(57)【要約】  本開示は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含む組成物を患者に投与し、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子を該患者にさらに投与することによって、がん患者を治療する方法に関する。さらに、本開示は、このような方法において使用される組成物に関する。
2021511826.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸であって、
（ａ）配列番号１もしくは４と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは少なくとも約９９．５％の配列同一性を有し、抗フルオレセインscFvをコードする核酸；または
（ｂ）配列番号１もしくは４に示される配列を有する核酸
を含み、
（ａ）または（ｂ）の核酸が、任意で、IgG4ヒンジドメイン、CD3ζ活性化ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインをコードする核酸をさらに含む、
核酸。
【請求項２】
キメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２もしくは３と少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％もしくは少なくとも約９９．５％の配列同一性を有し、抗フルオレセインscFvをコードするポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２もしくは３に示される配列を有し、抗フルオレセインscFvをコードするポリペプチド
を含み、
（ａ）または（ｂ）のポリペプチドが、任意で、IgG4ヒンジドメイン、CD3ζ活性化ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインをコードするポリペプチドをさらに含む、
ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
レンチウイルスベクターである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
請求項１、３および４のいずれか１項に記載の核酸またはベクターを含む細胞。
【請求項６】
Ｔリンパ球または細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
ヒト化アミノ酸配列もしくはヒトアミノ酸配列を含むか、またはヒト化アミノ酸配列もしくはヒトアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項２または７に記載のポリペプチドを含む細胞。
【請求項９】
Ｔリンパ球または細胞傷害性Ｔリンパ球である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
患者のがんを緩和または治療する方法であって、
フルオレセインイソチオシアネート（FITC）部分を有する小分子リガンドで患者のがんを標識する工程；および
請求項５、６または９に記載の細胞、Ｔリンパ球または細胞傷害性Ｔリンパ球を含むキメラ抗原受容体（CAR）Ｔ細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む方法。
【請求項１１】
FITC部分を有する前記小分子リガンドでがんを標識する前に、前記CAR Ｔ細胞組成物が投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記CAR Ｔ細胞組成物が自家細胞を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年9月26日に出願された「CAR T細胞の使用方法」という名称の米国仮出願第62/736,727号、2018年9月24日に出願された「CAR T細胞の使用方法」という名称の米国仮出願第62/735,627号、2018年8月29日に出願された「CAR T細胞の使用方法」という名称の米国仮出願第62/724,171号、2018年4月11日に出願された「CAR T細胞の使用方法」という名称の米国仮出願第62/656,233号、2018年1月23日に出願された「CAR T細胞の使用方法」という名称の米国仮出願第62/620,706号、および2018年1月22日に出願された「CAR T細胞の使用方法」という名称の米国仮出願第62/620,414号に基づく優先権を主張するものであり、これらの文献は引用によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI200WOSEQLISTのファイル名で2019年1月14日に作成された約26kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
本開示は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含む組成物を患者に投与し、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子を該患者にさらに投与することによって、がん患者を治療する方法に関する。さらに、本開示は、このような方法において使用される組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
患者にリンパ球（たとえばT細胞）を養子移入する免疫療法は、がんやその他の疾患の治療に有益な治療法である。リンパ球の養子移入を利用した免疫療法の開発では、重要な進歩が数多く得られている。様々な種類の免疫療法剤のうち、現在開発中の最も有望な免疫療法剤の１つとして、キメラ抗原受容体発現T細胞（CAR T細胞）がある。キメラ抗原受容体（CAR）は、特異的抗原（たとえば腫瘍抗原）をターゲティングするように設計された遺伝子組換え受容体を指す。このターゲッティングにより、腫瘍に対して細胞傷害性が発揮され、たとえば、CARを発現するCAR T細胞が、特異的な腫瘍抗原を介して腫瘍をターゲティングし、殺傷することが可能となる。
【０００５】
第１世代CARは、認識領域と活性化シグナル伝達ドメインから構成され、認識領域は、たとえば、腫瘍により発現される抗原を認識してこれに結合する抗体に由来する一本鎖可変領域断片（scFv）であり、活性化シグナル伝達ドメインは、たとえば、CARにおいてT細胞活性化シグナルを伝達するT細胞CD3ζ鎖である。CAR T細胞は、インビトロにおいて肯定的な結果を示しているが、臨床試験における疾患（たとえば、がん）の排除では、限定的な成功しか得られていない。問題点の１つとして、インビボでは活性化を長期間維持できず、CAR T細胞集団を増殖させることができないことがある。
【０００６】
この問題に対処するため、第２世代CARでは、共刺激ドメイン（たとえば、CD137、CD28またはCD134）が組み込まれ、インビボにおけるT細胞の活性化の維持が達成されている。共刺激ドメインを付加することによって、CARを含むT細胞のインビボでの増殖および生存を向上させることができ、初期の臨床データでは、このような構築物が、（がんなどの）疾患の治療に有望であることが示されている。
【０００７】
CAR T細胞療法において様々な改良がなされているが、いくつかの問題はいまだに残されている。１点目として、正常細胞がCAR T細胞の標的抗原（たとえば腫瘍関連抗原）を発現していることから、「オフターゲット」毒性が発生することが挙げられる。２点目としては、CAR T細胞が無秩序に活性化することが挙げられ、病変細胞（たとえば、がん細胞）がCAR T細胞によって急速かつ無制御に排除されることによって、様々な代謝障害が一斉に誘導されて腫瘍崩壊症候群またはサイトカイン放出症候群（CRS）と呼ばれる障害が起こるため、患者にとって致命的になりうる。制御が難しく、無秩序に活性化されてしまうCAR T細胞が投与されたことによって、腫瘍崩壊症候群やCRSが発生することがある。したがって、CAR T細胞は、（がんなどの）疾患の治療ツールとしての非常に有望であるが、オフターゲット毒性が低減され、CAR T細胞の活性化をより正確に制御できる新たなCAR T細胞療法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、オフターゲット毒性を低減する方法、より正確には、CAR T細胞の活性化を制御する方法を発見した。これに基づき、CAR T細胞療法の重要な進歩を提供する。本明細書に記載の様々な実施形態において、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを発現するCAR T細胞とがんの間の架橋として使用する。この架橋剤によって、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを発現するCAR T細胞をがんに指向させて、がんを緩和する。一実施形態において、「小分子リガンド」は、たとえば、葉酸類、DUPA、NK-1Rリガンド、CAIXリガンド、γ-グルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、NKG2Dリガンド、CCK2Rリガンドのいずれであってもよく、これらはいずれもがん細胞に特異的に結合する小分子リガンドである（すなわち、これらの各リガンドに対する受容体が、正常組織と比べ、がんにおいて過剰発現されている）。
【０００９】
一実施形態において、「小分子リガンド」は、CAR T細胞によって発現されるCARに結合する「標的化部分」に連結されている。様々な実施形態において、「標的化部分」は、たとえば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）および／またはNHS-フルオレセインから選択することができる。
【００１０】
「標的化部分」は、遺伝子組換えCARの認識領域に結合し、この認識領域は抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現している。したがって、CARの認識領域（たとえば、抗フルオレセイン抗体クローンE2断片の一本鎖可変領域（scFv）、Fab断片、Fv断片、Fc断片、(Fab’)2断片など）が「標的化部分」に指向される。したがって、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドは、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞とがんの間の架橋として作用し、CAR T細胞をがんに指向させて、がんを緩和する。
【００１１】
一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物の１回目の投与を前記患者に行う工程、および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含む前記CAR T細胞組成物の２回目の投与を前記患者に行う工程
を含む。
【００１２】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞と、形質転換していないT細胞との混合物を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【００１３】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）葉酸類、標的化部分を含んでいない葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与する工程
を含む。
【００１４】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与および２回目の投与を患者に行う工程、ならびに
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含み、
前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約2倍〜約15000倍である。
【００１５】
一例としての別の実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与を患者に行う工程；
ii）前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約50%少ない投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも２回目の投与を前記患者に行う工程；および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【００１６】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を、患者の体重あたり約10nmol/kg〜約2500nmol/kgの投与量で患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を、該CAR T細胞として約100万個〜約1500万個の投与量で前記患者に投与する工程
を含む。
【００１７】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に連続投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）前記患者においてサイトカイン放出症候群を抑制または予防するために、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了する工程
を含む。
【００１８】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に週１回投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【００１９】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を投与する前に、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与を患者に行う工程；
ii）前記CAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程；および
iii）前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与を前記患者に行う工程
を含む。
【００２０】
以下に記載の項において、さらなる実施形態を説明する。本特許出願の発明の概要、例示的な実施形態の詳細な説明、実施例または請求項で述べる適用可能な実施形態と、以下で述べる実施形態とを組み合わせたものも、本発明において想定される。
【００２１】
１．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程；
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するキメラ抗原受容体（CAR）を含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物の１回目の投与を前記患者に行う工程；および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物の２回目の投与を前記患者に行う工程
を含む方法。
【００２２】
２．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞と、形質転換していないT細胞との混合物を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む方法。
【００２３】
３．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）葉酸類、標的化部分を含んでいない葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与する工程
を含む方法。
【００２４】
４．前記工程iiiが、葉酸類を投与することを含む、項３に記載の方法。
【００２５】
５．前記工程iiiが、葉酸またはロイコボリンを投与することを含む、項３または４に記載の方法。
【００２６】
６．前記工程iiiが、前記葉酸含有複合体を投与することを含む、項３に記載の方法。
【００２７】
７．前記葉酸含有複合体が、１つ以上のアミノ酸に連結された葉酸類を含む、項６に記載の方法。
【００２８】
８．前記葉酸含有複合体が、以下の式
【化１】
2021511826.tif 000003
を有する、項７に記載の方法。
【００２９】
９．前記葉酸類が、以下の式
【化２】
2021511826.tif 000004
【００３０】
（式中、Ｘ１およびＹ１は、ハロ、Ｒ２、ＯＲ２、ＳＲ３およびＮＲ４Ｒ５からなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｕ、ＶおよびＷは、−（Ｒ６ａ）Ｃ＝、−Ｎ＝、−（Ｒ６ａ）Ｃ（Ｒ７ａ）−および−Ｎ（Ｒ４ａ）−からなる群からそれぞれ独立して選択される二価部分を示し；
Ｑは、ＣおよびＣＨからなる群から選択され；
Ｔは、Ｓ、Ｏ、Ｎおよび−Ｃ＝Ｃ−からなる群から選択され；
Ｘ２およびＸ３は、酸素、硫黄、−Ｃ（Ｚ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｚ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）−、−ＯＣ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ５ｂ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ４ａ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｒ６ｂ）（Ｒ７ｂ）−、−Ｎ（Ｃ≡ＣＨ）−、−Ｎ（ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）−、Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン、およびＣ１〜Ｃ１２アルキレンオキシからなる群からそれぞれ独立して選択され、ここでＺは、酸素または硫黄であり；
Ｒ１は、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂおよびＲ７ｂは、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ）カルボニル、および（Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミノ）カルボニルからなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｒ６およびＲ７は、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群からそれぞれ独立して選択されるか；またはＲ６およびＲ７は、一緒になってカルボニル基を形成し；
Ｒ６ａおよびＲ７ａは、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群からそれぞれ独立して選択されるか；またはＲ６ａおよびＲ７ａは、一緒になってカルボニル基を形成し；
ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、それぞれ独立して０または１であり；
＊は、複合体の残りの部分との共有結合を示す）
を有する、項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【００３１】
１０．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、リンパ球特異的チロシンキナーゼタンパク質阻害薬；PI3キナーゼ阻害薬；IL-2誘導性T細胞キナーゼの阻害薬；JAK阻害薬；BTK阻害薬；EC2319；および前記化合物またはその薬学的に許容される塩へのCAR T細胞の結合を阻害するが、がんには結合しない薬剤からなる群から選択される、項３に記載の方法。
【００３２】
１１．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、リンパ球特異的チロシンキナーゼタンパク質阻害薬である、項１０に記載の方法。
【００３３】
１２．前記リンパ球特異的チロシンキナーゼタンパク質阻害薬が、ダサチニブである、項１１に記載の方法。
【００３４】
１３．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、PI3キナーゼ阻害薬である、項１０に記載の方法。
【００３５】
１４．前記PI3キナーゼ阻害薬が、GDC0980である、項１３に記載の方法。
【００３６】
１５．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、IL-2誘導性T細胞キナーゼの阻害薬である、項１０に記載の方法。
【００３７】
１６．前記IL-2誘導性T細胞キナーゼの阻害薬が、BMS-509744である、項１５に記載の方法。
【００３８】
１７．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩へのCAR T細胞の結合を阻害するが、がんには結合しない薬剤である、項１０に記載の方法。
【００３９】
１８．前記薬剤が、フルオレセインアミン、FITCまたはフルオレセインナトリウムである、項１７に記載の方法。
【００４０】
１９．前記薬剤がFITCである、項１８に記載の方法。
【００４１】
２０．前記薬剤がフルオレセインナトリウムである、項１８に記載の方法。
【００４２】
２１．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.01〜約300μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００４３】
２２．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約100μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００４４】
２３．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約90μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００４５】
２４．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約80μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００４６】
２５．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約70μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００４７】
２６．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約60μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００４８】
２７．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約50μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００４９】
２８．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約40μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００５０】
２９．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約30μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００５１】
３０．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約20μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００５２】
３１．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約10μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００５３】
３２．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約8μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００５４】
３３．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約6μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００５５】
３４．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者に２回以上投与される、項３〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【００５６】
３５．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与前および／または投与後に前記患者に投与される、項３〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【００５７】
３６．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤の投与によって、前記患者のサイトカイン濃度が低下する、項３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【００５８】
３７．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与した約３時間後にサイトカイン濃度が低下する、項３６に記載の方法。
【００５９】
３８．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与した約６時間後にサイトカイン濃度が低下する、項３６に記載の方法。
【００６０】
３９．前記サイトカイン濃度の低下が、未治療患者のサイトカイン濃度と同程度の濃度に達する低下である、項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【００６１】
４０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤の投与前および投与後に投与される、項３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【００６２】
４１．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を投与した後に、たとえ前記患者のサイトカイン濃度が低下したとしても、前記患者の血液中のCAR T細胞数が増加する、項３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【００６３】
４２．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を投与した後に、たとえ治療した患者のサイトカイン濃度が低下したとしても、レスキュー剤で治療していない患者と比較して前記CAR T細胞の活性化が増強または維持される、項３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【００６４】
４３．前記がんが腫瘍を含み、前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与した場合に、前記患者の腫瘍の大きさが増加しない、項３〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【００６５】
４４．前記腫瘍に対する完全奏効が得られる、項４３に記載の方法。
【００６６】
４５．サイトカイン放出症候群（CRS）がグレード１、グレード２、グレード３またはグレード４に達した場合に、前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が前記患者に投与される、項３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【００６７】
４６．CRSがグレード３またはグレード４に達した場合に、前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が前記患者に投与される、項４５に記載の方法。
【００６８】
４７．肺水腫が抑制される、項３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【００６９】
４８．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約2500nmol/kgの投与量で投与され；前記CAR T細胞が、約100万個〜約1500万個の投与量で投与される、項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【００７０】
４９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約100nmol/kgの投与量で投与される、項４８に記載の方法。
【００７１】
５０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約50nmol/kgの投与量で投与される、項４８または４９に記載の方法。
【００７２】
５１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約20nmol/kgの投与量で投与される、項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【００７３】
５２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約600nmol/kgの投与量で投与される、項４８に記載の方法。
【００７４】
５３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約200nmol/kg〜約600nmol/kgの投与量で投与される、項４８に記載の方法。
【００７５】
５４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約400nmol/kg〜約600nmol/kgの投与量で投与される、項４８に記載の方法。
【００７６】
５５．前記CAR T細胞の投与量が、約100万個〜約1250万個である、項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【００７７】
５６．前記CAR T細胞の投与量が、約100万個〜約700万個である、項４８〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【００７８】
５７．前記CAR T細胞の投与量が、約100万個〜約500万個である、項４８〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【００７９】
