(57)【要約】本発明は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチドが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合に、上記ペプチドまたはそのバリアントもしくは断片に特異的に結合することが可能なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、操作された調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に関する。本発明は、操作されたＴｒｅｇを提供するための方法、ならびに前記操作されたＴｒｅｇの方法および使用、ならびに前記Ｔｒｅｇをコードするベクターおよびベクターのキットにさらに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合に、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）を含む前記ペプチドまたは配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有するバリアントまたはその断片に特異的に結合することが可能なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、操作された調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）。
【請求項２】
前記ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１分子によって提示されることが可能である、請求項１に記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項３】
前記ＴＣＲが、α鎖およびβ鎖を含み、
前記α鎖および前記β鎖が各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、各ＣＤＲ３の配列が、
CDR3α  -  TVYGGATNKLIFGTGTLLAVQPNIQNPD（配列番号５）
CDR3β  -  SARGGSYNSPLHFGNGTRLTVTE（配列番号６）
または最大で３アミノ酸の変化を有するこれらの配列のバリアント
である、先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項４】
前記ＴＣＲの前記α鎖が、以下のアミノ酸配列：
CDR1α  -  TISGTDY（配列番号７）
CDR2α  -  GLTSN（配列番号８）
CDR3α  -  TVYGGATNKLIFGTGTLLAVQPNIQNPD（配列番号９）
または最大で３アミノ酸の変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み；
前記ＴＣＲの前記β鎖が、以下のアミノ酸配列：
CDR1β  -  DFQATT（配列番号１０）
CDR2β  -  SNEGSKA（配列番号１１）
CDR3β  -  SARGGSYNSPLHFGNGTRLTVTE（配列番号１２）
または最大で３アミノ酸の変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含む、請求項３に記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項５】
ａ）前記ＴＣＲの前記α鎖の可変領域が、配列番号１９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記配列同一性が、請求項４に記載のＣＤＲ配列を含まず；
（ｂ）前記ＴＣＲの前記β鎖の可変領域が、配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記配列同一性が、請求項４に記載のＣＤＲ配列を含まない、
請求項４に記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項６】
（ａ）前記ＴＣＲの前記α鎖の可変領域が、配列番号１９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＴＣＲの前記β鎖の可変領域が、配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１から４のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項７】
前記ＴＣＲの前記α鎖およびβ鎖の定常領域ドメインが各々、前記α鎖と前記β鎖との間での追加のジスルフィド結合の形成を可能にする、さらなるシステイン残基を含む、先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項８】
（ａ）前記ＴＣＲの前記α鎖が、配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記ＴＣＲの前記β鎖が、配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項９】
被験体から単離されたＴ細胞に由来する、先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇ。
【請求項１０】
先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇを含む医薬組成物。
【請求項１１】
疾患を処置する際の使用のための、先行する請求項のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物。
【請求項１２】
医薬の製造における、請求項１から１０のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物の使用。
【請求項１３】
疾患を処置または予防することを必要とする被験体において疾患を処置または予防するための方法であって、請求項１から１０のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
前記疾患が多発性硬化症である、請求項１１から１３のいずれかに記載の、使用のための操作されたＴｒｅｇもしくは医薬組成物、使用または方法。
【請求項１５】
前記被験体が、ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１陽性の被験体である、請求項１１から１４のいずれかに記載の、使用のための操作されたＴｒｅｇもしくは医薬組成物、使用または方法。
【請求項１６】
請求項１から９のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードする核酸配列およびＦＯＸＰ３をコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１から９のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドまたはベクターと、ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドまたはベクターとを含む、ポリヌクレオチドまたはベクターのキット。
【請求項１８】
請求項１から９のいずれかに記載の操作されたＴｒｅｇを産生するための方法であって、細胞中に、請求項１から９のいずれかに記載のＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む、方法。
【請求項１９】
前記細胞中に、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞が、ＦＯＸＰ３を発現する天然のＴｒｅｇである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞が通常のＴ細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３をコードする前記ポリヌクレオチドを導入するステップが、順次、別々にまたは同時に実施される、請求項１９または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＣＲをコードする前記ポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３をコードする前記ポリヌクレオチドが、請求項１６に記載のベクターを使用して前記細胞に導入される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、操作された調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に関する。特に、本発明は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に特異的に結合することが可能なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴｒｅｇに関する。本発明は、操作されたＴｒｅｇを提供するための方法、ならびに前記操作されたＴｒｅｇの方法および使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの自己免疫性および炎症性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患には、自己反応性Ｔ細胞が関与する。例えば、多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系の自己免疫性炎症性脱髄性状態であり、若い成人において最も一般的な神経学的障害である。
【０００３】
自己免疫性および炎症性ＣＮＳ疾患のための現行の処置は、一般に、免疫系を抑制する。例えば、１つの処置は、細胞増殖抑制薬および免疫抑制（immunosupressive）薬の投与に加えて、骨髄の移植を含む。自家造血幹細胞移植は、一部の患者について持続的な有益な効果を有し得るが、この手順は、かなりの毒性およびリスクと関連する攻撃的な骨髄破壊的コンディショニングを要求する。
【０００４】
いくつかの疾患改変性処置（ＤＭＴ）が、臨床的再発の頻度を低減させるために承認されているが、ほとんどの患者は、現行の治療スケジュールの下で臨床的に悪化し続ける。ＤＭＴも幹細胞移植も、自己免疫性および炎症性ＣＮＳ疾患の免疫病理のＣＮＳ特異的抑制を媒介することができない。
【０００５】
現在、自己免疫性および炎症性ＣＮＳ疾患のための有効な処置は存在しない。処置は、通常は免疫系の全般的な抑制によって、その症状を低減させることにのみ焦点を当てている。ＣＮＳ疾患の開始および進行と関連する局所的免疫応答を特異的に標的化する治療が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、Ｔ細胞受容体遺伝子導入テクノロジーを、抗原特異的Ｔｒｅｇを生成するために使用することができるという、本発明者らの決定に少なくとも一部基づく。ヒト抗原特異的Ｔｒｅｇは、活性化されたＴ細胞を抑制できることが示されている。
【０００７】
特に、本発明者らは、例えば、精製されたＴｒｅｇ中へのＭＢＰ−ＴＣＲ遺伝子のレトロウイルス導入によって、ならびに通常のＣＤ４＋Ｔ細胞中へのＭＢＰ−ＴＣＲおよびフォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）遺伝子のレトロウイルス導入によって、ＭＢＰ特異的Ｔｒｅｇを産生した。理論に束縛されることは望まないが、ＭＢＰに対して特異的なＴＣＲを有するこれらの操作されたＴｒｅｇは、疾患、例えば、自己免疫性疾患の抑制において使用され得、このとき、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＭＢＰ特異的Ｔｒｅｇの局所的活性化が、ＭＳおよび他のＣＮＳ炎症性状態において見られるＣＮＳ病理を抑制し得る。
【０００８】
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らが病原性Ｔ細胞の増殖を抑制するＴｒｅｇを開発することができることは、予測されなかった。Ｔｒｅｇ中のＴＣＲは、通常のＴ細胞中のＴＣＲよりも、自己抗原に対するより高い親和性を有することが、当該分野において以前に示唆された（本明細書に参照により組み込まれる、Pacholczyk  and  Kern  Immunology,  2008.  125(4)  450-458）。島抗原特異的ＴＣＲで形質導入されたＴｒｅｇは、ウイルス抗原特異的ＴＣＲを発現するＴｒｅｇよりも効率が低いことも報告されている。これは、正当なＴｒｅｇ特異的ＴＣＲ要件、例えば、ある特定の親和性要件であり得ることが示唆された。したがって、Ｔｒｅｇレパートリーは、高度に多様であり、通常のＴ細胞のレパートリーと比較して、別個の一連のＴ細胞受容体を有すると考えられた。本発明者らは、通常のＴ細胞から単離されたＭＢＰ特異的ＴＣＲが、Ｔｒｅｇ細胞において首尾よく発現され得、機能的Ｔｒｅｇを産生できることを、予想外に実証した。
【０００９】
したがって、本発明は、ペプチドが主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＨＣ）分子によって提示される場合に、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性を含むペプチドまたはその断片に特異的に結合することが可能なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、操作された調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。
【００１０】
ＭＢＰ１１１−１２９ペプチドは、ＤＲＢ１＊０４０１に弱く結合することが公知である。これは、例えば、高い親和性でＨＬＡ−ＤＲ１５に結合するＭＢＰ８１−９９とは対照的である。
【００１１】
適切には、ＴＣＲは、ペプチドが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合に、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性を有するペプチドまたはその断片に特異的に結合することが可能である。
【００１２】
適切には、ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１分子によって提示されることが可能であり得る。
【００１３】
ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を含み、
α鎖およびβ鎖が各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、各ＣＤＲ３の配列が、
CDR3α  -  TVYGGATNKLIFGTGTLLAVQPNIQNPD（配列番号５）
CDR3β  -  SARGGSYNSPLHFGNGTRLTVTE（配列番号６）
または最大で３アミノ酸の変化を有するこれらの配列のバリアント
であり得る。
【００１４】
ＴＣＲのα鎖は、以下のアミノ酸配列：
CDR1α  -  TISGTDY（配列番号７）
CDR2α  -  GLTSN（配列番号８）
CDR3α  -  TVYGGATNKLIFGTGTLLAVQPNIQNPD（配列番号９）
または最大で３アミノ酸の変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み得；
ＴＣＲのβ鎖は、以下のアミノ酸配列：
CDR1β  -  DFQATT（配列番号１０）
CDR2β  -  SNEGSKA（配列番号１１）
CDR3β  -  SARGGSYNSPLHFGNGTRLTVTE（配列番号１２）
または最大で３アミノ酸の変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み得る。
【００１５】
ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、配列同一性はＣＤＲ配列を含まず；
ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、配列同一性はＣＤＲ配列を含まない。
【００１６】
ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得；
ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００１７】
ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の定常領域ドメインは各々、α鎖とβ鎖との間での追加のジスルフィド結合の形成を可能にする、さらなるシステイン残基を含み得る。適切には、さらなるジスルフィド結合は、内因性ＴＣＲ鎖と誤って対になることを低減させる。
【００１８】
ＴＣＲのα鎖は、配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得；
ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００１９】
一態様では、被験体から単離されたＴ細胞に由来する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、本発明に従う操作されたＴｒｅｇを含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、疾患を処置する際の使用のための、本発明に従う操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、医薬の製造における、本発明に従う操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物の使用に関する。
【００２３】
