(57)【要約】  本発明は、特別に改変した宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法、並びに各宿主細胞、並びにオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを製造するための該宿主細胞の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法であって、
‐配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有するタンパク質であってメバロン酸を生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、
及び、
配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、前記宿主細胞を改変すること、
‐前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、前記宿主細胞を改変すること、
‐前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で前記宿主細胞を培養すること、
‐並びに、前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の前記宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む、方法。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、又は配列番号３と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、前記宿主細胞をさらに改変することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＯＸ１（配列番号２５）、ＢＴＳ１（配列番号５４）、ＹＰＬ０６２Ｗ（配列番号５５）、ＤＯＳ２（配列番号５６）、ＹＥＲ１３４Ｃ（配列番号５７）、ＶＢＡ５（配列番号５８）、ＹＮＲ０６３Ｗ（配列番号５９）、ＹＪＬ０６４Ｗ（配列番号６０）、及びＹＧＲ２５９Ｃ（配列番号６１）からなる群より選択される少なくとも１つの座位をノックアウトするように、前記宿主細胞をさらに改変することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
好ましくはＣＴＲ３−プロモーターの挿入及び／又は硫酸銅ＣｕＳＯ４の添加によって、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制する、又は、配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってラノステロールを生成可能であるタンパク質を抑制するように、前記宿主細胞をさらに改変することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記硫酸銅の添加量は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、又は３７５ｍＭのＣｕＳＯ４、好ましくは少なくとも１５０ｍＭのＣｕＳＯ４である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する前記少なくとも１つの異種タンパク質は、ルペオール合成酵素、好ましくはTaraxacum koksaghyzのルペオール合成酵素、オキシドスクアレン環化酵素(OSC)、好ましくはTaraxacum koksaghyzのオキシドスクアレン環化酵素ＴｋＯＳＣ１−６、β−アミリン合成酵素、好ましくはArabidopsis thaliana又はArtemisia annuaのβ−アミリン合成酵素、テルペン環化酵素、好ましくはGlycyrrhiza uralensisのテルペン環化酵素(GuLUP1)からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの前記精製は、少なくとも２つのクロマトグラフィーステップによって、好ましくは第１のクロマトグラフィーステップにＣ１８カラムを使用して、及び第２のクロマトグラフィーステップにビフェニルカラムを使用して、行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
２つ以上のオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの前記生成量を増大する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを製造するための組換え宿主細胞であって、前記宿主細胞は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有するタンパク質であってメバロン酸を生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、並びに、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるタンパク質を過剰発現するように改変される、宿主細胞。
【請求項１０】
前記宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Nicotiana benthamiana、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Pichia stipitis、Candida albicans、Candida utilis、及びBY2細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞は、配列番号３を含む、又は配列番号３と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、改変される、請求項９又は１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記宿主細胞は、好ましくはＣＴＲ３−プロモーターの挿入及び／又は硫酸銅ＣｕＳＯ４の添加によって、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素を抑制する、又は、配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列であってラノステロールを生成可能であるタンパク質を抑制するように、さらに改変される、請求項９〜１１のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞は、ＲＯＸ１（配列番号２５）、ＢＴＳ１（配列番号５４）、ＹＰＬ０６２Ｗ（配列番号５５）、ＤＯＳ２（配列番号５６）、ＹＥＲ１３４Ｃ（配列番号５７）、ＶＢＡ５（配列番号５８）、ＹＮＲ０６３Ｗ（配列番号５９）、ＹＪＬ０６４Ｗ（配列番号６０）、及びＹＧＲ２５９Ｃ（配列番号６１）からなる群より選択される少なくとも１つの座位をノックアウトするようにさらに改変される、請求項９〜１２のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つは、オキシドスクアレン、好ましくは２，３−オキシドスクアレン、ステロール、好ましくはシグマステロール又はシトステロール、トリテルペン、好ましくは５員環トリテルペン、より好ましくは、限定されないがｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｌ及びｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３−ｏｌなどのルペオール、β−アミリン、α−アミリン、タラキサステロール、トリテルペンアセテート、アシル化トリテルペン、サポニン、サポゲニン、ｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｎｅ、ｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３−ｏｎｅ、タラキセロール、タラキセロン、α−アミロン、β−アミロン、タラキサステロン、フリーデリン、ベツリン、ベツリン酸、コレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エストロゲン、ゲスターゲン、カルデノリド、ブファジエノリド(bufadienolide)、ステロイドアルカロイド、サポニン、サポゲニン、又はアシル化トリテルペンである、請求項９〜１３のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１５】
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを製造するための、請求項９〜１４のいずれかに記載の宿主細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、コンピュータ可読形式の配列表を含み、これは言及することにより本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、組換え生物工学の分野のものであり、特に代謝工学の分野のものである。本発明は、概して、宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法、及びそれらの精製の方法に関する。また、本発明は、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する宿主細胞の能力を改良した、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを製造するための各宿主細胞に関する。また、本発明は、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを製造するための宿主細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
５員環トリテルペンは、メバロナート(MVA)経路に由来する植物の２次代謝物群であり、経済や医薬において高い可能性を示すものである。Saccharomyces cerevisiaeなどの異種系においてこれらの物質を生成することが望ましいことから、近年、そうした系における研究や設計が提起されている。
【０００４】
イソプレノイドは、あらゆる生体に見受けられる最も大きな天然化合物群であり、現在のところ知られる、様々な、少なくとも５万の種々の構造を示す(Hemmerlin et al., 2012; Liao et al., 2016)。これらの構造は、主に、アセチル−ＣｏＡがイソプレノイド前駆物質イソペンテニル二リン酸(IPP)に変換される、高制御メバロナート経路(MVA経路)に由来する。アセチル−ＣｏＡをＩＰＰに変換するため、６つの酵素を必要とするが、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素(HMGR)は経路の律速段階として知られている(Demierre et al., 2005)。ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)への異性化反応後、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは別のイソプレノイド経路に入ることが可能となる。２つのＩＰＰ分子と１つのＤＭＡＰＰ分子との反応後、ファルネシルピロリン酸(FPP)が生成されて、スクアレン合成酵素を介してスクアレンに変換される。スクアレンは、その酸化形態２，３−オキシドスクアレンにおいて、ステロール前駆物質（例えば、真菌及び動物におけるラノステロール、若しくは植物におけるシクロアルテノール）、又は、Taraxacum officinaleのルペオール合成酵素若しくはArtemisia annuaのβ−アミリン合成酵素などの種々のオキシドスクアレン環化酵素を介して５員環トリテルペンを合成するために使用される(Shibuya et al., 1999; Kirby et al., 2008)。さらに、他のＦＰＰ修飾により、ファルネセン、又は抗マラリア剤アルテミシニンの前駆物質であるアモルファ−４，１１−ジエンなどのセスキテルペンの合成がもたらされる(Martin et al., 2003)。
【０００５】
その経済や医薬における可能性から、多くの研究が、Saccharomyces cerevisiaeなどの異種系におけるイソプレノイドの生成を扱っている(Liao et al., 2016及びVickers et al., 2017における考察)。１９９７年にイソプレノイド生成のため酵母ＭＶＡ経路の可能性をクローズアップすることから始まって、Donald等は、酵母におけるＨＭＧＲの触媒ドメインの過剰発現を報告し、トリテルペンスクアレンの増大をもたらした。ＭＶＡ経路のディレギュレートにおけるさらなる報告は、ノックアウトされるとメバロナート及びトリテルペン蓄積を誘発する一連の座位を提供するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９実験においてなされた(Jakociunas et al., 2015; Ahrend et al., 2017)。この一連のものは、ＭＶＡ経路及びステロール生合成における遺伝子を抑制すると報告される転写調節因子ＲＯＸ１を含むものであった(Henry et al., 2002; Montanes et al., 2011; Ozaydin et al., 2013; Jakociunas et al., 2015)。さらに、いくつかの研究では、内在性だが競合性のイソプレノイド経路（例えば、ステロール生合成vs.５員環トリテルペン生合成）に関与する遺伝子を調節して代謝の流れを正確かつ所望するように変更するために、特定のプロモーターを酵母ゲノムに挿入することについて報告している。
【０００６】
ゆえに、Kirby等は、β−アミリン生成のため、後期ステロール生合成の第１段階を触媒する酵母ラノステロール合成酵素(ERG7)の発現をダウンレギュレートするようにメチオニン感応性ＭＥＴ３プロモーターを使用した。さらに、ＭＥＴ３プロモーターは、酵母スクアレン合成酵素遺伝子(ERG9)の抑制のため、アルテミシニン生成に使用された(Ro et al., 2006; Westfall et al., 2012)。
【０００７】
特許文献１は、酵母株、並びに酵母における５員環トリテルペン及び／又はトリテルペノイドの微生物における生成の方法を記載している。特に、該改変酵母株は、オキシドスクアレン環化酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー、ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つのコピー、及び／又はシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む５員環トリテルペノイドの生成のためのものである。
【０００８】
特許文献２は、ステロール生合成酵素の発現において１つ又は２つの欠損を有する突然変異体酵母においてＨＭＧ−ＣｏＡ−還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子の発現レベルを増大させることを含む、酵母におけるスクアレン及び特定のステロールの蓄積を増大させる方法を記載している。
【０００９】
５員環トリテルペン及びトリテルペノイドは、産業上及び医薬上の用途に大きな可能性を示すものである(Sheng and Sun, 2010)。しかしながら、植物内での全体量が少なく、異種宿主における生物工学的生成は、対応する酵素の低効率、又は翻訳後修飾の欠如などのいくつかの制約に直面することから、抽出がしばしば経済的に実行不可能であることが分かっている(Moses and Pollier, 2013; Arendt et al., 2016)。
【００１０】
したがって、植物からの有機的抽出及びその後の精製によるオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの生成及び抽出は可能であるが、これは、現在まで、植物におけるトリテルペンの濃度及び組成が広い範囲で変化し得ることから、純粋な最終生成物を得るための高いコスト、及び最終生成物の品質の大きなばらつきにつながっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１７／０１３０２３３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，４６０，９４８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このように、コストを抑えるとともに確実である、高生成量のオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドを得るための方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明において、発明者等は、コスト効率がよく、確実で、高純度のオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの生成を可能にする、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドを生成するための、新しい異種プラットフォームを設計した。
