(57)【要約】  カチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子を含有する治療用ナノ粒子であって、抗細菌活性を発揮するカチオン性ポリペプチドは、ポリアニオン性分子との静電相互作用を形成し、治療用ナノ粒子は５０ｎｍ未満の直径を有する、治療用ナノ粒子。全て治療用ナノ粒子に関連する医薬組成物、処理方法、および調製方法も開示される。
2021532192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性ポリペプチド、および
ポリアニオン性分子
を含む治療用ナノ粒子であって、
抗細菌活性を発揮するカチオン性ポリペプチドが、ポリアニオン性分子との静電相互作用を形成し、治療用ナノ粒子が５０ｎｍ未満の直径を有する、治療用ナノ粒子。
【請求項２】
カチオン性ポリペプチドが、コリスチン、ポリミキシンＢ、およびポリミキシンＭからなる群から選択される抗生物質である、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項３】
カチオン性ポリペプチドがコリスチンである、請求項２に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項４】
ポリアニオン性分子が、アニオン性ポリペプチド、アニオン性オリゴヌクレオチド、アニオン性ポリヌクレオチド、またはアニオン性ポリ有機酸である、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項５】
ポリアニオン性分子が、１０，０００ｂｐ未満のサイズを有するプラスミドである、請求項４に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項６】
両親媒性安定剤をさらに含む、請求項４に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項７】
両親媒性安定剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質である、請求項６に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項８】
両親媒性安定剤が、ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ビオチン、メトキシＰＥＧ−コレステロール（ｍＰＥＧ−コレステロール）、またはコレステロール−ＰＥＧ−アミンである、請求項７に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項９】
ポリアニオン性分子が、グルタミン酸またはアスパラギン酸から形成されたポリアミノ酸である、請求項６に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１０】
ポリアニオン性分子が、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはロック核酸である、請求項６に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１１】
ポリアニオン性分子が、２０量体二本鎖ＤＮＡである、請求項１０に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１２】
ポリアニオン性分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１３】
ポリアニオン性分子が、ポリエチレングリコールおよびアニオン性ポリペプチドを含有するジブロックコポリマーである、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１４】
アニオン性ポリペプチドが、グルタミン酸またはアスパラギン酸から形成されたポリアミノ酸である、請求項１３に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１５】
カチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子が、１：４〜７：１のカチオン：アニオン電荷比を有する、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１６】
治療用ナノ粒子が両親媒性安定剤をさらに含み、ポリアニオン性分子が、アニオン性ポリペプチド、アニオン性オリゴヌクレオチド、アニオン性ポリヌクレオチド、またはアニオン性ポリ有機酸である、請求項１５に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１７】
両親媒性安定剤が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ビオチン、ｍＰＥＧ−コレステロール、およびコレステロール−ＰＥＧ−アミンからなる群から選択されるＰＥＧ脂質である、請求項１６に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１８】
ポリアニオン性分子が、ポリエチレングリコールおよびアニオン性ポリペプチドを含有するジブロックコポリマーである、請求項１５に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項１９】
アニオン性ポリペプチドが、グルタミン酸またはアスパラギン酸から形成されたポリアミノ酸である、請求項１８に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２０】
治療用ナノ粒子が２５ｎｍ未満の直径を有する、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２１】
治療用ナノ粒子が１５ｎｍ未満の直径を有する、請求項２０に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２２】
カチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子が、１：４〜７：１のカチオン：アニオン電荷比を有する、請求項２１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２３】
治療用ナノ粒子が両親媒性安定剤をさらに含み、ポリアニオン性分子が、アニオン性ポリペプチド、アニオン性オリゴヌクレオチド、アニオン性ポリヌクレオチド、またはアニオン性ポリ有機酸である、請求項２２に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２４】
ポリアニオン性分子が、ポリエチレングリコールおよびアニオン性ポリペプチドを含有するジブロックコポリマーである、請求項２２に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２５】
治療用ナノ粒子が両親媒性安定剤をさらに含み、１５ｎｍ未満の直径を有し、カチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子が、１：４〜７：１のカチオン：アニオン電荷比を有し、ポリアニオン性分子が、アニオン性ポリペプチド、アニオン性オリゴヌクレオチド、アニオン性ポリヌクレオチド、またはアニオン性ポリ有機酸である、請求項１に記載の治療用ナノ粒子。
【請求項２６】
請求項１に記載の治療用ナノ粒子および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１に記載の治療用ナノ粒子を調製する方法であって、
両親媒性安定剤を含有する水溶液を用意すること、
水溶液に、所定のモル比のカチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子を混合すること、ならびに
生じた混合物から治療用ナノ粒子を得ること
を含む、方法。
【請求項２８】
グラム陰性細菌を処理する方法であって、必要とする対象に有効量の請求項１に記載の治療用ナノ粒子を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細菌感染症の治療は、抗生物質耐性の出現のために重大な問題に直面している。例えば、カルバペネム耐性アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）は、ヒトの健康に重大な脅威を引き起こす３種のグラム陰性細菌である。Willyard, Nature, 2017, 543, 15を参照されたい。これらの細菌は、肺炎、菌血症、髄膜炎、尿路および皮膚および創傷の感染を含む種々の疾患を起こす。Bergogne-Berezin et al., Clin. Microbiol. Rev., 1996, 9, 148-165およびGuzek et al., Adv. Exp. Med. Biol., 2017, 955, 39-46を参照されたい。
