(57)【要約】  本発明は、健康な機能的ミトコンドリアで富化された幹細胞、これらの細胞を含む医薬組成物、および疾患が後天性ミトコンドリア機能障害に関連する場合もしない場合もある筋疾患、障害、およびそれらの症状を治療するためにそれらを使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を必要とするヒト患者において、かかる治療に使用するための医薬組成物であって、前記組成物が、細胞の生存能力を支援することができる薬学的に許容可能な液体培地中、前記患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５〜２×１０７個のヒト幹細胞を含み、前記ヒト幹細胞は、凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、前記筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリアタンパク質をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされるミトコンドリア病または障害ではない、医薬組成物。
【請求項２】
前記富化が、百万個の細胞あたり少なくとも０．０８８〜最大１７６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を前記幹細胞に導入することを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記富化が、百万個の細胞あたり０．８８〜最大１７．６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量と前記幹細胞を接触させることを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記健康なヒト外因性ミトコンドリアが、同系または同種異系である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記疾患または障害が、後天性ミトコンドリア機能障害に関連している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記疾患または障害が、後天性ミトコンドリア機能障害に関連していない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記疾患または障害が、筋ジストロフィー、筋消耗疾患、心筋症、心筋虚血、炎症性ミオパシー、および中毒性ミオパシーからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記症状が、筋力低下、歩行困難、階段を登ることの困難、筋痙攣、硬直、攣縮、高トリグリセリドレベル、高総コレステロールレベル、および高ＶＬＤＬコレステロールレベルからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記医薬組成物が、筋に直接投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物が、全身投与によって投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記患者の体重１キログラムあたり約１０６個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ヒトミトコンドリアで富化された合計約５×１０５〜５×１０９個のヒト幹細胞を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞が、ミトコンドリア富化前の前記幹細胞における対応するレベルと比較して、
（ｉ）増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、
（ｉｉ）増加したＣＳ活性レベル、
（ｉｉｉ）増加したＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択された少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の含有量、
（ｉｖ）増加したＯ２消費率、
（ｖ）増加したＡＴＰ産生率、または
（ｖｉ）それらの任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ヒト幹細胞が、前記外因性ミトコンドリアで富化される前の前記患者から得られるかまたは由来する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ヒト幹細胞が、前記外因性ミトコンドリアで富化される前の前記患者とは異なるドナーから得られるかまたは由来する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ドナーが、少なくとも部分的に前記患者とＨＬＡ適合する、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ヒト幹細胞が、造血幹細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ヒト幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ヒト幹細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ヒト幹細胞が、ＣＤ３４＋である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ヒト幹細胞が、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを前記ヒト幹細胞に導入する前に、少なくとも１回の凍結−解凍サイクルを受けている、請求項２〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ヒト幹細胞が、骨髄、脂肪組織、口腔粘膜、皮膚線維芽細胞、血液、または臍帯血の細胞から単離されるか、由来するか、または得られる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアが、胎盤、培養で成長させた胎盤細胞、または血液細胞から単離されるかまたは得られる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ヒト幹細胞が、前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアでの富化後に、少なくとも１回の凍結−解凍サイクルを受けている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアが、前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％を構成する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアが、前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも１０％を構成する、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
非富化幹細胞、巨核球、赤血球、肥満細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
筋疾患もしくは筋障害、またはそれらの症状の治療を必要とする患者において、それらを治療するための方法であって、前記方法が、前記患者に医薬組成物を非経口投与するステップを含み、前記医薬組成物が、少なくとも約５×１０５〜５×１０９個のヒト幹細胞を含み、前記ヒト幹細胞が、凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、前記筋疾患または障害が、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリアタンパク質をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされるミトコンドリア病または障害ではない、方法。
【請求項２９】
前記医薬組成物の前記投与が、筋に直接行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬組成物の前記投与が、全身投与によるものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヒト幹細胞が、前記外因性ミトコンドリアで富化される前の前記患者から得られるかまたは由来する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記ヒト幹細胞が、前記外因性ミトコンドリアで富化される前の前記患者とは異なるドナーから得られるかまたは由来する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ドナーが、少なくとも部分的に前記患者とＨＬＡ適合する、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記患者と前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞との間の有害な免疫原性反応を防止、遅延、最小化、または無効化する薬剤を前記患者に投与するステップをさらに含む、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記有害な免疫原性反応が、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能的ミトコンドリアで富化された幹細胞、ならびにヒトにおける筋肉および心臓に関連する疾患、障害、および状態を治療するためのミトコンドリア増強療法を使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
筋疾患は、人間の筋系に影響を与える疾患および障害のいずれかに関わるために使用される一般的な用語である。ミオパシーは、筋線維が適切に機能せず、筋力低下を生じさせる筋の疾患である。これは、神経（「神経障害」または「神経原性」疾患）または他の場所（例えば、脳）とは対照的に、原発欠損が筋内にあることを示唆する。筋肉の痙攣、硬直、および攣縮もミオパシーと関連付けられ得る。筋疾患は、本質的に神経筋または筋骨格として分類することができる。筋炎などの一部の状態は、神経筋および筋骨格の両方と見なすことができる。
【０００３】
筋疾患の原因には、外傷、損傷または酷使（捻挫、筋違え、痙攣、けいれんまたは腱炎）、遺伝性疾患（筋ジストロフィーなど）、癌、炎症（筋炎）、筋肉に影響を与える神経の疾患（神経筋疾患）、感染症、およびある特定の薬剤が含まれる。
【０００４】
ミトコンドリア病は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の突然変異によって引き起こされる遺伝的に異質なグループの障害であり、広範囲の重症度および表現型を示す（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ  Ｃｈａｌｋｉａ，Ｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０１３；５：ａ０２１２２０）。ｍｔＤＮＡ関連疾患の有病率は、人口約８５００人に１人であるが（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８３，２５４−２６０，２００８）が、これまでのところ、支持療法を除けば、大部分のミトコンドリア病に対して効果的な治療はない。様々な治療が臨床試験で評価されているものの、画期的な結果を導いたものはない（Ｋａｎａｂｕｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１７１，１７９８−１８１７，２０１４）。
【０００５】
本発明者らに対するＷＯ２０１３／０３５１０１は、ミトコンドリア組成物およびそれを使用する治療方法に関し、部分的に精製された機能的なミトコンドリアの組成物、および組成物を使用して、組成物を必要とする対象に組成物を投与することによってミトコンドリア機能の増加から恩恵を受ける病態を治療する方法を開示する。
【０００６】
ＷＯ２０１６／００８９３７は、ドナー細胞の集団から単離されたミトコンドリアのレシピエント細胞の集団への細胞間移動のための方法に関する。本方法は、ある量のミトコンドリアの移動の改善された有効性を示す。
【０００７】
ＵＳ２０１２／０１０７２８５は、細胞のミトコンドリア増強を対象としている。ある特定の実施形態には、幹細胞を改変する方法、または改変された幹細胞を少なくとも１つの生体組織に投与する方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明者らに対するＷＯ２０１６／１３５７２３は、機能的ミトコンドリアで少なくとも５０％富化されたヒト骨髄細胞、それらの産生方法、およびかかる細胞を利用する治療方法に関する。
【０００９】
筋疾患、例えば、ミトコンドリア病とは関係のない筋疾患の療法の分野では、効果的かつ長期的な療法が長い間必要とされてきた。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の原理に従い、健康で機能的なミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞が、筋疾患または障害に罹患している対象に導入される。このプロセスは、一般に「ミトコンドリア増強療法」と称され、これらの幹細胞内の健康で機能的なミトコンドリアの数を増加させるものである。健康で機能的なミトコンドリアで富化された幹細胞は、筋関連の疾患および障害を患う患者に投与されて、筋疾患または障害に関連付けられる症状の緩和をもたらし、筋機能を改善する。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、後天性ミトコンドリア機能障害に関連している。他の実施形態では、疾患または障害は、後天性ミトコンドリア機能障害に関連していない。
【００１１】
本発明は、健康な機能的ミトコンドリアで富化された幹細胞を用いた、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異によって引き起こされる先天性疾患であるピアソン症候群（ＰＳ）を有する若年者の単回の治療が、筋機能に関係するパラメーターを含む様々なパラメーターを大きく改善するのに十分であったという発見に一部基づく。
【００１２】
理論や機序に制限されるものではないが、ミトコンドリアを増強したヒト幹細胞の全身投与により、患者の筋内のミトコンドリア活性が強化され、この強化が、ミトコンドリアＤＮＡ突然変異から直接的または間接的に由来する筋関連の症状を含むＰＳの症状の重症度を改善したと仮定される。
【００１３】
本発明は、一態様では、筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を、かかる治療を必要とするヒト患者において行うための方法を提供し、本方法は、患者に医薬組成物を非経口投与するステップを含み、医薬組成物は、少なくとも約５×１０５〜５×１０９個のヒト幹細胞を含み、ヒト幹細胞は、凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリア分子をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされるミトコンドリア病または障害ではない。
【００１４】
別の態様では、本発明は、筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を必要とするヒト患者において、かかる治療に使用するための医薬組成物を提供し、本組成物は、細胞の生存能力を支援することができる薬学的に許容可能な液体培地中、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５〜２×１０７個のヒト幹細胞を含み、ヒト幹細胞は、凍結解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリアタンパク質をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【００１５】
いくつかの実施形態では、富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．０８８〜最大１７６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。
【００１６】
さらなる実施形態では、富化は、百万個の細胞あたり０．８８〜最大１７．６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量と幹細胞を接触させることを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、単離されたミトコンドリアの用量は、所望の濃度でレシピエント細胞に添加される。ミトコンドリアドナー細胞の数とミトコンドリアレシピエント細胞の数との比率は、２：１（ドナー細胞対レシピエント細胞）を超える比率である。典型的な実施形態では、比率は、少なくとも５、あるいは少なくとも１０以上である。特定の実施形態では、ミトコンドリアが収集されるドナー細胞とレシピエント細胞との比率は、少なくとも２０、５０、１００、またはおそらくさらに高い。各可能性は、別個の実施形態である。
【００１８】
ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、同系または同種異系である。ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、同系である。ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、自家、すなわち、同じ母系血統である。ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、同種異系である。
【００１９】
ある特定の実施形態では、疾患または障害は、後天性ミトコンドリア機能障害に関連している。他の実施形態では、疾患または障害は、後天性ミトコンドリア機能障害に関連していない。
【００２０】
ある特定の実施形態では、疾患または障害は、筋ジストロフィー、筋消耗疾患、心筋症、心筋虚血、炎症性ミオパシー、および中毒性ミオパシーからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２１】
ある特定の実施形態では、症状は、筋力低下、歩行困難、階段を登ることの困難、筋痙攣、硬直、および攣縮からなる群から選択される。一部の場合には、追加の病的症状には、高トリグリセリドレベル、高総コレステロールレベル、および高ＶＬＤＬコレステロールレベルが含まれ得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２２】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与によって投与される。
【００２３】
代替的な実施形態では、医薬組成物は、筋に直接投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、心臓に直接投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、大動脈、肺動脈幹、右または左肺動脈、右冠動脈、左主冠状動脈、上大静脈、下大静脈、右または左肺静脈、大心臓静脈、中心臓静脈、小心臓静脈、または前心臓静脈に直接投与される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２４】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５〜２×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり約１０６個以上のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ヒトミトコンドリアで富化された合計約５×１０５〜５×１０９のヒト幹細胞を含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、ミトコンドリア富化前の幹細胞における対応するレベルと比較した（ｉ）増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、（ｉｉ）増加したＣＳ活性レベル、（ｉｉｉ）増加したＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択された少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の含有量、（ｉｖ）増加したＯ２消費率、（ｖ）増加したＡＴＰ産生率、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２６】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、外因性ミトコンドリアで富化される前に、患者から得られるかまたは由来する。