【００１４】
本発明は、宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有するタンパク質であってメバロン酸を生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、
及び、
配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明における方法では、宿主細胞は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、改変される。
【００１６】
好ましい実施形態において、本発明における方法は、ＲＯＸ１（配列番号２５）、ＢＴＳ１（配列番号５４）、ＹＰＬ０６２Ｗ（配列番号５５）、ＤＯＳ２（配列番号５６）、ＹＥＲ１３４Ｃ（配列番号５７）、ＶＢＡ５（配列番号５８）、ＹＮＲ０６３Ｗ（配列番号５９）、ＹＪＬ０６４Ｗ（配列番号６０）、及びＹＧＲ２５９Ｃ（配列番号６１）からなる群より選択される少なくとも１つの座位をノックアウトするように宿主細胞を改変することをさらに含む。
【００１７】
さらなる実施形態において、本発明における方法は、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制する、又は、配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってラノステロールを生成可能であるタンパク質を抑制するように、宿主細胞を改変することをさらに含む。好ましくは、該抑制は、ＣＴＲ３−プロモーターの挿入、及び／又は硫酸銅ＣｕＳＯ４の添加によって行われる。
【００１８】
この好ましい実施形態において、硫酸銅の添加量は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、又は３７５ｍＭのＣｕＳＯ４、好ましくは少なくとも１５０ｍＭのＣｕＳＯ４であってもよい。
【００１９】
本発明の方法において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質は、ルペオール合成酵素、好ましくはTaraxacum koksaghyzのルペオール合成酵素、オキシドスクアレン環化酵素(OSC)、好ましくはTaraxacum koksaghyzのオキシドスクアレン環化酵素ＴｋＯＳＣ１−６、β−アミリン合成酵素、好ましくはArabidopsis thaliana又はArtemisia annuaのβ−アミリン合成酵素、テルペン環化酵素、好ましくはGlycyrrhiza uralensis のテルペン環化酵素(GuLUP1)からなる群より選択することができる。
【００２０】
本発明の方法において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つは、植物から抽出される。
【００２１】
本発明の方法のさらなる実施形態において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの精製は、少なくとも２つのクロマトグラフィーステップによって、好ましくは第１のクロマトグラフィーステップにＣ１８カラム、第２のクロマトグラフィーステップにビフェニルカラムを使用して、行われる。
【００２２】
本発明の方法の一実施形態において、２つ以上のオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの生成量を増大することができる。
【００２３】
本発明は、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを製造するための組換え宿主細胞をさらに提供し、該宿主細胞は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有するタンパク質であってメバロン酸を生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、並びに、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、改変される。
【００２４】
本発明において、宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Nicotiana benthamiana、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Pichia stipitis、Candida albicans、Candida utilis、及びBY2細胞からなる群より選択することができる。
【００２５】
宿主細胞は、配列番号３を含む、又は、配列番号３と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを生成可能であるタンパク質を過剰発現するように、さらに改変することができる。
【００２６】
本発明の宿主細胞は、好ましくはＣＴＲ３−プロモーターの挿入及び／又は硫酸銅ＣｕＳＯ４の添加によって、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制する、又は、配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列であってラノステロールを生成可能であるタンパク質を抑制するように、さらに改変することができる。好ましくは、本発明において抑制されるラノステロール合成酵素(ERG7)は、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Pichia stipitis、Candida albicans、又はCandida utilisからのものである。
【００２７】
宿主細胞は、ＲＯＸ１（配列番号２５）、ＢＴＳ１（配列番号５４）、ＹＰＬ０６２Ｗ（配列番号５５）、ＤＯＳ２（配列番号５６）、ＹＥＲ１３４Ｃ（配列番号５７）、ＶＢＡ５（配列番号５８）、ＹＮＲ０６３Ｗ（配列番号５９）、ＹＪＬ０６４Ｗ（配列番号６０）、及びＹＧＲ２５９Ｃ（配列番号６１）からなる群より選択される少なくとも１つの座位をノックアウトするようにさらに改変されることが好ましい。
【００２８】
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つが、オキシドスクアレン、好ましくは２，３−オキシドスクアレン、ステロール、好ましくはシグマステロール又はシトステロール、トリテルペン、好ましくは５員環トリテルペン、より好ましくは、限定されないがｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｌ及びｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３−ｏｌなどのルペオール、β−アミリン、α−アミリン、タラキサステロール、トリテルペンアセテート、アシル化トリテルペン、サポニン、サポゲニン、ｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｎｅ、ｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３−ｏｎｅ、タラキセロール、タラキセロン、α−アミロン、β−アミロン、タラキサステロン、フリーデリン、ベツリン、ベツリン酸、コレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エストロゲン、ゲスターゲン、カルデノリド、ブファジエノリド(bufadienolide)、ステロイドアルカロイド、サポニン、サポゲニン、又はアシル化トリテルペンであることが、本発明の宿主細胞に好ましい。
【００２９】
また、本発明は、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを製造するための本発明の宿主細胞の使用にある。
【００３０】
このように、本発明者らは、メバロナート経路遺伝子及び／又はタンパク質の過剰発現を含む、組合せの改変方法を見いだした。さらに、一実施形態において、本発明の方法は、負の調節因子のノックアウト及びメバロナート経路の競合性経路のノックダウンを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、本発明の一実施形態において使用されるＰｅｒｇ７：：ＰＣＴＲ３−コンストラクト（配列番号１０）及びｒｏｘ１：：ＰＧａｌ１−ｔＨＭＧＲ；ＰＧＡＬ１９−ＥＲＧ１３−コンストラクト（配列番号１１）を概略的に示す。
【図３】図３は、Ｐｅｒｇ７：：ＰＣＴＲ３−コンストラクトのヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す。
【図４】図４は、ｒｏｘ１：：ＰＧａｌ１−ｔＨＭＧＲ；ＰＧＡＬ１0−ＥＲＧ１３−コンストラクトのヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図５】図５は、Taraxacum koksaghyzの酵素ＬＵＰ(TkLUP)のヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。
【図６】図６は、ＴｋＬＵＰ発現酵母におけるトリテルペン蓄積を示す。図６ａは、ＧＡＬ１プロモーター(GAL1-P)及びＣＹＣ１ターミネーター(CYC1-T)の制御下のＴｋＬＵＰコード配列（配列番号１２）の概略図を示す。図６ｂは、ＴｋＬＵＰコード配列（配列番号１２）を有する酵母細胞のＧＣ−ＭＳスペクトルにおける２つのさらなるピークを示し(矢印; m/z = 218)、これらが対応する標準物質と同じ保持時間を有することから、おそらくβ−アミリン(保持時間17.95 min)及びルペオール(保持時間18.25 min)を示す。図６ｃは、ＴｋＬＵＰコード配列（配列番号１２）を有する酵母が０．１６ｍｇ/ｇＣＤＷの推定ルペオールを蓄積する一方、β−アミリンピークの定量はできなかったことを示す。非形質転換(WT)及びｐＡＧ４２４ＧＡＬ１−ｃｃｄｂ形質転換(ベクターコントロール)ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ細胞をコントロールとした。ｎ＝３の個々の形質転換体から、標準偏差を計算した。ＣＤＷ＝細胞乾燥重量。
【図７】図７は、ＲＯＸ１（配列番号２５）の欠失及びＭＶＡ経路遺伝子の過剰発現後の、スクアレン及びルペオールの蓄積を示す。図７ａは、ＲＯＸ１（配列番号２５）の欠失並びにｔＨＭＧＲ（配列番号３２）及びＥＲＧ１３（配列番号１４）の過剰発現のためのコンストラクトの概略図を示す。ｔＨＭＧＲ及びＥＲＧ１３のコード配列を、ＧＡＬ１/ＧＡＬ１０双方向性プロモーター(GAL1-P; GAL10-P)の制御下でクローニングした。コンストラクトを酵母ゲノムに組み込むときウラシル栄養要求性を補完するため、ＫｌＵｒａ３を使用した。組込みの座位を、コンストラクトに隣接する（ターゲットアップ、ターゲットダウン）とともにゲノムターゲット部位（ROX1, 配列番号２５）に相同性の配列によって定めた。ＮｏｔＩ直鎖化コンストラクトの形質転換は、相同組換えによりＲＯＸ１（配列番号２５）のノックアウトをもたらす。図７ｂ及び図７ｃは、ＴｋＬＵＰ（配列番号１２）コード配列に加え、組み込みコンストラクトを有する酵母株(rox1::PGAL1-tHMGR PGAL10-ERG13 TkLUP)が、ＴｋＬＵＰ含有プラスミドのみを有する酵母(TkLUP; p = 0,0137)と対照的にルペオール前駆物質スクアレンの蓄積の増加を示したことを示す。空のベクターｐＡＧ４２４ＧＡＬｌ＿ｃｃｄＢを含有する細胞をコントロールとした(rox1::PGAL1-tHMGR PGAL10-ERG13ベクターコントロール)。さらに、ＲＯＸ１（配列番号２５）の欠失並びにｔＨＭＧＲ（配列番号３２）及びＥＲＧ１３（配列番号１４）の過剰発現により、ルペオールの蓄積が１６．５倍増加した(p=0.00893)。図７ｄは同定したルペオールピークのＭＳスペクトルを示し、図７ｅは測定したルペオール外部標準物質のＭＳスペクトルを示す。ｎ＝３の個々の形質転換体から、標準偏差を計算した。ＣＤＷ＝細胞乾燥重量、＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．０１。
【図８】図８は、ＥＲＧ７（配列番号２０）の抑制が２，３−オキシドスクアレン蓄積をもたらすことを示す。図８ａは、銅感応性ＣＴＲ３プロモーター(CTR3-P)（配列番号４２）の組込みためのコンストラクトの概略図である。プロモーターを酵母ゲノムに導入するため、ロイシン栄養要求性をＫｌＬｅｕ２遺伝子で補完した。ステロール生合成を抑制するため内在性ＥＲＧ７コード配列（配列番号２０）の前のＣＴＲ３プロモーター（配列番号４２）をターゲットにするように、コンストラクトを、ＥＲＧ７プロモーター（ターゲットアップ；ERG7-P）及びＥＲＧ７コード配列（ターゲットダウン；ERG7、配列番号４２）に相同性の配列に隣接させた。図８ｂ及び図８ｃは、ＣＴＲ３プロモーターコンストラクト（配列番号４２）を有する酵母株がＣｕＳＯ４に暴露しなくてもスクアレンレベルの低下（図８ｂ）及び２，３−オキシドスクアレン（図８ｃ）の蓄積を示すことを表す(rox1::PGAL1-tHMGR PGAL10-ERG13 PERG7Δ::PCTR3, 0μM CuSO4)。この効果は、１５０μＭのＣｕＳＯ４を増殖培地に添加することで有意に高めることができた(rox1::PGAL1-tHMGR PGAL10-ERG13 PERG7Δ::PCTR3, 150μM CuSO4; スクアレン低下ではp=0.00613; ２，３−オキシドスクアレンの蓄積ではp=0.00507)。２．５倍の銅濃度で添加することで、スクアレンレベルのさらなる有意な低下、及び２，３−オキシドスクアレン含有量のさらなる増加を示した(rox1::PGAL1-tHMGR PGAL10-ERG13 PERG7Δ::PCTR3, 375μM CuSO4)。ｎ＝３の個々の形質転換体から、標準偏差を計算した。ＣＤＷ＝細胞乾燥重量、＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．００１、＊＊＊＝ｐ≦０．００１。
【図９】図９は、ＥＲＧ７（配列番号２０）の抑制がルペオール蓄積の増加（図９ｅ）及びステロールレベルの低下（図９ｃ及び図９ｄ）をもたらすことを示す。２，３−オキシドスクアレンの蓄積（図９ｂ）及びスクアレンの減少（図９ａ）は、その親株と比較して(rox1::PGAL1-tHMGR PGAL10-ERG13 TkLUP; スクアレンではp = 0.04422)、増殖時に１５０μＭのＣｕＳＯ４に暴露させた後、rox1::PGAL1-tHMGR PGAL10-ERG13及びPERG7Δ::PCTR3修飾に加えＴｋＬＵＰ配列（配列番号１２）を有する酵母株において観察することができた(rox1::PGAL1-tHMGR PGAL10-ERG13 PERG7Δ::PCTR3 TkLUP)。予期されるように、ステロール含有量は減少し、ステロール生合成の典型としてのラノステロール及びエルゴステロールの量によって示される。ＥＲＧ７（配列番号２０）の抑制は、ラノステロールの６．５倍の減少(p = 0.02384)をもたらし、エルゴステロール含有量の３．９倍の減少をもたらした(p = 0.00941)。ステロール生合成の抑制により、ルペオール生成が７．６倍増加し(p = 0.00637)、ステロール生合成からルペオール生成へと代謝の流れを変更したことを示唆した。ｎ＝３の個々の形質転換体から、標準偏差を計算した。ＣＤＷ＝細胞乾燥重量、＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．００１。
【図１０】図１０は、ＥＲＧ７（配列番号２０）の抑制後の酵母におけるβ−アミリンの同定を示す。図１０ａは、改変酵母株の同定したβ−アミリンピークのＭＳスペクトルを示し(rox1::PGAL1-tHMGR PGAL10-ERG13 Perg7Δ::PCTR3 TkLUP)、図１０ｂは、測定したβ−アミリン外部標準物質のＭＳスペクトルを示す。
【図１１】図１１は、メバロナート経路の概略抜粋を示す。
【図１２】図１２はＨＰＬＣによるトリテルペン精製を示す。単一のトリテルペンをＵｌｔｒａＣ１８カラム（図１２ａ）、その後Ｕｌｔｒａビフェニルカラム（図１２ｂ）を使用して分離した。図１２ｃは、それぞれフラクション４(F4)及び５(F5)から精製された、β−アミリン及びタラキサステロール、並びにそれらのケトン誘導体のＭＳスペクトルを示す（実施例７を参照）。図１２ｃ〜図１２ｆは、それぞれＦ４及びＦ５から精製された、新しく同定したｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｌ、及びそのケトン誘導体ｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｎｅの分子構造及びＭＳスペクトルを示す（実施例７を参照）。
