(57)【要約】  本発明は、グラフェンナノ構造体を有効成分として含む抗炎症用組成物に関する。具体的に、前記組成物を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物、炎症性疾患の予防又は改善用化粧品組成物又は飼料組成物、及び前記組成物をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、炎症性疾患を治療する方法に関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラフェンナノ構造体（ｎａｎｏ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有効成分として含む抗炎症用組成物。
【請求項２】
前記グラフェンナノ構造体が、ナノサイズの酸化グラフェン（ｎａｎｏ−ｓｉｚｅｄ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ；ｎａｎｏ−ＧＯ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ナノサイズの酸化グラフェンが、１２ｎｍ以下の厚さ及び１５〜５０ｎｍの平均直径を有するものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記グラフェンナノ構造体が、グラフェン量子ドット（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ；ＧＱＤ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記グラフェン量子ドットが、１〜１０ｎｍの平均直径及び０．５〜３ｎｍの厚さを有する粒子である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、前炎症性サイトカインの発現又は分泌阻害、ミエロペルオキシダーゼ活性阻害、Ｔｈ１分化又は反応抑制、Ｔ細胞活性促進、Ｍ２ｂ大食細胞上向き調節又はこれらの組合せにより炎症を抑制するか又は減少させるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記炎症性疾患が、紅斑、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、第１型糖尿、ループス、慢性疲労症候群、線維筋肉痛、甲状腺機能低下症と亢進症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ショーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、子宮内膜症、乾癬、白斑症、全身性強皮症又は潰瘍性大腸炎である、 請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記炎症性疾患が、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）及び腸ベーチェット病（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）よりなる群から選ばれる炎症性腸疾患である、 請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記炎症性腸疾患が、結腸の短縮（ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ）、脱毛、活動性低下、体重減少、出血指数の上昇又は排便指数の上昇の症状を伴うものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、炎症性疾患の予防又は改善用化粧品組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、炎症性疾患の予防又は改善用食品添加物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、炎症性疾患の予防又は改善用飼料組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、炎症性疾患を予防又は治療する方法。
【請求項１５】
前記組成物の投与により短くなった結腸、脱毛、低下した活動性、減少した体重、上昇された出血指数又は上昇された排便指数を回復させるものである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラフェンナノ構造体（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｎａｎｏ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有効成分として含む抗炎症用組成物に関する。具体的に、前記組成物を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物、炎症性疾患の予防又は改善用化粧品組成物又は飼料組成物、及び前記組成物を用いた炎症性疾患を予防又は治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）は、組織の損傷、外部の刺激又は多様な感染源に対する生体組織の防御反応であって、血管と体液内の各種炎症媒介因子と多様な免疫細胞の有機的相互作用によって発生する複合的な病理現象である。一例として、細胞に外部刺激が加えられると、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）又はＩＬ−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）などの前炎症性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が増加し、前記サイトカインは、ｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｓｔｈａｓｅ）又はＣＯＸ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ−２）などの遺伝子の発現を刺激することによって、ＮＯ（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）又はＰＧＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２）を生成させて、炎症反応が起こることになる。前記免疫反応と関連したＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α又はＩＦＮ−αなどのサイトカインは、大食細胞により合成され分泌され、サイトカインの種類によって大食細胞による発現が上向き調節されたり、又は下向き調節され得る（Ｃａｖａｉｌｌｏｎ  ＪＭ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．１９９４；４８（１０）：４４５−５３）。
【０００３】
ＮＯは、体内防御機能、信号伝達機能、神経毒性、血管拡張などの多様な生理活性機能を有しているが、炎症状態でｉＮＯＳにより過剰生成されたＮＯは、血管透過性、浮腫、組織の損傷、遺伝子変移及び神経損傷などを誘発する。これにより、前記ＮＯの過度な生成を抑制する物質を開発するための多くの研究が行われており、多様な天然物に由来したコーヒー酸、クロロゲン酸、ケイ皮酸、ｐ−クマル酸、ヘスペリジン、ロスマリン酸などのフェニルプロパノイド化合物が皮膚炎症を抑制することができることが報告されたことがある（日本国特許公開第２０００−３１９１５４号）。しかしながら、天然物由来成分に関する研究は、まだ初期段階に過ぎず、より多様な成分の開発が要求される。
【０００４】
多様な炎症性疾患のうちクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）と潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）と代表される炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＩＢＤ）は、胃腸管を侵す原因が正確に明らかにされていない慢性的な炎症性疾患を意味する。大きく、前記クローン病と潰瘍性大腸炎の二種類に区分されるが、腸ベーチェット病（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含ませることがある。黒人や東洋人よりは白人やユダヤ人において多く発見されるが、東洋人において発病する場合が次第に増加している。好発年齢は、１５〜３５才の間であり、症状は、潰瘍性大腸炎の場合、下痢（血便及び粘液便）、渋り腹、腹痛、腹部圧痛、体重減少などが主に現れ、クローン病の場合には、体重減少、右下腹部痛、肛門周囲の異常、腹部圧痛などが現れる。腸ベーチェット病は、これらと類似に、下痢と腹痛などの症状を示し、それ以外のベーチェット病に準ずる症状を伴う。
【０００５】
内科的治療が原則であるが、これが難しいか又は合併症が発病した場合には、外科的治療を行う。薬物治療を行ってはいるが、原因が明確に明らかにされていないので、これだと言える治療剤が開発されず、一般的な抗炎症剤、副腎皮質ホルモン剤、免疫抑制剤、抗生剤及びその他薬品を適切に併用して複合的に使用する傾向にある。炎症の種類、程度、部位、合併症などによって薬品の種類と量を調節して使用する。しかしながら、このような複合療法は、副作用が発生する可能性が高いという短所がある。したがって、効果的な炎症性腸疾患の治療のための治療剤の開発は、非常に重要である。
【０００６】
これより、本発明者らは、生物医学的治療剤としての活性を有するグラフェン誘導体を発掘するために鋭意研究に努力した結果、グラフェンナノ構造体、特に粒子サイズ及び形態が調節されたナノサイズのグラフェンが、炎症性因子の発現及び／又は炎症性サイトカインの分泌を抑制し、大食細胞の特定の亜類型への分化を誘導する抗炎症活性を有することを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、グラフェンナノ構造体（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｎａｎｏ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有効成分として含む抗炎症用組成物を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記組成物をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、炎症性疾患を予防又は治療する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するための一様態として、本発明は、グラフェンナノ構造体を有効成分として含む抗炎症用組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、グラフェンナノ構造体、特にその粒子サイズ及び形態が調節されたナノサイズのグラフェンが、炎症性因子の発現及び／又は炎症性サイトカインの分泌を抑制し、大食細胞の特定の亜類型への分化を誘導して抗炎効果を示し、動物実験を通じて特に炎症性腸疾患を効果的に予防又は治療することができることを発見したことに基づく。
【００１１】
本発明において、グラフェンナノ構造体は、ナノサイズのグラフェン誘導体を指すものであって、ナノサイズの酸化グラフェン（ｎａｎｏ−ｓｉｚｅｄ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ；ｎａｎｏ−ＧＯ）、及びグラフェン量子ドット（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ；ＧＱＤ）を含む。
【００１２】
本発明の用語「グラフェン」とは、複数個の炭素原子が互いに共有結合で連結されて、ポリサイクリック芳香族分子を形成したことを意味するものであって、前記共有結合で連結された炭素原子は、基本反復単位として六員環を形成するが、五員環及び／又は七員環をさらに含むことも可能である。
【００１３】
本発明の用語「酸化グラフェン」とは、グラフェンオキサイド（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅｓ）とも呼ばれ、「ＧＯｓ」と略称され得る。グラフェン上にカルボキシル基、ヒドロキシ基、又はエポキシ基などの酸素原子を含有する官能基が結合された構造を含むことができるが、これに制限されない。
【００１４】
