(57)【要約】  ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株は、腫瘍関連ＭＵＣ−１抗原に結合する能力を提供することにより、癌細胞に対するそれらの選択性を高めるように改変されている。そのような改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の生産は、癌細胞に対して増加した細胞傷害性を有するように必要に応じてさらに改変されるＮＫ−ＣＡＲを生産するように遺伝子改変を介する。
2021503954.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＭＵＣ−１グリコフォームと比較して増加した親和性を有する腫瘍関連ムチン−１（ＭＵＣ−１）グリコフォームに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項２】
前記ＣＡＲが、野生型ＭＵＣ−１グリコフォームと比較して、少なくとも１０％の増加した親和性で腫瘍関連ＭＵＣ−１グリコフォームに結合する、請求項１に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項３】
前記ＣＡＲがＨＭＦＧ２配列を含む、請求項１または２に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項４】
野生型グリコフォームと比較した場合、前記腫瘍関連ＭＵＣ−１グリコフォームが、Ｔｎ、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）、Ｔ、およびシアリルＴ（ＳＴ）グリカンから選択されるより短いグリカンを優勢に含む、任意の先の請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項５】
患者において腫瘍を形成する傾向が低減されているかまたは存在しない、任意の先の請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞または細胞株。
【請求項６】
例えば照射により、分裂不能にされた、請求項５に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項７】
異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１の発現が減少するかまたは存在しないように改変された、任意の先の請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞または細胞株。
【請求項８】
野生型ＴＲＡＩＬと比較した場合に、１つまたはそれ以上のＴＲＡＩＬ死受容体に対して高い親和性を有する変異型ＴＲＡＩＬリガンドを発現するようにさらに改変された、任意の先の請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項９】
変異型ＴＲＡＩＬリガンドがＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む、請求項８に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１０】
１つまたはそれ以上のチェックポイント阻害性受容体の機能を除去するようにさらに改変された、任意の先の請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１１】
前記細胞株がＫＨＹＧ−１細胞株の誘導体である、任意の先の請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１２】
患者の癌の治療に使用するための、任意の先の請求項のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１３】
前記癌が固形癌であり、例えば、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌から選択される、請求項１２に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１４】
前記癌が血液癌であり、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む）、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、活動性骨髄腫、軽鎖骨髄腫から選択される、請求項１３に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１５】
患者の癌を治療するかどうかを決定する方法であって、（１）１つまたはそれ以上の癌細胞を患者から単離する工程、（２）該１つまたはそれ以上の癌細胞がＮＫ細胞耐性であるかどうかを該１つまたはそれ以上の癌細胞に対するＮＫ細胞の比細胞傷害性の％を測定することにより決定する工程、ならびに工程（２）の所見に基づいて癌を治療するかどうかの決定を行う工程を含み、該１つまたはそれ以上の癌細胞がＮＫ細胞耐性である場合、該癌の治療が実施されることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
前記１つまたはそれ以上の癌細胞に対するＮＫ細胞の比細胞傷害性の％が５０％またはそれ以下である場合、前記癌はＮＫ耐性であると決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌の治療が、請求項１から１４のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を投与することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（緒言）
本発明は、より細胞傷害性の表現型を有するその誘導体を産生するためのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫ細胞株の改変に関する。さらに、本発明は、改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を作製する方法、細胞および細胞株を含む組成物、ならびに癌、特に血液癌の治療における当該細胞、株および組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
代表的には、免疫細胞は、標的細胞の死をもたらす免疫応答を誘発する前に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を介して抗原を提示する標的細胞を必要とする。これにより、ＭＨＣクラスＩを示さない癌細胞が免疫応答の大部分を回避することができる。
【０００３】
しかし、ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩの発現がない場合に癌細胞を認識することができる。そのため、それらは癌に対する体の防御において重要な役割を果たす。
【０００４】
一方、特定の状況では、癌細胞は、ＮＫ細胞膜上の抑制性受容体に結合するリガンドの発現を通じて、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を弱める能力を示す。癌への抵抗はこれらと他の因子との間のバランスを含み得る。
【０００５】
この文脈において、細胞傷害性は、免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞が、（例えば細胞溶解性化合物を放出することによる、または癌細胞膜上の受容体を結合し、かつ該癌細胞のアポトーシスを誘導することにより）癌細胞死を誘発する能力をいう。細胞傷害性は、細胞溶解性化合物の放出を誘発するシグナルだけでなく、それらの放出を阻害するシグナルによっても影響を受ける。したがって、細胞傷害性の増加は、上記のように、癌細胞のより効率的な死滅をもたらし、癌細胞がＮＫの細胞傷害性活性を弱める可能性は少ない。
【０００６】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄の発達に方向付けられた前駆細胞が関与する造血系悪性腫瘍であり、成人（９０％）と子供（１５−２０％）との両方の急性白血病のかなりの割合を占める（Ｈｕｒｗｉｔｚ、Ｍｏｕｎｃｅら、１９９５年；Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ、Ｄｏｗｎｉｎｇら、１９９９年）。標準的な化学療法で患者の８０％が寛解を達成したにもかかわらず（Ｈｕｒｗｉｔｚ、Ｍｏｕｎｃｅら、１９９５年；Ｒｉｂｅｉｒｏ、Ｒａｚｚｏｕｋら、２００５年）、最小残存病変（ＭＲＤ）による再発率が高いため、生存率は依然として不十分である。５年生存率は年齢に依存し；子供では６０％（Ｒｕｂｎｉｔｚ  ２０１２年）、６５歳未満の大人では４０％（Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ、Ｄｏｗｎｉｎｇら、１９９９年）、および６５歳以上の大人では１０％（ＦｅｒｒａｒａおよびＳｃｈｉｆｆｅｒ  ２０１３年）である。これらの結果は、患者が適切な造血細胞ドナーを有している場合に改善され得るが、多くはそうではなく、治療への代替アプローチの必要性を強調している。
【０００７】
ＮＫ細胞は、例えばナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞とは異なる別個の表現型とエフェクター機能とを備える細胞傷害性リンパ球である。例えば、ＮＫ−Ｔ細胞はＣＤ３およびＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の両方を発現するが、ＮＫ細胞は発現しない。ＮＫ細胞は一般に、マーカーＣＤ１６およびＣＤ５６を発現することが見出されている。ここで、ＣＤ１６はＦｃ受容体として機能し、以下で説明する抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ＫＨＹＧ−１（下記参照）は、この点で注目すべき例外である。
【０００８】
いくつかの恒久的なＮＫ細胞株が樹立されており、最も注目すべきはＮＫ−９２である。これは、ＣＤ１６（Ｆｃγ受容体ＩＩＩ）を除いて、代表的なＮＫ細胞マーカーを発現する非ホジキンリンパ腫の患者に由来する。ＮＫ−９２は広範な前臨床試験を受けており、活性化ＮＫ細胞やリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と比較して、広範囲の腫瘍に対して優れた溶解を示す（Ｇｏｎｇ、Ｍａｋｉら、１９９４年）。初代ＡＭＬに対するＮＫ−９２細胞の細胞傷害性が確立されている（Ｙａｎ、Ｓｔｅｉｎｈｅｒｚら、１９９８年）。別のＮＫ細胞株であるＫＨＹＧ−１は、臨床使用の可能性がある候補として特定されている（Ｓｕｃｋら、２００５年）が、細胞傷害性が低下していると報告されているため、ＮＫ−９２ほど注目されていない。
