(57)【要約】  本発明は、ウイルスベクターの精製のための方法に関し、さらに詳細には単一の自動化されたプロセスの利用により産生細胞からウイルスベクターを精製することに関する。本方法は、以下のステップ、ａ）産生細胞および細胞溶解緩衝液を処理容器へ加えるステップと、ｂ）前記処理容器内において前記産生細胞および前記細胞溶解緩衝液を混合して混合物を取得するステップと、ｃ）前記混合物をウイルスベクター精製用のクロマトグラフィカラムに流し通すステップであって、ウイルスベクターが前記クロマトグラフィカラムに吸着される、ステップと、ｄ）クロマトグラフィカラムから製品容器内へとウイルスベクターを溶離するステップとを含む。
2021508470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
産生細胞中で目的の遺伝子を含むウイルスベクターを培養することによる産生後に前記ウイルスベクターを単離するための方法であって、以下のステップ
ａ）産生細胞（１）および細胞溶解緩衝液（２）を処理容器（５）へ加えるステップと、
ｂ）前記処理容器（５）内において前記産生細胞および前記細胞溶解緩衝液を混合して混合物を形成するステップと、
ｃ）前記処理容器（５）から前記混合物をウイルスベクター精製用の親和性樹脂を含むクロマトグラフィカラム（８）に流し通すステップであって、前記ウイルスベクターは前記クロマトグラフィカラム（８）内の前記樹脂に吸着される、ステップと、
ｄ）前記クロマトグラフィカラム（８）内の前記樹脂から製品容器（７）内へとウイルスベクターを溶離するステップと
を連続ワークフローに含む、方法。
【請求項２】
ステップｄ）において製品容器（７）内に取得されたウイルスベクターが、新たな産生細胞をトランスフェクトするために使用され、前記新たな産生細胞は、トランスフェクト後に、前記ステップａ）〜ｄ）が少なくとも１回繰り返される前に培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法により取得されたウイルスベクターの数が、前記クロマトグラフィカラム（８）内の前記樹脂の体積および飽和点により指定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｃ）またはステップｄ）の後に、前記処理容器（５）内に洗浄緩衝液（３）を放出することにより細胞／残屑をフラッシングし廃棄容器（６）内に前記細胞／残屑を排出するステップを含む、請求項１から３の１つまたは複数の請求項に記載の方法。
【請求項５】
前記処理容器（５）、前記製品容器（７）、および前記カラム（８）は、カセット内に取り付けられ、前記細胞溶解緩衝液（２）、前記洗浄緩衝液（３）、溶離緩衝液（４）、および任意には廃棄容器（６）が、前記カセットの外部に配置される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィカラム（８）は、前記カセット内において互換性を有し、選択されたウイルスベクターに対する特異性を有する親和性樹脂を備える、請求項１から５の１つまたは複数の請求項に記載の方法。
【請求項７】
前記処理容器（５）は、前記処理容器（５）内に任意の未処理細胞／細胞残屑を保持するためにフィルタ付きの出口ポートを備える、請求項１から６の１つまたは複数の請求項に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスである、請求項１から７の１つまたは複数の請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記目的の遺伝子は、キメラ抗原をコードする遺伝子（ＣＡＲ）などの疾患調節遺伝子を含む、請求項１から８の１つまたは複数の請求項に記載の方法。
【請求項１０】
製品容器（７）内の前記単離されたウイルスベクターの精製度は、ステップａ）〜ｄ）を繰り返す前にＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）検出を伴う品質アッセイにおいて試験される、請求項２から９の１つまたは複数の請求項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞療法のための、請求項１から１０の１つまたは複数の請求項に従って単離されたウイルスベクターの使用。
【請求項１２】
前記ウイルスベクターは、Ｔ細胞をＣＡＲ−Ｔ細胞へと形質転換するために使用される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