本発明の用語「ナノサイズの酸化グラフェン（ｎａｎｏ−ｓｉｚｅｄ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ；ｎａｎｏ−ＧＯ）」とは、ナノメートル水準のサイズを有する粒子の形態で製造される酸化グラフェンを指すものであって、グラフェン上にカルボキシル基、ヒドロキシ基、又はエポキシ基などの酸素原子を含有する官能基が結合された構造を含むことができるが、これに制限されないことがある。前記ナノサイズの酸化グラフェンは、１２ｎｍ以下の所定の厚さを有し、約１５〜５０ｎｍの平均直径を有する板状型の粒子を意味する。例えば、前記ナノサイズの酸化グラフェンは、酸化グラフェンに超音波を加えて（例えば、ｔｉｐ−ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎにより）製造することができるが、これに制限されない。例えば、前記ナノサイズの酸化グラフェンは、１５〜４５ｎｍ、１５〜２７ｎｍ、２５〜３５ｎｍ、３５〜４５ｎｍ又は２５〜４５ｎｍの平均直径を有することができる。ひいては、前記ナノ粒子は、５〜１２ｎｍ、３〜９ｎｍ、３〜７ｎｍ、５〜９ｎｍ，又は５〜７ｎｍの厚さを有する粒子でありうるが、これに制限されない。
【００１５】
本発明の用語「グラフェン量子ドット（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ；ＧＱＤ）」とは、ナノ−サイズ断片を有するグラフェンを意味するものであって、前記グラフェン量子ドットは、適切な加工を通じて製造される、数ｎｍ水準の横、縦及び高さを有するグラフェン粒子であり得、炭素繊維を熱酸化切断（ｔｈｅｒｍｏ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｕｔｔｉｎｇ）して獲得することができるが、その製造方法は、これに制限されない。例えば、前記グラフェン量子ドットは、１〜５ｎｍの平均直径及び０．５〜３ｎｍの厚さを有する粒子でありうるが、これに制限されない。例えば、前記グラフェン量子ドットは、１〜３ｎｍ又は３〜５ｎｍの平均直径を有しうる。ひいては、前記グラフェン量子ドットは、０．５〜２．５ｎｍ、０．５〜１．５ｎｍ、又は１．５〜２．５ｎｍの高さを有しうる。
【００１６】
本発明の用語「抗炎症」とは、炎症を抑制したり減少させる作用を意味し、前記用語「炎症」は、生体組織が損傷を受けたとき、体内で起こる防御的反応であって、炎症性疾患を誘発する原因である。
【００１７】
本発明において、上記の抗炎症用組成物は、炎症を抑制したり減少させる活性を示すことによって、炎症性疾患の予防、治療又は改善に用いられる。
【００１８】
具体的に、本発明のグラフェンナノ構造体を含む前記組成物は、前炎症性サイトカインの発現又は分泌阻害、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＭＰＯ）活性阻害、Ｔｈ１増殖、分化又は反応抑制、抑制性Ｔ細胞活性促進又はＭ２ｂ大食細胞上向き調節することによって、炎症を抑制したり減少させることができる。
【００１９】
例えば、本発明の組成物を処理することによって、代表的な前炎症性サイトカインであるＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−６及び／又はＭＣＰ−１の後続サイトカインの分泌又は発現を減少させることができる。又は、ＭＰＯ活性を減少させることができ、これは、好中球の移動及び炎症を抑制することができることを示す。ひいては、腸炎で重要な役割をするものと知られたＴｈ１細胞への分化及び／又はその増殖を抑制し、これに特異的な遺伝子発現をも減少させることができる。ひいては、炎症反応中にＭ１大食細胞をＭ２タイプに転換することによって、炎症を解消することができる。特に、Ｍ２亜類型のうちＭ２ｂ大食細胞を上向き調節することによって、炎症性反応を弱めることができる。
【００２０】
前記「発現」は、遺伝子発現又はタンパク質発現を全部含む。
【００２１】
前記炎症性疾患は、炎症により引き起こされる疾患を意味するので、本発明の抗炎症組成物は、炎症性疾患の予防又は治療に用いられる。
【００２２】
前記炎症性疾患は、本発明の薬学組成物により症状が緩和、軽減、改善又は治療され得る限り、特にこれに制限されないが、具体的な例として、紅斑、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、第１型糖尿、ループス、慢性疲労症候群、線維筋肉痛、甲状腺機能低下症と亢進症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、多発性硬化症、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ショーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、白斑症、子宮内膜症、乾癬、白斑症、又は全身性強皮症でありうるが、これに制限されない。
【００２３】
具体的に、本発明によるグラフェンナノ構造体を含む薬学的組成物により治療可能な炎症性疾患は、炎症性腸疾患でありうる。前記炎症性腸疾患は、腸に発生する原因不明の慢性的な炎症を意味するものであって、通常、特発性炎症性腸疾患である潰瘍性大腸炎とクローン病を指すが、腸ベーチェット病も、これに含まれ得る。より広い意味としては、細菌性、ウイルス性、アメーバ性、結核性腸炎などの感染性腸炎と、虚血性腸疾患、放射線腸炎などすべての腸で発生する炎症性疾患を全部含むことができる。本発明の組成物は、前記広い意味の炎症性腸疾患、例えば、細菌性、ウイルス性、アメーバ性、結核性腸炎などの感染性腸炎と、虚血性腸疾患、放射線腸炎などすべての腸で発生する炎症性疾患の予防又は治療に制限なしに使用され得、好ましくは、クローン病、潰瘍性大腸炎及び腸ベーチェット病の予防又は治療に使用され得る。
【００２４】
前記炎症性腸疾患の症状は、具体的な疾患によって異なるが、一般的に、腹痛、下腹部不快感、結腸の短縮（ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ）、脱毛、活動性低下、体重減少、出血指数の上昇（出血）又は排便指数の上昇（下痢）の症状を示すことができる。同じ疾患であっても、病変の範囲や位置又は重症度によって異なる様相を示すことができる。
【００２５】
前記炎症性疾患の予防又は治療は、炎症性サイトカインＩＬ−２３又はＴＧＦ−βの分泌及び／又はこれと関連した遺伝子の発現増加を減少させることによって行われ得る。
【００２６】
前記ＩＬ−２３は、ヘテロ二量体のサイトカインであって、免疫反応で重要な役割をする。樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）及びその他免疫細胞で生産されるものであって、腸で耐性と免疫間の均衡に影響を与える主要な要素と見なされ、結腸で炎症を媒介することが確認された。前記ＴＧＦ−βは、多様な組織で合成される要素であって、ＴＧＦ−αと相乗的に作用する。胚芽発達、細胞分化、ホルモン分泌及び免疫機能に重要な役割をするものと知られている。特に炎症反応を誘発するものと知られている。
【００２７】
本発明の用語「予防」とは、前記組成物の投与により炎症性疾患を抑制又は遅延させるすべての行為を意味する。
【００２８】
本発明の用語「治療」とは、前記組成物の投与により炎症性疾患の症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００２９】
前記本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。本発明の用語「薬学的に許容可能な」とは、前記組成物に露出する細胞やヒトに毒性がない特性を示すことを意味する。前記担体は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤、基剤、賦形剤、潤滑剤など当業界に公知となったものであれば、制限なしに使用することができる。本発明の薬学的組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使用して調製される。典型的に、膜を通過した移動を容易にする使用可能な界面活性剤としては、ステロイドから誘導されたものであるが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド］（ＤＯＴＭＡ）などのカチオン性脂質、又はヘミこはく酸コレステリルなどがある。
【００３０】
前記目的を達成するための他の様態として、本発明は、前記薬学的組成物をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、炎症性疾患を予防又は治療する方法を提供する。
【００３１】
本発明において、用語「個体」とは、炎症性疾患が発病したり発病しうるヒトを含むすべての動物を意味し、本発明の薬学的組成物を個体に投与することによって、前記炎症性疾患を効果的に予防又は治療することができる。本発明の薬学的組成物は、既存の炎症性疾患治療剤と併用してして投与され得る。
【００３２】
本発明の用語「投与」とは、適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、目的組織に到達しうる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与され得る。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与され得るが、これに制限されない。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記組成物以外に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート、スクロース、又はラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製する。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。しかしながら、経口投与時に、ペプチドは、消化されやすいので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化することが好ましい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用され得る。坐剤の基剤としては、ウィテプソル、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。ペプチドの安定性や吸収性を増加させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどのカーボハイドレート、アスコルビン酸、グルタチオンなどの抗酸化剤、キレート物質、低分子タンパク質又は他の安定化剤を使用することができる。
【００３３】
また、本発明の薬学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動しうる任意の装置により投与されることもできる。好ましい投与方式及び製剤は、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などである。注射剤は、生理食塩液、リンゲル液などの水性溶剤、植物油、高級脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、アルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、グリセリンなど）などの非水性溶剤などを用いて製造することができ、変質防止のための安定化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなど）、乳化剤、ｐＨ調節のための緩衝剤、微生物の発育を阻止するための保存剤（例えば、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレソール、ベンジルアルコールなど）などの薬学的担体を含むことができる。
【００３４】
一方、本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。前記用語「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスクの割合で疾患を治療するのに十分であり、副作用を起こさないほどの量を意味し、有効用量水準は、患者の性別、年齢、体重、健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路、及び排出比率、治療期間、配合又は同時に使用される薬物を含む要素及びその他医学分野におけるよく知られた要素によって当業者により容易に決定され得る。一般的に、活性物質を約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与することができる。経口投与する場合、５０〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲が適合であり、１日に１回以上投与することができる。
【００３５】
本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次又は同時に投与され得る。そして、単一又は多重投与され得る。前記要素を全部考慮して副作用なしに最小の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定され得る。
【００３６】
また、本発明において、上記の抗炎症用組成物は、炎症性疾患の予防又は改善用化粧品組成物でありうる。
【００３７】