５８．前記CAR T細胞の投与量が、約200万個〜約500万個である、項４８〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【００８０】
５９．前記患者においてサイトカイン放出症候群を抑制または予防するために、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了する工程をさらに含む、項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【００８１】
６０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、少なくとも１時間にわたり前記患者に連続投与される、項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【００８２】
６１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、少なくとも４時間にわたり前記患者に連続投与される、項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【００８３】
６２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、少なくとも６時間にわたり前記患者に連続投与される、項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【００８４】
６３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者に１日おきに投与される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【００８５】
６４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者に週３回投与される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【００８６】
６５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者に週２回投与される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【００８７】
６６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者に週１回投与される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【００８８】
６７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の前記患者への投与が、許容できない該患者の体重の減少、発熱、血圧低下または肺浮腫が起こるまで継続される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【００８９】
６８．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与および２回目の投与を患者に行う工程、ならびに
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含み、
前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約15000倍である、
方法。
【００９０】
６９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与、２回目の投与および３回目の投与が前記患者に行われ、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量と３回目の投与量がそれぞれ異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約750倍であり、３回目の投与量が、１回目の投与量の約800倍〜約10000倍である、項６８に記載の方法。
【００９１】
７０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与、２回目の投与、３回目の投与および４回目の投与が前記患者に行われ、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量と３回目の投与量と４回目の投与量がそれぞれ異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約750倍であり、３回目の投与量が、１回目の投与量の約800倍〜約7500倍であり、４回目の投与量が、１回目の投与量の約8000倍〜約15000倍である、項６８に記載の方法。
【００９２】
７１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、１回目の投与量の約100倍であり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の３回目の投与量が、１回目の投与量の約1000倍であり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の４回目の投与量が、１回目の投与量の約10000倍である、項７０に記載の方法。
【００９３】
７２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与および２回目の投与が前記患者に行われ、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約15000倍である、項６８に記載の方法。
【００９４】
７３．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与を患者に行う工程；
ii）前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約50%少ない投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも２回目の投与を前記患者に行う工程；および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む方法。
【００９５】
７４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約60%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【００９６】
７５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約70%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【００９７】
７６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約80%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【００９８】
７７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約90%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【００９９】
７８．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約95%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０１００】
７９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約96%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０１０１】
８０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約97%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０１０２】
８１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約98%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０１０３】
８２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約99%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０１０４】
８３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約99.5%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０１０５】
８４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約1000nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０１０６】
８５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約900nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０１０７】
８６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約800nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０１０８】
８７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約700nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０１０９】
８８．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約600nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０１１０】
８９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約200nmol/kg〜約600nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０１１１】
９０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約400nmol/kg〜約600nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０１１２】
９１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約500nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０１１３】
９２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約500nmol/kgである、項８４に記載の方法。
【０１１４】
９３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約450nmol/kgである、項８５に記載の方法。
【０１１５】
９４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約400nmol/kgである、項８６に記載の方法。
【０１１６】
９５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約350nmol/kgである、項８７に記載の方法。
【０１１７】
９６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約300nmol/kgである、項８８に記載の方法。
【０１１８】
９７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約1nmol/kg〜約300nmol/kgである、項８９に記載の方法。
【０１１９】
９８．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約2nmol/kg〜約300nmol/kgである、項９０に記載の方法。
【０１２０】
９９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約2nmol/kg〜約250nmol/kgである、項９１に記載の方法。
【０１２１】
１００．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約5nmol/kg〜約40nmol/kgである、項９２〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【０１２２】
１０１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約40nmol/kg〜約150nmol/kgである、項９２〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【０１２３】
１０２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量と同じ投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の３回目の投与を行う工程をさらに含む、項７３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【０１２４】
１０３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量および３回目の投与量と同じ投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の４回目の投与を行う工程をさらに含む、項１０２に記載の方法。
【０１２５】
１０４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与後に、該化合物またはその薬学的に許容される塩をさらに投与することによって、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与時と比べてがんの成長の抑制が維持される、項７３〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【０１２６】
１０５．前記CAR T細胞の投与量が、約100万個〜約4000万個である、項７３〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【０１２７】
１０６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与後に、該化合物またはその薬学的に許容される塩がさらに週１回投与される、項７３〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【０１２８】
１０７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が週２回投与される、項７３〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【０１２９】
１０８．前記CARが、IgG4ヒンジドメイン、CD3ζ活性化ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインをさらに含む、項１〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【０１３０】
１０９．前記抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片がscFv断片である、項１〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【０１３１】
１１０．前記CARのタンパク質配列が、配列番号２と少なくとも約90%の同一性を有する、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０１３２】
１１１．前記CARのタンパク質配列が、配列番号２と少なくとも約95%の同一性を有する、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０１３３】
１１２．前記CARのタンパク質配列が、配列番号２と少なくとも約98%の同一性を有する、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０１３４】
１１３．前記CARがフルオレセインに結合する、項１〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【０１３５】
１１４．前記CARのタンパク質配列が、約50個以下の保存的アミノ酸置換を有し、該CARがフルオレセインに結合する、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０１３６】
１１５．前記CARが、配列番号１と少なくとも約90%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０１３７】
１１６．前記CARが、配列番号１と少なくとも約95%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０１３８】
１１７．前記CARが、配列番号１と少なくとも約98%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０１３９】
１１８．前記CARがフルオレセインに結合する、項１１５〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【０１４０】
１１９．前記CARが、高ストリンジェントな条件下で、配列番号１を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、該CARがフルオレセインに結合する、項１〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【０１４１】
１２０．前記CARが、配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによってコードされる、項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【０１４２】
１２１．前記リガンドが、葉酸類、DUPA、NK-1Rリガンド、CAIXリガンド、γ-グルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、NKG2DリガンドおよびCCK2Rリガンドからなる群から選択される、項１〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【０１４３】
１２２．前記標的化部分が、フルオレセインまたはその薬学的に許容される塩である、項１〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【０１４４】
１２３．前記リンカーが、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロリン、親水性アミノ酸、糖類、非天然ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、pluronic F-127またはこれらの組み合わせを含む、項１〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【０１４５】
１２４．前記リンカーがPEGを含む、項１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【０１４６】
１２５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、以下の式
【化３】
2021511826.tif 000005
（式中、Ｂは、前記小分子リガンドを示し、
Ｌは、前記リンカーを示し、
Ｔは、前記標的化部分を示し、
ここで、Ｌは、以下の式を有する構造を含む
【化４】
2021511826.tif 000006
（式中、ｎは、０〜２００の整数である））
を有する、項１〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【０１４７】
１２６．前記がんが、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、子宮内膜がん、直腸がん、胃がん、大腸がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、上皮小体がん、非小細胞肺がん、副腎がん、軟組織肉腫、骨肉腫、尿道がん、前立腺がん、慢性白血病、急性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、胸膜中皮腫、膀胱がん、バーキットリンパ腫、尿管がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系新生物（CNS）、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、および食道胃接合部腺癌からなる群から選択される、項１〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【０１４８】
１２７．前記がんが、葉酸受容体を発現するがんである、項１〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【０１４９】
１２８．前記がんが、子宮内膜がんである、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０１５０】
１２９．前記がんが、非小細胞肺がんである、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０１５１】
１３０．前記がんが、卵巣がんである、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０１５２】
１３１．前記がんが、トリプルネガティブ乳がんである、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０１５３】
１３２．前記がんが、急性骨髄性白血病である、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０１５４】
１３３．前記がんが、葉酸受容体βを発現する、項１３２に記載の方法。
【０１５５】
１３４．前記CAR T細胞組成物が、複数回投与される、項１〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【０１５６】
１３５．前記CAR T細胞組成物が、少なくとも２回投与される、項１〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【０１５７】
１３６．前記化合物もしくはその薬学的に許容される塩を投与する前、または前記CAR T細胞組成物を投与する前に、前記患者の画像検査が行われる、項１〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【０１５８】
１３７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、抗体ではなく、かつ抗体断片を含んでいない、項１〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【０１５９】
１３８．前記標的化部分が、ペプチドエピトープを含んでいない、項１〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【０１６０】
１３９．前記患者において、オフターゲット毒性をもたらすサイトカインの放出が起こらず、前記CAR T細胞の毒性が前記がんに対して発揮される、項１〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【０１６１】
１４０．前記患者の組織に対するオフターゲット毒性が起こらず、前記CAR T細胞の毒性が前記がんに対して発揮される、項１〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【０１６２】
１４１．前記がんが腫瘍を含み、前記患者において腫瘍の大きさが縮小し、オフターゲット毒性が起こらない、項１〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【０１６３】
１４２．サイトカイン放出症候群（CRS）が抑制または予防され、前記方法によって前記患者の腫瘍の体積が減少する、項１〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【０１６４】
１４３．サイトカイン放出症候群（CRS）による体重減少が抑制または予防される、項１〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【０１６５】
１４４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に再投与する工程をさらに含む、項５９〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【０１６６】
１４５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の前記再投与により、前記患者においてCAR T細胞の活性化とサイトカイン濃度の上昇が起こる、項１４４に記載の方法。
【０１６７】
１４６．前記がんが腫瘍を含み、該腫瘍の完全奏効が得られる、項１〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
【０１６８】
１４７．前記CAR T細胞が、セントラルメモリー／エフェクターメモリーの表現型を有する、項１〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
【０１６９】
１４８．前記CAR T細胞のCD8とCD4の比率が約1：1である、項１〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
【０１７０】
別の実施形態では、以下が含まれる。
【０１７１】
１４９．キメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸であって、
配列番号１もしくは配列番号４と少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%もしくは少なくとも約99.5%の配列同一性を有し、抗フルオレセインscFvをコードする核酸；または
配列番号１もしくは配列番号４に示される配列を有する核酸
を含み、
（ａ）または（ｂ）の核酸が、任意で、IgG4ヒンジドメイン、CD3ζ活性化ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインをコードする核酸をさらに含む、
核酸。
【０１７２】
１５０．キメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリペプチドであって、
配列番号２もしくは配列番号３と少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%もしくは少なくとも約99.5%の配列同一性を有し、抗フルオレセインscFvをコードするポリペプチド；または
配列番号２もしくは配列番号３に示される配列を有し、抗フルオレセインscFvをコードするポリペプチド
を含み、
（ａ）または（ｂ）のポリペプチドが、任意で、IgG4ヒンジドメイン、CD3ζ活性化ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインをコードするポリペプチドをさらに含む、
ポリペプチド。
【０１７３】
１５１．項１４９に記載の核酸を含むベクター。
【０１７４】
１５２．レンチウイルスベクターである、項１５１に記載のベクター。
【０１７５】
１５３．項１４９、１５１および１５２のいずれか１項に記載の核酸またはベクターを含む細胞。
【０１７６】
１５４．Tリンパ球または細胞傷害性Tリンパ球である、項１５３に記載の細胞。
【０１７７】
１５５．ヒト化アミノ酸配列もしくはヒトアミノ酸配列を含むか、またはヒト化アミノ酸配列もしくはヒトアミノ酸配列からなる、項１５０に記載のポリペプチド。
【０１７８】
１５６．項１５０または１５５に記載のポリペプチドを含む細胞。
【０１７９】
１５７．Tリンパ球または細胞傷害性Tリンパ球である、項１５６に記載の細胞。
【０１８０】
１５８．患者のがんを緩和または治療する方法であって、
フルオレセインイソチオシアネート（FITC）部分を有する小分子リガンドで患者のがんを標識する工程；および
項１５３、１５４または１５７に記載の細胞、Tリンパ球または細胞傷害性Tリンパ球を含むキメラ抗原受容体（CAR）T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む方法。
【０１８１】
１５９．FITC部分を有する前記小分子リガンドで前記がんを標識する前に、前記CAR T細胞組成物が投与される、項１５８に記載の方法。
【０１８２】
１６０．前記CAR T細胞組成物が自家細胞を含む、項１５８または１５９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】E2コンストラクトと4M5.3コンストラクトを比較した図と、E2コンストラクトのマップを示す。
【０１８４】
【図２】投与量を固定した場合および投与量を低減した場合のEC17の投与の概要を示す。
【０１８５】
【図３Ａ−３Ｂ】EC17の投与量を低減した場合のE2-CAR-T細胞の抗腫瘍活性（3000万個）と、その際の体重の変化を示す。図に示すように、抗腫瘍活性は、NaFLによるレスキュー後でも維持される。
【０１８６】
【図４Ａ−４Ｂ】EC17の投与量を低減した場合の4M5.3-CAR-T細胞の抗腫瘍活性（3000万個）と、その際の体重の変化を示す。図に示すように、4M5.3-CAR-Tは、E2-CAR-Tよりも活性が低かった。さらに、EC17の投与量に依存した抗腫瘍活性および体重減少が観察された。
【０１８７】
【図５Ａ−５Ｂ】投与量を固定してEC17を投与するレジメン（500nmol/kg、週１回）におけるE2-CAR-T細胞（1000万個または2000万個）の抗腫瘍活性と、その際の体重の変化を示す。図に示すように、抗腫瘍活性は、NaFLによるレスキュー後でも維持された。
【０１８８】
【図６Ａ−６Ｂ】投与量を固定してEC17を投与するレジメン（500nmol/kg、週１回）における4M5.3-CAR-T細胞（1000万個または2000万個）の抗腫瘍活性と、その際の体重の変化を示す。図に示すように、4M5.3-CAR-Tは、E2-CAR-Tよりも活性が低かった。
【０１８９】
【図７Ａ−７Ｂ】NSGマウスに注入する前のE2 CAR T細胞の表現型の評価を示す。
