(57)【要約】  本出願は、血友病の治療において有用である抗体およびその断片などの類を見ないＦＸ結合分子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、前記抗体または抗原結合性断片が、
ａ．ＦＸ活性化を刺激することができるか、
ｂ．ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激することができるか、
ｃ．ＦＸ活性化を刺激するか、
ｄ．ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激するか、
ｅ．ＦＸをよりタンパク質分解しやすくすることができるか、または
ｆ．ＦＸをＦＩＸａによってよりタンパク質分解しやすくすることができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記ＦＸの活性化／タンパク質分解が、本明細書の実施例３に説明されるように決定される、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＸの活性化ペプチド（配列番号２のアミノ酸残基１４３〜１９４）に結合することができる、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、前記ＦＸの活性化ペプチドに結合することができ、ペプチドアレイにより決定される共通最小エピトープが、アミノ酸残基「ＬＬ」（配列番号２のアミノ酸残基１７７〜１７８）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、
ａ．ｍＡｂ  ００９１６の重鎖可変ドメイン（配列番号４）および軽鎖可変ドメイン（配列番号５）を含むか、
ｂ．ｍＡｂ  ００９１６の前記重鎖可変ドメイン（配列番号４）の３つのＣＤＲおよび前記軽鎖可変ドメイン（配列番号５）の３つのＣＤＲを含むか、
ｃ．ｍＡｂ  １３Ｆ６２の重鎖可変ドメイン（配列番号６）および軽鎖可変ドメイン（配列番号７）を含むか、
ｄ．ｍＡｂ  １３Ｆ６２の前記重鎖可変ドメイン（配列番号６）の３つのＣＤＲおよび前記軽鎖可変ドメイン（配列番号７）の３つのＣＤＲを含むか、
ｅ．配列番号８、９、１０、１１、５４、５５、５６もしくは５７を含むか、または
ｆ．配列番号８、９、１０、１１、５４、５５、５６もしくは５７の３つのＣＤＲを含む、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号８、９、１０、１１、５４、５５、５６、または５７により識別された配列に対して、それぞれ少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原性結合断片であって、請求項５に記載の参照抗体またはその抗原結合性断片と競合する、抗体またはその抗原性結合断片。
【請求項８】
前記抗体または抗原結合性断片が、
ａ．ＦＸ活性化を刺激することができるか、
ｂ．ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激することができるか、
ｃ．ＦＸ活性化を刺激するか、
ｄ．ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激するか、
ｅ．ＦＸをよりタンパク質分解しやすくすることができるか、または
ｆ．ＦＸをＦＩＸａによってよりタンパク質分解しやすくすることができる、請求項５または７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＩＸａ結合剤の存在と無関係に、ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
前記抗体または抗原結合性断片が、１０μＭ未満、例えば９μＭ未満、例えば８μＭ未満、例えば７μＭ未満、例えば６μＭ未満、例えば５μＭ未満、例えば４μＭ未満、例えば３μＭ未満、または例えば２μＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）として決定される結合親和性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記抗体または抗原結合性断片が、一価であり、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインまたはその抗原結合性断片、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、ラクダ化ＶＨドメイン、例えばＦａｂ、ｓｃＦａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、二価であり、例えば全長ｍＡｂまたはＦａｂ’２である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１４】
阻害物質を有するか、または有しない、血友病ＡまたはＢなどの血友病の治療において使用するための薬品の製造のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用。
【請求項１５】
阻害物質を有するか、または有しない、血友病ＡまたはＢなどの血友病の治療において使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固第Ｘ因子結合剤、および血友病などの凝固障害の治療におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表と共に提出される。配列表の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
血友病ＡおよびＢを有するヒトなどの凝固障害を有する患者では、凝固カスケードの様々な工程が、例えば、凝固因子が欠如しているかまたは存在が不十分であることに起因して、機能不全となる。そのような凝固カスケードの一部の機能不全は、不十分な血液凝固および潜在的に生命を脅かす出血、または関節などの内部器官への損傷をもたらす。
【０００４】
一般的に血友病Ａと呼ばれる凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損症は、世界中の約４２０，０００人に影響を及ぼす先天性出血障害であり、そのうち約１０５，０００人が現在診断されている。
【０００５】
血友病Ａを有する患者は、外因性ＦＶＩＩＩなどの凝固因子補充療法を受ける場合がある。従来の治療は、出血エピソードの予防法または要求に応じた治療として提供される、補充療法からなる。重度の血友病Ａを有する患者のケアの現行基準は、血漿由来ＦＶＩＩＩもしくは組み換えＦＶＩＩＩ、またはそれらの長時間作用型変異体のいずれかを用いた、１週間あたり最高３回までの予防的な静脈注射である。
【０００６】
しかしながら、そのような患者は、そのような外因性因子に対する中和抗体、いわゆる「阻害物質（inhibitor）」を発症し、以前有効であった療法を無効にするリスクがある。「阻害物質」（すなわち、ＦＶＩＩＩに対する同種抗体）を有する血友病Ａ患者は、部分的に先天性であり、部分的に後天性である、凝固障害の非限定的な例である。ＦＶＩＩＩに対する「阻害物質」を発症している患者は、予防として、または要求に応じてのいずれにせよ、従来の補充療法を受けることができない。
【０００７】
さらに、外因性凝固因子は、静脈内でのみ投与され得、これは患者に対して相当な不便および不快をもたらす。例えば、乳児および幼児は、静脈へのアクセスを確実にするために、静脈内カテーテルを胸部静脈中に外科的に挿入させる必要があり得る。これにより、細菌感染症を発症するリスクが非常に高まる。
【０００８】
出血している個体では、血管外ＴＦが血液中の活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）にさらされると、組織因子／第ＶＩＩａ因子（ＴＦ／ＦＶＩＩａ）複合体によって凝固が開始される。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の形成は、第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化第Ｘａ因子（ＦＸａ）への活性化をもたらし、活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）と共に、限定量のトロンビンを生成する。
【０００９】
少量のトロンビンが血小板を活性化する。活性化された血小板は、活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）および活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）から構成されるテナーゼ複合体の構築および結合を支持する。テナーゼ複合体は、ＦＸ活性化の非常に有効な触媒であり、この第２の工程において生成されるＦＸａは、最終的なトロンビンバーストの要因であるＦＶａ／ＦＸａプロトロンビナーゼ複合体中の活性プロテアーゼとして機能する。トロンビンは、フィブリノゲンを切断してフィブリンモノマーを生成し、これは重合してフィブリンネットワークを形成し、漏れている血管を封鎖して、出血を止める。急速かつ広範囲のトロンビンバーストは、頑丈かつ安定なフィブリン血栓形成の必要条件である。
【００１０】
凝固第ＦＶＩＩＩ因子活性の不在により生じる不適切なＦＸａ形成およびトロンビン生成の低下は、血友病Ａ患者の出血素因の根底にある素因である。
【００１１】
述べたように、ＦＸの酵素活性形態ＦＸａへのタンパク質分解変換は、ＦＩＸａおよびその補因子ＦＶＩＩＩａを含む固有のＦＸ活性化複合体によって達成することができる。補因子結合は、ＦＩＸａの酵素活性を約５桁増加させ、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒらの（２００８）Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，６：３１５−３２２で概説されるように、複数のメカニズムを通じて生じると考えられている。特に、ＦＶＩＩＩａは、ＦＸに対するタンパク質分解活性を増加させたＦＩＸａの構造を安定化させることがわかっている（Ｋｏｌｋｍａｎ  ＪＡ，Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｋ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：７３９８−７４０５、Ｚoｇｇ  Ｔ，Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ  Ｈ（２００９）  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，３９０：３９１−４００）。この観察に基づき、抗体が様々なタンパク質間相互作用を模倣できる多用途の結合タンパク質であることを認識し、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒらは、リン脂質表面およびカルシウムの存在下で、ただし天然補因子ＦＶＩＩＩａの非存在下で、ＦＩＸａによるＦＸ活性化を強化する能力を特徴とするアゴニスト抗ＦＩＸａ抗体のスクリーニングを実施した。５２８０のハイブリドーマ上清のスクリーニングから、８８の抗体が異なる程度のＦＩＸａアゴニスト活性を示すことが見出された。
【００１２】
第Ｘ／Ｘａ因子に結合する抗体は以前に特徴付けられており（ＵＳ８，０６２，６３５）、ＡＣＥ９１０として既知のエミシズマブ（ＵＳ９，３３４，３３１）は、一方のアームで第ＩＸ／ＩＸａ因子に、そして他方のアームで第Ｘ／Ｘａ因子に結合することによってＦＶＩＩＩａの作用を模倣するバイパス剤として認証されている。エミシズマブの抗ＦＸアームは、ＦＸの軽鎖に結合し、酵素前駆体に特異的ではなく、むしろ匹敵する親和性でＦＸおよびＦＸａに結合する。抗ＦＸアームは、主にＦＸを動員し、それをＦＩＸａに近づけると考えられている。
【００１３】
したがって、ＦＶＩＩＩａの全体的活性を模倣する一方で、ＦＶＩＩＩ模倣化合物エミシズマブは、ＦＶＩＩＩａの固有の特異性および機能の一部が欠如していると思われる。具体的には、ＦＶＩＩＩａは、リン脂質表面上のＦＩＸａおよび酵素前駆体ＦＸに結合することによって機能し、ＦＩＸａ活性を約２００，０００倍刺激し、その後ＦＸａを放出することによってＦＸ活性化を促進する。
【００１４】
機能改善を有すると明記されているＡＣＥ９１０の変異体が、ＷＯ２０１８／０２１４５０に開示されている。
【００１５】
さらなる二特異性抗ＦＩＸ／抗ＦＸ  ＦＶＩＩＩ模倣化合物が、ＷＯ２０１８／０９８３６３に開示されている。
【００１６】
本発明は、ＦＸａの生成を刺激するＦＸ結合剤に関する。したがって、そのような分子は、個別の化合物として、またはＦＶＩＩＩ模倣化合物の構成要素としてのいずれかで、潜在的に有用な治療薬である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＦＸの活性化、すなわち、ＦＸからのＦＸａの生成を刺激することができるＦＸ抗体またはその断片などのＦＸ結合剤の群、ならびにそのようなＦＸ結合剤の特定に関する。
【００１８】
本発明はさらに、活性化ＦＸ（ＦＸａ）ではなく酵素前駆体に結合することができる、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）などの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、抗体およびその抗原結合性断片を含むＦＸ結合剤の群に関する。
【００１９】
本明細書に開示されるＦＸ結合剤によるＦＸの結合は、それに続くＦＩＸａによるＦＸの活性化を刺激する。一態様では、結合は、ＦＸの活性化ペプチドにおけるペプチド伸長によって生じる。したがって、本明細書に開示されるＦＸ結合剤は、ＦＸをよりＦＩＸａ媒介活性化しやすくすることによってＦＸ活性化を刺激することが観察されている。
【００２０】
一態様では、活性化された形態（ＦＸａ）に対するＦＸの酵素前駆体形態の特異的結合は、発生したＦＸａに対するＦＸ結合剤の捕捉を阻止し、それにより酵素前駆体ＦＸとの相互作用に利用できるＦＸ結合剤の量が増加する。さらに、酵素前駆体ＦＸへの特異的結合は、ＦＸａ活性（プロトロンビナーゼ複合体の構築との干渉など）に対する潜在的阻害効果を回避する。
【００２１】
本明細書に開示されるＦＸ結合剤は、ＦＸをＦＩＸａによってよりタンパク質分解しやすくする様式でＦＸに結合することにより、予想外の機能的特性を示す。ＦＩＸａによるＦＸのタンパク質分解の増加が、ＦＸをＦＩＸａによってよりタンパク質分解しやすくし、結果としてより活性化しやすくする様式でのＦＸの結合によって達成できることは、発明者らによる驚くべき所見である。当該技術分野では、ＦＸのＦＸａへの変換のために、ＦＩＸａタンパク質分解活性を刺激する抗ＦＩＸａ化合物の例がある。しかしながら、出願者の知る限りでは、ＦＸに結合することができ、ＦＸをＦＩＸａによってよりタンパク質分解しやすくすることによりＦＸ活性化を刺激することができる化合物はこれまでに知られていない。
【００２２】
本発明の一態様は、抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤に関し、抗体またはその抗原結合性断片は、ＦＸ活性化を刺激することができる。本発明の別の態様は、そのような化合物の特定に関する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、治療の方法におけるそのようなＦＸ結合剤の使用、場合によっては、ただし独占的ではなく、ＦＶＩＩＩ模倣化合物の一部としての使用に関連する。ＦＸ活性化の刺激は凝固の刺激に有用であり、したがってそのような分子は、血友病ＡおよびＢを含む血友病などの凝固障害の治療に好適である。
【００２４】
配列表の概要
配列番号１−ヒト第ＩＸ因子酵素前駆体
ＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶ  ＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥ  ＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥ  ＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥ  ＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱ  ＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧ  ６０
ＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥ  ＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫ  ＮＣＥＬＤＶＴＣＮＩ  ＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫ  ＮＳＡＤＮＫＶＶＣＳ  ＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮ  １２０
ＱＫＳＣＥＰＡＶＰＦ  ＰＣＧＲＶＳＶＳＱＴ  ＳＫＬＴＲＡＥＡＶＦ  ＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥ  ＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱ  ＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲ  １８０
ＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧ  ＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧ  ＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩ  ＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡ  ＨＣＶＥＴＧＶＫＩＴ  ＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥ  ２４０
ＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶ  ＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮ  ＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩ  ＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶ  ＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩ  ＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬ  ３００
ＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷ  ＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡ  ＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬ  ＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴ  ＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣ  ＡＧＦＨＥＧＧＲＤＳ  ３６０
ＣＱＧＤＳＧＧＰＨＶ  ＴＥＶＥＧＴＳＦＬＴ  ＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡ  ＭＫＧＫＹＧＩＹＴＫ  ＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥ  ＫＴＫＬＴ        
