(57)【要約】  本発明は融合タンパク質、及び腫瘍及び／又はウイルス感染の治療薬を製造するためのその使用を開示する。前記融合タンパク質はヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと、ヒトインターフェロンとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと、
ｂ）ヒトインターフェロンとを含み、
前記ヒトインターフェロンは直接的に又はペプチドリンカーを介して前記抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端又はアミノ末端に接続される融合タンパク質。
【請求項２】
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３とを備える抗体重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３とを備える抗体軽鎖可変領域とを含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記重鎖可変領域は配列番号７に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号８に示すアミノ酸配列を含む請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合フラグメントはラクダ化された単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖ２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二重特異性抗体、ナノボディ、ドメイン抗体又は２価ドメイン抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗体は免疫グロブリン定常領域をさらに含み、好ましくは、前記定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の定常領域である請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ヒトインターフェロンはＩ型ヒトインターフェロン、ＩＩ型ヒトインターフェロン、ＩＩＩ型ヒトインターフェロンから選ばれ、
好ましくは、前記ヒトインターフェロンはＩＦＮα２ａ、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ３、ＩＦＮα２ｂであり、
より好ましくは、前記ヒトインターフェロンはＩＦＮα２ｂであり、そのアミノ酸配列は配列番号９に示すとおりであり、
さらに好ましくは、前記ヒトインターフェロンはＩＦＮα２ｂの突然変異体であり、配列番号９に示すアミノ酸配列で、Ｔ１０６Ａ、Ｒ１４９Ａ、Ａ１４５Ｇ、Ａ１４５Ｄ、Ｒ１２０Ａ、Ｌ１１７Ａから選ばれる１つ以上の突然変異を有し、
一層好ましくは、前記ＩＦＮα２ｂの突然変異体は配列番号９に示すアミノ酸配列で、Ｔ１０６Ａ／Ａ１４５Ｄ、Ｔ１０６Ａ／Ｒ１４９Ａ、Ｔ１０６Ａ／Ａ１４５Ｇ、Ｔ１０６Ａ／Ｒ１２０Ａ、Ｔ１０６Ａ／Ｌ１１７Ａから選ばれる二重突然変異を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーは（Ｇ）ｎ、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎから選ばれ、好ましくは、前記ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎは０〜５の整数であり、好ましくは、ｎは１〜３の整数である請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２、ＵＭＹ０２−Ｌ３、ＵＭＹ０２−Ｌ４、ＵＭＹ０２−Ｌ５、ＵＭＹ０２−Ｌ６、ＵＭＹ０２−Ｌ７、ＵＭＹ０２−Ｌ８、ＵＭＹ０２−Ｌ１３、ＵＭＹ０２−Ｌ１４、ＵＭＹ０２−Ｌ１５、ＵＭＹ０２−Ｌ１６、ＵＭＹ０２−Ｌ１７、ＵＭＹ０２−Ｌ１８、ＯＸ４０  ＩＦＮ−α２ａ、ＯＸ４０−ＩＦＮβ、ＯＸ４０−ＩＦＮγ、ＯＸ４０−ＩＦＮλ３のうちの１つ以上から選ばれる請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、分離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の分離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項９に記載の分離されたポリヌクレオチドを発現できる条件で請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質の発現方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含むキット。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
免疫応答の増強及び／又はインターフェロンへの曝露により利益を得る病状の治療薬を製造するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用であって、好ましくは、前記病状はがん又はウイルス感染であり、より好ましくは、前記ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス感染である前記使用。
【請求項１６】
免疫応答の増強及び／又はインターフェロンへの曝露により利益を得る病状の治療方法であって、治療を必要とする対象に治療有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項１４に記載の医薬組成物を投与することであって、好ましくは、前記病状はがん又はウイルス感染であり、より好ましくは、前記ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス感染であることを含む前記治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学分野に属し、詳しく言えば、融合タンパク質及びその使用に関し、より詳しく言えば、抗ＯＸ４０抗体及びヒトインターフェロンを含む融合タンパク質並びに腫瘍及び／又はウイルス感染の治療薬を製造するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＯＸ４０は主に、活性化されたＴ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔｈ、Ｔｒｅｇ細胞を含む）に発現される［非特許文献１］。ナイーブＴ細胞ではＯＸ４０の発現量が少ないものの、抗原誘導刺激によりその発現量がアップレギュレートされ、しかも１２時間から５〜６日以内にピークに達する。同様に、ＯＸ４０Ｌの発現も細胞の活性化状態から影響を受ける［非特許文献１］。ＡＰＣ細胞では抗原刺激から１〜３日後にＯＸ４０Ｌの発現が検出される。興味深いことに、免疫細胞の他に、筋細胞が炎症性因子に刺激されるとＯＸ４０Ｌを発現し［非特許文献２、３］、これはＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０シグナル伝達経路が体内の炎症反応に幅広く作用することを示す。
【０００３】
抗原依存性ＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０共刺激分子の活性化がＴ細胞内の複数のシグナル伝達経路に関与する。結晶構造研究から明らかなように、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０の結合がＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ複合体の三量体化を誘導して［非特許文献４］、細胞内に受容体関連因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ、略称ＴＲＡＦ）との結合部位を生成できる。そして後者（ＴＲＡＦ２、５）がＮＦ−κＢシグナル伝達経路を活性化させて、Ｔ細胞アポトーシスを抑制できる［非特許文献２、５、６］。関連の研究からＯＸ４０活性化がＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬの高発現につながることが判明し［非特許文献７］、これはＯＸ４０がＮＦ−κＢシグナル伝達経路によって抗アポトーシスタンパク質の発現を誘導することでＴ細胞アポトーシス抑制機能を実現することを示す。
【０００４】
ＰＫＢ／ＰＩ３ＫはＯＸ４０の下流のもう１つの重要なシグナル伝達経路である。Ｔ細胞におけるＯＸ４０の共刺激シグナルがＰＫＢの活性化を維持するために必要である一方、構成的に活性化されたＰＫＢがＯＸ４０欠損によるＴ細胞における抗アポトーシスタンパク質のダウンレギュレーションに拮抗することが関連の研究から明らかになる。ＯＸ４０共刺激シグナルはＰＫＢ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路によってサバイビンタンパク質の発現を維持できる［非特許文献８］。
【０００５】
さらに、Ｔ細胞ではＴＣＲ及びＯＸ４０の活性化は相乗的にカルシウムフラックス及びＮＦＡＴシグナル伝達経路の活性化を引き起こして、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γなどのサイトカインの発現を調節できる［非特許文献９］。
【０００６】
要約すると、従来の研究から、ＯＸ４０の活性化はＮＦ−κＢシグナル伝達経路、ＰＫＢ／ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路及びＮＦＡＴシグナル伝達経路によってＴ細胞の増殖、アポトーシス及びサイトカイン分泌活性を調節して、免疫系の活性を増強させる効果を得るということが分かる。
【０００７】
上記の知見を踏まえ、ＯＸ４０が免疫療法の１つの重要な標的であり、しかもＯＸ４０が腫瘍免疫療法の１つの重要な標的になることが多くの前臨床又は臨床研究から示される。興味深いことに、最近の研究ではＢ型肝炎ウイルス感染抑制におけるＯＸ４０シグナル伝達経路の役割が判明し［非特許文献１０］、これはＯＸ４０アゴニストが抗ウイルス感染（例えば、Ｂ型肝炎患者の治療）で１つの治療手段として有望であることを示す。
【０００８】
インターフェロンは高活性で多機能な糖タンパク質である。インターフェロンは腫瘍細胞増殖を調節し、腫瘍転移及び血管新生を抑制し、抗腫瘍免疫応答を活性化させることにより優れた抗腫瘍効果を発揮するとともに、ヒトの免疫系を調節することで抗ウイルスでは臨床上大きな利用価値があり、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス感染の臨床治療ではインターフェロンが既に重要な治療手段になっている。
【０００９】
ＯＸ４０アゴニストもインターフェロンも抗腫瘍及び抗ウイルス分野で大きな利用価値が見込まれるものの、両者は患者の応答率や効能の面で優れないことが従来の研究からも分かる。したがって、治療効果がより優れているＯＸ４０アゴニスト及びインターフェロンが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと、ヒトインターフェロンとを含む融合タンパク質を提供することを目的とし、さらに、腫瘍及び／又はウイルス感染を治療するための前記融合タンパク質の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明が前記目的を達成するために採用する技術的解決手段は以下のとおりである。
本発明の第１態様では、
ａ）ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと、
ｂ）ヒトインターフェロンとを含み、
前記ヒトインターフェロンは直接的に又はペプチドリンカーを介して前記抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端又はアミノ末端に接続される、融合タンパク質を開示する。
【００１２】
本発明に係る融合タンパク質において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３とを備える抗体重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３とを備える抗体軽鎖可変領域とを含む。
【００１３】
本発明に係る融合タンパク質において、前記重鎖可変領域は配列番号７に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号８に示すアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明に係る融合タンパク質において、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合フラグメントはラクダ化された単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖ２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二重特異性抗体、ナノボディ、ドメイン抗体又は２価ドメイン抗体である。
【００１５】
本発明に係る融合タンパク質において、前記抗体は免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の定常領域をさらに含む。
【００１６】
本発明に係る融合タンパク質において、前記ヒトインターフェロンはＩ型ヒトインターフェロン、ＩＩ型ヒトインターフェロン、ＩＩＩ型ヒトインターフェロンから選ばれ、好ましくは、前記ヒトインターフェロンはＩＦＮα２ａ、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＩＦＮα２ｂであり、より好ましくは、前記ヒトインターフェロンはＩＦＮα２ｂであり、そのアミノ酸配列は配列番号９に示すとおりである。
【００１７】
さらに好ましくは、前記ヒトインターフェロンはＩＦＮα２ｂの突然変異体であり、配列番号９に示すアミノ酸配列で、Ｔ１０６Ａ、Ｒ１４９Ａ、Ａ１４５Ｇ、Ａ１４５Ｄ、Ｒ１２０Ａ、Ｌ１１７Ａから選ばれる１つ以上の突然変異を有し、
一層好ましくは、前記ＩＦＮα２ｂの突然変異体は配列番号９に示すアミノ酸配列で、Ｔ１０６Ａ／Ａ１４５Ｄ、Ｔ１０６Ａ／Ｒ１４９Ａ、Ｔ１０６Ａ／Ａ１４５Ｇ、Ｔ１０６Ａ／Ｌ１１７Ａ、Ｔ１０６Ａ／Ｒ１２０Ａから選ばれる二重突然変異を有する。
【００１８】
本発明に係る融合タンパク質において、前記ペプチドリンカーは（Ｇ）ｎ、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎから選ばれ、好ましくは、前記ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎは０〜５の整数であり、好ましくは、ｎは１〜３の整数である。
【００１９】
本発明に係る融合タンパク質は、
配列番号１０に示すアミノ酸配列と、配列番号１１に示すアミノ酸配列とを含み、配列番号１０に示すアミノ酸配列はＯＸ４０の抗体の重鎖、ペプチドリンカー及びヒトインターフェロンであり、配列番号１１に示すアミノ酸配列はＯＸ４０の抗体の軽鎖であるＵＭＹ０２−Ｌ１、
配列番号１２に示すアミノ酸配列と、配列番号１３に示すアミノ酸配列とを含み、配列番号１２に示すアミノ酸配列はＯＸ４０の抗体の重鎖であり、配列番号１３に示すアミノ酸配列はＯＸ４０の抗体の軽鎖、ペプチドリンカー及びヒトインターフェロンであるＵＭＹ０２−Ｌ２、
配列番号１４に示すアミノ酸配列と、配列番号１３に示すアミノ酸配列とを含み、配列番号１４に示すアミノ酸配列はＯＸ４０の抗体の重鎖であり、配列番号１３に示すアミノ酸配列はＯＸ４０の抗体の軽鎖、ペプチドリンカー及びヒトインターフェロンであるＵＭＹ０２−Ｌ３、
重鎖は配列番号１４に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーはないＵＭＹ０２−Ｌ４、
重鎖は配列番号１４に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーはＧＧＧＧＳであるＵＭＹ０２−Ｌ５、
重鎖は配列番号１４に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）２であるＵＭＹ０２−Ｌ６、
重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーはＧＧＧＧＳであるＵＭＹ０２−Ｌ７、
重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）２であるＵＭＹ０２−Ｌ８、