【図１３】図１３は、Nicotiana tabacumのシクロアルテノール合成酵素様（配列番号２１、NP_001311688.1）、Schizosaccharomyces pombeのラノステロール合成酵素（配列番号６３、AAA92502.1）、Pichia pastorisのラノステロール合成酵素（配列番号６４、CCA38589.2）、Kluyveromyces lactisのラノステロール合成酵素（配列番号６５、CAH02375.1）、Kluyveromyces marxianusのラノステロール合成酵素（配列番号６６、BAP71121.1）、Candida albicans SC5314のラノステロール合成酵素（配列番号６７、XP_722612.2）、及びPichia stipitisのラノステロール合成酵素（オキシドスクアレン−ラノステロール環化酵素）（2,3-エポキシスクアレン−ラノステロール環化酵素）(OSC)（配列番号６２、XP_001384446.2）の配列アライメントを示す。このアライメントの条件は以下にさらに記載される。
【図１４】図１４は、図１３のアライメントから作成した、それぞれのバーセント同一性のマトリックスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む。
【００３３】
本発明において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つが、オキシドスクアレン、好ましくは２，３−オキシドスクアレン、ステロール、好ましくはシグマステロール又はシトステロール、トリテルペン、好ましくは５員環トリテルペン、より好ましくは、限定されないがｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｌ及びｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３−ｏｌなどのルペオール、β−アミリン、α−アミリン、タラキサステロール、トリテルペンアセテート、アシル化トリテルペン、サポニン、サポゲニン、ｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｎｅ、ｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３−ｏｎｅ、タラキセロール、タラキセロン、α−アミロン、β−アミロン、タラキサステロン、フリーデリン、ベツリン、ベツリン酸、コレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エストロゲン、ゲスターゲン、カルデノリド、ブファジエノリド(bufadienolide)、ステロイドアルカロイド、サポニン、サポゲニン、又はアシル化トリテルペンである。
【００３４】
これは、一実施形態において、本発明が宿主細胞において少なくとも１つのオキシドスクアレン、好ましくは２，３−オキシドスクアレンの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
少なくとも１つのオキシドスクアレン、好ましくは２，３−オキシドスクアレンを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
少なくとも１つのオキシドスクアレン、好ましくは２，３−オキシドスクアレンを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、少なくとも１つのオキシドスクアレン、好ましくは２，３−オキシドスクアレンを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、少なくとも１つのオキシドスクアレン、好ましくは２，３−オキシドスクアレンの生成量を増大させることを含むということを意味する。
【００３５】
これは、一実施形態において、本発明が宿主細胞において２，３−オキシドスクアレンの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
２，３−オキシドスクアレンを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
２，３−オキシドスクアレンを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、２，３−オキシドスクアレンを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、２，３−オキシドスクアレンの生成量を増大させることを含むということを意味する。
【００３６】
一実施形態において、本発明は、宿主細胞においてルペオールの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
ルペオールを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
ルペオールを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、ルペオールを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、ルペオールの生成量を増大させることを含む。
【００３７】
これは、一実施形態において、本発明が宿主細胞においてスクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
スクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
スクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、スクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、スクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つの生成量を増大させることを含むことを意味する。
【００３８】
本発明は、宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含み、
該オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つは、グリチルレチン酸(glycyrrhetinic acid)ではない。グリチルレチン酸は、グリチルレチン酸(glycyrrhetic acid)及びエノキソロンとしても知られ、グリチルリチン酸の加水分解から得られるβ−アミリンタイプの５員環トリテルペノイド誘導体である。
【００３９】
イソプレノイドとも呼ばれることのあるテルペノイドは、テルペンと類似する、五炭素イソプレン単位由来の、大きく多様な自然起源有機化合物群である。
【００４０】
植物のテルペノイドは、その芳香のある性質のため広範に使用されており、伝統的なハーブ療法に用いられている。テルペノイドは、ユーカリの芳香、シナモン、クローブ、及びジンジャーの風味、ヒマワリの黄色、トマトの赤色に寄与している。既知のテルペノイドは、シトラール、メントール、カンファー、植物Salvia divinorumのサルビノリンＡ、カンナビスで見つかったカンナビノイド、Ginkgo bilobaで見つかったギンコライド及びビロバライド、並びにターメリック及びマスタードシードで見つかったクルクミノイドを含む。
【００４１】
動物のステロイド及びステロールは、テルペノイド前駆物質から生物学的に生成される。テルペノイドは、例えばその細胞膜への付着性を向上させるため、タンパク質に付加されることがあり、これはイソプレニル化として知られる。
【００４２】
さらに、トリテルペノイドは、例えば、これらに限らないが、サポニン、サポゲニン、アシル化トリテルペン、α−アミロン、β−アミロン、タラキサステロンなどのトリテルペンのケト誘導体、並びにベツリン酸、グリチルレチン酸及びボスウェル酸(boswellic acid)などのカルボン酸誘導体である。
【００４３】
トリテルペンは、分子式Ｃ３０Ｈ４８を伴う３つのテルペン単位から構成される化学物質群である。また、これらは、６つのイソプレン単位からなるとも考えられている。トリテルペンは、直鎖状、４員環、及び５員環トリテルペンに細区分される。動物、植物、及び真菌はすべてトリテルペンを生成するが、おそらく最も重要な例はスクアレンであり、これはスクアレンがほぼすべてのステロイドの基礎を形成するためである。トリテルペンのさらなる例は、所定のステロイド及び強心配糖体である。本発明におけるさらなるトリテルペンは、例えば、これらに限らないが、ルペオール、ｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｌ、ｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３−ｏｌ、β−アミリン、α−アミリン、及びタラキサステロールである。さらに、例えば、トリテルペノイドサポニンは、この群の化学物質のサポニン群に属するトリテルペンである。
【００４４】
オキシドスクアレンは、例えば、これに限らないが、２，３−オキシドスクアレンである。
【００４５】
本発明において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることは、タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現しない、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現しない、宿主細胞との比較を意味し、該宿主細胞は、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現しない。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現するように、宿主細胞を改変することを含む。該３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素は、ｔＨＭＧＲと略記することができる。またこれは、酵素ＨＭＧＲの触媒ドメインとしても知られる。好ましい実施形態において、酵素ｔＨＭＧＲは配列番号１に示すアミノ酸配列からなる。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明における方法では、宿主細胞は、タンパク質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを生成可能であるという条件で、配列番号３のアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、改変される。
【００４８】
好ましい実施形態において、本発明における方法では、宿主細胞は、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡを生成可能であるという条件で、配列番号２のアミノ酸配列を含む、又は、配列番号２と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、改変される。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明における方法では、宿主細胞は、タンパク質がメバロナート−５−ホスフェートを生成可能であるという条件で、配列番号４のアミノ酸配列を含む、又は、配列番号４と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、改変される。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明における方法では、宿主細胞は、タンパク質がメバロナート−５−ピロホスフェートを生成可能であるという条件で、配列番号５のアミノ酸配列を含む、又は、配列番号５と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、改変される。
【００５１】
好ましい実施形態において、本発明における方法では、宿主細胞は、タンパク質がイソペンテニル−５−ピロホスフェートを生成可能であるという条件で、配列番号６のアミノ酸配列を含む、又は、配列番号６と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、改変される。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明における方法では、宿主細胞は、タンパク質がファルネシル−５−ピロホスフェートを生成可能であるという条件で、配列番号７のアミノ酸配列を含む、又は、配列番号７と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、改変される。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明における方法では、宿主細胞は、タンパク質がジメチルアリル−５−ピロホスフェートを生成可能であるという条件で、配列番号８のアミノ酸配列を含む、又は、配列番号８と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、改変される。
【００５４】
また、本発明は、宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む。
【００５５】
配列番号１：
MVLTNKTVISGSKVKSLSSAQSSSSGPSSSSEEDDSRDIESLDKKIRPLEELEALLSSGNTKQLKNKEVAALVIHGKLPLYALEKKLGDTTRAVAVRRKALSILAEAPVLASDRLPYKNYDYDRVFGACCENVIGYMPLPVGVIGPLVIDGTSYHIPMATTEGCLVASAMRGCKAINAGGGATTVLTKDGMTRGPVVRFPTLKRSGACKIWLDSEEGQNAIKKAFNSTSRFARLQHIQTCLAGDLLFMRFRTTTGDAMGMNMISKGVEYSLKQMVEEYGWEDMEVVSVSGNYCTDKKPAAINWIEGRGKSVVAEATIPGDVVRKVLKSDVSALVELNIAKNLVGSAMAGSVGGFNAHAANLVTAVFLALGQDPAQNVESSNCITLMKEVDGDLRISVSMPSIEVGTIGGGTVLEPQGAMLDLLGVRGPHATAPGTNARQLARIVACAVLAGELSLCAALAAGHLVQSHMTHNRKPAEPTKPNNLDATDINRLKDGSVTCIKS
【００５６】
３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル補酵素Ａ還元酵素は、コレステロール及びその他のイソプレノイドを生成する代謝経路であるメバロナート経路の律速酵素である。通常、哺乳動物細胞では、この酵素は、ＬＤＬ受容体を介した低密度リポタンパク質(LDL)の内部移行及び分解に由来するコレステロールや、コレステロールの酸化種によって抑制される。還元酵素の競合性阻害剤は、肝臓においてＬＤＬ受容体の発現を誘発し、これが血漿ＬＤＬの異化作用を増大させ、アテローム性動脈硬化症の重要な決定因子であるコレステロールの血漿中濃度を低下させる。このように、この酵素は、まとめてスタチンとして知られる広く入手可能なコレステロール降下剤のターゲットとなっている。
【００５７】
