(57)【要約】  試料中の分析物についてアッセイする方法、及びアッセイを実行するためのキット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物についてアッセイする方法であって、
反応混合物を形成すること、及び
トリガー溶液を前記反応混合物に混和することを含み、
前記アッセイされる分析物が前記試料中に存在してもよく、
前記反応混合物は、
第１の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した化学発光標識を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、前記分析物に結合して、分析物と結合した化学発光標識特異的結合複合体を形成することができる、前記化学発光標識特異的結合パートナーと、
第２の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した活性化剤標識を含む活性化剤標識特異的結合パートナーと、
選択的シグナル阻害剤とを含む水溶液であり、
前記トリガー溶液が、結合していない化学発光基質からバックグラウンドシグナルを生成することができ、
分析物の存在下で、トリガー溶液が、前記試料中の分析物の量に関係する検出可能な分析物シグナルを生成することができ、
前記反応混合物が、結合していない化学発光基質を更に含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記トリガー溶液が増強剤を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増強剤が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記トリガー溶液が、酸化剤又は還元剤を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記トリガー溶液が過酸化物を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記選択的シグナル阻害剤が、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、尿酸、１種以上のトコフェロール、及びカテキンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化剤標識がペルオキシダーゼ酵素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された化学発光標識を含み、前記化学発光標識が、式
【化１】
2021531458.tif 000045
［式中、
波線は前記特異的結合パートナーへの、又は前記化合物を前記特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、１〜２０個の炭素原子の、置換アルキル基、非置換アルキル基、置換アルキエニル基、非置換アルケニル基、置換アルキニル基、非置換アルキニル基、置換アラルキル基、及び非置換アラルキル基から独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルシリル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３２−、グリコシル、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３２−、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記化学発光標識特異的結合パートナー及び前記活性化剤標識特異的結合パートナーが、それぞれ前記試料中の前記分析物に結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学発光標識特異的結合パートナーが、前記分析物の類似体に接続された化学発光標識化合物を含み、更に、前記分析物と前記化学発光標識特異的結合パートナーとが競合して、前記活性化剤標識特異的結合パートナーに結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合していない化学発光基質が、ルミノール、イソルミノール、ロフィン、アクリジニウムエステル、例えば、ルシゲニン及びアクリダン、フタルヒドラジド、例えば、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、ルシフェリン、並びに１，２ジオキシエタン含有化合物、例えば、ジオン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ’−ガラクトピラノイルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム、及び１，２−ジオキセタンジオン、アダマンチリデン−アダマンチル−１，２−ジオキセタンからなる群から選択され、具体的にはルミノール又はイソルミノールであり、より具体的にはルミノールである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
分析物シグナル及びバックグラウンドシグナルを検出することを更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
分析物シグナルを検出することが、既知濃度の分析物を有する標準試料である少なくとも１つの試料から、少なくとも１つの標準分析物シグナルを検出することを含み、かつ未知濃度の分析物を有する少なくとも１つの試験試料から、試験分析物シグナルを検出することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
バックグラウンドシグナルを検出することが、既知濃度の分析物を有する標準試料である少なくとも１つの試料から、少なくとも１つの標準バックグラウンドシグナルを検出することを含み、かつ未知濃度の分析物を有する少なくとも１つの試験試料から、試験バックグラウンドシグナルを検出することを更に含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
分析物についてアッセイするためのキットであって、
第１の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した化学発光標識を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、前記分析物に結合して、分析物と結合した化学発光標識特異的結合複合体を形成することができる、前記化学発光標識特異的結合パートナーと、
第２の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した活性化剤標識を含む活性化剤標識特異的結合パートナーと、
選択的シグナル阻害剤とを含み、
トリガー溶液が、結合していない化学発光基質からバックグラウンドシグナルを生成することができ、
分析物の存在下で、前記トリガー溶液が、試料中の分析物の量に相関する検出可能な分析物シグナルを生成することができ、
前記反応混合物が、結合していない化学発光基質を更に含むことを特徴とする、キット。
【請求項１６】
前記トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される増強剤を更に含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記結合していない化学発光基質が、ルミノール、イソルミノール、ロフィン、アクリジニウムエステル、例えば、ルシゲニン及びアクリダン、フタルヒドラジド、例えば、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、ルシフェリン、並びに１，２ジオキシエタン含有化合物、例えば、ジオン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ’−ガラクトピラノイルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム、及び１，２−ジオキセタンジオン、アダマンチリデン−アダマンチル−１，２−ジオキセタンからなる群から選択され、具体的にはルミノール又はイソルミノールであり、より具体的にはルミノールである、請求項１４又は１５に記載のキット。
【請求項１８】
試料中の分析物についての溶液相アッセイ方法であって、
ｃ）以下の成分：
前記試料、
第１の特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された化学発光標識化合物を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、前記化学発光標識化合物が、式
【化２】
2021531458.tif 000046
［式中、
波線は前記特異的結合パートナーへの、又は前記化合物を前記特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、１〜２０個の炭素原子の、置換アルキル基、非置換アルキル基、置換アルキエニル基、非置換アルケニル基、置換アルキニル基、非置換アルキニル基、置換アラルキル基、及び非置換アラルキル基から独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルシリル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３２−、グリコシル、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３２−、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
の化合物である、前記化学発光標識特異的結合パートナー、
ペルオキシダーゼ活性を有し、第２の特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された、活性化剤標識化合物を含む活性化剤標識特異的結合パートナー、及び
Ｌ−アスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマナン−２−カルボン酸、２−アミノフェノール、３−アミネオ−Ｌ−チロシン、４−クロロカテコール、フェノキサジン、２−ブロモベンゼン−１，４−ジオール、５，６−イソプロピリデンアスコルビン酸、及びアスコルビン酸６−パルミテートからなる群から選択される選択的シグナル阻害剤
を含む水性反応混合物を、前記成分を任意の順序で又は同時に水溶液に加えることによって、形成することであって、
前記成分のすべてが前記水溶液に可溶であり、前記成分のいずれも固体支持体に固定されておらず、
前記化学発光標識特異的結合パートナーと前記活性化剤標識特異的結合パートナーとが、前記試料中に存在する前記分析物に結合して、前記水溶液中に結合複合体を形成する、ことと、
ｄ）前記水性反応混合物に、過酸化化合物を含むトリガー溶液を加えることであって、前記トリガー溶液が、前記選択的シグナル阻害剤の存在下で、前記水性反応混合物中の分析物と結合した化学発光標識特異的結合パートナー及び分析物と結合した活性化剤標識特異的結合パートナーの量と相関する、検出可能な化学発光シグナルを放出し、前記選択的シグナル阻害剤が、前記化学発光標識化合物と前記活性化剤標識化合物との間の反応によって生成するシグナルの割合を、このような複合体ではない場合の、前記化学発光標識化合物と前記活性化剤標識化合物との間の反応からのシグナルを超えさせる、こととを含み、
前記反応混合物が、前記試料中の前記分析物の濃度と相関しない検出可能なバックグラウンドシグナルを生成する、結合していない化学発光基質を更に含むこと
を特徴とする、溶液相アッセイ方法。
【請求項１９】
試料中の分析物を検出するためのキットであって、
前記分析物への第１の特異的結合パートナーと、
前記第１の特異的結合パートナーにコンジュゲートした化学発光化合物と、
前記分析物への第２の特異的結合パートナーと、
前記第２の特異的結合パートナーにコンジュゲートした活性化剤化合物と、
選択的シグナル阻害剤と、
トリガー溶液とを含み、
前記キットのこれらの成分のすべてが、水溶液に可溶であり、
前記化学発光化合物が、式
【化３】
2021531458.tif 000047
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルからなる群から選択され、Ｒ１及びＲ２が置換されている場合、Ｒ１及びＲ２は最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される、１〜３個の基によって置換されており、
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルからなる群から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミン、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、又はスルホネートであり、近接するＲ４〜Ｒ１１部分の対は、共有結合して５〜７員の炭素環又は複素環式環を形成することができる］
を有するアクリダンケテンジチオアセタール化合物であり、
前記選択的シグナル阻害剤が、グルタチオン、アスコルビン酸、具体的にはＬ−アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩、具体的にはＬ−アスコルビン酸の塩、尿酸、Ｌ−アスコルビン酸−６−パルミテート、トコフェロール、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−イソアスコルビン酸、Ｌ−イソアスコルビン酸、又は両方を含めたイソアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、ジエチルヒドロキシルアミン、ＢＨＴ、
【化４】
2021531458.tif 000048
【化５】
2021531458.tif 000049
及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、キット。
【請求項２０】
前記化学発光標識化合物が、式
【化６】
2021531458.tif 000050
［式中、
波線は前記特異的結合パートナーへの、又は前記化合物を前記特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、１〜２０個の炭素原子の、置換アルキル基、非置換アルキル基、置換アルキエニル基、非置換アルケニル基、置換アルキニル基、非置換アルキニル基、置換アラルキル基、及び非置換アラルキル基から独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルシリル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３２−、グリコシル、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３２−、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
