(57)【要約】機能性分極組織を必要とする対象体に投与されると、機能性分極組織を生じさせることができる、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体を含む組成物を開示する。
2021511937.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能性分極組織を必要とする対象体に投与されると、機能性分極組織を生じさせることができる、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体を含む組成物。
【請求項２】
刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体が、骨組織界面に由来する、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
骨組織界面が、皮質周囲組織界面、層状構造周囲組織界面、小柱周囲組織界面、皮質海綿組織界面、またはそれらの任意の組合せである、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体が、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
生存しているコアの強力な細胞実体が、LGR4、LGR5、LGR6、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される1つ以上のロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
生存しているコアの強力な細胞実体が、Pax 7、Pax 3、MyoD、Myf 5、またはそれらの任意の組合せの1つ以上のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する、請求項4または5に記載の組成物。
【請求項７】
刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体が、自然の骨組織で観察されるものと比較して副甲状腺ホルモンの発現レベルの上昇を示す、請求項2〜6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体が、自然の骨組織で観察されるものと比較して副甲状腺ホルモンの発現レベルの10倍〜15倍の上昇を示す、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体が、自然の骨組織で観察されるものと比較してTLR4の発現レベルの上昇を示す、請求項2〜8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体が、自然の骨組織で観察されるものと比較してチミジンホスホリラーゼの発現レベルの上昇を示す、請求項2〜9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体が、自然の骨組織で観察されるものと比較してチミジンホスホリラーゼの発現レベルの100倍〜200倍の上昇を示す、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
機能性分極組織が、自然の骨組織で観察されるものと比較してIL2、MYOSIN2、ITGB5およびSTAT3の1つ以上の発現レベルの低下を示す、請求項2〜11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
支持実体が、間葉由来の細胞集団を含む、請求項4〜12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
支持実体が、細胞集団、細胞外マトリックス構成要素、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項4〜13のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
細胞外マトリックス構成要素が、ヒアルロン酸、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外小胞、酵素および糖タンパク質の1つ以上を含む、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
送達基質をさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
送達基質が、足場を含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体の直径が、約40〜約250μmである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか一項に記載の組成物および使用のための指示書を含むキット。
【請求項２０】
有効量の請求項1〜18のいずれか一項に記載の組成物を対象体に投与することを含む、それを必要とする対象体において組織再生を促進するための方法。
【請求項２１】
有効量の請求項1〜18のいずれか一項に記載の組成物を対象体に投与することを含む、組織修復を必要とする対象体を処置するための方法。
【請求項２２】
対象体が、変性骨疾患に罹患している、請求項20または21に記載の方法。
【請求項２３】
変性骨疾患が、骨関節症または骨粗鬆症である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
対象体が、骨折を患っている、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
骨折が、安定骨折、開放複合骨折、横骨折、斜骨折または粉砕骨折である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
請求項1〜18のいずれか一項に記載の組成物を製造するための方法であって、
哺乳類の材料界面の少なくとも一部を単離して、異種哺乳類の組織界面細胞集合体を得ること、ここで、哺乳類の材料界面が、異種哺乳類の組織界面細胞を含む；
異種哺乳類の組織界面細胞を刺激すること
を含む、方法。
【請求項２７】
刺激が、機械的刺激、化学的刺激、酵素的刺激、エネルギー的刺激、電気的刺激、生物学的刺激、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
化学的または生物学的刺激が、ケモカイン受容体結合、パラクリン受容体結合、細胞膜変化、細胞骨格変化、生理学的勾配の変化、小分子の添加またはヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの添加の少なくとも1つを含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
機能性分極組織を必要とする対象体に投与されると、機能性分極組織を生じさせることができる、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体を含む組成物を有効量対象体に投与することを含む、組織修復を必要とする対象体を処置するための方法であって、組成物の投与は、投与前と比較して、対象体において副甲状腺ホルモン、TLR4、チミジンホスホリラーゼの少なくとも1つの増加をもたらす、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、2018年1月26日出願の米国仮出願第62/622,489に基づいて優先権を主張し、当該出願の内容は、出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、一般に、この材料の集合体が、配置、存在または実体化される領域において機能性材料、組織、組織系および／または組織区画を生成または再生するために用いられ得る、接触して自己組織化する細胞および無細胞性の材料（集合体）の合成組成物に関する。本開示はまた、一般に、1)このような組成物を製造する方法；2)このような組成物の維持、伝播および／または貯蔵；3)このような組成物の使用に関する。このような組成物は、混成生存界面調和自己組織化材料（Complex-Living, Interface-Coordinated, Self-Assembling Material、「CLICSAM」）と称され得る。
【０００３】
より具体的には、本開示は、a)医学、b)医療、c)デバイス、d)生物製剤、e)治療、f)小分子合成、g)高分子合成、h)細胞材料合成、i)細胞以下合成、j)組織工学、k)バイオリアクター開発および／または生体反応性のサポート、l)医学研究、m)医学および／または生物医学的製造、n)獣医学医療、o)獣医学研究、p)分子生物学的用途、q)化学および／または化学製造および／または化学工学、r)材料科学、s)食品製造および／または食品生産、t)ニュートラシューティカル製造、u)サプリメント製造、v)化粧品開発、w)混成生命システム、x)人工知能システム、y)農業、z)宇宙研究の取り組みおよび／または探査、aa)防衛、兵器または軍事用途、bb)材料の移植、免疫、耐性および／または免疫調節を含み得るがこれらに限定されない関連技術分野にわたって利用され得る、新生および再生性の材料および基質の技術分野におけるものである。
【背景技術】
【０００４】
システムを変化させる構造的記憶または組織化記憶を引き起こすために内因性の熱力学的な力に依存する、様々な合成、無機、有機および複合技術および／またはシステムが開発されてきた。システムにおける構造または組織化のこのタイプの回復は、このような材料がこのような方法で組織化することが熱力学的に好ましいためであり、材料が、配置される／された環境への応答を認識、感知、計算および自己決定するためではない。
【０００５】
機能的に分極した、階層的に組織化した材料、基質、組織および／または組織系の生成、再生、実体化および／または伝播は、様々な分野で興味の対象であり続けている。合成、置換、または変更された形態の自己伝播材料、基剤または組織要素を作製する材料組成および／またはメカニズムの開発に対する多くの関心および相当な研究にもかかわらず、このような事項は、明確に作製、確立または開発されていない。
【０００６】
従来の理論、教示および実施は、動的な生存している組織系のエンジニアリング、生成、再生、開発および／または実体化を追求するこれらの取り組みに対して、伝統的に還元主義的な3つのアプローチを反復し続けている。これらの3つの伝統的な反復的なアプローチは、一般に、公開された文献では組織工学の三要素（tissue engineering triad）と称され、三要素の各ポイントは、工学的材料の基礎に関連している。これらのアプローチは、1)細胞ベースのアプローチ；2)分子ベースのアプローチ；および3)足場および／またはマトリックスベースのアプローチと要約し得る。
【０００７】
理論、教示および実施において、これらのアプローチは、特異性、誘導化された特異システム、反復的な組合せおよび／または組合せの関係において、古典的に促進され、利用されていた。
【０００８】
細胞ベースのアプローチは、一般に、細胞、組織関連生成物を再生する、および／または細胞、細胞プロセスおよび／または組織を生物学的経路または機能的結果に向けて促進、駆動、指示または指令する、細胞実体の単離、培養、発生または指示作用発生に焦点を当てる。
【０００９】
分子ベースのアプローチは、一般に、細胞、細胞プロセスおよび／または組織を生物学的経路または機能的結果に向けて促進、駆動、指示または指令する、作用物質（例えば、因子、薬物、遺伝子指示剤、粒子）の送達に焦点を当てる。
【００１０】
足場またはマトリックスベースのアプローチは、1)周囲の自然の組織からの細胞の遊走、分化および／または伝播および／または2)組織系への細胞実体および／または作用物質の担体としての作用のいずれかを促進するシステムにおける、いくつかの形態の支持的構造（例えば、足場、マトリックス、線維、粒子）、ベクターおよび／または担体の使用に焦点を当てる。
【００１１】
3つの伝統的なアプローチは、このようなアプローチが、合成的に制限され、動的能力を欠く、有限で制限された細胞、作用物質、構造から結果として生じる複雑なシステムの開発、合成および／またはエンジニアリングの追求を求める方法で組織化されるため、還元主義的で不完全である。このように、これらの制限されたアプローチは、複雑で進化するシステム（実質的および機能的な生成、再生、および／または自己増殖を必要とする、組織および／または生体基質の空隙）に対する有限の完全な回答として機能しようとする点で、生命と一致しない。
【００１２】
さらに、このような従来の制限されたアプローチの送達に続いて、生物、システムまたは環境内に存在する、受け取る複雑で、進化し、反応性で動的なシステムは、急性および／または慢性的に反応するか、または送達される細胞、作用物質および／または三要素由来構造を含む外部の、合成の、異なるおよび／または変化した材料に応答する。これらの反応は、送達される生成物へおよび／またはその内部に、ならびに関連するシステムおよび経路に相互に依存する局所の自然の環境の内部に、劇的な変化をしばしばもたらす。
【００１３】
1)配置される伝統的な三要素由来の不完全なアプローチ（細胞、作用物質および／または構造）と2)反応性の混成系との間の不一致な作用は、完全なシステム（すなわち、機能的に分極した、階層的に組織化した材料、基質、組織および／または組織系）の真の生成、再生および／または伝播を送達できなくする。
【００１４】
したがって、機能的に分極した、階層的に組織化した材料、基質、組織および／または組織系の生成、再生、実体化および／または伝播に利用できる技術が未だ必要とされている。
【発明の概要】
【００１５】
本開示の一態様は、機能性分極組織を必要とする対象体に投与されると、機能性分極組織を生じさせることができる、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体を含む組成物に関する。
【００１６】
本開示の一態様は、哺乳類の材料界面の少なくとも一部を含む組成物に関する。哺乳類の材料界面は、コアの強力な細胞実体および支持実体を含む。組成物は、機能性材料を集合させることができる。
【００１７】
本開示の別の態様は、組成物を製造する方法に関する。方法は、コアの強力な細胞実体および支持実体を含む哺乳類の材料界面の少なくとも一部を単離することを含む。方法は、反応性で刺激された界面を生じさせ、組成物を提供することをさらに含む。組成物は、機能性材料を集合させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
特許または出願ファイルには、カラーで作成された図面が少なくとも1つ含まれる。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な手数料の支払いにより、官庁から提供される。
【００１９】
【図１】図1a〜1eは、頭蓋欠損モデルシステムにおける骨由来組成物を示す。
【００２０】
【図２】図2aおよび2bは、皮膚モデルシステムにおける皮膚由来組織を示す。
【００２１】
【図３】図3は、実施例5のウサギの長骨試験において自然の骨と比較した骨由来組成物（例えばAHBC）処置群についての血管新生因子の遺伝子発現における倍率変化を示すヒートマップを示す。
【００２２】
【図４】図4は、ウサギの長骨試験において自然の骨と比較した骨由来組成物（例えばAHBC）処置群についての骨形成遺伝子の遺伝子発現における倍率変化を示すヒートマップを示す。
【００２３】
【図５】図5は、ウサギの長骨試験において自然の骨と比較した骨由来組成物（例えばAHBC）処置群についての創傷治癒遺伝子の遺伝子発現における倍率変化を示すヒートマップを示す。
【００２４】
【図６】図6は、ウサギの長骨試験における骨由来組成物（例えばAHBC）処置群および未処置群についての手術後12週間（POW)における自然の骨、欠損作製、処置およびエクスビボエンドポイントのDSLT画像を示す。
【００２５】
【図７】図7は、手術後および12週間にわたり2週間ごとにウサギの長骨試験において骨由来組成物（例えばAHBC）処置群および未処置群について取得した3Dおよび2DのVimago連続CT画像を示す。各群は1匹の動物により表される。
【００２６】
【図８】図8は、手術後12週間（POW)におけるウサギの長骨エクスビボ試験において骨由来組成物（例えばAHBC）処置群および未処置群について取得した3Dおよび2DのマイクロCT画像を示す。各群は1匹の動物により表される。
【００２７】
【図９】図9は、ウサギの長骨試験において骨由来組成物（例えばAHBC）処置群および未処置群からの2つの試料の両側AおよびBのLeica M205 FAを用いて撮った光学画像を示す。AHBC処置群の画像を撮る前に、より明確に再成長領域を表すために橈骨を尺骨から取り除いた。未処置は、欠損エリアの再成長を欠くため橈骨がついたままである。
【００２８】
【図１０】図10は、ウサギの長骨試験について、再成長を欠くため橈骨がそのままである行1の未処置の試料、および行2の骨由来組成物（例えばAHBC）で処理した試料を示す。AおよびBは、同じ試料の反対側の写真である。CおよびDは、同じ試料の反対側の走査型電子顕微鏡（SEM）写真である。Eは、第2高調波多光子（MP）画像である。
【００２９】
【図１１】図11は、ウサギの長骨試験における自然の骨、未処置の欠損および骨由来組成物（例えばAHBC）処置群からの平均表面ポイントスキャンを示す。
【００３０】
【図１２】図12は、ウサギの長骨試験における自然の骨、未処置の欠損および骨由来組成物（例えばAHBC）処置群からの表面ラインスキャンを示す。赤色は高いラマン強度を表し、青色は低い強度を表す。ラインスキャン強度の混合ビュー（左）およびラインスキャンのzビュー（右）。
【００３１】
【図１３】図13は、ウサギの長骨試験における自然の骨、未処置の欠損および骨由来組成物（例えばAHBC）処置群からの表面エリアスキャンを示す。スキャンは自然-欠損界面で取った。赤色は高いラマン強度を表し、青色は低い強度を表す。ヒドロキシアパタイト強度は、950〜965 cm-1の範囲内である。
【００３２】
【図１４】図14は、実施例6のウサギの脊椎試験における脊椎固定頻度を表す。
【００３３】
【図１５】図15は、ダネット多重比較検定を用いたウサギの脊椎試験における自家移植処置と比較した骨密度を示す。
【００３４】
【図１６】図16は、ウサギの脊椎試験における、自然の骨および骨由来組成物（例えばAHBC）処置群を含む処置群からの平均横断面ポイントスキャンを示す。
【００３５】
【図１７】図17は、ウサギの脊椎試験における骨由来組成物（例えばAHBC）処置群を含む処置群からの横断面ラインスキャンを示す。
【００３６】
【図１８】図18は、ウサギの頭蓋試験における骨由来組成物（例えばAHBC）処置群を含む8週間にわたって取った連続Vimago CT画像を示す。3Dおよび2DのCT画像は、各群の1匹の代表的な動物について示したものである。
【００３７】
【図１９】図19は、ウサギの頭蓋試験において手術後8週間（POW)にてキャプチャーしたエクスビボマイクロCT画像を示す。3Dおよび2DのCT画像は、各群の1匹の代表的な動物について示したものである。
【００３８】
【図２０】図20は、手術後8週間（POW)におけるウサギの頭蓋試験での骨由来組成物（例えばAHBC）処置群を含む処置群についての骨密度測定を示す。値は、平均±標準偏差を表す。通常の一元配置分散分析とダネットの多重比較検定を用いて比較し、p＜0.05を有意と見なした。
【００３９】
【図２１】図21は、手術後8週間（POW)におけるウサギの頭蓋試験での骨由来組成物（例えばAHBC）処置群を含む処置群についての海綿骨密度測定を示す。値は、平均±標準偏差を表す。通常の一元配置分散分析とダネットの多重比較検定を用いて比較し、p＜0.05を有意と見なした。
【００４０】
【図２２】図22は、手術後8週間（POW)におけるウサギの頭蓋試験での骨由来組成物（例えばAHBC）処置群を含む処置群についての骨体積対組織体積の割合（BV/TV）を示す。値は、平均±標準偏差を表す。通常の一元配置分散分析とダネットの多重比較検定を用いて比較し、p＜0.05を有意と見なした。
【００４１】
【図２３】図23は、ウサギの頭蓋試験における自然の骨、未処置の欠損および骨由来組成物（例えばAHBC）処置群からの平均表面ポイントスキャンを示す。
【００４２】
【図２４】図24は、ウサギの頭蓋試験における自然の骨、未処置の欠損および骨由来組成物（例えばAHBC）処置群からの代表的な表面ラインスキャンを示す。赤色は高いラマン強度を表し、青色は低い強度を表す。ラインスキャン強度の混合ビュー（左）およびラインスキャンのzビュー（右）。
【００４３】
【図２５】図25は、ウサギの頭蓋試験における自然の骨、未処置の欠損および骨由来組成物（例えばAHBC）処置群からの横断面エリアスキャンを示す。赤色は高いラマン強度を表し、青色は低い強度を表す。範囲880〜840 cm-1（左）内のコラーゲン強度、範囲950〜965 cm-1（中央）内のヒドロキシアパタイト強度および参照画像（右）。
【００４４】
【図２６】図26は、手術後8週間（POW)におけるウサギの頭蓋試験の各処置群についての自然の骨、欠損作製、処置およびエクスビボエンドポイントの代表的なDSLR画像を示す。
【００４５】
【図２７】図27は、ウサギの頭蓋試験の各処置群についてのエクスビボ頭蓋の代表的なV16複合顕微鏡画像を示す。
【００４６】
【図２８】図28は、ウサギの頭蓋試験における骨由来組成物（例えばAHBC）で処置したおよび未処置である欠損の顕微鏡観察を示す。エクスビボでの1 mmの厚さの頭蓋骨横断面を、第2高調波発生顕微鏡（行A）を用いてイメージ化し、核（青色）をNucBlue Ready Probes（Catalog #: R37605, Molecular Probes, Eugene, OR, USA）で、ヒドロキシアパタイト（緑色）をOsetoimage Mineralization Assay（Catalog #: PA-1503, Lonza, Walkersville, MD, USA）で、アクチン（赤色）をActinRed-555（Catalog #: R37112, Thermofisher, Eugene, OR, USA）で染色した断面を、10倍の対物レンズ（行B）での共焦点顕微鏡、複合光学顕微鏡（行C）、SEMのHDBSD検出器（行D）およびSEMのC2DX検出器（行E）を用いてイメージ化した。脱灰したガラススライドに載せた4μM切片か試料のSHGイメージング、SEMおよび明視野イメージングを示す（行F〜J）。
【００４７】
【図２９】図29は、骨由来組成物対自然の骨組織で分子経路の変更を表す、4匹の処理前および5匹の処理後のウサギの頭蓋試料（x軸）からの骨形成、創傷治癒および血管新生の経路遺伝子（y軸）の階層的クラスター形成から生成したヒートマップを示す。濃い赤色および黄色は、それぞれ遺伝子発現の最高レベルと最低レベルに関する。
【００４８】
【図３０】図30は、骨形成の経路遺伝子についての前（n=5）と後(n=5）のウサギの頭蓋間の遺伝子発現差異を示すボルケーノプロットを示す。
【００４９】
【図３１】図31は、創傷治癒の経路遺伝子についての前（n=5）と後(n=5）のウサギの頭蓋間の遺伝子発現差異を示すボルケーノプロットを示す。
【００５０】