【０００９】
特定の癌マーカーの同定は、癌との闘いに役立つはずである。多くの既知の癌マーカーの問題は、それらがおそらく異なるレベルで健常な細胞にも発現していることである。つまり、「標的化」治療はそれでも必然的に一定量の自己標的化をもたらすということである。
【００１０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞に特定のタンパク質を標的とする能力を与えるために本来開発された受容体タンパク質である。ＣＡＲは、癌治療での使用について研究されている。ＷＯ２０１６／２０１３０４、ＷＯ２０１７／１９２４４０およびＷＯ２０１７／０１７１８４は、癌治療においてＮＫ細胞にＣＡＲを使用する可能性について説明している。
【００１１】
ムチン−１（ＭＵＣ−１）を標的するＣＡＲ−Ｔ細胞はＰｏｓｅｙらより公知である（２０１６年）。しかし、これらの細胞の使用は、それらが活性化された際に交差反応性を示し、循環の場合に持続的な性質を有するという点で制限されている。
【００１２】
ＭＵＣ−１は、活性化Ｔ細胞（ＫｏｎｏｗａｌｃｈｕｋおよびＡｇｒａｗａｌ、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１２年；２７２（２）：１９３−９）およびＴ細胞に結合しかつ阻害することが見出されたＭＵＣ−１に対する抗体（ＡｇｒａｗａｌおよびＬｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００５年４月；１７（４）：３９１−９）で発現することが示されている。ＭＵＣ−１抗体とＴ細胞との相互作用により、この標的に対する作業は中止となった（Ｍａｈｅｒら、Ｌｅｔｔｅｒ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第４５巻、第５号、ｐｐ．９４５−９４６、２０１６年１１月１５日）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
（発明の要旨）
したがって、癌細胞に対するより高い選択性を備える、代替かつ好適な改変された細胞ベースの治療法が必要とされている。
【００１４】
本発明の目的は、高い選択性で癌細胞を標的し、好ましくはより多くの細胞傷害性の表現型を有するＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を提供することである。さらなる目的は、改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を産生するための方法、細胞または細胞株を含む組成物、ならびに癌の治療におけるそのようなものの使用を提供することである。より特定の実施形態は、特定された癌（例えば白血病を含む血液癌）の治療を提供することを目的とする。特定の実施形態は、ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の２つまたはそれ以上の改変体を組み合わせて、改変された細胞の細胞傷害性をさらに増強することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書では、より高い細胞傷害性の表現型を有する改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株、ならびにこれらの細胞および細胞株を作製する方法が提供される。改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の組成物、ならびに癌を治療するための当該組成物の使用も提供される。この文脈における細胞傷害性は、上記のように、腫瘍細胞の殺傷をいう。
【００１６】
本発明は、腫瘍関連ＭＵＣ−１に結合するＮＫ細胞および細胞株、ならびに例えば遺伝子工学を使用してＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を改変し、ＮＫ細胞および細胞株に腫瘍関連ＭＵＣ−１に結合する能力を提供する方法を提供する。
【００１７】
本発明によれば、癌（例えば、全般的かつ特異的に（例えばＫＨＹＧ−１細胞の誘導体として）（改変された）ＮＫ細胞および細胞株を用いる癌（例えば血液癌）を治療する方法がさらに提供される。ここで、（改変された）ＮＫ細胞および株は、腫瘍関連ＭＵＣ−１に結合するように操作され、必要に応じてチェックポイント阻害受容体の発現の欠如に加えて、ＴＲＡＩＬリガンド変異体および／またはＦｃ受容体を発現する。
【００１８】
本発明により特に治療可能な疾患には、癌、固形癌および血液癌、より具体的には乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、白血病および特に急性骨髄性白血病が含まれる。特にヒトの腫瘍や癌を治療することができる。本明細書における腫瘍への言及は、新生物(neoplasms)への言及を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＭＵＣ−１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子配列構成を示す。
【図２】図２は、ＫＨＹＧ−１細胞でＣＡＲを発現させるために使用したＬｅｎｔｉ−ＥＦ１ａ−ＭＵＣ１−ＣＡＲのベクターマップを示す。
【図３】図３ａ、３ｂおよび３ｃは、ＭＵＣ−１  ＣＡＲ−ＮＫ細胞を使用した異なる乳癌細胞の死滅を示す。
【図４】図４は、ＭＵＣ−１  ＣＡＲ−ＮＫ細胞をエフェクター：標的比５：１で使用したＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞の殺傷を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細）
したがって、本発明は、その細胞傷害性を増大させるように遺伝子改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫ細胞株を提供する。
【００２１】
以下の実施例において詳細に記載されるように、ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株は、癌に対するそれらの細胞傷害活性を増加させるように遺伝子改変されている。
【００２２】
併せて、本発明のＮＫ細胞およびＮＫ細胞株はまた、（文脈が他を必要としない限り）ＮＫ細胞とも呼ばれる。
【００２３】
本発明のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株は、腫瘍関連ムチン−１（ＭＵＣ−１）グリコフォームに結合する能力を有する。このようなグリコフォームは、ＭＵＣ−１抗原の非天然型と見なされ、癌の表面で識別可能である。したがって、ＮＫ細胞および細胞株は、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１に結合する。
【００２４】
ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株は、腫瘍関連ＭＵＣ−１グリコフォームに結合する膜結合部分を発現するように遺伝子改変されていてもよい。
【００２５】
以下の実施例に示される、ＮＫ細胞によるこれらのＭＵＣ−１グリコフォームの結合は、好ましくは、野生型ＭＵＣ−１グリコフォーム（すなわち異常にグリコシル化されていないＭＵＣ−１）への結合と比較して、高い親和性で測定される。
【００２６】
結合親和性は、当技術分野で公知の任意の適切な方法に従って測定され得る。好ましくは、結合親和性は、表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定またはＥＬＩＳＡを使用して測定される。
【００２７】
癌細胞上の腫瘍関連ＭＵＣ−１に対する改変されたＮＫ細胞の親和性の増加は、野生型ＭＵＣ−１を発現する正常（非悪性）細胞に対するその親和性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％である。
【００２８】
本発明のＮＫ細胞による野生型ＭＵＣ−１の結合は、好ましくは、癌関連ＭＵＣ−１グリコフォーム（すなわち、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１）への結合に対して、低い親和性で測定される。
【００２９】
正常細胞に対する改変されたＮＫ細胞の親和性の低下は、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１を発現する癌細胞に対する親和性と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％である。
【００３０】
癌細胞に対する改変されたＮＫ細胞の親和性の増加は、野生型ＭＵＣ−１を発現する正常細胞に対する改変されたＮＫ細胞の親和性よりも、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍大きいことが好ましい。
【００３１】
野生型ＭＵＣ−１を発現する正常細胞に対する改変されたＮＫ細胞の親和性は、ＭＵＣ−１を異常にグリコシル化した癌細胞に対する改変されたＮＫの親和性よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍低いことが好ましい。
【００３２】
好ましくは、改変されたＮＫ細胞は、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１に対して高い親和性を有する。ここで、「高い親和性」とは、癌細胞を効果的に標的とするのに十分高いが、通常の異常にグリコシル化されたものでないＭＵＣ−１への標的化を回避するように十分に低い親和性を有するように定義される。
【００３３】
