(57)【要約】本発明は、植物内の遺伝子発現を調整するのに有用な組換えＤＮＡ分子及びコンストラクト、ならびにこれらのヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合した組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物の部位、及び種子も提供し、これらの使用方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡ分子であって、
ａ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかに対し少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかを含む配列、ならびに
ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかのフラグメント
からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、
前記ＤＮＡ配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合している、前記組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記配列が、配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかのＤＮＡ配列に対し少なくとも９０パーセントの配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記配列が、配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかのＤＮＡ配列に対し少なくとも９５パーセントの配列同一性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記ＤＮＡ配列が遺伝子調節活性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記異種の転写可能なＤＮＡ分子が農学的目的の遺伝子を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記農学的目的の遺伝子が、植物における除草剤耐性を付与する、請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記農学的目的の遺伝子が、植物における害虫抵抗性を付与する、請求項５に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記異種の転写可能なＤＮＡ分子が、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡをコードする、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
トランスジェニック植物細胞であって、
ａ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかに対し少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかを含む配列、ならびに
ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかのフラグメント
からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子を含み、
前記ＤＮＡ配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合している、前記トランスジェニック植物細胞。
【請求項１０】
前記トランスジェニック植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項９に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１１】
前記トランスジェニック植物細胞が双子葉植物細胞である、請求項９に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック植物またはその部位。
【請求項１３】
請求項１２に記載のトランスジェニック植物の後代植物またはその部位であって、前記組換えＤＮＡ分子を含む、前記後代植物またはその部位。
【請求項１４】
トランスジェニック種子であって、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を含む、前記トランスジェニック種子。
【請求項１５】
商品生産物を生産する方法であって、請求項１２に記載のトランスジェニック植物またはその部位を得ることと、そこから前記商品生産物を生産することとを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記商品生産物が、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物の部位、種子油、バイオマス、穀粉、または粗粉である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
転写可能なＤＮＡ分子を発現させる方法であって、請求項１２に記載のトランスジェニック植物を得ることと、前記植物を栽培することとを含み、前記転写可能なＤＮＡが発現する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１８年８月３日に出願された米国特許仮出願第６２／７１４，２２８号による利益を主張し、当該出願の全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の組み込み
「３８−２１−６２６９１−０００１＿Ｓｅｑｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、３１，０６０バイト（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）での計測）であり、２０１９年７月２日に作成されたものである。この配列表は、電子申請により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、植物内の遺伝子発現を調整するのに有用なＤＮＡ分子に関する。
【背景技術】
【０００４】
調節エレメントは、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の転写を調整することによって遺伝子活性を調節する遺伝子エレメントである。このようなエレメントとしては、プロモーター、リーダー、イントロン、及び３’非翻訳領域を挙げることができ、これらは、植物分子生物学及び植物遺伝子工学の分野で有用である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、植物で使用するための新規の合成遺伝子調節エレメントを提供する。本発明は、調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子コンストラクトも提供する。本発明は、調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子も提供する。１つの実施形態において、調節エレメントは、転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合している。ある特定の実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は、調節配列に対し異種であってもよい。したがって、本発明によって提供される調節エレメント配列は、特定の実施形態においては、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合していると定義することができる。また、本発明は、調節エレメントを使用し、調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子、ならびに転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合した調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、及び種子を作製及び使用する方法も提供する。
【０００６】
したがって、１つの態様において、本発明は、組換えＤＮＡ分子であって、（ａ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかに対し少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかを含む配列、ならびに（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含み、当該配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合している、組換えＤＮＡ分子を提供する。「異種の転写可能なＤＮＡ分子」とは、転写可能なＤＮＡ分子が、作動可能に結合したポリヌクレオチド配列に対し異種であることを意味する。特定の実施形態において、組換えＤＮＡ分子は、配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかのＤＮＡ配列に対し、少なくとも約８５パーセント、少なくとも約８６パーセント、少なくとも約８７パーセント、少なくとも約８８パーセント、少なくとも約８９パーセント、少なくとも約９０パーセント、少なくとも９１パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９３パーセント、少なくとも９４パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、または少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ配列は調節エレメントを含む。いくつかの実施形態において、調節エレメントはプロモーターを含む。さらに他の実施形態において、調節エレメントはイントロンを含む。さらに他の実施形態において、調節エレメントは３’ＵＴＲを含む。さらに他の実施形態において、異種の転写可能なＤＮＡ分子は、農学的目的の遺伝子、例えば、植物における除草剤抵抗性を提供可能な遺伝子、または植物における植物害虫耐性を提供可能な遺伝子を含む。さらに他の実施形態において、異種の転写可能なＤＮＡ分子は、低分子ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ）をコードする配列を含む。さらに他の実施形態において、本発明は、本明細書で提供される組換えＤＮＡ分子を含むコンストラクトを提供する。
【０００７】
別の態様において、本明細書では、トランスジェニック植物細胞であって、（ａ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかに対し少なくとも約８５パーセントの配列同一性を有する配列、（ｂ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかを含む配列、ならびに（ｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子を含み、当該ＤＮＡ配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合している、トランスジェニック植物細胞を提供する。ある特定の実施形態において、トランスジェニック植物細胞は単子葉植物細胞である。他の実施形態において、トランスジェニック植物細胞は双子葉植物細胞である。
【０００８】
さらにまた別の態様において、本明細書ではさらに、トランスジェニック植物またはその部位であって、ａ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかに対し少なくとも８５パーセントの配列同一性を有する配列、ｂ）配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかを含む配列、ならびにｃ）遺伝子調節活性を有する、配列番号１〜１９及び配列番号２６のいずれかのフラグメントからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、組換えＤＮＡ分子を含み、当該配列が、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合している、トランスジェニック植物またはその部位を提供する。特定の実施形態において、トランスジェニック植物は、組換えＤＮＡ分子を含む任意の世代の後代植物である。また、トランスジェニック種子であって、成長したときにこのようなトランスジェニック植物を産生する組換えＤＮＡ分子を含む、トランスジェニック種子も本明細書で提供される。
【０００９】
別の態様において、本発明は、商品生産物を生産する方法であって、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその一部を得ることと、それから商品生産物を生産することとを含む、方法を提供する。１つの実施形態において、商品生産物は、種子、加工種子、タンパク質濃縮物、タンパク質単離物、デンプン、穀物、植物の部位、種子油、バイオマス、穀粉、及び粗粉である。
【００１０】
さらにまた別の態様において、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を生産する方法であって、植物細胞を本発明の組換えＤＮＡ分子で形質転換して形質転換植物細胞を生産することと、形質転換植物細胞からトランスジェニック植物を再生することとを含む、方法を提供する。
【００１１】
配列の簡単な説明
配列番号１は、合成リーダー（Ｌ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３）と５’側で作動可能に結合した合成プロモーター（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４）を含む、合成調節発現エレメント群（ＥＸＰ）ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０のＤＮＡ配列である。
【００１２】
配列番号２は、合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４のＤＮＡ配列である。
【００１３】
配列番号３は、合成リーダーＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３のＤＮＡ配列である。
【００１４】
配列番号４は、合成イントロン（Ｉ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１）と５’側で作動可能に結合した、合成リーダー（Ｌ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーター（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４）を含む、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：２のＤＮＡ配列である。
【００１５】
配列番号５は、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１のＤＮＡ配列である。
【００１６】
配列番号６は、合成リーダー（Ｌ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：１）と５’側で作動可能に結合した合成プロモーター（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２）を含む、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０のＤＮＡ配列である。
【００１７】
配列番号７は、合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２のＤＮＡ配列である。
【００１８】
配列番号８は、合成リーダーＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：１のＤＮＡ配列である。
【００１９】
配列番号９は、合成イントロン（Ｉ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１）と５’側で作動可能に結合した、合成リーダー（Ｌ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：１）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーター（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２）を含む、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：２のＤＮＡ配列である。
【００２０】
配列番号１０は、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１のＤＮＡ配列である。
【００２１】
配列番号１１は、合成イントロン（Ｉ−Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１）と５’側で作動可能に結合した、合成リーダー（Ｌ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーター（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４）を含む、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１のＤＮＡ配列である。
【００２２】
配列番号１２は、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１のＤＮＡ配列である。
【００２３】
配列番号１３は、合成３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２のＤＮＡ配列である。
【００２４】
配列番号１４は、合成３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２のＤＮＡ配列である。
【００２５】