【０００２】
カルバペネムは致死的な細菌感染症に対する最後の療法として使用されることが多いので、その効力の衰えは、特定の細菌の処理における代替抗菌剤を求める多大な研究努力を促してきた。Antachopoulos et al., Pediatr. Infect. Dis. J., 2017, 36, 905-907を参照されたい。代替品のなかで、１０年が経過した抗菌剤であるコリスチンは、グラム陰性細菌に対する同等な効力を示す他の選択肢がほとんどないため、関心を集めつつある。Montero et al., The J. Antimicrob. Chemother., 2004, 54, 1085-1091を参照されたい。ポリミキシンのメンバーとして、コリスチンは、細菌細胞膜との強い静電相互作用に起因する強力な抗細菌活性を有するポリカチオン性環状ペプチドの混合物である。Colome et al., Int. J. Pharm., 1993, 90, 59-71を参照されたい。コリスチンは多剤耐性グラム陰性細菌を処理するための抗菌剤としてますます使用されてきたが、その腎毒性および神経毒性の副作用は重大な安全性の問題を起こす。Falagas et al., Expert Rev. Anti-Infect. Ther., 2018, 6, 593-600を参照されたい。
【０００３】
コリスチンは、その安全性プロファイルを改善するために化学修飾され、製剤化されてきた。例えば、コリスチンのプロドラッグおよび誘導体は、メタンスルホネート修飾およびアミンの非カチオン性残基による置換により合成されてきた。Li et al., Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2003, 52, 987-992; Li et al., J.Antimicrob. Chemother., 2004, 53, 837-840; Vaara et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2008, 52, 3229-3236; Vaara et al., J. Antimicrob. Chemother., 2013, 68, 636-639;およびVaara et al., Peptides, 2010, 31, 2318-2321を参照されたい。これらの誘導体における電荷の減少は薬物安全性の改善をもたらすが、抗菌効力の低下も起こす。
【０００４】
ナノ粒子薬物送達プラットフォーム、例えば、リポソームおよびポリマー性ナノ粒子は、既存の抗生物質の治療有効性を増強し、副作用を低下させるために大規模に利用されてきた。実際に、コリスチンは、量子ドット、リポソーム、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）−粒子、シリカナノ粒子、およびポリ（スチレンスルホネート）粒子を含むいくつかのナノ粒子プラットフォームにより製剤化されてきた。Carrillo-Carrion et al., Biosens. Bioelectron., 2011, 26, 4368-4374; Wallace et al., Drug Delivery and Translational Research, 2012, 2, 284-292; Wallace et al., J. Pharm. Sci., 2012, 101, 3347-3359; Shah et al., Pharm. Res., 2014, 31, 3379-3389; Gounani et al., Int. J. Pharm., 2018, 537, 148-161; Insua et al., Eur. Polym. J., 2017, 87, 478-486;およびInsua et al., Sci. Rep., 2017, 7, 9396を参照されたい。しかし、多くの場合、ナノ担体と会合したコリスチンは、低下した抗菌活性を示す。
望ましい安全性プロファイルを発揮すると同時に抗生物質の治療効力を改善する、抗生物質を送達するための新たなナノ担体系を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一態様は、カチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子を含有する治療用ナノ粒子である。抗細菌活性を発揮するカチオン性ポリペプチドは、ポリアニオン性分子との静電相互作用を形成し、治療用ナノ粒子は５０ｎｍ未満の直径を有する。意外にも、治療用ナノ粒子は、安全性プロファイルの改善と共に、カチオン性ポリペプチド、すなわちコリスチンの治療有効性を増強させる。
典型的には、カチオン性ポリペプチドは、コリスチン、ポリミキシンＢ、およびポリミキシンＭからなる群から選択される抗生物質である。例示的な治療用ナノ粒子は、カチオン性ポリペプチドとしてコリスチンを含有する。
他方で、ポリアニオン性分子は、アニオン性ポリペプチド、アニオン性オリゴヌクレオチド、アニオン性ポリヌクレオチド、またはアニオン性ポリ有機酸であり得る。例えば、ポリアニオン性分子は、１０，０００塩基対すなわちｂｐ未満（例えば、６，０００ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、および２０ｂｐ未満）のサイズを有するプラスミドである。別な例として、ポリアニオン性分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに、ポリアニオン性分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびアニオン性ポリペプチドを含有するジブロックコポリマーでもあり得る。
【０００６】
注目すべきことに、治療用ナノ粒子は両親媒性安定剤をさらに含有し得る。一般的に、両親媒性安定剤はＰＥＧ脂質である。ＰＥＧ脂質の例としては、ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ビオチン、メトキシＰＥＧ−コレステロール（ｍＰＥＧ−コレステロール）、およびコレステロール−ＰＥＧ−アミンがあるが、これらに限定されない。
上述の治療用ナノ粒子は、典型的には、１：４〜７：１（例えば、１：２、１：１、２：１、および４：１）のカチオン：アニオン電荷比を有するカチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子を含む。
本発明の別の態様は、上述の治療用ナノ粒子および薬学的に許容できる担体を含有する医薬組成物である。
本発明がさらに対象とするのは治療用ナノ粒子を調製する方法である。方法は、両親媒性安定剤を含有する水溶液を用意すること、水溶液に、所定のモル比のカチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子を混合すること、ならびに生じた混合物から治療用ナノ粒子を得ることを含む。
グラム陰性細菌を処理する方法であって、必要とする対象に有効量の上述の治療用ナノ粒子を投与することを含む、方法も本発明の範囲内である。
本発明の詳細は、以下の説明に述べられる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびに添付の請求項からも明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】凍結乾燥前後のコリスチンナノ粒子（ＣＳ  ＮＰ）のサイズおよびゼータ電位を示すグラフである（ｎ＝３）。
【図１Ｂ】ＣＳ  ＮＰ中のコリスチンＡ、コリスチンＢ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、およびポリグルタミン酸の回収収率を示すグラフである（ｎ＝３）。
【図１Ｃ】２５℃で４日間のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）および５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）溶液中のＣＳ  ＮＰのサイズ測定値を示すグラフであり、挿入図は、ＦＢＳ中のＦＢＳタンパク質とコリスチンナノ粒子の間の異なるサイズ分布を強調している（ｎ＝３）。
【図１Ｄ】ｐＨ７．４およびｐＨ５でのＣＳ  ＮＰからのコリスチン（ＣＳ）放出を示すグラフであり（ｎ＝３）、エラーバーは平均±標準偏差を表す。
【図２Ａ】ＣＳ  ＮＰの調製および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するグラム陰性細菌へのそれらの結合の模式的描写である。
