(57)【要約】本発明は、細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン、及び細胞質侵入ドメインを含有する細胞質侵入抗原結合分子；当該抗原結合分子を含む医薬組成物；当該抗原結合分子を標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法；当該抗原結合分子を用いて標的細胞において特異的に細胞質抗原を除去、抑制、又は活性化する方法；ならびに当該抗原結合分子を含む、患者において疾患を予防又は治療するための医薬組成物に関する。本発明はまた、細胞質侵入ドメイン及びFc領域を含有する細胞質侵入抗原結合分子であって、当該Fc領域が、当該細胞質侵入抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含む、細胞質侵入抗原結合分子にも関する。本発明はまた、異種の部分にコンジュゲートされている、細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質侵入ドメインを含む抗原結合分子にも関する。さらに、本発明は、スプリット蛍光タンパク質を含む分子の細胞質侵入能を検出する方法に関する。2021532135.tif 000014
2021532135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一及び第二のFab領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、及び
(b) 第二のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含む、
抗原結合分子。
【請求項２】
第一及び第二のFab領域、及び一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、 
(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し、及び
(c) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する、
抗原結合分子。
【請求項３】
第一及び第二のFab領域、及び一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合し、
(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し、及び
(c) 一本鎖ユニットは、細胞表面抗原に特異的に結合する、
抗原結合分子。
【請求項４】
第一及び第二のFab領域、及び一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一及び第二のFab領域が、(i) 細胞表面抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞表面抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含み、及び
(b) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する、
抗原結合分子。
【請求項５】
第1と第2のポリペプチド鎖を含む抗原結合分子であって、
(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞質侵入能を有する第一の重鎖可変領域であり、
VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、
Cは重鎖定常領域CH1であり、
X1はCH1ではないリンカーであり、
X2はFc領域であり、及び、
nは0又は1であり、
(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞質抗原に特異的に結合する第一の軽鎖可変領域であり、
VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の軽鎖可変領域であり、
Cは軽鎖定常領域CLであり、
X1はCLではないリンカーであり、
X2はFc領域を含まず、及び、
nは0又は1である、
抗原結合分子。
【請求項６】
第一、第二及び第三のFab領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 第二及び第三のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は (ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み、
(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み、
(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている、
抗原結合分子。
【請求項７】
第一、第二、第三及び第四のFab領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる1個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 上記(a)以外の3個のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み、
(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み、
(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている、
抗原結合分子。
【請求項８】
細胞質侵入能を有する領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、当該Fc領域が当該抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含み、当該1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む抗原結合分子と比較して細胞質侵入能が増加した、抗原結合分子。
【請求項９】
第一及び第二のFab領域、及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 第二のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と、細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と、細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含み、及び、
(c) Fc領域は、当該抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含む、
抗原結合分子。
【請求項１０】
前記細胞質侵入能を有する領域が、前記細胞表面抗原と異なる細胞表面上に発現する抗原に結合しない、請求項1〜9のいずれかに記載の抗原結合分子。
【請求項１１】
前記細胞表面抗原が標的細胞に特異的に発現する抗原であり、前記抗原結合分子が前記標的細胞の細胞質中に特異的に送達される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の抗原結合分子。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗原結合分子、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗原結合分子を、標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法であって、前記細胞表面抗原が前記標的細胞に特異的に発現する抗原である、方法。
【請求項１４】
請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗原結合分子を用いて、標的細胞特異的に細胞質抗原を除去、抑制又は活性化する方法であって、前記細胞表面抗原が当該標的細胞に特異的に発現する抗原である、方法。
【請求項１５】
疾患細胞が、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗原結合分子が特異的に結合する細胞表面抗原及び細胞質抗原を発現している、対象の疾患を診断、予防または治療するための医薬組成物であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載の抗原結合分子、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む抗原結合分子；当該抗原結合分子を含む医薬組成物；当該抗原結合分子を標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法；当該抗原結合分子を用いて標的細胞特異的に細胞質抗原を除去、抑制又は活性化する方法；ならびに当該抗原結合分子を含む、対象の疾患を診断、予防または治療するための医薬組成物に関する。また、本開示は、細胞質侵入ドメイン及びFc領域を含む抗原結合分子であって、当該Fc領域が当該抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含む、抗原結合分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は高い親和性で特異的に抗原と結合するタンパク質である。低分子化合物からタンパク質まで様々な分子が抗原となることが知られている。モノクローナル抗体の作製技術が開発されて以降、抗体改変技術が発達し、特定の分子を認識する抗体の取得が容易となった。
抗体は、血漿中での安定性が高く副作用が少ないことから、医薬品として注目されている。抗体は、抗原に結合する作用、アゴニスト作用やアンタゴニスト作用だけでなく、ADCC（Antibody Dependent Cytotoxicity：抗体依存性細胞傷害活性）、ADCP（Antibody Dependent Cell phagocytosis：抗体依存性細胞鈍食作用）、CDC（補体依存性細胞傷害活性）といったエフェクター細胞による細胞傷害活性（エフェクター機能とも言う）を誘導する。このような抗体の機能を利用して、癌、免疫疾患、慢性疾患、感染症等の医薬品が開発されている（Nat Rev Drug Discov. 2018 Mar;17(3):197-223.（非特許文献１））。
【０００３】
一方、全長のIgG分子は分子量が約150kDaと大きく、一般には細胞透過性を示さないため、抗体医薬品の標的抗原は細胞膜上の抗原や細胞外抗原に限られている。そこで、細胞内で抗体または抗体フラグメントを発現させる intrabody や、細胞透過性ペプチド (cell penetrationg peptide; CPP)を融合した抗体-CPP複合体、protein transfection法などが開発され、細胞内の抗原に対して抗体を作用させる技術として報告されている（MAbs. 2011 Jan-Feb;3(1):3-16. （非特許文献２））。
【０００４】
また、一部の天然の全長抗体が細胞内移行能を示すことが知られている。例えば、全身性エリテマトーデス (systemic lupus erythematosus; SLE)の患者やMRL-mpj/lpr lupusモデルマウスから同定された抗DNA自己抗体が、細胞内移行能を示すことも報告されている (Sci Rep. 2015 Jul 9;5:12022.（非特許文献３）、Mol Immunol. 2015 Oct;67(2 Pt B):377-87.（非特許文献４）)。一部の抗DNA抗体は細胞質移行能だけでなく、DNAの加水分解活性やDNA修復阻害活性を有し、細胞障害活性を示す(WO2012135831（特許文献１）、Sci Rep. 2014 Aug 5;4:5958（非特許文献５）)。また、SLEのモデルマウスから単離されたエンドソームから細胞質へのエスケープ能を有する抗体をヒト化した後、活性型Rasに結合することができる重鎖可変領域と組み合わせた抗体も報告されている(WO2016013871A1（特許文献２）)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2012/135831
【特許文献２】WO2016/013871A1
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nat Rev Drug Discov. 2018 Mar;17(3):197-223.
【非特許文献２】MAbs. 2011 Jan-Feb;3(1):3-16.
【非特許文献３】Sci Rep. 2015 Jul 9;5:12022.
【非特許文献４】Mol Immunol. 2015 Oct;67(2 Pt B):377-87.
【非特許文献５】Sci Rep. 2014 Aug 5;4:5958
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非限定的な一態様において、本発明の目的は、標的細胞の細胞質に特異的に送達される抗原結合分子、当該抗原結合分子を含む医薬組成物、当該抗原結合分子の使用方法、当該抗原結合分子の製造方法、及び、標的細胞の細胞質に抗原結合分子を特異的に送達する方法、を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
非限定的な一態様において、発明者らは、細胞質侵入抗体又はその断片、細胞表面抗原に結合する抗体又はその断片、及び／又は、細胞質中抗原に結合する抗体又はその断片、を組み合わせた多機能性抗原結合分子が、標的細胞特異的に細胞質中に送達されることを見出した。非限定的な一態様において、これらの抗原結合分子は、細胞表面抗原に結合することで、標的細胞特異的にインターナライズし、細胞質へ移行することが期待される。また、非限定的な一態様において、発明者らは、当該多機能性抗原結合分子が多量体化することにより、当該多機能性抗原結合分子の細胞質侵入能が向上することを見出した。
【０００９】
本開示はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に例示的に記載する実施態様を包含するものである。
[0] 細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む、抗原結合分子。
[0A]前記細胞表面抗原と異なる抗原であって、細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[0]に記載の抗原結合分子。
[0B] 前記細胞質抗原結合ドメイン及び前記細胞質侵入ドメインが、記細胞表面抗原と異なる抗原であって、細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[0に記載の抗原結合分子。
[0C] 前記細胞質抗原結合ドメイン及び前記細胞質侵入ドメインが、細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[0]または[0B]に記載の抗原結合分子。
[0D] 多機能性抗体又は抗体誘導体である、[0]から[0C]のいずれかに記載の抗原結合分子。
【００１０】
[1] 第一及び第二のFab領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、及び
(b) 第二のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含む、
抗原結合分子。
[1A] 第一及び第二のFab領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペアを含み、及び、
(b) 第二のFab領域は、細胞質抗原に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペアを含む、
抗原結合分子。
[1B] 第一及び第二のFab領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞表面抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペアを含み、及び、
(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞質抗原に結合する軽鎖可変領域(VL)のペアを含む
抗原結合分子。
[1C] さらに、Fc領域を含む、[1]〜[1B]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[1D] 前記Fc領域が、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[1]〜[1C]のいずれかに記載の抗原結合分子。
【００１１】
[2] 第一及び第二のFab領域、及び一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、 
(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し、及び
(c) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する、
抗原結合分子。
[2A] 前記一本鎖ユニットが、
(i) 前記第一のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、
(ii) 前記第一のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、又は
(iii) 前記第一のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端
に融合される、[2]に記載の抗原結合分子。
[2B] 前記抗原結合分子が、さらに、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含むFc領域を含み、前記一本鎖ユニットが、
(i) 前記第一のFcサブユニットのC末端、又は
(ii) 前記第二のFcサブユニットのC末端、
に融合される、[2]に記載の抗原結合分子。
[2C] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[2B]に記載の抗原結合分子。
[2D] 前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットが、当該前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[2B]または[2C]に記載の抗原結合分子。
[2E] 前記一本鎖ユニットが、単一ドメイン抗体可変領域または一本鎖抗体（scFv）である、[2]〜[2D]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[2F] 前記単一ドメイン抗体可変領域が、重鎖抗体可変領域（VHH）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）または免疫グロブリン新抗原受容体の可変領域（VNAR）である、[2E]に記載の抗原結合分子。
【００１２】
[3] 第一及び第二のFab領域、及び一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合し、
(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し、及び
(c) 一本鎖ユニットは、細胞表面抗原に特異的に結合する、
抗原結合分子。
[3A] 前記一本鎖ユニットが、
(i) 前記第一のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、
(ii) 前記第一のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、又は
(iii) 前記第一のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端
に融合される、[3]に記載の抗原結合分子。
[3B] 前記抗原結合分子が、さらに、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含むFc領域を含み、前記一本鎖ユニットが、
(i) 前記第一のFcサブユニットのC末端、又は
(ii) 前記第二のFcサブユニットのC末端、
に融合される、[3]に記載の抗原結合分子。
[3C] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[3B]に記載の抗原結合分子。
[3D] 前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットが、当該前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[3B]または[3C]に記載の抗原結合分子。
[3E] 前記一本鎖ユニットが、単一ドメイン抗体可変領域または一本鎖抗体（scFv）である、[3]〜[3D]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[3F] 前記単一ドメイン抗体可変領域が、重鎖抗体可変領域（VHH）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）または免疫グロブリン新抗原受容体の可変領域（VNAR）である、[3E]に記載の抗原結合分子。
[3G] 第一及び第二のFab領域、及び一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 第二のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合し、及び
(c) 一本鎖ユニットは、細胞質侵入能を有する、
抗原結合分子。
[3H] 前記一本鎖ユニットが、
(i) 前記第一のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、
(ii) 前記第一のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、又は
(iii) 前記第一のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端
に融合される、[3G]に記載の抗原結合分子。
[3I] 前記抗原結合分子が、さらに、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含むFc領域を含み、前記一本鎖ユニットが、
(i) 前記第一のFcサブユニットのC末端、又は
(ii) 前記第二のFcサブユニットのC末端、
に融合される、[3G]に記載の抗原結合分子。
[3J] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[3I]に記載の抗原結合分子。
[3K] 前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットが、当該前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[3I]または[3J]に記載の抗原結合分子。
[3L] 前記一本鎖ユニットが、単一ドメイン抗体可変領域または一本鎖抗体（scFv）である、[3G]〜[3K]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[3M] 前記単一ドメイン抗体可変領域が、重鎖抗体可変領域（VHH）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）または免疫グロブリン新抗原受容体の可変領域（VNAR）である、[3L]に記載の抗原結合分子。
【００１３】
[4] 第一及び第二のFab領域、及び一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一及び第二のFab領域が、(i) 細胞表面抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞表面抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含み、及び
(b) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する、
抗原結合分子。
[4A] 前記一本鎖ユニットが、
(i) 前記第一のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、
(ii) 前記第一のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、又は
(iii) 前記第一のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端
に融合される、[4]に記載の抗原結合分子。
[4B] 前記抗原結合分子が、さらに、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含むFc領域を含み、前記一本鎖ユニットが、
(i) 前記第一のFcサブユニットのC末端、又は
(ii) 前記第二のFcサブユニットのC末端、
に融合される、[4]に記載の抗原結合分子。
[4C] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[4B]に記載の抗原結合分子。
[4D] 前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットが、当該前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[4B]または[4C]に記載の抗原結合分子。
[4E] 前記一本鎖ユニットが、単一ドメイン抗体可変領域または一本鎖抗体（scFv）である、[4]〜[4D]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[4F] 前記単一ドメイン抗体可変領域が、重鎖抗体可変領域（VHH）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）または免疫グロブリン新抗原受容体の可変領域（VNAR）である、[4E]に記載の抗原結合分子。
【００１４】
[4G] 第一及び第二の単一ドメイン抗体可変領域、ならびに一本鎖ユニットを含む抗原結合分子であって、
(a) 第一の単一ドメイン抗体可変領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、 
(b) 第二の単一ドメイン抗体可変領域は、細胞質侵入能を有し、及び
(c) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する、
抗原結合分子。
[4H] 前記一本鎖ユニットが、前記第一の単一ドメイン抗体可変領域のN末端、及び／又は、前記第二の単一ドメイン抗体可変領域のN末端、に融合される、[4G]に記載の抗原結合分子。
[4I] 前記抗原結合分子が、さらに第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含むFc領域を含み、前記一本鎖ユニットが、
(i) 前記第一のFcサブユニットのC末端、又は
(ii) 前記第二のFcサブユニットのC末端、
に融合される、[4G]に記載の抗原結合分子。
[4J] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[4I]に記載の抗原結合分子。
[4K] 前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットが、当該前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[4I]または[4J]に記載の抗原結合分子。
[4L] 前記一本鎖ユニットが、単一ドメイン抗体可変領域または一本鎖抗体（scFv）である、[4G]〜[4K]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[4M] 前記単一ドメイン抗体可変領域が、重鎖抗体可変領域（VHH）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）または免疫グロブリン新抗原受容体の可変領域（VNAR）である、[4G]〜[4L]のいずれかに記載の抗原結合分子。
【００１５】
[5] 第1と第2のポリペプチド鎖を含む抗原結合分子であって、
(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞質抗原に特異的に結合する第一の重鎖可変領域であり、
VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、
Cは重鎖定常領域CH1であり、
X1はCH1ではないリンカーであり、
X2はFc領域であり、及び、
nは0又は1であり、
(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞質侵入能を有する第一の軽鎖可変領域であり、
VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の軽鎖可変領域であり、
Cは軽鎖定常領域CLであり、
X1はCLではないリンカーであり、
X2はFc領域を含まず、及び、
nは0又は1である、
抗原結合分子。
[5A] 第1と第2のポリペプチド鎖を含む抗原結合分子であって、
(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞質侵入能を有する第一の重鎖可変領域であり、
VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、
Cは重鎖定常領域CH1であり、
X1はCH1ではないリンカーであり、
X2はFc領域であり、及び、
nは0又は1であり、
(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞質抗原に特異的に結合する第一の軽鎖可変領域であり、
VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の軽鎖可変領域であり、
Cは軽鎖定常領域CLであり、
X1はCLではないリンカーであり、
X2はFc領域を含まず、及び、
nは0又は1である、
抗原結合分子。
[5B] 第1と第2のポリペプチド鎖を含む抗原結合分子であって、
(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の重鎖可変領域であり、
VD2は細胞質抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、
Cは重鎖定常領域CH1であり、
X1はCH1ではないリンカーであり、
X2はFc領域であり、及び、
nは0又は1であり、
(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の軽鎖可変領域であり、
VD2は細胞質侵入能を有する第二の軽鎖可変領域であり、
Cは軽鎖定常領域CLであり、
X1はCLではないリンカーであり、
X2はFc領域を含まず、及び、
nは0又は1である、
抗原結合分子。
[5C] 第1と第2のポリペプチド鎖を含む抗原結合分子であって、
(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の重鎖可変領域であり、
VD2は細胞質侵入能を有する第二の重鎖可変領域であり、
Cは重鎖定常領域CH1であり、
X1はCH1ではないリンカーであり、
X2はFc領域であり、及び、
nは0又は1であり、
(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、
VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の軽鎖可変領域であり、
VD2は細胞質抗原に特異的に結合する第二の軽鎖可変領域であり、
Cは軽鎖定常領域CLであり、
X1はCLではないリンカーであり、
X2はFc領域を含まず、及び、
nは0又は1である、
抗原結合分子。
【００１６】
[6] 第一、第二及び第三のFab領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 第二及び第三のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は (ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み、
(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み、
(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている、
抗原結合分子。
[6A] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[6]に記載の抗原結合分子。
[6B] [6]に記載の抗原結合分子であって、第一及び／又は第二のFab領域が、
(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換、
(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換、及び
(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、
から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域が同一の置換を含まない、前記抗原結合分子。
[6C] 第一、第二及び第三のFab領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一及び第三のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は (ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み、
(b) 第二のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み、
(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第2のFab領域の重鎖のN末端に融合されている、
抗原結合分子。
[6D] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[6C]に記載の抗原結合分子。
[6E] [6C]に記載の抗原結合分子であって、第一及び／又は第二のFab領域が、
(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換、
(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換、及び
(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、
から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域が同一の置換を含まない、前記抗原結合分子。
[6F] 第一、第二及び第三のFab領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一及び第二のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は (ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み、
(b) 第三のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み、
