(57)【要約】本出願は、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するための材料および方法、ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための材料および方法、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための材料および方法、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための材料および方法、ならびに細胞のＵＳＨ２Ａ遺伝子内にＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるための方法を提供する。本出願はまた、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡも提供する。本出願は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するための治療を提供する。本出願はまた、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのキットを提供する。
2021508451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、
前記ヒト細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、それによって、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子または前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードするＤＮＡ配列内またはその近傍に、修正をもたらす１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、
ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入し、それによって、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、修正をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
前記ＩＶＳ４０変異が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法であって、前記患者の細胞においてＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項５】
前記編集するステップが、
前記細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、修正をもたらし、アシェリンタンパク質機能の回復をもたらす、１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせること
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＶＳ４０変異が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、請求項４〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、その相同体、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化形態、またはそれらの修飾バージョン、ならびにそれらの組合せである、請求項１〜２、または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞へと、前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞へと、前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）を導入するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数のＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数の修飾ＲＮＡである、請求項８または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞へと、１つまたは複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を導入するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数のｇＲＮＡが、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞へと、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、イントロン領域、これらの断片もしくは組合せ、または前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡの全体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ドナー鋳型が、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ドナー鋳型が、１ｑ４１領域に対する相同性アームを有する、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞へと、１つのｇＲＮＡを導入するステップ
をさらに含み、
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に位置するローカスに１つのＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、
前記ｇＲＮＡが、イントロン４０内に位置する前記ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、請求項２または５に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞へと、１つまたは複数のｇＲＮＡを導入するステップ
をさらに含み、
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、１対のＳＳＢまたはＤＳＢであって、その第１のものが５’ローカスにありその第２のものが３’ローカスにある、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、
第１の前記ｇＲＮＡが、前記５’ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含み、第２の前記ｇＲＮＡが、前記３’ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、請求項２または５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＶＳ４０変異が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子の少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型をさらに含み、
前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に位置する前記ローカスにおいて染色体ＤＮＡへと挿入され、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子における前記ＩＶＳ４０変異の修正をもたらす、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子の少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型をさらに含み、
前記ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍の前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間において染色体ＤＮＡへと挿入され、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍の前記５’ローカスと前記３’ローカスとの間において前記染色体ＤＮＡの修正をもたらす、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの前記少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、イントロン領域、これらの断片もしくは組合せ、または前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡの全体である、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドドナー鋳型が、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドドナー鋳型が、１ｑ４１領域に対する相同性アームを有する、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＳＳＢまたはＤＳＢが、イントロン４０内で、前記ＩＶＳ４０変異の０〜１８００ヌクレオチド上流に位置する、請求項２０〜３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＳＳＢまたはＤＳＢが、イントロン４０内で、前記ＩＶＳ４０変異の０〜１１００ヌクレオチド下流に位置する、請求項２０〜３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０のセグメントに相補的である、請求項１２〜１５または２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記修正が、相同組換え修復（ＨＤＲ）によるものである、請求項１〜３または５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ドナー鋳型が、前記ＩＶＳ４０変異に対する相同性アームを有する、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞へと、２つのｇＲＮＡを導入するステップ
をさらに含み、
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、１対のＤＳＢであって、その第１のものが５’ＤＳＢローカスにあり、その第２のものが３’ＤＳＢローカスにあり、前記５’ＤＳＢローカスと前記３’ＤＳＢローカスとの間において染色体ＤＮＡの欠失を引き起こし、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍の前記５’ＤＳＢローカスと前記３’ＤＳＢローカスとの間において前記染色体ＤＮＡの欠失をもたらす、１対のＤＳＢを生じさせる、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、
第１の前記ｇＲＮＡが、前記５’ＤＳＢローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含み、第２の前記ｇＲＮＡが、前記３’ＤＳＢローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、請求項２または５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＩＶＳ４０変異が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記２つのｇＲＮＡが、２つのｓｇＲＮＡである、請求項３６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡが、２つの修飾ｇＲＮＡまたは２つの修飾ｓｇＲＮＡである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
イントロン４０内の前記５’ＤＳＢが、前記ＩＶＳ４０変異の０〜１８００ヌクレオチド上流に位置する、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
イントロン４０内の前記３’ＤＳＢが、前記ＩＶＳ４０変異の０〜１１００ヌクレオチド下流に位置する、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記欠失が、５０ｂｐ〜２９００ｂｐの欠失である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記欠失が、５０ｂｐ〜２０００ｂｐの欠失である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記欠失が、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの欠失である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記欠失が、５０ｂｐ〜５００ｂｐの欠失である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記欠失が、５０ｂｐ〜２５０ｂｐの欠失である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子の少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型をさらに含む、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ、別個の脂質ナノ粒子中に製剤化されるか、またはすべてが１つの脂質ナノ粒子中に共製剤化されるかのいずれかである、請求項２０〜２２、および３６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ、別個のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に製剤化されるか、またはすべてが１つのＡＡＶベクター中に共製剤化されるかのいずれかである、請求項２０〜２２、および３６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子中に製剤化され、前記ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方が、ＡＡＶベクターによって前記細胞へと送達される、請求項２０〜２２、および３６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子中に製剤化され、前記ｇＲＮＡが、電気穿孔によって前記細胞へと送達され、ドナー鋳型が、ＡＡＶベクターによって前記細胞へと送達される、請求項２０〜２２、および３６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＡＡＶベクターが、自己不活性化ＡＡＶベクターである、請求項５０〜５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子が、第１染色体：２１５，６２２，８９３〜２１６，４２３，３９５（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ−ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
アシェリンタンパク質機能の前記回復が、野生型または正常なアシェリンタンパク質機能と比較される、請求項１〜３または５〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリヌクレオチドドナー鋳型が、最大１１ｋｂである、請求項１６に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチドドナー鋳型が、ＡＡＶによって送達される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ヒト細胞が、光受容細胞または網膜前駆細胞である、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞が、光受容細胞または網膜前駆細胞である、請求項４〜５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記修正が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項６１】
前記修正が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす、請求項２に記載の方法。
【請求項６２】
前記修正が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらし、アシェリンタンパク質機能の回復をもたらす、請求項５に記載の方法。
【請求項６３】
前記編集するステップが、
前記細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらし、アシェリンタンパク質機能の回復をもたらす、１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせること
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６４】
ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、
前記ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入し、それによって、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子または前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードするＤＮＡ配列内またはその近傍に、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップ
を含む、方法。
【請求項６５】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、
ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入し、それによって、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップ
を含む、方法。
【請求項６６】
前記ＩＶＳ４０変異が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞において、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡであって、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡ。
【請求項６８】
前記ＩＶＳ４０変異が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、請求項６７に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡ。
【請求項６９】
１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、請求項６７〜６８に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡ。
【請求項７０】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項６７〜６９に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項７１】
前記細胞が、光受容細胞、網膜前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項６７〜７０に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項７２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための少なくとも１つまたは複数のｇＲＮＡを含む治療であって、前記１つまたは複数のｇＲＮＡが、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、治療。
【請求項７３】
前記ＩＶＳ４０変異が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、請求項７２に記載の治療。
【請求項７４】
前記１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、請求項７２〜７３に記載の治療。
【請求項７５】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、請求項７２〜７４に記載の治療。
【請求項７６】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するための治療であって、
１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入するステップ、
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡを導入するステップ、
必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型を導入するステップ
を含む方法によって構成され、
前記１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、治療。
【請求項７７】
前記ＩＶＳ４０変異が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、請求項７６に記載の治療。
【請求項７８】
ｉｎ  ｖｉｖｏで２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのキットであって、
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡであって、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと、
１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、
必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型と
を含む、キット。
【請求項７９】
前記ＩＶＳ４０変異が、前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、請求項７８に記載のキット。
【請求項８０】
前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、その相同体、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化形態、またはそれらの修飾バージョン、ならびにそれらの組合せである、請求項７８〜７９に記載のキット。
【請求項８１】
１つまたは複数のドナー鋳型を含む、請求項７８〜８０のいずれかに記載のキット。
【請求項８２】
前記ドナー鋳型が、１ｑ４１領域に対する相同性アームを有する、請求項８１に記載のキット。
【請求項８３】
前記ドナー鋳型が、前記ＩＶＳ４０変異に対する相同性アームを有する、請求項８１に記載のキット。
【請求項８４】
配列番号５３２１を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項８５】
配列番号５３２３を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項８６】
配列番号５３２５を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項８７】
配列番号５３２７を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項８８】
配列番号５３２８を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項８９】
配列番号５３２１、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項９０】
配列番号５３２３、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項９１】
配列番号５３２５、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項９２】
配列番号５３２７、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項９３】
配列番号５３２８、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ。
【請求項９４】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２１を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項９５】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２３を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項９６】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２５を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項９７】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２７を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項９８】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２８を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項９９】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２１、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項１００】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２３、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項１０１】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２５、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項１０２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２７、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項１０３】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２８、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法。
【請求項１０４】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２１を含む、方法。
【請求項１０５】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２３を含む、方法。
【請求項１０６】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２５を含む、方法。
【請求項１０７】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２７を含む、方法。
【請求項１０８】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２８を含む、方法。
【請求項１０９】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２１、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法。
【請求項１１０】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２３、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法。
【請求項１１１】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２５、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法。
【請求項１１２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２７、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法。
【請求項１１３】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２８、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法。
【請求項１１４】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２９５を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５２７９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１１５】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２９４を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１１６】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２９５を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１１７】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２９０を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１１８】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２７７を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１１９】
前記第１のｇＲＮＡおよび第２のｓｇＲＮＡが、同時に投与されるか、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与されるか、または前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与される、請求項１１４〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９５を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２７９を含む、方法。
【請求項１２１】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９４を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３００を含む、方法。
【請求項１２２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９５を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３００を含む、方法。
【請求項１２３】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９０を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３００を含む、方法。
【請求項１２４】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２７７を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３００を含む、方法。
【請求項１２５】
前記患者へと、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、同時に投与されるか、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与されるか、または前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与される、請求項１２０〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４５２を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４４９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１２７】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４５３を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４４９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１２８】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４５５を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４５７を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１２９】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４５２を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４５１を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１３０】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４４８を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４４９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法。
【請求項１３１】
前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、同時に投与されるか、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与されるか、または前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与される、請求項１２６〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５２を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４４９を含む、方法。
【請求項１３３】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５３を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４４９を含む、方法。
【請求項１３４】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５５を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５７を含む、方法。
【請求項１３５】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５２を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５１を含む、方法。
【請求項１３６】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、前記患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４４８を含み、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４４９を含む、方法。
【請求項１３７】
前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、同時に投与されるか、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与されるか、または前記第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与される、請求項１３２〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本出願は、２Ａ型アッシャー症候群を処置するための材料および方法を提供する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２０１７年１２月２１日に出願された米国仮出願第６２／６０９，３３３号および２０１８年１０月１６日に出願された米国仮出願第６２／７４６，２２６号の利益を主張し、これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
参照による配列表の組込み
本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含み（ファイル名：１７０６４６ＰＣＴ＿ＳＴ２５、１１，３９８，９７８バイトのＡＳＣＩＩテキストファイル、２０１８年１２月１９日に作成）、これは、参照によりその全体が組み込まれ、本開示の一部をなす。
【背景技術】
【０００４】
背景
アッシャー症候群は、聴覚および視覚の両方に影響を及ぼす状態である。アッシャー症候群の主要な症状は、聴覚喪失、ならびに網膜の進行的な変性を通じて夜盲および周辺視野の喪失を引き起こす網膜色素変性と称される眼の障害である。アッシャー症候群を有する多くの人が、重度の平衡感覚の問題も有する。
【０００５】
現在のところ、アッシャー症候群と関連する視力喪失の進行を効率的に停止または遅延させることができるこの疾患に適した処置は存在せず、アッシャー症候群の安全かつ有効な処置を開発する重大な必要性が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を、排除しないとしても改善するための新規な方法を提示する。この新規なアプローチは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子における変異、例えば、ＩＶＳ４０変異を、この変異を含む遺伝子によってコードされるスプライスドナー部位として使用される配列の破壊をもたらす方法により、標的とする。スプライスドナー部位は、誤ったスプライシングを引き起こす。さらに、一部の場合には、処置は、少ない回数の処置、一部の場合には単回の処置で、有効であり得る。結果として得られる治療は、ＩＶＳ４０変異が関連する２Ａ型アッシャー症候群を改善することができるか、または一部の場合には、ＩＶＳ４０変異が関連する２Ａ型アッシャー症候群を排除することができる。
【０００７】
ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、ヒト細胞へと、１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、それによって、ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードするＤＮＡ配列内またはその近傍に、修正をもたらす１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップを含む、方法が、本明細書に提示される。
【０００８】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入し、それによって、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、修正をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップを含む。
【０００９】
ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入し、それによって、ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードするＤＮＡ配列内またはその近傍に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップを含む、方法もまた、本明細書に提示される。
【００１０】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入し、それによって、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップを含む。
【００１１】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者の細胞においてＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００１２】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞において、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための１つまたは複数のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）もまた、本明細書に提示される。１つまたは複数のｇＲＮＡは、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む。
【００１３】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するための治療であって、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための少なくとも１つまたは複数のｇＲＮＡを含む、治療もまた、本明細書に提示される。１つまたは複数のｇＲＮＡは、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む。
【００１４】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するための治療であって、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入するステップと、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を導入するステップと、必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型を導入するステップとを含む方法によって構成される、治療もまた、本明細書に提示される。１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む。
【００１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏで２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのキットもまた、本明細書に提示される。キットは、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型とを含む。１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む。
【００１６】
配列番号５３２１を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００１７】
配列番号５３２３を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００１８】
配列番号５３２５を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００１９】
配列番号５３２７を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００２０】
配列番号５３２８を含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００２１】
配列番号５３２１、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００２２】
配列番号５３２３、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００２３】
配列番号５３２５、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００２４】
配列番号５３２７、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００２５】
配列番号５３２８、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。
【００２６】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２１を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００２７】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２３を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００２８】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２５を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００２９】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２７を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００３０】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２８を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００３１】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２１、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００３２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２３、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００３３】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２５、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００３４】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２７、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００３５】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５３２８、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む。
【００３６】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２１を含む。
【００３７】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２３を含む。
【００３８】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２５を含む。
【００３９】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２７を含む。
【００４０】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２８を含む。
【００４１】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２１、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む。
【００４２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２３、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む。
【００４３】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２５、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む。
【００４４】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２７、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む。
【００４５】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へとｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３２８、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む。
【００４６】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５２９５を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５２７９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００４７】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５２９４を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００４８】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５２９５を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００４９】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５２９０を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００５０】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５２７７を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００５１】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５２９５を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５２７９を含む。
【００５２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５２９４を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３００を含む。
【００５３】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５２９５を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３００を含む。
【００５４】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５２９０を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３００を含む。
【００５５】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５２７７を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５３００を含む。
【００５６】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５４５２を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４４９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００５７】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５４５３を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４４９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００５８】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５４５５を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４５７を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００５９】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５４５２を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４５１を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００６０】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、配列番号５４４８を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４４９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む。
【００６１】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４５２を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４４９を含む。
【００６２】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４５３を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４４９を含む。
【００６３】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４５５を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４５７を含む。
【００６４】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４５２を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４５１を含む。
【００６５】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法もまた、本明細書に提示される。本方法は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ここで、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４４８を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、配列番号５４４９を含む。
【００６６】
本明細書に記載される本発明は、この発明の概要に要約される例に限定されないことを理解されたい。様々な他の態様が、本明細書に記載され、例証される。この概要は、特許請求の範囲を制限することを意図するものではない。
【００６７】
本明細書において開示し、説明するアッシャー症候群の処置のための材料および方法の様々な態様は、付属の図を参照して、より良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｂは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。図１Ａは、ｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。
【００６９】
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｂは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。図１Ｂは、ｓｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を図示する。
【００７０】
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ａ〜Ｂは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
【００７１】
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ａ〜Ｂは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
【００７２】
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｃ〜Ｄは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を示す。
【００７３】
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｃ〜Ｄは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を示す。
【００７４】
【図２Ｅ】図２Ａ〜Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｅ〜Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
【００７５】
【図２Ｆ】図２Ａ〜Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｅ〜Ｆは、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
【００７６】
【図２Ｇ】図２Ｇ〜Ｉは、あるｓｇＲＮＡ配列について、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｇは、あるｓｇＲＮＡ配列について、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
【００７７】
【図２Ｈ】図２Ｇ〜Ｉは、あるｓｇＲＮＡ配列について、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｈは、あるｓｇＲＮＡ配列について、標的ＤＮＡ配列を示す。
【００７８】
【図２Ｉ】図２Ｇ〜Ｉは、あるｓｇＲＮＡ配列について、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｉは、あるｓｇＲＮＡ配列について、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
【００７９】
【図２Ｊ】図２Ｊ〜Ｌは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｊは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を示す。
【００８０】
【図２Ｋ】図２Ｊ〜Ｌは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｋは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を示す。
【００８１】
【図２Ｌ】図２Ｊ〜Ｌは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、標的ＤＮＡ配列、およびｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。図２Ｌは、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を示す。
【００８２】
【図３】図３は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０に位置するＩＶＳ４０変異、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異を編集する結果、およびＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異を編集しない結果を示す図である。
【００８３】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によってゲノムＤＮＡに導入されるＩＶＳ４０変異を示し、ＩＶＳ４０変異は、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０における一塩基変異（ＡからＧ）である。図４Ａは、ＨＤＲによるゲノムＤＮＡへのＩＶＳ４０変異の導入を示す。
【００８４】
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によってゲノムＤＮＡに導入されるＩＶＳ４０変異を示し、ＩＶＳ４０変異は、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０における一塩基変異（ＡからＧ）である。図４Ｂは、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０における一塩基変異（ＡからＧ）としてのＩＶＳ４０変異を示す。
【００８５】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂは、いくつかのＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡの結合領域、ならびにＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのそれぞれについて、オンターゲットおよびオフターゲット編集効率を示す。図５Ａは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のＩＶＳ４０変異の周囲のいくつかのｓｇＲＮＡスペーサー領域（配列番号５３２１、５３２３、５３２５、５３２７、および５３２８）の結合領域を示す。先端は、ゲノムＤＮＡにおいてＰＡＭ配列に隣接する領域である。
【００８６】
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｂは、いくつかのＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡの結合領域、ならびにＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのそれぞれについて、オンターゲットおよびオフターゲット編集効率を示す。図５Ｂは、図５Ａに示されるＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのそれぞれについて、オンターゲットおよびオフターゲット編集効率を示す。
【００８７】
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、（１）ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９と会合し、（２）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、またはＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、ｓｇＲＮＡについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、−８−（＋１１）は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の８ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の１１ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、−５７１−５９０は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の５７１ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の５９０ヌクレオチド上流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、＋７４４−７６３は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の７４４ヌクレオチド下流の位置からＩＶＳ４０の７６３ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。図６Ａ〜Ｂは、ＳｐＣａｓ９と会合し、（１）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、（２）ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、または（３）ＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、５２個のｓｇＲＮＡのそれぞれについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。
【００８８】
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、（１）ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９と会合し、（２）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、またはＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、ｓｇＲＮＡについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、−８−（＋１１）は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の８ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の１１ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、−５７１−５９０は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の５７１ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の５９０ヌクレオチド上流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、＋７４４−７６３は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の７４４ヌクレオチド下流の位置からＩＶＳ４０の７６３ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。図６Ａ〜Ｂは、ＳｐＣａｓ９と会合し、（１）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、（２）ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、または（３）ＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、５２個のｓｇＲＮＡのそれぞれについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。
【００８９】
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、（１）ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９と会合し、（２）ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするか、ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、またはＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、ｓｇＲＮＡについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、−８−（＋１１）は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の８ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の１１ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、−５７１−５９０は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の５７１ヌクレオチド上流の位置からＩＶＳ４０の５９０ヌクレオチド上流の位置の間に結合することを示す。ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置について、＋７４４−７６３は、ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の７４４ヌクレオチド下流の位置からＩＶＳ４０の７６３ヌクレオチド下流の位置の間に結合することを示す。図６Ｃは、ＳａＣａｓ９と会合し、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合するか、または（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合するかのいずれかである、１６個のｓｇＲＮＡのそれぞれについて、ＩＶＳ４０変異に対する位置、ＩＶＳ４０ヌクレオチドに対する位置、およびオンターゲット編集効率を示す。
【００９０】
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ａは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合、およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合を示す。
【００９１】
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｂは、ＩＶＳ４０変異を含む編集されていないゲノムＤＮＡを示す。
【００９２】
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｃは、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合する第１のｓｇＲＮＡまたは（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合する第２のｓｇＲＮＡのいずれかによる、ゲノムＤＮＡの編集を示す。
【００９３】
