(57)【要約】  本発明は、免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）に関連するバイオマーカー、特にＧＬＸ分子、さらにより具体的には、ＧＬＸ関連グリコサミノグリカン（glycosaminglycan）（ＧＡＧ）及びＧＬＸ関連プロテオグリカン（ＰＧ）に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において少なくとも１つの免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）を診断及び／又は予知するエキソビボ方法であって、
ａ．前記対象からの第１の生体サンプルにおいてグリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択される１つ又は複数のバイオマーカーのレベルのインビトロ測定を実施するステップと、
ｂ．任意選択的に、前記第１の生体サンプルよりも後の時点で得られた前記対象からの第２の又はさらなる生体サンプルにおいて前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルのインビトロ測定を実施するステップと、
ｃ．前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを１つ又は複数の対応する基準のレベルと比較するステップと、
ｄ．前記測定値を用いて、前記対象の状態を評価するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）がケラタン硫酸であり、及び／又は前記プロテオグリカン（ＰＧ）が、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及び／又はＣＤ４４から選択される、請求項１に記載のエキソビボ方法。
【請求項３】
２つ以上のバイオマーカーのレベルが測定される、請求項１又は２に記載のエキソビボ方法。
【請求項４】
ステップｄ．で評価される前記対象の状態が、ケラタン硫酸、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及びＣＤ４４のリストから選択される前記２つ以上のバイオマーカーを用いて、所与のＩＭＩＤを発症するリスク及び／又は患っているリスクがあると決定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項５】
前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルが、少なくとも０．０５未満のＰ値で対応する基準値よりも有意に高いか又は低い、請求項１〜４のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項６】
前記生体サンプルが、血液サンプル、例えば、全血、血漿、血清、又は脳脊髄液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項７】
少なくとも１つの付加的なバイオマーカーが、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、及びデルマタン硫酸（ＤＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）からなる群の１つ又は複数から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項８】
少なくとも１つの付加的なバイオマーカーが、シンデカン、グリピカン、及びビグリカンからなる群の１つ又は複数から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項９】
前記シンデカンが、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３及びシンデカン−４からなる群の１つ又は複数から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項１０】
前記グリピカンが、グリピカン−１、グリピカン−２、グリピカン−３、グリピカン−４、グリピカン−５及びグリピカン−６からなる群の１つ又は複数から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項１１】
前記プロテオグリカン（ＰＧ）が、ビグリカン、ＣＤ４４、パールカン、ミメカン、デコリン、ヒアレクタン（アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン）、ベータグリカン、ルミンカン（lumincan）、ケラトカンからなる群の１つ又は複数から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項１２】
前記バイオマーカーが、ビグリカン、ＣＤ４４、ケラタン硫酸、ＧＰＣ−１、ＧＰＣ−４、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、パールカン、シンデカン１、シンデカン２、シンデカン３、及びシンデカン４からなる群から選択される２つ以上のバイオマーカーである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのＩＭＩＤが、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、神経変性疾患、精神疾患、又は臓器系疾患である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＩＭＩＤが、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症及びＩ型糖尿病である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項１５】
検査される生体サンプルの量が０．０１μＬ以上である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項１６】
少なくとも２つのバイオマーカーが同時に又は連続して測定される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のエキソビボ方法。
【請求項１７】
グリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択される少なくとも１つ又は複数のバイオマーカーを有することが分かっている個人の状態を治療する方法において使用するための物質であって、前記バイオマーカーが、対応する１つ又は複数の基準レベルよりも高いレベルにあり、前記物質及び状態がそれぞれ、
【表１】
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から選択される、物質。
【請求項１８】
前記ＧＡＧがケラタン硫酸であり、及び／又は前記ＰＧが、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及びＣＤ４４のリストから選択される、請求項１７に記載の物質。
【請求項１９】
前記物質及び状態がそれぞれ、
【表２】
2021536582.tif 000021
【表３】
2021536582.tif 000022
【表４】
2021536582.tif 000023
【表５】
2021536582.tif 000024
から選択される、及び／又は
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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から選択される、請求項１７又は１８に記載の状態を治療する方法において使用するための物質。
【請求項２０】
グリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択される少なくとも１つ又は複数のバイオマーカーを有することが分かっている個人において、脳卒中、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）又はアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法において使用するための、
【表１２】
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【表１３】
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からなる群から選択される物質。
【請求項２１】
前記グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）がケラタン硫酸であり、及び／又は前記プロテオグリカン（ＰＧ）が、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及び／又はＣＤ４４から選択される、請求項２０に記載の物質。
【請求項２２】
−  グリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーに対する結合剤と、
−  任意選択的に、ＩＭＩＤの評価において前記結合剤を使用するための説明書と
を含むキット。
【請求項２３】
前記グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）がケラタン硫酸であり、及び／又は前記プロテオグリカン（ＰＧ）が、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及び／又はＣＤ４４から選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
−  ケラタン硫酸、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及び／又はＣＤ４４に対する結合剤と、
−  脳卒中、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）又はアルツハイマー病（ＡＤ）の評価において前記結合剤を使用するための説明書と
を含むキット。
【請求項２５】
患者においてＩＭＩＤを検出するためのマイクロ流体検出チップ（１）であって、前記チップが、グリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択されるバイオマーカーに対する１つ又は複数の結合剤でコーティングされた１つ又は複数の分離チャネル（２）を含む、マイクロ流体検出チップ（１）。
【請求項２６】
前記グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）がケラタン硫酸から選択され、及び／又は前記プロテオグリカン（ＰＧ）が、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及び／又はＣＤ４４から選択される、請求項２５に記載のマイクロ流体検出チップ。
【請求項２７】
前記チップ（１）が、複数の分離チャネル（２）が各層内に配置された１つ又は複数の層（３）と、前記分離チャネル（２）と流体連通すると共に生体サンプルがその中に導入される少なくとも１つのサンプルインレットポート（４）とを含み、前記分離チャネル（２）の１つ又は複数が、断続的な分配ゾーンを有する複数の三次元（３Ｄ）分離ゾーン（５）を有し、前記チップが光学チップである、患者において少なくとも１つのＩＭＩＤを検出するための、請求項２５又は２６に記載のマイクロ流体検出チップ。