の化合物である、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
溶液相発光アッセイは、例えば国際公開第２０１００９９４８６号において公知である。公知のアッセイは、特異的認識、及び特異的結合パートナーと互いに結合することに基づき、物質の存在又は量を検出する。例えば、イムノアッセイにおいて、抗体は、特異的結合パートナーに結合する。別の例として、核酸結合アッセイにおいては、アプタマーなどの核酸ストランドが、特異的結合パートナーに結合する。いくつかのアッセイは、化学発光を使用してシグナルを生成し、そのシグナルを分析物の量に関連付ける。
【発明の概要】
【０００２】
試料中の分析物についてアッセイする方法は、反応混合物を形成すること、及びトリガー溶液を反応混合物に混和することを含むことができる。アッセイされる分析物は、試料中に存在し得るが、アッセイは、分析物が存在しないことも明らかにし得る。反応混合物は、第１の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した化学発光標識を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、分析物に結合して、分析物と結合した化学発光標識特異的結合複合体を形成することができる、化学発光標識特異的結合パートナーと、第２の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した活性化剤標識を含む活性化剤標識特異的結合パートナーと、選択的シグナル阻害剤とを含む水溶液である。
【０００３】
反応混合物は、結合していない化学発光基質を更に含む。
【０００４】
トリガー溶液は、結合していない化学発光基質からバックグラウンドシグナルを生成することができ、分析物の存在下では、トリガー溶液は、試料中の分析物の量と相関する検出可能な分析物シグナルを生成することができる。
【０００５】
キットは、前述のアッセイを実施するために必要な、試料以外の成分を含むことができる。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本開示を通じて、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの単数形は、しばしば便宜上使用されるが、単数のみであることが明示的に指定されている場合又は文脈によって明確に示されている場合を除いて、単数形は複数を含むよう意図される。単数のみに言及する場合、典型的には「１つ、かつ１つのみ」という用語が使用される。
【０００７】
「通常の」、「通常」、「典型的には」、「通例の」、及び「通例」などの用語は、本明細書に記載する発明を作製又は実施する通常の、典型的な、又は通例の方法である特徴を指すために使用される。これらの用語は、そのような特徴が先行技術に存在すること、ましてや、先行技術において通常の、典型的な、又は通例のものであることを意味するものと解釈されるべきではない。
【０００８】
本開示におけるいくつかの用語が、以下に定義される。他の用語は、当業者によく知られており、それらの用語には当業者がそれらに割り当ててきた意味を与えるものとする。
【０００９】
分析物：アッセイにおいて検出又は定量される物質。分析物の検出を推進するために、分析物への特異的結合親和性を有する１種以上の物質、具体的には１種以上の特異的結合パートナーが、アッセイにおいて典型的に使用される。分析物は、特異的結合パートナーが結合することができる、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、抗体、ハプテン、又は小分子（すなわち、非ポリマー性分子）などであってもよい。例示的な分析物としては、ステロイド、ホルモン、タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、核タンパク質、リンタンパク質、オピオッド（opiods）、ビタミン、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、プリン、抗新生物剤、アンフェタミン、アゼピン、プロステグランジン（prosteglandins）などの薬物、並びに薬物の代謝物だけでなく、ヌクレオシド、有機ヌクレオシド、ヌクレオチド、有機ヌクレオチド、リボシド、ＤＮＡ、ＤＮＡセグメント、ＲＮＡ、ＲＮＡセグメント、ＰＤＮＡ、ＰＤＮＡセグメント、アプタマー、ヘモトキシン、フォトトキシン、神経毒素、シアノトキシン、ジノトキシン（dinotoxins）、ネクロトキシン、ミオトキシン、マイコトキシン、例えばＴ−２マイコトキシン、アフラトキシン、ボツリヌス毒素、リシン、アピトキシン、及び他の環境毒素又は生物毒素などの毒素が挙げられる。分析物は、細胞、ウイルス、細菌、又は真菌であってもよい。
【００１０】
活性化剤：トリガーの存在下で、化学発光化合物が発光するように、化学発光化合物の活性化を行う化合物。
【００１１】
活性化剤標識特異的結合パートナー：分析物への特異的結合部材と、特異的結合パートナーに直接又は間接的に（例えば、リンカーを介して）結合した活性化剤とを含む反応物質。
【００１２】
化学発光化合物：例えば、電子が励起された状態で形成される別の化合物に変換されることによって、又は電子が励起された状態に変換され、次いで、基底状態に緩和されることによって、光の放出を生じる反応を起こす化合物。励起状態は、一重項励起状態であっても、三重項励起状態であってもよい。励起状態は、基底状態への緩和の際に直接光を放出する場合もあり、又は、フェルスター機構若しくはデクスター機構などによって、まずエネルギーがエネルギー受容体に移動し、次にこれが光を放出する場合もある。
【００１３】
化学発光標識特異的結合パートナー：分析物への特異的結合部材と、特異的結合パートナーに直接又は間接的に（例えば、リンカーを介して）結合した化学発光化合物とを含む反応物質。
【００１４】
分析物シグナル：試料中に存在する分析物の量に関係する、アッセイからの化学発光出力などのシグナル。
【００１５】
バックグラウンドシグナル：試料中に存在する分析物の量に関係しない、化学発光出力などのシグナル。
【００１６】
不可逆結合：本明細書に記載するアッセイを実行している間に破壊されない、２つの部分を、典型的には、特異的結合パートナーと化学発光標識とを、又は特異的結合パートナーと活性化剤標識とを関連付ける結合。不可逆結合は、本明細書に記載するアッセイ中に不可逆結合が曝露されない、化学化合物の使用、又は温度などの物理的条件下のような、いくつかの他の手段によって破壊され得る。不可逆結合であり得る典型的な結合としては、共有結合、及びイオン結合などが挙げられる。不可逆結合によって接続される２つの部分は、「不可逆的に結合している」と言われる。不可逆結合は、特異的結合パートナー同士の、又は分析物の特異的結合パートナーへの可逆結合などの、可逆結合の相互作用とは区別される。
【００１７】
先行技術の化学発光に基づくアッセイ、結合アッセイ、例えば、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に記載されているイムノアッセイ、及び他のアッセイ、例えば、アプタマー結合に基づくアッセイ等は、未知濃度の分析物を有する試験試料の化学発光シグナルを、既知濃度の分析物を有する複数の試料を使用することによって作成した標準曲線と比較する。
【００１８】
特異的化学発光アッセイにおいては、例えば米国特許公開第２０１００２６７０７１号に記載されているように、未知濃度の分析物を含有する試験試料を、化学発光標識特異的結合パートナーと、活性化剤標識特異的結合パートナーと、選択的シグナル阻害剤とを含有するアッセイ溶液と混和させて、反応混合物を形成する。次いで、トリガー溶液を反応混合物と混和させる。トリガー溶液は、酸化剤又は還元剤、典型的には過酸化物と、多くの場合、増強剤とを含有する。
【００１９】
アッセイは、２つの方式のうちの１つで進む。「競合アッセイ」方式では、活性化剤標識特異的結合パートナーは、複合体において化学発光標識特異的結合パートナーに結合するが、複合体は、予め形成されてもよく、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成されてもよい。分析物が存在する場合、分析物と化学発光標識特異的結合パートナーとは、競合して分析物に結合する。トリガー溶液の存在下では、活性化剤標識特異的結合パートナーに結合している化学発光標識特異的結合パートナー上の化学発光標識は、活性化剤標識特異的結合パートナーに対して、機能可能な近接度にあり、そのため、これによって活性化されて、発光を生じる。分析物に結合している化学発光標識特異的結合パートナーは、活性化剤標識特異的結合パートナーに対して、機能可能な近接度にはなく、そのため、化学発光標識は活性化されず、発光しない。この方式では、分析物シグナルは発光強度であり、分析物濃度に逆相関する。
【００２０】
別の方法は、「サンドイッチアッセイ」方式であり、活性化剤標識特異的結合パートナーと化学発光標識特異的結合パートナーとの両方が、典型的には分析物の異なる一部において、分析物と結合して、化学発光標識が、活性化剤標識結合パートナーと機能可能な近接度に至る。得られる「サンドイッチ」複合体における、化学発光標識特異的結合パートナーの化学発光標識は、活性化剤標識特異的結合パートナーに対して、機能可能な近接度にあり、そのため、発光する。分析物の非存在下では、活性化剤標識結合パートナーは、活性化剤標識特異的結合パートナーに対して、機能可能な近接度にはなく、そのため、発光しない。この方式では、分析物シグナルは発光強度であり、分析物濃度に直接的に関係する。
【００２１】
いずれの場合においても、試験試料中の分析物シグナルの強度を、ルミノメータにおいて測定し、既知濃度の分析物を有する標準試料によって、同じアッセイを実行することによって構築された、発光強度対濃度の標準曲線と比較する。分析物シグナルを標準曲線に相関させると、分析物の濃度が提供される。
【００２２】
これは、分析される試料が分析物と水のみを含有する場合に許容可能であり得るが、ほとんどの化学発光の商業用途では、分析物以外の他の物質も含有するであろう。例えば、食品物質からの試験試料を、毒素の存在についてアッセイする場合、多くの化学化合物が（そのような残りの化合物は食品物質からのものであるが）、一般に、毒素に加えて存在するであろう。これらの他の化合物は、典型的には、化学発光種を生成する酸化反応又は還元反応に干渉することによって、分析物シグナルの生成に干渉し得る。この場合、これらの他の干渉化合物を含有しない溶液から標準曲線が作成されるため、分析物シグナルと標準曲線との相関は、試験試料中の分析物の正確な濃度を提供しないことになる。このことは、分析物シグナルを標準曲線と比較することが、試験試料中の分析物の濃度を正確に提供しないという相関誤差をもたらす。例えば、使用することができる１つの選択的シグナル阻害剤はアスコルビン酸であるが、アスコルビン酸は、天然に、又は添加された抗酸化剤としてのいずれかで、多くの食品物質にも見出される。有意な量のアスコルビン酸が試験試料中に存在する場合、試験試料からの分析物シグナルの生成を更に阻害する場合があり、分析物シグナルと標準曲線とを相関させることによって得る濃度が、低過ぎるものとなり得る。これは、実際には、食品が安全でないレベルの汚染物質を有する場合に、アッセイが、食品は安全なレベルの汚染物質を有するという正しくない示唆をし得るため、特に有害な食品汚染物質についてアッセイしている場合に、重大な問題となり得る。
【００２３】
より一般的には、アッセイしている試料中の他の化合物の干渉から生じ得る分析物濃度の誤差は、重大となることがあり、いくつかの場合、４０％もの大きさ、又は更に大きいこともある。食品試料を毒素について分析する例では、いくつかの毒素は、５ｐｐｂという低さ、又は更に低いレベルで、動物が消費するには安全ではない。したがって、これらの誤差は、一方では、実際には消費するのに安全な食品試料を廃棄すること、又は他方で、実際には消費した動物に病気若しくは死をもたらし得る、安全でないレベルで毒素が存在する場合に、毒素が安全なレベルで存在するという誤った確信を提供することとの間の相違を意味し得る。
【００２４】
この問題に対する先行技術の解決策は、許容可能なものではない。数千、数万、又は更に多くの、識別情報が未知である各種化合物が試験試料中に存在し得る場合、結合による干渉を防止するために、試験試料から分析物以外の化合物を除去して商業的状況を達成することは、不可能ではないとしても、極めて困難かつ非実用的である。別の許容可能でない先行技術の解決策は、分析物以外の化合物の干渉を無視できるほどに、試験試料を著しく希釈することである。この解決策は、分析物濃度も希釈され、そのため、分析物の最低検出レベル（「ＬＬＤ」）及び最低定量レベル（ＬＬＱ）が低減するため、許容可能ではない。上に示したように、多くの関係する分析物の濃度は、ｐｐｂレベルで決定する必要があるため、ＬＬＱ及びＬＬＤが低減することにより、試験試料の大幅な希釈を伴う解決策は許容可能ではない。
【００２５】
許容可能な解決策は、前述の欠点を回避するだけでなく、すなわち、商業的状況における使用が実用的であり、かつ試験試料の著しい希釈を必要としないだけでなく、多様な結合剤を用いて実行可能であるべきであり、これは、この技術が、結合パートナー（例えば、抗体、アプタマー等）の性質に依存せず、多様な異なる種類の結合アッセイに適用できることを意味する。
【００２６】
本開示は、このような技術的解決策を提供する。簡潔に述べると、以降により詳細に記載する技術的解決策は、バックグラウンド剤として化学発光基質を使用することを伴う。バックグラウンド剤は、（化学発光標識からの分析物シグナルを生じる同じ一連の酸化又は還元反応によって）トリガー溶液の存在下で発光バックグラウンドシグナルを提供するが、分析物が化学発光標識特異的結合パートナーに結合することとは独立している。すなわち、バックグラウンドシグナルを生成するために、バックグラウンド剤は、結合パートナーのいずれにも結合する必要はない。バックグラウンド剤は、標準曲線を構築するために使用する複数の標準中に、同一の既知の量で存在する。バックグラウンド剤は、化学発光標識結合パートナーとともに、アッセイ溶液中にも同じ濃度で存在する。したがって、分析物シグナル及びバックグラウンドシグナルを生じる酸化又は還元反応に化合物が干渉しない状況では（例えば、分析物が試験試料中に溶解している唯一の化合物である）、試験試料におけるバックグラウンドシグナルは、標準試料におけるバックグラウンドシグナルと同一であることになる。しかしながら、干渉化合物が存在する場合、試験試料からのバックグラウンドシグナルは、標準試料からのバックグラウンドシグナルとは異なることになる。標準試料からのバックグラウンドシグナルと試験試料からのバックグラウンドシグナルとの割合をとると、倍率変更係数が提供される。観測された分析物シグナルに倍率変更係数を乗じることによって、干渉化合物の存在について補正された「補正分析物シグナル」が提供される。観測された分析物シグナルではなく、補正された分析物シグナルを標準曲線に相関させることによって、試験試料中の分析物の濃度の正確な指標が提供される。