【図７Ｄ】図７Ａ〜Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｄは、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合する第１のｓｇＲＮＡおよび（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合する第２のｓｇＲＮＡの両方によるものであるが、編集が欠失をもたらさない、ゲノムＤＮＡの編集を示す。
【００９４】
【図７Ｅ】図７Ａ〜Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｅは、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合する第１のｓｇＲＮＡおよび（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合する第２のｓｇＲＮＡの両方によるものであり、編集が欠失をもたらす、ゲノムＤＮＡの編集を示す。
【００９５】
【図７Ｆ】図７Ａ〜Ｆは、ＩＶＳ４０変異の上流への第１のｓｇＲＮＡの結合およびＩＶＳ４０変異の下流への第２のｓｇＲＮＡの結合、ならびに二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。図７Ｆは、（１）ＩＶＳ４０変異の上流に結合する第１のｓｇＲＮＡおよび（２）ＩＶＳ４０変異の下流に結合する第２のｓｇＲＮＡの両方によるものであるが、編集が欠失をもたらさない、ゲノムＤＮＡの編集を示す。代わりに、編集は、逆転をもたらす。
【００９６】
【図８】図８は、ｄｄＰＣＲを使用して、欠失の定量分析を行うためのスキームである。
【００９７】
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す。それぞれの二重ｓｇＲＮＡを構成する図９Ａ〜Ｂに含まれるｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９と会合する。図９Ａは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す表である。
【００９８】
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す。それぞれの二重ｓｇＲＮＡを構成する図９Ａ〜Ｂに含まれるｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９と会合する。図９Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示すグラフである。
【００９９】
【図１０】図１０は、ＳａＣａｓ９と会合するｓｇＲＮＡをコードするように操作することができる、ｐＡＡＶ−Ｕ６プラスミドを示す。
【０１００】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す。それぞれの二重ｓｇＲＮＡを構成する図１１Ａ〜Ｂに含まれるｓｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９と会合する。図１１Ａは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す表である。
【０１０１】
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示す。それぞれの二重ｓｇＲＮＡを構成する図１１Ａ〜Ｂに含まれるｓｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９と会合する。図１１Ｂは、選択された異なる二重ｓｇＲＮＡについて、欠失の頻度および結果として得られる欠失のサイズを示すグラフである。
【０１０２】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｃは、スプライシングレポータープラスミドであるｐＥＴ０１；２つの異なるＵＳＨ２Ａ  ＤＮＡインサートの概略図；ならびに２つの異なるスプライスレポータープラスミドのうちの１つおよび４つの異なるＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのうちの１つをトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３  ＳｐＣａｓ９陽性細胞のｍＲＮＡから増幅させたＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル画像を示す。図１２Ａは、スプライシングレポータープラスミドｐＥＴ０１を示す。
【０１０３】
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｃは、スプライシングレポータープラスミドであるｐＥＴ０１；２つの異なるＵＳＨ２Ａ  ＤＮＡインサートの概略図；ならびに２つの異なるスプライスレポータープラスミドのうちの１つおよび４つの異なるＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのうちの１つをトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３  ＳｐＣａｓ９陽性細胞のｍＲＮＡから増幅させたＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル画像を示す。図１２Ｂは、２つの異なるＵＳＨ２Ａ  ＤＮＡインサート（変異体イントロン４０の一部または野生型イントロン４０の一部）およびインサートの周囲のベクターエレメントを示す。対応するＲＮＡスプライス産物（変異体スプライス産物または野生型スプライス産物）もまた、示される。
【０１０４】
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｃは、スプライシングレポータープラスミドであるｐＥＴ０１；２つの異なるＵＳＨ２Ａ  ＤＮＡインサートの概略図；ならびに２つの異なるスプライスレポータープラスミドのうちの１つおよび４つの異なるＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異ターゲティングｓｇＲＮＡのうちの１つをトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３  ＳｐＣａｓ９陽性細胞のｍＲＮＡから増幅させたＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル画像を示す。図１２Ｃは、２つの異なるスプライスレポータープラスミド（変異体イントロン４０の一部を含むプラスミドまたは野生型イントロン４０の一部を含むプラスミド）のうちの１つ、ならびに４つの異なるＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異−ターゲティングｓｇＲＮＡ（５３２１、５３２３、５３２５、または５３２７を含むｓｇＲＮＡ）のうちの１つをトランスフェクトした、ＨＥＫ  ２９３  ＳｐＣａｓ９陽性細胞のｍＲＮＡから増幅させたＲＴ−ＰＣＲ産物のゲル画像を示す。
【０１０５】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｃは、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）スプライシングレポーターアッセイに使用した構築物、ならびにゲノム編集が、構築物およびそれによるＢＦＰ遺伝子発現に対して有し得る、可能性のある効果を示す。図１３Ａは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを使用した、ＢＦＰを発現する構築物を示す。ＢＦＰ遺伝子は、ＢＦＰ  ＯＲＦの上流に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０野生型配列の一部を含む。ＢＦＰの発現が、予測される。
【０１０６】
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｃは、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）スプライシングレポーターアッセイに使用した構築物、ならびにゲノム編集が、構築物およびそれによるＢＦＰ遺伝子発現に対して有し得る、可能性のある効果を示す。図１３Ｂは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを使用した、ＢＦＰを発現する構築物を示す。ＢＦＰ遺伝子は、ＢＦＰ  ＯＲＦの上流に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０のＩＶＳ４０変異体配列の一部を含む。ＢＦＰの発現は、予測されない。
【０１０７】
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｃは、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）スプライシングレポーターアッセイに使用した構築物、ならびにゲノム編集が、構築物およびそれによるＢＦＰ遺伝子発現に対して有し得る、可能性のある効果を示す。図１３Ｃは、図１３Ｂからの構築物を、ゲノム編集前の第１の構成およびゲノム編集後の第２の構成で、示す。ゲノム編集後には、ＢＦＰの発現が予測される。
【０１０８】
【図１４】図１４は、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイに供した後に、ＢＦＰを発現した生細胞のパーセントを示す。単一ｓｇＲＮＡおよび二重ｓｇＲＮＡを使用した編集戦略のデータが、示される。ｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９と対にした。
【０１０９】
【図１５】図１５は、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイに供した後に、ＢＦＰを発現した生細胞のパーセントを示す。二重ｓｇＲＮＡを使用する編集戦略のデータが、示される。これらのｓｇＲＮＡ対を、ＳａＣａｓ９と対にした。
【０１１０】
【図１６】図１６は、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイに供した後に、ＢＦＰを発現したＧＦＰ陽性細胞のパーセントを示す。単一ｓｇＲＮＡおよび二重ｓｇＲＮＡを使用する編集戦略のデータが、示される。これらのｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９のいずれかと対にした。編集の陰性対照もまた、示される。
【０１１１】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｂは、ＵＳＨ２Ａ転写物のｄｄＰＣＲアッセイにおいて使用されるプライマーおよびプローブによって結合される部位を示す。図１７Ａは、ＩＶＳ４０変異体ＵＳＨ２Ａ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの配列を示す。プライマーおよびプローブが対応するｃＤＮＡに結合する位置もまた、示される。
【０１１２】
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｂは、ＵＳＨ２Ａ転写物のｄｄＰＣＲアッセイにおいて使用されるプライマーおよびプローブによって結合される部位を示す。図１７Ｂは、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子（または編集されたＵＳＨ２Ａ遺伝子）から転写されるｍＲＮＡの配列を示す。プライマーおよびプローブが対応するｃＤＮＡに結合する位置もまた、示される。
【０１１３】
【図１８】図１８は、本開示によるゲノム編集に供された、ＩＶＳ４０変異体細胞における修正された転写物および修正されていない転写物のパーセントを示す。単一ｓｇＲＮＡおよび二重ｓｇＲＮＡを使用した編集戦略のデータを、示す。これらのｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９と対にした。陰性対照もまた、示される。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
配列表の簡単な説明
配列番号１〜６１２は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ配列である。
【０１１５】
配列番号６１３〜４６９６は、マイクロＲＮＡ配列である。
【０１１６】
配列番号４６９７〜５２６５は、ＡＡＶ血清型配列である。
【０１１７】
配列番号５２６６は、ヒトＵＳＨ２Ａヌクレオチド配列である。
【０１１８】
配列番号５２６７〜５２６９は、ＳｐＣａｓ９が複合体化される、ｓｇＲＮＡ骨格配列の例を示す。
【０１１９】
配列番号５２７０は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の例である。
【０１２０】
配列番号５２７１は、その構造で分類される、公知のホーミングエンドヌクレアーゼファミリーを示す。
【０１２１】
配列番号５２７２〜５３１９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍で、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２２】
配列番号５３２０は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２３】
配列番号５３２１は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍で、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２４】
配列番号５３２２は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２５】
配列番号５３２３は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍で、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２６】
配列番号５３２４は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２７】
配列番号５３２５は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍で、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２８】
配列番号５３２６は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１２９】
配列番号５３２７〜５３２８は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍で、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３０】
配列番号５３２９〜５３８５は、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を表す配列である。
【０１３１】
配列番号５３８６〜５４４２は、５７個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を表す配列である。
【０１３２】
配列番号５４４３は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＩＶＳ４０変異の下流の領域をターゲティングするための１８ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３３】
配列番号５４４４は、１８ｂｐのｓｇＲＮＡ配列の標的ＤＮＡ配列を表す配列である。
【０１３４】
配列番号５４４５は、１８ｂｐのｓｇＲＮＡ配列について、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を表す配列である。
【０１３５】
配列番号５４４６〜５４６１は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼにより、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍で、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域をターゲティングするための２０ｂｐのスペーサー配列である。
【０１３６】
配列番号５４６２〜５４７７は、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、標的ＤＮＡ配列を表す配列である。
【０１３７】
配列番号５４７８〜５４９３は、１６個のｓｇＲＮＡ配列のそれぞれについて、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖を表す配列である。
【０１３８】
配列番号５４９４は、一本鎖ＨＤＲドナー配列である。
【０１３９】
配列番号５４９５〜５５０６は、ＰＣＲプライマー配列である。
【０１４０】
配列番号５５０７〜５５２３は、ｓｇＲＮＡを発現するプラスミドの配列である。
【０１４１】
配列番号５５２４は、ＵＳＨ２Ａの野生型イントロン４０の一部を含む、ｐＥＴ０１の配列である。
【０１４２】
配列番号５５２５は、ＵＳＨ２Ａの変異体イントロン４０の一部を含む、ｐＥＴ０１の配列である。
【０１４３】
配列番号５５２６〜５５３７は、ＳａＣａｓ９が複合体化される、ｓｇＲＮＡ骨格配列の例である。
【０１４４】
配列番号５５３８〜５５４９は、ｓｇＲＮＡを発現するプラスミドの配列である。ｓｇＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９と会合する。
【０１４５】
配列番号５５５０〜５５５７は、ｓｇＲＮＡを発現するプラスミドの配列である。ｓｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９と会合する。
【０１４６】
配列番号５５５８および５５５９は、ＵＳＨ２Ａ転写物から得られるｃＤＮＡの区画を増幅させるために使用されるオリゴヌクレオチド配列である。
【０１４７】
配列番号５５６０および５５６１は、修正されたかまたは修正されていないＵＳＨ２Ａ  ｃＤＮＡ配列を検出するために使用されるオリゴヌクレオチドプローブである。
【０１４８】
詳細な説明
本出願者らは、２Ａ型アッシャー症候群、例えば、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異が関連する２Ａ型アッシャー症候群を処置するための新規な方法を発見した。本方法は、２Ａ型アッシャー症候群の発症の遅延もしくは逆転、または個体における疾患の発症の予防をもたらすことができる。
【０１４９】
治療アプローチ
【０１５０】
本明細書に提示される方法は、細胞内での方法か、ｅｘ  ｖｉｖｏ方法か、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法かに関係なく、以下の方法のうちの１つまたは組合せを含み得る。１つの方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路に起因して生じる挿入および／または欠失によって、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異内またはその近傍において、スプライスドナー部位として使用されるコンセンサス配列を破壊することを含む。別の方法では、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０に位置するＩＶＳ４０変異を、切除する。第３の方法では、変異体対立遺伝子（例えば、ＩＶＳ４０変異）を、ＨＤＲによって修正する。
【０１５１】
ＮＨＥＪ戦略は、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（例えば、ｃＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）を用いて、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異内またはその近傍に、１つの一本鎖切断または二本鎖切断を誘導することを含み得る。このアプローチは、ＩＶＳ４０変異内またはその近傍で配列を編集し、誤ったスプライシングを引き起こしている配列を破壊することができる。この方法は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異に特異的なｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを用いる。
【０１５２】
切除戦略は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内で、ＩＶＳ４０変異の上流および下流に結合する１セットのガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含み、ＩＶＳ４０変異を含むゲノムの領域を切除することができる。この戦略は、変異体（Ｍｕｔ）および野生型（ＷＴ）の両方の対立遺伝子に影響を及ぼすことが予測され得、これは、イントロン変異で許容可能である。切除戦略は、新生前駆体メッセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、変異を生み出す主要スプライスドナーが欠如している）のより短いバージョンをもたらし得、これは、正しくスプライシングされ得るため、図３に示されるように、編集された細胞において、ＷＴ  ｍＲＮＡおよびＷＴアシェリンタンパク質の発現をもたらす。編集された細胞の機能および生存は、十分な網膜支持構造が依然として利用可能である場合には、改善されることが予測され得る。この方法は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内で、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域に特異的なｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを利用する。
【０１５３】
切除戦略によって作り出される欠失は、５０〜５０００塩基対（ｂｐ）のサイズであり得る。例えば、欠失は、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜１０００、５０〜１５００、５０〜２０００、２００〜５００、２００〜７５０、２００〜１０００、２００〜１１００、５００〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、または５０〜２，９００塩基対のサイズの範囲に及び得る。
【０１５４】
ＨＤＲ戦略は、相同組換え修復に対する細胞内ＤＳＢ応答を指示するために外部から導入したドナーＤＮＡ鋳型の存在下において、１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）を用いて、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内もしくはその近傍のＩＶＳ４０変異の上流および下流に１つもしくは複数の一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導すること、または１つもしくは複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）および２つもしくはそれよりも多いｇＲＮＡを用いて、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内もしくはその近傍のＩＶＳ４０変異の上流および下流に２つもしくはそれよりも多い一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導することを含み得る。ドナーＤＮＡ鋳型は、短い一本鎖オリゴヌクレオチドであってもよく、短い二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよく、長い一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。本方法は、遺伝子を２回切断することによって欠失を作製するｇＲＮＡの対を提供し得、これは、一方のｇＲＮＡがＩＶＳ４０変異の５’末端で切断し、他方のｇＲＮＡがＩＶＳ４０変異の３’末端で切断し、それによって、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異に置き換わるポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列の挿入が促進される。切断は、それぞれがＤＳＢを作製する１対のＤＮＡエンドヌクレアーゼ（イントロン４０内もしくはその近傍のＩＶＳ４０変異のそれぞれの末端に１つのＤＳＢ）、または一緒になってＤＳＢを作製する複数のニッカーゼ（イントロン４０内もしくはその近傍のＩＶＳ４０変異のそれぞれの末端に１つのＤＳＢ）によって、達成することができる。この方法は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内で、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域に特異的なｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを利用する。この方法はまた、ドナーＤＮＡ分子も利用する。
【０１５５】
上記の戦略（ＲＮＡスプライシングコンセンサス配列の破壊、切除、およびＨＤＲの戦略）の利点は、原則、短期的および長期的の両方の有益な臨床上および研究室上の効果を含め、類似である。
【０１５６】
そのような方法は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のゲノムローカス内で、ＩＶＳ４０変異を安定に修正するために、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼを使用する。任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを、本開示の方法において使用することができ、それぞれのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、疾患特異的な場合もあり、疾患特異的でない場合もある、それ自体と関連するＰＡＭを有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異をターゲティングするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、および５４４３に特定されている。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異をターゲティングするためのｇＲＮＡスペーサー配列は、配列表の配列番号５４４６〜５４６１に特定されている。
【０１５７】
本開示に記載される例は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内のＩＶＳ４０変異内またはその近傍、その上流および下流に、一本鎖切断または二本鎖切断を誘導して、１回程度の少ない処置で（可能性のある治療を患者の寿命にわたり送達するのではなく）、ＵＳＨ２Ａ遺伝子内のＩＶＳ４０変異にＲＮＡスプライシングコンセンサス配列の破壊、切除を導入するかまたはそれを修正することができる。
【０１５８】
アッシャー症候群
【０１５９】
アッシャー症候群は、感音難聴、網膜色素変性（ＲＰ）、および一部の場合には、前庭機能障害を特徴とする、常染色体劣性疾患である。アッシャー症候群の有病率は、１／６０００〜１／２５０００と推定されている。
【０１６０】
アッシャー症候群は、臨床的および遺伝子的に不均一疾患であり、遺伝性難聴−失明の組合せ（combined  hereditary  deafness-blindness）の全症例のうちの約半数を占める。現在までに、この疾患は、１３個の遺伝子と関連付けられている。この疾患には、聴覚障害の重症度、前庭機能障害の有無、および疾患発症の年齢に基づいて、３つの臨床型が同定されている（ＵＳＨ  Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）。
【０１６１】
ＩＩ型アッシャー症候群が、最も頻度の高い臨床型であり、アッシャー症候群の全症例のおよそ５０％を占める。ＩＩ型アッシャー症候群は、先天性聴覚障害および青年期または成年期に始まる進行性の視力喪失を特徴とする。聴覚喪失は、軽度から重度の範囲に及び、主として、高周波数の音を聞く能力に影響を及ぼす。視力喪失は、網膜の光感知細胞が徐々に劣化するにつれて生じる。夜間視力喪失が最初に始まり、周辺視野の喪失がそれに続く。時間とともに、これらの見えない範囲が拡大し、合体して、視野狭窄をもたらす。一部の場合には、視力は、白内障によってさらに損なわれる。多くの患者は、４０歳代に法的失明となる。
【０１６２】
２Ａ型アッシャー症候群は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子における変異に起因し、ＩＩ型アッシャー症候群の全症例のおよそ８０％およびアッシャー症候群の全症例の４０％を占める。
【０１６３】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子
【０１６４】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子（例えば、配列番号５２６６）は、８００，５０３塩基対であり、第１染色体：２１５，６２２，８９３：２１６，４２３，３９５（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ−ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）（１ｑ４１）に位置している。ＵＳＨ２Ａ遺伝子は、７２個のエクソンを含み、アシェリンと称されるタンパク質の２つの選択的スプライシングアイソフォームをコードする。全長５８０ｋＤａのアシェリンタンパク質（アイソフォームｂ）は、大きな細胞外ドメインを有する５，２０２アミノ酸の複雑な膜貫通タンパク質である。短い１７０ｋＤａのアシェリンタンパク質（アイソフォームａ）は、最初の２１個のコーディングエクソンのみからなるスプライスバリアントから翻訳され、１５４６アミノ酸の細胞外タンパク質とみなされる。
【０１６５】
アシェリンタンパク質は、毛様体周囲膜（periciliary  membrane）の小胞ローディング点に隣接して位置しており、光受容器の内側のセグメントと外側のセグメントとの間の小胞輸送において役割を果たし得る。
【０１６６】
ＩＶＳ４０変異
【０１６７】
挿入、欠失、ミスセンス、ナンセンス、フレームシフト、および他の変異であり得る、アッシャー症候群と関連する様々な変異が存在し、ＵＳＨ２Ａ遺伝子を不活性化する共通の効果を有する。
【０１６８】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＣ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ（ＩＶＳ４０変異）は、スプライスドナー部位の創出およびＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡへの１５２ｂｐの挿入をもたらし、これが、ひいてはフレームシフトおよび短縮された非機能性タンパク質をもたらす。
【０１６９】
アシェリンタンパク質機能を回復させるために、変異のうちのいずれか１つまたは複数を修復することができる。例えば、病理学的バリアントであるＩＶＳ４０を、切除または修正して、アシェリンタンパク質発現を回復させることができる（表１を参照されたい）。
【表１】
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【０１７０】
ｉｎ  ｖｉｖｏベースの治療
【０１７１】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するための方法が、本明細書に提示される。一部の態様では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞ベースの治療である。本明細書に記載される材料および方法を使用して、２Ａ型アッシャー症候群患者における細胞の染色体ＤＮＡを編集することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法は、光受容細胞または網膜前駆細胞などの患者の細胞において、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集することを含み得る。
【０１７２】
ある特定の細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける処置および療法のための有望な標的を提示するが、送達の有効性を増加させることにより、そのような細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏでの直接送達が可能となり得る。ターゲティングおよび編集は、関連細胞を対象とすることが理想的であろう。他の細胞における切断はまた、ある特定の細胞およびまたは成長段階においてのみ活性であるプロモーターの使用によって、防止することができる。追加のプロモーターは、誘導性であり、したがって、ヌクレアーゼがプラスミドとして送達される場合には、一時的に制御され得る。送達されたＲＮＡおよびタンパク質が、細胞内に留まる時間の量もまた、半減期を変化させるために付加される処置またはドメインを使用して、調整することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの処置により、いくつかの処置ステップが排除されるが、送達率が低いため、より高い編集率が必要となり得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでの処置は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの処置および生着による問題および損失を排除することができる。
【０１７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子治療の利点は、治療的生産および投与の容易さであり得る。同じ治療アプローチおよび治療は、１人を上回る患者、例えば、同じかまたは類似の遺伝子型または対立遺伝子を共有する何人かの患者を処置するために使用される潜在性を有する。対照的に、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞療法は、典型的に、患者自身の細胞を使用する必要があり、この細胞は、同じ患者から単離、操作され、その患者に戻される。
【０１７４】
ｅｘ  ｖｉｖｏベースの療法
【０１７５】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するための方法が、本明細書に提示される。そのような方法の態様は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞ベースの治療である。例えば、患者特異的な人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、創出することができる。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、これらのｉＰＳＣ細胞の染色体ＤＮＡを、編集することができる。例えば、本方法は、ｉＰＳＣのＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異内またはその近傍で編集するステップを含み得る。次いで、ゲノム編集したｉＰＳＣを、他の細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞へと分化させることができる。最後に、分化した細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと移植することができる（すなわち、患者の眼へと移植することができる）。
【０１７６】
そのような方法の別の態様は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞ベースの治療である。例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者から単離することができる。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、これらの光受容細胞または網膜前駆細胞の染色体ＤＮＡを、編集することができる。例えば、本方法は、光受容細胞または網膜前駆細胞のＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異内またはその近傍で編集するステップを含み得る。最後に、ゲノム編集した光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと移植することができる（すなわち、患者の眼へと移植することができる）。
【０１７７】
そのような方法の別の態様は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞ベースの治療である。例えば、間葉幹細胞を、患者から単離してもよく、これは、患者の骨髄、末梢血、脂肪組織、または臍帯から単離することができる。次いで、本明細書に記載される材料および方法を使用して、これらの間葉幹細胞の染色体ＤＮＡを、編集することができる。例えば、本方法は、間葉幹細胞のＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異内またはその近傍で編集するステップを含み得る。次いで、ゲノム編集した間葉幹細胞を、任意の種類の細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞へと分化させることができる。最後に、分化した細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと移植することができる（すなわち、患者の眼へと移植することができる）。
【０１７８】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞療法アプローチの１つの利点は、投与の前に、治療法（the  therapeutic）についての包括的な解析を行う能力である。ヌクレアーゼベースの治療法は、あるレベルのオフターゲット作用を有し得る。遺伝子修正をｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施することにより、埋め込み（implantation）の前に、修正した細胞集団を特徴付けることが可能である。本開示は、修正した細胞の全ゲノムを配列決定して、オフターゲット作用が存在する場合に、それが、確実に、患者に対する最小限の危険性と関連するゲノム位置に存在し得るようにすることを含む。さらに、クローン集団を含め、特定の細胞集団を、埋め込みの前に単離することができる。
【０１７９】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞療法の別の利点は、他の初代細胞供給源と比較した、ｉＰＳＣ内の遺伝子修正に関する。ｉＰＳＣは、多産であり、細胞ベースの療法に要求される多数の細胞を得ることを容易とする。さらに、ｉＰＳＣは、クローン単離を実施するために理想的な細胞型である。これにより、生存率を低下させる危険を冒さずに、正確なゲノム修正のためのスクリーニングが可能である。これに対し、他の初代細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞は、数回の継代にわたってのみ生存可能であり、クローン的に拡大することは困難である。このため、２Ａ型アッシャー症候群の処置のためのｉＰＳＣの操作は、はるかに容易であり得、所望される遺伝子修正を行うのに必要とされる時間の量を短縮することができる。
【０１８０】
ゲノム編集
【０１８１】
ゲノム編集とは、ゲノムのヌクレオチド配列を、例えば、精密なまたは所定の方式で、修飾するプロセスを指す。本明細書に記載されるゲノム編集法の例は、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、ＤＮＡを、ゲノム内の正確な標的位置で切断し、それによって、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を、ゲノム内の特定の位置において作り出す方法を含む。そのような切断は、ＨＤＲおよびＮＨＥＪなど、天然の内因性細胞プロセスにより修復することが可能であり、通常、そのように修復される。これらの２つの主要なＤＮＡ修復プロセスは、代替的な経路のファミリーからなる。ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接接合させるが、場合によって、ヌクレオチド配列の喪失または付加であって、遺伝子発現を破壊する場合もあり、増強する場合もある、喪失または付加を伴う。ＨＤＲは、相同配列またはドナー配列を、規定されたＤＮＡ配列を切断点に挿入するための鋳型として利用する。相同配列は、姉妹染色分体など、内因性ゲノム内に存在し得る。代替的に、ドナーは、ヌクレアーゼにより切断されるローカスとの相同性が大きな領域を有するが、切断された標的ローカスへと組み込まれ得る欠失を含むさらなる配列または配列変化も含み得る、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルスなどの外因性核酸であり得る。第３の修復機構は、「代替的ＮＨＥＪ（ＡＮＨＥＪ）」とも称される、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であって、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じ得るという点で、遺伝的結果がＮＨＥＪと同様である、ＭＭＥＪであり得る。ＭＭＥＪは、ＤＮＡ切断部位を挟む少数の塩基対の相同配列を利用して、より好ましいＤＮＡ末端結合による修復結果を駆動することができ、近年の報告により、このプロセスの分子機構がさらに解明されている。一部の事例では、ＤＮＡ切断部位における潜在的なマイクロホモロジーについての解析に基づき、可能性がある修復結果を予測することが可能であり得る。
【０１８２】
これらのゲノム編集機構の各々を使用して、所望のゲノムの変更を創出することができる。ゲノム編集工程内のステップは、意図される変異部位の近傍にまで近接した、標的ローカス内で、１つのＤＮＡ切断、または２つのＤＮＡ切断であって、二本鎖切断または２つの一本鎖切断としての２つのＤＮＡ切断を創出することでありうる。これは、本明細書で記載および例示される通り、部位特異的ポリペプチドの使用を介して達成することができる。
【０１８３】
部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼにより、二本鎖切断または一本鎖切断を、核酸内、例えば、ゲノムＤＮＡに導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路［例えば、相同性依存的修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）もしくは（ＡＮＨＥＪ）もしくは（ＭＭＥＪ）］を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同な鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復し得る。これは、場合によって、標的核酸内の切断部位において、小規模の欠失または挿入（インデル）をもたらし得、遺伝子発現の破壊または変更をもたらし得る。
【０１８４】
ＨＤＲは、相同な修復鋳型またはドナーが利用可能である場合に生じ得る。相同なドナー鋳型は、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含み得る。野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、イントロン領域、その断片もしくは組合せ、またはＵＳＨ２Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡ全体であり得る。
【０１８５】
ドナー鋳型は、一本鎖または二本鎖のいずれかのポリヌクレオチドであり得る。ドナー鋳型は、最大１１ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大１０ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大９ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大８ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大７ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大６ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大５ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大４ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大３ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大２ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、最大１ｋｂであり得る。ドナー鋳型は、１ｋｂ未満であり得る。ドナー鋳型は、５００ｂｐ〜１０００ｂｐであり得る。ドナー鋳型は、２５０ｂｐ〜５００ｂｐであり得る。ドナー鋳型は、１００〜２５０ｂｐであり得る。ドナー鋳型は、ＡＡＶによって送達され得る。相同なドナー鋳型は、標的核酸切断部位を挟む配列と相同であり得る配列を含み得る。例えば、ドナー鋳型は、１ｑ４１領域に対する相同性アームを有し得る。ドナー鋳型はまた、病理学的バリアントＩＶＳ４０に対する相同性アームを有し得る。姉妹染色分体は、細胞により、修復鋳型として使用され得る。しかしながら、ゲノム編集の目的では、修復鋳型は、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外因性核酸として供給することができる。さらなるまたは変更された核酸配列もまた、標的ローカスへと組み込まれるように、外因性ドナー鋳型とともに、さらなる核酸配列（トランス遺伝子など）または修飾（単一もしくは複数の塩基変化もしくは欠失など）を、相同性のフランキング領域の間に導入することができる。ＭＭＥＪは、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じ得るという点で、ＮＨＥＪと同様な遺伝的結果をもたらし得る。ＭＭＥＪは、切断部位を挟む少数の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合によるＤＮＡ修復結果を作動させることができる。一部の事例では、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーについての解析に基づき、可能性が高い修復結果を予測することが可能であり得る。
【０１８６】
したがって、一部の場合には、相同組換えを使用して、外因性ポリヌクレオチド配列を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。本明細書では、外因性ポリヌクレオチド配列を、ドナーポリヌクレオチド（またはドナーもしくはドナー配列もしくはポリヌクレオチドドナー鋳型）と称する。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位において、天然には存在しない配列であり得る。
【０１８７】
ＮＨＥＪおよび／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、遺伝子の修正をもたらし得る。
【０１８８】
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ系
【０１８９】
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）ゲノムローカスは、多くの原核生物（例えば、細菌および古細菌）のゲノム内で見出すことができる。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲローカスは、原核生物を、ウイルスおよびファージなど、外来の侵入者に対して防御する一助となる、ある種の免疫系として機能する産物をコードする。ＣＲＩＳＰＲローカスの機能の３つの段階：新たな配列の、ＣＲＩＳＰＲローカスへの組込み、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、および外来の侵入者核酸のサイレンシングが存在する。５種類のＣＲＩＳＰＲ系（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、およびＶ型）が同定されている。
【０１９０】
ＣＲＩＳＰＲローカスは、「リピート」と称する、いくつかの短い反復配列を含む。発現すると、リピートは、二次構造（例えば、ヘアピン）を形成する場合もあり、かつ／または非構造化一本鎖配列を構成する場合もある。リピートは通例、クラスターで生じ、種間で顕著に異なることが多い。リピートは、「スペーサー」と称する固有の介在配列で規則的に隔てられる結果として、リピート−スペーサー−リピートローカスアーキテクチャーをもたらす。スペーサーは、既知の外来インベーダー配列と同一であるか、またはこれと高度な相同性を有する。スペーサー−リピート単位は、スペーサー−リピート単位の成熟形態へとプロセシングされる、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする。ｃｒＲＮＡは、標的核酸のターゲティングに関与する、「シード」またはスペーサー配列（原核生物における天然に存在する形態では、スペーサー配列は、外来のインベーダー核酸をターゲティングする）を含む。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。
【０１９１】
ＣＲＩＳＰＲローカスはまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列も含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物におけるｃｒＲＮＡ機能の生合成および干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。一部のＣａｓ遺伝子は、相同な二次および／または三次構造を含む。
【０１９２】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系
【０１９３】
天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系におけるｃｒＲＮＡの生合成は、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内因性ＲＮアーゼＩＩＩにより修飾され、次いで、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ内のｃｒＲＮＡリピートとハイブリダイズすることができる。内因性ＲＮアーゼＩＩＩを動員して、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを切断することができる。切断されたｃｒＲＮＡを、エクソリボヌクレアーゼによるトリミング（例えば、５’トリミング）にかけて、成熟ｃｒＲＮＡ形態をもたらすことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡを、さらに、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせたままにすることができ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、複合体を、ｃｒＲＮＡがハイブリダイズしうる標的核酸へとガイドしうる。ｃｒＲＮＡの、標的核酸とのハイブリダイゼーションは、Ｃａｓ９を、ターゲティングされた核酸切断のために活性化させうる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系内の標的核酸を、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する。天然では、ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の、標的核酸への結合を容易とするのに不可欠である。ＩＩ型系（また、ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも称する）は、ＩＩ−Ａ型（ＣＡＳＳ４）およびＩＩ−Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）へとさらに細分することができる。Jinekら、Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁（２０１２年）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が、ＲＮＡによりプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／１７６７７２号は、部位特異的遺伝子編集のための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の多数の例および適用を提示する。
【０１９４】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系
【０１９５】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型系との、いくつかの重要な差違を有する。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型系とは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く、単一のＲＮＡによりガイドされるエンドヌクレアーゼである。実際、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらにトランス活性化させる要件なしに、成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされうる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、各成熟ｃｒＲＮＡが、１９ヌクレオチドのダイレクトリピートで始まり、２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列を後続させる、４２〜４４ヌクレオチドの長さの短い成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされうる。これに対し、ＩＩ型系における成熟ｃｒＲＮＡは、２０〜２４ヌクレオチドのスペーサー配列で始まり、約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートを後続させうる。また、Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体が、短いＴリッチＰＡＭを先行させる標的ＤＮＡを効率的に切断するように、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用するが、これは、ＩＩ型系についての標的ＤＮＡが、ＧリッチＰＡＭを後続させるのと対照的である。したがって、Ｖ型系が、ＰＡＭから遠い点で切断するのに対し、ＩＩ型系は、ＰＡＭと隣接する点で切断する。加えて、ＩＩ型系とは対照的に、Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチドの５’突出を伴う、ずれた位置でのＤＮＡの二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。ＩＩ型系は、平滑末端型二本鎖切断を介して切断する。ＩＩ型系と同様に、Ｃｐｆ１は、予測されるＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠き、これは、ＩＩ型系と対照的である。
【０１９６】
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチドおよびプロトスペーサー隣接モチーフ
【０１９７】
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドとしては、Fonfara  et  al.,  Nucleic  Acids  Research,  42:  2577-2590  (2014)の図１におけるＣａｓ９ポリペプチドが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、広範にわたり書き直されている。Fonfara（上記）の図５は、様々な種に由来するＣａｓ９ポリペプチドのＰＡＭ配列を提示している。
【０１９８】
部位特異的ポリペプチド
【０１９９】
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するために、ゲノム編集において使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ヌクレアーゼは、細胞または患者へと、１つもしくは複数のポリペプチドとして、またはポリペプチドをコードする１つもしくは複数のｍＲＮＡとしてのいずれかで、投与され得る。配列番号１〜６１２に列挙されているかまたは本明細書に開示されている酵素またはオルソログのうちのいずれかを、本明細書の方法において利用することができる。
【０２００】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の文脈では、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合することが可能であり、ガイドＲＮＡは、そのポリペプチドが対象とする標的ＤＮＡ内の部位を指定する。本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系では、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼであり得る。
【０２０１】
部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含みうる。２つまたはこれを超える核酸切断ドメインは、リンカーを介して、併せて連結することができる。例えば、リンカーは、可撓性リンカーを含みうる。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、またはこれを超えるアミノ酸の長さを含みうる。
【０２０２】
天然に存在する野生型のＣａｓ９酵素は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインおよびＲｕｖＣドメインという２つのヌクレアーゼドメインを含む。本明細書において、「Ｃａｓ９」とは、天然に存在するＣａｓ９および組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で想定されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨもしくはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、および／またはＲｕｖＣもしくはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。
【０２０３】
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様フォールドを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つのアンチパラレルのβ鎖およびα螺旋を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合性部位（例えば、二価カチオン結合性部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸（例えば、ｃｒＲＮＡによりターゲティングされる鎖の相補鎖）の１つの鎖を切断しうる。
【０２０４】
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮアーゼＨまたはＲＮアーゼＨ様フォールドを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨドメインは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に対する作用を含む核酸ベースの機能の多様なセットに関与する。ＲＮアーゼＨドメインは、複数のα螺旋により取り囲まれた、５つのβ鎖を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、金属結合性部位（例えば、二価カチオン結合性部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、標的核酸（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）の１つの鎖を切断しうる。
【０２０５】
部位特異的ポリペプチドにより、二本鎖切断または一本鎖切断を、核酸内、例えば、ゲノムＤＮＡ内に導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、ＨＤＲまたはＮＨＥＪもしくはＡＮＨＥＪもしくはＭＭＥＪ）を刺激し得る。ＮＨＥＪは、相同な鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復し得る。これは、場合によって、標的核酸内の切断部位において、小規模の欠失または挿入（インデル）をし得、遺伝子発現の破壊または変更をもたらし得る。ＨＤＲは、相同な修復鋳型またはドナーが利用可能である場合に生じ得る。相同なドナー鋳型は、標的核酸切断部位を挟む配列と相同である配列を含み得る。姉妹染色分体は、細胞により、修復鋳型として使用され得る。しかしながら、ゲノム編集の目的では、修復鋳型は、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、またはウイルス核酸などの外因性核酸として供給することができる。さらなるまたは変更された核酸配列もまた、標的ローカスへと組み込まれるように、外因性ドナー鋳型とともに、さらなる核酸配列（導入遺伝子など）または修飾（単一もしくは複数の塩基変化もしくは欠失など）を、相同性のフランキング領域の間に導入することができる。ＭＭＥＪは、切断部位において、小規模の欠失および挿入が生じ得るという点で、ＮＨＥＪと同様な遺伝的結果をもたらし得る。ＭＭＥＪは、切断部位を挟む少数の塩基対の相同配列を利用して、好ましい末端結合によるＤＮＡ修復結果を駆動することができる。一部の事例では、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーについての解析に基づき、可能性がある修復結果を予測することが可能であり得る。
【０２０６】
したがって、場合によって、相同組換えを使用して、外因性ポリヌクレオチド配列を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。本明細書では、外因性ポリヌクレオチド配列を、「ドナーポリヌクレオチド」（またはドナーもしくはドナー配列）と称する。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的核酸切断部位へと挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位において、天然には存在しない配列でありうる。
【０２０７】
部位特異的ポリペプチドは、例示的な、野生型の部位特異的ポリペプチド［例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９；ＵＳ２０１４／００６８７９７における配列番号８；またはSapranauskasら、Nucleic  Acids  Res、３９巻（２１号）：９２７５〜９２８２頁（２０１１年）］、および多様な他の部位特異的ポリペプチドに対する、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含みうる。部位特異的ポリペプチドは、１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、多くて７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、多くて７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０連続アミノ酸にわたり、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）に対する、多くて７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％の同一性を含み得る。
【０２０８】
部位特異的ポリペプチドは、例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態を含みうる。例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低減する変異を含みうる。例示的な野生型の部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、例示的な野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）の核酸切断活性のうちの、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有しうる。部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、実質的な核酸切断活性を有さない場合がある。部位特異的ポリペプチドが、実質的な核酸切断活性を有さない修飾形態である場合、本明細書では、「酵素的に不活性」と称する。
【０２０９】
部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、それが、標的核酸上のＳＳＢを誘導し得る（例えば、二本鎖標的核酸の糖−リン酸骨格のうちの１つだけを切断することにより）ような、変異を含み得る。変異は、野生型の部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９、前出）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数における核酸切断活性のうちの、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満をもたらし得る。変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力は低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数をもたらし得る。変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力は保持するが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力は低減する、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数をもたらし得る。例えば、例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基、例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６を変異させて、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つまたは複数を不活化する。変異させるべき残基は、例示的な野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６（例えば、配列および／または構造アライメントにより決定される）に対応し得る。変異の非限定的な例としては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａが挙げられる。アラニン置換以外の変異が、好適であり得る。
【０２１０】
Ｄ１０Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｈ８４０Ａ変異を、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５４Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。Ｎ８５６Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１または複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを作製することができる。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドを、「ニッカーゼ」と称する。
【０２１１】
ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９のニッカーゼバリアントを使用して、ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるゲノム編集の特異性を増大させることができる。野生型のＣａｓ９は、標的配列（内因性のゲノムローカスなど）内の、指定された約２０ヌクレオチドの配列とハイブリダイズするようにデザインされた、単一のガイドＲＮＡによりガイドされることが典型的である。しかし、ガイドＲＮＡと標的ローカスとのいくつかのミスマッチが許容される可能性があり、標的部位内で要求される相同性の長さを、例えば、たった１３ｎｔの相同性まで効果的に低減し、これにより、標的ゲノム内の他の場所で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による、結合および二本鎖核酸切断（オフターゲット切断としてもまた公知である）の潜在的可能性の上昇をもたらす。Ｃａｓ９のニッカーゼバリアントは各々、１つの鎖だけを切断するため、二本鎖切断を創出するためには、１対のニッカーゼが、近接して、かつ、標的核酸の逆鎖上で結合し、これにより、二本鎖切断の同等物である、１対のニックを創出することが必要である。これは、２つの別個のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼにつき１つずつ）が、近接して、かつ、標的核酸の逆鎖上で結合しなければならないことを要求する。この要件は本質的に、二本鎖切断が生じるために必要とされる、最小の相同性の長さを二倍にし、これにより、２つのガイドＲＮＡ部位（存在する場合）が、二本鎖切断の形成を可能とするのに十分な程度に、互いと近接する可能性が低い場合に、二本鎖切断イベントが、ゲノム内の別の場所で生じる可能性を低減する。当技術分野で記載される通り、ニッカーゼはまた、ＨＤＲを、ＮＨＥＪと対比して促進するのにも使用することができる。ＨＤＲを使用して、所望の変化を効果的に媒介する特異的ドナー配列の使用を介して、選択された変化を、ゲノム内の標的部位へと導入することができる。
【０２１２】
想定される変異は、置換、付加、および欠失、またはこれらの任意の組合せを含みうる。変異は、変異させるアミノ酸を、アラニンへと転換する。変異は、変異させるアミノ酸を、別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、またはアルギニン）へと転換する。変異は、変異させるアミノ酸を、非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）へと転換する。変異は、変異させるアミノ酸を、アミノ酸模倣体（例えば、リン酸化模倣体）へと転換する。変異は、保存的変異でありうる。例えば、変異は、変異させるアミノ酸を、サイズ、形状、電荷、極性、コンフォメーションが相似するアミノ酸、および／または変異させるアミノ酸のロタマー（例えば、システイン／セリン変異、リシン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）へと転換する。変異は、リーディングフレームのシフトおよび／または早期終止コドンの創出を引き起こしうる。変異は、遺伝子の調節的領域、または１もしくは複数の遺伝子の発現に影響を及ぼすローカスへの変化を引き起こしうる。
【０２１３】