(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第2のFab領域の重鎖のN末端に融合されている、
抗原結合分子。
[6G] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[6F]に記載の抗原結合分子。
[6H] [6F]に記載の抗原結合分子であって、第一及び／又は第二のFab領域が、
(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換、
(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換、及び
(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、
から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域が同一の置換を含まない、前記抗原結合分子。
[6I] 前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットが、当該前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[6]〜[6H]のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
【００１７】
[7] 第一、第二、第三及び第四のFab領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる1個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 上記(a)以外の3個のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み、
(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み、
(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている、
抗原結合分子。
[7A] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[7]に記載の抗原結合分子。
[7B] [7]又は[7A]に記載の抗原結合分子であって、第一及び／又は第二のFab領域が、
(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換、
(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換、及び
(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、
から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域が同一の置換を含まない、前記抗原結合分子。
[7C] [7]又は[7A]に記載の抗原結合分子であって、第三及び／又は第四のFab領域が、
(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換、
(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換、及び
(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、
から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第三のFab領域と第四のFab領域が同一の置換を含まない、前記抗原結合分子。
[7D] 第一、第二、第三及び第四のFab領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる2個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 上記(a)以外の2個のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み、
(d) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み、
(e) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている、
抗原結合分子。
[7E] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[7D]に記載の抗原結合分子。
[7F] [7D]又は[7E]に記載の抗原結合分子であって、第一及び／又は第二のFab領域が、
(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換、
(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換、及び
(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、
から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域が同一の置換を含まない、前記抗原結合分子。
[7G] [7D]又は[7E]に記載の抗原結合分子であって、第三及び／又は第四のFab領域が、
(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換、
(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換、及び
(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、
から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第三のFab領域と第四のFab領域が同一の置換を含まない、前記抗原結合分子。
[7H] 第一、第二、第三及び第四のFab領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる3個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 上記(a)以外の1個のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み、
(d) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み、
(e) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている、
抗原結合分子。
[7I] 前記第一のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであり、前記第二のFcサブユニットがIgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインである、[7H]に記載の抗原結合分子。
[7J] [7H]又は[7I]に記載の抗原結合分子であって、第一及び／又は第二のFab領域が、
(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換、
(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換、及び
(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、
から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域が同一の置換を含まない、前記抗原結合分子。
[7K] [7H]又は[7I]に記載の抗原結合分子であって、第三及び／又は第四のFab領域が、
(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換、
(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換、及び
(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、
から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第三のFab領域と第四のFab領域が同一の置換を含まない、前記抗原結合分子。
[7L] 前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットが、当該前記第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[7]〜[7K]のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
【００１８】
[8] 細胞質侵入能を有する領域及びFc領域を含む抗原結合分子であって、当該Fc領域が当該抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含み、当該1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む抗原結合分子と比較して細胞質侵入能が増加した、抗原結合分子。
[8A] 前記多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体又は六量体である、[8]に記載の抗原結合分子。
[8B] 前記多量体が、六量体である、[8]に記載の抗原結合分子。
[8C] 前記1又はそれ以上のアミノ酸改変が、EU345, EU430, EU440, EU437, EU248からなる群より選択される位置における1又はそれ以上のアミノ酸改変であり、数字がEUナンバリングであらわされる置換の位置を示す、[8]〜[8B]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[8D] 前記1又はそれ以上のアミノ酸改変が、E345R/E430G/S440Yの組合せ、またはT437R/K248Eの組合せであり、数字がEUナンバリングであらわされる置換の位置を示す、[8]〜[8C]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[8E] さらに、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質抗原結合ドメインを含む、[8]〜[8D]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[8F] 前記Fc領域が、さらに、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[8]〜[8E]のいずれかに記載の抗原結合分子。
【００１９】
[9] 第一及び第二のFab領域、及びFc領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、
(b) 第二のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と、細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と、細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含み、及び、
(c) Fc領域は、当該抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含む、
抗原結合分子。
[9A] 複数個の抗原結合分子を含む多量体の抗原結合分子複合体であって、当該抗原結合分子が、第一及び第二のFab領域、及びFc領域を含み、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と軽鎖可変領域(VL)のペアを含み
(b) 第二のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と、細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と、細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含み、及び、
(c) Fc領域は、当該抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含む、
抗原結合分子複合体。
[9B] 前記多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体又は六量体である、[9]又は[9A]に記載の抗原結合分子またはその複合体。
[9C] 前記多量体が、六量体である、[9]又は[9A]に記載の抗原結合分子またはその複合体。
[9D] 前記1又はそれ以上のアミノ酸改変が、EU345, EU430, EU440, EU437, EU248からなる群より選択される位置における1又はそれ以上のアミノ酸改変であり、数字がEUナンバリングであらわされる置換の位置を示す、[9]〜[9C]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体。
[9E] 前記1又はそれ以上のアミノ酸改変が、E345R/E430G/S440Yの組合せ、またはT437R/K248Eの組合せであり、数字がEUナンバリングであらわされる置換の位置を示す、[9]〜[9D]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体。
[9F] さらに、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質抗原結合ドメインを含む、[9]〜[9E]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体。
[9G] 前記1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む抗原結合分子と比較して細胞質侵入能が増加した、[9]から[9F]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体。
[9H] 前記Fc領域が、さらに、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[9]〜[9G]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[9I] Fc領域に多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を導入することを含む、当該1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む親細胞質侵入抗原結合分子と比較して、細胞質侵入抗原結合分子の細胞質侵入能を向上させる方法。
[9J] 細胞質侵入抗原結合分子を製造する方法であって、
親細胞質侵入抗原結合分子のFc領域に1又はそれ以上のアミノ酸改変を導入すること含み、当該改変が、当該親細胞質侵入抗原結合分子と比較して、当該細胞質侵入抗原結合分子の多量体形成を促進し、
当該細胞質侵入抗原結合分子の細胞質侵入能が、親細胞質侵入抗原結合分子と比較して向上している、方法。
[9K] [9J]に記載の方法であって、さらに、
(a) [9J]に記載の方法で作製された前記細胞質侵入抗原結合分子をコードする遺伝子と作動可能に連結された適切なプロモーターを含む発現ベクターを取得し、
(b) 当該ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して前記細胞質侵入抗原結合分子を生産させ、
(c) 宿主細胞培養物から前記細胞質侵入抗原結合分子を回収する、
ことを含む、方法。
[9L] 細胞質侵入抗原結合分子をスクリーニングする方法であって、
(a) Fc領域を含む親細胞質侵入抗原結合分子を提供し、
(b) 当該親細胞質侵入抗原結合分子のFc領域に1又はそれ以上のアミノ酸改変を導入して改変Fc領域を含む候補分子を取得し、
(c) 当該候補分子が多量体を形成するかどうかを決定し、
(d) 当該候補分子が、親細胞質侵入抗原結合分子と比較して、多くの多量体を形成する場合に、当該候補分子を好適な分子であると特定する、
ことを含み、
当該細胞質侵入抗原結合分子の細胞質侵入能が、親細胞質侵入抗原結合分子と比較して向上している、方法。
【００２０】
[10] 前記細胞質侵入能を有する領域が、前記細胞表面抗原と異なる細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[1]〜[9H]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体。
[11] 前記細胞表面抗原が標的細胞に特異的に発現する抗原であり、前記抗原結合分子またはその複合体が前記標的細胞の細胞質中に特異的に送達される、[1]〜[9H]および[10]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体。
[11A] 細胞表面抗原を発現しない細胞には、実質的に送達されない、[11]に記載の抗原結合分子またはその複合体。
[11B] [1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体をコードする核酸。
[11C] [11B]に記載の核酸を含むベクター。
[11D] [11B]に記載の核酸、又は、[11C]に記載のベクターを含む細胞。
[11E] [11D]に記載の細胞を培養することを含む、[1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体を製造する方法。
[12] [1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
[13] [1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体を、標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法であって、前記細胞表面抗原が標的細胞に特異的に発現する抗原である、方法。
[13A] [1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体を、前記標的細胞と接触させることを含む、[13]に記載の方法。
[13B] 細胞表面抗原を発現しない細胞には、抗原結合分子を実質的に送達しない、[13]または[13A]に記載の方法。
[14] [1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体を用いて、標的細胞特異的に細胞質抗原を除去、抑制又は活性化する方法であって、前記細胞表面抗原が当該標的細胞に特異的に発現する抗原である、方法。
[14A] [1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体を、前記標的細胞と接触させることを含む、[14]に記載の方法。
[14B] 細胞表面抗原を発現しない細胞の細胞質抗原は、実質的に除去、抑制又は活性化しない、[14]又は[14A]に記載の方法。
【００２１】
[15] 疾患細胞が、[1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体が特異的に結合する細胞表面抗原及び細胞質抗原を発現している、対象の疾患を診断、予防または治療するための医薬組成物であって、[1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
[15A] 前記細胞表面抗原に結合する領域を含まない抗原結合分子またはその複合体と比較して、前記細胞表面抗原を発現しない細胞における細胞質抗原の除去、抑制又は活性化に起因する副作用が低減された、[15]に記載の医薬組成物。
[15B] 疾患細胞が、[1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体が特異的に結合する細胞表面抗原及び細胞質抗原を発現している、対象の疾患を診断、予防または治療する方法であって、当該方法が、[1]〜[9H]、および[10]〜[11A]のいずれかに記載の抗原結合分子またはその複合体を投与することを含む、方法。
【００２２】
[16] 異種の部分にコンジュゲートされている、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む、抗原結合分子。
[16A] 前記細胞表面抗原と異なる抗原であって、細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[16]に記載の抗原結合分子。
[16B] 前記細胞質侵入ドメインが、前記細胞表面抗原と異なる抗原であって、細胞表面上に発現する抗原に結合しない、[16]に記載の抗原結合分子。
[16C] 多機能性抗体又は多機能性抗体誘導体である、[16]〜[16B]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[16D] 二重機能性抗体又は二重機能性抗体誘導体である、[16]〜[16C]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[16E] 前記異種の部分が、ペプチド、核酸、化学療法剤もしくは化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはその断片）、又は放射性同位体である、[16]〜[16D]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[16F] 前記異種の部分がペプチドである、[16]〜[16E]のいずれかに記載の抗原結合分子。
【００２３】
[17] 第一及び第二のFab領域を含む抗原結合分子であって、
(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、及び
(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し、
かつ、異種の部分にコンジュゲートされている、抗原結合分子。
[17A] さらに、Fc領域を含む、[17]に記載の抗原結合分子。
[17B] 前記Fc領域が、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含む、[17]または[17A]に記載の抗原結合分子。
[17C] 前記異種の部分がペプチド部分である、[17]〜[17B]のいずれかに記載の抗原結合分子。
[17D] [16]〜[17C]のいずれかに記載の抗原結合分子をコードする核酸。
[17E] [17D]に記載の核酸を含むベクター。
[17F] [17D]に記載の核酸、又は[17E]に記載のベクターを含む細胞。
[17G] [17F]に記載の細胞を培養することを含む、[16]〜[17C]のいずれかに記載の抗原結合分子を製造する方法。
[17H] [16]〜[17C]のいずれかに記載の抗原結合分子、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
[17I] 異種の部分を標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法であって、[16]〜[17C]のいずれかに記載の抗原結合分子を、当該標的細胞と接触させることを含む、方法。
[17J] 細胞表面抗原を発現しない細胞には、異種の部分を実質的に送達しない、[17I]に記載の方法。
【００２４】
[18] ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含むペプチドであって、
当該発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片が全体として、発光タンパク質の完全な補完物を含有する、ペプチド。
[18A] 前記発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片の各々は、発光を示す特性を有さないが、ペプチドに含まれる発光タンパク質の第一の断片が発光タンパク質の第二の断片に結合すると、発光を示す特性が回復する、[18]に記載のペプチド。
[18B] 前記ミトコンドリア外膜タンパク質が、追加的ミトコンドリアキナーゼアンカータンパク質1（additional mitochondrial kinase anchoring protein 1）（AKAP1）である、[18]または[18A]に記載のペプチド。
[18C] AKAP1タンパク質が、配列番号：６１のアミノ酸配列を含む、[18]〜[18B]のいずれかに記載のペプチド。
[18D] 前記発光タンパク質が、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む、[18]〜[18C]のいずれかに記載のペプチド。
[18E] 前記発光タンパク質の第一の断片が、配列番号：６２のアミノ酸配列を含み、前記発光タンパク質の第二の断片が、配列番号：６３のアミノ酸配列を含む、[18]〜[18D]のいずれかに記載のペプチド。
[18F] さらに、緑色蛍光タンパク質（GFP）又はその変異体を含む、[18]〜[18E]のいずれかに記載のペプチド。
[18G] GFP変異体が、配列番号：６５のアミノ酸配列を含む、[18F]に記載のペプチド。
[18H] ミトコンドリア外膜タンパク質を含まないこと以外は[18]〜[18G]のいずれかと同じであるペプチドと比較して、より低いバックグラウンドシグナルを有する、細胞質中の標的分子の検出において使用するためである[18]〜[18G]のいずれかに記載のペプチドであって、当該標的分子が発光タンパク質の第二の断片にコンジュゲートされている、ペプチド。
【００２５】
[19] [18]〜[18H]のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
[19A] [19]に記載の核酸を含むベクター。
[19B] [19]に記載の核酸、又は[19A]に記載のベクターを含む細胞。
[19C] [18]〜[18H]のいずれかに記載のペプチド、[19]に記載の核酸、[19A]に記載のベクター、[19B]に記載の細胞を含む、キット。
【００２６】
[20] (i) ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含むペプチド、及び(ii) 発光タンパク質の第二の断片を含む、スプリット（split）タンパク質システムであって、
当該発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片が全体として、発光タンパク質の完全な補完物を含有する、スプリットタンパク質システム。
[20A] 前記発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片の各々は、発光を示す特性を有さないが、ペプチドに含まれる発光タンパク質の第一の断片が発光タンパク質の第二の断片に結合すると、発光を示す特性が回復する、[20]に記載のスプリットタンパク質システム。
[20B] 前記ミトコンドリア外膜タンパク質が、追加的ミトコンドリアキナーゼアンカータンパク質1（AKAP1）である、[20]または[20A]に記載のスプリットタンパク質システム。
[20C] AKAP1タンパク質が、配列番号：６１のアミノ酸配列を含む、[20]〜[20B]のいずれかに記載のスプリットタンパク質システム。
[20D] 前記発光タンパク質が、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む、[20]〜[20C]のいずれかに記載のスプリットタンパク質システム。
[20E] 前記発光タンパク質の第一の断片が、配列番号：６２のアミノ酸配列を含み、前記発光タンパク質の第二の断片が、配列番号：６３のアミノ酸配列を含む、[20]〜[20D]のいずれかに記載のスプリットタンパク質システム。
[20F] (i)のペプチドが、さらに、緑色蛍光タンパク質（GFP）又はその変異体を含む、[20]〜[20E]のいずれかに記載のスプリットタンパク質システム。
[20G] GFP変異体が、配列番号：６５のアミノ酸配列を含む、[20F]に記載のスプリットタンパク質システム。
[20F] (i)のペプチドがミトコンドリア外膜タンパク質を含まないこと以外は[20]〜[20G]のいずれかと同じであるスプリットタンパク質システムと比較して、より低いバックグラウンドシグナルを有する、細胞質中の標的分子の検出において使用するためである[20]〜[20G]のいずれかに記載のスプリットタンパク質システムであって、当該標的分子が発光タンパク質の第二の断片にコンジュゲートされている、スプリットタンパク質システム。
【００２７】
[21] 標的分子の細胞質侵入能を検出する方法であって、
(i) ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含むペプチド、をコードする核酸を含む細胞を提供し、
(ii) 発光タンパク質の第二の断片にコンジュゲートされた標的分子を提供し、
(iii) (i)の細胞及び(ii)の標的分子を接触させ、ならびに
(iv) (iii)の細胞における発光シグナルを検出する、
ことを含み、
当該発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片が全体として、発光タンパク質の完全な補完物を含有する、方法。
[21A] 前記発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片の各々は、発光を示す特性を有さないが、前記ペプチドに含まれる発光タンパク質の第一の断片が発光タンパク質の第二の断片に結合すると、発光を示す特性が回復する、[21]に記載の方法。
[21B] 前記ミトコンドリア外膜タンパク質が、追加的ミトコンドリアキナーゼアンカータンパク質1（AKAP1）である、[21]または[21A]に記載の方法。
[21C] AKAP1タンパク質が、配列番号：６１のアミノ酸配列を含む、[21]〜[21B]のいずれかに記載の方法。
[21D] 前記発光タンパク質が、配列番号：６４のアミノ酸配列を含む、[21]〜[21C]のいずれかに記載の方法。
[21E] 前記発光タンパク質の第一の断片が、配列番号：６２のアミノ酸配列を含み、前記発光タンパク質の第二の断片が、配列番号：６３のアミノ酸配列を含む、[21]〜[21D]のいずれかに記載の方法。
[21F] (i)のペプチドが、さらに、緑色蛍光タンパク質（GFP）又はその変異体を含む、[21]〜[21E]のいずれかに記載の方法。
[21G] GFP変異体が、配列番号：６５のアミノ酸配列を含む、[21F]に記載の方法。
[21H] (i)のペプチドがミトコンドリア外膜タンパク質を含まないこと以外は[21]〜[21G]のいずれかと同じである方法と比較して、バックグラウンドシグナルがより低い、[21]〜[21G]のいずれかに記載の方法。
[21J] 細胞質侵入抗原結合分子をスクリーニングする方法であって、
(i) 試験抗原結合分子を提供し、
(ii) [21]〜[21H]のいずれかに記載の方法によって、(i)の試験抗原結合分子の細胞質侵入能を検出する、
ことを含み、
当該試験抗原結合分子の細胞質侵入能が検出され、当該試験抗原結合分子が、細胞質侵入抗原結合分子として特定される、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本開示の抗原結合分子のコンセプトを示す模式図である。図１においては、本開示の抗原結合分子が標的細胞特異的にデリバリー（送達）されるコンセプトを示すために、一例として二重機能性抗体の形態の抗原結合分子を示している。
【図２】本開示の抗原結合分子の分子形の例として、多価抗体の分子形を示す模式図である。
【図３】図中に示した各二重機能性抗体を含む培地で6時間インキュベートしたCHO細胞またはIL6R+CHO細胞の細胞質中での当該抗体の蓄積をBirAアッセイで評価した結果を示す図である。66kDaの下の矢印で示される部分に表示されるバンドが、BirAによってビオチン標識された抗体重鎖を表すHRPの発光シグナルである。
【図４】図中に示した各二重機能性抗体を含む培地で1時間インキュベートしたCHO細胞またはIL6R+CHO細胞の細胞質中での当該抗体の蓄積を蛍光顕微鏡を用いたイメージング解析で評価した結果を示す図である。図４（１）は抗体を検出した蛍光シグナルを細胞数で標準化した値をプロットしたグラフであり、縦軸は蛍光シグナル（A.U.: Arbitrary Unit）である。図４（２）は蛍光顕微鏡画像である。
【図５】図中に示した各濃度の抗体を含む培地で6時間インキュベートしたIL6R+CHO細胞の細胞質中での当該抗体の蓄積をBirAアッセイで評価した結果を示す図である。40kDaの下の矢印で示される部分に表示されるバンドが、BirAによってビオチン標識された抗体軽鎖を表すHRPの発光シグナルである。
【図６】図中に示した各抗体を含むpH7.4またはpH5.5に調整した培地で1時間インキュベートしたCHO細胞またはHela細胞の細胞質中での当該抗体の蓄積を蛍光顕微鏡を用いたイメージング解析で評価した結果を示す図である。図６（１）は抗体を検出した蛍光シグナルを細胞数で標準化した値をプロットしたグラフであり、縦軸は蛍光シグナル（A.U.: Arbitrary Unit）である。図６（２）は蛍光顕微鏡画像である。
【図７】本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域を含む。
【図８】本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域、及び一本鎖ユニットを含む。
【図９】本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一及び第二の単一ドメイン抗体可変領域、ならびに一本鎖ユニットを含む。
【図１０】本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）の分子形を有する。
【図１１】本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一、第二及び第三のFab領域を含む。
【図１２】本開示の抗原結合分子の例示的な分子形を示す模式図である。当該抗原結合分子は、第一、第二、第三及び第四のFab領域を含む。
【図１３】EGFP-Nanoluc LgBiT HeLa細胞及びAKAP-EGFP-Nanoluc LgBiT HeLa細胞のスプリットNanolucシグナルの差を示す。
【図１４】図１４Ａは、AKAP-EGFP-Nanoluc LgBiT HeLa細胞において3D8抗体に関する二重機能性抗体の細胞質輸送を評価するための、スプリットNanolucアッセイの結果を示す。図１４Ｂは、AKAP-EGFP-Nanoluc LgBiT HeLa細胞において2C10抗体に関する二重機能性抗体の細胞質輸送を評価した、スプリットNanolucアッセイの結果を示す。
【図１５】HeLa/BirA/IL6R細胞において二重機能性抗体の細胞質輸送を評価するための、ビオチンライゲース（BirA）アッセイの結果を示す。
【図１６】HeLa/ASGPR/BirA細胞において二重機能性抗体の細胞質輸送を評価するための、ビオチンライゲース（BirA）アッセイの結果を示す。
【図１７】HeLa/BirA細胞における（図１７Ａ）、HeLa/BirA/IL6R細胞における（図１７Ｂ）、及びHeLa/ASGPR/BirA細胞における（図１７Ｃ）、二価形式の細胞侵入抗体及び受容体結合抗体の細胞質輸送についてのイメージング解析の結果を示す。
【図１８Ａ】HeLa/BirA細胞における、二重機能性抗体の細胞質輸送についてのイメージング解析の結果を示す。
【図１８Ｂ】HeLa/BirA/IL6R細胞における、二重機能性抗体の細胞質輸送についてのイメージング解析の結果を示す。
