(57)【要約】  Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、悪性形質細胞上に発現する。本発明は、ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体およびそのようなキメラ抗原受容体を発現する細胞を提供する。ある特定の実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍の成長を阻害することができる。本発明の操作された細胞は、上方制御または誘導されたＢＣＭＡ標的化免疫応答が望まれる、かつ／または治療的に有益である疾患および障害の治療に有用である。例えば、本発明のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する操作された細胞は、多発性骨髄腫を含む様々な癌の治療に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）共刺激ドメインおよびシグナリングドメインを含む細胞質ドメインと、を含むＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記細胞外リガンド結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＢＣＭＡ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含み、任意に、前記抗ＢＣＭＡｓｃＦｖドメインは、前記ＬＣＶＲと前記ＨＣＶＲとの間のリンカーを含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記細胞外リガンド結合ドメインと前記ヒンジとの間のリンカーをさらに含む、請求項１または２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記リンカーは、配列番号９３〜９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記ヒンジ、前記膜貫通ドメイン、またはそれらの両方はＣＤ８αポリペプチドに由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
前記共刺激ドメインは、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
前記シグナリングドメインは、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
前記ＬＣＶＲは、配列番号１０、２６、４２、５８および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
前記ＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号１２−１４−１６、２８−３０−３２、４４−４６−４８、６０−６２−６４、または７６−７８−８０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
前記ＨＣＶＲは、配列番号２、１８、３４、５０および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
前記ＨＣＶＲは、それぞれ、配列番号４−６−８、２０−２２−２４、３６−３８−４０、５２−５４−５６、または６８−７０−７２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
前記ＬＣＶＲは、配列番号１０、２６、４２、５８および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０、２６、４２、５８および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と９５％〜９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＶＲは、配列番号２、１８、３４、５０および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２、１８、３４、５０および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と９５％〜９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
前記ＬＣＶＲは、配列番号１０、２６、４２、５８および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＶＲは、配列番号２、１８、３４、５０および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
前記ｓｃＦｖドメインは、配列番号１０／２、２６／１８、４２／３４、５８／５０または７４／６６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ／ＨＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
前記ヒンジは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
前記膜貫通ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１７】
前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
前記ＣＤ３ゼータシグナリングドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１９】
配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、または配列番号９０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２０】
配列番号８２のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２１】
配列番号８４のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２２】
配列番号８６のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２３】
配列番号８８のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２４】
配列番号９０のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子。
【請求項２６】
配列番号８１、８３、８５、８７および８９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
請求項２５または２６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２８】
前記ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
前記ベクターはレンチウイルスベクターである、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
請求項２５もしくは２６に記載の核酸分子、または請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３１】
前記細胞はヒトＴ細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む操作された細胞。
【請求項３３】
免疫細胞である、請求項３２に記載の操作された細胞。
【請求項３４】
前記免疫細胞は免疫エフェクター細胞である、請求項３３に記載の操作された細胞。
【請求項３５】
前記免疫エフェクター細胞はＴリンパ球である、請求項３４に記載の操作された細胞。
【請求項３６】
前記Ｔリンパ球は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球である、請求項３５に記載の操作された細胞。
【請求項３７】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項３６に記載の操作された細胞。
【請求項３８】
ＢＣＭＡを発現する癌の治療に使用するための、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の操作された細胞。
【請求項３９】
前記ＢＣＭＡを発現する癌は多発性骨髄腫である、請求項３８に記載の操作された細胞。
【請求項４０】
Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＢＣＭＡ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）４−１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞質ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を含む操作されたヒトＴ細胞。
【請求項４１】
前記ｓｃＦｖドメインは、配列番号１０／２、２６／１８、４２／３４、５８／５０または７４／６６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ／ＨＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項４０に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項４２】
前記ヒンジは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む、請求項４０または４１に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項４３】
前記膜貫通ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項４４】
前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項４５】
前記ＣＤ３ゼータシグナリングドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項４６】
配列番号８２のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項４０に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項４７】
配列番号８４のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項４０に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項４８】
配列番号８６のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項４０に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項４９】
配列番号８８のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項４０に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項５０】
配列番号９０のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項４０に記載の操作されたヒトＴ細胞。
【請求項５１】
遺伝子改変ヒトＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、前記遺伝子改変ヒトＴ細胞は、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含む、薬学的組成物。
【請求項５２】
請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の操作された細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項５３】
請求項４０〜５０のいずれか一項に記載の操作された細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項５４】
ＢＣＭＡを発現する癌の治療に使用するための、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
前記ＢＣＭＡを発現する癌は多発性骨髄腫である、請求項５４に記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
ＢＣＭＡを発現する癌の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項２５もしくは２６に記載の核酸分子、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のベクター、請求項３０もしくは３１に記載の細胞、または請求項３２〜３７もしくは４０〜５０のいずれか一項に記載の操作された細胞、の使用。
【請求項５７】
前記ＢＣＭＡを発現する癌は多発性骨髄腫である、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
対象におけるＴリンパ球活性を強化する方法であって、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含むＴリンパ球を前記対象に導入することを含む、方法。
【請求項５９】
癌に罹患している対象を治療するための方法であって、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含むＴリンパ球の治療有効量を前記対象に導入することを含む、方法。
【請求項６０】
対象の標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法であって、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現するために遺伝子改変された細胞の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６１】
対象に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現するために遺伝子改変された細胞の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項６２】
前記対象はヒトである、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象は、多発性骨髄腫、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、白血病およびリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、または小児急性リンパ芽球性白血病に罹患している、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象は多発性骨髄腫に罹患している、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
キメラ抗原受容体を発現するために細胞の集団を操作する方法であって、
（ａ）免疫細胞の集団を提供することと、
（ｂ）請求項１〜２４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を前記免疫細胞に導入することと、
（ｃ）前記核酸分子を発現する条件下で前記免疫細胞を培養することと、
（ｄ）前記細胞表面で前記キメラ抗原受容体を発現する前記免疫細胞を単離することと、を含む、方法。
【請求項６６】
前記核酸分子を導入する前に、対象から前記免疫細胞の集団を取得することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
対象におけるＢＣＭＡを発現する癌を治療する方法であって、
（ａ）請求項６６に記載の細胞の集団を操作することと、
（ｂ）前記キメラ抗原受容体を発現する前記免疫細胞の集団を前記対象に再導入することと、を含む、方法。
【請求項６８】
前記ＢＣＭＡを発現する癌は多発性骨髄腫である、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、２０１９年７月１７日に作成され、６６，９０７バイトを含むファイル１０４５５ＷＯ０１−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み入れる。
【０００２】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的である、そのようなＣＡＲを含む操作された細胞、ならびにそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＴＮＦＲＳＦ１７、またはＣＤ２６９としても既知のＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、シグナルペプチドを欠き、システインに富む細胞外ドメインを含むＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは、密接に関連するタンパク質と共に、発達の異なる段階でＢ細胞の生存を促進する。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞系列細胞、特に胚中心の濾胞間領域、ならびに形質芽球および分化した形質細胞でのみ発現する。ＢＣＭＡは形質細胞の分化中に選択的に誘導され、骨髄中の長寿命の形質細胞の最適な生存に必要である。多発性骨髄腫では、ＢＣＭＡは悪性形質細胞上に高レベルで広く発現しており、ＢＣＭＡの発現は、正常細胞から活動性多発性骨髄腫への進行と共に増加する。ＢＣＭＡはまた、ワルデンストレームマクログロブリン血症、バーキットリンパ腫、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含む、他のＢ細胞悪性腫瘍でも発現する。非特許文献１。
【０００４】
エクスビボで生成された自己抗原特異的Ｔ細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を治療するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるＴ細胞は、抗原特異的Ｔ細胞の拡大または遺伝子操作によるＴ細胞のリダイレクションのいずれかによって生成することができる。
【０００５】
Ｔ細胞の新しい特異性は、トランスジェニックＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子移入によってうまく生成されている（非特許文献２）。ＣＡＲは、単一の融合分子内の１つ以上のシグナリングドメインに関連する標的部分からなる合成受容体である。概して、ＣＡＲの結合部分は、可撓性リンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変フラグメントを含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。第１世代ＣＡＲのシグナリングドメインは、ＣＤ３ゼータの細胞質領域またはＦｃ受容体ガンマ鎖に由来する。第１世代のＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞傷害性をうまくリダイレクトすることが示されている。しかしながら、それらはインビボでの長期の拡大および抗腫瘍活性を提供することができなかった。共刺激分子からのシグナリングドメイン、ならびに膜貫通ドメインおよびヒンジドメインを追加して、第２世代および第３世代のＣＡＲを形成し、ヒトにおいて多少の治験の成功をもたらしている。例えば、Ｂ細胞分化抗原ＣＤ１９に特異的なＣＡＲリダイレクトＴ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療において劇的な有効性を示し、ＴＣＲリダイレクトＴ細胞は固形癌に罹患している患者に利益を示している。Ｓｔａｕｓｓらは、癌の治療に使用するために、例えば、抗原特異的エフェクター機能を強化し、操作されたＴ細胞の毒性を制限するために、治療用ＣＡＲおよびＴＣＲを改変する戦略を記載している（非特許文献３）。
【０００６】
ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞は、ＢＣＭＡを発現する細胞の特異的標的化およびＴ細胞媒介性死滅が望まれる治療環境において有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，７（１１）：１１８７−１１９９，２０１５
【非特許文献２】Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０
【非特許文献３】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２０１５，２４：１１３−１１８
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）共刺激ドメインおよびシグナリングドメインを含む細胞質ドメインと、を含むＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的キメラ抗原受容体を提供する。
【０００９】
場合によっては、細胞外リガンド結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＢＣＭＡ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡｓｃＦｖドメインは、ＬＣＶＲとＨＣＶＲとの間のリンカーを含む。場合によっては、キメラ抗原受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖドメイン）とヒンジとの間のリンカーをさらに含む。場合によっては、リンカーは、配列番号９３〜９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）nリンカーであり、ｎは１〜１０である。
【００１０】
場合によっては、ヒンジ、膜貫通ドメイン、またはそれらの両方はＣＤ８αポリペプチドに由来する。場合によっては、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。場合によっては、シグナリングドメインは、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