重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）２であり、インターフェロンは配列番号９をもとに突然変異Ｔ１０６Ａ／Ａ１４５Ｄを含むＵＭＹ０２−Ｌ１３、
重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）２であり、インターフェロンは配列番号９をもとに突然変異Ｔ１０６Ａ／Ｒ１４９Ａを含むＵＭＹ０２−Ｌ１４、
重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）２であり、インターフェロンは配列番号９をもとに突然変異Ｔ１０６Ａ／Ｒ１２０Ａを含むＵＭＹ０２−Ｌ１５、
重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）２であり、インターフェロンは配列番号９をもとに突然変異Ｔ１０６Ａ／Ａ１４５Ｇを含むＵＭＹ０２−Ｌ１６、
重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）３であり、インターフェロンは配列番号９をもとに突然変異Ｔ１０６Ａ／Ｒ１４９Ａを含むＵＭＹ０２−Ｌ１７、
重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）２であり、インターフェロンは配列番号９をもとに突然変異Ｔ１０６Ａ／Ｌ１１７Ａを含むＵＭＹ０２−Ｌ１８、
融合タンパク質ＯＸ４０  ＩＦＮ−α２ａ、ＯＸ４０−ＩＦＮβ、ＯＸ４０−ＩＦＮγ、ＯＸ４０−ＩＦＮλ３であって、ＯＸ４０  ＩＦＮ−α２ａ、ＯＸ４０−ＩＦＮβ、ＯＸ４０−ＩＦＮγ、ＯＸ４０−ＩＦＮλ３の重鎖は配列番号１５に示すとおり、ＯＸ４０  ＩＦＮ−α２ａの軽鎖、ペプチドリンカー及びインターフェロンは配列番号１６に示すとおり、ＯＸ４０  ＩＦＮ−βの軽鎖、ペプチドリンカー及びインターフェロンは配列番号１７に示すとおり、ＯＸ４０  ＩＦＮ−γの軽鎖、ペプチドリンカー及びインターフェロンは配列番号１８に示すとおり、ＯＸ４０  ＩＦＮ−λ３の軽鎖、ペプチドリンカー及びインターフェロンは配列番号１９に示すとおりである前記融合タンパク質ＯＸ４０  ＩＦＮ−α２ａ、ＯＸ４０−ＩＦＮβ、ＯＸ４０−ＩＦＮγ、ＯＸ４０−ＩＦＮλ３、
から選ばれる。
【００２０】
本発明の第２態様では、前記融合タンパク質をコードする、分離されたポリヌクレオチドを開示する。
【００２１】
本発明の第３態様では、前記分離されたポリヌクレオチドを含むベクターを開示する。
【００２２】
本発明の第４態様では、前記ベクターを含む宿主細胞を開示する。
【００２３】
さらに本発明は、分離されたポリヌクレオチドを発現できる条件で前記宿主細胞を培養すること含む前記融合タンパク質の発現方法を開示する。
【００２４】
さらに本発明は、前記融合タンパク質を含むキットを開示する。
【００２５】
さらに本発明は、前記融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を開示する。
【００２６】
さらに本発明は、免疫応答の増強及び／又はインターフェロンへの曝露により利益を得る病状の治療薬を製造するための前記融合タンパク質の使用を開示する。
【００２７】
好ましくは、前記病状はがん又はウイルス感染であり、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス感染である。
【００２８】
さらに本発明は、免疫応答の増強及び／又はインターフェロンへの曝露により利益を得る病状の治療方法であって、治療を必要とする対象に治療有効量の前記融合タンパク質を投与することを含む方法を開示し、好ましくは、前記病状はがん又はウイルス感染であり、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス感染である。
【００２９】
本発明は、免疫応答の増強及び／又はインターフェロンへの曝露により利益を得る病状を治療する融合タンパク質を開示し、好ましくは、前記病状はがん又はウイルス感染であり、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス感染である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明はＯＸ４０活性化抗体及びインターフェロンを含む融合タンパク質を開示し、当該融合タンパク質は両者の異なる作用機序を組み合わせ、相乗的な増強効果を得る。融合タンパク質のインターフェロンの部分がインターフェロン受容体を高発現する細胞（例えば、腫瘍又はウイルスに感染した細胞）の表面に結合すると、受容体の媒介によりＯＸ４０活性化抗体の活性を増強させることにより、免疫系の活性を一層増強させる。また、本発明の融合タンパク質はインターフェロン分子より半減期が大幅に延長するため、臨床でより低い頻度での投与が可能であるため、毎日注射が必要なインターフェロンよりも利点が大きい。
【００３１】
以上から分かるように、本発明の融合タンパク質は抗腫瘍及び抗ウイルス治療に優れた効能及び良好なコンプライアンスが見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
次に、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。
【図１】図１は本発明の融合タンパク質の構造模式図である。
【図２】図２は本発明の融合タンパク質とヒトＯＸ４０タンパク質のＥＬＩＳＡ結合実験の結果を示す。
【図３】図３はＭＴ０１−Ｌ１抗体がヒト及びカニクイザルＯＸ４０の両方に結合し、マウスＯＸ４０に結合しないＦＡＣＳ検出結果を示す。
【図４】図４はＤａｕｄｉ細胞に対する本発明の融合タンパク質の増殖抑制効果を示す。
【図５】図５は本発明の融合タンパク質のＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路活性化活性を示す。
【図６】図６は本発明の融合タンパク質がＭＴ０１−Ｃ１抗体のＯＸ４０シグナル伝達経路活性化活性を促進できることを示す。本実験系ではＯＸ４０モノクローナル抗体（ＭＴ０１−Ｃ１、ＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２））又はインターフェロン分子ＩＦＮα２ｂ単独がＪｕｒｋａｔ細胞のＯＸ４０シグナル伝達経路に活性化効果がなく又は効果が弱いが（図６ａ）、同じ条件下で融合タンパク質（ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２、ＵＭＹ０２−Ｌ３）はＯＸ４０シグナル伝達経路に明らかな活性化活性を有する（図６ｂ）。
【図７】図７はマウスにおけるＵＭＹ０２−Ｌ１及びＵＭＹ０２−Ｌ３の薬物動態曲線である（図７ａ）。対照的に図７ｂは、マウスにおけるＭＴ０１−Ｃ１の薬物動態曲線である。
【図８】図８は本発明の融合タンパク質の腫瘍細胞殺傷効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
次の記載が本願の様々な実施形態を説明するものに過ぎず、具体的な変更が記載される場合に本願の範囲を限定するものと理解されない。本願の範囲を逸脱せず当業者が同等な形態や、変化又は変更を行うことができ、このような同等な実施形態も本発明の範囲に含まれる。出版物、特許、特許出願を含め本願が引用する全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３４】
「関連の用語及び定義」
本発明で用語「抗体」とは、特定の抗原に結合できる任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性（２価）抗体を含む。天然の完全抗体が２つの重鎖と、２つの軽鎖とを含む。各重鎖は１つの可変領域及び第１、第２、第３定常領域で構成され、各軽鎖は１つの可変領域及び１つの定常領域で構成される。哺乳類の場合、重鎖はα、δ、ε、γ、μに分けられ、軽鎖はλ、κに分けられる。抗体は「Ｙ」字状であり、Ｙ字状構造のネック部がジスルフィドによって結合される２つの重鎖の第２及び第３定常領域で構成される。「Ｙ」字状構造の各アームが、一方の軽鎖の可変領域及び定常領域に結合される一方の重鎖の可変領域及び第１定常領域を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域が結合抗原を決定する。各鎖の可変領域はいずれも相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含む。軽鎖（Ｌ）のＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、重鎖（Ｈ）のＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む。本発明に係る抗体及び抗原結合フラグメントのＣＤＲの境界はＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ命名法で命名又は認識される（ＡＩ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４）：９２７（１９９７）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８６（３）：６５１−６３（１９８５）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２（６２５２）：８７７−８３（１９８９）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。３つのＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる側方の連続的な部分によって隔てられ、フレームワーク領域はＣＤＲよりも保守的で超可変ループをサポートする足場を形成する。重鎖及び軽鎖の定常領域は抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を有する。重鎖定常領域のアミノ酸配列によって抗体はいくつかのクラスに分けられる。α、δ、ε、γ、μ重鎖を含むかどうかで、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの５つの主なクラス又はアイソフォームに分けられる。当該主な抗体クラスはさらにＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）、ＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分けられる。
【００３５】
本願で用語「抗原結合フラグメント」とは、１つ以上のＣＤＲを備える抗体部分又は任意の他の結合抗原を含むが完全な抗体構造を有しない抗体フラグメントによって形成される抗体フラグメントである。抗原結合フラグメントの例としては、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化二重特異性抗体（ｄｓ  ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（２価二重特異性抗体）、２価一本鎖抗体（ＢｓＦｖ）、多重特異性抗体、ラクダ化された単一ドメイン抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、ドメイン抗体、２価ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントは親抗体と同じ抗原に結合できる。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは特定のヒト抗体に由来する１つ以上のＣＤＲを含み、１つ以上の異なるヒト抗体のフレームワーク領域にクラフトされる。
【００３６】
抗体の「Ｆａｂ」フラグメントとは、１つの軽鎖（可変領域及び定常領域を含む）、１つの重鎖の可変領域及び定常領域の一部がジスルフィドによって結合された抗体分子の部分である。
【００３７】
「Ｆａｂ’」フラグメントとは、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂフラグメントである。
【００３８】
「Ｆ（ａｂ’）２」とは、Ｆａｂの二量体である。
【００３９】
抗体のＦｃセグメントは様々なエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）に関与するが、抗原結合には関与しない。
【００４０】
抗体の「Ｆｖ」セグメントとは、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。Ｆｖフラグメントは１つの軽鎖の可変領域及び１つの重鎖の可変領域で構成される。
【００４１】
「融合タンパク質」とは遺伝子レベルにおいて標的タンパク質をコードするｃＤＮＡと抗体又は抗体フラグメントをコードするｃＤＮＡを接続させ、真核又は原核発現系で発現させる組換えタンパク質である。
【００４２】
「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」とは、ペプチド結合を形成する１〜５０個のアミノ酸で構成されるペプチド鎖又はその誘導体であり、Ｎ末端及びＣ末端はそれぞれ抗ＯＸ４０抗体又はインターフェロンのいずれかと共有結合を形成することにより、抗ＯＸ４０抗体とインターフェロンを結合させる。抗ＯＸ４０抗体の重鎖もしくは軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側でリンカー配列によって、又は直接的にペプチド結合を用いてインターフェロンのＮ末端又はＣ末端にそれぞれ結合させることにより、抗ＯＸ４０抗体とインターフェロンを組み立てる。インターフェロンと抗ＯＸ４０抗体を含む融合タンパク質の好ましい実施形態としては、抗ＯＸ４０抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端でリンカー配列によってインターフェロンのＮ末端に結合させてなる融合タンパク質、抗ＯＸ４０抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端でリンカー配列によってインターフェロンのＣ末端に結合させてなる融合タンパク質が挙げられる。
【００４３】
「一本鎖Ｆｖ抗体」又は「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域が直接的に接続され、又は１つのペプチド鎖によって接続されてなる組換え抗体である（Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８５：５８７９（１９８８））。
【００４４】
「一本鎖抗体Ｆｖ−Ｆｃ」又は「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」とは、特定の抗体のＦｃセグメントに接続されるｓｃＦｖからなる組換え抗体である。
【００４５】
「ラクダ化された単一ドメイン抗体（Ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「重鎖抗体（Ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ−ｏｎｌｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、略称ＨＣＡｂ）」とは、いずれも２つのＶＨドメインを含むが軽鎖を含まない抗体である（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１（１−２）：２５−３８（１９９９）、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（４）：２７７−３０２（２００１）、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９４／０４６７８号、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９４／２５５９１号、米国登録特許第６００５０７９号）。重鎖抗体は最初にラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ）から得る。軽鎖が欠落するとはいえ、ラクダ化された抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は抗原結合を含め全ての機能を備えることの確証がある（Ｈａｍｅｒｓ  Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３（６４２８）：４４６−８（１９９３）、Ｎｇｕｙｅｎ  ＶＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｍｅｌｉｄａｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５４（１）：３９−４７（２００２）、Ｎｇｕｙｅｎ  ＶＫ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１０９（１）：９３−１０１（２００３））。重鎖抗体の可変領域（ＶＨドメイン）は後天性免疫で産生した既知の最小の抗原結合単位である（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２１（１３）：３４９０−８．Ｅｐｕｂ（２００７））。