一態様では、疾患を処置または予防することを必要とする被験体において疾患を処置または予防するための方法であって、本発明に従う操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００２４】
別の態様では、疾患が多発性硬化症である、本発明に従う使用のための操作されたＴｒｅｇもしくは医薬組成物、使用または方法が提供される。
【００２５】
一態様では、被験体が、ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１陽性の被験体である、本発明に従う使用のための操作されたＴｒｅｇもしくは医薬組成物、使用または方法が提供される。
【００２６】
別の態様では、本明細書に記載のＴＣＲをコードする核酸配列およびＦＯＸＰ３をコードする核酸配列を含むベクターが提供される。
【００２７】
一態様では、本明細書に記載のＴＣＲをコードする核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドまたはベクターと、ＦＯＸＰ３をコードする核酸配列を含む第２のポリヌクレオチドまたはベクターとを含む、ポリヌクレオチドのキットまたはベクターのキットが提供される。適切には、第１および第２のポリヌクレオチドまたはベクターは、別々である。
【００２８】
一態様では、本発明に従う操作されたＴｒｅｇを産生するための方法であって、細胞中に、本明細書で規定されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む方法が提供される。
【００２９】
適切には、Ｔ細胞は、ＦＯＸＰ３を発現する天然のＴｒｅｇである。
【００３０】
一態様では、この方法は、細胞中に、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップをさらに含む。
【００３１】
適切には、細胞はＴ細胞である。
【００３２】
適切には、Ｔ細胞は、「通常の」Ｔ細胞である。
【００３３】
本発明の方法の一態様では、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドを導入するステップは、順次、別々にまたは同時に実施される。
【００３４】
本発明の方法の別の態様では、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドは、本発明のベクターを使用して細胞に導入される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、（Ａ）ＭＢＰ  ＴＣＲアルファおよびベータ鎖ならびに（Ｂ）ＦＯＸＰ３プラスＴＣＲアルファおよびベータ鎖をコードするｐＭＰ７１レトロウイルスベクターの概略図である。
【００３６】
【図２】図２は、ＭＳ２−３Ｃ８  ＴＣＲ  ｐＭＰ７１を示す図である。ＭＳ２−３Ｃ８  ＴＣＲは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１によって提示されるＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）を認識する。ＴＣＲはコドン最適化されており、定常アルファドメインおよびベータドメインの両方がマウス化されており、ｃ−アルファとｃ−ベータとの間に追加のジスルフィド結合が加えられている。
【００３７】
【図３】図３は、３’Ｔ２Ａ部位において停止コドンが除去され、ＭＳ−２  ＴＣＲの上流のＲｓｒＩＩ部位およびＥｃｏＲ１部位中に挿入されたＦＯＸＰ３遺伝子を含む、ＦＯＸＰ３−２Ａ−ＭＳ２−３Ｃ８  ＴＣＲ  ｐＭＰ７１を示す図である。
【００３８】
【図４】図４は、研究設計を示す概略図である。Ａ）操作されたＴｒｅｇにおけるＭＢＰ特異的抑制機能の実証。Ｂ）ＨＬＡトランスジェニックマウスモデルにおけるＭＳ様免疫病理を抑制するように操作されたＴｒｅｇの使用。
【００３９】
【図５】図５は、マウスＴＣＲ定常領域およびＦＯＸＰ３の発現を介して形質導入のレベルを評価するために７日目に実施した代表的なフローサイトメトリー分析を示すプロットを示す図である。ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ細胞は、モック形質導入され、またはＴＣＲ（ＭＳ−２）もしくはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３（ＭＳ−２  ＦＯＸＰ３）で形質導入される。
【００４０】
【図６】図６は、非形質導入細胞上の（ｄ０）、または形質導入された細胞集団に対してゲーティングした（ｄ７）、Ｔｒｅｇ表面マーカーの相対的発現を示すグラフである。ｎ＝２〜４。これらの結果は、調節性Ｔ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大増殖（expansion）の間にＦＯＸＰ３発現を維持することを実証している。
【００４１】
【図７】図７は、ペプチドによるエフェクターＴ細胞の再刺激を示すグラフである。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４およびＣＤ８０またはＣＤ８６で形質導入した。ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現する細胞を、引き続く実験のために等量で一緒に混合した。ＣＨＯ細胞を、飽和量（１０μＭ／ｍｌ）のＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）（ＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧ）と共に、培養培地中で１０×１０６／ｍＬで再懸濁した。ＭＳ２またはＭＳ２−ＦＯＸＰ３構築物で形質導入されたＴ細胞を洗浄し、カウントし、完全ＲＰＭＩ中に０．５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を、ペプチドありまたはなしで、インキュベートしたＣＨＯ細胞と共に１：１で４時間蒔いた。細胞を固定し、透過処理（permeablised）し、その後、ＩＬ−２に対する抗体およびＩＦＮγに対する抗体で染色した。Ｔ細胞の形質導入効率は、「Ｔｄ＝」によって示される。
【００４２】
【図８】図８は、ペプチドによるＴｒｅｇ細胞の再刺激を示すグラフである。方法は、エフェクターＴ細胞の代わりにＴｒｅｇを使用した、図７について上記したものであった。
【００４３】
【図９】図９は、形質導入されたＴ細胞を、ペプチド（pepide）パルスした照射（irradtiated）ＡＰＣありまたはなしで４日間培養したことを示す図である。上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２およびＩＦＮｇについてアッセイした（ｎ＝２〜４）。これらのデータは、ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇおよびＴＣＲ−ＦＯＸＰ３変換されたＴｃｏｎｖが、コグネートペプチドに対して低応答性であることを示している。
【００４４】
【図１０】図１０は、ＭＳ２  ＴＣＲを発現する細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮγ産生ならびにＭＳ２  ＴＣＲおよびＦＯＸＰ３を発現するＴ細胞からの産生を示す図である（ｎ＝３）。ＴＣＲおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３で形質導入された通常のＴ細胞（Ｔｃｏｎｖ）は、ＴＣＲ単独で形質導入された通常の細胞よりも少ないＩＬ−２を産生する。
【００４５】
【図１１】図１１は、ＴＣＲ形質導入されたＴｃｏｎｖを、ＣＦＳＥで染色し、１  Ｔｃｏｎｖ：０．０１  ＡＰＣの比で、ペプチドパルスした照射ＡＰＣありまたはなしで４日間培養したことを示す図である。モックＴｒｅｇ（一番左の棒）、ＭＢＰ  ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇ（左から２番目の棒）、ＭＢＰ  ＴＣＲ−ＦＯＸＰ３形質導入されたＴｒｅｇ（左から３番目の棒）およびＭＢＰ  ＴＣＲ−ＦＯＸＰ３形質導入されたＴｃｏｎｖ（各群において、左から４番目の棒）を、示された比で添加した。増殖を、ＣＦＳＥ染色したＴｃｏｎｖの希釈物を分析することによって決定した（Ｂ）。これらのデータは、ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇが、Ｔ細胞応答を抗原特異的様式で抑制することを示している。
【００４６】
【図１２】図１２は、ＴＣＲ形質導入されたＴｃｏｎｖをＣＦＳＥで染色し、１  Ｔｃｏｎｖ：０．０１  ＡＰＣの比で、ペプチドパルスした照射ＡＰＣありまたはなしで４日間培養したことを示す図である。モックＴｒｅｇ（一番左の棒）、ＭＢＰ  ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇ（左から２番目の棒）、ＭＢＰ  ＴＣＲ−ＦＯＸＰ３形質導入されたＴｒｅｇ（左から３番目の棒）およびＭＢＰ  ＴＣＲ−ＦＯＸＰ３形質導入されたＴｃｏｎｖ（各群において、左から４番目の棒）を、示された比で添加した。上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２についてアッセイした。これらのデータは、ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇが、Ｔ細胞応答を抗原特異的様式で抑制することを示している。
【００４７】
【図１３】図１３は、ＭＳ２．３Ｃ８アルファ可変（Ｖａ２６−２）ドメインのアルファ鎖Ｖ領域のヌクレオチド配列である、配列番号１８の配列を示す図である。
【００４８】
【図１４】図１４は、ＭＳ２．３Ｃ８アルファ可変（Ｖａ２６−２）ドメインのアルファ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列である、配列番号１９の配列を示す図である。
【００４９】
【図１５】図１５は、ヒトαＶ領域およびマウス定常領域である、配列番号１３のアミノ酸配列を示す図である。
【００５０】
【図１６】図１６は、ＭＳ２．３Ｃ８ベータ可変ドメインのベータ鎖ヒトＶ領域のヌクレオチド配列である、配列番号２０の配列を示す図である。
【００５１】
【図１７】図１７は、ＭＳ２．３Ｃ８ベータ可変ドメインのベータ鎖ヒトＶ領域のヌクレオチド配列である、配列番号２１のアミノ酸配列を示す図である。
【００５２】
【図１８】図１８は、ヒトβＶ領域およびマウスＣ領域のポリペプチド配列である、配列番号１４の配列を示す図である。
【００５３】
【図１９】図１９は、ＣＤＲ配列を除くＭＳ２．３Ｃ８アルファ可変アミノ酸配列である、配列番号２２の配列を示す図である。
【００５４】
【図２０】図２０は、ＣＤＲ配列を除くＭＳ２．３Ｃ８ベータ可変アミノ酸配列である、配列番号２３の配列を示す図である。
【００５５】
【図２１】図２１は、ＦＯＸＰ３をコードする配列番号２４の核酸配列を示す図である。
【００５６】
【図２２】図２２は、ＦＯＸＰ３である配列番号２５のアミノ酸配列を示す図である。
【００５７】
【図２３−１】図２３は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、ビーズ選別によって、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節および脾細胞から単離したことを示す図である。Ｔｒｅｇを、ＴＣＲ＋マウスＦＯＸＰ３で形質導入した。形質導入された細胞および等しい数のＣＤ４５．１＋ＯＴＩトランスジェニックＴ細胞を、４Ｇｙ照射でコンディショニングしたＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主中に注射した。７日後に、マウスに、不完全フロイント（Freud's）アジュバント中３０ｕｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）または３０ｕｇのＯＶＡおよび３０ｕｇのヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を、右または左の脇腹に皮下注射した  Ａ。対になったＦＡＣＳプロットは、同じマウスの右および左の鼠径部リンパ節中の、ＣＤ４５．１によって同定されたＯＴＩ細胞を示す。左のプロットは、未注射の脇腹（ペプチドなし）からのデータを示し、右のプロットは、ＯＶＡペプチドを注射した脇腹からのデータを示す  Ｂ。対になったＦＡＣＳプロットは、同じマウスの右および左の鼠径部リンパ節中のＯＴＩ細胞を示す。左のプロットは、ＯＶＡを注射した脇腹からのデータを示し、右のプロットは、ＯＶＡ＋ＭＢＰペプチドを注射した脇腹からのデータを示す  Ｃ。ＯＶＡまたはＯＶＡ＋ＭＢＰを受けた脇腹の鼠径部リンパ節中の％ＣＤ４５．１＋細胞（左パネル）およびＣＤ４５．１細胞の絶対数を示す、３つの独立した実験からの累積データ（ｎ＝９）。
【図２３−２】同上。
【図２３−３】同上。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド
ミエリン塩基性タンパク質は、神経のミエリン化のプロセスにおいて重要であり、神経系の細胞、例えば、オリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞のミエリン鞘において見出される。ＭＢＰ転写物は、骨髄および免疫系においても見出される。ミエリン鞘の１つの機能は、軸索インパルス伝導の速度を増加させることである。ＭＢＰは、ミエリンの正しい構造を維持することを助け、ミエリン膜中の脂質と相互作用する。ＭＢＰは、ＣＮＳおよび種々の造血細胞に局在化することが公知である。
【００５９】
ＭＢＰは、脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）の病理発生と関連付けられている。研究により、ＭＳの病理発生における、ＭＢＰに対する抗体の役割が実証されている。
【００６０】
一態様では、ＭＢＰの例示的アミノ酸配列は、配列番号１：
MGNHAGKRELNAEKASTNSETNRGESEKKRNLGELSRTTSEDNEVFGEADANQNNGTSSQDTAVTDSKRTADPKNAWQDAHPADPGSRPHLIRLFSRDAPGREDNTFKDRPSESDELQTIQEDSAATSESLDVMASQKRPSQRHGSKYLATASTMDHARHGFLPRHRDTGILDSIGRFFGGDRGAPKRGSGKDSHHPARTAHYGSLPQKSHGRTQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGKGRGLSLSRFSWGAEGQRPGFGYGGRASDYKSAHKGFKGVDAQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR（配列番号１）
として示される、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０２６８６−１を有する配列を含む。
【００６１】
一態様では、ＭＢＰの例示的アミノ酸配列は、配列番号１またはそのバリアントもしくは断片を含む。
【００６２】
一態様では、ＭＢＰのアミノ酸配列は、配列番号１を含む。
【００６３】
一態様では、ＭＢＰのアミノ酸配列は、配列番号１である。
【００６４】
適切には、ＭＢＰの例示的アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０２６８６−１のアイソフォーム、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０２６８６−５であり得る。アイソフォームＰ０２６８６−５は、以下のように、アミノ酸残基１〜１３３が欠けているという点で、配列番号１で上に示されるカノニカル配列とは異なる。
【００６５】
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０２６８６−５は、配列番号２６：
MASQKRPSQRHGSKYLATASTMDHARHGFLPRHRDTGILDSIGRFFGGDRGAPKRGSGKDSHHPARTAHYGSLPQKSHGRTQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGKGRGLSLSRFSWGAEGQRPGFGYGGRASDYKSAHKGFKGVDAQGTLSKIFKLGGRDSRSGSPMARR（配列番号２６）
として示される。
【００６６】
一態様では、本発明は、ペプチドが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合に、ＭＢＰ１００−１４０：ＰＰＳＱＧＫＧＲＧＬＳＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧ（配列番号２）に対して少なくとも９０％の同一性を含むペプチドまたはその断片に特異的に結合することが可能なＴＣＲを含む、操作されたＴｒｅｇを提供する。
【００６７】
適切には、ＴＣＲは、ペプチドが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合に、ＭＢＰ１００−１４０：ＰＰＳＱＧＫＧＲＧＬＳＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧ（配列番号２）に対して少なくとも９０％の同一性を有するペプチドまたはその断片に特異的に結合することが可能である。
【００６８】
特記しない限り、ＭＢＰ  ＸＸＸ−ＸＸＸは、本明細書で使用する場合、本明細書に参照により組み込まれる、Muraro  et  al.,  JCI  1997;  100,  2,  339-349において使用された番号付けを指す。
【００６９】