また、以下の実施例に示すように、膜結合部分は、適切にモジュール化された融合受容体であり、標的配列（通常は抗体由来の一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ））および通常はヒンジ（立体障害の問題を克服するため）、スペーサー、膜貫通エレメントおよびシグナル伝達エンドドメインを含む。代表的には、その部分はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。以下の実施例では、ＩｇＤに由来するヒンジを使用しており、他のヒンジ(例えばＣＤ８ａ）も適切である。多くの配列が異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１に結合することが知られており、５Ｅ５、ＳＭ３およびＨＭＦＧ２を含むこのような配列が標的配列として使用され得、本発明のＣＡＲに適切に組み込まれる。好ましくは、ＣＡＲはＨＭＦＧ２配列を含む。それにもかかわらず、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１を標的とするためのさらなる配列は、先行技術で公知のスクリーニング方法により同定され得、（上記で定義したような）高い親和性の配列は、本発明によるＭＵＣ−１  ＮＫ−ＣＡＲを産生するために使用され得る。
【００３４】
したがって、本発明は、野生型ＭＵＣ−１グリコフォームと比較して親和性が増大した腫瘍関連ＭＵＣ−１グリコフォームに結合する１つまたはそれ以上のＣＡＲを発現するように改変されたＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を提供する。
【００３５】
野生型または異常のないＭＵＣ−１と比較して、癌に関連するグリコフォームは独特の特徴、特に特定の抗原の量が多い傾向がある。本発明の細胞および株の結合特性により標的されるＭＵＣ−１の特定のグリコフォームは、野生型グリコフォームと比較した場合、Ｔｎ、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）、ＴおよびシアリルＴ（ＳＴ）グリカンから選択されるより短いグリカンの優位性を有する（ＭａｈｅｒおよびＷｉｌｋｉｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００９年６月１日、６９（１１）、４５５９−４５６２、ＤＯＩ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−０９−０５６４）。
【００３６】
本発明の細胞および株上の部分は、これらのより短いグリカンの１つまたはそれ以上、あるいはすべてを有するグリコフォームに、より高い親和性またはより低い親和性で結合し得る。特定の異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１に結合することが知られている特定の配列は、高い親和性と特異性ともって結合し得る。わずかに特異性は低いが、列挙された腫瘍関連グリコフォームの複数、好ましくはすべてに受容可能な親和性で結合する配列は、本発明においてより広いスペクトルで使用されることが見出されている。ＨＭＦＧ２  ｓｃＦｖには、シアリルＴ抗原、ならびにＴｎおよびシアリルＴｎ抗原を標的するという利点がある。後者２つは５Ｅ５  ｓｃＦｖにより標的される。
【００３７】
本発明の利点は、ＮＫ細胞および株が癌を標的することである。単独で使用する場合も、他の治療成分と組み合わせて使用する場合も、他の改変を加えた細胞／株として使用する場合も、細胞は癌治療に使用され得る。これまでのインビトロのデータは、本発明の実施例の細胞が細胞傷害性であることを示す。
【００３８】
関連するＴ細胞ベースの治療法では、ＭＵＣ−１は、腫瘍由来のＭＵＣ−１に関連する特定のグリコシル化パターンにより、以前はＴ細胞作用を標的する候補と見なされていた。その結果、これらの癌特異的グリコフォームを標的するために、モノクローナル抗体（例えば５Ｅ５およびＨＭＦＧ２）が開発されてきた。ＵＳ８４４０７９８は、モノクローナル抗体５Ｅ５を詳述する。その後、腫瘍関連ＭＵＣ−１を標的するＴ細胞キメラ抗原受容体（Ｔ−ＣＡＲ）が開発された（Ｗｉｌｋｉｅら、２００８年）。しかし、残念ながら、活性化Ｔ細胞との交差反応性と循環中のＴ細胞の持続性により、Ｔ−ＣＡＲ  ＭＵＣ−１療法は、このアプローチがもはや臨床的に追求されていない範囲で問題となっている。
【００３９】
本発明では、ＮＫ細胞を使用して、そのような自己標的化のリスクを考慮に入れ、これを克服するためのさらなる要素を提供することは任意である。
【００４０】
自己標的化効果（すなわち、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１が患者のＴ細胞、患者のＮＫ細胞または治療用のＮＫ細胞にも発現する）のためこれらの細胞タイプの１つまたはそれ以上が本発明の治療用ＮＫ細胞によって破壊され得るというリスクにもかかわらず、本発明の治療は、治療用ＮＫ細胞への曝露の期間を短縮して実施することができ、リスクを軽減する。ＮＫ細胞は一般に、循環して長期間、おそらく数週間までは生存せず（これはさまざまであるが）、自己標的化リスクを低減する。本発明は、患者において数ヶ月、さらには何ヶ月も持続するＴ細胞ではなく、ＣＡＲ−ＮＫ細胞を使用するため、本発明のＮＫ細胞の治療指数ははるかに広いと予想される。したがって、許容できる治療効果は、重大な負の副作用なしに達成することができる。
【００４１】
本発明によるＮＫ細胞または細胞株はまた、分裂できないようにするために処理または前処理されてもよい。これにより、患者の循環における寿命が例えばＴ細胞と比較してさらに短くなり、上記のリスクをさらに軽減する。そしてさらに、患者の腫瘍を形成する傾向が減少またはなくなる。これらの特徴についても、以下でより詳細に説明する。
【００４２】
本発明によるＮＫ細胞または細胞株は、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１の発現が減少するかまたは存在しないように、別々にまたはさらに改変され得る。例として、本発明の細胞および株は、必要に応じて、例えばｓｉＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲを用いる遺伝子改変によって達成可能な、ノックダウンまたはノックアウトされたＭＵＣ−１を有する。
【００４３】
好ましい実施形態では、細胞株は、ＫＨＹＧ−１細胞株の誘導体である。テストでは、この細胞株が異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１を発現せず、そのため自己標的効果を回避することを確認した。
【００４４】
本発明のＮＫ細胞および株は、患者の癌の治療に使用するためのものである。癌は、適切には固形癌（例えば、乳癌、卵巣癌、大腸癌）である。それは血液癌、特に急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む）、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、活動性骨髄腫および軽鎖骨髄腫から選択される血液癌、特に白血病または多発性骨髄腫であり得る。
【００４５】
好ましくは、本発明のＮＫ細胞およびＮＫ細胞株は、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対して本質的に耐性である癌を治療する際に使用するためのものである。
【００４６】
ＮＫ細胞耐性癌は当技術分野で周知である（Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｄ．Ｍ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０１５年）４２：６０５−６０６）。ＮＫ細胞を介した殺傷に対する癌細胞の感受性は、いくつかの要因によって決定される。癌細胞のリガンドと相互作用するＮＫ細胞の膜受容体を介して送達される、正と負のシグナルのバランスが存在する。多くの場合、癌がＮＫ細胞による殺傷に対して感受性であるか抵抗性であるかを決定するのは、これらの受容体に対するリガンドの発現のバランスである（Ｙｏｋｏｙａｍａ、Ｗ．Ｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ（２００５年）３２：３１７−３２５）。
【００４７】
ＮＫ細胞性細胞傷害性に対する癌感受性は、一般的に次のカテゴリーの１つに分類されると考えられている：非常に耐性、耐性、感受性、および非常に感受性。実験室では、細胞傷害性アッセイを使用して、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対する感受性について癌細胞がスクリーニングされ得る。次いで、各カテゴリーは、特定のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で、特定の時間、ＮＫ細胞への曝露中に殺滅された癌細胞の割合に対応するものとして理解される。
【００４８】
本発明の例において、最大５：１のＥ：Ｔ比で最大１５時間ＮＫ細胞とインキュベートした後に２５％以下の癌細胞が死滅すれば、癌はＮＫ細胞媒介殺傷に非常に耐性があると言われる。好ましくは、ＮＫ細胞はＫＨＹＧ−１細胞である。
【００４９】
本発明の例において、最大５：１のＥ：Ｔ比で最大１５時間ＮＫ細胞とインキュベートした後、５０％以下の癌細胞が死滅すれば、癌はＮＫ細胞媒介殺傷に耐性があると言われる。好ましくは、ＮＫ細胞はＫＨＹＧ−１細胞である。
【００５０】
本発明の例において、最大５：１のＥ：Ｔ比で最大１５時間ＮＫ細胞とインキュベートした後、５０％を上回る癌細胞が死滅すれば、癌はＮＫ細胞媒介性殺傷に感受性があると言われる。好ましくは、ＮＫ細胞はＫＨＹＧ−１細胞である。
【００５１】
本発明の例において、最大５：１のＥ：Ｔ比で最大１５時間ＮＫ細胞とインキュベートした後７５％以上の癌細胞が死滅すれば、癌はＮＫ細胞媒介性殺傷に非常に感受性があると言われる。好ましくは、ＮＫ細胞はＫＨＹＧ−１細胞である。
【００５２】
ＮＫ細胞の調製では、細胞がＮＫ細胞に分化する前に遺伝子組み換えが行われることがあり得る。例えば、多能性幹細胞（例えばｉＰＳＣ）を遺伝子改変した後、分化させて、細胞傷害性が増加した遺伝子改変ＣＡＲ  ＮＫ細胞が作製され得る。
【００５３】
本発明の特定の実施形態では、チェックポイント阻害性受容体機能が低減または存在しないようにさらに改変されたＮＫ細胞が提供される。腫瘍関連ＭＵＣ−１を標的とする組み合わせは、特に固形腫瘍、特に卵巣、乳房および／または結腸直腸に対して有効であり得る。１つまたはそれ以上のチェックポイント阻害性受容体遺伝子がノックアウトされたＮＫ細胞が産生され得る。好ましくは、これらの受容体は、特定のチェックポイント阻害受容体である。さらに好ましくは、これらのチェックポイント阻害受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよび／またはＴＩＭ−３の１つまたはそれ以上あるいはすべてである。他の実施形態では、１つまたはそれ以上の阻害性受容体シグナル伝達経路がノックアウトされるか、または機能の低下を示し、その結果、再び阻害性受容体機能が低下または欠如する、ＮＫ細胞が提供される。例えば、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、および／またはＳＨＩＰによって媒介されるシグナル伝達経路は、細胞の遺伝子改変によってノックアウトされる。