【００２７】
特異的結合パートナー
２種の標識特異的結合パートナーを用いる。一方は活性化剤標識され、他方は化学発光標識されている。特異的結合パートナーのそれぞれは、別の物質について特異的親和性を有する分子であり、通例は生物学的分子である。例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アプタマー、抗原、抗体、抗体−ＤＮＡキメラ、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンが挙げられる。
【００２８】
それぞれの特異的結合パートナーは、一般に、２種の特異的結合パートナーが、分析物上の同じ又は重複する結合部分について競合しないという点で、他方のパートナーと同一ではない。活性化剤標識特異的結合パートナーと化学発光標識特異的結合パートナーとの両方の特異的結合パートナー部が抗体である、典型的な場合では、抗体のそれぞれは、相異なる、分析物に関して競合しないエピトープを有する。
【００２９】
組み合わせて使用され得る、すなわち、一方が化学発光標識を有することができ、他方が活性化剤標識を有することができる、特異的結合パートナー同士の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びアプタマーなどの相補的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチン、ホルモン−受容体、レクチン−炭水化物、ＩＧタンパク質Ａ−結合タンパク質受容体、核酸−核酸結合タンパク質、アプタマー−アプタマー、並びに核酸−抗核酸抗体が挙げられる。米国特許公開第２０１００２６７０７１号において論じられている特異的結合パートナーが、好適である。
【００３０】
これらのうちの任意のものを、競合アッセイ方式又はサンドイッチアッセイ方式に適合させることができる。特異的結合パートナーの識別情報によって、アッセイの方式が、具体的には、アッセイがサンドイッチアッセイであるか、又は競合アッセイであるかが決定される。いずれの場合においても、化学発光標識特異的結合パートナーに使用される特異的結合パートナーは、分析物に特異的に結合するように選択される。最も通常には抗体が使用されるが、上に論じた特異的結合パートナーのうちのいずれを用いることもできる。競合アッセイ方式に適合させるためには、活性化剤標識特異的結合パートナーは、活性化剤−分析物類似体コンジュゲートとして設計される。この場合、活性化剤は、直接、又は本明細書において論じる補助物質を含むリンカーを経由して、分析物の類似体にコンジュゲートし、類似体は、分析物そのものであっても、分析物に対して十分な構造的類似性を有する化合物であってもよく、類似体は分析物と本質的に同じ方法で、化学発光標識特異的結合パートナーにも結合する。
【００３１】
サンドイッチアッセイ方式に適合させるためには、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの両方が、分析物に特異的に結合する。この場合、活性化剤標識特異的結合パートナーに使用される特異的結合パートナーは、典型的には抗体であるが、アプタマー又は上に論じた特異的結合パートナーのいずれかであってもよい。この場合、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの両方が、分析物に、典型的には分析物上の異なる結合部分に結合する。
【００３２】
競合アッセイとサンドイッチアッセイとの両方が当技術分野において公知であり、これらの適合を実現する方法は公知である。アッセイの方式及び特異的結合パートナーに関する実施例及び追加の詳細は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に見出すことができる。
【００３３】
化学発光標識特異的結合パートナー
化学発光標識特異的結合パートナーは、典型的には、１０−４Ｍ未満、具体的には１０−６Ｍ未満、最も具体的には１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの濃度で、反応混合物中に存在する。
【００３４】
化学発光標識特異的結合パートナーは、通例では不可逆結合によって、化学発光標識で標識された特異的結合パートナーを含む。典型的には、特異的結合パートナーの各分子は、各分子に不可逆的に結合した少なくとも１つの化学発光標識を有する。いくつかの場合では、各特異的結合パートナーに結合した１０２個もの、又は更に多くの化学発光標識が存在し得る。各特異的結合パートナー分子が、同じ数の化学発光標識を有する必要はない。
【００３５】
１つ以上の化学発光標識は、典型的には不可逆結合によって、特異的結合パートナーに結合することができる、任意の好適な化学発光部分であり得る。結合、典型的には不可逆結合は、直接的な接続であってもよく、間接的な接続であってもよい。直接的な接続では、１つ以上の化学発光標識と特異的結合パートナーとの間に、リンカー又は補助物質を使用することなく、１つ以上の化学発光標識が、特異的結合パートナーに直接接続される。直接的な接続は、典型的には、イオン結合、共有結合、疎水性相互作用、又は水素結合などの不可逆結合によるものであり、最も多くの場合、共有結合である。
【００３６】
間接的な接続が用いられる場合、当技術分野において補助物質と呼ばれることもあるリンカーが使用され、１つ以上の化学発光標識と特異的結合パートナーとを接続する。任意の好適なリンカーを使用することができ、好適なリンカーは、１つ以上の化学発光標識が発光することを妨げず、典型的には、化学発光標識特異的結合パートナーを、水性媒体に不溶性にしない。例示的なリンカーとしては、ストレプトアビジン、アビジン、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎのようなタンパク質、ビオチン、カチオン化ＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、キーホールヘモシアニン、免疫グロブリン（断片又はその一部を含む）、リポソーム、ミセル、ＡＭＡＭのような合成デンドリマー、ポリアクリル酸のような合成ポリマー、多糖類のような天然ポリマー、例えば、官能化デキストラン、ポリヌクレオチド、アプタマー、及びオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。多糖類、具体的にはアミノ−デキストラン又はカルボキシル−デキストラン、及び自己集合タンパク質が最も通常に用いられる。
【００３７】
化学発光標識は、一般式ＣＬ−Ｌ−ＲＧの化合物［式中、ＣＬは化学発光部分を表し、Ｌはリンカー又は共有結合を表し、ＲＧは、特異的結合パートナーと反応性基を表す］を、特異的結合パートナーと反応させることによって形成される。反応が完了すると、化学発光部分は、化学発光標識特異的結合パートナー上の化学発光標識となる。化学発光標識は、トリガー溶液中の酸化剤若しくは還元剤と、又は活性化剤標識特異的結合パートナーの活性化剤標識と反応して、典型的には化学発光標識の励起状態である、活性化した化学発光化合物を形成する。励起状態は、一重項励起状態、又は三重項励起状態のいずれであってもよい。励起状態は、発光によって緩和するか、又は放出性エネルギー受容体へのエネルギー移動を受け、次にこれが発光するかのいずれであってもよい。詳細な実施形態では、発光は、トリガー溶液を加えた後、非常に急速に起こり、より具体的には、トリガー溶液を加えて２秒以内にピーク強度に達する。しかしながらこのことは必須ではなく、その理由は、十分な時間にわたって分析物シグナルが測定される限り、より遅い反応も正確な結果を与えることができるためである。
【００３８】
抗体又は抗体断片などの特異的結合パートナーへの結合に好適な多種多様な化学発光化合物が、当技術分野において公知である。これらのいずれかを、本明細書に記載するアッセイに用いることができる。
【００３９】
例示的な化学発光部分及び化学発光標識としては、芳香環式ジアシルヒドラジン、例えば、ルミノール、イソルミノール、アミノブチルエチルイソルミノール、アミノヘキシルエチルイソルミノール、７−ジメチルアミノナフタレン−１，２−ジカルボン（dicarboxcylic）酸ヒドラジン、環置換アミノフタルヒドラジド、アントラセン−２，３−ジカルボン酸ヒドラジド、フェナントレセン（phenanthrecene）−１，２−ジカルボン酸ヒドラジド、ピレンジカルボン酸ヒドラジド、５−ヒドロキシフタルヒドラジド、６−ヒドロキシフタルヒドラジド、キサンテン染料、例えば、フルオレセイン、エオシン、ローダミン染料、ロドール（rhodol）染料、化学発光芳香族アミン又は複素環式アミン、ＭＣＬＡ、インドール酢酸、イソブチルアルデヒド、トリヒドロキシ芳香族化合物、例えば、ピロガロール、フロログルシノール、及びプルプロガリン、並びに米国特許第５４２０２７５号及び同第５３２４８３５号に開示されているフタラジンジオン化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。これらの標識のいずれも、放出性エネルギー受容体とともに、又は伴わずのいずれかで使用され得るが、イソブチルアルデヒドは、最も多くの場合、発光エネルギー受容体とともに使用される。
【００４０】
いくつかの化学発光標識は、式Ｉの標識であり得る。
【化１】
2021531458.tif 000002
【００４１】
式Ｉの標識において、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、又はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、及びハロゲンから選択される１〜５０個の原子を含有する有機部分であり、非水素原子の原子価を満たすのに十分な水素原子が加わる。最も通常には、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立して、特異的結合パートナーへのリンカー、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルである。Ｒ１及びＲ２が置換されている場合、最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される１〜３個の基によって置換されている。
【００４２】
式Ｉの標識において、Ｒ３は、Ｈ、又はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、及びハロゲンから選択される、１〜５０個の原子を、最も通常には１〜２０個の原子を含有する有機部分であり、非水素原子の原子価を満たすのに十分な水素原子が加わる。最も通常には、Ｒ３は、特異的結合パートナーへのリンカー、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルである。そのような場合、Ｒ３は、最も多くの場合、１〜２０個の炭素原子を有する。多くの場合、Ｒ３は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル、フェニル、ベンジル、置換ベンジル、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、又はアルキルスルホン酸である。Ｒ３がアルキル、置換アルキル、アルケニル、又は置換アルケニルである場合は特にであるが、他の場合にも、Ｒ３がＲ７又はＲ８に共有結合して、環を、典型的には５又は６員環を形成することができる。上術の部分のうちの１つ以上が置換されている場合、最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される１〜３個の基によって置換されている。
【００４３】
標識式Ｉにおいて、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは、独立して、Ｈ、又はＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｓｉ、及びハロゲンから選択される１〜５０個の原子を含有する有機部分であり、非水素原子の原子価を満たすのに十分な水素原子が加わる。最も通常には、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、独立して、特異的結合パートナーへのリンカー、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミン、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、又はスルホネートである。Ｒ４及びＲ５、Ｒ８及びＲ９等のような近接するＲ４〜Ｒ１１部分の対は、共有結合して環を形成することができる。この場合、環は典型的には５〜７員環であり、最も典型的には５員環又は６員環である。環は、炭素環式又は複素環式であってもよく、後者の場合、Ｎ、Ｏ、又はＳなどの複素原子を含有することができ、非置換であってもよく、１個以上の炭素原子上又は１個以上の複素原子上のいずれかで置換されていなくてもよく、又は置換されていてもよい。上術の部分のうちの１つ以上が置換される場合、最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される１〜３個の基によって置換されている。
【００４４】
最も通常には、式Ｉにおいて、Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれはＨである。
【００４５】
最も通常には、用いられる式Ｉの標識は、式ＩＩの標識であり、
【化２】
2021531458.tif 000003
式中、波線は、特異的結合パートナーへの付着箇所を示す。このような場合、Ｒ３は、典型的には、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルである。このような場合、Ｒ３は、最も多くの場合、１〜２０個の炭素原子を、具体的には、１〜４個の炭素原子を有するアルキル、フェニル、ベンジル、置換ベンジル、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、又はアルキルスルホン酸を有する。上述の部分のうちの１つ以上が置換されている場合、最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される１〜３個の基によって置換される。
【００４６】
式ＩＩの特定の標識において、波線は特異的結合パートナーへの、又は化合物を特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択され、Ｒ３は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される。