【請求項２８】
請求項２５又は２７に記載のマイクロ流体チップをさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患の診断及び／又は予知に関する。より具体的には、対象において炎症性疾患を発症するリスク及び／又は患っているリスクを予測するためのバイオマーカーの測定に関する。さらに、本発明は、個人の炎症性疾患の治療又は予防のための薬剤又は物質、治療成功の監視、及び治療の選択に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）は、炎症をもたらす一般的な炎症経路を特徴とし、正常な免疫応答の調節不全に起因し得るか、或いは誘発され得る状態又は疾患の群のいずれかである。全てのＩＭＩＤは末端臓器損傷を引き起こす可能性があり、罹患率及び／又は死亡率の増加に関連する。
【０００３】
炎症は、自己免疫疾患（例えば、強直性脊椎炎、乾癬、全身性エリテマトーデス乾癬性関節炎、ベーチェット病、関節リウマチ、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）及びアレルギー）、並びに多数の心血管疾患、神経筋疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病（ＰＤ））、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、精神疾患（例えば、大うつ病、双極性疾患、統合失調症、不安障害）、神経発達疾患、及び感染症などの多数の医学的障害を仲介し、その主要な駆動体であるため、炎症は生物医学研究及び保健医療の増大しつつある重要な領域である。
【０００４】
ＩＭＩＤは免疫調節不全を特徴とし、この免疫調節不全の１つの根本的な徴候は、ＩＬ−１２、ＩＬ−６又はＴＮＦアルファなどの炎症性サイトカインの不適切な活性化であり、多くの場合、抗炎症性サイトカインの産生の低下と同時に起こり、これらの作用が病理学的帰結につながる。
【０００５】
疾患関連性を示す証拠は存在しているが、研究が臨床像に従って疾患に特異的な方法で進められており、多くの場合、疾患の後期に集中していることにより、進展は限られている。したがって、免疫寛容の喪失を取り巻く初期機構、又は初期炎症扇動因子（instigator）は見落とされてきた。
【０００６】
特許文献の国際公開第２００９０６８６８５号は、一般的な原理、検出、診断、ハイスループットデバイス、及びこのようなデバイスの前記目的での使用を広く開示する。
【０００７】
血漿バイオマーカーを評価するためのプロテオミクスの出現にもかかわらず、治療戦略は、疾患重症度、新しい疾患再発の初期兆候、及び治療への応答を予測する特徴的なバイオマーカーの欠如という課題を抱えている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
西洋社会におけるＩＭＩＤの有病率は１０％であると推定される。現在、一般的な疾患の特徴を特定するための直接的な方法はなく、したがって、潜在的に臓器の機能障害、不全及び慢性疾患をもたらし得るＩＭＩＤを発症するリスクを予測するのに使用可能なバイオマーカーの必要性はまだ満たされていないままである。さらに、特定のタイプの炎症性疾患をさらに決定し、この背景において、標的とされた効果的な治療コースを開始することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明の第１の態様では、これらの目的の１つ又は複数は、対象において少なくとも１つの免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）を診断及び／又は予知するエキソビボ方法によって解決され、前記方法は、
ａ．対象からの第１の生体サンプルにおいてグリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択される１つ又は複数のバイオマーカーのレベルのインビトロ測定を実施するステップと、
ｂ．任意選択的に、前記第１の生体サンプルよりも後の時点で得られた対象からの第２の又はさらなる生体サンプルにおいて１つ又は複数のバイオマーカーのレベルのインビトロ測定を実施するステップと、
ｃ．前記１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを１つ又は複数の対応する基準のレベルと比較するステップと、
ｄ．測定値を用いて、対象の状態を評価するステップと
を含む。
【００１０】
さらなる実施形態では、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）はケラタン硫酸であり、及び／又はプロテオグリカン（ＰＧ）は、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及び／又はＣＤ４４から選択される。
【００１１】
さらなる実施形態では、２つ以上のバイオマーカーのレベルが測定される。
【００１２】
さらなる実施形態では、ステップｄ．で評価される対象の状態は、２つ以上のバイオマーカーの前記レベルが対応する１つ又は複数の基準レベルよりも高い及び／又は低ければ、所与のＩＭＩＤを発症するリスク及び／又は患っているリスクがあると決定され、そして前記１つ又は複数のレベルが１つ又は複数の対応する基準レベルに等しければ、ＩＭＩＤを発症するか又は患っているリスクがないと決定される。
【００１３】
さらに別の実施形態では、１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、少なくとも０．０５未満のＰ値で対応する基準値よりも有意に高いか又は低い。
【００１４】
グリコカリックスは、プロテオグリカン、糖タンパク質、及び糖脂質から構成される層であり、ほとんどの上皮動物細胞の細胞膜を被覆する。一般に、グリコカリックスの成分はシグナル伝達、細胞間認識、通信、細胞間接着（白血球及び血小板）に関与し、血管壁の恒常性を維持する。
【００１５】
血管内で、内皮グリコカリックスは、内腔に面する頂端表面に位置する。内皮細胞の頂端表面に位置するグリコカリックスは、プロテオグリカン、糖タンパク質、及び糖脂質の負に帯電したネットワークから構成される。血管をカチオン性染料で染色すると、透過電子顕微鏡法により、血管の内腔へと広がる不規則形状の多様な層が示される。これは、様々な微小血管床（毛細血管を含む）及び大血管（動脈及び静脈）の全体にわたって存在する。
【００１６】
グリコカリックス障壁は、血管及び臓器を疾患に対して強化する。血管内皮におけるグリコカリックスの別の主要な機能は、血管透過性障壁としての役割を果たしながら、血管壁を血流への直接曝露から遮蔽することである。その保護機能は、血管系全体にわたって普遍的である。心血管系全体にわたる別の保護機能は、毛細血管から間質腔への間質液のろ過に影響するその能力である。
【００１７】
グリコカリックスは心血管系全体にわたって非常に突出しているため、この構造の破壊は有害作用を有し、疾患を引き起こし得る。グリコカリックスの初期機能障害は、内部流体の不均衡と、潜在的に浮腫、白血球浸潤とをもたらし、障壁の機能と、潜在的に内皮細胞自体とを破壊し、炎症の有害なカスケード作用をもたらす。
【００１８】
グリコカリックスの脱落（shedding）は、腫瘍壊死因子−アルファなどの炎症性刺激によって誘発され得る。しかしながら、刺激が何であっても、グリコカリックスの脱落は、一連の調節不全、機能障害をもたらし、そして血管及びそれが貢献する臓器の損傷を許すことになる。
【００１９】
本発明の一実施形態では、生体サンプルは、血液サンプル、例えば、全血、血漿、血清、又は脳脊髄液である。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態では、少なくとも１つの付加的なバイオマーカーは、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）、ケラタン硫酸（ＫＳ）からなる群の１つ又は複数から選択され、及び／又はシンデカン、グリピカン、及びビグリカンからなる群の１つ又は複数から選択される。「１つの付加的なバイオマーカー」という用語は、別のバイオマーカーに加えた１つのバイオマーカー、又は２つ以上のバイオマーカーに加えた１つのバイオマーカーを意味する。
【００２１】
さらに別の実施形態では、シンデカンは、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３及びシンデカン−４からなる群の１つ又は複数から選択され、及び／又はグリピカンは、グリピカン−１、グリピカン−２、グリピカン−３、グリピカン−４、グリピカン−５及びグリピカン−６からなる群の１つ又は複数から選択され、及び又は、プロテオグリカン（ＰＧ）は、ビグリカン、ＣＤ４４、パールカン、ミメカン、デコリン、ヒアレクタン（hyalectan）（アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン）、ベータグリカン、ルミンカン（lumincan）、ケラトカンからなる群の１つ又は複数から選択される。
【００２２】
本発明の特定の実施形態では、バイオマーカーは、ビグリカン、ＣＤ４４、ケラタン硫酸、ＧＰＣ−１、ＧＰＣ−４、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、パールカン、ヘパラン硫酸、シンデカン１、シンデカン２、シンデカン３、及びシンデカン４からなる群から選択される２つ以上のバイオマーカーである。
【００２３】
本発明に従って診断又は予知される免疫介在性炎症性疾患は、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、神経変性疾患、精神疾患、臓器系疾患であり得るか又はこれらに進展し得る、或いはより具体的には、以下の表１の疾患の１つであり得るか又は以下の表１の疾患の１つに進展し得ると考えられ、これらは、本発明の方法によって診断又は予知され得る。個々の疾患は、単一の生体サンプルにおいて、単独で又は同時に診断又は予知され得る。
【００２４】
【表１】
2021536582.tif 000003
【００２５】
【表２】
2021536582.tif 000004
【００２６】
【表３】
2021536582.tif 000005
【００２７】
【表４】
2021536582.tif 000006
【００２８】
検査される生体サンプルの量は０．０１μｌ以上、例えば、０．０２μｌ、０．０５μｌ、０．１μｌ、０．５μｌ、１μｌ、２μｌ、５μｌ又は１０μｌである。アッセイに応じて、より大きい容積が使用され得る。
【００２９】
本発明に従うエキソビボ方法の一実施形態では、ステップａ）は、２、３、４、５、１０、２０個又はそれ以上の選択されたバイオマーカーのレベルのインビトロ測定を実施することである。２つ以上のバイオマーカーのレベルの測定は、同時に又は連続して行うことができ、例えば、２つ以上のバイオマーカーの多重化である。
【００３０】
本発明の別の態様では、目的は、グリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択される少なくとも１つ又は複数のバイオマーカーを有することが分かっている個人の状態を治療する方法において使用するための物質を提供することによって解決され、ここで、バイオマーカーは、対応する１つ又は複数の基準レベルよりも高いレベルにあり、物質及び状態は、以下から選択される：