配列番号１５は、イントロン（Ｉ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１）と５’側で作動可能に結合した、合成リーダー（Ｌ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーター（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４）を含む、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１のＤＮＡ配列である。
【００２６】
配列番号１６は、イントロン（Ｉ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１）と５’側で作動可能に結合した、合成リーダー（Ｌ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：１）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーター（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２）を含む、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１のＤＮＡ配列である。
【００２７】
配列番号１７は、合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４に由来する合成エンハンサーＥ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０のＤＮＡ配列である。
【００２８】
配列番号１８は、合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２に由来する合成エンハンサーＥ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０のＤＮＡ配列である。
【００２９】
配列番号１９は、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒのＮＬＴＰ４（非特異的脂質輸送タンパク質４）遺伝子に由来する３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２のＤＮＡ配列である。
【００３０】
配列番号２０は、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の植物発現に最適化された合成コード配列である。
【００３１】
配列番号２１は、カリフラワーモザイクウイルスに由来する３５Ｓプロモーター及びリーダーを含むＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５ＳのＤＮＡ配列である。
【００３２】
配列番号２２は、Ｚｅａ  ｍａｙｓの熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）遺伝子（ＤｎａＫ）に由来するイントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１のＤＮＡ配列である。
【００３３】
配列番号２３は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａの脂質輸送タンパク質様遺伝子（ＬＴＰ）に由来する３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１のＤＮＡ配列である。
【００３４】
配列番号２４は、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のコード配列である。
【００３５】
配列番号２５は、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ蛍光タンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）のコード配列である。Ｎｌｕｃは、深海エビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）ルシフェラーゼの定向進化によって操作されたものである。
【００３６】
配列番号２６は、合成３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ４３．ｎｎｏ：１のＤＮＡ配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、植物における遺伝子調節活性を有する合成調節エレメントを提供する。このような合成調節エレメントのヌクレオチド配列は、配列番号１〜１８及び配列番号２６として提供される。このような合成調節エレメントは、植物組織内で、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼすことができ、そのため、トランスジェニック植物内で、作動可能に結合した導入遺伝子の遺伝子発現を調節することができる。また、本発明は、植物における遺伝子調節活性を有し配列番号１９として提供される、新規の内在的調節エレメントも提供する。また、本発明は、提供される合成及び内在的調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子を修飾、産生、及び使用する方法も提供する。また、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞、植物、植物の部位、及び種子を含む組成物、ならびにこれらを調製し使用するための方法も提供する。
【００３８】
以下の定義及び方法は、本発明をより良好に定義し、当業者が本発明を実施する指針とするために提供される。別段の記載がない限り、用語は、関連技術分野の当業者による従来的な使用法に従って理解するものとする。
【００３９】
ＤＮＡ分子
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」という用語は、５’（上流）末端から３’（下流）末端に読み取られるゲノム起源または合成起源の２本鎖ＤＮＡ分子（すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基の多量体またはＤＮＡ分子）を意味する。本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ配列」という用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。本明細書で使用される命名法は、米国連邦規則集３７編１．８２２条の命名法に対応し、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）附属書２の表、表１及び３に記載されている。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」とは、ヒトの介入なしで天然に同時に生じないと考えられるＤＮＡ分子の組合せを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子は、互いに異種の少なくとも２つのＤＮＡ分子から構成されたＤＮＡ分子、自然界に存在するＤＮＡ配列から逸脱するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝子形質転換もしくは遺伝子編集によって宿主細胞のＤＮＡ内に組み込まれたＤＮＡ分子とすることができる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「合成ヌクレオチド配列」または「人工ヌクレオチド配列」とは、自然界で生じることが知られていないか、または天然に生じないヌクレオチド配列である。本発明の遺伝子調節エレメントは、合成ヌクレオチド配列を含む。好ましくは、合成ヌクレオチド配列は、天然配列に対し相同性の拡張をほとんどまたは全く共有しない。この文脈における相同性の拡張とは、概して、隣接する配列の約２５ヌクレオチドより多く拡張する１００％の配列同一性を意味する。
【００４２】
本出願における「単離されたＤＮＡ分子」、または等価の用語もしくは表現への言及は、ＤＮＡ分子が、単独で、または他の組成物と組み合わせて存在するが、その自然環境内には存在しないものであることを意味するように意図されている。例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列などのような、生物のゲノムのＤＮＡ内で天然に見出される核酸エレメントは、当該エレメントが生物のゲノム内にあり、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にある限りは、「単離された」とは見なされない。ただし、これらのエレメントの各々、及びこれらのエレメントの下位部分は、当該エレメントが生物のゲノム内になく、当該エレメントが天然に見出されるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離されている」と考えられる。同様に、殺虫性タンパク質またはそのタンパク質の天然に生じる任意の殺虫性バリアントをコードするヌクレオチド配列は、当該ヌクレオチド配列が、当該タンパク質をコードする配列が天然に生じる細菌のＤＮＡ内にない限り、単離されたヌクレオチド配列と考えられる。天然に生じる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的において単離されていると見なされると考えられる。本開示の目的において、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノム内に挿入されるか、または染色体外ベクター内に存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが、細胞の形質転換に使用されるプラスミドもしくは同様の構造内に存在しても、植物もしくは細菌のゲノム内に存在しても、または植物もしくは細菌に由来する組織、後代、生物学的試料、もしくは商品生産物の中に検出可能量で存在しても、単離されたヌクレオチド配列であると見なされる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」という用語は、２つの最適にアラインメントしたポリヌクレオチド配列または２つの最適にアラインメントしたポリペプチド配列が同一である程度を意味する。最適な配列アラインメントは、２つの配列、例えば、参照配列ともう１つの配列とを手動でアラインメントして、適切な内部ヌクレオチド挿入、欠失、またはギャップを伴った配列アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を最大化することによって作成される。本明細書で使用する場合、「参照配列」という用語は、配列番号１〜１９及び配列番号２６として提供されるＤＮＡ配列を意味する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」または「％同一性」という用語は、同一性の割合に１００を掛けたものである。参照配列に対し最適にアラインメントした配列における「同一性の割合」は、最適アラインメント内のヌクレオチドマッチ数を、参照配列内のヌクレオチド総数、例えば、全長参照配列全体のヌクレオチドの総数で割ったものである。したがって、本発明の１つの実施形態は、本明細書で配列番号１〜１９及び配列番号２６として示される参照配列に対し最適にアラインメントした場合に、参照配列に対し、少なくとも約８５パーセントの同一性、少なくとも約８６パーセントの同一性、少なくとも約８７パーセントの同一性、少なくとも約８８パーセントの同一性、少なくとも約８９パーセントの同一性、少なくとも約９０パーセントの同一性、少なくとも約９１パーセントの同一性、少なくとも約９２パーセントの同一性、少なくとも約９３パーセントの同一性、少なくとも約９４パーセントの同一性、少なくとも約９５パーセントの同一性、少なくとも約９６パーセントの同一性、少なくとも約９７パーセントの同一性、少なくとも約９８パーセントの同一性、少なくとも約９９パーセントの同一性、または少なくとも約１００パーセントの同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子を提供する。参照分子に対し、あるパーセントの配列同一性を有するＤＮＡ分子は、参照配列の活性を示し得る。
【００４５】
調節エレメント
調節エレメント、例えば、プロモーター、リーダー（５’ＵＴＲの別名でも知られている）、エンハンサー、イントロン、及び転写終結領域（または３’ＵＴＲ）は、生細胞内での遺伝子の全体的発現において不可欠な役割を担っている。本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を意味する。本明細書で使用する場合、「遺伝子調節活性」という用語は、例えば、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の転写及び／または翻訳に影響を及ぼすことにより、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼす能力を意味する。植物内で機能する調節エレメント、例えば、プロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、及び３’ＵＴＲは、遺伝子工学による植物の表現型の修飾に有用である。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「調節発現エレメント群」または「ＥＸＰ」配列とは、作動可能に結合した調節エレメント群、例えば、エンハンサー、プロモーター、リーダー、及びイントロンを意味し得る。例えば、調節発現エレメント群は、例えば、リーダー配列と５’側で作動可能に結合したプロモーターから構成され得る。本発明を実施する上で有用なＥＸＰとしては、配列番号１、４、６、９、１１、１５、及び１６が挙げられる。
【００４７】
調節エレメントは、その遺伝子発現パターンによって特徴付けることができ、例えば、正及び／または負の効果、例えば、構成的発現または時間的、空間的、発達的、組織、環境的、生理学的、病理学的、細胞周期、及び／または化学的応答性の発現、ならびにこれらの任意の組合せ、加えて定量的または定性的指標によって特徴付けることができる。本明細書で使用する場合、「遺伝子発現パターン」とは、作動可能に結合したＤＮＡ分子を転写ＲＮＡ分子に転写する任意のパターンである。転写ＲＮＡ分子は、翻訳されてタンパク質分子を生成する場合もあれば、アンチセンスまたは他の調節ＲＮＡ分子、例えば、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などをもたらす場合もある。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「タンパク質発現」という用語は、転写ＲＮＡ分子をタンパク質分子に翻訳する任意のパターンである。タンパク質の発現は、その時間的、空間的、発達的、または形態学的な性質により、さらに定量的または定性的指標により、特徴付けることができる。
【００４９】
プロモーターは、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための調節エレメントとして有用である。本明細書で使用する場合、「プロモーター」という用語は、概して、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びその他のタンパク質（例えば、トランス作用転写因子）の認識及び結合に関与するＤＮＡ分子を意味する。プロモーターは、最初に、遺伝子のゲノムコピーの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から単離することができる。代替的に、プロモーターは、合成的に産生または操作されたＤＮＡ分子であってもよい。また、プロモーターはキメラであってもよい。キメラプロモーターは、２つ以上の異種ＤＮＡ分子の融合によって産生される。本発明を実施する上で有用なプロモーターとしては、配列番号２及び７として提供される、または配列番号１、４、６、９、１１、１５、及び１６のいずれかに含まれるプロモーターエレメント、あるいはこれらのフラグメントまたはバリアントが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、本明細書で説明される、特許請求対象のＤＮＡ分子及びその任意のバリアントまたは誘導体はさらに、プロモーター活性を含むものとして定義され、すなわち、トランスジェニック植物などの宿主細胞内でプロモーターとして作用することができる。なおさらなる特定の実施形態において、フラグメントが、由来する開始プロモーター分子が有するプロモーター活性を示すものとして定義される場合もあれば、フラグメントが、基礎レベルの転写をもたらし、転写開始するためにＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体が認識及び結合するためのＴＡＴＡボックスまたは同等のＤＮＡ配列から構成された「最小プロモーター」を含む場合もある。
【００５０】
１つの実施形態において、本明細書で開示されるＥＸＰ配列またはプロモーター配列のフラグメントが提供される。プロモーターフラグメントは、上記のようなプロモーター活性を含むことができ、また、単独で、または（例えば、キメラプロモーターを構築する際の）他のプロモーター及びプロモーターフラグメントとの組合せで、または他の発現エレメント及び発現エレメントフラグメントとの組合せで有用であり得る。特定の実施形態において、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続したヌクレオチド、またはそれ以上の、本明細書で開示されるプロモーター活性を有するＤＮＡ分子を含む、プロモーターのフラグメントが提供される。出発プロモーター分子からこのようなフラグメントを産生するための方法は、当技術分野で周知されている。
【００５１】
さらなる実施形態において、本明細書で開示されるエンハンサーまたはイントロン配列のフラグメントが提供される。エンハンサーまたはイントロンフラグメントは、それらが由来するベース分子の活性を含むことができ、単独で、または他の調節エレメント（プロモーター、リーダー、他のエンハンサー、他のイントロン、もしくはこれらのフラグメントを含む）との組合せで有用であり得る。特定の実施形態において、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続したヌクレオチド、またはそれ以上の、本明細書で開示されるエンハンサーまたはイントロン活性を有するＤＮＡ分子を含む、エンハンサーまたはイントロンのフラグメントが提供される。出発分子からこのようなフラグメントを産生するための方法は、当技術分野で周知されている。
【００５２】
