(57)【要約】  本発明は、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを少なくとも１つ含むＨｅｒ２標的化４−１ＢＢアゴニスト、特に４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、並びにがんの治療におけるその使用及びＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体との併用に関する。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドは４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項２】
４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項３】
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドは、配列番号１、配列番号５、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、請求項１又は２に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項４】
Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進するノブ・イントゥ・ホール改変を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項５】
Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合を低減させる１又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項６】
Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、請求項１から５のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項７】
Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能なＦａｂ分子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項８】
Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
（ｃ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項９】
Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項１０】
Ｈｅｒ２に特異的に結合可能なＦａｂ分子を双方が含む第１の重鎖及び第１の軽鎖；
第２のペプチドリンカーによってＣ末端で第２の重鎖又は軽鎖に融合され、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された、４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片と定常ドメインとを含む、第２の重鎖；並びに
第３のペプチドリンカーによってそれぞれＣ末端で第２の軽鎖又は重鎖に融合された、前記４−１ＢＢＬの定常ドメインと１つのエクトドメイン又はその断片とを含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項１１】
第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドが、第２のペプチドリンカーによってそのＣ末端で重鎖の一部であるＣＬドメインに融合されており、且つ、
前記４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、第３のペプチドリンカーによってそのＣ末端で軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されている、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項１２】
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖；又は
配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖；又は
配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項１３】
（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖；又は
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖；又は
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離された核酸分子を含むベクター、特に発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸又は請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の発現に適した条件下で、請求項１６に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の生産方法。
【請求項１８】
宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によって生産される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項２０】
請求項１から１３又は１９のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
追加的治療剤を更に含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を更に含む、請求項２０又は２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
医薬としての使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又は請求項２０から２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
がんの治療における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又は請求項２０から２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が別の治療剤と併用される、請求項２５に記載の使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子、又は請求項２０から２３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子がＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と併用され、且つ、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と同時に、それに先立って、又はそれに続いて投与される、がんの治療における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子。
【請求項２８】
がんの治療のための医薬の製造のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用。
【請求項２９】
４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子がＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と併用される、がんの治療のための医薬の製造のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用。
【請求項３０】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
がんを有する個体の治療方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は請求項２０から２２のいずれか一項に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、方法。
【請求項３２】
がんを有する個体の治療方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は請求項２０から２２のいずれか一項に記載の薬学的組成物の有効量及びＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体の有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体が抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
がんを有する個体において細胞傷害性Ｔ細胞活性をアップレギュレーション又は延長する方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は請求項２０に記載の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを含むＨｅｒ２標的化４−１ＢＢアゴニスト、特に４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と、がんの治療におけるその使用に関する。本発明は更に、このような分子の生成方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞によって活性化されることにより発現する誘導性分子として最初に同定された（Kwon and Weissman, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86, 1963-1967）。その後の研究により、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、好中球、マスト細胞、樹状細胞（ＤＣ）、並びに内皮細胞及び平滑筋細胞といった非造血性起源の細胞を含む、多くの他の免疫細胞も４−１ＢＢを発現することが実証された（Vinay and Kwon, 2011, Cell Mol Immunol 8, 281-284）。様々な細胞型における４−１ＢＢの発現は、多くが誘導性であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガリングといった様々な刺激シグナル、及び共刺激分子又は炎症誘発性サイトカイン受容体を介して誘導されるシグナル伝達によって駆動される（Diehl et al., 2002, J Immunol168, 3755-3762; Zhang et al., 2010, Clin Cancer Res 13, 2758-2767）。
【０００３】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）は、１９９３年に同定された（Goodwin et al., 1993, Eur J Immunol 23, 2631-2641）。４−１ＢＢＬの発現はＢ細胞、ＤＣ及びマクロファージなどの専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に制限されていることが示された。４−１ＢＢＬの誘導性発現は、αβ及びγδ両方のＴ細胞サブセットを含むＴ細胞、並びに内皮細胞に特徴的である（Shao and Schwarz, 2011, J Leukoc Biol 89, 21-29）。
【０００４】
４−１ＢＢ受容体を介した共刺激（例えば４−１ＢＢＬのライゲーションによる）は、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットの両方）内の複数のシグナル伝達カスケードを活性化し、Ｔ細胞の活性化を強力に増強する（Bartkowiak and Curran, 2015）。ＴＣＲトリガリングとの組み合わせで、アゴニスト４−１ＢＢ特異性抗体は、Ｔ細胞の増殖を強化し、リンホカインの分泌を刺激し、活性化により誘導される細胞死に対するＴリンパ球の感受性を低下させる（Snell et al., 2011, Immunol Rev244, 197-217）。この機序は、がん免疫療法の最初の概念実証として更に発展した。前臨床モデルにおいて、４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体を担腫瘍マウスに投与したところ、強力な抗腫瘍効果が得られた（Melero et al., 1997, Nat Med 3, 682-685）。その後、エビデンスの蓄積により、４−１ＢＢは通常、他の免疫調節化合物、化学療法試薬、腫瘍特異的ワクチン接種又は放射線治療と併用投与されたときにのみ、抗腫瘍剤としてのその能力を呈することが示された（Bartkowiak and Curran, 2015, Front Oncol 5, 117）。
【０００５】
ＴＮＦＲスーパーファミリーのシグナル伝達は、受容体と結合するために三量体化リガンドの架橋を必要とし、野生型Ｆｃ結合を必要とする４−１ＢＢアゴニスト抗体も同様である（Li and Ravetch, 2011, Science333, 1030-1034Li and Ravetch, 2011）。しかしながら、機能的に活性のＦｃドメインを有する４−１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与は、肝臓毒性に関連するＣＤ８＋  Ｔ細胞の流入をもたらしたが（Dubrot et al., 2010, Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233）、これはマウスにおける機能的Ｆｃ受容体の非存在下では減少するか又は有意に改善される。臨床でＦｃコンピテント４−１ＢＢアゴニストＡｂ（ＢＭＳ−６６３５１３）（ＮＣＴ００６１２６６４）がグレード４の肝炎を引き起こし、治験の中止に至った（Simeone and Ascierto, 2012）。したがって、効果的で安全な４−１ＢＢアゴニストが必要とされている。
【０００６】
ヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２；ＥｒｂＢ２）は、受容体型チロシンキナーゼであり、膜貫通型受容体である上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである。Ｈｅｒ２は、様々なタイプの腫瘍で過剰発現しており、疾患の開始と進行に関与している。Ｈｅｒ２は、予後不良と関連している。例えば、Ｈｅｒ２の過剰発現は、ヒト乳がんの約３０％で観察され、これらの腫瘍に関連する侵襲性増殖と臨床転帰不良に関与している（Slamon et al (1987) Science 235:177-182）。
【０００７】
ヒト化抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体トラスツズマブ（ＣＡＳ  １８０２８８−６９−１、ハーセプチン（登録商標）、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  Ｈｅｒ２、ジェネンテック）は、ＨＥＲ−２の細胞外ドメインを標的とする（米国特許第５６７７１７１号；米国特許第５８２１３３７号；米国特許第６０５４２９７号；米国特許第６１６５４６４号；米国特許第６３３９１４２号；米国特許第６４０７２１３号；米国特許第６６３９０５５号；米国特許第６７１９９７１号；米国特許第６８００７３８号；米国特許第７０７４４０４号；Coussens et al (1985) Science 230:1 132-9; Slamon et al (1989) Science 244:707-12; Slamon et al (2001) New Engl. J . Med. 344 (783-792）。トラスツズマブは、ＨＥＲ−２を過剰発現し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のメディエーターであるヒト腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されている（Hudziak et al (1989) Mol Cell Biol 9:1 165-72; Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga et al (1998) Cancer Res. 58:2825-2831; Hotaling et al (1996) [abstract]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al (1997) [abstract]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60- 70; Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137）。
【０００８】
ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ、ジェネンテック社）は、１９９８年にＨＥＲ２過剰発現転移性乳がんの治療薬として承認された（Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14 (737-744）。２００６年、ＦＤＡは、ＨＥＲ２陽性、リンパ節転移陽性乳がん患者のアジュバント療法として、ドキソルビシン、シクロホスファミド及びパクリタキセルを含む治療レジメンの一部としてハーセプチン（登録商標）を承認した。
【０００９】
ペルツズマブ（組換えヒト化モノクローナル抗体２Ｃ４、ｒｈｕＭＡｂ  ２Ｃ４、パージェタ（登録商標）としても知られている；サウス・サンフランシスコのジェネンテック社）は、Ｈｅｒ２を標的とする別の抗体治療である。ペルツズマブは、Ｈｅｒ二量体化阻害剤（ＨＤＩ）であり、Ｈｅｒ２が他のＨｅｒ受容体（ＥＧＦＲ／Ｈｅｒｌ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４等）と活性ヘテロ二量体又はホモ二量体を形成する能力を阻害するように機能する。例えば、Ｈａｒａｒｉ  ａｎｄ  Ｙａｒｄｅｎ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：６１０２−１４（２０００）；Ｙａｒｄｅｎ  ａｎｄ  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２：１２７−３７（２００１）；Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １０：１５８−９（２００３）；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７５６−６０（２００３）；及びＭａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４４：１７６−７（２００３）；米国特許第７５６０１１１号を参照のこと。パージェタ（登録商標）は、進行性又は後期（転移性）のＨｅｒ２陽性乳がん患者の治療薬として、トラスツズマブ及びドセタキセルとの併用で２０１２年に初めて承認された。一方、トラスツズマブとペルツズマブを使用する併用療法も、Ｈｅｒ２陽性局所進行、炎症性又は初期乳がんのネオアジュバント（術前）療法として、また、再発リスクの高いＨｅｒ２陽性早期乳がん（ＥＢＣ）のアジュバント（術後）療法として承認されている。パージェタとハーセプチンの作用機序は、両者ともＨｅｒ２受容体に結合しているが、異なる場所に結合しているため、相互に補完し合うと考えられている。パージェタとハーセプチンの併用は、ＨＥＲのシグナル伝達経路をより包括的に二重に遮断することにより、腫瘍細胞の増殖と生存を防ぐことができると考えられている。
【００１０】
ヒトＥｒｂＢ２のドメインＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに対して向けられた二重特異性二価のＨｅｒ２抗体は、国際公開第２０１２／１４３５２３号に開示されている。抗体ｒｈｕＭａｂ  ２Ｃ４とｈｕ４Ｄ５の最適化された変異体を含む二重特異性ＨＥＲ−２抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔａｒｇと呼ばれる）は、国際公開第２０１５／０９１７３８号に記載されている。
【００１１】
乳癌におけるトラスツズマブの治療効果は十分に実証されているが、耐性のためにトラスツズマブの恩恵を受けていない患者が多く存在する。低レベルのＨｅｒ２を発現する特定のがんに対する有効な抗Ｈｅｒ２療法がないこと、現在の療法に対する耐性、及びＨｅｒ２関連のがんの有病率を考慮すると、このようながんを治療するためには新しい療法が必要である。
【００１２】
本発明の新規抗原結合分子は、抗Ｈｅｒ２抗原結合ドメインを、共刺激４−１ＢＢリガンド三量体を形成することができ、且つ、薬学的に有用であるのに十分に安定な部分と組み合わせる。ＣＤ１３７に対する結合特異性とＨｅｒ２／ｎｅｕに対する結合特異性から構成される融合タンパク質は、国際公開第２０１６／１７７８０２号に開示されている。これらの分子は、抗体−リポカリンムテイン融合ポリペプチドであり、ＣＤ１３７に対する結合特異性を有するリポカリンムテインが抗Ｈｅｒ２抗体に融合していることを意味する。リポカリンムテイン（アンチカリン）は非抗体足場であり、このようなモダリティを、特殊な薬物に変換することは困難であった（Vazquez-Lombardi et al. 2015, Drug Discovery Today 20, 1271-1283）。抗体と比較して、異なる血清半減期、組織浸透性及び免疫原性の観点から課題が生じる可能性がある。したがって、抗体技術又はヒト様タンパク質に基づく改善された特性を有する薬物候補が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の新規抗原結合分子は、抗Ｈｅｒ２抗原結合ドメインを、共刺激４−１ＢＢＬ三量体を形成することができ、且つ、薬学的に有用であるのに十分に安定な部分と組み合わせる。驚くべきことに、本発明の抗原結合分子は、三量体化４−１ＢＢＬエクトドメインの１つが該分子の他の２つの４−１ＢＢＬエクトドメインではなく別のポリペプチド上に位置しているにもかかわらず、三量体であり、故に生物学的に活性なヒト４−１ＢＢリガンドを提供する。抗Ｈｅｒ２抗原結合ドメインによって標的化された本発明の抗原結合分子は、腫瘍部位において増大した活性を有し、天然のヒト４−１ＢＢリガンドを含むため、従来の４−１ＢＢアゴニスト抗体又はより人工的な融合タンパク質と比較して、課せられるべき安全性の問題はより少ない。
【００１４】
一実施態様において、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドは４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
【００１５】
特定の態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドは、配列番号１、配列番号５、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
【００１７】
一態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的には、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。特定の態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進するノブ・イントゥ・ホール改変を含む。特定の態様において、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、前述の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関するものであり、ここで、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体への結合を低減させる１又は複数のアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４と２３５（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）及び／又は３２９（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
【００１９】
一態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は１つであり、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能なＦａｂ分子である。別の態様において、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能なクロスオーバーＦａｂ分子又はｓｃＦＶ分子である。
【００２０】
一態様では、本発明は、前述の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な１つのＦａｂドメインを含み、これは、Ｈｅｒ２に対する一価結合を含むことを意味する。
【００２１】
更なる態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
（ｃ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【００２２】
更なる態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む。
【００２３】
更なる態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
Ｈｅｒ２に特異的に結合可能なＦａｂ分子を双方が含む第１の重鎖及び第１の軽鎖；
第２のペプチドリンカーによってＣ末端で第２の重鎖又は軽鎖に融合され、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された、４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片と定常ドメインとを含む、第２の重鎖；並びに
第３のペプチドリンカーによってそれぞれＣ末端で第２の軽鎖又は重鎖に融合された、４−１ＢＢＬの定常ドメインと１つのエクトドメイン又はその断片とを含む第２の軽鎖
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。より詳細には、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含む第１のペプチドは、第２のペプチドリンカーによってそのＣ末端で重鎖の一部であるＣＬドメインに融合されており、且つ、前記４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドは、第３のペプチドリンカーによってそのＣ末端で軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合されている。
【００２４】
特定の態様では、本発明は、ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２、すなわち配列番号６８のペプチドである、上記のような４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関する。一態様では、ペプチドリンカーは、いかなる場合も（Ｇ４Ｓ）２である。
【００２５】
更に、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置き換えられ、且つ、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換された４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
【００２６】
別の態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖；又は
配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖；又は
配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
【００２７】
特定の態様において、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖；又は
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖；又は
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
【００２８】
本発明の別の態様によると、前述の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸分子が提供される。本発明は更に、ベクター、特に本発明の単離された核酸分子含む発現ベクター及び本発明の単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物の細胞である。
【００２９】
別の態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を単離する工程とを含む本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を生産するための方法が提供される。本発明は、本発明の方法によって生産される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子も包含する。
【００３０】
本発明は更に、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤とを含む薬学的組成物を提供する。別の態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤とを含み、更に追加の治療剤、例えばがんの免疫療法における使用のための化学療法剤及び／又は他の薬剤を含む薬学的組成物が提供される。更なる態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体を更に含む薬学的組成物が提供される。
【００３１】
また、本発明が包含するのは、医薬としての使用のための、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物である。一態様では、治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的薬組成物が提供される。特定の実施態様において、がんの治療における使用のための、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供される。別の態様において、細胞傷害性Ｔ細胞活性をアップレギュレーション又は延長することにおける使用のための、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供される。別の態様において、がんの治療における使用のための、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物が提供され、ここで、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、別の治療剤、特にＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と併用される。一態様において、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と同時に、その前に、またはその後に投与される。
【００３２】
更に、治療を必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造のための、特にがんの治療のための医薬の製造のための本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用、及び本明細書で開示されている４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を含む治療的有効量の組成物を薬学的に許容される形態で個体に投与することを含む、前記個体の疾患の治療方法が提供される。特定の態様において、疾患はがんである。更に提供されるのは、がんの治療のための医薬の製造のための、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用であって、ここで、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体と併用される。更に、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はその薬学的組成物の有効量と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異的抗体、特に抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体の有効量を対象に投与することを含む、がんを有する個体を治療するための方法が提供される。また、がんを有する個体において細胞傷害性Ｔ細胞活性をアップレギュレーション又は延長する方法であって、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む方法も提供される。上記のいずれの実施態様においても、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ−Ｂ】図１は、一価のＨｅｒ２標的化スプリット三量体４４−１ＢＢリガンドＦｃ融合抗原結合分子の組み立てのための構成要素を示す。図１Ａは、変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ（電荷変異体（charged variant））を有するヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインにＣ末端で融合された二量体４−１ＢＢリガンドを示し、図１Ｂは、変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ（電荷変異体）を有するヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインにＣ末端で融合された単量体４−１ＢＢリガンドを示す。
【図２Ａ】荷電残基を有するＣＨ−ＣＬクロスを含む一価のＨｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の構造を模式的に示した図である。太い黒い点は、ノブ・イントゥ・ホール改変を表している。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメインにおけるアミノ酸修飾を表す記号である（いわゆる荷電残基）。
【図２Ｂ】マウスサロゲート、すなわち、マウス４−１ＢＢに対する二価の結合とＨｅｒ２に対する一価の結合を有する（抗４−１ＢＢ／抗Ｈｅｒ２  ｍｏＩｇＧ１  ＤＤＫＫ  ＤＡＰＧ、ｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２と呼ばれる）二重特異性４−１ＢＢ抗体を示した図である。太い黒い点は、ＤＤ／ＫＫノブ・イントゥ・ホール改変を表している。ＤＡＰＧ変異は、マウスＦｃγ受容体を介して融合タンパク質の架橋又は補体の結合を無効にするが、ＦｃＲｎへの結合を可能にするため、分子はその抗体様の薬物動態を残す。
【図３Ａ】本発明のＨｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢリガンド含有抗原結合分子の同時結合のためのＳＰＲ実験のセットアップを示す。
【図３Ｂ】Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ（分析物１）の固定化されたヒト４−１ＢＢ及びヒトＨｅｒ２（分析物２）に対する同時結合を示す。
【図３Ｃ】Ｈｅｒ２（ａｆｆ  ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬのヒト４−１ＢＢ及びヒトＨｅｒ２への同時結合を示す。