本発明の化粧品組成物は、総組成物の重量に対して本発明のグラフェンナノ構造体を０．０００１〜５０重量％で含むことができ、具体的に０．０１重量％〜１０重量％で含むことができるが、これに制限されない。前記範囲内で本発明の優れた効果を示す利点があり、組成物の剤形が安定化される利点がある。
【００３８】
前記本発明の化粧品組成物は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、パック、柔軟水、乳液、メイクアップベース、エッセンス、石鹸、液体洗浄料、入浴剤、サンスクリーンクリーム、サンオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチ及びスプレーよりなる群から選ばれる剤形で製造することができるが、これに制限されるものではない。
【００３９】
前記本発明の化粧品組成物は、一般皮膚化粧料に配合される化粧品学的に許容可能な担体を１種以上さらに含むことができ、通常の成分として、例えば油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを適切に配合することができるが、これに制限されるものではない。
【００４０】
前記本発明の化粧品組成物に含まれる化粧品学的に許容可能な担体は、化粧料組成物の剤形によって多様である。
【００４１】
本発明の剤形が軟膏、ペースト、クリーム又はジェルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などが利用され得るが、これに制限されるものではない。これらは、単独で使用されるか、２種以上混合されて使用され得る。
【００４２】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダーなどが用いられ、特にスプレーである場合には、さらに、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進剤を含むことができるが、これに制限されるものではない。これらは、単独で使用されたり、２種以上混合されて使用され得る。
【００４３】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤又は乳濁化剤などが用いられ、例えば水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイルなどが用いられ、特に、綿実油、ピーナッツ油、とうもろこし胚芽油、オリーブ油、ひまし油及びゴマ油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルが用いられるが、これに制限されるものではない。これらは、単独で使用されたり、２種以上混合されて使用され得る。
【００４４】
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリールアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガ又はトラカントなどが用いられるが、これに制限されるものではない。これらは、単独で使用されたり２種以上混合されて使用され得る。
【００４５】
本発明の剤形が石鹸である場合には、担体成分として脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質ヒドロリゼート(hydrolysate)、イセチオン酸、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物性油、グリセロール、糖などが用いられるが、これに制限されるものではない。これらは、単独で使用されたり２種以上混合されて使用され得る。
【００４６】
本発明の剤形が界面−活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシテート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性オイル、ラノリン誘導体又はエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられるが、これに制限されるものではない。これらは、単独で使用されたり２種以上混合されて使用され得る。
【００４７】
ひいては、本発明において、上記の抗炎症用組成物は、炎症性疾患の予防又は改善用食品添加物又は健康機能食品でありうる。本発明の組成物を食品添加物として使用する場合、前記グラフェンナノ構造体をそのまま添加したり他の食品又は食品成分と共に使用することができ、通常の方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康又は治療的処置）によって好適に決定され得る。
【００４８】
本発明の用語「健康機能食品」は、健康補助の目的で特定の成分を原料としたり、食品原料に入っている特定の成分を抽出、濃縮、精製、混合などの方法で製造、加工した食品を言い、前記成分により生体防御、生体リズムの調節、疾患の防止と回復など生体調節機能を生体に対して十分に発揮することができるように設計され加工された食品を言うものであって、前記健康食品用組成物は、疾患の予防及び疾患の回復などに関連した機能を行うことができる。
【００４９】
また、本発明の組成物が使用され得る健康食品の種類には制限がない。なお、本発明のペプチド又はその食品学的に許容可能な塩を活性成分として含む組成物は、当業者の選択によって健康機能食品に含有され得る適切なその他補助成分と公知の添加剤を混合して製造することができる。添加しうる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲み物、お茶、ドリンク剤、アルコール飲み物及びビタミン複合剤などがあり、本発明によるグラフェンナノ構造体を抽出物を主成分として製造した汁、お茶、ゼリー及びジュースなどに添加して製造することができる。
【００５０】
ひいては、本発明において、上記の抗炎症用組成物は、炎症性疾患の予防又は改善用飼料組成物でありうる。
【００５１】
本発明の用語「飼料」は、動物が食べたり、摂取したり、消化させるための、又はこれに適当な任意の天然又は人工規定食、一片食など又は前記一片食の成分であって、本発明のグラフェンナノ構造体を有効成分として含む飼料は、当業界における公知となった多様な形態の飼料で製造可能であり、具体的に、濃厚飼料、粗飼料及び／又は特殊飼料が含まれ得る。
【００５２】
本発明の飼料組成物に含まれるグラフェンナノ構造体の含量は、飼料の使用目的及び使用条件によって変わり、一例として、家畜飼料組成物の総重量に対して０．０１〜１００重量％、より具体的には、１〜８０重量％で含まれ得るが、これに制限されない。
【００５３】
また、他の一つの様態として、本発明は、炎症性疾患の予防又は治療のための前記グラフェンナノ構造体の用途を提供する。
【００５４】
また、他の一様態として、本発明は、炎症性疾患の予防又は治療に使用するための前記グラフェンナノ構造体を含む組成物を提供する。
【００５５】
また、他の一様態として、本発明は、炎症性疾患の予防又は治療のための薬剤の製造において前記グラフェンナノ構造体の用途を提供する。
【００５６】
前記グラフェンナノ構造体及び炎症性疾患に関する具体的な内容は、前記で説明した通りである。
【００５７】
本発明の組成物、治療方法、用途で言及された事項は、互いに矛盾しない限り、同一に適用される。
【発明の効果】
【００５８】
本発明による組成物は、ナノサイズのグラフェン誘導体、すなわちグラフェンナノ構造体を含むことによって、前炎症性サイトカインの分泌及び／又は発現を抑制し、炎症性反応に関与する細胞の分化を調節することによって、炎症性疾患、特に、炎症性腸疾患の治療に有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ナノ−ＧＯｓの合成方法及び特性を示す図である。（Ａ）は、本発明によるナノ−ＧＯｓの合成方法を概略的に示す。（Ｂ）は、本発明によるナノ−ＧＯｓの代表的なＴＥＭイメージとこれから算出した粒子サイズ分布を示す。（Ｃ）は、本発明によるナノ−ＧＯｓの代表的なＡＦＭイメージ及びラインプロファイル分析結果を示す。（Ｄ）は、本発明によるナノ−ＧＯｓの代表的なラマンスペクトルを示す。
【図２】図２は、グラフェン量子ドット（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ；ＧＱＤｓ）の合成方法及び特性を示す図である。（Ａ）は、本発明によるＧＱＤｓの合成方法を概略的に示す。（Ｂ）は、本発明によるＧＱＤｓの代表的なＴＥＭイメージとこれから算出した粒子サイズ分布を示す。（Ｃ）は、本発明によるＧＱＤｓの代表的なＡＦＭイメージ及びラインプロファイル分析結果を示す。（Ｄ）は、本発明によるＧＱＤｓの代表的なラマンスペクトルを示す。
【図３】図３は、ナノ−ＧＯｓの腹腔内注射によるＤＳＳ−誘導大腸炎マウスでの保護効果を示す図である。（Ａ〜Ｄ）は、マウスに３％ＤＳＳ含有飲料水を７日間投与して大腸炎を誘導したマウスに対する実験結果を示す。ＤＳＳ投与後１日目にナノ−ＧＯｓを腹腔内投与した（３００μｇ／ｈｅａｄ）。臨床評価のために（Ａ）生存率、（Ｂ）体重減少率及び（Ｃ）大腸炎重症度に対する疾患活性指数（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ；ＤＡＩ）をモニターした。（Ｄ）には、腸の損傷を決定するために、ＤＳＳで大腸炎誘導後１０日に致死したマウスから摘出した結腸の形態及び長さを示した。ｎ＝１７〜２０マウス／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、平均±ＳＥＭで示した。
【図４】図４は、ＧＱＤｓの腹腔内注射によるＤＳＳ−誘導大腸炎マウスでの保護効果を示す図である。（Ａ〜Ｄ）は、マウスに３％ＤＳＳ含有飲料水を７日間投与して大腸炎を誘導したマウスに対する実験結果を示す。ＤＳＳ投与後１日目にＧＱＤｓを腹腔内投与した（３００μｇ／ｈｅａｄ）。臨床評価のために（Ａ）生存率、（Ｂ）体重減少率及び（Ｃ）大腸炎重症度に対する疾患活性指数（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ；ＤＡＩ）をモニターした。（Ｄ）には、腸の損傷を決定するために、ＤＳＳで大腸炎誘導後１０日に致死したマウスから摘出した結腸の形態及び長さを示した。ｎ＝１７〜２０マウス／群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、平均±ＳＥＭで示した。
【図５】図５は、腹腔（ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｃａｖｉｔｙ）でナノ−ＧＯｓの蓄積を示す図である。ＤＳＳで大腸炎誘導及びナノ−ＧＯｓ投与後１４日にマウスを致死した。ナノ−ＧＯｓは、脾臓及び結腸近所で観察された。
【図６】図６は、腹腔でＧＱＤｓの蓄積を示す図である。ＤＳＳで大腸炎誘導及びＧＱＤｓ投与後１４日にマウスを致死した。ＧＱＤｓは、脾臓及び結腸近所で観察された。
【図７】図７は、ＤＳＳ誘導後、マウスでナノ−ＧＯｓによる結腸及び全身炎症減少効果を示す図である。ＤＳＳで大腸癌誘導後、ナノ−ＧＯｓを腹腔内投与したマウスを１０日目に致死させて実験に使用した。（Ａ）の左側は、結腸断面の代表的なＨ＆Ｅ染色されたイメージを示し、右側は、リンパ球浸潤（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）及び腸の損傷により行われた組織病理学的評価結果を示す。スケールバー＝１ｍｍ（上端）及び５００μｍ（下端）。（Ｂ）の左側は、線維化を評価するための結腸のマッソントリクローム染色結果を、右側は、線維症領域（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ａｒｅａ）の定量的分析結果を示す。スケールバー＝１ｍｍ（上端）及び５００μｍ（下端）。大腸炎マウスから血清を収集してサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）分析を利用して表示したサイトカインの分泌水準を測定して（Ｃ）に示した。（Ｄ）は、結腸組織で測定したミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を示す。
【図８】図８は、ＤＳＳ誘導後、マウスでＧＱＤｓによる結腸及び全身炎症減少効果を示す図である。ＤＳＳで大腸癌誘導後、ＧＱＤｓを腹腔内投与したマウスを１０日目に致死させて実験に使用した。（Ａ）の左側は、結腸断面の代表的なＨ＆Ｅ染色されたイメージを示し、右側は、リンパ球浸潤及び腸の損傷により行われた組織病理学的評価結果を示す。スケールバー＝１ｍｍ（上端）及び５００μｍ（下端）。（Ｂ）の左側は、線維化を評価するための結腸のマッソントリクローム染色結果を、右側は、線維症領域（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ａｒｅａ）の定量的分析結果を示す。スケールバー＝１ｍｍ（上端）及び５００μｍ（下端）。大腸炎マウスから血清を収集してサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）分析を利用して表示したサイトカインの分泌水準を測定して（Ｃ）に示した。（Ｄ）は、結腸組織で測定したミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を示す。