当該分野で利用可能な方法を使用して、ペプチドがＭＨＣ分子によって提示されることが可能であるかどうか、およびＴ細胞によって認識されることが可能かどうかを決定することができる。例えば、アッセイは、試験されるＭＨＣ：ペプチド複合体を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、本明細書で規定されるＴＣＲを含むＴ細胞と共に共培養することを含み得る。次いで、Ｔ細胞増殖が、ペプチドの首尾よい提示の指標として測定され得る（例えば、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）アッセイによって）。あるいは、エフェクターサイトカイン産生もまた測定され得る。
【００７０】
一態様では、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１００−１４０：ＰＰＳＱＧＫＧＲＧＬＳＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧ（配列番号２）に対して少なくとも９０％の同一性を含む配列またはその断片を含む。適切には、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１００−１４０（配列番号２）に対して少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、またはその断片である。
【００７１】
適切には、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１００−１４０：ＰＰＳＱＧＫＧＲＧＬＳＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧ（配列番号２）に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列またはその断片を含む。適切には、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１００−１４０（配列番号２）に対して少なくとも９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、またはその断片である。
【００７２】
ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１００−１４０（配列番号２）と比較して変異され得る。例えば、ＭＢＰペプチドは、改変されたＭＢＰペプチドが未改変のペプチドのＭＨＣ結合特異性を保持し、Ｔ細胞に提示されることが可能である限り、アミノ酸挿入、欠失または置換によって変異され得る。ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１００−１４０（配列番号２）と比較して、例えば、３、２、１または０個の変異を有し得る。適切には、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１００−１４０（配列番号２）と比較して、例えば、３、２、１または０個の保存的アミノ酸置換を有し得る。適切には、ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１００−１４０（配列番号２）と比較して、例えば、３、２、１または０個の挿入を有し得る。適切には、ＭＢＰペプチド断片は、ＭＢＰ１００−１４０（配列番号２）と比較して、例えば、３、２、１または０個の欠失を有し得る。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」とは、ＴＣＲがペプチドに結合するが、他のペプチドには結合しない、または他のペプチドに対してはより低い親和性で結合することを意味する。
【００７４】
２つの分子、例えば、ＴＣＲとペプチドまたはその断片との間の結合親和性は、例えば、解離定数（ＫＤ）の決定によって定量され得る。ＫＤは、例えば、表面プラズモン共鳴（surface  plas,on  resonance）（ＳＰＲ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））による、ＴＣＲとペプチドとの間の複合体形成および解離の速度論の測定によって決定され得る。複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ｋａ（またはｋｏｎ）および解離速度定数ｋｄ．（またはｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、方程式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを介して、ｋａおよびｋｄと関連付けられる。
【００７５】
異なる分子相互作用と関連する結合親和性、例えば、異なるＴＣＲとペプチドとの結合親和性の比較は、個々のＴＣＲ／ペプチド複合体についてのＫＤ値の比較によって比較され得る。
【００７６】
ペプチドは、任意のヒト白血球抗原−抗原Ｄ関連（ＨＬＡ−ＤＲ）によって提示されることが可能であり得る。例えば、ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ１５またはＨＬＡ−ＤＲ１６によって提示されることが可能であり得る。
【００７７】
一態様では、ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ４によって提示されることが可能である。
【００７８】
一態様では、ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１分子によって提示されることが可能である。
【００７９】
一態様では、ペプチドは、ＭＢＰ１１１−１２９：ＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧ（配列番号３）に対して少なくとも９０％の同一性を有する。ＭＢＰペプチドは、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）と比較して変異され得る。例えば、ＭＢＰペプチドは、改変されたＭＢＰペプチドが未改変のペプチドのＭＨＣ結合特異性を保持し、Ｔ細胞に提示されることが可能である限り、アミノ酸挿入、欠失または置換によって変異され得る。ペプチドは、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）と比較して、例えば、３、２、１または０個の変異を有し得る。適切には、ペプチドは、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）と比較して、例えば、３、２、１または０個の保存的変異を有し得る。適切には、ペプチドは、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）と比較して、例えば、３、２、１または０個の挿入を有し得る。適切には、ＭＢＰペプチド断片は、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）と比較して、例えば、３、２、１または０個の欠失を有し得る。適切には、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）ペプチド断片は、ＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）ペプチドのＭＨＣ結合特異性を保持し、Ｔ細胞に提示されることが可能である。
【００８０】
一態様では、ペプチドは、ＭＢＰ１１６−１２３：ＷＧＡＥＧＱＲＰ（配列番号４）に対して少なくとも８５％の同一性を有する。
【００８１】
一態様では、ペプチドは、ＭＢＰ１１６−１２３：ＷＧＡＥＧＱＲＰ（配列番号４）と比較して、１、２または３個のアミノ酸置換、挿入または欠失を有する。適切には、ペプチドは、ＭＢＰ１１６−１２３：ＷＧＡＥＧＱＲＰ（配列番号４）と比較して、１、２または３個の保存的アミノ酸置換を有する。適切には、ペプチドは、ＭＢＰ１１６−１２３：ＷＧＡＥＧＱＲＰ（配列番号４）と比較して、１、２または３個の挿入を有する。適切には、ＭＢＰペプチド断片は、ＭＢＰ１１６−１２３：ＷＧＡＥＧＱＲＰ（配列番号４）と比較して、１、２または３個の欠失を有する。適切には、ＭＢＰ１１６−１２３（配列番号４）ペプチド断片は、ＭＢＰ１１６−１２３（配列番号４）ペプチドのＭＨＣ結合特異性を保持し、Ｔ細胞に提示されることが可能である。
【００８２】
一態様では、ペプチドは、ＭＢＰ１１６−１２３：ＷＧＡＥＧＱＲＰ（配列番号４）を含む。
【００８３】
一態様では、ペプチドは、ＭＢＰ１１６−１２３：ＷＧＡＥＧＱＲＰ（配列番号４）である。
【００８４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の両方の可変ドメインは、３つの超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。ＣＤＲ３は、処理された抗原の認識を担う主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１もまた、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、ベータ鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられている。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に位置する。これらの領域は、ＴＣＲ可変領域の構造を提供する。
【００８５】
本発明のＴＣＲは、そのペプチド／ＭＨＣ複合体と相互作用することができるのに十分なその可変ドメインを含む。かかる相互作用は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）機器を使用して測定され得る。適切には、ＴＣＲは、ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１と相互作用し得る。
【００８６】
ＴＣＲ可変領域のレパートリーは、可変（Ｖ）遺伝子、連結（joining）（Ｊ）遺伝子および多様性（Ｄ）遺伝子のコンビナトリアル連結によって；ならびにＮ領域多様化（酵素デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって挿入されたヌクレオチド）によって生成される。
【００８７】
α鎖は、ＶセグメントとＪセグメントとの間の組換え事象から形成される。β鎖は、Ｖ、ＤおよびＪセグメントが関与する組換え事象から形成される。
【００８８】
ＴＣＲδ遺伝子座もまた含むヒトＴＣＲα遺伝子座は、第１４染色体上に位置する（１４ｑ１１．２）。ＴＣＲβ遺伝子座は、第７染色体上に位置する（７ｑ３４）。ＴＣＲα鎖の可変領域は、４６の異なるＶα（可変）セグメントのうちの１つと５８のＪα（連結）セグメントのうちの１つとの間での組換えによって形成される（Koopら；１９９４年；Genomics；１９巻：４７８〜４９３頁、参考として本明細書に援用される）。ＴＣＲβ鎖の可変領域は、５４のＶβセグメントと、１４のＪβセグメントと、２つのＤβ（多様性）セグメントとの間での組換えから形成される（Rowenら；１９９６年；Science；２７２巻：１７５５〜１７６２頁、参考として本明細書に援用される）。
【００８９】
各ＴＣＲ鎖遺伝子座についてのＶおよびＪ（および適宜Ｄ）遺伝子セグメントが同定されており、各遺伝子の生殖系列配列が公知であり、アノテーションされている（例えば、ScavinerおよびLefranc；２０００年；Exp  Clin  Immunogenet；１７巻：８３〜９６頁ならびにFolchおよびLefranc；２０００年；Exp  Clin  Immunogenet；１７巻：４２〜５４頁を参照のこと、参考として本明細書に援用される）。
【００９０】
天然のＴＣＲのα鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３およびＣＤＲ３は、Ｖα遺伝子によってコードされる。天然のＴＣＲのβ鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２およびＦＲ３は、Ｖβ遺伝子によってコードされる。
【００９１】
各可変遺伝子の生殖系列配列は当該分野で公知である（ScavinerおよびLefranc；上記ならびにFolchおよびLefranc；上記）ので、特定のＴＣＲのＶαおよび／またはＶβが配列決定され得、ＴＣＲにおいて利用される生殖系列Ｖセグメントが同定され得る（例えば、Hodgesら；２００３年；J  Clin  Pathol；５６巻：１〜１１頁、Zhouら；２００６年；Laboratory  Investigation；８６巻；３１４〜３２１頁を参照のこと、参考として本明細書に援用される）。
【００９２】
本発明は、操作されたＴ細胞受容体を含む操作されたＴｒｅｇを提供する。
【００９３】
一態様では、本発明は、ペプチドが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合に、ＭＢＰ１００−１４０（配列番号２）に対して少なくとも９０％の同一性を含むペプチドまたはその断片に特異的に結合することが可能なＴＣＲを含む、操作されたＴｒｅｇを提供する。
【００９４】
適切には、本発明は、ペプチドが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合に、ＭＢＰ１００−１４０（配列番号２）に対して少なくとも９０％の同一性を有するペプチドまたはその断片に特異的に結合することが可能なＴＣＲを含む、操作されたＴｒｅｇを提供する。
【００９５】
一態様では、ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を含み、
α鎖およびβ鎖が各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、各ＣＤＲ３の配列が、
CDR3α  -  TVYGGATNKLIFGTGTLLAVQPNIQNPD（配列番号５）
CDR3β  -  SARGGSYNSPLHFGNGTRLTVTE（配列番号６）
または最大で３アミノ酸の変化を有するこれらの配列のバリアント
である。
【００９６】
一態様では、ＴＣＲのα鎖は、以下のアミノ酸配列：
CDR1α  -  TISGTDY（配列番号７）
CDR2α  -  GLTSN（配列番号８）
CDR3α  -  TVYGGATNKLIFGTGTLLAVQPNIQNPD（配列番号９）
または最大で３アミノ酸の変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含み；
ＴＣＲのβ鎖は、以下のアミノ酸配列：
CDR1β  -  DFQATT（配列番号１０）
CDR2β  -  SNEGSKA（配列番号１１）
CDR3β  -  SARGGSYNSPLHFGNGTRLTVTE（配列番号１２）
または最大で３アミノ酸の変化を有するこれらの配列のバリアント
を有する３つのＣＤＲを含む。
【００９７】
適切には、ＣＤＲ中のアミノ酸変化は、保存的置換、挿入または欠失である。好ましくは、アミノ酸変化は、保存的置換である。
【００９８】
一態様では、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この配列同一性は、ＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＣＤＲ配列は、本明細書で開示されるとおりである。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９９】
適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し得るアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この配列同一性は、ＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し得るアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この配列同一性は、ＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し得るアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この配列同一性は、ＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも９７％の配列同一性を有し得るアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、この配列同一性は、ＣＤＲ配列を含まない。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、この配列同一性は、ＣＤＲ配列を含まない。
【０１００】
別の態様では、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖の可変領域は、配列番号１９に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖の可変領域は、配列番号２１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
一態様では、ＴＣＲのα鎖は、配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
適切には、ＴＣＲのα鎖は、配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖は、配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖は、配列番号１３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、ＴＣＲのα鎖は、配列番号１３に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；ＴＣＲのβ鎖は、配列番号１４に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