【００２７】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、外因性ミトコンドリアで富化される前の患者とは異なるドナーから得られるかまたは由来する。ある特定の実施形態では、幹細胞のドナーは、少なくとも部分的に患者とＨＬＡ適合する。ある特定の実施形態では、上記の方法は、患者とミトコンドリア富化ヒト幹細胞との間の有害な免疫原性反応を防止、遅延、最小化、または無効化する薬剤を患者に投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、有害な免疫原性反応は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ＣＤ３４＋である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、造血幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、間葉系幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【００２９】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、ヒト幹細胞を単離する、由来する、または得る前ステップ、および健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入し、したがってミトコンドリア富化ヒト幹細胞を産生する前ステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）ヒト幹細胞を凍結すること、（ｂ）ヒト幹細胞を解凍すること、および（ｃ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入することを含む。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、骨髄の細胞から単離されるか、由来するか、または得られる。他の実施形態では、ヒト幹細胞は、脂肪組織、口腔粘膜、皮膚線維芽細胞、血液、または臍帯血から単離されるか、由来するか、または得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３０】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを該ヒト幹細胞に導入する前に、少なくとも１回の凍結−解凍サイクルを受けている。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを凍結すること、（ｂ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを解凍すること、および（ｃ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入することを含む。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、骨髄、脂肪組織、口腔粘膜、皮膚線維芽細胞、血液、または臍帯血の細胞から単離されるか、由来するか、または得られる。ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、胎盤、培養で成長させた胎盤細胞、または血液細胞から単離されるかまたは得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３１】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化された後、少なくとも１回の凍結−解凍サイクルを受けている。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を凍結し、（ｂ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を解凍してから、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を患者に投与する追加ステップをさらに含む。
【００３２】
ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％を構成する。ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも１０％を構成する。
【００３３】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非富化幹細胞、巨核球、赤血球、肥満細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３４】
本発明は、別の態様では、筋疾患または障害を治療することに使用するための、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞をさらに提供する。
【００３５】
本発明は、別の態様では、上記のような筋疾患または障害を治療することに使用するための健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞を治療有効量含む医薬組成物をさらに提供する。
【００３６】
ある特定の実施形態では、上記の医薬組成物は、筋疾患もしくは筋障害またはその症状を治療することに使用するためのものであり、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によって、または例えばタンパク質もしくはペプチドなどのミトコンドリア分子をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【００３７】
本発明は、患者に上記の医薬組成物を投与することを含む、筋疾患もしくは筋障害またはその症状を治療することを必要とする患者においてそれらを治療するための方法をさらに提供し、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によって、または例えばタンパク質もしくはペプチドなどのミトコンドリア分子をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者には明らかとなるため、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるものの、単に例示として与えられているにすぎないことを理解されたい。従来および伝統的なアプローチのさらなる制限および不利な点は、かかるシステムを、図面を参照して本出願の残りの部分に記載される本発明のいくつかの態様と比較することによって、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】健康な機能的野生型（ミトコンドリアＣ５７ＢＬマウスの肝臓から単離）で富化された幹細胞の投与から１日後、１週後、および１ヶ月後のマウスの骨髄における突然変異ｍｔＤＮＡ（ＦＶＢ／Ｎ  ｍｔＤＮＡ）の量を図示する棒グラフである。
【図２】ＭＡＴの３ヶ月後までのマウスの心臓におけるＣ５７ＢＬ  ｍｔＤＮＡの量による生体内分布を図示する棒グラフである。白色の棒および関連する点は増強された骨髄の試料を示し、灰色の棒は対照である。
【図３Ａ】本発明によって提供される、ピアソン症候群（ＰＳ）患者の異なる治療段階のスキームである。
【図３Ｂ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のＭＥＴスコアを図示する棒グラフである。
【図３Ｃ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の体重および身長の標準偏差スコアを図示する折れ線グラフである。
【図３Ｄ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のアルカリホスファターゼレベルを図示する折れ線グラフである。
【図３Ｅ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の血中乳酸レベルを図示する棒グラフである。
【図４】細胞あたりの正常なｍｔＤＮＡの数を表す１８ＳゲノムＤＮＡと比較した、欠失領域（各患者）のデジタルＰＣＲによって測定され、ベースラインごとに正規化された、療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療された３人のＰＳ患者（Ｐｔ．１、Ｐｔ．２、およびＰｔ．３）の正常なｍｔＤＮＡ含有量を図示する折れ線グラフである。
【図５Ａ】本発明によってさらに提供される、ピアソン症候群（ＰＳ）患者の異なる治療段階の別のスキームである。
【図５Ｂ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の血中乳酸レベルを図示する棒グラフである。
【図５Ｃ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の立ち上がり（ｓｉｔ−ｔｏ−ｓｔａｎｄ）スコアを図示する棒グラフである。
【図５Ｄ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の６分間の歩行試験スコアを図示する棒グラフである。
【図５Ｅ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の３回の連続反復（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）の力量計スコアを図示する棒グラフである。
【図５Ｆ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のリンパ球におけるＡＴＰレベルを図示する棒グラフである。
【図６Ａ】本発明によってさらに提供される、ピアソン症候群（ＰＳ）患者の異なる治療段階のまた別のスキームである。
【図６Ｂ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のトリグリセリド、総コレステロール、およびＶＬＤＬコレステロールレベルを図示する棒グラフである。
【図６Ｃ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の血中乳酸レベルを図示する棒グラフである。
【図６Ｄ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の立ち上がりスコアを図示する折れ線グラフである。
【図６Ｅ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の６分間の歩行試験スコアを図示する折れ線グラフである。
【図７Ａ】ミトコンドリア富化ＢＭ細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ対照、１×１０６個の細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル（対照、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）で処理された１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの開放地行動試験成績を図示する折れ線グラフを示す。図７Ａは、開放地試験中に移動した距離の定量化を示す。図７Ｂは中央期間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）、図７Ｃは壁持続時間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）を示す。
【図７Ｂ】ミトコンドリア富化ＢＭ細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ対照、１×１０６個の細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル（対照、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）で処理された１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの開放地行動試験成績を図示する折れ線グラフを示す。図７Ａは、開放地試験中に移動した距離の定量化を示す。図７Ｂは中央期間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）、図７Ｃは壁持続時間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）を示す。
【図７Ｃ】ミトコンドリア富化ＢＭ細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ対照、１×１０６個の細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル（対照、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）で処理された１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの開放地行動試験成績を図示する折れ線グラフを示す。図７Ａは、開放地試験中に移動した距離の定量化を示す。図７Ｂは中央期間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）、図７Ｃは壁持続時間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）を示す。
【図８Ａ】ミトコンドリア強化骨髄（ＢＭ）細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ、１×１０６細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル溶液（ＶＥＨＩＣＬＥ、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）のいずれかを投与され処置された１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＲｏｔａｒｏｄ試験を図示する棒グラフを示す。示される結果は、治療前のものと、治療の１ヶ月および３ヶ月後のものである。図８Ａは、示される時点での様々な処理試験群のＲｏｔａｒｏｄスコア（秒（秒）単位）である。図８Ｂは、示される時点での様々な処理試験群のＲｏｔａｒｏｄスコア（ベースラインからのパーセンテージとして示される）である。
【図８Ｂ】ミトコンドリア強化骨髄（ＢＭ）細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ、１×１０６細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル溶液（ＶＥＨＩＣＬＥ、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）のいずれかを投与され処置された１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＲｏｔａｒｏｄ試験を図示する棒グラフを示す。示される結果は、治療前のものと、治療の１ヶ月および３ヶ月後のものである。図８Ａは、示される時点での様々な処理試験群のＲｏｔａｒｏｄスコア（秒（秒）単位）である。図８Ｂは、示される時点での様々な処理試験群のＲｏｔａｒｏｄスコア（ベースラインからのパーセンテージとして示される）である。
【図９Ａ】ミトコンドリア強化骨髄（ＢＭ）細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ、１×１０６細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル溶液（ＶＥＨＩＣＬＥ、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）のいずれかを投与され処置された１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの強さ試験を図示する棒グラフを示す。示される結果は、治療前のものと、治療の１ヶ月および３ヶ月後のものである。図９Ａ〜９Ｂは、握力（力）（ｇまたはベースラインからの変化％）であり、図９Ｃ〜９Ｄは、握力時間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）である。
【図９Ｂ】ミトコンドリア強化骨髄（ＢＭ）細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ、１×１０６細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル溶液（ＶＥＨＩＣＬＥ、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）のいずれかを投与され処置された１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの強さ試験を図示する棒グラフを示す。示される結果は、治療前のものと、治療の１ヶ月および３ヶ月後のものである。図９Ａ〜９Ｂは、握力（力）（ｇまたはベースラインからの変化％）であり、図９Ｃ〜９Ｄは、握力時間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）である。
【図９Ｃ】ミトコンドリア強化骨髄（ＢＭ）細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ、１×１０６細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル溶液（ＶＥＨＩＣＬＥ、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）のいずれかを投与され処置された１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの強さ試験を図示する棒グラフを示す。示される結果は、治療前のものと、治療の１ヶ月および３ヶ月後のものである。図９Ａ〜９Ｂは、握力（力）（ｇまたはベースラインからの変化％）であり、図９Ｃ〜９Ｄは、握力時間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）である。
【図９Ｄ】ミトコンドリア強化骨髄（ＢＭ）細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ、１×１０６細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル溶液（ＶＥＨＩＣＬＥ、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）のいずれかを投与され処置された１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの強さ試験を図示する棒グラフを示す。示される結果は、治療前のものと、治療の１ヶ月および３ヶ月後のものである。図９Ａ〜９Ｂは、握力（力）（ｇまたはベースラインからの変化％）であり、図９Ｃ〜９Ｄは、握力時間（時間（秒）またはベースラインからの変化％）である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
健康な機能的外因性ミトコンドリアをロードされたヒト幹細胞が、多様な病因のミトコンドリア病および障害を患う患者の器官、組織、および細胞への健康な機能的ミトコンドリアのインビボ全身送達を達成できることがここで初めて示された。
【００４１】