【図３２】図32は、血管新生の経路遺伝子についての前（n=5）と後(n=5）のウサギの頭蓋間の遺伝子発現差異を示すボルケーノプロットを示す。
【００５１】
【図３３】図33は、肝臓由来の組成物（例えば、AHLC）対自然の肝臓組織における分子経路の変更の代表的なヒートマップを示す。濃い赤色および黄色は、それぞれ遺伝子発現の最高レベルと最低レベルに関する。
【００５２】
【図３４Ａ】図34Aは皮膚由来組織（例えばAHSC）対自然の皮膚組織において創傷治癒、幹細胞および細胞表面マーカー経路を評価する標的化トランスクリプトーム分析の代表的なヒートマップを示す。濃い赤色および黄色は、それぞれ遺伝子発現の最高レベルと最低レベルに関する。
【００５３】
【図３４Ｂ】図34Bは、自然の皮膚組織と比較した皮膚由来組織（例えばAHSC）における幹細胞マーカーの発現増加を示すボルケーノプロットを示す。
【００５４】
【図３５】図35は、骨由来組成物（例えばAHBC）対自然のウサギ長骨についての力対変位を示す。
【００５５】
【図３６】図36は、骨由来組成物（例えばAHBC）（右）対自然のウサギ 長骨（左）についてのヒドロキシアパタイト複合マップを示す。
【００５６】
【図３７】図37は、脂肪由来の組成物対自然の脂肪（ヒト）についての力対変位を示す。
【００５７】
【図３８】図38は、筋肉由来の組成物対自然の筋肉（ヒト）についての力対変位を示す。
【００５８】
【図３９】図39は、軟骨由来の組成物対軟骨（ブタ）についての力対変位を示す。
【００５９】
【図４０】図40は、骨（大腿骨）由来の組成物対自然の骨についての力対変位を示す。
【００６０】
【図４１】図41A〜Cは、様々な手術後日数（POD）において自然のブタ検体と比較した各処置群のブタにおいてキャプチャーした創傷治癒のインビボ画像を示す。図41Aは、ある創傷サイズについてのPOD 0、19、35、42および70における創傷治癒の代表的な画像を示す。図41Bは、別の創傷サイズについてのPOD 0、48、98、146および196における創傷治癒の代表的な画像を示す。図41Cは、さらに別の創傷サイズについてのPOD 0、34、62、105、132における創傷治癒の代表的な画像を示す。
【００６１】
【図４２】図42A〜Cは、各処置群のブタについてのPODに関する相対的収縮を示す。相対的収縮を計算した。0は収縮が無く、1は完全に収縮している。
【００６２】
【図４３】図43A〜Cは、皮膚由来組織（例えばAHSC）で処置した創傷の複合光学顕微鏡観察、組織学的染色、SEM、共焦点および多光子イメージングを示す。図43A〜Cは、様々な創傷サイズの代表的な画像を示す。複合光学顕微鏡試料の全体観察（列A）および横断面（列B）、マッソンのトリクローム染色（列C）、SEM（列D）、共焦点顕微鏡（列E）および多光子イメージング（列F）。特に、治癒は、未処置創傷（A-12）と比較して皮膚由来組織（例えばAHSC）で処置した創傷（A-8）において改善した。組織化ECMの発達は、組織学的試料、SEMおよび多光子分析（カラムC、DおよびF）で観察された。超微細構造要素は、共焦点顕微鏡観察（E）に示されるように皮膚由来組織（例えばAHSC）で処置した創傷で観察された。
【００６３】
【図４４】図44A〜Cは、それぞれ様々な創傷サイズについてのブタ処置群対自然の皮膚のラマン表面ポイントスキャン比較を示す。854 cm-1（プロリン）、875 cm-1（ヒドロキシプロリン）、1003 cm-1（フェニルアラニン）、1450 cm-1（エラスチン）および1650 cm-1（ケラチン）におけるピークは、処置した創傷と自然の皮膚の両方に存在する。
【００６４】
【図４５】図45A〜Cは、それぞれ様々な創傷サイズについてのブタ処置群対自然の皮膚および／または未処置創傷のラマン表面ポイントスキャン（左）および表面ラインスキャン（右）の比較を示す。854 cm-1（プロリン）、875 cm-1（ヒドロキシプロリン）、1003 cm-1（フェニルアラニン）、1450 cm-1（エラスチン）および1650 cm-1（ケラチン）におけるピークは、処置した創傷と自然の皮膚の両方に存在する。
【００６５】
【図４６】図46A〜Bは、それぞれ様々な創傷サイズについてのラマン横断面ラインスキャンを示す。包括的なラマンの図は、ブタ皮膚の分子フィンガープリントを示す。皮膚横断面にわたるラインスキャンの混合ビューは異なる処置についてである。ケミグラムは、皮膚横断面にわたるコラーゲンIV型の分布と比較する。
【００６６】
【図４７Ａ】図47Aは、ブタの皮膚創傷についての引張試験（Instron 3343）からの典型的な力対変位の曲線を示す。弾性率、すなわち皮膚弾性の測定を、グラフの直線部分の傾きを用いて測定した。
【００６７】
【図４７Ｂ】図47Bは、ブタの皮膚創傷についての引張試験（Instron 3343）からのヤング率を示す。
【００６８】
【図４８Ａ】図48Aは、創傷についてのインビボでのバリスト法の結果を示す。皮膚のプローブの影響の深さを測定する「陥凹」と呼ばれる最初の衝撃を、減衰曲線から推定した。
【００６９】
【図４８Ｂ】図48Bは、超音波エラストグラフィを用いたインビボ弾性率を示す（自然、創傷1、創傷2）。超音波エラストグラフィを用いたインビボ弾性測定。リアルタイム超音波せん断波エラストグラフィを実施して、皮膚の弾性を評価した。組織圧縮性から計算した弾性率は、皮膚の堅さを表す。凡例の青色および赤色は、それぞれ柔らかいおよび硬い組織を示す。自然の皮膚および処置した創傷のせん断波エラストグラフィは、120 kPa未満の平均エラストグラフィ値を有する均質で柔らかい帯域を示す。
【００７０】
【図４９】図49は、創傷についてのエクスビボでのバリスト法の結果を示す。皮膚のプローブの影響の深さを測定する「陥凹」と呼ばれる最初の衝撃を、減衰曲線から推定した。
【００７１】
【図５０】図50は、自然の皮膚と比較した皮膚由来組織（例えばAHSC）で治癒した創傷の遺伝子発現差異を示す、組織分子分析ヒートマップを示す。
【００７２】
【図５１】図51は、発現が自然の皮膚と比較した皮膚由来組織（例えばAHSC）で治癒した創傷において有意に異なった（p＜0.05）転写物の倍率変化を示す。
【００７３】
【図５２】図52は、未処置創傷と比較した皮膚由来組織（例えばAHSC）で処置した創傷の遺伝子発現差異を示すヒートマップ、ならびに発現が未処置創傷と比較した皮膚由来組織で処置した創傷において有意に異なった（p＜0.05）転写物の倍率変化を示す棒グラフを示す。幹細胞マーカーは、一般的に上方制御される。遺伝子発現における有意差は、CDH1、COL7A1、COL4A3、CTNNA1、CTNND1、ITGAE、ANOS1、ITGB4およびMMP12の12個の遺伝子について観察された。CDH1は、未処置創傷と比較して皮膚由来組織で処置した創傷において235倍増加され、COL7A1は、17倍増加された。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本明細書の全体を通して「一の実施態様」、「ある実施態様」または同様の用語への言及は、実施態様に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも1つの実施態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通して「一実施態様において」、「ある実施態様において」または同様の用語の語句の出現は、必ずしもそうである必要はないが、すべて同じ実施態様を指す場合がある。
【００７５】
また、本発明の記載される特徴、構造または特性は、1つ以上の実施態様においてあらゆる適切な方法で組み合され得る。以下の説明において、本発明の実施態様の完全な理解を提供するために、多数の複数の詳細が含まれている。しかしながら、当業者は、本発明が1つ以上の特定の詳細なしでまたは他の方法、構成要素、材料などを用いて実施され得ること認識するだろう。他の例では、周知の構造、材料または操作は、本発明の態様を曖昧にするのを避けるために、詳細には示されていないかまたは説明されていない。したがって、本開示の範囲を逸脱することなく、他の実施態様は利用され得て、変更がなされ得ること理解されたい。よって、以下の詳細な説明を限定的な意味で取るべきではない。
【００７６】
本明細書に記載の組成物は、医学、科学、工学および製造を含むがこれらに限定されない、様々な技術分野において有用性を有する。本開示は、相互作用的で生存しているコアの強力な細胞実体（例えば、幹細胞、前駆細胞、TA細胞（transit-amplifying cell））と支持実体の両方を含有する、動的で反応性の三次元的に界面接続した細胞実体の集合体の合成組成物に関する。
【００７７】
この材料の集合体が配置される／された環境を変化させるために用いられ得る、接触して自己組織化する細胞および無細胞性の材料（集合体）の組成物を開示する。このような集合体は、混成生存界面調和自己組織化材料（Complex-Living, Interface-Coordinated, Self-Assembling Material、CLICSAM）と称され得る。
【００７８】
本開示の組成物は、生じるかまたは合成されると、強力な細胞増殖の調和伝播、ならびにCLICSAMおよび機能的に分極した材料を形成するそれらの進行性中間誘導体の継続的な伝播のための材料および／または基質の組織化形成を促進する。
【００７９】
本開示の組成物は、組成物が置かれる環境またはシステムへの応答を認識、感知、計算、調整および自己決定する能力を有するため、本開示の組成物は、機械的、電気的、化学的なバリア、ならびに材料、基質、組織の空隙、欠陥または失敗を克服する能力（ability）および／または潜在能力（capability）を有する。
【００８０】
本開示の組成物は、組成物中のすべての構成要素を自己伝播、区別、適応、進化、複製、移行、自己合成、自己調節および自己制御し、組成物が置かれる環境またはシステムに影響を与える能力を有する。
【００８１】
本開示の組成物は、
- 化学的、電気化学的および／または電気的環境；
- ゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、エピトラスクリプトーム、プロテオミクス、エピプロテオミクスの材料；
- 細胞以下のオルガネラまたは細胞以下の構造ならびにこのような構造の誘導体；
- 細胞内および／または細胞外のマトリックス、足場、粒子、線維およびまたは構造要素；
- 同化、異化および／または代謝のプロセスおよび材料ならびにこのような材料の誘導体；
- 材料力学、材料力、材料動力学および／または材料熱力学；
- 他の生存しているおよび／または生体または細胞実体；
- 組織および／または器官の系；
- 細胞および／または細胞のシステム；および
- 混成系
を含むがこれらに限定されない、材料の合成、変化、修正、調節、制御、組織化または破壊を指示するおよび／または調和させることにより、それが置かれたまたは実体化された環境を変化させる能力を有する。
【００８２】
また、本開示の態様は、本明細書に記載の組成物を製造する方法に関する。さらに、本開示の態様は、本明細書に記載の組成物を用いて処置する方法に関する。
【００８３】
組成物
相互作用的で生存しているコアの強力な細胞実体と支持実体の両方を含有する、動的で反応性の三次元的に界面接続した細胞実体の集合体の合成された構造を含む組成物を開示する。より具体的には、コアの強力な細胞実体は、機能的で分極した自己組織化材料の形成を指示する界面由来の配向で、支持実体（例えば、細胞子孫）と接触している。
【００８４】
一実施態様において、組成物は、それを必要とする対象体に投与されると、機能性分極組織を生じさせることができる刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体を含む。
【００８５】
一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、骨組織界面に由来する。骨組織界面は、皮質周囲組織界面、層状構造周囲組織界面、小柱周囲組織界面、皮質海綿組織界面、またはそれらの組合せより選択され得る。
【００８６】
一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、皮膚組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、筋骨格組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、平滑筋組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、心筋組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、軟骨組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、脂肪組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、消化管組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、肺組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、食道組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、胃組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、腎臓組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、肝臓組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、膵臓組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、血管組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、リンパ組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、中枢神経組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、泌尿生殖器組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、腺組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、歯組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、末梢神経組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、出生組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、視覚組織界面に由来する。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体を含む。生存しているコアの強力な細胞実体は、LGR4、LGR5、LGR6、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される1つ以上のロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現し得る。生存しているコアの強力な細胞実体は、Pax 7、Pax 3、MyoD、Myf 5、ケラチン15、ケラチン5、分化抗原群34（CD34）、Sox9、c-Kit+、Sca-1+、またはそれらの任意の組合せの1つ以上のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現し得る。
【００８７】
支持実体は、間葉由来の細胞集団を含み得る。支持実体は、細胞集団、細胞外マトリックス構成要素、またはそれらの組合せを含み得る。細胞外マトリックス構成要素は、ヒアルロン酸、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外小胞、酵素および糖タンパク質の1つ以上を含み得る。
【００８８】
一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、自然の骨組織で観察されるものと比較して副甲状腺ホルモンの発現レベルの上昇を示す。刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、自然の骨組織で観察されるものと比較して副甲状腺ホルモンの発現レベルの10倍〜15倍の上昇を示し得る。
【００８９】
一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、自然の骨組織で観察されるものと比較してTLR4の発現レベルの上昇を示す。
【００９０】
一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、自然の骨組織で観察されるものと比較してチミジンホスホリラーゼの発現レベルの上昇を示す。刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体は、自然の骨組織で観察されるものと比較してチミジンホスホリラーゼの発現レベルの100倍〜200倍の上昇を示し得る。
【００９１】
一実施態様において、機能性分極組織は、自然の骨組織で観察されるものと比較してIL2、MYOSIN2、ITGB5およびSTAT3の1つ以上の発現レベルの低下を示す。一実施態様において、機能性分極組織は、自然の骨組織と比較して遺伝子発現において少なくとも98％の類似性を示す。
【００９２】
組成物は、送達基質をさらに含み得る。一実施態様において、送達基質は、足場を含む。
【００９３】
一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体の直径は、約50μmである。一実施態様において、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体の直径は、約40〜250μm、例えば約50〜250μm、約75〜250μm、約100〜250μm、約125〜250μm、約150〜250μm、約175〜250μm、約200〜250μまたは約225〜250μmである。
【００９４】
一実施態様において、組成物は、コアの強力な細胞実体および支持実体を含む哺乳類の材料界面の少なくとも一部を含む。組成物は、機能性材料を集合させることができる。
【００９５】
一実施態様において、哺乳類の材料界面は、皮膚組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、骨組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、筋骨格組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、平滑筋組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、心筋組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、軟骨組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、脂肪組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、消化管組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、肺組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、食道組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、胃組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、腎臓組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、肝臓組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、膵臓組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、血管組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、リンパ組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、中枢神経組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、泌尿生殖器組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、腺組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、歯組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、末梢神経組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、出生組織界面に由来する。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、視覚組織界面。
【００９６】
例示的なコアの強力な細胞実体は、幹細胞、前駆細胞およびTA細胞を含む。本明細書に記載の組成物の使用に適するコアの強力な細胞実体は、例えば特定の細胞以下の配列マーカー（すなわち、DNA、RNAおよびタンパク質）を特定することにより、特定または確立され得る。特定の実施態様において、本明細書に記載の組成物は、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体（LGR）の配列を発現する、界面接続したコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む。一実施態様において、コアの強力な細胞実体は、LGR4の配列、LGR5の配列、LGR6の配列、またはそれらの組合せを発現する。
【００９７】
コアの強力な細胞実体を特定する方法は、当該技術分野において公知である。コアの強力な細胞実体は、例えば電子顕微鏡、単一の筋線維外植片の位相差顕微鏡または蛍光顕微鏡により、特定され得る。例えば、インビボの衛星細胞集団は、開発された生物発光イメージング技術を用いて視覚化し得る。例えば、衛星細胞は、それらの「くさび形」の外観、ならびに核対細胞質の大きな比、少数の細胞小器官、小さな核および凝縮中間期クロマチンを含む形態的特徴に基づいて、電子顕微鏡を用いて特定され得る。インビボでは、衛星細胞は、Pax 7、Pax 3、MyoDおよびMyf 5などのバイオマーカーとして1つ以上の転写因子や細胞膜タンパク質を用いて、蛍光顕微鏡により特定され得る。
【００９８】
本明細書に記載される、材料の新生、再生極性および／または組織化形成は、材料および／または基質内にこのような記載の組成物を配置、配備および／または実体化することにより誘導または伝播され得る。
【００９９】