【０１９０】
【図８Ａ−８Ｂ】E2-CAR-T細胞、4M5.3-CAR-T細胞、GFP+4M5.3 CAR-T細胞などの様々な細胞製剤におけるCAR-T細胞の分化表現型の比較を示す。
【０１９１】
【図９Ａ−９Ｂ】FITCに対するDIG標識E2-IgGの結合を示す。
【０１９２】
【図１０Ａ−１０Ｂ】FITC標識KB細胞に結合したDIG標識抗FITC抗体クローンE2の免疫組織（IHC）染色を示す。
【０１９３】
【図１１】ヒト正常副腎組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０１９４】
【図１２】ヒト正常骨髄組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０１９５】
【図１３】ヒト正常乳房組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０１９６】
【図１４】ヒト正常小脳組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０１９７】
【図１５】ヒト正常子宮頸部組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０１９８】
【図１６】ヒト正常結腸組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０１９９】
【図１７】ヒト正常食道組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２００】
【図１８】ヒト正常眼組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２０１】
【図１９】ヒト正常心臓組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２０２】
【図２０】ヒト正常下垂体組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２０３】
【図２１】ヒト正常腎臓組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２０４】
【図２２】ヒト正常喉頭組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２０５】
【図２３】ヒト正常脾臓組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２０６】
【図２４】ヒト正常肝臓組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２０７】
【図２５】ヒト正常肺組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２０８】
【図２６】ヒト正常リンパ節組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２０９】
【図２７】ヒト正常神経組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１０】
【図２８】ヒト正常卵巣組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１１】
【図２９】ヒト正常膵臓組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１２】
【図３０】ヒト正常前立腺組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１３】
【図３１】ヒト正常皮膚組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１４】
【図３２】ヒト正常小腸組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１５】
【図３３】ヒト正常胃組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１６】
【図３４】ヒト正常横紋筋組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１７】
【図３５】ヒト正常精巣組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１８】
【図３６】ヒト正常胸腺組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２１９】
【図３７】ヒト正常舌組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２２０】
【図３８】ヒト正常子宮組織に対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した免疫組織（IHC）染色を示す。パネルＡ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験組織切片；パネルＢ：DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートしなかったコントロール組織切片。
【０２２１】
【図３９】様々な標的細胞と１日共培養したT細胞の活性化を示すグラフである。アッセイ時の標的細胞における葉酸受容体（FR）の発現量（ｘ軸）に対する、１日共培養後に活性化されたE2 CAR T細胞のパーセンテージ（ｙ軸）を示す。（▼）OV90細胞；（◆）SKOV3細胞；（▲）IGROV1細胞；（■）HOS-Frα細胞；（●）MDA-MB-231細胞。
【０２２２】
【図４０】３つの異なる条件下で５種の細胞（OV90細胞；SKOV3細胞；IGROV1細胞；HOS-Frα細胞；MDA-MB-231細胞）を使用して２日間共培養した標的細胞のアポトーシスを示すグラフである。各細胞に対する条件は以下のとおりである。左側の棒：標的細胞のみ＋EC17；中央の棒：EC17による前処理を行っていない標的細胞とCAR T細胞の共培養；右側の棒：EC17による前処理を行った標的細胞とCAR T細胞の共培養。
【０２２３】
【図４１】５種の細胞（OV90細胞；SKOV3細胞；IGROV1細胞；HOS-Frα細胞；MDA-MB-231細胞）における機能性葉酸受容体の発現量を示すグラフである。
【０２２４】
【図４２】腫瘍を有するマウスおよびナイーブマウスを使用した実験のタイムラインを示す概要図である。
【０２２５】
【図４３】左パネルは、ナイーブマウスおよび腫瘍を有するマウスにおいて、IFN-γサイトカインの濃度がEC-17に依存していたことを示すグラフであり、ナイーブマウスにおけるIFN-γの上昇は、MDA-MB-231腫瘍を有するマウスと比べて非常に低かった（23分の１）ことが示されている。右パネルは、FACS分析を示すグラフであり、MDA-MB-231腫瘍を有するマウスではCAR-T細胞が増殖していたが、ナイーブマウスではCAR-T細胞の増殖は検出されなかったことが示されている。
【０２２６】
【図４４】上パネルは、ポジティブコントロール細胞株であるK562-OKT3との共培養において、Mock T細胞と抗FL CAR T細胞が定量的に類似した濃度のサイトカイン（IL-2）を産生したことを示すグラフである（左の一組の棒において、左側の棒はMock T細胞を示し、右側の棒は抗FL CAR T細胞を示す）。K562と共培養した場合、Mock T細胞も抗FL CAR T細胞もサイトカインを産生しなかった（中央）。IL-2サイトカインの分泌を誘導することができた細胞は、抗FL CAR T細胞のみであったが、これはEC-17で前処理を行った場合にのみ観察された（右側に抗FL CAR T細胞の結果のみが示されている）。中央パネルは、ポジティブコントロール細胞株であるK562-OKT3との共培養において、Mock T細胞と抗FL CAR T細胞が定量的に類似した濃度のサイトカイン（IFN-γ）を産生したことを示すグラフである（左側の一組の棒において、左側の棒はMock T細胞を示し、右側の棒は抗FL CAR T細胞を示す）。K562と共培養した場合、Mock T細胞も抗FL CAR T細胞もサイトカインを産生しなかった（中央）。IFN-γサイトカインの分泌を誘導することができた細胞は、抗FL CAR T細胞のみであったが、これはEC-17で前処理を行った場合にのみ観察された（右側に抗FL CAR T細胞の結果のみが示されている）。下パネルは、ポジティブコントロール細胞株であるK562-OKT3との共培養において、Mock T細胞と抗FL CAR T細胞が定量的に類似した濃度のサイトカイン（TNF-α）を産生したことを示すグラフである（左の一組の棒において、左側の棒はMock T細胞を示し、右側の棒は抗FL CAR T細胞を示す）。K562と共培養した場合、Mock T細胞も抗FL CAR T細胞もサイトカインを産生しなかった（中央）。TNF-αサイトカインの分泌を誘導することができた細胞は、抗FL CAR T細胞のみであったが、これはEC-17で前処理を行った場合にのみ観察された（右側に抗FL CAR T細胞の結果のみが示されている）。
【０２２７】
【図４５】左上は、CD8+Mock T細胞または抗FL CAR T細胞を、ネガティブコントロールであるK562細胞と、30：1の比率、10：1の比率、3：1の比率または1：1の比率で共培養した場合の細胞溶解率（％）を示したグラフである。右上は、CD8+Mock T細胞または抗FL CAR T細胞を、K562+OKT3標的細胞と、30：1の比率、10：1の比率、3：1の比率または1：1の比率で共培養した場合の細胞溶解率（％）を示したグラフである。左下は、CD8+Mock T細胞または抗FL CAR T細胞を、非標識MDA-MB-231細胞と、30：1の比率、10：1の比率、3：1の比率または1：1の比率で共培養した場合の細胞溶解率（％）を示したグラフである。右下は、CD8+Mock T細胞または抗FL CAR T細胞を、EC17で標識したMDA-MB-231細胞と、30：1の比率、10：1の比率、3：1の比率または1：1の比率で共培養した場合の細胞溶解率（％）を示したグラフである。すべてのグラフにおいて、×印はCD8+Mock T細胞を示し、○印は抗FL CAR T細胞を示す。
【０２２８】
【図４６】上パネルは、FITC-葉酸の化学構造を示す。下パネルは、FITC-葉酸の用量反応曲線を示すグラフである。
【０２２９】
【図４７】上パネルは、FITC-DUPAの化学構造を示す。下パネルは、FITC-DUPAの用量反応曲線を示すグラフである。
【０２３０】
【図４８】上パネルは、FITC-CA9の化学構造を示す。下パネルは、FITC-CA9の用量反応曲線を示すグラフである。
【０２３１】
【図４９】上パネルは、FITC-NK1Rの化学構造を示す。下パネルは、FITC-NK1Rの用量反応曲線を示すグラフである。
【０２３２】
【図５０】は、インビボモデルにおいて使用した場合の、架橋剤の小分子リガンドに対応する受容体を発現する腫瘍細胞への架橋剤の結合を示す（FACS分析）。
【０２３３】
【図５１】EC17によって誘導された、CAR T細胞による葉酸受容体依存性の強力な腫瘍細胞殺傷効果を示す。
【０２３４】
【図５２】各腫瘍細胞における機能性葉酸受容体の発現量とCAR T細胞の細胞溶解活性の相関性を示す。
【０２３５】
【図５３】EC17および葉酸受容体（FR）に依存したCAR T細胞の活性化および疲弊を示す。EC17（100nM、37℃で30分間パルス）をプレロードしたFR+標的腫瘍細胞またはEC17をプレロードしなかったFR+標的腫瘍細胞と共培養したCAR-T細胞（E/T=1：1）において検出した早期T細胞活性化マーカー（CD69）、中期T細胞活性化マーカー（CD137）および後期T細胞活性化マーカー（PD1）の発現量を示す。最初の２つの白色の棒は、標的細胞を添加していないCAR-T細胞とMock形質導入T細胞を示す。
【０２３６】
【図５４】EC17および葉酸受容体（FR）に依存したCAR T細胞の疲弊プロファイルを示す。上段：標的細胞を加えずに培養したCAR-T細胞の０日目〜３日目の分化状態の変化を示したカラー円グラフである。下段：各腫瘍細胞にEC17（0.1nMまたは10nM、37℃で30分間パルス）をプレロードして、あるいはEC17をプレロードせずに、FR陽性腫瘍細胞（MDA-MB-231、THP-1FRb、HOS-FRa、KB）またはFR陰性腫瘍細胞（THP1-FG12、HOS-143b）と３日間共培養したCAR-T細胞（E/T=1：2）の分化状態を示した４組のカラー円グラフである。
【０２３７】
【図５５】抗FITC scFv（クローンE2）、完全長IgG4スペーサー（Fc由来ヒンジ-CH2(L235D,N297Q)-CH3）、CD28tm膜貫通ドメイン、4-1BB/CD3ζ細胞内活性化ドメイン、および上皮成長因子受容体の非機能性末端切断型の細胞表面ポリペプチド（EGFRt）を含む完全ヒト型CARコンストラクトを示す。下パネル：EGFRtでソートしたCAR-T細胞製剤（左の円グラフ）およびソートしていない「臨床模擬」CAR-T細胞製剤（右の円グラフ）における、フローサイトメトリーによるCD4/CD8 T細胞の表現型解析の例を示す。色の凡例を示す。
【０２３８】
【図５６】パネルＡ：37℃で２時間インキュベーション後のFR+標的細胞による3H-EC17の取り込みのKd値を示す（細胞１個あたりに結合した分子の数として算出した）。パネルＢ：室温で２時間インキュベーション後のE2-CAR-T細胞（EGFRt+約24%、CD8とCD4の比率=約95：5）による3H-EC17の取り込みのKd値を示す（細胞内に取り込まれた総放射能量（DPM）で算出した）。
【０２３９】
【図５７】パネルＡおよびパネルＢは、サイトカイン放出症候群（CRS）の評価尺度と、HOS-FRa腫瘍を有するマウスに対してフルオレセインナトリウムによるレスキューを行った実験条件を示す。また、レスキューを行った場合およびレスキューを行わなかった場合におけるT細胞由来サイトカインの変化を示す。ｐ値はスチューデントのｔ検定によって算出した。
【０２４０】
【図５８】3H-FA（葉酸）を使用した結合アッセイ（100nM、37℃で１時間）で測定した、腫瘍細胞上の機能性葉酸受容体の発現量を示す。
【０２４１】
【図５９】パネルＡは、E/T（エフェクター細胞／標的細胞）比を1：1として、EGFRtでソートしたCAR-T細胞と24時間共培養した５種の葉酸受容体（FR）陽性腫瘍細胞株の特異的溶解率（%）に対する、全濃度範囲のEC17の用量反応性を示す。パネルＢは、100nMまでの濃度で作製した用量反応曲線から得た最大溶解率（%）およびEC50値を示す。
【０２４２】
【図６０】葉酸受容体（FR）の発現量とCAR-T細胞活性の相関性、および腫瘍細胞固有の感受性とCAR-T細胞活性の相関性を示す。パネルＡ：10nMのEC17の存在下において、様々なE/T比で16時間または48時間共培養した後のFR陽性細胞株（MDA-MB-231、KB、THP1-FRb、OV90、HOS-FRa）およびFR陰性細胞株（HOS-143b）の特異的溶解率（%）の動態を示す。パネルＢ：線形スケールで示したE/T比に対してプロットした標的細胞の特異的溶解率（%）を示す。FRを高発現するKB細胞は16時間後に早期の抵抗性を示したが、FR陰性のHOS-143b細胞は反応を示さなかった。パネルＣ：KB細胞以外の細胞において、16時間共培養した場合の特異的溶解率（%）と腫瘍細胞上の機能性葉酸受容体の発現量の間で半対数の相関性が認められた。パネルＤ：10nMのEC17の存在下において44時間共培養した後の、CAR-T細胞由来Th1サイトカイン（IFN-γ、IL-2およびTNFa）の濃度と様々なE/T比の関連性を示した三次元グラフである。パネルＥ：Log10スケールにおいて、FR陽性標的細胞の葉酸受容体の発現量に対してプロットしたCAR-T細胞由来Th1サイトカインの濃度を示す。
【０２４３】
【図６１】パネルＡは、フローサイトメトリーによって確認し、MFIとして示した標的細胞におけるEC17のローディング状態を示す棒グラフである（FR陰性細胞株においてEC17は検出できなかった）。パネルＢは、図５４の記載と同様にして２日間共培養した後にアネキシンV染色により検出した標的細胞のアポトーシス（%）を示すグラフである。
【０２４４】
【図６２】インビボにおけるCAR-T細胞の薬理学的動態および腫瘍によるCAR-T細胞の取り込みを示す。パネルＡ：MDA-MB-231腫瘍担持マウスへのCAR-T細胞の注射および週１回のEC17の投与（500nmol/kg）に対してマウス選抜スケジュールを示した実験計画の概略図である。０日目に、EGFRtでソートした約480万個のCAR-T細胞を合計15匹のマウスに投与した（この時点で３匹のマウスにおいて大きな腫瘍が認められた）。パネルＢ：左パネルは、腫瘍体積と体重の変化の測定結果を示す。中央パネルは、EC17を１回投与した７日後の血液中におけるCAR-T細胞の増殖を示す。右の棒グラフは、小さい腫瘍を有するマウスおよび大きな腫瘍を有するマウスにおける血液循環CD4/CD8 CAR-T細胞サブセットの分化プロファイルを示す。パネルＣ：腫瘍体積と体重の変化の測定結果を示す。パネルＤ：上のグラフは、血液中（実線）のCAR-T細胞の動態と腫瘍中（点線）のCAR-T細胞の動態の比較を示す。下の棒グラフは、血液中のCAR-T細胞の表現型の変化を示す。パネルＥ：腫瘍に浸潤したCAR-T細胞の活性化マーカー（4-1BB、PD1）の表面発現の動態変化を示す。
【０２４５】
【図６３】抗腫瘍活性およびCRS毒性に対する食餌中の葉酸の影響を示す。パネルＡ：実験を通して高葉酸（FA）飼料または葉酸（FA）欠乏飼料で飼育しながら、大きなMDA-MB-231腫瘍を異種移植後に（約1000万個の「臨床模擬」）CAR-T細胞で処置し、500nmol/kgのEC17を週１回投与したNSGマウスにおける腫瘍体積および体重の変化の測定結果を示す（n=5）。パネルＢ：52日目（FA欠乏）および59日目（高FA）の試験終了時に測定した循環CAR-T細胞（ヒトCD3ε+EGFRt+）を示す棒グラフである。パネルＣ：CAR-T細胞のみ（EC17なし）で処置したFA欠乏マウスにおいて循環CAR-T細胞が存在しないこと、およびFA欠乏飼料で飼育し、EC17とCAR-T細胞で処置したマウスにおける循環CAR-T細胞の数が、高FA飼料で飼育し同じ処置を行ったマウスよりも増加していることを示す代表的なフローサイトメトリーのドットプロットである。パネルＤ：フローサイトメトリーで分析したところ、高FAマウスから59日目に採取した３つのMDA-MB-231腫瘍のうち２つにおいて、葉酸受容体の発現の欠失が検出されたことを示す（その後、定量放射性リガンド結合アッセイでも確認された；データ示さず）。
【０２４６】
用語の定義
本明細書において、「a」または「an」は、１つまたは１つ以上を意味してもよい。また、整数、分数およびパーセンテージなどの数値に関して本明細書において使用される「約」という用語は、通常、当業者であれば、記載の数値と同等である（たとえば、同じ機能を有したり、同じ結果が得られる）と判断できる一定の範囲の数値（たとえば、記載の数値の±5%〜10%）を指す。
【０２４７】
本明細書において、「治療する」、「治療すること」、「治療された」または「治療」は、治療処置と予防処置の両方を指す。
【０２４８】
がんに関して本明細書において使用される「緩和する」、「緩和すること」、「緩和」または「緩和された」という用語は、がんの症状の抑制、腫瘍の大きさの縮小、腫瘍の完全な除去もしくは部分的な除去（たとえば完全奏効もしくは部分奏効）、疾患の安定化、がんの進行の阻止（たとえば無増悪生存期間）、または医師によってがんの治療処置もしくは予防処置であると見なされるがんに対するその他の効果を意味してもよい。
【０２４９】
本明細書において、「投与する」「投与すること」または「投与された」は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物、または前記化合物もしくはその薬学的に許容される塩を患者に導入するためのあらゆる手段を意味し、これには、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および経皮投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５０】
本明細書において、「オフターゲット毒性」は、患者の治療を行っている医師にとって受け入れがたい臓器障害もしくは患者の体重の減少、または患者の治療を行っている医師にとって受け入れがたい患者に対するその他の影響を意味し、たとえば、B細胞無形成、発熱、血圧の低下または肺浮腫が挙げられる。
【０２５１】
本明細書において、「形質導入」および「トランスフェクション」という用語は同じ意味で使用され、ウイルスを使用した方法やウイルスを使用しない方法などの何らかの人工的な方法によって、細胞に核酸を導入することを意味する。
【０２５２】
例示的な実施形態の詳細な説明
本明細書に記載の様々な実施形態において、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを、CAR T細胞（すなわちキメラ抗原受容体を発現するT細胞）とがんの間の架橋として使用し、このCAR T細胞は、標的化部分に指向するように遺伝子組換えされたCARを含み、このCARは、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含む。この架橋剤は、CAR T細胞をがんに指向して、がんを緩和する。一実施形態において、「小分子リガンド」は、たとえば、葉酸類、CAIXリガンド、DUPA、NK-1Rリガンド、γ-グルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、NKG2Dリガンド、CCK2Rリガンドのいずれであってもよく、これらはいずれもがん細胞に特異的に結合する小分子リガンドである（すなわち、これらの各リガンドに対する受容体が、正常組織と比べ、がんにおいて過剰発現されている）。
【０２５３】
小分子リガンドに連結された「標的化部分」は、CAR T細胞によって発現される遺伝子組換えCARの認識領域に結合し、このCARは抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含む。したがって、CARの認識領域（たとえば、抗フルオレセイン抗体クローンE2の一本鎖可変領域断片（scFv））が「標的化部分」に指向される。したがって、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドは、遺伝子組換えCARを含むCAR T細胞とがんの間の架橋として作用し、CAR T細胞をがんに指向して、がんを緩和する。
【０２５４】
架橋剤は小さな有機分子であることから、血流からの急速な排除が可能である（たとえば約20分以内）。一態様において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含む遺伝子組換えCARを含むCAR T細胞の反応を、「架橋剤」の小分子リガンド部分に対する受容体を発現するがん細胞のみにターゲティングすることができ、これによって、正常組織に対するオフターゲット毒性を低減することができる。さらに、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含む１種類のCAR T細胞コンストラクトにおいて様々な「架橋剤」を使用することによって、このCAR T細胞コンストラクトを様々ながんにターゲティングすることができるため、このCAR T細胞システムは「汎用性が高い」と言える。より具体的に説明すると、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含む遺伝子組換えCARを含むCAR T細胞によって認識される標的化部分は、１種類のCAR T細胞で足りるように、変更されることはないと考えられるが、がんに結合する小分子リガンドは、様々ながんを標的とするように変更することが可能である。
【０２５５】
本明細書に記載の様々な実施形態において、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを「化合物」と呼ぶ。様々な実施形態において、「抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片」は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片（たとえばscFv断片）を含むCARを意味する。抗フルオレセイン抗体クローンE2は、たとえば、Vaughan, et al., Nature Biotechnol. Vol. 14(3), pp. 309-314, 1996（この文献は参照により本明細書に援用される）に記載されている。様々な実施形態において、CARは、IgG4ヒンジドメイン、CD3ζ活性化ドメイン、および／もしくは4-1BB共刺激ドメイン、またはEGFRtドメインなどのその他の適切なドメインをさらに含んでいてもよい。さらに別の実施形態において、CARは、配列番号１と少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。別の例示的な一実施形態において、CARは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号１を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされてもよい。さらに別の一態様において、CARは、配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによってコードされてもよい。別の実施形態において、CARのタンパク質配列は、配列番号２と少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%の同一性を有していてもよい。さらに別の一実施形態において、CARのタンパク質配列は、約50個以下の保存的アミノ酸置換を有していてもよい。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、CARはフルオレセインに結合する。
【０２５６】
一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物の１回目の投与を前記患者に行う工程、および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含む前記CAR T細胞組成物の２回目の投与を前記患者に行う工程
を含む。
【０２５７】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞と、形質転換していないT細胞との混合物を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【０２５８】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）葉酸類、標的化部分を含んでいない葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与する工程
を含む。
【０２５９】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を、患者の体重あたり約10nmol/kg〜約2500nmol/kgの投与量で患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を、該CAR T細胞として約100万個〜約1500万個の投与量で前記患者に投与する工程
を含む。
【０２６０】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に連続投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）前記患者においてサイトカイン放出症候群を抑制または予防するために、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了する工程
を含む。
【０２６１】
一例としての別の一態様において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与および２回目の投与を患者に行う工程、ならびに
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含み、
前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約2倍〜約15000倍である。
【０２６２】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に週１回投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【０２６３】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与を患者に行う工程；
ii）前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約50%少ない投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも２回目の投与を前記患者に行う工程；および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【０２６４】
以下に記載の項において、いくつかの実施形態を説明する。本特許出願の発明の概要、例示的な実施形態の詳細な説明、実施例または請求項で述べる適用可能な実施形態と、以下で述べる実施形態とを組み合わせたものも、本発明において想定される。
【０２６５】
１．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程；
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するキメラ抗原受容体（CAR）を含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物の１回目の投与を前記患者に行う工程；および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物の２回目の投与を前記患者に行う工程
を含む方法。
【０２６６】
２．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞と、形質転換していないT細胞との混合物を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む方法。
【０２６７】
３．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）葉酸類、標的化部分を含んでいない葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与する工程
を含む方法。
【０２６８】
４．前記工程iiiが、葉酸類を投与することを含む、項３に記載の方法。
【０２６９】
５．前記工程iiiが、葉酸またはロイコボリンを投与することを含む、項３または４に記載の方法。
【０２７０】
６．前記工程iiiが、前記葉酸含有複合体を投与することを含む、項３に記載の方法。
【０２７１】
７．前記葉酸含有複合体が、１つ以上のアミノ酸に連結された葉酸類を含む、項６に記載の方法。
【０２７２】
８．前記葉酸含有複合体が、以下の式
【化５】
2021511826.tif 000007
を有する、項７に記載の方法。
【０２７３】
９．前記葉酸類が、以下の式
【化６】
