(57)【要約】  本発明は、免疫治療分野に属し、具体的にバイナリーベクターおよびｓｙｎＮｏｔｃｈ技術を使用して標的抗原依存性調節サイトカインの発現の提供により、サイトカインを部分的に放出してＴ細胞の機能を増強し、同時にサイトカインの非特異的毒性副作用を低減する。合成ｎｏｔｃｈ受容体を使用して、プラスミドベクターを構築することにより、サイトカインの局所分泌を実現する。１つのプラスミドベクターは、標的抗原を認識するための特異的抗体を細胞外ドメインとして使用し、Ｎｏｔｃｈコアは膜貫通ドメインとｎｏｔｃｈ受容体上の特異的の酵素切断部位を含み、ＧＡＬ４ＶＰ６４は細胞内ドメインとして使用される。標的抗原が認識されると、ｎｏｔｃｈの酵素切断部位は対応する酵素によって認識され、細胞内転写因子ＧＡＬ４ＶＰ６４を加水分解および切断される。別のプラスミドベクターは、ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ認識結合領域ＧＡＬ４ＵＡＳおよび対応する標的遺伝子を活性化する最小プロモーターを有し、ＧＡＬ４ＶＰ６４が加水分解および切断された後、結合領域に結合して、後続の遺伝子の転写を活性化して、ＩＬ１２を発現しかつ細胞外に分泌する。
2021511784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のベクターおよび第２のベクターを含むプラスミドベクターペアであって、
前記第１のベクターは、Ｎｏｔｃｈコアを含み、他の細胞外セグメントおよび細胞内セグメントのコード核酸分子をさらに含み、前記細胞内セグメントは、転写活性化因子を含むことが好ましく、前記第２のベクターは、前記第１のベクター中の細胞内セグメントに特異的に認識して結合する核酸分子およびＩＬ１２をコードする核酸分子を含むことを特徴とする、前記プラスミドベクターペア。
【請求項２】
前記第１のベクターのＮｏｔｃｈコアは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される核酸配列を有し、好ましくは、前記第１のベクターの細胞内セグメントは、ＧＡＬ４ＶＰ６４であり、前記第２のベクターは、ＧＡＬ４ＵＡＳを含むことを特徴とする
請求項１に記載のプラスミドベクターペア。
【請求項３】
前記細胞外セグメントは、抗原または前記抗原の抗体またはその断片を含み、または受容体または前記受容体のリガンドを含むことを特徴とする
請求項１に記載のプラスミドベクターペア。
【請求項４】
前記第１のベクターの細胞外セグメントは、腫瘍抗原を特異的に認識することができ、好ましくは、前記腫瘍抗原は、固形腫瘍抗原であり、前記腫瘍抗原は、前列腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−Ｉ、ｈＴＥＲＴ、メソセリン、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ３、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＬＤＮ１８.２、葉酸受容体、ＣＬＤＮ６、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＡＳＧＰＲ１、ＣＤＨ１６、ＧＤ２、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＳＰＧ４、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ３、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＫＤＲ、Ｌａｍｂｄａ、ＭＣＳＰ、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体、および／またはフィブロネクチン、テネイシンまたは腫瘍壊死領域の癌胎児性変異体から選択された１つまたは複数であり、より好ましくは、前記腫瘍抗原は、ＧＰＣ３またはＣＬＤＮ１８.２であることを特徴とする
請求項１に記載のプラスミドベクターペア。
【請求項５】
前記細胞外セグメントは、ｓｃＦｖを含み、好ましくは、ａｎｔｉ−ＧＰＣ３  ｓｃＦｖを含むことを特徴とする
請求項１に記載のプラスミドベクターペア。
【請求項６】
前記第１のベクターは、Ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧおよび／またはＨＡなどのタグをさらに含むことを特徴とする
請求項１に記載のプラスミドベクターペア。
【請求項７】
前記第２のベクターは、ＧＦＰ、ＢＦＰおよび／またはｍｃｈｅｒｒｙなどのレポーターをさらに含むことを特徴とする
請求項１に記載のプラスミドベクターペア。
【請求項８】
前記第１のベクターのオープンリーディングフレームは、順番にＰＧＫプロモーター-シグナルペプチド−ｍｙｃタグ-ａｎｔｉ−ＧＰＣ３  ｓｃＦｖ-Ｎｏｔｃｈコア-ＧＡＬ４-リンカー-ＶＰ６４を含み、前記第２のベクターは、順番にＧＡＬ４ＵＡＳ-ＣＭＶ  ｍｉｎｉｍａｌプロモーター−ＩＬ１２−ＰＧＫプロモーター-ｍｃｈｅｒｒｙを含むことを特徴とする
請求項１に記載のプラスミドベクターペア。
【請求項９】
前記第１のベクターのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される配列を含み、前記第２のベクターのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される配列を含むことを特徴とする
請求項１に記載のプラスミドベクターペア。
【請求項１０】
前記第１のベクターまたは第２のベクターは、それぞれの機能的変異体をさらに含み、前記変異体のヌクレオチド配列はそれぞれ、前記第１のベクターまたは第２のベクターのヌクレオチド配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、好ましくは、ａｎｔｉ−ＧＰＣ３  ｓｃＦｖは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性有することを特徴とする
請求項１〜９のいずれか一項に記載のプラスミドベクターペア。
【請求項１１】
遺伝子修飾された免疫細胞であって、
前記細胞は、請求項１〜１０のいずれか一項のプラスミドベクターペアでトランスフェクトされることを特徴とする、前記遺伝子修飾された免疫細胞。
【請求項１２】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり、好ましくは、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞であることを特徴とする
請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項１３】
前記ＮＫ細胞は、血液または細胞株に由来し、好ましくは、細胞株に由来し、より好ましくは、前記細胞株に由来するＮＫはＮＫ９２細胞株であることを特徴とする
請求項１２に記載の免疫細胞。
【請求項１４】
ＩＬ１２の局所分泌またはＩＬ１２の発現の調節のための薬物の調製における請求項１−１０のいずれか一項のプラスミドベクターペアまたは請求項１１−１３のいずれか一項の免疫細胞の応用。
【請求項１５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の殺傷効果を増強するための薬物の調製における請求項１−１０のいずれか一項のプラスミドベクターペアまたは請求項１１−１３のいずれか一項の免疫細胞の応用。
【請求項１６】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原と同じであることを特徴とする
請求項１５に記載の用途。
【請求項１７】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原および前記ＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて同じ腫瘍で発現されることを特徴とする
請求項１５に記載の用途。
【請求項１８】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべてＧＰＣ３であることを特徴とする
請求項１６に記載の用途。
【請求項１９】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて肝臓癌で発現されることを特徴とする
請求項１７に記載の用途。
【請求項２０】
前記免疫細胞の第１のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される配列を含み、前記第２のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される配列を含み、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、２４または２５に示される配列を有することを特徴とする
請求項１７に記載の用途。
【請求項２１】
前記免疫細胞とＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞投与比は、１：１〜４：１であることを特徴とする
請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の用途。
【請求項２２】
前記免疫細胞は１回の投与サイクルで複数回の投与に分割され得ることを特徴とする
請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の用途。
【請求項２３】
請求項１１−１３のいずれか一項に記載の免疫細胞およびＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物。
【請求項２４】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原は、ＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原と同じであることを特徴とする
請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて同じ腫瘍で発現されることを特徴とする
請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべてＧＰＣ３であることを特徴とする
請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて肝臓癌で発現されることを特徴とする
請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記免疫細胞の第１のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される配列を含み、前記第２のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される配列を含み、
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲは、具有ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、２４または２５に示される配列を有することを特徴とする
請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記免疫細胞とＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞投与比は、１：１〜４：１であることを特徴とする
