(57)【要約】  本発明は、ｓＰＤ−１またはヒアルロニダーゼをコードする遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスおよびそれを含む医薬組成物に関する。本発明によるがん療法遺伝子を含みかつワクシニアウイルスのＫ３Ｌ、ＴＫ、またはＶＧＦ遺伝子の抑制された発現を有する組換えワクシニアウイルスは優れた抗腫瘍効果を有する。したがって、本発明の組換えワクシニアウイルスは、がん治療において有利に用いられ得る。
2021511048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性プログラム細胞死タンパク質−１（ｓＰＤ−１）をコードする遺伝子、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つを含む、組換えワクシニアウイルス。
【請求項２】
前記ｓＰＤ−１が配列番号１３１または配列番号１３３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３】
ｓＰＤ−１をコードする前記遺伝子が配列番号１３２または配列番号１３４のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４】
前記ヒアルロニダーゼが配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５】
ヒアルロニダーゼをコードする前記遺伝子が配列番号１３６のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項６】
インターロイキン（ＩＬ）−１２をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７】
前記ＩＬ−１２が配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８】
ＩＬ−１２をコードする前記遺伝子が配列番号１３８から配列番号１４０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項９】
Ｋ３Ｌをコードする遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子、ワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）をコードする遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つの抑制された発現を有する、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１０】
ウエスタンリザーブ（ＷＲ）、ニューヨークワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、ワイス（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、ＬＣ１６ｍ８、リスター、コペンハーゲン、ティアンタン、ＵＳＳＲ、タシュケント、エバンス、国際保健局−Ｊ株（ＩＨＤ−Ｊ）、国際保健局−ホワイト株（ＩＨＤ−Ｗ）、それらの変異体およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１１】
ＩＨＤ−Ｗである、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項１２】
活性成分として請求項１から１１のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、がんを予防または処置するための医薬組成物。
【請求項１３】
前記がんが固形がんまたは血液がんである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記固形がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がんおよびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記血液がんが、リンパ腫、急性白血病、多発性骨髄腫およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
活性成分として請求項１から１１のいずれか一項に記載の組換えワクシニアウイルスを含有する組成物を個体に投与する工程を含む、がんを予防または処置する方法。
【請求項１７】
前記がんが固形がんまたは血液がんである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記固形がんが、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がんおよびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記血液がんが、リンパ腫、急性白血病、多発性骨髄腫およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療遺伝子を含む組換えワクシニアウイルスおよびそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、様々なウイルスを遺伝学的に操作することにより改変された腫瘍溶解性ウイルスに関する研究ががん治療剤を開発する目的のために活発に実行されてきた。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスを伴う問題は完全には解決されていない。例えば、抗がん剤を開発するために、腫瘍選択的な複製能力を有するウイルスが遺伝子操作により製造された。しかしながら、以下の問題が見出されている：そのようなウイルスはがん細胞に加えて正常細胞を殺傷し、そしてまた不充分な抗がん効果を有する。したがって、腫瘍溶解性ウイルスを、正常細胞に対する影響を最小化しながらがん細胞に対する選択性および有効性が増加したものとする技術の開発に対する継続的な需要がある。
【０００３】
他方、ワクシニアウイルスは、約２００の独立した遺伝子をコードする約２００ｋｂｐの二本鎖直鎖状ゲノムＤＮＡを有するエンベロープ型ＤＮＡウイルスである。ワクシニアウイルスは、天然痘の予防ワクチンとして１８世紀にＥｄｗａｒｄ  Ｊｅｎｎｅｒにより初めて使用された。それ以来、ワクシニアウイルスは様々な予防ワクチンに開発されてきた。初期のワクシニアウイルスワクチンでは野生型ウイルスが使用され、ワクチン接種された患者は、全身感染症または進行性感染症などの深刻な副作用を示した。したがって、副作用を低減するために、改変型ワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）、ＬＣ１６ｍ８（リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）株に由来する）およびニューヨークワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ、コペンハーゲンワクシニア株に由来する）などの弱毒化された毒性を有する改変型ワクシニアウイルスが開発された。様々な疾患に応用可能なワクチンがこれらのワクシニアウイルスに基づいて開発された。特に、ウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ；ウエスタンリザーブ）（ＷＲ）、ＮＹＶＡＣ、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）およびリスターなどのワクシニアウイルス株はまた、腫瘍溶解性ウイルスとして開発されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、がん治療遺伝子を含みかつ一部の遺伝子の抑制された発現を有していてもよい組換えワクシニアウイルスおよび活性成分としてそれを含む、がんを予防または処置するための医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の目的を達成するために、本発明は、可溶性プログラム細胞死タンパク質−１（ｓＰＤ−１）をコードする遺伝子、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つを含む、組換えワクシニアウイルスを提供する。
【０００６】
加えて、本発明は、活性成分として組換えワクシニアウイルスを含む、がんを予防または処置するための医薬組成物を提供する。
【０００７】
加えて、本発明は、活性成分として組換えワクシニアウイルスを含有する組成物を個体に投与する工程を含む、がんを予防または処置する方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明による、がん治療遺伝子を含みかつ一部の遺伝子の抑制された発現を有していてもよい組換えワクシニアウイルスは、優れた抗腫瘍効果を有する。したがって、本発明の組換えワクシニアウイルスは、がんを治療するために有用に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌが欠失したＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルス（ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１）の遺伝子構造の模式図を示す。ウイルス遺伝子欠失および治療的遺伝子導入に関する略語は、以下の表１に示すような意味を有する。
【表１】
2021511048.tif 000003
【図２】図２は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌが欠失され、かつｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子が挿入されているＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２の遺伝子構造の模式図を示す。
【図３】図３は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２  ｇＤＮＡのＰＣＲ生成物の電気泳動を行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子が挿入されたことを同定する。
【図４】図４は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２を感染させたＨｅＬａ細胞から分泌されたタンパク質のウエスタンブロッティングを行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子が発現されたことを示す。
【図５】図５は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌが欠失され、かつＰＨ２０遺伝子が挿入されているＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３の遺伝子構造の模式図を示す。
【図６】図６は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３ｇ  ＤＮＡのＰＣＲ生成物の電気泳動を行うことにより得られた結果を示し、ＰＨ２０遺伝子が挿入されたことを示す。
【図７】図７は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３を感染させたＨｅＬａ細胞から分泌されたタンパク質のウエスタンブロッティングを行うことにより得られた結果を示し、ＰＨ２０遺伝子が発現されたことを示す。
【００１０】
【図８】図８は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌが欠失され、かつＩＬ−１２遺伝子が挿入されているＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４の遺伝子構造の模式図を示す。
【図９】図９は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４  ｇＤＮＡのＰＣＲ生成物の電気泳動を行うことにより得られた結果を示し、ＩＬ−１２遺伝子が挿入されたことを示す。
【図１０】図１０は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４を感染させたＨｅＬａ細胞から分泌されたタンパク質のウエスタンブロッティングを行うことにより得られた結果を示し、ＩＬ−１２遺伝子が発現されたことを示す。
【図１１】図１１は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌが欠失され、かつｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子が挿入されているＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５の遺伝子構造の模式図を示す。
【図１２】図１２は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５  ｇＤＮＡのＰＣＲ生成物の電気泳動を行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子が挿入されたことを同定する。
【図１３】図１３は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を感染させたＨｅＬａ細胞から分泌されたタンパク質のウエスタンブロッティングを行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子が発現されたことを示す。
【図１４】図１４は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌが欠失され、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子が挿入されているＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６の遺伝子構造の模式図を示す。
【図１５】図１５は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６  ｇＤＮＡのＰＣＲ生成物の電気泳動を行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子が挿入されたことを同定する。
【図１６】図１６は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を感染させたＨｅＬａ細胞から分泌されたタンパク質のウエスタンブロッティングを行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子が発現されたことを示す。
【００１１】
【図１７】図１７は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌの発現が不活性化されているＷＲワクシニアウイルス（ＷＲ−ＶＶ０１）の遺伝子構造の模式図を示す。ウイルス遺伝子不活性化および治療的遺伝子導入に関する略語は、以下の表２に示すような意味を有する。
【表２】
2021511048.tif 000004
【図１８】図１８は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌの発現が不活性化されておりかつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子が挿入されているＷＲ−ＶＶ０６の遺伝子構造の模式図を示す。
【図１９】図１９は、ＷＲ−ＶＶ０６  ｇＤＮＡのＰＣＲ生成物の電気泳動を行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子が挿入されたことを示す。
【図２０】図２０ａは、ＷＲ−ＶＶ０６を感染させたＨｅＬａ細胞から分泌されたタンパク質のウエスタンブロッティングを行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０遺伝子が発現されたことを示す。図２０ｂは、ＷＲ−ＶＶ０６を感染させたＨｅＬａ細胞から分泌されたタンパク質に対してＥＬＩＳＡを行うことにより得られた結果を示し、ＩＬ−１２遺伝子が発現されたことを示す。
【００１２】
【図２１】図２１は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌが欠失したリスターワクシニアウイルス（リスター−ＶＶ０１）の遺伝子構造の模式図を示す。ウイルス遺伝子欠失および治療的遺伝子導入に関する略語は、以下の表３に示すような意味を有する。
【表３】
2021511048.tif 000005
【図２２】図２２は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌが欠失されかつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子が挿入されているリスター−ＶＶ０６の遺伝子構造の模式図を示す。
【図２３】図２３は、リスター−ＶＶ０６  ｇＤＮＡのＰＣＲ生成物の電気泳動を行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子が挿入されたことを示す。
【図２４】図２４ａは、リスター−ＶＶ０６を感染させたＨｅＬａ細胞から分泌されたタンパク質のウエスタンブロッティングを行うことにより得られた結果を示し、ｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０遺伝子が発現されたことを示す。図２４ｂは、リスター−ＶＶ０６を感染させたＨｅＬａ細胞から分泌されたタンパク質に対してＥＬＩＳＡを行うことにより得られた結果を示し、ＩＬ−１２遺伝子が発現されたことを示す。
【図２５】図２５は、マウス結腸直腸腫瘍モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図２６】図２６は、マウス黒色腫モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図２７】図２７は、マウス肺腫瘍モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図２８】図２８は、マウス結腸直腸腫瘍モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図２９】図２９は、マウス肺腫瘍モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【００１３】
【図３０】図３０は、マウス結腸直腸腫瘍モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図３１】図３１は、マウス黒色腫モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図３２】図３２は、マウス肺腫瘍モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図３３】図３３は、マウス黒色腫モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図３４】図３４は、マウス肺腫瘍モデルの腫瘍内にＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図３５】図３５は、マウス肺腫瘍モデルの腫瘍内にＷＲ−ＶＶ０１およびＷＲ−ＶＶ０６を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図３６】図３６は、マウス肺腫瘍モデルの腫瘍内にリスター−ＶＶ０１およびリスター−ＶＶ０６を投与した後、腫瘍成長を測定することにより得られた結果を示す。