2021511826.tif 000008
（式中、Ｘ１およびＹ１は、ハロ、Ｒ２、ＯＲ２、ＳＲ３およびＮＲ４Ｒ５からなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｕ、ＶおよびＷは、−（Ｒ６ａ）Ｃ＝、−Ｎ＝、−（Ｒ６ａ）Ｃ（Ｒ７ａ）−および−Ｎ（Ｒ４ａ）−からなる群からそれぞれ独立して選択される二価部分を示し；
Ｑは、ＣおよびＣＨからなる群から選択され；
Ｔは、Ｓ、Ｏ、Ｎおよび−Ｃ＝Ｃ−からなる群から選択され；
Ｘ２およびＸ３は、酸素、硫黄、−Ｃ（Ｚ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｚ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）−、−ＯＣ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ５ｂ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ４ａ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｒ６ｂ）（Ｒ７ｂ）−、−Ｎ（Ｃ≡ＣＨ）−、−Ｎ（ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）−、Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン、およびＣ１〜Ｃ１２アルキレンオキシからなる群からそれぞれ独立して選択され、ここでＺは、酸素または硫黄であり；
Ｒ１は、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂおよびＲ７ｂは、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ）カルボニル、および（Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミノ）カルボニルからなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｒ６およびＲ７は、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群からそれぞれ独立して選択されるか；またはＲ６およびＲ７は、一緒になってカルボニル基を形成し；
Ｒ６ａおよびＲ７ａは、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群からそれぞれ独立して選択されるか；またはＲ６ａおよびＲ７ａは、一緒になってカルボニル基を形成し；
ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、それぞれ独立して０または１であり；
＊は、複合体の残りの部分との共有結合を示す）
を有する、項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０２７４】
１０．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、リンパ球特異的チロシンキナーゼタンパク質阻害薬；PI3キナーゼ阻害薬；IL-2誘導性T細胞キナーゼの阻害薬；JAK阻害薬；BTK阻害薬；EC2319；および前記化合物またはその薬学的に許容される塩へのCAR T細胞の結合を阻害するが、がんには結合しない薬剤からなる群から選択される、項３に記載の方法。
【０２７５】
１１．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、リンパ球特異的チロシンキナーゼタンパク質阻害薬である、項１０に記載の方法。
【０２７６】
１２．前記リンパ球特異的チロシンキナーゼタンパク質阻害薬が、ダサチニブである、項１１に記載の方法。
【０２７７】
１３．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、PI3キナーゼ阻害薬である、項１０に記載の方法。
【０２７８】
１４．前記PI3キナーゼ阻害薬が、GDC0980である、項１３に記載の方法。
【０２７９】
１５．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、IL-2誘導性T細胞キナーゼの阻害薬である、項１０に記載の方法。
【０２８０】
１６．前記IL-2誘導性T細胞キナーゼの阻害薬が、BMS-509744である、項１５に記載の方法。
【０２８１】
１７．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が投与され、該薬剤が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩へのCAR T細胞の結合を阻害するが、がんには結合しない薬剤である、項１０に記載の方法。
【０２８２】
１８．前記薬剤が、フルオレセインアミン、FITCまたはフルオレセインナトリウムである、項１７に記載の方法。
【０２８３】
１９．前記薬剤がFITCである、項１８に記載の方法。
【０２８４】
２０．前記薬剤がフルオレセインナトリウムである、項１８に記載の方法。
【０２８５】
２１．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.01〜約300μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２８６】
２２．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約100μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２８７】
２３．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約90μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２８８】
２４．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約80μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２８９】
２５．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約70μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２９０】
２６．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約60μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２９１】
２７．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約50μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２９２】
２８．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約40μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２９３】
２９．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約30μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２９４】
３０．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約20μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２９５】
３１．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約10μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２９６】
３２．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約8μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２９７】
３３．前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者の体重あたり約0.06〜約6μmol/kgの投与量で投与される、項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【０２９８】
３４．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記患者に２回以上投与される、項３〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【０２９９】
３５．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与前および／または投与後に前記患者に投与される、項３〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【０３００】
３６．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤の投与によって、前記患者のサイトカイン濃度が低下する、項３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【０３０１】
３７．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与した約３時間後にサイトカイン濃度が低下する、項３６に記載の方法。
【０３０２】
３８．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与した約６時間後にサイトカイン濃度が低下する、項３６に記載の方法。
【０３０３】
３９．前記サイトカイン濃度の低下が、未治療患者のサイトカイン濃度と同程度の濃度に達する低下である、項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【０３０４】
４０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤の投与前および投与後に投与される、項３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【０３０５】
４１．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を投与した後に、たとえ前記患者のサイトカイン濃度が低下したとしても、前記患者の血液中のCAR T細胞数が増加する、項３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【０３０６】
４２．前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を投与した後に、たとえ治療した患者のサイトカイン濃度が低下したとしても、レスキュー剤で治療していない患者と比較して前記CAR T細胞の活性化が増強または維持される、項３〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【０３０７】
４３．前記がんが腫瘍を含み、前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与した場合に、前記患者の腫瘍の大きさが増加しない、項３〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【０３０８】
４４．前記腫瘍に対する完全奏効が得られる、項４３に記載の方法。
【０３０９】
４５．サイトカイン放出症候群（CRS）がグレード１、グレード２、グレード３またはグレード４に達した場合に、前記葉酸類、標的化部分を含んでいない前記葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が前記患者に投与される、項３〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【０３１０】
４６．CRSがグレード３またはグレード４に達した場合に、前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が前記患者に投与される、項４５に記載の方法。
【０３１１】
４７．肺水腫が抑制される、項３〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【０３１２】
４８．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約2500nmol/kgの投与量で投与され；前記CAR T細胞が、約100万個〜約1500万個の投与量で投与される、項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【０３１３】
４９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約100nmol/kgの投与量で投与される、項４８に記載の方法。
【０３１４】
５０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約50nmol/kgの投与量で投与される、項４８または４９に記載の方法。
【０３１５】
５１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約20nmol/kgの投与量で投与される、項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【０３１６】
５２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約10nmol/kg〜約600nmol/kgの投与量で投与される、項４８に記載の方法。
【０３１７】
５３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約200nmol/kg〜約600nmol/kgの投与量で投与される、項４８に記載の方法。
【０３１８】
５４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者の体重あたり約400nmol/kg〜約600nmol/kgの投与量で投与される、項４８に記載の方法。
【０３１９】
５５．前記CAR T細胞の投与量が、約100万個〜約1250万個である、項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【０３２０】
５６．前記CAR T細胞の投与量が、約100万個〜約700万個である、項４８〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【０３２１】
５７．前記CAR T細胞の投与量が、約100万個〜約500万個である、項４８〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【０３２２】
５８．前記CAR T細胞の投与量が、約200万個〜約500万個である、項４８〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【０３２３】
５９．前記患者においてサイトカイン放出症候群を抑制または予防するために、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了する工程をさらに含む、項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【０３２４】
６０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、少なくとも１時間にわたり前記患者に連続投与される、項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【０３２５】
６１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、少なくとも４時間にわたり前記患者に連続投与される、項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【０３２６】
６２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、少なくとも６時間にわたり前記患者に連続投与される、項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【０３２７】
６３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者に１日おきに投与される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【０３２８】
６４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者に週３回投与される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【０３２９】
６５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者に週２回投与される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【０３３０】
６６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、前記患者に週１回投与される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【０３３１】
６７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の前記患者への投与が、許容できない該患者の体重の減少、発熱、血圧低下または肺浮腫が起こるまで継続される、項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【０３３２】
６８．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与および２回目の投与を患者に行う工程、ならびに
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含み、
前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約15000倍である、
方法。
【０３３３】
６９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与、２回目の投与および３回目の投与が前記患者に行われ、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量と３回目の投与量がそれぞれ異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約750倍であり、３回目の投与量が、１回目の投与量の約800倍〜約10000倍である、項６８に記載の方法。
【０３３４】
７０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与、２回目の投与、３回目の投与および４回目の投与が前記患者に行われ、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量と３回目の投与量と４回目の投与量がそれぞれ異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約750倍であり、３回目の投与量が、１回目の投与量の約800倍〜約7500倍であり、４回目の投与量が、１回目の投与量の約8000倍〜約15000倍である、項６８に記載の方法。
【０３３５】
７１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、１回目の投与量の約100倍であり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の３回目の投与量が、１回目の投与量の約1000倍であり、該化合物またはその薬学的に許容される塩の４回目の投与量が、１回目の投与量の約10000倍である、項７０に記載の方法。
【０３３６】
７２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与および２回目の投与が前記患者に行われ、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約15000倍である、項６８に記載の方法。
【０３３７】
７３．がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与を患者に行う工程；
ii）前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約50%少ない投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも２回目の投与を前記患者に行う工程；および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、前記標的化部分に対して指向性を有するCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む方法。
【０３３８】
７４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約60%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３３９】
７５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約70%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３４０】
７６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約80%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３４１】
７７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約90%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３４２】
７８．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約95%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３４３】
７９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約96%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３４４】
８０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約97%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３４５】
８１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約98%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３４６】
８２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約99%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３４７】
８３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与が、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約99.5%少ない投与量で行われる、項７４に記載の方法。
【０３４８】
８４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約1000nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３４９】
８５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約900nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３５０】
８６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約800nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３５１】
８７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約700nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３５２】
８８．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約100nmol/kg〜約600nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３５３】
８９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約200nmol/kg〜約600nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３５４】
９０．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約400nmol/kg〜約600nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３５５】
９１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量が、前記患者の体重あたり約500nmol/kgである、項７３〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【０３５６】
９２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約500nmol/kgである、項８４に記載の方法。
【０３５７】
９３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約450nmol/kgである、項８５に記載の方法。
【０３５８】
９４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約400nmol/kgである、項８６に記載の方法。
【０３５９】
９５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約350nmol/kgである、項８７に記載の方法。
【０３６０】
９６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約300nmol/kgである、項８８に記載の方法。
【０３６１】
９７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約1nmol/kg〜約300nmol/kgである、項８９に記載の方法。
【０３６２】
９８．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約2nmol/kg〜約300nmol/kgである、項９０に記載の方法。
【０３６３】
９９．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約2nmol/kg〜約250nmol/kgである、項９１に記載の方法。
【０３６４】
１００．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約5nmol/kg〜約40nmol/kgである、項９２〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【０３６５】
１０１．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、前記患者の体重あたり約40nmol/kg〜約150nmol/kgである、項９２〜９９のいずれか１項に記載の方法。
【０３６６】
１０２．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量と同じ投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の３回目の投与を行う工程をさらに含む、項７３〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【０３６７】
１０３．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量および３回目の投与量と同じ投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の４回目の投与を行う工程をさらに含む、項１０２に記載の方法。
【０３６８】
１０４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与後に、該化合物またはその薬学的に許容される塩をさらに投与することによって、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与時と比べてがんの成長の抑制が維持される、項７３〜１０３のいずれか１項に記載の方法。
【０３６９】
１０５．前記CAR T細胞の投与量が、約100万個〜約4000万個である、項７３〜１０４のいずれか１項に記載の方法。
【０３７０】
１０６．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与後に、該化合物またはその薬学的に許容される塩がさらに週１回投与される、項７３〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【０３７１】
１０７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が週２回投与される、項７３〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【０３７２】
１０８．前記CARが、IgG4ヒンジドメイン、CD3ζ活性化ドメインおよび4-1BB共刺激ドメインをさらに含む、項１〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【０３７３】
１０９．前記抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片がscFv断片である、項１〜１０８のいずれか１項に記載の方法。
【０３７４】
１１０．前記CARのタンパク質配列が、配列番号２と少なくとも約90%の同一性を有する、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０３７５】