【図２Ｂ】Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲートＣＳ  ＮＰと共培養されたＡ．バウマニの蛍光顕微鏡画像である。
【図２Ｃ】ＧＦＰがグリーンチャンネルで可視化され、ナノ粒子がレッドチャンネルで可視化された、シアニン（Ｃｙ５）コンジュゲートＣＳ  ＮＰと共培養されたＡ．バウマニの蛍光顕微鏡画像を示す。
【図２Ｄ】ＧＦＰがグリーンチャンネルで可視化され、ナノ粒子がレッドチャンネルで可視化された、Ｃｙ５コンジュゲートＣＳ  ＮＰと共培養されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図２Ｅ】蛍光性ＣＳ  ＮＰによる１．５時間の処理後に測定されたＧＦＰを発現するＡ．バウマニ内の正規化されたＧＦＰおよびナノ粒子蛍光シグナルを示すグラフである。
【図２Ｆ】蛍光性ＣＳ  ＮＰによる２４時間の処理後に測定されたＧＦＰを発現するＡ．バウマニ内の正規化されたＧＦＰおよびナノ粒子蛍光シグナルを示すグラフである。
【図３Ａ】１２．５ｍｇ／ｋｇのＣＳまたはＣＳ  ＮＰの静脈内注射後のマウスの生存を示すグラフである（ｎ＝６）。
【図３Ｂ−３Ｍ】ＰＢＳ、ＣＳ、またはＣＳ  ＮＰによる処置後のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）  アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、総タンパク（ＴＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、クレアチニン（ＣＲＥＡ）、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、リン（ＰＨＯＳ）、カルシウム（ＣＡ）、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）、グルコース（ＧＬＵ）、およびトリグリセリド（ＴＧ）の血清レベルをそれぞれ示すグラフである（破線は正常値を表し、エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍを表す；ｎ＝３）。
【図４Ａ】Ａ．バウマニ肺炎のマウスモデルにおけるＣＳ  ＮＰ処置およびその処置スケジュールの模式的描写である。
【図４Ｂ】３種の異なる処置群、すなわち、５ｍｇ／ｋｇのＣＳ、５ｍｇ／ｋｇのＣＳ  ＮＰ、または対照としてのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で処置されたマウスの感染後の生存を示すグラフである。
【図５Ａ】実施例２に記載されるＡｌｅｘａ  ６４７およびＡｌｅｘａ  ４８８フルオロフォアコンジュゲートＣＳ  ＮＰの調製および定量的な分析の模式的描写である。
【図５Ｂ】フルオロフォアコンジュゲートＣＳ  ＮＰと共に１．５および２４時間の細菌インキュベーションをした後の細菌ペレット中のＡｌｅｘａ  ６４７およびＡｌｅｘａ  ４８８の相対的蛍光強度を示すグラフである（エラーバーは平均±標準偏差を表す；ｎ＝３）。
【図６Ａ】それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、および４０ｍｇ／ｋｇで測定されたＣＳ、実施例１のＣＳ  ＮＰ（第１のＣＳ  ＮＰ）、および実施例２のもの（第２のＣＳ  ＮＰ）のＭＴＤを示す棒グラフである。
【図６Ｂ】ＣＳ（１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、および１２ｍｇ／ｋｇ）、第１のＣＳ  ＮＰ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、および第２のＣＳ  ＮＰ（４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、および５０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射後のマウスの生存を示すグラフである。
【図７Ａ】Ｋ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮＨＲＩ  １分離株のマウス生存モデルにおけるＣＳ  ＮＰ処置およびその処置スケジュールの模式的描写である。
【図７Ｂ】モニタリングされ、ログランク検定を使用して解析された、３種の処置群、すなわち、ＰＢＳ、５ｍｇ／ｋｇのＣＳ、２０ｍｇ／ｋｇ  ＣＳ  ＮＰで処置されたマウスの生存を示すグラフである（ｎ＝５〜６）。
【図７Ｃ】Ｋ．ニューモニエＮＨＲＩ  １分離株のマウス感染症モデルにおけるＣＳ  ＮＰ処置およびその処置スケジュールの模式的描写である。
【図７Ｄ】モニタリングされ、一元配置分散分析により解析された、２種の異なる処置群、すなわち、５ｍｇ／ｋｇのＣＳまたは２０ｍｇ／ｋｇ  ＣＳ  ＮＰにより処置されたマウスの血液、心臓、肝臓、脾臓、肺、および腎臓中のＣＦＵの数を示すグラフである（エラーバーは平均±ｓ．ｅ．ｍを表す；ｎ＝３）。
【図８】ＣＳ／ＤＮＡナノ粒子（左）およびＤＮＡのみ（右）とのインキュベーション後に４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドールにより染色されたカルバペネム耐性Ｋ．ニューモニエの蛍光顕微鏡画像を示す。
【図９】ＣＳ、ｆｔｓＺ  ＤＮＡ断片のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯftsZ）、ＣＳ＋ＡＳＯftsZ、およびＣＳ−ＡＳＯftsZナノ粒子（ＣＳ−ＡＳＯftsZ  ＮＰ）との２４時間の共培養後のＥ．コリ  ＡＴＣＣ２５９２２コロニー形成を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
改善された安全性プロファイルと共に、抗生物質（すなわちコリスチン）の治療有効性を意外にも増強させる治療用ナノ粒子が、まず本明細書に詳細に開示される。
上述の通り、本発明の治療用ナノ粒子はカチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子を含有し、抗細菌活性を発揮するカチオン性ポリペプチドは、ポリアニオン性分子との静電相互作用を形成する。
治療用ナノ粒子は、５０ｎｍ未満、好ましくは２５ｎｍ未満、より好ましくは１５ｎｍ未満の直径を有する。
カチオン性ポリペプチドの例としては、コリスチン（すなわちポリミキシンＥ）、ポリミキシンＢ、およびポリミキシンＭがあるが、これらに限定されない。
再び、ポリアニオン性分子は、典型的には、アニオン性ポリペプチド、アニオン性オリゴヌクレオチド、アニオン性ポリヌクレオチド、またはアニオン性ポリ有機酸である。
一実施形態において、ポリアニオン性分子は、グルタミン酸から形成されたポリアミノ酸、すなわちポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、またはアスパラギン酸から形成されたポリアミノ酸、すなわちポリアスパラギン酸（ＰＬＤ）である。それは、１種または複数のグルタミン酸またはアスパラギン酸と、１種または複数の他のアミノ酸（例えば、アラニン、システイン、およびチロシン）から形成されたポリマーでもよい。
【０００９】
別の実施形態において、ポリアニオン性分子は、一本鎖もしくは二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸、またはロック核酸である。例えば、ポリアニオン性分子は、２０量体二本鎖ＤＮＡである。別の例として、ポリアニオン性分子は、１０，０００ｂｐ未満（例えば、６，０００ｂｐ未満、５００ｂｐ未満、および２０ｂｐ未満）のサイズを有するプラスミドである。さらに別の例として、ポリアニオン性分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
さらなる実施形態において、ポリアニオン性分子は、ＰＥＧおよびアニオン性ポリペプチドを含有するジブロックコポリマーであり、アニオン性ポリペプチドは、グルタミン酸またはアスパラギン酸から形成されたポリアミノ酸であり得る。ジブロックコポリマーを含有する例示的な治療用ナノ粒子は、コリスチンおよびＰＥＧ−ポリアスパラギン酸（ＰＥＧ−ＰＬＤ）から形成される。
【００１０】
先に指摘された通り、本発明の治療用ナノ粒子は両親媒性安定剤をさらに含有し得るが、それは典型的にはＰＥＧ脂質である。ＰＥＧ脂質の例としては、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ビオチン、ｍＰＥＧ−コレステロール、およびコレステロール−ＰＥＧ−アミンがあるが、これらに限定されない。それらの構造は以下に示される。
【化１】
2021532192.tif 000003