【００４７】
式ＩＩの標識は、特異的結合パートナーと式ＩＩＩの化合物との反応によって、特異的結合パートナーに結合される。
【化３】
2021531458.tif 000004
［式中、Ｌ及びＲＧは、上記のとおりである。］
【００４８】
用いることができる式ＩＩＩの化合物の例は、米国特許第２０１００２６７０７１号の表８に提供されている。一般に式Ｉの化合物、及び具体的には式ＩＩＩの化合物は、米国特許出願公開第２００７０１７２８７８号に開示されている方法によって、調製することができる。例えば、市販のアクリダン又はＮ−置換アクリダンを強塩基で、続いて二硫化炭素で処理して、アクリダンジチオカルボキシレートを形成し、次に、従来のエステル化方法によって、エステル化又は部分エステル化して、置換基Ｒ１を導入することができる。Ｒ２は、残りのチオールを、ブチルリチウム又は水素化ナトリウムなどの強塩基によって脱プロトン化し、次いで、適当な求電子体によって処理して、Ｒ２を付着させることによって、加えることができる。置換基Ｒ１及びＲ２は、式ＩＩＩの所望の化合物を達成するために、その上の官能基を操作する更なる反応を受けてもよい。
【００４９】
化学発光標識はまた、芳香族環式ジアルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンエノール、及び式
【化４】
2021531458.tif 000005
［式中、
Ｒ１は、１〜２０個の炭素のアルイル（alyl）基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、及びアラルキル基、又はカルボニル、トリアルキルシリルから独立して選択される１〜３個の基部分で置換された、これらのもののいずれかから選択され、ＳＯ３−、−ＯＳＯ３、グリコシル、ＰＯ３−、−ＯＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、又は第四級ホスホニウムであり、Ｘは、１〜２０個の炭素原子を有するＣ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル、アルキル又はアルキルカルボニルから選択され、トリアルキルシリル、ＳＯ３−、グリコシル、及びＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ’’）［式中、Ｒ’及びＲ’’は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、シアノアリール、シアノアラルキル、トリアルキルシリル、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムカチオン、及びトリアニルホスホニウムカチオンから独立して選択される］から選択され、Ｚ１及びＺ２は独立してＯ及びＳ原子から選択され、Ｒ２及びＲ３は独立してＨ及びＣ１〜Ｃ８アルキルから選択される］を有する化合物から選択することもできる。
【００５０】
いっそう更なる化学発光標識は、米国特許第５４９７０７２、同第５２３２１２号、同第５５９３８４５号、同第５９２２５８８号、同第６０１３０８０３号、同第６６９６５６９号、同第６８９１０５７号、及び同第２０１００２６７０７１号に開示されている。これらのいずれか、又は他の化学発光標識を用いることができる。特に好適な化学発光標識及び化学発光標識特異的結合パートナーとしては、米国特許第２０１００２６７０７１号に開示されているものが挙げられる。
【００５１】
活性化剤標識特異的結合パートナー
活性化剤標識特異的結合パートナーは、典型的には、１０−４Ｍ未満、具体的には１０−６Ｍ未満、最も具体的には１０−１１Ｍ〜１０−７Ｍの濃度で、反応混合物中に存在する。
【００５２】
活性化剤標識特異的結合パートナーは、特異的結合パートナーに結合している、典型的には不可逆的に結合している、活性化剤標識を含む。任意の好適な活性化剤標識を使用することができる。化合物は、２つの要件を満たす場合、活性化剤標識であることに好適であり得る。第１に、酸化剤若しくは還元剤から、又はこれらに電子を、いくつかの稀な場合には複数の電子を、受容又は供与することができ、ラジカル、イオン−ラジカル、又は通常でない場合ではイオンを形成できることであり得る。このようなラジカル、イオン−ラジカル、又はイオンは、活性化された活性化剤標識と呼ばれることもあり、活性化された活性化剤標識の形成は、活性化剤標識を活性化すると呼ばれることがある。第２に、活性化した活性化剤標識が形成されると、化学発光標識特異的結合パートナー上の化学発光標識を、及び適用可能な場合、結合していない化学発光基質を活性化することができ、化学発光標識を、及び適用可能な場合、結合していない化学発光基質を発光させるであろう。
【００５３】
典型的な活性化剤標識は、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様活性を有する化合物である。例としては、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、真菌ペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、Ｍｎ依存性ペルオキシダーゼ、ダイズペルオキシダーゼ、及びＭｎ−ＴＰＰＳ４のような、酵素ではないが、ペルオキシダーゼ様活性を有する、ペルオキシダーゼ模倣化合物が挙げられる。
【００５４】
活性化剤標識特異的結合パートナーとしては、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様活性を有する化合物と生物学的分子とのコンジュゲート又は複合体を挙げることができる。このような場合、用いることができる典型的な生物学的分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、抗体、抗体断片、抗体ＤＮＡキメラ、抗原、ハプテン、タンパク質、ペプチド、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンが挙げられる。
【００５５】
１つ以上の活性化剤標識は、典型的には不可逆結合によって、特異的結合パートナーに結合する。結合、典型的には不可逆結合は、直接的な接続であってもよく、間接的な接続であってもよい。直接的な接続では、１つ以上の化学発光標識と特異的結合パートナーとの間に、リンカー又は補助物質を使用することなく、１つ以上の化学発光標識が、特異的結合パートナーに直接接続される。直接的な接続は、典型的には、イオン結合、共有結合、疎水性相互作用、又は水素結合などの不可逆結合によるものであり、最も多くの場合、共有結合である。
【００５６】
間接的な接続が用いられる場合、当技術分野において補助物質と呼ばれることもあるリンカーが使用され、１つ以上の化学発光標識と特異的結合パートナーとを接続する。任意の好適なリンカーを使用することができ、好適なリンカーは、１つ以上の化学発光標識が発光することを妨げず、典型的には、化学発光標識特異的結合パートナーを、水性媒体に不溶性にしない。例示的なリンカーとしては、ストレプトアビジン、アビジン、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎのようなタンパク質、ビオチン、カチオン化ＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、キーホールヘモシアニン、免疫グロブリン（断片又はその一部を含む）、リポソーム、ミセル、ＡＭＡＭのような合成デンドリマー、ポリアクリル酸のような合成ポリマー、多糖類のような天然ポリマー、例えば、官能化デキストラン、ポリヌクレオチド、アプタマー、及びオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。多糖類、具体的にはアミノ−デキストラン又はカルボキシル−デキストラン、及び自己集合タンパク質が最も通常に用いられる。
【００５７】
好適な活性化剤標識特異的結合パートナーとしては、米国特許出願公開第２０１００２６７０７１号に開示されているものが挙げられる。
【００５８】
選択的シグナル阻害剤
選択的シグナル阻害剤は、反応混合物中に存在するが本明細書に記載するアッセイに関与しない、過剰な化学発光標識特異的結合パートナーによって生じるノイズシグナルを低減する。その機能は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に、より詳細に記載されている。
【００５９】
典型的には、１種以上の選択的シグナル阻害剤が、反応混合物中に、１０−６Ｍ〜１０−１Ｍ、最も多くの場合１０−５Ｍ〜１０−４Ｍの濃度で存在する。詳細な濃度としては、５×１０−６Ｍ〜５×１０−４Ｍ、より具体的には５×１０−５Ｍ〜５×１０−４Ｍが挙げられる。
【００６０】
選択的シグナル阻害剤としての使用に好適な化合物としては、抗酸化剤、具体的には犠牲型抗酸化剤、及び活性化剤標識選択的結合パートナー上の活性化剤標識と相互作用する酸化剤又は還元剤によって形成される、ラジカル、イオン−ラジカル、若しくはいくつかの場合ではイオンと、又はいくつかの場合では酸化剤若しくは還元剤と反応することができる、他の分子が挙げられる。この開示の目的については、選択的シグナル阻害剤の様々な選択肢が同じ方法で機能するため、任意の抗酸化剤を用いることができる。具体的には、通例では過酸化物である、酸化剤若しくは還元剤と反応して、又は活性化剤標識特異的結合パートナー上の活性化した活性化剤標識と反応して、過酸化物ラジカル又は活性化した活性化剤標識をクエンチする。
【００６１】
選択的シグナル阻害剤として用いることができるいくつかの具体的な抗酸化剤は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号に記載されている。例としては、グルタチオン、アスコルビン酸、具体的にはＬ−アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩、具体的にはＬ−アスコルビン酸の塩、尿酸、Ｌ−アスコルビン酸−６−パルミテート、トコフェロール、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン（acobic）酸、Ｄ−イソアスコルビン酸、Ｌ−イソアスコルビン（isoasocrbic）酸、又は両方を含めたイソアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、ジエチルヒドロキシルアミン、ＢＨＴ、
【化５】
2021531458.tif 000006
【化６】
2021531458.tif 000007
及びこれらの組み合わせが挙げられる。最も通常には、トコフェロール又はアスコルビン酸、具体的にはアスコルビン酸が使用される。
【００６２】
使用の際、１種以上の選択的シグナル阻害剤を、任意の好適な方法で提供することができる。例えば、選択的シグナル阻害剤をトリガー溶液の成分として提供することができ、この場合、トリガー溶液を加えた時点で、反応混合物が形成される。選択的シグナル阻害剤はまた、化学発光標識特異的結合パートナー若しくは活性化剤標識特異的結合パートナーの一方若しくは両方とともに提供することもでき、又は固体として、若しくは適当な濃度の溶液として、単独で加えることもできる。最も通常には、１種以上の選択的シグナル阻害剤は、反応混合物に、具体的にはトリガー溶液の添加後に、提供される濃度よりも１０倍高い濃度で、又はいくつかの場合では、１０倍より更に高い濃度で、作動溶液中に提供される。作動溶液は典型的には水性であり、多くの場合、緩衝水などの水であってもよいが、十分に高い濃度の１種以上の選択的シグナル阻害剤を提供するために、いくつかの場合、界面活性剤、エタノール、グリコールなども含有することができる。いずれの状況においても、反応混合物中で好適な濃度を達成するために、適当な量で加える。
【００６３】
トリガー溶液
トリガー溶液は、化学発光標識特異的結合パートナーからの、いくつかの場合、バックグラウンド剤から発光を生じるために必要な、１種以上の酸化剤又は還元剤を提供する。１種以上の酸化剤又は還元剤は、化学発光標識と直接反応することによってこの機能を実行する場合もあるが、適用可能な場合、バックグラウンド剤、より通常には１種以上の酸化剤又は還元剤は、活性化剤標識特異的結合パートナー上の活性化剤標識と反応して、活性化剤標識と化学発光標識との作用を推進する。
【００６４】
１種以上の酸化剤又は還元剤は、活性化剤標識特異的結合パートナー上の活性化剤標識を活性化する、任意の化合物であり得る。最も通常には、１種以上の酸化剤又は還元剤は、活性化剤標識と相互作用する１種以上の過酸化物であり、典型的には、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様活性を有する化合物であり、活性化剤標識を活性化する。ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ様活性を有する化合物と反応する任意の過酸化物を使用することができるが、通常使用される過酸化物としては、過酸化アルキル、具体的にはアルキルがエチル又はメチルであるもの、ヒドロ過酸化アルキル、具体的にはアルキルがエチル又はメチルであるもの、芳香族過酸化物、具体的には過酸化ベンジル、ヒドロ過酸化脂質、具体的には、エイコサペンタエン（eicosapentaeonic）酸、ドコサヘキサエン（docosahexanoic）酸、又はリノール酸のヒドロ過酸化物、メタ−クロロ過安息香酸、過酸化水素、過酸化尿素、過酸化カルバメート、及び過ホウ酸塩などの過酸が挙げられる。過酸化物の濃度は変動し得るが、典型的には１０−８Ｍ〜３Ｍ、最も通常には１０−３Ｍ〜１０−１Ｍである。
【００６５】
必須ではないが、トリガー溶液の成分として、増強剤が典型的に使用される。増強剤は、活性化剤標識、典型的にはペルオキシダーゼ酵素の反応性を促進する、アッセイにおけるノイズシグナルを低減する、又はその両方を行う、任意の化合物であり得る。典型的な増強剤としては、フェノール系化合物、芳香族アミン、フェノキサジン又はフェノチジン（phenothizine）とインドフェノール又はインドアニリンとの混合物、置換ヒドロキシベンゾオキサゾール、置換又は非置換アリールボロン酸、並びにこれらのエステル及び無水物などが挙げられる。いくつかの好適な増強剤は、米国特許公開第２０１００２６７０７１号、米国特許第５１７１６６８号、同第５２０６１４９号、及び同第５５１２４５１号に開示されている。用いる場合、増強剤は、典型的には、１０−５Ｍ〜１０−１Ｍの濃度で存在する。
【００６６】
上に論じたように、酸化剤又は還元剤、及び用いる場合は増強剤に加えて、１種以上の選択的シグナル阻害剤が、トリガー溶液中に存在してもよい。
【００６７】
トリガー溶液は、典型的には、記載する様々な溶質を、水性溶媒中に含有する。水性溶媒は、典型的には、緩衝水である。十分な分析物シグナルを生成することができないほどに、化学発光標識の発光又はアッセイに干渉しない限り、生物学的系に有用な任意の緩衝剤を用いることができる。最も有用な緩衝剤は、５〜１０．５のｐＨを維持することになる。特に有用な緩衝剤は、６．０〜９．０、例えば６５．〜８．５、最も具体的には７．０〜８．０のｐＨを維持する。
