(57)【要約】本明細書に記載の技術は、例えば、本明細書に記載の1つまたは複数のバイオマーカーを使用して病変のサブタイプを判定することによって、気管支前悪性病変を処置および診断する方法に関する。2021536434.tif 000130
2021536434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル、および
非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル
のうちの少なくとも1つを有すると判定された対象に対して、
(i) 中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方、
(ii) 少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの一方、ならびに／または
(iii) 少なくとも1つの抗増殖薬
のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法。
【請求項２】
少なくとも1つのモジュール5遺伝子が、RACGAP1およびTPX2からなる群より選択され、
少なくとも1つのモジュール6遺伝子が、NEK11およびIFT88からなる群より選択される、
請求項1記載の方法。
【請求項３】
対象が、上昇した少なくとも1つのモジュール7またはモジュール4の遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
少なくとも1つのモジュール7またはモジュール4の遺伝子が、COX6A1、COX7A2、RPL26、およびRPL23からなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
表15の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1つの抗増殖薬が、アセチルコリン受容体拮抗薬；アセチルコリンエステラーゼ阻害薬；アデノシン受容体拮抗薬；アドレナリン作動性受容体拮抗薬；AKT阻害薬；アンジオテンシン受容体拮抗薬；アポトーシス刺激薬；オーロラキナーゼ阻害薬；CDK阻害薬；シクロオキシゲナーゼ阻害薬；サイトカイン産生阻害薬；デヒドロゲナーゼ阻害薬；DNAプロテインキナーゼ阻害薬；接着斑阻害薬；ドーパミン受容体拮抗薬；EGFR阻害薬；ERK1およびERK2のリン酸化阻害薬；エストロゲン受容体作動薬；EZH2阻害薬；FLT3阻害薬；グルココルチコイド受容体作動薬；グルタミン酸受容体拮抗薬；HDAC阻害薬；ヒスタミン受容体拮抗薬；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害薬；HSP阻害薬；IKK阻害薬；イオンチャネル拮抗薬；JAK阻害薬；JNK阻害薬；KIT阻害薬；ロイシンリッチリピートキナーゼ阻害薬；MDM阻害薬；メディエータ放出阻害薬；MEK阻害薬；MTOR阻害薬；モノアミンオキシダーゼ阻害薬；NFkB経路阻害薬；ヌクレオホスミン阻害薬；PARP阻害薬；PPAR受容体作動薬；PI3K阻害薬；チロシンキナーゼ阻害薬；ホスホジエステラーゼ阻害薬；プロテインキナーゼ阻害薬；RAF阻害薬；RNAポリメラーゼ阻害薬；トポイソメラーゼ阻害薬；RNA合成阻害薬；SIRT阻害薬；ナトリウムチャネル遮断薬；VEGFR阻害薬；ならびにビタミンD受容体作動薬からなる群より選択される、
請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
抗増殖薬が、吸入製剤または局所製剤として投与される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
抗増殖薬が、気管支鏡に基づく手技中に投与される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
抗増殖薬が、全身的に投与される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
抗増殖薬が、気管支鏡に基づく手技中にかつ全身的に投与される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
対象が、非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると判定された対象に対して、
(i) 中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンの両方、
(ii) 少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンのうちの一方、ならびに／または
(iii) 少なくとも1つの免疫刺激薬
のうちの少なくとも1つを施す、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると判定された対象に対して、
(i) 中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンの両方、
(ii) 少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンのうちの一方、ならびに／または
(iii) 少なくとも1つの免疫刺激薬
のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法。
【請求項１４】
モジュール9遺伝子が、EPSTI1、UBE2L6、B2M、およびTAP1からなる群より選択される、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1つの遺伝子モジュール9遺伝子が、表16から選択される、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
モジュール10遺伝子が、CACNB3およびMAPK10からなる群より選択される、請求項11〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも1つの免疫刺激薬が、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、PD-1、PD-L1、CTLA4、およびLAG3に対する阻害薬）；インターフェロンシグナル伝達を刺激する薬（例えば、インターフェロンシグナル伝達を改善する抗ウイルス薬）；DNA合成阻害薬；IMDH阻害薬；CDK阻害薬；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬；トポイソメラーゼ阻害薬；FLT3阻害薬；IGF-1阻害薬；MEK阻害薬；オーロラキナーゼ阻害薬；PKC阻害薬；RAF阻害薬；PDFGR/KIT阻害薬；VEGFR阻害薬；SRC阻害薬；レチノイド受容体作動薬；HDAC阻害薬；DNAメチルトランスフェラーゼ阻害薬；およびEZH2阻害薬からなる群より選択される、
請求項11〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
非炎症性の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベル、および
非炎症性の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル
のうちの少なくとも1つを有すると判定された対象に対して、
(iv) 中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方、
(v) 少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの一方、ならびに／または
(vi) 少なくとも1つの抗炎症薬
のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法。
【請求項１９】
少なくとも1つのモジュール2遺伝子が、MSANTD2、CCNL2、およびLUC7Lからなる群より選択され、
少なくとも1つのモジュール6遺伝子が、NEK11およびIFT88からなる群より選択される、
請求項17記載の方法。
【請求項２０】
対象が、上昇した少なくとも1つのモジュール7遺伝子、モジュール1遺伝子、もしくはモジュール8遺伝子の発現レベルおよび／または低下した少なくとも1つのモジュール4遺伝子もしくは1つのモジュール5遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される、請求項17または18記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも1つのモジュール7遺伝子が、RPL26およびRPL23からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも1つのモジュール1遺伝子が、KIRREL、PHLDB1、およびMARVELD1からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも1つのモジュール8遺伝子が、DOC2、CD53、およびLAPTMからなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも1つのモジュール4遺伝子が、COX6A1およびCOX7A2からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも1つのモジュール5遺伝子が、RACGAP1およびTPX2からなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
表15の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される、請求項17〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1つの抗炎症薬が、アセチルコリン受容体拮抗薬；アセチルコリンエステラーゼ阻害薬；アデノシン受容体拮抗薬；アドレナリン作動性受容体拮抗薬；アンジオテンシン受容体拮抗薬；抗IL1B抗体；アポトーシス刺激薬；オーロラキナーゼ阻害薬；CDK阻害薬；シクロオキシゲナーゼ阻害薬；サイトカイン産生阻害薬；デヒドロゲナーゼ阻害薬；ドーパミン受容体拮抗薬；EGFR阻害薬；ERK1およびERK2のリン酸化阻害薬；エストロゲン受容体作動薬；FLT3阻害薬；グルココルチコイド受容体作動薬；グルタミン酸受容体拮抗薬；HDAC阻害薬；ヒスタミン受容体拮抗薬；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害薬；HSP阻害薬；IKK阻害薬；イオンチャネル拮抗薬；KIT阻害薬；ロイシンリッチリピートキナーゼ阻害薬；MEK阻害薬；MDM阻害薬；ホスホジエステラーゼ阻害薬；モノアミンオキシダーゼ阻害薬；MTOR阻害薬；NFkB経路阻害薬；ヌクレオホスミン阻害薬；PARP阻害薬；PI3K阻害薬；PPAR受容体作動薬；タンパク質合成阻害薬（例えば、クロラムフェニコール）；RAF阻害薬；SIRT阻害薬；ナトリウムチャネル遮断薬；TGFβ受容体阻害薬；トポイソメラーゼ阻害薬；チロシンキナーゼ阻害薬；VEGFR阻害薬；ならびにビタミンD受容体作動薬からなる群より選択される、
請求項17〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
抗炎症薬が、気管支鏡に基づく手技中に投与される、請求項17〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
抗炎症薬が、全身的に投与される、請求項17〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
抗炎症薬が、気管支鏡に基づく手技中にかつ全身的に投与される、請求項17〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも1つの遺伝子が、表14から選択される、請求項1〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
表14の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
肺がん肺扁平上皮細胞癌腫の発症が予防、遅延、または減速される、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
肺がんが、肺扁平上皮細胞癌腫である、請求項1〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
発現レベルが、対象から得られた気管支内生検標本、気管支内ブラシ擦過サンプル、大気道生検標本、大気道ブラシ擦過サンプル、鼻上皮細胞、痰、または血液における発現レベルである、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
発現レベルが、右または左の主気管支から得られた気管支ブラシ擦過標本における発現レベルである、請求項1〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
生検標本またはブラシ擦過サンプルが、形態学的に正常な組織または細胞を含む、請求項34または35記載の方法。
【請求項３８】
生検標本またはブラシ擦過サンプルが、形態学的に正常な組織または細胞からなる、請求項34または35記載の方法。
【請求項３９】
発現レベルが、気管支前悪性病変細胞を含むサンプルにおける発現レベルである、請求項1〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
発現レベルが、形態学的に正常な細胞を含むサンプルにおける発現レベルである、請求項1〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
対象が、喫煙者または元喫煙者である、請求項1〜36のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C. § 119(e)の下、2018年8月20日に出願された米国仮出願第62/765,264号の恩典を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所によって与えられた契約番号CA196408の下、政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本明細書において記載される技術は、気管支前悪性病変の処置、診断、および処置のモニタリングに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
肺扁平上皮細胞癌は、気管支前悪性病変として知られている気道における非がん性病変から発症する。持続性または進行性の異形成気管支前悪性病変の存在は、（該病変が扁平上皮細胞肺癌の推定前駆体である）病変部位および肺の他の箇所の両方における肺がんリスクの増大のマーカーである。全ての気管支前悪性病変が侵襲性がんに進行するわけではなく、そして、進行するものは、様々な速度で進行し、転帰も様々である。現在のところ、どの病変ががんに進行し、どの病変ががんに進行しないのかを特定するための、診療所で利用可能なツールは存在しない。更に、気管支前悪性病変を検出するための現在の技術は、自家蛍光および白色光の気管支鏡を介するものである。気管支鏡の手技は侵襲的であり、そして、病変の可視化を必要とするので、小さな気管支前悪性病変の検出の感度および特異度は中程度でしかない。最後に、現在までに、気管支前悪性病変の唯一の処置は、外科手術または気管支鏡を介して病変部を切除することである。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明者らは、1）気管支前悪性病変の存在についての検査（そのうちの幾つかは気管支鏡を必要とせず、そして、気道の他の場所にある正常組織が、対象の気管支前悪性病変の存在を示すバイオマーカーを呈するという驚くべき知見を利用する）、2）気管支前悪性病変ががんに進行する可能性があるかどうかを判定するための方法、3）気管支前悪性病変を特徴付ける根底にある分子変化を標的とした気管支前悪性病変の新規療法を、今回開発した。
【０００６】
したがって、本明細書において提供される一局面は、（a）非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル；および（b）非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有すると判定された対象に対して、（i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；（ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの一方；ならびに／または（iii）少なくとも1つの抗増殖薬、のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法である。
【０００７】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様では、少なくとも1つのモジュール5遺伝子は、RACGAP1およびTPX2からなる群より選択され；そして、少なくとも1つのモジュール6遺伝子は、NEK11およびIFT88からなる群より選択される。
【０００８】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、対象は、上昇した少なくとも1つのモジュール7またはモジュール4の遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される。
【０００９】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つのモジュール7またはモジュール4の遺伝子は、COX6A1；COX7A2；RPL26；およびRPL23からなる群より選択される。
【００１０】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、表15の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される。少なくとも1つの抗増殖薬が、アセチルコリン受容体拮抗薬；アセチルコリンエステラーゼ阻害薬；アデノシン受容体拮抗薬；アドレナリン作動性受容体拮抗薬；AKT阻害薬；アンジオテンシン受容体拮抗薬；アポトーシス刺激薬；オーロラキナーゼ阻害薬；CDK阻害薬；シクロオキシゲナーゼ阻害薬；サイトカイン産生阻害薬；デヒドロゲナーゼ阻害薬；DNAプロテインキナーゼ阻害薬；接着斑阻害薬；ドーパミン受容体拮抗薬；EGFR阻害薬；ERK1およびERK2のリン酸化阻害薬；エストロゲン受容体作動薬；EZH2阻害薬；FLT3阻害薬；グルココルチコイド受容体作動薬；グルタミン酸受容体拮抗薬；HDAC阻害薬；ヒスタミン受容体拮抗薬；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害薬；HSP阻害薬；IKK阻害薬；イオンチャネル拮抗薬；JAK阻害薬；JNK阻害薬；KIT阻害薬；ロイシンリッチリピートキナーゼ阻害薬；MDM阻害薬；メディエータ放出阻害薬；MEK阻害薬；MTOR阻害薬；モノアミンオキシダーゼ阻害薬；NFkB経路阻害薬；ヌクレオホスミン阻害薬；PARP阻害薬；PPAR受容体作動薬；PI3K阻害薬；チロシンキナーゼ阻害薬；ホスホジエステラーゼ阻害薬；プロテインキナーゼ阻害薬；RAF阻害薬；RNAポリメラーゼ阻害薬；トポイソメラーゼ阻害薬；RNA合成阻害薬；SIRT阻害薬；ナトリウムチャネル遮断薬；VEGFR阻害薬；ならびにビタミンD受容体作動薬からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか記載の方法。
【００１１】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、抗増殖薬は、吸入製剤または局所製剤として投与される。
【００１２】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、抗増殖薬は、気管支鏡に基づく手技中に投与される。
【００１３】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、抗増殖薬は、全身的に投与される。
【００１４】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、抗増殖薬は、気管支鏡に基づく手技中にかつ全身的に投与される。
【００１５】
本明細書において提供される別の局面は、（a）非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル；および（b）非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有すると判定された対象であって、非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると更に判定された対象に対して、（i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；（ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの一方；ならびに／または（iii）少なくとも1つの抗増殖薬、のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法に関する。
【００１６】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様では、低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると判定された対象に対して、
i．中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンの両方；
ii．少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンのうちの一方；ならびに／または
iii．少なくとも1つの免疫刺激薬
のうちの少なくとも1つを施す。
【００１７】
また、別の局面では、非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると判定された対象に対して、（i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンの両方；（ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンのうちの一方；ならびに／または（iii）少なくとも1つの免疫刺激薬、のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法が、本明細書において提供される。
【００１８】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様では、モジュール9遺伝子は、EPSTI1；UBE2L6；B2M、およびTAP1からなる群より選択される。
【００１９】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つの遺伝子モジュール9遺伝子は、表16から選択される。
【００２０】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、モジュール10遺伝子は、CACNB3およびMAPK10からなる群より選択される。
【００２１】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つの免疫刺激薬は、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、PD-1、PD-L1、CTLA4、およびLAG3に対する阻害薬）；インターフェロンシグナル伝達を刺激する薬（例えば、インターフェロンシグナル伝達を改善する抗ウイルス薬）；DNA合成阻害薬；IMDH阻害薬；CDK阻害薬；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬；トポイソメラーゼ阻害薬；FLT3阻害薬；IGF-1阻害薬；MEK阻害薬；オーロラキナーゼ阻害薬；PKC阻害薬；RAF阻害薬；PDFGR/KIT阻害薬；VEGFR阻害薬；SRC阻害薬；レチノイド受容体作動薬；HDAC阻害薬；DNAメチルトランスフェラーゼ阻害薬；およびEZH2阻害薬からなる群より選択される。
【００２２】
本明細書において提供される別の局面は、（a）非炎症性の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベル；および（b）非炎症性の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有すると判定された対象に対して、（i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；（ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの一方；ならびに／または（iii）少なくとも1つの抗炎症薬、のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法に関する。
【００２３】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の一態様では、少なくとも1つのモジュール2遺伝子は、MSANTD2、CCNL2、およびLUC7Lからなる群より選択され；そして、少なくとも1つのモジュール6遺伝子は、NEK11およびIFT88からなる群より選択される。
【００２４】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、対象は、上昇した少なくとも1つのモジュール7遺伝子、モジュール1遺伝子、もしくはモジュール8遺伝子の発現レベルおよび／または低下した少なくとも1つのモジュール4遺伝子もしくは1つのモジュール5遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される。
【００２５】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つのモジュール7遺伝子は、RPL26およびRPL23からなる群より選択される。
【００２６】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つのモジュール1遺伝子は、KIRREL；PHLDB1；およびMARVELD1からなる群より選択される。
【００２７】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つのモジュール8遺伝子は、DOC2；CD53；およびLAPTMからなる群より選択される。
【００２８】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つのモジュール4遺伝子は、COX6A1およびCOX7A2からなる群より選択される。
【００２９】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つのモジュール5遺伝子は、RACGAP1およびTPX2からなる群より選択される。
【００３０】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、表15の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される。
【００３１】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つの抗炎症薬は、アセチルコリン受容体拮抗薬；アセチルコリンエステラーゼ阻害薬；アデノシン受容体拮抗薬；アドレナリン作動性受容体拮抗薬；アンジオテンシン受容体拮抗薬；抗IL1B抗体；アポトーシス刺激薬；オーロラキナーゼ阻害薬；CDK阻害薬；シクロオキシゲナーゼ阻害薬；サイトカイン産生阻害薬；デヒドロゲナーゼ阻害薬；ドーパミン受容体拮抗薬；EGFR阻害薬；ERK1およびERK2のリン酸化阻害薬；エストロゲン受容体作動薬；FLT3阻害薬；グルココルチコイド受容体作動薬；グルタミン酸受容体拮抗薬；HDAC阻害薬；ヒスタミン受容体拮抗薬；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害薬；HSP阻害薬；IKK阻害薬；イオンチャネル拮抗薬；KIT阻害薬；ロイシンリッチリピートキナーゼ阻害薬；MEK阻害薬；MDM阻害薬；ホスホジエステラーゼ阻害薬；モノアミンオキシダーゼ阻害薬；MTOR阻害薬；NFkB経路阻害薬；ヌクレオホスミン阻害薬；PARP阻害薬；PI3K阻害薬；PPAR受容体作動薬；タンパク質合成阻害薬（例えば、クロラムフェニコール）；RAF阻害薬；SIRT阻害薬；ナトリウムチャネル遮断薬；TGFβ受容体阻害薬；トポイソメラーゼ阻害薬；チロシンキナーゼ阻害薬；VEGFR阻害薬；ならびにビタミンD受容体作動薬からなる群より選択される。
【００３２】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、抗炎症薬は、気管支鏡に基づく手技中に投与される。
【００３３】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、抗炎症薬は、全身的に投与される。
【００３４】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、抗炎症薬は、気管支鏡に基づく手技中にかつ全身的に投与される。
【００３５】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、少なくとも1つの遺伝子は、表14から選択される。
【００３６】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、表14の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される。
【００３７】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、それにより、肺がん肺扁平上皮細胞癌腫の発症が、予防、遅延、または減速される。
【００３８】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、肺がんは、肺扁平上皮細胞癌腫である。
【００３９】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、発現レベルは、対象から得られた気管支内生検標本、気管支内ブラシ擦過サンプル、大気道生検標本、大気道ブラシ擦過サンプル、鼻上皮細胞、痰、または血液における発現レベルである。
【００４０】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、発現レベルは、右または左の主気管支から得られた気管支ブラシ擦過における発現レベルである。
【００４１】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、生検標本またはブラシ擦過サンプルは、形態学的に正常な組織または細胞を含む。
【００４２】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、生検標本またはブラシ擦過サンプルは、形態学的に正常な組織または細胞からなる。
【００４３】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、発現レベルは、気管支前悪性病変細胞を含むサンプルにおける発現レベルである。
【００４４】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、発現レベルは、形態学的に正常な細胞を含むサンプルにおける発現レベルである。
【００４５】
この局面および本明細書において提供される全ての他の局面の別の態様では、対象は、喫煙者または元喫煙者である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ−１】図1A〜1Eは、気管支内生検標本が、臨床および分子の表現型と相関する4つの特徴的な分子サブタイプに分かれることを示す。（図1A）9つの遺伝子共発現モジュールに体系化された遺伝子（n＝3,936）を用いて、コンセンサスクラスタリングを用いて190個のDC生検標本全体にわたって4つの分子サブタイプ（増殖性、炎症性、分泌性、および正常様）を発見した。ヒートマップは、3,936個の遺伝子および190個のDC生検標本全体にわたるzスコアで正規化された遺伝子発現の半教師付き階層クラスタリングを示す。上のバーは、4つの分子サブタイプを表す：増殖性（n＝52サンプル）、炎症性（n＝37サンプル）、分泌性（n＝61サンプル）、および正常様（n＝40サンプル）。全ての図を通して、4つの分子サブタイプは、前の文で与えられた順にそれぞれ明るさが増す4つの灰色の色合いによって表される。ヒートマップの左側には、モジュール遺伝子全体にわたって算出された第1の主成分の平均が、サブタイプごとにプロットされている。ヒートマップの右側には、多く含まれる生物学的経路の概要がモジュールごとに記入されている。
【図１Ａ−２】図1A-1の説明を参照のこと。
【図１Ｂ−１】（図1B）分子サブタイプと、喫煙状況、生検標本の組織学的グレード、および予測されるLUSC腫瘍の分子サブタイプとの間の有意な関連性（フィッシャーの直接検定によりp＜0.01）を示すバブルプロット。列は、4つの分子サブタイプ（増殖性、炎症性、分泌性、および正常様）を表し、そして、円の直径は、その行の表現型を有する各サブタイプ内のサンプル数に比例する。
【図１Ｂ−２】図1B-1の説明を参照のこと。
【図１Ｃ】（図1C）正常または過形成の組織学的所見を有する生検標本におけるMKI67の発現値のボックスプロット（それぞれ増殖性、炎症性、分泌性、および正常様のサブタイプにおいてn＝8、16、26、18）。増殖性サブタイプのMKI67発現レベルは、非増殖性サブタイプのサンプルよりも有意に高い（FDR＝3.4e-10）。
【図１Ｄ】（図1D）異形成の組織学的所見を有する生検標本におけるMKI67の発現値のボックスプロット（それぞれ増殖性、炎症性、分泌性、および正常のサブタイプにおいてn＝33、11、19、9）。増殖サブタイプのMKI67発現レベルは、非増殖性サブタイプのサンプルよりも有意に高い（FDR＝3.1e-8）。
【図１Ｅ】（図1E）対応するマーカー遺伝子の発現に従って、増殖性サブタイプにおけるMKI67およびKRT5の染色の増加ならびにTUB1A1染色の減少を示す免疫蛍光染色。増殖性および炎症性のサブタイプについて示された代表的なサンプルは異形成の組織学的所見を有し、一方、分泌性および正常様のサブタイプについて示されたサンプルは正常な組織学的所見を有する（倍率200倍）。
【図２Ａ】図2A〜2Dは、独立したサンプルセットにおいて、表現型と分子サブタイプとの関連が確認されたことを示す。（図2A）190個のDC生検標本および3,936個の遺伝子を用いて、22遺伝子最近傍重心分子サブタイプ分類器を構築した。22個の分類器遺伝子および190個のDC生検標本訓練サンプル全体にわたるzスコアで正規化された遺伝子発現の半教師付き階層的クラスタリング。
【図２Ｂ】（図2B）22遺伝子最近傍重心分子サブタイプ分類器を用いて、105個のVC生検標本の分子サブタイプを予測した。22個の遺伝子および105個のVC全体にわたるzスコアで正規化された遺伝子発現の半教師付き階層クラスタリングをプロットする。ヒートマップの行は、遺伝子名およびモジュールのメンバーシップを与え、そして、列のカラーバーは、分子サブタイプのメンバーシップを示す。
【図２Ｃ】（図2C）VCの分子サブタイプと、喫煙状況、生検標本の組織学的グレード、および予測されるLUSC腫瘍の分子サブタイプとの間の有意な関連性（フィッシャーの直接検定によりp＜0.01）を示すバブルプロット。列は、4つの分子サブタイプ（増殖性、炎症性、分泌性、および正常）を表し、そして、円の半径は、その行の表現型を有する各サブタイプ内のサンプル数に比例する。
【図２Ｄ】（図2D）VCの分子サブタイプと、喫煙状況、生検標本の組織学的グレード、および予測されるLUSC腫瘍の分子サブタイプとの間の有意な関連性（フィッシャーの直接検定によりp＜0.01）を示すバブルプロット。列は、4つの分子サブタイプ（増殖性、炎症性、分泌性、および正常様）を表し、そして、円の半径は、その行の表現型を有する各サブタイプ内のサンプル数に比例する。
【図３Ａ】図3A〜3Cは、気管内生検と同時にサンプリングされた正常な外観の上皮からの大気道ブラシ標本における分子サブタイプ分類器の性能を示す。（図3A）ブラシ標本がサンプリングされた時点で増殖性サブタイプと分類された少なくとも1個の生検標本（y軸）を有する、増殖性サブタイプについて陽性であると予測されるブラシ標本の数（y軸）を示す、DC（左）およびVC（右）のコホート。