DSPE-mPEG (分子量: 1k〜40k)
2021532192.tif 000004
DSPE-PEG-マレイミド(分子量: 1k〜5k)
2021532192.tif 000005
DSPE-PEG-ビオチン(分子量: 1k〜5k)
2021532192.tif 000006
mPEG-コレステロール(分子量: 1k〜40k)
2021532192.tif 000007
コレステロール-PEG-アミン(分子量: 1k〜10k)
【００１１】
注目すべきことに、上述の治療用ナノ粒子は、典型的には、１：４〜７：１、好ましくは、１：１〜７：１のカチオン：アニオン電荷比を有するカチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子を含む。
好ましい実施形態において、治療用ナノ粒子は両親媒性安定剤をさらに含有し、１５ｎｍ未満の直径を有し、カチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子は、１：４〜７：１のカチオン：アニオン電荷比を有し、ポリアニオン性分子は、アニオン性ポリペプチド、アニオン性オリゴヌクレオチド、アニオン性ポリヌクレオチド、またはアニオン性ポリ有機酸である。
上記治療用ナノ粒子および薬学的に許容できる担体を含有する医薬組成物も開示される。
医薬組成物中の担体は、組成物の有効成分と適合性があり（かつ、好ましくは有効成分を安定化することが可能であり）、治療される対象にとって有害でないという意味で「許容できる」ものでなくてはならない。１種または複数の可溶化剤が、活性のあるグリコシド化合物を送達するための医薬賦形剤として利用できる。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．１０がある。
【００１２】
本発明がさらに対象とするのは治療用ナノ粒子を調製する方法である。方法は、（ｉ）両親媒性安定剤を含有する水溶液を用意する工程、（ｉｉ）水溶液に、所定のモル比のカチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子を混合する工程、ならびに（ｉｉｉ）生じた混合物から治療用ナノ粒子を得る工程を含む。
治療用ナノ粒子を調製するためには、カチオン性ポリペプチドおよびポリアニオン性分子は、典型的には、１．６：１〜５１８：１のモル比で混合される。
最後に、本発明は、グラム陰性細菌を処理する方法であって、必要とする対象（例えば患者）に有効量の上述の治療用ナノ粒子を投与することを含む、方法も対象とする。
用語「有効量」は、治療される対象に治療効果を与えるのに要する複合体の量を指す。有効な投与量は、当業者に認識される通り、治療される疾患の種類、投与経路、賦形剤の使用、および他の治療的処置の同時利用の可能性により様々であろう。
本発明の方法を実施するために、上述のナノ粒子を有する組成物は、非経口的に、経口的に、鼻腔内に、直腸内に、局所的に、または頬側に投与され得る。本明細書での用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、または頭蓋内注射、ならびに任意の好適な注入技法を指す。
【００１３】
滅菌された注射用組成物は、１，３−ブタンジオール中の液剤など、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の液剤でも懸濁剤でもよい。利用することができる許容できるビヒクルおよび溶媒には、マンニトール、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム液がある。さらに、不揮発油は、従来溶媒または懸濁媒体として利用されている（例えば、合成のモノ−またはジグリセリド）。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は注射剤の調製において有用であり、オリーブ油またはヒマシ油、特にポリオキシエチル化された形態のオリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容できる油も同様である。これらの油性液剤または懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、カルボキシメチルセルロース、または類似の分散化剤も含有し得る。ＴｗｅｅｎもしくはＳｐａｎなどの他の通常使用される界面活性剤または薬学的に許容できる固体、液体、もしくは他の剤形の製造に通常使用される他の類似の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ増進剤も、製剤化の目的で使用できる。
【００１４】
経口投与用の組成剤は、カプセル剤、錠剤、乳剤および水性懸濁剤、分散剤、および液剤を含むあらゆる経口的に許容できる剤形であり得る。錠剤の場合、通常使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンがある。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も典型的には加えられる。カプセル形態での経口投与のためには、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥されたトウモロコシデンプンがある。水性懸濁剤または乳剤が経口投与される場合、有効成分は、乳化剤または懸濁化剤と合わされて油相に懸濁または溶解され得る。望まれる場合、特定の甘味剤、着香剤、または着色剤が加えられ得る。
鼻腔内エアロゾルまたは吸入組成物は、医薬製剤の分野に周知である技法に従って調製できる。例えば、そのような組成物は、当技術分野に公知であるベンジルアルコールもしくは他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを増強させる吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の可溶化剤もしくは分散化剤を利用して塩水中の液剤として調製できる。
ナノ粒子を含有する組成物は、直腸投与用の坐剤の形態でも投与できる。
さらに説明がなくても、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の具体例、すなわち実施例１〜４は、単なる例示として解釈すべきであり、いかなることがあっても本開示の残りを限定するものではない。本明細書に引用される全ての刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００１５】
全試薬および化学薬品は、分析グレードであった。コリスチン硫酸塩、ポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩（ＭＷ  ３０００〜１５０００）、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ウシ血清アルブミン、リン酸一ナトリウム一水和物、無水リン酸水素二ナトリウムを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。無水酢酸ナトリウムを、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００；分子量：２６９３．２８５Ｄａ）、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００；分子量：５７９７．０４Ｄａ）を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から購入した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩）［エチレングリコールの繰り返し単位の数：ｎ＝４５４（ＭＷ＝２０，０００Ｄａ）；アスパラギン酸の繰り返し単位の数：ｘ＝７５（ＭＷ＝１０，５００Ｄａ）］を、Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から購入した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（５’→３’）（Ｃｙ５−ｍＣｍＣｍＡｍＵ−ＴＧ−ＧＴＴ−ＣＡＡ−Ａ−ｍＣｍＡｍＵｍＡ、ｍ＿：２’Ｏ−メチル塩基）から合成した。
【実施例】
【００１６】
（実施例１：コリスチン、ＰＧＡ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００から形成されるナノ粒子）
コリスチン（ＣＳ）、ＰＧＡ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００から形成される治療用ナノ粒子を調製し、特性決定し、試験するための研究を下記の通り実施した。