開示の組成物の界面は、細胞から細胞、細胞から細胞内、細胞から基質、細胞から作用物質、細胞から材料因子、細胞から環境、細胞から系、細胞からインタラクトームの直接的または間接的形態に関するものであり、これらにおいて、このような界面は、材料および／またはエネルギーの接触、コミュニケーション、調節、制御、開始、影響、応答、化学的/機械的相互作用、伝達が、組成物が送達または配備される環境またはシステムを変化させるまたはそれに影響を与えることを可能にする。
【０１００】
このような界面は、細胞からECI（細胞外インタラクトーム）または細胞外基質の接触、コミュニケーション、影響、応答、化学的/機械的相互作用の直接的または間接的形態（例えば、分子、増殖因子、ペプチド、代謝産物、DNA/RNA、微生物、化学勾配、作用物質勾配、電気勾配、光子および／またはエネルギー）に関する。
【０１０１】
一実施態様において、本明細書に記載の組成物は、インビボで機能性材料（例えば、機能性組織）を組織化することができる。
【０１０２】
一実施態様において、本明細書に記載の組成物は、エクスビボで機能性材料（例えば、機能性組織）を組織化することができる。
【０１０３】
一実施態様において、本明細書に記載の組成物は、インビトロで機能性材料（例えば、機能性組織）を組織化することができる。
【０１０４】
一実施態様において、本明細書に記載の組成物は、複合または混成システムで機能性材料（例えば、機能性分極組織）を組織化することができる。
【０１０５】
本明細書で用いられる、対象体への組成物の「投与」は、その意図される機能を実施するために組成物を対象体へ導入または送達するあらゆる経路を含む。投与は、移植、経口、鼻腔内、非経腸（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）、直腸、髄腔内または局所を含むが、これらに限定されない、任意の適切な経路で行われ得る。投与は、自己投与および他者による投与を含む。
【０１０６】
本明細書で用いられる「コアの強力な細胞実体」は、細胞間コミュニケーション、遊走、走化性、増殖、分化、分化転換、脱分化、一過性増幅、非対称分裂が可能であり、幹細胞、前駆細胞およびTA細胞（transit-amplifying cell）を含む細胞実体を指す。コアの強力な細胞実体は、例えば、特定の細胞以下バイオマーカー（すなわち、DNA、RNAおよびタンパク質）についてアッセイすることにより特定または確立され得る。いくつかの実施態様において、コアの強力な細胞実体は、1つ以上のロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体（LGR）、例えばLGR4、LGR5、LGR6、またはそれらの組合せのRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する。これに加えてまたはこれとは別に、いくつかの実施態様において、コアの強力な細胞実体は、Pax 7、Pax 3、MyoD、Myf 5、ケラチン15、ケラチン5、分化抗原群34（CD34）、Sox9、c-Kit+、Sca-1+、およびそれらの任意の組合せの1つ以上のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する。コアの強力な細胞実体のためのバイオマーカーの更なる例は、Wong et al., International Journal of Biomaterials, vol. 2012, Article ID 926059, 8 pages, 2012に記載されている。
【０１０７】
本明細書で用いられる用語「有効量」は、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、本明細書に記載の疾患もしくは状態または本明細書に記載の疾患もしくは状態に関連する1つ以上の兆候または症状の予防または軽減をもたらす量を指す。治療的または予防的用途の文中において、対象体に投与される組成物の量は、組成物、疾患または状態の程度、種類および重症度、ならびに個人の特徴、例えば一般的な健康状態、年齢、性別、体重、薬物耐性に応じて変化する。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な投与量を決定することができる。組成物はまた、1つ以上のさらなる治療用化合物と組み合わせて投与され得る。本明細書に記載の方法では、治療組成物は、本明細書に記載の疾患または状態の1つ以上の兆候または症状を有する対象体に投与され得る。
【０１０８】
本明細書で用いる用語「有効な反応性刺激物質」は、細胞、細胞集団、細胞組織、および異種哺乳類の組織界面細胞の集団を活性化するあらゆる添加物であって、上記細胞の生理機能を活性化するまたは変化させることができ、ケモカイン受容体結合、パラクリン受容体結合、細胞膜変化、細胞骨格変化、細胞の物理的操作、生理学的勾配の変化、温度変化、小分子相互作用、ヌクレオチドおよびリボヌクレオチド、例えば低分子干渉RNAの導入を含むシグナルのうちの1つまたは組合せにより実施されることができるものを指す。
【０１０９】
本明細書で用いられる「刺激された」は、電気的刺激、酸素勾配、ケモカイン受容体結合、パラクリン受容体結合、細胞膜変化、細胞骨格変化、細胞の物理的操作、生理学的勾配の変化、温度変化、小分子相互作用、ヌクレオチドおよびリボヌクレオチド、例えば低分子干渉RNAの導入を含み、遺伝子発現の変化（例えば、図29〜34のヒートマップおよびボルケーノプロット参照）、タンパク質翻訳の変化、細胞内および細胞間シグナル伝達の変化、小胞の膜への結合の変化、ATPの生成および消費の変化、細胞の移動性の変化のうちの表現型／結果の1つ以上を誘導するのに十分である、シグナルの1つまたは組合せにより実施され得る異種の哺乳類の組織界面細胞の集合体に生物学的状態を活性化させる（例えば、変化させる）ことを指す。
【０１１０】
本明細書で用いられる「支持実体」は、コアの強力な細胞実体に構造的および生化学的支持を提供する非幹細胞集団（例えば、支持細胞実体）および／または細胞外マトリックス材料を指す。いくつかの実施態様において、支持細胞実体は、増殖および／または分化細胞を含み得る。これに加えてまたはこれとは別に、いくつかの実施態様において、支持細胞実体は、バイオマーカー、例えばBMPr1a、BMP2、BMP6、FGF、Notch受容体、δリガンド、CXCL12、Sonic Hedge Hog、VEGF、TGFβ、Wnt、HGF、NG2およびα平滑筋アクチンの発言により特定され得る。いくつかの実施態様において、支持細胞実体は、間葉由来の細胞集団を含む。
【０１１１】
本明細書で用いる「治療有効量」の組成物は、疾患または状態の生理学的影響を改善または排除する組成物レベルを指す。治療有効量は、1回以上の投与で与えられ得る。
【０１１２】
本明細書で用いられる「細胞外マトリックス」および「細胞外マトリックス構成要素」は、ヒアルロン酸、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外小胞、酵素および糖タンパク質などの細胞外高分子であって、周囲の細胞に構造的および生化学的支持を提供する三次元ネットワークとして組織化された分子を指す。
【０１１３】
本明細書で用いる用語「AHBC」は、自己同種骨構築物を指す。本明細書で用いる用語「AHLC」は、自己同種肝臓骨構築物を指す。本明細書で用いる用語「AHSC」は、自己同種皮膚骨構築物を指す。
【０１１４】
本明細書で用いる「発現」は、下記の1つ以上を含む：前駆体mRNAへの遺伝子の転写;成熟mRNAを生成するための前駆体mRNAのスプライシングおよび他の処理;mRNAの安定性;タンパク質への成熟mRNAの翻訳（コドン使用頻度とtRNAの利用可能性を含む）;適切な発現と機能に必要な場合は、翻訳産物のグリコシル化および／または他の修飾。
【０１１５】
本明細書で用いられる用語「機能性材料」、「機能性組織」および「機能性分極組織」は、同じ起源を有し、自然の対応組織で観察されるもの同様の生物学的機能を実行する細胞および細胞外マトリックスを指す。いくつかの実施態様において、「機能性材料」、「機能性組織」または「機能性分極組織」は、自然の対応組織で観察されるものと同様の極性、密度、柔軟性などの特性を示す。
【０１１６】
材料およびシステム極性を生じさせ、促進する組成物を開示する。
【０１１７】
本明細書で用いられる用語「材料界面」は、2つ以上の異なるまたは区別可能な細胞が、他の材料、基質または因子を含んでもよくまたは含まなくてもよい環境および／またはシステムにおいて互いに接近、接触（contact）、混合（merge）、統合、組み込み、合体（unite）、癒合（coalesce）、複合（combine）、複合（compound）、融合、隣接（abut）、接触（touch）、境界（border）、併合（meld）、コミュニケーション、シナプス、接合、相互作用、共有、凝集、接続、侵入、取り囲むまたは形成する領域、エリアおよび／または場所を指す。この他の環境および／またはシステムは、本明細書に記載の組成物と相互作用するのに用いられ得る。
【０１１８】
本明細書で用いられる「組織界面」は、独立した、所望により関係のない組織システムが相互作用し、互いにコミュニケーションする場所を指す。いくつかの実施態様において、組織界面の構成要素は、増殖、分化、遊走、同化、異化、刺激、または細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および細胞周囲のコミュニケーションまたはそれらの任意の組合せの少なくとも1つを含むがこれに限定されない、細胞形成および細胞発生および／または代謝を現在促進する／促進した。
【０１１９】
本明細書に記載の組成物は、完全な界面区画、または完全な界面を合成するのに利用され得る亜区画界面から構成される。完全な界面区画は、本明細書に開示されるように処理されると、本明細書に記載の組成物が生じるのに必要な材料を更なる処理によって供給するかまたは供給し得る、該領域内、エリアおよび／または位置に配置される内容物材料を指す。以下でより詳細に記載するように、対象とする各材料基質および／または組織について、完全な界面区画は、その独特な機能に寄与する組織の必須の層を含む。
【０１２０】
亜区画界面はまた、本明細書に開示されるように処理されると、本明細書に記載の組成物が生じるのに必要な材料を更なる処理によって供給するかまたは供給し得る、該領域、エリアおよび／または位置内に配置される内容物材料を指す。亜界面は、完全な界面の一部を指す。
【０１２１】
皮膚組織の場合、皮膚組織界面は、上皮-真皮界面、乳頭-網状真皮界面、真皮-下真皮（hypodermal）界面、下真皮-真皮下（subdermal）界面、付属器-基質界面およびそれらの組合せを含み得る。
【０１２２】
骨組織の場合、骨組織界面は、皮質周囲組織界面、層状構造周囲組織界面、小柱周囲組織界面、皮質海綿組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１２３】
筋骨格組織の場合、筋骨格組織界面は、筋-筋内（epimysial）組織界面、筋-筋周囲（perimysial）組織界面、筋-筋外（endomysial）組織界面、筋-筋膜組織界面、腱-筋肉組織界面、腱-骨組織界面、靭帯-骨組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１２４】
平滑筋組織の場合、平滑筋組織界面は、血管周囲組織界面、内臓周囲組織界面、神経周囲組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１２５】
心筋組織の場合、心筋組織界面は、心内膜-心筋組織界面、心筋-心外膜組織界面、心外膜-心膜組織界面、心膜-脂肪組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１２６】
軟骨組織の場合、軟骨組織界面は、軟骨-軟骨周囲組織界面、軟骨-軟骨内組織界面、軟骨内-軟骨下骨界面、軟骨-軟骨内骨界面、軟骨内-軟骨下骨界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１２７】
脂肪組織の場合、脂肪組織界面は、脂肪-血管周囲組織界面、脂肪-ストーマ周囲組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１２８】
消化管組織の場合、消化管組織界面は、粘膜-粘膜下組織界面、粘膜下-筋層組織界面、筋層-漿膜組織界面、漿膜-腸間膜組織界面、筋-神経組織界面、粘膜下-神経組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１２９】
肺組織の場合、肺組織界面は、粘膜-粘膜下組織界面、粘膜下-筋層組織界面、粘膜下-軟骨組織界面、筋肉-外膜組織界面、導管-外膜組織界面、実質-漿膜組織界面、漿膜-腸間膜組織界面、筋-神経組織界面、粘膜下-神経組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３０】
食道組織の場合、食道組織界面は、粘膜-粘膜下組織界面、粘膜下-筋層組織界面、筋層-外膜組織界面、筋-神経組織界面、粘膜下-神経組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３１】
胃組織の場合、胃組織界面は、粘膜-粘膜下組織界面、粘膜下-筋層組織界面、筋層-漿膜組織界面、筋-神経組織界面、粘膜下-神経組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３２】
腎臓組織の場合、腎臓組織界面は、莢膜（capsule）-皮質組織界面、皮質-髄質組織界面、神経-実質組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３３】
肝臓組織の場合、肝臓組織界面は、導管上皮-実質組織界面、莢膜（capsular）-実質組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３４】
膵臓組織の場合、膵臓組織界面は、導管上皮-実質組織界面、腺上皮-実質組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３５】
血管の場合、血管組織界面は、内皮-中膜（tunica）組織界面、中膜-中膜組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３６】
リンパ組織の場合、リンパ組織界面は、皮質-髄質組織界面、髄質-莢膜組織界面、莢膜-髄組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３７】
中枢神経組織の場合、中枢神経組織界面は、硬膜-皮質組織界面、皮質灰白質-髄質白質組織界面、髄膜-神経組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３８】
泌尿生殖器組織の場合、泌尿生殖器組織界面は、上皮-粘膜組織界面、粘膜-筋肉組織界面、筋肉-外膜組織界面、身体-血管組織界面、身体-筋肉組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１３９】
腺組織の場合、腺組織界面は、上皮-実質組織界面を含み得る。
【０１４０】
歯組織の場合、歯組織界面は、象牙質-髄組織界面を含み得る。
【０１４１】
末梢神経組織の場合、末梢神経組織界面は、神経上-神経周囲組織界面、神経周囲-神経外組織界面、神経外-軸索、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１４２】
出生組織の場合、出生組織界面は、羊膜-流体組織界面、上皮-上皮下組織界面、上皮-間質組織界面、緻密（compact）-線維芽細胞組織界面、線維芽細胞-中間組織界面、中間-網状組織界面、羊膜（amnio）-絨毛膜（chroion）組織界面、網状-栄養芽細胞組織界面、栄養芽細胞-子宮組織界面、栄養芽細胞-脱落膜組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１４３】
視覚組織の場合、視覚組織界面は、上皮-膜組織界面、膜-間質組織界面、間質-膜組織界面、膜-内皮組織界面、内皮-流体組織界面、強膜-脈絡膜組織界面、脈絡膜-上皮性組織界面、上皮-セグメント光受容体組織界面、セグメント光受容体-膜組織界面、膜-外核層組織界面、外核層-外網状組織界面、外網状-内網状組織界面、内網状-神経節組織界面、神経節-神経線維組織界面、神経線維組織界面-膜組織界面、膜-流体組織界面、およびそれらの組合せを含み得る。
【０１４４】
支持実体は、細胞および無細胞材料を含み得る。一実施態様において、支持実体は、界面接続した非幹細胞集団を含む細胞実体を含む。別の実施態様において、指示材料は、界面接続した細胞子孫集団および／または分化実体を含む細胞実体を含む。
【０１４５】
一実施態様において、支持実体は、間葉由来の細胞集団を含む。一実施態様において、支持実体は、細胞集団、細胞外マトリックス構成要素、またはそれらの組合せを含む。
【０１４６】
組成物はまた、送達基質を含む。送達基質は、分子、材料、流体、足場、マトリックス、粒子、細胞、線維、細胞以下の構造、生物製剤、デバイス、および／またはそれらの組合せを含むがこれらに限定されない様々な担体媒体より選択され得る。一実施態様において、送達基質は、足場、マトリックス、粒子、細胞、線維より選択される。
【０１４７】
組成物はまた、増殖因子、分析物、LGR相互作用成分、またはそれらの組合せより選択される補充物を含む。分析物は、遊走性分析物、漸増分析物、刺激物質、阻害物質、またはそれらの組合せより選択され得る。
【０１４８】
あるいは、本開示の組成物は、活性または作用物質の他の形態のための送達、配備および／または運搬の基質および／またはベクターとして機能し得る。
【０１４９】
あるいは、本開示の組成物は、このような作用を必要とする他の材料のバリアまたはカバーとして用いられ得る。
【０１５０】
あるいは、本開示の組成物は、直接的および間接的な形態で相互作用または界面接続する他の材料を増強するのに用いられ得る。
【０１５１】
一実施態様において、本明細書に記載の組成物は、物質の他の形態および／または自己反応性の方法で局所的に、システム全体で作用し得る本明細書に記載の組成物から、作用物質、物質、材料、基質、因子、分析物、補充物、分子が生じる意図的に作用することができるシステムをさらに含む。
【０１５２】
一実施態様において、本明細書に記載の組成物は、該本明細書に記載の組成物とコミュニケーションをとってシステムおよび実体の細胞生存、伝播、増殖、分化、遊走、刺激、変化、増大、調節を増強するように生じるおよび／または作用する材料をさらに含み得る。
【０１５３】
一実施態様において、本明細書に記載の組成物は、該本明細書に記載の組成物とコミュニケーションをとってシステムおよび実体の制御、阻害、停滞（stagnation）、終了、破壊、除去（obliteration）、休止を増強するように生じるおよび／または作用する材料をさらに含み得る。
【０１５４】
一実施態様において、組成物は、材料が存続および／または伝播することを可能にする、生存しているシステム、部分的に生存しているシステム、非生存システム、人工的なシステムおよび／または合成支持システムに直接配置され得る。
【０１５５】
一実施態様において、組成物は、このようなシステムまたは環境内における一次材料の機能、外観、構造、構成、挙動および／または存在を変更するように、他の材料に直接および／または間接的に、素材は、変化、変更、制御、操作、調整、修正、変形、変換、変異、再構築、進化、適応、統合および／または差し引きされ得る。
【０１５６】
製造方法
本開示はまた、本明細書に記載の組成物を製造する方法を提供する。方法は、コアの強力な細胞実体および支持実体を含む哺乳類の材料界面の少なくとも一部を単離することを含む。方法は、反応性で刺激された界面を生じさせ、組成物を提供することをさらに含む。組成物は、機能性材料を集合させることができる。
【０１５７】
一実施態様において、哺乳類の材料界面は、皮膚組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、骨組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、筋骨格組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、平滑筋組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、心筋組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、軟骨組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、脂肪組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、消化管組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、肺組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、食道組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、胃組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、腎臓組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、肝臓組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、膵臓組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、血管組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、リンパ組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、中枢神経組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、泌尿生殖器組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、腺組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、歯組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、末梢神経組織界面である。一実施態様において、哺乳類の材料界面は、出生組織界面である。一実施態様において、哺乳類の組織界面は、視覚組織界面である。例示的な組織界面は、上に記載されている。
【０１５８】
一実施態様において、支持実体は、間葉由来の細胞集団を含む。一実施態様において、支持実体は、細胞集団、細胞外マトリックス構成要素、またはそれらの組合せより選択される。
【０１５９】
本開示の組成物を生じさせるための材料は、完全な界面区画または亜区画界面のいずれかにおいて細胞-組織の環境および／またはシステムから得られ得る。負荷されると、哺乳類の材料界面周囲のコアの強力な細胞実体および支持実体を含有する集団は、当業者に理解される様々な方法により得られ得る。当該方法は、収集、生検、パンチ、切断、制限、消化、抽出、切除、解離、分離、除去、分割および／または単離プロトコールを含むがこれに限定されない。コアの強力な細胞実体および支持実体を含有する細胞集団が得られると、哺乳類の材料界面または亜界面は、材料の完全な破壊なしで材料の組織化を破壊し、最小分極を得るように破壊される。本明細書で用いられる「最小分極」は、組織の単位が、機能性分極組織を組織化することができるのに必要である生体材料の人口操作により達成される分極の程度を指す。人口操作は、機械的、化学的、酵素的、エネルギー的、電気的、生物学的および／または他の物理的方法を用いて達成され得る。