理論または機序に限定されるものではないが、機能的外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に進入し、それによってそれらのミトコンドリアの活性およびエネルギー産生を増加させることができるという仮説がここで立てられる。かかる細胞は、仮定上、循環を介して遠位器官に到達し、それらの機能的ミトコンドリアの少なくとも一部を他の器官の細胞に移送し得る。
【００４２】
再び理論または機序に限定されるものではないが、以下に記載の増強された幹細胞が損傷または罹患した器官に補充され、例えば、ミトコンドリア移送、種々の因子の分泌、分化などのいずれかによってそれらの機能を改善するという仮説がここでさらに立てられる。
【００４３】
より具体的には、驚くべきことに、ミトコンドリア増強療法を受けた自家幹細胞による若年のピアソン症候群（ＰＳ）患者の単回の治療は、多岐にわたる有害なＰＳ関連性およびＰＳ非依存性症状を顕著に改善するのに十分であることがわかった。
【００４４】
本発明は、一態様では、筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を、かかる治療を必要とする対象患者において行うための方法を提供し、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリア分子をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではなく、本方法は、複数の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与するステップを含み、これらの幹細胞は、健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化されている。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象であり、幹細胞は哺乳動物幹細胞である。ある特定の実施形態では、対象はヒト対象であり、幹細胞はヒト幹細胞である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を、かかる治療を必要とするヒト患者において行うための方法を提供し、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリア分子をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではなく、本方法は、複数のヒト幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与するステップを含み、これらのヒト幹細胞は、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化されている。
【００４６】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「ミトコンドリア病」および「原発性ミトコンドリア病」という用語は、交換可能に使用され得る。「ミトコンドリア病」および「原発性ミトコンドリア病」という用語は、ミトコンドリアＤＮＡの既知のもしくは明白な病原性突然変異によって、または遺伝子産物がミトコンドリアに取り込まれる核ＤＮＡの遺伝子の突然変異によって診断される先天性ミトコンドリア病を指す。「筋疾患または障害が原発性ミトコンドリア病ではない」という句は、筋疾患または障害が、ミトコンドリアＤＮＡの既知のもしくは明白な病原性突然変異によって、または遺伝子産物がミトコンドリアに取り込まれる核ＤＮＡの遺伝子の突然変異によって最初に診断されないことを意味する。本発明の治療の目的である筋疾患または障害は、ミトコンドリア分子をコードするミトコンドリアまたは核ＤＮＡのコード領域の突然変異または一群の突然変異に作動可能に関連している必要はない。
【００４７】
いくつかの実施形態では、筋疾患または障害は、後天性ミトコンドリア機能障害に関連している。他の実施形態では、疾患または障害は、後天性ミトコンドリア機能障害に関連していない。いくつかの実施形態では、筋疾患または障害は、続発性ミトコンドリア機能障害に関連している。他の実施形態では、筋疾患または障害は、続発性ミトコンドリア機能障害に関連していない。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「続発性ミトコンドリア機能障害」および「後天性ミトコンドリア機能障害」という用語は交換可能に使用され、多くの非原発性ミトコンドリア病に付随し得、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）タンパク質の機能も産生もコードしない遺伝子によって引き起こされてもよい、後天性ミトコンドリア機能障害を指す。続発性ミトコンドリア機能障害は、酸化ストレスを引き起こし得る環境要因によっても引き起こされ得る。
【００４９】
別の態様では、本発明は、筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を必要とするヒト患者において、かかる治療に使用するための医薬組成物を提供し、本組成物は、細胞の生存能力を支援することができる薬学的に許容可能な液体培地中、複数のヒト幹細胞を含み、ヒト幹細胞は、凍結解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリアタンパク質をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【００５０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５〜４×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５〜２×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも５×１０５〜１．５×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０６〜１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５個または少なくとも１０６個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、合計少なくとも５×１０５〜最大５×１０９個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、合計少なくとも１０６〜最大１０９個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、合計少なくとも２×１０６〜最大５×１０８個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。
【００５１】
ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒトミトコンドリアは、自家または同種異系である。ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒトミトコンドリアは、自家である。ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒトミトコンドリアは、同種異系である。
【００５２】
ある特定の実施形態では、筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を、かかる治療を必要とするヒト患者において行うための方法を提供し、本方法は、複数のヒト幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与するステップを含み、これらのヒト幹細胞は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異がなく、かつ核ＤＮＡによってコードされる突然変異したミトコンドリアタンパク質がない、健康で機能的な自家または同種異系ミトコンドリアで富化され、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリア分子（タンパク質、ペプチド、核酸、および同様のものなど）をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【００５３】
いくつかの実施形態では、筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を、かかる治療を必要とするヒト患者において行うための方法が提供され、本方法は、複数のヒト幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与するステップを含み、これらのヒト幹細胞は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異がない健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたは核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「方法」という用語は、所与の課題を達成するための様式、手段、技法、および手順を指し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学、医学の関係者によって、既知であるか、既知の様式、手段、技法、および手順から容易に発展されるかのいずれかである、様式、手段、技法、および手順を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、疾患または状態に関連するかまたは誘導される少なくとも１つの症状の縮小、軽減、または寛解を含む。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語はまた、防止的（例えば、予防的）、姑息的、および治癒的治療を含む。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤を含む任意の組成物を指す。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語はさらに、例えば、治療、予防、診断、防止、または予後の作用のために対象に送達される活性医薬成分を含む組成物を指す。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語はさらに、ヒト幹細胞を含む任意の組成物を指し、任意選択で、細胞が生存可能な状態に維持される培地または担体をさらに含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、活性医薬成分および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性のあるあらゆるすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は凍結される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は解凍される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は投与前に解凍される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は投与の最大２４時間前に解凍される。ある特定の実施形態では、富化されたヒト幹細胞は、医薬組成物中の唯一の活性成分である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な薬剤」という用語は、例えば、生細胞（複数可）、組織（複数可）、器官（複数可）、およびヒト（複数可）などの生物学的システムにおいて応答を誘発することができる任意の分子を指す。本発明による生物学的に活性な薬剤の非限定的な例には、細胞、無傷ミトコンドリア、ミトコンドリアＤＮＡ、およびミトコンドリアタンパク質が含まれる。本発明の原理によれば、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がない健康な機能的ヒトミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞は、生物学的に活性な薬剤である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「筋疾患または筋障害」という句は、筋肉、例えば心臓への損傷またはその疾患を指す。
【００５９】
遺伝的異常に関連するまたはそれによって引き起こされる疾患について、本発明の方法および組成物は、原因となる病状を治療するのではなく、疾患の症状を軽減するのに有用となることを明確に理解されたい。
【００６０】
「治療有効量」または「有効量」という用語は、治療された患者に治療効果を与えるために必要とされる活性剤または組成物の量を指す。有効用量は、例えば、投与経路、賦形剤の使用、および他の治療的処置との併用の可能性に応じて、当業者によって認識されるように変化することになる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、一般に、任意のヒト幹細胞を指す。幹細胞は、他の種類の細胞に分化することができ、分裂してほぼ同じ種類の幹細胞を産生することができる未分化細胞である。幹細胞は、全能性または多能性のいずれかであり得る。本明細書で使用される場合、「ヒト幹細胞」という用語は、一般に、ヒトに自然に見出されるすべての幹細胞、およびエクスビボで産生または誘導され、ヒトと適合性のあるすべての幹細胞を指す。幹細胞のような「前駆細胞」は、特定の種類の細胞に分化する傾向があるが、すでに幹細胞よりも特異的であり、その「標的」細胞に分化させられる。幹細胞と前駆細胞の最も重要な違いは、幹細胞は無制限に複製することができるのに対し、前駆細胞は限られた回数しか分裂することができないことである。本明細書で使用される場合、「ヒト幹細胞」という用語は、「前駆細胞」および「完全に分化していない幹細胞」をさらに含む。
【００６２】
本発明の原理によれば、幹細胞は、それら中のミトコンドリアの数および／または機能を増加させるために、必要としている患者に投与される前に、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで濃縮される。いかなる理論または機構に限定されることなく、投与された幹細胞におけるミトコンドリアの数および／または機能の増加は、ヒト患者において初めて本明細書に例示される様々な治療作用に関与している。本明細書で使用される場合、「富化」という用語は、哺乳動物細胞の、ミトコンドリア含有量、例えば、無傷のミトコンドリアの数、またはミトコンドリアの機能を増加させるように設計された任意の作用を指す。特に、機能的ミトコンドリアで富化された幹細胞は、富化前の同じ幹細胞と比較して、ミトコンドリア機能の強化を示すことになる。本明細書で使用される場合、「富化」という用語は、ヒト細胞の、ミトコンドリア含有量、例えば、無傷の機能的で健康なミトコンドリアの数を増加させる、エクスビボで実行される任意の作用をさらに指す。本発明の原理によれば、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に導入され、したがってこれらの細胞を健康な機能的ヒトミトコンドリアで富化する。かかる富化はヒト幹細胞のミトコンドリア含有量を変化させることを理解するべきである。ナイーブヒト幹細胞は、実質的に、宿主／自家／内因性ミトコンドリアの１つの集団を有するが、外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞は、実質的に、宿主／自家／内因性ミトコンドリアの１つの集団と、導入されたミトコンドリアの別の集団（すなわち、外因性ミトコンドリア）とのミトコンドリアの２つの集団を有する。よって、「濃縮された」という用語は、外因性ミトコンドリアを受け取った／組み込んだ後の細胞の状態に関する。ミトコンドリアの２つの集団間の数および／または比率を決定することは、２つの集団がいくつかの態様、例えばミトコンドリアＤＮＡにおいて異なり得るため、簡単である。したがって、「健康な機能性ヒトミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞」という句は、「内因性ミトコンドリアと健康な機能的外因性ミトコンドリアとを含むヒト幹細胞」という句と等しい。例えば、全ミトコンドリアの１％および３３％の健康な機能的外因性ミトコンドリアを含むヒト幹細胞は、それぞれ、９９：１の比率および６７：３３の比率の宿主／自家／内因性ミトコンドリアおよび健康な機能的外因性ミトコンドリアを含むと見なされる。例えば、「全ミトコンドリアの３％」は、富化後、元の（内因性）ミトコンドリア含有量が全ミトコンドリアの９７％であり、導入された（外因性）ミトコンドリアが全ミトコンドリアの３％であることを意味し、これは（３／９７＝）３．１％の富化と等しい。別の例として、「全ミトコンドリアの３３％」は、富化後、元の（内因性）ミトコンドリア含有量が全ミトコンドリアの６７％であり、導入された（外因性）ミトコンドリアが全ミトコンドリアの３３％であることを意味し、これは（３３／６７＝）４９．２％の富化と等しい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞」という句は、健康な機能的ミトコンドリアを含むヒト幹細胞を指し、健康な機能的ミトコンドリアは、ヒト幹細胞とは異なる起源のものである、すなわち、これらのミトコンドリアは、外因性の供給源から得られる／由来する／単離されると理解されるべきである。ヒト幹細胞内の「外因性」、「外来性」、または「非原型」の健康な機能的ミトコンドリアの存在は、これらの細胞が該ミトコンドリアで富化されるという証拠として働く。平均的な当業者であれば、当技術分野に周知の方法に基づいて、ヒト幹細胞が異なる起源からの外因性同種異系ミトコンドリアを含むことを決定する方法を知っているであろう（例えば、Ｚａｎｄｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．Ｉｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１７，Ｖｏｌ．２９，２４２−２４９ページを参照されたい）。かかる方法は、ヒト幹細胞内または複数のヒト幹細胞内の異なるミトコンドリア集団間の、例えば遺伝的差異に基づき得る。例えば、ヒトでは、ミトコンドリアＤＮＡは３７個の遺伝子をコードするため（Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０６）：４５７−６５）、ｍｔＤＮＡを配列決定することにより、ヒト幹細胞または複数のヒト幹細胞におけるｍｔＤＮＡの１つ、２つ以上の異なる集団の存在を容易に決定することができる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、ヒト幹細胞を該健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアとインキュベートした後に、ミトコンドリア富化幹細胞を洗浄することを含む。このステップは、細胞片またはミトコンドリア膜の残遺物および幹細胞に入らなかったミトコンドリアを実質的に欠いているミトコンドリア富化幹細胞の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、洗浄は、ヒト幹細胞を該健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアとインキュベートした後に、ミトコンドリア富化幹細胞を遠心分離することを含む。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む医薬組成物は、遊離ミトコンドリア、すなわち、幹細胞に入らなかったミトコンドリア、または他の細胞片から分離される。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む医薬組成物は、検出可能な量の遊離ミトコンドリアを含まない。
【００６５】
「健康な機能的ミトコンドリア」、「健康な機能的ヒトミトコンドリア」、「健康な機能的外因性ミトコンドリア」、「健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリア」、「ミトコンドリアＤＮＡまたはミトコンドリアタンパク質の病原性突然変異がない健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリア」、および「ミトコンドリアＤＮＡまたはミトコンドリア分子の病原性突然変異がない健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリア」という用語は、交換可能に使用され、正常な非病原レベルの活性を示すミトコンドリアを指してもよい。ミトコンドリアの活性は、テトラメチルローダミンエチルエステル過塩素酸塩（ＴＭＲＥ）染色、Ｏ２消費、ＡＴＰ産生、およびＣＳ活性レベルなど、当技術分野で周知の様々な方法で測定することができる。