【図３７】図３７は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６、ＷＲ−ＶＶ０６およびリスター−ＶＶ０６のインビトロ（in vitro）細胞殺傷能力を決定することにより得られた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一面では、可溶性プログラム細胞死タンパク質−１（ｓＰＤ−１）をコードする遺伝子、ヒアルロニダーゼをコードする遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つを含む組換えワクシニアウイルスが提供される。組換えワクシニアウイルスは、ＩＬ−１２をコードする遺伝子をさらに含んでもよい。
【００１５】
本明細書において用いる「ｓＰＤ−１」という用語は、５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質であり、免疫グロブリン分子のファミリーに属し、Ｔ細胞に対する共阻害分子として周知であるプログラム細胞死−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１；ＰＤ−１）の細胞外ドメインまたは断片を指す。加えて、ｓＰＤ−１という用語は、全長ｓＰＤ−１またはｓＰＤ−１の断片と免疫グロブリンＦｃ領域とが融合したｓＰＤ−１融合タンパク質を含む意味を有するとして使用されることがある。融合タンパク質の特定の例は、ｓＰＤ−１が免疫グロブリンＦｃ領域に結合したｓＰＤ−１−Ｆｃであり得る。ここで、ｓＰＤ−１およびＦｃは、互いに直接的にまたはリンカーを介して結合していてもよい。ここで、リンカーは、１〜５０、２〜４５、３〜４０、５〜３０、または７〜２５のアミノ酸から構成されるペプチドであってもよく、特に、３〜４０のアミノ酸から構成されるペプチドであってもよい。リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１２４）、ＳＰＫＡＱＡＧＧＧＧＳＡＱＰＱＡＥＧＳＬＧＧＧＧＳＡＫＡＳＡＰＡＧＧＧＧＳ（配列番号１２５）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＥＱＥＥＲ（配列番号１２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１２８）、ＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２９）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１３０）からなる群から選択されるアミノ酸配列であってもよいがそれに限定されない。
【００１６】
ｓＰＤ−１は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００８７９８．２の配列の部分であってもよく、いずれか１つの配列に限定されない。特に、ｓＰＤ−１は、配列番号１３１または配列番号１３３のアミノ酸配列であってもよい。加えて、ｓＰＤ−１は、ｓＰＤ−１の機能が改変されない限り、配列番号１３１のアミノ酸配列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはより高い、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはより高い、最も好ましくは約９９％またはより高い相同性を有してもよい。
【００１７】
加えて、本明細書において用いる「ｓＰＤ−１遺伝子」という用語は、「ｓＰＤ−１タンパク質」をコードする遺伝子またはｓＰＤ−１タンパク質、標的タンパク質および他のタンパク質が融合した「ｓＰＤ−１融合タンパク質」をコードする遺伝子を指す。特に、ｓＰＤ−１遺伝子は、Ｆｃ領域を含有するｓＰＤ−１融合タンパク質（ｓＰＤ１−Ｆｃ）をコードしていてもよい。ｓＰＤ−１遺伝子は、配列番号１３２または１３４のヌクレオチド配列を含んでもよい。加えて、ｓＰＤ−１遺伝子は、ｓＰＤ−１の機能が改変されない限り、配列番号１３４のヌクレオチド配列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはより高い、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはより高い、最も好ましくは約９９％またはより高い相同性を有してもよい。
【００１８】
加えて、本明細書において用いる「ヒアルロニダーゼ」という用語は、ヒアルロン酸を分解する酵素を指す。ヒアルロニダーゼは、ヒツジ、ウシ、マウス、またはヒトに由来してもよい。特に、ヒアルロニダーゼは、ヒトヒアルロニダーゼ（ＰＨ２０）または組換えヒトヒアルロニダーゼ（ｒＨｕＰＨ２０）であってもよい。ヒアルロニダーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００３１１７．４の配列であってもよいがそれに限定されない。特に、ヒアルロニダーゼは配列番号１３５のアミノ酸配列を有してもよい。加えて、特に、ヒアルロニダーゼ遺伝子は配列番号１３６のヌクレオチド配列を有してもよい。加えて、ヒアルロニダーゼ遺伝子は、ヒアルロニダーゼの機能が改変されない限り、配列番号１３６のヌクレオチド配列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはより高い、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはより高い、最も好ましくは約９９％またはより高い相同性を有してもよい。
【００１９】
加えて、本明細書において用いる「ＩＬ−１２」という用語は、サイトカインファミリーに属する分子であり、免疫系に関する。ＩＬ−１２は、ヒト（ｈＩＬ−１２）、マウス（ｍＩＬ−１２）、ウマ、ウシおよびブタなどの任意の動物から得られるものと同じであってもよい。ＩＬ−１２は、ＧｅｎＢａｎｋのＮＭ＿０００８８２．３（ｈＩＬ−１２Ａ）、ＡＹ００８８４７．１（ｈＩＬ−１２Ｂ）、ＮＭ＿００１１５９４２４．２（ｍＩＬ−１２α）、またはＮＭ＿００１３０３２４４．１（ｍＩＬ−１２β）において開示される配列であってもよいがそれに限定されない。特に、ＩＬ−１２は配列番号１３７のアミノ酸配列であってもよい。特に、ＩＬ−１２遺伝子は、配列番号１３８のヌクレオチド配列、配列番号１３９のヌクレオチド配列（ｐ３５サブユニット）、または配列番号１４０のヌクレオチド配列（ｐ４０サブユニット）により表されるリンカーを含んでもよい。加えて、ＩＬ−１２遺伝子は、ＩＬ−１２の機能が改変されない限り、配列番号１３８〜配列番号１４０のヌクレオチド配列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはより高い、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはより高い、最も好ましくは約９９％またはより高い相同性を有してもよい。
【００２０】
組換えワクシニアウイルスは、ｓＰＤ−１遺伝子を含むワクシニアウイルス、ヒアルロニダーゼ遺伝子を含むワクシニアウイルス、またはＩＬ−１２遺伝子を含むワクシニアウイルスであってもよい。ここで、ｓＰＤ−１遺伝子、ヒアルロニダーゼ遺伝子および／またはＩＬ−１２遺伝子は、ワクシニアウイルスのゲノムに挿入されていてもよい。加えて、遺伝子はまた、ワクシニアウイルスのゲノムの異なる位置において挿入されていてもよいが、そのような遺伝子は、同じまたは類似の位置において挿入されていてもよい。例として、そのような遺伝子のそれぞれは、ワクシニアウイルスのＴＫ、Ｋ３Ｌ、またはＶＧＦ位置において挿入されていてもよい。好ましくは、組換えワクシニアウイルスは、宿主細胞中でｓＰＤ−１、ヒアルロニダーゼおよび／またはＩＬ−１２を発現してもよい。
【００２１】
加えて、組換えワクシニアウイルスは、ｓＰＤ−１遺伝子、ヒアルロニダーゼ遺伝子、またはＩＬ−１２遺伝子の少なくとも２つを含んでもよい。例えば、組換えワクシニアウイルスは、ｓＰＤ−１遺伝子およびヒアルロニダーゼ遺伝子が挿入されているワクシニアウイルス、ｓＰＤ−１遺伝子およびＩＬ−１２遺伝子が挿入されているワクシニアウイルス、またはヒアルロニダーゼ遺伝子およびＩＬ−１２遺伝子が挿入されているワクシニアウイルスであってもよい。好ましくは、組換えワクシニアウイルスは、ｓＰＤ−１遺伝子、ヒアルロニダーゼ遺伝子およびＩＬ−１２遺伝子の全てを含んでもよい。すなわち、組換えワクシニアウイルスは、ｓＰＤ−１遺伝子、ヒアルロニダーゼ遺伝子およびＩＬ−１２遺伝子を発現することができるワクシニアウイルスであってもよい。
【００２２】
上述のワクシニアウイルスは、Ｋ３Ｌをコードする遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子、ワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）をコードする遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つの抑制された発現を有するワクシニアウイルスであってもよい。ここで、組合せは、Ｋ３Ｌをコードする遺伝子、ＴＫをコードする遺伝子およびＶＧＦをコードする遺伝子の少なくとも２つを指してもよい。
【００２３】
例えば、組換えワクシニアウイルスは、ｓＰＤ−１遺伝子を有するワクシニアウイルス、ヒアルロニダーゼ遺伝子を有するワクシニアウイルス、ｓＰＤ−１遺伝子およびヒアルロニダーゼ遺伝子を有するワクシニアウイルス、ｓＰＤ−１遺伝子およびＩＬ−１２遺伝子を有するワクシニアウイルス、ヒアルロニダーゼ遺伝子およびＩＬ−１２遺伝子を有するワクシニアウイルス、またはｓＰＤ−１遺伝子、ヒアルロニダーゼ遺伝子およびＩＬ−１２遺伝子を有するワクシニアウイルスであってもよく、各ワクシニアウイルスは、Ｋ３Ｌ遺伝子、ＴＫ遺伝子、ＶＧＦ遺伝子およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つの抑制された発現を有する。
【００２４】
本明細書において用いる「ＶＧＦ」という用語はワクシニア増殖因子を指す。ワクシニア増殖因子は、上皮成長因子と類似の活性を呈する酵素である。ＶＧＦ遺伝子によりコードされるワクシニア増殖因子は、ウイルスに感染した場合に成長因子活性を呈し、ウイルスにより引き起こされる感染の初期ステージにおいて合成されてもよい。ＶＧＦは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＯ８９２８８．１、ＡＢＤ５２４５５．１、またはＡＩＸ９８９２７．１の配列であってもよいがそれに限定されない。特に、ＶＧＦは配列番号１４１のアミノ酸配列を有してもよい。加えて、ＶＧＦ遺伝子は配列番号１４２のヌクレオチド配列であってもよい。ＶＧＦは、配列番号１４１のアミノ酸配列に対して、約７０％または７５％またはより高い、好ましくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％またはより高い相同性を有してもよい。加えて、ＶＧＦ遺伝子は、配列番号１４２のヌクレオチド配列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはより高い、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはより高い、最も好ましくは約９９％またはより高い相同性を有してもよい。
【００２５】
本明細書において用いる「ＴＫ」という用語はチミジンキナーゼを指す。チミジンキナーゼは、ヌクレオチドの生合成に関与する酵素である。ＴＫ遺伝子によりコードされるチミジンキナーゼによりＡＴＰのγ位におけるリン酸はチミジンに結合し、それにより、ウイルスＤＮＡを構成するヌクレオチドが生成され得る。ＴＫは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＯ８９３７３．１、ＡＢＤ５２５６０．１、またはＡＩＸ９９０１１．１の配列であってもよいがそれに限定されない。特に、ＴＫは配列番号１４３のアミノ酸配列を有してもよい。ＴＫ遺伝子は配列番号１４４のヌクレオチド配列であってもよい。ＴＫは、配列番号１４３のアミノ酸配列に対して、約７０％または７５％またはより高い、好ましくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％またはより高い相同性を有してもよい。加えて、ＴＫ遺伝子は、配列番号１４４のヌクレオチド配列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはより高い、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはより高い、最も好ましくは約９９％またはより高い相同性を有してもよい。
【００２６】
本明細書において用いる「Ｋ３Ｌ」という用語はＫ３Ｌタンパク質を指す。Ｋ３Ｌ遺伝子によりコードされるＫ３Ｌタンパク質は、翻訳開始因子−２α（ｅＩＦ−２α）に対して相同性を有するタンパク質であり、インターフェロン活性化因子であるプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の作用を抑制し得る。Ｋ３Ｌは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＯ８９３１３．１、ＡＢＤ５２４８３．１、またはＡＧＢ７５７５４．１の配列であってもよいがそれに限定されない。特に、Ｋ３Ｌは配列番号１４５のアミノ酸配列を有してもよい。Ｋ３Ｌ遺伝子は配列番号１４６のヌクレオチド配列であってもよい。Ｋ３Ｌは、配列番号１４５のアミノ酸配列に対して、約７０％または７５％またはより高い、好ましくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％またはより高い相同性を有してもよい。加えて、Ｋ３Ｌ遺伝子は、配列番号１４６のヌクレオチド配列に対して、約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはより高い、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはより高い、最も好ましくは約９９％またはより高い相同性を有してもよい。
【００２７】
本発明による遺伝子の抑制された発現は、遺伝子の部分的もしくは全体的な欠失または遺伝子への外来遺伝子の挿入により遺伝子が発現されないかまたは遺伝子の部分のみが発現され、それにより、遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が呈されないことを意味する。遺伝子を欠失させまたは外来遺伝子を挿入する方法は、当該技術分野において周知の方法により行われてもよい。例えば、これは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis (2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press、Virology Methods Manual, edited by Brian W J Mahy and Hillar O Kangro (1996), Academic PressおよびExpression of genes by Vaccinia virus vectors, and Current Protocols in Molecular Biology, published by John Wiley and Son (1998), Chapter 16において開示される外来遺伝子を挿入する方法により行われてもよい。特に、本発明の態様では、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ１３６０）またはｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ａ３６００）プラスミドシステムを使用して外来遺伝子を挿入した。
【００２８】
ワクシニアウイルスは、ウエスタンリザーブ（ＷＲ）、ニューヨークワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ）、ワイス（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ；ＮＹＣＢＯＨ）、ＬＣ１６ｍ８、リスター、コペンハーゲン、ティアンタン（Ｔｉａｎ  Ｔａｎ）、ＵＳＳＲ、タシュケント（Ｔａｓｈｋｅｎｔ）、エバンス（Ｅｖａｎｓ）、国際保健局−Ｊ株（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ−Ｊ；ＩＨＤ−Ｊ）、国際保健局−ホワイト株（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ−Ｗｈｉｔｅ；ＩＨＤ−Ｗ）、それらの変異体およびそれらの組合せからなる群から選択されてもよいがそれに限定されない。特に、ワクシニアウイルスは、ＷＲ、リスター、またはＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスであってもよく、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２４３３１２．１、ＤＱ１２１３９４．１、またはＡＩＸ９８９５１．１の配列を有してもよい。本発明の態様では、ワクシニアウイルスはＩＨＤ−Ｗであってもよい。
【００２９】
本明細書において用いる「Ｖ」または「ウイルスＶ」という用語は、ワクシニア増殖因子遺伝子ＶＧＦが欠失し、かつＶＧＦ遺伝子の欠失に起因してＶＧＦ遺伝子を発現しない組換えワクシニアウイルスを指す。
【００３０】
加えて、本明細書において用いる「Ｔ」または「ウイルスＴ」という用語は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が欠失し、かつＴＫ遺伝子の欠失に起因してＴＫ遺伝子を発現しない組換えワクシニアウイルスを指す。
【００３１】
加えて、本明細書において用いる「Ｋ」または「ウイルスＫ」という用語は、Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失し、かつＫ３Ｌ遺伝子の欠失に起因してＫ３Ｌ遺伝子を発現しない組換えワクシニアウイルスを指す。
【００３２】
加えて、本明細書において用いる「ＶＴ」または「ウイルスＶＴ」という用語は、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えワクシニアウイルスを指す。ワクシニア増殖因子およびチミジンキナーゼの発現を不活性化する方法は上記の通りである。
【００３３】
加えて、本明細書において用いる「ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１」という用語は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを指す。ワクシニア増殖因子、チミジンキナーゼおよびＫ３Ｌタンパク質の発現を不活性化する方法は上記の通りである。
【００３４】
加えて、本発明の態様において使用される「ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２」という用語は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを指す。
【００３５】
加えて、本発明の態様において使用される「ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３」という用語は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを指す。