部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアントの、変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性の部位特異的ポリペプチド）は、核酸をターゲティングしうる。部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアントの、変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＤＮＡをターゲティングしうる。部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアントの、変異させた、酵素的に不活性の、および／または条件的に酵素的に不活性のエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡをターゲティングしうる。
【０２１４】
部位特異的ポリペプチドは、１または複数の非天然配列（例えば、部位特異的ポリペプチドは、融合タンパク質である）を含みうる。
【０２１５】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、核酸結合性ドメイン、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
【０２１６】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
【０２１７】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメインに対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、核酸切断ドメインの一方または両方は、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９に由来するヌクレアーゼドメインに対する、少なくとも５０％のアミノ酸同一性を含む。
【０２１８】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）、および部位特異的ポリペプチドを、非天然配列へと連結する、非天然配列（例えば、核局在化シグナル）またはリンカーに対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含みうる。
【０２１９】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインの一方または両方における変異であって、ヌクレアーゼドメインの切断活性を、少なくとも５０％低減する変異を含む。
【０２２０】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９、および２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）に対して、少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列を含むことが可能であり、この場合、ヌクレアーゼドメインのうちの１つは、アスパラギン酸１０の変異を含み、かつ／またはヌクレアーゼドメインのうちの１つは、ヒスチジン８４０の変異を含むことが可能であり、変異は、ヌクレアーゼドメインの切断活性を、少なくとも５０％低減する。
【０２２１】
１または複数の部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的ローカスにおいて、１つの二本鎖切断を併せて生じさせる２つのニッカーゼ、またはゲノム内の特異的ローカスにおいて、２つの二本鎖切断を併せて生じさせるかまたは引き起こす４つのニッカーゼを含みうる。代替的に、１つの部位特異的ポリペプチド、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的ローカスにおいて、１つの二本鎖切断を生じさせうるかまたは引き起こしうる。
【０２２２】
他の細菌株に由来するＣａｓ９オルソログの非限定的な例としては、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ  ＭＢＩＣ１１０１７；Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ  ＤＳＭ  ５５０１；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ  ＡＴＣＣ  ２３２７０；Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＬＡＡ１；Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＤＳＭ  ４４６；Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  １８０；Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ  ＫＣ４；Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ  ＣＳ−３２８；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  ｓｔｒ．Ｐａｒａｃａ；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．ＰＣＣ  ８００５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ  ＤＳＭ  １２４４２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＭＬＳ１０；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  １＿１＿４７；Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ  ＤＳＭ  ６７２５；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ  ａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ  ＭＰ１０４Ｃ；Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ＿１０８；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈａｇｅ  ｃ−ｓｔ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ３  ｓｔｒ．Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｂａ４  ｓｔｒ．６５７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＱＣＤ−６３ｑ４２；Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ  ＷＨ  ８５０１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ５１１４２；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＣＣＹ０１１０；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７４２４；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７８２２；Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ  ２５５−１５；Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ  ＡＴＣＣ  ２９３２８；Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ  ＤＳＭ  ４４９６３；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＰＢ２００３／０４４−Ｔ３−４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  １１７４１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ；Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．ＰＣＣ  ８１０６；Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＥＬＢ１７；Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ  Ｚ−７３０３；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｈａｇｅ  Ｍａ−ＬＭＭ０１；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＮＩＥＳ−８４３；Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ  ＡＴＣＣ  ２３１３４；Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ  ＰＣＣ  ７４２０；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ  Ｎｃ４；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ＤＳＭ  ４３１１１；Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ  ＣＣＹ９４１４；Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７１２０；Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．ＰＣＣ  ６５０６；Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ＿ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ＿ＳＩ；Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＳＪ９５；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ  ＣＪ２；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＪＳ６６６；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ  ＴＡＣ１２５；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５４８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５４８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６；Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＤＳＭ  ４３０２１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７３３５；およびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ  ＴＣＦ５２Ｂにおいて同定されるＣａｓタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない（Chylinskiら、RNA  Biol.、２０１３年、１０巻（５号）：７２６〜７３７頁）。
【０２２３】
Ｃａｓ９オルソログに加えて、他のＣａｓ９バリアント、例えば、不活性ｄＣａｓ９および異なる機能を有するエフェクタードメインの融合タンパク質は、遺伝子モジュレーションのプラットフォームとしての機能を果たし得る。前述の酵素のうちのいずれも、本開示において有用であり得る。
【０２２４】
本開示において利用され得るエンドヌクレアーゼのさらなる例を、配列番号１〜６１２に提示する。これらのタンパク質は、使用前に修飾されてもよく、または核酸配列、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはｍＲＮＡにおいて、またはベクター構築物、例えば、本明細書において教示されるプラスミドもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター内にコードされてもよい。さらに、これらは、コドン最適化されていてもよい。  
【０２２５】
命名法は、本明細書において、所与の部位特異的ポリペプチドの起源となる種を示して使用されているが、部位特異的ポリペプチドおよび／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、起源となる種において生じる配列と比較して、修飾されていてもよい。例えば、「ＳｐＣａｓ９」は、問題のＣａｓ９遺伝子／タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓを起源としており、例えば、ＮＬＳの付加および／またはコドン最適化の実施によって修飾されていることを示す。例えば、「ＳａＣａｓ９」は、問題のＣａｓ９遺伝子／タンパク質が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを起源としており、例えば、ＮＬＳの付加および／またはコドン最適化の実施によって修飾されていることを示す。
【０２２６】
ゲノムターゲティング核酸
【０２２７】
本開示は、会合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を、標的核酸内の特異的標的配列へと誘導できるゲノムターゲティング核酸を提示する。ゲノムターゲティング核酸は、ＲＮＡであり得る。本明細書では、ゲノムターゲティングＲＮＡを、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と称する。ガイドＲＮＡは、少なくとも目的の標的核酸配列とハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とを含み得る。ＩＩ型系では、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ｇＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲリピート配列と、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、互いとハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。いずれの系でも、ガイドＲＮＡと、部位特異的ポリペプチドとが、複合体を形成するように、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し得る。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合により、複合体に、標的特異性をもたらし得る。したがって、ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導できる。
【０２２８】
例示的なガイドＲＮＡは、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１におけるスペーサー配列を含む（図２Ａ〜Ｂ、Ｇ、およびＪ）。標的ＤＮＡ配列（５’−３’）（配列番号５３２９〜５３８５、５４４４、および５４６２〜５４７７を参照されたい）は、図２Ｃ〜Ｄ、２Ｈ、および２Ｋに見出され得る。ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖（５’−３’）は、図２Ｅ〜Ｆ、Ｉ、およびＬに見出され得る。
【０２２９】
それぞれのガイドＲＮＡは、そのゲノムの標的配列と相補的なスペーサー配列を含むようにデザインすることができる。例えば、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１におけるスペーサー配列のそれぞれは、単一のＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡ（対応するｔｒａｃｒＲＮＡとともに）へ入れることができる。Jinek  et  al.,  Science,  337,  816-821  (2012)およびDeltcheva  et  al.,  Nature,  471,  602-607  (2011)を参照されたい。
【０２３０】
本明細書に開示されるｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼと会合して、リボヌクレオタンパク質複合体を形成し得、これが、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異内またはその近傍で安定な編集をもたらし得る。この編集によって引き起こされるＤＮＡ配列における変更（例えば、編集）は、非一過性であり得る。
【０２３１】
ゲノムターゲティング核酸は、二重分子ガイドＲＮＡであり得る（図１Ａ）。ゲノムターゲティング核酸は、単一分子ガイドＲＮＡであり得る（図１Ｂ）。二重分子ガイドＲＮＡまたは単一分子ガイドＲＮＡは、修飾されていてもよい。
【０２３２】
二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２つの鎖を含みうる。第１の鎖は、５’〜３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、および最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含みうる。
【０２３３】
ＩＩ型系内の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’〜３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、および任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を含みうる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、ガイドＲＮＡの、さらなる機能性（例えば、安定性）に寄与するエレメントを含みうる。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成しうる。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長は、１または複数のヘアピンを含みうる。
【０２３４】
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１７〜３０ヌクレオチドで長さが可変のスペーサー配列を含み得る（表２）。他の例では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１７〜２４ヌクレオチドで長さが可変のスペーサー配列を含み得る。
【０２３５】
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１９ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１８ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１７ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２０ヌクレオチドを上回るスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２１ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２２ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２３ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２４ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２５ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２６ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２７ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２８ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、２９ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、３０ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。
【０２３６】
ｓｇＲＮＡは、表２の配列番号５２６８、５５２７、５５３０、５５３３、または５５３６など、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まなくてもよい。ｓｇＲＮＡは、表２の配列番号５２６７、５２６９、５５２６、５５２８、５５２９、５５３１、５５３２、５５３４、５５３５、または５５３７など、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、１つまたは複数のウラシルを含んでもよい。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、１つのウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、２つのウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、３つのウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、４つのウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、５つのウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、６つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、７つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に、８つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。
【０２３７】
ｓｇＲＮＡは、修飾されていなくてもよく、または修飾されていてもよい。例えば、修飾ｓｇＲＮＡは、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
【表２−１】
2021508451.tif 000004
【表２−２】
2021508451.tif 000005
【０２３８】
Ｖ型系内の単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’〜３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列およびスペーサー配列を含みうる。
【０２３９】
例示を目的として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１系において使用されるガイドＲＮＡ、または他のより低分子のＲＮＡは、下記で例示され、当技術分野で記載される通り、化学的手段によりたやすく合成することができる。化学合成手順が、持続的に拡大しつつある一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；ＰＡＧＥなど、ゲルの使用を回避する）などの手順による、このようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が、１００ほどのヌクレオチドを優に超えて増大するにつれて、難しくなる傾向がある。より長いＲＮＡを作出するために使用される１つの手法は、併せてライゲーションされる、２つまたはこれを超える分子を作製することである。Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなど、はるかに長いＲＮＡは、酵素により、よりたやすく作出される。多様な種類のＲＮＡ修飾、例えば、当技術分野で記載される、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を増強する修飾は、ＲＮＡの化学合成および／または酵素による作出中に導入することもでき、これらの後で導入することもできる。
【０２４０】
スペーサー伸長配列
【０２４１】
ゲノムターゲティング核酸についての一部の例では、スペーサー伸長配列は、活性を修飾することも可能であり、安定性をもたらすことも可能であり、かつ／またはゲノムターゲティング核酸を修飾するための位置をもたらすこともできる。スペーサー伸長配列は、オンまたはオフターゲット活性または特異性を修飾しうる。一部の例では、スペーサー伸長配列を提供することができる。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドを超える長さを有しうる。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、またはこれを超えるヌクレオチド未満の長さを有しうる。スペーサー伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さでありうる。スペーサー伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチドの間の長さでありうる。スペーサー伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチドの間の長さでありうる。
【０２４２】
スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含みうる。この部分は、核酸ターゲティング核酸の安定性を低下させる場合もあり、増大させる場合もある。この部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）でありうる。この部分は、真核細胞内で機能しうる。この部分は、原核細胞内で機能しうる。この部分は、真核細胞内および原核細胞内の両方で機能しうる。適切な部分の非限定的な例は、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節ならびに／またはタンパク質およびタンパク質複合体のアクセシビリティの調節を可能とする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを、細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）へとターゲティングする配列、トラッキングをもたらす修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子への直接のコンジュゲーション、蛍光の検出を容易とする部分へのコンジュゲーション、蛍光の検出を可能とする配列など）、および／またはタンパク質の結合部位をもたらす修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）を含む。
【０２４３】
スペーサー配列
【０２４４】
スペーサー配列は、目的の標的核酸内の配列とハイブリダイズする。ゲノムターゲティング核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的に、標的核酸と相互作用しうる。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動しうる。
【０２４５】
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、スペーサー配列は、系内で使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’側に位置する標的核酸とハイブリダイズするようにデザインすることができる。スペーサーは、標的配列に完全にマッチする場合もあり、ミスマッチを有する場合もある。各Ｃａｓ９酵素は、それが標的ＤＮＡ内で認識する、特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、標的核酸内で、配列５’−ＮＲＧ−３’［配列中、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的とされる標的核酸配列のすぐ３’側にある］を含むＰＡＭを認識する。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９は、標的核酸内で、配列５’−ＮＮＧＲＲＴ−３’［配列中、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的とされる標的核酸配列のすぐ３’側にある］を含むＰＡＭを認識する。ある特定の例では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９は、標的核酸内で、配列５’−ＮＮＧＲＲＮ−３’［配列中、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的とされる標的核酸配列のすぐ３’側にある］を含むＰＡＭを認識する。例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉは、標的核酸内で、配列５’−ＮＮＮＮＡＣＡ−３’または５’−ＮＮＮＮＡＣＡＣ−３’［配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的とされる標的核酸配列のすぐ３’側にある］を含むＰＡＭを認識する。ある特定の例では、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９は、標的核酸内で、配列５’−ＮＮＮＶＲＹＭ−３’または５’−ＮＮＶＲＹＡＣ−３’［配列中、Ｖは、Ａ、Ｇ、またはＣのいずれかを含み、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｙは、ＣまたはＴのいずれかを含み、Ｍは、ＡまたはＣを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的とされる標的核酸配列のすぐ３’側にある］を含むＰＡＭを認識する。
【０２４６】
標的核酸配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、２０未満のヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、２０を上回るヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはこれを上回るヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、多くとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはこれを上回るヌクレオチドを含み得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基を含み得る。例えば、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ−３’（配列番号５２７０）を含む配列では、標的核酸は、複数のＮに対応する配列（配列中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線を付したＮＲＧ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＰＡＭである）を含み得る。
【０２４７】
標的核酸とハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有しうる。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔでありうる。一部の例では、スペーサー配列は、２４ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサー配列は、２３ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサー配列は、２２ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサー配列は、２１ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサー配列は、１９ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサー配列は、１８ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサー配列は、１７ヌクレオチドを含み得る。
【０２４８】
一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、多くて約３０％、多くて約４０％、多くて約５０％、多くて約６０％、多くて約６５％、多くて約７０％、多くて約７５％、多くて約８０％、多くて約８５％、多くて約９０％、多くて約９５％、多くて約９７％、多くて約９８％、多くて約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補鎖の標的配列のうちの、最も５’側の６つの連続ヌクレオチドにわたり、１００％である。スペーサー配列と標的核酸との相補性パーセントは、約２０連続ヌクレオチドにわたり、少なくとも６０％であり得る。スペーサー配列および標的核酸の長さは、１〜６ヌクレオチド異なる場合があるが、これは、１つまたは複数のバルジと考えることができる。
【０２４９】
スペーサー配列は、コンピュータプログラムを使用して、デザインすることもでき、選び出すこともできる。コンピュータプログラムは、予測溶融温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一であるかまたは類似するが、ミスマッチ、挿入、または欠失の結果として、１または複数のスポットで変動する配列）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を使用しうる。
【０２５０】
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列
【０２５１】
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、基準ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列であり得る。
【０２５２】
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチドを含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、二重鎖、すなわち、塩基対合した二本鎖構造を形成し得る。一体となって、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列および最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、部位特異的ポリペプチドに結合し得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズし得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含み得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対する、多くて約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の相補性を含み得る。
【０２５３】
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。一部の例では、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ９ヌクレオチドの長さであり得る。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、およそ１２ヌクレオチドの長さであり得る。
【０２５４】
最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型ｃｒＲＮＡ）に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列に対して、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一でありうる。
【０２５５】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
【０２５６】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列でありうる。
【０２５７】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内の最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズするヌクレオチドを含みうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とは、二重鎖、すなわち、塩基対合した二本鎖構造を形成する。一体となって、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列および最小ＣＲＩＳＰＲリピートは、部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズしうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補的でありうる。
【０２５８】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔ長でありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約９ヌクレオチドの長さでありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１２ヌクレオチドでありうる。最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Jinekら、前出において記載されている、ｔｒａｃｒＲＮＡのｎｔ２３〜４８からなりうる。
【０２５９】
最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型、ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して、少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一でありうる。
【０２６０】
最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、二重螺旋を含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖は、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。
【０２６１】
二重鎖は、ミスマッチを含みうる（すなわち、二重鎖の２つの鎖は、１００％相補的ではない）。二重鎖は、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超えるミスマッチを含みうる。二重鎖は、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超えるミスマッチを含みうる。二重鎖は、２つ以下のミスマッチを含みうる。
【０２６２】
バルジ（ｂｕｌｇｅ）
【０２６３】
一部の場合には、最小ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと、最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの二重鎖内には、「バルジ」が存在し得る。バルジとは、二重鎖内のヌクレオチドの非対合領域である。バルジは、二重鎖の、部位特異的ポリペプチドへの結合に寄与し得る。バルジは、二重鎖の一方の側に、非対合の５’−ＸＸＸＹ−３’［配列中、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、反対鎖上のヌクレオチドと、揺らぎ対を形成し得るヌクレオチドを含む］を含むことが可能であり、二重鎖の他の側に、非対合ヌクレオチド領域を含み得る。二重鎖の２つの側における非対合ヌクレオチドの数は、異なり得る。
【０２６４】
一例では、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上に、非対合プリン（例えば、アデニン）を含みうる。一部の例では、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の非対合５’−ＡＡＧＹ−３’［配列中、Ｙは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上のヌクレオチドと、揺らぎ対合を形成しうる、ヌクレオチドを含む］を含みうる。
【０２６５】
二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、最大で１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、１つの非対合ヌクレオチドを含みうる。
【０２６６】
二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。二重鎖の、第２の側のバルジ（例えば、二重鎖の、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）は、４つの非対合ヌクレオチドを含みうる。
【０２６７】
バルジは、少なくとも１つの揺らぎ対合を含みうる。一部の例では、バルジは、最大で１つの揺らぎ対合を含みうる。バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含みうる。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含みうる。一部の例では、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含みうる。
【０２６８】
ヘアピン
【０２６９】
多様な例では、１または複数のヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内の最小ｔｒａｃｒＲＮＡに対して３’側に位置しうる。
【０２７０】
ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖内の、最後の対合ヌクレオチドの３’側の、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超えるヌクレオチドから始まりうる。ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖内の、最後の対合ヌクレオチドの３’側の、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドから始まりうる。
【０２７１】
ヘアピンは、少なくとも約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超える連続ヌクレオチドを含みうる。ヘアピンは、最大で約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、またはこれを超える連続ヌクレオチドを含みうる。
【０２７２】
ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続シトシンヌクレオチド）を含みうる。
【０２７３】
ヘアピンは、二重鎖ヌクレオチド（例えば、ヘアピン内で一体にハイブリダイズしたヌクレオチド）を含みうる。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖内の、ＧＧジヌクレオチドへとハイブリダイズしたＣＣジヌクレオチドを含みうる。
【０２７４】
ヘアピンのうちの１または複数は、部位特異的ポリペプチドの、ガイドＲＮＡと相互作用する領域と相互作用しうる。
【０２７５】
ある例では、２つまたはこれを超えるヘアピンが存在し、他の例では、３つまたはこれを超えるヘアピンが存在する。
【０２７６】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
【０２７７】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｔｒａｃｒＲＮＡ）に対する、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％の配列同一性を伴う配列を含みうる。
【０２７８】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有しうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１４ヌクレオチドの長さを有しうる。
【０２７９】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なり（ｓｔｒｅｔｃｈ）にわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一でありうる。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８連続ヌクレオチドの連なりにわたり、基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して、少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一でありうる。
【０２８０】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つを超える二重鎖領域（例えば、ヘアピン領域、ハイブリダイズ領域）を含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖領域を含みうる。
【０２８１】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。ステムループ構造は、機能的部分を含みうる。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含みうる。ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。ステムループ構造は、最大で約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。
【０２８２】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のヘアピンは、Ｐドメインを含みうる。一部の例では、Ｐドメインは、ヘアピン内の二本鎖領域を含みうる。
【０２８３】
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
【０２８４】
ｔｒａｃｒＲＮＡが、単一分子ガイドの文脈にある場合であれ、二重分子ガイドの文脈にある場合であれ、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列をもたらすことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチドを超える長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、約２０〜約５０００またはこれを超えるヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチドを超える長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、またはこれを超えるヌクレオチド未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１０〜３０ヌクレオチドの長さであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、３０〜７０ヌクレオチドの長さであり得る。
【０２８５】
ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、機能的部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含みうる。機能的部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含みうる。機能的部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの全長を有しうる。機能的部分は、真核細胞内で機能しうる。機能的部分は、原核細胞内で機能しうる。機能的部分は、真核細胞内および原核細胞内の両方で機能しうる。
【０２８６】
適切なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長の機能的部分の非限定的な例は、３’ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節ならびに／またはタンパク質およびタンパク質複合体によるアクセシビリティの調節を可能とする）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、クロロプラストなど）へとターゲティングする配列、トラッキングをもたらす修飾もしくは配列（例えば、蛍光分子への直接のコンジュゲーション、蛍光の検出を容易とする部分へのコンジュゲーション、蛍光の検出を可能とする配列など）、および／またはタンパク質の結合性部位をもたらす修飾もしくは配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに対して作用するタンパク質）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、プライマー結合性部位または分子インデックス（例えば、バーコード配列）を含みうる。ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１または複数のアフィニティータグを含みうる。
【０２８７】
単一分子ガイドリンカー配列
【０２８８】
単一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有しうる。Jinekら、前出では、例えば、単純な４ヌクレオチドの「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）が使用された（Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁（２０１２年））。例示的なリンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、
約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有しうる。単一分子ガイド核酸のリンカーは、４〜４０ヌクレオチドの間でありうる。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドでありうる。リンカーは、最大で約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００、またはこれを超えるヌクレオチドでありうる。
【０２８９】
リンカーは、様々な配列のうちのいずれも含みうるが、一部の例では、リンカーは、ガイドＲＮＡの他の部分と相同的である広範な領域であって、ガイドの他の機能的な領域に干渉する可能性のある分子内結合を引き起こしうる領域を有する配列を含まない。Jinekら、前出では、単純な４ヌクレオチドの配列である、−ＧＡＡＡ−が使用された（Science、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁（２０１２年））が、より長い配列を含む、多数の他の配列も同様に、使用することができる。
【０２９０】
リンカー配列は、機能的部分を含みうる。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質と相互作用するヘアピン、タンパク質結合性部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエクソンを含む、１または複数の特色を含みうる。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。一部の例では、リンカー配列は、最大で約１、２、３、４、もしくは５、またはこれを超える機能的部分を含みうる。
【０２９１】
ゲノムターゲティング核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体
【０２９２】
ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９など、核酸にガイドされるヌクレアーゼ）と相互作用し、これにより、複合体を形成する。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドを、標的核酸へと導く。
【０２９３】
リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）
【０２９４】
部位特異的ポリペプチドおよびゲノムターゲティング核酸は、それぞれ、細胞または患者へと、別個に投与することができる。他方、部位特異的ポリペプチドは、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。部位特異的ポリペプチドは、１つまたは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化させることができる。次いで、あらかじめ複合体化させた材料を、細胞または患者へと投与することができる。このようなあらかじめ複合体化させた材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。ＲＮＰにおける部位特異的ポリペプチドは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。部位特異的ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方において、１つまたは複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）が隣接し得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｎ末端に位置する１つのＮＬＳおよびＣ末端に位置する第２のＮＬＳの２つのＮＬＳが、隣接し得る。ＮＬＳは、当技術分野において公知の任意のＮＬＳ、例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳであり得る。ＲＮＰにおける、ゲノムターゲティング核酸の部位特異的ポリペプチドに対する重量比は、１：１であり得る。例えば、ＲＮＰにおける、ｓｇＲＮＡのＣａｓ９エンドヌクレアーゼに対する重量比は、１：１であり得る。
【０２９５】
標的配列の選択
【０２９６】
５’境界部および／または３’境界部の位置の、特定の基準ローカスと比べたシフトを使用して、本明細書にさらに記載および例示される、編集のために選択されるエンドヌクレアーゼ系に部分的に依存する、遺伝子編集の特定の適用を容易とするかまたは増強することができる。
【０２９７】
このような標的配列選択の第１の非限定的な例では、多くのエンドヌクレアーゼ系は、切断のための潜在的な標的部位の初期の選択を導き得る規則または基準、例えば、ＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの場合のＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフの要件を有する。
【０２９８】
標的配列の選択または最適化についての別の非限定的な例では、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組合せについてのオフターゲット活性の頻度を、オンターゲット活性の頻度と比べて評価することができる。一部の場合には、所望されるローカスにおいて適正に編集されている細胞は、他の細胞と比べて、選択的利点を有し得る。選択的利点についての、例示的であるが非限定的な例としては、複製速度の増強、存続性、ある特定の条件に対する耐性、患者への導入後のｉｎ  ｖｉｖｏにおける、生着成功率または存続率の増強などの属性、およびこのような細胞の維持または数もしくは生存率の増加と関連する他の属性の獲得が挙げられる。他の場合には、所望されるローカスにおいて適正に編集されている細胞を、適正に編集されている細胞を同定するか、分取するか、または他の形で選択するのに使用される、１つまたは複数のスクリーニング法によって、正に選択することができる。選択的利点および指向選択法（directed  selection  method）のいずれも、修正と関連する表現型を利用し得る。一部の場合には、意図された細胞集団を選択または精製するのに使用される新たな表現型を作り出す第２の修飾を作り出すために、細胞を、２回またはこれを超える回数にわたり編集することができる。このような第２の修飾は、選択可能またはスクリーニング可能マーカーのための第２のｇＲＮＡを付加することによって、作り出す可能性がある。一部の場合には、ｃＤＮＡを含有し、また、選択可能マーカーも含有するＤＮＡ断片を使用して、細胞を、所望されるローカスにおいて適正に編集することができる。
【０２９９】
特定の場合に、いずれかの選択的利点が適用可能であるか、またはいずれかの指向選択を適用するかにかかわらず、適用の有効性を増強し、かつ／または所望される標的以外の部位における、所望されない変更の潜在性を低減するために、標的配列の選択はまた、オフターゲット頻度の考慮によっても導くことができる。本明細書および当技術分野で、さらに記載および例示される通り、オフターゲット活性の発生は、標的部位と多様なオフターゲット部位との間の類似性および相違性、ならびに使用される特定のエンドヌクレアーゼを含む、いくつかの因子の影響を受け得る。オフターゲット活性の予測の一助となる、バイオインフォマティクスツールが利用可能であり、多くの場合、このようなツールはまた、オフターゲット活性の可能性が最も高い部位を同定し、次いで、これを、実験状況下で評価して、オフターゲットの、オンターゲット活性に対する相対頻度について査定することができ、これにより、より高度な相対オンターゲット活性を有する配列の選択を可能とするのにも使用することができる。本明細書では、このような技法の実例を提示するが、当技術分野では、他の例が公知である。
【０３００】
本開示のｇＲＮＡは、編集が所望される遺伝子のローカス（例えば、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の変異体対立遺伝子）における編集を指示することができる。本明細書に使用される場合、「オンターゲット編集」、「オンターゲット活性」、または「オンターゲット切断」は、編集が所望される遺伝子のローカスにおける編集を意味する。本明細書に開示されるｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異内またはその近傍の対応する変異体対立遺伝子の編集を指示する場合、オンターゲット活性を有し得る。
【０３０１】
本開示のｇＲＮＡは、編集が所望されない遺伝子のローカスにおける編集も指示し得る。本明細書に使用される場合、「オフターゲット編集」、「オフターゲット活性」、または「オフターゲット切断」は、編集が所望されない遺伝子のローカスにおける編集を意味する。
【０３０２】
オフターゲット編集は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の野生型対立遺伝子の編集であり得る。本明細書では、この種類のオフターゲット編集は、「野生型オフターゲット編集」、「野生型オフターゲット活性」、または「野生型オフターゲット切断」と称される。本明細書に開示されるｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが、野生型ＵＳＨ２Ａ対立遺伝子の編集を指示する場合、野生型オフターゲット活性を有し得る。
【０３０３】
オフターゲット編集は、第２の遺伝子またはローカスの編集（例えば、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の配列でもＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列でもないゲノム配列の編集）であり得る。本明細書では、この種類のオフターゲット編集は、「ゲノムオフターゲット編集」、「ゲノムオフターゲット活性」、または「ゲノムオフターゲット切断」と称される。本明細書に開示されるｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の配列でもＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列でもないゲノム配列の編集を指示する場合、ゲノムオフターゲット活性を有する。
【０３０４】
一部の例では、ｇＲＮＡの野生型オフターゲット活性は、「最小限」であり得る。最小限の野生型オフターゲット活性を有するｇＲＮＡは、当技術分野において公知の方法、例えば、ｇＲＮＡによって引き起こされる野生型オフターゲット編集の量を決定する、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析に基づく方法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、またはｉｎ  ｖｉｖｏ方法を使用して、決定することができる。最小限の野生型オフターゲット活性を有するｇＲＮＡは、３０％もしくはそれよりも少ない細胞、例えば、２５％もしくはそれよりも少ない細胞、２０％もしくはそれよりも少ない細胞、１５％もしくはそれよりも少ない細胞、１０％もしくはそれよりも少ない細胞、５％もしくはそれよりも少ない細胞、４％もしくはそれよりも少ない細胞、３％もしくはそれよりも少ない細胞、２％もしくはそれよりも少ない細胞、１％もしくはそれよりも少ない細胞、０．５％もしくはそれよりも少ない細胞、０．２５％もしくはそれよりも少ない細胞、または０．１％もしくはそれよりも少ない細胞において、オフターゲット編集を引き起こし得る。このような決定は、一部の場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用して決定することができる。
【０３０５】
一部の例では、ｇＲＮＡのゲノムオフターゲット活性は、「最小限」であり得る。最小限のゲノムオフターゲット活性を有するｇＲＮＡは、ｇＲＮＡによって引き起こされるゲノムオフターゲット編集の量を決定する、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、またはｉｎ  ｖｉｖｏ方法に基づいて、決定することができる。最小限のゲノムオフターゲット活性を有するｇＲＮＡは、３０％もしくはそれよりも少ない細胞、例えば、例として、２５％もしくはそれよりも少ない細胞、２０％もしくはそれよりも少ない細胞、１５％もしくはそれよりも少ない細胞、１０％もしくはそれよりも少ない細胞、５％もしくはそれよりも少ない細胞、４％もしくはそれよりも少ない細胞、３％もしくはそれよりも少ない細胞、２％もしくはそれよりも少ない細胞、１％もしくはそれよりも少ない細胞、０．５％もしくはそれよりも少ない細胞、０．２５％もしくはそれよりも少ない細胞、または０．１％もしくはそれよりも少ない細胞において、少なくとも１つのゲノムオフターゲット編集事例を引き起こし得る。このような決定は、一部の場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用して決定することができる。
【０３０６】
標的配列選択の別の態様は、相同組換えイベントに関する。相同性領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす、相同組換えイベントのための焦点として機能し得る。このような組換えイベントは、染色体および他のＤＮＡ配列の、通常の複製過程中に生じ、また、通常の細胞複製サイクル中に定期的に生じるが、多様なイベント（ＵＶ光およびＤＮＡ切断の他の誘導因子など）の発生により増強される場合もあり、ある特定の作用物質（agent）（多様な化学的誘導因子など）の存在により増強される場合もある、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合など、ＤＮＡ配列が合成される他の時点においても生じる。多くのこのような誘導因子は、ＤＳＢを、ゲノム内で、無差別的に生じさせ、ＤＳＢは、通常の細胞内で、定期的に誘導および修復され得る。修復中に、元の配列は、完全な忠実度で再構築され得るが、しかしながら、一部の場合には、小規模の挿入または欠失（「インデル」と称する）が、ＤＳＢ部位に導入される。
【０３０７】
ＤＳＢはまた、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼ系の場合のように、特定の位置において、特異的に誘導することもでき、これを使用して、選択された染色体位置において、指向されたまたは優先的な遺伝子修飾イベントを引き起こすことができる。相同な配列が、ＤＮＡ修復（ならびに複製）の状況で組換えに供される傾向を、いくつかの状況において利用することができ、これは、相同組換え修復を使用して、「ドナー」ポリヌクレオチドの使用を介して供給される目的の配列を所望される染色体位置へと挿入する、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集系の１つの適用のための基礎である。
【０３０８】
１０塩基対またはそれ未満という少数の塩基対を含み得る、「マイクロホモロジー」の小領域であり得る、特定の配列の間の相同性の領域もまた、所望の欠失をもたらすのに使用することができる。例えば、単一のＤＳＢを、近傍の配列とのマイクロホモロジーを呈する部位に導入することができる。このようなＤＳＢの修復の通常の過程中、高頻度で生じる結果は、ＤＳＢおよび相伴う細胞の修復プロセスにより組換えが容易となる結果としての介在配列の欠失である。
【０３０９】
しかしながら、一部の状況では、相同性の領域内で、標的配列を選択することはまた、遺伝子融合（欠失が、コーディング領域内にある場合）を含む、はるかに大きい欠失ももたらし得、これは、特定の状況を考慮すると、所望される場合もあり、所望されない場合もある。
【０３１０】
本明細書に提示される例は、アシェリンタンパク質機能の回復をもたらす置き換えを誘導するようにデザインされたＤＳＢを作り出すための、多様な標的領域の選択、ならびにオンターゲットイベントと比べてオフターゲットイベントを最小化するようにデザインされたそのような領域内の特異的標的配列の選択をさらに例示する。
【０３１１】
相同組換え修復（ＨＤＲ）／ドナーヌクレオチド
【０３１２】
相同組換え修復とは、二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するための細胞機構である。最も一般的な形態は、相同組換えである。ＨＤＲには、一本鎖アニーリングおよび代替的ＨＤＲを含む、さらなる経路が存在する。ゲノム操作ツールは、研究者が、ゲノムに対して、部位特異的修飾を作り出すように、細胞の相同組換え経路を操作することを可能とする。細胞は、トランスに提供される合成のドナー分子を使用して、二本鎖切断を修復し得ることが見出されている。したがって、特異的変異の近傍に二本鎖切断を導入し、好適なドナーを提供することにより、標的とされる変化が、ゲノムにおいて作製され得る。特異的切断により、ＨＤＲ率は、相同なドナー単独を受ける細胞１０６個中における１の率よりも１，０００倍を超えて増加する。特定のヌクレオチドにおけるＨＤＲ率は、切断部位までの距離の関数であるので、重複するかまたは最近傍の標的部位を選び出すことが重要である。ｉｎ  ｓｉｔｕで修正することにより、ゲノムの残りは乱れないままとなるため、遺伝子編集は、遺伝子付加を上回る利点を提供する。
【０３１３】
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは、顕著に変動するが、小さいまたは大きいフランキング相同性アームを伴う配列であって、ゲノムＤＮＡとのアニーリングを可能とする意図される配列を含有し得る。導入される遺伝子変化を挟む相同性領域は、３０ｂｐまたはこれより小さい場合もあり、マルチキロベースという大きなカセットの場合もあり、これらは、プロモーター、ｃＤＮＡなどを含有し得る。一本鎖オリゴヌクレオチドドナーおよび二本鎖オリゴヌクレオチドドナーのいずれも使用されている。これらのオリゴヌクレオチドは、１００ｎｔ未満から多くのｋｂを超える（over  many  kb）サイズの範囲であるが、より長いｓｓＤＮＡもまた、生成および使用し得る。ＰＣＲ単位複製配列、プラスミド、およびミニサークルを含む、二本鎖ドナーを使用することができる。一般に、ＡＡＶベクターは、ドナー鋳型の送達の極めて有効な手段であり得ることが見出されているが、個々のドナーに対するパッケージング限界が＜５ｋｂである。ドナーの能動的転写が、ＨＤＲを３倍に増加させたことから、プロモーターを含むことが、転換を増加させ得ることが指し示される。逆に、ドナーのＣｐＧのメチル化は、遺伝子発現およびＨＤＲを減少させた。
【０３１４】
変異を修正するためのドナーヌクレオチドは、多くの場合、小さい（３００ｂｐ未満）。ＨＤＲ効率は、ドナー分子のサイズに対して逆に関連性し得るため、これは、有利である。また、ドナー鋳型が、サイズが制限されるＡＡＶ分子に適合し得ることも予測され、これは、ドナー鋳型送達の効果的な手段であることが示されている。
【０３１５】
Ｃａｓ９などの野生型エンドヌクレアーゼに加えて、一方のヌクレアーゼドメインまたは他方のヌクレアーゼドメインを不活化させる結果として、１つのＤＮＡ鎖だけの切断をもたらす、ニッカーゼバリアントが存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから誘導することができ、または標的領域を挟むニッカーゼ対を使用して誘導することもできる。ドナーは、一本鎖の場合もあり、ニック処理されている場合もあり、ｄｓＤＮＡの場合もある。
【０３１６】
ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼとともに供給することもでき、または様々な異なる方法、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、もしくはウイルスを介する形質導入により、独立して供給することもできる。ＨＤＲのためのドナーのアベイラビリティーを増加させる、一連のテザリングの選択肢が提起されている。例としては、ドナーの、ヌクレアーゼへの結合、近傍に結合するＤＮＡ結合性タンパク質への結合、またはＤＮＡ末端における結合もしくは修復に関与するタンパク質への結合が挙げられる。
【０３１７】
修復経路の選択は、細胞周期に影響を及ぼす培養条件など、いくつかの培養条件により導くこともでき、ＤＮＡ修復および関連タンパク質のターゲティングにより導くこともできる。例えば、ＨＤＲを増加させるために、ＫＵ７０、ＫＵ８０、またはＤＮＡリガーゼＩＶなど、鍵となるＮＨＥＪ分子を抑制することができる。
【０３１８】
ドナーが存在しない場合、接合部において塩基対合をほとんどまたは全く伴わずにＤＮＡ末端を接合させる、いくつかの非相同性修復経路を使用して、ＤＮＡ切断に由来する末端または異なる切断に由来する末端を接合させることができる。カノニカルのＮＨＥＪに加えて、ＡＮＨＥＪなど、同様の修復機構が存在する。２つの切断が存在する場合、介在するセグメントを、欠失させることもでき、反転させることもできる。ＮＨＥＪ修復経路は、接合部において、挿入、欠失、または変異をもたらし得る。
【０３１９】
ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼによる切断の後において、１５ｋｂの誘導的遺伝子発現カセットを、ヒト細胞株内の規定されたローカスへと挿入するのに使用された。大きい誘導的遺伝子発現カセットの挿入の方法が、説明されている［Maresca,  M.,  Lin,  V.G.,  Guo,  N.  &  Yang,  Y.,  Genome  Res  23,  539-546  (2013)、Suzuki  et  al.  Nature,  540,  144-149  (2016)］。
【０３２０】