【図４Ａ−Ｄ】ヒト乳がん細胞株ＳＫ−Ｂｒ３（図４Ａと４Ｃ）又はヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７（図４Ｂと４Ｄ）によって細胞表面に発現するＨｅｒ２への、Ｈｅｒ２標的化４−１ＢＢスプリット三量体リガンドＦｃ融合抗原結合分子の結合を示す。Ｈｅｒ２バインダーであるペルツズマブ（ＰＥＲ）若しくは親和性成熟ペルツズマブ（ａｆｆ−ＰＥＲ）若しくは融合タンパク質Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４（特許国際公開第２０１６／１７７８０２号に記載）を表示するＨｅｒ２標的化スプリット４−１ＢＢＬ抗原結合分子、又は以前に記載されたアゴニスト抗ヒト４−１ＢＢ抗体である抗ヒト４−１ＢＢクローン２０Ｈ４．９  ｈｕＩｇＧ４（米国特許第７６５９３８４号に記載）若しくは抗ヒト４−１ＢＢクローンＭＯＲ−７４８０  ｈｕＩｇＧ２（国際公開第２０１２／０３２４３３号に記載）、又は凡例に示されているコントロール分子が、Ｘ軸に示されているように異なる濃度のＨｅｒ２発現細胞株ＳＫ−Ｂｒ３（図４Ａと４Ｃ）又はＮＣＩ−Ｎ８７（図４Ｂと４Ｄ）と共にインキュベートされた。その後、過剰で結合していない分子は洗い流され、結合した分子は二次結合ＰＥコンジュゲート抗ヒトＦｃ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片で検出された。蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値は、フローサイトメトリーによって測定され、用量依存的に試験された分子の親和性（一価バインダー）又はアビディティー（二価バインダー）を示す。値は、ブランクコントロール（例：２番目の検出断片のみで染色）を差し引くことによってベースライン補正したものであり、示されているのは平均±ＳＥＭである。
【図５Ａ−Ｂ】ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ−４によって細胞表面に発現するＨｅｒ２への、Ｈｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢＬリガンドＦｃ融合抗原結合分子の結合を示す図である。Ｈｅｒ２バインダーであるＰＥＲ、ａｆｆ−ＰＥＲ若しくはトラスツズマブ（ＴＲＡＳ）、融合タンパク質Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４（国際公開第２０１６／１７７８０２号に記載）を含むＨｅｒ２標的化スプリット４−１ＢＢＬ抗原結合分子、又は以前に記載されたアゴニスト抗ヒト４−１ＢＢ抗体である２０Ｈ４．９  ｈｕＩｇＧ４若しくはＭＯＲ−７４８０  ｈｕＩｇＧ２、又は凡例に示されているコントロール分子が、Ｘ軸に示されているように異なる濃度のＨｅｒ２発現細胞株ＫＬ−４と共にインキュベートされた。その後、過剰で結合していない分子は洗い流され、結合した分子は二次結合ＰＥコンジュゲート抗ヒトＦｃ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片で検出された。蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値は、フローサイトメトリーによって測定され、用量依存的に試験された分子の親和性（一価バインダー）又はアビディティー（二価バインダー）を示す。値は、ブランクコントロール（例：２番目の検出断片のみで染色）を差し引くことによってベースライン補正したものであり、示されているのは平均±ＳＥＭである。
【図６】ヒト４−１ＢＢを発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞株を用いたＮＦκＢ活性化アッセイの一般的な原則を示すスキームである。レポーター細胞上に発現したヒト４−１ＢＢの架橋は、ＮＦκＢ活性化及びＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現を誘導する。細胞の溶解後、ルシフェラーゼは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化を触媒することができる。この化学反応は、ＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現の強さと正の相関があり、発光の強さ（放出された光の単位）によって測定することができる。
【図７Ａ−Ｆ】Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性を図７Ａから７Ｆに示す。９６ウェルプレートＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞を、凡例に示したように、異なる濃度（ｘ軸に示す）のＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ分子又はＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ分子又は融合タンパク質Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４又はアゴニスト抗ヒト４−１ＢＢ抗体２０Ｈ４．９  ｈｕＩｇＧ４若しくはＭＯＲ−７４８０  ｈｕＩｇＧ２又はコントロール分子とインキュベートした。Ｈｅｒ２＋細胞が存在しない場合の結果を図７Ａと７Ｄに、ヒトＨｅｒ２＋乳がん細胞株ＳＫ−Ｂｒ３が存在する場合の結果を図７Ｂと７Ｅに、又はＨｅｒ２＋ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７が存在する場合の結果を図７Ｃと７Ｆに示す。レポーター細胞を１：５の比率で６時間、Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞とインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、溶解し、検出バッファー中でルシフェリンと共にインキュベートした。ルシフェリンのルシフェラーゼ触媒酸化は、放出された光の単位として発光を介して検出された（ｙ軸）。示されているのは平均±ＳＥＭである。値は全て、ベースライン発光を差し引くことによってベースライン補正されている。
【図８Ａ−Ｈ】Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬとＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬを比較した第２の実験の結果を図８Ａから８Ｈに示す。３４８ウェルプレートＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞を、凡例に示したように、異なる濃度（ｘ軸に示す）のＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ分子又はＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ分子又は融合タンパク質Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４又はアゴニスト抗ヒト４−１ＢＢ抗体２０Ｈ４．９  ｈｕＩｇＧ４若しくはＭＯＲ−７４８０  ｈｕＩｇＧ２又はコントロール分子とインキュベートした。示されているのは、レポーター細胞株対腫瘍細胞株が１：５の比率で６時間投与された場合の、ヒトＨｅｒ２＋乳がん細胞株ＳＫ−Ｂｒ３の非存在下（図８Ａと８Ｅ）又はヒトＨｅｒ２＋乳がん細胞株ＳＫ−Ｂｒ３の存在下（図８Ｂと８Ｆ）、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ−４の存在下（図８Ｃと８Ｇ）又はＨｅｒ２＋ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７の存在下（図８Ｄと８Ｈ）でのＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株におけるＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現である。細胞を洗浄し、溶解し、検出バッファー中でルシフェリンと共にインキュベートした。ルシフェリンのルシフェラーゼ触媒酸化は、放出された光の単位として発光を介して検出された（ｙ軸）。示されているのは平均＋／−ＳＥＭである。値は全て、ベースライン発光を差し引くことによってベースライン補正されている。
【図９】実施例３．２．２に記載の、ヒトＰＢＭＣを使用した活性化アッセイの一般的な原理を示すスキームである。Ｔ細胞は、２ｎＭアゴニストＣＤ３抗体により活性化され、Ｈｅｒ２発現胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７細胞の存在下で、異なる濃度のアゴニスト４−１ＢＢ分子によって共刺激される。内容物／ウェルは、５０Ｇｙ照射２ｘ１０４  ＮＣＩ−Ｎ８７細胞、７．５ｘ１０４  ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣ、２ｎＭアゴニスト抗ヒトＣＤ３ヒトＩｇＧ  ｗｔ（クローンＶ９）、及び異なる濃度のＨｅｒ２標的化４−１ＢＢアゴニスト分子（ここではＨｅｒ２−４−１ＢＢＬとして示される）から構成された。細胞を４日間インキュベートし、その後Ｔ細胞活性化をフローサイトメトリーで決定した。
【図１０Ａ−Ｆ】その結果は、図１０Ａから１０ＦにＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化として示されている。健康なドナーのバフィーコートから単離した休止ＰＢＭＣを、２ｎＭアゴニストＣＤ３抗体で活性化し、Ｈｅｒ２発現胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７細胞の存在下で４日間、Ｘ軸及び凡例に示すように、異なる濃度のアゴニスト４−１ＢＢ分子で共刺激した。細胞を生きたＣＤ８＋  Ｔ細胞にゲーティングし、ＣＤ２５＋（図１０Ａと１０Ｄ）、グランザイムＢｈｉｇｈ（図１０Ｂと１０Ｅ）、又は増殖性（低ＣＦＳＥ  ＭＦＩ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１０Ｃと１０Ｆ）の頻度について分析した。示されているのは平均±ＳＤである。
【図１１Ａ−Ｆ】ＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化を図１１Ａから１１Ｆに示す。健康なドナーのバフィーコートから単離した休止ＰＢＭＣを、２ｎＭアゴニストＣＤ３抗体で活性化し、Ｈｅｒ２発現胃癌ＮＣＩ−Ｎ８７細胞の存在下で４日間、Ｘ軸に示すように、異なる濃度のアゴニスト４−１ＢＢ分子で共刺激した。細胞を生きたＣＤ４＋  Ｔ細胞にゲーティングし、ＣＤ２５＋（図１１Ａと１１Ｄ）、グランザイムＢｈｉｇｈ（図１１Ｂと１１Ｅ）、又は増殖性（低ＣＦＳＥ  ＭＦＩ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞（図１１Ｃと１１Ｆ）の頻度について分析した。示されているのは平均±ＳＤである。
【図１２】実施例３．２．３に記載したような、マウス脾細胞を用いた活性化アッセイの一般的な原理を説明するスキームである。Ｔ細胞は、０．５μｇ／ｍＬ（約３．６ｎＭ）のアゴニスト抗マウスＣＤ３アルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（クローン１４５２Ｃ１１）によって活性化され、Ｈｅｒ２発現ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ−４の存在下で、異なる濃度のアゴニストマウスサロゲートｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２と共刺激される。内容物／ウェルは、５０Ｇｙ照射２ｘ１０４  ＫＰＬ−４細胞、１５ｘ１０４バイオレット増殖色素標識マウス脾臓細胞、０．５μｇ／ｍＬ（約３．６ｎＭ）アゴニスト抗マウスＣＤ３アルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（クローン１４５２Ｃ１１）、及び異なる濃度のマウスサロゲートｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２又は非標的コントロールｍｕ４−１ＢＢ  ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧから構成された。細胞を３日間インキュベートし、その後Ｔ細胞活性化をフローサイトメトリーで決定した。
【図１３Ａ−Ｄ】その結果は、図１３Ａから１３ＤにマウスＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞の活性化として示されている。Ｃ５７ＢＬ／６脾臓から単離した休止マウス脾細胞を、０．５μｇ／ｍＬ（約３．６ｎＭ）のアゴニスト抗マウスＣＤ３アルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（クローン１４５２Ｃ１１）で活性化し、Ｈｅｒ２発現ヒト乳がんＫＰＬ−４細胞の存在下で、ｘ軸と凡例に示されるように、異なる濃度のマウスサロゲートｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２又は非標的コントロールで３日間共刺激した。細胞を生きたＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞にゲーティングし、ＣＤ２５＋発現の頻度（図１３Ａと１３Ｃ）又は増殖（低バイオレット増殖色素ＭＦＩ）（図１３Ｂと１３Ｄ）について分析した。示されているのは、一点ごとのテクニカルトリプケートの平均±ＳＤである。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａには、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（Ｈｅｒ２  ＴＤＢ）とＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬの併用のＴ細胞活性化と、各単剤のＴ細胞活性化が示されている。Ｈｅｒ２  ＴＤＢ単独によっても、両剤の併用によっても、強いＴ細胞活性化が誘導された。抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（Ｈｅｒ２  ＴＤＢ）とＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬの併用及び各単剤による標的細胞の死滅を図１４Ｂに示す。
【図１５Ａ−Ｂ】抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体（Ｈｅｒ２  ＴＤＢ）とＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬの併用のＴ細胞増殖アッセイの結果を図１５Ａと１５Ｂに示す。ＨＥＲ２−４−１ＢＢＬの添加により、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３−ＴＤＢ誘導Ｔ細胞の増殖／生存率がｉｎ  ｖｉｔｒｏで大幅に向上した。
【図１６Ａ−Ｄ】ヒトＨＥＲ２発現Ｆｏ５腫瘍同種移植片を移植し、ビヒクル（図１６Ａ）、Ｈｅｒ２  ＴＤＢ単独（図１４Ｂ）、ｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２マウスサロゲート単独（図１４Ｃ）、及びＨｅｒ２  ＴＤＢとｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２の併用（図１４Ｄ）で処置した免疫適格マウスで観察された腫瘍成長速度（線形目盛り）を示す。全ての処置群での各動物の個々の腫瘍成長速度が示される。ＣＲは試験終了時に検出可能な腫瘍がないことを意味し、ＰＲは０日目と比較して少なくとも５０％の腫瘍収縮が観察されることを意味する。ｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２アゴニストとの併用で処置された７頭のマウスのうち４頭は、試験終了時に検出可能な腫瘍を伴わない完全奏効を示した（ＣＲ＝５７％）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書の解釈上、以下の定義が適用され、適切な場合は常に、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、その逆も同様である。
【００３５】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００３６】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ、それに相補的な領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定部分にのみ結合する。抗原結合ドメインは、例えば、１又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００３７】
本明細書で使用される「Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメイン」又は「Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な部分」という用語は、Ｈｅｒ２に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。ある態様では、抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２を介したシグナル伝達を活性化又は阻害することができる。特定の態様において、抗原結合ドメインは、それが付着している実体（例：４−１ＢＢＬ三量体）を標的部位、例えばＨｅｒ２を有する特定のタイプの腫瘍細胞へ方向付けることができる。Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な部分には、本明細書で更に定義される抗体及びそれらの断片が含まれる。抗体又はその断片に関して、「標的細胞抗原に特異的に結合可能な部分」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ、それに相補的である領域を含む分子の部分を指す。特異的な抗原結合が可能な部分は、例えば１又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供されてもよい。特異的な抗原結合が可能な部分は、特に、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００３８】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、並びに、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している、あり得る変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００４０】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する１又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な２つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【００４１】
本願内で使用される用語「価」は、抗原結合分子における特定数の結合部位の存在を意味する。このように、用語「一価」、「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子中、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を意味する。
【００４２】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖と２つの重鎖とから構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて各重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプのうちの１つに割り当てられ、それらのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に更に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちのいずれかに割り当てることができる。
【００４３】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つ、増加したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば欧州特許第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ社，マサチューセッツ州ウォルサム；例えば米国特許第６２４８５１６号参照）である。抗体断片は、本明細書に記載の組換え宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）又はファージ）による産生の他、インタクトな抗体のタンパク質消化を含むがこれらに限定されない様々な技術で作製することができる。
【００４４】
インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更には軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。したがって、本明細書において使用される用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメインと定常ドメインとを含む軽鎖断片、並びに重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む、抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片が生成される。
【００４５】
用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」は、Ｆａｂ断片であって、重鎖と軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているものを指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖構成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方で、Ｆａｂ重鎖可変領域とＦａｂ軽鎖可変領域が交換されており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方で、Ｆａｂ重鎖定常領域とＦａｂ軽鎖定常領域が交換されている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖、及び軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００４６】
「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、これらの抗体ドメインと前述のリンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；前述のリンカーは、少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２から５０の間のアミノ酸からなるポリペプチドである。前述の一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成により、更に安定化する可能性もある。
【００４７】
「クロスオーバー一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、これらの抗体ドメインと前述のリンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し、ＶＨとＶＬは一緒に、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前述のリンカーは少なくとも３０のアミノ酸からなるポリペプチドである。加えて、これらｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成により、更に安定化する可能性もある。
【００４８】
「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０から約２５のアミノ酸からなる短いリンカーペプチドにより接続された、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに、溶解度のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することができ、又はその逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばＨｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特性、すなわちＶＬドメインと一緒に機能性的な抗原結合部位に集合することができる特性、又はＶＬドメインの特性、すなわちＶＨドメインと一緒に機能的な抗原結合部位に集合することができる特性を有し、それにより完全長抗体の抗原結合特性を提供する一本鎖ポリペプチドを含む。
【００４９】
「足場抗原結合タンパク質」は当技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されている。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３：２４５−２５５（２００９）ａｎｄ  Ｓｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：６９５−７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様において、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、プロテインＡに由来する分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、Ａドメイン（Ａｖｉｍｅｒ／Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランス体）；設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）；新規抗原受容体ベータ−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマ−クリスタリン又はユビキチン（Ａｆｆｉｌｉｎ分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクーニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えばノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）からなる群より選択される。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋  Ｔ細胞に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を持つように設計されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディとしても知られている（例：米国特許第７１６６６９７号）。エビボディは、抗体の単離された可変領域（例：ドメイン抗体）とほほ同じ大きさである。更なる詳細は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２），３１−４５（２００１）を参照のこと。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の疎水性の小分子を運搬する細胞外タンパク質のファミリーである。これは、様々な標的抗原に結合するように設計することができる、円錐構造の開放端に複数のループを備えた強固なベータシート二次構造を有する。アンチカリンは、大きさが１６０〜１８０アミノ酸であり、リポカリンに由来する。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８２：３３７−３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。アフィボディは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡ由来の足場であり、抗原に結合するように設計することができる。こ���ドメインは、約５８アミノ酸で構成される３ヘリックスバンドルからなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって生成されている。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５−４６２及び欧州特許出願第１６４１８１８号を参照のこと。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、明確なジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、Ａドメインのファミリーが表す天然変異のシャッフルによって生じる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１２），１５５６−１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １６（６），９０９−９１７（Ｊｕｎｅ  ２００７）を参照されたい。トランスフェリンは、単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、ペプチド配列を寛容な表面ループに挿入することにより、様々な標的抗原に結合するように設計することができる。設計されたトランスフェリン足場の例には、トランスボディが含まれる。更なる詳細は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４，２４０６６−２４０７３（１９９９）を参照のこと。設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格に対する内在性膜タンパク質の付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリン反復は、２つのアルファヘリックスと１つのベータターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、各反復の第１のアルファヘリックスとベータターンの残基をランダム化することにより、様々な標的抗原に結合するように設計することができる。それらの結合面は、モジュールの数を増加せることにより増大させることができる（親和性成熟の方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９−５０３（２００３），ＰＮＡＳ  １００（４），１７００−１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９，１０１５−１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと。単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。最初の単一ドメインは、ラクダ科の抗体重鎖の可変ドメインに由来するものであった（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。更に、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように設計可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の主鎖からなる。ベータサンドイッチの一端にある３つのループを設計して、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識できるようにすることができる。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５−４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された制限された可変ペプチド���ープを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細については、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，７８３−７９７（２００５）を参照されたい。ミクロボディは、３〜４個のシステインブリッジを含有する、長さ２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質に由来する。微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その全体的フォールドに影響を与えることなく、最大２５個のアミノ酸を含むように設計可能なループを有する。設計されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
【００５０】
リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の疎水性の小分子を運搬する細胞外タンパク質のファミリーである。これは、様々な標的抗原に結合するように設計することのできる、円錐構造の開放端に複数のループを備えた強固なベータシート二次構造を有する。アンチカリンは、大きさが１６０〜１８０アミノ酸であり、リポカリンに由来する。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８２：  ３３７−３５０（２０００）、Ｂｉｏｄｒｕｇｓ  １９（５），２７９−２８８（２００５）、米国特許第７２５０２９７号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。
【００５１】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいてその抗原に対する参照分子の結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は競合アッセイにおいてその抗原に対する抗原結合分子の結合を５０％以上ブロックする。
【００５２】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続したストレッチ又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染細胞の表面上に、その他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中に遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然タンパク質を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は、「完全長」、未処理のタンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の型のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体を包含する。
【００５３】
「Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な」という用語は、Ｈｅｒ２を標的とする上で診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように十分な親和性でＨｅｒ２に結合可能な抗原結合分子を指す。抗原結合分子には、抗体、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、一本鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、並びにＶＨ及び足場抗原結合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。一態様において、抗Ｈｅｒ２抗原結合分子の、無関係な、非Ｈｅｒ２タンパク質への結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して、抗原結合分子のＨｅｒ２への結合の約１０％未満である。特に、Ｈｅｒ２に結合可能な抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。特定の態様では、抗Ｈｅｒ２抗原結合分子は、様々な種由来のＨｅｒ２に結合する。特に、抗Ｈｅｒ２抗原結合分子は、ヒト及びカニクイザルのＨｅｒ２に結合する。
【００５４】