【００３６】
加えて、本発明の態様において使用される「ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４」という用語は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを指す。
【００３７】
加えて、本発明の態様において使用される「ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５」という用語は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを指す。
【００３８】
加えて、本発明の態様において使用される「ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６」という用語は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを指す。
【００３９】
特に、本発明による組換えワクシニアウイルスの例として、以下を言及することができる。ＷＲワクシニアウイルスの変異体は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の少なくとも１つの発現が誘導されているＷＲワクシニアウイルスを含み得る。
【００４０】
加えて、ＮＹＶＡＣワクシニアウイルスの変異体は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の少なくとも１つの発現が誘導されているＮＹＶＡＣワクシニアウイルスを含み得る。
【００４１】
加えて、ワイスワクシニアウイルスの変異体は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の少なくとも１つの発現が誘導されているワイスワクシニアウイルスを含み得る。
【００４２】
加えて、リスターワクシニアウイルスの変異体は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の少なくとも１つの発現が誘導されているリスターワクシニアウイルスを含み得る。
【００４３】
加えて、ティアンタンワクシニアウイルスの変異体は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の少なくとも１つの発現が誘導されているティアンタンワクシニアウイルスを含み得る。
【００４４】
加えて、ＵＳＳＲワクシニアウイルスの変異体は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の少なくとも１つの発現が誘導されているＵＳＳＲワクシニアウイルスを含み得る。
【００４５】
加えて、タシュケントワクシニアウイルスの変異体は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の少なくとも１つの発現が誘導されているタシュケントワクシニアウイルスを含み得る。
【００４６】
加えて、ＩＨＤ−Ｊワクシニアウイルスの変異体は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の少なくとも１つの発現が誘導されているＩＨＤ−Ｊワクシニアウイルスを含み得る。
【００４７】
さらには、ＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの変異体は、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の少なくとも１つの発現が抑制されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の少なくとも１つの発現が誘導されているＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを含み得る。
【００４８】
本発明の別の面では、活性成分として本発明による組換えワクシニアウイルスを含む、がんを予防または処置するための医薬組成物が提供される。ここで、上記のように、組換えワクシニアウイルスは、ｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０、またはＩＬ−１２遺伝子、またはその組合せの発現が誘導されており、かつＶＧＦ、ＴＫ、またはＫ３Ｌ遺伝子、またはその組合せの発現が抑制されているワクシニアウイルスであってもよい。ｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０、ＩＬ−１２、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子は上記の通りである。
【００４９】
本明細書において用いる「がん」という用語は、固形がんまたは血液がんであってもよい。ここで、固形腫瘍は、肺がん、結腸直腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、乳がん、脳腫瘍、頭頸部がん、線維肉腫、食道がん、皮膚がん、胸腺がん、胃がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮がん、膀胱がん、直腸がん、胆嚢がん、胆道がん、膵臓がんおよびそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。本発明の態様によれば、がんは、肺がん、肝臓がん、前立腺がん、頭頸部がん、線維肉腫、脳腫瘍、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、または結腸直腸がんであってもよい。加えて、血液がんは、リンパ腫、急性白血病、多発性骨髄腫およびそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、芳香剤および防腐剤からなる群から選択される１つまたは複数の薬学的に許容される添加物をさらに含有してもよい。
【００５１】
本発明の組成物は、従来法にしたがって配合されてもよい。本発明の組成物は、特に哺乳動物への投与後の、活性成分の迅速な、持続的な、または遅延した放出を提供するように当該技術分野において公知の方法を用いて配合されてもよい。配合物に依存して、本発明の組成物は、個体に適切に投与されてもよい。そのような投与は非経口投与であってもよく、その例は、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路を含み得る。非経口投与用の調製物の形態は、注射可能な調製物であってもよい。
【００５２】
本発明のさらに別の面では、活性成分として本発明による組換えワクシニアウイルスを含有する組成物を個体に投与する工程を含む、がんを予防または処置する方法が提供される。ここで、がんは上記の通りである。
【００５３】
個体は哺乳動物であってもよく、哺乳動物としては、霊長動物（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚および鳥などを挙げることができるがそれに限定されない。特に、哺乳動物はヒトであってもよい。本発明の組成物は、患者の年齢、性別、体重、疾患症状の重篤度および投与の経路に依存して当業者により適切に投与されてもよい。投与は１日１回または１日当たり複数回であってもよく、適切なサイクルにおいて繰り返し投与されてもよい。
【００５４】
本発明の組換えワクシニアウイルスを含有する組成物の好ましい投与量は、個体の状態および体重、疾患の重篤度、薬物形態、投与の経路および継続期間に依存して変化し、当業者により適切に選択されてもよい。特に、投与量は、患者がウイルス粒子を与えられ、ウイルス単位が、１×１０５〜１×１０１８、好ましくは１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７またはより高い感染力（ＴＣＩＤ５０）、またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）を有するようなものであってもよく、上記の間の様々な値および範囲が含まれ得る。加えて、ウイルスの投与量は、０．１ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌまたはより多くであってもよく、上記の間の全ての値および範囲が含まれ得る。
【実施例】
【００５５】
発明の様式
以下において、以下の実施例を参照して本発明をより詳細に記載する。しかしながら、以下の実施例は本発明を実例により説明する意図のものに過ぎず、本発明はそれに限定されない。
【００５６】
Ｉ．組換えワクシニアウイルスの製造
本発明者らは、ＴＫ、ＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失しまたはその発現が不活性化されている組換えワクシニアウイルスプラスミドを構築した。これらのプラスミドを使用して、上記の遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスを製造し、抗がん物質としてのその特性について比較を行った。加えて、本発明者らは、上記の組換えワクシニアウイルスプラスミドへのｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０、ＩＬ−１２遺伝子の挿入により得られる組換えワクシニアウイルスプラスミドを構築した。これらのプラスミドを使用して、上記の遺伝子の発現が誘導されている組換えワクシニアウイルスを製造し、抗がん物質としてのその特性について比較を行った。
【００５７】
実施例１．組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの製造
実施例１．１．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１ウイルスの製造
実施例１．１．１．ＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスプラスミドの構築
最初に、ＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＶＲ−１４４１）のゲノムＤＮＡ中の両側においてＶＧＦ遺伝子に隣接する遺伝子領域をＰＣＲにより増幅した。ここで、両側においてＶＧＦ遺伝子に隣接する相同ヌクレオチド配列の増幅のために使用したプライマーに関する情報を以下の表４に示す。そのようにして、ＶＧＦ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）およびＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）断片を得た後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｐｌａｓｍｉｄとライゲートしてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）またはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。
【００５８】
【表４】
2021511048.tif 000006
【００５９】
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）およびｐＳＰ７２をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩを用いてそれぞれ処理した後、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。構築したｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。
【００６０】
次に、ｐ１１プロモーターおよびＬａｃＺ遺伝子をｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）に導入するために、以下の実施例２．１．１において構築したようなＷＲ  ＶＧＦ（ｉ）シャトルプラスミド中のｐ１１−ＬａｃＺ発現カセットおよびｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）をＮｈｅＩおよびＰａｃＩを用いて処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦシャトルプラスミド」と称する）を構築した。
【００６１】
実施例１．１．２．ＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスプラスミドの構築
最初に、ＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡ中の両側においてＴＫ遺伝子に隣接する遺伝子領域を得るために、ＰＣＲを行い、結果として、ＴＫ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）およびＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）断片を得た。ここで、使用したプライマーを以下の表５に示す。得られたＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）断片およびｐＳＰ７２プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。加えて、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）およびＴＫ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）断片をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。
【００６２】
構築したｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）プラスミドおよび以下の実施例２．１．２において構築したようなＷＲ  ＴＫ（ｉ）シャトルプラスミドであるｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−Ｇｐｔ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。
【００６３】
【表５】
2021511048.tif 000007
【００６４】
実施例１．１．３．Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスプラスミドの構築
最初に、ＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡ中の両側においてＫ３Ｌ遺伝子に隣接する遺伝子領域をＰＣＲにより増幅した後に、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにそれぞれ挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。ここで、使用したプライマーを以下の表６に示す。
【００６５】
Ｋ３Ｌシャトルプラスミドの内部の遺伝子発現カセットを構築するために、以下の実施例２．１．３において構築したようなＷＲ  Ｋ３Ｌ（ｉ）シャトルプラスミドを鋳型として使用してＰＣＲによりｐ７．５−ＤｓＲｅｄ遺伝子カセットを増幅した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄを構築した。ｐ７．５プロモーターおよびＤｓＲｅｄ遺伝子の増幅のために使用したプライマーの配列を以下の表６に示す。
【００６６】
【表６】
2021511048.tif 000008
【００６７】
構築したｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄおよびｐＳＰ７２プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶを用いてそれぞれ処理した後、ライゲートしてｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄを完成させた。加えて、構築したｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄおよび上記の構築したｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩを用いて処理した後、ライゲートしてｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。次に、構築したｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてそれぞれ処理した後、ライゲートしてｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。
【００６８】
実施例１．１．４．ＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの製造
実施例１．１．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦシャトルプラスミドを使用して、ＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを以下の方法により製造した。
【００６９】
組換えウイルスを得るために、３×１０５細胞／ウェルの条件および２％のウシ胎仔血清を含有するＭＥＭ培地の状態において６ウェルプレート中でＨｅＬａ細胞を調製した。次に、ｊｅｔＰＲＩＭＥを使用してＨｅＬａ細胞に２μｇのＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドをトランスフェクトし、それと同時に０．０５ＭＯＩにおいてＩＨＤ−Ｗ野生型ワクシニアウイルスを用いて処理した。４時間のインキュベーション後、培地を５％のウシ胎仔血清を含有するＭＥＭ培地に置き換えた後、細胞をさらに４８時間インキュベートした。最後に、感染細胞を５００μｌの培地を用いて収集した後、凍結および解凍を３回繰り返すことにより細胞を溶解して、粗ウイルスを得た。粗ウイルスを使用して従来法によるプラーク単離に繰り返し供することにより、純粋に単離された組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶを得た。
【００７０】
実施例１．１．５．ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの製造
実施例１．１．２．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドおよび実施例１．１．４．において製造したような組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴを得た。
【００７１】
実施例１．１．６．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１ウイルスの製造
実施例１．１．３．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドおよび実施例１．１．５．において製造したような組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１を得、その遺伝子構造を図１に示す。
【００７２】
実施例１．２．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２ウイルスの製造
実施例１．２．１．ＴＫ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスプラスミドの構築
