(57)【要約】  本発明は、概して、低分子ヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ）を有し、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ受容体（ＲＩＧ−Ｉ）に結合することができる特異的な免疫調節性ＲＮＡ種に関する。特に、前記ＲＮＡ種は、ステム領域にキンクを創出するためのヌクレオチド挿入を含む。また、抗ウイルス薬剤もしくは抗がん薬剤としてまたはワクチン中のアジュバントとして使用するための、そのようなｓｈＲＮＡを含む組成物が包含される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子であって、
５’から３’の方向に、
Ｘ１−Ｌ−Ｘ２
（式中、
Ｘ１およびＸ２は各々、二本鎖ステム構造を形成するのに十分な互いに対する相補性を有する８〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、
Ｌは、ループ領域を形成するヌクレオチド配列であり、
Ｘ１の５’末端に位置する最初のヌクレオチドは、ｎ１と標記され、二リン酸化または三リン酸化されており、Ｘ２の３’末端の最後のヌクレオチドは、ｎｘと標記され、ｘは２５〜６５の整数である）
の構造を有し、
前記二本鎖ステム構造において非対合のままでありキンクを創出するヌクレオチド挿入を、Ｘ１のｎ７位もしくはそれよりも上にまたはＸ２のｎｘ−６位もしくはそれよりも下に含むｓｈＲＮＡ分子。
【請求項２】
Ｌは、１〜１０ヌクレオチド長の、好ましくは２〜４ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である、請求項１に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記５’末端のヌクレオチドは、三リン酸化されている、請求項１または２に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項４】
平滑末端化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項５】
Ｘ１およびＸ２は各々、１０〜２５ヌクレオチド長、好ましくは１０、１１、２０、２１、３０、もしくは３１、または１０〜２０ヌクレオチド長、より好ましくは１０もしくは１１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項６】
Ｘ１およびＸ２は、前記キンクを創出する前記ヌクレオチド挿入を数えずに、同じ長さであり、１０、２０、または３０ヌクレオチド長、好ましくは１０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項７】
Ｘ１およびＸ２は、前記キンクを創出する前記ヌクレオチド挿入を除き、互いに完全に相補的である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記ヌクレオチド挿入は、１〜２ヌクレオチドの、好ましくは単一ヌクレオチドのヌクレオチド挿入である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記ヌクレオチド挿入は、Ｘ１におけるヌクレオチド挿入である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド挿入は、ｎ７からＸ１の最後から２番目の位置までの範囲の位置、またはＸ２の２番目の位置からｎｘ−６までの範囲の位置から選択される位置にある、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド挿入は、ｎ９から前記ループ領域の最初のヌクレオチドの２もしくは３ヌクレオチド上流の位置までの範囲の位置から、または前記ループ領域の最後のヌクレオチドの２もしくは３ヌクレオチド下流の位置からｎｘ−８までの範囲の位置から選択される位置にある、請求項１０に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド挿入は、前記Ｘ１配列のｎ９位にある、請求項１１に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド挿入は、プリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチド、好ましくはＧおよびＡから選択されるプリンヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記ヌクレオチド挿入は、ＧまたはＡである、請求項１３に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記ループ領域Ｌは、配列ＵＵＣＧを含むかまたはからなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１６】
Ｘ１は、
【化１】
2021511037.tif 000012
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、
配列中、ｒはｇまたはａであり、ｙはｕまたはｃであり、ｗはａまたはｕであり、ｓはｇまたはｃであり、ｎは、ａ、ｇ、ｕ、またはｃであり、前記Ｘ１配列は、好ましくは挿入された非対合ヌクレオチドを含み、この非対合ヌクレオチドは、好ましくは９位のヌクレオチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１７】
Ｘ２は、
【化２】
2021511037.tif 000013
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、
配列中、ｒはｇまたはａであり、ｙはｕまたはｃであり、ｗはａまたはｕであり、ｓはｇまたはｃであり、ｎは、ａ、ｇ、ｕ、またはｃである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記ｓｈＲＮＡ分子は、
【化３】
2021511037.tif 000014
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、
配列中、ｒはｇまたはａであり、ｙはｕまたはｃであり、ｗはａまたはｕであり、ｓはｇまたはｃであり、ｎは、ａ、ｇ、ｕ、またはｃである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項１９】
ヒトレチノイン酸誘導性遺伝子１受容体（ＲＩＧ−Ｉ）と特異的に結合する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記ＲＮＡは修飾されており、任意選択で、ホスホロチオエートＲＮＡであるかまたは２’−フルオロ基により修飾されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子を少なくとも１つ含む組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子を複数含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
医薬組成物である、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
免疫刺激組成物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記免疫刺激組成物は、ワクチンをさらに含むワクチン組成物であり、前記ｓｈＲＮＡ分子はアジュバントである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
任意選択で活性抗ウイルス剤をさらに含む抗ウイルス組成物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
任意選択で活性抗がん剤、好ましくは化学療法剤またはチェックポイント阻害剤をさらに含む抗がん組成物である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
１つまたは複数の賦形剤をさらに含む、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
アジュバントとしての、または抗ウイルス剤としての、または抗がん剤としての、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子の使用。
【請求項３０】
それを必要とする対象の免疫系を刺激するための、またはウイルス感染症もしくはがんを治療もしくは予防するための方法に使用するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子または請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
それを必要とする対象の免疫系を刺激するための方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子または請求項２１〜２５もしくは２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与する工程を備える方法。
【請求項３２】
それを必要とする対象のウイルス感染症またはがんを予防または治療するための方法であって、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｓｈＲＮＡ分子または請求項２０〜２４もしくは２６〜２８のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与する工程を備える方法。
【請求項３３】
前記投与は、局所的または全身性である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を修飾するための方法であって、
前記ｓｈＲＮＡ分子は、
５’から３’の方向に、
Ｘ１−Ｌ−Ｘ２
（式中、
Ｘ１およびＸ２は各々、二本鎖ステム構造を形成するのに十分な互いに対する相補性を有する８〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、
Ｌは、ループ領域を形成するヌクレオチド配列であり、
Ｘ１の５’末端に位置する最初のヌクレオチドは、ｎ１と標記され、Ｘ２の３’末端の最後のヌクレオチドは、ｎｘと標記され、ｘは２５〜６５の整数である）
の構造を有し、
前記二本鎖ステム構造において非対合のままでありキンクを創出するヌクレオチド挿入を、Ｘ１のｎ７位もしくはそれよりも上にまたはＸ２のｎｘ−６位もしくはそれよりも下に導入する工程を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ受容体（ＲＩＧ−Ｉ）を活性化する強力な免疫調節性ＲＮＡ種を開発するための構造情報に基づくＲＮＡ設計（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｇｕｉｄｅｄ  ＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ）、そのようにして得られるＲＮＡ分子、それらを含む組成物、ならびにそれらの使用およびそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗ウイルス製品またはワクチンアジュバントとして採用することができる、新規作用機序を有する免疫調節性分子に対する公衆衛生需要は増加している。そのような分子は、ウイルスの代わりに宿主を標的にすることにより、広範なウイルス感染症を効果的に阻止することができる。初期および進行中の医薬品開発プログラムは、ほとんどが病原菌およびそれらの必須酵素を標的とする。感染に対する宿主免疫応答を調節する分子標的は、ほとんど無視されている。宿主分子を標的とすることの重要な利点は、ウイルスの適応突然変異により影響されにくい点である。
【０００３】
レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）様受容体（ＲＬＲ）は、感染中にウイルスＲＮＡを検知する重要なクラスのパターン認識受容体である。ＲＬＲは、３つのメンバー：レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ−Ｉ）、黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）、ならびに遺伝学および生理学２（ＬＧＰ２、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２）で構成される。それらは、ウイルス感染の検知およびインターフェロン媒介性抗ウイルス免疫応答の開始に必須の役割を果たす。ＲＬＲは、感染細胞の細胞質中のウイルスＲＮＡを検出し、炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインおよびＩ型インターフェロンの産生により自然免疫応答を引き起こす基本的なクラスのパターン認識受容体（ＰＲＲ）である。ＲＬＲは、ウイルス複製の特質を表わすあるモチーフにより、自己ＲＮＡおよび非自己ＲＮＡを区別する能力を有する。
【０００４】
複製するウイルスのＲＮＡ鎖には三リン酸化部分が存在するが、内因性ＲＮＡはさらにプロセシングされて５’キャップを含むため、ＲＩＧ−Ｉは、ウイルスにより生成されたＲＮＡを検出することができる（非特許文献１）。フォールディングしてパンハンドル構造を形成するｓｓＲＮＡウイルス複製起点に存在する部分的相補性末端配列も、ＲＩＧ−Ｉにより認識される（非特許文献２）。その他に、スナップバックに基づく対合構造が形成される欠損干渉ＲＮＡゲノムも、ＲＩＧ−Ｉにより認識される（非特許文献３）。５’三リン酸末端化ＲＮＡに加えて、ＲＩＧ−Ｉは、５’二リン酸化ＲＮＡも、Ｃａｐ  ０  ＲＮＡも認識し、それらに結合する（非特許文献４；非特許文献５）。
【０００５】
ＲＬＲのコアは、二本鎖ＲＮＡ骨格を認識するための、Ｈｅｌ１、Ｈｅｌ２、および挿入ドメインＨｅｌ２ｉで構成されている特殊なＤＥｘＤ／Ｈ−ボックスＲＮＡヘリカーゼである。Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）は、Ｚｎ２＋含有ＲＮＡ結合ドメインである。一緒になって、ＨＥＬ−ＣＴＤはＲＮＡ検知モジュールを形成し、これは、ＲＬＲ活性化が許容されるか否かを決定するために、捕捉したＲＮＡ種の化学的および構造的特徴を検出することに関わる（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５のＮ末端タンデムカスパーゼ活性化および動員ドメイン（ＣＡＲＤ、ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）は、ミトコンドリア外膜上のアダプタータンパク質ＭＡＶＳ（ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質）と相互作用およびオリゴマー化することによる下流シグナル伝達の活性化に関わるシグナル伝達ドメインである（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５は、異なるが重複するＲＮＡウイルスのサブセットを認識する。これは、それらのＲＮＡ認識選好性に関係がある。ＲＩＧ−Ｉは、５’末端三リン酸を有する短い二重鎖ＲＮＡを選好するが、ＭＤＡ５は、長い二重鎖ＲＮＡと協同的に結合し、５’末端の末端特徴に対するＲＮＡ選好性の要件はない（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０、非特許文献２１）。
【０００６】
細胞質において、ＲＩＧ−Ｉは、細胞が通常状態にある間は、ＣＡＲＤがＨＥＬ２ｉドメインと相互作用している自己抑制コンフォメーションで存在する（非特許文献１９、上記；非特許文献１８、上記）。ウイルス感染に際して病原性ＲＮＡに遭遇すると、ＡＴＰ加水分解を伴うタンパク質コンフォメーション再編成が生じる。結果として、Ｎ末端基ＣＡＲＤが露出して、ＭＡＶＳとの相互作用が可能になることになる（非特許文献１７；ウーら（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．）、上記）。続いて、ＭＡＶＳは、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、およびＮＦκＢ転写因子を介して下流シグナル伝達を活性化し、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）および炎症性サイトカインの産生を引き起こすことになる（非特許文献１２、上記；非特許文献１１、上記；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）。ＲＩＧ−ＩのＣＴＤは、ウイルス複製過程中に一般的に生成される５’三リン酸化ＲＮＡを認識し、それにより活性化される（非特許文献２５）。また、５’三リン酸化ＲＮＡの他に、ＲＩＧ−Ｉは、末端５’二リン酸およびｃａｐ０部分を非自己ＲＮＡとして認識する（非特許文献２６；非特許文献５）。最近の研究により、ＲＩＧ−Ｉが、ポリＵ／ＵＣトラクトおよびＡＵリッチＲＮＡに対してより高い選好性を有することが明らかになった（非特許文献２７；非特許文献２８）。さらに、１０〜１２塩基対に最小長を有する短鎖ＲＮＡヘアピンは、ＲＩＧ−Ｉに結合し、それを活性化することができる（非特許文献６、上記；非特許文献１８、上記）。短鎖ＲＮＡ二重鎖は、細胞タイプ依存的および長さ依存的な様式で、ＲＩＧ−Ｉ媒介性アポトーシスを誘発することも報告された（非特許文献２９）。
【０００７】
ＲＩＧ−Ｉによる自然免疫活性化に関する先端的知識を考慮すると、ＲＩＧ−Ｉを標的とする抗ウイルスおよび抗がん治療剤のための広域免疫調節因子を開発することは魅力的である（非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２）。多くの免疫調節因子は、ＲＩＧ−Ｉ媒介性ＩＦＮ−Ｉ産生シグナル経路を標的とする合成ＰＡＭＰ（病原体関連分子パターン）であることが報告されている（非特許文献３３）。報告されている活性作用剤の中でも、５’三リン酸化された短い二本鎖ＲＮＡが、最も強力なＲＩＧ−Ｉ特異的リガンドである（非特許文献５、上記；ホルヌングら（Ｈｏｒｎｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、上記；非特許文献３４；非特許文献３５）。細胞ベースアッセイおよび動物研究では、５’ｐｐｐＲＮＡ処置は、ＲＩＧ−Ｉ媒介性抗ウイルス防御シグナル経路を活性化し、インフルエンザ、水疱性口内炎、デング熱、およびチクングニヤウイルスなどの複数のウイルスの感染から細胞を保護する（非特許文献３６；非特許文献３７）。こうした短鎖ＲＮＡ種のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を実証する最近の先駆的研究が存在し（非特許文献３８）、最良の短鎖ステム−ループＲＮＡ（ＳＬＲ）は、１０および１４ｂｐ長であり、一方の末端に安定したテトラループおよび他方に５’ｐｐｐ平滑塩基対を有する。ＴＬＲ３、ＭＤＡ５、およびＲＩＧ−Ｉを広く活性化することが知られている、長さが不均一な合成の長い二重鎖ＲＮＡであるポリＩＣと比較して、ＳＬＲなどのＲＩＧ−Ｉ特異的リガンドは、よりＩＦＮ−Ｉ特異的であり、新規シグナル経路を活性化することができる。
【０００８】
したがって、ワクチンアジュバントおよび抗ウイルス剤としてのそれらの可能性の他に、免疫調節性（免疫刺激性）ＲＮＡは、がん免疫療法と共に使用される強力な自然免疫活性化因子であり得るか（非特許文献３９）、または細胞核酸センサーを標的とする他の療法と同様に、それら自体が抗腫瘍活性を示す可能性がある（非特許文献４０）。
【０００９】
デングウイルス（ＤＥＮＶ）は、感染したアエデス属（Ａｅｄｅｓ）蚊の咬傷によりヒトに伝染するアルボウイルスである。ＤＥＮＶは、フラビリダエ（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）科の一部であり、フラビウイルス属（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｕｓ）のメンバーである。この科のウイルスは、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、および日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）を含む、世界中のヒト集団に対して健康脅威を招くことが知られている他のウイルスを含む。ＤＥＮＶは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを含むエンベロープウイルスである。このウイルスゲノムは、ウイルスプロテアーゼおよび宿主プロテアーゼにより、３つの構造タンパク質（カプシド、ｐｒＭ、およびエンベロープタンパク質）および７つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５）へとプロセシングされる大型ポリタンパク質をコードする。ＤＥＮＶの伝染は、ウイルスが、咬刺蚊の唾液からヒト皮膚の皮層に移行することを含む。最外側の表皮層は、ケラチノサイト、および皮膚障壁を透過する病原体の検出に関与する皮膚常在抗原提示細胞（ＡＰＣ）であるランゲルハンス細胞（ＬＣ）を含む。皮層は、表皮層の下に位置しており、線維芽細胞、ならびにマクロファージ、Ｔ細胞、および樹状細胞を含む免疫細胞で構成され、流入領域リンパ節への免疫細胞遊走を可能にする血管およびリンパ管で神経支配されている。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＤＥＮＶ感染の主要宿主細胞である。皮膚のプロフェッショナルＡＰＣは、宿主へのウイルス進入地点に位置するため、感染の確立にとって特に重要である。ＤＥＮＶに感染すると、ＡＰＣは、そうした細胞の細胞質中のＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５にウイルスＲＮＡが結合することにより活性化される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ホルヌングら（Ｈｏｒｎｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４（５８０１）：９９４−７
【非特許文献２】シュレーら（Ｓｃｈｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２００９），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３１  （１）：２５−３４
【非特許文献３】シュトラーレら（Ｓｔｒａｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５１  （１）：１０１−１１
【非特許文献４】デバルカルら（Ｄｅｖａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１３（３）：５９６−６０１
【非特許文献５】ゴーバウら（Ｇｏｕｂａｕ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），Ｎａｔｕｒｅ  ５１４（７５２２）：３７２−５
【非特許文献６】コールウエイら（Ｋｏｈｌｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１３），ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  １４（９）：７７２−９