配列番号２−ヒト第Ｘ因子酵素前駆体
ＡＮＳＦＬＥＥＭＫＫ  ＧＨＬＥＲＥＣＭＥＥ  ＴＣＳＹＥＥＡＲＥＶ  ＦＥＤＳＤＫＴＮＥＦ  ＷＮＫＹＫＤＧＤＱＣ  ＥＴＳＰＣＱＮＱＧＫ  ６０
ＣＫＤＧＬＧＥＹＴＣ  ＴＣＬＥＧＦＥＧＫＮ  ＣＥＬＦＴＲＫＬＣＳ  ＬＤＮＧＤＣＤＱＦＣ  ＨＥＥＱＮＳＶＶＣＳ  ＣＡＲＧＹＴＬＡＤＮ  １２０
ＧＫＡＣＩＰＴＧＰＹ  ＰＣＧＫＱＴＬＥＲＲ  ＫＲＳＶＡＱＡＴＳＳ  ＳＧＥＡＰＤＳＩＴＷ  ＫＰＹＤＡＡＤＬＤＰ  ＴＥＮＰＦＤＬＬＤＦ  １８０
ＮＱＴＱＰＥＲＧＤＮ  ＮＬＴＲＩＶＧＧＱＥ  ＣＫＤＧＥＣＰＷＱＡ  ＬＬＩＮＥＥＮＥＧＦ  ＣＧＧＴＩＬＳＥＦＹ  ＩＬＴＡＡＨＣＬＹＱ  ２４０
ＡＫＲＦＫＶＲＶＧＤ  ＲＮＴＥＱＥＥＧＧＥ  ＡＶＨＥＶＥＶＶＩＫ  ＨＮＲＦＴＫＥＴＹＤ  ＦＤＩＡＶＬＲＬＫＴ  ＰＩＴＦＲＭＮＶＡＰ  ３００
ＡＣＬＰＥＲＤＷＡＥ  ＳＴＬＭＴＱＫＴＧＩ  ＶＳＧＦＧＲＴＨＥＫ  ＧＲＱＳＴＲＬＫＭＬ  ＥＶＰＹＶＤＲＮＳＣ  ＫＬＳＳＳＦＩＩＴＱ  ３６０
ＮＭＦＣＡＧＹＤＴＫ  ＱＥＤＡＣＱＧＤＳＧ  ＧＰＨＶＴＲＦＫＤＴ  ＹＦＶＴＧＩＶＳＷＧ  ＥＧＣＡＲＫＧＫＹＧ  ＩＹＴＫＶＴＡＦＬＫ  ４２０
ＷＩＤＲＳＭＫＴＲＧ  ＬＰＫＡＫＳＨＡＰＥ  ＶＩＴＳＳＰＬＫ      
下線：活性化ペプチド（ａａ  １４３〜１９４）。太字：「Ｃ共通最小エピトープ」（ａａ  １７７〜１７８）
配列番号３−ＦＸ上の「共通最少エピトープ」（配列番号２  に太字で示される）
ＬＬ
配列番号４−重鎖可変ドメインｍＡｂ  ００９１６
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬ  ＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴ  ＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳ  ＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰ  ＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩ  ＳＴＳＧＳＴＦＹＡＴ  ６０
ＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫ  ＴＳＴＴＶＤＬＫＩＩ  ＳＰＴＩＥＤＴＡＴＹ  ＦＣＡＲＤＭＷＡＧＳ  ＲＹＤＦＮＩＷＧＰＧ  ＴＬＶＴＶＳＳ  １１７
配列番号５−軽鎖可変ドメインｍＡｂ  ００９１６
ＡＤＩＶＭＴＱＴＰＡ  ＳＶＥＡＡＶＧＧＴＶ  ＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩ  ＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫ  ＰＧＱＲＰＫＬＬＩＹ  ＲＡＳＴＬＥＳＧＶＰ  ６０
ＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴ  ＱＦＴＬＴＩＳＤＬＥ  ＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱ  ＴＹＹＹＳＧＧＧＳＹ  ＡＳＡＦＧＧＧＴＥＶ  ＶＶＫ  １１３
配列番号６−重鎖可変ドメインｍＡｂ  １３Ｆ６２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ  ＱＶＫＰＧＧＳＬＲＬ  ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ  ＴＳＳＩＹＷＶＲＱＡ  ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ  ＩＳＳＧＳＳＹＩＦＹ  ６０
ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ  ＳＲＤＮＡＫＮＳＬＦ  ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ  ＴＡＶＹＹＣＶＳＧＹ  ＳＲＬＬＤＹＷＧＱＧ  ＴＬＶＴＶＳＳ  １１７
配列番号７−軽鎖可変ドメインｍＡｂ  １３Ｆ６２
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳ  ＬＰＶＴＬＧＱＰＡＳ  ＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶ  ＹＳＤＧＮＴＹＬＮＷ  ＦＱＱＲＰＧＱＳＰＲ  ＲＬＩＹＫＶＳＮＲＤ  ６０
ＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳ  ＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩ  ＳＲＶＥＡＥＤＶＧＦ  ＹＹＣＭＱＧＴＨＷＰ  ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥ  ＩＫ  １１２
配列番号８−Ｎｂ  ７０１Ｂ０９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＴＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＷＳＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＤＡＴＰＡＮＧＥＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９−Ｎｂ  ７０１Ｃ０６
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＴＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＲＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＤＡＴＡＲＤＧＬＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１０−Ｎｂ  ７０２Ｃ１２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＲＴＦＳＲＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＳＲＲＧＧＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＤＹＳＳＧＤＧＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１１−Ｎｂ  ７０１Ｄ０７
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＧＴＬＳＲＹＡＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＲＲＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＤＬＡＰＧＤＹＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１２−Ｎｂ  ５０１Ａ０２
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＥＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＤＩＧＳＧＧＧＶＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＷＴＹＧＳＤＧＭＤＹＷＧＫＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１３〜５３は、実施例５の表５に列挙される配列に対応する。
配列番号５４−Ｎｂ  ７２１Ｅ０８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＴＹＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＡＩＴＲＲＧＳＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＤＲＲＰＡＤＳＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５５−Ｎｂ  ７２９Ａ０４
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＴＳＧＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＶＲＴＬＧＬＲＧＳＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５６−Ｎｂ  ７２９Ｃ０８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＴＧＧＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＡＩＬＴＲＴＲＲＴＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５７−Ｎｂ  ７３０Ｃ０３
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＳＤＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＴＳＧＳＧＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳａＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＬＹＹＣＡＡＡＩＬＲＧＹＲＫＴＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【００２５】
下線の付いた配列が、Ｋａｂａｔナンバリングおよび定義を使用してｍＡｂのＣＤＲを表すのに対し、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ｎｂｓ）のＣＤＲは、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤuｂｅｌ（２０１０，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ  ２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，ｐｐ．３３−５１）に説明されるようなＫａｂａｔナンバリングおよびＡｂＭ定義を使用して決定される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ＦＩＸは、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン、ＦＸ、およびタンパク質Ｃと構造的に類似したビタミンＫ依存性凝固因子である。循環する酵素前駆体型は、Ｎ末端γ−カルボキシグルタミン酸リッチ（Ｇｌａ）ドメイン、２つのＥＧＦドメイン、およびＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む、４つの異なるドメインに分割された４１５個のアミノ酸からなる。ＦＩＸは、単鎖酵素前駆体（配列番号１）として血漿中で循環する。ＦＩＸの活性化は、Ａｒｇ１４５およびＡｒｇ１８０での限定的タンパク質分解によって生じ、活性化ペプチドを放出する（配列番号１の残基１４６〜１８０）。したがって、活性化ＦＩＸ（ＦＩＸａ）は、配列番号１の残基１〜１４５（軽鎖）および配列番号１の残基１８１〜４１５（重鎖）から構成される。
【００２７】
ＦＩＸａは、テナーゼ複合体の一部として、凝固中に適切なトロンビン形成を支持するために必要なＦＸａのほとんどを生成することにより、止血において重要な役割を果たす、トリプシン様セリンプロテアーゼである。
【００２８】
ＦＸは、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン、ＦＩＸ、およびタンパク質Ｃと構造的に類似したビタミンＫ依存性凝固因子である。これは、分泌のためにタンパク質を標的とする疎水性シグナル配列を含有するプレプロ配列を用いて合成される。プロペプチドは、γ−カルボキシル化をＦＸの軽鎖に導くために重要である。ヒトＦＸ酵素前駆体は、Ｎ末端ガンマカルボキシグルタミン酸リッチ（Ｇｌａ）ドメイン、２つのＥＧＦドメイン、それぞれＥＧＦ１（残基４６〜８２）およびＥＧＦ２（残基８５〜１２５）、およびＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメイン（残基１９５〜４４８）を含む、４つの異なるドメインを含む。ＦＸは、配列番号２の残基１〜１３９（軽鎖）および配列番号２の残基１４３〜４４８（重鎖）を含む、二鎖酵素前駆体として血漿中で循環する。ＦＸの活性化は、Ａｒｇ１９４での限定されたタンパク質分解によって生じ、活性化ペプチドの放出をもたらす（残基１４３〜１９４）。したがって、活性化ＦＸ（ＦＸａ）は、配列番号２の残基１〜１３９（軽鎖）および配列番号２の残基１９５〜４４８（活性化重鎖）から構成される。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「結合剤」という用語は、その最も広範な意味で理解され、例えば、レクチン、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド、ならびにすべてのＦＸ結合分子または物質を含む。ＦＸ結合分子は、例えば、抗体およびその抗原結合性断片（例えば、単一可変ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖなどであるが、それらに限定されない）、アフィボディ、アドネクチン、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アビマーを含む。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、抗原またはその一部分に結合することができる免疫グロブリン配列に由来するタンパク質を指す。抗体という用語は、任意のクラス（またはアイソタイプ）、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、および／またはＩｇＹの全長抗体を含むが、これらに限定されない。抗原、またはその断片に特異的に結合する抗体は、その抗原、またはその一部もしくは断片に排他的に結合し得るか、または限られた数の相同抗原に結合し得る。通常、単純な用語「結合」または「に結合」が使用され、抗体またはその断片の結合が「特異的」結合であることが一般的に理解される。エピトープが相同抗原間で共有される場合、抗体がさらにそのような高度に相同な抗原に結合し得ることは論理的である。抗体という用語は、多価、例えば、二重特異性抗体などの二価である抗体を含む。
【００３１】
天然全長抗体は、少なくとも４つのポリペプチド鎖：ジスルフィド結合によって結合される２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含む。いくつかの場合では、天然抗体は、軟骨魚綱に見られるＩｇＮＡＲの場合のように、４つ未満の鎖を含む。特定の薬学的な利益がある免疫グロブリンの１つのクラスはＩｇＧである。ヒトにおいて、ＩｇＧクラスは、それらの重鎖定常領域の配列に基づいて、４つのサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類され得る。軽鎖は、それらの配列組成物の差異に基づいて、カッパ鎖およびラムダ鎖の２種類に分類することができる。ＩｇＧ分子は、２つ以上のジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖、および各々がジスルフィド結合によって重鎖に結合した２つの軽鎖から構成されている。ＩｇＧ重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および最大３つの重鎖定常（ＣＨ）ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含み得る。軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み得る。ＶＨおよびＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保護された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨｖＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分化することができる。ＶＨおよびＶＬドメインは、典型的に３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される：  ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。超可変領域（ＣＤＲ）を含有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、抗原と相互作用することができる構造を形成する一方で、抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介し得る。この宿主組織または因子には、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体、および第１の構成成分である、古典的補体系のＣ１複合体のＣ１ｑなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明の抗体は、単一Ｂ細胞からまたはＢ細胞のクローン集団によって発現される一連のユニークな重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を表すという意味で、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）であり得る。本発明の抗体は、当業者に既知の様々な方法を使用して生成および精製され得る。例えば、抗体はハイブリドーマ細胞から生成され得る。抗体は、Ｂ細胞増殖によって生成され得る。抗体またはその断片は、哺乳類または微生物の発現系において、またはインビトロ翻訳によって、組み換え発現され得る。また、抗体またはその断片は、例えば、ファージディスプレイ、細菌表示、酵母表示、哺乳類細胞表示、またはリボソームもしくはｍＲＮＡ表示によって、細胞表面結合分子として組み換え発現され得る。
【００３３】
本発明の抗体は単離されてもよい。「単離抗体」という用語は、それが生成された環境中の他の（別の）構成成分（複数可）から分離および／もしくは回収されている抗体、ならびに／またはそれが生成された環境中に存在する構成成分の混合物から精製されている抗体を指す。
【００３４】