【００６６】
ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞は、異なる起源の健康な機能的ミトコンドリアの混合物を含む。ある特定の実施形態では、健康な機能的ミトコンドリアの混合物の起源のうちの１つは、ヒト幹細胞の起源と同じである。ある特定の実施形態では、健康な機能的ミトコンドリアの混合物の起源のうちのいずれも、ヒト幹細胞の起源ではない。ある特定の実施形態では、健康な機能的ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞は、ヒト幹細胞の起源とは異なる単一起源の健康な機能的ミトコンドリアを含む。
【００６７】
健康な機能的外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入すると、これらの細胞中の健康な機能性ミトコンドリアの総数／含有量が増加し得るため、本明細書で使用される「健康な機能的ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞」という句は、ある特定の実施形態では、幹細胞からの内因性であるか、異なる供給源もしくは起源からの外因性であるかのいずれかである、増加した量の健康な機能的ミトコンドリアを含むヒト幹細胞を指す。
【００６８】
「健康なミトコンドリア」または「機能的ミトコンドリア」という用語は、正常に機能しているミトコンドリアを指す。「健康なミトコンドリアＤＮＡ」または「正常なミトコンドリアＤＮＡ」という用語は、ミトコンドリアの正常な機能に影響を与える突然変異を含まないミトコンドリアＤＮＡを指す。本明細書で使用される場合、「機能的ミトコンドリア」という用語は、正常な非病原レベルの活性を示すミトコンドリアを指す。ミトコンドリアの活性は、膜電位、Ｏ２消費、ＡＴＰ産生、およびＣＳ活性レベルなど、当技術分野で周知の様々な方法で測定することができる。「機能的ミトコンドリア」および「健康なミトコンドリア」という用語は、交換可能に使用され、さらに、正常なｍｔＤＮＡ、正常なレベルの酸素消費およびＡＴＰ産生を示すパラメーターを呈するミトコンドリアを指す。
【００６９】
ミトコンドリアＤＮＡの突然変異と疾患または障害との関係に関して「関連付けられる」という用語は、概して、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異が、疾患または障害の症状のうちの少なくとも１つについて、直接的にまたは間接的に、単独でまたは他の因子と組み合わせて、任意の生物学的機序により、少なくとも部分的に原因となることを意味する。本明細書で使用される場合、「突然変異」という用語は、ＤＮＡによってコードされる分子、例えば、ＲＮＡ分子またはタンパク質分子の構造および／または機能に影響を与える欠失、挿入、または点突然変異を指す。
【００７０】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異または核ＤＮＡの病原性突然変異は、ミトコンドリア分子をコードする遺伝子にはない。ある特定の実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異または核ＤＮＡの病原性突然変異は、ミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子にはない。ある特定の実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異または核ＤＮＡの病原性突然変異は、ミトコンドリア酵素をコードする遺伝子にはない。ある特定の実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異または核ＤＮＡの病原性突然変異は、ミトコンドリアペプチドをコードする遺伝子にはない。ある特定の実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異または核ＤＮＡの病原性突然変異は、ミトコンドリアＲＮＡ分子をコードする遺伝子にはない。
【００７１】
ある特定の実施形態では、疾患または障害は、心筋虚血、心筋症、炎症性ミオパシー、および中毒性ミオパシーからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７２】
ある特定の実施形態では、症状は、体重増加不能、筋力低下、低血中アルカリホスファターゼレベル、高血中乳酸レベル、高トリグリセリドレベル、高総コレステロールレベル、高ＶＬＤＬコレステロールレベル、およびリンパ球中の低ＡＴＰ含有量からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。症状を「高」および「低」と定義することは、それぞれ「正常より検出可能に高い」および「正常より検出可能に低い」に対応し、正常レベルは、複数の健康な対象における対応するレベルであることを理解されたい。
【００７３】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、単一の起源のミトコンドリアＤＮＡを実質的に含む。ある特定の実施形態では、幹細胞は、単一のミトコンドリアＤＮＡハログループのミトコンドリアを実質的に含む。ヒト遺伝学では、「ヒトミトコンドリアＤＮＡハプログループ」という用語は、ヒトミトコンドリアＤＮＡの差異によって定義されるハプログループを指すように使用される。本明細書で使用される場合、「ハプログループ」という用語は、母系で共通の祖先を共有する人々の遺伝的集団群をさらに指す。ミトコンドリアハプログループは、シーケンシングによって決定される。
【００７４】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、２つ以上の起源のミトコンドリアＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞は、２つ以上のミトコンドリアＤＮＡハプログループのミトコンドリアを含む。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ハプログループＪおよびハプログループＶからなる群から選択されるミトコンドリアＤＮＡハプログループの機能的ミトコンドリアを含む。
【００７５】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、筋に直接投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、心臓に直接投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、大動脈、肺動脈幹、右または左肺動脈、右冠動脈、左主冠状動脈、上大静脈、下大静脈、右または左肺静脈、大心臓静脈、中心臓静脈、小心臓静脈、または前心臓静脈に直接投与される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７６】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０４、少なくとも１×１０５、少なくとも１×１０６、または少なくとも１×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０４個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約１×１０４〜約１×１０８個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、１×１０４〜１×１０９、１×１０５〜１×１０９、１×１０６〜１×１０９、または１×１０７〜１×１０９個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０５個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１０５個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。
【００７７】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者に静脈内投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内注入によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１×１０５、少なくとも１×１０６、または少なくとも１×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約１×１０６〜約１×１０８個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０５、少なくとも１×１０６、または少なくとも１×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり約１×１０５〜約１×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。
【００７８】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、（ｉ）宿主（内因性）ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡのレベル、（ｉｉ）クエン酸シンターゼのレベルもしくはクエン酸シンターゼ活性のレベル、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との両方によって決定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７９】
ある特定の実施形態では、本方法は、治療有効量の患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０４個の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、治療有効量の患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０５個の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、治療有効量の患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０６個の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、本方法は、治療有効量の患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０４〜約１×１０８個の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、治療有効量の患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０５〜約１×１０７個の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、治療有効量の患者の体重１キログラムあたり少なくとも約５×１０４〜約５×１０６個の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００８１】
ある特定の実施形態では、本方法は、治療有効量の患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０４〜約４×１０８個の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、治療有効量の患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０５〜約４×１０７個の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、治療有効量の患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１×１０６〜約４×１０６個の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。
【００８２】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、外因性機能的ミトコンドリアで富化される前に、患者自身から得られるかまたは由来する。
【００８３】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、外因性ミトコンドリアによる細胞の富化前に、患者とは異なるドナーから得られるかまたは由来する。ある特定の実施形態では、ドナーは、少なくとも部分的に患者とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合する。ある特定の実施形態では、上記の方法は、患者とミトコンドリア富化ヒト幹細胞との間の有害な免疫原性反応を防止、遅延、最小化、または無効化する薬剤を患者に投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、有害な免疫原性反応は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。
【００８４】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、無制限に増殖することができ、また体内に複数の細胞型を生じさせることができる細胞、例えば神経細胞を指す。全能性幹細胞は、体内の他のすべての細胞型を生じさせることができる細胞である。胚性幹細胞（ＥＳＣ）は全能性幹細胞であり、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は多能性幹細胞である。本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」という用語は、ヒト成体体細胞から生成することができる一種の多能性幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは非胚性幹細胞である。いくつかの実施形態に従い、ヒト胚性幹細胞は、特許請求の範囲から明示的に除外されることを理解されたい。本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する一種の全能性幹細胞を指す。
【００８５】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、それらの起源に関係なく、ＣＤ３４陽性であると特徴付けられる幹細胞を指す。この用語はさらに、幹細胞から得られるか、または骨髄から動員されるか、または臍帯血から得られるＣＤ３４陽性であると特徴付けられる造血幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、表面マーカータンパク質ＣＤ３４を発現する細胞を意味する。ＣＤ３４の発現は、ＣＤ３４に対する抗体を使用した免疫蛍光分析またはＦＡＣＳ分析によって決定することができる。ＣＤ３４抗原としても知られる造血前駆細胞抗原ＣＤ３４は、ヒトではＣＤ３４遺伝子によってコードされているタンパク質である。
【００８６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、臍帯細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、骨髄細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、造血細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、間葉系幹細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、内皮前駆細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、血管の内皮細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、肥満細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、亜集団樹状細胞（第ＸＩＩＩａ因子陰性である）である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ヒトＨＳＣ細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、患者に対してＨＬＡ適合である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、患者とＨＬＡ適合である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、患者に対して自家である。
【００８７】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、脂肪組織、口腔粘膜、末梢血、または臍帯血から由来する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態において、幹細胞は、骨髄細胞から由来する。本明細書で使用される場合、「骨髄細胞」という用語は、一般に、ヒトの骨髄に自然に見出されるすべてのヒト細胞、およびヒトの骨髄に自然に見出されるすべての細胞集団を指す。「骨髄幹細胞」という用語は、骨髄から由来する幹細胞集団を指す。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「骨髄造血細胞」という用語は、骨髄造血、例えば、骨髄およびそれから生じるすべての細胞、すなわち、すべての血液細胞の産生に関与する細胞を指す。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「赤血球生成細胞」という用語は、赤血球生成、例えば、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））の産生に関与する細胞を指す。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「多能性造血幹細胞」または「造血芽細胞」という用語は、造血のプロセスを通じて他のすべての血液細胞を生じさせる幹細胞を指す。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「一般的な骨髄系前駆細胞」という用語は、骨髄系細胞を生成する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「一般的なリンパ球系前駆細胞」という用語は、リンパ球を生成する細胞を指す。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」という用語は、神経細胞、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）（軟骨細胞（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｅｌｌ））、筋細胞（筋肉細胞）、および脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）（脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ））を含む、様々な細胞型に分化することができる、多能性間質細胞を指す。