ＴＫシャトルプラスミドの内部の遺伝子発現カセットを構築するために、鋳型としてｐＥ３．１（ＥＦ１ａ．ｓＰＤ−１．Ｆｃ）プラスミド（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの泌尿器がん研究部門により提供された）を使用してＰＣＲによりｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子を増幅した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｓＰＤ１−Ｆｃを構築した。加えて、鋳型としてｐＧＬ４．１  ｐ７．５ルシフェラーゼプラスミドを使用してＰＣＲによりｐ７．５プロモーターを増幅した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐ７．５を構築した。構築したｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐ７．５およびｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｓＰＤ１−ＦｃプラスミドをＰａｃＩおよびＮｈｅＩを用いてそれぞれ処理した後、ライゲートしてｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐ７．５−ｓＰＤ１−Ｆｃを完成させた。ｐ７．５プロモーターおよびｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子の増幅のために使用したプライマーの配列を以下の表７に示す。実施例１．１．２．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いて処理した後、ｐ７．５−ｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子カセットをインフュージョンクローニング法によりそこに挿入してｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ｐＳＥ／Ｌ−ＥＧＦＰ−ＴＦ−ＴＦ−ｓＰＤ１−Ｆｃ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ｓＰＤ１−Ｆｃ）シャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。インフュージョンクローニング法のために使用したプライマーの配列を以下の表７に示す。
【００７３】
【表７】
2021511048.tif 000009
【００７４】
実施例１．２．２．ＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの製造
実施例１．１．３．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドおよび実施例１．１．４．において製造したような組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＫを得た。
【００７５】
実施例１．２．３．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２ウイルスの製造
実施例１．２．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ｓＰＤ１−Ｆｃ）シャトルプラスミドおよび実施例１．２．２．において製造したような組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＫを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２を得、その遺伝子構造を図２に示す。
【００７６】
実施例１．２．４．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２におけるｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子の挿入および発現の同定
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（カタログ番号７４０９５６２５０）を使用して実施例１．２．３．において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２のｇＤＮＡを得、以下の表８におけるプライマーを使用して組換えウイルスのｇＤＮＡの構造を同定した。図３に示すように、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ位置のそれぞれにおけるＤＮＡ構造を同定することにより得られた結果は、対照群と比較して、遺伝子が挿入された位置においてＰＣＲ断片サイズが変化していることを示した。
【００７７】
ウエスタンブロッティングを行って、挿入されたｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。最初に、ＨｅＬａ細胞を０．０５ＭＯＩの組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２を用いて４４〜５２時間処理した。次に、培地をウシ胎仔血清を含有しないＭＥＭ培地で置き換え、細胞をさらに１６〜２０時間インキュベートした。培地および細胞を互いに分離し、タンパク質をそれらからそれぞれ得た。調製したタンパク質をブラッドフォードアッセイ法により定量化した後、ウエスタンブロッティングを使用してタンパク質発現を同定した。ここで、ａｎｔｉ−ｍＰｄｃｄ１（Ｅ−１８）（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ−１０２９９）を一次抗体として使用し、抗ヤギを二次抗体として使用した。発現の結果を図４に示す。
【００７８】
【表８】
2021511048.tif 000010
【００７９】
実施例１．３．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３ウイルスの製造
実施例１．３．１．ＴＫ遺伝子が欠失されかつＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスプラスミドの構築
以下の表９に示すプライマーを使用してｐＨｙｂプロモーターＤＮＡをｐＧＬ４．１−ｐＨｙｂプラスミドから合成した後、インフュージョンクローニング法によりｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐＨｙｂを構築した。構築したｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＨｙｂにＰＨ２０遺伝子を挿入するために、ＰＣＲ法を通じてＰＨ２０のエクソン２、エクソン３およびエクソン４をＡ５４９細胞のｇＤＮＡからそれぞれ合成した。ここで、使用したプライマーを以下の表９に示す。
【００８０】
最初に、ＰＨ２０−エクソン２を挿入するために、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐＨｙｂプラスミドをＳｐｅＩを用いて処理した。ＰＣＲ法を通じてＰＨ２０−エクソン２を合成した後、インフュージョンクローニング法により線状化ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐＨｙｂに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０−エクソン２プラスミドを構築した。構築したｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０−エクソン２プラスミドをＳａｃＩを用いて処理し、ＰＣＲ法を通じてＰＨ２０−エクソン３およびＰＨ２０−エクソン４を合成した後、インフュージョンクローニング法によりそこに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０を構築した。実施例１．１．２．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いて処理した後、ｐＨｙｂ−ＰＨ２０遺伝子カセットをインフュージョンクローニング法によりそこに挿入してｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ｐＳＥ／Ｌ−ＥＧＦＰ−ＴＦ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０−ＴＦ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ＰＨ２０）シャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。インフュージョンクローニング法において使用したプライマーの配列を以下の表９に示す。
【００８１】
【表９】
2021511048.tif 000011
【００８２】
実施例１．３．２．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３ウイルスの製造
実施例１．３．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ＰＨ２０）シャトルプラスミドおよび実施例１．２．２．において製造したような組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＫを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３を得、その遺伝子構造を図５に示す。
【００８３】
実施例１．３．３．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３におけるＰＨ２０遺伝子の挿入および発現の同定
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（カタログ番号７４０９５６２５０）を使用して実施例１．３．２．において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３のｇＤＮＡを得、以下の表１０におけるプライマーを使用して組換えウイルスのｇＤＮＡの構造を同定した。図６に示すように、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ位置のそれぞれにおけるＤＮＡ構造を同定することにより得られた結果は、対照群と比較して、遺伝子が挿入された位置においてＰＣＲ断片サイズが変化していることを示した。
【００８４】
ウエスタンブロッティングを行って、挿入されたＰＨ２０遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。最初に、ＨｅＬａ細胞を０．０５ＭＯＩの組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３を用いて４４〜５２時間処理した。次に、培地をウシ胎仔血清を含有しないＭＥＭ培地で置き換え、細胞を１６〜２０時間インキュベートした。培地および細胞を互いに分離し、タンパク質をそれらからそれぞれ得た。調製したタンパク質をブラッドフォードアッセイ法により定量化した後、ウエスタンブロッティングを使用してタンパク質発現を同定した。ここで、ａｎｔｉ−ｈＰＨ２０（ＬｓＢｉｏ、カタログ番号ＬＳ−Ｃ３３１９０９）を一次抗体として使用し、抗ウサギを二次抗体として使用した。発現の結果を図７に示す。
【００８５】
【表１０】
2021511048.tif 000012
【００８６】
実施例１．４．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４ウイルスの製造
実施例１．４．１．Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されかつＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスプラスミドの構築
以下の表１１におけるプライマーを用いてＤＮＡ鋳型としてｐＧＬ４．１−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒプラスミドを増幅してｐＩ１Ｌ−Ｂ１９ＲプロモーターＤＮＡを合成した後、その挿入をインフュージョンクローニング法により行ってｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒプラスミドを構築した。単一のペプチドをコードするＩＬ−１２遺伝子をプラスミドに挿入するために、ＤＮＡ鋳型としてｐＶＡＸ１−ＩＬ−１２プラスミドを使用して以下の表１１におけるプライマーを用いてＩＬ−１２  ｐ４０およびｐ３５サブユニット遺伝子を増幅した。ここで、リンカーを構成する配列をリバースプライマーｐ４０の５’末端およびｐ３５のフォワードプライマーの３’末端に挿入した。上記において増幅したＩＬ−１２遺伝子をインフュージョンクローニング法により、ＸｈｏＩを用いて線状化されたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒプラスミドに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＩＬ−１２プラスミドを構築した。上記の構築したｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＩＬ−１２プラスミドおよび実施例１．１．３．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３ＬシャトルプラスミドをＮｏｔＩを用いてそれぞれ処理した後、ライゲートしてｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＩＬ−１２−ＴＦ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒプラスミドを構築した。
【００８７】
以下の表１１におけるプライマーを用いてＤＨ１  ｇＤＮＡからＰＣＲを行い、得られたｇｕｓＡマーカー遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ−ｇｕｓＡを構築した。鋳型として該プラスミドを使用して以下の表１１におけるプライマーを用いてＧｕｓＡ断片を得た。上記の構築したｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＩＬ−１２−ＴＦ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−ＲプラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｃＩＩを用いて処理した後、インフュージョンクローニングを行ってｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ｇｕｓＡ−ＴＦ−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＩＬ−１２−ＴＦ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌ（ＩＬ−１２）シャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。上記の方法において使用したプライマーの配列を以下の表１１に示す。
【００８８】
【表１１】
2021511048.tif 000013
【００８９】
実施例１．４．２．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４ウイルスの製造
実施例１．４．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌ（ＩＬ−１２）シャトルプラスミドおよび実施例１．１．５．において製造したような組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４を得、その遺伝子構造を図８に示す。
【００９０】
実施例１．４．３．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４におけるＩＬ−１２遺伝子の挿入および発現の同定
Ｍａｘｗｅｌｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（カタログ番号ＡＳ１３３０）を使用して実施例１．４．２．において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４のｇＤＮＡを得、以下の表１２におけるプライマーを使用して組換えウイルスのｇＤＮＡの構造を同定した。図９に示すように、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ位置のそれぞれにおけるＤＮＡ構造を同定することにより得られた結果は、対照群と比較して、遺伝子が挿入された位置においてＰＣＲ断片サイズが変化していることを示した。
【００９１】
ウエスタンブロッティングを行って、挿入されたＩＬ−１２遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。最初に、ＨｅＬａ細胞を０．０５ＭＯＩの組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４を用いて４４〜５２時間処理した。次に、培地をウシ胎仔血清を含有しないＭＥＭ培地で置き換え、細胞を１６〜２０時間インキュベートした。培地および細胞を互いに分離し、タンパク質をそれらからそれぞれ得た。調製したタンパク質をブラッドフォードアッセイ法により定量化した後、ウエスタンブロッティングを使用してタンパク質発現を同定した。ここで、ａｎｔｉ−ｍＩＬ−１２／ＩＬ−２３  ｐ４０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ４９９１）を一次抗体として使用し、抗ラットを二次抗体として使用した。発現の結果を図１０に示す。
【００９２】
【表１２】
2021511048.tif 000014
【００９３】
実施例１．５．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５ウイルスの製造
実施例１．５．１．ＴＫ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスプラスミドの構築
実施例１．１．２．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドおよびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５−ｓＰＤ１−ＦｃプラスミドをＮｈｅＩおよびＳａｌＩを用いて処理した後、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＴＦ−ｓＰＤ１−Ｆｃ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）プラスミドを構築した。該プラスミドおよびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０プラスミドをＳａｌＩおよびＢａｍＨＩを用いて処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０−ＴＦ−ＴＦ−ｓＰＤ１−Ｆｃ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。マーカー遺伝子ＥＧＦＰをプラスミドに挿入するために、鋳型としてＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドを使用してＰＣＲ法を通じてｐＳＥ／Ｌ−ＥＧＦＰ遺伝子を合成した。ここで、使用したプライマーを以下の表１３に示す。ｐＳＰ７２  ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０−ＴＦ−ＴＦ−ｓＰＤ１−Ｆｃ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）シャトルプラスミドをＰａｃＩを用いて処理し、合成したｐＳＥ／Ｌ−ＥＧＦＰ遺伝子をインフュージョンクローニング法によりそこに挿入してｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ｐＳＥ／Ｌ−ＥＧＦＰ−ＴＦ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０−ＴＦ−ＴＦ−ｓＰＤ１−Ｆｃ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ｓＰＤ１−Ｆｃ＋ＰＨ２０）シャトルプラスミド」と称する）を構築した。