まったく同一のカセット内に取り付けられた処理容器（５）、製品容器（７）、および親和性カラム（８）を備え、前記カセットの外部に配置された産生細胞（１）、細胞溶解緩衝液（２）、洗浄緩衝液（３）、および溶離緩衝液（４）のためのソース容器と、任意には廃棄容器（６）とをさらに備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルスベクターの精製に関し、さらに詳細には単一の自動化されたプロセスを利用することにより産生細胞からウイルスベクターを精製するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞療法は、がんなどの重病治療のために新たに生まれてきた分野であり、従来の療法に対する付加的なものに相当する。数十年にわたり、がん治療は、化学療法および放射線療法に限定されてきた。より近年においては、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））およびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））のような生物学的薬物がより一般的になってきた。これらの薬物は、がん細胞内において主に見られる特定の分子変化に注目することによりがん細胞を標的とする。
【０００３】
しかし、過去数年の間において、新しい療法形式すなわち細胞療法または免疫療法が、例えばがん治療などのためのオプションとして登場した。
【０００４】
急激に台頭しつつある免疫療法アプローチは、養子細胞移植（ＡＣＴ、ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）と呼ばれ、がん治療のために患者自身の免疫細胞を収集および利用するものである。複数のタイプのＡＣＴ（ＴＩＬ、ＴＣＲ、およびＣＡＲ）が存在するが、食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された治療をもたらすものに最も近いものは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法と呼ばれる。
【０００５】
最近まで、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の利用は、主として進行した血液がんを患う患者における少数の臨床試験に限定されてきた。しかし、これらの治療は、あらゆる他の治療の効果がなくなった未成年および成人の両方の一部の患者において得られた顕著な成果により、研究者および一般人においても同様に注目を集めてきた。
【０００６】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を患う未成年を治療するためのあるＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、２０１７年８月に承認された。進行したリンパ腫を患う成人のための第２のＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、２０１７年１０月に承認を得た。
【０００７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、免疫反応の調整と病原菌に感染した細胞を殺すこととにおいて重要な役割を果たすＴ細胞に依存する。この療法は、患者からの血液採取と、Ｔ細胞の摘出とを必要とする。次に、ウイルスベクターを使用してＴ細胞が遺伝子操作されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる受容体がそのＴ細胞の表面上に産生される。
【０００８】
現行では、細胞形質転換のためのウイルスベクターの精製は、自動化されたプロセスではない。
【０００９】
典型的には、ウイルスベクターの精製は、粒子を確実に単離するためのカラムを必要とする。例えば、レンチウイルス精製は、そのタンパク質コートに対して特異性を有する抗体を必要とする。細胞単離の場合と同様に、それぞれのタイプのウイルス株は、抗体特異的精製アプローチを必要とする。しかし、細胞および細胞残屑からのウイルス粒子の分離は、密度勾配または同様の溶液ベース技術を利用した遠心分離ステップによっても実現できる。
【００１０】
多数の他の生物学的プロセスと同様に、このステップにおける汚染物質は、最善の場合でも患者への治療を遅延させるおそれがあり、最悪の場合では患者の健康に悪影響を及ぼすおそれがある。信頼性のある「セットアンドフォーゲット（ｓｅｔ−ａｎｄ−ｆｏｒｇｅｔ）」プロセスを生み出すことが、下流プロセスの安全性および有効性を確保することになろう。
【００１１】
Ｔ細胞をＣＡＲ−Ｔ細胞へと形質転換するために精製されたウイルスベクターを生成するプロセスを自動化することを可能にすることが、非常に望ましい。これは、とりわけ現在の細胞療法市場において有意義である。なぜならば、レンチウイルスベクターが、ＣＡＲ発現のためのＴ細胞への遺伝子挿入のために最も一般的に利用される方式であるからである。
【００１２】
これまでのところ、細胞形質転換が可能な多数のウイルス株に対して幅広く適用可能である望ましい精製方法は存在しない。
【００１３】
