(57)【要約】  本発明は、リンカーによって脂質に連結しているCpGオリゴデオキシヌクレオチド配列を含む化合物、並びに関連する組成物、及び方法を提供する。【選択図】図1
2021516991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記脂質
【化１】
2021516991.tif 000010
又はその塩と、5'末端で、結合又はリンカーによって連結しているヌクレオチド配列5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'（配列番号1）からなる化合物（ここで、XはO又はSである）。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が前記脂質に結合している、請求項1の化合物。
【請求項３】
5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'（配列番号1）のヌクレオシドを連結する全てのインターヌクレオシド基がホスホロチオエート類である、請求項1又は2の化合物。
【請求項４】
ヒト患者のがんの治療方法であって、請求項1又は2の化合物、MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びMHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質を患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項５】
前記がんがヒトパピローマウイルス（HPV）陽性である、請求項4の方法。
【請求項６】
前記がんがHPV16型陽性である、請求項5の方法。
【請求項７】
前記がんが頭頸部扁平上皮がんである、請求項4の方法。
【請求項８】
前記患者が白金含有化学療法を受けているか、又は受けたことがある、請求項4の方法。
【請求項９】
前記化合物及び配列番号2及び配列番号3のアミノ酸配列を有する蛋白質が同時に投与される、請求項4の方法。
【請求項１０】
前記化合物及び配列番号2及び配列番号3のアミノ酸配列を有する蛋白質が順次投与される、請求項4の方法。
【請求項１１】
請求項1又は2の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びMHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質をさらに含む、請求項11の医薬組成物。
【請求項１３】
(i)請求項1又は2の化合物、及び(ii) MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びMHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【配列リスト】
【０００１】
本願は、ASCII形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。_で作成されたASCIIコピーの名前は_でサイズは_バイトである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（HPV）関連がんは、世界で最も急速に増加しているがんの一つである。全体では、世界の全がんの5%がHPV感染に起因していると考えられている。さらなる効果的ながん治療が求められている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、治療方法に使用できる化合物を提供する。
【０００４】
即ち、第一の側面では、本発明は、下記脂質
【化１】
2021516991.tif 000003
又はその塩と、5'末端で、結合又はリンカーによって連結しているヌクレオチド配列5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'（配列番号1）からなる化合物（ここで、XはO又はSである）を特徴とする。
【０００５】
本発明の第一の側面の一実施形態では、ヌクレオチド配列が脂質に結合している。
【０００６】
本発明の第一の側面の別の実施形態では、5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'（配列番号1）のヌクレオシドを連結する全てのインターヌクレオシド基がホスホロチオエート類である。
【０００７】
第二の側面では、本発明は、ヒト患者のがんの治療方法を特徴とする。この方法は、第一の側面の化合物、MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びMHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質を患者に投与する工程を含む。
【０００８】
本発明の第二の側面の一実施形態では、がんがヒトパピローマウイルス（HPV）陽性（例えば、HPV16型陽性）である。
【０００９】
本発明の第二の側面の別の実施形態では、がんが頭頸部扁平上皮がんである。
【００１０】
本発明の第二の側面の追加の実施形態では、患者が白金含有化学療法を受けているか、又は受けたことがある。さらなる実施形態では、抗PD-1抗体（例えば、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）が患者に投与される。
【００１１】
本発明の第二の側面の別の実施形態では、本発明の第一の側面の化合物、配列番号2及び配列番号3のアミノ酸配列を有する蛋白質が同時に投与される。
【００１２】