【図１８Ｃ】HeLa/ASGPR/BirA細胞における、二重機能性抗体の細胞質輸送についてのイメージング解析の結果を示す。
【図１９】HeLa/BirA細胞における（図１９Ａ）、HeLa/BirA/IL6Rにおける（図１９Ｂ）、及びHeLa/ASGPR/BirA細胞における（図１９Ｃ）、二重機能性抗体の細胞質輸送についてのイメージング解析において検出された細胞質蛍光を示す。
【図２０】HeLa/BirA細胞における（図２０Ａ）、HeLa/BirA/IL6R細胞における（図２０Ｂ）、及びHeLa/ASGPR/BirA細胞における（図２０Ｃ）、二重機能性抗体によるカーゴ分子の細胞質送達についてのイメージング解析の結果を示す。
【図２１】HeLa/BirA細胞における（図２１Ａ）、HeLa/BirA/IL6Rにおける（図２１Ｂ）、及びHeLa/ASGPR/BirA細胞における（図２１Ｃ）、二重機能性抗体によるカーゴ分子の細胞質送達についてのイメージング解析において検出された細胞質蛍光を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
Ｉ．定義
本明細書の趣旨での「アクセプターヒトフレームワーク」は、下で定義するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン (VL) フレームワークまたは重鎖可変ドメイン (VH) フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含んでもよいし、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様において、アミノ酸の変更の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。
【００３０】
用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。一態様において、抗原結合分子は、抗体、抗体断片、または抗体誘導体である。
【００３１】
「アフィニティ」は、分子（例えば、抗体）の結合部位1個と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合アフィニティ」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する、固有の結合アフィニティのことをいう。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティは、一般的に、解離定数 (KD) または「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」により表すことができる。アフィニティは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
【００３２】
「アフィニティ成熟」抗体は、改変を備えていない親抗体と比較して、1つまたは複数の超可変領域 (hypervariable region: HVR) 中に抗体の抗原に対するアフィニティの改善をもたらす1つまたは複数の改変を伴う、抗体のことをいう。
【００３３】
「結合活性（binding activity）」は、分子（例えば、抗体）の１個またはそれ以上の結合部位と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。ここで、「結合活性（binding activity）」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用に厳密に限定されない。例えば、結合対のメンバーが、１価での結合および多価での結合の両方が可能である場合、結合活性は、これらの結合力の総和となる。分子XのそのパートナーYに対する結合活性は、一般的に、解離定数 (KD) または「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」により表すことができる。結合活性は、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
【００３４】
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多機能性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
【００３５】
本明細書で用いられる「アゴニスト」抗原結合分子または「アゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を有意に増強する抗体である。
【００３６】
本明細書で用いられる「阻止」抗原結合分子または「阻止」抗体、あるいは「アンタゴニスト」抗原結合分子または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を（部分的にまたは完全にのいずれでも）有意に阻害する抗体である。
【００３７】
「抗体断片」は、完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv（VHおよびVL）、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多機能性抗体、多重特異性抗体を含む。
【００３８】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する抗体のことをいい、また逆にいえば、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。
【００３９】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。
【００４０】
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
【００４１】
本明細書でいう用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するまたは妨げる、および／または細胞の死または破壊の原因となる物質のことをいう。細胞傷害剤は、これらに限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；例えば、低分子毒素または細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素（その断片および／または変異体を含む）などの、毒素；および、以下に開示される、種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含む。
【００４２】
「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因する、抗体のアイソタイプによって異なる生物学的活性のことをいう。抗体のエフェクター機能の例には次のものが含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity:CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）の下方制御；および、B細胞活性化。
【００４３】
ある剤（例えば、薬学的製剤）の「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効である、必要な用量におけるおよび必要な期間にわたっての、量のことをいう。
【００４４】
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
【００４５】
本明細書において、Fc領域または定常領域中のアミノ酸改変または置換は、EUナンバリングシステムとアミノ酸との組合せによって表され得る。たとえば、S424Nは、EUナンバリング424位のセリン（Ser）のアスパラギン（Asn）への置換を表す。また、EU424Nは、424位のアミノ酸（種類を問わない）のアスパラギン（Asn）への置換を表す。
【００４６】
「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体のことをいう。Fc受容体は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、および肥満細胞などの免疫細胞の表面上のタンパク質である。Fc受容体は、感染細胞または侵入病原体に付着した抗体のFc(結晶性フラグメント)領域に結合し、食細胞または細胞傷害性細胞を刺激して、抗体媒介性食作用または抗体依存性細胞介在性細胞傷害によって微生物または感染細胞を破壊する。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM）を含む。（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。）FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
【００４７】
用語「Fc受容体」または「FcR」はまた、母体のIgGの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）ならびに免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う、新生児型受容体FcRnを含む。FcRnへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al.)を参照のこと）。
【００４８】
インビボでのヒトFcRnへの結合およびヒトFcRn高アフィニティ結合ポリペプチドの血漿半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトされたヒト細胞株においてまたは変異Fc領域を伴うポリペプチドが投与される霊長類において測定され得る。WO2000/42072 (Presta) は、FcRに対する結合が増加したまたは減少した抗体変異体を記載している。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) も参照のこと。
【００４９】
本明細書で用語「Fc領域含有抗体」は、Fc領域を含む抗体のことをいう。Fc領域のC末端リジン（EUナンバリングシステムにしたがえば残基447）またはFc領域のC末端グリシン−リジン（残基446-447）は、例えば抗体の精製の間にまたは抗体をコードする核酸の組み換え操作によって除去され得る。したがって、本開示によるFc領域を有する抗体を含む組成物は、G446-K447を伴う抗体、G446を伴いK447を伴わない抗体、G446-K447が完全に除去された抗体、または上記3つのタイプの抗体の混合物を含み得る。
【００５０】
本明細書で用語「Fcドメインのサブユニット」および「Fcサブユニット」は、二量体であるFc領域を形成する２つのポリペプチドの一つ、即ち、安定に自己会合可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、IgGのFcドメインのサブユニットは、IgGのCH2及びIgGのCH3定常ドメインを含む。
【００５１】
「Fcドメインの第一及び第二のサブユニットの会合を促進する修飾」とは、ホモ二量体を形成するFcドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの会合を減少又は防止するペプチド骨格の操作又はFcドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書において使用される会合を促進する修飾は、会合が望まれる２つのFcドメインサブユニット（すなわちFcドメインの第一及び第２サブユニット）のそれぞれに対して行われた別々の修飾を特に含み、該修飾は２つのFcドメインのサブユニットの会合を促進するように互いに相補的である。例えば、会合促進修飾は、その会合をそれぞれ立体的又は静電気的に好ましくするために、Fcドメインの一方又は双方の構造又は電荷を改変しうる。従って、（ヘテロ）二量体化が、各サブユニットの各々に融合した更なる成分（例えば抗原結合部分）が同一ではないという意味で非同一であるかもしれない、第一Fcドメインサブユニットを含むポリペプチドと第二Fcドメインサブユニットを含むポリペプチドの間に生じる。幾つかの実施態様では、会合促進修飾は、Fcドメイン中にアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合修飾は、Fcドメインの２つのサブユニットの各々における別々のアミノ酸変異、特にアミノ酸置換を含む。
【００５２】
一態様において、前記修飾は、Fcドメインの２つのサブユニットの一方におけるノブ修飾及びFcドメインの2つのサブユニットの他方におけるホール修飾を含む、いわゆるノブ・イントゥ・ホール(knob into hole)修飾である。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号； Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、突起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での突起（「ノブ」）及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞（「穴」）を導入することを含む。突起は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換することによって構築される。突起と同一又はより小さい大きさの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって第二ポリペプチドの界面に作成される。
【００５３】
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
【００５４】
用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
【００５５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
【００５６】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。
【００５７】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
【００５８】
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
【００６０】
「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の異種の分子にコンジュゲートされた抗体である（異種の分子は、これに限定されるものではないが、細胞傷害剤を含む）。
【００６１】
「個体」または「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物は、これらに限定されるものではないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の態様では、個体または被験体は、ヒトである。
【００６２】
「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点分離法 (isoelectric focusing: IEF)、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相HPLC）で測定して、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の総説として、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) を参照のこと。
【００６３】
「単離された」核酸は、そのもともとの環境の成分から分離された核酸分子のことをいう。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。
【００６４】
「細胞質侵入抗原結合分子をコードする単離された核酸」は、細胞質侵入抗原結合分子をコードする1つまたは複数の核酸分子のことをいい、1つのベクターまたは別々のベクターに乗っている核酸分子、および、宿主細胞中の1つまたは複数の位置に存在している核酸分子を含む。TR細胞質侵入抗原結合分子が抗体である場合、「細胞質侵入抗原結合分子をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする1つまたは複数の核酸分子のことをいい、1つのベクターまたは別々のベクターに乗っている核酸分子、および、宿主細胞中の1つまたは複数の位置に存在している核酸分子を含む。
【００６５】
本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本開示にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００６６】
「裸抗体」は、異種の部分（例えば、細胞傷害部分）または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体のことをいう。裸抗体は、薬学的製剤中に存在していてもよい。
【００６７】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造を伴う免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、それに3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。
【００６８】
用語「細胞質侵入抗原結合分子」は、生きている細胞の細胞質中に侵入することができる抗原結合分子をいう。細胞質中への侵入方法は特に限定されず、エンドサイトーシス（endocytosis）過程を介して取り込まれた後に、エンドソーム脱出（endosome escape）を経ても良いし、それ以外の方法であっても良い。エンドソーム脱出以外の例としては、抗原結合分子が、細胞膜を直接透過する場合が挙げられる。同一の抗原結合分子が、エンドソーム脱出と細胞膜の直接透過の両方の方法で、細胞質中に侵入してもよい。エンドソーム脱出とは異なる方法で、細胞質中に侵入することのできる抗原結合分子が報告されている（例えば、WO2013102659）。一態様において、細胞質侵入抗原結合分子は抗体または抗体誘導体である。別の一態様において、細胞質侵入抗原結合分子は、細胞質侵入ドメインを含む。
【００６９】
用語「細胞質侵入ドメイン」及び「細胞質侵入能を有する領域」は互換的に使用され、生きている細胞の細胞質中に侵入することができるドメインをいう。細胞質中への侵入方法は特に限定されず、エンドサイトーシス（endocytosis）過程を介して取り込まれた後に、エンドソーム脱出（endosome escape）を経ても良いし、それ以外の方法であっても良い。エンドソーム脱出方法は特に限定されず、例えば、酸性pHであるエンドソーム内で細胞質侵入ドメインがエンドソーム膜と相互作用し、エンドソーム膜上に孔を形成することで、細胞質への移行が達成される。エンドソーム脱出以外の例としては、抗原結合分子が、細胞膜を直接透過する場合が挙げられる。同一の抗原結合分子が、エンドソーム脱出と細胞膜の直接透過の両方の方法で、細胞質中に侵入してもよい。一態様において、細胞質侵入ドメインは、エンドソーム脱出能および細胞膜透過能のうちの一方または両方を有する。一態様において、細胞質侵入ドメインはエンドサイトーシス能を有しない。別の一態様において、細胞質侵入ドメインはエンドサイトーシス能を有する。細胞質侵入ドメインは、細胞質侵入能を有するものであればその種類を問わないが、好ましい一態様において、抗体またはその断片、ペプチド部分、核酸部分である。細胞質侵入ドメインが抗体又はその断片である場合、細胞質侵入ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）及び抗体重鎖可変領域（VH）の組合せ、または、重鎖抗体可変領域（VHH）、抗体重鎖可変領域（VH）、抗体軽鎖可変領域（VL）、及び免疫グロブリン新抗原受容体（immunoglobulin new antigen receptor：IgNAR）の可変領域（VNAR）等の単一ドメイン抗体可変領域、の全部または一部を含む。細胞質侵入能を有する抗体又はその断片の例としては、例えば、細胞質侵入能を示す軽鎖可変領域を含むCytotransmab (Nat Commun. 2017 May 10;8:15090.)が挙げられる。細胞質侵入ドメインの異なる例としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「F(ab')2」等が挙げられる。細胞質侵入ドメインであるペプチド部分の例としては、細胞膜透過ペプチド（cell-penetrating peptide、CPP）、膜透過ペプチド（protein transduction domain、PTD）などが挙げられる（例えば、WO2017156630参照）。細胞質侵入ドメインである核酸部分の例としては、phosophorothioate骨格を有するオリゴ核酸が挙げられる（例えば、WO2015031837参照）。一態様において、細胞質侵入抗原結合分子は、細胞質侵入能を有しない抗原結合分子と細胞質侵入ドメインの融合体または複合体である。
関心対象のドメインが細胞質侵入ドメインであるか否か（細胞質侵入能を有するか否か）は、当業者に公知の種々の方法により確認することができる。例えば、細胞質侵入能を有しない分子（例えば抗原結合分子）に当該ドメインを融合させ、当該融合分子を細胞に接触させた後に当該細胞の細胞質において当該融合分子が検出されるか否かによって評価することができる。関心対象の分子の細胞質における存在を検出する種々の方法が公知であり、例えば後述の実施例に記載のBirA assayや蛍光顕微鏡を用いたイメージング解析が知られている。
一態様において、細胞質侵入ドメインは、細胞表面抗原及び／又は細胞質抗原と相互作用してもよい。
【００７０】
抗原結合分子の「細胞質輸送」能とは、細胞質に輸送される抗原結合分子の能力を意味し、用語「侵入する」、「輸送する（traffic）」、又は「輸送する（traffick）」は、互換的に用いられる。
【００７１】
「融合」とはその成分（例えば、Fab領域及びFcドメインサブユニット）が、直接または一つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されていることを意味する。
【００７２】
用語「添付文書」は、治療用品の商用パッケージに通常含まれ、そのような治療用品の使用に関する、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌、および／または警告についての情報を含む使用説明書のことをいうために用いられる。
【００７３】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR) ソフトウェア、またはGENETYX（登録商標）（株式会社ゼネティックス）などの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。
【００７４】
ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。
アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：分率X／Yの100倍。ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。
【００７５】
用語「薬学的製剤」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される被験体に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。
【００７６】
「薬学的に許容される担体」は、被験体に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
【００７７】
本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本開示の抗原結合分子は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
【００７８】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
【００８０】
本明細書で用いられる表現「実質的に減少した」、「実質的に増加した」または「実質的に異なる」は、2つの数値の間（通常、ある分子に関するものと、参照／比較用分子に関するものの間）の差が、当業者がそれら2つの数値の間の差が該数値（例えば、KD値）によって測定される生物学的特徴の観点で統計学的に有意であるとみなす程度に、充分に大きいことをいう。
【００８１】
本明細書で用いられる用語「実質的に類似の」、「実質的に変化しない」または「実質的に同じ」は、2つの数値の間（例えば、本開示の抗原結合分子に関するものと、参照／比較用抗原結合分子に関するものの間）の類似性が、当業者がそれら2つの数値の間の差が該数値（例えば、KD値）によって測定される生物学的特徴の観点でほとんどまたはまったく生物学的および／または統計学的に有意性がないとみなす程度に、充分高いことをいう。 
【００８２】
本明細書で用いられる表現「実質的に検出されない」は、当業者に公知の標準的な検出技術（例えば、ウェスタンブロッティング、キャピラリーイムノアッセイ、蛍光顕微鏡によるイメージングなど）の検出限界以下であることを意味し、全く検出されないか、または検出されたとしてもバックグラウンド程度もしくはノイズ程度の検出であることを意味する。具体的には、例えば、本開示の抗原結合分子の測定値がネガティブコントロールの測定値と実質的に類似であるかまたは実質的に同じである（例えば、統計学的に有意性が見られない）場合に、本開示の抗原結合分子は実質的に検出されないという。
また、「実質的に送達されない」とは、当該送達が、それを検出するための標準的な検出技術において実質的に検出されないことを意味する。例えば、細胞の細胞質中への送達に関して、本開示の抗原結合分子またはその複合体と接触させた細胞の細胞質中の当該抗原結合分子またはその複合体の存在量が、当該接触のない細胞の細胞質中の当該存在量と実質的に類似であるか実質的に同じである（例えば、統計学的に有意性が見られない）場合に、当該抗原結合分子は当該細胞の細胞質中に実質的に送達されないという。
同様に、実質的に除去、抑制、または活性化しないとは、当該除去、抑制、活性化が、それらを検出するための標準的な検出技術において実質的に検出されないことを意味する。例えば、細胞質抗原の除去、抑制、活性化に関して、本開示の抗原結合分子またはその複合体を用いた場合の測定値が、コントロールの測定値と実質的に類似であるか実質的に同じである（例えば、統計学的に有意性が見られない）場合に、細胞質抗原は実質的に除去、抑制又は活性化しないという。
【００８３】
ＩＩ．組成物および方法
一局面において、本開示は、細胞質侵入抗体又はその断片、細胞表面抗原に結合する抗体又はその断片、及び／又は、細胞質中抗原に結合する抗体又はその断片、を組み合わせた、多機能性抗原結合分子が、標的細胞特異的に細胞質中に送達されるという発見に一部基づくものである。特定の態様において、細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む、抗原結合分子が提供される。本開示の抗原結合分子は、例えば、細胞質抗原に起因する疾患の診断、予防または治療のために、有用である。
【００８４】
Ａ．細胞質侵入抗原結合分子
一局面において、本開示における抗原結合分子は、細胞質侵入抗原結合分子である。一態様において、本開示における細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む。好ましい一態様において、本開示における細胞質侵入抗原結合分子は、前記細胞表面抗原と異なる抗原であって、細胞表面上に発現する抗原に結合しない。好ましい一態様において、前記細胞質抗原結合ドメイン及び／または前記細胞質侵入ドメインは、(i) 前記細胞表面抗原と異なる抗原であって、細胞表面上に発現する抗原に結合しないか、または(ii) 細胞表面上に発現するいかなる抗原にも結合しない。
【００８５】
ここで、既存の細胞内移行抗体（Tmab4（重鎖:3D8、軽鎖:hT4VL））は、細胞表面のHeparan sulfate proteoglycan (HSPG)依存的なエンドサイトーシスにより細胞内エンドソームに取り込まれ、酸性pHであるエンドソーム内で、軽鎖の構造が変化することによりエンドソーム膜と相互作用し、膜上に孔を形成することで、細胞質への移行を達成していることが知られている。（J Control Release. 2016 Aug 10;235:165-175）。また、HSPGへの結合を減弱させた抗体（Tmab4-03（重鎖:3D8、軽鎖:hT4VL.03））は、pH5.5での孔形成能は維持しつつも、エンドサイトーシス能は損なわれていることも報告されている（J Control Release. 2016 Aug 10;235:165-175）。すなわちTmab4-03は、このままでは細胞特異的な細胞内移行を達成できないことを意味している。さらに、エンドソーム膜上に孔を形成するためには、Tmab4とエンドソーム膜上の分子とが相互作用して膜を歪めることが重要であると予想される（PNAS,2011 Oct.108;41;16883-16888）。したがって、一態様において、細胞質侵入能を向上させるためにはエンドソーム膜と相互作用する細胞質侵入ドメインは多価であることが望ましい。
【００８６】
他方で、前述の通り、Tmab4は上皮細胞に普遍的に発現しているHSPGを介してエンドサイトーシスされるため、標的細胞特異的に細胞質抗原結合抗体を送達することが困難である。すなわち、全身に投与された際に、標的組織への細胞質抗原結合抗体の送達が低くなることが予想される。そこで発明者らは、一態様において、細胞質侵入ドメインを一価にすることで非特異的な取り込みを抑え、さらに標的細胞表面結合ドメインを加えることで標的特異性を向上させると同時に、抗体とエンドソーム膜との相互作用が多価である状態をつくり、細胞質侵入能を維持又は向上させることを考えた。
【００８７】
上述の既存抗体と異なり、一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン、細胞質抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む。したがって、一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、標的細胞の細胞表面抗原に結合することで、標的細胞特異的にエンドサイトーシスされ、その後、エンドソームから細胞質へ移行することが期待される。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、既存の細胞質侵入抗体と比較して、より選択的に標的細胞の細胞質中に送達される。一態様において、一定量の本開示の細胞質侵入抗原結合分子を対象に投与しまたは接触させた場合、同量の既存の細胞質侵入抗体と比較して、より多くの抗原結合分子が標的細胞の細胞質中に送達される。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、標的細胞の細胞質中に特異的に送達され、当該抗原結合分子が特異的に結合する細胞表面抗原を発現しない細胞には実質的に送達されない。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子が医薬として用いられる場合、当該細胞質侵入抗原結合分子は、既存の細胞質侵入抗体と比較して、より強い薬効を発揮し、及び／又は、より少ない副作用を生じる。また、一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子を含む医薬組成物は、既存の細胞質侵入抗体を含む医薬組成物と比較して、少ない投与量、及び／又は、投与回数で薬効を発揮することができる。
【００８８】
本明細書における用語「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部または全部に特異的に結合し且つ相補的である領域を含んで成る抗原結合分子の部分をいう。抗原の分子量が大きい場合、抗原結合ドメインは抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは一または複数の抗体の可変ドメインより提供され得る。好ましい一態様において、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）及び抗体重鎖可変領域（VH）の組合せ、または、重鎖抗体可変領域（VHH）、抗体重鎖可変領域（VH）、抗体軽鎖可変領域（VL）、及び免疫グロブリン新抗原受容体（immunoglobulin new antigen receptor：IgNAR）の可変領域（VNAR）等の単一ドメイン抗体可変領域、の全部または一部を含む。抗原結合ドメインの異なる例としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「F(ab')2」等が挙げられる。
【００８９】
本明細書で用語「単一ドメイン抗体」、「単一ドメイン抗体可変領域」、「単ドメイン抗体」および「単ドメイン抗体可変領域」は、そのドメイン単独で抗原結合活性を発揮できるかぎりその構造は限定されない。IgG抗体等で例示される通常の抗体は、VHとVLのペアリングにより可変領域を形成された状態では抗原結合活性を示すのに対し、単ドメイン抗体は他のドメインとペアリングすることなく、単ドメイン抗体自身のドメイン構造単独で抗原結合活性を発揮できると知られている。単ドメイン抗体は通常比較的に低分子量を有し、単量体の形態で存在する。
単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科の動物のVHH、サメのVNAR（免疫グロブリン新抗原受容体（immunoglobulin new antigen receptor：IgNAR）の可変領域）のような、先天的に軽鎖を欠如する抗原結合分子、または抗体のVHドメインのすべてもしくは一部分またはVLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片が挙げられる。抗体のVH／VLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、米国特許第6,248,516号B1等に記載されているようなヒト抗体VHまたはヒト抗体VLから出発して人工的に作製された単ドメイン抗体が挙げられる。本発明のいくつかの実施態様において、1つの単ドメイン抗体は3つのCDR（CDR1、CDR2及びCDR3）を有する。