別の態様では、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の定常領域ドメインは各々、α鎖とβ鎖との間での追加のジスルフィド結合の形成を可能にする、さらなるシステイン残基を含む。
【０１０５】
適切には、さらなるジスルフィド結合の形成のために、定常アルファ鎖中の残基４８は、スレオニンからシステインに変換され、定常ベータ鎖の残基５７は、セリンからシステインに変換される。
【０１０６】
適切には、ＴＣＲは、コドン最適化される。
【０１０７】
適切には、ＴＣＲは、マウスにおける発現のためにコドン最適化される。
【０１０８】
一態様では、ＴＣＲにおいて採用される定常ドメインは、マウス配列である。
【０１０９】
適切には、定常領域は、マウス化されている。例えば、定常アルファドメインおよび定常ベータドメインは共に、マウス化されている。
【０１１０】
別の態様では、ＴＣＲは、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。適切には、ＴＣＲにおいて採用される定常ドメインは、ヒト配列である。
【０１１１】
一態様では、ＴＣＲは、例えば、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含み得る。
【０１１２】
本ＴＣＲは、生殖系列Ｖα遺伝子やＶβ遺伝子によってコードされない、本明細書で規定される１つまたは複数のアミノ酸残基を含み得る。言い換えると、ＴＣＲは、変更されていない生殖系列Ｖα遺伝子またはＶβ遺伝子によってコードされる対応するα鎖および／またはβ鎖と比較して、本明細書に記載される位置のうちの１または複数において変更されたアミノ酸残基を含むα鎖および／またはβ鎖の部分を含み得る。
【０１１３】
本明細書でフレームワーク（ＦＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）と同定されたアミノ酸残基は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）に従って同定される。この系は、当該分野で周知であり（Lefranceら；２００３年；Dev  Comp  Immunol；２７巻：５５〜７７頁）、可変領域の構造の高い保存に基づいている。この番号付けは、ＦＲおよびＣＤＲの定義、Ｘ線回折研究からの構造データならびに超可変ループの特徴付けを考慮に入れ、これらを組み合わせる。
【０１１４】
ＦＲ領域およびＣＤＲ領域の限界は、ＩＭＧＴ番号付け系内で定義される。ＦＲ１領域は、２３位における第１のＣＹＳを伴って、１〜２６位（Ｖ−ＧＥＮＥ群または下位群に依存して２５〜２６アミノ酸）を含む。ＦＲ２領域は、４１位における保存されたＴＲＰを伴って、３９〜５５位（１６〜１７アミノ酸）を含む。ＦＲ３領域は、８９位における保存された疎水性アミノ酸および１０４位における第２のＣＹＳを伴って、６６〜１０４位（ＶＧＥＮＥ群または下位群に依存して３６〜３９アミノ酸）を含む。ＩＧＭＴ番号付け系の残基１は、ＦＲ１中の最初の残基である。ＩＧＭＴ番号付け系の残基１０４は、ＦＲ３中の最後の残基である。
【０１１５】
本発明に従うＴＣＲを生成するために適切な方法は、当該分野で公知である。
【０１１６】
例えば、変異誘発が、ＴＣＲをコードする核酸配列中の特定のヌクレオチドを変更するために実施され得る。かかる変異誘発は、ＴＣＲが本明細書に記載のアミノ酸残基のうちの１つまたは複数を含むように、ＴＣＲのアミノ酸配列を変更する。
【０１１７】
変異誘発法の一例は、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ法である（Papworthら；１９９６年；Strategies；９巻（３号）；３〜４頁）。この方法は、高忠実度非鎖置換（high-fidelity  non-strand-displacing）ＤＮＡポリメラーゼ、例えばｐｆｕポリメラーゼを使用する熱サイクリング反応において鋳型核酸配列を増幅するための相補的変異原性プライマー対の使用を伴う。
【０１１８】
用語「１または複数」または「少なくとも１」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されるように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多くのアミノ酸残基を含み得る。
【０１１９】
用語「２またはそれよりも多く」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれよりも多くのアミノ酸残基を含み得る。
【０１２０】
保存的置換
適切には、本発明において所与の位置に存在するアミノ酸残基は、所与の配列番号について列挙されたアミノ酸と生化学的に類似の残基として定義され得る。
【０１２１】
類似の生化学的特性を有するアミノ酸は、保存的置換を介して置換され得るアミノ酸として定義され得る。
【０１２２】
高発現のＴＣＲが保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性性質における類似性に基づいて保存的アミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれ；類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
【０１２３】
保存的置換を、例えば、以下の表３に従って行うことができる。２番目の列の同じブロック中のアミノ酸、および好ましくは３番目の列の同じ並びのアミノ酸は、互いに置換され得る：
表３
【表１】
2021520831.tif 000002
【０１２４】
本発明は、相同置換（置換および置き換えは共に、代替的残基による既存のアミノ酸残基の交換を意味するために本明細書で使用される）、即ち、同じ条件の下での置換（like-for-like  substitution）、例えば、塩基性を塩基性に、酸性を酸性に、極性を極性に置換することなどもまた包含する。
【０１２５】
具体的な個々のアミノ酸に対する言及によって本明細書で明示的に言及されない限り、アミノ酸は、以下に列挙した保存的置換を使用して置換され得る。
【０１２６】
脂肪族非極性アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン残基であり得る。
【０１２７】
脂肪族極性非荷電アミノは、システイン、セリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギンまたはグルタミン残基であり得る。
【０１２８】
脂肪族極性荷電アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシンまたはアルギニン残基であり得る。
【０１２９】
芳香族アミノ酸は、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシン残基であり得る。
【０１３０】
適切には、保存的置換は、表３中の同じ並びにあるアミノ酸間で行われ得る。
【０１３１】
配列
本発明は、本明細書に記載されるＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖をコードするヌクレオチド配列をさらに提供する。一態様では、本明細書に記載されるＴＣＲをコードするヌクレオチド配列は、細胞中に導入され得る。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、用語「導入される」とは、細胞中に外来ＤＮＡを挿入するための方法を指す。本明細書で使用する場合、導入されるという用語は、形質導入法およびトランスフェクション法の両方を含む。トランスフェクションは、非ウイルス的方法によって細胞中に核酸を導入するプロセスである。形質導入は、ウイルスベクターを介して細胞中に外来ＤＮＡを導入するプロセスである。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、互いに同義であることとする。核酸配列は、任意の適切な型のヌクレオチド配列、例えば、合成ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列または部分的ゲノムＤＮＡ配列であり得る。
【０１３４】
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、通常の意味では、典型的には、α−アミノ基と隣接アミノ酸のカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに接続された、一連の残基、典型的にはＬ−アミノ酸を意味するために使用される。この用語は、「タンパク質」と同義である。
【０１３５】
遺伝コードの縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードし得ることが、当業者によって理解される。さらに、当業者が、慣用的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度（codon  usage）を反映するように、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行い得ることを、理解すべきである。
【０１３６】
本発明に従う核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。これらは、一本鎖または二本鎖であり得る。これらはまた、その中に合成ヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる型の改変が、当該分野で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’末端および／または５’末端におけるアクリジン鎖またはポリリシン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載される使用を目的として、ポリヌクレオチドが当該分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ることを理解すべきである。かかる改変は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために実施され得る。
【０１３７】
ポリヌクレオチドは、単離された形態または組換え形態であり得る。ポリヌクレオチドは、ベクター中に組み込まれ得、ベクターは、宿主細胞中に組み込まれ得る。かかるベクターおよび適切な宿主は、本発明のなおさらなる態様を形成する。
【０１３８】
ポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖であり得、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
【０１３９】
ポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。異なる細胞は、特定のコドンの使用頻度が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに対応する。対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致するようにそれらが調整されるように、配列中のコドンを変更させることによって、発現を増加させることが可能である。適切には、ポリヌクレオチドは、疾患のマウスモデルにおける発現のためにコドン最適化され得る。適切には、ポリヌクレオチドは、ヒト被験体における発現のためにコドン最適化され得る。
【０１４０】
ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、多数の稀なコドンを使用し、一般に使用される哺乳動物コドンに対応するようにこれらを変化させることによって、哺乳動物産生細胞におけるパッケージング成分の発現の増加が達成され得る。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞について、ならびに種々の他の生物について、当該分野で公知である。
【０１４１】
コドン最適化は、ｍＲＮＡ不安定性モチーフおよび潜在性スプライス部位の除去も伴い得る。
【０１４２】
ポリヌクレオチドは、α鎖をコードする核酸配列およびβ鎖をコードする核酸配列（a  nucleic  acid  sequence  encoding  an  α  chain  and  a  nucleic  acid  sequence  a  β  chain）の両方が同じｍＲＮＡ転写物から発現されるのを可能にする核酸配列を含み得る。
【０１４３】
例えば、ポリヌクレオチドは、α鎖をコードする核酸配列とβ鎖をコードする核酸配列との間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡ配列の中央部における翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列である。
【０１４４】
ポリヌクレオチドは、内部自己切断性配列によって連結されたα鎖をコードする核酸配列およびβ鎖をコードする核酸配列を含み得る。
【０１４５】
内部自己切断性配列は、α鎖を含むポリペプチドとβ鎖を含むポリペプチドとが分離されるのを可能にする任意の配列であり得る。
【０１４６】
切断部位は、ポリペプチドが産生されたときに、任意の外部切断活性を必要とせずに個々のペプチドへと即座に切断されるように、自己切断性であり得る。
【０１４７】
用語「切断」は、便宜のために本明細書で使用されるが、切断部位は、古典的切断以外の機構によってペプチドを個々の実体へと分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断性ペプチドについて、種々のモデルが「切断」活性を説明するために提唱されてきた：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク分解または翻訳効果（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔ）（Donnellyら（２００１年）J.  Gen.  Virol.  ８２巻：１０２７〜１０４１頁、参考として本明細書に援用される）。切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列間に位置する場合にそれらのタンパク質を別々の実体として発現させる限り、かかる「切断」の正確な機構は、本発明の目的のためには重要ではない。
【０１４８】
自己切断性ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断性ペプチドであり得る。
【０１４９】
バリアントは、類似性の観点から検討され得（即ち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、好ましくは、バリアントは、配列同一性の観点から表現される。
【０１５０】
配列比較は、目測で、またはより通常は、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けにより、実施され得る。これらの公的または商業的に入手可能なコンピュータープログラムは、２またはそれよりも多くの配列間の配列同一性を計算することができる。
【０１５１】
配列同一性は、連続する配列にわたって計算され得る、即ち、１つの配列が、他の配列とアラインされ、１つの配列中の各アミノ酸が、一度に１残基で、他の配列中の対応するアミノ酸と直接比較される。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。典型的には、かかるギャップなしアラインメントは、比較的短い数の残基（例えば、５０未満連続するアミノ酸）にわたってのみ実施される。
【０１５２】
これは、非常に単純かつ一貫性のある方法であるが、例えば、他の点では同一な配列の対において、１つの挿入または欠失が、後に続くアミノ酸残基をアラインメントから排除させ、したがって、全体的アラインメントが実施される場合に％相同性における大きな低減を潜在的に生じることを、考慮に入れることができない。結果的に、ほとんどの配列比較法は、相同性スコア全体に過度にペナルティを科すことなしに、可能な挿入および欠失を考慮に入れる、最適なアラインメントを生成するように設計される。これは、局所的相同性を最大化することを試みて、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１５３】
しかし、これらのより複雑な方法は、同じ数の同一アミノ酸について、可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメント  −  比較される２つの配列間のより高い関連性を反映する  −  が、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アラインメント中に存在する各ギャップに、「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在について比較的高いコストを課し、ギャップ中の各引き続く残基についてより小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が、典型的には使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然、より少ないギャップを有する最適化されたアラインメントを生成する。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの改変を可能にする。しかし、配列比較のためにかかるソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（以下を参照のこと）を使用する場合、アミノ酸配列についてのデフォルトギャップペナルティは、ギャップについて−１２、各伸長について−４である。