【００９４】
【表１３】
2021511048.tif 000015
【００９５】
実施例１．５．２．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５ウイルスの製造
実施例１．５．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ｓＰＤ１−Ｆｃ＋ＰＨ２０）シャトルプラスミドおよび実施例１．２．２．において製造したような組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＫを使用した以外は、実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失し、かつｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を得、その遺伝子構造を図１１に示す。
【００９６】
実施例１．５．３．組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５におけるｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子の挿入および発現の同定
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（カタログ番号７４０９５６２５０）を使用して実施例１．５．２．において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５のｇＤＮＡを得、以下の表１４におけるプライマーを使用して組換えウイルスのｇＤＮＡの構造を同定した。図１２に示すように、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ位置のそれぞれにおけるＤＮＡ構造を同定することにより得られた結果は、対照群と比較して、遺伝子が挿入された位置においてＰＣＲ断片サイズが変化していることを示した。
【００９７】
ウエスタンブロッティングを行って、挿入されたｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。最初に、ＨｅＬａ細胞を０．０５ＭＯＩの組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を用いて４４〜５２時間処理した。次に、培地をウシ胎仔血清を含有しないＭＥＭ培地で置き換え、細胞を１６〜２０時間インキュベートした。培地および細胞を互いに分離し、タンパク質をそれらからそれぞれ得た。調製したタンパク質をブラッドフォードアッセイ法により定量化した後、ウエスタンブロッティングを使用してタンパク質発現を同定した。ここで、ｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子について、ａｎｔｉ−ｍＰｄｃｄ１（Ｅ−１８）（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ−１０２９９）を一次抗体として使用し、抗ヤギを二次抗体として使用し、ＰＨ２０遺伝子について、ａｎｔｉ−ｈＰＨ２０（ＬｓＢｉｏ、カタログ番号ＬＳ−Ｃ３３１９０９）を一次抗体として使用し、抗ウサギを二次抗体として使用した。発現の結果を図１３に示す。
【００９８】
【表１４】
2021511048.tif 000016
【００９９】
実施例１．６．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６ウイルスの製造
実施例１．６．１．ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの製造
実施例１．４．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌ（ＩＬ−１２）シャトルプラスミドおよび実施例１．５．２．において製造したようなＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失し、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を得、その遺伝子構造を図１４に示す。
【０１００】
実施例１．６．２．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６におけるｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の挿入および発現の同定
Ｍａｘｗｅｌｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（カタログ番号ＡＳ１３３０）を使用して実施例１．６．１．において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６のｇＤＮＡを得、以下の表１５におけるプライマーを使用して組換えウイルスのｇＤＮＡの構造を同定した。図１５に示すように、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ位置のそれぞれにおけるＤＮＡ構造を同定することにより得られた結果は、対照群と比較して、遺伝子が挿入された位置においてＰＣＲ断片サイズが変化していることを示した。
【０１０１】
ウエスタンブロッティングを行って、挿入されたｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。最初に、ＨｅＬａ細胞を０．０５ＭＯＩの組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を用いて４４〜５２時間処理した。次に、培地をウシ胎仔血清を含有しないＭＥＭ培地で置き換え、細胞を１６〜２０時間インキュベートした。培地および細胞を互いに分離し、タンパク質をそれらからそれぞれ得た。調製したタンパク質をブラッドフォードアッセイ法により定量化した後、ウエスタンブロッティングを使用してタンパク質発現を同定した。ここで、ｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子について、ａｎｔｉ−ｍＰｄｃｄ１（Ｅ−１８）（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ−１０２９９）を一次抗体として使用し、抗ヤギを二次抗体として使用し、ＰＨ２０遺伝子について、ａｎｔｉ−ｈＰＨ２０（ＬｓＢｉｏ、カタログ番号ＬＳ−Ｃ３３１９０９）を一次抗体として使用し、抗ウサギを二次抗体として使用し、ＩＬ−１２遺伝子について、ａｎｔｉ−ｍＩＬ−１２／ＩＬ−２３  ｐ４０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ４９９１）を一次抗体として使用し、抗ラットを二次抗体として使用した。発現の結果を図１６に示す。
【０１０２】
【表１５】
2021511048.tif 000017
【０１０３】
実施例２．組換えＷＲワクシニアウイルスの製造
実施例２．１．ＷＲ−ＶＶ０１ウイルスの製造
実施例２．１．１．ＶＧＦ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスプラスミドの構築
ＷＲワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＶＲ−１３５４）のゲノムＤＮＡ中の両側においてＶＧＦ遺伝子に隣接する遺伝子領域をＰＣＲにより増幅した後、それぞれｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。両側においてＶＧＦ遺伝子に隣接する相同ヌクレオチド配列の増幅のために使用したプライマーに関する情報を以下の表１６に示す。
【０１０４】
【表１６】
2021511048.tif 000018
【０１０５】
その発現がｐ１１プロモーターにより調節されるＬａｃＺを、組換えがＶＧＦ遺伝子の位置において起こったウイルスのスクリーニング用のマーカーとして使用した。ＷＲ  ｇＤＮＡ中のｐ１１プロモーター部位をＰＣＲにより増幅し、ｐＡＡＶ−ＬａｃＺ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２４００７１−５２）中のＬａｃＺ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。次に、結果物をそれぞれｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙおよびｐＧＥＭ−Ｔに挿入して、それぞれｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ１１およびｐＧＥＭ−Ｔ−ＬａｃＺを構築した。ｐ１１プロモーターおよびＬａｃＺの増幅のために使用したプライマーに関する情報を表１９に示す。
【０１０６】
ＶＧＦ遺伝子の機能が部分的に欠失したシャトルプラスミドを構築するために、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（ＷＲ）をＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩを用いて処理し、ＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩを用いてｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｐ２１９１）を処理することにより得られたベクターとライゲートしてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ（ＷＲ）を構築した。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩを用いて処理し、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩを用いて上記の構築したｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ（ＷＲ）を処理することにより得られたベクターとライゲートしてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）を得た。ＬａｃＺ発現カセットを導入するために、ＰＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ１１をＳａｌＩおよびＮｈｅＩを用いて処理し、ＳａｌＩおよびＮｈｅＩを用いてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）を処理することにより得られたベクターとライゲートしてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ｐ１１−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。構築したｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ｐ１１−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）をＥｃｏＲＩおよびＰａｃＩを用いて処理した後、上記の構築したｐＧＥＭ−Ｔ−ＬａｃＺをＥｃｏＲＩおよびＰａｃＩを用いて切断した。結果物をライゲートして、ＶＧＦシャトルプラスミドであるｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  ＶＧＦ（ｉ）シャトルプラスミド」と称する）を完成させた。
【０１０７】
実施例２．１．２．ＴＫ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスプラスミドの構築
ＷＲワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡ中の両側においてＴＫ遺伝子に隣接する遺伝子領域を得るために、ＷＲ  ｇＤＮＡをＰＣＲにより増幅した後、ＴＫ遺伝子の左側および右側に位置する相同ヌクレオチド配列断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにそれぞれ挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｌ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。両側においてＴＫ遺伝子に隣接する相同ヌクレオチド配列の増幅のために使用したプライマーに関する情報を表１７に示す。
【０１０８】
【表１７】
2021511048.tif 000019
【０１０９】
その発現がｐＳＥ／Ｌプロモーターにより調節されるＥＧＦＰおよびその発現がｐ７．５プロモーターにより調節されるＧｐｔを、組換えがＴＫ遺伝子の位置において起こったウイルスのスクリーニング用のマーカーとして使用した。鋳型としてＷＲ  ｇＤＮＡを使用してＰＣＲによりｐ７．５プロモーター部位を増幅し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６０８０−１）中のＥＧＦＰ遺伝子およびＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号９０５７）中のＧｐｔ遺伝子もまたＰＣＲにより増幅した。次に、結果物をそれぞれｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙに挿入して、それぞれｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＥＧＦＰおよびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｇｐｔを構築した。加えて、ｐＳＥ／ＬプロモーターおよびＴＦをプライマーアニーリングを通じて構築した。実験において使用したプライマーの配列を表１７に示す。
【０１１０】
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５およびアニーリングしたｐＳＥ／ＬプロモーターをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５を構築した。構築したｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＥＧＦＰをＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩを用いてそれぞれ処理した後、ライゲートしてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５を構築した。
【０１１１】
ＴＫ遺伝子の機能が部分的に欠失したシャトルプラスミドを構築するために、ｐＳＰ７２をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて処理し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて処理した。次に、結果物をライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。構築したｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）をＸｈｏＩおよびＰｓｔＩを用いて処理し、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩを用いて処理することにより得られたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−ＬとライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。ＥＧＦＰ発現カセットを導入するために、構築したｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。
【０１１２】
加えて、構築したｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）およびアニーリングしたＴＦオリゴマーをＰｓｔＩおよびＮｏｔＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。Ｇｐｔ発現カセットを導入するために、構築したｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＧｐｔをＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩを用いてそれぞれ処理した後、ライゲートして、ＴＫシャトルプラスミドであるｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−Ｇｐｔ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  ＴＫ（ｉ）シャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。
【０１１３】
実施例２．１．３．Ｋ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスプラスミドの構築
ＷＲワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡ中のＫ３Ｌ遺伝子の左側および部分においてＫ３Ｌ遺伝子に隣接するゲノム領域をＰＣＲにより増幅した。ここで、増幅は、Ｋ３Ｌ−Ｌ配列の直後に配置されているＫ３Ｌ遺伝子の開始コドンを用いて実行し、Ｋ３Ｌ遺伝子の左側における相同配列の増幅のために使用したプライマーを表１８に示す。ここで、増幅された、Ｋ３Ｌ遺伝子の開始コドンを除外しかつそれに後続する部分を含むＫ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ（ＷＲ）断片を得た後、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙベクターとライゲートしてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ（ＷＲ）を構築した。
【０１１４】
【表１８】
2021511048.tif 000020
【０１１５】