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路およびＨＤＲの両方を使用する、部位特異的遺伝子挿入が、実施されている。組合せアプローチは、恐らくイントロン／エクソン境界部を含む、ある特定の状況において、適用可能であり得る。ＮＨＥＪは、イントロンにおけるライゲーションに有効であることを実証し得るが、エラーのないＨＤＲが、コーディング領域においてはより適している可能性がある。
【０３２１】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子内の例示的な改変としては、上記に参照された変異内またはその近傍（近位）、例えば、特異的変異から３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満上流または下流の領域内における置き換えが挙げられる。ＵＳＨ２Ａ遺伝子における変異の比較的広範な変化を考慮すると、上記の置き換えの多数の変化形（限定することなく、より大きい並びにより小さい欠失）が、アシェリンタンパク質機能の回復をもたらすと予測されるであろうことが理解される。
【０３２２】
そのようなバリアントは、問題の特異的変異よりも５’および／もしくは３’の方向に大きいか、またはいずれかの方向に小さい、置き換えを含み得る。したがって、特異的置き換えに関連する「近傍」または「近位」であるとは、所望される置き換え境界部（本明細書においてエンドポイントとも称される）と関連するＳＳＢまたはＤＳＢローカスが、基準ローカス、例えば、変異部位から約３ｋｂ未満である領域内にあり得ることを意図する。ＳＳＢまたはＤＳＢローカスは、より近位であってもよく、２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内であってもよい。小さい置き換えの事例では、所望されるエンドポイントは、基準ローカスにあってもよく、またはそれに「隣接して」いてもよく、これは、エンドポイントが、基準ローカスから１００ｂｐ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、または約１０ｂｐ未満〜５ｂｐであり得ることを意図する。
【０３２３】
より大きな置換えもより小さな置換えも、アシェリンタンパク質機能が回復される限り、同じ利点を提供し得る。したがって、本明細書に記載され、例示される置換えの多くの変化形が、２Ａ型アッシャー症候群を改善するのに有効であり得ることが予測される。
【０３２４】
ＳＳＢまたはＤＳＢに関連する「近傍」または「近位」という用語は、ＳＳＢまたはＤＳＢが、ＩＶＳ４０変異から２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、０．２５ｋｂ以内、０．２ｋｂ以内、０．１ｋｂ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、２０ｂｐ以内、１５ｂｐ以内、１０ｂｐ以内、５ｂｐ以内であることを指す。ＳＳＢまたはＤＳＢローカスはまた、イントロン４０から２ｋｂ以内、１ｋｂ以内、０．５ｋｂ以内、０．２５ｋｂ以内、０．２ｋｂ以内、または０．１ｋｂ以内、５０ｂｐ以内、２５ｂｐ以内、２０ｂｐ以内、１５ｂｐ以内、１０ｂｐ以内、５ｂｐ以内であり得る。
【０３２５】
核酸の修飾（化学的および構造的修飾）
【０３２６】
一部の場合には、細胞へと導入されたポリヌクレオチドは、例えば、活性、安定性、もしくは特異性を増強するか、送達を変更するか、宿主細胞内の自然免疫応答を低減するか、または本明細書でさらに記載され、当技術分野でも公知の他の増強のために、個別に、または組合せで使用され得る、１つまたは複数の修飾を含み得る。
【０３２７】
ある特定の例では、修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系で使用することができるが、この場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイドもしくは二重分子ガイド）、および／または細胞へと導入されるＣａｓもしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡは、以下に記載および例示されるように、修飾することができる。このような修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系で使用して、任意の１つまたは複数のゲノムローカスを編集することができる。
【０３２８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系を、このような使用の非限定的例示を目的として使用して、単一分子ガイドの場合もあり、二重分子ガイドの場合もある、ガイドＲＮＡと、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を増強するために、ガイドＲＮＡの修飾を使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、ゲノム編集複合体と、ゲノム内の標的配列との相互作用の開始、安定性、または反応速度を増強するのに使用することができ、例えば、オンターゲット活性を増強するのに使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、または代替的に、特異性、例えば、オンターゲット部位におけるゲノム編集の、他の（オフターゲット）部位における効果と比較した相対速度を増強するのに使用することができる。
【０３２９】
修飾はまた、または代替的に、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するその耐性を増加させ、これにより、細胞内でのその半減期の延長をもたらすことによって、ガイドＲＮＡの安定性を増加させるために使用することができる。ガイドＲＮＡの半減期を延長する修飾は、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳される必要があるＲＮＡを介して編集される細胞へと、ＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを導入する態様において、特に有用であり得るが、これは、エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入される、ガイドＲＮＡ半減期の延長が、ガイドＲＮＡと、コードされるＣａｓまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとが細胞内に共存する時間を延長するのに使用することができるためである。
【０３３０】
修飾はまた、または代替的に、細胞へと導入されたＲＮＡが、自然免疫応答を誘発する可能性または程度を減少させるのに使用することができる。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈では、十分に特徴付けられており、下記および当技術分野で記載されるこのような応答は、ＲＮＡの半減期の短縮および／またはサイトカインもしくは免疫応答と関連する他の因子の誘発と関連する傾向がある。
【０３３１】
限定なしに述べると、ＲＮＡの安定性を増強する（細胞内に存在するＲＮアーゼによる分解に対するその耐性を増大させることなどにより）修飾、結果として得られる産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する修飾、および／または細胞へと導入されたＲＮＡが、自然免疫応答を誘発する可能性もしくは程度を減少させる修飾を含む、１種または複数種の修飾もまた、細胞へと導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡへと施すことができる。
【０３３２】
前出および他のものなどの修飾の組合せも同様に、使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、例えば、１種または複数種の修飾を、ガイドＲＮＡ（上記で例示したガイドＲＮＡを含む）へと施すこともでき、かつ／または１種または複数種の修飾を、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ（上記で例示したＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡを含む）へと施すこともできる。
【０３３３】
例示を目的として述べると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系で使用されるガイドＲＮＡ、または他の低分子ＲＮＡは、化学的手段によりたやすく合成することができ、下記で例示され、当技術分野で記載される通り、いくつかの修飾をたやすく組み込むことを可能とする。化学合成手順が、断続的に拡大しつつある一方で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；ＰＡＧＥなど、ゲルの使用を回避する）などの手順による、このようなＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長が、１００ほどのヌクレオチドを優に超えて増加するにつれて、難しくなる傾向がある。より長い化学修飾ＲＮＡを生成するために使用され得る１つの手法は、一緒にライゲーションされる、２つまたはこれを上回る分子を作製することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡなど、はるかに長いＲＮＡは、酵素により、よりたやすく生成される。酵素により産生されたＲＮＡにおける使用のために利用可能な修飾の種類は少ないが、下記および当技術分野でさらに記載されるように、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性もしくは程度を低減し、かつ／または他の属性を増強するのに使用され得る修飾がまだ存在し、通例、新たな種類の修飾が開発されている。
【０３３４】
多様な種類の修飾、とりわけ、化学合成される低分子ＲＮＡとともに頻繁に使用される修飾についての例示を目的として述べると、修飾は、糖の２’位において修飾された、１つまたは複数のヌクレオチド、一部の態様では、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、または２’−フルオロで修飾されたヌクレオチドを含み得る。一部の例では、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース、無塩基残基、またはＲＮＡの３’末端における逆向き塩基における、２’−フルオロ、２’−アミノ、または２’−Ｏ−メチル修飾を含み得る。このような修飾は、規定の方式で、オリゴヌクレオチドへと組み込むことができ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対する２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりＴｍが大きい（すなわち、標的への結合アフィニティーが大きい）ことが示されている。
【０３３５】
いくつかのヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾は、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼ消化に対して、天然のオリゴヌクレオチドより耐性とすることが示されており、これらの修飾オリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間にわたりインタクトのまま存続する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例は、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルによる糖間連結、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環による糖間連結を含む修飾オリゴヌクレオチドを含む。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を伴うオリゴヌクレオチド、およびヘテロ原子骨格、特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知である）、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２骨格、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格［式中、天然のホスホジエステル骨格を、Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨとして表す］；アミド骨格［De  Mesmaekerら、Ace.  Chem.  Res.、２８巻：３６６〜３７４頁（１９９５年）を参照されたい］；モルホリノ骨格構造（SummertonおよびWeller、米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格を、ポリアミド骨格で置きかえ、ヌクレオチドを、ポリアミド骨格のアザ窒素原子へと、直接的または間接的に結合させる；Nielsenら、Science、１９９１年、２５４巻、１４９７頁を参照されたい）を伴うオリゴヌクレオチドである。リン含有連結は、ホスホロチオエート、キラルのホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルのホスホネートを含む、メチルホスホネートおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートであって、通常の３’−５’連結を有するこれら、２’−５’連結されたこれらの類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が、５’−３’に対する３’−５’、または５’−２’に対する２’−５’で連結される逆極性を有するリン含有連結を含むがこれらに限定されない（米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６���号；および同第５，６２５，０５０号を参照されたい）。
【０３３６】
モルホリノベースのオリゴマー性化合物については、BraaschおよびCorey、Biochemistry、４１巻（１４号）：４５０３〜４５１０頁（２００２年）；Genesis、３０巻、３号（２００１年）；Heasman、Dev.  Biol.、２４３巻：２０９〜２１４頁（２００２年）；Naseviciusら、Nat.  Genet.、２６巻：２１６〜２２０頁（２０００年）；Lacerraら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.、９７巻：９５９１〜９５９６頁（２０００年）；および１９９１年７月２３日に公布された、米国特許第５，０３４，５０６号において記載されている。
【０３３７】
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体については、Wangら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１２２巻：８５９５〜８６０２頁（２０００年）において記載されている。
【０３３８】
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルによるヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルとの混合によるヌクレオシド間連結、または１もしくは複数の短鎖のヘテロ原子もしくは複素環によるヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結を有する骨格（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２の構成要素部分の混合を有する他の骨格（米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号を参照されたい）を含む。
【０３３９】
１つまたは複数の置換糖部分、例えば、２’位における以下：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３  Ｏ（ＣＨ２）ｎ  ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎ  ＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎ  ＣＨ３（式中、ｎは、１〜約１０である）；Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール、またはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２  ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；挿入剤；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、ならびに同様の特性を有する他の置換基のうちの１つも含まれ得る。一部の態様では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としてもまた公知の、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）を含む（Martin  et  al,  HeIv.  Chim.  Acta,  1995,  78,  486）。他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾を、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においても施すことができる。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりに、シクロブチルなどの糖模倣体も有し得る。
【０３４０】
一部の例では、糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格を、新規の基で置きかえることができる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持することができる。１つのこのようなオリゴマー性化合物であるオリゴヌクレオチド模倣体であって、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称する。ＰＮＡ化合物中では、オリゴヌクレオチドの糖骨格を、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格で置きかえることができる。ヌクレオ塩基は保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子へと、直接的または間接的に結合させることができる。ＰＮＡ化合物の調製について教示する、代表的な米国特許は、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号を含むがこれらに限定されない。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示は、Nielsenら、Science、２５４巻：１４９７〜１５００頁（１９９１年）において見出すことができる。
【０３４１】
ガイドＲＮＡはまた、加えてまたは代替的に、ヌクレオ塩基（当技術分野では単に「塩基」と称することが多い）の修飾または置換も含みうる。本明細書で使用される場合、「非修飾」または「天然」ヌクレオ塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、天然の核酸内で、低頻度で、または一過性に見出されるに過ぎないヌクレオ塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に、５−メチルシトシン（また、５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、当技術分野では、５−Ｍｅ−Ｃと称されることが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ、およびゲントビオシルＨＭＣ、ならびに合成のヌクレオ塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾイルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン（2-(aminoalklyamino)adenine）または他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリンを含む（Kornberg,  A.、DNA  Replication、W.  H.  Freeman  &  Co.、San  Francisco、７５〜７７頁（１９８０年）；Gebeyehuら、Nucl.  Acids  Res.、１５巻：４５１３頁（１９９７年））。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えば、イノシンもまた、組み入れることができる。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６〜１．２℃だけ上昇させることが示されており（Sanghvi,  Y.  S.、Crooke,  S.  T.およびLebleu,  B.編、Antisense  Research  and  Applications、CRC  Press、Boca  Raton、１９９３年、２７６〜２７８頁）、塩基置換の態様である。
【０３４２】
修飾ヌクレオ塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルアデニンおよび８−ヒドロキシルグアニンならびに他の８−置換アデニンおよび８−置換グアニン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、特に、５−ブロモウラシルおよび５−ブロモシトシン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロメチルシトシン、ならびに他の５−置換ウラシルおよび５−置換シトシン、７−メチルグアニン（7-methylquanine）および７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなど、他の合成および天然ヌクレオ塩基を含みうる。
【０３４３】
さらに、ヌクレオ塩基は、；米国特許第３，６８７，８０８号において開示されているヌクレオ塩基；「The  Concise  Encyclopedia  of  Polymer  Science  And  Engineering」、８５８〜８５９頁、Kroschwitz,  J.I.編、John  Wiley  &  Sons、１９９０年において開示されているヌクレオ塩基；Englischら、「Angewandle  Chemie,  International  Edition」、１９９１年、３０巻、６１３頁により開示されているヌクレオ塩基；およびSanghvi,  Y.  S.、１５章、「Antisense  Research  and  Applications」、２８９〜３０２頁、Crooke,  S.T.およびLebleu,  B.編著、CRC  Press、１９９３年により開示されているヌクレオ塩基を含みうる。これらのヌクレオ塩基のうちのいくつかは、本発明のオリゴマー性化合物の結合アフィニティーを増大させるために、特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、Ｎ−２、Ｎ−６、および０−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を、０．６〜１．２℃だけ上昇させることが示されており（Sanghvi,  Y.  S.、Crooke,  S.  T.およびLebleu,  B.編、「Antisense  Research  and  Applications」、CRC  Press、Boca  Raton、１９９３年、２７６〜２７８頁）、なおより特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、塩基置換の態様である。修飾ヌクレオ塩基については、米国特許第３，６８７，８０８号のほか、同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第５，７６３，５８８号；同第５，８３０，６５３号；同第６，００５，０９６号；および米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号において記載されている。
【０３４４】
したがって、「修飾された」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼの両方へと組み込まれた、非天然の糖、リン酸、または塩基を指す。所与のオリゴヌクレオチド内の全ての位置が、一様に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾のうちの１つを超える修飾は、単一のオリゴヌクレオチドに組み込むこともでき、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むこともできる。
【０３４５】
ガイドＲＮＡおよび／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（またはＤＮＡ）は、活性、細胞の分布、またはオリゴヌクレオチドの細胞による取込みを増強する、１または複数の部分またはコンジュゲートへと化学的に連結することができる。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分［Letsingerら、Proc.  Natl.  Acad.、Sci.  USA、８６巻：６５５３〜６５５６頁（１９８９年）］；コール酸［Manoharanら、Bioorg.  Med.  Chem.  Let.、４巻：１０５３〜１０６０頁（１９９４年）］；チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Manoharanら、Ann.  N.  Y.  Acad.  Sci.、６６０巻：３０６〜３０９頁（１９９２年）；およびManoharanら、Bioorg.  Med.  Chem.  Let.、３巻：２７６５〜２７７０頁（１９９３年）］；チオコレステロール［Oberhauserら、Nucl.  Acids  Res.、２０巻：５３３〜５３８頁（１９９２年）］；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Kabanovら、FEBS  Lett.、２５９巻：３２７〜３３０頁（１９９０年）；およびSvinarchukら、Biochimie、７５巻：４９〜５４頁（１９９３年）］；リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［Manoharanら、Tetrahedron  Lett.、３６巻：３６５１〜３６５４頁（１９９５年）；およびSheaら、Nucl.  Acids  Res.、１８巻：３７７７〜３７８３頁（１９９０年）］；ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖［Mancharanら、Nucleosides  &  Nucleotides、１４巻：９６９〜９７３頁（１９９５年）］；アダマンタン酢酸［Manoharanら、Tetrahedron  Lett.、３６巻：３６５１〜３６５４頁（１９９５年）］；パルミチル部分［（Mishraら、Biochim.  Biophys.  Acta、１２６４巻：２２９〜２３７頁（１９９５年）］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール（hexylamino-carbonyl-t  oxycholesterol）部分［Crookeら、J.  Pharmacol.  Exp.  Ther.、２７７巻：９２３〜９３７頁（１９９６年）］を含むがこれらに限定されない。また、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，��６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；および同第５，６８８，９４１号も参照されたい。
【０３４６】
糖および他の部分を使用して、タンパク質と、カチオン性のポリソームおよびリポソームなど、ヌクレオチドを含む複合体とを、特定の部位へとターゲティングすることができる。例えば、肝細胞指向移入は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を媒介しうる（例えば、Huら、Protein  Pept  Lett.、２１巻（１０号）：１０２５〜３０頁（２０１４年）を参照されたい）。当技術分野で公知であり、定期的に開発されている他の系は、本場合において使用される生体分子および／またはその複合体を、目的の、特定の標的細胞へとターゲティングするのに使用することができる。
【０３４７】
これらのターゲティング部分またはコンジュゲートは、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基へと共有結合的に結合させたコンジュゲート基を含み得る。本開示のコンジュゲート基は、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増強する基を含む。典型的なコンジュゲート基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含む。本開示の文脈における、薬力学特性を増強する基は、取込みを改善する基、分解に対する耐性を増強する基、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本開示の文脈における、薬物動態特性を増強する基は、本開示の化合物の、取込み、分布、代謝、または排出を改善する基を含む。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号（ＷＯ１９９３００７８８３として公開）、および米国特許第６，２８７，８６０号において開示されている。コンジュゲート部分は、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むがこれらに限定されない。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、および同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
【０３４８】
化学合成にあまり適さず、酵素的合成により作製することが典型的な、長型のポリヌクレオチドもまた、多様な手段により修飾することができる。このような修飾は、例えば、ある特定のヌクレオチド類似体の導入、特定の配列または他の部分の、分子の５’または３’末端における組込み、および他の修飾を含みうる。例示を目的として述べると、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、約４ｋｂの長さであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写により合成することができる。ｍＲＮＡへの修飾は、例えば、その翻訳または安定性を増大させる（細胞による分解に対するその耐性を増大させることなどによる）ように適用することもでき、ＲＮＡの、自然免疫応答を誘発する傾向であって、外因性ＲＮＡ、特に、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡなど、長いＲＮＡの導入後において、細胞内で観察されることが多い傾向を低減するように適用することもできる。
【０３４９】
当技術分野では、ポリＡテール、５’キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾塩基（シュードＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）またはＮ６−メチル−ＡＴＰなど）の使用、または５’末端リン酸を除去する、ホスファターゼによる処理など、多数のこのような修飾について記載されている。当技術分野では、これらの修飾および他の修飾が公知であり、ＲＮＡの新たな修飾が、定期的に開発されている。
【０３５０】
例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、および多くの他の供給元を含む、修飾ＲＮＡの多数の市販品の供給元が存在する。ＴｒｉＬｉｎｋにより記載されている通り、例えば、５−メチル−ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼの安定性の増大、翻訳の増大、または生得的免疫受容体の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写されたＲＮＡとの相互作用の低減など、望ましい特徴を付与することができる。下記で言及される、KormannらおよびWarrenらによる刊行物において例示されている通り、５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、ならびにシュードＵＴＰおよび２−チオ−ＵＴＰはまた、培養物中およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける生得的免疫刺激を低減する一方で、翻訳を増強することも示されている。
【０３５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて送達される化学修飾ｍＲＮＡを使用して、治療効果の改善を達成しうることが示されている（例えば、Kormannら、Nature  Biotechnology、２９巻、１５４〜１５７頁（２０１１年）を参照されたい）。このような修飾を使用して、例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増大させ、かつ／またはその免疫原性を低減することができる。シュードＵ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ、および５−メチル−Ｃなどの化学修飾を使用して、ウリジンおよびシチジン残基のうちの４分の１だけを、それぞれ、２−チオ−Ｕおよび５−メチル−Ｃで置換する結果として、マウスにおける、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）により媒介されるｍＲＮＡの認識の顕著な低下がもたらされることが見出された。生得的免疫系の活性化を低減することにより、これらの修飾を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡの安定性および寿命を効果的に増大させることができる（例えば、Kormannら、前出を参照されたい）。
【０３５２】
また、生得的抗ウイルス応答を迂回するようにデザインされた修飾を組み込む、合成のメッセンジャーＲＮＡの反復投与は、分化ヒト細胞を、多能性へと再プログラム化できることも示されている。例えば、Warrenら、Cell  Stem  Cell、７巻（５号）：６１８〜３０頁（２０１０年）を参照されたい。一次再プログラム化タンパク質として作用する、このような修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラム化する、効率的な手段でありうる。このような細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称し、５−メチル−ＣＴＰ、シュードＵＴＰ、およびＡＲＣＡ（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ）を組み込む、酵素的に合成されたＲＮＡであれば、細胞の抗ウイルス応答を効果的に逃避するのに使用されうることが見出された（例えば、Warrenら、前出を参照されたい）。
【０３５３】
当技術分野で記載されるポリヌクレオチドの他の修飾は、例えば、ポリＡテールの使用、５’キャップ類似体（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ）など）の付加、５’もしくは３’非翻訳領域ＵＴＲの修飾、または５’末端リン酸を除去する、ホスファターゼによる処理（そして、新たな手法が定期的に開発されている）を含む。
【０３５４】
本明細書における使用のための修飾ＲＮＡを生成するのに適用可能な、いくつかの組成物および技法が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾との関連で開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ干渉を介する、遺伝子サイレンシングに対するそれらの効果が、一般に、一過性であり、これは、反復投与を要求し得るため、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、特定の課題を提示する。加えて、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳動物細胞は、ウイルス感染の副産物であることが多い、ｄｓＲＮＡを検出および中和するように進化した免疫応答を有する。したがって、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介し得る、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）など、哺乳動物の酵素、および潜在的にレチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、ならびにこのような分子に応答してサイトカインの誘導を惹起し得るＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８など）が存在する（例えば、Angart  et  al.,  Pharmaceuticals  (Basel)  6(4):  440-468  (2013)、Kanasty  et  al.,  Molecular  Therapy  20(3):  513-524  (2012)、Burnett  et  al.,  Biotechnol  J.  6(9):1130-46  (2011)、Judge  and  MacLachlan,  Hum  Gene  Ther  19(2):111-24  (2008)による総説を参照されたい）。
【０３５５】
ＲＮＡの安定性を増強し、自然免疫応答を低減し、かつ／またはポリヌクレオチドの、ヒト細胞への導入であって、本明細書で記載される導入との関連で有用でありうる他の利益を達成するように、多種多様な修飾が、開発および適用されている（例えば、Whitehead  KAら、Annual  Review  of  Chemical  and  Biomolecular  Engineering、２巻：７７〜９６頁（２０１１年）；GaglioneおよびMessere、Mini  Rev  Med  Chem、１０巻（７号）：５７８〜９５頁（２０１０年）；Chernolovskayaら、Curr  Opin  Mol  Ther.、１２巻（２号）：１５８〜６７頁（２０１０年）；Deleaveyら、Curr  Protoc  Nucleic  Acid  Chem、１６章：１６．３部（２００９年）；Behlke、Oligonucleotides、１８巻（４号）：３０５〜１９頁（２００８年）；Fuciniら、Nucleic  Acid  Ther、２２巻（３号）：２０５〜２１０頁（２０１２年）；Bremsenら、Front  Genet、３巻：１５４頁（２０１２年）による総説を参照されたい）。
【０３５６】
上記で言及した通り、それらの多くが、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するようにデザインされた修飾に特化した、修飾ＲＮＡのいくつかの市販品の供給元が存在する。文献で報告されている多様な知見に基づき、様々な手法が提供されている。例えば、Dharmaconは、Kole、Nature  Reviews  Drug  Discovery、１１巻：１２５〜１４０頁（２０１２年）により報告されている通り、非架橋酸素の、硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）による置きかえが、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するのに使用されていることについて言及している。リボースの２’位の修飾は、ヌクレオチド間のリン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善する一方で、二重鎖の安定性（Ｔｍ）を増大させ、これはまた、免疫活性化からの保護をもたらすことも示されていることが報告されている。Soutschekら、Nature、４３２巻：１７３〜１７８頁（２００４年）により報告されている通り、中程度のＰＳ骨格の修飾の、小型の、十分に忍容される２’−置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）との組合せは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適用のための、高度に安定的なｓｉＲＮＡと関連しており、Volkov、Oligonucleotides、１９巻：１９１〜２０２頁（２００９年）により報告されている通り、２’−Ｏ−メチル修飾は、安定性の改善において有効であることが報告されている。自然免疫応答の誘導を減少させることとの関連で、特異的配列を、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロで修飾することは、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８の相互作用を低減する一方で、一般に、サイレンシング活性を保存することが報告されている（例えば、Judgeら、Mol.  Ther.、１３巻：４９４〜５０５頁（２００６年）；およびCekaiteら、J.  Mol.  Biol.、３６５巻：９０〜１０８頁（２００７年）を参照されたい）。２−チオウラシル、シュードウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、およびＮ６−メチルアデノシンなどのさらなる修飾もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ８により媒介される免疫作用を最小化することが示されている（例えば、Kariko,  K.ら、Immunity、２３巻：１６５〜１７５頁（２００５年）を参照されたい）。
【０３５７】
また、当技術分野で公知であり、市販されている、いくつかのコンジュゲートであって、例えば、コレステロール、トコフェロール、および葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー、およびアプタマーを含み、それらの送達および／または細胞による取込みを増強し得るコンジュゲートを、本明細書における使用のために、ＲＮＡなどのポリヌクレオチドへと適用することができる（例えば、Winkler,  Ther.  Deliv.  4:791-809  (2013)による総説を参照されたい）。
【０３５８】
コドンの最適化
【０３５９】
部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で標準的な方法に従い、目的の標的ＤＮＡを含有する細胞内の発現のために、コドンを最適化することができる。例えば、意図された標的核酸が、ヒト細胞内にある場合、Ｃａｓ９をコードする、コドンを最適化したヒトポリヌクレオチドを、Ｃａｓ９ポリペプチドを産生するための使用に想定する。
【０３６０】
系の構成要素をコードする核酸
【０３６１】
本開示は、本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提示する。
【０３６２】
本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、および／または本開示の方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子をコードする核酸は、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含みうる。
【０３６３】
「ベクター」という用語は、それを連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は、さらなる核酸セグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなる核酸セグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、および哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。
【０３６４】
一部の例では、ベクターは、それらが作動的に連結された核酸の発現を導くことが可能でありうる。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」、またはより簡単に、「発現ベクター」と称するが、これらは、同等の機能を果たす。
【０３６５】
「作動可能に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とする形で、調節配列へと連結されていることを意味する。「調節配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Goeddel、Gene  Expression  Technology、Methods  in  Enzymology、１８５巻、Academic  Press、San  Diego、CA（１９９０年）において記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞内のヌクレオチド配列の構成的発現を導く調節配列と、ある特定の宿主細胞内だけのヌクレオチド配列の発現を導く調節配列（例えば、組織特異的調節配列）とを含む。当業者は、発現ベクターのデザインが、標的細胞の選び出し、所望の発現レベルなどの因子に依存しうることを察知するであろう。
【０３６６】
想定される発現ベクターとしては、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクター）に基づくウイルスベクター、ならびに他の組換えベクターが挙げられるが、これらに限定されない。真核標的細胞のために想定される他のベクターとしては、ｐＸＴ１ベクター、ｐＳＧ５ベクター、ｐＳＶＫ３ベクター、ｐＢＰＶベクター、ｐＭＳＧベクター、およびベクターｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。真核標的細胞のために想定される追加のベクターとしては、ｐＣＴｘ−１ベクター、ｐＣＴｘ−２ベクター、およびｐＣＴｘ−３ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞と適合性である限りにおいて、他のベクターを使用することができる。
【０３６７】
一部の例では、ベクターは、１または複数の転写および／または翻訳制御エレメントを含みうる。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的および誘導的プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの適切な転写および翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクター内で使用することができる。ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構もしくは他のエレメントの構成要素を不活化させる、自己不活化ベクターでありうる。
【０３６８】
適切な真核プロモーター（すなわち、真核細胞内で機能的なプロモーター）の非限定的な例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスに由来するＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）、ヒト伸長因子１プロモーター（ＥＦ１）、ニワトリベータ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）へと融合させたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むハイブリッド構築物、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１ローカスプロモーター（ＰＧＫ）、およびマウスメタロチオネインＩに由来するプロモーターを含む。
【０３６９】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼとの関連で使用されるガイドＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを発現するためには、例えば、Ｕ６およびＨ１を含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの多様なプロモーターが有利でありうる。当技術分野では、このようなプロモーターの使用を増強することについての記載、およびこのためのパラメータが公知であり、さらなる情報および手法が、定期的に記載されている（例えば、Ma,  H.ら、Molecular  Therapy  -  Nucleic  Acids、３巻、ｅ１６１頁（２０１４年）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい）。
【０３７０】
発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合性部位および転写ターミネーターも含有しうる。発現ベクターはまた、発現を増幅するのに適切な配列も含みうる。発現ベクターはまた、非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列であって、部位特異的ポリペプチドへと融合させ、したがって、融合タンパク質をもたらすヌクレオチド配列も含みうる。
【０３７１】
プロモーターは、誘導的プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーターなど）でありうる。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）でありうる。場合によって、プロモーターは、空間限定型および／または時間限定型プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）でありうる。
【０３７２】
本開示のゲノムターゲティング核酸および／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達のための送達媒体内またはその表面上にパッケージングすることができる。想定される送達媒体は、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ハイドロゲル、およびミセルを含むがこれらに限定されない。当該分野において記載されている通り、様々なターゲティング部分を使用して、このような媒体の、所望される細胞型または場所との優先的な相互作用を増強することができる。
【０３７３】
本開示の複合体、ポリペプチド、および核酸の、細胞への導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポソーム媒介型トランスフェクション、遺伝子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達などにより行うことができる。
【０３７４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
【０３７５】
遺伝子調節的領域の別のクラスは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位である。ｍｉＲＮＡは、転写後遺伝子調節において鍵となる役割を果たすノンコーディングＲＮＡである。報告によれば、ｍｉＲＮＡは、多数の哺乳動物タンパク質コード遺伝子の発現を調節する。さらなる低分子ノンコーディングＲＮＡを加えた、二本鎖ＲＮＡによる、特異的かつ強力な遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）が発見された（Canver,  M.C.  et  al.,  Nature  (2015)）。遺伝子サイレンシングに重要なノンコーディングＲＮＡの最大のクラスは、ｍｉＲＮＡである。哺乳動物では、ｍｉＲＮＡはまず、個別の転写単位、タンパク質イントロンの一部、または他の転写物であり得る、長いＲＮＡ転写物として転写される。長い転写物は、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれ、塩基対合の不完全なヘアピン構造を含む。これらのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａを伴う、核内のタンパク質複合体である、Ｍｉｃｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒにより、１つまたは複数の短い前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）へと切断され得る。
【０３７６】
ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、２ヌクレオチドの３’突出を有する約７０ヌクレオチドの長さの短いステムループであり、エクスポートされて１９〜２５ヌクレオチドの成熟ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二重鎖になる。塩基対合安定性の低い方のｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）が、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へとロードされ得る。パッセンジャーガイド鎖（＊でマークされる）は、機能的であり得るが、通常、分解される。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣを、標的ｍＲＮＡ内の部分的に相補的な配列モチーフであって、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に主に見出される相補的な配列モチーフへ係留し、転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Bartel,  D.P.  Cell  136,  215-233  (2009)、Saj,  A.  &  Lai,  E.C.  Curr  Opin  Genet  Dev  21,  504-510  (2011)）。
【０３７７】
ｍｉＲＮＡは、発生、分化、細胞周期、および増殖の制御、ならびに哺乳動物および他の多細胞の生物の事実上全ての生物学的経路において重要でありうる。ｍｉＲＮＡはまた、細胞周期の制御、アポトーシス、および幹細胞分化、造血、低酸素状態、筋発生、神経発生、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルスの複製、および免疫応答にも関与しうる。
【０３７８】
単一のｍｉＲＮＡが、数百の異なるｍＲＮＡ転写物を標的とし得る一方で、個々の転写物は、多くの異なるｍｉＲＮＡにより標的とされ得る。最新版のｍｉＲＢａｓｅ（ｖ．２１）では、２８６４５を超えるｍｉＲＮＡが、注釈されている。一部のｍｉＲＮＡは、複数のローカスによりコードされる場合があり、それらの一部は、タンデムに共転写されたクラスターから発現され得る。この特色は、複数の経路およびフィードバック制御を伴う、複雑な調節ネットワークを可能とする。ｍｉＲＮＡは、これらのフィードバックおよび調節回路の不可欠な部分である可能性があり、タンパク質の産生を制限内に保つことにより、遺伝子発現を調節する一助となり得る（Herranz,  H.  &  Cohen,  S.M.  Genes  Dev  24,  1339-1344  (2010);  Posadas,  D.M.  &  Carthew,  R.W.  Curr  Opin  Genet  Dev  27,  1-6  (2014)）。
【０３７９】
ｍｉＲＮＡはまた、異常なｍｉＲＮＡ発現と関連する多数のヒト疾患においても重要であり得る。この関連は、ｍｉＲＮＡ調節経路の重要性を強調する。最近のｍｉＲＮＡ欠失研究では、ｍｉＲＮＡを、免疫応答の調節と関連付けている（Stern-Ginossar,  N.  et  al.,  Science  317,  376-381  (2007)）。
【０３８０】
ｍｉＲＮＡはまた、がんとも強力な関連を有し、異なる種類のがんにおいて役割を果たし得る。ｍｉＲＮＡは、いくつかの腫瘍において、下方調節されることが見出されている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期の制御およびＤＮＡの損傷への応答など、鍵となるがん関連経路の調節において重要な場合があり、したがって、診断において使用することができ、臨床において標的とすることができる。ｍｉＲＮＡは、全てのｍｉＲＮＡを枯渇させる実験が、腫瘍血管新生を抑制するように、血管新生の平衡を精密に調節し得る（Chen,  S.  et  al.,  Genes  Dev  28,  1054-1067  (2014)）。
【０３８１】
タンパク質コーディング遺伝子について示されている通り、ｍｉＲＮＡ遺伝子はまた、がんと共に生じる後成的（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ）変化下にも置かれうる。多くのｍｉＲＮＡローカスは、ＤＮＡのメチル化によるそれらの調節の機会を増大させるＣｐＧアイランドと関連しうる（Weber,  B.、Stresemann,  C.、Brueckner,  B.、およびLyko,  F.、Cell  Cycle、６巻、１００１〜１００５頁（２００７年））。研究の大半は、クロマチンリモデリング薬による処理を使用して、ｍｉＲＮＡの後成的サイレンシングを明らかにしている。
【０３８２】
ＲＮＡサイレンシングにおけるそれらの役割に加えて、ｍｉＲＮＡはまた、翻訳も活性化させ得る（Posadas,  D.M.  &  Carthew,  R.W.  Curr  Opin  Genet  Dev  27,  1-6  (2014)）。これらの部位のノックアウトが、標的とした遺伝子の発現の低下をもたらし得るのに対し、これらの部位の導入は、発現を増加させ得る。
【０３８３】
個々のｍｉＲＮＡは、結合特異性に重要であり得る、シード配列（２〜８塩基のマイクロＲＮＡ）を変異させることにより、最も効果的にノックアウトすることができる。この領域内の切断、続いてＮＨＥＪによる誤修復は、標的部位への結合を遮断することにより、ｍｉＲＮＡの機能を効果的に消失させ得る。ｍｉＲＮＡはまた、回文配列に隣接する特殊なループ領域の特異的ターゲティングによっても阻害することができる。触媒的に不活性なＣａｓ９もまた、ｓｈＲＮＡの発現を阻害するために使用することができる（Zhao,  Y.  et  al.,  Sci  Rep  4,  3943  (2014)）。ｍｉＲＮＡのターゲティングに加えて、結合部位もまた、ｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防止するために標的とし、変異させることができる。
【０３８４】
本開示によると、ｍｉＲＮＡまたはそれらの結合部位のうちのいずれかを、本発明の組成物に組み込んでもよい。
【０３８５】
組成物は、配列番号６１３〜４６９６に列挙されるｍｉＲＮＡのうちのいずれかの配列、配列番号６１３〜４６９６に列挙されるｍｉＲＮＡの逆相補体、または配列番号６１３〜４６９６に列挙されるｍｉＲＮＡのうちのいずれかのｍｉＲＮＡアンチシード領域を含む領域などであるがこれらに限定されない領域を有し得る。
【０３８６】
本発明の組成物は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ標的配列、ｍｉＲＮＡ配列、またはｍｉＲＮＡシードを含み得る。そのような配列は、米国公開第２００５／０２６１２１８号および米国公開第２００５／００５９００５号に教示されるものなど、任意の公知のｍｉＲＮＡに対応し得る。非限定的な例として、公知のｍｉＲＮＡ、それらの配列、およびヒトゲノムにおけるそれらの結合部位の配列は、配列番号６１３〜４６９６に列挙されている。
【０３８７】
ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２位〜８位の領域にある配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完璧なワトソン・クリック相補性を有する。ｍｉＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２〜８または２〜７位を含み得る。一部の例では、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、ｍｉＲＮＡ  １位に対向するアデニン（Ａ）が隣接している。一部の例では、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ  １位に対向するアデニン（Ａ）が隣接している。例えば、Grimson  A,  Farh  KK,  Johnston  WK,  Garrett-Engele  P,  Lim  LP,  Bartel  DP;  Mol  Cell.  2007  Jul  6;27(1):91-105を参照されたい。ｍｉＲＮＡシードの塩基は、標的配列との完全な相補性を有する。
【０３８８】
ｍｉＲＮＡの同定、ｍｉＲＮＡ標的領域、ならびにそれらの発現パターンおよび生物学における役割が、報告されている（Bonauer  et  al.,  Curr  Drug  Targets  2010  11:943-949、Anand  and  Cheresh  Curr  Opin  Hematol  2011  18:171-176;  Contreras  and  Rao  Leukemia  2012  26:404-413  (2011  Dec  20.  doi:  10.1038/leu.2011.356);  Bartel  Cell  2009  136:215-233;  Landgraf  et  al,  Cell,  2007  129:1401-1414;  Gentner  and  Naldini,  Tissue  Antigens.  2012  80:393-403。
【０３８９】
例えば、組成物が、肝臓へと送達されるのを意図したものではないにもかかわらず、送達されてしまった場合、肝臓において豊富なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、ｍｉＲ−１２２の１つまたは複数の標的部位が、その標的配列をコードするポリヌクレオチド内に操作されていれば、送達された配列の発現を阻害することができる。異なるｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位の導入は、生存性、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させるように操作することができ、したがって、さらに妥当性（tenability）を重ねることができる。
【０３９０】
本明細書において使用されるとき、「ｍｉＲＮＡ部位」という用語は、ｍｉＲＮＡ標的部位もしくはｍｉＲＮＡ認識部位、またはｍｉＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来的なワトソン・クリックハイブリダイゼーション則に従い得るか、またはｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡ部位もしくはそれに隣接する標的配列との任意の安定な会合を反映し得ることを理解されたい。
【０３９１】
対照的に、本開示の組成物の目的で、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特異的組織におけるタンパク質発現を増加させるために、それらが天然に存在する配列の外部で（すなわち、そこから取り出して）操作されてもよい。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位は、肝臓におけるタンパク質発現を改善するために、取り出され得る。
【０３９２】
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも称される）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などにおいて、差次的に発現されることが知られている。免疫細胞に特異的なｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫性、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療および組織／器官移植後の望ましくない免疫応答に関与する。免疫細胞に特異的なマイクロＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化、およびアポトーシスの多数の側面を調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−１４６は、免疫細胞において排他的に発現され、特に、骨髄樹状細胞において豊富である。ｍｉＲ−１４２結合部位を、本開示のポリペプチドの３’−ＵＴＲへと導入することによって、ｍｉＲ−１４２により媒介されるｍＲＮＡの分解を通じて抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制し、プロフェッショナルＡＰＣ（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それによって、遺伝子送達後の抗原により媒介される免疫応答を予防することができる（例えば、Annoni  A  et  al.,  blood,  2009,  114,  5152-5161を参照されたい）。
【０３９３】
１つの例は、免疫細胞、特に、抗原提示細胞において発現されることが知られているｍｉＲＮＡ結合部位を、ポリヌクレオチド内に操作して、ｍｉＲＮＡにより媒介されるＲＮＡの分解を通じてＡＰＣにおけるポリヌクレオチドの発現を抑制し、抗原に媒介される免疫応答を緩和することができ、同時に、ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞に特異的なｍｉＲＮＡが発現されない非免疫細胞においては維持される。
【０３９４】
様々ながん細胞／組織および他の疾患におけるｍｉＲＮＡの差次的発現をプロファイリングするために、多くのｍｉＲＮＡ発現に関する研究が行われており、当技術分野において説明されている。一部のｍｉＲＮＡは、ある特定のがん細胞において異常に過剰発現され、その他のものは、過少発現される。例えば、ｍｉＲＮＡは、がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）、がん幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）、膵臓がんおよび疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）、喘息および炎症（ＵＳ８４１５０９６）、前立腺がん（ＵＳ２０１３／００５３２６４）、肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）、肺がん細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）、結腸直腸がん細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）、がん陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）、上咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）、慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）、甲状腺がん（ＷＯ２０１３／０６６６７８）、卵巣がん細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）、乳がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病およびリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３）において、差次的に発現される。
【０３９５】
ヒト細胞
【０３９６】
本明細書に記載および例示されるように、２Ａ型アッシャー症候群またはＵＳＨ２Ａと関連する任意の障害の改善に関して、遺伝子編集の主要な標的は、ヒト細胞である。例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ方法では、ヒト細胞は、体細胞であり得、体細胞は、記載される技法を使用して修飾された後に、分化した細胞、例えば、光受容細胞または網膜前駆細胞を生じ得る。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法では、ヒト細胞は、光受容細胞または網膜前駆細胞であり得る。
【０３９７】
自家細胞において遺伝子編集を実施することを必要とする患者に由来し、したがって、既に患者と完全にマッチしている自家細胞において遺伝子編集を実施することにより、患者へと安全に再導入することが可能であり、患者の疾患と関連する１つまたは複数の臨床状態の改善において有効であり得る細胞集団を効果的にもたらす細胞を生成することが可能である。
【０３９８】
前駆細胞（本明細書において幹細胞とも称される）は、増殖およびより多くの前駆細胞をもたらすことのいずれもが可能であり、分化細胞または分化可能な娘細胞をもたらし得る、多数の母細胞を発生させる能力を有する。娘細胞自体が、増殖し、その後、１つまたは複数の成熟細胞型へと分化する一方で、また、親の発生的潜在能を伴う１つまたは複数の細胞も保持する後代をもたらすように、誘導することができる。次いで、「幹細胞」という用語は、特定の状況下では、より特化したまたは分化した表現型へと分化する能力または潜在能を有し、ある特定の状況下では、実質的に分化せずに、増殖する能力を保持する、細胞を指す。一態様では、前駆細胞または幹細胞という用語は、それらの子孫細胞（後代）が、分化により、例えば、胚細胞および組織の、進行する多様化においてそうであるように、完全に個別の性格を獲得することにより、しばしば、異なる方向に特化する汎用母細胞を指す。細胞の分化とは、典型的に、多くの細胞分裂を介して生じる、複雑なプロセスである。分化細胞は、複能性細胞に由来することが可能であり、複能性細胞はそれ自体、複能性細胞に由来するなどである。これらの複能性細胞の各々は、幹細胞であると考えられるが、各々がもたらし得る細胞型の範囲は、かなり変動し得る。一部の分化細胞はまた、発生的潜在能が大きな細胞をもたらす能力も有する。このような能力は、天然の場合もあり、多様な因子による処理の際に、人工的に誘導される場合もある。多くの生物学的事例では、幹細胞はまた、１つを超える別個の細胞型の後代をもたらし得るため、「複能性」でもあり得るが、これは、「幹細胞性」であるために必要ではない。
【０３９９】
自己再生は、幹細胞の別の重要な側面でありうる。理論的に、自己再生は、２つの主要な機構のうちのいずれかにより生じうる。幹細胞は、一方の娘細胞が、幹細胞状態を保持し、他方の娘細胞が、何らかの別個の他の特異的機能および表現型を発現して、非対称的に分裂する場合がある。代替的に、集団内の幹細胞の一部が、２つの幹細胞へと、対称的に分裂することが可能であり、これにより、全体としての集団内に一部の幹細胞を維持するのに対し、集団内の他の細胞は、分化した後代だけをもたらす。一般に、「始原細胞」は、より始原性である（すなわち、発生経路または進行に沿って、完全な分化細胞より早期の段階にある）、細胞の表現型を有する。始原細胞はまた、顕著な、または極めて高度な、増殖潜在能も有する。始原細胞は、細胞が発生および分化する、発生の経路および環境に応じて、複数の別個の分化細胞型をもたらす場合もあり、単一の分化細胞型をもたらす場合もある。
【０４００】
細胞の個体発生の文脈では、「分化した」または「〜を分化させること」という形容詞は、相対的な用語である。「分化細胞」とは、比較する細胞より、発生経路をさらに下に進んだ細胞である。したがって、幹細胞は、系統制限前駆体細胞（lineage-restricted  precursor  cell）（筋細胞の前駆細胞など）へと分化することが可能であり、これは、経路をさらに下った、他の種類の前駆体細胞（筋細胞の前駆体細胞など）へと分化することが可能であり、次いで、筋細胞など、最終段階の分化細胞へと分化し、ある特定の組織型において、特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持する場合もあり、保持しない場合もある。