【図３Ｂ】（図3B）各コホートについての4つの分子サブタイプ（x軸）全体にわたるモジュール4、5、6、および7についてのPC1（y軸）のボックスプロット。アスタリスクは、増殖性サブタイプと他の全てのサンプルとの間の有意差を示す（FDR＜0.05）。
【図３Ｃ】（図3C）各コホートについての4つの分子サブタイプ（x軸）全体にわたるモジュール4、5、6、および7についてのPC1（y軸）のボックスプロット。アスタリスクは、増殖性サブタイプと他の全てのサンプルとの間の有意差を示す（FDR＜0.05）。
【図４Ａ】図4A〜4Hは、インターフェロンシグナル伝達および抗原プロセシングを多く含むモジュールが、生検標本の進行／持続、ならびに増殖性サブタイプにおける自然および適応の免疫細胞の枯渇と関連していることを示す。（図4Aおよび4F）増殖性サブタイプ内のDC生検標本の中でのモジュール9遺伝子のメタジーン発現（進行性／持続性生検標本と退行性生検標本との間でp＝0.002）。生検標本の進行／退行は、生検標本ごとに、生検標本の組織学的所見および将来同じ肺の解剖学的位置について記録される最悪の組織学的所見に基づいて定義した。正常、過形成、および化生間の組織学的変化を「正常安定性」として分類し、組織学的異形成グレードの低下または異形成の組織学的所見から正常／過形成／化生への変化を「退行性」として分類し、将来の組織学的データがないものを「不明」として分類し、そして、その他全てを「進行性／持続性」として分類した。
【図４Ｂ】（図4Bおよび4G）進行性／持続性生検標本と退行性生検標本との間のCD68およびCD163、CD68、CD163、CD4、ならびにCD8で陽性染色された細胞のパーセンテージのボックスプロット（全ての比較についてp＜0.001）。x軸のラベルは、ボックスプロットに描かれた染色および転帰グループごとの（P）対象全体にわたって数え上げられた領域の数（R）を示す。それらの臨床転帰がモジュール9のスコアと一致していた場合、生検標本を解析に含めた。（図4B）増殖性サブタイプ内のVC生検標本の中でのモジュール9遺伝子のメタジーン発現（進行性／持続性生検標本と退行性生検標本との間でp＝0.03）。
【図４Ｃ】（図4C）上：モジュール9における112個の遺伝子、そして、DC生検標本（左）およびVC生検標本（右）全体にわたる、zスコアで正規化された遺伝子発現。各ヒートマップは、モジュール9のGSVAスコアに従って教師付きである。上のバーは、生検標本の組織学的グレードおよびその進行状況を示す。下：DC生検標本（左）およびVC生検標本（右）全体にわたる免疫細胞型の相対的存在量を示すxCellの結果。提示されている免疫細胞型は、病変の進行性／持続と有意に関連している（上皮細胞含有量の差を調整した後のDCおよびVCの両方においてFDR＜0.05）。
【図４Ｄ】（図4D）代表的な組織学的所見、図中、破線は上皮および間質コンパートメントの分離を示す。上のパネル： M2マクロファージ（CD68／163染色、二重陽性細胞は矢印で示される）およびCD8 T細胞の発現の顕著な減少によって示される通り、進行性の重度の異形成では免疫細胞の存在が減少している。（サンプルは、図4Cの*Pに相当する）。下のパネル：退行性の中等度の異形成では、M2マクロファージ（CD68／163染色、二重陽性細胞は矢印で示される）およびCD8 T細胞を含む免疫細胞の存在が増加している。（サンプルは、図4Cの*Rに相当する）。
【図４Ｅ】（図4Eおよび4H）進行性／持続性生検標本と退行性生検標本との間のCD68およびCD163、CD68、CD163、CD4、ならびにCD8で陽性染色された細胞のパーセンテージのボックスプロット（全ての比較についてp＜0.001）。x軸のラベルは、ボックスプロットに描かれた染色および転帰グループごとの（P）対象全体にわたって数え上げられた領域の数（R）を示す。臨床転帰がモジュール9のスコアと一致していた場合、生検標本を解析に含めた。
【図４Ｆ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｇ】図4Bの説明を参照のこと。
【図４Ｈ】図4Eの説明を参照のこと。
【図５−１】図5は、発見コホートおよび検証コホートの両方におけるサンプルのバッチ情報およびアラインメント統計値を示す。カテゴリー変数にはフィッシャーの直接検定を、そして、連続変数にはスチューデントのT検定を用いて、発見コホートと検証コホートとの間で統計検定を実施した。カテゴリー変数についてはパーセンテージを報告し、連続変数については平均および標準偏差を報告する。
【図５−２】図5-1の説明を参照のこと。
【図６】図6は、遺伝子モジュールの概要を示す。モジュール番号、モジュールにおける遺伝子の数、モジュールに関連する生物学的経路および選抜された遺伝子、ならびに分子サブタイプ間でのモジュールのGSVAスコアの差についてのFDR値が報告される。
【図７−１】図7は、免疫蛍光研究に使用したサンプルのリストを示す。
【図７−２】図7-1の説明を参照のこと。
【図７−３】図7-1の説明を参照のこと。
【図７−４】図7-1の説明を参照のこと。
【図８】図8は、対象別の分子サブタイプの分布を示す。列は、4つの分子サブタイプ（増殖性、炎症性、分泌性、および正常様）を表し、そして、円の半径は、各サブタイプ内のサンプル数に比例する。
【図９】図9は、分子サブタイプ全体にわたる増殖、基底細胞、および繊毛細胞のマーカーの免疫蛍光染色定量のグラフを示す。各分子サブタイプからの代表的なサンプル（増殖性n＝4、炎症性n＝3、分泌性n＝1、正常様n＝1）全体にわたるKI67（増殖）、KRT5（基底細胞）、およびTUB1A1（繊毛細胞）の免疫蛍光染色定量のボックスプロット。KI67およびKRT5の染色は、増殖性サブタイプのサンプルにおいて有意に高い（増殖性サブタイプと他のサブタイプとの間のサンプル差について、それぞれp＝0.02およびp＝0.01）。TUB1A1は、増殖性および炎症性のサブタイプのサンプルにおいて低かったが、統計的有意差には至らなかった（増殖性および炎症性のサブタイプと炎症性および分泌性のサブタイプとの間のサンプル差について、p＝0.07）。
【図１０−１】図10A〜10Hは、分子サブタイプ別の発見および検証のコホート全体にわたる選抜された遺伝子および細胞型のデコンボリューション結果のボックスプロットを示す。（図10A〜10D）発見コホート生検標本。（図10E〜10H）検証コホート生検標本。（図10A）および（図10E）は、分子サブタイプ全体にわたるTCGAによって同定されたLUSCドライバー遺伝子の遺伝子発現レベルのボックスプロットを示す。（図10B）および（図10F）は、分子サブタイプ全体にわたる細胞型マーカー遺伝子の遺伝子発現レベルのボックスプロットを示す。（図10C）および（図10G）は、分子サブタイプ全体にわたるDvorakらの遺伝子セットを用いて算出されたGSVAスコアのボックスプロットを示す。（図10D）および（図10H）は、分子サブタイプ全体にわたるESTIMATEアルゴリズムスコアのボックスプロットを示す。ESTIMATEアルゴリズムは、各サンプルにおける間質細胞（StromalScore）、免疫細胞（ImmuneScore）、および上皮細胞（ESTIMATEScore）の分率を推定する。免疫細胞および間質細胞のスコアが高いことは、間質細胞および免疫細胞の分率が高いことを示し、一方、上皮細胞のスコアが低いことは、上皮細胞の分率が高いことを示す。
【図１０−２】図10-1の説明を参照のこと。
【図１０−３】図10-1の説明を参照のこと。
【図１０−４】図10-1の説明を参照のこと。
【図１１】図11は、発見および検証のコホート生検標本における22遺伝子分子サブタイプ分類器のヒートマップを示す。22個の分類器遺伝子と、190個のDC生検標本訓練サンプル（左）および105個のVC生検標本（右）全体にわたるzスコアで正規化された残差遺伝子発現の半教師付き階層的クラスタリング。ヒートマップの行は、遺伝子モジュールのメンバーシップを示す。1列目のカラーバーは、DCにおける分子サブタイプのメンバーシップおよびVCにおける22遺伝子予測サブタイプのメンバーシップを示す。2列目のカラーバーは、22遺伝子分類器を用いたDCにおける正しい予測および間違った予測、ならびにVC全体にわたってコンセンサスクラスタリングを実施すことによって導出された分子サブタイプを示す。
【図１２】図12は、発見および検証のコホート生検標本における分子サブタイプ全体にわたる遺伝子モジュールの挙動のグラフを示す。モジュール遺伝子全体にわたって算出された第1の主成分の平均が、分子タイプごとにプロットされている。
【図１３−１】図13は、モジュール9と2つの細胞型デコンボリューション解析との間の一致を示す。上：モジュール9における112個の遺伝子、そして、DC生検標本（左）およびVC生検標本（右）全体にわたる、zスコアで正規化された遺伝子発現の階層クラスタリング。各ヒートマップは、モジュール9のGSVAスコアに従って教師付きである。上のバーは、生検標本の組織学的グレードおよびその進行状況を示す。xCellの結果（中）およびBindeaらによって記載された遺伝子セットのGSVAスコア（下）は、DC生検標本（左）およびVC生検標本（右）全体にわたる免疫細胞型の相対的存在量を示す。提示されている免疫細胞型は、病変の進行／持続と有意に関連している（DCおよびVCの両方においてFDR＜0.05）。
【図１３−２】図13-1の説明を参照のこと。
【図１４−１】図14は、気管内生検によってサンプリングされた部位の位置の気管気管支生検マップを示す。
【図１４−２】図14-1の説明を参照のこと。
【図１５−１】図15は、4つの分子サブタイプ全体にわたる発見コホートの気管内生検標本の中での対象の分布を示す。9つの遺伝子共発現モジュールに体系化された遺伝子（n＝3,936）を用いて、コンセンサスクラスタリングを用いて190個の発見コホート（DC）生検標本全体にわたって4つの分子サブタイプ（増殖性、炎症性、分泌性、および正常様）を発見した。ヒートマップは、3,936個の遺伝子および190個のDC生検標本全体にわたるzスコアで正規化された遺伝子発現の半教師付き階層クラスタリングを示す。上のカラーバーは、サンプルが由来する対象および分子サブタイプのメンバーシップを表す：増殖性（n＝52サンプル）、炎症性（n＝37サンプル）、分泌性（n＝61サンプル）、および正常様（n＝40サンプル）。ヒートマップの左側には、平均モジュールGSVAスコアがサブタイプごとにプロットされている。
【図１５−２】図15-1の説明を参照のこと。
【図１６−１】図16は、気管支鏡手技全体にわたる対象ごとの分子サブタイプ分布を示す。バープロットは、対象ごとおよび気管支鏡手技ごとに、サンプリングされた生検標本の数およびそれに対応する分子サブタイプを示す。y軸は、対象番号、およびその対象に肺扁平上皮細胞癌腫（LUSC）または別の種類の肺がん（その他）のいずれかの前病歴があるかどうかを示す。発見コホートは対象1〜32を含み、検証コホートは対象33〜52を含む。肺がんの前病歴に基づく対象内のサブタイプ分類の多様性に差は認められなかった（肺がんの病歴のある患者内のサブタイプ分類の平均シャノンエントロピー＝1.12、n＝32対肺がんの病歴のない患者内のサブタイプ分類の平均シャノンエントロピー＝1.25、n＝17；ウィルコクソン順位和検定のp値＝0.43）。
【図１６−２】図16-1の説明を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
詳細な説明
本明細書において記載される通り、本発明者らは、対象の気道における前悪性病変が、正常様、分泌性、炎症性、進行性増殖性、および持続性増殖性の5種類のうちの1つであることを特徴とし得ることを見出した。異なる種類の病変は異なる処置に応答し、そして、異なる処置およびモニタリングのレジームを必要とするので、前悪性病変をこれら種類のうちの1つとして同定することにより、対象のより有効な処置が可能となる。したがって、対象における気管支前悪性病変の処置に関する処置方法が本明細書において提供される。このような方法は、アッセイ、検査、および／または病変の種類の同定と、その病変の種類に適した治療レジメンの投与とを含み得る。
【００４８】
本明細書において使用するとき、「前悪性病変」とは、がんの前駆体であるかまたはがんの前駆体であり得る上皮性病変または異形成を指す。基底膜は、がんとは対照的に、転移拡散の可能性がなく、未変化である。気管支前悪性病変とは、対象の気管支上皮に存在する前悪性病変である。気管支前悪性病変は、典型的には小さく、そして、従来の白色光気管支鏡検査を用いて可視化することが困難である場合がある。
【００４９】
気管支前悪性病変は、本明細書において記載される5つの表現型、すなわち、進行性増殖性、持続性増殖性、分泌性、炎症性、および正常様のうちの1つを呈し得る。サブタイプ名は、サブタイプを互いに識別する、分子経路活性における鍵となる違いを参照する。異なる表現型の病変は、本明細書において記載される遺伝子発現パターンを使用することにより互いに、そして、正常組織と区別することができる。本明細書において他の箇所で詳細に説明する通り、本明細書において同定される遺伝子発現パターンは、10個の遺伝子モジュールに関し、各モジュールは、異なる気管支前悪性病変サブタイプにまたがって類似の発現パターンを有する遺伝子の群である。モジュールのそれぞれの同一性、例えば、各モジュールを構成する遺伝子は、本明細書において表13に提供される。簡潔に述べると、増殖性病変（進行性および持続性の両方）は、モジュール4、5および7の発現が増加し、そして、モジュール6の発現が減少していることによって区別される。進行性増殖性病変は、モジュール9の発現が減少しているおよび／またはモジュール10の発現が増加しているという点で、持続性増殖性病変と区別することができる。分泌性病変は、モジュール6の発現の増加およびモジュール１の発現の減少と、任意で、モジュール8の発現の増加ならびにモジュール2、5および7の発現の減少によって区別される。正常様サブタイプは、モジュール6の発現の増加およびモジュール9の発現の減少と、任意で、モジュール1の発現の増加およびモジュール8の発現の減少によって区別される。
【００５０】
肺がんのリスクがあるか、または気管支前悪性病変を有すると同定された対象に対する標準的処置は、毎年の肺がん検診（例えば、気管支鏡検査および／または胸部CTスキャン）である。対象が増殖性の気管支前悪性病変を有する場合、このような処置ではもはや十分ではなく、対象はより積極的に処置されるべきである。したがって、態様のいずれかの一局面では、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有すると判定された対象に対して、i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの少なくとも1つ；ならびに／またはiii）少なくとも1つの抗増殖薬、のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法が、本明細書において提供される。態様のいずれかの一局面では、対象が、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有すると判定する工程と、i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；ii）少なくとも約6ヶ月ごとに（例えば、少なくとも1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、もしくは6ヶ月ごとに）、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの少なくとも1つ；ならびに／またはiii）少なくとも1つの抗増殖薬、のうちの少なくとも1つを対象に施す工程とを含む、気管支前悪性病変を処置する方法が、本明細書において提供される。局面のいずれかの幾つかの態様では、基準レベルは、非増殖性基準レベルである。
【００５１】
幾つかの態様では、対象が、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有しないと判定された場合、対象に抗増殖薬は投与されず、そして、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技および／または胸部CTスキャンが6ヶ月ごと以下の頻度で（例えば、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または12ヶ月ごと以下の頻度で）施される。幾つかの態様では、対象が、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のいずれをも有しないと判定された場合、対象に抗増殖薬は投与されず、そして、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技および／または胸部CTスキャンが6ヶ月ごと以下の頻度で（例えば、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または12ヶ月ごと以下の頻度で）施される。
【００５２】
増殖性サブタイプ病変を有する対象を同定するには、気管支ブラシ擦過サンプルにおけるモジュール5および6の遺伝子発現で十分である。これにより、実際の病変を可視化および／またはサンプリングする必要がなくなる。したがって、態様のいずれかの一局面では、気管支ブラシ擦過サンプルにおいて、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを有すると判定された対象に対して、i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの少なくとも1つ；ならびに／またはiii）少なくとも1つの抗増殖薬、のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法が、本明細書において提供される。態様のいずれかの一局面では、対象が、対象から得られた気管支ブラシ擦過サンプルにおいて、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを有すると判定する工程と、i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの少なくとも1つ；ならびに／またはiii）少なくとも1つの抗増殖薬、のうちの少なくとも1つを対象に施す工程とを含む、気管支前悪性病変を処置する方法が、本明細書において提供される。局面のいずれかの幾つかの態様では、基準レベルは、非増殖性基準レベルである。局面のいずれかの幾つかの態様では、気管支ブラシ擦過標本は、右または左の主気管支の形態的に正常な位置から採取される。局面のいずれかの幾つかの態様では、気管支ブラシ擦過標本は、右または左の主気管支の視覚的に正常な位置から採取される。
【００５３】
モジュール5および6の遺伝子は、表13に提供される。少なくとも1つのモジュール5遺伝子および／またはモジュール6遺伝子は、表13に収載されるモジュール5および6の遺伝子のうちのいずれか1つまたは複数であってよい。
【００５４】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール5遺伝子または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、2つもしくはそれ以上のモジュール5遺伝子または2つもしくはそれ以上のモジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13の各モジュール5遺伝子または各モジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。
【００５５】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール5遺伝子および少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、2つまたはそれ以上のモジュール5遺伝子および2つまたはそれ以上のモジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13の各モジュール5遺伝子および各モジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。
【００５６】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール5遺伝子は、RACGAP1もしくはTPX2を含むかまたはRACGAP1もしくはTPX2である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール5遺伝子は、RACGAP1およびTPX2を含むかまたはRACGAP1およびTPX2である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール6遺伝子は、NEK11もしくはIFT88を含むかまたはNEK11もしくはIFT88である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール6遺伝子は、NEK11およびIFT88を含むかまたはNEK11およびIFT88である。
【００５７】
増殖性サブタイプは、モジュール7および／または4の発現の増加によって更に区別される。したがって、局面のいずれかの幾つかの態様では、対象は、基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール7またはモジュール4の遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象は、基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール7および少なくとも1つのモジュール4の遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、基準レベルは、非増殖性基準レベルである。
【００５８】
モジュール4および7の遺伝子は、表13に提供される。少なくとも1つのモジュール4遺伝子および／またはモジュール7遺伝子は、表13に収載されるモジュール4および7の遺伝子のうちのいずれか1つまたは複数であってよい。
【００５９】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール4遺伝子または少なくとも1つのモジュール7遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、2つもしくはそれ以上のモジュール4遺伝子または2つもしくはそれ以上のモジュール7遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13の各モジュール4遺伝子または各モジュール7遺伝子の発現レベルが決定される。
【００６０】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール4遺伝子および少なくとも1つのモジュール7遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、2つまたはそれ以上のモジュール4遺伝子および2つまたはそれ以上のモジュール7遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13の各モジュール4遺伝子および各モジュール7遺伝子の発現レベルが決定される。
【００６１】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール4遺伝子は、COX6A1もしくはCOX7A2を含むかまたはCOX6A1もしくはCOX7A2である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール4遺伝子は、COX6A1およびCOX7A2を含むかまたはCOX6A1およびCOX7A2である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール7遺伝子は、RPL26もしくはRPL23を含むかまたはRPL26もしくはRPL23である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール7遺伝子は、RPL26およびRPL23を含むかまたはRPL26およびRPL23である。
【００６２】
対象が進行性増殖性気管支前悪性病変を有する場合、増殖性気管支前悪性病変に提供されるものを更に超える積極的な処置が適応となる場合がある。したがって、態様のいずれかの一局面では、基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると判定された対象に対して、i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの少なくとも1つ；iii）少なくとも1つの免疫刺激薬；ならびに／またはiv）少なくとも1つの免疫刺激薬および少なくとも1つの抗増殖薬、のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法が、本明細書において提供される。態様のいずれかの一局面では、a）対象が、基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると判定する工程と、b）i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの少なくとも1つ； iii）少なくとも1つの免疫刺激薬；ならびに／またはiv）少なくとも1つの免疫刺激薬および少なくとも1つの抗増殖薬、のうちの少なくとも1つを対象に施す工程とを含む、気管支前悪性病変を処置する方法が、本明細書において提供される。局面のいずれかの幾つかの態様では、基準レベルは、非増殖性基準レベルである。局面のいずれかの幾つかの態様では、気管支鏡に基づく手技は、異常組織を除去するための病変部の生検を更に含む。
【００６３】
幾つかの態様では、対象が、基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有しないと判定された場合、対象にi）免疫刺激薬は投与されない、ii）免疫刺激薬および抗増殖薬の両方は投与されない、iii）気管支鏡に基づく手技および／もしくは胸部CTスキャンは6ヶ月ごと以下の頻度で（例えば、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または12ヶ月ごと以下の頻度で）施される、ならびに／またはiv）異常組織を除去するための生検病変部に対する気管支鏡に基づく手技は施されない。
【００６４】
モジュール9遺伝子は、表13に提供される。少なくとも1つのモジュール9遺伝子は、表13に収載されるモジュール9遺伝子のうちのいずれか1つまたは複数であってよい。モジュール9遺伝子は、表16に提供される。少なくとも1つのモジュール9遺伝子は、表16に収載されるモジュール9遺伝子のうちのいずれか1つまたは複数であってよい。
【００６５】
局面のいずれかの幾つかの態様では、2つまたはそれ以上のモジュール9遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13の各モジュール9遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表16の各モジュール9遺伝子の発現レベルが決定される。
【００６６】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール9遺伝子は、EPSTI1；UBE2L6；B2Mおよび／もしくはTAP1を含むかまたはEPSTI1；UBE2L6；B2Mおよび／もしくはTAP1である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール9遺伝子は、EPSTI1；UBE2L6；B2MおよびTAP1を含むかまたはEPSTI1；UBE2L6；B2MおよびTAP1である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール9遺伝子は、
EPSTI1およびUBE2L6
EPSTI1およびB2M
EPSTI1およびTAP1
UBE2L6およびB2M
UBE2L6およびTAP1
B2MおよびTAP1
のうちのいずれかの対組み合わせを含むかまたは該対組み合わせである。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール9遺伝子は、
EPSTI1；UBE2L6；およびB2M
EPSTI1；UBE2L6；およびTAP1
EPSTI1；B2M；およびTAP1
TAP1；UBE2L6；およびB2M
のうちのいずれかの三要素組み合わせを含むかまたは該三要素組み合わせである。
【００６７】
モジュール10遺伝子は、表13に提供される。少なくとも1つのモジュール10遺伝子は、表13に収載されるモジュール9遺伝子のうちのいずれか1つまたは複数であってよい。局面のいずれかの幾つかの態様では、両モジュール10遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール10遺伝子は、CACNB3もしくはMAPK10を含むかまたはCACNB3もしくはMAPK10である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール10遺伝子は、CACNB3およびMAPK10を含むかまたはCACNB3およびMAPK10である。
【００６８】
対象が炎症性気管支前悪性病変を有する場合、積極的および／または抗炎症の処置が有益であり得る。したがって、態様のいずれかの一局面では、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有すると判定された対象に対して、i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの少なくとも1つ；ならびに／またはiii）少なくとも1つの抗炎症薬、のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法が、本明細書において提供される。態様のいずれかの一局面では、対象が、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有すると判定する工程と、i）中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方；ii）少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの少なくとも1つ；ならびに／またはiii）少なくとも1つの抗炎症薬、のうちの少なくとも1つを対象に施す工程とを含む、気管支前悪性病変を処置する方法が、本明細書において提供される。局面のいずれかの幾つかの態様では、基準レベルは、非炎症性基準レベルである。
【００６９】
幾つかの態様では、対象が、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有しないと判定された場合、対象に抗炎症薬は投与されず、そして、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技および／または胸部CTスキャンが6ヶ月ごと以下の頻度で（例えば、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または12ヶ月ごと以下の頻度で）施される。幾つかの態様では、対象が、a）基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベル；およびb）基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル、のいずれをも有しないと判定された場合、対象に抗炎症薬は投与されず、そして、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技および／または胸部CTスキャンが6ヶ月ごと以下の頻度で（例えば、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、または12ヶ月ごと以下の頻度で）施される。
【００７０】
モジュール2および6の遺伝子は、表13に提供される。少なくとも1つのモジュール2遺伝子および／またはモジュール6遺伝子は、表13に収載されるモジュール5および6の遺伝子のうちのいずれか1つまたは複数であってよい。
【００７１】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール2遺伝子または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、2つもしくはそれ以上のモジュール2遺伝子または2つもしくはそれ以上のモジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13の各モジュール2遺伝子または各モジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。
【００７２】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール2遺伝子および少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、2つまたはそれ以上のモジュール2遺伝子および2つまたはそれ以上のモジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13の各モジュール2遺伝子および各モジュール6遺伝子の発現レベルが決定される。
【００７３】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール2遺伝子は、MSANTD2、CCNL2、もしくはLUC7Lを含むかまたはMSANTD2、CCNL2、もしくはLUC7Lである。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール2遺伝子は、MSANTD2およびLUC7Lを含むかまたはMSANTD2およびLUC7Lである。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール2遺伝子は、MSANTD2およびCCNL2を含むかまたはMSANTD2およびCCNL2である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール2遺伝子は、CCNL2およびLUC7Lを含むかまたはCCNL2およびLUC7Lである。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール2遺伝子は、MSANTD2、CCNL2、およびLUC7Lを含むかまたはMSANTD2、CCNL2、およびLUC7Lである。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール6遺伝子は、NEK11もしくはIFT88を含むかまたはNEK11もしくはIFT88である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール6遺伝子は、NEK11およびIFT88を含むかまたはNEK11およびIFT88である。
【００７４】
炎症性サブタイプは、モジュール7、1、および／もしくは8の発現の増加ならびに／またはモジュール4および／もしくは5の発現の減少によって更に区別される。したがって、局面のいずれかの幾つかの態様では、対象は、基準レベルと比較して、i）上昇した少なくとも1つのモジュール7、モジュール1、および／またはモジュール8の遺伝子の発現レベル、ならびにii）低下した少なくとも1つのモジュール4またはモジュール5の遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有すると更に判定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象は、基準レベルと比較して、i）上昇した少なくとも1つのモジュール7、モジュール1、および／またはモジュール8の遺伝子の発現レベル、ならびにii）低下した少なくとも1つのモジュール4またはモジュール5の遺伝子の発現レベル、のうちの少なくとも1つを有すると更に判定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、基準レベルは、非炎症性基準レベルである。
【００７５】
モジュール7、1、8、4、および5の遺伝子は、表13に提供される。少なくとも1つのモジュール7、1、8、4、および／または5の遺伝子は、表13に収載されるモジュール7、1、8、4、および／または5の遺伝子のうちのいずれか1つまたは複数であってよい。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13の各モジュール7、1、8、4、および／または5の遺伝子の発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13の各モジュール7、1、8、4、および5の遺伝子の発現レベルが決定される。
【００７６】
