能または非手術性（ｎｏｎ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）であるとみなされるように、外科的候補プールから排除されるまたは排除されている。そのような患者は本開示のＴＧＦβ１阻害療法を受ける候補であり得る。本発明のＴＧＦβ１阻害剤は、患者が外科的切除の候補となり得るように、投与後に腫瘍を切除可能または手術可能にし得る。
【０６６１】
線維性状態を有する患者を処置するために、ＴＧＦβ１アイソフォーム特異的阻害剤を対象に、線維症を処置するために有効な量で投与する。有効量のそのような抗体は、対象において治療上の有効性および臨床的安全性をどちらも達成するために有効な量である。一部の実施形態では、阻害剤は、ＥＣＭに局在性の（たとえば繋留されている）ＬＴＢＰ媒介性ＴＧＦβ１および免疫細胞に局在性の（たとえばそれ上に繋留されている）ＧＡＲＰ媒介性ＴＧＦβ１の活性化を遮断することができる抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＥＣＭに局在性のＬＴＢＰ媒介性ＴＧＦβ１および単球／マクロファージに局在性の（たとえばそれ上に繋留されている）ＬＲＲＣ３３媒介性ＴＧＦβ１の活性化を遮断することができる抗体である。一部の実施形態では、ＬＴＢＰはＬＴＢＰ１および／またはＬＴＢＰ３である。一部の実施形態では、線維性微小環境中の線維性促進Ｍ２様マクロファー上のＬＲＲＣ３３によって提示されるＴＧＦβ１を標的化および阻害することが有益であり得る。
【０６６２】
線維症の変更について本開示の抗体および／または組成物の有効性を決定することにおいて有用なアッセイとしては、それだけには限定されないが、組織学的アッセイおよび当技術分野で知られている基本的な免疫組織化学的分析が挙げられる。
【０６６３】
一部の実施形態では、循環ＬＡＰ断片を線維形成の血清マーカーとして使用し得る。そのような断片の切断された末端を特異的に認識する抗体を使用して、ＬＡＰ断片を血清試料から検出し得る。たとえば、その内容が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第８，１９８，４１２号を参照されたい。
【０６６４】
糖尿病におけるＴＧＦβの役割
膵臓中のインスリン分泌β細胞の損失が２型糖尿病の主な機構である。最近の研究が、β細胞の機能およびグルコース恒常性の調節におけるＴＧＦβファミリーリガンドの役割を示唆している。これらのリガンドは、成人におけるβ細胞の増殖および／または前駆体からの新しいβ細胞の取り込みに影響を与え得る。インスリンプロモーターを通じてＴＧＦ−βのトランスジェニック過剰発現を引き起こすための遺伝子操作は、外分泌膵臓および島細胞（ｉｓｌｅｔｓ）の発生の減少、グルコース制御の維持を引き起こすことが報告されている。同様に、グルカゴンプロモーターを通じたＴＧＦ−βのトランスジェニック過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｓｉｏｎ）は、Ｂ細胞形成不全、インスリン分泌の減少、耐糖能異常を引き起こすことが報告されている（たとえばＴｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．、２０１０年７月、２１（７）：４４１〜４４８頁に総説）。膵臓ベータ細胞の拡大および再生は、膵臓の正常な発生および成人島細胞における機能の維持のどちらにも重大である。最近、いくつかの研究が、発生中の膵臓におけるＴＧＦβシグナル伝達の主要な役割の一部を同定している。具体的には、ＴＧＦβシグナル伝達は、前駆細胞の内分泌傾倒およびその続く成熟を促進する。ＴＧＦβＩＩ型受容体のドミナントネガティブ型を過剰発現するマウス  Ｔｕｌａｃｈａｎら  受容体レベルでＴＧＦβシグナル伝達を阻害し、内分泌前駆体数の増加、および内分泌細胞の増殖を見出した。成人島細胞では、３つすべてのＴＧＦβアイソフォームは、内分泌細胞においてびまん性パターンで発現される。しかし、インスリン陽性細胞中では強度はＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３でより高かった。外分泌膵臓では、腺房細胞のほとんどがＴＧＦβ１について陽性であった一方で、３つすべてのリガンドは導管細胞中で同等に発現されているように思われた。成人ベータ細胞は非常に低い代謝回転および低い増殖速度を有する。本明細書中に包含したものなどのアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、糖尿病および／またはグルコース不耐性の処置または防止において膵臓ベータ細胞複製を促進するために使用し得る。β細胞の複製が変化するインスリン要求に応答したβ細胞塊の維持および拡大の主な機構であり、そのような適応拡大の不全は糖尿病をもたらす可能性があるため（たとえばＤｈａｗａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．、２０１６年５月、６５（５）：１２０８〜１２１８頁を参照）、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤を、ＴＧＦβシグナル伝達の汎阻害に関連する望まない副作用を引き起こさずに糖尿病を寛解させるために有利に使用し得る。一部の実施形態では、たとえば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５９４６８号およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２０１４号に記載されているように、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤は、糖尿病またはグルコース不耐性の処置または防止において、ミオスタチン選択的阻害剤（たとえば、前駆／潜在型ミオスタチン／ＧＤＨ８と選択的に結合し、それによってミオスタチンの活性化を阻害する抗体）と併せて使用し得る。一部の実施形態では、糖尿病は２型糖尿病である。
【０６６５】
糖尿病に関連する状態としては、糖尿病性腎臓病とも呼ばれる糖尿病性腎症（ＤＮ）が挙げられる。糖尿病性腎症は１型糖尿病および２型糖尿病の重大な腎臓関連合併症である。糖尿病を有する人の４０パーセントまでが最終的には腎臓病を発症する。時間とともに、ＤＮは、最終的には生存のために透析または腎臓移植のどちらかを必要とする肺水腫、心血管病、および末期腎臓段階をもたらし得る。
【０６６６】
ヒトＤＮの主要な臨床的特長としては、アルブミン尿、ＧＦＲおよび高血圧の進行性低下、ならびに心血管病の危険性の増加が挙げられる。ＤＮの病因は糸球体血管形成および過剰濾過に関連している。さらに、糸球体基底膜の肥厚、メサンギウム細胞の拡大、糸球体硬化症、および尿細管間質性線維症が、ＤＮを有する患者において観察されている。ＴＧＦβ１およびその受容体は、実験的およびヒト糖尿病性腎症のどちらにおいてもアップレギュレーションされている。高グルコースに応答して糸球体細胞においてＴＧＦβ１受容体発現、ＴＧＦβ１生物活性、および外因性ＴＧＦβ１に対する応答性の増強が起こることが報告されており、細胞外アデノシンがこのプロセスにおいて役割を果たすことが結び付けられている（たとえばＲｏａら、（２００９年）、「Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  １  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｉ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｒａｔｓ」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ、５８３（１９）：３１９２〜３１９８頁を参照）。一部の実施形態では、ＤＮはアデノシン生合成またはシグナル伝達の調節不全を含む。一部の実施形態では、調節不全はＣＤ３９および／またはＣＤ７３に関与する。
【０６６７】
筋骨格状態におけるＴＧＦβの役割
組織と臓器とを一緒に支持して結合させる、骨格の骨、筋肉、軟骨、腱、靱帯、関節、および他の結合組織からなる筋骨格系では、ＴＧＦβは、増殖および分化の阻害、萎縮の誘導、および線維症の発生を含めた様々な役割を果たす。ＴＧＦβは衛生細胞の増殖を低下させ、分化を妨げる（ＭｙｏＤおよびミオゲニンの阻害を介して）（Ａｌｌｅｎ，Ｒ．Ｅ．およびＬ．Ｋ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９８７年、１３３（３）：５６７〜７２頁、Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９９１年、８８（９）：３８２２〜６頁、Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９８６年、８３（２１）：８２０６〜１０頁、Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９８６年、１０３（５）：１７９９〜８０５頁）。これらの初期の文献ではＴＧＦβのアイソフォーム（すなわち、ＴＧＦβ１、２、または３）は指定されていないが、ＴＧＦβ１であると推定される。ＴＧＦβは、筋線維症にも寄与しており、組換えＴＧＦβ１の直接注射は骨格筋線維症をもたらし、汎ＴＧＦβ阻害は、急性および慢性的に損傷した筋肉において線維症を減少させる（Ｌｉ，Ｙ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００４年、１６４（３）：１００７〜１９頁、Ｍｅｎｄｉａｓ，Ｃ．Ｌ．ら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２０１２年、４５（１）：５５〜９頁、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２０１１年、１７８（６）：２６１１〜２１頁）。ＴＧＦβ１は骨格筋内の筋原線維、マクロファージ、調節性Ｔ細胞、線維芽細胞、および線維細胞によって発現され（Ｌｉ，Ｙ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００４年、１６４（３）：１００７〜１９頁、Ｌｅｍｏｓ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２０１５年、２１（７）：７８６〜９４頁、Ｖｉｌｌａｌｔａ，Ｓ．Ａ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１４年、６（２５８）：２５８ｒａ１４２頁、Ｗａｎｇ，Ｘ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１６年、１９７（１２）：４７５０〜４７６１頁）、発現は傷害の際および疾患において増加する（Ｌｉ，Ｙ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００４年、１６４（３）：１００７〜１９頁、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２０１１年、１７８（６）：２６１１〜２１頁、Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ，Ｐ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９５年、９６（２）：１１３７〜４４頁、Ｉｓｈｉｔｏｂｉ，Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、２０００年、１１（１８）：４０３３〜５頁）。ｍｄｘ筋肉において、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３もアップレギュレーションされているが（ｍＲＮＡレベルで）、ＴＧＦβ１よりも低い程度である（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２０１１年、１７８（６）：２６１１〜２１頁、Ｚｈｏｕ，Ｌ．ら、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ、２００６年、１６（１）：３２〜８頁）。Ｐｅｓｓｉｎａらは最近、系列追跡実験を使用して、ジストロフィー筋肉内の複数の起源の細胞がＴＧＦβ依存性経路を介して線維形成性の運命をとることを示した（Ｐｅｓｓｉｎａ，Ｐ．ら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１５年、４（６）：１０４６〜６０頁）。
【０６６８】
骨は、身体におけるＴＧＦβの最大の貯蔵庫である。実際、ＴＧＦβ経路は、少なくとも部分的には骨芽細胞分化および／または破骨細胞骨吸収によって調節することによって、骨の恒常性およびリモデリングにおいて重要な役割を果たすを考えられている。このプロセスは正常および異常な状況のどちらにも関与しており、調節不全の場合、骨関連の状態および癌などの疾患を引き超すまたは悪化させ得る。したがって、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１選択的阻害剤を使用してそのような状態を処置し得る。一部の実施形態では、そのような阻害剤の投与は、骨形成−再吸収のバランスを回復または正常化させるために有効である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、組合せ療法としてミオスタチン阻害剤および／または骨増強剤などの別の治療と併せて対象に投与する。
【０６６９】
骨状態（たとえば骨格疾患）としては、骨粗鬆症、異形成、骨形成不全症、および骨癌が挙げられる。骨に起源を発する原発性骨癌に加えて、多くの悪性腫瘍が骨に転移することが知られており、これらとしては、それだけには限定されないが、乳癌、肺癌（たとえば扁平細胞癌）、甲状腺癌、精巣癌、腎細胞癌、前立腺癌、および多発性骨髄腫が挙げられる。
【０６７０】
骨関連状態のうち、骨形成不全症は、Ｉ型コラーゲンをコードしている遺伝子に影響を与える突然変異によって通常は引き起こされる遺伝的状態であり、脆弱な骨が非常に容易に折れることを引き起こす。現在、いくつかの処置の選択肢が存在し、ビスホスホネート薬が標準治療のままである。ＴＧＦβ１の活性化を選択的に阻害する抗原または抗原結合断片を、単独療法として単独で、または疾患を処置することを目的とする別の治療と併せてのどちらかで使用して、骨形成不完全症（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）を処置し得る。
【０６７１】
本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１阻害剤の治療効果は、骨形成（アルカリホスファターゼ活性）または再吸収（酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ）の血清マーカーなどの適切なバイオマーカーを使用してモニタリングし得る。
【０６７２】
一部の実施形態では、そのような状態は筋力低下に関連している。
【０６７３】
一部の実施形態では、筋骨格状態は、衛星細胞などの筋骨格系に関連する筋原性および非筋原性の幹／前駆細胞の調節不全に関与する。アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤を使用して、筋原性および非筋原性の幹／前駆細胞の拡大／分化を促進し得る。
【０６７４】
ＴＧＦβ１は、ヒト筋ジストロフィーなどの患部組織の慢性炎症に付随する線維性状態において役割を果たし得る。デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィンの不在によって引き起こされる、重篤な進行性の、最終的には致命的の疾患である（Ｂｕｓｈｂｙ，Ｋ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ、２０１０年、９（１）：７７〜９３頁）。ジストロフィンの欠如は、連続的な筋変性をもたらす、収縮誘導性傷害に対する感受性の増加をもたらす（Ｐｅｔｒｏｆ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９９３年、９０（８）：３７１０〜４頁、Ｄｅｌｌｏｒｕｓｓｏ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ、２００１年、２２（５）：４６７〜７５頁、Ｐｒａｔｔ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ、２０１５年、７２（１）：１５３〜６４頁）。修復の反復ラウンドは、慢性炎症、線維症、衛星細胞プールの消耗、最終的な可動性の欠如および死に寄与する（Ｂｕｓｈｂｙ，Ｋ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ、２０１０年、９（１）：７７〜９３頁、ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｃ．Ｍ．ら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２０１３年、４８（３）：３４３〜５６頁）。ＴＧＦβ１の発現はＤＭＤを有する患者において有意に増加しており、これらの患者において観察される線維症の程度に相関している（Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ，Ｐ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９５年、９６（２）：１１３７〜４４頁、Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｗ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００５年、６５（６）：８２６〜３４頁）。過剰なＥＣＭ蓄積は筋肉の収縮特性に対して有害な効果を有しており、筋原線維がその血液供給から隔離されるために栄養へのアクセスを制限する可能性がある（Ｋｌｉｎｇｌｅｒ，Ｗ．ら、Ａｃｔａ  Ｍｙｏｌ、２０１２年、３１（３）：１８４〜９５頁）。最近、追加のデータが、筋ジストロフィーにおいてＴＧＦβ１をさらに結び付けている。ＬＴＢＰ４における変異は、マウスおよびヒトにおいて疾患の重篤度を変更することが見出されている。マウスでは、ＬＴＢＰ４の変異体は、ジストロフィンまたはγ−サルコグリカンを欠くマウスにおいて保護的である（Ｃｏｌｅｙ，Ｗ．Ｄ．ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２０１６年、２５（１）：１３０〜４５頁、Ｈｅｙｄｅｍａｎｎ，Ａ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、２００９年、１１９（１２）：３７０３〜１２頁）。ヒトでは、ＬＴＢＰ４の変異体がＤＭＤにおいて保護的であり、歩行運動の損失を数年遅延させることを、２つのグループが独立して同定している（Ｆｌａｎｉｇａｎ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、２０１３年、７３（４）：４８１〜８頁、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、２０１５年、８６（１０）：１０６０〜５頁）。マウスおよびヒトにおける遺伝的変異の性質は異なるが、どちらの種においても、保護的変異はＴＧＦβシグナル伝達の減少をもたらす（Ｈｅｙｄｅｍａｎｎ，Ａ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、２００９年、１１９（１２）：３７０３〜１２頁）、Ｃｅｃｏ，Ｅ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１４年、６（２５９）：２５９ｒａ１４４）。骨格��生物学におけるＴＧＦβ１の機能の多くは、精製した活性成長因子を動物内に注射するまたは培養細胞に加える実験から推測されている（Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、１９８６年、８３（２１）：８２０６〜１０頁、Ｌｉ，Ｙ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２００４年、１６４（３）：１００７〜１９頁、Ｍｅｎｄｉａｓ，Ｃ．Ｌ．ら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２０１２年、４５（１）：５５〜９頁）。ＴＧＦβ１の特定の機能における細胞性コンテキストの重要性を考慮すると（たとえばＨｉｎｃｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ、２０１６年、８（１２）を参照）、これらの実験において観察された効果の一部がｉｎ  ｖｉｖｏでのサイトカイン内在性の役割を反映していない可能性がある。たとえば、組換えＴＧＦβ１、ミオスタチン、またはＧＤＦ１１を用いたヒト真皮線維芽細胞の処置は、これらの細胞における遺伝子発現にほぼ同一の変化をもたらす。ただし、ｉｎ  ｖｉｖｏではこれらのタンパク質の役割はかなり異なる（Ｔａｎｎｅｒ，Ｊ．Ｗ．、Ｋｈａｌｉｌ，Ａ．、Ｈｉｌｌ，Ｊ．、Ｆｒａｎｔｉ，Ｍ．、ＭａｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  １１  Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ｉｎ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．、２０１６年、コロラド州Ｋｅｙｓｔｏｎｅ）。
【０６７５】
複数の研究者らが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの成長因子の役割を明白にするためにＴＧＦβの阻害剤を使用している。汎ＴＧＦβ中和抗体１Ｄ１１を用いたｍｄｘマウスの処置は、線維症の低下（組織学およびヒドロキシプロリン含有量による）、筋肉損傷の低下（血清クレアチンキナーゼの低下およびより高い筋原線維密度）、ならびに改善された筋機能（スパイロメトリー、単離ＥＤＬ筋肉の強制生成、および前肢握力の増加による）を明らかにもたらす（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、２０１１年、１７８（６）：２６１１〜２１頁、Ａｎｄｒｅｅｔｔａ，Ｆ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、２００６年、１７５（１〜２）：７７〜８６頁、Ｇｕｍｕｃｉｏ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９８５年）、２０１３年、１１５（４）：５３９〜４５頁）。さらに、ドミナントネガティブＴＧＦβ  ＩＩ型受容体の筋原線維に特異的な発現は、心臓毒傷害後の筋肉損傷に対しておよびδ−サルコグリカン−／−マウスにおいて保護する（Ａｃｃｏｒｎｅｒｏ，Ｆ．ら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２０１４年、２３（２５）：６９０３〜１５頁）。骨格筋において豊富でありＴＧＦβ活性を阻害するプロテオグリカンデコリンは、ｍｄｘマウスにおいておよび裂傷傷害の後に筋線維症を減少させる（Ｌｉ，Ｙ．ら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００７年、１５（９）：１６１６〜２２頁、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ，Ｌ．Ｅ．ら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２００４年、３０（５）：６４５〜５３頁）。スラミン（抗新生物剤）およびロサルタン（アンジオテンシン受容体遮断剤）などのＴＧＦβ阻害活性を有する他の分子は、傷害、マルファン症候群、および筋ジストロフィーのマウスモデルにおいて、筋肉病理学を改善させ、線維症を低下させることに有効であった（Ｓｐｕｒｎｅｙ，Ｃ．Ｆ．ら、Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、２０１１年、１６（１）：８７〜９５頁、Ｔａｎｉｇｕｔｉ，Ａ．Ｐ．ら、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、２０１１年、４３（１）：８２〜７頁、Ｂｅｄａｉｒ，Ｈ．Ｓ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ、２００８年、３６（８）：１５４８〜５４頁、Ｃｏｈｎ，Ｒ．Ｄ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２００７年、１３（２）：２０４〜１０頁）。上述の治療剤のすべてが実際にＴＧＦβ１またはそのシグナル伝達を阻害する一方で、そのどれもがＴＧＦβ１アイソフォームに特異的でない。たとえば、１Ｄ１１は、ＴＧＦβ１、２、および３アイソフォームと結合してそれを阻害する（Ｄａｓｃｈ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８９年、１４２（５）：１５３６〜４１頁）。スラミンは、ＴＧＦβ１に加えて、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、およびＥＧＦを含めた複数の成長因子のその受容体と結合する能力を阻害する（Ｈｏｓａｎｇ，Ｍ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８５年、２９（３）：２６５〜７３頁、Ｏｌｉｖｉｅｒ，Ｓ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１９９０年、２６（８）：８６７〜７１頁、Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．およびＷ．Ｄ．Ｈｅｓｔｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｓ、１９９２年、５９：１３１〜５１頁）。デコリンも、直接結合することによって、およびミオスタチン阻害剤であるフォリスタチンのアップレギュレーションを通じての両方で、ミオスタチン活性を阻害する（Ｍｉｕｒａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２００６年、３４０（２）：６７５〜８０頁、Ｂｒａｎｄａｎ，Ｅ．、Ｃ．Ｃａｂｅｌｌｏ−Ｖｅｒｒｕｇｉｏ、およびＣ．Ｖｉａｌ、Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ、２００８年、２７（８）：７００〜８頁、Ｚｈｕ，Ｊ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００７年、２８２（３５）：２５８５２〜６３頁）。ロサルタンは、レニン−アンジオテンシン−アルドステロンシステムに対するその効果を通じて、ＩＧＦ−１／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を含めた追加のシグナル伝達経路に影響を与える（Ｂｕｒｋｓ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１１年、３（８２）：８２ｒａ３７頁、Ｓａｂｈａｒｗａｌ，Ｒ．およびＭ．Ｗ．Ｃｈａｐｌｅａｕ、Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２０１４年、９９（４）：６２７〜３１頁、ＭｃＩｎｔｙｒｅ，Ｍ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ、１９９７年、７４（２）：１８１〜９４頁）。したがって、これらの治療剤はすべて追加の分子を阻害し、これはその治療効果および毒性に寄与し得る。
【０６７６】
筋肉の恒常性、修復、および再生におけるＴＧＦβの仮定的役割を考慮すると、本明細書中に記載のモノクローナル抗体などの、ＴＧＦβ１シグナル伝達を選択的に変調する薬剤は、現在までに開発されているより広範に作用するＴＧＦβ阻害剤に関連する毒性なしに、慢性／遺伝的筋ジストロフィーおよび急性筋肉傷害におけるものなどの損傷した筋線維の処置に有効であり得る。
【０６７７】
したがって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＧＦβ効果のすべてではなく部分組を優先的に変調させる薬剤を使用して、損傷した筋線維を処置する方法を提供する。そのような薬剤はＴＧＦβ１シグナル伝達を選択的に変調することができる（「アイソフォーム特異的変調」）。
【０６７８】
慢性筋疾患における筋線維の修復
本発明は、線維症を制限し、筋肉の形態学および機能の正常化に寄与することによって、ＤＭＤ患者において筋肉の品質および機能を改善させるための方法を包含する。ＴＧＦβ１は筋形成も阻害するため、ＴＧＦβ１遮断はジストロフィー筋肉における再生も促進する場合があり、さらなる治療上の利点を付加する。ＴＧＦβ１阻害剤は、Ｅｘｏｎｄｙｓ  ５１（Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ）などのジストロフィンアップレギュレーション治療と併用し得る。筋ジストロフィーにおけるＴＧＦβ１阻害の潜在的な治療上の利点を考慮すると、（１）ＴＧＦβ１の役割をＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３のものから区別すること、ならびに（２）どの分子コンテキストでＴＧＦβ１阻害が最も有益であろうかを明白にすることが不可欠である。上述のように、汎ＴＧＦβ阻害剤は有意な毒性に関連づけられており、これらの化合物の臨床的使用が制限されている（Ａｎｄｅｒｔｏｎ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ、２０１１年、３９（６）：９１６〜２４頁、Ｓｔａｕｂｅｒ，Ａ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、２０１４年、４（３）：１〜１０頁）。ＴＧＦβアイソフォームのうちのどれがこれらの毒性を引き起こすかは不明である。記載した毒性の一部は、免疫系におけるＴＧＦβ１阻害が原因であり得る。たとえば、１Ｄ１１は横隔膜における線維症のレベルを有意に低下させた一方で、この処置は筋肉中のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数も増加させ、これは、長期的処置では有害な可能性がある、汎ＴＧＦβ阻害の際の炎症反応の増加を示唆している（Ａｎｄｒｅｅｔｔａ，Ｆ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、２００６年、１７５（１〜２）：７７〜８６頁）。実際、筋肉からのＴ細胞の枯渇はｍｄｘマウスの筋肉病理学を改善させ、これは、Ｔ細胞媒介性炎症反応がジストロフィー筋肉に対して有害であることを示唆している（Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１年、９８（２）：２３５〜４３頁）。１Ｄ１１投与の際のＴ細胞数の増加は、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞に対するＴＧＦβ１の効果が原因である可能性が高い。Ｔｒｅｇは、ＧＡＲＰを介してその細胞表面上にＴＧＦβ１を提示し、この複合体からのＴＧＦβ１の放出はＴｒｅｇ抑制活性を増強させ、したがってＴ細胞媒介性炎症を制限する（Ｗａｎｇ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、２０１２年、２３（６）：１１２９〜３９頁、Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｐ．、Ａ．Ｍ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、およびＥ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１４年、１９３（６）：２８４３〜９頁、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００４年、１７２（２）：８３４〜４２頁、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．、Ａ．Ｋｉｔａｎｉ、およびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２００１年、１９４（５）：６２９〜４４頁）。実際、ＰＣ６１抗体を使用したＴｒｅｇの枯渇はｍｄｘマウスの横隔膜において炎症および筋肉損傷の増加をもたらした一方で、Ｔｒｅｇの数および活性の増大は筋肉損傷を低下させた（Ｖｉｌｌａｌｔａ，Ｓ．Ａ．ら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、２０１４年、６（２５８）：２５８ｒａ１４２頁）。興味深いことに、免疫抑制性Ｔ細胞Ｔｒ１細胞の追加の集団���最近同定された。これらの細胞は、その抑制活性に必要であるＴＧＦβ３を大量に生成する（Ｇａｇｌｉａｎｉ，Ｎ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２０１３年、１９（６）：７３９〜４６頁、Ｏｋａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００９年、１０６（３３）：１３９７４〜９頁、Ｏｋａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ、２０１５年、６：６３２９頁）。骨格筋におけるＴｒ１細胞の役割は未知であるが、１Ｄ１１によるＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の両方の阻害が、ＴｒｅｇおよびＴｒ１細胞をどちらも阻害することによって相加的な炎症誘発効果を有することができるという可能性が存在する。
【０６７９】
ＴＧＦβ１の潜在性および活性化に関して上述した構造的見識は、ＴＧＦβ１の活性化を特異的に標的化する薬物の発見への新規手法を可能にする（Ｓｈｉ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、４７４（７３５１）：３４３〜９頁）。３つの成熟ＴＧＦβ成長因子間で共有される高い度合の配列同一性は潜在型複合体では共有されておらず、前駆ＴＧＦβ１に対して精巧に特異的な抗体の発見を可能にする。抗体発見の特許手法を使用して、本発明者らは前駆ＴＧＦβ１と特異的に結合する抗体（Ａｂ１、Ａｂ２、およびＡｂ３）を同定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ同時培養系を使用して、これらの抗体はＴＧＦβ１のインテグリン媒介性放出を阻害することが実証された。このシステムでは、ヒト皮膚またはマウス骨格筋に由来する線維芽細胞が潜在型ＴＧＦβ１の供給源であり、αＶβ６を発現する細胞系が活性ＴＧＦβ１の放出を許可し、その後、ＳＭＡＤ２／３応答性ルシフェラーゼレポーターを発現する第３の細胞系を使用してこれを測定する（図１２）。これらの抗体のうちの１つであるＡｂ１をｉｎ  ｖｉｖｏで試験しており、腎線維症のＵＵＯ（片側性尿管閉塞）マウスモデルにおいて有効性が示されている。このモデルでは、９ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ１を用いたマウス（ｎ＝１０匹）の処置は、ＴＧＦβ１応答性遺伝子のアップレギュレーションを防止し、傷害後の線維症の程度を低下させた（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色による）。ＴＧＦβ１特異的治療は、汎ＴＧＦβ阻害剤と比較して、ＤＭＤ集団においてのように長期的に使用されるであろう治療剤では重大な側面である改善された有効性および安全性プロフィールを有し得る。ＴＧＦβ１阻害性抗体は、特定のＴＧＦβ１阻害がＤＭＤまたは他の筋疾患の治療剤として潜在性を有するかどうかを決定するため、および骨格筋再生におけるＴＧＦβ１の役割を明白にするために、使用することができる。
【０６８０】
慢性対急性の筋原線維傷害および最適な治療剤の選択
正常であるが急性傷害（そうでなければ健康な筋肉または運動ニューロンに対する外傷性傷害など）後に再生中の筋肉では、炎症性マクロファージの初期浸潤が、損傷組織を一掃するため、および衛星細胞活性化に必要な因子（たとえばサイトカイン）分泌するために必要であると考えられている。続いて、これらの細胞はＭ２表現型に切り替わって創傷の回復を駆動する。
【０６８１】
対照的に、ＤＭＤを含めた疾患などの慢性症状では、炎症誘発性マクロファージが常に優勢であり、Ｍ２への切替わりが起こらず（または少なくとも十分に効率的でない）、炎症誘発性マクロファージが炎症および筋肉損傷を駆動し続ける。ＤＭＤでは、ＮＦｋＢ経路が永続的に活性であり、構成的炎症をもたらす。したがって、一部の実施形態では、慢性炎症を低下させるためにＮＦｋＢ阻害剤をＤＭＤ患者に投与し得る。
【０６８２】
したがって、ＤＭＤなどの慢性症状では、治療的焦点は、筋肉再生とは対照的に筋肉修復にあり得る。その理由は、これらがＤＭＤ筋線維は欠損があるが破壊はされておらず、膜の断裂、カルシウム一過性の調節不全、およびマクロファージからのＲＯＳ損傷によって損傷されているためである。それに比べて、健康な筋肉への傷害の場合、治療的焦点は再生にあり得る。たとえば、心臓毒モデルでは、筋線維は死滅しており再生させなければならない。これは、挫滅傷などの外傷性傷害の後の回復プロセスを刺激する。
【０６８３】
証拠は、ＬＲＲＣ３３が、Ｍ２様表現型を有するチオグリコレート誘導性腹膜マクロファージ中で発現されることを示唆している（高レベルのアルギナーゼを発現し、ｉＮＯＳを発現せず、高レベルのＣＤ２０６を発現することを特徴とする）。
【０６８４】
ＬＲＲＣ３３が主にＭ２細胞上で発現され、そのＴＧＦβ１の提示（「コンテキスト」）がこれらの細胞の創傷治癒促進効果に重要である状況下では、ＬＲＲＣ３３媒介性ＴＧＦβ１を活性化して修復および／または筋形成を促進すること有益であり得る。他方では、ＬＲＲＣ３３炎症誘発性Ｍ１細胞上でも発現される状況下では、特にＤＭＤなどのジストロフィー設定において炎症が線維症を駆動することを考慮すると、ＬＲＲＣ３３媒介性ＴＧＦβ１を阻害することが有益であり得る。したがって、疾患関連ＴＧＦβ１の供給源／コンテキストを同定することは、ＴＧＦβシグナル伝達の正しいモジュレーターを選択することにおいて重要なステップである可能性があり、これはどのレベルの選択性を考慮すべきかの情報を与える（たとえば、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性ＴＧＦβ１モジュレーターもしくはコンテキスト特異的ＴＧＦβ１モジュレーター、ＴＧＦβ１阻害剤、または活性化剤など）。
【０６８５】
慢性炎症とは別に、ＤＭＤの顕著な特徴は過剰かつ進行性の線維症である。進行疾患では、線維症は、個々の筋線維をその血液供給を実際に隔離することができるほど重篤である。これは筋肉の収縮特性も変更させる。ヒト患者において、ＴＧＦβ１アップレギュレーションの程度と線維症との間に強い相関が存在し、線維症の程度と負の可動性の成果との間に強い連関が存在する。したがって、一部の実施形態では、ＬＴＢＰ−前駆ＴＧＦβ１阻害剤を、ジストロフィー患者に、線維症の防止および／または低下のために、疾患においてＥＣＭ関連ＴＧＦβ１効果を選択的に標的化するために投与し得る。一部の実施形態では、本明細書中に記載の様々なアイソフォームおよび／またはコンテキスト選択剤を用いて、線維症を防止して筋形成を促進するが免疫系に対する望まない効果（たとえばＧＡＲＰまたはＬＲＲＣ３３を通じる）を有さないための、ＴＧＦβ１シグナル伝達の阻害を達成することができる。
【０６８６】
ＭＨＣのダウンレギュレーションまたは突然変異に関与する状態
ＴＧＦβ関連の適応症は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩが欠失または欠乏（たとえばダウンレギュレーション）されている状態も含み得る。そのような状態としては、ＭＨＣ媒介性シグナル伝達のうちの１つまたは複数の構成要素が損なわれている遺伝子障害、ならびにＭＨＣ発現が癌、感染症、線維症、および医薬品などの他の因子によって変更されている状態が挙げられる。
【０６８７】
たとえば、腫瘍におけるＭＨＣ  Ｉのダウンレギュレーションは、免疫監視からの腫瘍回避に関連する。実際、腫瘍ＭＨＣクラスＩ発現の損失を含めたＴ細胞認識を回避することを目的とする免疫回避戦略が、悪性細胞において一般的に見つかる。腫瘍免疫回避は、免疫チェックポイント分子を遮断する抗体を用いた処置を含めた癌免疫療法の臨床成績に対して負の効果を有することが観察されている（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＧａｒｒｉｄｏら、（２０１７年）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、３９：４４〜５１頁、「Ｔｈｅ  ｕｒｇｅｎｔ  ｎｅｅｄ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」に総説）。したがって、本開示によって包含されるアイソフォーム選択的なコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を、単独療法として、または別の治療（チェックポイント阻害剤、化学療法、放射線療法など）と併せてのどちらかで投与して、抗癌免疫を解放もしくはブーストするおよび／または別の治療に対する応答性もしくはその有効性を増強させ得る。
【０６８８】
一部の実施形態では、ＭＨＣダウンレギュレーションは、ＣＢＴなどの癌治療に対する獲得耐性に関連する。ＴＧＦβ１の高親和性アイソフォーム選択的阻害剤を、ＣＢＴなどの癌治療の一次応答者である患者を処置して、獲得耐性を発生する確率を低下させるために使用し得ることが企図される。したがって、癌治療の一次応答者であるＴＧＦβ１阻害剤で処置した者の中で、癌治療に対する二次または獲得耐性の経時的な発生（ｏｃｃｕｒａｎｃｅ）を低下させ得る。
【０６８９】
