(57)【要約】  本発明は、正常および血液組織で低いメチル化レベルを示すが、癌組織だけで高いメチル化レベルを示す一つ以上のＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定して、正常組織が混ざっている臨床検体を用いて肝癌の予後または危険度を評価する方法に関する。
2021503956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）の生物学的試料でＤＮＡを提供する段階と；
（ｂ）前記分離したＤＮＡで染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列、染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列、染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列、染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列、染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列、染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列、染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列、染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列、染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列、染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列、染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列、染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列、染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列、および染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列よりなる群から選ばれるＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する段階と；を含む肝癌の予後または危険度を評価する方法。
【請求項２】
２以上のＣｐＧ部位メチル化レベルを測定する、請求項１に記載の肝癌の予後または危険度を評価する方法。
【請求項３】
前記染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列は、配列番号１の塩基配列を有し、
前記染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列は、配列番号２の塩基配列を有し、
前記染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列は、配列番号３の塩基配列を有し、
前記染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列は、配列番号４の塩基配列を有し、
前記染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列は、配列番号５の塩基配列を有し、
前記染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列は、配列番号６の塩基配列を有し、
前記染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列は、配列番号７の塩基配列を有し、
前記染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列は、配列番号８の塩基配列を有し、
前記染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列は、配列番号９の塩基配列を有し、
前記染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列は、配列番号１０の塩基配列を有し、
前記染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列は、配列番号１１の塩基配列を有し、
前記染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列は、配列番号１２の塩基配列を有し、
前記染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列は、配列番号１３の塩基配列を有し、
前記染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列は、配列番号１４の塩基配列を有し、
前記染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列は、配列番号１５の塩基配列を有する、請求項１に記載の肝癌の予後または危険度を評価する方法。
【請求項４】
前記染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の２５４３９１１０番目に位置し、
前記染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１２の９５９４１９８８番目に位置し、
前記染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１０の１３４５９９８２３番目に位置し、
前記染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の１４４６５１００２番目に位置し、
前記染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１の４７９９９１６３番目に位置し、
前記染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の２６３９５４５８番目に位置し、
前記染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の１０４５１２８７７番目に位置し、
前記染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の９８２９０１４８番目に位置し、
前記染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の６３２８１１３９番目に位置し、
前記染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の６７８７４１７８番目に位置し、
前記染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃４の７６５５５８３２番目に位置し、
前記染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１の６３７８９２７８番目に位置し、
前記染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃５の７８５００７０番目に位置し、
前記染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の３９１８７５３３番目に位置し、
前記染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１４の７４２０８１６５番目に位置するＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する、請求項１に記載の肝癌の予後または危険度を評価する方法。
【請求項５】
前記生物学的試料は、肝癌が疑われる患者または診断対象由来の組織、細胞、血液、血しょう、便および尿よりなる群から選ばれる１種である、請求項１に記載の肝癌の予後または危険度を評価する方法。
【請求項６】
前記段階（ｂ）は、ＰＣＲ、メチル化特異ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ  ＰＣＲ、ＭｅｈｔｙＬｉｇｈｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ、ＥｐｉＴＹＰＥＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、パイロシークエンシングおよびバイサルファイトシーケンシングよりなる群から選ばれる１種の方法で行われる、請求項１に記載の肝癌の予後または危険度を評価する方法。