場合によっては、ＬＣＶＲは、配列番号１０、２６、４２、５８および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。場合によっては、ＬＣＶＲは、それぞれ、配列番号１２−１４−１６、２８−３０−３２、４４−４６−４８、６０−６２−６４、または７６−７８−８０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。場合によっては、ＨＣＶＲは、配列番号２、１８、３４、５０および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲを含む。場合によっては、ＨＣＶＲは、それぞれ、配列番号４−６−８、２０−２２−２４、３６−３８−４０、５２−５４−５６、または６８−７０−７２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３ドメインを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号１０、２６、４２、５８および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０、２６、４２、５８および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と９５％〜９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲは、配列番号２、１８、３４、５０および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２、１８、３４、５０および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と９５％〜９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＬＣＶＲは、配列番号１０、２６、４２、５８および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲは、配列番号２、１８、３４、５０および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖドメインは、配列番号１０／２、２６／１８、４２／３４、５８／５０、または７４／６６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ／ＨＣＶＲアミノ酸配列対を含む。場合によっては、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、リンカーで、任意にｎ＝１−３の（Ｇ４Ｓ）nリンカーで結合される。
【００１４】
場合によっては、キメラ抗原受容体は、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、または配列番号９０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、上記または本明細書で論じられるキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。場合によっては、核酸分子は、配列番号８１、８３、８５、８７および８９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は、上記または本明細書で論じられる核酸分子を含むベクターを提供する。場合によっては、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、核酸分子、または上記または本明細書で論じられるベクターを含む細胞を提供する。場合によっては、細胞は、ヒトＴ細胞である。
【００１８】
別の態様では、本発明は、上記または本明細書で論じられるようなキメラ抗原受容体を含む操作された細胞を提供する。場合によっては、操作された細胞は、免疫細胞である。場合によっては、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞である。場合によっては、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。
【００１９】
場合によっては、本発明の操作された細胞は、ＢＣＭＡを発現する癌の治療に使用するためのものである。場合によっては、ＢＣＭＡを発現する癌は、多発性骨髄腫である。
【００２０】
別の態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＢＣＭＡ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）４−１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナリングドメインを含む細胞質ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を含む操作されたヒトＴ細胞を提供する。
【００２１】
場合によっては、ｓｃＦｖドメインは、配列番号１０／２、２６／１８、４２／３４、５８／５０または７４／６６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ／ＨＣＶＲアミノ酸配列対を含む。場合によっては、ヒンジは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、膜貫通ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号８２のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号８４のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号８６のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号８８のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。いくつかの実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号９０のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
【００２３】
別の態様では、本発明は、遺伝子改変ヒトＴ細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供し、遺伝子改変ヒトＴ細胞は、上記または本明細書で論じられるようなキメラ抗原受容体を含む。場合によっては、薬学的組成物は、ＢＣＭＡを発現する癌の治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡを発現する癌は多発性骨髄腫である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、上記または本明細書で論じられるような操作された細胞を提供する。場合によっては、薬学的組成物は、ＢＣＭＡを発現する癌の治療に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡを発現する癌は、多発性骨髄腫である。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＢＣＭＡを発現する癌の治療のための薬剤の製造における、上記もしくは本明細書で論じられるようなキメラ抗原受容体、核酸分子、ベクター、細胞、または操作された細胞の使用を提供する。場合によっては、ＢＣＭＡを発現する癌は、多発性骨髄腫である。様々な実施形態では、上記もしくは本明細書で論じられるキメラ抗原受容体、核酸分子、ベクター、細胞、または操作された細胞は、上記または本明細書で論じられる方法のいずれかでの使用が企図される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で論じられるＣＡＲまたは操作された細胞は、上記または本明細書で論じられるように、医薬に使用するためまたは癌の治療に使用するためのものである。
【００２６】
別の態様では、本発明は、上記または本明細書で論じられるようなキメラ抗原受容体を含むＴリンパ球を対象に導入することを含む対象におけるＴリンパ球活性を強化する方法を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、上記または本明細書で論じられるようなキメラ抗原受容体を含むＴリンパ球の治療有効量を対象に導入することを含む癌に罹患している対象を治療するための方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、上記または本明細書で論じられるようなキメラ抗原受容体を発現するために遺伝子改変された細胞の有効量を対象に投与することを含む対象の標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激するための方法を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、対象に抗腫瘍免疫を提供する方法を提供し、この方法は、上記または本明細書で論じられるようなキメラ抗原受容体を発現するために遺伝子改変された細胞の有効量を対象に投与することを含む。
【００３０】
上記で論じられる方法のいくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。場合によっては、対象は、多発性骨髄腫、Ｂ系統急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、白血病およびリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、または小児急性リンパ芽球性白血病に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、多発性骨髄腫に罹患している。
【００３１】
別の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体を発現するために細胞の集団を操作する方法を提供し、この方法は、（ａ）免疫細胞の集団を提供することと、（ｂ）上記または本明細書で論じられるようなキメラ抗原受容体をコードする核酸分子を免疫細胞に導入することと、（ｃ）核酸分子を発現する条件下で免疫細胞を培養することと、（ｄ）細胞表面でキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を単離することと、を含む。場合によっては、この方法は、核酸分子を導入する前に、対象から免疫細胞の集団を取得することをさらに含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、対象におけるＢＣＭＡを発現する癌を治療する方法を提供し、この方法は、（ａ）上記で論じられる方法に従って細胞の集団を操作することと、（ｂ）キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞の集団を対象に再導入することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡを発現する癌は、多発性骨髄腫である。
【００３３】
他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を発現するための例示的なヌクレオチド構築物を示す。例示的なヌクレオチド構築物は、抗ＢＣＭＡ  ＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン、ならびにＣＡＲ形質導入細胞を追跡するためのＩＲＥＳ：ｅＧＦＰ配列を含む。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明を説明する前に、本発明は、特定の方法および説明される実験条件が変わり得るため、このような方法および条件に制限されないことは理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。任意の実施形態または実施形態の特徴は、互いに組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に含まれる。上記または本明細書で論じられる任意の特定の値は、上記または本明細書で論じられる別の関連する値と組み合わせて、範囲の上限および下限を表す値を有する範囲を列挙することができ、そのような範囲は、本開示の範囲内に含まれる。
【００３６】
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用される場合、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本発明で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１、ならびにその間の全値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。
【００３７】
本明細書に記載のものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及される特許、出願、および非特許刊行物はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
定義
本明細書で使用される「ＢＣＭＡ」という表現は、Ｂ細胞成熟抗原を指す。ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７およびＣＤ２６９としても既知）は、悪性形質細胞上に発現する細胞表面タンパク質であり、Ｂ細胞の成熟および免疫グロブリン産生形質細胞への分化の調節において中心的な役割を果たす。本明細書で使用される場合、「ＢＣＭＡ」は、非ヒト種（例えば、「マウスＢＣＭＡ」、「サルＢＣＭＡ」など）に由来するものとして特定されない限り、ヒトＢＣＭＡタンパク質を指す。ヒトＢＣＭＡタンパク質は、配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ＢＣＭＡに結合する抗体」または「抗ＢＣＭＡ抗体」は、ＢＣＭＡを特異的に認識する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。
【００４０】
「リガンド結合ドメイン」および「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書では区別なく使用され、キメラ抗原受容体または所定の抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合する対応する抗体の部分を指す。「対応する抗体」への言及は、キメラ抗原受容体で使用されるＣＤＲまたは可変領域（ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ）が由来する抗体を指す。例えば、実施例２で論じられるキメラ抗原受容体構築物は、特異的抗ＢＣＭＡ抗体に由来する可変領域を有するｓｃＦｖを含む。これらの抗ＢＣＭＡ抗体は、それぞれのキメラ抗原受容体に「対応する抗体」である。
【００４１】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合するか、またはこれと相互作用する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶHと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣH１、ＣH２、およびＣH３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶLと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣL１）を含む。ＶH領域およびＶL領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶHおよびＶLは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本発明の異なる実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【００４２】
本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然の、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、抗体可変ドメインおよび任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準的技術を使用して、完全抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは既知であり、かつ／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な立体配置へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作され得る。
【００４３】
抗原結合フラグメントの非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合フラグメント」という表現に包含される。
【００４４】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成物であり得、一般的に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、または１つ以上のフレームワーク配列とインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶLドメインと結合したＶHドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶHドメインおよびＶLドメインは、任意の適切な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶH−ＶH、ＶH−ＶLまたはＶL−ＶL二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶHドメインまたはＶLドメインを含み得る。
【００４５】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的立体配置としては、（ｉ）ＶH−ＣH１、（ｉｉ）ＶH−ＣH２、（ｉｉｉ）ＶH−ＣH３、（ｉｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２、（ｖ）ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３、（ｖｉ）ＶH−ＣH２−ＣH３、（ｖｉｉ）ＶH−ＣL、（ｖｉｉｉ）ＶL−ＣH１、（ｉｘ）ＶL−ＣH２、（ｘ）ＶL−ＣH３、（ｘｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２、（ｘｉｉ）ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３、（ｘｉｉｉ）ＶL−ＣH２−ＣH３、および（ｘｉｖ）ＶL−ＣLが挙げられる。先に列挙した例示的立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の連結をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いとのおよび／または１つ以上の単量体ＶHドメインもしくはＶLドメイン（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）との非共有結合において、先に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【００４６】
ある特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ヒト抗体である。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが企図される。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突然変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。
【００４７】
抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体など組換え手段によって調製、発現、作成または単離されたすべてのヒト抗体（後述）、組換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照のこと）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成または単離された抗体を含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物が使用される場合は、インビボ体細胞変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶHおよびＶL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶHおよびＶL配列に由来し関連してはいるが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。
【００４８】
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在することができる。第１の形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって一緒に保持されている約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４本鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して連結されておらず、共有結合した軽鎖および重鎖からなる約７５〜８０ｋＤａの分子が形成される（半抗体）。これらの形態は、親和性精製後でさえも分離することが極めて困難とされている。
【００４９】
様々な無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造上の相違によるが、それに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで第２の形態の出現を有意に減少させることができる（Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０：１０５）。本発明は、ヒンジ、ＣH２またはＣH３領域に１つ以上の変異を有する抗体を包含し、例えば産生において、所望の抗体形態の収率を改善するのに望ましい場合がある。
【００５０】