カチオン性ＣＳとアニオン性ＰＧＡとの間のコアセルベーションを引き起こすために、２種の成分を異なる質量比で混合することによりスクリーニングアッセイを実施した。５：５より低いＣＳ：ＰＧＡ比では、相分離は全く観察されなかった。ＣＳ：ＰＧＡ比を６：４超に増加させると、生じた溶液は濁り、液滴の形成を示した。ＣＳ：ＰＧＡ比が６：４から９：１の間で増加するにつれ、液滴の平均サイズは約３００ｎｍから約２０，０００ｎｍに増加し、それに対応してゼータ電位が−２０ｍＶから２ｍＶに増加した。コアセルベート形成は、ＣＳ：ＰＧＡ比が０：１０〜６：４の間または９：１〜１０：０の間である場合観察されなかった。ＣＳとＰＧＡとの間のコアセルベート複合化を確認する際に、ＣＳナノ粒子（ＣＳ  ＮＰ）を、ＣＳ：ＰＧＡ質量比を６：４として調製したが、その理由は、その混合物が負のゼータ電位を有する最小のコアセルベート液滴をもたらしたからである。
【００１７】
典型的な調合物において、３．６ｍｇのＣＳと２．４ｍｇのＰＧＡを、３６ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含有する７．２ｍＬの水中で混合した。次いで、混合物を、５，０００ｐｓｉで運転する高圧ホモジナイザーＮａｎｏｌｙｚｅｒ−Ｎ２（Ｇｏｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｈｓｉｎｃｈｕ  Ｃｏｕｎｔｙ、Ｔａｉｗａｎ）を使用して分散させた。生じたナノ粒子を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｃｏｕｎｔｙ  Ｃｏｒｋ、Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用し、濾過して遊離のＣＳ、ＰＧＡ、またはＤＳＰＥ−ＰＥＧを除去した。
その後に、ナノ粒子をその物理化学的性質に関して分析した。動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、ＣＳ  ＮＰが８ｎｍの直径および−３ｍＶのゼータ電位を有し、凍結乾燥および水での再構成後にサイズにもゼータ電位にも変化がなかったことを示した（図１Ａ）。ＣＳ  ＮＰの含量の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、コリスチンＡ、コリスチンＢ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、およびＰＧＡの回収収率が、それぞれ９９．０７、９５．７４、９９．６０、および８１．４５であることを示し（図１Ｂ）、ナノ粒子への非常に効率よいＣＳ組込みを示した。
【００１８】
ナノ粒子を安定性に関しても評価した。それらが、ＰＢＳおよび１０％ＦＢＳ溶液中で、室温で少なくとも４日間、サイズ変化を示さずに安定なままでいたことが分かった（図１Ｃ）。
ＣＳ  ＮＰからのＣＳ放出の研究を、透析チューブを５０ｋ  ＭＷＣＯ膜（Ｐｕｒ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｍａｘｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に使用して、０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）および０．１５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中で行った。リン酸緩衝液は、１６．４８ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4および４．６７ｇ／Ｌ  ＮａＨ2ＰＯ4を含有しており、酢酸緩衝液は、０．３％（ｖ／ｖ）酢酸および１．３％（ｗ／ｖ）酢酸ナトリウムを含有していた。試料を、それぞれ穏やかに撹拌されている３７℃の透析チューブ中に配置した。所定の時点で、試料を収集し、ＨＰＬＣを使用してＣＳ含量を分析した。
遊離のＣＳが装置から迅速に透析される一方で、ＣＳ  ＮＰは持続放出プロファイルを示し、２４時間後に７０％のＣＳ含量を保ったことが分かった（図１Ｄ）。ｐＨ７．４〜ｐＨ５．０の間で、放出速度に著しい差異は観察されなかった。ＣＳ上のアミン基のｐＫａが約１０であり、ＰＧＡ上のカルボキシル基のｐＫａが約４．３であるので、２つの分子は、それらの相対する電荷をｐＨ７．４およびｐＨ５．０で保持していると予想される。したがって、生理学的レベルでの酸度の変動が、複合化の動態に著しく影響するとは予想されない。
【００１９】
（ＣＳ  ＮＰの抗細菌効力）
ＣＳ  ＮＰの抗細菌効力を評価するために、それらの最小阻止濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を、５種の参考細菌株ならびにカルバペネム耐性Ａ．バウマニ、Ｐ．エルギノーザ、Ｅ．コリ、およびＫ．ニューモニエの３９種の臨床分離株に対して評価した。
参考細菌株をＡＴＣＣから購入した。カルバペネム耐性細菌の臨床分離株を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ（ＮＨＲＩ）およびＴｒｉ−Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＴＳＧＨ）から得た。ＭＩＣは、細菌の成長を阻害するのに要する抗生物質の最低濃度と定義されている。ＭＢＣは、菌類を根絶するのに要する抗生物質の最低濃度と定義されている。ＣＳおよびＣＳ  ＮＰのＭＩＣを、ブロス微量希釈法を使用して決定した。細菌懸濁液を、マクファーランド０．５±０．０５の濁度に調整し、異なる濃度のＣＳまたはＣＳ  ＮＰと共に一晩培養した。抗菌剤処理のない対照群を基準として調製した。一晩のインキュベーションの後、溶液濁度を目視検査により決定した。観察可能な濁りがない培養ウェルを、ＭＢＣ評価のためにさらに継代培養した。透明なウェルから得た溶液を寒天プレート上に置き、一晩培養して、ＭＢＣを決定した。
【００２０】
以下の表１に示される通り、ＣＳ  ＮＰのＭＩＣおよびＭＢＣは、全般的にＣＳのものに等しかった。細菌株の一部に対して、ＣＳ  ＮＰは、意外にも抗菌活性の２〜４倍の増強を示した。ＰＧＡおよびＰＥＧが静菌効果も殺菌効果も全く示さず、それらがＣＳ  ＮＰの活性に寄与しなかったことを示すことに留意すべきである。
結果は、ＣＳの治療効果が保持され、いくつかの場合に、意外にもナノ粒子集合時に改善され、カルバペネム耐性細菌の臨床症状に対する実行可能な選択肢を与えたことを示す。
【表１】
2021532192.tif 000008
2021532192.tif 000009
【００２１】
（ＣＳ  ＮＰの細菌への結合）
菌類とＣＳ  ＮＰとの相互作用をさらに調査するための研究を実施した。
簡潔に言うと、蛍光性ＣＳ  ＮＰを、最初にＣＳをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルと５対１のモル比で、水中で４８時間インキュベートすることにより調製した。コンジュゲーションの後に、ＣＳを、５，０００ｐｓｉのＮａｎｏｌｙｚｅｒ  Ｎ−２による分散により、ナノ粒子集合のためにＰＧＡおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧと混合した。生じたナノ粒子を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｆｉｌｔｅｒを使用し、濾過してコンジュゲートしていないフルオロフォアを除去した。青みがかった保持液を収集し、染料標識されたＣＳ  ＮＰを凍結乾燥させ、−８０℃で保存した。次いで、蛍光染料標識されたＣＳ  ＮＰをＰＢＳに懸濁させ、ＧＦＰを発現するＡ．バウマニまたはＥ．コリと共にインキュベートした（図２Ａ）。９０分または２４時間のインキュベーションの後、細菌をＰＢＳにより洗浄して、未結合のナノ粒子を除去した。生じた細菌を、４％パラホルムアルデヒドによりポリ−Ｌ−リジンコートスライドに固定化し、共焦点蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００）を使用して調査した。
【００２２】
ＣＳ  ＮＰのＭＩＣでの９０分の処理の後、共焦点顕微鏡法は、蛍光を発する点に覆われている細菌を明らかにした（図２Ｂ）。ナノ粒子付着は、Ａ．バウマニ（図２Ｃ）とＥ．コリ（図２Ｄ）の両方に観察され、グラム陰性細菌とナノ粒子との間の親和性を表している。Ａ．バウマニを９０分および２４時間、ＣＳ  ＮＰと共にインキュベーションに付した速度研究において、長時間のインキュベーションは、細菌全体に、より高い粒子蛍光をもたらした（図２Ｅおよび２Ｆ）。粒子蛍光のこの増加と共に、ＧＦＰ蛍光の減少が起こった。外部粒子と内部タンパク質内容物との平衡は、細菌細胞壁の完全性が損なわれたことを示唆する。これらの観察結果は、ナノ粒子がＣＳの活性を保存することを支持する。細菌への最初の粒子結合の後に、細菌細胞膜は続いて損傷を受け、成長阻害につながった。