【図９】図９は、大腸炎誘導後、ナノ−ＧＯｓによる結腸組織のＣＢＡ分析結果を示す図である。ＣＢＡ分析を行って結腸組織で表示したサイトカインの分泌水準を測定した。
【図１０】図１０は、ナノ−ＧＯｓの最適試験管内濃度を決定するための実験結果を示す図である。（Ａ）の左側は、ヒト臍帯血（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ；ｈＵＣＢ）から分離して表示した濃度のナノ−ＧＯｓ存在下にコンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ）により活性化した単核球細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ；ＭＮＣｓ）を、右側は、ｈＵＣＢから精製し表示した濃度のナノ−ＧＯｓ存在下に培養したＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。（Ｂ及びＣ）は、２０μｇ／ｍｌのＧＯｓを２日間Ｔｈ１細胞に添加して得た結果であって、（Ｂ）は、ＢｒｄＵアッセイによる増殖を、（Ｃ）は、各群からのＴｈ１細胞の代表的なイメージを示す。
【図１１】図１１は、ＧＱＤｓの最適試験管内濃度を決定するための実験結果を示す図である。（Ａ）の左側は、ヒト臍帯血（ｈＵＣＢ）から分離して表示した濃度のＧＱＤｓ存在下にコンカナバリンＡにより活性化した単核球細胞（ＭＮＣｓ）を、右側は、ｈＵＣＢから精製し表示した濃度のＧＱＤｓ存在下に培養したＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。（Ｂ及びＣ）は、２０μｇ／ｍｌのＧＱＤｓを２日間Ｔｈ１細胞に添加して得た結果であって、（Ｂ）は、ＢｒｄＵアッセイによる増殖を、（Ｃ）は、各群からのＴｈ１細胞の代表的なイメージを示す。
【図１２】図１２は、ナノ−ＧＯｓのＴｈ１分化した細胞の活性に対する抑制効果を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞をｈＵＣＢから分離してナノ−ＧＯｓ存在下に組み換えＩＬ−１２及びＩＦＮ−γと組合せで抗−ＣＤ３及びＣＤ２８ビーズを使用してＴｈ１細胞への分化を誘導した。（Ａ）は、ビオチン標識されたナノ−ＧＯｓ処理してＴｈ１分化した細胞での局所化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す。ビオチン標識されたナノ−ＧＯｓを検出するために抗ＧＦＰ−ビオチンを使用した。右側は、ナノ−ＧＯｓ処理されたＴｈ１細胞のＺ−スタックイメージを示す。スケールバー＝１０μｍ。（Ｂ）は、ｈＵＣＢから分離してナノ−ＧＯｓと共にコンカナバリンＡで刺激したＭＮＣｓを示す。ＭＮＣｓを２日間培養し、ＢｒｄＵアッセイで測定した。（Ｃ）は、ナノ−ＧＯｓ存在下に２日間培養されたＴｈ１細胞の増殖をＢｒｄＵアッセイで評価した結果である。（Ｄ）は、Ｔｈ１細胞の細胞死滅をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ細胞死滅検出キットで分析した結果である。（Ｅ）は、Ｐ．Ｉ．（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）染色を利用してＴｈ１細胞で行った細胞周期分析結果である。（Ｆ）は、ＩＦＮ−γ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率を流動細胞分析法で分析した結果である。（Ｇ）は、表示したＴｈ１特異的マーカーに対する各群Ｔｈ１細胞のｍＲＮＡ発現を確認した結果である。（Ｈ）は、ＣＢＡ分析によりＴｈ１細胞上澄み液中の標識したＴｈ１特異的サイトカインを分析した結果である。
【図１３】図１３は、ＧＱＤｓのＴｈ１分化した細胞の活性に対する抑制効果を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞をｈＵＣＢから分離してＧＱＤｓ存在下に組み換えＩＬ−１２及びＩＦＮ−γと組合せで抗−ＣＤ３及びＣＤ２８ビーズを使用してＴｈ１細胞への分化を誘導した。（Ａ）は、ビオチン標識されたＧＱＤｓ処理してＴｈ１分化した細胞での局所化を示す。ビオチン標識されたＧＱＤｓを検出するために抗ＧＦＰ−ビオチンを使用した。右側は、ＧＱＤｓ処理されたＴｈ１細胞のＺ−スタックイメージを示す。スケールバー＝１０μｍ。（Ｂ）は、ｈＵＣＢから分離してＧＱＤｓと共にコンカナバリンＡで刺激したＭＮＣｓを示す。ＭＮＣｓを２日間培養し、ＢｒｄＵアッセイで測定した。（Ｃ）は、ＧＱＤｓ存在下に２日間培養されたＴｈ１細胞の増殖をＢｒｄＵアッセイで評価した結果である。（Ｄ）は、Ｔｈ１細胞の細胞死滅をＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ細胞死滅検出キットで分析した結果である。（Ｅ）は、Ｐ．Ｉ．（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）染色を利用してＴｈ１細胞で行った細胞周期分析結果である。（Ｆ）は、ＩＦＮ−γ発現ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率を流動細胞分析法で分析した結果である。（Ｇ）は、標識したＴｈ１特異的マーカーに対する各群Ｔｈ１細胞のｍＲＮＡ発現を確認した結果である。（Ｈ）は、ＣＢＡ分析によりＴｈ１細胞上澄み液中の標識したＴｈ１特異的サイトカインを分析した結果である。
【図１４】図１４は、生体内ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞比率のナノ−ＧＯｓによる間接的な増加を示す図である。ナノ−ＧＯｓ投与したマウスを１５日目に致死させて、その後、生体外実験のために結腸と脾臓を収集した。結果は、各群当たり５〜６匹のマウスから取得した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞の（Ａ）結腸浸潤及び（Ｂ）脾臓浸潤を流動細胞分析法で測定した。（Ｃ）は、ＦｏｘＰ３（緑色）に対する免疫染色により結腸内で観察される調節Ｔ細胞を示す、スケールバー＝５０μｍ。ＦｏｘＰ３＋細胞を▼で表示した。結腸溶解物のＩＬ−１０発現を（Ｄ）ウェスタンブロットと（Ｅ）ＣＢＡ分析で確認した。（Ｆ）は、結腸でＴＧＦ−β１の分泌水準をＥＬＩＳＡで分析した結果を示す。（Ｇ）は、流動細胞分析法によるＴｒｅｇ細胞の偏向化及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞を分析した結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、平均±ＳＥＭで示した。
【図１５】図１５は、生体内ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞比率のＧＱＤｓによる間接的な増加を示す図である。ＧＱＤｓ投与したマウスを１５日目に致死させて、その後、生体外実験のために結腸と脾臓を収集した。結果は、各群当たり５〜６匹のマウスから取得した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋調節Ｔ細胞の（Ａ）結腸浸潤及び（Ｂ）脾臓浸潤を流動細胞分析法で測定した。（Ｃ）は、ＦｏｘＰ３（緑色）に対する免疫染色により結腸内で観察される調節Ｔ細胞を示す、スケールバー＝５０μｍ。ＦｏｘＰ３＋細胞を▼で表示した。結腸溶解物のＩＬ−１０発現を（Ｄ）ウェスタンブロットと（Ｅ）ＣＢＡ分析で確認した。（Ｆ）は、結腸でＴＧＦ−β１の分泌水準をＥＬＩＳＡで分析した結果を示す。（Ｇ）は、流動細胞分析法によるＴｒｅｇ細胞の偏向化及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞を分析した結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、平均±ＳＥＭで示した。
【図１６】図１６は、Ｍ１大食細胞の選択的に活性化したＭ２類型細胞への転換でナノ−ＧＯｓの役割を示す図である。ＣＤ１４＋細胞をｈＵＣＢから分離してナノ−ＧＯｓ存在下に培養した。（Ａ）は、ＣＤ１４＋大食細胞類似細胞をビオチン標識されたナノ−ＧＯｓで処理して局部化を観察した結果である。右側は、ナノ−ＧＯｓ処理されたＣＤ１４＋細胞のＺ−スタックイメージである。スケールバー＝１０μｍ。分離したＣＤ１４＋細胞をナノ−ＧＯｓ存在下に類型−特異的誘導サイトカイン（ｉｎｄｕｃｅｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）でＭ０，Ｍ１及びＭ２類型細胞に偏向化した。培養７日後、（Ｂ）は、ＣＣＫ−８アッセイにより細胞の増殖を確認した。類型−特異的細胞表面ＣＤマーカーを（Ｃ）流動細胞分析法と（Ｄ）免疫細胞化学法で分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、平均±ＳＥＭで示した。
【図１７】図１７は、Ｍ１大食細胞の選択的に活性化したＭ２類型細胞への転換でＧＱＤｓの役割を示す図である。ＣＤ１４＋細胞をｈＵＣＢから分離してＧＱＤｓ存在下に培養した。（Ａ）は、ＣＤ１４＋大食細胞類似細胞をビオチン標識されたＧＱＤｓで処理して局部化を観察した結果である。右側は、ＧＱＤｓ処理されたＣＤ１４＋細胞のＺ−スタックイメージである。スケールバー＝１０μｍ。分離したＣＤ１４＋細胞をＧＱＤｓ存在下に類型−特異的誘導サイトカインでＭ０、Ｍ１及びＭ２類型細胞に偏向化した。培養７日後、（Ｂ）は、ＣＣＫ−８アッセイにより細胞の増殖を確認した。類型−特異的細胞表面ＣＤマーカーを（Ｃ）流動細胞分析法と（Ｄ）免疫細胞化学法で分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、平均±ＳＥＭで示した。
【図１８】図１８は、ナノ−ＧＯｓによる大食細胞の分化能力はもちろん、細胞形態及び生存率変化を示す図である。（Ａ）の上端は、ナノ−ＧＯｓと共に培養したＲａｗ２６４．７細胞の位相差（ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ）イメージを示す。スケールバー＝１００μｍ。下端は、ＭＴＴアッセイで決定した細胞生存率を示す。分離したＣＤ１４＋細胞をナノ−ＧＯｓ存在下に類型−特異的誘導サイトカインでＭ０、Ｍ１及びＭ２類型細胞に偏向化した。（Ｂ）は、位相差イメージ（スケールバー＝２００μｍ）を、（Ｃ）は、流動細胞分析法によるドットプロットイメージを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、平均±ＳＥＭで示した。
【図１９】図１９は、ＧＱＤｓ媒介されたＭ２偏向化された細胞のうちＭ２ｂ大食細胞が主な亜類型であることを示す図である。分離したＣＤ１４＋細胞をＧＭ−ＣＳＦと共に２日間培養し、次の５日間、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳと培養してＭ１類型大食細胞に分化させた。７日間培養した後、細胞と培養された培地を回収してさらに分析した。（Ａ）は、流動細胞分析法で確認したＣＤ１６３の発現を示す。（Ｂ）は、ＣＢＡ分析法で測定したＴＮＦ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−６分泌水準を示す。（Ｃ）は、Ｍ１及びＭ２類型−特異的遺伝子発現をｑＲＴ−ＰＣＲで分析した結果である。
【図２０】図２０は、ナノ−ＧＯｓ媒介されたＭ２偏向化された細胞のうちＭ２ｂ大食細胞が主な亜類型であることを示す図である。分離したＣＤ１４＋細胞をＧＭ−ＣＳＦと共に２日間培養し、次の５日間、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳと培養してＭ１類型大食細胞に分化させた。７日間培養した後、細胞と培養された培地を回収してさらに分析した。（Ａ）は、流動細胞分析法で確認したＣＤ１６３の発現を示す。（Ｂ）は、ＣＢＡ分析法で測定したＴＮＦ、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−６分泌水準を示す。（Ｃ）は、Ｍ１及びＭ２類型−特異的遺伝子発現をｑＲＴ−ＰＣＲで分析した結果である。Ｍ２亜類型偏向化のために、ＣＤ１４＋細胞をＭ−ＣＳＦと共に２日間培養し、特異的サイトカイン組合せ（Ｍ２ａ、ＩＬ−４及びＩＬ−１３；Ｍ２ｂ、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、ＩＬ−１β及びＬＰＳ；Ｍ２ｃ、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β１）と共に次の５日間培養した。（Ｄ）は、Ｍ２亜類型特異的ＣＤマーカーの発現を流動細胞分析法で検出した結果を示す。（Ｅ）はＣＢＡ分析法により測定したＴＮＦ及びＩＬ−６分泌水準を示す。（Ｆ）は、ＩＬ−１β及びＩＬ−１０の遺伝子発現をｑＲＴ−ＰＣＲで確認した結果である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、平均±ＳＥＭで示した。