本発明の第二の側面のさらなる実施形態では、本発明の第一の側面の化合物、配列番号2及び配列番号3のアミノ酸配列を有する蛋白質が順次投与される。
【００１３】
さらなる側面では、本発明は、ヒト患者のがんの別の治療方法を特徴とする。この方法は、本発明の第一の側面の化合物、MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及び抗PD-1抗体（例えば、ペムブロリズマブ又はニボルマブ）を患者に投与する工程を含む。
【００１４】
第三の側面では、本発明は、本発明の第一の側面の化合物、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を特徴とする。
【００１５】
第三の側面の一実施形態では、医薬組成物は、MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びMHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質をさらに含む。
【００１６】
第四の側面では、本発明は、(i)本発明の第一の側面の化合物、又は本発明の第二の側面の組成物、及び(ii) MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びMHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む、キットを特徴とする。
【００１７】
定義
本明細書で使用される「リンカー」は、一方の結合価がある生物学的機能性基に共有結合し、他方の結合価が別の生物学的機能性基に共有結合している一価又は二価の基を指す。一例では、リンカーは、例えば、CpGオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を脂質（本明細書に記載されているように、例えば、-P(X)(OH)-O-CH(CH2NHCO-(CH2)16-CH3)2又はその塩であって、XはO又はSである）に連結する。そのようなリンカーは、任意に、1つ以上のヌクレオチド、例えば、ジヌクレオチド（例えば、GG）を含むことができる。
【００１８】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、活性化合物を懸濁又は溶解することができ、患者において非毒性であり、かつ非炎症性であるという特性を有するビヒクルを指す。さらに、薬学的に許容される担体は、医薬製剤の分野で知られているか又は使用されている、防腐剤、酸化防止剤、香料、乳化剤、染料、又は賦形剤のような薬学的に許容される添加剤を含んでもよく、活性剤の生物学的活性の治療効果を有意に阻害せず、かつ患者に無毒である。
【００１９】
用語「治療（treat）」、「治療（treatment）」、及び「治療（treating）」は、疾患又は障害に関連する状態、例えば、がんの進行又は重症度を逆転、緩和、改善、抑制、減速、又は停止させることを目的とする治療的アプローチを指す。これらの用語には、状態、疾患、又は障害の少なくとも1つの有害作用又は症状を軽減又は緩和することを含む。治療は、1つ以上の症状又は臨床マーカーが減少するか、又は所望の応答（例えば、特異的免疫応答）が誘導される場合、一般に「有効」である。あるいは、治療は、疾患の進行が減少又は停止される場合に「有効」である。
【００２０】
本発明は、いくつかの利点を提供する。例えば、脂質部位及び任意にリンカーを含む、本発明の特定の化合物は、それらが投与される対象の内因性アルブミンに結合し、それにより、対象のリンパ節への化合物の送達が促進される。これにより、例えば、対象に投与されたHPV蛋白質に対する治療的免疫応答の誘導が促進され、効果的ながん治療につながる。
【００２１】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図1は、HPV16 E6に対する免疫応答を示すグラフである。
【図２】図2は、HPV16 E7に対する免疫応答を示すグラフである。
【図３】図3は、HPV16 E7に対するテトラマー染色分析を示すグラフである。
【図４】図4は、HPV16 E6及びHPV16 E7のアンフィフィル-CpG（amphiphile-CpG）（aCpG）との投与が、aCpG単独又は無治療（No Tx）と比較して腫瘍サイズを減少させたことを示す一連のグラフである。
【図５】図5は、異なる時点での可溶性CpGワクチンと比較した、aCpGワクチンによる優れたHPVテトラマー反応を示すグラフである。
【図６】図6は、毎週又は2週間に1回の頻度でaCpGを投与した場合の経時的なHPVテトラマー反応の持続性を示すグラフである。
【図７】図7は、E7ワクチン治療に対する腫瘍サイズの応答を示すグラフである。
【図８】図8は、E7ワクチン治療された、TC-1腫瘍細胞を移植したC57BL6マウスにおける改善された生存を示すグラフである。
【図９】図9は、投与後の血清サイトカインレベルの変化を示す一連のグラフである。
【図１０】図10は、HPV16 E7/aCpGワクチンの経時的なテトラマー応答を示すグラフである。
【図１１】図11は、HPV16 E7/aCpGワクチン接種に抗PD-1抗体の投与をプラス又はマイナスした場合の腫瘍増殖反応を示すグラフである。
【図１２】図12は、HPV16 E7/aCpGワクチン接種に抗PD-1抗体をプラス又はマイナス投与した場合のTC-1腫瘍ベアリングマウスの生存率に対する効果を示すグラフである。
【図１３】図13は、aCpG用量エスカレーションのテトラマー解析を示すグラフである。