単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を産生できる動物から、または単ドメイン抗体を産生できる動物を免疫することにより取得し得る。単ドメイン抗体を産生できる動物の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科動物、単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物（transgenic animals）が挙げられる。ラクダ科動物はラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ等を含む。単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物の例として、それだけに限定されないが、国際公開WO2015/143414号、米国特許公開US2011/0123527号A1に記載の遺伝子導入動物が挙げられる。動物から取得した単ドメイン抗体のフレームワーク配列をヒトジャームライン配列あるいはそれに類似した配列とすることで、ヒト化した単ドメイン抗体を取得することも出来る。ヒト化した単ドメイン抗体（例えば、ヒト化VHH）はまた、本発明の単ドメイン抗体の一実施態様である。「ヒト化単ドメイン抗体」は、非ヒトCDRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ単ドメイン抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化単ドメイン抗体は、すべてのもしくは実質的にすべてのCDRは非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体において、ＦＲ中の残基の一部がヒト抗体のものと対応しない場合も、実質的にすべてのＦＲはヒト抗体のものに対応する一例として考えられる。たとえば、単ドメイン抗体の一態様であるＶＨＨをヒト化する場合、ＦＲ中の残基の一部をヒト抗体のものと対応しない残基にする必要がある（C Vinckeら、The Journal of Biological Chemistry 284, 3273-3284.）。
単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリから、ELISA、パニング等により取得し得る。単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリの例として、それだけに限定されないが、例えば、各種動物若しくはヒトから取得したナイーブ抗体ライブラリ（例：Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)、Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319)）、各種動物を免疫することで取得した抗体ライブラリ（例：Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536)）、または各種動物若しくはヒトの抗体遺伝子より作成した合成抗体ライブラリ（例：Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43)、Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)、AIDS 2016 30:11 (1691-1701)）が挙げられる。
【００９０】
本明細書において「特異的に結合する」とは、特異的に結合する分子の一方の分子がその一または複数の結合する相手方の分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態で結合することをいう。また、抗原結合ドメインが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗原結合分子は当該エピトープを含む様々な抗原と結合することができる。
【００９１】
本開示の抗原結合分子における「細胞表面抗原結合ドメイン」は、細胞表面に発現する抗原中に存在するエピトープに結合することができる。「細胞表面抗原」は、細胞によって発現され、かつ抗原結合ドメインがアクセスできるようその細胞表面上に存在する抗原構造を表す。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメインを含むことから、当該細胞表面抗原を発現している細胞（標的細胞）に特異的に取り込まれる。これにより、細胞質侵入抗原結合分子の標的細胞への特異的な送達が可能となる。一態様において、細胞表面抗原結合ドメインは、一または複数の抗体の可変ドメインより提供されることができ、上述の「抗原結合ドメイン」として例示される形態のいずれであってもよい。
【００９２】
本開示の抗原結合分子における「細胞質抗原結合ドメイン」は、細胞質中に発現する抗原中に存在するエピトープに結合することができる。「細胞質抗原」は、細胞によって発現され、細胞質内に存在する抗原構造を表す。細胞質抗原は、タンパク質であっても良いし、DNAやRNA等の核酸であっても良いし、細胞核やミトコンドリアなどの細胞小器官に発現している分子であってもよい。本開示の細胞質抗原結合分子は、細胞質抗原結合ドメインを含むことから、標的細胞の細胞質中において当該細胞質抗原に結合し、当該抗原の機能を中和・阻害・活性化すること等が可能となる。一態様において、細胞質抗原結合ドメインは、一または複数の抗体の可変ドメインより提供されることができ、上述の「抗原結合ドメイン」として例示される形態のいずれであってもよい。さらなる一態様において、細胞質抗原結合ドメインは、酵素やshRNAなどであってもよい。
【００９３】
一態様において、細胞質侵入抗原結合分子が、標的細胞特異的に細胞質中に送達されるとは、細胞質侵入抗原結合分子を、標的細胞及び非標的細胞と接触させた後の、a)任意の時点における非標的細胞の細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量が、b)同時点における標的細胞の細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量と比較して、少ないこと又は実質的に減少していることをいう。好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子を非標的細胞と接触させた後、当該非標的細胞の細胞質中から当該細胞質侵入抗原結合分子は実質的に検出されない。好ましい一態様において、当該細胞は、Hela細胞株、CHO細胞株、MDCK細胞、又はHepG2細胞株に由来する、細胞表面抗原を発現する又は発現しない細胞である。細胞に接触させる細胞質侵入抗原結合分子の量は、任意に決定されてよいが、前記a)における細胞質侵入抗原結合分子量と前記b)における細胞質侵入抗原結合分子量は同量である。細胞質侵入抗原結合分子と細胞との接触は、インキュベーションを含む任意の方法で行われる。
【００９４】
一態様において、細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量は、当該細胞質侵入抗原結合分子を細胞と接触させた後、0時間後、0.25時間後、0.5時間後、1時間後、1.5時間後、2時間後、2.5時間後、3時間後、3.5時間後、4時間後、4.5時間後、5時間後、5.5時間後、6時間後、6.5時間後、7時間後、7.5時間後、8時間後、8.5時間後、9時間後、9.5時間後、10時間後、11時間後、12時間後、13時間後、14時間後、15時間後、および／または16時間後に測定される。細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量は、当該細胞質侵入抗原結合分子を細胞と接触させた後、一度だけ測定しても良いし、複数回測定しても良い。細胞質中に存在する細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量を複数回測定することによって、時間の経過に伴う、細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量の変化を観察することが可能である。
【００９５】
好ましい一態様において、細胞質侵入抗原結合分子を非標的細胞及び標的細胞と接触させた後の、a)任意の時点における非標的細胞の細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量は、b)同時点における標的細胞の細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量の、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、または５％以下である。
【００９６】
一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子量をHRP発光シグナルまたは蛍光シグナルまたは発光シグナルであらわす場合、細胞質侵入抗原結合分子を非標的細胞及び標的細胞と接触させた後の、a)任意の時点における非標的細胞のHRP発光シグナル強度または蛍光シグナル強度または発光シグナル強度は、b)同時点における標的細胞のHRP発光シグナル強度または蛍光シグナル強度または発光シグナル強度の、0.5倍以下、0.4倍以下、0.3倍以下、0.2倍以下、0.1倍、または0.05倍以下である。一態様において、ビオチンライゲース（BirA）を発現する細胞を含む方法（実施例４に記載の方法など）が用いられる場合、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子の量は、HRP発光シグナルであらわすことができる。異なる一態様において、イメージング解析（実施例５に記載の方法など）が用いられる場合、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子の量は、蛍光シグナルであらわすことができる。異なる一態様において、スプリットタンパク質システム（実施例９に記載の方法など）が用いられる場合、任意の時点における細胞質中に存在する細胞質侵入抗原結合分子の量は、発光シグナルであらわすことができる。
【００９７】
本発明の一実施態様において、細胞表面抗原結合ドメインと細胞質侵入ドメイン、細胞表面抗原結合ドメインと細胞質抗原結合ドメイン、細胞質侵入ドメインと細胞質抗原結合ドメイン、細胞表面抗原結合ドメインとFcサブユニット、細胞質侵入ドメインとFcサブユニット、細胞質抗原結合ドメインとFcサブユニットを融合するため、ペプチドリンカーを使用してもよい。また、後述する１〜７の分子形を有する抗原結合分子において、1つのFab領域を別のFab領域に融合し、またはFab領域をFcサブユニットに融合するために、ペプチドリンカーを使用してよい。例えば、Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Alaなどから任意に選択されるアミノ酸、特にGly、Ser、Asp、Asn、Ala、ことさらGlyおよびSer、特にGlyなどが含まれる。
【００９８】
好適なペプチドリンカーは当業者が容易に選択可能であり、１アミノ酸（Ｇｌｙなど）から２１アミノ酸、２アミノ酸から１５アミノ酸あるいは、４アミノ酸から１０アミノ酸、５アミノ酸から９アミノ酸、６アミノ酸から８アミノ酸または７アミノ酸から８アミノ酸をはじめとして３アミノ酸から１２アミノ酸など、異なる長さのうちからの好適なものを選択できる。
【００９９】
ペプチドリンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ：配列番号：１０）ｎおよび（ＧＧＧＳ：配列番号：１）ｎを含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、従来技術において周知の他の可動リンカーが挙げられる。
このうちグリシンおよびグリシン−セリンポリマーが注目されているが、これらのアミノ酸が比較的構造化されておらず、成分間の中性テザーとして機能しやすいことがその理由である。
グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、
Ser
Gly・Ser（GS）
Ser・Gly（SG）
Gly・Gly・Ser（GGS）
Gly・Ser・Gly（GSG）
Ser・Gly・Gly（SGG）
Gly・Ser・Ser（GSS）
Ser・Ser・Gly（SSG）
Ser・Gly・Ser（SGS）
Gly・Gly・Gly・Ser（GGGS：配列番号：１）
Gly・Gly・Ser・Gly（GGSG：配列番号：２）
Gly・Ser・Gly・Gly（GSGG：配列番号：３）
Ser・Gly・Gly・Gly（SGGG：配列番号：４）
Gly・Ser・Ser・Gly（GSSG：配列番号：５）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS：配列番号：６）
Gly・Gly・Gly・Ser・Gly（GGGSG：配列番号：７）
Gly・Gly・Ser・Gly・Gly（GGSGG：配列番号：８）
Gly・Ser・Gly・Gly・Gly（GSGGG：配列番号：９）
Gly・Ser・Gly・Gly・Ser（GSGGS：配列番号：１０）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG：配列番号：１１）
Gly・Ser・Ser・Gly・Gly（GSSGG：配列番号：１２）
Gly・Ser・Gly・Ser・Gly（GSGSG：配列番号：１３）
Ser・Gly・Gly・Ser・Gly（SGGSG：配列番号：１４）
Gly・Ser・Ser・Ser・Gly（GSSSG：配列番号：１５）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGS：配列番号：１６）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGG：配列番号：１７）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGGS：配列番号：１８）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGGG：配列番号：１９）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS：配列番号：６）)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG：配列番号：１１）)n［nは１以上の整数である］
等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
【０１００】
さらに好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、次の１〜８の分子形のいずれかであってよい。
【０１０１】
１．第一及び第二のFab領域を含む、細胞質侵入抗原結合分子（図１、図７）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域を含む。
特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含む。
別の特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペアを含み；(b) 第二のFab領域は、細胞質抗原に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペアを含む。
さらに別の特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞表面抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペアを含み；(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞質抗原に結合する軽鎖可変領域(VL)のペアを含む。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子は、Fc領域をさらに含んでもよく、当該Fc領域は、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
【０１０２】
２．第一及び第二のFab領域、ならびに一本鎖ユニットを含む細胞質侵入抗原結合分子（図８）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域、ならびに一本鎖ユニットを含む。
特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し；(c) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する。
別の特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し；(c) 一本鎖ユニットは、細胞表面抗原に特異的に結合する。
また別の特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、細胞質抗原に特異的に結合し；(c) 一本鎖ユニットは、細胞質侵入能を有する。
さらに別の特定の態様において、(a) 第一及び第二のFab領域は、(i) 細胞表面抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と細胞表面抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含み；(b) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する。
また特定の態様において、一本鎖ユニットは、(i) 前記第一のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の重鎖可変領域(VH)のN末端；(ii) 前記第一のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖可変領域(VL)のN末端；あるいは(iii) 前記第一のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端、及び／又は、前記第二のFab領域の軽鎖定常領域(CL)のC末端に融合されている。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含むFc領域をさらに含んでもよく、一本鎖ユニットは、(i) 第一のFcサブユニットのC末端、又は(ii) 前記第二のFcサブユニットのC末端に融合されていてもよい。第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる一本鎖ユニットは、単一ドメイン抗体可変領域または一本鎖抗体（scFv）であってもよい。単一ドメイン抗体可変領域の例には、重鎖抗体可変領域（VHH）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）または免疫グロブリン新抗原受容体の可変領域（VNAR）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
３．第一及び第二の単一ドメイン抗体可変領域、ならびに一本鎖ユニットを含む細胞質侵入抗原結合分子（図９）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二の単一ドメイン抗体可変領域、ならびに一本鎖ユニットを含む。
特定の態様において、(a) 第一の単一ドメイン抗体可変領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二の単一ドメイン抗体可変領域は、細胞質侵入能を有し；(c) 一本鎖ユニットは、細胞質抗原に特異的に結合する。特定の態様において、一本鎖ユニットは、第一の単一ドメイン抗体可変領域のN末端、及び／又は、前記第二の単一ドメイン抗体可変領域のN末端、に融合されている。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含むFc領域をさらに含んでもよく、一本鎖ユニットは、(i) 第一のFcサブユニットのC末端、又は(ii) 前記第二のFcサブユニットのC末端に融合されていてもよい。第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
これらの態様における細胞質侵入抗原結合分子に含まれる一本鎖ユニットは、単一ドメイン抗体可変領域または一本鎖抗体（scFv）であってもよい。単一ドメイン抗体可変領域の例には、重鎖抗体可変領域（VHH）、重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）または免疫グロブリン新抗原受容体の可変領域（VNAR）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
４．ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）の分子形を有する細胞質侵入抗原結合分子（図１０）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第1と第2のポリペプチド鎖を含み、ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）の分子形を有する。
特定の態様において、(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞質抗原に特異的に結合する第一の重鎖可変領域であり、VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域CH1であり、X1はCH1ではないリンカーであり、
X2はFc領域であり、及び、nは0又は1であり；(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞質抗原に特異的に結合する第一の軽鎖可変領域であり、VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域CLであり、X1はCLではないリンカーであり、X2はFc領域を含まず、及び、nは0又は1である。
別の特定の態様において、(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞質侵入能を有する第一の重鎖可変領域であり、VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域CH1であり、X1はCH1ではないリンカーであり、X2はFc領域であり、及び、nは0又は1であり；(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞質侵入能を有する第一の軽鎖可変領域であり、VD2は細胞表面抗原に特異的に結合する第二の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域CLであり、X1はCLではないリンカーであり、X2はFc領域を含まず、及び、nは0又は1である。
さらに別の特定の態様において、(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の重鎖可変領域であり、VD2は細胞質抗原に特異的に結合する第二の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域CH1であり、X1はCH1ではないリンカーであり、X2はFc領域であり、及び、nは0又は1であり；(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の軽鎖可変領域であり、VD2は細胞質侵入能を有する第二の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域CLであり、X1はCLではないリンカーであり、X2はFc領域を含まず、及び、nは0又は1である、
なおさらに別の特定の態様において、(a) 当該第一のポリペプチド鎖は、第一のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の重鎖可変領域であり、VD2は細胞質侵入能を有する第二の重鎖可変領域であり、Cは重鎖定常領域CH1であり、X1はCH1ではないリンカーであり、X2はFc領域であり、及び、nは0又は1であり；(b) 当該第二のポリペプチド鎖は、第二のVD1-(X1)n-VD2-C-(X2)nを含み、VD1は細胞表面抗原に特異的に結合する第一の軽鎖可変領域であり、VD2は細胞質抗原に特異的に結合する第二の軽鎖可変領域であり、Cは軽鎖定常領域CLであり、X1はCLではないリンカーであり、X2はFc領域を含まず、及び、nは0又は1である。
これらの態様におけるリンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば重鎖可変領域VD1とVD2の間のリンカーの例として、ASTKGP（配列番号：２０）、ASTKGPSVFPLAP（配列番号：２１）、GGGGSG（配列番号：２２）、GGGGSGGGGS（配列番号：２３）、GGGGSGGGGSGGGG（配列番号：２４）等を挙げることができ、例えば軽鎖がκ鎖の場合の軽鎖可変領域VD1とVD2の間のリンカーの例として、RTVAAP（配列番号：２５）、RTVAAPSVFIFPP（配列番号：２６）、GGSGG（配列番号：８）、GGSGGGGSG（配列番号：２７）、GGSGGGGSGGGGS（配列番号：２８）等を挙げることができ、例えば軽鎖がλ鎖の場合の軽鎖可変領域VD1とVD2の間のリンカーの例として、GQPKAAP（配列番号：２９）、GQPKAAPSVTLFPP（配列番号：３０）、GGSGG（配列番号：８）、GGSGGGGSG（配列番号：２７）、GGSGGGGSGGGGS（配列番号：２８）等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
【０１０５】
５．第一、第二及び第三のFab領域を含む、細胞質侵入抗原結合分子（図１１）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一、第二及び第三のFab領域を含む。
特定の態様において、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二及び第三のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は (ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み；(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
別の特定の態様において、(a) 第一及び第三のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は (ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み；(b) 第二のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第2のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
さらに別の特定の態様において、(a) 第一及び第二のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は (ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み；(b) 第三のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(c) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(d) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第2のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
また特定の態様において、第一及び／又は第二のFab領域は、(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換；(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換；及び(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域は同一の置換を含まない。
これらの態様において、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
【０１０６】
６．第一、第二、第三及び第四のFab領域を含む、細胞質侵入抗原結合分子（図１２）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、第一、第二、第三及び第四のFab領域を含む。
特定の態様において、(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる1個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 上記(a)以外の3個のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み；(d) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(e) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
別の特定の態様において、(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる2個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 上記(a)以外の2個のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み；(d) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(e) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
さらに別の特定の態様において、(a) 第一、第二、第三及び第四のFab領域から選ばれる3個のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 上記(a)以外の1個のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域及び細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域及び細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域のペア、を含み；(d) Fc領域は、第一のFcサブユニットと第二のFcサブユニットを含み；(e) 第一のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFcサブユニットのN末端に融合されており、第二のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFcサブユニットのN末端に融合されており、第三のFab領域の重鎖のC末端が、第一のFab領域の重鎖のN末端に融合されており、第四のFab領域の重鎖のC末端が、第二のFab領域の重鎖のN末端に融合されている。
また特定の態様において、第一及び／又は第二のFab領域は、(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換；(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換；及び(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第一のFab領域と第二のFab領域は同一の置換を含まない。
また別の特定の態様において、第三及び／又は第四のFab領域は、(i) Fab軽鎖可変領域(VL)とFab重鎖可変領域(VH)の置換；(ii) Fab軽鎖定常領域(CL)とFab重鎖定常領域(CH1)の置換；及び(iii) Fab軽鎖(VL-CL)とFab重鎖(VH-CH1)の置換、から選ばれるいずれか一つの置換を含み、第三のFab領域と第四のFab領域は同一の置換を含まない。
これらの態様において、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
【０１０７】
７．多量体形成を促進する改変Fc領域を含む、細胞質侵入抗原結合分子（図２）
本開示の好ましい一態様における細胞質侵入抗原結合分子は、細胞質侵入能を有する領域及びFc領域を含み、当該Fc領域は当該細胞質侵入抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含み、当該1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む細胞質侵入抗原結合分子と比較して細胞質侵入能が増加している。当該細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質抗原結合ドメインをさらに含んでもよい。
特定の態様において、前記細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域、ならびにFc領域を含み、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し；(b) 第二のFab領域は、(i) 細胞質抗原に特異的に結合する重鎖可変領域(VH)と、細胞質侵入能を有する軽鎖可変領域(VL)のペア、又は、(ii) 細胞質侵入能を有する重鎖可変領域(VH)と、細胞質抗原に特異的に結合する軽鎖可変領域(VL)のペア、を含み；(c) Fc領域は、当該細胞質侵入抗原結合分子の多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を含む。このような改変Fc領域を含む細胞質侵入抗原結合分子は、当該1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む細胞質侵入抗原結合分子と比較して細胞質侵入能が増加しており、複数個の当該細胞質侵入抗原結合分子を含む多量体の細胞質侵入抗原結合分子複合体を形成することができる。
前記多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体又は六量体であってもよい。前記アミノ酸改変は、E345R/E430G/S440Yの組合せまたはT437R/K248Eの組合せであってもよい（数字がEUナンバリングであらわされる置換の位置を示す）。
これらの態様において、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットは、IgG抗体の重鎖定常領域CH2ドメイン及びCH3ドメインであってもよいし、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットの会合を促進する修飾を含んでもよい。
【０１０８】
８．異種の部分にコンジュゲートされた細胞質侵入抗原結合分子
一局面において、本開示の抗原結合分子は、異種の部分にコンジュゲートされている細胞質侵入抗原結合分子である。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含み、細胞質抗原結合ドメインを含まない。好ましい一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、前記細胞表面抗原と異なる抗原であって、細胞の表面上に発現する抗原に結合しない。好ましい一態様において、細胞質侵入ドメイン及び／又は異種の部分は、(i) 前記細胞表面抗原と異なる抗原であって、細胞の表面上に発現する抗原に結合しないか、又は(ii) 細胞の表面上に発現するいかなる抗原にも結合しない。
【０１０９】
一局面において、前述の通り、発明者らは、細胞質侵入ドメインを一価にすることで非特異的な取り込みを抑え、さらに標的細胞表面結合ドメインを加えることで標的特異性を向上させると同時に、抗体とエンドソーム膜との相互作用が多価である状態をつくり、細胞質侵入能を維持又は向上させることを考えた。
【０１１０】
一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む。したがって、一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、標的細胞上の細胞表面抗原に結合することで、標的細胞特異的にエンドサイトーシスされ、その後、エンドソームから細胞質へ移行し、それにより、異種の部分を細胞質中に送達することが期待される。