【００３１】
【表５】
2021536582.tif 000007
【００３２】
一実施形態では、ＧＡＧはケラタン硫酸であり、及び／又はＰＧは、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及びＣＤ４４のリストから選択される。
【００３３】
さらに、目的は、グリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択される少なくとも１つ又は複数のバイオマーカーを有することが分かっている個人の状態を治療する方法において使用するための物質を提供することによって解決され、ここで、物質及び状態は、以下から選択される：
【００３４】
【表６】
2021536582.tif 000008
【００３５】
【表７】
2021536582.tif 000009
【００３６】
【表８】
2021536582.tif 000010
【００３７】
【表９】
2021536582.tif 000011
【００３８】
及び／又は以下から選択される：
【００３９】
【表１０】
2021536582.tif 000012
【００４０】
【表１１】
2021536582.tif 000013
【００４１】
【表１２】
2021536582.tif 000014
【００４２】
【表１３】
2021536582.tif 000015
【００４３】
【表１４】
2021536582.tif 000016
【００４４】
特定の実施形態では、グリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択される少なくとも１つ又は複数のバイオマーカーを有することが分かっている個人において、脳卒中、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）又はアルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法において使用するための、以下から構成される群から選択される物質である：
【００４５】
【表１５】
2021536582.tif 000017
【００４６】
【表１６】
2021536582.tif 000018
【００４７】
一実施形態では、ＧＡＧはケラタン硫酸であり、及び／又はＰＧは、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及びＣＤ４４のリストから選択される。
【００４８】
本発明の別の態様では、上記の目的は、
−  グリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択される少なくとも２つのバイオマーカーに対する結合剤と、
−  任意選択的に、ＩＭＩＤの評価において結合剤を使用するための説明書と
を含むキットを提供することによって解決される。
【００４９】
一実施形態では、ＧＡＧはケラタン硫酸であり、及び／又はＰＧは、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及び／又はＣＤ４４のリストから選択される。
【００５０】
適切には、キットは、
−  ケラタン硫酸、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及び／又はＣＤ４４に対する結合剤と、
−  脳卒中、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）又はアルツハイマー病（ＡＤ）の評価において結合剤を使用するための説明書と
を含み得る。
【００５１】
さらに別の態様では、患者においてＩＭＩＤ感染を検出するためのマイクロ流体検出チップであって、前記チップは、グリコカリックスのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）からなる群から選択されるバイオマーカーに対する１つ又は複数の結合剤でコーティングされた１つ又は複数の分離チャネル（２）を含む。
【００５２】
一実施形態では、ＧＡＧは、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸から選択され、及び／又はプロテオグリカン（ＰＧ）は、ビグリカン、グリピカン−１、グリピカン−４、シンデカン−３及び／又はＣＤ４４から選択される。
【００５３】
別の実施形態では、患者において少なくとも１つのＩＭＩＤを検出するためのマイクロ流体検出チップは、複数の分離チャネル（２）が各層内に配置された１つ又は複数の層（３）と、分離チャネル（２）と流体連通すると共に生体サンプルがその中に導入される少なくとも１つのサンプルインレットポート（４）とを含み、分離チャネル（２）の１つ又は複数は、断続的な分配ゾーンを有する複数の三次元（３Ｄ）分離ゾーン（５）を有し、チップは光学チップである。
【００５４】
一実施形態では、本発明に従うキットは、前記マイクロ流体チップをさらに含み、ここで、１つ又は複数の分離チャネルは、ＧＡＧ及びＰＧの１つ又は複数のバイオマーカーに特異的な前記結合剤で被覆されている。
【００５５】
図面の簡単な説明
本発明は、実施形態の非限定的な例により、そして図１〜１０を参照して、以下により詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】脳卒中に対するグリコカリックス関連血液バイオマーカーのドットブロッティング分析の結果を示す。検査したバイオマーカーは、ａ）シンデカン−３、ｂ）コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ｃ）ＣＤ４４、ｄ）ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ｅ）シンデカン−４、ｆ）シンデカン−１、ｇ）グリピカン−１及びｈ）ヒアルロン酸（ＨＡ）である。
【図２Ａ】健常者（ＨＩ）の血漿において、及び虚血性脳卒中（ＩＳＳ）後に長期的に検出されるグリコカリックス（ＧＬＸ）成分を示す。ＨＩ並びにＩＳＳ後３日以内、７日目、及び９０日目の患者からの血漿をＧＬＸマーカーについてイムノアッセイした。
【図２Ｂ】健常者（ＨＩ）の血漿において、及び虚血性脳卒中（ＩＳＳ）後に長期的に検出されるグリコカリックス（ＧＬＸ）成分を示す。ＨＩ並びにＩＳＳ後３日以内、７日目、及び９０日目の患者からの血漿をＧＬＸマーカーについてイムノアッセイした。
【図２Ｃ】健常者（ＨＩ）の血漿において、及び虚血性脳卒中（ＩＳＳ）後に長期的に検出されるグリコカリックス（ＧＬＸ）成分を示す。ＨＩ並びにＩＳＳ後３日以内、７日目、及び９０日目の患者からの血漿をＧＬＸマーカーについてイムノアッセイした。
【図３】健常者の血漿において、及びＩＳＳ後に長期的に検出されるＧＬＸ成分の相関ヒートマッププロファイルを示す。
【図４Ａ】パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を患っている患者、並びに年齢適合健常対照群（ＨＣ）の血漿において検出されるＧＬＸ成分を示す。
【図４Ｂ】パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を患っている患者、並びに年齢適合健常対照群（ＨＣ）の血漿において検出されるＧＬＸ成分を示す。
【図５】パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を患っている患者、並びに年齢適合健常対照群（ＨＣ）の血漿において検出されるＧＬＸ成分の相関ヒートマッププロファイルを示す。
【図６Ａ】小児（６〜９歳）のＩ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を患っている患者の血漿、及びＴ１ＤＭのない兄弟姉妹の健常対照群の血漿において検出されるＧＬＸ成分を示す。
【図６Ｂ】小児（６〜９歳）のＩ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を患っている患者の血漿、及びＴ１ＤＭのない兄弟姉妹の健常対照群の血漿において検出されるＧＬＸ成分を示す。
【図７】小児（６〜９歳）のＩ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を患っている患者の血漿、及びＴ１ＤＭのない兄弟姉妹の健常対照群の血漿において検出されるＧＬＸ成分の相関ヒートマッププロファイルを示す。
【図８Ａ】アルツハイマー病（ＡＤ）を患っている患者及び年齢適合健常対照群（ＨＣ）の血漿において検出されるＧＬＸ成分を示す。
【図８Ｂ】アルツハイマー病（ＡＤ）を患っている患者及び年齢適合健常対照群（ＨＣ）の血漿において検出されるＧＬＸ成分を示す。
【図９】アルツハイマー病（ＡＤ）を患っている患者及び年齢適合健常対照群（ＨＣ）の血漿において検出されるＧＬＸ成分の相関ヒートマッププロファイルと、６か月の治療（プラセボ対治療）後のＧＬＸ成分の相関ヒートマッププロファイルとを示す。
【図１０】プラセボ投与に対して、６か月の治療後のアルツハイマー病（ＡＤ）を患っている患者の血漿において検出されるＣＤ４４を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
以下において、本発明の実施形態がさらに詳細に記載される。他に特に記述されない限り、特徴の特定の変化形はそれぞれ本発明の他の実施形態に適用され得る。
【００５８】
本発明のバイオマーカーは、内皮グリコカリックス（ＧＬＸ）と呼ばれる血管の厚いマトリックスライニングの可溶性成分である。この層は血管の恒常性を維持し、複数の破壊的刺激が可溶性及び検出可能な成分の脱落、したがってこの層の喪失をもたらす。血液中のＧＬＸの低下は、一部は、血管若しくは臓器の炎症駆動による変性及び／又は加齢及び／又は遺伝子抑制に起因し得る。これは血漿値の変化につながり、我々は、ほんの微量の血液を用いてこれらの変化を検出するための非常に高感度のアッセイを開発した。これらのバイオマーカーは、血管系及び脳の疾患、例えば、アルツハイマー病、全般的な認知症、パーキンソン病、ＡＬＳ、うつ病、統合失調症（Schziophrenia）、外傷性脳損傷、ループス、関節炎、炎症性腸疾患、甲状腺炎、ギラン・バレー症候群、及び血管炎のリスクを予測又はこれらの疾患を診断し得る。自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、神経疾患、変性疾患、精神疾患、及び心血管疾患などであるがこれらに限定されない、特定の種類の多数の稀な疾患を含めて、このような発明から利益を得ることができる疾患は広範に存在する。特定の疾患は表２に記載される。
【００５９】
ＧＬＸは、種々のプロテオグリカン、糖脂質及び／又はグリコサミノグリカンの組合せを含む。生体液又はサンプル中で検出されるこれらの分子の組合せは疾患のタイプによって異なり、例えば、アルツハイマー病対パーキンソン病では異なる。このようにして、異なる臓器に存在する異なる疾患は、疾患の経過を予測し、発作を予測し、さらにＭＲＩなどの他の技術を補って疾患を診断することができるであろう。
【００６０】
ＧＬＸ切断酵素は、罹患臓器への免疫浸潤の間に、或いは疾患を引き起こすことになる自己活性化免疫細胞によって活性化されると考えられる。実際に、ＧＬＸ除去酵素は、いくつかの疾患の血液中で増加される。
【００６１】
さらに、ＧＬＸ脱落に対する複合バイオマーカーは、疾患のモニタリングへの個別のアプローチを改善し、精密医療に基づいた治療法を設計し得ると考えられる。したがって、血液中のＧＬＸ脱落成分の全体構造の同定、及びこれらのマーカーを複合バイオマーカー、ＧＬＸプロファイル又はフィンガープリント若しくはシグネチャーへ組み込むことにより、疾患、重症度及び治療反応の検出が可能になる。