【非特許文献７】ルオら（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１１），Ｃｅｌｌ  １４７（２）：４０９−２２
【非特許文献８】シュレー（Ｓｃｈｌｅｅ）（２０１３），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１８：１３２２−１３３５
【非特許文献９】カワイら（Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５），Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：９８１−９８８
【非特許文献１０】メランら（Ｍｅｙｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：１１６７−１１７２
【非特許文献１１】ペイスレイら（Ｐｅｉｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５０９：１１０−１１４
【非特許文献１２】セスら（Ｓｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）Ｃｅｌｌ  １２２：６６９−６８２
【非特許文献１３】ウーら（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５５：５１１−５２３
【非特許文献１４】シュら（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．）（２００５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １９：７２７−７４０
【非特許文献１５】カトウら（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６），Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１０１−１０５
【非特許文献１６】ルー＆ゲール（Ｌｏｏ＆Ｇａｌｅ）（２０１１），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３４：６８０−６９２
【非特許文献１７】ウー＆チェン（Ｗｕ＆Ｃｈｅｎ）（２０１４），Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：４６１−４８８
【非特許文献１８】ゼンら（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４３：１２１６−１２３０
【非特許文献１９】コワリンスキーら（Ｋｏｗａｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１１），Ｃｅｌｌ  １４７：４２３−４３５
【非特許文献２０】ルオら（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１１），Ｃｅｌｌ  １４７：４０９−４２２
【非特許文献２１】ウーら（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１３），Ｃｅｌｌ  １５２：２７６−２８９
【非特許文献２２】ヒスコットら（Ｈｉｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １２：５３−５６
【非特許文献２３】イワナスズコ＆キンメル（Ｉｗａｎａｓｚｋｏ＆Ｋｉｍｍｅｌ）（２０１５），ＢＭＣ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６：３０７
【非特許文献２４】ラモス＆ゲール（Ｒａｍｏｓ＆Ｇａｌｅ）（２０１１），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｖｉｒｏｌ  １：１６７−１７６
【非特許文献２５】ホルヌングら（Ｈｏｒｎｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２００６），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：９９４−９９７
【非特許文献２６】デバルカルら（Ｄｅｖａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１３（３）：５９６−６０１
【非特許文献２７】ルンゲら（Ｒｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），ＰＬｏＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  １０：ｅ１００４０８１
【非特許文献２８】シュネルら（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１２），ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ８：ｅ１００２８３９
【非特許文献２９】イシバシら（Ｉｓｈｉｂａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１１），Ｓｃｉ．  Ｓｉｇｎａｌ．４（１９８），ｒａ７４
【非特許文献３０】エリオン＆クック（Ｅｌｉｏｎ＆Ｃｏｏｋ）（２０１８），Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１８，Ｖｏｌ．９，（Ｎｏ．４８），ｐｐ：２９００７−２９０１７
【非特許文献３１】エリオンら（Ｅｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１９），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１８年９月１７日に始めてオンライン発表された著者原稿；ＤＯＩ：１０．１１５８／０００８−５４７２
【非特許文献３２】デュウエルら（（Ｄｕｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２１，１８２５−１８３７
【非特許文献３３】ヤング＆ルオ（Ｙｏｎｇ＆Ｌｕｏ）（２０１８），Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１３７９
【非特許文献３４】カトウら（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１０１−１０５
【非特許文献３５】シュミットら（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）（２００９），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：１２０６７−１２０７２
【非特許文献３６】チャンら（Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８９（１５）：８０１１−２５
【非特許文献３７】リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１８），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４６（４）：１６３５−１６４７
【非特許文献３８】リネハンら（Ｌｉｎｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１８），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ４：ｅ１７０１８５４
【非特許文献３９】ムーアら（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１６），Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ４，１０６１−１０７１，ｄｏｉ：１０．１１５８／２３２６−６０６６
【非特許文献４０】ジャント＆バルヒェット（Ｊｕｎｔ＆Ｂａｒｃｈｅｔ）（２０１５），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，５２９−５４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ＲＩＧ−Ｉ媒介性免疫応答を調節することができる特異的で強力なＲＮＡ種は、新しい治療剤および有用な研究ツールの開発にとって価値があるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ＲＩＧ−Ｉ媒介性免疫応答を調節し、したがって治療剤、具体的にはアジュバントおよび抗ウイルス剤ならびに研究ツールとしての潜在的使用を有する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を提供することにより、この必要性を満たす。
【００１３】
したがって、第１の態様では、本発明は、５’から３’方向に、
Ｘ１−Ｌ−Ｘ２
（式中、
Ｘ１およびＸ２は各々、二本鎖ステム構造を形成するのに十分な互いに対する相補性を有する８〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、
Ｌは、ループ領域を形成するヌクレオチド配列であり、
Ｘ１の５’末端に位置する最初のヌクレオチドは、ｎ１と標記され、二リン酸化または三リン酸化されており、Ｘ２の３’末端の最後のヌクレオチドは、ｎｘと標記され、ｘは２５〜６５の整数である）
の構造を有する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子であって、
二本鎖ステム構造において非対合のままでありキンク（ｋｉｎｋ）を創出するヌクレオチド挿入を、Ｘ１のｎ７位もしくはそれよりも上にまたはＸ２のｎｘ−６位もしくはそれよりも下に含む、ｓｈＲＮＡ分子に関する。
【００１４】
こうしたｓｈＲＮＡ分子では、Ｌは、１〜１０ヌクレオチド長の、好ましくは２〜４ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であってもよい。
ｓｈＲＮＡ分子（ｍｏｌｃｅｕｌｅｓ）の種々の実施形態では、５’末端のヌクレオチド、つまりＸ１アームの最初のヌクレオチドは、三リン酸化されている。
【００１５】
種々の実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子は、平滑末端化されており、つまり５’突出または３’突出を含まない。５’−末端ヌクレオチドおよび３’−末端ヌクレオチドは、分子の末端に非対合ヌクレオチドが存在しないように互いに塩基対合することがさらに好ましい。
【００１６】
種々の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は各々、１０〜２５ヌクレオチド長、好ましくは１０、１１、２０、２１、３０、もしくは３１、または１０〜２０ヌクレオチド長、より好ましくは１０もしくは１１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。Ｘ１およびＸ２は、キンクを創出するヌクレオチド挿入を数えずに、同じ長さであり、１０、２０、または３０ヌクレオチド長、好ましくは１０であることが好ましい場合がある。
【００１７】
種々の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、キンクを創出するヌクレオチド挿入を除き、互いに完全に相補的である。
ヌクレオチド挿入は、１〜２ヌクレオチドの、好ましくは単一ヌクレオチドのヌクレオチド挿入であってもよい。一部の実施形態では、ヌクレオチド挿入は、Ｘ１におけるヌクレオチド挿入である。ヌクレオチド挿入は、Ｘ１のｎ７から３’末端位置のすぐ上流の位置（Ｘ１の最後から２番目の位置）までの範囲の位置から、またはＸ２の２番目の位置（５’末端位置のすぐ下流）からｎｘ−６までの範囲の位置から選択される位置にあってもよい。それらの種々の実施形態では、ヌクレオチド挿入は、ｎ９からループ領域の最初のヌクレオチドの２もしくは３ヌクレオチド上流の位置までの、またはループ領域の最後のヌクレオチドの２もしくは３ヌクレオチド下流の位置からｎｘ−８までの範囲の位置から選択される位置である。ヌクレオチド挿入は、好ましくは、Ｘ１配列の好ましくはｎ９位であってもよい。
【００１８】
種々の実施形態では、ヌクレオチド挿入は、プリンヌクレオチドまたはピリミジンヌクレオチド、好ましくはＧおよびＡから選択されるプリンヌクレオチドである。
ループ領域Ｌは、配列ＵＵＣＧを含んでいてもよく、またはからなっていてもよい。
【００１９】
種々の実施形態では、Ｘ１は、
【００２０】
【化１】
2021511037.tif 000003
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、
配列中、ｒはｇまたはａであり、ｙはｕまたはｃであり、ｗはａまたはｕであり、ｓはｇまたはｃであり、ｎは、ａ、ｇ、ｕ、またはｃである。
【００２１】
種々の実施形態では、Ｘ２は、
【００２２】
【化２】
2021511037.tif 000004
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、
配列中、ｒはｇまたはａであり、ｙはｕまたはｃであり、ｗはａまたはｕであり、ｓはｇまたはｃであり、ｎは、ａ、ｇ、ｕ、またはｃである。
【００２３】
種々の実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子は、
【００２４】
【化３】
2021511037.tif 000005
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたはからなり、
配列中、ｒはｇまたはａであり、ｙはｕまたはｃであり、ｗはａまたはｕであり、ｓはｇまたはｃであり、ｎは、ａ、ｇ、ｕ、またはｃである。
【００２５】
ｓｈＲＮＡ分子は、好ましくは、ヒトレチノイン酸誘導性遺伝子１受容体（ＲＩＧ−Ｉ）と特異的に結合する。
別の態様では、本発明は、本発明による少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子を含む組成物に関する。そのような組成物は、そのようなｓｈＲＮＡの１つの種を含んでいてもよく、または本発明による複数の異なるｓｈＲＮＡ分子を含んでいてもよい。
【００２６】
組成物は、医薬組成物、例えば、免疫刺激組成物または抗ウイルス組成物または抗がん組成物であってもよい。免疫刺激組成物は、ワクチンをさらに含むワクチン組成物であってよく、その場合、ｓｈＲＮＡ分子はアジュバントである。組成物が抗ウイルス組成物である場合、組成物は、追加の活性抗ウイルス剤をさらに含んでいてもよい。組成物が抗がん組成物である場合、組成物は、追加の活性抗がん剤をさらに含んでいてもよい。本発明の組成物は、それらの使用とは関わりなく、好ましくは薬学的に許容される１つまたは複数の賦形剤を含んでいてもよい。
【００２７】
本発明は、アジュバントとしての、または抗ウイルス剤としての、または抗がん剤としての、本発明のｓｈＲＮＡ分子の使用をさらに包含する。それを必要とする対象の免疫系を刺激するための、またはウイルス感染症を治療／予防するための、またはがんを治療もしくは予防するための方法で使用するための、本発明のｓｈＲＮＡ分子または本発明の組成物も企図される。ｓｈＲＮＡ分子は、活性作用剤のアジュバントとして作用してもよく、またはそれら自体の抗ウイルス活性もしくは抗がん活性のため使用してもよい。
【００２８】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象の免疫系を刺激するための方法であって、本発明によるｓｈＲＮＡ分子または本発明の組成物の有効量を前記対象に投与する工程を備える方法を特徴とする。本発明の別の方法は、それを必要とする対象のウイルス感染症を治療または予防するためのものであって、本発明によるｓｈＲＮＡ分子または本発明の組成物の有効量を前記対象に投与する工程を備える。本発明のまたさらなる方法は、それを必要とする対象のがんを治療または予防するためのものであって、本発明によるｓｈＲＮＡ分子または本発明の組成物の有効量を前記対象に投与する工程を備える。
【００２９】
またさらなる態様では、本発明は、５’から３’方向に、
Ｘ１−Ｌ−Ｘ２
（式中、
Ｘ１およびＸ２は各々、二本鎖ステム構造を形成するのに十分な互いに対する相補性を有する８〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、
Ｌは、ループ領域を形成するヌクレオチド配列であり、
Ｘ１の５’末端に位置する最初のヌクレオチドは、ｎ１と標記され、Ｘ２の３’末端の最後のヌクレオチドは、ｎｘと標記され、ｘは２５〜６５の整数である）
の構造を有する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を修飾するための方法であって、
二本鎖ステム構造において非対合のままでありキンクを創出するヌクレオチド挿入を、Ｘ１のｎ７位もしくはそれよりも上にまたはＸ２のｎｘ−６位もしくはそれよりも下に導入する工程を備える方法に関する。
【００３０】
以下において、本発明は、添付の図面および例を参照することより、より詳細に説明されることになる。
本発明は、詳細な説明を参照して、非限定的な例および添付の図面を併せて考慮すると、より良好に理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】３ｐ１０Ｌ  ＲＮＡヘアピン骨格（配列番号３７）に沿ったグアノシンの挿入は、ＲＩＧ−Ｉ酵素活性および細胞活性を様々に変化させた。（Ａ）ＲＮＡのステム領域に沿ってバルジ（ｂｕｌｇｅ）／キンクが導入されているヘアピンＲＮＡの設計。
【図１Ｂ】３ｐ１０Ｌ  ＲＮＡヘアピン骨格（配列番号３７）に沿ったグアノシンの挿入は、ＲＩＧ−Ｉ酵素活性および細胞活性を様々に変化させた。（Ｂ）ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−ＩおよびＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌでの、様々なＲＮＡの細胞ベースアッセイ。ＲＮＡを１００ｎＭの一定濃度でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は三重重複で測定し、ＲＬＵとして表されている。
【図１Ｃ】３ｐ１０Ｌ  ＲＮＡヘアピン骨格（配列番号３７）に沿ったグアノシンの挿入は、ＲＩＧ−Ｉ酵素活性および細胞活性を様々に変化させた。（Ｃ）親鎖のＲＮＡ（３ｐ１０Ｌ；配列番号３７）と比較して、最も高い細胞ベースアッセイ活性（３ｐ１０ＬＧ９；配列番号２６）および最も低い活性（３ｐ１０ＬＧ５；配列番号３０）を有するＲＮＡのＡＴＰａｓｅ活性。データをミカエリス−メンテン式にフィッティングし、Ｋｍ，ＡＴＰおよびＫｃａｔ，ＡＴＰを、ｈｓＲＩＧ−Ｉに対する飽和量のＲＮＡで決定した。
【図２Ａ】ヘアピンＲＮＡに沿った９位でのプリン塩基の挿入は、ｉｍｍＲＮＡ３ｐ１０Ｌの効力を向上させる。（Ａ）ＲＮＡのステム領域に沿って９位に様々な塩基が導入されているヘアピンＲＮＡの設計。
【図２Ｂ】ヘアピンＲＮＡに沿った９位でのプリン塩基の挿入は、ｉｍｍＲＮＡ３ｐ１０Ｌの効力を向上させる。（Ｂ）ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−ＩおよびＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）Ｎｕｌｌでの、様々なＲＮＡの細胞ベースアッセイ。ＲＮＡを１００ｎＭの一定濃度でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は三重重複で測定し、ＲＬＵとして表されている。
【図２Ｃ】ヘアピンＲＮＡに沿った９位でのプリン塩基の挿入は、ｉｍｍＲＮＡ３ｐ１０Ｌの効力を向上させる。（Ｃ）９位に様々な塩基挿入を有するＲＮＡのＡＴＰａｓｅ活性。データをミカエリス−メンテン式にフィッティングし、Ｋｍ，ＡＴＰおよびＫｃａｔ，ＡＴＰを、ｈｓＲＩＧ−Ｉに対する飽和量のＲＮＡで決定した。
【図３Ａ】３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）は、２つの異なるレポーター細胞において３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）および３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）よりも強力な活性を実証した。（Ａ）ＲＮＡを、異なる濃度範囲のＲＮＡでＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉへとトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は三重重複で測定し、最大活性の正規化パーセンテージ対ｌｏｇ濃度として表した。３ｐ１０Ｌ  Ｇ９のＥＣ５０は１３３ｎＭだった。３ｐ１０ＬＡ９は１９９ｎＭだった。３ｐ１０Ｌは１０８ｎＭだった。
【図３Ｂ】３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）は、２つの異なるレポーター細胞において３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）および３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）よりも強力な活性を実証した。Ｂ）ＲＮＡを、１００ｎＭの一定濃度でＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉにトランスフェクトし、トランスフェクションの４、６、８、１０、１２、２４、４８、および７２時間後にルミネセンスを測定した。
【図３Ｃ】３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）は、２つの異なるレポーター細胞において３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）および３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）よりも強力な活性を実証した。（Ｃ）ＲＮＡを、異なる濃度範囲のＲＮＡでＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にルミネセンスを測定した。結果を三重重複で測定し、最大活性のパーセンテージ対ｌｏｇ濃度として表した。３ｐ１０Ｌ  Ｇ９のＥＣ５０は９１ｎＭだった。３ｐ１０ＬＡ９は５１ｎＭだった。３ｐ１０Ｌは２２６ｎＭだった。
【図３Ｄ】３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）は、２つの異なるレポーター細胞において３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）および３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）よりも強力な活性を実証した。Ｄ）ＲＮＡを、１００ｎＭの一定濃度でＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）にトランスフェクトし、トランスフェクションの４、６、８、１０、１２、２４、４８、および７２時間後にルミネセンスを測定した。