請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
組み合わせキットであって、
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の免疫細胞のキットＡおよびＣＡＲ−Ｔ細胞含有キットＢを含むことを特徴とする、前記組み合わせキット。
【請求項３１】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外ドメインによって特異的に認識される腫瘍抗原は、ＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原と同じであることを特徴とする
請求項３０に記載の組み合わせキット。
【請求項３２】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外ドメインによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて同じ腫瘍で発現されることを特徴とする
請求項３０に記載の組み合わせキット。
【請求項３３】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外ドメインによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべてＧＰＣ３であることを特徴とする
請求項３１に記載の組み合わせキット。
【請求項３４】
前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外ドメインによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて肝臓癌で発現されることを特徴とする
請求項３２に記載の組み合わせキット。
【請求項３５】
前記免疫細胞の第１のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される配列を含み、前記第２のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される配列を含み、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、２４または２５に示される配列を有することを特徴とする
請求項３０に記載の組み合わせキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０１８年１月１９日に出願された、出願番号がＣＮ２０１８１００５３２１９.６の中国特許出願に対して優先権を主張する。本出願は、当該中国特許出願の全文を引用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、免疫治療の分野に属し、具体的には、プラスミドベクターペアおよび標的抗原に依存してＩＬ１２発現を調節する免疫細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＩＬ１２は、複数の生物学的活性を持つ一種の免疫細胞増殖刺激因子であり、ヘテロ二量体サイトカインでもあり、Ｔヘルパー細胞１（Ｔｈ１）の増殖を促進し、ＮＫ細胞とＴ細胞を誘導してγインターフェロンを生成し、ＮＫ細胞の細胞毒性を改善し、細胞毒性Ｔ細胞の形成を促進する。現在、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の抗腫瘍効果を高めるためにＩＬ１２を直接ロードしているが、このロード方法は、ＣＡＲ−ＴによってＩＬ１２が全身的に分泌され、Ｔ細胞の増幅によってＩＬ１２発現量を抑制できず、体に深刻な副作用をもたらす。
【０００４】
米国特許ＵＳ９，８３４，６０８Ｂ２（この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、結合トリガー転写スイッチポリペプチドおよびそのコード核酸および宿主細胞を開示する。前記ポリペプチドは、細胞外ドメイン、Ｎｏｔｃｈ調節領域、および細胞内ドメインを含むキメラＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドであり、ここで、細胞外ドメインは、特定の結合ペアの第１のメンバーを含み、前記第１のメンバーは、特定の結合ペアの第２のメンバーに特異的に結合し、Ｎｏｔｃｈ調節領域はＬｉｎ  １２−Ｎｏｔｃｈリピートユニット、Ｓ２タンパク質分解切断部位、およびＳ３タンパク質分解切断部位含有膜貫通ドメインを含み、特異的結合ペアの第１のメンバーは第２のメンバーに結合してＳ２およびＳ３タンパク質分解切断部位の切断を誘導して、細胞内ドメインを放出する。第１のメンバーは、抗体、抗体ベースの認識足場（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）、非抗体ベースの認識足場（ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）、抗原、受容体リガンド、受容体、非抗体ベースの認識足場のターゲット、細胞外マトリックスコンポーネント、および接着分子から選択される。細胞内ドメインは転写活性化因子を含み、細胞内ドメインの放出により、転写活性化因子は細胞内の内因性遺伝子の発現を誘導する。または、細胞内ドメインは転写リプレッサーを含み、細胞内ドメインの放出により、転写リプレッサーは細胞内の内因性遺伝子の発現を阻害する。
【０００５】
しかし、前記米国特許は、免疫細胞におけるＩＬ−１２の発現および局所分泌を制御する必要性およびその有益な効果について言及していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来技術におけるＩＬ−１２の発現および局所分泌を制御する免疫細胞の欠如を解決するために、本発明はプラスミドベクターペアを提供し、ｓｙｎＮｏｔｃｈ技術を使用して、標的抗原に依存してＩＬ１２の発現を調節する免疫細胞を提供する。具体的に、本発明は、ＩＬ１２の局所分泌を達成するために、ＮＫ９２細胞におけるコアとして合成Ｎｏｔｃｈ（ｓｙｎＮｏｔｃｈ）受容体を使用し、２つのプラスミドベクターを構築した。１つのプラスミドベクターは、細胞外セグメントとしてａｎｔｉＧＰＣ３  ｓｃｆｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用して、標的抗原ＧＰＣ３を認識し、ｎｏｔｃｈコア（ｎｏｔｃｈ  ｃｏｒｅ，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）は、膜貫通領域を含み、２つの酵素切断部位を含み、ＧＡＬ４ＶＰ６４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）転写因子は、細胞内セグメントとして機能する。標的抗原ＧＰＣ３が認識されると、ｎｏｔｃｈコア上の酵素切断部位は、対応する酵素によって認識され、加水分解されて、細胞内転写因子ＧＡＬ４ＶＰ６４を放出する。別のプラスミドベクターは、ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ認識結合領域ＧＡＬ４ＵＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と、標的遺伝子ＩＬ１２を開始するｍｉｎｉｍａｌ  ＣＭＶ  プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を含み、ＧＡＬ４ＶＰ６４が加水分解されて切断されると、結合領域ＧＡＬ４ＵＡＳに結合されることにより、後続の遺伝子の転写を開始し、ＩＬ１２を発現し、それを細胞外に分泌する。
【０００７】
本発明は、毒性を低減し、特定の標的抗原と接触した場合にのみ、ＩＬ１２の分泌および発現を誘導し、それにより腫瘍の近くでＩＬ１２を局所的に放出し、ＣＡＲ−Ｔ効果を増強する。さらに、使用されるＮＫ９２細胞株は基本的に生体内で拡大されないため、生体内でのＴ細胞の拡大によって誘導されるＩＬ１２量を制御できないことによって引き起こされる深刻な副作用を回避できる。さらに、ＮＫ細胞と比較して、ＮＫ９２は大量生産が可能であり、産業用アプリケーションにより適する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様では、本発明は、第１のベクターおよび第２のベクターを含むプラスミドベクターペアであって、前記第１のベクターは、Ｎｏｔｃｈコアを含み、他の細胞外セグメントおよび細胞内セグメントのコード核酸分子をさらに含み、前記細胞内セグメントは、転写活性化因子を含むことが好ましく、前記第２のベクターは、前記第１のベクター中の細胞内セグメントに特異的に認識して結合する核酸分子およびＩＬ１２をコードする核酸分子を含む、前記プラスミドベクターペアに関する。
【０００９】
好ましい具体的な実施例では、前記第１のベクターのＮｏｔｃｈコアＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される核酸配列を有する。
【００１０】
本発明によれば、第１のベクターの細胞内セグメントは、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴａ）、ＧＡＬ４ＶＰ６４およびＺＦＨＤ１−ＶＰ６４などの転写活性化因子を含み、第２のベクターは、前記転写活性化因子に対応するＴｅｔ、ＵＡＳ、およびＺＦＲＥなどのＤＮＡ結合領域をを含む。好ましくは、第１のベクターの細胞内セグメントは、ＧＡＬ４ＶＰ６４を含み、第２のベクターは、ＧＡＬ４ＵＡＳを含む。第１のベクターの細胞内セグメントは、Ｚｉｐ（−）Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ポリペプチドなどのＤＮＡ結合ポリペプチドであり、またはＮＬＳ  ＶＰ６４  Ｚｉｐ（＋）である。
【００１１】
本発明第１のベクター中の細胞外セグメントは標的物体と特異的に結合および対合することができる限り、特に限定されず、例えば、抗原または前記抗原の抗体またはその断片、受容体または前記受容体のリガンド、非抗体ベースの認識足場またはその標的、接着分子またはその細胞外マトリックス、Ｆｃまたはその受容体、受容体またはその共同受容体などを含み得る。
【００１２】
本発明の抗体は、ナノボディ、一本鎖抗体、二価抗体、三価抗体またはミニ抗体を含む抗原に特異的に結合する。抗体断片は、完全な抗体の抗原結合領域または可変領域などの完全な抗体の一部を指す。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含む。Ｆｖは最小の抗体断片であり、完全な抗原認識および結合部位を含む。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを指し、これらのドメインは一本鎖ポリペプチドの形態をなす。一部の実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬとの間のリンカーをさらに含む。細胞外セグメントは、好ましくは抗体、より好ましくはｓｃＦｖを含む。
【００１３】
本発明の抗体またはその断片は、前記抗原、特に乳癌、Ｂ細胞リンパ腫、前立腺癌、ホジキンリンパ腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、中皮腫、黒色腫、急性および慢性リンパ性白血病、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽腫、結腸癌、胃癌、肝臓癌などを含む癌関連抗原のエピトープを特異的に標的とする。
【００１４】