抗体は、単離された抗体であり得る。本明細書で使用される「単離された抗体」は、同定された抗体、ならびにその天然環境の少なくとも１つの成分から分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が天然に存在するかもしくは天然に産生される組織または細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離工程を受けている抗体である。ある特定の実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５１】
本明細書に開示される抗ＢＣＭＡ抗体は、抗体が由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異する（そのような配列変化を本明細書ではまとめて、「生殖系列変異」と称する）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体および抗原結合フラグメントを容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶHおよび／またはＶLドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基はすべて、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持され、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合フラグメントは、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られる抗体および抗原結合フラグメントは、本発明の範囲内に包含される。
【００５２】
抗ＢＣＭＡ抗体は、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体を含み得る。例えば、抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下等の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有し得る。
【００５３】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。エピトープは、立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原上の糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。
【００５４】
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはそのフラグメントを指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下に考察するように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなど、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定される場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【００５５】
ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の割合または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負以外の値を有する任意の変化である。
【００５６】
ポリペプチドに対する配列類似性は、配列同一性とも呼ばれ、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータと共に使用することができるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、各々、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２を参照されたい。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド（デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）など）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されるフラグメント、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成されるフラグメントを指す。核酸分子は、天然に発生するヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）であるモノマー、または天然に発生するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に発生するヌクレオチドのエナンチオマー形態）、または両方の組み合わせからなり得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分におよび／またはピリミジンもしくはプリン塩基部分に変化を有することができる。糖修飾には、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が含まれるか、または糖をエーテルまたはエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を、アザ糖および炭素環式糖類似体などの立体的および電子的に類似した構造に置換することができる。塩基部分の修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換が挙げられる。核酸モノマーを、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結することができる。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。
【００５８】
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するために、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば所望の抗原に対する特異性（例えば、ＢＣＭＡなどの腫瘍抗原）に、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインを組み合わせる分子を指す。概して、ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合した細胞外一本鎖抗体結合ドメイン（ｓｃＦｖ）からなり、Ｔ細胞で発現する場合に、モノクローナル抗体の特異性に基づいて抗原認識をリダイレクトする能力を有する。
【００５９】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、または染色体性、非染色体性、半合成もしくは合成核酸からなり得る線状もくしは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。場合によっては、ベクターは、自律複製（エピソームベクター）および／またはそれらが連結される核酸の発現（発現ベクター）が可能なものである。多数の適切なベクターが当業者に知られており、市販されている。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、はしかおよびセンダイ）、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリア痘）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウィルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルスおよび肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、鳥類白血症−肉腫、哺乳類のＣ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶグループ、およびレンチウイルスが挙げられる。
【００６０】
「共刺激ドメイン」または「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、限定的ではないが増殖のような細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）（配列番号９９）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３などと特異的に結合するリガンドが挙げられる。共刺激分子は、効果的な免疫応答に必要な抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。
【００６１】
「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、シグナルを提供し、これらに限定されないが、増殖活性化、分化などを含むＴ細胞応答を媒介する抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体を結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞の増殖および／または主要分子の上方制御または下方制御をもたらすシグナルを指す。
【００６３】
本明細書で使用される「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンド、例えば細胞表面分子に結合することができるオリゴまたはポリペプチドを指す。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の病状（例えば、癌）に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。リガンドとして作用する細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生感染、自己免疫疾患ならびに癌細胞に関連するものが挙げられる。
【００６４】
本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界のすべてのメンバーを含む。一実施形態では、患者は、癌（例えば、多発性骨髄腫）を有するヒトである。
【００６５】
本明細書で使用される、ＣＡＲの「シグナル伝達ドメイン」または「シグナリングドメイン」は、標的への細胞外リガンド結合ドメインの結合に続いて、細胞内シグナル伝達を担い、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす。言い換えれば、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の少なくとも１つの通常のエフェクター機能の活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞傷害活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。ＣＡＲで使用するためのシグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体の関与に続いて、シグナル伝達を開始するように協力して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体ならびに同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。場合によっては、シグナリングドメインは、抗原依存性一次活性化を開始するもの、および二次または共刺激シグナルをもたらすように抗原非依存的に作用するものの、２つの異なるクラスの細胞質シグナリング配列を含む。一次細胞質シグナリング配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフとして既知のシグナリングモチーフを含み得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合部位として機能を果たす様々な受容体の細胞質内尾部中に見られる詳細に定義されたシグナリングモチーフである。例示的なＩＴＡＭとしては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＦｃＲイプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナリングドメイン（配列番号１００）を含むことができる。
【００６６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞表面上に発現する抗体認識抗原（例えば、癌細胞）に対するＴ細胞特異性をリダイレクトするが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は標的の範囲を拡大して細胞内抗原（例えば、腫瘍抗原）を含む。
【００６７】
本発明の一態様は、悪性形質細胞の表面上に発現するＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。本発明の一実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＡＲは、細胞外標的特異性結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナリングドメイン（ＣＤ３ゼータもしくはＦｃＲガンマに由来するシグナリングドメインなど）、および／または限定的ではないが４−１ＢＢのような共刺激分子に由来する１つ以上の共刺激シグナリングドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲは、細胞外結合ドメインとＣＤ８アルファヒンジなどの膜貫通ドメインとの間のヒンジまたはスペーサー領域を含む。
【００６８】
ＣＡＲの結合ドメインまたは細胞外ドメインは、関心対象の標的抗原に結合する能力を有するＣＡＲを提供する。結合ドメイン（例えば、リガンド結合ドメインまたは抗原結合ドメイン）は、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、または生体分子（例えば、細胞表面受容体もしくは腫瘍タンパク質、もしくはそれらの成分）を特異的に認識および結合する能力を有するペプチドであり得る。結合ドメインは、関心対象の生体分子のための、任意の天然に発生する、合成、半合成、または組換え生成された結合パートナーを含む。例えば、本明細書にさらに記載されるように、結合ドメインは、抗体軽鎖および重鎖可変領域であり得るか、軽鎖および重鎖可変領域は、一本鎖およびいずれかの配向に（例えば、ＶＬ−ＶＨもしくはＶＨ−ＶＬ）互いに結合することができる。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または表面プラズモン共鳴分析（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析を使用）を含む、特定の標的と特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための、様々なアッセイが知られている。抗原は、腫瘍の死滅をもたらすエフェクター免疫応答を誘発することが望ましい、臨床的関心対象の抗原であり得る。一実施形態では、キメラ抗原受容体の結合ドメインの標的抗原は、腫瘍細胞、特に多発性骨髄腫細胞などのＢ細胞系統の腫瘍細胞の表面上のＢＣＭＡタンパク質である。
【００６９】
例示的なリガンド結合ドメインとしては、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体のためのリガンド、またはそれらの受容体結合ドメインなどの抗体の抗原結合フラグメントなどの抗原結合タンパク質、および腫瘍結合タンパク質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明のＣＡＲに含まれる抗原結合ドメインは、可変領域（Ｆｖ）、ＣＤＲ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ドメイン抗体変異体（ｄＡｂ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ）、フィブロネクチン３ドメイン変異体、アンキリンリピート変異体、および他のタンパク質足場に由来する他の抗原特異性結合ドメインであり得る。
【００７０】
一実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、抗ＢＣＭＡ一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、マウス、ヒト、またはヒト化ｓｃＦｖであり得る。一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローン化され得る。可変領域重鎖（ＶＨ）および可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングに使用できる技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３−３８３７に記載されている。したがって、ある特定の実施形態では、結合ドメインは、抗体由来の結合ドメインを含むが、非抗体由来の結合ドメインであり得る。抗体由来の結合ドメインは、抗体のフラグメント、または抗体の１つ以上のフラグメントの遺伝子操作された生成物であり得、そのフラグメントは、抗原との結合に関与している。
【００７１】
ある特定の実施形態では、本発明のＣＡＲは、分子の適切な間隔および立体配座のために追加された、様々なドメイン間のリンカーを含み得る。例えば、一実施形態では、結合ドメインＶＨまたはＶＬの間に、１〜１０アミノ酸長であり得るリンカーが存在し得る。他の実施形態では、キメラ抗原受容体のドメインのいずれかの間のリンカーは、１〜２０または２０アミノ酸長の間であり得る。これに関して、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長であり得る。さらなる実施形態では、リンカーは、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸長であり得る。本明細書に記載の数を含む範囲もまた本明細書に含まれ、例えば、１０〜３０アミノ酸長のリンカーである。
【００７２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲでの使用に適したリンカーは、可撓性リンカーである。適切なリンカーは容易に選択することができ、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）〜２０アミノ酸、２アミノ酸〜１５アミノ酸、４アミノ酸〜１０アミノ酸、５アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、または７アミノ酸〜８アミノ酸を含む３アミノ酸〜１２アミノ酸などの異なる長さの適切なもののいずれかであり得、１、２、３、４、５、６または７アミノ酸であり得る。
【００７３】
例示的な可撓性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および当技術分野で既知の他の可撓性リンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されていないため、本明細書に記載のＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間で中性つなぎ鎖として機能することができる。グリシンは、アラニンよりもはるかに多くのファイ−プシー空間にアクセスし、より長い側鎖を持つ残基よりはるかに制限が少なくなる（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）を参照）。当業者は、ＣＡＲの設計が、すべてまたは部分的に可撓性であるリンカーを含み得、その結果、リンカーは、可撓性リンカー、および所望のＣＡＲ構造を提供するためのより可撓性でない構造を付与する１つ以上の部分を含み得ることを認識するであろう。特異的リンカーとしては、（Ｇ４Ｓ）nリンカー（ｎ＝１〜３、配列番号９５〜９７に示されるような）、および配列番号９６に示されるリンカーが挙げられる。
【００７４】
ＣＡＲの結合ドメインの後には、「スペーサー」または「ヒンジ」が続く場合があり、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から遠ざけて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。ＣＡＲのヒンジ領域は、概して、膜貫通（ＴＭ）と結合ドメインとの間にある。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリンヒンジ領域であり、野生型免疫グロブリンヒンジ領域または改変された野生型免疫グロブリンヒンジ領域であり得る。本明細書に記載のＣＡＲで使用される他の例示的なヒンジ領域には、ＣＤ８アルファ、ＣＤ４、ＣＤ２８およびＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が含まれ、これらはこれらの分子からの野生型ヒンジ領域であり得るか、または改変され得る。一実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８アルファヒンジ（配列番号９７）を含む。
【００７５】
「膜貫通」領域またはドメインは、細胞外結合部分を免疫エフェクター細胞の血漿細胞膜に固定し、標的抗原への結合ドメインの結合を促進するＣＡＲの部分である。膜貫通ドメインはＣＤ３ゼータ膜貫通ドメインであり得るが、使用され得る他の膜貫通ドメインとしては、ＣＤ８アルファ、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４から得られるものが挙げられる。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ１３７の膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは合成であり、その場合、それは、ロイシンおよびバリンなどの主に疎水性残基を含むであろう。
【００７６】