【図４】様々なＲＮＡ分子に対するハツカネズミ（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＲＩＧ−Ｉ（ｍｍＲＩＧ−Ｉ）およびｍｍＲＩＧ−ＩΔＣＡＲＤ結合のＡＴＰａｓｅ活性を示すミカエリス−メンテンプロット。（Ａ）様々なステム修飾を有する短鎖ＲＮＡヘアピンにより刺激されたｍｍＲＩＧ−Ｉの、０から５ｍＭまでの範囲のＡＴＰ濃度にわたる触媒作用の速度。（Ｂ）様々な塩基組成のＲＮＡヘアピンにより刺激されたｍｍＲＩＧ−Ｉの、０から５ｍＭまでの範囲のＡＴＰ濃度にわたる触媒作用の速度。（Ｃ）様々な長さのＲＮＡヘアピンにより刺激されたｍｍＲＩＧ−Ｉの、０から５ｍＭまでの範囲のＡＴＰ濃度にわたる触媒作用の速度。
【図５】Ｉ型ＩＦＮを誘導するそれらの能力についてのｉｍｍＲＮＡ構築物のスクリーニング。Ａ）ＲＩＧ−Ｉリガンド免疫調節性ＲＮＡ（ｉｍｍＲＮＡ）を、ＭＸ１プロモーターにより駆動される安定的に組み込まれたルシフェラーゼレポーター（ＭＸ１Ｐ−ｌｕｃ）を含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞へとトランスフェクトした。ＲＮＡを、系列希釈（２×）により達成された種々の濃度でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は、ＯＨＹｒ２３（親構築物；配列番号３７）の３１２ｎＭ処置で測定されたＲＬＵのパーセンテージとして表わされている。Ｂ）ＭＸ１プロモーター駆動性ルシフェラーゼを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＯＨＹｒ２３を１０ｎＭでトランスフェクトした。こうした細胞を、一連の濃度（０ｎＭ〜３１２ｎＭ）のＯＨＹｒ１０（配列番号３０）またはＯＨＹｒ０９（配列番号３４）のいずれかで共トランスフェクトした。細胞をＢｒｉｇｈｔｇｌｏで溶解し、ルミネセンスを読み取った。エラーバーは、１条件当たり三重重複のトランスフェクションのものである。
【図６】Ｉ型ＩＦＮを誘導するそれらの能力についてのｉｍｍＲＮＡ構築物のスクリーニング。ＩｍｍＲＮＡを、ＩＳＧ５４により駆動されるｌｕｃｉａルシフェラーゼレポーターの安定組込みによりヒトＴＨＰ−１単球細胞株に由来するＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）細胞へとトランスフェクトした。ルシフェラーゼレポーター応答を、１００％に対して正規化し、ＲＮＡのｌｏｇ濃度に対してプロットした。ＯＨＹｒ０５（配列番号２６）のＥＣ５０値は、ＯＨＹｒ２３（配列番号３７）のＥＣ５０が１４ｎＭだったことと比較して、３．４７ｎＭであると決定された。
【図７】ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−ＩおよびＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ｎｕｌｌでの、様々なＩｍｍＲＮＡによる細胞ベースアッセイ。Ａ）様々な長さのＩｍｍＲＮＡ、Ｂ）様々なグアノシン挿入を有するＩｍｍＲＮＡ。Ｃ）９位に様々なヌクレオチドを有するＩｍｍＲＮＡ。様々な長さのＲＮＡを１００ｎＭの一定濃度でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後にルミネセンスを測定した。結果は三重重複で測定し、ＲＬＵとして表されている。
【図８】Ａ）ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）細胞およびＢ）ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉにおける、市販ＲＮＡおよびＩｍｍＲＮＡ  ＯＨＹｒ１６（３ｐ１０ＬＡ９；配列番号２５）の活性間の比較。様々な濃度のＲＮＡを両細胞へとトランスフェクトし、２×系列希釈した。トランスフェクションの２４時間後にルミネセンス値を記録した。
【図９】）ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）細胞およびＢ）ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉにおける、ＩｍｍＲＮＡ  ＯＨＹｒ１６（３ｐ１０ＬＡ９；配列番号２５）および市販ＲＮＡの安定性試験。ＲＮＡを、細胞へのトランスフェクション前に無血清培地で２４、４８、７２、および９６時間インキュベートした。トランスフェクションの２４時間後にルミネセンス値を記録した。
【図１０Ａ】ｉｍｍＲＮＡのキンク位置は、生物学的活性に影響を及ぼす。Ａ）ヌクレオチド５位（ＯＨＹｒ１０）、１９位（ＯＨＹｒ１１）、および２１位（ＯＨＹｒ０１）のキンクは、ＩＦＮ産生を無効にする。ルシフェラーセ（ｌｕｃｉｆｅｒａｃｅ）活性％を、３１２ｎＭで使用したＯＨＹｒ２３で検出された値に対して正規化した。
【図１０Ｂ】ｉｍｍＲＮＡのキンク位置は、生物学的活性に影響を及ぼす。Ｂ）ステムから９位のｉｍｍＲＮＡの５’側のキンク（ＯＨＹｒ０５）は、キンク無し（ＯＨＹｒ２３）と比較して生物学的活性を向上させたが、ステムから９位のｉｍｍＲＮＡの３’側のキンク（ＯＨＹｒ０２）は、生物学的活性を無効にした。ルシフェラーセ活性％を、１００ｎＭで使用したＯＨＹｒ２３で検出された値に対して正規化した。
【図１０Ｃ】ｉｍｍＲＮＡのキンク位置は、生物学的活性に影響を及ぼす。Ｃ）９位キンクのプリン（ＯＨＹｒ０５ではグアニンおよびＯＨＹｒ１６ではアデニン）は、９位キンクのピリミジン（ＯＨＹｒ１７ではウラシルおよびＯＨＹｒ１８ではシトシン）よりも高い生物学的活性を有する。直接トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＸ１Ｐ−ｌｕｃレポーター細胞を、Ａ〜Ｃでの読出しとして使用した。
【図１１】ステムの長さは、ｉｍｍＲＮＡの生物学的活性に影響を及ぼす。ＯＨＹｒ２３（１０ヌクレオチド長）およびＯＨＹｒ０８（３０ヌクレオチド長）は、ＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＸ１Ｐ−ｌｕｃレポーターアッセイにて高い活性を示す。対照的に、ＯＨＹｒ１２（６ヌクレオチド長）、ＯＨＹｒ２０（９ヌクレオチド長）、ＯＨＹｒ０３（１１ヌクレオチド長）、ＯＨＹｒ０７（１２ヌクレオチド）、およびＯＨＹｒ１３（１４ヌクレオチド長）は、生物学的活性が低いかまたは生物学的活性を示さなかった。ルシフェラーセ活性％を、１００ｎＭで使用したＯＨＹｒ２３で検出された値に対して正規化した。直接トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ  ＭＸ１Ｐ−ｌｕｃレポーター細胞を、Ａ〜Ｃでの読出しとして使用した。
【図１２】３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）は、インターフェロン応答を誘導し、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞およびＡ５４９細胞の両方においてＤＥＮＶ−２感染に対する予防に効果的である。（Ａ）３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）および３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）の構造および配列は、表に示されている通りである。（Ｂ）３ｐ１０Ｌ、３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）、またはＧ９ｎｅｇ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）を、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮまたはＡ５４９細胞へとトランスフェクトした。上清を回収し、ＩＳＲＥ−ｌｕｃ  ＨＥＫ−２９３Ｔレポーター細胞でインキュベートした。上清と共に６時間インキュベーションした後、ルミネセンスを測定した。表には、３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）および３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）のＥＣ５０値（ｎＭ）が示されている。（Ｃ）トランスフェクトした細胞を、ＤＥＮＶ−２（ＴＳＶ０１）にＭＯＩ−１で感染させ、感染の２４時間後に、ＮＳ１に結合する抗体およびＥ−タンパク質に結合する抗体（４Ｇ２）で染色した。表には、３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）および３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）のＥＣ５０値（ｎＭ）が示されている。（Ｄ）感染させたＵ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞（左）またはＡ５４９細胞（右）の代表的なフローサイトメトリーグラフが示されている。Ｕ９３７−ＤＣ実験の場合、記号は、２つの独立実験の平均±ＳＥＭ、ｎ＝６である。Ａ５４９実験の場合、記号は、２つの独立実験の平均±ＳＥＭ、ｎ＝４である。（Ｂ）および（Ｃ）におけるルシフェラーゼアッセイおよび感染アッセイの統計的有意差は、通常の二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、それぞれＵ９３７−ＤＣ（ｐ＝０．０１３、ｐ＜０．０００１）およびＡ５４９（ｐ＝０．００５８、ｐ＜０．０００１）と算出された。
【図１３】３ｐ１０ＬＧ９／ＯＨＹｒ０５（配列番号２６）は、一次ヒト皮膚ＤＣにおいて、３ｐ１０Ｌ／ＯＨＹｒ２３（配列番号３７）と比較して、ＤＥＮＶ−２感染に対する予防剤としてより高い効力を有する。（Ａ）ヒト皮膚ＤＣを、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、および６２ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）または３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）でトランスフェクトし、２４時間インキュベートした。上清を、インターフェロン刺激応答エレメントにより駆動されるルシフェラーゼレポーター（ＩＳＲＥ−ｌｕｃ）を含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞でインキュベートし、６時間後にルミネセンスを測定した（右パネル）。結果は、Ｇ９ｎｅｇ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）と比較した倍数変化として示されている。各記号は、１人のドナーに由来する試料を表わす。統計的有意差（ｐ＜０．０５）を、ダネットの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（ｎｓ：有意でない）。（Ｂ）２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、および６２ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）または３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）を２４時間トランスフェクトしたヒト皮膚ＤＣを、ＤＥＮＶ−２にＭＯＩ  ５で４８時間感染させた。４Ｇ２抗体で細胞内染色することにより、フローサイトメトリーを使用して、皮膚ＤＣの各部分集団中のＤＥＮＶ−２感染細胞のパーセンテージを定量化した。各条件の感染細胞のパーセンテージを、Ｇ９ｎｅｇ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）に対して正規化した。（Ｃ〜Ｅ）６２ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）または３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）でトランスフェクションした後の（Ｂ）にプロットされているデータから取った皮膚ＤＣの各部分集団の感染細胞のパーセンテージ（左）および代表的なフローサイトメトリー（右）。（Ｃ）ＣＤ１１ｃ  ＤＤＣ、（Ｄ）ランゲルハンス細胞、（Ｅ）ＣＤ１４  ＤＤＣ。各記号は、１人のドナーを表わす。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差（ｐ＜０．０５）を、ダネットの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５）。
【図１４】ＩｍｍＲＮＡ  ３ｐ１０ＬＧ９は、一次ヒト皮膚ＤＣにおいてＤＥＮＶ−２感染に対する治療効果を有する。（Ａ〜Ｃ）ヒト皮膚ＤＣを、ＤＥＮＶ２にＭＯＩ  ５で感染させ、感染後のそれぞれの時点で、６２ｎＭの３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）、３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）、またはＧ９ｎｅｇ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）を導入した。皮膚ＤＣの各部分集団内の感染細胞のパーセンテージを示すグラフ（左）は、ＦＡＣＳプロット（右）により表わされているように、４Ｇ２抗体による細胞内染色により反映されている。各条件の感染細胞のパーセンテージを、その特定のドナーのＧ９ｎｅｇ対照に対して正規化した。（Ａ）ＣＤ１１ｃ皮膚ＤＣ、（Ｂ）ランゲルハンス細胞、（Ｃ）ＣＤ１４皮膚ＤＣ。各ドットは、１人のドナーに由来する試料を表わす。統計的有意差を、多重比較を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５）。
【図１５】ＩｍｍＲＮＡは、ＤＥＮＶ−２  ＶＬＰワクチンと共にアジュバントとして使用した場合、抗体産生を増強し、保護を増加させた。１０ｕｇのＤＥＮＶ−２  ＶＬＰを、ｉｎ  ｖｉｖｏＪＥＴ−ＰＥＩまたはポリＩ：Ｃと混合された２５ｕｇのｉｍｍＲＮＡと共に注射し、ＣＤ１１ｃ−ｃｒｅ−ＩＦＮＡＲｆｌ／ｆｌマウス（ツストら（Ｚｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８８（１３）：７２７６−８５）に筋肉内注射した。（Ａ）ワクチン接種実験の免疫化および負荷スケジュール。（Ｂ）ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を、１０６ｐｆｕのＤＥＮＶ−２で感染させたＤＥＮＶ−２  ＶＬＰワクチン接種マウス（ｎ＝５〜９）の血漿から抽出した。Ｔａｑｍａｎアッセイを行って、血漿中のｖＲＮＡ濃度を決定した。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差は、スチューデントｔ−検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１、ｎｓ：有意ではない）。（Ｃ）ワクチン接種後の２１および２８日目に出血させたＤＥＮＶ−２  ＶＬＰワクチン接種マウスに由来する血漿でのエンドポイント力価ＤＥＮＶ−２  ＥＬＩＳＡ。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差は、スチューデントＴ−検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、ｎｓ：有意ではない）。（Ｄ）カプラン−マイヤー方法を使用して生存曲線を生成し、有意差をログランク検定を使用することにより算出した（ｎｓ：有意ではない）。（Ｅ）感染後６日間の期間にわたって体重を測定し、初期体重の％としてプロットした。２０％を超える体重減少を有するマウスは瀕死であるとみなし、安楽死させた。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差を、多重比較を用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（Ｐ＝０．０００７）。
【図１６】３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）は、一次ヒト皮膚ＤＣサブセットにおいてＣＤ８０発現を増加させた。一次ヒト皮膚細胞を、２５０ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９またはＧ９ｎｅｇでトランスフェクトしたか、または陽性対照としての１０００Ｕの組換えヒトＩＦＮβで処置した。７２時間後、皮膚抗原提示細胞の各部分集団でのＣＤ８０発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。個々のドナー（ｎ＝４）に由来するデータポイントは直線で接続されている。統計的有意差を、対応スチューデントＴ−検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５）。
【図１７】ｉｍｍＲＮＡは、ヒト抗原提示細胞において自然免疫遺伝子上方制御を誘導した。ｒＮＥＧ（５’リン酸化を有していない配列番号２６）で処置された同じバッチの細胞と比べて、ｒ０５（配列番号２６）で処置されたヒト皮膚に由来する抗原提示細胞において発現が異なる遺伝子を分析した。データポイントは、ヒトＣＤ１１ｃ＋  ＤＤＣ、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１４１＋  ＤＤＣ、およびランゲルハンス細胞からのものである。各記号は、１つの単離細胞を表わす。単離細胞ＲＮＡｓｅｑ  ＳＭＡＲＴ−ｓｅｑ  ｖ２技術を使用して、細胞のトランスクリプトームを配列決定した。データは、ｒ０５をｒＮＥＧ処置細胞と比較した場合の上位６つのＤＥＧを示す。ｙ軸は、遺伝子発現の倍数変化をｌｏｇ２スケールで示す。
【図１８】３ｐ１０ＬＧ９により誘導されたインターフェロンシグナルは、ＲＩＧ−Ｉ依存性である。（Ａ）ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、５０ｎｇのｐＵＮＯ−ｈＲＩＧ−ＩまたはｐＵＮＯ−ｈＭＤＡ５でトランスフェクトした。その後、こうした細胞を、１０ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９、３ｐ１０Ｌ、またはＧ９ｎｅｇのいずれかでトランスフェクトした。こうしたトランスフェクトＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に由来する上清を、インターフェロン刺激応答エレメントにより駆動されるルシフェラーゼレポーター（ＩＳＲＥ−ｌｕｃ）を含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞でインキュベートした。上清と共に６時間インキュベーションした後、ルミネセンスを測定した。バーは、平均±ＳＤを示す。統計的有意差を、多重比較を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００５）。（Ｂ）３ｐ１０ＬＧ９、３ｐ１０Ｌ、Ｇ９ｎｅｇ、またはＬＭＷポリＩ：Ｃを、ＲＩＧ−ＩノックアウトＵ９３７−ＤＣ細胞（ＫＯ）または親Ｕ９３７−ＤＣ細胞（ＷＴ）のいずれかへとトランスフェクトした。ＩＦＮＢ、ＤＤＸ５８（ＲＩＧ−Ｉ）、ＭＤＡ５、およびＲＳＡＤ２（Ｖｉｐｅｒｉｎ）に関する、トランスフェクトＵ９３７−ＤＣ細胞から抽出されたｍＲＮＡの遺伝子発現分析：データは、Ｇ９ｎｅｇ処置ＲＩＧ−Ｉ  ＷＴ試料の平均と比較した倍数変化として表わされている。バーは、三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示し、データは、２つの独立実験を代表するものである。統計的有意差は、両側スチューデントｔ−検定を使用して決定した（＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。
【図１９】３ｐ１０ＬＧ９の抗ウイルス効果は、ＲＩＧ−ＩおよびＩＦＮＡＲシグナル依存性である。（Ａ）ｉｍｍＲＮＡまたはポリＩ：ＣのいずれかでトランスフェクトしたＵ９３７−ＤＣ細胞に由来する上清を、インターフェロン刺激応答エレメントにより駆動されるルシフェラーゼレポーター（ＩＳＲＥ−ｌｕｃ）を含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞でインキュベートした。上清と共に６時間インキュベーションした後、ルミネセンスを測定した。バーは、三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示し、データは、２つの独立実験を代表するものである。統計的有意差は、両側スチューデントｔ−検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。（Ｂ）ｉｍｍＲＮＡまたはポリＩ：Ｃのいずれかで事前に２４時間処置したＵ９３７−ＤＣ細胞を、ＤＥＮＶ−２  ＴＳＶ０１（ＭＯＩ−１）に感染させた。感染の２４時間後に、ＮＳ１を標的とする抗体およびＥ−タンパク質融合ループを標的とする抗体（４Ｇ２）によるフローサイトメトリーを使用して感染生存細胞を定量化した。バーは、三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示し、データは、２つの独立実験を代表するものである。各細胞タイプ内の処置方法間の統計的有意差は、両側スチューデントｔ−検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊＊Ｐ≦０．００１）。（Ｃ）ＮＳ１を標的とする抗体およびＥ−タンパク質を標的とする抗体（４Ｇ２）で染色された生存Ｕ９３７−ＤＣ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。ＨＭＷ：高分子量、ＬＭＷ：低分子量。（Ｄ）３ｐ１０ＬＧ９の抗ウイルス効果は、Ｉ型インターフェロン依存性である。１０ｕｇ／ｍＬの抗ＩＦＮＡＲ阻止抗体またはアイソタイプ対照のいずれかを添加する前に６時間にわたって、Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞を、ｉｍｍＲＮＡ、ポリＩ：Ｃでトランスフェクトしたか、またはＩＦＮβで処置した。一晩インキュベーションした後、上清を収集し、インターフェロン刺激応答エレメントにより駆動されるルシフェラーゼレポーター（ＩＳＲＥ−ｌｕｃ）を含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞でインキュベートした。上清と共に６時間インキュベーションした後、ルミネセンスを測定した。バーは、２つの独立実験の三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示す。統計的有意差は、両側スチューデントｔ−検定を使用して決定した（＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。（Ｅ）Ｕ９３７−ＤＣ細胞を、ＤＥＮＶ−２  ＴＳＶ０１（ＭＯＩ−１）に感染させた。感染の２４時間後に、ＮＳ１を標的とする抗体およびＥ−タンパク質を標的とする抗体（抗体４Ｇ２）によるフローサイトメトリーを使用して感染生存細胞を定量化した。バーは、２つの独立実験の三重重複トランスフェクションの平均±ＳＤを示す。統計的有意差は、両側スチューデントｔ−検定を使用して決定した（＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１）。