ＭＨＣクラスＩタンパク質のダウンレギュレーションは、ＨＩＶなどのウイルス感染症を含めた特定の感染性疾患とも関連する。たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＣｏｈｅｎら、（１９９９年）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１０（６）：６６１〜６７１頁、「Ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＨＩＶ−１  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ」を参照されたい。したがって、本開示によって包含されるアイソフォーム選択的なコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤を、単独療法として、または別の治療（抗ウイルス療法、プロテアーゼ阻害剤療法など）と併せてのどちらかで投与して、宿主免疫を解放もしくはブーストするおよび／または別の治療に対する応答性もしくはその有効性を増強させ得る。
【０６９０】
幹細胞自己複製、組織再生、および幹細胞再増殖に関与する状態
証拠は、ＴＧＦβ１が様々な幹細胞集団の恒常性および組織内でのその分化／再増殖の調節において役割を果たすことを示唆している。恒常性維持の間、組織に特異的な幹細胞は主に休止状態に保たれるが、特定のストレスの際に細胞周期に入ることが始動される。ＴＧＦβ１は、幹細胞の分化および再構成を厳しく調節するプロセスにおける「休み」と機能し、細胞周期への進入を始動するストレスが「休み」を取り除くＴＧＦβ１阻害と合致すると考えられている。したがって、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤を、特定の組織内の幹細胞／前駆細胞の細胞周期およびＧ０進入決定を歪めるまたは正すために使用し得ることが企図される。
【０６９１】
したがって、本開示の発明者らは、ｉ）幹細胞／前駆細胞の分化／再構成が、疾患が元で停止もしくは攪乱している、または治療／医薬品の副作用として誘導されている、ｉｉ）患者が、健康な細胞が死滅または枯渇することを引き起こす治療または医薬品を受けている、ｉｉｉ）患者が幹細胞／前駆細胞の分化／再構成の増加から利益を受け得る、ｉｖ）疾患が異常な幹細胞の分化または再構成に関連している状態における、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤の使用を企図する。
【０６９２】
骨髄（血液細胞生成）および表皮などの自己再生組織では、幹細胞集団が生涯の間維持されることを確実にするために、増殖と分化との間のプロセスのバランスが厳しく調節されている。Ｄ’Ａｒｃａｎｇｅｌら、（２０１７年）、Ｉｎｔ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．、１８（７）：１５９１によって総説されている。ＴＧＦβ１は、部分的にはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ｐ１５／ＩＮＫ４ｂ、ｐ２１、およびｐ５７の誘導を通じて、細胞周期および腫瘍抑制因子の強力な負の調節因子として作用する。証拠は、ＴＧＦβ１がｐ１６／ＩＮＫ４ａおよびｐ１９／ＡＲＦの誘導に寄与して、特定の細胞種において成長停止および老化を媒介することを示唆している。したがって、一部の実施形態では、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１の活性化の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤を使用して、様々な幹細胞集団においてｐ１６／ＩＮＫ４ａ依存性の細胞老化および幹細胞動態を調節する。
【０６９３】
たとえば、間葉間質／幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪組織、および臍帯血などのほとんどの成人結合組織中に存在する間質細胞の小集団である。ＭＳＣはｉｎ  ｖｉｖｏで比較的休止の状態に維持されるが、様々な生理的および病理学的刺激に応答して、増殖し、その後、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または平滑筋細胞（ＳＭＣ）および心筋細胞などの他の中胚葉型系列へと分化することが可能である。複数のシグナル伝達ネットワークが、ＭＳＣが機能的間葉系列へと分化することを編成し、その中で、ＴＧＦ−β１が主要な役者として出現している（たとえばＺｈａｏおよびＨａｎｔａｓｈ（２０１１年、Ｖｉｔａｍ  Ｈｏｒｍ、８７：１２７〜４１頁によって総説）。
【０６９４】
同様に、造血幹細胞は生涯にわたる血液細胞の生成に必要である。消耗を防ぐために、造血幹細胞の大多数は定常状態の造血中に休止状態のまま保たれる。しかし、血液学的ストレス中、増加した造血要求を満たすために、これらの細胞は細胞周期へと迅速に動員され、大規模な自己複製および分化を受ける。ＴＧＦβ１は、休止状態−再増殖の移行／バランスを制御するための「スイッチ」として作用し得る。
【０６９５】
したがって、ＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤は、造血幹細胞の欠損および骨髄不全に関与する状態の処置において使用することができる。一部の実施形態では、造血幹細胞リザーバーの枯渇または機能障害は造血不全または血液悪性腫瘍をもたらす。一部の実施形態では、そのような状態は、進行性骨髄不全によって特徴づけられたＤＮＡ修復障害である。一部の実施形態では、そのような状態は幹細胞および前駆細胞の摩耗によって引き起こされる。一部の実施形態では、そのような状態は貧血に関連する。一部の実施形態では、そのような状態はファンコーニ貧血（ＦＡ）である。一部の実施形態では、そのような状態は、ＤＮＡ損傷の際に特定の細胞種の生存を抑制する過剰活性のＴＧＦβ経路によって特徴づけられている。したがって、ＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤を、ＦＡ造血幹細胞の増殖の欠損および／またはＦＡを有する対象における骨髄不全を救出するために使用できることが企図される。たとえばｚｈａｎｇら、（２０１６年）、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、１８：６６８〜６８１頁、「ＴＧＦ−β  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  Ｆａｎｃｏｎｉ  Ａｎｅｍｉａ」を参照されたい。
【０６９６】
処置（ｔｒｅａｔｅｍｅｎｔ）誘導性造血調節不全に関与する状態
様々な病状を処置するために設計されている特定の薬物が、しばしば処置している患者において貧血を誘導するまたは悪化させることが認識されている（たとえば、化学療法誘導性貧血および放射線療法誘導性貧血などの処置または薬物誘発性の貧血）。一部の実施形態では、患者を、貧血を含む副作用を引き起こし得る骨髄抑制薬で処置する。そのような患者は、造血をブーストするために薬理学的ＴＧＦβ１阻害から利益を受け得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβ１阻害剤は、休止状態に入ることを妨げることによって、患者において造血を促進し得る。一部の実施形態では、患者はＧ−ＣＳＦ治療（たとえばフィルグラスチム）を受け得る。
【０６９７】
したがって、本発明は、骨髄抑制療法（たとえば骨髄抑制効果を含む副作用を有する治療）を受ける患者に投与する、本明細書中に開示されているものなどのＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤の使用を含む。骨髄抑制療法の例としては、それだけには限定されないが、ペグインターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−ｎ３、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ、アルデスロイキン、ゲムツズマブオゾガマイシン、インターフェロンアルファコン−１、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、Ｌ−フェニルアラニン、ボルテゾミブ、クラドリビン、カルムスチン、アムサクリン、クロラムブシル、ラルチトレキセド、マイトマイシン、ベキサロテン、ビンデシン、フロキシウリジン、チオグアニン、ビノレルビン、デクスラゾキサン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ゲムシタビン、テニポシド、エピルビシン、クロラムフェニコール、レナミドマイド、アルトレタミン、ジドブジン、シスプラチン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、フルオロウラシル、プロピルチオウラシル、ペントスタチン、メトトレキサート、カルバマゼピン、ビンブラスチン、リネゾリド、イマチニブ、クロファラビン、ペメトレキセド、ダウノルビシン、イリノテカン、メチマゾール、エトポシド、ダカルバジン、テモゾマイド、タクロリムス、シロリムス、メクロレタミン、アザシチジン、カルボプラチン、ダクチノマイシン、シタラビン、ドキソルビシン、ヒドロキシ尿素、ブスルファン、トポテカン、メルカプトプリン、サリドマイド、メルファラン、フルダラビン、フルシトシン、カペシタビン、プロカルバジン、三酸化ヒ素、イダルビシン、イホスファミド、ミトキサントロン、ロムスチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ダサチニブ、デシタビン、ネララビン、エベロリムス、ボリノスタット、チオテパ、イクサベピロン、ニロチニブ、ベリノスタット、トラベクテジン、トラスツズマブエムタンシン、テムシロリムス、ボスチニブ、ベンダムスチン、カバジタキセル、エリブリン、ルキソリチニブ、カルフィルゾミブ、トファシチニブ、ポナチニブ、ポマリドミド、オビヌツズマブ、リン酸テジゾリド、ブリナツモマブ、イブルチニブ、パルボシクリブ、オラパリブ、ジヌツキシマブ、およびコルヒチンが挙げられる。
【０６９８】
追加のＴＧＦβ関連の適応症としては、そのそれぞれの内容が本明細書中にその全体で参考として組み込まれている米国特許公開第２０１３／０１２２００７号、米国特許第８，４１５，４５９号、または国際公開ＷＯ２０１１／１５１４３２号に開示されているもののうちの任意のものを挙げ得る。
【０６９９】
好ましい実施形態では、本開示の抗体、その抗原結合部分、および組成物は、ＴＧＦβ１シグナル伝達に関連する幅広い種類の疾患、障害、および／または状態を処置するために使用し得る。一部の実施形態では、標的組織／細胞は他のアイソフォームよりも優先的にＴＧＦβ１アイソフォームを発現する。したがって、本発明は、ＴＧＦβ１発現に関連するそのような状態（たとえばＴＧＦβ１シグナル伝達の調節不全および／またはＴＧＦβ１発現のアップレギュレーション）を、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物を使用して処置する方法を含む。
【０７００】
一部の実施形態では、疾患は、複数の細胞源に関連する（たとえばそれ上に提示されるまたはそれから蓄積される）ＴＧＦβ１を含む。一部の実施形態では、そのような疾患は、ＴＧＦβ１機能の免疫構成要素およびＥＣＭ構成要素をどちらも含む。一部の実施形態では、そのような疾患は、ｉ）ＥＣＭの調節不全（たとえば、コラーゲンおよびプロテアーゼなどのＥＣＭ構成要素の過剰生成／蓄積、ＥＣＭ基質の変更された硬直、筋線維芽細胞、線維細胞、およびＣＡＦなどの線維芽細胞の異常もしくは病理学的な活性化もしくは分化）、ｉｉ）Ｔｒｅｇの増加および／もしくはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の抑制が原因の免疫抑制、たとえば、Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆの比の上昇、ＣＤ４および／もしくはＣＤ８  Ｔ細胞の抑制を引き起こす白血球浸潤（たとえばマクロファージおよびＭＤＳＣ）の増加、ならびに／または、ｉｉｉ）マクロファージ（たとえば、骨髄由来単球性／マクロファージおよび組織常在マクロファージ）、単球、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、好中球、樹状細胞、およびＮＫ細胞などの骨髄細胞の異常もしくは病理学的な活性化、分化、および／もしくは動員を含む。
【０７０１】
一部の実施形態では、状態は、複数種の提示分子（たとえば、ＧＡＲＰ、ＬＲＲＣ３３、ＬＴＢＰ１および／またはＬＴＢＰ３のうちの２つ以上）によって提示されるＴＧＦβ１を含む。一部の実施形態では、複数の細胞源からのＴＧＦβ１を含む患部組織／臓器／細胞である。一例のみを挙げると、固形腫瘍（骨髄に関与する増殖性疾患、たとえば骨髄線維症および多発性骨髄腫も含み得る）は、様々な種類の提示分子に関与する、癌細胞、間質細胞、周囲の健康な細胞、および／または浸潤性免疫細胞（たとえばＣＤ４５＋白血球）などの複数の供給源からのＴＧＦβ１を含み得る。関連する免疫細胞としては、それだけには限定されないが、骨髄細胞ならびにリンパ球細胞、たとえば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球（たとえば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞）、単球が挙げられる。ＴＧＦβ１のコンテキスト非依存性阻害剤はそのような状態の処置に有用であり得る。
【０７０２】
本明細書中に記載の抗体またはその断片などのＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤で処置し得る状態または障害の非限定的な例を以下に提供する。
【０７０３】
治療レジメン、投与
本明細書中に開示されている方法を実施するために、有効量の上述の医薬組成物を、静脈内投与などの適切な経路を介した処置を必要としている対象（たとえばヒト）に、たとえばボーラスとしてまたは一定期間にわたる持続注射によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、くも膜下腔内、経口、吸入、または局所的経路によって、投与することができる。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含めた液体配合物用の市販の噴霧器が投与に有用である。液体配合物は直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末は再構成後に噴霧することができる。あるいは、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を、炭化フッ素配合物および定量吸入器を使用してエアロゾル化するか、または凍結乾燥した粉砕粉末として吸入することができる。
【０７０４】
本明細書中に記載の方法によって処置する対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトであることができる。哺乳動物としては、それだけには限定されないが、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットが挙げられる。処置を必要とするヒト対象は、上述のものなどのＴＧＦβ関連の適応症を有する、その危険性にある、または有することが疑われるヒト患者であり得る。ＴＧＦβ関連の適応症を有する対象は、ルーチン的な医学的検査、たとえば、臨床検査、臓器機能試験、ＣＴスキャン、または超音波によって同定することができる。そのような適応症のうちの任意のものを有すると疑われる対象は、適応症の１つまたは複数の症状を示し得る。適応症の危険性にある対象は、その適応症の危険因子のうちおの１つまたは複数を有する対象であることができる。
【０７０５】
本明細書中で使用する用語「有効量」および「有効用量」とは、その意図する目的、すなわち、組織または対象における許容される損益比の所望の生物学的または医学的応答を満たすために十分である、化合物または組成物の任意の量または用量をいう。たとえば、本発明の特定の実施形態では、意図する目的は、ＴＧＦβ−１活性化をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害すること、ＴＧＦβ−１阻害に関連する臨床的に有意義な成果を達成することであり得る。当業者によって理解されるように、有効量は、処置する特定の状態、状態の重篤度、年齢、体調、大きさ、性別、および体重を含めた個々の患者パラメータ、処置の持続期間、同時治療（ある場合）の性質、具体的な投与経路、ならびに健康従事者の知識および専門知識内にある同様の要因に応じて変動する。これらの要因は当業者に周知であり、日常的な実験以上のことを用いずに対処することができる。一般に、個々の構成要素またはその組合せの最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従った最高の安全用量を使用することが好ましい。しかし、患者が、医学的理由、心理学的理由、または事実上任意の他の理由のためにより低い用量または耐用用量を強く主張し得ることが、当業者には理解されよう。
【０７０６】
半減期などの経験的考慮が、投薬量の決定に一般に寄与する。たとえば、抗体の半減期を延長させるため、および抗体が宿主の免疫系によって攻撃されることを妨げるために、ヒト化抗体または完全ヒト抗体などのヒト免疫系と適合性のある抗体を使用し得る。投与の頻度は治療の過程にわたって決定および調節してよく、一般に、必ずしもではないが、ＴＧＦβ関連の適応症の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。あるいは、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体の持続的な連続放出配合物が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な配合物および装置は当業者に明らかであろうし、本開示の範囲内にある。
【０７０７】
一例では、本明細書中に記載の抗体の投薬量は、抗体の１回または複数回の投与を与えた個体において経験的に決定し得る。個体に漸増する投薬量の拮抗剤を与える。有効性を評価するために、ＴＧＦβ関連の適応症の指標に従うことができる。たとえば、筋原線維損傷、筋原線維修復、筋肉における炎症レベル、および／または筋肉における線維症レベルを測定する方法が当業者に周知である。
【０７０８】
本発明は、ＴＧＦβの活性化ステップをアイソフォームに特異的な様式で変調することができる薬剤が、医薬品として使用した場合に改善された安全性プロフィールを提供し得るという認識を包含する。したがって、本発明は、ＴＧＦβ１と特異的に結合してその活性化を阻害するが、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３はそうではなく、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＧＦβ１シグナル伝達の特異的阻害を与える一方でＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３シグナル伝達に影響を与えることからの望まない副作用を最小限にする、抗体およびその抗原結合断片を含む。
【０７０９】
一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、対象に投与した場合に毒性でない。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、対象に投与した場合に、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の両方と特異的に結合する抗体と比較して低下した毒性を示す。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、対象に投与した場合に、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の両方と特異的に結合する抗体と比較して低下した毒性を示す。一部の実施形態では、本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分は、対象に投与した場合に、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３と特異的に結合する抗体と比較して低下した毒性を示す。
【０７１０】
一般に、本明細書中に記載の抗体のうちの任意のものを投与するために、初期候補投薬量は、１回の投与あたり約１〜２０ｍｇ／ｋｇを、たとえば、週に１回、２週間毎、３週間毎、月に１回などであることができる。たとえば、患者は１週間あたり、２週間あたり、３週間あたり、または４週間あたり約１〜１０ｍｇ／ｋｇの注射などを、疾患（たとえば癌）を処置するために有効な、十分に耐用される（許容される毒性または有害事象内の）量で受け得る。
【０７１１】
本開示の目的のために、典型的な投薬量（注射および輸液などの１回の投与あたり）は、上述の要因に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。数日間またはそれより長くにわたる反復投与では、状態に応じて、症状の所望の抑制が起こるまで、またはＴＧＦβ関連の適応症もしくはその症状を緩和させるための十分な治療レベルが達成されるまで、処置を持続させる。たとえば、Ａｂ６の適切な有効投薬量は、週に２回、週に１回、２週間毎、４週間毎、または月に１回投薬する、１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ（たとえば、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜１５ｍｇ／ｋｇ、３〜２０ｍｇ／ｋｇ、５〜３０ｍｇ／ｋｇなど）であり得る。Ａｂ６の適切な有効用量としては、たとえば週に１回投薬する、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。
【０７１２】
例示的な投薬レジメンは、初期用量、続いて１つまたは複数の維持量を投与することを含む。たとえば、初期用量は、たとえば週に１回または週に２回の約１〜３０ｍｇ／ｋｇであり得る。それ以降、たとえば週に１回、隔週、月に１回などの、たとえば約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの維持量が続き得る。しかし、従事者が達成することを望む薬物動態学的減衰のパターンに応じて、他の投薬レジメンが有用であり得る。薬物動態学的実験により、本明細書中に開示されている抗体（たとえばＡｂ３）の血清濃度が、前臨床動物モデル（たとえばマウスモデル）に投与した後少なくとも７日間安定に保たれることが示されている。任意の特定の理論に束縛されることを望まずに、抗体を投与した対象（たとえばヒト対象）において臨床的に有効な血清濃度を維持しつつ、抗体をより低頻度で投与し得るため、この投与後の安定性は有利であり得る。一部の実施形態では、投薬頻度は、１週間毎、２週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、もしくは１０週間毎に１回、または１カ月毎、２カ月間毎、もしくは３カ月間毎に１回、またはより長くである。この治療の進行は慣用の技術およびアッセイによって容易にモニタリングされる。投薬レジメン（使用する抗体を含む）は経時的に変動する場合がある。
【０７１３】
一部の実施形態では、正常な体重の成人患者では、約０．３〜５．００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与し得る。特定の投薬レジメン、たとえば、用量、タイミング、および反復は、特定の個体およびその個体の病歴、ならびに個々の薬剤の特性（薬剤の半減期、および他の関連考慮事項など）に依存する。
【０７１４】
本開示によるＴＧＦβ１関連の適応症を処置するために治療上有効な高親和性のアイソフォーム選択的抗体の血清濃度は、少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、たとえば約１０μｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、血清濃度によって測定した抗体の有効量は約２０〜４００μｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、血清濃度によって測定した抗体の有効量は約１００〜８００μｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、血清濃度によって測定した抗体の有効量は、少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、たとえば、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ、または２００μｇ／ｍＬである。本明細書中の実施例１２に詳述するように、非ヒト霊長類では、約２，０００〜３，０００μｇ／ｍＬの血清濃度レベルを少なくとも８週間維持した後にＡｂ６に関連する毒性は観察されなかった（たとえば、心毒性、過形成および炎症、歯および歯肉の所見なし）。したがって、約１０〜１００倍の治療ウィンドウが達成され得る。
【０７１５】
本開示の目的のために、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体の適切な投薬量は、用いる具体的な抗体（またはその組成物）、適応症の種類および重篤度、抗体を予防目的または治療目的で投与しているかどうか、以前の治療、患者の病歴および拮抗剤に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存する。一部の実施形態では、臨床家は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体を、所望の結果を達成する投薬量に達するまで投与する。ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体の投与は、たとえば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、および熟練した従事者に知られている他の要因に応じて、連続的または断続的であることができる。ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体の投与は、たとえば、ＴＧＦβ関連の適応症を発症する前、その間、またはその後のいずれかに、事前に選択された期間にわたって本質的に連続的であり得るか、または一連の間隔をあけた用量であり得る。
【０７１６】
本明細書中で使用する用語「処置すること」とは、１つまたは複数の活性薬剤を含む組成物を、ＴＧＦβ関連の適応症、適応症の症状、または適応症に対する素因を有する対象に、適応症、適応症の症状、または適応症に対する素因を治癒する、治す、緩和させる、軽減させる、変更する、救済する、寛解させる、改善させる、またはそれに影響を与える目的で施用または投与することをいう。
【０７１７】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体を用いたＴＧＦβ関連の適応症の緩和は、適応症の発生もしくは進行を遅延させること、または適応症の重篤度を低下させることを含む。適応症を緩和させることは、必ずしも治癒的結果を必要としない。それ中で使用する、ＴＧＦβ関連の適応症に関連する適応症の発生を「遅延させる」とは、適応症の進行を塩基させる、妨害する、遅くする、遅延させる、安定化、および／または延ばすことを意味する。この遅延は、適応症の病歴および／または処置する個体に応じて様々な長さの時間であることができる。適応症の発生を「遅延させる」もしくは緩和させる、または適応症の発症を遅延させる方法は、方法を使用しない場合と比較して、所定のタイムフレーム内で適応症の１つもしくは複数の症状を発生する確率を低下させる方法、および／または所定のタイムフレーム内で症状の程度の程度を低下させる方法、である。そのような比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるために十分な数人の対象を使用した臨床的研究に基づく。
【０７１８】
ＤＢＡ２／ＪマウスはＬＴＢＰ４対立遺伝子中に４０ｂｐの欠失を有する。潜在型ＴＧＦｂ１が関連するＥＣＭの調節不全は、Ａｂ１が結合するエピトープを曝露させ得る。Ａｂ１が結合するエピトープが曝露される疾患が存在する場合があり、ＴＧＦｂ１阻害が示されている場合は、これらの疾患はＡｂ１の治療機会であり得る。
【０７１９】
組合せ療法
本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦβ阻害から利益を受け得る対象を処置するための組合せ療法として使用する医薬組成物および関連方法をさらに包含する。これらの実施形態のうちの任意のものにおいて、そのような対象は、少なくとも１つのＴＧＦβ阻害剤、たとえば本明細書中に記載の抗体またはその抗原結合部分を含む第１の組成物を、同じまたは重複する疾患または臨床状態を処置することを意図する少なくとも１つの追加の治療剤を含む第２の組成物と併せて含む、組合せ療法を受け得る。第１および第２の組成物はどちらも同じ細胞標的または別々の細胞標的に作用し得る。一部の実施形態では、第１および第２の組成物は、疾患または臨床状態同じまたは重複する症状または側面の組を処置するまたは緩和させ得る。一部の実施形態では、第１および第２の組成物は、疾患または臨床状態の別々の症状または側面の組を処置するまたは緩和させ得る。一例のみを挙げると、第１の組成物はＴＧＦβシグナル伝達に関連する疾患または状態を処置し得る一方で、第２の組成物は同じ疾患に関連する炎症または線維症を処置し得る、などである。そのような組合せ療法は互いに併せて投与し得る。組合せ療法のコンテキストにおいて、語句「と併せて」とは、組合せ療法を受けている対象において、第１の治療の治療効果が第２の治療の治療効果と時間的および／または空間的に重複することを意味する。したがって、組合せ療法は、同時投与のための単一配合物として、または治療を連続的に投与するための別々の配合物として配合し得る。
【０７２０】
好ましい実施形態では、組合せ療法は疾患の処置において相乗効果を生じる。用語「相乗的」とは、それぞれの単独療法の総計の相加効果よりも高い効果（たとえばより高い有効性）をいう。
【０７２１】
一部の実施形態では、本明細書中に記載の医薬組成物を含む組合せ療法は、別の治療（第２の薬剤の単独療法など）によって生じられるものと全体的に等価であるが、第２の薬剤の単独療法と比較して、第２の薬剤に関連してより少ない望まない有害作用または重篤度がより低い毒性に関連する、有効性を生じる。一部の実施形態では、そのような組合せ療法は、より低い投薬量の第２の薬剤を許可するが、全体的な有効性を維持する。そのような組合せ療法は、長期的処置が保証されているおよび／または小児患者に関与する患者集団に特に適切えあり得る。
【０７２２】
したがって、本発明は、本明細書中に記載のように、ＴＧＦβ１タンパク質活性化を低下させるおよびＴＧＦβ１シグナル伝達に関連する疾患または状態を処置または防止するのための組合せ療法において使用する、医薬組成物および方法を提供する。したがって、この方法または医薬組成物は第２の治療をさらに含む。一部の実施形態では、第２の治療は、ＴＧＦβ１シグナル伝達に関連する疾患または状態を処置または防止することにおいて有用であり得る。第２の治療は、標的疾患に関連する少なくとも１つの症状を減弱させ得るまたは処置し得る。第１および第２の治療は、類似もしくは無関連の作用機構によってその生物学的効果を発揮し得る、または、第１および第２の治療の一方もしくは両方のどちらかが、非常に多数の作用機構によってその生物学的効果発揮し得る。
【０７２３】
それぞれの記載した実施形態について、本明細書中に記載の医薬組成物は第１および第２の治療を同じ薬学的に許容される担体中または異なる薬学的に許容される担体中に有し得ることを理解されたい。第１および第２の治療を記載した実施形態内で同時にまたは連続的に投与し得ることをさらに理解されたい。
【０７２４】
本発明の１つまたは複数の抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合部分は、追加の治療剤のうちの１つまたは複数と併用し得る。本発明の抗ＴＧＦβ抗体と共に使用することができる追加の治療剤の例としては、それだけには限定されないが、癌ワクチン、操作した免疫細胞による治療、化学療法、放射線療法、ミオスタチン阻害剤およびＧＤＦ１１阻害剤などのＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーのモジュレーター、ＶＥＧＦ作用剤、ＩＧＦ１作用剤、ＦＸＲ作用剤、ＣＣＲ２阻害剤、ＣＣＲ５阻害剤、二重ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害剤、ＣＣＲ４阻害剤、リジルオキシダーゼ様−２阻害剤、ＡＳＫ１阻害剤、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、ピルフェニドン、ニンテダニブ、Ｍ−ＣＳＦ阻害剤（たとえばＭ−ＣＳＦ受容体拮抗剤およびＭ−ＣＳＦ中和剤）、ＭＡＰＫ阻害剤（たとえばＥｒｋ阻害剤）、免疫チェックポイント作用剤または拮抗剤、ＩＬ−１１拮抗剤、ならびにＩＬ−６拮抗剤などが挙げられる。ＴＧＦβ阻害剤と共に使用することができる追加の治療剤の他の例としては、それだけには限定されないが、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、アルギナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ阻害剤、二重特異的キナーゼ阻害剤が挙げられる。一部の実施形態では、そのような薬剤はＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、またはＪＡＫ阻害剤であり得る。
【０７２５】
一部の実施形態では、追加の薬剤はチェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、追加の薬剤は、ＰＤ−１拮抗剤、ＰＤＬ１拮抗剤、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤＬ２融合タンパク質、ＣＴＬＡ４拮抗剤、ＧＩＴＲ作用剤、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＩＣＯＳＬ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＯＸ４０抗体（ＯＸ４０作用剤）、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗４１ＢＢ抗体、抗ＰＤ−１抗体、腫瘍退縮ウイルス、およびＰＡＲＰ阻害剤からなる群から選択される。一部の実施形態では、本明細書中に開示されているＴＧＦβ１の活性化の高親和性のコンテキスト非依存性阻害剤は、本明細書中に列挙したものなどのチェックポイント阻害療法の乏しい応答者または非応答者である対象における癌の処置において使用する。
【０７２６】
一部の実施形態では、追加の薬剤は、阻害性同時刺激分子および活性化同時刺激分子などのＴ細胞同時刺激分子と結合する。一部の実施形態では、追加の薬剤は、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、および抗ＣＤ７４抗体からなる群から選択される。
【０７２７】
一部の実施形態では、追加の治療は放射線照射である。一部の実施形態では、追加の薬剤は化学療法剤である。一部の実施形態では、化学療法剤はタクソールである。一部の実施形態では、追加の薬剤は抗炎症剤である。一部の実施形態では、追加の薬剤は、単球／マクロファージの動員および／または組織浸潤のプロセスを阻害する。一部の実施形態では、追加の薬剤は肝星細胞活性化の阻害剤である。一部の実施形態では、追加の薬剤はケモカイン受容体拮抗剤、たとえばＣＣＲ２拮抗剤およびＣＣＲ５拮抗剤である。一部の実施形態では、そのようなケモカイン受容体拮抗剤はＣＣＲ２／ＣＣＲ５拮抗剤などの二重特異的拮抗剤である。一部の実施形態では、組合せ療法として投与する追加の薬剤は、ＴＧＦβ成長因子スーパーファミリーのメンバーまたはその調節因子であるまたはそれを含む。一部の実施形態では、そのような薬剤は、ＧＤＦ８／ミオスタチンおよびＧＤＦ１１のモジュレーター（たとえば阻害剤および活性化剤）から選択される。一部の実施形態では、そのような薬剤は、ＧＤＦ８／ミオスタチンシグナル伝達の阻害剤である。一部の実施形態では、そのような薬剤は、前駆／潜在型ミオスタチン複合体と特異的に結合してミオスタチンの活性化を遮断するモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、前駆／潜在型ミオスタチン複合体と特異的に結合してミオスタチンの活性化を遮断するモノクローナル抗体は、遊離した成熟ミオスタチンとは結合しない。
【０７２８】
一部の実施形態では、追加の治療はＣＡＲ−Ｔ治療などの細胞治療を含む。
【０７２９】
一部の実施形態では、追加の治療は癌ワクチンである。ペプチドに基づく癌ワクチンを試験した数々の臨床治験は、血液学的悪性腫瘍（血液の癌）、黒色腫（皮膚癌）、乳癌、頭頸部癌、胃食道癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、および結腸直腸癌を標的としていた。抗原は、ＨＥＲ２、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、サバイビン（ＢＩＲＣ５）、およびウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）からのペプチドを含んでいた。いくつかの治験では、１２〜１５個の明白に異なるペプチドの「個人化された」混合物も使用した。すなわち、これらは、患者の腫瘍からのペプチドであって、患者がそれに対して免疫応答を示すペプチドの混合物を含有する。一部の治験は、固形腫瘍、神経膠腫、膠芽細胞腫、黒色腫、ならびに乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、結腸直腸癌、および非小細胞肺癌を標的としており、ＭＵＣ１、ＩＤＯ１（インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ）、ＣＴＡＧ１Ｂ、ならびに２つのＶＥＧＦ受容体、ＦＬＴ１およびＫＤＲからの抗原を含む。注目すべきは、ＩＤＯ１ワクチンは、黒色腫を有する患者において、免疫チェックポイント阻害剤イピリムマブおよびＢＲＡＦ（遺伝子）阻害剤ベムラフェニブと組み合わせて試験する。
【０７３０】
癌ワクチンとして有用な腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＥＲ２、ＨＰＶ１６  Ｅ７（パピローマウイルス科＃Ｅ７）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＷＴ１、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、サバイビング（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、ＭＵＣ１、およびＭＵＣ２が挙げられる。
【０７３１】
しかし、そのような癌ワクチンによってプライミングされた活性化免疫細胞は、部分的にはＴＧＦβ１依存性機構を通じて、ＴＭＥから排除し得る。免疫抑制を克服するために、ワクチンの潜在性を解放するために本開示の高親和性のコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤の使用を考慮し得る。
【０７３２】
本目最初中で企図する組合せ療法では、投与した治療剤のより低い投薬量を有利に利用する場合があり、したがって、様々な単独療法に関連する、可能性のある毒性または合併症を回避する。一部の実施形態では、本明細書中に記載のＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤の使用は、治療（たとえば標準治療）に対して応答性が乏しいまたは非応答性である者をより応答性にし得る。一部の実施形態では、本明細書中に記載のＴＧＦβ１のアイソフォーム特異的阻害剤の使用は、治療（たとえば標準治療）の投薬量の低下を許可し得てよく、これは、患者において等価な臨床的有効性を依然として生じるが、薬物関連の毒性または有害事象の数または度合がより少ない。
【０７３３】
一部の実施形態では、本明細書中において企図するＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤は、ＴＧＦβ３のアイソフォーム選択的阻害剤と併せて（たとえば、組合せ療法、付加型治療など）使用し得る。そのような使用は、癌治療、たとえば、免疫チェックポイント阻害剤、癌ワクチン、放射線療法、および／または化学療法などの追加の治療をさらに含み得る。
【０７３４】
一部の実施形態では、本明細書中において企図するＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤は、ミオスタチンの選択的阻害剤（ＧＤＦ８）と併せて（たとえば、組合せ療法、付加型治療など）使用し得る。
【０７３５】
診断学、患者の選択、モニタリング
ＴＧＦβ１阻害療法を含む（ｉｎｌｃｕｄｅ）治療方法は、ＴＧＦβ１適応症の診断および／またはそのような治療に応答する可能性の高い患者の選択を含み得る。さらに、ＴＧＦβ１阻害剤を受ける患者を、処置の治療効果についてモニタリングしてよく、これは、典型的には、状態の指標である１つまたは複数の適切なパラメータを測定することを含み、処置の前後に測定（たとえばアッセイ）してパラメータにおける処置関連の変化を評価することができる。たとえば、そのようなパラメータとしては、患者から収集した生体試料中に存在するバイオマーカーのレベルを挙げ得る。バイオマーカーは、ＲＮＡに基づくもの、タンパク質に基づくもの、細胞に基づくもの、および／または組織に基づくものであり得る。たとえば、特定の病状において過剰発現されている遺伝子は、疾患または治療に対する応答を診断および／またはモニタリングするためのバイオマーカーとして役割を果たし得る。疾患関連細胞集団の細胞表面タンパク質がバイオマーカーとして役割を果たし得る。そのような方法としては、腫瘍サイズ／体積などの、特定の疾患の程度の指標である疾患パラメータの直接測定を挙げ得る。血清／血液試料、生検、およびイメージングなどの任意の適切なサンプリング方法を用い得る。生検としては組織生検（腫瘍など）および液体生検を挙げ得る。