局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール4遺伝子は、COX6A1もしくはCOX7A2を含むかまたはCOX6A1もしくはCOX7A2である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール4遺伝子は、COX6A1およびCOX7A2を含むかまたはCOX6A1およびCOX7A2である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール7遺伝子は、RPL26もしくはRPL23を含むかまたはRPL26もしくはRPL23である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール7遺伝子は、RPL26およびRPL23を含むかまたはRPL26およびRPL23である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール5遺伝子は、RACGAP1もしくはTPX2を含むかまたはRACGAP1もしくはTPX2である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール5遺伝子は、RACGAP1およびTPX2を含むかまたはRACGAP1およびTPX2である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール1遺伝子は、KIRREL；PHLDB1；もしくはMARVELD1を含むかまたはKIRREL；PHLDB1；もしくはMARVELD1である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール1遺伝子は、PHLDB1およびMARVELD1を含むかまたはPHLDB1およびMARVELD1である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール1遺伝子は、KIRRELおよびPHLDB1を含むかまたはKIRRELおよびPHLDB1である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール1遺伝子は、KIRRELおよびMARVELD1を含むかまたはKIRRELおよびMARVELD1である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール1遺伝子は、KIRREL；PHLDB1；およびMARVELD1を含むかまたはKIRREL；PHLDB1；およびMARVELD1である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール8遺伝子は、DCO2；CD53；もしくはLAPTMを含むかまたはDCO2；CD53；もしくはLAPTMである。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール8遺伝子は、CD53およびLAPTMを含むかまたはCD53およびLAPTMである。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール8遺伝子は、DCO2およびCD53を含むかまたはDCO2およびCD53である。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール8遺伝子は、DCO2およびLAPTMを含むかまたはDCO2およびLAPTMである。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つのモジュール8遺伝子は、DCO2；CD53；およびLAPTMを含むかまたはDCO2；CD53；およびLAPTMである。
【００７７】
局面のいずれかの幾つかの態様では、表15の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、気管支ブラシ擦過サンプルにおける表15の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される。
【００７８】
局面のいずれかの幾つかの態様では、表14の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される。局面のいずれかの幾つかの態様では、気管支ブラシ擦過サンプルにおける表14の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される。
【００７９】
局面のいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、以下の遺伝子のいずれかの発現レベルを決定する工程を更に含み得る：SOX2、NFE2L2、PIK3CA（扁平上皮癌マーカー遺伝子である）、KRT5、MUC5AC、TUB1A1、SCGB1A1、およびFOXK1（上皮マーカー遺伝子である）。
【００８０】
本明細書において記載される通り、遺伝子発現レベルは、異なるサブタイプの前悪性病変を有する対象において調節（例えば、上昇または低下）され得る。
【００８１】
局面のいずれかの幾つかの態様では、方法は、本明細書において記載される通りの発現レベルを有すると以前に判定された対象に対して、本明細書において記載される処置を施す工程を含む。局面のいずれかの幾つかの態様では、a）まず、対象から得られたサンプル中の少なくとも1つの遺伝子の発現レベルを決定する工程と；b）次いで、本明細書において記載される通り基準に対して発現レベルが調節されていた場合、対象に対して本明細書において記載される処置を施す工程とを含む、それを必要とする対象における気管支前悪性病変を処置する方法が本明細書において記載される。態様のいずれかの一局面では、a）対象が本明細書において記載される発現レベルの調節を有するかどうかを判定する工程と、b）判定された特定の発現の調節について本明細書において記載される適切な処置を対象に施すように指示または命令する工程とを含む、それを必要とする対象における気管支前悪性病変を処置する方法が本明細書において記載される。
【００８２】
局面のいずれかの幾つかの態様では、対象が発現レベルの調節を有するかどうかを判定する工程は、i）対象からサンプルを得るかまたは得たことと、ii）対象における発現レベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルに対してアッセイを実施するかまたは実施したことと、を含み得る。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象が発現レベルの調節を有するかどうかを判定する工程は、対象における発現レベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルに対してアッセイを実施するかまたは実施したことを含み得る。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象が発現レベルの調節を有するかどうかを判定する工程は、対象における発現レベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルに対するアッセイを要求または依頼することを含み得る。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象が発現レベルの調節を有するかどうかを判定する工程は、対象における発現レベルを決定／測定するために、対象から得られたサンプルに対するアッセイの結果を受け取ることを含み得る。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象が発現レベルの調節を有するかどうかを判定する工程は、対象を発現レベルの調節を有する対象として同定する報告書、結果、または他の手段を受け取ることを含み得る。
【００８３】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、特定の処置を対象に施すように指示または命令する工程は、アッセイ結果の報告書を提供することを含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、特定の処置を対象に施すように指示または命令する工程は、アッセイ結果の報告書を提供すること、および／またはアッセイ結果を考慮して処置を推奨することを含み得る。
【００８４】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的のレベルの測定、および／または標的、例えば、発現産物（本明細書において記載される遺伝子のうちの1つの核酸またはポリペプチド）もしくは変異のレベルもしくは存在の検出は、変換を含み得る。本明細書において使用するとき、用語「変換する」または「変換」とは、物体または物質、例えば、生体サンプル、核酸、またはタンパク質を別の物質に変化させることを指す。変換は、物理的、生物学的、または化学的であってよい。例示的な物理的変換は、生体サンプルの前処理、例えば、分画遠心法による全血から血清への前処理を含むが、それに限定されるわけではない。生物学的／化学的な変換は、反応における少なくとも1つの酵素および／または化学試薬の作用を伴い得る。例えば、DNAサンプルを1つまたは複数の制限酵素によって消化して断片化してもよく、または断片化されたDNAサンプルに外因性分子をリガーゼによって連結させてもよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、DNAサンプルは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、酵素的複製を受けることができる。
【００８５】
標的分子、例えば、mRNAまたはポリペプチドの変換、測定、および／または検出は、対象から得られたサンプルに、標的に対して特異的な試薬（例えば、検出試薬）、例えば標的特異的試薬を接触させる工程を含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的特異的試薬は、検出可能に標識されている。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的特異的試薬は、検出可能なシグナルを生成することができる。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的特異的試薬は、標的分子が存在するときに検出可能なシグナルを生成する。
【００８６】
遺伝子発現産物を測定する方法は、当業者に公知である。このような遺伝子発現産物、例えば、タンパク質レベルを測定する方法は、抗体またはタンパク質結合剤等の検出試薬を用いたELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を含む。あるいは、標識された抗ペプチド抗体および他の種類の検出剤を対象に導入することにより、対象におけるペプチドを検出することもできる。例えば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的なイメージング技術によって検出される検出可能なマーカーで標識され得る。
【００８７】
例えば、本明細書において記載される様々な標的に対する抗体が市販されており、タンパク質の発現レベルを測定するために本発明の目的のために使用することができる。あるいは、本明細書において記載される標的に対するアミノ酸配列は公知であり、NCBIのウェブサイトで公的に利用可能であるので、当業者であれば、本明細書において記載される方法の目的のために、関心対象のこれらポリペプチドに対する自身の抗体を産生させることができる。
【００８８】
本明細書において記載されるポリペプチドのアミノ酸配列には、ヒト、マウス、およびラット等の様々な種についてのNCBIアクセッション番号が割り当てられている。本明細書において記載される遺伝子のいずれかの配列は、当業者であれば、いずれのデータベースからも容易に検索することができる。局面のいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される遺伝子、転写物、またはポリペプチドの配列は、本出願の出願日の時点でNCBIまたはENSMBLのデータベースで利用可能な配列である。
【００８９】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、免疫組織化学（「IHC」）および免疫細胞化学（「ICC」）の技術を使用することができる。IHCは、組織切片に対する免疫化学の応用であり、一方、ICCは、例えば液体ベースの調製等の特定の細胞学的調製を受けた後の細胞や組織インプリントに対する免疫化学の応用である。免疫化学は、細胞の内部または表面上の分子を特異的に標的にするために抗体を使用する、抗体の使用に基づく技術の分類である。抗体は、典型的には、標的分子に遭遇した際に、生化学的反応を受け、それによって、色の変化を経験するマーカーを含有する。幾つかの例では、一次特異的抗体の適用に続いて、マーカー染色またはマーカーシグナルを含む二次抗体が適用される特定のプロトコルに、シグナル増幅を組み込んでもよい。
【００９０】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、アッセイは、ウェスタンブロット分析であってよい。あるいは、二次元ゲル電気泳動システムによってタンパク質を分離することもできる。二次元ゲル電気泳動は、当技術分野において周知であり、そして、典型的には、第1の次元に沿って等電点電気泳動を行い、続いて、第2の次元に沿ってSDS-PAGE電気泳動を行うことを伴う。また、これらの方法は、かなりの量の細胞物質を必要とする。2D SDS-PAGEゲルの解析は、ゲル上のタンパク質スポットの強度を求めることにより実施してもよく、免疫検出を用いて実施してもよい。他の態様では、質量分析法によってタンパク質サンプルを分析する。
【００９１】
免疫学的試験を本明細書において記載される方法およびアッセイと共に使用してもよく、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（RIA）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、例えば、ラテックス凝集、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、例えば、FIA（蛍光結合免疫アッセイ）、化学発光イムノアッセイ（CLIA）、電気化学発光イムノアッセイ（ECLIA、計数免疫アッセイ（CIA）、ラテラルフロー試験またはイムノアッセイ（LFIA）、磁気イムノアッセイ（MIA）、およびプロテインAイムノアッセイ等の技術を用いる競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系を含む。このようなアッセイを実施するための方法は、当技術分野において公知であるが、ただし、適切な抗体試薬が利用可能である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、イムノアッセイは、定量的または半定量的なイムノアッセイであってよい。
【００９２】
イムノアッセイは、1つまたは複数の抗体とその抗原との相互作用を使用して、生体サンプル、典型的には血液または血清等の流体サンプル中の物質の濃度を測定する生化学的試験である。このアッセイは、抗体とその抗原との高度に特異的な結合を利用する。本明細書において記載される方法およびアッセイでは、イムノアッセイにおいて標的ポリペプチドと本明細書において記載されるそれぞれのタンパク質もしくはタンパク質断片、または単離されたペプチド、または融合タンパク質との特異的結合が生じて、標的タンパク質／ペプチド複合体が形成される。次いで、当技術分野において公知の様々な方法によって複合体を検出する。また、イムノアッセイは、多くの場合、検出抗体の使用を伴う。
【００９３】
ELISA、酵素イムノアッセイ、またはEIAとも呼ばれる酵素結合免疫吸着アッセイは、サンプル中の抗体または抗原の存在を検出するために主に免疫学で使用される生化学的技術である。ELISAは、医学および植物病理学における診断ツールとして、また、様々な業界において品質管理のチェックにも使用されている。
【００９４】
ある態様では、特定の所望の抗原（例えば、本明細書において記載される標的のいずれか）に対する特異性を有する少なくとも1つの抗体を伴うELISAを実施してもよい。既知の量のサンプルおよび/または抗原を固体支持体（通常、ポリスチレンマイクロタイタープレート）に固定化する。固定化は、非特異的（例えば、表面への吸着による）または特異的（例えば、表面に固定化された別の抗体を使用して抗原または一次抗体をキャプチャーする場合）のいずれであってもよい。抗原を固定化した後、検出抗体を添加して、抗原と複合体を形成させる。検出抗体は、酵素と共有結合的に連結してもよく、バイオコンジュゲーションを通して酵素に連結する二次抗体によってそれ自体検出されてもよい。各工程と工程との間に、特異的に結合していない任意のタンパク質または抗体を除去するために、典型的には、穏やかな洗剤溶液でプレートを洗浄する。最後の洗浄工程の後、サンプル中の抗原の量を示す可視シグナルを生じさせるために、酵素基質を添加することによってプレートを発色させる。以前のELISAでは発色基質を使用するが、最近のアッセイは、はるかに高感度の蛍光発生基質を利用する。
【００９５】
別の態様では、競合ELISAを使用する。標的ポリペプチドまたはその断片に対する精製抗体を、マルチウェルプレートの固相上にコーティングする、すなわち、固体表面にコンジュゲートさせる。また、いかなる固体支持体上にもコンジュゲートしていない第2のバッチの精製抗体も必要である。これらコンジュゲートしていない精製抗体を、検出目的のために標識する、例えば、検出可能なシグナルを生じさせるためにセイヨウワサビペルオキシダーゼで標識する。対象からのサンプル（例えば、血液サンプル）を、セイヨウワサビペルオキシダーゼで標識された抗体と共に既知の量の所望の抗原（例えば、既知の体積または濃度の標的ポリペプチドを含むサンプル）と混合し、次いで、コーティングされたウェルに混合物を添加して、競合的な組み合わせを形成する。インキュベーション後、サンプル中のポリペプチドレベルが高い場合、標識された抗体試薬−抗原の複合体が形成される。この複合体は溶液中では遊離しており、洗い流すことができる。ウェルを洗浄して複合体を除去する。次いで、ウェル内のセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体の局在化のために、TMB（3,3’,5,5’-テトラメチルベンジデン）発色基質と共にインキュベーションする。サンプル中の標的ポリペプチドレベルが高い場合、色が変化しないか、またはほとんど色が変化しない。標的ポリペプチドがサンプル中にほとんどまたは全く存在しない場合、異なる複合体、すなわち固体支持体に結合している抗体試薬−標的ポリペプチドの複合体が形成される。この複合体はプレート上に固定化されており、洗浄工程では洗い流されない。その後、TMBと共にインキュベーションすると、著しい色の変化が生じる。このような競合的なELSA試験は、特異的であり、高感度であり、再現性があり、そして、操作が簡単である。
【００９６】
他の異なる形態のELISAが存在し、これは当業者に周知である。ELISAのための当技術分野において公知の標準的な技術は、"Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980；およびOellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904に記載されている。これら参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９７】
ある態様では、サンプル中のポリペプチドのレベルは、イムノクロマトグラフィーアッセイとしても知られているラテラルフローイムノアッセイ試験（LFIA）、またはストリップ試験によって検出することができる。LFIAは、流体サンプル中の抗原、例えば、ポリペプチドの存在（または非存在）を検出することを意図する単純な装置である。現在、家庭での検査、ポイントオブケア検査、または臨床検査のいずれかで使用するための医療診断用の多くのLFIA試験が存在する。LFIA試験は、毛細管作用を介して固体基材に沿って試験サンプルが流れるイムノアッセイの形態である。サンプルを試験ストリップに塗布した後、該サンプルは、サンプルと混ざり合うマイクロ粒子に結合している着色試薬（一般的には、試験標的抗原に特異的な抗体を含む）に遭遇し、そして、別の抗体または抗原で前処理されている基質遭遇ラインまたはゾーンに移行する。サンプル中に存在する標的ポリペプチドのレベルに応じて、着色試薬は、試験ラインまたはゾーンでキャプチャーされ、結合することができる。LFIAは、本質的には、試験ストリップ形式またはディップスティック形式に適した1本の軸に沿って動作するように適合したイムノアッセイである。ストリップ試験は極めて汎用性が高く、そして、尿、血液、水、および／または均質化された組織サンプル等の流体サンプルから非常に広い範囲の抗原を検出するために、当業者によって容易に改変され得る。ストリップ試験は、ディップスティック試験としても知られており、その名称は、試験される流体サンプルに試験ストリップを「浸す」という文字通りの行為に由来している。LFIAストリップ試験は、使いやすく、最低限の訓練しか必要とせず、そして、現場においてその場で使用されるポイントオブケア試験（POCT）診断の構成要素として容易に含めることができる。LFIA試験は、競合的アッセイまたはサンドイッチアッセイのいずれかとして運用することができる。サンドイッチLFIAは、サンドイッチELISAに類似している。サンプルは、まず、標的抗原に対して産生された抗体で標識された着色粒子に遭遇する。試験ラインも同じ標的に対する抗体を含有するが、抗原上の異なるエピトープに結合し得る。試験ラインは、陽性サンプルでは着色バンドとして示される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、ラテラルフローイムノアッセイは、二重抗体サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、定量アッセイ、またはそれらの変形例であり得る。競合的LFIAは、競合的ELISAに類似している。サンプルは、まず、標的抗原または類似体で標識された着色粒子に遭遇する。試験ラインは、標的／その類似体に対する抗体を含有する。サンプル中の非標識抗原は、抗体上の結合部位をブロックし、着色粒子の取り込みを防ぐ。試験ラインは、陰性サンプルでは着色バンドとして示される。ラテラルフロー技術には多数の変形例が存在する。また、複数のキャプチャーゾーンを適用してマルチプレックス試験を作り出すことも可能である。
【００９８】
「ディップスティック」またはLFIA試験ストリップおよび他の固体支持体の使用は、多数の抗原バイオマーカーのためのイムノアッセイに関連して当技術分野において記載されている。その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,943,522号；同第6,485,982号；同第6,187,598号；同第5,770,460号；同第5,622,871号；同第6,565,808号、米国特許出願第10/278,676号；米国出願第09/579,673号および米国出願第10/717,082号は、このようなラテラルフロー試験装置の非限定的な例である。免疫化学的アッセイを介して可溶性抗原を検出するための「ディップスティック」技術の使用について記載している特許の例は、米国特許第4,444,880号、同第4,305,924号、および同第4,135,884号を含むが、それに限定されるわけではなく、これらは全体が参照により本明細書に組み入れられる。これら3つの特許の装置および方法は、スティック上の構成要素−抗原複合体を検出する前に、「ディップスティック」上に固定された構成要素に結合する可溶性抗原を含有する溶液に曝露される、「ディップスティック」上の固体表面に固定された第1の構成要素について広く記載している。本明細書において記載される抗体試薬を用いてポリペプチドを検出するために、この「ディップスティック」技術の教示を改変することは、当業者の技能の範囲内である。
【００９９】
サンプル中のポリペプチドのレベルを検出するために他の技術を使用することもできる。そのような技術の1つは、ウエスタンブロッティングを適合させたドットブロットである（Towbin et at., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)）。ウェスタンブロットでは、ポリペプチドまたはその断片を洗剤および熱で解離させ、そして、SDS-PAGEゲル上で分離した後、ニトロセルロースまたはPVDFメンブレン等の固体支持体に転写してよい。メンブレンを、標的ポリペプチドまたはその断片に特異的な抗体試薬と共にインキュベーションする。次いで、メンブレンを洗浄して、結合していないタンパク質および非特異的に結合しているタンパク質を除去する。次いで、検出可能に標識された酵素結合二次または検出抗体を使用して、試験されるサンプル中のポリペプチドの量を検出および評価することができる。ドットブロットは、ウエスタンブロッティングと同様に、支持体の規定の領域にタンパク質サンプルを固定化し、次いで、抗体および標識された二次抗体でプロービングする。いずれの形式でも、検出可能な標識からのシグナルの強度は、存在する酵素の量に対応し、したがって、ポリペプチドの量に対応する。レベルは、例えばデンシトメトリーによって定量することができる。
【０１００】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、標的のレベルは、非限定的な例として、ウェスタンブロット；免疫沈降；酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）；放射免疫アッセイ（RIA）；サンドイッチアッセイ；蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）；免疫組織学的染色；放射免疫学的アッセイ；免疫蛍光アッセイ；質量分析法、および／または免疫電気泳動アッセイによって測定することができる。
【０１０１】
特定の態様では、本明細書において記載される遺伝子発現産物は、代わりに、本明細書において記載される遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）の発現レベルを求めることによって決定することができる。このような分子は、血液サンプル等の生体サンプルから単離してもよく、由来していてもよく、または増幅してもよい。mRNA発現を検出するための技術は、当業者に公知であり、PCR手技、RT-PCR、定量RT-PCRノーザンブロット解析、差次的遺伝子発現、RNAse保護アッセイ、マイクロアレイベースの解析、次世代シーケンシング；ハイブリダイゼーション法等を含み得るが、それに限定されるわけではない。
【０１０２】
一般に、PCR手技は、（i）核酸のサンプルまたはライブラリ内の特定の遺伝子または配列にプライマーを配列特異的にハイブリダイゼーションさせ、（ii）その後、熱安定性DNAポリメラーゼを用いて複数ラウンドのアニーリング、伸長、および変性を伴う増幅を行い、そして、（iii）正しいサイズのバンドについてPCR産物をスクリーニングすることで構成される遺伝子増幅方法を説明する。使用されるプライマーは、重合を開始させるのに十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドであり、すなわち、各プライマーは、増幅されるべきゲノム遺伝子座の鎖に対して相補的であるように特異的に設計される。別の態様では、本明細書において記載される遺伝子発現産物のmRNAレベルは、逆転写（RT）PCRによって、および定量RT-PCR（QRT-PCR）またはリアルタイムPCR法によって決定することができる。RT-PCRおよびQRT-PCRの方法は、当技術分野において周知である。
【０１０３】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、mRNAのレベルは、定量シーケンシング技術、例えば、定量次世代シーケンシング技術によって測定することができる。核酸配列のシーケンシングの方法は、当技術分野において周知である。簡単に説明すると、対象から得られたサンプルを、標的遺伝子配列に隣接する一本鎖核酸配列に特異的にハイブリダイズする1つまたは複数のプライマーに接触させることができ、そして、相補鎖が合成される。幾つかの次世代技術では、アダプター（二本鎖または一本鎖）がサンプル中の核酸分子にライゲーションし、そして、アダプターまたはアダプター適合性プライマーから合成が進行する。幾つかの第3世代の技術では、例えば、プローブのハイブリダイゼーションの位置およびパターンを決定することによって、またはセンサを通過する際に単一分子の1つもしくは複数の特徴（例えば、核酸分子がナノ細孔を通過する際の電場の変調）を測定することによって、配列を決定することができる。例示的なシーケンシング方法は、Sangerシーケンシング、ジデオキシ鎖終結、ハイスループットシーケンシング、次世代シーケンシング、454シーケンシング、SOLiDシーケンシング、ポロニーシーケンシング、Illuminaシーケンシング、Ion Torrentシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシング、Helioscopeシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング、RNAPシーケンシング等を含むが、それに限定されるわけではない。これらシーケンシング方法を実施するための方法およびプロトコルは、当技術分野において公知であり、例えば、“Next Generation Genome Sequencing” Ed. Michal Janitz, Wiley-VCH；“High-Throughput Next Generation Sequencing” Eds. Kwon and Ricke, Humanna Press, 2011；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012)を参照；これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０４】
本明細書において記載される遺伝子の核酸配列には、ヒト、マウス、およびラット等の様々な種についてのNCBIおよびENSBLのアクセッション番号が割り当てられている。本明細書において記載される遺伝子のいずれかの配列は、当業者であれば、いずれのデータベースからも容易に検索することができる。局面のいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される遺伝子、転写物、またはポリペプチドの配列は、本出願の出願日の時点でNCBIまたはENSMBLのデータベースで利用可能な配列である。したがって、当業者は、それぞれの遺伝子のmRNAレベルを求めるために既知の配列に基づいて適切なプライマーを設計することができる。
【０１０５】
核酸およびリボ核酸（RNA）の分子は、当技術分野において周知である多数の手技のいずれかを用いて特定の生体サンプルから単離することができ、選択される特定の単離手技は、特定の生体サンプルにとって適切である。例えば、凍結融解およびアルカリ溶解の手技は、固体材料から核酸分子を得るために有用であり得；加熱およびアルカリ溶解の手技は、尿から核酸分子を得るために有用であり得；そして、プロテイナーゼK抽出は、血液から核酸を得るために使用することができる（Roiff, A et al. PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)）。
【０１０６】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される試薬（例えば、抗体試薬および／または核酸プローブ）のうちの1つまたは複数は、検出可能な標識を含み得る、および／または（例えば、化合物を検出可能な生成物に変換する反応を触媒することによって）検出可能なシグナルを生成する能力を有し得る。検出可能な標識は、例えば、光吸収色素、蛍光色素、または放射性標識を含み得る。検出可能な標識、それを検出する方法、およびそれを試薬（例えば、抗体および核酸プローブ）に組み込む方法は、当技術分野において周知である。
【０１０７】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁的、放射化学的、または蛍光、化学蛍光、もしくは化学発光等の化学的な手段、あるいは他の適切な手段によって検出することができる標識を含み得る。本明細書において記載される方法で使用される検出可能な標識は、一次標識（標識が直接検出可能であるかまたは直接検出可能な部分を生成する部分を含む場合）または二次標識（例えば、二次抗体および三次抗体を使用する免疫学的標識において一般的であるように、検出可能な標識が別の部分に結合して検出可能なシグナルを生成する場合）であってよい。検出可能な標識は、共有結合的または非共有結合的手段によって試薬に連結することができる。あるいは、リガンド−受容体結合対配置を介して試薬への結合を達成する分子または他のこのような特異的認識分子を直接標識すること等により、検出可能な標識は連結することができる。検出可能な標識は、放射性同位体、生物発光化合物、発色団、抗体、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素を含み得るが、それに限定されるわけではない。
【０１０８】
他の態様では、検出試薬は、蛍光化合物で標識される。蛍光標識された試薬を適当な波長の光に曝露したとき、蛍光によりその存在を検出することができる。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、蛍光色素分子、またはフルオレセイン、フィコエリトリン、フィコシアニン、o−フタルデヒド、フルオレスカミン、Cy3（商標）、Cy5（商標）、アロフィコシアニン、Texas Red、ペリデニンクロロフィル、シアニン、フィコエリトリン-Cy5（商標）等のタンデムコンジュゲート、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびOregon Green（商標）、ローダミンおよび誘導体（例えば、Texas Redおよびテトラロージミンイソチオシネート（tetrarhodimine isothiocynate）（TRITC））、ビオチン、フィコエリトリン、AMCA、CyDyes（商標）、6−カルボキシフィオレセイン（carboxyfhiorescein）（略称FAMおよびFによって一般的に知られている）、6-カルボキシ-2’,4’,7’,4,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、6−カルボキシ-4’,5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシフルオレセイン（JOEまたはJ）、N,N,N’,N’-テトラメチル-6カルボキシローダミン（TAMRAまたはT）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROXまたはR）、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5またはG5）、6−カルボキシローダミン-6G（R6G6またはG6）、およびローダミン110を含むがそれに限定されるわけではないフルオロフォア；シアニン色素、例えば、Cy3、Cy5、およびCy7色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えば、Hoechst 33258；フェナントリジン色素、例えば、Texas Red；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、Cy3、Cy5等のシアニン色素；BODIPY色素およびキノリン色素であってよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、3H、125I、35S、14C、32P、および33Pを含むがそれに限定されるわけではない放射標識であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含むがそれに限定されるわけではない酵素であり得る。酵素標識は、例えば、化学発光シグナル、色シグナル、または蛍光シグナルを生成することができる。抗体試薬を検出可能に標識するために使用することが企図される酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-V-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-VI-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含むが、それに限定されるわけではない。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、ルシゲニン、ルミノール、ルシフェリン、イソルミノール、テロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルを含むがそれに限定されるわけではない化学発光標識である。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出可能な標識は、コロイド金または色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、およびラテックス）ビーズを含むがそれに限定されるわけではないスペクトル比色標識であり得る。