【０１１１】
一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、既存の細胞質侵入抗体と比較して、より選択的に標的細胞の細胞質中に送達され、そのため、本開示の細胞質侵入抗原結合分子は、異種の部分をより選択的に標的細胞の細胞質中に送達することができる。一態様において、一定量の本開示の細胞質侵入抗原結合分子を対象に投与しまたは接触させた場合、同量の、既存の細胞質侵入抗体にコンジュゲートされた異種の部分と比較して、より大量の、細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分が、標的細胞の細胞質に送達される。一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分は、標的細胞の細胞質中に特異的に送達されるが、当該抗原結合分子が特異的に結合する細胞表面抗原を発現しない細胞には実質的に送達されない。
【０１１２】
一態様において、本開示の細胞質侵入抗原結合分子が医薬として用いられる場合、当該細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分は、既存の細胞質侵入抗体にコンジュゲートされた異種の部分と比較して、より強い薬効を発揮し、及び／又は、より少ない副作用を生じる。一態様において、細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分を含む医薬組成物は、既存の細胞質侵入抗体にコンジュゲートされた異種の部分を含む医薬組成物と比較して、少ない投与量、及び／又は、投与回数で薬効を発揮することができる。
【０１１３】
一態様において、細胞質侵入抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域を含み、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、及び(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し、かつ当該抗原結合分子は、異種の部分にコンジュゲートされている。好ましい一態様において、異種の部分は、抗原結合分子のL鎖のC末端（好ましくは、ビオチン標識されたC末端）にコンジュゲートされている。
【０１１４】
一態様において、細胞質侵入抗原結合分子にコンジュゲートされた異種の部分は、ペプチド、核酸、化学療法剤もしくは化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはその断片）、又は放射性同位体である。一態様において、異種の部分はペプチドである。
【０１１５】
Ｂ．抗体
本開示のさらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗原結合分子は抗体であり、好ましい一態様において、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一態様において、抗原結合分子は、例えば、Fv、Fab、Fab’、scFv、ダイアボディ、またはF(ab’)2断片などの、抗体断片である。別の態様において、抗体は、例えば、完全IgG1抗体や、本明細書で定義された他の抗体クラスまたはアイソタイプの、全長抗体である。
【０１１６】
さらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗体は、単独または組み合わせで、以下の項目1〜7に記載の任意の特徴を取り込んでもよい。 
【０１１７】
１．抗体の結合活性およびアフィニティ
特定の態様において、本明細書で提供される抗体の結合活性（binding activity）またはアフィニティは、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM（例えば、10-8M以下、例えば10-8M〜10-13M、例えば10-9M〜10-13M）の解離定数 (KD) である。
【０１１８】
２．抗体断片
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、およびscFv断片、ならびに、後述する他の断片を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みインビボ (in vivo) における半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
【０１１９】
ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097号; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) に記載されている。
【０１２０】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516号B1参照）。
【０１２１】
抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌 (E. coli) またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。
【０１２２】
３．キメラおよびヒト化抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものからクラスまたはサブクラスが変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片も含む。
【０１２３】
特定の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティを維持したままでヒトへの免疫原性を減少させるために、ヒト化される。通常、ヒト化抗体は1つまたは複数の可変ドメインを含み、当該可変ドメイン中、HVR（例えばCDR（またはその部分））は非ヒト抗体に由来し、FR（またはその部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性またはアフィニティを回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、HVR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置換されている。
【０１２４】
ヒト化抗体およびその作製方法は、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)において総説されており、また、例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)； Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)； 米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号、および第7,087,409号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（特異性決定領域 (specificity determining region: SDR) グラフティングを記載）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （リサーフェイシングを記載）； Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （FRシャッフリングを記載）；ならびに、Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) およびKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （FRシャッフリングのための「ガイドセレクション」アプローチを記載）において、さらに記載されている。
【０１２５】
４．ヒト抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) および Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) に、概説されている。
【０１２６】
５．ライブラリ由来抗体
本開示の抗体は、所望の1つまたは複数の活性を伴う抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリの生成や、所望の結合特性を備える抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野において知られている。そのような方法は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) において総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)； Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)； Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)； Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) に記載されている。
【０１２７】
６．多機能性抗体抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、多機能性抗体である。多機能性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に、それぞれ異なる機能を有する、モノクローナル抗体である。例えば、多機能性抗体は、(i)結合特異性および(ii)結合特異性とは異なる機能、の2つの機能を有する、モノクローナル抗体である。結合特異性とは異なる機能の例として、細胞質侵入能が挙げられる。一態様において、多機能性抗体は、二重機能性抗体（抗原結合特異性および細胞質侵入能の二つの機能を有する）である。一態様において、多機能性抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。二重特異性抗体は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。
【０１２８】
多重特異性抗体を作製するための手法は、これらに限定されるものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、およびknob-in-hole技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を含む。多重特異性抗体は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effects) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。多機能性抗体を作製するために、上述の多重特異性抗体を作製するための手法と同様の手法が用いられ得ることが、理解されよう。
【０１２９】
「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能的抗原結合部位を伴う改変抗体も、本明細書では含まれる（例えば、米国特許出願公開第2006/0025576号A1参照）。
【０１３０】
本明細書で抗体または断片は、「デュアルアクティングFab」または「DAF」も含む（例えば、米国特許出願公開第2008/0069820号参照）。
【０１３１】
７．抗体変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗体の結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性を改善することが、望ましいこともある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること、または、ペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列中への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列中の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合性）を備えることを前提に、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが、最終構築物に至るために行われ得る。
【０１３２】
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換的変異導入の目的部位は、HVRおよびFRを含む。保存的置換を、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変更を、表１の「例示的な置換」の見出しの下に提供するとともに、アミノ酸側鎖のクラスに言及しつつ下で詳述する。アミノ酸置換は目的の抗体に導入されてもよく、産物は、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善したADCCまたはCDCなどの、所望の活性についてスクリーニングされてもよい。
【０１３３】
【表１】
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【０１３４】
アミノ酸は、共通の側鎖特性によって群に分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)；
(2) 中性の親水性：システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln)；
(3) 酸性：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)；
(4) 塩基性：ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg)；
(5) 鎖配向に影響する残基：グリシン (Gly)、プロリン (Pro)；
(6) 芳香族性：トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。
【０１３５】
置換変異体の1つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。通常、その結果として生じ、さらなる研究のために選ばれた変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加したアフィニティ、減少した免疫原性）を有する、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、アフィニティ成熟抗体であり、これは、例えばファージディスプレイベースのアフィニティ成熟技術（例えば本明細書に記載されるもの）を用いて適宜作製され得る。簡潔に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、そして変異抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合アフィニティ）に関してスクリーニングを行う。
【０１３６】
改変（例えば、置換）は、例えば抗体のアフィニティを改善するために、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) を参照のこと）および／または抗原に接触する残基において行われ得、得られた変異VHまたはVLが結合アフィニティに関して試験され得る。二次ライブラリからの構築および再選択によるアフィニティ成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) に記載されている。アフィニティ成熟のいくつかの態様において、多様性は、任意の様々な方法（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向変異導入）によって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリは、所望のアフィニティを有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのHVR残基（例えば、一度に4〜6残基）を無作為化するHVR指向アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入またはモデリングを用いて、具体的に特定され得る。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的化される。
【０１３７】
特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、1つまたは複数のHVR内で行われ得る。例えば、結合アフィニティを実質的に減少させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）が、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基の外側であり得る。上記の変異VHおよびVL配列の特定の態様において、各HVRは改変されていないか、わずか1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含む。
【０１３８】
変異導入のために標的化され得る抗体の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085によって記載される、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれるものである。この方法において、一残基または一群の標的残基（例えば、荷電残基、例えばアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、およびグルタミン酸）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）で置き換えられ、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。この初期置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸位置に、さらなる置換が導入され得る。あるいはまたは加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を解析してもよい。そのような接触残基および近隣の残基を、置換候補として標的化してもよく、または置換候補から除外してもよい。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１３９】
アミノ酸配列の挿入は、配列内部への単一または複数のアミノ酸残基の挿入と同様、アミノ末端および／またはカルボキシル末端における1残基から100残基以上を含むポリペプチドの長さの範囲での融合も含む。末端の挿入の例は、N末端にメチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のN-またはC-末端に、酵素（例えば、ADEPTのための）または抗体の血漿半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものを含む。
【０１４０】
ｂ）グリコシル化変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加させるまたは減少させるように改変されている。抗体へのグリコシル化部位の追加または削除は、1つまたは複数のグリコシル化部位を作り出すまたは取り除くようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成可能である。
【０１４１】
抗体がFc領域を含む場合、そこに付加される炭水化物が改変されてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、枝分かれした二分岐のオリゴ糖を含み、当該オリゴ糖は通常Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN-リンケージによって付加されている。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 参照。オリゴ糖は、例えば、マンノース、N‐アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸などの種々の炭水化物、また、二分岐のオリゴ糖構造の「幹」中のGlcNAcに付加されたフコースを含む。いくつかの態様において、本開示の抗体中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を伴う抗体変異体を作り出すために行われてもよい。
【０１４２】
一態様において、Fc領域に（直接的または間接的に）付加されたフコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％または20％〜40％であり得る。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されるようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297に付加されたすべての糖構造体（例えば、複合、ハイブリッド、および高マンノース構造体）の和に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域の297位のあたりに位置するアスパラギン残基を表す（Fc領域残基のEUナンバリング）。しかし、複数の抗体間のわずかな配列の多様性に起因して、Asn297は、297位の±3アミノ酸上流または下流、すなわち294位〜300位の間に位置することもあり得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号 (Presta, L.) ；第2004/0093621号 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例は、US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) を含む。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例は、タンパク質のフコシル化を欠くLec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第US2003/0157108号A1、Presta, L；およびWO2004/056312A1、Adams et al.、特に実施例11）およびノックアウト細胞株、例えばアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；およびWO2003/085107を参照のこと）を含む。
【０１４３】
例えば抗体のFc領域に付加された二分枝型オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、減少したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.) ；米国特許第6,602,684号 (Umana et al.)；およびUS2005/0123546 (Umana et al.) に記載されている。Fc領域に付加されたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体変異体は、例えば、WO1997/30087 (Patel et al.)；WO1998/58964 (Raju, S.)； およびWO1999/22764 (Raju, S.) に記載されている。
【０１４４】
ｃ）Fc領域変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のFc領域に、1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりFc領域変異体を生成してもよい。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸ポジションのところでアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトFc領域配列（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含んでもよい。
【０１４５】
特定の態様において、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を備える抗体変異体も、本開示の考慮の内であり、当該エフェクター機能は、抗体を、そのインビボでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびADCCなど）は不要または有害である場合の適用に望ましい候補とするものである。CDCおよび／またはADCC活性の減少／欠乏を確認するために、インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害測定を行うことができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合測定は、抗体がFcγR結合性を欠く（よってADCC活性を欠く蓋然性が高い）一方でFcRn結合能を維持することを確かめるために行われ得る。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、一方単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) の第464頁のTable 3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロ測定法（アッセイ）の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 参照）および Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 参照）に記載されている。あるいは、非放射性の測定法を用いてもよい（例えば、ACT1（商標）non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；および、CytoTox 96（登録商標）non-radioactive cytotoxicity assays 法 (Promega, Madison, WI) 参照）。このような測定法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC) およびナチュラルキラー (natural killer: NK) 細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) に記載されるような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。また、抗体がC1qに結合できないこと、よってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合測定を行ってもよい。例えば、WO2006/029879 および WO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照のこと。また、補体活性化を評価するために、CDC測定を行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 参照）。さらに、FcRn結合性およびインビボでのクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野において知られた方法を用いて行い得る（例えばPetkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 参照）。
【０１４６】
減少したエフェクター機能を伴う抗体は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を伴うものを含む（米国特許第6,737,056号）。このようなFc変異体は、残基265および297のアラニンへの置換を伴ういわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含む、アミノ酸ポジション265、269、270、297、および327の2つ以上の置換を伴うFc変異体を含む。
【０１４７】
FcRsへの増加または減少した結合性を伴う特定の抗体変異体が、記述されている。（米国特許第6,737,056号；WO2004/056312、およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) を参照のこと。）
【０１４８】
特定の態様において、抗体変異体は、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Fc領域のポジション298、333、および／または334（EUナンバリングでの残基）のところでの置換）を伴うFc領域を含む。
【０１４９】
いくつかの態様において、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) に記載されるように、改変された（つまり、増加したか減少したかのいずれかである）C1q結合性および／または補体依存性細胞傷害 (CDC) をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。
【０１５０】
増加した半減期、および新生児型Fc受容体（FcRn：母体のIgG類を胎児に移行させる役割を負う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)））に対する増加した結合性を伴う抗体が、米国特許出願公開第2005/0014934号A1(Hinton et al.) に記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合性を増加する1つまたは複数の置換をその中に伴うFc領域を含む。このようなFc変異体は、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434の1つまたは複数のところでの置換（例えば、Fc領域残基434の置換（米国特許第7,371,826号））を伴うものを含む。
【０１５１】
Fc領域変異体の他の例については、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；およびWO94/29351も参照のこと。
【０１５２】
ｄ）システイン改変抗体変異体
特定の態様において、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗体（例えば、「thioMAbs」）を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様において、置換を受ける残基は、抗体の、アクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、当該反応性のチオール基は、当該抗体を他の部分（薬剤部分またはリンカー‐薬剤部分など）にコンジュゲートして本明細書でさらに詳述するようにイムノコンジュゲートを作り出すのに使用されてもよい。特定の態様において、以下の残基の任意の1つまたは複数が、システインに置換されてよい：軽鎖のV205（Kabatナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるようにして生成されてもよい。
【０１５３】
ｅ）抗体誘導体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野において知られておりかつ容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール (PEG)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１,3ジオキソラン、ポリ1,3,6,トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでも）、および、デキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、および、これらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水に対する安定性のために、製造において有利であるだろう。ポリマーは、いかなる分子量でもよく、枝分かれしていてもしていなくてもよい。抗体に付加されるポリマーの数には幅があってよく、1つ以上のポリマーが付加されるならそれらは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、これらに限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での療法に使用されるか否か、などへの考慮に基づいて、決定することができる。
【０１５４】
別の態様において、抗体と、放射線に曝露することにより選択的に熱せられ得る非タンパク質部分との、コンジュゲートが提供される。一態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線はいかなる波長でもよく、またこれらに限定されるものではないが、通常の細胞には害を与えないが抗体‐非タンパク質部分に近接した細胞を死滅させる温度まで非タンパク質部分を熱するような波長を含む。
【０１５５】
Ｃ．組み換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。一態様において、本明細書に記載の抗原結合分子をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。一態様において、本開示の抗原結合分子の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗原結合分子をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗原結合分子を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗原結合分子を作製する方法が提供される。
【０１５６】
本開示の抗原結合分子の組み換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗原結合分子をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
【０１５７】
本開示の抗原結合分子が抗体である場合、当該抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
【０１５８】
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。
【０１５９】
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗体の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
【０１６０】
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
【０１６１】
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR− CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
【０１６２】
Ｄ．測定法（アッセイ）