【０１６０】
機械的、化学的、酵素的、エネルギー的、電気的、生物学的および／または物理的メカニズムを含むがこれらに限定されない様々な破壊方法は、当業者に理解される。このような破壊は、反応性で刺激された界面を生じさせる。
【０１６１】
また、機能性分極組織を必要とする対象体に投与されると、機能性分極組織を生じさせることができる、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体を含む組成物を製造するための方法を開示する。いくつかの実施態様において、方法は、哺乳類の材料界面の少なくとも一部を単離して異種哺乳類の組織界面細胞集合体を得ること（ここで、哺乳類の材料界面は、異種哺乳類の組織界面細胞を含む）；および異種哺乳類の組織界面細胞を刺激することを含む。
【０１６２】
一実施態様において、刺激は、機械的刺激、化学的刺激、酵素的刺激、エネルギー的刺激、電気的刺激、生物学的刺激、またはそれらの任意の組合せを含む。一実施態様において、刺激は、解離、切開、切断、剪断、ボルテックス、またはそれらの任意の組合せを含む。一実施態様において、化学的または生物学的刺激は、ケモカイン受容体結合、パラクリン受容体結合、細胞膜変化、細胞骨格変化、生理学的勾配の変化、小分子の添加またはヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの添加の少なくとも1つを含む。
【０１６３】
一実施態様において、破壊された界面材料（すなわち、反応性で刺激された界面）は、その後収集および／または分離され得る。これは、当該材料の機能的ろ過、分画、捕捉、選択、遠心分離、濃縮、補助的還元、分離、段階的分配、分配、沈殿を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の様々な方法で達成され得る。
【０１６４】
一実施態様において、非界面材料（哺乳類の材料界面の少なくとも一部がそこから単離された哺乳類の検体材料から残っている）は、その後収集および／または分離され得る。当業者は、当該材料の機能的ろ過、分画、捕捉、選択、遠心分離、濃縮、補助的還元、分離、段階的分配、分配、沈殿を含むがこれらに限定されない様々な方法で達成され得ることを理解する。
【０１６５】
一実施態様において、破壊された界面材料および非界面材料は、全体的または部分的に合わせられて、機能性材料を組織化することができる組成物を作る。あるいは、破壊された界面材料は単独で用いられ得る（すなわち、非界面材料なし）。エクスビボまたは人工的刺激により達成される反応性で刺激された界面は、機能性材料を組織化することができる組成物を提供する。一実施態様において、組成物はまた、材料が存続および／または増殖することを可能にする、生存しているシステム、部分的に生存しているシステムおよび／または合成支持システムに直接配置され得る。
【０１６６】
一実施態様において、送達基質は、組成物に加えられ得る。送達基質は、固体、半固体、液体、半液体、流体、粒子、線維、足場、マトリックス、分子、基質、材料、細胞実体、組織実体、デバイス、生物学的、治療的、高分子、化学的、薬剤、生物体、媒体および／または合成物質、およびそれらの組合せを包含し得る。一実施態様において、送達基質は、足場、マトリックス、粒子、細胞、線維より選択される。
【０１６７】
一実施態様において、方法は、増殖因子、分析物、LGR相互作用成分、またはそれらの組合せより選択される補充物を加えることをさらに含み得る。分析物は、遊走性分析物、漸増分析物、刺激物質、阻害物質、またはそれらの組合せより選択され得る。
【０１６８】
界面および非界面材料の刺激事象中に、関連する材料作用物質は、製造および／または生成される。一実施態様において、この作用物質を反応性で刺激された界面および非界面材料を組み合わせて、機能性材料を組織化することができる組成物を生成し得る。あるいは、このよう作用物質は、独立して用いられ得る。別の選択肢として、このような作用物質は、他の物質に加えられてもよく、または他のシステム内で合わせられてもよい。
【０１６９】
一実施態様において、本明細書に記載の方法により製造される組成物は、インビボで機能性材料を組織化することができる。一実施態様において、本明細書に記載の方法により製造される組成物は、エクスビボで機能性材料を組織化することができる。一実施態様において、本明細書に記載の方法により製造される組成物は、インビトロで機能性材料を組織化することができる。当業者は、エクスビボまたはインビトロで機能性分極組織を組織化するために、適切で従来の増殖培地を本明細書に記載の組成物と合わせて用いることを認識する。
【０１７０】
その後、組成物は、当業者に理解される方法によって、安定化、保存、不死化、培養、増殖または部分分布に供され得る。
【０１７１】
組成物はまた、公知の方法に従って、凍結保存または凍結乾燥（cryodesiccate）（すなわち、凍結乾燥（freeze-dry））され得る。凍結乾燥の方法は、1つ以上の前処理（例えば、組成物を濃縮する；凍結保護剤を組成物に加える；組成物の表面積を増加させる；組成物を凍結する；および組成物を乾燥する、例えば、組成物を減圧下にさらして、組成物中に存在する水の昇華を生じさせる）を含み得る。
【０１７２】
使用方法
各組織に由来する本開示の組成物は、直接的または間接的な適用のための、ベクター、基質、流体、サポート、足場、マトリックス、デバイス、生物製剤、細胞、組織、ポリマー、分子、粒子、線維、治療剤を含むがこれらに限定されない、いくつかの形態の一体型の送達システム、プラットフォームまたは混成配置への、本開示の組成物の送達、配備、結合、統合、組合せ合成、添加により、医学/研究/再生医学/組織工学/食品/製造/軍事を含むがこれらに限定されない様々な適用可能な分野にわたって用いられ得る。
【０１７３】
また、有効量の本明細書に記載の組成物を対象体に投与することを含む、組織修復を必要とする対象体を処置するための方法を開示する。
【０１７４】
また、有効量の本明細書に記載の組成物を対象体に投与することを含む、それを必要とする対象体において組織（例えば、骨組織、皮膚組織、筋骨格組織、平滑筋組織、心筋組織、軟骨組織、脂肪組織、消化管組織、肺組織、食道組織、胃組織、腎臓組織、肝臓組織、膵臓組織、血管組織、リンパ組織、中枢神経組織、泌尿生殖器組織、腺組織、歯組織、末梢神経組織、出生組織または視覚組織）再生を促進するための方法を開示する。
【０１７５】
一実施態様において、対象体は、変性組織（例えば、骨組織、皮膚組織、筋骨格組織、平滑筋組織、心筋組織、軟骨組織、脂肪組織、消化管組織、肺組織、食道組織、胃組織、腎臓組織、肝臓組織、膵臓組織、血管組織、リンパ組織、中枢神経組織、泌尿生殖器組織、腺組織、歯組織、末梢神経組織、出生組織または視覚組織）疾患に罹患している。一実施態様において、変性骨疾患は、骨関節症または骨粗鬆症である。一実施態様において、対象体は、骨折（bone fractureまたはbreak）を患っている。一実施態様において、骨折は、安定骨折、開放複合骨折、横骨折、斜骨折または粉砕骨折である。
【０１７６】
本明細書に記載の組成物は、組織治癒を促進し、空隙を満たし、本質的な構造を維持し、その生物学的および機械的特性を介して別個の組織表面を橋渡しするために、足場または空隙充填剤の代替物として、または他のデバイスと組み合わせて機能し得る。したがって、本明細書に記載の組成物は、整形外科手術、神経外科手術、形成外科手術、歯科外科手術および皮膚外科手術を含むがこれらに限定されない移植手術において適用され得る。
【０１７７】
また、機能性分極組織を必要とする対象体に投与されると、機能性分極組織を生じさせることができる、刺激された異種哺乳類の組織界面細胞集合体を含む組成物を有効量対象体に投与することを含む、組織修復を必要とする対象体を処置するための方法であって、組成物の投与は、投与前と比較して、対象体において副甲状腺ホルモン、TLR4、チミジンホスホリラーゼの少なくとも1つの増加をもたらす、方法を開示する。
【０１７８】
また、組織の喪失または破壊を生じるか、組織の形成不全を生じるか、または異常組織の形成を生じる、組織の疾患または障害を処置する方法を開示する。組織の疾患または障害を処置する方法であって、該方法が、それを必要とする対象体の標的部位に本明細書に記載の組成物を投与することを含み、組織の疾患または障害が、(i)組織の喪失または破壊；(ii)組織の形成不全；または(iii)異常組織の形成を生じる、方法を開示する。
【０１７９】
また、組織の疾患または障害を処置する方法であって、該方法が、それを必要とする対象体の標的部位に本明細書に記載の組成物を移植することを含み、組織の疾患または障害が、(i)組織の喪失または破壊；(ii)組織の形成不全；または(iii)異常組織の形成を生じる、方法を開示する。
【０１８０】
さらに、組織の疾患または障害を処置する方法であって、該方法が、それを必要とする対象体の標的部位に本明細書に記載の組成物を埋め込むことを含み、組織の疾患または障害が、(i)組織の喪失または破壊；(ii)組織の形成不全；または(iii)異常組織の形成を生じる、方法を開示する。
【０１８１】
また、本明細書に記載の組成物および使用のための指示書を含むキットを開示する。
【０１８２】
本明細書で用いる用語「対象体」は、哺乳類を指す。一実施態様において、哺乳類は、ヒトである。他の実施態様において、哺乳類は、非ヒト動物である。哺乳類は、例えばラット、マウス、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコ、霊長類、雌ウシ、雄ウシ、ラクダ、ロバ、モルモットまたはバイソンより選択され得る。
【０１８３】
本明細書で用いる用語「標的部位」または「標的」は、組成物が直接的または間接的に影響、作用または変化しようとする組織内、組織上または組織に隣接する場所を指す。
【０１８４】
本明細書で用いる「処置」および「処置する」は、疾患もしくは障害の完全な治癒または疾患もしくは障害の症状の完全な解消（例えば、機能性組織の完全な形成または再構築）を必要としない。投与様式は、あらゆる適切な様式であり得る。代表的で非限定的な投与様式としては、配置、配備、塗布、移植、埋込み、直接播種、指向型遊走、指向型追跡、設置（in setting）、積層、注入、吸収およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１８５】
例示的実施態様
1. コアの強力な細胞実体および支持実体を含む、エクスビボまたは人工的に刺激された哺乳類の材料界面の少なくとも一部を含む組成物であって、該組成物が、機能性材料を集合させることができる、組成物。
2. 哺乳類の材料界面が、皮膚組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
3. 皮膚組織界面が、上皮-真皮界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
4. 皮膚組織界面が、乳頭-網状真皮界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
5. 皮膚組織界面が、真皮-下真皮界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
6. 皮膚組織界面が、下真皮-真皮下界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
7. 皮膚組織界面が、付属器-基質界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
8. 哺乳類の材料界面が、骨組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
9. 骨組織界面が、皮質周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
10. 骨組織界面が、層状構造周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
11. 骨組織界面が、小柱周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
12. 骨組織界面が、皮質海綿組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
13. 哺乳類の材料界面が、筋骨格組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
14. 筋骨格組織界面が、筋-筋内組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
15. 筋骨格組織界面が、筋-筋周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
16. 筋骨格組織界面が、筋-筋外組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
17. 筋骨格組織界面が、筋-筋膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
18. 筋骨格組織界面が、腱-筋肉組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
19. 筋骨格組織界面が、腱-骨組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
20. 筋骨格組織界面が、靭帯-骨組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
21. 哺乳類の材料界面が、平滑筋組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
22. 平滑筋組織界面が、血管周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
23. 平滑筋組織界面が、内臓周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
24. 平滑筋組織界面が、神経周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
25. 哺乳類の材料界面が、心筋組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
26. 心筋組織界面が、心内膜-心筋組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
27. 心筋組織界面が、心筋-心外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
28. 心筋組織界面が、心外膜-心膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
29. 心筋組織界面が、心膜-脂肪組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
30. 哺乳類の材料界面が、軟骨組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
31. 軟骨組織界面が、軟骨-軟骨周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
32. 軟骨組織界面が、軟骨-軟骨内組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
33. 軟骨組織界面が、軟骨内-軟骨下骨界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
34. 軟骨組織界面が、軟骨-軟骨内骨界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
35. 軟骨組織界面が、軟骨内-軟骨下骨界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
36. 哺乳類の材料界面が、脂肪組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
37. 脂肪組織界面が、脂肪-血管周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
38. 脂肪組織界面が、脂肪-ストーマ周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
39. 哺乳類の材料界面が、消化管組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
40. 消化管組織界面が、粘膜-粘膜下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
41. 消化管組織界面が、粘膜下-筋層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
42. 消化管組織界面が、筋層-漿膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
43. 消化管組織界面が、漿膜-腸間膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
44. 消化管組織界面が、筋-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
45. 消化管組織界面が、粘膜下-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
46. 哺乳類の材料界面が、肺組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
47. 肺組織界面が、粘膜-粘膜下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
48. 肺組織界面が、粘膜下-筋層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
49. 肺組織界面が、粘膜下-軟骨組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
50. 肺組織界面が、筋肉-外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
51. 肺組織界面が、導管-外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
52. 肺組織界面が、実質-漿膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
53. 肺組織界面が、漿膜-腸間膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
54. 肺組織界面が、筋-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
55. 肺組織界面が、粘膜下-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
56. 哺乳類の材料界面が、食道組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
57. 食道組織界面が、粘膜-粘膜下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
58. 食道組織界面が、粘膜下-筋層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
59. 食道組織界面が、筋層-外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
60. 食道組織界面が、筋-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
61. 食道組織界面が、粘膜下-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
62. 哺乳類の材料界面が、胃組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
63. 胃組織界面が、粘膜-粘膜下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
64. 胃組織界面が、粘膜下-筋層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
65. 胃組織界面が、筋層-漿膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
66. 胃組織界面が、筋-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
67. 胃組織界面が、粘膜下-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
68. 哺乳類の材料界面が、腎臓組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
69. 腎臓組織界面が、莢膜-皮質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
70. 腎臓組織界面が、皮質-髄質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
71. 腎臓組織界面が、神経-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
72. 哺乳類の材料界面が、肝臓組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
73. 肝臓組織界面が、導管上皮-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
74. 肝臓組織界面が、莢膜-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
75. 哺乳類の材料界面が、膵臓組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
76. 膵臓組織界面が、導管上皮-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
77. 膵臓組織界面が、腺上皮-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
78. 哺乳類の材料界面が、血管組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
79. 血管組織界面が、内皮-中膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