本発明によれば、前記腫瘍抗原は、前列腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−Ｉ、ｈＴＥＲＴ、メソセリン、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＣ３、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＬＤＮ１８.２、葉酸受容体、ＣＬＤＮ６、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＡＳＧＰＲ１、ＣＤＨ１６、ＧＤ２、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＳＰＧ４、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ３、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＫＤＲ、Ｌａｍｂｄａ、ＭＣＳＰ、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体、および／またはフィブロネクチン、テネイシンまたは腫瘍壊死領域の癌胎児性変異体を含む。
【００１５】
本発明によれば、細胞外セグメントは、ａｎｔｉ−ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ａｎｔｉ−メソセリンｓｃＦｖ、ａｎｔｉ−ＧＦＰ  ｎａｎｏｂｏｄｙ、ａｎｔｉ−ＧＰＣ３  ｓｃＦｖなど、特にａｎｔｉ−ＧＰＣ３  ｓｃＦｖ（即ち、ＧＰＣ３  ｓｃＦｖ）を含むが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明によれば、Ｎｏｔｃｈコアは、Ｎｏｔｃｈ膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の切断部位を含む。
【００１７】
本発明によれば、Ｎｏｔｃｈコアの細胞外末端には、１つまたは複数の上皮成長因子（ＥＧＦ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）反復単位を任意選択で加えることができる。ＥＧＦ反復単位は、基本的なバックグラウンドの非特異的な活性化を減らすことができる。
【００１８】
本発明によれば、第１のベクターおよび第２のベクターは、シグナル配列（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、リンカー、プロモーター、タグ（ｔａｇ）およびレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）などの要素をさらに含み、ここで、タグは、血球凝集素（ＨＡ）、Ｃ−ｍｙｃおよびＦｌａｇ等の１つまたは複数を含み、レポーターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）およびｍｃｈｅｒｒｙ等の１つまたは複数を含む。
【００１９】
本発明によれば、前記第１のベクターは、順番にＰＧＫプロモーター-シグナル配列−ｍｙｃタグ-ａｎｔｉ−ＧＰＣ３  ｓｃＦｖ-ｎｏｔｃｈ  ｃｏｒｅ-ＧＡＬ４-リンカー-ＶＰ６４を含み、前記第２のベクターは、順番にＧＡＬ４ＵＡＳ-ＣＭＶ  ｍｉｎｉｍａｌプロモーター-ＩＬ１２−  ＰＧＫプロモーター-ｍｃｈｅｒｒｙを含む。
【００２０】
本発明によれば、前記第１のベクターのオープンリーディングフレームは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示されるヌクレオチド配列を含み、前記第２のベクターのオープンリーディングフレームは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示されるヌクレオチド配列を含む。前記ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列は、本発明のベクターの要素および／またはベクターによりコードされるポリペプチドである。
【００２１】
本発明によれば、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失および／または付加は、特にポリペプチドの保存領域が既知である場合、通常、ポリペプチド変異体の機能に実質的に影響を与えない。保存的置き換え（例えば、１つの塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸に置き換え、そして１つの酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸に置き換え）もまた、当業者により容易に考えられる。したがって、本発明ベクター要素および／またはベクターによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列以外に、本発明ベクター要素および／またはベクターによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％、好ましくて７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、より好ましくて９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する機能的変異体は、保護範囲内にある。さらに、ポリペプチドをコードするヌクレオチドコドンは縮重でき、したがって、本発明ベクター要素および／またはベクターのヌクレオチド配列とすくなくとも５０％、好ましくて７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、より好ましくて９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する機能的変異体も、保護範囲内にある。さらにより好ましくは、ａｎｔｉ−ＧＰＣ３  ｓｃＦｖはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する。
【００２２】
別の態様では、本発明はまた、本発明のプラスミドベクターペアで修飾された免疫細胞を提供する。前記免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。好ましくは、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞である。前記細胞は、上記いずれか一項のプラスミドベクターペアでトランスフェクトされる。前記ＮＫ細胞は、天然ＮＫ細胞または不死化ＮＫ細胞である。好ましくは、不死化ＮＫ細胞である。より好ましくは、ＮＫ９２細胞である。
【００２３】
また別の態様では、本発明は、ＩＬ１２の局所分泌またはＩＬ１２の発現の調節のための薬物の調製における上記いずれか一項のプラスミドベクターペアまたは上記いずれか一項の免疫細胞の応用を提供する。
【００２４】
また別の態様では、本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の殺傷効果を増強するための薬物の調製における上記いずれか一項のプラスミドベクターペアまたは上記いずれか一項の免疫細胞の応用を提供する。
【００２５】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原と同じである。
【００２６】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原および前記ＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて同じ腫瘍で発現される。
【００２７】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべてＧＰＣ３である。
【００２８】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて肝臓癌で発現される。
【００２９】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される配列を含み、前記第２のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される配列を含み、
好ましい具体的な実施例では、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、２４または２５に示される配列を有する。
【００３０】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞とＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞投与比は、１：１〜４：１である。
【００３１】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞は１回の投与サイクルで複数回の投与に分割され得る。
【００３２】
また別の態様では、本発明は、上記いずれか一項に記載の免疫細胞およびＣＡＲ−Ｔ細胞の組成物を提供する。
【００３３】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターのの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原は、ＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原と同じである。
【００３４】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて同じ腫瘍で発現される。
【００３５】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべてＧＰＣ３である。
【００３６】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外セグメントによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて肝臓癌で発現される。
【００３７】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される配列を含み、前記第２のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される配列を含み、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、２４または２５に示される配列を有する。
【００３８】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞と前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞投与比は、１：１〜４：１である。最後の態様では、本発明はさらに、上記いずれか一項に記載の免疫細胞のキットＡおよびＣＡＲ−Ｔ細胞含有キットＢを含む組み合わせキットに関する。
【００３９】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外ドメインによって特異的に認識される腫瘍抗原は、ＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原と同じである。
【００４０】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外ドメインによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて同じ腫瘍で発現される。
