(57)【要約】  本発明は、非構造タンパク質を含むジカウイルス(ZIKV)キメラポリエピトープ、及び免疫原性組成物におけるその使用を対象とする。本発明は、前記キメラポリエピトープを発現する手段、特にポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞を提供する。本発明は、ヒト対象におけるZIKV感染の予防における使用のための、又はヒト対象におけるZIKV及びデングウイルス(DENV)感染の予防における使用のための、前記ポリエピトープ、ポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞のうちの少なくとも1つを含む組成物又はワクチンにも関する。
2021502115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)少なくとも以下の(a)及び(b)のT細胞エピトープ、又は(ii)少なくとも以下の(a)及び(c)のT細胞エピトープ、又は(iii)少なくとも以下の(b)及び(c)のT細胞エピトープ:
(a)配列番号10〜12、14、15、17〜19、23、24、及び78〜83からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ジカウイルス(ZIKV)の非構造(NS)NS1タンパク質のT細胞エピトープ、
(b)配列番号28、29、31、33〜35、84、及び85からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS3タンパク質のT細胞エピトープ、
(c)配列番号46、48〜50、52〜55、57〜60、62、64、67、69、72、73、及び86〜91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS5タンパク質のT細胞エピトープ、
或いは、1つ又は複数のアミノ酸残基の点変異によって(a)、(b)、又は(c)のT細胞エピトープの元のアミノ酸配列とは異なり、且つ前記元の配列と少なくとも90%の配列同一性又は95%を上回る配列同一性又は99%の配列同一性を有する、そのT細胞エピトープバリアント
を含む、キメラポリエピトープ。
【請求項２】
少なくとも(a)、(b)、及び(c)のT細胞エピトープ、又はそのT細胞エピトープバリアントを含む、請求項1に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項３】
(i)(a)及び(b)のT細胞エピトープ、若しくは(ii)(a)及び(c)のT細胞エピトープ、若しくは(iii)(b)及び(c)のT細胞エピトープ、若しくは(iv)(a)、(b)、及び(c)のT細胞エピトープ、又はそのT細胞エピトープバリアントからなる、請求項1又は2に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項４】
(a)のT細胞エピトープは、配列番号17、23、及び78〜83からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれからなり、(b)のT細胞エピトープは、配列番号31、33、84、及び85からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれからなり、(c)のT細胞エピトープは、配列番号46、48、52、57、62、64、67、及び86〜91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項５】
(a)のT細胞エピトープは、配列番号11、12、17〜19、23、24、78、80、及び83のアミノ酸配列を含み又はそれからなり、(b)のT細胞エピトープは、配列番号28、31、33、34、84、及び85のアミノ酸配列を含み又はそれからなり、(c)のT細胞エピトープは、配列番号48〜50、52〜55、57、58、60、62、67、88、89、及び90のアミノ酸配列を含む又はそれからなる、請求項1から3のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項６】
(i)配列番号1、2、4〜6、及び75からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのCタンパク質のT細胞エピトープ、
(ii)配列番号7、76、及び77からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのEタンパク質のT細胞エピトープ、
(iii)配列番号25のアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのNS2Bタンパク質のT細胞エピトープ、
(iv)配列番号36のアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのNS4Aタンパク質のT細胞エピトープ、並びに
(v)配列番号40〜43からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのNS4Bタンパク質のT細胞エピトープ
からなる群から選択される、ZIKVタンパク質の少なくとも1つのT細胞エピトープを更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項７】
ZIKVタンパク質の前記少なくとも1つのT細胞エピトープは、
- 配列番号1、2、4〜6、及び75からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのCタンパク質のT細胞エピトープ、並びに
- 配列番号40〜43からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのNS4Bタンパク質のT細胞エピトープ
からなる群から選択される、請求項6に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項８】
配列番号99のアミノ酸配列を有する、請求項7に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項９】
(i)ヒト対象におけるZIKV感染の予防における使用のための、又は(ii)ヒト対象におけるZIKV及びデングウイルス(DENV)感染の予防における使用のための、請求項1から8のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項１０】
T細胞エピトープは、配列番号1、2、5、10、11、19、27、31、40〜43、46、72、73、75、78〜80、82、84、85、87、及び91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるZIKV特異的エピトープである、請求項9に記載のヒト対象におけるZIKV感染の予防における使用のためのキメラポリエピトープ。
【請求項１１】
T細胞エピトープは、配列番号1、5、6、12、14、15、17〜19、23、24、27、28、33〜35、40、41、46、48〜50、52〜55、57、59、60、62、64、67、69、72、73、84、85、及び86〜91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるZIKV-DENV交差反応性エピトープである、請求項9に記載のヒト対象におけるZIKV及びDENV感染の予防における使用のためのキメラポリエピトープ。
【請求項１２】
(i)ZIKVに対して、又は(ii)ZIKV及びDENV、特にDENV血清型1(DENV1)、DENV血清型2(DENV2)、DENV血清型3(DENV3)、及びDENV血清型4(DENV4)に対して、ヒト白血球抗原(HLA)拘束性CD8+及び/又はCD4+ T細胞応答を誘発する、請求項1から11のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項１３】
T細胞エピトープは融合ポリペプチドにおいて組み立てられている、請求項1から12のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項１４】
ZIKVは、アフリカ系列由来、特にアフリカ系統ArD158084(GenBank:KF383119)若しくはアフリカ系統ArD128000(GenBank:KF383117)、又はアフリカ分離株ARB13565(GenBank:KF268948)由来、或いはアジア系列由来、特にアジア系統FLR(GenBank:KX087102)、又はアジア分離株SSABR1(GenBank:KU707826)若しくはアジア分離株Z1106031(GenBank:KU312314)若しくはアジア分離株Bahia07(GenBank:KU940228)、又はアジア系統FVM00318/VEN/マラカイ/2016(GenBank:KY693680)、又はアジア分離株FLR(GenBank:KU820897)由来である、請求項1から13のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープ。
【請求項１５】
請求項1から14のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープをコードする、単離された又は精製されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリエピトープを保有する組換え分子である、又は前記ポリエピトープを発現するウイルスベクター若しくは哺乳類発現ベクターである、請求項1から14のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープの送達に適したベクター、特に非複製ベクター。
【請求項１７】
請求項15に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１８】
請求項15に記載のポリヌクレオチド又は請求項16若しくは17に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
トリ細胞、特にCEF(ニワトリ胚線維芽細胞)細胞、哺乳類細胞、特にHEK-293(ヒト胎児腎臓)細胞、又は酵母細胞等の真核細胞である、請求項18に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
(i)請求項1から14のいずれか一項に記載のキメラポリエピトープ、
(ii)請求項15に記載のポリヌクレオチド、
(iii)請求項16又は17に記載のベクター、及び
(iv)請求項18又は19に記載の宿主細胞
からなる群から選択される少なくとも1つの構成要素を含む、免疫原性組成物。
【請求項２１】
アジュバント及び/又は薬学的に許容されるビヒクルを更に含む、請求項20に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、筋肉内(i.m.)、腹腔内(i.p.)、又は静脈内(i.v.)注射等の非経口経路を通じた投与のために製剤化される、請求項20又は21に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
1回又は複数回の投与用量で、特にプライム-ブースト投与レジームで投与される、請求項20から22のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
(i)ヒト対象におけるZIKV感染の予防における使用のための、又は(ii)ヒト対象におけるZIKV及びデングウイルス(DENV)感染の予防における使用のための、請求項20から23のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非構造タンパク質を含むジカウイルス(ZIKV)キメラポリエピトープ、及び免疫原性組成物におけるその使用を対象とする。本発明は、前記キメラポリエピトープを発現する手段、特にポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞を提供する。本発明は、ヒト対象におけるZIKV感染の予防における使用のための、又はヒト対象におけるZIKV及びデングウイルス(DENV)感染の予防における使用のための、前記ポリエピトープ、ポリヌクレオチド、ベクター、又は宿主細胞のうちの少なくとも1つを含む組成物又はワクチンにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ジカウイルス(ZIKV)は、ヤブカ(Aedes)種の蚊によって伝播されるフラビウイルスである。それは、黄熱病ウイルス、デングウイルス(DENV)、及び西ナイルウイルスと近縁関係にある一本鎖プラス鎖RNAウイルスである(Kuno Gら、1998、J Virol. 72(1):73〜83頁)。1947年にウガンダのジカ森林において最初に単離され(Dick GWら、1952、Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 46(5):509〜520頁)、それは、ミクロネシア連邦のヤップ島において初めて爆発的大発生を引き起こした(Duffy MRら、2009、The New England journal of medicine 360(24):2536〜2543頁)。より多くの症例数を有するそれに続く大発生が、フランス領ポリネシア及び他の南太平洋諸島において2013〜2014年に、並びにアメリカ大陸においてより最近起こった(Cao-Lormeau VMら、2014、Emerging infectious diseases 20(6):1085〜1086頁;Campos GSら、2015、Emerging infectious diseases 21(10):1885〜1886頁;Dupont-Rouzeyrol Mら、2015、Emerging infectious diseases 21(2):381〜382頁;Zanluca Cら、2015、Mem Inst Oswaldo Cruz 110(4):569〜572頁;Pacheco Oら、2016、Zika Virus Disease in Colombia - Preliminary Report. The New England journal of medicine)。初めは、軽度の自己限定的な疾患を引き起こすに過ぎないと思われたものの、フランス領ポリネシア及びブラジルにおける2013年及び2015年の大発生とともに、ギラン・バレー症候群又は先天性奇形等、ZIKVと神経学的合併症との間の因果関係が最近になってやっと確立された(Oehler Eら、2014 Euro Surveill 19(9);Cao-Lormeau VMら、2016、Lancet 387(10027):1531〜1539頁;Cauchemez Sら、2016、Lancet 387 (10033): 2125〜2132頁;Soares de Araujo JSら、2016、Bull World Health Organ 94(11):835〜840頁)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】欧州特許出願EP17305676.3
【特許文献２】国際出願WO2004/000876
【特許文献３】国際出願WO2004/001051
【特許文献４】国際出願WO2014/049094
【特許文献５】国際出願WO2015/197565
【特許文献６】国際出願WO2005/111221
【特許文献７】国際出願WO2007/052165
【特許文献８】国際出願WO2008/078198
【特許文献９】国際出願WO2009/019612
【特許文献１０】国際出願WO2016/091836
【特許文献１１】国際出願WO2012135805
【特許文献１２】国際出願WO2013039861
【特許文献１３】国際出願WO2015/085318
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kuno Gら、1998、J Virol. 72(1):73〜83頁