用語「エピトープ」とは、抗［［ＰＲＯ］］抗体が結合する抗原上のタンパク性又は非タンパク性の部位をいう。エピトープは、連続したアミノ酸ストレッチから形成されることも（直鎖状エピトープ）、又は、例えば抗原のフォールドにより、すなわちタンパク性抗原の３次フォールドにより空間的に近接する非連続的なアミノ酸を含むこと（立体構造エピトープ）も可能である。直鎖状エピトープは通常、タンパク性抗原を変性剤にさらした後も抗体によって結合されているが、一方、立体構造エピトープは通常、変性剤で処理すると破壊される。エピトープは、独特の空間的立体構造の中に少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は少なくとも８〜１０のアミノ酸を含む。
【００５５】
「エピトープ４Ｄ５」又は「４Ｄ５エピトープ又は「４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４６３）及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近く、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内にある。４Ｄ５エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているような常套的なクロスブロッキングアッセイを実行することができる。或いは、エピトープマッピングを実施して、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、ＨＥＲ２（配列番号５４）のおよそ残基５５０からおよそ残基６１０までの領域の任意の１又は複数の残基）に結合するかどうかを評価することができる。
【００５６】
「エピトープ２Ｃ４」又は「２Ｃ４エピトープ」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメイン内の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているような常套的なクロスブロッキングアッセイを実行することができる。代替的に、エピトープマッピングを実施して、抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評価することができる。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩＩの残基を含む。２Ｃ４抗体及びペルツズマブは、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの接合部でＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：３１７−３２８（２００４））。
【００５７】
「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であることを意味し、不要な又は非特異的な相互作用とは区別され得る。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００５８】
「親和性」又は「結合親和性」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表され、この解離定数（Ｋｄ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含め、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００５９】
本明細書で使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばＴ細胞又はＢ細胞、がん細胞などの腫瘍内の細胞又は腫瘍間質の細胞の表面に提示される抗原性決定因子を指す。特定の態様では、標的細胞抗原は、がん細胞の表面上の抗原である。ある態様では、標的細胞抗原は、Ｈｅｒ２である。
【００６０】
「ＥｒｂＢ２」、「ＥｒｂＢ２受容体」又は「ｃ−Ｅｒｂ−Ｂ２」としても知られる、本明細書で使用される用語「Ｈｅｒ２」は、細胞中のＨｅｒ２前駆体タンパク質のプロセシングから生じる任意の天然の成熟ＨＥＲ２を指す。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト及びカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来のＨＥＲ２を指す。この用語は、天然に存在するＨＥＲ２の変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も含む。例示的なヒトＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５４に示されている。
【００６１】
本明細書において使用される「Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に提示される抗原決定基を指す。
【００６２】
本明細書において使用される「Ｔ細胞活性化治療剤」は、対象におけるＴ細胞活性化を誘導することのできる治療剤、特に対象におけるＴ細胞活性化を誘導するために設計された治療剤を指す。Ｔ細胞活性化治療剤の例には、ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原及びＣＥＡ又は葉酸受容体などの標的細胞抗原に特異的に結合する二重特異性抗体が含まれる。
【００６３】
本明細書において使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球によって発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘導又は増強することができる。具体的には、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードのトリガーとなることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。例示的な活性化Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３である。
【００６４】
特に断らない限り、用語「ＣＤ３」は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＣＤ３を指す。この用語は、「完全長」の、未処理のＣＤ３だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、天然に存在するＣＤ３の変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様において、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のエプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）のアクセッション番号Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号８５も参照のこと。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｎｏ．ＢＡドメインＢ７１８４９．１に示されている。配列番号８６も参照のこと。
【００６５】
用語「可変ドメイン」又は「可変領域」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は、類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，９１頁（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【００６６】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、且つ、抗原結合特異性を決定する抗原結合可変ドメインの各領域、例えば「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）を指す。抗体は通常、ＶＨに３つ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）及びＶＬに３つ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）、計６つのＣＤＲを有する。本明細書における例示的なＣＤＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；及び
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）及び９３−１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（antigen contact）（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））である。
【００６７】
別途指示がない限り、ＣＤＲは、上掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．に従って決定される。当業者であれば、ＣＤＲの名称はまた、上掲のＣｈｏｔｈｉａ、上掲のＭｃＣａｌｌｕｍ又は他の科学的に認められた命名法に従って決定することができることを理解するであろう。Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを、配列自体を超える実験データに頼ることなく、どのような可変領域配列にも明確に割り当てることができる。「Ｋａｂａｔ番号付け」は、本明細書で使用される場合、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって定められた番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００６８】
本明細書において抗原結合分子（例えば抗体）の文脈で使用される用語「親和性成熟」は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して、参照抗原結合分子より高い親和性を有す抗原結合分子を指す。親和性成熟は通常、抗原結合分子の１又は複数のＣＤＲにおいて１又は複数のアミノ酸残基の修飾を伴う。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【００６９】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ配列とＦＲ配列は一般に、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４の順序でＶＨ（又はＶＬ）に現れる。
【００７０】
本明細書において、「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００７１】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００７２】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００７３】
「ヒト起源に由来する定常領域」又は「ヒト定常領域」という用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体の定常重鎖領域及び／又は定常軽鎖カッパ若しくはラムダ領域を示す。このような定常領域は当技術分野でよく知られており、例えばＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）で記載されている（例えばJohnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788も参照のこと)。特に断らない限り、定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２に記載されるように、ＫａｂａｔのＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００７４】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の型は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性が生じるように定常領域が追加的に改変されたか又は元の抗体のものから変更されたものである。
【００７５】
「ヒト」抗体は、ヒト若しくはヒト細胞により生成された抗体の、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、或いは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００７６】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、宿主細胞によって生成された抗体は、重鎖のＣ末端から１又は複数、特に１又は２のアミノ酸の翻訳後切断を受けることがある。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現により宿主細胞によって生成された抗体は、完全長重鎖を含んでも、完全長重鎖の切断された変異体を含んでもよい。これは、重鎖の最終的２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在することもしないこともあり得る。Ｆｃ領域を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に断らない限り、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチドなしで本明細書に示される。一実施態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。一実施態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域を含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は通常、およそ２３１位のアミノ酸残基からおよそ３４０位のアミノ酸残基まで延びる。一実施態様では、ＣＨ２ドメインに糖鎖が結合している。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメインでも変異型ＣＨ２ドメインでもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの残基のストレッチ（すなわちＩｇＧのおよそ３４１位のアミノ酸残基からおよそ４４７位のアミノ酸残基まで）を含む。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメインでも変異型ＣＨ３ドメイン（例えばその一方の鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）と、その他方の鎖に導入された対応する「空洞」（「ホール」）とを有するＣＨ３ドメイン；米国特許第５８２１３３３号（出典明示により本明細書において明示的に援用される）参照）でもよい。このような変異型ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載されるように、２つの非同一の抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用することができる。
【００７７】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８，７−１５（２００１）に記載されている。通常、この方法は、隆起（「ノブ」）が対応する空洞（「ホール」）内に配置されて、ヘテロ二量体形成を促進し、且つ、ホモ二量体形成を妨げることができるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起を、空洞を第２のポリペプチドの接触面に導入することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発又はペプチド合成によって変化させることにより作られる。特定の実施態様では、ノブ改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる特定の実施態様では、ノブ改変を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、ホール改変を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、したがって二量体を更に安定させる（Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001)）。番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に従う。
【００７８】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」には、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体と、置換、付加又は欠失を生じるが免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害）を媒介する能力を実質的に低下させない変更を有する変異体とが含まれることが意図される。例えば、１又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損なうことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。このような変異体は、活性に対する影響が最小となるように、当技術分野で知られている一般的な規則に従って選択することができる（例えばBowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)参照）。
【００７９】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因しうる生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００８０】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域の結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。活性化Ｆｃ受容体は特に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【００８１】
「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「ＴＮＦファミリーリガンド」という用語は、炎症誘発性サイトカインを指す。サイトカイン一般、特にＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、免疫系の刺激及び調整において重要な役割を果たしている。現在、１９種類のサイトカインが、配列、機能、構造の類似性に基づいて、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）リガンドスーパーファミリーのメンバーとして同定されている。これらのリガンドは全て、Ｃ末端の細胞外ドメイン（エクトドメイン）、Ｎ末端の細胞内ドメイン、及び単一の膜貫通ドメインを有する膜貫通タンパク質タイプＩＩＩである。ＴＮＦホモロジードメイン（ＴＨＤ）として知られるＣ末端細胞外ドメインは、スーパーファミリーメンバー間で２０〜３０％のアミノ酸同一性を有し、受容体への結に関与している。また、ＴＮＦエクトドメインは、ＴＮＦリガンドがそれらの特定の受容体によって認識される三量体複合体を形成するのにも関与している。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、リンパトキシンα（ＬＴＡ又はＴＮＦＳＦ１としても知られている）、ＴＮＦ（ＴＮＦＳＦ２としても知られている）、ＬＴβ（ＴＮＦＳＦ３としても知られている）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４としても知られている）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４又はＴＮＦＳＦ５としても知られている）、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１７８又はＴＮＦＳＦ６としても知られている）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０又はＴＮＦＳＦ７としても知られている）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３又はＴＮＦＳＦ８としても知られている）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９としても知られている）、ＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ２Ｌ、ＣＤ２５３又はＴＮＦＳＦ１０としても知られている）、ＲＡＮＫＬ（ＣＤ２５４又はＴＮＦＳＦ１１としても知られている）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２としても知られている）、ＡＰＲＩＬ（ＣＤ２５６又はＴＮＦＳＦ１３としても知られている）、ＢＡＦＦ（ＣＤ２５７又はＴＮＦＳＦ１３Ｂとしても知られている）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８又はＴＮＦＳＦ１４としても知られている）、ＴＬ１Ａ（ＶＥＧＩ又はＴＮＦＳＦ１５としても知られている）、ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８としても知られている）、ＥＤＡ−Ａ１（エクトジスプラシンＡ１としても知られている）及びＥＤＡ−Ａ２（エクトジスプラシンＡ２としても知られている）からなる群より選択される。特に断らない限り、この用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然型ＴＮＦファミリーリガンドを指す。「共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリーリガンド」という用語は、Ｔ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができる、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのサブグループを指す。これらのＴＮＦファミリーリガンドは、対応するＴＮＦ受容体と相互作用すると、ＴＣＲシグナルを同時刺激することができ、その受容体との相互作用はＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員をもたらし、それによりシグナル伝達カスケードが開始されてＴ細胞活性化を招く。共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、Ｇ��ＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ及びＬＩＧＨＴからなる群より選択され、特に、共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４−１ＢＢＬである。
【００８２】
前述の通り、４−１ＢＢＬは、膜貫通タンパク質タイプＩＩであり、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーの１つである。配列番号６９のアミノ酸配列を有する完全又は完全長４−１ＢＢＬは、細胞の表面上に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４−１ＢＢＬのエクトドメインの特定のモチーフにより可能になる。上記モチーフは、本明細書では、「三量体化領域」と称される。ヒト４−１ＢＢＬ配列（配列番号７０）のアミノ酸５０〜２５４は、４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するが、その断片までもが三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２〜２５４）、配列番号１（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１〜２５４）、配列番号３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０〜２５４）、及び配列番号２（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５〜２５４）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチド、又は配列番号５（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１〜２４８）、配列番号８（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２〜２４８）、配列番号７（ヒト４−１ＢＢＬアミノ酸８０〜２４８）及び配列番号６（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５〜２４８）から選択されるアミノ酸を有するポリペプチドを指すが、本明細書には三量体化することが可能なエクトドメインの他の断片も含まれる。
【００８３】
「エクトドメイン」は、細胞外空間（すなわち標的細胞外の空間）に及ぶ膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは通常、表面との接触を開始するタンパク質の部分であり、シグナル伝達をもたらす。したがって、本明細書に記載のＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、細胞外空間（細胞外ドメイン）に及ぶＴＮＦリガンドタンパク質の一部を指すが、三量体化及び対応するＴＮＦ受容体への結合に関与する、そのより短い部分又はその断片も含む。したがって、用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞外ドメイン又はやはり受容体に結合可能なその部分（受容体結合ドメイン）を指す。
【００８４】
用語「ペプチドリンカー」は、１又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当技術分野において既知であるか、又は本明細書に記載されている。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は通常１から１０の間、典型的には１から４の間の数字、特に２であり、すなわちＧＧＧＧＳ（配列番号７１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７２）、（Ｇ４Ｓ）３又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ又はＧ４（ＳＧ４）２（配列番号７４）、及び（Ｇ４Ｓ）４又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７５）からなる群より選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号７６）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７７）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号７８）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（７９）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号８０）、ＧＧＳＧ（配列番号８１）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号８２）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号８３）、及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号８４）も含む。特に目的とするペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）１又はＧＧＧＧＳ（配列番号７１）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）、及び（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）である。
【００８５】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【００８６】
本明細書で使用される「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、抗体断片と抗体に由来しないペプチドとから構成される一本鎖ポリペプチドを指す。一態様では、融合ポリペプチドは、抗原結合ドメインの一部又はＦｃ部分に融合された４−１ＢＢＬの１つ又は２つのエクトドメイン又はその断片から構成される。融合は、ペプチドリンカーを介して抗原結合部分のＮ又はＣ末端アミノ酸を、上記４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片のＣ又はＮ末端アミノ酸に直接連結することによって起こり得る。
【００８７】
「融合された」又は「接続された」とは、構成要素（例えば、上記ＴＮＦのリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及びエクトドメイン）が、直接又は１若しくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されていることを意味する。
【００８８】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、これらの配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない場合の、該参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書において、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、ユーザー文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、ここで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から一般に利用可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされていなければならない。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの（又はこれに対する）アミノ酸配列同一性％（或いは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと（又はこれに対して）特定のアミノ酸配列同一性％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａ、ということもできる）は次のように計算される：
分数Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアライメントにおいて完全一致（identical match）としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性％とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載のようにして得られる。
【００８９】
特定の実施態様では、本明細書に提供される、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、該分子をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような改変には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又はそれへの挿入及び／又はそれの置換が含まれる。最終が所望の特性、例えば抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達するまでなされ得る。置換突然変異誘発の対象となる部位には、ＨＶＲとフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換が、表Ｂの「好ましい置換」という項目でが示されており、その下に更に、アミノ酸側鎖分類（１）から（６）に基づいて記載されている。アミノ酸置換を目的の分子に導入することができ、生成物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
【００９０】
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アミノ酸は以下の共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ
【００９１】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの要素を別のクラスの要素と交換することを必然的に伴うものである。
【００９２】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子の１又は複数の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的変異体を含む（例えばヒト化又はヒト抗体）。一般に、更なる研究のために選択された結果として得られる変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば改善）（例えば親和性の向上、免疫原性の低下）を有し、且つ／又は、親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているものである。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔に言えば、１又は複数のＣＤＲ残基が変異し、変異型抗原結合分子は、ファージ上に表示され、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、これらの変更が抗原に対する抗原結合分子の抗原との結合能を実質的に低下させない限り、１又は複数のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＣＤＲ内で行うことができる。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、複数の標的残基のうちの１つ残基又は群（例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ等の荷電残基）を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）で置き換えて、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判定する。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。別法として又はそれに加えて、抗体と抗原との接触点を特定するための抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうか判定することができる。
【００９３】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００又はそれ以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が含まれる。該分子のその他の挿入変異体には、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の血清半減期を延ばす、ポリペプチドに対するＮ末端又はＣ末端への融合体が含まれる。
【００９４】