【請求項７】
（ｃ）前記段階（ｂ）後に、前記メタル化レベルを正常対照群のメチル化レベルと比較する段階；をさらに含む、請求項１に記載の肝癌の予後または危険度を評価する方法。
【請求項８】
染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列、染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列、染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列、染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列、染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列、染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列、染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列、染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列、染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列、染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列、染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列、染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列、染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列、および染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列よりなる群から選ばれるＣｐＧ部位に結合するプローブを含む肝癌発病危険度診断用キット。
【請求項９】
前記ＣｐＧ部位に結合する２以上のプローブを含む、請求項８に記載の肝癌発病危険度診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定遺伝子ＣｐＧ部位のメチル化程度を測定して肝癌関連危険度を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、細胞周期が調節されないため、細胞分裂を継続する疾病であって、周囲組織に浸潤しながら早く成長し、身体各部位に拡散したり転移して生命を威嚇する。
【０００３】
肝に発生した癌を肝癌と言い、肝癌は、世界的に発病率が高い癌の一つである。韓国で肝癌の死亡率は、人口１０万人当たり２３人と非常に高いほうであり、韓国人の総死亡率の約１０％は、肝炎、肝硬変および肝癌と関係している。
【０００４】
他の組織の癌が肝に転移する移転性肝癌と、肝細胞自体で癌が発生する原発性肝癌（ＨＣＣ；ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）とに肝癌を分類することができるが、原発性肝癌が肝癌の９０％を占めるので、多くの肝癌は、原発性肝癌（ＨＣＣ）を意味する。
【０００５】
肝癌は、超音波検査（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）、電算化断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴撮影（ＭＲＩ）および肝動脈造影撮影（Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ）などの映像診断方法がある。超音波検査は、肝癌の大きさによって感度に多くの影響を受け、肝癌の発生を調べる一次映像検査方法として用いられている。
【０００６】
５ｃｍ以上の大きい肝癌組織の場合、７５％以上の感度を示す反面、１ｃｍ未満の小さい肝癌の場合、約４２％の感度を示す（Ｇｏｍａａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏ．，１５：１３０１，２００９）。
【０００７】
電算化断層撮影（ＣＴ）は、最も感度が高い検査であって、２ｃｍ以上の肝癌の場合、ほぼ１００％、１〜２ｃｍの場合、９３％、そして１ｃｍ以下の肝癌も、６０％近い感度で診断することができる（Ｇｏｍａａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏ．，１５：１３０１，２００９）。
【０００８】
しかしながら、このような検査は、費用が比較的高いので、一般大衆で日常的なスクリーニング検査として使用するには負担になる検査法である。
【０００９】
肝癌の場合、診断当時の腫瘍の大きさが予後と関連があり、患者の生存率を高めるためには、肝癌を早期に発見することである。したがって、高い感度で早期に肝癌を発見できる診断技術の開発が切実に要求されている。
【００１０】
一方、後成遺伝学（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）は、ＤＮＡの塩基配列が変化しない状態で行われる遺伝子の発現調節を研究する分野である。後成遺伝学は、ＤＮＡメチル化、ｍｉＲＮＡまたはヒストンのアセチル化、メチル化、リン酸化およびユビキチン化などのような後成的変異を通した遺伝子発現調節を研究する。
【００１１】
この中でＤＮＡメチル化が最も多く研究がなされている後成的変異である。後成的変異は、遺伝子機能変異および腫瘍細胞への変化をもたらすことができる。したがって、ＤＮＡメチル化は、細胞内疾患調節遺伝子の発現（または抑制および誘導）と関連しており、最近、ＤＮＡメチル化の測定を通した癌診断方法が提示されている。
【００１２】
ＤＮＡメチル化は、主に、特定遺伝子のプロモーター部位のＣｐＧアイランド（ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ）のシトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で起こり、そのため、転写因子の結合が妨害を受けることになって、特定遺伝子の発現が遮断（ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）されるものであって、コーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に突然変異がなくてもその遺伝子の機能が消失する主な機序である。
【００１３】
遺伝子のプロモーター地域以外にもエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、調節部位のような非翻訳地域のＤＮＡメチル化も、染色体の構造変異、ヒストン変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と共に作用し、様々な疾病の原因機序になると知られている。癌を含む多様な疾病においてＣｐＧアイランドでのこのような非正常的なメチル化／脱メチル化が報告され、疾病関連遺伝子のプロモーターメチル化を調査して、各種疾患の診断に使用しようとする試みが活発に行われている。
【００１４】
本発明者らは、肝癌発病と関連がある遺伝子のメチル化部位を選別し、これを検証する実験を通じて肝癌の危険性または予後を診断する方法を提供しようとした。
【００１５】