実施例１．１．３において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３ＬシャトルプラスミドおよびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ（ＷＲ）をＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。構築したｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）にＫ３Ｌの開始コドンを導入するために、上記の表１８に示すようなプライマーを使用して点突然変異を行い、それにより、ｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３ＬＡＴＧ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  Ｋ３Ｌ（ｉ）シャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。
【０１１６】
実施例２．１．４．ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスの製造
最初に、ＷＲ  ＶＧＦ（ｉ）シャトルプラスミドおよびＷＲ野生型ウイルスを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉを得た。その後、ＷＲ  ＴＫ（ｉ）シャトルプラスミドおよび組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉを使用した以外は上記と同じ方法においてＶＧＦおよびＴＫ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉＴｉを得た。
【０１１７】
実施例２．１．５．ＷＲ−ＶＶ０１ウイルスの製造
最初に、ＷＲ  Ｋ３Ｌ（ｉ）シャトルプラスミドおよび組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉＴｉを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスＷＲ−ＶＶ０１を得、その遺伝子構造を図１７に示す。
【０１１８】
実施例２．２．ＷＲ−ＶＶ０６ウイルスの製造
実施例２．２．１．ＴＫ遺伝子の発現が不活性化されておりかつｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えＷＲワクシニアウイルスプラスミドの構築
最初に、実施例２．１．２．において構築したようなＷＲ  ＴＫ（ｉ）シャトルプラスミドおよび実施例１．２．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ｓＰＤ１−Ｆｃ）シャトルプラスミドをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いてそれぞれ処理した後、ライゲートしてＰＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ＴＦ−ｓＰＤ１−Ｆｃ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  ＴＫｉ（ｓＰＤ１−Ｆｃ）シャトルプラスミド」と称する）を構築した。その後、そのように構築したプラスミドおよび実施例１．３．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ＰＨ２０）シャトルプラスミドをＢａｍＨＩおよびＰａｃＩを用いてそれぞれ処理した後、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ｐＳＥ／Ｌ−ＥＧＦＰ−ＴＦ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０−ＴＦ−ＴＦ−ｓＰＤ１−Ｆｃ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  ＴＫｉ（ｓＰＤ１−Ｆｃ＋ＰＨ２０）シャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。
【０１１９】
実施例２．２．２．Ｋ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されておりかつＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えＷＲワクシニアウイルスプラスミドの構築
ＷＲ  Ｋ３Ｌｉシャトルプラスミドの内部の遺伝子発現カセットを構築するために、実施例２．１．３．において構築したようなＷＲ  Ｋ３Ｌｉシャトルプラスミドおよび実施例１．４．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌ（ＩＬ−１２）シャトルプラスミドをＳａｌＩを用いて処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２  Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＩＬ−１２−ＴＦ−ＴＦ＿Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  Ｋ３Ｌｉ（ＩＬ−１２）シャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。
【０１２０】
実施例２．２．３．ＷＲ−ＶＶ０６ウイルスの製造
最初に、実施例２．１．３．において構築したようなＷＲ  Ｋ３Ｌｉシャトルプラスミドおよび実施例２．１．４．において構築したような組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉＫｉを得た。
【０１２１】
実施例２．２．１．において構築したようなＷＲ  ＴＫｉ（ｓＰＤ１−Ｆｃ＋ＰＨ２０）シャトルプラスミドおよび組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉＫｉを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されており、かつｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えＷＲワクシニアウイルスＷＲ−ＶＶ０５を得た。
【０１２２】
実施例２．２．２．において構築したようなＷＲ  Ｋ３Ｌｉ（ＩＬ−１２）シャトルプラスミドおよび組換えＷＲ−ＶＶ０５を使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されており、かつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えＷＲ−ＶＶ０６を得、その遺伝子構造を図１８に示す。
【０１２３】
実施例２．２．４．ＷＲ−ＶＶ０６におけるｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の挿入および発現の同定
Ｍａｘｗｅｌｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（カタログ番号ＡＳ１３３０）を使用して実施例２．２．２．において製造したような組換えＷＲ−ＶＶ０６のｇＤＮＡを得、以下の表１９におけるプライマーを使用して組換えウイルスのｇＤＮＡの構造を同定した。図１９に示すように、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ位置のそれぞれにおけるＤＮＡ構造を同定することにより得られた結果は、対照群と比較して、遺伝子が挿入された位置においてＰＣＲ断片サイズが変化していることを示した。
【０１２４】
ウエスタンブロッティングを行って、挿入されたｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。最初に、ＨｅＬａ細胞を０．０５ＭＯＩの組換えＷＲ−ＶＶ０６を用いて４４〜５２時間処理した。次に、培地をウシ胎仔血清を含有しないＭＥＭ培地で置き換え、細胞を１６〜２０時間インキュベートした。培地および細胞を互いに分離し、タンパク質をそれらからそれぞれ得た。調製したタンパク質をブラッドフォードアッセイ法により定量化した後、ウエスタンブロッティングを使用してタンパク質発現を同定した。ここで、ｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子について、ａｎｔｉ−ｍＰｄｃｄ１（Ｅ−１８）（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ−１０２９９）を一次抗体として使用し、抗ヤギを二次抗体として使用し、ＰＨ２０遺伝子について、ａｎｔｉ−ｈＰＨ２０（ＬｓＢｉｏ、カタログ番号ＬＳ−Ｃ３３１９０９）を一次抗体として使用し、抗ウサギを二次抗体として使用した。発現の結果を図２０ａに示す。
【０１２５】
加えて、ＥＬＩＳＡを行って、挿入されたＩＬ−１２遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。最初に、ＨｅＬａ細胞を０．０５ＭＯＩの組換えＷＲ−ＶＶ０６を用いて処理した。４４〜５２時間後、培地のみを分離し、発現されたタンパク質をそこから得た。調製されたタンパク質について、Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２  ｐ７０  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｍ１２７０）を使用してタンパク質発現レベルを同定した。ここで、タンパク質ストック溶液を１／５，０００に希釈して使用した。測定結果を図２０ｂに示す。
【０１２６】
【表１９】
2021511048.tif 000021
【０１２７】
実施例３．組換えリスターワクシニアウイルスの製造
実施例３．１．リスター−ＶＶ０１ウイルスの製造
実施例３．１．１．ＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスプラスミドの構築
最初に、リスターワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ、ＶＲ−１５４９）のゲノムＤＮＡ中の両側においてＶＧＦ遺伝子に隣接する遺伝子領域をＰＣＲにより増幅した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにそれぞれ挿入してｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（リスター）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｒ（リスター）を構築した。両側においてＶＧＦ遺伝子に隣接する相同ヌクレオチド配列の増幅のために使用したプライマーに関する情報を以下の表２０に示す。
【０１２８】
ｐＳＰ７２ベクターおよびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（リスター）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ（リスター）を構築した。加えて、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ（リスター）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｒ（リスター）をＰａｃＩおよびＫｐｎＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（リスター）を構築した。
【０１２９】
構築したｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（リスター）ベクターおよび実施例１．１．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦシャトルプラスミドをＮｈｅＩおよびＰａｃＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦ−Ｒ（リスター）（以下、「リスターＶＧＦシャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。
【０１３０】
【表２０】
2021511048.tif 000022
【０１３１】
実施例３．１．２．ＴＫ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスプラスミドの構築
リスターワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ、ＶＲ−１５４９）のゲノムＤＮＡ中の両側においてＴＫ遺伝子に隣接する遺伝子領域をＰＣＲにより増幅した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにそれぞれ挿入して、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｌ（リスター）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｒ（リスター）を構築した。両側においてＴＫ遺伝子に隣接する相同ヌクレオチド配列の増幅のために使用したプライマーに関する情報を以下の表２１に示す。
【０１３２】
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｌ（リスター）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｒ（リスター）をＢａｍＨＩおよびＸｍａＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（リスター）を構築した。加えて、ｐＳＰ７２ベクターおよびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（リスター）をＳｐｅＩおよびＸｍａＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（リスター）を構築した。
【０１３３】
構築したｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（リスター）ベクターおよび実施例１．１．２．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドをＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ｐＳＥ／Ｌ−ＥＧＦＰ−ＴＫ−Ｒ（リスター）（以下、「リスターＴＫシャトルプラスミド」）を最終的に構築した。
【０１３４】
【表２１】
2021511048.tif 000023
【０１３５】
実施例３．１．３．Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスプラスミドの構築
実施例１．１．３．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３ＬシャトルプラスミドをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＶを用いて処理し、リスターワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ、ＶＲ−１５４９）のゲノムＤＮＡ中のＫ３Ｌ遺伝子の右側に位置する遺伝子（Ｒアーム）をＰＣＲにより増幅した。次に、インフュージョンクローニング法を使用してその挿入を行って、ｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（リスター）を構築した。
【０１３６】
構築したｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（リスター）をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて処理し、リスターワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡ中のＫ３Ｌ遺伝子の左側に位置する遺伝子（Ｌアーム）をＰＣＲにより増幅した。次に、インフュージョンクローニング法を使用してその挿入を行って、ｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（リスター）（以下、「リスターＫ３Ｌシャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。インフュージョンクローニング法において使用したプライマーの配列を以下の表２２に示す。
【０１３７】
【表２２】
2021511048.tif 000024
【０１３８】
実施例３．１．４．ＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスの製造
リスター野生型ワクシニアウイルスおよび実施例３．１．１．において構築したようなリスターＶＧＦシャトルプラスミドを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスＶを得た。
【０１３９】
実施例３．１．５．ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスの製造
実施例３．１．４．において製造したような組換えリスターワクシニアウイルスＶおよび実施例３．１．２．において構築したようなリスターＴＫシャトルプラスミドを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスＶＴを得た。
【０１４０】
実施例３．１．６．リスター−ＶＶ０１ウイルスの製造
実施例３．１．５．において製造したような組換えリスターワクシニアウイルスＶＴおよび実施例３．１．３．において構築したようなリスターＫ３Ｌシャトルプラスミドを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えリスター−ＶＶ０１を得、その遺伝子構造を図２１に示す。
【０１４１】
実施例３．２．リスター−ＶＶ０６ウイルスの製造
実施例３．２．１．ＴＫ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えリスターワクシニアウイルスプラスミドの構築
実施例３．１．２．において構築したようなプラスミドおよび実施例１．５．１において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ｓＰＤ１−Ｆｃ＋ＰＨ２０）シャトルプラスミドをＮｏｔＩおよびＮｈｅＩを用いてそれぞれ処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ｐＳＥ／Ｌ−ＥＧＦＰ−ｐＨｙｂ−ＰＨ２０−ＴＦ−ＴＦ−ｓＰＤ１−Ｆｃ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（リスター）（以下、「リスターＴＫ（ｓＰＤ１−Ｆｃ＋ＰＨ２０）シャトルプラスミド」と称する）を最終的に構築した。
【０１４２】
実施例３．２．２．Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されかつＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えリスターワクシニアウイルスプラスミドの構築
リスターＫ３Ｌシャトルプラスミドの内部の遺伝子発現カセットを構築するために、実施例３．１．３．において構築したようなリスターＫ３Ｌシャトルプラスミドおよび実施例１．４．１．において構築したようなＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌ（ＩＬ−１２）シャトルプラスミドをＳａｌＩを用いて処理し、ライゲートしてｐＳＰ７２  Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＩＬ−１２−ＴＦ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（リスター）（以下、「リスターＫ３Ｌ（ＩＬ−１２）シャトルプラスミド」）を最終的に構築した。