【非特許文献２】Dick GWら、1952、Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 46(5):509〜520頁
【非特許文献３】Duffy MRら、2009、The New England journal of medicine 360(24):2536〜2543頁
【非特許文献４】Cao-Lormeau VMら、2014、Emerging infectious diseases 20(6):1085〜1086頁
【非特許文献５】Campos GSら、2015、Emerging infectious diseases 21(10):1885〜1886頁
【非特許文献６】Dupont-Rouzeyrol Mら、2015、Emerging infectious diseases 21(2):381〜382頁
【非特許文献７】Zanluca Cら、2015、Mem Inst Oswaldo Cruz 110(4):569〜572頁
【非特許文献８】Pacheco Oら、2016、Zika Virus Disease in Colombia - Preliminary Report. The New England journal of medicine
【非特許文献９】Oehler Eら、2014 Euro Surveill 19(9)
【非特許文献１０】Cao-Lormeau VMら、2016、Lancet 387(10027):1531〜1539頁
【非特許文献１１】Cauchemez Sら、2016、Lancet 387 (10033): 2125〜2132頁
【非特許文献１２】Soares de Araujo JSら、2016、Bull World Health Organ 94(11):835〜840頁
【非特許文献１３】Enfissi Aら、Lancet 387(10015):227〜228頁
【非特許文献１４】Liu Yら、2017、Nature 545 (7655): 482〜486頁
【非特許文献１５】Katzelnick LCら、The Lancet. Infectious diseases 17(3):e88〜e100頁
【非特許文献１６】Dejnirattisai Wら、2016 Nat Immunol 17(9):1102〜1108頁
【非特許文献１７】Stettler Kら、2016 Science 353(6301):823〜826頁
【非特許文献１８】Paul LMら、2016 Dengue Virus Antibodies Enhance Zika Virus Infection. BioRxiv
【非特許文献１９】Priyamvada Lら、2016、Proc Natl Acad Sci U S A 113(28):7852〜7857頁
【非特許文献２０】Bardina SVら、2017、Science 356(6334):175〜180頁
【非特許文献２１】Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036
【非特許文献２２】Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2013、110(22):E2046〜2053頁
【非特許文献２３】Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2015、112(31):E4256〜4263頁
【非特許文献２４】Rivino L & Lim MQ、2016、Immunology 150(2):146〜154頁
【非特許文献２５】Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036、23〜25頁
【非特許文献２６】Elong Ngono Aら、2017、Cell host & microbe 21(1):35〜46頁
【非特許文献２７】2017年10月4日にオンラインで掲載された、Grifoni Aら、2017、J. Virol. DOI: 10.1128/JVI. 01469-17
【非特許文献２８】Combredet, C.ら、2003、J Virol、77(21): 11546〜11554頁
【非特許文献２９】2015年6月30日にオンラインで発表された、Youn H.及びChung JKによるExpert Opinion、Expert Opin Biol Ther. 2015 Sep 2; 15(9): 1337〜1348頁、doi: 10.1517/14712598.2015.1057563
【非特許文献３０】Aubry Mら、2017、Emerging infectious diseases 23(4):669〜672頁
【非特許文献３１】Andreatta Mら、2015、Immunogenetics 67(11-12):641〜650頁
【非特許文献３２】Nielsen M & Andreatta M 2016、Genome Med 8(1):33
【非特許文献３３】Simmons CPら、2005、J. Virol. 79(9):5665〜5675頁
【非特許文献３４】Duangchinda Tら、2010、Proc Natl Acad Sci U S A 107(39):16922〜16927頁
【非特許文献３５】Rivino Lら、2013、J. Virol. 87(5):2693〜2706頁
【非特許文献３６】Dar Hら、2016、Asian Pac J Trop Med 9(9):844〜850頁
【非特許文献３７】Weiskopf Dら、2015、J. Virol. 89(1):120〜128頁
【非特許文献３８】Dikhit MRら、2016、Infection, genetics and evolution: journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases 45:187〜197頁
【非特許文献３９】Imrie Aら、2007、J. Virol. 81(18):10081〜10091頁
【非特許文献４０】Zhang SCら、2012、J. Immunol. 188(12):5924〜5934頁
【非特許文献４１】Dowd, K.A.ら、Science 2016、354、237〜240頁
【非特許文献４２】Boyer, J.D.ら、J Med Primatol 2005、34、262〜270頁
【非特許文献４３】Suschak, J.J.ら、The Journal of infectious diseases 2018
【非特許文献４４】Suschak, J.J.ら、Antiviral research 2018、159、113〜121頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アメリカ大陸におけるその最近の再発を説明し得るであろう(Enfissi Aら、Lancet 387(10015):227〜228頁)、NS1における自然変異に起因したZIKVのアジア系列の増強した感染力に加えて(Liu Yら、2017、Nature 545 (7655): 482〜486頁)、今日の最も重要な懸念の1つは、ZIKVが広まっているエリアにおける高レベルのDENV血清有病率に関係している(Katzelnick LCら、The Lancet. Infectious diseases 17(3):e88〜e100頁)。実際に、最近の研究により、抗DENV既存抗体はZIKV感染を増強させ得、疾患重症度を増加させ得ることが示されている(Dejnirattisai Wら、2016 Nat Immunol 17(9):1102〜1108頁;Stettler Kら、2016 Science 353(6301):823〜826頁;Paul LMら、2016 Dengue Virus Antibodies Enhance Zika Virus Infection. BioRxiv;Priyamvada Lら、2016、Proc Natl Acad Sci U S A 113(28):7852〜7857頁;Bardina SVら、2017、Science 356(6334):175〜180頁)。これらの制約、及びZIKV感染に対する適当な治療がないことを考慮すると、この感染性疾患に対するワクチンを開発する緊急の必要性がある。
【０００６】
DENV又はZIKVのEタンパク質に対する抗体は高度に交差反応性であることが示されたものの、T細胞は、標的ペプチドに応じて交差反応性である又はそうではないことがあり得る。DENVとZIKVとの間の低い程度のCD4 T細胞交差反応性が、これらのウイルスの一方に対して免疫があるヒトドナーにおいて実際に観察され(Stettler Kら、2016、Science 353(6301):823〜826頁)、一方でDENV/ZIKV交差反応性であり且つ防御性であるCD8 T細胞が、ZIKVを用いた負荷後のDENV免疫マウスにおいて同定された(Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036)。カプシド及びエンベロープ構造タンパク質に関する、並びにそれぞれDENV特異的CD4及びCD8 T細胞の主な標的である非構造タンパク質NS3及びNS5に関するDENVとZIKVとの間の配列同一性、並びにDENV特異的T細胞の防御的役割を考えて(Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2013、110(22):E2046〜2053頁;Weiskopf Dら、Proc Natl Acad Sci USA 2015、112(31):E4256〜4263頁;Rivino L & Lim MQ、2016、Immunology 150(2):146〜154頁)、ZIKVに対する新たな且つより有効なワクチンを設計するために、故に努力は現在T細胞エピトープのマッピングに向けられている。ZIKVプロテオームから、種々のHLAクラスI又はクラスIIアレルに結合し得る潜在的エピトープをモデル化することによって、並びにヒトHLA-B*0702及びHLA-A*0101分子を発現するトランスジェニックマウスにおいてエクスビボのT細胞応答を分析することによって、T細胞抗原の予測が行われた(Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036、23〜25頁)。際立ったことに、DENV/ZIKV交差反応性T細胞がこれらDENV免疫マウスにおいて同定され、それはZIKV感染に対する防御を媒介し得た(Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036、23〜25頁)。この結果は、マウスにおけるZIKVに対する免疫防御におけるCD8+ T細胞の防御的役割を実証した付随的研究と一致している(Elong Ngono Aら、2017、Cell host & microbe 21(1):35〜46頁)。しかしながら、これらの研究はマウスにおけるZIKV感染に対するCD8+ T細胞の防御的役割を実証しているものの、並びにZIKVに由来するいくつかのペプチドがDENVナイーブ及びDENV事前曝露ドナーにおいて同定されているものの(2017年10月4日にオンラインで掲載された、Grifoni Aら、2017、J. Virol. DOI: 10.1128/JVI. 01469-17)、ZIKVに固有である又はDENVと共有されるヒトT細胞エピトープの正確な同定はまだ不完全である。本研究において、本発明者らは、ZIKV感染のみ又はDENV及びZIKV感染の両方の病歴を有する血液ドナーからこれらのエピトープを同定した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以前のZIKV感染を有するコロンビア人血液ドナー由来のPBMCを使用して、本発明者らは、酵素結合免疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイにより全ZIKVプロテオミクス配列を網羅するペプチドに対するエクスビボのIFNγ応答を定量することによって、ZIKV T細胞エピトープの分布についての最初のマップを確立した。これらのペプチドに対するT細胞応答(CD4及び/又はCD8 T細胞によって媒介される)の大きさの測定により、特異的HLAアレルを保有するドナーにおいて強い応答を誘導する免疫優性エピトープの同定が可能となった。より具体的には、本発明者らは、構造タンパク質C及びE、並びに非構造(NS)タンパク質NS1、NS3、NS4B、及びNS5、特に非構造タンパク質NS1、NS3、及びNS5が、強いT細胞応答を誘導する免疫優性エピトープのほとんどを含有することを示した。DENV感染の病歴を有するドナーにおいて、最も強いT細胞応答は、DENVの4つの血清型との高いレベルのアミノ酸同一性を有するペプチドに向けられ、一部は、以前に記載されたDENV CD8+ T細胞エピトープと合致しており、交差反応性T細胞の活性化を示唆した。本発明者らの結果は、ZIKVに対するT細胞応答についての新たな洞察を提供し、将来のZIKV及びDENVワクチン候補に使用され得るT細胞エピトープを免疫個体において初めて同定した。
【０００８】
故に、本発明は、(i)少なくとも以下の(a)及び(b)のT細胞エピトープ、又は(ii)少なくとも以下の(a)及び(c)のT細胞エピトープ、又は(iii)少なくとも以下の(b)及び(c)のT細胞エピトープ:
(a)配列番号10〜12、14、15、17〜19、23、24、及び78〜83からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ジカウイルス(ZIKV)の非構造(NS)NS1タンパク質のT細胞エピトープ、
(b)配列番号28、29、31、33〜35、84、及び85からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS3タンパク質のT細胞エピトープ、
(c)配列番号46、48〜50、52〜55、57〜60、62、64、67、69、72、73、及び86〜91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS5タンパク質のT細胞エピトープ、
或いは、1つ又は複数のアミノ酸残基の点変異によって(a)、(b)、又は(c)のT細胞エピトープの元のアミノ酸配列とは異なり、且つ前記元の配列と少なくとも90%の配列同一性又は95%を上回る配列同一性又は99%の配列同一性を有する、そのT細胞エピトープバリアント
を含む、キメラポリエピトープに関する。
【０００９】
本発明の特定の実施形態において、キメラポリエピトープは、(i)少なくとも以下の(a)及び(b)のT細胞エピトープ、又は(ii)少なくとも以下の(a)及び(c)のT細胞エピトープ、又は(iii)少なくとも以下の(b)及び(c)のT細胞エピトープ:
(a)配列番号10〜12、14、15、17〜19、23、24、及び78〜83からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS1タンパク質のT細胞エピトープ、
(b)配列番号28、31、33〜35、84、及び85からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS3タンパク質のT細胞エピトープ、
(c)配列番号46、52〜55、57、59、60、62、64、67、69、72、73及び86、87、89〜91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS5タンパク質のT細胞エピトープ、
或いは、1つ又は複数のアミノ酸残基の点変異によって(a)、(b)、又は(c)のT細胞エピトープの元のアミノ酸配列とは異なり、且つ前記元の配列と少なくとも90%の配列同一性又は95%を上回る配列同一性又は99%の配列同一性を有する、そのT細胞エピトープバリアント
を含む。
【００１０】