【０７３６】
伝統的には生検が線維症（たとえば臓器線維症）および増殖性障害（たとえば癌）などの様々な疾患を診断およびモニタリングするための標準であった一方で、より侵襲性の低い代替方法が好ましい場合がある。たとえば、多くの非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を使用して、処置するための患者を診断、モニタリング、および選択し得る。したがって、本発明は、患者または対象において疾患を診断および／またはモニタリングするための、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法の使用を含む。一部の実施形態では、患者または対象は、本明細書中に記載のアイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤を受けている。他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を使用して、アイソフォーム特異的ＴＧＦβ１阻害剤を用いて処置するための患者を選択し得る。一部の実施形態では、そのような技法を使用して、患者が治療、たとえばＴＧＦβ１阻害療法に応答するかどうか、またはどのように応答するかを決定し得る。
【０７３７】
この方法のために使用する例示的なｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法としては、それだけには限定されないが、Ｘ線撮影、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、医学的超音波検査（ｕｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ）または超音波（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）、内視鏡検査、エラストグラフィー、触覚イメージング、温度記録法、医学的写真撮影が挙げられる。他のイメージング技法としては、核医学機能イメージング、たとえば、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、および単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。これらの技法を実施して結果を分析する方法は当技術分野で知られている。
【０７３８】
癌を診断およびモニタリングするために一般的に使用する非侵襲性イメージング技法としては、それだけには限定されないが、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、蛍光反射率イメージング（ＦＲＩ）、および蛍光媒介断層撮影（ＦＭＴ）が挙げられる。ハイブリッドイメージングプラットフォームも癌を診断およびモニタリングするために使用し得る。たとえば、ハイブリッド技法としては、それだけには限定されないが、ＰＥＴ−ＣＴ、ＦＭＴ−ＣＴ、ＦＭＴ−ＭＲＩ、およびＰＥＴ−ＭＲＩが挙げられる。動的造影ＭＲＩ（ＤＣＥ−ＭＲＩ）は、乳癌を検出するために一般的に使用する別のイメージング技法である。これらの技法を実施して結果を分析する方法は当技術分野で知られている。
【０７３９】
線維症を診断およびモニタリングするために一般的に使用する非侵襲性イメージング技法としては、それだけには限定されないが、超音波（たとえば慣用の超音波または造影超音波）、超音波エラストグラフィー（たとえば、一過性エラストグラフィー、点剪断波エラストグラフィー、および２Ｄ剪断波エラストグラフィー）、ＣＴスキャン（たとえば慣用のＣＴまたはＣＴ灌流イメージング）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）（たとえば、慣用のＭＲＩ、磁気共鳴エラストグラフィー、拡散強調磁気共鳴画像法、ガドキセト酸二ナトリウム、および磁気共鳴灌流イメージング）が挙げられる。
【０７４０】
一部の実施形態では、非侵襲性イメージング技法を使用して肝線維症または肝脂肪症のレベルを評価する。たとえば、肝線維症を評価するために特に有用なイメージング技法としては、それだけには限定されないが、ＦｉｂｒｏＳｃａｎ（一過性エラストグラフィー、ＴＥ）、点剪断波エラストグラフィー（ｐＳＷＥ、音響放射力インパルス（ＡＲＦＩ）としても知られる）、２Ｄ−３Ｄ  ＳＷＥ、磁気共鳴エラストグラフィー（ＭＲＥ）、および多パラメータＭＲＩを挙げ得る。肝脂肪症を評価するために特に有用なイメージング技法としては、それだけには限定されないが、超音波検査、制御減衰パラメータ（ＣＡＰ）エラストグラフィー、ＭＲＩで推定した陽子密度脂肪割合（ＭＲＩ−ＰＤＦＦ）、および磁気共鳴分光分析（ＭＲＳ）を挙げ得る。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を使用して肝臓硬直を評価する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を使用して、肝臓内トリグリセリドレベルを検出および評価する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を使用して、すべて肝線維症のステージ決定および硬変をサブステージに分けることにおいて有益である、肝臓表面小結節形成（ＬＳＮ、「肝臓スコア」としても知られる）、肝臓硬直、および／または肝臓分節性体積比（ＬＳＶＲ）を評価する。これらの技法を実施して結果を分析する方法は当技術分野で知られている。
【０７４１】
より最近では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの目的の細胞（たとえば、細胞毒性Ｔ細胞、マクロファージ、および癌細胞）の検出を許可するであろう、非侵襲性イメージング方法が開発されている。たとえば、そのそれぞれが本明細書中に参考として組み込まれている、ｗｗｗ．ｉｍａｇｉｎａｂ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／、Ｔａｖａｒｅら、（２０１４年）、ＰＮＡＳ、１１１（３）：１１０８〜１１１３頁、Ｔａｖａｒｅら、（２０１５年）、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ、５６（８）：１２５８〜１２６４頁、Ｒａｓｈｉｄｉａｎら、（２０１７年）、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、２１４（８）：２２４３〜２２５５頁、Ｂｅｃｋｆｏｒｄ  Ｖｅｒａら、（２０１８年）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、１３（３）：ｅ０１９３８３２、およびＴａｖａｒｅら、（２０１５年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７６（１）：７３〜８２頁を参照されたい。いわゆる「Ｔ細胞追跡」は、抗腫瘍エフェクターＴ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで検出および局在化することを目的とする。これは、固形腫瘍の免疫抑制性の表現型の理解に関する有用な見識を提供し得る。細胞毒性Ｔ細胞で十分に浸潤されている腫瘍（「炎症性」または「熱い」腫瘍）は、チェックポイント遮断療法（ＣＢＴ）などの癌治療に応答する可能性が高い。他方では、免疫抑制性の表現型を有する腫瘍は、抗腫瘍免疫応答が存在する場合でさえもＴ細胞浸潤が乏しい傾向にある。これらのいわゆる「免疫排除された」腫瘍は、ＣＢＴなどの癌治療に対する応答に失敗する可能性が高い。Ｔ細胞追跡技法は、これらの様々な表現型を明らかにし、患者に利益を与える可能性が高いであろう治療手法において指導するための情報を提供し得る。たとえば、「免疫排除された」腫瘍を有する患者は、ＴＧＦβ１阻害剤療法から利益を受けて、免疫抑制性の表現型の逆転を助ける可能性が高い。類似の技法を使用して、他の疾患、たとえば線維症を診断およびモニタリングし得ることが企図される。典型的には、検出部分（たとえば、放射標識、蛍光など）を用いて操作した抗体または抗体様分子を患者内に注射することができ、その後これは特定のマーカー（たとえばＣＤ８＋およびＭ２マクロファージ）の部位へと分配され局在化する。
【０７４２】
非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法は、患者を診断すること、ＴＧＦβ１阻害剤療法から利益を受ける可能性が高い患者を選択もしくは同定すること、および／または、患者を処置の際の治療反応についてモニタリングすることの目的で、様々な適切な方法において適用し得る。既知の細胞表面マーカーを有する任意の細胞を、細胞マーカーと特異的に結合する抗体または類似の分子を用いることのおかげで検出／位置特定し得る。典型的には、そのような技法を使用することによって検出する細胞は、細胞毒性Ｔリンパ球、調節性Ｔ細胞、ＭＤＳＣ、疾患関連マクロファージ（ＴＡＭおよびＦＡＭ等のＭ２マクロファージ（ｍａｃｒｏｐａｈｇｅ））、ＮＫ細胞、樹状細胞、ならびに好中球などの免疫細胞である。
【０７４３】
適切な免疫細胞マーカーの非限定的な例としては、単球マーカー、マクロファージマーカー（たとえばＭ１および／またはＭ２マクロファージマーカー）、ＣＴＬマーカー、抑制性免疫細胞マーカー、ＭＤＳＣマーカー（たとえばＧ−および／またはＭ−ＭＤＳＣのマーカー）が挙げられ、それだけには限定されないが、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ６６、ＣＤ３４、ＣＤ２５、およびＣＤ４７が挙げられる。
【０７４４】
癌および線維症などのＴＧＦβ１関連の疾患を診断された患者において特定のＭＤＳＣを検出、位置特定、および／または追跡するために、上述のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を用い得る。健康な個体は、循環中のＭＤＳＣが存在しないまたは低頻度である。そのような疾患の発症または進行に伴って、循環および／または疾患関連ＭＤＳＣのレベルの上昇が検出され得る。たとえば、ＣＣＲ２陽性Ｍ−ＭＤＳＣは炎症を有する組織に蓄積されることが報告されており、組織における線維症（肺線維症など）の進行を引き起こす場合があり、これはＴＧＦβ１の発現に相関していることが示されている。同様に、ＭＤＳＣはいくつかの固形腫瘍（三重陰性乳癌を含む）において富化されており、ＴＭＥの免疫抑制性の表現型に部分的に寄与する。したがって、ＭＤＳＣを位置特定または追跡することによって、本開示によるＴＧＦβ１阻害療法に対する処置応答をモニタリングし得る。検出可能なＭＤＳＣの低下または低頻度は、典型的には治療上の利点またはより良好な予後診断の指標である。
【０７４５】
多くのヒト癌は、健康な対照と比較して患者においてＭＤＳＣレベルの上昇を引き起こすことが知られている（たとえばＥｌｌｉｏｔｔら、（２０１７年）、「Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ：ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８巻、論文第８６号に総説）。これらのヒト癌としては、それだけには限定されないが、膀胱癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、膠芽細胞腫、肝細胞癌、頭頸部扁平細胞癌、肺癌、黒色腫、ＮＳＣＬ、卵巣癌、膵癌、および腎細胞癌が挙げられる。ＭＤＳＣレベルの上昇は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）および組織試料（たとえば腫瘍生検）などの生体試料において検出され得る。たとえば、ＭＤＳＣの頻度またはその数の変化は、適切な細胞表面マーカー（表現型）を使用して、全ＰＢＭＣのパーセント（％）、ＣＤ１４＋細胞のパーセント（％）、ＣＤ４５＋細胞のパーセント（％）、単核細胞のパーセント（％）、全細胞のパーセント（％）、ＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセント（％）、単球のパーセント（％）、非リンパ球性ＭＮＣのパーセント（％）、ＫＬＡ−ＤＲ細胞のパーセント（％）として測定し得る。
【０７４６】
さらに、免疫細胞マーカーを使用して、癌の場合は、腫瘍が免疫排除の表現型を有するかどうかを決定することが可能である。腫瘍が免疫排除の表現型を有すると決定された場合、腫瘍が腫瘍環境内において十分な細胞毒性細胞を欠くため、癌治療（ＣＢＴなど）単独では効果的でない場合がある。したがって、本明細書中に記載のものなどのＴＧＦβ１阻害剤を用いた付加型治療は、免疫抑制を低下させ、それによって癌治療耐性腫瘍を癌治療に対してより応答性にし得る。免疫マーカーを、線維性コンテキストにおいて免疫細胞を追跡するため、ならびに／または線維性組織の免疫細胞組成を決定するため（たとえばマクロファージおよび／もしくは筋線維芽細胞の存在を追跡するため）にも使用できることが企図される。
【０７４７】
したがって、本発明は、ｉ）ＴＧＦβ１関連の疾患または状態を診断された患者を選択するステップと、ｉｉ）患者に、本明細書中に包含される抗体または断片を、疾患または状態を処置するために有効な量で投与するステップとを含み得る、ＴＧＦβ１関連の疾患または状態を処置する方法も含む。一部の実施形態では、選択ステップ（ｉ）は疾患マーカー（たとえば本明細書中に記載の線維症または癌マーカー）の検出を含み、任意選択で、検出は、生検分析、血清マーカー分析、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを含む。一部の実施形態では、選択ステップ（ｉ）は本明細書中に記載のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を含む。
【０７４８】
一部の実施形態では、ＴＧＦβ１関連の疾患または状態は線維性状態である。一部の実施形態では、選択ステップ（ｉ）は、筋線維芽細胞またはその１つもしくは複数のマーカーの検出を含む。一部の実施形態では、選択ステップ（ｉ）は、肝脂肪症、肝性トリグリセリド、免疫細胞、および／または筋線維芽細胞の検出を含む。一部の実施形態では、検出は、生検分析、血清マーカー分析、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを含む。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、超音波、超音波エラストグラフィー、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＰＥＴ−ＳＰＥＣＴ、光学的蛍光／生物発光ＦｉｂｒｏＳｃａｎ（ＴＥ）、ｐＳＷＥ、２Ｄ−３Ｄ  ＳＷＥ、ＭＲＥ、超音波検査、ＣＡＰ、ＭＲＩ−ＰＤＦＦ、および／またはＭＲＳを含む。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、免疫細胞または免疫細胞の細胞表面マーカーと結合する抗体を直接または間接的に標識することを含む。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングはトレーサーの使用を含む。
【０７４９】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法は、肝脂肪症、肝性トリグリセリド、免疫細胞（たとえば以下に記述）、および／または筋線維芽細胞を測定する。一部の実施形態では、処置は、幹部組織におけるトリグリセリド、脂肪症、肝臓表面小結節、炎症、および／またはマクロファージを低下させる。一部の実施形態では、処置は肝臓内トリグリセリド含有量を≦５．５％まで低下させる。一部の実施形態では、処置は患部組織中のＭＤＳＣを低下させる。一部の実施形態では、処置は患部組織中のマクロファージを低下させる。一部の実施形態では、有効量は０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、任意選択で３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、この方法は、対象を、本明細書中に記載の治療反応（たとえば、トリグリセリドの低下、脂肪症の低下、肝臓表面小結節の低下、炎症の低下、マクロファージの低下、および／または肝臓スコアの低下）についてモニタリングすることをさらに含む。
【０７５０】
本発明はまた、ｉ）固形腫瘍を含む癌を診断された患者を選択するステップであって、固形腫瘍は免疫排除された腫瘍である、またはそう疑われるステップと、ｉｉ）患者に、本明細書中に包含される抗体または断片を、癌を処置するために有効な量で投与するステップとを含み得る、癌を処置する方法も含む。好ましくは、患者は、免疫チェックポイント阻害療法（たとえばＰＤ−（Ｌ）１抗体）、化学療法、放射線療法、操作した免疫細胞による治療、および癌ワクチン療法などの癌治療を受けた、または受ける候補である。一部の実施形態では、選択ステップ（ｉ）は免疫細胞またはその１つもしくは複数のマーカーの検出を含み、任意選択で、検出は、腫瘍生検分析、血清マーカー分析、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを含む。一部の実施形態では、選択ステップ（ｉ）は本明細書中に記載のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を含む。一部の実施形態では、この方法は、本明細書中に記載の治療反応についてモニタリングすることをさらに含む。
【０７５１】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、対象におけるＴＧＦβ１阻害療法に対する治療反応をモニタリングするために行う。ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは本明細書中に記載のイメージング技法のうちの任意の１つを含み、本明細書中に記載のマーカーおよび／またはパラメータのうちの任意の１つを測定することができる。たとえば、肝線維症の場合は、治療反応は、脂肪肝の低下、トリグリセリド含有量の低下、ＥＣＭ蓄積／線維症の低下、硬変の低下、および／または疾患の進行の低下を含み得る。一部の実施形態では、本明細書中に記載のアイソフォーム特異的ＴＧＦＢ１阻害剤を用いた処置は、ＭＲＩによって測定して、肝臓内トリグリセリド含有量を≦５．５％のレベルまで低下させる。癌の場合は、治療反応は免疫排除された腫瘍から炎症性腫瘍への変換（これは腫瘍内への免疫細胞浸潤の増加と相関する）、腫瘍サイズの低下、および／または疾患の進行の低下を含み得る。免疫細胞浸潤の増加は、腫瘍内免疫細胞の頻度または放射標識および蛍光などの検出シグナルの度合の増加によって可視化し得る。
【０７５２】
一部の実施形態では、患者を診断、選択、処置、またはモニタリングするために使用するｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、Ｇ−ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣとしても知られる）およびＭ−ＭＤＳＣなどのＭＤＳＣ追跡を含む。たとえば、ＭＤＳＣは、ベースラインにおいて疾患部位（線維性組織および固形腫瘍など）で富化されていてもよい。治療の際（たとえばＴＧＦβ１阻害剤療法）、治療効果の指標である標識（放射性同位元素および蛍光など）の強度の低下によって測定して、より少ないＭＤＳＣが観察され得る。
【０７５３】
一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングは、ＬＲＲＣ３３陽性細胞の追跡または位置特定を含む。ＬＲＲＣ３３陽性細胞としては、たとえば、ＭＤＳＣならびに活性化Ｍ２様マクロファージ（たとえばＴＡＭおよび線維性組織に関連する活性化マクロファージ）が挙げられる。たとえば、ＬＲＲＣ３３陽性細胞は、ベースラインにおいて疾患部位（線維性組織および固形腫瘍など）で富化されていてもよい。治療の際（たとえばＴＧＦβ１阻害剤療法）、治療効果の指標である標識（放射性同位元素および蛍光など）の強度の低下によって測定して、より少ない数の、細胞表面ＬＲＲＣ３３を発現する細胞が観察され得る。
【０７５４】
一部の実施形態では、本明細書中に記載のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法は、目的の細胞を検出するために、ＰＥＴ−ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ、および／または光学的蛍光／生物発光の使用を含み得る。
【０７５５】
一部の実施形態では、検出部分を用いた抗体または抗体様分子の標識は、直接標識または間接標識を含み得る。
【０７５６】
一部の実施形態では、検出部分はトレーサーであり得る。一部の実施形態では、トレーサーは放射性同位元素であってよく、任意選択で放射性同位元素は陽電子放出同位体であり得る。一部の実施形態では、放射性同位元素は、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、６８Ｇａ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、および８９Ｚｒからなる群から選択される。
【０７５７】
したがって、そのような方法を用いて、免疫−ＰＥＴにおいて、標識した抗体を使用してｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを実施し得る。
【０７５８】
したがって、本発明は、診断、患者の選択、および／またはイメージング技法を用いた治療効果のモニタリングのステップが組み込まれる、対象においてＴＧＦβ１適応症を処置する方法も含む。一部の実施形態では、本開示による高親和性のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤をＴＧＦβ１適応症の処置において使用し、処置は、適応症を処置するための有効量のＴＧＦβ１阻害剤の投与を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによって対象における治療効果をモニタリングするステップをさらに含む。任意選択で、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを含む診断ステップまたは選択ステップを使用して、対象を、ＴＧＦβ１阻害剤療法を受ける候補として選択し得る。ＴＧＦβ１適応症は増殖性障害（固形腫瘍を有する癌および骨髄線維症など）または線維性障害（臓器線維症など）であり得る。
【０７５９】
一部の実施形態では、対象は癌を有しており、方法は、ｉ）固形腫瘍を含む癌を診断された患者を選択するステップであって、固形腫瘍は免疫排除された腫瘍である、またはそう疑われるステップと、ｉｉ）患者に、本明細書中に包含される抗体または断片を、癌を処置するために有効な量で投与するステップとを含む。好ましくは、患者は、免疫チェックポイント阻害療法（たとえばＰＤ−（Ｌ）１抗体）、化学療法、放射線療法、操作した免疫細胞による治療、および癌ワクチン療法などの癌治療を受けた、または受ける候補である。一部の実施形態では、選択ステップ（ｉ）は免疫細胞またはその１つもしくは複数のマーカーの検出を含み、任意選択で、検出は、腫瘍生検分析、血清マーカー分析、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを含む。一部の実施形態では、選択ステップ（ｉ）は本明細書中に記載のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング技法を含む。一部の実施形態では、この方法は、本明細書中に記載の治療反応についてモニタリングすることをさらに含む。
【０７６０】
大型潜在型複合体（ＬＬＣ）を検出するためのアッセイ
一部の実施形態では、本明細書中に提供する方法および組成物は、対象から得た試料中のＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体を検出する方法に関する。本明細書中で使用する「対象」とは、個々の生物、たとえば個々の哺乳動物をいう。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。一部の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。一部の実施形態では、対象はげっ歯動物である。一部の実施形態では、対象は、ヒツジ、ヤギ、畜牛、家禽、ネコ、またはイヌである。一部の実施形態では、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚、昆虫、ハエ、または線虫である。一部の実施形態では、対象は研究動物である。一部の実施形態では、対象は遺伝子操作している、たとえば遺伝子操作した非ヒト対象である。対象はどちらの性別でもよく、任意の発達段階であってよい。一部の実施形態では、対象は患者または健康なボランティアである。
【０７６１】
一部の実施形態では、対象から得た試料中のＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体を検出する方法は、（ａ）試料を、ＧＡＲＰ−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ１複合体、ＬＴＢＰ３−ＴＧＦβ１複合体、および／またはＬＲＲＣ３３−ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する抗体と、抗原が試料中に存在する場合は抗体と抗原との結合に適した条件下で接触させて、それによって結合複合体を形成させるステップと、（ｂ）抗原と結合した抗体のレベルを決定する（たとえば結合複合体のレベルを決定する）ステップとを含む。
【０７６２】
一実施形態では、繋留を提供することによって、インテグリンによる潜在型ＴＧＦβの活性化を許可する、表面上に固定されたビオチン標識した潜在型ＴＧＦβ１複合体を利用するスクリーニングアッセイ。他の非インテグリン活性化剤もこのシステムにおいて試験することができる。読取値は、レポーター細胞または他のＴＧＦβ依存性細胞性応答を通じたものであることができる。
【０７６３】
ＴＧＦβの活性化を測定するための細胞に基づくアッセイ
ＴＧＦβの活性化（および抗体などのＴＧＦβ試験阻害剤によるその阻害）は、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって測定し得る。たとえば、ＴＧＦβのインテグリン媒介性活性化は、本明細書中により詳述されている「ＣＡＧＡ１２」レポーター（たとえばルシフェラーゼ）アッセイなどの、細胞に基づく効力アッセイにおいて利用することができる。示すように、そのようなアッセイシステムは以下の構成要素を含み得る：ｉ）ＴＧＦβ（組換え、内在性、または形質移入）の供給源、ｉｉ）インテグリン（組換え、内在性、または形質移入）などの活性化剤の供給源、およびｉｉｉ）ＴＧＦβに応答してシグナルを読取可能な出力へと翻訳することができるＴＧＦβ受容体を発現する細胞などのＴＧＦβの活性化に応答するレポーターシステム（たとえばＣＡＧＡ１２細胞または他のレポーター細胞系におけるルシフェラーゼ活性）。一部の実施形態では、レポーター細胞系は、ＴＧＦβ応答性プロモーター（たとえばＰＡＩ−１プロモーター）の制御下のレポーター遺伝子（たとえばルシフェラーゼ遺伝子）を含む。一部の実施形態では、感度を与える特定のプロモーター要素をレポーターシステム内に組み込ませ得る。一部の実施形態では、そのようなプロモーター要素はＣＡＧＡ１２要素である。アッセイにおいて使用し得るレポーター細胞系は、たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているＡｂｅら、（１９９４年）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１６（２）：２７６〜８４頁に記載されている。一部の実施形態では、前述のアッセイ構成要素のそれぞれは、同じ供給源（たとえば同じ細胞）から提供される。一部の実施形態では、前述のアッセイ構成要素のうちの２つは同じ供給源から提供され、３つ目のアッセイ構成要素は異なる供給源から提供される。一部の実施形態では、３つすべてのアッセイ構成要素が異なる供給源から提供される。たとえば、一部の実施形態では、インテグリンならびに潜在型ＴＧＦβ複合体（前駆ＴＧＦβおよび提示分子）は、アッセイのために同じ供給源（たとえば同じ形質移入した細胞系）から提供される。一部の実施形態では、インテグリンおよびＴＧＦは、アッセイのために別々の供給源（たとえば、２つの異なる細胞系、精製したインテグリンと形質移入した細胞との組合せ）から提供される。細胞をアッセイ構成要素のうちの１つまたは複数の供給源として使用する場合、そのようなアッセイ構成要素は、細胞に内在性である、細胞中で安定発現される、一過的に形質移入した、またはその任意の組合せであり得る。
【０７６４】
当業者は、そのようなアッセイを様々な適切な立体配置に容易に適応させることができる。たとえば、ＴＧＦβの様々な供給源を考慮し得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβの供給源は、ＴＧＦβを発現および蓄積する細胞（たとえば、初代細胞、伝播細胞、不死化細胞、または細胞系など）である。一部の実施形態では、ＴＧＦβの供給源は、適切な手段を使用してアッセイシステム中に固定された精製および／または組換えＴＧＦβである。一部の実施形態では、アッセイシステム中に固定されたＴＧＦβは、脱細胞化を用いてまたは用いずに、アッセイプレート上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）組成物内で提示され、これは線維芽細胞由来のＴＧＦβを模倣する。一部の実施形態では、ＴＧＦβは、アッセイに使用する細胞の細胞表面上に提示される。さらに、希望の提示分子をアッセイシステムに含めて適切な潜在型−ＴＧＦβ複合体を提供し得る。当業者は、どの提示分子が特定の細胞または細胞種中に存在し得るまたはそれ中で発現され得るかを容易に決定することができる。そのようなアッセイシステムを使用して、試験薬剤（抗体など）の存在または非存在におけるＴＧＦβの活性化の相対的変化を容易に測定して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＧＦβの活性化に対する試験薬剤の効果を評価し得る。例示的な細胞に基づくアッセイからのデータを以下の実施例セクションに提供する。
【０７６５】
そのような細胞に基づくアッセイは、研究するＴＧＦβアイソフォーム、潜在型複合体（たとえば提示分子）の種類などに応じて、いくつかの方法で改変またはあつらえ得る。一部の実施形態では、ＴＧＦβを活性化することができるインテグリンを発現することが知られている細胞を、アッセイにおけるインテグリンの供給源として使用し得る。そのような細胞としてはＳＷ４８０／β６細胞（たとえばクローン１Ｅ７）が挙げられる。一部の実施形態では、インテグリン発現細胞を、目的の提示分子（ＧＡＲＰ、ＬＲＲＣ３３、ＬＴＢＰ（たとえばＬＴＢＰ１またはＬＴＢＰ３）など）をコードしているプラスミドおよび目的のＴＧＦβアイソフォームの前駆形態（前駆ＴＧＦβ１など）をコードしているプラスミドと共に同時形質移入し得る。形質移入後、細胞を、形質移入した遺伝子の発現を許可するために十分な時間インキュベートし（たとえば約２４時間）、細胞を洗浄し、試験薬剤（たとえば抗体）の段階希釈と共にインキュベートする。その後、レポーター細胞系（たとえばＣＡＧＡ１２細胞）をアッセイシステムに加え、ＴＧＦβシグナル伝達を許可するために適切なインキュベーション時間が続く。試験薬剤の添加に続くインキュベーション期間（たとえば約１８〜２０時間）の後、適切な手段（たとえば、ルシフェラーゼを発現するレポーター細胞系には、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することができる）を使用してシグナル／読み取り（たとえばルシフェラーゼ活性）を検出する。一部の実施形態では、ＢｉｏＴｅｋ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１）プレートリーダーを使用して、オートゲイン設定を用いて、ルシフェラーゼ蛍光を検出し得る。
【０７６６】
データは、本発明の例示的な抗体が、コンテキスト非依存性の様式でＴＧＦβ１の活性化を選択的に阻害できることを実証している。
【０７６７】
核酸
一部の実施形態では、本開示の抗体、その抗原結合部分、および／または組成物は核酸分子によってコードされて得る。そのような核酸分子としては、それだけには限定されないが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ分子、ベクター、プラスミドなどが挙げられる。一部の実施形態では、本開示は、本開示の化合物および／または組成物をコードしている核酸分子を発現するようにプログラミングまたは作製あれた細胞を含みる。一部の事例では、本開示の核酸はコドン最適化された核酸を含む。コドン最適化された核酸の作製方法は当技術分野で知られており、それだけには限定されないが、そのそれぞれの内容が本明細書中にその全体で参考として組み込まれている米国特許第５，７８６，４６４号および第６，１１４，１４８号に記載されているものが挙げられ得る。
【０７６８】
特定の実施形態の列挙
本開示の非限定的な実施形態を以下に列挙する。
１．溶液平衡滴定に基づくアッセイによって測定して、以下の抗原複合体のそれぞれ：
ｉ）ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉ）ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉｉ）ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および
ｉｖ）ｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１
と≦１０ｎＭのＫＤ、任意選択で≦５ｎＭで結合し、完全ヒトもしくはヒト化抗体またはその断片である、抗体またはその抗原結合断片。
２．溶液平衡滴定に基づくアッセイによって測定して、ｉ）ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびｉｉ）ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１の複合体のそれぞれと≦５ｎＭのＫＤで結合し、任意選択で、溶液平衡滴定に基づくアッセイによって測定して複合体のそれぞれと≦１ｎＭのＫＤで結合する、実施形態１に記載の抗体または抗原結合断片。
３．溶液平衡滴定に基づくアッセイによって測定して、以下の抗原複合体のそれぞれ：
ｉ）ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉ）ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉｉ）ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および
ｉｖ）ｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１
と≦２００ｐＭのＫＤ、任意選択で≦１００ｐＭで結合し、完全ヒトもしくはヒト化抗体またはその断片である、抗体またはその抗原結合断片。
４．ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３［式中、
ＣＤＲ−Ｈ１はＦＴＦ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｍ（Ｘ５）によって表されるアミノ酸配列を有し［式中、任意選択で、Ｘ１は、Ｓ、Ｇ、もしくはＡであり、Ｘ２は、ＳもしくはＦであり、Ｘ３は、ＦもしくはＹであり、Ｘ４は、ＳもしくはＡであり、および／または、Ｘ５は、Ｄ、Ｎ、もしくはＹである］（配列番号１４３）、
ＣＤＲ−Ｈ２はＹＩ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）Ａ（Ｘ４）ＴＩＹＹＡ（Ｘ５）ＳＶＫＧによって表されるアミノ酸配列を有し［式中、任意選択で、Ｘ１は、ＳもしくはＨであり、Ｘ２は、ＰもしくはＳであり、Ｘ３は、ＳもしくはＤであり、Ｘ４は、ＤもしくはＳであり、および／または、Ｘ５は、ＤもしくはＧである］（配列番号１４４）、
ＣＤＲ−Ｈ３は（Ｘ１）Ｒ（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｄ（Ｘ５）ＧＤＭＬ（Ｘ６）Ｐによって表されるアミノ酸配列を有し［式中、任意選択で、Ｘ１は、ＡもしくはＶであり、Ｘ２は、ＧもしくはＡであり、Ｘ３は、ＶもしくはＴであり、Ｘ４は、ＬもしくはＷであり、Ｘ５は、ＹもしくはＭであり、および／または、Ｘ６は、ＭもしくはＤである］（配列番号１４５）、
ＣＤＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号１０５）を有し、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有し、
ＣＤＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１０６）を有し、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有し、
ＣＤＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴ（配列番号１２）を有し、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有する］
を含む、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
５．ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３［式中、
ＣＤＲ−Ｈ１はアミノ酸配列ＦＴＦＳＳＦＳＭＤ（配列番号１０７）を有し、任意選択で４個までのアミノ酸変化または２個までのアミノ酸変化を有し、
ＣＤＲ−Ｈ２はアミノ酸配列ＹＩＳＰＳＡＤＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０３）を有し、任意選択で４個までのアミノ酸変化を有し、
ＣＤＲ−Ｈ３はアミノ酸配列ＡＲＧＶＬＤＹＧＤＭＬＭＰ（配列番号６）を有し、任意選択で３個までのアミノ酸変化を有し、
ＣＤＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号１０５）を有し、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有し、
ＣＤＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＤＡＳＮＬＥＴ（配列番号１０６）を有し、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有し、
ＣＤＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴ（配列番号１２）を有し、任意選択で１または２個のアミノ酸変化を有する］
を含む、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
６．ＣＤＲ−Ｈ１がＧＦＴＦＳＳＦＳ（配列番号２）を含み、ＣＤＲ−Ｈ２がＩＳＰＳＡＤＴＩ（配列番号４）を含み、ＣＤＲ−Ｈ３がＡＲＧＶＬＤＹＧＤＭＬＭＰ（配列番号６）を含み、ＣＤＲ−Ｌ１がＱＤＩＴＮＹ（配列番号８）を含み、ＣＤＲ−Ｌ２がＤＡＳ（配列番号１０）を含み、ＣＤＲ−Ｌ３がＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴ（配列番号１２）を含む、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
７．潜在型ラッソの１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープと結合し、任意選択でエピトープがコンビナトリアルエピトープであり、さらに任意選択でコンビナトリアルエピトープが成長因子ドメインのフィンガー−１および／またはフィンガー−２の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
８．エピトープがＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号１６９）の１つまたは複数のアミノ酸残基を含み、任意選択でエピトープがＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号１６５）および／またはＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬ（配列番号１６８）の１つまたは複数のアミノ酸残基をさらに含む、実施形態７に記載の抗体または抗原結合断片。
９．エピトープが、ＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号１６９）の１つまたは複数のアミノ酸残基、およびＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号１６５）の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、実施形態８に記載の抗体または抗原結合断片。
１０．エピトープが、ＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号１６９）の１つまたは複数のアミノ酸残基およびＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬ（配列番号１６８）の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、実施形態８に記載の抗体または抗原結合断片。