【００９３】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非富化幹細胞、巨核球、赤血球、肥満細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含んでもよい。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９４】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、ヒト幹細胞を単離する、由来する、または得る前ステップ、および健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入し、したがってミトコンドリア富化ヒト幹細胞を産生する前ステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）ヒト幹細胞を凍結すること、（ｂ）ヒト幹細胞を解凍すること、および（ｃ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入することを含む。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、骨髄、脂肪組織、口腔粘膜、皮膚線維芽細胞、血液、または臍帯血の細胞から単離されるか、由来するか、または得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９５】
いくつかの実施形態では、上記の方法は、健康な機能的外因性ミトコンドリアを細胞に導入する前に、ヒト幹細胞からＣＤ３４陽性細胞を選択するステップをさらに含む。ＣＤ３４陽性細胞の選択は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳまたはＰｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の方法によって行うことができる。
【００９６】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを好適な供給源から単離または得る前ステップ、および健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入し、したがってミトコンドリア富化ヒト幹細胞を産生する前ステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを凍結するステップ、（ｂ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを解凍するステップ、および（ｃ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入するステップを含んでもよい。ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、胎盤、培養で成長させた胎盤細胞、または血液細胞を含むがこれらに限定されない好適な供給源から単離されるかまたは得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９７】
本発明の原理によれば、ヒト幹細胞を富化する前に健康な機能的外因性ミトコンドリアを凍結する可能性は、例えば、ヒト幹細胞を富化する前に、健康な機能的外因性ミトコンドリアの機能性および／もしくはある特定の属性を試験するのに十分な時間を提供する、ならびに健康な機能的外因性ミトコンドリアの貯蔵期間を延長する、かつ／または健康な機能的外因性ミトコンドリアを容易に分布させることができるため、ミトコンドリア増強療法プロセスにとって重要である。
【００９８】
いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、凍結−解凍サイクルを受けていない対照ミトコンドリアと比較して、解凍後に同等の酸素消費率を示す。
【００９９】
いくつかの実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、該機能的ミトコンドリアを解凍前に少なくとも２４時間凍結することを含む。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、該機能的ミトコンドリアを解凍前に少なくとも１ヶ月間、解凍前に数ヶ月以上凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクル後の機能的ミトコンドリアの酸素消費量は、凍結−解凍サイクル前の機能的ミトコンドリアの酸素消費量と等しいかまたはそれよりも高い。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「凍結−解凍サイクル」という用語は、機能的ミトコンドリアを０℃を下回る温度に凍結し、ミトコンドリアを０℃を下回る温度で所定の期間維持し、ミトコンドリアを室温または体温またはミトコンドリアによる幹細胞の処理を可能にする０℃超の任意の温度に解凍することを指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「室温」という用語は、典型的には、１８℃〜２５℃の温度を指す。本明細書で使用される場合、「体温」という用語は、３５．５℃〜３７．５℃、好ましくは３７℃の温度を指す。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、機能的ミトコンドリアである。
【０１０１】
別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも−７０℃以下の温度で凍結された。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも−２０℃以下の温度で凍結された。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも−４℃以下の温度で凍結された。別の実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、漸進的である。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、瞬間凍結による。本明細書で使用される場合、「瞬間凍結」という用語は、ミトコンドリアを低温貯蔵温度に供することによって急速に凍結することを指す。
【０１０２】
別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも３０分間凍結された。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、機能的ミトコンドリアを解凍前に少なくとも３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０分間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、４８、７２、９６、または１２０時間凍結された。各凍結時間は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも４、５、６、７、３０、６０、１２０、３６５日間凍結された。各凍結時間は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、解凍前に機能的ミトコンドリアを少なくとも１、２、３週間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、解凍前に機能的ミトコンドリアを少なくとも１、２、３、４、５、６ヶ月間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０３】
別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも３０分間−７０℃で凍結された。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、ミトコンドリアを凍結し、それらを長期間後に解凍する可能性は、長期間の貯蔵後でも再現性のある結果をもって、ミトコンドリアの容易な貯蔵および使用を可能にする。
【０１０４】
一実施形態によれば、解凍は、室温である。別の実施形態では、解凍は、体温である。別の実施形態によれば、解凍は、本発明の方法によるミトコンドリアの投与を可能にする温度である。別の実施形態によれば、解凍は、漸進的に実行される。
【０１０５】
別の実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、凍結緩衝液中で凍結された。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、単離緩衝液中で凍結された。本明細書で使用される場合、「単離緩衝液」という用語は、本発明のミトコンドリアが単離されている緩衝液を指す。非限定的な例では、単離緩衝液はスクロース緩衝液である。いかなる機構または理論によっても拘束されることを望むものではないが、単離緩衝液中でミトコンドリアを凍結すると、凍結前に単離緩衝液を凍結緩衝液に交換するか、または解凍時に凍結緩衝液を交換する必要がないため、時間および単離ステップが省ける。
【０１０６】
別の実施形態によれば、凍結緩衝液は、抗凍結剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凍結剤は、糖、オリゴ糖、または多糖である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結緩衝液中の糖濃度は、ミトコンドリア機能を保存するように作用する十分な糖濃度である。別の実施形態によれば、単離緩衝液は、糖を含む。別の実施形態によれば、単離緩衝液中の糖濃度は、ミトコンドリア機能を保存するように作用する十分な糖濃度である。別の実施形態によれば、糖は、スクロースである。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を凍結し、（ｂ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を解凍し、（ｃ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を患者に投与する前ステップをさらに含む。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％を構成する。ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも１０％を構成する。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも約３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％を構成する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０９】
機能的ミトコンドリアによる幹細胞の富化の程度は、酸素（Ｏ２）消費率、クエン酸シンターゼの含有量または活性レベル、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率を含むがこれらに限定されない機能的および／または酵素的アッセイによって決定され得る。別の方法では、健康なドナーミトコンドリアによる幹細胞の富化は、ドナーのミトコンドリアＤＮＡの検出によって確認することができる。いくつかの実施形態によれば、機能的ミトコンドリアによる幹細胞の富化の程度は、ヘテロプラスミーの変化のレベルによって、および／または細胞あたりのｍｔＤＮＡのコピー数によって決定され得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１０】
ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル）または関連するＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル）は、ミトコンドリア膜電位の変化を特定することにより、生細胞のミトコンドリア機能を評価するために一般的に使用される細胞透過性蛍光発生色素である。いくつかの実施形態によれば、富化のレベルは、ＴＭＲＥまたはＴＭＲＭで染色することによって決定することができる。
【０１１１】
別の実施形態によれば、ミトコンドリア膜の無傷性は、当技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。非限定的な例では、ミトコンドリア膜の無傷性は、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）蛍光プローブを使用して測定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。顕微鏡下で観察され、ＴＭＲＭまたはＴＭＲＥ染色を示すミトコンドリアには、無傷ミトコンドリア外膜を有する。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア膜」という用語は、ミトコンドリア内膜、ミトコンドリア外膜、およびその両方からなる群から選択されるミトコンドリア膜を指す。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、細胞中の全ミトコンドリアＤＮＡの少なくとも統計的に代表的な部分を配列決定し、宿主／内因性ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡの相対レベルを決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中のミトコンドリアの富化のレベルは、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析によって決定される。ある特定の実施形態では、最大のミトコンドリア集団および／もしくは最大のミトコンドリアＤＮＡ集団は、宿主／内因性ミトコンドリア集団および／もしくは宿主／内因性ミトコンドリアＤＮＡ集団であり、かつ／または２番目に大きいミトコンドリア集団および／もしくは２番目に大きいミトコンドリアＤＮＡ集団は、外因性ミトコンドリア集団および／もしくは外因性ミトコンドリアＤＮＡ集団である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１３】
ある特定の実施形態によれば、健康な機能的ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、当技術分野で認識されている従来のアッセイによって決定することができる。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、（ｉ）宿主／内因性ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡのレベル、（ｉｉ）クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、チトクロームＣオキシダーゼ（ＣＯＸ１）、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラビンタンパク質サブユニットＡ（ＳＤＨＡ）、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるミトコンドリアタンパク質のレベル、（ｉｉｉ）ＣＳ活性レベル、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせよって決定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、（ｉ）同種異系ミトコンドリアの場合、宿主ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡのレベル、（ｉｉ）クエン酸シンターゼ活性のレベル、（ｉｉｉ）コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラボタンパク質サブユニットＡ（ＳＤＨＡ）もしくはチトクロームＣオキシダーゼ（ＣＯＸ１）のレベル、（ｉｖ）酸素（Ｏ２）消費率、（ｖ）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つによって決定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。これらの様々なパラメーターを測定するための方法は、当技術分野で周知である。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非富化幹細胞、巨核球、赤血球、肥満細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含んでもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を、かかる治療を必要とするヒト患者において行うための方法が提供され、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリアタンパク質をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではなく、本方法は、複数のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与するステップを含み、これらのヒト幹細胞は、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化されている。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、筋疾患、障害、またはそれらの症状の治療を、かかる治療を必要とするヒト患者において行うための方法が提供され、本方法は、複数のヒト幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与するステップを含み、これらのヒト幹細胞は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異がない健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリアタンパク質をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異で引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【０１１８】
本発明は、別の態様では、筋疾患、障害、またはそれらの症状を治療する方法において使用するための、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞を含む医薬組成物をさらに提供し、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリア分子をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）治療有効量の健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を含む凍結医薬組成物を解凍することと、（ｂ）解凍した医薬組成物を患者に投与することとを含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、筋疾患、障害、またはそれらの症状を治療する方法において使用するための、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異がない健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞を含む医薬組成物が提供され、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリアタンパク質をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異で引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【０１２１】
本発明は、別の態様では、筋疾患、障害、またはそれらの症状を治療する方法において使用するための、健康な機能的ヒトミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞を含む医薬組成物をさらに提供し、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたはミトコンドリア分子をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異によって引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【０１２２】