【図２０】一次ヒト皮膚細胞による３ｐ１０ＬＧ９取込み。皮膚細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７で標識された種々の濃度の３ｐ１０ＬＧ９でトランスフェクトした。細胞を、感染の２４時間後にフローサイトメトリーを使用して分析した。様々な濃度の３ｐ１０ＬＧ９−ｒｅｄを有する様々な細胞タイプ間の統計的有意差は、反復測定の二元配置ＡＮＯＶＡを使用して算出した（ｐ＝０．００２６）。記号は、平均±ＳＤ、ｎ＝３を示す。
【図２１】ｉｍｍＲＮＡによる処置後のＡ５４９細胞生存率アッセイ。様々な濃度の３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）、３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）または５’三リン酸を有していない３ｐ１０ＬＧ９でトランスフェクションした２４時間後の生存細胞の定量化。Ｄｏｘ（ドキソルビシン）を、細胞死の陽性対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下の詳細な説明では、例示のために、本発明を実施することができる具体的な詳細および実施形態が参照される。こうした実施形態は、当業者が本発明を実施することができる程度に十分に詳述されている。他の実施形態を利用してもよく、本発明の範囲を逸脱することなく構造的および論理的変更をなすことができる。種々の実施形態は、必ずしも相互に排他的ではなく、一部の実施形態を１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせて新しい実施形態を形成することができる。
【００３３】
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術的および科学用語は全て、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。単数の用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、状況が明らかにそうではないと示さない限り、複数の指示物を含む。同様に、単語「または」は、状況が明らかにそうではないと示さない限り、「および」を含むことが意図されている。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が優先することになる。
【００３４】
本発明は、ＲＩＧ−Ｉシグナル伝達の活性化に対する、短鎖５’三リン酸化ＲＮＡの構造修飾の効果を精査する本発明者らの努力に基づく。こうした研究中に、既知の短鎖ヘアピンＲＮＡ、３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）にミスマッチを導入して、ＲＮＡステムに沿って挿入を創出することが、生物学的活性に著しい影響を及ぼすことを見出した。研究したＲＮＡは、概して、ＲＩＧ−Ｉが単一の配向性で結合することを保証するように、一方の末端が熱力学的に安定なＵＵＣＧテトラループの末端であるヘアピンＲＮＡとして設計されていた。したがって、上方（ｕｐｐｅｒ）鎖および下方（ｌｏｗｅｒ）鎖のキンクを効果的に研究することができた。
【００３５】
以前に得られた結晶学的データに基づくと、ＲＩＧ−ＩのＣＴＤおよびＨＥＬ１は、ＲＮＡ分子の５’末端および３’末端から最初の４個のヌクレオチドに強固なホールドを形成するが、ＨＥＬ２ｉドメインは、上方鎖の５番目のヌクレオチド以降から塩基９までのステム領域と相互作用することが示された（ＰＤＢ  ｉｄ：４ＡＹ２、５Ｆ９Ｈ、３ＺＤ６、３ＺＤ７、および５Ｅ３Ｈ）。ＨＥＬ２ｉドメインは、ＲＮＡのステム領域をスキャンすることが観察された。ＣＡＲＤドメインは、不活性コンフォメーションのＨＥＬ２ｉドメインと相互作用するため、ＨＥＬ２ｉの相対的位置が、ＲＩＧ−Ｉ活性化に影響を及ぼすことが示された。ＲＮＡのステムに創出された挿入が、ドメインの相対的な動きに対してアロステリック効果を示し、それにより、ＲＩＧ−ＩによるＩ型インターフェロン活性化のロバストネスも達成されることが観察された。特に、ＲＮＡステムの９位にプリンを挿入することにより、より高いＩ型インターフェロン応答が引き起こされる。ＨＤＸ−ＭＳによるコンフォメーション動力学研究は、ＲＩＧ−Ｉに対する３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）の結合が、既知の３ｐ１０Ｌ  ＲＮＡ（配列番号３７）と比較して、ＣＡＲＤ露出を増加させることを証明した。こうした知見は、短鎖ヘアピンＲＮＡの構造修飾が、ＲＩＧ−ＩによるＩ型インターフェロン活性化を増強することができることを強調する。
【００３６】
細胞ベースアッセイは、上方鎖（３ｐ１０ＬＧ９）の９位に導入される挿入が、Ｉ型インターフェロン活性化を増強することを示した。３ｐ１０ＬＧ９のモデルに基づくと、３ｐ１０ＬＧ９に存在する挿入の付加は、ＲＩＧ−Ｉのヘリカーゼ２ｉドメインの背面と相互作用する。多数の異なるＲＮＡリガンドおよびＡＴＰ類似体が捕捉されている結晶構造では、ＨＥＬ２ｉドメインは、最も可動性のあるドメインであり、ＲＮＡ鎖をサンプリングする。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、９位のキンクは、おそらくは、ＨＥＬ２ｉのα−ヘリックスバンドルを、伸長コンフォメーションに、およびＨＥＬ２ｉドメインにあるＣＡＲＤドメインを押し出す位置に固定することができるという仮説がたてられる。ＡＴＰａｓｅ活性およびシグナル伝達の提案されている機序に基づくと、より長期間にわたって活性コンフォメーションに固定されたＲＩＧ−Ｉは、Ｉ型インターフェロン産生を持続させる能力を向上させることになるだろう。
【００３７】
この仮説をさらに検証するために、ＨＤＸ−ＭＳを実施して、より迅速な水素重水素交換を起こすＲＩＧ−Ｉの内の領域を比較した。ＨＤＸ−ＭＳでは、より動的な領域はより高い重水素組込みを起こすが、強固な領域はより低い重水素組込みを示すことになる。３ｐ１０ＬＧ９と結合すると、３ｐ１０Ｌと比較してより高い重水素組込みを示すＲＩＧ−Ｉタンパク質の幾つかの領域が観察された。より高い重水素交換を呈する領域の１つは、不活性コンフォメーションではＲＩＧ−Ｉ  ＨＥＬ２ｉドメインに結合する、ＣＡＲＤドメインのラッチペプチド（ｌａｔｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（Ｙ１０３〜１１４）である。したがって、ＲＩＧ−Ｉが３ｐ１０ＬＧ９に結合すると、３ｐ１０Ｌに結合したＲＩＧ−Ｉと比較して、ＣＡＲＤがより露出され、重水素組込みからの保護がより少なくなる。３ｐ１０ＬＧ９と結合した場合に重水素組込みからの高い保護を呈した別の領域は、ヘリカーゼ１ドメインのモチーフＩａおよびモチーフＩｃである。これは、３ｐ１０Ｌと比較して、３ｐ１０ＬＧ９が、ＨＥＬ１ドメインとより緊密に結合することを示す。その上、ＨＥＬ１ドメイン、ＣＴＤのキャッピングループ、および３ｐ１０ＬＧ９に対するＣＴＤ結合部位も、３ｐ１０Ｌと比較して３ｐ１０ＬＧ９がより緊密に結合することを示す、より低い水素−重水素交換を呈した。ＨＥＬ１ドメインおよびＣＴＤドメインは、ＣＡＲＤドメインと直接相互作用していなかったが、ＲＮＡに対してＨＥＬ１およびＣＴＤが全体的により緊密に結合することは、ヘリカーゼドメインの全体的なコンパクト化を示す。以前の生化学および構造研究から、ＡＴＰ結合時のヘリカーゼのコンパクト化は、ＣＴＤドメインおよびＣＡＲＤドメインを接近させ、ドメインの衝突により、下流のシグナル伝達事象のためにＣＡＲＤが解放される。
【００３８】
いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、得られたデータからは、３ｐ１０ＬＧ９とのより緊密な結合のため、よりコンパクトなＲＩＧ−ＩヘリカーゼドメインのＲＮＡとの相互作用が、ＣＡＲＤドメインのより持続的な解放に結び付くことになると仮定される。
【００３９】
ヘアピンＲＮＡの５位にＧを挿入することにより創出されたキンク（３ｐ１０ＬＧ５）は、Ｉ型インターフェロンの活性化を消失させる。３ｐ１０ＬＧ５のモデルに基づくと、３ｐ１０ＬＧ５に導入されたキンクは、ＨＥＬ１ドメインと相互作用する。ＨＥＬ１は、主にＲＮＡ結合に関与する。キンクがＨＥＬ１ドメインと相互作用する領域は、モチーフＩＩａと共に存在する。ＳＦ２ヘリカーゼの構造に基づくと、モチーフＩＩａは、ＲＮＡと相互作用し、ＤＥＡＤ−ボックスファミリーメンバー内で構造的保存を呈することが示されている。このモチーフＩＩａは、ＲＮＡとの安定的相互作用を形成するのに重要なモチーフであり得る。以前に観察されたように、ｈｓＲＩＧ−ＩのモチーフＩＩａにおける重要な残基である残基Ｑ３８０のプロリンへの突然変異は、Ｉ型インターフェロン活性化を消失させた（ルーバーら（Ｌｏｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５），ＢＭＣ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：５４）。ヘアピンＲＮＡの上方鎖の５位に導入されたキンクは、潜在的には、ＲＮＡ結合、およびＲＩＧ−Ｉ活性化に必要なＲＮＡに対するＨＥＬ１ドメインのグリップを妨害する可能性がある。ＲＩＧ−Ｉがヌクレオチドを判別する能力、およびウラシルの伸長を有する一部のＲＮＡに対する選好性が以前報告されている（ルンゲら（Ｒｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），ＰＬｏＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  １０：ｅ１００４０８１；シュネルら（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１２），ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ８：ｅ１００２８３９）。９位キンクの異なるヌクレオチドに関して、ＨＥＬ２ｉドメイン妨害には、ピリミジンのより小さな側鎖と比較して、より嵩高いプリンの存在が必要とされる可能性がより高い。
【００４０】
このように、本発明者らは、ステムＲＮＡの構造修飾が、Ｉ型インターフェロン活性化のロバストネスを変更することができることを実証した。Ｉ型インターフェロン活性化を消失させるステムの５位へのグアノシン挿入の導入とは異なり、ＲＮＡのステムの９位へのプリンに基づく挿入（ｐｕｒｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）は、ＲＩＧ−Ｉ活性化およびＩ型インターフェロンシグナル伝達を増強することが見出された。
【００４１】
インターフェロン活性化に必要な最小ＲＮＡリガンドを決定するための以前の研究に基づき、本発明者らは、元の配列に種々の修飾を施し、そうした新たに設計された免疫調節性ＲＮＡ（ｉｍｍＲＮＡ）が宿主細胞にてＲＩＧ−Ｉ−媒介性自然免疫応答を活性化する能力を試験した。新たに設計された候補ｉｍｍＲＮＡは、親構築物と比較してＩ型インターフェロン応答の活性化により大きな効力を有することを見出し、それらを使用して、ヒト細胞株ならびにヒト皮膚細胞アッセイモデルの両方において、ＤＥＮＶ感染に対するそれらの保護効果を研究し、予防用および治療用分子としてのそれらの可能性を評価した。
【００４２】
したがって、本発明は、５’から３’の方向に、構造Ｘ１−Ｌ−Ｘ２を有する新たに発見された低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子に関する。
本明細書では同義的に使用される「低分子ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、リボース単位を含み、核酸塩基アデニン、グアニン、ウラシル、およびシトシンを含む糖リン酸骨格を有するポリヌクレオチドである低分子ヘアピンリボ核酸分子に関する。それぞれのヌクレオチド単位は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ命名法に従って、Ａ、Ｇ、Ｕ、およびＣと標記される。さらに、ＩＵＰＡＣ命名法に準拠して、記号ＷおよびＳは、弱い相互作用（２つのＨ結合）、つまりＡ／Ｕ、および強い相互作用（３つのＨ結合）、つまりＧ／Ｃのために使用される。記号ＹおよびＲは、それぞれ、ピリミジン（ＣおよびＵ）核酸塩基を有するヌクレオチド、およびプリン（ＧおよびＡ）核酸塩基を有するヌクレオチドのために使用される。
【００４３】
本明細書に記載のＲＮＡ分子は、典型的には最大で８０個のヌクレオチド、好ましくは２１〜６５個のヌクレオチド、より好ましくは約２５個のクレオチドを含む。ＲＮＡは典型的には一本鎖であるが、分子の５’末端および３’末端の自己相補性は、典型的にはループ構造により接続されている２つの相補的アームである５’アームおよび３’アームのステム領域で構成される、慣例的には「ヘアピン構造」と名付けられている二次構造の形成に結び付く。
【００４４】
本明細書で開示されたヌクレオチド配列全ては、別様の指定がない限り、常に５’から３’方向に示されている。同様に、分子内のヌクレオチドの位置が言及される場合、前記位置は、常に５’末端から開始してヌクレオチドを数えることにより決定され、５’末端の最初のヌクレオチドは１位である。
【００４５】
以下では一般にＲＮＡ分子が参照されており、開示されている具体的な分子は全て、５’末端が全て二リン酸化または三リン酸化されていることを除いて非修飾であるが、例えば代謝安定性を向上させるために例えば糖リン酸骨格が修飾されているそうした分子の修飾誘導体を提供することができることが理解される。例示的な修飾としては、限定ではないが、天然骨格の代わりにホスホロチオエートを使用すること、または２’−フルオロ修飾が挙げられる。したがって、非修飾ＲＮＡ分子に関係して本明細書で開示されている実施形態は全て、本明細書に記載の本質的な構造決定要因が維持される限り、修飾ＲＮＡ分子でも同様に実施することができる。
【００４６】
本発明のｓｈＲＮＡ分子は、５’末端が二リン酸化または三リン酸化されている。これは、５’末端ヌクレオチドのリボース単位の５’炭素の一リン酸基が、二リン酸基または三リン酸基に置き換えられていることを意味する。したがって、それらのヌクレオチド配列について本明細書で開示されている分子は全て、それが具体的に示されていなくとも、その５’末端で二リン酸化または三リン酸化されている。三リン酸化分子が特に好ましい。
【００４７】
本発明のＲＮＡ分子では、Ｘ１およびＸ２は各々、二本鎖ステム構造を形成するのに十分な互いに対する相補性を有する８〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。「相補性」が言及される場合、典型的なワトソン−クリック型塩基対合相補性が意味されている。つまり、ＡはＵと相補的であり、ＧはＣと相補的である。相補性は、所与の一本鎖配列伸長の対合ヌクレオチドをこの伸長のヌクレオチドの総数で除算し、それを１００倍することにより算出される、％の数値として得ることができる。例えば、１０ヌクレオチド長の配列伸長のうち９ヌクレオチドがワトソン−クリック型塩基対合で対合することができる場合、相補性は９０％になるだろう。これに準拠すると、「十分な相補性」は、所与の配列伸長の全てのヌクレオチドが、対応する相補的配列とワトソン−クリック型塩基対合で対合することができることを意味する。本発明の分子との関係では、これは、Ｘ１の全てのヌクレオチドが、Ｘ２の全てのヌクレオチドと塩基対合することができ、その逆も同様であることを意味する場合がある。
【００４８】
Ｘ１領域は、ｓｈＲＮＡ分子の５’末端配列であり、したがって本明細書では５’アームとも標記される。同様に、Ｘ２領域は、３’末端部分であるため、３’アームとも名付けられる。両配列は、ループ領域Ｌにより互いに共有結合で連結されている。ループ領域は、Ｘ１およびＸ２の対合配列伸長を連結する１つまたは複数の非対合ヌクレオチドを含むループ領域を形成するヌクレオチド配列である。ループは、１〜１０ヌクレオチド長、例えば、２〜８、２〜６、３〜５、２〜４、または３もしくは４ヌクレオチド長であってもよい。種々の実施形態では、本発明の分子のループ領域Ｌは、配列ＹＹＹＲ、ＷＷＳＳ、ＵＹＹＧ、ＹＵＣＲ、ＵＵＳＳ、ＷＷＣＧ、ＵＵＣＳ、ＵＵＣＲ、ＹＹＣＧ、ＹＵＣＧ、ＷＵＣＧ、またはＵＵＣＧの４ヌクレオチドを含むかまたはからなる。
【００４９】
従来の命名法によると、上記で定義されているように、Ｘ１の５’末端に位置する最初のヌクレオチドは、ｎ１と標記され、Ｘ２の３’末端の最後のヌクレオチドは、ｎｘと標記され、ｘは、ＲＮＡ分子のヌクレオチドの総数を示す整数である。典型的には、ｘは２５〜６５の整数である。したがって、ｎ１は５’末端ヌクレオチドであり、ｎｘは３’末端ヌクレオチドである。この命名法に従うと、ｎ９は、５’末端から数えて９位のヌクレオチドを示し、ｎｘ−１（ｘマイナス１）は、最後から２番目のヌクレオチド、つまり３’末端ヌクレオチドｎｘの上流のヌクレオチドを示す。「上流」は、本明細書で使用される場合、基準ヌクレオチドに対して５’方向に位置することを指し、「下流」は、本明細書で使用される場合、基準点に対して３’方向に位置することを意味する。
【００５０】
本発明のｓｈＲＮＡ分子は、二本鎖ステム構造において非対合のままでありキンクを創出するヌクレオチド挿入を、Ｘ１のｎ７位もしくはそれより上にまたはＸ２のｎｘ−６位もしくはそれよりも下に含むことを特徴とする。「ｎ７またはそれよりも上に」は、５’末端から数えて７位、または８、９、１０、および１１位などを含む、その下流（つまり３’方向）の任意の位置を意味し、したがって「ｎｘ−６またはそれよりも下に」は、ｘ−６（ｘマイナス６）位、つまり３’末端ヌクレオチドの６位上流を意味する。したがって、２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子では、ｎｘ−６位は、ｎ（２５−６）＝ｎ１９位になるだろう。用語「キンク」は、本明細書で使用される場合、別の二本鎖ステム構造の一方の鎖のみにある非対合ヌクレオチドにより創出される、ステム構造の歪み（「バルジ」）を記述する。
【００５１】
種々の実施形態では、本発明のｓｈＲＮＡ分子は、平滑末端化されており、つまりＸ１およびＸ２は、キンクを創出する挿入は数えずに、同じ長さであり、分子の５’末端および３’末端ヌクレオチドは、好ましくは、二本鎖ステム構造が両方末端ヌクレオチドを含むようにワトソン−クリック型塩基対合により互いにハイブリダイズしている。
【００５２】
種々の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は各々、１０〜２５ヌクレオチド長、好ましくは１０、１１、２０、２１、３０、もしくは３１、または１０〜２０ヌクレオチド長、より好ましくは１０もしくは１１ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。一般に、Ｘ１およびＸ２は、構造にキンクを創出するために挿入されたヌクレオチドである１ヌクレオチドのみだけ長さが異なることが好ましい。生物学的活性は、長さが１０ヌクレオチド長、または１０ヌクレオチドの倍数、つまり１０、２０、３０塩基対長などであるステム領域の場合に、最も高いと考えられることが見出された。１０塩基対長の二本鎖ステム領域を有する低分子ＲＮＡ分子が好ましい。
【００５３】
Ｘ１およびＸ２が、キンクを創出するヌクレオチド挿入を除き、互いに完全に相補的であるｓｈＲＮＡ分子が特に好ましい。
キンクを創出するヌクレオチド挿入は、原理的には任意の長さを有してもよいが、最大で５個のみ、好ましくは最大で３個、より好ましくは１または２個、最も好ましくは１個のみのヌクレオチド長の短いヌクレオチド挿入であることが好ましい。挿入は、任意のヌクレオチドで作製することができるが、挿入は、プリンヌクレオチド、つまりＡまたはＧからなることが好ましい。種々の実施形態では、挿入は、ＡおよびＧから選択される単一のヌクレオチドであることが好ましい場合があり、そうした実施形態の一部では、活性がより高いためＡがさらにより好ましい。
【００５４】
ｓｈＲＮＡの生物学的活性を調節することに関して言えば、５’アーム、つまりＸ１配列への挿入が、一般により効果的であると考えられることが見出された。したがって、挿入はＸ１配列にあることが好ましい。
【００５５】
さらに、上記でも考察されているように、挿入の位置は、活性に著しい影響を及ぼすことが見出された。Ｘ１配列のｎ７位またはそれより上から、Ｘ１配列の３’末端前の１ヌクレオチドまで、つまりループ領域が始まる前の最後の対合ヌクレオチドの上流にあるヌクレオチド（Ｘ１配列の最後から２番目のヌクレオチド）までにおける挿入が好ましい。７位および８位における挿入が機能的であり得るが、生物学的活性は、挿入が９位またはそれよりも上にある場合に著しく増加されることが見出された。好ましい位置は、９位、および９位〜最初のループヌクレオチドの２または３位ヌクレオチド上流、好ましくは３位ヌクレオチド上流の位置である。５’アームが１１ヌクレオチド長である分子では、これは、少なくとも５’末端から下流の位置であり、同時に最初のループヌクレオチドの３位上流であるため、９位が特に好ましいことを意味するだろう。
【００５６】
代替的な実施形態では、３’アームに挿入を配置することも可能であり得る。そのような実施形態では、挿入は、Ｘ２配列の２番目のヌクレオチド、つまり、Ｘ２配列の最初の対合ヌクレオチドのすぐ下流のヌクレオチド、またはｎｘ−６位までの任意の次位置、つまりＸ２配列の３’末端から７位上流であってもよい。そのような位置としては、ｎｘ−７、ｎｘ−８、およびｎｘ−９が挙げられる。
【００５７】
種々の実施形態では、Ｘ１は、
【００５８】
【化４】
2021511037.tif 000006
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなり、
配列中、ｒはｇまたはａであり、ｙはｕまたはｃであり、ｗはａまたはｕであり、ｓはｇまたはｃであり、ｎは、ａ、ｇ、ｕ、またはｃである。これら配列では、太字ヌクレオチドは、好ましくは挿入であり、つまり対合しない。本明細書で開示されている全ての例示的なＸ１配列では、挿入されたヌクレオチド、つまり非対合ヌクレオチドは、好ましくは９位にある。そのような実施形態では、Ｘ２配列は、挿入されたヌクレオチドを除いて、この配列の完全相補体であることが好ましい。
【００５９】
したがって、種々の実施形態では、Ｘ２は、
【００６０】
【化５】
2021511037.tif 000007
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなり、
配列中、ｒはｇまたはａであり、ｙはｕまたはｃであり、ｗはａまたはｕであり、ｓはｇまたはｃであり、ｎは、ａ、ｇ、ｕ、またはｃである。こうした実施形態では、Ｘ２は、好ましくはヌクレオチド挿入を含まず、したがって、挿入は５’アームに位置する。また、こうした実施形態では、Ｘ１配列は、挿入されたヌクレオチドを除いて、この配列の完全相補体であることが好ましい。
【００６１】
好ましいループ配列と共に、本発明のｓｈＲＮＡ分子は、好ましくは、
【００６２】
【化６】
2021511037.tif 000008
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、から本質的になるか、またはからなり、
配列中、ｒはｇまたはａであり、ｙはｕまたはｃであり、ｗはａまたはｕであり、ｓはｇまたはｃであり、ｎは、ａ、ｇ、ｕ、またはｃである。これら配列では、太字ヌクレオチドは、挿入であり、つまり対合しない。したがって、挿入されたヌクレオチドは、好ましくは９位にある。
【００６３】
本発明は、配列番号２５〜３２および４２〜４３、特に２５、２６、４２、および４３を含むか、から本質的になるか、またはからなるｓｈＲＮＡ分子にさらに関する。