【００４６】
「ナノボディ」とは、重鎖抗体に由来する１つのＶＨドメイン、２つの定常領域ＣＨ２、ＣＨ３で構成される抗体フラグメントである。
【００４７】
「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は２つの抗原結合部位を有する短い抗体フラグメントを含み、当該フラグメントは１つのポリペプチド鎖で接続されたＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む（参照文献：Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９０（１４）：６４４４−８（１９９３）、欧州特許出願第ＥＰ４０４０９７号、ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９３／１１１６１号）。２つのドメインの間のリンカーが非常に短いため、１つの鎖における２つのドメインが互いにペアリングできず、２つのドメインが別の２つの鎖の相補性決定領域にペアリングして、２つの抗体結合部位を形成する。当該２つの抗体結合部位は同じ又は異なる抗原（又はエピトープ）標的に結合できる。
【００４８】
「ドメイン抗体」とは、１つの重鎖可変領域又は１つの軽鎖可変領域を含む抗体フラグメントである。場合によっては、２つ以上のＶＨドメインが１つのポリペプチドリンカーによって共有結合されて２価ドメイン抗体が形成される。２価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインが同じ又は異なる抗原標的に作用できる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」は３つのペプチド鎖を含み、２つのＶＨ基は１つのポリペプチドリンカーによって接続され、且つジスルフィド結合によって２つのＶＬ基に結合される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、「ｄｓ二重特異性抗体」はＶＬ１−ＶＨ２（２つのポリペプチドリンカーによって接続される）及びＶＨ１−ＶＬ２（２つのポリペプチドリンカーによって接続される）を含み、ＶＨ１とＶＬｌの間に両者がジスルフィドによって結合される。
【００５１】
「二重特異性ｄｓＦｖ」又は「ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ」は３つのポリペプチド鎖を含み、ＶＨ１−ＶＨ２基で両方の重鎖がポリペプチドリンカー（例えば、長い弾性リンカー）によって接続され、且つジスルフィド結合によってそれぞれＶＬ１基、ＶＬ２基に結合され、ジスルフィド結合によってペアリングする各重鎖−軽鎖対が異なる抗原特異性を備える。
【００５２】
いくつかの実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」とは、２価二重特異性抗体又は２価一本鎖抗体（ＢｓＦｖ）であり、二量体化された２つのＶＨ−ＶＬ基（ポリペプチドリンカーによって接続される）を含み、２つの基のＶＨが別の基のＶＬと協働して２つの結合部位を形成し、当該２つの結合部位は同じ抗原（もしくはエピトープ）又は異なる抗原（もしくはエピトープ）標的に結合できる。また、いくつかの実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」とは二重特異性抗体であり、互いにポリペプチドリンカーによって接続されるＶL1−ＶH2、ポリペプチドリンカーによって接続されるＶH1−ＶL2を含み、ＶH1とＶL1が協働し、ＶH2とＶL2が協働し、しかも協働する各対が異なる抗原特異性を備える。
【００５３】
本願で用語「完全ヒト化」は、抗体又は抗原結合フラグメントに対して使用される場合、前記抗体又は抗原結合フラグメントが特定のアミノ酸配列を備え、又は前記アミノ酸配列で構成されることであり、前記アミノ酸配列はヒト又はヒト免疫細胞が産生した、もしくはヒト化抗体ライブラリーを利用した遺伝子組換え非ヒト動物などの非ヒト由来の抗体のアミノ酸配列、又はヒト化抗体をコードする他の配列に対応する。いくつかの実施形態では、完全ヒト化抗体は非ヒト抗体に由来するアミノ酸残基（特に抗原結合残基）を含まない。
【００５４】
本願で用語「ヒト化」は、抗体又は抗原結合フラグメントに対して使用される場合に、非ヒト動物に由来するＣＤＲ、ヒトに由来するＦＲ領域、（適用する場合に）ヒトに由来する定常領域を含む抗体又は抗原結合フラグメントである。ヒト化抗体又は抗原結合フラグメントは免疫原性が低下しているため、いくつかの実施形態で人間用治療剤として使用できる。いくつかの実施形態では、前記非ヒト動物とは哺乳類で、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスターである。いくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体又は抗原結合フラグメントではＣＤＲ配列が非ヒト化である以外に、殆どがヒト化配列で構成される。いくつかの実施形態では、前記ヒトに由来するＦＲ領域は由来するヒト化抗体と同じアミノ酸配列を含み、又はいくつかのアミノ酸変化を含み、例えば、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下のアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、当該アミノ酸変化は重鎖ＦＲ領域のみに存在してもよいし、軽鎖ＦＲ領域のみに存在してもよいし、又は２つの鎖に同時に存在する。いくつかの好ましい実施形態では、前記ヒト化抗体はヒト化ＦＲｌ−３、ヒト化ＪＨ、ＪＫを含む。
【００５５】
本願で用語「キメラ」とは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の生物種に由来し、且つ前記重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる生物種に由来する抗体又は抗原結合フラグメントである。一例として、キメラ抗体はヒトに由来する定常領域と、非ヒト動物（例えば、マウス）に由来する可変領域とを含む。
【００５６】
用語「ＯＸ４０」とは、ＯＸ４０Ｌに結合する受容体である。ＴＮＦ受容体ファミリーに属するＩ型膜タンパク質である。別名にＡＣＴ−４、ＯＸ４０Ｌ受容体、ＣＤ１３４抗原、ＡＣＴ３５抗原、ＴＮＦＲＳＦ４がある。分子量が５０ｋＤａであり、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔに登録されており、登録番号はＰ４３４８９である。
【００５７】
本願で「ヒトインターフェロン」とは、高活性で多機能の分泌型糖タンパク質であり、抗ウイルス、免疫調節、抗腫瘍などの機能を有する。その遺伝子配列、受容体特異性などによってＩ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型ＩＦＮｓに分けられる。Ｉ型ヒトインターフェロンは１３種のサブタイプからなるＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮκ、ＩＦＮωを含む。Ｉ型ＩＦＮｓは共通の細胞表面受容体ＩＦＮＡＲを有し、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２の２つのサブユニットで構成される。ＩＩ型インターフェロンにはＩＦＮγの１種しかない。ＩＦＮγの細胞表面受容体はＩＦＮＧＲであり、ＩＦＮＧＲ１及びＩＦＮＧＲ２の２つのサブユニットで構成される。ＩＩＩ型ＩＦＮｓはＩＦＮλ１、ＩＦＮλ２、ＩＦＮλ３、ＩＦＮλ４を含む。本願に係る融合タンパク質でインターフェロンは本分野で知られるインターフェロン変異体をさらに含む。
【００５８】
本願で「特異的に結合する」又は「特異的な結合」とは、２つの分子の非ランダム結合反応であり、例えば、抗体と抗原の反応である。いくつかの実施形態では、本願の抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト及び／又はサルＯＸ４０に特異的に結合し、且つ結合親和性（ＫD）が１０-6Ｍ以下である。本願でＫDとは解離速度と結合速度の比（ｋoff／ｋon）であり、表面プラズモン共鳴により、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ社の装置を使用して測定できる。
【００５９】
本願で「ＵＭＹ０２−Ｌ１」とは、配列番号１０に示す重鎖、ペプチドリンカー及びヒトインターフェロンと、配列番号１１に示す軽鎖とを備え、重鎖のカルボキシル末端でペプチドリンカーを介して配列番号９に示すヒトインターフェロンＩＦＮα２ｂが接続される融合タンパク質である。
【００６０】
本願で「ＵＭＹ０２−Ｌ２」とは、配列番号１２に示す重鎖と、配列番号１３に示す軽鎖、ペプチドリンカー及びヒトインターフェロンとを備え、軽鎖のカルボキシル末端でペプチドリンカーを介して配列番号９に示すヒトインターフェロンＩＦＮα２ｂが接続される融合タンパク質である。
【００６１】
本願で「ＵＭＹ０２−Ｌ３」とは、配列番号１４に示す重鎖と、配列番号１３に示す軽鎖、ペプチドリンカー及びヒトインターフェロンとを備え、軽鎖のカルボキシル末端でペプチドリンカーを介して配列番号９に示すヒトインターフェロンＩＦＮα２ｂが接続される融合タンパク質である。
【００６２】
本願で「ＭＴ０１−Ｃ１」とは、ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及びＵＭＹ０２−Ｌ３と同じＶＨ配列（配列番号７）及びＶＬ配列（配列番号８）を備え、且つ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１で、軽鎖定常領域がκ鎖であるモノクローナル抗体である。
【００６３】
本願で「ＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）」とは、ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及びＵＭＹ０２−Ｌ３と同じＶＨ配列（配列番号７）及びＶＬ配列（配列番号８）を備え、且つ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ２で、軽鎖定常領域がκ鎖であるモノクローナル抗体である。
【００６４】
本願で「ＭＴ０１−Ｌ１」とは、ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及びＵＭＹ０２−Ｌ３と同じ重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列（配列番号１〜６）を備え、且つ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１で、軽鎖定常領域がκ鎖であるヒト−マウスキメラ抗体である。
【００６５】
ここで、前記「ＭＴ０１−Ｃ１」、「ＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）」、「ＭＴ０１−Ｌ１」はいずれも中国特許出願第２０１７１１４７６１６０．３号に記載されたもので、その配列は表１及び配列表に詳細に示され、前記文献が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６６】
本願で用語「保守的な置換」は、アミノ酸配列に対して使用される場合に、１つのアミノ酸残基を物理的及び化学的特性が類似する側鎖を備える別のアミノ酸残基に置換することである。例えば、疎水性側鎖アミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＶａＬ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）、中性親水性側鎖残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、酸性側鎖残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性側鎖アミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）又は芳香族側鎖残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ）に対して保守的な置換を行うことができる。本分野で知られる保守的な置換が一般にタンパク質に明らかな立体構造の変化を引き起こさないため、タンパク質の生物学的活性が保持される。
【００６７】
用語「パーセント配列同一性」は、アミノ酸配列（又は核酸配列）に対して使用される場合に、配列アラインメントを行う時、なお且つ所望により対象アミノ酸（又は核酸）の数量が最多になるよう間隔を入れた後、候補配列で参照配列と同じアミノ酸（又は核酸）残基が前記候補配列のアミノ酸（又は核酸）残基に占めるパーセントである。前記アミノ酸残基の保守的な置換は同じ残基と見なされてもよいし、見なされなくてもよい。本分野で知られるツールを用いて配列アラインメントを行ってアミノ酸（又は核酸）配列のパーセント配列同一性を決定できる。当業者が前記ツールのデフォルトパラメータを適用してもよいし、又はアラインメントの要件に応じてパラメータを適切に調整してもよく、例えば、適切なアルゴリズムを選択する。
【００６８】
本願で用語「Ｔ細胞」とは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞を含む。
【００６９】
本願で用語「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域とそのエフェクター（例えば、Ｃ１複合体とＦｃ受容体）の結合の生物学的活性である。エフェクター機能の例としては、抗体とＣ１複合体におけるＣ１ｑの相互作用が誘導する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞におけるＦｃ受容体の結合が誘導する抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食が挙げられる。
【００７０】
本願で「がん」又は「がん的状態」とは、腫瘍又は悪性細胞の成長、増殖又は転移が媒介して、固形腫瘍又は非固形腫瘍（例えば、白血病）を引き起こす状況である。本発明で「腫瘍」とは、腫瘍及び／又は悪性細胞のような実在する物質である。
【００７１】
本願で「ウイルス感染」とは、ウイルスが様々な経路で人体に侵入し、ヒト細胞で増殖することにより、生体を損傷させ、疾患を引き起こす過程である。慢性ウイルス感染、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎や、ヘルペスウイルス、ＥＢ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルスの感染や、カポシ肉腫関連のヘルペスウイルス感染症、トルケテノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅｔｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス又はＢＫウイルス感染などである。
【００７２】
特定の状態に対する「治療」又は「療法」は、特定の状態の予防又は緩和、特定の状態の発生又は進行速度の低減、特定の状態に発展するリスクの低減、特定の状態に関連する症状の発展の予防又は遅延、特定の状態に関連する症状の低減又は解消、特定の状態の完全な逆転又は不完全な逆転、特定の状態の治癒、又は前記事項の組み合わせを含む。がんの場合は、「治療」又は「療法」とは腫瘍又は悪性細胞の成長、増殖、転移、又は前記事項の組み合わせを抑制又は軽減することである。腫瘍の場合は、「治療」又は「療法」とは腫瘍の全部又は一部の除去、腫瘍成長又は転移の抑制又は軽減、腫瘍の進行の予防又は遅延、前記事項の組み合わせを含む。
【００７３】