本発明は、別の態様では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアでヒト幹細胞を富化するためのエクスビボ法を提供し、本方法は、（ｉ）ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によって、またはミトコンドリア分子をコードする核ＤＮＡの病原性突然変異で引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない筋疾患もしくは障害またはそれらの症状に罹患している患者から単離されたまたは部分的に精製された複数のヒト幹細胞、あるいは健康なドナーから単離されたまたは部分的に精製された複数のヒト幹細胞を含む、第１の組成物を提供するステップと、（ｉｉ）ミトコンドリアＤＮＡまたはミトコンドリア分子（タンパク質など）の病原性突然変異がないドナーから得られた複数の単離された健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを含む、第２の組成物を提供するステップと、（ｉｉｉ）第１の組成物のヒト幹細胞を第２の組成物の健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアと接触させ、それにより第３の組成物を提供するステップと、（ｉｖ）健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件下で第３の組成物をインキュベートし、それにより該ヒト幹細胞を該健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化し、よってミトコンドリアＤＮＡまたはミトコンドリア分子の病原性突然変異がない健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を含む第４の組成物を提供するステップと、を含み、ここで、ステップ（ｉｖ）の富化されたヒト幹細胞は、ステップ（ｉ）のヒト幹細胞と比較して、検出可能に高い健康な機能的ヒトミトコンドリアの総含有量を有する。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「エクスビボ法」という用語は、人体外でのみ実行されるステップを含む任方法を指す。特に、エクスビボ法は、後に治療される対象に再導入または移植される体外の細胞の操作を含む。
【０１２４】
「健康なドナー」および「健康な対象」という用語は、交換可能に使用され、治療されている疾患または状態を患っていない対象を指す。
【０１２５】
「接触する」という用語は、ミトコンドリアおよび細胞の組成物を十分に近接させて、ミトコンドリアが細胞に入るのを促進することを指す。ミトコンドリアを幹細胞に「導入する」という用語は、接触するという用語と交換可能に使用される。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「単離されたヒトの健康な機能的ミトコンドリア」という用語は、ミトコンドリア病に罹患していない健康な対象から得られた細胞から単離されたか、得られたか、または由来する無傷のミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態では、かかるミトコンドリアは外因性ミトコンドリアである。
【０１２７】
ミトコンドリアの文脈において、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「単離された」という用語は、該供給源に見出される他の構成要素から少なくとも部分的に精製されたミトコンドリアを含む。ある特定の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の２０％〜８０％、２０〜７０％、４０〜７０％、２０〜４０％、または２０〜３０％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の２０％〜８０％である。ある特定の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内分画の合計重量の２０％〜８０％である。他の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内分画の合計重量の８０％を超える。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、第１の組成物の幹細胞を、幹細胞を拡大させることができる培養または増殖培地中で該幹細胞を培養することによって、拡大させることをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、第４の組成物のミトコンドリア富化幹細胞を、幹細胞を拡大させることができる培養または増殖培地中で該細胞を培養することによって、拡大させることをさらに含む。本出願を通して使用される場合、「培養または増殖培地」という用語は、細胞培養培地、細胞成長培地、細胞に栄養を提供する緩衝液などの流体培地である。本出願を通して、および特許請求の範囲で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、細胞培養培地、細胞成長培地、細胞に栄養を提供する緩衝液などの流体担体を含む。
【０１２９】
追加の実施形態では、ヒト幹細胞は、ミトコンドリア増強の前または後に拡大される。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、健康な機能的外因性ミトコンドリアでヒト幹細胞を富化するための方法は、細胞の膜電位を測定することを含まない。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．０４４〜最大１７６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．０８８〜最大１７６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。他の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．２〜最大１５０ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。他の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．４〜最大１００ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．６〜最大８０ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．７〜最大５０ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．８〜最大２０ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．８８〜最大１７．６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．９〜最大１５ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。
【０１３２】
ミトコンドリアの用量は、本明細書で説明するように、健康な機能的ミトコンドリアの量の他の定量化可能な測定値のＣＳ活性ユニットまたはｍｔＤＮＡコピー数で表すことができる。「ＣＳ活性の単位」は、１ｍＬの反応体積で１分間に１マイクロモルの基質の変換を可能にする量として定義される。
【０１３３】
本発明は、別の態様では、上記の方法によって得られた、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞をさらに提供する。
【０１３４】
本発明は、別の態様では、上記のような健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞を治療有効量含む医薬組成物をさらに提供する。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、上記の医薬組成物は、筋疾患もしくは筋障害またはその症状を治療するためのものであり、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたは核ＤＮＡの病原性突然変異で引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【０１３６】
本発明は、患者に上記の医薬組成物を投与することを含む、筋疾患もしくは筋障害またはその症状を治療することを必要とする患者においてそれらを治療するための方法をさらに提供し、筋疾患または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの病原性突然変異によってまたは核ＤＮＡの病原性突然変異で引き起こされる原発性ミトコンドリア病または障害ではない。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、第１の組成物は新鮮である。ある特定の実施形態では、第１の組成物は、凍結され、次いでインキュベーションの前に解凍された。ある特定の実施形態では、第２の組成物は新鮮である。ある特定の実施形態では、第２の組成物は、凍結され、次いでインキュベーションの前に解凍された。ある特定の実施形態では、第４の組成物は新鮮である。ある特定の実施形態では、第４の組成物は、凍結され、次いで投与の前に解凍された。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の２０％〜８０％である。ある特定の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の２０％〜７０％、２０％〜６０％、または３０％〜５０％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内分画の合計重量の２０％〜８０％である。他の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内分画の合計重量の８０％を超える。
【０１３９】
真核生物のＮＡＤＰＨ−チトクロームＣレダクターゼ（チトクロームＣレダクターゼ）は、小胞体に局在するフラボタンパク質である。それは電子をＮＡＤＰＨからいくつかのオキシゲナーゼに移動し、その中で最も重要なのは生体異物の解毒に関与するチトクロームＰ４５０ファミリーの酵素である。チトクロームＣレダクターゼは、小胞体マーカーとして広く使用されている。ある特定の実施形態では、第２の組成物は、チトクロームＣレダクターゼまたはチトクロームＣレダクターゼ活性を実質的に含まない。ある特定の実施形態では、第４の組成物は、第１の組成物と比較して、チトクロームＣレダクターゼまたはチトクロームＣレダクターゼ活性で富化されていない。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、第４の組成物中の幹細胞は、第１の組成物中の幹細胞と比較して、（ｉ）増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、（ｉｉ）ＣＳ、ＣＯＸ１、およびＳＤＨＡからなる群から選択された少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の増加した含有量、（ｉｉｉ）増加した酸素（Ｏ２）消費率、（ｉｉ）増加したクエン酸シンターゼの活性レベル、（ｉｉｉ）増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、またはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量」という用語は、ミトコンドリア富化前の、第１の組成物中のミトコンドリアＤＮＡ含有量よりも検出可能に高いミトコンドリアＤＮＡの含有量を指す。ミトコンドリアＤＮＡ含有量は、核遺伝子に対して正規化された、ミトコンドリア富化の前後のミトコンドリア遺伝子の定量的ＰＣＲを実行することによって測定され得る。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「増加した少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質含有量」という用語は、ミトコンドリア富化前の第１の組成物中の該ミトコンドリアタンパク質の含有量よりも検出可能に高い、核コード化またはミトコンドリアコード化のいずれかのミトコンドリアタンパク質、例えば、ＣＳ、ＣＯＸ１、およびＳＤＨＡの含有量を指す。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「増加した酸素（Ｏ２）消費率」という用語は、ミトコンドリア富化前の第１の組成物における酸素（Ｏ２）消費率よりも検出可能に高い酸素（Ｏ２）消費率を指す。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「増加したクエン酸シンターゼ含有量または活性レベル」という用語は、ミトコンドリア富化前の第１の組成物中のクエン酸シンターゼの含有量値または活性レベルよりも検出可能に高いクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率」という用語は、ミトコンドリア富化前の第１の組成物中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率よりも検出可能に高いアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率を指す。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出可能に高い」という用語は、正常値と増加した値との間の統計的に有意な増加を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出可能に高い」という用語は、非病理学的増加、すなわち、実質的に高い値に関連する病理学的症状が明らかにならないレベルを指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「増加した」という用語は、複数の健康な対象の対応する細胞もしくは対応するミトコンドリア、またはミトコンドリア富化前の第１の組成物の幹細胞に見られる対応する値よりも１．０５倍、１．１倍、１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍以上高い値を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４７】
特定の状況では、ミトコンドリア富化前の同じ細胞は、ＣＳおよびＡＴＰ活性を測定し、富化レベルを決定するための対照として機能する。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「ヒト機能的外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件」という句は、一般に、時間、温度、および外因性ミトコンドリアとヒト幹細胞との間の近接性などのパラメーターを指す。これらの条件の特定は、当業者であればいずれの者であってもその能力の範囲内であるが、かかる条件は、本発明によって提供される。例えば、ヒト細胞およびヒト細胞株は、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気で、無菌環境において、液体培地中のミトコンドリアとともに慣習的にインキュベートされる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、４．５％ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を含有する生理食塩水中で、室温で２４時間、ミトコンドリアとともにインキュベートされた。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、１６〜３７℃の範囲の温度で、０．５〜３０時間の範囲の時間にわたって、健康な機能的外因性ミトコンドリアとともにインキュベートされる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、１〜３０または５〜２５時間の範囲の時間にわたって、健康な機能的外因性ミトコンドリアとともにインキュベートされる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態では、インキュベーションは、２０〜３０時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、室温（１８℃〜３０℃）で少なくとも１、５、１０、１５、または２０時間である。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。他の実施形態では、インキュベーションは、最大１、５、１０、１５、２０、または３０時間である。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。特定の実施形態では、インキュベーションは２４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、室温（２０℃〜３０℃）である。ある特定の実施形態では、インキュベーションは３７℃であるいくつかの実施形態では、インキュベーションは、５％ＣＯ２雰囲気で、少なくとも１、５、１０、１５、または２０時間、および／または最大１、５、１０、１５、または２０時間である。他の実施形態では、インキュベーションは、空気中に見られるレベルを超える追加のＣＯ２を含まない。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、細胞の生存を支援する培地中である。いくつかの実施形態では、培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。他の実施形態では、培地は、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を含有する生理食塩水である。いくつかの実施形態では、生理食塩水は、２％〜１０％のＨＳＡを含有する。さらなる実施形態では、生理食塩水は、３〜６％のＨＳＡを含有する。さらに別の実施形態では、生理食塩水は、４．５％のＨＳＡを含有する。特定の実施形態では、幹細胞と健康な機能的ミトコンドリアとのインキュベーションは、１６〜３０℃の範囲の温度で、１５〜３０時間の範囲の時間、３〜６％のＨＳＡを含有する生理食塩水中であり、空気中で見られるレベルを超える追加のＣＯ２を含まない。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、幹細胞と外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に遠心分離をさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、幹細胞と外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に単一遠心分離ステップを含む。いくつかの実施形態では、遠心力は１０００ｇ〜８５００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心力は２０００ｇ〜４０００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心力は２５００ｇを超える。いくつかの実施形態では、遠心力は２５００ｇ〜８５００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心力は２５００ｇ〜８０００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心力は３０００ｇ〜８０００ｇの範囲である。他の実施形態では、遠心力は４０００ｇ〜８０００ｇの範囲である。特定の実施形態では、遠心力は７０００ｇである。他の実施形態では、遠心力は８０００ｇである。いくつかの実施形態では、遠心分離は２分〜３０分の範囲の時間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、遠心分離は３分〜２５分の範囲の時間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、遠心分離は５分〜２０分の範囲の時間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、遠心分離は８分〜１５分の範囲の時間にわたって実行される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、遠心分離は、４〜３７℃の範囲の温度で実行される。ある特定の実施形態では、遠心分離は、４〜１０℃または１６〜３０℃の範囲の温度で実行される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態では、遠心分離は２〜６℃で実行される。特定の実施形態では、遠心分離は４℃で実行される。いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、幹細胞と外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に単一遠心分離、続いて細胞を３０℃より低い温度で静止させることを含む。いくつかの実施形態では、ヒト機能的ミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件は、幹細胞と外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に単一遠心分離、続いて１６〜２８℃の範囲の温度で細胞を静止させることを含む。