１１．エピトープが、ＫＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶＬ（配列番号１６９）の１つまたは複数のアミノ酸残基、ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号１６５）の１つまたは複数のアミノ酸残基、およびＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬ（配列番号１６８）の１つまたは複数のアミノ酸残基を含む、実施形態７に記載の抗体または抗原結合断片。
１２．完全ヒトもしくはヒト化抗体または抗原結合断片である、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
１３．ヒトおよびマウスの前駆ＴＧＦβ１複合体と交差反応する、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
１４．ヒトＩｇＧ４またはＩｇＧ１の亜型である、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
１５．ＩｇＧ１様ヒンジを生じるＳｅｒからＰｒｏへの主鎖置換を含む、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
１６．細胞に基づくレポーターアッセイによって測定して、以下の複合体のそれぞれ：
ｉ）ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉ）ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉｉ）ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および
ｉｖ）ｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１
に対して≦２ｎＭのＩＣ５０を有する、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
１７．バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴によって測定して、以下の抗原のそれぞれ：
ａ）ヒトＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１複合体、
ｂ）ヒトＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１複合体、
ｃ）ヒトＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体、および
ｄ）ヒトＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体
と≦１ｎＭの親和性で特異的に結合する、単離したモノクローナル抗体またはその断片であって、
モノクローナル抗体は、上記複合体のうちの任意の１つに対して他方の複合体よりも３倍を超えない親和性の偏りを示し、
モノクローナル抗体は、前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれからの成熟ＴＧＦβ１成長因子の放出を阻害するが、前駆ＴＧＦβ２または前駆ＴＧＦβ３複合体からのものは阻害しない
、単離したモノクローナル抗体またはその断片。
１８．アミノ酸配列ＰＧＰＬＰＥＡＶ（配列番号１６１）またはその一部分を有する結合領域で前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する、単離したモノクローナル抗体またはその断片であって、
水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）によって決定して、溶液中で前駆ＴＧＦβ１複合体と結合した際、抗体または断片が結合領域を溶媒曝露から保護することを特徴とし、
バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴によって測定して、抗体または断片が以下の複合体、すなわち、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと≦５ｎＭの親和性で特異的に結合する
、単離したモノクローナル抗体またはその断片。
１９．アミノ酸配列ＬＶＫＲＫＲＩＥＡ（配列番号１５９）またはその一部分を有する結合領域で前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合する、単離したモノクローナル抗体またはその断片であって、
水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）によって決定して、溶液中で前駆ＴＧＦβ１複合体と結合した際、抗体または断片が結合領域を溶媒曝露から保護することを特徴とし、
バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴によって測定して、抗体または断片が以下の複合体、すなわち、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと≦５ｎＭの親和性で特異的に結合する
、単離したモノクローナル抗体またはその断片。
２０．
ｉ）潜在型ラッソの少なくとも一部分を含む第１の結合領域（配列番号１５３）、および
ｉｉ）フィンガー−１の少なくとも一部分を含む第２の結合領域（配列番号１５１）
で前駆ＴＧＦβ１複合体と特異的に結合し、
水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）によって決定して、溶液中で前駆ＴＧＦβ１複合体と結合した際、抗体または断片が結合領域を溶媒曝露から保護することを特徴とする
、単離したモノクローナル抗体またはその断片。
２１．第１の結合領域がＰＧＰＬＰＥＡＶ（配列番号１６１）またはその一部分を含み、第２の結合領域がＲＫＤＬＧＷＫＷ（配列番号１７０）またはその一部分を含む請求項４５に記載の抗体または断片。
２２．抗体が、バイオレイヤー干渉法または表面プラズモン共鳴によって測定して、５倍未満の親和性の偏りでマトリックス関連前駆ＴＧＦβ１複合体および細胞関連前駆ＴＧＦｂ１複合体と結合するようなコンテキスト非依存性抗体である、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または断片。
２３．以下の複合体のそれぞれ、すなわち、ｍＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｍＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｍＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｍＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１と≦１ｎＭの親和性で特異的に結合する、請求項４３から４７のいずれか一項に記載の抗体または断片。
２４．以下の結合領域：
ＬＶＫＲＫＲＩＥＡ（配列番号１５９）、
ＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬ（配列番号１５３）、
ＰＧＰＬＰＥＡＶ（配列番号１６１）、
ＬＡＬＹＮＳＴＲ（配列番号１６２）、
ＲＥＡＶＰＥＰＶＬ（配列番号１６３）、
ＹＱＫＹＳＮＮＳＷＲ（配列番号１６４）、
ＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥ（配列番号１７１）、
ＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号１７２）、
ＬＧＰＣＰＹＩＷＳ（配列番号１６６）、
ＡＬＥＰＬＰＩＶ（配列番号１６７）、および
ＶＧＲＫＰＫＶＥＱＬ（配列番号１６８）
またはその一部分のうちの１つまたは複数で前駆ＴＧＦβ１複合体と結合する、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または断片。
２５．
ＧＦＴＦＳＳＦＳ（配列番号２）
ＩＳＰＳＡＤＴＩ（配列番号４）
ＡＲＧＶＬＤＹＧＤＭＬＭＰ（配列番号６）
ＱＤＩＴＮＹ（配列番号８）
ＤＡＳ（配列番号１０）および
ＱＱＡＤＮＨＰＰＷＴ（配列番号１２）
からなる群から選択されるＣＤＲ配列を有する、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または断片。
２６．すべてのＣＤＲを含む、実施形態２５に記載の抗体。
２７．以下の抗原のそれぞれ：
ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１
ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１
ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および
ｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１
と結合する、抗体またはその抗原結合断片であって、
溶液平衡滴定に基づくアッセイによって測定して、≦１ｎＭのＫＤでｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと結合し、
ＬＲＬＡＳＰＰＳＱＧＥＶＰＰＧＰＬＰＥＡＶ（配列番号１７３）の１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープと結合し、任意選択（ｏｔｉｏｎａｌｌｙ）で、エピトープがＲＫＤＬＧＷＫＷＩＨＥＰＫＧＹＨＡＮＦ（配列番号１６５）の１つまたは複数のアミノ酸残基をさらに含む
抗体または断片。
２８．
ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと≦１ｎＭの親和性で結合し、
細胞関連前駆ＴＧＦβ１複合体よりも少なくとも１０倍高い親和性でマトリックス関連前駆ＴＧＦβ１複合体と結合する
前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
２９．ＩＣ５０が≦５ｎＭであり、任意選択でＩＣ５０が≦１ｎＭである、前述の実施形態に記載の抗体または抗原結合断片。
３０．ＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化を阻害することができる、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
３１．ＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化を阻害することができる、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
３２．ＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化およびＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化を阻害することができる、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
３３．前駆ＴＧＦβ２または前駆ＴＧＦβ３と特異的に結合しない、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
３４．前駆ＴＧＦβ１複合体と会合していない遊離ＴＧＦβ１成長因子と特異的に結合しない、前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
３５．前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または断片と交差遮断する抗体またはその抗原結合断片。
３６．前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または断片を含むキット。
３７．前述の実施形態のうちのいずれか一項に記載の抗体または断片と薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物。
３８．対象におけるＴＧＦβ関連の適応症の処置における治療において使用するための、実施形態３７に記載の組成物。
３９．ＴＧＦβ関連の適応症が、癌、骨髄線維症、幹細胞障害、および／または線維性障害である、実施形態３８に記載の使用のための組成物。
４０．ＴＧＦβ関連の適応症が以下から選択される、実施形態３８に記載の使用のための組成物：
ｉ）ＴＧＦβ１が過剰発現されているまたはＴＧＦβ１シグナル伝達が調節不全である疾患、
ｉｉ）異常な幹細胞の分化または再増殖に関連する、任意選択で以下である疾患：
ａ）疾患が原因で幹細胞／前駆細胞の分化／再構成が停止もしくは攪乱している、または治療／医薬品の副作用として誘導される、
ｂ）患者が、健康な細胞が死滅または枯渇することを引き起こす治療または医薬品を受けている、
ｃ）患者が幹細胞／前駆細胞の分化／再構成の増加から利益を受け得る、
ｄ）疾患が異常な幹細胞の分化または再構成に関連している
ｉｉｉ）処置誘導性造血調節不全などの造血調節不全に関与する状態、
ｉｖ）セルピン（Ｓｅｒｐｉｎｅ）１（ＰＡＩ−１をコードしている）、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２としても知られる）、ＣＣＬ３、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、ＦＮ１、ＴＧＦＢ１、ＣＴＧＦ、ＡＣＴＡ２（α−ＳＭＡコードしている）、ＩＴＧＡ１１、ＳＮＡＩ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＴＩＭＰ１、ＦＯＸＰ３、ＣＤＨ１（Ｅカドヘリン）、およびＣＤＨ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の異常な遺伝子発現を伴う疾患、
ｖ）プロテアーゼに関与する疾患、
ｖｉ）上皮間葉転換（ＥＭＴ）および／または内皮間葉転換（ＥｎｄＭＴ）などの間葉転換に関与する疾患、
ｖｉｉ）免疫抑制に関与する疾患であって、任意選択で免疫抑制が疾患部位での増加した免疫抑制細胞を含み、さらに任意選択で免疫抑制細胞がＭ２マクロファージおよび／またはＭＤＳＣである疾患、
ｖｉｉｉ）マトリックスの硬化およびリモデリングに関与し、任意選択でＥＣＭの硬直を含む疾患、
ｉｘ）臓器線維症、任意選択で進行臓器線維症、
ｘ）原発性および後続性の骨髄線維症
ｘｉ）悪性腫瘍／癌
ａ）固形腫瘍、任意選択で進行固形腫瘍または転移性腫瘍、
ｂ）血液癌。
４１．癌が固形腫瘍を含む、または癌が血液癌である、実施形態４０に記載の使用のための組成物。
４２．固形腫瘍が癌治療に対して応答性が乏しく、任意選択で、癌治療が、チェックポイント阻害剤療法、癌ワクチン、化学療法、放射線療法、腫瘍退縮ウイルス療法、ＩＤＯ阻害剤療法、および／または操作した免疫細胞による治療である、実施形態４１に記載の使用のための組成物。
４３．固形腫瘍が免疫排除腫瘍である、実施形態４１に記載の使用のための組成物。
４４．固形腫瘍が、Ｔｒｅｇ、腫瘍内Ｍ２マクロファージ、および／またはＭＤＳＣを含む、実施形態４１に記載の使用のための組成物。
４５．固形腫瘍が、ＣＡＦおよび／または筋線維芽細胞が富化された間質を含む、実施形態４１に記載の使用のための組成物。
４６．対象が、化学療法、放射線療法、ＣＡＲ−Ｔ、癌ワクチン、腫瘍退縮ウイルス療法、およびチェックポイント阻害剤療法からなる群から選択される癌治療を受けている、または受ける候補である、実施形態４１に記載の使用のための組成物。
４７．癌が癌治療に対する獲得耐性または一次耐性によって特徴づけられている、実施形態４１に記載の使用のための組成物。
４８．癌の処置が、固形腫瘍の成長を低下させるために治療上有効な量の組成物を投与することを含み、任意選択で組成物の投与が生存を増加させる、実施形態３８〜４７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
４９．処置が、１〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で組成物を投与することを含む、実施形態３８〜４８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
５０．
癌を診断された対象同定するステップであって、ｉ）癌が、癌治療に対して耐性となりやすいことが知られている種類の癌である、および／または、ｉｉ）対象が癌治療に対して耐性であり、任意選択で対象が癌治療に対する一次非応答者であり、
任意選択で、癌治療が、化学療法、放射線療法、および／または免疫チェックポイント阻害療法であるステップと、
対象をＴＧＦβ１阻害療法の候補として選択するステップと
を含む、ＴＧＦβ１阻害療法に応答する可能性が高い対象を選択する方法。
５１．
ｉ）固形腫瘍を含む癌を診断された患者を選択するステップであって、固形腫瘍は免疫排除された腫瘍である、またはそう疑われるステップと、
ｉｉ）患者に、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体または断片を、癌を処置するために有効な量で投与するステップであって、
（ａ）患者は、免疫チェックポイント阻害療法（ＣＢＴ）、化学療法、放射線療法、操作した免疫細胞による治療、および癌ワクチン療法からなる群から選択される癌治療を受けた、もしくは受ける候補である、または、（ｂ）患者は、統計的に低い一次応答率を有する癌を有しており、患者はＣＢＴを受けていないステップと
を含む、癌を処置する方法。
５２．免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１阻害剤である、請求項２５に記載の方法。
５３．選択ステップ（ｉ）が免疫細胞またはその１つもしくは複数のマーカーの検出を含む、請求項２６に記載の方法。
５４．検出が、腫瘍生検分析、血清マーカー分析、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを含む、請求項２７に記載の方法。
５５．免疫細胞が、細胞毒性Ｔリンパ球、調節性Ｔ細胞、ＭＤＳＣ、腫瘍関連マクロファージ、ＮＫ細胞、樹状細胞、および好中球からなる群から選択される、請求項２７または２８に記載の方法。
５６．免疫細胞マーカーが、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ６８、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ２５、ＣＤ４７からなる群から選択される、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
５７．ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングがＴ細胞追跡を含む、請求項２８に記載の方法。
５８．ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングが、ＰＥＴ−ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩ、および／または光学的蛍光／生物発光の使用を含む、請求項２８または３１に記載の方法。
５９．ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングが、免疫細胞または免疫細胞の細胞表面マーカーと結合する抗体を直接または間接的に標識するステップを含む、請求項３１または３２に記載の方法。
６０．ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングがトレーサーの使用を含む、請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
６１．トレーサーが放射性同位元素である、請求項３４に記載の方法。
６２．放射性同位元素が陽電子放出同位体である、請求項３５に記載の方法。
６３．放射性同位元素が、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、６８Ｇａ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、および８９Ｚｒからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
６４．ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングが、免疫−ＰＥＴにおける標識した抗体の使用を含む、請求項２８から３７のいずれか一項に記載の方法。
６５．ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを、対象におけるＴＧＦβ１阻害療法に対する治療反応をモニタリングするために行う、請求項２８から３８のいずれか一項に記載の方法。
６６．治療反応が、免疫排除された腫瘍から炎症性腫瘍への変換を含む、請求項３９に記載の方法。
６７．
ｉ）溶液平衡滴定に基づくアッセイによって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで≦１０ｎＭのＫＤで結合することができる抗体または抗原結合断片のプールを選択するステップと、
ｉｉ）任意選択で細胞に基づくアッセイにおいて、ＴＧＦβの活性化を阻害することができる抗体または抗原結合断片のプールを選択するステップと、
ｉｉｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究において、ステップｉ）およびｉｉ）からの１つまたは複数の抗体またはその抗原結合断片を試験するステップと、
ｉｖ）ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性学／安全性研究において、ステップｉ）〜ｉｉｉ）からの１つまたは複数の抗体またはその抗原結合断片を試験するステップと、
ｖ）ステップｉ）〜ｉｖ）からの１つまたは複数の抗体または抗原結合断片を同定するステップであって、抗体または断片が、ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性学／安全性研究において決定されたＮＯＡＥＬ未満である、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究において決定された効果的用量を示すステップと
を含む、治療的使用のためのＴＧＦβ１の活性化のアイソフォーム選択的阻害剤を同定する方法。
６８．ＴＧＦβ１適応症を処置するための医薬品の製造における、実施形態１〜３５のいずれか一項に記載の抗体または断片の使用。
６９．抗体または断片を含む配合物の無菌濾過のステップをさらに含む、実施形態６８に記載の使用。
７０．バイアルまたはシリンジ内に充填および／または梱包するステップをさらに含む、実施形態６８または６９に記載の使用。
７１．
ｉ）ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと１ｎＭ以下のＫＤで結合することができる抗体を提供するステップと、
ｉｉ）有効量を決定するためにステップ（ｉ）の抗体を前臨床モデルに投与する、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究を実施するステップと、
ｉｉｉ）望ましくない毒性が観察される量を決定するために、ＴＧＦβ阻害に対して感受性であることが知られている動物モデルを使用して毒性学研究を実施するステップと、
ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に基づいて十分な治療ウィンドウを決定または確認するステップと、
ｖ）抗体を含む医薬組成物を製造するステップと
を含む、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤を含む医薬組成物を作製する方法。
７２．
ｉ）前駆ＴＧＦβ１複合体を含む、任意選択でＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、ＬＲＲＣ３３またはその断片のうちの少なくとも２つを含む抗原を提供するステップと、
ｉｉ）抗体または断片のプールを、ステップ（ｉ）の抗原と結合する能力について選択するステップと、
ｉｉｉ）任意選択で、望ましくない結合プロフィールを示す抗体または断片をプールから除去するステップと、
ｉｖ）ステップ（ｉｉ）および／または（ｉｉｉ）から選択された抗体または断片のプールを、ＴＧＦβ１を阻害する能力について選択するステップと、
ｖ）任意選択で、ステップ（ｉｖ）から選択された１つまたは複数の完全ヒトまたはヒト化抗体または抗体断片を生成して、ヒトまたはヒト化阻害剤を提供するステップと、
ｖｉ）ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１に対する親和性を決定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイを実施するステップと、
ｖｉｉ）ＴＧＦβ１ならびに任意選択でＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３に対する阻害剤の活性を決定または確認するために、機能アッセイを実施するステップと
を含む、実施形態１〜３５のいずれか一項に記載の抗体または断片を製造する方法。
７３．前臨床動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性研究およびｉｎ  ｖｉｖｏ毒性学研究において候補の抗体またはその断片を評価し、それによって、効果的および安全の両方または耐用されると示された有効量を決定するステップをさらに含む、実施形態７２に記載の方法。
７４．医薬組成物へと配合するステップをさらに含む、実施形態７２または７３に記載の方法。
７５．ヒト対象における線維症の処置における治療的使用のための、実施形態７４に記載の組成物。
７６．ヒト対象における骨髄線維症の処置における治療的使用のための、実施形態７４に記載の組成物。
７７．ヒト対象における癌の処置における治療的使用のための、実施形態７４に記載の組成物。
７８．癌が固形腫瘍を含む、実施形態７７に記載の使用のための組成物。
７９．固形腫瘍が局所進行性固形腫瘍である、実施形態７８に記載の使用のための組成物。
８０．癌が癌治療に対して応答性が乏しく、任意選択で、癌治療が、チェックポイント阻害剤療法、癌ワクチン、化学療法、放射線療法、ＩＤＯ阻害剤療法、および／または操作した免疫細胞による治療である、実施形態７７〜７９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
８１．癌が獲得耐性または一次耐性によって特徴づけられている、実施形態８０に記載の使用のための組成物。
８２．腫瘍が免疫排除によって特徴づけられている、実施形態８１に記載の使用のための組成物。
８３．腫瘍が腫瘍内Ｍ２マクロファージおよび／またはＭＤＳＣを含む、実施形態７８〜８２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
８４．腫瘍が、ＣＡＦが富化された間質を含む、実施形態７８〜８２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
８５．対象が、化学療法、放射線療法、ＣＡＲ−Ｔ、癌ワクチン、腫瘍退縮ウイルス療法、およびチェックポイント阻害剤療法からなる群から選択される癌治療を受けている、または受ける候補である、実施形態８０に記載の使用のための組成物。
８６．対象をＴＧＦβ３阻害剤でさらに処置する、実施形態のうちのいずれか一項に記載の使用のための組成物。
８７．対象がＴＧＦβ１陽性およびＴＧＦβ３陽性の癌を有しており、対象が、チェックポイント阻害剤療法を受けていた、受けている、または受ける候補である、実施形態７０に記載の使用のための組成物。
８８．対象が腫瘍の外科的切除を受ける候補ではない、実施形態７７〜８４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
８９．
対象が癌を有しており、
免疫応答が抗癌免疫を含む
、ヒト対象における宿主免疫の増強において使用するための、実施形態３７に記載の組成物。
９０．宿主免疫の増強が、腫瘍からの免疫排除を低下させること、または腫瘍内への免疫細胞浸潤を促進することを含む、実施形態８９に記載の使用のための組成物。
９１．宿主免疫の増強が、ＴＧＦβ１のプラスミン依存性活性化を阻害することを含む、実施形態８９に記載の使用のための組成物。
９２．対象がサイトカインストームを発生する危険性にある、実施形態３７に記載の使用のための組成物。
９３．対象が操作した免疫細胞による治療を受けている、または受ける候補である、実施形態３７に記載の使用のための組成物。
９４．対象が癌ワクチンを受けている、または受ける候補である、実施形態３７に記載の使用のための組成物。
９５．対象が免疫チェックポイント阻害剤療法を受けている、または受ける候補であり、任意選択で、対象が免疫チェックポイント阻害剤療法に対して応答性が乏しい、実施形態７６〜９４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
９６．任意選択で対象が感染症またはＭＳを罹患している、ヒト対象におけるサイトカイン放出症候群（たとえばサイトカインストームまたは敗血症）の防止において使用するための、実施形態３７に記載の組成物。
９７．対象におけるＴＧＦβ１のプラスミン依存性活性化を阻害するための方法において使用するための、請求項３７に記載の組成物。
９８．対象においてＴＧＦβ１適応症を処置する方法であって、適応症を処置するために対象に治療上有効な量のアイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤を投与するステップを含み、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤が、溶液平衡滴定によって測定して、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと≦１０ｎＭのＫＤで特異的に結合するモノクローナル抗体である方法。
９９．抗体が、溶液平衡滴定によって測定して、≦１ｎＭのＫＤでｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１のそれぞれと結合し、任意選択で、抗体が、ｈＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ｈＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、ｈＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびｈＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１複合体のそれぞれと≦１ｎＭのＫＤで結合する、実施形態９８に記載の方法。
１００．抗体が潜在型ラッソまたはその一部分と結合する、実施形態９８または９９に記載の方法。
１０１．抗体が、フィンガー−１、フィンガー−２、またはその一部分とさらに結合する、実施形態１００に記載の方法。
１０２．ＴＧＦβ１適応症が癌および骨髄増殖性疾患から選択される増殖性障害である、実施形態９８〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
１０３．対象が癌治療の乏しい応答者であり、任意選択で、癌治療が、チェックポイント阻害療法、化学療法、および／または放射線療法を含む、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．対象を、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤と併せて、癌治療でさらに処置する、実施形態１０２に記載の方法。
【０７６９】
本発明は、限定的として解釈されるべきでない以下の実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【０７７０】
【実施例１】
【０７７１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合プロフィール
１）ＢＬＩに基づくアッセイ：
Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、およびＡｂ３の親和性はヒト前駆ＴＧＦβ１細胞に対するＯｃｔｅｔ（登録商標）アッセイによって測定した一方で、活性はヒト前駆ＴＧＦβ１阻害を試験するＣＡＧＡ１２レポーター細胞によって測定した。抗体の、本明細書中に提供する複合体に対する親和性を測定するために使用したプロトコルを以下の表１９に要約し、本開示の例示的な抗体の親和性プロフィールの要約リストを本明細書中の表８に提供する。
表１９．Ｏｃｔｅｔ（登録商標）結合アッセイを行うための例示的なプロトコル
2021531254.tif 000040
一例として、ＴＧＦβ抗原に対するＡｂ６結合を、バイオレイヤー干渉法によって、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４上で、ポリスチレン９６ウェル黒色半領域プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を使用して測定した。Ａｂ６とヒト成熟ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３成長因子ならびにヒト潜在型ＴＧＦβ１との結合は、製造者の仕様書に従ってアミン反応性第二世代（ＡＲ２Ｇ）試薬キット（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、抗原をアミン反応性第二世代（ＡＲ２Ｇ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）とカップリングさせた後に行った。最初にＡＲ２Ｇバイオセンサーを実験の開始前にオフラインで少なくとも１０分間、水中で水和させた。実験開始の際、ＡＲ２Ｇ先端を水中で１分間平衡化させた。その後、先端を新鮮に調製した活性化溶液（１８部の水、１部の４００ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）、および１部の２００ｍＭのスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド））内に５分間移した。組換えＴＧＦβタンパク質（１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５中に１０ｕｇ／ｍＬ）を活性化させた先端と３分間カップリングさせた後、エタノールアミン、ｐＨ８．５で１５分間を用いてクエンチングした。ベースラインは、カップリングさせた先端を、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ＭのＮａＣｌ、および０．０９％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）を添加したＥＫＢ緩衝液（動力学的緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で２０分間インキュベーションすることで決定した。その後、先端をＥＫＢ中のＡｂ６の１５ｕｇ／ｍＬ溶液中で１０分間会合させた後、ＥＫＢ中で１０分間解離させた。Ａｂ６とヒト大型潜在型複合体との結合は、Ａｂ６を抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）（ＥＫＢ中に１ｕｇ／ｍＬ）の表面に５分間固定させた後に測定した。その後、さらに１分間のベースラインを行った後に、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ２、またはＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ３（ＥＫＢ中に１００ｎＭ）の会合を１０分間行った。最後に、１０分間の解離を行った。
【０７７２】
２）溶液平衡滴定に基づくアッセイ：
ＭＳＤ−ＳＥＴは、溶液相平衡ＫＤの決定に使用することができる、十分に特徴づけられた技法である。ＭＳＤ−ＳＥＴなどの溶液に基づく平衡アッセイは、リアルタイムの会合および解離の速度ではなく平衡状態での遊離リガンド結合を測定して親和性を決定する、動力学的排除の原理に基づている。
【０７７３】
平衡状態での抗体の親和性を測定するためにＭＳＤ−ＳＥＴアッセイを行った。手短に述べると、それぞれの試験抗体を３〜５倍に希釈し、試料を４８ウェル皿中でビオチン標識した抗原と混合した。ＳＥＴ試料を２０〜２４時間、室温で平衡化させた。一方で、捕捉プレートをＩｇＧ（２０ｎＭ）でコーティングし、終夜４℃でまたは３０分間室温でインキュベートし、続いて５％のＢＳＡを用いた遮断ステップを行った。捕捉プレートを３回洗浄した後、ＳＥＴ試料を加え、１５０秒間インキュベートした。プレートを１回洗浄して未結合の複合体を除去した。２５０ｎｇ／ｍｌのＳＡ−スルホタグを加え、その後、３回洗浄した。２×読取緩衝液を加え、標識した結合した複合体からのシグナルを、ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ（商標）ＳＱ１２０機器を使用して読み取った。
【０７７４】
ＭＳＤ−ＳＥＴによって測定した本開示の例示的な抗体の親和性プロフィールの要約リストを、本明細書中の表９および１０に提供する。
【０７７５】
一例として、ＭＳＤ標準プレート（ＭＳＤ）を、ＰＢＳ中に２０ｎＭのモノクローナル抗体の溶液を用いて、３０分間室温でまたは終夜４℃でコーティングした。その後、漸増濃度のコーティングに使用したものと同じモノクローナル抗体を、ビオチン標識した抗原（Ａｂ６との結合には５０〜４００ｐＭ、Ａｂ４との結合には０．８〜１．６ｎＭ）と、終夜、室温で、振盪せずに。２０〜２４時間の平衡化後、抗体でコーティングしたプレートを、遮断緩衝液Ａ（ＭＳＤ）を用いて３０分間、室温で遮断し、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗浄した後、平衡化した抗体−抗原複合体をプレートに厳密に２．５分間加えた。プレートを洗浄バッファーで再度洗浄した後、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中の２５０ｎｇ／ｍｌスルホタグ標識したストレプトアビジン二次試薬（ＭＳＤ）を加えた。洗浄バッファーで洗浄した後、プレートを、ＭＳＤ読取緩衝液（ＭＳＤ）中でＭＥＳＯ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ１２０（ＭＳＤ）を使用して読み取った。結合データを、Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）中の非線形曲線の当てはめによって処理して、平衡結合ＫＤ値を計算した。
【実施例２】
【０７７６】
潜在型ＴＧＦβ１の活性化の阻害を測定するための機能アッセイ
ＴＧＦβ１の活性化の新規のコンテキスト依存性細胞に基づく効力アッセイの展開は、本明細書中その全体で参考として組み込まれているＷＯ２０１９／０２３６６１号に記載されている。以前のアッセイ様式では、内在性の提示分子によって提示される前駆ＴＧＦβ１の活性化と外因性のＬＴＢＰによって提示される前駆ＴＧＦβ１の活性化とを区別することができなかった。インテグリン発現細胞を直接形質移入させることによって、ＷＯ２０１９／０２３６６１号に開示されており本明細書中で使用する新規アッセイは、内在性の提示因子−前駆ＴＧＦβ１活性および外因性のＬＴＢＰ−前駆ＴＧＦβ１活性との間のウィンドウを確立する。ＬＴＢＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体は細胞外マトリックス内に包埋されているため、アッセイプレートのコーティングもアッセイの重要な構成要素である。ＥＣＭタンパク質フィブロネクチンでコーティングした高結合プレートの使用がＬＴＢＰアッセイをより頑強にした。
【０７７７】
Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、およびＡｂ３抗体が機能的であった（たとえば阻害効力を有していた）かどうかを決定するために、大型潜在型複合体（ＬＬＣ）からのＴＧＦβ１成長因子のαＶβインテグリン依存性放出を測定した、細胞に基づくアッセイを展開した。それぞれのアッセイは、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、またはＬＲＲＣ３３を含むＬＬＣのそれぞれに特異的である。アッセイの展開および最適化のプロセスを通じて、フィブロネクチンがＬＴＢＰ提示前駆ＴＧＦβ１のインテグリン依存性ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化に重大なＥＣＭタンパク質であることが決定された。
【０７７８】
アッセイＩ．ＥＣＭ中に蓄積された潜在型ＴＧＦβ１の活性化
図１および図２に図示したアッセイについて、以下のプロトコルを展開した。このアッセイは、ＥＣＭ関連潜在型前駆ＴＧＦβ１複合体（ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１またはＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１）からのＴＧＦβ１のインテグリン依存性放出を測定するために最適である。
【０７７９】
材料：
・ＭｖＬｕ１−ＣＡＧＡ１２細胞（クローン４Ａ４）
・ＳＷ４８０／β６細胞（クローン１Ｅ７）（αＶサブユニットは高レベルで内在的に発現され、β６サブユニットは安定に過剰発現される）
・ＬＮ２２９細胞系（高レベルの内在性αＶβ８インテグリン）
・Ｃｏｓｔａｒ白色壁のＴＣ処理した９６ウェルアッセイプレート＃３９０３
・Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ高結合白色ｕｃｌｅａｒ９６ウェルアッセイプレート＃６５５０９４