本明細書で提供される抗原結合分子は、当該技術分野において知られている種々の測定法によって、同定され、スクリーニングされ、または物理的／化学的特性および／または生物学的活性について明らかにされてもよい。
【０１６３】
１．結合活性（binding activity）およびアフィニティの測定
一態様において、抗体の結合活性（binding activity）またはアフィニティの測定には、表面プラズモン共鳴分析法を測定原理とするBIACORE（登録商標）T200またはBIACORE（登録商標）4000（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を用いたリガンド捕捉法が用いられる。機器操作にはBIACORE（登録商標）Control Softwareが用いられる。一態様においてアミンカップリングキット（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を供給元の指示にしたがって使用し、カルボキシメチルデキストランをコーティングしたセンサーチップ（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）にリガンド捕捉用分子、たとえば抗タグ抗体、抗IgG抗体、プロテインAなど、を固相化する。リガンド捕捉分子は適切なpHの10 mM酢酸ナトリウム溶液を用いて希釈され、適切な流速および注入時間で注入される。結合活性測定は0.05％ポリソルベート20（その他の名称としてTween（登録商標）-20）含有緩衝液を測定用緩衝液として使用し、流速は10- 30 μL/分、測定温度は好ましくは25℃や37℃で測定される。リガンド捕捉用分子に抗体をリガンドとして捕捉させて測定を実施する場合は、抗体を注入して目的量を捕捉させたのち、測定用緩衝液を用いて調製された抗原およびまたはFc受容体の段階希釈物（アナライト）が注入される。リガンド捕捉用分子に抗原およびまたはFc受容体をリガンドとして捕捉させて測定を実施する場合は、抗原およびまたはFc受容体を注入して目的量を捕捉させたのち、測定用緩衝液を用いて調製された抗体の段階希釈物（アナライト）が注入される。
【０１６４】
一態様において、測定結果はBIACORE（登録商標）Evaluation Softwareを用いて解析される。例えば、速度論的パラメータ（kinetics parameter）は1:1 Bindingのモデルを用いて、結合および解離のセンサーグラムを同時にフィッティングすることによって実施され、結合速度 (konもしくはka) 、解離速度 (koffもしくはkd)、平衡解離定数 (KD)が計算され得る。結合活性が弱い、特に解離が早く速度論的パラメータ算出が困難な場合はSteady stateモデルを用いて平衡解離定数 (KD)を計算しても良い。結合活性の他のパラメータとしては特定の濃度のアナライトの結合量（RU）をリガンドの捕捉量（RU）で除して「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」も算出され得る。
【０１６５】
２．細胞質中の抗原結合分子の測定
一態様において、細胞質中の抗原結合分子は、当該抗原分子を細胞と接触させた後、任意の時点において測定される。抗原結合分子と細胞との接触は、インキュベーションを含む任意の方法で行われる。抗原結合分子と細胞との接触をインキュベーションによって行う場合、インキュベーション時間およびインキュベーション後、細胞質中の抗原結合分子の測定までの時間は任意に決定される。例えば、細胞質中に存在する抗原結合分子を、当該抗原結合分子を細胞と接触させた後一度だけ測定する場合は、抗原結合分子と細胞を1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間インキュベートした後、抗原結合分子を含む培地を除去し、直ちに細胞質中の抗原結合分子を測定してよい。例えば、細胞質中に存在する抗原結合分子を、当該抗原結合分子を細胞と接触させた後、複数回測定する場合は、抗原結合分子と細胞を1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間インキュベートした後、抗原結合分子を含む培地を除去し、抗原結合分子を含まない新たな培地で0時間、0.25時間、0.5時間、1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、3.5時間、4時間、4.5時間、5時間、5.5時間、6時間、6.5時間、7時間、7.5時間、8時間、8.5時間、9時間、9.5時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、および／または16時間インキュベートした後、細胞質中の抗原結合分子を測定してよい。細胞質中の抗原結合分子を、当該抗原結合分子を細胞と接触させた後、任意の時点において検出することによって、当該抗原結合分子の細胞質侵入能もまた、検出するか又は評価することができる。したがって、本開示はまた、抗原結合分子の細胞質侵入能を検出する方法も提供することが、理解されよう。
【０１６６】
a) BirA assay
一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する抗原結合分子量は、BirA アッセイにおいて、ビオチン化されたAvi tagと抗原結合分子の融合体を、標識されたビオチン結合タンパク質で検出することにより評価することができる。ビオチン標識されたAvi tagは、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定される。例えば、ビオチン化されたAvi tagをストレプトアビジンHRP（Streptavidin−HRP）で検出する場合、細胞質中に存在する抗原結合分子量は、HRPの発光シグナルの強度により表すことができる。BirAアッセイは当業者に公知の方法であり、例えば、W.P.R. Verdurmen et al., Journal of Controlled Release 200 (2015) 13-22、および本開示の実施例に記載されている。細胞質中に存在する抗原結合分子量を決定するためのアッセイにおいて用いられる条件は、当業者によって適宜選択され得、したがって特に限定されない。また、細胞質中においてビオチン化されたAvi tagと抗原結合分子の融合体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質でも標識され得る。具体的には、放射性標識または蛍光標識などが公知である。BirAアッセイにおける、標識されたビオチン結合タンパク質の検出（例えば、ストレプトアビジンHRPにおけるHRP発光シグナルの検出）は、当業者に公知の方法によって適宜行われ得る。具体的には、ウェスタンブロッティング（western blotting）またはキャピラリーイムノアッセイ（capillary immuno assay）（ProteinSimple社）などが公知である。
【０１６７】
b) 蛍光顕微鏡によるイメージング
別の一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する抗原結合分子量は、当該抗原結合分子に結合する標識されたタンパク質で検出することにより評価することができる。例えば、抗原結合分子がIgG抗体を含む場合、細胞質中に存在する抗原結合分子を、標識された抗IgG抗体で検出することができる。標識は、例えば、放射性標識または蛍光標識などが公知である。標識された抗原結合分子の検出は、当業者に公知の方法によって適宜行われ得る。例えば、本明細書および本開示の実施例に記載されているように、蛍光顕微鏡を用いて蛍光シグナルをイメージングすることにより、標識された抗原結合分子を検出することができる。
【０１６８】
c) Split-GFP
別の一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する抗原結合分子量は、split-GFP相補的システムにおいて、GFP蛍光シグナルを検出することにより評価することができる。具体的な方法は当業者に公知であり、例えば、WO2016/013870に記載されている。具体的には、緑色蛍光タンパク質であるGFPを1〜10番、11番の断片で分けると、蛍光を示す特性が除去されて、もし二つの断片の距離が近くなって結合すると、蛍光を示す特性を回復することができる（Cabantous et al.,2005）。このような特性を利用して、GFP1〜10番の断片は、細胞質に発現させて、GFP11番の断片は、抗原結合分子の任意の部位に融合させる。この方法において、GFP蛍光が観察されれば、GFPの2つの断片が結合していること、すなわち抗原結合分子が細胞質中に存在することが示される。
【０１６９】
d) 改善されたスプリットタンパク質システム
別の一態様において、任意の時点における細胞質中に存在する抗原結合分子量は、スプリットタンパク質システムにおいて発光及び／又は蛍光シグナルを検出することにより評価することができる。一態様において、スプリットタンパク質システムは、(i) ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含むペプチド、及び(ii) 発光タンパク質の第二の断片、を含み、当該発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片は全体として、発光タンパク質の完全な補完物を含有する。スプリットタンパク質システムにおいて、発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片は、発光を示す特性を有さないが、ペプチドに含まれる発光タンパク質の第一の断片が発光タンパク質の第二の断片に結合すると、発光を示す特性が回復する。Nanoluc補完を用いて細胞質侵入能を評価する方法（Schaub et al., Cancer Res. (2015) 75(23):5023、Dixon et al., ACS Chem Biol. (2016) 11(2):400）が報告されたが、方法のバックグラウンドの発光及び／又は蛍光シグナルは依然として高かった。これらを考慮して、一態様において、発明者らは、ミトコンドリア外膜タンパク質をスプリットタンパク質システムにおいて用いることでバックグラウンドシグナルを低減させることを考えた。
【０１７０】
一態様において、スプリット発光タンパク質は、スプリットNanoLuc（登録商標）である。NanoLucは、深海発光エビから遺伝子操作で作製された小さな19kDaのルシフェラーゼ酵素である。スプリットNanoLucアッセイは、2つのサブユニット：小さな1.3 kDaのSmall BiT（SmBiT）（配列番号：６３）及びより大きな18kDaのLarge BiT（LgBiT）（配列番号：６２）へと切断されるNanoLucを利用する。LgBiTとSmBiTとの補完は、NanoLuc Live Cell Assay System（Promega）の使用により生細胞中で、基質上での酵素反応からの発光として観察される。スプリットNanoLucアッセイにおいては、NanoLuc LgBiTを細胞内で安定に発現するように、HeLa細胞を遺伝子改変した。通常、NanoLuc LgBiTは、フリーの細胞質タンパク質として発現され得る。しかし、一態様において、NanoLuc LgBiTは、細胞質内の細胞内構造、例えば、ミトコンドリア外膜に係留される。発明者らは、驚くべきことに、NanoLuc LgBiTのミトコンドリア外膜への係留が、NanoLuc LgBiTがフリーの細胞質タンパク質として発現された場合と比較して、有意に低いバックグラウンドシグナル及び良好なアッセイ感度をもたらすことを発見した。他方で、SmBiTコンジュゲートを、抗原結合分子上の任意の部位に融合させることができる。好ましくは、抗原結合分子は抗体であり、発光タンパク質の第二の断片が、当該抗体の重鎖のC末端に融合されている。抗原結合分子-SmBiTコンジュゲートは、細胞質中に侵入し、それによりNanoLuc LgBiTルシフェラーゼ酵素を補完して、それを発光の促進によって検出することができる。
【０１７１】
一例では、本開示は、(i) ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含むペプチド、及び(ii) 発光タンパク質の第二の断片を含む、改善されたスプリットタンパク質システムであって、当該発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片が全体として、発光タンパク質の完全な補完物を含有する、改善されたスプリットタンパク質システムを提供する。別の一例では、本開示は、改善されたスプリットタンパク質システムにおいて用いられるペプチドであって、当該ペプチドが、ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含み、かつ当該発光タンパク質の第一の断片及び第二の断片が全体として、発光タンパク質の完全な補完物を含有する、ペプチドを提供する。
【０１７２】
発光タンパク質の第一の断片の例は、NanoLuc Large BiT（LgBiT）である。発光タンパク質の第二の断片の例は、NanoLuc SmBiT（SmBiT）である。さらなる一態様において、ミトコンドリア外膜タンパク質と発光タンパク質の第一の断片とを含むペプチドは、さらに、緑色蛍光タンパク質（GFP）又はその変異体を含む。好ましくは、ミトコンドリア外膜タンパク質と、発光タンパク質の第一の断片と、GFP変異体とを含むペプチドは、配列番号：５０のアミノ酸配列を含む。
【０１７３】
改善されたスプリットタンパク質システムにおいて用いられるミトコンドリア外膜タンパク質は、ミトコンドリア外膜上に局在化している任意のタンパク質であることができる。ミトコンドリア外膜タンパク質は、例えば、AKAP1、BAK1、FIS1、CYB5B、FISS、FUNDC1、GDAP1、MARC1、MARC2、MFN1、MFN2、MFN3、MIEF1、MIEF2、MID49、MID51、MIGA1、MIGA2、MIRO1、MIRO2、MSTO1、MTX1、MTX2、MTX3、PGAM5、PLD6、RAB32、RMDN3、SYNJ2BP、TOM5、TOM6、TOM7、TOM20、TOM22、TOM34、TOM70、TSPO、及び／又はUBP30であることができる。
好ましい一態様において、ミトコンドリア外膜タンパク質は、追加的ミトコンドリアキナーゼアンカータンパク質1（AKAP1；A-キナーゼアンカータンパク質1としても知られる）である。好ましい一態様において、ミトコンドリア外膜タンパク質は、配列番号：６１のアミノ酸配列を含む。好ましい一態様において、発光タンパク質の第一の断片を含むペプチドは、配列番号：５０のアミノ酸配列（AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBit）を含む。
【０１７４】
一態様において、本開示は、ミトコンドリア外膜タンパク質と蛍光タンパク質の第一の断片とを含むペプチドをコードする核酸、当該核酸を含むベクター、当該核酸もしくは当該ベクターを含む細胞、又は当該タンパク質、核酸、ベクター、もしくは細胞を含むキットを提供する。さらなる態様において、本開示は、細胞質中に存在する標的分子を検出する方法であって、(i) ミトコンドリア外膜タンパク質と蛍光タンパク質の第一の断片とを含むペプチドをコードする核酸を含む細胞を提供し、(ii) 蛍光タンパク質の第二の断片にコンジュゲートされた標的分子を提供し、(iii) (i)の細胞及び(ii)の標的分子を接触させ、ならびに(iv) (iii)の細胞における発光シグナルを検出する、ことを含み、当該蛍光タンパク質の第一の断片及び第二の断片が全体として、蛍光タンパク質の完全な補完物を含有する、方法を提供する。本明細書で提供される方法は、(i)のペプチドがミトコンドリア外膜タンパク質を含まないこと以外は同じである方法と比較して、より低いバックグラウンド発光シグナルを有する。好ましい一態様において、標的分子は、細胞質侵入抗原結合分子である。
【０１７５】
別の一態様において、改善されたスプリットタンパク質システムにおいては、細胞質内の任意の細胞内構造上に局在化している任意のタンパク質を、ミトコンドリア外膜タンパク質の代わりに用いることができる。細胞内構造上に局在化したタンパク質の例は、核外膜タンパク質であり、当該核外膜タンパク質は、核外膜上に局在化している任意のタンパク質であることができる。核外膜タンパク質は、例えば、NUP37、NUP43、NUP96、NUP85、NUP88、NUP107、NUP133、NUP160、NUP214、及び／又はNUP358であることができる。
【０１７６】
Ｅ．抗原結合分子の製造方法およびスクリーニング方法ならびに細胞質抗原のイメージング方法
１．抗原結合分子の製造方法
一局面において、本開示は、本開示の抗原結合分子の製造方法を提供する。
一態様において、前記製造方法は、
(a) 抗原結合分子をコードする遺伝子と作動可能に連結された適切なプロモーターを含む発現ベクターを取得し、
(b) 当該ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して前記抗原結合分子を生産させ、
(c) 宿主細胞培養物から前記抗原結合分子を回収する、
ことを含む。
別の態様において、前記製造方法は、親細胞質侵入抗原結合分子のFc領域に1又はそれ以上のアミノ酸改変を導入することを含み、当該改変は、当該親細胞質侵入抗原結合分子と比較して、当該細胞質侵入抗原結合分子の多量体形成を促進し、当該細胞質侵入抗原結合分子の細胞質侵入能は、親細胞質侵入抗原結合分子と比較して向上している。
【０１７７】
２．細胞質侵入抗原結合分子のスクリーニング方法
一局面において、本開示は、細胞質侵入抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する。
一態様において、前記スクリーニング方法は、
(a) Fc領域を含む親細胞質侵入抗原結合分子を提供し、
(b) 当該親細胞質侵入抗原結合分子のFc領域に1又はそれ以上のアミノ酸改変を導入して改変Fc領域を含む候補分子を取得し、
(c) 当該候補分子が多量体を形成するかどうかを決定し、
(d) 当該候補分子が、親細胞質侵入抗原結合分子と比較して、多くの多量体を形成する場合に、当該候補分子を好適な分子であると特定する、
ことを含む。
特定の態様において、前記改変Fc領域を含む細胞質侵入抗原結合分子の細胞質侵入能は、親細胞質侵入抗原結合分子と比較して向上している。
【０１７８】
３．細胞質抗原のイメージング方法
別の一局面において、本開示は、本開示の抗原結合分子、前記製造方法により製造された抗原結合分子、または前記スクリーニング方法により好適な分子として特定された細胞質侵入抗原結合分子を使用することを含む、試料細胞中の細胞質抗原をイメージングする方法を提供する。
別の一局面において、本開示は、試料細胞中の細胞質抗原のイメージングにおいて使用するための、本開示の抗原結合分子、前記製造方法により製造された抗原結合分子、または前記スクリーニング方法により好適な分子として特定された細胞質侵入抗原結合分子を提供する。
また別の一局面において、本開示は、細胞質抗原のイメージング剤の製造における、本開示の抗原結合分子、前記製造方法により製造された抗原結合分子、または前記スクリーニング方法により好適な分子として特定された細胞質侵入抗原結合分子の使用を提供する。
これらの局面の特定の態様において、使用される抗原結合分子は標識されている。
【０１７９】
Ｆ．イムノコンジュゲート
本開示はまた、1つまたは複数の細胞傷害剤（例えば化学療法剤または化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはそれらの断片）または放射性同位体）にコンジュゲートされた本明細書の抗原結合分子を含むイムノコンジュゲートを提供する。
【０１８０】
Ｇ．抗原結合分子を標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法及び細胞質侵入抗原結合分子の細胞質侵入能を向上させる方法
一局面において、本開示は、抗原結合分子を標的細胞の細胞質中に特異的にデリバリー（送達）する方法であって、抗原結合分子が結合する細胞表面抗原は標的細胞に特異的に発現する抗原である、方法を提供する。一態様において、前記方法は、抗原結合分子を標的細胞と接触させることを含む。一態様において、抗原結合分子は、細胞質侵入抗体若しくはその断片、標的細胞の細胞表面抗原に結合する抗体若しくはその断片、及び／又は、細胞質中抗原に結合する抗体若しくはその断片、を組み合わせた多機能性抗原結合分子である。特定の態様において、前記方法は、細胞表面抗原を発現しない細胞には、抗原結合分子を実質的に送達しない。特定の態様において、抗原結合分子は、標的細胞に特異的な細胞表面抗原に結合することで、当該標的細胞に特異的にインターナライズし、細胞質へ移行する。特定の態様において、抗原結合分子は、多量体を形成し、高い細胞質侵入能を呈する。
別の一局面において、本開示は、Fc領域に多量体形成を促進する1又はそれ以上のアミノ酸改変を導入することを含む、当該1又はそれ以上のアミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む親細胞質侵入抗原結合分子と比較して、細胞質侵入抗原結合分子の細胞質侵入能を向上させる方法を提供する。
【０１８１】
別の一局面において、本開示は、異種の部分を標的細胞の細胞質中に特異的に送達する方法であって、当該異種の部分が、細胞表面抗原結合ドメイン及び細胞質侵入ドメインを含む抗原結合分子にコンジュゲートされている、方法を提供する。好ましくは、抗原結合分子は、第一及び第二のFab領域を含み、(a) 第一のFab領域は、細胞表面抗原に特異的に結合し、及び(b) 第二のFab領域は、細胞質侵入能を有し、かつ当該抗原結合分子は、異種の部分にコンジュゲートされている。より好ましくは、抗原結合分子は、二重機能性抗体であり、かつ細胞質抗原結合ドメインを含まない。一態様において、抗原結合分子が結合する細胞表面抗原は、標的細胞上に特異的に発現する抗原である。一態様において、方法は、前記異種の部分にコンジュゲートされた抗原結合分子を標的細胞と接触させることを含む。好ましい一態様において、方法は、異種の部分を標的細胞の細胞質中に特異的に送達することを含む。好ましい一態様において、方法は、細胞表面抗原を発現しない細胞には、異種の部分を実質的に送達しない。
【０１８２】
Ｈ．細胞質抗原のノックダウンのための方法
特定の態様において、本開示の結合分子は、標的細胞中の細胞質抗原の除去能が向上している。したがって、本明細書で提供される抗原結合分子は、標的細胞中の細胞質抗原をタンパク質レベルでノックダウンするのに有用である。本明細書で用いられる用語「ノックダウン」は、特定のタンパク質の発現量または存在量が減少することを意味する。具体的には、細胞質抗原がタンパク質レベルでノックダウンされると、一細胞あたりの細胞質抗原量が減少する。
【０１８３】
Ｉ．診断および検出のための方法および組成物
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、生物学的サンプルにおける標的細胞中の細胞質抗原の存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる用語「検出」は、定量的または定性的な検出を包含する。
【０１８４】
一態様において、診断方法または検出方法において使用するための、抗原結合分子が提供される。さらなる局面において、生物学的サンプルにおける標的細胞中の細胞質抗原の存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、この方法は、細胞質抗原への抗原結合分子の結合が許容される条件下で本明細書に記載の抗原結合分子と生物学的サンプルを接触させること、および抗原結合分子と細胞質抗原の間で複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。そのような方法は、インビトロの方法またはインビボの方法であり得る。異なる一態様において、本開示の抗原結合分子は、細胞質抗原をイメージング等の方法で検出するのに有用である。
【０１８５】
特定の態様において、標識されている、本開示の抗原結合分子が提供される。標識は、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識）ならびに、例えば酵素反応または分子間相互作用を通じて間接的に検出される部分（例えば酵素またはリガンド）を含むが、これらに限定されない。例示的な標識は、これらに限定されるものではないが、以下を含む：放射性同位体32P、14C、125I、3Hおよび131I、希土類キレートなどの発蛍光団またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (horseradish peroxidase: HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、単糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ）と連結されたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル類、ならびにこれらに類するもの。
【０１８６】
Ｊ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗原結合分子の薬学的製剤は、所望の純度を有する抗原結合分子を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０１８７】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗体製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン−アセテート緩衝液を含んでいる。
【０１８８】
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症のために必要であれば1つより多くの有効成分を含んでもよい。互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものが好ましい。このような有効成分は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。
【０１８９】
有効成分は、例えば液滴形成（コアセルベーション）手法によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）に取り込まれてもよいし、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込まれてもよいし、マクロエマルションに取り込まれてもよい。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) に開示されている。
【０１９０】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗原結合分子を含んだ固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、当該マトリクスは例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態である。
【０１９１】
生体内 (in vivo) 投与のために使用される製剤は、通常無菌である。無菌状態は、例えば滅菌ろ過膜を通して濾過することなどにより、容易に達成される。
【０１９２】
Ｋ．治療的方法および治療用組成物
一局面において、本明細書で提供される抗原結合分子は、治療的な方法において使用されてよい。
一態様において、医薬品としての使用のための、本開示の抗原結合分子が提供される。特定の態様において、治療方法における使用のための、本開示の抗原結合分子が提供される。このような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの（例えば後述するような）追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。上記態様の任意のものによる「個体」は、好適にはヒトである。
【０１９３】
さらなる局面において、本開示は医薬品の製造または調製における本開示の抗原結合分子の使用を提供する。このような態様の1つにおいて、方法は、当該個体に少なくとも1つの追加治療剤の有効量を投与する工程を、さらに含む。上記態様の任意のものによる「個体」は、ヒトであってもよい。
【０１９４】
さらなる局面において、本開示は、本明細書で提供される抗原結合分子の任意のものを含む、薬学的製剤を提供する（例えば上述の治療的方法の任意のものにおける使用のための）。一態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗原結合分子の任意のものと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗原結合分子の任意のものと、少なくとも1つの追加治療剤とを含む。
【０１９５】
本開示の抗原結合分子（および、任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および経鼻投与、また局所的処置のために望まれる場合は病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。投薬は、投与が短期か長期かに一部応じて、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によるなど、任意の好適な経路によってなされ得る。これらに限定されるものではないが、単回投与または種々の時点にわたる反復投与、ボーラス投与、および、パルス注入を含む、種々の投薬スケジュールが本明細書の考慮の内である。
【０１９６】
本開示の抗原結合分子は、優良医療規範 (good medical practice) に一致したやり方で、製剤化され、投薬され、また投与される。この観点から考慮されるべきファクターは、治療されているその特定の障害、治療されているその特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、剤を送達する部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知の他のファクターを含む。抗原結合分子は、必ずしもそうでなくてもよいが、任意で、問題の障害を予防するまたは治療するために現に使用されている1つまたは複数の剤とともに、製剤化される。そのような他の剤の有効量は、製剤中に存在する抗原結合分子の量、障害または治療のタイプ、および上で論じた他のファクターに依存する。これらは通常、本明細書で述べたのと同じ用量および投与経路で、または本明細書で述べた用量の約1から99%で、または経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量および任意の経路で、使用される。
【０１９７】
疾患の予防または治療のために、本開示の抗原結合分子の適切な用量（単独で用いられるときまたは1つまたは複数の他の追加治療剤とともに用いられるとき）は、治療される疾患のタイプ、本開示の抗原結合分子が抗体である場合は当該抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗原結合分子が予防的目的で投与されるのか治療的目的で投与されるのか、薬歴、患者の臨床歴および抗原結合分子に対する応答、ならびに、主治医の裁量に依存するだろう。抗原結合分子は、患者に対して、1回で、または一連の処置にわたって、好適に投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、例えば、1回または複数回の別々の投与によるにしても連続注入によるにしても、約1μg/kgから15 mg/kg（例えば、0.1mg/kg〜10mg/kg）の抗原結合分子が、患者に対する投与のための最初の候補用量とされ得る。1つの典型的な1日用量は、上述したファクターに依存して、約1μg/kgから100mg/kg以上まで、幅があってもよい。数日またはより長くにわたる繰り返しの投与の場合、状況に応じて、治療は通常疾患症状の所望の抑制が起きるまで維持される。抗原結合分子の1つの例示的な用量は、約0.05mg/kg から約 10mg/kgの範囲内である。よって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、もしくは 10mg/kgの1つまたは複数の用量（またはこれらの任意の組み合わせ）が、患者に投与されてもよい。このような用量は、断続的に、例えば1週間毎にまたは3週間毎に（例えば、患者が約2から約20、または例えば約6用量の抗原結合分子を受けるように）、投与されてもよい。高い初回負荷用量の後に、1回または複数回の低用量が投与されてもよい。この療法の経過は、従来の手法および測定法によって、容易にモニタリングされる。
【０１９８】
上述の製剤または治療的方法のいずれについても、抗原結合分子の代わりにまたはそれに追加して、本開示のイムノコンジュゲートを用いて実施してもよいことが、理解されよう。
【０１９９】
Ｌ．製品
本開示の別の局面において、上述の障害の治療、予防、および／または診断に有用な器材を含んだ製品が、提供される。製品は、容器、および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書を含む。好ましい容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器類は、ガラスやプラスチックなどの、様々な材料から形成されていてよい。容器は組成物を単体で保持してもよいし、症状の治療、予防、および／または診断のために有効な別の組成物と組み合わせて保持してもよく、また、無菌的なアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって突き通すことのできるストッパーを有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本開示の抗原結合分子である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選ばれた症状を治療するために使用されるものであることを示す。さらに製品は、(a)第一の容器であって、その中に収められた本開示の抗原結合分子を含む組成物を伴う、第一の容器；および、(b)第二の容器であって、その中に収められたさらなる細胞傷害剤またはそれ以外で治療的な剤を含む組成物を伴う、第二の容器を含んでもよい。本開示のこの態様における製品は、さらに、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示す、添付文書を含んでもよい。あるいはまたは加えて、製品はさらに、注射用制菌水 (BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第二の（または第三の）容器を含んでもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの、他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
【０２００】
上述の製品のいずれについても、抗原結合分子の代わりにまたはそれに追加して、本開示のイムノコンジュゲートを含んでもよいことが、理解されよう。
【実施例】
【０２０１】
以下は、本開示の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
【０２０２】
前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
【０２０３】
実施例１
コンセプト