【００４１】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外ドメインによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべてＧＰＣ３である。
【００４２】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターの細胞外ドメインによって特異的に認識される腫瘍抗原およびＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原はすべて肝臓癌で発現される。
【００４３】
好ましい具体的な実施例では、前記免疫細胞の第１のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される配列を含み、前記第２のベクターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される配列を含み、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＡＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、２４または２５に示される配列を含む。
【発明の効果】
【００４４】
本発明は、それぞれＧＰＣ３を発現する細胞株とインキュベートして、感染していないＮＫ９２細胞がＧＰＣ３高発現する細胞株ＩＬ１２に対する分泌量が非常に低く、二重感染がｐＨＲＬＳＩＮ−ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４および有意にｐＨＲＬＳＩＮ−ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２−ＰＧＫ-ｍｃｈｅｒｒｙのＮＫ９２細胞のＩＬ１２分泌量は有意に増加したことを実験により証明した。
【００４５】
したがって、ＧＰＣ３に対する一本鎖抗体の選択は、ＮＫ９２細胞におけるサイトカインＩＬ１２の発現を調節し、ＩＬ１２を局所的に放出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】２つのベクターの構築である。
【図２】感染したＮＫ９２細胞の陽性率である。
【図３】標的細胞ＧＰＣ３の発現状況である。
【図４Ａ】Ｅｌｉｓａによって検出されたサイトカインＩＬ１２の発現状況を示す。
【図４Ｂ】異なる時点でのＩＬ１２の分泌状況を示す。
【図５Ａ】マウス生体内における腫瘍成長曲線を示す。
【図５Ｂ】マウス腫瘍重量の比較結果を示す。
【図５Ｃ】異なる投与条件下でのマウス移植腫瘍モデルの体重変化状況を示す。
【図６】免疫組織化の結果である。
【図７】インビトロでの細胞殺傷状況を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明の技術的解決策をより明確に説明するために、添付の図面と併せて以上に簡単な紹介を行った。明らかに、これらの図面は、本出願で説明されているいくつかの具体的な実施形態にすぎない。本発明はこれらの図面を含むがこれらに限定されない。
【００４８】
本発明をさらに理解するために、本発明の好ましい解決策を実施例と併せて以下に説明する。これらの説明は、本発明の特徴および利点を例示するだけであり、本発明の保護範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例に記載がない場合は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「分子クローニング：実験室マニュアル（１９８９）」に記載されている従来の条件に準じて実施するか、試薬会社の推奨する条件に準じて実施する。
【００４９】
以下の具体的な説明は、本明細書に開示される実施形態を詳細に示す。本明細書は、ここに開示された具体的な実施形態に限定されず、変更されてもよいことが理解されるべきである。当業者は、本明細書に開示された内容が様々な変更または変化を有し、これらはすべて開示された範囲および原理によってカバーされることを理解するであろう。特に明記しない限り、各実施形態は、他の任意の実施形態と任意に組み合わせることができる。
【００５０】
本明細書に開示される特定の実施形態は、数値範囲を含み、本発明の特定の態様は、範囲の方法を使用して説明され得る。特に明記しない限り、数値範囲または範囲の説明は、簡潔さおよび便宜上の目的のためだけであり、本発明の範囲に対する厳密な制限として考えられるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲方法を使用した説明は、すべての可能なサブ範囲とその範囲内のすべての可能な特定の数値ポイントを具体的に開示するために考慮されるべきであり、これらのサブ範囲と数値ポイントが本明細書で明確に記述されているのと同じである。例えば、１から６の範囲の説明は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などのサブ範囲、および１、２、３、４、５、６などのこれらの範囲内の具体的な数値ポイントを具体的に開示したと見なされるべきである。上記の原則は、指定された数値の幅に関係なく等しく適用される。範囲を使用して説明する場合、前記範囲は範囲の端点を含む。
【００５１】
用語「受容体」は、細胞膜または細胞内に存在する特殊なタンパク質の一種であり、細胞外の特定のシグナル分子に結合して、細胞内の一連の生化学反応を活性化し、細胞が外部刺激に対応する効果を生み出すようにする。受容体に結合する生物活性物質は、リガンド（ｌｉｇａｎｄ）と総称される。
【００５２】
用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、Ｔ細胞を含むがこれに限定されない免疫細胞によって発現され得る操作された分子を指す。ＣＡＲはＴ細胞で発現され、Ｔ細胞をリダイレクトして、人工受容体によって決定される特異性で標的細胞の殺傷を誘導できる。ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウス、ヒト化または完全ヒトのモノクローナル抗体に由来され得る。
【００５３】
キメラ抗原受容体は通常、細胞外抗原結合領域を含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合領域は完全にヒトであってもよい。他の場合では、細胞外抗原結合領域をヒト化することができる。他の場合では、細胞外抗原結合領域はマウス由来であり得るか、または前記細胞外抗原結合領域のキメラは少なくとも２つの異なる動物からのアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、前記細胞外抗原結合領域は非ヒトであり得るか、または複数の抗原結合領域が設計され得る。非限定的な例は、抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ライブラリーから選択された断片の抗原結合領域（Ｆａｂ）、単一ドメイン断片、またはそれらの同族受容体に関与する天然リガンドを含む。いくつかの実施形態では、細胞外抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは天然リガンド、およびそれらの任意の誘導体を含み得る。細胞外抗原結合領域は、完全抗体の一部を含み得、完全抗体が結合する抗原に結合し得、完全抗体以外の分子を指し得る。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２と、二機能性抗体、線状抗体と、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖなど）と、および抗体断片と、から形成された多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【００５４】
用語「操作された」および他の文法形は、生物のゲノム内の核酸などの核酸における１つまたは複数の変更を指すことができる。用語「操作された」は、遺伝子の変更、付加、および／または欠失を指すことができる。操作された細胞は、付加、欠失、および／または変更された遺伝子を含む細胞を指すこともできる。
【００５５】
用語「細胞」または「操作された細胞」およびその文法上の他の形態は、ヒトまたは非ヒト動物由来の細胞を指すことができる。操作された細胞は、ＣＡＲを発現する細胞を指すこともできる。
【００５６】
用語「トランスフェクション」は、真核細胞への外因性核酸の導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染およびバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）など、当技術分野で既知のさまざまな手段によって達成できる。
【００５７】
本明細書で使用される用語「コード核酸分子」、「コード核酸配列」は、デオキシリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または順序を指し、これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖のアミノ酸の順序を決定する。したがって、核酸配列はアミノ酸配列をコードする。
【００５８】
用語「末梢血リンパ球」およびその文法上の他の形態は、血液（例えば、末梢血）中を循環するリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は、臓器に限定されないリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００５９】
用語「免疫細胞」は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＤＮＴ細胞などを含むがこれらに限定されなく、免疫応答を誘発することができる細胞、それらのそれぞれの前駆細胞およびそれらの子孫を指す。免疫応答細胞は、リンパ系または骨髄系の細胞を指すこともできる。
【００６０】
用語「免疫細胞」およびその文法上の他の形態は、あらゆる由来の免疫細胞を指すことができる。例えば、免疫細胞は、自己Ｔ細胞、同種Ｔ細胞、自己ＮＫ細胞、同種ＮＫ細胞などの血液から得ることができ、またはＥＢＶウイルス感染を使用してＮＫ細胞株を調製するなどの細胞株、胚性幹細胞およびｉＰＳＣから誘導および分化されたＮＫ細胞およびＮＫ９２細胞株など、血液由来であることができる。
【００６１】
用語「免疫細胞」はまたヒトまたは非ヒトであり得る。
【００６２】
ヌクレオチド配列を指すために使用される場合、用語「配列」およびその文法上の他の形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸配列は変異させることができる。核酸配列は、任意の長さを有することができる。
【００６３】
用語「有効量」は、治療的または予防的利益を提供する量を指す。
【００６４】
本明細書で使用される用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要な細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