・ヒトフィブロネクチン（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３５４００８）
・Ｐ２００マルチチャネルピペット
・それぞれに無菌的なフィルター先端を備えたＰ２０、Ｐ２００、およびＰ１０００ピペット
・無菌的な微量遠心管およびラック
・無菌的な試薬リザーバー
・０．４％のトリパンブルー
・２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、および２５ｍＬの無菌的なピペット
・組織培養物で処理した１００ｍｍまたは１５０ｍｍのプレート
・７０％エタノール
・Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ還元血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ＃３１９８５−０７０）
・Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ＃Ｌ３００００１５）
・Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ２６２０）
・０．２５％のトリプシン＋０．５３ｍＭのＥＤＴＡ
・前駆ＴＧＦβ１発現プラスミド、ヒト
・ＬＴＢＰ１Ｓ発現プラスミド、ヒト
・ＬＴＢＰ３発現プラスミド、ヒト
・ＬＲＲＣ３２（ＧＡＲＰ）発現プラスミド、ヒト
・ＬＲＲＣ３３発現プラスミド、ヒト
【０７８０】
設備：
・ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１プレートリーダー
・ＴＣフード
・ベンチトップ遠心分離器
・ＣＯ２インキュベーター、３７Ｃ、５％のＣＯ２
・３７Ｃの水／ビーズ浴
・プラットフォーム振盪器
・顕微鏡
・血球計数器／ｃｏｕｎｔｅｓｓ
【０７８１】
定義：
・ＣＡＧＡ１２  ４Ａ４細胞：ＭｖＬｕ１細胞（ミンク肺上皮細胞）の誘導体、ＣＡＧＡ１２合成プロモーターを安定に形質移入、ルシフェラーゼ遺伝子発現を駆動
・ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ：アッセイ培地。基底培地はＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃１１９９５−０６５）であり、培地は０．１％ｗ／ｖまで希釈したＢＳＡ、ペニシリン／ストレプチノマイシン（ｓｔｒｅｐｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、および４ｍＭのグルタミンも含有する
・Ｄ１０：ＤＭＥＭ  １０％のＦＢＳ、Ｐ／Ｓ、４ｍＭのグルタミン、１％のＮＥＡＡ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃３５０５００６１）
・ＳＷ４８０／β６培地：Ｄ１０＋１０００ｕｇ／ｍＬのＧ−４１８
・ＣＡＧＡ１２（４Ａ４）培地：Ｄ１０＋０．７５ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン
【０７８２】
手順：
【０７８３】
０日目に、形質移入用に細胞を播種した。ＳＷ４８０／β６（クローン１Ｅ７）細胞をトリプシンで剥離させ、ペレット化する（５分間＠２００×ｇで遠心）。細胞ペレットをＤ１０培地に再懸濁させ、１ｍｌあたりの生細胞を計数した。細胞を５．０×１０６個の細胞／１２ｍｌ／１００ｍｍの組織培養皿で播種した。ＣＡＧＡ１２細胞では、３日目にアッセイで使用するために細胞をＴ７５フラスコ１個あたり１００万個の密度で継代培養した。培養物は３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０７８４】
１日目に、インテグリン発現細胞を形質移入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００試薬を用いた形質移入の製造者のプロトコルに従った。手短に述べると、以下をＯｐｔｉＭＥＭ（商標）Ｉで希釈して１２５μｌ／ウェルとした：７．５μｇのＤＮＡ（提示分子）＋７．５μｇのＤＮＡ（前駆ＴＧＦβ１）、３０ｕｌのＰ３０００、およびＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉで１２５μｌまで。ＤＮＡを一緒にピペット操作することによってウェルを混合し、その後、ＯｐｔｉＭＥＭを加えた。Ｐ３０００を加え、すべてをピペット操作によって十分に混合した。ＤＮＡ混合物に加えるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００のマスターミックスを作製した：ＬＴＢＰ１アッセイ用：１５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉで１２５μｌ／ウェルまで、ＬＴＢＰ３アッセイ用：４５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉで１２５ｕｌ／ウェルまで。希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００をＤＮＡに加え、ピペット操作によって十分に混合し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、溶液をピペット操作によって数回混合し、その後、２５０μｌのＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（２×１２５μｌ）／皿を滴下した。それぞれの皿を穏やかに回旋させて混合し、皿を組織培養インキュベーターに約２４時間戻した。
【０７８５】
１〜２日目に、アッセイプレートをヒトフィブロネクチンでコーティングした。具体的には、凍結乾燥フィブロネクチンを超純粋な蒸留水（無菌的）で１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。１ｍｇ／ｍｌのストック溶液をＰＢＳ（無菌的）で１９．２μｇ／ｍｌまで希釈した。５０μｌ／ウェルをアッセイプレート（高結合）に加え、終夜、組織培養インキュベーター（３７℃および５％のＣＯ２）中でインキュベートした。最終濃度は３．０μｇ／ｃｍ２であった。
【０７８６】
２日目に、アッセイおよび阻害剤の添加のために形質移入した細胞を播種した。まず、２００μｌ／ウェルのＰＢＳをアッセイプレート中に既に入っているフィブロネクチン溶液に加えることによって、フィブロネクチンコーティングを洗浄した。マルチチャネルピペットを用いて洗浄液を手動で取り除いた。洗浄を繰り返して合計２回洗浄した。細胞添加の前に、プレートの蓋を外して室温で乾燥させた。その後、トリプシンで剥離し、ペレット化する（５分間＠２００×ｇで遠心）ことによって細胞を播種した。ペレットをアッセイ培地に再懸濁させ、１ｍｌあたりの生細胞を計数した。ＬＴＢＰ１アッセイには、細胞を０．１０×１０６個の細胞／ｍｌまで希釈し、５０μｌ／ウェル（５，０００個の細胞／ウェル）で播種する。ＬＴＢＰ３アッセイには、細胞を０．０５×１０６個の細胞／ｍｌまで希釈し５０μｌ／ウェル（２，５００個の細胞／ウェル）で播種する。機能的抗体希釈液を調製するために、抗体をビヒクル中で一貫した作業濃度まで事前希釈した。ストック抗体をビヒクル（ＰＢＳが最適、クエン酸ナトリウム緩衝液は回避）中で段階希釈した。段階希釈の各点をアッセイ培地で希釈し、４×最終濃度の抗体とした。２５μｌ／ウェルの４×抗体を加え、培養物を３７℃および５％のＣＯ２で約２４時間インキュベートした。
【０７８７】
３日目に、ＴＧＦβレポーター細胞を加えた。アッセイ用のＣＡＧＡ１２（クローン４Ａ４）細胞をトリプシンで剥離させ、ペレット化する（５分間＠２００×ｇで遠心）。ペレットをアッセイ培地に再懸濁させ、１ｍｌあたりの生細胞を計数する。細胞を０．４×１０６個の細胞／ｍｌまで希釈し、５０μｌ／ウェル（２０，０００個の細胞／ウェル）で播種する。細胞をインキュベーターに戻した。
【０７８８】
４日目に、アッセイを読み取った（抗体および／またはレポーター細胞の添加の１６〜２０時間後）。読取り前にＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）試薬および試験プレートを室温にさせた。ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１の読取り設定はＴＭＬＣ＿ｓｔｄプロトコルを使用して設定した。この方法はオートゲイン設定を有する。陽性対照ウェルをオートスケール（高）用に選択した。１００μｌ／ウェルのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬を加えた。２分間、振盪しながら、室温で、プレートを光から保護してインキュベートした。プレートをＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１で読み取った。
【０７８９】
Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、または対照ＩｇＧによるＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＢβ１の活性化の阻害をＬＮ２２９レポーターアッセイで測定した（図１）。
【０７９０】
Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、または対照ＩｇＧによるＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＢβ１の活性化の阻害をＬＮ２２９レポーターアッセイによって測定した（図２）。
【０７９１】
アッセイＩＩ．細胞表面上に提示された潜在型ＴＧＦβ１の活性化
図３および図４に図示したアッセイについて、以下のプロトコルを展開した。このアッセイまたは「直接形質移入」プロトコルは、細胞関連潜在型前駆ＴＧＢβ１複合体（ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＢβ１またはＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＢβ１）からのＴＧＦβ１のインテグリン依存性放出（活性化）の測定に最適である。
【０７９２】
材料：
・ＭｖＬｕ１−ＣＡＧＡ１２細胞（クローン４Ａ４）
・ＳＷ４８０／β６細胞（クローン１Ｅ７）（αＶサブユニットは高レベルで内在的に発現され、β６サブユニットは安定に過剰発現される）
・ＬＮ２２９細胞系（高レベルの内在性αＶβ８インテグリン）
・Ｃｏｓｔａｒ白色壁のＴＣ処理した９６ウェルアッセイプレート＃３９０３
・Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ高結合白色ｕｃｌｅａｒ９６ウェルアッセイプレート＃６５５０９４
・ヒトフィブロネクチン（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３５４００８）
・Ｐ２００マルチチャネルピペット
・それぞれに無菌的なフィルター先端を備えたＰ２０、Ｐ２００、およびＰ１０００ピペット
・無菌的な微量遠心管およびラック
・無菌的な試薬リザーバー
・０．４％のトリパンブルー
・２ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、および２５ｍＬの無菌的なピペット
・組織培養物で処理した１００ｍｍまたは１５０ｍｍのプレート
・７０％エタノール
・Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ還元血清培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ＃３１９８５−０７０）
・Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ＃Ｌ３００００１５）
・Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ２６２０）
・０．２５％のトリプシン＋０．５３ｍＭのＥＤＴＡ
・前駆ＴＧＦβ１発現プラスミド、ヒト
・ＬＴＢＰ１Ｓ発現プラスミド、ヒト
・ＬＴＢＰ３発現プラスミド、ヒト
・ＬＲＲＣ３２（ＧＡＲＰ）発現プラスミド、ヒト
・ＬＲＲＣ３３発現プラスミド、ヒト
【０７９３】
設備：
・ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１プレートリーダー
・組織培養フード
・ベンチトップ遠心分離器
・ＣＯ２インキュベーター、３７℃、５％のＣＯ２
・３７℃の水／ビーズ浴
・プラットフォーム振盪器
・顕微鏡
・血球計数器／ｃｏｕｎｔｅｓｓ
【０７９４】
定義：
・ＣＡＧＡ１２  ４Ａ４細胞：ＭｖＬｕ１細胞（ミンク肺上皮細胞）の誘導体、ＣＡＧＡ１２合成プロモーターを安定に形質移入、ルシフェラーゼ遺伝子発現を駆動
・ＤＭＥＭ−０．１％ＢＳＡ：アッセイ培地。基底培地はＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃１１９９５−０６５）であり、培地は０．１％ｗ／ｖまで希釈したＢＳＡ、ペニシリン／ストレプチノマイシン（ｓｔｒｅｐｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、および４ｍＭのグルタミンも含有する
・Ｄ１０：ＤＭＥＭ  １０％のＦＢＳ、Ｐ／Ｓ、４ｍＭのグルタミン、１％のＮＥＡＡ、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏカタログ＃３５０５００６１）
・ＳＷ４８０／β６培地：Ｄ１０＋１０００ｕｇ／ｍＬのＧ−４１８
・ＣＡＧＡ１２（４Ａ４）培地：Ｄ１０＋０．７５ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン
【０７９５】
方法：
【０７９６】
０日目に、形質移入用にインテグリン発現細胞を播種した。細胞をトリプシンで剥離させ、ペレット化した（５分間＠２００×ｇで遠心）。細胞ペレットをＤ１０培地に再懸濁させ、１ｍｌあたりの生細胞を計数する。細胞を０．１ｅ６個の細胞／ｍｌまで希釈し、アッセイプレート中に１００ｕｌ／ウェル（１０，０００個の細胞／ウェル）で播種した。ＣＡＧＡ１２細胞では、２日目にアッセイに使用するためにＴ７５フラスコ１個あたり１５０万個の密度で継代培養した。培養物は３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０７９７】
１日目に、細胞を形質移入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００試薬を用いた形質移入には製造者のプロトコルに従った。手短に述べると、以下をＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉで希釈して５ｕｌ／ウェルとした：０．１ｕｇのＤＮＡ（提示分子）＋０．１ｕｇのＤＮＡ（前駆ＴＧＦβ１）、０．４ｕｌのＰ３０００、およびＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉで５ｕｌまで。ＤＮＡを一緒にピペット操作することによってウェルを混合し、その後、ＯｐｔｉＭＥＭを加える。Ｐ３０００を加え、すべてのピペット操作によって十分に混合する。ＤＮＡ混合物に加えるマスターミックスを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて作製した：０．２ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉで５ｕｌ／ウェルまで。希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００をＤＮＡに加え、ピペット操作によって十分に混合し、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、溶液をピペット操作によって数回混合し、その後、１０ｕｌ／ウェルのＤＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（２×５ｕｌ）を加えた。細胞プレートを組織培養インキュベーターに約２４時間戻した。
【０７９８】
２日目に、抗体およびＴＧＦβレポーター細胞を加えた。機能的抗体希釈液を調製するために、ビヒクル（ＰＢＳが最適）中のストック抗体を段階希釈した。その後、各点をアッセイ培地で希釈して２×最終濃度の抗体とした。抗体を調製した後、吸引し（真空アスピレーター）、続いて１００ｕｌ／ウェルのアッセイ培地を添加することによって、細胞プレートをアッセイ培地で２回洗浄した（ｗｉｓｈｅｄ）。２回目の洗浄後、アッセイ培地を５０ｕｌ／ウェルの２×抗体で置き換えた。細胞プレートをインキュベーターに約１５〜２０分間戻した。
【０７９９】
アッセイ用のＣＡＧＡ１２（クローン４Ａ４）細胞を調製するために、細胞をトリプシンで剥離させ、ペレット化した（５分間＠２００×ｇで遠心）。ペレットをアッセイ培地に再懸濁させ、１ｍｌあたりの生細胞を計数した。細胞を０．３ｅ６細胞／ｍｌまで希釈し、５０ｕｌ／ウェル（１５，０００個の細胞／ウェル）で播種した。細胞をインキュベーターに戻した。
【０８００】
３日目に、抗体および／またはレポーター細胞を加えた約１６〜２０時間後にアッセイを読み取った。読取り前にＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）試薬および試験プレートを室温にさせた。ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）Ｈ１の読取り設定はＴＭＬＣ＿ｓｔｄプロトコルを使用するように設定した。この方法はオートゲイン設定を有する。陽性対照ウェルをオートスケール（高）用に設定した。１００ｕＬ／ウェルのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬を加えた。２分間、振盪しながら、室温で、プレートを光から保護してインキュベートした。プレートをＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１で読み取った。
【０８０１】
Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、またはＩｇＧ対照によるＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１の活性化の阻害をＳＷ４８０β６アッセイで測定した（図３）。
【０８０２】
Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、またはＩｇＧ対照によるＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１の活性化の阻害をＳＷ４８０β６アッセイで測定した（図４）。
【０８０３】
図３３Ｂに提供するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力データを得るために使用した細胞に基づくレポーターアッセイは以下のとおりである。
【０８０４】
アッセイの２日前、１２，５００個のＬＮ２２９細胞／ウェルを白色壁の９６ウェルの組織培養物で処理したアッセイプレートに播種した。翌日に、ＬＮ２２９細胞を、前駆ＴＧＦβ１（ＬＴＢＰアッセイ）、前駆ＴＧＦβ１＋ＧＡＲＰ（ＧＡＲＰアッセイ）、または前駆ＴＧＦβ１＋ＬＲＲＣ３３（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を使用してＧＡＲＰ膜貫通および細胞質ドメインと融合させたＬＲＲＣ３３外部ドメインのキメラ構築体のいずれかをコードしているプラスミドで形質移入した。ＴＧＦβ１アイソフォーム特異性の対照として、そのプロドメイン中におけるＲＧＤ配列の存在が原因でやはりαＶインテグリンによって活性化される、ＬＮ２２９細胞を前駆ＴＧＦβ３で形質移入した。約２４時間後、Ａｂ６を段階希釈し、ＤＭＥＭ＋０．１％のＢＳＡに懸濁させたＣＡＧＡ１２レポーター細胞（１５，０００個の細胞／ウェル）と一緒に形質移入体に加えた。同時培養を設定した約１６〜２０時間後、アッセイを２分間、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ試薬を使用して展開し、ルミネセンスをプレートリーダーで読み取った。抗体ビヒクルの存在下におけるルシフェラーゼ活性は１００％の活性を決定し、１６７ｎＭ（２５μｇ／ｍｌ）の高親和性汎ＴＧＦβ抗体１２．７の存在下におけるシグナルを０％の活性として設定した。
【０８０５】
Ｐｒｉｓｍ  ７および計算された最良の当てはまりのＩＣ５０値を使用して、用量応答活性を３パラメータの対数阻害剤対応答モデルへと非線形的に当てはめた。
【０８０６】
タンパク質分解性ＴＧＦβ１の活性化の阻害を試験するために、ＣＡＧＡ１２レポーター細胞を白色壁の９６ウェルのルミネセンスアッセイプレートに播種した（１２，５００個の細胞／ウェル）。２４時間後、細胞をアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋０．１％のＢＳＡ）で洗浄し、Ａｂ６（２．５μｇ／ｍｌ）および小型潜在型複合体前駆ＴＧＦβ１  Ｃ４Ｓ（１．５ｎｇ／ｍｌ）をアッセイ培地中でＣＡＧＡ細胞に加えた。この混合物を３７℃で４時間インキュベートして、抗体結合させた。このインキュベーションの後、組換えヒト血漿カリクレインプロテアーゼ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を５００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。アッセイ混合物をＣＡＧＡ細胞と共に約１８時間インキュベートし、その後、上述のようにＴＧＦβ１の活性化を生物発光によって読み取った。
【実施例３】
【０８０７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＧＦβ１のプロテアーゼ誘導性活性化に対するＴＧＦβ１に特異的なコンテキスト非依存性抗体の効果
以前に、本出願人は、Ａｂ３（アイソフォーム選択的なコンテキストに偏ったＴＧＦβ１阻害剤）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞に基づく／ＣＡＧＡアッセイで、インテグリン依存性およびＴＧＦβ１のカリクレイン依存性活性化の両方を阻害できることを示した。
【０８０８】
Ａｂ６（アイソフォーム選択的な高親和性のコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤）がＴＧＦβ１のプロテアーゼ依存性活性化を阻害する能力を試験し、Ａｂ３およびＡｂ６の効果をさらに比較するために、２つの細胞に基づく／ＣＡＧＡアッセイを確立した：ｉ）カリクレイン依存性ＴＧＦβ１の活性化ならびにＡｂ３およびＡｂ６の効果、ｉｉ）プラスミン依存性ＴＧＦβ１の活性化ならびにＡｂ３およびＡｂ６の効果。
【０８０９】
手短に述べると、ＣＡＧＡレポーター細胞をアッセイ開始の２４時間前に播種した。前駆ＴＧＦβ１−Ｃ４ＳをＣＡＧＡ細胞に対して力価決定した。プロテアーゼ（血漿−ＫＬＫまたはプラスミン）を示した固定濃度で加えた。アッセイ混合物を約１８時間インキュベートした。ＴＧＦβの活性化をルシフェラーゼアッセイによって測定した。
【０８１０】
第１の研究では、ＫＬＫの存在下で前駆ＴＧＦβ１を活性化した（陽性対照）。このＴＧＦβの活性化はＡｂ３の添加によって有効に阻害され、以前の結果が確認された。同様に、Ａｂ６もＴＧＦβ１のカリクレイン誘導性活性化を阻害した。これらの結果は、ＴＧＦβ１のインテグリン依存性活性化に加えて、アイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害性抗体（偏りありおよびなしの両方）がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＧＦβ１のＫＬＫ依存性活性化を遮断できることを示している（図５Ａ）。
【０８１１】
第２の研究では、組換えヒトプラスミンの存在下で前駆ＴＧＦβ１が活性化された陽性対照）。驚くべきことに、このＴＧＦβの活性化は、ＡＢ６によってのみ有効に阻害された、Ａｂ３によって阻害されなかった。これらの結果は、コンテキストに偏った阻害剤（Ａｂ３）とコンテキストに偏らない阻害剤（Ａｂ６）との間の予想外の機能的差異を明らかにしている（図５Ｂ）。
【実施例４】
【０８１２】
急性腎線維症の片側性尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルにおける、抗ＴＧＦβ１抗体Ａｂ３およびＡｂ６による急性線維症の阻害
抗ＴＧＦβ１抗体による急性線維症の阻害を、急性腎線維症の片側性尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルにおいて試験した。このモデルでは、線維症は、研究０日目の左尿管の永久外科的結紮によって雄マウスにおいて誘導させる。手術を受けたがその尿管を閉塞させなかったニセ処置のマウスを、これらの実験における健康な対照として含めた。
【０８１３】
対照（ＩｇＧ）または試験抗体（Ａｂ３、Ａｂ６）を、研究１および４日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によってマウスに投与した。手術後の５日目の研究の終わりに腎臓を収集し、ＲＮＡをこれらの組織から収集した。続いて、線維症誘導の度合を、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１）、ＩＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ３ａ１）、フィブロネクチン１（Ｆｎ１）、リジルオキシダーゼ（Ｌｏｘ）、リジルオキシダーゼ様２（Ｌｏｘｌ２）、平滑筋アクチン（Ａｃｔａ２）、マトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍｍｐ２）、およびインテグリンアルファ１１（Ｉｔｇａ１１）を含めた線維症関連遺伝子のパネルについて、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｐＣＲ）によって評価した（Ｒｏｌｆｅ、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｇｒｏｂｂｅｌａａｒ、およびＬｉｎｇｅ、２００７年）（Ｔａｍａｋｉら、１９９４年）（Ｂａｎｓａｌら、２０１７年）（ＬｅａｆおよびＤｕｆｆｉｅｌｄ、２０１６年）。
【０８１４】
コラーゲン遺伝子発現に対するＡｂ３またはＡｂ６処置の効果
Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１は線維症の主要な駆動因子である。Ｃｏｌ１ａ１は閉塞した腎臓中で１０〜４０倍誘導されており、Ｃｏｌ３ａ１は５〜２５倍アップレギュレーションされている（Ｐ＜０．００５、ニセ＋ＩｇＧで処置したマウスをＵＵＯ＋ＩｇＧ群と比較）。図７に示すように、３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ３で処置したＵＵＯマウスは、ＵＵＯ＋ＩｇＧと比較して両方のコラーゲン遺伝子の発現の低下を示す（Ｐ＜０．０５）。３または１０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ６を用いた処置も、ＵＵＯによる線維性遺伝子の誘導を抑制した（Ｐ＜０．０５、ＵＵＯ＋ＩｇＧと比較）。総合すると、これらのデータは、Ａｂ３またはＡｂ６のいずれを用いたＴＧＦβ１阻害もＵＵＯに関連するコラーゲン誘導を強力に寛解させることを示唆している。
【０８１５】
フィブロネクチンおよびリジルオキシダーゼ様２の遺伝子発現に対するＡｂ３またはＡｂ６処置の効果
Ｆｎ１およびＬｏｘｌ２は、線維症において細胞外マトリックスの蓄積および硬直における役割を果たすタンパク質をコードしている。図８に示すように、どちらの遺伝子もＵＵＯ＋ＩｇＧ群からの試料中でアップレギュレーションされているが（Ｐ＜０．００５、対ニセ＋ＩｇＧ）、両方の遺伝子、特にＬｏｘｌ２の遺伝子発現の増加の倍数は、コラーゲン遺伝子よりも小さい。３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ３で処置した試料では、本発明者らはＦｎ１およびＬｏｘｌ２の低下（対ＵＵＯ＋ＩｇＧ）のに向かう傾向に留意したが、この処置効果は、Ｌｏｘｌ２発現についてのみ、かつ３ｍｇ／ｋｇ／週の用量についてのみ統計的に有意である（１０ｍｇ／ｋｇ／週の用量のＦｎ１は統計的有意性に近く、Ｐ＝０．０７である）。しかし、３または１０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ６のどちらかを用いた処置は、Ｆｎ１およびＬｏｘｌ２の両方の阻害をもたらす（Ｐ＜０．０５、対ＵＵＯ＋ＩｇＧ）。
【０８１６】
図９は、ＵＵＯモデルにおける、処置後の遺伝子発現の変化（対ＵＵＯ＋ＩｇＧ）の統計的有意性を要約する。Ａｂ３は、試験したすべての用量でＣｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１の低下を示した。統計的に有意な変化がＩｔｇａ１１およびＬｏｘｌ２でも観察されたが（どちらのレベルもＵＵＯ＋ＩｇＧと比較てい低下していた）、３ｍｇ／ｋｇ／週の用量においてのみである。対照的に、Ａｃｔａ２以外の検査したすべての遺伝子が、１０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ６を用いた処置の後に発現の統計的に有意な変化を示した（すべてのレベルがＵＵＯ＋ＩｇＧと比較して低下していた）。さらに、Ａｃｔａ２およびＬｏｘ以外の検査したすべての遺伝子が、３ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ６で処置したマウスにおいても統計的に有意な低下を示した。
【実施例５】
【０８１７】
クラウドマンＳ９１黒色腫モデルにおける腫瘍進行に対する、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３およびＡｂ６の効果
多くのヒト腫瘍が以下の表現型：ｉ）部分組がＰＤ−（Ｌ）１軸の遮断に応答性である、ｉｉ）免疫排除の証拠、ならびにｉｉｉ）ＴＧＦＢ１発現およびＴＧＦβシグナル伝達の証拠によって特徴づけられているという認識に基づいて、また、一般的に使用される同系免疫−腫瘍学マウスモデルはＴＧＦβ１の偏りまたは抗ＰＤ−（Ｌ）１の耐性を概括しないという観察にさらに基づいて、本発明者らは、改善された翻訳可能性についてヒト腫瘍と類似のプロフィールを示すｉｎ  ｖｉｖｏ前臨床モデルを特異的に選択することを追求した（実施例１１を参照）。これらの要因を考慮に入れて、これらの研究においてい記載されているクラウドマンＳ９１黒色腫モデルを含めた、有効性研究を実施するために適切なｉｎ  ｖｉｖｏモデルを選択した。
【０８１８】
黒色腫の腫瘍進行を減少させる、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３およびＡｂ６の効果を評価するために、クラウドマンＳ９１マウス黒色腫モデルを使用した。
【０８１９】
腫瘍細胞培養物
クローンＭ３［クラウドマンＳ９１黒色腫］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−５３．１（商標））細胞をアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手し、ＣＲ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓにて、２．５％のウシ胎児血清、１５％のウマ血清、２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、および２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを添加したカイン（Ｋａｉｇｈｎ）改変ハムＦ１２培地中で指数関数的に増殖する懸濁培養物として維持した。腫瘍細胞は、３７℃、５％のＣＯ２および９５％の空気の雰囲気中で、加湿インキュベーター内の組織培養フラスコ中で成長させた。
【０８２０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ移植および腫瘍成長
腫瘍移植の日に、それぞれの雌ＤＢＡ／２試験マウスに、５０％のマトリゲル中に５×１０６個のクラウドマンＳ９１細胞を側腹部に皮下注射し、腫瘍成長をモニタリングした。腫瘍が１２５〜１７５ｍｍ３の体積に達成した際、マウスを同一の平均腫瘍体積を有する１２匹のグループへとランダム化し、投薬を開始した。カリパスを使用して腫瘍を２次元で測定し、以下の式を使用して体積を計算した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｗ２×ｌ／２
［式中、ｗ＝腫瘍の幅のｍｍであり、ｌ＝腫瘍の長さのｍｍである。腫瘍重量は、１ｍｇが１ｍｍ３の腫瘍体積に等しいという仮定を用いて推定し得る］。
【０８２１】
処置
手短に述べると、１日目に皮下Ｃ９１腫瘍（１２５〜１７５ｍｍ３）を保有するマウス（ｎ＝１２匹）に、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に３ｍｇ／ｋｇのＡｂ６、または１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ６を週に１回、６０日間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ラット抗マウスＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１−１４−ｒＩｇＧ２ａ、ＢｉｏＸＣｅｌ）に、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に１０ｍｇ／ｋｇを週に２回、６０日間ｉ．ｐ．投与した。
【０８２２】
グループ１は抗ＰＤ−１抗体のみを受けた。グループ２は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３（１０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ３は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３（３０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ４は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ５は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ６（３０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。未処置の対照を使用し、データ示さない。
【０８２３】
エンドポイントおよび腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）の分析
カリパスを使用して腫瘍を週に２回測定し、その腫瘍が２，０００ｍｍ３のエンドポイント体積に達した際、または研究の終わり（６０日目）のいずれか早く起こった方に、それぞれの動物を安楽死させた。腫瘍体積エンドポイントのために研究を退出したマウスは、安楽死の日付と共に、腫瘍進行（ＴＰ）のために安楽死させたと記述した。分析のためのエンドポイント到達時間（ＴＴＥ）を、ＷＯ２０１８／１２９３２９号に記載の方法に従って、それぞれのマウスについて計算した。
【０８２４】
パーセント腫瘍成長遅延（％ＴＧＤ）は、未処置の対照と比較した、処置群におけるエンドポイント到達時間の中央値の増加として定義し、対照のエンドポイント到達時間（ＴＴＥ）の中央値の百分率として表す：
Ｔ＝処置のＴＴＥの中央値
Ｃ＝対照のＴＴＥの中央値
％ＴＧＤ＝（（Ｔ−Ｃ）／Ｃ）＊１００
【０８２５】
抗ＰＤ１処置は、アイソタイプ対照処置と比較して２５％のＴＧＤをもたらした。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１／Ａｂ３は１４％のＴＧＤを有していた一方で、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１／Ａｂ３は９２％のＴＧＤを有していた。抗ＰＤ１処置単独における２９．８日間と比較して、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１／Ａｂ３のエンドポイント到達時間の中央値は４５．８日間であった。
【０８２６】
第２のクラウドマンＳ９１研究では、抗ＰＤ−１処置は、アイソタイプ対照処置と比較して４８％のＴＧＤをもたらした。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ３は１２２％のＴＧＤを有していた一方で、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ３は２１７％のＴＧＤを有していた。１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ６はどちらも２１７％のＴＧＤを有していた。抗ＰＤ−１のエンドポイント到達時間の中央値は３４．６日間であり、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ３では５１．７日間であり、３０ｍｇ／ｋｇでは７４日間で研究の終わりまでであった。１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ６はどちらも、７４日間での研究の終わりに生存期間中央値に達しなかった。
【０８２７】
研究からの結果は、抗ＰＤ−１と組み合わせた３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３の投与が、処置したマウスにおいて生存を延長させたことを示す。図１０に示すように、５０％の生存に達するまでに、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ３で処置したマウスは約４５日間かかった一方で、１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３およびＰＤ−１単独で処置したマウスは、約３０日未満で５０％の生存に達し、これは、ＰＤ−１およびＴＧＦβ１の同時阻害が延命効果をもたらしたことを示す。
【０８２８】
図１１Ａに示すように、抗ＰＤ１と組み合わせた１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３またはＡｂ６の投与は腫瘍成長を遅延させた。ＰＤ−１単独で処置した８匹のマウスは２０００ｍｍ３の腫瘍体積に達した一方で（点線によって示す）、抗ＰＤ−１および１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３で処置した６匹のマウスならびに抗ＰＤ−１および３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３で処置した４匹のマウスのみが２０００ｍｍ３の腫瘍体積に達した。抗ＰＤ−１および１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ６で処置した３匹のマウスならびに抗ＰＤ−１および３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ６で処置した５匹のマウスのみが２０００ｍｍ３の腫瘍体積に達した。図１１Ｂは、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３またはＡｂ６を用いた処置後の腫瘍進行中央値を示す。
【０８２９】
別のＳ９１研究を行って、抗ＰＤ−１抗体とＡｂ６（３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ）との組合せによって達成される有効な腫瘍制御を評価した。抗腫瘍応答を定量するために、処置に応答した「有効な腫瘍制御」を、研究終了時に２，０００ｍｍ３の生存閾値（たとえばエンドポイント腫瘍体積）の２５％未満の腫瘍体積を達成した、それぞれの試験群内の動物の百分率として定義した。結果を以下に要約する（図１１Ｃ、１１Ｅ、および１１Ｆを参照）。
表２０．クラウドマンＳ９１有効性の要約
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【０８３０】
図１１Ｃに示すように、クラウドマンＳ９１モデルは単独療法としてのＰＤ−１遮断に対して応答性が乏しいとして認識されているにもかかわらず、３つすべての用量での組合せ処置を受けたほとんどの動物（それぞれ８３％、７８％、および７３％）は有効な腫瘍制御を達成し（たとえば腫瘍体積が５００ｍｍ３以下まで低下した）、Ａｂ６の頑強な相乗効果を実証している。したがって、チェックポイント遮断療法（抗ＰＤ−（Ｌ）１など）に対するヒト一次耐性を反映する同系マウス腫瘍モデルにおいては、Ａｂ６を用いた処置は、クラウドマンＳ９１（黒色腫）腫瘍を抗ＰＤ１治療に対して脆弱にした。Ａｂ６（１週間あたり３ｍｇ／ｋｇと低い）および抗ＰＤ１抗体を用いた組合せ処置は有意な腫瘍回帰または有効な腫瘍制御をもたらした。ここで達成された相乗的な腫瘍成長遅延は、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤を、チェックポイント阻害に対して耐性であるＴＧＦβ１陽性腫瘍を有する対象を処置するために、チェックポイント遮断療法と併せて使用できることを示す。組合せ処置群では、抗ＰＤ−１と併せて試験したＡｂ６のすべての用量（３ｍｇ／ｋｇは水色、１０ｍｇ／ｋｇは濃青色、および３０ｍｇ／ｋｇは紫色）が有意な腫瘍制御を達成した（それぞれ１２匹のうちの９匹、９匹のうちの４匹、および１１匹のうちの８匹）。まとめると、これらの動物の６５％を超えるものが、エンドポイント腫瘍体積の２５％未満である腫瘍体積の低下を達成した。結果を腫瘍体積中央値としても示す（図１１Ｅ）。すべての組合せ処置群（３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ６）は試験した用量で類似の抗腫瘍効果を示し、このモデルにおいて、Ａｂ６が３ｍｇ／ｋｇと低い用量で効果的であることを示唆している。これは延命効果にも反映されている（図１１Ｆを参照）。