本明細書において定義するとき、「ポリエピトープ」という用語は、キメラ又は組換え分子、特に、全長又は天然ZIKVタンパク質を除いたZIKVタンパク質において、特にZIKVの全長又は天然NS1、NS3、又はNS5タンパク質を除いたZIKVの非構造タンパク質NS1、NS3、又はNS5において同定された、少なくとも2個、特に少なくとも3個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは10個若しくは10個を上回る、又は15個若しくは15個を上回る数のT細胞エピトープを有するキメラ又は組換えポリペプチドを指す。
【００１１】
本明細書において定義するとき、「エピトープ」とは、抗原決定基であるペプチド又はポリペプチド、すなわち、免疫系の細胞(免疫細胞)によって認識されるペプチド部位、とりわけ免疫応答を誘発するのに必要な部位である。エピトープという用語は、連続したアミノ酸(9〜15個、特に8、9、10、又は15個、より好ましくは9又は15個)が免疫細胞によって認識される直鎖状エピトープ、及び免疫細胞が、それらが適正な構成又は立体構造を採用する程度にアミノ酸を認識する立体構造エピトープの両方を包含する。その結果として、一部のエピトープにおいて、立体構造(3次元構造)は、アミノ酸配列(一次構造)と同じくらい重要である。
【００１２】
本明細書において定義するとき、「T細胞エピトープ」とは、ZIKV、又はZIKV及びDENVに対する、特にDENV1、DENV2、DENV3、DENV4のいずれか1つに対する、又は複数、特に全DENV血清型に対する、T細胞免疫応答の誘導に関与する任意のペプチド又はポリペプチドである。特に、前記T細胞エピトープは、標的細胞がCD4+ Tリンパ球であるもの等のクラスII MHC分子と関連して認識される、標的細胞がCD8+ Tリンパ球又はTエピトープであるエピトープ等のクラスI MHC(主要組織適合性複合体)分子と関連して認識される。
【００１３】
本明細書において定義するとき、「そのバリアント」という用語は、1つ又は複数のアミノ酸残基の点変異によって、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸残基分(a)、(b)、又は(c)のT細胞エピトープの元のアミノ酸配列とは異なり、且つ前記元の配列と少なくとも90%の配列同一性又は95%を上回る配列同一性又は99%の配列同一性を有するT細胞エピトープを指す。T細胞エピトープのバリアントを規定する変異は、とりわけ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、若しくはそれを上回る数のアミノ酸残基の点欠失を含めた欠失であり得る、又は置換、とりわけ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、若しくはそれを上回る数のアミノ酸残基の保存的置換であり得る。T細胞エピトープの前記バリアントは、(a)、(b)、又は(c)のT細胞エピトープの元のアミノ酸配列と同じ長さを有するアミノ酸配列を有し得る。
【００１４】
本明細書において定義するとき、「キメラポリエピトープ」という用語は、異なるZIKVタンパク質、特に異なるZIKV NSタンパク質、好ましくはNS1、NS3、及びNS5タンパク質の中から選択される異なるZIKV NSタンパク質の下位部分又はフラグメントを含む、任意のポリエピトープ性ポリペプチドを意味する。前記キメラポリエピトープは、全長又は天然ZIKVタンパク質を含まず、特に全長又は天然ZIKV NSタンパク質を含まず、好ましくはNS1、NS3、及びNS5タンパク質の中から選択される全長又は天然ZIKV NSタンパク質を含まない。
【００１５】
本発明の特定の実施形態において、キメラポリエピトープは、30個未満のZIKV T細胞エピトープ、特に25個未満のZIKV T細胞エピトープ、好ましくは20個未満のZIKV T細胞エピトープを含む。
【００１６】
本発明の特定の実施形態において、全体として捉えられるZIKVタンパク質のT細胞エピトープのアミノ酸配列は、別のZIKVタンパク質の他の任意のエピトープ、特に別のZIKVタンパク質の他の任意のZIKV T細胞エピトープのアミノ酸配列とは異なる。
【００１７】
本発明の別の特定の実施形態において、ZIKV T細胞エピトープのアミノ酸配列は、他のエピトープ、特に他のZIKV T細胞エピトープのアミノ酸配列と1つ若しくは複数のアミノ酸と異なり得、且つ/又は重複配列を有し得、従って一部のアミノ酸を共有し得る。
【００１８】
本発明のキメラポリエピトープは、全長又は天然ZIKVタンパク質を除いた、ZIKVのNS1及びNS3タンパク質の少なくともT細胞エピトープ、又はZIKVのNS1及びNS5タンパク質の少なくともT細胞エピトープ、又はZIKVのNS3及びNS5タンパク質の少なくともT細胞エピトープを含む。好ましくは、本発明のキメラポリエピトープは、全長又は天然ZIKVタンパク質を除いた、ZIKVのNS1及びNS3タンパク質のT細胞エピトープ、又はZIKVのNS1及びNS5タンパク質のT細胞エピトープ、又はZIKVのNS3及びNS5タンパク質のT細胞エピトープからなる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、キメラポリエピトープは、全長又は天然ZIKVタンパク質を除いた、ZIKVのNS1、NS3、及びNS5タンパク質の少なくともT細胞エピトープを含む。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施形態において、キメラポリエピトープは、全長又は天然ZIKVタンパク質を除いた、ZIKVのNS1、NS3、及びNS5タンパク質のT細胞エピトープからなる。
【００２１】
本発明の特定の実施形態において、キメラポリエピトープは、同じZIKVタンパク質、特にZIKVのNSタンパク質、好ましくはZIKVのNS1、NS3、若しくはNS5タンパク質由来の異なるポリエピトープの下位部分若しくはフラグメント、又は更に、異なるZIKVタンパク質、特にZIKVのNSタンパク質、好ましくはZIKVのNS1、NS3、及びNS5タンパク質由来の同じポリエピトープからの下位部分又はフラグメントを含む。本発明のポリエピトープには、ポリエピトープバリアントが含まれる。従って、本明細書において開示される各定義又は実施形態は、それが技術的に無関係でない限り、バリアントポリエピトープに適用される。
【００２２】
本明細書において定義するとき、「フラグメント」という用語は、ZIKVタンパク質の、好ましくはZIKVのNSタンパク質(すなわち、NS1、NS3、又はNS5タンパク質)の一部又は一部分を指し、それは、それの起源となるタンパク質、好ましくはNSタンパク質(すなわち、NS1、NS3、又はNS5タンパク質)よりも長さが短い。各フラグメントは、免疫応答、とりわけZIKV感染に対する又はZIKV及びDENV感染に対する免疫T細胞応答の誘発に適した複数のエピトープを含み得る。各フラグメントは、一連の連続したアミノ酸に相当する。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、キメラポリエピトープは、上で規定される少なくとも(a)、(b)、及び(c)のT細胞エピトープ、又はそのT細胞エピトープバリアントを含む。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施形態において、キメラポリエピトープは、(i)上で規定される(a)及び(b)のT細胞エピトープ、若しくは(ii)上で規定される(a)及び(c)のT細胞エピトープ、若しくは(iii)上で規定される(b)及び(c)のT細胞エピトープ、若しくは(iv)上で規定される(a)、(b)、及び(c)のT細胞エピトープ、又はそのT細胞エピトープバリアントからなる。
【００２５】
本発明の別の好ましい実施形態において、(a)のT細胞エピトープは、配列番号17、23、及び78〜83からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれからなり、(b)のT細胞エピトープは、配列番号31、33、84、及び85からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれからなり、且つ(c)のT細胞エピトープは、配列番号46、48、52、57、62、64、67、及び86〜91、好ましくは配列番号46、52、57、62、64、67、86、87、及び89〜91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる。前記T細胞エピトープ配列のそれぞれは、15個のアミノ酸残基を含有する、すなわち個々に及び/又は集合的にT細胞免疫応答を誘導する15merエピトープである。これら15merエピトープのそれぞれは、またT細胞免疫応答を誘導する少なくとも9merエピトープを個々に及び/又は集合的に含む。例えば、配列番号17(FHTSVWLKVREDYSL)のZIKVのNS1タンパク質(NS1163〜177)における15merエピトープの配列は、配列番号18(VWLKVREDY)の9merエピトープの配列及び配列番号19(WLKVREDYS)の9merエピトープの配列を含む。このことは、上記の15merエピトープは、少なくとも9merエピトープを含むが、9mer又はそれを上回る大きさの他のエピトープも含み得ることを示唆する。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態において、(a)のT細胞エピトープは、配列番号11、12、17〜19、23、24、78、80、及び83のアミノ酸配列を含み又はそれからなり、(b)のT細胞エピトープは、配列番号28、31、33、34、84、及び85のアミノ酸配列を含み又はそれからなり、且つ(c)のT細胞エピトープは、配列番号48〜50、52〜55、57、58、60、62、67、88、89、及び90、好ましくは配列番号52〜55、57、60、62、67、89、及び90のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。
【００２７】
本発明の別の特定の実施形態において、キメラポリエピトープは、
(i)配列番号1、2、4〜6、及び75からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのカプシド(C)タンパク質のT細胞エピトープ、
(ii)配列番号7、76、及び77からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのEタンパク質のT細胞エピトープ、
(iii)配列番号25のアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのNS2Bタンパク質のT細胞エピトープ、
(iv)配列番号36のアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのNS4Aタンパク質のT細胞エピトープ、並びに
(v)配列番号40〜43からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのNS4Bタンパク質のT細胞エピトープ
からなる群から選択される、ZIKVタンパク質の少なくとも1つのT細胞エピトープを更に含む。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、キメラポリエピトープは、少なくとも2種、好ましくは少なくとも3又は4種、より好ましくは少なくとも5、6、7、8、9、10、又は11種の異なるZIKVタンパク質のT細胞エピトープを含む。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態において、キメラポリエピトープは、配列番号1、2、4〜6、及び75からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのCタンパク質のT細胞エピトープ、並びに配列番号40〜43からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなる、ZIKVのNS4Bタンパク質のT細胞エピトープを更に含む。
【００３０】
故に、キメラポリエピトープは、前記全長又は天然ZIKVタンパク質を除いた、ZIKVのC、NS1、NS3、NS4B、及びNS5タンパク質の少なくともT細胞エピトープを含む。特に、キメラポリエピトープは、少なくとも以下のT細胞エピトープ:
(i)配列番号1、2、4〜6、及び75、好ましくは配列番号1、4、及び75からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのCタンパク質のT細胞エピトープ、
(ii)配列番号10〜12、14、15、17〜19、23、24、及び78〜83、好ましくは配列番号17、23、及び78〜83からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS1タンパク質のT細胞エピトープ、
(iii)配列番号28、29、31、33〜35、84、及び85、好ましくは配列番号28、31、33〜35、84、及び85、より好ましくは配列番号31、33、84、及び85からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS3タンパク質のT細胞エピトープ、
(iv)配列番号40〜43からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS4Bタンパク質のT細胞エピトープ、
(v)配列番号46、48〜50、52〜55、57〜60、62、64、67、69、72、73、及び86〜91、好ましくは配列番号46、52〜55、57、59、60、62、64、67、69、72、73及び86、87、及び89〜91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、又は配列番号46、48、52、57、62、64、67、及び86〜91、好ましくは配列番号46、52、57、62、64、67、86、87、及び89〜91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む若しくはそれからなる、ZIKVのNS5タンパク質のT細胞エピトープ、
或いは、1つ若しくは複数のアミノ酸残基の点変異によって(i)、(ii)、(iii)、(iv)、若しくは(v)のT細胞エピトープの元のアミノ酸配列とは異なり、且つ前記元の配列と少なくとも90%の配列同一性若しくは95%を上回る配列同一性若しくは99%の配列同一性を有する、そのT細胞エピトープバリアント
を含む。
【００３１】
本発明の別の好ましい実施形態において、上記のキメラポリエピトープにおいて、
(i)ZIKVのCタンパク質のT細胞エピトープは、配列番号4、5、6、及び75のアミノ酸配列を含み又はそれからなり、
(ii)ZIKVのNS1タンパク質のT細胞エピトープは、配列番号11、12、17〜19、23、24、78、80、及び83のアミノ酸配列を含み又はそれからなり、
(iii)ZIKVのNS3タンパク質のT細胞エピトープは、配列番号28、31、33、34、84、及び85のアミノ酸配列を含み又はそれからなり、
(iv)ZIKVのNS4Bタンパク質のT細胞エピトープは、配列番号40及び41のアミノ酸配列を含み又はそれからなり、且つ
(v)ZIKVのNS5タンパク質のT細胞エピトープは、配列番号48〜50、52〜55、57、58、60、62、67、88、89、及び90、好ましくは配列番号52〜55、57、60、62、67、89、及び90のアミノ酸配列を含む又はそれからなる。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施形態において、キメラポリエピトープは、全長又は天然ZIKVタンパク質を除いた、ZIKVのC、NS1、NS3、NS4B、及びNS5タンパク質のT細胞エピトープからなる。
【００３３】