【００６２】
免疫細胞が内皮細胞に到達する作用のメカニズムは、酵素を分泌してＧＬＸ構造を除去し、所与の臓器内へ遊出させ、損傷を引き起こすと考えられる。さらに、ＧＬＸ脱落は、遺伝子抑制及び臓器変性のために、血液中で下方制御され得る。
【００６３】
炎症に基づく疾患は診断の最大の標的であり、本質的に抗炎症性又は疾患修飾性である治療は、治療効力を検査し、治療応答者を非応答者から分離するための主要な使用であり得る。
【００６４】
二次的に、非常に多数の疾患は臓器への損傷をもたらし、その後に炎症が起こる。二次的炎症、及びさらに慢性炎症が関与する疾患は非常に多数あるが、これは、例えば、脳卒中及びてんかん及びパーキンソン病に当てはまる。
【００６５】
したがって、本発明は、この類の疾患についても、発生する損傷、損傷の拡大及び疾患の回復（バイオマーカーの低減が伴われるように）を追跡するために有用であろう。さらに、炎症は疾患重症度の二次的なマーカーであり、治療応答者及び非応答者の分離に対しても価値を広げるので、これは、根本的な疾患に対する治療効力と連結され得る。
【００６６】
さらに、バイオマーカーは、臓器系を区別するための方法において使用され得ると考えられる。これは、体内のどこから炎症が起こっているのかを決定するために価値があるであろう。例えば、ループス患者からの炎症は、腎臓又は皮膚からのものであり得る。
【００６７】
バイオマーカーの検出のためのアッセイは抗体に基づき、抗体はバイオマーカーの特異的なエピトープに結合する。例えば、ＨＲＰ酵素活性又は蛍光若しくは近赤外発光に基づく化学発光検出システムにより、標識二次抗体を使用して、抗体−抗原複合体を可視化する。代替案として、ランタニドの連結が使用され得る。
【００６８】
ＧＬＸ−バイオマーカーの同定のための方法は、免疫ストリップであり得る。免疫ストリップは免疫センサーであり、ここで、認識剤は分析物に結合する抗体であり、検出は反射又は蛍光分光光度法による。
【００６９】
本発明のバイオマーカーを検出するのに適した検出システムには、特異的抗体、ランタニド、レクチン、ＧＡＧ結合分子（表２）、アルシアンブルー、トルイジンブルー又はジメチルメチレンブルーに基づくイムノアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
【表１７】
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【００７１】
ＧＬＸ−バイオマーカーの同定のための他の方法は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＨＰＬＣ−ＭＳ又は液体クロマトグラフィ−エレクトロスプレーイオン化−タンデム質量分析などの質量分析（ＭＳ）であり得る。
【００７２】
１つのサンプルにおいて１つ又は複数のバイオマーカーを検出する（いわゆる多重化）ためのプラットフォームは、チップベースのデバイスにおけるものであり得る。
【００７３】
キットは、特定の疾患に対するバイオマーカーとして価値があると見なされる全てのＧＬＸマーカーのパネルを含み得る。これらは、個々のＧＬＸマーカーのそれぞれに特異的に結合し得る、表面（例えば、プレート又はチューブ）に化学的に結合された検出分子（例えば、抗体）である。このキットは１つの生体サンプルを取り、１回で全てのＧＬＸマーカーについて検査し、基準値と比較する。これは多重アッセイであり、基準と比較した各マーカーの表示値を提供し、所与の疾患が活性であるか、或いは治療反応及び／又は自己免疫疾患の場合には、寛解期にあるかを決定し得る。
【００７４】
これらの要素を結合するチップベースの技術において、デバイスは、プリントアウト、ブルートゥース（登録商標）、WIFi／インターネット、及び／又はリモートセンサリング（remote sensoring）技術によって、発生したシグナルを送信し得る。
【００７５】
チップシステムは、マイクロ流体チップであり得る。
【００７６】
定義
本発明をさらに詳細に議論する前に、以下の用語及び慣習が最初に定義される。
【００７７】
免疫介在性炎症性疾患
免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）は、炎症をもたらす一般的な炎症経路を特徴とし、正常な免疫応答の調節不全に起因し得るか、或いは誘発され得る状態又は疾患の群のいずれかである。全てのＩＭＩＤは末端臓器損傷を引き起こす可能性があり、罹患率及び／又は死亡率の増加に関連する。ＩＭＩＤは、表１に示されるリストからの任意の疾患であり得る。
【００７８】
ＧＬＸ分子
「ＧＬＸ」又は「グリコカリックス」は、内腔内皮を含む体内の細胞の大部分の細胞表面の、炭水化物が豊富な外側部分である。この層は、全身及び血液脳関門（ＢＢＢ）において、血液と血管壁との間の最初の相互作用である。本明細書に記載されるように、ＧＬＸの脱落は、自己免疫及び神経変性、疾患重症度、並びに治療効力の早期の予測因子であり得る。ＧＬＸ分子の例は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）である。これらは脳に由来し得る。したがって、「ＧＬＸ関連」という用語は、ＧＬＸ構造に関連している（又は関連していた）分子であると理解されるべきである。言い換えると、「ＧＬＸ関連」は、ＧＬＸ構造に由来する分子であると理解され得る。
【００７９】
グリコサミノグリカン
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）又は「ムコ多糖」は、二糖単位の繰り返しからなる長鎖非分枝多糖類である。本発明の一部を形成するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の例は、以下のものである：
−  ケラタン硫酸：ケラタン硫酸（ＫＳ）は、β−１，３−結合ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンであり、ガラトース（galatose）及びＮ−アセチルグルコサミンの６位に硫酸残基を有する。
−  コンドロイチン硫酸：コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、交互の糖（Ｎ２０アセチルガラクトサミン及びグルクロン酸）の鎖から構成される硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。通常、プロテオグリカンの一部としてタンパク質に結合して見出される。
−  ヒアルロン酸：ヒアルロナンとも呼ばれるヒアルロン酸（ＨＡ）は、結合組織、上皮組織、及び神経組織の全体わたって広く分布するアニオン性の非硫酸化ＧＡＧである。ゴルジ装置ではなく形質膜において非硫酸化形態であり、非常に大きいことがあり、その分子量は１００万に達することが多いという点で、グリコサミノグリカンの中で独特である。Ｄ−グルコロン酸（glucoronic acid）及びＮ−アセチルグルコサミンの二量体によって構成される。
−  ヘパラン硫酸：ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、全ての動物組織において見出される線状多糖類である。細胞表面又は細胞外マトリックスタンパク質に極めて近接して２つ又は３つのＨＳ鎖が結合されたプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）として存在する。硫酸化されており、グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンの二量体によって構成される。
−  デルマタン硫酸（ＤＳ）：ＤＳは、β結合（それぞれ、１．４又は１．３）によりＧａｌＮＡｃ及びＩｄｏＡを含有する二糖によって形成される線状多糖類である。
【００８０】
プロテオグリカン
プロテオグリカン（ＰＧ）は、高度にグリコシル化されたタンパク質である。基本的なプロテオグリカン単位は、１つ又は複数の共有結合したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を有する「コアタンパク質」からなる。本発明の一部を形成するプロテオグリカンの例は、以下のものである：
−  シンデカン：シンデカンは、特にＧタンパク質結合受容体に対する共受容体として働くと考えられる、単一膜貫通ドメインプロテオグリカンである。これらのコアタンパク質は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）及びコンドロイチン硫酸（ＣＳ）鎖を保有する。シンデカンタンパク質ファミリーは、シンデカン１〜４の４つのメンバーを有する。
−  グリピカン：グリピカン（ＧＰＣ又はＧＰ）は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンの２つの主要なファミリーの１つを構成し、他の主要なファミリーはシンデカンである。哺乳類において６つのグリピカンが同定されており、ＧＰＣ１〜ＧＰＣ６又はＧＰ１〜ＧＰ６と称される。
−  ビグリカン：ビグリカンは小分子ロイシンに富むリピートプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）であり、様々な細胞外マトリックス組織において見出され、多くの場合、ＧＡＧ鎖が結合されている。
−  ＣＤ４４−ＣＤ４４は、細胞間相互作用、細胞接着及び遊走に関与する細胞表面ＰＧであり、ヒアルロン酸及び他のリガンドの受容体として働く。
−  パールカン−主にその広範な分布のために、種々の生物学的プロセスを制御するモジュラーＨＳＰＧである。
−  ヒアレクタン（アグリカン、バーシカン、ニューロカン、ブレビカン）−ヒアルロナン結合ドメイン、ＧＡＧ側鎖、及びレクチン結合ドメインを含むトリドメイン構造を有するＰＧである。
−  ミメカン−オステオグリシンとしても知られており、ＫＳ  ＧＡＧ及び小分子ロイシンリピートに関連するＰＧである。
−  ケラトカン−３本鎖のＫＳ、マンノース含有オリゴ糖によってアスパラギン残基に共有結合されたＮ−アセチル−ラクトサミンの高度に硫酸化された線状ポリマーを含有するＫＳ  ＰＧである。
−  ルミンカン（lumincan）−Ｆａｓリガンドと相互作用し、シェダーゼ活性を制御するＫＳ  ＰＧである。
−  デコリン−様々な種類のプロセスにおける機能活性を有する小分子ロイシンに富むＰＧである。
−  ベータグリカン−高トランスフォーミング成長因子β結合を有する膜結合ＰＧである。
【００８１】
基準レベル
本発明との関連において、「基準レベル」という用語は、他の値又は特徴と比較することができる、量に関連する標準に関する。本発明の一実施形態では、健常者からの生体サンプル又は血液サンプルにおいて、本発明に従うバイオマーカーの１つ又は複数の存在量（例えば、基準レベルに関して上昇又は低下したレベル）を調べることによって、基準レベルを決定することが可能である。多変量解析などの異なる統計的手段を適用することにより、１つ又は複数の基準レベルを計算することができる。これらの結果に基づいて、検出レベルとリスクのある患者との関係を示すカットオフを得ることができる。それにより、カットオフを使用して、例えばＰＤのリスクの増加に対応する、１つ又は複数のバイオマーカーの量を決定することができる。
【００８２】
基準は単一のサンプルのバイオマーカーレベルからなるか、又は２つ以上のサンプルからのバイオマーカーレベルの平均値を含むことができる。或いは、２つ以上の単一のサンプルはそれぞれ２つ以上の基準と考えることができる。