【００６８】
使用することができる例示的な緩衝剤は、米国特許第２０１００２６７０７１号に開示されている。最も通常には、緩衝剤は、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシ−メチルアミン）メタン、グリシン、トリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ジエタノールアミン、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、及びＭＥＳなどから選択される。
【００６９】
１種以上の洗浄剤又はポリマー性界面活性剤を使用して、発光を増強すること、又はノイズシグナルを減少させることができる。例としては、ポリオキシエチレン化アルキルフェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化エーテル、ポリオキシエチレン化ソルビトールエステル、ＣＴＡＢなどの第四級アンモニウム塩、及び第四級ホスホニウム塩が挙げられる。特に有用な例は、ポリマー性カチオン性界面活性剤、最も具体的には第四級アンモニウム塩及び第四級ホスホニウム塩である。
【００７０】
上に論じたように、１種以上の選択的シグナル阻害剤が、トリガー溶液中に任意に存在してもよい。
【００７１】
一例として、トリガー溶液は、水性緩衝液、１０−５Ｍ〜１Ｍの濃度の過酸化物、及び１０−５Ｍ〜１０−１Ｍの濃度の増強剤を含むことができる。別の実施例では、トリガー溶液は、水性緩衝液、１０−５Ｍ〜１Ｍの濃度の過酸化物を含有し得る。１０−５Ｍ〜１０−１Ｍの濃度の増強剤と、１つ以上の選択的シグナル阻害剤が、反応混合物中に１０−６Ｍ〜１０−１Ｍの濃度を有するような濃度の１つ以上の選択的シグナル阻害剤と、を含む。
【００７２】
結合していない化学発光基質
結合していない化学発光基質は、分析物標識選択的結合パートナー又は化学発光標識特異的結合パートナーにコンジュゲートしていない、又は別の方法で不可逆的に結合した、任意の化学発光分子であり得る。ほとんどの場合、結合していない化学発光基質は、反応混合物に可溶である。化学発光標識特異的結合パートナーと結合していない化学発光基質との発光強度を別々に測定するために、化学発光標識の極大発光波長とは異なる極大発光波長を有する結合していない化学発光基質を選択することが便利であり得るが、これは必須ではない。
【００７３】
アッセイ中、結合していない化学発光基質は、酸化剤又は還元剤と、最も多くの場合、活性化剤標識特異的結合パートナー上の活性化剤標識によって間接的に、反応し得る。この反応によって、化学発光基質が、発光することができる電子励起状態となり、バックグラウンドシグナルを生成する。あるいは、より典型的ではないが、結合していない化学発光基質の励起状態は、放出性エネルギー受容体との更なる反応を受ける場合があり、これは次に、発光してバックグラウンドシグナルを生成することができる。
【００７４】
好適な結合していない化学発光基質としては、ルミノール及びイソルミノールなどの環式ヒドラジド、ロフィンなどのイミダゾール化合物、ルシゲニン及びアクリダンなどのアクリジニウムエステル、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンなどのフタルヒドラジド、ルシフェリン、並びにジオン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ’−ガラクトピラノイルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム、及び１，２−ジオキセタンジオン、アダマンチリデン−アダマンチル−１，２−ジオキセタンなどの１，２ジオキシエタン含有化合物が挙げられる。ルミノール及びイソルミノール、具体的にはルミノールが最も通常である。
【００７５】
このアッセイでは、結合していない化学発光基質は、化学発光標識と同じ光化学機構によって、すなわち、典型的には活性化剤標識による酸化剤又は還元剤との反応によって、典型的には発光の形態で、検出可能なバックグラウンドシグナルを生成する励起状態に変換される。検出可能なバックグラウンドシグナルは、分析物の濃度と相関しない。したがって、分析物シグナルの生成に干渉し得る、試料の非分析物成分は、同様に、バックグラウンドシグナルの生成に干渉することになる。
【００７６】
これを利用して、非分析物化合物のアッセイへの干渉を補正する、補正係数を得ることができる。これを行うために、反応混合物の他の成分（すなわち、化学発光標識特異的結合パートナー、活性化剤標識特異的結合パートナー、及び結合していない化学発光基質）とともに、それぞれが異なる既知量の分析物を含有する、標準試料のセットを調製し、これらをトリガーに曝露する。標準試料とともに使用する反応混合物のそれぞれは、同じ量の化学発光標識特異的結合パートナー、活性化剤標識特異的結合パートナー、及び結合していない化学発光基質を有する。トリガー溶液を加え、異なる濃度の分析物における分析物シグナルとバックグラウンドシグナルの両方について、標準試料を測定するが、結合していない化学発光基質の濃度が、標準試料のすべてにおいて同一であるため、通常、バックグラウンドシグナルは、標準試料のすべてにおいて同じであることになる。バックグラウンドシグナルが、試験試料のすべてについて同じではない場合、これは、アッセイ装置の側の誤差、又は分析物が結合していない化学発光基質と相互作用することのいずれかを示している。後者の場合、異なる結合していない化学発光基質を用いてもよい。
【００７７】
異なる濃度の分析物における分析物シグナルを使用して、分析物シグナル対分析物濃度の相関曲線を作成することができる。
【００７８】
試験試料からのバックグラウンドシグナルを使用して、次のように、倍率変更係数を作成することができる。試験試料をアッセイして、分析物シグナルとバックグラウンドシグナルとの両方を決定する。倍率変更係数は、標準試料によって生成されるバックグラウンドシグナルと、試験試料によって生成されるバックグラウンドシグナルとの割合として計算される。この倍率変更係数は、試験試料中の非分析物化合物の効果を考慮するものであり、試験試料中に、アッセイに干渉する非分析物化合物が存在しない場合には、１である。
【００７９】
試験試料中の分析物濃度を決定するために、試験試料の分析物シグナルに倍率変更係数を乗じて、補正分析物シグナルを得る。補正分析物シグナルを、標準試料から決定した分析物シグナル対分析物濃度の相関曲線と比較して、分析物濃度を提供する。
【００８０】
検出
バックグラウンドシグナル及び分析物シグナルなどの様々なシグナルは、当技術分野において公知の任意の装置によって検出することができる。装置の種類は、シグナルの種類に依存し得る。シグナルが発光シグナルである場合、ルミノメータ又はＣＣＤカメラが典型的に使用される。他の有用な検出器としては、写真フィルム、Ｘ線フィルム、シンチレーションカウンター、光量計、並びにＵＶ／Ｖｉｓ及びＩＲ検出器のような透過検出器などが挙げられる。最も通常には、検出は、ルミノメータ中又はＣＣＤカメラの前で、試験管内又はマルチウェルプレート内で実行される。マルチウェルプレートとＣＣＤカメラとを使用することは、この場合、マルチウェルプレートの異なるウェルのそれぞれにおいて、複数の試験試料及び標準試料のアッセイ及び検出を同時に実行することができる場合があるため、便利であり得る。検出は、多数の市販されている、又は当技術分野において公知のルミノメータ、ＣＣＤカメラ等のいずれかによって、実行することができる。
【００８１】
使用
本明細書に記載するアッセイは、様々な系における使用を見出すことができる。ＥＬＩＳＡ系は１つの使用であるが、本明細書における手引及び当業者の知識に従って、アプタマー結合及び他の非免疫原特異的結合パートナーを伴うアッセイも用いることができる。例としては、溶液ハイブリダイゼーションアッセイ、サザンブロット法におけるＤＮＡ検出、ノーザンブロット法におけるＲＮＡ検出、ＤＮＡ又はＲＮＡの配列決定、ＤＮＡ又はＲＮＤのフィンガープリント法、コロニーハイブリダイゼーション、及びプラークアッセイが挙げられ、これらはすべて当技術分野において公知である。少なくとも１種の特異的結合パートナーを作製することができる任意の分析物を、分析することができる。例としては、抗原、毒素、毒物、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、薬物、ステロイド、ハプテン、抗体、ペプチド、ペプチド断片、ホルモン、受容体、プライマー、及び小分子などが挙げられる。
【００８２】
例示的な実施形態の列挙
この実施形態の列挙は、本発明の特定の態様の理解を助けることを意図している。限定を目的とするものではない。
【００８３】
１．試料中の分析物についてアッセイする方法であって、
反応混合物を形成すること、及び
トリガー溶液を反応混合物に混和することを含み、
アッセイされる分析物が試料中に存在してもよく、
この反応混合物は、
第１の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した化学発光標識を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、分析物に結合して、分析物と結合した化学発光標識特異的結合複合体を形成することができる、化学発光標識特異的結合パートナーと、
第２の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した活性化剤標識を含む活性化剤標識特異的結合パートナーと、
選択的シグナル阻害剤とを含む水溶液であり、
反応混合物が、結合していない化学発光基質を更に含み、
トリガー溶液が、結合していない化学発光基質からバックグラウンドシグナルを生成することができ、
分析物の存在下で、トリガー溶液が、試料中の分析物の量に関係する検出可能な分析物シグナルを生成することができる、方法。
２．反応混合物が増強剤を更に含む、実施形態１に記載の方法。
３．トリガー溶液が増強剤を更に含む、実施形態１に記載の方法。
４．選択的シグナル阻害剤が、分析物を有する複合体において、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの間の反応によって生成するシグナルの割合を、分析物を有する複合体が存在しない場合の、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの間の反応からのシグナルを超えさせる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
５．選択的シグナル阻害剤が、オルト又はパラ配向性において少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、少なくとも１つのヒドロキシル基と、この少なくとも１つのヒドロキシル基のうちの１つ以上に対して、オルト又はパラであるアミノ基とを有する芳香族化合物、エチレン性不飽和基上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、及び窒素複素環式基を有する化合物からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
６．選択的シグナル阻害剤が、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、尿酸、１種以上のトコフェロール、及びカテキンからなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
７．選択的シグナル阻害剤がアスコルビン酸である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
８．化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合対部材に直接又は間接的に接続された化学発光標識を含み、化学発光標識が、芳香族環式ジアルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンエノール、及び式
【化７】
2021531458.tif 000008
［式中、
Ｒ１は、１〜２０個の炭素のアルイル（alyl）基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、及びアラルキル基、又はカルボニル、トリアルキルシリル、ＳＯ３−、−ＯＳＯ３、グリコシル、ＰＯ３−、−ＯＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、若しくは第四級ホスホニウムから独立して選択された１〜３つの基部分によって置換された、これらのもののいずれかから選択され、
Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルカルボニル、トリアルキルシリル、ＳＯ３−、グリコシル、及びＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ”）［式中、Ｒ’及びＲ”は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、シアノアリール、シアノアラルキル、トリアルキルシリル、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムカチオン、及びトリアンルキル（anlkyl）ホスホニウムカチオンから独立して選択される］から選択され、
Ｚ１及びＺ２は、Ｏ及びＳ原子から独立して選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ８アルキルから独立して選択される］
を有する化合物からなる群から選択される、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
９．化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された化学発光標識を含み、化学発光標識が、式
【化８】
2021531458.tif 000009
［式中、
波線は特異的結合パートナーへの、又は化合物を特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、１〜２０個の炭素原子の、置換アルキル基、非置換アルキル基、置換アルキエニル基、非置換アルケニル基、置換アルキニル基、非置換アルキニル基、置換アラルキル基、及び非置換アラルキル基から独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルシリル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３２−、グリコシル、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３２−、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