【００２３】
（ＣＳ  ＮＰの安全性プロファイル）
マウスにおけるＣＳ  ＮＰおよびＣＳの安全性プロファイルを比較するための研究を実施した。
簡潔に言うと、ＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から得た８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＣＳまたはＣＳ  ＮＰを、８、９、１０、１１、１２、１２．５、および１３ｍｇ／ｋｇのＣＳで、尾静脈により静脈内注射して、遊離の薬物およびナノ粒子の最大耐用量（ＭＴＤ）を決定した。例えば、Li et al, International Journal of Pharmaceutics, 2016, 515, 20-29;およびBarnett et al., British Journal of Pharmacology and Chemotherapy, 1964, 23, 552-574を参照されたい。調査した全対象が生存したままであった最高用量をＭＴＤと定義した。
【００２４】
ＣＳ  ＮＰおよびＣＳのＭＴＤが、それぞれ１２．５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇであることが分かった。１２．５ｍｇ／ｋｇで、ＣＳは、数分のうちに振戦、呼吸困難、および死亡をマウスに引き起こしたが、ＣＳ  ＮＰは、動物による忍容性が良好であった（図３Ａ）。
ＣＳとＣＳ  ＮＰの間での長期の処置効果をさらに比較するために、３匹のマウスの群を、それぞれの製剤（ＰＢＳに溶解）による７日間の処置（４ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与、１日２回）後に包括的な血清化学検査に付した。１群のマウスに、陰性対照として、滅菌されたＰＢＳを尾静脈により静脈内注射した。最後の処置の２４時間後に、０．５ｍＬの血液を、包括的な代謝パネル分析のために、動物から収集した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ステューデントのｔ検定と、それに続くダネットの多重比較検定により解析した。０．０５より小さいｐ値を有意であるとみなした。
図３Ｂおよび３Ｃに示される通り、ＣＳ処置は、ＰＢＳ対照と比べて、肝臓損傷の指標であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを著しく増加させた。この知見は、ＣＳおよびＣＳ誘導体と関連する肝臓毒性の臨床例を示した以前の報告と一致する。Kalin et al., Infection, 2014, 42, 37-42; Katz et al., Med. Ann. D. C., 1963, 32, 408-413;およびFalagas et al., Crit. Care, 2006, 10, R27を参照されたい。対照的に、ＣＳ  ＮＰは、ＣＳと比べてＡＬＴおよびＡＳＴ値の減少をもたらした。包括的な代謝パネル中の他のパラメーター（図３Ｄ〜３Ｍ）の中で、ＣＳもＣＳ  ＮＰも顕著な変化を起こさなかった。これらの結果は、ＣＳ  ＮＰが投与するのにより安全であり、追加のＰＧＡおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧが予期せぬ有害作用を全く引き起こさないことを示す。報告されたＣＳの副作用である腎毒性の徴候がこの研究において全く観察されず、クレアチニン（ＣＲＥＡ）および血液尿素窒素（ＢＵＮ）のレベルが、ＰＢＳ群、ＣＳ群、およびＣＳ  ＮＰ処置群の間で類似であることは注目に値する。
要約すると、結果は、ナノ粒子集合が、意外にもＣＳのＭＴＤを改善し、肝臓毒性を減少させたことを示す。
【００２５】
（ＣＳ  ＮＰのインビボ抗菌活性）
ＣＳ  ＮＰのインビボ抗菌活性を、Ａ．バウマニ肺炎のマウスモデルにおいてさらに評価した。Yang et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2016, 60, 4047-4054を参照されたい。
簡潔に言うと、Ａ．バウマニ１７９７８を、３０ｍＬのＬＢブロス中で、振とうしながら３７℃で成長させて、対数増殖中期に達させた。次いで、細菌を、４，０００ｇでの１５分間の遠心分離によりペレット化した。細菌ペレットをＰＢＳに再懸濁させ、ブタの胃由来の５％ムチン（タイプ３；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｉｗａｎ）と混合した。
【００２６】
Ａ．バウマニ肺炎を引き起こすために、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔａｉｗａｎ）に、最初に、２％トリブロモエタノール（Ａｖｅｒｔｉｎ；０．０１８ｍＬ／ｇ）により麻酔をかけた。次いで、６．０７×１０8ＣＦＵのＡ．バウマニ１７９７８を、気管内注射によりマウスに投与して、肺炎を引き起こした（図４Ａ）。接種後２時間で、マウスを、１日２回、静脈内注射により、ＰＢＳ（対照として）、５ｍｇ／ｋｇのＣＳまたはＣＳ  ＮＰにより処置した。
【００２７】
ＣＳとＣＳ  ＮＰの間の効力を、生存分析により比較した。群の間の生存率の差異を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用してログランク検定により解析した。２つの薬物処置群のどちらにも死亡率が記録されない一方で、対照群動物の３７．５％が死亡したので、ＣＳおよびＣＳ  ＮＰの処置効力が感染後３６時間で観察された。７２時間の観察後、ＣＳ  ＮＰは、ＣＳに類似の処置効力を示し（ｐ＝０．６７）、２つの処置群のそれぞれで８匹の評価される動物のうち生存しているマウスが３匹対４匹であった（図４Ｂ）。生存転帰は、ナノ粒子集合後のＣＳの抗菌活性の保持を支持している。
これらの結果は、本発明のＣＳ  ＮＰが、意外にも、望ましい安全性プロファイルを有し、薬剤耐性細菌の処理において治療効力を示したことを示す。
【００２８】
（実施例２：ＣＳ、ＰＧＡ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００から形成されるナノ粒子）
ＣＳ、ＰＧＡ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００（ＭＷ５０００）から形成される治療用ナノ粒子を調製し、特性決定し、試験するための研究を下記の通り実施した。
治療用ナノ粒子を、以下に記載の通り改変して、実施例１に記載の手順に従って調製した。より具体的には、６：７（ｗ／ｗ）のＣＳ対ＰＧＡの比を採用し、ナノ粒子を１．５％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００中で安定化させた。追加の量のＰＧＡおよびより高分子量のＰＥＧを使用して、ＣＳ  ＮＰの安定性を増強させた。
典型的な調合物において、６ｍｇのＣＳと７ｍｇのＰＧＡを、１８０ｍｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を含有する１２ｍＬの水中で混合した。次いで、生じた混合物を、高圧ホモジナイザーを使用して分散させ、生じたナノ粒子を濾過した。このように収集したナノ粒子を、サイズおよびゼータ電位に関してＤＬＳにより評価し、その後に−８０℃での保存のために凍結乾燥させた。他の実験は全て、凍結乾燥させたＣＳ  ＮＰをＰＢＳに再懸濁させて実施した。ＤＬＳ分析は、ナノ粒子が、直径１２．５ｎｍ、ゼータ電位−５ｍＶであり、凍結乾燥および再懸濁の後で安定であったことを示した（表２）。
【００２９】
表２において、「Ｚ−Ａｖｅ」はキュムラント平均を指し、「ＰＤＩ」は多分散指数を指す。
【表２】
2021532192.tif 000010
【００３０】
ＨＰＬＣ定量化は、ＣＳ  ＮＰが、コリスチンＡおよびコリスチンＢの高いカプセル化効率（ＥＥ％）を有することを示す（表３）。
【表３】
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【００３１】
（ＣＳ、ＰＧＡ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００から形成されたナノ粒子の抗細菌効力）
この研究のＣＳ  ＮＰの抗細菌効力を評価するために、それらのＭＩＣおよびＭＢＣを、５種の参考細菌株ならびにカルバペネム耐性Ａ．バウマニ、Ｅ．コリ、Ｋ．ニューモニエ、およびＰ．エルギノーザの２０種の臨床分離株に対して、実施例１で述べられた手順に従って評価した。参考細菌株はＡＴＣＣから購入した。カルバペネム耐性臨床分離株はＮＨＲＩから得た。