【００８３】
さらに、いくつかのバイオマーカーのバイオマーカーレベルをそれらの対応する基準レベルと比較して、分析サンプルの「プロファイル」を得ることも可能である。このようなプロファイルは、２つ以上のディメンション、例えば、いくつかのバイオマーカーのレベルの上昇及び低下、及び／又はマーカー間の関係性の増加又は低下を含むことができる。
【００８４】
リスクアセスメント
本発明者らは、対象が脳卒中、ＡＤ、ＡＬＳ、ＰＤ、Ｔ１ＤＭ及び／又はＭＳＡを発症するリスクを予測するための新規の方法を開発するのに成功した。実施例において提示される結果は、患者が脳卒中、ＡＤ、ＡＬＳ、ＰＤ、Ｔ１ＤＭ及び／又はＭＳＡを発症するリスクが増大しているかを決定するために、記載されるバイオマーカー（単独又は組み合わせで）が効率的なバイオマーカーであると思われることを示す。
【００８５】
患者が脳卒中、ＡＤ、ＡＬＳ、ＰＤ、Ｔ１ＤＭ及び／又はＭＳＡを発症するリスク、或いはループス発作などの急性炎症性発作の事象を起こすリスクが増大しているかを決定するために、カットオフを設定しなければならない。このカットオフは、研究所により、医師により、又は各患者に対して個別的に応じて設定され得る。カットオフレベルは、多変量統計検定（例えば、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）、ランダムフォレスト、サポートベクターマシンなど）、パーセンタイル、平均＋／−標準偏差、中央値、倍率変化を含むいくつかの方法を用いて設定され得る。多変量判別分析及び他のリスクアセスメントは、無料若しくは市販のコンピュータ統計パッケージ（ＳＡＳ、ＳＰＳＳ、Ｍａｔｌａｂ、Ｒなど）、又は当業者に知られている他の統計ソフトウェアパッケージ若しくはスクリーニングソフトウェアにおいて実施することができる。
【００８６】
当業者には明らかであるように、上記の実施形態のいずれかにおいて、リスクカットオフレベルの変化は、各対象の判別分析の結果を変化させ得る。統計学は、各レベルの有意性の評価を可能にする。データセットに適用される慣用的な統計的検定には、ｔ−検定、ｆ−検定、又はさらにより進歩したデータの比較検定若しくは方法が含まれる。このような検定又は方法の使用により、２つ以上のサンプルが有意に異なるかどうかの決定が可能になる。
【００８７】
有意性は、当業者に知られている標準的な統計的方法論によって決定され得る。選択された基準レベルは、検定が適用される哺乳類／対象に応じて変化され得る。好ましくは、本発明に従う対象はヒト対象、例えば、脳卒中を患っているか又は発症するリスクがあると考えられる対象である。
【００８８】
選択される基準レベルは、所望により、当該技術分野において知られているように、異なる特異性又は感度を与えるように変化され得る。感度及び特異性は、バイオマーカー又は診断検査がどの程度良好で信頼できるかを説明及び定量化するために広く使用される統計値である。感度は、疾患の検出においてバイオマーカー又は診断検査がどの程度良好であるかを評価し、特異性は、個人（すなわち対照群、疾患のない患者）が病気でないと正確に特定され得る可能性がどの程度かを評価する。
【００８９】
感度及び特異性の記載と共にいくつかの用語が使用される：真陽性（ＴＰ）、真陰性（ＴＮ）、偽陰性（ＦＮ）及び偽陽性。病気の患者に疾患が存在することが証明されており、診断検査が疾患の存在を確認すれば、診断検査の結果は、ＴＰと考えられる。個人（すなわち対照群、疾患のない患者）において疾患が存在せず、診断検査が疾患の不在を確認すれば、検査結果はＴＮである。このような疾患のない個人において診断検査が疾患の存在を示せば、検査結果はＦＰである。最後に、診断検査が、疾患のある患者において疾患の不在を示せば、検査結果はＦＮである。
【００９０】
感度
感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）＝真陽性アセスメントの数／疾患を有する患者からの全てのサンプルの数。本明細書で使用される場合、感度は、診断検査と同様に（すなわち、正常よりも低いＰａＯ２を有すると特定された、正常よりも低いＰａＯ２を有する人の割合）、陽性であると正確に特定された実際の陽性の割合の尺度を指す。
【００９１】
特異性
特異性＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）＝真陰性アセスメントの数／対照群からの全てのサンプルの数。本明細書で使用される場合、特異性は、正確に特定される陰性の割合の尺度を指す。感度及び特異性の両方の間の関係は、ＲＯＣ曲線によって評価することができる。このグラフ表示は、診断検査又はバイオマーカー候補のための最良の閾値又はカットオフの決定を通して、最適モデルを判定するのに役立つ。
【００９２】
当業者により一般的に理解され得るように、スクリーニングのための方法は意思決定のプロセスであり、したがって、選択される特異性及び感度は、所与のアッセイにより最適な結果であると考えられることに依存する。
【００９３】
大抵の場合、より低い特異性を犠牲にしてより高い感度を選択し、疾患リスクを有する患者をできるだけ多く特定することが有利であり得ることは、当業者には明らかであろう。
【００９４】
好ましい実施形態では、本発明は、高い特異性、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば１００％の特異性を有する方法に関する。別の好ましい実施形態では、本発明は、高い感度、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば１００％の感度を有する方法に関する。
【実施例】
【００９５】
実施例
実施例１：ヒト脳卒中患者からの血液（図１）
ＧＬＸ構造のバイオマーカーが血液サンプル中で検出可能であること、及びこれらのバイオマーカーが疾患及び炎症に応答して増加することを示すために、急性脳卒中事象の１日目（７２時間以内）、１０日後、及び９０日後に患者から得られた血液サンプルを検査し、健常者からの血液サンプル中のＧＬＸマーカーのレベルと比較した（基準サンプルは、図１ａ）〜ｈ）のｘ軸上にＧＬＸマーカーの略語で示される）。
【００９６】
材料及び方法
血漿ドットブロッティング
抗体に基づくドットブロットを用いて、長期的にＧＬＸマーカーを評価した。２μｌの血漿をカチオン性ニトロセルロース膜（Hybond N+、Amersham, GE Healthcare, Brondby, Denmark）にデュプリケートでドットし、乾燥させた。ブロッキング緩衝液：トリス緩衝生理食塩水＋０．０５％のTween20（TBS-T；Sigma-Aldrich）中５％のスキムミルク粉末（Sigma-Aldrich）の中で膜を室温で６０分間インキュベートした。その後、膜をそのそれぞれの希釈度の一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。その後、TBS-T中で膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合され、ブロッキング緩衝液中にそれぞれの希釈度で希釈され、一次抗体のソースに対して産生された二次抗体と共に６０分間インキュベートした。膜をTBS-Tで十分に洗浄し、最後にＴＢＳ中で洗浄した。Supersignal Westフェムト発光基質及び Chemidoc XRS ＣＣＤカメラ（Bio-Rad Laboratories）を用いて膜を可視化した。ImageJソフトウェアでバックグラウンドに対して正規化した後に、デンシトメトリーにより化学発光を定量化した。
【００９７】
一次抗体：ヘパラン硫酸（ＨＳ）（１：１５００、Millipore）、シンデカン−１（R&D Systems）、シンデカン−４（Santa Cruz)）。コンドロイチン硫酸（ＣＳ）（１：１０００、Sigma-Aldrich）、シンデカン−３（１：１０００、R&D Systems）。ＨＡ（Bio-Rad）、グリピカン−１（R&D Systems）、ＣＤ４４（１：２００、DAKO/Aglient）。
【００９８】
二次抗体：ＨＲＰ結合：抗ウサギ（１：２０００）、抗ラット（１：４０００）、抗マウス（１：３０００）（DAKO/Agilent）。
【００９９】
可視化及び光学濃度分析は、二次抗体−ＨＲＰ複合体及び化学発光を用いて上記のように実施される（フェムトグラム分解能）。以下のバイオマーカーについて検査を実施した：
プロテオグリカン：
シンデカン−１（図１ｆ））
シンデカン−３（図１ａ））
シンデカン−４（図１ｅ））
グリピカン−１（図１ｇ））
ＣＤ４４（図１ｃ））
グリコサミノグリカン：
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）（図１ｂ））
ヘパラン硫酸（ＨＳ）（図１ｄ））
ヒアルロン酸（ＨＡ）（図１ｈ））
【０１００】
データ分析：
統計解析を実施する（一元配置ＡＮＯＶＡ）前に、正規性（Shapiro-Wilk）及び等分散についてデータセットを検定した。非正規であるデータを対数変換し、正規性及び等分散について再検定した。次に、変換後の正規性に基づいてパラメトリック又はノンパラメトリック統計によりデータセットを分析した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意に異なるとして報告した。データは、正規データについては平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ、そして非正規データについては中央値±四分位範囲で表される。
【０１０１】
結果
図１ａ）〜ｈ）に見られるように、全てのＧＬＸマーカーは、全ての患者及び健常対照群サンプルにおいてバックグラウンドを上回って検出可能である。全てのＧＬＸマーカーは、患者と健常対照群との間で、そして各患者において時間スケールにわたって独特のシグネチャーを表示する。図１に見られるように、シンデカン−３、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ＣＤ４４及びヘパラン硫酸（ＨＳ）は、７日の時間間隔で健常対照群サンプルを脳卒中患者サンプルから分離するのに特に有効である。
【０１０２】
結論
この一連の実験において、様々な種類にわたるＧＬＸ成分は、脳卒中患者間で、そして各患者において時間と共に上昇され且つ可変であり、したがって、疾患、疾患重症度、及び治療反応の潜在的なバイオマーカーであると考えるべきであることが示される。実質的に関連性があることが示されたＧＬＸの種類は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びプロテオグリカン（ＰＧ）である。
【０１０３】
まとめると、本明細書において、生体サンプルにおけるＧＡＧ：コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、及びヘパラン硫酸と、ＰＧ：シンデカン、及びグリピカンとからなるＧＬＸ成分の同定の証拠が提供される。これらはＧＬＸ構造の大部分を表し、全てが脳卒中疾患のバイオマーカーであることを示していると特定される。
【０１０４】
実施例２：ヒト脳卒中患者からの血液（図２及び図３）
ＧＬＸ構造のバイオマーカーが血液サンプル中で検出可能であること、及びこれらのバイオマーカーが疾患及び炎症に応答して増加又は低下することを示すために、急性脳卒中事象の３日以内、７日後、及び９０日後に患者から得られた血液サンプルを検査し、年齢適合健常者（ＨＩ）からの血液サンプル中のＧＬＸマーカーのレベルと比較した。