【０４０１】
編集されたヒト細胞
【０４０２】
ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための方法が、本明細書に提示される。ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するためのｇＲＮＡが、本明細書に提示される。
【０４０３】
本明細書に開示されるこれらの方法および／またはｇＲＮＡは、ヒト細胞集団を編集するために使用することができる。患者を処置する際に使用するのに十分な細胞集団内のいくつかのヒト細胞が、編集され得る。例えば、細胞集団内のヒト細胞の９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％が、編集され得、患者を処置するために使用するのに十分であり得る。他の例では、細胞集団内のヒト細胞の４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、または０．５％が、編集され得、患者を処置するために使用するのに十分であり得る。様々な例では、編集されたヒト細胞は、まず、選択して培養し、患者へと投与する前に、編集した細胞の数を増やすことができる。
【０４０４】
人工多能性幹細胞
【０４０５】
本明細書で記載される、遺伝子操作されたヒト細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）でありうる。ｉＰＳＣを使用する利点は、細胞を、始原細胞が投与される同じ対象から導出しうることである。すなわち、体細胞は、対象から得、人工多能性幹細胞へと再プログラム化し、次いで、対象へと投与するように、始原細胞へと再分化させることができる（例えば、自家細胞）。始原細胞は、自家供給源から本質的に導出されるため、別の対象または対象群に由来する細胞の使用と比較して、生着拒絶またはアレルギー応答の危険性を低減することができる。加えて、ｉＰＳＣの使用は、胚供給源から得られた細胞に対する必要も無化する。したがって、一態様では、開示される方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
【０４０６】
分化は、生理学的文脈では、一般に、不可逆的であるが、体細胞を、ｉＰＳＣへと再プログラム化するためのいくつかの方法が最近開発されている。当業者には、例示的な方法が公知であり、本明細書の下記で略述する。
【０４０７】
「〜を再プログラム化すること」という用語は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変更するまたは逆行させ工程を指す。言い換えると、再プログラム化することとは、細胞の分化を、より未分化なまたはより始原的な細胞型へと戻すように駆動する工程を指す。多くの初代細胞を培養することは、完全な分化特徴の、何らかの喪失をもたらしうることに留意されたい。したがって、分化細胞という用語に含まれるこのような細胞を単に培養するだけで、これらの細胞が、非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞となるわけではない。分化細胞から多能性への移行は、培養物中で分化的性格の部分的な喪失をもたらす刺激を越えた、再プログラム化刺激を要求する。再プログラム化細胞はまた、培養物中では一般に、回数の限定された分裂能だけを有する初代親細胞と比べて、増殖可能性の喪失を伴わない、拡大継代能の特徴も有する。
【０４０８】
再プログラム化されるべき細胞は、再プログラム化する前に、部分分化している場合もあり、最終分化している場合もある。再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、多能性状態または複能性状態への完全な逆行を包含しうる。再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全なまたは部分的な逆行を包含しうる。再プログラム化は、細胞による特定の遺伝子であって、その発現が、再プログラム化にさらに寄与する遺伝子の発現をもたらしうる。本明細書で記載されるある特定の例では、分化細胞（例えば、体細胞）の再プログラム化は、分化細胞に、未分化状態を取らせうる（例えば、分化細胞を、未分化細胞としうる）。結果として得られる細胞を、「再プログラム化細胞」または「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）」と称する。
【０４０９】
再プログラム化は、細胞の分化の間に生じる遺伝パターンであって、核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、後成的変化、ゲノムインプリンティングなどの遺伝性パターンの少なくとも一部の変更、例えば、逆行を伴いうる。再プログラム化は、既に多能性である細胞の、既存の未分化状態を単に維持すること、または既に複能性細胞（例えば、筋原性幹細胞）である細胞の、既存の完全未満の分化状態を維持することとは別個である。再プログラム化はまた、既に多能性または複能性である細胞の自己再生または増殖の促進とも別個であるが、一部の例では、本明細書で記載される組成物および方法はまた、このような目的でも有用でありうる。
【０４１０】
当技術分野では、体細胞から多能性幹細胞を作出するのに使用しうる多くの方法が公知である。体細胞を、多能性表現型へと再プログラム化する、任意のこのような方法が、本明細書で記載される方法における使用に適切であろう。
【０４１１】
転写因子の規定された組合せを使用して、多能性細胞を作出するための再プログラム化法については記載されている。Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの直接的な形質導入により、マウス体細胞を、発生の潜在能を拡大した、ＥＳ細胞様細胞へと転換することができる（例えば、TakahashiおよびYamanaka、Cell、１２６巻（４号）：６６３〜７６頁（２００６年）を参照されたい）。ｉＰＳＣは、多能性関連の転写回路およびエピジェネティックランドスケープの大半を修復するので、ＥＳ細胞に似ている。加えて、マウスｉＰＳＣは、多能性についての全ての標準的アッセイ：具体的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、三胚葉の細胞型への分化、奇形腫の形成、キメラへの寄与、生殖細胞系列伝達［例えば、MaheraliおよびHochedlinger、Cell  Stem  Cell、３巻（６号）：５９５〜６０５頁（２００８年）を参照されたい］、および四倍体補完法を満たす。
【０４１２】
ヒトｉＰＳＣは、同様の形質導入方法を使用して得ることができ、転写因子のトリオである、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＮＡＮＯＧが、多能性を支配する転写因子のコアセットとして確立されている。例えば、Budniatzky  and  Gepstein,  Stem  Cells  Transl  Med.  3(4):448-57  (2014)、Barrett  et  al.,  Stem  Cells  Trans  Med  3:1-6  sctm.2014-0121  (2014)、Focosi  et  al.,  Blood  Cancer  Journal  4:  e211  (2014)を参照されたい。ｉＰＳＣの作製は、従来通りにウイルスベクターを使用して、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸配列を、成体の体細胞へと導入することにより達成することができる。
【０４１３】
ｉＰＳＣは、最終分化した体細胞から生成または得ることができるほか、成体幹細胞または体細胞性幹細胞から生成または得ることもできる。すなわち、非多能性前駆細胞を、再プログラム化することにより、多能性または複能性とすることができる。このような事例では、最終分化細胞を再プログラム化するのに要求されるほど多くの再プログラム化因子を含むことが必要ではない場合がある。さらに、再プログラム化は、再プログラム化因子の非ウイルス的導入により誘導することができ、例えば、タンパク質自体を導入することにより、または再プログラム化因子をコードする核酸を導入することにより、または翻訳の際に再プログラム化因子をもたらすメッセンジャーＲＮＡを導入することにより誘導することができる（例えば、Warren  et  al.,  Cell  Stem  Cell,  7(5):618-30  (2010)を参照されたい。再プログラム化は、例えば、Ｏｃｔ−４（Ｏｃｔ−３／４またはＰｏｕｆ５１としてもまた公知）、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、およびＬＩＮ２８を含む幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組合せを導入することにより達成することができる。本明細書に記載される方法および組成物を使用する再プログラム化は、Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘファミリーのメンバー、Ｋｌｆファミリーのメンバー、およびＭｙｃファミリーのメンバーのうちの１つまたは複数を、体細胞へと導入することをさらに含み得る。本明細書に記載される方法および組成物は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ−ＭＹＣ、およびＫｌｆ４のそれぞれのうちの１つまたは複数を、再プログラム化のために導入することをさらに含み得る。上記で言及した通り、再プログラム化のために使用される正確な方法は、本明細書に記載される方法および組成物にとって、必ずしも不可欠なわけではない。しかしながら、再プログラム化細胞から分化させた細胞を、例えば、ヒト治療において使用しようとする場合、一態様では、再プログラム化は、ゲノムを変更する方法によりなされるわけではない。したがって、このような例では、再プログラム化は、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを使用せずに達成することができる。
【０４１４】
出発細胞集団から導出される再プログラム化の効率（すなわち、再プログラム化細胞の数）は、Shiら、Cell-Stem  Cell、２巻：５２５〜５２８頁（２００８年）；Huangfuら、Nature  Biotechnology、２６巻（７号）：７９５〜７９７頁（２００８年）；およびMarsonら、Cell-Stem  Cell、３巻：１３２〜１３５頁（２００８年）により示される通り、多様な薬剤、例えば、低分子の添加により増強することができる。したがって、人工多能性幹細胞作製の効率または速度を増強する薬剤または薬剤の組合せを、患者特異的または疾患特異的ｉＰＳＣの作製において使用することができる。再プログラム化効率を増強する薬剤の一部の非限定的な例は、とりわけ、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ馴化培地、ＢＩＸ−０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５’−アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、およびトリコスタチン（ＴＳＡ）を含む。
【０４１５】
再プログラム化増強剤の他の非限定的な例は、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えば、ＭＫ０６８３、ボリノスタット）および他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ−２１０、Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ（例えば、（−）−Ｄｅｐｕｄｅｃｉｎ）、ＨＣトキシン、Ｎｕｌｌｓｃｒｉｐｔ（４−（１，３−ジオキソ−１Ｈ，３Ｈ−ベンゾ［デ］イソキノリン−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシブタンアミド）、フェニルブチレート（例えば、フェニル酪酸ナトリウムおよびバルプロ酸（ＶＰＡ）および他の短鎖脂肪酸）、Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、酪酸ナトリウム、酪酸ピバロイルオキシメチル（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ−９）、Ｔｒａｐｏｘｉｎ  Ｂ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としてもまた公知である）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ−９９４（例えば、Ｎ−アセチルジナリン）およびＭＳ−２７−２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４、ＣＢＨＡ（ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、Ｔｕｂａｃｉｎ、Ａ−１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ（例えば、６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロンヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１、およびＣＨＡＰ５０を含む。他の再プログラム化増強剤は、例えば、ＨＤＡＣのドミナントネガティブ形態（例えば、触媒不活性形態）、ｓｉＲＮＡによるＨＤＡＣ阻害剤、およびＨＤＡＣに特異的に結合する抗体を含む。このような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔｉｔａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、およびＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
【０４１６】
本明細書に記載される方法による使用のための多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離されたクローンを、幹細胞マーカーの発現について調べることができる。体細胞に由来する細胞内のこのような発現により、細胞を、人工多能性幹細胞として同定する。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔｌ、Ｅｓｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘｌ、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘｌ、Ｕｔｆｌ、およびＮａｔｌを含む非限定的な群から選択することができる。１つの場合には、例えば、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現する細胞は、多能性であると同定される。このようなマーカーの発現を検出するための方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、およびウエスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析など、コードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法を含み得る。検出は、ＲＴ−ＰＣＲを含み得るだけでなく、タンパク質マーカーの検出も含み得る。細胞内マーカーは、ＲＴ−ＰＣＲ、または免疫細胞化学などのタンパク質検出法を介して、最も良好に同定され得、一方で細胞表面マーカーは、例えば、免疫細胞化学によって容易に同定される。
【０４１７】
単離された細胞の多能性幹細胞性は、ｉＰＳＣが、三胚葉の各々の細胞へと分化する能力について査定する試験により確認することができる。一例として述べると、ヌードマウスにおける奇形腫形成を使用して、単離されたクローンの多能性について査定することができる。細胞を、ヌードマウスへと導入し、細胞から生じる腫瘍に対して、組織学および／または免疫組織化学を実施することができる。三胚葉全てに由来する細胞を含む腫瘍の増殖は、例えば、細胞が多能性幹細胞であることをさらに指し示す。
【０４１８】
網膜前駆細胞および光受容細胞
【０４１９】
一部の例では、本明細書に記載される遺伝子操作されたヒト細胞は、光受容細胞または網膜前駆細胞（ＲＰＣ）である。ＲＰＣは、網膜の６つ全てのニューロンならびにミューラーグリアをもたらし得る、複能性前駆細胞である。ミューラーグリアは、網膜膠細胞の一種であり、網膜の主要な膠細胞構成要素である。それらの機能は、網膜のニューロンを補助すること、ならびに網膜の恒常性および完全性を維持することである。成体ヒト網膜から単離されたミューラーグリアは、桿体光受容器に分化することが示されている。パッチクランプ記録によるそのようなミューラーグリアに由来する光受容器の機能的特徴付けにより、それらの電気的特性が、成体桿体に匹敵することが明らかとなった（Giannelli  et  al.,  2011,  Stem  Cells,  (2):344-56）。ＲＰＣは、網膜形成の間に、徐々に、系統制限前駆体細胞へと特化し、その後、最終分化したニューロンまたはミューラーグリア（Mueller  glia）へと成熟する。胎児由来のヒト網膜前駆細胞（ｈＲＰＣ）は、最大で６回目の継代まで、網膜前駆細胞状態の指標である分子特徴を呈する。それらは、継代１回目から６回目まで、ＫＩ６７、ＳＯＸ２、およびビメンチン陽性細胞の割合の漸減を示し、一方で、ネスチンおよびＰＡＸ６の発現の持続は、継代６回目まで見られる。継代１回目のｈＲＰＣのマイクロアレイ分析は、初期網膜発生遺伝子：ＶＩＭ（ビメンチン）、ＫＩ６７、ＮＥＳ（ネスチン）、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、ＨＥＳ５、ＧＮＬ３、ＯＴＸ２、ＤＡＣＨ１、ＳＩＸ６、およびＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）の発現を示す。ｈＲＰＣは、本質的に機能性であり、興奮性神経伝達物質に応答する（Schmitt  et  al.,  2009,  Investigative  Ophthalmology  and  Visual  Sciences.  2009;50(12):5901-8）。網膜の最も外側の領域は、補助的な網膜色素上皮（ＲＰＥ）層を含み、これは、栄養を輸送し、脱落した光受容器部分を再利用することによって、光受容器の健康状態を維持する。ＲＰＥは、脈絡膜と網膜との間の界面にある細胞外マトリックス構造体であるブルッフ膜に結合している。眼の内部へ向かって内側に移動し、ＲＰＥの反対側には、ニューロンの３つの層がある：光を感知する桿体および錐体光受容器、ニューロンをつなぐ中間層（アマクリン、双極細胞および水平細胞）、ならびに最も内側の神経節細胞の層、これは、光受容器層を起源とするシグナルを、視神経を通じて脳へと伝達する。一部の態様では、本明細書に記載される遺伝子操作されたヒト細胞は、光受容細胞であり、これは、網膜において見られる特化した種類のニューロンである。光受容器は、光を、生物学的プロセスを刺激することができるシグナルに変換し、視覚を担う。桿体および錐体は、視覚系への情報に寄与する、２つの古典的な光受容細胞である。
【０４２０】
網膜前駆細胞および光受容細胞の単離
【０４２１】
前駆細胞を含め、網膜細胞は、当技術分野において公知の任意の方法に従って、単離することができる。例えば、ヒト網膜細胞は、新しい外科手術標本から単離される。網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、組織を、ＩＶ型コラゲナーゼで消化させることによって、脈絡膜から分離させ、網膜色素上皮パッチを、培養する。外植片から１００〜５００個の細胞の増殖後に、初代培養物を、継代させ（Ishida  M.  et  al.,  Current  Eye  Research  1998;  17(4):392-402）、ＲＰＥマーカーの発現について特徴付ける。桿体は、パパインを使用して、生検網膜の破壊によって単離される。激しい破壊を回避し、細胞収率を改善するために、予防措置を講じる。単離した細胞を選別して、純粋な桿体細胞の集団を得、免疫染色によって、さらに特徴付ける（Feodorova  et  al.,  MethodsX  2015;  2:39-46）。
【０４２２】
錐体を単離するために、神経網膜を同定し、切り出し、１０％ゼラチン上に置く。内部網膜層を、レーザーを使用して単離する。単離した錐体単層を、１８時間培養し、光学顕微鏡法および透過電子顕微鏡法によって、未処理の網膜と比較して、任意の構造的損傷を調べる。細胞を、錐体特異的マーカーの発現について特徴付ける（Salchow  et  al.,  Current  Eye  Research  2001;22）。
【０４２３】
網膜前駆細胞を単離するために、生検網膜を、二重メス（dual  scalpel）で細かく刻み、インキュベーターにおいて３７℃で酵素消化させる。消化した細胞の上清を、遠心分離し、細胞を、無細胞網膜前駆細胞条件培地に再懸濁する。細胞を、新しい培地を含有する、フィブロネクチンをコーティングした組織培養フラスコへと移し、培養する（Klassen  et  al.,  Journal  of  Neuroscience  Research  2004;  77:334-343）。
【０４２４】
患者特異的なｉＰＳＣの創出
【０４２５】
本開示のｅｘ  ｖｉｖｏ方法の１つのステップは、患者特異的な１つのｉＰＳ細胞、患者特異的な複数のｉＰＳ細胞、または患者特異的なｉＰＳ細胞株を創出することを含み得る。TakahashiおよびYamanaka、２００６年；Takahashi、Tanabeら、２００７年において記載されている通り、当技術分野では、患者特異的なｉＰＳ細胞を創出するための多くの方法が確立されている。例えば、創出するステップは、ａ）体細胞、例えば、皮膚細胞または線維芽細胞を、患者から単離すること、およびｂ）多能性幹細胞となるように細胞を誘導するために、多能性関連遺伝子のセットを、体細胞へと導入することを含み得る。多能性関連遺伝子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ−ＭＹＣ、ｎ−ＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ、およびＬＩＮ２８からなる群から選択される遺伝子のうちの１つまたは複数であり得る。
【０４２６】
患者の骨髄の生検または吸引の実施
【０４２７】
生検または吸引物は、身体から採取される組織または体液の試料である。多数の異なる種類の生検または吸引物が存在する。それらのほぼ全てが、鋭利なツールを使用して、少量の組織を摘出することを含む。生検が、皮膚または他の感受性領域に行われる場合、麻痺させる薬を、最初に適用してもよい。生検または吸引は、当技術分野において公知の方法のうちのいずれかに従って実施され得る。例えば、骨髄吸引の場合、大きな針を使用して、骨盤の骨に進入させ、骨髄を採取する。
【０４２８】
間葉幹細胞の単離
【０４２９】
間葉幹細胞は、当技術分野において公知の任意の方法に従って、患者の骨髄または末梢血などから単離することができる。例えば、骨髄吸引物を、ヘパリンを有するシリンジに採取してもよい。細胞を、洗浄し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）密度勾配において遠心分離してもよい。細胞、例えば、血液細胞、肝臓細胞、間質細胞、マクロファージ、マスト細胞、および胸腺細胞を、密度勾配遠心分離培地、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）を使用して、分離してもよい。細胞を、次いで、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）において培養してもよい（Pittinger  MF,  Mackay  AM,  Beck  SC  et  al.,  Science  1999;  284:143-147）。
【０４３０】
ゲノム編集したｉＰＳＣの、他の細胞型への分化
【０４３１】
本開示のｅｘ  ｖｉｖｏ方法の別のステップは、ゲノム編集したｉＰＳＣを、光受容細胞または網膜前駆細胞へと分化させることを含み得る。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。例えば、ｉＰＳＣを使用して、当技術分野において説明されているように、網膜オルガノイド（retinal  organioid）および光受容器を生成することができる（Phillips  et  al.,  Stem  Cells,  June  2014,  32(6):  pgs.  1480-1492、Zhong  et  al.  Nat.  Commun.,  2014,  5:  pg  4047、Tucker  et  al.,  PLoS  One,  April  2011,  6(4):  e18992）。例えば、ｈｉＰＳＣを、Ｗｎｔ、Ｎｏｄａｌ、およびＮｏｔｃｈ経路阻害剤（Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｋ１、ＬｅｆｔｙＡ、およびＤＡＰＴ）、ならびに他の成長因子を含む、様々な処理を使用して、網膜前駆細胞へと分化させる。網膜前駆細胞を、光受容細胞へとさらに分化させるが、処理には、共培養系、ＲＸ＋もしくはＭｉｔｆ＋においてナイーブ網膜細胞に曝露し、続いて、レチノイン酸およびタウリンで処理すること、またはＮｏｇｇｉｎ、Ｄｋｋ１、ＤＡＰＴ、およびインスリン様成長因子を含む、いくつかの外因性因子に曝露することが含まれる（Yang  et  al.,  Stem  Cells  International  2016）。
【０４３２】
ゲノム編集した間葉幹細胞の、光受容細胞または網膜前駆細胞への分化
【０４３３】
本開示のｅｘ  ｖｉｖｏ方法の別のステップは、ゲノム編集した間葉幹細胞を、光受容細胞または網膜前駆細胞へと分化させることを含み得る。分化させるステップは、当技術分野において公知の任意の方法に従って実施することができる。
【０４３４】
細胞の、患者への埋め込み
【０４３５】
本開示のｅｘ  ｖｉｖｏ方法の別のステップは、光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと埋め込むことを含み得る。この埋め込むステップは、当技術分野で公知の任意の埋め込み方法を使用して、達成することができる。例えば、遺伝子改変細胞を、患者の血液に直接注射してもよく、またはそうでなければ、患者に投与してもよい。
【０４３６】
本発明のｅｘ  ｖｉｖｏ方法の別のステップは、光受容細胞または網膜前駆細胞を、患者へと埋め込むことを含む。この埋め込むステップは、当技術分野で公知の任意の埋め込み方法を使用して、達成することができる。例えば、遺伝子改変細胞を、患者の眼に直接注射してもよく、またはそうでなければ、患者に投与してもよい。
【０４３７】
遺伝子改変細胞
【０４３８】
「遺伝子改変細胞」という用語は、ゲノム編集によって（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１系を使用して）導入された少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞を指す。本明細書における一部のｅｘ  ｖｉｖｏでの例では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変された前駆細胞であり得る。本明細書における一部のｉｎ  ｖｉｖｏでの例では、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変された光受容細胞または網膜前駆細胞であり得る。外因性ゲノムターゲティング核酸および／またはゲノムターゲティング核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝子改変細胞が、本明細書において想定される。
【０４３９】
「対照で処置された集団」という用語は、ゲノム編集の構成要素の付加を除き、同一な培地、ウイルスによる誘導、核酸配列、温度、コンフルエンシー、フラスコサイズ、ｐＨなどで処置された細胞の集団について記載する。当技術分野において公知の任意の方法、例えば、アシェリンタンパク質のウエスタンブロット分析、またはＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡを定量するためのリアルタイムＰＣＲを使用して、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の回復またはアシェリンタンパク質の発現もしくは活性を測定することができる。
【０４４０】
「単離細胞」という用語は、それが元来見出される生物から取り出された細胞、またはこのような細胞の子孫を指す。任意選択で、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、規定された条件下、または他の細胞の存在下で培養することができる。任意選択で、細胞は、後に、第２の生物へと導入することもでき、それが単離された生物（またはそれを子孫とする細胞）へと再導入することもできる。
【０４４１】
細胞の単離集団に関する「単離集団」という用語は、混合細胞集団または異質細胞集団から、取り出され、分離された細胞集団を指す。場合によって、単離集団は、細胞がそこから単離されるかまたは濃縮された異質集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団でありうる。場合によって、単離集団は、ヒト始原細胞の単離集団、例えば、ヒト始原細胞と、ヒト始原細胞がそこから導出された細胞とを含む異質細胞集団と比較して、実質的に純粋なヒト始原細胞の集団でありうる。
【０４４２】
特定の細胞集団に関する、「実質的に増強された」という用語は、特定の種類の細胞の発生が、例えば、２Ａ型アッシャー症候群を改善するための、このような細胞の所望のレベルに応じて、既存のまたは基準レベルと比べて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍、またはこれを超える倍数だけ増加する細胞集団を指す。
【０４４３】
特定の細胞集団に関する「実質的に濃縮された」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に照らして、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、またはこれを超える細胞集団を指す。
【０４４４】
特定の細胞集団に関する「実質的に純粋」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。すなわち、前駆細胞集団に関して、「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、本明細書の用語により規定される前駆細胞ではない細胞を、約２０％未満、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満含有する細胞集団を指す。
【０４４５】
送達
【０４４６】
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）および／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、当技術分野で公知のウイルス性または非ウイルス性の送達媒体によって送達することができる。代替的に、エンドヌクレアーゼポリペプチドは、当技術分野で公知のウイルス性または非ウイルス性送達媒体によって、例えば、電気穿孔もしくは脂質ナノ粒子によって、送達することができる。さらに代替的な態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１つまたは複数のポリペプチドとして単独で送達するか、または１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、もしくはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つもしくは複数のｃｒＲＮＡとあらかじめ複合体化させた、１つまたは複数のポリペプチドとして送達することができる。
【０４４７】
ポリヌクレオチドは、ナノ粒子、リポソーム、リボヌクレオタンパク質、正に帯電させたペプチド、低分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー−ＲＮＡキメラ、およびＲＮＡ−融合タンパク質複合体を含むがこれらに限定されない、非ウイルス性送達媒体により送達することができる。一部の例示的な非ウイルス性送達媒体については、Peer  and  Lieberman,  Gene  Therapy,  18:  1127-1133  (2011)（これは、他のポリヌクレオチドの送達にもまた有用な、ｓｉＲＮＡのための非ウイルス性送達媒体に焦点を当てている）において記載されている。
【０４４８】
ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、およびエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）により、細胞または患者へと送達することができる。
【０４４９】
ＬＮＰは、１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍの直径を有する任意の粒子を指す。代替的に、ナノ粒子は、１〜１０００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜２５０ｎｍ、２５〜２００ｎｍ、２５〜１００ｎｍ、３５〜７５ｎｍ、または２５〜６０ｎｍのサイズの範囲であり得る。
【０４５０】
ＬＮＰは、カチオン性脂質から作製することもでき、アニオン性脂質から作製することもでき、中性脂質から作製することもできる。融合性リン脂質であるＤＯＰＥまたは膜成分であるコレステロールなどの中性脂質を、トランスフェクション活性およびナノ粒子安定性を増強する「ヘルパー脂質」として、ＬＮＰ中に組み入れることができる。カチオン性脂質の限界は、低い安定性および急速なクリアランスに起因する低い効能ならびに炎症性または抗炎症性応答の発生を含む。
【０４５１】
ＬＮＰはまた、疎水性脂質から構成される場合もあり、親水性脂質から構成される場合もあり、疎水性脂質および親水性脂質の両方から構成される場合もある。
【０４５２】
当技術分野で公知の、任意の脂質または脂質の組合せを使用して、ＬＮＰを作製することができる。ＬＮＰを作製するのに使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ−コレステロール、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ−ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ−ＤＯＰＥ−ＤＭＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭである。ＰＥＧで修飾された脂質の例は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０である。
【０４５３】
脂質を、任意の数のモル比で組み合わせて、ＬＮＰを作製することができる。加えて、ポリヌクレオチド（複数可）を、脂質（複数可）と、広範にわたるモル比で組み合わせて、ＬＮＰを作製することができる。
【０４５４】
既に明示した通り、部位特異的ポリペプチドおよびゲノムターゲティング核酸は、それぞれ、細胞または患者へと、別個に投与することができる。他方、部位特異的ポリペプチドは、１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと、あらかじめ複合体化させることができる。次いで、あらかじめ複合体化させた材料を、細胞または患者へと投与することができる。このようなあらかじめ複合体化させた材料は、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。
【０４５５】
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡとの特異的相互作用を形成することが可能である。この特性は、多くの生物学的プロセスで利用されているが、核酸に富む細胞内環境における、無差別的な相互作用の危険性とも隣り合わせである。この問題に対する１つの解決法は、ＲＮＡを、エンドヌクレアーゼと、あらかじめ複合体化させる、リボヌクレオタンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成である。ＲＮＰの別の利点は、ＲＮＡの、分解からの保護である。
【０４５６】
ＲＮＰ内のエンドヌクレアーゼは、修飾することもでき、非修飾とすることもできる。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡは、修飾することもでき、非修飾とすることもできる。当技術分野では、多数の修飾が公知であり、使用することができる。
【０４５７】
エンドヌクレアーゼとｓｇＲＮＡとは、一般に、１：１のモル比で組み合わせることができる。代替的に、エンドヌクレアーゼと、ｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとは、一般に、１：１：１のモル比で組み合わせることができる。しかし、広範にわたるモル比を使用して、ＲＮＰを作製することができる。
【０４５８】
ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）
【０４５９】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、送達のために使用することができる。当技術分野では、パッケージされるＡＡＶゲノムであって、送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能を含むＡＡＶゲノムを、細胞へともたらす、ｒＡＡＶ粒子を作製する技法が標準的である。ｒＡＡＶの作製は典型的に、以下の構成要素：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個の（すなわち、ｒＡＡＶゲノム内には存在しない）ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一の細胞（本明細書では、パッケージング細胞として表す）内に存在することを要求する。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る、任意のＡＡＶ血清型に由来し得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型であって、本明細書中に記載されるＡＡＶ血清型を含むがこれらに限定されないＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの作製については、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ  ０１／８３６９２号に開示されている。
【０４６０】
ＡＡＶ血清型
【０４６１】
本開示の組成物をコードするポリヌクレオチド、例えば、本開示のエンドヌクレアーゼ、ドナー配列、またはＲＮＡガイド分子をパッケージングするＡＡＶ粒子は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含み得るか、またはそれに由来し得る。本開示によると、ＡＡＶ粒子は、以下のＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ１−７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１−８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２−１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２−３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２−４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２−５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ−２−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３−１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ３−９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−ａａ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ４−８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−８／ｒｈ．６４、ＡＡＶ４−９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５−２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ５−３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−８ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ−ｈ、ＡＡＶＨ−１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ−５／ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．ｔ  １９、ＡＡＶＬＧ−１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１−８／ｒｈ．４３、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、���ＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ｒ５３３Ａ変異体、ＢＡＡＶ、ＢＮＰ６１  ＡＡＶ、ＢＮＰ６２  ＡＡＶ、ＢＮＰ６３  ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、日本ＡＡＶ  １０、真型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ  ＡＡＶ  １０、ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶシャッフル１００−１、ＡＡＶシャッフル１００−２、ＡＡＶシャッフル１００−３、ＡＡＶシャッフル１００−７、ＡＡＶシャッフル１０−２、ＡＡＶシャッフル１０−６、ＡＡＶシャッフル１０−８、ＡＡＶ  ＳＭ  １００−１０、ＡＡＶ  ＳＭ  １００−３、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−１、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−２、および／またはＡＡＶ  ＳＭ  １０−８を含むがこれらに限定されない、血清型のうちのいずれかおよびそれらのバリアントから選択される血清型を利用し得るか、またはそれに基づき得る。
【０４６２】
一部の例では、ＡＡＶ血清型は、N  Pulicherla  et  al.  (Molecular  Therapy  19(6):1070-1078  (2011)によって説明されるように、ＡＡＶ９配列における変異、例えば、限定されないが、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４であり得るか、またはそれを有し得る。
【０４６３】
一部の例では、ＡＡＶ血清型は、米国特許第６１５６３０３号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＡＡＶ３Ｂ（ＵＳ  ６１５６３０３の配列番号１および１０）、ＡＡＶ６（ＵＳ  ６１５６３０３の配列番号２、７、および１１）、ＡＡＶ２（ＵＳ  ６１５６３０３の配列番号３および８）、ＡＡＶ３Ａ（ＵＳ  ６１５６３０３の配列番号４および９）、またはこれらの誘導体であり得るか、またはそれを有し得る。
【０４６４】
一部の例では、血清型は、Grimm  et  al.  (Journal  of  Virology  82(12):  5887-5911  (2008))によって説明されるように、ＡＡＶＤＪまたはそのバリアント、例えば、ＡＡＶＤＪ８（またはＡＡＶ−ＤＪ８）であり得る。ＡＡＶＤＪ８のアミノ酸配列は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために、２つまたはそれよりも多くの変異を含み得る。非限定的な例として、米国特許第７，５８８，７７２号において配列番号１として記載されるＡＡＶ−ＤＪ配列は、２つの変異：（１）アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）へと変化する、Ｒ５８７Ｑ、および（２）アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）へと変化する、Ｒ５９０Ｔを含み得る。別の非限定的な例としては、３つの変異：（１）アミノ酸４０６におけるリシン（Ｋ、Ｌｙｓ）が、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）へと変化する、Ｋ４０６Ｒ、（２）アミノ酸５８７におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）へと変化する、Ｒ５８７Ｑ、および（３）アミノ酸５９０におけるアルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）が、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）へと変化する、Ｒ５９０Ｔを含み得る。
【０４６５】
一部の例では、ＡＡＶ血清型は、国際公開第ＷＯ２０１５１２１５０１号に記載される配列、例えば、限定されないが、真型ＡＡＶ（true  type  AAV）（ｔｔＡＡＶ）（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号２）、「ＵＰｅｎｎ  ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号８）、「日本ＡＡＶ１０（Japanese  AAV10）」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号９）、またはこれらのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。
【０４６６】
本開示によると、ＡＡＶキャプシド血清型選択または使用は、様々な種に由来し得る。１つの例では、ＡＡＶは、トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）であり得る。ＡＡＡＶ血清型は、米国特許第９２３８８００号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＡＡＡＶ（ＵＳ  ９，２３８，８００の配列番号１、２、４、６、８、１０、１２、および１４）、またはこれらのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。
【０４６７】
１つの例では、ＡＡＶは、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）であり得る。ＢＡＡＶ血清型は、米国特許第９，１９３，７６９号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＢＡＡＶ（ＵＳ  ９１９３７６９の配列番号１および６）、またはこれらのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。ＢＡＡＶ血清型は、米国特許第ＵＳ７４２７３９６号に記載される配列、例えば、限定されないが、ＢＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号５および６）、またはこれらのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。
【０４６８】
１つの例では、ＡＡＶは、ヤギＡＡＶであり得る。ヤギＡＡＶ血清型は、米国特許第ＵＳ７４２７３９６号に記載される配列、例えば、限定されないが、ヤギＡＡＶ（ＵＳ７４２７３９６の配列番号３）、またはそのバリアントであり得るか、またはそれを有し得る。
【０４６９】
他の例では、ＡＡＶは、２つまたはそれよりも多くの親血清型に由来するハイブリッドＡＡＶとして操作してもよい。１つの例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９に由来する配列を含む、ＡＡＶ２Ｇ９であってもよい。ＡＡＶ２Ｇ９  ＡＡＶ血清型は、米国特許公開第ＵＳ２０１６００１７００５号に記載される配列であり得るか、またはそれを有し得る。
【０４７０】
１つの例では、ＡＡＶは、Pulicherla  et  al.  (Molecular  Therapy  19(6):1070-1078  (2011)によって説明されるように、アミノ酸３９０〜６２７（ＶＰ１番号付け）における変異を有する、ＡＡＶ９キャプシドライブラリーによって生成された血清型であってもよい。血清型ならびに対応するヌクレオチドおよびアミノ酸の置換は、ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ；Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８ＡおよびＴ１４３６Ｘ；Ｖ４７３ＤおよびＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ；Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０ＣおよびＡ１６１７Ｔ；Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ；Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ；Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ；Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ；Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ；Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ；Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ；Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ；Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ；Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ；Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ；Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ；Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ；Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ；Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ；Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ；Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ；Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ；Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ；Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ；Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ；Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（Ｃ１５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ；Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ；Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ；Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ；Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ；Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ；Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ；Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ，；Ｇ４８１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ；Ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ���、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ；Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ；Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ；Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ；Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ；Ｍ５５９Ｌ）およびＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）であり得るが、これらに限定されない。
【０４７１】
１つの例では、ＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、血清型であってもよい。非限定的な例として、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ８であり得る。
【０４７２】
１つの例では、ＡＡＶは、バリアント、例えば、Deverman.  2016.  Nature  Biotechnology.  34(2):  204-209に記載されるＰＨＰ．ＡまたはＰＨＰ．Ｂであってもよい。
【０４７３】
１つの例では、ＡＡＶは、配列番号４６９７〜５２６５および表３に見出されるもののうちのいずれかから選択される血清型であってもよい。
【０４７４】
１つの例では、ＡＡＶは、配列番号４６９７〜５２６５および表３に記載される配列、断片、またはバリアントによってコードされ得る。
【０４７５】
パッケージング細胞を作製する方法は、ＡＡＶ粒子の作製に必要な構成要素の全てを安定に発現する細胞株を作り出すステップを含む。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個のＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびに選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む、プラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Samulski  et  al.,  1982,  Proc.  Natl.  Acad.  S6.  USA,  79:2077-2081）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Laughlin  et  al.,
1983,  Gene,  23:65-73）、または直接の平滑末端ライゲーション（Senapathy  &  Carter,  1984,  J.  Biol.  Chem.,  259:4661-4666）などの手技によって、細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株に、ヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルスを感染させることができる。この方法の利点は、細胞が、選択可能であり、大規模なｒＡＡＶの作製に好適であることである。好適な方法の他の例は、プラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを利用して、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を、パッケージング細胞に導入する。
【０４７６】
ｒＡＡＶ作製の一般原理については、例えば、Carter,  1992,  Current  Opinions  in  Biotechnology,  1533-539;  and  Muzyczka,  1992,  Curr.  Topics  in  Microbial.  and  Immunol.,  158:97-129)において総説されている。様々なアプローチが、Ratschin  et  al.,  Mol.  Cell.  Biol.  4:2072  (1984);  Hermonat  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  81:6466  (1984);  Tratschin  et  al.,  Mo1.  Cell.  Biol.  5:3251  (1985);  McLaughlin  et  al.,  J.  Virol.,  62:1963  (1988);およびLebkowski  et  al.,  1988  Mol.  Cell.  Biol.,  7:349  (1988)に記載されている。Samulski  et  al.  (1989,  J.  Virol.,  63:3822-3828)、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ  ９５／１３３６５および対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ  ９５／１３３９２、ＷＯ  ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ  ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ  ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ  ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ  ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ  ９９／１１７６４、Perrin  et  al.  (1995)  Vaccine  13:1244-1250;  Paul  et  al.  (1993)  Human  Gene  Therapy  4:609-615、Clark  et  al.  (1996)  Gene  Therapy  3:1124-1132、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、ならびに米国特許第６，２５８，５９５号。
【０４７７】
ＡＡＶベクターの血清型は、標的細胞型とマッチさせることができる。例えば、以下の例示的な細胞型には、とりわけ、表示のＡＡＶ血清型を形質導入することができる。
【表３】
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【０４７８】
アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを使用することができる。そのようなウイルスベクターとしては、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パポーバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７９】
一部の場合には、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の１つまたは２つのローカスをターゲティングするｓｇＲＮＡ、およびドナーＤＮＡは、それぞれ、別個に脂質ナノ粒子へと製剤化され得るか、または全てが１つの脂質ナノ粒子へと共製剤化される。
【０４８０】
一部の場合には、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子中に製剤化され得るが、一方でｓｇＲＮＡおよびドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクターで送達され得る。
【０４８１】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として送達する選択肢が、利用可能である。ガイドＲＮＡは、同じＤＮＡから発現されてもよく、またはＲＮＡとして送達されてもよい。ＲＮＡは、その半減期を変更もしくは改善するか、または免疫応答の可能性もしくは程度を減少させるように、化学修飾されていてもよい。エンドヌクレアーゼタンパク質は、送達の前に、ｇＲＮＡと複合体化させてもよい。ウイルスベクターは、効率的な送達を可能にし、Ｃａｓ９の分割バージョンおよびＣａｓ９のより小さいオルソログは、ＨＤＲのドナーで可能なように、ＡＡＶにパッケージすることができる。これらの構成要素のそれぞれを送達することができる、一連の非ウイルス性送達方法もまた、存在し得るか、または非ウイルス性方法およびウイルス性方法を、タンデムで利用してもよい。例えば、ナノ粒子を使用して、タンパク質およびガイドＲＮＡを送達してもよく、一方で、ＡＡＶを使用して、ドナーＤＮＡを送達してもよい。
【０４８２】
レンチウイルス
【０４８３】
一部の態様では、レンチウイルスベクターまたは粒子は、送達媒体として使用され得る。レンチウイルスは、ウイルスのＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙのサブグループである。レンチウイルス粒子は、それらの遺伝子材料を標的／宿主細胞のゲノムへと組み込むことができる。レンチウイルスの例として、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ビスナ・マエディおよびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が挙げられる。ＬＶは、標的細胞のインタクトな核膜を通過するそれらの固有の能力により、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染できる。Greenberg  et  al.,  University  of  Berkeley,  California;  2006）。遺伝子送達媒体を形成するレンチウイルス粒子は、複製欠損であり、ＨＩＶ病原性遺伝子を弱毒化することによって生成される。例えば、遺伝子Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｎｅｆ、ＥｎｖおよびＴａｔは、切り取られて生物学的に安全なベクターが作製される。レンチウイルス媒体、例えばＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２由来のものは、非分裂細胞への導入遺伝子の効率的な送達、組込みおよび長期間の発現を媒介できる。本明細書において使用されるとき、「組換え」という用語は、レンチウイルス配列および非レンチウイルスレトロウイルス配列の両方を含有するベクターまたは他の核酸を指す。
【０４８４】
宿主細胞に感染することができるレンチウイルスを産生するために、３種類のベクターがウイルス産生細胞において共発現される必要がある：目的の導入遺伝子および自己不活性化３’−ＬＴＲ領域を含有する骨格ベクター、ウイルス構造タンパク質を発現する１つの構築物ならびに封入のための水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）をコードする１つのベクター（Naldini,  L.  et  al.,  Science  1996;  272,  263-267）。他の構造遺伝子からのＲｅｖ遺伝子の分離は、逆組換え（reverse  recombination）の可能性を低減することによってバイオセイフティーをさらに増加させる。高力価レンチウイルス粒子を産生するために使用できる細胞株として、２９３Ｔ細胞、２９３ＦＴ細胞および２９３ＳＦ−３Ｆ６細胞が挙げられるが、これらに限定されない（Witting  et  al.,  Human  Gene  Therapy,  2012;  23:  243−249;  Ansorge  et  al.,  Journal  of  Genetic  Medicine,  2009;  11:  868-876）。
【０４８５】
組換えレンチウイルス粒子を生成するための方法は、当技術分野、例えば、ＷＯ２０１３０７６３０９（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３６４５）；ＷＯ２００９１５３５６３（ＰＣＴ／ＧＢ２００９／００１５２７）；米国特許第７，６２９，１５３号および同第６，８０８，９０５号において考察されている。
【０４８６】
光受容体、網膜色素上皮およびガングリオン細胞などの細胞型は、レンチウイルス（ＬＶ）ベクターで良好に標的とされる。光受容体およびガングリオン細胞への送達の効率は、ＬＶベクターよりもＡＡＶで顕著に高い。
【０４８７】
薬学的に許容される担体
【０４８８】
本明細書で想定される、始原細胞を対象へと投与するｅｘ  ｖｉｖｏ方法は、始原細胞を含む治療用組成物の使用を伴う。
【０４８９】
治療用組成物は、細胞組成物と併せた、生理学的に忍容可能な担体と、任意選択で、本明細書で記載される、少なくとも１つのさらなる生体活性薬剤であって、その中に、有効成分として溶解または分散させた生体活性薬剤とを含有しうる。場合によって、治療用組成物は、治療目的で、哺乳動物またはヒト患者へと投与される場合、そうであることが所望されない限りにおいて、実質的に免疫原性ではない。
【０４９０】
一般に、本明細書で記載される始原細胞は、薬学的に許容される担体を伴う懸濁液として投与することができる。当業者は、細胞組成物中で使用される、薬学的に許容される担体は、緩衝剤、化合物、低温保存剤、保存剤、または他の薬剤を、対象へと送達される細胞の生存率に実質的に干渉する量では含まないことを認識する。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性の維持を可能とする浸透圧緩衝剤と、任意選択で、細胞生存率を維持するか、または投与時における生着を増強する栄養物質とを含みうる。このような処方物および懸濁液は、当業者に公知であり、かつ／または規定の実験を使用して、本明細書で記載される始原細胞を伴う使用に適合させることができる。
【０４９１】
細胞組成物はまた、乳化手順が、細胞の生存率に有害な影響を及ぼさないことを条件として、乳化することもでき、リポソーム組成物として提示することもできる。細胞および任意の他の有効成分は、薬学的に許容され、有効成分に対して適合性であり、本明細書で記載される治療法における使用に適する量の賦形剤と混合することができる。
【０４９２】
細胞組成物中に含まれるさらなる薬剤は、その中の成分の薬学的に許容される塩を含みうる。薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される）を含む。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来しうる。
【０４９３】
当技術分野では、生理学的に忍容可能な担体が周知である。例示的な液体担体は、有効成分および水に加えて、材料を含有しないか、または、生理学的ｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理学的生理食塩液、またはリン酸緩衝生理食塩液など、これらの両方などの緩衝剤を含有する滅菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、１つを超える緩衝液塩のほか、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含有しうる。液体組成物はまた、水に加えた液相および水を除く液相も含有しうる。このようなさらなる液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水−油エマルジョンである。特定の障害または状態の処置において有効な細胞組成物中で使用される活性化合物の量は、障害または状態の性格に依存する場合があり、標準的な臨床法により決定することができる。
【０４９４】
ガイドＲＮＡ製剤
【０４９５】
本開示のガイドＲＮＡは、特定の投与方式および剤形に応じて、担体、溶媒、安定化剤、アジュバント、希釈剤など、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することができる。ガイドＲＮＡ組成物は、製剤および投与経路に応じて、生理学的に適合性のｐＨを達成し、約３のｐＨ〜約１１のｐＨ、ｐＨ約３〜ｐＨ約７の範囲となるように製剤化することができる。場合によって、ｐＨは、ｐＨ約５．０〜ｐＨ約８の範囲に調整することができる。場合によって、組成物は、本明細書で記載される、治療有効量の少なくとも１つの化合物を、１または複数の薬学的に許容される賦形剤と併せて含みうる。任意選択で、組成物は、本明細書で記載される化合物の組合せを含む場合もあり、細菌の増殖の処理または防止において有用な、第２の有効成分（例えば、かつ、限定なしに述べると、抗菌剤または抗微生物剤）を含む場合もあり、本開示の試薬の組合せを含む場合もある。
【０４９６】
適切な賦形剤は、例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子など、大型で、ゆっくりと代謝される高分子を含む担体分子を含む。他の例示的な賦形剤は、抗酸化剤（例えば、かつ、限定なしに述べると、アスコルビン酸）、キレート化剤（例えば、かつ、限定なしに述べると、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、かつ、限定なしに述べると、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、およびヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば、かつ、限定なしに述べると、油、水、生理食塩液、グリセロール、およびエタノール）、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを含みうる。
【０４９７】
投与および効能
【０４９８】
所望の効果（複数可）をもたらすような、損傷または修復部位など、所望の部位における、導入された細胞の、少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、細胞、例えば、前駆細胞の、対象への配置の文脈では、「〜を投与すること」、「〜を導入すること」、および「〜を移植すること」という用語は、互換的に使用される。細胞、例えば、前駆細胞、またはそれらの分化した後代を、対象における所望の場所への送達をもたらす、任意の適切な経路により投与することができ、この場合、移植された細胞または細胞の構成要素のうちの少なくとも一部は、依然として生存可能なままである。対象への投与後における細胞生存期間は、数時間、例えば、２４時間という短期から数日間、数年間もの長期、またはさらに患者の生涯、すなわち、長期にわたる生着でありうる。例えば、本明細書で記載される一部の態様では、有効量の光受容細胞または網膜前駆細胞を、腹腔内または静脈内経路などの全身投与経路を介して投与する。
【０４９９】