１１１．前記CARのタンパク質配列が、配列番号２と少なくとも約95%の同一性を有する、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０３７６】
１１２．前記CARのタンパク質配列が、配列番号２と少なくとも約98%の同一性を有する、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０３７７】
１１３．前記CARがフルオレセインに結合する、項１〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【０３７８】
１１４．前記CARのタンパク質配列が、約50個以下の保存的アミノ酸置換を有し、該CARがフルオレセインに結合する、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０３７９】
１１５．前記CARが、配列番号１と少なくとも約90%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０３８０】
１１６．前記CARが、配列番号１と少なくとも約95%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０３８１】
１１７．前記CARが、配列番号１と少なくとも約98%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、項１〜１０９のいずれか１項に記載の方法。
【０３８２】
１１８．前記CARがフルオレセインに結合する、項１１５〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【０３８３】
１１９．前記CARが、高ストリンジェントな条件下で、配列番号１を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、該CARがフルオレセインに結合する、項１〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【０３８４】
１２０．前記CARが、配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによってコードされる、項１〜１１９のいずれか１項に記載の方法。
【０３８５】
１２１．前記リガンドが、葉酸類、DUPA、NK-1Rリガンド、CAIXリガンド、γ-グルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、NKG2DリガンドおよびCCK2Rリガンドからなる群から選択される、項１〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【０３８６】
１２２．前記標的化部分が、フルオレセインまたはその薬学的に許容される塩である、項１〜１２１のいずれか１項に記載の方法。
【０３８７】
１２３．前記リンカーが、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロリン、親水性アミノ酸、糖類、非天然ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、pluronic F-127またはこれらの組み合わせを含む、項１〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【０３８８】
１２４．前記リンカーがPEGを含む、項１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【０３８９】
１２５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、以下の式
【化７】
2021511826.tif 000009
（式中、Ｂは、前記小分子リガンドを示し、
Ｌは、前記リンカーを示し、
Ｔは、前記標的化部分を示し、
ここで、Ｌは、以下の式を有する構造を含む
【化８】
2021511826.tif 000010
（式中、ｎは、０〜２００の整数である））
を有する、項１〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【０３９０】
１２６．前記がんが、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、子宮内膜がん、直腸がん、胃がん、大腸がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、上皮小体がん、非小細胞肺がん、副腎がん、軟組織肉腫、骨肉腫、尿道がん、前立腺がん、慢性白血病、急性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、胸膜中皮腫、膀胱がん、バーキットリンパ腫、尿管がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系新生物（CNS）、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、および食道胃接合部腺癌からなる群から選択される、項１〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【０３９１】
１２７．前記がんが、葉酸受容体を発現するがんである、項１〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
【０３９２】
１２８．前記がんが、子宮内膜がんである、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０３９３】
１２９．前記がんが、非小細胞肺がんである、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０３９４】
１３０．前記がんが、卵巣がんである、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０３９５】
１３１．前記がんが、トリプルネガティブ乳がんである、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０３９６】
１３２．前記がんが、急性骨髄性白血病である、項１〜１２７のいずれか１項に記載の方法。
【０３９７】
１３３．前記がんが、葉酸受容体βを発現する、項１３２に記載の方法。
【０３９８】
１３４．前記CAR T細胞組成物が、複数回投与される、項１〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【０３９９】
１３５．前記CAR T細胞組成物が、少なくとも２回投与される、項１〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【０４００】
１３６．前記化合物もしくはその薬学的に許容される塩を投与する前、または前記CAR T細胞組成物を投与する前に、前記患者の画像検査が行われる、項１〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【０４０１】
１３７．前記化合物またはその薬学的に許容される塩が、抗体ではなく、かつ抗体断片を含んでいない、項１〜１３６のいずれか１項に記載の方法。
【０４０２】
１３８．前記標的化部分が、ペプチドエピトープを含んでいない、項１〜１３７のいずれか１項に記載の方法。
【０４０３】
１３９．前記患者において、オフターゲット毒性をもたらすサイトカインの放出が起こらず、前記CAR T細胞の毒性が前記がんに対して発揮される、項１〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【０４０４】
１４０．前記患者の組織に対するオフターゲット毒性が起こらず、前記CAR T細胞の毒性が前記がんに対して発揮される、項１〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【０４０５】
１４１．前記がんが腫瘍を含み、前記患者において腫瘍の大きさが縮小し、オフターゲット毒性が起こらない、項１〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【０４０６】
１４２．サイトカイン放出症候群（CRS）が抑制または予防され、前記方法によって前記患者の腫瘍の体積が減少する、項１〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【０４０７】
１４３．サイトカイン放出症候群（CRS）による体重減少が抑制または予防される、項１〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【０４０８】
１４４．前記化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に再投与する工程をさらに含む、項５９〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【０４０９】
１４５．前記化合物またはその薬学的に許容される塩の前記再投与により、前記患者においてCAR T細胞の活性化とサイトカイン濃度の上昇が起こる、項１４４に記載の方法。
【０４１０】
１４６．前記がんが腫瘍を含み、該腫瘍の完全奏効が得られる、項１〜１４５のいずれか１項に記載の方法。
【０４１１】
１４７．前記CAR T細胞が、セントラルメモリー／エフェクターメモリーの表現型を有する、項１〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
【０４１２】
１４８．前記CAR T細胞のCD8とCD4の比率が約1：1である、項１〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
【０４１３】
したがって、一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物の１回目の投与を前記患者に行う工程、および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物の２回目の投与を前記患者に行う工程
を含む。
【０４１４】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞と、形質転換していないT細胞との混合物を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【０４１５】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）葉酸類、標的化部分を含んでいない葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与する工程
を含む。
【０４１６】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を、患者の体重あたり約10nmol/kg〜約2500nmol/kgの投与量で患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を、該CAR T細胞として約100万個〜約1500万個の投与量で前記患者に投与する工程
を含む。
【０４１７】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に連続投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）前記患者においてサイトカイン放出症候群を抑制または予防するために、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了する工程
を含む。
【０４１８】
別の例示的な一態様において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与および２回目の投与を患者に行う工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含み、
前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約15000倍である。
【０４１９】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に週１回投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【０４２０】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与を患者に行う工程；
ii）前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約50%少ない投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも２回目の投与を前記患者に行う工程；および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【０４２１】
したがって、前述のパラグラフおよび前記の一連の項において様々な実施形態が提供され、この「例示的な実施形態の詳細な説明」、発明の概要、実施例および請求項に記載の適用可能な実施形態はいずれも、これらの実施形態にも適用される。
【０４２２】
本明細書において、「患者」はヒトであってもよく、獣医学的適用の場合には、患者は、実験動物、農業用動物、愛玩動物、野生動物のいずれであってもよい。様々な態様において、患者は、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、サル、チンパンジーなどの実験動物、イヌ、ネコまたはウサギなどの愛玩動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの農業用動物、またはクマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカ、クジラなどの捕獲された野生動物であってもよい。
【０４２３】
様々な実施形態において、治療の対象となるがんは、癌腫、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、悪性黒色腫、中皮腫、上咽頭癌、白血病、腺癌または骨髄腫から選択することができる。別の実施形態において、前記がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部がん、頸部がん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、子宮内膜がん、直腸がん、胃がん、大腸がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、上皮小体がん、非小細胞肺がん、副腎がん、軟組織肉腫、骨肉腫、尿道がん、前立腺がん、慢性白血病、急性白血病（急性骨髄性白血病を含む）、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、ヘアリー細胞白血病、胸膜中皮腫、膀胱がん、バーキットリンパ腫、尿管がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系新生物（CNS）、原発性中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、食道胃接合部腺癌のいずれであってもよい。
【０４２４】
これらの実施形態のいくつかの態様において、前記がんは、葉酸受容体を発現するがんである。別の一実施形態において、前記がんは、葉酸受容体αを発現するがんである。さらに別の一実施形態において、前記がんは、葉酸受容体βを発現するがんである。これらの実施形態のいくつかの態様において、前記がんは、子宮内膜がん、非小細胞肺がん、卵巣がんまたはトリプルネガティブ乳がんである。別の一実施形態において、治療の対象となるがんは腫瘍である。別の一実施形態において、前記がんは悪性である。別の一実施形態において、前記がんは急性骨髄性白血病である。さらに別の一実施形態において、前記がんは急性骨髄性白血病であり、葉酸受容体βを発現する。さらに別の一実施形態において、前記がんは、急性骨髄性白血病であり、前記CAR-T細胞は、セントラルメモリー／エフェクターメモリーの表現型を有する。さらに別の一実施形態において、前記CAR T細胞におけるCD8とCD4の比率は、約1：1、約1.2〜1、約1〜1.2、約1.3〜1、約1〜1.3、約1.4〜1、約1〜1.4、約1.5〜1、または約1〜1.5である。別の一実施形態において、前記がんが急性骨髄性白血病または別の種類のがんである場合、この腫瘍に作用するCAR T細胞は、この腫瘍に作用しないCAR T細胞と比べてCD25の発現が増加している。
【０４２５】
一実施形態において、「小分子リガンド」は、葉酸類、DUPA（PSMA陽性ヒト前立腺がん細胞およびその他の種類のがん細胞が結合するリガンド）、NK-1Rリガンド（たとえば大腸がんおよび膵臓がんで見られるNK-1R受容体のリガンド）、CAIXリガンド（たとえば腎臓がん、卵巣がん、外陰がんおよび乳がんで見られるCAIX受容体のリガンド）、γ-グルタミルトランスペプチダーゼのリガンド（たとえば卵巣がん、大腸がん、肝臓がん、神経膠星状細胞腫、悪性黒色腫および白血病で過剰発現されるトランスペプチダーゼ）、NKG2Dリガンド（たとえば肺がん、大腸がん、腎臓がん、前立腺がん、T細胞リンパ腫およびB細胞リンパ腫で見られるNKG2D受容体のリガンド）、またはCCK2Rリガンド（甲状腺がん、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、脳腫瘍、胃がん、消化管間質腫瘍、大腸がんなどで見られるCCK2R受容体のリガンド）であってもよく、これらはいずれもがん細胞に特異的に結合する小分子リガンドである（すなわち、これらの各リガンドに対する受容体が、正常組織と比べ、がんにおいて過剰発現されていてもよい）。
【０４２６】
一実施形態において、小分子リガンドの質量は、約10,000ダルトン未満、約9000ダルトン未満、約8,000ダルトン未満、約7000ダルトン未満、約6000ダルトン未満、約5000ダルトン未満、約4500ダルトン未満、約4000ダルトン未満、約3500ダルトン未満、約3000ダルトン未満、約2500ダルトン未満、約2000ダルトン未満、約1500ダルトン未満、約1000ダルトン未満、または約500ダルトン未満であってもよい。別の一実施形態において、小分子リガンドの質量は、約1〜約10,000ダルトン、約1〜約9000ダルトン、約1〜約8,000ダルトン、約1〜約7000ダルトン、約1〜約6000ダルトン、約1〜約5000ダルトン、約1〜約4500ダルトン、約1〜約4000ダルトン、約1〜約3500ダルトン、約1〜約3000ダルトン、約1〜約2500ダルトン、約1〜約2000ダルトン、約1〜約1500ダルトン、約1〜約1000ダルトン、または約1〜約500ダルトンであってもよい。
【０４２７】
一実施形態において、標的化部分に連結された小分子リガンドのリガンドとしてDUPA誘導体を使用することもでき、DUPA誘導体は、WO2015/057852（この文献は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０４２８】
一実施形態において、「リンカーに連結された小分子リガンド」における小分子リガンドは、葉酸類である。様々な実施形態において、この葉酸類は、葉酸、葉酸類似体、別の葉酸受容体結合性分子のいずれであってもよい。様々な実施形態において、使用することができる葉酸類似体としては、ホリニン酸；プテロポリグルタミン酸；ならびにテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、これらのデアザ類似体およびジデアザ類似体などの葉酸受容体結合性プテリジンが挙げられる。当技術分野において、「デアザ」類似体および「ジデアザ」類似体は、天然の葉酸構造において１つまたは２つの窒素原子が炭素原子で置換された類似体を指すと理解される。たとえば、デアザ類似体として、１−デアザ類似体、３−デアザ類似体、５−デアザ類似体、８−デアザ類似体および１０−デアザ類似体が挙げられる。ジデアザ類似体としては、たとえば、１，５−ジデアザ類似体、５，１０−ジデアザ類似体、８，１０−ジデアザ類似体および５，８−ジデアザ類似体が挙げられる。前記葉酸類似体は、従来、葉酸受容体に対する結合能を反映して「葉酸類」と呼ばれる。その他の葉酸受容体結合性類似体としては、アミノプテリン、アメトプテリン（メトトレキサート）、Ｎ１０−葉酸メチル、２−デアミノ−ヒドロキシ葉酸、１−デアザメトプテリンや３−デアザメトプテリンなどのデアザ類似体、および３’，５’−ジクロロ−４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルプテロイルグルタミン酸（ジクロロメトトレキセート）が挙げられる。
【０４２９】
別の一実施形態において、「リンカーに連結された小分子リガンド」における小分子リガンドは、以下の式
【化９】
2021511826.tif 000011
（式中、Ｘ１およびＹ１は、ハロ、Ｒ２、ＯＲ２、ＳＲ３およびＮＲ４Ｒ５からなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｕ、ＶおよびＷは、−（Ｒ６ａ）Ｃ＝、−Ｎ＝、−（Ｒ６ａ）Ｃ（Ｒ７ａ）−および−Ｎ（Ｒ４ａ）−からなる群からそれぞれ独立して選択される二価部分を示し；
Ｑは、ＣおよびＣＨからなる群から選択され；
Ｔは、Ｓ、Ｏ、Ｎおよび−Ｃ＝Ｃ−からなる群から選択され；
Ｘ２およびＸ３は、酸素、硫黄、−Ｃ（Ｚ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｚ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）−、−ＯＣ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ５ｂ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ４ａ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｒ６ｂ）（Ｒ７ｂ）−、−Ｎ（Ｃ≡ＣＨ）−、−Ｎ（ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）−、Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン、およびＣ１〜Ｃ１２アルキレンオキシからなる群からそれぞれ独立して選択され、ここでＺは、酸素または硫黄であり；
Ｒ１は、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂおよびＲ７ｂは、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ）カルボニル、および（Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミノ）カルボニルからなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｒ６およびＲ７は、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群からそれぞれ独立して選択されるか；またはＲ６およびＲ７は、一緒になってカルボニル基を形成し；
Ｒ６ａおよびＲ７ａは、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群からそれぞれ独立して選択されるか；またはＲ６ａおよびＲ７ａは、一緒になってカルボニル基を形成し；
ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、それぞれ独立して０または１であり；
＊は、複合体の残りの部分との共有結合を示す）
を有していてもよい。
【０４３０】
一態様において、CAR T細胞によって発現され、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARに結合する「標的化部分」は、たとえば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびNHS-フルオレセインから選択することができる。標的化部分を選択する際の条件としては、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARによって（好ましくは特異的に）認識され結合されるものであること、および分子量が比較的低いことのみを満たしていればよい。様々な態様において、典型的な標的化部分はハプテンであり、低分子量の有機分子が含まれる。
【０４３１】
例示的な一実施形態において、標的化部分は、たとえば、以下の構造
【化１０】
2021511826.tif 000012
（式中、Ｘは、酸素、窒素または硫黄であり、リンカーＬに結合しており；
Ｙは、ＯＲａ、ＮＲａ２またはＮＲａ３＋であり；
Ｙ’は、Ｏ、ＮＲａまたはＮＲａ２＋であり；
各Ｒは、Ｈ、フルオロ、スルホン酸、スルホン酸塩およびその他の塩などからそれぞれ独立して選択され；
Ｒａは、水素またはアルキルである）
を有していてもよい。
【０４３２】
例示的な一態様において、前記リンカーは、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロリン、親水性アミノ酸、糖類、非天然ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、pluronic F-127またはこれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【０４３３】
例示的な別の一態様において、本明細書に記載の前記化合物またはその薬学的に許容される塩に含まれるリンカーは、直接結合（たとえば、FITCのイソチオシアネート基と小分子リガンドの遊離アミン基の間の反応）を含んでいてもよく、あるいは中間リンカーを介して結合されていてもよい。一実施形態において、中間リンカーが存在する場合、この中間リンカーは、当技術分野で公知のものであれば、どのような生体適合性リンカー（たとえば二価リンカー）であってもよい。例示的な一実施形態において、この二価リンカーは、約１個〜約30個の炭素原子を含んでいてもよい。例示的な別の一実施形態において、この二価リンカーは、約2個〜約20個の炭素原子を含んでいてもよい。別の実施形態では、さらに分子量の低い（すなわち分子量が約30ダルトン〜約300ダルトンの）二価リンカーを使用する。別の一実施形態において、適切な長さのリンカーとして、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個もしくは40個の原子、またはそれ以上の個数の原子を有するリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３４】
様々な実施形態において、標的化部分に連結された小分子リガンドは、以下の式
【化１１】
2021511826.tif 000013
（式中、Ｂは、小分子リガンドを示し、
Ｌは、以下の式
【化１２】
2021511826.tif 000014
（式中、ｎは、０〜２００の整数である）
を有する構造を含むリンカーを示し、
Ｔは、標的化部分を示す）
で示されるものであってもよい。
別の一実施形態において、nは、0〜150、0〜110、0〜100、0〜90、0〜80、0〜70、0〜60、0〜50、0〜40、0〜30、0〜20、0〜15、0〜14、0〜13、0〜12、0〜11、0〜10、0〜9、0〜8、0〜7、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2、0〜1、15〜16、15〜17、15〜18、15〜19、15〜20、15〜21、15〜22、15〜23、15〜24、15〜25、15〜26、15〜27、15〜28、15〜29、15〜30、15〜31、15〜32、15〜33、15〜34、15〜35、15〜36、15〜37、15〜38、15〜39、15〜40、15〜50、15〜60、15〜70、15〜80、15〜90、15〜100、15〜110、15〜120、15〜130、15〜140または15〜150の整数であってもよく、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、108、110、120、130、140、または150であってもよい。別の一実施形態において、リンカーは、１つ以上のスペーサーを含む二価リンカーであってもよい。一例としてのスペーサーを以下の表に示す。以下のスペーサーにおいて、*は、小分子リガンド、標的化部分またはその他の二価リンカー部分への結合部位を示す。
【表１】
2021511826.tif 000015
2021511826.tif 000016
別の実施形態において、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンド（架橋剤）は、以下の構造のいずれかを有していてもよい。
【化１３】
2021511826.tif 000017
2021511826.tif 000018
2021511826.tif 000019
2021511826.tif 000020
【０４３５】
別の実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩は抗体ではなく、かつ抗体断片を含んでいない。さらに別の一実施形態において、標的化部分はペプチドエピトープを含んでいない。
【０４３６】
例示的な一実施形態において、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンド（架橋剤）は、小分子リガンドに連結されたフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を含む。一態様において、がんは、前記小分子リガンドに対する受容体を過剰発現していてもよい。別の一態様において、たとえば、細胞傷害性T細胞またはその他の種類のT細胞を形質転換することによって、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを発現させることができる。この態様では、がんに小分子リガンドが結合し、その結果、がんがFITC分子で修飾され、このFITCがCARによりターゲティングされてもよい。したがって、標的ではない正常細胞に対する毒性を回避することができる。この実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを発現するT細胞がFITCに結合すると、CAR T細胞が活性化されて、がんが緩和される。
【０４３７】
リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドの「薬学的に許容される塩」も本発明において想定される。本明細書において、「薬学的に許容される塩」は、その対イオンが医薬品において使用されてもよい塩類を指す。様々な実施形態において、このような塩類として、１）塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸、過塩素酸などの無機酸、もしくは酢酸、シュウ酸、（Ｄ）−リンゴ酸、（Ｌ）−リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、マロン酸などの有機酸と、親化合物の遊離塩基との反応によって得ることができる酸付加塩；または２）親化合物中の酸性プロトンが、金属イオン（たとえばアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンもしくはアルミニウムイオン）と置換されることによって形成される塩類、もしくはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリメタミン、N-メチルグルカミンなどの有機塩基が親化合物中の酸性プロトンに配位結合することによって形成される塩類が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩類は当業者によく知られており、当業者に公知の薬学的に許容される塩であれば、どのようなものであっても本明細書に記載の実施形態に使用することができる。