本発明の種々の実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子は、自然免疫受容体レチノイン酸誘導性遺伝子１（ＲＩＧ−Ｉ）、特にホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ＲＩＧ−Ｉに結合することをさらに特徴とする。結合は、好ましくは、他の免疫受容体またはＲＬＲファミリーの他のメンバーなどの他の潜在的な結合パートナーよりも好ましくはＲＩＧ−Ｉに対して生じるという点で特異的である。この選好性は、結合親和性が、他の受容体に対するものよりも少なくとも１０×、好ましくは少なくとも１００×高いことを意味する場合がある。
【００６４】
また、本発明により包含される種々の代替的な実施形態では、ｓｈＲＮＡは、上記で規定されている位置ではなく、むしろ５’アームのさらに上流に、または３’アームのさらに下流にヌクレオチド挿入を有してもよい。一部の実施形態では、ｎ５位の挿入が好ましい場合があるが、本発明はそれに制限されない。そのような分子、特に配列番号３０に示されているヌクレオチド配列を有するｓｈＲＮＡは、ＲＩＧ−Ｉアンタゴニストとして作用し、したがってＲＩＧ−Ｉ媒介性シグナル伝達を抑制することができることが見出された。ヌクレオチド挿入の位置が異なることは別にして、上記に記載のようにＸ１のｎ７位もしくはそれより上にまたはＸ２のｎｘ−６位もしくはそれよりも下にヌクレオチド挿入を有するｓｈＲＮＡについて本明細書で開示されている全ての実施形態は、ステムの末端により近い非対合ヌクレオチドの挿入を有するそうしたｓｈＲＮＡ分子にも同様に適用可能である。
【００６５】
本発明のｓｈＲＮＡ分子は、免疫調節性ＲＮＡ（ｉｍｍＲＮＡ）であり、つまり免疫系を調節するという点で有用性を有する。典型的には、これは、それらが免疫刺激性であることを意味するが、一部の実施形態では、免疫抑制活性が所望な場合もある。
【００６６】
したがって、本発明は、本発明による少なくとも１つのｓｈＲＮＡ分子を含む組成物にも関する。また、種々の実施形態では、そのような組成物は、配列または構造が異なる多数のｓｈＲＮＡ分子を含んでいてもよい。本発明によるそのような複数のｓｈＲＮＡ分子は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種、またはそれよりも多くの異なる種のｓｈＲＮＡ分子を含んでいてもよい。本発明のＲＮＡ分子に加えて、こうした組成物は、これらに限定されないが、本発明によるものではない他のＲＮＡ分子を含む種々の他の成分を追加で含んでいてもよい。
【００６７】
組成物は、医薬組成物、特に免疫刺激組成物であってもよい。そのような組成物では、ｓｈＲＮＡ分子はアジュバントとして作用し、したがって、そのような組成物に共に含まれていてもよく、または別々に製剤化されていてもよい選択された抗原に対する免疫応答を増加させることができる。そのような組成物では、ｓｈＲＮＡは、その代わりにまたはそれに加えて、アジュバントとして作用するだけでなく、それ自体が免疫刺激活性を有していてもよく、したがって例えば、抗ウイルス剤または抗がん剤として作用することができる。
【００６８】
例示的な免疫刺激組成物としては、病原体または毒素などの、実際のワクチン、例えば弱毒化ウイルスもしくは細菌、またはウイルスタンパク質もしくは細菌タンパク質をさらに含んでもよいワクチン組成物が挙げられる。そのような実施形態では、ｓｈＲＮＡ分子は、アジュバントとして使用されてもよい。
【００６９】
その代わりに、組成物は、任意選択で活性抗ウイルス剤をさらに含む抗ウイルス組成物であってもよい。
さらに別の代替形態では、組成物は、任意選択で活性抗がん剤をさらに含む抗がん組成物であってもよい。例示的な抗がん剤としては、限定ではないが、化学療法剤および細胞チェックポイント阻害剤が挙げられる。好適なチェックポイント阻害剤としては、限定ではないが、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、およびＰＤ−Ｌ１阻害剤が挙げられる。好適な化学療法剤としては、限定ではないが、抗体、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、および抗微小管剤が挙げられる。
【００７０】
抗ウイルス剤および抗がん剤では両方とも、本発明のｓｈＲＮＡ分子は、活性作用剤であってもよく、または活性作用剤である抗ウイルス剤または抗がん剤と共製剤化もしくは共投与されてもよい。後者の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、アジュバントまたは活性作用剤または両方として作用してもよい。
【００７１】
組成物の具体的なタイプとは無関係に、組成物は、典型的には、薬学的に許容される賦形剤など、意図されている目的のために公知であるかまたは使用される１つまたは複数の賦形剤をさらに含んでいてもよい。そのような成分としては、助剤、溶媒などの担体、および保存剤などが挙げられる。
【００７２】
したがって、アジュバントまたは抗ウイルス剤または抗がん剤としての本発明のｓｈＲＮＡ分子の使用が、明示的に企図される。したがって、種々の実施形態では、本発明は、本発明のｓｈＲＮＡ分子、あるいはそれを必要とする対象の免疫系を刺激するための、またはウイルス感染症もしくはがんを治療もしくは予防するための方法で使用するためのものを含む任意の組成物をさらに特徴とする。対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。同様に、本発明は、それを必要とする対象の免疫系を刺激するための、またはウイルス感染症を治療もしくは予防するための、またはがんを治療もしくは予防するための方法であって、本発明によるｓｈＲＮＡ分子または本明細書に記載の組成物の有効量を前記対象に投与する工程を備える方法を包含する。「有効量」は、この関連で使用される場合、所望の生物学的応答、つまり、典型的には非刺激状態と比べた免疫系の活性化またはウイルス感染症の治療をもたらすのに必要な量を指す。したがって、有効量は、治療有効量または予防有効量であってもよい。そのような方法では、ｓｈＲＮＡ分子は、ワクチン接種剤などの活性作用剤、または抗ウイルス剤もしくは抗がん剤などの治療的活性作用剤と共に共投与してもよい。
【００７３】
上記に記載の使用および方法では、投与は、局所的であってもよくまたは全身性であってもよい。
本発明の種々の実施形態では、治療または予防しようとするウイルス感染としては、これらに限定されないが、デングウイルス感染が挙げられる。
【００７４】
本発明のさらなる実施形態では、本明細書に開示されているｉｍｍＲＮＡは、がん治療または予防（防止）に使用される。したがって、ウイルス感染症を治療または予防するための上記に記載の方法は、同様に、がん治療または予防の様々な徴候のために実施することができる。
【００７５】
本発明者らは、ヌクレオチド挿入をステム構造に創出する構造修飾により、ｓｈＲＮＡ活性を調節することができることを見出した。この知見の結果として、本発明は、前記知見を活用する方法であって、所与の低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を、５’アームにヌクレオチドを挿入することにより修飾して、その生物学的活性を増加させるという方法にも関する。こうした方法では、鋳型ｓｈＲＮＡは、好ましくは、５’から３’の方向に、
Ｘ１−Ｌ−Ｘ２
（式中、
Ｘ１およびＸ２は各々、二本鎖ステム構造を形成するのに十分な互いに対する相補性を有する８〜３０ヌクレオチド長のヌクレオチド配列であり、
Ｌは、ループ領域を形成するヌクレオチド配列であり、
Ｘ１の５’末端に位置する最初のヌクレオチドは、ｎ１と標記され、Ｘ２の３’末端の最後のヌクレオチドは、ｎｘと標記され、ｘは２５〜６５の整数である）の構造を有する。種々の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、本発明の修飾ｓｈＲＮＡ分子について上記に記載のように定義された要素Ｘ１、Ｘ２、およびＬに関わる。こうした鋳型は、二本鎖ステム構造において非対合のままでありキンクを創出するヌクレオチド挿入を、Ｘ１のｎ７位もしくはそれよりも上にまたはＸ２のｎｘ−６位もしくはそれよりも下に導入することにより修飾される。また、さらなる実施形態では、そのような挿入は、ＲＩＧ−Ｉアンタゴニストとして作用するｓｈＲＮＡについて上記に記載されているように、異なる位置であってもよい。そのような挿入を生成するための好適な方法は当業者に公知であり、当該分野で日常的に実施されている。さらに、そのような分子を生成するための例示的な技法は、本明細書の例のセクションにて具体的な配列を参照することにより本明細書に記載されている。加えて、既に存在していない場合、鋳型分子を、それが二リン酸化または三リン酸化されるように５’末端をリン酸化することにより修飾してもよい。これに好適な方法は、当業者に公知である。
【００７６】
本発明のＲＮＡ分子に関係して本明細書に開示されている全ての実施形態は、本明細書に記載の全ての組成物、使用、および方法に同様に適用可能であり、その逆も同様であることが理解される。
【００７７】
本発明は、以下の例によりさらに説明される。しかしながら、本発明は、例示されている実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００７８】
物質および方法
タンパク質発現および精製
ｐＥＴＳＵＭＯ中のヒトＲＩＧ−Ｉ（ｈｓＲＩＧ−Ｉ）構築物およびＣＡＲＤを有していないヒトＲＩＧ−Ｉ（ｈｓＲＣ２）の構築物を、Ｒｏｓｅｔｔａ  ＩＩ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞（ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ）、米国マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）へと形質転換し、抗生物質カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびクロラムフェニコール（３７ｍｇ／Ｌ）を有する２．５％（ｗ／ｖ）グリセロール５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で補完されたＬＢ培地で増殖させた。培養物を、ＯＤ６００が０．８に到達するまで２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で増殖させ、培養物を１８℃に冷却し、０．５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で２０時間誘導した。細胞を、４℃で１０分間４０００ｒｐｍにて遠心分離することにより回収し、−８０℃で保管した。回収した細胞を解凍し、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、および５ｍＭ  β−ＭＥを含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を、８００ｂａｒでホモジナイザー（ＧＥＡ社）に通すことにより、溶解した。溶解物を４℃で４０分間４００００ｒｐｍにて遠心分離することにより清澄化した。ヘキサヒスチジンタグを有する目的のタンパク質を含む上清をインキュベートし、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））で精製した。溶出した後、目的のタンパク質を、１：４０（ｗ／ｗ）比のＳＵＭＯプロテアーゼを用いて４℃にて一晩切断した。タンパク質を、Ｎｉ−ヘパリンＨＰタンデムカラムでさらに精製して、プロテアーゼおよび切断されたＨｉｓ−タグをトラップし、タンパク質をさらに仕上げた。それらを、ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥヘルスケア社（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））カラムを使用してサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製し、ｖｉｖａｓｐｉｎ３００００ＭＷＣＯカットオフ（ＧＥ，ヘルスケアライフサイエンス社（ＧＥ，Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））で濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析し、その後ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国所在）を使用して２８０ｎｍの吸光度を測定することにより定量化した。タンパク質を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、および２ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液で保管し、液体窒素で瞬間凍結した。
【００７９】
ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
ＲＮＡを、ＩＤＴ（インテグレイテイッドＤＮＡテクノロジーインコポレイティッド社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ））で化学的に合成されたＴ７プロモーターを含む相補的ＤＮＡオリゴ対を使用して転写した。手短に言えば、相補的ＤＮＡオリゴ対を、９５℃に加熱し、室温へとゆっくり冷却することによりアニーリングさせた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、３０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５ｍＭ  ＧＴＰ、および４ｍＭ  ＮＴＰ（ＣＴＰ、ＡＴＰ、およびＵＴＰ）、１μＭのアニーリングしたＤＮＡ鋳型、４００ｎＭ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、０．２Ｕ／ｍＬ熱安定性無機ピロホスファターゼ中で１６時間３７℃にて実施した。転写されたＲＮＡを、１容積のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）、続いてエタノール沈澱により精製した。ＲＮＡペレットを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．４に再懸濁し、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラムによるさらなる精製に供した。溶出したＲＮＡを、エタノール沈澱に供し、２０％変性尿素−ＰＡＧＥでさらに精製した。予想サイズを有するＲＮＡをゲルから切除し、抽出し、続いてエタノール沈澱した。精製したＲＮＡを、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液に再懸濁した。
【００８０】
このようにして産生されたＲＮＡ分子は、テーブル１に示されている。太字は、構造にキンクを創出するステム領域中の非対合ヌクレオチドを示す。使用されるｉｍｍＲＮＡは全て、そうではないと明示的に示されていない限り、５’三リン酸化されていた。
【００８１】
【表１】
2021511037.tif 000009
ＮＡＤＨ結合ＡＴＰａｓｅアッセイ（ＮＡＤＨ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ＡＴＰａｓｅ  ａｓｓａｙ）
ｈｓＲＩＧ−ＩのＡＴＰａｓｅアッセイを、１ｍＭ  ＮＡＤＨ、１００Ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ、５００Ｕ／ｍｌピルビン酸キナーゼ、２．５ｍＭホスホエノールピルビン酸を含む５×アッセイミックスの存在下の、２５ｍＭ  ＭＯＰｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液で実施した。ＡＴＰのＫｍを決定するために、２０ｎＭの目的のタンパク質を使用した。飽和量のＲＮＡを、１μＭの濃度で添加し、タンパク質ＲＮＡ混合物を、反応開始前に２時間インキュベートした。３９ｎＭから５０００ｎＭまでの範囲の８つの異なる濃度に希釈した１対１モル比のＡＴＰおよびＭｇＣｌ２を添加することにより反応を開始させ、９６ウェルプレート形式でＣｙｔａｔｉｏｎ  ３  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ（バイオテック社（ＢｉｏＴｅｋ））を使用して３４０ｎｍのＡｂを室温にて１０分間にわたってモニターした。データは全て三重重複で取得し、ミカエリス−メンテン式を使用したＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）バージョン６プログラム（グラフパッドソフトウェアインコポレイティッド社（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ））を使用して、ＮＡＤＨ加水分解の速度をＡＴＰ濃度の関数としてプロットした。速度は、１０分間の期間にわたって得た。速度はバックグラウンドＮＡＤＨ分解について補正されている。
【００８２】
細胞培養およびＩＦＮ−β誘導アッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に由来するＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉ細胞およびＴＨＰ−１細胞に由来するＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）は、分泌Ｌｕｃｉａルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するように生成された細胞株である。このレポーター遺伝子は、多量体ＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）により増強されるＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターの制御下にある。細胞を、Ｔ−７５フラスコ中の１０％ウシ胎仔血清で補完されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ギブコ社（ＧＩＢＣＯ））で維持した。ＩＦＮ−β誘導アッセイは、５０，０００細胞／ウェルの播種密度で９６ウェルプレートにて実施した。細胞に、ＬｙｏＶｅｃ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））を使用して、３００ｎＭから６ｎＭまでの様々な濃度のＲＮＡでトランスフェクトした。２４時間後、１０μＬの細胞培養培地を収集し、５０μｌのＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ（商標）（Ｌｕｃｉａルシフェラーゼの活性を定量的に測定するために必要な成分を全て含むアッセイ試薬）と混合した。Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１プレートリーダ（バイオテック社（Ｂｉｏｔｅｋ）、アメリカ合衆国バーモント州ウィヌースキー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ）所在）を使用して、ルミネセンスを測定した。また、タイムポイント実験を、９６ウェルプレート形式で１００ｎＭ  ＲＮＡを使用して最大で７２時間にわたって実施した。
【００８３】
細胞ベース阻害アッセイ
細胞ベース阻害アッセイを、ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉ細胞を使用して実施した。ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉ細胞を５０，０００細胞／ウェルの播種密度でプレーティングし、製造業者の推奨に従ってＬｙｏＶｅｃを使用して、３００ｎＭから６ｎＭまでの範囲の異なる濃度のアンタゴニスト３ｐ１０ＬＧ５と共に１０ｎＭの３ｐ１０Ｌでトランスフェクトした。２４時間後、１０μＬの細胞培養培地を収集し、５０μｌのＱＵＡＮＴＩ−Ｌｕｃ（商標）と混合し、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１プレートを使用して、ルミネセンスを測定した。アッセイは全て、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルプレートにて三重重複で実施した。阻害剤の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６（グラフパッドソフトウエア社（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、米国カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）所在）を使用して決定した。
【００８４】
水素／重水素交換（ＨＤＸ）と組み合わせた質量分析法（ＨＤＸ−ＭＳ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎ／Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、および２ｍＭ  ＤＴＴ中の５μｌの１０μＭ  ＲＩＧ−Ｉタンパク質を、１０倍過剰のＲＮＡリガンド３ｐ１０ＬＧ５、３ｐ１０ＬＧ９、および３ｐ１０ＬＡ９と共に４℃で１時間インキュベートした。タンパク質複合体混合物を、２０μｌのＤ２Ｏ交換緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ）に希釈し、４℃でインキュベートし、２５μｌの氷冷４Ｍ  ｇＨＣＬ、１％トリフルオロ酢酸と混合することによりクエンチした。試料を、３Ｍ  ｇＨＣＬを含むＤ２Ｏ交換緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、および３Ｍ  ｇＨＣＬ）中で一晩室温でインキュベートした。反応をクエンチした後、試料をＨＤＸプラットフォームに注入するまで、試料チューブを直ちにドライアイスに置いた。注入に際して、試料を、２００μｌ  ｍｉｎ−１で固定ペプシンカラム（２ｍｍ×２ｃｍ）に通し、消化ペプチドを２ｍｍ×１ｃｍ  Ｃ８  ｔｒａｐカラム（アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ））で捕捉し、脱塩した。ペプチドを、２．１ｍｍ×５ｃｍ  Ｃ１８カラム（１．９  ｍ□Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ、サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））で、５分間にわたって４％−４０％ＣＨ３ＣＮおよび０．３％ギ酸の線形勾配を用いて分離した。試料取り扱い、タンパク質消化、およびペプチド分離は、４℃で実施した。質量分析データは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ、サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））を使用して取得した。測定分解能は、ｍ／ｚ４００で６５，０００だった。ＨＤＸ分析は、各タンパク質リガンド複合体の単一調製物を用いて三重重複で実施した。各ペプチドエンベロープの強度加重平均ｍ／ｚセントロイド値を算出し、続いて重水素組込みのパーセンテージに変換した。推定７０％の重水素リカバリーに基づき、および重水素交換緩衝液の既知８０％の重水素含有量を考慮して逆交換の補正を行った。２つの試料を比較する場合、２つの試料間の差異を算出することにより摂動％Ｄを決定する。ＨＤＸ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈにより、各々の表示されている図に示されている滑らかな色勾配のＨＤＸ摂動キー（％Ｄ）に従って各ペプチドを着色する。−５％〜５％の％Ｄ差異は、有意ではないとみなして、ＨＤＸ摂動キーに従って灰色に着色する（パスカルら（Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ）、２０１２）。加えて、独立ｔ−検定を算出して、各時点での試料間の統計的有意（ｐ＜０．０５）差を検出した。０．０５未満のｐ値を有する少なくとも１つの時点が、データセットの各ペプチドに存在し、差異が有意であることがさらに確認された。