「分離された」物質は自然の状態から人為的に変更させたものである。自然界に「分離された」物質又は成分が出現する場合は、それは既に変更されているか、本来の状態と異なるもので、あるいは両方の場合を含む。例えば、特定の動物に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは分離されていないもので、当該ポリヌクレオチド又はポリペプチドは自然状態でそれと共存する物質から充分に分離されており、しかも十分な純度で存在する場合に、「分離された」ものと見なされてもよい。いくつかの実施形態では、抗体及び抗原結合フラグメントの純度は少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であり、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動）、又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ）によって測定される。
【００７４】
本発明で「ベクター」とは、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを操作可能に挿入でき、当該タンパク質を発現させるビヒクルである。ベクターはその遺伝物質要素を宿主細胞内で発現させることで、宿主細胞の形質転換、形質導入又はトランスフェクトのために利用できる。ベクターの例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、Ｐ１由来の人工染色体（ＰＡＣ））、ファージ（例えば、λファージ、Ｍ１３ファージ）、動物ウイルスなどが挙げられる。ベクターとして利用可能な動物ウイルスには、レトロウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）を含む）がある。ベクターは様々な発現制御要素を含んでもよく、例えば、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素、レポーター遺伝子である。さらに複製起点を含んでもよい。さらに細胞に入らせるよう働く成分を含んでもよく、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、カプシドであり、これらに限定されない。
【００７５】
本発明で「宿主細胞」とは、外因性ポリヌクレオチド及び／又はベクターを導入する細胞である。
【００７６】
本発明で「治療有効量」又は「有効用量」とは、疾患を効果的に治療する特定の薬物の用量又は濃度である。例えば、本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントの使用の場合、治療有効量とは当該用量又は濃度で、当該抗体又は抗原複合体が腫瘍の全部又は一部を除去すること、腫瘍の成長を抑制又は軽減すること、腫瘍細胞の転移を抑制すること、腫瘍又はがん的状態に関連する症状又はマーカーを緩和すること、腫瘍又はがん的状態の進行を予防又は遅延すること、ウイルス又はウイルスに感染した細胞を抑制又は除去すること、又は前記事項の組み合わせである。
【００７７】
「薬学的に許容される」は、担体、溶媒、希釈剤、賦形剤及び／又は塩に対して使用され、化学的に及び／又は物理的に製剤の他の成分に適合し、且つ生理的に投与対象に適合するものである。
【００７８】
「本発明に係る融合タンパク質」
本願のいくつかの実施形態では、例示的に融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及び／又はＵＭＹ０２−Ｌ３を開示する。
【００７９】
当業者が理解したように、１つ以上のアミノ酸置換を含むように前記ＣＤＲ配列を改変させて、生物学的活性を高める（例えば、ヒトＯＸ４０との結合親和性を高める）ことができる。例えば、ファージディスプレイ技術を利用して抗体変異体ライブラリー（例えば、Ｆａｂ又はＦｃＦｖ変異体）を生成し発現させた後、ヒトＯＸ４０に親和性がある抗体をスクリーニングする。別の例では、コンピュータソフトウェアで前記抗体とヒトＯＸ４０の結合をシミュレートし、抗体で結合界面を形成するアミノ酸残基を同定してもよい。これらの残基の置換を避けて結合親和性の低下を防ぎ、あるいは同残基を標的に置換することでより強い結合を得る。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列で少なくとも１つの（又は全ての）置換が保守的である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質及び抗原結合フラグメントは１つ以上のＣＤＲ配列を含み、当該配列は本願で開示されている例示的な融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及び／又はＵＭＹ０２−Ｌ３の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の配列同一性を有し、なお且つヒトＯＸ４０との結合親和性が親抗体と同等であり又は親抗体より高く、前記親抗体はほぼ同じ配列を備え、しかも対応するＣＤＲ配列は参照配列と１００％配列同一性を有する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本願に係る融合タンパク質は１０-7Ｍ以下の結合親和性（ＫD）でヒトＯＸ４０に特異的に結合でき、結合親和性は表面プラズモン共鳴によって測定される。ＫD値で結合親和性の大きさを示し、抗原と抗原結合分子の結合が平衡状態になる時の解離速度と結合速度の比（ｋoff／ｋon）から算出される。前記抗原結合親和性（例えば、ＫD）は本分野で周知の適切な手法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ社のプラズモン共鳴結合装置を使用して測定される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本願に係る融合タンパク質は１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０（半数効果濃度）でヒトＯＸ４０に結合する。抗体又は融合タンパク質とヒトＯＸ４０の結合は本分野で知られる方法、例えば、サンドイッチ法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、ＦＡＣＳ又は他の結合試験により測定できる。一例として、被験抗体（一次抗体）を固定化されたヒトＯＸ４０又はヒトＯＸ４０を発現させる細胞に結合させた後、結合していない抗体を洗い流し、標識された二次抗体を導入し、二次抗体が一次抗体に結合できるため結合後の二次抗体を検出できる。固定化されたＯＸ４０を使用する場合はマイクロプレートリーダーにおいて前記検出を行い、ヒトＯＸ４０を発現させる細胞を使用する場合はＦＡＣＳ分析により前記検出を行う。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本願に係る融合タンパク質が０．１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ（ＦＡＣＳ分析で測定）のＥＣ５０（５０％効果濃度）でヒトＯＸ４０に結合する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本願に係る融合タンパク質はＦｃＲ媒介又はインターフェロン受容体媒介によりヒトＯＸ４０シグナル伝達経路を活性化させることにより、例えば、誘導活性化したＴ細胞産生サイトカイン（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、誘導活性化したＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）の増殖、逆転制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制機能などの生物学的活性を提供する。
【００８５】
前記融合タンパク質はヒトＯＸ４０に特異性的である。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質はマウスＯＸ４０に結合せず、ヒトＯＸ４０の場合と同等な結合親和性でサルＯＸ４０に結合する。例えば、本発明の融合タンパク質と同じＣＤＲ配列を有するモノクローナル抗体ＭＴ０１−Ｌ１とマウスＯＸ４０の結合は通常の結合測定方法（例えば、ＦＡＣＳ分析）で検出できないが、ＭＴ０１−Ｌ１がサルＯＸ４０又はヒトＯＸ４０の両方に結合することがＦＡＣＳによって検出される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質はＩｇＧ２アイソタイプの定常領域を有し、エフェクター機能が低下又は消失している。例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣなどのエフェクター機能がＯＸ４０を発現する細胞に細胞毒性を生じさせる。正常な細胞のうち、ＯＸ４０を発現できるものがある。当該正常な細胞産生に望ましくない毒性が生じないよう、本発明に係る抗体のいくつかの実施形態ではエフェクター機能を低下又は消失させている。ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性を推定するためには、例えば、Ｆｃ受容体結合試験、補体Ｃｌｑ結合実験、細胞溶解など多くの試験が知られ、当業者が適宜選択することができる。理論的に不都合なしに、ＡＤＣＣやＣＤＣなどのエフェクター機能が低下又は消失している抗体がＯＸ４０を発現させる細胞（例えば、正常な細胞）に細胞毒性を生じさせず、細胞毒性を最低の程度まで低下させているため、望ましくない副作用が避けられる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本願に係る融合タンパク質は生体内でインターフェロン分子よりも作用時間が延長される。これは動物体内で融合タンパク質の半減期及び薬物保持時間が長いためである。当該特性は患者への投与頻度の低減及び薬物の効能向上に役立つ。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本願に係る融合タンパク質は副作用が低下している。例えば、前記抗ＯＸ４０抗体及びその抗原結合フラグメントは完全ヒト化ＩｇＧ配列を有し、ヒト化抗体より免疫原性が低下している。もう一例として、前記融合タンパク質及びその抗原結合フラグメントはＩｇＧ２又はＩｇＧ４でＡＤＣＣ又はＣＤＣを消失させている。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本願に係る融合タンパク質の利点が、免疫原性を有する物質、例えば、腫瘍細胞、精製された腫瘍抗原、免疫刺激因子でトランスフェクトさせた細胞、腫瘍ワクチンと併用できることである。また、前記抗ＯＸ４０抗体及びその抗原結合フラグメントは併用治療、例えば、標準的な化学療法、放射線療法、標的に基づく小分子療法、他の新たな免疫チェックポイント阻害剤療法に組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、前記抗体及びその抗原結合フラグメントは抗体−薬物複合体、二重特異性又は多価抗体の基本分子として利用可能である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本願に係る融合タンパク質及びその抗原結合フラグメントはラクダ化された単一ドメイン抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二重特異性抗体（ｄｓ  ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノボディ、ドメイン抗体又は２価ドメイン抗体である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本願に係る融合タンパク質は免疫グロブリン定常領域を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。前記重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ１〜ＣＨ２、ＣＨ１〜ＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は所望の特性を得るために１つ以上の改変をさらに含む。例えば、前記定常領域を改変させて１つ以上のエフェクター機能を低下又は解消させることでＦｃＲｎ受容体との結合を増強し又は１つ以上のシステイン残基を導入する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、前記抗体及びその抗原結合フラグメントはさらに複合体を含む。本発明に係る抗体又はその抗原結合フラグメントが様々な複合体に接続できることは予想される（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ、Ｊｒ．（ｅｄｓ．），Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））。これらの複合体は共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、錯体形成、結合、混合又は付加などにより前記抗体又は抗原複合体に接続される。いくつかの実施形態では、本発明に係る抗体及び抗原結合フラグメントでは組換えによりエピトープ結合部位以外の特定の部位を含み、これらの部位に１つ以上の複合体が結合できる。例えば、複合先との共有結合を促すために、当該部位は１つ以上の反応性アミノ酸残基、例えば、システイン残基、ヒスチジン残基を含む。いくつかの実施形態では、抗体が間接的に複合体に接続され、又は別の複合体を介して接続される。例えば、前記抗体又はその抗原結合フラグメントにビオチンが結合され、さらに間接的に、アビジンに接続される第２の複合体が結合される。前記複合体は検出可能な標識、薬物動態学的な改変基、精製要素、又は細胞毒性部分である。検出可能な標識の例としては、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン、テキサスレッド）、酵素基質マーカー（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、β−Ｄガラクトシダーゼ）、安定同位体又は放射性同位体、発色団、ジゴキシン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子、金が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記複合体は薬物動態学的な改変基、例えば、抗体の半減期を延長させるＰＥＧである。他の適切な重合体としては、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体などが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記複合体とは精製要素、例えば、磁気ビーズである。「細胞毒性部分」とは、細胞に害があり又は細胞を損傷又は死滅させる任意の薬剤である。細胞毒性部分の例としては、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンとその類似体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、窒素マスタード、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シ��ロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シス−ジクロロジアミン白金（ＤＤＰ）、シスプラチン）、アントラサイクリン系抗生物質（例えば、ダウノルビシン（旧称ダウノマイシン）、アドリアマイシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧称アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））、有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
ポリヌクレオチド及び組換え方法
本分野で周知の遺伝工学技術を用いて、本願の融合タンパク質のアミノ酸配列を対応するＤＮＡコード配列に変えることができる。遺伝暗号の縮退により、得られたＤＮＡ配列が完全に一致し、コードするタンパク質配列が変わらない場合がある。
【００９４】
本分野で周知の組換え技術を用いて、クローニング（ＤＮＡ増幅）又は遺伝子発現のために前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することができる。別の実施形態では、本分野で周知の相同組換えの手法で前記融合タンパク質を合成できる。利用可能なベクターは多くある。ベクターの成分は一般にシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー配列、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１ａ）、転写終結配列のうちの２種以上を含み、これらに限定されない。