したがって、ウイルスベクターの精製のための幅広く適用可能な方法の必要性が依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２０１７／１０９０７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、好ましくは細胞療法ワークフローに含まれることを予め意図されたＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（登録商標）などの器具を使用した自動化されたプロセスにおいてウイルスベクターを精製するための幅広く適用可能な方法およびキットを提供することにより、先行技術における欠点を回避する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本方法は、溶液ベース細胞溶解ステップ、ウイルス粒子のカラム抽出ステップ、洗浄ステップ、および溶離ステップの組合せを利用することにより、オールインワンキット製品におけるあらゆるタイプのウイルスベクターの精製に対して採用可能である。
【００１７】
第１の態様では、本発明は、産生細胞中で目的の遺伝子を含むウイルスベクターを培養することによる産生後に前記ウイルスベクターを単離するための方法に関する。この方法は、以下のステップ、ａ）産生細胞および細胞溶解緩衝液を処理容器へ加えるステップと、ｂ）前記処理容器内において前記産生細胞および前記細胞溶解緩衝液を混合して混合物を形成するステップと、ｃ）前記混合物をウイルスベクター精製用の親和性樹脂を含むクロマトグラフィカラムに流し通すステップであって、ウイルスベクターが前記クロマトグラフィカラム内の前記樹脂に吸着される、ステップと、ｄ）クロマトグラフィカラム内の樹脂から製品容器内へとウイルスベクターを溶離するステップとを連続ワークフローに含む。
【００１８】
ステップｄ）において製品容器内に取得されたウイルスベクターが、新たな産生細胞をトランスフェクトするために使用され、この新たな産生細胞は、次いで、ステップａ）〜ｄ）が３〜６回または３〜６通過など少なくとも１回繰り返される前に培養される。
【００１９】
産出規模、すなわち本方法により取得されるウイルスベクターの数量は、親和性樹脂の飽和点およびクロマトグラフィカラムの体積により指定される。好ましい構成におけるカラム体積は最大で２００ｍＬである。
【００２０】
任意には、本方法は、ステップｃ）またはステップｄ）の後に、処理容器内に洗浄緩衝液を放出することにより細胞／残屑をフラッシングし廃棄容器内に細胞／残屑を排出するステップを含む。
【００２１】
好ましくは、処理容器、製品容器、およびカラムは、まったく同一のカセット内に取り付けられ、細胞溶解緩衝液、洗浄緩衝液、溶離緩衝液、および任意には廃棄容器が、このカセットの外部に配置される。本発明では、カセットを含むすべてのパーツ１〜８は、時としてウイルスベクターキットと呼ばれる。好ましくは、これらの容器はプラスチックバッグ容器である。産生細胞は、ソースバッグまたは任意の他の適切な容器の中に用意され得る。これらの容器は、プラスチックバッグまたは任意の他の適切な容器であってもよい。カセットは、図２〜図７において以下で説明されるキットを通過する液体の流れを促進するポンプを有するデバイス上に取り付けられる。ピンチ弁により、個々の入力に対して特定のラインを選択することが可能となり、培養物を処理容器内の中心で処理することが可能となる。
【００２２】
本発明の方法およびキットは、好ましくはＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（登録商標）である器具と共に使用され、この器具は、固有のワークフローを最適化するためにユーザが特定のプロセスパラメータを設定することを可能にするデジタルインターフェースを有する。カセットにより、親和性カラムを用いた従来的なウイルスベクター単離の自動化が可能となる一方で、本方法は、細胞溶解緩衝液を使用したウイルス粒子の放出と、同一プロセスにおいて抗体、リガンド、または他のアンカー可能分子との特異的ウイルス結合の利用とをさらに伴う。また、本方法およびキットは、残存ウイルス培養物を精製するために仲介的に使用されることも可能であり、これが、ウイルスベクター産生分野におけるこれらの方法およびキットの汎用性を極めて新規性の高いものにする。
【００２３】
クロマトグラフィカラムは、選択されたウイルスベクターに対する特異性を有する互換性の親和性カラムである。親和性カラムは、カラム内のウイルスベクターを結合する特異性を有する抗体、リガンド、または任意の他のアンカー可能分子を含むことが可能であるが、それらに限定されない。
【００２４】
一実施形態では、処理容器は、処理容器内に任意の未処理細胞／細胞残屑を保持するためにフィルタ付きの出口ポートを備える。
【００２５】
ウイルスベクターは、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスなどの任意のウイルスであってよい。