抗体のある特定の抗原結合性断片は、抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって実施され得ることが示されているため、本発明の文脈において好適であり得る。抗体の「抗原結合性断片」という用語は、本明細書に説明されるように、ＦＸまたは別の標的分子などの抗原に結合するか、またはこれらの抗原を認識する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗原結合性断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインの組み合わせ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８；２４２：４２３−４２６、および  Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  １９８８；８５：５８７９−５８８３を参照されたい）、ｄＳｆｖ、Ｆｄ（典型的には、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、単一のＶＨおよび単一のＶＬ鎖を含む一価分子、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびカッパボディ（例えば、Ｉｌｌら、（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １０：９４９−５７を参照されたい）、ならびに１つ以上の単離されたＣＤＲまたは機能的パラトープが含まれ（ただしこれらに限定されない）、単離されたＣＤＲまたは抗原結合残基もしくはポリペプチドを、関連付けるかまたは一緒に結合して、機能性抗体断片を形成することができる。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技法を使用して得てもよく、断片は、インタクト抗体と同一の様式で有用性についてスクリーニングされ得る。
【００３５】
「Ｆａｂ」および「Ｆａｂ’２」断片を含む、抗体の「Ｆａｂ断片」は、抗体の重鎖を接続するヒンジシステイン残基のＮ末端またはＣ末端上のヒンジ領域における重鎖の開裂によって、該抗体から派生し得る。「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、ならびに重鎖の可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む。「Ｆａｂ’２」断片は、それらのヒンジシステインによって一般に共有結合された一対の「Ｆａｂ」断片を含む。Ｆａｂ’は、形式的には、Ｆａｂ’２での重鎖を接続するヒンジジスルフィド結合の開裂によって、Ｆａｂ’２断片から派生する。抗体断片のジスルフィド結合以外の他の化学的結合も当該技術分野で既知である。Ｆａｂ断片は、潜在的に低親和性で、その抗原に結合する親抗体の能力を保持する。Ｆａｂ’２断片が二価の結合をすることができる一方、Ｆａｂ断片およびＦａｂ’断片は一価で結合することができる。一般に、Ｆａｂ断片は、定常ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、すなわちＦｃ受容体とＣ１ｑとの相互作用が発生することになるＦｃ部が欠如している。したがって、Ｆａｂ断片は一般にエフェクター機能を欠いている。Ｆａｂ断片は、例えば、Ｆａｂを得るためにパパインを使用するか、またはＦａｂ’２を得るためにペプシンを使用するかのいずれかの抗体の酵素開裂により、当該技術分野で既知の方法によって生成され得、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２を含むＦａｂ  断片は、当業者には周知の技法を使用して組み換えで生成され得る。
【００３６】
「Ｆｖ」（断片可変）断片は、完全な抗原認識および結合部位を含有する抗体断片であり、一般に、例えば、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）において、自然に共有結合できることに関連して、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体を含む。この構成では、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。集合的に、６つの超可変領域またはそのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。
【００３７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９４，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｖｏｌ．  １１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【００３８】
「単鎖Ｆａｂ」または「ｓｃＦａｂ」抗体は、抗体のＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆａｂポリペプチドは、ｓｃＦａｂ  が抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＣＬドメインとの間、またはＶＬドメインとＣＨ１ドメインとの間のいずれかのポリペプチドリンカーをさらに含む（Ｋｏｅｒｂｅｒら、（２０１５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４２７：５７６−８６）。
【００３９】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、ここで断片は、同一のポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一の鎖上の２つの可変ドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、可変ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的にペアリングされ、２つの抗原結合部位を作製する。
【００４０】
「線形抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａら、（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８：１０５７−１０６２に説明されるような抗体を指す。簡潔に述べると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含有する。線形抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【００４１】
抗体断片は、従来の組み換え技法またはタンパク質操作技法を使用して得られる場合があり、断片は、インタクト抗体と同一の様式でＦＸなどの抗原への結合についてスクリーニングすることができる。
【００４２】
本発明の抗体断片は、切頭によって、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の除去によって、作製され得る。また、断片は、１つ以上の内部欠失によって生成され得る。
【００４３】
本発明の抗体は、抗体の断片、もしくは本明細書に開示される抗体のうちのいずれか１つの変異体であり得るか、またはそれを含み得る。本発明の抗体は、これらの抗体のうちの１つの抗原結合部分、もしくはその変異体であり得るか、またはそれを含み得る。例えば、本発明の抗体は、これらの抗体のうちの１つのＦａｂ断片、もしくはその変異体であり得、またはこれらの抗体のうちの１つに由来する単鎖抗体、もしくはその変異体であり得る。また、本発明の抗体は、全長抗体およびその断片の組み合わせであり得る。
【００４４】
しかしながら、抗原に特異的な３つの高可変領域のみを含む単一の可変ドメインでさえ、通常は結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し高い親和性で結合する能力を保持することができる（ＣａｉおよびＧａｒｅｎ（１９９６）ＰＮＡＳ  ９３：６２８０−６２８５）。重鎖可変ドメインのみを有する自然発生的なラクダ科抗体（ＶＨＨ）は、抗原に結合することができる（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２３６４５−２３６５０、Ｂｏｎｄら、（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：６４３−６５５）。ＩｇＮＡＲ  （またはＶＮＡＲ）と同様に、軟骨魚類から単一ドメイン抗体結合領域が提供される。代替物は、骨格としてヒト第１０フィブロネクチンＦＮ３ドメイン（１０ＦＮ３ドメイン）を使用するＣｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓによって提供される。そのような抗体分子は、単一可変ドメイン、免疫グロブリン単一可変ドメイン、または単一可変ドメイン断片と呼ばれる。分子は単量体であり、典型的には１２〜１５ｋＤａのサイズである。
【００４５】
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインまたは単一可変ドメインは、（本明細書で定義されるような）Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）またはその好適な断片であり得る。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の概説については、ＷＯ２００８／０２００７９（１６ページ）などを参照する。
【００４６】
「単一可変ドメイン」と交換可能に使用される「免疫グロブリン単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位が存在し、単一免疫グロブリンドメインによって形成される分子を定義する。これにより、免疫グロブリン単一可変ドメインは、「従来型」免疫グロブリンまたはそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）から離れて設定されるが、上記のように、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメイン（重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、相互作用して抗原結合部位を形成する。対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨまたはＶＬドメインによって形成される。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３個以下のＣＤＲによって形成される。
【００４７】
したがって、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」および「単一可変ドメイン」という用語は、抗原結合部位の形成のために少なくとも２つの可変ドメインとの相互作用を必要とする、従来型免疫グロブリンまたはそれらの断片を含まない。しかしながら、これらの用語は、従来型免疫グロブリンの断片を含み、ここで抗原結合部位は単一可変ドメインによって形成される。
【００４８】
一般的に、単一可変ドメインは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から実質的になるポリペプチド配列、またはそのようなポリペプチド配列の好適な断片（通常、ＣＤＲの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基の少なくとも一部を含有する）である。免疫グロブリン配列、特にＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）などの免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列および構造は、それらに限定されるものではないが、当該技術分野および本明細書において「フレームワーク領域１」もしくは「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」もしくは「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」もしくは「ＦＲ３」、および「フレームワーク領域４」もしくは「ＦＲ４」とそれぞれ呼ばれている４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」からなり、フレームワーク領域は、当該技術分野において「相補性決定領域１」もしくは「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」もしくは「ＣＤＲ２」、および「相補性決定領域３」もしくは「ＣＤＲ３」とそれぞれ呼ばれている３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」によって分断されていると考えることができる。
【００４９】
免疫グロブリン単一可変ドメインの全長は、通常、例えば１１０〜１２０個のアミノ酸残基の領域におけるＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）については、好ましくは１１２〜１１５個、最も好ましくは１１３個のアミノ残基である。
【００５０】
そのような単一可変ドメインおよび断片は、免疫グロブリンフォールドを含むか、または好適な条件下で、免疫グロブリンフォールドを形成することができるため、最も好ましい。そのため、単一可変ドメインは、単一抗原結合ユニット（すなわち、例えば、別の可変ドメインと（例えば、ＶＨ／ＶＬ相互作用を介して）相互作用して機能性抗原結合ドメインを形成する必要がある、従来型の抗体およびｓｃＦｖフラグメントに存在する可変ドメインについての場合のように、単一抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用して機能性抗原結合ユニットを形成する必要がないような、単一可変ドメインから本質的になる機能性抗原結合ユニット）を形成することができる限り、例えば、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）もしくはその好適な断片、または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列もしくはＶＨＨ配列）もしくはその好適な断片を含んでもよい。
【００５１】
本発明の一実施形態では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）、または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）であり、より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来型４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
【００５２】
例えば、単一可変ドメインまたは免疫グロブリン単一可変ドメイン（または免疫グロブリン単一可変ドメインとしての使用に好適なアミノ酸配列）は、（単一）ドメイン抗体、「ｄＡｂ」もしくは「ｓｄＡｂ」またはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、またはラクダ化ＶＨドメインを含むがこれらに限定されない）、その他の単一可変ドメイン、またはそれらのうちのいずれか１つの好適な断片として言及され得る。（単一）ドメイン抗体の概説については、ＥＰ０３６８６８４なども参照する。「ｄＡｂ」という用語については、例えば、Ｗａｒｄら、１９８９（Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４）、Ｈｏｌｔら、２００３（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：４８４）、ならびにＤｏｍａｎｔｉｓ  Ｌｔｄ．の、例えば、ＷＯ２００４／０６８８２０、ＷＯ２００６／０３０２２０、ＷＯ２００６／００３３８８他の、公開された特許出願を参照する。
【００５３】
したがって、本発明の意味では、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」という用語は、非ヒト源、好ましくはラクダ科、好ましくはラクダ科重鎖抗体由来のポリペプチドを含む（例えば、ＶＨＨｓ）。それらはヒト化されてもよい（例えば、ヒト化ＶＨＨｓ）。さらに、用語は、例えば、マウスまたはヒトなどの非ラクダ科源由来のポリペプチドを含み、これらは、例えば、ＤａｖｉｅｓおよびＲｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９４（ＦＥＢＳ  ３３９：２８５）、１９９５（Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌ．１３：４７５）および１９９６（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：５３１）、ならびにＲｉｅｃｈｍａｎｎ  およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、１９９９（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５）に説明されるように、「ラクダ化」されている（例えば、ラクダ化ＶＨドメイン）。
本明細書で使用される場合、「単一特異性」抗体という用語は、１つの特定のエピトープ（二価の抗体を含むがこれらに限定されない）に結合することができる抗体を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「二重特異性」抗体という用語は、２つの異なる抗原または同一の抗原上の２つの異なるエピトープに結合することができる抗体を指す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「三重特異性」抗体という用語は、３つの異なる抗原、または同一の抗原上の３つの異なるエピトープ、または２つの異なる抗原上に存在する３つの異なるエピトープに結合することができる抗体を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「多重特異性」抗体という用語は、２つ以上の異なる抗原または同一の抗原上の２つ以上の異なるエピトープに結合することができる抗体を指す。したがって、多重特異性抗体は、二重特異性抗体および三重特異性抗体を含む。
【００５７】
全長ＩｇＧ型の二重特異性抗体は、２つの個別ハイブリドーマの融合によって生成され、二重特異性ヘテロ二量体化抗体の断片を含む抗体の混合物を生成する、ハイブリッドクアドローマを形成することができる（Ｃｈｅｌｉｕｓ  Ｄ．ら、ＭＡｂｓ．２０１０  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２（３）：３０９−３１９）。二重特異性ヘテロ二量体化抗体は、代替的に、組み換え技術を使用することにより生成され得る。また、ヘテロ二量体化は、Ｆｃ領域の二量体化インターフェースを操作してヘテロ二量体化を促進することによって達成することもできる。この一例は、いわゆるノブインホール変異であり、立体的に嵩高い側鎖（ノブ）が、対向するＦｃ上の立体的に小さい側鎖（ホール）に一致する１つのＦｃに導入され、それによってヘテロ二量体化を促進する立体的相補性を作製する。操作されたヘテロ二量体化Ｆｃインターフェースの他の方法は、静電相補性、非ＩｇＧヘテロ二量体化ドメインへの融合、またはヘテロ二量化を制御するためのヒトＩｇＧ４の天然Ｆａｂアーム交換現象の利用である。ヘテロ二量体化二重特異性抗体の例は、文献、例えば、（Ｋｌｅｉｎ  Ｃ．ら、ＭＡｂｓ．２０１２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；４（６）：６５３−６６３）に詳しく説明されている。ヘテロ二量体抗体の軽鎖には、特別な注意を払う必要がある。ＬＣとＨＣとの正しいペアリングは、共通の軽鎖の使用によって達成することができる。この場合も、ＬＣ／ＨＣインターフェースの操作を使用して、ＣｒｏｓｓＭａｂの場合のように、ヘテロ二量体化または軽鎖クロスオーバー操作を促進することができる。適切な変異を含有する２つの個別のＩｇＧからの穏やかな還元条件下での抗体のインビトロ再構築を使用して、二重特異性を生成することもできる（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎら、ＰＮＡＳ，１１０，５１４５−５１５０（２０１３））。また、正しい軽鎖のペアリングを確実にするための、天然Ｆａｂアーム交換方法も報告されている。