80. 血管組織界面が、中膜-中膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
81. 哺乳類の材料界面が、リンパ組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
82. リンパ組織界面が、皮質-髄質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
83. リンパ組織界面が、髄質-莢膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
84. リンパ組織界面が、莢膜-髄組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
85. 哺乳類の材料界面が、中枢神経組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
86. 中枢神経組織界面が、硬膜-皮質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
87. 中枢神経組織界面が、皮質灰白質-髄質白質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
88. 中枢神経組織界面が、髄膜-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
89. 哺乳類の材料界面が、泌尿生殖器組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
90. 泌尿生殖器組織界面が、上皮-粘膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
91. 泌尿生殖器組織界面が、粘膜-筋肉組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
92. 泌尿生殖器組織界面が、筋肉-外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
93. 泌尿生殖器組織界面が、身体-血管組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
94. 泌尿生殖器組織界面が、身体-筋肉組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
95. 哺乳類の材料界面が、腺組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
96. 腺組織界面が、上皮-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
97. 哺乳類の材料界面が、歯組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
98. 歯組織界面が、象牙質-髄組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
99. 哺乳類の材料界面が、末梢神経組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
100. 末梢神経組織界面が、神経上-神経周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
101. 末梢神経組織界面が、神経周囲-神経外組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
102. 末梢神経組織界面が、神経外-軸索を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
103. 哺乳類の材料界面が、出生組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
104. 出生組織界面が、羊膜-流体組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
105. 出生組織界面が、上皮-上皮下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
106. 出生組織界面が、上皮-間質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
107. 出生組織界面が、緻密-線維芽細胞組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
108. 出生組織界面が、線維芽細胞-中間組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
109. 出生組織界面が、中間-網状組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
110. 出生組織界面が、羊膜-絨毛膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
111. 出生組織界面が、網状-栄養芽細胞組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
112. 出生組織界面が、栄養芽細胞-子宮組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
113. 出生組織界面が、栄養芽細胞-脱落膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
114. 哺乳類の材料界面が、視覚組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の組成物。
115. 視覚組織界面が、上皮-膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
116. 視覚組織界面が、膜-間質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
117. 視覚組織界面が、間質-膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
118. 視覚組織界面が、膜-内皮組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
119. 視覚組織界面が、内皮-流体組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
120. 視覚組織界面が、強膜-脈絡膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
121. 視覚組織界面が、脈絡膜-上皮性組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
122. 視覚組織界面が、上皮-セグメント光受容体組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
123. 視覚組織界面が、セグメント光受容体-膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
124. 視覚組織界面が、膜-外核層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
125. 視覚組織界面が、外核層-外網状組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
126. 視覚組織界面が、外網状-内網状組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
127. 視覚組織界面が、内網状-神経節組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
128. 視覚組織界面が、神経節-神経線維組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
129. 視覚組織界面が、神経線維-膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
130. 視覚組織界面が、膜-流体組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
131. 支持実体が、間葉由来の細胞集団を含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
132. 支持実体が、細胞集団、細胞外マトリックス構成要素、またはそれらの組合せを含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
133. 送達基質をさらに含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
134. 送達基質が、足場、マトリックス、粒子、細胞、線維より選択される、先行する項のいずれかに記載の組成物。
135. 増殖因子、分析物、LGR相互作用成分、またはそれらの組合せより選択される補充物をさらに含む、先行する項のいずれかに記載の組成物。
136. 分析物が、遊走性分析物、漸増分析物、刺激物質、阻害物質、またはそれらの組合せより選択される、先行する項のいずれかに記載の組成物。
137. 下記：
コアの強力な細胞実体および支持実体を含む哺乳類の材料界面の少なくとも一部を単離すること；および
反応性で刺激された界面を生じさせ、組成物を提供すること
を含む、組成物を製造する方法であって、
該組成物が、機能性材料を集合させることができる、方法。
138. 哺乳類の材料界面が、皮膚組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
139. 皮膚組織界面が、上皮-真皮界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
140. 皮膚組織界面が、乳頭-網状真皮界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
141. 皮膚組織界面が、真皮-下真皮界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
142. 皮膚組織界面が、下真皮-真皮下界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
143. 皮膚組織界面が、付属器-基質界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
144. 哺乳類の材料界面が、骨組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
145. 骨組織界面が、皮質周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
146. 骨組織界面が、層状構造周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
147. 骨組織界面が、小柱周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
148. 骨組織界面が、皮質海綿組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
149. 哺乳類の材料界面が、筋骨格組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
150. 筋骨格組織界面が、筋-筋内組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
151. 筋骨格組織界面が、筋-筋周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
152. 筋骨格組織界面が、筋-筋外組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
153. 筋骨格組織界面が、筋-筋膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
154. 筋骨格組織界面が、腱-筋肉組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
155. 筋骨格組織界面が、腱-骨組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
156. 筋骨格組織界面が、靭帯-骨組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
157. 哺乳類の材料界面が、平滑筋組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
158. 平滑筋組織界面が、血管周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
159. 平滑筋組織界面が、内臓周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
160. 平滑筋組織界面が、神経周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
161. 哺乳類の材料界面が、心筋組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
162. 心筋組織界面が、心内膜-心筋組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
163. 心筋組織界面が、心筋-心外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
164. 心筋組織界面が、心外膜-心膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
165. 心筋組織界面が、心膜-脂肪組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
166. 哺乳類の材料界面が、軟骨組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
167. 軟骨組織界面が、軟骨-軟骨周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
168. 軟骨組織界面が、軟骨-軟骨内組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
169. 軟骨組織界面が、軟骨内-軟骨下骨界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
170. 軟骨組織界面が、軟骨-軟骨内骨界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
171. 軟骨組織界面が、軟骨内-軟骨下骨界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
172. 哺乳類の材料界面が、脂肪組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
173. 脂肪組織界面が、脂肪-血管周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
174. 脂肪組織界面が、脂肪-ストーマ周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
175. 哺乳類の材料界面が、消化管組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
176. 消化管組織界面が、粘膜-粘膜下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
177. 消化管組織界面が、粘膜下-筋層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
178. 消化管組織界面が、筋層-漿膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
179. 消化管組織界面が、漿膜-腸間膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
180. 消化管組織界面が、筋-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
181. 消化管組織界面が、粘膜下-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
182. 哺乳類の材料界面が、肺組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
183. 肺組織界面が、粘膜-粘膜下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
184. 肺組織界面が、粘膜下-筋層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
185. 肺組織界面が、粘膜下-軟骨組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
186. 肺組織界面が、筋肉-外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
187. 肺組織界面が、導管-外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
188. 肺組織界面が、実質-漿膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
189. 肺組織界面が、漿膜-腸間膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
190. 肺組織界面が、筋-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
191. 肺組織界面が、粘膜下-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
192. 哺乳類の材料界面が、食道組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
193. 食道組織界面が、粘膜-粘膜下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
194. 食道組織界面が、粘膜下-筋層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
195. 食道組織界面が、筋層-外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
196. 食道組織界面が、筋-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
197. 食道組織界面が、粘膜下-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
198. 哺乳類の材料界面が、胃組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
199. 胃組織界面が、粘膜-粘膜下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
200. 胃組織界面が、粘膜下-筋層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
201. 胃組織界面が、筋層-漿膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
202. 胃組織界面が、筋-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
203. 胃組織界面が、粘膜下-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
204. 哺乳類の材料界面が、腎臓組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
205. 腎臓組織界面が、莢膜-皮質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
206. 腎臓組織界面が、皮質-髄質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
207. 腎臓組織界面が、神経-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
208. 哺乳類の材料界面が、肝臓組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
209. 肝臓組織界面が、導管上皮-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
210. 肝臓組織界面が、莢膜-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
211. 哺乳類の材料界面が、膵臓組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
212. 膵臓組織界面が、導管上皮-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
213. 膵臓組織界面が、腺上皮-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
214. 哺乳類の材料界面が、血管組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
215. 血管組織界面が、内皮-中膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
216. 血管組織界面が、中膜-中膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
217. 哺乳類の材料界面が、リンパ組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
218. リンパ組織界面が、皮質-髄質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
219. リンパ組織界面が、髄質-莢膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
220. リンパ組織界面が、莢膜-髄組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
221. 哺乳類の材料界面が、中枢神経組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