上で言及されるZIKVのNS1、NS3、及びNS5タンパク質に向けられるすべての定義は、ZIKVの他のタンパク質、特にZIKVのC、E、NS1、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5タンパク質にも適用される。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、キメラポリエピトープは、(i)ヒト対象におけるZIKV感染の予防における使用のための、又は(ii)ヒト対象におけるZIKV及びデングウイルス(DENV)感染の予防における使用のためのものである。
【００３５】
本明細書において定義するとき、「予防」という用語は、一次、二次、及び三次予防を指す。ZIKV感染又はZIKV及びDENV感染の予防とは、前記感染及び関連するリスク因子が最小限に抑えられる、すなわち妨げられる又は先延ばしにされることを意味する。特に、前記感染は、それが生じる又は早期段階で同定される前に予防され得、それにより前記感染の症状は低下し得る。
【００３６】
本発明のより好ましい実施形態において、ポリエピトープがヒト対象におけるZIKV感染の予防において使用される場合、T細胞エピトープは、配列番号1、2、5、10、11、19、27、31、40〜43、46、72、73、75、78〜80、82、84、85、87、及び91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるZIKV特異的エピトープである。
【００３７】
本発明の別のより好ましい実施形態において、ポリエピトープがヒト対象におけるZIKV及びDENV感染の予防において使用される場合、T細胞エピトープは、配列番号1、5、6、12、14、15、17〜19、23、24、27、28、33〜35、40、41、46、48〜50、52〜55、57、59、60、62、64、67、69、72、73、84、85、及び86〜91、好ましくは配列番号1、5、6、12、14、15、17〜19、23、24、27、28、33〜35、40、41、46、52〜55、57、59、60、62、64、67、69、72、73、84、85、86、87、及び89〜91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるZIKV-DENV交差反応性エピトープである。
【００３８】
留意すべきは、配列番号1、5、19、27、40、41、46、72、73、84、85、87、及び91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はそれからなるT細胞エピトープは、ZIKVドナーにおいて及びDENV/ZIKVドナーにおいて、両方でT細胞免疫応答を誘導し得ることである。
【００３９】
ZIKV T細胞エピトープ、特にZIKV特異的T細胞エピトープ及び/又はZIKV-DENV交差反応性T細胞エピトープの非包括的なリストが、下記のTable 2(表2)及びTable 3(表3)に提供されている。前記ZIKV T細胞エピトープは、配列番号1〜91として規定されるアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本発明の特定の実施形態において、キメラポリエピトープは、ヒト白血球抗原(HLA)拘束性エピトープを含む。「HLA拘束性」という表現は、このタイプのHLA分子に対する親和性を有する特定のエピトープの能力を指す。本発明において使用されるHLA分子は、クラスI分子(HLA-A、B、又はCと称される)又はクラスII分子(DRBと称される)のいずれかを包含する。
【００４１】
本発明の別の特定の実施形態において、キメラポリエピトープは、(i)ZIKVに対して、又は(ii)ZIKV及びDENV、特にDENV血清型1(DENV1)、DENV血清型2(DENV2)、DENV血清型3(DENV3)、及びDENV血清型4(DENV4)に対して、好ましくはDENV血清型1(DENV1)に対して、ヒト白血球抗原(HLA)拘束性CD8+及び/又はCD4+ T細胞応答を誘発する。
【００４２】
4つのデングウイルス血清型の参照ゲノムの完全ヌクレオチド配列には、それぞれ受託番号NC_001477.1、NC_001474.2、NC_001475.2、及びNC_002640.1の下でGenbankデータベースからアクセスし得る。
【００４３】
本発明の特定の実施形態において、前記DENVは、以下の系統:GenBank KDH0026A(DENV1)、GenBank R0712259(DENV2)、GenBank KDH0010A(DENV3)、及びGenBank CRBIP10.4VIMFH4(DENV4)由来である。
【００４４】
本発明の特定の実施形態において、ポリエピトープは、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-B*0702、HLA-B*3501、HLA-B*4002、好ましくはHLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-B*0702、及びHLA-B*3501等のHLA拘束性を有する抗原応答を誘発する。
【００４５】
本発明の特定の実施形態において、全長又は天然ZIKVタンパク質を除いた、(i)ZIKVのNS1及びNS3タンパク質の少なくともT細胞エピトープ、又は(ii)ZIKVのNS1及びNS5タンパク質の少なくともT細胞エピトープ、又は(iii)ZIKVのNS3及びNS5タンパク質の少なくともT細胞エピトープ、又は(iv)ZIKVのNS1、NS3、及びNS5タンパク質の少なくともT細胞エピトープ、又は(v)ZIKVのC、NS1、NS3、NS4B、及びNS5タンパク質の少なくともT細胞エピトープは、固有のポリペプチドにおいて、好ましくは融合ポリペプチドにおいて組み立てられている。好ましくは、上で規定されるT細胞エピトープは、融合ポリペプチドにおいて組み立てられている。
【００４６】
前記T細胞エピトープは、直接的に又は間接的に互いに融合され得る。
【００４７】
本発明の特定の実施形態によれば、一方のT細胞エピトープを、もう一方のT細胞エピトープと「直接的に」融合させる、すなわちT細胞エピトープの3'末端を、第2のT細胞エピトープ(等)の5'末端に直接連結させ、これは、少なくとも2種の異なるZIKVタンパク質、特にZIKV Cタンパク質並びにNS1、NS3、NS4B、及びNS5の中から選定されるZIKV NSタンパク質由来の、特にZIKVのコンセンサス配列を起源とする、連続したT細胞エピトープから構成されるキメラポリエピトープに相当する。代替的な実施形態によれば、少なくとも2つのT細胞エピトープ、特に少なくとも3つのT細胞エピトープの融合は「間接的」であり、従って、ヒトT細胞エピトープを形成しない、特に1〜15個のアミノ酸残基を含む、他の、特に非NSのアミノ酸残基セグメントの存在を伴う。
【００４８】
本発明のキメラポリエピトープは、1つ又は複数の抗原領域、特に2〜15箇所の抗原領域、好ましくは10〜15箇所の抗原領域、より好ましくは11、12、13、又は14箇所の抗原領域を含む又はそれからなる。
【００４９】
本明細書において定義するとき、「抗原領域」という用語は、1つ又は複数のZIKV T細胞エピトープを含む領域、すなわちZIKV T細胞エピトープの群を指す。前記ZIKV T細胞エピトープのアミノ酸配列は、他のZIKV T細胞エピトープのアミノ酸配列と1つ又は複数のアミノ酸残基と異なり得、且つ/又は重複配列を有し得、従って一部のアミノ酸を共有し得る。決定された抗原領域において、前記ZIKV T細胞エピトープは、同じZIKVタンパク質のものであり、特にZIKVのC、NS1、NS3、NS4B、及びNS5タンパク質のものであり、好ましくはZIKVのNS1、NS3、及びNS5タンパク質のものである。本発明のキメラポリエピトープは、同じZIKVタンパク質の1つ又は複数の異なる抗原領域を含み得る。
【００５０】
本発明の特定の実施形態において、2つの連続する抗原領域間の接合部の両側に位置する近接アミノ酸配列が、新たなエピトープ、特に新たな強いヒトT細胞エピトープを形成しないことをチェックする必要がある。結果として、前記アミノ酸配列は、わずか15個のアミノ酸残基からなり、Immuno Epitope Database(IEDB)分析リソース(http://tools.immuneepitope.org/mhci/)に従った、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*35:01、及びHLA-B*40:03アレルへのそれらの低い結合予測に基づいて選択される。例えば、2つのZIKVタンパク質フラグメント間、特にZIKVのC、NS1、NS3、NS4B、及びNS5タンパク質からなる群から選択される2つのZIKVタンパク質フラグメント間、又は2つの抗原領域間の融合において、融合接合部を取り囲む領域は、わずか15個のアミノ酸残基からなり且つ強いエピトープを形成しないペプチド配列を含む。故に、接合部ペプチドは、第1のZIKVタンパク質の14個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の1個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の13個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の2個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の12個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の3個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の11個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の4個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の10個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の5個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の9個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の6個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の8個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の7個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の7個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の8個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の6個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の9個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の5個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の10個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の4個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の11個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の3個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の12個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の2個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の13個のアミノ酸残基、又は第1のZIKVタンパク質の1個のアミノ酸残基及び第2のZIKVタンパク質の14個のアミノ酸残基を含み得る。前記第1及び第2のZIKVタンパク質は、異なり得る又は同一であり得る。
【００５１】
本発明の特定の実施形態において、キメラポリエピトープは、1500個未満のアミノ酸残基、特に1000個未満のアミノ酸残基を有する。
【００５２】
本発明において使用され得るキメラポリエピトープの例は、962個のアミノ酸残基からなる配列番号99のアミノ酸配列を有する。前記キメラポリエピトープは11箇所の抗原領域からなり、第1の抗原領域はアミノ酸残基1〜93(配列番号102)に位置し、第2の抗原領域はアミノ酸残基94〜206(配列番号104)に位置し、第3の抗原領域はアミノ酸残基207〜270(配列番号106)に位置し、第4の抗原領域はアミノ酸残基271〜286(配列番号108)に位置し、第5の抗原領域はアミノ酸残基287〜331(配列番号110)に位置し、第6の抗原領域はアミノ酸残基332〜473(配列番号112)に位置し、第7の抗原領域はアミノ酸残基474〜547(配列番号114)に位置し、第8の抗原領域はアミノ酸残基548〜766(配列番号116)に位置し、第9の抗原領域はアミノ酸残基767〜821(配列番号118)に位置し、第10の抗原領域はアミノ酸残基822〜839(配列番号120)に位置し、且つ第11の抗原領域はアミノ酸残基840〜962(配列番号122)に位置する。
【００５３】
前記キメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドの天然配列及び最適化配列は、それぞれ配列番号100及び101に規定されるとおりである。
【００５４】
前記キメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドの別のヌクレオチド配列は、配列番号124に規定されるとおりである。
【００５５】
前記キメラポリエピトープの第1の抗原領域は、ZIKVのCタンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第1の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号103に規定されるとおりである。
【００５６】
前記キメラポリエピトープの第2の抗原領域は、ZIKVのNS1タンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第2の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号105に規定されるとおりである。
【００５７】
前記キメラポリエピトープの第3の抗原領域は、ZIKVのNS1タンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第3の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号107に規定されるとおりである。
【００５８】
前記キメラポリエピトープの第4の抗原領域は、ZIKVのNS1タンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第4の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号109に規定されるとおりである。
【００５９】
前記キメラポリエピトープの第5の抗原領域は、ZIKVのNS3タンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第5の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号111に規定されるとおりである。
【００６０】
前記キメラポリエピトープの第6の抗原領域は、ZIKVのNS3タンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第6の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号113に規定されるとおりである。
【００６１】