を有する、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
１０．活性化剤標識特異的結合パートナーが、特異的結合対部材に直接又は間接的に接続された活性化剤標識化合物を含み、活性化剤標識が、遷移金属塩、遷移金属複合体、及び酵素から選択され、活性化剤標識がペルオキシダーゼ活性を有する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１１．活性化剤標識がペルオキシダーゼ酵素である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１２．活性化剤標識がセイヨウワサビペルオキシダーゼである、実施形態１１に記載の方法。
１３．化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとのうちの少なくとも１つが、可溶性タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ、ビオチン、カチオン化ＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、可溶性合成デンドリマー、可溶性合成ポリマー、多糖類、デキストラン、有機ヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、アプタマー、リポソーム、及びミセルから選択される補助物質を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１４．増強剤が、ペルオキシダーゼ活性を有する活性化剤の触媒回転を促進する１種以上の化合物である、実施形態２〜１２のいずれかに記載の方法。
１５．増強剤が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される、実施形態１３に記載の方法。
１６．トリガー溶液が、酸化剤又は還元剤を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１７．トリガー溶液が過酸化物を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
１８．過酸化物が、過酸化アルキル、具体的にはアルキルがエチル又はメチルであるもの、ヒドロ過酸化アルキル、具体的にはアルキルがエチル又はメチルであるもの、芳香族過酸化物、具体的には過酸化ベンジル、ヒドロ過酸化脂質、具体的にはエイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、又はリノール酸のヒドロ過酸化物、メタ−クロロ過安息香酸、過酸化水素、過酸化尿素、過酸化カルバメート、及び過ホウ酸塩などの過酸からなる群から選択される、実施形態１７に記載の方法。
１９．過酸化物が過酸化水素である、実施形態１８に記載の方法。
２０．トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される増強剤を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２１．トリガー溶液及び反応混合物の成分のすべて、並びに分析物が水溶性である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２２．トリガー溶液、アッセイ溶液、又は反応混合物のいずれも、固相物質に直接又は間接的にコンジュゲートされる材料を含有しない、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２３．選択的シグナル剤が、オルト又はパラ配向性において少なくとも２つのヒドロキシル部分を有する芳香族化合物、オルト又はパラ配向性において、ヒドロキシル部分とアミネオ（amineo）部分とを有する芳香族化合物、少なくとも２つのビニルヒドロキシル基を有する化合物、及び窒素複素環からなる群から選択される化合物を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２４．選択的シグナル阻害剤がアスコルビン酸を含み、アスコルビン酸が、具体的にはＬ−アスコルビン酸である、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２５．選択的シグナル阻害剤が、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル（mehtyl）クロマン−２−カルボン酸を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２６．選択的シグナル阻害剤が２−アミネオ（amineo）フェノールを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２７．選択的シグナル阻害剤が、３−アミネオ（amineo）−チロシン、具体的には３−アミノ−Ｌ−チロシンを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２８．選択的シグナル阻害剤が４−クロロカテコールを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
２９．選択的シグナル阻害剤がフェノキサジンを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３０．選択的シグナル阻害剤が２−ブロモベンゼン（benzne）−１，４−ジオールを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３１．選択的シグナル阻害剤が５，６−イソプロピリジン（isopropylidine）アスコルビン酸を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３２．選択的シグナル阻害剤が６−パルミテートを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３３．化学発光標識特異的結合パートナー及び活性化剤標識特異的結合パートナーが、それぞれ試料中の分析物に結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３４．化学発光標識特異的結合パートナーが、分析物の類似体に接続された化学発光標識化合物を含み、更に、分析物と化学発光標識特異的結合パートナーとが競合して、活性化剤標識特異的結合パートナーに結合する、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３５．結合していない化学発光基質が、環式ヒドラジド、例えば、ルミノール及びイソルミノール、イミダゾール化合物、例えば、ロフィン、アクリジニウムエステル、例えば、ルシゲニン及びアクリダン、フタルヒドラジド、例えば、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、ルシフェリン、並びに１，２ジオキシエタン含有化合物、例えば、ジオン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ’−ガラクトピラノイルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム、及び１，２−ジオキセタンジオン、アダマンチリデン−アダマンチル−１，２−ジオキセタンからなる群から選択され、具体的にはルミノール又はイソルミノールであり、より具体的にはルミノールである、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３６．結合していない化学発光基質がルミノールを含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３７．結合していない化学発光基質の極大発光強度の波長が、化学発光標識の極大発光強度の波長と異なる、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３８．分析物シグナル及びバックグラウンドシグナルを検出することを更に含む、先行する実施形態のいずれかに記載の方法。
３９．分析物シグナルを検出することが、既知濃度の分析物を有する標準試料である少なくとも１つの試料から、少なくとも１つの標準分析物シグナルを検出することを含み、かつ未知濃度の分析物を有する少なくとも１つの試験試料から、試験分析物シグナルを検出することを更に含む、実施形態３８に記載の方法。
４０．バックグラウンドシグナルを検出することが、既知濃度の分析物を有する標準試料である少なくとも１つの試料から、少なくとも１つの標準バックグラウンドシグナルを検出することを含み、かつ未知濃度の分析物を有する少なくとも１つの試験試料から、試験バックグラウンドシグナルを検出することを更に含む、実施形態３８又は３９に記載の方法。
４１．分析物についてアッセイするためのキットであって、
第１の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した化学発光標識を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、分析物に結合して、分析物と結合した化学発光標識特異的結合複合体を形成することができる、化学発光標識特異的結合パートナーと、
第２の特異的結合パートナーに不可逆的に結合した活性化剤標識を含む活性化剤標識特異的結合パートナーと、
選択的シグナル阻害剤とを含み、
トリガー溶液が、結合していない化学発光基質からバックグラウンドシグナルを生成することができ、
結合していない化学発光基質
を更に含み、
分析物の存在下で、トリガー溶液が、試料中の分析物の量に関係する検出可能な分析物シグナルを生成することができる、キット。
４２．トリガー溶液が増強剤を更に含む、実施形態４１に記載のキット。
４３．選択的シグナル阻害剤が、分析物を有する複合体において、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの間の反応によって生成するシグナルの割合を、分析物を有する複合体が存在しない場合の、化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとの間の反応からのシグナルを超えさせる、実施形態４１又は４２に記載のキット。
４４．選択的シグナル阻害剤が、オルト又はパラ配向性において少なくとも２つのヒドロキシル基を有する芳香族化合物、少なくとも１つのヒドロキシル基と、この少なくとも１つのヒドロキシル基のうちの１つ以上に対して、オルト又はパラであるアミノ基とを有する芳香族化合物、エチレン性不飽和基上で置換された少なくとも２つのヒドロキシル基を有する化合物、及び窒素複素環式基を有する化合物からなる群から選択される、実施形態４１〜４３のいずれかに記載のキット。
４５．選択的シグナル阻害剤が、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、アスコルビン酸６−パルミテート、５，６−イソプロピリジエン−アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、尿酸、１種以上のトコフェロール、及びカテキンからなる群から選択される、実施形態４１〜４４のいずれかに記載のキット。
４６．選択的シグナル阻害剤がアスコルビン酸である、実施形態４１〜４５のいずれかに記載のキット。
４７．化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合対部材に直接又は間接的に接続された化学発光標識を含み、化学発光標識が、芳香族環式ジアルヒドラジド、トリヒドロキシ芳香族化合物、アクリダンケテンジチオアセタール化合物、アクリダンエステル、アクリダンチオエステル、アクリダンエノール、及び式
【化９】
2021531458.tif 000010
［式中、
Ｒ１は、１〜２０個の炭素のアルイル（alyl）基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、及びアラルキル基、又はカルボニル、トリアルキルシリル、ＳＯ３−、−ＯＳＯ３、グリコシル、ＰＯ３−、−ＯＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、若しくは第四級ホスホニウムから独立して選択された１〜３つの基部分によって置換された、これらのもののいずれかから選択され、
Ｘは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、アリール、アラルキル、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル若しくはアルキルカルボニル、トリアルキルシリル、ＳＯ３−、グリコシル、及びＰＯ（ＯＲ’）（ＯＲ”）［式中、Ｒ’及びＲ”は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、シアノアルキル、シアノアリール、シアノアラルキル、トリアルキルシリル、アルカリ金属カチオン、アルカリ土類カチオン、アンモニウムカチオン、及びトリアンルキル（anlkyl）ホスホニウムカチオンから独立して選択される］から選択され、
Ｚ１及びＺ２は、Ｏ及びＳ原子から独立して選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ及びＣ１〜Ｃ８アルキルから独立して選択される］
を有する化合物からなる群から選択され、先行する実施形態のいずれかに記載のキット。
４８．化学発光標識特異的結合パートナーが、特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された化学発光標識を含み、化学発光標識が、式
【化１０】
2021531458.tif 000011
［式中、
波線は特異的結合パートナーへの、又は化合物を特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１及びＲ２は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル（alkyenyl）、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択され、
Ｒ３は、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルキエニル（alkyenyl）、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アラルキル、及び非置換アラルキルから選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリアルキルシリル、−ＳＯ３、グリコシル、−ＰＯ３、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