【００９５】
いくつかの実施形態では、前記ベクターは哺乳類ベクター、細菌ベクター、酵母ベクターなどを含み、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＬｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＬｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２を含むがこれらに限定されないプラスミドなど、実験室で得られるベクター又は市販ベクターを含む。適切なベクターはプラスミド、ウイルスベクター（例えば、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）を含む。
【００９６】
クローニング又は遺伝子発現のために、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入してもよい。本発明でクローニング又は前記ベクターにおけるＤＮＡの発現に適する宿主細胞は原核細胞、酵母、前記高等真核細胞である。本発明に係る使用に適する原核細胞は真正細菌、例えば、グラム陰性菌、グラム陽性菌（例えば、腸内細菌科（例えば、大腸菌）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（例えば、サルモネラ・チフィムリウム）、セラチア属（例えば、セラチア・マルセッセンス）、赤痢菌、バチルス属（例えば、バチルス・サブチリス、バチルス・リケニフォルミス）、シュードモナス属（例えば、緑膿菌）、ストレプトマイセス属）を含む。
【００９７】
原核細胞以外にも、真核微生物（例えば、糸状菌、酵母）は宿主細胞をクローニングし又は融合タンパク質を発現させるベクターとして利用できる。出芽酵母は最もよく利用する下等真核宿主微生物である。本発明に適する属、種、株が他にも多くあり、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ、クルイベロミセス属（例えば、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・フラジリス（ＡＴＣＣ  １２４２４）、クルイベロミセス・ブルガリクス（ＡＴＣＣ  １６０４５）、クルイベロミセス・ウィッケルハミ（ＡＴＣＣ  ２４１７８）、クルイベロミセス・ウォルティ（ＡＴＣＣ  ５６５００）、クルイベロミセス・ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ  ３６９０６）、クルイベロミセス・サーモトレランス、クルイベロミセス・マルキシアヌス）、ヤロウィア・リポリティカ（欧州特許出願第ＥＰ４０２２２６号）、ピキア・パストリス（欧州特許出願第ＥＰ１８３０７０号）、カンジダ属（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（欧州特許出願第ＥＰ２４４２３４号））、アカパンカビ、シュワニオミセス属（例えば、シュワニオミセス・オキシデンタリス）、糸状菌（例えば、ニューロスポラ、アオカビ、トリポクラジウム・シネンシス）、コウジカビ（例えば、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー）である。
【００９８】
本発明に係るグリコシル化抗体又はその抗原結合フラグメントの発現に適する宿主細胞は多細胞生物に由来する。無脊椎生物細胞は植物細胞、昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ）、その変異体及び対応する許容昆虫宿主細胞（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｉｎｓｅｃｔ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ）が発見され、これらは例えば、ツマジロクサヨトウ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、カイコなどの宿主に由来する。オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス及びカイコ核多角体病ウイルスのＢｍ−５変異体など、トランスフェクトするための多くのウイルス株が知られ、これらのウイルスはいずれも本発明に使用でき、特にツマジロクサヨトウ細胞をトランスフェクトするために使用できる。木綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、タバコから培養した植物細胞も宿主として利用できる。
【００９９】
最も好ましいのは脊椎動物細胞であり、脊椎動物細胞培養（組織培養）は通常技術になっている。利用可能な哺乳類宿主細胞としては、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓細胞ＣＶ１（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎臓細胞（２９３又は浮遊培養する２９３細胞サブクローン、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））、マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎臓尿細管上皮細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ−３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト胎児肺線維芽細胞（ＷＩ−３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝がん由来細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝がん由来細胞（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、前記宿主細胞は２９３Ｆ細胞である。
【０１００】
前記融合タンパク質を発現又はクローニングできる前記ベクターで宿主細胞を形質転換した後、通常の栄養培地で培養し、前記栄養培地はプロモーターの誘導、形質転換細胞の選択又は目的配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変される。
【０１０１】
本発明で前記融合タンパク質を産生するための宿主細胞は本分野で周知の様々な培地で培養することができる。前記培地は本分野で周知の必要な任意の添加物を適切な濃度でさらに含んでもよい。前記培地の条件は、例えば、温度、ｐＨなどが、発現用宿主細胞を選択するために使用されたもので、当業者が周知する事項である。
【０１０２】
組換え技術を用いる場合、前記抗体は細胞内、ペリプラズムで生成され、又は直接的に培地に分泌される。前記抗体が細胞内に生成される場合には、まず宿主細胞又は溶解した粒子状の破片を、例えば、遠心分離又は超音波により除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）では大腸菌のペリプラズムに分泌される抗体の分離方法が開示される。要約すると、酢酸ウラニル（ｐＨ  ３．５）、ＥＤＴＡ及びベンジルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）が存在する条件で、細胞ペースト（ｃｅｌｌ  ｐａｓｔｅ）を約３０分間以上溶融させた後、遠心分離により細胞破片を除去する。前記抗体が培地に分泌される場合には、一般にまず市販されるタンパク質濃縮フィルター（例えば、ｌＡｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＰｅｌｌｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）を用いて当該発現系の上清液を濃縮させる。前記いずれのステップでプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ）を加えてタンパク質の分解を抑制し、抗生物質を加えて偶発的な汚染物質の成長を防ぐ。
【０１０３】
前記細胞から製造された抗体は精製技術、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿法、塩析、アフィニティークロマトグラフィーで精製でき、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。前記抗体の種類及び前記抗体に任意の免疫グロブリンのＦｃドメインが存在することがプロテインＡはアフィニティーリガンドとしてふさわしいかどうかが決まる。プロテインＡはヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に利用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスアイソフォーム、ヒトγ３に適用される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７  １５７５（１９８６））。アガロースは最もよく使用するアフィニティーリガンド付着マトリックスであり、他のマトリックスも利用できる。物理的に安定的なマトリックス（例えば、多孔性ガラス粉体（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）、ポリスチレン）はアガロースよりも流速が早く処理時間が短縮される。例えば、当該抗体がＣＨ３ドメインを含む場合に、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）で精製できる。又は、製造したい抗体によって、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂によるヘパリンヘパリンセファロースクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿法など他のタンパク質精製技術から選択することができる。
【０１０４】
いずれの初歩的な精製ステップ後にも、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにより対象抗体及び不純物を含む混合物を処理してもよく、ｐＨ約２．５〜４．５の溶離バッファーを使用し、好ましくは低塩濃度（例えば、約０から０．２５Ｍの塩濃度）において実行する。
【０１０５】
「キット」
本願は前記融合タンパク質を含むキットを開示する。いくつかの実施形態では、前記キットは生体試料におけるＯＸ４０の存否又はその量を検出するために用いられる。前記生体試料は細胞、組織を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、前記キットは検出標識と複合できる融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記キットは標識されていない融合タンパク質を含み、標識されていない融合タンパク質に結合できる標識された二次抗体をさらに含む。前記キットは取扱説明書及びキットの各要素を分割させた包装をさらに含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質が、サンドイッチアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ又は免疫クロマトグラフィーアッセイ）を行うために基質又は装置に接触する。適切な基質又は装置の例は、マイクロプレート、試験紙である。
【０１０８】
「医薬組成物及び治療方法」
さらに本願は、前記融合タンパク質と、薬学的に許容される１種以上の担体とを含む医薬組成物を開示する。
【０１０９】
本願に係る医薬組成物に使用される薬学的に許容される担体は例えば、薬学的に許容される液体、ゲルもしくは固体担体、水系媒体、非水系媒体、抗菌物質、等張液、バッファー、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤もしくは非毒性補助物質、本分野で周知の他の成分、又はこれらの様々な組み合わせである。
【０１１０】
適切な成分は、例えば、抗酸化剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、バッファー、防腐剤、潤滑剤、矯味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤、安定剤（例えば、糖類、シクロデキストリン）である。適切な抗酸化剤は、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチルメチルアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン及び／又は没食子酸プロピルである。本発明に係る融合タンパク質を含む組成物が１種以上の抗酸化剤（例えば、メチオニン）を含む場合は、前記融合タンパク質の酸化を軽減できる。酸化作用の軽減が結合親和性の低下を緩和又は防止して、抗体安定性を高め保存期間を引き延ばすことができる。
【０１１１】
さらに、薬学的に許容される担体は、例えば、水系媒体、例えば、塩化ナトリウム注射液、注射用リンゲル液、等張グルコース注射液、注射用滅菌水、グルコース−乳酸リンゲル注射液、非水系媒体、例えば、植物に由来する不揮発性油、綿実油、コーン油、ゴマ油、ピーナッツ油、細菌阻止もしくは真菌阻止濃度の抗菌物質、等張剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース）、バッファー（例えば、リン酸塩、クエン酸塩バッファー）、抗酸化剤（例えば、硫酸水素ナトリウム）、局所麻酔剤（例えば、塩酸プロカイン）、懸濁化剤及び分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン）、乳化剤（例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０））、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、乳酸）である。抗菌剤は担体として複数回投与容器内の医薬組成物に加えられてもよく、その例は、フェノール、クレゾール、水銀製剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、クロロフェネチルアミンである。適切な賦形剤は、例えば、水、塩、グルコース、グルコース、エタノールである。適切な非毒性補助物質は、例えば、乳化剤、ｐＨバッファー、安定剤、可溶化剤、又は酢酸ナトリウム、ラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエート、シクロデキストリンなどである。
【０１１２】
前記医薬組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、ピル、カプセル、錠剤、徐放性製剤又は粉末である。経口製剤は通常の担体、例えば、直打用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は注射用組成物として製剤化される。注射用医薬組成物は任意の通常形態で提供されてもよく、例えば、溶媒、懸濁液、エマルジョン又は溶媒、懸濁液又はエマルジョンを生成するのに適する固体形態である。注射製剤は従来の滅菌及び／又はパイロジェンフリー溶液、使用前に溶媒に結合させる滅菌乾燥可溶物（例えば、凍結乾燥粉末）を含み、皮下パッチ、注射用滅菌懸濁剤、使用前に媒体に結合させる滅菌乾燥不溶性製品、滅菌及び／又はパイロジェンフリーのエマルジョンを含む。溶媒は水系であってもよいし非水系であってもよい。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、単位用量の注射製剤は１つのアンプル、１つのチューブ又は１つの注射器に収容される。本分野で周知のように、注射投与製剤は例外なく滅菌で且つパイロジェンフリーである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本願に係る抗体又はその抗原結合フラグメントを適切な特定の溶媒に溶解して滅菌凍結乾燥粉末を製造できる。前記溶媒は粉末もしくは粉末から調製した再構成溶液の安定性を高め、粉末もしくは再構成溶液を改善させるために他の薬理学的成分を含んでもよい。適切な賦形剤として、水、グルコース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グルコース、グルコース、黒糖、他の適切な物質が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は、バッファー（例えば、クエン酸バッファー、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムバッファー、当業者に知られる他のバッファー）を含んでもよく、一実施形態では、バッファーはｐＨ中性である。次に、本分野で周知の標準的な条件において前記溶液を濾過・滅菌した後、凍結乾燥により好ましい製剤を得る。一実施形態では、得られた溶媒をバイアルに分注して凍結乾燥を行う。各バイアルは１回投与量又は複数回投与量の前記抗ＯＸ４０抗体、その抗原結合フラグメント又はその組成物を収容できる。正確な量のサンプルを取得し又は正確な投与を保証するために、バイアルの内容物の量が１回投与量又は複数回投与量よりやや（例えば、１０％）多くてもよい。凍結乾燥粉末は適切な条件下で、例えば、約４℃から室温の範囲で保存してもよい。