前記キメラポリエピトープの第7の抗原領域は、ZIKVのNS4Bタンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第7の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号115に規定されるとおりである。
【００６２】
前記キメラポリエピトープの第8の抗原領域は、ZIKVのNS5タンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第8の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号117に規定されるとおりである。
【００６３】
前記キメラポリエピトープの第9の抗原領域は、ZIKVのNS5タンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第9の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号119に規定されるとおりである。
【００６４】
前記キメラポリエピトープの第10の抗原領域は、ZIKVのNS5タンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第10の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号121に規定されるとおりである。
【００６５】
前記キメラポリエピトープの第11の抗原領域は、ZIKVのNS5タンパク質のT細胞エピトープを含む。前記第10の抗原領域をコードするポリヌクレオチドの天然配列は、配列番号123に規定されるとおりである。
【００６６】
本発明は、本発明のキメラポリエピトープと、他のZIKV抗原を含む別個の免疫原性ポリペプチドとの会合にも関する。ポリペプチドの前記会合は、本明細書において開示されるベクターからの、前記キメラポリエピトープ及び別個の免疫原性ポリペプチドのそれぞれをコードするポリヌクレオチドの発現の結果として達成され得る。或いは、前記会合は、前記キメラポリエピトープ及び別個の免疫原性ポリペプチドを包含するアミノ酸構築物から生じ得る。
【００６７】
本発明のキメラポリエピトープは、化学合成され得る、又は細胞系におけるキメラポリエピトープをコードする核酸分子の発現後にインビトロ(無細胞系)若しくはインビボのいずれかで産生され得る。
【００６８】
インビトロ細胞系における本発明のキメラポリエピトープの正しい発現をチェックするために、前記キメラポリエピトープはその3'末端にタグ配列を含み得る。
【００６９】
本発明において、ZIKVタンパク質、特にZIKVのC、NS1、NS3、NS4B、又はNS5タンパク質、好ましくはZIKVのNS1、NS3、又はNS5タンパク質は、特に、ZIKVに対するコンセンサス配列を使用して設計された抗原である。特に、前記抗原は、2013年以降広まっているのが観察されるジカウイルスのコンセンサスアミノ酸配列を使用して設計される。
【００７０】
本発明の特定の実施形態において、前記ZIKVは、アフリカ系列由来、特にアフリカ系統ArD158084(GenBank:KF383119)若しくはアフリカ系統ArD128000(GenBank:KF383117)、又はアフリカ分離株ARB13565(GenBank:KF268948)由来、或いはアジア系列由来、特にアジア系統FLR(GenBank:KX087102)、又はアジア分離株SSABR1(GenBank:KU707826)若しくはアジア分離株Z1106031(GenBank:KU312314)若しくはアジア分離株Bahia07(GenBank:KU940228)、又はアジア系統FVM00318/VEN/マラカイ/2016(GenBank:KY693680)、又はアジア分離株FLR(GenBank:KU820897)由来である。
【００７１】
本発明の別の特定の実施形態において、前記ZIKVは、2013年以来太平洋及びアメリカ大陸において広まった系統を含めた、ZIKウイルスの様々な系列に相当する。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態において、ZIKVのC、NS1、NS3、NS4B、又はNS5タンパク質は、アジア系列由来を含めたZIKVの選りすぐりの様々な系統のC、NS1、NS3、NS4B、又はNS5配列を代表するコンセンサスアミノ酸配列であるアミノ酸配列を有し、特にZIKV系統由来である(GenBank:KX087102、KU707826、KU312314、KU940228、KY693680、KU820897)。
【００７３】
本発明は、本発明に従ったキメラポリエピトープをコードする単離された又は精製されたポリヌクレオチドにも関する。
【００７４】
本発明は、他のZIKV抗原をコードするポリヌクレオチドを更に含む核酸構築物における、本発明に従ったキメラポリエピトープをコードする単離された又は精製されたポリヌクレオチドにも関する。
【００７５】
本明細書において定義するとき、「単離された又は精製された」という用語は、それらの天然状態から人間によって変更されている分子を意味し、すなわち分子が天然に存在する場合、それらはそれらの初めの環境から変化している及び/又は取り出されている。例として、それを天然に発現する生きた生物の生物学的環境に天然に存在し且つ見い出されるポリヌクレオチドは、この文脈においては「単離されて」いない。しかしながら、同じポリヌクレオチドは、その天然環境から分離された場合並びに/又はクローニング、増幅、及び/若しくは化学合成によって獲得された場合、本発明において「単離されて」いると見なされる。更に、形質転換、遺伝子操作、又は他の任意の組換え法によって生物に導入されるポリヌクレオチドは、たとえそれが前記生物に存在するとしても、「単離されて」いる。
【００７６】
本明細書において定義するとき、「コードする」という用語は、核酸分子が転写される能力、及び適当な場合には、転写のためのプロモーターを含めた発現制御配列下に前記分子が置かれた場合に、選択された細胞又は細胞株内への産物発現のために翻訳される能力を定義する。従って、本発明に従った「コードするポリヌクレオチド」は、アミノ酸配列に翻訳される配列を有する核酸に限定される、又は代替的に、指定される場合には発現制御配列も含む。
【００７７】
本発明は、本発明に従ったキメラポリエピトープの送達に適したベクター、特に非複製ベクターであって、前記ベクターは、ポリエピトープを保有する組換え分子である、又はポリエピトープを発現するウイルスベクター、若しくはpcDNA3ベクター、pcDNA5ベクター、pcDNA6ベクター、pCIベクター、及びpCMVベクター等、ポリエピトープを発現する哺乳類発現ベクターである、ベクターにも関する。
【００７８】
本発明は、本発明に従ったポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。
【００７９】
本明細書において定義するとき、「ベクター」という用語は、1種又は複数種の細胞タイプの形質導入/トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物を指す。ベクターは、例えば、挿入されたポリヌクレオチド(インサートと称される)の単離、増殖、及び複製のために設計される「クローニングベクター」、ポリヌクレオチド分子の発現のために、とりわけ宿主細胞におけるインサートの発現のために設計される「発現ベクター」、又は組換えウイルス粒子若しくはウイルス様粒子の産生をもたらすように設計される「ウイルスベクター」、又は1種を上回るタイプのベクターの属性を含む「シャトルベクター」であり得る。
【００８０】
細胞の形質導入又はトランスフェクションに、特に細胞及び細菌の安定なトランスフェクションに適したいくつかのベクターが、そのような細胞株を構築するための方法のように、公に入手可能である(例えば、プラスミド、ウイルス)。本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む任意のタイプのベクターを包含すると理解されるであろう。
【００８１】
本発明の特定の実施形態において、本発明は、本明細書において規定される核酸分子のうちの1つ又は複数をポリヌクレオチドインサートとして含むプラスミドであり得る、発現ベクターに関する。特定の実施形態において、プラスミドは、本明細書において規定される本発明のキメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドをインサートとして含み、及び任意で、他のZIKV抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００８２】
本発明において使用され得る当業者に周知のベクターは、麻疹ウイルスベクター、特に生きた弱毒化麻疹ウイルスベクター(例えば、Combredet, C.ら、2003、J Virol、77(21): 11546〜11554頁、欧州特許出願EP17305676.3、及び国際出願WO2004/000876、WO2004/001051、WO2014/049094、WO2015/197565に開示される)、レンチウイルスベクター(例えば、国際出願WO2005/111221、WO2007/052165、WO2008/078198、WO2009/019612、及びWO2016/091836に開示される)、又はmRNA(例えば、Moderna社のmRNA Therapeutics(商標)プラットフォーム;国際出願WO2012135805、WO2013039861、及びWO2015/085318、又は2015年6月30日にオンラインで発表された、Youn H.及びChung JKによるExpert Opinion、Expert Opin Biol Ther. 2015 Sep 2; 15(9): 1337〜1348頁、doi: 10.1517/14712598.2015.1057563に開示される)を包含する。
【００８３】
本発明は、本発明に従ったポリヌクレオチド又は本発明に従ったベクターで形質転換された宿主細胞にも関する。
【００８４】
宿主細胞は、本発明のキメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドで、及び任意で、他のZIKV抗原をコードするポリヌクレオチドで遺伝的に形質転換され得る。故に、特定の宿主細胞は、本発明のベクターで遺伝的に形質転換され得る。
【００８５】
本発明の宿主細胞は、当業者に周知の方法によって、すなわち化学的トランスフェクション(リン酸カルシウム(calcium phospate)、リポフェクタミン)、脂質に基づく技法(リポソーム)、エレクトロポレーション、フォトポレーション、ウイルスベクターの使用等によって、ゲノムベクターをトランスフェクトされ得る。
【００８６】
本発明の特定の実施形態において、相同な細胞配列との組換えによって又は細胞ゲノムへの挿入によって、細胞ゲノム内へのポリヌクレオチドの組込みを可能にするやり方で、細胞を本発明のポリヌクレオチドで形質転換する又は形質導入する。トランスフェクション、感染、又は形質導入は、エクスビボで、すなわち生きた生物の外側にある人工環境において生じ得る。
【００８７】
本明細書において使用するとき、「トランスフェクトされた」、「形質転換された」、又は「感染した」という用語は、本発明のベクターを含む細胞(一過性発現)を指し、一方で「遺伝的に形質転換された」という用語は、そのゲノムが本発明のポリヌクレオチドによって決定的に改変されている細胞(永続性発現)を指す。
【００８８】
前記一過性の又は安定に形質転換された細胞は、任意の原核(細菌)又は真核(酵母、昆虫、又は哺乳類、とりわけヒトを含めた動物)細胞であり得る。一実施形態において、細胞は非ヒト細胞である。特定の実施形態において、本発明の細胞は、単離されたヒト細胞であり、「単離された」とはそれらの天然環境の外側にあることを意味する。
【００８９】
本発明の特定の実施形態において、宿主細胞は、トリ細胞、特にCEF(ニワトリ胚線維芽細胞)細胞、哺乳類細胞、特にその細胞株293が第CRL-1573号(国際出願WO2008/078198に開示される)の下でATCCに寄託されているHEK-293(ヒト胎児腎臓)細胞、又は酵母細胞等の真核細胞である。
【００９０】
本発明は、
(i)本発明に従ったキメラポリエピトープ、
(ii)本発明に従ったポリヌクレオチド、
(iii)本発明に従ったベクター、及び
(iv)本発明に従った宿主細胞
からなる群から選択される少なくとも1つの構成要素を含む免疫原性組成物にも関する。
【００９１】
本発明の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバント及び/又は薬学的に許容されるビヒクルを更に含む。
【００９２】
本発明の別の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、他のZIKV抗原をコードするポリヌクレオチドを更に含む。
【００９３】
本発明の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバント及び/又は薬学的に許容されるビヒクルを含まない。
【００９４】
本明細書において定義するとき、薬学的に許容されるビヒクルは、組成物内での、本発明に従ったポリエピトープ、ポリヌクレオチド、ベクターの製剤化を可能にする任意の物質を包含する。ビヒクルは、生理学的に許容される、すなわち宿主、とりわけヒトと接触した組成物におけるその使用に適当な、故に非毒性の、任意の物質又は物質の組合せである。そのようなビヒクルの例は、リン酸緩衝生理食塩溶液、蒸留水、油/水型エマルション等のエマルション、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液等である。
【００９５】
本明細書において定義するとき、アジュバントは、例えば、一般的に水性相とのエマルションの形成において使用される、フロイントタイプのアジュバント等の油性相であるリポソームを含む、又は水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、コロイド水酸化鉄、リン酸カルシウム、若しくは塩化カルシウム等の非水溶性の無機塩類を含み得る。
【００９６】
本発明の別の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、筋肉内(i.m.)、腹腔内(i.p.)、又は静脈内(i.v.)注射等の非経口経路を通じた投与のために製剤化される。
【００９７】
本発明の別の特定の実施形態において、免疫原性組成物は、1回又は複数回の投与用量で、特にプライム-ブースト投与レジームで投与される。
【００９８】
投与されるべき分量(投薬量)は、患者の病状、個体の免疫系の状態、投与の経路、及び宿主のサイズを含めた、治療されるべき対象に依存する。適切な投薬量は、ウイルスベクターに関して103 TCID50〜107 TCID50の範囲、又は100マイクログラムのプラスミドDNAに及び、状況に応じて当業者によって修正され得る。
【００９９】
本発明は、
(i)本発明に従ったキメラポリエピトープ、
(ii)本発明に従ったポリヌクレオチド、
(iii)本発明に従ったベクター、及び
(iv)本発明に従った宿主細胞
からなる群から選択される少なくとも1つの構成要素を含むワクチン組成物にも関する。
【０１００】
本発明の好ましい実施形態において、免疫原性又はワクチン組成物は、ヒト対象におけるZIKV感染の予防における使用のための、又は(ii)ヒト対象におけるZIKV及びデングウイルス(DENV)感染の予防における使用のためのものである。
【０１０１】