【０１５２】
インキュベーションの条件を操作することにより、産物の特徴を操作することができる。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、３７℃で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも６時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも１２時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、１２〜２４時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、４．４ユニットのＣＳを有するかまたは示す外因性ミトコンドリアの量あたり１×１０５〜１×１０７個のナイーブ幹細胞の比率で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、４．４ユニットのＣＳを有するかまたは示す外因性ミトコンドリアの量あたり１×１０６個のナイーブ幹細胞の比率で実行される。ある特定の実施形態では、条件は、ＣＳ活性によって決定して、ナイーブ幹細胞のミトコンドリア含有量を約５％〜約１０％増加させるのに十分である。ある特定の実施形態では、条件は、ＣＳ活性によって決定されるように、ナイーブ幹細胞のミトコンドリア含有量を少なくとも約５％増加させるのに十分である。
【０１５３】
ヘテロプラスミーとは、細胞または個体内に２種以上のミトコンドリアＤＮＡが存在することである。ヘテロプラスミーレベルは、変異ｍｔＤＮＡ分子対野生型／機能的ｍｔＤＮＡ分子の比率であり、ミトコンドリア病の重症度を考慮するのに重要な要素である。低レベルのヘテロプラスミー（十分な量のミトコンドリアが機能している）は、健康な表現型に関連しているが、高レベルのヘテロプラスミー（十分な量のミトコンドリアが機能していない）は病状に関連している。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも１％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも３％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも５％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも１０％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも１５％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも２０％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも２５％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも３０％低い。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア含有量」という用語は、細胞内のミトコンドリアの量を指す。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア含有量」という用語はまた、細胞内の機能的ミトコンドリアの量、または複数の細胞内の機能的ミトコンドリアの平均量を指す。
【０１５５】
「富化されたヒト幹細胞」という用語は、ヒト幹細胞、およびヒト幹細胞の集団であって、それらのミトコンドリア含有量が、それらのナイーブな対応物と比較して、方法の能動的ステップによって平均して増加した、ヒト幹細胞の集団を指す。本明細書で使用される場合、「増加したミトコンドリア含有量」という用語は、さらに、ミトコンドリア富化前の細胞のミトコンドリア含有量よりも検出可能に高い、ミトコンドリアとのインキュベーション後における細胞のミトコンドリア含有量を指す。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、対象／患者から「得られた」幹細胞という句は、該対象／患者から単離された時点で対象／患者の幹細胞であった細胞を指す。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、対象／患者に「由来する」幹細胞という句は、患者の幹細胞ではなく、幹細胞になるように操作された細胞を指す。この句はさらに、異なる種類の幹細胞になるように操作されたある特定の種類の幹細胞を含む。本明細書で使用される場合、「操作された」という用語は、体細胞を未分化状態に再プログラミングし、人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）になり、任意選択で、骨髄細胞（Ｘｕ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，Ｖｏｌ．７（４），ｅ３４３２１ページ）などの所望の系統または集団の細胞になるようにｉＰＳｃをさらに再プログラミングする（Ｃｈｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＩＯＶＳ，２０１０，Ｖｏｌ．５１（１１），５９７０〜５９７８ページ）ための、この分野で既知の方法のいずれか１つ（Ｙｕ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，Ｖｏｌ．３１８（５８５８），１９１７〜１９２０ページ）を使用することを指す。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「末梢血」という用語は、血液系中を循環する血液を指す。本明細書で使用される場合、「末梢血から単離する」という用語は、血液中に見出される他の成分からの幹細胞の単離を指す。
【０１５９】
クエン酸シンターゼ（ＣＳ）は、ミトコンドリアマトリックスに局在するが、核ＤＮＡによってコードされている。クエン酸シンターゼは、クレブス回路の第１のステップに関与し、無傷のミトコンドリアの存在の定量的酵素マーカーとして一般的に使用される（Ｌａｒｓｅｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．５９０（１４），３３４９〜３３６０ページ、Ｃｏｏｋ  Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９８３，Ｖｏｌ．７６３（４），３５６〜３６７ページ）。ある特定の実施形態では、第１の組成物または第４の組成物中の幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの含有量を決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、第１の組成物または第４の組成物中の幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの活性レベルを決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、第１の組成物または第４の組成物中の幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの含有量と相関する。ある特定の実施形態では、第１の組成物または第４の組成物中の幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの活性レベルと相関する。ＣＳ活性は、例えば、ＣＳ活性キットＣＳ０７２０（Ｓｉｇｍａ）を使用することによって測定することができる。
【０１６０】
ミトコンドリアＤＮＡ含有量は、核遺伝子に対して正規化された、ミトコンドリア富化の前後のミトコンドリア遺伝子の定量的ＰＣＲを実行することによって測定され得る。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、ＨＬＡ適合幹細胞のドナーは患者である。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ適合幹細胞のドナーは患者の家族親戚である。本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ適合」という用語は、患者および幹細胞のドナーが、少なくとも患者がドナーの幹細胞に対する急性免疫応答を発症しない程度まで可能な限り厳密にＨＬＡ適合であるようにという望みを指す。かかる免疫応答の予防および／または治療は、免疫抑制剤の急性的または慢性的使用により達成されても、それによらずに達成されてもよい。ある特定の実施形態では、ドナーからの幹細胞は、患者が幹細胞を拒絶しない程度まで患者に対してＨＬＡ適合である。ある特定の実施形態では、患者は、幹細胞移植片の免疫拒絶を防ぐために免疫抑制療法によってさらに治療される。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「自家細胞」または「自家である細胞」という用語は、患者自身の細胞であることを指す。「自家ミトコンドリア」という用語は、患者自身の細胞または母性的に関連する細胞から得られたミトコンドリアを指す。「同種異系細胞」または「同種異系ミトコンドリア」という用語は、異なるドナー個体からの細胞またはミトコンドリアを指す。
【０１６３】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「同系」という用語は、拒絶なく個体間の移植を可能にするのに十分な遺伝的同一性または遺伝的近同一性を指す。ミトコンドリアの文脈における同系という用語は、本明細書では、同じ母体の血統を意味する自家ミトコンドリアという用語と交換可能に使用される。
【０１６４】
「外因性ミトコンドリア」という用語は、細胞の外部にある供給源から標的細胞（すなわち、幹細胞）に導入されるミトコンドリアを指す。例えば、いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアは、標的細胞とは異なる細胞に由来するかまたは単離され得る。例えば、外因性ミトコンドリアは、ドナー細胞で産生／作製され、ドナー細胞から精製／単離、得られ、その後、標的細胞に導入され得る。
【０１６５】
「内因性ミトコンドリア」という用語は、細胞によって作製／発現／産生されており、外部供給源から細胞に導入されないミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態では、内因性ミトコンドリアは、細胞のゲノムによってコードされているタンパク質および／または他の分子を含有する。いくつかの実施形態では、「内因性ミトコンドリア」という用語は、「宿主ミトコンドリア」という用語と等しい。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、内因性ミトコンドリアの外因性ミトコンドリアからの特定／区別は、後者が標的細胞に導入された後、例えば、限定されないが、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列の差異、例えば、内因性ミトコンドリアと内因性ミトコンドリアとの間の異なるハプロタイプを特定すること、外因性ミトコンドリアの組織に由来する特定のミトコンドリアタンパク質、例えば、胎盤からのチトクロームｐ４５０コレステロール側鎖切断（Ｐ４５０ＳＣＣ）、褐色脂肪組織からのＵＣＰ１などを特定すること、またはそれらの任意の組み合わせを含む、様々な手段によって実行され得る。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、ミトコンドリア生合成を促進する薬剤を患者に投与するステップをさらに含む。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア生合成」という用語は、ミトコンドリアの成長および分裂を指す。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア生合成を促進する薬剤は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはその塩である。ある特定の実施形態では、薬剤は、組換えヒトエリスロポエチンおよび単離されたヒトエリスロポエチンからなる群から選択される。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「移植前コンディショニング剤」という用語は、ヒト対象の骨髄内の骨髄細胞を殺傷することができる任意の薬剤を指す。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「瞬間凍結」という用語は、ミトコンドリアを低温貯蔵温度に供することによって急速に凍結することを指す。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、示される整数、数、または量より１０％未満から１０％超の範囲を意味する。例えば、「約１×１０５」という句は、「１．１×１０５〜９×１０４」を意味する。典型的には、本明細書で使用される場合、数値は、示された数値の±１０％を指す。
【０１７１】
本発明はある特定の実施形態を参照して説明されてきたが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、同等物に置き換えることができることを理解するだろう。さらに、その範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために多くの修正を行うことができる。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されないが、本発明は、添付の特許請求の範囲に含まれるすべての実施形態を含むことが意図される。
【０１７２】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに詳しく示すために提示される。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７３】
実施例１．マウス細胞におけるミトコンドリア増強療法。
ミトコンドリアの含有量および活性を増加させるために、異なるマウス細胞を、単離されたマウスまたはヒトのミトコンドリアとともに、ＤＭＥＭ（２４時間、３７℃、５％ＣＯ２）中でインキュベートした。表１は、プロセス前の細胞のＣＳ活性と比較した、プロセス後の細胞のＣＳ活性の相対的な増加によって決定される、ミトコンドリア増強療法プロセスの代表的な結果を示す。
【表１】
2021532094.tif 000002
【０１７４】
実施例２．前臨床生体内分布試験。
ミトコンドリアはＣ５７／ＢＬマウス（野生型ｍｔＤＮＡのドナー）の胎盤から単離された。骨髄細胞はＦＶＢ／Ｎマウス（ＡＴＰ８にｍｔＤＮＡ突然変異を担持する）から単離された。ＦＶＢ／Ｎ細胞は、Ｃ５７／ＢＬ外因性ミトコンドリア（１×１０６個の細胞あたり４．４Ｕのミトコンドリア）をロードされ、その後、ＦＶＢ／ＮマウスにＩ．Ｖ．注射で戻された。その後、ＦＶＢ／Ｎマウスは種々の時点で屠殺され、器官の生体内分布が試験された。
【０１７５】
図１は、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての骨髄中に見られるＦＶＢ／Ｎ  ｍｔＤＮＡのレベルを示す。データは、骨髄中の突然変異したｍｔＤＮＡのレベルが経時的に大幅に低下したことを教示する。
【０１７６】
ＦＶＢ／Ｎの雌から採取した骨髄は、Ｃ５７ＢＬ／６胎盤ミトコンドリア（１×１０６個の細胞あたり４．４ｍＵのＣＳ活性）で富化された。レシピエントマウスは、動物あたり１００万個の増強細胞のＩＶ投与を受けた。デジタルＰＣＲを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６固有ＳＮＰを検出した。
【０１７７】
図２は、ＭＡＴの３ヶ月後のマウスの心臓にＣ５７ＢＬ／６由来ｍｔＤＮＡが存在することを示す。
【０１７８】
実施例３．ピアソン症候群（ＰＳ）およびＰＳ関連ファンコニー症候群（ＦＳ）を有する若年患者に対するＭＮＶ−ＢＬＤ（血液由来ミトコンドリア）で富化された自家ＣＤ３４＋細胞を使用した人道的治療。
患者１は、ピアソン症候群と診断された６．５歳の男児患者であり、ｍｔＤＮＡのヌクレオチド５８３５〜９７５３が欠失している。ミトコンドリア増強療法（ＭＡＴ）の前の彼の体重は１４．５ＫＧであった。彼の成長は治療前の３年間大幅に遅れ、１年以上胃瘻管（Ｇ−チューブ）によって栄養補給されていたにもかかわらず、改善しなかった。患者は腎不全（ＧＦＲ  ２２ｍｌ／分）、電解質補給を必要とする近位尿細管症、およびカルシウム補給を必要とする副甲状腺機能低下症を有した。
【０１７９】
患者からの造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の動員は、ＧＣＳＦを５日間単独で皮下投与することによって実行された。白血球アフェレーシスは、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｏｐｔｉａシステム（ＴｅｒｕｍｏＢＣＴ）を使用して、施設のガイドラインに従って末梢静脈アクセスを介して実行された。ＣＤ３４陽性選択は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４試薬を製造元の指示に従って使用することにより、動員された末梢血由来細胞で実行された。ミトコンドリアは、２５０ｍＭスクロース緩衝液ｐＨ７．４を使用して、母体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分画遠心分離によって単離された。
【０１８０】
ＭＡＴの場合、自家ＣＤ３４＋細胞は、患者の母親からの健康なミトコンドリア（４．４ユニットのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）を有するミトコンドリアの量あたり１×１０６個の細胞）とともにインキュベートされ、細胞ミトコンドリア含有量が１．５６倍増加した（ＣＳ活性によって示されるようにミトコンドリア含有量の５６％の増加）。ミトコンドリアとのインキュベーションは、４．５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で、室温で２４時間行われた。富化された細胞は、生理食塩水中の４．５％１＊１０６に懸濁された。
【０１８１】
図３Ａに示されるタイムラインに従って、患者は、ＩＶ注入により、体重１キログラムあたり、健康なミトコンドリアで富化された１．１×１０６個の自家ＣＤ３４＋細胞の単回の治療を受けた。
【０１８２】
図３Ｂは、細胞療法後の時間の関数としての患者の有酸素代謝当量（ＭＥＴ）スコアのレベルを示す。データは、患者の有酸素ＭＥＴスコアが経時的に５（ウォーキングおよびサイクリングなどの中強度の活動）から８（ランニング、ジョギング、および縄跳びなどの激しい強度の活動）に大幅に増加したことを示す。
【０１８３】
表２は、細胞療法後の時間の関数としての患者の小児ミトコンドリア病尺度（ＩＰＭＤＳ）−生活の質（ＱｏＬ）質問票の結果を示す。「苦情と症状」および「身体検査」の両方のカテゴリで、０は関連する属性の「正常」を表す一方で、悪化した状態は重症度に応じて１〜５のスコアが付けられる。
【表２】
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【０１８４】