【０１５４】
したがって、最大％配列同一性の計算は、ギャップペナルティを考慮に入れた、最適なアラインメントの生成を最初に要求する。かかるアラインメントを実施するために適切なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ；本明細書に参照により組み込まれる、Devereux  et  al.,  1984,  Nucleic  Acids  Research  12:387）。配列比較を実施できる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel  et  al.,  1999  ibid  -  Chapter  18を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（本明細書に参照により組み込まれる、Atschul  et  al.,  1990,  J.  Mol.  Biol.,  403-410）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳパッケージソフトの比較ツールが含まれるがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは共に、オフラインおよびオンライン検索のために利用可能である（本明細書に参照により組み込まれる、Ausubel  et  al.,  1999  ibid,  pages  7-58  to  7-60を参照のこと）。しかし、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
【０１５５】
一実施形態では、配列同一性は、配列全体にわたって決定される。一実施形態では、配列同一性は、本明細書に列挙される配列と比較される候補配列全体にわたって決定される。
【０１５６】
最終的な配列同一性は、同一性の観点から測定され得るが、アラインメントプロセス自体は、典型的には、オールオアナッシングの対比較には基づかない。その代わり、化学的類似性または進化的距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てる、スケール化（scaled）類似性スコアマトリックスが、一般に使用される。一般に使用されるかかるマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス  −  ＢＬＡＳＴパッケージソフトのプログラムのためのデフォルトマトリックス  −  である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、提供される場合、公開のデフォルト値またはカスタムシンボル比較テーブルのいずれかを使用する（さらなる詳細については、ユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージについては公開のデフォルト値を、または他のソフトウェアの場合には、デフォルトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。
【０１５７】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成すると、％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生じる。
【０１５８】
本発明に従う用語「バリアント」は、配列からのまたは配列への、未改変の配列と実質的に同じ活性を保持する、結果として得られるアミノ酸配列を提供する、１つ（または複数）のアミノ酸の任意の置換、変形形態、改変、置き換え、欠失または付加を含む。例えば、保存的アミノ酸置換が行われ得る。本明細書で使用する場合、バリアントポリペプチドは、本明細書に示される配列に対して少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むと解釈される。
【０１５９】
一態様では、バリアントは、親配列の機能を維持する。
【０１６０】
一態様では、本発明に従う細胞  ＦＯＸＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列もまた、細胞中に導入されている。
【０１６１】
一態様では、本発明の細胞、操作されたＴｒｅｇまたは医薬組成物は、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードする核酸配列を含み得、適切には、この核酸配列は、配列番号１７として示されるアミノ酸配列、または本明細書で配列番号１７として示される配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％同一な、好ましくは少なくとも９５もしくは９９％同一なアミノ酸配列をコードする。
【０１６２】
ＴＣＲおよび／またはＦＯＸＰ３をコードする核酸は、開始コドンの上流にリーダー配列を含み得る。この配列は、転写物の翻訳を調節し得る。例として（By  ay  of）、本発明における使用のために適切なリーダー配列は、ＭＫＬＶＴＳＩＴＶＬＬＳＬＧＩＭＧ（配列番号１５）およびＭＬＬＬＬＬＬＬＧＰＧＩＳＬＬＬＰＧＳＬＡＧＳＧＬ（配列番号１６）である。
【０１６３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で規定されるＴＣＲをコードする第１の核酸配列およびＦＯＸＰ３をコードする第２の核酸を含む核酸配列のキットを提供する。
【０１６４】
ベクター
本発明は、本明細書に記載されるＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むベクターもまた提供する。適切には、ベクターは、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。一態様では、本発明の１または複数の核酸配列、例えば、本明細書で規定されるＴＣＲをコードする核酸およびＦＯＸＰ３をコードする核酸を含むベクターのキットが提供される。
【０１６５】
ＦＯＸＰ３は、ＦＯＸタンパク質ファミリーの転写因子のメンバーであり、調節性Ｔ細胞の発生および機能における調節経路のマスター調節因子として機能する。
【０１６６】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、ヒト由来、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｑ９ＢＺＳ１：
MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSS  LNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRR  HLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGP（配列番号１７）
である。
【０１６７】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、ポリペプチドは、配列番号１７に対して８５、９０、９５、９８または９９％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、断片は、ＦＯＸＰ３活性を保持する。適切には、断片は、ＦＯＸＰ３標的に結合し、転写因子として機能することができる。
【０１６８】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１７の天然のバリアントであり得る。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１７のアイソフォームである。例えば、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１７と比較して、アミノ酸位置７２〜１０６の欠失を含み得る。あるいは、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号１７と比較して、アミノ酸位置２４６〜２７２の欠失を含み得る。
【０１６９】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２５：
MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQVEELSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGPEGRGSLLTCGDVEEN（配列番号２５）
に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１７０】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、ポリペプチドは、配列番号２５に対して８５、９０、９５、９８または９９％同一なアミノ酸配列またはその断片を含む。適切には、断片は、ＦＯＸＰ３活性を保持する。適切には、断片は、ＦＯＸＰ３標的に結合し、転写因子として機能することができる。
【０１７１】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２５の天然のバリアントであり得る。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２５のアイソフォームである。例えば、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２５と比較して、アミノ酸位置７２〜１０６の欠失を含み得る。あるいは、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２５と比較して、アミノ酸位置２４６〜２７２の欠失を含み得る。
【０１７２】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２９：
ATGCCCAACCCCAGGCCTGGCAAGCCCTCGGCCCCTTCCTTGGCCCTTGGCCCATCCCCAGGAGCCTCGCCCAGCTGGAGGGCTGCACCCAAAGCCTCAGACCTGCTGGGGGCCCGGGGCCCAGGGGGAACCTTCCAGGGCCGAGATCTTCGAGGCGGGGCCCATGCCTCCTCTTCTTCCTTGAACCCCATGCCACCATCGCAGCTGCAGCTGCCCACACTGCCCCTAGTCATGGTGGCACCCTCCGGGGCACGGCTGGGCCCCTTGCCCCACTTACAGGCACTCCTCCAGGACAGGCCACATTTCATGCACCAGCTCTCAACGGTGGATGCCCACGCCCGGACCCCTGTGCTGCAGGTGCACCCCCTGGAGAGCCCAGCCATGATCAGCCTCACACCACCCACCACCGCCACTGGGGTCTTCTCCCTCAAGGCCCGGCCTGGCCTCCCACCTGGGATCAACGTGGCCAGCCTGGAATGGGTGTCCAGGGAGCCGGCACTGCTCTGCACCTTCCCAAATCCCAGTGCACCCAGGAAGGACAGCACCCTTTCGGCTGTGCCCCAGAGCTCCTACCCACTGCTGGCAAATGGTGTCTGCAAGTGGCCCGGATGTGAGAAGGTCTTCGAAGAGCCAGAGGACTTCCTCAAGCACTGCCAGGCGGACCATCTTCTGGATGAGAAGGGCAGGGCACAATGTCTCCTCCAGAGAGAGATGGTACAGTCTCTGGAGCAGCAGCTGGTGCTGGAGAAGGAGAAGCTGAGTGCCATGCAGGCCCACCTGGCTGGGAAAATGGCACTGACCAAGGCTTCATCTGTGGCATCATCCGACAAGGGCTCCTGCTGCATCGTAGCTGCTGGCAGCCAAGGCCCTGTCGTCCCAGCCTGGTCTGGCCCCCGGGAGGCCCCTGACAGCCTGTTTGCTGTCCGGAGGCACCTGTGGGGTAGCCATGGAAACAGCACATTCCCAGAGTTCCTCCACAACATGGACTACTTCAAGTTCCACAACATGCGACCCCCTTTCACCTACGCCACGCTCATCCGCTGGGCCATCCTGGAGGCTCCAGAGAAGCAGCGGACACTCAATGAGATCTACCACTGGTTCACACGCATGTTTGCCTTCTTCAGAAACCATCCTGCCACCTGGAAGAACGCCATCCGCCACAACCTGAGTCTGCACAAGTGCTTTGTGCGGGTGGAGAGCGAGAAGGGGGCTGTGTGGACCGTGGATGAGCTGGAGTTCCGCAAGAAACGGAGCCAGAGGCCCAGCAGGTGTTCCAACCCTACACCTGGCCCCTGA（配列番号２７）
に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１７３】
本発明の一部の実施形態では、ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはバリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７に対して少なくとも８０％同一なポリヌクレオチド配列またはその機能的断片を含む。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはバリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７に対して少なくとも８５、９０、９５、９８または９９％同一なポリヌクレオチド配列またはその機能的断片を含む。本発明の一部の実施形態では、ＦＯＸＰ３ポリペプチドまたはバリアントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２７またはその機能的断片を含む。
【０１７４】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２４：
GAATTCGTCGACATGCCCAACCCCAGACCCGGCAAGCCTTCTGCCCCTTCTCTGGCCCTGGGACCATCTCCTGGCGCCTCCCCATCTTGGAGAGCCGCCCCTAAAGCCAGCGATCTGCTGGGAGCTAGAGGCCCTGGCGGCACATTCCAGGGCAGAGATCTGAGAGGCGGAGCCCACGCCTCTAGCAGCAGCCTGAATCCCATGCCCCCTAGCCAGCTGCAGCTGCCTACACTGCCTCTCGTGATGGTGGCCCCTAGCGGAGCTAGACTGGGCCCTCTGCCTCATCTGCAGGCTCTGCTGCAGGACCGGCCCCACTTTATGCACCAGCTGAGCACCGTGGACGCCCACGCCAGAACACCTGTGCTGCAGGTGCACCCCCTGGAAAGCCCTGCCATGATCAGCCTGACCCCTCCAACCACAGCCACCGGCGTGTTCAGCCTGAAGGCCAGACCTGGACTGCCCCCTGGCATCAATGTGGCCAGCCTGGAATGGGTGTCCCGCGAACCTGCCCTGCTGTGCACCTTCCCCAATCCTAGCGCCCCCAGAAAGGACAGCACACTGTCTGCCGTGCCCCAGAGCAGCTATCCCCTGCTGGCTAACGGCGTGTGCAAGTGGCCTGGCTGCGAGAAGGTGTTCGAGGAACCCGAGGACTTCCTGAAGCACTGCCAGGCCGACCATCTGCTGGACGAGAAAGGCAGAGCCCAGTGCCTGCTGCAGCGCGAGATGGTGCAGTCCCTGGAACAGCAGCTGGTGCTGGAAAAAGAAAAGCTGAGCGCCATGCAGGCCCACCTGGCCGGAAAGATGGCCCTGACAAAAGCCAGCAGCGTGGCCAGCTCCGACAAGGGCAGCTGTTGTATCGTGGCCGCTGGCAGCCAGGGACCTGTGGTGCCTGCTTGGAGCGGACCTAGAGAGGCCCCCGATAGCCTGTTTGCCGTGCGGAGACACCTGTGGGGCAGCCACGGCAACTCTACCTTCCCCGAGTTCCTGCACAACATGGACTACTTCAAGTTCCACAACATGAGGCCCCCCTTCACCTACGCCACCCTGATCAGATGGGCCATTCTGGAAGCCCCCGAGAAGCAGCGGACCCTGAACGAGATCTACCACTGGTTTACCCGGATGTTCGCCTTCTTCCGGAACCACCCCGCCACCTGGAAGAACGCCATCCGGCACAATCTGAGCCTGCACAAGTGCTTCGTGCGGGTGGAAAGCGAGAAGGGCGCCGTGTGGACAGTGGACGAGCTGGAATTTCGGAAGAAGCGGTCCCAGAGGCCCAGCCGGTGTAGCAATCCTACACCTGGCCCTGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCC（配列番号２４）
に示される核酸配列によってコードされる。
【０１７５】
適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２４に示される核酸配列またはその断片によってコードされる。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２４に対して少なくとも８０％同一な核酸配列またはその断片によってコードされる。適切には、ＦＯＸＰ３ポリペプチドは、配列番号２４に対して８５、９０、９５、９８または９９％同一な核酸配列またはその断片によってコードされる。適切には、断片は、ＦＯＸＰ３活性を保持する。適切には、この断片によってコードされるポリペプチドは、ＦＯＸＰ３標的に結合し、転写因子として機能することができる。