【０１０９】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、検出試薬は、検出可能なタグ、例えば、c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5、HIS、またはビオチンで標識されてもよい。また、他の検出系、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン系を用いることもできる。この系では、関心対象のバイオマーカーに対して免疫反応性の（すなわち、特異的な）抗体がビオチン化される。バイオマーカーに結合しているビオチン化抗体の量は、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートおよび発色基質を用いて決定される。このようなストレプトアビジンペルオキシダーゼ検出キットは、例えば、DAKO；Carpinteria, CAから市販されている。また、152Euまたはランタニド系列の他の金属等の蛍光発光金属を用いて試薬を検出可能に標識してもよい。これら金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）またはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）等の金属キレート化基を使用して試薬に結合することができる。
【０１１０】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、発現レベルは、対象から得られたサンプルにおけるレベルである。用語「サンプル」または「試験サンプル」は、本明細書で使用されるとき、生物有機体から採取または単離されたサンプル、例えば、対象からの血液または組織のサンプルを意味する。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本発明は、生体サンプルの幾つかの例を包含する。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、生体サンプルは、細胞、または組織、または末梢血、または体液である。例示的な生体サンプルは、生検、腫瘍サンプル、生体液サンプル；血液；血清；血漿；尿；精液；粘液；組織生検；臓器生検；滑液；胆汁液；脳脊髄液；粘膜分泌物；滲出液；汗；唾液；および／または組織サンプル等を含むが、それに限定されるわけではない。この用語は、上述のサンプルの混合物も含む。また、用語「試験サンプル」は、未処理のまたは前処理（または前加工）された生体サンプルも含む。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、対象からの細胞を含み得る。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象から得られたサンプルは、生検サンプルであり得る。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象から得られたサンプルは、血液または血清のサンプルであり得る。
【０１１１】
局面のいずれかの幾つかの態様では、サンプルは、対象から得られた気管支内生検標本、気管支ブラシ擦過サンプル、気管支生検標本、気管支内ブラシ擦過サンプル、大気道生検標本、大気道ブラシ擦過サンプル、鼻上皮細胞、痰、および／または血液である。局面のいずれかの幾つかの態様では、サンプルは、右または左の主気管支から得られた気管支ブラシ擦過標本である。試験サンプルは、対象からサンプルを採取することによって得ることができるが、以前に単離されたサンプル（例えば、事前の時点で単離された、および同一または別の人物によって単離された）を使用することによって達成することもできる。
【０１１２】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、未処理の試験サンプルであってよい。本明細書において使用するとき、語句「未処理試験サンプル」とは、希釈および／または溶液への懸濁を除いていかなる事前のサンプル前処理も行っていない試験サンプルを指す。試験サンプルを処理するための例示的な方法は、遠心分離、濾過、超音波処理、均質化、加熱、凍結および解凍、ならびにそれらの組み合わせを含むが、それに限定されるわけではない。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、凍結試験サンプル、例えば、凍結組織であってよい。凍結サンプルは、本明細書において記載される方法、アッセイ、および系を利用する前に解凍してよい。解凍後、本明細書において記載される方法、アッセイ、および系に供される前に凍結サンプルを遠心分離してもよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、例えば、遠心分離し、そして、清澄化された試験サンプルを含む上清を回収することによる、清澄化された試験サンプルである。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、試験サンプルは、前加工された試験サンプル、例えば、遠心分離、濾過、解凍、精製、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される処理から得られた上清または濾液であってよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、化学的および／または生物学的試薬で試験サンプルを処理してもよい。化学的および／または生物学的試薬は、加工中に、その中に生体分子（例えば、核酸およびタンパク質）を含むサンプルの安定性を保護および／または維持するために使用することができる。1つの例示的な試薬は、プロテアーゼ阻害薬であり、これは一般に、加工中にタンパク質の安定性を保護または維持するために使用される。当業者は、本明細書において記載される通り発現産物のレベルの決定に必要な生体サンプルの前加工に適切な方法およびプロセスを十分に認識している。
【０１１３】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法、アッセイ、および系は、対象から試験サンプルを得るまたは得た工程を更に含み得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象はヒト対象であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、対象は、前悪性病変の処置を必要とする（例えば、前悪性病変を有するかまたは有すると診断された）対象、または本明細書の他の箇所に記載される通り前悪性病変を発症するリスクがあるかまたは発症するリスクが増大している対象であり得る。
【０１１４】
局面のいずれかの幾つかの態様では、生検標本またはブラシ擦過サンプルは、形態学的に正常な組織または細胞を含み、例えば、組織または細胞は、病変部からのものではなく、それらのインビボにおける位置において正常な形態を示す。局面のいずれかの幾つかの態様では、生検標本またはブラシ擦過サンプルは、形態学的に正常な組織または細胞から本質的になる。局面のいずれかの幾つかの態様では、生検標本またはブラシ擦過サンプルは、形態学的に正常な組織または細胞からなる。
【０１１５】
局面のいずれかの幾つかの態様では、生検標本またはブラシ擦過サンプルは、視覚的に正常な組織または細胞を含み、例えば、組織または細胞は、病変部からのものではなく、それらのインビボにおける位置においてヒトの肉眼で正常な外観を有する。局面のいずれかの幾つかの態様では、生検標本またはブラシ擦過サンプルは、視覚的に正常な組織または細胞から本質的になる。局面のいずれかの幾つかの態様では、生検標本またはブラシ擦過サンプルは、視覚的に正常な組織または細胞からなる。
【０１１６】
局面のいずれかの幾つかの態様では、生検またはブラシ擦過サンプルは、気管支前悪性病変細胞を含む。局面のいずれかの幾つかの態様では、生検またはブラシ擦過サンプルは、気管支前悪性病変細胞から本質的になる。局面のいずれかの幾つかの態様では、生検またはブラシ擦過サンプルは、気管支前悪性病変細胞からなる。
【０１１７】
基準レベルよりも低いレベルは、基準レベルに対して少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、またはそれよりも少ない、低いレベルであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準レベルよりも低いレベルは、基準レベルよりも統計的に有意に低いレベルであり得る。
【０１１８】
基準レベルよりも高いレベルは、基準レベルよりも少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約200％、少なくとも約300％、少なくとも約500％、またはそれよりも多い、高いレベルであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準レベルよりも高いレベルは、基準レベルよりも統計的に有意に高いレベルであり得る。
【０１１９】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準は、気管支前悪性病変を有していないもしくは有していると診断されていない、および／または気管支前悪性病変の徴候もしくは症状を示していない対象の集団における標的分子のレベルであり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準はまた、対照サンプル、対照個体のプールされたサンプル、またはそれらに基づく数値もしくは数値範囲における、標的分子の発現レベルであってもよい。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、基準は、より早い時点における同じ対象から得られたサンプルにおける標的分子レベルであってもよく、例えば、本明細書において記載される方法を使用して、所与の療法に対する対象の感受性または応答が経時的に変化しているかどうか、またはそれらの病変のサブタイプが変化しているかどうかを判定することができる。
【０１２０】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、200個以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが決定される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、100個以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが決定される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、20個以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが決定される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、10個以下の他の遺伝子の発現産物のレベルが決定される。
【０１２１】
前述の局面の幾つかの態様では、所与の遺伝子の発現レベルは、1つまたは複数の参照遺伝子または参照タンパク質の発現レベルに対して正規化され得る。
【０１２２】
幾つかの態様では、基準レベルは、発現レベルが決定されるサンプル／対象と類似の細胞型、サンプルの種類、サンプル加工の、ならびに／または類似の年齢、性別、および他の人口統計学的パラメータの対象から得られたサンプルにおけるレベルであり得る。幾つかの態様では、試験サンプルおよび対照参照サンプルは、同じ種類のもの、すなわち、同じ生物学的源から得られ、そして、同じ組成、例えば、同じ数および種類の細胞を含むものである。
【０１２３】
局面のいずれかの幾つかの態様では、基準レベルは、非増殖性基準レベル、例えば、増殖性病変を含まない、または増殖性病変を有しない対象からの組織もしくは細胞におけるレベルであり得る。例えば、レベルは、炎症性、分泌性、もしくは正常様の病変のサブタイプにおけるレベル、またはその平均またはプーリングであり得る。
【０１２４】
幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、気管支前悪性病変を有するかまたは有すると診断された対象の処置に関する。気管支前悪性病変を有する対象は、医師が現在の気管支前悪性病変の診断方法を用いて同定することができる。例えば、気管支前悪性病変の診断に役立ち得る検査は、気管支鏡検査、自家蛍光気管支鏡検査などを含むが、それに限定されるわけではない。気管支前悪性病変の家族歴または気管支前悪性病変の危険因子（例えば、タバコの煙）への曝露も、対象が気管支前悪性病変を有する可能性があるかどうかを判定したり、または気管支前悪性病変の診断を下したりするのに役立つことがある。
【０１２５】
本明細書において記載される組成物および方法は、気管支前悪性病変を有するかまたは有すると診断された対象に投与することができる。幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、気管支前悪性病変の症状を軽減するために、本明細書において記載される組成物の有効量を対象に投与する工程を含む。本明細書において使用するとき、「気管支前悪性病変の症状を軽減する」とは、気管支前悪性病変に関連する任意の病態または症状を回復させることである。等価な未処置対照と比較したとき、このような減少は、任意の標準的な技術によって測定したとき、少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％またはそれ以上である。本明細書において記載される組成物を対象に投与するための様々な手段は、当業者に公知である。このような方法は、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、肺、皮膚、局所、注射、または腫瘍内の投与を含み得るが、それに限定されるわけではない。投与は、局所であっても全身であってもよい。
【０１２６】
本明細書において記載される方法は、肺がん、例えば、肺扁平上皮細胞癌腫の発症を予防、遅延、または減速することができる。局面のいずれかの幾つかの態様では、本方法に従って処置される対象は、肺がんを有する対象ではない。局面のいずれかの幾つかの態様では、本方法に従って処置される対象は、肺がんを有しない対象である。局面のいずれかの幾つかの態様では、本方法に従って処置される対象は、肺がんを有しておらず、そして、有していたこともない対象である。局面のいずれかの幾つかの態様では、本方法に従って処置される対象は、肺がんのリスクを有する。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象は、気管支前悪性病変を有する対象である。
【０１２７】
局面のいずれかの幾つかの態様では、対象は、喫煙者である。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象は、元喫煙者である。局面のいずれかの幾つかの態様では、対象は、非喫煙者である。
【０１２８】
本明細書において記載される処置、例えば、抗増殖薬、抗炎症薬、または免疫刺激薬は、全身的に、吸入によって、および／または対象の気道の任意の部分（鼻および口を含む）に局所的に投与することができる。局面のいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される処置、例えば、抗増殖薬、抗炎症薬、または免疫刺激薬は、気管支鏡検査またはブラシ擦過による採取中に、i）全身的に、およびii）吸入によって、または対象の気道の任意の部分（鼻および口を含む）に局所的に投与することができる。
【０１２９】
抗増殖薬は、細胞の成長および／または分裂を阻害する薬、例えば、細胞分裂阻害薬であり、それは、関連する状況における化合物の主要な活性である。抗増殖薬の非限定的な例は、CDK阻害薬（例えば、プルバラノール-a、パルボシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、およびオロモウシンII）；HDAC阻害薬（例えば、THM-I-94、ボリノスタット、ギビノスタット）；PARP阻害薬（例えば、AG-14361、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、ベリパリブ、パミパリブ、CEP 9722、E7016、イニパリブ、3-アミノベナズミド(3-aminobenazmide)）；JAK阻害薬（例えば、JAK3阻害薬-VI、ルキソリチニブ、トファシチニブ、オクラシチニブ、バリシチニブ、ペフィシチニブ、フィルゴチニブ、セルドュラチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、モメロチニブ、パクリチニブ、PF-04965842、ウパダシチニブ、フェドラチニブ、ククルビタシン、CHZ868）；JNK阻害薬（例えば、ZG-10、AS-601245、AM-111）；MTOR阻害薬（例えば、AZD-8055、PI-103、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、ラパログス、シロリムス）；FLT3阻害薬（例えば、レスタウルチニブ、TG-101348、ギルテリチニブ、キザルチニブ、ミドスタウリン、ソラフェニブ、スニチニブ）；PI3K阻害薬（例えば、GDC-0941、PI-828、ワートマニン、LY294002、ハイビスコンC、イデラリシブ、コパンリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ、タセリシブ、ペリフォシン、ブパルリシブ、ウンブラリシブ、PX-866、ダクトリシブ、CUDC-907、ボクスタリシブ、ME-401、IPI-549、SF1126、PR6530、INK1117、ピクチリシブ、XL147、パルモイド529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100-115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477、AEZS-136）；AKT阻害薬（例えば、A-443644、パモ酸ピルビニウム、VQD-002、ペリフォシン、ミルテフォシン、MK-2206、AZD5363、イパタセイシチブ）；チロシンキナーゼ阻害薬（例えば、アミノプルバラノール-a、SU-11652、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、アダボセルチブ、ラパチニブ）；プロテインキナーゼ阻害薬（例えば、HG-5-113-01、アダボセルチニブ、アファチニブ、アキシチニブ、ボスンチニブ、セツキシマブ、コンビメチニブ、クリゾチニブ、カボザンチニブ、ダサチニブ、エヌトレクチニブ、エルダフィチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、SU6656、バンデタニブ、ベムラフェニブ）；RNAポリメラーゼ阻害薬（例えば、ダクチノマイシン、トリプトリド）；トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、ピドルビシン、ドキソルビシン、カンポテシン類、インデノシオキノリン類、インドテカン、イムジミテカン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ICRF-193、ゲニステイン）；HSP阻害薬（例えば、HSP90阻害薬、17-N-アリルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン（17AAG）、ガミトリニブ）；DNAプロテインキナーゼ阻害薬（例えば、PIK-75）；接着斑キナーゼ阻害薬（例えば、PF-562271、PF573,228、PF-271、NVP-226、Y15、PND-1186、GSK2256098、VS-6062、VS-6063、VS-4718）；RNA合成阻害薬（ダウノルビシン）；メディエータ放出阻害薬（例えば、ER-27319）；およびEZH2阻害薬（DZNep、EPZ005687、EI1、GSK126、UNC1999、EPZ-6438、タゼメト���タット）を含み得る。抗増殖薬の更なる非限定的な例は、アセチルコリン受容体拮抗薬（例えば、クロザピン、クエチアピン、アトロピン、ベンズトロピン、ビペリデン、クロルフェニラミン、シタロプラム、ジシクロミン、ジメントヒドリナート、ジフェンヒドラミン、ドクサピン、ドキシラミン、グリコピロラート、グリコピロニウム、ヒヨスチアミン、イプラトロピウム、オルフェナドリン、オキシトロピウム、オキシブチニン、プロメタジン、臭化プロパンテリン、スコポラミン、ソリフェナシン、ソリフェナシン、トルテロジン、チオトロピウム、トリヘキシフェニジル、トロピカミド、ツボクラリン、メカミラミン、ヘキサメトニウム、ドキサクリウム、デキストロメトルファン、ブプリオピオン）；アセチルコリンエステラーゼ阻害薬（例えば、フィゾスチグミン、ネオスチグミン、ピリドスチグミン、アンベノニウム、デメカリウム、リバスチグミン、フェナントレン誘導体、ガランタミン、α-ピネン-非競合的可逆性、ピペリジン、ドネペジル、タクリン、エドロホニウム、フペルジンA、ラドスチギル、ウンゲレミン、ラクツコピクリン、およびアコチアミド）；アデノシン受容体拮抗薬（例えば、テオフィリンおよびテオブロミン）；アドレナリン作動性受容体拮抗薬（例えば、フェントラミン、フェノキシベンザミン、プロプラノロール、ネビビロール、アテノロール、オクスプレノロール、メトプロロール、チモロール、ピンドロール、ナドロール、ピンドロール、エスモロール、アセブトロール、ソタロール、タリノロール、ベタキソロール、ラベタロール、およびカルベジロール）；アンジオテンシン受容体拮抗薬（例えば、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、バルサルタン）；アポトーシス刺激薬（例えば、アシアチン酸、グリコデオキシコール酸）；シクロオキシゲナーゼ阻害薬（例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ）；サイトカイン産生阻害薬（例えば、シロリムス、バシリキシマブ、ダクリズマブ）；デヒドロゲナーゼ阻害薬（例えば、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸）；ドーパミン受容体拮抗薬（例えば、ベンペリドール、クロルプロマジン、クロペンチキソール、ドロペリドール、ハロペリドール、フルフェナジン、フルペンチキソール、フルスピリレン、ペンフルリドール、ペラジン、ペルフェナジン、ピモジド、スピペロン、スルピリド、チオリダジン、アミスルプリド、アセアナピン、アリプリプラゾール、クロザピン、ロキサピン、ネモナプリド、オランザピン、クエチアピン、パリペリドン、レモキシプリド、リスペリドン、チアプリド、ジプラシドン、ドンペリドン、ブロモプリド、メトクロプラミド、エチクロプリド、ナファドトリド、ラクロプリド）；EGFR阻害薬（例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、イアパチニブ、オシメルチニブ、セツキシマブ、ネラチニブ、プナイツムマブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、ダコミチニブ）；ERK1およびERK2のリン酸化阻害薬（例えば、RAF、RAS、またはMEKの阻害薬）；エストロゲン受容体作動薬（例えば、エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、フィトエストロゲン類、タモキシフェン、クロミフェン、ラロキシフェン）；��ルタミン酸受容体拮抗薬（例えば、AP5、バルビツール酸塩、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジゾクリピン、イボガイン、イフェンプロジル、ケタミン、キヌレン酸、メマンチン、ペランパネル、フェンシクリジン）；ヒスタミン受容体拮抗薬（例えば、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、ニザチジン、ロキサチジン、ラフチジン）；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害薬（EPZ004777、EPZ5676、BIX01294）；IKK阻害薬（例えば、クルクミン、エンベリン、オーラノフィン、ブテイン、IMD0354、IKK16、SC514、BAY11-7082、MRT67307、BMS-345541、アンレキサノクス、MLN120B）；イオンチャネル拮抗薬（例えば、エラスチン）；ロイシンリッチリピートキナーゼ阻害薬（例えば、MLi-2、PF-06447475、GSK2578215、LRKK2-IN1、HG 10/102/01、CZC-25146）；MDM阻害薬（例えば、テノビン-2、イダサヌトリン、SP141 MI-773、RO8994、AMG232、ヌトリン-3）；モノアミンオキシダーゼ阻害薬（例えば、ヒドラジン、イソカルボキサジド、ニアラミド、フェネルジン、ヒドラカルバジン、トラニルシプロミン（tnrylcypromine）、ベフェメラン、モクロベミド、ピルリンドール、トロキサトン、ラサギリン、セレギリン、サフィナミド）；ヌクレオホスミン阻害薬（例えば、EAPB0503、NSC348884、Rev37-47 CIGB-300、アブラインビラミド、デグエリン、EPTG、YTR107）；PPAR受容体作動薬（例えば、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、フェノフィブラート、チアゾリジンジオン類、BW501516、アレグリタザル、ムラグリチザル、テサグリタザル）；ホスホジエステラーゼ阻害薬（例えば、ビンポセチン、ENHA、BAY 60-7550、オキシンドール、PDP、IBMX、アミノフィリン、プラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、イナムリノン、ミルリノン、エノキシモン、アナグレリド、シロスタゾール、ピモベンダン）；SIRT阻害薬（例えば、(s)-2-フェンチル-6-クロロ、8-ボルモ-クロマン-4-オン、3'-フェネチルオキシ-2-アニリノベンズアミド）；ナトリウムチャネル遮断薬（例えば、プロカインアミド、キニジン、ジソピラミド、リドカイン、メキシレチン、トカイニド、フェニトイン、エンカイニド、フレカイニド、モリシジン、プロパフェノン）；およびビタミンD受容体作動薬（例えば、EB 1089、BXL-01-0029、エロカルシトール）を含む。幾つかの態様では、本明細書において記載される任意の状況における抗炎症活性を欠く抗増殖薬は、JAK阻害薬、JNK阻害薬、AKT阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、RNAポリメラーゼ阻害薬、HSP阻害薬、DNAプロテインキナーゼ阻害薬、接着斑阻害薬、RNA合成阻害薬、およびメディエータ放出阻害薬を含み得る。
【０１３０】
本明細書において使用するとき、用語「抗炎症」は、炎症を低減または阻害することが可能な化合物を指し、それは、関連する状況における化合物の主要な活性である。本明細書において使用するとき、用語「抗炎症薬」または「抗炎症物質」は、炎症を低減または阻害するために使用され得る任意の化合物（その類似体、誘導体、プロドラッグ、および薬学的塩を含む）を説明するために使用される。抗炎症薬の非限定的な例は、NFkB経路阻害薬（例えば、9-メチル-5H-6-チア-4,5-ジアザ-クリセン-6,6-ジオキシド、デノスマブ、ジスルフィラム、オルメサルタン、ジチオカルバマート、アナタビン、BAY 11-7082、パルミトイルエタノールアミド、イグアルチモド）；タンパク質合成阻害薬（例えば、クロラムフェニコール）；抗IL1B抗体（例えば、カナキヌマブ）；グルココルチコイド受容体作動薬（例えば、デキサメタゾン、ミフェプリストン）；およびTGFβ受容体阻害薬（例えば、LY-364947、GW-755.55、LY-2109761、ガルニセルチブ、SB431542、SB-525334）を含み得る。抗増殖薬の更なる非限定的な例は、アセチルコリン受容体拮抗薬；アセチルコリンエステラーゼ阻害薬；アデノシン受容体拮抗薬；アドレナリン作動性受容体拮抗薬；アンジオテンシン受容体拮抗薬；アポトーシス刺激薬；シクロオキシゲナーゼ阻害薬；サイトカイン産生阻害薬；デヒドロゲナーゼ阻害薬；ドーパミン受容体拮抗薬；EGFR阻害薬；ERK1およびERK2のリン酸化阻害薬；エストロゲン受容体作動薬；グルタミン酸受容体拮抗薬；ヒスタミン受容体拮抗薬；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害薬；IKK阻害薬；イオンチャネル拮抗薬；ロイシンリッチリピートキナーゼ阻害薬；MDM阻害薬；モノアミンオキシダーゼ阻害薬；ヌクレオホスミン阻害薬；PPAR受容体作動薬；ホスホジエステラーゼ阻害薬；SIRT阻害薬；ナトリウムチャネル遮断薬；ならびにビタミンD受容体作動薬を含む。幾つかの態様では、本明細書において記載される任意の状況における抗増殖活性を欠く抗炎症薬は、タンパク質合成阻害薬およびTGFβ受容体阻害薬を含み得る。
【０１３１】
本明細書においては、例えば、状況に応じて、単一の化合物が複数の活性を呈する場合があることに留意されたい。状況に応じて（例えば、作用物質が投与される／接触する対象または細胞）、主に抗炎症活性および／または抗増殖活性を呈することができる作用物質の非例は、アセチルコリン受容体拮抗薬、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬、アデノシン受容体拮抗薬、アドレナリン作動性受容体拮抗薬、アンジオテンシン受容体拮抗薬、アポトーシス刺激薬、オーロラキナーゼ阻害薬、CDK阻害薬、シクロオキシゲナーゼ阻害薬、サイトカイン産生阻害薬、デヒドロゲナーゼ阻害薬、ドーパミン受容体拮抗薬、EGFR阻害薬、ERK1およびERK2のリン酸化阻害薬、エストロゲン受容体作動薬、FLT3阻害薬、グルココルチコイド受容体作動薬、グルタミン酸受容体拮抗薬、HDAC阻害薬、ヒスタミン受容体拮抗薬、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害薬、HSP阻害薬、IKK阻害薬、イオンチャネル拮抗薬、KIT阻害薬、ロイシンリッチリピートキナーゼ阻害薬、MEK阻害薬、MDM阻害薬、ホスホジエステラーゼ阻害薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬、MTOR阻害薬、NFkB経路阻害薬、ヌクレオホスミン阻害薬、PARP阻害薬、PI3K阻害薬、PPAR受容体作動薬、RAF阻害薬、SIRT阻害薬、ナトリウムチャネルブロッカー、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害薬、VEGFR阻害薬、ならびにビタミンD受容体作動薬を含み得る。
【０１３２】
免疫刺激薬は、好ましくはがん細胞または異形成細胞に対する免疫系の活性を増加させる薬であり、それは、関連する状況における化合物の主要な活性である。本明細書において使用するとき、用語「免疫刺激薬」または「抗炎症薬」は、免疫系を刺激するために使用され得る任意の化合物（その類似体、誘導体、プロドラッグ、および薬学的塩を含む）を説明するために使用される。免疫刺激薬の非限定的な例は、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、PD-1、PD-L1、CTLA4、およびLAG3に対する阻害薬）；インターフェロンシグナル伝達を刺激する薬（例えば、ペギントロン、ペガシス、レフェロンA、ユニフェロン、マルチフェロン、レビフ、アボネックス、シンノベックス、ベタセロン、アクティミューン、レイフェロン、ペゲトロンなどのインターフェロンシグナル伝達を改善する抗ウイルス薬）；DNA合成阻害薬（例えば、TAS-102、NC-6004、ガンシクロビル）；CDK阻害薬（例えば、プルバラノール-a、パルボシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、およびオロモウシンII）；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬（例えば、モテキサフィン、ヒドロキシウレア、フルダラビン、クラドリビン、ゲムシタビン、テザシタビン、トリアピン、ガリウムマルトラート、硝酸ガリウム）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬（例えば、メトトレキサート、ピリトレキサム、シクログアニル、JPC-2056）；トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、ピドルビシン、ドキソルビシン、カンポテシン類、インデノシオキノリン類、インドテカン、イムジミテカン、アムサクリン、エトポシド、テニポシド、ICRF-193、ゲニステイン）；FLT3阻害薬（例えば、レスタウルチニブ、TG-101348、ギルテリチニブ、キザルチニブ、ミドスタウリン、ソラフェニブ、スニチニブ）；IGF-1阻害薬；MEK阻害薬（例えば、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、PD-325901、TAK-733）；オーロラキナーゼ阻害薬（例えば、ZM447439、ヘスペリジン、VX-680）；PKC阻害薬（例えば、ルボキシスタウリン、チェレリスリン、ミヤベノールC、ミリシトリン、ゴシポール、ベルバスコシド、BIM-1、ブリオステート1（bryostate1）、タモキシフェン）；RAF阻害薬（例えば、ベムラフェニブ、GDC-0879、PLX-4720、ソラフェニブ、ダブラフェニブ、LGX818）；PDFGR/KIT阻害薬（例えば、イマチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、ニロチニブ、モテサニブ、リニフェニブ）；VEGFR阻害薬（例えば、アキシチニブ、カボザンチニブ、レンバチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ）；SRC阻害薬（例えば、KX2-391、ボスチニブ、サラカチニブ、PP1、PP2、ケルセチン、ダスタビニブ）；レチノイド受容体作動薬（例えば、アリトレチノイン、イソレチノイン）；HDAC阻害薬（例えば、THM-I-94、ボリノスタット、ギビノスタット）；DNAメチルトランスフェラーゼ阻害薬（例えば、アザシチジン、デシタビン、ゼウブラリン）；およびEZH2阻害薬（DZNep、EPZ005687、EI1、GSK126、UNC1999、EPZ-6438、タゼメトスタット）を含み得る。
【０１３３】
幾つかの態様では、本明細書において記載される任意の状況における抗増殖／炎症活性を欠く免疫刺激薬は、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、PD-1、PD-L1、CTLA4、およびLAG3に対する阻害薬）；インターフェロンシグナル伝達を刺激する薬（例えば、インターフェロンシグナル伝達を改善する抗ウイルス薬）；DNA合成阻害薬；IMDH阻害薬；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬；SRC阻害薬；レチノイド受容体作動薬；HDAC阻害薬；およびDNAメチルトランスフェラーゼ阻害薬を含み得る。
【０１３４】
用語「有効量」は、本明細書で使用されるとき、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するために必要な組成物の量を指し、そして、所望の効果を提供する薬学的組成物の十分な量に関する。したがって、用語「治療的有効量」は、典型的な対象に投与したときに特定の治療効果を提供するのに十分な組成物の量を指す。有効量は、本明細書において使用するとき、様々な状況において、疾患の症状の発現を遅らせる、症状疾患の経過を変化させる（例えば、疾患の症状の進行を減速させるが、それに限定されるわけではない）、または疾患の症状を逆行させるのに十分な量も含む。したがって、一般的に、正確な「有効量」を指定するのは実用的ではない。しかしながら、任意の所与の症例について、当業者はルーチンな実験のみを用いて適切な「有効量」を決定することができる。
【０１３５】