【０１１６】
注射用水で凍結乾燥粉末を再溶解して注射投与用の製剤を得る。一実施形態では、凍結乾燥粉末を滅菌パイロジェンフリー水又は他の適切な液体担体に加えて再溶解させてもよい。量は療法によって正確に決定してもよいし、経験値から決定してもよい。
【０１１７】
さらに、治療有効量の本願に係る融合タンパク質を、これを必要とする対象に投与することを含む治療方法を開示する。
【０１１８】
本願に係る融合タンパク質の治療有効用量は本分野で周知の様々な要因、例えば、体重、年齢、既往歴、進行中の治療、投与対象の健康状態、交差感染のリスク、アレルギー、過敏症、副作用、投与経路、腫瘍の病期分類によって決まる。当業者（例えば、医師、獣医）がこれらの又は他の要因や要件に基づいて、比例的に用量を増減してもよい。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本発明に係る融合タンパク質は約０．０ｌｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの治療有効用量で投与される。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は約５０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与され、いくつかの実施形態では、投与量は１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下、又は０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定の用量は所定の間隔で投与されてもよく、例えば、１日１回、１日２回以上、月２回以上、週１回、２週間に１回、３週間に１回、月１回、２月に１回、又は３月以上に１回である。いくつかの実施形態では、投与量は治療の段階によって変わる。例えば、いくつかの実施形態では、初期と比べて後期の投与量が高い。いくつかの実施形態では、治療中に投与対象の応答に応じて投与量を調整する。
【０１２０】
投与量を調整して最適な応答（例えば、治療応答）を得ることができる。例えば、１回だけの投与であってもよいし、所定の間隔を開けて複数の用量に分けて投与してもよい。
【０１２１】
本発明に係る融合タンパク質は本分野で周知の投与経路で投与されてもよく、例えば、注射投与（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈注射（静脈内点滴、筋肉内注射、皮内注射を含む））、非注射投与（例えば、経口投与、鼻内投与、舌下投与、直腸投与、局所投与）である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質はその分子作用機序に関連する疾患の治療に使用することができ、前記疾患は腫瘍、がんを含み、例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸・直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉腫（ｍｙｃｏｓｉｓ  ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ）、メルケル細胞がん、他の血液悪性疾患（例えば、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性又は陰性のＰＴＬＤ、ＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽細胞性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻咽頭がん、ＨＨＶ８関連の原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫）、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍（例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹部グリオーマ）を含む。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質で治療する疾患は慢性ウイルス感染を含み、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎や、ヘルペスウイルス、ＥＢ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルスの感染や、カポシ肉腫関連のヘルペスウイルス感染症、トルケテノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅｔｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ＪＣウイルス又はＢＫウイルス感染などである。
【０１２３】
「使用方法」
さらに本願は、前記融合タンパク質の使用方法を開示する。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本願は、治療有効量の本願に係る融合タンパク質を投与することを含む、個体における前記融合タンパク質の作用機序に関連する疾患又は症状の治療方法を開示する。
【０１２５】
本発明に係る融合タンパク質は単独で投与されてもよいし、１つ以上の他の治療手段もしくは物質と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明に係る融合タンパク質は化学療法、放射線療法、がん治療手術（例えば、腫瘍切除術）、抗ウイルス薬、１種以上の制吐薬、他の化学療法による合併症の治療方法、がんもしくはウイルス感染に適する任意の他の治療物質と併用されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明に係る融合タンパク質が１種以上の治療物質と併用される場合には、前記１種以上の治療物質と同時に投与されてもよく、いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は同一の医薬組成物の一部として同時に投与されてもよい。なお、他の治療物質と「併用」される融合タンパク質は必ずしも同時に投与され、又は当該治療物質と１つの組成物から投与されるとは限らない。本発明でいう「併用」の場合、他の治療物質より先に又は後から投与される融合タンパク質も当該治療物質との「併用」と見なされ、前記融合タンパク質と第２の物質が異なる投与経路で投与されても構わない。必要ならば、本発明に係る融合タンパク質と併用される他の治療物質は当該他の治療物質の取扱説明書に記載の方法で投与されてもよいし、医師用卓上参考書２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７ｔｈ  Ｅｄ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７，２００２．１１）又は本分野で周知の他の方法を参照して投与されてもよい。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、前記治療物質はがんに対する免疫応答を誘導又は増強させることができる。例えば、腫瘍ワクチンは特定の腫瘍又はがんに対する免疫応答を誘導するために用いられる。サイトカイン治療は腫瘍抗原の免疫系への提示を高めるために用いられる。サイトカイン治療の例としては、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、β、γ）、コロニー刺激因子（例えば、マクロファージＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦ、顆粒球ＣＳＦ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−Ｌ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−ｌｌ、ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制標的を不活性化する試薬、例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１抗体、ＴＧＦ−β抑制剤、ＩＬ−１０抑制剤、Ｆａｓリガンド抑制剤を使用してもよい。別の試薬としては、腫瘍又はがん細胞に対する免疫応答を活性化させる試薬、例えば、Ｔ細胞の活性化を高める試薬（例えば、Ｔ細胞共剌激分子アゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ））、樹状細胞の機能及び抗原提示を高める試薬である。
【０１２７】
次の実施例は本発明を一層説明するためのもので、本発明の範囲に対する制限と理解されない。下記特定の組成物、材料及び方法の全てが、全体であれその部分であれ、本発明の範囲に含まれる。これらの特定の組成物、材料及び方法は本発明を制限するためのものではなく、特定の実施形態が本発明の範囲に含まれることを説明するためのものに過ぎない。新規性がなく本発明の範囲を逸脱せず当業者が同等な組成物、材料及び方法を考案できる。なお、本発明に係る方法に行われる様々な変更も、本発明の範囲に含まれる。本発明者はこのような変更を本発明の範囲に含めることを意図する。
【０１２８】
実施例１：本発明の融合タンパク質の製造
本実施例ではいくつかの抗ＯＸ４０抗体−ヒトインターフェロン融合タンパク質の設計及び発現を例示的に説明する。抗ヒトＯＸ４０活性化抗体の重鎖及び軽鎖配列は中国特許出願第２０１７１１４７６１６０．３号のＭＴ０１−Ｃ１又はＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）に由来し、ここで、「ＭＴ０１−Ｃ１」とは、ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及びＵＭＹ０２−Ｌ３と同じＶＨ配列（配列番号７）及びＶＬ配列（配列番号８）を備え、且つ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１で、軽鎖定常領域がκ鎖であるモノクローナル抗体である。「ＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）」とは、ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及びＵＭＹ０２−Ｌ３と同じＶＨ配列（配列番号７）及びＶＬ配列（配列番号８）を備え、且つ重鎖定常領域がヒトＩｇＧ２で、軽鎖定常領域がκ鎖であるモノクローナル抗体である。
【０１２９】
インターフェロンＩＦＮα２ｂ配列はヒトインターフェロンＩＦＮα２ｂ（ＮＰ＿０００５９６．２）に由来し、そのアミノ酸配列は配列番号９に示すとおりである。
【０１３０】
例示的な融合タンパク質の構造設計は図１に示すとおりである。ここで、「ＵＭＹ０２−Ｌ１」とは、配列番号１０に示す重鎖、ペプチドリンカー及びヒトインターフェロンと、配列番号１１に示す軽鎖とを備え、重鎖のカルボキシル末端でペプチドリンカーを介して配列番号９に示すヒトインターフェロンＩＦＮα２ｂが接続される融合タンパク質である。「ＵＭＹ０２−Ｌ２」とは、配列番号１２に示す重鎖と、配列番号１３に示す軽鎖、ペプチドリンカー及びヒトインターフェロンとを備え、軽鎖のカルボキシル末端でペプチドリンカーを介して配列番号９に示すヒトインターフェロンＩＦＮα２ｂが接続される融合タンパク質である。「ＵＭＹ０２−Ｌ３」とは、配列番号１４に示す重鎖と、配列番号１３に示す軽鎖、ペプチドリンカー及びヒトインターフェロンとを備え、軽鎖のカルボキシル末端でペプチドリンカーを介して配列番号９に示すヒトインターフェロンＩＦＮα２ｂが接続される融合タンパク質である。
【０１３１】
融合タンパク質の抗体重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をそれぞれ哺乳類細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４にクローニングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクト試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて重鎖発現プラスミド及び軽鎖発現プラスミドを２：１のモル比でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、３７℃で５％二酸化炭素の条件下で７日間培養した。培養液上清を収集し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより上清中の抗体を精製した。精製後の抗体にＰＢＳ溶液透析及び凍結乾燥濃縮を行った後、−２０℃で保存した。
【０１３２】
実施例２：ＥＬＩＳＡ結合実験
濃度１μｇ／ｍＬのヒトＯＸ４０タンパク質溶液を１００μＬ／ウェルで高親和性９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩振盪した。翌日、３００μＬのＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５‰）で３回洗浄した後、５％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて１００μＬ／ウェルで２時間ブロッキングし、室温で振盪した。３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳで融合タンパク質試料の勾配希釈溶液を調製した。１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、室温で１時間振盪した。３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ溶液を調製し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、室温で１時間振盪した。３００μＬのＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルでＴＭＢを加えて、２０分間発色させた。１００μＬ／ウェルで０．６ＮのＨ2ＳＯ4を加えて発色を停止し、ＯＤ４５０ｎｍを検出した。
【０１３３】
図２の検出結果に示すように、融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及びＵＭＹ０２−Ｌ３のＥＬＩＳＡ結合ＥＣ５０はそれぞれ０．７６２６、０．３９４８、０．３１７７μｇ／ｍＬであり、ＯＸ４０抗体ＭＴ０１−Ｃ１のＥＣ５０（０．２９７７μｇ／ｍＬ）と同等であった（図２）。
【０１３４】
実施例３：ヒト、カニクイザル及びマウスＯＸ４０との結合（ＦＡＣＳ）
ヒト、カニクイザル又はマウスＯＸ４０タンパク質をコードした発現プラスミドでＣＨＯ細胞をトランスフェクトした後、４８時間培養した。ＰＢＳでＯＸ４０抗体ＭＴ０１−Ｌ１の濃度勾配溶液を調製し、最終濃度の１０×ワーキング溶液を得た。ＣＨＯ−ｈＯＸ４０細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄した後カウントし、２×１０6／ｍＬの細胞懸濁液に希釈した。それぞれ１０μＬのＯＸ４０抗体ＭＴ０１−Ｌ１ワーキング溶液を１００μＬの細胞懸濁液に加え、４℃の暗所で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、二次抗体を加え、４℃の暗所で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、４００μＬのＦＡＣＳバッファーで懸濁させて、装置で検出した。図３の結果に示すように、ＭＴ０１−Ｌ１がヒトＯＸ４０（ｈｓＯＸ４０）に結合しており、ＥＣ５０は０．６６μｇ／ｍＬであった。