【図１４】図14は、アンフィフィル-CpG-7909；5'-（ジアシル脂質）TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3'（配列番号1）の構造を示すグラフである。 全ての塩基はDNAである。ジアシル脂質とオリゴデオキシヌクレオチドとの間の連結を含む、全ての連結はホスホロアミダイトである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は治療方法において使用できる化合物を提供する。化合物は、CpGオリゴデオキシヌクレオチド（ODNs）（例えば、CpG ODNは5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'（配列番号1）の配列を有する）を含む。CpG ODNは、5'末端において、例えば下記
【化２】
2021516991.tif 000004
（ここで、XはO又はS）のような脂質又はその塩と連結している。CpGオリゴデオキシヌクレオチドは脂質に直接結合していてもよい。もしくは、CpGはGGのようなリンカーを介して脂質と連結していてもよい。CpGオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、全てのインターヌクレオシド基はホスホロチオエート類（例えば、化合物の全てのインターヌクレオシド基はホスホロチオエート類であってもよい）である。
【００２４】
CpG ODNは、がん抗原（例えば、HPV抗原）に対する免疫応答のような、対象における免疫応答を引き起こすためのアジュバントとして機能できる。このように、本発明の化合物及び組成物は、治療方法において使用できる。特に、CpG ODN含有化合物を1つ以上のHPV蛋白質と組み合わせて投与すると、その化合物はHPV陽性がん細胞に対する免疫応答を誘導できる。従って、本発明は、対象（例えば、ヒト患者）に本発明の1種以上の化合物又は組成物を投与することにより、対象のがんの治療方法を提供する。様々な例において、がんは、HPV陽性（例えば、HPV16型陽性）がんである。
【００２５】
HPV陽性がんは、頭頸部扁平上皮がん、子宮頸がん、肛門がん、外陰がん、頭頸部がん、口腔咽頭がん、陰茎がん、膣がん、ウイルス性誘導がん、膀胱がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、卵巣がん、コロンキャンサー、胃がん、神経芽腫、乳がん、前立腺がん、腎がん、白血病、サルコーマ、カルシノーマ、基底細胞カルシノーマ、非小細胞肺カルシノーマ、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、B細胞慢性リンパ性白血病（B-CLL）、多発性骨髄腫（MM）、赤白血病、腎細胞カルシノーマ、サルコーマ、メラノーマ、星細胞腫、乏突起胃細胞腫、胆道がん、絨毛がん、CNSがん、喉頭がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（NSCLC）、アデノカルシノーマ、巨（又はオート）細胞カルシノーマ、扁平上皮カルシノーマ、口腔がん、皮膚がん、基底細胞がん、扁平上皮がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、直腸がん、呼吸器系のがん、又は泌尿器系のがんであってもよい。
【００２６】
任意に、本発明の方法は、治療のための第二の（又はさらなる）異なるアプローチと組み合わせて、本発明の化合物又は組成物を投与する工程をさらに含むことができる。
【００２７】
また、本発明は、それぞれが、例えば、本発明の1つ以上の化合物を含む第一の容器を含み、任意に、本明細書に記載されたHPV蛋白質のようながん抗原を含む第二の容器と一緒の、キットを提供する。
【００２８】
CpG
CpG ODNsは、特定の配列コンテキスト中の非メチル化CpGジヌクレオチドを含む短い合成一本鎖DNA分子である。CpG ODNsは、DNA分子中の天然のホスホジエステル（PO）骨格とは対照的に、部分的又は完全にホスホロチオ化された（PS）骨格を有する。ヒト末梢血単核細胞（PBMCs）、特にB細胞及び形質細胞様樹状細胞（pDCs）における構造的特性及び活性に基づいて、刺激性CpG ODNsの3つの主要なクラスが同定されている。これらの3つのクラスは、Aクラス（D型）、Bクラス（K型）、及びCクラスである。
【００２９】
CpG1826とCpG7909は共にCpGクラスBである。クラスB CpG ODNsは、1つ以上のCpGジヌクレオチドを有するフルPSバックボーンを含む。それらは、B細胞及びTLR9依存性NF-κBシグナルを強く活性化するが、IFN-α分泌を弱く刺激する。
【００３０】
変異型HPV
C70G、C113G、及びI135G（下記の下線部）の点変異は、ヒトp53との立体化学的相互作用を防ぐために、野生型HPV16 E6ウイルス蛋白質に導入できる。抗原としてのこのコンポーネントの性能は、蛋白質の配列によって決定され、蛋白質の構造はその目的の機能には重要ではない。
mHPV 16 E6 (158 aa; 配列番号2)
MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL
【００３１】
C24G及びE26G（下記の下線部）の点変異は、ヒトRb1との立体化学的相互作用を防ぐために、野生型HPV16 E7ウイルス蛋白質に導入できる。ここでも、抗原としてのこのコンポーネントの性能は、蛋白質の配列によって決定され、蛋白質の構造はその目的の機能には重要ではない。
mHPV 16 E7 (98 aa; 配列番号3)
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP.