【００２６】
好ましくは、目的の遺伝子は、キメラ抗原をコードする遺伝子（ＣＡＲ）などの疾患調節遺伝子を含む。
【００２７】
製品容器内の単離されたウイルスベクターの精製度は、ステップａ）〜ｄ）を繰り返す前にＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）検出を伴う品質アッセイにおいて試験され得る。このアッセイにおいて、親和性カラム内のものと同一のタイプの親和性リガンドが、センサ表面に固定され得る。
【００２８】
第２の態様では、本発明は、Ｔ細胞をＣＡＲ−Ｔ細胞へと形質転換するためなど、細胞療法のための、本発明に従って単離されたウイルスベクターの使用に関する。
【００２９】
第３の態様では、本発明は、まったく同一のカセット内に取り付けられた処理容器、製品容器、およびクロマトグラフィカラムを備え、カセットの外部に配置された産生細胞、細胞溶解緩衝液、洗浄緩衝液、および溶離緩衝液のためのソース容器と、任意には廃棄容器とをさらに備える、キットに関する。すべての容器は、好ましくはプラスチックバッグ容器である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明による方法において使用されるウイルスベクター単離キットの種々の構成要素を示す概略図である。
【図２】このウイルスベクター単離キットの使用における第１のステップ（産生細胞の溶解）を示す図である。
【図３】キットの使用において所要に応じて任意ステップ間で適用され得る混合ステップを示す図である。
【図４】ウイルスベクター単離キットの使用における第２のステップ（カラムによる上清フラッシング）を示す図である。
【図５】ウイルスベクター単離キットの使用における第３のステップ（プロセスバッグ洗浄）を示す図である。
【図６】ウイルスベクター単離キットの使用における第４のステップ（カラム溶離）を示す図である。
【図７】本発明において使用されるウイルスベクター単離キットの流路のさらに詳細な図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
複数のＦＤＡ承認されたＣＡＲ−Ｔ細胞療法の出現により、レンチウイルスおよびガンマレトロウイルスなどの最も効果的な候補ウイルスが知られている。
【００３２】
本発明は、バッグおよびクロマトグラフィカラムのシステムを備える、小規模から中規模のあらゆるウイルスベクターの精製のためのプラットフォームを提供する。このプラットフォームは、クロマトグラフィカラム内の樹脂の飽和点および体積のみにより制限され、カラムは、種々のタイプのウイルスベクターの精製を可能にするように互換性を有する。
【００３３】
添付の図面に関連して本発明をさらに詳細に説明する。
【００３４】
本発明は、好ましいウイルスベクターとしてレンチウイルスを用いて説明されるが、任意のウイルスベクターが本発明のプラットフォームにおいて精製され得る。
【００３５】
本発明によるキットの構成要素は、レンチウイルスに予め感染させた産生細胞を収容するソースバッグと、培養中で産生された上清内の任意のレンチウイルスを含む。さらに、産生細胞を溶解してさらなるウイルス粒子を放出させる、したがって収量を最大化するための細胞溶解緩衝液。洗浄緩衝液が、最終カラム溶離の前にキットから細胞残屑をすすぎ落すために使用される。最後に、カラム溶離溶液が、精製されたウイルス粒子を最終製品バッグ内に放出するために必要とされる。
【００３６】
図１は、ウイルスベクター単離キットの種々の構成要素を示す。このキットは、８つのパーツまたは容器を備え、好ましくは７つのバッグタイプ容器および１つのカラム形状容器を備える。
【００３７】
最初に、ウイルスベクターを産生する産生細胞１を含むソース容器、好ましくはソースバッグが存在する。このバッグの体積は変更可能であり、クロマトグラフィカラムの飽和点のみにより制限される。
【００３８】
細胞溶解緩衝液２が、ソースバッグからの産生細胞の細胞溶解のために、細胞溶解緩衝液容器または細胞溶解緩衝液バッグ内に用意される。溶解作用は、ｐＨまたは酵素により仲介される。細胞溶解緩衝液は、細胞を溶解するが、ウイルスベクターを保存する。溶解緩衝液２は、使用の容易性と、ソースバッグにおいて見られる体積の変化に対する柔軟性のために、小体積の高濃度溶解剤を含む。細胞溶解緩衝液の例は、脂質二重層細胞膜を崩壊させるために典型的には洗剤ベースである。細胞溶解緩衝液は、細胞を溶解するには十分であるが、下流のカラム単離での抗体結合またはタンパク質相互作用に干渉しない程度の侵攻性を有さなければならない。細胞溶解緩衝液は、産生細胞懸濁物と混合された場合にその最終濃度が適切なものとなるように高濃度化されることが重要である。
【００３９】
好ましくは、洗浄緩衝液３がバッグ内に用意され、この洗浄緩衝液３は、キットから細胞、細胞残屑をすすぎ落すための洗浄緩衝液を含む。その体積は、溶解緩衝液２の全痕跡を除去するために十分な量となる。