222. 中枢神経組織界面が、硬膜-皮質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
223. 中枢神経組織界面が、皮質灰白質-髄質白質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
224. 中枢神経組織界面が、髄膜-神経組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
225. 哺乳類の材料界面が、泌尿生殖器組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
226. 泌尿生殖器組織界面が、上皮-粘膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
227. 泌尿生殖器組織界面が、粘膜-筋肉組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
228. 泌尿生殖器組織界面が、筋肉-外膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
229. 泌尿生殖器組織界面が、身体-血管組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
230. 泌尿生殖器組織界面が、身体-筋肉組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
231. 哺乳類の材料界面が、腺組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
232. 腺組織界面が、上皮-実質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
233. 哺乳類の材料界面が、歯組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
234. 歯組織界面が、象牙質-髄組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
235. 哺乳類の材料界面が、末梢神経組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
236. 末梢神経組織界面が、神経上-神経周囲組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
237. 末梢神経組織界面が、神経周囲-神経外組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
238. 末梢神経組織界面が、神経外-軸索を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
239. 哺乳類の材料界面が、出生組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
240. 出生組織界面が、羊膜-流体組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
241. 出生組織界面が、上皮-上皮下組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
242. 出生組織界面が、上皮-間質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
243. 出生組織界面が、緻密-線維芽細胞組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
244. 出生組織界面が、線維芽細胞-中間組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
245. 出生組織界面が、中間-網状組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
246. 出生組織界面が、羊膜-絨毛膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
247. 出生組織界面が、網状-栄養芽細胞組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
248. 出生組織界面が、栄養芽細胞-子宮組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
249. 出生組織界面が、栄養芽細胞-脱落膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
250. 哺乳類の材料界面が、視覚組織界面に由来する、先行する項のいずれかに記載の方法。
251. 視覚組織界面が、上皮-膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
252. 視覚組織界面が、膜-間質組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
253. 視覚組織界面が、間質-膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
254. 視覚組織界面が、膜-内皮組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
255. 視覚組織界面が、内皮-流体組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
256. 視覚組織界面が、強膜-脈絡膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
257. 視覚組織界面が、脈絡膜-上皮性組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
258. 視覚組織界面が、上皮-セグメント光受容体組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
259. 視覚組織界面が、セグメント光受容体-膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
260. 視覚組織界面が、膜-外核層組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
261. 視覚組織界面が、外核層-外網状組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
262. 視覚組織界面が、外網状-内網状組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
263. 視覚組織界面が、内網状-神経節組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
264. 視覚組織界面が、神経節-神経線維組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
265. 視覚組織界面が、神経線維-膜組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
266. 視覚組織界面が、膜-流体組織界面を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
267. 支持実体が、間葉由来の細胞集団を含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
268. 支持実体が、細胞集団、細胞外マトリックス構成要素、またはそれらの組合せより選択される、先行する項のいずれかに記載の方法。
269. 増殖因子、分析物、LGR相互作用成分、またはそれらの組合せより選択される補充物を加えることをさらに含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
270. 分析物が、遊走性分析物、漸増分析物、刺激物質、阻害物質、またはそれらの組合せより選択される、先行する項のいずれかに記載の方法。
271. 組成物を送達基質に加えることをさらに含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
272. 送達基質は、足場、マトリックス、粒子、細胞、線維より選択される、先行する項のいずれかに記載の方法。
273. 組成物を凍結保存することをさらに含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
274. 組成物を凍結乾燥することをさらに含む、先行する項のいずれかに記載の方法。
275. 先行する項のいずれかに記載の方法により製造される組成物。
276. 組織の疾患または障害を処置する方法であって、該方法が、それを必要とする対象体の標的部位に組成物を投与することを含み、組織の疾患または障害は、
(i)組織の喪失または破壊；
(ii)組織の形成不全；または
(iii)異常組織の形成
を生じ、
組成物は、コアの強力な細胞実体および支持実体を含む哺乳類の材料界面の少なくとも一部を含み、組成物は、機能性組織を組織化することができる、方法。
【実施例】
【０１８６】
実施例1
哺乳類の検体材料から始めて、各々静かに撹拌、揺り動かす、振とうまたは撹拌しながら、等張の生体適合性溶液（例えば0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸リンゲル液、水中の5%デキストロース、3.2％クエン酸ナトリウム）（抗生物質添加または非添加）を用いた約5分間の一連の1回以上の洗浄に哺乳類の検体材料を入れる。
【０１８７】
洗浄したら、組織界面を配置する。装置および／またはサポートシステムの使用を含む配置方法は、当該技術分野において周知であり、適切な組織界面を配置するのに用いられ得る。完全な界面が存在しない場合、亜区画または界面のサブセット（すなわち、亜界面）が存在するエリアに配置する。
【０１８８】
哺乳類の検体材料の残り（すなわち、非界面材料）からの完全なまたは亜区画（すなわち、亜界面）のいずれかで界面を分離する。界面の分離は、目下の用途に十分な材料、例えばあるサイズの創傷を処置するのに必要とされる材料の容量／質量が得られるまで、界面を分離するそのような作用を続ける。装置および／またはサポートシステムの使用を含む分離方法は、当該技術分野において周知であり、適切な界面を分離するのに用いられ得る。
【０１８９】
完全な界面または亜界面材料を支持培地溶液（例えば、HBSS、PBS）に入れ、有効な反応性刺激物質および／または関連する促進剤アジュバント（例えば、コラゲナーゼ、精巣ヒアルロニダーゼ、トリプシン）を温度制御CO2環境で1〜15分間加える。試薬、装置および／またはサポートシステムの使用を含む反応性刺激方法は、当該技術分野において周知であり、反応性で刺激された界面を提供するのに用いられ得る。
【０１９０】
反応性刺激物質および／または関連する促進剤アジュバントの作用を適切な停止剤、溶液、因子および／または培地（例えば、EDTA）で停止する。停止、試薬、装置および／またはサポートシステムの使用を含む停止方法は、当該技術分野において周知であり、このような作用を停止するのに用いられ得る。
【０１９１】
刺激された界面を溶液から収集する。溶液を保存する。試薬、装置および／またはサポートシステムの使用を含む収集方法は、当該技術分野において周知であり、反応性で刺激された界面を収集するのに用いられ得る。
【０１９２】
収集した反応性で刺激された界面を、少量の等張性生体適合性溶液を含む一時的な滅菌容器に入れ、保存する。残りの界面接続していない材料に戻す（すなわち、洗浄した哺乳類検体内に配置する）。
【０１９３】
非界面材料を支持培地溶液に入れ、有効な反応性刺激物質および／または関連する促進剤アジュバントを温度制御CO2環境で1〜15分間加える。試薬、装置および／またはサポートシステムの使用を含む反応性刺激方法は、当該技術分野において周知であり、反応性かつ刺激された非界面材料を提供するのに用いられ得る。
【０１９４】
反応性刺激物質および／または関連する促進剤アジュバントの作用を適切な停止剤、溶液、因子および／または培地で停止する。停止、試薬、装置および／またはサポートシステムの使用を含む停止方法は、当該技術分野において周知であり、このような作用を停止するのに用いられ得る。
【０１９５】
反応性で刺激された非界面材料を溶液から収集する。溶液を後の使用のため保存する。収集、試薬、装置および／またはサポートシステムの使用を含む収集方法は、当該技術分野において周知であり、反応性かつ刺激された非界面材料を収集するのに用いられ得る。
【０１９６】
反応性で刺激された非界面材料を二次培養容器、エクスビボサポートシステムまたはバイオリアクターのいずれかに加え、補充培地材料を加え、そして環境制御および環境変化の能力を有する閉鎖システム（例えば、インキュベーターまたはバイオリアクター）でインキュベートする。
【０１９７】
反応性で刺激された界面材料および得られた処理液を二次培養容器、エクスビボサポートシステムまたはバイオリアクターのいずれかに加え、補充培地材料を加え、そして環境制御および環境変化の能力を有する閉鎖システム（例えば、インキュベーターまたはバイオリアクター）でインキュベートする。
【０１９８】
必要に応じて、または目的に応じて、処理した材料のエクスビボおよび／または培養を個別にまたは二重培養システムの形態で維持する。
【０１９９】
必要に応じて、このような反応性で刺激された材料を、対象とする標的に組み合わせてまたは別個に配備するか、配置するかまたは組み合わせる。
【０２００】
実施例2
骨組織検体を得て、各々静かに撹拌、揺り動かす、振とうまたは撹拌しながら、等張の生体適合性溶液（例えば0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸リンゲル液、水中の5%デキストロース、3.2％クエン酸ナトリウム）（抗生物質添加または非添加）を用いた約5分間の一連の連続洗浄に入れた。
【０２０１】
洗浄したら、骨組織界面を配置し、十分な量の骨組織界面材料を骨組織検体の残り（すなわち、非界面材料）から分離した。
【０２０２】
骨組織界面材料を支持培地溶液に入れ、有効な反応性刺激物質および関連する促進剤アジュバント（例えば、コラゲナーゼ、精巣ヒアルロニダーゼ、トリプシン）を加えた。反応性刺激は、温度制御CO2環境で1〜15分間生じ、反応性で刺激された骨組織界面を提供した。
【０２０３】
反応性刺激物質および関連する促進剤アジュバントの作用を停止剤（例えば、EDTA）で停止した。
【０２０４】
反応性で刺激された骨組織界面を溶液から収集した。溶液を後の使用のため保存した。
【０２０５】
収集した反応性で刺激された骨組織界面の乾燥を防ぐために、収集した反応性で刺激された骨組織界面を、少量の等張性生体適合性溶液を含む一時的な滅菌容器に入れ、保存した。
【０２０６】
非界面材料を支持培地溶液（例えば、HBSS、PBS）に入れ、有効な反応性刺激物質および関連する促進剤アジュバントを加えた。反応性刺激は、温度制御CO2環境で1〜15分間生じ、反応性で刺激された非界面材料を提供した。
【０２０７】
反応性刺激物質および関連する促進剤アジュバントの作用を停止剤で停止した。
【０２０８】
反応性で刺激された非界面材料を溶液から収集した。溶液を後の使用のため保存した。
【０２０９】
反応性で刺激された非界面材料をインキュベーターに加え、補充培地材料を加え、その合わせたものを環境的に制御された閉鎖システムにおいてインキュベートした。
【０２１０】
反応性で刺激された骨組織界面および関連する溶液をインキュベーターに加え、補充培地材料を加え、その合わせたものを環境的に制御された閉鎖システムにおいてインキュベートした。
【０２１１】
別の例では、反応性で刺激された骨組織界面、および反応性で刺激された骨組織界面と反応性で刺激された非界面材料の組合せを、対象とする標的に配置する。
【０２１２】
実施例3
図1a〜eは、重大なサイズの頭蓋欠損モデルシステムにおける骨由来本明細書に記載の組成物の比較画像を示す。(a)時点TPDNでのインビボモデルシステムの欠損前左および右頭頂骨を示す三次元（3-D）マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）自然の頭蓋骨。(b)時点T0でのインビボモデルシステム内での左および右頭頂骨両方の外科的に作製した完全な両頭頂の重大なサイズの欠損の全体画像。(c)インビボモデルシステム内での左および右頭頂骨両方の外科的に作製した完全な（全層）両頭頂の重大なサイズの欠損の3-DマイクロCT。
【表１】
2021511937.tif 000003
未処置であり、試験全体を通じて欠損コントロールとして維持された、時点T0で直径8 mmの欠損を有する右頭頂骨領域を示す。
【表２】
2021511937.tif 000004
骨由来組成物で処置され、試験全体を通じて欠損処置コントロールとして維持された、8 mmの欠損を有する左頭頂骨領域を示す。
(d)処置および介入後4週間（時点TPPI-4WK）におけるインビボモデルシステム内での左および右頭頂骨両方の外科的に作製した完全な両頭頂の重大なサイズの欠損の3-DマイクロCT。
【表３】
2021511937.tif 000005
4週間における未処置である右頭頂骨領域（欠損コントロール）を示す。
【表４】
2021511937.tif 000006
4週間における処置した左頭頂骨領域（骨由来組成物処置）を示す。
(e)時点T0での一次両頭頂の欠損（点線の円）の相対マージンを示す；ROI（破線のボックス）は、3-DマイクロCTの処置4週間後欠損の拡大比較、および相対的な表面の深さおよび体積の輪郭を示す相関的3D熱スペクトル色付き表面プロットを示す。略語：欠損前自然の時点（TPDN）：欠損作製前に自然の頭蓋をイメージ化した時点；欠損の自然の時点（T0）：完全な（全層）8 mmの重大なサイズの欠損を頭頂頭蓋領域に作製した時点；処置および介入後4週間の時点（TPPI-4WK）：欠損を作製し、介入で処置しておよびせずに4週間経過した時点。したがって、これらの結果は、骨由来本明細書に記載の組成物が、骨再生を促進するための方法で有用であることを示している。
【０２１３】
実施例4
図2aおよび2bは、皮膚モデルシステム（ブタ）における皮膚由来組織による機能性分極組織の発達の進行を示す。図2aおよび2bは、様々なイメージングプラットフォームにおける同じ動物の結果を示す。図2aのイメージングプラットフォームは、高解像度DSLRカメラであった。図2bのイメージングプラットフォームは、拡大下偏光カメラであった。(a)列は、皮膚の空隙への配置および機能的に分極した全層皮膚組織病巣の発達後の皮膚由来組織の進行を示す。(b)列は、皮膚由来組織病巣の進行が、当該皮膚由来組織を受け取ったシステムで収束し、空隙全体にわたって機能的に分極した全層皮膚組織の漸次的生成を生じたことを示す。
【０２１４】
実施例5：ウサギの長骨試験
長骨欠損モデルは、30匹のニュージーランドホワイトウサギから構成されていた。3〜4 cmの長さの背中線切開を骨幹のほぼ中央の前肢の上に作製した。伸筋と屈筋の腱の間の軟組織を切開し、尺骨の表面から注意深く約12〜18 mm筋肉を持ち上げた。振動鋸を用いて尺骨幹を切断した。隣接組織への熱損傷を防ぐために、切断手順中にクリスタロイド灌注を用いるように注意を払った。ケアは、隣接する放射状の表面が、骨切除手順の実施中に刻み目や傷が付かないようにするために利用した。近位骨切除が完了した後に、遠位切除を完了し、骨内靭帯への外傷を最小限に抑えながら骨断片をゆっくり取り出した。尺骨欠損の合計サイズは10 mmであった。
【０２１５】
欠損を、骨由来組成物（例えばAHBC）による処置を含む様々な処置に供したか、または未処置のままにした。表1は、処置群を示す：
【表５】
2021511937.tif 000007
【０２１６】
欠損部位から骨を取り除いた後、無菌輸送培地に入れ、その場で骨由来組成物（例えばAHBC）に処理した。処理を骨組織界面に実施して、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む刺激された組成物であって、生存しているコアの強力な細胞実体は、LGR4、LGR5および／またはLGR6の配列を発現する組成物を作製した。AHBCを欠損へ埋め込み、手術部位上の筋肉/軟組織を吸収性縫合糸で閉じた。皮下層および皮膚層を、層状に非吸収性縫合糸で閉じた。
【０２１７】
DBM＋BMP-2を、（ヒト）DBMを10μg/mLのBone Morphogenic Protein-2（BMP-2）を合わせることにより調製した。AHBC処置動物に用いたAHBCの量と等しい量を用で、欠損をDBM＋BMP-2で満たした。
【０２１８】
試験終了時に、採取した組織には前肢全体が含まれた。
組織の下流の切開には、覆っている皮膚筋肉および骨膜の除去が含まれた。
【０２１９】
イメージング方法：
【０２２０】
全体イメージング：DSLR写真を手術中にCanon 5DSRで取得した。コピースタンドにカメラを取り付け、同じ設定を用いてエクスビボ画像を記録した。
【０２２１】
Vimago CT：下記設定でVimago CTを用いて、8週間の試験中に2週間ごとに動物をスキャンした：
・60 mA
・80 kV
・7 ms
・時間  32秒
・解像度  200μm
【０２２２】
マイクロCT（μCT）：Quantum GX2（PerkinElmer）装置を用いて、すべてのエクスビボのウサギの長骨検体をイメージ化した。最高の解像度を得るために、各検体を、90kV、40μA、FOV 36mm、ボクセルサイズ90μm、Al 0.5 CU 1.0フィルターで4分間イメージ化した。画像を、Analyzeソフトウェアバージョン12.0（AnalyzeDirect, Overland Park, KS, USA）を用いて分析した。
【０２２３】
複合顕微鏡：DFC7000Tカメラを備えたLeica 205 FAを用いて、各試料をその周囲についてタイムラプスシリーズを用いてイメージ化して、各欠損の360°ビューを取得する。これらの試料をイメージ化する前に、橈骨を再成長した尺骨から取り除き、欠損および再成長領域の可能な最高の表現を示す。未処置群において、再成長はほとんどなく、それ故に橈骨は尺骨に維持される。これを用いて、骨、ならびに欠損領域の周囲および内部の他の組織のカラー画像を示す。
【０２２４】
走査型電子顕微鏡イメージング：Zeiss Evo LS 10 環境走査型電子顕微鏡を用いて、各群からのすべての長骨試料の画像を撮影し、骨再生の生存率を決定するのを助ける。
【０２２５】
第2高調波発生（SHG）イメージング：10×0.40 NA対物レンズを用いて、880nmにChameleon波長可変2光子レーザーを備えたLeica SP8 多光子共焦点顕微鏡を用いて、第2高調波発生イメージングを実施した。
【０２２６】
ラマン分光：
10倍の対物レンズおよび785 nmのレーザー波長（28 mWレーザーパワー）を備えた共焦点ラマン顕微鏡（Thermo Fisher Raman DXR）を用いて、スペクトルを収集した。25μmのスリット開口部を用いて、波数500〜3500 cm-1の間のスペクトルを収集した。推定分解能は、2.3〜4.3 cm-1であった。スペクトルデータを、300のS/N比で1秒間の露出を用いて収集し、収集したスペクトルがバルク材料を表すことを確実にした。表面ポイントスキャンについて、合計2〜5個のスペクトルを、欠損の上面全体の任意の位置から収集した。表面ラインスキャンについて、6個のスペクトルを、収集の各ポイント間が200μm間隔で収集した。