特定の実施態様では、本明細書に提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように変化させることができる。該分子のグリコシル化変異体は、簡便には、１又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を変化させることにより得ることができる。４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物を変化させることができる。哺乳動物細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって通常結合される分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えばＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸の他、二分岐オリゴ糖構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有する変異体を作製するために、４−１ＢＢＬリガンド三量体含有抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾を行うことができる。一態様において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合するフコースを欠く糖鎖構造を有する４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.)又は同第２００４／００９３６２１号（協和発酵株式会社）を参照のこと。本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の更なる変異体は、二分されたオリゴ糖を含むもの、例えば、Ｆｃ領域に結合する二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されているものを含む。このような変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能有し得る。例えば国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet et al.）；米国特許第６６０２６８４号（Umana et al.）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana et al.）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１のガラクトース残基を持つ変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有することがあり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patel et al.）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４号（Raju, S.）に記載されている。
【００９５】
特定の実施態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のシステイン操作変異体、例えば、該分子の１又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作製することが望ましい。特定の実施態様において、置換される残基が到達可能な該分子の部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、到達可能な抗体の部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分にコンジュゲートさせて、免疫コンジュゲートを作るために使用され得る。ある実施態様において、次の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のいずれか１つ又はそれ以上がシステインと置換され得る。システイン操作抗原結合分子は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成され得る。
【００９６】
特定の態様では、本明細書に提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにこれらの混合物が含まれる（ただし、これらに限定されない）。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性による製造上の利点を有し得る。該ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、複数のポリマーが結合する場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は型は、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、その二重特異性抗体誘導体が規定の条件下で治療に使用されるかどうかを含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて決定され得る。別の態様では、放射線への曝露によって選択的に加熱さ得る非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅する温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含むがこれに限定されない。
【００９７】
別の態様では、本明細書で提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートが得られる。「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、１又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【００９８】
用語「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」には、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質が含まれる。各ヌクレオチドは、塩基、具体的にはプリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基から構成される。しばしば、核酸分子は塩基の配列によって記述されることにより、これらの塩基は核酸分子の一次構造（直鎖状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には５’から３’まで表される。ここで、核酸分子という用語は、例えば相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、並びにこれらの２以上の分子を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、直鎖状であっても円形であってもよい。更に、核酸分子という用語には、センス鎖及びアンチセンス鎖の双方、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態が含まれる。更に、本明細書に記載の核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は非天然に存在するヌクレオチドを含み得る。非天然に存在するヌクレオチドの例には、誘導体化された糖若しくはリン酸骨格連結を有する修飾ヌクレオチド塩基、又は化学的に修飾された残基が含まれる。核酸分子はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば宿主又は患者において本発明の抗体を直接発現させるためのベクターとして好適なＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を包含する。このようなＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ベクターは、改変されていなくても、改変されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡを化学的に修飾して、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高め、ｍＲＮＡを対象に注入してｉｎ  ｖｉｖｏで抗体を生成することができるようにすることが可能である（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｒｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１７、２０１７年６月１２日オンライン公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又は欧州特許第２１０１８２３号参照）。
【００９９】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、その天然環境から除去された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡが意図される。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖及びマイナス鎖型、並びに二本鎖型が含まれる。更に、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸には、合成により生成されたこのような分子が含まれる。また、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーター等の調節エレメントであっても、それを含んでいてもよい。
【０１００】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されてもよく、或いは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続した群として散在してもよい。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。
【０１０１】
用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片中に取り込むことができる。発現ベクターの組換え発現カセット部分には、数ある配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが典型的に含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１０２】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に会合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造物としてのベクター、及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１０３】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換（された）細胞」を含み、それには初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突異を含んでいてもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞といった、哺乳動物の培養細胞；酵母細胞；昆虫細胞；及び植物細胞を含み、更には、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞を含む。
【０１０４】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１０５】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【０１０６】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１０７】
用語「薬学的組成物」とは、中に含まれる活性成分の生物活性が有効になるような形態の調製物であり、且つ、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
【０１０８】
「薬学的に許容される添加剤」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される添加剤には、限定されないが、バッファー、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１０９】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１１０】
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１１１】
本明細書で使用される用語「がん」は、増殖性疾患、例えばリンパ腫、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん、乳がん、三種陰性乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫、黒色腫、多発性骨髄腫、Ｂ細胞がん（リンパ腫）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、毛細血管性白血病、慢性骨髄芽球性白血病（任意の上記がんの難治性型、又は１つ以上の上記がんの組み合わせを含む）を指す。
【０１１２】
「Ｈｅｒ２陽性」がんは、Ｈｅｒ２のレベルが通常よりも高いがん細胞を含む。Ｈｅｒ２陽性がんの例には、Ｈｅｒ２陽性乳がん及びＨｅｒ２陽性胃がんが含まれる。任意選択的に、Ｈｅｒ２陽性がんは、２＋又は３＋の免疫組織化学（ＩＨＣ）スコア及び／又は≧２．０のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）増幅比を有する。
【０１１３】
用語「初期乳がん（ＥＢＣ）」又は「早期乳がん」は、乳房又は腋窩リンパ節を越えては広がっていない乳がんを指すために本明細書で使用される。これには、非浸潤性乳管癌とステージＩ、ステージＩＩＡ、ステージＩＩＢ及びステージＩＩＩＡの乳がんが含まれる。
【０１１４】
腫瘍又はがんを、「ステージ０」、「ステージＩ」、「ステージＩＩ」、「ステージＩＩＩ」又は「ステージＩＶ」及びこの分類内の様々なサブステージと呼ぶことは、当技術分野で知られている総合ステージ分類又はローマ数字ステージ分類法を用いた腫瘍又はがんの分類を示している。がんの実際のステージはがんの種類によるものの、一般的に、ステージ０のがんはｉｎ  ｓｉｔｕ病変であり、ステージＩのがんは小さな局所腫瘍であり、ステージＩＩ及びＩＩＩのがんは、局所リンパ節の転移を示す局所進行腫瘍であり、また、ステージＩＶのがんは転移性がんを表す。腫瘍の種類ごとの具体的なステージは、熟練した臨床医に知られている。
【０１１５】
「転移性乳がん」という用語は、がん細胞が元の部位から血管又はリンパ管によって体内の他の場所の１つ以上の部位に伝播し、乳房以外の１又は複数の臓器に１又は複数の続発性腫瘍を形成する乳がんの状態を意味する。
【０１１６】
「進行」がんとは、局所浸潤又は転移のいずれかによって、発生部位又は臓器の外に広がったがんである。したがって、「進行」がんという用語には、局所進行性疾患及び転移性疾患の双方が含まれる。
【０１１７】
「再発」がんとは、手術などの初期治療への反応後に、初期部位又は遠隔部位のいずれかで再成長したがんのことである。「局所再発」がんとは、以前に治療したがんと同じ場所で治療後に再発するがんである。「手術可能」又は「切除可能」ながんとは、原発臓器に限局しており、手術（切除）に適したがんである。「切除不可能」又は「切除不能」ながんは、手術で除去（切除）することができないがんである。
【０１１８】
本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子
本発明は、生産可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、低い毒性、及び低い免疫性（ｉｍｍｕｎｉｃｉｔｙ）等の特に有利な特性を有する新規な４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１１９】
第１の態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドは４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１２０】
更なる態様では、前述のような４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合ドメインが
（ｉ）第１のポリペプチドはＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドはＣＬ又はＣＨ１ドメインをそれぞれ有し、ここで第２のポリペプチドはＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されており、ここで第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前述のポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続された、前述の４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドはＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドはＣＨ３ドメインをそれぞれ有し、ここで第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前述のポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続された、前述の４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むこと、或いは
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドはＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドはＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインをそれぞれ有し、ここで第２のポリペプチドは、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されており、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＶＨ又はＶＬに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前述のポリペプチドのＶＬ又はＶＨにペプチドリンカーを介して接続された、前述のＴＮＦ  リガンドファミリーメンバーの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと
を特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０１２１】
別の態様では、前述のような４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合ドメインが
（ｉ）第１のポリペプチドはＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドはＣＬ又はＣＨ１ドメインをそれぞれ有し、ここで第２のポリペプチドは、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されており、ここで第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前述のポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続された、前述の４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、或いは
（ｉｉ）第１のポリペプチドはＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドはＣＨ３ドメインをそれぞれ有し、ここで第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含み、第２のポリペプチドは、前述のポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端にペプチドリンカーを介して接続された、前述の４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むこと
を特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０１２２】
一態様では、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。更に具体的には、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号１又は配列番号５のアミノ酸配列を含む。最も具体的には、４−１ＢＢＬのエクトドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。特に、前述の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって４−１ＢＢＬの３つ全てのエクトドメイン又はそれらの断片が同一である抗原結合分子が提供される。
【０１２３】
更なる態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、並びに第２のポリペプチドは、配列番号１、配列番号５、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む。
【０１２４】
一態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む。
【０１２５】
更なる態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む。
【０１２６】
別の態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＣＨ１又はＣＬドメインを含む第１のポリペプチドと、ＣＬ又はＣＨ１ドメインを含む第２のポリペプチドであって、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されている第２のポリぺプチドと
を含み、
ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むことと、第２のポリペプチドは、前述のポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続された４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むこととを特徴とする。
【０１２７】
一態様において、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ＣＨ１ドメインを有する第１のポリペプチドと、ＣＬドメインを有する第２のポリペプチドであって、ＣＨ１及びＣＬドメイン間のジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されている第２のポリぺプチドと
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、
ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＨ１ドメインに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むことと、第２のポリペプチドは、前述のポリペプチドのＣＬドメインにペプチドリンカーを介して接続された４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片のみを含むこととを特徴とする。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な１つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドは４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１２９】
更に別の態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な複数の抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドは４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１３０】
一態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な２つの抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドは４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１３１】
更なる態様において、本発明は、前述のような４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される、抗原結合分子を提供する。
【０１３２】
一態様において、前述のような４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインが抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、一本鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、又はＶＨ及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される、抗原結合分子が提供される。一態様において、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、ＶＨ又は足場抗原結合タンパク質である。
【０１３３】
特定の態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインがＨｅｒ２に特異的に結合可能なＦａｂ分子又はクロスオーバーＦａｂ分子である、抗原結合分子が提供される。特に、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能なＦａｂである。
【０１３４】
更なる態様では、本発明による４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドが、そのＣ末端で、第２のペプチドリンカーによって重鎖のＣＨ１ドメインに融合されており、且つ、前述の４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片が、第３のペプチドリンカーによってそのＣ末端で軽鎖上のＣＬドメインに融合されている。
【０１３５】
別の態様では、本発明による４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーリンカーによって重鎖のＣＬドメインに融合されており、且つ、前述の４−１ＢＢ１のエクトドメイン又はその断片が、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーリンカーによって軽鎖上のＣＨ１ドメインに融合されている。
【０１３６】
更なる態様では、本発明は、本発明による４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関し、ここで、第１のペプチドリンカーによって互いに接続された４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むペプチドが、そのＣ末端で、第２のペプチドリンカーによって軽鎖のＣＬドメインに融合されており、且つ、前述の４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片が、第３のペプチドリンカーによってそのＣ末端で重鎖のＣＨ１ドメインに融合されている。
【０１３７】
特定の態様では、本発明は、ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２である、上記のような４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関する。一態様では、第１のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号６８）であり、第２のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号６８）であり、第３のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号６８）である。
【０１３８】
別の態様では、上記の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【０１３９】
特に、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、（ａ）  Ｈｅｒ２に特異的に結合可能なＦａｂ分子であって、Ｆａｂ重鎖がＣ末端でＦｃドメイン内のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合されているＦａｂ分子、並びに（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【０１４０】
更なる態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。より具体的には、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。
【０１４１】
Ｆｃ受容体の結合を低減させ、且つ／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメインの改変
本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリン  Ｇ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に会合可能である。
【０１４２】
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び望ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながら、同時に、Ｆｃドメインは、好ましい抗原保有細胞に対するのではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する、本発明の二重特性抗体の望ましくない標的化の原因となることがある。したがって、特定の態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、天然型ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。一態様では、Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。低下したエフェクター機能には、低下した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、低下した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、低下した抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、低下したサイトカイン分泌、抗原提示細胞による低下した免疫複合体を介した抗原取り込み、ＮＫ細胞への低減された結合、マクロファージへの低減された結合、単球への低減された結合、多形核細胞への低減された結合、アポトーシスを誘導する、低減された直接シグナル伝達、低減された樹状細胞成熟、又は低減されたＴ細胞プライミングのうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
特定の態様において、１又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、１又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１４４】
特定の態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドは４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインであって、Ｆｃ受容体への、特にＦｃ受容体への結合を低減させる１又は複数のアミノ酸置換を含むＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１４５】
一態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる、１又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、１又は複数の同じアミノ酸変異が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。更に詳細には、ＩｇＧ重鎖にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む、本発明による三量体ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、いわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させるもので、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載があり、同文献には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体の結合又はエフェクター機能といったその特性を決定するための方法も記載されている。「ＥＵ番号付け」とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＥＵインデックスに従った番号付けをいう。
【０１４６】
Ｆｃ受容体の結合が低減され、且つ／又はエフェクター機能が低下したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１又は複数の置換を伴うものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７位のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体が含まれる（米国特許第７３３２５８１号）。
【０１４７】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４のＦｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４  Ｆｃドメイン変異及びそのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
【０１４８】
変異Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正しいヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【０１４９】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）などの標準的装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に測定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは、本明細書に記載されている。代替的に、Ｆｃドメインの、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性を、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【０１５０】
Ｆｃドメインの、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３，７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６，１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（カリフォルニア州マウンテンビューのＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０１５１】
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインが低下したエフェクター機能を有するように設計されているいくつかの実施態様では、前述のエフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合できるかどうか、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを判定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照）。
【０１５２】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。