【００８５】
データレンダリング：全ての重複ペプチドのＨＤＸデータを、残基平均手法を使用して個々のアミノ酸値に統合した。手短に言えば、各残基について、全ての重複ペプチドの重水素組込み値およびペプチド長をまとめた。より短いペプチドにより重い重みをかけ、より長いペプチドにより軽い重みをかける重み関数を適用した。その後、重みを加えた重水素組込み値の各々を平均して、各アミノ酸について単一の値を得た。各ペプチドの最初の２残基ならびにプロリンを計算から除外した。この手法は、以前記載されているものと同様である（ケッペル＆ワイス（Ｋｅｐｐｅｌ＆Ｗｅｉｓ），２０１５）。
【００８６】
ヒト皮膚ＤＣ単離
ヒト皮膚から単離細胞を単離するためのプロトコールは、以前詳細に記載されていた（セルニーら（Ｃｅｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１４；１０（１２）：ｅ１００４５４８）。ヒト皮膚細胞を単離するための、３００ｍｍの真皮節切片を、０．８ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（ＩＶ型、ワーシングトン−バイオケミカル社（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））および０．０５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を含む、ＲＰＭＩ＋１０％加熱不活性化ＦＢＳ（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））中で１２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を７０μｍストレーナーで濾過して、単離細胞懸濁物を得た。
【００８７】
細胞株
ＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｕ９３７、およびＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））で補完されたＲＰＭＩで増殖させた。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するＵ９３７細胞を、レンチウイルストランスフェクションにより生成した（ズストら（Ｚｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１３），ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９：ｅ１００３５２１）。ＭＸ１Ｐ−ｌｕｃを発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、ゲオルグ  コクスにより生成された（コクスら（Ｇｅｏｒｇ  Ｋｏｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．），Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９０：２９９０−２９９４）（ユニバーシティオブフライブルク（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）、ドイツ所在）。ＩＳＲＥ−ｌｕｃレポータープラスミドを含むＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用して、０．５μｇのＩＳＲＥ−ｌｕｃプラスミドをトランスフェクトすることにより生成した。
【００８８】
ＲＩＧ−Ｉノックアウト細胞株を、ＲＩＧ−Ｉのエクソン１を標的とするｇＲＮＡ配列を含むｐＲＲＬ−ｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−Ｔ２ＡプラスミドによるＵ９３７−ＤＣ細胞のレンチウイルス形質導入により生成した。ＲＩＧ−Ｉ  ｇＲＮＡ含有プラスミドは、アルビン  タン博士（Ａｌｖｉｎ  Ｔａｎ）（ゲノムインスティチュートオブシンガポール（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）、Ａ＊スター社（Ａ＊ＳＴＡＲ）、シンガポール所在）から得た。レンチウイルス粒子を、以下の３つのプラスミドと共に２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用することにより２９３Ｔ細胞で産生した：（ｉ）ビリオン主要構造タンパク質をコードするｇａｇ；レトロウイルス特異的酵素に関わるｐｏｌ；および核からのＲＮＡ搬出を促進するｒｅｖタンパク質の結合部位であるＲＲＥを含むｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ。（ｉｉ）ＲＳＶ  Ｕ３プロモーターの転写制御下のＨＩＶ−１  ｒｅｖをコードするｐＲＳＶ−Ｒｅｖ；（ｉｉｉ）ＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミドであるｐＭＤ２．Ｇ。ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５１）、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ（ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５３）、およびｐＭＤ２．Ｇは、ディディエ  トロノ教授（スイスローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）所在）により生成された。形質導入が成功した細胞を、２μｇ／ｍｌピューロマイシンを有する培養培地を補完することにより選択した。（トルエットら（Ｔｒｕｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：５２−５４）に記載の「ＨｏｔＳＨＯＴ」ゲノムＤＮＡ調製法を使用することにより、ゲノムＤＮＡを細胞から抽出した。精製したＤＮＡを、エクソン１を隣接するプライマー（フォワード：５’ＧＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＡＡＡＣＴＡＧＣＣ３’（配列番号４６）およびリバース：５’ＧＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＣ３’（配列番号４７）を使用した配列決定のために送付した（ファーストベース社（Ｆｉｒｓｔ  Ｂａｓｅ））。配列を、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ＥＮＳＧ０００００１０７２０１．９）のヒトＤＤＸ５８の公的に入手可能な配列と比較した。
【００８９】
ウイルス
ヒト細胞株での感染実験に使用したＤＥＮＶ−２菌株ＴＳＶ０１（ＮＣＢＩ受託番号ＡＹ０３７１１６．１）は、Ｃ６／３６蚊細胞にて５〜２０継代にわたって継代された患者単離株である。一次ヒト皮膚ＤＣの感染に使用したＤ２Ｙ９８Ｐは、感染性クローンに由来していた。Ｄ２Ｙ９８Ｐの増強されたウイルスＲＮＡ合成を、ＮＳ４ｂタンパク質の天然突然変異にマッピングした。この突然変異は、ウイルスのＩＦＮ阻害能力に影響を及ぼさなかった（グラントら（Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１１），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８５：７７７５−７７８７）。
【００９０】
Ｉ型インターフェロンバイオアッセイでのＲＮＡスクリーニング
ＨＥＫ−２９３Ｔ  ＭＸ１Ｐ−ｌｕｃ細胞を、１ウェル当たり２．５×１０４細胞の密度で白色９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。ｉｍｍＲＮＡを適切な濃度に希釈し、製造業者の使用説明書に従って２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））でトランスフェクトした。細胞を２４時間インキュベートし、その後溶解し、製造業者の使用説明書に従ってＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用してＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉマイクロプレートリーダ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））で分析した。
【００９１】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞を、２４ウェルプレートの１０％ＦＢＳを有する５００μｌ  ＲＰＭＩに、１ウェル当たり３．０×１０５細胞の密度で播種し、一晩インキュベートした。ｉｍｍＲＮＡを適切な濃度に希釈し、製造業者の使用説明書に従ってＨｉｌｙｍａｘ（ドウジンドウモレキュラーテクノロジー社（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でトランスフェクトした（三重重複で）。２４時間インキュベーションした後、細胞を、５００×ｇで４分間遠心分離し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に回収し、全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従って回収した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用してＲＮＡを逆転写した。ＰＣＲプライマーを、インテグレイテイッドＤＮＡテクノロジー社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から購入し、定量ＲＴ−ＰＣＲを、ｉＴａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオ−ラッドラボラトリー社（Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を使用して、ＡＢＩ  ７９００  ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で実施した。プライマー配列は、下記の表に見出すことができる。ｑＰＣＲデータの分析は、ベータアクチンを参照遺伝子対照として使用して、ΔΔＣｔ方法による相対的定量化により行った。
【００９２】
【表２】
2021511037.tif 000010
Ｉ型インターフェロン産生のバイオアッセイ
ｉｍｍＲＮＡトランスフェクト細胞に由来する上清を、０．５μｇのＩＳＲＥ−ｌｕｃプラスミドで前日にトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞でインキュベートし、翌日に９６ウェル白色不透明プレートにプレーティングした。上清を６時間インキュベートしてから、溶解し、製造業者の使用説明書に従ってＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用してＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉマイクロプレートリーダ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））で分析した。
【００９３】
ｉｍｍＲＮＡでトランスフェクトしたＲＬＲ発現ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のＩ型インターフェロンバイオアッセイ。
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、２４ウェルプレートの１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩに１ウェル当たり１．２５×１０５細胞の密度で播種した。５０ｎｇのｐＵＮＯ−ｈＲＩＧ−ＩまたはｐＵＮＯ−ｈＭＤＡ５（ルオら（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１１）、Ｃｅｌｌ  １４７：４０９−４２２）を、Ｌｙｏｖｅｃ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））を使用してトランスフェクトし、細胞を一晩インキュベートした。ＲＬＲを発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、ｉｍｍＲＮＡでトランスフェクトした。細胞に由来する上清を、ｄｓＲＮＡでトランスフェクションした２４時間後に回収し、ＩＳＲＥ−ｌｕｃを発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を使用してＩ型インターフェロンバイオアッセイを行った。
【００９４】
Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞ＩＦＮＡＲ阻止アッセイ
Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞を、１ウェル当たり０．６×１０５細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、製造業者の使用説明書に従ってＨｉｌｙｍａｘ（ドウジンドウモレキュラーテクノロジー社（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いてｉｍｍＲＮＡでトランスフェクトした（三重重複で）。６時間後、抗ヒトＩＦＮＡＲ阻止抗体（クローンＭＭＨＡＲ−２、ＰＢＬインターフェロンソース（ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ））またはＩｇＧアイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））を、１０ｕｇ／ｍＬの濃度で添加した。一晩のインキュベーション後、上清を回収し、Ｉ型インターフェロンのバイオアッセイを行った。Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞を、ＤＥＮＶ−２（ＴＳＶ０１）にＭＯＩ−１で感染させ、感染を定量化した。
【００９５】
ＤＥＮＶ−２感染およびフローサイトメトリー分析。
Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞を、１ウェル当たり０．６×１０５細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、製造業者の使用説明書に従ってＨｉｌｙｍａｘ（ドウジンドウモレキュラーテクノロジー社（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用してｉｍｍＲＮＡでトランスフェクトした（三重重複で）。Ａ５４９細胞を、１ウェル当たり１．０×１０４細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、製造業者の使用説明書に従って２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用してｉｍｍＲＮＡでトランスフェクトした。２４時間インキュベーションした後、トランスフェクトしたＵ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮおよびＡ５４９細胞を、ＤＥＮＶ−２（ＴＳＶ０１菌株）にそれぞれＭＯＩ−１およびＭＯＩ−５で感染させた。ＤＥＮＶ−２を含むＲＰＭＩで細胞を２時間インキュベートした。２回洗浄した後、感染細胞を、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩに再懸濁し、インキュベーターに２４時間入れた。ＦＡＣＳ分析のために、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に再懸濁することにより、洗浄した細胞を固定および透過処理した。デングＥタンパク質を、Ａｌｅｘａ  ６４７にコンジュゲートされた抗Ｅタンパク質抗体（４Ｇ２）（ＡＴＣＣ）、およびＡｌｅｘａ  ４８８にコンジュゲートされた抗ＮＳ１抗体で染色した。こうした細胞の蛍光を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩアナライザー（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で測定し、Ｆｌｏｗｊｏ（ツリースター社（ＴｒｅｅＳｔａｒ））で分析を行った。ＮＳ１およびＥタンパク質の両方が陽性染色された細胞を、感染とみなした。
【００９６】
ヒト皮膚ＤＣを単離し、以前記載のようにｉｍｍＲＮＡをトランスフェクトした。予防研究の場合、トランスフェクションの２４時間後、単離したヒト皮膚ＤＣを、ＤＥＮＶ−２（Ｄ２Ｙ９８Ｐ菌株）にＭＯＩ−５で感染させた。治療研究の場合、単離したヒト皮膚ＤＣを、ＤＥＮＶ−２（Ｄ２Ｙ９８Ｐ菌株）にＭＯＩ−５で感染させ、感染の４時間、６時間、および２４時間後に、ｉｍｍＲＮＡのトランスフェクションを行った。感染７２時間後に、フローサイトメトリーを使用して感染細胞を分析して、感染細胞のパーセンテージを決定した。感染４時間後に、１０００Ｕのヒト組換えＩＦＮ−ｂ（イムノツールズ社（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ））を細胞に添加した。フローサイトメトリーを、ＬＳＲＩＩ（ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）［ＢＤ］）で実施し、ＦｌｏｗＪｏ（ツリースター社（ＴｒｅｅＳｔａｒ））を使用してデータを分析した。以下の試薬をヒト皮膚ＤＣの染色に使用した：固定可能な生／死色素（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、抗ＣＤ１ａ（ＨＩ１４９）（バイオレジェンド社（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））、抗ＣＤ１１ｃ（Ｂ−ｌｙ６）、抗ＣＤ４５（ＨＩ３０）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）（全てＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から）、抗ＣＤ１４１（ＡＤ５−１４Ｈ１２）（ミルテニー社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ））、抗ＣＤ１４（ＲＭＯ５２）（ベックマンコールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））、およびＡｌｅｘａ６４７にコンジュゲートされた抗Ｅタンパク質（４Ｇ２）（ＡＴＣＣ）。
【００９７】
ＲＮＡｓｅｑ実験
単一細胞ＲＮＡｓｅｑ：皮膚細胞サブセットを、フローサイトメトリー分析に記載されているように特定し、９６ウェルＰＣＲプレートへと個々に選別（ｓｏｒｔ）し、直ちに凍結した。単一細胞を、以下のように改変されたＳＭＡＲＴｓｅｑ２プロトコール（ピセリら（Ｐｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ９：１７１−１８１））を使用して処理した。
【００９８】
１．  １ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ溶解緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）所在）
２．  １／５反応のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴキット（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在）による２００ｐｇ  ｃＤＮＡの使用
ｃＤＮＡライブラリーの長さ分布を、ＤＮＡ高感度試薬キットを使用してＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）所在）でモニターした。試料は全て、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００システム（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在）での２×１５１サイクルのインデックス付きペアエンドシーケンシング（ｉｎｄｅｘｅｄ  ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）実行に供した（３０９試料／レーン）。
【００９９】
ペアエンド生リードを、ＲＳＥＭバージョン１．３．０（３６）を使用してヒト参照ゲノムにアラインした。Ｇｅｎｃｏｄｅによるヒト参照ゲノムＧＲＣｈ３８バージョン２５リリースを使用した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏｄｅｇｅｎｅｓ．ｏｒｇ／ｈｕｍａｎ／ｒｅｌｅａｓｅ＿２５．ｈｔｍｌ）。１００万リード当たりの転写物（ＴＰＭ）値を、ＲＳＥＭバージョン１．３．０（リ＆デューイ（Ｌｉ＆Ｄｅｗｅｙ）（２０１１），ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １２：３２３）を使用して算出し、下流での分析のために対数変換（ｌｏｇ２（発現＋１））した。品質管理、高度バリアブル遺伝子の選択、主成分分析（ＰＣＡ）、および差次的遺伝子分析を、Ｓｅｕｒａｔ  Ｒパッケージバージョン２．０（バトラーら（Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１８），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３６：４１１−４２０）を使用して実施した。本発明者らのデータセットの低品質細胞を、検出された遺伝子数の閾値（１細胞当たり最低で２００個の固有遺伝子）に基づいてフィルタリングし、本発明者らの全ての単一細胞の少なくとも１．９％で検出されなかった遺伝子を全て破棄し、全てのさらなる分析のために１５９個の細胞および１５１７４個の遺伝子を残した。データをスケーリングした後、８１０個の高度バリアブル遺伝子に対して主成分分析（ＰＣＡ）を実施した。負の二峰性ワルド検定（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｉｍｏｄａｌ  Ｗａｌｄ  ｔｅｓｔ）を使用して差次的遺伝子発現を分析し、推定倍数変化の調整されたｐ値（ベンジャミニ−ホッホバーグ補正）が＜０．０５だった遺伝子を選択した。
【０１００】