【００４０】
好ましくは、溶離緩衝液４が、カラム８をフラッシングするための溶離緩衝液を含むカラム溶離緩衝液バッグ内に用意される。その体積は、カラムからの複数の溶離ステップによるウイルス収量を最大化するのに十分な大きさであるべきである。
【００４１】
容器５は、処理容器または処理バッグであり、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｋｉｔにおける処理バッグの体積に相当する８５０ｍＬなど、約０．５〜１Ｌであるべきである。
【００４２】
容器６は、廃棄容器または廃棄バッグであり、最大で６Ｌである現行のＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｋｉｔにおける処理バッグの体積と同様であるべきである。
【００４３】
容器またはバッグ７は、精製されたウイルスベクターのための製品バッグである。その体積は、すべての溶離緩衝液４の体積を保持するのに十分なものであるべきである。
【００４４】
カラム８は、単離される所望のウイルスベクターに対する特異性を有する抗体またはリガンドを備えるクロマトグラフィ媒体またはクロマトグラフィ樹脂をパッキングされたクロマトグラフィカラムである。
【００４５】
カラム８は、例えばＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  “ＲｅａｄｙＭａｔｅ”（登録商標）コネクタシステムなどの任意の技術を利用した互換性を有する。
【００４６】
図２に示すように、本プロセスの第１のステップでは、産生細胞１および細胞溶解緩衝液２は、処理バッグ５に加えられる。これらの細胞および緩衝液は、図３に示すようにキット内を循環されることにより、混合とその後の溶解の実現が確保される。細胞が溶解されると、混合物は、図４に示すようにカラム８に押し通される。このステップのための出口ポートには、すべての未処理細胞／細胞残屑を処理バッグ５内に保持するフィルタが付けられる。すべての細胞／残屑がシステム外へフラッシングされたことを確実にするために、洗浄緩衝液３は、処理バッグ５内に放出され、システム内で循環され、最後に図５に示すように廃棄バッグ６内へと排出される。その後、カラム８のための溶離緩衝液が放出されて、図６に示すように最終製品バッグ７内にウイルスベクターが押し込まれる。
【００４７】
図７は、本発明の方法におけるウイルス単離キットの使用のさらなる詳細図である。この例ではピンチ弁である弁が、三角形の砂時計記号により示され、ポンプヘッドが、６つのローラを有する円により示される。入力構成要素（１〜４）および廃棄バッグ（６）を除くキットのすべての構成要素が、カセットに取り付けられる。好ましくは、カセットは、好ましくはレール機構により、ＷＯ２０１７／１０９０７１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（登録商標）内に取り付けられる。
【００４８】
本発明によるウイルスベクターキットと共に使用するための器具は、ＷＯ２０１７／１０９０７１に記載のものと同一である。動作時に、この器具は、ウイルスベクター採取に必要なすべての流体要素（例えば流路、緩衝液バッグ、およびカラム）を備える除去可能および使い捨て式の低コストウイルスベクターキットと共に、ポンプ、ピンチ弁、および秤量機構を含む再使用可能な機械的要素を含む。これらの特徴部の組合せにより、ウイルスベクター単離のための方法がもたらされ、選択されたウイルスベクターキットが、この器具上に容易に取り付けられる。この器具のいかなる機械的パーツも流体に触れないため、各ウイルスベクター単離を実施する間における機械的パーツの洗浄が不要となる。これは、細胞治療用途における後の使用においてとりわけ重要であり、器具の容易に実現可能な無菌動作条件により、治療成功確率がはるかに改善され、コストおよび所要時間が削減される。
【００４９】
このウイルスベクター単離キットは、ＷＯ２０１７／１０９０７１に記載されるＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（登録商標）Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｋｉｔの流路概要と複数の類似点を有するが、複数の追加点が存在する。すなわち、洗浄緩衝液および溶離緩衝液のためのバッグが、プロセスのための洗浄緩衝液および溶離溶液を収容するために追加されなければならない。キットの主要循環部にこれらのバッグを連結するラインがさらに追加されて、現行でＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（登録商標）に設置されたポンプヘッドを追加する必要なく、システム中にいずれの入力バッグが流れ得るかを選択するピンチ弁および接合ピース内へと送られる。クロマトグラフィカラム（８）は、中空糸フィルタカートリッジの典型的な位置に置き換わる。