【０８３１】
上述の有効性研究の終わりに処置を停止し、有意な腫瘍制御を達成した動物における腫瘍体積の変化のモニタリングを延長することによって、ＴＧＦβ１およびＰＤ−１の合わせた阻害の永続的抗腫瘍効果を検査した。図１１ＣからのクラウドマンＳ９１腫瘍を経験した応答者を、投薬なしで６週間追跡した（灰色ボックス）。図１１Ｄに示すように、Ａｂ６／抗ＰＤ−１の組合せでの延長された腫瘍制御が達成された。報告した数は、研究終了時に制御された腫瘍を有する動物の数である。
【０８３２】
さらに、抗ＰＤ１で処置する動物においてＡｂ６（１用量あたり３ｍｇｋ、１０ｍｇｋ、または３０ｍｇｋ）を評価する、Ｓ９１腫瘍モデルの継続中の研究において、図１１Ｆに示すように、組合せ処置は有意な延命効果をもたらす。３８日目に、抗ＰＤ１／Ａｂ６（３０ｍｇｋ）の組合せを受けたすべての動物は生存しており（たとえば３０ｍｇｋの用量群で３８日目に１００％の生存）、組合せ群（３、１０、および３０ｍｇｋ）中の動物はどれも生存期間中央値に達していなかった（研究継続中）。研究の終わりに、組合せ処置群中の動物の９０％が生存した。これらのデータは、Ａｂ６などのアイソフォーム選択的阻害剤ＴＧＦβ１を、延命効果を達成するためにチェックポイント遮断療法を受けている対象において、チェックポイント阻害耐性腫瘍を処置するために使用できることを示す。図１１Ｃ〜１１Ｆについて、緑色＝ＩｇＧ対照（３０ｍｇ／ｋｇ、週に１回）、オレンジ色＝Ａｂ６（３０ｍｇ／ｋｇ、週に１回）、赤色＝抗ＰＤ１（５ｍｇ／ｋｇ、週に２回）、水色＝抗ＰＤ１＋Ａｂ６（３ｍｇ／ｋｇ）、濃青色＝抗ＰＤ１＋Ａｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）、紫色＝抗ＰＤ１＋Ａｂ６（３０ｍｇ／ｋｇ）。
【実施例６】
【０８３３】
ＭＢＴ２同系膀胱癌モデルにおける、抗ＰＤ−１と組み合わせたＡｂ３およびＡｂ５によるＴＧＦβホスホ−ＳＭＡＤ２／３経路の阻害
ＭＢＴ−２尿路上皮癌モデルを、チェックポイント阻害剤と組み合わせたＴＧＦβ１特異的阻害を試験するためのＴＧＦβ１優勢腫瘍として選択した。薬力学的研究では、下流ＴＧＦβシグナル伝達に対する抗ＰＤ１と組み合わせたＡｂ３またはＡｂ５の効果を、ＭＢＴ−２モデルにおいて評価した。ホスホ−ＳＭＡＤ２／３アッセイは、製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって行った。
【０８３４】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ移植および腫瘍成長
腫瘍移植の日に、それぞれの雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ試験マウスに、５×１０５個のＭＢＴ２腫瘍細胞を側腹部に皮下注射し、腫瘍成長をモニタリングした。腫瘍が４０〜８０ｍｍ３の体積に達成した際、マウスを同一の平均腫瘍体積を有する１０匹のグループへとランダム化し、投薬を開始した。カリパスを使用して腫瘍を２次元で測定し、以下の式を使用して体積を計算した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｗ２×ｌ／２
［式中、ｗ＝腫瘍の幅のｍｍであり、ｌ＝腫瘍の長さのｍｍである。腫瘍重量は、１ｍｇが１ｍｍ３の腫瘍体積に等しいという仮定を用いて推定し得る］。
【０８３５】
処置
手短に述べると、１日目に皮下ＭＢＴ２腫瘍（４０〜８０ｍｍ３）を保有するマウス（ｎ＝１０匹）に、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に３ｍｇ／ｋｇのＡｂ５、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ５、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３、または１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３を１および８日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ラット抗マウスＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１−１４−ｒＩｇＧ２ａ、ＢｉｏＸＣｅｌ）に、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に１０ｍｇ／ｋｇを１、４、および８日目にｉ．ｐ．投与した。
【０８３６】
グループ１は抗ＰＤ−１抗体のみを受けた。グループ２は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ５（３ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ３は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ５（１０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ４は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３（１０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ５は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３（３０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。未処置の対照を使用し、これは示していない。
【０８３７】
ＳＭＡＤ２／３シグナル伝達の抑制
動物を屠殺し、８日目の最終用量の８時間に腫瘍を取り出し、フラッシュ凍結した。腫瘍をドライアイス上で微粉砕し、スパイクしたホスファターゼ阻害剤を加えてタンパク質溶解物を作製した。
【０８３８】
結果はリン酸化対総ＳＭＡＤ２／３比によって評価した。図１２に示すように、持続性ＳＭＡＤ２／３シグナル伝達は、抗ＰＤ−１と組み合わせたＡｂ３またはＡｂ５のどちらで処置した動物においても有意に抑制されており、Ａｂ５（１０ｍｇ／ｋｇ）が最も有意な抑制を示した。これらのデータは、下流シグナル伝達の抑制をもたらすＴＧＦβ１活性化阻害剤の有効な標的会合を実証している。
【実施例７】
【０８３９】
ＭＢＴ２同系膀胱癌マウスモデルにおける腫瘍進行に対する、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３およびＡｂ６の効果
抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３およびＡｂ６の、膀胱癌腫瘍進行を減少させる能力を評価するために、ＭＢＴ２同系膀胱癌マウスモデルを使用した。これは非常に攻撃的かつ成長の速い腫瘍モデルであり、腫瘍進行を薬物処置で克服するのは非常に困難である。
【０８４０】
腫瘍細胞培養物
ＭＢＴ２は、雌Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウスにおける移植可能なＮ−［４−（５−ニトロ−２−フリル）−２−チアゾリル］ホルムアミド誘導性膀胱癌に由来する、分化の乏しいネズミ膀胱癌細胞系である。細胞を１０％のウシ胎児血清および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）−１６００培地中、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。培養培地を隔日に置き換え、細胞のコンフルエンシーが９０％に達した際に継代培養を行った。トリプシン処理によって細胞をサブコンフルエントの培養物から収集し、無血清培地で洗浄した。＞９０％の細胞生存度を有する単個細胞懸濁液をトリパンブルー排除によって決定した。注射前に細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。
【０８４１】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ移植および腫瘍成長
移植に使用するＭＢＴ２細胞を対数期成長中に収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。腫瘍移植の日に、それぞれの試験マウスに、５×１０５個の細胞（０．１ｍＬの細胞懸濁液）を側腹部に皮下注射し、腫瘍成長をモニタリングした。腫瘍が平均４０〜８０ｍｍ３に達した際、マウスを１５匹のグループへとランダム化した。
【０８４２】
カリパスを使用して腫瘍を２次元で測定し、以下の式を使用して体積を計算した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝ｗ２×ｌ／２
［式中、ｗ＝腫瘍の幅のｍｍであり、ｌ＝腫瘍の長さのｍｍである。腫瘍重量は、１ｍｇが１ｍｍ３の腫瘍体積に等しいという仮定を用いて推定し得る］。
【０８４３】
処置
手短に述べると、１日目に皮下ＭＢＴ２腫瘍（４０〜８０ｍｍ３）を保有するマウス（ｎ＝１５匹）に、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に３ｍｇ／ｋｇのＡｂ６、または１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ６を週に１回、２９日間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。ラット抗マウスＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１−１４−ｒＩｇＧ２ａ、ＢｉｏＸＣｅｌ）に、１０ｍＬ／ｋｇの投薬体積中に１０ｍｇ／ｋｇを週に２回、２９日間ｉ．ｐ．投与した。
【０８４４】
グループ１は抗ＰＤ−１抗体のみを受けた。グループ２は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３（１０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ３は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３（３０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ４は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ６（３ｍｇ／ｋｇ）を受けた。グループ５は抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）を受けた。未処置の対照を使用し、これは示していない。
【０８４５】
エンドポイントおよび腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）の分析
カリパスを使用して腫瘍を週に２回測定し、その腫瘍が１，２００ｍｍ３のエンドポイント体積に達した際、または研究の終わりに、それぞれの動物を安楽死させた。腫瘍体積エンドポイントのために研究を退出したマウスは、安楽死の日付と共に、腫瘍進行（ＴＰ）のために安楽死させたと記述した。分析のためのエンドポイント到達時間（ＴＴＥ）を、ＷＯ２０１８／１２９３２９号に記載の方法に従って、それぞれのマウスについて計算した。
【０８４６】
１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１／Ａｂ３は１９１％のＴＧＤを有しており、３０ｍｇ／ｋｇでは１９６％のＴＧＤであった。３ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１／Ａｂ６は６８％のＴＧＤであり、１０ｍｇ／ｍｋでは１９６％のＴＧＤであった。処置に起因する部分応答（ＰＲ）は、研究の経過中、３つの連続した測定についてその１日目の体積の５０％以下であり、かつこれら３つの測定のうちの１つまたは複数について１３．５ｍｍ３以上であった腫瘍体積として定義する。完全応答（ＣＲ）では、腫瘍体積は研究の経過中、３つの連続した測定について１３．５ｍｍ３未満であった。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ３は研究終了時に０匹のＰＲおよび４匹のＣＲを有していた。３０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ３は研究終了時に１匹のＰＲおよび１匹のＣＲを有していた。３ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ６は０匹のＰＲおよび３匹のＣＲを有していた。１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１／Ａｂ６は０匹のＰＲおよび５匹のＣＲを有していた。
【０８４７】
図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、抗ＰＤ−１と組み合わせＡｂ３の投与は、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの用量のどちらにおいても腫瘍成長を遅延させた。一部の動物は腫瘍の完全回帰を示した。また、抗ＰＤ−１と組み合わせたＡｂ６の投与は、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量のどちらにおいても腫瘍成長を遅延させた。一部の動物は腫瘍の完全回帰を示した。ＰＤ−１単独で処置したマウスのほとんどが約８日目から１４日目の間に１０２４ｍｍ３の腫瘍体積（点線によって示す）に達した一方で、１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３、３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３、３ｍｇ／ｋｇのＡｂ６、または１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ６で処置したマウスは１０２４ｍｍ３の腫瘍体積に達するまでに２８日間までの多くの日数がかかった。図１３Ｃは、抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡｂ３（左上）またはＡｂ６（右上）を用いた処置後の腫瘍進行中央値を示す。下のグラフは、抗ＰＤ−１と組み合わせたＡｂ３またはＡｂ６を投与したマウスにおける、１５日目での腫瘍体積中央値（ｍｍ３）を要約する。抗ＰＤ−１と組み合わせたＡｂ３（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ａｂ３（３０ｍｇ／ｋｇ）、またはＡｂ６（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスにおける１５日目での腫瘍体積中央値は約５００ｍｍ３以下であった一方で、抗ＰＤ−１単独で処置したマウスにおける１５日目での腫瘍体積中央値は１０００ｍｍ３以上であった（下のグラフ）。
【０８４８】
図１３ＤはＭＢＴ２におけるＡｂ６の有効性を表示する。５つの処置群からのマウスにおける腫瘍進行を示す。対照ＩｇＧ、Ａｂ６単独、または抗ＰＤ−１単独を受けた動物はどれも、エンドポイント体積の２５％以下まで低下した腫瘍体積として定義される有効な腫瘍制御を達成しなかった（それぞれ上部および下部の点線で示す）。対照的に、Ａｂ６／抗ＰＤ−１の組合せ処置を受けた合わせて２８匹中の１２匹の動物（約４３％）が有効な腫瘍（ｔｕｒｍｏｒ）制御を達成し、これは、ＰＤ−１およびＴＧＦβ１経路の同時阻害が腫瘍成長を有意に低下（たとえば遅延または回帰）させることができることを示す。
【０８４９】
さらに、組合せ処置は、３つすべての処置群において抗ＰＤ−１単独と比較して生存の延長に有効であった。図１４に示すように、５０％の生存に達するまでに、１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３または１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ６で処置したマウスは２８日間より長くかかった一方で、ＰＤ−１単独で処置したマウスは、約１６日間で５０％の生存に達した。まとめると、これらの結果は組合せ療法の延命効果を実証する。
【０８５０】
結果の要約および考察
腫瘍成長に対するＡｂ６−抗ＰＤ−１の相乗効果：Ａｂ６の発見は、ＴＧＦβ１の活性化の選択的阻害がＣＢＴに対する腫瘍の一次耐性を克服するために十分であろうという仮説の直接評価を可能にする。前臨床試験では、本発明者らは、ＣＢＴに対する一次耐性を示すヒト腫瘍の主要な特長の一部を概括するネズミ同系腫瘍モデルを同定することを追求した。モデル選択の基準としては、１）他の同系腫瘍モデルにおいて効果的であると示された用量で、抗ＰＤ−（Ｌ）１単一薬剤の処置に対する応答がわずかであるまたはない、２）浸潤性ＣＤ３＋Ｔ細胞の欠乏を伴った免疫排除の証拠、３）活性ＴＧＦβシグナル伝達の証拠、および４）ＴＧＦβ１アイソフォーム発現の証拠が挙げられる。
【０８５１】
公的に利用可能な全腫瘍由来ＲＮＡのＲＮＡｓｅｑデータセットを含めた、腫瘍応答および腫瘍プロファイリングデータの探求は、これらの基準を満たした３つの腫瘍モデルの選択をもたらした：ＭＢＴ−２膀胱癌モデル（ＭＢＴ−２）、クラウドマンＳ９１（Ｓ９１）黒色腫モデル、およびＥＭＴ−６乳癌モデル（ＥＭＴ−６）。全腫瘍ＲＮＡｓｅｑデータの分析は、免疫排除された表現型と一貫した、ＴＧＦβ経路の活性化の指標であるＴＧＦβ応答遺伝子のアップレギュレーション、およびエフェクターＴ細胞遺伝子の低い発現を実証している（図２０Ｆ）。総ＴＧＦβアイソフォームタンパク質発現についてプロービングするための、ＥＬＩＳＡによる全腫瘍溶解物の分析により、ＴＧＦβ１成長因子が３つすべてのモデルにおいて広く普及していることが見出された。
【０８５２】
マウス同系モデルにおいてＡｂ６を評価するために、本発明者らは、免疫原性を最小限にするために、Ａｂ６を、マウスＩｇＧ１／カッパ定常ドメインと融合させたＡｂ６のヒトＶドメインのキメラ抗体として発現させた。Ａｂ６−ｍＩｇＧ１は完全ヒトＡｂ６と類似の阻害活性を有する。本発明者らは、ＭＢＴ−２腫瘍を保有する動物が、治療レベルで投薬した場合に抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）に対して、およびＡｂ６−ｍＩｇＧ１単独に対して耐性であることを確認した。しかし、組み合わせると、１週間あたり３ｍｇ／ｋｇまたは１週間あたり１０ｍｇ／ｋｇのどちらかで投薬した抗ＰＤ−１およびＡｂ６−ｍＩｇＧ１は、それぞれ２１％および３６％の腫瘍のない生存者、ならびにそれぞれの研究の持続期間にわたる有意な延命効果を含めた、腫瘍量の有意な低下をもたらした（図１３Ｄおよび１４）。全体として、抗ＰＤ−１単独の０／１３匹と比較して、４／１４匹の動物が抗ＰＤ−１／Ａｂ６−ｍＩｇＧ１（１週間あたり３ｍｇ／ｋｇ）に応答し、８／１４匹が抗ＰＤ−１／Ａｂ６−ｍＩｇＧ（１週間あたり１０ｍｇ／ｋｇ）に応答した。本発明者らは、穏やかに抗ＰＤ−１応答性のクラウドマンＳ９１黒色腫モデルにおいて類似の応答を観察した。ここでも、抗ＰＤ−１／Ａｂ６−ｍＩｇＧ１の組合せ処置は、すべての用量レベルで７５％までの応答率および有意な生存利点を伴った著しい腫瘍抑制をもたらした（実施例５を参照）。
【０８５３】
次に、本発明者らはＭＢＴ−２腫瘍のない生存者において抗腫瘍応答の永続性を評価した。処置を中断し、動物を７週間追跡した。本発明者らは、どの動物においても検出可能な腫瘍の再発を観察しなかった（実施例８を参照）。
【０８５４】
ＴＧＦβシグナル伝達がＣＢＴの有効性に損害を与えるほどの免疫排除を駆動するという臨床由来の仮説と、汎ＴＧＦβ阻害が、免疫系がこの耐性機構を克服してＣＢＴの有効性を促進することを可能にできるという以前に報告されている前臨床の実証とが、本発明の抗体で見られる有意な腫瘍応答および延命効果が腫瘍免疫構成の関連する変化に対応し得るかどうかを検査することを、本発明者らに部分的に促した。
【０８５５】
単一薬剤としてまたは組み合わせの抗ＰＤ−１またはＡＢ６−ｍＩｇＧ１処置の免疫効果を研究するために、ＭＢＴ−２腫瘍をマウスから処置開始の１０日後に収集し、その後、選定された免疫細胞マーカーの免疫組織化学的分析およびフローサイトメトリー分析に供した。フローサイトメトリー分析は、ＣＤ４５＋免疫区画の全体的な百分率が処置で変化しなかったことを明らかにした一方で、抗ＰＤ−１およびＡｂ６−ｍＩｇＧ１の組合せは、アイソタイプ対照抗体処置と比較してこの区画でのＣＤ８＋Ｔ細胞の提示の１０倍の増加を引き起こした（それぞれ平均３．５％対３４％（図２７Ｂ）。注目すべきは、抗ＰＤ−１を用いた単一薬剤処置がＣＤ８＋細胞の提示の中程度の増加をもたらすように思われるが、観察された増加はこの研究では有意性に達しなかった。さらに、これらの腫瘍に由来するＲＮＡの分析は細胞毒性Ｔ細胞活性化のマーカーの増加を示し、これはＣＤ８＋細胞数の増加と一貫しており、これらの細胞の活性エフェクター機能の指標である（図３２Ｄ）。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の提示の有意な増加も組合せ処置で観察されたことは注目すべきである。組合せ処置で観察された有意な抗腫瘍効果を考慮すると、Ｔｒｅｇ細胞のこの増加の関連性は不明確である。しかし、Ｔｒｅｇ：ＣＤ８の比は組合せ処置に応答して変更されなかった。興味深いことに、抗ＰＤ−１／Ａｂ６−ｍＩｇＧ１の組合せ処置は、ＭＢＴ−２腫瘍内の全体的なＣＤ１１ｂ＋細胞の提示の有意な低下も誘導した。これは、それぞれ免疫抑制性Ｍ２様マクロファージおよび骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）に対応する、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋部分集団における選択的低下が原因であると思われる。まとめると、これら２つの細胞集団の提示は、ＣＤ４５＋細胞集団の平均４７％から組合せ処置後の１４％まで低下する（図２８Ｂ）。Ｍ１様マクロファージ部分集団（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６−）は処置で変化しないように思われ、これは、ＰＤ−１／ＴＧＦβ１遮断が腫瘍内の免疫抑制環境に対して選択的であるが広範な影響を持ち、リンパ系および骨髄の区画のどちらにも有益な影響を与えることを示す。
【０８５６】
組み合わせたＰＤ−１およびＴＧＦβ１阻害が有意なＣＤ８＋Ｔ細胞の進入および／または腫瘍微小環境内への拡大をもたらす具体的な機構は不明確である。したがって、本発明者らは、ＴＧＦβ経路の活性と免疫排除との間の関係性に関する追加の見識を集めるために、より詳細な組織学的分析を引き受けた。最初に、本発明者らは、免疫組織化学的分析によって、対照群ＭＢＴ−２腫瘍全体にわたってＣＤ８＋染色の有意な増加を確認し、これはフローサイトメトリーデータと一致している（図３０）。次に、本発明者らは、腫瘍微小環境中のどの細胞が活性化ＴＧＦβ１に応答性であり得るかを決定する試みにおいて、ＴＧＦβ応答性遺伝子の活性化を媒介する転写因子であるホスホ−Ｓｍａｄ３（ｐＳｍａｄ３）の免疫組織化学的分析を行った。
【０８５７】
驚くべきことに、抗ＰＤ−１で処置したおよび対照マウスからの腫瘍において、ｐＳｍａｄ３染色は腫瘍血管内皮の核に大部分が閉じ込められているように見え、このシグナルはＡｂ６−ｍＩｇＧで処置した際に大きく減弱した（図３０Ｆ）。
【０８５８】
末梢血管のＴＧＦβシグナル伝達の関連性をさらに探求するため、本発明者らはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ３１＋血管内皮を同時染色した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３１＋腫瘍血管に隣接するよう生きにおいて富化されているように見える（図３０Ｆおよび３０Ｇ）。この観察により、腫瘍血管構造がＴ細胞進入の経路として役割を果たし得る可能性が持ち上がる。他の研究者は、ＴＧＦβシグナル伝達が、Ｔ細胞が腫瘍内に入ることについて障壁を形成する、線維芽細胞に富んだ腫瘍周辺間質の存在に関連していると報告しているが、本発明者らの予備観察は、追加のＴＧＦβ１依存性の血管障壁が、ＣＤ８＋Ｔ細胞が腫瘍内に入ることの防止において顕著な役割を果たし得ることを示唆している。
【実施例８】
【０８５９】
ＭＢＴ−２、クラウドマンＳ９１、およびＥＭＴ−６腫瘍における抗ＰＤ１／Ａｂ３および抗ＰＤ１／Ａｂ６の完全応答者の永続的な抗腫瘍適応免疫記憶応答の発生
１．ＭＢＴ−２腫瘍における抗腫瘍記憶
以前にＭＢＴ２腫瘍が除去された完全応答者において強力かつ永続的な適応免疫応答が生じたかどうかを確定するために、腫瘍再誘発実験を実施した。
【０８６０】
方法
８〜１２週齢の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに、５×１０５個のＭＢＴ２腫瘍細胞を側腹部に皮下移植した。腫瘍が４０〜８０ｍｍ３の平均サイズに達した際に動物を処置群にランダム化して、処置を開始した。開始平均腫瘍体積は群にわたって等しかった。抗ＰＤ１（ＲＭＰ１−１４）を週に２回、１０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投薬し、Ａｂ３を週に１回、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇで投薬し、Ａｂ６を３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで５週間投薬した。５週間後、少なくとも３回の連続した測定で１３．５ｍｍ３未満の腫瘍体積を有する、すべての抗ＰＤ１／Ａｂ３および抗ＰＤ１／Ａｂ６の動物を「完全応答者（ＣＲ）」とみなした。測定は週に２回行った。抗ＰＤ１単独を受けたマウスではそのような完全応答者は存在しなかった。再誘発実験では、完全応答動物は測定可能な腫瘍を全く有さなかった（たとえば０ｍｍ３）。以前に投薬した化合物の洗い出しを可能にするために、これらの完全応答者を投薬なしで７週間（「洗い出し」期間）追跡した（たとえば「休ませた」）。７週間の終わりに、完全応答者および年齢適合のナイーブ対照動物に５×１０５個のＭＢＴ２腫瘍細胞を反対側の側腹部に皮下注射した。動物を、２５日間または腫瘍体積が１２００ｍｍ３を超えるまでのいずれか早い方まで追跡した。エンドポイントは１２００ｍｍ３の腫瘍体積として定義した。エンドポイントに達した際、動物を屠殺した。
【０８６１】
結果
有効性研究からの完全応答者に、さらなる処置なしに、元の移植の反対側の側腹部にＭＢＴ−２細胞を皮下再移植した場合、完全応答マウスのいずれにおいても検出可能な腫瘍成長は観察されなかった一方で、対照の年齢適合の腫瘍にナイーブなマウス群はすべて、移植の３週間以内に測定可能な腫瘍を発生した（図１５）。
【０８６２】
より詳細には、腫瘍再誘発モデルは、転移または腫瘍再発に対する免疫記憶および監視を実証する手段である。これらの事例において、完全応答者（処置に応答して完全な腫瘍回帰を達成した動物）に腫瘍細胞を再移植し、成長を年齢適合のナイーブマウスと比較した。ナイーブ動物における腫瘍の出現は２５日目までに１００％（１２／１２匹）であり（図１５）、いくつかの動物がエンドポイント基準に達していた。上述のようにＭＢＴ２細胞で再誘発した、図１３Ａおよび１３Ｂの研究からの完全応答者は、研究の終わりまでに検出可能な腫瘍を有さず（併せて０／９匹の完全応答者）、これは、完全応答者の１００％がＭＢＴ２腫瘍再誘発に対して頑強な免疫記憶を保持していることを示す。これらの結果は、腫瘍抗原に対する永続的かつ強力な記憶応答が腫瘍を経験した動物において生じることを示し、初期曝露における腫瘍クリアランスが適応免疫応答に関連していたことを示唆している。この適応免疫応答は腫瘍細胞を破壊し、腫瘍の確立を妨げるために十分であり、これらの動物における転移または腫瘍再発の継続的な抑制を示唆するであろう。さらに、これは初回免疫応答中のＴＧＦβ１阻害が記憶リンパ球集団の発生と干渉しないことを実証している。
【０８６３】
ＭＢＴ−２腫瘍モデルからのこれらの再誘発の結果は、ＴＧＦβ１およびＰＤ−１の合わせた阻害がこれらの動物において永続的かつ強力な抗腫瘍免疫記憶を確立するために十分であることを示す。
【０８６４】
２．クラウドマンＳ９１における永続的抗腫瘍効果
注目すべきは、抗ＰＤ−１／Ａｂ６の組合せ群中のクラウドマンＳ９１腫瘍を保有するマウスの何匹か完全応答を経験した一方で、一部の動物は、残りの処置期間にわたって小さいが安定した残留腫瘍塊を支持していたことである。本発明者らは、ＭＢＴ−２で行ったものと同様に、このモデルにおいて腫瘍再誘発データを概括することを追求した。しかし、腫瘍の獲得率はこのモデルでは可変であり、この分析をより困難にした。その代わりに、本発明者らは処置を止めて動物を数週間追跡することを選択した。
【０８６５】
処置の停止の６週間後、処置停止時に測定可能な腫瘍を有さないマウスは腫瘍のないままであった。投薬停止時に測定可能な腫瘍は混合応答を有しており、多くは除去されたが、いくつかは安定に保たれたまたは大きくなった（図１１Ｄ）。これらのデータは、完全な腫瘍クリアランスが達成されるまで処置を維持することの重要性を強調している（実施例５も参照）。
【０８６６】
３．ＥＭＴ−６における永続的抗腫瘍効果
特筆すべきことに、本発明者らは、ＥＭＴ−６乳癌モデルにおいて抗ＰＤ−１／Ａｂ６−ｍＩｇＧ１の組合せに対して類似の応答を観察し、組合せ処置の後に５０％の完全応答率および抗ＰＤ−１を超える有意な生存上の利点が伴っていた（図３４Ａおよび３４Ｃ）。ＴＧＦβ１が優性発現されるアイソフォームであるＭＢＴ−２およびクラウドマンＳ９１とは対照的に、ＥＭＴ６はＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方において同様のレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を発現する。この処置の組合は抗ＰＤ−１／汎ＴＧＦβ阻害よりも効果的であり、これは、複数のＴＧＦβアイソフォームの存在下においてさえも、ＴＧＦβ１が免疫排除、したがって一次耐性の主な駆動因子であることを示唆している。このモデルでは、本発明者は処置を停止し、投薬停止の６週間後に完全応答者は腫瘍のないまま保たれることを再度確認し、応答の永続性が再度実証された（図３４Ｃ、右）。
【実施例９】
【０８６７】
抗体スクリーニング、選択方法、および特徴づけ
成熟ＴＧＦβ１成長因子とその密に関連するファミリーメンバーであるＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３との間の高い配列および構造の類似度を考慮して、本発明者らは、このＴＧＦβ１成長因子の活性型を標的とする、選択的かつ十分に高い親和性の抗体に基づく阻害剤の作製が困難であることが判明するであろうと推論した。潜在型ＴＧＦβ１の構造、および特定のインテグリンとの相互作用を介したその活性化の機械的側面に関する最近報告された見識は、作用機構として潜在型複合体の活性化を防止することを目的とする、潜在型ＴＧＦβ１複合体中のプロドメインを標的化する可能性を指摘している。
【０８６８】
結合および活性化阻害の両方におけるアイソフォーム選択性の達成は、それぞれの成長因子ホモ二量体を制限して不活性にする、ファミリーメンバープロドメイン間のより低い配列類似度を活用するであろう。ＴＧＦβ１の活性化の選択的阻害剤を同定するためのさらなる主要な考慮事項は、潜在型ＴＧＦβ１が、細胞外マトリックスまたは細胞表面上のその同化のいずれか上への不活性成長因子複合体の蓄積を許可するジスルフィド結合大型潜在型複合体（ＬＬＣ）へとアセンブルされることである。複数のＴＧＦβ１  ＬＬＣが腫瘍微小環境中で発現され得るという可能性を考慮して、ＴＣＧＡからのＲＮＡｓｅｑデータを分析した。本質的にすべての腫瘍種が、４つの前駆ＴＧＦβ１−提示分子、すなわち、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、およびＬＲＲＣ３３の発現の証拠を示す（図２０Ｅ）。したがって、本発明者らは、これらの局所的コンテキストすべてにおいて潜在型ＴＧＦβ１と結合して活性化を阻害するであろう具体的な抗体を同定することを追求した。
【０８６９】
それぞれのＴＧＦβ１  ＬＬＣの可溶性のネズミおよびヒト形態を設計し、発現させ、精製し、特徴づけ、酵母に基づくナイーブなヒト抗体ディスプレイライブラリの注意深く設計したスクリーニングにおける陽性選択ステップに使用した。選択的な潜在型ＴＧＦβ１結合剤の同定を確実にするために、複合体形成していないＬＬＣ−提示分子も陰性選択ステップにおいて使用した。
【０８７０】
親抗体は、ＴＧＦβ１  ＬＬＣ（ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、およびＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１）のヒトおよびネズミ形態を陽性選択抗原として使用して酵母に基づくナイーブな完全ヒトＩｇＧ抗体ライブラリを選択し、ヒトおよびネズミのＬＬＣ−提示分子（ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、およびＧＡＲＰ）に対して対抗選択することを介して、同定した。選択は、２ラウンドの磁気ビーズ支援細胞分取（ＭＡＣＳ）および続く数ラウンドの蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む多ラウンド工程であった。ＭＡＣＳラウンドは、事前清掃（非特異的な結合剤を除去するため）、ビオチン標識した抗原とのインキュベーション、洗浄、溶出、および酵母増幅を含んでいた。ＦＡＣＳ選択ラウンドは、ビオチン標識した抗原とのインキュベーション、洗浄、およびフローサイトメトリーによる結合（陽性選択について）または非結合（陰性もしくは除外のため）集団の選択、続いて、適切な酵母増殖培地中での成長による選択された酵母の増幅を含んでいた。すべての選択を溶液相において行った。
【０８７１】
数百個のユニークな抗体が完全長ヒトＩｇＧ１ａｇｌｙ（脱グリコシル化されたＦｃ）モノクローナル抗体として発現された。その後、これらの抗体をバイオレイヤー干渉法によって特徴づけて、ヒトおよびネズミのＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、ＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、およびＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１と結合するその能力を決定した。これらのＴＧＦβ１  ＬＬＣと結合した抗体を試験し、細胞に基づく効力スクリーニングアッセイ（ＬＴＢＰ−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１アッセイ）においてランク順序付けした。阻害性抗体を、ヒトＩｇＧ４ｓｄｋ  Ｆｃ（Ｓ２２８Ｐ突然変異によってヒンジが安定化されている、Ａｎｇａｌ、１９９３年）を用いて組換え発現させ、その阻害活性をインテグリン媒介性ＴＧＦβ１の活性化アッセイ（ＬＴＢＰ−前駆ＴＧＦβ１、ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１アッセイ、実施例２を参照）において試験した。いくつかの抗体がレポーター細胞アッセイにおいて前駆ＴＧＦβ１を有意に阻害することができた。ヒトおよびマウスの前駆ＴＧＦβ１複合体と結合してすべてのヒトおよびマウスの前駆ＴＧＦβ１  ＬＬＣのインテグリン媒介性活性化を阻害するその能力に基づいて、抗体Ａｂ４を親和性成熟のリード抗体として選択した。
【０８７２】
Ａｂ４の親和性成熟は、２つの異なる抗体操作戦略を使用して二段階で行った。第１期では、親ＣＤＲＨ３をＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２の変異体（Ｈ１／Ｈ２シャッフル）を含む事前に作製された抗体ライブラリと合わせて、抗体分子のライブラリを作製した。このライブラリを、ヒトおよびマウスの前駆ＴＧＦβ１複合体との結合について選択した。その後、この親和性成熟キャンペーン期からの最も強力な結合剤を、親分子の重鎖ＣＤＲ３をプライマー二量体ウォーキング手法（Ｈ３オリゴ突然変異）を使用した突然変異誘発に供した親和性成熟の第２期へと進め、作製された変異体のライブラリをヒトおよびマウスの前駆ＴＧＦβ１複合体との結合について選択した。
【０８７３】
両方の親和性成熟段階からのリード抗体Ａｂ４の親和性最適化された子孫を表す合計１４個の抗体を、抗原結合および潜在型ＴＧＦβ１  ＬＬＣの阻害について再度試験した。Ａｂ６は、４つのすべて潜在型ＴＧＦβ１  ＬＬＣに対するその高い親和性、マウス、ラット、およびカニクイザルタンパク質に対する交差反応性、ならびに細胞に基づくアッセイにおける効力の増加が理由で選択した。
【０８７４】
Ａｂ６の結合特性をさらに特徴づけるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合活性をＭＳＤ−ＳＥＴアッセイにおいて測定した。Ａｂ６は潜在型ＴＧＦβ１複合体について選択的であることが確認され（図３３Ａを参照）、潜在型ＴＧＦβ２または潜在型ＴＧＦβ３複合体に対する有意義な結合は検出されなかった。同様に、プロドメインと会合していない活性（成熟）ＴＧＦβ１成長因子自体に対する結合は検出されなかった。以下に示すように、Ａｂ６は高い親和性ですべての大型潜在型ＴＧＦβ１複合体（すなわち提示分子＋前駆ＴＧＦβ１）と結合する。さらに、Ａｂ６は望ましい種交差反応性を有することが示され、高い親和性でラットおよびカニクイザルの対応物を認識して結合する。
表２１．Ａｂ６異種間特異性
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【０８７５】
インテグリンによる潜在型ＴＧＦβ１の活性化を阻害するＡｂ６の能力を試験するために、ＴＧＦβ１の提示および活性化を可能にするＬＬＣコンテキストのそれぞれに対応する、一連の細胞に基づく活性化アッセイを展開した。ヒトＬＮ２２９膠芽細胞腫細胞はαＶβ８インテグリンを発現し、これは潜在型ＴＧＦβ１複合体を活性化することができる。また、これらの細胞はＬＴＢＰ１およびＬＴＢＰ３も内在的に発現し（ｑｐＣＲによって測定）、これは、ＴＧＦβ１をコードしているプラスミドで形質移入した場合に、これらのＴＧＦβ１  ＬＬＣ（ＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１およびＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１）の細胞外マトリックス内への生成および蓄積を可能にする。細胞関連ＧＡＲＰまたはＬＲＲＣ３３含有ＴＧＦβ１  ＬＬＣ（ＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１およびＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１）を生成するために、ＬＮ２２９細胞（ｑｐＣＲにより、これらの遺伝子を発現しない）に、これらの提示分子のうちの１つをコードしている発現構築体をＴＧＦβ１発現構築体と共に同時形質移入した。細胞外マトリックス内に蓄積またはＬＮ２２９細胞の細胞表面上に同化された後、ＴＧＦβ１  ＬＬＣは、同じ細胞によって発現されるαＶβ８インテグリンによって活性化されることができる。その後、インテグリン活性化によって潜在型複合体から放出される成熟（活性）ＴＧＦβ１成長因子は、成長因子の活性の測定を可能にするＣＡＧＡ１２−ルシフェラーゼプロモーター−レポーターを用いて操作した同時培養細胞上のその同族受容体と自由に会合することができる。
【０８７６】
すべてのＴＧＦβ１  ＬＬＣは上述のアッセイ条件下で容易に活性化された。ＧＡＲＰまたはＬＲＲＣ３３の、潜在型ＴＧＦβ１を発現するＬＮ２２９細胞内への同時形質移入は、有意により高いＴＧＦβシグナルをもたらし、これは、細胞表面上でのＴＧＦβ１  ＬＬＣの形成および活性化と一貫しており、内在性ＬＴＢＰに打ち勝つ。Ａｂ６は、すべての複合体の活性化を１．１５〜１．４２ｎＭのＩＣ５０値で濃度依存性様式で阻害した。マウスＴＧＦβ１複合体の阻害効力は同様であり、Ａｂ６の種交差反応性と一致していた。Ａｂ６とＬＴＢＰ１−ＴＧＦβ３複合体との有意な結合の欠如と一貫して、インテグリン媒介性ＬＴＢＰ−ＴＧＦβ３  ＬＬＣ活性化複合体の観察された阻害は、同一設計のアッセイにおいてわずかまたは存在せず、したがって、ＴＧＦβ１の活性化の阻害の選択性を実証している（図３３Ｂ）。
【０８７７】
注目すべきは、Ａｂ６はヒト血漿カリクレインおよびプラスミンによる潜在型ＴＧＦβ１の活性化も阻害し（図５Ａおよび５Ｂを参照）、複数の推定上の活性化機構がこの抗体によって阻害され得ることを示す。
【０８７８】
ＴＧＦβ１の活性化の生物学的に関連する結果を阻害するＡｂ６の能力をさらに評価するために、本発明者らは、初代ヒトＴｒｅｇ細胞の主要な抑制活性を阻害するこの抗体の能力を評価した。選別したＣＤ４＋ＣＤ２５高ＣＤ１２７低Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔ細胞受容体刺激の際にＴＧＦβ１−ＧＡＲＰ  ＬＬＣの表面発現をアップレギュレーションする（図２６Ａ）。これらの活性化Ｔｒｅｇ細胞は、自己エフェクターＣＤ４  Ｔ細胞の増殖を抑制し、Ａｂ６はこの抑制性Ｔｒｅｇ活性を１μｇ／ｍｌと低い濃度で遮断した（図２６Ｂ）。これらの結果は、Ｔｒｅｇ細胞がＴＧＦβシグナル伝達を利用してＴ細胞を抑制するという以前の観察と一貫している。
【実施例１０】
【０８７９】
前駆ＴＧＦβ複合体中のどこにＡｂ５、Ａｂ６、およびＡｂ３が結合するかを決定するためのエピトープマッピング
ＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤の活性化の阻害性作用機構に関する初期の見識を得るために、本発明者らは、潜在型ＴＧＦβ１と抗体との相互作用の可能性のある部位を同定するために、水素−重水素交換質量分析（Ｈ／ＤＸ−ＭＳ）分析を行った。水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）は、溶液中のタンパク質コンホメーションを探るために幅広く使用されている技法である。ＨＤＸ−ＭＳ方法は、本明細書中その全体で参考として組み込まれているＷｅｉら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．、２０１４年１月、１９（１）：９５〜１０２頁に記載されている。手短に述べると、ＨＤＸ−ＭＳは、タンパク質主鎖アミド水素と溶液中の重水素との交換に依存する。弱い水素結合に関与している、またはタンパク質の表面に位置する主鎖アミド水素は迅速に交換され得る一方で、内部に埋もれているものまたは安定水素結合に関与しているものは、よりゆっくりと交換される。主鎖アミド水素のＨＤＸ率を測定することによって、タンパク質の動態およびコンホメーションに関する情報を得ることができる。
【０８８０】
潜在型ＴＧＦβ１（１５μＭ）および前駆ＴＧＦβ１／Ａｂ  Ｆａｂ（１：３のモル比）を試料緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で調製した。重水素を含まない実験では、それぞれの試料を試料緩衝液（１：１５、ｖ／ｖ）と室温で混合し、その後、１：１（ｖ／ｖ）のクエンチング緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、４ＭのグアニジンＨＣｌ、０．５ＭのＴＣＥＰ）と０℃で混合した。クエンチングした試料を、オンカラムペプシン消化のためにＨＤＸ技術（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ）を備えたｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）システム内にすぐに注入した。ＭＳＥモードでの分析のために、溶出液をＳＹＮＡＰＴ（登録商標）Ｇ２  ＨＤＭＳ質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ）内に導いた。Ｈ／Ｄ交換実験では、それぞれの試料を標識緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの重水中のＮａＣｌ、ｐＤ７．５）（１：１５、ｖ／ｖ）と混合して、標識反応を２５℃で開始させた。５アリコートのそれぞれの試料を様々な時間間隔、すなわち、１０秒間、１分間、１０分間、１時間、および２時間で標識した。それぞれの標識時点の終わりに、１：１（ｖ／ｖ）のクエンチング緩衝液を加えることによって反応をクエンチングし、クエンチングした試料を分析用にＷａｔｅｒｓ  Ｈ／ＤＸ−ＭＳシステム内に注入した。それぞれの試料の実行の間に、ペプシン洗浄バッファー（１．５ＭのグアニジンＨＣｌ、４％のアセトニトリル、０．８％のギ酸）をＨ／ＤＸ−ＭＳシステム内に注入することによってクリーンブランクを流した。
【０８８１】
データ非依存性獲得モード（ＭＳＥ）およびＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ（ＰＬＧＳ）３．０ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ）における正確な質量および衝突誘導性解離を使用して、Ｈ／ＤＸ−ＭＳ実験に使用するものと同じＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴｏＦシステムで分析した重水素を含まないタンパク質試料中の消化性ペプチドを決定した。ＰＬＧＳから生じた消化性ペプチドは、ＭＳ１シグナル強度≧１０００のペプチド品質閾値および１ｐｐｍの最大質量誤差を用いて、ＤｙｎａｍＸ３．０（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ）内にインポートした。様々な電荷状態での対応するｍ／ｚおよび同位体分布が適切な消化性ペプチドへと正しく割り当てられていることを確実にするために、自動結果を手動で検査した。ＤｙｎａｍＸ３．０を使用して、それぞれの消化性ペプチドについて相対的重水素取り込みプロットおよびＨ／ＤＸヒートマップを生成した。それぞれのペプチドの相対的重水素取り込みは、重水素を含まない対照試料の同位体分布の重量平均質量中心の質量を、それぞれの標識時点での重水素標識した試料の同位体分布の重量平均質量中心の質量のそれから減算することによって決定した。すべての比較は同一の実験条件下で行い、したがって、重水素取り込みの決定における逆交換補正の必要性を打ち消した。したがって、Ｈ／Ｄ交換レベルは相対的なものとして報告する。相対的重水素取り込み割合は、それぞれの消化性ペプチドの相対的重水素取り込みを、その理論的な最大の取り込みによって除算することによって計算した。すべてのＨ／ＤＸ−ＭＳ実験は二つ組で行い、平均相対的重水素取り込みの不確実性についての９８％の信頼限界を記載のように計算した。０．５Ｄａを超える、未結合とＦａｂ結合の潜在型ＴＧＦβ１との間の重水素取り込みの差異を有意とみなした。
【０８８２】
ＨＤＸ−ＭＳを実施して、前駆ＴＧＦβ複合体中のどこでＡｂ５およびＡｂ６が結合していたかを決定した。ＨＤＸ−ＭＳでは、抗体によって密に結合された抗原の領域は、タンパク質−タンパク質の相互作用が原因でプロトン交換から保護されている一方で、溶媒に曝露されている領域はプロトン交換を容易に受けることができる。これに基づいて、抗原の結合領域を同定した。
【０８８３】
ヒートマップは、Ａｂ５  Ｆａｂ結合が、前駆ＴＧＦβ１の領域（領域１および領域２）におけるＨＤＸ保護をもたらすことを示す（図１６）。図１７は、Ａｂ５によって結合されたＨＤＸ−保護領域に重ね合わせた前駆ＴＧＦβ１複合体の構造を図示する。注目すべきは、ＨＤＸ−ＭＳが、Ａｂ５が前駆ＴＧＦβ１のＬＡＰ／成長因子領域中のユニークなエピトープと潜在的に結合することを示したことである。
【０８８４】
類似のＨＤＸ研究を実施して、Ａｂ６と前駆ＴＧＦβ１との結合に関与する結合領域を同定した。約９０％の優れたペプチドカバレッジが達成された。分析により、Ａｂ６  Ｆａｂ結合によって重水素交換から保護されていた潜在型ＴＧＦβ１上の３つの領域が明らかとなった。図１８Ａに提供するヒートマップは、Ａｂ６と抗原との相互作用によって影響を受ける前駆ＴＧＦβ１の特定の領域を示す。抗原のこれらの領域は図中に示す赤色の四角によって注記した。図１８Ｂは前駆ＴＧＦβ１複合体の構造を示し、前駆ＴＧＦβ１複合体内のこれらの領域の空間的な関係性を示すために図１８Ａ中に同定した領域をしかるべく印した。
【０８８５】
図１８Ａに示すように、アスタリスク（＊）を印した保護領域はＡｂ５について同定した領域１と同じであることが判明した。二重アスタリスク（＊＊）で印した保護領域はＡｂ５について同定した領域２の部分組であることが判明した。これらのデータは、有利な阻害活性を示す好ましい抗体が潜在型複合体の潜在型ラッソ（潜在型ループ）の一部分を含むエピトープと結合し得ることを示唆する。データはまた、そのようなエピトープが、成長因子をロックインされた状態に有効に「クランプ」し、それによってその放出を妨げ得る、潜在型ラッソの一部分および成長因子ドメインの一部分によって形成されるコンビナトリアルエピトープであり得ることも示唆する。
【０８８６】
統計分析は、Ａｂ６  Ｆａｂ結合によって重水素交換から強力に保護されていた前駆ＴＧＦβ１上の３つの結合領域を明らかにした（図１９Ａ）。領域１は潜在型ＴＧＦβ１プロドメイン内にある一方で、領域２および３はＴＧＦβ１成長因子にマッピングされる。興味深いことに、領域１は潜在型ラッソを大きくまたがり、プラスミンおよびカリクレインプロテアーゼの両方のタンパク質分解的切断部位を含有する。この領域の保護は、Ａｂ６が潜在型ＴＧＦβ１のカリクレインおよびパルスミン（Ｐａｌｓｍｉｎ）媒介性活性化を阻害するという本発明者らの観察と一貫している（図５Ａおよび５Ｂ）。また、Ａｂ６が、遊離形態（たとえばプロドメインと会合していない）の３つのＴＧＦβ成長因子二量体とはどれとも結合しないということを繰り返し記載することが重要であり、これは、成長因子ドメイン上の部位とのすべての潜在的な相互作用がプロドメインの相互作用に依存していることを暗示している。さらに、インテグリン認識部位を保有するＴＧＦβ１プロドメイン中において抗体結合領域は始動ループに遠位であるため、Ａｂ６およびインテグリンαＶβ６は潜在型ＴＧＦβ１と同時に結合することができる。この観察は、インテグリン依存性ＴＧＦβ１の活性化のアロステリックな機構を示唆している（ＲＧＤ、図１９Ｂ）。さらに、推定上のエピトープ領域１〜３（特に領域１および２）の配列アラインメントは、３つのＴＧＦβアイソフォームにわたる有意な配列多様性を明らかにし、これが、前駆ＴＧＦβ２および前駆ＴＧＦβ３複合体と対比した、Ａｂ６の前駆ＴＧＦβ１に対する観察された選択性を説明している可能性が高い（図１９Ｂ）。
【実施例１１】
【０８８７】
ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、およびＴＧＦＢ３の相対的発現の生物情報学的分析
ヒト腫瘍試料の以前の分析は、ＴＧＦβシグナル伝達をＣＢＴに対する一次耐性の重要な寄与要因として結び付けている（Ｈｕｇｏら、２０１６年）。これらの研究のうちの１つは、尿路上皮癌におけるＴＧＦΒ１遺伝子発現が抗ＰＤ−Ｌ１処置の非応答者に関連する上位スコアのＴＧＦβ経路遺伝子のうちの１つであったことを明らかにしており、このアイソフォーム活性がＴＧＦβシグナル伝達を駆動している可能性があることを示唆している。
【０８８８】
癌性腫瘍におけるＴＧＦβアイソフォームの発現を評価するために、公的に（ｐｕｂｌｉｃａｌｌｙ）利用可能なデータセットからの遺伝子発現（ＲＮＡｓｅｑ）データを検査した。癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）中におけるＴＧＦβアイソフォーム（ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、およびＴＧＦＢ３）の発現を検査するために公的に（ｐｕｂｌｉｃａｌｌｙ）利用可能なオンラインインターフェイスツール（Ｆｉｒｅｂｒｏｗｓｅ）を使用して、正常および癌性組織の両方における、ＴＧＦβアイソフォームをコードしているＲＮＡの示差的な発現を最初に検査した。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３のｍＲＮＡ発現をヒト癌種の集団にわたって、および個々の腫瘍内で評価した。正常な組織比較対象が存在していたＴＣＧＡデータベース中のすべての腫瘍のＲＮＡｓｅｑデータセットを選択し、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、およびＴＧＦＢ３遺伝子の発現を検査した（図２０Ａ）。Ｆｉｒｅｂｒｏｗｓｅインターフェイスからのデータは、百万のキロベースあたりの読取り（ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｍｉｌｌｉｏｎ、ＲＰＫＭ）のｌｏｇ２として表す。
【０８８９】
これらのデータは、ほとんどの腫瘍種（灰色）において、ＴＧＦＢ１がＴＧＦβアイソフォームのうちの最も豊富に発現される転写物であることを示唆しており、ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）値は、ＴＧＦＢ２の０〜２およびＴＧＦＢ３の２〜４に対して一般に４〜６の範囲である。本発明者らはまた、いくつかの腫瘍種において、ＴＧＦＢ１およびＴＧＦＢ３の両方の発現の平均レベルが正常な比較対象試料（黒色）と比較して上昇していることにも注目し、これらのＴＧＦβアイソフォームの発現の増加が癌細胞に関連している場合があることを示唆している。癌微小環境中の宿主免疫系の抑制におけるＴＧＦβシグナル伝達の潜在的な役割が理由で、本発明者らは、ＴＧＦＢ１転写物が、抗ＰＤ−１または抗ＰＤＬ１療法が認可されている癌腫において上昇していることに興味深く注目した。これらの適応症を図２０Ａに灰色で標識する。
【０８９０】
ＲＰＫＭ＞１は、生物学的に関連する遺伝子発現に関連する最小値であると一般にみなされるが（Ｈｅｂｅｎｓｔｒｅｉｔら、２０１１年、Ｗａｇｎｅｒら、２０１３年）、続く分析では、偽陽性を回避するために、ＲＰＫＭ（または関連する測度ＦＰＫＭ（Ｃｏｎｅｓａら、２０１６年を参照））＞１０または＞３０のよりストリンジェントなカットオフを使用した。比較のために、これらの閾値のうちの３つすべてを図２０Ａに示す。
【０８９１】
図２０Ａ中の大きな四分位範囲は、個々の患者間でのＴＧＦβアイソフォーム発現の有意なばらつきを示す。患者集団の少なくとも部分組がＴＧＦβ１アイソフォームを示差的に発現する腫瘍を有する癌を同定するために、ＴＣＧＡデータセット中の個々の腫瘍試料からのＲＮＡｓｅｑデータを分析し、百万のキロベースあたりの断片数（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｍｉｌｌｉｏｎ、ＦＰＫＭ）を計算した。ＲＰＫＭおよびＦＰＫＭは大体等価であるが、ＦＰＫＭは同じ転写物の逆末端の二重計上した読取りについて補正する（Ｃｏｎｅｓａら、２０１６年）。転写物のＦＰＫＭ値が＞３０であった場合に、腫瘍試料をＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、またはＴＧＦβ３発現について陽性としてスコア付けし、それぞれのＴＧＦβアイソフォームを発現するそれぞれの癌種の患者の割合（％として表す）を計算した（図２０Ｂ）。
【０８９２】
癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）からのＲＮＡｓｅｑデータの比較分析は、３つのファミリーメンバー間で、ＴＧＦΒ１発現が大多数の腫瘍種にわたって最も広く普及していると思われることを明らかにした。注目すべき例外は、乳癌、中皮腫、および前立腺癌であり、ＴＧＦΒ１と比較して他のファミリーメンバー、特にＴＧＦΒ３の発現が少なくとも同等に広く普及ている。図２０Ｂに示すように、大多数の腫瘍種がＴＧＦβ１陽性である個々の試料の有意な百分率を示し、急性骨髄性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および頭頸部扁平細胞癌を含めた一部の癌種は、全腫瘍試料の８０％より多くでＴＧＦβ１を発現する。図２０Ａのデータと一貫して、より少ない癌種がＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３に対して陽性であるが、乳房浸潤癌腫、中皮腫、および肉腫を含めたいくつかの癌は、同等またはより高い百分率の、ＴＧＦβ３陽性である腫瘍試料を示す。これらのデータは、癌種はＴＧＦβアイソフォーム発現について重層であり得ること、およびそのような層別化が、ＴＧＦβアイソフォーム特異的阻害剤を用いた処置の候補である患者の同定において有用であり得ることを示差している。
【０８９３】
この仮説をさらに調査するために、個々の腫瘍試料の部分組からのｌｏｇ２（ＦＰＫＭ）ＲＮＡｓｅｑデータを分析し、ヒートマップ中にプロットし（図２０Ｃ）、ＦＰＫＭ＞３０を反映するカラー閾値を、ＴＧＦβアイソフォーム陽性とスコア付けする最小転写レベルとして設定した。７つのＣＢＴが認可された腫瘍種の中で、個々の腫瘍試料におけるＴＧＦΒ１のｍＲＮＡ発現のランク順序付けを行い、ここでも注目すべき乳癌の例外を伴って、ＴＧＦΒ２およびＴＧＦΒ３と比較してＴＧＦΒ１のｍＲＮＡの発現がより高いかつより頻繁であることが確認された。尿路上皮癌におけるこれらおよび以前に公開された観察は、ＴＧＦβ経路の活性が、ほとんどのヒト腫瘍においてＴＧＦβ１の活性化によって駆動されている可能性が高いことを示唆している。
【０８９４】
それぞれの試料をヒートマップ中に一列として表し、試料をＴＧＦβ１発現のレベルによって配置している（最も高い発現レベルが上）。図２０Ｂ中の分析と一貫して、それぞれの癌種中の有意な数の試料がＴＧＦＢ１発現について陽性である。しかし、この表示は、多くの腫瘍、特に、食道癌腫、膀胱尿路上皮、肺腺癌、および皮膚黒色腫の癌種がＴＧＦＢ１転写物のみを発現することも強調している。興味深いことに、乳房浸潤癌腫からの試料はＴＧＦＢ１陽性であるよりもはるかに多数のＴＧＦＢ３陽性である試料を示すため、そのようなＴＧＦＢ１の歪みはすべての癌の特長ではない。それでもなお、この分析は、β１アイソフォームが優性であり、ほとんどの事例では多数の癌患者からの腫瘍中に存在する唯一のＴＧＦβファミリーメンバーであることを示す。ＴＧＦβシグナル伝達が癌微小環境中の免疫抑制において有意な役割を果たすことを示唆するデータと総合すると、これらの所見は、これらの腫瘍の処置におけるＴＧＦβ１特異的阻害の有用性も指し示す。
【０８９５】
癌治療剤としてのＴＧＦβ１特異的阻害の有効性を試験するためのマウスモデルを同定するために、マウス同系腫瘍モデルにおいて使用される様々な細胞系からのＲＮＡｓｅｑデータにおけるＴＧＦβアイソフォーム発現を分析した。この分析では、データの２つの表示を生成した。最初に、本発明者らは、それぞれの細胞系に由来する腫瘍についてｌｏｇ２（ＦＰＫＭ）値のヒートマップを生成した（図２０Ｄ、左）。この分析は、ヒト腫瘍（ＴＧＦＢ１が優性）を概括するであろう同系モデルを同定するために実施したため、本発明者らは偽陰性を回避することに主に関心があり、「陽性」閾値を、図２０Ｂおよび２０Ｃの表示中のものをはるかに下回るＦＰＫＭ＞１に設定した。
【０８９６】
図２０Ｄ（左）のデータ表示が明らかにするように、ＭＣ−３８、４Ｔ−１、およびＥＭＴ６を含めたいくつかの同系腫瘍が、有意なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３の両方を一般的に発現する。対照的に、Ａ２０およびＥＬ４モデルはＴＧＦβ１をほぼ排他的に発現し、Ｓ９１およびＰ８１５腫瘍はＴＧＦＢ１発現に強い偏りを示す。
【０８９７】
ＴＧＦＢ１対ＴＧＦＢ２および／またはＴＧＦＢ３の示差的な発現をさらに評価するために、ｌｏｇ２（ＦＰＫＭＴＧＦＢ１）−ｌｏｇ２（ＦＰＫＭＴＧＦＢ２）またはｌｏｇ２（ＦＰＫＭＴＧＦＢ１）−ｌｏｇ２（ＦＰＫＭＴＧＦＢ３）のうちの小さい方の値として定義されるｍｉｎΔＴＧＦＢ１を計算した。それぞれのモデルのｍｉｎΔＴＧＦＢ１を図２０Ｄ（右）中にヒートマップと示し、Ａ２０、ＥＬ４、Ｓ９１、および／またはＰ８１５細胞系からの同系腫瘍がＴＧＦβ１特異的阻害剤の有効性を試験するための優れたモデルを表し得るという、図２０Ｄ（左）からの結論を強調する。
【０８９８】
ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３を超える、ＴＧＦβ１発現とＣＢＴに対する一次耐性との関連をさらに確認するために、本発明者らは、アイソフォーム発現を、生得的抗ＰＤ−１耐性シグネチャ（「ＩＰＲＥＳ」）を有すると相関させた（Ｈｕｇｏら、Ｃｅｌｌ、２０１６年３月２４日、１６５（１）：３５〜４４頁）。手短に述べると、ＩＰＲＥＳは２６個のトランスクリプトミクスのシグネチャのコレクションであり、抗ＰＤ−１治療に対する腫瘍耐性を集合的に示す。ＩＰＲＥＳシグネチャは、間葉転換の調節、細胞接着、ＥＣＭリモデリング、血管形成、および創傷治癒に関与する遺伝子の上方発現を示す。ＣＢＴが認可された７つの腫瘍種にわたって、本発明者らは、ＴＧＦΒ１のｍＲＮＡレベルとＩＰＲＥＳスコアとの相関について、他の２つのＴＧＦβアイソフォームのｍＲＮＡ発現よりも正かつ有意な相関を見出した（図３７Ａ）。総合すると、これらのデータは、ＴＧＦβ１活性の選択的阻害がＣＢＴに対する一次耐性を克服し得ることを示唆している。
【０８９９】
ＣＢＴが認可された治療を有するＴＣＧＡに定義された腫瘍種にわたる、ＩＰＲＥＳ（生得的抗ＰＤ−１耐性）転写シグネチャの遺伝子組差異分析（ＧＳＶＡ）は、ＴＧＦβ１のＲＮＡの存在度と最も強力かつ有意に相関し（ピアソン係数）、発現の存在についてカットオフはＦＰＫＭ≧３０である。総合すると、これらのデータは、ＴＧＦβ１活性の選択的阻害がＣＢＴに対する一次耐性を克服し得ることを示唆している。
【０９００】
ＣＢＴが認可された治療を有するＴＣＧＡに定義された腫瘍種にわたる、ＩＰＲＥＳ（生得的抗ＰＤ−１耐性）転写シグネチャの遺伝子組差異分析（ＧＳＶＡ）は、ＴＧＦβ１のＲＮＡの存在度と最も強力かつ有意に相関し（ピアソン係数）、発現の存在についてカットオフはＦＰＫＭ≧３０である。
【０９０１】
ＴＧＦβ１発現とＣＢＴに対する耐性との相関をさらに評価するために、ＴＧＦβ１のＲＮＡの存在度を、ＣＤＴが認可された治療を有するＴＣＧＡに定義された腫瘍種にわたる、Ｐｌａｓａｒｉ  ＴＧＦβ経路（生得的抗ＰＤ−１耐性）転写シグネチャの遺伝子組差異分析（ＧＳＶＡ）と比較した。ｐｌａｓａｒｉ遺伝子組はｍＳｉｇＤＢウェブポータル（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）から入手し、遺伝子組スコアの計算はＲのＧＳＶＡパッケージを使用して決定した（Ｈａｎｚｅｌｍａｎｎら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１３１４：７、２０１３年およびＬｉｂｅｒｚｏｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１１年６月１５日、２７（１２）：１７３９〜１７４０頁）。図３７Ｂに示すように、ＧＳＶＡはＴＧＦβ１のＲＮＡの存在度と最も強力かつ有意に相関し（ピアソン係数）、発現の存在についてカットオフはＦＰＫＭ≧３０である。
【０９０２】
これらのデータは、ＴＧＦβ経路の活性が、ほとんどのヒト腫瘍においてＴＧＦβ１の活性化によって駆動されている可能性が高いことを示唆している。
【０９０３】
以下の資源を上述の生物情報学分析に使用した：
ＴＧＦベータアイソフォームＴＣＧＡ発現データは、ＵＣＳＣ  Ｘｅｎａブラウザ  データセットリソースからダウンロードした（ｈｔｔｐｓ：／／ｘｅｎａｂｒｏｗｓｅｒ．ｎｅｔ／ｄａｔａｐａｇｅｓ／）。高発現を決定するための発現カットオフは、ＴＧＦベータアイソフォームデータのＦＰＫＭ値の分布を検査することによって確定した。ヒートマップおよび散布図はＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して生成した。Ｐｌａｓａｒｉ遺伝子組はｍＳｉｇＤＢウェブポータル（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）から入手し、遺伝子組スコアの計算はＲのＧＳＶＡパッケージを使用して決定した。
【実施例１２】
【０９０４】
安全性／毒性学的研究において、ＴＧＦβ１選択的阻害剤はＡＬＫ５キナーゼ阻害剤ＬＹ２１０９７６１および汎ＴＧＦβ抗体と比較して低下した毒性を示す
小分子ＴＧＦ−β  Ｉ型受容体（ＡＬＫ５）キナーゼ阻害剤ＬＹ２１０９７６１および汎ＴＧＦβ抗体（ｈＩｇＧ４、中和性）と比較した、Ａｂ３およびＡｂ６の潜在的なｉｎ  ｖｉｖｏ毒性を評価するために、安全性／毒性学的研究をラットで行った。ラットがこの安全性研究の種の選択肢として選択されたことは、ラットがマウスよりもＴＧＦβ阻害に対する感受性が高いという以前の報告に基づく。ラットにおいて観察された類似の毒性は、イヌ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの他の哺乳動物種においても観察されている。
【０９０５】
手短に述べると、雌Ｆｉｓｈｅｒ３４４ラット（図２１Ａおよび２１Ｂ）またはスプラーグドーリーラット（図２１Ｃ）に、Ａｂ３を３ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）、３０ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）、もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）で、Ａｂ６を１０ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）、３０ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）、もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）で、汎ＴＧＦβ抗体を３ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）、３０ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）、もしくは１００ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）で、ＬＹ２１０９７６１を２００ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）もしくは３００ｍｇ／ｋｇ（１グループ、ｎ＝５匹）で、またはＰＢＳ（ｐＨ７．４）ビヒクル対照（１グループ、ｎ＝５匹）のいずれかを投与した。
【０９０６】
汎ＴＧＦβ抗体を受ける動物は、１０ｍＬ／ｋｇの体積を１回（１日目）静脈内投薬し、８日目に屠殺し、死体解剖を行った。Ａｂ３またはＡｂ６のいずれかを受ける動物は、１０ｍＬ／ｋｇの体積を週に１回、４週間（１、８、１５、および２２日目）ｉ．ｖ．投薬した。ＬＹ２１０９７６１を受ける動物は、１日１回、５〜７日間、経口胃管栄養法によって投薬した。動物を２９日目に屠殺し、死体解剖を行った。
【０９０７】
動物の一般的な臨床観察を１日２回行い、投薬後は急性毒性を評価するためにケージサイド観察を実施した。行った他の観察は、摂食量の評価および週に１回の体重測定を含む。また、これらは臨床的病理学（血液学、血清化学、および凝固）ならびに解剖学的病理学（肉眼的および微視的）の評価も含む。微視的評価のために、包括的な組織の組を死体解剖時に収集した。組織を１０％の中性緩衝ホルマリン中に保存し、トリミングし、ルーチン的に処理し、パラフィンに包埋した。パラフィンブロックをミクロトームに供し、切片をヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。特に、心臓は、肺動脈の平面に垂直な平面に沿って縦方向に二等分して、右房室、左房室、および大動脈弁を露出させることによってトリミングした。どちらの半分も包埋に供した。それぞれの心臓の半側切断を、切断表面を下にしてパラフィンに包埋した。少なくとも３つの心臓弁が得られるようにブロックを切片にした。組織切片は、アメリカ動物病理学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ、ＡＣＶＰ）の有資格のメンバーによって、光学顕微鏡観察によって検査した。
【０９０８】
表２０および図２１に示すように、≧３ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した動物は、ＬＹ２１０９７６１を投与した動物において記載したものに類似の心臓弁の所見（すなわち弁膜症）を示した。≧３０ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した動物は、ＬＹ２１０９７６１を投与した動物のものに類似の心房の所見を示した。１００ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した動物は、ＬＹ２１０９７６１を投与した動物において記載したものに類似の心筋の所見を示し、３０ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した動物は心筋中に出血を有していた。１００ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した１匹の動物は、冠状動脈中に中等度の壁内出血を伴う壊死を有しており、これは、軽微な血管周囲の混合炎症細胞浸潤と関連していた。汎ＴＧＦβ抗体およびＬＹ２１０９７６１を投与した動物における骨の所見は、胸骨の終板ならびに大腿骨および脛骨の骨端軟骨における巨視的な異常形状の胸骨および微視的な肥大帯域の厚みの増加からなっていた。これらの所見は、汎ＴＧＦβ抗体と比較してＬＹ２１０９７６１を投与した動物においてより高い発生率および／または重篤度のものであった。
表２２．汎ＴＧＦβ抗体を受ける動物における微視的な心臓の所見
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【０９０９】
図２１Ａに示すように、汎ＴＧＦβ抗体を投与した動物は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれているＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１２６０１号に記載のＬＹ２１０９７６１を投与した動物において記載したものに類似の毒性を示した。具体的には、≧３ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した動物は、ＬＹ２１０９７６１を投与した動物において記載したものに類似の心臓弁の所見（たとえば弁膜症）を示した。≧３０ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した動物は、ＬＹ２１０９７６１を投与した動物において記載したものに類似の心房の所見を示した。１００ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した動物は、ＬＹ２１０９７６１を投与した動物において記載したものに類似の心筋の所見を示し、３０ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した動物は心筋中に出血を有していた。１００ｍｇ／ｋｇの汎ＴＧＦβ抗体を投与した１匹の動物は、冠状動脈中に中等度の壁内出血を伴う壊死を有しており、これは、軽微な血管周囲の混合炎症細胞浸潤と関連していた。汎ＴＧＦβ抗体およびＬＹ２１０９７６１を投与した動物における骨の所見は、胸骨の終板ならびに大腿骨および脛骨の骨端軟骨における巨視的な異常形状の胸骨および微視的な肥大帯域の厚みの増加からなっていた。図２１Ｂおよび２１Ｃに示す、続くＬＹ２１０９７６１および汎ＴＧＦβを用いた研究も類似の毒性を実証した。ＴＧＦβの汎阻害剤で処置した動物において観察された、出血が原因の心臓弁の肥厚、内皮過形成、混合炎症細胞浸潤、および／または間質の過形成によって特徴づけられた心臓弁膜症は、以前に報告された所見と一貫している。
【０９１０】
対照的に、汎ＴＧＦβ抗体またはＬＹ２１０９７６１で処置した動物とは異なり、ＴＧＦβ１選択的阻害剤、すなわちＡｂ３またはＡｂ６を投与したラットでは、これらの研究におけるＡｂ６およびＡｂ３の両方の無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、試験した最高用量である１００ｍｇ／ｋｇの週に１回の用量であった。図２１Ｂに示すように、最小限または軽微な心臓弁の所見のみがＡｂ３で処置した動物のうちの少数で起こり、これらの所見は、低い発生率（動物および動物内の心臓弁の数）、用量応答性もしくはそれとの相関の欠如、ならびに／または同時の骨の所見の欠如が原因で、被験物質関連である可能性が低いとみなされた。さらに、Ａｂ６で処置した動物では所見は起こらなかった（図２１Ｃ）。
【０９１１】
薬物動態学（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｅｎｅｔｉｃｓ）的分析は、Ａｂ６の血清濃度が、１００ｍｇ／ｋｇを４週間投薬した動物において２，３００μｇ／ｍｌに達したことを示した。研究の終わり（２９日目）での平均Ａｂ６血清濃度は、最も高い評価した用量である１００ｍｇ／ｋｇについて２．３ｍｇ／ｍｌに達した。これらの結果は、ＴＧＦβ１の活性化の選択的阻害は、複数のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて観察された治療効果に必要なものよりをはるかに超える用量で、主要な用量規制毒性を回避すると思われることを示唆している。
【０９１２】
要約すると、Ａｂ３またはＡｂ６で処置した動物は、４週間の期間にわたる試験したすべての用量（３ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇ）で、ラット（ＴＧＦβ阻害に感受性であることが知られている種）において、以下のパラメータのうちのいずれにおいてもバックグラウンドを超える毒性効果を示さなかった：心筋の変性または壊死、心房の出血、心筋の出血、弁の出血、弁内皮の過形成、弁間質の過形成、心臓弁における混合炎症細胞浸潤、鉱化、冠状動脈における出血を伴う壊死、大動脈起始部における炎症を伴う壊死、心筋細胞における壊死または炎症細胞浸潤、および弁膜症。したがって、ＴＧＦβ１の活性化のアイソフォーム特異的阻害剤を用いた処置は、驚くべきことに、汎ＴＧＦβ阻害剤処置（たとえばＡＬＫ５キナーゼ阻害剤ＬＹ２１０９７６１または汎ＴＧＦβ抗体）と比較して有意に改善された安全性プロフィール、たとえば、死亡率の低下、心毒性の低下、および骨の所見の低下をもたらした。
【０９１３】
また、ＧＬＰ毒性学研究も非ヒト霊長類（カニクイザル）において実施して、高親和性のＴＧＦβ１選択的阻害剤Ａｂ６の安全性プロフィールを評価した。プロトコルは、１週間あたり３０、１００、および３００ｍｇ／ｋｇでの４週間の反復用量、続いて４週間の回復を含む。
【０９１４】
Ａｂ６は３０、１００、および３００ｍｇ／ｋｇ／週で良好に耐用された。有害なＡｂ６関連の所見は主および回復コホートのどちらにおいても指摘されなかった。汎ＴＧＦβ阻害剤で観察された毒性部位である標的臓器においてＡｂ６関連の所見は指摘されなかった（たとえば、心毒性、過形成、および炎症、歯および歯肉の所見なし）。
【０９１５】
Ａｂ６血清濃度は、５回の３００ｍｇ／ｋｇの週に１回の用量の後に１５，６００μｇ／ｍＬに達した。回復期間の終わりに、Ａｂ６血清濃度レベルは約２，０００〜３，０００μｇ／ｍＬと高いまま保たれた。
【０９１６】
これらのデータに基づいて、カニクイザルにおけるＡｂ６のＮＯＡＥＬは試験した最高用量である３００ｍｇ／ｋｇ／週である。
【実施例１３】
【０９１７】
腫瘍内免疫細胞に対する抗ＰＤ−１／Ａｂ３の組合せの効果
以前の報告では、前臨床動物モデルにおける免疫抑制された腫瘍からのエフェクターＴ細胞の排除を検査した。
【０９１８】
しかし、これらの報告は、マクロファージに関する見識は提供しなかった。免疫抑制された同系腫瘍モデルにおけるマクロファージ浸潤の関係性およびコンテキスト内におけるＴＧＦβ１阻害の効果を評価するために、免疫組織化学を、上記実施例７からの３０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１およびＡｂ３で処置したクラウドマンＳ９１腫瘍試料に対して行った（図２４Ａ〜２４Ｄを参照）。
【０９１９】
抗ＰＤ１／Ａｂ３の組合せを受けなかった動物からの対照腫瘍切片では、いくらかのＦ４／８０陽性細胞が検出され、これは、腫瘍が、Ｍ２型、いわゆる腫瘍関連マクロファージ、またはＴＡＭである可能性が高いマクロファージをいくらか含有することを示す。それに比べて、抗ＰＤ１／Ａｂ３の組合せで処置した動物から調製した切片では、Ｆ４／８０陽性細胞数の著しい増加が腫瘍内で観察された（図２４Ａ〜２４Ｃを参照）。抗ＰＤ１単独と比較した、抗ＰＤ−１／Ａｂ３で処置した動物におけるＦ４／８０陽性マクロファージによる腫瘍のこの大規模な浸潤は、組合せ処置が、恐らくは腫瘍を浸潤した循環単球の動員が原因で細胞の大流入を誘導したが、抗ＰＤ１単独ではしなかったことを示唆している。これらのマクロファージの表現型を同定するために、抗ＣＤ１６３をＭ２マクロファージマーカーとして使用した。図２４Ｄに示すように、これらの細胞のほとんどがＣＤ１６３陰性であることが示され、抗ＰＤ１／Ａｂ３の組合せ処置に応答して腫瘍内に動員されたマクロファージはＭ１型、したがって抗腫瘍亜型である可能性が高いことを示唆している。これは、マクロファージが細胞毒性細胞によって生成された癌細胞細片を一掃していることの指標である場合があり、恐らくはＴＧＦβ１阻害の直接の結果である。
【実施例１４】
【０９２０】
ＭＢＴ２腫瘍における細胞毒性細胞に対するＴＧＦβ１阻害剤の効果
顆粒（Ｇｒａｎｕａｌ）開口分泌は、細胞毒性Ｔ細胞が常在腫瘍細胞と会合して死滅させる一機構である。活性化の際、顆粒（ｇｒａｎｕａｌ）は形質膜と融合して、パーフォリンおよびグランジム（ｇｒａｎｚｙｍ）Ｂなどの細胞毒素を含めたその内容物を放出し、これが腫瘍細胞の排除をもたらす。さらに、ＣＤ８抗原（ＣＤ８ａ）は、Ｔ細胞受容体と共に補助受容体として作用する、ほとんどの細胞毒性Ｔ細胞上に見つかる細胞表面糖タンパク質である。したがって、ＣＤ８ａ、パーフォリン、およびグランザイムＢのレベルを、それぞれ抗ＰＤ−１と組み合わせたＡｂ３またはＡｂ６で処置した腫瘍において測定して、エフェクターＴ細胞活性を評価した。
【０９２１】
方法
８〜１２週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ雌マウスに５×１０５個のＭＢＴ２腫瘍細胞を側腹部に移植した。処置開始前に、動物を４０〜８０ｍｍ３の平均腫瘍サイズを有する投薬群へとランダム化した。抗ＰＤ１（ＲＭＰ１−１４）を週に２回、１０ｍｇ／ｋｇで投薬した。Ａｂ３を週に１回、３０ｍｇ／ｋｇで投薬した。８日間の投薬後、最終用量（３つの総用量の抗ＰＤ１、２つの総用量のＡｂ３）の８時間後に動物を屠殺し、腫瘍を切除した。Ａｂ６では、免疫構成を処置後の１０日目または１３日目に分析した。抗ＰＤ−１を週に２回、１０ｍｋｇで投薬した。Ａｂ６を週に１回、１０ｍｋｇで投薬した。腫瘍を液体窒素中でフラッシュ凍結し、Ｃｏｖａｒｉｓバッグ中、ｃｒｙｏＰＲＥＰインパクタを使用して微粉砕し、Ｔｒｉｚｏｌ／クロロホルムを使用してＲＮＡを抽出した。Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックスを使用してｃＤＮＡを生成し、目的遺伝子に対して向けられているプライマーおよびプローブを有するカスタムのＴａｑｍａｎ  Ａｒｒａｙ  ＣａｒｄにＣＤＮＡを載せた。ｑｐＣＲをＶｉｉａ７熱サイクラー上で実行した。ＣＴＬ遺伝子の発現をそれぞれの試料あたりのＨＰＲＴに対して正規化し、変化の倍数は抗ＰＤ１／Ａｂ３または抗ＰＤ１／Ａｂ６対抗ＰＤ１単独で表した。
【０９２２】
結果
抗ＰＤ１／Ａｂ３の組合せは、腫瘍内で、抗ＰＤ１単独を超える、抗腫瘍応答に関連するＣＴＬ遺伝子の強力なアップレギュレーションを誘導した（図２５を参照）。ＭＢＴ２腫瘍モデルでは、抗ＰＤ１単独では腫瘍成長および抗腫瘍免疫の非常にわずかな抑制しか提供しなかった。したがって、これらの結果は、抗ＴＧＦβ抗体の添加がエフェクターＣＤ８  Ｔ細胞の完全な活性化および浸潤を許可することを示す。
【実施例１５】
【０９２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇ活性に対するＡｂ３およびＡｂ６の効果
方法
ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌを用いたバフィーコートによって健康なドナーから単離した。磁気選択を介してＣＤ４細胞を選択し、その後、ＣＤ２５＋ＣＤ１２７低Ｔｒｅｇを選別した。Ｂｉｏｒａｄ  Ｓ３Ｅを使用して、クローンＢＣ９６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＣＤ２５高に使用し、クローンＨＩＬ  ７Ｒｍ２１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をＣＤ１２７低に使用した。選別したＴｒｅｇを１週間、プレートに結合させた抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＴｅｘＭａｃｓ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中の可溶性抗ＣＤ２８（クローン２８．２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で刺激した。一部の研究では、ＧＡＲＰおよび前駆ＴＧＦβの発現をアップレギュレーションさせるためにＩＬ２をさらに加えた。Ｔｒｅｇを、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  ９ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染めた自己ＣＤ４  Ｔ細胞と共に１：１で同時培養し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で５日間、再度刺激した。５日後、細胞分裂をフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーター、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定し、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ色素の希釈に対してゲーティングし、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。
【０９２４】
結果
５日間の培養の間に、エフェクターＣＤ４  Ｔ細胞（Ｔｅｆｆ）の８０％が分裂した。１：１のＴｒｅｇの添加がＴｅｆｆ分裂を約１５％まで抑制し、１０ｕｇ／ｍｌのＡｂ３のさらなる添加がＴエフェクター分裂のＴｒｅｇ媒介性阻害を完全に抑制した（図２６Ａを参照）。１μｇ／ｍｌのＡｂ３はＴｒｅｇ抑制をより弱く阻害した。１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのＡｂ６はどちらもＴｒｅｇ由来のＴＧＦβを同等に阻害した。したがって、Ａｂ６は、Ｔｒｅｇに対するＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１複合体のＴＧＦβ１活性化のより強力な阻害剤であると思われる。
【実施例１６】
【０９２５】
ＭＢＴ２腫瘍における腫瘍内免疫細胞集団／構成に対するＡｂ６／抗ＰＤ−１の組合せ処置の効果
抗ＰＤ−１とＡｂ６の組合せで処置したマウスにおいて観察された腫瘍回帰効果を媒介し得る様々な免疫細胞集団の解明を開始するために、ＭＢＴ２腫瘍モデルをＦＡＣＳ研究に使用した。研究設計を以下に要約する。
表２３．ＭＢＴ２腫瘍免疫構成の研究設計
2021531254.tif 000044
【０９２６】