を有する、実施形態４１〜４６のいずれかに記載のキット。
４９．活性化剤標識特異的結合パートナーが、特異的結合対部材に直接又は間接的に接続された活性化剤標識化合物を含み、活性化剤標識が、遷移金属塩、遷移金属複合体、及び酵素から選択され、活性化標識がペルオキシダーゼ活性を有する、実施形態４１〜４８のいずれかに記載のキット。
５０．活性化剤標識がペルオキシダーゼ酵素である、実施形態４１〜４９のいずれかに記載のキット。
５１．活性化剤標識がセイヨウワサビペルオキシダーゼである、実施形態５０に記載のキット。
５２．化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとのうちの少なくとも１つが、可溶性タンパク質、ストレプトアビジン、アビジン、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ、ビオチン、カチオン化ＢＳＡ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、可溶性合成デンドリマー、可溶性合成ポリマー、多糖類、デキストラン、有機ヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、アプタマー、リポソーム、及びミセルから選択される補助物質を含む、実施形態４１〜５０のいずれかに記載のキット。
５３．増強剤が、ペルオキシダーゼ活性を有する活性化剤の触媒回転を促進する１種以上の化合物である、実施形態４２〜５２のいずれかに記載のキット。
５４．増強剤が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される、実施形態５３に記載のキット。
５５．トリガー溶液が、酸化剤又は還元剤を含む、実施形態４１〜５４のいずれかに記載のキット。
５６．トリガー溶液が過酸化物を含む、実施形態４１〜５５のいずれかに記載のキット。
５７．過酸化化合物が、過酸化アルキル、具体的にはアルキルがエチル又はメチルであるもの、ヒドロ過酸化アルキル、具体的にはアルキルがエチル又はメチルであるもの、芳香族過酸化物、具体的には過酸化ベンジル、ヒドロ過酸化脂質、具体的にはエイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、又はリノール酸のヒドロ過酸化物、メタ−クロロ過安息香酸、過酸化水素、過酸化尿素、過酸化カルバメート、及び過ホウ酸塩などの過酸からなる群から選択される、実施形態５６に記載のキット。
５８．過酸化物が過酸化水素である、実施形態５７に記載のキット。
５９．トリガー溶液が、フェノール化合物、芳香族アミン、ベンゾオキサゾール、ヒドロキシベンゾチアゾール、アリールボロン酸、及びこれらのいずれかの混合物から選択される増強剤を含む、実施形態４１〜５８のいずれかに記載のキット。
６０．トリガー溶液及び反応混合物の成分のすべて、並びに分析物が水溶性である、実施形態４１〜５９のいずれかに記載のキット。
６１．トリガー溶液、アッセイ溶液、又は反応混合物のいずれも、固相物質に直接又は間接的にコンジュゲートされる材料を含有しない、実施形態４１〜６０のいずれかに記載のキット。
６２．選択的シグナル剤が、オルト又はパラ配向性において少なくとも２つのヒドロキシル部分を有する芳香族化合物、オルト又はパラ配向性において、ヒドロキシル部分とアミネオ部分とを有する芳香族化合物、少なくとも２つのビニルヒドロキシル基を有する化合物、及び窒素複素環からなる群から選択される化合物を含む、実施形態４１〜６１のいずれかに記載のキット。
６３．選択的シグナル阻害剤がアスコルビン酸を含み、アスコルビン酸が、具体的にはＬ−アスコルビン酸である、実施形態４１〜６２のいずれかに記載のキット。
６４．選択的シグナル阻害剤が、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸を含む、実施形態４１〜６３のいずれかに記載のキット。
６５．選択的シグナル阻害剤が２−アミネオフェノールを含む、実施形態４１〜６４のいずれかに記載のキット。
６６．選択的シグナル阻害剤が、３−アミネオ−チロシン、具体的には３−アミノ−Ｌ−チロシンを含む、実施形態４１〜６５のいずれかに記載のキット。
６７．選択的シグナル阻害剤が４−クロロカテコールを含む、実施形態４１〜６６のいずれかに記載のキット。
６８．選択的シグナル阻害剤がフェノキサジンを含む、実施形態４１〜６７のいずれかに記載のキット。
６９．選択的シグナル阻害剤が２−ブロモベンゼン−１，４−ジオールを含む、実施形態４１〜６８のいずれかに記載のキット。
７０．選択的シグナル阻害剤が５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸を含む、実施形態４１〜６９のいずれかに記載のキット。
７１．選択的シグナル阻害剤が６−パルミテートを含む、実施形態４１〜７０のいずれかに記載のキット。
７２．化学発光標識特異的結合パートナー及び活性化剤標識特異的結合パートナーが、それぞれ試料中の分析物に結合するようになっている、実施形態４１〜７１のいずれかに記載のキット。
７３．化学発光標識特異的結合パートナーが、分析物の類似体に接続された化学発光標識化合物を含み、更に、分析物と化学発光標識特異的結合パートナーとが競合して、活性化剤標識特異的結合パートナーに結合するようになっている、実施形態４１〜７２のいずれかに記載のキット。
７４．結合していない化学発光基質が、環式ヒドラジド、例えば、ルミノール及びイソルミノール、イミダゾール化合物、例えば、ロフィン、アクリジニウムエステル、例えば、ルシゲニン及びアクリダン、フタルヒドラジド、例えば、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、ルシフェリン、並びに１，２ジオキシエタン含有化合物、例えば、ジオン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−β−Ｄ’−ガラクトピラノイルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン｝−４−イル）フェニルリン酸二ナトリウム、及び１，２−ジオキセタンジオン、アダマンチリデン−アダマンチル−１，２−ジオキセタンからなる群から選択され、具体的にはルミノール又はイソルミノールであり、より具体的にはルミノールである、実施形態４１〜７３のいずれかに記載のキット。
７５．結合していない化学発光基質がルミノールを含む、実施形態４１〜７４のいずれかに記載のキット。
７６．結合していない化学発光基質の極大発光強度の波長が、化学発光標識の極大発光強度の波長と異なる、実施形態４１〜７５のいずれかに記載のキット。
７７．試料中の分析物についての溶液相アッセイ方法であって、
ａ）以下の成分：
試料（sampele）、
第１の特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された化学発光標識化合物を含む化学発光標識特異的結合パートナーであって、化学発光標識化合物が、式
【化１１】
2021531458.tif 000012
［式中、
波線は特異的結合パートナーへの、又は化合物を特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、１〜２０個の炭素原子の、置換アルキル基、非置換アルキル基、置換アルキエニル基、非置換アルケニル基、置換アルキニル基、非置換アルキニル基、置換アラルキル基、及び非置換アラルキル基から独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルシリル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３２−、グリコシル、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３２−、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
の化合物である、化学発光標識特異的結合パートナー、
ペルオキシダーゼ活性を有し、第２の特異的結合パートナーに直接又は間接的に接続された、活性化剤標識化合物を含む活性化剤標識特異的結合パートナー、及び
Ｌ−アスコルビン酸、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマナン（chromanan）−２−カルボン酸、２−アミノフェノール、３−アミネオ−Ｌ−チロシン、４−クロロカテコール、フェノキサジン、２−ブロモベンゼン−１，４−ジオール、５，６−イソプロピリデンアスコルビン酸、及びアスコルビン酸６−パルミテートからなる群から選択される選択的シグナル阻害剤
を含む水性反応混合物を、成分を任意の順序で又は同時に水溶液に加えることによって、形成することであって、
成分のすべてが水溶液に可溶であり、成分のいずれも固体支持体に固定されておらず、
化学発光標識特異的結合パートナーと活性化剤標識特異的結合パートナーとが、試料中に存在する分析物に結合して、水溶液中に結合複合体を形成する、ことと、
ｂ）水性反応混合物に、過酸化化合物を含むトリガー溶液を加えることであって、トリガー溶液が、選択的シグナル阻害剤の存在下で、水性反応混合物中の分析物と結合した化学発光標識特異的結合パートナー及び分析物と結合した活性化剤標識特異的結合パートナーの量と相関する、検出可能な化学発光シグナルを放出し、選択的シグナル阻害剤が、化学発光標識化合物と活性化剤標識化合物との間の反応によって生成するシグナルの割合を、このような複合体ではない場合の、化学発光標識化合物と活性化剤標識化合物との間の反応からのシグナルを超えさせる、こととを含み、
反応混合物が、試料中の分析物の濃度と相関しない検出可能なバックグラウンドシグナルを生成する、結合していない化学発光基質を更に含むこと
を特徴とする、溶液相アッセイ方法。
７８．試料中の分析物を検出するためのキットであって、
分析物への第１の特異的結合パートナーと、
第１の特異的結合パートナーにコンジュゲートした化学発光化合物と、
分析物への第２の特異的結合パートナーと、
第２の特異的結合パートナーにコンジュゲートした活性化剤化合物と、
選択的シグナル阻害剤と、
トリガー溶液とを含み、
キットのこれらの成分のすべてが、水溶液に可溶であり、
化学発光化合物が、式
【化１２】
2021531458.tif 000013
［式中、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルからなる群から選択され、Ｒ１及びＲ２が置換されている場合、Ｒ１及びＲ２は最も通常には、カルボニル、カルボキシル、トリ（アルキル）シリル、グリコシル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３−、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、アミノ、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから選択される、１〜３個の基によって置換されており、
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルからなる群から選択され、
Ｒ４〜Ｒ１１のそれぞれは、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミノ、置換アミン、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボキシアミド、シアノ、又はスルホネートであり、近接するＲ４〜Ｒ１１部分の対は、共有結合して５〜７員の炭素環又は複素環式環を形成することができる］
を有するアクリダンケテンジチオアセタール化合物であり、
選択的シグナル阻害剤が、グルタチオン、アスコルビン酸、具体的にはＬ−アスコルビン酸、アスコルビン酸の塩、具体的にはＬ−アスコルビン酸の塩、尿酸、Ｌ−アスコルビン酸−６−パルミテート、トコフェロール、５，６−イソプロピリデン−Ｌ−アスコルビン酸、Ｄ−イソアスコルビン酸、Ｌ−イソアスコルビン酸、又は両方を含めたイソアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、ジエチルヒドロキシルアミン、ＢＨＴ、
【化１３】
2021531458.tif 000014
【化１４】
2021531458.tif 000015
及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、キット。
７９．化学発光標識化合物が、式
【化１５】
2021531458.tif 000016
［式中、
波線は特異的結合パートナーへの、又は化合物を特異的結合パートナーに接続しているリンカーへの付着部位を示し、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、１〜２０個の炭素原子の、置換アルキル基、非置換アルキル基、置換アルキエニル基、非置換アルケニル基、置換アルキニル基、非置換アルキニル基、置換アラルキル基、及び非置換アラルキル基から独立して選択され、Ｒ１又はＲ２が置換されている場合、Ｒ１又はＲ２は１〜３個の置換基によって置換されており、各置換基は、カルボニル、カルボキシル、トリ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルシリル、−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３２−、グリコシル、−ＰＯ３−、−ＯＰＯ３２−、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、アミノ、Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、第四級アンモニウム、及び第四級ホスホニウムから独立して選択される］
の化合物である、実施形態７８に記載のキット。
【実施例】
【００８４】
材料
エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩（ＥＤＴＡ−二カリウム塩）、パラ−クマル酸、ＴＷＥＥＮ  ２０、トリス塩基、トリス塩酸塩、アスコルビン酸ナトリウム、及びルシゲニンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
過酸化水素（３０％、Ｂａｋｅｒ  ａｎａｌｙｚｅｄ）は、ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）から入手した。
エタノール（２００プルーフ）は、Ｄｅｃｏｎ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡから入手した。
ＰＶＰ３６０［平均分子量３６０，０００のポリ（ビニルピロリジノン）］及び
ＰＥＧ−６０００［平均分子量６０００のポリ（エチレングリコール））をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。