有効量、毒性、および治療有効性は、例えば、LD50（集団の50％にとって致死性である用量）およびED50（集団の50％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手技によって決定することができる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に依存して変動し得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、比LD50／ED50として表すことができる。大きな治療指数を呈する組成物および方法が好ましい。治療的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。また、細胞培養物または適切な動物モデルで決定されたIC50（すなわち、症状の半最大阻害を達成する活性成分濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて用量を定式化することもできる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投与量の効果は、好適なバイオアッセイ、例えば、特に本明細書に記載の遺伝子発現についてのアッセイ等によってモニタリングすることができる。投与量は、医師によって決定され、そして、必要に応じて、観察された処置の効果に適するように調整され得る。
【０１３６】
幾つかの態様では、本明細書において記載される技術は、本明細書において記載される薬物および任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。幾つかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書において記載される薬物を含む。幾つかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書において記載される薬物から本質的になる。幾つかの態様では、薬学的組成物の活性成分は、本明細書において記載される薬物からなる。薬学的に許容される担体および希釈剤は、生理食塩水、水性バッファ溶液、溶媒、および／または分散媒を含む。このような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として機能し得る物質の幾つかの非限定的な例は、（1）乳糖、ブドウ糖、およびショ糖等の糖類；（2）コーンスターチおよびバレイショデンプン等のデンプン類；（3）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、および酢酸セルロース等のセルロースおよびその誘導体；（4）粉末状トラガカンス；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク等の滑沢剤；（8）カカオバターおよび坐剤用ワックス等の賦形剤；（9）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油等の油類；（10）プロピレングリコール等のグリコール類；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（PEG）等のポリオール類；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル類；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）パイロジェンフリー水；（17）等張生理食塩水；（18）リンゲル溶液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ酸無水物；（22）ポリペプチドおよびアミノ酸等の増量剤；（23）血清アルブミン、HDL、およびLDL等の血清成分；（22）エタノール等のC2〜C12アルコール；ならびに（23）薬学的製剤に使用される他の非毒性の適合性物質を含む。また、湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、着香料、香料、防腐剤、および酸化防止剤が製剤中に存在していてもよい。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」等の用語は、本明細書において互換的に使用される。幾つかの態様では、担体は、活性薬剤の分解を阻害する。
【０１３７】
幾つかの態様では、本明細書において記載される薬物を含む薬学的組成物は、非経口剤形であってよい。非経口剤形の投与は、典型的には、汚染物質に対する患者の自然防御を迂回するので、非経口剤形は、好ましくは、患者に投与する前に無菌であるかまたは滅菌され得る。非経口剤形の例は、注射の準備が整った液剤、注射のために薬学的に許容されるビヒクルに溶解または懸濁される準備が整った乾燥製品、注射の準備が整った懸濁剤、および乳剤を含むが、それに限定されるわけではない。更に、DUROS（登録商標）タイプの剤形および用量ダンピングを含むがそれに限定されるわけではない制御放出性非経口剤形を、患者に投与するために調製することができる。
【０１３８】
本明細書内に開示される薬物の非経口剤形を提供するために使用することができる好適なビヒクルは、当業者に周知である。例は、非限定的に、滅菌水；注射用水USP；生理食塩水；グルコース溶液；塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、デキストロース注射剤、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射剤、ならびに乳酸加リンゲル注射剤等であるがそれに限定されるわけではない水性ビヒクル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール等であるがそれに限定されるわけではない水混和性ビヒクル；ならびにコーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジル等であるが、それに限定されるわけではない非水性ビヒクルを含む。従来の制御放出性非経口剤形を含む、本明細書において開示される薬物の薬学的に許容される塩の溶解度を変化させるかまたは調節する化合物を、本開示の非経口剤形に組み込んでもよい。
【０１３９】
薬物を含む薬学的組成物はまた、経口投与に好適であるように、例えば、錠剤（非限定的に分割錠またはコーティング錠を含む）、丸剤、カプレット、カプセル、チュアブル錠、粉末パケット、カシェ剤、トローチ剤、ウェハ剤、エアゾールスプレー、または例えば、シロップ剤、エリキシル剤、水性液体、非水性液体、水中油型エマルション、もしくは油中水型エマルション中の溶液もしくは懸濁液等であるがそれに限定されるわけではない液剤等であるが、それに限定されるわけではない、分離した剤形として製剤化してもよい。このような組成物は、開示される化合物の薬学的に許容される塩を所定の量含有し、そして、当業者に周知の調剤の方法によって調製することができる。一般的には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005)を参照。
【０１４０】
従来の剤形は、一般的に、製剤から迅速にまたは即時に薬物を放出させる。薬物の薬理および薬物動態に依存して、従来の剤形を使用すると、患者の血液および他の組織における薬物の濃度が広く変動する場合がある。これら変動は、投与頻度、作用の発現、有効性の持続時間、治療域の血中レベルの維持、毒性、副作用等の多数のパラメータに影響を与え得る。有利なことに、薬物の作用の発現、作用の持続時間、治療濃度域内の血漿レベル、および血中ピークレベルを制御するために、制御放出性製剤を使用することができる。特に、薬物の毒性レベルを超えた場合はもちろん、薬物の過少投与（すなわち、最低治療レベルを下回る）からも生じ得る潜在的な有害作用および安全性に対する懸念を最小限に抑えながら、薬物の最大の有効度を確実に達成するようにするために、制御放出性または持続放出性の剤形または製剤を使用することができる。幾つかの態様では、薬物を持効性製剤で投与してよい。
【０１４１】
制御放出性薬学的製品は、その非制御放出性対応物によって達成されるものを超えて薬物療法を改善するという共通の目標を有している。理想的には、医学的処置における最適に設計された制御放出性調製物の使用は、最小の原薬を使用して、最小量の時間で病態を治癒または制御することを特徴とする。制御放出性製剤の利点は、1）薬物の活性の延長；2）投与頻度の低下；3）患者のコンプライアンスの向上；4）合計薬物使用量の減少；5）局所的または全身的な副作用の低減；6）薬物の蓄積の最小化；7）血中レベルの変動の低減；8）処置の有効性の改善；9）薬物活性の増強または喪失の低減；および10）疾患または病態の制御の速度改善を含む。Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)。
【０１４２】
ほとんどの制御放出性製剤は、速やかに所望の治療効果を生じさせる量の薬物（活性成分）を最初に放出し、そして、このレベルの治療効果または予防効果を長期間にわたって維持するために他の量の薬物を徐々にかつ継続的に放出するように設計されている。体内でこの一定のレベルの薬物を維持するためには、代謝されて体内から排出される薬物の量に置き換わる速度で剤形から薬物が放出されなければならない。活性成分の制御放出は、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理学的な条件または化合物を含むがそれに限定されるわけではない様々な条件によって刺激することができる。
【０１４３】
様々な公知の制御放出または持続放出性の剤形、製剤、および装置は、本開示の塩および組成物と共に使用するために適合させることができる。例としては、米国特許第3,845,770号；同第3,916,899号；同第3,536,809号；同第3,598,123号；同第4,008,719号；同第5674,533号；同第5,059,595号；同第5,591,767号；同第5,120,548号；同第5,073,543号；同第5,639,476号；同第5,354,556号；同第5,733,566号；および同第6,365,185 B1号に記載されているものを含むが、それに限定されるわけではなく、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み入れられる。これら剤形は、様々な比率で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系（例えば、OROS（登録商標）（Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA)）、またはそれらの組み合わせを使用して、1つまたは複数の活性成分の徐放または制御放出を提供するために使用することができる。
【０１４４】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される薬物は、単剤療法として投与され、例えば、気管支前悪性病変のための別の処置は、対象に施されない。
【０１４５】
局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、第2の作用物質および／または処置を、例えば併用療法の一部として、対象に施す工程を更に含んでいてもよい。
【０１４６】
特定の態様では、本明細書において記載される薬物を含む組成物の有効用量を、患者に1回投与してよい。特定の態様では、薬物を含む組成物の有効用量を、患者に繰り返し投与してもよい。全身投与の場合、薬物を含む組成物の治療量、例えば、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、またはそれ以上を対象に投与してよい。
【０１４７】
幾つかの態様では、初期の処置レジメンの後、より少ない頻度で処置を施してよい。例えば、3ヶ月間にわたって隔週で処置を施した後、6ヶ月間または1年間またはそれ以上にわたって1ヶ月に1回処置を繰り返してよい。本明細書において記載される方法に従った処置は、マーカーまたは病態の症状のレベルを、例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、もしくは少なくとも90％、またはそれ以上低下させることができる。
【０１４８】
本明細書において記載される組成物の投与量は、医師によって決定され、そして、必要に応じて、観察された処置の効果に適するように調整され得る。処置の持続時間および頻度に関して、熟練した臨床医は、処置がいつ治療的利益を提供するかを判断するため、そして、投与量を増加させるか減少させるか、投与頻度を増加させるか減少させるか、処置を中断するかどうか、処置を再開するかどうか、または処置レジメンに対して他の変更を行うかどうかを判断するために、対象をモニタリングするのが典型的である。投与スケジュールは、活性成分に対する対象の感受性等の多数の臨床的要因に応じて、1週間に1回から1日1回まで変動し得る。所望の用量または量の活性化を一度に施してもよく、または例えば、1日を通して適切な間隔で、一定期間にわたって分割用量、例えば、2〜4回の分割用量に分割して施してもよく、または他の適切なスケジュールで施してもよい。幾つかの態様では、投与は慢性的であってよく、例えば、数週間または数ヶ月間にわたって毎日、1回または複数回の投薬および／または処置を行ってよい。投薬および／または処置のスケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、もしくは6ヶ月間、またはそれ以上の期間にわたって、1日1回、1日2回、1日3回、または1日4回以上の投与である。本明細書において記載される薬物を含む組成物は、例えば、5分間、10分間、15分間、20分間、または25分間等の期間にわたって投与してよい。
【０１４９】
本明細書において記載される方法に従って薬物を投与するための投与量範囲は、例えば、その薬物の形態、その効力、および本明細書において記載される病態の症状、マーカー、もしくは指標が低下することが望まれる程度、例えば、病変のサイズに関して望まれる低下率、または、例えば、病変のサブタイプの変更を誘導することが望まれる程度に依存する。投与量は、有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般的に、投与量は、患者の年齢、状態、および性別によって異なり、そして、当業者が決定することができる。また、何らかの合併症の場合、個々の医師が投与量を調整することもできる。
【０１５０】
例えば、本明細書において記載される病態の処置におけるまたは本明細書において記載される応答（例えば、病変のサイズの減少）を誘導する薬物の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、本明細書において記載される病態の徴候または症状のうちの1つまたは複数が有益に変化した場合、他の臨床的に認められた症状が改善されたもしくは更には回復した場合、または例えば本明細書において記載される方法に従って処置した後に、所望の応答が例えば少なくとも10％誘導された場合、処置は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、「有効な処置」とみなされる。有効性は、例えば、本明細書において記載される方法に従って処置される病態のマーカー、指標、症状、および／もしくは発生率、または適切な任意の他の測定可能なパラメータを測定することによって評価することができる。有効性は、また、入院によって評価したときに悪化した個体の機能不全、または医学的介入の必要性（すなわち、病気の進行が停止する）によって測定することもできる。これら指標を測定する方法は、当業者に公知であるおよび／または本明細書に記載されている。処置は、個体または動物（幾つかの非限定的な例は、ヒトまたは動物を含む）における疾患の任意の処置を含み、そして、（1）疾患を阻害する、例えば、症状（例えば、疼痛または炎症）の悪化を防ぐ；または（2）疾患の重篤度を緩和する、例えば、症状を退行させることを含む。疾患を処置するための有効量とは、それを必要とする対象に投与したときに、その疾患に対して有効な処置（その用語は本明細書において定義される通りである）をもたらすのに十分な量を意味する。作用物質の有効性は、病態または所望の応答の身体的指標を評価することによって決定することができる。そのようなパラメータのうちのいずれか1つ、またはパラメータ任意の組み合わせを測定することにより、投与および/または処置の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。有効性は、本明細書において記載される病態の動物モデル、例えば、気管支前悪性病変のマウスモデルの処置において評価することができる。実験動物モデルを使用するとき、例えば病変のサイズまたは遺伝子発現等のマーカーに統計的に有意な変化が観察されたときに処置の有効性が証明される。
【０１５１】
本明細書において使用するとき、「気管支鏡に基づく手技」とは、気管支および／または肺の検査を可能にする任意の内視鏡技術を指す。気管支鏡に基づく手技は、白色光気管支鏡検査、自家蛍光気管支鏡検査、柔軟性気管支鏡検査、硬性気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄検査などを含み得る。気管支鏡に基づく手技は、生検、ブラシ擦過、または組織サンプリングを更に含み得る。の場合は
【０１５２】
処置方法に加えて、本明細書において記載される方法およびバイオマーカーシグネチャは、対象における肺がんのリスクを予測するおよび／または処置の有効性もしくは更なる処置の必要性を判定する方法に適用することができる。例えば、増殖性または炎症性のサブタイプから正常様または分泌性のサブタイプへの移行は、処置が有効であったかまたは処置を中止できることを示す。
【０１５３】
態様のいずれかの一局面では、対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール5遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程を含む、対象における肺がんに進行するリスクまたは可能性を予測する方法であって、非増殖性病変部の基準レベルと比較した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベルの上昇；および／または非増殖性病変部の基準レベルと比較した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルの低下が、肺がんに進行するリスクまたは可能性の増加を示す方法が本明細書において記載される。態様のいずれかの一局面では、第1の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール5遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程と、第2のその後の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール5遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程とを含む、対象における肺がんに進行するリスクまたは可能性を予測する方法であって、経時的な少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベルの上昇；および／または経時的な少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルの低下が、肺がんに進行するリスクまたは可能性の増加を示す方法が本明細書において記載される。
【０１５４】
態様のいずれかの一局面では、対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール9遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを検出する工程を含む、対象における肺がんに進行するリスクまたは可能性を予測する方法であって、非増殖性病変部の基準レベルと比較した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルの上昇；および／または非増殖性病変部の基準レベルと比較した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルの低下が、肺がんに進行するリスクまたは可能性の増加を示す方法が本明細書において記載される。態様のいずれかの一局面では、第1の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール10遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルを検出する工程と、第2のその後の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール9遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを検出する工程とを含む、対象における肺がんに進行するリスクまたは可能性を予測する方法であって、経時的な少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルの上昇；および／または経時的な少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルの低下が、肺がんに進行するリスクまたは可能性の増加を示す方法が本明細書において記載される。
【０１５５】
態様のいずれかの一局面では、対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール2遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程を含む、対象における肺がんに進行するリスクまたは可能性を予測する方法であって、非増殖性病変部の基準レベルと比較した少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベルの上昇；および／または非増殖性病変部の基準レベルと比較した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルの低下が、肺がんに進行するリスクまたは可能性の増加を示す方法が本明細書において記載される。態様のいずれかの一局面では、第1の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール2遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程と、第2のその後の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール2遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程とを含む、対象における肺がんに進行するリスクまたは可能性を予測する方法であって、経時的な少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベルの上昇；および／または経時的な少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルの低下が、肺がんに進行するリスクまたは可能性の増加を示す方法が本明細書において記載される。
【０１５６】
態様のいずれかの一局面では、第1の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール5遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程と、処置または候補処置を施す工程と、第2のその後の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール5遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程とを含む、処置の有効性を判定する方法であって、経時的な少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベルの低下；および／または経時的な少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルの上昇が、処置が有効であることを示す方法が本明細書において記載される。
【０１５７】
態様のいずれかの一局面では、第1の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール10遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルを検出する工程と、処置または候補処置を施す工程と、第2のその後の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール9遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを検出する工程とを含む、処置の有効性の方法であって、経時的な少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルの低下；および／または経時的な少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルの上昇が、処置が有効であることを示す方法が本明細書において記載される。
【０１５８】
態様のいずれかの一局面では、第1の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール2遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程と、処置または候補処置を施す工程と、第2のその後の時点で対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール2遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程とを含む、処置の有効性を判定する方法であって、経時的な少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベルの低下；および／または経時的な少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルの上昇が、処置が有効であることを示す方法が本明細書において記載される。
【０１５９】
態様のいずれかの一局面では、対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール5遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程を含み、1,000個以下（例えば、500個以下、400個以下、300個以下、200個以下、または100個以下）の遺伝子の発現レベルを決定する方法が、本明細書において記載される。態様のいずれかの一局面では、対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール9遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを検出する工程を含み、1,000個以下（例えば、500個以下、400個以下、300個以下、200個以下、または100個以下）の遺伝子の発現レベルを決定する方法が、本明細書において記載される。態様のいずれかの一局面では、対象から得られたサンプル中の少なくとも1つのモジュール2遺伝子および／または少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベルを検出する工程を含み、1,000個以下（例えば、500個以下、400個以下、300個以下、200個以下、または100個以下）の遺伝子の発現レベルを決定する方法が、本明細書において記載される。局面のいずれかの幾つかの態様では、サンプルは、気管支ブラシ擦過サンプルである。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つの遺伝子は、表14または15から選択される。
【０１６０】
（表１３）
2021536434.tif 000003
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2021536434.tif 000104
【０１６１】
（表１４）検証コホート（気管支内生検標本）における分子サブタイプを予測するために3,936個から選択された22個の遺伝子
2021536434.tif 000105
【０１６２】
（表１５）気管支ブラシ標本において増殖性サブタイプかどうかを予測するために22個の遺伝子（表14）の中から選択された8個の遺伝子
2021536434.tif 000106
【０１６３】
（表１６）増殖性サブタイプに分類された気管支内生検標本において進行／持続対退行を予測するために使用した112個の遺伝子。モジュール9の遺伝子は、進行／退行に関連している。これら遺伝子は表13内に含まれている。
2021536434.tif 000107
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【０１６４】
本明細書において記載される方法は、少なくとも1つの遺伝子の発現レベルの決定に関する。局面のいずれかの幾つかの態様では、少なくとも1つの遺伝子は、表13、14、15、および／または16から選択される1つまたは複数の遺伝子であってよい。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13、表14および表16の遺伝子リストは、組織学的所見において正常から前悪性までの範囲の気管支内生検サンプルに関連する。局面のいずれかの幾つかの態様では、サンプルが気管支内生検サンプルである場合、1つまたは複数の遺伝子が、表13、14および／または16から選択される。局面のいずれかの幾つかの態様では、表15は、正常な気管支ブラシ擦過標本に関連する。局面のいずれかの幾つかの態様では、サンプルが（例えば、正常組織の）気管支ブラシ擦過サンプルである場合、1つまたは複数の遺伝子は、表15から選択される。
【０１６５】
局面のいずれかの幾つかの態様では、表13または表16から選択される1つまたは複数の遺伝子は、B2M、HLA-DRA、HLA-DRB1、またはHLA-DPA1ではない。局面のいずれかの幾つかの態様では、表13または表16から選択される1つまたは複数の遺伝子が、B2M、HLA-DRA、HLA-DRB1、および／またはHLA-DPA1を含む場合、表13または16から少なくとも1つの追加の遺伝子が選択される。
【０１６６】
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される幾つかの用語および語句の意味を以下に提供する。特に断らない限りまたは文脈から暗に示されていない限り、以下の用語および語句は、以下に提供される意味を含む。定義は、特定の態様の説明を支援するために提供され、そして、請求される発明を限定することを意図するものではないが、その理由は、本発明の範囲が、特許請求の範囲によってのみ限定されるためである。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用法と本明細書において提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内に提供される定義を優先するものとする。
【０１６７】
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語は、ここに集められる。
【０１６８】
本明細書において使用するとき、用語「がん」は、一般に、異常な細胞が無制御に分裂して近くの組織に侵入し得る疾患または病態のクラスに関する。また、がん細胞は、血液およびリンパ系を通して体の他の部分にも拡散し得る。がんには幾つかの主な種類がある。癌腫は、皮膚、または内臓を覆うもしくは被覆する組織で発生するがんである。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織で発生するがんである。白血病は、骨髄などの血液形成組織で発生し、多数の異常な血液細胞を産生させて血液中に入り込ませるがんである。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞で発生するがんである。中枢神経系がんは、脳および脊髄の組織で発生するがんである。
【０１６９】
局面のいずれかの幾つかの態様では、がんは、原発がんである。局面のいずれかの幾つかの態様では、がんは、悪性がんである。本明細書において使用するとき、用語「悪性」とは、腫瘍細胞の群が、無制御の成長（すなわち、正常の限界を超えた分裂）、侵襲（すなわち、隣接する組織への侵入および破壊）、および転移（すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の場所への拡散）のうちの1つまたは複数を示すがんを指す。本明細書において使用するとき、用語「転移」とは、体のある部分から別の部分へのがんの拡散を指す。拡散した細胞によって形成された腫瘍を「転移性腫瘍」または「転移」と呼ぶ。転移性腫瘍は、元の（原発）腫瘍と同様の細胞を含有する。本明細書において使用するとき、用語「良性」または「非悪性」とは、より大きく成長する可能性があるが、体の他の部分には拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は、自己限定性であり、そして、典型的には、侵襲も転移もしない。
【０１７０】
「がん細胞」または「腫瘍細胞」とは、がん性の成長の個々の細胞または組織を指す。腫瘍とは、一般的に、細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変部を指し、良性である場合も、前悪性である場合も、悪性である場合もある。ほとんどのがん細胞は腫瘍を形成するが、例えば白血病など一部のがん細胞は必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成するがん細胞については、がん（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は互換的に使用される。
【０１７１】
本明細書において使用するとき、用語「新生物」は、組織の任意の新規かつ異常な成長、例えば、組織の異常な塊を指し、その成長は、正常な組織の成長を超えており、そして、それと協調していない。したがって、新生物は、良性新生物、前悪性新生物、または悪性新生物であり得る。
【０１７２】
がんまたは腫瘍を有する対象は、対象の体内に存在する客観的に測定可能ながん細胞を有する対象である。この定義には、悪性で活発に増殖するがん、および潜在的に休眠状態にある腫瘍または微小転移が含まれる。元の場所から移動し、そして、他の重要な臓器に播種したがんは、最終的には、罹患臓器の機能低下を通して対象の死につながる場合がある。
【０１７３】
がんの例は、癌腫、リンパ腫、芽球腫、肉腫、白血病、基底細胞癌腫、胆管がん；膀胱がん；骨がん；脳およびCNSのがん；乳がん；腹膜のがん；子宮頸がん；絨毛癌；結腸および直腸のがん；結合組織がん；消化器系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼がん；頭頸部のがん；胃がん（胃腸がんを含む）；神経膠芽腫（GBM）；肝癌腫；肝細胞がん；上皮内新生物；腎臓がんまたは腎がん；喉頭がん；白血病；肝臓がん；肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌腫）；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；黒色腫；骨髄腫；神経芽腫；口腔がん（例えば、口唇、舌、口、および咽頭）；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽腫；横紋筋肉腫；直腸がん；呼吸器系のがん；唾液腺癌腫；肉腫；皮膚がん；扁平上皮細胞がん；胃がん；精巣がん；甲状腺がん；子宮または子宮内膜のがん；泌尿器系のがん；外陰部がん；ならびに他の癌腫および肉腫；ならびにB細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）；小リンパ球性（SL）NHL；中悪性度／濾胞性NHL；中悪性度びまん性NHL；高悪性度免疫芽球性NHL；高悪性度リンパ芽球性NHL；高悪性度小細胞非開裂型NHL；巨大腫瘤病変NHL；マントル細胞リンパ腫；AIDS関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（CLL）；急性リンパ芽球性白血病（ALL）；ヘアリーセル白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性障害（PTLD）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、およびメイグス症候群に関連する異常な血管増殖を含むが、それに限定されるわけではない。
【０１７４】