所望の効果（複数可）をもたらすような、損傷または修復部位など、所望の部位における、導入されたｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよび／またはエンドヌクレアーゼの、少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼの少なくとも１つの、対象への配置の文脈では、「〜を投与すること」、「〜を導入すること」、および「〜を移植すること」という用語は、互換的に使用される。ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡおよび／またはエンドヌクレアーゼは、対象における所望の場所への送達をもたらす、任意の適切な経路により投与することができる。
【０５００】
本明細書では、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語が、互換的に使用され、診断、処置、または治療が所望される任意の対象を指す。一部の態様では、対象は、哺乳動物である。一部の態様では、対象は、ヒトである。
【０５０１】
予防的に提供される場合、本明細書に記載される前駆細胞は、２Ａ型アッシャー症候群の任意の症状に先立って、対象へと投与することができる。したがって、前駆細胞集団の予防的投与は、２Ａ型アッシャー症候群を防止する機能を果たす。
【０５０２】
本明細書に記載される方法に従って投与される前駆細胞集団は、１つまたは複数のドナーから得られた、同種異系前駆細胞を含み得る。そのような前駆細胞は、例えば、肝臓、筋肉、心臓など、任意の細胞または組織起源のものであり得る。「同種異系」とは、同じ種の１つまたは複数の異なるドナーから得られた前駆細胞、または前駆細胞を含む生物学的試料を指し、ここで、１つまたは複数のローカスにおける遺伝子は、同一ではない。例えば、対象へと投与される光受容体または網膜前駆細胞集団は、１つまたは複数の血縁のないドナー対象に由来する場合もあり、１つまたは複数の同一でない兄弟姉妹（sibling
）に由来する場合もある。一部の事例では、遺伝子的に同一な動物または一卵性双生児から得られた集団など、同系前駆細胞集団を使用してもよい。前駆細胞は、自家細胞であってもよい、すなわち、前駆細胞を、対象から得るか、または単離し、同じ対象へと投与する、すなわち、ドナーとレシピエントとが同じである。
【０５０３】
「有効量」という用語は、２Ａ型アッシャー症候群の、少なくとも１つまたは複数の徴候または症状を防止または緩和するのに必要とされる、前駆細胞またはそれらの後代の集団の量を指し、所望の効果を生じる、例えば、２Ａ型アッシャー症候群を有する対象を処置するのに十分な、組成物の量に関する。したがって、「治療有効量」という用語は、典型的な対象、例えば、２Ａ型アッシャー症候群を有するかまたはその危険性がある対象へと投与されると、特定の効果を促進するのに十分な、前駆細胞または前駆細胞を含む組成物の量を指す。有効量はまた、疾患の症状の発生を防止もしくは遅延させるか、疾患の症状の経過を変更する（例えば、疾患の症状の進行を緩徐化させることであるが、これに限定されない）か、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量も含むであろう。任意の所与の事例について、適切な「有効量」とは、日常の実験を使用して、当業者により決定され得ることが理解される。
【０５０４】
本明細書で記載される多様な態様における使用のために、有効量の始原細胞は、始原細胞少なくとも１０２個、始原細胞少なくとも５×１０２個、始原細胞少なくとも１０３個、始原細胞少なくとも５×１０３個、始原細胞少なくとも１０４個、始原細胞少なくとも５×１０４個、始原細胞少なくとも１０５個、始原細胞少なくとも２×１０５個、始原細胞少なくとも３×１０５個、始原細胞少なくとも４×１０５個、始原細胞少なくとも５×１０５個、始原細胞少なくとも６×１０５個、始原細胞少なくとも７×１０５個、始原細胞少なくとも８×１０５個、始原細胞少なくとも９×１０５個、始原細胞少なくとも１×１０６個、始原細胞少なくとも２×１０６個、始原細胞少なくとも３×１０６個、始原細胞少なくとも４×１０６個、始原細胞少なくとも５×１０６個、始原細胞少なくとも６×１０６個、始原細胞少なくとも７×１０６個、始原細胞少なくとも８×１０６個、始原細胞少なくとも９×１０６個、またはこれらの倍数個を含む。始原細胞は、１または複数のドナーから導出することもでき、自家供給源から得ることもできる。本明細書で記載される一部の例では、始原細胞は、それを必要とする対象への投与の前に、培養物中で拡大することができる。
【０５０５】
２Ａ型アッシャー症候群を有する患者の細胞において発現される機能性アシェリンタンパク質のレベルにおけるわずかな増加および漸増は、疾患の１つもしくは複数の症状を軽減するため、長期にわたる生存を増加させるため、および／または他の処置に付随する副作用を低減するために、有益であり得る。そのような細胞をヒト患者へと投与したときに、増加したレベルの機能性アシェリンタンパク質を生じる前駆細胞の存在が、有益である。一部の事例では、対象の有効な処置により、処置される対象における総アシェリンと比べて、少なくとも約３％、５％、または７％の機能性アシェリンタンパク質が生じる。一部の例では、機能性アシェリンは、総アシェリンの少なくとも約１０％である。一部の例では、機能性アシェリンタンパク質は、総アシェリンタンパク質の少なくとも約２０％〜３０％である。同様に、一部の状況では、正常化された細胞は、罹患した細胞と比べて、選択的利点を有するため、機能性アシェリンタンパク質のレベルが有意に上昇した細胞は、比較的限定的な亜集団の導入であっても、様々な患者において、有益であり得る。しかしながら、機能性アシェリンタンパク質のレベルが上昇した前駆細胞は、わずかなレベルであっても、患者における２Ａ型アッシャー症候群の１つまたは複数の側面を改善するのに有益であり得る。一部の例では、そのような細胞が投与された患者における光受容細胞または網膜前駆細胞のうちの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くが、増加したレベルの機能性アシェリンタンパク質を産生している。
【０５０６】
「投与された」とは、所望の部位において、細胞組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、始原細胞組成物の、対象への送達を指す。細胞組成物は、対象において有効な処置をもたらす、任意の適切な経路により、すなわち、対象における所望の位置への送達をもたらす投与であって、送達される組成物のうちの少なくとも一部、すなわち、細胞少なくとも１×１０４個を、所望の部位へと、ある期間にわたり送達する投与により投与することができる。
【０５０７】
本方法の一態様では、医薬組成物は、腸内（腸に）、胃腸内、硬膜外（硬膜に）、経口（口を経由して）、経皮、硬膜上、脳内（大脳に）、脳室内（脳室に）、皮膚上（皮膚の上への適用）、皮内（皮膚そのものに）、皮下（皮膚の下に）、経鼻投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈に）、静脈内ボーラス、静脈内滴注、動脈内（動脈に）、筋肉内（筋肉に）、心臓内（心臓に）、骨内注入（骨髄に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、空洞内注射（病理学的腔に）、腔内（陰茎の基底部に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分配のための無傷な皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、経膣、吹送（吸飲）、舌下、口唇下、浣腸、点眼（結膜上）、点耳、耳介（耳にまたは耳を経由して）、頬側（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯科的（単数または複数の歯に）、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内部）、仙骨内（馬尾内部）、脳槽内（小脳延髄大槽（cisterna  magna  cerebellomedularis）内部）、角膜内（角膜内部）、歯冠内（dental  intracornal）、冠内（冠動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体（corporus  cavernosa）の膨張性空隙内
）、椎間板内（椎間板内部）、腺管内（腺の管内部）、十二指腸内（十二指腸内部）、硬膜内（硬膜内部またはその下に）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内部）、歯肉内（歯肉内部）、回腸内（小腸遠位部分内部）、病巣内（局在化した病変部の内部またはそこへの直接の導入）、管腔内（管腔内部）、リンパ管内（リンパ内部）、髄内（骨の骨髄腔内部）、髄膜内（髄膜内部）、心筋内（心筋内部）、眼内（眼内部）、卵巣内（卵巣内部）、心膜内（心膜内部）、胸膜内（胸膜内部）、前立腺内（前立腺内部）、肺内（肺またはその気管支内部）、洞内（intrasinal）（副鼻腔または眼窩周囲腔内部）、脊髄内（脊柱内部）、滑膜内（関節の滑膜腔内部）、腱内（腱内部）、精巣内（精巣内部）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液内部）、胸郭内（胸郭内部）、小管内（器官の細管内部）、腫瘍内（腫瘍内部）、鼓室内（中耳内部）、血管内（単数または複数の血管内部）、脳室内（脳室内部）、イオン導入（可溶性塩のイオンが身体の組織に移動する電流のよって）、灌注（irrigation）（開放創傷部または体腔を浸すかまたは洗い流すため）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻を通じて胃内に）、閉塞包帯技法（後で領域を閉鎖する包帯剤によって被覆する局所経路の投与）、眼部（外眼部に）、口腔咽頭（口および咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所的または全身的な効果のための経口または経鼻吸入により気道内部へ）、眼球後（橋（pons）背後または眼球背後）、心筋内（心筋に入る）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通じてまたはそれを越えて）、経気管（気管壁を通じて）、経鼓膜（鼓室を越えてまたはそれを通じて）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス、ならびに脊髄などであるがこれらに限定されない経路を介して、投与され得る。
【０５０８】
投与方式は、注射、注入、点滴、および／または内服を含む。「注射」は、限定せずに述べると、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、心室内、関節包内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、網膜下、くも膜下、脊髄内注、脳脊髄内、ならびに胸骨内（intrasternal）注射および注入を含む。一部の例では、経路は静脈内である。細胞を送達するためには、注射または注入による投与を行うことができる。ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９、およびドナー鋳型の送達について、投与は、網膜下腔への注射によって、光受容器に近接してなされ得る。
【０５０９】
細胞は、全身投与されうる。「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」、および「末梢投与された」という語句は、始原細胞の集団の、標的部位、組織、または臓器への直接投与以外の投与であって、代わりに、それが、対象の循環系に入り、したがって、代謝および他の同様の過程下に置かれるような投与を指す。
【０５１０】
当業者は、２Ａ型アッシャー症候群を処置するための組成物を含む処置の効能を決定しうる。しかし、ごく一例として述べると、機能性アシェリンのレベルの徴候または症状の任意の１つまたは全てが、有益な形で変更される（例えば、少なくとも１０％増加する）か、または疾患の、他の臨床的に許容される症状もしくはマーカーが、改善されるかまたは軽快する場合に、処置は、「有効な処置」と考えられる。効能はまた、入院または医療的介入の必要により評価される、個体の非悪化（例えば、疾患の進行が止まるか、もしくは少なくとも緩徐化する）により測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書で記載されている。処置は、個体または動物（一部の非限定的な例は、ヒトまたは哺乳動物を含む）における、疾患の任意の処置を含み、（１）疾患の阻害、例えば、症状の進行を止めるか、もしくは緩徐化させること；または（２）疾患を和らげること、例えば、症状の減退を引き起こすこと；および（３）症状の発症の可能性を防止または低減することを含む。
【０５１１】
本開示に従った処置により、個体における機能性アシェリンの量を増加、減少、または変更することによって、２Ａ型アッシャー症候群と関連する１つまたは複数の症状を改善することができる。典型的に２Ａ型アッシャー症候群と関連する兆候としては、例えば、聴覚喪失、ならびに網膜の進行的な変性を通じて夜盲および周辺視野の喪失を引き起こす網膜色素変性と称される眼の障害が挙げられる。アッシャー症候群を有する多くの人が、重度の平衡感覚の問題も有する。
【０５１２】
キット
【０５１３】
本開示は、本明細書で記載される方法を実行するためのキットを提示する。キットは、ゲノムターゲティング核酸、ゲノムターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または本明細書で記載される方法の態様を実行するのに必要な、任意の核酸もしくはタンパク質性分子のうちの１または複数、あるいはこれらの任意の組合せを含みうる。
【０５１４】
キットは、（１）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）部位特異的ポリペプチドまたは部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（３）ベクターおよびまたはポリペプチドを修復および／または希釈するための試薬とを含みうる。
【０５１５】
キットは、（１）（ｉ）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターと、（２）ベクターを修復および／または希釈するための試薬とを含みうる。
【０５１６】
上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、単一分子ガイドゲノムターゲティング核酸を含みうる。上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、二重分子ゲノムターゲティング核酸を含みうる。上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、２つまたはこれを超える、二重分子ガイドまたは単一分子ガイドを含みうる。キットは、核酸ターゲティング核酸をコードするベクターを含みうる。
【０５１７】
上記のキットのうちのいずれにおいても、キットは、所望の遺伝子改変を生じさせるように挿入されるポリヌクレオチドをさらに含みうる。
【０５１８】
キットの構成要素は、別個の容器内の場合もあり、単一の容器内で組み合わせる場合もある。
【０５１９】
上記の任意のキットは、１または複数のさらなる試薬をさらに含む場合があるが、この場合、このようなさらなる試薬は、バッファ、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞へと導入するためのバッファ、洗浄バッファ、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける作製のための試薬、配列決定のためのアダプターなどから選択される。バッファは、安定化バッファ、修復バッファ、希釈バッファなどでありうる。キットはまた、オンターゲットへの結合もしくはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断を容易とするかもしくは増強するか、またはターゲティングの特異性を改善するのに使用しうる、１または複数の構成要素も含みうる。
【０５２０】
上記で言及した構成要素に加えて、キットは、キットの構成要素を使用して、方法を実施するための指示をさらに含みうる。方法を実施するための指示は、適切な記録媒体上に記録することができる。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基板上に印刷することができる。指示は、キット内に、添付文書として存在する場合もあり、キットまたはその構成要素の容器（すなわち、パッケージングまたは部分パッケージングと関連する）の表示中に存在する場合などもある。指示は、適切なコンピュータ読取り用保存媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブなどに存在する電子保存データファイルとして存在しうる。一部の場合には、実際の指示は、キット内に存在しないが、遠隔の供給源から、指示を得る（例えば、インターネットを介して）ための手段を提供することができる。この場合の例は、指示を閲覧することができ、かつ／または指示をダウンロードしうるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を得るためのこの手段は、適切な基板上に記録することができる。
【０５２１】
追加の治療アプローチ
【０５２２】
遺伝子編集は、特異的配列を標的とするように操作されたヌクレアーゼを使用して行うことができる。現在のところ、ヌクレアーゼの４つ主要な種類：メガヌクレアーゼおよびそれらの誘導体、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系が存在する。特に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの特異性が、タンパク質−ＤＮＡ間相互作用を介するのに対し、ＲＮＡ−ＤＮＡ間相互作用は、主にＣａｓ９をガイドするので、ヌクレアーゼプラットフォームは、デザインの難易度、標的化の密度、および作用方式において様々である。Ｃａｓ９切断は、異なるＣＲＩＳＰＲ系間で異なる隣接モチーフ、ＰＡＭも必要とする。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９は、ＮＧＧ  ＰＡＭを使用して切断し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴおよびＮＮＮＮＧＣＴＴを含むＰＡＭを含む部位で切断できる。多数の他のＣａｓ９オルソログは、代替ＰＡＭに隣接するプロトスペーサーを標的とする。
【０５２３】
本開示の方法では、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することができる。しかし、治療のための標的部位など、本明細書で記載される教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、またはＭｅｇａＴＡＬなど、エンドヌクレアーゼの他の形態へと適用することもでき、ヌクレアーゼの組合せの使用へと適用することもできる。しかし、本開示の教示を、このようなエンドヌクレアーゼへと適用するためには、とりわけ、特異的標的部位へと導かれるタンパク質を操作することが必要となろう。
【０５２４】
さらなる結合性ドメインをＣａｓ９タンパク質へと融合させて、特異性を増大させることができる。これらの構築物の標的部位は、同定されたｇＲＮＡ指定部位へとマップされるが、亜鉛フィンガードメインなどのための、さらなる結合モチーフを要求するであろう。Ｍｅｇａ−ＴＡＬの場合は、メガヌクレアーゼを、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインへと融合させることができる。メガヌクレアーゼドメインは、特異性を増大させ、切断をもたらしうる。同様に、不活化Ｃａｓ９またはｄｅａｄ  Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、切断ドメインへと融合させることができ、これは、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位と、融合させたＤＮＡ結合性ドメインのための隣接結合性部位とを要求する。これは、さらなる結合性部位がなければ、結合を減少させるように、触媒性の不活化に加えて、ｄＣａｓ９の何らかのタンパク質操作を要求する可能性が高い。
【０５２５】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
【０５２６】
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）とは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼであるＦｏｋＩの触媒性ドメインへと連結された、操作亜鉛フィンガーＤＮＡ結合性ドメインから構成されるモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは、二量体としてだけ機能するため、１対のＺＦＮを、逆ＤＮＡ鎖上にあり、それらの間に正確な間隔を伴う、コグネイトの標的「半部位」配列に結合するように操作して、触媒的に活性のＦｏｋＩ二量体の形成を可能としなければならない。それ自体では配列特異性を有さないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ＺＦＮ半部位間で、ゲノム編集における開始ステップとして、ＤＮＡ二本鎖切断が作出される。
【０５２７】
各ＺＦＮのＤＮＡ結合性ドメインは、夥多なＣｙｓ２−Ｈｉｓ２アーキテクチャーによる、３〜６つの亜鉛フィンガーであって、各フィンガーが、標的ＤＮＡ配列の１つの鎖のヌクレオチドのトリプレットを主に認識する亜鉛フィンガーから構成されることが典型的であるが、４番目のヌクレオチドとの交差相互作用もまた、重要でありうる。ＤＮＡとの鍵となる接触点を作る位置における、フィンガーのアミノ酸の変更は、所与のフィンガーの配列特異性を変更する。したがって、４フィンガーによる亜鉛フィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識するが、この場合、トリプレットの優先性は、可変的な程度で、隣接するフィンガーの影響を受けうるが、標的配列は、各フィンガーが寄与するトリプレット優先性の複合物である。ＺＦＮの重要な側面は、個々のフィンガーを修飾するだけで、ほぼ任意のゲノムアドレスへと、たやすく再ターゲティングしうるが、これを十分に行うには、かなりの熟練が要求されることである。ＺＦＮの大半の適用では、それぞれ、１２〜１８ｂｐずつを認識する、４〜６フィンガーのタンパク質が使用される。よって、１対のＺＦＮは、２４〜３６ｂｐの標的配列の組合せであって、半部位間の、典型的に５〜７ｂｐのスペーサーを含まない組合せを認識することが典型的であろう。結合性部位は、１５〜１７ｂｐを含む大型のスペーサーにより、さらに分離することができる。この長さの標的配列は、デザイン工程時に、リピートの配列または遺伝子の相同体を除外することを仮定すると、ヒトゲノム内で固有である可能性が高い。しかしながら、ＺＦＮタンパク質−ＤＮＡ間相互作用は、それらの特異性において絶対的ではないので、オフターゲット結合および切断イベントが、２つのＺＦＮの間のヘテロ二量体、またはＺＦＮの一方もしくは他方によるホモ二量体として生じる。後者の可能性は、互いとだけ二量体化することが可能であり、それら自体では二量体化しえない、偏性ヘテロ二量体バリアントとしてもまた公知の、「プラス」および「マイナス」バリアントを創出するように、ＦｏｋＩドメインの二量体化界面を操作することにより効果的に排されている。偏性ヘテロ二量体を強いることにより、ホモ二量体の形成が防止される。これは、ＺＦＮ、ならびにこれらのＦｏｋＩバリアントを採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性を大いに増強している。
【０５２８】
当技術分野では、様々なＺＦＮベースの系が記載されており、それらの改変は、定期的に報告され、多数の参考文献が、ＺＦＮのデザインを導くのに使用される規則およびパラメータについて記載している（例えば、Segalら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、９６巻（６号）：２７５８〜６３頁（１９９９年）；Dreier  Bら、J  Mol  Biol.、３０３巻（４号）：４８９〜５０２頁（２０００年）；Liu  Qら、J  Biol  Chem.、２７７巻（６号）：３８５０〜６頁（２００２年）；Dreierら、J  Biol  Chem、２８０巻（４２号）：３５５８８〜９７頁（２００５年）；およびDreierら、J  Biol  Chem.、２７６巻（３１号）：２９４６６〜７８頁（２００１年）を参照されたい）。
【０５２９】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
【０５３０】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）とは、モジュラーヌクレアーゼの別のフォーマットであって、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインを、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインへと連結し、１対のＴＡＬＥＮが、タンデムに働いて、標的化ＤＮＡ切断を達成するフォーマットを表す。ＺＦＮとの主要な差違は、ＤＮＡ結合ドメインおよび関連する標的ＤＮＡ配列認識特性の性格である。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインは、元来、植物の細菌性病原体であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．において記載された、ＴＡＬＥタンパク質に由来する。ＴＡＬＥは、３３〜３５アミノ酸のリピートによるタンデムアレイであって、典型的には、最大で２０ｂｐの長さの標的ＤＮＡ配列であり、全標的配列の長さを最大で４０ｂｐとする、標的ＤＮＡ配列内の単一の塩基対を、各リピートが認識するタンデムアレイから構成される。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２および１３位における、２つのアミノ酸だけを含む、反復可変二残基（repeat  variable  diresidue）（ＲＶＤ）により決定される。塩基である、グアニン、アデニン、シトシン、およびチミンは主に、４つのＲＶＤ：それぞれ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ、およびＡｓｎ−Ｇｌｙにより認識される。これは、亜鉛フィンガーの場合より、はるかに単純な認識コードを構成し、したがって、ヌクレアーゼデザインのために、後者を上回る利点を表す。しかしながら、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ間相互作用は、それらの特異性において絶対的ではなく、ＴＡＬＥＮもまた、オフターゲット活性を低減するように、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体バリアントの使用から利益を得ている。
【０５３１】
それらの触媒機能を失活させた、ＦｏｋＩドメインのさらなるバリアントも作り出されている。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ対の片方が、不活性のＦｏｋＩドメインを含有する場合は、標的部位において、ＤＳＢではなく、一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）だけが生じる。結果は、Ｃａｓ９切断ドメインのうちの一方を失活させた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１「ニッカーゼ」変異体の使用と同等である。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を駆動しうるが、効率は、ＤＳＢによる場合より低下する。主要な利益は、オフターゲットのニックは、ＮＨＥＪにより媒介される誤修復を受けやすいＤＳＢと異なり、迅速かつ正確に修復されることである。
【０５３２】
当技術分野では、様々なＴＡＬＥＮベースの系が記載されており、それらの改変も、定期的に報告されている（例えば、Boch、Science、３２６巻（５９５９号）：１５０９〜１２頁（２００９年）；Makら、Science、３３５巻（６０６９号）：７１６〜９頁（２０１２年）；およびMoscouら、Science、３２６巻（５９５９号）：１５０１頁（２００９年）を参照されたい）。「Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ」プラットフォームまたはクローニングスキームに基づくＴＡＬＥＮの使用については、複数のグループにより記載されている（例えば、Cermakら、Nucleic  Acids  Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁（２０１１年）；Liら、Nucleic  Acids  Res.、３９巻（１４号）：６３１５〜２５頁（２０１１年）；Weberら、PLoS  One.、６巻（２号）：ｅ１６７６５頁（２０１１年）；Wangら、J  Genet  Genomics、４１巻（６号）：３３９〜４７頁、Epub、２０１４年５月１７日（２０１４年）；およびCermak  Tら、Methods  Mol  Biol.、１２３９巻：１３３〜５９頁（２０１５年）を参照されたい）。
【０５３３】
ホーミングエンドヌクレアーゼ
【０５３４】
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）とは、長い認識配列（１４〜４４塩基対）を有し、ＤＮＡを、高特異性で切断する（ゲノム内の固有の部位であることが多い）、配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＨＥの、少なくとも６つの公知のファミリーであって、真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、およびファージを含む、広範囲にわたる宿主に由来する、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号５２７１）、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈｉｓ−Ｃｉｓボックス、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、およびＶｓｒ様を含む、それらの構造により分類されるファミリーが存在する。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集における最初のステップとして、標的ローカスにおけるＤＳＢを作り出すことができる。加えて、一部の天然および操作ＨＥは、ＤＮＡの単一の鎖だけを切断し、これにより、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きい標的配列およびそれらがもたらす特異性のために、ＨＥは、部位特異的ＤＳＢを作り出すのに魅力的な候補物質となっている。
【０５３５】
当技術分野では、様々なＨＥベースの系が記載されており、それらの改変は、定期的に報告されている；例えば、Steentoft  et  al.,  Glycobiology  24(8):663-80  (2014);  Belfort  and  Bonocora,  Methods  Mol  Biol.  1123:1-26  (2014);  Hafez  and  Hausner,  Genome  55(8):553-69  (2012)による総説を参照されたい。
【０５３６】
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ−ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
【０５３７】
ハイブリッド体のヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォームおよびＴｅｖ−ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインと、触媒的に活性のＨＥとの融合体を使用し、微調整可能なＤＮＡ結合およびＴＡＬＥの特異性の両方、ならびにＨＥの切断配列特異性を利用する（例えば、Boisselら、NAR、４２巻：２５９１〜２６０１頁（２０１４年）；Kleinstiverら、G3、４巻：１１５５〜６５頁（２０１４年）；ならびにBoisselおよびScharenberg、Methods  Mol.  Biol.、１２３９巻：１７１〜９６頁（２０１５年）を参照されたい）。
【０５３８】
さらなる変化形では、ＭｅｇａＴｅｖアーキテクチャーは、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）の、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインである、Ｉ−ＴｅｖＩ（Ｔｅｖ）との融合体である。２つの活性部位は、ＤＮＡ基質で、約３０ｂｐ離れて位置し、非適合性の粘着末端を伴う２つのＤＳＢを発生させる（例えば、Wolfsら、NAR、４２巻、８８１６〜２９頁（２０１４年）を参照されたい）。既存のヌクレアーゼベースの手法の他の組合せが進化し、本明細書で記載される、ターゲティングされたゲノム修飾の達成において有用となることが予期される。
【０５３９】
ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１−Ｆｏｋ１および他のヌクレアーゼ
【０５４０】
上記で記載したヌクレアーゼプラットフォームの構造的特性と機能的特性とを組み合わせることにより、ゲノム編集のためのさらなる手法であって、固有の欠点のうちの一部を潜在的に克服しうる手法を提供する。例として述べると、ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集系は、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、ＤＳＢを創出することが典型的である。ターゲティングの特異性は、標的ＤＮＡ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９の場合、隣接するＮＡＧまたはＮＧＧであるＰＡＭ配列内のさらなる２塩基を加えた）とのワトソン−クリック型塩基対合を経るガイドＲＮＡ内の、２０または２４ヌクレオチドの配列により駆動される。このような配列は、ヒトゲノム内では、固有となるのに十分に長いが、ＲＮＡ／ＤＮＡ間相互作用の特異性は絶対的ではなく、場合によって、顕著な無差別性が、特に、標的配列の５’側において許容され、特異性を駆動する塩基の数を有効に低減する。これに対する１つの解決法は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の触媒性機能を完全に失活させる（ＲＮＡにガイドされるＤＮＡ結合機能だけを保持しながら）代わりに、ＦｏｋＩドメインを、失活させたＣａｓ９へと融合させることであった（例えば、Tsaiら、Nature  Biotech、３２巻：５６９〜７６頁（２０１４年）；およびGuilingerら、Nature  Biotech.、３２巻：５７７〜８２頁（２０１４年）を参照されたい）。ＦｏｋＩは、触媒的に活性となるには、二量体化しなければならないため、２つのガイドＲＮＡは、２つのＦｏｋＩ融合体を、近接してテザリングして、二量体を形成し、ＤＮＡを切断することが要求される。これは本質的に、標的部位の組合せにおける塩基の数を二倍化し、これにより、ＣＲＩＳＰＲベースの系によるターゲティングの厳密性を増大させる。
【０５４１】
さらなる例として述べると、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインの、Ｉ−ＴｅｖＩなど、触媒的に活性なＨＥへの融合は、オフターゲット切断をさらに低減しうることを期待して、微調整可能なＤＮＡ結合およびＴＡＬＥの特異性の両方のほか、Ｉ−ＴｅｖＩの切断配列特異性も利用する。
【０５４２】
本発明の方法、組成物、治療、およびキット
【０５４３】
このように、本開示は、特に、以下の非限定的な発明に関する。
【０５４４】
第１の方法である方法１では、本開示は、ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入し、それによって、ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードするＤＮＡ配列内またはその近傍に、修正をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップを含む、方法を提示する。
【０５４５】
別の方法である方法２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、修正をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップを含む、方法を提示する。
【０５４６】
別の方法である方法３では、本開示は、ＩＶＳ４０変異が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、方法２に提示される、ヒト細胞においてＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法を提示する。
【０５４７】
別の方法である方法４では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法であって、患者の細胞においてＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０５４８】
別の方法である方法５では、本開示は、編集するステップが、細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、修正をもたらし、アシェリンタンパク質機能の回復をもたらす、１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含む、方法４に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５４９】
別の方法である方法６では、本開示は、ＩＶＳ４０変異が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、方法４または５のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５５０】
別の方法である方法７では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、その相同体、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化形態、またはそれらの修飾バージョン、ならびにそれらの組合せである、方法１〜２または５のいずれか１つに提示される方法を提示する。
【０５５１】
別の方法である方法８では、本開示は、細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含む、方法７に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５５２】
別の方法である方法９では、本開示は、細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のＲＮＡを導入するステップを含む、方法７に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５５３】
別の方法である方法１０では、本開示は、１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数のＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数の修飾ＲＮＡである、方法８または９のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５５４】
別の方法である方法１１では、本開示は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドである、方法７に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５５５】
別の方法である方法１２では、本開示は、細胞へと、１つまたは複数のｇＲＮＡを導入するステップをさらに含む、方法１〜１１のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５５６】
別の方法である方法１３では、本開示は、１つまたは複数のｇＲＮＡが、ｓｇＲＮＡである、方法１２に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５５７】
別の方法である方法１４では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、方法１２〜１３のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５５８】
別の方法である方法１５では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、方法１１〜１３のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５５９】
別の方法である方法１６では、本開示は、細胞へと、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型を導入するステップをさらに含む、方法１〜１５のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５６０】
別の方法である方法１７では、本開示は、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、イントロン領域、これらの断片もしくは組合せ、または前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡの全体である、方法１６に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５６１】
別の方法である方法１８では、本開示は、ドナー鋳型が、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、方法１６〜１７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５６２】
別の方法である方法１９では、本開示は、ドナー鋳型が、１ｑ４１領域に対する相同性アームを有する、方法１６〜１７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５６３】
別の方法である方法２０では、本開示は、細胞へと、１つのｇＲＮＡを導入するステップをさらに含み、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に位置するローカスに１つのＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、ｇＲＮＡが、イントロン４０内に位置するローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、方法２または５のいずれか１つに提示される方法を提示する。
【０５６４】
別の方法である方法２１では、本開示は、細胞へと、１つまたは複数のｇＲＮＡを導入するステップをさらに含み、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、１対のＳＳＢまたはＤＳＢであって、その第１のものが５’ローカスにあり、その第２のものが３’ローカスにある、１対のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせる、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、第１のガイドＲＮＡが、５’ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが、３’ローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、方法２または５のいずれか１つに提示される方法を提示する。
【０５６５】
別の方法である方法２２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、方法２０または２１のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５６６】
別の方法である方法２３では、本開示は、１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、方法２０〜２２のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５６７】
別の方法である方法２４では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、方法２０〜２３のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５６８】
別の方法である方法２５では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、方法２０〜２４のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５６９】
別の方法である方法２６では、本開示は、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子の少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型をさらに含み、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に位置するローカスにおいて染色体ＤＮＡへと挿入され、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異の修正をもたらす、方法２０に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７０】
別の方法である方法２７では、本開示は、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子の少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型をさらに含み、ポリヌクレオチドドナー鋳型に由来する新しい配列が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍の５’ローカスと３’ローカスとの間において染色体ＤＮＡへと挿入され、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍の５’ローカスと３’ローカスとの間において染色体ＤＮＡの修正をもたらす、方法２１に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７１】
別の方法である方法２８では、本開示は、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部分が、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、エクソン６７、エクソン６８、エクソン６９、エクソン７０、エクソン７１、エクソン７２、イントロン領域、これらの断片もしくは組合せ、または前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子もしくはｃＤＮＡの全体である、方法２０〜２７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７２】
別の方法である方法２９では、本開示は、ポリヌクレオチドドナー鋳型が、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかである、方法２０〜２８のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７３】
別の方法である方法３０では、本開示は、ポリヌクレオチドドナー鋳型が、１ｑ４１領域に対する相同性アームを有する、方法２０〜２９のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７４】
別の方法である方法３１では、本開示は、ＳＳＢまたはＤＳＢが、イントロン４０内で、ＩＶＳ４０変異の０〜１８００ヌクレオチド上流に位置する、方法２０〜３０のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７５】
別の方法である方法３２では、本開示は、ＳＳＢまたはＤＳＢが、イントロン４０内で、ＩＶＳ４０変異の０〜１１００ヌクレオチド下流に位置する、方法２０〜３０のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７６】
別の方法である方法３３では、本開示は、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０のセグメントに相補的である、方法１２〜１５または２３〜２５のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７７】
別の方法である方法３４では、本開示は、修正が、ＨＤＲによるものである、方法１〜３または５〜３３のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７８】
別の方法である方法３５では、本開示は、ドナー鋳型が、ＩＶＳ４０変異に対する相同性アームを有する、方法２６〜２７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５７９】
別の方法である方法３６では、本開示は、細胞へと、２つのｇＲＮＡを導入するステップをさらに含み、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、１対の二本鎖切断（ＤＳＢ）であって、その第１のものが５’ＤＳＢローカスにあり、その第２のものが３’ＤＳＢローカスにあり、５’ＤＳＢローカスと３’ＤＳＢローカスとの間において染色体ＤＮＡの欠失を引き起こし、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍の５’ＤＳＢローカスと３’ＤＳＢローカスとの間において染色体ＤＮＡの欠失をもたらす、１対のＤＳＢを生じさせる、１つまたは複数のＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり、第１のガイドＲＮＡが、５’ＤＳＢローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含み、第２のガイドＲＮＡが、３’ＤＳＢローカスのセグメントに相補的であるスペーサー配列を含む、方法２または５のいずれか１つに提示される方法を提示する。
【０５８０】
別の方法である方法３７では、本開示は、ＩＶＳ４０変異が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、方法３６に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５８１】
別の方法である方法３８では、本開示は、２つのｇＲＮＡが、２つのｓｇＲＮＡである、方法３６または３７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５８２】
別の方法である方法３９では、本開示は、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡが、２つの修飾ｇＲＮＡまたは２つの修飾ｓｇＲＮＡである、方法３６〜３８のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５８３】
別の方法である方法４０では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、２つのｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡとあらかじめ複合体化されている、方法３６〜３９のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５８４】
別の方法である方法４１では、本開示は、イントロン４０内の５’ＤＳＢが、ＩＶＳ４０変異の０〜１８００ヌクレオチド上流に位置する、方法３６〜４０のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５８５】
別の方法である方法４２では、本開示は、イントロン４０内の３’ＤＳＢが、ＩＶＳ４０変異の０〜１１００ヌクレオチド下流に位置する、方法３６〜４０のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５８６】
別の方法である方法４３では、本開示は、欠失が、５０ｂｐ〜２９００ｂｐの欠失である、方法３６〜４２のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５８７】
別の方法である方法４４では、本開示は、欠失が、５０ｂｐ〜２０００ｂｐの欠失である、方法３６〜４２のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５８８】
別の方法である方法４５では、本開示は、欠失が、５０ｂｐ〜１０００ｂｐの欠失である、方法３６〜４２のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５８９】
別の方法である方法４６では、本開示は、欠失が、５０ｂｐ〜５００ｂｐの欠失である、方法３６〜４２のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５９０】
別の方法である方法４７では、本開示は、欠失が、５０ｂｐ〜２５０ｂｐの欠失である、方法３６〜４２のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５９１】
別の方法である方法４８では、本開示は、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子の少なくとも一部分を含む、ポリヌクレオチドドナー鋳型をさらに含む、方法３６〜４７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５９２】
別の方法である方法４９では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ、別個の脂質ナノ粒子中に製剤化されるか、またはすべてが１つの脂質ナノ粒子中に共製剤化されるかのいずれかである、方法２０〜２２および３６〜３７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５９３】
別の方法である方法５０では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、およびドナー鋳型が、それぞれ、別個のＡＡＶベクター中に製剤化されるか、またはすべてが１つのＡＡＶベクター中に共製剤化されるかのいずれかである、方法２０〜２２および３６〜３７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５９４】
別の方法である方法５１では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子中に製剤化され、ｇＲＮＡおよびドナー鋳型の両方が、ＡＡＶベクターによって細胞へと送達される、方法２０〜２２および３６〜３７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５９５】
別の方法である方法５２では、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１  ｍＲＮＡが、脂質ナノ粒子中に製剤化され、ｇＲＮＡが、電気穿孔によって細胞へと送達され、ドナー鋳型が、ＡＡＶベクターによって細胞へと送達される、方法２０〜２２および３６〜３７のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５９６】
別の方法である方法５３では、本開示は、ＡＡＶベクターが、自己不活性化ＡＡＶベクターである、方法５０〜５２のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５９７】
別の方法である方法５４では、本開示は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子が、第１染色体：２１５，６２２，８９３〜２１６，４２３，３９５（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ−ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置する、方法１〜５３のいずれか１つに提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０５９８】
別の方法である方法５５では、本開示は、アシェリンタンパク質機能の回復が、野生型または正常なアシェリンタンパク質機能と比較される、方法１〜３または５〜５４のいずれか１つに提示される方法を提示する。
【０５９９】
別の方法である方法５６では、本開示は、ポリヌクレオチドドナー鋳型が、最大１１ｋｂである、方法１６に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０６００】
別の方法である方法５７では、本開示は、ポリヌクレオチドドナー鋳型が、ＡＡＶによって送達される、方法５６に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０６０１】
別の方法である方法５８では、本開示は、ヒト細胞が、光受容細胞または網膜前駆細胞である、方法１〜３のいずれか１つに提示される方法を提示する。
【０６０２】
別の方法である方法５９では、本開示は、細胞が、光受容細胞または網膜前駆細胞である、方法４〜５７に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０６０３】
別の方法である方法６０では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２１を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６０４】
別の方法である方法６１では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２３を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６０５】
別の方法である方法６２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２５を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６０６】
別の方法である方法６３では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２７を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６０７】
別の方法である方法６４では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２８を含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６０８】
別の方法である方法６５では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２１、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６０９】
別の方法である方法６６では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２３、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６１０】
別の方法である方法６７では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２５、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６１１】
別の方法である方法６８では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２７、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６１２】
別の方法である方法６９では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５３２８、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含むｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む前記ＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するステップを含む、方法を提示する。
【０６１３】
別の方法である方法７０では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２１を含む、方法を提示する。
【０６１４】
別の方法である方法７１では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２３を含む、方法を提示する。
【０６１５】
別の方法である方法７２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２５を含む、方法を提示する。
【０６１６】
別の方法である方法７３では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２７を含む、方法を提示する。
【０６１７】
別の方法である方法７４では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２８を含む、方法を提示する。
【０６１８】
別の方法である方法７５では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２１、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
【０６１９】
別の方法である方法７６では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２３、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
【０６２０】
別の方法である方法７７では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２５、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
【０６２１】
別の方法である方法７８では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２７、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
【０６２２】
別の方法である方法７９では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３２８、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、方法を提示する。
【０６２３】
別の方法である方法８０では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２９５を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５２７９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６２４】
別の方法である方法８１では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２９４を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６２５】
別の方法である方法８２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２９５を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６２６】
別の方法である方法８３では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２９０を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６２７】
別の方法である方法８４では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５２７７を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５３００を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、前記ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６２８】
別の方法である方法８５では、本開示は、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、同時に投与されるか、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与されるか、または第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与される、方法８０〜８４のいずれか１つに記載の方法を提示する。
【０６２９】
別の方法である方法８６では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９５を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２７９を含む、方法を提示する。
【０６３０】
別の方法である方法８７では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９４を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３００を含む、方法を提示する。
【０６３１】
別の方法である方法８８では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９５を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３００を含む、方法を提示する。
【０６３２】
別の方法である方法８９では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２９０を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３００を含む、方法を提示する。
【０６３３】
別の方法である方法９０では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５２７７を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５３００を含む、方法を提示する。
【０６３４】
別の方法である方法９１では、本開示は、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、同時に投与されるか、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与されるか、または第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与される、方法８６〜９０のいずれか１つに記載の方法を提示する。
【０６３５】
別の方法である方法９２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４５２を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４４９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６３６】
別の方法である方法９３では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４５３を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４４９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６３７】
別の方法である方法９４では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４５５を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４５７を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６３８】
別の方法である方法９５では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４５２を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４５１を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６３９】
別の方法である方法９６では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、配列番号５４４８を含む第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび配列番号５４４９を含む第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用して、ＩＶＳ４０変異を含む配列を欠失させるステップを含む、方法を提示する。
【０６４０】
別の方法である方法９７では、本開示は、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、同時に投与されるか、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与されるか、または第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与される、方法９２〜９６のいずれか１つに記載の方法を提示する。
【０６４１】
別の方法である方法９８では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５２を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４４９を含む、方法を提示する。
【０６４２】
別の方法である方法９９では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５３を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４４９を含む、方法を提示する。
【０６４３】
別の方法である方法１００では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５５を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５７を含む、方法を提示する。
【０６４４】
別の方法である方法１０１では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５２を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４５１を含む、方法を提示する。
【０６４５】
別の方法である方法１０２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する患者を処置するための方法であって、患者へと、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを投与するステップを含み、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４４８を含み、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列番号５４４９を含む、方法を提示する。