【００５８】
多重特異性抗体ベースの分子はまた、ＩｇＧの天然モジュールを組み合わせた融合タンパク質として組み換え発現され、文献に説明されるような多重特異性および多価抗体誘導体を形成し得る。融合抗体の例は、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＩｇＧ−ｓｃＦＶ、ダイアボディ、ＤＡＲＴなどである。特定の検出タグまたは精製タグ、半減期延長部分またはその他の構成要素を、融合タンパク質に組み込むことができる。追加的な非ＩｇＧモダリティーもまた融合タンパク質に組み込まれ得る。ＦＣヘテロ二量化に基づく二重特異性全長抗体は、ＬＣペアリング法に関わらず、一般的に非対称ＩｇＧと呼ばれる。一般的に、二重特異性抗体は、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎらによって概説された様々な分子形式で生成され得る  （Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｔｈｅ  ｍａｋｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍａｂｓ  ９，１８２−２１２（２０１７））。
【００５９】
多重特異性抗体ベースの分子はまた、文献に説明されるように、個別の全長ＩｇＧの化学結合もしくはカップリング、またはＩｇＧ断片のカップリングによっても生成され、多重特異性抗体誘導体および多価抗体誘導体を形成し得る。融合抗体の例には、化学結合型Ｆａｂ’２、ＩｇＧ二量体などが挙げられる。特定の検出タグまたは精製タグ、半減期延長分子またはその他の構成要素を、複合体タンパク質に組み込むことができる。追加的な非ＩｇＧポリペプチドもまた融合タンパク質に組み込まれ得る。多重特異性分子は、上述のものを含む組み換え型および化学的方法を組み合わせることによっても生成され得る。
【００６０】
本明細書に開示される抗ＦＸ抗体またはその抗原結合性断片は、多重特異性血液凝固促進抗体の一部として使用することができる。したがって、本発明の一態様は、二重特異性血液凝固促進抗体などの多重特異性血液凝固促進抗体における使用に好適な、個別の構成要素（中間体）抗ＦＸ抗体またはその抗原結合性断片に関する。一態様では、そのような二重特異性（または多重特異性）抗体は、ＦＩＸおよび／またはその活性化形態であるＦＩＸａ、およびＦＸに結合することができる。
【００６１】
一態様では、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である。そのような抗体は、例えば、好適な抗体表示または免疫化プラットフォーム、または当該分野で既知のその他の好適なプラットフォームまたは方法を使用することによって生成することができる。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域の少なくとも一部分および／またはＣＤＲの少なくとも一部分が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する、可変ドメインを有する抗体を含むことが意図される。（例えば、ヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲの両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する、可変ドメインを有し得る。）さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域またはその一部分もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）。
【００６２】
一態様では、そのようなヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。そのようなヒトモノクローナル抗体は、遺伝子導入非ヒト動物（例えば、不死化細胞に融合されたヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子セグメントレパートリーを含むゲノムを有する遺伝子導入マウス）から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得る。
【００６３】
ヒト抗体は、ヒト生殖系列配列の選択に基づいて構築された配列ライブラリから単離されてもよく、天然および合成の配列多様性でさらに多様化されている。
【００６４】
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロでの免疫化に続いて、リンパ球のエプスタイン・バーウイルスでの形質転換によって調製され得る。
【００６５】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の化合物または抗体との複合体など、ヒト抗体の任意の修飾形態を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列（ＣＤＲまたはその部分）を含有するヒト／非ヒトキメラ抗体を指す。したがって、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、少なくともレシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、配列組成および機能性を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類など非ヒト種（ドナー抗体）からの抗体の超可変領域からの残基によって置換される。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。そのような修飾の例は、１つ以上のいわゆる逆突然変異の導入であり、これは典型的にはドナー抗体に由来するアミノ酸残基である。抗体のヒト化は、当業者に既知の組み換え技法を使用して実施されてもよい（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４８，Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｌｏ編を参照されたい）。軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方に対する好適なヒトレシピエントフレームワークは、例えば、配列または構造相同性によって特定され得る。代替的に、例えば、構造、生物物理学特性および生化学特性の知識に基づいて、固定レシピエントフレームワークを使用してもよい。レシピエントフレームワークは、生殖系列由来または成熟抗体配列由来であり得る。ドナー抗体からのＣＤＲは、ＣＤＲ移植によって移植することができる。ＣＤＲ移植ヒト化抗体は、ドナー抗体からのアミノ酸残基の再導入（逆突然変異）がヒト化抗体の特性に有益な影響を与える重要なフレームワーク位置の特定により、例えば、親和性、機能性、および生物物理学特性をさらに最適化することができる。ドナー抗体由来の逆突然変異に加えて、ヒト化抗体を、ＣＤＲまたはフレームワーク領域への生殖系列残基の導入、免疫原性エピトープの除去、部位特異的変異誘発、または親和性成熟などによって操作することができる。
【００６７】
さらなる態様では、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、またはドナー抗体においても見られない、残基を含む。これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを含み、その中ですべてのまたは実質的にすべてのＣＤＲが、非ヒト免疫グロブリンのものと対応し、その中ですべてのまたは実質的にすべてのＦＲ残基が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの部分も含むことができる。
【００６８】
「ヒト化抗体誘導体」という用語は、抗体と化学的化合物との複合体、または抗体と別の抗体との複合体など、ヒト化抗体の任意の修飾形態を指す。
【００６９】
「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、２種以上の種に由来する抗体の部分を含む抗体を指す。例えば、そのような抗体をコードする遺伝子は、可変ドメインをコードする遺伝子、および２つの異なる種から生じた定常領域をコードする遺伝子を含む。例えば、マウスモノクローナル抗体の可変セグメントをコードする遺伝子は、ヒト起源の抗体の定常領域をコードする遺伝子に結合されてもよい。
【００７０】
抗体の断片結晶可能領域（「Ｆｃ領域」／「Ｆｃドメイン」）は、抗体のＣ末端領域であり、これはヒンジおよび定常ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体、ならびに補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する場合がある。Ｆｃ領域は、抗体が免疫系と相互作用することを可能にする。本発明の一態様では、抗体は、とりわけ血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、タンパク質の安定性、および／または抗原依存性細胞障害活性、またはそれらの欠如など、典型的にはその機能特性の１つ以上を変更するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本発明の抗体は、ここでもまた、抗体の機能的特性の１つ以上を変更するために、化学的に修飾されるか（例えば、１つ以上の化学的部分を抗体に取り付けることができる）、またはそのグリコシル化を変更するために修飾され得る。ＩｇＧ１抗体は、ある特定のＦｃガンマ受容体（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａ）への親和性の低下、およびＣ１ｑ介在性補体固定（Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ）（ＥＵ指標による残基ナンバリング）の減少を、それぞれ結果として生じるであろう、１つ以上の、およびおそらくすべての以下の突然変異を含む、修飾Ｆｃドメインを担持し得る。
【００７１】
本発明の抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、例えばＩｇＧ２、例えばＩｇＧ４であり得る。所望であれば、抗体のクラスは、既知の技法によって「スイッチ」されてもよい。例えば、元々ＩｇＭ分子として生成された抗体は、ＩｇＧ抗体にクラススイッチされる場合がある。クラススイッチング技法は、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４へ、ＩｇＧ２からＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４へ、またはＩｇＧ４からＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２へと、あるＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換するためにも使用され得る。異なるＩｇＧサブクラスからの領域の組み合わせによって、定常領域キメラ分子を生成する抗体の操作を実施することもできる。
【００７２】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化するように、例えば、増加または減少するように修飾される。このアプローチは、例えば、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに説明されている。
【００７３】
定常領域は、抗体を安定化させるように、例えば、二価の抗体が２つの一価のＶＨ−ＶＬ断片に分離するリスクを低減させるように修飾され得る。例えば、ｌｇＧ４定常領域では、残基Ｓ２２８（ＥＵナンバリング指数およびＫａｂａｔによるＳ２４１による）は、ヒンジにおける重鎖間ジスルフィド架橋形成を安定化するためのプロリン（Ｐ）残基に変異してもよい（例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；３０：１０５−８を参照されたい）。
【００７４】
抗体またはその断片は、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）の観点から画定され得る。「相補性決定領域」または「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与するアミノ酸残基が位置する抗体の領域を指す。超可変性の領域またはＣＤＲは、抗体可変ドメインのアミノ酸アライメントの最も高い可変性を有する領域として特定することができる。データベースは、ＫａｂａｔデータベースなどのＣＤＲ識別に使用でき、このＣＤＲは、例えば、軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）を含むものとして定義されている（Ｋａｂａｔら、１９９１；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ公開番号９１〜３２４２）。代替的には、ＣＤＲは、「超可変ループ」からのこれらの残基として定義され得る（軽鎖可変ドメインの残基２６〜３３（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１−９１７）。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、上述のＫａｂａｔらに説明される方法によって実施される。本明細書において、「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔ残基」、および「Ｋａｂａｔによれば」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのためのこのナンバリングシステムを指す。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すると、ペプチドの実線形アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク（ＦＲ）もしくはＣＤＲの短縮化、またはそれらへの挿入に対応する、より少ないか、または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５２の後のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる、残基５２ａ、５２ｂ、および５２ｃ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる、残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列との相同性領域でのアライメントにより、所与の抗体について決定され得る。
【００７５】
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、例えば、ＲｉｅｃｈｍａｎｎおよびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８）の図２に示されるように、ラクダ科からのＶＨＨドメインに適用される、Ｋａｂａｔらにより与えられるＶＨドメインの一般的なナンバリングに従ってナンバリングされてもよい。類似の方法でＶＨＨドメインにも適用することができる、ＶＨドメインのアミノ酸残基をナンバリングするための代替方法は、当該技術分野において既知である。ＣＤＲの決定は、異なる方法によっても行われ得る。ＫａｂａｔによるＣＤＲ決定において、ＶＨＨのＦＲ１は、位置１〜３０のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は、位置３１〜３５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は、位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は、位置５０〜６５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は、位置６６〜９４のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は、位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４は、位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。
【００７６】
本文書において、単一可変ドメイン抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））のＣＤＲ配列は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤuｂｅｌ（２０１０，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ  ２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，ｐｐ．３３−５１）によるＡｂＭ定義を使用して決定される。この方法によれば、ＦＲ１は、位置１〜２５のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は、位置２６〜３５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は、位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は、位置５０〜５８のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は、位置５９〜９４のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は、位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は、位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む（Ｋａｂａｔナンバリングによる）。
【００７７】
本文書において、ＩｇＧ抗体（全長ＩｇＧ抗体およびそのＦａｂ断片を含む）のＣＤＲ配列は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤuｂｅｌ（２０１０，Ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ  ２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，ｐｐ．３３−５１）によるＫａｂａｔ定義を使用して決定される。この方法によると、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、位置２４〜３４（ＣＤＲ１）、位置５０〜５６（ＣＤＲ２）、および位置８９〜９７（ＣＤＲ３）として定義され、一方、重鎖可変ドメインのＣＤＲは、位置３１〜３５（ＣＤＲ１）、位置５０〜６５（ＣＤＲ２）、位置９５〜１０２（ＣＤＲ３）として定義される。
【００７８】
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書に定義されるように、ＣＤＲ内ではないこれらのＶＨまたはＶＬアミノ酸残基を指す。
【００７９】
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に開示される特定の抗体のうちの１つ以上からのＣＤＲを含み得る。
【００８０】
「血液凝固促進抗体」という用語は、例えば、血液凝固のプロセスを加速することによって、および／または１つ以上の凝固因子の酵素活性を増加させることによって、血液凝固を増強する抗体を指す。
【００８１】