「がん細胞」とは、新しい遺伝物質の取り込みを必ずしも伴うわけではない自発性のまたは誘導された表現型の変化を有する、インビボ、エクスビボ、または組織培養下のいずれかにおける、がん性の、前がん性の、または形質転換された細胞である。形質転換は、形質転換ウイルスの感染および新しいゲノム核酸の組み込み、または外因性核酸の取り込みから生じ得るが、自発的にまたは発がん性物質への曝露に続いて生じることもあり、それによって内因性遺伝子が変異する。形質転換／がんは、例えば、形態学的変化、細胞の不死化、異常な成長制御、病巣形成、足場非依存性、悪性度、成長の接触阻害および密度制限の喪失、成長因子または血清の非依存性、腫瘍特異的マーカー、侵襲性または転移、およびヌードマウスなどの好適な動物宿主における腫瘍の成長に関連する。
【０１７５】
用語「減少」、「低下」、「低減」、または「阻害」は、全て、統計的に有意な量の減少を意味するために本明細書において使用される。幾つかの態様では、「低下」、「低減」、または「減少」、または「阻害」は、典型的には、基準レベル（例えば、所与の処置または物質の非存在下）と比較して少なくとも10％の減少を意味し、例えば、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれ以上の減少を含み得る。本明細書において使用するとき、「低減」または「阻害」は、基準レベルと比較して完全な阻害も低減も包含しない。「完全な阻害」とは、基準レベルと比較して100％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害を有しない個体にとって正常な範囲内であると許容されるレベルまで下げることができる。
【０１７６】
用語「増加」、「増大」、「増強」、または「活性化」は、全て、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書において使用される。幾つかの態様では、用語「増加」、「増大」、「増強」、または「活性化」は、基準レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、もしくは100％以下の増加、または基準レベルと比較して10〜100％の任意の増加、または基準レベルと比較して、少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍〜10倍、もしくはそれ以上の任意の増加、またはそれ以上を意味し得る。マーカーまたは症状に関連して、「増加」とは、そのようなレベルの統計的に有意な増加である。
【０１７７】
本明細書において使用するとき、「対象」とは、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜、または狩猟動物等の脊椎動物である。霊長類は、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルを含む。げっ歯類は、マウス、ラット、マーモット、フェレット、ウサギ、およびハムスターを含む。家畜および狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、例えば、イエネコ、イヌ科の種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類の種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えば、マス、ナマズ、およびサケを含む。幾つかの態様では、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。用語、「個体」、「患者」、および「対象」は、本明細書において互換的に使用される。
【０１７８】
好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであってよいが、これらの例に限定されるわけではない。ヒト以外の哺乳動物は、気管支前悪性病変の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。対象は、雄性であっても雌性であってもよい。
【０１７９】
対象は、処置を必要とする病態（例えば気管支前悪性病変）またはそのような病態に関連する1つもしくは複数の合併症に罹患しているまたは有すると以前診断または特定されたことがあり、そして、任意で、気管支前悪性病変または気管支前悪性病変に関連する1つもしくは複数の合併症の処置を既に受けたことがあるものであってよい。あるいは、対象は、気管支前悪性病変または気管支前悪性病変に関連する1つもしくは複数の合併症を有するとそれまで診断されたことがないものであってもよい。例えば、対象は、気管支前悪性病変または気管支前悪性病変に関連する1つもしくは複数の合併症についての1つまたは複数の危険因子を呈している対象であってもよく、危険因子を呈していない対象であってもよい。
【０１８０】
特定の病態に対する処置を「必要とする対象」は、その病態を有する対象、その病態を有すると診断された対象、またはその病態を発症するリスクのある対象であってよい。
【０１８１】
本明細書において使用するとき、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、隣接する残基のα−アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書において互換的に使用される。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」とは、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化等）およびアミノ酸類似体を含む、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きなポリペプチドに関連して使用されることが多く、一方、用語「ペプチド」は、小さなポリペプチドに関連して使用されることが多いが、当技術分野におけるこれら用語の用法は重複している。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、遺伝子産物およびその断片に言及するとき、本明細書において互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の等価物、バリアント、断片、および前述の類似体を含む。
【０１８２】
本明細書において記載される様々な態様では、記載される特定のポリペプチドのいずれかのバリアント（天然に存在するかまたは存在しない）、対立遺伝子、ホモログ、保存的に改変されたバリアント、および／または保存的置換バリアントが包含されることが更に企図される。アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされている配列中の単一のアミノ酸またはわずかな比率のアミノ酸を変更する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、その変更の結果、アミノ酸が化学的に類似のアミノ酸で置換されてポリペプチドの所望の活性を保持している場合、「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。このような保存的に改変されたバリアントは、本開示と一致する多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加されるものであり、そして、これらを除外するものではない。
【０１８３】
例えば、ある脂肪族残基の別の脂肪族残基による置換（例えば、互いにIle、Val、Leu、またはAla）、またはある極性残基の別の極性残基による置換（例えば、LysとArgとの間、GluとAspとの間、またはGlnとAsnとの間）等、所与のアミノ酸を類似の生理化学的特徴を有する残基によって置き換えることができる。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特徴を有する領域全体の置換が周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、所望の活性、例えば、ネイティブポリペプチドまたは参照ポリペプチドの活性および特異性が保持されていることを確認するために、本明細書において記載されるアッセイのいずれか1つにおいて試験することができる。
【０１８４】
アミノ酸は、その側鎖の特性における類似性に従ってグループ化することができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)）：（1）非極性：Ala（A）、Val（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）;（2）無電荷極性：Gly（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）;（3）酸性：Asp（D）、Glu（E）;（4）塩基性；Lys（K）、Arg（R）、His（H）。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分類することもできる：（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）塩基性：His、Lys、Arg；（5）鎖の配向に影響を与える残基：Gly、Pro；（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保存的置換は、これらクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。具体的な保存的置換は、例えば、AlaをGlyまたはSerに；ArgをLysに；AsnをGlnまたはHisに；AspをGluに；CysをSerに；GlnをAsnに；GluをAspに；GlyをAlaまたはProに；HisをAsnまたはGlnに；IleをLeuまたはValに；LeuをIleまたはValに；LysをArg、Gln、またはGluに；MetをLeu、Tyr、またはIleに；PheをMet、Leu、またはTyrに；SerをThrに；ThrをSerに；TrpをTyrに；TyrをTrpに；および／またはPheをVal、Ile、またはLeuに置換することを含む。
【０１８５】
幾つかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードしている核酸）は、本明細書において記載されるアミノ酸配列のうちの1つの機能性断片であり得る。本明細書において使用するとき、「機能性断片」とは、本明細書において以下に記載されるアッセイに従って、野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも50％を保持しているペプチドの断片またはセグメントである。機能性断片は、本明細書において開示される配列の保存的置換を含み得る。
【０１８６】
幾つかの態様では、本明細書において記載されるポリペプチドは、本明細書において記載される配列のバリアントであってよい。幾つかの態様では、バリアントは、保存的に改変されたバリアントである。保存的置換バリアントは、例えば、ネイティブヌクレオチド配列の変異によって得ることができる。「バリアント」は、本明細書において言及するとき、ネイティブまたは参照のポリペプチドと実質的に相同であるが、1つまたは複数の欠失、挿入、または置換のためにネイティブまたは参照のポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。バリアントポリペプチドをコードしているDNA配列は、ネイティブまたは参照のDNA配列と比較したとき、ヌクレオチドの1つまたは複数の付加、欠失、または置換を含むが、活性を保持しているバリアントタンパク質またはその断片をコードしている配列を包含する。多種多様なPCRベースの部位特異的変異誘発アプローチは、当技術分野において公知であり、そして、当業者によって適用され得る。
【０１８７】
バリアントのアミノ酸またはDNAの配列は、ネイティブまたは参照の配列と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはそれ以上同一であり得る。ネイティブ配列と変異体配列との間の相同性の程度（同一性パーセント）は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に使用されている自由に利用可能なコンピュータプログラム（例えば、デフォルト設定のBLASTpまたはBLASTn）を使用して2つの配列を比較することによって決定することができる。
【０１８８】
ネイティブアミノ酸配列の変更は、当業者に公知の多数の技術のいずれかによって達成され得る。例えば、ネイティブ配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位に隣接する、変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に変異を導入することができる。ライゲーション後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードしている。あるいは、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発手技を使用して、必要な置換、欠失、または挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更されたヌクレオチド配列を提供することができる。このような変更を行うための技術は非常によく確立されており、例えば、Walder et al. (Gene 42:133, 1986)；Bauer et al. (Gene 37:73, 1985)；Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19)；Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；ならびに米国特許第4,518,584号および同第4,737,462号によって開示されているものを含み、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。また、ポリペプチドの適当な高次構造の維持には関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化的安定性を改善するためおよび異常な架橋を防ぐために、一般的にセリンで置換することができる。逆に、ポリペプチドの安定性を改善したり、オリゴマー化を促進したりするために、システイン結合をポリペプチドに付加してもよい。
【０１８９】
本明細書において使用するとき、用語「核酸」または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはこれらの類似体のユニットが組み込まれた任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖核酸は、変性した二本鎖DNAのうちの1本の核酸鎖であってもよい。あるいは、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であってもよい。一局面では、核酸は、DNAであってよい。別の局面では、核酸は、RNAであってよい。好適なDNAは、例えば、ゲノムDNAまたはcDNAを含み得る。好適なRNAは、例えば、mRNAを含み得る。
【０１９０】
用語「発現」とは、適用可能な場合、例えば、転写、転写物のプロセシング、翻訳、ならびにタンパク質の折り畳み、修飾、およびプロセシングを含むがそれに限定されるわけではない、RNAおよびタンパク質の産生、ならびに必要に応じてタンパク質の分泌に関与する細胞プロセスを指す。発現とは、本発明の核酸断片に由来するセンス（mRNA）またはアンチセンスのRNAの転写および安定な蓄積、ならびに／またはmRNAのポリペプチドへの翻訳を指し得る。
【０１９１】
幾つかの態様では、本明細書において記載されるバイオマーカー、標的、または遺伝子／ポリペプチドの発現は、組織特異的である。幾つかの態様では、本明細書において記載されるバイオマーカー、標的、または遺伝子／ポリペプチドの発現は、広範囲（global）である。幾つかの態様では、本明細書において記載されるバイオマーカー、標的、または遺伝子／ポリペプチドの発現は、全身である。
【０１９２】
「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られるポリペプチドを含む。用語「遺伝子」とは、適切な調節配列に機能的に連結されたとき、インビトロまたはインビボにおいてRNAに転写される核酸配列（DNA）を意味する。遺伝子は、コードされている領域に先立つ領域および続く領域、例えば、5’非翻訳（5’UTR）または「リーダー」の配列、および3’UTRまたは「トレイラー」の配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
【０１９３】
本発明の状況における「マーカー」とは、対照対象（例えば、健常対象）から採取された同等のサンプルと比較して、特定のサブタイプの気管支前悪性病変を有する対象から採取されたサンプル中に異なって存在する発現産物、例えば、核酸またはポリペプチドを指す。用語「バイオマーカー」は、用語「マーカー」と互換的に使用される。
【０１９４】
幾つかの態様では、本明細書において記載される方法は、少なくとも1つのマーカーのレベルを測定、検出、または決定することに関する。本明細書において使用するとき、用語「検出」または「測定」とは、サンプル中のアナライトの存在を示すために、例えば、プローブ、標識、または標的分子からのシグナルを観察することを意味する。検出には、特定の標識部分を検出するための当技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。例示的な検出方法は、分光学的、蛍光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な方法を含むが、それに限定されるわけではない。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、測定は、定量的観察であってよい。
【０１９５】
本明細書において使用するとき、用語「処置する」、「処置」、「処置している」、または「回復」とは、疾患または障害、例えば気管支前悪性病変に関連する病態の進行または重篤度を逆行、軽減、回復、阻害、減速、または中止することを目的とする治療的処置を指す。用語「処置する」とは、気管支前悪性病変に関連する病態、疾患、または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を低減または軽減することを含む。一般的には、1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少した場合、処置は「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減または停止した場合、処置は「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置しなかった場合に予測されるものと比較した症状の進行または悪化の休止または少なくとも減速も含む。有益なまたは望ましい臨床結果は、検出可能であろうと検出不可能であろうと、1つもしくは複数の症状の軽減、疾患の程度の減弱、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延もしくは減速、疾患状態の回復もしくは待機、（部分または完全）寛解、および／または死亡率の低下を含むが、それに限定されるわけではない。疾患の「処置」という用語は、疾患の症状または副作用の緩和（待機的処置を含む）も含む。
【０１９６】
本明細書において使用するとき、用語「薬学的組成物」は、例えば製薬業界で一般的に使用される担体などの薬学的に許容される担体と組み合わせた活性薬剤を指す。語句「薬学的に許容される」は、本明細書において、正しい医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしにヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに好適であり、合理的なベネフィット／リスク比に見合う化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために使用される。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルジョン、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、および／または軟膏であり得る。局面のうちのいずれかの幾つかの態様では、薬学的に許容される担体は、人工的なまたは操作された担体、例えば、活性成分が自然に生じることはみられない担体であり得る。
【０１９７】
本明細書において使用するとき、用語「投与」とは、本明細書において開示される化合物を所望の部位に少なくとも部分的に送達する方法または経路により、その物質を対象に配置することを指す。本明細書において開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象において有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。幾つかの態様では、投与は、ヒトの身体活動、例えば、注射、摂取の行為、塗布の行為、および／または送達用の装置もしくは機械の操作を含む。そのような活動は、例えば、医療専門家および／または処置される対象によって実施され得る。
【０１９８】
本明細書において使用するとき、「接触」とは、少なくとも1つの細胞に作用物質を送達または曝露するための任意の適切な手段を指す。例示的な送達方法は、細胞培養培地への直接送達、灌流、注射、または当業者に周知の他の送達方法を含むが、それに限定されるわけではない。幾つかの態様では、接触は、ヒトの身体活動、例えば、注射；分注、混合、および／もしくはデカンテーションの行為；ならびに／または送達用の装置もしくは機械の操作を含む。
【０１９９】
本明細書において使用するとき、用語「阻害薬」とは、標的とする分子または活性またはプロセスの発現および／または活性を、例えば、少なくとも10％以上、例えば、10％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、または98％以上減少させることができる物質を指す。
【０２００】
本明細書において使用するとき、用語「薬物」、「化合物」または「作用物質」は互換的に使用され、分子および／または組成物を指す。化合物／作用物質は、化学化合物および化学化合物の混合物、例えば、有機または無機の低分子；糖類；オリゴ糖類；多糖類；生体高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ならびにペプチドの類似体および誘導体；ペプチドミメティック；核酸；核酸の類似体および誘導体；細菌、植物、真菌、または動物の細胞または組織などの生物学的材料から作られた抽出物；天然に存在するまたは合成された組成物；ペプチド；アプタマー；ならびに抗体および細胞内抗体、またはこれらの断片を含むが、それに限定されるわけではない。幾つかの態様では、「薬物」は、本明細書において使用されるとき、例えば、FDAによって医療用途について承認された物質を指す。
【０２０１】
用語「統計的に有意」または「有意に」とは、統計的有意性を指し、そして、一般的には、標準偏差2つ分（2SD）以上の差を意味する。
【０２０２】
動作例または他の指定がある場合以外に、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す数字は全て、全ての例において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。百分率に関連して使用されるとき、用語「約」は、±1％を意味し得る。
【０２０３】
本明細書において使用するとき、用語「含む」は、提示される規定の要素に加えて、他の要素が存在していてもよいことを意味する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【０２０４】
用語「からなる」は、態様の説明に列挙されていないいかなる要素も除いた、本明細書において記載される組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。
【０２０５】
本明細書において使用するとき、用語「本質的にからなる」とは、所与の態様に必要な要素を指す。この用語は、本発明の態様の基本的および新規のまたは機能的な特徴に実質的に影響を与えない追加の要素の存在を許容する。
【０２０６】
単数形の用語「a」、「an」、および「the」は、特に文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という語は、特に文脈が明確に指示していない限り、「および」を含むことを意図する。本明細書において記載されるものと類似または等価な方法および材料をこの開示の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料については以下に記載する。略語「e.g.」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「e.g.」は、「例えば」と同義である。
【０２０７】
本明細書において開示される本発明の別の要素または態様のグループ化は、限定として解釈されるものではない。各グループのメンバーは、個別に、または本明細書においてみられるグループの他のメンバーまたは他の要素との任意の組み合わせで参照され、そして、請求され得る。便宜上および／または特許性の理由から、グループの1つまたは複数のメンバーをグループに含めてもよく、グループから削除してもよい。いずれかのそのような包含または削除が行われた場合、本明細書では、このようにして添付の特許請求の範囲で使用される全てのマーカッシュグループの書面による説明を満たすように修正されたグループを明細書が含むものとみなされる。
【０２０８】
特に本明細書で定義しない限り、本願に関連して使用される科学用語および技術用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書において記載される具体的な方法論、プロトコル、および試薬等に限定されるものではなく、したがって、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、具体的な実施態様を説明する目的のためだけのものであり、そして、特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978-0911910421)；Robert S. Porter et al.(eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006；Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978-0815345053)；Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014  (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)、Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005；およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.)John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見出すことができ、これらの内容は全て全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０９】
他の用語は、本発明の様々な局面の説明の中で本明細書において定義される。
【０２１０】
本願全体を通して引用される、参照文献、交付済み特許、公開済み特許出願、および同時係属中の特許出願を含む全ての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書において記載される技術に関連して使用される可能性のある、そのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的のために、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これら刊行物は、本願の出願日前の開示のみについて提供される。これに関するいかなるものも、本発明者らが先行発明によってまたは任意の他の理由からこのような開示に先行する権利が与えられるものではないことを認めると解釈されるべきではない。これら文書の日付に関する記述または内容に関する表示は全て、出願人が入手可能な情報に基づくものであり、そして、これら文書の日付または内容の正確性についていかなる承認も与えるものではない。
【０２１１】
本開示の態様の説明は、網羅的であることを意図するものでもなく、開示される正確な形態に本開示を限定することを意図するものでもない。本開示の具体的な態様および例は、例示目的で本明細書において記載されるが、関連する技術分野の当業者であれば認識するように、本開示の範囲内で様々な等価な改変が可能である。例えば、方法の工程または機能は所与の順序で提示されるが、別の態様は、異なる順序で機能を発揮してもよく、または実質的に同時に機能が発揮されてもよい。本明細書において提供される開示の教示は、適宜、他の手技または方法に適用することができる。本明細書において記載される様々な態様は、更なる態様を提供するために組み合わせることができる。本開示の更なる態様を提供するために、必要に応じて、上記の参照文献および出願の組成物、機能、および概念を採用するように、本開示の局面を改変することができる。詳細な説明に照らして本開示に対してこれらおよび他の変更を行うことができる。全てのこのような変形例が、添付の特許の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０２１２】
前述の態様のうちのいずれかの特定の要素は、他の態様の要素と組み合わせたり、該要素を置き換えたりすることができる。更に、本開示の特定の態様に関連する利点をこれら態様の文脈で説明してきたが、他の態様がそのような利点を呈してもよく、そして、全ての態様が、必ずしも本開示の範囲内に収まるようにそのような利点を呈する必要はない。
【０２１３】
本明細書において記載される技術は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらは、いかなる方法においても、更なる限定であると解釈されるべきではない。
【０２１４】
本明細書において記載される技術の幾つかの態様は、以下の番号を付したパラグラフのいずれかに従って定義することができる。
1.  非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール5遺伝子の発現レベル、および
非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル
のうちの少なくとも1つを有すると判定された対象に対して、
(i) 中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方、
(ii) 少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの一方、ならびに／または
(iii) 少なくとも1つの抗増殖薬
のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法。
2.  少なくとも1つのモジュール5遺伝子が、RACGAP1およびTPX2からなる群より選択され、
少なくとも1つのモジュール6遺伝子が、NEK11およびIFT88からなる群より選択される、
パラグラフ1の方法。
3.  対象が、上昇した少なくとも1つのモジュール7またはモジュール4の遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される、パラグラフ1または2の方法。
4.  少なくとも1つのモジュール7またはモジュール4の遺伝子が、COX6A1、COX7A2、RPL26、およびRPL23からなる群より選択される、パラグラフ3の方法。
5.  表15の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される、パラグラフ1〜4のいずれかの方法。
6.  少なくとも1つの抗増殖薬が、アセチルコリン受容体拮抗薬；アセチルコリンエステラーゼ阻害薬；アデノシン受容体拮抗薬；アドレナリン作動性受容体拮抗薬；AKT阻害薬；アンジオテンシン受容体拮抗薬；アポトーシス刺激薬；オーロラキナーゼ阻害薬；CDK阻害薬；シクロオキシゲナーゼ阻害薬；サイトカイン産生阻害薬；デヒドロゲナーゼ阻害薬；DNAプロテインキナーゼ阻害薬；接着斑阻害薬；ドーパミン受容体拮抗薬；EGFR阻害薬；ERK1およびERK2のリン酸化阻害薬；エストロゲン受容体作動薬；EZH2阻害薬；FLT3阻害薬；グルココルチコイド受容体作動薬；グルタミン酸受容体拮抗薬；HDAC阻害薬；ヒスタミン受容体拮抗薬；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害薬；HSP阻害薬；IKK阻害薬；イオンチャネル拮抗薬；JAK阻害薬；JNK阻害薬；KIT阻害薬；ロイシンリッチリピートキナーゼ阻害薬；MDM阻害薬；メディエータ放出阻害薬；MEK阻害薬；MTOR阻害薬；モノアミンオキシダーゼ阻害薬；NFkB経路阻害薬；ヌクレオホスミン阻害薬；PARP阻害薬；PPAR受容体作動薬；PI3K阻害薬；チロシンキナーゼ阻害薬；ホスホジエステラーゼ阻害薬；プロテインキナーゼ阻害薬；RAF阻害薬；RNAポリメラーゼ阻害薬；トポイソメラーゼ阻害薬；RNA合成阻害薬；SIRT阻害薬；ナトリウムチャネル遮断薬；VEGFR阻害薬；ならびにビタミンD受容体作動薬からなる群より選択される、
パラグラフ1〜5のいずれかの方法。
7.  抗増殖薬が、吸入製剤または局所製剤として投与される、パラグラフ1〜6のいずれかの方法。
8.  抗増殖薬が、気管支鏡に基づく手技中に投与される、パラグラフ1〜7のいずれかの方法。
9.  抗増殖薬が、全身的に投与される、パラグラフ1〜8のいずれかの方法。
10.  抗増殖薬が、気管支鏡に基づく手技中にかつ全身的に投与される、パラグラフ1〜9のいずれかの方法。
11.  対象が、非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される、パラグラフ1〜10のいずれかの方法。
12.  低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると判定された対象に対して、
(i) 中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンの両方、
(ii) 少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンのうちの一方、ならびに／または
(iii) 少なくとも1つの免疫刺激薬
のうちの少なくとも1つを施す、パラグラフ11の方法。
13.  非増殖性病変部の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール9遺伝子の発現レベルおよび／または非増殖性病変部の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール10遺伝子の発現レベルを有すると判定された対象に対して、
(i) 中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンの両方、
(ii) 少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技であって、異常組織を除去するために病変部を生検する、手技、および胸部CTスキャンのうちの一方、ならびに／または
(iii) 少なくとも1つの免疫刺激薬
のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法。
14.  モジュール9遺伝子が、EPSTI1、UBE2L6、B2M、およびTAP1からなる群より選択される、パラグラフ11〜13のいずれかの方法。
15.  少なくとも1つの遺伝子モジュール9遺伝子が、表16から選択される、パラグラフ11〜14のいずれかの方法。
16.  モジュール10遺伝子が、CACNB3およびMAPK10からなる群より選択される、パラグラフ11〜15のいずれかの方法。
17.  少なくとも1つの免疫刺激薬が、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、PD-1、PD-L1、CTLA4、およびLAG3に対する阻害薬）；インターフェロンシグナル伝達を刺激する薬（例えば、インターフェロンシグナル伝達を改善する抗ウイルス薬）；DNA合成阻害薬；IMDH阻害薬；CDK阻害薬；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬；ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬；トポイソメラーゼ阻害薬；FLT3阻害薬；IGF-1阻害薬；MEK阻害薬；オーロラキナーゼ阻害薬；PKC阻害薬；RAF阻害薬；PDFGR/KIT阻害薬；VEGFR阻害薬；SRC阻害薬；レチノイド受容体作動薬；HDAC阻害薬；DNAメチルトランスフェラーゼ阻害薬；およびEZH2阻害薬からなる群より選択される、