「細胞内シグナリングドメイン」または「シグナリングドメイン」は、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖およびＣＡＲ結合標的細胞に対する細胞傷害性因子の放出を含む細胞傷害活性、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合によって誘発される他の細胞応答などの、標的抗原に結合する効果的なＣＡＲのメッサージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達し、エフェクター細胞機能を誘発することに関与するキメラ抗原受容体タンパク質の部分を指す。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞傷害活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルプまたは活性であり得る。したがって、本明細書で区別なく使用される「細胞内シグナリングドメイン」または「シグナリングドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナリングドメイン全体を使用できるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナリングドメインの短縮部分が使用される限り、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、そのような短縮部分は、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内シグナリングドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナリングドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。細胞内シグナリングドメインは「シグナル伝達ドメイン」としても既知であり、典型的には、ヒトＣＤ３またはＦｃＲｙ鎖の一部に由来する。
【００７７】
Ｔ細胞受容体のみを介して生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次刺激または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、抗原依存性一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナリング配列）および二次または共刺激シグナルをもたらすように抗原非依存的に作用するもの（二次細胞質シグナリング配列）の、２つの異なるクラスの細胞質シグナリング配列によって媒介されると言うことができる。共刺激的に作用する細胞質シグナリング配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして既知のシグナリングモチーフを含み得る。
【００７８】
本発明で特に有用な一次細胞質シグナリング配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。１つの特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ゼータに由来する。いくつかの実施形態では、シグナリングドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナリングドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分を指す。共刺激分子は、抗原に結合するとＴリンパ球の効果的な活性化および機能に必要な第二のシグナルを提供する、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。そのような共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＤ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ２およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられる。したがって、本開示は、ＣＤ３ゼータおよび４−１ＢＢに由来する例示的な共刺激ドメインを提供するが、他の共刺激ドメインは、本明細書に記載のＣＡＲと共に使用することが企図されている。１つ以上の共刺激シグナリングドメインを含めることにより、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および拡大が促進され得る。細胞内シグナリングおよび共刺激シグナリングドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に任意の順序で直列に連結することができる。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。
【００８０】
ＣＤ３またはＦｃＲガンマからのシグナリングドメインを含むように操作されたｓｃＦｖベースのＣＡＲは、Ｔ細胞活性化およびエフェクター機能のための強力なシグナルを伝達することが示されているが、それらは、付随する共刺激シグナルの非存在下でＴ細胞生存および拡大を促進するシグナルを誘発するには十分ではない。結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメインおよび１つ以上の共刺激シグナリングドメインを有するＣＤ３ゼータまたはＦｃＲガンマに由来するシグナリングドメイン（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４およびＣＤ２７８に由来する細胞内共刺激ドメイン）を含む他のＣＡＲは、抗腫瘍活性、ならびにインビトロでＴ細胞を発現するＣＡＲにおいて、および動物モデルおよび癌患者において、増加したサイトカイン分泌、溶解性活性、生存およびＴ細増殖をより効果的に配向し得る（Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００９；１７：１４５３−１４６４；Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１０；１８：４１３−４２０；Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００９；１０６：３３６０−３３６５）。
【００８１】
本発明のＢＣＭＡ  ＣＡＲは、（ａ）結合ドメインとしての抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ（表１で同定されるＢＣＭＡ抗体のうちの１つ以上からの結合領域（例えば、ＣＤＲまたは可変ドメイン）を有するｓｃＦｖ）と、（ｂ）ヒトＣＤ８アルファに由来するヒンジ領域と、（ｃ）ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメインと、（ｄ）ヒトＴ細胞受容体ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３）細胞内シグナリングドメイン、および任意に１つ以上の共刺激シグナリングドメイン（例えば４−１ＢＢ）と、を含む。一実施形態では、異なるタンパク質ドメインは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、結合ドメイン、ヒンジ領域、および膜貫通ドメインの順序で配置されている。細胞内シグナリングドメインおよび任意の共刺激シグナリングドメインは、膜貫通型カルボキシ末端に任意の順序で直列に連結されて、一本鎖キメラポリペプチドを形成する。一実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする核酸構築物は、異なるコード配列、例えば、（５’〜３’）ヒト抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖのコード配列、ヒトＣＤ８アルファ−ヒンジ、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメインおよびＣＤ３ゼータ細胞内シグナリングドメイン、を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。別の実施形態では、ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする核酸構築物は、異なるコード配列、例えば、（５’〜３’）ヒト抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖのコード配列、ヒトＣＤ８アルファ−ヒンジ、ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータ共刺激ドメイン、を含む核酸分子を含むキメラ核酸分子である。
【００８２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ベクターに挿入される。ベクターは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが共有結合的に挿入して、そのタンパク質の発現および／またはポリヌクレオチドのクローニングをもたらすことができるビヒクルである。そのようなベクターは、「発現ベクター」と呼ばれることもある。単離されたポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の方法を使用してベクターに挿入することができ、例えば、限定するものではないが、適切な制限酵素を使用してベクターを消化し、次に対応する制限末端を有する単離されたポリヌクレオチドと結合することができる。発現ベクターは、細胞内で転写することができる遺伝子生成物の少なくとも一部をコードする非相同的または修飾核酸配列を組み込んで発現する能力を有する。ほとんどの場合、次にＲＮＡ分子はタンパク質に翻訳される。発現ベクターは、特定の宿主生物において機能的に連結されたコード配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列を指す様々な制御配列を含むことができる。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能にも作用する核酸配列を含み得、以下で論じられる。発現ベクターは、追加の要素を含み得、例えば、発現ベクターは、２つの複製システムを有し得、したがって、それを２つの生物、例えば、発現のためのヒト細胞ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において、維持することを可能にする。
【００８３】
発現ベクターは、ＣＭＶ、ＰＧＫおよびＥＦ１アルファプロモーター、リボソーム認識および結合ＴＡＴＡボックスなどのプロモーター配列などの必要な５’上流および３’下流の調節要素、ならびにそれぞれの宿主細胞における効果的な遺伝子転写および翻訳のための３’ＵＴＲ  ＡＡＵＡＡＡ転写終結配列を有し得る。他の適切なプロモーターとしては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターの構成型プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢＶ最初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスプロモーターが挙げられる。アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターを含むがこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターも使用することができる。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターはまた、キメラ抗原受容体を発現するベクターの一部として企図される。これは、関心対象のポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターまたはテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
発現ベクターは、発現されたＣＡＲに組み込まれる６ｘ−ヒスチジン、ｃ−Ｍｙｃ、およびＦＬＡＧタグなどの追加の配列を有し得る。したがって、発現ベクターは、発現ベクターに運ばれる関心対象の核酸（複数可）の効果的な転写を促進もしくは増強することができるエンハンサー配列、プロモーター領域および／またはターミネーター配列として時に作用することができる、５’および３’の非翻訳調節配列を含むように操作され得る。発現ベクターはまた、特定の細胞型、細胞位置、または組織型における複製および／または発現機能（例えば、転写および翻訳）のために操作され得る。発現ベクターは、宿主またはレシピエント細胞におけるベクターの維持のための選択可能なマーカーを含み得る。
【００８５】
様々な実施形態では、ベクターは、プラスミド、自己複製配列、および転移因子である。追加の例示的なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターの例は、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）バイシストロン性発現システム（Ｎｅｏ）ベクター（Ｃｌｏｎｔｒｃｈ）、哺乳類細胞の発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、例えばｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、および哺乳類細胞のレンチウイルス媒介性遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ６．２Ｎ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。本明細書に開示されるＣＡＲのコード配列は、哺乳類細胞におけるキメラタンパク質の発現のためにそのような発現ベクターに連結され得る。
【００８６】
ある特定の実施形態では、本発明のＣＡＲをコードする核酸は、ウイルスベクターで提供される。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、またはフォーミーウイルスに由来するものであり得る。本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載の様々なキメラタンパク質のコード配列を含むことができる。ベクターおよび／または粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸をインビトロまたはインビボのいずれかで細胞に移入する目的で利用することができる。多数の形態のウイルスベクターは、当技術分野で知られている。
【００８７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのコード配列を含むウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的および機能的遺伝子要素を含むベクターを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来する、ＬＴＲの外側の構造的および機能的遺伝的要素を含むベクターを指す。
【００８８】
本明細書で使用するレトロウイルスベクターは、任意の既知のレトロウイルス（例えば、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンド、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびニワトリ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などのｃ型レトロウイルス）に由来することができる。本発明の「レトロウイルス」としては、また、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２、ならびにヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ免疫不全症ウイルス（ＥＩＶ）および他のクラスのレトロウイルスなどのレトロウイルスのレンチウイルスファミリーが挙げられる。
【００８９】
本明細書で使用するためのレンチウイルスベクターは、ゆっくりと進行する疾患を引き起こすレトロウイルス群（または属）であるレンチウイルスに由来するベクターを指す。この群に含まれるウイルスとしては、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含むヒト免疫不全症ウイルス）、ビスナ−マエディ、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。組換えレンチウイルスの調製は、ＤｕｌｌらおよびＺｕｆｆｅｒｅｙらによる方法を使用して達成することができる（Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９８；７２：８４６３−８４７１およびＺｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７２：９８７３−９８８０）。
【００９０】
本発明で使用するためのレトロウイルスベクター（すなわち、レンチウイルスおよび非レンチウイルスの両方）は、本明細書に記載の順序および方向で所望のＤＮＡ配列を組み合わせることにより、標準的なクローニング技術を使用して形成することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ９．１０−９．１４  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌｓ；Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ３：６４１−６４７；Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５号；ならびにＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３号）。
【００９１】
ベクターの形成に使用するためのレトロウイルス（すなわち、レンチウイルスおよび非レンチウイルスの両方）配列を取得するための適切な供給源としては、例えば、Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄを含む市販の供給源から入手可能なゲノムＲＮＡおよびｃＤＮＡが挙げられる。この配列は、化学的に合成することもできる。
【００９２】
ＢＣＭＡ  ＣＡＲの発現のために、ベクターを宿主細胞に導入して、宿主細胞内でのポリペプチドの発現を可能にすることができる。発現ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能なマーカーおよびシグナル配列を含むがこれらに限定されない、発現を制御するための様々な要素を含み得る。これらの要素は、上記のように、当業者によって適切に選択され得る。例えば、プロモーター配列は、ベクター中のポリヌクレオチドの転写を促進するように選択され得る。適切なプロモーター配列としては、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの転写を増強するために、エンハンサー配列を選択することができる。選択可能なマーカーは、ベクターと共に挿入された宿主細胞をそうでないものから選択できるように選択することができ、例えば、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性を付与する遺伝子であり得る。シグナル配列は、発現されたポリペプチドが宿主細胞の外に輸送されることを可能にするように選択され得る。
【００９３】
ポリヌクレオチドのクローニングのために、ベクターを宿主細胞（単離された宿主細胞）に導入して、ベクター自体の複製を可能にし、それにより、そこに含まれるポリヌクレオチドのコピーを増幅することができる。クローニングベクターとしては、一般的に、複製起点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、および選択可能なマーカーが挙げられるがこれらに限定されない、配列成分を含み得る。これらの要素は、当業者によって適切に選択され得る。例えば、複製起点は、宿主細胞におけるベクターの自律複製を促進するように選択され得る。
【００９４】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含む宿主細胞は、ベクターに含まれるポリヌクレオチドの発現またはクローニングに有用であり得る。適切な宿主細胞としては、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞などの高等真核細胞が挙げられ得るが、これらに限定されない。この目的のために適切な原核細胞としては、グラム陰性菌またはグラム陽性菌などの真正細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属（例えば、ネズミチフス菌）、Ｓｅｒｒａｔｉａ属（例えばセラチナ菌）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ属などの腸内細菌科、ならびに枯草菌およびリケニホルミス菌などの桿菌、緑膿菌などのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明のＣＡＲは、当技術分野で既知のトランスフェクションおよび／または形質導入技術を使用して宿主細胞に導入される。本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」および「形質導入」という用語は、外因性核酸配列が宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸は、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれ得るか、または染色体外に維持され得る。核酸は一時的に維持され得るか、または安定した導入であり得る。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染症、および微粒子銃を含むがこれらに限定されない当技術分野で既知の様々な方法によって達成され得る。形質導入とは、トランスフェクションではなくウイルス感染によるウイルスまたはレトロウイルスベクターを用いた遺伝子（複数可）の送達を指す。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、細胞と接触する前にベクターをビリオンにパッケージングすることによって形質導入される。例えば、レトロウイルスベクターによって運ばれるＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする核酸は、感染およびプロウイルスの組み込みを介して細胞に形質導入することができる。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞内の全遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝物質の添加を指す。「遺伝子改変された細胞」、「改変された細胞」、および「リダイレクト細胞」という用語は、区別なく使用される。
【００９７】
特に、本発明のＣＡＲは、関心対象の標的抗原、例えば、悪性形質細胞、例えば多発性骨髄腫にそれらの特異性をリダイレクトするように、免疫エフェクター細胞に導入および発現される。
【００９８】