抗体を細胞質に送達し、細胞質中の抗原に対して作用させる創薬技術が求められている。例えば、Cytotransmab (Nat Commun. 2017 May 10;8:15090.) は、細胞質侵入能を示す軽鎖可変領域と細胞質中の抗原である活性型Rasに結合する重鎖可変領域を組み合わせた抗体により、細胞質中の活性型Rasを中和することで抗腫瘍効果を示すことを報告している。一方、公知の細胞質侵入抗体は、多くの細胞において非特異的に細胞質侵入能を示すことが報告されている。例えばCytotransmabは、上皮細胞に普遍的に発現しているHeparan sulfate proteoglycan (HSPG)を介して細胞内に取り込まれるため、全身に投与された際に癌組織への送達が低くなることが予想される。そこでOrum Therapeutics社は、癌組織特異性を高めるため、癌で特異的に発現しているインテグリンに結合性のあるRGD10環状ペプチドをCytotransmabに融合させたRT11-i抗体を作製したが、RT11-i抗体もまたHSPG依存的な細胞質侵入能を有する軽鎖を有しているため (Nat Commun. 2017 May 10;8:15090.)、標的特異性は未だ十分でない可能性がある。抗体医薬品として細胞内の標的分子に対してより効率よく作用させ、かつ副作用を防ぐためには、標的細胞特異的な細胞質侵入能の獲得は不可欠である。また、投与量や投与回数を下げ、利便性の高い抗体医薬品を開発するためには、細胞質侵入能の向上が必要である。
【０２０４】
Cytotransmabの軽鎖が細胞質侵入能を獲得している機構として、HSPG依存的なエンドサイトーシスによりエンドソーム内に取り込まれたのち、エンドソーム膜上の分子と相互作用して孔を形成することで細胞質への侵入を可能にしていることが知られている（J Control Release. 2016 Aug 10;235:165-175）。エンドソーム膜上に孔を形成するためには、膜上の分子に多価で相互作用して膜を引っ張る（歪める）ことが重要であると考えられる。よって、HSPGを介した非標的細胞へのエンドサイトーシスを減少させるために、HSPG結合細胞質侵入ドメインを一価にすると、細胞質侵入能も損なわれることが予想できる。
【０２０５】
そこで、これらの本課題の解決に当たって、発明者らは、図１に示すように細胞膜上のレセプター（細胞表面抗原）に結合する抗体と細胞質侵入抗体の二重機能性抗体を構築することで、標的細胞特異性を向上させ、さらにエンドソーム内での相互作用が多価である状態を維持して細胞質侵入能を維持又は向上させることが可能であると考えた。さらに、HSPG結合能は失っているがエンドソームから細胞質への侵入能は維持している改変体が報告されている(3D8.03又はTmab4-03)。すなわちこの改変体と細胞表面結合抗体との二重機能性抗体を構築すれば、HSPGを介した非標的細胞への取り込みは減弱させることができると考えた。また、例えば、図２に示すように、細胞表面抗原結合ドメインを多価にすることで細胞特異性及び細胞質侵入能を高めることができ、また、細胞質侵入能を示す抗体のドメインを多価にすることで、細胞質侵入能を高めることができると考えた。
そこで、公知の細胞質侵入抗体と細胞表面抗原に対する抗体の二重機能性抗体、および多価抗体を構築し、二重機能性抗体を細胞表面抗原依存的に標的細胞の細胞質に特異的に送達できるか試みた。
【０２０６】
実施例２
二重機能性抗体の調製
表２に示す公知の細胞質侵入抗体、公知のIL6R結合抗体、及び公知の細胞質侵入能を有しないコントロール抗体の発現ベクターを当業者公知の方法で構築し、得られた発現ベクターの塩基配列を当業者公知の方法で決定した。3D8VH-G4T1E356K.Avi/hT4VL-KT0は3D8、3D8VH-G4T1E356K.Avi/hT4VL03-KT0は3D8.03、2C10VH-G4T1E356K.Avi/2C10VL-KT0は2C10、及びMRAH-G4T1K439E.Avis/MRAL-KT0はMRAとそれぞれ表記する。
【０２０７】
【表２】
2021532135.tif 000004
【０２０８】
この時、Biotin ligase (BirA) によってビオチン標識することが知られているペプチド配列Avi tag (Protein Science 1999, 8:921-929.)をコードする遺伝子を重鎖をコードする遺伝子に連結し、重鎖のC末端にAvi tagが融合された抗体の発現ベクターを構築した。
【０２０９】
構築した発現ベクターをExpi293細胞 (Thermo Fisher Scientific)に、一過性に導入し抗体の発現を行った。得られた培養上清から、MabSelect SuRe pcc (5mL) (GE Healthcare) とAKTA Xpress (GE Healthcare)を用いて当業者公知の方法で抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。なお、精製抗体は必要に応じてAmicon Ultra-4 (30K) (Merck Millipore)を用いて濃縮した。
【０２１０】
精製した抗体から二重機能性抗体の調製は当業者公知の方法にて行った。二重機能性抗体の表記及び各アーム（arm）の組合せを表３に示す。3D8VH-G4T1E356K.Avi/hT4VL03-KT0とMRAH-G4T1K439E.Avi/MRAL-KT0との二重機能性抗体を3D8.03//MRA、H237-G4T1K439E.Avis/L104-KT0との二重機能性抗体を3D8.03//SA、及びIC17HdK-G4T1K439E.Avi/IC17L-KT0との二重機能性抗体を3D8.03//IC17と表記する。また、3D8VH-G4T1E356K.Avi/hT4VL03-KT0の代わりに2C10VH-G4T1E356K.Avi/2C10VL-KT0と組み合わせて調製した各二重機能性抗体をそれぞれ2C10//MRA、2C10//SA、及び2C10//IC17と表記する。また、コントロール抗体IC17HdK-G4T1E356K.Avi/IC17L-KT0をMRAH-G4T1K439E.Avi/MRAL-KT0及びH237-G4T1K439E.Avi/L104-KT0と組み合わせて調製した二重機能性抗体をそれぞれIC17//MRA、IC17//SAと表記する。
【０２１１】
【表３】
2021532135.tif 000005
【０２１２】
実施例３
標的細胞株の構築
GenPeptに登録済みのヒトIL6R遺伝子（登録番号NP_000556）の下流に、豚テシオウイルス-1由来P2A peptideおよびGFPを付加したDNAを合成し、自社構築したpCXND3ベクターにクローニングすることで、pCXND3-IL6R/P2A/GFPを構築した。10% FBS（Sigma Aldrich）と100 unit/mLペニシリン-100 μg/mLストレプトマイシン（Gibco）を含むHam’s F-12培地（Gibco）で培養した、Flp-In-CHO細胞（Invitrogen）3E+05 cellsに対し、Lipofectamine 3000（Invitrogen）を用いて、調製したベクター2.5 μgのトランスフェクションを実施した。トランスフェクション３日後より、Geneticin（Invitrogen）を400-500 μg/mLの濃度にて培地に加えることで選抜を実施した。選抜後の細胞は、FACSAria（BD Bioscience）にて解析し、GFP positiveの細胞のシングルクローン化を実施した。このようにして樹立した細胞株は、抗ヒトIL6R抗体PF-1（自社調製）およびPE標識抗ヒトkappa鎖抗体（SouthernBiotech）によって染色し、再度FACSAriaにて解析することで、IL6Rの発現を確認した。以下に記述する実施例４では、IL6Rを発現させたFlp-In-CHO細胞をIL6R+CHO細胞として表記し、Flip-In-CHO細胞はCHO細胞として表記する。
【０２１３】
実施例４
細胞質に移行した抗体のビオチンライゲースを使用したアッセイによる検出
実施例２で作製した各種抗体の細胞質移行能を評価するため、W.P.R. Verdurmen et al. / Journal of Controlled Release 200 (2015) 13-22に記載の方法を参考に細胞質に移行した抗体を検出した。すなわち、下記に記載の方法でビオチンライゲース（BirA）を発現させた細胞と Avi tagが融合された抗体をインキュベートし、抗体が細胞質に移行すると、細胞質中で発現しているBirAによってAvi tagがビオチン標識される。ビオチン標識された抗体をStreptavidin−HRPで検出することで、細胞質中に存在する抗体量を評価することができる。
【０２１４】
（１）細胞と抗体の反応
10％ FBS (Sigma Aldrich, Cat# 182012-500ML) とPenicillin-Streptomycin (Gibco, Cat# 15140-122)を含むHam's F-12 Nutirent Mix (Gibco, Cat# 11765-054 )で調製したCHO細胞、及びIL6R+CHO細胞の懸濁液をCostar（登録商標） 48 well cell culture cluster Flat bottom with Lid (Corning, Cat# 3548)に250 μL/well（IL6R+CHO: 3.0×104細胞/well、CHO: 6×104細胞/well）で播種し、37℃、5% CO2条件下で一晩培養した。
次に、Opti-MEM I (1x) (Gibco, Cat# 31985-062)及びLipofectamin 3000 kit (Life Technologies, Cat# L3000-015)を用いて、当業者公知の方法でIL6R+CHO細胞およびCHO細胞にBirA（配列番号：４３）の発現ベクターを一過性に導入し、37℃、5% CO2条件下で一晩培養することでBirAを発現させた。
【０２１５】
培養上清を除去した後、抗体（終濃度 4 μM）、D-Biotin（Sigma Aldrich, Cat# B4501-10G）（終濃度0.1 mM）、MG-132 (Merck Millipore, Cat# 474790-5MG)（終濃度 50 μM）を含む培地を225 μL/well 添加し、37℃で6時間インキュベートした。抗体を含む溶液をアスピレーターで除去し、細胞を250 μLのD-PBS(-)で3回洗浄した。Accutase (Nacalai Tesque, Cat# 12679-54)を100 μL/wellで添加して37℃でインキュベートし、培養フラスコから細胞を剥離した。その後、800 μL/wellの培地を添加して細胞をマイクロチューブに回収した。遠心分離 (400×g、2分)して上清を除去し、800 μLのD-PBS(-)を添加して再度遠心分離を行い上清を除去した。Sample Buffer Solution with 3-Mercapto-1,2-propanediol (Wako, Cat# 199-16132)を等量のMQと混合し、予め96℃に加熱した後、回収した細胞に10 μLを加えて、直ちに96℃で8分間加熱した。その後、サンプルを氷冷した後、-20℃で保存した。
【０２１６】
（２）ビオチン標識された抗体の検出
（１）で調製した細胞破砕液中の、ビオチン標識された抗体をSimple Western Wes (Protein Simple)及び12-230 kDa Wes Separation Module, 8 x 25 capillary cartridges (Protein Simple, Cat# SM-W004)を用いて検出した。調製した細胞破砕液を室温で融解した後、遠心分離 (15,000 rpm, 3分間)し、上清を回収した。上清をMQで8倍に希釈した後、希釈した上清を、10X Sample Bufer 20 μL、400 mM DTT 20 μL、Fluorescent Standard 1本を予め混合して調製した5×Fluorescent Master Mixと、4:1の容量比で混合した。95℃で5分間加熱し、撹拌後に混合物を氷上で保存し測定サンプルとした。また、Luminol-S 200 μLとPeroxide 200 μLを混合してHRP基質を調製した。
【０２１７】
12-230 kDa Wes Separation Module, 8 x 25 capillary cartridgesのPre-filled Micro PlateのA列に測定サンプルを3 μL、B列にAntibody Diluent IIを10 μL、C列にStreptavidin-HRPを10 μL、E列にHRP基質を15 μL添加し、測定を実施した。なお、予めMilliQ 16 μL、10×Sample Buffer 2 2 μL、400 mM DTT 2 μL及びBiotin Ladder 1本を混合して調製したBiotin Ladder 5 μLを分子量マーカーとして用いて同時に測定を行った。各試薬はSimple Western Wes (Protein Simple)及び12-230 kDa Wes Separation Module, 8 x 25 capillary cartridges (Protein Simple, Cat# SM-W004)とBiotin Detection Module for Wes, Peggy Sue or Sally Sue (Cat# DM-004)に付属のものを用いた。
【０２１８】
Wesによる測定は、Separation Matrix Load Time 200秒、Stacking Matrix Load Time 15秒、Sample Load Time 9秒、Separation Time 25秒、Separation voltage 375 V、Standards Exposure 4秒、EE Immobilization Time 230秒、Matrix washes 3回、Matrix Wash Soak Time 150秒、Wash Soak Time 150秒、Antibody Diluent Time 5分、Primary Antibody Time 30分、Washes 2回、Wash Soak Time 150秒、Detection Profile HDRで実施した。
また、Streptavidin-HRPの代わりに、β−Actin (13E5) Rabbit mAb (HRP conjugate) (Cell Signaling, Cat#5125S) をAntibody Diluent IIで50倍希釈して用い、測定サンプル中に含まれるactinを検出した。この時、細胞破砕液を室温で融解した後、遠心分離 (15,000 rpm, 3分間)し、回収した上清をMQで2倍に希釈して測定サンプルの調製に用いた。
検出したHRPシグナルをCompass for Simple Western Version 3.1.7 (Protein Simple)を用いて解析し、図３に示すようなレーン画像を作成した。
【０２１９】
その結果、公知の細胞質侵入抗体である3D8はCHO細胞とIL6R+CHO細胞の破砕液中から検出され、細胞表面抗原の発現に関わらず非特異的に細胞質に移行することが確認された（図３）。また、heparan sulfate proteoglycan (HSPG)結合能を失った3D8の変異体である3D8.03はCHO細胞とIL6R+CHO細胞の破砕液中から検出されず、両細胞の細胞質に到達できないことが確認された。一方、3D8.03と抗IL6R抗体の二重機能性抗体である3D8.03//MRAは、CHO細胞の破砕液中からは僅かにしか検出されず、IL6R+CHO細胞の破砕液中からは高い検出シグナルが得られた。また、3D8.03//IC17は両細胞の破砕液中から検出されなかった。これらの結果は、3D8.03と抗IL6R抗体の二重機能性抗体により、IL6R依存的に標的細胞の細胞質に抗体を送達できることを示している。
また、2C10を用いた二重機能性抗体についても同様で、2C10が両細胞の破砕液から検出されたのに対し、2C10//MRAはCHO細胞と比べIL6R+CHO細胞の破砕液からのみ高い検出シグナルが得られた。一方、2C10//IC17はいずれの細胞破砕液からもわずかにしか検出されなかった。
SAは、エンドソーム内の酸性pH環境において細胞表面抗原であるIL6Rから解離するような改変を、当業者公知の方法（WO2009/125825など）にてMRAに導入した改変体（pH依存性抗体）である。3D8.03//SA、2C10//SAも同様に、IL6R+CHO細胞の破砕液中から高い検出シグナルが得られた（図３）。細胞表面抗原結合抗体にpH依存性を付与すると、抗体の血中半減期が延長することが知られていることから、このようなpH依存性を細胞質侵入抗原結合分子に提供することで、当該抗原結合分子の投与頻度の軽減や投与量の低減が期待できる。pH依存性抗体は、例えば、WO2009/125825の記載に基づき、当業者が適宜作製することができる。
【０２２０】
以上の結果より、3D8.03や2C10のような細胞質侵入抗体と細胞表面抗原結合抗体による多機能性抗原結合分子によって、抗体を細胞表面抗原依存的に標的細胞の細胞質に送達できることが示された。特に、3D8.03は、細胞表面抗原であるHSPGへの結合能を失いエンドソーム脱出能のみを有する抗体であることから、このようなエンドソーム脱出能抗体と細胞表面抗原結合抗体を組み合わせた多機能性抗原結合分子により、非標的細胞への送達を最小限に抑えつつ、標的細胞の細胞質に効率的に多機能性抗原結合分子を送達することが可能となる。本技術によって、標的細胞の細胞質に抗原結合分子を特異的に送達し、細胞質中の抗原に作用させることが可能だと考えられる。
【０２２１】
実施例５
蛍光顕微鏡を用いた細胞質中の抗体のイメージング解析
実施例２で作製した抗体について、蛍光顕微鏡を用いたイメージング解析を実施した。
10％ FBS (GEヘルスケア・ジャパン株式会社, Cat# SH30070.03) とPenicillin-Streptomycin (Gibco, Cat# 15140-122)を含むHam's F-12 Nutrient Mix (Gibco, Cat# 11765-054)で調製したFlp-In-CHO細胞（Invitrogen）またはIL6R（GenPept登録番号NP_000556）を当業者公知の方法で過剰発現させたFlp-In-CHO細胞（IL6R+CHO細胞）の懸濁液を、I型コラーゲンが底面にコーティングされた96 well plate（Corning, Cat# 354649）に50 μL/well（それぞれ8.0×105細胞/mL または 4.0×105細胞/mL）で播種し、細胞を37℃、5% CO2条件下で一晩培養した。翌日、培養上清を除去し、抗体（終濃度 3 μM）及びMG-132 (Merck Millipore, Cat# 474790-5MG) （終濃度 30 μM）を含む培地を30 μL/well 添加し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、試料より培地を除去し、D-PBS (-) で洗浄した。さらに、細胞膜上に残存する抗体を除去する目的で、200 mM Glycine（和光純薬工業, Cat# 077-00735）-HCl（和光純薬工業, Cat# 083-01095）、150 mM NaCl（和光純薬工業, Cat# 191-01665）、pH 2.5から成る洗浄液にて30秒洗浄する操作を2回実施した。その後、4%‐パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（ナカライテスク, Cat# 09154-56）を室温にて15分作用させることで、細胞を固定した。次いで、0.5% Triton X-100（Bio-rad, Cat# 161-0407）および5% FBSを含むPBSにて、4℃で一晩インキュベートすることで、細胞を透過処理した。なお、透過処理に用いた溶液は、その後の標識抗体とのインキュベーションや洗浄のステップにも使用した。細胞質に移行した抗体は、500倍希釈したGoat Anti-Human IgG-TRITC（Thermo, Cat# A18810）とともに室温で1時間インキュベートすることで標識した。このとき、核を可視化するためにHoechst33342（Thermo, Cat# H3570）を2000倍希釈して併せて添加した。最後に細胞をPBSにて2回洗浄し、測定試料とした。試料の測定は、IN Cell Analyzer 6000（GEヘルスケア社製）を用いた。
その結果、3D8、3D8.03及び2C10と抗IL6R抗体 MRAまたはSAの二重機能性抗体である3D8//MRA、3D8.03//MRA、3D8.03//SA、2C10//MRA、及び2C10//SAは、CHO細胞からは僅かにしか蛍光シグナルが観察されなかったのに対し、IL6R+CHO細胞からは強い蛍光シグナルが観察された。また、IL6R+CHO細胞において、3D8//MRA、3D8.03//MRA、3D8.03//SA、2C10//MRA及び2C10//SAは、3D8//IC17、3D8.03//IC17、2C10//IC17、IC17//MRA及びIC17//SAと比較して強い蛍光シグナルが検出された。さらに、3D8はCHO細胞からも蛍光シグナルが観察され、細胞非特異的に抗体の細胞質侵入が起きていることが示唆されたが、3D8//MRAは、IL6R+CHO細胞には3D8と同程度の細胞質侵入が起きている一方、CHO細胞にはほとんど細胞質侵入が確認されなかった。（図４）。これらの結果から、3D8等の細胞質侵入抗体と抗IL6R抗体の二重機能性抗体により、細胞質侵入能は維持しながら、IL6R依存的に標的細胞の細胞質に抗体を送達できることを示している。
【０２２２】
実施例６
多量体形成を促進するアミノ酸改変を含むFc領域を有する抗体の細胞質侵入能の評価
実施例２に記載の公知の細胞質侵入抗体および二重機能性抗体について、六量体化抗体（Hexabody）を作製するため、当業者公知の方法で重鎖定常領域にR,G,Y改変(E345R/E430G/S440Y)（WO2016/164480参照）を導入した抗体3D8VH-G1m.RGY/hT4VL03-KT0.Avi（3D8.03RGY.LAvi）（重鎖配列番号：４４、軽鎖配列番号：４５）を調製した。この際、重鎖定常領域のC末端にAvitagを融合すると抗体の多量体化が阻害されるため、軽鎖定常領域のC末端にAvitagを融合した。また、R,G,Y改変を入れず軽鎖定常領域のC末端にAvitagを融合した抗体3D8VH-G1m/hT4VL03-KT0.Avi（3D8.03.LAvi）（重鎖配列番号：４６、軽鎖配列番号：４５）を調製した。3D8.03はpH5.5で細胞質侵入能を示すことが報告（Journal of Controlled Release 235 (2016) 165-175）されているため、3D8.03RGY.LAvi及び3D8.03.LAviについてもpH5.5の条件で細胞とインキュベートし、細胞質侵入能を評価した。
【０２２３】
10％ FBS (Sigma Aldrich, Cat# 182012-500ML) とPenicillin-Streptomycin (Gibco, Cat# 15140-122)を含むHam's F-12 Nutirent Mix (Gibco, Cat# 11765-054)で調製したIL6R+CHO細胞の懸濁液をCostar（登録商標） 48 well cell culture cluster Flat bottom with Lid (Corning, Cat# 3548)に250 μL/well（IL6R+CHO: 3.0×104細胞/well、CHO: 6×104細胞/well）で播種し、37℃、5% CO2条件下で一晩培養した。
次に、Opti-MEM I (1x) (Gibco, Cat# 31985-062)及びLipofectamin 3000 kit (Life Technologies, Cat# L3000-015)を用いて、当業者公知の方法でIL6R+CHO細胞にBirA（配列番号：４３）の発現ベクターを一過性に導入し、37℃、5% CO2条件下で一晩培養することでBirAを発現させた。
【０２２４】
D-Biotin（Sigma Aldrich, Cat# B4501-10G）（終濃度0.1 mM）、MG-132 (Merck Millipore, Cat# 474790-5MG)（終濃度 50 μM）を含む培地に0.5 M MES buffer pH4.5を添加した溶液に抗体を終濃度 2、4、または10 μMとなるように添加し、pH5.5となった溶液を調製した。調製した溶液225 μL/well を培養上清を除去した細胞に添加し、37℃で6時間インキュベートした。抗体を含む溶液をアスピレーターで除去し、250 μLのD-PBS(-)で3回洗浄した。Accutase (Nacalai Tesque, Cat# 12679-54)を100 μL/wellを添加して37℃でインキュベートした後、800 μL/wellの培地を添加して細胞をマイクロチューブに回収した。遠心分離 (400×g、2分)して上清を除去し、800 μLのD-PBS(-)を添加して再度遠心分離を行い上清を除去した。Sample Buffer Solution with 3-Mercapto-1,2-propanediol (Wako, Cat# 199-16132)を等量のMQと混合し、予め96℃に加熱した後、回収した細胞に10 uLを加えて、直ちに96℃で8分間加熱した。その後、サンプルを氷冷した後、-20℃で保存した。
調製した細胞破砕液中からのビオチン標識された抗体の検出は実施例４−（２）に記載の方法に従って実施した。
【０２２５】
その結果、RGY改変を導入していない3D8.03.LAviとインキュベートした細胞破砕液と比較して、3D8.03RGY.LAviとインキュベートした細胞破砕液から検出されたAvitagを融合した抗体の軽鎖に相当する分子量のタンパク質は高い検出シグナルを示した（図５）。さらに、10 μMの3D8.03.LAviとインキュベートした場合よりも2 μMの3D8.03RGY.LAviとインキュベートした場合の方が抗体軽鎖に相当するタンパク質の検出シグナルが高かった。
また、実施例５に記載の方法で蛍光顕微鏡によるイメージング解析を実施した。ただし、細胞は実施例５に記載の方法で調製したFlp-In-CHO細胞 (CHO細胞)に加え、10％ FBS (Sigma Aldrich, Cat# 182012-500ML) とPenicillin-Streptomycin (Gibco, Cat# 15140-122)を含むMinimum Essential Medium Eagle (Sigma, Cat# M4655-500ML)で調製したHeLa細胞懸濁液をI型コラーゲンが底面にコーティングされた96 well plate（Corning, Cat# 354649）に50 μL/well（Flp-In-CHO細胞は 4.0×104細胞/mL, HeLaは3.0×104細胞/mL）で播種し、37℃、5% CO2条件下で一晩培養してアッセイに用いた。また、抗体と細胞をインキュベートする際に、細胞懸濁液に0.5 M MES buffer pH4.5を添加することでpH 5.5に調整した条件で、抗体の細胞質移行を評価した。その結果、RGY改変を導入していない3D8.03と比べて、3D8.03RGYとインキュベートした細胞から強い蛍光シグナルが観察された（図６）。これらの結果から6量体形成を促進することが知られているRGY改変を導入した細胞質侵入抗体は細胞質侵入能が向上することが示された。以上より、細胞質侵入抗体を多量体化することで細胞質侵入能を向上できる可能性が示された。
【０２２６】
実施例７
多量体形成を促進するアミノ酸改変を含むFc領域を有する抗体の標的細胞特異的な細胞質侵入能の評価
前述の通り、3D8.03は中性条件下ではHSPGを介したエンドサイトーシスや膜上分子との相互作用が生じないため、このままでは細胞質抗原結合抗体を細胞質に送達することができない。一方で、中性条件下でも細胞質への送達が可能な3D8を用いて同様に3D8.RGY抗体を調製して評価した場合、同様に細胞質侵入能が向上することが期待できるが、標的細胞特異性は減弱してしまうことが予想できる。そこで、3D8.03//MRA、3D8//MRA等から成る二重機能性抗体についても重鎖定常領域にRGY(E345R/E430G/S440Y), RY(E345R/S440Y), RG(E345R/E430G), GY(E430G/S440Y), R(E345R)改変又はK428E/T437R改変（mAbs,2017, 9, 7, 1129-1142）のいずれかを導入し、溶液中では単量体（モノマー）として存在し抗原に結合したときのみ六量体（ヘキサマー）を形成するような抗体を調製して、実施例４−（２）に記載の方法でビオチンライゲースアッセイを実施する。その結果、単純な二重機能性抗体である3D8.03//MRA、3D8//MRAと比較したとき、IL6R+CHO細胞破砕液から、Avi-tagを付与した抗体重鎖または軽鎖に相当する分子量の位置に高いHRPの発光シグナルを示す。さらに、実施例５に記載の方法でイメージング解析を実施した結果も同様に、3D8.03//MRA、3D8//MRAと比較して、IL6R+CHO細胞において強い蛍光シグナルが観察される。以上のことから、これらの抗体は、標的細胞表面抗原に結合したときのみ六量体を形成してエンドサイトーシスが起き、エンドソーム内で膜と強く相互作用することで、標的細胞特異性の向上と細胞質侵入の向上を両立できていることが示される。
【０２２７】
実施例８
標的細胞特異性及び細胞質侵入能が向上した二重機能性抗体を多価化した抗体の細胞質侵入能の評価
図２に記載の分子形のうち実施例６及び７で記載したHexabody以外の分子形であって、二重機能性抗体を多価化した分子形の抗体においても、標的細胞特異性および細胞質侵入能が向上することを、ビオチンライゲースを使用したアッセイおよび蛍光顕微鏡を用いたイメージング解析により検証する。
抗体は当業者公知の方法で調製し、実施例４−（２）に記載の方法でビオチンライゲースアッセイを実施した結果、図２に示した分子形では、3D8又は3D8.03等の細胞質侵入抗体及び細胞表面結合抗体から成る単純な二重機能性抗体（図１a）と比較したとき、Avi-tagを付与した抗体重鎖または軽鎖に相当する分子量の位置に高いHRPの発光シグナルを示す。さらに、実施例５に記載の方法でイメージング解析を実施した結果も同様に、単純な二重機能性抗体と比較して、強い蛍光シグナルが観察される。以上より、図２に記載の様々な分子形でもHexabodyと同様に、細胞特異性および細胞質侵入能が向上できることが示される。
【０２２８】
実施例９
スプリットNanolucアッセイによる細胞質に輸送された抗ASGPRを有する二重機能性抗体の検出
細胞質輸送能を評価する別の方法として、Nanoluc補完を利用することが公知である（Schaub et al., Cancer Res. (2015) 75(23):5023、Dixon et al., ACS Chem Biol. (2016) 11(2):400）。発明者らは、バックグラウンドシグナルを低減させるための改善された方法を作り出して、公知の細胞質侵入抗体と抗ASGPR抗体との二重機能性抗体を試験した。
【０２２９】
（１）スプリットNanoLucアッセイのコンセプト
NanoLucは、深海発光エビから遺伝子操作で作製された小さな19kDaのルシフェラーゼ酵素である。スプリットNanoLucアッセイは、2つのサブユニット：小さな1.3kDaのSmall BiT（SmBiT）及びより大きな18kDaのLarge BiT（LgBiT）へと切断されるNanoLucを利用する。LgBiTとSmBiTとの補完は、NanoLuc Live Cell Assay System（Promega）の使用により生細胞中で、基質上での酵素反応からの発光として観察される。
スプリットNanoLucアッセイにおいては、NanoLuc LgBiTを細胞内で安定に発現するように、HeLa細胞を遺伝子改変した。NanoLuc LgBiTは、フリーの細胞質タンパク質として発現されるか、又は細胞質内の細胞内構造、例えば、ミトコンドリア外膜に係留されるかのいずれかであった。NanoLuc LgBiTのミトコンドリア外膜への係留は、NanoLuc LgBiTがフリーの細胞質タンパク質として発現された場合と比較して、有意に低いバックグラウンドシグナル及び良好なアッセイ感度をもたらした。係留されたNanoLuc LgBiTは、GFPにより測定した時、全体的により低い発現を有していたにもかかわらず、そうであった。SmBiTコンジュゲートを、試験した抗体上に発現させた。抗体-SmBiTコンジュゲートの細胞質中への侵入は、NanoLuc LgBiTルシフェラーゼ酵素を補完すると考えられ、これは、発光の促進によって検出することができた。
【０２３０】
（２）細胞株の構築
ヒトASGPRを安定に発現するHeLa細胞を生成するために、Lipofectamine 3000（Invitrogen）を用いて、細胞に、それぞれ2:1の比でヒトASGPR-H1（配列番号：４７）及びASGPR-H2（配列番号：４８）サブユニットをコードするプラスミドをトランスフェクトした。CAGプロモーターを使用しかつネオマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXND3中に、ASGPR-H1およびASGPR-H2をクローニングした。抗生物質耐性細胞を、FACSAria III（BD）での細胞選別により、ASGPRの高発現についてさらに濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、限界希釈及びプレーティングによって単離し、顕微鏡観察（Solentim, Cell Metric CLD）により単一細胞クローンとして特定した。
ASGPR及びeGFP-Nanoluc LgBiTの両方を発現する細胞、ならびにASGPR及びAKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiTを発現する細胞を生成するために、HeLa用のプリセットヌクレオフェクションプログラムを用いて、ASGPRを安定に発現するHeLa細胞に、Cell Line Optimization 4D-Nucleofector（商標） X Kit （Lonza）ならびに4D-Nucleofector Core unit及び4D-Nucleofector X unit（Lonza）を用いてヌクレオフェクションした。CAGプロモーターを使用しzeocin抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXZD1中に、LgBiT構築物をクローニングした。始めは、eGFPのC末端にコンジュゲートされたNanoLuc LgBiT（eGFP-NanoLuc LgBit；配列番号：４９）であった。次は、eGFPのN末端にコンジュゲートされた追加的ミトコンドリアキナーゼアンカータンパク質1（AKAP1）を伴うもの（AKAP1-eGFP-NanoLuc LgBit；配列番号：５０）であった。抗生物質耐性細胞を、FACSAria III（BD）での細胞選別により、eGFPの高発現についてさらに濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、限界希釈及びプレーティングによって単離し、顕微鏡観察（Solentim, Cell Metric CLD）により単一細胞クローンとして特定した。
HeLa細胞を、10％ v/v胎児ウシ血清、1％ v/v MEM Non-Essential Amino Acids Solution（Gibco）、1％ v/vピルビン酸ナトリウム（Gibco）、及び1％ v/v Penicillin-Streptomycin（Gibco）を含むMinimum Essential Media（Gibco）の標準的な培養培地中で培養した。アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）を発現するHeLaクローンを、1 mg/mL Geneticin（G418硫酸塩）（Gibco）を補給した標準的な培養培地で培養した。ASGPR及びeGFP-NanoLuc LgBiT、又はASGPR及びAKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiTを発現するHeLa細胞を、1 mg/mL Geneticin及び600μg/mL Zeocin（Invivogen）を含む標準的な培養培地中で培養した。すべての細胞タイプは、加湿した5％ CO2、37℃のインキュベーター中で培養した。