【００５４】
ＮＫ細胞の活性化に伴う前者の発現により、他の阻害性受容体よりもチェックポイント阻害性受容体の機能を低下させることが好ましい。ＫＩＲファミリーの大部分であるＮＫＧ２ＡやＬＩＲ−２などの通常のまたは「古典的な」抑制性受容体は、ＭＨＣクラスＩに結合し、そのため、主に自己標的化の問題の軽減に関与する。したがって、好ましくは、チェックポイント阻害受容体はノックアウトされる。本発明によるこれらの受容体の機能の低下または欠如は、癌細胞が免疫エフェクター機能を抑制しないようにする（さもなければ、受容体が完全に機能的であった場合に起こり得る）。したがって、本発明のこれらの実施形態の重要な利点は、癌細胞によるそれらの細胞傷害性活性の抑制の影響を受けにくいＮＫ細胞にあり、結果として、それらは癌治療に有用である。
【００５５】
本明細書中で用いられるように、阻害性受容体への参照は、一般に、免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞）の原形質膜上に発現される受容体を指す。その相補的リガンドに結合すると、細胞内シグナルを生じ、当該免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を低下させる原因となる。これらの抑制性受容体は、免疫エフェクター細胞の「休止」状態と「活性化」状態との両方で発現し、多くの場合、免疫系に細胞と体の組織に対する細胞傷害性反応を抑制する「自己寛容」メカニズムを提供することに関連している。例としては、ＮＫ細胞に発現し、体の健康な細胞に発現するＭＨＣクラスＩを認識する抑制性受容体ファミリー「ＫＩＲ」がある。
【００５６】
また、本明細書中で用いられるように、チェックポイント阻害受容体は、通常、上記の阻害受容体のサブセットと見なされる。しかし、他の阻害性受容体とは異なり、チェックポイント阻害性受容体は、免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞）の長期活性化および細胞傷害性の間、より高いレベルで発現される。この現象は、例えば炎症部位での慢性細胞傷害性を抑制するのに役立つ。例としては、チェックポイント阻害受容体ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ９６があり、これらはすべてＮＫ細胞で発現される。
【００５７】
したがって、本発明はまた、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１に結合し、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３から選択されるチェックポイント阻害受容体をコードする遺伝子を欠くＮＫ細胞も提供する。
【００５８】
遺伝子の欠如とは、機能的遺伝子産物が発現されない結果となる、完全なまたは部分的な欠失、突然変異、またはその他を指していう。実施形態では、ＮＫ細胞は、２つまたはそれ以上の阻害性受容体をコードする遺伝子を欠いている。
【００５９】
より具体的な実施形態は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）、特にＣＤ９６またはＣＤ３２８から選択されるチェックポイント阻害受容体をコードする遺伝子を欠くＮＫ細胞を含む。
【００６０】
以下の実施例に記載される特定の一実施形態では、本発明のＮＫ細胞は、シグレックリガンドを発現する癌に対して細胞傷害性であった。このような癌については、ＳＩＧＬＥＣ９および／または特にＳＩＧＬＥＣ７が低減または存在しない本発明のＮＫ細胞が好ましい。
【００６１】
本発明の他の実施形態では、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１に結合し、また、ＴＲＡＩＬリガンド、または好ましくは、変異体（改変体）ＴＲＡＩＬリガンドを発現している、ＮＫ細胞が提供される。生じたＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬ受容体への結合の増加を示し、その結果、癌、特に固形癌、特に卵巣癌、乳癌および結腸直腸癌、ならびに血液癌、特に白血病に対する細胞傷害性の増加を示す。この組み合わされた活性を有するＮＫ細胞はまた、癌転移を減少させるのに有効であり得る。
【００６２】
ＴＲＡＩＬ変異体／改変体は、デコイ受容体への野生型ＴＲＡＩＬの結合と比較して、「デコイ」受容体に対する親和性が低い（または実際には親和性がない）ことが好ましい。このようなデコイ受容体は、ＴＲＡＩＬリガンドに結合するが細胞死を開始する能力を持たず、場合によっては死シグナル伝達経路に拮抗するように作用するクラスのＴＲＡＩＬ受容体を表す。変異体／改変体ＴＲＡＩＬリガンドは、ＷＯ２００９／０７７８５７に従って調製され得る。
【００６３】
変異体／改変体は、ＴＲＡＩＬ受容体（例えばＤＲ４およびＤＲ５）に対する親和性が別々に増加していてもよい。野生型ＴＲＡＩＬは通常、ＤＲ４で＞２ｎＭ、ＤＲ５で＞５ｎＭ、デコイ受容体ＤｃＲ１で＞２０ｎＭ（ＷＯ２００９／０７７８５７、表面プラズモン共鳴により測定）、またはＤＲ４で５０〜１００ｎＭ、ＤＲ５で１〜１０ｎＭ、ＤｃＲ１で１７５〜２２５ｎＭ（Ｔｒｕｎｅｈ、Ａ．ら、２０００年；等温滴定熱量測定およびＥＬＩＳＡで測定）のＫＤを有することが知られている。したがって、ＤＲ４についての親和性の増加は、それぞれ＜２ｎＭまたは＜５０ｎＭのＫＤとして適切に定義されるが、ＤＲ５についての増加した親和性は、それぞれ＜５ｎＭまたは＜１ｎＭのＫＤとして適切に定義される。デコイ受容体ＤｃＲ１についての減少した親和性は、それぞれ、＞５０ｎＭまたは＞２２５ｎＭのＫＤとして適切に定義される。いずれの場合も、ＴＲＡＩＬ改変体／変異体によって示される親和性の増加または減少は、野生型ＴＲＡＩＬによって示されるベースライン親和性に関連する。親和性は、野生型ＴＲＡＩＬによって示される親和性と比較して、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％増加する。
【００６４】
ＴＲＡＩＬ改変体は、好ましくは、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２についての親和性と比較して、ＤＲ５についての増加した親和性を有する。好ましくは、親和性は、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２の１つまたはそれ以上よりも、ＤＲ５について少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、あるいは１，０００倍またはそれ以上でさえある。より好ましくは、親和性は、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２の少なくとも２つ、好ましくはすべてよりも、ＤＲ５について少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、あるいは１，０００倍またはそれ以上でさえある。
【００６５】
ＴＲＡＩＬ改変体は、好ましくは、野生型ＴＲＡＩＬについてのその親和性と比較して、ＤＲ４およびＤＲ５の一方または両方に対して増大した親和性を有する。好ましくは、親和性は、野生型ＴＲＡＩＬよりも、ＤＲ４および／またはＤＲ５に対して、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、あるいは１０００倍またはそれ以上でさえある。
【００６６】
高親和性ＴＲＡＩＬ改変体は、上記で定義したように、ＴＲＡＩＬ死受容体に対する親和性を増加させている。
【００６７】
さらなる特定の実施形態は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対する親和性が低下しているかまたは親和性がない変異ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞を含む。さらなる特定の実施形態は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対する親和性が低下しているかまたは親和性がなく、ＤＲ４および／またはＤＲ５についての親和性が増大している変異ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞を含む。
【００６８】
ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ改変体を発現する改変ＮＫ細胞を使用する癌の治療は、癌細胞上のＴＲＡＩＬ死受容体の発現をアップレギュレートすることができる薬剤を患者に投与することにより、必要に応じて増強される。この薬剤は、改変されたＮＫ細胞の投与の前に、それと組み合わせて、またはその後に投与され得る。しかし、改変されたＮＫ細胞を投与する前に薬剤を投与することが好ましい。薬剤は、癌細胞上のＤＲ５の発現をアップレギュレートする。薬剤は、必要に応じて化学療法薬（例えば、プロテアソーム阻害剤。その１つはボルテゾミブである）であり、癌のＤＲ５発現をアップレギュレートできる低用量で投与される。ＤＲ５誘導剤の他の例には、ゲフィチニブ、ピペルロングミン、ドキソルビシン、コハク酸α−トコフェリルおよびＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる。
【００６９】
異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１への結合は、好ましくはＣＡＲを使用して達成される。本発明の細胞または株で使用されるＣＡＲは、１つまたはそれ以上のＮＫ細胞共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ３ζ／ＣＤ２４７、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０を含むか、またはそれに連結され得る。したがって、標的細胞上のその受容体への改変体の結合は、標的細胞内のアポトーシスシグナルを促進するとともに、ＮＫ細胞における細胞傷害性シグナルを刺激する。以下の実施例では、ＣＡＲはＣＤ２８、ＯＸ４０、およびＣＤ３ζで構成されている。
【００７０】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１に結合するＣＡＲを発現するＮＫ細胞が提供され、チェックポイント阻害受容体機能が低下し、これら各々のＮＫ細胞の改変に関連して上記でより詳細に記載したように変異ＴＲＡＩＬリガンドも発現する。