【００６５】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る組成物である。当技術分野で知られている多くのベクターは、線形ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない。したがって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の導入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス性化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用される用語配列「同一性」は、比較ウィンドウで最もよく一致する２つの配列を比較することにより、同一性パーセントを決定し、ここで比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、付加または欠失（つまり、ギャップ）を含むことができ、例えば、最も一致する２つの配列について、参照配列（付加または欠失を含まない）を比較して、２０％以下のギャップ（例えば、５〜１５％、または１０〜１２％）を含むことができる。通常、２つの配列で同じ核酸塩基またはアミノ酸残基が発生する位置の数を決定してパーセンテージを計算して、正しい一致位置の数を生成し、正しい一致位置の数を、参照配列の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を算出します。
【００６７】
用語「ａｎｔｉＧＰＣ３」、「ａｎｔｉ−ＧＰＣ３」および「抗ＧＰＣ３」は、互換的に使用することができ、同じ意味を有する。
【００６８】
用語「ＩＬ１２」、「インターロイキン１２」および「ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２」は、互換的に使用することができ、同じ意味を有する。用語「ＩＬ１２」は、複数の生物学的活性を有する免疫調節因子であり、例えば、用語「ＩＬ１２」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７で定義されるヒトＩＬ１２またはその活性断片、または他の種を指すことができる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＧＰＣ３に特異的に結合する受容体を構築するための要素、または前記ＩＬ１２は、天然に存在し得、例えば、それは哺乳動物から単離または精製され得る；それはまた、例えば、従来の遺伝子工学組換え技術に従って生成することができる組換え要素またはＩＬ１２など人工的に調製され得る。好ましくは、本発明は、組換えられた各要素またはＩＬ１２を使用することができる。
【００７０】
前記各要素またはＩＬ１２ポリペプチド配列に基づいて、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失または付加によって形成されたアミノ酸配列も本発明に含まれる。アミノ酸の適切な置換は、当技術分野で周知の技術であり、容易に実施でき、得られる分子の生物活性が変化しないことを保証する。これらの技術により、当業者は、一般的に言えば、ポリペプチドの非必須領域で単一のアミノ酸を変化させても生物活性は実質的に変化しないことを認識した。
【００７１】
前記各要素またはＩＬ１２のポリペプチドの生物活性断片はすべて本発明に適用することができる。ここで、前記生物活性断片の意味は、完全長ポリペプチドの一部として、完全長ポリペプチドの機能の全部または一部を依然として維持することができるポリペプチドを指す。一般に、生物活性断片は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持している。より好ましい条件下では、活性断片は、全長ポリペプチドの活性の６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保持することができる。
【００７２】
前記各要素またはＩＬ１２ポリペプチド配列に基づいて、修飾または改善されたポリペプチドも本発明に適用することができ、例えば、それらの半減期、有効性、代謝、および／またはポリペプチド有効性を促進するために修飾または改善されたポリペプチドを使用することができる。言い換えれば、ポリペプチドの生物活性に影響を及ぼさない任意の変更形態は、本発明において使用され得る。
【００７３】
用語「腫瘍」は、細胞または組織の病理学的増殖、およびその後の他の組織または器官の移動または浸潤を特徴とする疾患を指す。腫瘍の成長は通常制御されておらず進行性であり、正常な細胞増殖を誘発または阻害しない。腫瘍は、膀胱、乳房、食道、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、子宮器官、または組織または対応する細胞から選択されるものを含むがこれらに限定されない、さまざまな細胞、組織、または臓器に影響を与える可能性がある。本発明の腫瘍は、肝臓癌、胃癌、肺癌、乳癌、頭頸部癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮頸癌、脂肪肉腫、黒色腫、副腎癌、神経鞘腫、悪性線維性組織球腫、食道癌を含み得るがこれらに限定されない。好ましくは、前記「腫瘍」は、肝臓癌、胃癌、肺癌、および乳癌を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
細胞外抗原結合領域は、任意の相補的なターゲットに結合できる。細胞外抗原結合領域は、その可変領域配列が既知である抗体に由来し得る。細胞外抗原結合領域は、入手可能なマウスハイブリドーマから得られた抗体配列から得ることができる。または、細胞外抗原結合領域は、腫瘍細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの初代細胞の全細胞外切断配列決定から得ることができる。
【００７５】
いくつかの場合において、細胞外抗原結合領域の結合特異性は、軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＣＤＲなどの相補性決定領域またはＣＤＲによって決定することができる。多くの場合、結合特異性は軽鎖ＣＤＲと重鎖ＣＤＲによって決定できる。他の参照抗原と比較して、特定の重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲの組み合わせは、特定の結合ポケットを提供でき、これにより、抗原（ＧＰＣ３など）に大きな親和性と特異性を与えることができる。例えば、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３に特異的なＣＤＲはＣＡＲの細胞外結合領域で発現するため、ＧＰＣ３を標的とするＣＡＲはＧＰＣ３を発現する腫瘍細胞を免疫応答細胞に標的化できる。
【００７６】
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の特定の態様では、ｓｃＦｖなどの細胞外抗原結合領域は、抗原に特異的な軽鎖ＣＤＲを含み得る。軽鎖ＣＤＲは、ＣＡＲなどの抗原結合ユニットのｓｃＦｖ軽鎖の相補性決定領域であり得る。軽鎖ＣＤＲは、連続したアミノ酸残基の配列、または非相補性決定領域（例えば、フレームワーク領域）によって分離された２つ以上の連続したアミノ酸残基の配列を含み得る。いくつかの場合において、軽鎖ＣＤＲは、軽鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２などと呼ばれ得る２つ以上の軽鎖ＣＤＲを含み得る。いくつかの場合において、軽鎖ＣＤＲは、それぞれ軽鎖ＣＤＲ−１、軽鎖ＣＤＲ−２、および軽鎖ＣＤＲ−３と呼ばれ得る３つの軽鎖ＣＤＲを含み得る。いくつかの例では、共通の軽鎖上に存在するＣＤＲのグループは、まとめて軽鎖ＣＤＲと呼ぶことができる。
【００７７】
本明細書に開示されるいずれかの実施形態の特定の態様では、ｓｃＦｖなどの細胞外抗原結合領域は、抗原に特異的な重鎖ＣＤＲを含み得る。重鎖ＣＤＲは、ｓｃＦｖなどの抗原結合ユニットの重鎖相補性決定領域であり得る。重鎖ＣＤＲは、アミノ酸残基の連続配列、または非相補性決定領域（フレームワーク領域など）によって分離された２つ以上のアミノ酸残基の連続配列を含み得る。いくつかの場合において、重鎖ＣＤＲは、重鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２などと呼ばれることもある２つ以上の重鎖ＣＤＲを含み得る。いくつかの場合において、重鎖ＣＤＲは、それぞれ重鎖ＣＤＲ−１、重鎖ＣＤＲ−２、および重鎖ＣＤＲ−３と呼ばれ得る３つの重鎖ＣＤＲを含み得る。いくつかの場合において、共通の重鎖上に存在するＣＤＲのグループは、まとめて重鎖ＣＤＲと呼ぶことができる。
【００７８】
遺伝子工学を使用することにより、細胞外抗原結合領域をさまざまな方法で修飾できる。いくつかの場合において、細胞外抗原結合領域は、その細胞外抗原結合領域がその標的に対してより高い親和性を有するように選択され得るように変異され得る。いくつかの場合において、その標的に対する細胞外抗原結合領域の親和性は、正常組織では低レベルで発現できる標的に対して最適化できる。この最適化は、潜在的な毒性を最小限に抑えるために行うことができる。他の場合では、標的の膜結合形態に対してより高い親和性を有する細胞外抗原結合領域のクローンは、それらの可溶性対応物よりも優れている可能性がある。可溶性形態の異なるレベルの標的も検出でき、それらの標的化が望ましくない毒性を引き起こす可能性があるため、この修飾を行うことができる。
【００７９】
いくつかの場合において、細胞外抗原結合領域はヒンジまたはスペーサーを含む。用語ヒンジとスペーサーは互換的に使用できる。ヒンジは、細胞外抗原結合領域に柔軟性を提供するための一部と考えることができる。
【００８０】
用語「治療」は、個人を変えようとする過程、または細胞によって引き起こされる疾患に対処する過程における臨床的介入を指し、臨床病理学的過程における予防または介入に使用することができる。治療効果は、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の低減、転移の防止、疾患の進行の遅延、状態の改善または緩和、予後の緩和または改善などを含むが、これらに限定されない。
【００８１】
用語「構成的発現」は、すべての生理学的条件下での発現を指す。
【００８２】
用語「発現の誘導」は、Ｔ細胞が抗原に結合するときなど、特定の条件下での発現を指す。当業者はどのようにして従来の「発現の誘導」を行うのか。
【００８３】
用語「Ｎｏｔｃｈ受容体」は、３つの主要な構成要素を有する：１）リガンドが上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）に結合した反復配列、２）活性化中に受容体の切断を制御するＮｏｔｃｈコア、および３）放出されて転写を調節する細胞内ドメイン。
【００８４】
用語「Ｎｏｔｃｈコア」は、リガンド依存性の切断と活性化を制御するために使用される最小の足場であり、メタロプロテイナーゼに対するＳ２切断部位のアクセスを制御するＬｉｎ１２−Ｎｏｔｃｈ反復配列（ＬＮＲ）、ヘテロ二量化ドメイン（ＨＤ）、およびＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の放出に必要なγ−セクレターゼ切断部位含有膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む。
【００８５】
免疫細胞
いくつかの実施形態では、本発明は、プラスミドベクターペアを発現する免疫細胞を提供する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、ＩＬ１２を局所的に分泌するか、またはＩＬ１２の発現を調節することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍殺傷を増強することができる。
【００８８】
組成物
本発明の免疫細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と組み合わせて使用することができる。前記薬学的組成物は、有効量の免疫細胞に加えて、有効量のＣＡＲ−Ｔ細胞も含み得る。