ウシＩｇＧ  ＳＰＡＲＣＬアッセイキットは、Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）から入手した。ＰＢＳ中のウシＩｇＧ標準溶液は、表１に記載の溶液配合に従って調製した。
ウシＩｇＧ標準＋ルシゲニン溶液は、２０体積部のウシＩｇＧ標準溶液（表１）を、１体積部のルシゲニンの脱イオン水中飽和溶液と組み合わせることによって調製した。
（抗ウシＩｇＧ）−ＨＲＰコンジュゲートを含有する溶液は、アッセイキットの指示に従って調製した。
アクリダン標識抗ウシＩｇＧを含有する溶液は、アッセイキットの指示に従って調製し、更に、アスコルビン酸ナトリウム（２００マイクロモル濃度）を追加した。
ウマ血清（１６０５０−１３０）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手した。ウマ血清を有する試験試料は、ＰＢＳ中、１ｅ−１、１ｅ−２、１ｅ−３、１ｅ−４、及び１ｅ−５（体積／体積）の希釈濃度で調製した。
【００８５】
【表１】
2021531458.tif 000017
【００８６】
実施例１のためのトリガー溶液は、表２に列挙する成分の水溶液として調製した。
【００８７】
【表２】
2021531458.tif 000018
【００８８】
Ｃｏｒｔｉｓｏｌ  ＳＰＡＲＣＬアッセイキットは、Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手した。
【００８９】
コルチゾール標準溶液は、アッセイキットにおいて提供されたコルチゾールストック及び希釈剤を使用して調製した。
【００９０】
コルチゾール−ＨＲＰコンジュゲートを含有する溶液は、キットのコルチゾール−ＨＲＰコンジュゲート（７８１マイクロリットル）を、キットの２４９マイクロリットルの希釈剤と混合することによって調製した。
【００９１】
抗コルチゾールアクリダンコンジュゲートを含有する溶液は、キットの抗コルチゾールアクリダンコンジュゲート（２．５マイクロリットル）を、キットの２４７．５マイクロリットルの希釈剤と混合することによって調製した。
【００９２】
計算
倍率変更係数（ＳＦ）は、報告された標準試料のバックグラウンドシグナルを、報告された試験試料のバックグラウンドシグナルで除することによって決定した。
【００９３】
試験試料の補正分析物シグナルは、試験試料の分析物シグナルに倍率変更係数（ＳＦ）を乗じることによって計算した。
【００９４】
実施例１
まず、ウマ血清希釈試料（２０マイクロリットル）をプレートのウェルに加えることによって、反射性白色９６ウェルプレート中に試験試料を調製した。各ウェルは単一の試験試料を含有し、各試験試料を３回試験した。標準試料を含有するウェルについては、２０マイクロリットルのＰＢＳ溶液を使用した（３回反復）。次に、２０マイクロリットルのウシＩｇＧ標準＋ルシゲニン溶液を各ウェルに加え、プレートを３００ｒｐｍで３０秒間振盪した。抗ウシＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート溶液（２０マイクロリットル）を各ウェルに加え、プレートを３００ｒｐｍで３０秒間振盪した。次いで、アクリダン標識抗ウシＩｇＧコンジュゲート溶液（２０マイクロリットル）を各ウェルに加え、プレートを３００ｒｐｍで３０秒間振盪した。３Ｍ  ＭＬＳ  ＩＩ注入ルミノメータ（３Ｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ，ＭＮ）から入手可能）を使用して、３０マイクロリットルのトリガー溶液を各ウェルに加えた。この機器を、フラッシュ発光シグナル（試験試料又は標準試料のいずれかの分析物シグナル）を３秒間読み取り、同時に積分するように設定した。フラッシュ発光シグナル（発光量、ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ、ＲＬＵ）を記録した後、注入後６０〜７０秒の期間、第２の発光シグナル（試験試料又は標準試料のバックグラウンドシグナル）を記録した（１秒の積分時間による）。第２のシグナルについて報告されたＲＬＵ値は、１０秒の時間範囲にわたって記録した値の平均であった。表３〜７において、試験試料のバックグラウンドシグナル（ＲＬＵ）、標準試料の平均バックグラウンドシグナル（ＲＬＵ）、試験試料の分析物シグナル（ＲＬＵ）、標準試料の平均分析物シグナル（ＲＬＵ）、計算された倍率変更係数、及び試験試料の補正分析物シグナル（ＲＬＵ）の値を、各反復試料について報告する。各試験試料についての補正分析物シグナルが、対応する標準試料についての分析物シグナルの±２０％以内であったかについての判定も、表に報告する。
【００９５】
標準試料を含有する３つのウェルについて、個々のバックグラウンドシグナルは、６４３、７４８、及び８５３ＲＬＵであった。倍率変更係数は、標準試料のバックグラウンドシグナル（ｎ＝３）についての平均値である、７４８ＲＬＵを使用して計算した。標準試料の平均分析物シグナル（ＲＬＵ）は、３８０１５ＲＬＵであると計算された（３つの個々の標準試料の分析物シグナルは、３５９０３、３８０７５、及び４００６７ＲＬＵである）。
【００９６】
【表３】
2021531458.tif 000019
【００９７】
【表４】
2021531458.tif 000020
【００９８】
【表５】
2021531458.tif 000021
【００９９】
【表６】
2021531458.tif 000022
【０１００】
【表７】
2021531458.tif 000023
【０１０１】
比較例Ａ
ウシＩｇＧ標準＋ルシゲニン溶液（２０マイクロリットル）を、ウシＩｇＧ標準溶液（２０マイクロリットル）によって置き換えたことを除いて、実施例２に記載したものと同じ手順に従った。表８〜１２において、試験試料の分析物シグナル（ＲＬＵ）及び標準試料の平均分析物シグナル（ＲＬＵ）の値を、各反復試料について報告する。標準試料の平均分析物シグナル（ＲＬＵ）は、３７６９４ＲＬＵであると計算された（３つの個々の標準試料の分析物シグナルは、３６９５５、３７０６２、及び３９０６６ＲＬＵである）。各試験試料についての分析物シグナルが、対応する標準試料についての分析物シグナルの±２０％以内であったかについての判定も、表に報告する。
【０１０２】
【表８】
2021531458.tif 000024
【０１０３】
【表９】
2021531458.tif 000025
【０１０４】
【表１０】
2021531458.tif 000026
【０１０５】
【表１１】
2021531458.tif 000027
【０１０６】
【表１２】
2021531458.tif 000028
【０１０７】
比較例Ｂ
ウマ血清の試験試料（１ｅ−１〜１ｅ−５希釈）を、上に記載したように調製した。標準試料は、ウマ血清を加えていないＰＢＳ溶液であった。ウシＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＩＧＧ−１１、Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手）を使用して、製造業者の案内に従って、試験試料及び標準試料を分析した。各ウェルについての吸光度値（Ａ４５０）を、ＢｉｏＴｅｋ  ＰＯＷＥＲＷＡＶＥ  ３４０プレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）から入手）によって決定した。各複製（試験試料及び標準試料）についての吸光度（Ａ４５０）値を表１３に報告し、標準試料について計算した平均Ａ４５０値と比較する。３つの標準試料についての平均Ａ４５０値は、０．５５１であった。
【０１０８】
【表１３】
2021531458.tif 000029
【０１０９】
実施例２
乾燥飼料トウモロコシをＲｏｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩミル（Ｒｏｍｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｇｅｔｚｅｒｄｏｒｆ，Ａｕｓｔｒｉａ））を使用して粉砕し、＃２０篩を通過させた。篩にかけたトウモロコシ（２ｇ）を、Ｃｏｒｔｉｓｏｌ  ＳＰＡＲＣＬアッセイキット（Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手）の８ｍＬの緩衝液に加えた。得られたスラリーを、３分間繰り返し反転させることによって混合した。試料の上澄みを、０．４５ミクロンのシリンジフィルタ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ  ＵＳＡ））を通して濾過した。アッセイキットの緩衝剤を使用して、希釈系列の５つの濾液を調製した（２×、４×、６×、８×、及び１０×）。非希釈試料及び各希釈系列について、８個の個々の試験試料を調製した。各試験試料に、異なる濃度のコルチゾールを添加した（２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１３ｎＭ、１．５６ｎＭ、０．７８ｎＭ、０．３９ｎＭ、又は０．２０ｎＭ）。対応する一連の標準試料を、コルチゾール溶液標準から調製した。ルシゲニン（５マイクロリットルの１０ｍｇ／ｍＬ水溶液）を、各試料（試験試料及び標準試料）に加えた。
【０１１０】
競合方式アッセイのために、まずコルチゾール添加試料（５０マイクロリットル）をプレート中のウェルに加えることによって、キットにおいて供給された９６ウェルプレート中に試料を調製した。各ウェルは、単一の試験試料又は標準試料を含有した。次に、２５マイクロリットルのコルチゾール−ＨＲＰコンジュゲート溶液を各ウェルに加え、プレートを３００ｒｐｍで３０秒間振盪した。次いで、抗コルチゾール−アクリダンコンジュゲート溶液（２５マイクロリットル）を各ウェルに加え、プレートを３００ｒｐｍで３０秒間振盪した。
【０１１１】
Ｔｕｒｎｅｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ＴＤ  ２０／２０ｎルミノメータ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して、３０マイクロリットルのトリガー溶液（アッセイキットから入手）を、アッセイプレートの各ウェルに加えた。この機器を、発光シグナルを６０秒間読み取り、同時に積分するように設定した（０．１秒積分時間）。（試験試料又は標準試料のいずれかの）分析物シグナルを、最初の２０秒の間測定し、平均した。フラッシュ発光シグナルを記録した後、５８秒及び５９秒の期間、第２の発光シグナル（試験試料又は標準試料のバックグラウンドシグナル）を記録し、平均した。
【０１１２】
表１４〜１９において、試験試料のバックグラウンドシグナル（ＲＬＵ）、標準試料のバックグラウンドシグナル（ＲＬＵ）、試験試料の分析物シグナル（ＲＬＵ）、標準試料の分析物シグナル（ＲＬＵ）、計算された倍率変更係数、及び試験試料の補正分析物シグナル（ＲＬＵ）の値を、各試料について報告する。
【０１１３】
各試験試料についての補正分析物シグナルが、対応する標準試料についての分析物シグナルの±７．５％以内であったかについての判定を、表２６に報告する。
【０１１４】
【表１４】
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【０１１５】
【表１５】
2021531458.tif 000031
【０１１６】
【表１６】
2021531458.tif 000032
【０１１７】
【表１７】
2021531458.tif 000033
【０１１８】
【表１８】
2021531458.tif 000034
【０１１９】
【表１９】
2021531458.tif 000035
【０１２０】
比較例Ｃ
試験試料のいずれにもルシゲニンを加えなかったことを除いて、実施例２に記載したものと手順と同じ手順に従った。表２０〜２５において、試験試料の分析物シグナル（ＲＬＵ）及び標準試料の分析物シグナル（ＲＬＵ）の値を、各試料について報告する。各試験試料についての分析物シグナルが、対応する標準試料についての分析物シグナルの±７．５％以内であったかについての判定を、表２７に報告する。
【０１２１】
【表２０】
2021531458.tif 000036
【０１２２】
【表２１】
2021531458.tif 000037
【０１２３】
【表２２】
2021531458.tif 000038
【０１２４】
【表２３】
2021531458.tif 000039
【０１２５】
【表２４】
2021531458.tif 000040
【０１２６】
【表２５】
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【０１２７】
【表２６】
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【０１２８】
【表２７】
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【０１２９】
実施例３
溶液相発光アッセイに対する、ルシゲニン、結合していない化学発光基質の効果を評価した。Ｃｏｒｔｉｓｏｌ  ＳＰＡＲＣＬアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を、競合方式で使用した。４つの異なる試料Ａ〜Ｄを調製した。試料Ａでは、アッセイキットの希釈剤を使用して、２５ｎＭのコルチゾール濃度を有するコルチゾール標準試料（５０マイクロリットル）を調製した。試料Ｂでは、コルチゾールを含有しない対照標準（５０マイクロリットル）を調製した（すなわち、試料Ａの希釈剤のみを含有した）。試料Ｃでは、５０マイクロリットルのコルチゾール標準試料を試料Ａと同様に調製し、５マイクロリットルの１０ｍｇ／ｍＬのルシゲニン水溶液を追加した。試料Ｄでは、５０マイクロリットルの対照標準試料を試料Ｂと同様に調製し、５マイクロリットルの１０ｍｇ／ｍＬのルシゲニン水溶液を追加した。試料Ａ〜Ｄ（それぞれ５０マイクロリットル）を、アッセイキットとともに提供された製造業者の指示に従って、個々に分析した。Ｔｕｒｎｅｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ＴＤ  ２０／２０ｎルミノメータ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して、トリガー溶液（１００μＬ）を、アッセイプレートの各ウェルに加えた。この機器を、トリガー溶液の添加後、１、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、及び６０秒の時点で、発光シグナルを読み取るように設定した。報告された発光値（ＲＬＵ）のそれぞれを、直前の１０個の０．１秒積分の平均として記録した。結果を表２８に報告する。
【０１３０】
【表２８】
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【国際調査報告】
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