本明細書の全体にわたって多数の論文および特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文および特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照に挿入されて、本発明の属する技術分野におけるレベルおよび本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、前述した従来技術の問題点を解決するためのものであって、本発明の目的は、肝癌の危険性を初期に発見するために、正常組織や血液では低いメチル化を示すが、肝癌組織だけで高いメチル化レベルを示す特定のプローブを用いて検体のメチル化レベルを測定することによって、肝癌の危険性または予後を診断する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一態様によれば、（ａ）対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）の生物学的試料でＤＮＡを提供する段階と；（ｂ）前記分離したＤＮＡで染色体＃２の２５４３８７２５ないし２５４３９２７６番目の配列、染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列、染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列、染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列、染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列、染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列, 染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列、染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列、染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列、染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列、染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列、染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列、染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列、染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列、および染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列よりなる群から選ばれるＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する段階と；を含む肝癌の予後または危険度を評価する方法が提供される。
【００１８】
一実施例において、前記方法は、２以上のＣｐＧ部位メチル化レベルを測定することができる。
【００１９】
一実施例において、前記染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列は、配列番号１の塩基配列を有し、前記染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列は、配列番号２の塩基配列を有し、前記染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列は、配列番号３の塩基配列を有し、前記染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列は、配列番号４の塩基配列を有し、前記染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列は、配列番号５の塩基配列を有し、前記染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列は、配列番号６の塩基配列を有し、前記染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列は、配列番号７の塩基配列を有し、前記染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列は、配列番号８の塩基配列を有し、前記染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列は、配列番号９の塩基配列を有し、前記染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列は、配列番号１０の塩基配列を有し、前記染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列は、配列番号１１の塩基配列を有し、前記染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列は、配列番号１２の塩基配列を有し、前記染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列は、配列番号１３の塩基配列を有し、前記染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列は、配列番号１４の塩基配列を有し、前記染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列は、配列番号１５の塩基配列を有しうる。
【００２０】
一実施例において、前記染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の２５４３９１１０番目に位置し、前記染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１２の９５９４１９８８番目に位置し、前記染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１０の１３４５９９８２３番目に位置し、前記染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の１４４６５１００２番目に位置し、前記染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１の４７９９９１６３番目に位置し、前記染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の２６３９５４５８番目に位置し、前記染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の１０４５１２８７７番目に位置し、前記染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の９８２９０１４８番目に位置し、前記染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の６３２８１１３９番目に位置し、前記染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の６７８７４１７８番目に位置し、前記染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃４の７６５５５８３２番目に位置し、前記染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１の６３７８９２７８番目に位置し、前記染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃５の７８５００７０番目に位置し、前記染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の３９１８７５３３番目に位置し、前記染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１４の７４２０８１６５番目に位置することができる。
【００２１】
一実施例において、前記生物学的試料は、肝癌が疑われる患者または診断対象由来の組織、細胞、血液、血しょう、便および尿よりなる群から選ばれる１種でありうる。
【００２２】
一実施例において、前記段階（ｂ）は、ＰＣＲ、メチル化特異ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ  ＰＣＲ、ＭｅｈｔｙＬｉｇｈｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ、ＥｐｉＴＹＰＥＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、パイロシークエンシングおよびバイサルファイトシーケンシングよりなる群から選ばれる１種の方法で行われ得る。
【００２３】
一実施例において、前記方法は、（ｃ）前記メタル化レベルを正常対照群のメチル化レベルと比較する段階；をさらに含むことができる。
【００２４】