【０１７６】
用語「ベクター」は、発現ベクター、即ち、ＴＣＲ、即ち、本発明に従うα鎖および／またはβ鎖の発現を可能にする構築物を含む。適切には、発現ベクターは、ＦＯＸＰ３ポリペプチドの発現をさらに可能にする。一部の実施形態では、ベクターは、クローニングベクターである。
【０１７７】
適切なベクターには、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、ポリペプチドと複合体化した核酸、または固相粒子上に固定された核酸が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１７８】
ウイルス送達系には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。
【０１７９】
レトロウイルスは、溶解性ウイルス（ｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ）のものとは異なる生活環を有するＲＮＡウイルスである。これに関して、レトロウイルスは、ＤＮＡ中間体を介して複製する感染性実体である。レトロウイルスが細胞に感染すると、そのゲノムは、逆転写酵素によってＤＮＡ形態に変換される。このＤＮＡコピーは、感染性ウイルス粒子のアセンブリに必要な、新たなＲＮＡゲノムおよびウイルスによりコードされたタンパク質の産生のための鋳型として機能する。
【０１８０】
多くのレトロウイルス、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｎａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス（Ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）−２９（ＭＣ２９）およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、ならびにレンチウイルスを含む全ての他のレトロウイルス科（retroviridiae）が存在する。
【０１８１】
レトロウイルスの詳細なリストは、参考として本明細書に援用されるCoffinら（「Retroviruses」１９９７年Cold  Spring  Harbour  Laboratory  Press編：JM  Coffin、SM  Hughes、HE  Varmus  ７５８〜７６３頁）中に見出され得る。
【０１８２】
レンチウイルスもまたレトロウイルス科に属するが、これらは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染でき、参考として本明細書に援用される（Lewisら（１９９２年）EMBO  J.  ３０５３〜３０５８頁）。
【０１８３】
ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを、細胞、例えば、本明細書で規定される宿主細胞に移入させることが可能であり得る。ベクターは、理想的には、α鎖および／またはβ鎖が宿主細胞において適切に発現されるように、宿主細胞における持続的な高レベル発現が可能でなければならない。
【０１８４】
ベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。ベクターは、ＭＰ７１ベクター骨格に基づき得、またはＭＰ７１ベクター骨格から誘導可能であり得る。ベクターは、全長または短縮型バージョンのウッドチャック肝炎応答エレメント（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）を欠き得る。
【０１８５】
ヒト細胞の効率的感染のために、ウイルス粒子は、両種指向性エンベロープまたはテナガザル白血病ウイルスエンベロープを用いてパッケージングされ得る。
【０１８６】
細胞
本発明は、細胞、例えば、本発明に従うポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
【０１８７】
宿主細胞は、ＴＣＲを発現および産生するために使用され得る任意の細胞であり得る。
【０１８８】
適切には、細胞は、Ｔ細胞、例えば、通常のＴ細胞である。
【０１８９】
適切には、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
【０１９０】
一態様では、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＴｒｅｇは、被験体から取得された血液から単離され得る。適切には、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＴｒｅｇは、被験体から取得された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。
【０１９１】
適切には、細胞は、ＦＯＸＰ３を発現する天然のＴｒｅｇである。
【０１９２】
一態様では、細胞は、幹細胞である。
【０１９３】
別の態様では、細胞は、前駆細胞である。
【０１９４】
本明細書で使用する場合、用語「幹細胞」とは、同じ型のより多くの幹細胞を無制限に生じることが可能な未分化細胞を意味し、ここから、他の特殊化した細胞が、分化によって生じ得る。幹細胞は、複能性である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞または成体幹細胞であり得る。
【０１９５】
本明細書で使用する場合、用語「前駆細胞」とは、１または複数の型の細胞を形成するように分化することができるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで限定的な自己複製を有する細胞を意味する。
【０１９６】
適切には、細胞は、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇへと分化されることが可能である。
【０１９７】
適切には、細胞は、ＦＯＸＰ３を発現するＴ細胞、例えば、Ｔｒｅｇへと分化する能力を有する。
【０１９８】
適切には、細胞は、ヒト細胞である。適切には、細胞は、ヒトＴｒｅｇである。
【０１９９】
適切には、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり得る。適切には、細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。適切には、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。適切には、細胞は、臍帯血から取得され得る。適切には、細胞は、成体末梢血から取得され得る。
【０２００】
一部の態様では、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、臍帯血から取得され得る。臍帯血は、当該分野で公知の技術に従って回収され得る（例えば、本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第７，１４７，６２６号および同第７，１３１，９５８号）。
【０２０１】
一態様では、ＨＳＰＣは、多能性幹細胞供給源、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）から取得され得る。
【０２０２】
本明細書で使用する場合、用語「造血幹細胞・前駆細胞」または「ＨＳＰＣ」とは、抗原性マーカーＣＤ３４を発現する（ＣＤ３４＋）細胞およびかかる細胞の集団を指す。特定の実施形態では、用語「ＨＳＰＣ」とは、抗原性マーカーＣＤ３４の存在（ＣＤ３４＋）および系統（ｌｉｎ）マーカーの非存在によって同定される細胞を指す。ＣＤ３４＋および／またはＬｉｎ（−）細胞を含む細胞の集団は、造血幹細胞および造血前駆細胞を含む。
【０２０３】
ＨＳＰＣは、大腿骨、寛骨、肋骨、胸骨および他の骨を含む、成体の骨髄から取得または単離され得る。ＨＳＰＣを含有する骨髄吸引液は、針およびシリンジを使用して、寛骨から直接取得または単離され得る。ＨＳＰＣの他の供給源には、臍帯血、胎盤血、動員された末梢血、ワルトン膠様質、胎盤、胎児血液、胎児肝臓または胎児脾臓が含まれる。特定の実施形態では、治療的適用における使用のために十分な量のＨＳＰＣを回収することは、被験体において幹細胞・前駆細胞を動員することを要求し得る。
【０２０４】
本明細書で使用する場合、用語「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、多能性状態へとリプログラミングされた非多能性細胞を指す。被験体の細胞が多能性状態へとリプログラミングされると、次いで、これらの細胞は、所望の細胞型、例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞（それぞれ、ＨＳＣおよびＨＰＣ）へとプログラミングされ得る。
【０２０５】
本明細書で使用する場合、用語「リプログラミングする」とは、あまり分化していない状態へと、細胞の潜在能を増加させる方法を指す。
【０２０６】
本明細書で使用する場合、用語「プログラミングする」とは、細胞の潜在能を低下させるか、または細胞をより分化した状態へと分化させる方法を指す。
【０２０７】
適切には、細胞は、被験体と一致している、または被験体にとって自家である。細胞は、患者自身の末梢血から（第一者）、またはドナー末梢血（第二者）、もしくは無関係のドナーからの末梢血（第三者）からの造血幹細胞移植の状況において、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成され得る。
【０２０８】
適切には、細胞は、被験体にとって自家である。適切には、被験体は、ヒトである。
【０２０９】
一部の態様では、細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の、免疫細胞へのｅｘ−ｖｉｖｏ分化に由来し得る。これらの例では、細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多くの手段の１つによって、本発明のＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【０２１０】
適切には、細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多くの手段の１つによって、本発明のＴＣＲに加えて、ＦＯＸＰ３をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【０２１１】
本明細書で使用する場合、用語「通常のＴ細胞」またはＴｃｏｎｖとは、αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ならびに表面抗原分類４）ＣＤ４または表面抗原分類８（ＣＤ８）であり得る共受容体を発現するＴリンパ球細胞を意味する。通常のＴ細胞は、末梢血、リンパ節および組織中に存在する。ＦＯＸＰ３は、胸腺由来のＴｒｅｇによって発現され、新たに活性化された通常のＴ細胞によって発現され得る。
【０２１２】
本明細書で使用する場合、用語「調節性Ｔ細胞」またはＴｒｅｇとは、マーカーＣＤ４、ＣＤ２５およびＦＯＸＰ３を発現する（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）Ｔ細胞を意味する。Ｔｒｅｇは、表面タンパク質ＣＤ１２７の非存在下のまたは表面タンパク質ＣＤ１２７の低レベル発現と組み合わせた細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ２５（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−）を使用しても同定され得る。Ｔｒｅｇはまた、細胞表面上に、高レベルのＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子−４）またはＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体）を発現し得る。通常のＴ細胞とは異なり、調節性Ｔ細胞は、ＩＬ−２を産生せず、したがって、ベースラインにおいてアネルギー性である。Ｔｒｅｇ細胞には、胸腺由来の天然のＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞および末梢性に生成された誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞が含まれる。
【０２１３】
一態様では、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋．Ｔ細胞である。
【０２１４】
一態様では、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞である。
【０２１５】
一態様では、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ１２７−Ｔ細胞である。
【０２１６】
本明細書で使用する場合、用語「天然のＴｒｅｇ」とは、胸腺由来のＴｒｅｇを意味する。天然のＴｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ヘリオス＋ニューロピリン１＋である。ｉＴｒｅｇと比較すると、ｎＴｒｅｇは、ＰＤ−１（プログラム細胞死−１、ｐｄｃｄ１）、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）、ヘリオス（Ｉｋｚｆ２）およびＣＤ７３のより高い発現を有する。ｎＴｒｅｇは、ヘリオスタンパク質またはニューロピリン１（Ｎｒｐ１）の発現に個々に基づいて、ｉＴｒｅｇから識別され得る。
【０２１７】
本明細書で使用する場合、用語「誘導性調節性Ｔ細胞」（ｉＴｒｅｇ）とは、胸腺の外側で、成熟したＣＤ４＋の通常のＴ細胞から発生する、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋ヘリオス−ニューロピリン１−Ｔ細胞を意味する。例えば、ｉＴｒｅｇは、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦＯＸＰ３−細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導され得る。
【０２１８】
組成物
本発明は、本発明に従う操作されたＴｒｅｇ、ベクターまたは細胞を含む組成物もまた提供する。適切には、本発明は、本発明に従う操作されたＴｒｅｇを含む組成物を提供する。適切には、本発明は、本発明に従うベクターを含む組成物を提供する。適切には、本発明は、本発明に従う細胞を含む組成物を提供する。
【０２１９】
一部の実施形態では、組成物は、医薬組成物である。かかる医薬組成物は、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含み得る。医薬用キャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、意図した投与経路および標準的な医薬実務に関して選択され得る。医薬組成物は、キャリア、賦形剤もしくは希釈剤として（またはそれに加えて）、任意の適切な結合剤（複数可）、滑沢剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）および他のキャリア剤を含み得る。
【０２２０】
医薬組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。非経口投与のための製剤には、本明細書で議論される懸濁剤、液剤、油性または水性ビヒクル中の乳剤、ペースト剤、および植込み型の徐放性または生分解性製剤が含まれるが、これらに限定されない。無菌の注射可能な製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を使用して調製され得る。本発明に従う使用のための医薬組成物は、採用される投薬量および濃度において被験体にとって非毒性である、薬学的に許容される分散剤、湿潤剤、懸濁化剤、等張剤、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、キャリア、賦形剤、塩または安定剤を含み得る。好ましくは、かかる組成物は、例えば、非経口（例えば、皮下、皮内または静脈内注射）または髄腔内投与のための、投与の所与の方法および／または部位と適合性である、疾患の処置における使用のための薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤をさらに含み得る。
【０２２１】
医薬組成物が本発明に従う細胞を含む場合、この組成物は、現行の医薬品等の製造管理及び品質管理に関する基準（current  good  manufacturing  practices）（ｃＧＭＰ）を使用して生産され得る。
【０２２２】
適切には、細胞を含む医薬組成物は、例えば、酢酸メチル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）およびジメチルアセトアミド（それらの混合物または組合せを含む）であるがこれらに限定されない有機溶媒を含み得る。
【０２２３】
適切には、細胞を含む医薬組成物は、エンドトキシンを含まない。
【０２２４】
処置の方法
本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法であって、本発明の操作されたＴｒｅｇを被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２２５】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法であって、本発明の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２２６】