【０１０５】
図２：血液中のＧＬＸマーカーは、炎症性疾患の結果として変化する。健常者（ＨＩ）、並びに脳卒中事象の３日以内（７２時間以内に採取したサンプル）、７日後、及び９０日後の虚血性脳卒中患者において、ＧＬＸマーカーをヒト血漿中で測定し、箱ひげ図（１０〜９０パーセンタイル、中央線及び平均に対する「＋」）として示した。データは、ｐ＜０．０５、０．０１、又は＜０．００１の場合に、それぞれ＊、＊＊、＊＊＊を用いて有意であると表示した。血液中のＧＬＸマーカーは、炎症性疾患の結果として変化する。
【０１０６】
図３：血液中のＧＬＸマーカーは、炎症性疾患の結果として変化する。ａ）健常対照群、並びに虚血性脳卒中後のｂ）１日目（脳卒中後７２時間以内）、ｃ）７日目、及びｄ）９０日目におけるグリコカリックス（ＧＬＸ）マーカーの相関ヒートマップ。ＧＬＸマーカーをヒト血漿中で測定し、ピアソン相関を−１〜１のスケールでマッピングした。０未満の値を赤色でプロットし、ゼロを超える値を青色でプロットした。血液中のＧＬＸマーカーは炎症性疾患の結果として変化し、また、脳卒中の損傷が回復したらベースラインへ戻り（９０日目）、可溶性プロファイルを表す。
【０１０７】
材料及び方法
患者
急性脳卒中ユニットにおいて３日以内（７２時間以内  Ｎ＝１３）、７日目（Ｎ＝９）、及び９０日目（Ｎ＝１３）のＩＳＳ患者から、そして健常者（ＨＩ、Ｎ＝８）から、インフォームドコンセントの後に血漿を−２０℃で貯蔵した。国際的脳卒中ガイドラインに従って患者（patent）を治療し、抗血栓性スタチンと、適切な場合には降圧治療とを受けさせた。除外基準：一過性脳虚血、炎症性疾患及び癌；細胞増殖抑制／免疫抑制療法；並びに３か月以内の大脳、心臓、眼又は末梢の梗塞。ＮＩＨ脳卒中スケール（National Institutes of Health Stroke Scale）（ＮＩＨＳＳ）を用いて神経学的障害を推定した。
【０１０８】
血漿ＧＬＸ分析
２マイクロリットルの血漿をナイロン膜（Hybond N, Amersham, RPN203B）にデュプリケートでドットした。膜をブロッキング緩衝液（５％スキムミルク＋ＴＢＳ−０．０５％のTween20）中でブロックし、ブロッキング緩衝液＋一次抗体中、４℃で一晩インキュベートし、洗浄し（ＴＢＳ−０．０５％のTween20）、ブロッキング緩衝液＋二次抗体と共にインキュベートし、洗浄し、SuperSignal Femto Reagent（Thermo Scientific）と共にインキュベートし、ＣＣＤカメラ（LAS 4000, GE）により画像化し、ImageJを用いて生の積分密度（raw integrated density）について分析し、１０−５の倍率で変換した。一次抗体標的：グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）：コンドロイチン硫酸（ＣＳ、Sigma）、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）（ＨＳ、Millipore）、ケラチン硫酸（keratin sulfate）（ＫＳ、US-Biologicals）、及びヒアルロン酸（ＨＡ、Bio-Rad）；並びにプロテオグリカン（ＰＧ）：ＣＤ４４（DAKO）、シンデカン（Ｓｙｎ）−１（R&D）、−２（R&D）、−３（R&D）、−４（Santa Cruz）、グリピカン−１（R&D）、及びビグリカン（Abcam）。二次抗体標的：抗マウス、抗ヤギ、抗ラット、抗ウサギ−ＨＲＰ（DAKO）。
【０１０９】
データ分析
データセットを正規性について検定した（Shapiro-Wilk）。非正規データセットを対数変換し、再度検定した。非正規のままであるデータセットをノンパラメトリック統計により検定した。パラメトリックデータを一元配置ＡＮＯＶＡで検定し、ノンパラメトリックデータをKruskal-Wallis検定で検定した。７日目は、最も動的なサンプリング時間であるようであった。したがって、我々は、３日以内のＮＩＳＳが７日目のレベルを予測するかを検定した。最良適合のロバストラインにアプローチするために、ＲＯＵＴ（ロバスト回帰及び外れ値除去）補正（Ｑ＝１％）による最小二乗回帰モデリングを用いてデータセットを検定した。残差を正規性について検定した（ＱＱプロット）。相関を正規性について検定し、ピアソン係数を報告した。有意差は、ｐ＜０．０５の場合に報告される（GraphPad Prism 8）。
【０１１０】
ＧＬＸ測定から相関ヒートマップを作成し、マーカー間のピアソン相関を−１〜１のスケールでマッピングした。０未満の値を赤色でプロットし、ゼロを超える値を青色でプロットした。
Ａ）グリコサミノグリカン：
ケラタン硫酸（ＫＳ）
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）
ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ヒアルロン酸（ＨＡ）
Ｂ）プロテオグリカン：
ＣＤ４４
シンデカン−１
シンデカン−２
シンデカン−３
シンデカン−４
グリピカン−１
ビグリカン
【０１１１】
結果
図２Ａ）及びＢ）に見られるように、全てのＧＬＸマーカーは、全ての患者及び健常対照群サンプルにおいてバックグラウンドを上回って検出可能である。全てのＧＬＸマーカーは、患者と健常対照群との間で、そして各患者において時間スケールにわたって独特のシグネチャーを表示する。１１のＧＬＸマーカーのうちの５つ（ＫＳ、ＣＳ、ＨＳ、ＣＤ４４及びシンデカン−３）はＩＳＳ後に有意に増加し、１つは減少した（シンデカン−２）。一元配置ＡＮＯＶＡにより正規データの差を検定し、Kruskal-Wallisにより対数変換後に非正規であるデータを検定した。＊、＊＊、＊＊＊、及び＊＊＊＊は、それぞれ＜０．０５、０．０１、０．００１及び０．０００１のＰ値を表す。データの表示：中央値（ライン）／箱（２５ｔｈ〜７５ｔｈパーセンタイル）及びひげ部分（１０ｔｈ〜９０ｔｈパーセンタイル）；ドットとしての残りのデータポイント；及びパラメトリックな生データについての平均（＋）。
【０１１２】
ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ＣＤ４４、シンデカン−３及びシンデカン−２は、７日の時間間隔で健常対照群サンプルを脳卒中患者サンプルから分離するのに特に有効である。
【０１１３】
ケラタン硫酸及びシンデカン−２は、９０日の時間間隔で健常対照群サンプルを脳卒中患者サンプルから分離するのに特に有効である。
【０１１４】
図２Ｃ）に見られるように、７日目の可溶性ＣＤ４４は、軽微な脳卒中後の初期神経学的障害と有意に相関する。虚血性脳卒中事象の７２時間以内（３日以内）にＮＩＨＳＳにより神経学的障害を推定した。７日目の血漿ＣＤ４４はＮＩＨＳＳと有意に相関した（正規データ、ピアソン（Person）のｒ：０．７２、Ｐ＜０．０５；ロバスト線形回帰フィット：０．５２）。
【０１１５】
図３に見られるように、健常対照群、並びに脳卒中の１日、７日及び９０日後の脳卒中患者のサンプルについて、バイオマーカーの各セット間の関係性が分析されている。脳卒中後３日以内のヒートマップ相関プロファイルは、ビグリカン、Ｓｙｎ１又はＳｙｎ３のいずれかと組み合わせたＣＤ４４のレベル間の正の関係性の増加を明白に示す。また、脳卒中の１日後のヒートマップは、ビグリカン、Ｓｙｎ１又はＳｙｎ３のいずれかと組み合わせたＫＳのレベルの上昇、Ｓｙｎ３と組み合わせたＧＰＣ−１のレベルの上昇、並びにビグリカン、ＣＤ４４、ＫＳ、ＨＡ及びＳｙｎ１と組み合わせたＳｙｎ−３のレベルの上昇を明白に示す。脳卒中の１日後にバイオマーカーの組合せのレベルが上昇又は低下する他の組合せは、図３において見出すことができる。
【０１１６】
脳卒中の７日後のヒートマップ相関プロファイルは、ビグリカン、Ｓｙｎ１、Ｓｙｎ３又はＳｙｎ４のいずれかと組み合わせたＣＤ４４のレベルの上昇を明白に示す。また、脳卒中の７日後のヒートマップは、ビグリカン、Ｓｙｎ１、Ｓｙｎ３又はＳｙｎ４のいずれかと組み合わせたＫＳのレベル間の正の関係性の増加、Ｓｙｎ１又はＳｙｎ２のいずれかと組み合わせたＧＰＣ−１のレベルの上昇、並びにＣＤ４４、ＫＳ  Ｓｙｎ−１及びＳｙｎ−４と組み合わせたＳｙｎ−３のレベルの上昇を明白に示す。脳卒中の７日後にバイオマーカーの組合せのレベルが上昇又は低下する、上に記載されていない他の組合せは図３に開示される。
【０１１７】
脳卒中の９０日後のヒートマップは相関するバイオマーカーの数の減少のみを示し、バイオマーカープロファイルは、健常対照群のヒートマップのプロファイルと類似するところまで戻るが、まだ同一ではない。
【０１１８】
結論
この一連の実験において、様々な種類にわたるＧＬＸ成分は、脳卒中患者間で、そして各患者において時間と共に上昇され且つ可変であり、したがって、疾患、疾患重症度、及び治療反応の潜在的なバイオマーカーであると考えるべきであることが示される。実質的に関連性があることが示されたＧＬＸ成分は、ケラタン硫酸、ＣＤ４４、シンデカン−３及びシンデカン−２である。さらに、脳卒中後及び互いに経時的な、そして健常対照群からの、血液ＧＬＸプロファイルを示すＧＬＸプロファイル（ヒートマップ）は、疾患と疾患からの寛解とを区別することができる。
【０１１９】
我々はさらに、脳卒中後の１日目及び／又は７日目に２つのバイオマーカーの１つ又は複数のセットが上昇されており、図３に示されるようにバイオマーカーのいくつかの間に特定の関係性があることが示されると結論する。
【０１２０】
まとめると、本明細書において、脳卒中患者からの生体サンプルにおけるＧＬＸ成分のケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ＣＤ４４、シンデカン−３及びシンデカン−２の同定の証拠が提供される。これらはＧＬＸ構造の大部分を表し、全てが脳卒中疾患のバイオマーカーであることを示していると特定される。
【０１２１】
実施例３：神経変性障害患者からの血液（図４及び図５）
ＧＬＸ構造のバイオマーカーが血液サンプル中で検出可能であること、及びこれらのバイオマーカーの濃度が疾患及び炎症に応答して変化することを示すために、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する患者から得られた血液サンプルを検査し、年齢適合健常対照群（ＨＣ）からの血液サンプル中のＧＬＸマーカーのレベルと比較した（ｙ軸：任意ＯＤ）。
【０１２２】
図４：血液中のＧＬＸマーカーは、炎症性疾患の結果として変化する。年齢／性別適合健常対照群（ＨＣ）、並びにパーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）において、ＧＬＸマーカーをヒト血漿中で測定し、箱ひげ図（１０〜９０パーセンタイル、中央線及び平均に対する「＋」）として示した。データは、ｐ＜０．０５、０．０１、又は＜０．００１の場合に、それぞれ＊、＊＊、＊＊＊を用いて有意であると表示した。血液中のＧＬＸマーカーは炎症性疾患の結果として変化する。
【０１２３】
図５：血液中のＧＬＸマーカーは、炎症性疾患の結果として変化する。ａ）年齢／性別適合健常対照群、及びｂ）パーキンソン病（ＰＤ）、ｃ）多系統萎縮症（ＭＳＡ）、ｄ）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）におけるグリコカリックス（ＧＬＸ）マーカーの相関ヒートマップ。ＧＬＸマーカーをヒト血漿中で測定し、ピアソン相関をスケール−１〜１でマッピングした。０未満の値を赤色でプロットし、ゼロを超える値を青色でプロットした。血液中のＧＬＸマーカーは炎症性疾患の結果として変化し、可溶性ＧＬＸプロファイルを表す。