【０１５３】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの改変
一態様において、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに対して連結されている第１のポリペプチドと第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドは４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドと、（ｃ）安定な会合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含む。したがって、該分子は、典型的には２つの同一でないポリペプチド鎖（「重鎖」）に含まれる、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合された、異なる部分を含む。これらポリペプチドの組換え共発現とそれに続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組換え生産において４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の収率及び純度を改善するためには、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する改変を導入することが有利であろう。
【０１５４】
したがって、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する改変を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質間相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、前記改変は特に、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。
【０１５５】
特定の態様では、前記改変は、いわゆる「ノブ・トゥ・ホール」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」改変を、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール」改変を含んでいる。したがって、特定の態様において、本発明は、ＩｇＧ分子を含む前述の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関するものであり、ここで、第１の重鎖のＦｃ部分は第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分はＩｇＧ分子の２つの重鎖のヘテロ二体量化を可能にする第２の二量体化モジュールを含み、ノブ・イントゥ・ホール技術により第１の二量体化モジュールはノブを含み、第２の二量体化モジュールはホールを含む。
【０１５６】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）、及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８，７−１５（２００１）に記載されている。通常、この方法は、隆起（「ノブ」）が対応する空洞（「ホール」）内に配置されて、ヘテロ二量体形成を促進し、且つ、ホモ二量体形成を妨げることができるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起を、空洞を第２のポリペプチドの接触面に導入することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【０１５７】
このように、特定の態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
【０１５８】
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発又はペプチド合成によって、改変することにより作られる。
【０１５９】
特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。より詳細には、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）。より詳細には、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて更に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて更に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成される。ジスルフィド架橋は、二量体を更に安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０１６０】
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果（electrostatic steering effect）を媒介する改変を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるように、荷電アミノ酸残基による２つのＦｃドメインサブユニットの接触面における１又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。
【０１６１】
ＣＨ１／ＣＬドメイン内の改変
正しいペアリングに改良を加えるために、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を有することができる。このような改変は、交差（ｃｒｏｓｓｅｄ）又は非交差（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓｅｄ）ＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、１つのＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、且つ、１つのＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関する。
【０１６２】
更に詳細には、本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置き換えられ、且つ、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換された４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に関する。
【０１６３】
したがって、特定の態様において、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）アミノ酸変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋを含むＣＬドメインを有する第１のポリペプチド、並びにアミノ酸変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅを含むＣＨ１ドメインを有し、ＣＨドメインとＣＬドメインの間のジスルフィド結合によって第１のポリペプチドに連結されている第２のポリペプチドであって、
ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって互いに及びＣＬドメインに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むことと、第２のポリペプチドは、前述のポリペプチドのＣＨ１ドメインにペプチドリンカーを介して接続された１つの４−１ＢＢＬ又はその断片を含むこととを特徴とする、第１及び第２のポリペプチドと、
（ｃ）  安定な会合が可能な第１のサブユニットと第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０１６４】
一態様では、本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置き換えられ、且つ、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換された４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。これらの改変は、例えばミスペアリングなどの望ましくない影響を回避する有利な特性を有する、いわゆる荷電残基をもたらす。
【０１６５】
特に、ＣＬドメインはアミノ酸変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋを含み、ＣＨ１ドメインはアミノ酸変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅを含む。
【０１６６】
特定の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子
本発明は、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインを含む４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様において、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子はＨｅｒ２に特異的に結合可能な１つの部分を含むが、これは、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が一価であることを意味する。別の態様において、本発明は、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な２つの部分を含む４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供するが、これは、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が二価であることを意味する。
【０１６７】
一態様において、 本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、
（ａ）（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
（ｂ）（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン；又は
（ｃ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１６８】
一態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供し、ここで、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【０１６９】
一態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【０１７０】
更なる態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｖｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【０１７１】
更なる態様では、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１７２】
別の態様では、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１７３】
更なる態様では、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１７４】
更なる態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、
（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン；又は
（ｃ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン
を含む。
【０１７５】
一態様において、前述の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むか、又はＨｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む可変重鎖と配列番号３６のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【０１７６】
特定の態様では、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。別の態様では、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。特定の態様では、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列からなるＶＨドメインと配列番号２８のアミノ酸配列からなるＶＬドメインとを含む。
【０１７７】
更なる態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖；又は
配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖；又は
配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【０１７８】
特定の態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインと、
（ｂ）ジスルフィド結合によって互いに連結されている第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドであって、ここで抗原結合分子が、第１のポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドと
を含む。
【０１７９】
特定の態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖；又は
配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖；又は
配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２及び配列番号４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。
【０１８０】
別の態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、
（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖；又は
（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号４８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖；又は
（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号５０のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。
【０１８１】
ポリヌクレオチド
本発明は更に、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸分子又はその断片を提供する。
【０１８２】
本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば２以上の）ポリヌクレオチとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的抗原結合分子を形成することができる。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされる。共発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。
【０１８３】
いくつかの態様では、単離された核酸分子は、本明細書に記載されるように、本発明による４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子全体をコードする。特に、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、本発明による４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０１８４】
一態様では、本発明は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする単離された核酸分子に関し、ここで、核酸分子は、（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な抗原結合ドメインをコードする配列；（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドをコードする配列；及び（ｃ）前述の４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０１８５】
別の態様では、４−１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで、ポリヌクレオチドは、（ａ）Ｈｅｒ２に特異的に結合可能な部分をコードする配列；（ｂ）ペプチドリンカーによって互いに接続されている４−１ＢＢＬの２つのエクトドメイン又はそれらの断片を含むポリペプチドをコードする配列；及び（ｃ）４−１ＢＢＬの１つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【０１８６】
特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【０１８７】
組換え法
本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固体相合成）又は組換え生産によって得ることができる。組換え生産のために、例えば上述したように、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードする１又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために１又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され、配列決定され得る。本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子（断片）のコード配列を有する発現ベクターを構築することができる。このような方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であっても、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターには、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットが含まれる。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、（存在する場合には）コード領域の一部と考えられる。但し、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域等の任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば単一のベクター上）に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば別々の（異なる）ベクター上）に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を有してもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域には、限定さ���ないが、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインなどの特殊なエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能な会合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、１又は複数の制御配列と会合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに会合するプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に会合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に会合されているといえる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する、細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０１８８】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、最初期プロモーターとイントロンＡ）、シミアンウイルス４０（例えば最初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa−グロビン（ｒａｂｂｉｔ  a−ｇｌｏｂｉｎ）、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込みエレメントといった他の特徴を含んでいてもよい。
【０１８９】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と会合させることができる。例えば、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る排出輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作動可能に会合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０１９０】
（例えばヒスチジンタグなど）後の精製を容易にするため又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片の中又は両末端に含まれ得る。
【０１９１】
本発明の更なる態様では、本発明の１又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の１又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように設計可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は、特定の発現ベクターを適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、臨床応用に十分な量の抗原結合分子を得るために大規模発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離することができ、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌などの真核微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成を結果として生じる菌類及び酵母菌株を含む、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２，１４０９−１４１４（２００４），及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４，２１０−２１５（２００６）を参照。
【０１９２】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。特にヨウトガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用することができる、多数のバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体作製に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばGraham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載の２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載のＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ  細胞（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ．２５５−２６８（２００３）を参照。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、更にはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現した生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように操作することができる。
【０１９３】
一態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を生産する方法が提供され、この方法は、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で、本明細書に提供される本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することを含む。
【０１９４】
本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子において、その構成要素（標的細胞抗原に特異的に結合可能な少なくとも１つの部分、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメインを含む１つのポリペプチド又はその断片、及び前述の４−１ＢＢＬファミリーメンバ−の１つのエクトドメインを含むポリペプチドまたはその断片）は通常、互いに遺伝的に融合されていない。これらのポリペプチドは、その構成要素（ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの２つのエクトドメイン又はその断片、及びＣＨ又はＣＬのような他の構成要素）が直接又はリンカー配列を介して互いに融合するように設計されている。リンカーの組成及び長さは、当技術分野でよく知られている方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。本発明の抗原結合分子の様々な構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に提供されている配列に見出される。必要に応じて、融合タンパク質の個々の構成要素を切り離すための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
【０１９５】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、標的細胞抗原（例えばＦａｂ断片）に特異的に結合可能な部分は、少なくとも、抗原に結合することのできる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つ、そのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産する方法は、当技術分野でよく知られている（例えばHarlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照）。天然には存在しない抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え生産することも、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることもできる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
【０１９６】
あらゆる動物種の免疫グロブリンを本発明に使用することができる。本発明において有用な、非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトでの使用を目的とする場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ型の免疫グロブリンを使用することができる。ヒト化又は完全ヒト型の免疫グロブリンも、当分野でよく知られている方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それらの方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わない、ヒト（例えばレシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「クローキング」することが含まれる。ヒト化抗体及びその製造方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に総説され、更に、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１，６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４，６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎ  ３１（３），１６９−２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植について記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８，４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」について記載）；Ｏｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  がん８３，２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択（guided selection）」アプローチについて記載）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ��．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）で一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つ、そのような抗体から得ることができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによっても作製することができる（例えば、Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)参照）。ファージは通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として表示する。
【０１９７】
特定の態様では、本発明の抗原結合分子に含まれる、標的細胞抗原に特異的に結合できる部分（例えばＦａｂ断片）は、例えば国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従って、向上した結合親和性を有するように設計される。特定の抗原決定基に対する本発明の抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）によって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために使用され得る。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）によるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻の「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原は、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー）を参照。
【０１９８】
本明細書に記載されるように調製された本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用され得る。連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるように、抗原結合分子を単離するために使用され得る。４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む任意の様々な周知の分析方法によって決定され得る。例えば、実施例に記載されるように発現された４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、還元型及び非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるようにインタクトであり、且つ、適切に集合することが示された。
【０１９９】
アッセイ
本明細書で提供される抗原結合分子は、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされ得る。生物活性は、例えば、様々な免疫細胞、特にＴ細胞の活性化及び／又は増殖を強化する能力を含み得る。例えば、それらは、免疫調節サイトカインの分泌を増強する。増強されている、又は増強され得る他の免疫調節サイトカインは、例えば、ＩＬ２、グランザイムＢなどである。生物活性には、カニクイザル結合交差反応性及び異なる細胞型への結合も含まれ得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでこのような生物活性を有する抗原結合分子が提供される。
【０２００】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に対する親和性は、実施例に記載の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ装置ＧＥヘルスケア（）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。また、ＨＥＲ２に対する４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための特定の例示的な実施態様は、実施例４に記載されている。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００装置（ＧＥヘルスケア）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２０１】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の、対応する受容体発現細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、４−１ＢＢを発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイで使用され得る。この細胞は、単離後そのまま使用することも（ナイーブＰＭＢＣ）、刺激後に使用することもできる（活性化ＰＭＢＣ）。別の態様では、活性化されたマウス脾細胞（４−１ＢＢを発現している）を使用して、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の、４−１ＢＢ発現細胞への結合を実証することができる。
【０２０２】
更なる態様では、Ｈｅｒ２を発現している細胞株を使用して、この標的細胞抗原への該抗原結合分子の結合を実証した。
【０２０３】
別の態様では、競合アッセイを使用して、Ｈｅｒ２又は４−１ＢＢそれぞれへの結合について特定の抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、特定の抗Ｈｅｒ２抗体又は特定の４−１ＢＢ抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ）に提供されている。
【０２０４】
３．活性アッセイ
一態様において、Ｈｅｒ２及び４−１ＢＢに結合する、生物活性を有する４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、Ｈｅｒ２を発現しているがん細胞上での４−１ＢＢを介したアゴニストシグナル伝達が含まれる。これらのアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有すると認められた４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子も提供される。