他の実施形態において、本明細書で開示される３’ＵＴＲ配列のフラグメントが提供される。３’ＵＴＲフラグメントは、それらが由来するベース３’ＵＴＲ分子の活性を含むことができ、単独で、または他の調節エレメント（プロモーター、リーダー、イントロン、もしくはこれらのフラグメントを含む）との組合せで有用であり得る。特定の実施形態において、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続したヌクレオチド、またはそれ以上の、本明細書で開示される３’ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ分子を含む、イントロンのフラグメントが提供される。出発３’ＵＴＲ分子からこのようなフラグメントを産生するための方法は、当技術分野で周知されている。
【００５３】
配列番号２及び７として提供される、または配列番号１、４、６、９、１１、１５、及び１６のいずれかに含まれる（例えば、内部もしくは５’欠失）プロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物は、発現を改善または改変するために、当技術分野で知られている方法を用いて、例えば、発現に正もしくは負いずれかの効果を及ぼすエレメントの除去、発現に正もしくは負の効果を及ぼすエレメントの重複、及び／または発現に組織特異的もしくは細胞特異的な効果を及ぼすエレメントの重複もしくは除去を含む方法により、産生することができる。配列番号２及び７として提供される、または配列番号１、４、６、９、１１、１５、及び１６のいずれかに含まれる、ＴＡＴＡボックスエレメントもしくはその同等の配列及び下流配列が除去されている３’欠失から構成されたプロモーターエレメントのいずれかに由来する組成物を使用して、例えば、エンハンサーエレメントを作製することができる。さらなる欠失を行って、発現に正または負の組織特異的、細胞特異的、または時間特異的な（例えば、限定されるものではないが、概日リズム）効果を及ぼすエレメントを除去してもよい。配列番号２及び７として提供される、または配列番号１、４、６、９、１１、１５、及び１６のいずれかに含まれるプロモーターエレメント、ならびにこれらに由来するフラグメントまたはエンハンサーを使用して、キメラ転写調節エレメント組成物を作製することができる。
【００５４】
本発明においては、プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、既知のプロモーターエレメント、すなわち、ＴＡＴＡボックス及び他の既知の転写因子結合部位モチーフなどのＤＮＡ配列特性の存在について解析され得る。このような既知のプロモーターエレメントの識別情報は、当業者により、元のプロモーターと同様の発現パターンを有するプロモーターのバリアントを設計するために使用され得る。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「リーダー」という用語は、遺伝子の非翻訳５’領域（５’ＵＴＲ）から単離され、転写開始部位（ＴＳＳ）とタンパク質コード配列開始部位との間のヌクレオチドセグメントとして一般に定義されるＤＮＡ分子を意味する。代替的に、リーダーは、合成的に産生または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。リーダーは、作動可能に結合している転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための５’調節エレメントとして使用することができる。リーダー分子は、異種のプロモーターまたはそのネイティブプロモーターと共に使用することができる。本発明を実施する上で有用なリーダーとしては、配列番号３及び８、もしくは配列番号１、４、６、９、１１、１５、及び１６のいずれかに含まれるリーダーエレメントのいずれか、またはこれらのフラグメントもしくはバリアントが挙げられる。特定の実施形態において、このようなＤＮＡ配列は、宿主細胞（例えば、トランスジェニック植物細胞を含む）内でリーダーとして作用することができると定義することができる。１つの実施形態において、このような配列は、リーダー活性を含むものとしてデコードされる。
【００５６】
配列番号３及び８として提示されるリーダー配列（５’ＵＴＲとも称される）、または配列番号１、４、６、９、１１、１５、及び１６のいずれかに含まれるリーダーエレメントのいずれかは、調節エレメントから構成される場合もあれば、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の転写または翻訳に効果を及ぼし得る二次構造を採用する場合もある。配列番号３及び８として提示されるリーダー配列、または配列番号１、４、６、９、１１、１５、及び１６のいずれかに含まれるリーダーエレメントのいずれかを本発明に従って使用して、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の転写または翻訳に影響を与えるキメラ調節エレメントを作製することができる。 
【００５７】
本明細書で使用する場合、「イントロン」という用語は、遺伝子から単離または同定することができ、翻訳前のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）プロセシング中にスプライシング除去された領域として一般に定義することができる、ＤＮＡ分子を意味する。代替的に、イントロンは、合成的に生成または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。イントロンは、作動可能に結合した遺伝子の転写をもたらすエンハンサーエレメントを含むことができる。イントロンは、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための調節エレメントとして使用することができる。コンストラクトはイントロンを含むことができ、イントロンは、転写可能なＤＮＡ分子に対し異種であってもなくてもよい。当技術分野におけるイントロンの例としては、イネアクチンイントロン及びトウモロコシＨＳＰ７０イントロンが挙げられる。
【００５８】
植物において、遺伝子コンストラクトにいくつかのイントロンを含めると、イントロンを含まないコンストラクトに比べて、ｍＲＮＡ及びタンパク質の蓄積が増加する。この効果は、遺伝子発現の「イントロン媒介増強」（ＩＭＥ）と称される。植物内の発現を刺激することが知られているイントロンは、トウモロコシ遺伝子（例えば、ｔｕｂＡ１、Ａｄｈ１、Ｓｈ１、及びＵｂｉ１）やイネ遺伝子（例えば、ｔｐｉ）、ならびにペチュニア（例えば、ｒｂｃＳ）、ジャガイモ（例えば、ｓｔ−ｌｓ１）、及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（例えば、ｕｂｑ３及びｐａｔ１）のような双子葉植物遺伝子で同定されている。イントロンのスプライス部位内の欠失または変異によって遺伝子発現が低減することが示されており、このことは、ＩＭＥにはスプライシングが必要であり得ることを示すものである。ただし、双子葉植物におけるＩＭＥは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのｐａｔ１遺伝子のスプライス部位内の点変異によって示されている。１つの植物における同じイントロンの複数回使用は、デメリットを呈することが示されている。このような場合、適切な組換えＤＮＡエレメントを構築するための基本的な制御エレメントの集合を有することが必要になる。本発明を実施する上で有用な例示的なイントロンは、配列番号５、１０、及び１２として提示されている。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「３’転写終結分子」、「３’非翻訳領域」、または「３’ＵＴＲ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の３’部分の非翻訳領域に転写する間に使用されるＤＮＡ分子を意味する。ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域は、特異的切断及び３’ポリアデニル化（ポリＡテールの別名でも知られる）によって生成することができる。３’ＵＴＲは、転写可能なＤＮＡ分子に作動可能に結合し、その下流に位置することができ、また、転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響を及ぼすことができるポリアデニル化シグナル及びその他の調節シグナルを含むことができる。ポリＡテールは、ｍＲＮＡの安定性及び翻訳の開始において機能すると考えられている。当技術分野における３’転写終結分子の例としては、ノパリンシンターゼ３’領域、コムギｈｓｐ１７  ３’領域、エンドウルビスコ小サブユニット３’領域、ワタＥ６  ３’領域、及びコイクシン（ｃｏｉｘｉｎ）３’ＵＴＲがある。
【００６０】
３’ＵＴＲは、典型的には、特定のＤＮＡ分子の組換え発現に有益な用途が見出される。弱い３’ＵＴＲはリードスルーを生じる可能性を有し、このリードスルーにより、隣接する発現カセット内にあるＤＮＡ分子の発現に影響が及ぶ恐れがある。転写終結を適切に制御することにより、下流に局在するＤＮＡ配列（例えば、他の発現カセット）へのリードスルーを防止し、さらに、遺伝子発現を改善するためのＲＮＡポリメラーゼの効率的なリサイクルを可能にすることができる。効率的な転写終結（ＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩの解放）は、転写の再開の前提条件であり、これによって全体的な転写レベルに直接影響が及ぶ。転写終結に続いて、成熟ｍＲＮＡが合成部位から解放され、鋳型が細胞質に輸送される。真核生物のｍＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリ（Ａ）形態として蓄積されることから、従来の方法で転写終結部位を検出することは困難である。しかし、バイオインフォマティクス法により機能的かつ効率的に３’ＵＴＲを予測するのは、有効な３’ＵＴＲを容易に予測することを可能にする保存ＤＮＡ配列が存在しないため、困難である。
【００６１】
実際的な観点から、典型的には、発現カセットで使用される３’ＵＴＲが以下の特性を有することは有益である。最初に、３’ＵＴＲは、導入遺伝子の転写を効率的かつ有効に終結できるべきであり、かつ、１つの転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）内に存在する複数の発現カセットの場合のように別の発現カセットから構成され得る任意の隣接するＤＮＡ配列、またはＴ−ＤＮＡを挿入した隣接する染色体ＤＮＡへの転写物のリードスルーを防止できるべきである。次に、３’ＵＴＲは、ＤＮＡ分子の発現を促進するために使用されるプロモーター、リーダー、エンハンサー、及びイントロンが付与する転写活性の低減を引き起こすべきではない。最後に、植物バイオテクノロジーにおいて、３’ＵＴＲは、形質転換植物から抽出された逆転写ＲＮＡの増幅反応のプライミングに使用されることが多く、（１）植物染色体に一旦組み込まれた発現カセットの転写活性または発現の評価、（２）植物ＤＮＡ内の挿入物のコピー数の評価、及び（３）育種後に得られた種子の接合性の評価に使用される。また、３’ＵＴＲは、挿入されたカセットのインタクト性を特徴付けるために、形質転換植物から抽出されたＤＮＡの増幅反応にも使用される。本発明を実施する上で有用な３’ＵＴＲは、配列番号１３、１４、１９、及び２６として提示されている。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」という用語は、シス作用性調節エレメント（別名シスエレメント）を意味する。これは、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の全体的発現パターンの一態様をもたらすが、通常、単独では転写の駆動に不十分である。プロモーターとは異なり、通常、エンハンサーエレメントには、転写開始部位（ＴＳＳ）もしくはＴＡＴＡボックス、または同等のＤＮＡ配列が含まれていない。プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、天然に、作動可能に結合したＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼす１つ以上のエンハンサーエレメントを含むことができる。また、エンハンサーエレメントをプロモーターと融合させて、キメラプロモーターシスエレメントを産生することもでき、これにより遺伝子発現の全体的調整の一態様がもたらされる。
【００６３】
多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質に結合する、及び／またはＤＮＡトポロジーに影響を及ぼし、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ鋳型へのアクセスを選択的に許可もしくは制限する局所的立体構造、または転写開始部位での二重らせんの選択的開放を促進する局所的立体構造をもたらすと考えられている。エンハンサーエレメントは、転写を調節する転写因子に結合するように機能することができる。いくつかのエンハンサーエレメントが２つ以上の転写因子に結合し、転写因子は、異なる親和性で２つ以上のエンハンサードメインと相互作用することができる。エンハンサーエレメントの同定は、欠失解析（すなわち、プロモーターに対する５’末端もしくは内部から１つ以上のヌクレオチドを欠失させる）や、ＤＮアーゼＩフットプリンティングを用いたＤＮＡ結合タンパク質解析、メチル化干渉、電気泳動移動度シフトアッセイ、ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｉｎ  ｖｉｖｏゲノムフットプリンティング、及びその他の従来的なアッセイを含めた複数の技法により、または、ＢＬＡＳＴなどの従来のＤＮＡ配列比較法と共に標的配列もしくは標的モチーフとして、既知のシスエレメントモチーフもしくはエンハンサーエレメントを用いたＤＮＡ配列類似性解析により、行うことができる。エンハンサードメインの微細構造は、１つ以上のヌクレオチドの変異誘発（もしくは置換）により、または当技術分野で知られているその他の従来的な方法により、さらに研究することができる。エンハンサーエレメントは、化学合成により、またはこのようなエレメントを含む調節エレメントからの単離により得ることができ、これらは、部分配列の操作を容易にするための有用な制限酵素部位を含む追加の隣接ヌクレオチドと共に合成することができる。したがって、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための、本明細書で開示される方法に従ったエンハンサーエレメントの設計、構築、及び使用は、本発明に包含される。本発明を実施する上で有用な例示的なエンハンサーは、配列番号１７及び１８として提示される。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「キメラ」という用語は、第１のＤＮＡ分子を第２のＤＮＡ分子と融合させることによって産生される単一のＤＮＡ分子を意味し、第１のＤＮＡ分子も第２のＤＮＡ分子も、通常はこの構成（すなわち、他方と融合した構成）では見出されない。したがって、キメラＤＮＡ分子は、他の方法では通常は自然界に見出されない新規のＤＮＡ分子である。本明細書で使用する場合、「キメラプロモーター」という用語は、このようなＤＮＡ分子の操作によって産生されたプロモーターを意味する。キメラプロモーターは、２つ以上のＤＮＡフラグメントを組み合わせる（例えば、プロモーターをエンハンサーエレメントと融合させる）ことができる。したがって、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子の発現を調整するための、本明細書で開示される方法に従ったキメラプロモーターの設計、構築、及び使用は、本発明に包含される。
【００６５】
キメラ調節エレメントは、当技術分野で知られている様々な方法、例えば、制限酵素消化及びライゲーション、ライゲーション非依存的クローニング、増幅中のＰＣＲ産物のモジュラーアセンブリ、または調節エレメントの直接化学合成、ならびに当技術分野で知られているその他の方法によって、作動可能に結合することができる様々な構成エレメントを含むように設計することができる。得られる様々なキメラ調節エレメントは、同じ構成エレメントまたは同じ構成エレメントのバリアントから構成されてもよいが、構成部分が作動可能に結合するのを可能にする結合ＤＮＡ配列（１つまたは複数）を含むＤＮＡ配列（１つまたは複数）が異なる。本発明において、配列番号１〜１９及び配列番号２６として提供されるＤＮＡ配列は、調節エレメント参照配列を提供する場合があり、このとき、参照配列を構成する構成エレメントは、当技術分野で知られている方法によって連結することができ、また、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、及び／または挿入、あるいは変異を含むことができる。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、組成が第１のＤＮＡ分子と類似しているが同一ではない第２のＤＮＡ分子、例えば、調節エレメントを意味し、このとき、第２のＤＮＡ分子は、例えば、おおよそ同等の転写活性によって、第１のＤＮＡ分子の一般的な機能性、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを依然として維持する。バリアントは、第１のＤＮＡ分子のより短いもしくは短縮バージョン、または第１のＤＮＡ分子の配列の改変バージョン、例えば、制限酵素部位が異なる、及び／または内部の欠失、置換、もしくは挿入を有するバージョンであり得る。また、「バリアント」は、参照配列の１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を含むヌクレオチド配列を有する調節エレメントも包含することができ、このとき、誘導体調節エレメントは、対応する親調節分子よりも大きいまたは小さいまたは同等の転写または翻訳活性を有する。また、調節エレメント「バリアント」は、細菌及び植物細胞の形質転換で天然に生じる変異から生じるバリアントも包含する。本発明において、配列番号１〜１９及び配列番号２６として提供されるポリヌクレオチド配列を使用して、元の調節エレメントのＤＮＡ配列と組成が類似するが同一ではなく、一方で元の制御エレメントの一般的な機能性、すなわち、同じまたは同様の発現パターンを依然として維持する、バリアントを創出することができる。本発明のこのようなバリアントの産生は、本開示に照らして当業者の通常の技量範囲内であり、本発明の範囲内に包含される。
【００６７】