【００７１】
本発明の任意の特徴は、上記のＮＫ細胞およびＮＫ細胞株にさらなる改変を提供することを含み、例えば、Ｆｃ受容体（サブタイプおよび誘導体を含む、ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４であり得る）は、細胞の表層に発現される。使用中、これらの細胞は、抗体でコーティングされた癌細胞の認識の増加と細胞傷害性応答の改善された活性化を示す。
【００７２】
本発明のさらなる任意の特徴は、身体の特定の標的領域によりよくホーミングするように改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を適合させることを含む。本発明のＮＫ細胞は、特定の癌細胞位置に対して標的され得る。血液癌の治療のための好ましい実施形態では、本発明のＮＫエフェクターは、骨髄にホーミングするように適合されている。特定のＮＫ細胞は、フコシル化および／またはシアル化によって骨髄に戻るように改変される。これは、適切なフコシルトランスフェラーゼおよび／またはシアリルトランスフェラーゼをそれぞれ発現するようにＮＫ細胞を遺伝的に改変することによって達成され得る。腫瘍部位へのＮＫエフェクター細胞のホーミングの増加は、腫瘍血管系の破壊、例えばメトロノーム化学療法によるか、または血管新生を標的とする薬物（Ｍｅｌｅｒｏら、２０１４年）を使用して、癌血管を介してＮＫ細胞浸潤を正常化する。
【００７３】
本発明のさらに別の任意の特徴は、培養中の急速な成長および増殖について増大した固有の能力を有する改変されたＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を提供することである。これは、例えば、成長誘導サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１５を過剰発現させるように細胞をトランスフェクトすることにより達成することができる。さらに、このオプションの変更は、継続的に成長培地にサイトカインを補充することに対する費用対効果の高い代替手段を提供する。これらの細胞は、治療適用（前述のように、患者における分裂を防ぐための照射などの治療を含めることができる）前に、後続の処理（例えば、分裂能力を低下させる）のために、著量の細胞を調製するための中間体として使用できる。
【００７４】
本発明はさらに、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１に結合するＣＡＲを発現するように、本明細書に記載の細胞または細胞株を遺伝子改変する工程を含む、改変ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を作製する方法を提供する。
【００７５】
本明細書中上記および以下に記載される改変されたＮＫ細胞、ＮＫ細胞株およびそれらの組成物は、癌、特にヒトにおける癌の治療（例えば、血液細胞の癌または固形癌の治療）に適している。ＮＫ細胞および誘導体は、好ましくはヒトＮＫ細胞である。ヒトの治療には、ヒトＮＫ細胞を使用することが好ましい。本発明はまた、有効量の細胞または細胞株または組成物を投与することを含む、ヒトの癌を治療する方法を提供する。
【００７６】
活性剤およびそれらの組み合わせを必要とする患者に送達するための様々な投与経路が当業者に知られている。本発明の実施形態は、血液癌治療のためのものである。改変されたＮＫ細胞および／またはＮＫ細胞株の投与は、例えば腹腔内経路を介するなど、全身的または局所的であり得る。
【００７７】
他の実施形態では、活性剤はより直接的に投与される。したがって、投与は腫瘍内に直接行うことができ、特に固形腫瘍に適している。
【００７８】
ＮＫ細胞は一般に、本発明の方法、使用および組成物に適していると考えられている。本明細書の特定の例で使用される細胞ごとに、ＮＫ細胞は、癌細胞株から得られたＮＫ細胞であり得る。有利には、ＮＫ細胞（好ましくは、（例えばそれを死滅させるかつ／または分裂不能にすることにより）その腫瘍形成能を低下させるように処理された）が血液癌細胞株から得られ、血液癌を治療するために本発明の方法で使用することができる。
【００７９】
癌由来のＮＫ細胞を治療的使用に対してより許容できるものとするために、それは一般に、患者に腫瘍を形成する傾向を低減または除去するように、何らかの方法で処理または前処理される。実施例で使用される特定の改変されたＮＫ細胞株は分裂不能にされたので、安全である。それらは照射されてその殺傷能力を保持するが、約３〜４日以内に死亡する。したがって、特定の細胞および細胞株は、例えば照射の結果として、増殖することができない。本明細書の方法で使用する潜在的ＮＫ細胞の処理としては、それらがインビボで分裂して腫瘍を形成するのを防ぐための照射、および腫瘍形成性を低下させるための遺伝子改変（例えば、インビボで細胞が分裂して腫瘍を形成するのを防ぐように活性化され得る、自殺遺伝子をコードする配列を挿入することによる）が挙げられる。自殺遺伝子は、外因性要因（例えば循環する要因）によってオンとされ得、次いで、その遺伝子を発現している細胞で細胞死を引き起こす。さらなる代替は、治療の特定のＮＫ細胞を標的とするモノクローナル抗体の使用である。たとえば、ＣＤ５２はＫＨＹＧ−１細胞で発現し、このマーカーへのモノクローナル抗体の結合は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）およびＫＨＹＧ−１細胞死を引き起こす。
【００８０】
Suck et al、2006により公開された文献で説明されているように、癌由来のＮＫ細胞および細胞株は、Gammacell 3000 Elanなどの照射装置を使用して容易に照射できる。セシウム１３７の線源を放射線の線量を制御するために使用し、例えば１Ｇｙと５０Ｇｙの間の線量応答曲線が、増大した細胞傷害性の利益を維持しつつ細胞の増殖能を排除するための最適線量を決定するために用いられ得る。これは、放射線の各線量が投与された後に細胞傷害性について細胞をアッセイすることによって達成される。
【００８１】
養子細胞免疫療法に照射されたＮＫ細胞株を使用することには、十分樹立された自家またはＭＨＣ適合性のＴ細胞アプローチを上回る重要な利点がある。第一に、増殖性の高いＮＫ細胞株を使用することで、改変されたＮＫ細胞株の増殖がより容易に、商業レベルで達成できるようになる。次に、細胞を患者に投与する前に、改変されたＮＫ細胞株の照射を行うことができる。これらの照射された細胞は、それらの有用な細胞傷害性を保持するものであるが、寿命が限られており、よって、改変されたＴ細胞とは異なり、永続的な副作用を引き起こす長期間にわたって循環しない。
【００８２】
さらに、同種ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の使用により、患者のＭＨＣクラスＩ発現細胞は、自己ＮＫ細胞傷害性応答に対して可能であるのと同じようにはＮＫ細胞傷害性応答を阻害することができなくなる。癌細胞殺傷に同種ＮＫ細胞および細胞株を使用することは、前述のＧＶＬ効果の恩恵を受ける。そして、Ｔ細胞とは異なり、同種ＮＫ細胞と細胞株はＧＶＨＤの発症を刺激しないため、養子細胞免疫療法による癌の治療の好ましい選択肢ともなる。
【００８３】
本発明のさらなる局面では、上記および下記のＭＵＣ−１  ＮＫ−ＣＡＲによる癌の治療を続行するかどうかを決定する前に、ＮＫ細胞媒介細胞傷害性に対する癌の感受性を評価する方法が提供される。
【００８４】
したがって、（１）患者から１つまたはそれ以上の癌細胞を単離する工程、（２）ＮＫ細胞の比細胞傷害性の％を測定することにより１つまたはそれ以上の癌細胞がＮＫ細胞耐性であるかどうかを決定する工程、ならびに（３）工程（２）の知見に基づいて癌を治療するかどうかに関する決定を行う工程を含み、１つまたはそれ以上の癌細胞がＮＫ細胞耐性である場合に癌の治療が行われることを特徴とする、方法が提供される。
【００８５】
好ましくは、ＮＫ細胞耐性は、比細胞傷害性の％が５０％またはそれ以下であるものとして定義される。
【００８６】
好ましくは、本発明のＭＵＣ−１  ＮＫ−ＣＡＲは、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対して本質的に耐性がある患者の癌を治療するために使用される。
【００８７】
（実施形態）
本発明によれば、以下の実施形態が提供される。
１．腫瘍関連ムチン−１（ＭＵＣ−１）グリコフォームに結合するように改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫ細胞株。
【００８８】
２．野生型ＭＵＣ−１グリコフォームと比較して高い親和性で腫瘍関連ＭＵＣ−１グリコフォームに結合する膜結合部分を発現するようにＮＫ細胞またはＮＫ細胞株が遺伝子改変されている、実施形態１に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【００８９】
３．膜結合部分がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、実施形態２に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【００９０】
４．ＣＡＲがＨＭＦＧ２配列を含む、実施形態３に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【００９１】
５．腫瘍関連ＭＵＣ−１グリコフォームが、野生型グリコフォームと比較した場合、Ｔｎ、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）、Ｔ、およびシアリルＴ（ＳＴ）グリカンから選択されるより短いグリカンを優勢に含む、任意の先の実施形態に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【００９２】
６．患者において腫瘍を形成する傾向が低下しているかまたは存在しない、任意の先の実施形態に記載のＮＫ細胞または細胞株。
【００９３】
７．例えば照射により、分裂不能にされた、実施形態６に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【００９４】
８．異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１の発現が低減または欠如するように改変された、任意の先の実施形態に記載のＮＫ細胞または細胞株。
【００９５】