バルクＲＮＡｓｅｑ：１サブセットおよび１ドナー当たり５００個の細胞を選別し、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ単離キットを使用してＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡライブラリーを、以下のように改変したピセリら（Ｐｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に従って調製した。
【０１０１】
１．  １ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ溶解緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）所在）
２．  ２０μＭ  ＴＳＯの添加
３．  １／５反応のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴキット（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在）による２００ｐｇ  ｃＤＮＡの使用
ｃＤＮＡライブラリーの長さ分布を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐ（パーキンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、米国マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）所在）でＤＮＡ高感度試薬キットを使用してモニターした。試料は全て、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００システム（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在）での２×１５１サイクルのインデックス付きペアエンドシーケンシング実行に供した（３０９試料／レーン）。
【０１０２】
長さ１５０ｂｐ（対では３００ｂｐ）のペアエンドリードを、Ｓａｌｍｏｎ（バージョン０．１１．３）（パトロら（Ｐａｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１７），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４：４１７−４１９）を使用して、Ｇｅｎｃｏｄｅバージョン２９（フランキッシュら（Ｆｒａｎｋｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１８），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：Ｄ７６６−Ｄ７７３）から得たヒトトランスクリプトーム配列にマッピングした。Ｓａｌｍｏｎから得られた転写物毎のリード計数を、ｔｘ２ｇｅｎｅ  Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用して遺伝子毎の計数に要約した（ソネソンら（Ｓｏｎｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５），Ｆ１０００Ｒｅｓ  ４：１５２１−１８）。比較されている条件に関連する試料の遺伝子毎に要約された計数を、ＤＥＳｅｑ２にロードした（ラブら（Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １５：３１−２１）。少なくとも１つの試料中で少なくとも１つの計数を有する遺伝子を、データセットに維持した。ＤＥＳｅｑ２を使用して、計数データを、負の二項性一般化線形モデルにフィッティングした。ライブラリーサイズ正規化のためのサイズ係数ならびに各遺伝子の平均および分散パラメーターを、ｅｓｔｉｍａｔｅＳｉｚｅＦａｃｔｏｒｓおよびｅｓｔｉｍａｔｅＤｉｓｐｅｒｓｉｏｎ機能を使用して推定した。差次的遺伝子発現を、負の二項ワルド検定（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｉｎｏｍｉａｌ  Ｗａｌｄ  ｔｅｓｔ）を使用して分析した。推定倍数変化のｐ値を、多重検定のためにベンジャミニ−ホッホバーグ法を使用して補正し、調整したｐ値＜０．０５に基づいて発現が異なる遺伝子を選択した。各細胞タイプにおいてＧ９刺激時に発現が異なると特定された遺伝子のリストを、それぞれの倍数変化およびｐ値と共に、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）（ＩＰＡ）ソフトウェアに供給した。各細胞タイプにおいて刺激により有意に調節される経路を決定するために、発現の差異に基づく経路濃縮分析をＩＰＡで実施した。
【０１０３】
実施例１：ＨＥＬ２ｉドメインは、ＲＩＧ−Ｉ活性化のためにＲＮＡ  ＰＡＭＰをサンプリングする
ＲＩＧ−Ｉタンパク質によるＲＮＡ検知の構造的基盤を推論するために、ヒトＲＩＧ−Ｉ  ＨＥＬ−ＣＴＤ  ｄｓＲＮＡ複合体構造の５つの入手可能な構造を比較した。インバリアントＨＥＬ１−ｄｓＲＮＡ−ＣＴＤドメインを重ね合わせることにより、ＨＥＬ２−ＨＥＬ２ｉドメインが、ｄｓＲＮＡ骨格に沿って相対的に移動することを見出した。ＨＥＬ２ｉは、ＲＮＡ  ＰＡＭＰとの結合時のＣＡＲＤドメイン解放に中心的な役割を果たす。これは、２つの反対の機能的表面：保存されているＲＮＡ認識残基（ヒトＲＩＧ−ＩではＫ５０８〜Ｑ５１１）を有する１つのＲＮＡサンプリング表面、およびＣＡＲＤ２ドメインと相互作用し、その解放を抑え込む１つの表面により媒介される（ルオ（Ｌｕｏ）（２０１４）ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ  １１：２５−３２；ゼンら（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．），上記）。５つの構造にわたって、ＨＥＬ２ｉは、およそ５塩基対をサンプリングする（上部鎖の５’末端三リン酸化ヌクレオチドから数えて塩基対５〜１０）。それに固執するわけではないが、この領域の任意の構造的摂動は、互いに対するＨＥＬ−ＣＴＤドメインの分子内移動に影響を及ぼし、ＣＡＲＤ解放の速度論、つまり活性化の閾値を変更することになるという仮説が成り立つ。この仮説を試験するために、ＲＮＡヌクレオチド挿入および点突然変異を、コールウエイら（Ｋｏｈｌｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１３年、上記）により記載されているように、開始ｉｍｍＲＮＡ−３ｐ１０Ｌ（１０塩基対のステム領域を有する５’三リン酸化ＲＮＡ；配列番号３７）に導入し、生化学アッセイおよび細胞ベースアッセイの両方を使用して評価した。
【０１０４】
実施例２：位置特異的グアノシン挿入はＲＩＧ−Ｉ活性化を変化させる
挿入されたヌクレオチドが、ＲＩＧ−Ｉを活性化する３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）の能力にどのような影響を及ぼすのかを評価するために、３ｐ１０ＬのｄｓＲＮＡステムに沿って１つのグアノシン挿入を有する６つのＲＮＡ種、すなわち３ｐ１０ＬＧ５（配列番号３０）、３ｐ１０ＬＧ７（配列番号２９）、３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）、３ｐ１０ＬＧ１７（配列番号２８）、３ｐ１０ＬＧ１９（配列番号３１）、および３ｐ１０ＬＧ２１（配列番号２７）を生成し、これらＲＮＡの相対的ＩＦＮ産生活性を、３ｐ１０Ｌの活性と比較した（図１Ａ）。これらＲＮＡ分子を、ＩＦＮ−β発現についてＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉレポーター細胞株を使用して試験して（対照としてＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ｎｕｌｌ細胞を用いた）、ステム領域におけるどの挿入がより高いＩＦＮ−β活性をもたらすことができるかを決定した。ヘアピンＲＮＡのステムの９位にグアノシンが挿入されたＲＮＡの１つ（３ｐ１０ＬＧ９；配列番号２６）は、親免疫調節性ＲＮＡ（ｉｍｍＲＮＡ）３ｐ１０Ｌと比較して少なくとも３倍高いＩＦＮ−β誘導を示す、ＲＩＧ−Ｉ活性化の強力な誘導因子だった（図１Ｂ）。７位または１７位にＧが挿入されたＲＮＡは、３ｐ１０Ｌと同等の活性を示した。飽和濃度のｉｍｍＲＮＡ（１μＭ）と共に２０ｎＭのｈｓＲＩＧ−Ｉタンパク質を使用して実施したＡＴＰａｓｅアッセイは、３ｐ１０Ｌおよび３ｐ１０ＬＧ９において、ＡＴＰのＫｃａｔが、それぞれ９．０１ｓ−１および１１．７ｓ−１であることを明らかにした（図１Ｃ）。したがって、５’ｐｐｐ末端から少なくとも６塩基対遠ざかるＧ挿入を有するｉｍｍＲＮＡは、アゴニストのままであり、Ｇ９位における挿入は、ＲＩＧ−Ｉの最も強力な活性化因子である。
【０１０５】
上記に記載のそうした活性化ｉｍｍＲＮＡとは対照的に、ｉｍｍＲＮＡ  ３ｐ１０ＬＧ５（配列番号３０）は、酵素活性アッセイでも細胞活性アッセイでも活性を示さず（図１Ｂおよび１Ｃ）、３ｐ１０ＬＧ５はＲＩＧ−Ｉを不活化することができることが示唆された。これをさらに証明するために、細胞ベース競合阻害アッセイを使用した。３ｐ１０ＬＧ５の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）は３４ｎＭだったことが決定された。これは、漸増濃度の３ｐ１０ＬＧ５と共に１０ｎＭ  ３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）をトランスフェクトすることにより測定した（図１Ｄ）。結果は、３ｐ１０ＬＧ５が、ＲＩＧ−Ｉのアンタゴニストとして作用することを示した。Ｇ挿入を有するｉｍｍＲＮＡが全てＲＩＧ−Ｉと結合することを保証するため、ｈｓＲＣ２の精製タンパク質およびｉｍｍＲＮＡを使用して分析的ゲル濾過実験を実施した。ｉｍｍＲＮＡは全て、生理学的濃度の電解質を有する緩衝液中で安定したＲＩＧ−Ｉ：ＲＮＡ複合体を形成することができることが見出された（データ非表示）。まとめると、３ｐ１０Ｌの様々な位置にＧ挿入を導入することにより、３ｐ１０ＬＧ９が、試験したものの中で最も強力なＲＩＧ−Ｉアゴニストとして、および３ｐ１０ＬＧ５がＲＩＧ−Ｉアンタゴニストとして特定された。
【０１０６】
実施例３：ｉｍｍＲＮＡの９位におけるプリン塩基挿入は効力を増加させる
３ｐ１０Ｌの９位における様々な塩基の挿入がＲＩＧ−Ｉ活性化を変化させるか否かを評価するために、３ｐ１０ＬＧ９を、アデノシン、ウリジン、またはシトシンに置き換えた（図２Ａ）。ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉ細胞を刺激した２４時間後、３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）およびＡ９（配列番号２５）は、３ｐ１０Ｌで観察された活性の約２倍である同様のＩＦＮ−β活性化活性を有する。それに比べて、ピリミジン挿入を有するｉｍｍＲＮＡ（３ｐ１０ＬＣ９（配列番号４３）およびＵ９（配列番号４２））は、３ｐ１０Ｌと比較して同様のレベルの活性を示した（図２Ｂ）。プリン挿入を有するＩｍｍＲＮＡ（３ｐ１０ＬＧ９およびＡ９）は、ＡＴＰａｓｅアッセイにおいてピリミジン挿入を有するものよりも優れており、より高いｋｃａｔ値（１１．７および１２．６対８．３および７．３ｓ−１）およびより高い触媒効率（２５．３および２９．３対１８．９および１９．３ｍＭ−１ｓ−１）が観察された（図２Ｃ）。こうした結果は、９位におけるプリン塩基の挿入は、ＲＩＧ−Ｉ酵素活性およびＩＦＮ誘導活性を増加させることにより３ｐ１０Ｌを強化することを明らかにした。
【０１０７】
実施例４：ＨＤＸ−ＭＳは、３ｐ１０Ｌと比較して、３ｐ１０ＬＧ９とＲＩＧ−Ｉと結合に対してより強力なアロステリック効果があることを明らかにした
ＨＤＸ−ＭＳは、リガンド結合に際するタンパク質動力学を研究するための高感度でロバストな方法である（ゼンら（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１７），Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ８：９２３；ゼンら（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５）、上記）。ＨＥＬ２ｉとＣＡＲＤとの分子内相互作用、およびＲＩＧ−ＩによるＲＮＡ認識中のＣＡＲＤのアロステリックな解放が明らかにされた。手短に言えば、タンパク質ＲＮＡ複合体を重水と接触させ、変性させてペプチドにし、ゼンら（Ｚｈｅｎｇら）（２０１５年、上記）により記載のようにＬＣ−ＭＳに供した。以前記載のように、ＨＤＸ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを使用し、残基平均手法を使用して、ＨＤＸデータを統合し、構造モデルにマッピングした（ケッペル＆ワイス（Ｋｅｐｐｅｌ＆Ｗｅｉｓ）８２０１５），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２６：５４７−５５４；パスカルら（Ｐａｓｃａｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２３：１５１２−１５２１；ゼンら（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１５）、上記）。
【０１０８】
３ｐ１０Ｌよりも増加した３ｐ１０ＬＧ９の酵素活性および細胞活性の物理学的説明を提供するため、水素／重水素交換と組み合わせた質量分析法（ＨＤＸ−ＭＳ）を使用して、３ｐ１０ＬＧ９および３ｐ１０Ｌとの結合に際するＲＩＧ−Ｉの構造動力学を分析した。ＨＤＸプロファイルは、ＣＡＲＤドメインおよび特にＣＡＲＤ２ラッチペプチド（Ｙ１０３〜１１４）が、ｈｓＲＩＧ−Ｉとの３ｐ１０ＬＧ９では、３ｐ１０Ｌと比較してより高い重水素組込みを呈したことを明らかにした。３ｐ１０Ｌと３ｐ１０ＬＧ９との重要な差異は、３ｐ１０ＬＧ９が、ＨＥＬ１ドメイン、特に、ＲＮＡと相互作用することが知られているモチーフＩａ（Ｆ２９６〜３１０）およびＩｃ（Ｉ３４３〜３６６）においてｈｓＲＩＧ−Ｉとより緊密に結合することを含む。別の観察は、３ｐ１０ＬＧ９に対するＣＴＤキャッピングループ（Ｆ８４２〜８５６）およびＣＴＤ結合領域（Ｖ８９３〜９０４）の結合が、３ｐ１０Ｌと比較してより緊密であることだった（データ非表示）。ＨＤＸ−ＭＳは、３ｐ１０Ｌよりも緊密にＨＥＬ−ＣＴＤと結合した３ｐ１０ＬＧ９は、ＣＡＲＤ２−ＨＥＬ２ｉ分子内阻害インターフェースをさらに不安定化させ、より露出したＣＡＲＤおよびより大きなＲＩＧ−Ｉ刺激に結び付くことを明らかにした（データ非表示）。ＲＩＧ−Ｉ  ３ｐ１０ＬＧ９複合体をモデル化すると、挿入されたＧ９塩基は、ＨＥＬ２ｉの後部近傍に位置すると考えられ、Ｇ９挿入がＨＥＬ２ｉ移動を制限し、ＣＡＲＤをＨＥＬ−ＣＴＤ：３ｐ１０ＬＧ９複合体から解放する追加の反発力を提供したという結論に結び付いた。
【０１０９】
実施例５：３ｐ１０ＬＡ９は、３ｐ１０ＬＧ９と比較して、時間依存性および細胞タイプ依存性の活性増強を呈した
リードｉｍｍＲＮＡの細胞活性をさらに調査するために、細胞ベースの速度論的実験を、３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）に対する２つの最良のｉｍｍＲＮＡ  ３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）およびＡ９（配列番号２５）の濃度依存性応答および刺激後時間の時間応答を見ることにより実施した。ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉ細胞では、３ｐ１０ＬＧ９およびＡ９は、トランスフェクション２４時間後、３ｐ１０Ｌよりも高い同様の活性を示した（図３Ａ）。時間依存性実験では、３つのｉｍｍＲＮＡの刺激活性が、２４時間後に明らかに検出され、トランスフェクション４８時間後および７２時間後に継続して増加した。顕著には、３ｐ１０Ａ９は、２４時間後、３ｐ１０ＬＧ９よりも強力になり、より多くのルシフェラーゼシグナルを刺激した（図３Ｂ）。その後、第２のタイプの細胞、ＩＲＦ−Ｌｕｃレポーターを有する単球細胞であるＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）を使用した。ＥＣ５０値を正確に決定することはできなかったが、３ｐ１０ＬＡ９が最も強力なｉｍｍＲＮＡであり、３ｐ１０ＬＧ９が２番目であり、３ｐ１０Ｌが最弱であると考えられた（図３Ｃ）。ＴＨＰ−１レポーター細胞では、３ｐ１０ＬＡ９と３ｐ１０ＬＧ９との差異は、濃度依存性および時間依存性の両様式でもより明白になった（図３Ｃおよび３Ｄ）。
【０１１０】
実施例６：様々なｉｍｍＲＮＡ分子の生化学的特徴付け
様々なｉｍｍＲＮＡがＲＩＧ−Ｉを活性化する能力を試験するために、精製組換え全長ＲＩＧ−Ｉを、様々な濃度のＡＴＰとの反応を開始させる前に、飽和量のｉｍｍＲＮＡとのＮＡＤＨ結合ＡＴＰａｓｅアッセイに供した。手短に言えば、アッセイは、１ｍＭ  ＮＡＤＨ、１００Ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ、５００Ｕ／ｍｌピルビン酸キナーゼ、２．５ｍＭホスホエノールピルビン酸を含む５×アッセイミックスの存在下の、２５ｍＭ  ＭＯＰ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む緩衝液中で実施した。こうした実験は、一部のｉｍｍＲＮＡは、ＲＩＧ−Ｉ、例えばＯＨＹｒ０５（配列番号２６）およびＯＨＹｒ２３（３ｐ１０Ｌ；配列番号３７）を活性化するが、ＯＨＹｒ２２（配列番号４５）およびＯＨＹｒ１２（配列番号３３）などの他のＲＮＡ分子は、ＲＩＧ−Ｉを活性化することができなかったことを実証した（図４）。使用した全てのＲＮＡの配列情報は、上記のテーブル１に示されている。
【０１１１】
テーブル２は、様々なｉｍｍＲＮＡに対するｍｍＲＩＧ−Ｉ結合のＡＴＰａｓｅ活性のＫｃａｔ、Ｋｍ、およびＫｃａｔ／Ｋｍ値を示す。
【０１１２】
【表３】
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実施例７：ヒト細胞における様々なｉｍｍＲＮＡのインターフェロン誘導能力
ｉｍｍＲＮＡの生物学的機能を、異なるアッセイで試験した。まず、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ−２９３Ｔ）レポーター細胞を、トランスフェクション試薬として２９３ｆｅｃｔｉｎを使用して直接トランスフェクトした。ルシフェラーゼレポーターは、ＭＸ１、ＩＦＮ受容体に結合するインターフェロン（ＩＦＮ）βの下流にあるＩＦＮ刺激遺伝子により駆動される。以前発表された構築物ＯＨＹｒ２３／３ｐ１０Ｌ（配列番号３７）を、比較のために使用した。２つの構築物ＯＨＹｒ０５およびＯＨＹｒ０６（配列番号２６および２５；テーブル１を参照）は、ＩＦＮ産生誘導にＯＨＹｒ２３よりもほとんど１０倍のより高い効力を有することを見出した（図５）。また、インターフェロン誘導能力をＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）細胞で試験した。ＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）細胞は、ＩＳＧ５４により駆動されるルシフェラーゼレポーターが安定ライゲーションされたヒトＴＨＰ−１単球細胞株に由来する。ＯＨＹｒ０５のＥＣ５０値は、ＯＨＹｒ２３と比較してより低かった。これは、ＯＨＹｒ０５が、３．４７ｎＭというより低い濃度で最大半量インターフェロン応答を誘発することができることを示す（図６）。また、ＩｍｍＲＮＡを試験するための細胞ベースアッセイを、ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉ細胞（これらは、高レベルのヒトＲｉｇ−Ｉを発現するＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ｎｕｌｌ細胞である）およびＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ｎｕｌｌ細胞を使用して実施した（図７）。細胞を、１００ｎＭ  ｉｍｍＲＮＡでトランスフェクトし、アッセイには２つの市販ＲＮＡポリＩ：Ｃおよび３ｐ−ｈｐＲＮＡ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））が比較のために含まれていた。３ｐ−ｈｐＲＮＡは、８７ヌクレオチド長さの長さを有するＡ型インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）に由来するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ配列である。３ｐ−ｈｐＲＮＡは、ＲＩＧ−Ｉ特異的アゴニストである（図８ａおよび８ｂ）。
【０１１３】
ＯＨＹｒ１６、ポリＩ：Ｃ、および３ｐ−ｈｐＲＮＡの安定性を試験するために、こうしたＲＮＡ分子を、ＨＥＫ−Ｌｕｃｉａ（商標）ＲＩＧ−Ｉ細胞およびＴＨＰ１−Ｄｕａｌ（商標）細胞でのトランスフェクション前に、室温で２４、４８、７２、および９６時間にわたって無血清培地でインキュベートした。試験したＲＮＡは、無血清培地中で最大９６時間安定していた（図９ａおよび９ｂ）。
【０１１４】
実施例８：ＯＨＹｒ２３の生物学的活性を向上させる配列修飾
ＯＨＹｒ２３（配列番号３７）に幾つかの配列修飾を施し、ＭＸ１Ｐルシフェラーゼレポーターを読出しとして使用して、生物学的活性に対するそれらの影響を試験した。
【０１１５】
ｉｍｍＲＮＡキンク（ヌクレオチド挿入）の位置およびヌクレオチドの変化
ＯＨＹｒ２３（配列番号３７）にはキンクがない。しかしながら、ＯＨＹｒ２３よりもＩＦＮ誘導がより強力であるＯＨＹｒ０５（配列番号２６）には、ステムの一方の側にグアニンを付加することによりキンクが創出されている。キンクの位置がｉｍｍＲＮＡ機能に影響を及ぼすか否かを試験した。ヌクレオチド５位（ＯＨＹｒ１０；配列番号３０）、１９位（ＯＨＹｒ１１；配列番号３１）、および２１位（ＯＨＹｒ０１；配列番号２７）を含むステム末端に近いキンクが、ＩＦＮ産生を減少させたことを見出した（図１０Ａ）。したがって、生物学的機能を増加させるには、ステムから９位またはそれよりも上のヌクレオチドでのキンクが好ましい。さらに、ヘアピンの５’側のキンクが、ステムから同じ距離にあるヘアピンの３’側のキンクよりも性能が良好である（ＯＨＹｒ０２をＯＨＹｒ０５と比較する）（図１０Ｂ）。
【０１１６】
次に、ｉｍｍＲＮＡの生物学的活性が、キンク位置にあるヌクレオチドの性質により影響を受けたか否かを評価した。９位キンクのプリン（ＯＨＹｒ０５ではグアニンおよびＯＨＹｒ１６ではアデニン）は、９位キンクのピリミジン（ＯＨＹｒ１７ではウラシルおよびＯＨＹｒ１８ではシトシン）よりも良好に作動する（図１０Ｃ）。
【０１１７】
自然免疫活性化に対するｉｍｍＲＮＡステムの長さの影響
ｉｍｍＲＮＡステム長が、ＲＮＡ結合性分子との結合およびその後の下流シグナルにどのように影響を及ぼすかを見出すために、本発明者らは、種々の長さのｉｍｍＲＮＡを比較した。図１１Ａに示されているように、１０ヌクレオチド長のＯＨＹｒ０５が、最も高い活性を有する。ＯＨＹｒ２３（１０ヌクレオチド長、図１１）、ＯＨＹｒ０６（２０ヌクレオチド長、図１０Ａ）、およびＯＨＹｒ０８（３０ヌクレオチド長、図１１）にも高い活性が見出された。対照的に、より短い構築物ＯＨＹｒ１２（６ヌクレオチド長）およびＯＨＹｒ２０（９ヌクレオチド長）、ならびにより長い構築物ＯＨＹｒ０３（１１ヌクレオチド長）、ＯＨＹｒ０７（１２ヌクレオチド）、およびＯＨＹｒ１３（１４ヌクレオチド長）は、生物学的活性が低いかまたは生物学的活性を示さなかった（図１１）。