【００３２】
CpG ODNsは、脂質に直接結合していてもよいし、リンカーによって連結していてもよい。この化合物は、当技術分野で知られている通常のホスホロアミダイト化学を用いて製造してもよい。いくつかの例では、CpG ODN又はCpG ODN-GGを以下の化合物
【化３】
2021516991.tif 000005
と反応させ、中間体を生産してもよく、ここで、酸化（例えば、当技術分野で知られているホスファイト酸化方法、例えば、硫化剤、例えば、3-((N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ)-3H-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン）及びシアノエチル基の加水分解により、本発明の化合物を生産してもよい。
【００３３】
本発明をより完全に理解するために、以下に実施例を示す。これらの実施例は、例示のみを目的としたものであり、本発明の範囲をいかなる意味でも制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３４】
実施例1：HPV16 E6及びHPV16 E7蛋白質とCpGアンフィフィルアジュバントの組み合わせによる免疫応答の生成
マウスを予防的に免疫し、生成した免疫応答を、HPV16 E6及びHPV16 E7（E6/E7）刺激時のE7-テトラマー染色及びIFNγ-細胞内サイトカイン染色（ICS）を介して記録した。 
【００３５】
実験デザインは、以下の6群のマウス（各群n＝10）を含んでいた。
1. 非免疫化
2. E6/E7 + 可溶性CpG1826
3. E6/E7 + アンフィフィルCpG1826（aCpG1826）
4. E6/E7 + 可溶性CpG7909
5. E6/E7 + アンフィフィルCpG7909（aCpG7909；図14）。
6. E6/E7 + ポリIC（pIC）
【００３６】
pICをベンチマークアジュバント対照として使用した。
【００３７】
蛋白質ストック溶液は8M尿素に溶解した。アジュバントストック溶液はH2Oに溶解した。最終注入物は1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（尿素のCF＜1M）で希釈される。
【００３８】
aCpG1826に関して、5'末端に2つのグアニンが付加された可溶性CpG1826配列（5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'；配列番号4）の配列（5'-gg tccatgacgttcctgacgtt-3'；配列番号5）を使用した。可溶性CpG1826及びaCpG1826の両方について、各100μl注入において5nmolの濃度で使用した。CpG1826はマウスに最適な配列であり、一方でCpG7909はヒトに最適であり、マウスでは活性が低い。CpG1826及びCpG7909は、同じCpGクラス（クラスB）にあり、一般に、それぞれの種において同様の活性プロファイルを有する。
【００３９】
aCpG7909及び可溶性CpG7909の両方について、各100μl注入において5nmolの濃度で、5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'（配列番号6）の配列を使用した。
【００４０】
C70G、C113G、及びI135G（下記の下線部）に点変異を有する変異型HPV16 E6を免疫に使用した。使用したアミノ酸配列を以下に示す。
mHPV 16 E6 (158 aa; 配列番号2)
MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL
【００４１】
C24G及びE26G（下記の下線部）に点変異を有する変異型HPV16 E7を免疫に使用した。使用したアミノ酸配列を以下に示す。
mHPV 16 E7 (98 aa; 配列番号3)
MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP
【００４２】
E6/E7については、100μlの注入あたり、変異型HPV16 E6及び変異型HPV16 E7の各10μgを使用した。
【００４３】
雌のC57BL/6Jマウス（B6）を、プライマー用量（E6/7+aCpG）及び2週間後に1回のブースター用量で皮下（s.c.）免疫した。
【００４４】
H-2Db HPV16 E7（RAHYNIVTF; 配列番号7）のためのテトラマー分析を、ブースター投与の7日後に実施した（図3）。
【００４５】
E6/E7に対する免疫応答を分析するために、ブースター投与の7日後にIFNγの細胞内サイトカイン染色（ICS）を末梢血で実施した。
【００４６】
E6刺激には以下のペプチドを使用し、図1に示すデータを生成した。E6-10: EVYDFAFRDL（配列番号8）、E6 49-57: VYDFAFRDL（配列番号9）、E6 37-45: CVYCKQQLL（配列番号10）、E6 72-80: KCLKFYSKI（配列番号11）、及びE6 100-108: NKPLCDLLI（配列番号12）
【００４７】
E6刺激のデコンボリューションにより、E49-57が刺激をもたらした唯一のペプチドであることが明らかになった。
【００４８】