本明細書で説明される修飾、重複、または欠失における、特定の導入遺伝子の所望の発現態様に対する有効性は、安定した一過性の植物アッセイ、例えば、本明細書の作業実施例で説明されるアッセイで、経験的に試験して結果を検証することができる。結果は、出発ＤＮＡ分子に行う変更、及び変更の目的に応じて異なり得る。
【００６８】
コンストラクト
本明細書で使用する場合、「コンストラクト」という用語は、任意の供給源に由来し、ゲノム統合または自己複製が可能であり、少なくとも１つのＤＮＡ分子が別のＤＮＡ分子と機能的に作動する方式で結合した、すなわち作動可能に結合したＤＮＡ分子を含む、任意の組換えＤＮＡ分子、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または線状もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を意味する。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、形質転換、すなわち、宿主細胞内に異種のＤＮＡまたはＲＮＡを導入する目的で使用することができる任意のコンストラクトを意味する。コンストラクトは、典型的には、１つ以上の発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「発現カセット」とは、１つ以上の調節エレメント、典型的には少なくともプロモーター及び３’ＵＴＲと作動可能に結合した、少なくとも１つの転写可能なＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子を意味する。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「作動可能に結合した」という用語は、第１のＤＮＡ分子が第２のＤＮＡ分子と連結し、第１のＤＮＡ分子が第２のＤＮＡ分子の機能に影響を及ぼすように第１及び第２のＤＮＡ分子が配置されていることを意味する。２つのＤＮＡ分子は、単一の連続したＤＮＡ分子の一部である場合もそうでない場合もあり、隣接する場合もそうでない場合もある。例えば、プロモーターが細胞内の目的となる転写可能なＤＮＡ分子の転写を調整する場合、プロモーターは転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合している。例えば、リーダーは、ＤＮＡ配列の転写または翻訳に影響を及ぼすことができる場合、ＤＮＡ配列と作動可能に結合している。
【００７０】
本発明のコンストラクトは、１つの実施形態において、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞がもたらす転移分子と共に、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞のゲノム内への統合を可能にするＴ−ＤＮＡを含む、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから単離された二重腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドの右側ボーダー（ＲＢまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）及び左側ボーダー（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）領域を有するＴｉプラスミドボーダーコンストラクトとして提供することができる（例えば、米国特許第６，６０３，０６１号を参照）。また、コンストラクトは、細菌細胞における複製機能及び抗生物質選択をもたらすプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、例えば、ｏｒｉ３２２などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ複製開始点、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉなどの広宿主域複製開始点、及びスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードするＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐなどの選択マーカー、またはゲンタミシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカー遺伝子についてのコード領域も含むことができる。植物形質転換については、宿主細菌株は、多くの場合Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＡＢＩ、Ｃ５８、またはＬＢＡ４４０４であるが、植物形質転換の技術分野において当業者に知られているその他の株も、本発明では機能し得る。
【００７１】
転写可能なＤＮＡ分子が、タンパク質として翻訳及び発現される機能的ｍＲＮＡ分子に転写されるような方式で、コンストラクトを集成し細胞内に導入するための方法が、当技術分野で知られている。本発明の実施については、コンストラクト及び宿主細胞を調製及び使用するための従来的な組成物及び方法は、当業者に周知されている。より高等な植物内での核酸の発現に有用である典型的なベクターは当技術分野で周知されており、これにはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来するベクター及びｐＣａＭＶＣＮ転移制御ベクターが含まれる。
【００７２】
本明細書で提供される任意の調節エレメントを含めた様々な調節エレメントをコンストラクトに含めることができる。任意のこのような調節エレメントは、他の調節エレメントと組み合わせて提供することができる。このような組合せは、望ましい調節機能をもたらすように設計または修飾することができる。１つの実施形態において、本発明のコンストラクトは、３’ＵＴＲと作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合した、少なくとも１つの調節エレメントを含む。
【００７３】
本発明のコンストラクトは、本明細書で提供されるか、または当技術分野で知られている任意のプロモーターまたはリーダーを含むことができる。例えば、本発明のプロモーターは、異種の非翻訳５’リーダー（例えば、熱ショックタンパク質遺伝子に由来するもの）と作動可能に結合することができる。代替的に、本発明のリーダーは、異種のプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物プロモーター）と作動可能に結合することができる。
【００７４】
発現カセットは、作動可能に結合したタンパク質が、特に葉緑体、白色体、もしくは他の色素体細胞小器官、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、液胞、または細胞外の位置に対し、細胞レベル以下で標的化するのに有用なペプチドをコードする、輸送ペプチドコード配列も含むことができる。多くの葉緑体局在化タンパク質は、核遺伝子から前駆体として発現し、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体に標的化される。このような単離された葉緑体タンパク質の例としては、限定されるものではないが、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、集光性複合タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、ならびにエノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）に関連するものが挙げられる。葉緑体輸送ペプチドは、例えば、米国特許第７，１９３，１３３号で説明されている。非葉緑体タンパク質は、非葉緑体タンパク質をコードする導入遺伝子と作動可能に結合した異種ＣＴＰを発現させることにより、葉緑体を標的化させ得ることが実証されている。
【００７５】
転写可能なＤＮＡ分子
本明細書で使用する場合、「転写可能なＤＮＡ分子」という用語は、ＲＮＡ分子への転写が可能な任意のＤＮＡ分子を意味し、これには、限定されるものではないが、タンパク質コード配列を有する分子や、遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を産生する分子が含まれる。ＤＮＡ分子のタイプとしては、限定されるものではないが、同じ植物からのＤＮＡ分子、別の植物からのＤＮＡ分子、異なる生物からのＤＮＡ分子、あるいは合成ＤＮＡ分子、例えば、遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ分子、または人工、合成、もしくは別の方法で修飾された導入遺伝子バージョンをコードするＤＮＡ分子を挙げることができる。本発明のコンストラクトに組み込むための例示的な転写可能なＤＮＡ分子としては、例えば、ＤＮＡ分子を組み込む種以外の種からのＤＮＡ分子もしくは遺伝子、または同じ種から生じるもしくは同じ種に存在するが、古典的な育種技法ではなく遺伝子工学の方法によってレシピエント細胞に組み込まれる遺伝子が挙げられる。
【００７６】
「導入遺伝子」とは、少なくとも宿主細胞ゲノム内の位置に関して宿主細胞に対し異種である転写可能なＤＮＡ分子、及び／または細胞の現行世代もしくは任意の過去の世代に人工的に宿主細胞のゲノムに組み込まれた転写可能なＤＮＡ分子を意味する。
【００７７】
調節エレメント、例えば、本発明のプロモーターは、調節エレメントに対し異種である転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合していてもよい。本明細書で使用する場合、２つ以上のＤＮＡ分子の組合せが自然界で通常は見出されないとき、「異種」という用語は、このような２つ以上のＤＮＡ分子の組合せを意味する。例えば、２つのＤＮＡ分子は異なる種に由来してもよく、及び／または２つのＤＮＡ分子は異なる遺伝子に由来してもよい（例えば、同じ種からの異なる遺伝子、または異なる種からの同じ遺伝子に由来してもよい）。したがって、調節エレメントは、作動可能に結合した転写可能なＤＮＡ分子に対し、このような組合せが自然界で通常は見出されない場合、すなわち、転写可能なＤＮＡ分子が、調節エレメントと作動可能に結合して天然に生じない場合、異種である。
【００７８】
転写可能なＤＮＡ分子は、概して、転写物の発現が所望される任意のＤＮＡ分子であり得る。このような転写物の発現により、結果として生じるｍＲＮＡ分子の翻訳、よってタンパク質発現がもたらされ得る。代替的に、例えば、転写可能なＤＮＡ分子は、最終的に、特定の遺伝子またはタンパク質の発現低下を引き起こすように設計されてもよい。１つの実施形態において、これは、アンチセンス方向に配向した転写可能なＤＮＡ分子を使用することによって達成することができる。当業者は、このようなアンチセンス技術の使用に精通している。この方式で任意の遺伝子を負に調節することができ、１つの実施形態においては、転写可能なＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子の発現を介して特定の遺伝子を抑制するように設計することができる。
【００７９】
したがって、本発明の１つの実施形態は、本発明の調節エレメント（例えば、配列番号１〜１９及び配列番号２６として提供されるもの）を含む組換えＤＮＡ分子であって、コンストラクトがトランスジェニック植物細胞のゲノム内で統合されたときに、転写可能なＤＮＡ分子の転写を所望のレベルまたは所望のパターンで調整するように異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合している、組換えＤＮＡ分子である。１つの実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のタンパク質コード領域を含み、別の実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は遺伝子のアンチセンス領域を含む。
【００８０】
農学的目的の遺伝子
転写可能なＤＮＡ分子は、農学的目的の遺伝子であり得る。本明細書で使用する場合、「農学的目的の遺伝子」という用語は、特定の植物組織、細胞、または細胞タイプで発現したときに、望ましい特性を付与する転写可能なＤＮＡ分子を意味する。農学的目的の遺伝子の産物は、植物の形態、生理学、成長、発達、収量、穀粒組成、栄養プロファイル、病害もしくは害虫抵抗性、及び／または環境的もしくは化学的耐性に対する効果を引き起こすために植物内で作用する場合もあれば、植物を常食とする害虫の餌に殺虫剤として作用する場合もある。本発明の１つの実施形態において、本発明の調節エレメントは、調節エレメントが、農学的目的の遺伝子である転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合するように、コンストラクト内に組み込まれる。このようなコンストラクトを含むトランスジェニック植物において、農学的目的の遺伝子の発現は、有益な農学的形質を付与することができる。有益な農学的形質としては、例えば、限定されるものではないが、除草剤耐性、昆虫防除、改変された収量、疾患抵抗性、病原体抵抗性、改変された植物成長及び発達、改変されたデンプン含量、改変された油含量、改変された脂肪酸含量、改変されたタンパク質含量、改変された果実成熟、動物及びヒトの栄養強化、生体高分子産生、環境ストレス抵抗性、医薬品ペプチド、加工品質の改善、風味の改善、ハイブリッド種子産生有用性、繊維産生の改善、ならびに望ましいバイオ燃料産生を挙げることができる。
【００８１】
当技術分野で知られている農学的目的の遺伝子の非限定的な例としては、除草剤抵抗性（米国特許第６，８０３，５０１号；第６，４４８，４７６号；第６，２４８，８７６号；第６，２２５，１１４号；第６，１０７，５４９号；第５，８６６，７７５号；第５，８０４，４２５号；第５，６３３，４３５号；及び第５，４６３，１７５号）、収量増加（米国特許第ＵＳＲＥ３８，４４６号；第６，７１６，４７４号；第６，６６３，９０６号；第６，４７６，２９５号；第６，４４１，２７７号；第６，４２３，８２８号；第６，３９９，３３０号；第６，３７２，２１１号；第６，２３５，９７１号；第６，２２２，０９８号；及び第５，７１６，８３７号）、昆虫防除（米国特許第６，８０９，０７８号；第６，７１３，０６３号；第６，６８６，４５２号；第６，６５７，０４６号；第６，６４５，４９７号；第６，６４２，０３０号；第６，６３９，０５４号；第６，６２０，９８８号；第６，５９３，２９３号；第６，５５５，６５５号；第６，５３８，１０９号；第６，５３７，７５６号；第６，５２１，４４２号；第６，５０１，００９号；第６，４６８，５２３号；第６，３２６，３５１号；第６，３１３，３７８号；第６，２８４，９４９号；第６，２８１，０１６号；第６，２４８，５３６号；第６，２４２，２４１号；第６，２２１，６４９号；第６，１７７，６１５号；第６，１５６，５７３号；第６，１５３，８１４号；第６，１１０，４６４号；第６，０９３，６９５号；第６，０６３，７５６号；第６，０６３，５９７号；第６，０２３，０１３号；第５，９５９，０９１号；第５，９４２，６６４号；第５，９４２，６５８号；５，８８０，２７５号；第５，７６３，２４５号；及び第５，７６３，２４１号）、真菌病害抵抗性（米国特許第６，６５３，２８０号；第６，５７３，３６１号；第６，５０６，９６２号；第６，３１６，４０７号；第６，２１５，０４８号；第５，５１６，６７１号；第５，７７３，６９６号；第６，１２１，４３６号；第６，３１６，４０７号；及び第６，５０６，９６２号）、ウイルス抵抗性（米国特許第６，６１７，４９６号；第６，６０８，２４１号；第６，０１５，９４０号；第６，０１３，８６４号；第５，８５０，０２３号；及び第５，３０４，７３０号）、線虫抵抗性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌病害抵抗性（米国特許第５，５１６，６７１号）、植物成長及び発達（米国特許第６，７２３，８９７及び第６，５１８，４８８号）、デンプン産生（米国特許第６，５３８，１８１号；第６，５３８，１７９号；第６，５３８，１７８号；第５，７５０，８７６号；第６，４７６，２９５号）、改変された油産生（米国特許第６，４４４，８７６号；第６，４２６，４４７号；第６，３８０，４６２号）、高い油産生（米国特許第６，４９５，７３９号；第５，６０８，１４９号；第６，４８３，００８号；及び第６，４７６，２９５号）、改変された脂肪酸含量（米国特許第６，８２８，４７５号；第６，８２２，１４１号；第６，７７０，４６５号；第６，７０６，９５０号；第６，６６０，８４９号；第６，５９６，５３８号；第６，５８９，７６７号；第６，５３７，７５０号；第６，４８９，４６１号；第６，４５９，０１８号）、高いタンパク質産生（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実成熟（米国特許第５，５１２，４６６号）、動物及びヒトの栄養強化（米国特許第６，７２３，８３７号；第６，６５３，５３０号；第６，５４１２，５９号；第５，９８５，６０５号；第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国特許第ＵＳＲＥ３７，５４３号；第６，２２８，６２３号；及び第５，９５８，７４５号、及び第６，９４６，５８８号）、環境ストレス抵抗性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬ペプチド及び分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号；第６，７７４，２８３号；第６，１４０，０７５号；及び第６，０８０，５６０号）、プロセシング形質の改善（米国特許第６，４７６，２９５号）、消化率の改善（米国特許第６，５３１，６４８号）、低いラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、工業用酵素産生（米国特許第５，５４３，５７６号）、風味の改善（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、ハイブリッド種子産生（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維産生（米国特許第６，５７６，８１８号；第６，２７１，４４３号；第５，９８１，８３４号；及び第５，８６９，７２０号）、ならびにバイオ燃料産生（米国特許第５，９９８，７００号）が挙げられる。
【００８２】