【図２１】図２１は、ナノ−ＧＯｓ処理に対するＭ２亜類型大食細胞の反応を示す図である。ＣＤ１４＋細胞をＭ−ＣＳＦと共に２日間培養し、特異的サイトカイン組合せと共に次の５日間培養した。（Ａ）は、流動細胞分析法によるドットプロットイメージを示す。（Ｂ）は、Ｍ２ａ亜類型特異的遺伝子発現をｑＲＴ−ＰＣＲで確認した結果である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果は、平均±ＳＥＭで示した。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下、実施例を通じて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。
【００６１】
製造例１：ナノサイズの酸化グラフェン（ＧＯ）の製造及びビオチン化
改善されたハマー方法（Ｈｕｍｍｅｒ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を通じて汚染されない（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）酸化グラフェン（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅｓ；ＧＯｓ）を合成した。ナノサイズのＧＯｓを製造するために、収得したＧＯｓの蒸留水溶液（３ｍｇ／ｍｌ）を３時間の間激しく超音波処理し（ｔｉｐ−ｓｏｎｉｃａｔｅｄ）、硝酸セルロース膜フィルター（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ、０．４５μｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で真空−濾過した。
【００６２】
また、ＥＤＣカップリングによりナノ−ＧＯｓをビオチン化した。まず、１０ｍｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（Ｎ−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ’−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＥＤＣ  ｒｅａｇｅｎｔ，Ｓｉｇｍａ）を１０ｍｌのナノ−ＧＯｓ溶液（３ｍｇ／ｍｌ）に添加して、末端のカルボキシル基（ｅｄｇｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ）をＥＤＣ試薬で置換した。３０分後、２０ｍｇのアミン−ＰＥＧ３−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を前記溶液に添加して２４時間の間反応させて、ナノ−ＧＯの活性化した末端とビオチンの反応性アミド基との間にアミド結合を形成するようにした。前記ナノサイズのＧＯｓ製造方法と同様に適切な透析及び濾過過程後、粉末の形態で最終生成物を収得した。
【００６３】
製造例２：グラフェン量子ドットの製造及びビオチン化
硫酸及び硝酸（ＳＡＭＣＨＵＮ化学社）の３：１混合溶液に８０℃で１日間反応させることによって、炭素繊維（ｃａｒｂｏｎ  ｆｉｂｅｒｓ，Ｃａｒｂｏｎ  Ｍａｋｅ，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）の熱酸化切断（ｔｈｅｒｍｏ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｕｔｔｉｎｇ）によりグラフェン量子ドット（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ；ＧＱＤｓ）を合成した。前記溶液を希釈し、ＭＷＣＯ  １ｋＤニトロセルロース膜（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で透析して、非常に小さい切れ（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）と余分の酸（ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ａｃｉｄ）を除去した後、無機膜フィルター（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ，Ｗｈａｔｍａｎ−Ａｎｏｄｉｓｃ  ４７，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で真空−濾過した。凍結乾燥して、最終生成物を粉末の形態で収得した。
【００６４】
また、前記製造例１のナノサイズの酸化グラフェンと同じ方法でＧＱＤｓをビオチン化し、適切な透析及び濾過過程後、粉末の形態で最終生成物を収得した。
【００６５】
実験例１：ＴＥＭイメージング
３００メッシュレース型炭素（ｌａｃｅｙ  ｃａｒｂｏｎ）がコーティングされた銅格子（ｃｏｐｐｅｒ  ｇｒｉｄｓ）（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）に前記製造例によって準備した各試料を分散させた溶液（１０μｇ／ｍｌ）を３０分間吸着させた。イメージングに先立って、前記格子を数滴の蒸留水で洗浄し、デシケーターで完全に乾燥させた。このように準備した試料を高解像度透過電子顕微鏡（ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＨＲ−ＴＥＭ，ＪＥＭ−３０１０，ＪＥＯＬ  Ｌｔｄ．）で分析し、顕微鏡に結合させたＧａｔａｎデジタルカメラ（ＭＳＣ−７９４）でイメージを収集した。
【００６６】
実験例２：ラマン分光測定
ラマンスペクトル測定のために、前記製造例によって準備した粉末状態の生成物をＳｉＯ２基材上に準備した。５１４．５ｎｍ  Ａｒ励起レーザーを具備したＲｅｎｉｓｈａｗマイクロ−ラマン分光器でスペクトルを測定した。
【００６７】
実験例３：ＦＴ−ＩＲ分光測定
フーリエ−変換赤外線スペクトル（Ｆｏｕｒｉｅｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ（ＦＴ−ＩＲ）ｓｐｅｃｔｒａ）測定に先立って、粉末状態の試料をデシケーターで完全に乾燥して、所望しない酸素含有ピーク（ｏｘｙｇｅｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅａｋｓ）を排除した。通常のＫＢＲペレット法（Ｎｉｃｏｌｅｔ  ６７００，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でスペクトルを測定した。
【００６８】
実験例４：実験動物
すべての動物実験は、ソウル大学校動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ  Ｎｏ．ＳＮＵ−１７０５２３−４）の承認された指針に従って行った。６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｏｒｉｅｎｔｂｉｏ，Ｓｕｎｇｎａｍ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｋｏｒｅａ）を無作為でグループ化し、７日間飲用水に３％ＤＳＳを提供した（グループ当たり１６匹）。１日目（Ｄａｙ１）、すなわち、ＤＳＳ誘導後１日に、マウスに前記製造例によって準備したナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓを１５ｇ／ｋｇ用量で腹腔内投与した。マウスの体重を毎日測定し、体重減少、活性度、排便一貫性（ｓｔｏｏｌ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）、出血及び毛髪状態で構成される疾患活性指数（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ；ＤＡＩ）を７日目（Ｄａｙ７）と１０日目（Ｄａｙ１０）に評価した。マウスを致死させた後、さらなる体外検査（ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ）のために脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、大腸（ｌａｒｇｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）及び血液試料を収集した。
【００６９】
実験例５：組織病理学的評価
収集した結腸（ｃｏｌｏｎ）試料を、エタノールで脱水化、キシレンで透明化（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｘｙｌｅｎｅ）及びパラフィンでワックス浸潤（ｗａｘ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐａｒａｆｆｉｎ）を含む通常の方法によって、１０％ホルマリンに固定した。パラフィン内蔵されたブロックを厚さ５μｍに切断し、Ｈ＆Ｅ又はマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）で染色した。杯細胞（ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ）の損失、充血（ｈｙｐｅｒｅｍｉａ）／浮腫（ｅｄｅｍａ）、免疫細胞の浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、陰窩膿瘍（ｃｒｙｐｔ  ａｂｓｃｅｓｓｅｓ）の存在及び上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）の損失をＨ＆Ｅ染色による組織病理学的指数（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｅｘ）で記録した。線維症組織（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ）領域をマッソントリクローム染色で測定し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４６ｒ、ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して定量化した。
【００７０】
実験例６：サイトカイン生成
多様なサイトカインの分泌水準を決定するために、血液から分離した血清、結腸溶解物（ｌｙｓａｔｅ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ）及び細胞の培養上澄み液を準備した。生体内炎症の程度を測定するために、マウス炎症に対するサイトメトリックビーズアレイ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ；ＣＢＡ）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＭＰＯ及びＴＧＦ−β１に対するＥＬＩＳＡキット（それぞれＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ及びＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者のプロトコルによって使用した。試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）免疫細胞の誘導されたサイトカイン分泌を評価するためには、Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７に対するＣＢＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）とＴＧＦ−β１に対するＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。結果は、流動細胞分析法（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）と分光光度計を使用して検出した。
【００７１】
実験例７：ｈＭＮＣｓの分離及び培養
ヒト臍帯血（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ；ｈＵＣＢ）又は臍帯血−由来細胞（ＵＣＢ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）と関連したすべての実験過程は、韓国ボラメ病院医学研究倫理審議委員会（Ｂｏｒａｍａｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ））とソウル大学校ＩＲＢの承認された指針に従って行った。公知の方法でヒト臍帯血−単核球細胞（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ−ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ；ｈＵＣＢ−ＭＮＣｓ）を分離して培養した。具体的に、事前同意（ｉｎｆｏｒｍｅｄ  ｃｏｎｓｅｎｔ）及び保護者の承認（ｐａｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏｖａｌ）下に、出産直後、ＵＣＢ試料を収集した。収集したＵＣＢ試料は、ＨｅｔａＳｅｐ溶液（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）と５：１の割合で混合して、室温で１時間の間インキュベーションした。その後、Ｆｉｃｏｌｌで上澄み液を収集し、２，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、単核球細胞を分離した。分離した細胞は、ＰＢＳで２回洗浄した。以上のように分離した細胞で以後に試験管内分析でさらに行われる実験を進めた。