本発明は、ヒトHLAクラスIアレル:HLA-A*02:01又はHLA-A*24:02又はHLA-B*07:02又はHLA-B*35:01を発現するマウスにおける、ZIKVポリエピトープのエピトープに対するインビボでの免疫応答の誘導にも関する。マウスの免疫付与は、ZIKVポリエピトープをコードするプラスミドDNAの第1の皮内注射(所定の手順を使用した、腰背部における50マイクログラムのプラスミドDNAの2回の同時皮内注射、それに続くインビボエレクトロポレーション)、それに続く3週間後のブースト免疫付与(同じ所定の手順を使用した、腰背部における50マイクログラムのプラスミドDNAの2回の皮内注射、及びエレクトロポレーション)を用いた、プライムブースト投与レジメンの後に実施される。AgilePulse装置(BTX、Harvard apparatus社)を使用したエレクトロポレーション設定は、450V、50マイクロ秒のパルス長、0.2マイクロ秒のパルス間隔、及び1パルスを用いた第1の電圧群、450V、50マイクロ秒のパルス長、50マイクロ秒のパルス間隔、及び1パルスを用いた第2の電圧群、並びに110V、10ミリ秒のパルス長、20ミリ秒のパルス間隔、及び8パルスを用いた第3の電圧群を含む、3つの電圧群からなる。ブースト免疫付与の10日後、免疫付与されたマウスの脾臓を採取し、脾臓細胞を、ELISPOTアッセイに従って、ZIKVポリエピトープに由来する特異的ペプチドを用いたインビトロ刺激に応答してインターフェロンガンマを分泌するそれらの能力について試験する。
【０１０２】
本発明の他の特長及び利点は、後に続く実施例から明白であり、図において例証もされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】応答ドナーのZIKV特異的応答の大きさ及び頻度のグラフである。ZIKVプロテオームにわたる各重複ペプチドに対する累積的なIFN-γ応答(百万個細胞あたりのスポット形成細胞(SFC)として)が、(A)全ドナー、(B)ZIKVドナー、又は(C)DENV/ZIKVドナーに関して示されている。ヒートマップは、各タンパク質(C、カプシド;M、膜;E、エンベロープ、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5)内の各ペプチドに対して、陽性のIFN-γ応答を有するドナーの数を示す。各グラフの下の数字は、各タンパク質に対する全応答についてのパーセンテージを表す。
【図２】以前のDENV感染を有するZIKVドナーは、より大きな大きさを有するより広いT細胞応答を示す。ZIKV及びDENV/ZIKVドナーにおける、応答の(A)広さ及び(B)大きさ。各点は、1人のドナー(白丸、ZIKVドナー;黒丸、DENV/ZIKVドナー)を表し、バーは、ドナーの各群に対する中央値を表す。P値は、ノンパラメトリック両側マン・ホイットニー検定を使用して算出された。ZIKV(C)及びDENV/ZIKV(D)ドナーにおける、ドナーあたりの、個々のペプチドに対する応答の頻度。各点は、1種のペプチドを表す。バーは、各ドナーに対する応答中央値を表す。
【図３】ZIKV及びDENV/ZIKVドナーにおける、応答の大きさ及びDENVとの配列同一性の比較のグラフである。各点は、1種のペプチドに対する種々のドナーの累積的応答を表す。パーセンテージは、ZIKV及び4つのDENV血清型の配列間の平均同一性値を表す。(A)ZIKVドナーにおいて応答を誘導するペプチド。(B)DENV/ZIKVドナーにおいて応答を誘導するペプチド。
【図４】18AAHK3C_pVAX-ZIKV_PolyEpitop_pVAX1プラスミドの概略図である。本発明者らは、Thermo Fisher Scientific社によって商品化されたpVAX1プラスミドを使用した。配列番号124に規定されるZIKVのキメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドを、前記プラスミドに挿入した。
【図５】HLA-A*2402トランスジェニックマウスを、ZIKVのキメラポリエピトープをコードするプラスミドDNAを用いて、皮内注射及びインビボエレクトロポレーション(0日目における2×50μg DNAを用いたプライム、及び21日目における2×50μg DNAを用いたブースト)によって免疫付与した。ZIKVの前記キメラポリエピトープは、配列番号99のアミノ酸配列を有した。前記キメラポリエピトープをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号124に規定されるとおりであった。ブーストの14日後、免疫付与されたマウスを、2mgの抗IFNAR抗体(MAR1-5A3)を用いた腹腔内注射によって、IFNアルファ応答について一過性に枯渇させ、抗IFNAR抗体での処理の24時間後にウイルス接種を実施した。ウイルス接種に関して、マウスは、マウスあたり103pfuを使用して、ZIKVのフランス領ギアナ系統FG15の腹腔内注射を受け、ウイルス接種後1、2、3、及び6日目におけるqRT-PCRによってウイルス血症を定量した。4匹のマウスが対照マウスとして使用され(空ベクターを用いたエレクトロポレーション)、5匹のマウスがpZIKV構築物をワクチン接種された(ZIKVのキメラポリエピトープをコードするプラスミドDNAを用いたエレクトロポレーション)。AgilePulse装置(BTX、Harvard apparatus社)を使用したエレクトロポレーション設定は、450V、50マイクロ秒のパルス長、0.2マイクロ秒のパルス間隔、及び1パルスを用いた第1の電圧群、450V、50マイクロ秒のパルス長、50マイクロ秒のパルス間隔、及び1パルスを用いた第2の電圧群、並びに110V、10ミリ秒のパルス長、20ミリ秒のパルス間隔、及び8パルスを用いた第3の電圧群を含む、3つの電圧群からなった。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１０４】
倫理声明
ヒト血液サンプルは、匿名様式で、Fundacion Hematologica Colombia(Bogota D.C.、Colombia)から健常成人ドナーより獲得された。本研究において記載されるすべてのプロトコールは、EL Bosque University(Colombia)の施設内倫理委員会(IRB)によって承認された。
【０１０５】
ヒト血液サンプル
ドナーは男女であり20〜60歳であった。2016年10月〜12月の3カ月間の時間経過にわたり、Bogota D.C.近くの種々のZIKV固有種エリアから(主にVillavicencioから、Metaから)、合計82個のサンプルを獲得した。PBMCを密度勾配遠心分離(Lymphoprep(商標);Stemcell technologies社)によって精製し、10%ジメチルスルホキシドを含有するFBS(Gibco社)中に再懸濁し、液体窒素中で凍結保存した。獲得された82個の血液サンプルのうちの11個は、細胞の生存能力が低いことに起因して研究から除外されなければならなかった。
【０１０６】
ウイルス及び細胞株
DENV1 KDH0026A(Dr L. Lambrecht、Institut Pasteur、Parisによって提供された)、DENV2 R0712259(Dr. A. Failloux、Institut Pasteur、Parisによって提供された)、DENV3 KDH0010A(Dr. L. Lambrecht、Institut Pasteur、Parisによって提供された)、DENV4 CRBIP10.4VIMFH4(Institut Pasteur Collectionから)、及びZIKV KU312312(Dr. Dominique Rousset、Institut Pasteur、Cayenneによって提供された)を使用して、インビトロアッセイを行った。0.1mM非必須アミノ酸及び1×トリプトースホスフェートブロスを含有する、10%胎仔ウシ血清を補充されたLeibovitz's L-15培地中で培養されたヒトスジシマカ(Aedes Albopictus)の蚊細胞株C6/36を使用して、すべてのウイルスを成長させた。Vero-E6細胞及びDC-SIGN発現U937は、それぞれDr M. Flamand及びDr B. Jacquelin(Institut Pasteur、Paris)から親切にも提供された。
【０１０７】
HLA型判定
標準的技法(QIAmp;Qiagen社)によって研究対象のPBMCから単離されたゲノムDNAを、HLA型判定に使用した。HLAクラスI(アレルA、B、及びC)及びHLAクラスII(アレルDRB1)に対する高分解能Luminexに基づく型判定を、メーカーのプロトコール(配列特異的オリゴヌクレオチド(Sequence-Specific Oligonucleotides)(SSO)型判定;Immucor社、Lifecodes)に従って使用した。
【０１０８】
血清学
以前に記載されるように(Aubry Mら、2017、Emerging infectious diseases 23(4):669〜672頁)、組換え抗原に基づく(EDIII抗原)間接ELISAを使用して、ZIKV血清陽性を判定した。簡潔には、96ウェルプレート(Nunc、Life Technologies社、Rochester、NY)に、PBS中50ngの抗原を4℃で一晩コーティングした。洗浄後、3%スキムミルク及び0.1%Tween-20を含有する200μl PBSを37℃で1時間添加した。ブロッキング溶液を、1.5%BSA及び0.1%Tween-20を含有するPBS中1:500に希釈された100μlの血漿によって置き換え、プレートを37℃で60分間インキュベートした。3回の洗浄後、結合している抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトIgG免疫グロブリン(ROCKLAND社)で検出した。37℃で1時間のインキュベーション及び3回の洗浄の後、TMB(KPL、Eurobio社)を含有する100μlの基質溶液を添加した。15分間のインキュベーション後、光学密度(OD)を自動プレートリーダー(Tecan社infinite 200 pro)で650nmにて判定した。各血漿サンプルを二つ組で試験した。ZIKV大発生の前に収集された陽性のDENV IgG血清学を有する個体から獲得された血漿サンプルを、陰性対照として使用した。カットオフは陰性対照から算出され、0.196であった。DENV血清陽性を、メーカーの取扱説明書に従い、IgGに対する間接ELISA(Panbio;Alere社)によって及びIgMに対する捕捉ELISA(Tecnosuma社)によって判定した。血清陽性ドナーの更なる特徴付けのために及びELISAの特異度を確認するために、フローサイトメトリーに基づく中和アッセイを、以前に記載されるように実施した(Andreatta Mら、2015、Immunogenetics 67(11-12):641〜650頁;Nielsen M & Andreatta M 2016、Genome Med 8(1):33)。簡潔には、血漿サンプルの10倍連続希釈物を、7〜15%の感染を誘導するウイルスの希釈物とともに37℃で1時間インキュベートした。次いで、ウイルス-抗体混合物を、DENV1〜4感染の中和のためにU937-DC-SIGN細胞に、又はZIKV感染の中和のためにVero細胞に37℃で2時間添加し、その後、細胞を新鮮な培地で2回洗浄し、次いで24時間インキュベートした。次いで、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、Alexa-488にコンジュゲートされた4G2抗体で染色し、感染細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。抗体の中和力価を、ウイルスの50%が阻害される、血漿の相互希釈(reciprocal dilution)として表現した。ZIKV大発生の前に収集されたドナー由来、又は抗DENV抗体を検出するキットから提供された陰性サンプル由来の血漿サンプルは、それぞれZIKV又はDENV感染に対していかなる中和活性も示さなかった。ELISA及び中和アッセイの後、本研究のために選択された71個の血漿サンプルから、ZIKV血清陽性個体由来の合計9個のサンプル、及びDENV/ZIKV血清陽性個体由来の11個のサンプルを、ELISPOT分析に更に選択した。本研究に含まれた20人の血液ドナーの完全なリストは、Table 1(表1)に列挙されている。
【０１０９】
ウイルス配列
ColombiaからのZIKVの同一のアミノ酸配列(GenBank KX087102及びKU820897)を、重複する15merペプチドのセットに対する参照として使用した。
【０１１０】
Colombiaからの合計50個の全長タンパク質コードDENV配列(血清型1:14個の配列;血清型2:16個の配列;血清型3:13個の配列;血清型4:7個の配列)を、GenBankから読み出し、一対配列同一性比較に使用した。
【０１１１】
ペプチド
すべてのペプチドをMimotopes社(Victoria、Australia)によって合成した。11個のアミノ酸分重複している合計853種の15merペプチド及び8個のアミノ酸分重複している197種の9merペプチドを、ELISPOTアッセイによって試験した。T細胞エピトープの同定に関しては、15merペプチドを12種のペプチドのプールに組み合わせ、陽性プールからの個々のペプチドを、第2のELISPOTアッセイにおいて試験した。陽性の15merペプチドの同定の後、且つそれらのHLAクラスI又はクラスII拘束潜在性(少なくとも2人のドナーの間で予測される又は共有される)に従って、9merペプチドを合成し、個々に試験した。
【０１１２】
エクスビボでのIFN-γ  ELISPOTアッセイ
PBMC(2×105個)を、10%ヒトAB血清を含有する0.2mlの完全RPMIを有する抗IFN-γ  mAb(クローン1-D1K、Mabtech社、Sweden)をコーティングした96ウェル平底プレート(MSIPS 4510、Millipore社、Bedford、MA)中で、12種のペプチドのプール(2μg/ml、最終濃度)又は個々のペプチド(1μg/ml、最終濃度)とともに20時間インキュベートした。37℃で20時間のインキュベーションの後、ウェルをPBS/0.05%Tween20で洗浄し、次いでビオチン化抗IFN-γ  mAb(クローン7-B6-1、Mabtech社)とともに1時間30分インキュベートした。スポットを、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ(Mabtech社)及びBCIP/NBT基質(Promega社、France)を使用して展開し、自動ELISPOTリーダー(Immunospot、Cellular Technology Limited社、Germany)を使用してカウントした。IFN-γ産生細胞の数を、1×106個のPBMCに対するスポット形成細胞(SFC)として表現した。刺激されていない対照ウェルにおいて検出されたスポットの数を差し引くことによって、値を算出した。値は、それらが20個のスポットに等しい又はそれを上回り、且つ刺激されていない対照ウェルの平均を少なくとも3倍上回る場合に陽性と見なされた。陽性対照として、細胞をCEFペプチドプール(Mabtech社)で刺激した。
【０１１３】
免疫原性及びHLA拘束性予測
MHCクラスI及びクラスIIアレルへのペプチドの結合可能性についての評価を、それぞれNetMHCpan3.0及びNetMHCIIpan3.1サーバーを使用して分析した(Andreatta Mら、2015、Immunogenetics 67(11-12):641〜650頁;Nielsen M & Andreatta M 2016、Genome Med 8(1):33)。
【０１１４】
統計学
すべてのデータを、Prismソフトウェアバージョン7.0(GraphPad Software社)を用いて分析した。2つの独立した群を比較するノンパラメトリック両側マン・ホイットニー検定を使用して、統計的有意性を判定した。差は、P<0.05で有意と見なされた。
【０１１５】
結果
ZIKVプロテオームの免疫優性領域の同定