【０２２７】
ラマン分光分析を、Dispersive RamanのためのOMNIC（Thermo Scientific）ソフトウェアを用いて実施した。OMNICソフトウェアで利用可能な特性を使用し、6次多項式ベースラインフィッティングを用いてすべての表面ポイントスキャンのスペクトルからバックグラウンド蛍光を取り除いた。各検体から収集した表面ポイントのスペクトルを正規化し、平均化して、個々の動物を表した。群全体の平均を、各群内の個々の動物からの平均スペクトルを用いて計算した。横断面エリアスキャンのOMNICケミグラムを、ヒドロキシアパタイトについて950〜965 cm-1の範囲を用いて作成した。
【０２２８】
遺伝子発現方法：
【０２２９】
試料採取：組織を、全体イメージング後に、処置したおよび未処置である創傷および自然の尺骨から採取した。組織をAllProtect（Qiagen）で採取し、4℃にて24時間保持し、その後RNA抽出を実施するまで保存するために-80℃に移した。
【０２３０】
RNA抽出：細胞の溶解を、PowerLyzer（Qiagen）を用いて3500 rpmにて45秒の2サイクルで、サイクル間の滞留時間を30秒として実施した。RNeasy Plus Universal Mini Kit（Qiagen）を用いて、得られた組織溶解液からRNAを精製した。RNAを、Nanodrop Lite（ThermoFisher Scientific）を用いて定量した。
【０２３１】
逆転写およびqRT-PCR：800ngのRNAを、cDNA using RT2 First Strand Kit（Qiagen）を用いて逆転写した。得られたcDNAを、RT2 PCR Profilerプレートのテンプレートとして用い、QuantStudio 12K FlexまたはQuantStudio 3（Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific）でメーカーの指示書（Qiagen）に従って実施した。これらの実施からのデータを、自然の組織の創傷治癒と未処置コントロールの創傷治癒を比較して分析した。個々の遺伝子の倍率制御を決定するΔΔCt法、および有意差を決定するスチューデントt検定（2つの試料間の両側分布および等分散）を用いて、オンラインのQiagen Data Analysis Centerによって、qPCRデータを分析した。
【０２３２】
結果：
AHBC処置群は、骨形成を生じた。図6〜8の画像は、AHBC処置での定性的な骨再生を示す。図9および10の画像はまた、AHBC処置での定性的な骨再生を示す。AHBCはまた、構造的完全性を示し、橈骨から分離すると、橈骨の解離を示す。図9および10は、AHBC処置が自然の骨と同様の骨形成を生じたことを示す。さらに、図9および10はまた、AHBC処置を受けた対象体が、骨欠損の未処置動物と比較して骨成長の増加を示したことを示す。したがって、これらの結果は、骨由来本明細書に記載の組成物が、それを必要とする対象体において骨再生を促進するための方法において有用であることを示す。
【０２３３】
自然の骨、未処置の欠損およびAHBC処置群の平均表面ポイントスペクトルを、図11に示すようにリン酸塩のピークの位置で比較した。自然の骨、未処置の欠損およびAHBC処置群の表面ラインスキャンを収集し、図12に示すようにリン酸塩のピーク線を示す。自然の骨、未処置の欠損およびAHBC処置群の表面エリアスキャンを、図13に示すように比較した。961 cm-1におけるリン酸塩のピークは、骨ミネラルのヒドロキシアパタイト形成を示し、強度は濃度に関連する。図11〜12に示すように、AHBC処置群は、自然の骨ミネラルと同様に高いリン酸塩強度を示し、これは、自然の骨における骨ミネラル形成を示している。
【０２３４】
AHBC処置による欠損についての遺伝子発現プロファイルを、自然の組織と比較し、AHBC（群3）をまた未処置創傷と比較した。図3は、自然の骨と比較したAHBC処置群についての血管新生因子の遺伝子発現における倍率変化を示すヒートマップを示す。図4は、自然の骨と比較したAHBC処置群についての骨形成遺伝子の遺伝子発現における倍率変化を示すヒートマップを示す。図5は、自然の骨と比較したAHBC処置群についての創傷治癒遺伝子の遺伝子発現における倍率変化を示すヒートマップを示す。AHBC対自然の組織の比較は、試験した252遺伝子のうち4つの下方制御された遺伝子（IL2、MYOSIN2、ITGB5およびSTAT3）をもたらし、これは、試験した遺伝子の98.4％がAHBC処置および自然の組織においで同様であることを示している。よって、AHBC処置は、遺伝子発現レベルで自然の骨と極めて同様な創傷治癒をもたらした。したがって、これらの結果は、骨由来本明細書に記載の組成物が、それを必要とする対象体において骨再生を促進するための方法において有用であることを示す。
【０２３５】
実施例6：ウサギの脊椎試験
試験の目的は、骨由来組成物（例えばAHBC）の欠損治癒における脊椎固定効果を決定することであった。欠損モデルは、36匹のニュージーランドホワイトウサギから構成されていた。骨稜のレベルで中央切開を行い、腸骨稜を両側に曝露させた。約2〜2.5 cm3の骨を各腸骨稜から取り除いた。この骨を処理して、骨組織界面を得て、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む刺激された組成物であって、生存しているコアの強力な細胞実体は、LGR4、LGR5および／またはLGR6の配列を発現する組成物を作製した。次に、正中傍筋膜切開を行い、横突起にアクセスした。筋膜を通過すると、筋肉間のエリアを生じさせるために、指での鈍的剥離を用いた。鈍的切開を用いて、最長筋の線維を横突起から、融合レベルで頭側および尾側の両方の椎骨からさらに移動させた。次に、高速バールを用いて横突起の皮剥を行った。頭側および尾側の横突起を適切に皮剥すると、骨由来組成物を皮剥エリアに注意深く適用した。その後、このプロセスを反対側に繰り返した。筋膜を上部で閉じ、組織および皮膚の残りの層を層状に閉じた。
【０２３６】
表2は、処置群を示す：
【表６】
2021511937.tif 000008
【０２３７】
ラマン分光：
10倍の対物レンズおよび785 nmのレーザー波長（28 mWレーザーパワー）を備えた共焦点ラマン顕微鏡（Thermo Fisher Raman DXR）を用いて、脊椎固定塊の横断面に沿ってスペクトルを収集した。25μmのスリット開口部を用いて、波数500〜3500 cm-1の間のスペクトルを収集した。推定分解能は、2.3〜4.3 cm-1であった。スペクトルデータを、300のS/N比で1秒間の露出を用いて収集し、収集したスペクトルがバルク材料を表すことを確実にした。
【０２３８】
ラマン分光分析を、Dispersive RamanのためのOMNIC（Thermo Scientific）ソフトウェアを用いて実施した。OMNICソフトウェアで利用可能な特性を使用し、6次多項式ベースラインフィッティングを用いてすべての表面ポイントスキャンのスペクトルからバックグラウンド蛍光を取り除いた。各検体から収集した表面ポイントのスペクトルを正規化し、平均化して、個々の動物を表した。群全体の平均を、各群内の個々の動物からの平均スペクトルを用いて計算した。横断面エリアスキャンのOMNICケミグラムを、ヒドロキシアパタイトについて950〜965 cm-1の範囲を用いて作成した。
【０２３９】
結果：
AHBC処置群は、最高の癒合頻度を示し、自家移植と同じであった。図14のグラフは、脊椎固定頻度を示す。
【０２４０】
自然の骨および処置群の平均ポイントスペクトルを、図16に示すようにリン酸塩のピークの位置で比較した。961 cm-1におけるリン酸塩のピークは、骨ミネラルのヒドロキシアパタイト形成を示し、強度は濃度に関連する。AHBC処置群は、自然の骨ミネラルと同様に高いリン酸塩強度を示し、これは、自然の骨における骨ミネラル形成を示している。
【０２４１】
横断面ラインスキャンを収集し、図17に示すように特定の距離に沿った骨ミネラルの分布を示す。ヒドロキシアパタイトのピーク強度は、961 cm-1における線として表される。
図17に示すように、AHBC処置群は、自然の骨ミネラルと同様に高いリン酸塩強度を示し、これは、自然の骨における骨ミネラル形成を示している。
【０２４２】
図15に示すように、AHBC処置群の骨密度は、自家移植を受けた動物に匹敵する。また、AHBCで処置された動物は、DBM＋BMP2による処置を受けた動物と比較して優れた骨密度を示す。したがって、これらの結果は、骨由来本明細書に記載の組成物が、それを必要とする対象体において骨再生を促進するための方法において有用であることを示す。
【０２４３】
実施例7：ウサギの頭蓋試験
この試験の目的は、大きな動物のウサギモデルにおいて骨由来組成物（例えばAHBC）が重大なサイズの欠損を修復する能力を調べることであった。7か月の骨格成熟まで歳をとった25匹の雌性ニュージーランドホワイトウサギに、8 mmの頭頂骨の重大なサイズの欠損を2つ与えた。各動物において、1つの欠損は、未処置コントロールとして機能し、他方の欠損を処置した。表3は、処置群を示す：
【表７】
2021511937.tif 000009
【０２４４】
鼻前頭エリアから外後頭稜の前面まで中線切開を行い、骨膜を露出させた。骨膜を切開し、鈍的切開を使用して両側に反映させ、頭頂頭蓋骨表面を露出させた。正中傍の8 mmの欠損を、クリスタロイドを大量灌注しながらトレフィンボアビットを用いて注意深く穴をあけることにより作製した。必要に応じて、ボーンワックスを用いて、作った欠損内で止血した。中央洞の両側に1つ有して、ウサギ1匹当たり合計2つの欠損を作製した。硬膜およびその下の血管および洞を損傷しないように、注意を払った。
【０２４５】
欠損部位から骨を取り除いた後、無菌輸送培地に入れ、その場で骨由来組成物（例えばAHBC）に処理した。処理を骨組織界面に実施して、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む刺激された組成物であって、生存しているコアの強力な細胞実体は、LGR4、LGR5および／またはLGR6の配列を発現する組成物を作製した。一般的に、AHBCを左の欠損へ埋め込んだが、欠損作製中に生じた硬膜断裂、または止血を達成するボーンワックスの使用の場合、試験物を右の欠損に配備した。処置部位への試験物の適用後、手術部位上の骨膜を、非吸収性縫合糸を用いて閉じた。その後、軟組織/筋肉および皮膚を、非吸収性縫合糸を用いて閉じた。
【０２４６】
分割頭蓋冠自家移植を、欠損部位の作製中に取り除いた頭蓋冠ディスクを取り、ディスクの内板および海綿状構成要素を掘り下げることにより製造した。その後、残りの外板を欠損部位へ埋め込んだ。
【０２４７】
DBM＋BMP-2を、（ヒト）DBMを10μg/mLのBone Morphogenic Protein-2（BMP-2）を合わせることにより調製した。AHBC処置動物に用いたAHBCの量と等しい量を用で、欠損をDBM＋BMP-2で満たした。
【０２４８】
試験終了時に、採取した組織には頭蓋全体が含まれた。組織の下流の切開には、覆っている皮膚筋肉および骨膜の除去と、それに続く両方の欠損部位を含む頭蓋骨を全体除去が含まれた。
【０２４９】
手術の2週間後および手術の8週間後の組織採取の時点でCTスキャンを得た。
【０２５０】
イメージング方法：
【０２５１】
全体イメージング：DSLR写真を手術中にCanon 5DSRで取得した。コピースタンドにカメラを取り付け、同じ設定を用いてエクスビボ画像を記録した。
【０２５２】
Vimago CT：下記設定でVimago CTを用いて、手術直後、2週間ごとおよび8週間の試験終了時に動物をスキャンした：
・60 mA
・80 kV
・7 ms
・時間  32秒
・解像度  200μm
【０２５３】
マイクロCT（μCT）：Quantum GX2（PerkinElmer）装置を用いて、すべてのエクスビボのウサギの頭蓋検体をイメージ化した。最高の解像度を得るために、各検体を、70kV、88μA、FOV 36mm、ボクセルサイズ90μm、Al 0.5 CU 1.0フィルターで14分間イメージ化した。画像を、Analyzeソフトウェアバージョン12.0（AnalyzeDirect, Overland Park, KS, USA）を用いて分析した。海綿および皮質の骨密度（BMD）を、ヒドロキシアパタイトの公知の密度50 mg/cm3、200 mg/cm3、800 mg/cm3および1200 mg/cm3とともに1つのファントム（25mm QRM BMDファントム）を用いて決定した。閾値を539ハンスフィールドユニット、294.34 mg/cm3に設定した。
【０２５４】
統計分析を、GraphPad Prism 7を用いて実施した。ダネット多重比較検定を用いて、群間の統計学的有意差を決定した。自然のまたは未処置群のいずれかをダネット多重比較検定におけるコントロールとして用いた。
【０２５５】
第2高調波発生（SHG）イメージング：10×0.40 NA対物レンズを用いて、880nmにChameleon波長可変2光子レーザーを備えたLeica SP8 多光子共焦点顕微鏡を用いて、第2高調波発生イメージングを実施した。シグナルを、Leica HyD検出システムを用いて検出し、LeicaアプリケーションSuite Xソフトウェアを用いてTIFフォーマットに変換した。
【０２５６】
共焦点蛍光イメージング：共焦点蛍光イメージングを、Leica TCS SP8単光子共焦点顕微鏡を用いて実施した。試料を10×0.40 NA対物レンズでイメージ化した。NucBlue（Catalog #: R37605, Thermofisher, Eugene, OR, USA）、Osetoimage Mineralization Assay（Catalog #: PA-1503, Lonza, Walkersville, MD, USA）およびActin-555 R37112, Thermofisher, Eugene, OR, USA）で標識した試料を、405（ダイオード）、488（アルゴン）、514（ダイオード）および633（HeNe）のレーザーラインを用いて可視化し、シグナルを、Leica HyDおよびPMT検出器を用いて検出した。画像を見て、Leica適用suite X ソフトウェアを用いてTIFフォーマットに変換した。
【０２５７】
複合顕微鏡：まとめて切除した欠損両方をZeiss V16複合顕微鏡503カメラでイメージ化した。上部および下部の全体のZスタックおよびタイル画像を取得した。個々の欠損上部および下部もまた取得した。対象とする領域を、周囲の自然の骨に由来する特徴に応じて、様々な倍率で取得した。
【０２５８】
複合顕微鏡を、Leica M205 FA複合顕微鏡を用いて、10％標準緩衝ホルマリン（NBF）固定頭蓋横断面で実施した。試料を0.63倍のplanapoレンズで2倍のズームにて見て、Leica DFC7000 Tカメラを用いて画像を収集した。
【０２５９】
走査型電子顕微鏡イメージング：走査型電子顕微鏡を、EVO LS10 ESEM（SEM）を用いて実施した。試料をExtended Range Cascade Current Detector（C2DX）に加えて高解像度後方散乱検出器（HDBSD）でイメージ化した。Zeiss SmartSEMおよびSmartStitchソフトウェア（Zeiss SmartSEM：バージョン6.02、Zeiss SmartStitch：バージョンV01.02.09）を用いて、画像をキャプチャーし、編集した。画像の最終的なステッチを、FIJI（バージョン1.52e）を用いて完了した。
【０２６０】
ラマン分光：
10倍の対物レンズおよび785 nmのレーザー波長（28 mWレーザーパワー）を備えた共焦点ラマン顕微鏡（Thermo Fisher Raman DXR Microscope）を用いて、スペクトルを収集した。25μmのスリット開口部を用いて、波数500〜3500 cm-1の間のスペクトルを収集した。推定分解能は、2.3〜4.3 cm-1であった。スペクトルデータを、300のS/N比で1秒間の露出を用いて収集し、収集したスペクトルがバルク材料を表すことを確実にした。表面ポイントスキャンについて、合計2〜5個のスペクトルを、欠損の上面全体の任意の位置から収集した。表面ラインスキャンについて、6個のスペクトルを、収集の各ポイント間が200μm間隔で収集した。ポイントおよびラインスキャンに加えて、横断面エリアスキャンを、各動物欠損について収集した。エリアスキャンは、100〜320ポイントの収集で3〜15 mm2のエリアをカバーする全層横断面から構成されていた。
【０２６１】
ラマン分光分析を、Dispersive RamanのためのOMNICソフトウェア（v.32、Thermo Fisher）を用いて実施した。OMNICソフトウェアで利用可能な特性を使用し、6次多項式ベースラインフィッティングを用いてすべての表面ポイントスキャンのスペクトルからバックグラウンド蛍光を取り除いた。各検体から収集した表面ポイントのスペクトルを正規化し、平均化して、個々の動物を表した。群全体の平均を、各群内の個々の動物からの平均スペクトルを用いて計算した。横断面エリアスキャンのOMNICケミグラムを、ヒドロキシアパタイトについては950〜965 cm-1、およびコラーゲンについては880〜840 cm-1の範囲を用いて作成した。
【０２６２】
結果：
骨密度測定値は、AHBCでの処置が自然の骨と同様の骨密度を生じたこと示す。図20は、AHBC処置群の骨密度が自然の骨に匹敵することを示す。図21は、AHBC処置群の海綿骨密度が自然の骨に匹敵することを示す。
【０２６３】
AHBCは、自然の骨と同様の骨体積対組織体積の割合を生じた。図22は、AHBC処置群の骨体積対組織体積の割合が自然の骨に匹敵することを示す。
【０２６４】
ラマン分光は、平均ポイントスキャン、表面ラインスキャンおよびエリアスキャンにおけるヒドロキシアパタイトを示し、これはAHBC処置についての骨ミネラル形成を示している。自然の骨、未処置の欠損およびAHBC処置群の平均表面ポイントスペクトルを、図23に示すようにリン酸塩のピークの位置で比較した。自然の骨、未処置の欠損およびAHBC処置群の表面ラインスキャンを収集し、図24に示すようにリン酸塩のピーク線を示す。自然の骨、未処置の欠損およびAHBC処置群の横断面エリアスキャンを収集し、ヒドロキシアパタイトの分布を図25に示す。961 cm-1におけるリン酸塩のピークは、骨ミネラルのヒドロキシアパタイト形成を示し、強度は濃度に関連する。図23〜25に示すように、AHBC処置群はリン酸塩強度を示し、これは骨ミネラル形成を示している。図24において、ヒドロキシアパタイトの線は、AHBC処置群について自然のものと明らかに同様である。
【０２６５】
AHBC処置群は、骨形成を生じた。図18および19のCTスキャンは、AHBC処置での骨形成を示す。図26〜28の画像はまた、AHBC処置での骨形成を示す。AHBC処置は、ABGと比較して、CT画像および肉眼検査でDBM＋BMP2処置によって観察された骨の形成不良が最小限で、ABGと同様の開頭閉鎖が得られた。走査型電子顕微鏡および第2高調波共振イメージングによる超微細構造分析は、AHBC処置欠損が裂け目と組織化されたコラーゲン構造を有する完全な皮質骨生じさせたことを示す。機械的、組成的および構造的分析は、AHBC形成骨がABGと同様であり（p＜0.05）、一方DBM＋BMP2および未処置コントロールが最小限の骨形成を伴う線維症を示す特性を有することを示す。これらの結果は、骨由来本明細書に記載の組成物が骨再生を促進するための方法で有用であることを示す。
【０２６６】
実施例8：骨由来組成物と自然の骨組織（ウサギ）との間の遺伝子発現の差異
Qiagen RT2 PCRプロファイラーアレイを用いて、処理に対する分子応答を評価した。処理を骨組織界面に実施して、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む刺激された組成物であって、生存しているコアの強力な細胞実体は、LGR4、LGR5および／またはLGR6の配列を発現する組成物を作製した。骨形成、血管新生および創傷治癒経路をアッセイした。異なって発現した遺伝子を、スチューデントt検定を用いて決定して、試料処理前と後における遺伝子発現間の関係を試験した。低p値（P＜0.05）の濃縮を並び替えによって評価した。特定の処理前および後のシグネチャーを骨形成、創傷治癒および血管新生経路において検出した（経験的P＜0.05）。表4は、処置群を示す。
【表８】
2021511937.tif 000010
【０２６７】
試料採取：組織を、4匹の処理前および5匹の処理後のウサギの頭蓋から採取した。組織をAllProtect（Qiagen）で採取し、4℃にて24時間保持し、その後RNA抽出を実施するまで保存するために-80℃に移した。
【０２６８】
RNA抽出：細胞の溶解を、PowerLyzer（Qiagen）を用いて3500 rpmにて45秒の2サイクルで、サイクル間の滞留時間を30秒として実施した。RNeasy Plus Universal Mini Kit（Qiagen）を用いて、得られた組織溶解液からRNAを精製した。RNAを、Nanodrop Lite（ThermoFisher Scientific）を用いて定量した。
【０２６９】
逆転写およびqRT-PCR：800ngのRNAを、cDNA using RT2 First Strand Kit（Qiagen）を用いて逆転写した。得られたcDNAを、RT2 PCR Profilerプレートのテンプレートとして用い、QuantStudio 12K FlexまたはQuantStudio 3（Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific）でメーカーの指示書（Qiagen）に従って実施した。
【０２７０】
統計分析：これらの実施からのデータを、試料の前と後を比較して分析した。qPCRデータを、Rv3.5.1を用いて分析した。Qiagen経路遺伝子（骨形成、血管新生および創傷治癒）の差異的発現を、スチューデントt検定（2つの試料間の両側分布および等分散）を用いて決定した。個々の遺伝子の倍率制御を、ΔΔCt法を用いて計算した。試験した3つのアレイの各々において低p値濃縮（P＜0.05）を評価するために、前/後の表現型を10,000回並び替えて、その後スチューデントt検定を用いて、遺伝子発現と各並び替えた表現型との間の関係を試験した。濃縮のための経験的p値を、並べ替えたデータセットで0.05未満のp値の割合が観測されたデータよりも大きかった回数を記録することによって生成した。
【０２７１】
結果：遺伝子発現プロファイルを、Qiagen RT2 PCR経路アレイを用いて試料の前および後について生成した。各群と自然のものとの間の統計学的有意差を、スチューデントt検定を用いて決定した。図29に示すように各試料からの分子シグネチャーの階層的クラスター形成は、処理前および後の試料が、試験したすべての経路について異なる群へクラスターを形成したことを示しており、これは、骨由来本明細書に記載の組成物への処理後に分子経路が変更されることを示している。試験の試料サイズが小さいと考えられるため、各パネル内で複数の補正を試験した後、遺伝子は有意でなかった（P＜5.95×10-4）。10,000回の並び替えと比較してデータセットにおける低p値（P＜0.05）の濃縮について、試験をさらに実施した。並び替えは、偶然見られると予測する低p値の数をシミュレーションする。すべてのパネルを低p値について少なくとも適度に濃縮（P＜0.05）にした。すなわち、0.05未満のp値の数を偶然と予測されるものより大きい。