９．野生型ＴＲＡＩＬと比較した場合、１つまたはそれ以上のＴＲＡＩＬ死受容体に対して高い親和性を有する変異型ＴＲＡＩＬリガンドを発現するようにさらに改変された、任意の前の実施形態に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【００９６】
１０．変異型ＴＲＡＩＬリガンドがＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む、実施形態９に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【００９７】
１１．１つまたはそれ以上のチェックポイント阻害受容体の機能を除去するようにさらに改変された、任意の先の実施形態に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【００９８】
１２．細胞株がＫＨＹＧ−１細胞株の誘導体である、任意の先の実施形態のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【００９９】
１３．患者の癌を治療する際に使用するための、任意の先の実施形態に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【０１００】
１４．癌が固形癌であり、例えば、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌から選択される、実施形態１３に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【０１０１】
１５．癌が血液癌であり、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む）、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、活動性骨髄腫、および軽鎖骨髄腫から選択される、実施形態１４に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【実施例】
【０１０２】
本発明は、異常にグリコシル化されたＭＵＣ−１に結合する能力を介してより高い細胞傷害性活性を示すように改変されたＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１誘導体の産生に関して、より具体的な詳細で説明される。
【０１０３】
添付の図面を参照して、本発明を特定の実施形態で説明する。
【０１０４】
以下に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアミノ酸配列について言及する。
配列番号１はＭＵＣ−１  ＣＡＲ  ＤＮＡ配列である；
配列番号２はＭＵＣ−１  ＣＡＲペプチド配列である；そして
配列番号３は、ＭＵＣ−１結合に使用される２４ｍｅｒのペプチド染色配列である。
【０１０５】
配列番号１
ATGTGGCAACTGCTGCTGCCTACAGCTCTGCTGCTTCTGGTGTCCGCCGATATCGTGGTCACACAAGAGAGCGCCCTGACCACCTCTCCTGGCGAAACAGTGACCCTGACCTGCAGATCTTCTACAGGCGCCGTGACCACAAGCAACTACGCCAACTGGGTGCAAGAGAAGCCCGATCACCTGTTCACAGGCCTGATCGGCGGCACAAACAATAGAGCACCTGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGATCTCTGATCGGAGACAAGGCCGCACTGACAATCACAGGCGCCCAGACAGAGGACGAGGCCATCTACTTTTGCGCCCTGTGGTACAGCAACCACTGGGTTTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACAGTGCTGGGATCTGAAGGTGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGAGGTTCTGAAGTTCAGCTGCAACAATCTGGCGGCGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTATGAAGCTGAGCTGTGTGGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACTGGATGAACTGGGTCCGACAGAGCCCCGAGAAAGGCCTGGAATGGGTTGCCGAGATCAGACTGAAGTCCAACAATTACGCCACACACTACGCCGAGAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAGCAGCGTGTACCTCCAGATGAACAACCTGAGAGCCGAGGACACCGGCATCTACTACTGCACCTTCGGCAACAGCTTCGCCTATTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACCGTGTCCAGCACCTTCACCTGTTTTGTCGTGGGCAGCGACCTGAAGGATGCCCACCTGACATGGGAAGTCGCCGGCAAAGTTCCTACCGGTGGCGTGGAAGAAGGCCTGCTGGAAAGACACAGCAACGGCAGCCAGAGCCAGCACAGCAGACTGACACTGCCTAGAAGCCTGTGGAATGCCGGCACCAGCGTGACCTGCACACTGAATCATCCTAGCCTGCCTCCACAGAGACTGATGGCCCTGAGAGAACCTGCTGCTCAGGCCCCTGTGAAGCTGTCCCTGAATCTGCTCGCCAGCAGCGATCCTCCTGAAGCCGCCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAGACAAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCAAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGACAGCCCGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAACTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACTTTTGGGTGCTCGTGGTTGTTGGCGGAGTGCTGGCCTGTTACAGCCTGCTGGTTACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTCCGAAGCAAGCGGAGCCGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACAGAAGCAGACGGGACCAAAGACTGCCTCCTGACGCTCACAAACCTCCAGGCGGCGGAAGCTTCAGGACCCCTATCCAAGAAGAACAGGCTGACGCCCACAGCACCCTGGCCAAGATCCGCGTGAAGTTCTCCAGATCCGCCGACGCTCCTGCCTATCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGAAAGCCCCAGCGGAGAAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGACGCCCTGCACATGCAGGCTCTGCCTCCA
【０１０６】
配列番号２
MWQLLLPTALLLLVSADIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSTFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAANVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
【０１０７】
配列番号３
TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPP
【０１０８】
ＭＵＣ１キメラ抗原受容体の予想される分子量は、８１３アミノ酸＝８９．６ｋＤａであり、その中で、ＭＵＣ１  ＣＡＲの一本鎖可変フラグメントと活性化ドメインの配列はは次のとおりである。
【０１０９】
【表１】
2021503954.tif 000003
【０１１０】
抑制性受容体機能のノックアウト／ノックダウンおよび変異型ＴＲＡＩＬのノックインの関連例については、ＷＯ２０１７／０１７１８４（その内容が参照により本明細書に援用される）を参照する。
【０１１１】
（実施例１−ＭＵＣ−１−ＣＡＲをコードするレンチウイルスプラスミド）
腫瘍関連抗原ＭＵＣ−１（配列番号１）を認識するＨＭＦＧ２クローンに由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードするＤＮＡヌクレオチドを、ｐＣＤＣＡＲ１−ＧＦＰベクターにクローニングした。このｓｃＦｖ配列の後に、追加の免疫グロブリンベースのヒンジ領域が続き、ＭＵＣ−１の立体障害を克服した。ＮＫ細胞傷害性に対する活性化シグナルを提供するために、ヒンジ領域の後に、ＣＤ２８、ＯＸ４０、およびＣＤ３ζの共刺激活性化ドメインが続き、それによってＭＵＣ−１陽性腫瘍細胞の細胞溶解を誘発する。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）タンパク質（配列番号２）に続いて、選択マーカー高感度緑色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＧＦＰ）をＴ２Ａ配列の下流に配置し、ＣＡＲとＥＧＦＰを分離した。この配列を、ｐＣＤＣＡＲ１−ＧＦＰベクターのＥｃｏＲＩとＸｂａＩ制限部位との間にクローニングした（図１および２を参照）。
【０１１２】
適格な大腸菌バクテリアの１５０μｌバイアルを氷上で解凍した。その間、ラベルのないチューブを氷上で冷やした。最後の結晶が溶けたら、５０μｌの細胞を１μｌの適切な希釈プラスミド溶液（５ｎｇ／μｌ）とともに、すぐに各冷却チューブに移した。次に、管を氷上に３０分間置いた。４２℃に設定したウォーターバスにチューブを３０秒間浸し、氷上で５分間冷却することにより、細胞に熱ショックを与えた。９５０μｌの室温ＬＢブロスを各チューブに加え、チューブを軽くたたいて均一な混合物にした。チューブをインキュベーター（３７℃）のシェーカー（２５０ｒｐｍ）に１時間置いた。次に、各プラスミド溶液５０μｌを、アンピシリンを含む対応する寒天プレートに加えた。プレートをインキュベーター内で一晩反転させて保存して、プラスミドを含む細菌を増殖させ、単一のコロニーを形成させた（１４〜１６時間）。プレートの１つからコロニーを選択した。オートクレーブ処理されたピペットチップを使用して、コロニーを採取し、対応する培養チューブの内面に塗りつけた。次に、チューブをインキュベーター（３７℃）内のシェーカー（１２５ｒｐｍ）に一晩置いて、最大１６時間放置した。プラスミドＤＮＡを、製造元の指示に従って単離した。プラスミドを制限酵素による制限消化により確認した。細菌培養物（２．５ｍｌ）を、アンピシリンを含む２４７．５ｍｌのＬＢブロスに加えた。次に、２５０ｍｌの細菌溶液を５０ｍｌのチューブに分け、−２０℃で保存した。