【０１３５】
同様のように、本発明者が抗体とマウスＯＸ４０を発現したＣＨＯ細胞の結合を検出したところ、ＭＴ０１−Ｌ１がマウスＯＸ４０（ｍｓＯＸ４０）に結合しなかったことが分かった。
【０１３６】
同様のように、本発明者が抗体とカニクイザルＯＸ４０を発現したＣＨＯ細胞の結合を検出したところ、ＭＴ０１−Ｌ１が明らかにカニクイザルＯＸ４０（ｃｙＯＸ４０）に結合したことが分かった。
【０１３７】
実施例４：Ｄａｕｄｉ細胞増殖抑制実験
Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ）でインターフェロン受容体が高発現されるため、インターフェロンがそれに対して生物学的活性を有する。Ｄａｕｄｉ細胞を２万細胞／９０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、検出試料を濃度勾配に希釈して１０×ワーキング溶液を調製し、それぞれ１０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃のインキュベーターに入れ、７２時間後にＣＣＫ８を加えてＯＤ４５０を検出し、各ウェルの細胞増殖抑制率を計算した。当該抑制率が試料におけるインターフェロンの活性を示す。実験結果から融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及びＵＭＹ０２−Ｌ３のＤａｕｄｉ細胞に対する増殖抑制活性（ＩＣ５０）はそれぞれ９．５４９、９．１５２、２７．４４ｐＭであることが分かった（図４）。
【０１３８】
実施例５：ＦｃＲが媒介するＯＸ４０シグナル伝達経路活性化実験
本発明者がＯＸ４０活性化因子を検出する細胞実験系を構築した。具体的には、「Ｊｕｒｋａｔ−ＯＸ４０−ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子」安定トランスフェクション細胞株を構築し、ＯＸ４０活性化性抗体、当該安定トランスフェクション細胞株及びＦｃＲを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を混合すると、ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を活性化させることができる。
【０１３９】
ＰＢＳで融合タンパク質濃度勾配溶液を調製し、最終濃度の２×ワーキング溶液を得、氷上で操作した。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦｋＢ−ルシフェラー−ＯＸ４０細胞及びＦｃＲを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を収集し、遠心分離した後、培地に再懸濁し、３８４ウェルプレートにプレーティングした。３８４ウェルプレートに融合タンパク質ワーキング溶液及び適量の細胞懸濁液を加え、５時間インキュベートした後、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）検出試薬を加え、均一に混合した後、Ｐｈｅｒａｓｔａｒオートフォーカス蛍光発光マイクロプレートリーダーで蛍光信号を検出した。
【０１４０】
図５の検出結果に示すように、ＯＸ４０抗体ＭＴ０１−Ｃ１、融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及びＵＭＹ０２−Ｌ３が前記実験系でＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化させるＥＣ５０はそれぞれ０．０４５２３、０．０２４３７、０．０２８３７、０．０２９０７ｎｇ／ｍＬであった。この結果から、ＦｃＲが媒介するＯＸ４０活性化活性ではＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２及びＵＭＹ０２−Ｌ３がＭＴ０１−Ｃ１を上回ることが分かった。
【０１４１】
実施例６：インターフェロン受容体が媒介するＯＸ４０シグナル伝達経路活性化実験
「Ｊｕｒｋａｔ−ＯＸ４０−ＮＦκＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子」安定トランスフェクション細胞株を１万個／ウェルで３８４ウェルプレートにプレーティングした。ＰＢＳで融合タンパク質濃度勾配溶液又は対照溶液を調製し、最終濃度の２×ワーキング溶液を得、氷上で操作した。３８４ウェルプレートに融合タンパク質又はインターフェロンワーキング溶液及び適量の細胞懸濁液を加え、５時間インキュベートした後、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）検出試薬を加え、均一に混合した後、Ｐｈｅｒａｓｔａｒオートフォーカス蛍光発光マイクロプレートリーダーで蛍光信号を検出した。
【０１４２】
図６ａに示すように、実験で全ての抗体及びインターフェロンの最終濃度はいずれも１０ｎＭであった。ＯＸ４０抗体ＭＴ０１−Ｃ１又はＭＴ０１−Ｃ１（Ｇ２）はＪｕｒｋａｔ細胞のＯＸ４０シグナル伝達経路に活性化効果がなく、インターフェロンＩＦＮα２ｂを単独で加えるのもＯＸ４０抗体ＭＴ０１−Ｃ１及びＩＦＮα２ｂを同時に加えるのも対照群と比べて４０％未満の活性化効果しか認められなかった。しかし、融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２又はＵＭＹ０２−Ｌ３を加えた後、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＯＸ４０シグナル伝達経路が明らかに活性化され、しかも活性化の程度がインターフェロン単独群を明らかに上回った（図６ｂ）。
【０１４３】
実施例７：Ｃ５７ＢＬ／６マウス薬物動態学実験
週齢６〜８週の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス１８匹を等しく３群に分け、それぞれ静脈注射でＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ３、ＭＴ０１−Ｃ１を投与した。投与量は５ｍｇ／ｋｇであった。ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ３は投与前及び投与後１、２、６、２４、４８、７２、９６、１７４、２２０、２８８時間の動物末梢静脈血を採取し、ＭＴ０１−Ｃ１は投与前及び投与後１、２、６、２４、４８、７２、９６、１９２、３１２時間の動物末梢静脈血を採取し、遠心分離して血清を収集した。各時刻は３匹の動物の血清を採取し、異なる時刻で交互に各群の６匹動物から採血した。
【０１４４】
濃度１μｇ／ｍＬのヒトＯＸ４０タンパク質溶液を１００μＬ／ウェルで高親和性９６ウェルプレートにコーティングし、４℃で一晩振盪した。翌日、３００μＬのＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５‰）で３回洗浄した後、５％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて１００μＬ／ウェルで１時間ブロッキングし、室温で振盪した。３００μＬのＰＢＳＴで４回洗浄した。ＰＢＳを用いて被験血清試料、異なる濃度の標準品血清溶液の１００倍希釈溶液を調製した。１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、室温で１．５時間振盪した。３００μＬのＰＢＳＴで４回洗浄した。ＭＴ０１−Ｃ１は二次抗体ロバ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７０９−０３５−１４９）溶液を調製し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、室温で１時間振盪した。３００μＬのＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルでＴＭＢを加えて、２０分間発色させた。１００μＬ／ウェルで０．６ＮのＨ2ＳＯ4を加えて発色を停止し、ＯＤ４５０ｎｍを検出した。ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ３は０．５μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトＩＦＮ（ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２２２５５２）溶液を調製し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、室温で１．５時間振盪した。３００μＬのＰＢＳＴで４回洗浄した。二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ（金斯瑞生物科技、カタログ番号Ａ０００９８）溶液を調製し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、室温で１時間振盪した。３００μＬのＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μＬ／ウェルでＴＭＢを加えて、２０分間発色させた。１００μＬ／ウェルで０．６ＮのＨ2ＳＯ4を加えて発色を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍを検出した。異なる濃度の標準品溶液の検出値と標準品濃度のロジスティクス４パラメータ当てはめを行って、検量線回帰式を得た。試料の検出値を方程式に代入して、異なる時刻の血清中薬物濃度を算出した。
【０１４５】
図７ａ、図７ｂに示すように、実験マウスにＵＭＹ０２−Ｌ３、ＵＭＹ０２−Ｌ１を５ｍｇ／ｋｇで静脈注射し、投与後７日目にＵＭＹ０２−Ｌ３の血清中薬物濃度は依然として１０μｇ／ｍＬ以上であり、投与後１２日目にＵＭＹ０２−Ｌ１の血清中薬物濃度は依然として１０μｇ／ｍＬ以上であった。当該結果からマウス体内では融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ３、ＵＭＹ０２−Ｌ１が抗体薬ＭＴ０１−Ｃ１と同等な薬物動態特性を有し、半減期がＩＦＮα２ｂの２〜３時間より大幅に延長した（Ｍｅｒｃｋ社Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ取扱説明書を参照）ことが分かった。
【０１４６】
実施例８：抗体融合タンパク質の活性に対する抗体サブタイプ及びペプチドリンカーの長さの影響
融合タンパク質のＯＸ４０シグナル伝達経路活性化活性に対するＯＸ４０活性化性抗体とインターフェロンＩＦＮα２ｂをつなげるペプチドリンカーの長さ及び抗体サブタイプの影響を調べるために、ＵＭＹ０２−Ｌ３をもとに異なる長さのペプチドリンカー及び異なる抗体サブタイプを有する抗体融合タンパク質を構築した（表１参照）。
【０１４７】
ここで、融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ４、ＵＭＹ０２−Ｌ５及びＵＭＹ０２−Ｌ６の重鎖は配列番号１４に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、表１に示すとおり、違いはペプチドリンカーの数量だけである。
【０１４８】
ここで、融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ７及びＵＭＹ０２−Ｌ８の重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、表１に示すとおり、違いはペプチドリンカーの数量だけである。
【０１４９】
実施例４の方法でＤａｕｄｉ細胞の増殖に対するこれらの抗体融合タンパク質の影響を検出した結果、ペプチドリンカーの長さが抗体融合タンパク質のインターフェロン活性に明らかな影響があり、ペプチドリンカーの長さが短いほど、インターフェロン活性が低いことが分かった（表１参照）。
【０１５０】
実施例５の方法でこれらの融合タンパク質のＯＸ４０シグナル伝達経路活性化活性を検出した。表１に示すとおり、ＯＸ４０抗体ＭＴ０１−Ｃ１、各抗体融合タンパク質がいずれもＪｕｒｋａｔ−ＯＸ４０細胞のＯＸ４０シグナル伝達経路を効果的に活性化できることを検出した。
【０１５１】
（表１）インターフェロン活性に対する抗体サブタイプ及びリンカーの長さの影響
2021536231.tif 000002
【０１５２】
実施例９：ＯＸ４０抗体と異なるＩＦＮα２ｂ突然変異タンパク質の融合
ＯＸ４０活性化抗体がインターフェロン突然変異体とも融合できる。これらのインターフェロン突然変異体は野生型インターフェロンより比活性度が低いため、同等な薬物濃度ではＯＸ４０抗体と相乗的に役割を果たしながらも、インターフェロン活性の高さによる毒性及び副作用が避けられる。
【０１５３】
本実施例では、ＨＥＫ２９３発現系を構築し、これを用いて複数のＯＸ４０抗体−突然変異インターフェロン融合タンパク質を発現させた（表２）。これらの抗体融合タンパク質でＯＸ４０の抗体サブタイプはＩｇＧ４であり、ＩＦＮα２ｂ部分はいずれもそのグリコシル化部位を除去するためにＴ１０６Ａ突然変異を有する。
【０１５４】
ここで、融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ１３、ＵＭＹ０２−Ｌ１４、ＵＭＹ０２−Ｌ１５、ＵＭＹ０２−Ｌ１６、ＵＭＹ０２−Ｌ１７及びＵＭＹ０２−Ｌ１８の重鎖は配列番号１５に示すとおり、軽鎖及びヒトインターフェロンは配列番号１３の軽鎖及びヒトインターフェロンに示すとおりで、違いは次の２点である。
１．ＵＭＹ０２−Ｌ１３、ＵＭＹ０２−Ｌ１４、ＵＭＹ０２−Ｌ１５、ＵＭＹ０２−Ｌ１６及びＵＭＹ０２−Ｌ１８のペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）２であり、ＵＭＹ０２−Ｌ１７のペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）３である。
２．融合タンパク質ＵＭＹ０２−Ｌ１３、ＵＭＹ０２−Ｌ１４、ＵＭＹ０２−Ｌ１５、ＵＭＹ０２−Ｌ１６、ＵＭＹ０２−Ｌ１７及びＵＭＹ０２−Ｌ１８のインターフェロンは配列番号９をもとに表２の突然変異を含む。
【０１５５】
実施例４の方法でＤａｕｄｉ細胞の増殖に対するこれらの抗体融合タンパク質の影響を検出した結果、突然変異を含む抗体融合タンパク質のインターフェロン活性は野生型ＩＦＮα２ｂと比べ、程度の差があるが明らかに低下していることが分かった（表２）。また、実施例５の方法でＪｕｒｋａｔ細胞のＯＸ４０シグナル伝達経路に対するこれらの抗体融合タンパク質の活性化効果を検出した結果、これらの突然変異を含む抗体融合タンパク質のＯＸ４０活性化活性がほぼ変わらないことが分かった（表２）。当該結果から分かるように、インターフェロン配列に特定の突然変異を導入すると、適切なＯＸ４０抗体−ＩＦＮ融合タンパク質が得られ、しかも同等なモル濃度ではＯＸ４０活性化活性とインターフェロン活性が釣り合って、人体内でそれぞれの機能を相乗的に発揮することで、一方の活性の高さ又は低さにより治療効果が好ましくないことや深刻な毒性又は副作用をもたらすことが避けられる。
【０１５６】
（表２）突然変異を含む抗体融合タンパク質の活性
2021536231.tif 000003
ここで、
１．突然変異アミノ酸の位置番号は野生型ヒトインターフェロンＩＦＮα２ｂのアミノ酸配列の配列番号９を参照して表示する。
２．ＩＦＮα２ｂの活性を１と定義する。
３．ＯＸ４０モノクローナル抗体ＭＴ０１−Ｃ１の活性を１と定義する。
【０１５７】
実施例１０：融合タンパク質の腫瘍細胞殺傷効果
さらに、本発明者がＯＸ４０抗体の重鎖と異なるタイプのインターフェロンを融合させて、様々な融合タンパク質を製造した。ＯＸ４０  ＩＦＮ−α２ａ、ＯＸ４０−ＩＦＮβ、ＯＸ４０−ＩＦＮγ、ＯＸ４０−ＩＦＮλ３の重鎖は配列番号１５に示すとおりで、ＯＸ４０  ＩＦＮ−α２ａの軽鎖、ペプチドリンカー及びインターフェロンは配列番号１６に示すとおり、ＯＸ４０  ＩＦＮ−βの軽鎖、ペプチドリンカー及びインターフェロンは配列番号１７に示すとおり、ＯＸ４０  ＩＦＮ−γの軽鎖、ペプチドリンカー及びインターフェロンは配列番号１８に示すとおり、ＯＸ４０  ＩＦＮ−λ３の軽鎖、ペプチドリンカー及びインターフェロンは配列番号１９に示すとおりである。
【０１５８】