【０１４３】
実施例３．２．３．リスター−ＶＶ０６ウイルスの製造
最初に、実施例３．１．４．において製造したような組換えリスターワクシニアウイルスＶおよび実施例３．１．３．において構築したようなリスターＫ３Ｌシャトルプラスミドを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスＶＫを得た。
【０１４４】
実施例３．２．１．において構築したようなリスターＴＫ（ｓＰＤ１−Ｆｃ＋ＰＨ２０）シャトルプラスミドおよび組換えリスターワクシニアウイルスＶＫを使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−ＦｃおよびＰＨ２０遺伝子の発現が誘導されている組換えリスターワクシニアウイルスリスター−ＶＶ０５を得た。
【０１４５】
実施例３．２．２．において構築したようなリスターＫ３Ｌ（ＩＬ−１２）シャトルプラスミドおよび組換えリスター−ＶＶ０５を使用した以外は実施例１．１．４．におけるものと同じ条件および方法においてＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えリスター−ＶＶ０６を得、その遺伝子構造を図２２に示す。
【０１４６】
実施例３．２．４．リスター−ＶＶ０６におけるｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の挿入および発現の同定
Ｍａｘｗｅｌｌ  ｖｉｒａｌ  ｔｏｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＡＳ１３３０）を使用して実施例３．２．３．において製造したような組換えリスター−ＶＶ０６のｇＤＮＡを得、以下の表２３におけるプライマーを使用して組換えウイルスリスター−ＶＶ０６のｇＤＮＡの構造を同定した。図２３に示すように、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ位置のそれぞれにおけるＤＮＡ構造を同定することにより得られた結果は、対照群と比較して、遺伝子が挿入された位置においてＰＣＲ断片サイズが変化していることを示した。ウエスタンブロッティングを行って、挿入されたｓＰＤ１−Ｆｃ遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。最初に、ＨｅＬａ細胞を０．０５ＭＯＩの組換えリスター−ＶＶ０６を用いて４４〜５２時間処理した。次に、培地をウシ胎仔血清を含有しないＭＥＭ培地で置き換え、細胞を１６〜２０時間インキュベートした。培地および細胞を互いに分離し、タンパク質をそれらからそれぞれ得た。
【０１４７】
調製したタンパク質をブラッドフォードアッセイ法により定量化した後、ウエスタンブロッティングを使用してタンパク質発現を同定した。ここで、ａｎｔｉ−ｍＰｄｃｄ１（Ｅ−１８）（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ−１０２９９）を一次抗体として使用し、抗ヤギを二次抗体として使用した。加えて、ウエスタンブロッティングを行って、挿入されたＰＨ−２０遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。ここで、ａｎｔｉ−ｈＰＨ２０（ＬｓＢｉｏ、カタログ番号ＬＳ−Ｃ３３１９０９）を一次抗体として使用し、抗ウサギを二次抗体として使用した。発現の結果を図２４ａに示す。加えて、ＥＬＩＳＡを行って、挿入されたＩＬ−１２遺伝子が感染細胞中で組換えウイルスを介して発現されることを同定した。最初に、ＨｅＬａ細胞を０．０５ＭＯＩの組換えリスター−ＶＶ０６に感染させた。４４〜５２時間後、培地のみを分離し、発現されたタンパク質をそこから得た。調製されたタンパク質について、Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２  ｐ７０  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号Ｍ１２７０）を使用してタンパク質発現レベルを同定した。ここで、タンパク質ストック溶液を１／５，０００に希釈して使用した。測定結果を図２４ｂに示す。
【０１４８】
【表２３】
2021511048.tif 000025
【０１４９】
ＩＩ．インビボでの組換えワクシニアウイルスの腫瘍細胞殺傷能力の決定
実験例１．ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されかつｓＰＤ１−ＦｃまたはＰＨ２０またはＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えＩＨＤ−Ｗ株ワクシニアウイルスの、動物モデルにおける腫瘍抑制効果の決定
実験例１．１．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５ウイルスの、動物モデルにおける腫瘍抑制効果の決定
実施例１において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５の間の抗腫瘍効果の比較をマウスモデルにおいて行った。
【０１５０】
結腸直腸腫瘍モデル
最初に、１０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ培地中でのインキュベートにより結腸直腸がん細胞株ＣＴ２６．ＷＴを調製した。３７℃および５％のＣＯ２の条件下でインキュベーター中でインキュベートされている細胞がディッシュの７０％〜８０％を占有した場合、細胞をがん細胞接種のために調製した。調製したがん細胞を４℃において１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して全ての上清を除去し、そこに賦形剤（ＲＰＭＩ培地）を加えることにより細胞を調製した。そのように調製した１×１０６個の細胞をＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス結腸直腸腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合に、調製したマウスモデルを４匹のマウス／群でＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を投与する群に分割した後、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０７  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図２５に示す。
【０１５１】
図２５に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍サイズを測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２投与群、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３投与群およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群はＰＢＳ投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。腫瘍体積をウイルス投与群の間で比較した場合、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２投与群またはＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３投与群より小さい腫瘍体積を呈することが同定された。
【０１５２】
実験例１．２．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５ウイルスの、動物モデルにおける腫瘍抑制効果の決定
実施例１において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５の間の抗腫瘍効果の比較をマウスモデルにおいて行った。
【０１５３】
皮膚腫瘍モデル
次に、１０％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中でのインキュベートにより皮膚がん細胞株Ｂ１６Ｆ１０を調製した。３７℃および５％のＣＯ２の条件下でインキュベーター中でインキュベートされている細胞がディッシュの７０％〜８０％を占有した場合、細胞をがん細胞接種のために調製した。調製したがん細胞を４℃において１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して全ての上清を除去し、そこに賦形剤（ＤＭＥＭ培地）を加えることにより細胞を調製した。そのように調製した５×１０５個の細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス皮膚腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合に、調製したマウスモデルを６匹のマウス／群でＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を投与する群に分割した後、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０６  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図２６に示す。
【０１５４】
図２６に示すように、ウイルス治療後１２日目に腫瘍体積を測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。ＰＢＳ投与群において、腫瘍体積はウイルス投与後１２日目の前に２，０００ｍｍ３の平均に既に達していた。したがって、ＰＢＳ投与群を安楽死させ、１２日より後のデータを解析から除外した。
【０１５５】
肺腫瘍モデル
次に、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％の抗生物質−抗真菌薬（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５２４０−０６２）から構成されるＤＭＥＭ培地を使用して３７℃および５％のＣＯ２の条件下で肺がん細胞株ＬＬＣ１をインキュベーター中でインキュベートした。３回の継代を行った後、細胞が最後の継代の間に培養プレートの７０％〜８０％を占有した場合に細胞を回収した。回収した細胞の上清を除去し、そこに賦形剤（ＤＭＥＭ）を加えることにより、１×１０７／ｍＬの濃度を有するように細胞を調製した。そのように調製した１×１０６個の細胞を含有する細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス肺腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合に、調製したマウスモデルを６匹のマウス／群でＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５を投与する群に分割した。次に、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０６  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図２７に示す。
【０１５６】
図２７に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍サイズを測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１投与群およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群はＰＢＳ投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。腫瘍体積をウイルス投与群の間で比較した場合、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１投与群より小さい腫瘍体積を呈することが同定された。
【０１５７】
実験例１．３．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６ウイルスの、動物モデルにおける腫瘍抑制効果の決定
実施例１において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６の間の抗腫瘍効果の比較をマウスモデルにおいて行った。
【０１５８】
結腸直腸腫瘍モデル
最初に、１０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ培地中でのインキュベートにより結腸直腸がん細胞株ＣＴ２６．ＷＴを調製した。３７℃および５％のＣＯ２の条件下でインキュベーター中でインキュベートされている細胞がディッシュの７０％〜８０％を占有した場合、細胞をがん細胞接種のために調製した。調製したがん細胞を４℃において１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して全ての上清を除去し、そこに賦形剤（ＲＰＭＩ培地）を加えることにより細胞を調製した。そのように調製した１×１０６個の細胞をＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス結腸直腸腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合に、調製したマウスモデルを４匹のマウス／群でＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与する群に分割した後、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０７  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図２８に示す。
【０１５９】
図２８に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍体積を測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２投与群、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３投与群、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４投与群およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＰＢＳ投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。腫瘍体積をウイルス投与群の間で比較した場合、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２投与群、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３投与群、またはＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４投与群より小さい腫瘍体積を呈することが同定された。
【０１６０】
肺腫瘍モデル
次に、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％の抗生物質−抗真菌薬（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５２４０−０６２）から構成されるＤＭＥＭ培地を使用して３７℃および５％のＣＯ２の条件下で肺がん細胞株ＬＬＣ１をインキュベーター中でインキュベートした。３回の継代を行った後、細胞が最後の継代の間に培養プレートの７０％〜８０％を占有した場合に細胞を回収した。回収した細胞の上清を除去し、そこに賦形剤（ＤＭＥＭ）を加えることにより、１×１０７／ｍＬの濃度を有するように細胞を調製した。そのように調製した１×１０６個の細胞を含有する細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス肺腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合に、調製したマウスモデルを６匹のマウス／群でＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与する群に分割した。次に、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０６  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図２９に示す。
【０１６１】
図２９に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍サイズを測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２投与群、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３投与群、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４投与群およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＰＢＳ投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。腫瘍体積をウイルス投与群の間で比較した場合、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０２投与群、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０３投与群、またはＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０４投与群より小さい腫瘍体積を呈することが同定された。
【０１６２】
実験例１．４．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６ウイルスの、動物モデルにおける腫瘍抑制効果の決定
実施例１において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６の間の抗腫瘍効果の比較をマウスモデルにおいて行った。
【０１６３】
結腸直腸腫瘍モデル
最初に、１０％のウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ培地中でのインキュベートにより結腸直腸がん細胞株ＣＴ２６．ＷＴを調製した。３７℃および５％のＣＯ２の条件下でインキュベーター中でインキュベートされている細胞がディッシュの７０％〜８０％を占有した場合、細胞をがん細胞接種のために調製した。調製したがん細胞を４℃において１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して全ての上清を除去し、そこに賦形剤（ＲＰＭＩ培地）を加えることにより細胞を調製した。そのように調製した１×１０６個の細胞をＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス結腸直腸腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合、調製したマウスモデルを４匹のマウス／群でＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与する群に分割した後、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０７  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図３０に示す。