【０１２４】
材料及び方法
患者
血漿サンプルは、ＰＤ、ＭＳＡ、ＡＬＳを有する患者及び適合健常対照群（ＨＣ）（Ｎ＝２０）から得た。
【０１２５】
血漿ＧＬＸ分析
２マイクロリットルの血漿をナイロン膜（Hybond N, Amersham, RPN203B）にデュプリケートでドットした。膜をブロッキング緩衝液（５％スキムミルク＋ＴＢＳ−０．０５％のTween20）中でブロックし、ブロッキング緩衝液＋一次抗体中、室温で１時間インキュベートし、洗浄し（ＴＢＳ−０．０５％のTween20）、ブロッキング緩衝液＋二次抗体と共にインキュベートし、洗浄し、SuperSignal Femto Reagent（Thermo Scientific）と共にインキュベートし、ＣＣＤカメラ（LAS 4000, GE）により画像化し、ImageJを用いて生の積分密度について分析した。一次抗体標的：グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）：コンドロイチン硫酸（ＣＳ、Sigma）、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）（ＨＳ、Millipore）、ケラチン硫酸（keratin sulfate）（ＫＳ、US-Biologicals）、及びヒアルロン酸（ＨＡ、Bio-Rad）；並びにプロテオグリカン（ＰＧ）：ＣＤ４４（DAKO）、シンデカン（Ｓｙｎ）−１（R&D）、−２（R&D）、−３（R&D）、−４（Santa Cruz）、グリピカン−１（R&D）、グリピカン−４（Us Biologicals）及びビグリカン（Abcam）。二次抗体標的：抗マウス、抗ヤギ、抗ウサギ−ＨＲＰ（DAKO）及びラット−ＨＲＰ（Sigma）。
【０１２６】
データ分析
データセットを正規性について検定した（Shapiro-Wilk）。非正規データセットを対数変換し、再度検定した。非正規のままであるデータセットをノンパラメトリック統計により検定した。パラメトリックデータを一元配置ＡＮＯＶＡで検定し、ノンパラメトリックデータをKruskal-Wallis検定で検定した。有意差は、ｐ＜０．０５の場合に報告される（GraphPad Prism 8）。＊、＊＊、＊＊＊、及び＊＊＊＊は、それぞれ＜０．０５、０．０１、０．００１及び０．０００１のＰ値を表す。
【０１２７】
ＧＬＸ測定から相関ヒートマップを作成し、マーカー間のピアソン相関を−１〜１のスケールでマッピングした。０未満の値を赤色でプロットし、ゼロを超える値を青色でプロットした。
ＧＬＸ構造：
ケラタン硫酸（ＫＳ）
ＣＤ４４
ＧＰＣ−４
ビグリカン
ヒアルロン酸（ＨＡ）
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）
ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ＧＰＣ−１
シンデカン−１
シンデカン−２
シンデカン−３
シンデカン−４
【０１２８】
結果
図４に見られるように、全てのＧＬＸマーカーは、全ての患者及び健常対照群サンプルにおいてバックグラウンドを上回って検出可能である。全てのＧＬＸマーカーは、患者と健常対照群との間で、独特のシグネチャーを表示する。
【０１２９】
ＰＤ患者の場合、１２のＧＬＸマーカーのうちの１０のマーカー、すなわち、ＫＳ、ＣＤ４４、ＧＰ４、ビグリカン、ＨＡ、ＨＳ、ＧＰＣ−１、Ｓｙｎ２、Ｓｙｎ３及びＳｙｎ４は、健常対照群と比べて有意に増加される。最強の増加は、バイオマーカーＫＳ、ＨＡ、及びＳｙｎ４に関して観察される。
【０１３０】
ＭＳＡ患者の場合、１２のＧＬＸマーカーのうちの１０のマーカー、すなわち、ＫＳ、ＣＤ４４、ＧＰ４、ＨＡ、コンドロイチン硫酸、ＨＳ、ＧＰＣ−１、Ｓｙｎ２、Ｓｙｎ３、及びＳｙｎ４は、健常対照群と比べて有意に増加される。最強の増加は、バイオマーカーＫＳ、ＣＤ４４、ＧＰ４、ＨＡ、ＨＳ、Ｓｙｎ２、Ｓｙｎ３、及びＳｙｎ４に関して観察される。
【０１３１】
ＡＬＳ患者の場合、１２のＧＬＸマーカーのうちの２つ、すなわちＳｙｎ２及びＳｙｎ４は、健常対照群と比べて有意に増加される。最強の増加は、バイオマーカーＳｙｎ２に関して観察される。
【０１３２】
３つの疾患（ＰＤ、ＭＳＡ及びＡＬＳ）の全てのサンプルにおいて有意に増加されるバイオマーカーはＳｙｎ２及びＳｙｎ４である。３つの疾患のうちの２つ、すなわちＰＤ及びＭＳＡについて増加されるバイオマーカーは、ＫＳ、ＣＤ４４、ＧＰ４、ＨＡ、ＨＳ、ＧＰＣ−１、及びＳｙｎ３である。
【０１３３】
図５に見られるように、健常対照群、並びにパーキンソン病、ＭＳＡ及びＡＬＳの患者のサンプルについて、２つのバイオマーカーの各セットにおける関係性が分析された。
【０１３４】
ＰＤ患者についての図５ｂ）のヒートマッププロファイリングは、Ｓｙｎ３及びビグリカン、ＣＤ４４及びビグリカン、Ｓｙｎ４及びビグリカン、Ｓｙｎ４及びＧＰＣ４、ＣＤ４４及びＳｙｎ３、ＣＤ４４及びＳｙｎ４、Ｓｙｎ４及びＧＰＣ１、並びにＣＤ４４及びＧＰＣ１のレベル間の正の関係性の増加を明白に示す。
【０１３５】
ＭＳＡ患者についての図５ｃ）のヒートマップは、分析されるバイオマーカーの全体的な増加を明白に示す。特に正に増加されたバイオマーカーのセットは、ＨＡ及びビグリカン、ビグリカン及びＧＰＣ−１、ビグリカン及びＳｙｎ３、ＣＤ４４及びＧＰＣ−１、ＣＤ４４及びＳｙｎ４、ＧＰ４及びＳｙｎ１、ＫＳ及びＳｙｎ４、ＨＡ及びＧＰＣ−１、ＨＡ及びＳｙｎ１、ＨＡ及びＳｙｎ２、ＨＡ及びＳｙｎ３、ＣＳ及びＳｙｎ３、ＣＳ及びＳｙｎ１、ＣＳ及びＳｙｎ２、ＣＳ及びＧＰＣ１、ＨＳ及びＣＤ４４、ＨＳ及びＧＰＣ−１、ＨＳ及びＳｙｎ１、ＨＳ及びＳｙｎ２、ＨＳ及びＳｙｎ３、ＧＰＣ−１及びＧＰＣ−１及びＳｙｎ３、ＧＰＣ−１及びＳｙｎ４、並びにＳｙｎ３及びＳｙｎ４のセットである。
【０１３６】
ＡＬＳ患者についての図５ｄ）のヒートマップ相関プロファイルは、ビグリカン及びＣＤ４４、ビグリカン及びＨＡ、ビグリカン及びＣＳ、ビグリカン及びＨＳ、ビグリカン及びＳｙｎ２、ＣＤ４４及びＣＳ、ＣＤ４４及びＨＳ、ＣＤ４４及びＳｙｎ２、ＨＡ及びＳｙｎ２、ＣＳ及びＳｙｎ１、ＣＳ及びＳｙｎ２、ＨＳ及びＳｙｎ２、ＧＰＣ１及びＳｙｎ４、並びにＳｙｎ３及びＳｙｎ４のセットについてレベルの関係性の増加を明白に示す。
【０１３７】
ＰＤ、ＭＳＡ及びＡＬＳに対するバイオマーカーの組合せのレベルが上昇又は低下する、上に記載されていない他の組合せは、図５に開示される。
【０１３８】
図５ａ）〜ｄ）に見られるように、ＰＤ、ＭＳＡ及びＡＬＳのヒートマップは、各疾患の特定のパターンを示す。
【０１３９】
結論
この一連の実験において、様々な種類にわたるＧＬＸ成分は、ＰＤ、ＭＳＡ及びＡＬＳ患者に対して上昇されると共に可変であり、したがって、疾患の潜在的なバイオマーカーであると考えるべきであることが示される。ＰＤ患者について実質的に関連性があることが示されたＧＬＸ成分は、ケラタン硫酸、ＣＤ４４、ビグリカン、ＧＰＣ−４、ＧＰＣ−１、ＨＡ、Ｓｙｎ２、Ｓｙｎ３及びＳｙｎ４である。ＭＳＡ患者について実質的に関連性があることが示されたＧＬＸ成分は、ケラタン硫酸、ＣＤ４４、ＧＰＣ−４、ＧＰＣ−１、ＨＡ、Ｓｙｎ２、Ｓｙｎ３及びＳｙｎ４である。ＡＬＳ患者について実質的に関連性があることが示されたＧＬＸ成分は、Ｓｙｎ２及びＳｙｎ４である。
【０１４０】
我々はさらに、ＰＤ、ＡＬＳ及びＭＳＡの各疾患について、２つのバイオマーカーの１つ又は複数のセットが特に上昇されており、図５に示されるようにバイオマーカーのいくつかの間に特定の関係性があることが示されると結論する。さらに、ＰＤ、ＡＬＳ及びＭＳＡ各疾患について、相関関係の典型的なパターンを「フィンガープリント」として使用して、患者のＰＤ、ＡＬＳ及び／又はＭＳＡの状態を決定することができる。
【０１４１】
まとめると、本明細書において、ＰＤ、ＭＳＡ及び／又はＡＬＳ患者からの生体サンプルにおけるＧＬＸ成分の同定の証拠が提供される。上記のＧＬＸ成分は全て、ＰＤ、ＭＳＡ及び／又はＡＬＳのバイオマーカーであることを示していると特定される。
【０１４２】
実施例４：自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病の患者からの血液（図６及び図７）
ＧＬＸ構造のバイオマーカーが血液サンプル中で検出可能であること、及びこれらのバイオマーカーの濃度が疾患及び炎症に応答して変化することを示すために、自己免疫性Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）を有する６〜９歳の小児から得られた血液サンプルを検査し、Ｔ１ＤＭのない兄弟姉妹の健常対照群（兄弟姉妹）からの血液サンプル中のＧＬＸマーカーのレベルと比較した（ｙ軸：任意ＯＤ）。
【０１４３】
図６：年齢／性別適合健常対照群（兄弟姉妹）及びＩ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）において、ＧＬＸマーカーをヒト血漿中で測定し、箱ひげ図（１０〜９０パーセンタイル、中央線及び平均に対する「＋」）として示した。健常対照群は、家族にＴ１ＤＭ兄弟姉妹がいる健常な兄弟姉妹である。データは、ｐ＜０．０５、０．０１、又は＜０．００１の場合に、それぞれ＊、＊＊、＊＊＊を用いて有意であると表示した。血液中のＧＬＸマーカーは、炎症性疾患の結果として変化する。
【０１４４】
図７：血液中のＧＬＸマーカーは、炎症性疾患の結果として変化する。ａ）年齢／性別適合健常対照群及びｂ）自己免疫疾患Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）におけるグリコカリックス（ＧＬＸ）マーカーの相関ヒートマップ。ＧＬＸマーカーをヒト血漿中で測定し、ピアソン相関をスケール−１〜１でマッピングした。０未満の値を赤色でプロットし、ゼロを超える値を青色でプロットした。血液中のＧＬＸマーカーは炎症性疾患の結果として変化し、可溶性ＧＬＸプロファイルを表す。
【０１４５】
材料及び方法
患者
血漿は、自己免疫性Ｔ１ＤＭを有する患者、及び健常であるがＴ１ＤＭを有する兄弟姉妹のいる兄弟姉妹からの適合対照群（それぞれ、Ｎ＝３３、３６）から得た。
【０１４６】
血漿ＧＬＸ分析
２マイクロリットルの血漿をナイロン膜（Hybond N, Amersham, RPN203B）にデュプリケートでドットした。膜をブロッキング緩衝液（５％スキムミルク＋ＴＢＳ−０．０５％のTween20）中でブロックし、ブロッキング緩衝液＋一次抗体中、４Ｃで一晩インキュベートし、洗浄し（ＴＢＳ−０．０５％のTween20）、ブロッキング緩衝液＋二次抗体と共にインキュベートし、洗浄し、SuperSignal Femto Reagent（Thermo Scientific）と共にインキュベートし、ＣＣＤカメラ（LAS 4000, GE）により画像化し、ImageJを用いて生の積分密度について分析した。一次抗体標的：グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）：コンドロイチン硫酸（ＣＳ、Sigma）、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）（ＨＳ、Millipore）、ケラチン硫酸（keratin sulfate）（ＫＳ、US-Biologicals）、及びヒアルロン酸（ＨＡ、Bio-Rad）；並びにプロテオグリカン（ＰＧ）：ＣＤ４４（DAKO）、シンデカン（Ｓｙｎ）−１（R&D）、−２（R&D）、−３（R&D）、−４（Santa Cruz）、グリピカン−４（Us Biologicals）及びビグリカン（Abcam）。二次抗体標的：抗マウス、抗ヤギ、抗ウサギ−ＨＲＰ（DAKO）及びラット−ＨＲＰ（Sigma）。