本発明において、過剰発現は、当業者に知られるいずれかの方法において行うことができる。一般に、これは、遺伝子の転写／翻訳を増加させることで、例えば遺伝子のコピー数を増加させる、又は遺伝子発現に関連する調節配列若しくは部位を変化させる若しくは修飾することで、行うことができる。例えば、過剰発現は、各タンパク質をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコピー、又はその各調節配列（例えばプロモーター）に作動可能に連結された機能的相同体を導入することによって行うことができる。例えば、遺伝子は、高い発現レベルを得るために、強力な恒常的プロモーター及び／又は強力な遍在的プロモーターに作動可能に連結することができる。そうしたプロモーターは内在性プロモーター又は組換えプロモーターであり得る。あるいは、発現が恒常的となるように、調節配列を除くこともできる。所与の遺伝子の天然プロモーターを、該遺伝子の発現を増大させる又は該遺伝子の恒常的発現をもたらす異種プロモーターと置換することができる。例えば、ｔＨＭＧＲ（配列番号３２）、及び／又は配列番号１のアミノ酸配列を含む各タンパク質ｔＨＭＧＲは、改変前の、同じ条件下で培養した宿主細胞と比較して本発明における宿主細胞によって、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％を超えて、又は３００％を超えて過剰発現することができる。例えば、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む少なくとも１つのタンパク質は、改変前の、同じ条件下で培養した宿主細胞と比較して該宿主細胞によって、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％を超えて、又は３００％を超えて過剰発現することができる。誘導的プロモーターの使用は、さらに宿主細胞培養において発現の増加を可能にする。また、さらに、過剰発現は、例えば、特定の遺伝子の染色体位置を修飾すること、リボソーム結合部位若しくは転写ターミネーターなどの特定の遺伝子に隣接する核酸配列を変化させること、遺伝子の転写及び／若しくは遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど）を修飾すること、又は、例えば、リプレッサータンパク質の発現をブロックするようにアンチセンス核酸分子を使用すること、若しくは、通常過剰発現させたい遺伝子の発現を抑制する転写因子のための遺伝子を欠失若しくは突然変異させることを含むが、これらに限らない、当技術分野における慣例的な特定の遺伝子発現をディレギュレートする他の任意の従来の手段によっても行うことができる。また、ｍＲＮＡの寿命を延ばすことも、発現レベルを向上させ得る。例えば、所定のターミネーター領域は、ｍＲＮＡの半減期を延ばすために使用することができる(Yamanishi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2011) 75:2234 and US 2013/0244243)。複数の遺伝子コピーを含む場合、遺伝子は、種々のコピー数のプラスミドに配置される、又は染色体に組み込まれ増幅させることができる。宿主細胞が過剰発現のための各タンパク質をコードする遺伝子を含まない場合、発現のために遺伝子を宿主���胞に導入することができる。この場合、「過剰発現」とは、当業者に知られる任意の方法を使用して遺伝子産物を発現することを意味する。
【００５８】
本発明において、「ＥＲＧ１０」は、ステロール及び非ステロールイソプレノイドの生合成に必要とされる中間体である、メバロナートの生合成におけるアセトアセチル−ＣｏＡの形成を触媒する、タンパク質のアセチル−ＣｏＡ−アセチルトランスフェラーゼ（アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＥＲＧ１０とも呼ばれる）をコードする遺伝子（配列番号２）である。つまり、これは、一方のアセチル−ＣｏＡ分子から他方へ、アセチル基を転移させて、アセトアセチル−ＣｏＡを形成するとともに、メバロナート生合成の第１段階に関与する、サイトゾル酵素をコードする。さらに、「ＥＲＧ１０」のヌクレオチド配列は、配列番号１３として本明細書に記載される。
【００５９】
本発明において、「ＥＲＧ１３」という用語は、アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡとの縮合を触媒して、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の基質である３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ(HMG-CoA)を形成する、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ(HMG-CoA)合成酵素(ERG13)をコードする遺伝子（配列番号３）を意味する。このように、これはメバロナート生合成の第２段階に関与する。さらに、「ＥＲＧ１３」のヌクレオチド配列は、配列番号１４として本明細書に記載される。
【００６０】
本発明の文脈において、「ＥＲＧ１２」という用語は、メバロン酸のＡＴＰとの反応を触媒して、メバロナート−５−ホスフェートを生成する、タンパク質のメバロナートキナーゼをコードする遺伝子(ERG12)（配列番号４）を意味する。さらに、「ＥＲＧ１２」のヌクレオチド配列は、配列番号１５として本明細書に記載される。
【００６１】
本発明において、「ＥＲＧ８」という用語は、エルゴステロールを含むイソプレノイド及びステロールのメバロナートからの生合成において作用する必須のサイトゾル酵素である、タンパク質のホスホメバロナートキナーゼをコードする遺伝子(ERG8)（配列番号５）を意味する。このタンパク質は、メバロナート−５−ホスフェートのＡＴＰとの反応を触媒して、メバロナート−５−ピロホスフェートを生成する。さらに、「ＥＲＧ８」のヌクレオチド配列は、配列番号１６として本明細書に記載される。
【００６２】
本発明の文脈において、「ＥＲＧ１９」という用語は、エルゴステロールを含むイソプレノイド及びステロールの生合成に関与する必須の酵素であるとともに、ホモ二量体として作用する、タンパク質のメバロナート−５−ピロホスフェートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子(ERG19)（配列番号６）を意味する。メバロナート−５−ピロホスフェートデカルボキシラーゼによって触媒される反応は、イソペンテニル−５−ピロホスフェートを形成する。また、「ＥＲＧ１９」遺伝子は、「ｍｖｄ１」という名称でも知られる。さらに、「ＥＲＧ１９」のヌクレオチド配列は、配列番号１７として本明細書に記載される。
【００６３】
本発明において、「ＥＲＧ２０」という用語は、タンパク質のファルネシルピロホスフェート合成酵素をコードする遺伝子(ERG20)（配列番号７）を意味する。この酵素は、ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ活性とゲラニルトランストランスフェラーゼ活性との両方を有するとともに、イソプレノイド及びステロール生合成のためにＣ１５ファルネシルピロホスフェート単位の形成を触媒する。また、該「ＥＲＧ２０」遺伝子は、「ｂｏｔ３」、「ｆｄｓ１」、及び「ｆｐｐ１」という名称でも知られる。さらに、「ＥＲＧ２０」のヌクレオチド配列は、配列番号１８として本明細書に記載される。
【００６４】
本発明において使用するとき「ＩＤＩ１」という用語は、比較的反応性の低いイソペンテニルピロホスフェート(IPP)の、より反応性の高い親電子性ジメチルアリルピロホスフェート(DMAPP)への変換を触媒するイソメラーゼである、イソペンテニルピロホスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子(IDI1)（配列番号８）である。この異性化反応は、メバロナート経路を介したイソプレノイドの生合成における重要な段階である。さらに、「ＩＤＩ１」のヌクレオチド配列は、配列番号１９として本明細書に記載される。
【００６５】
本発明において、遺伝子は本明細書において常に大文字で記されている一方、突然変異／ノックアウトアレルは小文字で記されている。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態において、該方法は、配列番号１に示される３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素のアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有するタンパク質を過剰発現するように宿主細胞を改変することを含む。該タンパク質はメバロン酸を生成することができる。
【００６７】
本発明の文脈で使用するとき「配列同一性」又は「同一性％」"は、標準アルゴリズムを用いてアライメントした少なくとも２つのポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列間の残基整合パーセンテージを指す。こうしたアルゴリズムは、２つの配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で、比較される配列にギャップを挿入してもよく、ゆえに、２つの配列のより意味のある比較をすることができる。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の配列同一性は、クラスタルオメガ(Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/))のデフォルト設定を用いて判定することができる。入力パラメータは、program: clustalo; version 1.2.4; output guide tree: false; output distance matrix: false; dealign input sequences: false; mBed-like clustering guide tree: true; mBed-like clustering iteration: true; number of iterations: 0; maximum guide tree iterations: -1; maximum HMM iterations: -1; output alignment format: clustal_num; output order: aligned; sequence type: proteinであった。
【００６８】
したがって、本発明のさらなる態様において、宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む。
【００６９】
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることは、本明細書において、タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現しない、及び、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現しない、宿主細胞と比較することを意味する。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態において、該方法は、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように宿主細胞を改変することを含む。
【００７１】
これは、本発明のさらなる態様が、宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含むことを意味する。
【００７２】
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることは、この実施形態において、タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現しない、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現しない、及び、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現しない、宿主細胞との比較を意味する。
【００７３】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、宿主細胞においてオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示される３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素のアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有するタンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、 
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む。
【００７４】
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることは、この特定の実施形態において、タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示される３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素のアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現しない、及び、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現しない、宿主細胞との比較における増大を意味する。
【００７５】
本発明における方法の好ましい実施形態において、宿主細胞は、タンパク質が３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡを生成可能であるという条件で、配列番号３のアミノ酸配列を含む、又は、配列番号３と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように改変される。
【００７６】
本発明における方法の好ましい実施形態において、該方法は、ＲＯＸ１（配列番号２５）、ＢＴＳ１（配列番号５４）、ＹＰＬ０６２Ｗ（配列番号５５）、ＤＯＳ２（配列番号５６）、ＹＥＲ１３４Ｃ（配列番号５７）、ＶＢＡ５（配列番号５８）、ＹＮＲ０６３Ｗ（配列番号５９）、ＹＪＬ０６４Ｗ（配列番号６０）、及びＹＧＲ２５９Ｃ（配列番号６１）からなる群より選択される少なくとも１つの座位をノックアウトするように宿主細胞を改変することをさらに含む。
【００７７】
本発明における方法の好ましい実施形態において、該方法は、ＲＯＸ１（配列番号２５）、ＹＰＬ０６２Ｗ（配列番号５５）、ＤＯＳ２（配列番号５６）、ＹＥＲ１３４Ｃ（配列番号５７）、ＶＢＡ５（配列番号５８）、ＹＮＲ０６３Ｗ（配列番号５９）、ＹＪＬ０６４Ｗ（配列番号６０）、及びＹＧＲ２５９Ｃ（配列番号６１）からなる群より選択される少なくとも１つの座位をノックアウトするように宿主細胞を改変することをさらに含む。
【００７８】
特に、該方法がＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトするように宿主細胞を改変することをさらに含むことがさらにより好ましい。
【００７９】
本発明における特に好ましい方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む。
【００８０】
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることは、この特定の実施形態において、タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現しない、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現しない、宿主細胞との比較における増大を意味し、該宿主細胞は、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現せず、並びに、該宿主細胞は、ＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトしない。
【００８１】
また本発明は、一実施形態において、宿主細胞においてスクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
スクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
スクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、スクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、スクアレン、ラノステロール、又はエルゴステロールの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む。
【００８２】
スクアレン、ラノステロール、及び／又はエルゴステロールの少なくとも１つの生成量を増大させることは、この特定の実施形態において、タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現しない、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現しない、宿主細胞との比較における増大を意味し、該宿主細胞は、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現せず、並びに、該宿主細胞は、ＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトしない。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明における方法は、配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有する配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するように、宿主細胞をさらに改変することを含む。ラノステロール合成酵素の各ヌクレオチド配列は、配列番号２０に示すように本明細書においてさらに示される。好ましくは、ラノステロール合成酵素(ERG7)をコードするポリヌクレオチドの該抑制、又はタンパク質ラノステロール合成酵素自体の抑制は、ＣＴＲ３−プロモーター（配列番号４２）の挿入、及び／又は硫酸銅ＣｕＳＯ４の添加によって行われる。