【００８９】
抗腫瘍薬物と組み合わせる
いくつかの実施形態では、本発明の免疫応答細胞は、別の治療薬と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、前記他の治療薬は化学療法薬である。本発明の免疫応答細胞と組み合わせて使用することができる化学療法薬は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ノビビン（ＴＭ）（ビノレルビン、５’−硫化水素）などの有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）；ＣａｍｐｔｏｓａｒＴＭ（イリノテカンＨＣＬ）、ＨｙｃａｍｔｉｎＴＭ（トポテカンＨＣＬ）、およびカンプトテシンとその類似体に由来するその他の化合物を含む、カンプトテシン化合物などのトポイソメラーゼＩ阻害剤；エトポシド、テニポシド、ミドキシゾズなどのポドフィロトキシン誘導体；、アルキル化剤シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ブリキアジン、ウラシルマスタード、クロプロフェンおよびダカルバジン；シタラビン、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、プロカルバジンなどの代謝拮抗剤；ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、マイシンマイシン、マイトマイシン、サルコマイシンＣおよびダウノマイシンを含むがこれらに限定されない抗生物質；および抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサカム、メルファラン、イホスファミド、ミトキサントロンを含むがこれらに限定されないその他の化学療法薬と含むがこれらに限定されない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明の免疫応答細胞と組み合わせて使用できる化学療法剤は、抗ＶＥＧＦ抗体（ヒト化およびキメラ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマーおよびアンチセンスオリゴを含む）、およびアンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、レチノイン酸、およびメタロプロテイナーゼ−１とメタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤などの他の抗血管新生剤を含む抗血管新生剤を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
組み合わせキット
本発明は、本発明の免疫細胞を含む組み合わせキットをさらに提供する。前記キットは、癌、病原体感染、免疫障害、または同種移植の治療または予防に使用できる。一実施形態では、キットは、１つまたは複数の単位剤形を含む有効量の免疫細胞を含有する治療用または予防用組成物を含み得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、キットは、治療用または予防用組成物を含み得る無菌容器を含む。
【００９３】
いくつかの場合において、キットは、約１×１０４個の細胞〜約１×１０６個の細胞を含み得る。いくつかの場合において、キットは、少なくとも約１×１０５個の細胞、少なくとも約１×１０６個の細胞、少なくとも約１×１０７個の細胞、少なくとも約４×１０７個の細胞、少なくとも約５×１０７個の細胞、少なくとも約６×１０７個の細胞、少なくとも約７×１０７個の細胞、８×１０７個の細胞、少なくとも約９×１０７個の細胞、少なくとも約１×１０８個の細胞、少なくとも約２×１０８個の細胞、少なくとも約３×１０８個の細胞、少なくとも約４×１０８個の細胞、少なくとも約５×１０８個の細胞、少なくとも約６×１０８個の細胞、少なくとも約７×１０８細胞、少なくとも約８×１０８個の細胞、少なくとも約９×１０８細胞、少なくとも約１×１０９個の細胞、少なくとも約２×１０９個の細胞、少なくとも約３×１０９個の細胞、少なくとも約４×１０９個の細胞、少なくとも約５×１０９個の細胞、少なくとも約６×１０９個の細胞、少なくとも約８×１０９個の細胞、少なくとも約９×１０９個の細胞、少なくとも約１×１０１０個の細胞、少なくとも約２×１０１０個の細胞、少なくとも約３×１０１０個の細胞、少なくとも約４×１０１０個の細胞、少なくとも約５×１０１０個の細胞、少なくとも約６×１０１０個の細胞、少なくとも約９×１０１０個の細胞、少なくとも約９×１０１０個の細胞、少なくとも約１×１０１１個の細胞、少なくとも約２×１０１１個の細胞、少なくとも約３×１０１１個の細胞、少なくとも約４×１０１１個の細胞、少なくとも約５×１０１１個の細胞、少なくとも約８×１０１１個の細胞、少なくとも約９×１０１１個の細胞、または少なくとも約１×１０１２個の細胞を含み得る。例えば、キットに、約５×１０１０個の細胞を含み得る。
【００９４】
実施例１：コード核酸のキメラ抗原受容体タンパク質のレンチウイルスプラスミドの構築およびウイルスパッケージング
以下の表１は、本発明の例のキメラ抗原受容体の各部の接続順序を説明するものである。
【００９５】
【表１】
2021511784.tif 000003
【００９６】
１.ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４核酸断片の増幅
１）ＧＰＣ３  ｓｃＦｖ配列の増幅
従来のＰＣＲ法により抗ＧＰＣ３のｓｃＦｖの核酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を取得する。
【００９７】
ＰＨＲ−ＰＧＫ−ａｎｔｉＣＤ１９−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４（ａｄｄｇｅｎｅから購入）をテンプレートとしてＰＣＲによって他の核酸配列を取得した。ここで、シグナル配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、プライマーペア［上流プライマー：５’−ｔｃｔｃａｃｇｃｇｔｃａａｇｔｇｇａｇｃ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、下流プライマー：５’−ｔｃｔｇｃａｃｃａｇｃｔｇｃａｃｃｔｃｇａｇｇｔｃｃｔｃｔｔｃａｇａｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）］でＰＣＲ増幅を実行し、ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４配列は、プライマーペア［上流プライマー：５’−ａｔｃｃｔｇｇａｃｔａｃａｇｃｔｔｃａｃａｇｇｔｇｇｃｇｃ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）。下流プライマー：５’−ａｇａｇｃｃｇｇｃａｇｃａｇｇｃｃｇｃｇｇｇａａｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）］でＰＣＲ増幅を実行した。
【００９８】
２.ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４核酸断片のスプライシング
ａｎｔｉＧＰＣ３  ｓｃｆｖ核酸断片と等モルのシグナル配列核酸断片および等モルのｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４核酸断片を３断片スプライシングし、ＰＣＲを実行し、スプライシング条件：事前変性：９４ ℃、４分；変性：９４ ℃，４０秒；アニーリング：４２ ℃、４０秒；伸長：６８ ℃、３分２０秒、７サイクル行った後、合計伸長６８ ℃、１０分であり、ＤＮＡポリメラーゼおよびフォワードプライマーとリバースプライマーを補足した後、ＰＣＲ増幅を３０サイクル行い、増幅条件は、事前変性：９４ ℃、４分；変性：９４ ℃、４０秒；アニーリング：６０ ℃、４０秒；伸長：６８ ℃、３分２０秒、３０サイクル行った後、合計伸長６８ ℃、１０分である。増幅して得られた断片は、ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４である。
【００９９】
３.ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２−ＰＧＫ−ｍｃｈｅｒｒｙ核酸断片増幅
まず、ｐＨＲ−ＧＡＬ４ＵＡＳ−ｔＢＦＰ−ＰＧＫ−ｍｃｈｅｒｒｙ（ａｄｄｇｅｎｅから購入）をテンプレートとしてｔＢＦＰとＰＧＫ−ｍｃｈｅｒｒｙとの間に１つのＭｌｕI制限酵素切断部位を添加し、次にこのプラスミドをテンプレートとして使用して構築を続行した。
【０１００】
１）ＩＬ１２配列の増幅
ＰＣＲ増幅によってＩＬ１２配列（ここで、ＩＬ１２  Ｐ４０の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示され、ＩＬ１２  Ｐ３５の核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される）を得た。
【０１０１】
２）他の部分の核酸配列
他の部分の核酸配列は、ｐＨＲ−ＧＡＬ４ＵＡＳ−ｔＢＦＰ−ＰＧＫ−ｍｃｈｅｒｒｙをテンプレートとしてＰＣＲ法によって得た。ここで、ＧＡＬ４ＵＡＳ配列は、プライマーペア［上流プライマー：５’−ａｇａｔｃｇｃ  ｇａｔｇｇｇａａａａａａｔｔｃ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、下流プライマー：５’−ｔｇｃｔｇａａｃｔｔｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｃ  ａａｃｇａａｔｇｔｃｇａｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）］でＰＣＲ増幅を実行した。
【０１０２】
４.ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２核酸断片のスプライシング
上記で取得したＩＬ１２核酸断片と等モルのＧＡＬ４ＵＡＳ核酸断片をそれぞれ２断片スプライシングし、ＰＣＲを実行した。スプライシング条件は、事前変性：９４ ℃、４分；変性：９４ ℃，４０秒；アニーリング：４２ ℃、４０秒；伸長：６８ ℃、３分２０秒、７サイクル行った後、合計伸長６８ ℃、１０分であり、ＤＮＡポリメラーゼおよびフォワードプライマーとリバースプライマーを補足した後、ＰＣＲ増幅を３０サイクル行い、増幅条件は、事前変性：９４ ℃、４分；変性：９４ ℃，４０秒；アニーリング：６０ ℃、４０秒；伸長：６８ ℃、３分２０秒、３０サイクル行った後、合計伸長６８ ℃、１０分である。増幅して得られた断片は、ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２である。
【０１０３】
５.レンチウイルスプラスミドベクターの構築
レンチウイルスプラスミドベクターが使用するベクターシステムは、第３世代の自己不活性化レンチウイルスベクターシステムに属し、前記システムには、Ｇａｇ／Ｐｏｌをコードするタンパク質と、Ｒｅｖタンパク質をコードするパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（ａｄｄｇｅｎｅから購入）、ＶＳＶ−Ｇタンパク質をコードするエンベローププラスミドＰＭＤ２.Ｇ（ａｄｄｇｅｎｅから購入）の３つのプラスミドがある。
【０１０４】