【０１１３】
細菌細胞ペレットを含むラベル付きの５０ｍｌチューブを−２０℃の冷凍庫から取り出し、ベンチで数分間解凍した。最初の細胞ペレットをボルテックスし、ＲＮａｓｅ  Ａを含む１２ｍｌの再懸濁バッファーに再懸濁した。１２ｍｌの溶解バッファーを懸濁液に加えた。懸濁液を混合するために逆さにしてから、室温で５分間インキュベートした。１２ｍｌの中和バッファーを各懸濁液に加え、サンプルが青から無色に変わるまでチューブを反転させた。次に、粗溶解物を氷上で５分間インキュベートした。カラムフィルターをＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａカラムに挿入した後、各カラムフィルターの縁に１５ｍｌの平衡化バッファーを適用して、カラム全体とその周囲を確実に湿らせた。重力流によりカラムをカラムラックの下の水盤に空にした。溶解物をそれらの指定されたカラムフィルターに注いだ。カラムフィルターを５ｍｌのフィルターウォッシュバッファーで洗浄し、上記のようにフィルターの漏斗状の縁にバッファーが適用することを確実とする。次に、カラムを重力流により空にした。カラムフィルターを取り除いて廃棄した。ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａカラムを３５ｍｌの洗浄バッファーで洗浄した後、重力流によりカラムを空にした。カラムの洗浄では、バッファーをリム上ではなく、静かに中央に直接ピペッティングした。次に、この洗浄工程を繰り返した。１５ｍｌチューブを各カラムの下に配置して、溶出液を収集した。プラスミドＤＮＡを５ｍｌのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒの入ったカラムから溶出した。溶出したプラスミドＤＮＡを沈殿させるために、室温のイソプロパノール３．５ｍｌを各１５ｍｌチューブにピペッティングした。次に、チューブを完全にボルテックスした。上澄みを注意深く吸引する前に、チューブを４５００ｒｐｍで４℃にて４０分間遠心分離した。エンドトキシンフリーの室温７０％エタノール２ｍｌを各ペレットに加えた。次に、チューブを室温で４５００×ｇで１０分間遠心分離した。各チューブからエタノールをピペットを使用して除去し、ペレットがわずかに不透明からより半透明のガラス状の外観に変わるまで、室温でフードの下で乾燥させた。次に、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用してＤＮＡ濃度を測定し、ＤＮＡペレットを４００μｌのＨ２Ｏ−ＥＦに溶解させた。
【０１１４】
（実施例２−ＭＵＣ−１  ＣＡＲプラスミドのＫＨＹＧ−１細胞へのヌクレオフェクション）
ＫＨＹＧ−１細胞を、細胞が対数増殖期にある間、Ｔ２５フラスコでのヌクレオフェクションの前日に１：１（５ｍｌ細胞＋５ｍｌ培養培地）で継代させた。Lonza NucleofectionキットＴ（Cat：VCA-1002）を使用した。１つのヌクレオフェクションサンプルは、１００μｌのヌクレオフェクション溶液（標準キュベット）と２×１０６細胞を含んだ。ヌクレオフェクション溶液には１８μｌのサプリメントと新しく調製した８２μｌのＮｕｌｃｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液（サンプルあたり）を含み、３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１１５】
溶液Ｔを室温に温めた。２．４ｍｌのＦＢＳ、９．６ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０、および６μｌのＩＬ−２（ＲＰＭＩ１６４０＋２０％ＦＢＳ＋５００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２）を含む培地（ＣＭ）の新鮮な１２ｍｌアリコートを準備し、１５ｍｌのチューブに３７℃で入れた（抗生物質なし））。４ｍｌのＣＭをＴ２５フラスコに等分し、プレートを３７℃の加湿インキュベーターで２０分間プレインキュベートした。１５ｍｌチューブで１０ｍｌの細胞培養物を採取し、細胞をカウントして細胞密度を決定した。２×１０６サンプルを１５ｍｌチューブに分注し、１０００ＲＰＭで５分間遠心分離した（acc.9/decc.7）。残留培地が細胞ペレットを覆わないように上清を完全に廃棄した。細胞ペレットを１００μｌの室温Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（上記参照）に再懸濁し、最終濃度を２×１０６細胞／１００μｌにした。細胞懸濁液をＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中に５分より長く保管することを避けた。これは、細胞生存率と遺伝子導入効率を低下させることが知られているためである。０．２〜２μｇのＬｅｎｔｉ−ＥＦ１ａ−ＭＵＣ１−ＣＡＲプラスミドＤＮＡを各チューブに加えた。次に、サンプルをＡｍａｘａ認定のキュベットに移し、ピペッティング中の気泡を避けるために、サンプルがキュベットの底を覆っていることを確認する。キュベットを青いキャップで閉じ、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラムＡ−０２４を選択した。「ｘ」ボタンを押してプログラムを開始する前に、キュベットをキュベットホルダーに挿入した（注：プログラムＵ−００１も使用できる）。セルの損傷を避けるために、プログラムが終了した直後にサンプルをキュベットから取り出した（ディスプレイは「ＯＫ」と表示）。予め温めた培地をキュベットに加え、サンプルを１つのＴ２５フラスコに移した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒをリセットするために「Ｘ」ボタンを押した。加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで細胞を４８時間インキュベートした。２〜４ｍｌの新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２）を追加し、細胞をさらに２４〜９６時間インキュベートして、最適なタンパク質発現を確立した（注：細胞培養は顕微鏡を用いて２４時間ごとに監視し、細胞の状態および条件を確認した）。フローサイトメトリー分析をヌクレオフェクションの７２〜２４０時間後に行った。
【０１１６】
ＭＵＣ−１  ＣＡＲプラスミドは、選択マーカーとしてＥＧＦＰを有していた。したがって、ＭＵＣ−１  ＣＡＲを発現するＫＨＹＧ−１細胞を、ＧＦＰ陽性ＫＨＹＧ−１細胞の数を推定することによって測定し得る。
【０１１７】
０．５ｍｌの細胞懸濁液（１×１０５細胞）を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を捨て、１ｍｌのＦＡＣＳバッファーを加え、１２００ｒｐｍで５分間再び遠心分離した。細胞を最終容量２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。
【０１１８】
次に、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  Ａで４８８ｎｍレーザーと５３０／３０の検出フィルターを使用するフローサイトメトリーを使用して細胞を分析した。ＧＦＰ陽性細胞の存在がトランスフェクションの成功を確認した。
【０１１９】
（実施例３−ＭＵＣ−１  ＣＡＲ−ＫＨＹＧ−１細胞による血液癌細胞の殺傷）
ＮＫ細胞の細胞傷害性を、Ｕ２６６およびＲＰＭＩ−８２２６標的多発性骨髄腫細胞を使用して測定した（両方とも事前にＦＡＣＳスクリーニングを行い、標的上のＭＵＣ−１発現を確認する；ＲＰＭＩ−８２２６はシグレックリガンドも発現する）。エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は０．１２５：１、０．２５：１、０．５：１、１：１、２：１であり、１４時間アッセイで、１００μｌあたり４０，０００個の標的腫瘍細胞を９６ウェルの平底プレートに播種した。モックトランスフェクトされたＫＨＹＧ−１細胞またはＭＵＣ−１−ＣＡＲトランスフェクトされたＫＨＹＧ−１細胞を遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を１ｍｌの新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２）に再懸濁し、カウントした。次に、ＫＨＹＧ−１細胞を最終濃度８００，０００細胞／１００μｌにし、腫瘍細胞と合わせて最終容量を２００μｌにした。最終反応のＩＬ−２濃度は５０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２であった。その後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１４時間インキュベートした。
【０１２０】
ＮＫ細胞誘導標的細胞死を、フローサイトメトリーによって測定した。２０００ＲＰＭで３分間遠心分離する前に、エッペンドルフリピーターユニットを使用して、ＦＡＣＳチューブに２００μｌのＦＡＣＳバッファーをあらかじめ充填した。上清を逆さにしてから、乾いたきれいな紙に吸い取って廃棄した。ボルテックスを使用して細胞をチューブに再懸濁した。４μｌの希釈したＣＤ２  ＢＶ４２１抗体を加え、氷上で暗所で２０分間インキュベートした。エッペンドルフリピーターユニットを使用して２００μｌのＦＡＣＳバッファーを添加した後、２０００ＲＰＭで３分間回転させ、逆さにして上清を捨て、きれいな乾いた紙で吸い取った。次に、細胞をボルテックスを使用してチューブに再懸濁した。エッペンドルフリピーターユニットを備えた３０本の各チューブに２００μｌのＦＡＣＳバッファーを添加した。２μｌのヨウ化プロピジウムを各チューブに加え、２〜３分待ってから、フローサイトメトリーを使用して各チューブを分析した。
【０１２１】