これらの抗体融合タンパク質の腫瘍細胞殺傷効果を検出した。具体的には、本発明者がヒト由来ＰＢＭＣｓと卵巣がんＳＫＯＶ３細胞を２０：１の比率で混合して共培養し、それぞれＰＢＳ（対照）、濃度０．１ｎＭのＯＸ４０モノクローナル抗体ＭＴ０１−Ｃ１、異なる抗体融合タンパク質（ＯＸ４０  ＩＦＮ−α２ａ、ＯＸ４０−ＩＦＮβ、ＯＸ４０−ＩＦＮγ、ＯＸ４０−ＩＦＮλ３）を投与して刺激し、３７℃で５％二酸化炭素の条件下で４８時間培養した後、ＣＣＫ８キットを用いてＳＫＯＶ３細胞に対するＰＢＭＣの細胞毒性を検出し、実験結果を図８に示す。刺激がない場合はＰＢＭＣがＳＫＯＶ３細胞増殖に抑制効果がなく、ＯＸ４０モノクローナル抗体で刺激した場合はＰＢＭＣのＳＫＯＶ３抑制率が約２８％であり、融合タンパク質で刺激する場合はＰＢＭＣの細胞毒性がいずれもＯＸ４０モノクローナル抗体刺激より高く、ＯＸ４０モノクローナル抗体ＭＴ０１−Ｃ１−ＩＦＮ  α２ａ及びＯＸ４０モノクローナル抗体ＭＴ０１−Ｃ１−ＦＮ  βは抑制率が明らかに増強され、それぞれ６０％、６３％であるということが分かった。
【０１５９】
上述したのが本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明に制限を加えるものではない。当業者が本発明の技術的解決手段から逸脱せず、本発明に係る技術的解決手段又は技術内容に任意の形態で同等な置換や修正などの変更を加える場合に、前記変更はいずれも本発明の技術的解決手段から逸脱しないものと見なされ、本発明の保護範囲に含まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１６０】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ  Ｊ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｊ，Ｔｅｗｓ  Ｉ，Ｃｒａｇｇ  ＭＳ．ＯＸ４０：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−  Ｗｈａｔ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ  ｒｅｍａｉｎ？  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；８３：１３−２２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１７．０１．００６．
【非特許文献２】Ｉｍｕｒａ  Ａ，Ｈｏｒｉ  Ｔ，Ｉｍａｄａ  Ｋ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｔ，Ｔａｎａｋａ  Ｙ，Ｍａｅｄａ  Ｍ，Ｉｍａｍｕｒａ  Ｓ，Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｔ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＯＸ４０／ｇｐ３４  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９６；１８３：２１８５−９５．
【非特許文献３】Ｂｕｒｇｅｓｓ  ＪＫ，Ｃａｒｌｉｎ  Ｓ，Ｐａｃｋ  ＲＡ，Ａｒｎｄｔ  ＧＭ，Ａｕ  ＷＷ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＰＲ，Ｂｌａｃｋ  ＪＬ，Ｈｕｎｔ  ＮＨ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＯＸ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ？  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；１１３：６８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２００３．１２．３１１．
【非特許文献４】Ｃｏｍｐａａｎ  ＤＭ，Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ＳＧ．Ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００６；１４：１３２１−３０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２００６．０６．０１５．
【非特許文献５】Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｓｏ  Ｔ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ１  ｂｙ  ＯＸ４０  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｒｉｖｅｎ  Ｔ  ：  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：７２４０−８．
【非特許文献６】Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＴＮＦＲ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＯＸ４０（ＣＤ１３４）．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；２８：５７−７８．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｉｍｍｕｎｏｌ−０３０４０９−１０１２４３．
【非特許文献７】Ｒｏｇｅｒｓ  ＰＲ，Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｇｒａｍａｇｌｉａ  Ｉ，Ｋｉｌｌｅｅｎ  Ｎ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．ＯＸ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｂｃｌ−ｘＬ  ａｎｄ  Ｂｃｌ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００１；１５：４４５−５５．
【非特許文献８】Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｓｏ  Ｔ，Ｃｈｅｎｇ  Ｍ，Ｔａｎｇ  Ｘ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ＯＸ４０  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｄｒｉｖｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００５；２２：６２１−３１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００５．０３．０１２．
【非特許文献９】Ｓｏ  Ｔ，Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｓｕｇｉｅ  Ｋ，Ａｌｔｍａｎ  Ａ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．Ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ＯＸ４０  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃ１  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐｅｒ  ２  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００６；１０３：３７４０−５．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６００２０５１０３．
【非特許文献１０】Ｐｕｂｌｉｃｏｖｅｒ  Ｊ，Ｇａｇｇａｒ  Ａ，Ｊｅｓｐｅｒｓｅｎ  ＪＭ，Ｈａｌａｃ  Ｕ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＡＪ，Ｇｏｏｄｓｅｌｌ  Ａ，Ａｖａｎｅｓｙａｎ  Ｌ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ＳＬ，Ｈｏｌｄｏｒｆ  Ｍ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  ＫＧ，Ｊｕｄｇｅ  ＪＢ，Ｋｏｓｈｔｉ  Ａ，Ｃｒｏｆｔ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１８；１０．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｈ５７６６．
【図１】
2021536231.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年10月8日(2021.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと、
ｂ）ヒトインターフェロンとを含み、
前記ヒトインターフェロンは直接的に又はペプチドリンカーを介して前記抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端又はアミノ末端に接続される融合タンパク質。
【請求項２】
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３とを備える抗体重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３とを備える抗体軽鎖可変領域とを含む請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記重鎖可変領域は配列番号７に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号８に示すアミノ酸配列を含む請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ヒトＯＸ４０に特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合フラグメントはラクダ化された単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖ２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二重特異性抗体、ナノボディ、ドメイン抗体又は２価ドメイン抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗体は免疫グロブリン定常領域をさらに含み、好ましくは、前記定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の定常領域である請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ヒトインターフェロンはＩ型ヒトインターフェロン、ＩＩ型ヒトインターフェロン、ＩＩＩ型ヒトインターフェロンから選ばれ、
好ましくは、前記ヒトインターフェロンはＩＦＮα２ａ、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ３、ＩＦＮα２ｂであり、
より好ましくは、前記ヒトインターフェロンはＩＦＮα２ｂであり、そのアミノ酸配列は配列番号９に示すとおりであり、
さらに好ましくは、前記ヒトインターフェロンはＩＦＮα２ｂの突然変異体であり、配列番号９に示すアミノ酸配列で、Ｔ１０６Ａ、Ｒ１４９Ａ、Ａ１４５Ｇ、Ａ１４５Ｄ、Ｒ１２０Ａ、Ｌ１１７Ａから選ばれる１つ以上の突然変異を有し、
一層好ましくは、前記ＩＦＮα２ｂの突然変異体は配列番号９に示すアミノ酸配列で、Ｔ１０６Ａ／Ａ１４５Ｄ、Ｔ１０６Ａ／Ｒ１４９Ａ、Ｔ１０６Ａ／Ａ１４５Ｇ、Ｔ１０６Ａ／Ｒ１２０Ａ、Ｔ１０６Ａ／Ｌ１１７Ａから選ばれる二重突然変異を有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ペプチドリンカーは（Ｇ）ｎ、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎから選ばれ、好ましくは、前記ペプチドリンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎは０〜５の整数であり、好ましくは、ｎは１〜３の整数である請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＵＭＹ０２−Ｌ１、ＵＭＹ０２−Ｌ２、ＵＭＹ０２−Ｌ３、ＵＭＹ０２−Ｌ４、ＵＭＹ０２−Ｌ５、ＵＭＹ０２−Ｌ６、ＵＭＹ０２−Ｌ７、ＵＭＹ０２−Ｌ８、ＵＭＹ０２−Ｌ１３、ＵＭＹ０２−Ｌ１４、ＵＭＹ０２−Ｌ１５、ＵＭＹ０２−Ｌ１６、ＵＭＹ０２−Ｌ１７、ＵＭＹ０２−Ｌ１８、ＯＸ４０  ＩＦＮ−α２ａ、ＯＸ４０−ＩＦＮβ、ＯＸ４０−ＩＦＮγ、ＯＸ４０−ＩＦＮλ３のうちの１つ以上から選ばれる請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、分離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の分離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項９に記載の分離されたポリヌクレオチドを発現できる条件で請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質の発現方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含むキット。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
免疫応答の増強及び／又はインターフェロンへの曝露により利益を得る病状の治療薬を製造するための請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用であって、好ましくは、前記病状はがん又はウイルス感染であり、より好ましくは、前記ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス感染である前記使用。
【請求項１６】
免疫応答の増強及び／又はインターフェロンへの曝露により利益を得る病状の治療方法であって、治療を必要とする対象に治療有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質又は請求項１４に記載の医薬組成物を投与することであって、好ましくは、前記病状はがん又はウイルス感染であり、より好ましくは、前記ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス感染であることを含む前記治療方法。
【請求項１７】
配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１と、配列番号２のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２と、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３とを備える抗体重鎖可変領域と、
配列番号４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２と、配列番号６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３とを備える抗体軽鎖可変領域とを含むヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記重鎖可変領域は配列番号７に示すアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号８に示すアミノ酸配列を含む請求項１７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ラクダ化された単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖ２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二重特異性抗体、ナノボディ、ドメイン抗体又は２価ドメイン抗体である請求項１７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記抗体は免疫グロブリン定常領域をさらに含み、好ましくは、前記定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の定常領域である請求項１７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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