【０６４６】
別の方法である方法１０３では、本開示は、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、同時に投与されるか、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与されるか、または第２のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの前に投与される、方法９８〜１０２のいずれか１つに記載の方法を提示する。
【０６４７】
別の方法である方法１０４では、本開示は、ヒト細胞が、活性欠損を有し、編集されたヒト細胞が、機能性ＵＳＨ２Ａを発現する、方法１に提示される、ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法を提示する。
【０６４８】
別の方法である方法１０５では、本開示は、ヒト細胞が、活性欠損を有し、編集されたヒト細胞が、機能性ＵＳＨ２Ａを発現する、方法２に提示される、ヒト細胞においてＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法を提示する。
【０６４９】
別の方法である方法１０６では、本開示は、修正が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす、方法１に提示される、ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法を提示する。
【０６５０】
別の方法である方法１０７では、本開示は、修正が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす、方法２に提示される、ヒト細胞においてＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法を提示する。
【０６５１】
別の方法である方法１０８では、本開示は、修正が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらし、アシェリンタンパク質機能の回復をもたらす、方法５に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０６５２】
別の方法である方法１０９では、本開示は、編集するステップが、細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらし、アシェリンタンパク質機能の回復をもたらす、１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせることを含む、方法４に提示される、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提示する。
【０６５３】
別の方法である方法１１０では、本開示は、ヒト細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、ＵＳＨ２Ａ遺伝子またはＵＳＨ２Ａ遺伝子の調節配列をコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップを含む、方法を提示する。
【０６５４】
別の方法である方法１１１では、本開示は、ヒト細胞においてＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法であって、ヒト細胞へと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入して、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内またはその近傍に、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の発現または機能の調節をもたらす１つまたは複数のＳＳＢまたはＤＳＢを生じさせ、それによって、編集されたヒト細胞を創出するステップを含む、方法を提示する。
【０６５５】
別の方法である方法１１２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、方法１１１に提示される、ヒト細胞においてＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子を編集するための方法を提示する。
【０６５６】
第１の組成物である組成物１では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞において、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡであって、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
【０６５７】
別の組成物である組成物２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、組成物１に記載の１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
【０６５８】
別の組成物である組成物３では、本開示は、１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、組成物１または２のいずれかに記載の１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
【０６５９】
別の組成物である組成物４では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、組成物１〜３のいずれかに記載の１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
【０６６０】
別の組成物である組成物５では、本開示は、細胞が、光受容細胞、網膜前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、組成物１〜４のいずれかに記載の１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
【０６６１】
別の組成物である組成物６では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２１を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６６２】
別の組成物である組成物７では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２３を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６６３】
別の組成物である組成物８では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２５を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６６４】
別の組成物である組成物９では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２７を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６６５】
別の組成物である組成物１０では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２８を含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６６６】
別の組成物である組成物１１では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２１、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６６７】
別の組成物である組成物１２では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２３、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６６８】
別の組成物である組成物１３では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２５、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６６９】
別の組成物である組成物１４では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２７、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６７０】
別の組成物である組成物１５では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者に由来する細胞においてＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、配列番号５３２８、および配列番号５２６７〜５２６９のうちのいずれか１つを含む、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提示する。
【０６７１】
別の組成物である組成物１６では、本開示は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡであって、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡを提示する。
【０６７２】
第１の治療である治療１では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するための治療であって、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための少なくとも１つまたは複数のｇＲＮＡを含み、１つまたは複数のｇＲＮＡが、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、治療を提示する。
【０６７３】
別の治療である治療２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、治療１に記載の治療を提示する。
【０６７４】
別の治療である治療３では、本開示は、１つまたは複数のｇＲＮＡが、１つまたは複数のｓｇＲＮＡである、治療１または２のいずれか１つに記載の治療を提示する。
【０６７５】
別の治療である治療４では、本開示は、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、１つもしくは複数の修飾ｇＲＮＡまたは１つもしくは複数の修飾ｓｇＲＮＡである、治療１〜３のいずれか１つに記載の治療を提示する。
【０６７６】
別の治療である治療５では、本開示は、２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するための治療であって、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼを導入するステップ、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡを導入するステップ、必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型を導入するステップを含む方法によって構成され、１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、治療を提示する。
【０６７７】
別の治療である治療６では、本開示は、ＩＶＳ４０変異が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、治療５に記載の治療を提示する。
【０６７８】
第１のキットであるキット１では、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏで２Ａ型アッシャー症候群を有する患者を処置するためのキットであって、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異を編集するための１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡであって、配列表の配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３、および５４４６〜５４６１における核酸配列からなる群から選択されるスペーサー配列を含む、１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼと、必要に応じて、１つまたは複数のドナー鋳型とを含む、キットを提示する。
【０６７９】
別のキットであるキット２では、本開示は、ＩＶＳ４０変異が、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内に位置する、キット１に記載のキットを提示する。
【０６８０】
別のキットであるキット３では、本開示は、１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、その相同体、その天然に存在する分子の組換え、そのコドン最適化形態、またはそれらの修飾バージョン、ならびにそれらの組合せである、キット１または２のいずれか１つに記載のキットを提示する。
【０６８１】
別のキットであるキット４では、本開示は、１つまたは複数のドナー鋳型を含む、キット１〜３のいずれか１つに記載のキットを提示する。
【０６８２】
別のキットであるキット５では、本開示は、ドナー鋳型が、１ｑ４１領域に対する相同性アームを有する、キット４に記載のキットを提示する。
【０６８３】
別のキットであるキット６では、本開示は、ドナー鋳型が、ＩＶＳ４０変異に対する相同性アームを有する、キット４に記載のキットを提示する。
【０６８４】
第１の核酸である、核酸１では、本開示は、配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３および５４４６〜５４６１からなる群から選択されるスペーサー配列を含むｇＲＮＡをコードする核酸を提示する。
【０６８５】
別の核酸である、核酸２では、本開示は、ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである、核酸１の核酸を提示する。
【０６８６】
第１のベクターである、ベクター１では、本開示は、配列番号５２７２〜５３１９、５３２１、５３２３、５３２５、５３２７〜５３２８、５４４３および５４４６〜５４６１からなる群から選択されるスペーサー配列を含むｇＲＮＡをコードするベクターを提示する。
【０６８７】
別のベクターである、ベクター２では、本開示は、ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである、ベクター１のベクターを提示する。
【０６８８】
別のベクターである、ベクター３では、本開示は、ＡＡＶである、ベクター１または２のいずれか１つのベクターを提示する。
【０６８９】
別のベクターである、ベクター４では、本開示は、ＡＡＶ５血清型キャプシドベクターである、ベクター１〜３のいずれか１つのベクターを提示する。
【０６９０】
定義
【０６９１】
本明細書に既に記載した定義に加えて、次の定義は本開示に関連する。
【０６９２】
本明細書に使用される場合、「遺伝子」という用語は、特定の遺伝子産物をコードし、それを発現させることができる、核酸のセグメントを指す。遺伝子は、その遺伝子産物として、タンパク質またはポリペプチドを産生することが多いが、遺伝子は、任意の所望されるポリペプチドまたは核酸産物を産生し得る。
【０６９３】
「変更」または「遺伝子情報の変更」という用語は、細胞のゲノムにおける任意の変化を指す。
【０６９４】
「挿入」という用語は、ＤＮＡ配列における１つまたは複数のヌクレオチドの付加を指す。挿入は、数個のヌクレオチドの小さな挿入から、大きなセグメント、例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子の挿入までの範囲に及び得る。
【０６９５】
「欠失」という用語は、ＤＮＡ配列における１つもしくは複数のヌクレオチドの喪失もしくは除去、または遺伝子の機能の喪失もしくは除去を指す。一部の事例では、欠失は、例えば、数個のヌクレオチド、エクソン、イントロン、遺伝子セグメント、または遺伝子の配列全体の喪失を含み得る。一部の事例では、遺伝子の欠失は、遺伝子またはその遺伝子産物の機能または発現の排除または低減を指す。これは、遺伝子内またはその近傍の配列の欠失だけでなく、その遺伝子の発現を破壊する他の事象（例えば、挿入、ナンセンス変異）によっても生じ得る。
【０６９６】
「修正」という用語は、本明細書において使用されるとき、細胞内のゲノムの１つまたは複数のヌクレオチドの変化を指す。変化の非限定的な例としては、挿入、欠失、置換、組込み、逆転、または重複が挙げられる。そのような修正は、構造か機能かにかかわらず、修正されるゲノム部位に、より好ましい遺伝子型または表現型の結果をもたらし得る。「修正」の１つの非限定的な例としては、遺伝子またはその遺伝子産物（複数可）の構造または機能を回復させる、変異体または欠陥のある配列の変化が挙げられる。変異の性質に応じて、修正は、本明細書に開示される様々な戦略を介して達成することができる。
【０６９７】
「ハイブリダイズする」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏの温度および溶液のイオン強度の条件下において、非共有結合して、例えば、ワトソン・クリック塩基対を形成するか、配列特異的な逆平行様式で別の核酸に「アニーリング」または「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸が、相補的な核酸に特異的に結合する）ことを可能にする、ヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当技術分野において公知のように、標準的なワトソン・クリック塩基対合は、アデニン（Ａ）がチミジン（Ｔ）と対合すること、アデニン（Ａ）がウラシル（Ｕ）と対合すること、およびグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と対合すること［ＤＮＡ、ＲＮＡ］を含む。一部の例では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのスペーサー配列は、ヌクレオチド配列に完全に相補的であり得る。他の例では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのスペーサー配列は、少なくとも１つの位置を除き、ヌクレオチド配列に完全に相補的であり得る。他の例では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのスペーサー配列は、少なくとも２つの位置を除き、ヌクレオチド配列に完全に相補的であり得る。
【０６９８】
「ノックイン」という用語は、ゲノムへのＤＮＡ配列またはその断片の付加を指す。ノックインしようとするそのようなＤＮＡ配列としては、単一のまたは複数の遺伝子全体を挙げることができ、遺伝子と関連する調節配列、または前述のものの任意の部分もしくは断片を挙げることができる。例えば、野生型タンパク質をコードするｃＤＮＡを、変異体遺伝子を有する細胞のゲノムに挿入することができる。ノックイン戦略は、欠陥のある遺伝子を、全体的または部分的に置き換えることを必要とするものではない。一部の事例では、ノックイン戦略は、既存の配列の提供される配列での置換、例えば、変異体対立遺伝子の野生型コピーでの置換をさらに含んでもよい。一方、「ノックアウト」という用語は、遺伝子または遺伝子の発現の排除を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊を生じる、ヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによって、ノックアウトすることができる。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係な配列で置き換えることによって、ノックアウトすることができる。最後に、「ノックダウン」という用語は、本明細書において使用されるとき、遺伝子またはその遺伝子産物（複数可）の発現の低減を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性もしくは機能が減弱され得るか、またはタンパク質のレベルが、低減もしくは排除され得る。
【０６９９】
「〜を含むこと」または「〜を含む」という用語は、本開示に必須であるが、必須であってもそうでなくても、未指定の要素の包含に対しても開かれた、組成物、治療、キット、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素（複数可）に言及して使用される。
【０７００】
「〜から本質的になる」という用語は、所与の態様に要求される要素を指す。用語は、本開示のその態様の、基本的かつ新規のまたは機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない、さらなる要素の存在を許容する。
【０７０１】
「〜からなる」という用語は、態様についてのその記載において列挙されない任意の要素を除外して、本明細書で記載される組成物、治療、キット、方法、およびこれらのそれぞれの構成要素を指す。
【０７０２】
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により、そうでないことが明確に指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。
【０７０３】
本明細書で列挙される任意の数値範囲は、数値精度が同じである（すなわち、指定された桁数と同じ桁数を有する）全ての部分範囲であって、列挙された範囲内に包含される部分範囲について記載する。例えば、「１．０〜１０．０」という列挙範囲は、本明細書の本文中で、「２．４〜７．６」という範囲が、明示的に列挙されていない場合であってもなお、例えば、「２．４〜７．６」など、列挙された最小値である１．０と、列挙された最大値である１０．０との間（およびこれらを含む）の、全ての部分範囲について記載する。したがって、本出願者は、本明細書で明示的に列挙される範囲内に包含される、同じ
数値精度の、任意の部分範囲を、明示的に列挙するように、特許請求の範囲を含む本明細書を矯正する権利を留保する。任意のこのような部分範囲を明示的に列挙するように矯正することが、記載、記載の十分性、ならびに３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ａ）およびＥＰＣ  １２３（２）条下の要件を含む、新規事項の要件に準拠するように、全てのこのような範囲は本明細書で固有に記載される。文脈により、明示的に指定またはそうでないことが要求されない限りにおいて、本明細書で記載される、全ての数値パラメータ（値、範囲、量、百分率などを表す数値パラメータ）はまた、「約」という語が、数の前に明示的に現れない場合であってもなお、「約」という語を前置しているかのように読むことができる。加えて、本明細書で記載される数値パラメータは、報告される有効桁数である、数値精度に照らして、通常の丸め法を適用することにより解釈されるものとする。また、本明細書で記載される数値パラメータは、必然的に、パラメータの数値を決定するのに使用される基礎的な測定法に特徴的な、固有のばらつきを有することも理解される。
【０７０４】
本明細書で特定される任意の特許、刊行物、または他の開示材料は、別に示されない限り、組み込まれる材料が本明細書で明白に示される既存の説明、定義、記述、または他の開示材料と矛盾しない範囲でのみ、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。そのため、および必要な範囲内でのみ、本明細書で示される明らかな開示は、参照により組み込まれる任意の矛盾する材料に優先する。本明細書に参照により組み込まれると述べられているが、本明細書で示される既存の定義、記述、または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその部分は、その組み込まれる材料と既存の開示材料との間で矛盾が生じない限りにおいてのみ組み込まれる。出願人らは、本明細書に参照により組み込まれる、任意の主題またはその部分を明白に列挙するために、本明細書を補正する権利を有する。
【０７０５】
本開示の１つまたは複数の態様の詳細が、以下に付随する実施例において記載されている。本明細書において記載されるものと類似または同等の任意の材料および方法を、本開示の実施または試験において使用することができるが、想定される材料および方法の具体的な例が、記載されている。本開示の他の特性、目的、および利点は、本説明から明らかである。本説明例において、単数形は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合には、本説明が、優先される。
【実施例】
【０７０６】
本開示は、本発明の例示的で非限定的な態様を提供する以下の実施例を参照して、より完全に理解される。
【０７０７】
実施例では、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異内またはその近傍に、ゲノムローカスにおけるＩＶＳ４０変異の破壊または切除をもたらし、アシェリンタンパク質機能を回復させる、定義された治療的ゲノム欠失、挿入、または置換えを創出するための例示的なゲノム編集技法としての、ＣＲＩＳＰＲ系の使用について説明する。定義された治療改変の導入は、本明細書において説明され、例示されるように、２Ａ型アッシャー症候群の排除ではなくとも潜在的な改善のための新規な治療戦略を代表する。
【０７０８】
（実施例１）
ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ）Ｃａｓ９  ＰＡＭ部位
ＳｐＣａｓ９によるゲノム編集のための標的部位を発見するために、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異の１８００ヌクレオチド上流および１１００ヌクレオチド下流に及ぶ領域（合計２．９ｋＢ）を、ＳｐＣａｓ９プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に関してスキャンした。この範囲を、配列ＮＲＧを有するＰＡＭについてスキャンした。次いで、ＮＲＧ  ＰＡＭのすぐ上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７〜２４ｂｐ）を、同定した。これらの配列が、遺伝子の編集に使用するための候補である。
【０７０９】
（実施例２）
ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（Ｓａ）Ｃａｓ９  ＰＡＭ部位
ＳａＣａｓ９によるゲノム編集のための標的部位を発見するために、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異の１１００ヌクレオチド上流および５５０ヌクレオチド下流に及ぶ領域を、ＳａＣａｓ９  ＰＡＭに関してスキャンした。この範囲を、配列ＮＮＧＲＲＴを有するＰＡＭについてスキャンした。次いで、ＮＮＧＲＲＴ  ＰＡＭのすぐ上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７〜２４ｂｐ）を、同定した。これらの配列が、遺伝子の編集に使用するための候補である。
【０７１０】
（実施例３）
ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓｔ）Ｃａｓ９  ＰＡＭ部位
ＳｔＣａｓ９によるゲノム編集のための標的部位を発見するために、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異の１８００ヌクレオチド上流および１１００ヌクレオチド下流に及ぶ領域（合計２．９ｋＢ）を、ＳｔＣａｓ９  ＰＡＭに関してスキャンする。この範囲を、配列ＮＮＡＧＡＡＷを有するＰＡＭについてスキャンする。次いで、ＮＮＡＧＡＡＷ  ＰＡＭのすぐ上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７〜２４ｂｐ）を、同定した。これらの配列が、遺伝子の編集に使用するための候補である。
【０７１１】
（実施例４）
ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｔｄ）Ｃａｓ９  ＰＡＭ部位
ＴｄＣａｓ９によるゲノム編集のための標的部位を発見するために、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異の１８００ヌクレオチド上流および１１００ヌクレオチド下流に及ぶ領域（合計２．９ｋＢ）を、ＴｄＣａｓ９  ＰＡＭに関してスキャンする。この範囲を、配列ＮＡＡＡＡＣを有するＰＡＭについてスキャンする。次いで、ＮＡＡＡＡＣ  ＰＡＭのすぐ上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７〜２４ｂｐ）を、同定する。これらの配列が、遺伝子の編集に使用するための候補である。
【０７１２】
（実施例５）
ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（Ｎｍ）Ｃａｓ９  ＰＡＭ部位
ＮｍＣａｓ９によるゲノム編集のための標的部位を発見するために、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異の１８００ヌクレオチド上流および１１００ヌクレオチド下流に及ぶ領域（合計２．９ｋＢ）を、ＮｍＣａｓ９  ＰＡＭに関してスキャンする。この範囲を、配列ＮＮＮＮＧＨＴＴを有するＰＡＭについてスキャンする。次いで、ＮＮＮＮＧＨＴＴ  ＰＡＭのすぐ上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７〜２４ｂｐ）を、同定する。これらの配列が、遺伝子の編集に使用するための候補である。
【０７１３】
（実施例６）
ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１  ＰＡＭ部位
Ｃｐｆ−１によるゲノム編集のための標的部位を発見するために、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異の１８００ヌクレオチド上流および１１００ヌクレオチド下流に及ぶ領域（合計２．９ｋＢ）を、Ｃｐｆ１  ＰＡＭに関してスキャンする。この範囲を、配列ＹＴＮを有するＰＡＭについてスキャンする。次いで、ＹＴＮ  ＰＡＭのすぐ上流に位置するｇＲＮＡスペーサー配列（１７〜２４ｂｐ）を、同定する。これらの配列が、遺伝子の編集に使用するための候補である。
【０７１４】
（実施例７）
ガイドＲＮＡ鎖のバイオインフォマティクス解析
ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、編集が所望されるゲノム配列などのオンターゲット部位に、ＲＮＰ複合体を誘導し得るが、編集が所望されないオフターゲット部位と相互作用する潜在性も有し得る。どの候補ｇＲＮＡがオンターゲットおよび／またはオフターゲット活性を有する可能性があるかを同定するために、候補ｇＲＮＡを、オンターゲット部位およびオフターゲット部位の両方において、結合のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析および実験的に評価した活性の両方を使用した、単一プロセスまたは複数ステップのプロセスにおいて、スクリーニングし、選択した。
【０７１５】
例示として、意図される染色体位置以外の染色体位置での効果の可能性（likelihood）を査定するために、以下により詳細に説明および例示するように、オフターゲット結合を査定するために使用可能な様々なバイオインフォマティクスツールのうちの１つまたは複数を使用して、隣接するＰＡＭを有する、ＵＳＨ２Ａ遺伝子におけるＩＶＳ４０変異内またはその近傍の部位などの、特定のオンターゲット部位に適合する配列を有する候補ｇＲＮＡを、同様の配列を有するオフターゲット部位で切断するそれらの潜在性について査定した。
【０７１６】
その後、オフターゲット活性について比較的低い潜在性を有することが予測される候補は、それらのオンターゲット活性、およびその後様々な部位でのオフターゲット活性を測定するために実験的に査定された。選択したローカスで所望の遺伝子編集レベルを達成するために十分に高いオンターゲット活性を有し、他の染色体ローカスでは改変の可能性を低減させるために比較的低いオフターゲット活性を有するｇＲＮＡが好まれた。オンターゲット活性対オフターゲット活性の比はしばしば、ｇＲＮＡの「特異性」と呼ばれる。
【０７１７】
予測されるオフターゲット活性の最初のスクリーニングのために、最も可能性があるオフターゲット部位を予測するために使用された、いくつかの公知かつ一般に利用可能なバイオインフォマティクスツールがあり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ系における標的部位への結合は相補的配列間のワトソン・クリック塩基対形成により駆動されるので、相違の程度（およびそれゆえオフターゲット結合の潜在性の低減）は本質的に、標的部位に対する、潜在的オフターゲット部位における、一次配列の差、ミスマッチおよびバルジ、すなわち、非相補的塩基に変えられた塩基、ならびに塩基の挿入または欠失に関連する。ＣＯＳＭＩＤ（ＣＲＩＳＰＲ  Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ，Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（ウェブ上でcrispr.bme.gatech.eduにて使用可能）と呼ばれる例示的なバイオインフォマティクスツールは、かかる類似点をコンパイルする。他のバイオインフォマティクスツールとして、ａｕｔｏＣＯＳＭＩＤ、およびＣＣＴｏｐが挙げられるが、これらに限定されない。
【０７１８】
変異および染色体再編の有害作用を低減させるために、バイオインフォマティクスツールを使用して、オフターゲット切断を最小限にした。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系についての研究は、特に、ＰＡＭ領域から遠位位置での、塩基対ミスマッチおよび／またはバルジを有するＤＮＡ配列へのガイド鎖の非特異的ハイブリダイゼーションに起因するオフターゲット活性の可能性を示唆した。それゆえ、塩基対ミスマッチに加えて、ＲＮＡガイド鎖とゲノム配列との間の挿入および／または欠失を有する、潜在的オフターゲット部位を同定したバイオインフォマティクスツールを有することは、重要であった。オフターゲット予測アルゴリズムＣＣＴｏｐに基づくバイオインフォマティクスツールを使用して、潜在的ＣＲＩＳＰＲオフターゲット部位のゲノムを探索した（ＣＣＴｏｐは、crispr.cos.uni-heidelberg.de/においてウェブ上で利用可能である）。出力は、ミスマッチの数および位置に基づいて潜在的オフターゲット部位のリストをランク付けし、より多くの情報に通じた標的部位の選択を可能にし、オフターゲット切断の可能性が高い部位の使用を回避する。
【０７１９】
ある領域におけるｇＲＮＡ標的化部位の見積もられたオンターゲット活性および／またはオフターゲット活性を比較検討する（weigh）、追加のバイオインフォマティクスパイプラインを使用した。活性を予測するために使用した他の特徴として、問題の細胞種、ＤＮＡのアクセシビリティ、クロマチン状態、転写因子結合部位、転写因子結合データ、および他のＣＨＩＰ−ｓｅｑデータについての情報が挙げられる。ｇＲＮＡ対の相対的位置および方向、局所配列特徴、ならびにマイクロホモロジーなどの、編集効率を予測する追加の要素を比較検討した。
【０７２０】
これらのプロセスにより、高い特異性のｇＲＮＡの選択が可能となった。
【０７２１】
（実施例８）
ＩＶＳ４０変異体細胞株の生成
ゲノムＤＮＡに対するオンターゲット活性に関して候補ｇＲＮＡを試験するために、ホモ接合性Ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ変異を有するＨＥＫ  ２９３細胞株（ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞株）を、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞を使用して生成した。野生型ＨＥＫ  ２９３細胞は、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子の２つの野生型対立遺伝子を含み、低いレベルのＵＳＨ２Ａを内因的に発現する。
【０７２２】
野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ＬｏｎｚａのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キット、Ｌｏｎｚａのヌクレオフェクター装置、およびＨＥＫ  ２９３細胞に推奨されるプログラム（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能）を使用して、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）および一本鎖ＤＮＡオリゴ（３〜６μｇ）をトランスフェクトした。
【０７２３】
リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を、２．５μｇのＴｒｕｅＣｕｔ（商標）Ｃａｓ９タンパク質ｖ２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳから入手可能）および１μｇ（約２５ｐＭ）の合成ｇＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）を用いて作製した。合成ｇＲＮＡは、以下の未修飾プロトスペーサー領域：ＵＡＡＡＧＡＵＧＡＵＣＵＣＵＵＡＵＣＵＵ（配列番号５３２６）およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの独自のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでいた。野生型ＨＥＫ  ２９３ゲノムに二本鎖切断を導入するために使用される合成ｇＲＮＡは、ＲＮＰによって認識されるＰＡＭ配列が、所望されるＩＶＳ４０変異がゲノムに導入された後にはもはやＰＡＭ配列として機能しなくなるようにデザインし、これによって、ＨＤＲが成功した細胞のゲノムのさらなる編集を予防した（図４Ａ）。
【０７２４】
ＨＤＲの鋳型として使用した一本鎖ＤＮＡオリゴは、ＧＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＣＣＣＡＣＡＡＴＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴ（配列番号５４９４）であった。
【０７２５】
トランスフェクトした細胞は、トランスフェクション後３〜７日間、培養液中で回復させた。単一細胞を、９６ウェルプレートに自動で選別し、単一細胞からコロニーを生じさせた。ゲノムＤＮＡを、細胞のそれぞれのコロニーから単離し、フォワードプライマーＡＧＴＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＡＴ（配列番号５４９５）およびリバースプライマーＣＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＣ（配列番号５４９６）を使用してＰＣＲ増幅させ、ＰＣＲ産物を、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子における所望されるＣ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ（ＩＶＳ４０）一塩基変異の存在について配列決定した。ＩＶＳ４０変異が両方の対立遺伝子に導入されているいくつかのクローンを単離した（図４Ｂ）。このようにして、本出願者らは、オンターゲット編集実験において使用するのに適した細胞株を生成した。
【０７２６】
（実施例９）
ｓｇＲＮＡ（ＵＳＨ２Ａ  ＭＯ、ＵＳＨ２Ａ  ＭＧ、ＵＳＨ２Ａ  ＭＢ、ＵＳＨ２Ａ  ＭＰ、およびＵＳＨ２Ａ  ＭＲ）の試験
最も低いオフターゲット活性を有することが予測される選択したｇＲＮＡについて、オンターゲット活性を、実施例８において得られたＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞株を使用して、試験した。
【０７２７】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞株を、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの１０％熱不活性化（ＨＩ）ＦＢＳ／９０％  ＤＭＥＭ中に、１ウェル当たり２００，０００個の細胞で播種し、１μｇのｓｇＲＮＡおよび２．５μｇのＳｐＣａｓ９タンパク質を、ＲＮＰ複合体として、ヌクレオフェクトした。
【０７２８】
このアッセイに使用したｓｇＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから、未修飾の合成ｓｇＲＮＡとして購入した。ｓｇＲＮＡは、ＩＶＳ４０変異をターゲティングする（図５Ａ〜５Ｂ、６Ａ、行１〜５）。
【０７２９】
トランスフェクトしたＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞を、対照細胞と比較したが、対照細胞は、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトしたか（ＧＦＰ）（トランスフェクション効率を視覚的に確認するため）、または全くトランスフェクトしなかった、ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞である（データは示されない）。
【０７３０】
トランスフェクションの４８〜９６時間後に、ゲノムＤＮＡを、ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞から採取し、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のＩＶＳ４０変異の周辺をＰＣＲ増幅させた。結果として得られたゲノム特異的ＰＣＲ産物を、それぞれの増幅させたＰＣＲ産物の内部に位置するプライマーを用いて配列決定し、配列を、ＴＩＤＥ分析に供した。ＴＩＤＥは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）によって決定される標的ローカスのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム編集を高速で査定するためのウェブツールである。２つの標準的なキャピラリーシーケンシング反応から得られた定量的配列追跡データに基づいて、ＴＩＤＥソフトウェアは、編集の有効性を定量し、ターゲティングされる細胞プールのＤＮＡにおける優勢な種類の挿入および欠失（インデル）を同定する。詳細な説明および例については、Brinkman  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.  (2014)を参照されたい。
【０７３１】
配列分析により、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＰ（配列番号５３２７を含むｓｇＲＮＡ）が、６９．７％のオンターゲット編集効率を有し、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＯ（配列番号５３２１を含むｓｇＲＮＡ）が、６８．３％のオンターゲット編集効率を有し、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＧ（配列番号５３２３を含むｓｇＲＮＡ）が、８６．４５％のオンターゲット編集効率を有し、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＢ（配列番号５３２５を含むｓｇＲＮＡ）が、８６．３％のオンターゲット編集効率を有し、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＲ（配列番号５３２８を含むｓｇＲＮＡ）が、９１．３％のオンターゲット編集効率を有することが判明した（図５Ｂ）。
【０７３２】
これらのデータは、本明細書に提示されるｇＲＮＡが、変異体ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａローカス内またはその近傍で編集を指示することができるという根拠を提供する。この実施例において試験したｇＲＮＡなどのｇＲＮＡによる編集は、少なくともＮＨＥＪ戦略を介してＩＶＳ４０変異の修正に寄与し得る。
【０７３３】
（実施例１０）
ｓｇＲＮＡ（ＵＳＨ２Ａ  ＭＯ、ＵＳＨ２Ａ  ＭＧ、ＵＳＨ２Ａ  ＭＢ、ＵＳＨ２Ａ  ＭＰ、およびＵＳＨ２Ａ  ＭＲ）の試験
ＩＶＳ４０変異をターゲティングする選択したｇＲＮＡについて、ＵＳＨ２Ａに関して野生型であるＨＥＫ  ２９３細胞におけるオフターゲット活性を決定するために、試験を行った。
【０７３４】
ＨＥＫ  ２９３細胞を、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの１０％  ＨＩＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に、１ウェル当たり２００，０００個の細胞で播種し、１μｇのｓｇＲＮＡおよび２．５μｇのＳｐＣａｓ９タンパク質を、ＲＮＰ複合体として、ヌクレオフェクトした。
【０７３５】
このアッセイに使用したｓｇＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから、未修飾の合成ｓｇＲＮＡとして購入した。ｓｇＲＮＡは、ＩＶＳ４０変異を標的とする（図５Ａ〜Ｂ）
【０７３６】
トランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３細胞を、対照細胞と比較したが、対照細胞は、ＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクトしたか（トランスフェクション効率を視覚的に確認するため）、または全くトランスフェクトしなかった、ＨＥＫ  ２９３細胞（ＵＳＨ２Ａに関して野生型）である（データは示されない）。
【０７３７】
トランスフェクションの４８〜９６時間後に、ゲノムＤＮＡを、ＨＥＫ  ２９３細胞から採取し、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のＩＶＳ４０変異の周辺をＰＣＲ増幅させた。結果として得られたゲノム特異的ＰＣＲ産物を、それぞれの増幅させたＰＣＲ産物の内部に位置するプライマーを用いて配列決定し、配列を、ＴＩＤＥ分析に供した。
【０７３８】
配列分析により、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＰ（配列番号５３２７を含むｓｇＲＮＡ）が、０．７％のオフターゲット編集効率を有し、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＯ（配列番号５３２１を含むｓｇＲＮＡ）が、１．０５％のオフターゲット編集効率を有し、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＧ（配列番号５３２３を含むｓｇＲＮＡ）が、４０．５５％のオフターゲット編集効率を有し、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＢ（配列番号５３２５を含むｓｇＲＮＡ）が、６．６５％のオフターゲット編集効率を有し、ＩＶＳ４０変異を標的とするＵＳＨ２Ａ  ＭＲ（配列番号５３２８を含むｓｇＲＮＡ）が、１．４５％のオフターゲット編集効率を有することが判明した（図５Ｂ）。
【０７３９】
これらのデータは、本明細書に提示されるｇＲＮＡが、最小限の野生型オフターゲット活性を有し得、これらのｇＲＮＡを使用して、特異性を伴ってＩＶＳ４０変異を修正することができるという根拠を提供する。
（実施例１１）
ＳｐＣａｓ９を発現するＨＥＫ  ２９３ＦＴ細胞（ＵＳＨ２Ａに関して野生型）におけるオンターゲット活性についてのｓｇＲＮＡの試験
【０７４０】
実施例９および１０において特徴付けたｇＲＮＡは、ゲノム標的にハイブリダイズしたとき、ＩＶＳ４０変異とオーバーラップするが、ＩＶＳ４０変異の上流または下流のいずれかにハイブリダイズする別の群のｇＲＮＡもまた、本明細書に提示される。最も低いオフターゲット活性を有すると予測されたこの群のｇＲＮＡを、ＳｐＣａｓ９を使用して、野生型ＨＥＫ  ２９３ＦＴ細胞においてオンターゲット編集について試験した。ｇＲＮＡは、ＩＶＳ４０変異の近傍であるがオーバーラップしないＤＮＡ配列に結合するので、本出願者らは、野生型ＨＥＫＦＴ  ２９３細胞においてこれらの実験を行った。
【０７４１】
ＡＡＶＳ１ローカスに組み込まれた構成的プロモーターによって調節されるＳｐＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するこれらのＨＥＫ  ２９３ＦＴ細胞を、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを補充した、１０％  ＨＩ  ＦＢＳ／９０％  ＤＭＥＭ中で培養し、３〜４日間ごとに継代させた。
【０７４２】
ＳｐＣａｓ９を発現するＨＥＫ  ２９３ＦＴ細胞株を、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの１０％  ＨＩＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に、１ウェル当たり５０，０００個の細胞で播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ−Ｍａｘ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳから入手可能）を使用して、１μｇのｓｇＲＮＡをトランスフェクトした。
【０７４３】
このアッセイに使用したｓｇＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって合成した。ｓｇＲＮＡは、ＩＶＳ４０変異の下流または上流の位置を標的とする（図６Ａ〜Ｂ）。
【０７４４】
トランスフェクションの４８時間後に、培養培地を除去し、全ＤＮＡを、ｐｒｅｐＧｅｍ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＶＷＲ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳから入手可能）を使用して抽出した。ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０の一部（ｇＲＮＡが編集する場所）を、ＰＣＲで増幅させた。結果として得られた産物を、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳから入手可能）を使用して、クリーンアップし、配列決定してＣａｓ９に媒介される遺伝子改変を評価した。少ない挿入および欠失（インデル）の頻度を、ＴＩＤＥを使用して予測した。
【０７４５】
ｓｇＲＮＡ（配列番号５２７２〜５３１９のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡ）のＴＩＤＥ分析により、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内のオンターゲット編集効率を決定した（図２Ａ〜Ｂ）。
【０７４６】
配列分析により、ＩＶＳ４０変異の下流の位置を標的とするｓｇＲＮＡが、２４．０〜８９．９％のオンターゲット編集効率を有することが判明した（図６Ａ〜Ｂ）。
【０７４７】
配列分析により、ＩＶＳ４０変異の上流の位置を標的とするｓｇＲＮＡが、２４．３〜９１．３％のオンターゲット編集効率を有することが判明した（図６Ａ〜Ｂ）。
【０７４８】
これらのデータは、本明細書に提示される上流および下流のｇＲＮＡが、ＵＳＨ２Ａローカスにおけるオンターゲット活性を呈し得るという根拠を提供する。このオンターゲット活性は、少なくとも切除戦略および／またはＨＤＲ戦略を介したＩＶＳ４０変異修正に寄与し得る。
（実施例１２）
ＳａＣａｓ９を発現するＫ５６２細胞（ＵＳＨ２Ａに関して野生型）における編集効率についてのｓｇＲＮＡの試験
【０７４９】
ＩＶＳ４０変異の上流または下流のいずれかにハイブリダイズする別の群のｇＲＮＡを、オンターゲット活性に関して試験した。これらのｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９と会合し、遺伝子操作されたＫ５６２細胞において使用した。Ｋ５６２細胞は、誘導性プロモーターによりＳａＣａｓ９タンパク質を発現し、野生型ＵＳＨ２Ａ遺伝子を有する。
【０７５０】
トランスフェクションの４８時間前に、ＳａＣａｓ９を発現する野生型Ｋ５６２細胞を、１〜１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで処理して、ＳａＣａｓ９発現を誘導した。細胞株を、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの１０％  ＦＢＳ／ＩＭＤＭ中に、１ウェル当たり２００，０００個の細胞で播種し、ｓｇＲＮＡをコードする１μｇの全プラスミドをヌクレオフェクトした。
【０７５１】
ｓｇＲＮＡは、ＩＶＳ４０変異の下流または上流の位置を標的とする（図６Ｃ）。
【０７５２】
編集されたＫ５６２細胞を、対照細胞と比較したが、対照細胞は、ＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクトしたか（トランスフェクション効率を視覚的に確認するため）、または全くトランスフェクトしなかった細胞であった（データは示されない）。
【０７５３】
トランスフェクションの４８〜９６時間後に、ゲノムＤＮＡを、Ｋ５６２細胞から採取し、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のＩＶＳ４０変異の周辺をＰＣＲ増幅させた。結果として得られたゲノム特異的ＰＣＲ産物を、それぞれの増幅させたＰＣＲ産物の内部に位置するプライマーを用いて配列決定し、ＴＩＤＥ分析に供した。
【０７５４】
配列分析により、ＩＶＳ４０変異の下流の位置を標的とするｓｇＲＮＡが、１．６７〜１５．５８％のオンターゲット編集効率を有することが判明した（図６Ｃ）。
【０７５５】
配列分析により、ＩＶＳ４０変異の上流の位置を標的とするｓｇＲＮＡが、１．１４〜３０．６１％のオンターゲット編集効率を有することが判明した（図６Ｃ）。
【０７５６】
これらのデータは、本開示の上流および下流のｇＲＮＡが、ＵＳＨ２Ａローカスにおけるオンターゲット活性を呈し得るという根拠を提供する。このオンターゲット活性は、少なくとも切除戦略および／またはＨＤＲ戦略を介したＩＶＳ４０変異修正に寄与し得る。
（実施例１３）
ｐＥＴ０１構築
【０７５７】
本開示によるゲノム編集後のイントロン４０のスプライシングを測定するために、２つのプラスミドを、ｐＥＴ０１から構築した。ｐＥＴ０１を使用して創出した２つのプラスミドは、（１）ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０（配列番号５５２５）および（２）ｐＥＴ０１−ＷＴ（配列番号５５２４）である。
【０７５８】
ｐＥＴ０１（図１２Ａ）は、イントロン配列によって分離したラットプレプロインスリン５’および３’エクソンを含む、プラスミドである。イントロン配列は、多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含む。イントロンには、真核生物エクソンの５’スプライスドナー部位および３’スプライスアクセプター部位が隣接している。３’スプライスアクセプター部位には、３’ポリアデニル化部位（ポリＡ）が続く。ベクターは、原核生物細胞および真核生物細胞における複製のための原核生物および真核生物遺伝子エレメントを含む。このベクター配列の発現は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復（ＬＴＲ）に存在するプロモーター、続いて、真核生物遺伝子の短いストレッチ（ホスファターゼ）によって駆動される。
【０７５９】
ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａのイントロン４０の３１５０ｂｐの領域を、ｐＥＴ０１のＭＣＳへとクローニングして、ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０を創出した。ＵＳＨ２Ａのイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異は、スプライスドナー部位の創出およびＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡへの１５２ｂｐの挿入をもたらし、増幅したＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片が合計３８７個の塩基対となる（図１２Ｂ）。
【０７６０】
野生型配列を含むＵＳＨ２Ａのイントロン４０の３１５０ｂｐの領域を、ｐＥＴ０１のＭＣＳへとクローニングして、ｐＥＴ０１−ＷＴを創出した。ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡは、ｐＥＴ０１−ＷＴから転写され、イントロンが、ｍＲＮＡから除去され、増幅したＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片が合計２３５個の塩基対となる（図１２Ｂ）。
【０７６１】
このように、ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０プラスミドおよびｐＥＴ０１−ＷＴプラスミドから得られた転写物を分析して、ＩＶＳ４０変異の修正およびＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０におけるスプライシングの状態を調査することができる。
（実施例１４）
スプライシングレポーターアッセイ
【０７６２】
本開示によるゲノム編集後のイントロン４０のスプライシングを測定するために、実施例１３において構築した２つのプラスミドから得られた転写物のスプライシングを、ＳｐＣａｓ９を発現するＨＥＫ  ２９３細胞を使用して調査した。
【０７６３】
ＡＡＶＳ１ローカスに組み込まれた構成的プロモーターによって調節されるＳｐＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する野生型ＨＥＫ  ２９３細胞を、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを補充した１０％熱不活性化（ＨＩ）ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で培養し、３〜４日間ごとに継代させた。
【０７６４】
ＳｐＣａｓ９を発現する野生型ＨＥＫ  ２９３細胞株を、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの１０％  ＨＩＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に、１ウェル当たり２００，０００個の細胞で播種し、（１）ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０または（２）ｐＥＴ０１−ＷＴのいずれかを１μｇトランスフェクトし、ＵＳＨ２Ａ  ＭＰ（配列番号５３２７）、ＵＳＨ２Ａ  ＭＯ（配列番号５３２１）、ＵＳＨ２Ａ  ＭＧ（配列番号５３２３）、またはＵＳＨ２Ａ  ＭＢ（配列番号５３２５）のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡを１μｇトランスフェクトした。このアッセイに使用したｓｇＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって合成した。
【０７６５】
トランスフェクションの４８〜１６８時間後に、ＲＮＡを、トランスフェクトした野生型ＨＥＫ  ２９３細胞から採取し、プラスミド転写の産物のみを増幅させる転写物特異的プライマーＧＡＴＣＣＡＣＧＡＴＧＣ（配列番号５４９８）を使用して、ｃＤＮＡへと逆転写した。
【０７６６】
ｃＤＮＡを、次いで、フォワードプライマーＧＧＴＧＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＧ（配列番号５４９９）およびリバースプライマーＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＧＴ（配列番号５５００）を使用して、ＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ産物を、ＲＮＡを分析するために使用されるチップベースのキャピラリー電気泳動装置であるＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳから入手可能）にかけた。
【０７６７】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０およびＵＳＨ２Ａ  ＭＰ（配列番号５３２７）を含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたとき、２３５ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン４）。これらの結果は、ＵＳＨ２Ａのイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異が、編集され、これが、スプライスドナー部位の破壊およびＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片からの１５２ｂｐの除去をもたらし、ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片が合計２３５個の塩基対となることを示す。
【０７６８】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０およびＵＳＨ２Ａ  ＭＯ（配列番号５３２１）を含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたとき、２３５ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン６）。これらの結果は、ＵＳＨ２Ａのイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異が、編集され、これが、スプライスドナー部位の破壊およびＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片からの１５２ｂｐの除去をもたらし、ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片が合計２３５個の塩基対となることを示す。
【０７６９】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０およびＵＳＨ２Ａ  ＭＧ（配列番号５３２３）を含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたとき、２３５ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン８）。これらの結果は、ＵＳＨ２Ａのイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異が、編集され、これが、スプライスドナー部位の破壊およびＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片からの１５２ｂｐの除去をもたらし、ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片が合計２３５個未満の塩基対となることを示す。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒのエラーにより、バンドに下向きのシフトをもたらした可能性がある。
【０７７０】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０およびＵＳＨ２Ａ  ＭＢ（配列番号５３２５）を含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたとき、２３５ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン１０）。これらの結果は、ＵＳＨ２Ａのイントロン４０におけるＩＶＳ４０変異が、編集され、これが、スプライスドナー部位の破壊およびＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片からの１５２ｂｐの除去をもたらし、ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡ断片が合計２３５個の塩基対となることを示す。
【０７７１】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＷＴおよびＵＳＨ２Ａ  ＭＰ（配列番号５３２７）を含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたとき、２３５ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン３）。これらの結果は、ＵＳＨ２Ａ  ＭＰ（配列番号５３２７）を含むｓｇＲＮＡが、野生型配列を含むＵＳＨ２Ａのイントロン４０のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼさないことを示す。
【０７７２】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＷＴおよびＵＳＨ２Ａ  ＭＯ（配列番号５３２１）を含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたとき、２３５ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン５）。これらの結果は、ＵＳＨ２Ａ  ＭＯ（配列番号５３２１）を含むｓｇＲＮＡが、野生型配列を含むＵＳＨ２Ａのイントロン４０のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼさないことを示す。
【０７７３】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＷＴおよびＵＳＨ２Ａ  ＭＧ（配列番号５３２３）を含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたとき、２３５ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン７）。これらの結果は、ＵＳＨ２Ａ  ＭＧ（配列番号５３２３）を含むｓｇＲＮＡが、野生型配列を含むＵＳＨ２Ａのイントロン４０のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼさないことを示す。
【０７７４】
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＷＴおよびＵＳＨ２Ａ  ＭＢ（配列番号５３２５）を含むｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたとき、２３５ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン９）。これらの結果は、ＵＳＨ２Ａ  ＭＢ（配列番号５３２５）を含むｓｇＲＮＡが、野生型配列を含むＵＳＨ２Ａのイントロン４０のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼさないことを示す。
【０７７５】
ＳｐＣａｓ９を発現するトランスフェクトした野生型ＨＥＫ  ２９３ＦＴ細胞を、対照細胞と比較したが、対照細胞は、ＳｐＣａｓ９を発現する野生型ＨＥＫ  ２９３細胞であり、ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０またはｐＥＴ０１−ＷＴをトランスフェクトしたが、いずれのｓｇＲＮＡもトランスフェクトしていないものである。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＷＴをトランスフェクトし、ｓｇＲＮＡをトランスフェクトしなかったとき、２３５ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン１）。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの結果は、野生型ＨＥＫ  ２９３細胞に、ｐＥＴ０１−ＩＶＳ４０をトランスフェクトし、ｓｇＲＮＡをトランスフェクトしなかったとき、３８７ｂｐの産物を示した（図１２Ｃ、レーン２）。
【０７７６】
これらのデータは、本明細書に提示されるｇＲＮＡが、少なくともＮＨＥＪ戦略を介してＩＶＳ４０変異と関連するスプライシング表現型を修正し得るという根拠を提供する。加えて、ｇＲＮＡは、野生型配列を含むＵＳＨ２Ａのイントロン４０では転写物のスプライシングに影響を及ぼさない。
（実施例１５）
オフターゲット活性についての細胞におけるｓｇＲＮＡの試験
【０７７７】
一般に、オフターゲット編集を制限することが望ましい。したがって、ゲノムレベルでオフターゲット編集の程度を決定するために、オンターゲット活性を有することが示されたｇＲＮＡ（またはｓｇＲＮＡ）を、ガイド配列（GUIDE-seq）、アンプリコン配列、および／またはジゲノム配列（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ）を使用して、標的とされるゲノムワイドなオフターゲット編集について試験する。オフターゲット効果は、ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）光受容細胞において試験する。このような方法は、当技術分野において公知であり、例が、本明細書に提示される。
（実施例１６）
ＳｐＣａｓ９を使用した二重ｓｇＲＮＡ編集
【０７７８】
切除戦略をさらに調査するために、ＳｐＣａｓ９と会合し得るｓｇＲＮＡを、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内のＩＶＳ４０変異を欠失させるために、対で使用した（図７Ａ）。「二重ｓｇＲＮＡ編集」とは、ＩＶＳ４０変異の下流の位置を標的とする第１のｓｇＲＮＡおよびＩＶＳ４０変異の上流の位置を標的とする第２のｓｇＲＮＡを指す。
【０７７９】
図７Ｂ〜Ｆは、第１のｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の上流の位置に結合／標的とし、第２のｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の下流の位置に結合／標的とする、二重ｓｇＲＮＡを使用して得られる５つの可能性のある編集結果を示す。５つの可能性のある編集結果としては、次のものが挙げられる：（１）ゲノムＤＮＡが、編集されないままとなる（図７Ｂ）、（２）ゲノムＤＮＡが、ＩＶＳ４０変異の上流の位置またはＩＶＳ４０変異の下流の位置で編集される（図７Ｃ）、（３）ゲノムＤＮＡが、ＩＶＳ４０変異の上流の位置およびＩＶＳ４０変異の下流の位置の両方で編集されるが、編集は、欠失をもたらさない（任意の予測されるインデル以外で）（図７Ｄ）、（４）ゲノムＤＮＡが、ＩＶＳ４０変異の上流の位置およびＩＶＳ４０変異の下流の位置の両方で編集され、編集が、欠失をもたらす（図７Ｅ）、ならびに（５）ゲノムＤＮＡが、ＩＶＳ４０変異の上流の位置およびＩＶＳ４０変異の下流の位置の両方で編集されるが、編集は、欠失をもたらさない。代わりに、編集は、逆転をもたらす（図７Ｆ）。
【０７８０】
欠失産物のサイズ（図７Ｅの場合）および編集効率は、二重ｓｇＲＮＡのそれぞれに重要である。第１のｓｇＲＮＡと第２のｓｇＲＮＡとの間において編集により生成される欠失産物のサイズを、第１のｓｇＲＮＡおよび第２のｓｇＲＮＡのそれぞれについてのＰＡＭ配列の３ヌクレオチド上流に位置する理論上予測されるＤＮＡ切断部位から計算した。ＳｐＣａｓ９と会合する二重ｓｇＲＮＡについては、欠失産物のサイズは、７０〜１４２２ｂｐの範囲に及んだ（表４、図９Ａ）。
【表４】
2021508451.tif 000007
【０７８１】