【００５０】
（実施例）
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法のワークフローに適合する本発明のウイルスベクター単離手順の具体的な一実施例は、ｇａｇ／ｐｏｌ、ｒｅｖ、エンベロープ遺伝子、およびこの場合ではキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である目的の遺伝子をコードする伝達プラスミドなどのウイルス機構をコーディングするレンチウイルスプラスミドを用いてトランスフェクトされたヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ  ２９３Ｔ）細胞の従来的な静置培養からなる。約７２時間後に、細胞培養基内のウイルス負荷が適切な濃度に達している場合には、産生細胞培養物が、静置培養からソース容器へ輸送される。このソース容器は、カセットに溶接またはルアー連結され得るソースバッグであることが可能である。これは、従来のワークフローではユーザがウイルス粒子を採取するために上清のみを移すことが典型的に必要となるため、先行技術とは異なる。本発明によれば、産生細胞および上清の両方が採取のために使用される。他の入力バッグ、細胞溶解緩衝液、洗浄緩衝液、およびカラム溶離緩衝液が、同様の様式で連結される。次いで、ユーザが、採取するウイルスベクターに対する特異的親和性を有するカラムを選択し、ＲｅａｄｙＭａｔｅ（登録商標）システムと同様の使い捨て式無菌コネクタを用いてカセットにこのカラムを無菌連結する。すべての構成要素が装着されると、カセットはＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（登録商標）器具に挿入され、プロトコルが選択される。
【００５１】
最初に、産生細胞およびウイルスベクターを収容したソースバッグが、処理バッグに加えられる。空になると、細胞溶解緩衝液が、処理バッグに加えられる。次いで、処理バッグの流体が、カセット内の回路に押し通されることにより混合される。このステップは、所望のワークフローに応じて任意となる。次いで、処理バッグの中身が、クロマトグラフィカラム内へ注がれ、特定ウイルス用のアンカーリガンドがウイルスに結合し、細胞残屑が廃棄バッグへと送られる。処理バッグの体積がカラムに完全に押し通されると、次いでカラム溶離緩衝液がカセットに進入し、カラムへ向かって処理バッグを通過し、最終製品バッグ内へとウイルス粒子を溶離する。
【００５２】
次いで、製品は、Ｔ細胞をＣＡＲ−Ｔ細胞へと形質転換するために残存Ｔ細胞培養物に導入される。代替的には、製品は、精製された製品で細胞をトランスフェクトし、より高い精製度の製品を生み出す目的で産生細胞を培養するために、欠陥ウイルスがカラム外へと廃棄されることにより産生細胞の新しい培養で再懸濁され得る。これは、複数の精製ステップを必要とするｃＧＭＰプロセスに従う。ウイルスベクターがその精製度および安定性において十分であると品質アッセイにより判断されると、Ｔ細胞の形質転換において使用するためのベクターをさらにもう１回またはさらに複数回にわたり単離するために、新規のウイルスベクター単離キットが使用され得る。
【００５３】
現行の方法は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞培養から培地を除去することのみを伴うプロセスである、ウイルス上清の採取を必要とする。細胞内に依然として存在するウイルス粒子は、このステップにおいて残されたままとなる。次いで、上清が、深層濾過を利用して不純物除去され、中空糸フィルタカートリッジで限外濾過される。特定ウイルスベクター用カラム（８）が、このプロセスを１つのステップに変えるのに十分な親和性をウイルス粒子に対して有するように選択される。これは、細胞溶離と組み合わされることにより、現行のプロセスと比較してより高いウイルス収量がもたらされる。
【符号の説明】
【００５４】
１  産生細胞
２  細胞溶解緩衝液
３  洗浄緩衝液
４  溶離緩衝液
５  容器、処理バッグ
６  容器、廃棄バッグ
７  容器、バッグ、最終製品バッグ
８  カラム、クロマトグラフィカラム、特定ウイルスベクター用カラム
【図１】
2021508470.tif 000003
【図２】
2021508470.tif 000004
【図３】
2021508470.tif 000005
【図４】
2021508470.tif 000006
【図５】
2021508470.tif 000007
【図６】
2021508470.tif 000008
【図７】
2021508470.tif 000009
【国際調査報告】
2021508470.tif 000010
2021508470.tif 000011
2021508470.tif 000012