パラグラフ11〜16のいずれかの方法。
18.  非炎症性の基準レベルと比較して上昇した少なくとも1つのモジュール2遺伝子の発現レベル、および
非炎症性の基準レベルと比較して低下した少なくとも1つのモジュール6遺伝子の発現レベル
のうちの少なくとも1つを有すると判定された対象に対して、
(iv) 中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンの両方、
(v) 少なくとも6ヶ月ごとの、中央気道を調べるための気管支鏡に基づく手技、および胸部CTスキャンのうちの一方、ならびに／または
(vi) 少なくとも1つの抗炎症薬
のうちの少なくとも1つを施す工程を含む、気管支前悪性病変を処置する方法。
19.  少なくとも1つのモジュール2遺伝子が、MSANTD2、CCNL2、およびLUC7Lからなる群より選択され、
少なくとも1つのモジュール6遺伝子が、NEK11およびIFT88からなる群より選択される、
パラグラフ17の方法。
20.  対象が、上昇した少なくとも1つのモジュール7遺伝子、モジュール1遺伝子、もしくはモジュール8遺伝子の発現レベルおよび／または低下した少なくとも1つのモジュール4遺伝子もしくは1つのモジュール5遺伝子の発現レベルを有すると更に判定される、パラグラフ17または18の方法。
21.  少なくとも1つのモジュール7遺伝子が、RPL26およびRPL23からなる群より選択される、パラグラフ19の方法。
22.  少なくとも1つのモジュール1遺伝子が、KIRREL、PHLDB1、およびMARVELD1からなる群より選択される、パラグラフ19の方法。
23.  少なくとも1つのモジュール8遺伝子が、DOC2、CD53、およびLAPTMからなる群より選択される、パラグラフ19の方法。
24.  少なくとも1つのモジュール4遺伝子が、COX6A1およびCOX7A2からなる群より選択される、パラグラフ19の方法。
25.  少なくとも1つのモジュール5遺伝子が、RACGAP1およびTPX2からなる群より選択される、パラグラフ19の方法。
26.  表15の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される、パラグラフ17〜24のいずれかの方法。
27.  少なくとも1つの抗炎症薬が、アセチルコリン受容体拮抗薬；アセチルコリンエステラーゼ阻害薬；アデノシン受容体拮抗薬；アドレナリン作動性受容体拮抗薬；アンジオテンシン受容体拮抗薬；抗IL1B抗体；アポトーシス刺激薬；オーロラキナーゼ阻害薬；CDK阻害薬；シクロオキシゲナーゼ阻害薬；サイトカイン産生阻害薬；デヒドロゲナーゼ阻害薬；ドーパミン受容体拮抗薬；EGFR阻害薬；ERK1およびERK2のリン酸化阻害薬；エストロゲン受容体作動薬；FLT3阻害薬；グルココルチコイド受容体作動薬；グルタミン酸受容体拮抗薬；HDAC阻害薬；ヒスタミン受容体拮抗薬；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ阻害薬；HSP阻害薬；IKK阻害薬；イオンチャネル拮抗薬；KIT阻害薬；ロイシンリッチリピートキナーゼ阻害薬；MEK阻害薬；MDM阻害薬；ホスホジエステラーゼ阻害薬；モノアミンオキシダーゼ阻害薬；MTOR阻害薬；NFkB経路阻害薬；ヌクレオホスミン阻害薬；PARP阻害薬；PI3K阻害薬；PPAR受容体作動薬；タンパク質合成阻害薬（例えば、クロラムフェニコール）；RAF阻害薬；SIRT阻害薬；ナトリウムチャネル遮断薬；TGFβ受容体阻害薬；トポイソメラーゼ阻害薬；チロシンキナーゼ阻害薬；VEGFR阻害薬；ならびにビタミンD受容体作動薬からなる群より選択される、
パラグラフ17〜25のいずれかの方法。
28.  抗炎症薬が、気管支鏡に基づく手技中に投与される、パラグラフ17〜26のいずれかの方法。
29.  抗炎症薬が、全身的に投与される、パラグラフ17〜27のいずれかの方法。
30.  抗炎症薬が、気管支鏡に基づく手技中にかつ全身的に投与される、パラグラフ17〜28のいずれかの方法。
31.  少なくとも1つの遺伝子が、表14から選択される、パラグラフ1〜29のいずれかの方法。
32.  表14の遺伝子のそれぞれの発現レベルが決定される、パラグラフ1〜30のいずれかの方法。
33.  肺がん肺扁平上皮細胞癌腫の発症が予防、遅延、または減速される、パラグラフ1〜31のいずれかの方法。
34.  肺がんが、肺扁平上皮細胞癌腫である、パラグラフ1〜32のいずれかの方法。
35.  発現レベルが、対象から得られた気管支内生検標本、気管支内ブラシ擦過サンプル、大気道生検標本、大気道ブラシ擦過サンプル、鼻上皮細胞、痰、または血液における発現レベルである、パラグラフ1〜33のいずれかの方法。
36.  発現レベルが、右または左の主気管支から得られた気管支ブラシ擦過標本における発現レベルである、パラグラフ1〜34のいずれかの方法。
37.  生検標本またはブラシ擦過サンプルが、形態学的に正常な組織または細胞を含む、パラグラフ34または35の方法。
38.  生検標本またはブラシ擦過サンプルが、形態学的に正常な組織または細胞からなる、パラグラフ34または35の方法。
39.  発現レベルが、気管支前悪性病変細胞を含むサンプルにおける発現レベルである、パラグラフ1〜34のいずれかの方法。
40.  発現レベルが、形態学的に正常な細胞を含むサンプルにおける発現レベルである、パラグラフ1〜35のいずれかの方法。
41.  対象が、喫煙者または元喫煙者である、パラグラフ1〜36のいずれかの方法。
【実施例】
【０２１５】
実施例1：分子サブタイピングにより気管支前悪性病変の進行に関連する免疫変化を明らかにする
気管支前悪性病変および気道損傷野の分子キャラクタリゼーションによって、肺がんリスクバイオマーカーおよび妨害ストラテジーを開発するために利用することができる進行性／持続性の気管支異形成に関連する上皮および免疫の変化を同定したことが本明細書において記載される。
【０２１６】
気管支前悪性病変（PML）は肺扁平上皮細胞癌腫の前駆体であるが様々な転帰を有し、侵襲がんへの進行リスクが最も高いPMLを同定および処置するためのツールが不足している。高リスク喫煙者から得られたPMLの気管支内生検標本をRNA-Seqによってプロファイリングしたところ、上皮および免疫のプロセスに違いがある4つのPMLサブタイプが同定された。1つの分子サブタイプ（増殖性）は、異形成病変が多く、代謝および細胞周期の経路のアップレギュレーションならびに繊毛プロセスのダウンレギュレーションを呈する。正常な外観の非疾患大気道ブラシ擦過標本からのRNA-Seqプロファイルにより、高い特異度で増殖性病変を有する対象を同定することができた。インターフェロンシグナル伝達および抗原プロセシング／提示経路の発現は、進行性／持続性の増殖性病変部では減少し、そして、免疫蛍光は、これら病変部で自然および適応の免疫細胞の枯渇を示す。PMLまたは非疾患気道で測定された分子バイオマーカーは、病理組織学的グレード分類を改良することができ、そして、免疫予防ストラテジーがPMLの肺がんへの進行を妨害するのに有効である可能性があることを示す。
【０２１７】
序論
肺がん（LC）は、がんによる死亡原因の第1位であり、毎年約16万人の米国人の命を奪っており、これは、結腸直腸がん、膵臓がん、乳がん、および前立腺がんを合わせたよりも多い。死亡率を低下させるためには、最も早期かつ潜在的に最も治癒可能な段階で疾患を診断することによってがんの発症を妨害する画期的なストラテジーが必要である。National Lung Screening Trial（1）の結果に基づく最近の進歩は、高リスク個体のコンピュータ断層撮影（CT）検診により死亡率が有意に低下することから、早期LC検出のあり方を劇的に変えつつある。このような進展にもかかわらず、適格基準に当てはまるのは米国でLCと診断された個体の27％未満であるので（2）、LC検診のための個体を選択するためのバイオマーカー、そして、検診の偽陽性率が非常に高い（＞90％）ので、良性またはがん性の不確定な肺結節を区別するためのバイオマーカーが必要とされている。また、この高リスク集団において発症前にLCを「妨害」するために、疾患プロセスにおいてより早期の個別化療法を開発する差し迫ったアンメットニーズが存在する。
【０２１８】
LCリスクバイオマーカーおよびLC妨害ストラテジーの開発には、呼吸器上皮で発生する肺発がんに関与する最も初期の分子変化の詳細な理解が必要である（3、4）。たばこの煙に曝露されると、前悪性病変（PML）およびLCが発症する「リスクのある」気道につながる可能性のある様々なゲノム変化が誘導されることにより、呼吸器全体に損傷野が生じる。肺扁平上皮細胞癌（LUSC）は気管支気道の上皮層に発生し、正常な上皮から過形成、扁平上皮化生、異形成（軽度、中等度、および重度）、上皮内癌（CIS）へ、そして、最終的に侵襲性、次いで転移性のLUSCへの段階的な組織学的進行を通じたPMLの発症に先立つことが多い（5）。実際に、高悪性度の持続性または進行性の異形成（中等度または重度）の存在は、（該病変が扁平上皮細胞肺癌の推定前駆体である）病変部位および肺の他の箇所の両方におけるLCリスクの増大のマーカーであるが、多くの異形成病変の転帰は様々である（6）。しかし、現在のところ、侵襲性癌腫への進行リスクが最も高いPMLを同定するための有効なツールが不足している（7）。疾患進行のマーカーを開発することで、高リスクの患者が同定され、新規の肺がん化学予防剤が提案され、そして、肺がん予防試験において転帰をモニタリングするための分子バイオマーカーが提供されるであろう。
【０２１９】
上皮細胞と免疫細胞との混合物を含む気管支生検標本の分子キャラクタリゼーションによって、高悪性度の組織学的所見および前悪性病変の進行に関連するトランスクリプトームの変化を同定することが可能になると本明細書では仮定する。本研究では、自家蛍光気管支鏡検査および胸部CTによる肺がん検診を受けている高リスク喫煙者からの連続気管支鏡検査を通して得られた気管支内生検標本およびブラシ擦過標本をプロファイリングするためにmRNAシーケンシングを使用した。気管支生検標本を用いて、臨床表現型および生物学的プロセスに関連する4つの分子サブタイプを同定した。1つのサブタイプ（増殖性サブタイプ）は、異形成の組織学的所見を有する生検標本、基底細胞のシグナルが高くかつ繊毛細胞のシグナルが低い生検標本、および増殖関連経路が発現している生検標本が多い。インターフェロンシグナル伝達およびT細胞媒介免疫に関与する遺伝子は、退行性病変と比較して増殖性サブタイプ内の進行性／持続性病変の中ではダウンレギュレーションされ、そして、これら経路は、自然および適応の免疫細胞型の両方における減少と相関していた。生検標本の高悪性度／進行性疾患群への分子的分類を使用して、患者を予防試験に層別化し、そして、処置の有効性をモニタリングすることができる。この結果はまた、特定のがん関連経路または免疫系を標的とする個別化された肺がんの化学予防が、潜在的な処置上の利益を有する可能性があることを示す。
【０２２０】
結果
対象集団
この研究では、Roswell Park Comprehensive Cancer Center（Roswell）（Buffalo, NY）において自家蛍光気管支鏡検査および胸部CTによる肺がん検診を受けている高リスク喫煙者の連続気管支鏡検査を通して得られた気管支内生検標本およびブラシ擦過標本をプロファイリングするためにmRNAシーケンシングを使用した。発見コホートのサンプルは、2010年から2012年の間にRoswell対象から得られ（DC；n＝29人の患者、n＝191個の生検標本、n＝91個のブラシ標本）、そして、検証コホートのサンプルは、2012年から2015年の間に得られた（VC；n＝20人の患者、n＝111個の生検標本、およびn＝49個のブラシ標本）。対象は主に高齢の喫煙者であり、その多くは肺がん、慢性閉塞性肺疾患（COPD）の病歴があり、そして、肺がん発症のリスクが高くなる職業性曝露を受けている。性別、年齢、ベースライン来院時に報告された喫煙状況（喫煙経験ありまたはなし）、パックイヤー、肺がんの前病歴、COPDの状態、および職業性曝露などのベースライン時に報告された臨床的特徴は、2つのコホート間で有意に異なってはいなかった（表1）。幾つかの品質メトリクスに基づいてサンプルをフィルタリングした後、DCは190個の生検標本および89個のブラシ標本を有しており、一方、VCは105個の生検標本および48個のブラシ標本を有していた。対象の94パーセントが、気管支内生検を介して2回またはそれ以上サンプリングされた少なくとも1つの肺解剖学的位置を有していた。DCおよびVCは、それぞれ、組織学的グレードが異形成またはそれ以上の生検標本を37.9％および35.2％含有しており、そして、23.1％および19.0％が進行性／持続性異形成を有していた（表2）。喫煙状況はベースライン時にのみ入手可能であったので、既に報告されている喫煙関連シグネチャ（8）を用いて各サンプルの喫煙状況を予測したところ、DCではVC（36.2％）と比較して、現在喫煙者であると予測される生検の割合が高い（62.6％）ことが判明した。1時点あたり1個のブラシ標本しか採取していないため、2つのコホート間で、気管支ブラシ擦過標本の中で喫煙状況に有意差は存在しない。予測された喫煙状況は、それぞれDCとVCの対象の63％と70％について全ての手技にわたって一貫していた。RNAシーケンシングの品質の観点では、DCはVCよりも生検標本の中での総リード数、一意的にマッピングされたリードの割合、および転写物完全性数スコア中央値が有意に高かったが、コホート間のこれら差はブラシ標本には反映されなかった（図5）。
【０２２１】
発見コホート内のLUSC PMLは、特徴的な分子サブタイプに分類される
気管支内生検標本を使用してLUSC PMLの組織学的重症度に関連する遺伝子発現の違いを同定するために、発見ベースのアプローチを用いて、遺伝子共発現の特徴的なパターン（遺伝子モジュール）に基づいて、デノボ分子サブタイプを同定した。生検標本内に組織学的な異質性があること、およびmRNA-Seqを介してプロファイリングされた生検標本に隣接する生検標本を用いて病理学的解析が行われたことを考慮して、このアプローチを選択した。まず、異なるLUSCデータセットにまたがって存在する遺伝子モジュールのセットを選択することが求められた。重み付け遺伝子共発現ネットワーク解析（9）（WGCNA）を用いて、DC生検標本（n＝190サンプル、n＝16653遺伝子、n＝15遺伝子モジュール）、DCブラシ標本（n＝89サンプル、n＝16058遺伝子、n＝47遺伝子モジュール）、TCGA扁平上皮細胞癌腫（LUSC）腫瘍（10）（n＝471サンプル、n＝17887遺伝子、n＝55遺伝子モジュール）、およびn-ニトロソトリス-（2-クロロエチル）ウレア（NTCU）で処理したマウスからの気管気管支サンプル（n＝25サンプル、n＝14897遺伝子、n＝40遺伝子モジュール）において遺伝子モジュールを導出した。4つのデータセットのそれぞれの中で、少なくとも1つの他の非DC生検標本モジュールと高度に相関（絶対ピアソン相関係数r＞0.85）していたDC生検標本遺伝子モジュールを選択した。選択されたモジュールにおける遺伝子を、相関している非DC生検標本モジュールのうちの少なくとも1つにも各遺伝子が存在することを条件にフィルタリングし、その結果、合計3,936個の遺伝子からなる9個の遺伝子モジュールのセットが得られた（図6）。これら遺伝子モジュールから、コンセンサスクラスタリングを介してDC生検標本内の4つの分子サブタイプを同定した：増殖性（濃青、n＝52サンプル、27.4％）、炎症性（濃緑、n＝37サンプル、19.5％）、分泌性（薄青、n＝61サンプル、32.1％）、および正常様（薄緑、n＝40サンプル、21.1％）（図1A、表3）。
【０２２２】
各分子サブタイプをキャラクタリゼーションするために、まず、各遺伝子モジュールを構成する遺伝子において大きな比率を占めている生物学的経路を特定することに焦点を当てたが、それは、遺伝子モジュールの発現パターンが各PMLサブタイプを定義するためである。各遺伝子モジュールは、特徴的な上皮および免疫の生物学的プロセスに関連していることが判明した（図1A、図6、および表5）。増殖性サブタイプは、エネルギー代謝および細胞周期の経路に関与する遺伝子の発現増加によって特異的に特徴づけられる（モジュール4および5）。分泌性および正常様のサブタイプではいずれも、繊毛関連経路における遺伝子の発現が増加している（モジュール6）が、正常様サブタイプでは、特異的に、炎症、リンパ球および白血球の制御、ならびに抗原のプロセシングおよび提示の経路に関与する遺伝子の発現が減少している（モジュール8および9）。分泌性サブタイプは、タンパク質翻訳に関与する遺伝子の発現の減少を呈する（モジュール7）が、一方で、RNAプロセシング遺伝子（モジュール2）は、炎症性サブタイプにおいてより高発現している。
【０２２３】
分子サブタイプは、臨床表現型との関連性によって更にキャラクタリゼーションされ、LUSC腫瘍の分子サブタイプを確立した(11、12)。サンプルの喫煙状況、サンプルが由来した対象、およびサンプルの組織学的所見は、サブタイプとの有意な関連性を示した（p＜0.01、図1B、表6、図8）。増殖性および分泌性のサブタイプは、現喫煙者に多く含まれており、そして、対象の79％が研究期間全体を通して喫煙状況を維持しているので、この関連性によってより多くの対象が含まれるようになる。更に、増殖性サブタイプは、異形成の組織学的所見を有する生検標本に多く含まれている（図1B）。増殖性サブタイプでは、他のサブタイプのサンプルと比較してこのサブタイプのサンプルの中で有意にアップレギュレーションされる（FDR＝1.0e-30、線形モデル、全遺伝子にわたる増殖性サブタイプのサンプルと非増殖性サブタイプのサンプルとの間の差次的発現解析に基づく）増殖マーカーMKI67を含む細胞周期プロセスに関与する遺伝子が高発現している。この遺伝子は、正常／過形成の組織学的所見を有するサンプル（FDR＝3.4e-10、線形モデル）および異形成の組織学的所見を有するサンプル（FDR＝3.1e-8、線形モデル）内の増殖性サブタイプにおいて有意にアップレギュレーションされたままであり、そして、これら観察結果は、代表的なサンプルにおけるタンパク質発現の増加（p＝0.02）によって裏付けられている（図1C〜1Eおよび図9）。増殖性サブタイプのサンプルはまた、LUSC-古典的サブタイプ（図1B）と高い一致を有していた。TCGA LUSC腫瘍において、LUSC-古典的サブタイプは、KEAP1およびNFE2L2の変化および過剰発現、ならびにSOX2、TP63、およびPIK3CAの過剰発現を伴う3q26の増幅と関連していた（11）。同様に、本発明者らによる増殖性PMLでは、KEAP1、NFE2L2、TP63、およびPIK3CAの発現が増加していた（それぞれ、FDR＝1.4e-6、4.5e-12、1.4e-9、および0.03、線形モデル）（図10A）。更に、LUSC-古典的サブタイプは、エネルギー代謝に関与する遺伝子の発現増加と関連していることが判明し、そして、本発明者らによる増殖性サブタイプは、酸化的リン酸化および電子伝達系に関連する遺伝子が多く含まれるモジュール4の高発現によって部分的に規定される。対照的に、炎症性および分泌性のPMLサブタイプは、LUSC-分泌性サブタイプに多く含まれることを示す。LUSC-分泌性サブタイプは、免疫応答に関するプロセスに関連しており、そして、炎症性および分泌性のPMLは、これら同じ経路の遺伝子が多く含まれるモジュール8の最も高い発現を有する。
【０２２４】
最後に、多数のカノニカルな細胞型マーカーの発現を評価することにより、PMLの分子サブタイプが上皮および免疫の細胞型の組成の違いによって駆動される程度について調べた。炎症性サブタイプおよび分泌性サブタイプは、LUSC-分泌性サブタイプに多く含まれることと一致して、白血球細胞マーカーPTPRC（CD45）の発現レベルがより高い（図10B、それぞれ、FDR＝0.12および0.01、線形モデル）。モジュール6に多く含まれる挙動および経路と一致して、繊毛細胞マーカーTUB1A1の発現は、炎症性および増殖性のサブタイプで減少し（それぞれFDR＝1.1e-4および3.5e-19、線形モデル）、そして、これは、代表的な組織学的サンプルにおけるアセチル化ａ-チューブリン染色の減少によっても示される（図1E、図9）。増殖性サブタイプは、基底細胞マーカー（KRT5）の発現が最も高く（FDR＝2.4e-15、l線形モデル）、これは、代表的な組織学的サンプルにおけるタンパク質発現と密接に相関する高悪性度の組織学的所見を有する病変部に多く含まれることを示す（p＝0.01）（図1E、図9、図10B、表7）。更に、杯状上皮細胞のマーカーであるMUC5ACの遺伝子発現は、現喫煙者に多く含まれるサブタイプ（増殖性および分泌性）で増加するが、分泌性サブタイプで最も有意に増加する（FDR＝3.4e-5、線形モデル）。対照的に、クラブ細胞のマーカーであるSCGB1A1の遺伝子発現は、増殖性サブタイプにおいて最も低い（FDR＝6.1e-5、線形モデル）。正常様サブタイプは、全ての上皮細胞型の発現によって支持され、そして、CD45の発現が最も低い（FDR＝7.6e-4、線形モデル）。これらマーカー遺伝子の発現レベルは、上皮および免疫の細胞の含有量を調べるための細胞型デコンボリューション法と一致している（図10C〜10D）。これら特徴の総和は、喫煙によって調節される上皮および免疫の細胞に関連する経路およびPMLの組織学的所見を強調し、そして、増殖および細胞周期に関連する経路を発現する高悪性度PMLのサブセットとして増殖性サブタイプを同定する。
【０２２５】
表現型の分子サブタイプとの関連を検証コホートで確認する
次に、DC生検標本由来の分子サブタイプで捕捉された異質性がVCで再現可能かどうかを判定することが望まれた。9個の遺伝子モジュールのそれぞれの代表的な遺伝子を選択することによって、22遺伝子最近傍重心分子サブタイプ予測器を開発した。予測器は、DC生検標本（トレーニングセット、図2Aおよび図11）全体にわたって84.7％の精度を有し、サブタイプごとの誤分類率は以下の通りである：増殖性では5/52（9.6％）、炎症性では7/37（18.9％）、分泌性では9/61（14.8％）、そして、正常様では8/40（20％）。22遺伝子分類器を用いて、105個のVC生検標本の分子サブタイプを予測した（図2B）。DCサブタイプと比較して、予測されたVCサブタイプとの間で9個のモジュール（各モジュールの遺伝子のフルセットを使用）のそれぞれについてのメタジーンスコアの一致を調べることによって、VCサブタイプの予測を評価した。サブタイプ全体にわたる主成分1（PC1）の平均的な挙動は、わずかな例外（すなわち、遺伝子数が最も少ないモジュール3）を除いて、非常に類似していた（図12）。更に、DCサブタイプを導出するために用いたのと同じ方法を用いて、22遺伝子分類器からのVCサブタイプの予測をVC生検標本で導出されたサブタイプと比較したところ、有意な一致がみられた（p＝1.0e-7、増殖性サブタイプが予測間で最大の一致を有する、図11）。
【０２２６】
VC生検標本全体にわたる（22遺伝子分類器を介した）VCサブタイプと臨床および分子の表現型との間の統計的関連性は、DC生検標本全体にわたって観察されたものに類似している（図2C、表6、図8、および図10A〜10H）。簡潔に述べると、増殖性サブタイプは、現喫煙者、異形成の組織学的所見を有する生検標本、およびLUSC-古典的腫瘍サブタイプに多く含まれる（図2C、表6）。VC生検標本全体にわたる上皮および白血球細胞のマーカー遺伝子発現によって、LUSC-分泌性サブタイプに多く含まれることと一致して、炎症性サブタイプにおける白血球細胞マーカーPTPRC（CD45発現）のレベルがより高い（FDR＝0.002）ことが明らかになった（図10F）。
【０２２７】
炎症性および増殖性のサブタイプでは、モジュール6と一致して繊毛細胞マーカーの発現（FOXJ1）が減少する（それぞれ、FOXJ1 FDR＝0.0005およびFDR＝2.62e-6、ならびにモジュール6 FDR＝5.73e-6およびFDR＝4.34e-10）。増殖性サブタイプでは、基底細胞マーカーKRT5（FDR＝1.67e-7）、増殖マーカーMKI67（FDR＝3.03e-10）、および細胞周期関連モジュール5（FDR＝1.23e-18）の発現が最も高く、これは、高悪性度の組織学的所見に関連した特徴を発現する病変部に多く含まれていることを示す。クラブ細胞のマーカーであるSCGB1A1の遺伝子発現は、増殖性サブタイプにおいて最も低い（FDR＝1.8e-4）。杯状上皮細胞のマーカーであるMUC5ACの遺伝子発現は、現喫煙者で増加し、そして、DC生検標本では分泌性サブタイプにおいて最も有意であったが；VC生検標本では、現喫煙者は分泌性サブタイプを多く含んでいないので、この傾向は保持されない。これらマーカー遺伝子の発現レベルは、上皮および免疫の細胞の含有量を調べるための他のデコンボリューション法と一致している（図10E〜10H）。
【０２２８】
正常な外観の気道野のブラシ標本は、生検標本の分子サブタイプを反映している
以前、主気管支の正常な外観の区域からの気管支ブラシ標本からPMLの存在を予測できることが示されたが（13）；その研究では、同じ対象からの生検標本およびブラシ標本が欠けていた。上記のDCおよびVCの生検標本の両方において、増殖性サブタイプは、代謝および増殖の経路を発現している異形成の組織学的所見に多く含まれるPMLの特徴的なサブタイプを表す。増殖性サブタイプに分類された生検標本は、緊密なモニタリングおよび介入を必要とするPMLの群を表し得る。その結果、ブラシ標本を用いて増殖性サブタイプの生検標本の存在を予測できるかどうかを調べることが求められた。増殖性サブタイプは、モジュール4、5、6、および7の挙動によって定義され（表3）、したがって、これらモジュールに対応する（22遺伝子予測器からの）8個の遺伝子のサブセットを使用して、DCおよびVCの生検標本およびブラシ標本全体にわたって増殖性サブタイプの存在を予測した。ブラシ標本における増殖性サブタイプの予測は、同じ時点で検出された少なくとも1つの増殖性PMLの存在を示すことにおいて特異的である（DC生検標本およびVC生検標本でそれぞれ91％および92％）が、感度は高くない（DC生検標本およびVC生検標本でそれぞれ39％および32％）（図3A）。ブラシ標本における増殖性サブタイプの予測における分類器の性能を理解するために、DCおよびVCのブラシ標本において、増殖性サブタイプを定義するモジュール4、5、6、および7について遺伝子セット変動分析（GSVA）（14）のスコアを調べた（図3B）。DCおよびVCのブラシ標本において、GSVAスコアは、モジュール5および6についてのみ、増殖性サブタイプ対他の全てのサンプルで有意に異なっており（FDR＜0.05）、したがって、これらが、ブラシ標本における増殖性サブタイプ分類に最も大きく寄与している可能性が高い。モジュール5には細胞周期および増殖に関連する遺伝子が含まれ、一方、モジュール6には繊毛の構築および組織化に関連する遺伝子が含まれている。ブラシ標本におけるモジュール5および6のダウンレギュレーションは、増殖性サブタイプPMLの存在を特異的に予測するが；気道損傷野におけるこれらシグナルの不在は、増殖性サブタイプPMLの発症を排除するものではない。
【０２２９】
免疫関連遺伝子が、増殖性サブタイプの進行性／持続性のPMLと退行性のPMLとを分ける
気管支PMLのこれまでの研究では、高悪性度病変（現喫煙者においてより高頻度で発生する）は侵襲性癌腫に進行する可能性がより高いことが示唆されている（6）。そこで、増殖性サブタイプのDC生検標本の中でその後のPMLの進行／持続（n＝15）対退行（n＝15）に関連する分子変化を同定することが求められたが、その理由は、該変化が適切な妨害ストラテジーの同定に臨床的に関連している可能性があるためである。9個のモジュールのそれぞれについて、全てのDC生検標本にわたって算出したGSVAスコアを用いて、増殖性サブタイプに属するサンプルにおける進行性／持続性疾患と退行性疾患との間で、どのスコアが統計的に異なるかを算出した（図7）。モジュール9についてのDC生検標本のGSVAモジュールスコアは、進行性／持続性の増殖性PMLと比較して、退行性増殖性PMLの中で有意に高いことが判明した（p＝0.002、線形モデル、図4A）。モジュール9スコアの低さと進行／持続との関連性は、VC生検標本でも再現される（n＝7進行性／持続性生検標本、n＝13退行性生検標本；p＝0.03、線形モデル、図4B）。受信者動作特性（ROC）下面積によって測定したとき、退行性生検標本と進行性／持続性生検標本との間を判別するモジュール9のGSVAスコアの能力は、DCおよびVCの生検でそれぞれ0.809および0.802であった。
【０２３０】
モジュール9における遺伝子は、インターフェロンシグナル伝達ならびに抗原のプロセシングおよび提示に関与するタンパク質をコードしている多数の遺伝子（SP100、CIITA、CXCL10、SOCS1、GBP1、GBP4、B2M、TAP1、TAPBP、TRIM14、TRIM21、TRIM22、STAT1、PML、OAS2、OAS3、MX1、ADAR、ISG15、IFI35、IFIT3、IFI27、PSMB8、PSMB9、BST2、IRF1、IRF9、CD74、PSME1、PSME2、HLA-DQA1/DPA1/DPB1/DRA/DQB2/DRB1/DQB1/DMA/DMB/DOA、HLA-A/B/C/E/F）を含み、そして、阻害性受容体LAG3を含む。その結果、自然または適応の免疫細胞の有無が増殖性サブタイプ内のモジュール9の発現と関連しているかどうかを評価することが望まれた。免疫細胞型の潜在的な存在をデコンボリューションするための試みにおいて、既に報告されている免疫細胞のシグネチャ（15）およびxCellアルゴリズムを用いた64の異なる細胞型のスコア（16）を用いて、DC生検標本およびVC生検標本の両方について別々にGSVAスコアを生成した。細胞型スコアとモジュール9との間で有意な（FDR＜0.05）関連が同定され（図13）、これは、DC生検標本とVC生検標本との間で共通しており、そして、樹状細胞、活性化樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、マクロファージ、M1マクロファージ、ならびにCD8+エフェクターメモリーT細胞、CD8+セントラルメモリーT細胞、および制御性T細胞を含む8個の細胞タイプが同定された（xCellを介して）（図4C）。まとめると、増殖性サブタイプにおける進行性／持続性生検標本では、退行性生検標本と比較して、モジュール9の発現がダウンレギュレーションされており、これは、自然および適応の免疫細胞集団の両方からのシグナルの減少と相関している。
【０２３１】
免疫蛍光により、増殖性PMLにおけるマクロファージおよびT細胞の進行関連調節を明らかにする
モジュール9に関連する免疫細胞型と増殖性サブタイプにおけるPMLの組織学的進行／持続と間の関係を確認するために、マクロファージ／単球（n＝16から数え上げられたn＝52領域）、CD4（n＝17対象から数え上げられたn＝50領域）、およびCD8 T細胞（n＝16から数え上げられたn＝47領域）の免疫蛍光染色を行った（表7）。増殖性サブタイプ内のアッセイされた全ての対象、および病変転帰（進行／持続対退行）がモジュール9のGSVAスコアと一致していた対象のサブセット（一致セットと表記）にわたって結果を解析した。M1型マクロファージを示唆する汎マクロファージ（および腫瘍関連マクロファージ）マーカーであるCD68の染色は、進行性／持続性病変部で増加した（一致セットではp＜＜0.001）。対照的に、M2型マクロファージを示唆すると考えられるCD68と組み合わせたCD163の染色は、増殖性サブタイプにおける進行性／持続性病変部の中で減少した（それぞれ全対象を用いてp＜＜0.001、一致セットではp＝0.0007、線形モデル）（図4D〜4E）。更に、進行／持続するPMLでは、CD4 T細胞が増加し（一致セットではp＜＜0.001、線形モデル）、そして、CD8 T細胞が減少した（一致セットではp＜＜0.001）。興味深いことに、進行性／持続性病変部の中では、CD8 T細胞は特徴的な局在パターンを有しており（一致セットではp＝0.07、線形モデル）、ここでは、CD8 T細胞は、異形成が存在する区域において上皮を覆っており、かつ上皮内に埋め込まれている（図4D）。免疫蛍光の結果は、モジュール9のスコアに関係なく病変転帰のみを用いた場合、CD163を除いて有意には至らなかった。
【０２３２】
考察
肺扁平上皮細胞癌腫（LUSC）は、肺がんの2番目に一般的な形態であり、気管支気道の上皮層で発生する。肺扁平上皮前悪性病変（PML）の発症が先行することが多い。異形成の持続性および進行性のPMLの存在は、LUSCのリスク増加のマーカーである（6）。しかし、現在のところ、侵襲性癌腫への進行リスクが最も高いPMLを同定するための有効なツールが不足している（7）。疾患進行を予測するマーカーの開発は、LUSC発症のリスクが最も高い患者を同定し、そして、LUSCの化学予防に利用できる生物学的経路を同定する上で重要である。この目的のために、胸部コンピュータ断層撮影（CT）および自家蛍光気管支鏡検査による縦断的な肺がん検診を受けている対象から得られた気管支ブラシ標本および気管支内生検標本のRNA-Seqを介したプロファイリングが、本明細書において記載される。4つの転写的に特徴的な生検標本グループが同定され、そのうちの1つは増殖性と命名され、そして、高悪性度の異形成と関連していることが判明した。増殖性PMLを有する患者はまた、非疾患大気道上皮における細胞から測定された遺伝子発現を介して同定することもできる。更に、持続性／進行性の増殖性PMLは、インターフェロンシグナル伝達および抗原プロセシング／提示の経路に関与する遺伝子の発現が低下していることを特徴とすることが判明した。これら遺伝子発現の知見と一致して、CD68+/CD163+マクロファージおよびCD8 T細胞では進行性／持続性の増殖性PMLが枯渇することが免疫蛍光により判明した。まとめると、これらデータは、気道の遺伝子発現に基づいて、侵襲性肺がんの発症リスクのある進行性／持続性LUSC PML患者のサブセットが同定される可能性と、退行に関連する免疫応答を増強することにより、これら患者における進行のリスクが減少する可能性の両方を示す。
【０２３３】
これまでの研究によって、気管支の異形成に関連する様々なゲノム変化が示されている。上皮細胞のEGFRおよびKi67の染色の発現増加は、組織学的重症度の増大およびその後の組織学的進行と関連している(6、17)。TP53、CCND1、CCNE1、BAX、およびBCL2のタンパク質レベルの変化は、組織学的グレードとは無関係にCISまたは肺がんの発生と関連している（18）。肺がんにおいて高頻度で検出される領域（3p、5q、9p、13q、17p）におけるテロメアの短縮および維持（19）ならびにヘテロ接合性の消失は、初期の過形成／化生病変部で観察されており（20〜22）、そして、より高悪性度の異形成では頻度および大きさが増加することが判明している。SOX2、TP63、EGFR、MYC、CEP3、およびCEP5を含む遺伝子座におけるゲノムの増加もまた、高悪性度異形成の進行と関連している（23）。PMLの組織学的グレードおよび進行に関連する多数のゲノム変化にもかかわらず、PMLの病理学的分類を補完する網羅的なPML分子分類システムが不足している。4つの特徴的な分子PMLサブタイプ（増殖性、炎症性、分泌性、および正常様）の同定につながる教師なしクラス発見アプローチの使用。
【０２３４】
PMLサブタイプを識別する転写パターンはロバストであり、そして、発見コホートで同定された22遺伝子パネルは、独立した検証コホートで異なる分子サブタイプ間を区別するために使用することができる。興味深いことに、肺がんの前病歴は気道の遺伝子発現に影響を与える可能性があり、そして、対象の約3分の2が肺がんの前病歴歴を有するが、本発明者らは、肺がんの病歴と分子サブタイプとの間に有意な関連性を検出せず、そして、肺がんの病歴のある対象およびない対象から採取された生検の間にも同様の分子サブタイプの多様性が存在する。増殖性サブタイプは、現喫煙者からの異形成PMLで多く含まれ、そして、代謝経路（OXPHOS/ETC/TCA）および細胞周期経路のアップレギュレーションならびに繊毛関連経路のダウンレギュレーションを特徴とする。これまでの研究によって、異形成病変を有する対象（13）、LUSC腫瘍に隣接するPML（24）、および肺がんリスクの高い喫煙者（25）の気道における代謝経路の増加、ならびに肺がんの化学予防のエンドポイントとして利用されてきた増殖の増加（Ki67レベルを介して、前述の通り）が示されている（26、27）。増殖性病変を有する患者の同定は、肺がん化学予防試験に高リスクの対象を多く含めたり、またはより高頻度の肺がん検診から恩恵を受ける患者を同定したりするのに有用である。炎症性サブタイプは、元喫煙者からのPMLで大きな比率を占めるが、興味深いことに、異常な上皮を示唆する、繊毛関連経路の発現減少が同様に生じるにもかかわらず、異形成には有意に多くは含まれていない。炎症性サブタイプはまた、炎症ならびにリンパ球および白血球の制御に関与する遺伝子が多く含まれる遺伝子モジュールの発現増加を示す（モジュール8）。この遺伝子モジュールはまた、現喫煙者からの病変部で大きな比率を占める分泌性病変でも上昇し、そして、杯細胞マーカーの発現増加を呈する。興味深いことに、IL1Bはこの炎症関連遺伝子モジュールの一部であり、このことは、最近IL1Bの阻害が肺がんの発生率を低下させることが示されたので、非常に興味深い（28）。