「血液凝固促進活性」という用語は、例えば、血液凝固のプロセスを加速することによって、および／または１つ以上の凝固因子の酵素活性を増加させることによって、血液凝固を増強する抗体などの化合物の能力を指す。
【００８２】
ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて、当該技術分野において周知であるように、各ＣＤＲ中のアミノ酸残基の総数は異なる場合があり、Ｋａｂａｔナンバリングによって示されるアミノ酸残基の総数に対応していない場合がある（つまり、Ｋａｂａｔナンバリングによる１つ以上の位置が、実際の配列中に占拠していない場合がある、または実際の配列が、Ｋａｂａｔナンバリングにより許容される数よりも多いアミノ酸残基を含有する場合がある）ことに留意されたい。つまり、概して、Ｋａｂａｔによるナンバリングは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応しているか、または対応していない場合があることを意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインにおけるアミノ酸残基の総数は、通常１１０〜１２０の範囲内であり、１１２〜１１５の範囲であることが多い。しかしながら、より小さくより長い配列が、本明細書に説明される目的に好適である場合もあることに留意されたい。本発明の抗体は、本明細書に開示される特定の抗体のうちの１つ以上からのＣＤＲを含み得る。
【００８３】
「抗原」（Ａｇ）という用語は、Ａｇを認識する抗体（Ａｂ）を生成するために、免疫応答性の脊椎動物の免疫化のために使用される分子実体を指す。本明細書において、Ａｇはより広範に称され、かつＡｂによって特異的に認識される標的分子を含むことが一般に意図されており、したがって、Ａｂを生成するために使用される、免疫化プロセス、または、例えば、ファージディスプレイなどの他のプロセスにおいて使用される分子の断片または模倣物を含む。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体（Ａｂ）およびその対応する抗原（Ａｇ）などの「抗原結合ポリペプチド」間の分子相互作用の文脈において定義される。一般に、「エピトープ」は、Ａｂが特異的に結合するＡｇ上の区域または領域、すなわちＡｂと物理的接触する区域または領域を指す。物理的接触は、Ａｂ分子およびＡｇ分子内の原子に対する、様々な基準（例えば、３Åなど、３．５Åなど、４Åなど、４．５Åなど、５Åなどの２〜６Åの距離カットオフ、または溶媒露出度）を使用して定義され得る。
【００８５】
ＦＸ／ＦＸａは、多数の異なるエピトープを含んでもよく、そのようなエピトープは（１）直鎖ペプチドエピトープ、（２）成熟ＦＸ／ＦＸａ構造において相互に近接して位置する１つ以上の非連続アミノ酸からなる構造エピトープ、および（３）炭水化物基などのＦＸ／ＦＸａに共有結合した分子構造の全部または一部のいずれかからなるエピトープを含み得るが、これらに限定されない。
【００８６】
所与の抗体（Ａｂ）／抗原（Ａｇ）対のエピトープは、様々な実験的および計算的なエピトープマッピング方法を使用して、異なるレベルの詳細さで説明し、特徴付けることができる。実験方法には、変異誘発法、Ｘ線結晶法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素重水素交換質量分析法（ＨＤＸ−ＭＳ）および様々な競合結合方法、当該分野で既知の方法が含まれる。各方法が独特の原理に依存するため、エピトープの説明は、それが決定された方法と密接な関連がある。したがって、用いられるエピトープマッピング方法に応じて、所与のＡｂ／Ａｇ対のエピトープは異なる説明をされ得る。
【００８７】
所与の抗体（Ａｂ）／抗原（Ａｇ）対のエピトープおよびパラトープは、日常的な方法によって特定され得る。例えば、エピトープの一般的な位置は、ＦＸの異なる断片または変異体に結合する抗体の能力を評価することによって決定されてもよい。また、抗体（エピトープ）と接触するＦＸ内の特定のアミノ酸、およびＦＸ（パラトープ）と接触する抗体における特定のアミノ酸は、日常的な方法を使用して決定されてもよい。本発明による抗体は、ＦＸに結合するために、自然発生的なリガンドもしくは受容体または別の抗体などの別の分子と競合することができる場合がある。
【００８８】
標的への抗体の結合が別の抗体などのその標的の別のリガンドによる標的の結合と比較される、競合結合アッセイを行うことができる。
【００８９】
同じ抗原に結合する抗体は、それらの共通抗原に同時に結合する能力に関して特徴付けることができ、「競合結合」／「ビニング」の対象となる場合がある。本文脈では、「ビニング」という用語は、同一の抗原に結合する抗体をグループ化する方法を指す。抗体の「ビニング」は、標準技法に基づくアッセイにおけるそれらの共通抗原に対する２つの抗体の競合結合に基づいてもよい。
【００９０】
抗体の「ビン」は、参照抗体を使用して定義される。第２の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合することができない場合、第２の抗体は、参照抗体と同一の「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および第２の抗体は、抗原の同一部分に競合的に結合し、「競合抗体」と見なされる。第２の抗体が参照抗体と同時に抗原に結合することができる場合、第２の抗体は、別個の「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および第２の抗体は、抗原の同一部分に競合的に結合せず、「非競合抗体」と見なされる。
【００９１】
抗体「ビニング」は、エピトープに関する直接情報を提供しない。
【００９２】
競合抗体、すなわち、同一の「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープ、重複するエピトープ、またはさらには別個のエピトープを有してもよい。後者は、抗原上のそのエピトープに結合した参照抗体が、第２の抗体が抗原上のそのエピトープに接触するために必要な空間を占有する場合である（「立体障害」）。非競合抗体は一般に別個のエピトープを有する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に特異的に開示される抗体のうちの少なくとも１つと同一のエピトープに結合することになる。
【００９３】
抗体が本明細書に開示される抗ＦＸ抗体と同一のエピトープに結合するかどうか、または結合するためにそれらと競合するかどうかを決定するための競合アッセイは、当該技術分野で既知である。例示的な競合アッセイとしては、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ）、表面プラズモン共鳴解析（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）機器を使用して）、バイオレイヤー干渉法、およびフローサイトメトリーが挙げられる。典型的には、競合アッセイは、固体表面に結合した、または細胞表面上に発現した抗原、試験ＦＸ結合抗体、および参照抗体の使用を含む。参照抗体は標識化され、試験抗体は標識化されない。競合阻害は、試験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合した標識化された参照抗体の量を判定することによって測定される。通常、試験抗体は、参照抗体よりも過剰に存在する（例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍または１０００００倍）。競合アッセイで競合的であると特定された抗体（すなわち、競合抗体）は、参照抗体と同一のエピトープ、または重複するエピトープに結合する抗体、および立体障害を生じるために参照抗体によって結合されるエピトープに十分に近位の隣接するエピトープに結合する抗体を含む。
【００９４】
例示的な競合アッセイでは、参照抗ＦＸまたは抗ＦＸａ抗体は、市販の試薬を使用してビオチン化される。ビオチン化参照抗体は、試験抗体または標識化されていない参照抗体の段階希釈液と混合して（自己競合対照）、標識化された参照抗体に対して、試験抗体（または標識化されていない参照抗体）の様々なモル比（例えば、１、５、１０、２０、１００、１０００、１００００または１０００００倍）の混合物を得られる。抗体混合物を、ＦＸまたはＦＸａポリペプチド被覆ＥＬＩＳＡプレートに添加する。次いで、プレートを洗浄し、検出試薬としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）をプレートに添加する。標的抗原に結合した標識化された参照抗体の量は、当該技術分野で既知である、発色基質（例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）またはＡＢＴＳ（２，２’’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホナート））の添加後に検出される。光学密度読み取り値（ＯＤ単位）は、分光計（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２分光計（分子装置））を使用して測定される。ゼロパーセント阻害に対応する応答（ＯＤ単位）は、いかなる競合抗体も含まないウェルから決定される。１００％阻害、すなわち、アッセイバックグラウンドに対応する応答（ＯＤ単位）は、いかなる標識化された参照抗体または試験抗体も含まないウェルから決定される。各濃度での試験抗体（または標識化されていない参照抗体）によるＦＸまたはＦＸａに対する標識化された参照抗体の阻害パーセントは、以下のように計算される：％阻害＝（１−（ＯＤ単位−１００％阻害）／（０％阻害−１００％阻害））＊１００。
【００９５】
当業者は、２つ以上の抗ＦＸ／ＦＸａ抗体が、結合領域、ビンを共有し、かつ／または競合的に抗原に結合するかどうかを決定するために、類似のアッセイを実施し得ることを理解する。当業者はまた、競合アッセイが、当該技術分野で既知の様々な検出システムを使用して実施することができることも理解する。
【００９６】
競合結合アッセイにおいて測定されたときに、過剰な１つの抗体（例えば、１、５、１０、２０、１００、１０００、１００００または１０００００倍）が他の抗体の結合を、例えば、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、または９９％阻害する場合、試験抗体は、抗原と結合するために参照抗体と競合する。競合アッセイの例は、方法セクション５に提供される。
【００９７】
「結合親和性」という用語は、本明細書では、２つの分子間、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の非共有相互作用の強度の測定として使用される。「結合親和性」という用語は、一価の相互作用を説明するために使用される。
【００９８】
２つの分子間、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の結合親和性は、一価の相互作用により、平衡解離定数（ＫＤ）を決定することによって定量化され得る。ＫＤは、複合体形成および解離の動態の、例えば、ＳＰＲ法による測定によって、決定することができる。一価の複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋａ（またはｋｏｎ）、および解離速度定数ｋｄ（またはｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを介して、ｋａおよびｋｄと関連する。
【００９９】
上記の定義にしたがって、所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較など、異なる分子相互作用に関連する結合親和性は、個別の抗体／抗原複合体のＫＤ値の比較によって比較されてもよい。
解離定数の値は、周知の方法によって直接決定することができる。標的に向かう抗体などのリガンドの結合能力を評価するための標準アッセイは、当該技術分野で既知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー解析を含む。抗体の結合動態および結合親和性も、ＳＰＲなどの当該技術分野で既知の標準アッセイによって評価することができる。ＳＰＲ結合アッセイの例を、本明細書の実施例２に提供する。
【０１００】
本発明による抗体またはその断片などのＦＸ結合剤は、その標的の１×１０−４Ｍ以下、１×１０−５Ｍ以下、１×１０−６Ｍ以下、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、または１×１０−９Ｍ以下、または１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、１×１０−１２Ｍ以下、１×１０−１３Ｍ以下、または１×１０−１４Ｍ以下のＫＤを有し得る。一実施形態では、本発明による抗体のＫＤは、１００μＭ、例えば５０μＭ未満、例えば１０μＭ未満であり得る。一実施形態では、ＫＤは、９μｍ未満、例えば８μｍ未満、例えば７μｍ未満、例えば６μｍ未満、例えば５μｍ未満である。一実施形態では、ＫＤは、４μｍ未満、例えば３μｍ未満、例えば２μｍ未満、例えば１μｍ未満である。
【０１０１】
同一性
当該技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係を指す。当該技術分野では、「同一性」はまた、２つ以上のアミノ酸残基の文字列の間の一致の数によって決定されるような、ポリペプチド間の配列の関連性の程度も意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されたギャップアラインメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列の小さい方の間の完全一致の割合を測定する。関連するポリペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。
【０１０２】
本発明では、ＥＭＢＯＳＳ−６．６．０からのＮｅｅｄｌｅｍａｎ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３−４５３）を使用し、ギャップ開始およびギャップ伸長についてそれぞれパラメータ１０および０．５を使用して（ｇａｐｏｐｅｎ＝１０、ｇａｐｅｘｔｅｎｄ＝０．５）、類似性および同一性が決定された。
【０１０３】
医薬製剤
別の態様では、本発明は、本明細書に説明される抗体などの本発明の化合物を含む組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物を提供する。
【０１０４】
したがって、本発明の１つの目的は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在するそのような抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬製剤を提供することであり、当該製剤は２．０〜１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定剤、または界面活性剤、ならびにそれらの様々な組み合わせのうちの１つ以上をさらに含んでもよい。医薬組成物に保存剤、等張剤、キレート剤、安定剤、および界面活性剤を使用することは、当業者には周知である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、１９９５が参照され得る。
【０１０５】
一実施形態では、医薬製剤は水性製剤である。そのような製剤は典型的には溶液または懸濁液であるが、コロイド、分散剤、乳濁液、および多相材料も含み得る。用語「水性製剤」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
【０１０６】
別の実施形態では、医薬製剤は、使用前に溶媒および／または希釈剤が添加される凍結乾燥製剤である。
【０１０７】
さらなる態様では、医薬製剤は、そのような抗体の水溶液、およびこの抗体が０．１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で存在する緩衝液を含み、当該製剤は約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
【０１０８】
一実施形態では、本発明は当該組成物の内容物を有する注入装置に関する。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、注入装置における使用および／または注入装置内への収容が意図されている。いくつかの実施形態では、注入装置は、使い捨て、事前充填式、複数回投与式のＦｌｅｘＴｏｕｃｈ（登録商標）型のペン（供給元：Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）である。いくつかの実施形態では、注入装置は、単一ショット装置である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、注入装置は、複数の所定の用量の薬剤を送達するように構成されたものなどの固定用量装置であり、時として複数の固定用量装置または固定用量、複数ショット装置と呼ばれる。
【０１１０】
投与
本発明の化合物、例えば、抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのような化合物を含む組成物は、静脈内、筋肉内、皮下など、非経口的に投与されてもよい。代替的に、本発明の化合物、例えば、抗体もしくはその抗原結合性断片、またはそのような化合物を含む組成物は、経口的または局所的など、非経口経路を介して投与されてもよい。化合物または組成物は、予防的に投与されてもよい。代替的に、化合物または組成物は、（要求に応じて）治療的に投与されてもよい。
【０１１１】
投与量
送達される化合物の用量は、１日あたり約０．０１ｍｇ〜５００ｍｇの化合物、好ましくは１日あたり約０．１ｍｇ〜２５０ｍｇ、より好ましくは１日あたり約０．５ｍｇ〜約２５０ｍｇであってもよく、状態の重症度に応じて、初回量および維持量として、１日、１週間、２週間、または１か月に１回でもよい。また、好適な用量は、特定の化合物について、そのインビボ半減期または平均滞留時間およびその生物活性を含む、その化合物の特性に基づいて調整され得る。例えば、送達される化合物は、一実施形態では１週間に１回、または別の実施形態では１週間おきに１回、または別の実施形態では１か月に１回投与されてもよく、当該実施形態のいずれかにおいて、例えば体重１ｋｇあたり０．１、０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇの用量で投与されてもよい。
【０１１２】
本明細書に開示される化合物を含有する組成物は、予防的な処置のために、および／または一部の実施形態では治療的な処置のために投与することができる。治療的な用途では、組成物は、上述のような何らかの出血障害などの疾患を既に患っている対象に、疾患およびその合併症を治癒、緩和、または部分的に阻止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療有効量」として定義される。当業者によって理解されるように、この目的のために有効な量は、疾患または傷害の重度、ならびに対象の体重および全身状態に依存する。
【０１１３】
一態様では、本発明は、ＦＸの活性化を刺激してＦＸａを生成することができるＦＸ結合分子に関する。上述したように、そのような機能性は、特に血友病患者の凝固機能を改善するための新規および改善された治療の探求において望ましい。
【０１１４】
一実施形態では、本発明は、ヒトＦＸに結合し、ＦＸ活性化を刺激する抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤に関する。
【０１１５】