本発明の他の態様によれば、染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列、染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列、染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列、染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列、染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列、染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列、染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列、染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列、染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列、染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列、染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列、染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列、染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列、および染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列よりなる群から選ばれるＣｐＧ部位に結合するプローブを含む肝癌発病危険度診断用キットが提供される。
【００２５】
一実施例において、前記診断用キットは、前記ＣｐＧ部位に結合する２以上のプローブを含むことができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の一態様によれば、癌と正常組織だけでなく、血液を含む多くの正常細胞と異なるメチル化レベルを示す特定ＣｐＧ部位のメチル化を測定することによって、正常組織が混ざっている臨床検体を用いて肝癌の発病可能性を効果的に予測することができる。
【００２７】
本発明の効果は、上記した効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明または請求範囲に記載された発明の構成から推論可能なすべての効果を含むものと理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図１は、本発明の肝癌診断マーカー選定パイプラインを図式化したものである。
図２は、本発明の一実施例によるＤＮＡメチル化データ標準化の前（左側）、後（右側）の肝癌患者の分布を示すグラフである。
図３は、本発明の一実施例による肝癌患者で過メチル化し、正常ヒトで低メチル化されたＤＭＰｓ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ）のヒートマップである。
図４は、ヒートマップ（Ｈｅａｔｍａｐ）を通じて選別されたプローブに対する肝癌サンプル、肝正常サンプル、血液サンプルにおけるメチル化程度を示すヒートマップである。赤色であるほど過メチル化を示す。
図５は、機械学習を通じて選別した本発明の一実施例による診断マーカーを選別した結果である。
図６は、機械学習を通じて選別した本発明の一実施例による診断マーカーのメチル化程度を肝癌サンプル、肝正常サンプル、血液サンプルで確認したヒートマップである。
図７は、本発明の一実施例による単一プローブの肝癌診断効率を評価した結果である。プローブ別の肝癌診断効率をＡＵＣで表示した。
図８は、Ｐｕｂｌｉｃ  ＤＢであるＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）の肝癌データで本発明の一実施例による単一プローブの肝癌診断効率を評価した結果である。プローブ別の肝癌診断効率をＡＵＣで表示した。
図９は、本発明の一実施例によるプローブ（１５種）の組合せによる診断効率を確認した結果である。
図１０は、パイロシークエンシングを通じて本発明の一実施例によって選別されたプローブのメチル化程度を示すヒートマップである。Ｘ軸は、独立したコホート１９６人の肝癌およびこれに相当する肝正常サンプルを意味し、Ｙ軸は、プローブ（黄色ボックス）およびプローブ付近のＣｐＧ部位（ｓｉｔｅ）を意味する。
図１１は、ＥｐｉＴＹＰＥＲ実験を通じて本発明の一実施例によって選別されたプローブのメチル化程度を示すヒートマップである。Ｘ軸は、独立したコホート１８４人の肝癌およびこれに相当する肝正常サンプルを意味し、Ｙ軸は、プローブ（黄色ボックス）およびプローブ付近のＣｐＧ部位（ｓｉｔｅ）を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下では、添付の図面を参照して本発明を説明することとする。しかしながら、本発明は、様々な異なる形態に具現され得、したがって、ここで説明する実施例に限定されるものではない。
【００３０】
任意の部分が或る構成要素を「含む」というとき、これは、特に反対になる記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに備えることができることを意味する。
【００３１】
別途定義されない限り、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、およびＤＮＡ配列分析および当業者の能力範囲内で組換えＤＮＡ分野において頻繁に使用される通常の技術によって行われ得る。前記技術は、当業者に知られており、多くの標準化された教材および参考書に記述されている。
【００３２】
本明細書に別途定義されていなければ、使用されたすべての技術および科学用語は、当業界における通常の技術者が通常的に理解するもののような意味を有する。
【００３３】
本明細書に含まれる用語を含む多様な科学的辞典がよく知られており、当業界において利用可能である。本明細書に説明されたものと類似または等価の任意の方法および物質が本願の実行または試験に使用されることが発見されるが、いくつかの方法および物質が説明されている。当業者が使用する脈絡によって、多様に使用され得るので、特定の法学、プロトコルおよび試薬に本発明が制限されるものではない。
【００３４】
本明細書で使用されるもののように、単数型は、文脈が明確に別途指示しなければ、複数の対象を含む。また、別途指示されたことがなければ、核酸は、それぞれ左側から右側、５’から３’方向に書かれ、アミノ酸配列は、左側から右側、アミノからカルボキシル方向に書かれる。以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００３５】
本発明の一態様によれば、１種以上ＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定する段階；を含む肝癌の予後または危険度を評価する方法が提供される。
【００３６】
前記対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、診断対象としてヒトであってもよく、前記生物学的試料は、肝癌関連疾患の危険性を評価しようとする前記対象体から分離した試料であって、組織、細胞、血液、血しょう、腹膜液、滑膜液、唾液、尿、便などを含むが、これに制限されるものではない。好ましくは、前記生物学的試料は、血液であってもよく、具体的に血液から分離した血しょうであってもよい
【００３７】
また、前記ＣｐＧ部位のメチル化レベルを個別的に分析して、肝癌の予後または危険性の有無を診断することができるが、好ましくは２種以上、３種以上、または４種以上のＣｐＧ部位を同時に分析することによって、診断の正確性を向上させることができる。
【００３８】
前記診断は、特定疾病または疾患に対する対象体の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定するものであって、好ましくは、対象体が肝癌を現在有しているか否かを判定すること、肝癌にかかった対象体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）を判定すること、またはテラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）を含むことができる。
【００３９】
前記「メチル化」は、ＤＮＡを構成する塩基にメチル基が付着することを意味する。好ましくは、メチル化の可否は、特定遺伝子の特定ＣｐＧ部位のシトシンで起こるメチル化の可否を意味する。
【００４０】
前記「メチル化状態」は、ＤＮＡ塩基配列内での一つ以上のＣｐＧジヌクレオチドの５−メチル−シトシンの存在または不在を意味する。前記「メチル化レベル」は、例えばすべてのゲノム領域および一部の非ゲノム領域内の標的ＤＮＡメチル化遺伝子のＤＮＡ塩基配列に存在するメチル化の量を意味する。
【００４１】