【０２３１】
（３）アッセイセット条件
ASGPR及びeGFP-NanoLuc LgBiTを発現するHeLa細胞（以下HeLa-Nlucと呼ぶ）、ならびにASGPR及びAKAP1-eGFP-NanoLuc LgBiTを発現するHeLa細胞（以下HeLa-AKAP1_Nlucと呼ぶ）を、DPBS, no calcium, no magnesium（Gibco）でリンスした。次いで、細胞を、培養フラスコから剥離するまで、室温で0.25％ Trypsin-EDTA（Gibco）を用いてトリプシン処理した。次いで、10％ FBSを含有する過剰な培養培地中で、トリプシンを中和した。細胞を、200×gで5分間、4℃でペレットにして、冷却Opti-MEM（Gibco）で2回リンスした。細胞を、1×106細胞/mLの濃度で冷却Opti-MEMに懸濁し、使用の最長30分間前から冷たく保った。
試験されるべき抗体を、ヒスチジン緩衝液、20 mM His-HCl＋150 mM NaCl（ナカライテスク）において、試験濃度の11倍に希釈した。NanoLuc Live Cell Assay System（Promega, Cat#N2011）由来の5倍基質を、室温で調製した。
1×105細胞を、well（Perkin Elmer, Cat#6005688）当たり100μLで移動させ、10μLの11倍抗体を、細胞に直接添加して、ピペットで混合した。次いで、混合の直後に、5倍基質を細胞及び抗体の混合物に添加した。
プレートを直ちに、予め温めた37℃発光プレートリーダー（Promega, Glomax Explorer）に置いた。2ステップリードサイクルを5分おきに12サイクル行い、プレートを1分間、400 rpmで振盪した後、発光を読んだ。
【０２３２】
（４）抗体調製
表４に示す公知の細胞質侵入抗体及び抗ASGPR結合抗体の発現ベクターを、当業者公知の方法で構築し、得られたベクターのヌクレオチド配列を、当業者公知の方法で決定した。重鎖のC末端にSmBiTが融合された抗体の発現ベクターを、重鎖をコードする遺伝子とSmBiTをコードする遺伝子とを連結することによって、構築した。
AGA0078Ha-SG1.S3p.SmBiT/AGA0078L0030-k0MCは、当業者公知の方法（例えば、WO 2009/125825）を用いてエンドソームなどの酸性環境においてASGPRから解離することを可能にした、AGA0078Ha-SG1.S3p.SmBiT/AGA0078La-k0MCの変異体である。3D8H-SG1.S3n.SmBiT/hT4VL-SK1、2C10VH-SG1.S3n.SmBiT/2C10VL-SK1、AGA0078Ha-SG1.S3p.SmBiT/AGA0078La-k0MC、AGA0078Ha-SG1.S3p.SmBiT/AGA0078L0030-k0MC、及びIC17HdK-SG1.S3p.SmBiT/IC17L-SK1は、それぞれ3D8、2C10、NpH_ASGPR、pH_ASGPR、及びIC17dKと表記する。
【０２３３】
【表４】
2021532135.tif 000006
【０２３４】
抗体調製のために、重鎖および軽鎖プラスミドをexpi293-F細胞（Thermo scientific）に、製造業者の説明書にしたがって一過性にトランスフェクトした。組換え抗体を、プロテインA（GE Healthcare）アフィニティクロマトグラフィーで精製して、D-PBS、Tris緩衝生理食塩水（TBS）、又はHis緩衝液（20 mMヒスチジン、150 mM NaCl、pH 6.0）中に溶出させた。溶出液をさらに、Superdex 200カラム（GE healthcare）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーに供して、高分子量及び/又は低分子量の成分を除去した。精製抗体は、必要に応じてAmicon Ultra-4 (30K)（Merck Millipore）を用いて濃縮した。
二重機能性抗体を、当業者公知の方法にて精製抗体から調製した。二重機能性抗体の名称及びアームの組合せを表５に示す。3D8H-SG1.S3n.SmBiT/hT4VL-SK1 とIC17HdK-SG1.S3p.SmBiT/IC17L-SK1との二重機能性抗体、AGA0078Ha-SG1.S3p.SmBiT/AGA0078La-k0MCとの二重機能性抗体、及びAGA0078Ha-SG1.S3p.SmBiT/AGA0078L0030-k0MCとの二重機能性抗体を、それぞれIC17dK//3D8、NpH_ASGPR//3D8、及びpH_ASGRP//3D8と表記する。また、3D8H-SG1.S3n.SmBiT/hT4VL-SK1の代わりに2C10VH-SG1.S3n.SmBiT/2C10VL-SK1との組合せによって調製した二重機能性抗体を、それぞれ IC17dK//2C10、NpH_ASGPR//2C10、及びpH_ASGPR//2C10と表記する。さらに、IC17HdK-SG1.S3n.SmBiT/IC17L-SK1とAGA0078Ha-SG1.S3p.SmBiT/AGA0078La-k0MCとの組合せ、AGA0078Ha-SG1.S3p.SmBiT/AGA0078L0030-k0MCとの組合せ、及びIC17HdK-SG1.S3p.SmBiT/IC17L-SK1との組合せによって調製した二重機能性抗体を、それぞれNpH_ASGPR//IC17dK、pH_ASGPR//IC17dK、及びIC17dK//IC17dKと表記する。
【０２３５】
【表５】
2021532135.tif 000007
【０２３６】
（５）結果
生成されたスプリットNanoluc細胞株の感度を比較するために、細胞質ターゲティング抗体3D8及び2C10を、eGFP-NanoLuc LgBiT HeLa細胞株及びAKAP1-eGFP-Nanoluc LgBiT HeLa細胞株において試験した。各細胞株におけるバックグラウンドシグナルを評価するために、可溶性SmBiTペプチド（配列番号：６３）を添加した。用いた3D8、2C10、及びSmBiTペプチドのモル濃度は、0.2マイクロモル濃度で同一であった。比較を可能にするために、各細胞株についてのルシフェラーゼシグナルを、ヒスチジン緩衝条件に対して標準化し、ヒスチジン緩衝液を参照とすることによってルシフェラーゼシグナルの1.0倍率変化として算出されるように設定した。
Nanoluc SmBiTペプチドのシグナルを比較することによって、AKAP1-eGFP-Nanoluc LgBiT HeLa細胞株は、eGFP-NanoLuc LgBiTと比較して、より低いバックグラウンドを示した（図１３）。加えて、細胞質侵入抗体3D8及び2C10の倍率変化もまた、AKAP1-eGFP-Nanoluc LgBiT HeLa細胞株において、より高かった。
二重機能性抗体の評価について言うと、IC17dK//3D8及びIC17dK//2C10などの一価形態の細胞質侵入抗体の倍率変化は、二価形態の3D8及び2C10よりも低く、これは、一価形態が細胞質中にあまり侵入しなかったことを示唆している。しかし、NpH_ASGPR//3D8、pH_ASGPR//3D8、NpH_ASGPR//2C10、及びpH_ASGPR//2C10などの、ASGPRを標的としかつ細胞侵入アームを有する二重機能性抗体は、一価形態の細胞質侵入抗体IC17dK//3D8及びIC17//2C10よりも高い倍率変化を示した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。それらの結果から、二重機能性抗体は、ASGPR媒介様式により細胞中にインターナライズし、細胞質侵入抗体機能によりエンドソームから脱出する。
【０２３７】
実施例１０
ビオチンライゲースアッセイによるIL6R及びASGPR発現細胞株に対する二重機能性抗体の検出
（１０−１）細胞株構築
（１）HeLa/BirA
BirAを安定に発現するHeLa細胞を生成するために、Lipofectamine 3000（Theromo Fisher Scientific）を用いて、HeLa細胞（ATCC, Cat# CCL-2）に、BirA（配列番号：４３）をコードするプラスミドをトランスフェクトした。CAGプロモーターを使用しかつネオマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXND3中に、BirAをクローニングした。抗生物質耐性細胞を、FACSAria IIu sorter（Beckton Dickinson）での細胞選別により、BirAの高発現についてさらに濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、限界希釈及びプレーティングによって単離し、顕微鏡観察により単一細胞クローンとして特定した。
次いで、選択されたクローンを増大させた。BirA発現を、12-230 kDa Wes Separation Module, 8 x 25 capillary cartridges（Protein Simple, Cat# SM-W004）、1/500希釈した抗BirA抗体（Novus Biologicals, Cat# NBP2-59938）、及びAnti-Mouse Detection Module for Wes, Peggy Sue or Sally Sue（Protein Simple, Cat# DM-002）を伴うSimple Western Wes（Protein Simple）を用いたキャピラリーイムノアッセイによって評価した。BirA発現を、Compass for Simple Western Version 3.1.7（Protein Simple）を用いて確認し、高いBirA発現を示す細胞クローンを選択した。
【０２３８】
（２）HeLa/BirA/IL6R
BirA（配列番号：４３）及びヒトIL6R（登録番号NP_000556）を安定に発現するHeLa細胞を生成するために、CAGプロモーターを使用しかつzeocin抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXZD1中に、IL6R遺伝子をクローニングした。Lipofectamine 3000（Theromo Fisher Scientific）を用いて、HeLa/BirA細胞に、pCXZD1_IL6Rプラスミドをトランスフェクトした。
IL6Rを安定に発現する細胞を選択するために、抗生物質耐性細胞を、MACS緩衝液（Auto MACS Rinsing Solution（Miltenyi Biotec, Cat# 130-091-222）およびMACS BSA Stock Solution（Miltenyi Biotec, Cat# 1130-091-376））中で1μMの抗IL6R抗体PF1H-G4T1K439E.Avi/PF1L-KT0（重鎖、PF1H-G4T1K439E.Avi（配列番号：６６）；軽鎖、PF1L-KT0（配列番号：６７））と30分間、氷上でインキュベートした。MACS緩衝液中で洗浄した後、細胞をさらに、MACS緩衝液中でR-フィコエリトリン（PE）標識された抗κ抗体（Southern Biotech, Cat# 2060-09）と30分間、氷上でインキュベートした。MACS緩衝液中で洗浄した後、IL6Rを発現する細胞を、FACSAria IIu sorter（Beckton Dickinson）によって選別した。次いで、選択されたクローンを増大させた。抗IL6R抗体PF1H-G4T1K439E.Avi/PF1L-KT0、及びR-フィコエリトリン（PE）標識された抗κ抗体（Southern Biotech, Cat# 2060-09）を用いたFACS Verse（Beckton Dickinson）でのフローサイトメトリーにより、IL6Rの高発現を確認した。BirA発現もまた、Simple Western Wes（Protein Simple）を用いたキャピラリーイムノアッセイによって確認した。
【０２３９】
（３）HeLa/ASGPR
ヒトASGPRを安定に発現するHeLa細胞を生成するために、Lipofectamine 3000（Theromo Fisher Scientific）を用いて、細胞に、それぞれ2:1の比でヒトASGPR-H1（配列番号：４７）及びASGPR-H2（配列番号：４８）サブユニットをコードするプラスミドをトランスフェクトした。CAGプロモーターを使用しかつネオマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXND3中に、ASGPR-H1及びASGPR-H2をクローニングした。抗生物質耐性細胞を、FACSAria III（Beckton Dickinson）での細胞選別により、ASGPRの高発現についてさらに濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、限界希釈及びプレーティングによって単離し、顕微鏡観察（Solentim, Cell Metric CLD）により単一細胞クローンとして特定した。
【０２４０】
（４）HeLa/ASGPR/BirA
BirA（配列番号：４３）ならびにヒトASGPR（ASGPR-H1（配列番号：４７）及びASGPR-H2（配列番号：４８））を安定に発現するHeLa細胞を生成するために、CAGプロモーターを使用しかつzeocin抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドpCXZD1中に、BirA遺伝子をクローニングした。Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）を用いて、HeLa/ASGPR細胞に、pCXZD1_ BirAプラスミドをトランスフェクトした。抗生物質耐性細胞を、FACSAria IIu sorter（Beckton Dickinson）での細胞選別により、BirAの高発現についてさらに濃縮した。次いで、濃縮された細胞を、限界希釈及びプレーティングによって単離し、顕微鏡観察により単一細胞クローンとして特定した。
次いで、選択されたクローンを増大させた。抗ASGPR抗体AGA0008Ha-G4T1K439E.Avi/AGA0008La-k0MC（重鎖、AGA0008Ha-G4T1K439E.Avi（配列番号：６８）；軽鎖、AGA0008La-k0MC（配列番号：６９））及びGoat Anti-Human IgG-Alexa Fluor 647（Southern Biotech, Cat# 2040-31）と共にFACS Verse（Beckton Dickinson）を用いたフローサイトメトリー解析により、ASGPR発現を確認した。BirA発現もまた、Simple Western Wes（Protein Simple）を用いたキャピラリーイムノアッセイによって確認した。
アッセイのために、HeLa/BirA細胞を、10％ FBS（Sigma Aldrich, Cat# 172012-500ML）、Penicillin-Streptomycin（Gibco, Cat# 15140-122）、及び750μg/mL Geneticin（Cat# 10131-027, Thermo Fisher Scientific）を含有するMinimum Essential Medium Eagle（Sigma Aldrich, Cat# M4655-500ML）中で培養した。HeLa/BirA/IL6R細胞及びHeLa/ASGPR/BirA細胞は、10％ FBS（Sigma Aldrich, Cat# 172012-500ML）、Penicillin-Streptomycin（Gibco, Cat# 15140-122）、750μg/mL Geneticin（Thermo Fisher Scientific, Cat# 10131-027）、及び100μg/mLのzeocin（Thermo Fisher Scientific, Cat# R25001）を含有するMinimum Essential Medium Eagle（Sigma, Cat# M4655-500ML）中で培養した。
【０２４１】
（１０−２）ビオチンライゲース（BirA）アッセイ
ビオチンライゲース（BirA）アッセイは、細胞表面上に発現する受容体を標的とする二重機能性抗体の細胞質輸送を評価した。細胞侵入アーム及び受容体結合アームを有する二重機能性抗体を、細胞質中のBirA及び細胞表面上の受容体抗原を発現する標的細胞とインキュベートした。軽鎖のC末端上にAvitagが融合した二重機能性抗体が細胞質中に侵入すると、抗体がビオチン標識された。次いで、細胞質中のそれらビオチン標識された抗体を、Simple Western Wes（Protein Simple）を用いたキャピラリーイムノアッセイによって、ストレプトアビジン-HRPで細胞破砕液から検出した。
【０２４２】
（１０−３）細胞と抗体の反応
実施例２に記載されたのと同様に、表６に列記した抗体を用いて、表７に列記した二重機能性抗体を調製した。Avitagを、それらの抗体の軽鎖のC末端に融合させた。HeLa/BirA/IL6R及びHeLa/ASGPR/BirAの懸濁液を、Costar 96 well cell culture plate（Corning, Cat# 3596）に100μL/well（0.2×105細胞/well）で播種した。次いで、細胞を、加湿した5％ CO2、37℃のインキュベーター中で一晩培養した。次いで、細胞上清をアスピレーターにより除去し、細胞を、150μL/wellのD-PBS(-)で洗浄した。0.1 mM D-Biotin（Sgima Aldrich, Cat# B4501-10G）及び30μM MG-132（Merck Millipore, Cat# 474790-5MG）を含有する培養培地において調製した3μMの抗体サンプルを、細胞（50μL/well）に添加して、加湿した5％ CO2、37℃のインキュベーター中で3時間インキュベートした。次いで、抗体溶液をアスピレーターにより除去し、細胞を、150μLの氷冷D-PBS(-)において2回洗浄した。次いで、1 x Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail（Thermo Fisher Scientific, Cat# 1861281）と、5 mM EDTA（Thermo Fisher Scientific, Cat# 1861274）と、N末端がアセチル化されC末端がアミド化された100μMのAvitagペプチド（配列番号：９０）（Genscript）とを含有する30μLのRIPA buffer（Thermo Fisher Scientific, Cat# 89900）を細胞に添加し、氷上で5分間インキュベートして、細胞破砕液を調製した。次いで、細胞破砕液を回収して、検出ステップまで-80℃で保存した。
細胞破砕液中のビオチン標識された抗体を、Simple Western Wes（Protein Simple）及び12-230 kDa Wes Separation Module, 8 x 25 capillary cartridges（Protein Simple, Cat# SM-W004）を用いたキャピラリー免疫アッセイによって検出した。細胞破砕液を、20μLの10×Sample Bufer、20μLの400 mM DTT、及び1本のFluorescent Standardを予め混合して調製した5×Fluorescent Master Mixと、4:1の容量比で混合した。次いで、サンプルを95℃で5分間加熱した。次いで、混合物を氷上で保存し測定サンプルとした。HRP基質を、200μLのLuminol-Sと200μLのペルオキシドを混合して調製した。12-230 kDa Wes Separation Module, 8 x 25 capillary cartridgesのPre-filled Micro PlateのA列に3μLの測定サンプル、B列に10μLのAntibody Diluent II、C列に10μLのStreptavidin-HRP、及びE列に15μLのHRP基質をアプライし、測定を実施した。16μLのMQ、2μLの10×Sample Buffer、2μLの400 mM DTT、及び1本のBiotin Ladderを予め混合して調製した5μLのBiotin Ladderを、分子量マーカーとして用いた。それらの試薬は、12-230 kDa Wes Separation Module, 8 x 25 capillary cartridges（Protein Simple, Cat# SM-W004）及びBiotin Detection Module for Wes, Peggy Sue or Sally Sue（Protein Simple, Cat# DM-004）由来のものを用いた。細胞破砕液中の抗体の総量を検出するために、Anti-Human IgG Detection Module for Wes, Peggy Sue or Sally Sue（Protein Simple, Cat# DM-005）及びAnti-Human IgG Secondary HRP Antibody（Protein Simple, Cat# 043-491）を用いた。細胞破砕液中の内部標準としてHSP90を検出するために、Antibody Diluent IIにおいて調製した1/50希釈したRabbit anti-HSP90 mAb (C45G5) HRP conjugate（Cell Signaling Technologies, Cat# 79641）を用いた。
【０２４３】
Simple Western Wes（Protein Simple）による測定は、Separation Matrix Load Time 200秒、Stacking Matrix Load Time 15秒、Sample Load Time 9秒、Separation Time 25秒、Separation voltage 375 V、Standards Exposure 4秒、EE Immobilization Time 230秒、Matrix washes 3回、Matrix Wash Soak Time 150秒、Wash Soak Time 150秒、Antibody Diluent Time 5分、Primary Antibody Time 30分、Washes 2回、Wash Soak Time 150秒、Detection Profile HDRで実施した。
検出したHRPシグナルを、Compass for Simple Western Version 3.1.7 （Protein Simple）を用いて解析した。
【０２４４】
【表６】
2021532135.tif 000008
【０２４５】
【表７】
2021532135.tif 000009
【０２４６】
（１０−４）結果
BirAアッセイにより、二重機能性抗体の細胞質侵入を評価した。3D8、2C10、及びm3E10.D31Nなどの二価（mAb）形式の細胞侵入抗体のビオチン標識された軽鎖が、HeLa/BirA/IL6R及びHeLa/ASGPR/BirAの両方の細胞破砕液からストレプトアビジン-HRPによって検出された（図１５及び図１６）。しかし、第一のアームが細胞質侵入抗体であり第二のアームがKLH結合抗体IC17dKnである、3D8//IC17dKn、2C10//IC17dKn、及びm3E10.D31N//IC17dKnなどの一価形式の細胞質侵入抗体は、ストレプトアビジン-HRP及び抗ヒトIgGの両方によって検出した場合に、二価形式よりも低いシグナルを示した（図１５及び図１６）。本結果は、一価形式の細胞侵入抗体が、それらの抗体の二価形式よりも細胞質中にインターナライズしなかったことを示唆している。
受容体依存的な細胞質輸送を評価するために、抗IL6R抗体（MRA）及びpH依存性抗IL6R抗体（H237）を用いて二重機能性抗体を調製した。細胞侵入抗体及びIL6R結合抗体から構成される二重機能性抗体（3D8//MRA、3D8//H237、3D8.03//MRA、3D8.03//H237、2C10//MRA、2C10//H237、m3E10.D31N//MRA、及びm3E10.D31N//H237）は、ストレプトアビジンHRP及び抗ヒトIgGによって検出した場合に、HeLa/BirA/IL6Rにおいて3D8//IC17dKn、3D8.03//IC17dKn、2C10//IC17dKn、及びm3E10.D31N//IC17dKnよりも高いシグナルを示した（図１５）。それらの結果は、細胞侵入抗体アーム及びIL6R結合アームを有する二重機能性抗体が、IL6R依存的様式で細胞質輸送を示したことを示している。
HeLa/ASGPR/BirA細胞において、二重機能性抗体は、ASGPR依存的な細胞質輸送を同様に示した。ASGPRを標的とするために、抗ASGPR抗体（AGA0008）及びpH依存性抗ASGPR抗体（A0841）を用いて二重機能性抗体を調製した。細胞侵入抗体及びASGPR結合抗体から構成される二重機能性抗体（3D8//AGA0008、3D8//A0841、3D8.03//AGA0008、3D8.03//A0841、2C10//AGA0008、2C10//A0841、m3E10.D31N//AGA0008、及びm3E10.D31N//A0841）は、ストレプトアビジンHRP及び抗ヒトIgGによって検出した場合に、3D8//IC17dKn、3D8.03//IC17dKn、2C10//IC17dKn、及びm3E10.D31N//IC17dKnよりも高いシグナルを示した（図１６）。それらの結果は、二重機能性抗体が、ASGPR依存的様式により細胞中にインターナライズして細胞質輸送能を示したことを示している。
【０２４７】
実施例１１
IL6R及びASGPR発現細胞株における二重機能性抗体の細胞質輸送のイメージング解析
イメージング解析を実施して、受容体依存的様式での二重機能性抗体の細胞質侵入能を評価した。実施例２に記載されたのと同様に、表８に列記した抗体を用いて、表９に列記した二重機能性抗体を調製した。IL6Rを標的とするために、抗IL6R抗体MRA及びH54/L28、ならびにpH依存性抗IL6R抗体H237を用いた。ASGPRを標的とするために、抗ASGPR抗体AGA0008を用いた。
HeLa/BirA、HeLa/BirA/IL6R、及びHeLa/ASGPR/BirAの懸濁液を、BioCoat Collagen I Multiwell Plates 96-well Black/clear（Corning, Cat# 354649）に50μL/well（7.5×105細胞/well）で播種した。次いで、細胞を、加湿した5％ CO2、37℃のインキュベーター中で24時間培養した。培養上清を除去した後、細胞を、加湿した5％ CO2、37℃のインキュベーター中で3時間、30μL/wellの培養培地中の3μMの抗体とインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、200 mM Glycine（和光純薬工業, Cat# 077-00735）-HCl（和光純薬工業, Cat# 083-01095）、150 mM NaCl（和光純薬工業, Cat# 191-01665）、pH 2.5において2回洗浄した。次いで、細胞を、4％パラホルムアルデヒド-リン酸緩衝液（ナカライテスク, Cat# 09154-56）により室温で15分間、固定処理し、0.5％ Triton X-100（Bio-rad, Cat# 161-0407）及び5％ FBSを含有するPBSにより透過処理した。透過処理に用いた溶液は、その後の二次抗体とのインキュベーションや洗浄のステップにも用いた。細胞を、1/500希釈したGoat Anti-Human IgG-TRITC（Thermo Fisher Scientific, Cat# A18810）及び1/2000希釈したHoechst33342（Thermo Fisher Scientific, Cat# H3570）と1時間、室温でインキュベートした。2回洗浄した後、細胞を、UV（励起波長375 nm）及び緑色レーザー（励起波長561 nm）を有するIN Cell Analyzer 6000（GE Healthcare）を用いたイメージング解析に供した。
【０２４８】
TRITC及びHoechst33342の蛍光シグナルをマージして、図１７及び１８に示した。細胞質蛍光を、細胞当たりの蛍光シグナルの平均区域サイズとして評価した（図１９）。
図１７及び図１９に示すように、3D8、2C10、及びm3E10.D31Nなどの抗体の細胞質侵入が、HeLa/BirA、HeLa/BirA/IL6R、及びHeLa/ASGPR/BirAの細胞質から検出された。特に、2C10及びm3E10.D31Nは、細胞質だけでなく核にも局在化していた。
IL6Rに対する抗体（MRA、H237、及びH54/L27）及びASGPRに対する抗体（AGA0008）が、それぞれHela/BirA/IL6R及びHeLa/ASGPR/BirAから検出された。しかし、それらの受容体結合抗体は小胞様の蛍光を示し、これは、それらの抗体がエンドソームなどの細胞区画内に捕捉されエンドソームから脱出していなかったことを示唆している。
【０２４９】
細胞侵入抗体である1つのアーム及びKLH結合抗体IC17dKnである1つのアームから構成される一価形態の細胞質侵入抗体（3D8//IC17dKn、2C10//IC17dKn、及びm3E10.D31N//IC17dKn）は、二価形式の3D8、2C10、及びm3E10.D31Nよりも少ないシグナルを示し、これは、細胞質侵入抗体の2つのアームがインターナリゼーションには必要であったことを示した（図１８Ａ〜１８Ｃ及び図１９Ａ〜１９Ｃ）。
IL6Rを標的とする二重機能性抗体（3D8//MRA、3D8//H237、3D8//H54/L28、2C10//MRA、2C10//H237、2C10//H54/L28、m3E10.D31N//MRA、m3E10.D31N//H237、及びm3E10.D31N//H54/L28）は、HeLa/BirA/IL6Rにおいて細胞質侵入を示した（図１８Ｂ及び図１９Ｂ）。それらの結果は、二重機能性抗体が、IL6R媒介様式により細胞中にインターナライズして細胞侵入抗体機能によりエンドソームから脱出することを示している。
ASGPRを標的とする二重機能性抗体は、受容体媒介性インターナリゼーション及び細胞侵入活性を同様に示した。ASGPRを標的とする二重機能性抗体（3D8//AGA0008、2C10//AGA0008、及びm3E10.D31N//AGA0008）は、細胞質における蛍光シグナルを示した（図１８Ｃおよび図１９Ｃ）。それらの結果は、二重機能性抗体が、ASGPR媒介様式により細胞中にインターナライズして細胞侵入抗体機能によりエンドソームから脱出することを示している。
IL6Rを標的とする二重機能性抗体（3D8//MRA、3D8//H237、3D8//H54/L28、2C10//MRA、2C10//H237、2C10//H54/L28、m3E10.D31N//MRA、m3E10.D31N//H237、及びm3E10.D31N//H54/L28）ならびにASGPRを標的とする二重機能性抗体（3D8//AGA0008、2C10//AGA0008、及びm3E10.D31N//AGA0008）は、標的受容体を発現していないHeLa/BirA中への効率的なインターナリゼーションは示さなかった（図１８Ａ及び図１９Ａ）。この結果は、二重機能性抗体形式が、標的受容体を発現していない細胞への抗体のオフターゲット細胞侵入を低減できることを示している。
【０２５０】
2C10//MRA、2C10//H237、2C10//H54/L28、m3E10.D31N//MRA、m3E10.D31N//H237、m3E10.D31N//H54/L28、2C10//AGA0008、及びm3E10.D31N//AGA0008などのそれらの二重機能性抗体のうちのいくつかは、細胞質だけではなく核にも局在化しており、他方、二価形態の細胞侵入抗体である2C10及びm3E10.D31Nは、核への局在化を示した。それらの結果は、細胞侵入抗体及び受容体結合抗体から構成される二重機能性抗体が、受容体媒介様式により細胞質と同様に核に抗体を送達できることを示唆している。
二重機能性抗体形式は、細胞質中への抗体の受容体特異的送達を達成した。それらの結果から、二重特異性抗体形式は、細胞質及び核への抗体の受容体特異的送達を達成した。
【０２５１】
【表８】
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【０２５２】
【表９】
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【０２５３】
実施例１２
IL6R及びASGPR発現細胞株におけるカーゴにコンジュゲートされた二重機能性抗体の細胞質輸送のイメージング解析
二重機能性抗体にコンジュゲートされたカーゴの送達を評価するために、ストレプトアビジン-AlexaFluor647を、ビオチン標識された抗体にコンジュゲートして、イメージング解析に供した。ビオチン標識された抗体は、ビオチンを補給した培養培地中でのExpi293細胞における抗体及びBirAの一過性発現によって調製した。表１０に列記したビオチン標識された抗体を、実施例２に記載されたのと同様に精製して、表１１に列記したビオチン標識された二重機能性抗体を調製するために用いた。ビオチン標識された二重機能性抗体を、等モル量のStreptavidin-AlexaFluor647（Thermo Fisher Scientific, Cat# S32357）と混合して、3μMの最終抗体濃度でHeLa/BirA、HeLa/BirA/IL6R、及びHeLa/ASGPR/BirA細胞とインキュベートした。イメージング解析を、実施例１１に記載されたのと同様に実施した。UV（励起波長375 nm）、青色レーザー（励起波長488 nm）、及び赤色レーザー（励起波長641 nm）を有するIN Cell Analyzer 6000（GE Healthcare）を用いて、それぞれHoechst33342、TRITC標識された抗ヒトIgG、及びAlexaFluor647標識されたストレプトアビジンを検出した。
【０２５４】
図２０および図２１に示すように、IL6Rを標的とする二重機能性抗体（3D8//MRA及び2C10//MRA）ならびにASGPRを標的とする二重機能性抗体（3D8//AGA0008及び2C10//AGA0008）は、それぞれHeLa/BirA/IL6R及びHeLa/ASGPR/BirAにおいて、コントロール抗体3D8//IC17dKn及び2C10//IC17dKnよりも高いAlexaFluor647の蛍光シグナルを示した。それらの二重機能性抗体は、標的受容体を発現しないHeLa/BirA細胞においては蛍光シグナルを示さなかった。この結果は、ストレプトアビジン-AlexaFluor647が、細胞質侵入アーム及び受容体結合アームから構成される二重機能性抗体にコンジュゲートすることによって標的細胞に送達されたことを示している。それらの結果は、二重機能性抗体が、カーゴ分子を、標的受容体抗原を発現する標的細胞の細胞質及び核に送達できることを示唆している。
【０２５５】
【表１０】
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【０２５６】
【表１１】
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【産業上の利用可能性】
【０２５７】
本開示の、細胞質侵入抗原結合分子は、標的細胞の細胞質中に特異的に送達されることができ、治療用、予防用、診断または検出用の抗原結合分子として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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