本発明は、本明細書に記載されるように、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞を有する対象などの対象から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含み、その結果、免疫エフェクター細胞は本明細書に記載されるような１つ以上のＣＡＲを発現する。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、個体から単離され、インビトロでさらに操作することなく遺伝子改変される。次に、そのような細胞は、個体に直接再投与することができる。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前に、最初に活性化され、刺激されて、インビトロで増殖する。これに関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前または後に培養され得る（すなわち、本明細書に記載されるように、ＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされ得る）。
【００９９】
本明細書に記載の免疫エフェクター細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、細胞の供給源を対象から得られ得る。特に、本明細書に記載されるようなＣＡＲと共に使用するための免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺の問題、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、複数の供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ分離などの当業者に知られている任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。一実施形態では、個体の循環血液からの細胞は、アフェレシスによって得られる。アフェレシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含む。一実施形態では、アフェレシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿分画を除去し、その後の処理のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。本発明の一実施形態では、細胞をＰＢＳで洗浄する。代替の実施形態では、洗浄された溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠くか、またはすべてではないにしても多くの二価カチオンを欠く可能性がある。当業者によって認識されるように、洗浄工程は、半自動フロースルー遠心分離機を使用することなど、当業者に知られている方法によって達成することができる。洗浄後、細胞を様々な生体適合性緩衝液または緩衝液の有無にかかわらず他の生理食塩水に再懸濁することができる。ある特定の実施形態では、アフェレシスサンプルの望ましくない成分は、細胞に直接再懸濁された培養培地において除去され得る。
【０１００】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって単球を枯渇させることによって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特異的亜集団は、ポジティブまたはネガティブの選択技術によってさらに単離することができる。例えば、ネガティブの選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブに選択された細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせで達成することができる。本明細書で使用する１つの方法は、ネガティブに選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、磁性免疫付着を介する細胞選別および／もしくは選択またはフローサイトメトリーである。例えば、ネガティブの選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルには、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体が含まれる。フローサイトメトリーおよび細胞選別はまた、本発明で使用するための関心対象の細胞集団を単離するために使用され得る。
【０１０１】
ＰＢＭＣは、本明細書に記載されるような方法を使用して、ＣＡＲによる遺伝子改変に直接使用され得る。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球がさらに単離され、ある特定の実施形態では、細胞傷害性およびヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子改変および／または拡大の前または後のいずれかで、ナイーブ、メモリー、およびエフェクターＴ細胞亜集団に分類することができる。ＣＤ８＋細胞は、標準的な方法を使用して得ることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、これらのタイプのＣＤ８＋細胞のそれぞれに関連する細胞表面抗原を同定することによって、ナイーブ、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞にさらに分類される。実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体で染色した後、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋分画に分類される。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴＣＭの表現型マーカーの発現としては、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３およびＣＤ１２７が挙げられ、グランザイムＢに対してネガティブである。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８およびＣＤ１２７に対してネガティブであり、グランザイムＢおよびパーフォリンに対してポジティブである。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ  １２７、およびＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はさらに亜集団に分類される。例えば、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞に分類することができる。ＣＤ４＋リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２ＬポジティブおよびＣＤ４５ＲＯポジティブである。いくつかの実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯネガティブである。
【０１０３】
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、既知の方法を使用して単離した後に、遺伝子改変することでき、または免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前にインビトロで、活性化および拡大（または前駆体細胞の場合は分化）することができる。別の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体で遺伝子改変され（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターで形質導入される）、その後、インビトロで活性化および拡大される。Ｔ細胞を活性化および拡大するための方法は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第６，９０５，８７４号；米国特許第６，８６７，０４１号；米国特許第６，７９７，５１４号；ＷＯ２０１２／０７９０００に記載されている。概して、そのような方法は、通常、ＩＬ−２などの適切なサイトカインを含む培地においてビーズまたは他の表面に付着させた、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体などの刺激性剤および共刺激剤を有するＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を接触させることを含む。同じビーズに付着させた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体は、「代理」抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する。他の実施形態では、Ｔ細胞は、米国特許第６，０４０，１７７号；米国特許第５，８２７，６４２号；およびＷＯ２０１２／１２９５１４に記載されているような方法を使用して、フィーダー細胞ならびに適切な抗体およびサイトカインと増殖するように活性化および刺激され得る。
【０１０４】
本発明は、ＢＣＭＡ発現腫瘍、例えば、多発性骨髄腫によって引き起こされる悪性腫瘍を有する患者の治療のための改変免疫エフェクター細胞の集団を提供し、改変免疫エフェクター細胞は、本明細書に開示されるようなＢＣＭＡ  ＣＡＲを含む。
【０１０５】
本明細書に記載されるように調製されたＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、既知の技術、または本開示に基づいて当業者に明らかであるそれらの変形形態による養子免疫療法のための方法および組成物において利用され得る。例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号を参照されたい。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号も参照されたい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、細胞は、最初にそれらの培養培地からそれらを採取し、次に、治療有効量での投与に適した培地および容器システム（「薬学的に許容される」担体）で細胞を洗浄および濃縮することによって処方される。適切な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には通常の生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ  Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であり得るが、５％ブドウ糖水溶液またはリンガーの乳酸も利用できる。注入培地は、ヒト血清アルブミンで補充することができる。
【０１０７】
少なくとも２細胞（例えば、少なくとも１つのＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞および少なくとも１つのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット）であるか、またはより一般的には１０2細胞を超え、最大１０6まで、最大１０8もしくは１０9細胞を含み、１０10細胞超であり得る。細胞の数は、その中に含まれる細胞の種類と同様に、組成物が意図される最終的な用途に依存するであろう。
【０１０８】
細胞は、治療を受けている患者に対して自己または異種であり得る。必要に応じて、治療としては、免疫応答の誘導を増強するための本明細書に記載されるような、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカインおよび／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８およびＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与も挙げられ得る。
【０１０９】
本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団は、単独で、または希釈剤および／またはＩＬ−２または他のサイトカインまたは細胞集団などの他の成分と組み合わせて薬学的組成物として投与することができる。簡潔に説明すると、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されるようなＴ細胞などのＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞集団を含み得る。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；ブドウ糖、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；水酸化アルミニウムなどのアジュバント；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは静脈内投与用に処方される。
【０１１０】
本明細書に記載の方法、または他の当技術分野で既知の他の方法を使用して、本明細書に記載のＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与することによって対象に誘導される抗腫瘍免疫応答は、感染細胞、制御性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞応答を死滅することができる細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化して抗体産生をもたらすことができるヘルパーＴ細胞によって主に媒介される体液性免疫応答も、誘導される可能性がある。当技術分野で十分に説明されている、本発明の組成物によって誘導される免疫応答のタイプを分析するために、様々な技術を使用することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ）。
【０１１１】
したがって、本発明は、本明細書に記載されるようなＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の治療有効量を個体に投与することを含む、多発性骨髄腫などの骨髄の免疫グロブリン産生血漿細胞の異常な蓄積を部分的に特徴とする造血悪性腫瘍と診断されるまたは有する疑いがある、もしくは発病するリスクがある個体を治療する方法を提供する。
【０１１２】
一実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡを発現する癌と診断された対象から免疫エフェクター細胞を取り除くことと、本発明のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターで上記の免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することと、それにより、改変免疫エフェクター細胞の集団を形成することと、同じ対象に改変免疫エフェクター細胞の集団を投与することと、を含むＢＣＭＡを発現する癌と診断された対象を治療する方法を提供する。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０１１３】
本明細書に記載の細胞組成物を投与するための方法は、対象において本発明のＣＡＲを直接発現するか、対象に導入されるとＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の遺伝子改変前駆細胞の再導入のいずれかである、エクスビボ遺伝子改変免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに効果的である任意の方法を含む。１つの方法は、本発明に従って核酸構築物を用いてエクスビボで末梢血Ｔ細胞を形質導入することと、対象に形質導入細胞を戻すことと、を含む。
【０１１４】
キメラ抗原受容体および対応する抗体の結合特性
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体または対応する抗体が、例えば、細胞表面タンパク質もしくはそのフラグメントなどの所定の抗原のいずれかへ結合する文脈における「結合」という用語は、最低２つの実体もしくは抗原結合ドメイン：抗原相互作用などの分子構造間の相互作用または会合を指す。
【０１１５】
例えば、結合親和性は、リガンドとして抗原を、分析物（または抗リガンド）として抗体またはキメラ抗原受容体を使用して、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定される場合、典型的には約１０-7Ｍ以下、例えば約１０-8Ｍ以下、例えば約１０-9Ｍ以下のＫD値に対応する。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）結合アッセイなどの細胞ベースの結合戦略もまた日常的に使用されており、ＦＡＣＳデータは放射性リガンド競合結合およびＳＰＲ（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ、ＣＡ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７，２０１（２）：２２３−３１；Ｇｅｕｉｊｅｎ，ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５，３０２（１−２）：６８−７７）などの他の方法とよく相関する。
【０１１６】
したがって、本発明のキメラ抗原受容体または対応する抗体は、非特異的抗原（例：ＢＳＡ、カゼイン）へ結合するその親和性よりも少なくとも１０倍低いＫD値に対応する親和性を有する所定の抗原または細胞表面分子に結合する。本発明によると、非特異的抗原よりも１０倍以下の低いＫD値を有するキメラ抗原受容体または対応する抗体の親和性は、検出不可能な結合とみなされ得る。
【０１１７】
用語「ＫD」（Ｍ）は、特定の抗原結合ドメイン：抗原相互作用の解離平衡定数、または抗原に対応する抗体の解離平衡定数を指す。ＫDと結合親和性との間には逆の関係があり、したがって、ＫD値が小さいほど、親和性は高い、すなわちより強い。したがって、「より高い親和性」または「より強い親和性」という用語は、相互作用を形成するより高い能力、つまりより小さいＫD値に関し、逆に「より低い親和性」または「より弱い親和性」という用語は、相互作用を形成するより低い能力、つまりより大きなＫD値に関する。状況によっては、他の相互作用パートナー分子（例えば抗原Ｙ）に対する分子（例えば、キメラ抗原受容体または対応する抗体）の結合親和性と比較して、その相互作用パートナー分子（例えば抗原Ｘ）に対する特定の分子（例えば、キメラ抗原受容体または対応する抗体）のより高い結合親和性（またはＫD）は、より大きなＫD値（より低い、またはより弱い、親和性）をより小さなＫD（より高い、またはより強い、親和性）で割ることによって決定される結合比として表され、例えば、場合によって５倍または１０倍高い結合親和性として表される。
【０１１８】
用語「ｋd」（ｓｅｃ−１または１／ｓ）は、特定の抗原結合ドメイン：抗原相互作用の解離速度定数、またはキメラ抗原受容体もしくは対応する抗体の解離速度定数を指す。その値はｋoff値とも呼ばれる。
【０１１９】
用語「ｋa」（Ｍ−１×ｓｅｃ−１または１／Ｍ）は、特定の抗原結合ドメイン：抗原相互作用の会合速度定数、またはキメラ抗原受容体もしくは対応する抗体の会合速度定数を指す。
【０１２０】
「ＫA」（Ｍ−１または１／Ｍ）という用語は、特定の抗原結合ドメイン：抗原相互作用の会合平衡定数、またはキメラ抗原受容体または対応する抗体の会合平衡定数を指す。会合平衡定数は、ｋaをｋdで割ることによって得られる。
【０１２１】
「ＥＣ５０」または「ＥＣ50」という用語は、最大半量の有効濃度を指し、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間の中間で応答を誘導するキメラ抗原受容体の濃度を含む。ＥＣ50は本質的に、その最大効果の５０％が観察されるキメラ抗原受容体の濃度を表す。ある特定の実施形態では、ＥＣ50値は、例えばＦＡＣＳ結合アッセイによって決定された場合に、抗原（例えば、ＢＣＭＡなどの腫瘍関連抗原）を発現する細胞に最大半量の結合を与える本発明のキメラ抗原受容体または対応する抗体の濃度に等しい。したがって、低下したまたは弱い結合は、ＥＣ50の増加、または最大半量の有効濃度値で観察される。
【０１２２】
一実施形態では、結合の低下は、最大半量の標的細胞への結合を可能にするＥＣ50キメラ抗原受容体または対応する抗体濃度の増加として定義することができる。
【０１２３】
キメラ抗原受容体の配列変異体
本明細書のキメラ抗原受容体は、対応する抗体の個々の抗原結合ドメインが由来した対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明のキメラ抗原受容体は、本明細書に開示する例示的なＣＤＲまたは可変領域アミノ酸配列のいずれかに由来する抗原結合ドメインを含んでもよく、１つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、対応する抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へ変異する（このような配列変化はまとめて、「生殖系列変異」と本明細書で呼ばれる）。当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはこれらの組み合わせを含む多数の抗体を容易に産生することができる。特定の実施形態において、ＶHドメインおよび／またはＶLドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基はすべて、抗原結合ドメインが由来した元の生殖系列配列において認められる残基へと戻り変異する。他の実施形態では、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗原結合ドメインが本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、抗原結合ドメインは、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異のいずれかの組み合わせを含有してもよく、例えば、特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は維持され、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。
【０１２４】
キメラ抗原受容体および対応する抗体の生物学的特性
本発明は、高い親和性（例えば、ナノモル以下のＫD値）を有するヒトＢＣＭＡに結合する抗体に由来する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を含む。
【０１２５】