【０２０５】
特定の態様では、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、このような生物活性について試験される。本発明の該分子の生物活性を検出するためのアッセイは、実施例３に記載されているものである。更に、細胞溶解（例えばＬＤＨ放出の測定による）、誘導性アポトーシスのカイネティクス（例えばカスパーゼ３／７活性の測定による）又はアポトーシス（例えばＴＵＮＥＬアッセイを使用）を検出するためのアッセイは、当技術分野で周知である。更に、このような複合体の生物活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞などの様々なリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するこれらの複合体の作用を調べるか、或いは樹状細胞、単球／マクロファージ又はＢ細胞等の抗原提示細胞の表現型と機能を調節するこれらの能力を査定することによって、評価され得る。
【０２０６】
薬学的組成物、製剤及び投与経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１種の追加的治療剤を、例えば後述するように含む。
【０２０７】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加剤に溶解又は分散した１又は複数の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー又は他の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と、任意選択的に追加の活性成分とを含有する薬学的組成物の調製は、（参照により本明細書に援用される）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０によって例示されている通りであり、本開示に照らして当業者には既知であろう。特に、該組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される添加剤」には、当業者に既知であるように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【０２０８】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水緩衝液（physiological saline buffer）等の、生理的に適合性のバッファー中で製剤化され得る。該溶液は、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤等の調合剤を含有することができる。或いは、融合タンパク質は、使用前に、適切なビヒクル（例えば発熱性物質除去蒸留水）と構成するために、粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜に通して濾過することにより、容易に達成することができる。分散体は通常、塩基性分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を取り込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又はエマルジョンの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥又は凍結乾燥技術であり、これは、事前に滅菌濾過された該活性成分の液体媒質から該活性成分＋任意の所望の追加的成分の粉末を得るものである。場合によっては、該液体媒質を適切に緩衝し、注射前にまず、その液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする必要がある。該組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な添加剤には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等の懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、該懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル（ethyl cleat）若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２０９】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル、ポリ−（メチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ−（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
【０２１０】
本明細書における例示的な薬学的に許容される添加剤には、間質性薬物分散剤（insterstitial drug dispersion agent）、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が更に含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法については、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１種以上のさらなるグリコサミノグリカナーゼと併用される。
【０２１１】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、この製剤はヒスチジン−酢酸塩バッファーを含む。
【０２１２】
上記の組成物に加えて、融合タンパク質は、デポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、植込（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（例えば、皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性又は疎水性物質（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとしての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２１３】
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、１種以上の生理的に許容される担体、希釈剤、添加剤、又はタンパク質の薬学的に使用可能な調製物への加工を容易にする補助剤を使用して、従来の方法で製剤化できる。適した製剤は、選択される投与経路に応じて決まる。
【０２１４】
４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０２１５】
本明細書の組成物は治療される特定の適応症に必要な複数の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するのも含有し得る。そのような活性成分は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０２１６】
一態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１種の追加的治療剤とを含み得る。一態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれかと、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体とを含み得る。
【０２１７】
一態様において、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、Ｈｅｒ２に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。特定の態様において、Ｈｅｒ２に結合する第２の抗原結合ドメインは、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子とは異なるＨｅｒ２上のエピトープに結合する。
【０２１８】
一態様では、本明細書で使用される抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号９２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号９３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号９４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号９５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号９６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更に詳細には、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号９８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
【０２１９】
一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（そのヒト化型で、トラスツズマブとして知られている）抗体４Ｄ５と同じエピトープに結合する第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（そのヒト化型で、ペルツズマブとして知られている）抗体２Ｃ４と同じエピトープに結合する第２の抗原結合ドメインを含む。更に別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗体７Ｃ２（米国特許第９５１８１１８号）と同じエピトープに結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
【０２２０】
別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号２１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号２２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号２３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）；並びに／若しくは配列番号２４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号２５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号２６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）、又は
（ｂ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）；並びに／若しくは配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）、又は
（ｃ）配列番号９９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１００のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１０１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）；並びに／若しくは配列番号１０２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１０３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０２２１】
一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０２２２】
一態様において、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号９８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、配列番号２７のアミノ酸配を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２８のアミノ酸配を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０２２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌されている。滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜に通して濾過することにより、容易に達成することができる。
【０２２４】
治療方法及び組成物
本明細書において提供される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子のいずれも、治療法に使用することができる。
【０２２５】
治療方法において使用される場合、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、医療実施基準に一致した様式で製剤化、調薬及び投与され得る。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。
【０２２６】
一態様では、医薬としての使用のための本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。更なる態様において、疾患の治療における使用のための、特にがんの治療における使用のための、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。特定の態様では、治療法における使用のための、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。一態様では、本発明は、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子であって、それを必要とする個体の疾患の治療における使用のための４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様において、本発明は、疾患を有する個体に治療的有効量の融合タンパク質を投与することを含む、該個体の治療法における使用のための４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、治療される疾患は、ＨＥＲ２陽性がんである。ＨＥＲ２陽性がんの例には、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺、子宮内膜がん、膵臓がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が含まれる。一態様では、Ｈｅｒ２陽性がんは、Ｈｅｒ２＋陽性乳がん、例えば早期又は局所進行Ｈｅｒ２＋陽性乳がんである。したがって、これらのがんの治療における使用のための、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供される。治療を必要とする対象、患者又は「個体」は、典型的には哺乳動物であり、より具体的にはヒトである。
【０２２７】
別の態様において、提供されるのは、感染症の治療のための、特にウイルス感染症の治療のための、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子である。更なる態様において、提供されるのは、自己免疫疾患、例えばループス病の治療における使用のための、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子である。
【０２２８】
更なる態様では、本発明は、必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用に関する。一態様において、該医薬は、疾患を有する個体に治療的有効量の該医薬を投与することを含む疾患の治療方法における使用のためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害、特にがんである。したがって、一態様では、本発明は、がん、特にＨｅｒ２陽性がんの治療のための医薬の製造又は調製における、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用に関する。ＨＥＲ２陽性がんの例には、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺、子宮内膜がん、膵臓がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が含まれる。特定の態様において、治療されるがんは、ＨＥＲ２陽性乳がん、特にＨｅｒ２陽性転移性乳がんである。当業者であれば、場合によっては４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的恩恵を提供するだけであることが分かる。いくつかの態様では、いくらかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの態様では、生理的変化をもたらす４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。
【０２２９】
更なる態様において、本発明は、個体に治療的有効量の本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を投与することを含む、前記個体における疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物が前記個体に投与される。特定の態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の態様では、疾患はがんである。特定の態様では、該方法は、該個体に治療的有効量の少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合には抗がん剤）を投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
【０２３０】
疾患の予防又は治療に関し、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の（単独での使用又は１種以上の他の追加的治療剤との併用の際の）適切な投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、抗原結合分子が予防又は治療のどちらの目的で投与されるか、従前又は同時の治療的介入、患者の病歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。いずれにしても、投与を担当する施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象にとって適切な用量を決定する。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが想定される。
【０２３１】
４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、単回、又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば１又は複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日用量は、上記の要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与に関しては、病状に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで継続されるものとする。融合タンパク質の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、投与１回につき、体重１ｋｇあたり約１μｇから、体重１ｋｇあたり約５μｇから、体重１ｋｇあたり約１０μｇから、体重１ｋｇあたり約５０μｇから、体重１ｋｇあたり約１００μｇから、体重１ｋｇあたり約２００μｇから、体重１ｋｇあたり約３５０μｇから、体重１ｋｇあたり約５００μｇから、体重１ｋｇあたり約１ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約２００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約３５０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇまで、又はそれ以上の範囲、及びそこから導き出せる範囲を含む。本明細書に挙げた数字から導き出せる範囲の例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ〜体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ等の範囲が投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１又は複数の用量を患者に投与することができる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、または例えば融合タンパク質の約６用量を受けるように）投与してよい。初回の高負荷用量の後、それより低い用量を１以上投与してもよい。しかしながら、他の用量レジメンも有用である。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２３２】
一般に、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、意図された目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患の状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２３３】
全身投与の場合、治療的有効用量は、細胞培養アッセイなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。その後、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を定式化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
【０２３４】
初期投与量は、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当技術分野でよく知られている技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づくヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０２３５】
投与の量及び間隔は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の、治療効果を維持するのに十分な血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための患者への通常の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数回投与を行うことにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２３６】
局所投与又は選択的取り込みの場合、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０２３７】
本明細書に記載される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の治療的に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的効果を提供する。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究を用いて、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。大きな治療指数を呈する４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明による４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを用いて、ヒトにおける使用に適した投与量の範囲を定式化することができる。投与量は、好ましくは、毒性を殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、様々な要素、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、対象の病状等に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路及び用量は、患者の病状を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、本明細書に参照により全文が援用されるＦｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１章，１頁参照）。
【０２３８】
本発明の融合タンパク質を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には、治療レベルを上げるように調整する（毒性は予め排除）ことも知っているであろう。対象となる障害の管理における投与量の大きさは、治療される病状の重症度、投与経路などによって変わる。例えば、病状の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。更に、用量及び恐らくは投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答応じて変化するであろう。
【０２３９】
その他の薬剤及び治療
治療において、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、１種以上の他の薬剤との併用で投与され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１種の追加の治療剤と共投与され得る。用語「治療剤」は、このような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与され得る任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。特定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。
【０２４０】
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の量、障害又は治療の種類、及び上述の他の要素に応じて決まる。一般に、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、本明細書に記載されているのと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。
【０２４１】
上記のこうした併用療法は、併用投与（二以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起こり得る別々の投与を包含する。
【０２４２】
したがって、一態様では、がん、特にＨｅｒ２陽性がんの治療における使用のための、本明細書に記載の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子が提供され、ここで、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体と併用される。
【０２４３】
一態様において、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に結合する第１の抗原結合ドメインと、Ｈｅｒ２に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む。特定の態様において、Ｈｅｒ２に結合する第２の抗原結合ドメインは、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子とは異なるＨｅｒ２上のエピトープに結合する。
【０２４４】
一態様では、本明細書で使用される抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号９２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号９３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号９４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号９５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号９６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更に詳細には、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号９８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
【０２４５】
一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（そのヒト化型で、トラスツズマブとして知られている）抗体４Ｄ５と同じエピトープに結合する第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、（そのヒト化型で、ペルツズマブとして知られている）抗体２Ｃ４と同じエピトープに結合する第２の抗原結合ドメインを含む。更に別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗体７Ｃ２（米国特許第９５１８１１８号）と同じエピトープに結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
【０２４６】
別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号２１のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号２２のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号２３のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）；並びに／若しくは配列番号２４のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号２５のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号２６のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）、又は
（ｂ）配列番号１３のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１４のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１５のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）；並びに／若しくは配列番号１６のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１７のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）、又は
（ｃ）配列番号９９のＣＤＲ−Ｈ１配列、配列番号１００のＣＤＲ−Ｈ２配列、及び配列番号１０１のＣＤＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）；並びに／若しくは配列番号１０２のＣＤＲ−Ｌ１配列、配列番号１０３のＣＤＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０４のＣＤＲ−Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）
を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０２４７】
一態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。別の態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。更なる態様では、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＥＡ）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０２４８】
一態様において、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）及び／又は配列番号９８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインと、配列番号２７のアミノ酸配を含む重鎖可変領域（ＶＨＨｅｒ２）及び／又は配列番号２８のアミノ酸配を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨｅｒ２）を含む第２の抗原結合ドメインを含む。
【０２４９】
更なる態様では、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と併用され、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と同時に、それに先立って、又はそれに続いて投与される。
【０２５０】
更なる態様において、提供されるのは、がんの治療のための医薬の製造のための４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子の使用であって、ここで、４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体と併用される。特定の態様では、治療される疾患は、ＨＥＲ２陽性がんである。ＨＥＲ２陽性がんの例には、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺、子宮内膜がん、膵臓がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が含まれる。特定の態様において、治療されるがんは、ＨＥＲ２陽性乳がん、特にＨｅｒ２陽性転移性乳がんである。
【０２５１】
更なる態様では、本発明は、個体におけるがんの治療のための方法であって、前記個体に治療的有効量の本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子と有効量の上記Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、特に抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体とを投与することを含む方法を提供する。特定の態様では、該方法は、ＨＥＲ２陽性がんに対するものである。ＨＥＲ２陽性がんの例には、乳がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、唾液腺、子宮内膜がん、膵臓がん及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が含まれる。一態様では、該方法は、ＨＥＲ２陽性転移性乳がんを治療するためのものである。
【０２５２】
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等が含まれる。該容器は、例えばガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。該容器は、該病状の治療、予防及び／又は診断に有効な、単独の又は他の組成物と組み合わされる組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、該容器は皮下注射針で穿孔可能な、ストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。該組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子である。
【０２５３】