代替的に、農学的目的の遺伝子は、内在的遺伝子の遺伝子発現の標的化された調整を引き起こすＲＮＡ分子をコードすることにより、例えば、アンチセンス（例えば、米国特許５，１０７，０６５号を参照）、阻害ＲＮＡ（「ＲＮＡｉ」；例えば、公開出願Ｕ．Ｓ．２００６／０２００８７８及びＵ．Ｓ．２００８／００６６２０６、ならびに米国特許出願第１１／９７４，４６９号で説明されているように、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、トランス作用ｓｉＲＮＡ、及びフェーズｓＲＮＡが媒介する機構による遺伝子発現の調整が含まれる）、または共抑制が媒介する機構により、上記の植物の特性または表現型に影響を及ぼすことができる。また、ＲＮＡは、所望の内在的ｍＲＮＡ産物を切断するように操作された触媒ＲＮＡ分子（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ；例えば、Ｕ．Ｓ．２００６／０２００８７８を参照）であってもよいと考えられる。転写可能なＤＮＡ分子が遺伝子抑制を引き起こすことができる分子に転写されるような方式で、コンストラクトを構築し細胞内に導入するための方法が、当技術分野で知られている。
【００８３】
選択マーカー
選択マーカー導入遺伝子を本発明の調節エレメントと共に使用してもよい。本明細書で使用する場合、「選択マーカー導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック植物、組織、もしくは細胞内の発現、または発現の欠如が何らかの方法でスクリーニングまたはスコアリングすることができる、任意の転写可能なＤＮＡ分子を意味する。本発明を実施する上で使用するための選択マーカー遺伝子、及びその関連する選択及びスクリーニング技法は当技術分野で知られており、これには、限定されるものではないが、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗生物質抵抗性を付与するタンパク質、及び除草剤耐性を付与するタンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子が含まれる。選択マーカー導入遺伝子の例は、配列番号２０及び２４として提供される。
【００８４】
細胞形質転換
本発明は、形質転換された細胞及び植物を産生する方法であって、転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合した１つ以上の調節エレメントを含む、方法も対象とする。
【００８５】
「形質転換」という用語は、ＤＮＡ分子をレシピエント宿主内に導入することを意味する。本明細書で使用する場合、「宿主」という用語は細菌、真菌、または植物を意味し、これには、任意の細胞、組織、器官、または細菌、真菌、もしくは植物の後代が含まれる。特に目的となる植物組織及び細胞としては、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、及び花粉が挙げられる。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「形質転換された」という用語は、外来ＤＮＡ分子（例えば、コンストラクト）が導入された細胞、組織、器官、または生物を意味する。導入されたＤＮＡ分子をレシピエント細胞、組織、器官、または生物のゲノムＤＮＡに組み込んで、導入されたＤＮＡ分子が次の後代に受け継がれるようにすることができる。「トランスジェニック」または「形質転換された」細胞または生物には、細胞または生物の後代、及び交配でこのようなトランスジェニック生物を親として用いた育種プログラムから産生され、外来ＤＮＡ分子の存在によって生じる表現型の改変を示す後代も含まれ得る。また、導入されたＤＮＡ分子をレシピエント細胞内に一過性に導入して、導入されたＤＮＡ分子が次の後代に受け継がれないようにすることもできる。「トランスジェニック」という用語は、１つ以上の異種のＤＮＡ分子を含む細菌、真菌、または植物を意味する。
【００８７】
ＤＮＡ分子を植物細胞内に導入するための方法は多数存在し、当業者に周知されている。このプロセスは、概して、好適な宿主細胞を選択するステップと、宿主細胞をベクターで形質転換するステップと、形質転換宿主細胞を得るステップとを含む。本発明を実施する上で、植物コンストラクトを植物ゲノム内に導入することにより植物細胞を形質転換するための方法及び材料には、任意の周知され実証された方法が含まれ得る。好適な方法としては、限定されるものではないが、中でも細菌感染（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バイナリーＢＡＣベクター、ＤＮＡの直接送達（例えば、ＰＥＧ媒介の形質転換、乾燥／阻害媒介のＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維による撹拌、及びＤＮＡコーティング粒子の加速）、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム）が挙げられる。
【００８８】
宿主細胞は、任意の細胞または生物、例えば、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞とすることができる。特定の実施形態において、宿主細胞及び形質転換細胞には、作物植物からの細胞が含まれ得る。
【００８９】
トランスジェニック植物は、その後、本発明のトランスジェニック植物細胞から再生させることができる。従来の育種技法または自家受粉を用いて、このトランスジェニック植物から種子を産生することができる。このような種子、及びこのような種子から成長した結果生じる後代植物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含み、そのためトランスジェニックとなる。
【００９０】
本発明のトランスジェニック植物は、自家受粉して（組換えＤＮＡ分子に対してホモ接合性の）本発明のホモ接合性トランスジェニック植物の種子を提供することができ、または非トランスジェニック植物もしくは異なるトランスジェニック植物と交配して、（組換えＤＮＡ分子に対しヘテロ接合性の）本発明のヘテロ接合性トランスジェニック植物の種子を提供することができる。このようなホモ接合性及びヘテロ接合性のトランスジェニック植物は共に、本明細書では「後代植物」と称される。後代植物は、元のトランスジェニック植物に由来し本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物である。本発明のトランスジェニック植物を用いて産生した種子は、収穫し、本発明のコンストラクトを含み農学的目的の遺伝子を発現するトランスジェニック植物、すなわち本発明の後代植物の世代を成長させるために使用することができる。種々の作物に一般に使用されている育種の方法についての説明は、いくつかの参考文献の１つから見出すことができる。例えば、Ａｌｌａｒｄ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｕ．ｏｆ  ＣＡ，Ｄａｖｉｓ，ＣＡ，５０−９８（１９６０）；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，３６９−３９９（１９７９）；Ｓｎｅｅｐ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，Ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ（ｅｄ），Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１９７９）；Ｆｅｈｒ，Ｓｏｙｂｅａｎｓ：  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，１６：２４９（１９８７）；Ｆｅｈｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，（Ｖｏｌ．１）ａｎｄ  Ｃｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｏｙｂｅａｎ（Ｖｏｌ．２），Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ＮＹ，３６０−３７６（１９８７）を参照。
【００９１】
形質転換植物は、目的の遺伝子（１つまたは複数）の存在、ならびに本発明の調節エレメントが付与する発現レベル及び／またはプロファイルについて解析され得る。当業者は、形質転換植物の解析に利用できる多数の方法を認識している。例えば、植物解析の方法としては、限定されるものではないが、サザンブロットまたはノーザンブロット、ＰＣＲベースのアプローチ、生化学的解析、表現型スクリーニング法、現地評価、及び免疫診断アッセイが挙げられる。転写可能なＤＮＡ分子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））の試薬及び製造業者が説明する方法、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘを用いて決定したＰＣＲサイクル時間を用いて測定することができる。代替的に、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））の試薬及び製造業者が説明する方法を使用して、導入遺伝子の発現を評価してもよい。
【００９２】
本発明は、本発明の植物の部位も提供する。植物の部位としては、限定されるものではないが、葉、茎、根、塊茎、種子、胚乳、胚珠、及び花粉が挙げられる。本発明の植物の部位は、生存可能、生存不能、再生可能、及び／または再生不可能であり得る。また、本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換植物細胞も含み、これを提供する。本発明の形質転換またはトランスジェニック植物細胞には、再生可能及び／または再生不可能な植物細胞が含まれる。
【００９３】
また、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその一部から産生される商品生産物も提供する。本発明の商品生産物は、配列番号１〜１９及び配列番号２６からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む、ある検出可能量のＤＮＡを含む。本明細書で使用する場合、「商品生産物」とは、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物、種子、植物細胞、または植物の部位に由来する材料から構成される任意の組成物または産物を意味する。商品生産物としては、限定されるものではないが、加工された種子、穀物、植物の部位、及び粗粉が挙げられる。本発明の商品生産物は、本発明の組換えＤＮＡ分子に対応する、ある検出可能量のＤＮＡを含むことになる。商品生産物の含量または供給源を決定するために、試料中での１つ以上のこのＤＮＡの検出を使用することができる。本明細書で開示される検出方法を含めて、任意の標準的なＤＮＡ分子の検出方法を使用することができる。
【００９４】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解することができる、この実施例は、明記されない限り、例示として示されるものであり、本発明を限定するようには意図されていない。当業者は、以下の実施例で開示される技法が、発明者によって発見された、本発明を実施する上で十分に機能するための技法に相当することを、理解するはずである。ただし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、類似のまたは同様の結果が得られることを理解するはずである。そのため、添付の図面に記載または示された全ての内容は例示的なものとして解釈するものとし、限定的な意味では解釈しないものとする。
【実施例】
【００９５】
実施例１
合成調節エレメントの設計、合成、及びクローニング
新規の合成転写調節エレメントは、アルゴリズム法によって設計された合成発現エレメントである。計算的に設計されたこれらの調節エレメントを化学合成及びクローン化して、合成調節発現エレメント群（ＥＸＰ）を作製した。１，０００を十分に上回る合成調節エレメントを設計し、トウモロコシプロトプラスト及び安定的に形質転換したトウモロコシ植物においてアッセイして、所望の特性（例えば、タンパク質の発現レベル及び発現パターン）をもたらす合成調節エレメントを同定した。本発明の合成エレメントは、多くの異なるコード配列及び農学的目的の干渉ＲＮＡの発現を駆動するのに有用な様々なパターンの構成的発現をもたらす。
【００９６】
設計した合成転写調節エレメントは、自然界に存在するいかなる既知の核酸配列との相同性も拡張していないが、それでもなお、天然に生じるプロモーター、リーダー、イントロン、及び３’ＵＴＲと同じ方式で、作動可能に結合したコード配列の転写に影響を及ぼす。合成ＥＸＰ及びこれに対応する合成プロモーター、リーダー、イントロン、及び合成３’ＵＴＲを表１に提示する。合成ＥＸＰは、当技術分野で知られている方法を使用して、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コード配列と作動可能に結合したバイナリー植物形質転換ベクター内でクローンし、安定的に形質転換したトウモロコシ植物における発現のレベル及びパターンを評価した。
【００９７】
調節エレメントＴＳＳ及びイントロン／エクソンスプライスジャンクションの解析は、形質転換植物組織を用いて実施することができる。簡潔に説明すると、異種の転写可能なＤＮＡ分子と作動可能に結合したクローン化ＤＮＡフラグメントを含む植物発現ベクターで、植物を形質転換した。次に、５’  ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２００８））を使用して、産生したｍＲＮＡ転写産物のＤＮＡ配列を解析することにより、調節エレメントＴＳＳ及びイントロン／エクソンスプライスジャンクションを確認した。合成３’ＵＴＲを、遺伝子発現に及ぼす効果及び転写産物の適切な終結について特徴付けた。
【００９８】
合成発現エレメントに加えて、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒの非特異的脂質輸送タンパク質４遺伝子に由来する新規の内在的３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２を本明細書で提供し、配列番号１９として提示する。Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２を、合成３’ＵＴＲと同様の方式で特徴付けた。
【表１】
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【００９９】
実施例２
トウモロコシ葉プロトプラストにおけるＧＵＳを駆動する合成調節エレメントの解析
トウモロコシ葉プロトプラストをベクターで、具体的には、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験調節エレメントを含む発現ベクターで、形質転換した。得られた形質転換トウモロコシ葉プロトプラストをＧＵＳタンパク質発現について解析して、選択した調節エレメントが発現に及ぼす効果を評価した。
【０１００】
葉組織に由来するトウモロコシプロトプラストを、合成発現エレメントを含む発現ベクターで形質転換した。トウモロコシプロトプラストにおけるこれらの合成発現エレメントベクターの発現のレベル及びパターンを、当技術分野で知られている発現エレメントの発現のレベル及びパターンと比較した。別々の実験を行って、ＥＸＰについてＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０（配列番号１）及びＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０（配列番号６）、イントロンについてＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１（配列番号５）及びＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１（配列番号１０）、３’ＵＴＲについてＴ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２（配列番号１３）及びＴ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２（配列番号１４）の活性を評価した。発現エレメントを発現ベクター内でクローンし、プロセシング可能なイントロンを含むＧＵＳコード配列、ＧＯＩ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１：１：１（配列番号２４）と作動可能に結合した。対照発現ベクターは、異なる構成の既知の発現エレメントを含み、この発現エレメントは、評価対象のエレメントのタイプ（ＥＸＰ、イントロン、または３’ＵＴＲ）に応じて変化した。当技術分野で知られている方法を用いて、プロトプラストの同時形質転換及びデータの正規化で使用するプラスミドも構築した。このプラスミドは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１（配列番号２３）と５’側で作動可能に結合したＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ蛍光タンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１））をコードするコード配列（本明細書ではＮｌｕｃ（配列番号２５）と称される）と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ（配列番号２１）から構成された導入遺伝子カセットを含んでいた。
【０１０１】
トウモロコシ葉プロトプラストを、当技術分野で知られているものと同様に、ＰＥＧベース形質転換法を用いて形質転換した。プロトプラスト細胞を９６ウェル形式で形質転換した。１２マイクログラムの試験ベクターＤＮＡまたは対照ベクターＤＮＡと、６マイクログラムのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ベクターＤＮＡとを、ウェル当たり３．２×１０５個のプロトプラストの形質転換に使用した。形質転換後、プロトプラストを暗中２５℃で１６〜２０時間インキュベートした。インキュベート後、プロトプラストを溶解し、溶解物を使用してルシフェラーゼ及びＧＵＳの発現を測定した。細胞を溶解するため、プレート内の細胞を遠心分離によりペレット化し、洗浄し、小体積で再懸濁し、ストリップウェルチューブに移した。チューブを再び遠心分離し、上清を吸引してプロトプラスト細胞ペレットを残した。細胞ペレットをＱＢバッファー（１００ｍＭ  ＫＰＯ４、ｐＨ７．８；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％トリトンＸ−１００；１０％グリセロール；１ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を数回激しくピペッティングし、チューブをボルテックスし、チューブを氷上で５分間インキュベートすることにより、細胞を溶解した。次いで、溶解物を遠心分離して細胞デブリをペレット化した。次いで、得られた溶解物を清潔なプレートに移した。