前記メチル化レベルは、ＰＣＲ、メチル化特異ＰＣＲ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、リアルタイムメチル化特異ＰＣＲ（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ  ＰＣＲ、ＭｅｈｔｙＬｉｇｈｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ、ＥｐｉＴＹＰＥＲ、メチル化ＤＮＡ特異的結合タンパク質を用いたＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＤＮＡチップ、パイロシークエンシングおよびバイサルファイトシーケンシングよりなる群から選ばれる１種の方法で行われ得るが、これに制限されるものではない。
【００４２】
前記メチル化程度は、マイクロアレイにより識別され得る。前記マイクロアレイは、固相の表面に固定化されたプローブを用いることができる。前記プローブは、前記ＳＮＰを含む各遺伝子上の１０〜１００個の連続ヌクレオチド配列に相補的な配列を含むことができる。
【００４３】
前記ＣｐＧ部位は、前記遺伝子のＤＮＡ上に存在するＣｐＧ部位を意味する。前記遺伝子のＤＮＡは、発現するのに必要であり、互いに作動可能に連結されている一連の構成単位を全部含む概念であって、例えば、プロモーター領域、タンパク質コーディング領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）およびターミネーター領域を含む。
【００４４】
したがって、前記遺伝子のＣｐＧ部位は、当該遺伝子のプロモーター領域、タンパク質コーディング領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）またはターミネーター領域などに存在しうる。好ましい例としては、前記遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧ部位でありうる。
【００４５】
前記ＣｐＧ部位は、染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列、染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列、染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列、染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列、染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列、染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列、染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列、染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列、染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列、染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列、染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列、染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列、染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列よりなる群から選ばれる１種以上の塩基配列内に存在しうる。
【００４６】
前記染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列は、配列番号１の塩基配列を有し、前記染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列は、配列番号２の塩基配列を有し、前記染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列は、配列番号３の塩基配列を有し、前記染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列は、配列番号４の塩基配列を有し、前記染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列は、配列番号５の塩基配列を有し、前記染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列は、配列番号６の塩基配列を有し、前記染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列は、配列番号７の塩基配列を有し、前記染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列は、配列番号８の塩基配列を有し、前記染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列は、配列番号９の塩基配列を有し、前記染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列は、配列番号１０の塩基配列を有し、前記染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列は、配列番号１１の塩基配列を有し、前記染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列は、配列番号１２の塩基配列を有し、前記染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列は、配列番号１３の塩基配列を有し、前記染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列は、配列番号１４の塩基配列を有し、前記染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列は、配列番号１５の塩基配列を有しうる。
【００４７】
前記染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の２５４３９１１０番目に位置し、前記染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１２の９５９４１９８８番目に位置し、前記染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１０の１３４５９９８２３番目に位置し、前記染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の１４４６５１００２番目に位置し、前記染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１の４７９９９１６３番目に位置し、前記染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の２６３９５４５８番目に位置し、前記染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の１０４５１２８７７番目に位置し、前記染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の９８２９０１４８番目に位置し、前記染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の６３２８１１３９番目に位置し、前記染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃８の６７８７４１７８番目に位置し、前記染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃４の７６５５５８３２番目に位置し、前記染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１の６３７８９２７８番目に位置し、前記染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃５の７８５００７０番目に位置し、前記染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃２の３９１８７５３３番目に位置し、前記染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列のＣｐＧ部位は、染色体＃１４の７４２０８１６５番目に位置することができる。
【００４８】