【０４３８】
様々な実施形態において、適切な酸付加塩は、無毒な塩類を形成する酸から形成される。適切な酸付加塩の例としては、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素酸塩／二水素リン酸塩、糖酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびトリフルオロ酢酸塩が挙げられる。
【０４３９】
様々な実施形態において、適切な塩基付加塩は、無毒な塩類を形成する塩基から形成される。適切な塩基付加塩の例としては、アルギニン塩、ベンザチン塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジオールアミン塩、グリシン塩、リシン塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、オラミン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩および亜鉛塩が挙げられる。また、たとえばヘミ硫酸塩やヘミカルシウム塩などの、酸および塩基のヘミ塩を形成してもよい。
【０４４０】
例示的な一態様において、本明細書に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩は、１つ以上のキラル中心を含んでいてもよく、あるいは、複数種の立体異性体として存在していてもよい。したがって、様々な実施形態において、純粋な立体異性体および立体異性体の混合物が含まれていてもよく、たとえば、エナンチオマー、ジアステレオマー、エナンチオマー濃縮混合物、ジアステレオマー濃縮混合物などが含まれていてもよい。一態様において、本明細書に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩は、幾何異性体として存在していてもよい。したがって、様々な実施形態において、純粋な幾何異性体または幾何異性体の混合物が含まれていてもよい。
【０４４１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩は、溶媒和されていない形態で存在してもよく、溶媒和された形態で存在していてもよい。溶媒和形態には、水和形態が含まれる。通常、溶媒和形態は、溶媒和されていない形態と同じであり、本発明の範囲内に含まれる。
【０４４２】
本明細書に記載の方法において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含み、架橋剤の標的化部分（たとえば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）またはNHS-フルオレセイン）を認識してこれに結合するキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように遺伝子組換えされたTリンパ球（たとえば細胞傷害性Tリンパ球）も利用される。一実施形態において、本明細書に記載のCARは３つのドメインを含み、すなわち、１）標的化部分を特異的に認識してこれに結合する認識領域（たとえば、抗フルオレセイン抗体クローンE2の一本鎖可変領域断片（scFv）やFab断片など）、２）Tリンパ球の増殖および生存を増強する共刺激ドメイン、および３）Tリンパ球活性化シグナルを発生する活性化シグナル伝達ドメインを含む。
【０４４３】
様々な態様において、たとえば、フルオレセインに結合する抗体のscFv領域、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）に結合する抗体のscFv領域、およびNHS-フルオレセインに結合する抗体のscFv領域を使用することができるが、これらに限定されない。一例としての実施形態において、scFv領域は、（ｉ）前記標的化部分に結合する当技術分野で公知の抗フルオレセイン抗体クローンE2から作製することができ、かつ（iii）このような抗体のscFv領域に由来する配列バリアントであってもよく、たとえば、このような配列バリアントは、該配列バリアントが由来するscFv領域のアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の配列同一性を有するscFv領域であってもよいが、これらに限定されない。
【０４４４】
一態様において、共刺激ドメインは、標的化部分にCARが結合すると、細胞傷害性Tリンパ球の増殖および生存を増強させる。適切な共刺激ドメインとしては、CD28；CD137（4-1BB）；腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバーであるCD134（OX40）；腫瘍壊死因子（TNF）受容体のスーパーファミリーのメンバーであるCD27、CD30、CD150、DAP10、NKG2DおよびCD278（ICOS）；活性化T細胞上に発現される共刺激分子であるCD28スーパーファミリー；またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な一実施形態において、遺伝子組換えCARの共刺激ドメインは、CD28とCD137を含む。当業者であれば、これらの共刺激ドメインに由来し、これらの共刺激ドメインと同じまたは同様の活性を有する配列バリアントも、本発明に悪影響を与えることなく使用することができることを理解できるであろう。様々な実施形態において、このようなバリアントは、これらのバリアントが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の配列同一性を有していてもよい。
【０４４５】
例示的な一実施形態において、活性化シグナル伝達ドメインは、標的化部分にCARが結合すると、Tリンパ球（たとえば細胞傷害性Tリンパ球）を活性化させる。様々な実施形態において、適切な活性化シグナル伝達ドメインとしては、T細胞のCD3ζ鎖、CD3δ受容体タンパク質、mbl受容体タンパク質、B29受容体タンパク質、およびFc受容体γが挙げられる。当業者であれば、これらの活性化シグナル伝達ドメインに由来し、これらの活性化シグナル伝達ドメインと同じまたは同様の活性を有する配列バリアントも、使用することができることを理解できるであろう。様々な実施形態において、このようなバリアントは、これらのバリアントが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の配列同一性を有する。
【０４４６】
一態様において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARをコードするコンストラクトは、遺伝子工学的手法を使用して作製される。このような技術は、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)（この文献は参照により本明細書に援用される）およびGreen and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)（この文献は参照により本明細書に援用される）に詳細に記載されている。
【０４４７】
一例として、５’方向から３’方向にインフレームで連結された、認識領域と１つ以上の共刺激ドメインと活性化シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質をコードするプラスミド発現ベクターまたはウイルス発現ベクター（たとえば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、sleeping beautyおよびpiggyback（ウイルスを使用しないCAR遺伝子送達システムを含むトランスポゾン／トランスポゼースシステム））を作製することができる。別の実施形態において、各ドメインの配置を変えることもでき、認識領域と活性化シグナル伝達ドメインと１つ以上の共刺激ドメインをこの順で含む。一実施形態において、融合タンパク質中における認識領域の配置は、通常、認識領域が細胞の外部に提示されるように行う。一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARは、さらなる構成要素を含んでいてもよく、たとえば、融合タンパク質を細胞表面へと適切に輸送するためのシグナルペプチド（たとえばCD8αシグナルペプチド）、融合タンパク質を内在性膜タンパク質として維持するための膜貫通ドメイン（たとえばCD8α膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメインまたはCD3ζ膜貫通ドメイン）、認識領域に柔軟性を付与し、標的化部分への強力な結合を可能とするヒンジドメイン（たとえばCD8αヒンジまたはIgG4ヒンジ）、およびその他の適切なドメインを含んでいてもよい。
【０４４８】
抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを発現させるための代表的なCARコンストラクトの略図を図１に示す。この融合タンパク質配列は、発現ベクターに組み込まれ、このCARは、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片、IgG4ヒンジドメイン、CD28膜貫通ドメイン、共刺激ドメインCD137（4-1BB）および活性化シグナル伝達ドメインCD3ζを含む。このCARは、適切なドメインをさらに含んでいてもよい。CARインサートの代表的な核酸配列を配列番号１に示し、これにコードされる代表的なアミノ酸配列を配列番号２に示す。本明細書において、「配列番号１」は、下線を引いた「agc」コドンから始まり、下線を引いた「ggc」コドンで終わる配列を意味する。以下の長い配列のこの部分は、T細胞の細胞膜に挿入されるCARをコードする。この長い配列のその他の部分には、シグナルペプチドやEGFRtドメインなどのコード配列が含まれ、これらのシグナルペプチドやEGFRtドメインは、細胞膜に挿入されてキメラ抗原受容体として機能するCARの一部ではない。本明細書において、「配列番号２」は、下線を引いた「Ｓ」から始まり、下線を引いた「Ｇ」で終わる配列を意味する。以下の長い配列のこの部分は、T細胞の細胞膜に挿入されるCARのアミノ酸配列である。この長い配列のその他の部分には、シグナルペプチドやEGFRtドメインなどのアミノ酸配列が含まれ、これらのシグナルペプチドやEGFRtドメインは、細胞膜に挿入されてキメラ抗原受容体として機能するCARの一部ではない。さらに別の一実施形態において、配列番号２は、ヒト化アミノ酸配列またはヒトアミノ酸配列を含んでいてもよく、ヒト化アミノ酸配列またはヒトアミノ酸配列からなっていてもよい。配列番号１および配列番号２は前記の通りである。以下の長い核酸配列において、開始コドンと終止コドンを下線で示し、この長い配列は、本明細書に記載の方法において使用されるT細胞の形質導入に使用することが可能な配列の一例である。
【０４４９】
配列番号１（抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARの核酸配列（インサート））
2021511826.tif 000021
【０４５０】
配列番号２（抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARのアミノ酸配列（インサート））
2021511826.tif 000022
【０４５１】
一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCARは、認識領域、共刺激ドメインおよび活性化シグナル伝達ドメインを含み、該認識領域は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の一本鎖可変領域断片（scFv）であり、該共刺激ドメインはCD137（4-1BB）であり、該活性化シグナル伝達ドメインはT細胞のCD3ζ鎖である。別の一実施形態において、このCARは、さらなる適切なドメインをさらに含むことができる。抗FITC scFvと抗フルオレセインscFvが、同じ意味であることは当業者によく知られている。
【０４５２】
様々な実施形態において、「抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片」は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片（たとえばscFv断片）を含むCARであってもよい。抗フルオレセイン抗体クローンE2は、たとえば、Vaughan, et al., Nature Biotechnol. Vol. 14(3), pp. 309-314, 1996（この文献は参照により本明細書に援用される）に記載されている。一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCARは、フルオレセインに対する結合親和性が、約0.7nM〜約0.8nM、約0.72nM〜約0.8nM、約0.73nM〜約0.8nM、約0.72nM〜約7.8nM、約0.73nM〜約0.77nM、または約0.75nMであってもよい。
【０４５３】
様々な実施形態において、CARは、IgG4ヒンジドメイン、CD3ζ活性化ドメイン、および／または4-1BB共刺激ドメイン、ならびにその他の適切なドメインをさらに含んでいてもよい。さらに別の実施形態において、CARは、配列番号１と少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。別の例示的な一実施形態において、CARは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号１を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされてもよい。さらに別の一態様において、CARは、配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによってコードされてもよい。別の実施形態において、CARのタンパク質配列は、配列番号２と少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の同一性を有していてもよい。さらに別の一実施形態において、CARのタンパク質配列は、約50個以下の保存的アミノ酸置換を有していてもよい。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、CARはフルオレセインに結合する。
【０４５４】
一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCARコンストラクトをコードする発現ベクターでTリンパ球集団をトランスフェクトすることによって、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCARコンストラクトを発現するようにTリンパ球（たとえば細胞傷害性Tリンパ球）を遺伝子組換えすることができる。抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現する形質導入Tリンパ球集団の作製に適した方法は、当業者によく知られており、このような方法は、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)（この文献は参照により本明細書に援用される）およびGreen and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)（この文献は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０４５５】
一実施形態において、配列番号１の核酸を含むCAR T細胞を、本明細書の記載に従って使用することができる。別の一実施形態において、配列番号２のポリペプチドを含むCAR T細胞を、本明細書の記載に従って使用することができる。例示的な別の一態様において、配列番号１を含み、キメラ抗原受容体をコードする核酸（たとえば単離された核酸）を使用して、本明細書の記載に従って使用されるCAR T細胞を作製することができる。さらに別の一実施形態において、配列番号２を含むキメラ抗原受容体ポリペプチドを使用して、本明細書の記載に従って使用されるCAR T細胞を作製することができる。別の一実施形態において、配列番号１を含むベクターを使用して、本明細書の記載に従って使用されるCAR T細胞を作製することができる。別の一態様において、配列番号１を含むレンチウイルスベクターを提供し、このレンチウイルスベクターを使用して、本明細書の記載に従って使用されるCAR T細胞を作製することができる。さらに別の一実施形態において、配列番号２は、ヒト化アミノ酸配列またはヒトアミノ酸配列を含んでいてもよく、ヒト化アミノ酸配列またはヒトアミノ酸配列からなっていてもよい。
【０４５６】
前述の各実施形態において、配列番号１と少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の配列同一性を有する核酸配列のバリアントまたはアミノ酸配列のバリアントも想定される。別の一実施形態において、前記核酸配列は、配列番号２のポリペプチドをコードするものである限り、配列番号１と少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の配列同一性を有する核酸配列のバリアントであってもよい。別の一実施形態において、前記核酸配列または前記アミノ酸配列は、配列番号１の核酸配列の200ヌクレオチド長または配列番号２のアミノ酸配列の200アミノ酸長と少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の配列同一性を有する核酸配列のバリアントまたはアミノ酸配列のバリアントであってもよい。一実施形態において、配列間の同一性または類似性のパーセンテージの測定は、たとえば、GAPプログラム（Genetics Computer Group社製のソフトウェア；現在はhttp：//www.accelrys.comのAccelrysを介して利用可能）を使用して行うことができ、アラインメントは、たとえば、ClustalWアルゴリズム（VNTIソフトウェア、InforMax Inc.）を使用して行うことができる。目的の核酸配列またはアミノ酸配列を使用して、配列データベースを検索することができる。データベース検索用のアルゴリズムは、通常、BLASTソフトウェア（Altschulら、1990）に基づく。いくつかの実施形態において、同一性のパーセンテージは、核酸配列またはアミノ酸配列の全長に沿って測定することができる。
【０４５７】
さらに、本発明の範囲内において、配列番号１に示される核酸に相補的な核酸を使用して、本明細書の記載に従って使用されるCAR T細胞を作製することができ、また、配列番号１に示される核酸にハイブリダイズする核酸、または高ストリンジェントな条件下において配列番号１に示される核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸も使用することができる。本発明によれば、「高ストリンジェントな条件」とは、5×SSPEおよび50%ホルムアミド中、65℃でハイブリダイゼーションし、0.5×SSPE中において65℃で洗浄することを意味する。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（この文献は参照により本明細書に援用される）およびGreen and Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)（この文献は参照により本明細書に援用される）に記載されている。例示的ないくつかの態様において、核酸の全長に沿ってハイブリダイゼーションが起こる。
【０４５８】
さらに別の実施形態において、本明細書に記載の方法において使用されるCARは、配列番号１と少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約99.5%の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。別の例示的な一実施形態において、CARは、高ストリンジェントな条件下で、配列番号１を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされてもよい。さらに別の一態様において、CARは、配列番号１を有するポリヌクレオチドまたは配列番号１の縮重バリアントによってコードされてもよい。本明細書において、「縮重バリアント」は、特定のアミノ酸が２つ以上のコドンによって定義される遺伝子コードを指す。特定のアミノ酸を定義する縮重コドンのバリアントは当技術分野でよく知られている。さらに別の一態様において、特定の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞におけるポリペプチドの産生量を最適化するために置換を行うこともできる（すなわち、コドンの使用頻度を最適化したバリアント）。
【０４５９】
別の実施形態において、CARのタンパク質配列は、配列番号２と少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%または少なくとも約99%の同一性を有していてもよい。さらに別の一実施形態において、CARのタンパク質配列は、約50個以下の保存的アミノ酸置換を有していてもよい。一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCARのタンパク質配列は、約5個以下の保存的アミノ酸置換、約10個以下の保存的アミノ酸置換、約15個以下の保存的アミノ酸置換、約20個以下の保存的アミノ酸置換、約25個以下の保存的アミノ酸置換、約30個以下の保存的アミノ酸置換、約35個以下の保存的アミノ酸置換、約40個以下の保存的アミノ酸置換、約45個以下の保存的アミノ酸置換、約50個以下の保存的アミノ酸置換、約55個以下の保存的アミノ酸置換、約60個以下の保存的アミノ酸置換、約65個以下の保存的アミノ酸置換、約70個以下の保存的アミノ酸置換、または約75個以下の保存的アミノ酸置換を有していてもよい。当業者によく知られているように、ポリペプチドにおいて重要ではないアミノ酸を保存的アミノ酸置換により変更しても、置換後のアミノ酸の側鎖は、置換前のアミノ酸の側鎖と同様の結合および接触を形成できるはずであるから、置換後のポリペプチドの活性が顕著に変わることはない。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、CARはフルオレセインに結合する。
【０４６０】
一例としての態様において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片ポリペプチドのフルオレセイン結合活性に過度に悪影響を与えない限り、非保存的置換も可能である。当技術分野でよく知られているように、アミノ酸の「保存的置換」またはポリペプチドの「保存的置換バリアント」とは、１）ポリペプチドの二次構造；２）アミノ酸の電荷または疎水性；および３）側鎖の嵩高さ、またはこれらの特性のうちのいずれか１つ以上を維持するアミノ酸置換を指す。一実施形態において、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸類似体を使用して行うこともできる。具体的には、「親水性残基」というよく知られた用語は、セリンまたはトレオニンに関する。「疎水性残基」は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンなどを指す。「正電荷残基」は、リシン、アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンに関する。「負電荷残基」は、アスパラギン酸またはグルタミン酸を指す。「嵩高い側鎖」を有する残基は、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンなどを指す。典型的な保存的アミノ酸置換の一覧を表１に示す。
【表２】
2021511826.tif 000023
【０４６１】
一実施形態において、本明細書に記載の方法において使用されるTリンパ球（たとえば、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の作製に使用される細胞傷害性Tリンパ球、または形質転換していないT細胞）は、自家細胞であってもよいが、治療対象の患者が、免疫系の破壊のために高用量の化学療法または放射線療法を受けている場合などには、異種細胞を使用することもできる。一実施形態において、同種細胞を使用することができる。
【０４６２】
一態様において、前記Tリンパ球は、当技術分野で公知の手段で患者から得ることができる。たとえば、T細胞（たとえば細胞傷害性T細胞または形質転換していないT細胞）は、患者から末梢血を採取し、フィコール密度勾配遠心分離法で血液を処理した後、T細胞ネガティブ単離キット（EasySepTM T Cell Isolation Kitなど）を使用して末梢血からT細胞集団を単離することによって得ることができる。例示的な一実施形態において、Tリンパ球（たとえば細胞傷害性T細胞または形質転換していないT細胞）の集団は純粋なものである必要はなく、（たとえば、Tリンパ球集団が細胞傷害性T細胞の場合には）その他の種類のT細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、B細胞などの、その他の種類の細胞を含んでいてもよい。一態様において、採取された細胞集団は、選択された種類の細胞を少なくとも約90%含んでいてもよく、選択された種類の細胞を少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または少なくとも約100%含んでいてもよい。
【０４６３】
一実施形態において、Tリンパ球（たとえば、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の作製に使用するための細胞傷害性T細胞）が得られた後、Tリンパ球の活性化が促進される条件下でTリンパ球を培養する。この実施形態において、Tリンパ球の培養は、培地成分に対する反応性を懸念することなく患者にTリンパ球を投与することができるような培養条件で行ってもよい。たとえば、培養条件には、ウシ血清アルブミンなどのウシ血清製剤が含まれていなくてもよい。例示的な一態様において、Tリンパ球の活性化は、公知の活性化剤を培地に導入することによって行うことができ、たとえば、細胞傷害性T細胞の場合には、抗CD3抗体などを培地に導入することによって活性化することができる。その他の適切な活性化剤として抗CD28抗体が挙げられる。一態様において、リンパ球集団は、活性化が促進される条件下で約１日〜約４日間培養することができる。一実施形態において、適切な活性化の程度は、細胞の大きさ、増殖速度、またはフローサイトメトリーで分析される活性化マーカーによって測定することができる。
【０４６４】
例示的な一実施形態において、活性化が促進される条件下で、Tリンパ球集団（たとえば、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の作製に使用される細胞傷害性Tリンパ球）を培養した後、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARをコードする発現ベクターでTリンパ球集団をトランスフェクトすることができる。様々な実施形態において使用される適切なベクターおよび適切なトランスフェクション方法は前述の通りである。一態様において、Tリンパ球をトランスフェクション後、直ちに患者に投与することができ、あるいは、たとえばトランスフェクションからTリンパ球を回復させる期間として、少なくとも約１日、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約10日間、少なくとも約11日間、少なくとも約12日間、少なくとも約13日間、少なくとも約14日間、少なくとも約15日間、少なくとも約16日間、少なくとも約17日間、少なくとも約18日間もしくはそれ以上、または約５日間〜約12日間、約６日間〜約13日間、約７日間〜約14日間もしくは約８日間〜約15日間にわたってTリンパ球を培養することができる。一態様において、この培養における適切な条件は、Tリンパ球を活性化させた培養条件と同様としてもよく、この際、活性化の促進に使用した薬剤を添加しても添加しなくてもよい。
【０４６５】
したがって、例示的な一態様において、前述したように、本明細書に記載の治療方法は、
１）自家Tリンパ球集団または異種Tリンパ球集団（たとえば、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の作製に使用される細胞傷害性Tリンパ球）を得る工程、
２）前記Tリンパ球の活性化が促進される条件下で該Tリンパ球を培養する工程、および
３）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARをコードする発現ベクターで前記Tリンパ球をトランスフェクトして、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞を作製する工程
をさらに含むことができる。
【０４６６】
例示的な一実施形態において、Tリンパ球にトランスフェクトし、活性化することによって、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含む組成物を調製し、形質転換していないT細胞を加えて、または形質転換していないT細胞を加えずに、前記CAR T細胞を含む組成物を患者に投与することができる。一実施形態において、ウシ血清などの動物製品を含んでいない培養培地を使用して、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞および／または形質転換していないT細胞を培養することができる。別の一実施形態において、細菌、真菌およびマイコプラズマの混入を避けるために当業者によって通常使用されている組織培養条件を使用することもできる。代表的な一実施形態において、T細胞（たとえば、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞および／または形質転換していないT細胞）は、患者に投与する前に、ペレット化し、洗浄し、薬学的に許容される担体または希釈剤に再懸濁する。抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR発現Tリンパ球（たとえば細胞傷害性Tリンパ球）または形質転換していないT細胞を含む組成物の具体例としては、290mOsmの滅菌生理食塩水中に前記T細胞を含む組成物、注入可能な凍結保存培地（Plasma-Lyte A、デキストロース、塩化ナトリウム注射液、ヒト血清アルブミンおよびDMSOを含む）中に前記T細胞を含む組成物、2%ヒト血清アルブミンを含む0.9%NaCl中に前記T細胞を含む組成物、またはその他の注入可能な290mOsmの滅菌材料中に前記T細胞を含む組成物が挙げられる。あるいは、別の一実施形態において、培地の種類に応じて、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞または形質転換していないT細胞を培地中に懸濁し、組成物として投与することができ、または投与前に濃縮して培地中に再懸濁することができる。様々な実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞組成物は、形質転換していないT細胞を加えて、または形質転換していないT細胞を加えずに、たとえば非経口投与（たとえば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与または鞘内投与）などの適切な手段により患者に投与することができる。