ラベル又は添付文書は、最適な病状の治療のために該組成物が使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を含む組成物を中に含む第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物を中に含む第２の容器を含んでもよい。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書を更に備えてもよい。
【０２５４】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を収容する第２（又は第３）の容器を更に備えてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に備えてもよい。
【０２５５】
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【０２５６】
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に示されている。抗体鎖のアミノ酸は、上記に定義されるように、Ｋａｂａｔ（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）によるＥＵ番号付けシステムに従って番号付け及び参照される。
【実施例】
【０２５７】
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２５８】
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ９１−３２４２に示されている。
【０２５９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【０２６０】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いるＰＣＲによって生成されたか、又は自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ社（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター中でクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２６１】
細胞培養技術
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ  Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているような、標準的な細胞培養技術を使用した。
【０２６２】
タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、抗体を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥヘルスケア）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出はｐＨ２．８で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、ＧＥヘルスケア）により、ＰＢＳ中又は２０ｍＭのヒスチジン（１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中の単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し（必要な場合）、−２０℃又は−８０℃で冷凍し、保存した。試料の一部が、その後のタンパク質分析、及び例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析による分析的特徴付けのために提供された。
【０２６３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の指示書に従って使用した。特に、１０％若しくは４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２６４】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムで３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−システムで２倍のＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥヘルスケア）に塗布した。ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分により、溶出したタンパク質を定量化した。ＢｉｏＲａｄゲル濾過Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１−１９０１が標準として機能した。
【０２６５】
実施例１
Ｈｅｒ２標的化４−１ＢＢアゴニスト抗原結合分子の生成と生産
１．１．Ｈｅｒ２標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生成と生産
三量体４−１ＢＢリガンドを標的とするために使用されたＨｅｒ２バインダーは、国際公開第２０１５／０９１７３８号に記載されているように、ペルツズマブ（以下の文中ではＰＥＲという）、トラスツズマブ（ＴＲＡＳ）、及び親和性成熟ペルツズマブ（ａｆｆ−ＰＥＲ）であった。
【０２６６】
Ｈｅｒ２に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のいずれかと共にフレーム内でサブクローニングした。
【０２６７】
ヒト４−１ＢＢリガンドのエクトドメイン（アミノ酸７１−２４８）の一部をコードするＤＮＡ配列を、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ４１２７３配列に従って合成した。
【０２６８】
（Ｇ４Ｓ）２リンカーによって分離された４−１ＢＢリガンドの２つのエクトドメインを有し、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合されたポリペプチドを、図１Ａに描かれているようにクローニングした：ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ。
【０２６９】
４−１ＢＢリガンドの１つのエクトドメインを有し、ヒトＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合されたポリペプチドを、図１Ｂに描かれているようにクローニングした：ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ。
【０２７０】
正しいペアリングに改良を加えるために、以下の変異を交差ＣＨ−ＣＬに導入した（荷電変異体）。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンドには、変異Ｅ１２３ＲとＱ１２４Ｋが導入された。ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンドにおいて、変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅが、国際公開第２０１５１５０４４７号に記載されているように、ヒトＣＨ１ドメインにクローニングされた。
【０２７１】
Ｈｅｒ２（ＰＥＲ、ＴＲＡＳ及びａｆｆ−ＰＥＲ）に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖のいずれかと共にフレーム内でサブクローニングした。
【０２７２】
Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を有する二量体リガンドＦｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を有する標的抗Ｈｅｒ２−Ｆｃホール鎖、及び抗Ｈｅｒ２軽鎖の組み合わせにより、集合した三量体４−１ＢＢリガンド及びＨｅｒ２結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体が生成された（図２Ａ）。
【０２７３】
表１に、ＣＨ１−ＣＬクロスオーバー及び荷電残基を有する一価の抗Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のアミノ酸配列を示す。該分子は、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬと称される。
【０２７４】
表２に、ＣＨ１−ＣＬクロスオーバー及び荷電残基を有する一価の抗Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のアミノ酸配列を示す。該分子は、Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬと称される。
表３に、ＣＨ１−ＣＬクロスオーバー及び荷電残基を有する一価のＨｅｒ２（ａｆｆ−ＰＥＲ）スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のアミノ酸配列を示す。該分子は、Ｈｅｒ２（ａｆｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬと称される。
【０２７５】
2021520805.tif 000018
2021520805.tif 000019
【０２７６】
2021520805.tif 000020
【０２７７】
2021520805.tif 000021
【０２７８】
二重特異性コンストラクトは、ポリエチレンイミンを使用して、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を哺乳動物発現ベクターでコトランスフェクトすることにより作製された。上記細胞は、１：１：１：１の比の対応する発現ベクター（「べクター４−１ＢＢＬ  Ｆｃ−ｋｎｏｂ鎖」：「ベクターＦｃ−ホール鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトされた。
【０２７９】
生成は、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を使用して、振盪フラスコ中で行った。トランスフェクションのために、細胞を遠心分離し、培地を予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地で置き換えた。発現ベクターをＣＤ  ＣＨＯ培地で混合し、ＰＥＩを添加し、溶液をボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内で３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地を加えた。トランスフェクションの翌日、１２％のＦｅｅｄを加えた。７日間培養した後、細胞上清を遠心分離によって回収した。溶液を滅菌濾過し、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）になるようにアジ化ナトリウムを補充し、４℃で維持した。
【０２８０】
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケア）に上清をロードした。結合していないタンパク質を平衡化バッファーで洗浄することにより除去した。結合したタンパク質は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）で作製した段階溶出液を使用して溶出した。回収した画分のｐＨは、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）の１／１０（ｖ／ｖ）を添加することにより調整した。該タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥヘルスケア）にロードした。
【０２８１】
精製されたコンストラクトのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。この二重特異性コンストラクトの純度及び分子量をＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（ノギス）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）の有無に関わらずＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。二重特異性コンストラクトの凝集体含有量を、２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー中で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０２８２】
表４は、ＨＥＲ２標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子、並びにコントロール分子の収量と最終的なモノマー含有量をまとめたものである。
【０２８３】
2021520805.tif 000022
【０２８４】
１．２．マウスサロゲートとしてのＨｅｒ２標的化４−１ＢＢアゴニスト抗原結合分子（ｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２）の生成及び生産
ｍｕ４−１ＢＢＢＬは自然に二量体を形成し（A. Brita et al. 2018）、ヒトのように三量体を形成しないため、マウス４−１ＢＢに二価結合しＨｅｒ２に一価結合する二重特異性アゴニスト４−１ＢＢ抗体（２＋１ともいう）は、図２Ｂに示すように調製された。
【０２８５】
本実施例では、コンストラクトのＨＣ１は、抗マウス４−１ＢＢ（クローンＭＵ１３７−１）のＶＨＣＨ１に続いてＣＨ２及びＣＨ３から構成された。ＨＣ２は、抗Ｈｅｒ２（クローン２Ｃ４、Adams CWら、Cancer Immunol Immunother、55(6), 2006, 717-727頁，ｃｒｏｓｓ  Ｆａｂ）のＶＬＣＨ１に続いて抗マウス４−１ＢＢ（クローンＭＵ１３７−１）のＶＨＣＨ１、並びにＣＨ２及びＣＨ３から構成された。Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１０，１９６３７−１９６４６によって記載されているヘテロ二量化を促進する変異、すなわちＥ３５６ＫとＤ３９９Ｋ（ＫＫという）及びＫ３９２ＤとＫ４０９Ｄ（ＤＤという）をそれぞれＨＣ１及びＨＣ２に導入した。
【０２８６】
更に、Ｂａｕｄｉｎｏら  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８），１８１，６６６４−６６６９又は国際公開第２０１６／０３０３５０号に記載の方法に従って、重鎖の定常領域にＤＡＰＧ変異を導入し、マウスＦｃガンマ受容体への結合を無効にした。簡潔には、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、Ｆｃ−ＤＤとＦｃ−ＫＫ重鎖の定数領域にＤ２６５ＡとＰ３２９Ｇ変異が導入された（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスに従った番号付け；すなわち、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）。
【０２８７】
Ｆｃ−ＤＤとＦｃ−ＫＫ鎖を組み合わせることで、１つのＨｅｒ２結合Ｆａｂと２つの４−１ＢＢ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体を生成することができた。正しいペアリングに改良を加えるために、以下の変異を抗４−１ＢＢ結合ＦａｂのＣＨ−ＣＬに導入した：ＣＬにＥ１２３ＲとＱ１２４Ｋ、ＣＨ１にＫ１４７ＥとＫ２１３Ｅ。
【０２８８】
２＋１抗４−１ＢＢ（ＭＵ１３７−１）、抗Ｈｅｒ２（２Ｃ４）抗体のアミノ酸配列は、表４Ａに記載されている。
【０２８９】
2021520805.tif 000023
【０２９０】
2021520805.tif 000024
【０２９１】
実施例２
表面プラズモン共鳴法によるＨｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合抗原結合分子の機能的特性解析
４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の調製
ヒト４−１ＢＢのエクトドメインをコードするＤＮＡ配列（Ｑ０７０１１、配列番号５１によるヒト４−１ＢＢのアミノ酸２４から１８６）を、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、抗原エクトドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。抗原−ＦｃノブのＣ末端に、定方向（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ビオチン化用のＡｖｉタグを導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を有する抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を有するＦｃホール鎖との組み合わせにより、４−１ＢＢエクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成が可能になり、それによってＦｃ結合抗原の単量体形態を作製する。表５に、抗原Ｆｃ融合コンストラクトのアミノ酸配列を示す。
【０２９２】
2021520805.tif 000025
【０２９３】
全ての４−１ＢＢ−Ｆｃ融合分子をコードする配列は、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を有するプラスミドベクターにクローン化された。更に、ベクターには、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列が含まれている。
【０２９４】
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁液ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、融合タンパク質の２つの構成要素（ノブ鎖とホール鎖）をコードする３つのベクターと、ビオチン化反応に必要な酵素ＢｉｒＡとをコトランスフェクトした。対応するベクターは、２：１：０．０５の比率（「抗原ＥＣＤ−ＡｃＴＥＶ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃ（ホール）」：「ＢｉｒＡ」）で使用された。
【０２９５】
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質生成のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地で上清を置き換えた。発現ベクターは、２００μｇのベクターＤＮＡを含む２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁させた。５４０μｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を加えた後、該溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１６０ｍＬのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの翌日、サプリメントを含む１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培養液に加えた。７日間の培養後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることにより、細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）になるようにアジ化ナトリウムを補充し、４℃で維持した。
【０２９６】
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、４０ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥヘルスケア）に上清をロードした。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）含有バッファーで洗浄することにより除去した。結合したタンパク質は、２０カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）で作製された塩化ナトリウムの直線ｐＨ勾配（０〜５００ｍＭ）を使用して溶出した。その後、１０カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）でカラムを洗浄した。
【０２９７】
回収した画分のｐＨは、２Ｍトリス（ｐＨ８．０）の１／４０（ｖ／ｖ）を添加することにより調整した。このタンパク質を濃縮し、濾過した後、２ｍＭ  ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥヘルスケア）にロードした。
【０２９８】
組換えヒトＨｅｒ２（ＥｒｂＢ２タンパク質のＥＣＤ、配列番号５４のアミノ酸２３〜６５２、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｐ０４６２６−１）は市販されており（例えばａｂｃａｍから、カタログ番号ａｂ１６８８９６）、Ｈｅｒ２への結合の決定に使用した。
【０２９９】
Ｈｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合抗原結合分子の同時結合の決定
ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）とヒトＨｅｒ２に同時に結合する能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験は、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ドイツ国フライブルグのＢｉａｃｏｒｅ社）をランニングバッファーとして用い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５℃で実施された。ビオチン化ヒト４−１ＢＢ  Ｆｃ（ｋｉｈ）は、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。最大４５０レゾナンスユニット（ＲＵ）までの固定化量が使用された。
【０３００】
Ｈｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合コンストラクトを、９０秒にわたってフローセルに３０μＬ／分の流量で２００ｎＭの濃度範囲で通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＨｅｒ２は、５００ｎＭの濃度で９０秒間にわたってフローセルに３０μＬ／分の流量で２番目の分析物として注入された（図３Ａ）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、タンパク質が全く固定化されていない基準フローセルで得られた応答差し引くことによって補正した。
【０３０１】
図３Ｂと３Ｃのグラフに見られるように、二重特異性コンストラクトは、ヒト４−１ＢＢ及びヒトＨｅｒ２を同時に結合することができた。
【０３０２】
実施例３
Ｈｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合抗原結合分子の機能的特性解析
機能アッセイでは、本発明者らは、上記の一価のＨｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合抗原結合分子、つまり、２つの前述のアゴニスト抗ヒト４−１ＢＢ抗体に対するＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ、Ｈｅｒ２（ａｆｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ及びＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬ、すなわち抗ヒト４−１ＢＢクローン２０Ｈ４．９  ヒトＩｇＧ４（欧州特許第１６７０８２８号及び米国特許第７６５９３８４号に記載、配列番号５５の重鎖と配列番号５６の軽鎖を有する抗体）と抗ヒト４−１ＢＢクローンＭＯＲ７４８０  ヒトＩｇＧ２（国際公開第２０１２／０３２４３３号に記載、配列番号５７の重鎖と配列番号５８の軽鎖を有する抗体）、及び前述の融合ポリペプチドＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン−４−１ＢＢ  ヒトｇＧ４（国際公開第２０１６／１７７８０２号に記載の、配列番号５９と６０の融合ポリペプチド）を試験した。
【０３０３】
更に、非標的化ＤＰ４７−４−１ＢＢＬ（配列番号３７、２８、６１及び６２のアミノ酸配列を含み、国際公開第２０１６／０７５２７８号にコントロールＤと記載されている分子であって、抗原に結合しないＤＰ４７と呼ばれる生殖系列コントロールを使用して、抗原結合ドメインを置き換えた）、ＤＰ４７−アンチカリン−４−１ＢＢヒトＩｇＧ４（国際公開第２０１６／１７７８０号に記載されている分子と同様に調製された配列番号６３及び６４の融合ポリペプチド）、Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（配列番号６５の重鎖と配列番号４８の軽鎖とを有する抗体）、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（配列番号６６の重鎖と配列番号４６の軽鎖とを有する抗体）、及び非標的化ＤＰ４７ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ（配列番号６７の重鎖と配列番号６２の軽鎖を有する抗体）などの種々のコントロール分子が使用された。これらのＩｇＧ１抗体は、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を含む。
【０３０４】
３．１．Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞への結合
細胞表面に発現したＨｅｒ２との結合を試験するために、種々のヒトＨｅｒ２発現腫瘍細胞を用いた：ヒト乳がん細胞株ＳＫ−Ｂｒ３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３０）、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ−４（川崎医科大学）及びヒト胃がん細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８２２）。
【０３０５】
ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０３２６）中に再懸濁させた０．２ｘ１０６腫瘍細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，ｃｅｌｌｓｔａｒ，カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに加えた。細胞を２００μＬのＤＰＢＳで１回洗浄し、ペレットを再懸濁させた。１：５０００希釈した、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８６３−１８）を含む４℃のコールドＤＰＢＳバッファーを１００μＬ／ウェル添加し、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。細胞を４℃のコールドＤＰＢＳバッファー２００μＬで１回洗浄し、滴定濃度の、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ又はＨｅｒ２（ａｆｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ又はＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬと呼ばれるヒトスプリット４−１ＢＢリガンド分子と、コントロール分子、すなわち、非標的化ＤＰ４７−４−１ＢＢＬ又は抗ヒト４−１ＢＢ抗体（抗ヒト４−１ＢＢクローン２０Ｈ４．９  ｈｕＩｇＧ４又は抗ヒト４−１ＢＢクローンＭＯＲ−７４８０  ｈｕＩｇＧ２と呼ばれる）又は融合タンパク質［Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン−４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４又はその非標的化コントロールＤＰ４７−アンチカリン−４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４又はＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ又はＨｅｒ２（ＰＥＲ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ又はＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ］とを含む、５０μＬ／ウェルの４℃のコールドＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）と７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）中に再懸濁させた。細胞を４℃で１時間インキュベートし、その後、非結合抗体を除去するためにコールドＦＡＣＳバッファーで数回洗浄した。細胞を更に、５０μＬ／ウェルの４℃のコールドＦＡＣＳバッファー５μｇ／ｍＬ  ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片特異的ヤギＦ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９  １１６  ０９７）を用いて、４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬの４℃のＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含む５０μＬ／ウェルＤＰＢＳ中で少なくとも１０分間固定した。その後、細胞を１００μＬの４℃のＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、Ｃｙｔｏｍａｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に結合されたＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して取得した。データは、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０（ＦＬｏｗＪｏ  ＬＬＣ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ）を用いて分析した。
【０３０６】
図４Ａから４Ｄに示すように、Ｈｅｒ２（ｐｅｒ）−４−１ＢＢＬ及びＨｅｒ２（ａｆｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬは、ヒト腫瘍細胞ＳＫ−Ｂｒ３又はＮＣＩ−Ｎ８７によって発現されたヒトＨｅｒ２と同様の結合を示し、それにより、Ｈｅｒ２（ａｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ分子は、表６に記載されているように、わずかに高いＥＣ５０値を示す。抗体Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）ｈｕＩｇＧ  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡは、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬとは異なり、一価ではなく二価で結合する。これは、図４に示すように、わずかに低いＭＦＩ（抗体が１つのＨｅｒ２分子ではなく２つのＨｅｒ２分子を占めることができるため、細胞表面に対する抗体が少ない）と、表６に記載されているようなアビディティー効果を反映して、わずかに低いＥＣ５０値に反映される。二価トラスツズマブ結合融合タンパク質Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン−４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４は、二価結合Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）ｈｕＩｇＧ  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡよりも低いＭＦＩと高いＥＣ５０値を示す（図４と表６に示す）。これは、トラスツズマブ（ＴＲＡＳ）バインダーの、ペルツズマブ（ＰＥＲ）バインダーと比べて低い親和性及びアビディティーを反映している。
【０３０７】
2021520805.tif 000026
【０３０８】
図５Ａと５Ｂに示すように、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ及びＨｅｒ２（ａｆｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬは、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ−４によって発現されたヒトＨｅｒ２に類似の結合を示す。Ｈｅｒ２（Ｔｒａｓ）−４−１ＢＢＬは、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ及びＨｅｒ２（ａｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬよりも低いＭＦＩ（図５Ａ）及びわずかに高いＥＣ５０値（表７）を有し、これは、トラスツズマブ（Ｔｒａｓ）の親和性がパーツズマブ（ＰＥＲ）よりも低いことを反映している。これは、一価のＨｅｒ２結合コンストラクトについてのみ、二価のＨｅｒ２結合Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）ｈｕＩｇＧ１  ＰＧ  ＬＡＬＡ及びＨｅｒ２（ＰＥＲ）ｈｕＩｇＧ１  ＰＧ  ＬＡＬＡ分子（アビディティーを示す）が同様に結合することを示している（図５Ｂと表７）。二価のＨｅｒ２結合分子Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン−４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４は、Ｈｅｒ２（Ｔｒａｓ）−４−１ＢＢＬよりも低いＭＦＩ（図５Ａ）を示したが、より低いＥＣ５０（表６）を示した  −  これは、２つのＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）−標的分子の親和性（一価結合）とアビディティー（二価結合）の間の違いを反映している。
【０３０９】
2021520805.tif 000027
３．２．生物活性アッセイ
３．２．１  ヒト４−１ＢＢを発現するＪｕｒｋａｔ細胞及びＮＦκＢ−ｌｕｃレポーターカセットにおけるＮＦκＢ活性化
Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２レポーター細胞株をＰｒｏｍｅｇａ（ＣＳ１９６００４）から注文し、１０％ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１６０００−０４４）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＧＩＢＣＯ、カタログ番号３５０５０−０３８）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ−非必須アミノ酸溶液（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ７１４５）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号Ｈ０８８７）、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８（ロッシュ、カタログ番号０４７２７８９４００１）及び４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（ロッシュ、カタログ番号１０８４３５５５００１）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＧＩＢＣＯ、カタログ番号４２４０１−０４２）中で培養した。活性化アッセイをセットアップするために、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２を１０％ＦＣＳと２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを補充したＲＰＭＩ  １６４０（以下アッセイ培地という）に再懸濁させ、組織培養処理した平底白色９６ウェルプレート（Ｈｕｂｅｒ  ｌａｂ，ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）の各ウェルに１００  μμＬ中に２０｀０００個の細胞を、又は組織培養処理した平底白色３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３８２６）の各ウェルに１０  μＬ中に２｀０００個の細胞を播種した。その後、５０μＬ（９６ウェルプレート）又は１０μＬ（３８４ウェルプレート）のアッセイ培地又はＨｅｒ２発現腫瘍細胞のいずれか（ＳＫ−Ｂｒ３、ＫＬＰ−４又はＮＣＩ−Ｎ８７のいずれか、９６ウェルプレートで１００｀０００細胞／ウェル又は３８４ウェルプレートで１０｀０００細胞／ウェル）を添加した。最後に、異なる滴定濃度の、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ、Ｈｅｒ２（ａｆｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ若しくはＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬと呼ばれる一価Ｈｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃｃ融合抗原結合分子、又は非標的化コントロールＤＰ４７−４−１ＢＢＬ、又は抗ヒト４−１ＢＢ抗体２０Ｈ４．９  ｈｕＩｇＧ４若しくはＭＯＲ−７４８０  ｈｕＩｇＧ２、又は融合タンパク質Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン−４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４若しくはその非標的コントロールＤＰ４７−アンチカリン−４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４、又はコントロール抗体Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ若しくはＨｅｒ２（ＰＥＲ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ若しくはＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡを含有するアッセイ培地を５０μＬ（９６ウェルプレート）又は１０μＬ（３８４ウェルプレート）加えた。プレートを細胞培養インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。
【０３１０】
９６ウェルプレートを用いてルシフェラーゼ活性を検出するために、プレートを２００μＬ／ウェルＤＰＢＳで２回洗浄した。４０μｌの新鮮なＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ３９７１）を各ウェルに添加し、プレートを２０℃で一晩保存した。翌日、凍結したプレート及び検出バッファー（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  １０００  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｅ４５５０）を室温に解凍した。１００μＬの検出バッファーを各ウェルに添加し、積分時間５００ｍｓ、フィルターなし、全波長収集、トップ読み取りでマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して、プレートを可能な限り高速で測定した。
【０３１１】
３８４ウェルプレートを用いてルシフェラーゼ活性を検出するために、各ウェルに室温に解凍したばかりのＯｎｅ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１１０）６μ」Ｌを添加し、プレートを５００ｍｓ積分時間、フィルターなし、全波長収集、トップ読み取りでＴｅｃａｎマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を用いて、可能な限り高速で測定した。ルシフェラーゼを介したルシフェリン酸化による発光を、放出光の単位（ＵＲＬ）として検出した。データは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ）を用いて分析した。
【０３１２】
図６において、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦＢ−ｌｕｃ２活性化アッセイのセットアップを示す。図７Ａから７Ｆに示すように、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬとＨｅｒ２（ａｆｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬは、Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞の存在下で同様の活性を示す（図７Ｂ及び７Ｃ）一方、融合タンパク質Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ１は、より低い活性のポテンシャル（曲線下面積の減少で示される）及び表８に記載のより高いＥＣ５０値を示す。３つ全てのＨｅｒ２標的４−１ＢＢアゴニスト分子は、Ｈｅｒ２発現細胞の非存在下では、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２の活性化を全く誘導しない（図７Ａ）。アゴニスト抗ヒト４−１ＢＢクローン２０Ｈ４．９  ｈｕＩｇＧ４のみが、Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞の有無に関係なく、Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２活性化を誘導することができた（図７Ｄ、７Ｅ及び７Ｆ）。
【０３１３】
2021520805.tif 000028
【０３１４】
図８Ａから８Ｄで、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬを、Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬと比較している。より低い親和性バインダーであるトラスツズマブ（ＴＲＡＳ）のために、Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬは、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬよりも低い活性を示している（図８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄ）。これは、表９では、曲線下面積がより低く、ＥＣ５０値がより高く表示されている。Ｈｅｒ２＋腫瘍細胞の非存在下では、両分子は、レポーター細胞株Ｊｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦＫＢ−ｌｕｃ２を活性化しなかった（図８Ａ）。この場合も、融合タンパク質Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ１は、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ又はＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬよりも低い活性を示し、曲線下面積が小さく、プラトー値が低く、ＥＣ５０が高くなっている（図８Ｂ−８Ｄ及び表９に示されている）。図７と同様に、この実験でも、Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞の有無に関係なく、アゴニスト抗ヒト４−１ＢＢクローン２０Ｈ４．９ｈｕＩｇＧ４のみがＪｕｒｋａｔ−ｈｕ４−１ＢＢ−ＮＦｋＢ−ｌｕｃ２活性化を誘導できた。
【０３１５】
2021520805.tif 000029
【０３１６】
３．２．２  Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７の存在下でのヒトＰＢＭＣの活性化アッセイ
Ｈｅｒ２結合を介した架橋には、Ｈｅｒ２を発現する付着性ヒト胃癌細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７を使用した。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞をＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０  ３２６）で洗浄し、酵素フリー、ＰＢＳベースのＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１３１５１−０１４）で３７℃で１５分間処理した。細胞を採取し、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ７１４５）及び５０μＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号（Ｃｙｔ．−Ｎｏ．）Ｍ３１４８）を補充したＲＰＭＩ  １６４０からなるＴ細胞培地に再懸濁させ、５０Ｇｙで照射した（Ｘ−Ｒａｙ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ  ＲＳ  ２０００、Ｒａｄ  Ｓｏｕｒｃｅ社製）。
【０３１７】
５０μＬのＴ細胞培地中の２ｘ１０４ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、丸底組織培養９６ウェルプレート（ＴＴＰ、カタログ番号９２６９７）の各ウェルに播種した。異なる滴定濃度の、ヒト一価Ｈｅｒ２標的化スプリット三量体４−１ＢＢリガンドＦｃｃ融合抗原結合分子Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ、Ｈｅｒ２（ａｆｆ−ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬ若しくはＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬ、又は非標的化コントロール分子ＤＰ４７−４−１ＢＢＬ、又はアゴニスト抗ヒト４−１ＢＢ抗体抗ヒト４−１ＢＢクローン２０Ｈ４．９  ｈｕＩｇＧ４若しくは抗ヒト４−１ＢＢクローンＭＯＲ−７４８０  ｈｕＩｇＧ２、又は融合タンパク質Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン−４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４若しくはその非標的コントロールＤＰ４７−アンチカリン−４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４、又はコントロール抗体Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ若しくはＤＰ４７  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡを含有するアッセイ培地を５０μＬ加えた。健康なドナーのバフィーコートから単離されたヒトＰＢＭＣを、４０ｎＭ  ＣＦＤＡ−ＳＥ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２１８８８−２５ＭＧ−Ｆ）を含有する３７℃の温かいＤＰＢＳ中で３７℃で１５分間標識した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加することによりＣＦＳＥ標識を停止させ、ＰＢＭＣを２回洗浄し、Ｔ細胞培地に再懸濁させて最終濃度を１．５ｘ１０６細胞／ｍＬにした。このＰＢＭＣ細胞溶液５０μＬを各ウェルに播種し、ウェルあたり７．５ｘ１０４個のＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣを添加した。最後に、８ｎＭアゴニスト抗ヒトＣＤ３ヒトＩｇＧ１クローンＶ９を含有するＴ細胞培地のストック溶液を調製し、５０μＬ／ウェルを各ウェルに添加し、最終濃度２ｎＭの抗ヒトＣＤ３ヒトＩｇＧ１クローンＶ９を得た。
【０３１８】
プレートを細胞インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１：１０００に希釈したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ３４９５７）を含む１００μＬ／ウェルＤＰＢＳで４℃で３０分間染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルＤＰＢＳで１回洗浄し、０．１μｇ／ｍＬ  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ヒトＣＤ１３７マウスＩｇＧ１κ（クローン４Ｂ４−１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０９８１４）、０．１μｇ／ｍＬ  ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ヒトＰＤ−１マウスＩｇＧ１κ（クローンＥＨ１２．２Ｈ７，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２９９１８）、０．０３μｇ／ｍＬ  ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ２５マウスＩｇＧ１κ（クローンＢＣ９６，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０２６１０）、０．０６μｇ／ｍＬ  ＡＰＣ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ヒトＣＤ８マウスＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ−Ｔ８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３０１０１６）、ＢＶ４２１コンジュゲート抗ヒトＣＤ４マウスＩｇＧ１κ（クローンＲＰＡ−Ｔ４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）を含有する５０μＬ  ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）及び７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を補充したＤＰＢＳ）を用い、４℃で３０分間染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬ／ウェルの新たに調製したＦｏｘＰ３Ｐｅｒｍ／Ｆｉｘバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号００−５１２３）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、新たに調製した、１：２５０希釈した抗ヒトグランザイムＢマウスＩｇＧ１κ（クローンＧＢ１１、ロット４２６９８０３，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５６１１４２）を補充した５０μＬ／ウェルのＰｅｒｍバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号００−８３３３）に再懸濁させ、４℃で１時間インキュベートした。２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳでプレートを２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含有するＤＰＢＳで１５分間細胞を固定した。細胞を、１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて取得した。データは、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０３１９】
図９において、ＰＢＭＣ活性化アッセイのセットアップを示す。図１０Ａから１０Ｆ及び図１１Ａから１１Ｆに示すように、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬは、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）のアップレギュレーション（図１０Ａと１１Ａ）、グランザイムＢの細胞内増加（図１０Ｂと１１Ｂ）、及び増殖の増加（図１０Ｃと１１Ｃ）によって示される、ＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞の最も強い活性化を誘導した。Ｈｅｒ２（ＴＲＡＳ）−４−１ＢＢＬも、ＣＤ８  Ｔ細胞（図１０Ａ−１０Ｃ）及びＣＤ４  Ｔ細胞（図１１Ａ−１１Ｃ）の強い活性化を誘導したが、ＥＣ５０値が高かった。融合ポリペプチドＨｅｒ２（ＴＲＡＳ）−アンチカリン４−１ＢＢ  ｈｕＩｇＧ４は、主にＣＤ２５＋、グランザイムＢｈｉｇｈ、増殖中のＣＤ８  Ｔ細胞（図１０Ａ−１０Ｃ）及びＣＤ４  Ｔ細胞（図１１Ａ−１１Ｃ）のはるかに低い頻度で示されている、Ｔ細胞の少ない活性化を媒介した。アゴニスト抗ヒト４−１ＢＢクローン２０Ｈ４．９ｈｕＩｇＧ４抗体は、再びある程度の活性化ポテンシャルを示すが、Ｈｅｒ２標的４−１ＢＢアゴニストポリペプチドほど強力ではない（図１０Ｄ−１０Ｆ及び図１１Ｄ−１１Ｆ）。ＥＣ５０値及びバックグラウンドを超える曲線下面積の値を表１０と表１１に示す。
【０３２０】
2021520805.tif 000030
【０３２１】
2021520805.tif 000031
【０３２２】
３．２．３  Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞株ＫＰＬ−４の存在下でのマウス脾細胞の活性化アッセイ
Ｈｅｒ２結合を介した架橋には、Ｈｅｒ２を発現する付着性ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ−４を使用した。ＫＰＬ−４細胞をＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０  ３２６）で洗浄し、酵素フリー、ＰＢＳベースのＣｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１３１５１−０１４）で３７℃で１５分間処理した。細胞を採取し、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍ７１４５）及び５０μＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号（Ｃｙｔ．−Ｎｏ．）Ｍ３１４８）を補充したＲＰＭＩ  １６４０からなるＴ細胞培地に再懸濁させ、５０Ｇｙで照射した（Ｘ−Ｒａｙ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ  ＲＳ  ２０００，Ｒａｄ  Ｓｏｕｒｃｅ社製）。
【０３２３】
Ｔ細胞培地５０μＬ中の２ｘ１０４の照射ＫＰＬ−４細胞を、丸底組織培養９６ウェルプレート（ＴＴＰ、カタログ番号９２６９７）の各ウェルに播種した。異なる滴定濃度のマウスサロゲートｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２又は非標的化コントロールｍｕ４−１ＢＢ  ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧを含む５０μＬのＴ細胞培地を添加した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの新鮮な脾臓からマウス脾臓を分離した（Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、製造元のプロトコールに従った）。その後、赤血球をＡＣＫ溶解バッファー（ｄｄＨ２Ｏ中、０．１５Ｍ  ＮＨ４ＣＬ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中で室温で１０分間インキュベートすることにより溶解した。Ｔ細胞培地を加えることにより溶解を停止し、細胞をＤＰＢＳで洗浄した。マウス脾細胞を、０．５μＭ  ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット増殖色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｃ３４５５７）を含有する３７℃の温かいＤＰＢＳ中で３７℃で１５分間インキュベートすることにより標識した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加することによりＣＦＳＥ標識を停止させ、マウス脾細胞を２回洗浄し、Ｔ細胞培地に再懸濁させて最終濃度を３ｘ１０６細胞／ｍＬにした。このマウス脾細胞細胞溶液５０μＬを各ウェルに播種し、１ウェルあたり１５ｘ１０４個のバイオレット増殖色素標識マウス脾細胞を添加した。最後に、２μｇ／ｍＬのアゴニスト抗マウスＣＤ３εアルメニアンハムスターＩｇＧ１クローン１４５２Ｃ１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  カタログ番号１００３３１）を含有するＴ細胞培地のストック溶液を調製し、各ウェルに５０μＬ／ウェルを添加し、最終濃度０．５μｇ／ｍＬのアゴニスト抗マウスＣＤ３εアルメニアンハムスターＩｇＧ１クローン１４５２Ｃ１１を得た。
【０３２４】
プレートを細胞インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、１：１０００に希釈したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ３４９５７）を含む１００μＬ／ウェルＤＰＢＳで４℃で３０分間染色した。細胞を２００μＬ／ウェルＤＰＢＳで１回洗浄し、０．６７μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ８ａ−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７１４、クローン５３−６．７、ラットＩｇＧ２ａ  κ）、０．６７μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ４−ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４１２  クローンＧＫ１．５、ラットＩｇＧ２ｂ、κ）、０．６７μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ１３７−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０６１０６、クローン１７Ｂ５、シリアンハムスターＩｇＧ）、０．６７μｇ／ｍＬ抗マウスＣＤ２５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０１９１２、クローン３Ｃ７、ラットＩｇＧ２ｂ、κ）を含有する５０μμＬのＦＡＣＳバッファー（２％ＦＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１７７）と７．５ｍＭアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓ２００２）を補充したＤＰＢＳ）を４℃で３０分間染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬ／ウェルの新たに調製したＦｏｘＰ３Ｐｅｒｍ／Ｆｉｘバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号００−５１２３）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＥｏｍｅｓ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５３−４８７５−８２、クローンＤａｎ１１ｍａｇ、ｒａｔＩｇＧ２ａ）を補充した、新たに調製した５０μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号００−８３３３）に再懸濁させ、４℃で１時間インキュベートした。２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳでプレートを２回洗浄し、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）を含有するＤＰＢＳで１５分間細胞を固定した。細胞を、１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて取得した。データは、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）及びＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いて解析した。
【０３２５】
図１２において、マウス脾細胞活性化アッセイのセットアップを示す。図１３Ａから１３Ｄに示すように、マウスサロゲートｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２は、ＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）のアップレギュレーション（図１３Ａと１３Ｃ）及び増殖の増加（図１３Ｂと１３Ｄ）によって示されるＣＤ８  Ｔ細胞及びＣＤ４  Ｔ細胞の活性化を誘導した。対照的に、非標的アゴニストｍｕ４−１ＢＢ  ｍｕＩｇＧ１  ＤＡＰＧは、このような活性化を誘導しなかった。したがって、この相乗的な共刺激効果は、Ｈｅｒ２架橋に強く依存する。ＥＣ５０値及びバックグラウンドを超える曲線下面積の値を表１２と表１３に示す。
【０３２６】
2021520805.tif 000032
【０３２７】
2021520805.tif 000033
【０３２８】
実施例４
Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬとＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体の併用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬとＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体（Her2 TDB, Junttila et al., 2014）の併用を試験するために、ペルツズマブ（２Ｃ４）由来のＦａｂを用いて、本発明者らは、Ｈｅｒ２に結合する４−１ＢＢＬ二重特異性分子を生成した（図２Ａ）。トラスツズマブベースのＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体（Ｈｅｒ２−ＴＤＢ）はＨｅｒ２のドメインＩＶに結合する（Cho et al., 2003）のに対し、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬはＨｅｒ２のドメインＩＩに非競合的に結合する（Franklin et al., 2004）。Ｈｅｒ２  ＴＤＢは、国際公開第２０１５／０９５３９２号に記載されているように作製された。マウスサロゲートは、「ノブ」アームがマウス抗ＨＥＲ２（ｈｕ４Ｄ５）であり、「ホール」アームがキメラ抗マウスＣＤ３（２Ｃ１１）であるｍｕＩｇＧ２ａ  ＨＥＲ２  ＴＤＢである（Leo et al. Proc Natl Acad Sci USA. 84: 1374-1378, 1987）。
【０３２９】
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞単離：
Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を用いて、健康なボランティアの血液からヒトＰＢＭＣを分離した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（＃１３０−０９４−１５６）のヒトＣＤ８＋  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、ネガティブセレクションによって、ＣＤ８＋細胞をＰＢＭＣから抽出した。
【０３３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞活性化：
フローサイトメトリー細胞染色用の抗体は全て、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンホセ）からのものであった。ヒトＣＤ８＋細胞及びヒト乳がん細胞株ＳＫＢＲ３細胞（比率３：１）を、被験物の存在下、平底９６ウェルプレート（ＢＤ）中で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を新しいＶ底９６ウェルプレートに移した。細胞を、抗ＣＤ８−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ６９−ＰＥ及び抗ＣＤ２５−ＡＰＣで染色した。ＣＤ６９及びＣＤ２５表面発現を、フローサイトメトリーによりＣＤ８＋  Ｔ細胞上で検出した。Ｔ細胞活性化としてＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ２５＋の割合を報告した。
【０３３１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的細胞死滅：
エフェクター細胞（ヒトＣＤ８＋細胞）と標的細胞（ＳＫＢＲ３、ウェルあたり２０，０００細胞の密度で）を、被験物の存在下、黒色のクリアボトム９６ウェルプレート中で３：１の比率で４８時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞上清を捨て、プレートをＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏｗ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｇ７５７０）を添加し、説明書に記載されているようにルミノメーターでプレートを読み取った。
【０３３２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖＆生存アッセイ：
ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖応答を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）蛍光強度希釈を測定することによって検出した。簡潔には、ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＣＦＳＥで標識し、ＳＫＢＲ３標的細胞及び被験物と共培養した。ＨＥＲ２  ＴＤＢを１００ｎｇ／ｍｌで使用し、４−１ＢＢアゴニストを１０００ｎｇ／ｍｌで使用した。０日目（新鮮に単離され、標識されたＣＤ８＋）、３日目及び７日目からの細胞のアリコートを、フローサイトメトリーでＣＦＳＥ蛍光強度を分析した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存率を、０日目、３日目及び７日目の生きたＣＤ８＋  Ｔ細胞の数によって測定した。
【０３３３】
予想通り、単剤のＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではＴ細胞活性化又は標的細胞死滅を誘導しなかった（それぞれ図１４Ａ及び１４Ｂ）。抗ＨＥＲ２／ＣＤ３−ＴＤＢは強いＴ細胞活性化と腫瘍細胞死滅を誘導したが、これはＨｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬとの共処理では実質的に増強されなかった。対照的に、Ｈｅｒ２（ＰＥＲ）−４−１ＢＢＬの添加は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗ＨＥＲ２／ＣＤ３−ＴＤＢ誘導Ｔ細胞増殖／生存を実質的に増強した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。
【０３３４】
実施例５
マウスサロゲートＨｅｒ２（２Ｃ４）−４−１ＢＢとＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体の併用によるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
マウス４−１ＢＢアゴニストの抗腫瘍活性は、ヒトＨＥＲ２発現Ｆｏ５腫瘍同種移植片を移植した免疫適格マウスにおいて試験された（Lewis Phillips et al., 2008）。単剤ＨＥＲ２  ＴＤＢ処置は、典型的には、このモデルの処置において一過性の応答をもたらし、完全な応答は、高用量レベルであってもまれである（Li et al., 2018）。ｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２とＴＤＢの共処置は、応答の有意な改善をもたらさなかったが、Ｈｅｒ２  ＴＤＢとｍｕ４−１ＢＢ−Ｈｅｒ２の併用で処置された７頭のマウスのうち４頭（５７％）は、試験終了時に検出可能な腫瘍を伴わない完全な応答を示した（図１６Ｄ）。
【０３３５】
抗腫瘍効果−Ｆｏ５腫瘍同種移植モデル：
メスＦＶＢ  ＷＴマウスの第３乳腺脂肪パッドのすぐ吻側の皮膚に１ｃｍの切開を行った。腫瘍のためのポケットを第２／３乳腺脂肪パッドに作り、２ｘ２ｍｍのＭＭＴＶ−Ｈｅｒ２−トランスジェニックファウンダー＃５（Ｆｏ５）腫瘍切片（Lewis Phillips et al., 2008）をポケットに入れた。創傷クリップを用いて皮膚を閉じた。創傷クリップは手術後７〜１０日目に除去され、触知可能な腫瘍の出現についてマウスをモニターした。腫瘍体積が平均約１９０ｍｍ３まで成長したとき、同等の腫瘍体積平均サイズを有する治療コホートに入れた。
【０３３６】
担腫瘍マウスを、１群７頭ずつの群に分けた（Ｎ＝７）。１つの群は、０、７、１４日目の週２回（ｑｗｘ２）ＨＥＲ２  ＴＤＢの０．５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与によって処置された。もう１つの群は、１０ｍｇ／ｋｇ用量のｍｕ４−１−ＢＢ−ＨＥＲ（２Ｃ４）（マウスサロゲート）の週２回（ｑｗｘ２）、０日目にｉ．ｖ．、７日目にｉ．ｐ．注入により処置され、更にもう１つの群は、０、７、１４日目の週２回（ｑｗｘ２）Ｈｅｒ２  ＴＤＢの０．５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与と、１０ｍｇ／ｋｇ用量のｍｕ４−１−ＢＢ  Ｈｅｒ２（２Ｃ４）（マウスサロゲート）の週２回（ｑｗｘ２）、０日目にｉ．ｖ．、７日目にｉ．ｐ．注入により処置された。コントロール群はビヒクルのみで処置した。
【０３３７】
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【図１Ａ−Ｂ】
2021520805.tif 000034
【図２Ａ】
2021520805.tif 000035
【図２Ｂ】
2021520805.tif 000036
【図３Ａ】
2021520805.tif 000037
【図３Ｂ】
2021520805.tif 000038
【図３Ｃ】
2021520805.tif 000039
【図４Ａ−Ｄ】
2021520805.tif 000040
【図５Ａ−Ｂ】
2021520805.tif 000041
【図６】
2021520805.tif 000042
【図７Ａ−Ｆ】
2021520805.tif 000043
【図８Ａ−Ｄ】
2021520805.tif 000044
【図８Ｅ−Ｈ】
2021520805.tif 000045
【図９】
2021520805.tif 000046
【図１０Ａ−Ｆ】
2021520805.tif 000047
【図１１Ａ−Ｆ】
2021520805.tif 000048
【図１２】
2021520805.tif 000049
【図１３Ａ−Ｄ】
2021520805.tif 000050
【図１４Ａ−Ｂ】
2021520805.tif 000051
【図１５Ａ−Ｂ】
2021520805.tif 000052
【図１６Ａ−Ｄ】
2021520805.tif 000053
【配列表】
2021520805000001.app
【国際調査報告】
2021520805.tif 000054
2021520805.tif 000055
2021520805.tif 000056
2021520805.tif 000057
2021520805.tif 000058