本発明の他の態様によれば、染色体＃２の２５４３８７２５〜２５４３９２７６番目の配列、染色体＃１２の９５９４１９０６〜９５９４２９７９番目の配列、染色体＃１０の１３４５９７３５７〜１３４６０２６４９番目の配列、染色体＃８の１４４６４９７７４〜１４４６５１７７４番目の配列、染色体＃１の４７９９８８９９〜４７９９９５１７番目の配列、染色体＃２の２６３９４１０２〜２６３９６１０２番目の配列染色体＃８の１０４５１０８７０〜１０４５１３９１３番目の配列、染色体＃８の９８２８９６０４〜９８２９０４０４番目の配列、染色体＃２の６３２８１０３４〜６３２８１３４７番目の配列、染色体＃８の６７８７３３８８〜６７８７５６００番目の配列、染色体＃４の７６５５５３６６〜７６５５６０７９番目の配列、染色体＃１の６３７８２３９４〜６３７９０４７１番目の配列、染色体＃５の７８４９９４５〜７８５０４３９番目の配列、染色体＃２の３９１８６７７７〜３９１８７９６８番目の配列、および染色体＃１４の７４２０７６６５〜７４２０８６６５番目の配列よりなる群から選ばれるＣｐＧ部位に結合するプローブを含む肝癌発病危険度診断用キットが提供される。
【００４９】
前記プローブは、ハイブリダイゼーションアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として用いられ、基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に固定化され得る。
【００５０】
前記基体は、適切な堅固性または半堅固性支持体であって、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウェハー、ファイバー、磁性ビーズまたは非磁性ビーズ、ゲル、チュービング、プレート、高分子、微小粒子および毛細管を含むことができる。前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、前記の基体上に配列され、固定化され得る。
【００５１】
前記固定化は、化学的結合方法またはＵＶのような共有結合的方法により実施され得る。例えば、前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、エポキシ化合物またはアルデヒド基を含むように変形されたガラスの表面に結合され得、ポリリジンコーティングの表面でＵＶにより結合されることもできる。また、前記ハイブリダイゼーションアレイ要素は、リンカー（例：エチレングリコールオリゴマーおよびジアミン）を介して基体に結合され得る。
【００５２】
前記マイクロアレイに適用される試料ＤＮＡは、標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）され得、マイクロアレイ上のアレイ要素とハイブリダイゼーションされ得る。ハイブリダイゼーション条件は、多様に変更することができ、ハイブリダイゼーション程度の検出および分析は、標識物質によって多様に実施されることもできる。
【００５３】
前記プローブの標識は、ハイブリダイゼーションの可否を検出するシグナルを提供することができ、オリゴヌクレオチドに連結され得る。
【００５４】
前記標識は、蛍光団（例えば、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン、リサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、そしてＣｙ３とＣｙ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、発色団、化学発光団、磁気粒子、放射性同位元素（Ｐ３２およびＳ３５）、マス標識、電子密集粒子、酵素（アルカリンホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼ）、補因子、酵素に対する基質、重金属（例えば、金）、そして抗体、ストレプトアビジン、ビオチン、ジゴキシゲニンとキレート基のような特定の結合パートナーを有するヘプテンを含むことができが、これに限定されるものではない。
【００５５】
前記標識は、当業界において通常的に実施される多様な方法、例えば、ニックトランスレーション（ｎｉｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）方法、無作為プライミング方法（Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｏｏｋｌｅｔ，“Ａｍｅｒｓｈａｍ”（１９８９））およびカイネーション方法（Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９（１９８６））によりラベリングされ得る。
【００５６】
前記標識は、蛍光、放射能、発色測定、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素的活性、マス分析、結合親和度、ハイブリダイゼーション高周波、ナノクリスタルにより検出できるシグナルを提供することができる。
【００５７】
前記分析対象となる核酸試料は、多様な生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅｓ）から得られたｍＲＮＡを用いて製造することができる。前記プローブの代わりに分析対象となるｃＤＮＡを標識してハイブリダイゼーション反応−基礎分析を実施することもできる。
【００５８】
前記プローブを用いる場合、プローブをｃＤＮＡ分子とハイブリダイゼーションさせることができる。前記適切なハイブリダイゼーション条件は、最適化手続により一連の過程で決定され得る。前記手続は、研究室での使用のためのプロトコルを樹立するために、当業者により一連の過程で実施され得る。
【００５９】
例えば、温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーションおよび洗浄時間、緩衝液成分およびこれらのｐＨおよびイオン強さなどの条件は、プローブの長さおよびＧＣ量およびターゲットヌクレオチド配列などの多様な因子に依存する。前記ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；およびＭ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照することができる。
【００６０】
例えば、前記厳格条件のうち高厳格条件は、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、１ｍＭのＥＤＴＡで６５℃の条件でハイブリダイゼーションし、０．１ｘＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）／０．１％ＳＤＳで６８℃の条件で洗浄することを意味する。または、前記高厳格条件は、６ｘＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウムで４８℃の条件で洗浄することを意味し、低厳格条件は、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃の条件で洗浄することを意味する。
【００６１】
前記ハイブリダイゼーション反応後に、ハイブリダイゼーション反応を通じて出るハイブリダイゼーションシグナルを検出することができる。例えば、前記プローブが酵素により標識された場合、前記酵素の基質をハイブリダイゼーション反応結果物と反応させてハイブリダイゼーションの可否を確認することができる。
【００６２】
前記酵素および基質は、パーオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュパーオキシダーゼ）とクロロナフト―ル、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトレート）、レゾルフィンンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌおよびｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’−Ａｚｉｎｅ−ｄｉ［−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびナフトール／ピロニン；アルカリンホスファターゼとブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ−ＡＳ−Ｂ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびＥＣＦ基質；グルコースオキシダーゼとｔ−ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）およびｍ−ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）が使用され得る。
【００６３】
前記プローブが金粒子で標識された場合には、硝酸銀を用いて銀染色方法で検出することもできる。
【００６４】