ある特定の実施形態によると、本発明は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、約５ｎＭ未満のＫDを有するヒトＢＣＭＡ（例えば２５℃で）に結合する対応する抗体に由来する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を含む。ある特定の実施形態では、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、対応する抗体は、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、または約２５ｐＭ未満のＫDを有するＢＣＭＡに結合する。
【０１２６】
本発明はまた、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、約１０分超または約１２５分超の解離半減期（ｔ1/2）を有するＢＣＭＡに結合する対応する抗体に由来する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を含む。ある特定の実施形態では、２５℃での表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、対応する抗体は、約３分超、約４分超、約１０分超、約２０分超、約３０分超、約４０分超、約５０分超、約６０分超、約７０分超、約８０分超、約９０分超、約１００分超、約１１０分超、または約１２０分超のｔ1/2を有するＢＣＭＡに結合する。
【０１２７】
本発明はまた、ＦＡＣＳ結合アッセイよって決定された場合に、内因性ＢＣＭＡ（例えば、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＭＯＬＰ−８、またはＯＭＰ−２）を発現するヒト細胞株に特異的に結合する対応する抗体に由来する抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体を含む。
【０１２８】
本発明は、また、（ｉ）ＢＣＭＡを発現する細胞によって活性化される、および／または（ｉｉ）ヒト多発性骨髄腫異種移植片を保有する免疫不全マウスにおける腫瘍成長の阻害を示す、ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体を発現する操作された細胞を含む。
【０１２９】
抗原結合ドメインの調製
特定の抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的な、本発明のキメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは、当技術分野で既知の任意の抗体産生技術によって調製することができる。ある特定の実施形態では、本発明の対応する抗体の１つ以上の個々の成分（例えば、重鎖および軽鎖）は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体に由来する。そのような抗体を作製するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、重鎖および／または軽鎖のうちの１つ以上は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術を使用して調製することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術（または任意の他のヒト抗体生成技術）を使用して、特定の抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に対する高親和性キメラ抗体が、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有して最初に単離される。抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特性について特徴付けられ、選択される。本明細書で論じられるように、次に、これらのヒト可変領域（またはＣＤＲ）は、キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインに組み込まれ得る。
【０１３０】
ポリヌクレオチドおよびベクター
本発明はまた、本明細書で論じられるキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドおよびベクターに関する。
【０１３１】
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または哺乳類宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスなどのプラスミドもしくはウイルスベクター）を含み得る。
【０１３２】
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７もしくは配列番号８９のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８もしくは配列番号９０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターは、配列番号９７、配列番号９８、配列番９９もしくは配列番号１００のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を操作する方法
本発明は、エクスビボで、そのような免疫細胞に、本明細書に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体の１つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを導入することを含む免疫療法のための免疫細胞を調製する方法を包含する。
【０１３４】
本発明はまた、本明細書に記載のＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体の１つをコードするポリヌクレオチドまたはレンチウイルスベクターを含む免疫細胞を包含する。いくつかの実施形態では、これらの免疫細胞は、免疫療法（例えば、癌の治療）に使用される。
【０１３５】
本発明はまた、同種異系間移植により適したものにするために免疫細胞を遺伝子改変する方法を包含する。第１の態様によれば、例えば、免疫細胞は、ＷＯ２０１３／１７６９１５に記載されるようにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の１つ以上の成分を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって同種異系にすることができ、それはＨＬＡまたはβ２ｍのタンパク質発現をコードするまたは調節する遺伝子の不活性化と組み合わせることができる。したがって、移植片対宿主症候群および移植片拒絶のリスクは大幅に減少する。本発明のさらなる態様によれば、免疫細胞は、ＰＤ１またはＣＴＬＡ−４などのＴ細胞活性化の制御因子として作用する「免疫チェックポイント」として作用するタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、より活性化または消耗を制限するようにさらに操作することができる。
【０１３６】
操作された免疫細胞
本発明のキメラ抗原受容体を含む免疫細胞（または操作された免疫細胞）は、本発明の別の目的である。場合によっては、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞である。場合によっては、免疫細胞は、Ｔ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球から選択されるＴリンパ球である。場合によっては、免疫細胞は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ａ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗ＢＣＭＡ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ドメインを含む細胞外リガンド結合ドメインと、（ｂ）ヒンジと、（ｃ）膜貫通ドメインと、（ｄ）共刺激ドメインおよびシグナリングドメインを含む細胞質ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を含むヒトＴ細胞である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、操作されたヒトＴ細胞のｓｃＦｖドメインは、配列番号１０／２、２６／１８、４２／３４、５８／５０または７４／６６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ／ＨＣＶＲアミノ酸配列対を含む。場合によっては、ヒンジは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。場合によっては、膜貫通ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。場合によっては、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ共刺激ドメインである。場合によっては、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。場合によっては、シグナリングドメインは、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインである。場合によっては、ＣＤ３ゼータシグナリングドメインは、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
様々な実施形態では、操作されたヒトＴ細胞は、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、または配列番号９０のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
【０１４０】
生物学的等価物
本発明は、本明細書に開示される例示的な分子のものとは異なるが、ＢＣＭＡに結合する能力を保持し、ＢＣＭＡを発現する細胞の存在下でキメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を活性化し、またはＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞の成長もしくは増殖を抑制するアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体およびキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞を包含する。このような変異体抗体は、親配列と比較してアミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、説明された二重特異性抗原結合分子の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を呈する。
【０１４１】
一実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体を発現する２つの操作された免疫細胞は、これらの安全性、純度、および有効性において臨床的に有意性のある差がない場合、生物学的に等価である。
【０１４２】
一実施形態では、２つの操作された免疫細胞は、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物の間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。
【０１４３】
一実施形態では、２つの操作された免疫細胞は、これらが両方とも、条件または使用条件についての共通の機序または作用機序によって、このような機序が知られている程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
【０１４４】
生物学的等価性は、インビボおよびインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）操作された細胞の濃度が血液、血漿、血清または他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒト生物学的利用能データと相関した、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）操作された細胞（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）操作された細胞の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
【０１４５】
本明細書に示す例示的な操作された細胞の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を生じること、または生物学的活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失することによって構築され得る。
【０１４６】
種の選択性および種の交差反応性
本発明の特定の実施形態によると、ヒトＢＣＭＡに結合するが他の種由来のＢＣＭＡには結合しない抗原結合ドメインが提供される。本発明はまた、ヒトＢＣＭＡおよび１つ以上の非ヒト種由来のＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインを含む。
【０１４７】
本発明のある特定の例示的な実施形態によると、ヒトＢＣＭＡに結合し、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーＢＣＭＡのうちの１つ以上に結合し得るか、または結合し得ない抗原結合ドメインが提供される。
【０１４８】
操作された免疫細胞の活性化および拡大
操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）の遺伝子改変の前または後であるかどうかにかかわらず、本発明の遺伝子改変免疫細胞が活性化され、抗原結合機序とは無関係に増殖したとしても、免疫細胞、特に本発明のＴ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６／０１２１００５号に記載されるような方法を使用して一般的にさらに活性化ならびに拡大することができる。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで拡大させることができる。
【０１４９】
概して、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３ＴＣＲ複合体およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激して、Ｔ細胞のための活性化シグナルを生成する薬剤と接触することによって拡大される。例えば、カルシウムイオノホアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などのマイトジェンレクチンなどの化学物質は、Ｔ細胞のための活性化シグナルを生成するために使用することができる。
【０１５０】
非限定的な例としては、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合フラグメント、もしくは表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノホアと共にタンパク質キナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）との接触によってなど、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞表面のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。Ｔ細胞培養に適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、１Ｌ−４、１Ｌ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、１Ｌ−１５、ＴＧＦｐ、およびＴＮＦ−αまたは当業者に知られている細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む増殖ならびに生存度に必要な要因を含み得る、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０または、Ｘ−ｖｉｖｏ５、（Ｌｏｎｚａ））が挙げられる。細胞の成長のための他の添加剤としては、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮアセチル−システインおよび２−メルカプトエタノイ（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｉ）などの還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加された、無血清の、または適切な量の血清（もしくは血漿）、または規定されたセットのホルモン、ならびに／またはＴ細胞の成長および拡大に十分な量のサイトカイン（複数可）を補充された、ＲＰＭＩ１６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１、ならびにＸ−Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験的な培養にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％Ｏ2）下で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特性を示し得る。
【０１５１】
別の特定の実施形態では、前述の細胞は、組織または細胞と共培養することによって拡大され得る。前述の細胞はまた、インビボで、例えば、前述の細胞を対象に投与した後、対象の血液中で拡大され得る。
【０１５２】
治療用途
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）および薬学的に許容されるビヒクルを含む組成物を含む。場合によっては、操作された細胞は、特に免疫療法のための薬剤を形成する。場合によっては、操作された細胞は、癌（例えば、多発性骨髄腫）の治療に使用される。場合によっては、操作された細胞は、免疫療法および／または癌（例えば、ＢＣＭＡを発現する癌）の治療のための薬剤の製造に使用される。
【０１５３】
本発明は、それを必要とする対象に、本明細書で論じられるようなキメラ抗原受容体を発現する操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む治療用組成物を投与することを含む方法を含む。治療用組成物は、本明細書に開示される任意のキメラ抗原受容体を発現する細胞、および薬学的に許容される担体、希釈剤またはビヒクルを含むことができる。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という表現は、癌の１つ以上の症状または徴候を示すヒトまたは非ヒト動物（例えば、腫瘍を発現する対象または本明細書で述べられる癌のうちのいずれかに罹患している対象）、あるいは、そうでなければＢＣＭＡ活性の阻害もしくは減少またはＢＣＭＡ＋細胞（例えば、多発性骨髄腫細胞）の枯渇から利益を得る者を意味する。
【０１５４】
本発明の操作された細胞は、とりわけ、免疫応答の刺激、活性化および／または標的化が有益である任意の疾患または障害の治療に有用である。特に、本発明の操作された細胞は、ＢＣＭＡ発現もしくは活性またはＢＣＭＡ＋細胞の増殖に関連するかまたはそれによって媒介される任意の疾患または障害の治療、予防、および／または改善に使用され得る。本発明の操作された細胞を使用して阻害または死滅させることができるＢＣＭＡを発現する細胞には、例えば、多発性骨髄腫細胞が含まれる。
【０１５５】
本発明の操作された細胞は、例えば、多発性骨髄腫を含む癌または他のＢ細胞もしくは形質細胞癌、例えば、ワルデンストレームマクログロブリン血症、バーキットリンパ腫、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含む、ＢＣＭＡ発現と関連する疾患または障害を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡを発現する疾患または障害は、キャッスルマン病、リンパ形質細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または慢性リンパ性白血病である。本発明の特定の実施形態によると、操作された細胞は、多発性骨髄腫に罹患している患者を治療するために有用である。本発明の他の関連実施形態によると、本明細書に開示される操作された細胞を、多発性骨髄腫に罹患している患者に投与することを含む方法が提供される。腫瘍スキャニングなどの当技術分野で既知の分析的／診断的方法を使用して、患者が多発性骨髄腫または別のＢ細胞系統癌を抱えているかどうかを確かめることができる。
【０１５６】
本発明はまた、対象における残存癌を治療するための方法も含む。本明細書で使用される場合、「残存癌」という用語は、抗癌療法による治療後の対象における１つ以上の癌性細胞の存在または持続を意味する。
【０１５７】
ある特定の態様によると、本発明は、対象が多発性骨髄腫であると決定された後、本明細書の他所に記載の操作された細胞の集団を対象に投与することを含む、ＢＣＭＡ発現に関連する疾患または障害（例えば、多発性骨髄腫）を治療するための方法を提供する。例えば、本発明は、対象が他の免疫療法または化学療法を受けてから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、または４週間、２カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１年、またはそれ以上後に、操作された免疫細胞を患者に投与することを含む、多発性骨髄腫を治療するための方法を含む。
【０１５８】
本明細書で論じられる治療は、寛解的、治療的、または予防的であり得る。治療は、自己免疫療法の一部または同種異系免疫療法の一部のいずれかであり得る。自己とは、患者を治療するのに使用される細胞、細胞株、または細胞集団が、患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）互換性ドナーに由来することを意味する。同種異系とは、患者を治療するのに使用される細胞、細胞株、または細胞集団が、患者に由来するのではなく、ドナーに由来することを意味する。
【０１５９】
開示された方法で使用することができる細胞は、本明細書に記載されている。治療は、ＢＣＭＡを発現する細胞、特に過剰なＢＣＭＡを発現する細胞によって特徴付けられる前悪性または悪性癌状態と診断された患者を治療するために使用することができる。そのような状態は、多発性骨髄腫などの癌に見られる。
【０１６０】