本発明は、疾患を処置および／または予防する際の使用のための、本発明の操作されたＴｒｅｇもまた提供する。
【０２２７】
本発明は、疾患を処置および／または予防する際の使用のための、本発明の医薬組成物もまた提供する。
【０２２８】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、本発明に従う操作されたＴｒｅｇ、ベクターまたは細胞の使用にも関する。
【０２２９】
好ましくは、本発明の処置の方法は、被験体への本発明の医薬組成物の投与に関する。
【０２３０】
用語「処置する／処置／処置すること（treat/treatment/treating）」とは、本明細書に記載される操作されたＴｒｅｇ、細胞、ベクターまたは医薬組成物を、既存の疾患または状態を有する被験体に投与して、疾患と関連する少なくとも１つの症状を低下、低減もしくは改善し、かつ／または疾患の進行を減速、低減もしくは遮断することを指す。
【０２３１】
「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」／「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」（または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））に対する言及は、本明細書で使用する場合、疾患の症状の開始を遅延または予防することを指す。予防は、（疾患が生じないように）完全であり得る、または一部の個体においてのみもしくは限られた時間量の間のみ有効であり得る。
【０２３２】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかの被験体は、哺乳動物、好ましくは、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットである。好ましくは、被験体はヒトである。
【０２３３】
本発明の医薬組成物の投与は、活性成分を生体利用可能にする種々の経路のいずれかを使用して、達成され得る。例えば、Ｔｒｅｇ、細胞、ベクターまたは医薬組成物は、静脈内で、髄腔内で、経口および非経口経路によって、鼻腔内で、腹腔内で、皮下で、経皮的にまたは筋肉内で、投与され得る。
【０２３４】
一態様では、本発明に従う操作されたＴｒｅｇまたは本発明に従う医薬組成物は、静脈内投与される。
【０２３５】
別の態様では、本発明に従う操作されたＴｒｅｇまたは本発明に従う医薬組成物は、髄腔内投与される。
【０２３６】
典型的には、医師は、個々の被験体にとって最も適切な実際の投薬量を決定し、この投薬量は、特定の患者の年齢、体重および応答によって変動する。投薬量は、疾患症状を低減および／または予防するのに十分なものである。
【０２３７】
当業者は、例えば、送達経路（例えば、経口、静脈内、皮下など）が、用量に影響を与え得ること、および／または要求される用量が、送達経路に影響を与え得ることを理解する。例えば、特定の部位または場所内の薬剤の特に高い濃度が目的とされる場合、集中的な送達が、所望され得るおよび／または有用であり得る。所与の治療レジメンのために経路および／または投与スケジュールを最適化する場合に考慮される他の因子には、例えば、処置されている疾患（例えば、型またはステージなど）、被験体の臨床状態（例えば、年齢、健康全般など）、併用療法の存在または非存在、および医療実務者に公知の他の因子が含まれ得る。
【０２３８】
投薬量は、疾患の症状を安定化または改善するのに十分なものである。
【０２３９】
本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法であって、細胞、例えば、本発明に従うＴ細胞を含む医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法もまた提供する。
【０２４０】
適切には、本発明は、疾患を処置および／または予防するための方法であって、本発明に従う操作されたＴｒｅｇを被験体に投与するステップを含む方法もまた提供する。
【０２４１】
この方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）被験体からの細胞含有試料の単離；
（ｉｉ）細胞に、ＴＣＲをコードする核酸配列、および必要に応じて、ＦＯＸＰ３タンパク質をコードする核酸を導入するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ。
【０２４２】
適切には、（ｉｉ）由来の細胞は、被験体への投与前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖され得る。
【０２４３】
疾患
本発明の方法および使用によって処置および／または予防される疾患は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する任意の疾患であり得る。
【０２４４】
疾患は、例えば、がん、感染性疾患または自己免疫性疾患であり得る。
【０２４５】
適切には、本発明の方法および使用によって処置および／または予防される疾患は、自己免疫性疾患であり得る。
【０２４６】
理論に束縛されることは望まないが、本発明の方法および使用によって処置および／または予防される疾患は、ＭＢＰが抗原である、例えば、ＭＢＰが自己抗原である、任意の疾患であり得る。
【０２４７】
適切には、疾患は、自己免疫性および炎症性中枢神経系疾患（例えば、慢性神経変性状態）であり得る。
【０２４８】
適切には、疾患は、慢性神経変性状態、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経向性ウイルス感染症、脳卒中、傍腫瘍性障害および外傷性脳傷害であり得る。
【０２４９】
一態様では、疾患は、多発性硬化症である。
【０２５０】
適切には、疾患は、慢性進行型多発性硬化症である。
【０２５１】
適切には、疾患は、再発寛解型多発性硬化症である。
【０２５２】
一態様では、疾患は、全身性自己免疫性および炎症性疾患、例えば、ベーチェット病、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、強皮症およびシェーグレン症候群の中枢神経系（ＣＮＳ）関与を有し得る。
【０２５３】
適切には、疾患は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１陽性の被験体中に存在する。
【０２５４】
適切には、疾患は、多発性硬化症であり、被験体は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１陽性である。
【０２５５】
適切には、疾患は、慢性進行型多発性硬化症であり、被験体は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１陽性である。
【０２５６】
適切には、疾患は、再発寛解型多発性硬化症であり、被験体は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１陽性である。
【０２５７】
多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）は、欧州および米国で、若い成人において最も一般的な神経学的障害である。ＭＳは、脱髄性疾患として特徴付けられ、中枢神経系の慢性変性疾患であり、ミエリンの漸進的破壊が、脳および／または脊髄のあらゆる場所で所々に生じ、神経接続性を妨害し、筋力低下、協調の喪失ならびに言語障害および視覚障害を引き起こす。
【０２５８】
臨床的に孤立した症候群（ＣＩＳ）、再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、一次性進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）および二次性進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）を含む、ＭＳの進行のいくつかの型またはパターンが同定されている。一部の患者については、能力障害の増加または進行は、非常に漸進的であり、他の患者については、より迅速に生じ得る。しかし、一般に、発作からの回復は、次第に完全ではなくなり、症状は増加する傾向があり、能力障害（disability）は大きくなる。
【０２５９】
いくつかの疾患改変性処置（ＤＭＴ）が、臨床的再発の頻度を低減させるために承認されているが、ほとんどの患者は、現行の治療スケジュールの下で臨床的に悪化し続ける。自家造血幹細胞移植は、患者について持続的な有益な効果を有し得るが、この手順は、かなりの毒性と関連する攻撃的な骨髄破壊的コンディショニングを要求する。ＤＭＴも幹細胞移植も、ＭＳの免疫病理の抗原特異的抑制を媒介することができない。理論に束縛されることは望まないが、将来、１用量の本発明の操作されたＴｒｅｇの投与が、全身副作用の非存在下で、ＭＳ免疫病理の持続的な抑制を提供し得る。これは、ＭＳを有する人における疾患の進行に対して有意な影響を有する。
【０２６０】
適切には、本発明のＴｒｅｇ、ベクターまたは医薬組成物は、視力低下または視力喪失、よろめきおよび一様でない歩行、不明瞭発語、頻尿および失禁、気分変化および抑うつ、筋痙攣および麻痺を含むＭＳの症状のうちの１または複数を低減または寛解させ得る。
【０２６１】
方法
本発明は、操作されたＴｒｅｇを産生するための方法であって、細胞中に、本明細書で規定されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む方法もまた提供する。適切には、この方法は、本発明のＴＣＲ分子の発現を可能にする条件下で細胞をインキュベートするステップをさらに含む。必要に応じて、この方法は、操作されたＴｒｅｇ細胞を精製するステップをさらに含み得る。
【０２６２】
適切には、細胞は、Ｔ細胞である。
【０２６３】
適切には、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
【０２６４】
適切には、細胞は、ＦＯＸＰ３を発現する天然のＴｒｅｇである。
【０２６５】
一態様では、細胞は、幹細胞である。適切には、本発明に従う方法では、本明細書で規定されるＴＣＲをコードする核酸は、幹細胞中に導入されており、次いで、幹細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇへと分化される。
【０２６６】
適切には、幹細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇへと分化する能力を有する。適切には、細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり得る。適切には、細胞は、臍帯血から取得され得る。適切には、細胞は、成体末梢血から取得され得る。適切には、細胞は、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）である。適切には、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【０２６７】
別の態様では、細胞は、前駆細胞である。適切には、前駆細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇへと分化する能力を有する。
【０２６８】
別の態様では、本発明は、操作されたＴｒｅｇを産生するための方法であって、細胞中に、本明細書で規定されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップを含む方法を提供する。適切には、本明細書で規定されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、別々のポリヌクレオチドとして提供される。適切には、別々のポリペプチドは、細胞中に、別々に、順次または同時に導入される。ポリペプチドが別々にまたは順次導入される場合、適切には、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドが最初に導入される。ポリペプチドが別々にまたは順次導入される場合、適切には、ＦＯＸＰ３をコードするポリヌクレオチドが最初に導入される。適切には、本明細書で規定されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド上で提供される。
【０２６９】
適切には、この方法は、ＦＯＸＰ３および本発明のＴＣＲ分子の発現を引き起こす条件下で細胞をインキュベートするステップをさらに含む。必要に応じて、この方法は、操作されたＴｒｅｇ細胞を精製するステップをさらに含み得る。
【０２７０】
一態様では、本発明は、操作されたＴｒｅｇを産生するための方法であって、細胞中に、本明細書で規定されるＴＣＲをコードするポリヌクレオチドおよびＦＯＸＰ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで導入するステップ、ならびにこの細胞を、Ｔ細胞、例えば、ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇへと分化させるステップを含む方法を提供する。適切には、この方法は、ＦＯＸＰ３および本発明のＴＣＲ分子の発現を引き起こす条件下で細胞をインキュベートするステップをさらに含む。必要に応じて、この方法は、操作されたＴｒｅｇ細胞を精製するステップをさらに含み得る。
【０２７１】
適切には、一態様では、細胞は、ＦＯＸＰ３が細胞中に導入される前に、Ｔ細胞へと分化される。
【０２７２】
操作されたＴｒｅｇの精製は、当該分野で公知の任意の方法によって達成され得る。適切には、操作されたＴｒｅｇは、細胞集団の陽性および／または陰性選択を使用する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫磁気単離（即ち、磁気ナノ粒子またはビーズに結合した抗体を使用する）を使用して精製され得る。
【０２７３】
適切には、操作されたＴ細胞の精製は、本明細書で規定されるＴＣＲの発現を使用して実施され得る。
【０２７４】
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと類似または等価な任意の方法および材料が、本開示の実施形態の実施または試験において使用され得る。数的範囲は、その範囲を規定する数を含む。特記しない限り、それぞれ、任意の核酸配列は、左から右へと、５’から３’の配向で書かれる；アミノ酸配列は、左から右へと、アミノからカルボキシの配向で書かれる。
【０２７５】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に他を示さない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の１０分の１単位までの各介在する値もまた具体的に開示されることが理解される。述べられた範囲中の任意の述べられた値または介在する値とその述べられた範囲中の任意の他の述べられた値または介在する値との間の、より小さい各範囲は、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、その範囲中に独立して含まれ得または排除され得、上限および下限のいずれかがより小さい範囲中に含まれる、上限および下限のいずれもより小さい範囲中に含まれない、または上限および下限の両方がより小さい範囲中に含まれる各範囲もまた、本開示内に包含され、その述べられた範囲中の具体的に排除された任意の上限／下限の支配下にある。述べられた範囲が上限および下限の一方または両方を含む場合、含まれた上限および下限のいずれかまたは両方を排除する範囲もまた、本開示に含まれる。
【０２７６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含むことに留意すべきである。
【０２７７】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜から構成される（comprised  of）」は、本明細書で使用する場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包含的またはオープンエンドであり、列挙されていないさらなるメンバー、要素または方法ステップを排除しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜から構成される」は、用語「〜からなる」もまた含む。
【０２７８】
本明細書に記載される本発明の実施形態が組み合わされ得ることに留意されたい。
【０２７９】
本明細書で議論される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。かかる刊行物が本明細書に添付される特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの承認として解釈すべきものは、本明細書中には存在しない。
【０２８０】
本発明は、本発明を実施するにあたり当業者を補助するように機能することを意味し、本発明の範囲を決して限定しない意図である実施例によって、ここでさらに記載される。
【実施例】
【０２８１】
（実施例１）
ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３をコードするレトロウイルスベクターの産生
ＭＳ２−３Ｃ８  ＴＣＲ