前記肝癌の予後または危険度を評価する方法は、多様な統計処理方法を通じて肝癌診断の可能性を評価することができる。統計的処理方法として一具現例において機械学習（Ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ）方法が使用され、Ｍａｘｗｅｌｌ  Ｗ．Ｌｉｂｂｒｅｃｈｔ，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：３２１−３３２を参照することができる。
【００６５】
前記マシンラーニングは、人工知能の一分野であって、パターン認識とコンピュータ学習理論の研究から進化した分野である。マシンラーニングは、経験的データをベースに学習をし、予測を行い、自らの性能を向上させるシステムとこのためのアルゴリズムを研究し構築する技術である。マシンラーニングのアルゴリズムは、厳格に定められた静的なプログラム命令を行うことというより、入力データをベースに予測や決定を導き出すために特定のモデルを構築する方式である。
【００６６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に記述する。
【００６７】
実施例１．肝癌発病に関連したＤＭＰ選定
サンプル
肝癌発病に関連したＤＮＡメチル化地域を選別するために、ソウル大病院の肝癌患者１８４人から肝癌サンプルを得た。肝癌組織と相当する正常組織は、正常対照群として使用した。
【００６８】
カラム基盤のＤＮＡ抽出方法（ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ   Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とビーズ（Ｂｅａｄ）方式のＤＮＡ抽出方法（ＭａｇＬｉｓｔｏＴＭ  ５Ｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いてそれぞれのサンプルからｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを抽出した。抽出されたｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡは、ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて定量し、ＤＮＡ状態は、１．５％アガロースゲルで電気泳動して、ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎの有無を確認した。
【００６９】
バイサルファイト（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）処理
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡにバイサルファイト（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）を処理すると、ＤＮＡ塩基配列のうち５’−ＣｐＧ−３’部位のシトシンがメチル化された場合には、そのまま維持されるが、非メチル化された場合には、ウラシルに変わってメチル化程度を測定することができる。
【００７０】
したがって、メチル化されたシトシンと非メチル化されたシトシンを区別するために、ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡをバイサルファイトで処理した。７００ｎｇのｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡをＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）を用いて製造メーカーのマニュアルによって処理し、このように作られたバイサルファイト処理されたＤＮＡをＭ−Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで溶かして使用時まで−８０℃で保管した。
【００７１】
バイサルファイト処理されたＤＮＡは、１ヶ月以内に使用した。
【００７２】
ＤＮＡメチル化マイクロアレイ
Ｉｎｆｉｎｉｕｍ（（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ８５０Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐ）を使用して、ＤＮＡメチル化マイクロアレイを行った。
【００７３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＥＰＩＣ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  ｋｉｔｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて製造メーカーのマニュアルによって、バイサルファイト処理されたＤＮＡを増幅し、切断（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）および再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した後、ＢｅａｄＣｈｉｐにハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）した。
【００７４】
洗浄後、ＢｅａｄＣｈｉｐをＩｌｌｕｍｉｎａ  ｉＳｃａｎ  ｓｃａｎｎｅｒを用いてスキャンした。
【００７５】
Ｒパッケージのうち、ｍｉｎｆｉパッケージを用いてパッケージのマニュアルによってデータの品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を行った。品質管理基準を通過したサンプルに限ってメチル化程度が色で表示された生データ（ｒａｗ  ｄａｔａ）のｉｄａｔファイルを数値化した値であるβ値を計算した。
【００７６】
ＤＮＡメチル化程度は、０〜１の値を有するβ値で表示され、β値０は、当該ＣｐＧ部位が完全に非メチル化されたことを意味し、１は、完全にメチル化されたことを意味する。算出された結果を標準化し、補正した。すべての統計は、Ｒ統計環境（ｖ．３．３．２以上）で行われた（図１）。
【００７７】
実施例２．診断マーカー候補群の選定
図１を参照すると、１８２人の肝癌およびこれに相当する肝正常サンプルからＤＮＡを抽出して、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ＥＰＩＣ  ＢｅａｄＣｈｉｐを行った。
【００７８】
自体的に構築したパイプラインでメチル化データ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄａｔａ）を分析した。正常(ｎｏｒｍａｌ)でメチル化が低く、腫瘍(ｔｕｍｏｒ)でメチル化レベルが高いプローブ（ｐｒｏｂｅ）を選定した。
【００７９】
まず、正常と癌サンプルのメチル化の差異を示すＤＭＰを選定した。
【００８０】
正常サンプルでメチル化レベルが非常に低く、７０％以上の癌患者でメチル化が５０％以上と非常に高い７個のプローブを選別し、機械学習方法で効率を検証した（図１、藍色）。
【００８１】
正常サンプルでは、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が１０％以下と非常に低く、肝癌患者で平均的に３０％以上と高いプローブを選別し、機械学習を行って、肝癌／肝正常サンプルを効果的に区分する上位９個のプローブを選別した（図１、茶色）。
【００８２】
最終的に選別された１５個（１個重複）の肝癌診断マーカー候補群を多様な実験を通じて検証した。
【００８３】
実施例３．ヒートマップ（Ｈｅａｔｍａｐ）を通したプローブ選別
１８２肝癌サンプルおよび１２７正常サンプルのＤＮＡメチル化を調査した結果、５％以上の肝癌サンプルで３０％以上過メチル化された１００，０５３ＤＭＰ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ）を選別した。
【００８４】
正常／癌サンプル間の差異を示すＤＭＰの中で血液生検が可能となるように正常サンプルでメチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）が１０％以下と非常に低い１３，０７８プローブを選別した。
【００８５】
選別されたプローブのうち７０％以上の癌患者で５０％以上過メチル化された７個のプローブを選別した（表1）。
【００８６】
【表１】
2021503956.tif 000003
【００８７】
選定された７個のプローブの肝癌患者のメチル化値を確認したヒートマップを作成した（図4）。
【００８８】
実施例４．機械学習を通したプローブ選別
正常／癌サンプル間の差異を示すＤＭＰのうち正常サンプルでメチル化レベルが非常に低く、肝癌患者で平均的に３０％以上高いプローブを選別した。