表４に示される通り、追加の量のポリマーは、実施例１で使用されたものと比べて、生じたＣＳ  ＮＰの抗菌活性に影響しなかった。実際に、それらは、ＣＳのものと同等な抗菌活性を示した。ＰＧＡおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧが静菌効果も殺菌効果も全く示さず、それらがＣＳ  ＮＰの活性に全く寄与しなかったことに留意すべきである。
【表４】
2021532192.tif 000012
【００３２】
（細菌へのＣＳ  ＮＰの結合の調査）
細菌と、実施例１に記載のＣＳ  ＮＰと比べて追加量のポリマーを含有するＣＳ  ＮＰとの相互作用を調査するための、研究を実施した（図５Ａ）。
フルオロフォアコンジュゲートＣＳを、ＣＳをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ＮＨＳと共に５対１のモル比で、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液中で７２時間インキュベートすることにより調製した。他方で、フルオロフォアコンジュゲートＰＧＡを、ＰＧＡをＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ＮＨＳエステルと共に１対７．５のモル比で、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液中で７２時間インキュベートすることにより調製した。フルオロフォアコンジュゲーションの後、ＣＳとＰＧＡを、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含有する水中で混合した。次いで、混合物を、５，０００ｐｓｉでＮａｎｏｌｙｚｅｒ  Ｎ−２を使用して分散させた。生じたフルオロフォアコンジュゲートナノ粒子を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｆｉｌｔｅｒを使用し、濾過して非コンジュゲートフルオロフォアを除去した。蛍光を発する保持液を収集し、フルオロフォアコンジュゲートナノ粒子を凍結乾燥させて、−８０℃で保存した。
【００３３】
Ｅ．コリＡＴＣＣ  ２５９２２の一晩培養物を、１０，０００×ｇで、１０分間４℃でペレット化し、ＰＢＳに再懸濁させた。細菌懸濁液を、フルオロフォアコンジュゲートＣＳまたはフルオロフォアコンジュゲートＣＳ  ＮＰと混合し、３７℃でインキュベートした。陰性対照として、ＣＳまたはＣＳ  ＮＰインキュベーションしていない細菌懸濁液を調製した。フルオロフォアコンジュゲートＣＳまたはフルオロフォアコンジュゲートＣＳ  ＮＰとの１．５および２４時間のコインキュベーションの後、細菌をＰＢＳで洗浄した。試料を凍結乾燥させ、１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｗ／ｖ）により再懸濁させ、マイクロプレート蛍光リーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００、Ａｕｓｔｒｉａ）によりＣＳ含量を測定した。
Ａｌｅｘａ  ６４７と４８８のどちらの蛍光も、２４時間のコインキュベーションの後で強度が増加し、ＣＳ  ＮＰ中のＣＳが容易に細菌と相互作用したことを示す（図５Ｂ）。言い換えると、追加量のポリマーは、ＣＳ  ＮＰの細菌結合機能に干渉しなかった。
【００３４】
（ＣＳ  ＮＰのＭＴＤの決定）
マウスの用量漸増研究を実施して、ＣＳ  ＮＰのＭＴＤを決定した。
この研究のために、マウス（８週、Ｂａｌｂ／ｃマウス）を、Ｂｉｏ−ＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から得た。ナノ粒子のＭＴＤを評価するために、ＣＳまたはＣＳ  ＮＰを、尾静脈により、２５、４０、４５、および５０ｍｇ／ｋｇのＣＳベースでマウスに静脈内注射した（ｎ＝１０）。調査した全対象が生存したままであった最高用量をＭＴＤと定義した。
図６に示されるように、この研究のＣＳ  ＮＰは４０ｍｇ／ｋｇのＭＴＤを示し、ＣＳのＭＴＤの３倍超高く、実施例１のＣＳ  ＮＰのＭＴＤより２倍超高い（図６）。増加したＭＴＤのため、クリニックにおいて薬剤耐性分離株を処理するためのより高い薬物投与が可能である。
【００３５】
（Ｋ．ニューモニエ感染のマウス生存モデルにおけるＣＳ  ＮＰ処置）
Ｋ．ニューモニエによるマウス感染症モデルを採用して、ＣＳ  ＮＰの抗菌活性をインビボで確認した（図７Ａ）。
マウス（２０〜２２ｇ、１０週、Ｂａｌｂ／ｃマウス）を、Ｂｉｏ−ＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から得た。感染の３日前および１日前に、マウスに、それぞれ１５０および１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内注射して、好中球減少症を引き起こした。Ｋ．ニューモニエＮＨＲＩ  １分離株を、６０ｍＬのミュラーヒントンブロス中で、１５０ｒｐｍ（オービタルシェーカー、Ｙｉｈｄｅｒ  ＴＳ−５８０）で、２．５時間３７℃で成長させて、対数増殖中期に達させた。次いで、細菌を、１０，０００×ｇで、１０分間４℃で収集した。細菌ペレットをＰＢＳに再懸濁させた。致死的な細菌投与量によりＫ．ニューモニエ腹腔内感染を引き起こすために、マウスを、５０ｍＬ中１．５×１０8ＣＦＵ／マウスで、腹腔内注射により感染させた。感染の５時間後に、感染したマウスを、５ｍｇ／ｋｇ  ＣＳ（５０％ＭＴＤ）、２０ｍｇ／ｋｇ  ＣＳ  ＮＰ（５０％ＭＴＤ）、または対照としてのＰＢＳにより処置した。
ＣＳ  ＮＰにより可能であった高投与量処置が、マウス生存率を０％から５０％に改善したのに対し、ＣＳは感染したマウスの生存を改善しなかったことが分かった（図７Ｂ）。
【００３６】
（Ｋ．ニューモニエによるマウス感染症モデルにおけるＣＳ  ＮＰ処置）
ＣＳとＣＳ  ＮＰとの間の効力を比較するために、非致死性の細菌曝露において細菌計数研究をさらに実施した（図７Ｃ）。
マウス（２０〜２２ｇ、１０週、Ｂａｌｂ／ｃマウス、各群３匹）をＢｉｏ−ＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から得た。感染の３日前および１日前に、マウスに、それぞれ１５０および１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内注射して、好中球減少症を引き起こした。Ｋ．ニューモニエＮＨＲＩ  １分離株を、６０ｍＬのミュラーヒントンブロス中で、１５０ｒｐｍ（オービタルシェーカー、Ｙｉｈｄｅｒ  ＴＳ−５８０）で、２．５時間３７℃で成長させ、対数増殖中期に達させた。次いで、細菌を、１０，０００×ｇで、１０分間４℃で収集した。細菌ペレットをＰＢＳに再懸濁させた。Ｋ．ニューモニエ腹腔内感染を引き起こすために、マウスを、５０ｍＬ中８．４×１０7ＣＦＵ／マウスで腹腔内注射により感染させた。感染の２時間後および７時間後に、感染したマウスを、５ｍｇ／ｋｇ  ＣＳまたは２０ｍｇ／ｋｇ  ＣＳ  ＮＰにより静脈内に処置した。感染の２４時間後に、マウスを屠殺し、その組織を細菌計数のために収集した。２つの処置の効力を、調査した組織中のＣＦＵの数により比較した。
【００３７】
対応する５０％ＭＴＤでのＣＳまたはＣＳ  ＮＰの２種の処置を受けたマウスから誘導された異なる器官からの細菌数を調査することにより、ＣＳ  ＮＰ処置群の血液および心臓中の細菌数の２−対数減少値が観察された（図７Ｄ）。
結果は、ＣＳと比べて、本発明のＣＳ  ＮＰが、意外にも、抗菌活性に影響を与えずに、はるかに安全なプロファイルを示したことを示す。
【００３８】
（実施例３：ＣＳ、オリゴヌクレオチド、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００から形成されたナノ粒子）
ＣＳ、オリゴヌクレオチド、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００から形成される治療用ナノ粒子を調製し、特性決定し、試験するための研究を実施した。
蛍光性２０量体二本鎖ＤＮＡをオリゴヌクレオチドとして使用した。蛍光性２０量体二本鎖ＤＮＡを調製するために、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）を有するオリゴ鎖（５’−／５６−ＦＡＭ／ＴＴ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＣＧＣ−３’）を、蛍光染料のない別のフォワードオリゴ鎖と混合し、リバースオリゴ鎖と共に９４℃でアニーリングし、徐々に冷却した。ＣＳおよびオリゴヌクレオチドを含有するナノ粒子（ＣＳ／ＤＮＡ  ＮＰ）を調製するために、ＣＳをオリゴヌクレオチドと６：７（ｗ：ｗ）比で混合し、１．５％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００中で安定化させた。