【０２３５】
本発明者らの先行研究では、気管支鏡検査中に主気管支をブラシ擦過することを介して得られた細胞をプロファイリングすることにより、正常な外観の気道上皮における遺伝子発現の変化について広範囲に研究した(8、29、35)。この研究の一環として、気管支異形成の存在を反映する遺伝子発現変化が報告された（31）。本研究では、初めて、気管支ブラシ標本および気管支内生検標本の両方を同じ手技中に採取し、増殖性サブタイプPMLの存在を示す正常な外観の気道からの気管支ブラシ擦過標本における遺伝子発現の違いを同定することができた。発見および検証のコホートの両方において、増殖性サブタイプのPMLを同定するために使用した予測器（PML生検標本の遺伝子発現に基づく）を、正常な外観の気道ブラシ擦過標本からの遺伝子発現データに適用した結果、非常に特異的（91％）に増殖性サブタイプが予測されたが、感度は低かった（31〜38％）。増殖性に分類されたブラシ標本では、細胞周期経路の発現が増加し、そして、繊毛関連遺伝子の発現が減少しており、このことは、正常な上皮よりも扁平上皮化生により類似していることを示唆する。もしかすると、患者のサブセットが、このタイプの高悪性度PMLの存在のマーカーとして機能する広範囲にわたる気道損傷を有している可能性があり、その結果、感度は中等度であるが、特異度は高くなる。他の場合には、これら増殖性PMLを生じさせる損傷の区域がより限局化している可能性があり、したがって、もしかするとブラシ擦過によって検出することがより困難である可能性があり、これは感度の低下につながる。これら知見は、一部の対象では気道上皮全体を通した変化を標的とする療法が必要な場合があり、一方、特定の症例では、より部位特異的なアブレーション（例えば、光線力学的療法）がより有効である場合もあることを示す。別の可能性および将来の研究分野は、増殖性サブタイプのブラシ標本が、偶発的なLUSCの予測器であるということである。
【０２３６】
また、PMLの分子プロファイリングおよび遺伝子共発現モジュールの同定は、その後のPML進行の分子的決定因子を同定する機会を提供する。分子サブタイプを定義するために使用した9個の遺伝子共発現モジュールのうちの1つは、DCおよびVCのコホートの両方において、増殖性サブタイプ内の退行する生検標本と比較して、進行または持続する生検標本との間で有意に異なっていた。モジュールは、インターフェロンシグナル伝達ならびに抗原のプロセシングおよび提示に関与する持続性／進行性生検標本で発現が減少する遺伝子を含有する。これら遺伝子発現の変化は、コンピュータによる予測を介して自然および適応の免疫細胞の存在量の減少と相関していた。FFPE生検標本切片の免疫蛍光染色により、モジュール9のGSVAスコアが低い進行性／持続性増殖性病変部では、CD163+マクロファージおよびCD8+T細胞の数が少なく、そして、CD8+T細胞が特徴的な局在パターンを有していたことが確認された。また、これら病変部にはより多数のCD4+T細胞が含有されており、これら細胞が免疫抑制環境を促進する制御性Ｔ細胞であるかどうかを評価することは将来の研究において重要である。
【０２３７】
分極化した表現型（炎症促進性としてのM1または抗炎症性としてのM2）を有する腫瘍関連マクロファージの存在は、肺がんの予後と関連している。CD163の発現を特徴とするM2マクロファージが圧倒的に多く存在することは、生存率の悪化と関連している。しかし、肺PMLの状況では、この関係は十分に研究されてはいない。退行性増殖性PMLにはより多くのCD163+細胞が存在し、そして、IFNgシグナル伝達に関与する遺伝子の発現が増加するという本所見は、活動性のIFNgシグナル伝達を有するCD163+マクロファージの存在がより良好な転帰と関連しているという口腔扁平上皮細胞癌腫に先行するPMLでみられたもの（36）と一致している。更に、増殖性サブタイプ内の進行性／持続性病変では、CD8+T細胞の数が少なく、そして、HLAクラスI遺伝子およびB2Mの発現が低いことが観察された。肺腫瘍におけるB2M（37、38）およびインターフェロンシグナル伝達（39）のダウンレギュレーションまたは消失を含むHLAクラスI抗原のプロセシングおよび提示の障害が、チェックポイント阻害薬に対する応答および獲得抵抗性に影響を与えることを示す幾つかの研究で、適当なT細胞媒介免疫監視の崩壊が報告されている。HLA-I複合体を欠く肺腫瘍は、細胞傷害性CD8+リンパ球浸潤が少なく、これはより低レベルのPD-L1とも関連していた。更に、研究によって、チェックポイント阻害薬の有効性ならびに制御性Tマーカー（FOXP3、CD25）を発現しているCD4+T細胞が増加し、その結果免疫抑制状態になっている腫瘍を有するLC患者における生存率に対する負の影響が、CD8+T細胞の動員およびエフェクター機能を妨げることが示唆されている（40、41）。ここでプロファイリングされたPMLに関する将来のDNAシーケンシングデータは、B2Mのヘテロ接合性またはホモ接合性の消失、またはインターフェロンならびに抗原のプロセシングおよび提示の経路における他の遺伝子における変異を示す可能性があるが；獲得抵抗性の場合でさえも、変異およびコピー数の変化が全ての対象にわたるこれら経路のダウンレギュレーションを説明することはできず、このことは、他のエピジェネティックな変化またはシグナル伝達経路が役割を果たしている可能性があることを示唆している。実際、エピジェネティック療法、具体的にはDNAメチルトランスフェラーゼ阻害薬（42）は、免疫チェックポイント療法への応答を高め、そして、HLAクラスI遺伝子（HLA-BおよびHLA-C）、B2M、CD58、TAP1、免疫プロテアソームサブユニットPSMB9およびPSMB8、ならびに転写因子IRF9を含む増殖性サブタイプ内の進行性／持続性病変部でダウンレギュレーションされる遺伝子の多くをアップレギュレーションすることが示されている。このPMLのサブセットにおける自然免疫および適応免疫のダウンレギュレーションの機序を解明することは、有望な免疫予防療法を同定するために重要である。
【０２３８】
本データは、病変部の微小環境における浸潤性免疫細胞が欠失した結果である、その後のLUSC前悪性病変の進行を予測するサブタイプ特異的なトランスクリプトーム変化が存在することを示す。これらデータは、PMLのサブタイプを決定しかつ免疫浸潤を評価するためのバイオマーカーが、より集中的な臨床管理を必要とする攻撃性PMLの検出に有用である可能性があり、そして、これらPMLで変化した遺伝子が肺化学予防の候補となる可能性があることを示唆している。これらバイオマーカーは、PML組織において直接測定してもよく、または本データによって示されるように、気管支気道上皮等の代替組織で測定してもよい。代替組織で測定された攻撃性PMLの挙動を予測するバイオマーカーの利点は、これらバイオマーカーが気管支鏡検査中に直接観察されないPMLの挙動も予測できる可能性があることである。
【０２３９】
材料および方法
対象集団およびサンプル採取
気管支内生検標本およびブラシ擦過標本は、Roswellにおいて白色光および自家蛍光の気管支鏡検査ならびにコンピュータ断層撮影により約1年間隔で肺がん検診を受けている高リスクの対象から得た。気管支鏡検査は、気管支の壁に外傷を引き起こすことなく、目に見える声帯、気管、主気管分岐部、および亜区域気管支の入口部を可視化することを含んでいた。全ての異常な領域および疑わしい区域を2回生検し、肺の解剖学的位置を記録する（図14、表8）。一方の生検標本はルーチンの病理学的評価に、そして、他方は分子プロファイリングに使用した。更に、研究のために左または右の主気管支の正常な外観の区域からブラシ擦過標本を得た。生検標本を評価するために使用する形態学的基準は、世界保健機関（WHO）の指針（43）に準拠する。検診の適格性は、気道消化器がんの既往歴、および登録時に疾患がない、または年齢50歳超、最低曝露量20パックイヤーの現在の喫煙または過去の喫煙歴、そして、中等度の慢性閉塞性肺疾患（COPD）（強制呼気量（FEV1）が＜70％と定義）、アスベスト関連肺疾患が確認されている、または肺がんの強い家族歴（少なくとも1〜2人の第一度親族）を含む少なくとも1つの追加の危険因子を含む。全ての研究検体は、RNA Allprotect（Qiagen）中に保存し、-80℃で保存した。
【０２４０】
連続気管支鏡検査を介して繰り返し複数の場所で（repeat locations）採取された生検標本を有する対象を選択したが、RNA単離後、3人の対象からのサンプルは1個の生検標本を有しており、1人の対象からのサンプルは1個のブラシ擦過標本を有していた。2010年から2012年の間に採取された気管支内生検標本およびブラシ標本で構成されるサンプルの発見コホート（DC）（n＝30対象、n＝197生検標本、およびn＝91ブラシ擦過標本）においてmRNAシーケンシングを行った。続いて、2012年から2015年の間に採取された気管支内生検標本およびブラシ標本で構成されるサンプルの検証コホート（VC）（n＝20対象、n＝111生検標本、およびn＝49ブラシ擦過標本）においてmRNAシーケンシングを行った。ブラシ標本の組織学的所見は、同じ時点で観察された最悪の生検標本の組織学的所見によって定義した。生検標本の進行／退行は、各生検標本ごとに、生検標本の組織学的所見および将来同じ肺の解剖学的位置について記録される最悪の組織学的所見に基づいて定義した。正常、過形成、および化生間の組織学的変化を「正常安定性」として分類し、組織学的異形成グレードの低下または異形成の組織学的所見から正常／過形成／化生への変化を「退行性」として分類し、将来の組織学的データがない場合「不明」として分類し、そして、その他全てを「進行性／持続性」として分類した。Boston University Medical CenterおよびRoswellの施設内審査委員会は、この研究を承認し、そして、全ての対象から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
【０２４１】
RNA-Seqライブラリの調製、シーケンシング、およびデータ処理
miRNeasy（商標）Mini KitまたはAllPrep（商標）DNA/RNA/miRNA Universal Kit（Qiagen）を用いて、気管支内生検標本および気管支ブラシ擦過標本から全RNAを抽出した。Illumina TruSeq（商標）RNA Kit v2を用いて全RNAサンプルからシーケンシングライブラリを調製し、そして、Illumina TruSeq（商標）Paired-End Cluster Kitを用いて4つのグループにマルチプレックス化した。各サンプルをIllumina HiSeq（商標）2500でシーケンスして、ペアエンドの100ヌクレオチドリードを生成した。Illumina CASAVA（商標）1.8.2またはBaseSpaceを用いてデマルチプレックスおよびFASTQファイルの作成を行った。hg19および2-pass STAR（44）のアライメントを用いて、サンプルをアライメントした。Ensembl（商標）v74アノテーションを用い、RSEM（45）を用いて、遺伝子および転写物のレベルカウントを算出した。品質メトリクスは、STARおよびRSeQCによって算出した（46）。CYorf15A（ENSG00000131002）、DDX3Y（ENSG00000067048）、KDM5D（ENSG00000012817）、RPS4Y1（ENSG00000129824）、USP9Y（ENSG00000114374）、およびUTY（ENSG00000183878）にわたって性別アノテーションが遺伝子発現と相関していなかったサンプルを除外した（n＝4サンプル）。Peddy（商標）ソフトウェアを使用して、患者内でのサンプルの関係性を確認した（47）。
【０２４２】
ヘテロ接合率の高い（中央値を標準偏差3つ分超上回る）サンプル、または同じ患者からのサンプルとの関係性が低い（中央値を標準偏差3つ分超下回る）サンプルは、更なる解析から除外した（n＝11サンプル、2ブラシ標本、および9生検標本）。その後、発見および検証のコホート（上に概説した通り）に、組織タイプ（生検標本またはブラシ標本）によって、サンプルを分けた。その後のサンプルおよび遺伝子のフィルタリングは、以下の通り各セットについて別々に実施した：まず、EdgeR（商標）（48）を使用して、正規化されたデータ（コンピュータで計算したTMM、M値のトリム平均、および100万あたりのlog2カウントを用いて正規化したライブラリサイズ）をコンピュータで計算し、そして、四分位数間範囲がゼロに等しいか、またはサンプル全体にわたる合計が1以下である遺伝子を除外した。以下の基準のうちの1超について平均値から標準偏差2つ分よりも大きな値に基づいて、サンプルを除外した：1）フィルタリングした全ての遺伝子にわたって算出された他の全てのサンプルとの平均ピアソン相関、2）フィルタリングした遺伝子発現マトリックスを使用して算出された第1または第2の主成分、3）転写物完全性数（transcript integrity number、TIN、RSeQCによってコンピュータで計算）。サンプルをフィルタリングした後、高品質のサンプルの最終セットについて上記の通り遺伝子フィルタリングをコンピュータで再計算した。データは、アクセッションGSE109743を用いて、NCBIのGene Expression Omnibusから入手可能である。
【０２４３】
分子サブタイプの導出
DC生検標本（n＝190サンプル、n＝16653遺伝子）およびブラシ標本（n＝89サンプル、n＝16058遺伝子）を用いて、分子サブタイプを導出した。分子サブタイプの導出中に、2つの追加のRNA-Seqデータセットを使用した：TCGA扁平上皮細胞癌腫（LUSC）腫瘍（10）（n＝471サンプル、n＝17887遺伝子）およびn-ニトロソトリス-（2-クロロエチル）ウレア（NTCU）で処理したマウスからの気管気管支サンプルのデータセット（n＝25サンプル、n＝14897遺伝子）。マウスは、組織学的および分子的にヒトの病変と同等でかつLUSCに進行する病変を発症し、そして、サンプルは、様々な組織学的所見（正常、軽度の異形成、中等度の異形成、重度の異形成、上皮内癌（CIS）、およびLUSC腫瘍）を表す。マウスのデータは、アクセッションID  GSE111091を用いて、NCBIのGene Expression Omnibusから入手可能である。TCGA LUSC腫瘍およびマウス組織からのサンプルおよび遺伝子のフィルタリングは、本明細書において他の箇所に記載されている通り処理した。
【０２４４】
重み付き相関ネットワーク解析（9）（WGCNA）をデフォルトのパラメータで使用して、上記の4つのデータセット全体にわたる遺伝子共発現モジュールを導出した。RNA品質（中央TIN）およびバッチ（Illuminaフローセル）について調整する残差遺伝子発現値を、生検標本およびブラシ標本のデータセットのWGCNAの入力として使用した。マウスのデータセットについては、RNA品質（中央TIN）、マウス系統、およびサンプルタイプ（レーザーキャプチャーマイクロダイセクション対全組織）について調整する残差遺伝子発現値をWGCNAの入力として使用した。100万あたりのLog2カウント（cpm）値を、LUSC腫瘍サンプルのWGCNAの入力として使用した。各データセットの共発現モジュールごとに遺伝子セットを作成し、次いで、それらを組み合わせて、4つのデータセットのそれぞれから生成された遺伝子セットの一覧を作成した。一覧の各遺伝子セットについて、各zスコアで正規化されたデータセット全体にわたって第1の主成分（PC1）を算出した。データセットごとに、一覧の全ての遺伝子セットにわたるPC1値のピアソン相関行列をコンピュータで計算し、閾値を以下の通り設定した：r＞0.85を1に設定し、r≦0.85を0に設定した。その後、4つの行列を合計し、そして、全てのデータセットにわたって別の非生検標本由来の遺伝子セットに相関していた生検標本共発現モジュールに由来する遺伝子セットを保持した（n＝9個のモジュールを保持）。保持された生検標本モジュールを定義する遺伝子は、生検標本モジュール内に存在し、かつ少なくとも相関していた遺伝子セットのうちの1つに存在することが必要であった。
【０２４５】
上記のフィルタリングプロセスにより、生検標本データ中の分子サブタイプを定義するために使用される縮小遺伝子セット（n＝3,936）が得られた。発見生検標本についての縮小遺伝子セット全体にわたる残差遺伝子発現値を、コンセンサスクラスタリングの入力として使用した（49）。k（グループ数）を10、反復回数を1000、サブサンプリングを80％、クラスタリングアルゴリズムをメドイド(mediods)による分割、そして、距離メトリクスをピアソン相関に設定してコンセンサスクラスタリングを行った。kの最適値は、kごとにコンセンサスマトリクスに基づいて算出された累積分布関数下面積の相対的な変化に基づいて4であった。
【０２４６】
分子サブタイプ予測器
フィルタリングされた遺伝子全体にわたるDC生検標本を使用して、分子サブタイプ予測器を導出した。まず、各遺伝子とモジュール固有遺伝子（eigengenes）（9個のモジュールのそれぞれについてのPC1）との間のピアソン相関メトリクスを求めた。割り当てられたモジュールについての相関値が最も高い場合、遺伝子をそのモジュールの一部として保持した。モジュール固有遺伝子に対する保持された遺伝子の平均ピアソン相関をコンピュータで計算したところ、予測器のために各モジュールから選択された遺伝子の数はこのメトリクスに反比例していた。第2に、予測器におけるモジュールを表すためにモジュール固有遺伝子と最も相関の高い遺伝子を選択した。DC生検標本データ全体にわたるこの解析から得られた22個の遺伝子を使用して、閾値がゼロであるpamrパッケージを用いた最近傍重心予測器をトレーニングし、そして、VC生検標本データ全体にわたる分子サブタイプを予測した。これら試験セットの分子サブタイプを予測する前に、トレーニングおよび試験セットをコンバット（50）調整し、そして、組み合わせたトレーニングおよび試験データ全体にわたってzスコアで正規化した。上記の方法を用いて、VC生検標本全体にわたるコンセンサスクラスタリングを用いて分子サブタイプを導出し、そして、これらを予測されたサブタイプと比較した。
【０２４７】
遺伝子モジュールおよび分子サブタイプに関連する生物学的プロセスの同定
DCにおける分子サブタイプを発見するために使用した9個のモジュールのそれぞれに多く含まれていた生物学的プロセスおよび経路を、EnrichRを使用して同定した（51）。各モジュールをモジュール固有遺伝子と正または負の相関を持つ遺伝子に分け、biomaRtを用いてEnsembl IDを遺伝子略号に変換し、そして、以下のデータベースを検索した：GO Biological Process 2015、KEGG 2016、WikiPathways 2016、TargetScan microRNA、Transcription Factor PPIs、TRANSFAC and JASPAR PWM、OMIM Disease、Reactome 2016、およびBiocarta 2016。FDR＜0.05のプロセス／経路を、有意に多く含まれているとみなした。limmaを介して患者を変量効果とする線形混合効果モデルを用いて、各モジュールのGSVA（14）スコアが分子サブタイプと有意に（FDR＜0.05）関連しているかどうかを検定することによって、DC生検標本の分子サブタイプに対する各遺伝子モジュールの寄与を評価した。
【０２４８】
分子サブタイプと臨床および生物学的表現型との関連性の同定
limmaを介して、患者を変量効果とする線形混合効果モデルを使用して、各モジュールについてのGSVA（14）スコアが、他の全てのサンプルに対して、特定の分子サブタイプにおいて有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされたかどうか（FDR＜0.05）を算出することによって、各遺伝子モジュールの挙動に従って、DC生検標本における分子サブタイプにアノテーションを付けた。更に、各サブタイプに関連する生物学的経路および転写因子を、各サブタイプとの関連性についてt統計量によってランク付けした遺伝子を用いて、GSEA（52）およびmSigDB（53）の遺伝子セットを用いて同定した。サブタイプのメンバーシップに関連する発現の異なる遺伝子を同定するために、limma（54）およびedgeR（48）パッケージを使用して、ランク付けされたリストを作成した。
【０２４９】
各線形モデルは、voom変換された（55）データを使用し、そして、共変数として関心対象のサブタイプにおけるメンバーシップ、バッチ、およびRNA品質（TIN）を、そして変量効果として患者を含んでいた。分子サブタイプにアノテーションを付けるために、ランク付けされたリストに多く含まれる経路（FDR＜0.05）を使用した。この分析または正常／過形成の組織学的所見もしくは異形成の組織学的所見のサンプルのみを使用した類似のモデルから、個々の遺伝子についてのFDR値を導出した。
【０２５０】
DCおよびVCの生検標本について、残差遺伝子発現値を使用して、喫煙状況、LUSC腫瘍サブタイプ、ならびにサンプルごとの上皮細胞および免疫細胞の相対的存在量を予測した。既に報告されている通り（13）、サンプルごとに喫煙状況（現喫煙者対元／非喫煙者）を予測した。サンプリングされた全ての生検標本およびブラシ標本にわたる予測スコアの平均（現喫煙者の予測については＞0、元／非喫煙者の予測については＜0）を算出することにより、対象ごとに各時点での喫煙状況を決定した。LUSC分子サブタイプを予測する遺伝子（12）にわたって、既に報告されている通り（11）、LUSC腫瘍サブタイプを決定した。ESTIMATEアルゴリズム（56）を使用して、相対的な上皮、間質、および免疫の細胞の含有量を推測した。Bindeaらによる免疫細胞型特異的シグネチャ（15）およびDvorakらによる上皮細胞型特異的シグネチャ（50）を用いて、シグネチャごとにサンプル全体にわたるGSVA（14）スコアを生成した。更に、log RPKM値を用いて算出した残差遺伝子発現値をxCell（16）に入力して、64個の異なる細胞型の相対的存在量を推測した。上記のカテゴリー別表現型は、生検標本の組織学的所見、対象、肺がんの既往歴、性別、および生検標本の進行／退行状況などの追加の臨床変数と共に、フィッシャーの直接検定を用いて分子サブタイプと関連していた。連続変数は、limmaを介して線形モデルを用いて分子サブタイプと関連していた。
【０２５１】
病変転帰に関連する分子変化をキャラクタリゼーションするために、線形混合効果モデルを用いて、limmaを介して患者を変量効果として各分子サブタイプ内の進行性／持続性病変部と退行性病変部との間のモジュールGSVAスコアの差を評価した。本発明者らは、上皮細胞の含有量（xCellにおける「上皮」、Bindeaらにおける「正常粘膜」）を補正する線形混合効果モデルを介して、そして、患者を変量効果として、増殖性サブタイプにおける進行性／持続性病変部と退行性病変部との間の免疫細胞の含有量の差を推定した（xCellおよびBindeaらについて別々に）。本発明者らは、発見コホートおよび検証コホートの両方において、増殖性サブタイプにおける進行性／持続性病変部と退行性病変部との間で有意に異なっていた（FDR＜0.05）細胞型に焦点を当てた。
【０２５２】
生検標本とブラシ標本との関係
増殖サブタイプの生検標本の存在に関して、ブラシ標本の予測性能を定量化することが望まれていた。22遺伝子分子サブタイプ予測器のサブセットを使用して、DCおよびVCのブラシ標本および生検標本全体にわたって増殖性サブタイプの有無を予測した。具体的には、（増殖性サブタイプにおいて有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた）モジュール4〜７に対応する8個の遺伝子（22個中）を用いて、分子サブタイプ予測器について上記したのと同じ方法を用いて、サンプルを増殖性のものとそうでないものとに分類した。DCまたはVCのブラシ標本における増殖性サブタイプ予測が増殖性サブタイプの少なくとも1つの生検標本の存在を示す能力に基づいて、感度および特異度の性能メトリクスを算出した。ブラシ標本における増殖性サブタイプ予測を更に理解するために、（上記の方法に基づいて）DC生検標本における増殖性サブタイプを定義するモジュールの挙動を、DCおよびVCのブラシ標本全体にわたって解析した。
【０２５３】
免疫蛍光染色および定量
Roswellにおいて標準的なホルマリン固定および包埋の技術を使用し、そこで、Roswellでルーチンの病理学的評価に使用されるFFPEサンプルから5ミクロンの切片を切り出した（表7）。染色の前に、サンプルをキシレンで脱脂し、段階的な一連のエタノール溶液を通して再水和した。抗原回復のためにARまたはクエン酸バッファを使用し、組織を一次抗体と共に一晩4℃でインキュベーションし、そして、蛍光コンジュゲート（Invitrogen Alexa Fluor 488、594、647）を有する二次抗体と共に室温で1時間プロービングした。表9に収載した一次抗体を用いて免疫染色を行った。スコアリングのためにAperio Slide Scannerを使用し、そして、追加の画像を捕捉するためにCarl Zeiss Axio（20倍および40倍の対物レンズ）およびCarl Zeiss LSM 710 NLO共焦点顕微鏡を使用してイメージングを行った。免疫蛍光染色を数え上げるために、Definiens Tissue Studio（Definiens Inc.）を用いてデジタルスライドを解析した。DAPI陽性細胞を含む免疫蛍光の数え上げを、染色ごとにスコア化した。生検ごとに、スライド上に存在する異なる領域（組織の独立した区域）について数え上げを行った（1〜5領域／生検標本）。領域ごとに、陽性染色細胞の数をDAPI陽性細胞の総数で除することによって、所与のタンパク質についての陽性染色細胞のパーセンテージを算出した。lme4 Rパッケージを介した二項混合効果モデルを使用して、各領域で染色された全細胞を重みとして使用し、そして、スライド番号を変量効果として調整して、進行性／持続性生検標本と退行性生検標本との間で各領域における所与のタンパク質について陽性染色された細胞のパーセンテージの違いを評価した。増殖性サブタイプからのサンプル全体にわたって、そして、生検標本の転帰（進行性／持続性対退行性）がモジュール9のGSVAスコアと一致した（0未満のスコアは進行／持続と関連し、0超のスコアは退行と関連する）増殖性サブタイプからのサンプル全体にわたって、モデルを使用した。また、細胞が上皮を覆っており、かつ上皮内に埋め込まれている特徴的なCD8 T細胞の局在パターンを有することについて、陽性または陰性のいずれかとして、各領域を定性的にスコア付けした。
【０２５４】
参照文献
2021536434.tif 000110
2021536434.tif 000111
2021536434.tif 000112
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2021536434.tif 000114
2021536434.tif 000115
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【０２５５】
（表１）発見コホートおよび検証コホートの両方における対象に対する人口統計学的および臨床的アノテーション。カテゴリー変数にはフィッシャーの直接検定を、そして、連続変数にはスチューデントのT検定を用いて、発見コホートと検証コホートの間の統計検定を実施した。カテゴリー変数についてはパーセンテージを報告し、連続変数については平均および標準偏差を報告する。
2021536434.tif 000117
【０２５６】
（表２）発見コホートおよび検証コホートの両方におけるサンプルに対する臨床的アノテーション。生検標本またはブラシ標本のいずれか内で発見コホートと検証コホートとの間の統計検定をフィッシャーの直接検定を用いて実施し、パーセンテージを報告する。
2021536434.tif 000118
【０２５７】
（表３）発見コホートにおける分子サブタイプの特徴の要約。各分子サブタイプについて、9個の遺伝子モジュールのそれぞれ、臨床的特徴、カノニカルな細胞型の上皮および白血球細胞の遺伝子マーカー、経路、ならびにとの有意な関連性が報告される。
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【０２５８】
実施例2：実施例1の補足材料
材料および方法
N-ニトロソトリス-(2-クロロエチル)ウレア（NTCU）マウスサンプルの採取およびライブラリの調製
本発明者らは、以前、NTCUで処理したSWR/JマウスおよびA/Jマウスから、Acrutus Pixcell（商標）IIを用いて単離した40個の新鮮な凍結全肺切片（カール）およびレーザーマイクロダイセクション（LCM）された組織からRNAを収集し、バンク化しておいた。RPCCでIACUCに承認されたプロトコルに従って実施した研究の一部として、15または25umol NTCU（15または25週間にわたって40mM NTCUを25uL）でマウスを局所的に処理した。サンプルは、以下の例を含む：正常（SWR/J n＝3LCMおよび3カールならびにA/J n＝2LCMおよび1カール）、化生／軽度の異形成（SWR/J n＝5LCMおよび2カール）、中等度の異形成（SWR/J n＝7LCMおよび4カールならびにA/J n＝2LCMおよび1カール）、および重度の異形成（SWR/J n＝3 LCMおよび2カール）、ならびに上皮内癌／LUSC（A/J n＝2 LCMおよび2カール）。製造業者のプロトコルに従って、Qiagen mi-RNAeasy キットを用いてサンプルを抽出した。Illumina（登録商標）TruSeq（登録商標）RNA Sample Preparation Kit v2を使用して、全RNAサンプルからシーケンシングライブラリを調製する。各サンプルをIllumina（登録商標）HiSeq 2500で1レーンあたり5つのシーケンシングを行って、シングルエンドの50ヌクレオチドリードを生成した。
2021536434.tif 000120
【０２５９】
NTCUマウスのデータ処理
Illumina CASAVA 1.8.2を用いてデマルチプレックスおよびFASTQファイルの作成を行った。Trimmomaticを使用して、アダプター配列をトリミングしたことに加えて、以下のパラメータを使用して質の悪いリードをトリミングした：ILLUMINACLIP:TruSeq3-SE.fa:2:30:10、LEADING:20、TRAILING:20、SLIDINGWINDOW:4:20、およびMINLEN:20。トリミング後、全てのサンプルで99％を超えるリードが保持された。その後、mm9および2-pass STAR（44）アライメントを用いて、サンプルをアライメントした。Ensemblアノテーションを用い、RSEM（45）を用いて、遺伝子および転写物のレベルカウントを算出した。品質メトリクスは、STARおよびRSeQCによって算出した（46）。最初に、（総リード数と比較して）一意的にアラインメントされたリードの割合が15％未満であることに基づいて、15個のサンプルを削除した。その後のサンプルおよび遺伝子のフィルタリングは、以下の通り各セットについて別々に実施した：まず、EdgeR（48）を使用して、正規化されたデータ（コンピュータで計算したTMM、M値のトリム平均、および100万あたりのlog2カウントを用いて正規化したライブラリサイズ）をコンピュータで計算し、そして、四分位数間範囲がゼロに等しいか、またはサンプル全体にわたる合計が1以下である遺伝子を除外した。1）フィルタリングした全ての遺伝子にわたって算出された他の全てのサンプルとの平均ピアソン相関、2）フィルタリングした遺伝子発現マトリックスを使用して算出された第1または第2の主成分、3）転写物完全性数（TIN、RSeQCによってコンピュータで計算）について、平均値から標準偏差2つ分よりも大きな値に基づいてサンプルを除外した。サンプルをフィルタリングした後、高品質のサンプルの最終セットについて上記の通り遺伝子フィルタリングをコンピュータで再計算した。データは、アクセッションGSE111091を用いて、NCBIのGene Expression Omnibusから入手可能である。
【０２６０】
細胞型および増殖マーカーの免疫蛍光による定量化
基底および繊毛の細胞型マーカー（KRT5およびTUB1A1）ならびに増殖性マーカー（KI67）を、DAPI染色に関して生検内の全ての上皮について手作業で数え上げ、生検標本あたり最低500個の細胞を数えた。生検標本ごとに、スライド上に存在する異なる領域（組織の独立した区域）について数え上げを行った（1〜4領域／生検標本）。数え上げられた各領域におけるマーカーごとに、陽性に染色された細胞のパーセントを算出した。lme4 Rパッケージを介した二項混合効果モデルを使用して、各領域で染色された全細胞を重みとして使用し、患者について変量効果として調整して、分子サブタイプ間で各領域における所与のタンパク質について陽性染色された細胞のパーセンテージの違いを評価した。
【０２６１】
TCGA SCC腫瘍のデータ処理
476個のLUSC腫瘍からの20,500個の遺伝子全体にわたる100万あたりのlog2転写物のデータを、Campbell（10）らから得た。四分位数間範囲が0に等しいか、またはサンプル全体にわたる合計が1以下であった遺伝子を除外した。以下の基準のうちの1超について、平均値から標準偏差2つ分よりも大きな値に基づいて、サンプルを除外した：1）フィルタリングした全ての遺伝子にわたって算出された他の全てのサンプルとの平均ピアソン相関、2）フィルタリングした遺伝子発現マトリックスを使用して算出された第1または第2の主成分、3）転写物完全性数（TIN、RSeQCによってコンピュータで計算）。サンプルをフィルタリングした後、高品質のサンプルの最終セットについて上記の通り（n＝17,887遺伝子）遺伝子フィルタリングをコンピュータで再計算した（n＝471腫瘍）。
【０２６２】
（表５）遺伝子モジュールに多く含まれる経路を表す。各遺伝子モジュールに関連する選択された経路についてのEnrichrの結果（FDR＜0.05）。
2021536434.tif 000121
【０２６３】
（表６）発見コホート（DC）および検証コホート（VC）内の分子サブタイプと臨床的および生物学的特徴との関連。発見および検証のコホート内での統計検定は、フィッシャー直接検定を用いて行った。
2021536434.tif 000122
【０２６４】
（表７）遺伝子モジュールごとの各分子サブタイプおよびコホート（DCおよびVC）内の進行／持続と退行との間の統計的関連性。0.05未満のP値を報告する。ns＝非有意、N/A＝解析を行うのに十分なサンプルが各群に存在しない。分子サブタイプについては、N＝正常、S＝分泌性、I＝炎症性、およびP＝増殖性。
2021536434.tif 000123
【０２６５】
（表８）気管支内生検標本が得られた肺の部位。各部位について部位のコード、名称、および説明を報告する。
2021536434.tif 000124
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【０２６６】
（表９）免疫蛍光研究で使用した抗体
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【０２６７】
（表１０）対象ごとのゲノム喫煙状況の経時変化。既に公開されている喫煙関連遺伝子シグネチャ6（詳細については方法を参照のこと）に基づいて、各時点における対象ごとの喫煙状況をコンピュータで計算した。列は、患者ごとにサンプリングされた全ての時点にわたる喫煙状況を示す。→記号は、経時的な喫煙状況の変化を示す。発見コホートと検証コホートとの間で喫煙状況分類における対象の分布間には、両側フィッシャー直接検定による統計的差は存在しない（p＝0.90）。ソースデータをソースデータファイルとして提供する。
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【０２６８】
（表１２）分子サブタイプの肺がんの既往歴との関連性。肺がん（LC）の既往歴を以下の通り分類した：既往歴無し（LC病歴無し）、肺扁平上皮細胞癌腫を含むLCの既往歴（LC病歴-LUSC）、および肺扁平上皮細胞癌腫を含まないLCの既往歴（LC病歴-その他）。両側フィッシャー直接検定を用いて、発見および検証のコホート内での統計検定を行った。
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【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【国際調査報告】
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