【０１０２】
ＱＢバッファー中のＮａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１））でルシフェラーゼ活性をアッセイした。簡潔には、小体積の溶解液、ＱＢバッファー、及びＮａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ／ＱＢ溶液を、白色の９６ウェルプレート内で一緒に混合した。次いで、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）プレートリーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ  Ｉｎｃ．（Ｃａｒｙ，ＮＣ  ２７５１３））を用いて蛍光を測定した。
【０１０３】
５０マイクロリットルの総反応体積で蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）を用いてＧＵＳ活性をアッセイした。反応産物４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）は高ｐＨで最大限に蛍光性となり、このときヒドロキシル基がイオン化される。炭酸ナトリウムの塩基性溶液を添加すると、アッセイが停止し、同時に蛍光産物を定量化するためのｐＨが調整される。溶解物のアリコートを、ＱＢバッファーに溶解したＭＵＧのアリコートと混合し、３７℃でインキュベートした。溶解物／ＭＵＧ反応混合物の少量のアリコートを取り出し、３つの異なる時点：（１）「時間ゼロ分」としての溶解物／ＭＵＧ反応物を混合した直後、（２）２０分時、及び（３）６０分時に停止バッファーに添加した。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）プレートリーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ  Ｉｎｃ．（Ｃａｒｙ，ＮＣ  ２７５１３））を用いて３５５ｎｍ励起、４６０ｎｍ発光で蛍光を測定した。発現のレベルは、プレート内標準曲線から導出された「ＭＵＧ加水分解ｎＭ」として表される。
【０１０４】
各プレートについて、各コンストラクトを４〜８ウェルにおいて形質転換する。ＭＵＧアッセイ用に各形質転換からアリコートを取り出し、プレート内標準曲線から「ＭＵＧ加水分解ｎＭ」を導出した。また、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）読み取り（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＲＬＵ）用にも各形質転換からアリコートを取り出した。各コンストラクトにおける平均ＭＵＧ加水分解ｎＭ／ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ＲＬＵを、１００％に設定したＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ／Ｉ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１／Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１コンストラクトを基準に正規化した。
【０１０５】
合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０によって駆動されるトウモロコシ葉プロトプラストにおけるＧＵＳ発現の解析。
当技術分野で知られている方法を用いて構築した、ＧＵＳ発現を駆動する発現エレメントを含む発現ベクターで、トウモロコシ葉プロトプラスト細胞を形質転換した。２つの試験発現ベクターは、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０（配列番号１）を含む導入遺伝子カセットを含んでいた。合成ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０は、合成リーダーＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３（配列番号３）と５’側で作動可能に結合した合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４（配列番号２）で構成される。第１の試験ベクターは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１（配列番号２３）と５’側で作動可能に結合した、プロセシング可能なイントロンを含むＧＵＳ（配列番号２４）をコードするコード配列と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０を含んでいた。第２の導入遺伝子カセットは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳコード配列と５’側で作動可能に結合した、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号２２）と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０を含んでいた。
【０１０６】
３つの対照発現ベクターも構築し、トウモロコシ葉プロトプラストの形質転換に使用した。第１の対照発現ベクターは、プロモーターなしの導入遺伝子カセットを含み、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳコード配列と５’側で作動可能に結合した、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１から構成されていた。第２の対照ベクターは、イントロンなしの導入遺伝子カセットを含み、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳコード配列と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ（配列番号２１）から構成されていた。第３の対照ベクターは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳコード配列と５’側で操作可能に結合した、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓを含む導入遺伝子カセットを含んでいた。
【０１０７】
トウモロコシ葉プロトプラストを、５つ全てのベクターで形質転換した。プロトプラスト細胞の形質転換及び溶解は、本明細書で説明されているように実施した。ルシフェラーゼ及びＧＵＳの発現は、本明細書で説明されているようにアッセイした。表２は、アッセイした平均ＧＵＳ発現を示しており、ＧＵＳを駆動するＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ及びＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１を含む第３の対照発現ベクターと比べての発現のパーセンテージとして表される。
【表２】
2021532739.tif 000003
【０１０８】
上記の表２で分かるように、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０（配列番号１）は、プロモーターなしのコンストラクトで形質転換したトウモロコシ葉プロトプラスト細胞と比較すると、トウモロコシ葉プロトプラスト内でＧＵＳ導入遺伝子発現を駆動することができた。
【０１０９】
合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０によって駆動されるトウモロコシ葉プロトプラストにおけるＧＵＳ発現の解析。
トウモロコシ葉プロトプラスト細胞を、ＧＵＳ発現を駆動する発現エレメントを含む構築した発現ベクターで形質転換した。試験発現ベクターは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳをコードするコード配列（配列番号２０）と５’側で作動可能に結合した、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号２２）と５’側で作動可能に結合した、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０（配列番号６）を含む導入遺伝子カセットを含んでいた。合成ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０（配列番号６）は、合成リーダーＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：１（配列番号８）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２（配列番号７）から構成されている。３つの対照発現ベクターもトウモロコシ葉プロトプラストに形質転換し、上記のように構築した。表３は、ＧＵＳを駆動するＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ及びＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１を含む第３の対照発現ベクターと比べての平均発現パーセントを示している。
【表３】
2021532739.tif 000004
【０１１０】
表３で分かるように、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０（配列番号６）は、プロモーターなしのコンストラクトで形質転換したトウモロコシ葉プロトプラスト細胞と比較すると、トウモロコシ葉プロトプラスト内でＧＵＳ導入遺伝子発現を駆動することができた。
【０１１１】
合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１によるＧＵＳ発現の増強の解析
トウモロコシ葉プロトプラスト細胞を、ＧＵＳ発現を駆動する発現エレメントを含む構築した発現ベクターで形質転換した。試験発現ベクターを使用して、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５によって駆動される合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１（配列番号５）からのＧＵＳ発現の増強をアッセイした。導入遺伝子カセットは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳをコードするコード配列（配列番号２４）と５’側で作動可能に結合した、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１（配列番号５）と５’側で作動可能に結合したＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５を含んでいた。２つの対照発現ベクターも構築し、トウモロコシ葉プロトプラストの形質転換に使用した。第１の対照発現ベクターは、イントロンなしの導入遺伝子カセットを含み、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳコード配列と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓから構成されていた。第２の対照ベクターは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳコード配列と５’側で作動可能に結合した、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓを含む、導入遺伝子カセットを含んでいた。表４は、ＧＵＳを駆動するＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ及びＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１の両方を含む第２の対照発現ベクターと比べての平均発現パーセントを示している。
【表４】
2021532739.tif 000005
【０１１２】
表４で分かるように、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１（配列番号５）は、イントロンなしの対照発現ベクターと比較すると、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓによって駆動されるトウモロコシ葉プロトプラスト内でのＧＵＳ導入遺伝子発現を増強した。
【０１１３】
合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１によるＧＵＳ発現の増強の解析
トウモロコシ葉プロトプラスト細胞を、ＧＵＳ発現を駆動する発現エレメントを含む構築した発現ベクターで形質転換した。試験発現ベクターを使用して、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５によって駆動される合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１（配列番号１０）からのＧＵＳ発現の増強をアッセイした。導入遺伝子カセットは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳをコードするコード配列（配列番号２４）と５’側で作動可能に結合した、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１と５’側で作動可能に結合したＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５を含んでいた。３つの対照発現ベクターも構築し、トウモロコシ葉プロトプラストの形質転換に使用した。第１の対照発現ベクターは、プロモーターなしの導入遺伝子カセットを含み、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳコード配列と５’側で作動可能に結合した、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１から構成されていた。第２の対照ベクターは、イントロンなしの導入遺伝子カセットを含み、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１に５’で結合した、ＧＵＳコード配列と５’側で結合した、ＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓで構成されていた。第３の対照ベクターは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１と５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳコード配列と５’側で作動可能に結合した、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓを含む導入遺伝子カセットを含んでいた。表５は、ＧＵＳを駆動するＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ及びＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１の両方を含む第３の対照発現ベクターと比べての平均発現パーセントを示している。
【表５】
2021532739.tif 000006
【０１１４】
表５で分かるように、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１（配列番号１０）は、イントロンなしの対照発現ベクターと比較すると、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓによって駆動されるトウモロコシ葉プロトプラスト内でのＧＵＳ導入遺伝子発現を増強した。発現の増強は、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１と５’側で作動可能に結合したＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓを含む第３の対照発現ベクターと比較すると、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１が付与する増強よりも大きかった。
【０１１５】
合成３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２及びＴ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２によるＧＵＳ発現の増強の解析。
トウモロコシ葉プロトプラスト細胞を、ＧＵＳ発現を駆動する発現エレメントを含む構築した発現ベクターで形質転換した。２つの試験ベクターは、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２（配列番号１３）及びＴ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２（配列番号１４）が付与するＧＵＳ発現増強の解析に使用する導入遺伝子カセットを含み、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２（配列番号１３）または３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２（配列番号１４）のいずれかと５’側で作動可能に結合した、ＧＵＳをコードするコード配列（配列番号２４）と５’側で作動可能に結合した、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓで構成されていた。上記のように、３つの対照発現ベクターも構築し、トウモロコシ葉プロトプラストの形質転換に使用した。表６は、ＧＵＳを駆動するＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ及びＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１の両方を含む第３の対照発現ベクターと比べての平均発現パーセントを示している。
【表６】
2021532739.tif 000007
【０１１６】