本発明の操作された細胞で治療される癌のタイプとしては、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および他のＢ細胞または形質細胞癌が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、キャッスルマン病、リンパ形質細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、もしくは慢性リンパ性白血病などのＢＣＭＡを発現する疾患または障害を治療するために使用できる。
【０１６１】
本発明の組成物および方法は、ＢＣＭＡを発現する細胞または組織を有すると特徴付けられているか、またはＢＣＭＡを発現する細胞または組織を有することが疑われる対象を治療するために使用され得る。例えば、本発明による治療から利益を得る対象には、多発性骨髄腫を有する対象が含まれる。
【０１６２】
本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、着床または移植を含む、任意の便利な方法で実施され得る。本明細書に記載の組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に患者に投与され得る。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
【０１６３】
細胞または細胞集団の投与は、体重１ｋｇあたり１０4〜１０9細胞、好ましくは、これらの範囲内のすべての整数値の細胞数を含めて１０5〜１０6細胞／体重１ｋｇの投与からなり得る。細胞または細胞集団は、１回以上の用量で投与することができる。いくつかの実施形態では、有効量の細胞は、単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、有効量の細胞は、ある時間にわたって２回以上の用量として投与される。投与のタイミングは、管理医師の判断内であり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から得ることができる。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の範囲の決定は、当業者の技能範囲内である。有効量とは、治療的または予防的利益をもたらす量を意味する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康および体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、および望まれる効果の性質に依存することになる。
【０１６４】
一実施形態では、有効量の細胞またはこれらの細胞を含む組成物は、非経口的に投与される。この投与は静脈内投与であり得る。場合によっては、投与は、腫瘍内への注射によって直接行うことができる。
【０１６５】
本発明のある特定の実施形態では、細胞は、それだけに限らないが、抗ウイルス治療、シドフォビルおよびインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても既知）などの薬剤を用いた治療、もしくはＭＳ患者のナタリズマブ治療、もしくは乾癬患者のエファリズマブ治療、またはＰＭＬ患者の他の治療などを含む任意の数の該当する治療モダリティと併せて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダリビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用され得る。
【０１６６】
さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用するＴ細胞切除治療と併せて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される、別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０、例えば、Ｒｉｔｕｘａｎと反応する薬剤などのＢ細胞切除治療後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法を用いた標準的治療を受け、その後に末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある特定の実施形態では、移植後に、対象は、本発明の拡大した免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、拡大した細胞は、手術前または後に投与される。ある特定の実施形態では、任意の手段（例えば、手術、化学療法、または放射線療法）は、本発明の拡大した免疫細胞の投与の前に腫瘍負荷を減らすために使用され得る。一実施形態では、本発明の操作された細胞の投与の前に腫瘍負荷を減らすことにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法に関連し得る副作用であるサイトカイン放出症候群またはサイトカインストームの可能性を減らす、または予防することができる。
【０１６７】
併用療法
本発明は、本明細書に記載のキメラ抗原受容体のいずれかを含む操作された細胞または細胞の集団を、１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて、投与することを含む方法を提供する。本発明の細胞もしくは細胞の集団と組み合わせて、または組み合わせて投与することができる例示的な追加の治療剤は、例えば、抗腫瘍剤（例えば、メルファラン、ビンクリスチン（オンコビン）、シクロホスファミド（シトキサン）、エトポシド（ＶＰ−１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームドキソルビシン（ドキシル）、オベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ）を含む化学療法剤、または対象における形質細胞腫瘍の治療に有効であることが知られている任意の他のもの）を含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、ステロイドを含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、サリドマイド、レナリドマイド、およびボルテゾミブを含む標的療法を含み、これらは、新たに診断された患者を治療するために承認された療法である。レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、パノビノスタット、イキサゾミブ、エロツズマブ、およびダラツムマブは、再発性骨髄腫を治療するために有効な第２の治療剤の例である。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、放射線療法または幹細胞移植を含むレジメンである。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、免疫調節剤であり得る。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）、カルフィルゾミブ（Ｋｙｐｒｏｌｉｓ）、イキサゾミブ（Ｎｉｎｌａｒｏ）を含むプロテアソーム阻害剤であり得る。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｋ）などのヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり得る。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、モノクローナル抗体、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤にコンジュゲートした二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、またはそれらの組み合わせであり得る。本発明の抗原結合分子と組み合わせて有益に投与され得る他の薬剤には、小分子サイトカイン阻害剤およびＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８などのサイトカインに結合する抗体、またはそれらのそれぞれの受容体を含むサイトカイン阻害剤が含まれる。本発明の薬学的組成物（例えば、本明細書に開示される、操作された細胞または細胞の集団を含む薬学的組成物）はまた、形質細胞表面上の異なる抗原と相互作用し得る本明細書に記載の抗体以外のモノクローナル抗体、腫瘍細胞表面上の抗原に結合する一方のアームおよびＴ細胞上の抗原に結合する他方のアームを有する二重特異性抗体、抗体薬物コンジュゲート、抗腫瘍剤にコンジュゲートした二重特異性抗体、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４を標的化するもの、またはそれらの組み合わせ、から選択される１つ以上の治療的組み合わせを含む治療レジメンの一部として投与され得る。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、またはセミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）などのＰＤ−１阻害剤から選択され得る。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、またはデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）などのＰＤ−Ｌ１阻害剤から選択され得る。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）などのＣＴＬＡ−４阻害剤から選択され得る。
【０１６８】
本発明はまた、本明細書で述べられる操作された細胞もしくは細胞の集団のいずれか、およびＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ−ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＦＯＬＨ１（ＰＳＭＡ）、ＰＲＬＲ、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＳＬＮ、ＣＡ９、ウロプラキンのうちの１つ以上の阻害剤、または前述のサイトカインのいずれかを含む治療的組み合わせを含み、その阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ、ナノボディもしくは抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、ｄＡｂフラグメント、またはダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、および最小認識ユニット）である。いくつかの実施形態では、本発明の操作された細胞もしくは細胞の集団はまた、放射線治療および／または従来の化学療法も含む治療計画の一部として投与され得る。
【０１６９】
追加の治療活性成分は（複数可）、本発明の操作された細胞の投与の直前、同時に、または直後に投与され得る（本開示の目的のために、そのような投与計画は、追加の治療活性成分と「組み合わせて」操作された細胞を投与することとみなされる）。
【０１７０】
本発明には、本発明の操作された細胞が、本明細書の他所に記載されるような追加の治療活性成分（複数可）の１つ以上と同時製剤された薬学的組成物が含まれる。
【０１７１】
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によれば、操作された細胞の複数回用量は、既定される時間経過にわたって対象に投与され得る。本発明のこの態様による方法は、細胞の複数回用量を対象に連続的に投与することを含む。本発明で使用する場合、「連続的に投与すること」は、各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、または数か月）よって分けられた異なる日に、対象へ投与されることを意味する。本発明には、単回の一次用量と、それに続く１回以上の二次用量、次いで場合により１回以上の三次用量を患者へ連続的に投与することを含む方法が含まれる。
【０１７２】
「一次用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、本発明の操作された細胞の投与の時系列を指す。したがって、「一次用量」とは、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称する）であり、「二次用量」とは、一次用量後に投与される用量であり、「三次用量」とは、二次用量後に投与される用量である。一次用量、二次用量、および三次用量はすべて、同じ量の操作された細胞を含有し得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、ある特定の実施形態では、一次用量、二次用量および／または三次用量に含まれる操作された細胞の量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。ある特定の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｏｓｅ）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
【０１７３】
本発明のある例示的な実施形態では、各二次用量および／または三次用量は、直前の用量の１〜２６（例えば、１、１1/2、２、２1/2、３、３1/2、４、４1/2、５、５1/2、６、６1/2、７、７1/2、８、８1/2、９、９1/2、１０、１０1/2、１１、１１1/2、１２、１２1/2、１３、１３1/2、１４、１４1/2、１５、１５1/2、１６、１６1/2、１７、１７1/2、１８、１８1/2、１９、１９1/2、２０、２０1/2、２１、２１1/2、２２、２２1/2、２３、２３1/2、２４、２４1/2、２５、２５1/2、２６、２６1/2、またはそれ以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用する場合、一連の複数回投与において、介入用量のない直後の用量の投与の前に患者へ投与される用量を意味する。
【０１７４】
本発明のこの態様による方法は、任意の数の二次および／または三次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態では、単回の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単回の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の三次用量が患者に投与される。
【０１７５】
複数回の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１〜２週間後に患者に投与され得る。同様に、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の用量の２〜４週間後に患者に投与され得る。あるいは、二次用量および／または三次用量が患者へ投与される頻度は、治療計画の経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過の間に調整され得る。
【実施例】
【０１７６】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【０１７７】
実施例１：抗ＢＣＭＡ抗体の生成
抗ＢＣＭＡ抗体は、遺伝子改変されたマウスをヒトＢＣＭＡ抗原（例えば、ｈＢＣＭＡ、配列番号１０１）で免疫することによって、またはヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウスをヒトＢＣＭＡ抗原で免疫することによって得られた。
【０１７８】
免疫後、各マウスから脾細胞を採取して、（１）マウス骨髄腫細胞と融合してそれらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞を形成してＢＣＭＡ特異性についてスクリーニングし、または（２）反応性抗体（抗原陽性Ｂ細胞）に結合して同定する選別試薬としてヒトＢＣＭＡフラグメントを使用して、Ｂ細胞を選別した（ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように）。
【０１７９】
ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＢＣＭＡに対するキメラ抗体が最初に単離された。抗体を、親和性、選択性などを含む望ましい特徴について特徴付けし選択する。必要ならば、マウス定常領域を所望のヒト定常領域、例えば野生型または改変ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域と置き換えて、完全ヒト型抗ＢＣＭＡ抗体を生成した。選択された定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
【０１８０】
抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列：表１は、本発明の選択された抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表２に示す。
【表１】
2021531004.tif 000003
【表２】
2021531004.tif 000004
【０１８１】
実施例２：ＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体の生成
６つの抗ＢＣＭＡ抗体（ｍＡｂ１６７１１、ｍＡｂ１６７１６、ｍＡｂ１６７３２、ｍＡｂ１６７４７およびｍＡｂ２１５８１）をＶＬ−ＶＨ一本鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）に再フォーマットし、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメインならびにＣＤ３ζ刺激ドメインに使用するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物に配置した。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを、（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）バイシストロン性発現システム（Ｎｅｏ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  カタログ番号６３２１８１）にクローニングし、レンチウイルス粒子を、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｈｏｔ（ＶＳＶ−Ｇ）システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  カタログ番号６３１２７６）を介して、製造元のプロトコルに従って生成した。ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ．３Ｃ７）を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を、次に、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）プレコートディッシュ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号Ｔ１１０ａ）を使用して、製造元のプロトコルに従って異なるＣＡＲ構築物で形質導入した。５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８１１−０９８）中で少なくとも２週間選択した後、次のＣＡＲ−Ｔ細胞株を生成した；Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ  ｃｌ．３Ｃ７／ＢＣＭＡ  １６７１６  ＶＬ−ＶＨ  ＣＡＲＴ、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ  ｃｌ．３Ｃ７／ＢＣＭＡ  １６７１１  ＶＬ−ＶＨ  ＣＡＲＴ、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ  ｃｌ．３Ｃ７／ＢＣＭＡ  １６７３２ＶＬ−ＶＨ  ＣＡＲＴ、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ  ｃｌ．３Ｃ７／ＢＣＭＡ  １６７４７ＶＬ−ＶＨ  ＣＡＲＴ、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ  ｃｌ．３Ｃ７／ＢＣＭＡ  ２１５８１ＶＬ−ＶＨ  ＣＡＲＴ。これらのＣＡＲ−Ｔ細胞株の生成に使用されるＣＡＲ構築物のヌクレオチド配列は、図１に示すように、配列番号８１（ｍＡｂ１６７１１  ＶＬ／ＶＨ）、配列番号８３（ｍＡｂ１６７１６  ＶＬ／ＶＨ）、配列番号８５（ｍＡｂ１６７３２  ＶＬ／ＶＨ）、配列番号８７（ｍＡｂ１６７４７  ＶＬ／ＶＨ）および配列番号８９（ｍＡｂ２１５８１  ＶＬ／ＶＨ）に示される。これらの６つのＣＡＲ−Ｔ細胞株は、実施例３で論じられるように、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞表面発現および活性化を評価するために使用された。
【０１８２】
抗ＢＣＭＡ  ＶＬ−ＶＨ  ｓｃＦｖ、ｈｕＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナリングドメインを含むキメラ抗原受容体を、２つの抗ＢＣＭＡ抗体、ｍＡｂ２１５８１およびｍＡｂ１６７４７（それぞれ、配列番号８９および８７に対応）のＶＬおよびＶＨヌクレオチド配列を使用して、構築した。非結合対照として、無関係のｓｃＦｖ（配列番号９１のＣＡＲ構築物）のヌクレオチド配列を使用して、同様のＣＡＲを設計した。これらのＣＡＲを、ＥＦ１ａプロモーターおよびＩＲＥＳ：ｅＧＦＰ配列を有するｐＬＶＸレンチウイルスベクターにクローニングし（ＣＡＲ形質導入細胞を追跡するため）、ＶＳＶ−偽型レンチウイルスを生成した。
【０１８３】
ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離され、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ＋１００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２で刺激され、ＭＯＩ＝５でレンチウイルスによって形質導入された。形質導入細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ＋１００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２で３週間拡大させた後、インビボ実験で使用するまで凍結保存された。実施例４および５で論じられるように、これら３株のＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して、インビボでの腫瘍負荷の減少における有効性を評価した。