【０１６４】
図３０に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍体積を測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＰＢＳ投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。腫瘍体積をウイルス投与群の間で比較した場合、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群より小さい腫瘍体積を呈することが同定された。
【０１６５】
皮膚腫瘍モデル
次に、１０％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中でのインキュベートにより皮膚がん細胞株Ｂ１６Ｆ１０を調製した。３７℃および５％のＣＯ２の条件下でインキュベーター中でインキュベートされている細胞がディッシュの７０％〜８０％を占有した場合、細胞をがん細胞接種のために調製した。調製したがん細胞を４℃において１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して全ての上清を除去し、そこに賦形剤（ＤＭＥＭ培地）を加えることにより細胞を調製した。そのように調製した５×１０５個の細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス皮膚腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合、調製したマウスモデルを６匹のマウス／群でＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与する群に分割した後、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０６  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図３１に示す。
【０１６６】
図３１に示すように、ウイルス治療後１２日目に腫瘍体積を測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。ＰＢＳ投与群において、腫瘍体積はウイルス投与後１２日目の前に２，０００ｍｍ３の平均に既に達していた。したがって、ＰＢＳ投与群を安楽死させ、１２日より後のデータを解析から除外した。
【０１６７】
肺腫瘍モデル
次に、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％の抗生物質−抗真菌薬（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５２４０−０６２）から構成されるＤＭＥＭ培地を使用して３７℃および５％のＣＯ２の条件下で肺がん細胞株ＬＬＣ１をインキュベーター中でインキュベートした。３回の継代を行った後、細胞が最後の継代の間に培養プレートの７０％〜８０％を占有した場合に細胞を回収した。回収した細胞の上清を除去し、そこに賦形剤（ＤＭＥＭ）を加えることにより、１×１０７／ｍＬの濃度を有するように細胞を調製した。そのように調製した１×１０６個の細胞を含有する細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス肺腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合、調製したマウスモデルを６匹のマウス／群でＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与する群に分割した。次に、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０６  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図３２に示す。
【０１６８】
図３２に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍体積を測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＰＢＳ投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。腫瘍体積をウイルス投与群の間で比較した場合、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０５投与群より小さい腫瘍体積を呈することが同定された。
【０１６９】
実験例２．ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失しまたはその発現が不活性化されておりかつｓＰＤ１−ＦｃまたはＰＨ２０またはＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている様々な組換えワクシニアウイルスの、動物モデルにおける腫瘍抑制効果の決定
実験例２．１．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６ウイルスの、動物モデルにおける腫瘍抑制効果の決定
実施例１において製造したような組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６の間の抗腫瘍効果の比較をマウスモデルにおいて行った。
【０１７０】
皮膚腫瘍モデル
次に、１０％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中でのインキュベートにより皮膚がん細胞株Ｂ１６Ｆ１０を調製した。３７℃および５％のＣＯ２の条件下でインキュベーター中でインキュベートされている細胞がディッシュの７０％〜８０％を占有した場合、細胞をがん細胞接種のために調製した。調製したがん細胞を４℃において１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して全ての上清を除去し、そこに賦形剤（ＤＭＥＭ培地）を加えることにより細胞を調製した。そのように調製した５×１０５個の細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス皮膚腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合、調製したマウスモデルを４匹のマウス／群でＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与する群に分割した後、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０６  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図３３に示す。
【０１７１】
図３３に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍体積を測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。ＰＢＳ投与群において、腫瘍体積はウイルス投与後１２日目の前に２，０００ｍｍ３の平均に既に達していた。したがって、ＰＢＳ投与群を安楽死させ、１２日より後のデータを解析から除外した。
【０１７２】
肺腫瘍モデル
次に、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％の抗生物質−抗真菌薬（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５２４０−０６２）から構成されるＤＭＥＭ培地を使用して３７℃および５％のＣＯ２の条件下で肺がん細胞株ＬＬＣ１をインキュベーター中でインキュベートした。３回の継代を行った後、細胞が最後の継代の間に培養プレートの７０％〜８０％を占有した場合に細胞を回収した。回収した細胞の上清を除去し、そこに賦形剤（ＤＭＥＭ）を加えることにより、１×１０７／ｍＬの濃度を有するように細胞を調製した。そのように調製した１×１０６個の細胞を含有する細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス肺腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合、調製したマウスモデルを６匹のマウス／群でＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６を投与する群に分割した。次に、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０６  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図３４に示す。
【０１７３】
図３４に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍サイズを測定することにより得られた結果は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１投与群およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＰＢＳ投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。腫瘍体積をウイルス投与群の間で比較した場合、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６投与群はＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０１投与群より小さい腫瘍体積を呈することが見出された。
【０１７４】
実験例２．２．ＷＲ−ＶＶ０１およびＷＲ−ＶＶ０６ウイルスの、動物モデルにおける腫瘍抑制効果の決定
実施例２において製造したような組換えＷＲ−ＶＶ０１およびＷＲ−ＶＶ０６の間の抗腫瘍効果の比較をマウスモデルにおいて行った。
【０１７５】
肺腫瘍モデル
次に、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％の抗生物質−抗真菌薬（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５２４０−０６２）から構成されるＤＭＥＭ培地を使用して３７℃および５％のＣＯ２の条件下で肺がん細胞株ＬＬＣ１をインキュベーター中でインキュベートした。３回の継代を行った後、細胞が最後の継代の間に培養プレートの７０％〜８０％を占有した場合に細胞を回収した。回収した細胞の上清を除去し、そこに賦形剤（ＤＭＥＭ）を加えることにより、１×１０７／ｍＬの濃度を有するように細胞を調製した。そのように調製した１×１０６個の細胞を含有する細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス肺腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合、調製したマウスモデルを６匹のマウス／群でＰＢＳ、ＷＲ−ＶＶ０１およびＷＲ−ＶＶ０６を投与する群に分割した。次に、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０６  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図３５に示す。
【０１７６】
図３５に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍サイズを測定することにより得られた結果は、ＷＲ−ＶＶ０１投与群およびＷＲ−ＶＶ０６投与群はＰＢＳ投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。腫瘍体積をウイルス投与群の間で比較した場合、ＷＲ−ＶＶ０６投与群はＷＲ−ＶＶ０１投与群より小さい腫瘍体積を呈することが見出された。
【０１７７】
実験例２．３．リスター−ＶＶ０１およびリスター−ＶＶ０６ウイルスの、動物モデルにおける腫瘍抑制効果の決定
実施例３において製造したような組換えリスター−ＶＶ０１およびリスター−ＶＶ０６の間の抗腫瘍効果の比較をマウスモデルにおいて行った。
【０１７８】
肺腫瘍モデル
次に、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％の抗生物質−抗真菌薬（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５２４０−０６２）から構成されるＤＭＥＭ培地を使用して３７℃および５％のＣＯ２の条件下で肺がん細胞株ＬＬＣ１をインキュベーター中でインキュベートした。３回の継代を行った後、細胞が最後の継代の間に培養プレートの７０％〜８０％を占有した場合に細胞を回収した。回収した細胞の上清を除去し、そこに賦形剤（ＤＭＥＭ）を加えることにより、１×１０７／ｍＬの濃度を有するように細胞を調製した。そのように調製した１×１０６個の細胞を含有する細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄ；ＫＯＡＴＥＣＨ、Ｋｏｒｅａ）の右脇腹の皮下に注射してマウス肺腫瘍モデルを調製した。１週後、腫瘍体積が約７０〜１００ｍｍ３に成長した場合、調製したマウスモデルを６匹のマウス／群でＰＢＳ、リスター−ＶＶ０１およびリスター−ＶＶ０６を投与する群に分割した。次に、５０ｕｌのＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、カタログ番号ＬＢ００１−０２）または１×１０６  ＴＣＩＤ５０／５０ｕｌの各ウイルスを腫瘍に１回投与した。ウイルス投与後の腫瘍体積を測定することにより得られた結果を図３６に示す。
【０１７９】
図３６に示すように、ウイルス治療後１４日目に腫瘍サイズを測定することにより得られた結果は、リスター−ＶＶ０６投与群はＰＢＳ投与群より小さい腫瘍体積を呈することを示した。腫瘍体積をウイルス投与群の間で比較した場合、リスター−ＶＶ０６投与群はリスター−ＶＶ０１投与群より小さい腫瘍体積を呈することが見出された。
【０１８０】
ＩＩＩ．ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失しまたはその発現が不活性化されておりかつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えワクシニアウイルスのインビトロ細胞殺傷能力の決定
実験例１．ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６、ＷＲ−ＶＶ０６、またはリスター−ＶＶ０６の投与により引き起こされる腫瘍細胞殺傷効果の決定
ＣＣＫ−８アッセイを行って、実施例１において製造したような組換えワクシニアウイルスＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６、実施例２において製造したような組換えワクシニアウイルスＷＲ−ＶＶ０６、または実施例３において製造したような組換えワクシニアウイルスリスター−ＶＶ０６が様々な種類のがん細胞に対して殺傷能力を呈するかどうかを同定した。
【０１８１】
様々なマウスがん細胞株において組換えウイルスの細胞殺傷能力を同定するために、以下の表２４に示すようにがん細胞株を調製し、３７℃および５％のＣＯ２の条件下でインキュベーター中でインキュベートした。次に、細胞株を９６ウェルプレートに分配した。
【０１８２】
【表２４】
2021511048.tif 000026
【０１８３】
ここで、細胞数／ウェルがＣＴ２６−ＷＴおよびＨｅｐ−５５．１Ｃについて２×１０４細胞、Ｒｅｎｃａ、ＬＬＣ１、４Ｔ１、ＣＭＴ９３およびＢ１６Ｆ１０について１×１０４細胞、ならびにＪＣについて２×１０３細胞となるように各々の細胞株を分配した。２４時間のインキュベーション後、各組換えウイルスの野生型ウイルスの細胞殺傷能力を考慮して、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＶ０６について１ＭＯＩ、ＷＲ−ＶＶ０６について１ＭＯＩ、リスター−ＶＶ０６について１０ＭＯＩとなるように細胞株を組換えワクシニアウイルスに感染させた。ここで、非ウイルス処理細胞を各々の対照群として使用した。３日後、細胞をＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、カタログ番号ＣＫ０４）溶液を用いて染色してがん細胞株の細胞生存能力を決定した。結果を図３７に示す。
【０１８４】
図３７に示すように、ワクシニア株にかかわらず、ＶＧＦ、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失しまたはその発現が不活性化されておりかつｓＰＤ１−Ｆｃ、ＰＨ２０およびＩＬ−１２遺伝子の発現が誘導されている組換えワクシニアウイルスは様々な種類のがん細胞に対して殺能力を呈する。
【図１】
2021511048.tif 000027
【図２】
2021511048.tif 000028
【図３】
2021511048.tif 000029
【図４】
2021511048.tif 000030
【図５】
2021511048.tif 000031
【図６】
2021511048.tif 000032
【図７】
2021511048.tif 000033
【図８】
2021511048.tif 000034
【図９】
2021511048.tif 000035
【図１０】
2021511048.tif 000036
【図１１】
2021511048.tif 000037
【図１２】
2021511048.tif 000038
【図１３】
2021511048.tif 000039
【図１４】
2021511048.tif 000040
【図１５】
2021511048.tif 000041
【図１６】
2021511048.tif 000042
【図１７】
2021511048.tif 000043
【図１８】
2021511048.tif 000044
【図１９】
2021511048.tif 000045
【図２０ａ】
2021511048.tif 000046
【図２０ｂ】
2021511048.tif 000047
【図２１】
2021511048.tif 000048
【図２２】
2021511048.tif 000049
【図２３】
2021511048.tif 000050
【図２４ａ】
2021511048.tif 000051
【図２４ｂ】
2021511048.tif 000052
【図２５】
2021511048.tif 000053
【図２６】
2021511048.tif 000054
【図２７】
2021511048.tif 000055
【図２８】
2021511048.tif 000056
【図２９】
2021511048.tif 000057
【図３０】
2021511048.tif 000058
【図３１】
2021511048.tif 000059
【図３２】
2021511048.tif 000060
【図３３】
2021511048.tif 000061
【図３４】
2021511048.tif 000062
【図３５】
2021511048.tif 000063
【図３６】
2021511048.tif 000064
【図３７】
2021511048.tif 000065
【配列表】
2021511048000001.app
【国際調査報告】
2021511048.tif 000066
2021511048.tif 000067
2021511048.tif 000068
2021511048.tif 000069
2021511048.tif 000070
2021511048.tif 000071