【００８４】
この好ましい実施形態において、ラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するための硫酸銅の添加量は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、又は３７５ｍＭのＣｕＳＯ４、好ましくは少なくとも１５０ｍＭのＣｕＳＯ４であってもよい。
【００８５】
ラノステロール合成酵素は、（Ｓ）−２，３−オキシドスクアレンをプロトステロールカチオンに、そしてラノステロールに変換するオキシドスクアレン環化酵素(OSC)酵素である。ラノステロールは、コレステロール生合成における重要な４環中間体である。ヒトにおいて、ラノステロール合成酵素は、ＬＳＳ遺伝子によってコードされる。
【００８６】
好ましくは、本発明における抑制されるラノステロール合成酵素（又は植物における同種のシクロアルテノール合成酵素）は、Saccharomyces cerevisiae、Nicotiana benthamiana、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Pichia stipitis、Candida albicans、Candida utilis、及びBY2細胞からのものである。
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明における方法は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシクロアルテノール合成酵素を抑制するように、宿主細胞をさらに改変することを含む。シクロアルテノール合成酵素のヌクレオチド配列は、配列番号２２に示すように本明細書においてにさらに示される。
【００８８】
つまり、本発明における特に好ましい方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
及び、
タンパク質がラノステロールを生成可能であるという条件で、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、又は配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む。
【００８９】
メバロナート経路のタンパク質の生成量を増大させることは、この特定の実施形態において、タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現しない、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現しない、及び、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現しない、及び、ＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトしない、及び、タンパク質がラノステロールを生成可能であるという条件で、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、又は配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制しない、宿主細胞との比較における増大を意味する。
【００９０】
これは、一実施形態において、本発明が宿主細胞において２，３−オキシドスクアレンの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
及び、
タンパク質がラノステロールを生成可能であるという条件で、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、又は配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するように、宿主細胞を改変すること、
２，３−オキシドスクアレンを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
２，３−オキシドスクアレンを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、２，３−オキシドスクアレンを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、２，３−オキシドスクアレンの生成量を増大させることを含むということを意味する。
【００９１】
２，３−オキシドスクアレンの生成量を増大させることは、この特定の実施形態において、タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現しない、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現しない、及び、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現しない、及び、ＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトしない、及び、タンパク質がラノステロールを生成可能であるという条件で、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、又は配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制しない、宿主細胞との比較における増大を意味する。
【００９２】
本発明の方法において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つをコードする少なくとも１つの異種タンパク質は、ルペオール合成酵素、好ましくはTaraxacum koksaghyzのルペオール合成酵素、オキシドスクアレン環化酵素(OSC)、好ましくはTaraxacum koksaghyzのオキシドスクアレン環化酵素ＴｋＯＳＣ１−６、β−アミリン合成酵素、好ましくはArabidopsis thaliana又はArtemisia annuaのβ−アミリン合成酵素、テルペン環化酵素、好ましくはGlycyrrhiza uralensis のテルペン環化酵素(GuLUP1)からなる群より選択することができる。
【００９３】
本発明の方法において、該宿主細胞を培養することは、適切な条件下で行われる。そうした条件は、好ましくは、少なくとも５０℃、６０℃、７０℃、８０℃において、より好ましくは約８０℃で、２〜６分間、より好ましくは約５分間の、凍結乾燥酵母細胞のインキュベートである。好ましくは、メタノール中のＫＯＨ及び内部標準物質としてのコレステロールを各サンプルに添加する。オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの抽出には、好ましくはｎ−ヘキサンを添加する。例えば、その上部抽出相を好ましくは使用する。その後、サンプルを、例えば、アセトンに再溶解し、ＧＣ−ＭＳを行う。ＧＣ−ＭＳ分析は、好ましくは、ＧＣ−ＭＳ−ＱＰ２０１０Ｕｌｔｒａにおいて、温度勾配で行う。
【００９４】
本発明の方法の他の実施形態において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つは、植物から抽出される。これは、本発明において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つが、本明細書に記載の各実施形態において、本明細書に記載されるような宿主細胞から抽出、あるいは植物から抽出することができることを意味する。
【００９５】
他の実施形態において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つは、好ましくは第１のクロマトグラフィーステップにＣ１８カラム、第２のクロマトグラフィーステップにビフェニルカラムを使用して、植物抽出物から精製される。
【００９６】
また、本発明は、植物からのオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、植物を改変すること、
並びに、適切な条件下でそれぞれの植物抽出からオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを精製することで、
改変前の植物と比較して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成量を増大させることを含む。
【００９７】
本明細書において、植物は、好ましくは、Taraxacum koksaghyz、Adiantum capillus-veneris、Ajuga reptans、Aquilegia coerulea、Arabidopsis thaliana、Arachis hypogaea、Artemisia annua、Aster sedifolius、Aster tataricus、Avena strigose、Barbarea vulgaris、Betula platyphylla、Bruguiera gymnorhiza、Bupleurum falcatum、Catharanthus roseus、Cicer arietinum、Centella asiatica、Chenopodium quinoa、Citrullus lanatus、Citrullus colocynthis、Costus speciosus、Cucumis melo、Cucumis sativus、Cucurbita pepo、Eleutherococcus senticosus、Euphorbia tirucalli、Gentiana straminea、Glycine max、Glycyrrhiza glabra、Glycyrrhiza uralensis、Ilex asprella、Kalanchoe daigremontiana、Kandelia candel、Laurencia dendroidea、Lens culinaris、Luffa cylindrica、Lotus japonicus、Maesa lanceolata、Malus domestica、Maytenus ilicifolia、Medicago truncatula、Nicotiana benthamiana、Nicotiana tabacum、Nigella sativa、Ocimum basilicum、Olea europaea、Oryza sativa、Phaeodactylum tricornutum、Phaseolus vulgaris、Pisum sativum、Platycodon grandifloras、Polygala tenuifolia、Polypodiodes niponica、Panax ginseng、Pisum sativum、Rhizophora stylosa、Ricinus communis、Saponaria vaccaria、Siraitia grosvenorii、Stevia rebaudiana、Solanum aculeatissimum、Solanum chacoense、Solanum tuberosum、Solanum lycopersicum、Sorghum bicolor、Taraxacum officinale、Taraxacum brevicorniculatum、Taraxacum mongolicum、Taraxacum platycarpum、Triticum aestivum、Vaccaria hispanica、Veratrum californicum、Vitis vinifera、Withania somnifera、及びZea maysからなる群より選択される。
【００９８】
さらに、本発明の方法において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの精製は、少なくとも２つのクロマトグラフィーステップによって行うことができる。この実施形態において、第１のクロマトグラフィーステップにはＣ１８カラムを使用することが好ましい。この実施形態において、第２のクロマトグラフィーステップにはビフェニルカラムを使用することがさらに好ましい。第１のクロマトグラフィーステップにはＣ１８カラムを、第２のクロマトグラフィーステップにはビフェニルカラムを使用することがさらにより好ましい。
【００９９】
Ｃ１８カラムは、固定相としてＣ１８物質を使用するＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）カラムである。Ｃ１８のＨＰＬＣカラムは、環境科学及び化学分析、並びに、化学物質混合物の個々の成分を分析するために、医薬や環境科学などの産業において使用される。Ｃ１８固定相は、一方のＣ１８のＨＰＬＣカラムと他方のものとで同一ではない。Ｃ１８は、単に分子が１８炭素原子を含むことを意味するので、分子における他の原子は変化して、大きく異なる物質をもたらし得る。しかしながら、当業者は、Ｃ１８カラムを流れる化合物の特性を知っていると、所望の結果を得るためのカラムを選択することができる。Ｃ１８カラムは、多様なサイズを有していてもよく、エンドキャップがあってもなくてもよく、種々の粒子径及び細孔径を有していてもよく、種々の疎水性の程度を有していてもよく、酸性成分及び／又は塩基性成分を分離する能力が異なっていてもよい。Ｃ１８カラムを用いた本発明におけるそうしたクロマトグラフィーステップは、好ましくは、溶媒相としてメタノールを使用することで行われる。
【０１００】
本発明において使用されるようなビフェニルカラムは、リガンドタイプとしてビフェニル残基を含む。ビフェニルカラムを用いたそうしたクロマトグラフィーステップは、好ましくは、溶媒相としてメタノール及び水の勾配を使用することで本発明において行われる。
【０１０１】
本発明の方法を適用することで、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの各少なくとも１つは、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらに１００％の高純度で得ることができる。
【０１０２】
本発明の方法において、さらに２つ以上のオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの生成量を増大することができる。
【０１０３】
「生成量」という用語は、例えば改変宿主細胞又は植物抽出物から採取した、それぞれ本明細書に記載されるオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの量を指し、増大した生成量は、宿主細胞によってオキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成又は分泌の量が増大したためであり得る。生成量は、メバロナート経路のタンパク質ｇ／宿主細胞のバイオマスｇ（乾燥細胞重量又は湿細胞重量として測定）であってもよい。生成量の増大は、本発明において一般に、改変宿主細胞から得た生成量を、改変前の宿主細胞から、すなわち非改変宿主細胞から得た生成量と比較したとき、測定することができる。
【０１０４】
本発明は、さらなる実施形態において、本明細書に記載の任意の方法によって得ることができる抽出物、好ましくは植物抽出物をさらに提供する。
【０１０５】
本発明は、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを製造するための組換え宿主細胞をさらに提供し、該宿主細胞は、タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、及び、タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、改変される。
【０１０６】
本明細書で使用するとき、「宿主細胞」は、タンパク質発現、任意でタンパク質分泌が可能である細胞を指す。そうした宿主細胞は、本発明の方法に適用される。その目的で、宿主細胞がメバロナート経路に関与するポリペプチドを過剰発現又は低発現するように、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に存在させる又は宿主細胞に導入する。本発明によって提供される宿主細胞は、真核生物又は原核生物の宿主細胞であり得る。本発明における好ましい宿主細胞は、真核生物細胞である。より好ましいものは、非哺乳動物の真核生物宿主細胞である。また、好ましいものは、真菌宿主細胞又は酵母細胞である。当業者に理解されるように、原核生物細胞は膜結合性核を持たず、一方で真核生物細胞は膜結合性核を有する。真核生物細胞の例は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、線形動物細胞、昆虫細胞、幹細胞、真菌細胞、又は酵母細胞を含むが、これらに限らない。