【０１８４】
実施例３：Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物の細胞表面発現およびＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化
Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴＬｕｃ細胞におけるＢＣＭＡ  ＣＡＲ構築物の関連する細胞表面発現は、フローサイトメトリーによってアクセスされた。染色するために、細胞を、９６ウェルＶ字底プレートのウェルあたり２００，０００個の細胞の密度で、染色緩衝液（ＰＢＳ、カルシウムおよびマグネシウムを含まない（Ｉｒｖｉｎｇ  ９２４０）＋２％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ  ３０−２０２０）に播き、ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＢＣＭＡ  ｅｃｔｏ−ｈＦｃ）に融合された１０ｕｇ／ｍｌのＢＣＭＡ細胞外ドメインまたはｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｆｃアイソタイプ対照）に融合された無関係のタンパク質によって４℃で３０分間染色した。ＢＣＭＡ−ｈＦｃまたはＦｃアイソタイプ対照と一緒にインキュベートした後、細胞を染色緩衝液で１回洗浄し、１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ６４７コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−６０６−１７０）を用いて３０分間４℃で染色した。次に、細胞を洗浄し、染色緩衝液で希釈したＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ、カタログ番号５５４６５５）の５０％溶液を使用して、固定した。サンプルをＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ｉＱｕｅフローサイトメーターで実行し、Ｆｌｏｗｊｏ  １０．２で分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。信号対雑音比（Ｓ：Ｎ）は、ＢＣＭＡ−ｈＦｃまたはＦｃアイソタイプ対照  ＭＦＩと二次抗体単独  ＭＦＩの比率をとることによって決定される。
【０１８５】
ＣＡＲ−Ｔ株の活性化をＣＡＲ−Ｔ／ＡＰＣ（抗原提示細胞）バイオアッセイで評価した。バイオアッセイを実施するために、５０，０００個のＣＡＲ−Ｔ細胞を、５０ｕｌのアッセイ培地（１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓ／Ｇを含むＲＰＭＩ培地）中の、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｎｕｎｃ９６ウェル白色プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１３６１０１）に添加し、その後、５０ｕｌのアッセイ培地中のＡＰＣの３倍連続希釈（５００，０００個の細胞〜６８５個の細胞）を添加した。次のＡＰＣ、ＲＡＪＩ、Ｄａｕｄｉ、ＲＰＭＩ８２２６（内因的にＢＣＭＡ発現）およびＨＥＫ２９３（ＢＣＭＡ陰性）、を利用した。細胞混合物を３７℃、５％Ｃ０２、加湿インキュベーター内で５時間インキュベートした。ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（カタログ番号Ｅ６１３０）およびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して測定した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を生成し、８ポイントの応答曲線上で４パラメータロジスティック方程式を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにプロットした。各用量応答曲線のゼロＡＰＣ条件も、３倍連続希釈の継続として分析に含まれ、最低用量として表される。ＣＡＲ−Ｔ活性は、曲線上の最高のＲＬＵと最低のＲＬＵの比率をとることによって決定され、表４に信号：雑音（Ｓ：Ｎ）として表される。
【０１８６】
表３は、１６７４７および２１５８１ＣＡＲ−Ｔが同様の表面発現を有したことを示し、Ｓ：Ｎが２０９〜２７３の範囲であり、１６７１６ＣＡＲ−Ｔが４４倍を超えるバックグラウンドで発現するが、１６７３２および１６７１１ＣＡＲの発現は、それぞれ１３および４のＳ：Ｎではるかに低かった。
【０１８７】
表４は、６つすべてのＢＣＭＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞株が、ＲＡＪＩ、Ｄａｕｄｉ、およびＲＰＭＩ８２２６細胞で活性化されたことを示す。ＨＥＫ２９３で活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞株はなかった。１６７４７ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ／ＡＰＣバイオアッセイで最も強い活性を有したが、ＣＡＲ１６７１１は、ＢＣＭＡ発現ＡＰＣに関係なく、最も弱い活性を有した。最後に、ＣＡＲ発現（表３）とＣＡＲ活性（表４）との間に相関が観察された。
【表３】
2021531004.tif 000005
【表４】
2021531004.tif 000006
【０１８８】
実施例４：ＢＣＭＡ標的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、異種腫瘍モデルにおいてインビボでＢＣＭＡを発現する腫瘍（ＯＰＭ−２）の成長を減らす
ＢＣＭＡ標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のインビボでの有効性を決定するために、高レベルのＢＣＭＡを発現するＯＰＭ−２ヒト多発性骨髄腫細胞を使用して、マウスにおいて異種腫瘍研究を実施した。
【０１８９】
異種腫瘍の移植および測定：０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩｌ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、ホタルルシフェラーゼ（ＯＰＭ−２−ルシフェラーゼ細胞）も発現するように操作された２×１０6個のＢＣＭＡ+ＯＰＭ−２ヒト多発性骨髄腫腫瘍細胞を静脈内投与した。２１日目に、マウスに、対照ＣＡＲまたは抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのいずれかを発現する２ｘ１０6Ｔ細胞を静脈内注射した（ＣＡＲで形質導入されたこれらの細胞のマーカーであるＧＦＰを発現する細胞の頻度によって決定されるように）。マウス（群あたりｎ＝５）に２ｘ１０6無関係のｓｃＦｃ  ＣＡＲ  Ｔ（対照ｓｃＦｖ  ＣＡＲ）、２１５８１ｓｃＦｖ  ＣＡＲをコードする２ｘ１０6抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ、または１６７４７ｓｃＦｖをコードする２ｘ１０6抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔを投与した。麻酔した動物の腫瘍生物発光（ＢＬＩ）を測定することによって、６１日間にわたって腫瘍成長を評価した。陽性対照として、マウス群（ｎ＝５）には、ＯＰＭ−２−ルシフェラーゼ細胞のみを投与し、Ｔ細胞は投与しなかった。バックグラウンドＢＬＩレベルを測定するために、マウス群（ｎ＝５）は治療せず、腫瘍またはＴ細胞を投与しなかった。
【０１９０】
異種腫瘍成長の測定：ＢＬＩイメージングを使用して腫瘍負荷を測定した。マウスに、ＰＢＳ中に懸濁したルシフェラーゼ基質のＤ−ルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇをＩＰ注射した。この注射から５分後、マウスのＢＬＩイメージングを、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳシステムを使用してイソフルラン麻酔下で実施した。Ｄでの視野、１．５ｃｍの被写体の高さ、およびＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアによって決定される自動露光時間の中程度のビニングレベルで、画像収集を行った。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用してＢＬＩシグナルを抽出した：関心領域を各腫瘍量の周囲に描き、光子強度をｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒとして記録した。
【０１９１】
ＢＣＭＡ+ＯＰＭ−２−ルシフェラーゼ腫瘍は、無関係のｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスで進行的に成長したが、２１５８１ｓｃＦｖ  ＣＡＲをコードするＣＡＲ  Ｔ細胞は、動物の大多数で腫瘍負荷をバックグラウンドレベルまで減少させ、１６７４７ｓｃＦｖ  ＣＡＲをコードするＣＡＲ  Ｔ細胞は、動物の大多数で腫瘍負荷をバックグラウンドレベルまで減少させた。結果を、以下の表５ａに示す。
【表５】
2021531004.tif 000007
【表６】
2021531004.tif 000008
【０１９２】
マウスに、対照ＣＡＲまたは抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのいずれかを発現する２ｘ１０6Ｔ細胞を２２日目に（２１日目ではなく）静脈内注射し、５６日（６１日目ではなく）にわたって腫瘍成長を評価したことを除いて、上記で論じられるようにさらに実験を実施した。
【０１９３】
ＢＣＭＡ+ＯＰＭ−２−ルシフェラーゼ腫瘍は、無関係のｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスで進行的に成長したが、２１５８１および１６７４７ｓｃＦｖ  ＣＡＲをコードするＣＡＲ  Ｔ細胞は、動物の大多数で腫瘍負荷をバックグラウンドレベルまで減少させた。結果を、以下の表５ｂに示す。
【表７】
2021531004.tif 000009
【表８】
2021531004.tif 000010
【０１９４】
実施例５：ＢＣＭＡ標的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、異種腫瘍モデルにおいてインビボでＢＣＭＡを発現する腫瘍（ＭＯＬＰ−８）の成長を減らす
ＢＣＭＡ標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞のインビボでの有効性を決定するために、低レベルのＢＣＭＡを発現するＭＯＬＰ−８ヒト多発性骨髄腫細胞を使用して、マウスにおいて異種腫瘍研究を実施した。
【０１９５】
異種腫瘍の移植および測定：０日目に、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃscidＩｌ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに、ホタルルシフェラーゼ（ＭＯＬＰ−８−ルシフェラーゼ細胞）も発現するように操作された２×１０6個のＢＣＭＡ+ＭＯＬＰ−８ヒト多発性骨髄腫腫瘍細胞を静脈内投与した。１２日目に、マウスに、対照ＣＡＲまたは抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのいずれかを発現する２ｘ１０6Ｔ細胞を静脈内注射した（ＣＡＲで形質導入されたこれらの細胞のマーカーであるＧＦＰを発現する細胞の頻度によって決定されるように）。マウス（群あたりｎ＝５）に２ｘ１０6無関係のｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ（対照ｓｃＦｖ  ＣＡＲ）、２１５８１ｓｃＦｖ  ＣＡＲをコードする２ｘ１０6抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ、または１６７４７ｓｃＦｖをコードする２ｘ１０6抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔを投与した。麻酔した動物の腫瘍生物発光（ＢＬＩ）を測定することによって、実験を通して腫瘍成長を評価した。陽性対照として、マウス群（ｎ＝５）には、ＭＯＬＰ−８−ルシフェラーゼ細胞のみを投与し、Ｔ細胞は投与しなかった。バックグラウンドＢＬＩレベルを測定するために、マウス群（ｎ＝５）は治療せず、腫瘍またはＴ細胞を投与しなかった。
【０１９６】
異種腫瘍成長の測定：ＢＬＩイメージングを使用して腫瘍負荷を測定した。マウスに、ＰＢＳ中に懸濁したルシフェラーゼ基質のＤ−ルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇをＩＰ注射した。この注射から５分後、マウスのＢＬＩイメージングを、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳシステムを使用してイソフルラン麻酔下で実施した。Ｄでの視野、１．５ｃｍの被写体の高さ、およびＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアによって決定される自動露光時間の中程度のビニングレベルで、画像収集を行った。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用してＢＬＩシグナルを抽出した：関心領域を各腫瘍量の周囲に描き、光子強度をｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒとして記録した。
【０１９７】
ＢＣＭＡ+ＭＯＬＰ−８−ルシフェラーゼ腫瘍は、無関係のｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスで進行的に成長したが、２１５８１ｓｃＦｖ  ＣＡＲおよび１６７４７ｓｃＦｖ  ＣＡＲをコードするＣＡＲ  Ｔ細胞は、動物の大多数で腫瘍負荷をバックグラウンドレベルまで減少させた。結果を、以下の表６に示す。
【表９】
2021531004.tif 000011
【表１０】
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【０１９８】
実施例６：ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞はＢＣＭＡを発現する細胞の細胞溶解を媒介する
実施例２において上記で論じられるように、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からを単離され、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ＋１００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２で刺激され、ＭＯＩ＝５でレンチウイルスによって形質導入された。形質導入細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ＋１００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２で３週間拡大させた後、細胞溶解アッセイを設定した。
【０１９９】
ＢＣＭＡ標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の細胞溶解能を決定するために、拡大したＣＡＲ−Ｔ細胞およびＢＣＭＡの様々なレベルを発現する様々な腫瘍標的細胞株を使用して、細胞溶解アッセイを実施した。拡大の２１日目に、拡大したＣＡＲ−Ｔ細胞をカルセイン標識ＢＣＭＡ＋標的細胞株と様々な比率で３回共培養した。各標的細胞株を採取し、２ｘ１０6／ｍＬの密度で再懸濁した後、８ｕＭの濃度のカルセイン−ＡＭ色素を３７℃で３５分間添加した。カルセイン標識後、標的細胞を２回洗浄して余分なカルセインを除去した。その後、Ｔ細胞および標的細胞を９６ウェル丸底プレート上で様々な比率で共培養し、培養上清を採取する時に３７℃で２．５時間培養した。陰性対照の場合、標的細胞は、ＢＣＭＡを認識しない無関係なｓｃＦｖを含むように設計された同様のＣＡＲを使用して生成されたＴ細胞と共培養された。追加のＣＡＲ陰性対照として、同じ正常な健康なドナーからの非形質導入および拡大したＴ細胞を使用した。死滅を媒介させた抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の対照として、ＢＣＭＡ発現が陰性であるため、慢性骨髄性白血病Ｋ５６２標的細胞株を使用した。カルセインがＨ−９２９およびＭＯＬＰ−８標的細胞株から自発的に放出されるかどうかを決定するために、各細胞株をＣＡＲ−Ｔ細胞の非存在下で培養した。カルセインの可能な最大放出を決定するために、標的細胞株を培養し、１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４界面活性剤を含有するように補充したＯｐｔｍｉｚｅｒ培地を使用して溶解した。上清内で、Ｖｉｋｔｏｒ  Ｘ４プレートリーダーを使用して相対カルセインレベルを測定し、細胞傷害性パーセントを（（カルセインシグナル−自発的カルセイン放出）／（カルセイン最大放出−自発的カルセイン放出））＊１００として計算した。
【０２００】
以下の表７Ａ〜７Ｃに示すように、２１５８１および１６７４７ｓｃＦｖを使用して生成されたＢＣＭＡ標的ＣＡＲ＋Ｔ細胞からなる培養は、Ｈ−９２９標的細胞およびＭＯＬＰ−８標的細胞の強力な細胞溶解を誘導した。Ｈ−９２９細胞と比較して、ＭＯＬＰ−８細胞に対してより低いレベルの細胞傷害性が観察された。この結果は、ＭＯＬＰ−８細胞よりも高レベルのＢＣＭＡ抗原を発現するＨ−９２９によって説明される。各ＢＣＭＡ標的ＣＡＲ−Ｔ細胞培養について、Ｈ−９２９細胞に対して最大の細胞傷害性が観察され、１６７４７ｓｃＦｖで操作されたＢＣＭＡ標的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、両方の標的細胞株に対して最大の細胞傷害性を示した。非形質導入および拡大した（ＭＯＩ  ０）Ｔ細胞と、無関係なＣＡＲ−Ｔ細胞（１７３６３）との両方を、１つの標的細胞に対して５０Ｔ細胞の最大比率で標的細胞と共培養した場合、ＭＯＬＰ−８およびＨ−９２９標的細胞の細胞溶解を誘発しなかった。この結果は、ＣＡＲ構造にＢＣＭＡを認識するｓｃＦｖが含まれている場合にのみ細胞溶解が観察されることを示す（例えば、ｍＡｂ２１５８１およびｍＡｂ１６７４７から）。さらに、ＢＣＭＡ標的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ発現を欠くＫ５６２細胞に対してごくわずかな細胞傷害性を示し、細胞溶解を観察するにはＢＣＭＡ発現が必要であることを示す。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【０２０１】
実施例７：多発性骨髄腫患者由来の骨髄におけるＢＣＭＡ標的ＣＡＲ−Ｔ細胞のエクスビボ細胞傷害性
実施例２において上記で論じられるように、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からを単離され、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ＋１００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２で刺激され、ＭＯＩ＝５でレンチウイルスによって形質導入された。形質導入細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ＋１００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−２で３週間拡大させた後、細胞傷害性アッセイを設定した。
【０２０２】
採取時に、拡大するＣＡＲ−Ｔ細胞を洗浄し、完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２９２μｇ／ｍＬのＬグルタミンで補充されるＲＰＭＩ）に再懸濁した。多発性骨髄腫患者の骨髄を解凍し、完全培地に再懸濁した。ＨＳ−５間質細胞を９６ウェル平底プレートにウェルあたり１００００個の細胞で播種し、一晩インキュベートした。Ｔ細胞および患者由来の骨髄を様々なＥ：Ｔ比（Ｅ：Ｔ＝１０：１から開始して２倍滴定）で間質含有ウェルに添加し、３７℃で１２時間培養した。ＣＡＲ陰性対照として、同じ正常な健康なドナーからの非形質導入および拡大したＴ細胞を使用した。
【０２０３】
１２時間後、フローサイトメトリーを使用して多発性骨髄腫芽球の生存率を決定した。細胞を、３０分間４℃でＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液中のフルオロフォアコンジュゲート抗体（抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ１３８、および抗ＳｌａｍＦ７）のカクテルで染色した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ死細胞染色を用いて４℃で２０〜３０分間染色した後、ＰＢＳで２回洗浄し、冷ミルテニーＡｕｔｏＭａｃｓ緩衝液に再懸濁した。ウェルあたりの絶対細胞数を定量化するために、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズをサンプルに添加した。サンプルはＢＤ  ＦｏｒｔｅｓｓａＸ２０フローサイトメーターで分析した。生存している多発性骨髄腫芽球を、生きた単一のＣＤ４−／ＣＤ８−／ＳｌａｍＦ７＋／ＣＤ１３８＋としてゲーティングした。生存率は、未処理の対照の生きた多発性骨髄腫細胞に対して正規化された、処理されたサンプルの生きた多発性骨髄腫芽球の絶対数として計算された。
【０２０４】
ｍＡｂ２１５８１  ＶＨ／ＶＬを使用して生成されたＢＣＭＡ標的ＣＡＲ＋Ｔ細胞からなる培養は、新たに診断された２人の患者および再発した１人の患者からの多発性骨髄腫芽球の強力な標的特異的細胞溶解を誘導した。１０：１のＥ：Ｔ比で、多発性骨髄腫芽球の８７〜９４％が溶解した。非形質導入および拡大した（ＭＯＩ  ０）Ｔ細胞は、多発性骨髄腫芽球の３４〜０％を溶解した。この結果は、患者由来の多発性骨髄腫芽球を標的特異的に強力に溶解する、ＢＣＭＡ標的ＣＡＲ＋Ｔ細胞の能力を示す。結果を、以下の表８に示す。
【表１４】
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【０２０５】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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