E7刺激のために以下のペプチドを使用した：RAHYNIVTF（配列番号13）。このペプチドを使用して、図2に示すデータを生成した。 
【００４９】
図1及び2に示すように、aCpG1826の使用は、変異型HPV16 E6及び変異型HPV16 E7の両方に対して強い免疫応答を生じさせた。
【００５０】
また、図1及び図2に示すように、ヒトに最適であり、一般的にマウスでは効果が低いaCpG7909の使用は、驚くべきことに、変異型HPV16 E6及び変異型HPV16 E7の両方に対して強い免疫応答を生じさせた。
【００５１】
E6/E7 + aCpGは、aCpG単独又は無治療と比較して腫瘍の成長を減少させ、対応するパーセント生存率の増加を示した（図4）。
【００５２】
実施例2：HPV16 E7とaCPGの投与スケジュールの決定
TC-1腫瘍を移植した雌のC57BL/6U（B6）マウスにおける抗腫瘍効果に関してE7 + aCpGの最適な投与スケジュールを決定するために、毎週の投与を2週間毎の投与とベースライン（プライムのみ）の投与と比較した。E7 + aCpGをE7 + 可溶性CpGと比較した。全ワクチンを3回（プライムと2回のブースト）投与した。
【００５３】
0日目及び12日目に50,000個のTC-1細胞を雌のC57BL/6Jマウス（B6）の脇腹に皮下接種した。マウスを治療群に分け、表1に示したように治療した。
【００５４】
【表１】
2021516991.tif 000006
【００５５】
蛋白質/アンフィフィリックCpGワクチンに対するHPVテトラマー特異的T細胞反応は、単回投与及び反復投与後のいずれにおいても、蛋白質/水溶性CpGワクチンよりも優れていた（図5）。蛋白質/aCpGに対するHPVテトラマー反応は、ブースト接種後にさらに増加し、その増加は毎週及び2週間に1回レジメンの場合はそれぞれ28日目及び35日目まで持続した（図6）。aCpG群における強力なHPVテトラマー反応は、可溶性CpGワクチン接種動物と比較して腫瘍サイズの縮小（図7）と相関し、生存期間が改善した（図8）。全身性サイトカインの治療に関連した増加は、IL-10及びIFNγを除いて可溶性及びaCpG群で同等であった。IL-10は可溶性CpGに比べてaCpGの方が低く、IFNγは可溶性CpGに比べてaCpGの方が高かった（図9）。
【００５６】
実施例3：抗PD-1抗体の添加・非添加の可溶性又はアンフィリックCpGとの併用におけるE7蛋白質の抗腫瘍効果
抗PD-1抗体の添加・非添加の可溶性又はアンフィリックCpGとの併用におけるE7蛋白質の抗腫瘍効果を評価するために、ベースラインで50,000個のTC-1細胞を雌のC57BL/6Jマウス（B6）の脇腹に接種した。接種11日後に表2に示すようにマウスを5群に分けた。比較群は無治療とした。
【００５７】
【表２】
2021516991.tif 000007
【００５８】
試験期間中、接種後40日目まで隔日で腫瘍サイズを測定し、動物の生存率をモニターした。H-2Db HPV16 E7（RAHYNIVTF）のテトラマー分析を、各ワクチン投与の7日後に実施した。
【００５９】
抗PD-1抗体の添加・非添加のE7/Amph-CpGワクチンの投与は、HPV16 E7（RAHYNIVTF; 配列番号13）ペプチドに特異的なHPVテトラマー+CD8細胞の安定した増加を引き起こした（図10）。この応答は、1回目の投与後早くから明らかに認められ、2回目の投与でピークを迎え、3回目の投与まで持続した（対照的に、E7/CpGでは応答が低く、抗PD-1の同時投与により増加したが、持続しなかった）。
【００６０】
この強力なHPVテトラマー+CD8応答に対応して、腫瘍の増殖は24日目頃に停止し、E7/Amph-CpG（抗PD-1抗体の添加・非添加）の初回投与後に逆転し、他の群で増殖が進行したのとは対照的に、試験終了時まで小さく安定したままであった（図11）。
【００６１】
また、腫瘍サイズに対する効果に対応して、E7/aCpGワクチン（抗PD-1抗体の添加・非添加）による治療は生存率に有意な効果があり、抗体なしのE7/aCpGでは6/7（85％）の治癒、E7/aCpG+抗PD-1抗体では8/10（80％）の治癒が得られた（図12）。
【００６２】
実施例4：aCpG用量漸増試験
6回の投与の過程で最大の抗原特異的テトラマー+CD8応答を生じるaCpGの用量を決定するために、抗原として10μgのオバルブミン（OVA）の固定用量を使用して用量漸増試験を実施した。比較として可溶性CpGを使用した。耐性（体重及び一般観察に基づく）も評価した。試験デザインは、表3に概説されている。
【００６３】
【表３】
2021516991.tif 000008
【００６４】
総試験期間11週間、2週間間隔で6回のワクチンを投与した。
【００６５】
各注射の7日後に末梢血サンプルを採取し、CD8+細胞上のテトラマーのフローサイトメトリー分析をH-2Kb OVA（SIINFEKL; 配列番号14）を用いて行った。
【００６６】
テトラマー+CD8+細胞の有意な増加は、aCpG + OVAで処理した群でのみ観察され、6 nmolが最大の薬理学的効果をもたらした（図13）。体重減少、興味／食欲減退、又は創傷／損傷は観察されなかった。
【００６７】
他の実施形態