【０１０７】
本明細書で使用するとき、「改変」宿主細胞とは、遺伝子工学を用いて、ヒトの介入によって操作した宿主細胞である。宿主細胞が所定のタンパク質を「過剰発現するように改変」されるとき、宿主細胞は、該宿主細胞が遺伝子発現を調節する能力を有する、好ましくは、メバロナート経路の遺伝子及び／若しくはタンパク質又はそれらの機能的相同体を過剰発現するように操作され、それにより所定のタンパク質の発現が操作前の同じ条件下の宿主細胞と比較して増加する。
【０１０８】
本発明の宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Nicotiana benthamiana、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Pichia stipitis、Candida albicans、Candida utilis、及びBY2細胞からなる群より選択される宿主細胞である。
【０１０９】
本発明の宿主細胞は、タンパク質が３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを生成可能であるという条件で、配列番号３を含む、又は、配列番号３と少なくとも４４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、さらに改変することができる。
【０１１０】
本発明の宿主細胞は、タンパク質がラノステロールを生成可能であるという条件で、好ましくはＣＴＲ３−プロモーターの挿入及び／又は硫酸銅ＣｕＳＯ４の添加によって、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制する、又は、配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を抑制するように、さらに改変することができる。好ましい実施形態において、パリンドロームTTTGCTC(A/G) ... (T/C)GAGCAAAを含む配列は、銅の転写調節に必要とされる(Yamaguchi-Iwai et al., 1997; Jamison McDaniels et al., 1999; Labbe et al., 1997)。
【０１１１】
宿主細胞は、ＲＯＸ１（配列番号２５）、ＢＴＳ１（配列番号５４）、ＹＰＬ０６２Ｗ（配列番号５５）、ＤＯＳ２（配列番号５６）、ＹＥＲ１３４Ｃ（配列番号５７）、ＶＢＡ５（配列番号５８）、ＹＮＲ０６３Ｗ（配列番号５９）、ＹＪＬ０６４Ｗ（配列番号６０）、及びＹＧＲ２５９Ｃ（配列番号６１）からなる群より選択される少なくとも１つの座位をノックアウトするようにさらに改変されることが好ましい。宿主細胞は、ＲＯＸ１（配列番号２５）、ＹＰＬ０６２Ｗ（配列番号５５）、ＤＯＳ２（配列番号５６）、ＹＥＲ１３４Ｃ（配列番号５７）、ＶＢＡ５（配列番号５８）、ＹＮＲ０６３Ｗ（配列番号５９）、ＹＪＬ０６４Ｗ（配列番号６０）、及びＹＧＲ２５９Ｃ（配列番号６１）からなる群より選択される少なくとも１つの座位をノックアウトするようにさらに改変されることがさらに好ましい。
【０１１２】
オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つが、オキシドスクアレン、好ましくは２，３−オキシドスクアレン、ステロール、好ましくはシグマステロール又はシトステロール、トリテルペン、好ましくは５員環トリテルペン、より好ましくは、限定されないがｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｌ及びｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３−ｏｌなどのルペオール、β−アミリン、α−アミリン、タラキサステロール、トリテルペンアセテート、アシル化トリテルペン、サポニン、サポゲニン、ｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｎｅ、ｌｕｐ−２０（２９）−ｅｎ−３−ｏｎｅ、タラキセロール、タラキセロン、α−アミロン、β−アミロン、タラキサステロン、フリーデリン、ベツリン、ベツリン酸、コレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エストロゲン、ゲスターゲン、カルデノリド、ブファジエノリド(bufadienolide)、ステロイドアルカロイド、サポニン、サポゲニン、又はアシル化トリテルペンであることが、本発明の宿主細胞に好ましい。本発明の宿主細胞の特定の一実施形態において、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つは、上述のようなグリチルレチン酸ではない。
【０１１３】
また、本発明の方法に関して本明細書に記載されるすべての実施形態は、宿主細胞に適用される実施形態であり、逆もまた同様である。
【０１１４】
また、本発明は、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを製造するための本発明の宿主細胞の使用にある。
【０１１５】
ラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するための、ＣｕＳＯ４を介した転写抑制のため、ＣＴＲ３プロモーター（配列番号４２）を使用することによって、発明者らは、工業プロセス(Paddon et al., 2013)と比較してコストを下げることができた。
【０１１６】
つまり、発明者らは、本明細書にて、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つを合成するための新しいプラットフォームを提供する。例えば、発明者らは、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の過剰発現をもたらすＭＶＡ経路遺伝子ＥＲＧ１３（配列番号１４）及びｔＨＭＧＲ（配列番号３２）の過剰発現、ＲＯＸ１（配列番号２５）の破壊、並びにＣＴＲ３プロモーターを介したＥＲＧ７（配列番号２０）の銅調節性制御を組み合わせた。このプラットフォームにより、本発明の発明者らは、ＭＶＡ経路の生産性を上げるとともに、後期ステロール生合成の代謝の流れを変更して、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生成を最大１２７倍高めることができた。
【０１１７】
例えば、発明者らは、酵母において、ＭＶＡ経路の重要な酵素であるＥＲＧ１３（配列番号１４）及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素１(tHMGR)（配列番号１）を過剰発現させた。同改変段階において、例えば、発明者らは、経路及びステロール生合成の負の調節因子を欠失させ(ROX1)、プッシュプル方法をなして、システムにおいて代謝の流れを高めた。第２の段階において、例えば、発明者らは、この後期ステロール生合成の高めた代謝の流れを、５員環トリテルペンの直接的な前駆物質である２，３−オキシドスクアレンの生成に変更した。この方法により、発明者らは、最大１２７倍の５員環トリテルペン量を生成することができ、ロシアタンポポTaraxacum koksaghyzのルペオール合成酵素である、第２生成物のモデル酵素ＴｋＬＵＰを検出できた。
【０１１８】
これは、一実施形態において、本発明が宿主細胞においてルペオールの生成量を増大させる方法を提供し、該方法は、
タンパク質がメバロン酸を生成可能であるという条件で、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素を過剰発現する、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する該タンパク質を過剰発現するように、
及び、
タンパク質がアセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、メバロナート−５−ホスフェート、メバロナート−５−ピロホスフェート、イソペンテニル−５−ピロホスフェート、ファルネシル−ピロホスフェート、若しくはジメチルアリル−ピロホスフェートの少なくとも１つを生成可能であるという条件で、配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、又は配列番号２、３、４、５、６、７、及び８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも４４％の配列同一性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む該タンパク質を過剰発現するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
ＲＯＸ１（配列番号２５）座位をノックアウトするように、宿主細胞を改変すること、
及び、
タンパク質がラノステロールを生成可能であるという条件で、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する、又は配列番号９と少なくとも３４％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するラノステロール合成酵素(ERG7)を抑制するように、宿主細胞を改変すること、
及び、
T.koksaghyzルペオール合成酵素ＴｋＬＵＰ（配列番号１２）を発現するように、宿主細胞を改変すること、
ルペオールを生成する少なくとも１つの異種タンパク質を発現するように、宿主細胞を改変すること、
ルペオールを発現するように、適切な条件下で該宿主細胞を培養すること、
並びに、ルペオールを精製することで、
改変前の宿主細胞と比較して、ルペオールの生成量を増大させることを含むことを意味する。
【０１１９】
つまり、本発明の実施形態において、例えば５員環トリテルペンの生成を高めるための改変プラットフォームが提供される。例えば、ｔＨＭＧＲ（配列番号３２）及びＥＲＧ１３（配列番号１４）の過剰発現を行った、酵母プラットフォームが提供される。さらに、例えば、ＲＯＸ１（配列番号２５）をノックアウトして、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つ並びに後期ステロール生合成の生産性を高めた。特定の実施形態において、T. koksaghyz ルペオール合成酵素(TkLUP,合成酵素１２)による後期ステロール生合成から５員環トリテルペン合成への代謝の流れが誘導される。ゆえに、例えば、ＣＴＲ３プロモーター(CTR3-P)（配列番号４２）を使用して、銅(Cu2+)の添加の際、ＥＲＧ７（配列番号２０）発現を減少させた。２，３−オキシドスクアレン蓄積におけるさらなる効果は、この実施形態におけるステロール含有量（ラノステロール及びエルゴステロール）の減少による、ＥＲＧ９（配列番号４９）及びＥＲＧ１（配列番号５１）の抑制欠如によって得られ得る。
【０１２０】
本明細書に使用されるとき、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈において明らかに示されない限り、複数形をも含むことが留意される。このように、例えば、「試薬」というとき、１つ以上のそうした種々の試薬を含み、「方法」というとき、本明細書に記載される方法では改変又は置換され得る、当業者に既知の同等のステップ及び方法を指すことを含む。さらに、例えば、「宿主細胞」というとき、それぞれ１つ以上のそうした宿主細胞を含む。同様に、例えば、「方法」又は「宿主細胞」（複数）というとき、それぞれ宿主細胞又は方法（単数）を含む。
【０１２１】
示されない限り、一連の構成要素の前の「少なくとも」という用語は、一連の構成要素すべてを指すと理解される必要がある。当業者は、本明細書に記載の本発明における特定の実施形態の多数の同等形を認識する、又は慣例的な実験のみで把握することができる。そうした同等形は本発明に包含することが意図される。
【０１２２】
本明細書のいずれかの個所に使用される「及び／又は」という用語は、「及び」、「又は」、並びに「該用語で接続された構成要素のすべて、又は任意の他の組合せ」の意味を含む。例えば、Ａ、Ｂ、及び／又はＣは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、及びＡ＋Ｂ＋Ｃを意味する。
【０１２３】
この明細書及び以下の特許請求の範囲において、文脈において必要とされない限り、「含む」という文言、並びに「含む（三人称）」及び「含むこと」などの変形は、記載される構成物又はステップ又は構成物若しくはステップの群を包含することを指し、他の任意の構成物又はステップ又は構成物若しくはステップの群を除外するわけではない、ということを理解する必要がある。本明細書で使用するとき、「含むこと」という用語は、「含有すること」又は「包含すること」という用語と置き換え可能であり、本明細書で使用するとき「有する」という用語で置き換え可能でもある。本明細書で使用するとき、「からなる」は、特定されない任意の構成要素、ステップ、又は成分を除外する。
【０１２４】
「含む」という用語は、「含むがこれらに限らない」ということを意味する。「含む」と「含むがこれらに限らない」とは、互換的に使用される。
【０１２５】
この発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、及び物質など限らず、したがって変わり得るということが理解される必要がある本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみに使用され、特許請求の範囲のみによって規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１２６】
本明細書の文中で引用されたすべての刊行物（すべての特許、特許出願、科学出版物、指導書などを含む）は、上述又は以下に記載を問わず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる記載も、本発明は先の発明を理由にそうした開示に先行する権利が与えられないと認めるものと解釈されるものではない。参照により組み込まれた資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しないところまで、本明細書が任意のそうした資料に代わるものとなる。
【０１２７】
本明細書で使用するとき「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。また、これは具体的な数値、例えば、約２０は２０を含む。
【０１２８】
さらに、本発明の代表的な実施形態を記載する際、本明細書では、本発明の方法及び／又はプロセスを特定のステップのシーケンスとして提示している場合がある。しかしながら、方法又はプロセスが本明細書に記載された特定のステップの順序に基づくものではないところまで、方法又はプロセスが、記載された特定のステップのシーケンスに限定されるべきではない。当業者であれば理解するように、他のステップのシーケンスも可能であり得る。ゆえに、明細書に記載された特定のステップの順序は、特許請求の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。さらに、本発明の方法及び／又はプロセスに関する特許請求の範囲は、記載された順序でそれらのステップを実行することに限定されるべきではなく、当業者であれば、シーケンスが変わってもよく、それでも本発明の趣旨及び範囲内にとどまることを容易に理解することができる。
【０１２９】
本発明及びその利点のより良い理解は、例示目的のためだけに提供される以下の実施例から得ることができる。実施例は、本発明の範囲をいかようにも限定することを意図しない。
【実施例】
【０１３０】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を例示することのみを意図し、本発明の範囲がこれに限定されるものではない。
【０１３１】
［材料と方法］
実施例１：コンストラクトのクローニング
ｐＡＧ４２４Ｇａｌ−ＴｋＬＵＰを生成するため、ＴｋＬＵＰ（配列番号１２）(GenBank MG646375)のコード配列を、fw-プライマー5´-AAA (GTC GAC) TAA AAA AAT GTG GAA GCT GAA AAT AGC-3´（配列番号２３）及びbw-プライマー5´-AAA (CTC GAG) ATA TAT TTT GAA CAA TAC GA-3´（配列番号２４）とともにT. koksaghyzｃＤＮＡでＰＣＲ増幅し、精製、消化、並びにｐＥＮＴＲ３ｃ(Invitrogen, カールスバッド、米国)にライゲーションした。その後、ＴｋＬＵＰコード配列（配列番号１２）を組み換えによってｐＡＧ４２４Ｇａｌ１−ｃｃｄＢ(Alberti et al. 2007; Addgene,ケンブリッジ、米国)に導入した。