一実施形態では、本発明は、抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤に関し、ＦＸ結合剤、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＦＸに結合し、ＦＸ活性化を刺激することができる。
観察された活性化が、ＦＸとＦＩＸａを一緒にするＦＩＸａ結合剤を含む、ＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩ模倣化合物などのＦＩＸ接合部分の不在においても生じることは、特に興味深い。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤は、ヒトＦＸに結合し、それによって、ＦＸａを生成するＦＩＸａによるＦＸのタンパク質分解を刺激する。
【０１１６】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＦＩＸａ結合部分の存在と無関係に、ＦＸａ生成を刺激する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＦＩＸａ結合部分の存在と無関係に、ＦＸａ生成を刺激することができる。
【０１１７】
一実施形態では、ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤は、ＦＩＸａ結合部分の存在と無関係に、ＦＸをよりタンパク質分解しやすくすることができる。一実施形態では、ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤は、ＦＸをＦＩＸａによってよりタンパク質分解しやすくすることができる。一実施形態では、ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤は、ＦＩＸａ結合部分の存在と無関係に、ＦＸをよりタンパク質分解しやすくすることができる。
【０１１８】
ＦＸａ生成を刺激するＦＸ結合剤の能力は、当業者に既知の好適なアッセイによって試験され得る。所与のＦＸ結合剤の活性化機能を試験するのに好適なインビトロアッセイを提供する、本明細書の実施例３を参照する。一実施形態では、ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤は、実施例３によって決定されるようにＦＸ活性化を刺激する。ＦＸ結合剤は、ＦＸ結合剤または非活性化ＦＸ結合剤を用いずに実施された同等のアッセイと比較して、当該ＦＸ結合剤の存在下でＦＸａの増加が測定されたときに、刺激性であるか、またはＦＸ活性化を刺激することができる。
【０１１９】
ＦＩＸａ媒介性ＦＸ活性化を促進するＦＸ結合剤の能力は、ＦＸ結合剤が存在しない場合、すなわちＦＸ活性化の倍増加が、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、または１．９など、１を超えて観察された場合と比較して、所与のＦＸ結合剤について本明細書の実施例３によるアッセイにおいて説明されるようにＦＸ活性化速度における増加が観察された場合に、存在すると考えられる。好ましい実施形態では、観察されたＦＸ活性化の倍増加は２倍超、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍以上である。一実施形態では、ＦＸ活性化の倍増加は２〜１００，０００倍である。そのような一実施形態では、ＦＸ活性化の倍増加は２〜５００倍である。そのような一実施形態では、ＦＸ活性化の倍増加は３〜５００倍である。別のそのような実施形態では、ＦＸ活性化の倍増加は４〜５００倍である。別のそのような実施形態では、ＦＸ活性化の増加は５〜１００倍である。別の実施形態では、ＦＸ活性化の増加は１０〜１００倍、例えば１０〜８３倍である。
【０１２０】
ＦＸ結合剤の結合活性が本明細書の実施例３に説明されるようなアッセイの測定値に影響を与えることを避けるために、アッセイは、一価のＦＸ結合剤を使用することにより実施されるのが好ましい。ＦＸ結合剤が二価または多価のＦＸ結合剤である場合、活性化アッセイは、その一価の抗原結合性断片を使用して実施されるべきである。
【０１２１】
本発明の一態様は、ＦＸａよりも強いヒトＦＸに結合する抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤に関する。一実施形態では、ＦＸ結合剤はＦＸａに結合しない。別の実施形態では、ＦＸ結合剤はＦＸａに対して優先的にＦＸに結合する。そのような一実施形態では、ＦＸ結合剤は低親和性でＦＸａに結合する。ＦＸが活性化ペプチドの存在によってＦＸａと区別される場合、本発明は、一態様では、ヒトＦＸの活性化ペプチドに結合する抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤に関する。ヒトＦＸの活性化ペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１４３〜１９４によって定義される。
【０１２２】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２のアミノ酸残基１４３〜１９４によって特定されるＦＸの活性化ペプチドに結合する。さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２によって特定されるＦＸの活性化ペプチド内のアミノ酸残基１７０〜１８５に結合する。
実施例５に説明されるように実施されたペプチド配列に基づき、特定されたＦＸ活性化ＦＸ結合剤の共有結合部位が特定された。共通最小ペプチドエピトープが決定され、配列番号２によって特定されるヒトＦＸのアミノ酸残基１７７〜１７８に対応するＦＸの活性化ペプチド内にペプチド「ＬＬ」を含むことが見出された。
【０１２３】
一実施形態では、本発明は、配列番号２によって特定されるヒトＦＸのアミノ酸残基１７７〜１７８に対応するＦＸの活性化ペプチド内の「ＬＬ」に結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤に関する。
【０１２４】
一実施形態では、本発明は、ＦＸの活性化ペプチドに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤に関し、ペプチド配列によって決定される共通最小エピトープは、「ＬＬ」（配列番号２のアミノ酸残基１７７〜１７８）によって構成される。
【０１２５】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片などのＦＸ結合剤は、配列番号２のアミノ酸残基１４３〜１９４によって特定されるＦＸの活性化ペプチドに結合し、ペプチド配列によって決定される共通最小エピトープは、「ＬＬ」（配列番号２のアミノ酸残基１７７〜１７８）によって構成される。
【０１２６】
抗原結合分子が様々な形態をとり得ることは、当該技術分野では周知である。一連の周知の分子形態の種類が本明細書に説明されているが、これは網羅的なリストと見なされるべきではないこと、かつ当業者は本出願の教示をその好ましい分子形態に困難なく適用することができることにも留意されたい。
【０１２７】
一実施形態では、ＦＸ結合剤は一価である。そのような一実施形態では、ＦＸ結合剤は、例えば、（単一）ドメイン抗体もしくはその抗体断片、またはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、またはラクダ化ＶＨドメインなどの免疫グロブリン単一可変ドメインである。一実施形態では、ＦＸ結合剤はＦａｂである。一実施形態では、ＦＸ結合剤は二価である。一実施形態では、ＦＸ結合剤はモノクローナル抗体全体（ｍＡｂ）またはｍＡｂの抗原結合性断片である。
【０１２８】
本発明の態様は、ＦＸ活性化を刺激することができるＦＸ結合剤の特定に関する。そのような一実施形態では、以下の工程：ａ）ＦＸ結合剤を提供する工程、ｂ）所与のＦＸ結合剤のＦＸ活性化機能を試験するのに好適なインビトロアッセイにおいて、ＦＸ結合剤を試験する工程、およびｃ）ＦＸ活性化を刺激することができるＦＸ結合剤を選択する工程を含む方法が提供される。
【０１２９】
上述のように、ＦＸ活性化を刺激することができるＦＸ結合剤は、二重特異性分子、または三重特異性分子、またはさらには多重特異性分子に含まれる望ましい要素であり得る。
【０１３０】
したがって、本発明の一態様は、ＦＸ刺激を提供する少なくとも１つのＦＸ結合部分を含む抗体分子（またはその抗原結合性断片）などの、二重、三重、および多重特異性分子に関する。
【０１３１】
本発明の態様は、薬品の製造のための本明細書に説明される抗体またはその抗原結合性断片などの分子の使用に関する。
【０１３２】
本発明の態様は、治療方法における使用のための、本明細書に説明される抗体またはその抗原結合性断片などの分子に関する。
【０１３３】
本発明の態様は、血友病などの凝固障害の治療について本明細書に説明される抗体またはその抗原結合性断片などの分子の使用に関する。
【０１３４】
本発明の態様は、治療を必要とする個人に、治療有効用量の本明細書に説明される抗体またはその抗原結合性断片などの分子を投与する工程を含む治療方法に関する。一実施形態では、方法は、血友病などの凝固障害、特に阻害物質を有するか、または有しない、血友病Ａを患う患者を治療するためのものである。一実施形態では、方法は、阻害物質を有するか、または有しない、血友病Ｂを患う患者を治療するためのものである。
【０１３５】
実施形態
１．配列番号２のアミノ酸残基１４３〜１９４によって特定されるＦＸの活性化ペプチドに結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１３６】
２．配列番号２によって特定されるＦＸの活性化ペプチド内のアミノ酸残基１７０〜１８５のうちの１つ以上に結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１３７】
３．配列番号２によって特定されるヒトＦＸの位置１７７〜１７８のアミノ酸残基に対応するＦＸの活性化ペプチド内の「ＬＬ」に結合することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１３８】
４．ＦＸの活性化ペプチドに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、ペプチドアレイにより決定される共通最小エピトープが「ＬＬ」（配列番号２のＡＡ  １７７〜１７８）を含む、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１３９】
５．ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、ＦＸ活性化を刺激することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１４０】
６．ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１４１】
７．ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、ＦＩＸａ結合剤の存在と無関係に、ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１４２】
８．実施形態１〜４のいずれか１つに記載のＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、ＦＸ活性化を刺激することができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１４３】
９．抗体またはその抗原結合性断片の、ＦＸ活性化を刺激することができる能力が、本明細書の実施例３に説明されるように決定される、実施形態５〜８のいずれか１つに記載のＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
【０１４４】
１０．ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、ＦＩＸａ結合部分の存在と無関係に、ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激する、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１４５】
１１．ＦＸ活性化の刺激が、本明細書の実施例３に説明されるように決定される、実施形態５〜１０のいずれか１つに記載のＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
【０１４６】
１２．ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、ＦＸをより活性化しやすくすることができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１４７】
１３．ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、ＦＸをＦＩＸａによってよりタンパク質分解しやすくすることができる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１４８】
１４．ＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片であって、ＦＩＸａ結合部分の存在と無関係に、ＦＸをＦＩＸａによってよりタンパク質分解しやすくすることができる、抗体または抗原結合性断片。
【０１４９】
１５．抗体またはその抗原結合性断片の、ＦＸをよりタンパク質分解しやすくすることができる能力が、本明細書の実施例３に説明されるように決定される、実施形態１２〜１４のいずれか１つに記載のＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５０】
１６．抗体またはその抗原結合性断片が、実施形態５〜１１のいずれか１つに記載のＦＸ活性化を刺激することができる、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５１】
１７．抗体またはその抗原結合性断片が、実施形態５〜１１のいずれか１つに記載のＦＸ活性化を刺激する単一可変ドメイン抗体である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５２】
１８．抗体またはその抗原結合性断片が、実施形態１２〜１５のいずれか１つに記載のＦＸをよりタンパク質分解しやすくすることができる単一可変ドメイン抗体である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５３】
１９．その一価の抗原結合性断片が、
ａ．ＦＸ活性化を刺激するか、
ｂ．ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激するか、
ｃ．ＦＸ活性化を刺激することができるか、
ｄ．ＦＩＸａによるＦＸ活性化を刺激することができるか、
ｅ．ＦＸをよりタンパク質分解しやすくすることができるか、または
ｆ．ＦＸをＦＩＸａによってよりタンパク質分解しやすくすることができる、実施形態５〜１８のいずれか１つに記載のＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５４】
２０．抗体または抗原結合性断片が、１０μＭ未満、例えば９μＭ未満、例えば８μＭ未満、例えば７μＭ未満、例えば６μＭ未満、例えば５μＭ未満、例えば４μＭ未満、例えば３μＭ未満、または例えば２μＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）として決定される結合親和性を有する、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のＦＸに結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５５】
２１．抗体または抗原結合性断片が一価である、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５６】
２２．抗体またはその抗原結合性断片が、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはその抗体断片、例えば、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨ、またはラクダ化ＶＨドメインである、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５７】
２３．抗体またはその抗原結合性断片が、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５８】
２４．抗体またはその抗原結合性断片が二価である、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１５９】
２５．抗体または抗原結合性断片が、Ｆａｂ’２のｍＡｂである、実施形態２４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１６０】
２６．重鎖可変ドメインが、配列番号８、９、１０、１１、５４、５５、５６または５７よって特定された配列に対して、それぞれ少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１６１】
２７．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号８によって特定された重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸残基変化を有する３つの重鎖ＣＤＲ配列か、
ｂ．配列番号９によって特定された重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸残基変化を有する３つの重鎖ＣＤＲ配列か、
ｃ．配列番号１０によって特定された重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸残基変化を有する３つの重鎖ＣＤＲ配列か、
ｄ．配列番号１１によって特定された重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸残基変化を有する３つの重鎖ＣＤＲ配列か、
ｅ．配列番号５４によって特定された重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸残基変化を有する３つの重鎖ＣＤＲ配列か、
ｆ．配列番号５５によって特定された重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸残基変化を有する３つの重鎖ＣＤＲ配列か、
ｇ．配列番号５６によって特定された重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸残基変化を有する３つの重鎖ＣＤＲ配列か、または
配列番号５７によって特定された重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸残基変化を有する３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１６２】
２８．３つの重鎖ＣＤＲ配列が、特定された配列番号の３つのＣＤＲと比較して、最大で９個、例えば８個、例えば７個、または例えば６個のアミノ酸変化を有する、実施形態２７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１６３】
２９．３つの重鎖ＣＤＲ配列が、特定された配列番号の３つのＣＤＲと比較して、最大で５個、例えば４個、例えば３個、例えば２個、または最大１個のアミノ酸変化を有する、実施形態２８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１６４】
３０．配列番号８、９、１０、１１、５４、５５、５６、もしくは５７を含むか、またはそれらからなる、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１６５】