それぞれの研究グループは、本明細書中に記載のＭＢＴ２腫瘍を有するマウスを１２匹含有していた。Ａｂ６処置（ｔｒｅａｔｅｍｅｎｔ）群は、週に１回、１日目および８日目に、１０ｍｇ／ｋｇの抗体を受けた。抗ＰＤ１処置群は、週に２回、１回の注射あたり１０ｍｇ／ｋｇで、１、４、８、および１１日目に、１週間あたり合計２０ｍｇ／ｋｇで処置した。それぞれの対照ＩｇＧ群は、抗ＰＤ１のＩｇＧ亜型およびＡｂ６と一致するようにしかるべく処置した。１３日目に、上記に示したように腫瘍をマウスから収集した。
【０９２７】
フローサイトメトリー分析：腫瘍関連免疫細胞の部分組も、ＭＢＴ−２腫瘍における腫瘍フローサイトメトリーによって分析した。手短に述べると、腫瘍を切除して秤量した後に、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳの腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して解離した。７０μｍの細胞濾過器を通じて試料を濾過して、凝集体が存在する場合は除去した。Ｌｖｅ単個細胞をＦＡＣｓ緩衝液で洗浄した後、以下を含有する染色カクテルを適用させた：ＭｕＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦＣＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＦｃｙＲＩＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ４５−ＡＦ７００クローン３０−Ｆ１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３−ＰＥクローン１７Ａ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４−ＢＵＶ３９５クローンＧＫ１．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８−ＡＰＣ−Ｈ７クローン５３−６．７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５クローンＭ１／７０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＧＲ−１−ＦＩＴＣクローンＲＢ６−８Ｃ５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦｏｘＰ３−ＡＰＣクローンＦＪＫ−１６ｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｆ４／８０−ＰＥ−ＤａｚｚｌｅクローンＢＭ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２０６−ＢＶ４２１クローンＣ０６８Ｃ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。フローサイトメトリーをＡｔｔｕｎｅ  ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上で行い、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて分析した。
【０９２８】
ＭＢＴ２腫瘍におけるＴ細胞部分集団を解明するためのゲーティング戦略を図２７Ａに提供する。処置開始後の１３日目に収集した腫瘍において測定した結果を図２７Ｂに要約する。実証したように、抗ＰＤ１と併せて使用したＡｂ６は、腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤および拡大を可能にすることによって、免疫排除を克服することができた。具体的には、抗ＰＤ１／Ａｂ６の組合せは腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の数（頻度）の有意な増加を誘導した一方で、処置群にわたって全生細胞の％ＣＤ４５＋細胞に変化は観察されなかった。抗ＰＤ１／Ａｂ６の組合せはＴｒｅｇの有意な増加を引き起こしたが、ＣＤ８＋：Ｔｒｅｇの比は抗ＰＤ１処置と比較して有意に変化していなかった。
【０９２９】
骨髄細胞部分集団を解明するためのゲーティング戦略を図２８Ａに提供する。処置開始後の１３日目に収集した腫瘍において測定した結果を図２８Ｂに要約する。１３日目の骨髄浸潤は、総免疫細胞数（たとえばＣＤ４５＋）が処置群にわたって安定に保たれることを示す。総骨髄細胞数（たとえば、ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０低−高）は抗ＰＤ１／Ａｂ６処置によって有意に変更された。具体的には、対照群では、骨髄の割合は腫瘍中のマクロファージ集団のほぼ７５％を構成していた。この割合は組合せ処置群において半分未満まで低下しており、これは、Ｍ２型腫瘍促進マクロファージの数（頻度）の著しい低下、およびこの群におけるＭＤＳＣの割合のほぼ完全な排除と合致していた一方で、Ｍ１型マクロファージは比較的変化なく保たれた。
【０９３０】
細胞の骨髄部分集団の中で、ＭＢＴ−２腫瘍関連Ｍ２マクロファージはＬＲＲＣ３３の高い細胞表面発現を示した（図２８Ｃ）。ＭＤＳＣ部分集団も強力なＬＲＲＣ３３発現を示した。ＭＢＴ−２腫瘍から単離されたＧ−ＭＤＳＣ亜型のほとんど（６７．８％）が細胞表面ＬＲＲＣを発現した一方で、ＭＢＴ−２腫瘍から単離されたＭ−ＭＤＳＣ亜型の約１／３が細胞表面ＬＲＲＣ３３を発現した（図２８Ｄ）。
【０９３１】
さらに、抗ＰＤ１／Ａｂ６処置群において観察されたＣＤ８＋Ｔ細胞：Ｍ２マクロファージの比が劇的に増加した（図２９Ｃを参照）。総合すると、データは、チェックポイント遮断療法と併せて使用した場合、ＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的阻害剤を腫瘍の免疫排除を克服するために使用できることを実証している。これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤および拡大を促進する一方で、腫瘍環境中の腫瘍促進マクロファージ（Ｍ２）および免疫抑制ＭＤＳＣを低下させることによって、少なくとも部分的に媒介され得る。これらの効果がそれぞれＴＧＦβ１のＧＡＲＰアームおよびＬＲＲＣ３３アームによって媒介され得るという可能性がある。
【０９３２】
免疫組織化学的分析には、６匹の動物からの腫瘍を半分に切断して固定した。ＩＨＣ用の切片を調製し、様々な免疫細胞マーカーで染色した。図３０は１０日目または１３日目での代表的な画像を提供する。示すように、腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の著しい増加が、抗ＰＤ１／Ａｂ６の組合せ処置群において観察された（図３０Ｄ）。データは、Ａｂ６をチェックポイント遮断療法と併せて使用して、細胞毒性Ｔ細胞の浸潤および拡大を誘導することによって免疫排除を克服できることを示す。図３０Ｅは、全核のうちのＣＤ８陽性細胞の％として示すＩＨＣデータの定量を提供する。この腫瘍モデルでは、数個のベースラインＣＤ８＋細胞が存在していた（たとえば「冷たい」腫瘍）。Ａｂ６単独または抗ＰＤ−１単独のどちらかで処置した群では、ＣＤ８＋の百分率の軽微な増加が観察された（それぞれ約１０％）。対照的に、組合せ処置群では、腫瘍内のＣＤ８＋細胞の頻度の著しい（ｍａｒｋｅｔ）増加が達成され、チェックポイント阻害と組み合わせたＴＧＦβ１阻害が、免疫排除を克服することによって抗腫瘍効果を相乗的に誘発できることを示している。データは、組合せが、「免疫排除された」腫瘍を「炎症性／熱い」腫瘍へと有効に変換できることを示唆している。
【０９３３】
ＭＢＴ２腫瘍において観察された免疫応答と相関する遺伝子発現の変化を確認するために、ＲＮＡ発現分析を行った。１３日目のＭＢＴ２腫瘍からのＲＮＡ調製物をｑｐＣＲに基づく遺伝子発現分析に供した。１群あたり５〜６匹の動物から調製したＲＮＡを研究に使用した。分析は、示したマーカーとして使用した以下の遺伝子の発現レベルを含んでいた：Ｐｔｐｒｃ（ＣＤ４５）、Ｃｄ８ａ（ＣＤ８  Ｔ細胞）、Ｃｄ８ｂ１（ＣＤ８  Ｔ細胞）、Ｃｄ４（ＣＤ４  Ｔ細胞）、Ｃｄ３ｅ（Ｔ細胞）、Ｆｏｘｐ３（Ｔｒｅｇ）、Ｉｆｎｇ（Ｔｈ１免疫）、Ｐｒｆ１（ＣＴＬタンパク質）、Ｇｚｍｂ（ＣＴＬタンパク質）、Ｇｚｍａ（ＣＴＬタンパク質）、Ｋｌｒｋ１（ＮＫ／ＣＴＬ）、Ａｄｇｒｅ１（Ｆ４／８０マクロファージ）、Ｍｒｃ１（Ｍ２マクロファージ）、Ｃｄ１６３（Ｍ２マクロファージ）、Ｃｄ８０（ＡＰＣ同時刺激／Ｍ１マクロファージ）、Ｐｔｇｅｒ２（腫瘍血管形成）、Ｎｒｒｏｓ（ＬＲＲＣ３３）、Ｔｇｆｂ１（免疫寛容）、１８Ｓ（ハウスキーパー）、およびＰｐｉｂ（ハウスキーパー）。
【０９３４】
図３１Ａ〜３１Ｄは、それぞれＰｔｐｒｃ、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、およびＦｏｘｐ３の免疫応答遺伝子発現の変化を提供する。抗ＰＤ１／Ａｂ６の組合せ処置は、ＭＢＴ２腫瘍におけるこれらの転写物のレベルの有意な増加を誘導した。これらの観察は、抗ＰＤ１／Ａｂ６処置が、パーフォリンおよびグランザイムなどの細胞毒性エフェクタータンパク質を装備したＣＤ８＋Ｔ細胞の大規模な流入を誘発することを裏付けている。
【０９３５】
図３２は、１０日目または１３日目での免疫マーカーＩｆｎｇ、Ｇｚｍｂ、Ｐｒｆ１、およびＫｌｒｋ１の遺伝子発現の変化を提供する。示すように、これらのマーカー遺伝子のｐＰＣＲ分析は、抗ＰＤ−１およびＴＧＦβ１阻害剤の組合せ処置が、腫瘍における細胞溶解性タンパク質（グランザイムＢおよびパーフォリン）、Ｔｈ１免疫（ＩＦＮγ）のマーカー、ならびにＣＴＬ／ＮＫ細胞マーカー（Ｋｌｒｋ１）の遺伝子発現を誘導することを実証している。これらのデータは、抗腫瘍効果を媒介するチェックポイント阻害およびＴＧＦβ１阻害の相乗効果を支持するさらなる証拠を提供する。
【０９３６】
要するに、これらの結果は、チェックポイント遮断およびＴＧＦβ１阻害によって誘発された抗腫瘍免疫の頑強な動員を集合的に示す。具体的には、全体的な腫瘍浸潤性免疫細胞の割合は処置群にわたって一定に保たれるが、抗ＰＤ−１／Ａｂ６の組合せは、ａ）腫瘍内ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加（＊Ｐ＜０．０５、抗ＰＤ−１群に対する両側性Ｔ検定）、ｂ）Ｔｒｅｇの有意な増加（＊Ｐ＜０．０５）、しかしＣＤ８＋：Ｔｒｅｇの比は変化しない（ｎ．ｓ．、抗ＰＤ−１に対して有意差なし）、ならびにｃ）免疫抑制性Ｍ２マクロファージおよび骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）集団の低下によって駆動される、任意の他の群と比較した骨髄細胞の有意な低下（＊Ｐ＜０．０５、抗ＰＤ−１群に対する両側性Ｔ検定）を引き起こす。全腫瘍溶解物の定量的ＰＣＲ分析は、ＣＤ８エフェクター遺伝子の頑強な増加を裏付けている。同様に、抗ＰＤ−１およびＡｂ６の組合せは腫瘍塊内におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の著しい増加を誘導し、免疫排除を克服する。
【０９３７】
ＴＧＦβ１下流シグナル伝達に対する効果を確認するために、追加の免疫組織化学的分析を実施して、ＭＢＴ２腫瘍におけるリン酸化されたＳＭＡＤ３を検出および局在化した。図３０Ｆに示すように、ホスホＳＭＡＤ３は、抗ＰＤ−１で処置した腫瘍内の血管内皮付近で富化されていることが見出された。Ａｂ６を用いた処置はこのシグナルを抑止し、ＴＧＦβ１阻害が腫瘍内免疫細胞浸潤を促進し、それによって免疫排除された腫瘍をチェックポイント遮断に対して応答性である炎症性腫瘍へと変換することができるという見方を支持する。
【０９３８】
抗ＰＤ−１で処置した動物は、腫瘍血管構造（ＣＤ３１染色、内皮マーカー）に密に関連する一部の浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。組合せ処置はさらなるＴ細胞浸潤を支援する。ＣＤ８＋Ｔ細胞が血管内皮に近接していることは、Ｔ細胞が腫瘍を腫瘍内血管構造から浸潤し得ることを示唆している。腫瘍のＣＤ８陽性領域とＣＤ３１陽性血管構造からの距離との関係性を図３０Ｇに示す。ヒストグラムは、組合せ処置（ＴＧＦβ１阻害およびチェックポイント遮断）が、特に血管から遠位である領域においてＣＤ８＋領域の割合を増加させることを実証しており、ＴＧＦβ１阻害が血管構造を介した腫瘍内へのＣＤ８＋細胞の浸潤を促進し、免疫抑制を有効に克服するまたは逆転させることを示唆している。
【実施例１７】
【０９３９】
骨髄増殖性疾患のＭＰＬモデルに対するアイソフォーム選択的なコンテキスト非依存性ＴＧＦβ１阻害剤の効果
骨髄線維症の前臨床ＭＰＬＷ５１５Ｌモデルは以前に記載されている（たとえばＷｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２１巻、１４７３〜１４８０頁（２０１５年）を参照）。手短に述べると、レシピエントマウスに致死的照射を行い、続いて、Ｗ５１５Ｌに構成的活性化突然変異を有するヒトトロンボポエチン受容体ＭＰＬ（ＭＰＬＷ５１５Ｌ）を形質導入したドナー骨髄細胞を移植する。このモデルにおけるレシピエントマウスは２〜３週間で白血球増加、赤血球増加症、および血小板増加症を生じる。
【０９４０】
骨髄線維症のネズミモデルにおいてＴＧＦβ１選択的阻害の効果を評価するために、ＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム特異的コンテキスト非依存性阻害剤（Ａｂ６）をＭＰＬＷ５１５Ｌモデルにおいて試験した。手短に述べると、５０万個のＭＰＬ＋ｃｋｉｔ＋細胞を８〜１０週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植した。３週間後、レシピエントマウスは、１０もしくは３０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ６、または陰性対照ＩｇＧ（３０ｍｇ／ｋｇ／週）を、４週間（合計５つの用量）、週に１回のｉ．ｐ．注射で受けた。マウスを最終用量の２４時間後に屠殺した（ｓｃａｒｉｆｉｅｄ）。
【０９４１】
骨髄の組織病理学を行って、レチクリン染色によって評価されるＡｂ６の抗線維性効果を評価した。予備データは、Ａｂ６で処置した動物からとった骨髄切片が抗線維性効果を示したことを示す。代表的な骨髄切片のレチクリン染色から収集した画像を図３６Ａに提供する。レチクリン線維（ほとんどＩＩＩ型コラーゲン）の明白な低下が、Ａｂ６を１０および３０ｍｇ／ｋｇで週に１回受けたマウスにおいて観察された。同様であるがより低い度合の抗線維性効果が、試験した第２のＴＧＦβ１選択的阻害抗体でも観察された（データ示さず）。
【０９４２】
病理学者が行った骨髄切片の線維症のスコア付けに基づいた定量分析には、ＷＨＯによって公開された分類システムを使用してレチクリン染色をスコア付けした（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ  ＳＨ、Ｃａｍｐｏ  Ｅ、Ｈａｒｒｉｓ  ＮＬら編、ＷＨＯ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ、第４版、ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、フランスＬｙｏｎ、２００８年中の４４〜４７頁のＴｈｉｅｌｅ  Ｊ、Ｋｖａｓｎｉｃｋａ  ＨＭ、Ｔｅｆｆｅｒｉ  Ａら、Ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）。手短に述べると、４段階システム（ＭＦ−０、ＭＦ−１、ＭＦ−２、およびＭＦ−３）を使用して組織切片をスコア付けした。ＭＦ−０のスコアは、正常な骨髄に対応する、点在する交差（クロスオーバー）のない直線状レチクリンを示す。ＭＦ−１のスコアは、特に血管周囲領域における、多くの交差を伴うレチクリンの緩いネットワークを示す。ＭＦ−２のスコアは、大規模な交差を伴い、時折コラーゲンの巣状の線維束および／または巣状骨硬化症を伴う、レチクリンのびまん性かつ高密度の増加を示す。ＭＦ−３のスコアは、大規模な交差およびコラーゲンの粗いビンドル（ｂｉｎｄｌｅ）を伴い、多くの場合は骨硬化症に関連する、びまん性かつ高密度のレチクリンを示す。
【０９４３】
線維症スコアを図３６Ｂに提供し、対照ＩｇＧを受けた動物と比較した、Ａｂ６の用量依存的な抗線維性効果を示す。左のグラフは、処置の開始時に高い疾患負担（＞５０％）を有する動物を、示すようにＡｂ６または対照ＩｇＧで処置した第１の研究（研究１）からの線維症スコアを示す。研究を繰り返した（研究２）。対応するコホートからのデータを合わせて右グラフ（研究１＋２）に提示する。週に１回の３０ｍｇ／ｋｇのＡｂ６の投薬が線維症を有意に低下させた。
【０９４４】
標準技法を使用して、動物を様々な血液学的パラメータ、たとえば骨髄移植後の全血算（ＣＢＣ）（白血球（ＷＢＣ）、血小板（Ｐｌｔ）、ヘモグロビン（ＨＢ）、およびヘマトクリット（ＨＣＴ）を含む）についても評価した（図３６Ｃおよび３６Ｄ）。予想通り、処置開始の４週間後に、ＩｇＧ対照で処置したＭＰＬマウスは、ＷＢＣおよびＰｌｔのレベルの増加を含めた、髄線維症に特徴的な血液学的な異常を顕在化しているように思われる。Ａｂ６で処置した動物は、対照ＩｇＧ動物と比較して、ＷＢＣ、Ｐｌｔ、およびＨＢ濃度の正常化に向かう用量依存的な傾向、ならびにベースラインを超える変化を示した。さらに、Ａｂ６で処置した動物は、対照ＩｇＧ動物と比較して、ＨＣＴ濃度の統計的に有意な正常化およびベースラインを超える変化を示し、Ｈｃｔレベルは４週間までにベースラインまで回復したように思われた。
【実施例１８】
【０９４５】
ＥＭＴ−６同系乳癌モデルに対する高親和性ＴＧＦβ１阻害剤の効果
乳癌は、米国において女性の中で最も一般的な癌であり、癌死亡の４番目に多い原因である。図２０Ｄ（左）および図３５に示すように、ＴＧＦβ１を優性に発現する多くの腫瘍とは異なり、ＥＭＴ６腫瘍は有意なレベルのＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を両方発現する（たとえばＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３共優性）。免疫排除およびＣＢＴ耐性に対するこれらの腫瘍におけるＴＧＦβ３の貢献は不明確である。
【０９４６】
ＷＯ２０１８／１２９３２９号に記載されているように、Ａｂ３（ＴＧＦβ１のアイソフォーム選択的なコンテキストに偏った阻害剤）が、このモデルにおける腫瘍成長および生存に対して部分的な効果を示したことが以前に示されている。
【０９４７】
これらの研究では、アイソフォーム選択的ＴＧＦβ１阻害剤およびアイソフォーム選択的ＴＧＦβ３阻害剤の組合せの効果をＥＭＴ６モデルにおいて、免疫チェックポイント阻害剤と併せて評価した。この腫瘍はＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３アイソフォームの両方が共優性であるため、このような組合せ療法が腫瘍回帰において有効性を示し得ると推論された一方で、チェックポイント阻害剤と併せたどちらかのアイソフォーム選択的阻害剤が単独で（ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３）、腫瘍成長の阻害において部分的な効果を生じるはずであると仮定された。
【０９４８】
ＥＭＴ６腫瘍を皮下移植した。処置はＥＭＴ６腫瘍が３０〜８０ｍｍ３に達した際に開始した。抗ＰＤ−１は週に２回、１０ｍｋｇで投薬した。Ａｂ６は週に１回、１０ｍｋｇで投薬した。抗ＴＧＦβ３中和抗体は週に１回、３０ｍｋｇで投薬した。
【０９４９】
応答者は、研究終了時にエンドポイント体積の＜２５％の腫瘍サイズを達成するものとして定義する。
【０９５０】
驚くべきことに、抗ＰＤ−１抗体と併用したＴＧＦβ１の高親和性のアイソフォーム選択的阻害剤Ａｂ６が、ＥＭＴ６においてチェックポイント阻害耐性を克服するために十分であった。図３４Ａは腫瘍成長に対するＡｂ６および／または抗ＰＤ−１の効果を示す。どちらの抗体も、単独で使用した場合は有意な腫瘍回帰を達成しなかった。しかし、組み合わせると、処置した動物の５０％（１０匹のうち５匹）が有意な腫瘍回帰（エンドポイント腫瘍体積の２５％以下までの低下）を達成した。これらのデータは、完全応答者または腫瘍成長遅延のどちらかによって証明されるように、組合せ療法群における相乗的な抗腫瘍有効性を示す。予想外に、ＴＧＦβ３のアイソフォーム選択的阻害剤の添加は追加の効果を生じなかった。Ａｂ６を用いたＴＧＦβ１アイソフォームの阻害が、腫瘍内ＴＧＦβ３の存在下においてさえも腫瘍を抗ＰＤ−１に対して感作させるために十分であったという観察は、ＴＧＦβ１が、疾患関連ＴＧＦβシグナル伝達、免疫排除、およびＣＢＴに対する一次耐性を駆動するアイソフォームであるという仮説を支持している。
【０９５１】
それに対応して、組合せ療法（ＴＧＦβ１＋抗ＰＤ−１）は、処置した動物において、抗ＰＤ−１単独と比較して有意な延命効果を達成した（＊＊＊、Ｐ＜０．００１、ログランク検定）（図３４Ｂを参照）。処置開始の５６日後、組合せ群において動物の６０％が生きていた一方で、他方の処置群では、２８日目までにすべての動物が死亡したまたは安楽死させる必要があった。
【０９５２】
別の研究（研究２）も、Ａｂ６および抗ＰＤ−１の組合せで処置した、ＴＧＦβ１／３陽性ＥＭＴ６腫瘍を有する動物（ａｎｉｍａｓ）において生存の有意な改善を示したが、いずれかの抗体単独を用いた動物では示さなかった（図３４Ｃ）。このモデルでは、本発明者らは処置を停止し、ＥＭＴ−６腫瘍のない生存者を投薬なしで６週間追跡した（灰色ボックス）。投薬停止の６週間後、完全応答者は腫瘍のないまま保たれ、応答の永続性が再度実証された（図３４Ｃ、右）。報告した数は、研究終了時に測定可能な腫瘍を有さない動物の数である。抗ＰＤ−１単独で処置した動物と比較して、組合せ処置（Ａｂ６＋抗ＰＤ−１）の有意な延命効果が観察された（図３４Ｄ）。
【実施例１９】
【０９５３】
組換えタンパク質発現
組換えタンパク質を、目的ｃＤＮＡを含有するｐＴＴ５プラスミド（ＮＲＣ  Ｃａｎａｄａ）を一過的に形質移入したＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で発現させた。大型潜在型ＴＧＦβ複合体は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞に、前駆ＴＧＦβ１、前駆ＴＧＦβ２、または前駆ＴＧＦβ３をコードしているプラスミド、およびＬＬＣ−提示タンパク質をコードしているプラスミドを同時形質移入することによって生成した。ＴＧＦβ結合ＴＢ３ドメインおよび隣接するＥＧＦ様ドメインを含有するＬＴＢＰ断片を使用して、完全長ＬＴＢＰの収率およびタンパク質品質を改善させた（ヒトＬＴＢＰ１ではＥ８７３からＩ１５０７、ヒトＬＴＢＰ３ではＤ８６６からＥ１０３９）。ＬＴＢＰ断片は、精製を容易にするためにＣ末端Ｈｉｓタグを有していた。Ｃ末端にＨｉｓタグ付けしたＧＡＲＰまたはＬＲＲＣ３３外部ドメインを発現する、安定Ｅｘｐｉ２９３細胞系を作製した。これらの安定細胞に前駆ＴＧＦβ１をコードしているプラスミドを一過的に形質移入して、潜在型ＴＧＦβ１とのＧＡＲＰまたはＬＲＲＣ３３複合体を生成した。小型潜在型ＴＧＦβ複合体を、Ｎ末端Ｈｉｓタグを有し、大型潜在型複合体を形成するシステインをセリンに突然変異させて発現させた（ＴＧＦβ１中のＣ４Ｓ、ＴＧＦβ２中のＣ５Ｓ、およびＴＧＦβ３プロドメイン中のＣ７Ｓ）。活性ＴＧＦβ成長因子はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。形質移入体は、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で５日間培養した後、馴化上清を収集した。組換えタンパク質を、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。タンパク質の品質およびジスルフィド結合複合体の形成をＳＤＳ  ＰＡＧＥおよび分析用ＳＥＣによって確認した。抗体は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を目的の重鎖および軽鎖をコードしているｐＴＴ５プラスミドで同時形質移入することによって発現させた。ヒトＩｇＧ４およびマウスＩｇＧ１抗体を、タンパク質Ａ捕捉、続いてＳＥＣによって精製した。動物モデルにおいて使用した抗体が何であるかを質量分析によって確認した。
【実施例２０】
【０９５４】
同系マウスモデル
ネズミモデルは、ノースカロライナ州ＭｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｓで、ＩＡＣＵＣに従って行った。ＭＢＴ−２モデルでは、８〜１２週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）雌マウスをイソフルランで麻酔して、５×１０５個のＭＢＴ−２腫瘍細胞を側腹部に皮下移植した。すべての群が等しい開始体積平均および範囲を有するように、動物を４０〜８０ｍｍ３の平均腫瘍体積の群に分配した。クラウドマンＳ９１では、８〜１２週齢のＤＢＡ／２（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）雌マウスをイソフルランで麻酔して、５０％のマトリゲル中に５×１０５個のクラウドマンＳ９１腫瘍細胞を側腹部に皮下移植した。すべての群が等しい開始体積平均および範囲を有するように、平均腫瘍体積が１２５〜１７５ｍｍ３に達した際に、動物を群に分配した。ＥＭＴ−６モデルでは、８〜１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に、５×１０６個のＥＭＴ−６腫瘍細胞を側腹部に皮下移植した。すべての群が等しい開始体積平均および範囲を有するように、動物を３０〜６０ｍｍ３の平均開始体積の群に分配した。対照ＨｕＮｅｇ−ｒＩｇＧ１または抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を１０ｍｇ／ｋｇで週に２回投薬した。Ａｂ６−ｍＩｇＧ１または対照抗体ＨｕＮｅｇ−ｍＩｇＧ１を示した用量レベルで週に１回投薬した。すべての抗体は腹腔内投薬した。腫瘍体積を週に２回測定し、腫瘍が１，２００ｍｍ３（ＭＢＴ−２、ＥＭＴ６）もしくは２，０００ｍｍ３（クラウドマンＳ９１）に達した際、または潰瘍形成した際に、動物をＣＯ２窒息によって屠殺した。腫瘍体積はｍｍ３＝（ｗ２×ｌ）／２として計算した。応答者または応答率は、そのモデルのエンドポイント体積の２５％以下の腫瘍体積として定義した。完全応答は、３回以上の連続した測定について１３．５ｍｍ３未満の腫瘍として分類した。腫瘍のない生存者は、研究終了時に触診可能な腫瘍を有さなかった。ＩＡＣＵＣに従って壊死が原因で屠殺した動物は分析から完全に除去した。
【０９５５】
３つのＴＧＦβアイソフォームおよび提示分子の相対的発現を、ヒト臨床データを概括する前臨床薬理学的モデルを選択するために考慮に入れた。ＭＢＴ−２、Ｓ９１、およびＥＭＴ６における３つのアイソフォームの相対的タンパク質発現のＥＬＩＳＡ分析を図２０Ｇに提供する。ＭＢＴ−２およびＳ９１腫瘍のどちらにおいても、ＴＧＦβ１が優性アイソフォームであり、ほとんどのヒト癌に似ている。ＥＭＴ−６も優性なＴＧＦβ１発現を示してはいたが、より低い度合ではあるがＴＧＦβ３も同時発現し、特定のヒト癌腫において観察されるものにより似ていた。
【０９５６】
４つのすべて提示分子（ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ３、ＧＡＲＰ、およびＬＲＲＣ３３）がＭＢＴ−２、Ｓ９１、およびＥＭＴ−６腫瘍においてＲＮＡによって発現される（図２０Ｈ）。
【実施例２１】
【０９５７】
ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１の抗体誘導性内部移行
本発明者らは、ＬＲＲＣ３３のＲＮＡを発現する細胞種のうち、部分組のみがＬＲＲＣ３３タンパク質を細胞表面上に発現するように思われることを観察した。本発明者らは、ＬＲＲＣ３３が形質膜でのタンパク質輸送によって調節され得ることを仮定した。この可能性を評価するために、本発明者らは内部移行アッセイを設計した。
【０９５８】
細胞表面ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１を発現するＥｘｐｉ２９３細胞系を作製した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅシステムを使用して、Ａｂ６と細胞表面ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１との結合の際のＬＲＲＣ３３の内部移行を測定した。手短に述べると、Ｉｎｃｙｃｙｔｅシステムは、標的が酸性ｐＨを有する細胞内区画（たとえばリソソーム）内に内部移行される場合に検出することができるｐＨ感受性検出標識を用いる。ＬＲＲＣ３３および前駆ＴＧＦβ１を発現する細胞におえｋるＡｂ６結合の際に、ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１の迅速な内部移行が観察されたが（図６）、Ｅｘｐｉ２９３親系統では観察されなかった（データ示さず）。ここで観察された内部移行は、初代ヒトマクロファージに対する内部移行に類似していた。
【０９５９】
ＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１の内部移行は、Ｅｘｐｉ２９３細胞はＦｃ受容体を有さないためＦｃＲ媒介性ではない（データ示さず）。これらの結果は、Ａｂ６会合が標的のダウンレギュレーションを促進できることを示す。これは、ＴＭＥおよびＦＭＥなどの疾患部位での利用可能な前駆ＴＧＦβ１レベルを低下させることによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＧＦβ１阻害の追加または代替の機構を提供し得る。
【０９６０】
上記の個々のセクションにおいて言及した本発明の様々な特長および実施形態は、必要に応じて、必要な変更を加えて他のセクションに適用される。したがって、１つのセクションで指定した特長は、必要に応じて、他のセクションで指定した特長と組み合わせ得る。
【０９６１】
当業者は、日常的な実験以上のことを使用せずに、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を理解する、または確定することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【図１】
2021531254.tif 000045
【図２】
2021531254.tif 000046
【図３】
2021531254.tif 000047
【図４】
2021531254.tif 000048
【図５Ａ】
2021531254.tif 000049
【図５Ｂ】
2021531254.tif 000050
【図６】
2021531254.tif 000051
【図７】
2021531254.tif 000052
【図８】
2021531254.tif 000053
【図９】
2021531254.tif 000054
【図１０】
2021531254.tif 000055
【図１１Ａ】
2021531254.tif 000056
【図１１Ｂ】
2021531254.tif 000057
【図１１Ｃ】
2021531254.tif 000058
【図１１Ｄ】
2021531254.tif 000059
【図１１Ｅ】
2021531254.tif 000060
【図１１Ｆ】
2021531254.tif 000061
【図１２】
2021531254.tif 000062
【図１３Ａ】
2021531254.tif 000063
【図１３Ｂ】
2021531254.tif 000064
【図１３Ｃ】
2021531254.tif 000065
【図１３Ｄ】
2021531254.tif 000066
【図１４】
2021531254.tif 000067
【図１５】
2021531254.tif 000068
【図１６】
2021531254.tif 000069
【図１７】
2021531254.tif 000070
【図１８Ａ】
2021531254.tif 000071
【図１８Ｂ】
2021531254.tif 000072
【図１９Ａ】
2021531254.tif 000073
【図１９Ｂ】
2021531254.tif 000074
【図２０Ａ】
2021531254.tif 000075
【図２０Ｂ】
2021531254.tif 000076
【図２０Ｃ】
2021531254.tif 000077
【図２０Ｄ】
2021531254.tif 000078
【図２０Ｅ】
2021531254.tif 000079
【図２０Ｆ】
2021531254.tif 000080
【図２０Ｇ】
2021531254.tif 000081
【図２０Ｈ】
2021531254.tif 000082
【図２１Ａ】
2021531254.tif 000083
【図２１Ｂ】
2021531254.tif 000084
【図２１Ｃ】
2021531254.tif 000085
【図２２】
2021531254.tif 000086
【図２３】
2021531254.tif 000087
【図２４Ａ−Ｂ】
2021531254.tif 000088
【図２４Ｃ−Ｄ】
2021531254.tif 000089
【図２５】
2021531254.tif 000090
【図２６Ａ】
2021531254.tif 000091
【図２６Ｂ】
2021531254.tif 000092
【図２７Ａ】
2021531254.tif 000093
【図２７Ｂ】
2021531254.tif 000094
【図２８Ａ】
2021531254.tif 000095
【図２８Ｂ】
2021531254.tif 000096
【図２８Ｃ】
2021531254.tif 000097
【図２８Ｄ】
2021531254.tif 000098
【図２９Ａ−Ｂ】
2021531254.tif 000099
【図２９Ｃ】
2021531254.tif 000100
【図３０Ａ−Ｂ】
2021531254.tif 000101
【図３０Ｃ−Ｄ】
2021531254.tif 000102
【図３０Ｅ】
2021531254.tif 000103
【図３０Ｆ】
2021531254.tif 000104
【図３０Ｇ】
2021531254.tif 000105
【図３１Ａ−Ｂ】
2021531254.tif 000106
【図３１Ｃ−Ｄ】
2021531254.tif 000107
【図３２Ａ−Ｃ】
2021531254.tif 000108
【図３２Ｄ】
2021531254.tif 000109
【図３３Ａ】
2021531254.tif 000110
【図３３Ｂ】
2021531254.tif 000111
【図３４Ａ】
2021531254.tif 000112
【図３４Ｂ】
2021531254.tif 000113
【図３４Ｃ】
2021531254.tif 000114
【図３４Ｄ】
2021531254.tif 000115
【図３５】
2021531254.tif 000116
【図３６Ａ】
2021531254.tif 000117
【図３６Ｂ】
2021531254.tif 000118
【図３６Ｃ】
2021531254.tif 000119
【図３６Ｄ】
2021531254.tif 000120
【図３７Ａ】
2021531254.tif 000121
【図３７Ｂ】
2021531254.tif 000122
【配列表】
2021531254000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月8日(2021.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオレイヤー干渉法によって測定して、以下の抗原複合体のそれぞれ：
ｉ）ヒトＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉ）ヒトＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉｉ）ヒトＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および
ｉｖ）ヒトＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１
と≦５ｎＭのＫＤで結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
ＴＧＦβ１の活性化を阻害し、
完全ヒトもしくはヒト化抗体またはその断片であり、
式、ＦＴＦ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｍ（Ｘ５）［式中、Ｘ１は、Ｓ、Ｇ、もしくはＡであり、Ｘ２は、ＳもしくはＦであり、Ｘ３は、ＦもしくはＹであり、Ｘ４は、ＳもしくはＡであり、Ｘ５は、Ｄ、Ｎ、もしくはＹである］（配列番号１４３）によって表されるＨ−ＣＤＲ１と、
式、ＹＩ（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）Ａ（Ｘ４）ＴＩＹＹＡ（Ｘ５）ＳＶＫＧ［式中、Ｘ１は、ＳもしくはＨであり、Ｘ２は、ＰもしくはＳであり、Ｘ３は、ＳもしくはＤであり、Ｘ４は、ＤもしくはＳであり、Ｘ５は、ＤもしくはＧである］（配列番号１４４）によって表されるＨ−ＣＤＲ２と、
式、（Ｘ１）Ｒ（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｄ（Ｘ５）ＧＤＭＬ（Ｘ６）Ｐ［式中、Ｘ１は、ＡもしくはＶであり、Ｘ２は、ＧもしくはＡであり、Ｘ３は、ＶもしくはＴであり、Ｘ４は、ＬもしくはＷであり、Ｘ５は、ＹもしくはＭであり、Ｘ６は、ＭもしくはＤである］（配列番号１４５）によって表されるＨ−ＣＤＲ３と、
配列番号１０５に記載のＬ−ＣＤＲ１と、
配列番号１０６に記載のＬ−ＣＤＲ２と、
配列番号１２に記載のＬ−ＣＤＲ３と
を含む、抗体またはその断片。
【請求項２】
バイオレイヤー干渉法によって測定して、以下の抗原複合体のそれぞれ：
ｉ）ヒトＬＴＢＰ１−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉ）ヒトＬＴＢＰ３−前駆ＴＧＦβ１、
ｉｉｉ）ヒトＧＡＲＰ−前駆ＴＧＦβ１、および
ｉｖ）ヒトＬＲＲＣ３３−前駆ＴＧＦβ１
と≦０．５ｎＭのＫＤで結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
ＴＧＦβ１の活性化を阻害し、
完全ヒトもしくはヒト化抗体またはその断片であり、
配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号１５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、
抗体またはその断片。
【請求項３】
Ｈ−ＣＤＲ１が配列番号１０７であり、Ｈ−ＣＤＲ２が配列番号１０３であり、Ｈ−ＣＤＲ３が配列番号６である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
バイオレイヤー干渉法によって測定して、抗原複合体のそれぞれと≦１ｎＭのＫＤ、任意選択で≦０．５ｎＭで結合する、請求項１または３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
配列番号１６９の１つまたは複数のアミノ酸残基を含むエピトープと結合する、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項６】
成長因子ドメインの一部分とさらに結合する、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号１３に記載のＶＨおよび配列番号１５に記載のＶＬを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
ヒトＩｇＧ４またはＩｇＧ１の亜型のものである、前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前述の請求項のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と賦形剤とを含む組成物。
【請求項１０】
対象における増殖性および／または線維性障害の処置において使用するための、請求項１から８に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
障害が癌である、請求項１０に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合断片または組成物。
【請求項１２】
障害が骨髄線維症である、請求項１０に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合断片または組成物。
【請求項１３】
対象が癌治療に対して一次耐性または獲得耐性を有しており、癌治療がチェックポイント阻害療法、化学療法、および／または放射線療法であってもよい、請求項１１に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合断片または組成物。
【請求項１４】
処置が、請求項９に記載の組成物を、チェックポイント阻害剤、化学療法および放射線療法、ならびに／または癌ワクチンからなる群から選択される追加の癌治療と併せて投与するステップを含む、請求項１３に記載の使用のための抗体もしくはその抗原結合断片または組成物。
【請求項１５】
ｉ）請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を提供するステップと、
ｉｉ）抗体またはその抗原結合断片を医薬組成物内に薬学的に許容される担体と共に配合するステップと
を含む、医薬組成物を製造する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2021531254000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月23日(2021.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2021531254000001.app
【国際調査報告】
2021531254.tif 000123
2021531254.tif 000124
2021531254.tif 000125
2021531254.tif 000126
2021531254.tif 000127