【０１４７】
データ分析
データセットを正規性について検定した（Shapiro-Wilk）。非正規データセットを対数変換し、再度検定した。非正規のままであるデータセットをノンパラメトリック統計により検定した。パラメトリックデータを一元配置ＡＮＯＶＡで検定し、ノンパラメトリックデータをKruskal-Wallis検定で検定した。有意差は、ｐ＜０．０５の場合に報告される（GraphPad Prism 8）。＊、＊＊、＊＊＊、及び＊＊＊＊は、それぞれ＜０．０５、０．０１、０．００１及び０．０００１のＰ値を表す。
【０１４８】
ＧＬＸ測定から相関ヒートマップを作成し、マーカー間のピアソン相関を−１〜１のスケールでマッピングした。０未満の値を赤色でプロットし、ゼロを超える値を青色でプロットした。
ＧＬＸ構造：
ケラタン硫酸（ＫＳ）
ＣＤ４４
ＧＰＣ−４
ビグリカン
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）
ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ヒアルロン酸（ＨＡ）
シンデカン−１
シンデカン−２
シンデカン−３
シンデカン−４
【０１４９】
結果
図６に見られるように、全てのＧＬＸマーカーは、全ての患者及び健常対照群サンプルにおいてバックグラウンドを上回って検出可能である。全てのＧＬＸマーカーは、患者と健常対照群との間で、独特のシグネチャーを表示する。
【０１５０】
Ｔ１ＤＭ患者の場合、１１のＧＬＸマーカーのうちの７つ、すなわち、ＫＳ、ＣＤ４４、ＧＰ４、ビグリカン、ＨＡ、Ｓｙｎ１、及びＳｙｎ３は、健常対照群と比べて有意に増加される。最強の増加は、バイオマーカーＫＳ、ビグリカン、ＧＰ４及びＳｙｎ３に関して観察される。
【０１５１】
図７に見られるように、兄弟姉妹の健常対照群（図７ａ））及びＴ１ＤＭ患者のサンプル（図７ｂ））について、２つのバイオマーカーの各セットにおける関係性が分析された。
【０１５２】
Ｔ１ＤＭ患者についてのヒートマップは、ビグリカン及びＣＤ４４、ビグリカン及びＳｙｎ３、ビグリカン及びＳｙｎ４、ＣＤ４４及びＳｙｎ３、ＣＤ４４及びＳｙｎ４、ＨＡ及びビグリカン、ＨＡ及びＳｙｎ３、ＨＡ及びＳｙｎ４、並びにＳｙｎ３及びＳｙｎ４のセットのレベルの上昇を明白に示す。
【０１５３】
Ｔ１ＤＭに対するバイオマーカーの組合せのレベルが上昇又は低下する、上に記載されていない他の組合せは、図７に開示される。
【０１５４】
結論
この一連の実験において、様々な種類にわたるＧＬＸ成分は、Ｔ１ＤＭ患者に対して上昇されると共に可変であり、したがって、疾患の潜在的なバイオマーカーであると考えるべきであることが示される。Ｔ１ＤＭ患者について実質的に関連性があることが示されたＧＬＸ成分は、ケラタン硫酸、ＣＤ４４、ビグリカン、ＧＰＣ−４、Ｓｙｎ１及びＳｙｎ３である。
【０１５５】
我々はさらに、Ｔ１ＤＭについて、２つのバイオマーカーの１つ又は複数のセットが特に上昇されており、図７に示されるようにバイオマーカーのいくつかの間に特定の関係性があることが示され、これは、健康及び疾患を区別することができると結論する。
【０１５６】
まとめると、本明細書において、Ｔ１ＤＭ患者からの生体サンプルにおけるＧＬＸ成分の同定の証拠が提供される。ＧＬＸ成分のケラタン硫酸、ＣＤ４４、ビグリカン、ＧＰＣ−４、Ｓｙｎ１及びＳｙｎ３は全て、Ｔ１ＤＭのバイオマーカーであることを示していると特定される。
【０１５７】
実施例５：アルツハイマー病患者からの血液（図８及び図９）
ＧＬＸ構造のバイオマーカーが血液サンプル中で検出可能であること、及びこれらのバイオマーカーの濃度が疾患及び炎症に応答して変化することを示すために、アルツハイマー病患者から得られた血液サンプル（ＡＤ、灰色のバー）を検査し、年齢適合健常対照群からの血液サンプル（ＨＣ、白色のバー）中のＧＬＸマーカーのレベルと比較した（ｙ軸：任意ＯＤ）。
【０１５８】
図８：血液中のＧＬＸマーカーは、炎症性疾患の結果として変化する。年齢／性別適合健常対照群（白色）及びアルツハイマー病（ＡＤ；灰色）において、ＧＬＸマーカーをヒト血漿中で測定し、箱ひげ図（１０〜９０パーセンタイル、中央線及び平均に対する「＋」）として示した。データは、ｐ＜０．０５、０．０１、又は＜０．００１の場合に、それぞれ＊、＊＊、＊＊＊を用いて有意であると表示した。血液中のＧＬＸマーカーは、炎症性疾患の結果として変化する。
【０１５９】
図９：血液中のＧＬＸマーカーは炎症性疾患の結果として変化し、疾患修飾性薬物治療に応答する。ａ）年齢／性別適合健常対照群、並びにｂ）アルツハイマー病（ＡＤ）、及びｃ）プラセボによる治療及びｄ）疾患修飾性薬物治療の６か月後のＡＤ患者におけるグリコカリックス（ＧＬＸ）マーカーの相関ヒートマップ。ＧＬＸマーカーをヒト血漿中で測定し、ピアソン相関をスケール−１〜１でマッピングした。０未満の値を赤色でプロットし、ゼロを超える値を青色でプロットした。血液中のＧＬＸマーカーは炎症性疾患及び治療の結果として変化し、可溶性ＧＬＸプロファイルを表す。
【０１６０】
材料及び方法
患者
ＡＤ患者（ベースライン（Ｎ＝３２））、健常対照群（Ｎ＝２０）からの血漿を得て、プラセボ（Ｎ＝１９）又は疾患治療（Ｎ＝１３）を受けさせた６か月後にＡＤ患者を追跡した。
【０１６１】
血漿ＧＬＸ分析
２マイクロリットルの血漿をナイロン膜（Hybond N, Amersham, RPN203B）にデュプリケートでドットした。膜をブロッキング緩衝液（５％スキムミルク＋ＴＢＳ−０．０５％のTween20）中でブロックし、ブロッキング緩衝液＋一次抗体中、室温で１時間インキュベートし、洗浄し（ＴＢＳ−０．０５％のTween20）、ブロッキング緩衝液＋二次抗体と共にインキュベートし、洗浄し、SuperSignal Femto Reagent（Thermo Scientific）と共にインキュベートし、ＣＣＤカメラ（LAS 4000, GE）により画像化し、ImageJを用いて生の積分密度について分析した。一次抗体標的：グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）：コンドロイチン硫酸（ＣＳ、Sigma）、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）（ＨＳ、Millipore）、ケラチン硫酸（keratin sulfate）（ＫＳ、US-Biologicals）、及びヒアルロン酸（ＨＡ、Bio-Rad）；並びにプロテオグリカン（ＰＧ）：ＣＤ４４（DAKO）、シンデカン（Ｓｙｎ）−１（R&D）、−２（R&D）、−３（R&D）、−４（Santa Cruz）、グリピカン−１（R&D）、グリピカン−４（Us Biologicals）、パールカン（R&D）、及びビグリカン（Abcam）。二次抗体標的：抗マウス、抗ヤギ、抗ウサギ−ＨＲＰ（DAKO）及びラット−ＨＲＰ（Sigma）。
【０１６２】
データ分析
データセットを正規性について検定した（Shapiro-Wilk）。非正規データセットを対数変換し、再度検定した。非正規のままであるデータセットをノンパラメトリック統計により検定した。パラメトリックデータを一元配置ＡＮＯＶＡで検定し、ノンパラメトリックデータをKruskal-Wallis検定で検定した。有意差は、ｐ＜０．０５の場合に報告される。＊、＊＊、＊＊＊、及び＊＊＊＊は、それぞれ＜０．０５、０．０１、０．００１及び０．０００１のＰ値を表す（GraphPad Prism 8）。
【０１６３】
ＧＬＸ測定から相関ヒートマップを作成し、マーカー間のピアソン相関を−１〜１のスケールでマッピングした。０未満の値を赤色でプロットし、ゼロを超える値を青色でプロットした。
ＧＬＸ構造：
ケラタン硫酸（ＫＳ）
ＣＤ４４
ＧＰＣ−４
ビグリカン
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）
ヘパラン硫酸（ＨＳ）
ヒアルロン酸
ＧＰＣ−１
シンデカン−１
シンデカン−２
シンデカン−３
シンデカン−４
パールカン
【０１６４】
結果
図８に見られるように、全てのＧＬＸマーカーは、全ての患者及び健常対照群サンプルにおいてバックグラウンドを上回って検出可能である。全てのＧＬＸマーカーは、患者と健常対照群との間で、独特のシグネチャーを表示する。
【０１６５】
ＡＤ患者の場合、１３のＧＬＸマーカーのうちの７つ、すなわち、ＫＳ（増加）、ＣＤ４４（増加）、ＧＰ４（増加）、ビグリカン（低下）、ＧＰＣ−１（低下）、コンドロイチン硫酸（低下）、ヘパラン硫酸（低下）は、健常対照群と比べて有意に変化する。最強の増加は、バイオマーカーＫＳ、ＣＤ４４及びＧＰＣ−１について観察される。
【０１６６】
図９に見られるように、ＡＤ患者のヒートマップ（図９ｂ））は、健常対照群のヒートマップ（図９ａ））と比べて、バイオマーカー間の異なる相関関係を示す。正の関係性が増加したバイオマーカーのセットは、例えば、ＣＤ４４及びＣＳ、ＣＤ４４及びＨＳ、ＧＰ４及びＨＳ、ＧＰ４及びＳｙｎ２、ＫＳ及びＨＡ、ＫＳ及びＳｙｎ２、ビグリカン及びＨＡ、ＨＡ及びＳｙｎ４、ＣＳ及びＳｙｎ３、ＣＳ及びＳｙｎ４、並びにＨＳ及びＳｙｎ３のセットである。
【０１６７】
６か月のプラセボサンプルについてのバイオマーカーヒートマップ（図９ｃ））は、未治療のＡＤ患者のヒートマップ（図９ｂ））と類似しているが、同一ではない。対照的に、６か月の治療のサンプルのバイオマーカーヒートマップ（図９ｄ））は、健常対照群と比較的似ているが同一ではなく、プラセボサンプルとは全く似ていない。
【０１６８】
ＡＤに対するバイオマーカーの組合せのレベルが上昇又は低下する、上に記載されていない他の組合せは、図９に開示される。
【０１６９】
図１０に見られるように、６か月の治療を受けたＡＤ患者におけるＣＤ４４の存在は、プラセボのみを受けたＡＤ患者におけるＣＤ４４のレベルと比べて低下される。
【０１７０】
結論
この一連の実験において、様々な種類にわたるＧＬＸ成分は有意に増加又は低下され、したがってＡＤ患者に対して異なり、したがって、疾患、疾患重症度、及び治療反応の潜在的なバイオマーカーであると考えるべきであることが示される。ＡＤ患者について実質的に関連性があることが示されたＧＬＸ成分は、ケラタン硫酸、ＣＤ４４、ＧＰ４、ビグリカン、ＧＰＣ−１及びコンドロイチン硫酸である。
【０１７１】
我々はさらに、ＡＤについて、２つのバイオマーカーの１つ又は複数のセットが特に相関性があり、図９に示されるようにバイオマーカーのいくつかの間に特定の関係性があることが示されると結論する。さらに、分析したバイオマーカーを用いて、プラセボのみの治療と比べて治療の進行をモニターすることが可能である。これを用いて、治療を受けた患者と、治療を全く受けていない患者又は不十分な治療しか受けていない患者とを区別することも可能である。例示的に、ＣＤ４４のレベルは、わずか６か月後に、プラセボを受けた患者と、治療を受けた患者とを区別することができる。
【０１７２】
まとめると、本明細書において、ＡＤ患者からの生体サンプルにおけるＧＬＸ成分の同定の証拠が提供される。ＧＬＸ成分のＫＳ、ＣＤ４４、ＧＰ４、ビグリカン、ＧＰＣ−１及びコンドロイチン硫酸は全て、ＡＤのバイオマーカーであることを示していると特定される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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