３１．配列番号８、９、１０、１１、５４、５５、５６、または５７の３つのＣＤＲを含む、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１６６】
３２．抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号８、９、１０、１１、５４、５５、５６、もしくは５７を含むか、またはそれらからなる、参照抗体または抗原結合性断片と競合する、抗体または抗原結合性断片。
【０１６７】
３３．ｍＡｂ  ００９１６の重鎖可変ドメイン（配列番号４）および軽鎖可変ドメイン（配列番号５）を含む、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１６８】
３４．ｍＡｂ  １３Ｆ６２の重鎖可変ドメイン（配列番号６）および軽鎖可変ドメイン（配列番号７）を含む、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１６９】
３５．ｍＡｂ  ００９１６の重鎖可変ドメイン（配列番号４）の３つのＣＤＲと、軽鎖可変ドメイン（配列番号５）の３つのＣＤＲとを含む、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１７０】
３６．ｍＡｂ  １３Ｆ６２の重鎖可変ドメイン（配列番号６）の３つのＣＤＲと、軽鎖可変ドメイン（配列番号７）の３つのＣＤＲとを含む、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１７１】
３７．抗体またはその抗原結合性断片であって、ｍＡｂ  ００９１６の重鎖可変ドメイン（配列番号４）および軽鎖可変ドメイン（配列番号５）を含む参照抗体または抗原結合性断片と競合する、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１７２】
３８．抗体またはその抗原結合性断片であって、ｍＡｂ  １３Ｆ６２の重鎖可変ドメイン（配列番号６）および軽鎖可変ドメイン（配列番号７）を含む参照抗体または抗原結合性断片と競合する、抗体またはその抗原結合性断片。
【０１７３】
３９．抗体または抗原結合性断片が、実施形態５〜９のいずれか１つに記載のＦＸ活性化を刺激することができる、実施形態２６〜３８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１７４】
４０．抗体または抗原結合性断片が、実施形態９〜１１．のいずれか１つに記載のＦＸ活性化を刺激する、実施形態２６〜３８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１７５】
４１．抗体または抗原結合性断片が、実施形態１２〜１５のいずれか１つに記載のＦＸをよりタンパク質分解しやすくすることができる、実施形態２６〜３８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【０１７６】
４２．実施形態１〜４１のいずれか１つに記載の、抗体または抗原結合性断片を含む、二重、三重、または多重特異性分子。
【０１７７】
４３．当該抗体またはその抗原結合性断片が単一可変ドメイン抗体である、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の、抗体またはその抗原結合性断片を含む、二重、三重、または多重特異性分子。
【０１７８】
４４．実施形態１〜４３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合性断片、および任意で１つ以上の薬学的に許容可能な担体（複数可）を含む、医薬組成物。
【０１７９】
４５．阻害物質を有するか、もしくは有しない、血友病Ａなどの、または阻害物質を有するか、もしくは有しない、血友病Ｂなどの、凝固障害の治療において使用するため薬品の製造のための、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物の使用。
【０１８０】
４６．阻害物質を有するか、もしくは有しない、血友病Ａなどの、または阻害物質を有するか、もしくは有しない、血友病Ｂなどの、凝固障害の治療において使用するための、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物。
【０１８１】
４７．血友病などの血液凝固障害を患っている対象を治療する方法であって、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物を当該対象に投与することを含む、方法。
【０１８２】
４８．実施形態４７に記載の方法であって、凝固障害または血液凝固障害が、阻害物質を有するか、または有しない、血友病ＡまたはＢである、方法。
【０１８３】
４９．実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の抗体を特定するための方法であって、ａ）ＦＸ結合剤を提供する工程と、ｂ）工程ａで提供されたＦＸ結合剤のＦＸ活性化機能を試験するのに好適なインビトロアッセイにおいて、ＦＸ結合剤を試験する工程と、ｃ）ＦＸ活性化を刺激することができるＦＸ結合剤を選択する工程とを含む、方法。
【０１８４】
５０．実施形態５〜２３のいずれか１つに記載の抗体を特定するための方法であって、ａ）ＦＸ結合剤を提供する工程と、ｂ）工程ａで提供されたＦＸ結合剤のＦＸ活性化機能を試験するのに好適なインビトロアッセイにおいて、ＦＸ結合剤を試験する工程と、ｃ）ＦＸを、例えばＦＩＸａによって、よりタンパク質分解しやすくすることができるＦＸ結合剤を選択する工程とを含む、方法。
【０１８５】
５１．実施形態１〜４３のいずれか１つに記載の、抗体またはその抗原結合性断片を発現する、真核細胞。
【０１８６】
５２．実施形態１〜４４のいずれかに１つに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または組成物、および使用説明書を含む、キット。
【０１８７】
実施例および方法
一般的な方法
ＦＸ結合Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの調製
一般分子生物学
一般的な分子生物学技術については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版，２００１，Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
【０１８８】
１．免疫化およびライブラリ
Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｂｌｙｎｘ  Ｃａｍｅｌｉｄ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＬＡ１４００５７５）の承認後、１頭のラマおよび１頭のアルパカを、ＦＸ（Ｈａｅｍｏｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＶＴ  ＵＳＡ）で免疫化した。
【０１８９】
重鎖のみの抗体断片レパートリーのクローニングおよびファージ免疫ライブラリの調製を以下のように実施した。
【０１９０】
最終免疫原注射後、血液試料を採取した。これらの血液飼料から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳ）の指示に従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用して調製した。ＰＢＭＣから全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲの出発材料として使用して、本質的にＷＯ２００５／０４４８５８に説明されるように、ＶＨＨ／Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）コードＤＮＡセグメントを増幅した。簡潔に述べると、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）コードＤＮＡセグメントを、ファージミドベクターｐＡＸ２１２にクローニングし、Ｈｉｓ６およびＦＬＡＧ３タグで融合されたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を表示するファージ粒子の生成を可能にした。その後、ファージを標準プロトコルに従って調製し、保管した。
【０１９１】
合成ライブラリ
合成ライブラリは、合成Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）遺伝子断片をファージミドベクターｐＡＸ１９０にクローニングすることによって生成され、これは上述のｐＡＸ２１２と同一の特徴を有するが、複数のクローニング部位において差異を有した。
【０１９２】
ＦＸに結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのライブラリスクリーニング
Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）ファージディスプレイの選択は、生成された免疫および合成ライブラリで実施した。ライブラリは、固定化ヒトＦＸ（Ｈａｅｍｏｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＶＴ  ＵＳＡ）およびカニクイザルＦＸ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ自社生産）の異なる組み合わせに対して、１〜４個の連続した富化ラウンドを受けた。
【０１９３】
ＦＸａに対しＦＸに選択的なＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを特異的に富化するために、特定の実験では、固定化されたＦＸを用いたライブラリのインキュベーション中の競合のために過剰な可溶性ＦＸａを使用した。
【０１９４】
他の構造的に関連する凝固因子に対しＦＸに選択的なＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを特異的に富化するために、特定の実験では、固定化されたＦＸを用いたライブラリのインキュベーション中の競合のために過剰な可溶性ＦＩＸを使用した。
【０１９５】
選択出力からの約４５００個の個別のクローンを、ヒトおよびカニクイザルＦＸ、ＦＸａ、またはＦＩＸに対して、ＥＬＩＳＡで結合するためにスクリーニングした（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓを発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞からのペリプラズム抽出物を使用した）。ヒトＦＸ／ＦＸａへの特異的結合を示した約１５００個のクローンを特定し、その大部分はカニクイザルＦＸへの交差結合を示した。一部のクローンは、ＦＸａに対してＦＸへの優先的結合を示した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンの配列解析は、ＦＸ／ＦＸａに結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの約７００個のユニーク配列を特定した。
【０１９６】
２．Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）  発現構築物の生成
ファージディスプレイ選択出力からのＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの配列解析を、一般的に公知の手順に従って行った（Ｐａｒｄｏｎら（２０１４）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ９：６７４）。
【０１９７】
ユニークな制限部位を各々担持するフォワードＦＲ１プライマーおよびリバースＦＲ４プライマーの特定の組み合わせを用いたＰＣＲにより得られたＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）含有ＤＮＡ断片を、適切な制限酵素を用いて消化し、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）発現ベクターの一致するクローニングカセットにライゲーションした（以下に説明する）。次いで、ライゲーション混合物を、エレクトロコンピテント  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＧ１（６０５０２，Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）またはＴＯＰ１０（Ｃ４０４０５２，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）細胞に変換し、次いでそれらを適切な抗生物質選択圧（カナマイシンまたはゼオシン）の下で増殖させた。抵抗性クローンを、プラスミドＤＮＡのＳａｎｇｅｒシークエンシング（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により検証した。
【０１９８】
一価のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを、ｌａｃプロモータを含有するプラスミド発現ベクターからのＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１、カナマイシンの耐性遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ複製元、およびＯｍｐＡシグナルペプチドのコード配列によって先行されるＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）クローニング部位において発現させた。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）コード配列とインフレームで、ベクターはＣ末端ＦＬＡＧ３およびＨＩＳ６タグをコードする。シグナルペプチドは、発現されたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓを細菌宿主のペリプラズム区画に導く。
【０１９９】
Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの一般的な発現
目的のＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）構築物を含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ−１細胞を、３７℃で２時間、その後、３０℃で２９時間、「５０５２」自動誘導培地（０．５％グリセロール、０．０５％グルコース、０．２％ラクトース＋３ｍＭのＭｇＳＯ４）を含有するバッフル付き振盪機フラスコ中で増殖させた。一晩凍結させたＥ．ｃｏｌｉ発現培養物からの細胞ペレットを、次いでＰＢＳ（元の培養物の体積の１／１２．５）中に溶解し、穏やかに攪拌しながら４℃で１時間インキュベーションする。最後に、細胞をもう一度ペレット化し、ペリプラズム空間内に分泌されたタンパク質を含有する上清を保管する。
【０２００】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の一般的な発現
目的のＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）構築物を含有するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を、ＢＧＣＭ培地中で２日間（３０℃で、２００ｒｐｍ）増殖させた。３日目に、培地をＢＭＣＭに切り替え、構築物をさらに増殖させて（３０℃、２００ｒｐｍ）、８時間後に０．５％ｖ／ｖメタノールを用いて誘導した。翌日、構築物を、０．５％ｖ／ｖメタノールを用いて、午前中、正午、および夕方に誘導した。５日目に、細胞を遠心分離し、上清（分泌されたＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を含有する）を収集した。
【０２０１】
Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の一般的な精製
ＨＩＳ６タグ付きＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）を、Ｎｉ−Ｅｘｃｅｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＮｉ−ＩＤＡ／ＮＴＡ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）樹脂のいずれかで、イミダゾール（前者用）または酸性溶出（後者用）を用いた固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって、その後、ＰＢＳ中の脱塩工程（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５樹脂を用いたＰＤコラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、およびもし必要であれば、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘコラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。
【０２０２】
３．熱シフトアッセイ
抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の熱安定性を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩ機器（Ｒｏｃｈｅ）上の９６ウェルプレート内で実施される熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）を使用して決定した。１列ごとに、１つのＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を、以下のｐＨ範囲：３．５／４／４．５／５／５．５／６／６．５／７／７．５／８／８．５／９に従って分析した。１ウェルごとに、５μＬのＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）の試料（ＰＢＳ中０．８ｍｇ／ｍＬ）を、５μＬのＳｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ（ＭｉｌｌｉＱ水中で４０倍、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｓ６５５１）および１０μＬの緩衝液（１００ｍＭのリン酸塩、１００ｍＭのホウ酸塩、１００ｍＭのクエン酸塩、および１１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ範囲３．５〜９）に添加した。適用された温度勾配（０．０３℃／秒の速度で３７〜９９℃）は、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの展開を誘発し、それによってそれらの疎水性パッチが露出される。Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅは、それらの疎水性パッチに結合し、蛍光強度の増加をもたらす（Ｅｘ／Ｅｍ＝４６５／５８０ｎｍ）。ｐＨ７での蛍光強度曲線の一次導関数の変曲点は、溶融温度（Ｔｍ）の尺度としての役目を果たす。 
【０２０３】
４．分析用サイズ排除クロマトグラフィー
Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の凝集およびオリゴマー化の潜在的な発生を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって調査した。この目的のために、８μｇのＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）試料（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬ）および１０μＬのＢｉｏＲａｄ標準（カタログ番号１５１〜１９０１、ＰＢＳ中で１／１０に希釈）を、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００を介してＷａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅカラム（粒径：３．５μｍ、孔径２００Å、内径７．８ｍｍ）に注入した。アルギニン緩衝液［１０ｍＭのリン酸塩＋１５０ｍＭのアルギニン＋１０％の１−プロパノール＋０．０２％のＮａＮ３（ｐＨ７．０）］を移動相として使用し、０．５ｍＬ／分の流速を適用した。全体的なＳＥＣの動作を、１．３５ｋＤａのＢｉｏＲａｄ標準ピークに対する３つのパラメータ：主ピークのピーク面積（９０％超＝合格）、回収率（８０％超＝合格）、および保持時間を考慮することによって決定した。
【０２０４】
５．競合アッセイ
同一または類似のエピトープに結合する抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）は、以下のように実施され得る競合アッセイを使用して特徴付けることができる。
【０２０５】
２５μＬ（１μｇ／ｍＬ）のヒト血漿由来ＦＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に固定する。ウェルの洗浄およびブロッキングの後、「ビニング」ｍＡｂ（ｍＡｂ  ００９１６）を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  Ｐｈ７．４、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％  ＢＳＡ、および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含有する緩衝液、または緩衝液のみを用いた対照に、１μＭの濃度で添加し、被覆ヒトＦＸで３０分間プレインキュベートする。その後、試験抗体（ここでは異なるＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））を添加し、１時間結合を許容する。未結合試験抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））および結合ｍＡｂを洗浄し、結合Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合化抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ８５９２）およびそれに続く基質ｅｓＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメンチルベンジジン）（ＳＤＴ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の存在下での酵素反応を使用して検出する。
【０２０６】
「ビニング」ｍＡｂについて、試験抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標））の各々の存在下で観察された阻害パーセントを、以下の式により計算する。
【数１】
2021502984.tif 000002
【０２０７】
抗体分子は、５０％を超える阻害が観察された場合には一般的に競合すると考えられる。
【０２０８】
［実施例１〜５］
実施例１：抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）
抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのプールから、ＦＸ酵素前駆体を選択的に結合するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの群（ＦＸおよび非ＦＸａ）を、さらなる研究のために選択した。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの配列は、配列番号８〜１１および５４〜５７により定義される。「ビニング」抗体としてのｍＡｂ  ００９１６（ＩｇＧ１アイソタイプ、配列番号４および５により特定される可変配列）との競合実験を実施し、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ  Ｎｂ  ７０１Ｂ０９、Ｎｂ  ７０１Ｃ０６、Ｎｂ  ７０２Ｃ１２、Ｎｂ  ７０１Ｄ０７、Ｎｂ  ７２１Ｅ０８、Ｎｂ  ７２９Ａ０４、Ｎｂ  ７２９Ｃ０８およびＮｂ  ７３０Ｃ０３は、すべてｍＡｂ  ００９１６と競合することが示された。ＦＸの異なる領域に結合する制御Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）、Ｎｂ  ５０１Ａ０２（配列番号１２）も含まれ、このＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）についてはｍＡｂ  ００９１６との競合は観察されなかった。結果を以下の表１に示し、Ｎｂ  ５０１Ａ０２を除くすべての化合物が、ＦＸに結合するために、すなわち、ｍＡｂ  ００９１６と同一または重複するＦＸ上のエピトープに結合するために、ｍＡｂ  ００９１６と競合していることを示す。
【表１】
2021502984.tif 000003
【０２０９】
実施例２：ＦＸに結合する抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）のＳＰＲ分析
精製された抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（Ｎｂ）のヒト血漿由来ＦＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）への結合を、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００）によりプローブした。
【０２１０】
簡潔に述べると、標準アミンカップリング化学を使用して、抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製のＭＡＢ０５０）をＣＭ４センサーチップ上に固定した。表３に従い、抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（１０ｎＭ）を、１０μＬ／分の流速で１分間注入した。その後、４０９６、１０２４、２５６、６４、１６、４、および０ｎＭのＦＸを３０μＬ／分の流速で４分間注入し、抗ＦＸ  Ｎｂへの結合を許容し、続いて、泳動用緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、Ｐｈ７．４）を５分間注入して、抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）からの解離を許容した。泳動用緩衝液はまた、抗ＦＸ  ＮｂおよびＦＸ試料の希釈にも使用された。チップの再生を、３ＭのＭｇＣｌ２からなる再生緩衝液、３０秒間の接触時間、および３０μＬ／分の流速を使用して達成した。結合データを２５℃で収集し、製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により供給されたＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１を使用する１：１モデルにより解析した。
【０２１１】
すべての場合において、結合センソグラムは、運動分析に基づくＫＤ決定を除外する運動プロファイルに結合する迅速なオンおよび迅速なオフを示した。したがって、報告されたＫＤ値を、定常状態解析に基づいて決定する。解析により、表２に報告された結合定数を得た。特定された最も強い結合剤はＮｂ７０２Ｃ１２であり、一方、試験された他のＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）は、わずかに高いＫＤおよび低いＲｍａｘでＦＸに結合する。
【表２】
2021502984.tif 000004
【０２１２】
実施例３：ＦＸａ生成アッセイにおける抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの活性
ＦＩＸａ媒介型ＦＸ活性化を促進する一価の抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）（Ｎｂ）の能力を、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら（２００８）Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，６：３１５−３２２で概説されるように、複数のメカニズムを通じて生じると考えられている。また、同じく活性化ペプチドに結合することが見出されたｍＡｂ  １３Ｆ６２のＦａｂ（ＩｇＧ１アイソタイプ、配列番号６および７により特定された可変配列）も、比較のために含んだ。さらに、ＡＣＥ９１０の抗ＦＸアームに対応する、ＵＳ９，３３４，３３１（当該公報のＪ３２７およびＬ４０４−ｋ）、ならびにより最近ではＷＯ２０１８／０２１４５０（当該公報のＪ３２７  Ｄ３１ＨおよびＪＹＬ２８０）およびＷＯ２０１８／０９８３６３（配列番号４２７により表されるＢＩＩＢ−１２−９１７および当該公報の６１５）に開示されるような抗ＦＸ抗体は、抗ＦＩＸ／抗ＦＸ二特異性ＦＶＩＩＩ模倣化合物の一部としての使用に好適であると明記されており、それらをさらに比較のために含んだ。
【０２１３】
各化合物を、０〜１０００ｎＭ、０〜２０００ｎＭ、０〜４０００ｎＭまたは０〜８０００ｎＭの濃度範囲で、１〜１．５ｎＭのヒト血漿由来ＦＩＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）およびアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、ｐＨ７．３）中の５００μＭの２５：７５の比率のホスファチジルセリン：ホスファチジルコリンリン脂質小胞（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）で１０分間プレインキュベートすることにより、個別に試験した。ヒト血漿由来ＦＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）の１００ｎＭの最終濃度および５０μＬの反応物体積への添加により反応を開始した。攪拌（１０００  ＲＰＭ）しながら室温で２０分間活性化した後、２５μＬのクエンチ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、ｐＨ  ７．３）の添加により、反応物をクエンチした。２５μＬの２ｍＭのＳ−２７６５発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）を添加することにより、生成されたＦＸａの量を決定し、続いて、マイクロプレートリーダーで１０分間、４０５ｎｍでの吸光度を測定することにより、発色基質変換を決定した。４０５ｎｍの吸光度（ΔＡｂｓ４０５／分）において観察された変化を、二次結合方程式（式１）に適合して、ピーク刺激活性およびＥＣ５０を得た。
【０２１４】
表３は、ＦＸａ生成速度の適合最大増大（ＦＸ活性化における倍増）および適合ＫＤ値を列挙している。試験されたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのほとんどは、ＦＩＸａ媒介性ＦＸ活性化（ＦＩＸａ単独に対して約４〜約８３倍）を刺激し、一方、ｍＡｂ１３Ｆ６２のＦａｂは、１．５倍の活性化を示し、Ｎｂ  ５０１Ａ０２は活性化を示さなかった。１３Ｆ６２のＦａｂおよびＦＩＸａ単独については、適合ＥＣ５０値は提供されない。
【数２】
2021502984.tif 000005
【０２１５】
式中、Ｙｉは、所与のＦＸ結合剤濃度（ｉ）で観察された基質変換（ΔＡｂｓ４０５／分）であり、［ＦＸ］および［結合剤］は、それぞれ総濃度ＦＸおよびＦＸ結合剤であり、ＫＤは、ＦＸ結合剤の明確な解離定数であり、ＹｍａｘおよびＹ０は、それぞれ最大および初期シグナル（ΔＡｂｓ４０５／分）である。
【表３】
2021502984.tif 000006
【０２１６】
実施例４：ＦＸａアミド分解活性に対する抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの効果
実施例３において観察された活性化における倍増が、ＦＸａアミド分解活性に対するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの陽性効果に起因する可能性を除外するために、ＦＸａアミド分解活性を刺激する一価の抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの能力を以下のとおり調査した。５ｎＭヒト血漿由来ＦＩＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、ｐＨ７．３）中の５０μＭの２５：７５の比率のホスファチジルセリン：ホスファチジルコリンリン脂質小胞（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）で１０分間プレインキュベートした。ヒト血漿由来ＦＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，ＵＳＡ）を、１００ｎＭの最終濃度および４０μＬの最終活性化体積で反応物に添加した。攪拌（１０００  ＲＰＭ）しながら室温で２０分間インキュベートした後、２５μＬのクエンチ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ８０００、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、ｐＨ  ７．３）の添加により、ＦＸ活性化反応を終了した。その後、１０μＬの２５μＭの個々のＦＸ結合剤を、生成されたＦＸａに添加して、２５μＬの２ｍＭ  Ｓ−２７６５発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，Ｓｗｅｄｅｎ）を添加し、マイクロプレートリーダーにおいて４０５ｎｍでの吸光度（ΔＡｂｓ４０５／分）の測定により、発色基質変換を決定した。相対的ＦＸａアミド分解活性（ａｒｅｌ）は、以下の式２を使用して計算され、
【数３】
2021502984.tif 000007
【０２１７】
結合剤は、ＦＸａ／ＦＸ結合剤複合体のアミド分解活性であり、ａＦＸａは、ＦＸａ単独のアミド分解活性である。
【０２１８】
表４は、個々のＦＸ結合剤についての相対的なＦＸａアミド分解活性を示し、増加したＦＸ活性化は、増加したＦＸａアミド分解活性を有するＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）によるものではないことが結論付けられた。
【表４】
2021502984.tif 000008
【０２１９】
実施例５：抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の結合エピトープ
抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）およびｍＡｂ  １３Ｆ６２抗体の結合エピトープがヒトＦＸの活性化ペプチド（ＡＰ）内に位置しているかどうかを判定するために、ＥＬＩＳＡアッセイをセットアップした。
【０２２０】
１つのアミノ酸間隔を有する活性化ペプチドの５２個の残基にわたる４１個のユニークな１２量体ペプチド断片を、マイクロタイタープレートウェル中に固定し、続いて、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）／抗体を用いたインキュベーションを行って試験し、二次ＨＲＰ標識抗体の添加により結合リガンドの検出を実施した。
【０２２１】
ペプチドをビオチンにＣ末端結合し、５０μＬの１μｇ／ｍＬペプチド溶液を使用して、１μｇ／ｍＬのストレプトアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレートの個別ウェル中に固定した。各ウェルを洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ８．６０）で洗浄し、続いて５０μＬの２μｇ／ｍＬのＦＬＡＧタグ付き抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）を添加して試験した。１時間後、非結合型Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）／抗体を、洗浄緩衝液を使用して洗浄した。
【０２２２】
結合抗ＦＸ活性化ペプチドリガンドを、まずＨＲＰ標識二次抗体（ＦＬＡＧタグ付けＮａｎｏｂｏｄｉｅｓについてはＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ｍＡｂ  Ｍ２−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳ）、抗体についてはＦｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳ）またはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳ））を１時間結合し、次いで１００μＬのＴＭＢ−１  ＥＬＩＳＡ基質（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を添加することにより検出した。
【０２２３】
次いで、各ＦＸ結合剤による一組のペプチド（表５）結合に含まれる共通配列を特定することにより、ベースラインを上回るシグナルを生じさせる一組のペプチドから最小エピトープを推定した。エピトープの第１の残基を、第１の連続的なＥＬＩＳＡ陽性ペプチドにおける最後のアミノ酸により定義し、一方で、エピトープの最後の残基を、最後の連続的なＥＬＩＳＡ陽性ペプチドの第１の残基として定義した。
【０２２４】
したがって、表５は、いくつかの異なる抗ＦＸ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）  （Ｎｂ）および抗ＦＸ  ｍＡｂ  １３Ｆ６２についてのＦＸ  ＡＰ全体にわたる連続ペプチドからのＥＬＩＳＡシグナルを示す。ＥＬＩＳＡシグナルは、バックグラウンドシグナル（ｂｂｇ）に対して正規化されている。灰色の領域は、最小エピトープを決定するために使用される陽性結合シグナルを示す。
【表５−１】
2021502984.tif 000009
【表５−２】
2021502984.tif 000010
【０２２５】
各ＦＸ結合剤について、最小エピトープをＥＬＩＳＡ陽性ペプチド間に共通なアミノ酸配列として定義した。決定されたＡＰ内の最小エピトープを表６に要約する。
【表６】
2021502984.tif 000011
【０２２６】
表５および６のデータを表３のデータと相関させることにより、ＦＸ上の最小エピトープが例えば「ＰＦＤＬＬＤＦ」であるＦＸ結合剤について、ＦＸ活性化を刺激する能力が観察されることが観察される。
【０２２７】
続いて、表６から、共通最小エピトープを「ＬＬ」として特定することができる。
【０２２８】
本明細書では、本発明の特定の特徴が例示および説明されているが、当業者には多数の修正、置換、変更、および同等物が思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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