表６で分かるように、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２（配列番号１３）及びＴ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２（配列番号１４）は、トウモロコシ葉プロトプラストの対照と比べると、ＧＵＳ発現を増強した。
【０１１７】
実施例３
安定的に形質転換したＬＨ２４４品種トウモロコシ植物内での合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：２及びＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１によって駆動されるＧＵＳ発現の解析
トウモロコシ植物をベクターで、具体的には、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験調節エレメントを含む植物発現ベクターで、形質転換した。得られた植物をＧＵＳタンパク質発現について解析して、選択した調節エレメントが発現に及ぼす効果を評価した。
【０１１８】
トウモロコシ植物を植物ＧＵＳ発現コンストラクトで形質転換した。当技術分野で知られている標準的な方法を用いて、調節エレメントをベース植物発現ベクター内でクローンした。得られた植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの左側のボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ）と、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用する第１の導入遺伝子選択カセットと、合成調節エレメントの活性を評価するための第２の導入遺伝子カセットであって、３’終結領域、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２（配列番号１９）と５’側で作動可能に結合した、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを含むβ−グルクロニダーゼをコードする植物細胞内での発現用に設計された合成コード配列（ＧＵＳ、ＧＯＩ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１、配列番号２０）と５’側で作動可能に結合した、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：２（配列番号４）またはＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１（配列番号１１）のいずれかを含む、第２の導入遺伝子カセットと、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの右側ボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｒｉｇｈｔ  ｂｏｒｄｅｒ）とを含んでいた。合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：２（配列番号４）は、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１（配列番号５）に５’側で作動可能に結合した、合成リーダーＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３（配列番号３）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４（配列番号２）から構成されていた。合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１（配列番号１１）は、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１（配列番号１２）と５’側で作動可能に結合した、合成リーダーＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３（配列番号３）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーター、Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４（配列番号２）から構成されていた。
【０１１９】
トウモロコシ品種ＬＨ２４４植物細胞を、当技術分野で周知されているように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介の形質転換により、上記のバイナリー形質転換ベクターコンストラクトを用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、全トウモロコシ植物を形成するように誘導した。
【０１２０】
定性的及び定量的ＧＵＳ解析を使用して、形質転換植物の選択した植物器官及び組織内での発現エレメントの活性を評価した。組織化学的染色によるＧＵＳ発現の定性的解析のために、全載または切片組織を、１ｍｇ／ｍＬのＸ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−グルクロニド）を含むＧＵＳ染色液と共に３７℃で５時間インキュベートし、３５％  ＥｔＯＨ及び５０％酢酸で脱色した。解剖顕微鏡または複合顕微鏡下で、選択した植物器官または組織の青色着色を目視検査することにより、ＧＵＳの発現を定性的に決定した。
【０１２１】
酵素アッセイによるＧＵＳ発現の定量的解析のために、形質転換したトウモロコシ植物の選択組織から全タンパク質を抽出した。１〜２マイクログラムの全タンパク質を、５０マイクロリットルの総反応体積中１ｍＭの濃度の蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）と共にインキュベートした。３７℃で１時間のインキュベート後、３５０マイクロリットルの２００ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液を添加することにより、反応を停止した。反応産物４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）は高ｐＨで最大限に蛍光性となり、このときヒドロキシル基がイオン化される。塩基性の炭酸ナトリウム溶液を添加すると、アッセイが停止し、同時に蛍光産物４−ＭＵを定量化するためのｐＨが調整される。４−ＭＵが形成された量は、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ）（３５５ｎｍ励起、４６０ｎｍ発光）を用いて、その蛍光を測定することによって推定した。ＧＵＳ活性値は、４−ＭＵ／時間／ｍｇ全タンパク質のナノモルで提供される。
【０１２２】
以下の組織を、Ｒ０世代におけるＧＵＳ発現のために試料採取した：Ｖ４段階の葉及び根；Ｖ７段階の葉及び根；ＶＴ段階の葉、根、花／葯；Ｒ１段階の穂軸／毛；受粉から２１日後のＲ３段階の種子胚及び種子胚乳。表７は、各合成ＥＸＰの平均定量的ＧＵＳ発現値を示している。
【表７】
2021532739.tif 000008
【０１２３】
表７で分かるように、合成ＧＳＰ８５０プロモーター及びリーダー（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４（配列番号２）及びＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３（配列番号３））は、安定的に形質転換したＬＨ２４４品種トウモロコシ植物内でＧＵＳの構成的発現を駆動した。転写開始部位の分子解析からは、ＧＳＰ８５０プロモーター及びリーダーの一貫的なＴＳＳが示された。合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１（配列番号５）及びＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１（配列番号１２）は、試料採取した異なる組織内で発現に異なる影響を及ぼした。イントロンスプライス部位の分子解析からは、合成イントロンの一貫的なプロセシングが示された。ＧＵＳ発現の全体的な増強は、Ｉ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１（配列番号５）を含む植物からのほとんどの組織試料でより高いものであったが、Ｖ４段階の葉、Ｖ７段階の根、及びＲ３種子胚は例外であり、ＧＵＳ発現レベルが比較的類似していた。Ｉ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１（配列番号５）が付与した発現の増強は、Ｉ−Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１（配列番号１２）と比べると、Ｖ４根でおよそ７．５倍、ＶＴ葉で７．７倍、ＶＴ根で６．０倍、ＶＴ花／葯で４．３倍、Ｒ１穂軸／毛で３．２倍、Ｒ３種子胚乳で２．３倍高かった。
【０１２４】
実施例４
安定的に形質転換した０１ＤＫＤ２品種トウモロコシ植物内で合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：２、及びＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１によって駆動されるＧＵＳ発現の解析
トウモロコシ植物をベクターで、具体的には、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験調節エレメントを含む植物発現ベクターで、形質転換した。得られた植物をＧＵＳタンパク質発現について解析して、選択した調節エレメントが発現に及ぼす効果を評価した。
【０１２５】
トウモロコシ植物を植物ＧＵＳ発現コンストラクトで形質転換した。当技術分野で知られている標準的な方法を用いて、調節エレメントをベース植物発現ベクター内でクローンした。得られた植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの左側のボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ）と、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用する第１の導入遺伝子選択カセットと、調節エレメントの活性を評価するための第２の導入遺伝子カセットであって、３’終結領域、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２（配列番号１９）と５’側で作動可能に結合した、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを含むβ−グルクロニダーゼをコードする植物細胞内での発現用に設計された合成コード配列（ＧＵＳ、ＧＯＩ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１、配列番号２０）と５’側で作動可能に結合した、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号１５）、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：２（配列番号４）、またはＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１（配列番号１１）のいずれかを含む、第２の導入遺伝子カセットと、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの右側ボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｒｉｇｈｔ  ｂｏｒｄｅｒ）とを含んでいた。合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号１５）は、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号２２）と５’側で作動可能に結合した、合成リーダーＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３（配列番号３）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーター、Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４（配列番号２）から構成されていた。合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：２（配列番号４）及びＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１（配列番号１１）は、実施例３で説明されている。
【０１２６】
トウモロコシ品種０１ＤＫＤ２植物細胞を、当技術分野で周知されているように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介の形質転換により、上記のバイナリー形質転換ベクターコンストラクトを用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、全トウモロコシ植物を形成するように誘導した。定性的及び定量的ＧＵＳ発現を実施例３で説明されているようにアッセイした。表８は、各合成ＥＸＰにおける平均定量的ＧＵＳ発現値を示す。
【表８】
2021532739.tif 000009
【０１２７】
表８で分かるように、合成ＧＳＰ８５０プロモーター及びリーダー（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４（配列番号２）及びＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：３（配列番号３））は、安定的に形質転換した０１ＤＫＤ２品種トウモロコシ植物内でＧＵＳの構成的発現を駆動した。合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１５３．ｎｎｏ：１（配列番号５）及びＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１４０．ｎｎｏ：１（配列番号１２）は、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号２２）と比べて、アッセイした全ての組織内で発現を増強した。
【０１２８】
実施例５
安定的に形質転換した０１ＤＫＤ２品種トウモロコシ植物内での合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１及びＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：２によって駆動されるＧＵＳ発現の解析
トウモロコシ植物をベクターで、具体的には、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験調節エレメントを含む植物発現ベクターで、形質転換した。得られた植物をＧＵＳタンパク質発現について解析して、選択した調節エレメントが発現に及ぼす効果を評価した。
【０１２９】
トウモロコシ植物を植物ＧＵＳ発現コンストラクトで形質転換した。当技術分野で知られている標準的な方法を用いて、調節エレメントをベース植物発現ベクター内でクローンした。得られた植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの左側のボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ）と、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用する第１の導入遺伝子選択カセットと、調節エレメントの活性を評価するための第２の導入遺伝子カセットであって、３’終結領域、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２（配列番号１９）と５’側で作動可能に結合した、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを含むβ−グルクロニダーゼをコードする植物細胞内での発現用に設計された合成コード配列（ＧＵＳ、ＧＯＩ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１、配列番号２０）と５’側で作動可能に結合した、合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号１６）またはＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：２（配列番号９）のいずれかを含む、第２の導入遺伝子カセットと、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの右側ボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｒｉｇｈｔ  ｂｏｒｄｅｒ）とを含んでいた。合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：２（配列番号９）は、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１（配列番号１０）と５’側で作動可能に結合した、合成リーダーＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：１（配列番号８）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーター、Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２（配列番号７）から構成されていた。合成ＥＸＰ、ＥＸＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号１６）は、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号２２）と５’側で作動可能に結合した、合成リーダーＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：１（配列番号８）と５’側で作動可能に結合した、合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２（配列番号７）から構成されている。
【０１３０】