【００３９】
典型的な調合物において、６ｍｇのＣＳと７ｍｇのオリゴヌクレオチドを、１．５％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を含有する１２ｍＬの水中で混合した。次いで、混合物を、５，０００ｐｓｉでＮａｎｏｌｙｚｅｒ  Ｎ−２を使用して分散させた。生じたナノ粒子を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｆｉｌｔｅｒを使用し、濾過して遊離のＣＳ、オリゴヌクレオチド、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を除去した。ＣＳ／ＤＮＡ  ＮＰの調製の成功を、蛍光標識されたＤＮＡがサイズ排除フィルターにより除去されなかったことを示す蛍光を発する保持液を観察して確認した。蛍光を発する黄色保持液を収集し、ＣＳ／ＤＮＡナノ粒子を凍結乾燥させて、−８０℃で保存した。ＤＬＳ測定は、ナノ粒子が、１０．７５ｎｍのサイズであり、わずかに負のゼータ電位を有し、凍結乾燥時に安定であることを明らかにした。以下の表５を参照されたい。
【００４０】
「Ｚ−Ａｖｅ」および「ＰＤＩ」の定義に関して、上記実施例２を参照されたい。
【表５】
2021532192.tif 000013
【００４１】
菌類とＣＳ／ＤＮＡ  ＮＰとの相互作用を観察するために、ナノ粒子をＰＢＳに懸濁させ、カルバペネム耐性クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と共にインキュベートした。対照として、遊離のＤＮＡも細菌と共にインキュベートした。３時間のインキュベーション後に、細菌をＰＢＳで洗浄して、未結合のナノ粒子を除去した。生じた細菌を、４％パラホルムアルデヒドによりポリ−Ｌ−リジンコートスライドに固定化し、共焦点蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００）を使用して調査した。この研究は、ＣＳ／ＤＮＡ  ＮＰが多量のＤＮＡを細菌中に送達することを明らかにした。対照的に、対照群では、ＤＮＡはほとんど細菌と会合しなかった（図８）。
【００４２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの治療上適切なオリゴヌクレオチドが抗菌処置の増強のためにＣＳ  ＮＰに組み込まれ得ることを実証するために、その遮断が原核生物の細胞分裂を減少させるｆｔｓＺ  ＤＮＡ断片のＡＳＯ（ＡＳＯftsZ）を含有するＣＳ  ＮＰを調製し、試験するための研究を実施した。ｆｔｓＺ標的化ＡＳＯの送達成功は、原核生物のｆｔｓＺ遺伝子を遮断し、細菌コロニー形成を阻害し得る。
この研究のために、シアニン標識ＡＳＯftsZ（Ｃｙ５−ＡＳＯftsz）を合成し、ナノ粒子調製のためにＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートＣＳ（Ａｌｅｘａ４８８−ＣＳ）とのコアセルベーション複合体を形成するために使用した。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰＲＯ）を使用して測定したＡｌｅｘａ４８８−ＣＳおよびＣｙ５−ＡＳＯftsZの回収収率は、それぞれ８９．５％および７１．１３％であった。
【００４３】
Ａｌｅｘａ４８８−ＣＳおよび二重フルオロフォア標識ＣＳ  ＮＰ（ＣＳ−ＡＳＯftsZ  ＮＰ）のＭＩＣおよびＭＢＣを、Ｅ．コリＡＴＣＣ  ２５９２２に対して評価したが、結果は、ＡＳＯftsZの組込みがＣＳのＭＩＣおよびＭＢＣに影響しなかったことを示す（表６）。さらに、ＣＳのＭＩＣより低い１μｇ／ｍＬで、ＣＳ−ＡＳＯftsZ  ＮＰは、相乗的な抗細菌作用を示した（図９）。
【表６】
2021532192.tif 000014
【００４４】
菌類とＣＳ−ＡＳＯftsZ  ＮＰとの相互作用を観察するために、ＰＢＳに懸濁しているこれらのナノ粒子を、Ｅ．コリＡＴＣＣ  ２５９２２と共にインキュベートした。２時間のインキュベーションの後で、細菌をＰＢＳで洗浄して、未結合のナノ粒子を除去した。次いで、細菌を、４％パラホルムアルデヒドによりポリ−Ｌ−リジンコートスライドに固定化し、共焦点蛍光顕微鏡（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｐｌｕｓ  Ｓｕｐｅｒ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＬＳＭ  ７８０＋ＥＬＹＲＡ）を使用して調査した。
【００４５】
ＣＳ−ＡＳＯftsZ  ＮＰとの、または遊離のＣＳ／遊離のＡＳＯftsZ混合物との細菌インキュベーションの後で、著しく異なるＣＳおよびＡＳＯftsZ分布が観察された。より具体的には、遊離のＣＳおよび遊離のＡＳＯftsZとのインキュベーションは、細菌の端でのＣＳおよびＡＳＯftsZ局在化をもたらした一方で、ナノ粒子とのインキュベーションは、細菌全体でのＣＳおよびＡＳＯftsZ分布をもたらした。ＣＳ−ＡＳＯftsZ  ＮＰによるＡＳＯftsZ送達の成功は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール染色の増加により立証される通り、高いＤＮＡ含量ももたらした。
これらの結果は、ＡＳＯがＣＳ  ＮＰ調製のためのバイオポリマーとして使用でき、ＣＳ  ＮＰがＡＳＯの細菌中への送達を促進できることを示す。それらは、ナノ粒子形成のために治療上適切なＡＳＯをＣＳとカップリングさせることにより相乗効果を得ることができ、ＡＳＯftsZの場合、送達成功が細菌分裂に影響を与えることができ、それにより細菌ＤＮＡのより多くの蓄積をもたらすことも示す。
【００４６】
（実施例４：ＣＳおよびメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩）（ｍＰＥＧ20K−ｂ−ＰＬＤ75）から形成されたナノ粒子）
ＣＳ  ＮＰを、また、ＣＳおよびジブロックコポリマー、すなわちｍＰＥＧ20K−ｂ−ＰＬＤ75を使用して調製した。ジブロックコポリマーとＣＳの比は２：３（ｗ／ｗ）であった。簡潔に言うと、コリスチンとジブロックコポリマーを２：３（ｗ／ｗ）の比で混合して、コアセルベーション複合体を形成し、それを、５，０００ｐｓｉでＮａｎｏｌｙｚｅｒ  Ｎ−２によりさらに分散させた。生じたナノ粒子を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ｆｉｌｔｅｒを使用し、濾過して遊離のコリスチンおよび遊離のコポリマーを除去した。収集したナノ粒子を凍結乾燥させ、−８０℃で保存した。
【００４７】
生じたナノ粒子、すなわちＣＳ／ｍＰＥＧ20K−ｂ−ＰＬＤ75  ＮＰは、ＤＬＳ分析により判定してサイズがおよそ６０ｎｍであった。この製剤は安定で、凍結乾燥後にサイズおよびゼータ電位が不変であった。以下の表７を参照されたい。
ここでもやはり、「Ｚ−Ａｖｅ」および「ＰＤＩ」の定義に関して、上記実施例２を参照されたい。
【表７】
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【００４８】
ＣＳのカプセル化効率は、ナノ粒子調製時に非常に高く、ＨＰＬＣ分析により測定してコリスチンＡおよびコリスチンＢの回収収率がそれぞれ９７．６％および６４．２％であった。クライオ電子顕微鏡観察時に、製剤が、およそ１０ｎｍのサイズのナノ粒子をもたらしたことが分かった。ＤＬＳによるサイズ決定をゆがませたいくつかの大きなナノ粒子があった（表７）。この研究のナノ粒子のＭＴＤは１７．５ｍｇ／ｋｇであり、ＣＳ（ＭＴＤ＝１０ｍｇ／ｋｇ）より安全性が高いことを示した。
【００４９】
（他の実施形態）
本明細書に開示される特徴の全ては、あらゆる組合せで組み合わせることができる。本明細書に開示される各特徴は、同じ、等価な、または類似の目的を果たす代替の特徴により置き換えることができる。そのため、明白にそうではないと述べられていない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の等価または類似の特徴の一例に過ぎない。
さらに、上記説明から、当業者は、本発明の基本的な特性を容易に認識でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明の種々の変更および改変を行って、それを種々の用法および状態に適応させることができる。そのため、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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