【０２７２】
各パネルについて濃縮遺伝子を図30〜32に示す。図30〜32において、倍率変化をx軸に示す。P値（y軸）は、頭蓋試料の前と後の間の遺伝子発現の差異に対応する。
色付きのドットは、P＜0.05の差異を示す。頭蓋処理後における処理前と比較した対応する遺伝子発現の増加および減少は、それぞれ赤色および青色のドットで示される。黒色のドットは、P＜0.05の部位を示す。
【０２７３】
骨形成経路を低p値（経験的P＝0.016）について適度に濃縮にした。遺伝子の13％（N＝9）は、異なって発現した。発現の最大の増加は副甲状腺ホルモンであり（PTH；13倍の増加）、これはヒト間葉性幹細胞における骨形成の向上を示している。Kuo S-W, Rimando MG, Liu, S, Lee OK. Intermittent Administration of Parathyroid Hormone Enhances Osteogenesis of Human Mesenchymal 幹細胞s by Regulating Protein Kinase Cδ. Int J Mol Sci. 2017; 18(10)参照。これは、PTHによって増強され、Wnt/β-カテニンシグナル伝達を阻害する（β-カテニン[CTNNB1]/γ-カルボキシグルタミン酸[BGLAP]の減少）ことが知られている、BMP/TGF-βシグナル伝達の観察された増加と一致する。Yu B, Zhao X, Yang C, Crane J, Xian L, Lu W, Wan M, Cao X. PTH Induces Differentiation of Mesenchymal 幹細胞s by Enhancing BMP Signaling. J Bone Miner Res. 2013; 27(9):2001-2014; Wany Y, Li Y-P, Pulson C, Shao J-Z, Zhang X, Wu M, Chen W. Wnt and the Wnt signaling pathway in bond development and disease. Fron Biosci. 2014; 19:379-407参照。創傷治癒経路をまた、低p値（P＝0.0072）について濃縮した。遺伝子の13％（9/63）は、処置の前と後の間で適度に異なる。これらの遺伝子の大部分（8/9）は、処理後に発現が減少しており、これは処理が創傷治癒経路のシグナル伝達を減少させることを示唆している。例えば、成長に関連する他の分子のうち結合組織増殖因子は、処理後に減少している。病原体関連パターン認識受容体である、TLR4の処理後の発現増加は、試料の処理による免疫監視機構の活性化を示す。血管新生経路は、破壊に関連する経路遺伝子の24％（19/80遺伝子）で中程度のp値についての濃縮の最大量（P＜1×10-5）を示す。これらの遺伝子の大部分（16/19）は、処理時に発現を増加させ、これは、処理が血管新生シグナル伝達を増加させることを示唆している。血管新生を促進する遺伝子であるチミジンホスホリラーゼでは、最大の倍率の増加は189倍である。更なる血管新生促進分子もまた観察されている（TGF-α、TGF-βR1、EFNA1）。
【０２７４】
したがって、骨由来本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象体における骨再生を促進するのに有用である。
【０２７５】
実施例9：肝臓由来の組成物と自然の肝臓組織（マウス）との間の遺伝子発現の差異
図33は、本明細書に記載の肝臓由来の組成物対自然の肝臓組織における分子経路の変更の代表的なヒートマップを示す。濃い赤色および黄色は、それぞれ遺伝子発現の最高レベルと最低レベルに関する。この標的転写産物評価は、自然のおよび処理した肝臓（AHLC）試料についての異なる遺伝子発現プロファイルの存在を示す。
【０２７６】
実施例10：様々な組織由来の組成物と自然の組織との間の圧縮強度の差異
ウサギ長骨、脂肪（ヒト）、筋肉（ヒト）、軟骨（ブタ）および骨（ウサギ大腿骨）の各々を処理して、組織界面を得て、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む刺激された組成物であって、生存しているコアの強力な細胞実体は、LGR4、LGR5および／またはLGR6の配列を発現する組成物を作製した。刺激された組成物の各々を、それぞれの自然の組成物と機械的に比較した。平板を圧縮試験に用いた。1kN荷重設定のInstron 3343を用いた。図35および37〜40は、力対変位を示す。グラフの傾きは圧縮強度を定義する。自然のおよび処理した組織についての力対変位の応答は、異なる傾き（率として定義）では比較できない。このデータは、自然のおよび処理した組織の両方が異なる物理的特性を有することを示す。
【０２７７】
実施例11：骨由来組成物と自然の骨組織（ウサギ）との間のヒドロキシアパタイトの差異
図36は、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む刺激された組成物であって、生存しているコアの強力な細胞実体は、LGR4、LGR5および／またはLGR6の配列を発現する組成物を作製」するために、自然のウサギの長骨および骨-組織界面を処理したウサギの長骨のラマン横断面エリアスキャンを示す。ラマンスキャンは、実施例5で説明したように行った。ラマン断面スキャンは、図36にヒドロキシアパタイトの分布を示す。強度は、骨ミネラルヒドロキシアパタイトの濃度に関連している。図36に示すように、ヒドロキシアパタイトの分布は、処理した組織と自然の組織で異なる。
【０２７８】
実施例12：膚由来組織と自然の皮膚組織（ヒト）との間の発現の差異
図34Aは、創傷治癒、幹細胞、および細胞表面マーカー経路を評価する皮膚標的化トランスクリプトーム分析が、処理組成物（AHSC）と比較して、自然の皮膚に存在する別個のシグネチャーを特定することを示す。
図34Bは、標的化幹細胞アッセイが、自然の皮膚と比較して、処理組成物（AHSC）に存在する幹細胞マーカーの発現増加を示すこと示し、これは処理および保存による常在幹細胞の活性化を示唆している。
【０２７９】
実施例13：筋肉由来の組成物の製造
鋭的剥離を用いてウサギ大腿筋肉を採取する。組織を、静かに揺り動かしながら4℃にて5分間等張液（例えば0.9％NaCl）で洗浄する。筋肉組織界面分離を、10 gの組織を50 ccコニカルチューブ（コニカルA）に氷上で入れ、20 mLの冷やしたHBSSに浸すことにより開始する。コラゲナーゼIV型（0.143 g）、パパイン（0.019 g）、ジチオスレイトール（0.0028 g）を加え、コニカルAを、5分間37.7℃に温めた加温槽に移す。試料（300 VPM）をボルテックスし、内容物を培養皿へ移し、37.7℃にて5％CO2環境で20〜25分間、または組織解離が十分になるまでインキュベートする。組成物を50 mLコニカルチューブ（コニカルB）へ移し、停止剤を合わせる。組成物を1000 RPMにて10分間遠心分離する。メッシュろ過または沈殿を含む標準的な方法と一致して、筋肉組織界面接続した材料を界面接続していない材料から分離する。界面接続していない材料を含む残りの組成物を、1000 RPMにて5分間室温で遠心分離する。上清を50 mL（コニカルC）へ移す。コニカルCを30,000 RPMにて20分間遠心分離する。上清を捨てる。コニカルCを10 mLの生体適合性等張液（1×HBSS、DMEM、RPMI、0.9％NaCl、乳酸リンゲル液）で洗浄する。生体適合性溶液と2：1（v/v）で合わせ、活性化した界面接続した材料との得られた組合せを加えて、十分な水和を確実にする。処理は、直径約40〜250μmのサイズの範囲の反応性で刺激された構成要素を備えた界面接続した筋肉組織を生じる。
【０２８０】
実施例14：軟骨由来の組成物の製造
ウサギの関節軟骨を単離し、4℃にてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回すすぐ。組織を、1〜5 mm3の体積のセグメントに機械的に分画する。その後、これらの組織を、37度に温めたPBSで2回すすぎ、50 ccコニカルチューブへ移す。2 mg/mL精巣ヒアルロニダーゼ1-S型および0.25％トリプシン/1mM EDTAを用いて組織容量に対して10：1（v/v）の容量で、PBSを37℃に予め温める。筋肉組織を5〜30分間インキュベートする。組織をPBSで2回すすぐ。4.5 mg/mlグルコース、10mM HEPES緩衝液、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび0.05〜2％（w/v）コラゲナーゼII型を添加した、組織容量に対して10：1（v/v）の容量で、37℃に予め温めたDMEMを加え、組織を、60 RPMで遠心分離しながら、37℃で1〜20時間インキュベートする。得られた組成物を1200 RPMにて10分間遠心分離する。上清を映し、後の使用のために保存する。残りの反応性で刺激されている界面接続したおよび界面接続していない組織を、PBSと1：1（v/v）で合わせ、メッシュろ過、沈殿および／または機械的単離のいずれかを用いて分離する。得られた処理組成物の反応性で刺激されている界面接続した構成要素は、最長軸の長さが約30〜275μmである。
【０２８１】
実施例15：脂肪由来の組成物の製造
褐色ウサギの皮下、内臓および／または脂肪組織を採取し4℃に冷やした100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含むPBSで3回すすぐ。脂肪組織および界面を、5分間、合計5サイクル、遠心分離および／またはボルテックス（600 VPM）を含む当該技術分野において公知である方法によって、機械的に解離させる。その後、脂肪組織を生体適合性溶液（DMEM、RPMI、PBS、0.9％NaCl、乳酸リンゲル液）と同等な容量で合わせ、2000 RPMにて5分間遠心分離する。油/脂肪層を取り除く。このサイクルを合計3回繰り返す。残りの反応性で刺激されている界面接続した組織および界面接続していない構成要素を、DMEMに0.5：1（v/v）で再懸濁させ、500 RPMにて2分間遠心分離する。反応性で刺激されている界面接続した組織を吸引により分離する。単離した活性な界面接続した構成要素を1900〜31,400μm3の体積の範囲にする。
【０２８２】
実施例16：ブタの皮膚試験
この試験の目的は、皮膚由来組織（例えばAHSC）で処置した全層創傷床内での新真皮の成長、上皮の拡大、毛髪の成長および脈管構造の形成の発達を評価すること、および／または様々な補助剤の有りまたは無しで皮膚由来組織の様々な調製物（例えばAHSC）で創傷閉鎖を評価することであった。
【０２８３】
方法：
12匹の未経産雌性の通常のヨークシャーブタ（試験開始時に30〜40 kg）を無菌で準備した。創傷床を、メスでの鋭的剥離および電気焼灼の組合せを用いて全層皮膚を切除することにより作製した。全層創傷の深さを、所定の創傷エリアの下にある筋膜を視覚化することにより確認した。皮膚由来組織（例えばAHSC）を、作製した創傷床からの切除した全層皮膚の一部を用いて作製して、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む刺激された組成物であって、生存しているコアの強力な細胞実体は、LGR4、LGR5および／またはLGR6の配列を発現する組成物を作製した。
【０２８４】
処置を創傷床に適用し、包帯をした。創傷を、手術後18〜200日間治癒させた。
【０２８５】
インビボイメージング方法：
【０２８６】
全体イメージング：全体写真を、デジタルカメラで週に1回以上（包帯の交換手順中）取得した。
【０２８７】
ベクトラ：輪郭および収縮を、ブタの背中を三次元にする立体視カメラ（Canfield Vectra H1）を用いて測定した。背側表面のこれらの画像を、頭側から尾側へ撮影した。データを記録し、Canfield VAM ソフトウェアを用いて収縮測定を行った。
【０２８８】
巨視的イメージング：対象とする領域の巨視的画像を、iPhone 6に取り付けられたolloclipレンズ（7倍、14倍、21倍ズーム）を用いて取得した。選択したブタについては、ダーマスコープ（Canfield VEOS）を対象とする領域のイメージングのため導入した。
【０２８９】
LDI：ムーア全視野レーザー灌流画像装置（moorFLPI-2）レーザードップラー画像装置（LDI、WO9740/09）の画像をブタSKN001-SKN012について取得した。1つの創傷当たり1つの画像を取得し、コントロールの目的で自然のブタの皮膚の画像を頭蓋創傷のすぐ上で取得した。
【０２９０】
顕微鏡：複合顕微鏡観察を、Leica DFC7000 Tカメラに取り付けられたLeica M205 FAを用いて取得した。画像を、0.63倍の対物レンズで0.78、1および2倍ズームにて得た。
【０２９１】
組織学および組織イメージング：ブタ試料を10％標準緩衝ホルマリン中で採取し、70％エタノールへ移す前に一晩固定した。その後、試料を70％、95％および100％エタノール中で処理し、キシレン中で清浄化し、パラフィンを浸透させた。その後、試料をパラフィンに包埋し、4μmのスライスを作り、正に帯電したガラススライドに載せた後、ヘマトキシリン・エオジン、マッソンのトリクロームまたは過ヨウ素酸シフで染色した。染色したスライドを、化合物、SEM、共焦点および多光子顕微鏡を用いてイメージ化して、全体的な解剖学的および顕微鏡的超微細構造特徴を評価した。
【０２９２】
共焦点蛍光イメージング：共焦点蛍光イメージングを、Leica TCS SP8単光子共焦点顕微鏡を用いて実施した。試料を10×0.40 NA対物レンズでイメージングした。NucBlue（Molecular Probes）、Col-F（Immunochemistry Technologies）、Actin-555（Thermofisher）およびWheat-germ agglutinin-647（Thermofisher）で標識した試料を、405（ダイオード）、488（アルゴン）、514（ダイオード）および633（HeNe）のレーザーラインを用いて可視化し、シグナルを、Leica HyDおよびPMT組合せ検出システムを用いて検出した。
【０２９３】
第2高調波多光子イメージング：第2高調波イメージングを、Chameleon 2光子レーザーを備えたLeica SP8多光子共焦点顕微鏡を用いて実施し、10×0.40 NA対物レンズを用いて収集した。
【０２９４】
走査型電子顕微鏡イメージング：走査型電子顕微鏡観察を、EVO LS10 ESEMを用いて実施した。試料を、15キロボルト（kV）および60 Paにて50倍の倍率を用いて高解像度後方散乱検出器（HDBSD）でイメージ化した。
【０２９５】
ラマン顕微鏡：10倍の対物レンズおよび785 nmのレーザー波長（サンプリングポイントにて28 mWのパワー）を備えた共焦点ラマン顕微鏡（Thermo Fisher Raman DXR）を用いて、スペクトルを収集した。試料上の推定スポットサイズは2.1μmであり、分解能は、2.3〜4.3 cm-1であった。共焦点開口部は25μmのスリットであり、波数500〜3500 cm-1の間のスペクトルを収集した。ラマン分光分析を、Dispersive RamanのためのOMNICソフトウェアを用いて実施した。OMNIC（Thermo Scientic）ソフトウェアで利用可能な独自の機能を使用し、多項式ベースラインフィッティング（6次）を用いてすべてのスペクトルからバックグラウンド蛍光を除き、スペクトルを正規化した。スペクトルデータは、300のS/N比で1秒間の露出を用いて収集し、検体が均質であり、収集したスペクトルがバルク材料を表すことを確実にした。これらのデータ収集技術を、(1)横断面エリア、(2)横断面ラインおよび(3)表面ラインスキャンを含むラマン分光を用いて、自然の組織および創傷で実施した。横断面エリアおよびラインスキャンは、全層の創傷または自然の皮膚を含む。横断面ラインスキャンは、組織の横断面全体に沿って7ポイントを含む。表面ラインスキャンは、組織の表面に沿って20μm間隔を空けた5ポイントを含む。
【０２９６】
機械的特性評価：処置した皮膚および自然のものの機械的特性を、最大120または200日間の処置を受けたブタで試験した。3つの方法を用いた：バリスト法（インビボでの皮膚のはり）、引張試験（エクスビボでの弾性率）および超音波せん断波エラストグラフィ（インビボでの弾性率）。
【０２９７】
引張試験：処置した創傷にわたる皮膚スライスを、5 mm変位に達するまで、0.5 mm/分の一定クロスヘッド速度にて1 kNの負荷荷重を有する電子型UTM（万能試験機）（Instron, MA, USA）を用いて、弾性強度について試験した。荷重および変位を、試験中に0.1秒間隔で記録した。処置した皮膚試料および自然の皮膚試料を試験して、エクスビボでの皮膚弾性率を決定した。
【０２９８】
バリストメーター：バリストメーター（Diastron Ltd., Andover, UK）を、各解剖学的試験部位の、隣接するが重なり合わない3つの領域に適用した。最大200日間処置されたブタを、この技術を用いてインビボで試験した。データの一貫性を確保するために、1人の試験者がすべてのバリストメーター測定を実施した。バリストメーターは、独自のDiastron MAppソフトウェアを用いて、陥凹；αおよび反発係数（CoR）の3つの主要なパラメーターを記録した。
【０２９９】
US SWE（超音波せん断波エラストグラフィ）：SWE機能を備えたGE超音波（GE Medical systems, Chicago, IL）を用いて、処置した創傷のインビボ弾性を自然の皮膚と比較して評価した。ARF（音響ラジオ周波数）パルスを用いて、小さな（約8 cm3）ROIの組織においてせん断波を生成した。Bモードイメージングを用いて、せん断波による組織の変位をモニターした。せん断波速度を用いて、ヤング率（kPa）を評価した。ROIにおけるせん断波速度（cm/秒）またはヤング率（kPa）の平均、最大、最小および標準偏差を示す。処置した創傷全体のヤング率を表面マップ（エラストグラム）としてプロットした。
【０３００】
分子分析方法：
【０３０１】
試料採取：組織を、全体イメージング後に、創傷および自然の皮膚から採取した。組織をAllProtect（Qiagen）で採取し、4℃にて24時間保持し、その後RNA抽出を実施するまで保存するために-80℃に移した。
【０３０２】
RNA抽出：組織の溶解を、TissueLyser LT（Qiagen）を用いて50 hzにて60分間で実施した。RNeasy Plus Universal Mini Kit（Qiagen）を用いて、得られた組織溶解液からRNAを精製した。RNAを、Nanodrop Lite（ThermoFisher Scientific）を用いて定量した。
【０３０３】
逆転写およびqRT-PCR：800ngのRNAを、cDNA using RT2 First Strand Kit（Qiagen）を用いて逆転写した。得られたcDNAを、RT2 PCR Profilerプレートのテンプレートとして用い、QuantStudio 12K FlexまたはQuantStudio 3（Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific）でメーカーの指示書（Qiagen）に従って実施した。これらの実施からのデータを、自然の組織およびAHSCの創傷とコントロール創傷を比較して分析した。個々の遺伝子の倍率制御を決定するΔΔCt法、および有意差を決定するスチューデントt検定（2つの試料間の両側分布および等分散）を用いて、オンラインのQiagen Data Analysis Centerによって、qPCRデータを分析した。用いたQiagenプレートは、細胞外マトリックスおよび接着分子（PASS-013Z）、肝細胞（PASS-405Z）、WNTシグナル伝達標的（PASS-243Z）、炎症性サイトカインおよび受容体（PASS-011Z）、創傷治癒（PASS-121Z）を含む。
【０３０４】
結果：
図41〜52は、試験の結果を示す。自然の皮膚およびコントロールは、最小限の創傷収縮、真皮と表皮の成長ならびに予測される毛髪、腺、脈管構造の存在によって示されるように機能的な皮膚の特性を示した。創傷のみ（未処置）、コラーゲン処置およびプラコール処置のコントロールは、瘢痕、創傷収縮、ならびに腺、毛包および毛細血管を含む機能的な皮膚構成要素の最小限の発達を示した。AHSCの使用は、未処置の創傷のみのコントロール、コラーゲンのみまたはプラコールのみで処置した創傷と比較して、創傷収縮の減少、新しい真皮および表皮の成長、新しい毛髪の成長および脈管構造の存在をもたらした。現在の試験で用いた皮膚由来組織の量は、完全に機能する皮膚を示す超微細構造の特徴の再生を促進した。
【０３０５】
処置した創傷および自然の皮膚を切除し、イメージ化した。複合顕微鏡観察は、AHSCで処置した創傷において治癒の改善および収縮の減少を示した。マッソンのトリクロームでの組織学的染色、SEMおよび多光子イメージングは、全層皮膚を示す、組織化された細胞外マトリックス（ECM）を示した。共焦点蛍光顕微鏡観察は、上皮-真皮界面における毛包、脈管構造および表皮突起の存在を表し、これは、機能的な皮膚の再生を強調している。
【０３０６】
図50〜52は、試験の組織分子分析の結果を示す。全体として、皮膚由来組織で処置した創傷を自然の皮膚組織を比較すると、遺伝子発現の変化は最小限である。CDH1、CTNNB1、BMP4、EGFR、FST、GJA1、JAG1、LEF1、FZD7およびVEGFAについて、顕著な下方制御が観察される。これらの遺伝子すべては、WNTシグナル伝達経路で何らかの機能を有するかまたはその標的であることが知られている。全体として、幹細胞、ECMおよび接着およびWNT経路プロファイルの傾向は顕著でない。創傷治癒マーカーは、全体として上方制御され、試験した多くの炎症マーカーは下方制御される。
【０３０７】
皮膚由来組織で処置した創傷と自然の皮膚組織との間の遺伝子発現の最小限の差異は、皮膚由来組織で処置した創傷が、分子レベルで自然の皮膚からほとんど区別がつかないことを示唆する。WNT経路プレーヤーの顕著な変化は、WNTシグナル伝達が、皮膚由来組織での処置において創傷治癒を介在する重要なメカニズムであり得ることを示唆する。
【０３０８】
重要な上皮接着転写物のCDH1およびCOL7A1は、皮膚由来組織で処置した創傷に存在するが、コントロール創傷には存在しない。CDH1は、上皮細胞の細胞-細胞接着に必要であり、COL7A1は、基底膜の一部として重要な機能を有する。
【０３０９】
創傷床内での表皮の拡大および新真皮島の成長は、創傷が完全に修復されるまでこの種の成長が継続することを示唆する。現在の試験で用いた皮膚由来組織の量は、完全に機能する皮膚を示す超微細構造の特徴の再生を促進した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【国際調査報告】
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