ＭＳ２−３Ｃ８  ＴＣＲは、本明細書に参照により組み込まれる、Muraro  et  al.,  JCI  1997;  100,  2,  339-349によって記載されるように、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１によって提示されたＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）を認識する。コドン最適化されたＭＳ２−ＴＣＲｖα、マウス化された定常アルファドメイン、コドン最適化されたＭＳ２−ＴＣＲｖβおよびマウス化された定常ベータドメインを、レトロウイルス発現カセットｐＭＰ７１中にクローニングすることによって、ＭＳ２−３Ｃ８  ＴＣＲをコードするコドン最適化されたＭＳ−２  ＴＣＲ発現カセットを構築した（図１および図２）。本明細書に参照により組み込まれる、Blood.  2007  Mar  15;  109(6):  2331-2338.およびCancer  Res.  2007  Apr  15;  67(8):  3898-3903に記載されるように、定常アルファドメインと定常ベータドメインとの間に追加のジスルフィド結合を加えた。定常アルファドメインとＭＳ２−ＴＣＲｖβドメインとを、Ｐ２Ａ配列によって分離した。
【０２８２】
ＭＳ２−３Ｃ８  ＦＯＸＰ３
ＦＯＸＰ３およびＭＳ−２  ＴＣＲをコードする発現カセットを、上記ＭＳ−２  ＴＣＲを改変することによって構築した（図１および図３）。停止コドンが除去されたＦＯＸＰ３遺伝子およびＴ２Ａ配列を、ＭＳ−２  ＴＣＲの上流のＲｓｒＩＩ部位およびＥｃｏＲ１部位を使用して、ｐＭＰ７１ベクター中に挿入した。
【０２８３】
（実施例２）
ＴＣＲおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３によるＴ細胞の形質導入
Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ細胞を、標準的な組織培養条件で、８ｍＬのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中２×１０６で２４時間播種した。１日目に、細胞を、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）トランスフェクション試薬、ならびに２．５μｇの適切なプラスミドＤＮＡおよび同種指向性レトロウイルス共受容体をコードする１．５μｇのｐＣＬ−Ａｍｐと混合した最適な培地を使用して、室温で２０分間トランスフェクトした。トランスフェクション混合物を、接着性Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ（Ｐｈｏｅｎｉｘ−ＡＭＰＨＯ）細胞に添加し、さらに２４時間インキュベートした。２日目に、培地を５ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）組織培養培地に交換し、細胞を、さらに２４時間インキュベートした。
【０２８４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋陽性選択キットを使用して単離した。細胞を、引き続いて、フローサイトメトリー抗体ＣＤ４、ＣＤ２５およびＣＤ１２７で染色し、その後、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）サイトメーターを使用して細胞選別した。
【０２８５】
ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７−ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７＋Ｔｃｏｎｖを、ポリプロピレンチューブ中に収集した。細胞選別の純度を、ＦＯＸＰ３  ＰＥ抗体の添加によって決定した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−ＦＯＸＰ３＋細胞の純度は、決まって＞７０％であった。
【０２８６】
０日目に、ＦＡＣＳ選別した細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズと共に１：１で培養することによって、４８時間活性化した。２日目に、細胞をカウントし、Ｔｃｏｎｖについては完全ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ−１６４０）（Ｇｉｂｃｏ）中に、ＴｒｅｇについてはＴｅｘＭＡＣＳ（登録商標）培地中に、１×１０６／ｍＬで再懸濁した。組織培養処理していない２４ウェルプレートを、レトロネクチン（retronectin）によるコーティングによって事前調製し、引き続いて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中２％のウシ血清アルブミンでブロッキングし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞懸濁物を１：１混合した。ＩＬ−２の最終濃度は、Ｔｃｏｎｖについては３００ｕ／ｍｌ、Ｔｒｅｇについては１０００ｕ／ｍｌであった。細胞を、３７度で一晩インキュベートし、その後、上清を除去し、新鮮な完全培地およびＩＬ−２を補充した。培地を、１日おきに交換した。
【０２８７】
Ｔｃｏｎｖ細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；１００単位／ｍＬペニシリン；１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン；２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で成長させた。調節性Ｔ細胞を、１００単位／ｍＬペニシリン；１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＴｅｘＭＡＣＸ（登録商標）培地中で培養した。
【０２８８】
図５中のＦＡＣＳドットプロットは、マウスＴＣＲ定常領域およびＦＯＸＰ３の発現の測定を介して形質導入のレベルを評価するために７日目に実施した代表的なフローサイトメトリー分析を示す。
【０２８９】
（実施例３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大増殖の間のＦＯＸＰ３発現
Ｔ細胞を、実施例２に上記したように単離した。０日目に、ＦＯＸＰ３ならびにＴｒｅｇ細胞表面マーカーＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２としても公知）およびＣＤ２５の発現を、フローサイトメトリーによって測定した。
【０２９０】
実施例２に上記したように、Ｔ細胞を形質導入し、培養した。７日目に、細胞を、フローサイトメトリーによって分析し、ドットプロットを、形質導入された細胞集団に対してゲーティングした。ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２５の相対的発現を測定した。図６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大増殖の７日目のＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２５の発現を示す棒グラフを示す。ＦＯＸＰ３発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大増殖の間維持される。
【０２９１】
ＭＳ−２  ＴＣＲ形質導入されたＴ細胞の抗原特異的活性化
（実施例４）
エフェクターＴ細胞およびＴｒｅｇのペプチド再刺激
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４およびＣＤ８０またはＣＤ８６で形質導入した。ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現する細胞を、引き続く実験のために等量で一緒に混合した。
【０２９２】
ＣＨＯ細胞を、飽和量（１０μＭ／ｍｌ）のＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）（ＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧＦＧＹＧＧ）と共に、培養培地中で１０×１０６／ｍＬで再懸濁した。懸濁物を、標準的な組織培養条件で２時間インキュベートし、その後、照射し、洗浄し、再懸濁した。
【０２９３】
ＭＳ２またはＭＳ２−ＦＯＸＰ３構築物で形質導入されたＴ細胞を洗浄し、カウントし、完全ＲＰＭＩ中に０．５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を、ペプチドありまたはなしで、インキュベートしたＣＨＯ細胞と共に１：１で４時間蒔いた。細胞を固定し、透過処理し、その後、ＩＬ−２に対する抗体およびＩＦＮγに対する抗体で染色した。
【０２９４】
図７は、エフェクターＴ細胞のペプチド再刺激を示すＦＡＣＳドットプロットを示す。Ｔ細胞の形質導入効率は、「Ｔｄ＝」によって示される。
【０２９５】
Ｔｒｅｇ細胞を、上記のように、ＣＨＯ細胞と共に培養した。図８は、Ｔｒｅｇ細胞のペプチド再刺激を示すＦＡＣＳドットプロットを示す。Ｔ細胞の形質導入効率は、「Ｔｄ＝」によって示される。
【０２９６】
（実施例５）
ＴＣＲ形質導入されたＴ細胞およびＴＣＲ−ＦＯＸＰ３形質導入されたＴ細胞は、コグネートペプチドに対して応答する
ＴＣＲ形質導入されたＴｃｏｎｖ、ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇ、ＴＣＲ−ＦＯＸＰ３変換されたＴｃｏｎｖおよびＴＣＲ−ＦＯＸＰ３変換されたＴｃｏｎｖ（上記方法）を、ペプチドパルスした照射ＡＰＣありまたはなしで４日間培養した。上清を培養物から収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２およびＩＦＮγについてアッセイした（ｎ＝２〜４）。図９は、ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇおよびＴＣＲ−ＦＯＸＰ３変換されたＴｃｏｎｖが、コグネートペプチドに対して応答することを示している。
【０２９７】
（実施例６）
ＴＣＲ形質導入およびＴＣＲ−ＦＯＸＰ３形質導入
ＣＨＯ細胞を、上記のように調製した。Ｔｃｏｎｖ細胞を、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３で形質導入した。形質導入されたＴ細胞を、磁気ビーズ選別によって単離した。形質導入された細胞を、ＡＰＣにコンジュゲートした抗マウス定常ベータ抗体で染色した。細胞を、十分に洗浄し、第２の抗ＡＰＣ抗体で染色した。細胞を洗浄し、磁気カラムを通過させ、形質導入された細胞を捕捉し、溶出した。決まって、精製された細胞のうち＞９５％が、ＡＰＣ＋であった。
【０２９８】
ＣＨＯ細胞なしに培養した未刺激の細胞は、陰性対照として機能した。ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）刺激した細胞は、陽性対照として機能した。白色の棒は、ＭＳ２  ＴＣＲを発現する細胞からのサイトカイン産生を示し、黒色の棒は、ＭＳ２  ＴＣＲおよびＦＯＸＰ３を発現するＴ細胞からのサイトカイン産生を示す（ｎ＝３）。図１０は、ＴＣＲおよびＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３で形質導入された通常のＴ細胞が、ＴＣＲ単独で形質導入された通常の細胞よりも少ないＩＬ−２を産生することを示している。
【０２９９】
ＭＳ−２  ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇの抗原特異的抑制
（実施例７）
ＴＣＲ形質導入されたＴ細胞の増殖
ＣＤ８０＋ＣＤ８６＋ＤＲ４＋ＣＨＯ細胞にペプチドをロードし、上記のように照射し、その後、０．１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。形質導入された応答性Ｔ細胞を、温ＰＢＳ中で３７度で３分間、ＣＦＳＥ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ色素で染色し、その後、等体積の温ＰＢＳを添加し、さらに３分間インキュベートした。
【０３００】
細胞を、５倍体積の完全培地中で洗浄し、その後、カウントし、１×１０６の形質導入された細胞／ｍｌで再懸濁した。ＴｃｏｎｖおよびＴｒｅｇの形質導入効率を、フローサイトメトリーによって決定した。調節性Ｔ細胞を、培養物から取り出し、洗浄し、完全ＲＰＭＩ中に１×１０６の形質導入された細胞／ｍｌで再懸濁する。細胞を、１  Ｔｒｅｇ：０．１  ＣＨＯ細胞：および様々な比のＴｃｏｎｖで蒔いた。増殖を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色されたＴｃｏｎｖの希釈物を分析することによって決定した。
【０３０１】
図１１中のデータは、ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇが、増殖を抗原特異的様式で抑制することを示している。上清を培養培地から収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２についてアッセイした。図１２中に示されるデータは、ＴＣＲ形質導入されたＴｒｅｇが、ＩＬ−２産生を抗原特異的様式で抑制することを示している。
【０３０２】
（実施例８）
実験的自己免疫性脳脊髄炎の養子移入モデルにおける操作されたＴｒｅｇ
ＭＳ２−３Ｃ８  ＴＣＲで形質導入された通常のヒトＴ細胞を、養子移入によって、ＨＬＡＤＲＢ１＊０４０１についてトランスジェニックの免疫不全ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンママウス（ＮＳＧ）に投与する。
【０３０３】
ヒトＴ細胞の養子移入は、マウスにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）型の疾患をもたらし得る。次いで、マウスを、ＭＳ２−３Ｃ８  ＴＣＲで形質導入されたヒトＴｒｅｇ細胞または対照Ｔｒｅｇで処置した。
【０３０４】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＋０４０１拘束されるＭＢＰ１１１−１２９（配列番号３）特異的ヒト化ＴＣＲトランスジェニックマウスは、脊髄および脊髄神経根に加えて、脳幹および脳神経根に位置する、ＭＳ２−３Ｃ８トランスジェニックＴ細胞の浸潤物および炎症性病変を有する（本明細書に参照により組み込まれる、Quandt  et  al.,  J.  Exp.  Med.  V.  200(2);2004）。
【０３０５】
ＴＣＲ誘導されたＴｒｅｇによる病原性Ｔ細胞の増殖の抑制を、例えば、ＣＦＳＥ、ＩＬ−２および／またはＩＦＮγレベルによって、マウスモデルにおいて測定する。
【０３０６】
（実施例９）
実験的自己免疫性脳脊髄炎の古典的モデルにおける操作されたＴｒｅｇ
マウスを、Ｍｏｇ（ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質）で免疫して、ＭＳの広く受容された動物モデルであるＥＡＥを誘発する。
【０３０７】
次いで、マウスを、ＭＳ２−３Ｃ８  ＴＣＲで形質導入されたヒトＴｒｅｇ細胞または対照Ｔｒｅｇで処置する。ＴＣＲ誘導されたＴｒｅｇによる病原性Ｔ細胞の増殖の抑制を、例えば、ＣＦＳＥ、ＩＬ−２および／またはＩＦＮγレベルによって、マウスモデルにおいて測定する。
（実施例１０）
ＴＣＲ形質導入された調節性Ｔ細胞は、照射された宿主中に生着できる。
【０３０８】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、ビーズ選別によって、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニックマウスのリンパ節および脾細胞から単離した。Ｔｒｅｇを、ＴＣＲで形質導入した。形質導入の１日後、ＴＣＲまたはＴＣＲ＋ＦＯＸＰ３形質導入された細胞を、４Ｇｙ照射でコンディショニングしたＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１トランスジェニック宿主中に注射した（０日目）。７週間後、フローサイトメトリーを使用して、ＴＣＲについての染色を介して、形質導入されたＴｒｅｇの生着を決定した（＋７週間）。
【０３０９】
図２３中の結果は、投与の７週間後の、Ｔｒｅｇおよび抗原特異的抑制効果の持続を示している。
【０３１０】
上記明細書中で言及される全ての刊行物が、本明細書で参照によって組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションが、本発明の範囲および精神から逸脱することなしに、当業者に明らかである。本発明を、具体的な好ましい実施形態との関連で記載してきたが、特許請求された本発明は、かかる具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないと理解すべきである。実際、分子生物学、細胞免疫学または関連する分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１】
2021520831.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2021520831.tif 000019
【図１８】
2021520831.tif 000020
【図１９】
2021520831.tif 000021
【図２０】
2021520831.tif 000022
【図２１】
2021520831.tif 000023
【図２２】
2021520831.tif 000024
【図２３−１】
2021520831.tif 000025
【図２３−２】
2021520831.tif 000026
【図２３−３】
2021520831.tif 000027
【配列表】
2021520831000001.app
【国際調査報告】
2021520831.tif 000028
2021520831.tif 000029
2021520831.tif 000030
2021520831.tif 000031