【００７２】
実験例８：Ｔ細胞の分離及び偏向化（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）
製造メーカの指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によってヒト純粋ＣＤ４＋Ｔ細胞分離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で純粋な（ｎａｉｖｅ）ＣＤ４＋Ｔ細胞を新鮮に分離したｈＵＣＢ−ＭＮＣｓから分離した。分離したＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞亜型（ｓｕｂｓｅｔｓ）の増殖に必須の、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、抗−ＣＤ３／２８ビーズ活性剤（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）に培養した。細胞をＴ細胞亜型に分化させるために、類型−特異的サイトカイン（ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）（１型ヘルパーＴ細胞に対して２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、及びＴｒｅｇ細胞に対して２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１）を成長培地に添加して、ナノ−ＧＯｓ又はＧＱＤｓの存在／不在下に湿式５％ＣＯ２大気で３７℃に５日間培養した。偏向した（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）Ｔｈ１及びＴｒｅｇ細胞を類型−特異的染色及び流動細胞分析法で確認した。Ｔｈ１細胞に対しては、ＣＤ４抗体で表面染色後、ＩＦＮγで細胞内そめた。Ｔｒｅｇ分析には、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＩＬ−４抗体を使用した。
【００７３】
実験例９：大食細胞の分離及び偏向化
公知の方法で大食細胞を分離して培養した。具体的に、製造メーカの指示によってヒトＣＤ４＋Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で新鮮に分離したｈＵＣＢ−ＭＮＣｓから大食細胞を分離した。分離したＣＤ１４＋細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０に培養した。大食細胞亜型に細胞を偏向化するために、類型−特異的サイトカイン（Ｍ１細胞に対して２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ及び１μｇ／ｍｌのＬＰＳ、及びＭ２細胞に対して２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３）を成長培地に添加して、ナノ−ＧＯｓ又はＧＱＤｓの存在／不在下に湿式５％ＣＯ２大気で３７℃に５日間培養した。偏向した大食細胞を確認するために、類型−特異的染色及び流動細胞分析法を利用した。汎大食細胞マーカー（ｐａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）としてＣＤ１４抗体を使用し、Ｍ１及びＭ２亜型に対する特異的マーカーとしてＣＤ８６及びＣＤ２０６を適用した。
【００７４】
実験例１０：細胞増殖分析
細胞増殖を測定するために、細胞増殖ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）及びＣＣＫ−８キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を製造メーカの指示によって使用した。ブロモデオキシウリジン（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ；ＢｒｄＵ）細胞増殖アッセイのために、公知の方法を使用した。具体的に、細胞を１００μＭのＢｒｄＵ標識試薬（ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）と共に湿式５％ＣＯ２大気で３７℃に２時間の間インキュベーションした。提供されたＦｉｘＤｅｎａｔ溶液で３０分間固定した後、細胞を抗−ＢｒｄＵ抗体溶液で９０分間、そして室温で提供された基質（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＴＭＢ）溶液に５〜３０分間インキュベーションした。各ウェルに停止液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を注いだ後、４５０ｎｍ及び６９０ｎｍ波長で吸光度を測定して、細胞増殖水準を定量化した。
【００７５】
実験例１１：定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造メーカの指示によって総（ｔｏｔａｌ）ＲＮＡを抽出した。収得したＲＮＡをスーパースクリプトファースト−ストランド合成システム（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるｃＤＮＡ合成に使用した。標的ｍＲＮＡの相対的発現水準はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）を使用してＡＢＩ  ７３００検出システムで測定した。各遺伝子に対して最小３回の独立的な分析を行った。
【００７６】
実験例１２：細胞周期分析
公知のプロトコルによって細胞周期分析（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｓｓａｙ）を行った。具体的に、細胞を氷冷の７０％エタノールで−２０℃で３０分以上固定した。固定された細胞は、ＰＢＳで洗浄し、４００μｌのＲＮａｓｅ  Ａ含有ＰＢＳ（７．５μｇ／ｍｌ）及びヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ；ＰＩ、５０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間インキュベーションした。細胞周期は、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用するＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ上で行う流動細胞分析で分析した。
【００７７】
実験例１３：細胞死滅分析
公知の方法で細胞死滅分析（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓｓａｙ）を行った。具体的に、細胞を細胞死滅検出キット（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）中の５μｌのＦＩＴＣ  ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖと５μｌのＰＩで染色した。混合物を軽くボールテックスで撹拌し、室温の暗室で１５分間インキュベーションした。その後、４００μｌの１×結合緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を前記混合物に添加し、すべての試料は、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアを使用するＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ上で行う流動細胞分析で分析した。
【００７８】
実験例１４：免疫蛍光分析
細胞を４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ；ＰＦＡ）ＰＢＳ溶液に室温で１５分間固定し、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で１０分間処理して透過性を高めた（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｌｉｚｅｄ）。固定された細胞は、遮断溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、５％正常ヤギ血清（ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ））と共に１時間の間室温でインキュベーションし、一次抗体と４℃で一晩中インキュベーションした。その後、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識された二次抗体とインキュベーションし、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）染色を５分間行って、核を染色した。
【００７９】
全組織免疫蛍光（ｗｈｏｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のために、パラフィンスライドのパラフィンを除去し（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚｅｄ）、５％正常ヤギ血清含有ＰＢＳで遮断した。断片（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を一次抗体と一晩中インキュベーションした後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４とインキュベーションと、ＤＡＰＩ染色した。イメージは、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）で収集した。
【００８０】
実験例１５：ウェスタンブロット分析
結腸試料をＰｒｏ−Ｐｒｅｐ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｓｕｎｇｎａｍ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｋｏｒｅａ）で溶解させて、組織からタンパク質を抽出した。収得したタンパク質試料は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離し、ニトロセルロース膜に移した。３％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）溶液で遮断した後、膜上のタンパク質をＩＬ−１０日目抗体と共に４℃で１２時間以上インキュベーションし、二次抗体とインキュベーションした。タンパク質と抗体複合体は、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬及び分析システムを通じて検出した。
【００８１】
実験例１６：統計的分析
すべての結果の平均値は、平均（ｍｅａｎ）±ＳＥＭ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  ｏｆ  ｍｅａｎ）で表現した。統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用する多重グループ比較（ｍｕｌｔｉｇｒｏｕｐ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）を大切にして、スチューデント両側ｔ−検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ２−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）又はボンフェローニポストホック検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）に続く一員ＡＮＯＶＡ（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して行った。統計的有意性は、図面に対する説明に示した。
【００８２】
実施例１．ナノ−酸化グラフェン及びＧＱＤの特性分析