【０４６７】
一態様において、患者に投与される前記組成物中の、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の総数およびその濃度は、様々な要因に応じて変動し、このような要因としては、使用するTリンパ球の種類（たとえば細胞傷害性Tリンパ球）、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARの結合特異性、標的化部分および小分子リガンドの種類、がんの種類、患者の体内におけるがんの位置、前記組成物を患者に投与するための手段、ならびに治療対象の患者の健康状態、年齢および体重が挙げられる。様々な実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現する形質導入CAR T細胞を含む適切な組成物の体積として、約0.1ml〜約200mlおよび約0.1ml〜約125mlが挙げられる。
【０４６８】
様々な実施形態において、患者に投与するための、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含む形質導入CAR T細胞は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現する形質導入CAR T細胞を、約1×105個〜約1×1015個または1×106個〜約1×1015個含んでいてもよい。様々な実施形態において、患者に投与することが可能な、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の数は、約1×105個〜約1×1010個、約1×106個〜約1×1010個、約1×106個〜約1×109個、約1×106個〜約1×108個、約1×106個〜約2×107個、約1×106個〜約3×107個、約1×106個〜約1.5×107個、約1×106個〜約1×107個、約1×106個〜約9×106個、約1×106個〜約8×106個、約1×106個〜約7×106個、約1×106個〜約6×106個、約1×106個〜約5×106個、約1×106個〜約4×106個、約1×106個〜約3×106個、約1×106個〜約2×106個、約2×106個〜約6×106個、約2×106個〜約5×106個、約3×106個〜約6×106個、約4×106個〜約6×106個、約4×106個〜約1×107個、約1×106個〜約1×107個、約1×106個〜約1.5×107個、約1×106個〜約2×107個、約0.2×106個〜約1×107個、約0.2×106個〜約1.5×107個、約0.2×106個〜約2×107個、または約5×106個であってもよい。一態様における本明細書に記載のいずれかの実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞を患者に１回または複数回投与することができる。本明細書またはこの段落に記載のいずれかの実施形態において、CAR T細胞の数は、患者のkg体重あたりで示される場合がある。本明細書に記載のいずれかの実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を投与する前に、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞を投与することができる。本明細書に記載のいずれかの方法の各工程を指すｉ）、ii）、iii）などは、特段の記載がない限り、特定の順序を示さないと理解される。
【０４６９】
本明細書に記載の様々な実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞とともに、形質転換していないT細胞を投与することができ、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の投与量および形質転換していないT細胞の投与量として本明細書で述べた量で投与することができる。一態様において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞と形質転換していないT細胞の混合物を１回または複数回投与することができ、あるいは、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞のみの投与と、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞と形質転換していないT細胞の混合物の投与を組み合わせることができる（たとえば、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞を１回投与した後、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞と形質転換していないT細胞の混合物を１回以上投与する）。本明細書の開示を参照した当業者であれば理解できるように、本明細書に記載の、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞と形質転換していないT細胞の「混合物」は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞が、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARの発現に使用されるコンストラクトに暴露されていない非形質転換T細胞と混合されていることを意味する。
【０４７０】
別の実施形態において、CAR T細胞組成物の形態での、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の患者への投与量は、約100万個、約200万個、約300万個、約400万個、約500万個、約600万個、約700万個、約800万個、約900万個、約1000万個、約1100万個、約1200万個、約1250万個、約1300万個、約1400万個および約1500万個からなる群から選択される。
【０４７１】
例示的なさらに別の実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物は、注射により患者の血流中へ投与され、患者の血流中において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞は、CAR T細胞組成物を注射した約４週間後までに患者の血流中の全T細胞の少なくとも5%、少なくとも7%、少なくとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%もしくは少なくとも15%を占め；CAR T細胞組成物を注射した約３週間後までに患者の血流中の全T細胞の少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%もしくは少なくとも50%を占め；CAR T細胞組成物を注射した約２週間後までに患者の血流中の全T細胞の少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%もしくは少なくとも80%を占め；またはCAR T細胞組成物を注射した約１週間後までに患者の血流中の全T細胞の少なくとも85%、少なくとも90%もしくは少なくとも95%を占める。本明細書に記載の実施形態において、CAR T細胞組成物は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞を含み、その他の種類の細胞を含んでいなくてもよく、あるいは、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞とともに形質転換していないT細胞を患者に投与することもできる。CAR T細胞組成物を複数回投与する実施形態では、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞、または抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞と形質転換していないT細胞の混合物が、何回目の投与に含まれていてもよい。様々な実施形態において、形質転換していないT細胞は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の投与量として前述した量で投与することができる。
【０４７２】
別の一実施形態において、約1：5、約1：4、約1：3、約1：2および約1：1から選択される比率の、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞と形質転換していないT細胞の混合物が、CAR T細胞組成物の何回目の投与に含まれていてもよい。
【０４７３】
さらに別の実施形態において、約1：1〜約1：5の比率の、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞と形質転換していないT細胞の混合物が、CAR T細胞組成物の何回目の投与に含まれていてもよく、あるいはCAR T細胞組成物は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現する約1000万個のCAR T細胞と形質転換していない約4000万個のT細胞の混合物を含んでいてもよく、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現する約1500万個のCAR T細胞と形質転換していない約3500万個のT細胞の混合物を含んでいてもよく、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現する約2000万個のCAR T細胞と形質転換していない約3000万個のT細胞の混合物を含んでいてもよく、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現する約2500万個のCAR T細胞と形質転換していない約2500万個のT細胞の混合物を含んでいてもよい。
【０４７４】
本明細書に記載の、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物、または前記化合物もしくはその薬学的に許容される塩は、当技術分野で公知の適切な方法を使用して患者に投与することができる。本明細書において、「投与する」または「投与された」は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物、または前記化合物もしくはその薬学的に許容される塩を患者に導入するためのあらゆる手段を包含し、これには、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与などが含まれるが、これらに限定されない。一態様において、本明細書に記載の前記化合物またはその薬学的に許容される塩は、単位投与剤形で投与してもよく、かつ／または従来の無毒な薬学的に許容される担体、アジュバントおよび溶媒を含む製剤として投与してもよい。
【０４７５】
一態様において、本明細書に記載の、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを発現するCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物、または前記化合物もしくはその薬学的に許容される塩は、血流、筋肉内または内臓中へと直接投与してもよい。様々な実施形態において、このような非経口投与に適した経路としては、静脈内送達、動脈内送達、腹腔内送達、髄腔内送達、硬膜外送達、脳室内送達、尿道内送達、胸骨内送達、頭蓋内送達、腫瘍内送達、筋肉内送達および皮下送達が挙げられる。一実施形態において、非経口投与のための手段として、インジェクターニードル（マイクロニードルを含む）、針が付いていないインジェクターおよび注入技術が挙げられる。
【０４７６】
例示的な一態様において、非経口製剤は、通常、担体または賦形剤（塩類、糖鎖、緩衝剤など）を含んでいてもよい（好ましくはpH３〜９の）水溶液であるが、より好適には、滅菌した非水性溶液として製剤化してもよく、滅菌したパイロジェンフリー水または滅菌した生理食塩水などの適切な溶媒と使用される乾燥形態として製剤化してもよい。別の実施形態において、本明細書に記載の液体製剤は、本明細書に記載の非経口投与に適するものであってもよい。無菌条件下での凍結乾燥による非経口製剤用の滅菌凍結乾燥粉末は、当業者に公知の標準的な医薬品技術を使用して容易に調製することができる。一実施形態において、非経口製剤の調製において使用される前記化合物またはその薬学的に許容される塩の溶解性は、溶解性を向上する薬剤の添加などの適切な製剤化技術を使用して向上させてもよい。
【０４７７】
前記化合物またはその薬学的に許容される塩の患者への投与量は、治療対象のがん、該化合物またはその薬学的に許容される塩の投与経路、およびその組織内分布に応じて大幅に変動しうる。患者への投与量は、体表面積、体重および医師による評価に基づいて決定することができる。様々な実施形態において、投与量は、たとえば、約0.05mg〜約30mg、約0.05mg〜約25.0mg、約0.05mg〜約20.0mg、約0.05mg〜約15.0mg、約0.05mg〜約10.0mg、約0.05mg〜約9.0mg、約0.05mg〜約8.0mg、約0.05mg〜約7.0mg、約0.05mg〜約6.0mg、約0.05mg〜約5.0mg、約0.05mg〜約4.0mg、約0.05mg〜約3.0mg、約0.05mg〜約2.0mg、約0.05mg〜約1.0mg、約0.05mg〜約0.5mg、約0.05mg〜約0.4mg、約0.05mg〜約0.3mg、約0.05mg〜約0.2mg、約0.05mg〜約0.1mg、約0.01mg〜約2mg、約0.3mg〜約10mg、約0.1mg〜約20mg、または約0.8〜約3mgの範囲であってもよい。当業者であれば、前記投与量が前述の要因に基づいて前記の様々な範囲内で変動する場合があり、医師の判断に従って前記投与量を決定してもよいことを容易かつ十分に理解するであろう。
【０４７８】
別の実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与量は、たとえば、患者の体重あたり約50nmol/kg〜約3000nmol/kg、約50nmol/kg〜約2000nmol/kg、約50nmol/kg〜約1000nmol/kg、約50nmol/kg〜約900nmol/kg、約50nmol/kg〜約800nmol/kg、約50nmol/kg〜約700nmol/kg、約50nmol/kg〜約600nmol/kg、約50nmol/kg〜約500nmol/kg、約50nmol/kg〜約400nmol/kg、約50nmol/kg〜約300nmol/kg、約50nmol/kg〜約200nmol/kg、約50nmol/kg〜約100nmol/kg、約100nmol/kg〜約300nmol/kg、約100nmol/kg〜約500nmol/kg、約100nmol/kg〜約1000nmol/kg、約100nmol/kg〜約2000nmol/kgの範囲であってもよい。別の実施形態において、前記投与量は、患者の体重あたり約1nmol/kg、約5nmol/kg、約10nmol/kg、約20nmol/kg、約25nmol/kg、約30nmol/kg、約40nmol/kg、約50nmol/kg、約60nmol/kg、約70nmol/kg、約80nmol/kg、約90nmol/kg、約100nmol/kg、約150nmol/kg、約200nmol/kg、約250nmol/kg、約300nmol/kg、約350nmol/kg、約400nmol/kg、約450nmol/kg、約500nmol/kg、約600nmol/kg、約700nmol/kg、約800nmol/kg、約900nmol/kg、約1000nmol/kg、約2000nmol/kg、約2500nmol/kg、または約3000nmol/kgであってもよい。
【０４７９】
別の様々な実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与量は、たとえば、患者の体重あたり約10nmol/kg〜約10000nmol/kg、約10nmol/kg〜約5000nmol/kg、約10nmol/kg〜約3000nmol/kg、約10nmol/kg〜約2500nmol/kg、約10nmol/kg〜約2000nmol/kg、約10nmol/kg〜約1000nmol/kg、約10nmol/kg〜約900nmol/kg、約10nmol/kg〜約800nmol/kg、約10nmol/kg〜約700nmol/kg、約10nmol/kg〜約600nmol/kg、約10nmol/kg〜約500nmol/kg、約10nmol/kg〜約400nmol/kg、約10nmol/kg〜約300nmol/kg、約10nmol/kg〜約200nmol/kg、約10nmol/kg〜約150nmol/kg、約10nmol/kg〜約100nmol/kg、約10nmol/kg〜約90nmol/kg、約10nmol/kg〜約80nmol/kg、約10nmol/kg〜約70nmol/kg、約10nmol/kg〜約60nmol/kg、約10nmol/kg〜約50nmol/kg、約10nmol/kg〜約40nmol/kg、約10nmol/kg〜約30nmol/kg、約10nmol/kg〜約20nmol/kg、約200nmol/kg〜約900nmol/kg、約200nmol/kg〜約800nmol/kg、約200nmol/kg〜約700nmol/kg、約200nmol/kg〜約600nmol/kg、約200nmol/kg〜約500nmol/kg、約250nmol/kg〜約600nmol/kg、約300nmol/kg〜約600nmol/kg、約300nmol/kg〜約500nmol/kg、または約400nmol/kg〜約600nmol/kgの範囲であってもよい。別の様々な実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与量は、たとえば、約1nmol/kg〜約10000nmol/kg、約1nmol/kg〜約5000nmol/kg、約1nmol/kg〜約3000nmol/kg、約1nmol/kg〜約2500nmol/kg、約1nmol/kg〜約2000nmol/kg、約1nmol/kg〜約1000nmol/kg、約1nmol/kg〜約900nmol/kg、約1nmol/kg〜約800nmol/kg、約1nmol/kg〜約700nmol/kg、約1nmol/kg〜約600nmol/kg、約1nmol/kg〜約500nmol/kg、約1nmol/kg〜約400nmol/kg、約1nmol/kg〜約300nmol/kg、約1nmol/kg〜約200nmol/kg、約1nmol/kg〜約150nmol/kg、約1nmol/kg〜約100nmol/kg、約1nmol/kg〜約90nmol/kg、約1nmol/kg〜約80nmol/kg、約1nmol/kg〜約70nmol/kg、約1nmol/kg〜約60nmol/kg、約1nmol/kg〜約50nmol/kg、約1nmol/kg〜約40nmol/kg、約1nmol/kg〜約30nmol/kg、または約1nmol/kg〜約20nmol/kgの範囲であってもよい。さらに別の実施形態において、前記投与量は、約0.1nmol/kg、約0.2nmol/kg、約0.3nmol/kg、約0.4nmol/kg、または約0.5nmol/kgであってもよく、患者の体重あたり約0.1nmol/kg〜約1000nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約900nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約850nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約800nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約700nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約600nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約500nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約400nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約300nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約200nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約100nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約50nmol/kg、約0.1nmol/kg〜約10nmol/kg、または約0.1nmol/kg〜約1nmol/kgであってもよい。別の実施形態において、前記投与量は、患者の体重あたり約0.3nmol/kg〜約1000nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約900nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約850nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約800nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約700nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約600nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約500nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約400nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約300nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約200nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約100nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約50nmol/kg、約0.3nmol/kg〜約10nmol/kg、または約0.3nmol/kg〜約1nmol/kgであってもよい。これらの実施形態において、「kg」は、患者のキログラム体重である。一態様において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を１回または複数回患者に投与してもよい。
【０４８０】
別の一実施形態において、患者の体重あたり約20μg/kg〜約3mg/kgの前記化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与することができる。別の一態様において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与量は、患者の体重あたり約0.2mg/kg〜約0.4mg/kgであってもよく、患者の体重あたり約50μg/kgであってもよい。一態様において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を１回または複数回患者に投与してもよい。
【０４８１】
一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを有するCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を投与する前に、標的化部分に連結された小分子リガンド（前記化合物）を患者に投与することができる。別の一実施形態において、標的化部分に連結された小分子リガンド（架橋剤）は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを有するCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物の投与と同時に患者に投与することができ、架橋剤とCAR T細胞組成物は、別々の製剤に含まれていてもよく、同じ製剤に含まれていてもよい。さらに別の一実施形態において、標的化部分に連結された小分子リガンドは、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを有するCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を投与した後に患者に投与することができる。
【０４８２】
例示的な一態様において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを有するCAR T細胞の投与と、標的化部分に連結された小分子（架橋剤）の投与の間のタイミングは、様々な要因に応じて変動し、このような要因として、使用される抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の種類、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を有するCARの結合特異性、標的化部分および小分子リガンドの種類、がんの種類、患者体内におけるがんの位置、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞および標的化部分に連結された小分子リガンドを患者に投与するための手段、ならびに患者の健康状態、年齢および体重が挙げられる。一態様において、標的化部分に連結された小分子リガンドは、CAR T細胞の投与前またはその後に投与することができ、投与の時間差は、たとえば、約３時間以内、約６時間以内、約９時間以内、約１２時間以内、約１５時間以内、約１８時間以内、約２１時間以内、約２４時間以内、約２７時間以内、約３０時間以内、約３３時間以内、約３６時間以内、約３９時間以内、約４２時間以内、約４５時間以内、約４８時間以内もしくは約５１時間以内、または約０.５日以内、約１日以内、約１.５日以内、約２日以内、約２.５日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内、約１０日以内、もしくはそれ以上であってもよい。
【０４８３】
一実施形態において、当技術分野で公知の適用可能な投薬スケジュールを使用して、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを有するCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物、または前記化合物もしくはその薬学的に許容される塩を投与することができる。たとえば、１日１回投与（すなわちqd）、１日２回投与（すなわちbid）、１日３回投与（すなわちtid）、週に２回投与（すなわちBIW）、週に３回投与（すなわちTIW）、週１回投与などを使用することができる。一態様において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを有するCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物および前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投薬スケジュールは、CAR T細胞組成物の細胞傷害性を制御し、かつサイトカイン放出症候群（CRS）を抑制する目的で、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の濃度、および抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の投与数を考慮に入れて選択することができる。
【０４８４】
一実施形態において、患者においてサイトカイン放出症候群（CRS）を予防または抑制するための、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）葉酸類、標的化部分を含んでいない葉酸含有複合体、または前記CAR T細胞の活性化を抑制する薬剤を前記患者に投与する工程
を含む。
【０４８５】
この方法の実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤、標的化部分を含んでいない葉酸含有複合体、または葉酸類を前記患者に投与する工程を使用して、患者のCRSを予防または抑制することができる。この実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤、標的化部分を含んでいない葉酸含有複合体、または葉酸類を、本明細書において「レスキュー剤」と呼ぶことがある。一実施形態において、葉酸などの葉酸類を投与することによって、患者のCRSを予防または抑制することができる。この実施形態において、葉酸類は、架橋剤（すなわち、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンド）と腫瘍上の架橋剤に対する受容体との間の相互作用を抑制し、それによって、腫瘍の溶解を抑制し、患者においてCRSを予防または抑制する。
【０４８６】
別の一実施形態において、レスキュー剤を投与してから約３０分間後、約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約６時間後、約７時間後、約８時間後、約９時間後または約１０時間後という短時間でCRSを抑制することができる。たとえば、CRSのグレードを低下させることができる（たとえば、グレード３からグレード２へと低下させることができ、グレード４からグレード３へと低下させることができる）。
【０４８７】
典型的な段階評価システムを、以下の１列目〜６列目に示し、それぞれグレード０、グレード１、グレード２、グレード３、グレード４およびグレード５を示す。
【表３】
2021511826.tif 000024
【０４８８】
一実施形態において、腫瘍への架橋剤の結合に対する阻害剤として投与される葉酸類は、たとえば、葉酸、葉酸類似体、別の葉酸受容体結合分子のいずれであってもよい。様々な実施形態において、使用することができる葉酸類似体としては、ホリニン酸；プテロポリグルタミン酸；ならびにテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、これらのデアザ類似体およびジデアザ類似体などの葉酸受容体結合性プテリジンが挙げられる。当技術分野において、「デアザ」類似体および「ジデアザ」類似体は、天然の葉酸構造において１つまたは２つの窒素原子が炭素原子で置換された類似体を指すと理解される。たとえば、デアザ類似体として、１−デアザ類似体、３−デアザ類似体、５−デアザ類似体、８−デアザ類似体および１０−デアザ類似体が挙げられる。ジデアザ類似体としては、たとえば、１，５−ジデアザ類似体、５，１０−ジデアザ類似体、８，１０−ジデアザ類似体および５，８−ジデアザ類似体が挙げられる。前記葉酸類似体は、従来、葉酸受容体に対する結合能を反映して「葉酸類」と呼ばれる。その他の葉酸受容体結合性類似体としては、アミノプテリン、アメトプテリン（メトトレキサート）、Ｎ１０−葉酸メチル、２−デアミノ−ヒドロキシ葉酸、１−デアザメトプテリンや３−デアザメトプテリンなどのデアザ類似体、および３’，５’−ジクロロ−４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルプテロイルグルタミン酸（ジクロロメトトレキセート）が挙げられる。