ZIKV感染後に誘導されたT細胞免疫を検討するために、本発明者らは、ガンマインターフェロン(IFN-γ)特異的な酵素結合免疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイにおいて、ZIKV固有種エリアに住んでいる血液ドナーからの応答を調べた。全研究参加者からの血液サンプルを、ZIKV IgG並びにDENV IgM及びIgGの存在についてはELISAによって、ウイルス特異的抗体の存在については、ZIKV及び4つのDENV血清型に対するフローサイトメトリーに基づく中和アッセイによって試験し、ZIKV血清陽性個体由来のPBMCをHLA型判定した。本研究に含まれた血液ドナーの詳細は、Table 1(表1)に列挙されている。20人のZIKV血清陽性ドナー由来のPBMCを、ZIKVプロテオーム全体にわたる15merペプチド(11個のアミノ酸分重複している)のプールに対するT細胞反応性についてスクリーニングした。応答の大きさ(106個細胞あたりのスポット形成細胞(SFC)として)及び応答ドナーの頻度についての分析により、非構造(NS)タンパク質NS1、NS3、及びNS5は最も強力に且つ高頻度に認識されるタンパク質であり、全応答の69%を占めることが明らかになった(図1A)。際立ったことに、これらNS1、NS3、及びNS5タンパク質は、ZIKVドナーにおける全応答のそれぞれ15%、19%、及び35%に当たり、一方でNS3、NS4B、及びNS5タンパク質は、DENV特異的T細胞応答のそれぞれ31%、15%、及び22%を占めることが報告されている(Simmons CPら、2005、J. Virol. 79(9):5665〜5675頁;Duangchinda Tら、2010、Proc Natl Acad Sci U S A 107(39):16922〜16927頁;Rivino Lら、2013、J. Virol. 87(5):2693〜2706頁;Weiskopf Dら、2013、Proc Natl Acad Sci U S A 110(22):E2046〜2053頁)。これらのドナーはDENV固有種及びZIKV固有種エリアにおいて選択されたため、並びにこれらのウイルスは、全体で43%タンパク質配列同一性を共有するため(非構造タンパク質に関しては最高で68%を有する)、本発明者らは、ZIKV特異的エピトープと両ウイルスによって共有されるものとを区別することを追求した。20人のZIKV血清陽性血液ドナーの中で、11人の個体は抗DENV及び抗ZIKV IgG抗体の両方を有し、9人の個体はいかなる検出可能な抗DENV抗体も示さなかった(Table 1(表1))。故に、本発明者らは、ZIKV感染の病歴のみを有するドナー(ZIKVドナー)からのT細胞応答、並びにDENV及びZIKV感染の病歴を有するドナー(DENV/ZIKVドナー)からのものを別々に分析した。図1B及び1Cに示されるように、NS1、NS3、及びNS5タンパク質は、ZIKVドナーにおける応答のそれぞれ13%、31%、及び32%を占め、一方でそれらは、DENV/ZIKVドナーにおける応答の15%、16%、及び36%を占めた。これらの結果は、DENVによる以前の感染にかかわらず、NS1、NS3、及びNS5が、ZIKV感染ドナーにおけるT細胞に対する主な標的であることを裏付け、並びに、ZIKVのみに感染したドナーと比較して、DENVに以前に感染したドナーにおけるNS5に対する応答の頻度及び大きさの増加を明らかにした。
【０１１６】
【表１Ａ】
2021502115.tif 000003
【０１１７】
【表１Ｂ】
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【０１１８】
【表１Ｃ】
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【０１１９】
【表１Ｄ】
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【０１２０】
ZIKVプロテオーム全体にわたる853種のペプチドから、410種のペプチドが有意なT細胞応答を誘発し、その一部は複数のドナーによって認識された。ほとんどの抗原ペプチドに関して、応答ドナーのHLAクラスI及びクラスIIアレルは、このエピトープに結合すると予測されるアレルと一致した(Andreatta Mら、2015、Immunogenetics 67(11-12):641〜650頁;Nielsen M & Andreatta M 2016、Genome Med 8(1):33)。ZIKV及びDENV/ZIKVドナーにおいて強い応答を誘導するエピトープの中で、いくつかの15merペプチドは、応答ドナーによって発現される少なくとも1つのアレルに強く結合すると予測される短い配列を含有した(Table 2(表2))。例えば、NS2B117〜131ペプチド(配列番号25に規定されるアミノ酸配列を有する)は、応答ドナー55によって発現されるHLA-A*0301及び-A*1101分子に強く結合すると予測される10mer配列(配列番号26に規定されるアミノ酸配列を有する)を含有した。他の場合では、複数の応答ドナーが、刺激ペプチドに結合する強い潜在性を有する少なくとも1つの共通アレルを発現した。このことは、エンベロープにおけるE455〜469ペプチド(配列番号7に規定されるアミノ酸配列を有する)に当てはまり、それは、両アレルとも応答ドナー1及び77によって発現されるHLA-B*5101及びHLA-A*0201アレルに結合すると予測される9mer(配列番号9に規定されるアミノ酸配列を有する)及び10mer(配列番号8に規定されるアミノ酸配列を有する)配列を含有した。このことは、NS513〜27ペプチド(配列番号46に規定されるアミノ酸配列を有する)にも適用され、それは、HLA-B*3501アレルを共有するドナー55及び69において強い応答を誘導し、このアレルは、9merペプチドMSALEFYSY(配列番号47に規定されるアミノ酸配列を有する)に高い親和性で結合すると予測される。興味深いことに、このエピトープは、ドナー69によって発現されるHLA-A*0101分子を保有するトランスジェニックマウスにおいて有意な応答を誘導することも示された(Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036)。同様に、HLA-B*4002及び-B*4403アレルを発現するドナー28、53、及び66においてNS5546〜560ペプチド(配列番号67に規定されるアミノ酸配列を有する)に対して、並びに予測されるHLA-A*2402アレルを共有するドナー33及び59においてNS5605〜619ペプチド(配列番号72に規定されるアミノ酸配列を有する)に対して、強いT細胞応答が観察された。最後に、本発明者らは、NS4B112〜126(配列番号41に規定されるアミノ酸配列を有する)、NS5293〜307(配列番号49及び50に規定されるアミノ酸配列を有する)、NS5297〜311(配列番号53〜55に規定されるアミノ酸配列を有する)、及びNS5345〜359(配列番号58に規定されるアミノ酸配列を有する)ペプチドに含まれる、NS4B及びNS5タンパク質におけるいくつかの9mer免疫優性エピトープも同定し、それは、これらのペプチドに結合する強い潜在性を有する1つ又はいくつかのアレルを共有するドナーにおいて実質的なT細胞応答を誘導した。
【０１２１】
目立ったことに、NS3及びNS5タンパク質の中で、いくつかのエピトープは、ヒトにおけるDENV感染若しくはワクチン接種の後又はマウスにおけるZIKV感染の後に予測された又は実験的に検証された、免疫優性エピトープとして既に記載されている(Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036;Dar Hら、2016、Asian Pac J Trop Med 9(9):844〜850頁;Weiskopf Dら、2015、J. Virol. 89(1):120〜128頁;Dikhit MRら、2016、Infection, genetics and evolution: journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases 45:187〜197頁)。実際に、DENV/ZIKVドナーにおいて同定された9merペプチドの中で、NS5293〜307(配列番号49及び50に規定されるアミノ酸配列を有する)、NS5297〜311(配列番号53〜55に規定されるアミノ酸配列を有する)、及びNS5345〜359(配列番号58に規定されるアミノ酸配列を有する)は、DENV1、DENV2による感染後の、又は、それぞれZIKV由来のNS5297〜311(配列番号53〜55に規定されるアミノ酸配列を有する)及びNS5345〜359(配列番号58に規定されるアミノ酸配列を有する)ペプチドにおける残基302及び350におけるリジンからアルギニンへの及びフェニルアラニンからチロシンへのアミノ酸置換を有する、DENVの生きた弱毒化ワクチン(DLAV)によるワクチン接種の後の、HLA-B*3501個体由来のPBMCにおいて既に検出されている(Rivino Lら、2013、J. Virol. 87(5):2693〜2706頁;Weiskopf Dら、2015、J. Virol. 89(1):120〜128頁;Imrie Aら、2007、J. Virol. 81(18):10081〜10091頁)(Table 2(表2))。故に、DENV/ZIKVドナーから獲得されたこれらの結果は、これらNS5ペプチドが、HLA-B*3501分子によって拘束されるネステッドエピトープを含有することを裏付けた。しかし、APTRVVAAEMエピトープ(配列番号29に規定されるアミノ酸配列を有する)を含有する15merのNS3219〜233ペプチド(配列番号28に規定されるアミノ酸配列を有する)は、HLA-B*0702もB*3501も発現しない2人のDENV/ZIKVドナーにおいて実質的な応答を誘導したが、とはいえこれらのアレルは、DLAVをワクチン接種された応答ドナーにおいて、又はZIKV感染後のifnar-/- HLA-B*0702トランスジェニックマウスにおいて発現した(Wen Jら、2017、Nat. Microbiol. 2:17036;Weiskopf Dら、2015、J. Virol. 89(1):120〜128頁)。このことは、NS3219〜233ペプチド(配列番号28に規定されるアミノ酸配列を有する)が、別のエピトープ、又はHLA-B*0702若しくはB*3501以外に他のHLAアレルに結合する無差別エピトープを含有することを示唆した。
【０１２２】
【表２Ａ】
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【０１２３】
【表２Ｂ】
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【０１２４】
【表２Ｃ】
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【０１２５】
【表２Ｄ】
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【０１２６】
【表２Ｅ】
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【０１２７】
【表２Ｆ】
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【０１２８】
【表２Ｇ】
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【０１２９】
【表２Ｈ】
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【０１３０】
以前のDENV感染を有するドナーにおける、より大きな大きさを有するより広い応答
NS1に対するZIKV特異的抗体応答、並びにE及びNS1タンパク質に対するDENVとZIKVとの間の低いレベルのCD4 T細胞交差反応性(Stettler Kら、2016、Science 353(6301):823〜826頁)を考慮して、本発明者らは、免疫優性エピトープの中で、ZIKVドナー由来のPBMCにおけるT細胞応答と、DENV/ZIKVドナー由来のものとを比較した。まず、ZIKV及びDENV/ZIKVドナーにおける応答T細胞の頻度についての比較は、ZIKVドナーと比べて、DENV/ZIKVドナーにおけるより大きな大きさの応答を強調した(図1B及び1C)。ドナーあたりの刺激ペプチドの数、並びにドナーあたりの平均応答は、以前のDENV感染を有するドナーにおいて有意により広い応答及びより大きな大きさの応答を有して、これら2つの群において異なった(図2A、左及び右のパネル)。この差は、各ドナーにおいてより強い応答を誘発したごく少数のペプチドに関係するのかどうか、又はそれはペプチドの大多数に関係するのかどうかを判定するために、本発明者らは、2つの異なる群において、ドナーごとに種々のペプチドに対する応答の頻度をプロットした。図2Bに示されるように、ZIKVドナーの中で9人のうちの2人の個体は、100 SFC/百万個細胞よりも高い応答中央値を示し、一方で11人のDENV/ZIKVドナーのうちの6人はこの強い応答を進展させ、それはより多くの数のペプチドにも向けられた。この結果は、ナイーブドナーと比較して、DENVに以前に感染したドナーにおいてより大きな大きさの応答を有して、ZIKVペプチドに対するより高い頻度のT細胞の活性化を明らかにした。DENV及びZIKVによる逐次的な感染後のマウスにおいて最近示されたように(Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036)、このことは交差反応性T細胞の存在を強く主張し、これらT細胞はDENVによる初回感染の間にプライムされ、その後ZIKVによる後続感染の間に拡大される。
【０１３１】
DENV/ZIKV交差反応性T細胞は、NS5タンパク質を主に標的にする
ZIKV特異的ペプチド及びDENV/ZIKV交差反応性ペプチドをより特異的に同定するために、本発明者らは、両タイプのドナーによって認識される最も免疫優性なエピトープの配列を比較した。図2A及びTable 3(表3)に示されるように、NS1及びNS3タンパク質は、ZIKV及びDENV/ZIKVドナーの両方において強い応答を誘発した高い割合のペプチドを含有し、一方でEタンパク質及びより高い程度にNS5タンパク質は、DENV/ZIKVドナーにおいてのみ強い応答を誘導するペプチドの大多数を含有した。このことは、NS1及びNS3タンパク質がより多くのZIKV特異的エピトープを含有し、一方でNS5タンパク質は、DENV及びZIKVによって共有され且つ交差反応性T細胞によって認識されるより多くのエピトープを含有することを示唆した。際立ったことに、DENV/ZIKVドナーによってのみ認識されるペプチドのほとんどは、4つのDENV血清型との高い程度の同一性を呈した。例えば、NS1タンパク質において、ZIKVドナーにおいて応答を誘導した5種のエピトープのうちの2種は、4つのDENV血清型と60%よりも高い配列同一性を示し、一方で、DENV/ZIKVドナーにおいて強い応答を誘導したNS5タンパク質における11種のエピトープのうちの8種は、4つのDENV血清型と66.7%よりも高い配列同一性を示した(Table 3(表3))。応答の大きさの増加が、DENVとのより高い配列同一性を有するペプチドの認識と相関するかどうかを判定するために、本発明者らは、DENV及びZIKV配列間の同一性のパーセンテージに対して、各ペプチドに対する累積的応答をプロットした。ZIKVドナーの中で、DENVと約60%の同一性を有する4種のZIKVペプチドのみが、百万個細胞あたり300 SFCよりも高い応答を誘発し得、一方でDENVと少なくとも70%の同一性を有する21種のZIKVペプチドが、DENV/ZIKVドナーにおいてこの強い応答を誘導した(図3);これらのドナーにおいて最も強いT細胞応答を誘導する4種のペプチドは、DENVと最も高い配列同一性を共有した。まとめると、これらのデータは、DENV及びZIKV感染後に誘導される交差反応性T細胞の活性化を強く支持し、それは、DENV及びZIKV間の共通エピトープを認識し且つZIKVに対するT細胞応答を支配した。
【０１３２】
【表３Ａ】
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【０１３３】
【表３Ｂ】
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【０１３４】