ＫＨＹＧ１細胞でのＣＤ２発現を、４０５ｎｍレーザーおよび検出器４５０／５０を使用して測定し、ヨウ化プロピジウムを、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで４８８ｎｍレーザーと５８５／４２の検出フィルターとで細胞を励起して測定した。
【０１２２】
結果は、ＭＵＣ−１  ＣＡＲ  ＫＨＹＧ−１細胞が、Ｕ２６６およびＲＰＭＩ８２２６標的の両方に対してＣＡＲを発現していないＫＨＹＧ−１細胞よりも高い細胞傷害性を示したことを確認した。
【０１２３】
（実施例４−ＭＵＣ−１  ＣＡＲ−ＫＨＹＧ−１細胞による乳癌細胞の殺傷）
（乳癌細胞におけるＭＵＣ−１の発現）
乳癌細胞株ＨＣＣ−１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−１９５４およびＺＲ−７５−１のＭＵＣ−１発現をフローサイトメトリーを使用して分析した。手短に言えば、細胞を抗ＭＵＣ１（クローン：ＨＭＦＧ２）−ＡＦ６４７（カタログ：ＢＤ  ５６６５９０）で２５分間氷上で染色し、続いてＭＵＣ−１発現を６３３／６６０／２０を使用してＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで測定した。発現分析により、乳癌細胞株はすべて、細胞表面でＭＵＣ−１が発現していることが分かったが、レベルは異なっていた。したがって、ＭＵＣ−１は、本発明のＭＵＣ−１  ＮＫ−ＣＡＲの適切な候補標的抗原を表した。
【０１２４】
（ＭＵＣ−１  ＣＡＲによるＮＫ細胞のトランスフェクション）
ＭＵＣ−１  ＣＡＲのｍＲＮＡを、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈのインビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して合成した。ＥＧＦＰ配列は、ＣＡＲ活性を損なうことなくｍＲＮＡのサイズを小さくするために、ｍＲＮＡ構築物から除外した。
【０１２５】
ＫＨＹＧ−１細胞に、１２．５μｇのＭＵＣ−１  ＣＡＲ発現ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。ＫＨＹＧ−１細胞を対照として使用するためにモックエレクトロポレーションした。両方のサンプルを２４時間インキュベートして、ＭＵＣ−１  ＣＡＲ構築物のタンパク質発現を可能にした。２４時間後、細胞を２４ｍｅｒのペプチド配列（ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ−ＯＨ）で染色し、５（６）カルボキシ−フルオレセイン（ＪＰＴペプチドソリューション）に３０分間コンジュゲートした。このペプチド配列はＭＵＣ−１  ＣＡＲに特異的に結合する。エレクトロポレーション後、８６％ＫＨＹＧ−１細胞はＭＵＣ−１  ＣＡＲ発現が陽性であった。モックエレクトロポレーションされたＫＨＹＧ−１細胞は、エレクトロポレーションの２４時間後に＜１％のＭＵＣ−１  ＣＡＲ＋細胞を示した。したがって、ＭＵＣ−１  ＣＡＲの発現の成功は、ＮＫ細胞で示された。
【０１２６】
（乳癌細胞に対するＭＵＣ−１  ＮＫ−ＣＡＲの細胞傷害性）
ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイを、９６ウェルの平底プレートで最終容量２００μｌで行った。１４時間の共培養後、細胞を採取し、ＣＤ２−ＢＶ−４２１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３０分間染色して、ＣＤ２陰性乳癌細胞とＣＤ２陰性ＫＨＹＧ−１細胞とを区別した。１．５μｌの１００μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム溶液を添加し、フローサイトメトリー分析の前に細胞を氷上で２分間インキュベートすることにより、細胞死を分析した。
【０１２７】
ＭＵＣ−１  ＮＫ−ＣＡＲと乳癌細胞株のパネルを共培養すると、ＭＵＣ−１  ＮＫ−ＣＡＲは、モックエレクトロポレーションしたＫＨＹＧ−１より、ＮＫ細胞耐性乳癌細胞株（ＨＣＣ−１９５４およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３）に対してより細胞傷害性が高いことを観察した。この観察は、複数のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で有効であった（図３ａ、３ｂ、および４を参照）。
【０１２８】
ＺＲ−７５−１細胞に対して、本発明のＭＵＣ−１  ＮＫ−ＣＡＲと対照細胞（モックエレクトロポレーションしたＫＨＹＧ−１）との間で細胞傷害性に差はなかった。この観察結果は、図３ｃに見られるように、ＺＲ−７５−１細胞はすでにＮＫ細胞媒介性殺傷に感受性であるとして、説明することができる。データは、１４時間の細胞傷害性共培養アッセイを代表する。ＮＫ細胞誘導腫瘍溶解は、ＣＤ２陰性乳癌細胞をゲーティングした後、ヨウ化プロピジウムを使用したフローサイトメトリーで測定した。
【０１２９】
したがって、本発明のＭＵＣ−１  ＮＫ−ＣＡＲは、特に癌がＮＫ細胞媒介性細胞傷害性に対して本質的に耐性である場合に、一連の癌タイプの殺傷に特に効果的であることが示される。
【０１３０】
したがって、本発明は、血液癌治療で使用するためのＮＫ細胞および細胞株、ならびにそれらの産生を提供する。
【図１】
2021503954.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月27日(2020.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＭＵＣ−１グリコフォームと比較して、少なくとも１０％の増加した親和性を有する腫瘍関連ムチン−１（ＭＵＣ−１）グリコフォームに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項２】
前記増加した親和性が少なくとも５０％である、請求項１のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項３】
前記ＣＡＲが、５Ｅ５、ＳＭ３またはＨＭＦＧ２に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１または２に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項４】
野生型グリコフォームと比較した場合、前記腫瘍関連ＭＵＣ−１グリコフォームが、Ｔｎ、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）、Ｔ、およびシアリルＴ（ＳＴ）グリカンから選択されるより短いグリカンを優勢に含む、請求項１から３のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項５】
患者において腫瘍を形成する傾向が低減されているかまたは存在しない、請求項１から４のいずれかに記載のＮＫ細胞または細胞株。
【請求項６】
照射により分裂不能にされた、請求項５に記載のＮＫ細胞または細胞株。
【請求項７】
癌関連ＭＵＣ−１グリコフォームの発現が減少するかまたは存在しないように改変された、請求項１から６のいずれかに記載のＮＫ細胞または細胞株。
【請求項８】
野生型ＴＲＡＩＬと比較した場合に、１つまたはそれ以上のＴＲＡＩＬ死受容体に対して少なくとも１０％高い親和性を有する変異型ＴＲＡＩＬリガンドを発現するようにさらに改変された、請求項１から７のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項９】
変異型ＴＲＡＩＬリガンドがＤ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む、請求項８に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１０】
１つまたはそれ以上のチェックポイント阻害性受容体の機能を除去するようにさらに改変された、請求項１から９のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１１】
前記チェックポイント阻害性受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３の１つまたはそれ以上あるいは全部から選択される、請求項１０に記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１２】
前記細胞株がＫＨＹＧ−１細胞株の誘導体である、請求項１から１１のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１３】
患者の癌の治療に使用するための、請求項１から１２のいずれかに記載のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１４】
前記癌が固形癌である、請求項１３に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１５】
前記固形癌が、乳癌、卵巣癌または結腸直腸癌である、請求項１４に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１６】
前記癌が血液癌である、請求項１３に記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１７】
前記血液癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む）、多発性骨髄腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、活動性骨髄腫または軽鎖骨髄腫である、請求項１６に記載の記載の使用のためのＮＫ細胞またはＮＫ細胞株。
【請求項１８】
患者の癌を治療するかどうかを決定する方法であって、（１）１つまたはそれ以上の癌細胞を患者から単離する工程、（２）該１つまたはそれ以上の癌細胞がＮＫ細胞耐性であるかどうかを該１つまたはそれ以上の癌細胞に対するＮＫ細胞の比細胞傷害性の％を測定することにより決定する工程、ならびに工程（２）の所見に基づいて癌を治療するかどうかの決定を行う工程を含み、癌は、該１つまたはそれ以上の癌細胞に対するＮＫ細胞の比細胞傷害性の％が５０％またはそれ以下である場合、ＮＫ細胞耐性であると決定され、そして１つまたはそれ以上の癌細胞がＮＫ細胞耐性であると見出された場合、該癌の治療が、請求項１から１７に記載のＮＫ細胞もしくはＮＫ細胞株を投与することにより実施されることで特徴づけられる、方法。
【国際調査報告】
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