【０１３２】
ｐＥＳＣ−ｒｏｘ１−ＫｌＵｒａ３＿ｔＨＭＧＲ／ＥＲＧ１３を生成するため、ＲＯＸ１コード配列（配列番号２５）を、酵母ＤＮＡテンプレートからfw-プライマー5´-AAA (GCG GCC GC)A TGA ATC CTA AAT CCT CTAC-3´（配列番号２６）及びbw-プライマー5´-AAA (GCG GCC GC)T CAT TTC GGA GAA ACT AGG-3´（配列番号２７）（制限部位は丸括弧部分）を用いてＰＣＲ増幅した。さらに、ｐＥＳＣ−Ｕｒａ(Agilent Technologies, サンタクララ、米国)をテンプレートとして使用して、fw-プライマー5´- AAA (GCG GCC GC)C CAG CTG CAT TAA TGA ATC G（配列番号２８）、bw-プライマー5´- AAA (GCG GCC GC)G AAG TTC CTA TTC TCT AGA AA（配列番号２９）を用いてＮｏｔＩ制限部位を含むｐＥＳＣ−Ｕｒａベクターバックボーンを増幅した。両ＮｏｔＩ消化フラグメントをライゲーションして、ｐＥＳＣ−ｒｏｘ１を得た。このベクターをＢｇｌＩＩで消化し、ＫｌＵｒａ３マーカーカセット（配列番号３０）(Gueldener et al., 2002)及びＡｓｉＳＩ／Ｎｂ．ＢｓｍＩ  ＵＳＥＲカセット（配列番号３１）(Hansen et al., 2012)からなる合成ＤＮＡフラグメント(Invitrogen, カールスバッド、米国)を挿入してｐＥＳＣ−ｒｏｘ１−ＫｌＵｒａ３を得た。並行して、ｔＨＭＧＲ（配列番号３２）及びＥＲＧ１３（配列番号１４）のコード配列を、酵母ＤＮＡテンプレートから、ｔＨＭＧＲではfw-プライマー5`- AAA (GGA TCC) AAA AAA ATG GTT TTA ACC AAT AAA AC-3`（配列番号３３）及びbw-プライマー5´- AAA (GTC GAC) TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC（配列番号３４）、並びにＥＲＧ１３ではfw-プライマー5`- AAA (GAA TTC) AAA AAA ATG AAA CTC TCA ACT AAA CTT TG-3´（配列番号３５）及び bw-プライマー5´- AAA (GCG GCC GC)T TAT TTT TTA ACA TCG TAA GAT C-3´（配列番号３６）を用いてＰＣＲ増幅した。得られたフラグメントをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩで消化して、ｐＥＳＣ−Ｕｒａにライゲーションし、ｐＥＳＣ−Ｕｒａ＿ｔＨＭＧＲ／ＥＲＧ１３を生成した。製造者による手順に従って、ＮｏｔＩ制限部位をQuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesisキット(Agilent Technologies, サンタクララ、米国)によって除去した。最終ステップにおいて、ｔＨＭＧＲ（配列番号３２）及びＥＲＧ１３（配列番号１４）コード配列、並びに双方向性Ｇａｌ１／Ｇａｌ１０−プロモーター及びＡＤＨ−１／ＣＹＣ−１ターミネーターを含む発現カセットを、fw-プライマー5´-CGT GCG A{U}T CAG AGC GAC CTC ATG CTA TAC -3´（配列番号３７）及びbw-プライマー5´-CAC GCG A{U}C TTC GAG CGT CCC AAA ACC -3´（配列番号３８）を用いてＰＣＲ増幅し（ＵＳＥＲのためのウラシルベースクローニング、波括弧部分）、ウラシル特異的切除反応(USER)ベースクローニングによって、ＡｓｉＳＩ消化ｐＥＳＣ−ｒｏｘ１−ＫｌＵｒａ３にクローニングした。
【０１３３】
ｐＥＳＣ＿ＥＲＧ７−Ｐ＿ＫｌＬｅｕ２＿ＣＴＲ３−Ｐ＿ＥＲＧ７を生成するため、第１段階にて、それぞれ、ＥＲＧ７フラグメント（配列番号３９）を、fw-プライマー5´- [CAC ATT TAA GGG CTA TAC AAA G]AT GAC AGA ATT TTA TTC TGA CA-3´（配列番号４０）（角括弧部分は重複領域を示す）及びbw-プライマー5´-AAA (GCG GCC GC)C CCA ATA AAC GTA AGA TTA CA-3´（配列番号４１）を用いて酵母ＤＮＡで増幅し、ＣＴＲ３プロモーターフラグメント（配列番号４２）を、fw-プライマー5´- AAA (GCG GCC GCC AGC TG)A A(GG ATC C)GG TAT TCC AAT GAG AAT CGC-3´（配列番号４３）及びbw-プライマー5´-[TGT CAG AAT AAA ATT CTG TCA T]CT TTG TAT AGC CCT TAA ATG T-3´（配列番号４４）を用いて増幅した。両フラグメントを、オーバーラップＰＣＲによってＣＴＲ３プロモーターｆｗ−プライマー（配列番号４３）及びＥＲＧ７−ｂｗプライマー（配列番号４１）に融合させ、ＮｏｔＩ消化させて、ＮｏｔＩ消化ｐＥＳＣ−Ｕｒａベクターバックボーンにライゲーションして、ｐＥＳＣ＿ＣＴＲ３−Ｐ＿ＥＲＧ７を得た。第２段階において、上流ＥＲＧ７−プロモーターフラグメント（配列番号４５）を、fw-プライマー5´-AAA (CAG CTG) AAT CTG CTG CTA TTC GTG-3´（配列番号４６）及びbw-プライマー5´-AAA (GGA TCC CCT GCA GG)C GCT GCA GGT CGA CAA C-3´（配列番号４７）を用いて酵母ＤＮＡでＰＣＲ増幅し、ＰｖｕＩＩ／ＢａｍＨＩ制限部位を介してライゲーションして、ｐＥＳＣ＿ＥＲＧ７−Ｐ＿ＣＴＲ３−Ｐ＿ＥＲＧ７を得た。最終段階において、ＫｌＬｅｕ２栄養要求性カセット（配列番号４８）(Gueldener et al., 2002)を含む合成ＤＮＡフラグメント(Invitrogen, カールスバッド、米国)を、ＳｂｆＩ／ＢａｍＨＩ制限部位にライゲーションして、ｐＥＳＣ＿ＥＲＧ７−Ｐ＿ＫｌＬｅｕ２＿ＣＴＲ３−Ｐ＿ＥＲＧ７を得た。
【０１３４】
すべてのコンストラクトを、ABI PRISM 3100ジェネティックアナライザ(Applied Biosystems, フォスターシティ、米国)においてシーケンシングによって検証した。酵母株ＣＥＮ．ＰＫ２−１ＣをEUROSCARF(オーバーウルゼル、独国)から得た。New England Biolabs GmbH (フランクフルト、独国)から制限酵素を得た。
【０１３５】
実施例２：株作製と培養条件
S. cerevisiae株ＣＥＮ−ＰＫ２−１Ｃを、選択マーカーとしてウラシル(pCFB255_rox1_KlUra3_tHMGR/ERG13, 配列番号１１)、ロイシン(pCFB255_ERG7-P_KlLeu2_CTR3-P_ERG7, 配列番号１０)、及びトリプトファン(pAG424Gal-TkLup)を用いて酢酸リチウム法(Gietz 2007)によって形質転換した。安定して酵母ゲノムに組み込むため、ｐＣＦＢ２５５＿ｒｏｘ１＿ＫｌＵｒａ３＿ｔＨＭＧＲ／ＥＲＧ１３（配列番号１１）及びｐＣＦＢ２５５＿ＥＲＧ７−Ｐ＿ＫｌＬｅｕ２＿ＣＴＲ３−Ｐ＿ＥＲＧ７（配列番号１０）をＮｏｔＩ消化してプラスミドのバックボーンを除去した。細胞を最小合成培地(SD培地, Clontech, マウンテンビュー、米国)にプレーティングし、３０℃で増殖させた。必要な場合組込みコンストラクトの両側のプライマーを用いてコロニーＰＣＲによって、クローンを健常性について確認した。
【０１３６】
ガラクトース誘導遺伝子の発現のため、単一のコロニーを取り出し、５ｍＬのＳＤ培地に播種して、回転させながら一晩３０℃で培養した。この培養物から、５０ｍＬの新しいＳＤ培地（ＥＲＧ７（配列番号２０）の発現を抑制する場合150μM CuSO4を含む）を、１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの最終細胞密度まで加え、２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコにおいて３０℃及び１４０ｒｐｍで増殖させた。培養物が、０．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に達すると、培地を、グルコースではなくガラクトースを含むＳＤ培地に交換して、遺伝子発現を誘導した。４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度に達するまで酵母を増殖させ、遠心分離(10分,1000 xg)によって採取した。
【０１３７】
実施例３：スクアレン及びトリテルペンの抽出及び測定
酵母代謝物の抽出は、Rodriguez等(2014)のプロトコルに従って行った。手短に説明すると、凍結乾燥酵母細胞は、メタノール中の１ｍＬの６％[w/v]ＫＯＨ(Roth,カールスルーエ、独国)及び１００μｇのコレステロール（内部標準物質として、Sigma, セントルイス、米国）を各サンプルに添加後、８０℃の温浴で５分間インキュベートした。メタノール混合物から代謝物を抽出するため、２ｍｌのｎ−ヘキサン(Roth, カールスルーエ、独国)を３段階で、ボルテックス後に添加した。上部相を新しいバイアルに移し、ｎ−ヘキサンを蒸発させて除去した。その後、サンプルを１ｍＬのアセトン(Roth, カールスルーエ、独国)に再溶解し、ＧＣ−ＭＳを行った。ＧＣ−ＭＳ分析を、３０ｍ  Ｒｔｘ−５ＭＳカラムを備えたＧＣ−ＭＳ−ＱＰ  ２０１０  Ｕｌｔｒａ(Shimadzu, デュースブルク、独国)で行い、温度グラジエント（120-330°C; 21°C per min; 圧力: 58,8 kPa）を、１２０℃で１分の保持時間、その後３３０℃で１０分間の保持時間後に用いた。イオン質量43m/z、55m/z、69m/z、95m/z、109m/z及び189m/z、204m/z、207m/z、218m/z、271m/z、285m/z、411m/zによって分子を検出した。それぞれLabSolutionソフトウエア(Shimadzu, デュースブルク、独国)及びNISTライブラリによって、ピーク積分及び同定を行った。検出した物質のトータルイオンカレント(TIC)を、内部標準物質に由来するコレステロール及び使用したサンプルの乾燥重量に対してノーマライズした。２つのサンプルのｔ検定をｐ＜０．０５で用いて、結果の統計的有意性を確認した。
【０１３８】
実施例４：T. koksaghyzのルペオール合成酵素としてのＴｋＬＵＰの同定
提示した酵母システムのモデル酵素として、ゴム産生タンポポTaraxacum koksaghyz由来のルペオール合成酵素を選んだ（図６参照）。T. officinaleのルペオール合成酵素であるＴＲＸの増幅に用いるプライマーにより(Shibuya et al., 1999)、７５９アミノ酸をコードする（配列番号１２）T. koksaghyz(GenBank受託番号MG646375)のｃＤＮＡの２２７７ｂｐのＯＲＦを増幅することができた。この配列は、記載のルペオール合成酵素と９９．３％のアミノ酸配列類似性を有するので、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ制限部位を介してｐＥＮＴＲ３ｃにクローニングした。ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ酵母株(WT)にて発現させるため、アドバンスドゲートウェイデスティネーションベクターシステム(pAG-ベクターシステム)を用い、得られた配列を、ＧＡＬ１プロモーターの制御下での発現を可能にするｐＡＧ４２４ＧＡＬ１−ｃｃｄＢに組み換えた。コンストラクトの概略図を図６ａに示す。空のべクターｐＡＧ４２４ＧＡＬ１−ｃｃｄＢは、発現実験においてベクターコントロールとした。培養及びトリテルペン抽出後、２つのさらなるｍ／ｚ２１８フラグメントが、推定ルペオール合成酵素配列（配列番号１２）を有する３つの個別の形質転換体からの抽出物のＧＣ−ＭＳ測定において同定できた（図６ｂ参照）。これらのピークは、ＷＴでもベクターコントロールサンプルでも同定できなかった。検出フラグメントの保持時間がβ−アミリン及びルペオール標準物質において測定される保持時間に適合するので(Extrasynthese, ジュネ,仏国;図１ｂ)、得られたフラグメントは、微量の定量不可能な量のβ−アミリンの蓄積、及び０．１６ｍｇ／ｇＣＤＷのルペオールの蓄積を示すと推測した（図６ｃ）。配列相同性と、おそらくルペオールを示す主要な同定ピークとにより、得らえた配列は、ＴｋＬＵＰという名称のT. koksaghyzからのルペオール合成酵素（配列番号１２）をコードすると結論付けた。
【０１３９】
実施例５：ＲＯＸ１の欠失とｔＨＭＧＲ及びＥＲＧ１３の過剰発現によりルペオール蓄積が１６．５倍高まる
酵母における推定ルペオールの生成をさらに高めるため、以前に異種酵母システムにおいてイソプレノイド生成量を高めることを示した酵母メバロナート経路遺伝子を過剰発現させることにした(Kirby et al., 2008; Asadollahi et al., 2010; Paddon et al., 2013)。ＨＭＧ１は経路の重要な酵素であり、フィードバック機構による厳密な制御の基盤となるので、ユビキチン化信号欠如のためフィードバック機構の基盤とならないトランケート形態（tHMGRと呼ぶ）（配列番号３２）を過剰発現させた(DeBose-Boyd, 2008)。一方で、イソプレノイド生合成に正の効果を有することも示されているＥＲＧ１３（配列番号１４）を過剰発現させることを選択した(Yuan et al.,2014)。さらに経路をディレギュレート／アップレギュレートするため、発明者らは、メバロナート経路及び後期ステロール生合成の負の調節因子として記載されるＲＯＸ１（配列番号２５）をノックアウトすることを考え(Henry et al., 2002; Montanes et al., 2011; Ozaydin et al., 2013; Jakociunas et al., 2015)、後期ステロール生合成を高めることによるスクアレンのダウングレード向上に関して、メバロナート経路自体をディレギュレートすることによってメバロナート経路における流れを高めることを狙いとした。これらの段階を組み合わせるため、双方向性ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下でｔＨＭＧＲ（配列番号３２）及びＥＲＧ１３（配列番号１４）を発現させることを選択し、過剰発現カセットをｒｏｘ１（配列番号２５）座位に組み込んで、ノックアウトさせた。したがって、ＮｏｔＩ消化ｐＣＦＢ２５５＿ｒｏｘ１＿ＫｌＵｒａ３＿ｔＨＭＧＲ／ＥＲＧ１３（配列番号１１）からもたらされるフラグメントで、ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ酵母細胞を形質転換した（図７ａ）。予期されるように、組込み遺伝子の発現及びｒｏｘ１（配列番号２５）のノックアウト後、ＴｋＬＵＰ配列（配列番号１２）のみを有する細胞と比較して、コンストラクト及びＴｋＬＵＰ配列（配列番号１２）を有する酵母において、スクアレンの有意な８．２倍の蓄積向上を検出できた（図７ｂ）。さらに、指定したルペオールの蓄積において、１６．５倍の増加が見受けられ（図７ｂ）、ラノステロール含有量の３．６倍の増加を観察できた（以下の表１参照）。
【０１４０】
以前に記載されたデータのとおり、酵母細胞は、誘導後及び細胞回収前に細胞密度（材料及び方法の項に記載）に達するためにより長い時間を必要としたので、わずかに少ない増殖を示すものであり、これは細胞に毒性のある高レベルスクアレンの結果として起こり得るものであった(Donald et al., 1997; Asadollahi et al., 2010)。しかしながら、この改変ステップは、測定ルペオール標準物質の質量スペクトル（図７ｄ）に対する推定ルペオールピークの質量スペクトル（図７ｃ）の比較を可能にした。同等のピーク質量は、観察されたコード配列がT. koksaghyzのルペオール合成酵素をコードするという本発明の発明者らの推測をはっきりと示す。推定β−アミリンピークは、詳しい質量分析にはなお非常に弱いものであった。
【０１４１】
ＴｋＬＵＰ（配列番号１２）の基質である２，３−オキシドスクアレンではなく５員環トリテルペン前駆物質スクアレンの蓄積を観察することができたので、経路のこの時点でのボトルネックが観察された。このボトルネックは、ＥＲＧ９と比較したＥＲＧ１の低い能力のため(Asadohalli et al., 2010により提示)、及びＴｋＬＵＰ自体の２，３−オキシドスクアレンに対する高活性のため、又は内在性後期ステロール生合成の活性のため起こり得る。この制限要因を克服するため、ＥＲＧ１（スクアレンから２，３−オキシドスクアレンへの反応を触媒する、酵母スクアレンエポキシダーゼをコードする）の過剰発現が考えられるが、２，３−オキシドスクアレンの蓄積がＥＲＧ１を過剰発現する酵母株において観察できなかったので、５員環トリテルペン生成向上には適切ではない(Veen et al., 2003)。ゆえに、発明者らは、内在性だが競合性の後期ステロール生合成に影響を与える後期ステロール生合成の開始点である、ＥＲＧ７（配列番号２０）をダウンレギュレートした。