ＡＡＶＳ１ローカスに組み込まれた構成的プロモーターによって調節されるＳｐＣａｓ９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する野生型ＨＥＫ  ２９３細胞を、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを補充した１０％熱不活性化（ＨＩ）ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で培養し、３〜４日間ごとに継代させた。この実験の野生型ＨＥＫ  ２９３細胞（ＳｐＣａｓ９を発現する）の使用は、二重ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域に結合し、これらの領域が、野生型細胞株とＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞株との間で異ならないため、可能である。ホモ接合性Ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ変異を有する遺伝子操作したＨＥＫ  ２９３細胞（ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞株）を、これらの実験に使用してもよいが、これらの細胞は、ＳｐＣａｓ９を発現しない。
【０７８２】
ＳｐＣａｓ９を発現する野生型ＨＥＫ  ２９３細胞株を、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの１０％  ＨＩＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に、１ウェル当たり２００，０００個の細胞で播種し、ＩＶＳ４０変異の上流の位置を標的とする第１のｓｇＲＮＡを０．５μｇ、ＩＶＳ４０変異の下流の位置を標的とする第２のｓｇＲＮＡを０．５μｇトランスフェクトした。
【０７８３】
このアッセイに使用したＩＶＳ４０変異の上流または下流の位置をターゲティングするｓｇＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒによって合成されたｓｇＲＮＡであった。これらのｓｇＲＮＡは、特異的プロトスペーサー配列およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの独自のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。
【０７８４】
ＳｐＣａｓ９を発現するトランスフェクトした野生型ＨＥＫ  ２９３細胞を、対照細胞と比較したが、対照細胞は、ＳｐＣａｓ９を発現する野生型ＨＥＫ  ２９３細胞であるが、いずれのｓｇＲＮＡもトランスフェクトしていないか、またはＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクトした細胞であった（データは示されない）。
【０７８５】
二重ｓｇＲＮＡを使用する場合には、ＴＩＤＥ分析は、編集効率を測定するのに使用することはできないが、これは、ゲノムＤＮＡの大きな領域が切除され、ＴＩＤＥソフトウェアでは、これらの大きな欠失を定量することができないためである。ＴＩＤＥ分析は、単一のｓｇＲＮＡによって生成されるＤＳＢにより生じるＮＨＥＪにより生成されると予測されるものなど、小さいサイズの欠失および挿入を分析するのにより適している。加えて、二重ｓｇＲＮＡの編集レベルを推定するためのＰＣＲ反応においては、長さが短いＰＣＲ産物の方が好ましく、したがって、編集された細胞の割合は過大推定される。代わりに、第１のｓｇＲＮＡと第２のｓｇＲＮＡとの間の編集により生成される欠失の定量的分析は、ドロップレットデジタル（ｄｄ）ＰＣＲを使用して行うのが最適であり得る。
【０７８６】
トランスフェクションの４８〜９６時間後に、ゲノムＤＮＡを、トランスフェクトした野生型ＨＥＫ  ２９３細胞から採取し、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化させ、７０ｎｇをｄｄＰＣＲに使用した。ｄｄＰＣＲ中に、２つのＰＣＲ産物（第１のＰＣＲ産物および第２のＰＣＲ産物）を、増幅させることができた（図８）。ｄｄＰＣＲの前に粘度を低減させるために、ゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化させたが、これは、２つのＰＣＲ産物のごく近傍もそれらの間の領域も切断するものではない。
【０７８７】
第１のＰＣＲ産物（標的ＰＣＲ産物）を、フォワードプライマーＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＡＡＴＡＡＡ（配列番号５５０１）およびリバースプライマーＧＡＴＧＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣ（配列番号５５０３）を使用して、増幅させた。標的ＰＣＲ産物に、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）ＡＡＴＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＡＧ（配列番号５５０２）で標識したＵＳＨ２Ａ標的プローブを結合させた。編集されていない細胞では、ゲノムＤＮＡの欠失はなく、フォワードプライマーおよびリバースプライマーによってゲノムＤＮＡを増幅させ、標的ＰＣＲ産物を創出し、ＵＳＨ２Ａ標的プローブ（ＴａｑＭａｎ型）により標的ＰＣＲ産物を標識／定量した。編集された細胞では、ゲノムＤＮＡの一部が欠失しており、ＵＳＨ２Ａ標的プローブは、プローブの結合部位が切除されていたため、編集されたＤＮＡに結合することができない。
【０７８８】
第２のＰＣＲ産物（基準ＰＣＲ産物）を、フォワードプライマーＡＣＣＴＡＣＣＴＡＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴＣＡ（配列番号５５０４）およびリバースプライマーＧＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＡＡＴ（配列番号５５０６）を使用して増幅させた。基準ＰＣＲ産物に、２’−クロロ−７’フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＶＩＣ）ＣＴＴＡＧＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＣＡＡＴＧＧＧＣ（配列番号５５０５）で標識したＵＳＨ２Ａ基準プローブによって結合させた。編集された細胞および編集されていない細胞のいずれにおいても、ゲノム領域は影響を受けておらず、フォワードプライマーおよびリバースプライマーにより、ゲノムＤＮＡを増幅させ、基準ＰＣＲ産物を創出し、ＵＳＨ２Ａ基準プローブにより基準ＰＣＲ産物を標識／定量した。この理由のため、基準ＰＣＲ産物の量は、編集細胞と未編集細胞との間で変動するものではない。
【０７８９】
編集されていない細胞では、標的ＰＣＲ産物の、基準ＰＣＲ産物に対する比の比較は、安定しているはずであり、理想的には、１に近い（２つのＰＣＲ産物に類似の増幅効率があることを想定）。編集された細胞では、プローブは、標的ＰＣＲ産物ＤＮＡに結合しないが、これは、ゲノム内の標的部位が切除されているためであり、したがって、標的ＰＣＲ産物の、基準ＰＣＲ産物に対する比は、例えば、編集されていない細胞における比と比較して、減少する。
【０７９０】
ＳｐＣａｓ９に会合する選択した二重ｓｇＲＮＡの編集効率を決定すると、１８．５〜６６．３％の範囲であった（図９Ａ〜Ｂ）。
【０７９１】
これらのデータは、二重ｓｇＲＮＡを使用した、本明細書に提示される切除戦略が、ＩＶＳ４０変異をコードするＤＮＡの欠失を引き起こし得るという根拠を提供する。データは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物のスプライシングが、修正され得ることを示唆する。
（実施例１７）
ＳａＣａｓ９を使用した二重ｓｇＲＮＡ編集
【０７９２】
切除戦略をさらに調査するために、ＳａＣａｓ９と会合し得るｓｇＲＮＡを、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０内のＩＶＳ４０変異を欠失させるために、対で使用した（図７Ａ）。「二重ｓｇＲＮＡ編集」とは、ＩＶＳ４０変異の下流の位置を標的とする第１のｇＲＮＡおよびＩＶＳ４０変異の上流の位置を標的とする第２のｓｇＲＮＡを指す。
【０７９３】
欠失産物のサイズ（図７Ｅの場合）および編集効率は、二重ｓｇＲＮＡのそれぞれに重要である。第１のｓｇＲＮＡと第２のｓｇＲＮＡとの間において編集により生成される欠失産物のサイズを、第１のｓｇＲＮＡおよび第２のｓｇＲＮＡのそれぞれのＰＡＭ配列の３ヌクレオチド上流に位置する理論上予測されるＤＮＡ切断部位から計算した。ＳａＣａｓ９と会合する二重ｓｇＲＮＡについては、欠失産物のサイズは、２１１〜１０７８ｂｐの範囲に及んだ（表５、図１１Ａ）。
【表５−１】
2021508451.tif 000008
【表５−２】
2021508451.tif 000009
【０７９４】
野生型Ｋ５６２細胞は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の２つの野生型対立遺伝子を含み、細胞を、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを安定に発現するように操作した。この実験の野生型Ｋ５６２細胞（ＳａＣａｓ９を発現する）の使用は、二重ｓｇＲＮＡが、ＩＶＳ４０変異の上流および下流の領域に結合し、これらの領域が、野生型細胞株とＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞株との間で異ならないため、可能である。ホモ接合性Ｃ．７５９５−２１４４Ａ＞Ｇ変異（ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞株）を有する遺伝子操作したＨＥＫ  ２９３細胞を、使用してもよいが、これらの細胞は、ＳａＣａｓ９を発現しない。
【０７９５】
トランスフェクションの４８時間前に、ＳａＣａｓ９を発現する野生型Ｋ５６２細胞を、１〜１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリンで処理して、ＳａＣａｓ９発現を誘導した。ＳａＣａｓ９を発現する野生型Ｋ５６２細胞を、次いで、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの１０％  ＦＢＳ／ＩＭＤＭ中に、１ウェル当たり２００，０００個の細胞で播種し、ＩＶＳ４０変異の上流の位置を標的とする第１のｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（図１０、または配列番号５５０７〜５５２２および配列番号５５５１〜５５５７のうちのいずれか１つ）を１μｇ、ＩＶＳ４０変異の下流の位置を標的とする第２のｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（図１０、または配列番号５５０７〜５５２２および配列番号５５５１〜５５５７のうちのいずれか１つ）を１μｇ、ヌクレオフェクトした。
【０７９６】
ＳａＣａｓ９を発現するトランスフェクトした野生型Ｋ５６２細胞を、対照細胞と比較したが、対照細胞は、ＳａＣａｓ９を発現する野生型Ｋ５６２細胞であるが、ｓｇＲＮＡをコードするいずれのプラスミドもトランスフェクトしていない細胞である（データは示されない）。
【０７９７】
トランスフェクトした野生型Ｋ５６２細胞を、トランスフェクションの後、さらに４８〜９６時間、１〜１０μｇ／ｍＬドキシサイクリンで処理した。トランスフェクションの４８〜９６時間後に、ゲノムＤＮＡを、トランスフェクトした野生型Ｋ５６２細胞から採取し、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化させ、４０〜７０ｎｇを、実施例１６に記載されるｄｄＰＣＲ分析に使用した。
【０７９８】
ＳａＣａｓ９と会合するいくつかの二重ｓｇＲＮＡの編集効率を決定すると、８．７〜３０．８％の範囲であった（図１１Ａ〜Ｂ）。
【０７９９】
これらのデータは、二重ｓｇＲＮＡを使用した、本明細書に提示される切除戦略が、ＩＶＳ４０変異をコードするＤＮＡの欠失を引き起こし得るという根拠を提供する。データは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物のスプライシングが、修正されたことを示唆する。
（実施例１８）
ＢＦＰ発現によりスプライシングを測定するための細胞株の構築
【０８００】
ｇＲＮＡおよびＣａｓ９オルソログの複数の組合せ間における直接的な比較を可能にするために、本出願者らは、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）の発現に基づくＢＦＰスプライシングレポーターアッセイをデザインした。ＨＥＫ  ２９３細胞を使用して、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイに必要とされる細胞株を創出した。
【０８０１】
Ｊｕｍｐ−Ｉｎ（商標）ＧｒｉｐＴｉｔｅ（商標）ＨＥＫ  ２９３キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を使用して、レポーター構築物を、ＨＥＫ  ２９３ゲノムに組み込んだ。このキットは、指定されていない部位の細胞ゲノムへのレポーター構築物の組込みを促進するために、Ｒ４インテグラーゼによって標的とすることができるＲ４  ａｔｔＰ部位を含むＨＥＫ  ２９３細胞を含む。インテグラーゼをコードするプラスミドおよびレポーター構築物を保持するように操作された第２のプラスミドを、細胞にコトランスフェクトした。組込み後に、レポーター構築物を含む細胞を、１０μｇ／ｍＬブラストサイジンを使用して選択した。
【０８０２】
組み込まれたレポーター構築物は、ＢＦＰ遺伝子の転写を可能にするために、ＢＦＰ遺伝子に作動可能に連結された、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを含む。ＢＦＰ遺伝子は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０の一部を含む。構築物には２つのバージョンが存在する。第１のバージョン（「野生型バージョン」）は、野生型イントロン４０配列を含む（図１３Ａ）。野生型バージョンは、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイを検証し、構築物がＢＦＰを発現し得ることを確認する機能を果たした（データは示されない）。第２のバージョン（「ＩＶＳ４０変異体バージョン」）は、ＩＶＳ４０変異体イントロン４０配列を含む（図１３Ｂ〜Ｃ）。
【０８０３】
図１３Ｂ〜Ｃは、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイの結果をどのように解釈することができるかについての図を示す。ＩＶＳ４０変異体バージョンの構築物を含む細胞は、検出可能なレベルのＢＦＰを発現しない。ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターは、ＢＦＰ遺伝子の転写を活性化するが、イントロン４０配列におけるＩＶＳ４０変異は、異常なスプライシングおよび隣接するＩＶＳ４０のイントロン配列の包含を引き起こし、これにより、レポーターＢＦＰ遺伝子はフレーム外となる（図１３Ｂ）。しかしながら、本開示によるゲノム編集が、ＩＶＳ４０変異の欠失またはＩＶＳ４０変異内もしくはその近傍における配列の修飾を介して、異常なｍＲＮＡスプライシングを修正するのであれば、ＢＦＰは、フレーム内で翻訳されて、機能性タンパク質が産生され得る（図１３Ｃ）。ＢＦＰ発現を、次いで、フローサイトメトリーまたはタンパク質発現を検出するのに好適な別の方法によって、検出することができる。ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイにより、Ｃａｓ９オルソログおよび対応するｇＲＮＡによって媒介されるゲノム編集の、ＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０変異体スプライシングに対する効果（およびその割合）を間接的に推定することができる。
（実施例１９）
ＳｐＣａｓ９ガイドＲＮＡを使用したＢＦＰスプライシングレポーターアッセイ
【０８０４】
ＳｐＣａｓ９と対にしたｇＲＮＡにより、ＩＶＳ４０変異に起因する異常なスプライシングを修正する能力を試験するために、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイを行った。ＮＨＥＪ戦略および切除戦略の両方を、試験した。
【０８０５】
実施例１８に記載されるＩＶＳ４０変異体バージョンの構築物を含む、実施例１８から得られた、操作されたＨＥＫ  ２９３細胞を、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイで使用した。操作されたＨＥＫ  ２９３細胞を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．３）、および０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を補充した、９０％  ＤＭＥＭ／１０％透析ＦＢＳ中で成長させた。
【０８０６】
一部のアッセイでは、ＩＶＳ４０変異とオーバーラップする単一ｓｇＲＮＡを、使用した。これらのアッセイにより、ＮＨＥＪ戦略を試験した。他のアッセイでは、二重ｓｇＲＮＡを使用した。これらのアッセイにより、切除戦略を試験した。
【０８０７】
単一ｓｇＲＮＡを使用したか二重ｓｇＲＮＡを使用したかにかかわらず、それぞれのｓｇＲＮＡは、（１）Ｕ６プロモーターに作動可能に連結されたｓｇＲＮＡ遺伝子および（２）ニワトリβアクチンプロモーターに作動可能に連結されたＳｐＣａｓ９遺伝子を含む、別個のプラスミド上にコードされた。したがって、単一ｓｇＲＮＡの実験では、細胞に、１つのプラスミドをトランスフェクトし、二重ｓｇＲＮＡの実験では、細胞に、２つのプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を使用した。遺伝子投与量（gene  dosage）の制御のために、２つのプラスミドをトランスフェクトする場合には、それぞれのプラスミドを１μｇトランスフェクトし、単一のプラスミドをトランスフェクトする場合には、２μｇのプラスミドをトランスフェクトした。それぞれのプラスミドは、Ｔ２Ａペプチドを通じてＣａｓ９遺伝子に作動可能に連結されたＧＦＰ遺伝子もコードする。これにより、ＧＦＰシグナルの測定を介したトランスフェクション効率のモニタリングが可能となり得る。
【０８０８】
それぞれのアッセイにおいて、１５０，０００個の細胞にトランスフェクトし、フローサイトメトリーによる蛍光レベル分析の前に、７２時間インキュベートした。編集の陰性対照として、細胞へのＳｐＣａｓ９およびヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０を編集しないスクランブルｓｇＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクションも行った（データは示されない）。結果を、表６および図１４に示す。報告されている値は、総生存細胞のうちのＢＦＰ陽性であるパーセンテージである。すべてのアッセイは、３連で行った。
【表６】
2021508451.tif 000010
【０８０９】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａ  ＭＯをコードするｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３２１を含むｓｇＲＮＡ）を含むプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２２．９％においてＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１０】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａ  ＭＰをコードするｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３２７を含むｓｇＲＮＡ）を含むプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２４．４％においてＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１１】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａ  ＭＲをコードするｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３２８を含むｓｇＲＮＡ）を含むプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１３．８％においてＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１２】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３８７をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２９５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１６．２％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１３】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ２６１をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５２９８を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３８７をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２９５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１１．２％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１４】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３４３をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５２７９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３８７をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２９５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１２．７％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１５】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１７６をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１３．１％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１６】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ２１０をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２９４を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１７．８％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１７】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３４３をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５２７９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ２１０をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２９４を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の８．８％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１８】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１９３をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２７７を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１４．４％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８１９】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ５０５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２７４を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１７．１％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８２０】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３４３をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５２７９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１９３をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２７７を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の９．５％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８２１】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ５８５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２７５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１４．０％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８２２】
これらのデータは、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子に由来する転写物のスプライシングが、本明細書に提示されるＮＨＥＪ戦略または本明細書に提示される切除戦略のいずれかによって修正され得るという根拠を提供し、機能性ＵＳＨ２Ａタンパク質が発現され得ることを示唆する。
（実施例２０）
ＳａＣａｓ９ガイドＲＮＡを使用したＢＦＰスプライシングレポーターアッセイ
【０８２３】
ＳａＣａｓ９と対にしたｇＲＮＡにより、ＩＶＳ４０変異に起因する異常なスプライシングを修正する能力を試験するために、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイを行った。切除戦略を試験した。
【０８２４】
実施例１８に記載されるＩＶＳ４０変異体バージョンの構築物を含む、実施例１８から得られた、操作されたＨＥＫ  ２９３細胞を、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイで使用した。操作したＨＥＫ  ２９３細胞を、実施例１９のように成長させた。二重ｓｇＲＮＡを使用して、切除戦略を試験した。
【０８２５】
それぞれのｓｇＲＮＡは、（１）Ｕ６プロモーターに作動可能に連結されたｓｇＲＮＡ遺伝子および（２）ニワトリβアクチンプロモーターに作動可能に連結されたＳａＣａｓ９遺伝子を含む、別個のプラスミド上にコードした。したがって、細胞には、２つのプラスミド（試験しようとする１対の二重ｓｇＲＮＡのそれぞれに１つのプラスミド）をトランスフェクトした。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を使用した。遺伝子投与量の制御のために、細胞には、それぞれのプラスミドを１μｇずつトランスフェクトした。それぞれのプラスミドは、Ｔ２Ａペプチドを通じてＣａｓ９に作動可能に連結されたＧＦＰ遺伝子もコードする。これにより、ＧＦＰシグナルの測定を介したトランスフェクション効率のモニタリングが可能となり得る。
【０８２６】
それぞれのアッセイにおいて、１５０，０００個の細胞にトランスフェクトし、フローサイトメトリーによる蛍光レベル分析の前に、７２時間インキュベートした。編集の陰性対照として、細胞へのＳａＣａｓ９およびヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０を編集しないスクランブルｓｇＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクションも行った（データは示されない）。結果を、表７および図１５に示す。報告されている値は、総生存細胞のうちのＢＦＰ陽性であるパーセンテージである。すべてのアッセイは、３連で行った。
【表７】
2021508451.tif 000011
【０８２７】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ９３をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４４８を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２７．８％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８２８】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１３４をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５２を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１２７をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４５０を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２２．２％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８２９】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１４０をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５３を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の３５．５％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３０】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１４２をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５４を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の３３．５％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３１】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１４２をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５４を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の３３．５％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３２】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１３４をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５２を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２５．６％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３３】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１９０をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の３５．１％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３４】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１３４をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５２を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ２１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４５７を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２６．６％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３５】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１４０をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５３を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１３１をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４５１を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の３３．２％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３６】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１３４をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５２を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１３１をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４５１を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２７．４％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３７】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１９０をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ２１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４５７を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２４．３％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３８】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１９０をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１３１をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４５１を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２７．７％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８３９】
これらのデータは、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子に由来する転写物のスプライシングが、本明細書に提示される切除戦略によって修正され得るという根拠を提供し、機能性ＵＳＨ２Ａタンパク質が発現され得ることを示唆する。
（実施例２１）
ＳａＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９、およびｇＲＮＡの選択した組合せのＢＦＰスプライシングレポーターアッセイ
【０８４０】
ＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９と対にしたｇＲＮＡにより、ＩＶＳ４０変異に起因する異常なスプライシングを修正する能力を試験するために、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイを行った。これらの実験により、単一の実験から得られたデータを使用して、様々なｇＲＮＡおよびヌクレアーゼの組合せ間での比較を行うことが可能となった。ＮＨＥＪ戦略および切除戦略の両方を、試験した。
【０８４１】
実施例１８に記載されるＩＶＳ４０変異体バージョンの構築物を含む、実施例１８から得られた、操作されたＨＥＫ  ２９３細胞を、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイで使用した。操作したＨＥＫ  ２９３細胞を、実施例１９のように成長させた。
【０８４２】
一部のアッセイでは、ＩＶＳ４０変異とオーバーラップする単一ｓｇＲＮＡを、使用した。これらのアッセイにより、ＮＨＥＪ戦略を試験した。他のアッセイでは、二重ｓｇＲＮＡを使用した。これらのアッセイにより、切除戦略を試験した。
【０８４３】
単一ｓｇＲＮＡを使用したか二重ｓｇＲＮＡを使用したかにかかわらず、それぞれのｓｇＲＮＡは、（１）Ｕ６プロモーターに作動可能に連結されたｓｇＲＮＡ遺伝子および（２）ニワトリβアクチンプロモーターに作動可能に連結されたＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９遺伝子を含む、別個のプラスミド上にコードした。したがって、単一ｓｇＲＮＡの実験では、細胞に、１つのプラスミドをトランスフェクトし、二重ｓｇＲＮＡの実験では、細胞に、２つのプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を使用した。遺伝子投与量の制御のために、２つのプラスミドをトランスフェクトする場合には、それぞれのプラスミドを１μｇトランスフェクトし、単一のプラスミドをトランスフェクトする場合には、２μｇのプラスミドをトランスフェクトした。それぞれのプラスミドは、別個のプロモーターに作動可能に連結されたＧＦＰ遺伝子もコードする。これにより、ＧＦＰシグナルの測定を介したトランスフェクション効率のモニタリングが可能となり得る。ＧＦＰ陽性細胞は、少なくとも１つのプラスミドのトランスフェクションが成功した細胞である。
【０８４４】
トランスフェクションの２４時間前に、１００，０００〜１５０，０００個の細胞を、１ｍＬの培地中に播種した。トランスフェクション後に、細胞を、フローサイトメトリーによる蛍光レベル分析の前に、７２時間インキュベートした。編集の陰性対照として、細胞へのＳａＣａｓ９およびヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のイントロン４０を編集しない非ターゲティングｓｇＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクションも行った。同様の陰性対照を、ＳｐＣａｓ９および非ターゲティングｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを用いて行った。結果を、表８および図１６に示す。報告されている値は、総ＧＦＰ陽性細胞のうちのＢＦＰ陽性であるパーセンテージである。
【表８】
2021508451.tif 000012
【０８４５】
以下のデータが、ＳａＣａｓ９とともに発現されるｓｇＲＮＡについて得られた。
【０８４６】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ベクター骨格陰性対照を含む第１のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の０．０％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８４７】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ９３をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４４８を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の３６．０％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８４８】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１４０をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５３を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の５０．７％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８４９】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１４２をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５４を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の４９．１％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８５０】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１３４をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５２を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の３６．１％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８５１】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１９０をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１１５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４４９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の４８．３％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８５２】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１４０をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５４５３を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１３１をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５４５１を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の４５．８％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８５３】
以下のデータが、ＳｐＣａｓ９とともに発現されるｓｇＲＮＡについて得られた。
【０８５４】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ベクター骨格陰性対照を含む第１のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の０．０％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８５５】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａ  ＭＯをコードするｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３２１を含むｓｇＲＮＡ）を含むプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の３８．０％においてＢＦＰの発現をもたらした。
【０８５６】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａ  ＭＰをコードするｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３２７を含むｓｇＲＮＡ）を含むプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の３５．０％においてＢＦＰの発現をもたらした。
【０８５７】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３８７をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２９５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１７．０％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８５８】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３４３をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５２７９を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３８７をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２９５を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の１１．７％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８５９】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１７６をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２０．５％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８６０】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１９３をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２７７を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２９．２％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８６１】
操作したＨＥＫ  ２９３細胞に、ＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５をコードする第１のｓｇＲＮＡ遺伝子（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）を含む第１のプラスミドおよびＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ５０５をコードする第２のｓｇＲＮＡ（配列番号５２７４を含むｓｇＲＮＡ）を含む第２のプラスミドをトランスフェクトした場合、ＢＦＰレポーターのスプライシングは、ゲノム編集によって修正され、細胞の２７．９％にＢＦＰの発現をもたらした。
【０８６２】
これらのデータは、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子に由来する転写物のスプライシングが、本明細書に提示されるＮＨＥＪ戦略または本明細書に提示される切除戦略のいずれかによって修正され得、機能性ＵＳＨ２Ａタンパク質の発現をもたらすという根拠を提供する。
（実施例２２）
選択したＳｐＣａｓ９  ｇＲＮＡのｄｄＰＣＲアッセイ
【０８６３】
ＳｐＣａｓ９と対にしたｇＲＮＡにより、ＩＶＳ４０変異を修正する能力を試験するために、ドロップレットデジタル逆転写酵素ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）実験を行った。ＮＨＥＪ戦略および切除戦略の両方を、試験した。
【０８６４】
実施例８において生成したＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞株を、これらの実験において使用した。ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞株を、９６ウェルプレートにおいて、２００μｌの１０％熱不活性化（ＨＩ）ＦＢＳ／９０％  ＤＭＥＭ中に、１ウェル当たり２００，０００個の細胞で播種した。
【０８６５】
一部の実験では、単一の非修飾合成ｓｇＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）を使用した。これらの実験により、ＮＨＥＪ戦略を試験した。他の実験では、二重の非修飾合成ｓｇＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）を使用した（二重ｓｇＲＮＡ）。これらの実験により、切除戦略を試験した。
【０８６６】
単一ｓｇＲＮＡを使用した場合、１μｇのｓｇＲＮＡおよび２．５μｇのＳｐＣａｓ９タンパク質を、編集ＲＮＰ複合体として用いて、ヌクレオフェクションを行った。二重ｓｇＲＮＡを使用した場合、０．５μｇのそれぞれのｓｇＲＮＡおよび２．５μｇのＳｐＣａｓ９タンパク質を、編集ＲＮＰ複合体として用いて、ヌクレオフェクションを行った。
【０８６７】
本出願者らは、編集ＲＮＡ複合体（複数可）をトランスフェクトした細胞にｄｄＰＣＲを行おうとした。しかしながら、ＵＳＨ２Ａ遺伝子は、ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞遺伝子バックグラウンドで低いレベルで転写されるため、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の転写活性化は、ｍＲＮＡを単離する前が好ましい。ＵＳＨ２Ａ  ｍＲＮＡの転写を増加させるために、細胞に、ＵＳＨ２Ａ転写活性化複合体をコードする遺伝子を含むプラスミドの２回目の（１回目のトランスフェクションの７２時間後）トランスフェクションを行った。第１のプラスミドは、ｄＣａｓ９バリアント（ヌクレアーゼ活性を不活性化する点変異を含むＣａｓ９タンパク質）をコードする。第２のプラスミドは、ｓｇＲＮＡおよびマウスＮＦ−κＢのｐ６５サブユニット（ｐ６５）のＣ末端部分に融合された、バクテリオファージＭＳ２コーティングタンパク質をコードする。ｓｇＲＮＡは、ＲＮＡ複合体を、ＵＳＨ２Ａ転写開始部位の上流の領域へと導く。
【０８６８】
ｄＣａｓ９は、転写活性化因子ＶＰ６４に融合されている。ｓｇＲＮＡは、２つのＭＳ２  ＲＮＡアプタマーに融合されており、これは、ＭＳ２コーティングタンパク質に融合した転写活性化因子を動員することができる（例えば、ｐ６５、およびＨＳＦ１）。ＲＮＰ複合体が、ＵＳＨ２Ａ転写開始部位の上流でアセンブルされると、融合パートナーおよび細胞タンパク質の活性により、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の転写が活性化され、それによって、事前に編集されたＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞において産生されるｍＲＮＡの量が増加し得る。
【０８６９】
２回目のトランスフェクションの７日後に、ｍＲＮＡを、細胞から単離し、ｃＤＮＡを、逆転写によって調製した。ｃＤＮＡにｄｄＰＣＲを行って、ＩＶＳ４０変異が欠失または修飾されたＵＳＨ２Ａ遺伝子から作製される転写物を、ＩＶＳ４０変異が欠失も修飾もされていないＵＳＨ２Ａ遺伝子から作製される転写物に対して、定量した。
【０８７０】
ｄｄＰＣＲ中に、第１のＰＣＲ産物を、フォワードプライマーＣＣＡＡＣＣＧＴＡＣＡＣＡＧＡＧＴＡＴＡＴＧ（配列番号５５５８）およびリバースプライマーＣＴＴＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡ（配列番号５５５９）を使用して増幅させることができる。第１のＰＣＲ産物は、図１７Ａに示され、ＩＶＳ４０変異が欠失も修飾もされていないＵＳＨ２Ａ遺伝子から転写されたｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡから産生される。第１のＰＣＲ産物は、第１のプローブ（図１７Ａにおける「変異体特異的プローブ」）によって結合され得る。第１のプローブは、２’−クロロ−７’フェニル−１，４−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＶＩＣ）で標識され、配列ＡＧＴＡＧＡＴＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＣ（配列番号５５６０）を含む。
【０８７１】
ｄｄＰＣＲ中に、第２のＰＣＲ産物を、フォワードプライマーＣＣＡＡＣＣＧＴＡＣＡＣＡＧＡＧＴＡＴＡＴＧ（配列番号５５５８）およびリバースプライマーＣＴＴＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡ（配列番号５５５９）を使用して増幅させることができる。第２のＰＣＲ産物は、図１７Ｂに示され、ＩＶＳ４０変異が欠失または修飾されているＵＳＨ２Ａ遺伝子から転写されたｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡから産生される。第２のＰＣＲ産物は、第２のプローブ（図１７Ｂにおける「野生型特異的プローブ」）によって結合され得る。第２のプローブは、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識され、配列ＡＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＡＧ（配列番号５５６１）を含む。ｄｄＰＣＲ中に検出された、総シグナルに対する第１のＶＩＣ標識したプローブに由来するものの割合は、ＩＶＳ４０変異が欠失も修飾もされていないＵＳＨ２Ａ遺伝子から産生されたｍＲＮＡの画分に対応する（修正されていないＵＳＨ２Ａ転写物％、図１８）。ｄｄＰＣＲ中に検出された、総シグナルに対する第２のＦＡＭで標識されたプローブに由来するものの割合は、ＩＶＳ４０変異が欠失または修飾されているＵＳＨ２Ａ遺伝子から産生されたｍＲＮＡの画分に対応する（修正されたＵＳＨ２Ａ転写物％、図１８）。
【０８７２】
結果を、表９および図１８に示す。
【表９】
2021508451.tif 000013
【０８７３】
以下のデータは、二重ｓｇＲＮＡを用いた切除戦略を使用した場合に得られた。
【０８７４】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、第１の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１７６（配列番号５２９０を含むｓｇＲＮＡ）および第２の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の７７．５％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８７５】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、第１の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ２１０（配列番号５２９４を含むｓｇＲＮＡ）および第２の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の６７．３％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８７６】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、第１の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３８７（配列番号５２９５を含むｓｇＲＮＡ）および第２の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ７１５（配列番号５３００を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の７７．６％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８７７】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、第１の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ１９３（配列番号５２７７を含むｓｇＲＮＡ）および第２の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３４３（配列番号５２７９を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の６２．６％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８７８】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、第１の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３８７（配列番号５２９５を含むｓｇＲＮＡ）および第２の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３４３（配列番号５２７９を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の７７．４％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８７９】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、第１の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ５０５（配列番号５２７４を含むｓｇＲＮＡ）および第２の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３４３（配列番号５２７９を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の４８．５％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８８０】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、第１の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ５８５（配列番号５２７５を含むｓｇＲＮＡ）および第２の合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａｍｕｔ＿Ｔ３４３（配列番号５２７９を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の７１．９％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８８１】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、ＲＮＰ複合体なしで疑似トランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の１．０％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８８２】
以下のデータは、単一ｓｇＲＮＡを用いたＮＨＥＪ戦略を使用した場合に得られた。
【０８８３】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａ  ＭＰ（配列番号５３２７を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の９０．７％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８８４】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａ  ＭＯ（配列番号５３２１を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の８９．８％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８８５】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａ  ＭＧ（配列番号５３２３を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の３７．４％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８８６】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａ  ＭＢ（配列番号５３２５を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の４３．３％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８８７】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、合成ｓｇＲＮＡであるＵＳＨ２Ａ  ＭＲ（配列番号５３２８を含むｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の８４．１％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８８８】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、ＧＦＰプラスミド対照をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の１．９％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８８９】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ対照をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の４．１％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８９０】
ＩＶＳ４０  ＵＳＨ２Ａ変異体細胞に、ＭＯＣトランスフェクション対照をトランスフェクトした場合、ＵＳＨ２Ａ転写物の３．０％が、ＩＶＳ４０変異によって引き起こされる異常なイントロン配列（偽エクソン）を含まなかった。
【０８９１】
これらのデータは、ＩＶＳ４０変異を含むＵＳＨ２Ａ遺伝子に由来する転写物のスプライシングが、本明細書に提示されるＮＨＥＪ戦略または本明細書に提示される切除戦略のいずれかによって修正され得、機能性ＵＳＨ２Ａタンパク質の発現をもたらすという根拠を提供する。
（実施例２３）
オンターゲット活性およびオフターゲット活性についての細胞におけるガイドＲＮＡの試験
【０８９２】
本明細書に提示されるｇＲＮＡをさらに評価するために、選択したｇＲＮＡを、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のホモ接合性ＩＶＳ４０変異を有するヒト患者由来の不死化線維芽細胞において、オンターゲット活性についてさらに試験することができる。
【０８９３】
ＵＳＨ２Ａ遺伝子の対立遺伝子にホモ接合性ＩＶＳ４０変異を有する患者から、皮膚生検を得て、不死化細胞株を創出する。不死化細胞株に、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９（またはｓｇＲＮＡおよび／もしくはＣａｓ９をコードする核酸）をトランスフェクトする。ＮＨＥＪ戦略および切除戦略の両方を、試験する。編集された細胞におけるＵＳＨ２Ａ転写物の標的とされたゲノム欠失および／またはスプライシングの分析を、本明細書に記載されるｄｄＰＣＲによって行う。結果は、本開示によるゲノム編集が、ＩＶＳ４０変異を修正し、患者由来の細胞において機能性ＵＳＨ２Ａタンパク質の発現をもたらす能力を示し得る。
【０８９４】
同様の試験を、健常なヒト志願者から得られた不死化細胞において行って、本開示のｇＲＮＡのオフターゲット活性を分析する。
（実施例２４）
他のｇＲＮＡの試験
【０８９５】
例えば、ＡＵＡＵＧＡＵＧＡＵＡＧＵＡＵＵＡＵ（配列番号５４４３）などの他のスペーサー配列を含む、追加のｓｇＲＮＡを、本明細書に記載される実施例における実験に対応する実験などの実験を使用して、試験する。配列番号５４４３は、図２Ｇに見出されるスペーサー配列であり、標的ＤＮＡ配列（５’−３’）は、図２Ｈに見出され、ｓｇＲＮＡが結合する標的ＤＮＡ配列の逆鎖（５’−３’）は、図２Ｉに見出される。
【０８９６】
例えば、オンターゲットおよびオフターゲット活性は、本明細書に記載される細胞株および方法を使用して決定される。そのようなｓｇＲＮＡの、ＵＳＨ２Ａ  ＩＶＳ４０スプライシング欠陥を修正する能力を、ＢＦＰスプライシングレポーターアッセイ（実施例１８〜２１において例証）および／またはｄｄＰＣＲアッセイ（実施例２２において例証）を使用して、試験する。そのような配列が編集に使用される能力を確認するために、さらなる試験を、患者由来の細胞（実施例２３）において行う。他のスペーサー配列を含むｓｇＲＮＡを、互いと対にするか、または本明細書に提示される他のｓｇＲＮＡと対にして、二重ｓｇＲＮＡとして使用することができる。他のスペーサー配列を含むｓｇＲＮＡを、単一のｓｇＲＮＡとして使用してもよい。
（実施例２５）
ＨＤＲ遺伝子編集の異なるアプローチの試験
【０８９７】
オンターゲット活性およびオフターゲット活性についてｇＲＮＡを試験することに加えて、ＨＤＲ戦略を試験する。
【０８９８】
ＨＤＲ戦略については、ドナーＤＮＡ鋳型は、短い一本鎖オリゴヌクレオチド、短い二本鎖オリゴヌクレオチド（インタクトなＰＡＭ配列／変異したＰＡＭ配列）、長い一本鎖ＤＮＡ分子（インタクトなＰＡＭ配列／変異したＰＡＭ配列）、または長い二本鎖ＤＮＡ分子（インタクトなＰＡＭ配列／変異したＰＡＭ配列）として提供される。一部の例では、ドナーＤＮＡ鋳型は、ＡＡＶによって送達される。
【０８９９】
これらの結果は、様々なＨＤＲ遺伝子編集戦略の有効性を示し、有効な構築物および戦略を選択するために使用される。
（実施例２６）
リードＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナー組合せの再評価
【０９００】
一部の場合には、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ＤＮＡドナーの組合せを、欠失の効率、組換え、およびオフターゲット特異性について、細胞において再評価する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡまたはＲＮＰを、送達用脂質ナノ粒子中に製剤化し、ｓｇＲＮＡを、ナノ粒子中に製剤化するかまたは組換えＡＡＶ粒子として送達し、ドナーＤＮＡを、ナノ粒子中に製剤化するかまたは組換えＡＡＶ粒子として送達する。
【０９０１】
これらのデータは、例えば、ＨＤＲ遺伝子編集戦略の、製剤化の有効性を示す。
（実施例２７）
関連する動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの試験
【０９０２】
本明細書において同定された選択したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの組合せを、動物モデル、例えば、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）およびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験する。加えて、製剤を、ヒトドナーから得られたヒト眼において試験する。
【０９０３】
例示的な例についての注釈
【０９０４】
本開示は、本開示の様々な例および／またはその潜在的適用を例示する目的のために様々な具体的な態様の説明を提供するが、変形および改変が当業者に想起されることが理解される。したがって、本明細書で説明する発明（単数または複数）は、少なくともそれらが請求されるのと同程度に広いものであり、本明細書で提供される特定の例示的な例により、より狭く定義されるものではないと理解されるべきである。
【図１Ａ】
2021508451.tif 000014
【図１Ｂ】
2021508451.tif 000015
【図２Ａ】
2021508451.tif 000016
【図２Ｂ】
2021508451.tif 000017
【図２Ｃ】
2021508451.tif 000018
【図２Ｄ】
2021508451.tif 000019
【図２Ｅ】
2021508451.tif 000020
【図２Ｆ】
2021508451.tif 000021
【図２Ｇ】
2021508451.tif 000022
【図２Ｈ】
2021508451.tif 000023
【図２Ｉ】
2021508451.tif 000024
【図２Ｊ】
2021508451.tif 000025
【図２Ｋ】
2021508451.tif 000026
【図２Ｌ】
2021508451.tif 000027
【図３】
2021508451.tif 000028
【図４Ａ】
2021508451.tif 000029
【図４Ｂ】
2021508451.tif 000030
【図５Ａ】
2021508451.tif 000031
【図５Ｂ】
2021508451.tif 000032
【図６Ａ】
2021508451.tif 000033
【図６Ｂ】
2021508451.tif 000034
【図６Ｃ】
2021508451.tif 000035
【図７Ａ】
2021508451.tif 000036
【図７Ｂ】
2021508451.tif 000037
【図７Ｃ】
2021508451.tif 000038
【図７Ｄ】
2021508451.tif 000039
【図７Ｅ】
2021508451.tif 000040
【図７Ｆ】
2021508451.tif 000041
【図８】
2021508451.tif 000042
【図９Ａ】
2021508451.tif 000043
【図９Ｂ】
2021508451.tif 000044
【図１０】
2021508451.tif 000045
【図１１Ａ】
2021508451.tif 000046
【図１１Ｂ】
2021508451.tif 000047
【図１２Ａ】
2021508451.tif 000048
【図１２Ｂ】
2021508451.tif 000049
【図１２Ｃ】
2021508451.tif 000050
【図１３Ａ】
2021508451.tif 000051
【図１３Ｂ】
2021508451.tif 000052
【図１３Ｃ】
2021508451.tif 000053
【図１４】
2021508451.tif 000054
【図１５】
2021508451.tif 000055
【図１６】
2021508451.tif 000056
【図１７Ａ】
2021508451.tif 000057
【図１７Ｂ】
2021508451.tif 000058
【図１８】
2021508451.tif 000059
【配列表】
2021508451000001.app
【国際調査報告】
2021508451.tif 000060
2021508451.tif 000061
2021508451.tif 000062