本発明に使用したナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓの合成方法をそれぞれ図１Ａ及び図２Ａに概略的に示した。ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓのサイズと形態を同定するために、ＴＥＭイメージ及び制限視野電子回折（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ａｒｅａ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ；ＳＡＥＤ）パターン分析を使用して粒子を分析した（それぞれ、図１Ｂ、１Ｃ及び図２Ｂ及び２Ｃ）。合成されたナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓの特性は、原子力顕微鏡（ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＡＦＭ）で評価した（それぞれ、図１Ｃ及び図２Ｃ）。また、ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓのラマンスペクトルを測定した（それぞれ、図１Ｄ及び図２Ｄ）。ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓを免疫細胞内に位置させるために、ビオチン化された（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓをそれぞれ製造した。ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓのビオチンへの改質後、ＦＴ−ＩＲスペクトルは、アミンの振動ピークを示した。
【００８３】
実施例２．マウスモデルでグラフェンナノ構造体のＤＳＳ−誘導結腸炎改善効果
ＤＳＳ−誘導大腸炎（ＤＳＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ）マウスでグラフェンナノ構造体の治療的効果を確認するために、前記ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓをそれぞれ大腸炎誘導後１日目に腹腔内注射し、体重、生存率及び活動性を２週間モニターした。その結果、ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓがいずれも増加した生存率及び減少した体重で決定される、重症大腸炎（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）からマウスを保護する効果を示した（図３Ａ、Ｂ及び図４Ａ、Ｂ）。ひいては、７日目及び１０日目に、疾患活性指数を測定して大腸炎の経過を確認した。生存率及び体重からの結果と同様に、ナノ−ＧＯ−処理マウス及びＧＱＤｓ−処理マウスは、いずれも顕著に減少した疾患活性指数を示した（図３Ｃ及び図４Ｃ）。大腸炎誘導後１４日目に、各グループから結腸を収集し、その長さを測定した。ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓは、大腸炎により誘導された結腸長さの減少を顕著に遮断した（図３Ｄ及び図４Ｄ）。グラフェンナノ構造体は、内臓器官（ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｏｒｇａｎｓ）近所と隣接した腹膜（ｏｍｅｎｔｕｍ）で発見された（図５及び図６）。ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓの位置特異的蓄積（ｒｅｇｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）機序は、まだ明らかにされていない。総合的に、このような結果は、グラフェンナノ構造体がマウスで結腸の炎症を減少させることを示すものである。
【００８４】
実施例３．グラフェンナノ構造体によるＤＳＳ−結腸炎誘導炎症反応に対する損傷
結腸の組織学的分析は、ＤＳＳが上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）の破壊、粘膜下浮腫（ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ  ｅｄｅｍａ）、陰窩膿瘍（ｃｒｙｐｔ  ａｂｓｃｅｓｓｅｓ）及びリンパ球浸潤（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を誘導することを示した（図７Ａ図８Ａ）。ナノ−ＧＯ−処理マウス及びＧＱＤｓ−処理マウスで、炎症病変（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｅｓｉｏｎｓ）は、ＰＢＳ−処理マウスに比べてほとんど現れないか又は緩和されることが観察された。ひいては、大腸炎により誘導された結腸の粘膜及び粘膜下で線維症を評価するために、マッソントリクローム染色を行った。ＰＢＳ−処理マウスは、青色染色により確認されるコラーゲン沈着を示した。ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓは、コラーゲン蓄積をも減少させた。ＧＱＤｓの注入は、結腸の短縮（ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）を遮断した。全身炎症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を評価するために、ＣＢＡ分析を利用して血清から分泌された前炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの水準を測定した。クローン病で比重を占める主なサイトカインであるＩＦＮγの誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）は、ナノ−ＧＯ−処理マウス及びＧＱＤｓ−処理マウスで阻害された（図７Ｃ及び図８Ｃ）。また、ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓの処理は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−６及びＭＣＰ−１の後続サイトカイン（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を減少させた。好中球顆粒成分（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ）であるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、移動した好中球（ｍｉｇｒａｔｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）の数に比例すると知られている。ナノ−ＧＯｓ−処理マウス及びＧＱＤｓ−処理マウスは、結腸組織でＰＢＳ−処理マウスに比べて減少したＭＰＯ活性を示し、これは、グラフェンナノ構造体が好中球の移動及び炎症を抑制することを示すものである（図７Ｄ及び図８Ｄ）。したがって、このような結果は、クローン病モデルでグラフェンナノ構造体が免疫−抑制特性を有することを示す。
【００８５】
実施例４．グラフェンナノ構造体のＣＤ４＋Ｔ細胞活性抑制効果
Ｔｈ１細胞が腸炎で重要な役割をすることを考慮して、ＣＤ４＋Ｔ細胞でグラフェンナノ構造体の直接的な効果を確認した。まず、適正濃度を決定するために、ＭＮＣｓ及び一次ＣＤ４＋Ｔ細胞にナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓを多様な濃度で処理した（図１０Ａ及び図１１Ａ）。２０μｇ／ｍｌのナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓは、ＭＮＣｓ及びＴ細胞の増殖を毒性なしに効果的に抑制した（それぞれ、図１０Ｂ、１０Ｃ及び図１１Ｂ、１１Ｃ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞内にグラフェンナノ構造体を位置させるために、ＧＦＰ−ビオチン抗体を利用してビオチン−標識されたナノ−ＧＯｓ又はＧＱＤｓを処理した後、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞を免疫染色した（図１２Ａ及び図１３Ａ）。ビオチン−標識されたナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓは、Ｔ細胞内で検出された。これは、物質が細胞内に内在化され得ることを示すものである。免疫細胞の増殖に対するグラフェンナノ構造体の効果を確認するために、ｈＵＣＢ−由来ＭＮＣｓ及びＣＤ４＋Ｔ細胞をナノ−ＧＯｓ又はＧＱＤｓで処理した後、培養した（それぞれ、図１２Ｂ、Ｃ及び図１３Ｂ、Ｃ）。グラフェンナノ構造体は、ＭＮＣｓ及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を効果的に抑制した。グラフェンナノ構造体のＴｈ１抑制特性は、クローン病モデルで治療効果を示す主な機序でありうる。ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ分析は、ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓが細胞死滅経路に影響を与えないことを示した（図１２Ｄ及び図１３Ｄ）。しかしながら、ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓは、細胞周期でＧ１期を多少増加させ、これは、細胞周期の進行を抑制することを示す（図１２Ｅ及び図１３Ｅ）。グラフェンナノ構造体のＴｈ１細胞に対する特異的な効果を確認するために、ｈＵＣＢからＣＤ４＋Ｔ細胞を精製し、ナノ−ＧＯｓ又はＧＱＤｓの存在下にＴｈ１タイプに分化させた（図１２Ｆ及び図１３Ｆ）。その結果、ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓは、いずれもＴｈ１分化を顕著に抑制した。Ｔｈ１偏向した条件で培養されたＣＤ４＋Ｔ細胞でＴｈ１特異的遺伝子発現を分析した（図１２Ｇ及び図１３Ｇ）。ナノ−ＧＯｓ／ＧＱＤｓ−処理されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、顕著に抑制されたＴｈ１遺伝子発現を示した。ナノ−ＧＯｓ／ＧＱＤｓ−処理されたＴｈ１細胞で機能的変化を分析するために、細胞培養上澄み液に分泌されたサイトカインの濃度を測定した（図１２Ｈ及び図１３Ｈ）。ナノ−ＧＯｓ／ＧＱＤｓ−処理された細胞でＩＦＮγ、ＴＮＦ及びＩＬ−２の分泌は顕著に減少した。一方、ナノ−ＧＯｓ／ＧＱＤｓ−処理されたＴｈ１細胞でＩＬ−６、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の水準は増加した。このような結果は、グラフェンナノ構造体がＴｈ１反応の抑制及び調節Ｔ細胞活性の促進により大腸炎を緩和させることを示すものである。
【００８６】
実施例５．グラフェンナノ構造体による生体内調節Ｔ細胞浸潤増加
本発明者らは、先行研究を通じて実験的大腸炎の回復が調節Ｔ細胞の拡張及び浸潤を伴うことを確認したことがあった。これより、本発明者は、グラフェンナノ構造体の投与がＴｒｅｇ細胞の局所化に影響を与えるかを流動細胞分析法で確認した。具体的に、ナノ−ＧＯｓ又はＧＱＤｓの投与は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の結腸浸潤（ｃｏｌｏｎｉｃ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）及び脾臓偏向化（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を増加させた（図１４Ａ及び図１５Ａ）。ナノ−ＧＯｓ又はＧＱＤｓ処理されたマウスでＴｒｅｇ細胞の増加した結腸浸潤を免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）でも確認した（図１４及び図１５）。次に、Ｔｒｅｇ密度（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の主な誘導体及び生成物であり、Ｔｒｅｇ−媒介大腸炎の緩和で重要な役割をする、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β１の発現を決定した。ＩＬ−１０発現水準は、ナノ−ＧＯｓ処理されたマウスの結腸で顕著に増加した。また、グラフェンナノ構造体が直接的にＴｒｅｇ細胞の偏向化に影響を与えるかを確認するために、ナノ−ＧＯｓ又はＧＱＤｓの存在下に純粋なＣＤ４＋細胞を調節Ｔ細胞系統（ｌｉｎｅａｇｅ）で誘導した。その結果、ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤｓは、Ｔｒｅｇ偏向化に対する増加効果を有しなく、かえって干渉した。
【００８７】
総合的に、前記の結果は、グラフェンナノ構造体が生体内で調節Ｔ細胞の数及びこれと関連したサイトカインを増加させ、これは、Ｔｒｅｇ偏向化に対する直接的な効果により媒介されないことを示すものである。
【００８８】