【０１４２】
実施例６：ＣＴＲ３プロモーターを介したＥＲＧ７（配列番号２０）の抑制は、２，３−オキシドスクアレンの蓄積、さらに７．６倍向上したルペオール蓄積をもたらす
必須の後期ステロール生合成におけるノックアウトは、致死性酵母株をもたらし、ＥＲＧ１の過剰発現は、５員環トリテルペン生成において２，３−オキシドスクアレン蓄積を高めるのに十分ではないので、発明者らは、２，３−オキシドスクアレン合成のボトルネックを克服するためＥＲＧ７（配列番号２０）を抑制して、後期ステロール生合成からルペオール生成への代謝の流れを変更した。ゆえに、内在性ＥＲＧ７コード配列（配列番号２０）の前に銅輸送体の７３５ｂｐプロモーターフラグメント(CTR3)（配列番号４２）を挿入し、同段階において、内在性コアプロモーターの１９６ｂｐフラグメントを欠失させることを選択した（図８ａ）。挿入したＣＴＲ３プロモーターフラグメント（配列番号４２）では、２つのシスエレメント(TTTGCTC, 銅応答エレメント、略語はCuRE)がＣｕＳＯ４の存在下において遺伝子発現低下の原因となることが示された(Labbe et al., 1997)。さらに、ＣＴＲ３プロモーターフラグメント（配列番号４２）は、アルテミシニン生成を高めるためＥＲＧ９（配列番号４９）を抑制するように適切に使用して、この工業プロセスにおいてコストを下げ、著述者らの以前の研究に使用されたＭＥＴ３プロモーター（配列番号５０）との同等性を示した(Paddon et al., 2013)。
【０１４３】
コンストラクトの効果をテストするため、選択マーカーとしてＫｌＬｅｕ２及びＣＴＲ３プロモーターフラグメント（配列番号４２）を含むｐＣＦＢ２５５＿ＥＲＧ７−Ｐ＿ＫｌＬｅｕ２＿ＣＴＲ３−Ｐ＿ＥＲＧ７（配列番号１０）のＮｏｔＩ消化フラグメントを、ｐＣＦＢ２５５＿ｒｏｘ１＿ＫｌＵｒａ３＿ｔＨＭＧＲ／ＥＲＧ１３（配列番号１１）を有する酵母株に形質転換させた。正の形質転換体を０μＭ、１５０μＭ、及び３７５μＭのＣｕＳＯ４の存在下で培養し、ｔＨＭＧＲ（配列番号３２）及びＥＲＧ１３（配列番号１４）の遺伝子発現をガラクトースで誘導して、酵母においてスクアレンから２，３−オキシドスクアレンの蓄積への変化をもたらした（図８ｂ）。銅の欠如下においても、抽出したＧＣ−ＭＳサンプルにおいて２，３−オキシドスクアレンのわずかな蓄積を検出でき、内在性ＥＲＧ７プロモーター（配列番号４５）と比較してより弱いＣＴＲ３フラグメント（配列番号４２）のプロモーター活性を示す。１５０μＭのＣｕＳＯ４の存在下で増殖させた酵母において、この効果はさらに強いものであった。２，３−オキシドスクアレンの蓄積が４．７倍高まると(p=0.00507)、スクアレンの量は有意に減少し(p=0,00613)、これは、エルゴステロールによるＥＲＧ９（配列番号４９）及びＥＲＧ１（配列番号５１）の抑制の欠如、並びに限定的なラノステロール条件下でのＥＲＧ１（配列番号５１）の誘導の向上に起因し得る(表１; M´Baya et al., 1989)。３７５μＭの上昇銅濃度における酵母の培養後、スクアレンレベルにおけるさらなる有意な減少(p=0.00061)を観察することができた。しかしながら、２，３−オキシドスクアレンの有意な変化は観察できなかったものの、酵母は増殖速度の低下を示して、２，３−オキシドスクアレン合成のボトルネックを克服するため高レベルのＣｕＳＯ４の毒性及び１５０μＭのＣｕＳＯ４の存在下でのＥＲＧ７（配列番号２０）の有意な抑制を示した。このように、発明者らは、ｒｏｘ１：：ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲ  ＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ１３（配列番号１１）Ｐｅｒｇ７Δ：：ＰＣＴＲ３（配列番号１０）と、ＴｋＬｕｐのコード配列（配列番号１２）又はコントロールをなすｐＡＧ４２４ＧＡＬ１＿ｃｃｄＢの空のプラスミドとを組み合せた株におけるルペオールの生成を高めるため十分な量の銅をとして、１５０μＭのＣｕＳＯ４濃度を選択した。
【０１４４】
予期されるように、３つのコンストラクトを有するとともに銅の存在下で培養した酵母株は、ＣＴＲ３プロモーターフラグメント（配列番号４２）を欠失するその親株と比較してスクアレン及び２，３−オキシドスクアレンのレベルの変化を示した。ゆえに、スクアレンの蓄積は２．６倍少なく(p=0.04422)、２，３−オキシドスクアレンの蓄積を観察することができた。さらに、ラノステロール(6.5倍; p = 0.02384)及びエルゴステロール(3.9倍; p=0.00941)で示されるステロール量の減少を検出でき、ＴｋＬＵＰ（配列番号１２）を発現する株におけるこれらの化合物による銅抑制の機能、並びにＥＲＧ９（配列番号４９）及びＥＲＧ１（配列番号５１）の調節を示した。さらに、銅抑制プロモーターの使用によるルペオール蓄積のさらなる向上を検出でき、測定サンプル（図１０ａ）及びβ−アミリン外部標準物質（図１０ｂ）のＭＳスペクトルの比較で見られることからβ−アミリンの同定が可能になった。ルペオールレベルは７．６倍増加する(p=0.00637)一方、β−アミリンの定量はなお可能ではなかった。しかしながら、２，３−オキシドスクアレン及びルペオールの蓄積、並びにステロール量の減少は、この改変酵母株においてステロール生合成からルペオール生成へと代謝の流れを変更したことを示す。
【０１４５】
表１は、ＧＣ−ＭＳにより定量したｇ／ｇＣＤＷにおけるＷＴ及び改変酵母株の代謝物レベルを示す。
【表１】
2021520806.tif 000002
2021520806.tif 000003
【０１４６】
ｇ／ｇＣＤＷ（±標準偏差）。標準偏差は、スチューデントｔ検定によってｎ＝３の個々の形質転換体からを計算した。ｎ．ｄ．＝検出不可能。ＣＤＷは細胞乾燥重量。
【０１４７】
実施例７：ＨＰＬＣによるトリテルペン精製
ＵＶ検出器(SPD-M20A)及びフラクションコレクター(FRC-10A)に接続されたShimadzu LC20A HPLCシステム(Shimadzu, デュースブルク、独国)を用いてセミ分取ＨＰＬＣを行った。ＵｌｔｒａＣ１８カラム(250 x 21.2 mm, 粒径: 5 μm, Restek GmbH, バート・ホムブルク、独国)及び１０ｍｌ／ｍｉｎの流量で溶媒としてメタノールを使用して、トリテルペンを分離した。カラムオーブン温度を４０℃に設定した。２０５ｎｍで検出を行い、トリテルペンフラクションを収集し、Ｒｏｃｋｅｔエバポレーターシステム(Thermo Fisher Scientific)を使用して乾燥させ、アセトンに溶解して、ＧＣ−ＭＳによって分析した。第２の固定相として、Ｕｌｔｒａビフェニルカラムを使用した(250 x 21.2 mm, 粒径:5 μm, Restek GmbH, バート・ホムブルク、独国)。カラムオーブン温度を４０℃に設定し、トリテルペンを、以下の溶出プロファイルを用いて、８ｍｌ／ｍｉｎの流量でメタノール(A)及び水(B)のグラジエントにおいて分離した：０〜２５分、アイソクラティック90% A；２５〜７１分、リニア90%〜100% A；７１〜７５分、アイソクラティック100% A；その後カラム再平衡化：７５〜７６分、リニア100%〜90% A；７６〜８５分、アイソクラティック90% A。
【０１４８】
［化学分析］
トリテルペンを、上述のようにＣＧ−ＭＳによって定量及び同定した(Putter et al., 2017)。
【０１４９】
上述の方法によって、発明者らは、T. koksaghyzの根の天然ゴムアセトン抽出物における５員環トリテルペノイド組成物の詳しい分析を行うことができた。単一のトリテルペノイドのＨＰＬＣベース精製により、新しい５員環トリテルペンｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｌ、及び、その対応する５員環トリテルペノイドケトンｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｎｅを同定できた。
【０１５０】
Taraxacum koksaghyz天然ゴムアセトン抽出物はトリテルペン組成物を明らかにする
主要な成分ポリ（ｃｉｓ−１，４−イソプレン）を除いて、天然ゴムは、ポリマーの物性に影響を与えるタンパク質、脂肪酸、及びトリテルペンといったさらなる物質を含む(Xu et al., 2017)。ＮＲ特性に関与する単一のトリテルペンの詳しい全体像を得るため、溶媒としてアセトンを用いてT. koksaghyz NRから脂質フラクションを抽出した。アセトン抽出物をＨＰＬＣによってＣ１８カラムで分離し、２０５ｎｍでＵＶ検出を使用して７つの主要なフラクションを観察することができた（図１２ａ）。これらを収集して、その後ＧＣ−ＭＳによって分析した。７つのフラクションのうち３つにおいて、フラクションＦ１のルペオール(lup-20(29)-en-3-ol)、Ｆ４のタラキサステロール及びβ−アミリン、並びにＦ６のα−アミリンを含む、Taraxacum種の根に非常に豊富であると記載される(Post et al. 2012)種々の５員環トリテルペンを検出できた。アルコールに加え、これらの４つの５員環トリテルペンのケトン誘導体、すなわちＦ２のルペノン(lup-20(29)-en-3-one)、Ｆ５のタラキサステロン及びβ−アミロン、並びにＦ７のα−アミロンも３つのフラクションで同定された。さらに、２つのフラクション(F3及びF5)において、Taraxacum種の根材に存在するとして以前に記載されている２つのステロール化合物、スチグマステロール及びシトステロールを検出した(Post et al. 2012)。
【０１５１】
ＨＰＬＣに第２の固定相（ビフェニルカラム）を用いて、本発明の発明者らは、図１２ｂのＦ４及びＦ５に示すように単一のトリテルペンを互いからさらに分離することができた。タラキサステロール及びβ−アミリンに加えて、現在のところ未知の第３のトリテルペンが、Ｆ４において検出でき、Ｆ５において対応するケトンを検出できた(GC-MSデータは図１２ｃにおいてβ−アミリン、タラキサステロール、及びそれらのケトンを例示的に示す)。約１．５ｍｇのトリテルペン純物質と、０．３ｍｇの対応するケトンを、ＮＭＲ分析のため精製し、現在未知の５員環トリテルペンｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｌ、及びその対応する５員環トリテルペノイドのケトンｌｕｐ−１９（２１）−ｅｎ−３−ｏｎｅを同定した（図１２ｄ）。
【０１５２】
アセトン抽出物にて見つかったすべてのトリテルペノイドを以下の表２にまとめる。
【０１５３】
フラクションＦ２、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６、及びＦ７において、さらなる微量の化合物を検出し、それらのＧＣ−ＭＳプロファイルによりトリテルペノイドとして分類することができたが、これらの化合物のうちの８つにおける詳しい分子構造は未だ未知である。単一のトリテルペンの量が限定的であるため、ＮＭＲ分析は行えなかった。
【０１５４】
表２は、ＮＲアセトン抽出物において同定し、Ｃ１８ＨＰＬＣフラクションにおけるその発生に従って分類したトリテルペノイドを示す。
【表２】
2021520806.tif 000004
【０１５５】
本明細書において、本発明の発明者らは、酵母などの異種システムにおいて、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つ、例えば５員環トリテルペンを生成するための新しいプラットフォームを確立した。したがって、T.koksaghyz（配列番号１２）のルペオール合成酵素は、モデル酵素として使用されている。
【０１５６】
このプラットフォームは、例えばメバロナート経路遺伝子の過剰発現と好ましくは該経路及び後期ステロール生合成の負の調節因子の欠失を含む、プッシュプル方法に基づく。さらに、発明者らは、銅調節プロモーターによって、ラノステロールの形成で開始する後期ステロール生合成から、直接的な５員環トリテルペン前駆物質２，３−オキシドスクアレンの生成へ代謝の流れを変更することで、例えば５員環トリテルペン生成を高めることができた。
【０１５７】
一実施形態において、発明者らは、ＭＶＡ経路遺伝子ＥＲＧ１３（配列番号１４）及びｔＨＭＧＲ（配列番号３２）を過剰発現することを選択した。ＨＭＧＲは経路の重要な段階を触媒し、そのディレギュレーション形態ｔＨＭＧＲとして、種々の酵母プラットフォームにおいてスクアレン蓄積及びイソプレノイド生成量を高めるように使用されている(Kirby et al., 2008; Asadohalli et al., 2010; Westfall et al., 2011; Scalcinati et al., 2012; Paddon et al., 2013; Lv et al., 2014; Yuan et al., 2014; など)。記載の過剰発現カセットの組込み部位として、本発明の一実施形態においてｒｏｘ１（配列番号２５）座位を選択し、メバロナート経路及び後期ステロール生合成におけるこの負の調節因子をノックアウトさせた(Henry et al., 2002; Montanes et al., 2011; Ozaydin et al., 2013; Jakociunas et al., 2015)。ノックアウトは、ディレギュレートした後期ステロール生合成のスクアレン消費向上に起因する、メバロナート経路のその後の部分へのスクアレンのダウングレードに関して、概してメバロナート経路のアップレギュレートをもたらす。この方法によって、スクアレン、ラノステロール、エルゴステロール、及びルペオールの蓄積を高めて（図７ｂ及び表１）、この方法及びコンストラクトの機能について証明することができた。
【０１５８】
５員環トリテルペン合成の直接的な前駆物質分子である２，３−オキシドスクアレンの蓄積を観察できなかったので、発明者らは、内在性ＥＲＧ７プロモーター（配列番号４５）を銅抑制性ＣＴＲ３−プロモーター（配列番号４２）に置き換えることで、後期ステロール生合成から５員環トリテルペン生成へと代謝の流れを変更した(Labbe et al., 1997)。つまり、２，３−オキシドスクアレンの蓄積の欠如には２つの理由がある。第１に、ＥＲＧ９（配列番号５３）と比較したＥＲＧ１（配列番号５２）の低い能力(Asadohalli et al., 2010により提示)、第２に、ＥＲＧ７（配列番号９）消費によるラノステロール(Veen et al., 2003)、及び／又はこの場合ＴｋＬＵＰ（配列番号１２）の消費による５員環トリテルペンへの急速な反応である。
【０１５９】
本発明の発明者らは、本発明の一実施形態において、使用したスクアレン及び５員環トリテルペン蓄積酵母株において内在性ＥＲＧ７（配列番号２０）を抑制すると、スクアレンレベルの減少及び２，３−オキシドスクアレンの蓄積を検出することができた。一方で、この蓄積はＥＲＧ７（配列番号２０）自体の発現低下により起こり得るが、ＥＲＧ１（配列番号５１）及びＥＲＧ９（配列番号４９）の調節機構もこの知見に寄与し得る。発明者らは、この特定の実施形態において、エルゴステロール及びラノステロールのレベル低下を検出したので、記載される負のフィードバックループのディレギュレートはまた、酵母スクアレン合成酵素及びスクアレンエポキシダーゼをコードするＥＲＧ９（配列番号４９）及びＥＲＧ１（配列番号５１）の発現向上に寄与し得る。ゆえに、ステロール量の減少は、限定的なエルゴステロールレベルにより、ＥＲＧ９（配列番号４９）及びＥＲＧ１（配列番号５１）の抑制の欠如こと、及びラノステロール由来の抑制の欠如によるＥＲＧ１（配列番号５１）の発現向上につながり得る(M´Baya et al., 1989)。しかしながら、本発明の発明者らは、多数の直接的なＴｋＬＵＰ（配列番号１２）基質を提供することで、例えば、ルペオールの蓄積をさらに高めることができ、さらに、β−アミリンとしてそれぞれのＣＧ−ＭＳスペクトルにおいて現在のところ未知のピークを同定することができた。
【０１６０】
つまり、本発明の発明者らは、例えば５員環トリテルペン合成などの、オキシドスクアレン、トリテルペン、及び／又はトリテルペノイドの少なくとも１つの生産性を最大１２７倍高めることができた。さらに、本発明者らは、例えば、本発明に使用されるモデル酵素ＴｋＬＵＰ（配列番号１２）により合成された第２の５員環トリテルペン（β−アミリン）を特徴づけることができた。
【０１６１】
さらに、本発明の発明者らは、例えば、T.koksaghyz植物材料からのトリテルペン混合物について例示的に示される、第１のクロマトグラフィーステップのＣ１８カラム、及び第２のクロマトグラフィーステップのビフェニルカラムを使用して、単一のトリテルペンを精製することができた。
【０１６２】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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