【００８９】
前記プローブを用いて機械学習を行って、肝癌／肝正常サンプルを効果的に区分する上位９個のプローブを選別した。
【００９０】
図5を参照すると、青色円は、一つのプローブを意味し、重要度が高い順（ｘ、ｙ軸）に上位９個のプローブを選別した。
【００９１】
Ｘ軸は、機械学習で構築されたモデルで各プローブの正確度を意味し、Ｙ軸は、機械学習で構築されたモデルで各プローブの純粋度を意味する。
【００９２】
機械学習で選別された９個のプローブのメチル化程度を２００人の全血（ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）、１２５人の正常サンプル、１８０人の肝癌サンプルでメチル化値を確認したヒートマップを作成した（図6）。
【００９３】
実施例４および５の方法を通じて最終的に選別された１５個のプローブ情報は、下記表２の通りである。
【００９４】
【表２】
2021503956.tif 000004
【００９５】
実施例5．単一プローブ肝癌診断効率の評価
選別された１５個のプローブの肝癌診断効率を評価した（図7）。
【００９６】
図7は、各プローブの肝癌診断効率をＡＵＣで表示した結果である。
【００９７】
１５個のプローブを単独で使用して肝癌診断効率（ＡＵＣ；ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）を確認した結果は、下記表３の通りである。
【００９８】
【表３】
2021503956.tif 000005
【００９９】
また、Ｐｕｂｌｉｃ  ＤＢで単一プローブの肝癌診断効率を検証した（図8）。図8は、各プローブの肝癌診断効率をＡＵＣで表示した結果である。
【０１００】
ＴＣＧＡ  ＬＩＨＣ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｄａｔａ（４５０Ｋ）を用いて単一プローブの効率を検証した結果は、下記表４の通りである。
【０１０１】
灰色（−）で表示された領域は、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ４５０Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐにはなく、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ＥＰＩＣ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（８５０Ｋ）にのみあるプローブを意味する。
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
また、１５個のパネルプローブの肝癌診断効率を分析するために、１５個のプローブを統合して肝癌診断効率（ＡＵＣ；ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）を確認した（図9）。図9は、１５個のプローブで機械学習を行って出た訓練データおよび検証データの混同行列（Ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ  Ｍａｔｒｉｘ）結果である（２次交差検証）。
【０１０４】
データの偏向を防止するために、無作為で２個に分ける２次交差検証方法を１０回ずつ行って、テストセット（Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｓｅｔ）とトレーニングセット（Ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）に分類した。
【０１０５】
トレーニングセットに分類されたデータをベースに正常と肝癌のパターンを学習し、それによる肝癌特異的診断モデルを構築した。
【０１０６】
下記表５は、トレーニングセットの誤差行列である。
【０１０７】
【表５】
2021503956.tif 000007
【０１０８】
前記トレーニングセットで構築された肝癌特異的診断モデルをベースにテストセットを診断して、肝癌診断効率を確認した（表６）。
【０１０９】
【表６】
2021503956.tif 000008
【０１１０】
表５および表６を参照すると、マシンラーニングをベースに選定された１５個のプローブで肝癌特異的診断モデルを構築することができ、診断効率は、非常に高いレベルと評価された。
【０１１１】
実施例6．複数のプローブを用いた肝癌診断効率の評価
前記肝癌特異的診断モデルをベースに１５個のプローブのうち最大効率を有する最小のプローブ個数を探すために、プローブの個数による効率を測定した（図９）。
【０１１２】
図９は、可能なプローブ組合せに対して機械学習を進めて算出された結果である（２次交差検証）。Ｘ軸は、プローブ個数を意味し、Ｙ軸は、ＡＵＣ（診断効率）を意味する。
【０１１３】
図９を参照すると、プローブ個数が３個以上であるとき、診断効率が９９％以上に収束するので、非常に正確な診断情報を提供することができる。
【０１１４】
したがって、単一のプローブを用いるときと比較して、複数のプローブを用いるとき、診断の正確度が顕著に改善され得る。
【０１１５】
実施例7．パイロシークエンシングを通したプローブを含むＣｐＧアイランドのメチル化分析
選別されたプローブのうちプローブが結合されるＣｐＧ部位のメチル化程度を測定するために、パイロシークエンシングを実施した。
【０１１６】
パイロシークエンシングは、ヌクレオチド添加で放出されたピロホスフェート（ＰＰｉ）を用いる。ＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによりアデノシン５’ホスホサルフェートの存在下でＡＴＰに変換される。
【０１１７】
ルシフェラーゼは、ＡＴＰを使用してルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、この反応は、探知され、分析され得る光を生成する。
【０１１８】
選定されたプローブのＣｐＧ部位のメチル化程度をヒートマップで示した（図１０）。
【０１１９】
確認結果、正常（ｎｏｒｍａｌ）でメチル化レベルが低く、腫瘍(ｔｕｍｏｒ)ではメチル化レベルが高いことが示され、選別されたプローブのＣｐＧ部位とその周辺のメチル化程度が類似していることが確認された。
【０１２０】
実施例8．ＥｐｉＴＹＰＥＲを通したプローブを含むＣｐＧアイランドのメチル化分析
データの検証のために、プローブのうち上位３個のプローブのメチル化状態をＥｐｉＴＹＰＥＲＴＭ  ａｓｓａｙ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて定量的に分析した。
【０１２１】
ＰＣＲ増幅後に、試験管内で転写させた増幅断片（ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）をｓｈｒｉｍｐ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで処理し、ＲＮａｓｅＡで切断した後、メチル化状態を決定するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙに入れた。
【０１２２】
結果は、ＥｐｉＴＹＰＥＲＴＭ  ｖｅｒ．１．０  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
【０１２３】
選定された３個のプローブに対してＥｐｉＴＹＰＥＲでバリデーション（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を行った。選定されたプローブとその周辺のＣｐＧ部位のメチル化程度は、ヒートマップで確認した（図１１）。
【０１２４】
図１１を参照すると、正常（ｎｏｒｍａｌ）でメチル化レベルが低く、腫瘍(ｔｕｍｏｒ)ではメチル化レベルが高いことが示され、選別されたプローブのＣｐＧ部位とその周辺のメチル化程度が類似していることが確認された。
【０１２５】
したがって、ＣｐＧプローブを含むＣｐＧアイランド全体のメチル化レベルも、癌予後および危険度の診断に同一に使用され得る。
【０１２６】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。例えば、単一型と説明されている各構成要素は、分散して実施されることもでき、同様に、分散したものと説明されている構成要素も、結合された形態に実施され得る。
【０１２７】
本発明の範囲は、後述する請求範囲によって示され、請求範囲の意味および範囲、そしてその均等概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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