上記ステップ１および２で取得した標的遺伝子ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４をＭｌｕＩおよびＳａｃＩＩ制限酵素により二重消化され、同じ二重消化でｐＨＲＬＳＩＮベクター（ａｄｄｇｅｎｅから購入）に接続し；および標的遺伝子ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２は、ＮｒｕＩおよびＭｌｕＩ制限酵素により二重消化され、同じ二重消化でＭｌｕIのｐＨＲＬＳＩＮベクターに接続された。正常に構築されたベクターはシーケンスが正しく行われた後、レンチウイルスのパッケージングのために準備できる。
【０１０５】
得られたターゲット断片を含むベクターは次のとおりである（機能要素と接続関係については、図１Ａおよび図１Ｂを参照）：
ｐＨＲＬＳＩＮ−ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４（すなわち、ｐＨＲ−ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ  −ＧＡＬ４ＶＰ６４、ここで、ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示さる）；
ｐＨＲＬＳＩＮ−ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２−ＰＧＫ−ｍｃｈｅｒｒｙ（すなわち、ｐＨＲ−ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２−ＰＧＫ-ｍｃｈｅｒｒｙ、その配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示さる）
６.プラスミドトランスフェクション２９３Ｔパッケージングレンチウイルス
１）トランスフェクションするために、６〜１０継代まで培養した２９３Ｔ細胞を５×１０６の密度で１０  ｃｍペトリ皿に接種し、３７ ℃、５％  ＣＯ２で一晩培養し、培地は１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭである；
２）１０ μｇの標的遺伝子プラスミドｐＨＲＬＳＩＮ−ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４、ｐＨＲＬＳＩＮ−ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２−ＰＧＫ−ｍｃｈｅｒｒｙをそれぞれ３ μｇのエンベローププラスミドｐＭＤ２.Ｇ、７.５ μｇのパッケージングプラスミドｐＡＸ２と８００ μｌのブランクＤＭＥＭ培養液に溶解し、均一に混合する；
３）６０ μｇのポリエーテルイミド（ＰＥＩ）（１  μｇ／μｌ）を８００ μｌの無血清ＤＭＥＭ培養液に溶解し、穏やかに混合（または１０００  ｒｐｍで５秒間ボルテックス）し、５分間インキュベートする；
４）トランスフェクション複合体の形成：プラスミド混合液をＰＥＩ混合液に加え、添加後すぐにボルテックスまたは穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートする；
５）１.６ ｍｌのトランスフェクション複合体を１１ ｍｌのＤＭＥＭ培地を含む１０  ｃｍペトリ皿に滴下する（培地を交換する必要はない）；
６）４−５時間後、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞を１０  ％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地と交換する；
７）トランスフェクションの７２時間後、ウイルス上清を０.４５  μｍのフィルターでろ過する；
８）５×ＰＥＧ−８０００  ＮａＣｌ濃縮ウイルス、３０ ｍｌの初期溶液あたり７.５ ｍｌの母液を加える。２０−３０分に１回、合計３−５回混合し、４ ℃で一晩放置する；
９）翌日４ ℃、４０００  ｒｐｍで６０分間遠心し、上清を廃棄し、遠心分離によって得られた沈殿物を１／１０−１／５０  の元の容量の溶解溶液で再懸濁し、−８０ ℃で１００  μｌ／チューブに保存して、レンチウイルス１を得た。
【０１０６】
７.レンチウイルス力価の測定
１）２９３Ｔ細胞を１×１０５細胞の数で１２ウェル培養プレートに接種し、１ ｍｌ／ウェル；０.６ μｌ／ ｍｌで初期濃度１０ μｇ／μｌのｐｏｌｙｂｒｅｎｅ溶液に加え、最終濃度６ μｇ／ ｍｌ；３７ ℃、５％  ＣＯ２で１時間培養し、培養液は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭである；
２）１０ μｌ／ウェルのウイルス濃縮液を加えて３つの勾配で５倍に希釈し、３７ ℃、５％  ＣＯ２で培養する；
３）感染から７２時間後、２９３Ｔ細胞をトリプシン消化（３０秒）し、１ ｍｌ  ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）を加えて消化を停止し、細胞懸濁液を２ ｍｌの遠心チューブに（二等分）に移し、５０００  ｒｐｍで５分間遠心し、上清を廃棄し；ＰＢＳ（２％  Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ））で２回洗浄する；
４）ｐＨＲＬＳＩＮ−ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４ウイルス対照群細胞を直接にＰＢＳ（２％  ＮＢＳ）で２回洗浄し、対照として再懸濁し；実験群細胞は上記のとおり、実験群細胞＋５０  μｌ  １：５０で希釈したＡｌｅｘａ（Ｒ）−６４７標識ａｎｔｉ−ｍｙｃ抗体を氷上で４５分間インキュベートし、５０００  ｒｐｍ／分、５分間遠心し、上清を廃棄し；２回繰り返し；５００ μｌ  ＰＢＳ（２％  ＮＢＳ）を加え、フローチューブに移し、フローサイトメトリーでＡｌｅｘａ（Ｒ）−６４７チャネルを確認する；
５）ｐＨＲＬＳＩＮ−ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２−ＰＧＫ−ｍｃｈｅｒｒｙウイルスフローサイトメトリーでＰＥ−ＣＦ５９４チャネルを直接に検出する；
６）陽性率が５−２０％の細胞数を適宜取り、力価（Ｕ／ｍＬ）＝細胞数×陽性率／ウイルス体積を計算する。濃縮後に測定されたウイルス力価は、約ｐＨＲＬＳＩＮ−ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎｎｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４：１×１０８Ｕ／ｍｌ；ｐＨＲＬＳＩＮ−ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２−ＰＧＫ−ｍｃｈｅｒｒｙ：３×１０８Ｕ／ｍｌである。
【０１０７】
実施例２：ＮＫ９２細胞の組換えレンチウイルス感染
実施例１で調製されたレンチウイルス１でＮＫ９２細胞を感染させて、ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２細胞を得、具体的な操作は以下の通りである：
１）感染の１日前に２４ウェルプレートに組換えヒトフィブロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）をコーティングし、５  μｇ／ ｍｌの組換えヒトフィブロネクチン溶液（ＰＢＳ）３８０  μｌを各ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートする；
２）感染時に２４ウェルプレート内の組換えヒトフィブロネクチン溶液（ＰＢＳ）を廃棄し、ＰＢＳ  １ ｍｌで２回洗浄する。ＭＯＩ ＝ ３０で上記の組換えレンチウイルスを感染させ、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を最終濃度１０  μｇ／ｍｌで添加して感染効率を高め、ウェルあたりの細胞数は５×１０５で、培地は５００  μｌ、３２ ℃、１８００  ｇ、９０分間遠心分離してから細胞インキュベーターに移し；
３）感染後の細胞を５×１０５／ｍｌの密度で隔日継代する。
【０１０８】
実施例３：ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２細胞の同定
レンチウイルスに感染したＮＫ９２細胞は、培養７日目にフローサイトメトリーによって異なる受容体発現をテストされ、抗ＧＰＣ３のＮ末端にはＭｙｃタグがあるため、Ｍｙｃの発現の検出は、ｐＨＲＬＳＩＮ−ａｎｔｉＧＰＣ３−ｓｙｎＮｏｔｃｈ−ＧＡＬ４ＶＰ６４に感染した陽性細胞であり、ｍｃｈｅｒｒｙの発現の検出は、ｐＨＲＬＳＩＮ−ＧＡＬ４ＵＡＳ−ＩＬ１２−ＰＧＫ−ｍｃｈｅｒｒｙに感染した陽性細胞であり、Ｍｙｃとｍｃｈｅｒｒｙの同時発現は、二重感染が成功した陽性細胞ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２である。
【０１０９】
１）異なる感染したＮＫ９２細胞からそれぞれ１×１０６細胞を取り、２ ｍｌの遠心チューブに二等分し、４ ℃、５０００  ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、ＰＢＳで２回洗浄する；
２）ｍｙｃ発現を検出するための対照群細胞を直接ＰＢＳ（２％ＮＢＳ）で２回洗浄し、対照として再懸濁し；実験群細胞は上記のとおり、実験群細胞＋５０  μｌ  １：５０で希釈したＡｌｅｘａ（Ｒ）−６４７標識ａｎｔｉ−ｍｙｃ抗体を氷上で４５分間インキュベートする；
３）２ ｍｌ  ＰＢＳ（２％  ＮＢＳ）を加えて細胞を再懸濁し、４ ℃、５０００  ｒｐｍ／分で５分間遠心し、上清を廃棄し；２回繰り返す；
４）５００ μｌ  ＰＢＳ（２％  ＮＢＳ）を加え、フローチューブに移す。フローサイトメトリーでＡｌｅｘａ（Ｒ）−６４７チャネルおよびＰＥ−ＣＦ５９４チャネルを確認し、陽性のＮＫ９２細胞の割合を決定する。
【０１１０】
結果は図２に示したとおり、ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２細胞のＭｙｃおよびＭｃｈｅｒｒｙタグの二重陽性率は４０.６％で、そのうちＭｙｃの陽性率は６３.１％、Ｍｃｈｅｒｒｙの陽性率は５４.２％である。
【０１１１】
ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２細胞を５×１０５／ｍｌの細胞密度で隔日継代培養し、カウントし、培養１１日目に、約２０〜４０倍の増殖があり、二重感染したＮＫ９２細胞がインビトロで特定の数を実行できることを示し、後続のインビトロ毒性試験とインビボ試験に保証を提供した。
【０１１２】
実施例４：ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２細胞のＩＬ１２調節発現
１）調節発現は、次のとおりの材料を使用する：肝癌細胞株（Ｈｕｈ７（ＧＰＣ３高発現）、ＰＬＣ／ＰＦＲ／５（ＧＰＣ３低発現）、ＳＫ−Ｈｅｐ−１（ＧＰＣ３発現しない）、ＳＫ−Ｈｅｐ−１−ＧＰＣ３（ＧＰＣ３過剰発現）を標的細胞抗原として刺激し、各標的細胞ＧＰＣ３の発現状況は図３に示したとおりである。エフェクター細胞は、インビトロで１２日間培養されたキメラ抗原受容体を発現するＮＫ９２細胞である；
２）エフェクターと標的の比率（ｅｆｆｅｃｔｏｒ：ｔａｒｇｅｔ）は、１：１で１２ウェルプレートを２×１０５／ウェル；４００ｇで１分間遠心して相互の接触を増加する；
３）実験群と対照群は以下のとおりである：
各実験群：各標的細胞 ＋ ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２
対照群：各標的細胞 ＋ ＮＫ９２