患者は治療前の３年間は体重が増えていない、すなわち、３．５歳から体重が増えていないことに留意するべきである。図３Ｃは、患者の体重および身長の標準偏差スコアによって測定された成長を示し、データは、ＭＡＴ前の４年間およびフォローアップ期間中に開始されている。データは、１回の治療から約９ヶ月または１５ヶ月後に、それぞれ患者の体重および身長が増加したことを示す。
【０１８５】
患者の成長の別の証拠は、アルカリホスファターゼレベルから来ている。アルカリホスファターゼレベルテスト（ＡＬＰテスト）は、血流中のアルカリホスファターゼ酵素の量を測定する。血中のＡＬＰレベルが正常よりも低い場合は、栄養失調を示している可能性があり、これは、ある特定のビタミンおよびミネラルの不足が原因である可能性がある。図３Ｄに示されるデータは、患者のアルカリホスファターゼレベルをわずか１２ヶ月で１５９から４８６  ＩＵ／Ｌに上げるには、１回の治療で十分であることを示す。
【０１８６】
血中乳酸は、ミトコンドリアが損傷した場合、または組織への酸素輸送がミトコンドリア機能障害の特徴の１つである正常な代謝要求を支援するには不十分である場合に、嫌気性代謝の結果として血中に現れる乳酸である。図３Ｅは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の血中に見られる乳酸のレベルを示す。図３Ｅに見られるように、ＭＡＴ後、患者１の血中乳酸レベルは正常値に低下した。
【０１８７】
使用された療法の成功の遺伝的指標は、総ｍｔＤＮＡと比較した正常なｍｔＤＮＡの普及率である。図４（Ｐｔ．１）に示されるように、患者の正常なｍｔＤＮＡの普及率は、ベースラインの約１からわずか４ヶ月で１．６（＋６０％）にまで、治療の２０ヶ月後に１．９（＋９０％）に増加した。特に、正常なｍｔＤＮＡレベルは、ほとんどの時点でベースラインレベルを上回った。
【０１８８】
実施例４．ピアソン症候群（ＰＳ）およびＰＳ関連ファンコニー症候群（ＦＳ）を有する若年患者に対するＭＮＶ−ＢＬＤ（血液由来ミトコンドリア）で富化された自家ＣＤ３４＋細胞を使用した人道的治療。
患者２は、ピアソン症候群と診断された７歳の女児患者であり、ｍｔＤＮＡの４９７７ヌクレオチドが欠失している。患者はまた、貧血、内分泌膵機能不全を患っており、かつ糖尿病である（ヘモグロビンＡ１Ｃ  ７．１％）。患者は、乳酸値が高く（＞２５ｍｇ／ｄＬ）、体重が少なく、食事および体重増加に問題がある。患者はさらに高マグネシウム尿症（高レベルの尿中マグネシウム、低レベルの血中マグネシウム）を患っている。患者は、記憶および学習の問題、乱視があり、ＴＭＲＥ、ＡＴＰ含有量、およびＯ２消費率（健康な母親と比較して）によって決定される末梢リンパ球のミトコンドリア活性が低い。
【０１８９】
自家造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の動員、白血球アフェレーシス、ならびにＣＤ３４陽性選択は、白血球アフェレーシス前の−１日目にプレリキサフォル（ｎ＝２）を添加して患者１（実施例４）と同様に実行された。ミトコンドリアは、２５０ｍＭスクロース緩衝液ｐＨ７．４を使用して、母体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分画遠心分離によって単離された。
【０１９０】
ＭＡＴの場合、自家ＣＤ３４＋細胞は、患者の母親からの健康なミトコンドリア（４．４ユニットのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）を有するミトコンドリアの量あたり１×１０６個の細胞）とともにインキュベートされ、細胞ミトコンドリア含有量が１．６２倍増加した（ＣＳ活性が示すようにミトコンドリアＤＮＡ含有量の６２％の増加）。ミトコンドリアとのインキュベーションは、４．５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で、室温で２４時間行われた。ミトコンドリア富化後、患者からのＣＤ３４＋細胞はコロニー形成率を２６％増加させたことに留意するべきである。
【０１９１】
患者２（治療日１５ＫＧ）は、図５Ａに示されるタイムラインに従って、ＩＶ注入により、体重１キログラムあたり、健康なミトコンドリアで富化された１．８×１０６個の自家ＣＤ３４＋細胞で治療された。
【０１９２】
図５Ｂは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の血中に見られる乳酸のレベルを示す。データは、血中乳酸レベルが経時的に大幅に低下したことを示す。
【０１９３】
図５Ｃおよび５Ｄは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の「立ち上がり」および「６分間歩行」試験の結果を示す。データは、患者の身体能力が経時的に改善されたことを示す。
【０１９４】
図５Ｅは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の右脚の筋肉に対して実行された力量計試験の結果を示す。各試験では、３回の連続反復が記録された。データは、倦怠感の減少という側面と筋力の増加という側面との両方で、患者の筋肉能力が経時的に改善されたことを示す。
【０１９５】
図５Ｆは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者のリンパ球のＡＴＰ含有量を示す。対照は、ミトコンドリアのドナーである患者の母親のリンパ球のＡＴＰ含有量である。データは、患者のＡＴＰ含有量が経時的に改善されたことを示す。
【０１９６】
図４（Ｐｔ．２）は、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての正常なｍｔＤＮＡの普及率を示す。図４（Ｐｔ．２）に見られるように、正常なｍｔＤＮＡの普及率は、ベースラインの約１からわずか１ヶ月で２（＋１００％）にまで増加し、治療後１０ヶ月まで比較的高いままであった。特に、正常なｍｔＤＮＡレベルは、すべての時点でベースラインレベルを上回った。
【０１９７】
実施例５．ピアソン症候群（ＰＳ）を有する若年患者に対するＭＮＶ−ＢＬＤ（血液由来ミトコンドリア）で富化された自家ＣＤ３４＋細胞を使用した人道的治療。
患者３は、ピアソン症候群と診断された１０．５歳の女児患者であり、ｍｔＤＮＡのヌクレオチド１２１１３〜１４４２１が欠失している。患者は、貧血、および腎不全ステージ４に発展したファンコニー症候群も患っていた。患者は週に３回透析で治療された。過去２ヶ月で、患者は、重度の視力障害、視野の狭小化、および近見視力の喪失も患っていた。患者は身体活動をまったく行うことができなかった（歩くことはなく、ベビーカーに座っている）。患者の乳酸レベルは高く（＞５０ｍｇ／ｄＬ）、インスリンで治療された膵臓障害を有した。脳ＭＲＩは多くの病変および萎縮領域を示した。患者は、胃瘻造設術によってのみ栄養補給された。患者には記憶および学習の問題があった。患者は、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）、ＡＴＰ含有量、およびＯ２消費率（健康な母親と比較して）試験によって決定される末梢リンパ球のミトコンドリア活性が低かった。
【０１９８】
自家造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の動員、ならびに白血球アフェレーシス、およびＣＤ３４陽性選択は、白血球アフェレーシス前の−１日目にプレリキサフォル（ｎ＝１）を添加して患者１（実施例４）と同様に実行された。白血球アフェレーシスは、恒久的な透析カテーテルを介して実行された。ミトコンドリアは、２５０ｍＭスクロース緩衝液ｐＨ７．４を使用して、母体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分画遠心分離によって単離された。
【０１９９】
ＭＡＴの場合、自家ＣＤ３４＋細胞は、患者の母親からの健康なミトコンドリア（４．４ユニットのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）を有するミトコンドリアの量あたり１×１０６個の細胞）とともにインキュベートされ、細胞ミトコンドリア含有量が１．１４倍増加した（ＣＳ活性によって示されるようにミトコンドリア含有量の１４％の増加）。細胞は、４．５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で、室温で２４時間、ミトコンドリアとともにインキュベートされた。ミトコンドリア富化後、患者からのＣＣＤ３４＋細胞はコロニー形成率を５２％増加させたことに留意するべきである。
【０２００】
患者３（２１ＫＧ）は、図６Ａに示されるタイムラインに従って、ＩＶ注入により、体重１キログラムあたり、母親からの健康なミトコンドリアで富化された２．８×１０６個の自家ＣＤ３４＋細胞で治療された。
【０２０１】
図６Ｂは、細胞療法前後の時間の関数としての患者の血中のトリグリセリド、総コレステロール、および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールのレベルを示す。データは、患者のトリグリセリド、総コレステロール、およびＶＬＤＬコレステロールの血中レベルが経時的に大幅に低下したことを示す。血中のトリグリセリド、総コレステロール、およびＶＬＤＬコレステロールの低レベルを達成することは、肝機能の増加および脂質代謝の改善の証拠である。
【０２０２】
図６Ｃは、療法前後の時間の関数としての患者の血中に見られる乳酸レベルを示す。データは、血中乳酸レベルが経時的に大幅に低下したことを示す。
【０２０３】
図６Ｄおよび６Ｅは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の「立ち上がり」（６Ｄ）および「６分間歩行」（６Ｅ）試験の結果を示し、治療５ヶ月後の両方のパラメーターにおける改善を示す。
【０２０４】
図４（Ｐｔ．３）は、ＭＡＴ後の時間の関数としてのヘテロプラスミーレベルの変化を示す。ベースラインでヘテロプラスミーのレベルが比較的低かった患者３では、ＭＡＴ後にヘテロプラスミーが減少した（欠失ｍｔＤＮＡが少ない）ことがわかる。これはフォローアップ期間を通して続いた。特に、正常なｍｔＤＮＡレベルは、ほとんどの時点でベースラインレベルを上回った。
【０２０５】
実施例６．カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）を有する若年患者に対するＭＮＶ−ＢＬＤ（血液由来ミトコンドリア）で富化された自家ＣＤ３４＋細胞を使用した人道的治療。
患者４は、１４歳、１９．５ｋｇの女児患者で、カーンズ・セイヤー症候群と診断され、トンネル状視野、眼瞼下垂、眼筋麻痺、および網膜萎縮を経験していた。患者は、視力の問題、ＣＰＥＯ、てんかん発作、病的ＥＥＧ、座位または歩行障害を伴う重度のミオパチー、心不整脈を有した。患者は、ミトコンドリアＤＮＡに７．４Ｋｂの欠失があり、これには次の遺伝子が含まれる：ＴＫ、ＮＣ８、ＡＴＰ８、ＡＴＰ６、ＣＯ３、ＴＧ、ＮＤ３、ＴＲ、ＮＤ４Ｌ、ＴＨ、ＴＳ２、ＴＬ２、ＮＤ５、ＮＤ６、ＴＥ、ＮＣ９、およびＣＹＢ。
【０２０６】
造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の動員、ならびに白血球アフェレーシス、およびＣＤ３４陽性選択は、患者３（実施例５）と同様に実行された。ＭＡＴの場合、自家ＣＤ３４＋細胞は、４．５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で、患者の母親からの健康なミトコンドリア（４．４ユニットのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）を有するミトコンドリアの量あたり１×１０６個の細胞）とともに室温で２４時間インキュベートされた。富化により、細胞ミトコンドリア含有量が１．０３倍増加した（ＣＳ活性によって示されるようにミトコンドリア含有量が３％増加した）。
【０２０７】
患者４は、図６Ａに示されるタイムラインに従って、体重１キログラムあたり、健康なミトコンドリアで富化された２．２×１０６個の自家ＣＤ３４＋細胞で治療された。
【０２０８】
予想外に、健康なミトコンドリアでわずか３％しか富化されなかったＣＤ３４＋による１回の治療の４ヶ月後、患者はＥＥＧの改善を示し、てんかん発作を示さなかった。治療の５ヶ月後、患者は疾患に関連した房室（ＡＶ）ブロックを患い、ペーサーが取り付けられた。患者は回復し、改善が続いた。末梢血中のＡＴＰ含有量は、治療の６ヶ月後に測定され、治療前と比較してＡＴＰ含有量が約１００％増加したことを示した。治療の７ヶ月後、患者は一人で座り、助けを借りて歩き、話すことができ、食欲が増し、３．６ＫＧ増えた。
【０２０９】
実施例７：ミトコンドリア増強療法は中年マウスの探索行動を増加させる
中年（１２ヶ月齢）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ミトコンドリア富化骨髄（ＢＭ）細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ、１×１０６細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル溶液（ＶＥＨＩＣＬＥ、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）のいずれかを投与され、投与は約３ヶ月ごとに繰り返された。初回投与の１週間前および初回投与の９ヶ月後に、マウスは開放地での行動試験に供された。
図７Ａ〜７Ｂに示される結果は、ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣで処理されたマウスが、広範な探索行動、アリーナの中央で過ごす時間の増加を呈したことを示し、この増加は、ＢＭ対照群の中央期間と比較して統計的に有意であった。
【０２１０】
図７Ｃに示されるように、投与の９ヶ月後に、アリーナの壁のそばで過ごす時間の増加に反映される走触行動を呈したＢＭおよびＶＥＨＩＣＬＥ対照群とは異なり、ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣで治療されたマウスは、ＢＭ対照群と比較して統計的に有意な様式で壁期間を減少させた。
【０２１１】
アリーナの中央ゾーンで過ごす時間の増加は、ミトコンドリア増強療法を受けたマウスの広範な探索行動を示す。これは、不安様行動に関連付けられる走触性の低下とともに、ミトコンドリア増強の抗不安作用を裏付ける。
【０２１２】
実施例８．ミトコンドリア富化は、中年マウスの加齢関連性運動機能低下を弱める
全体的運動能力および協調は、ミトコンドリア強化骨髄（ＢＭ）細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１×１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ、１×１０６細胞、ｎ＝２３）、または対照ビヒクル溶液（ＶＥＨＩＣＬＥ、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）のいずれかを投与された中年（１２ヶ月齢）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、Ｒｏｔａｒｏｄ装置を使用して評価された。
【０２１３】
図８Ａ〜８Ｂに示すように、投与の１ヶ月後、ＶＥＨＩＣＬＥおよびＢＭ対照群は、回転ロッドから落下するまでの待ち時間の減少を示し（ベースラインから−２．８２％および−２．１８％、ｎｓ）、これはさらに、投与の３ヶ月後のベースラインと比較して１４．１５％および２１．７９％（＊＊＊ｐ＝０．０００８）低落した。ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣマウスは、ミトコンドリア富化療法の１ヶ月後にロッドから落下するまでの待ち時間が１６．１７％減少し（＊ｐ＝０．０４６４）、富化の３ヶ月後に停止した（ベースラインから−８．７２％、ｎｓ）。
【０２１４】
結果は、ミトコンドリア富化中年マウスでは、年齢を一致させた対照と比較して、より中程度の運動機能障害を示しており、ミトコンドリア富化療法が加齢関連性運動機能衰退を軽減できることを示唆する。
【０２１５】
実施例９  中年のマウスは、ミトコンドリア増強療法の３ヶ月後に握力を維持する
骨格筋機能が、ミトコンドリア富化（増強）ＢＭ細胞（ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣ、１０６個の細胞、ｎ＝２４）、骨髄細胞（ＢＭ、１０６細胞、ｎ＝２３）、またはビヒクル溶液（ＶＥＨＩＣＬＥ、０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ中４．５％のアルブミン、ｎ＝２３）のいずれかを投与された中年（１２ヶ月齢）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの前肢の握力によって評価された。
【０２１６】
図９Ａ〜９Ｂに示されるように、ＭＮＶ−ＢＭ−ＰＬＣマウスは、ミトコンドリア増強（富化）療法の１ヶ月および３ヶ月後、握力スコアを一定に維持し（それぞれベースラインの−１．２９％および−１．４０％）、投与の３ヶ月後に開始した握力時間（把握を解放するまでの待ち時間）のより遅い減退を呈した（投与の１ヶ月および３ヶ月後のベースラインの＋６．０７％および−０．６９％）。
【０２１７】
図９Ｃ〜９Ｄに示すように、投与の１ヶ月後にベースラインからの−４．８０％および−０．９％の低下が観察されたＶＥＨＩＣＬＥおよびＢＭ対照群と比較して、２ヶ月後にさらに悪化した（それぞれ、ベースラインの−１５．３％および−６．３５％、ｎｓ）。ＶＥＨＩＣＬＥおよびＢＭ対照マウスのベースライン握力は、投与の１ヶ月後に増加し（ベースラインから＋６．０１％および＋４．０６％、ｎｓ）、２ヶ月後までに、それぞれ、ベースラインの−６．０３％（＊＊ｐ＝０．００８４）および−１７．７７％（＊ｐ＝０．０４０４）に低下した。
【０２１８】
これらの結果は、ミトコンドリア富化治療マウスの握力および保持時間の低下の遅延／減少を示し、ミトコンドリア富化療法が筋肉機能の加齢関連性障害を改善し得ることを示唆する。
【０２１９】
実施例１０．筋疾患および障害のための、ミトコンドリアで富化された幹細胞を使用する治療。
標題：筋疾患および障害を有する患者におけるミトコンドリアで富化された幹細胞の移植の安全性、生着、および治療効果を評価するための第Ｉ／ＩＩ相非盲検単回投与臨床試験。
【０２２０】
デザイン：登録されたすべての患者は、筋疾患または障害の確定診断を有する。ミトコンドリアのドナーは、ｍｔＤＮＡの異常を担持していないことが確認されている。適格患者は、試験に登録され、短期間入院し、治療手順を受ける。治療の安全性、有害事象（ＡＥ）、および疾患の評価は、治療期間中および治療後のフォローアップ期間を通じて記録される。
【０２２１】
治療用量：体重１ｋｇあたり最大４＾１０６細胞の治療用細胞用量が、臨床科の所定の標準手順に従ってＩＶ注入によって移植される。
【０２２２】
主要安全性評価項目の評価：対象は、登録から開始して、ＣＴＣＡＥ  ｖ４．０３に従い、細胞による治療後の有害事象について評価される。
【０２２３】
主要有効性評価項目の評価：代謝危機の年間発生率の変化、野生型ｍｔＤＮＡの相対的存在量の変化。
【０２２４】
副次的有効性評価項目の評価：ＭＮＶ−ＢＭ−ＢＬＤの全身的利益および遠位器官への影響（治療の前年における増加率と比較した、入院回避、輸血回避、標準成長曲線上の体重増加）。追加の患者固有の個別の転帰は、疾患標的器官の変化（試験の前年と比較した、クレアチニンクリアランスによって測定された腎糸球体機能；カリウムおよびマグネシウムの血清および尿中レベルによって測定された腎尿細管機能；インスリン必要量、Ｃ−ペプチドおよびヘモグロビンＡ１ｃによって評価された内分泌膵臓機能；外分泌膵臓機能および下痢の割合；ベースラインと比較した脳ＭＲＩ所見の変化；生活の質（ＱｏＬ）質問票／ＰＥＤＩ−ＣＡＴ（子どもの能力低下評価法−コンピューター適応型テスト）スコア）を含むものとする。
【０２２５】
予備的有効性評価：機能評価（全体的運動機能測定によって評価された神経筋機能；６分間の歩行テスト；ストレステスト；発達テスト；ＷＩＰＳＳＩ（ウェクスラー式幼児用知能検査）；記憶テスト；反応時間；ボックス＆ブロックテスト；３０秒椅子立ち上がり；支えなしでの立ち上がり）；病理学的評価（心エコー検査；骨髄穿刺＋生検；リンパ球Ｏ２消費、ＡＴＰ含有量、ＴＭＲＥ／ＭＴＧ）。
【０２２６】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【国際調査報告】
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