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されてきたが、さらなる改変が可能であり、本願は、一般に、本発明の原理に従う本発明のあらゆる変形、使用、又は適応をカバーすることを意図していることが理解され得、本発明が属する技術分野における既知又は慣例の範囲内にある、本明細書の開示からのそのような逸脱を含むものであり、本明細書に先に述べた本質的な特徴に適用され得るものである。
【００６８】
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願が、その全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態は、以下の番号を付したパラグラフ内に記載されている。
【００７０】
1. 下記脂質
【化４】
2021516991.tif 000009
又はその塩と、5'末端で、結合又はリンカーによって連結しているヌクレオチド配列5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'（配列番号1）からなる化合物（ここで、XはO又はSである）。
【００７１】
2. 上記ヌクレオチド配列が上記脂質に結合している、パラグラフ1の化合物。
【００７２】
3. 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'（配列番号1）のヌクレオシドを連結する全てのインターヌクレオシド基がホスホロチオエート類である、パラグラフ1又は2の化合物。
【００７３】
4. ヒト患者のがんの治療方法であって、パラグラフ1〜3のいずれか1つの化合物、MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びMHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質を患者に投与する工程を含む、方法。
【００７４】
5. 上記がんがヒトパピローマウイルス（HPV）陽性である、パラグラフ4の方法。
【００７５】
6. 上記がんがHPV16型陽性である、パラグラフ5の方法。
【００７６】
7. 上記がんが頭頸部扁平上皮がんである、パラグラフ4〜6のいずれか1つの方法。
【００７７】
8. 上記患者が白金含有化学療法を受けているか、又は受けたことがある、パラグラフ4〜7のいずれか1つの方法。
【００７８】
9. 上記パラグラフ1の化合物及び配列番号2及び配列番号3のアミノ酸配列を有する蛋白質が同時に投与される、パラグラフ4の方法。
【００７９】
10. 上記パラグラフ1の化合物及び配列番号2及び配列番号3のアミノ酸配列を有する蛋白質が順次投与する、パラグラフ4の方法。
【００８０】
11. パラグラフ1〜3のいずれか1つの化合物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【００８１】
12. 上記組成物は、MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びMHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質をさらに含む、パラグラフ11の医薬組成物。
【００８２】
13. (i)パラグラフ1〜3のいずれか1つの化合物、又はパラグラフ11の組成物、及び(ii) MHQKRTAMFQ DPQERPRKLP QLCTELQTTI HDIILECVYC KQQLLRREVY DFAFRDLCIV YRDGNPYAVG DKCLKFYSKI SEYRHYCYSL YGTTLEQQYN KPLCDLLIRC INGQKPLCPE EKQRHLDKKQ RFHNGRGRWT GRCMSCCRSS RTRRETQL（配列番号2）のアミノ酸配列を有する蛋白質、及びMHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYGYGQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP（配列番号3）のアミノ酸配列を有する蛋白質を含む、キット。
【００８３】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載されている。
【図１】
2021516991.tif 000011
【図２】
2021516991.tif 000012
【図３】
2021516991.tif 000013
【図４】
2021516991.tif 000014
【図５】
2021516991.tif 000015
【図６】
2021516991.tif 000016
【図７】
2021516991.tif 000017
【図８】
2021516991.tif 000018
【図９】
2021516991.tif 000019
【図１０】
2021516991.tif 000020
【図１１】
2021516991.tif 000021
【図１２】
2021516991.tif 000022
【図１３】
2021516991.tif 000023
【図１４】
2021516991.tif 000024
【配列表】
2021516991000001.app
【国際調査報告】
2021516991.tif 000025
2021516991.tif 000026