４）３７ ℃、５％  ＣＯ２で２４時間共培養後、上清を回収し、ＥｌｉｓａキットでＩＬ１２の発現を検出する。
【０１１３】
図４Ａを参照すると、Ｅｌｉｓａの結果から、それぞれＧＰＣ３中高発現する細胞株Ｈｕｈ７、ＰＬＣ、およびＧＰＣ３過剰発現するＳＫ−Ｈｅｐ−１を一緒にインキュベートして、本発明のＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２細胞のＩＬ１２を分泌量は大幅に増加したが、ＧＰＣ３を発現しないＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞のＩＬ１２はわずかな基本的な発現であり、ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２細胞によって分泌されるＩＬ１２が標的抗原の刺激と調節に依存することを示す。
【０１１４】
ＧＰＣ３−Ｓｙｎ−ＩＬ１２  ＮＫ９２細胞とＨｕｈ７細胞およびＳＫ−Ｈｅｐ−１−ＧＰＣ３を一緒にインキュベートして、異なる時点でのＩＬ１２分泌が図４Ｂに示されたとりであり、時間の経過とともにＩＬ１２分泌が大幅に増加することを示す。
【０１１５】
実施例５：ＣＡＲ−Ｔ細胞の構築
一例として、本実施例ではＧＰＣ３のＣＡＲ−Ｔ細胞を標的とＣＡＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に示されるアミノ酸配列を有する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６に示されるＧＰＣ−ＢＢＺ、ＧＰＣ−２８ＢＢＺ、ＧＰＣ３−ｚのように、他の世代のＣＡＲも同様の効果があることを理解すべきである。
【０１１６】
ベクターとしてｐＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ.ＥＦ−１αを使用して、ヒト化抗体ｈｕＧＰＣ３の第２世代キメラ抗原受容体を発現するレンチウイルスプラスミド、ＰＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ.ＥＦ−１α−ｈｕＧＰＣ３−２８Ｚを構築した。ＨｕＧＰＣ３−２８Ｚ配列は、シグナルペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ｈｕＧＰＣ３  ｓｃＦＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＣＤ８  ｈｉｎｇｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＣＤ２８  膜貫通ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）および細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）とＣＤ３ＣＤ３ξの細胞内セグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）が構成される。
【０１１７】
実施例１の操作を参照して、２９３Ｔパッケージングレンチウイルスをトランスフェクトし、レンチウイルス２を取得した。
【０１１８】
レンチウイルス２を使用してＴ細胞を感染させ、ＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を得た。
【０１１９】
実施例６：インビトロ実験
ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用し、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性検出キットの指示を参照してください。
【０１２０】
１）標的細胞：５０  μＬの２×１０５／ｍＬのｈｕｈ７細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＫ−Ｈｅｐ−１−ＧＰＣ３、ＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞を９６ウェルプレートに接種する；
２）エフェクター細胞：エフェクターと標的の比率３：１、１：１または１：３でＵＴＤ、ＵＴＤ＋ＧＰＣ３−Ｓｙｎ−ＩＬ１２、ＧＰＣ３−２８Ｚ、およびＧＰＣ３−２８Ｚ＋ＧＰＣ３−Ｓｙｎ−ＩＬ１２細胞を加える。
【０１２１】
エフェクター細胞と標的細胞を１２時間一緒にインキュベートし、実験結果は図６に示したとおりである。
【０１２２】
実施例７：インビボ腫瘍抑制実験
ａ.ＮＳＧマウスにＨｕｈ７移植腫瘍を接種する
Ｈｕｈ７細胞を、マウスあたり２×１０６個に皮下に接種する。
【０１２３】
ｂ.ＵＴＤ、ＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、および二重感染ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２を準備する。
【０１２４】
１）０日目に、３×１０７  ＰＢＭＣ細胞を取り、ＣＤ３−ＣＤ２８抗体に従ってコーティング磁気ビーズ：細胞 ＝ ２：１で磁気ビーズを追加し、培地はＡＩＭ−Ｖ（２％ＡＢ血清）で、総容量は５ ｍｌである。そして最終濃度が５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を加えた；
２）１日目に、２４ウェル細胞培養プレートを組換えヒトフィブロネクチンでコーティングし：組換えヒトフィブロネクチンの濃度は５ μｇ／ｍｌ、３８０  μｌ／ウェル、４ ℃で一晩インキュベートする；
３）２日目に、ウイルス感染のために活性化細胞を採取し、各ウイルスに感染したＰＢＭＣの数は３×１０６でＭＯＩ ＝ １０であった。細胞とウイルス液を組換えヒトフィブロネクチンでコーティングした２４ウェルプレートに移し、感染条件は３２ ℃、１８００  ｒｐｍで４０分間遠心する；
４）３日目に、感染したＰＢＭＣ細胞を低速（５００  ｒｐｍ、１０分）で遠心分離して死んだ細胞を取り除き、培地を交換する；
５）５日目に、ＣＤ３−ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズを磁極で取り除き、１２日間インキュベートする。
【０１２５】
ｃ.Ｈｕｈ７移植腫瘍にＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞とＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２細胞の養子免疫療法の併用を行う。
【０１２６】
１８日目に、ＮＳＧマウスにおけるＨｕｈ７の移植腫瘍の体積を測定し、約１５０  ｍｍ３である。マウスを、ＵＴＤ対照群、ＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ単一治療群、ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２単一治療群、およびＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ ＋ ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２併用治療群を含む４つの群に分け、各グループ６匹のマウスであり、グループ化されたマウスに養子免疫療法を行う。２００  μｌの細胞を尾静脈から注射する。
【０１２７】
（ａ）ＵＴＤ群（トランスフェクションベクターなしのＴ細胞群：１×１０６／個ＵＴＤ。
【０１２８】
（ｂ）ＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞群：１×１０６／個の陽性細胞。
【０１２９】
（ｃ）ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２群：１×１０６／個の陽性細胞。
【０１３０】
（ｄ）ＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ ＋ ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２併用治療群：それぞれ１×１０６／個の陽性細胞、その後３〜４日ごとにＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２細胞を再度投与し、合計４回投与し、毎回１×１０６／個の陽性細胞。
【０１３１】
ｄ.Ｈｕｈ７移植腫瘍のサイズを３〜４日ごとに測定し、マウスの各群の腫瘍体積の変化を記録し、腫瘍体積の計算式は（長さ×幅２）／２である。結果は図５Ａに示したとおり、ＧＰＣ３−２８ＺＣＡＲ−Ｔ ＋ ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２併用治療群は、腫瘍の成長を大幅に抑制できることがわかる。
【０１３２】
４５日目に、マウスを首で死に至らしめ、マウスの皮下腫瘍を剥がして腫瘍の重量を測定し、結果は図５Ｂに示したとおり、対照群と比較して、ＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ ＋ ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２併用治療群のマウスの腫瘍重量はより軽かった。
【０１３３】
マウスの各群の腫瘍体積の変化を記録するプロセスで、マウスの体重変化を図５Ｃに示したとおり、各治療群のマウスの体積変化に統計的な差はなかった。データの統計的方法は、±ＳＥＭ、＊Ｐ ＜ ０.０５、＊＊Ｐ ＜ ０.０１、＊＊＊Ｐ ＜ ０.００１、＊＊＊＊Ｐ ＜ ０.０００１、２  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡである。
【０１３４】
従来の組織切片調製法を使用して、マウスの腫瘍組織を組織切片にした。組織切片を免疫組織化学で染色し、抗ヒトＣＤ３抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して腫瘍組織切片のヒトＣＡＲ−Ｔ細胞を検出し、結果は図７に示したとおり、ＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ ＋ ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−ＮＫ９２併用療法群では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の浸潤が多く、上記の結果は、併用療法群の２つの細胞間に相乗効果があることを示す。
【０１３５】
結論：インビトロ実験では、ＧＰＣ３−２８Ｚ ＋ ＧＰＣ３−Ｓｙｎ−ＩＬ１２細胞は、対照群と比較して腫瘍細胞の殺傷に有意差はなかった。インビボ実験では、ＧＰＣ３−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔ ＋ ＧＰＣ３−ＳＹＮ−ＩＬ１２−対照群と比較して、ＮＫ９２併用治療群のマウスの腫瘍増殖は有意に抑制された。
【０１３６】
上記の実施例の説明は、本発明の核となる考えを理解するのを助けるためにのみ使用される。当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、本発明の固体粉末組成物およびその調製方法にいくつかの改良および修飾を行うことができるが、これらの改良および修飾はまた、本発明の特許請求の範囲に含まれることに留意されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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