【０１１８】
こうしたデータは、１０ヌクレオチドの単位のステム長が、生物学的に最も活性な種であり、１０ヌクレオチド単位ルール外のより短いステムまたはより長いステムは活性がより低いことを示す。
【０１１９】
実施例９：ヒト細胞におけるｉｍｍＲＮＡの抗ウイルス効果
ＩＦＮの誘導は、細胞の幾つかの抗ウイルス防御戦略の１つである。ｉｍｍＲＮＡ誘導性抗ウイルスエフェクター機序が、その後の感染を阻止することができるか否かを試験するため、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞（安定的にＤＣ−ＳＩＧＮを発現する単球細胞）およびヒト肺線維芽細胞細胞株Ａ５９４を、３ｐ１０ＬＧ９／ＯＨＹｒ０５（配列番号２６）または３ｐ１０Ｌ／ＯＨＹｒ２３（配列番号３７）でトランスフェクトし（図１２Ａ）、続いてＤＥＮＶに感染させた（図１２Ｂ）。陰性対照として、５’三リン酸化されていない３ｐ１０ＬＧ９構築物を使用した（Ｇ９ｎｅｇ）。Ｅ−タンパク質特異的蛍光標識抗体およびＮＳ１タンパク質特異的蛍光標識抗体を使用してフローサイトメトリーにより細胞内の感染を検出することにより感染細胞のパーセンテージを定量化した。両ヒト細胞株において、３ｐ１０ＬＧ９は、３ｐ１０Ｌよりも効率的に、用量依存的な様式でＩＦＮ応答を活性化した。
【０１２０】
ｉｍｍＲＮＡが、ＤＥＮＶ感染を阻害することができるかどうかを決定するため、本発明者らは、Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞およびＡ５４９細胞を３ｐ１０Ｌおよび３ｐ１０ＬＧ９でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、細胞をＤＥＮＶ−２に感染させた。Ｅ−タンパク質特異的蛍光標識抗体およびＮＳ１タンパク質特異的蛍光標識抗体を使用してフローサイトメトリーにより細胞内のウイルスタンパク質を検出することにより感染細胞のパーセンテージを定量化した。Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞およびＡ５４９細胞の両方において、３ｐ１０ＬＧ９および３ｐ１０Ｌは、用量依存的な様式でＤＥＮＶ感染を低減し、３ｐ１０ＬＧ９は、３ｐ１０Ｌよりも強力だった（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。興味深いことには、６２ｎＭよりも多くのいずれかのｉｍｍＲＮＡによるＵ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞のトランスフェクションは、Ｉ型インターフェロン産生の効力低減および抗ウイルス効果の消失をもたらした。全体として、こうした結果は、３ｐ１０ＬＧ９が、ＩＦＮシグナル伝達、ならびにＵ９３７−ＤＣおよびＡ５４９ヒト細胞株でのＤＥＮＶ２感染に対する抗ウイルス応答の誘導に、３ｐ１０Ｌと比較してより大きな効力を有することを示す。
【０１２１】
実施例１０：ｅｘ  ｖｉｖｏヒト抗原提示細胞での自然免疫活性化（アジュバント効果）
樹状細胞およびマクロファージを含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、適応免疫応答および免疫記憶を生成するための必須メディエーターである。感染またはワクチン接種後、ＡＰＣは、表面のまたはＡＰＣ内部の病原体認識受容体（ＰＲＲ）に結合する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）により活性化される。ＲＮＡ結合性分子ＲＩＧ−ＩおよびＭＤＡ５は、ＡＰＣを活性化するために特異的に標的とすることができるＰＲＲの例である。ｉｍｍＲＮＡがＲＩＧ−Ｉを介して一次ヒト細胞を活性化する可能性を試験するために、ヒト皮膚をモデル器官として使用した。皮膚（乳房切除手術から）は、ヒト研究のために入手できる少数の器官の１つであり、一般にヒト組織でのＡＰＣ集団に代表的な数多くの樹状細胞サブセットおよびマクロファージを含むため非常に価値がある。
【０１２２】
健康な皮膚試料を処理して、ｉｍｍＲＮＡによるトランスフェクションおよび下流分析に使用することができる単離細胞懸濁物を調製した。皮膚細胞の調製およびＤＥＮＶによる感染の方法は、以前記載されている（サーニーら（Ｃｅｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）（２０１４），ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．２０１４；１０（１２）：ｅ１００４５４８）。ＣＤ１４＋皮膚樹状細胞（ＤＤＣ）、ＣＤ１１ｃ＋  ＤＤＣ、ＣＤ１４１＋  ＤＤＣ、およびランゲルハンス細胞（ＬＣ）を、染色およびゲーティング戦略により区別した。
【０１２３】
皮膚におけるＤＣの効率的なＤＥＮＶ感染は、ＤＥＮＶの全身蔓延にそれらが重要な役割を果たすことを示唆する。感染ＤＣは、感染部位からリンパ節などの二次リンパ器官までウイルスを運搬する可能性がある。ｉｍｍＲＮＡが一次ヒト皮膚細胞の感染を阻止することができるか否かを試験するため、健康な皮膚試料を処理して、ｉｍｍＲＮＡによるトランスフェクションおよびその後のフローサイトメトリー分析のための単離細胞懸濁物を調製した（サーニーら（Ｃｅｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）、上記）。まず、どの細胞が最も効率的にｉｍｍＲＮＡでトランスフェクトされたかを、フローサイトメトリーにより追跡することができる蛍光標識型の３ｐ１０ＬＧ９（３ｐ１０ＬＧ９−ＲＥＤ）を使用して試験した。全ての細胞タイプがトランスフェクト可能であり、取込みは、ＣＤ１４１＋  ＤＤＣが最も効率的であり、その次がＣＤ１１ｃ＋  ＤＤＣおよびランゲルハンス細胞であり、ＣＤ１４＋  ＤＤＣが最も低効率の取込みを示した。トランスフェクション試薬を用いずにｉｍｍＲＮＡ−ＲＥＤを細胞に添加した場合、取込みは最小限であった。これは、ファゴサイトーシスによるｉｍｍＲＮＡ取込みが最小限だったことを実証した（図２０）。
【０１２４】
まず、どの細胞が最も効率的にトランスフェクトされるかを、フローサイトメトリーにより追跡することができる蛍光標識型のＯＨＹｒ０５（ＯＨＹｒ５−ＲＥＤ）を使用して試験した。全ての細胞タイプがトランスフェクトされたが、取込みは、ＭＰ、ＣＤ１４＋  ＤＤＣ、およびＣＤ１１ｃ＋  ＤＤＣが最も効率的だった（データ非表示）。トランスフェクション試薬を用いずにｉｍｍＲＮＡ−ＲＥＤを細胞に添加する場合、取込みは最小限であった。これは、ファゴサイトーシスによるｉｍｍＲＮＡ取込みが最小限であることを実証する。
【０１２５】
実施例１１：ｅｘ  ｖｉｖｏヒトＡＰＣでのｉｍｍＲＮＡの予防的および治療的抗ウイルス効果
ｉｍｍＲＮＡで処置したヒト皮膚ＡＰＣがＤＥＮＶ感染から保護されたか否かを試験した。そのため、皮膚単離細胞懸濁物を、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、および６２ｎＭのＯＨＹｒ０５（配列番号２６）、ＯＨＹｒ２３（配列番号３７）、およびＯＨＹｒＮＥＧ（５’リン酸化されていない配列番号２６）で処置し、続いて２４時間後に、上清をＩＳＲＥルシフェラーゼアッセイのために収集し、細胞をＭＯＩ  ５でＤＥＮＶに感染させた。感染４８時間後、細胞を、フローサイトメトリーに基づく感染定量化のために染色した（サーニーら（Ｃｅｒｎｙ  ｅｔ  ａｌ．）、上記）。３ｐ１０ＬＧ９によるヒト皮膚ＡＰＣの予防的処置は、ＩＳＲＥルシフェラーゼアッセイに基づくと、３ｐ１０Ｌで処置されたものと比較してより効率的にＩ型ＩＦＮを誘導した（図１３Ａ）。また、ｉｍｍＲＮＡによるヒト皮膚ＡＰＣの予防的処置は、用量依存的な様式で細胞をＤＥＮＶ感染から保護した。ＥＣ５０値は、３ｐ１０ＬＧ９が、ＣＤ１１ｃ＋  ＤＤＣ（３ｐ１０ＬＧ９：１３．６ｎＭ、３ｐ１０Ｌ：８１．０ｎＭ）、ＬＣ（３ｐ１０ＬＧ９：１５．５ｎＭ、３ｐ１０Ｌ：１２３．３ｎＭ）、およびＣＤ１４＋  ＤＤＣ（３ｐ１０ＬＧ９：１５．５ｎＭ、３ｐ１０Ｌ：１２１．６ｎＭ）では、３ｐ１０Ｌと比較して抗ウイルス応答の誘導がより強力だったことを示した（図１３Ｂ）。試験した最も低い濃度（６２ｎＭ）では、３ｐ１０ＬＧ９は、感染したＣＤ１１ｃ＋  ＤＤＣ（ｐ≦０．０１）およびＣＤ１４＋  ＤＤＣ（ｐ≦０．０５）の数の低減において、３ｐ１０Ｌよりも有意に、より効果的だった（図１３Ｃ〜１３Ｅ）。
【０１２６】
ｉｍｍＲＮＡが、ＤＥＮＶ感染皮膚ＡＰＣの治療剤として作用することができるかどうかを決定するために、皮膚単離細胞懸濁物を、ＭＯＩ  ５でＤＥＮＶに感染させ、感染の４、６、および２４時間後に６２ｎＭの３ｐ１０ＬＧ９で処置した。感染４８時間後、細胞を、フローサイトメトリーに基づく感染定量化のために染色した。感染効力は、個々の皮膚試料間で最大４０％のばらつきがあったため、感染を、感染後４時間の時点に由来するＧ９ｎｅｇに対して正規化した。３ｐ１０ＬＧ９の阻害効果は全体的には中程度だった。３ｐ１０ＬＧ９で処置した後の感染細胞の有意な減少は、ランゲルハンス細胞でのみ、ならびに感染後４時間および６時間の初期時点でのみ見られた（図１４Ｂ）。ＣＤ１１ｃ＋  ＤＤＣ（図１４Ａ）およびＣＤ１４＋  ＤＤＣ（図１４Ｃ）では、わずかな治療効果が初期時点で見られた。感染２４時間後に処置した場合、４８時間後の感染３ｐ１０ＬＧ９処置ＣＤ１１ｃ＋  ＤＤＣ細胞のパーセンテージは、Ｇ９ｎｅｇ処置細胞と比較してより高くなる傾向があった。いかなる理論にも束縛されることは望まないが、ウイルスが、この細胞サブセットでは抗ウイルス応答をより効率的に阻害し、ＲＩＧ−Ｉリガンドの活性を覆したと考えることが可能である。全体として、こうしたデータは、３ｐ１０ＬＧ９が、一次ヒト皮膚ＡＰＣにおけるＤＥＮＶ−２感染に対して中程度の治療的抗ウイルス効果を有していたことを示唆する。
【０１２７】
実施例１２：ｉｍｍＲＮＡのアジュバント活性
自然免疫細胞刺激因子としてのＲＩＧ−Ｉアゴニストは、ワクチンのアジュバントとして使用することができる。ワクチンアジュバントとしてのｉｍｍＲＮＡの能力をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するため、マウスを、３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）と混合した市販のＤＥＮＶ−２ウイルス様粒子（ＶＬＰ）で、トランスフェクション試薬ＪｅｔＰＥＩとの混合物を注射することにより免疫した。陰性対照として、３ｐ１０Ｌｎｅｇ（５’末端に三リン酸基を有していない３ｐ１０ＬＧ９）と混合したＶＬＰ、およびアジュバントを有していないＶＬＰを使用した。陽性対照として、ＶＬＰをｐｏｌｙＩＣと混合した。３ｐ１０ＬＧ９を、ＶＬＰと組み合わせてアジュバントとして使用した場合、Ｇ９ｎｅｇとの製剤と比較して、ＶＬＰに対する抗体応答を増加させた（図１５）。３ｐ１０ＬＧ９アジュバントＶＬＰで免疫したマウスは、デングウイルス菌株Ｄ２Ｙ９８Ｐで負荷した後、Ｇ９ｎｅｇ処置群および非アジュバントＶＬＰ処置群と比較して、ウイルス量の低減を示した。また、３ｐ１０ＬＧ９アジュバントＶＬＰで免疫したマウスは、負荷後の非アジュバントＶＬＰ処置群と比較して、生存優位性を示した（図１５）。
【０１２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのアジュバント活性に加えて、ヒト細胞におけるｉｍｍＲＮＡのアジュバント能力も研究した。この実験では、ヒト一次皮膚抗原提示細胞を、ｉｍｍＲＮＡで処置して、免疫共刺激分子ＣＤ８０を上方制御した（図１６）。
【０１２９】
ｉｍｍＲＮＡ処置の活性化プロファイルを、トランスフェクション３５時間後に、単離およびバルク選別皮膚ＡＰＣサブセットのｍＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）により評価した。１人のドナーに由来する合計１５９個の単離ＡＰＣ（ＣＤ１１ｃ＋  ＤＤＣ、ＣＤ１４１＋  ＤＤＣ、ＣＤ１４＋細胞、およびＬＣの組合せ）中で発現が異なる遺伝子（ＤＥＧ）の主成分分析は、３Ｇ１０ＬＧ９処置細胞およびＧ９ｎｅｇ処置細胞を明白に分離した。３Ｇ１０ＬＧ９処置細胞中の上位６つの下方制御遺伝子には、ケモカインＣＸＣＬ５およびサイトカインＩＬ−１Ｂおよびリボソームタンパク質が含まれていた（データ非表示）。上位６つの上方制御遺伝子は、５つのインターフェロン誘導性遺伝子（ＩＳＧ１５、ＩＳＧ２０、ＩＦＩ６、ＩＦＩＴ３、およびＩＦＩＴＭ３）および免疫細胞ホーミングケモカイン受容体ＣＣＲ７を含んでいた（図１７）。１人よりも多くのドナーでのｉｍｍＲＮＡ活性化後のトランスクリプトーム変化をさらに評価するため、５人のドナーに由来するバルク選別皮膚ＡＰＣサブセットを配列決定した。単離細胞分析と同様に、ＣＤ１４＋細胞は、他のＡＰＣサブセットとは転写が異なっていた（データ非表示）。それにもかかわらず、細胞タイプ間にはＤＥＧの大きな重複が存在し、ｉｍｍＲＮＡ媒介性活性化の少なくとも一部は、皮膚ＡＰＣサブセット全てに共通していたことを示した。同時に、単離細胞分析で特定された上位１２個のＤＥＧの幾つかが、バルク細胞分析で確認された（データ非表示）。宿主細胞での抗ウイルス応答に関連する規定されたセットの遺伝子に基づき選択されたＤＥＧのヒートマップは、種々の遺伝子が、３ｐ１０ＬＧ９処置細胞およびｐＩＣ処置細胞の両方で上方制御されたことを示した。しかしながら、３ｐ１０ＬＧ９は、ｐＩＣと比較して、抗ウイルス宿主応答遺伝子の一般により強力な活性化因子であると考えられた。これは、ｉｍｍＲＮＡおよびｐＩＣのリガンドであるＲＩＧ−ＩおよびＴＬＲ３の細胞タイプ特異的発現レベルに関係する可能性がある。１細胞タイプ毎のＤＥＧのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓは、個々のＡＰＣサブセットには上位３つの経路が共通していたことを明らかにした。しかしながら、他の経路は、ＣＤ１４１＋細胞でより著しかった「抗ウイルス自然免疫におけるＲＩＧ−Ｉ様受容体の役割」など、より細胞タイプ特異的だった。次いで、この細胞タイプは、抗原提示経路には関連していなかった。
【０１３０】
こうしたデータは、ｉｍｍＲＮＡが、一次ヒトＡＰＣにおいて抗ウイルス転写プログラムを効率的に活性化することを強調した。これは、ＡＰＣが、自然感染中の抗ウイルス応答に重要な役割を果たすことが知られているため重要である。
【０１３１】
実施例１３：ＩｍｍＲＮＡ媒介性ウイルス阻害は、ＲＩＧ−Ｉ依存性およびＩ型ＩＦＮ依存性である
短鎖ヘアピンｉｍｍＲＮＡ分子が、ＲＩＧ−Ｉに結合してＭＤＡ５には結合しないか否かを実験的に試験した。そのために、ｉｍｍＲＮＡ構築物を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＲＩＧ−Ｉを過剰発現するプラスミドまたはＭＤＡ５を過剰発現するプラスミドのいずれかと共に共トランスフェクトした。ＩＦＮシグナル伝達の３ｐ１０ＬＧ９活性化が、ＲＩＧ−Ｉ過剰発現により著しく増強され、この増強は、ＭＤＡ５過剰発現と比較してより大きかったことが見出された（図１８Ａ）。次に、ヒトＲＩＧ−Ｉのエクソン１を標的とするように設計されたｇＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９媒介性遺伝子ノックダウンを使用したＲＩＧ−Ｉノックアウト（ＲＩＧ−Ｉ  ＫＯ）Ｕ９３７−ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を生成し、そうした細胞をｉｍｍＲＮＡおよびＧ９ｎｅｇでトランスフェクトした。ＲＩＧ−Ｉ  ＫＯ  Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞でのインターフェロン刺激性遺伝子（ＩＳＧ）発現は、３ｐ１０ＬＧ９または３ｐ１０Ｌによるトランスフェクション後、有意に阻害された（図１８Ｂ）。この阻害は、Ｇ９ｎｅｇ（対照）処置ＲＩＧ−Ｉ  ＫＯ細胞でのＩＦＮＢ転写物レベルがＷＴ細胞と比較してわずかに増加したにも関わらず（１．３倍増）、観察された。ＲＴ−ｑＰＣＲで使用したプライマーは、ｇＲＮＡによる妨害の標的領域だったエクソン１から遠く離れた領域に対して設計されていたため、ＤＤＸ５８転写物レベルは、タンパク質の非存在にも関わらず依然として検出可能だった。ＲＩＧ−Ｉ  ＫＯ  Ｇ９ｎｅｇ対照処置細胞でのＤＤＸ５８転写物レベルは、ＷＴ細胞と比較して有意により高かった（２．４倍）。しかしながら、ＲＩＧ−Ｉ  ＫＯ細胞におけるＩＳＧのベースラインレベルのこの増加は、ＩＳＲＥルシフェラーゼアッセイで検出されたルシフェラーゼシグナルに増加がなかったため、Ｉ型インターフェロン活性化に対して有意な効果を示さなかった（図１９Ａ）。こうした結果は、３ｐ１０ＬＧ９が、親構築物３ｐ１０Ｌと比較して、ＩＦＮ刺激遺伝子のより強力な誘導因子であり、ＩＦＮおよびＩＳＧの上方制御は、ＲＩＧ−Ｉ依存性だったことを示した。抗ウイルス効果が、ＲＩＧ−Ｉ依存性だったか否かを決定するため、ＷＴおよびＲＩＧ−Ｉ  ＫＯ  Ｕ９３７−ＤＣを、ｉｍｍＲＮＡまたはポリＩ：Ｃ（低分子量または高分子量）のいずれかで予防的に処置し、２４時間後に細胞をＤＥＮＶ−２に感染させた。Ｉ型インターフェロン活性は、ＷＴでのみ観察され、ＲＩＧ−ＩノックアウトＵ９３７−ＤＣ細胞では観察されなかった（図１９Ａ）。ＲＩＧ−Ｉ  ＫＯ  Ｕ９３７−ＤＣ細胞は、ＷＴ  Ｕ９３７−ＤＣ細胞と比較して、有意により高いパーセンテージのＤＥＮＶ−２感染を示した。ｉｍｍＲＮＡまたはポリＩ：Ｃで事前に処置した場合、ＤＥＮＶ複製は、ＷＴでは有意に阻害されたが、ＲＩＧ−Ｉ  ＫＯ  Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞では有意には阻害されなかった（図１９Ｂおよび１９Ｃ）。これは、観察された抗ウイルス効果がＲＩＧ−Ｉ依存性だったことを示唆した。
【０１３２】
３ｐ１０ＬＧ９で観察された抗ウイルス効果が、Ｉ型インターフェロン依存性だったかどうかを決定するため、Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞を、３ｐ１０ＬＧ９でトランスフェクトし、インターフェロンアルファ受容体（ＩＦＮＡＲ）阻止抗体を使用して、ＲＩＧ−Ｉシグナル伝達に応答して産生されるＩ型インターフェロンによるＩＦＮ活性化を防止した。抗ＩＦＮＡＲ抗体の存在下では、ＩＳＲＥ誘導性ルシフェラーゼシグナルが効率的に阻害され、アッセイの機能性が実証された（図１９Ｄ）。重要なことには、抗ＩＦＮＡＲ阻止抗体は、３ｐ１０ＬＧ９の抗ウイルス効果を消失させ、ＤＥＮＶ−２は、Ｇ９ｎｅｇ処置Ｕ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞と同様に効率的に複製した（図１９Ｅ）。要約すると、実験は、３ｐ１０ＬＧ９で処置されたＵ９３７−ＤＣ  ＳＩＧＮ細胞で観察された抗ウイルス効果が、ＲＩＧ−Ｉ依存性およびＩ型インターフェロンシグナル依存性だったことを示した。
【０１３３】
実施例１４：がん細胞株Ａ５４９に対するｉｍｍＲＮＡの細胞傷害効果
ＩｍｍＲＮＡ  ３ｐ１０ＬＧ９（配列番号２６）および３ｐ１０ＬＡ９（配列番号２５）は、濃度の増加と共に細胞傷害効果の増加を示した。５’三リン酸を有していない３ｐ１０ＬＧ９は、対照として含まれており、細胞傷害効果を示さなかった。この対照は、トランスフェクション手順が細胞に対して細胞傷害効果を示す可能性を除外した。この実験では、Ａ５４９細胞を９６ウェルプレートに播種した。１日後、細胞を、２３９ｆｅｃｔｉｎを使用してｉｍｍＲＮＡでトランスフェクトし、３７℃で２４時間インキュベーターでインキュベートした。その後、ＣＣＫ−８試薬（ドウジンドウ社（Ｄｏｊｉｎｄｏ））を細胞に添加し、３０分間暗所でインキュベートしてから、停止溶液を添加した。比色定量試験は、生細胞中のデヒドロゲナーゼ活性に依存し、１ウェル当たりのＯＤ値は、生細胞の数に比例する。ＯＤ４５０値を、プレートリーダで測定した（図２１）。
【０１３４】
本発明は、本明細書にて幅広くおよび一般的に記載されている。属の開示内に入るより狭義の種および亜属群の各々も、本発明の一部を形成する。これは任意の主題をその属から除去する条件または否定の制限を有する本発明の属の記載を含み、これは取り除かれた題材が本明細書に具体的に記述されているか否かに関わらない。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の観点で記載されている場合、当業者であれば、本発明は、それによりマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの部分群の観点でも記載されていることを認識するだろう。
【０１３５】
当業者であれば、本発明は、目的を実施し、言及されている結果および利点ならびにそれらに伴うものを得るように十分に構成されていることを容易に理解するだろう。さらに、本明細書で開示された本発明には、本発明の範囲および趣旨から逸脱せずに様々な置換および改変をなすことができることは、当業者であれば直ちに明らかであろう。本明細書に記載されている組成物、方法、手順、処置、分子、および特定の化合物は、現時点での好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲に対する限定とは意図されていない。当業者であれば、それらにおける変化および他の使用を企図することになり、それらは、特許請求の範囲により定義されている本発明の趣旨内に包含される。本明細書における以前に発表された文献の列挙または考察は、そうした文献が技術水準の一部であるかまたはありふれた一般知識であることを認めるものとしては必ずしも解釈されるべきではない。
【０１３６】
本明細書で例示的に記載されている本発明は、本明細書にて具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定の非存在下で好適に実施することができる。したがって、例えば、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含むこと（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、拡張的におよび非限定的に解釈されるものとする。したがって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、表記されている整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を排除しないことを意味すると理解されることになる。加えて、本明細書中で採用されている用語および表現は、説明のための用語として使用されており、限定のための用語ではない。そのような用語および表現には、図示または記載されている特徴またはそれらの部分の任意の均等物を除外する意図はないが、特許請求されている本発明の範囲内で種々の修飾が可能であることが認識される。したがって、本発明は、例示的な実施形態および任意選択の特徴により具体的に開示されているが、本明細書に開示されておりそれらにて具現化されている本発明の改変および変異は、当業者であれば実施することができ、そのような改変および変異は、本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
【０１３７】
本明細書で引用された文献および特許文献全ての内容は、参照によりそれらの全体が援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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