実施例６．グラフェンナノ構造体による免疫反応中にＭ１大食細胞のＭ２タイプへの転換
実施例６−１．ナノ−ＧＯｓによる免疫反応中にＭ１大食細胞のＭ２タイプへの転換
腸大食細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）の免疫寛容性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ）及び保護的な免疫反応の間の不均衡により結腸炎症が発生し得、これは、Ｔｒｅｇ細胞及びその分泌性サイトカインを募集する役割をする、選択的に活性化した（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｍ２類型大食細胞により改善され得る。これにより、ナノ−ＧＯｓの処理が大食細胞の細胞運命の決定に影響を及ぼすかを確認した。ナノ粒子の内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）がビオチン化された炭素ナノ構造体及び免疫組織化学により確認された（図１６Ａ）。ナノ−ＧＯｓ処理時に、マウス大食細胞細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞の増殖は増加し、拡大した細胞形態が観察された（図１８Ａ）。Ｒａｗ２６４．７細胞と同様に、一次的に分離された（ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ）ＣＤ１４＋細胞も、ナノ−ＧＯｓと共にＭ０及びＭ２類型細胞に培養されたとき、増加した増殖を示した。反面、ナノ−ＧＯｓはＭ１類型細胞には、いかなる有効な変化も示さなかった（図１６Ｂ及び図１８Ｂ）。
【００８９】
大食細胞類型−特異的偏向化に対するナノ−ＧＯｓの効果を流動細胞分析法を利用した細胞表面マーカー分析を通じて確認した。前記グラフェンナノ構造体は、いずれも純粋なＣＤ１４＋細胞を他の追加されるサイトカインなしに大食細胞の前炎症性類型（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｔｙｐｅ）に誘導する傾向を示した。Ｍ２−類型大食細胞と関連して、ナノ−ＧＯｓ処理は、ＣＤ１４＋ＣＤ８６＋細胞及びＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋細胞すべての増加を誘導した。ＣＤ１４＋細胞上でＣＤ２０６表面マーカーの発現は、免疫組織化学により確認された（図１６Ｄ）。このような結果は、ナノ−ＧＯｓが前炎症性に活性化した大食細胞のＭ１−類似特性を下向き調節し、Ｍ２類型を転換することによって、炎症解消（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）に役割をすることを示すものである。
【００９０】
実施例６−２．ＧＱＤｓによる免疫反応中にＭ１大食細胞のＭ２タイプへの転換
ＧＱＤｓの処理が大食細胞の細胞運命の決定に影響を及ぼすかを確認した。ナノ粒子の内在化がビオチン化された炭素ナノ構造体及び免疫組織化学により確認された（図１７Ａ）。一次的に分離されたＣＤ１４＋細胞は、ＧＱＤｓと共にＭ０類型細胞に培養されたとき、増加した増殖を示す反面、Ｍ１及びＭ２類型細胞には、いかなる有効な変化も示さなかった（図１７Ｂ）。
【００９１】
大食細胞類型−特異的偏向化に対するＧＱＤｓの効果を流動細胞分析法を利用した細胞表面マーカー分析を通じて確認した。ＧＱＤ処理が前炎症性に活性化したＭ１類型の大食細胞を抗−炎症性Ｍ２亜類型に転換することを確認するために、追加に他のＭ２類型特異的特性の発現を確認した。その結果、ヘモグロビンスカベンジャー受容体（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ＣＤ１６３の発現は、ＧＱＤｓ存在時に増加した（図１９Ａ及び図１９Ｃ）。代表的な前炎症性サイトカインであるＴＮＦの分泌水準は多少減少したが、ＩＬ−６水準には、いかなる有意的な変化も現れなかった（図１９Ｂ）。ひいては、ＧＱＤｓ処理は、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα及びＭ１類型特異的転写因子であるＩＲＦ５のｍＲＮＡ発現を抑制した。一方、ＧＱＤｓ処理は、ＣＬＥＣ７Ａ及びＩＬ−１ｒａの発現を維持又は多少増加させる傾向があった（図１９Ｃ）。
【００９２】
このような結果は、ＧＱＤｓが前炎症性に活性化した大食細胞のＭ１−類似特性を下向き調節し、Ｍ２類型を転換することによって、炎症解消に役割をすることを示すものである。
【００９３】
実施例７．ナノ−ＧＯｓにより誘導された大概に活性化した大食細胞のうち主な亜類型であるＭ２ｂ
ナノ−ＧＯｓ処理が古典的に活性化したＭ１類型大食細胞を抗−炎症性Ｍ２亜類型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）に転換することを確認するために、追加に他のＭ２類型特異的特性の発現を確認した。ヘモグロビンスカベンジャー受容体ＣＤ１６３の発現は、ナノ−ＧＯｓの存在時に増加した（図２０Ａ及び２０Ｃ）。代表的な前炎症性サイトカインであるＴＮＦ及びＩＦＮ−γの分泌水準は、顕著に減少したが、ＩＬ−６水準には、いかなる有意的な変化も現れなかった（図２０Ｂ）。ひいては、ナノ−ＧＯｓ処理は、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦα及びＭ１類型特異的転写因子であるＩＲＦ５のｍＲＮＡ発現を抑制した。反面、Ｍ２大食細胞の最も重要なマーカーであるＩＬ−１０の水準は増加した。しかしながら、ナノ−ＧＯｓ処理は、ＣＬＥＣ７Ａ及びＩＬ−１ｒａの発現を向上させなく、かえって阻害した（図２０Ｃ）。
【００９４】
Ｍ２大食細胞は、免疫体系で明確な役割を有する三つ又はそれ以上の亜類型に区分され得る。ＩＬ−１０の分泌は増加した反面、Ｍ２ａマーカーであるＣＬＥＣ７Ａ及びＩＬ−１ｒａは減少したところ、これに基づいてナノ−ＧＯｓが他のＭ２亜類型細胞を上向き調節することを仮定した。これを立証するために、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ及びＭ２ｃ大食細胞を誘導し、グラフェンナノ構造体の役割を確認した。以前の結果に示されたように、Ｍ２ａ大食細胞のＣＤ１６３及びＣＤ２０６発現は、ナノ−ＧＯｓ存在時に顕著に減少した（図２０Ｄ及び図２１Ａ）。また、マーカー遺伝子ＣＬＥＣ７Ａ及びＩＬ−１ｒａ、転写因子ＩＲＦ４の発現は減少した（図２１Ｂ）。Ｍ２ｃ亜類型と関連して、何らの目につくほど変化も現れなかった。Ｍ２ｂ亜類型大食細胞の比率は、ナノ−ＧＯｓ処理により増加した（図２０Ｄ及び図２１Ａ）。また、ナノ−ＧＯｓ処理されたＭ２ｂ大食細胞は、莫大な量のＴＮＦ及びＩＬ−６を分泌し、より多くのＩＬ−１β及びＩＬ−１０を発現した（図２０Ｅ及び図２０Ｆ）。このような結果は、ナノ−ＧＯｓが、Ｍ２ａやＭ２ｃでなく、Ｍ２ｂ大食細胞を上向き調節することによって、炎症性反応を弱化させることができることを示すものである。
【００９５】
＜結論＞
本発明では、ナノサイズのグラフェン誘導体、すなわちグラフェンナノ構造体の実験的大腸炎に対する保護効果及びその作用機序を分析した。
【００９６】
本発明者らは、先天性免疫細胞と適応免疫細胞に対するグラフェンナノ構造体の総合的な影響を識別するために一連の試験管内実験を行った。ナノ−ＧＯｓ又はＧＱＤｓは、一次的に分離したＴｈ１細胞及びＣＤ１４＋大食細胞類似細胞により多量摂取された。前炎症性サイトカイン、特に、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及び転写因子Ｔ−ｂｅｔが１型ヘルパーＴ細胞の作用（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）に重要な役割をするものと知られている。反面、Ｔｈ２及びＴｒｅｇに対する代表的なサイトカインであるＩＬ−４とＩＬ−１０、ひいては前炎症性サイトカインであるＩＬ−６は、Ｔｈ１発達阻害を媒介した。グラフェンナノ構造体は、免疫性環境（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｌｉｅｕ）を調節するのに効果を示し、これは、サイトカイン生成と確認された。また、ＧＱＤｓが類似にＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制するが、Ｔｈ１細胞の発達には相異に影響を及ぼすことを糾明した。
【００９７】
調節Ｔ細胞は、過度な炎症から組織を保護し、活性化した免疫細胞を抑制することによって組織の治癒過程を助ける。ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β１は、Ｔｒｅｇの発達、拡張及び特異的役割に関与された。本発明では、細胞の運命に直接的に影響を与えないにも関わらず、ナノ−ＧＯｓの投与がＩＬ−１０及びＴＧＦ−β１の増加した生成を通じて調節Ｔ細胞の結腸及び脾臓浸潤（ｃｏｌｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を向上させることを確認し、ＧＱＤｓの投与がＴ細胞の結腸浸潤を向上させることを確認した。
【００９８】
大食細胞は、特異的な可塑性（ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を示し、環境的刺激によってその性質を調節する。腸大食細胞は、免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の主な調節子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）として腸（ｇｕｔ）の恒常性を調節し、調節Ｔ細胞の機能性を維持することによって、過度な免疫反応に対して組織を保護する。また、代わりに（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ）活性化したＭ２大食細胞も、組織復旧及びＴｈ２反応に重要な役割をする。これにより、Ｍ０、Ｍ１及びＭ２状態の細胞にナノ粒子を処理することによって、グラフェンナノ構造体が大食細胞の偏向化にどのような影響を及ぼすかを確認した。
【００９９】
結果として、ナノ−ＧＯｓ及びＧＱＤがＭ０細胞を活性化してＭ１類型細胞に偏向化し、Ｍ２類型細胞を抑制することを確認した。また、ナノ−ＧＯｓ−処理又はＧＱＤｓ−処理が、Ｍ１からＭ２大食細胞への転換を誘導することによって、潜在的免疫抑制性薬物でありうることを確認した。
【０１００】
炎症反応中に結腸Ｔｒｅｇ及びＭ２類型大食細胞の浸潤が増加することを考慮する時、本願のグラフェンナノ構造体がＩＬ−１０及びＴＧＦ−β１信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を通じてＴｒｅｇ及び腸大食細胞の調節ループを形成するのに重要な役割をすることが分かる。
【０１０１】
Ｍ２大食細胞は、遺伝子プロファイル及び多様なサイトカイン生産により媒介される区別される機能などの多様な細胞的特性を有する、少なくとも３種類以上の亜類型に分類される。そのうちＭ２ａ及びＭ２ｂは、免疫調節活性（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）を示し、Ｔｈ２反応を誘導し、Ｍ２ｃは、免疫抑制能（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ）と組織−リモデリングに関与する。これらの大食細胞の亜類型とグラフェン誘導体の間の相互作用は、まだ明らかにされていない。本発明では、Ｍ１誘導中に、Ｍ１類似特性が減少する反面、Ｍ２類型細胞を誘導するＩＬ−６水準は変化しなかった。また、ＩＬ−１０のような代表的なＭ２関連因子（ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ）は、ナノ−ＧＯｓ存在時に顕著に増加した。Ｍ２ａ関連遺伝子であるＣＬＥＣ７Ａ及びＩＬ−１Ｒａは、細胞マーカーの発現が減少するにつれて下向き調節され、Ｍ２ｃ細胞は、いかなる有効な変化も示さなかった。かえって、Ｍ２ｂ亜類型細胞及びその関連生成物の比率は、ナノ−ＧＯｓ処理に反応して増加した。このような結果は、ナノ−ＧＯｓがＴＬＲ媒介信号伝達の増加に関与することを示すものであり、したがって、Ｍ２類型細胞のうち、Ｍ２ｂ大食細胞は、本願のグラフェンナノ構造体により直接的に影響を受け、炎症状態下の結腸でＴｒｅｇの移動に関与した。
【０１０２】
結論的に、本発明では、ナノサイズのグラフェン誘導体、具体的に、ナノサイズの酸化グラフェン（ナノ−ＧＯｓ）及びＧＱＤｓが１型ヘルパーＴ細胞を抑制すると同時に、腸大食細胞と調節Ｔ細胞の間の調節ループ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｏｏｐ）を活性化することによって、実験的大腸炎に対する保護効果を有することを確認した。ひいては、このような治療的効果は、ナノ粒子サイズ及び形態によって変化しうることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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