トウモロコシ品種０１ＤＫＤ２植物細胞を、当技術分野で周知されているように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介の形質転換により、上記のバイナリー形質転換ベクターコンストラクトを用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、全トウモロコシ植物を形成するように誘導した。定性的及び定量的ＧＵＳ発現を、先に実施例３で説明されたようにアッセイした。表９は、各合成ＥＸＰにおける平均定量的ＧＵＳ発現値を示し、「ＮＤ」は未測定を示す。
【表９】
2021532739.tif 000010
【０１３１】
ここで分かるように、合成ＧＳＰ９９０プロモーター及びリーダー（Ｐ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２（配列番号７）及びＬ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：１（配列番号８））がＧＵＳの発現を駆動した。転写開始部位の分子解析からは、ＧＳＰ９９０プロモーター及びリーダーの一貫的なＴＳＳが示された。合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１（配列番号１０）は、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号２２）と比べて、一部の組織内の発現を弱め、その一方で他の組織内の発現を増強した。例えば、ＧＵＳの発現は、Ｖ４、Ｖ７、及びＶＴの段階の葉で弱まった。ＧＵＳの発現は、Ｉ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１と比べて、Ｖ７及びＶＴの根でわずかに増強された。花／葯の発現は、Ｉ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１と比べて、Ｉ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１（配列番号：１０）によっておよそ２．７倍増強された。Ｉ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１と比べてのＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１（配列番号：１０）が付与する発現の違いは、葉の低発現及び花／葯の高発現が所望される場合に非常に有用であり得る。イントロンスプライス部位の分子解析からは、合成イントロンＩ−Ｚｍ．ＧＳＩ１９７．ｎｎｏ：１（配列番号：１０）の一貫的なプロセシングが示された。
【０１３２】
実施例６
合成３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２、及びＴ−Ｚｍ．ＧＳＴ４３．ｎｎｏ：１、ならびにネイティブＴ−Ｓｂ．Ｎｔｌｐ４−１：１：２が、安定的に形質転換した０１ＤＫＤ２品種トウモロコシ植物内でのＧＵＳ発現に及ぼす効果の解析
トウモロコシ植物をベクターで、具体的には、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する試験調節エレメントを含む植物発現ベクターで、形質転換した。得られた植物をＧＵＳタンパク質発現について解析して、選択した調節エレメントが発現に及ぼす効果を評価した。
【０１３３】
トウモロコシ植物を植物ＧＵＳ発現コンストラクトで形質転換した。当技術分野で知られている標準的な方法を用いて、調節エレメントをベース植物発現ベクター内でクローンした。得られた植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの左側のボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ）と、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用する第１の導入遺伝子選択カセットと、３’ＵＴＲ調節エレメントの活性を評価するための第２の導入遺伝子カセットであって、３’終結領域と５’側で作動可能に結合した、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを含むβ−グルクロニダーゼをコードする植物細胞内での発現用に設計された合成コード配列（ＧＵＳ、ＧＯＩ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１、配列番号２０）と５’側で作動可能に結合した、イントロンＩ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１（配列番号２２）と５’側で作動可能に結合した、ＥＸＰ、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ（配列番号２１）を含む、第２の導入遺伝子カセットと、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの右側ボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｒｉｇｈｔ  ｂｏｒｄｅｒ）とを含んでいた。３つの試験発現ベクターは、ＧＵＳコード配列と作動可能に結合した３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２（配列番号１３）、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２（配列番号１４）、またはＴ−Ｚｍ．ＧＳＴ４３．ｎｎｏ：１（配列番号２６）を含んでいた。追加の試験発現ベクターは、ＧＵＳコード配列に作動可能に結合したネイティブ３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２（配列番号１９）を含み、ネイティブと合成３’ＵＴＲとの間の発現を比較するために使用した。
【０１３４】
トウモロコシ品種０１ＤＫＤ２植物細胞を、当技術分野で周知されているように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介の形質転換により、上記のバイナリー形質転換ベクターコンストラクトを用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、全トウモロコシ植物を形成するように誘導した。
【０１３５】
定性的及び定量的ＧＵＳ解析を使用して、形質転換植物のＶ４葉及び根組織内の発現エレメント活性を評価し、上記の実施例３で説明されているように実施した。３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２（配列番号１９）による発現の効果と比較することにより、合成３’ＵＴＲの効果を評価した。得られた転写物を解析して、適切な終結が生じたか、及び転写物のリードスルーがないかを判定した。リードスルーがあるかを評価する１つの方法は、３’ＵＴＲに対し３’側であるＴ−ＤＮＡボーダー配列の部分に対応する増幅プライマーを用いた転写ｃＤＮＡの増幅を使用することによるものであった。Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２（配列番号１３）、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２（配列番号１４）、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ４３．ｎｎｏ：１（配列番号２６）、及びＴ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２（配列番号１９）を含む４つのコンストラクトで形質転換した植物の平均ＧＵＳ発現を表１０に示す。
【表１０】
2021532739.tif 000011
【０１３６】
表１０で分かるように、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２（配列番号１３）及びＴ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２（配列番号１４）の両方が、３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２と比べると、Ｉ−Ｚｍ．ＤｎａＫ：１と作動可能に結合したＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓによって駆動されるＧＵＳ発現を増強した。Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２（配列番号１３）を含む植物内のＧＵＳ発現は、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２を含む植物よりも高かった。Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ４３．ｎｎｏ：１（配列番号２６）は、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２と比べるとＶ４根内のＧＵＳ発現を増強したが、Ｖ４葉内の発現を弱めた。４つの全てのコンストラクトからのＧＵＳ転写産物の解析からは、転写産物の適切な終結が示され、得られたＧＵＳ転写産物にリードスルーの証拠は示されなかった。３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ９．ｎｎｏ：２（配列番号１３）、Ｔ−Ｚｍ．ＧＳＴ１８．ｎｎｏ：２（配列番号１４）、及びＴ−Ｚｍ．ＧＳＴ４３．ｎｎｏ：１（配列番号２６）は、ネイティブ３’ＵＴＲと同様の方式で作動し、ネイティブ３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２と比べるとＧＵＳ発現の調整を示した。４つの全ての合成３’ＵＴＲ及び追加のネイティブ３’ＵＴＲ、Ｔ−Ｓｂ．Ｎｌｔｐ４−１：１：２は、安定的に形質転換したトウモロコシ植物内の発現を微調整する上で有用な一連の発現値をもたらす。
【０１３７】
実施例７
調節エレメントに由来するエンハンサーエレメント
エンハンサーは、配列番号２及び７として提示されるプロモーターエレメントに由来する。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントと５’または３’側で作動可能に結合した場合、またはプロモーターと作動可能に結合した追加のエンハンサーエレメントと５’または３’側で作動可能に結合した場合に、転写可能なＤＮＡ分子の発現レベルを増強または調整することができる、あるいは特定の細胞タイプもしくは植物器官内で、または発達もしくは概日リズムにおける特定の時点に、転写可能なＤＮＡ分子の発現をもたらす、１つ以上のシス調整エレメントから構成され得る。エンハンサーは、配列番号２及び７として提示されるプロモーターまたはそのフラグメントから転写を開始するのを可能にするプロモーターから、ＴＡＴＡボックスまたは機能的に同様のエレメント及び任意の下流配列を除去することによって作製される。
【０１３８】
植物プロモーター内のＴＡＴＡボックスは、他のいくつかの真核生物ほどは高度に保存されていない。そのため、フラグメントをエンハンサーとして定義するには、第１に、５’ＵＴＲが最初に転写される遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）を同定する必要がある。合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４（配列番号２）に由来するエンハンサーは、配列番号２のヌクレオチド１から４１８を含むことができ、合成エンハンサーＥ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０（配列番号１７）が得られる。合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２（配列番号７）に由来するエンハンサーは、配列番号７のヌクレオチド１から４１６を含むことができ、合成エンハンサーＥ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０（配列番号１８）が得られる。これらのプロモーターに由来するエンハンサーは、配列番号１７及び１８のフラグメント、または配列番号１７及び１８の重複物もしくはそのそれぞれのフラグメントを含むことができる。合成プロモーターに由来する合成エンハンサーの有効性は、合成プロモーターＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ８５０．ｎｎｏ：４（配列番号２）またはＰ−Ｚｍ．ＧＳＰ９９０．ｎｎｏ：２（配列番号７）のいずれかに由来するフラグメントを含むキメラ転写調節エレメントを構築することによって経験的に決定される。このエレメントは、プロモーター及びリーダーと作動可能に結合し、安定性または一過性の植物アッセイにおいてＧＵＳなどの転写可能なＤＮＡ分子の発現を駆動するために使用される。
【０１３９】
エンハンサーエレメントのさらなる精密化が必要とされる場合があり、これは経験的に検証される。加えて、キメラ転写調節エレメント内でのエンハンサーエレメントの他のエレメントに対する位置も、経験的に決定される。これは、キメラ転写調節エレメント内の各エレメントの順序が、各エレメントの相対的位置に応じて異なる効果を付与する可能性があるためである。いくつかのプロモーターエレメントは、複数のＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス様エレメントを有し、場合によっては複数の転写開始部位を有する。このような状況下では、最初に第１のＴＳＳが位置する場所を同定し、次いで第１のＴＳＳを用いてエンハンサーの設計を開始して、推定上のエンハンサーエレメント内で潜在的な転写開始が生じるのを防止することが必要であり得る。
【０１４０】
配列番号２及び７として提示されるプロモーターエレメントに由来するエンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントと５’側でもしくはプロモーターエレメント内で作動可能に結合するように、またはプロモーターと作動可能に結合した追加のエンハンサーエレメントと５’または３’側で作動可能に結合するように、当技術分野で知られている方法を用いてクローン化される。代替的に、エンハンサーエレメントは、当技術分野で知られている方法を用いて、エンハンサーの２つ以上のコピーから構成されるより大きなエンハンサーエレメントをもたらすようにクローンしてもよく、また、当技術分野で知られている方法を用いて、プロモーターと５’または３’側で作動可能に結合するように、または、キメラ転写調節エレメントをもたらすプロモーターと作動可能に結合した追加のエンハンサーエレメントと５’または３’側で作動可能に結合するようにクローンしてもよい。複数の属の生物に由来する遺伝子に由来するプロモーターに由来するエンハンサーエレメントは、合成プロモーターに由来するエンハンサーと作動可能に結合することができる。
【０１４１】
当技術分野で知られている方法を用いて、実施例３で説明されているコンストラクトと同様のＧＵＳ発現植物形質転換ベクターを構築することができ、得られる植物発現ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの左側のボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｌｅｆｔ  ｂｏｒｄｅｒ）と、除草剤グリホサートに対する抵抗性を付与する形質転換植物細胞の選択に使用する第１の導入遺伝子選択カセットと、エンハンサーエレメントを試験するための第２の導入遺伝子カセットであって、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ脂質輸送タンパク質様遺伝子（Ｔ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１、配列番号２３）からの３’終結領域と作動可能に結合した、ジャガイモ光誘導性組織特異的ＳＴ−ＬＳ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：Ｘ０４７５３）に由来するプロセシング可能なイントロンを含むβ−グルクロニダーゼのためのコード配列（ＧＯＩ−Ｅｃ．ｕｉｄＡ＋Ｓｔ．ＬＳ１．ｎｎｏ：１、配列番号２０）と作動可能に結合した、イントロンエレメントと５’側で作動可能に結合した、リーダーエレメントと５’側で作動可能に結合した、プロモーターエレメントと５’もしくは３’側で作動可能に結合したまたはプロモーターと作動可能に結合した追加のエンハンサーエレメントと５’もしくは３’側で作動可能に結合した、エンハンサーエレメントから構成された、第２の導入遺伝子カセットと、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの右側ボーダー領域（Ｂ−ＡＧＲｔｕ．ｒｉｇｈｔ  ｂｏｒｄｅｒ）とを含む。得られるプラスミドを使用して、上記の方法によりトウモロコシ植物または他の単子葉属植物を形質転換する。代替的に、トウモロコシまたは他の単子葉属植物に由来するプロトプラスト細胞を、当技術分野で知られている方法を使用して形質転換して、一過性アッセイを実施する。
【０１４２】
１つ以上のエンハンサーを含む調節エレメントによって駆動されるＧＵＳ発現を安定性または一過性の植物アッセイで評価して、転写可能なＤＮＡ分子の発現に及ぼすエンハンサーエレメントの効果を決定する。１つ以上のエンハンサーエレメントへの修飾または１つ以上のエンハンサーエレメントの重複は、経験的実験と、各調節エレメント組成物を用いて観察される、得られる遺伝子発現調節とに基づいて、実施することができる。得られる調節またはキメラ調節エレメント内の１つ以上のエンハンサーの相対的位置を変更することは、調節またはキメラ調節エレメントの転写活性または特異性に影響を及ぼす可能性があり、トウモロコシ植物またはその他の植物内の所望の導入遺伝子発現プロファイルに対する最良のエンハンサーを同定するように、経験的に決定される。
【０１４３】
本発明の原理を例示及び説明したが、このような原理から逸脱することなく、本発明を配置及び詳細において変更することができることは、当業者には明らかであるはずである。発明者らは、請求項の趣旨及び範囲内にある全ての変更を特許請求する。本明細書で引用される全ての刊行物及び公表された特許文献は、各々の刊行物または特許出願が、参照により援用されているように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度において、参照により援用される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021532739.tif 000013
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