【表３Ｃ】
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【０１３５】
本研究において、ZIKV感染したヒト血液ドナー由来のPBMCを用いて、本発明者らは、ZIKVに特異的である又はDENVとZIKVとの間で共有される数々のT細胞エピトープを同定した。DENV特異的T細胞応答は、主としてNS3、NS4B、及びNS5に向けられているが、ZIKVに対する応答は、NS1、NS3、及びNS5タンパク質におけるエピトープを主に標的にした。以前にDENVに感染したドナーにおいて観察された、NS5タンパク質由来のペプチドに対するより強く且つより広いIFN-γ応答は、本発明者らが、この領域は、交差反応性T細胞によって認識されるより多くのペプチドを含有し、一方でNS1タンパク質は、ZIKV特異的T細胞によって優先的に標的にされると仮定することにつながった。これらのデータは、NS1タンパク質と比較して、NS5タンパク質におけるZIKV及びDENV配列間で観察されたより高いパーセンテージの同一性と一致した。その配列同一性に加えて、ZIKVのアジア系列に関して観察される高いNS1分泌可能性(Liu Yら、2017、Nature 545 (7655): 482〜486頁)も、DENVに感染したドナーにおいて観察されるNS1特異的T細胞の頻度と比較した、ZIKVに感染したドナーにおいて誘導されるNS1特異的T細胞のより高い頻度を説明し得た(Weiskopf Dら、2013、Proc Natl Acad Sci U S A 110(22):E2046〜2053頁)。
【０１３６】
いくつかのエピトープに関して、15mer又は9merペプチドは、ヒトHLA分子を発現するトランスジェニックマウスにおいて最近同定されたエピトープと合致し、故に、このペプチドに対するクラスIアレル拘束性を裏付けた。これは、HLA-B*0702アレルを発現するドナーにおいて応答を誘導する15merペプチドVARVSPFGGLKRLPA(配列番号92に規定されるアミノ酸配列を有する)に当てはまり(データ示さず)、それは、ZIKVに感染したHLA-B*0702トランスジェニックマウスにおいて有意な応答を誘発することを示したC25〜35ペプチドSPFGGLKRLPA(配列番号93に規定されるアミノ酸配列を有する)(Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036)を含有した。同じ相関が、NS3(FPDSNSPIM、配列番号94に規定されるアミノ酸配列を有する)、NS4B(RGSYLAGASLIYTVT、配列番号95に規定されるアミノ酸配列を有する)、及びNS5(NQMSALEFYSY、配列番号96に規定されるアミノ酸配列を有する)ペプチドに関して確立され、それは、それぞれHLA-B*0702及びHLA-A*0101アレルを発現するヒトドナーにおいて(データ示さず、及びTable 2(表2))、並びにこれらのアレルを発現するトランスジェニックマウスにおいて(Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036)、強い応答を誘導した。他の場合では、NS3219〜233ペプチド(配列番号28に規定されるアミノ酸配列を有する)(Table 2(表2))及びNS119〜33(配列番号78に規定されるアミノ酸配列を有する)又はNS513〜27(配列番号46に規定されるアミノ酸配列を有する)ペプチド(Table 3(表3))等、HLA-B*0702及びHLA-A*0101トランスジェニックマウスにおいて同定されたエピトープは、それにもかかわらず、これらのアレルを発現しない応答ドナーにおいても同定され、それは、HLA-B*0702又はHLA-A*0101という2つのアレルのどちらも発現しないドナーにおいて応答を誘発した。これらのドナーに関して、1つの可能性は、トランスジェニックマウスにおいて同定されたエピトープが、トランスジェニックマウスによって発現されるアレルとは異なるヒトHLAアレルに対してより高い親和性を有すること、又は15merペプチドが、異なるアレルに結合する別のエピトープを含有することであり得た。9merエピトープを用いた結合研究、及びTAP欠損細胞を使用したHLAクラスI安定化アッセイは、これらの可能性を区別するはずである。
【０１３７】
本発明者らは、DENVとの共通配列を共有し且つDENV及びZIKV感染後に交差反応性T細胞によって優先的に標的にされる、いくつかのペプチドの同定も報告した。これらのペプチドの中で、NS5293〜307(配列番号48に規定されるアミノ酸配列を有する)及びNS5297〜311(配列番号52に規定されるアミノ酸配列を有する)ペプチドは、アミノ酸配列HPYRTWAYH(配列番号49に規定されるアミノ酸配列を有する)を含有し、それは、DENV1に感染した太平洋諸島民において以前に同定されたエピトープと7個のアミノ酸を共有した(Imrie Aら、2007、J. Virol. 81(18):10081〜10091頁)。同様に、NS5325〜339(配列番号86に規定されるアミノ酸配列を有する)ペプチドは、アミノ酸配列KPWDVVTGV(配列番号97に規定されるアミノ酸配列を有する)を含有し、それも、DENV1に感染したこれらの個体において同定されたエピトープKPWDVIPMV(配列番号98に規定されるアミノ酸配列を有する)と66.7%同一であった(Imrie Aら、2007 J. Virol. 81(18):10081〜10091頁)。最後に、DENV/ZIKVドナーにおいて最も強い応答を誘導するNS5345〜359(配列番号58に規定されるアミノ酸配列を有する)、NS5465〜479(配列番号88に規定されるアミノ酸配列を有する)、及びNS5481〜495(配列番号89に規定されるアミノ酸配列を有する)ペプチド(Table 3(表3))も、DENVに感染した個体において以前に同定された9merエピトープを含有した(Weiskopf Dら、2015、J. Virol. 89(1):120〜128頁)。まとめると、これらのデータは、逐次的なDENV及びZIKV感染後の応答を支配するDENV/ZIKV交差反応性T細胞の活性化を明らかにした。注目すべきは、これらの交差反応性ペプチドは、DENVとの高い程度の配列同一性を呈し、DENV感染後にT細胞応答を刺激し得たものの、これらのペプチドはZIKVによる初感染後には応答を誘導せず、これらのペプチドがDENVの背景において免疫優性であるが、ZIKV感染の背景においてはそうではないことを示唆した。エピトープの免疫優性又はその相対的存在量は、タンパク質によって発現される他のエピトープに依存することから、この結果は予想された。これは、エピトープ産生が、タンパク質配列において発現される隣接残基の切断可能性と相関することを示した以前の観察結果とも一致した(Zhang SCら、2012、J. Immunol. 188(12):5924〜5934頁)。重要なことに、DENV/ZIKV応答ドナーにおいて発現されるアレルのほとんどがZIKVドナーにおいても発現されることから、これらの交差反応性エピトープに関して、ZIKVに感染したドナーにおいてT細胞応答がないことは、単に、この集団に提示HLAアレルがないことに起因するわけではなかった(Table 1(表1))。これは、本発明者らが、ZIKVドナーによって高頻度に発現されるHLA-B*3501及びHLA-B*4002アレルへの強い結合体であることがそれぞれ予測される、NS513〜27(配列番号46に規定されるアミノ酸配列を有する)、NS5293〜307(配列番号48に規定されるアミノ酸配列を有する)、NS5345〜359(配列番号57に規定されるアミノ酸配列を有する)、及びNS5546〜560(配列番号67に規定されるアミノ酸配列を有する)エピトープに関して観察したものである(Table 2(表2)及び図3)。まとめると、これらの結果は、初回ZIKV感染の場合、ZIKV特異的エピトープの優先的認識があり、一方で異種DENV/ZIKV感染の後に、交差反応性エピトープに対するより高頻度で且つより強いT細胞応答があることを示した。興味深いことに、これらNS5エピトープに対するDENV/ZIKVドナーにおいて観察された強いT細胞応答は、DENVに対する非常に大きな応答、並びにDENV感染及び疾患に対するより強い防御と関連したアレルであるHLA-B*3501アレルを発現するドナーに主に依存した(Weiskopf Dら、2013、Proc Natl Acad Sci U S A 110(22):E2046〜2053頁)。すべての血液サンプルは、無症候性ZIKV感染の病歴を有するドナーから獲得されたことから、本発明者らは、HLA-B*3501ドナーにおいて獲得されたZIKV特異的T細胞応答の強さと、疾患に対する防御とを関連付けすることはできなかった。DENVに関しては、ZIKV感染においてT細胞のHLAに関連した防御的役割があるかどうかを判定するために、ZIKV初感染後に疾患へのより高い感受性を有するより多くの対象を用いた更なる研究を要した。同じように、マウスにおいて最近示唆されたように(Wen Jら、2017、Nat Microbiol 2:17036;Elong Ngono Aら、2017、Cell host & microbe 21(1):35〜46頁)、以前のDENV感染を有する又は経験していないドナーにおける疾患重症度を比較して、DENV感染後に誘導される交差反応性T細胞が、ZIKV感染及び疾患に対するより良好な防御を媒介し得るかどうかを判定することも重要であろう。CD4+及びCD8+ T細胞の両方とも、DENV感染に対する防御に寄与することが示されたことから、ZIKV感染及び疾患防御におけるCD4の役割を判定するために、MHCクラスII拘束性応答の包括的分析が必要とされる。最後に、無症候性又は症候性ドナーにおけるZIKV特異的T細胞の更なる表現型分析は、ZIKV感染及び疾患に対する自然免疫及びワクチン接種における防御の相関を規定するのに役立つであろう。DENV特異的T細胞に関しては、ZIKV特異的ペプチドに対する強い応答が、特異的HLAアレルにおいてより高頻度であり、多機能性と関連しているかどうかを判定することが特に重要であろう(Weiskopf Dら、2013、Proc Natl Acad Sci U S A 110(22):E2046〜2053頁)。
【０１３８】
結論として、多くの研究がZIKVに対する抗体応答、より具体的にはZIKVとDENVとの間で共有されるB細胞エピトープの同定に焦点を合わせているものの、ZIKV感染の制御におけるT細胞の役割に関してはほとんど知られていない。DENVに対して血清陽性の又はそうではない、ZIKV感染の最近の病歴を有する血液ドナー由来のPBMCを使用して、本発明者らは、インターフェロン(IFN)-γ酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイにより完全プロテオームをスクリーニングすることによって、ZIKV T細胞エピトープの分布についての最初のマップを確立した。本発明者らは、非構造タンパク質NS1、NS3、及びNS5が、強いT細胞応答を誘導する免疫優性ペプチドのほとんどを含有することを示した。本発明者らは、NS5タンパク質が、両ウイルスによって共有され且つDENV及びZIKV感染後に最も高い応答を誘導する多くのエピトープを含有することも示した。際立ったことに、DENV感染の病歴を有するドナーは、DENV CD8+ T細胞エピトープとして以前に同定されたペプチドに対して実質的な応答を示した。これらのドナーにおいて観察された最も強いT細胞応答は、4つのDENV血清型との高いレベルのアミノ酸同一性を有する配列に相当し、交差反応性T細胞の活性化を示唆した。これらの結果は、将来のZIKV及びDENVワクチンに対する重大な暗示を有し、これらのウイルスに対する長期免疫の誘導におけるZIKV特異的で且つDENV/ZIKVで共有されるT細胞エピトープの役割を研究する新たな機会を提供する。
【０１３９】
マウスにおけるポリZIKV DNAワクチン接種
DNA免疫付与は、キメラポリエピトープをコードするプラスミド、及び3週間の間隔での2×50μg DNAを用いたエレクトロポレーション、及びウイルスを用いたブーストの15日後の負荷(103pfu/マウスを用いたZIKVの腹腔内注射)を使用して実施される。
【０１４０】
プラスミド及びエレクトロポレーション(EP)を用いたDNAワクチン接種は、以下のように実施される。
【０１４１】
ワクチン接種に関して、2mg/mlの25μlのDNAのそれぞれの2回の注射は、背部における皮内接種、その直後にAgilePulse装置(BTX Harvard Apparatus)を使用したエレクトロポレーションが続くことによって実施される。
【０１４２】
エレクトロポレーション手順は、3つの電圧群:
群1:450V、パルス長50μ秒、0.2μ秒のパルス間隔、Nbパルス:1;
群2:450V、パルス長50μ秒、50μ秒のパルス間隔、Nbパルス:1;
群3:110V、パルス長10m秒、20m秒のパルス間隔、Nbパルス:8
からなる。
【０１４３】
ZIKVを用いた負荷の-1日前に、2mgの抗IFNAR抗体(MAR1-5A3)を用いた腹腔内注射を実施して、IFN I型応答を一過性に遮断する。
【０１４４】
負荷後1日目〜6日目の血漿サンプルにおけるqRT-PCRによって、ウイルス血症を定量する。
【０１４５】
非ヒト霊長類(インド猿アカゲザル(Rhesus Macaques))におけるDNAワクチン接種
DNAワクチン接種は、以前に記載されるように(Dowd, K.A.ら、Science 2016、354、237〜240頁)、0及び4週間の時点における、ZIKVのキメラポリエピトープをコードする1mgプラスミドを用いた2回の筋肉内注射、それに続く104pfuのZIKVを皮下に接種することによる4週間後の負荷によって実施される。
【０１４６】
PBMCを、0日目(プライム前)、プライム後7日目、次いで35日目(ブーストの1週間後)、及び60日目(ZIKVを用いた負荷前)に収集して、キメラポリエピトープ配列全体を網羅する重複ペプチドに対するT細胞応答(IFN-γ及びTNF-α)をELISpotによって分析する。単球CD14、DC、T細胞、B細胞、及びNK細胞の数及び表現型、並びにT細胞(CD8 T細胞)のサイトカインプロファイルを、細胞内染色によって分析する。
【０１４７】
血液サンプルも、0日目(免疫付与前)、14日目、28日目(ブースト前)、及び56日目(負荷前)に収集して、フォーカス減少中和力価(Focus Reduction Neutralization Titre)(FRNT)によって中和Ab力価を判定する。
【０１４８】
血漿サンプルを、56日目(負荷前)から66日目まで毎日、qRT-PCRによるウイルス血症の定量のために試験する。
【０１４９】
エレクトロポレーションを排除する遺伝的アジュバントとして、サイトカインを発現するプラスミドを用いたDNAワクチン接種を使用する代替的プロトコール
最近の研究により、T細胞エピトープを発現するプラスミドと、IL-12若しくはGM-CSFのいずれか、又はIL-12及びGM-CSFの両方の組合せを発現するプラスミドとの共投与は、エレクトロポレーション(EP)の必要性を排除するほど十分にT細胞応答を向上させることが示されている(Boyer, J.D.ら、J Med Primatol 2005、34、262〜270頁;Suschak, J.J.ら、The Journal of infectious diseases 2018;Suschak, J.J.ら、Antiviral research 2018、159、113〜121頁)。
【０１５０】
故に、本発明者らは、ZIKVペプチドに対するT細胞応答の大きさ、及びアカゲ猿におけるZIKV感染に対する免疫防御に対しての、ポリZIKV DNA免疫付与と組み合わせたIL-12及びGM-CSF DNA免疫付与の効果を査定する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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