【０４８９】
別の一実施形態において、腫瘍への架橋剤の結合に対する阻害剤として投与される葉酸類は、以下の式
【化１４】
2021511826.tif 000025
（式中、Ｘ１およびＹ１は、ハロ、Ｒ２、ＯＲ２、ＳＲ３およびＮＲ４Ｒ５からなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｕ、ＶおよびＷは、−（Ｒ６ａ）Ｃ＝、−Ｎ＝、−（Ｒ６ａ）Ｃ（Ｒ７ａ）−および−Ｎ（Ｒ４ａ）−からなる群からそれぞれ独立して選択される二価部分を示し；
Ｑは、ＣおよびＣＨからなる群から選択され；
Ｔは、Ｓ、Ｏ、Ｎおよび−Ｃ＝Ｃ−からなる群から選択され；
Ｘ２およびＸ３は、酸素、硫黄、−Ｃ（Ｚ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｚ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）−、−ＯＣ（Ｚ）Ｎ（Ｒ４ｂ）−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ４ｂ）Ｃ（Ｚ）Ｎ（Ｒ５ｂ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ４ａ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｒ６ｂ）（Ｒ７ｂ）−、−Ｎ（Ｃ≡ＣＨ）−、−Ｎ（ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）−、Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン、およびＣ１〜Ｃ１２アルキレンオキシからなる群からそれぞれ独立して選択され、ここでＺは、酸素または硫黄であり；
Ｒ１は、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群から選択され；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５、Ｒ５ｂ、Ｒ６ｂおよびＲ７ｂは、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキニル、（Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ）カルボニル、および（Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミノ）カルボニルからなる群からそれぞれ独立して選択され；
Ｒ６およびＲ７は、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群からそれぞれ独立して選択されるか；またはＲ６およびＲ７は、一緒になってカルボニル基を形成し；
Ｒ６ａおよびＲ７ａは、水素、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルおよびＣ１〜Ｃ１２アルコキシからなる群からそれぞれ独立して選択されるか；またはＲ６ａおよびＲ７ａは、一緒になってカルボニル基を形成し；
ｐ、ｒ、ｓおよびｔは、それぞれ独立して０または１であり；
＊は、複合体の残りの部分との共有結合を示す）
を有する。
【０４９０】
さらに別の一実施形態において、葉酸含有複合体を投与することによって、患者においてサイトカイン放出症候群（CRS）を予防または抑制することができる。CRSは当技術分野でよく知られており、この症候群は患者に体重減少、高熱、肺浮腫および危険な血圧低下など（ただしこれらに限定されない）の有害な作用を起こす場合がある。
【０４９１】
この実施形態において、前記葉酸含有複合体は標的化部分を含まず、したがって、この葉酸含有複合体は、腫瘍と架橋剤の相互作用を抑制し、それによって腫瘍の溶解を阻止し、患者におけるCRSを抑制する。この実施形態において、この葉酸含有複合体の葉酸部分は、標的化部分を含まない化学部分に連結された前記段落に記載の葉酸類のいずれを含んでいてもよい。一態様において、この葉酸含有複合体は、標的化部分を含まない１つ以上のアミノ酸に連結された葉酸類を含んでいてもよい。具体的には、葉酸含有複合体は以下の式を有していてもよい。
【化１５】
2021511826.tif 000026
【０４９２】
この化合物は「EC923」とも呼ばれる。これらの実施形態において、葉酸類または葉酸含有複合体は、架橋剤（すなわち、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンド）に対してモル過剰量で患者に投与することができ、たとえば、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドに対して、10倍の過剰量、100倍の過剰量、200倍の過剰量、300倍の過剰量、400倍の過剰量、500倍の過剰量、600倍の過剰量、700倍の過剰量、800倍の過剰量、900倍の過剰量、1000倍の過剰量、または10,000倍の過剰量で葉酸類または葉酸含有複合体を患者に投与することができる。架橋剤と腫瘍の間の相互作用の抑制に必要な、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドの投与量に対する葉酸類または葉酸含有複合体の投与量は、当業者によって決定することができる。別の一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制するレスキュー剤を患者に投与することによって、CAR T細胞の活性化を抑制し、患者におけるCRSを抑制または予防することができる。一態様において、レスキュー剤は、リンパ球特異的チロシンキナーゼタンパク質阻害薬（たとえばダサチニブ）、PI3キナーゼ阻害薬（たとえばGDC0980）、IL-2誘導性T細胞キナーゼの阻害薬（たとえばBMS-509744）、JAK阻害薬、BTK阻害薬、トシリズマブ、SIPアゴニスト（たとえばシポニモドおよびオザニモド）、および架橋剤へのCAR T細胞の結合を阻害するが、がんには結合しない薬剤（たとえばフルオレセインアミン、FITCまたはフルオレセインナトリウム）からなる群から選択することができる。当業者であれば、生理学的条件下、または、たとえば生理学的なpHの緩衝液中において、FITC（すなわちフルオレセイン）は、塩の形態（たとえばフルオレセインナトリウム）であってもよく、遊離形態であってもよいことを理解できるであろう。したがって、一実施形態において、フルオレセインを患者に投与する場合、このフルオレセインは、塩の形態（たとえばフルオレセインナトリウム）と遊離形態の間で平衡状態であってもよい。別の一実施形態において、CAR T細胞の活性化を抑制するレスキュー剤は、以下の式の化合物であってもよい。
【化１６】
2021511826.tif 000027
【０４９３】
様々な実施形態において、レスキュー剤は、たとえば、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、10ml、100ml、1000mlなどの適切な体積あたり、約0.001nM〜約100mM、約0.01nM〜約100mM、約1nM〜約100mM、約10nM〜約100mM、約50nM〜約100mM、または約100nM〜約100mMの濃度で投与することができる。別の実施形態において、レスキュー剤は、患者の体重あたり約0.01〜約300μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約100μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約90μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約80μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約70μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約60μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約50μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約40μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約30μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約20μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約10μmol/kg、患者の体重あたり約0.06〜約8μmol/kg、または患者の体重あたり約0.06〜約6μmol/kgの投与量で投与することができる。
【０４９４】
これらの実施形態において、レスキュー剤は、前記化合物（すなわち、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンド）またはその薬学的に許容される塩に対してモル過剰量で患者に投与することができ、たとえば、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドに対して、約10倍の過剰量、約20倍の過剰量、約30倍の過剰量、約40倍の過剰量、約50倍の過剰量、約60倍の過剰量、約70倍の過剰量、約80倍の過剰量、約90倍の過剰量、約100倍の過剰量、約200倍の過剰量、約300倍の過剰量、約400倍の過剰量、約500倍の過剰量、約600倍の過剰量、約700倍の過剰量、約800倍の過剰量、約900倍の過剰量、約1000倍の過剰量または約10,000倍の過剰量でレスキュー剤を投与することができる。前記化合物またはその薬学的に許容される塩と、腫瘍および／または抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞との間の相互作用の抑制に必要な、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンド（架橋剤）の投与量に対するレスキュー剤の投与量は、当業者によって決定することができる。
【０４９５】
別の一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤、標的化部分を含まない葉酸含有複合体、または葉酸類を患者に２回以上投与することができる。
【０４９６】
「レスキュー剤」を使用する本明細書に記載の実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤、標的化部分を含まない葉酸含有複合体、または葉酸類は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与前および／または投与後に患者に投与することができる。別の一態様において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤、標的化部分を含まない葉酸含有複合体、または葉酸類の投与前および投与後に投与することができる。この実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を後から投与することによって、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞を活性化させ、患者のサイトカイン濃度を上昇させることができる。
【０４９７】
別の一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤、標的化部分を含まない葉酸含有複合体、または葉酸類を投与することによって、患者のサイトカイン濃度を低下させることができる。さらに別の一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤、標的化部分を含まない葉酸含有複合体、または葉酸類を患者に投与した約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約６時間後、約７時間後、または約８時間後にサイトカイン濃度の低下が起こりうる。別の一実施形態において、このサイトカイン濃度の低下は、未治療患者のサイトカイン濃度と同程度の濃度に達する低下である。
【０４９８】
例示的な別の一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤、標的化部分を含まない葉酸含有複合体、または葉酸類を投与した後、たとえ患者のサイトカイン濃度が低下したとしても、該患者の血液中において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の数は増加しうる。例示的な別の一態様において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制するレスキュー剤、標的化部分を含まない葉酸含有複合体、または葉酸類を投与した後、たとえ治療した患者のサイトカイン濃度が低下したとしても、このレスキュー剤、標的化部分を含まない葉酸含有複合体、または葉酸類で治療していない患者と比較して、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化が増強または維持されうる。さらに別の一実施形態において、前記がんは腫瘍を含み、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制するレスキュー剤、標的化部分を含まない葉酸含有複合体、または葉酸類を患者に投与した場合、該患者の腫瘍の大きさは増加しない。この実施形態において、腫瘍に対する完全奏効を得ることができる。
【０４９９】
別の実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制するレスキュー剤は、CRSがグレード１、グレード２、グレード３もしくはグレード４に達した場合、またはCRSがグレード３もしくはグレード４に達した場合に、患者に投与される。別の一態様において、レスキュー剤を投与することによって、患者の肺水腫が抑制される。
【０５００】
本明細書に記載の一実施形態において、がんの治療方法であって、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に連続投与する工程、
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）前記患者においてサイトカイン放出症候群を抑制または予防するために、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の連続投与を終了する工程
を含む方法を提供する。
【０５０１】
この実施形態によれば、「連続」とは、たとえば、少なくとも１時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間にわたって、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与することを意味してもよく、１日１回、１日２回、１日３回、毎日、１日おき、週１回、週２回、週３回などの、毎日または毎週投与を行うレジメンを意味してもよく、当業者によって連続投与と考えられているその他の適切なレジメンを意味してもよい。別の一態様において、「連続」は、この段落に記載の実施形態の組み合わせを意味してもよい。
【０５０２】
前記方法のこの実施形態において、前記患者においてサイトカイン放出症候群を抑制または予防するために、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の「連続投与を終了する」工程は、たとえば、数時間または数日の連続投与期間の後に投与を中止すること、または前述した毎日または毎週投与を行うレジメンなどの、治療レジメンを中止することを意味してもよい。別の一実施形態において、「連続投与を終了する」工程は、たとえば、許容できない患者の体重減少が起こるまで投与を続けること、または高熱、血圧低下、肺浮腫などのその他の許容できない副作用が起こるまで投与を続けることを意味してもよい。この実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の「連続投与を終了する」工程は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩により１回治療を行った後に、該化合物またはその薬学的に許容される塩によるさらなる治療を行わないことを意味しない。前記方法のこの実施形態において、サイトカイン放出症候群（CRS）を「抑制または予防する」とは、CRSを排除すること、またはCRSの症状を抑制もしくは緩和することを意味する。
【０５０３】
前記化合物またはその薬学的に許容される塩の「連続投与を終了する」工程を含む実施形態のいずれかにおいて、前記方法は、iv）前記化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に再投与する工程をさらに含むことができる。一実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩は、たとえば、週１回投与した後に１回投与を休止することができる。別の一実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩は、隔日（すなわち一日おき）に投与した後に、１回以上（たとえば２回、３回、４回など）の投与を休止することができる。別の一実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩は、週２回投与した後、１回以上（たとえば２回、３回、４回など）の投与を休止することができる。別の一実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩は、月曜日および火曜日に投与した後、次の月曜日に投与し、その後２週間にわたって投与を休止し、このサイクルを繰り返すことができる。別の一実施形態において、前述したレジメンの実施形態のいずれかを使用し、１回以上（たとえば２回、３回、４回など）の投与を休止することができる。これらの実施形態では、投与を休止することによって、患者におけるCRSを予防または抑制することができる。
【０５０４】
さらに別の例示的な一態様において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与および２回目の投与を患者に行う工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含み、
前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量と２回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約２倍〜約15000倍である、
方法を提供する。
【０５０５】
この実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の投与量を徐々に増加することによって、患者におけるサイトカイン放出症候群を抑制または予防することができる。たとえば、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与および２回目の投与を患者に行うことができ、１回目の投与量と２回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約20倍〜約15000倍または2倍〜約15000倍である。別の実施形態において、２回目の投与量すなわち次の投与量は、１回目の投与量の約2倍〜約5倍、約2倍〜約10倍、約2倍〜約20倍、約2倍〜約30倍、約2倍〜約40倍、約2倍〜約50倍、約2倍〜約60倍、約2倍〜約70倍、約2倍〜約80倍、約2倍〜約90倍、約2倍〜約100倍、約2倍〜約15000倍、約2倍〜約10000倍、約5倍〜約9000倍、約5倍〜約8000倍、約5倍〜約7000倍、約5倍〜約6000倍、約5倍〜約5000倍、約5倍〜約4000倍、約5倍〜約3000倍、約5倍〜約4000倍、約5倍〜約3000倍、約5倍〜約2000倍、約5倍〜約1000倍、約5倍〜約750倍、約2倍〜約750倍、約5倍〜約500倍、約5倍〜約100倍、約800倍〜約15000倍、約800倍〜約10000倍、約800倍〜約9000倍、約800倍〜約8000倍、約800倍〜約7000倍、約800倍〜約6000倍、約800倍〜約5000倍、約800倍〜約4000倍、約800倍〜約3000倍、約800倍〜約2000倍、約800倍〜約1000倍、約8000倍〜約15000倍、約8000倍〜約10000倍、約8000倍〜約9000倍、約15000倍、約10000倍、約9000倍、約8000倍、約7000倍、約6000倍、約5000倍、約4000倍、約3000倍、約2000倍、約1000倍、約500倍、約400倍、約300倍、約200倍、約100倍、約90倍、約80倍、約70倍、約60倍、約50倍、約40倍、約30倍、約20倍、約10倍、約5倍、または約2倍であってもよい。
【０５０６】
前述の投与量を増加させる方法の例示的な別の一実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与、２回目の投与および３回目の投与を前記患者に行うことができ、１回目の投与量と２回目の投与量と３回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約2倍〜約750倍であり、３回目の投与量が、１回目の投与量の約800倍〜約10000倍である。
【０５０７】
前述の投与量を増加させる方法の別の一態様において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも１回目の投与、２回目の投与、３回目の投与および４回目の投与を前記患者に行うことができ、１回目の投与量と２回目の投与量と３回目の投与量と４回目の投与量が異なり、２回目の投与量が、１回目の投与量の約2倍〜約750倍であり、３回目の投与量が、１回目の投与量の約800倍〜約7500倍であり、４回目の投与量が、１回目の投与量の約8000〜約15000倍である。
【０５０８】
さらに別の一実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量が、１回目の投与量の約100倍であってもよく、該化合物またはその薬学的に許容される塩の３回目の投与量が、１回目の投与量の約1000倍であってもよく、該化合物またはその薬学的に許容される塩の４回目の投与量が、１回目の投与量の約10000倍であってもよい。代表的な一実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量は0.05nmol/kgであり、２回目の投与量は5nmol/kgであり、３回目の投与量は50nmol/kgであり、４回目の投与量は500nmol/kgである。本明細書に記載の、投与量を増加させる実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量、２回目の投与量、３回目の投与量、４回目の投与量およびそれ以降の投与量は、複数回投与することができる（たとえば、0.05nmol/kgの１回目の投与量は、投与量を増加した次の投与を行う前に数回投与することができる）。
【０５０９】
本明細書に記載の別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与を患者に行う工程；
ii）前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量よりも少なくとも約50%少ない投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の少なくとも２回目の投与を前記患者に行う工程；および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
【０５１０】
投与量が低減される前記実施形態の様々な実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量は、１回目の投与量よりも少なくとも約60%少なくてもよく、１回目の投与量よりも少なくとも約70%少なくてもよく、１回目の投与量よりも少なくとも約80%少なくてもよく、１回目の投与量よりも少なくとも約90%少なくてもよく、１回目の投与量よりも少なくとも約95%少なくてもよく、１回目の投与量よりも少なくとも約96%少なくてもよく、１回目の投与量よりも少なくとも約97%少なくてもよく、１回目の投与量よりも少なくとも約98%少なくてもよく、１回目の投与量よりも少なくとも約99%少なくてもよく、１回目の投与量よりも少なくとも約99.5%少なくてもよい。
【０５１１】
本明細書に記載の、投与量が低減される前記実施形態の様々な実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与量は、患者の体重あたり約100nmol/kg〜約1000nmol/kg、患者の体重あたり約100nmol/kg〜約900nmol/kg、患者の体重あたり約100nmol/kg〜約800nmol/kg、患者の体重あたり約100nmol/kg〜約700nmol/kg、患者の体重あたり約100nmol/kg〜約600nmol/kg、患者の体重あたり約200nmol/kg〜約600nmol/kg、患者の体重あたり約400nmol/kg〜約600nmol/kg、または患者の体重あたり約500nmol/kgであってもよい。
【０５１２】
本明細書に記載の、投与量が低減される前記実施形態の様々な実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量は、患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約500nmol/kg、患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約450nmol/kg、患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約400nmol/kg、患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約350nmol/kg、患者の体重あたり約0.5nmol/kg〜約300nmol/kg、患者の体重あたり約1nmol/kg〜約300nmol/kg、患者の体重あたり約2nmol/kg〜約300nmol/kg、患者の体重あたり約2nmol/kg〜約250nmol/kg、患者の体重あたり約5nmol/kg〜約40nmol/kg、または患者の体重あたり約40nmol/kg〜約150nmol/kgであってもよい。
【０５１３】
本明細書に記載の、投与量が低減される前記実施形態のさらなる実施形態において、前記方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量と同じ投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の３回目の投与を行う工程をさらに含んでいてもよい。別の一実施形態において、前記方法は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与量および３回目の投与量と同じ投与量で、該化合物またはその薬学的に許容される塩の４回目の投与を行う工程をさらに含んでいてもよい。さらに別の一実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与後に、該化合物またはその薬学的に許容される塩をさらに１回または複数回投与することによって、該化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与時と比べてがんの成長の抑制を維持することができる。
【０５１４】
本明細書に記載の、投与量が低減される前記実施形態の別の実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞は、約100万個〜約4000万個の投与量で投与することができる。
【０５１５】
さらに別の実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与後に、該化合物またはその薬学的に許容される塩をさらに週１回または週２回投与することができる。本明細書に記載の、投与量が低減される前記実施形態のさらに別の実施形態において、前記方法は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤、標的化部分を含んでいない葉酸含有複合体または葉酸類を前記患者に投与する工程をさらに含むことができる。
【０５１６】
別の一実施形態において、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の活性化を抑制する薬剤が患者に投与され、この薬剤は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩への、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞の結合を阻害するが、がんには結合しない薬剤であり、フルオレセインアミン、フルオレセインナトリウムまたはフルオレセインである。さらに別の一実施形態において、この薬剤はフルオレセインナトリウムである。
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を投与する少なくとも約１時間前に、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩の１回目の投与を患者に行う工程；
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含む前記CAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程、および
iii）前記化合物またはその薬学的に許容される塩の２回目の投与を前記患者に行う工程
を含む。
この前治療に関するこの実施形態の様々な実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の患者への１回目の投与は、CAR T細胞組成物を投与する少なくとも約２時間前、少なくとも約４時間前、少なくとも約８時間前、少なくとも約１２時間前、少なくとも約１６時間前、少なくとも約２０時間前、または少なくとも約２４時間前に行うことができ、いずれの場合も、CAR T細胞組成物は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含む。
【０５１７】
前記前治療に関する前記実施形態の様々な実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の患者への２回目の投与は、CAR T細胞組成物を投与した少なくとも約２４時間後まで、少なくとも約２０時間後まで、少なくとも約１８時間後まで、少なくとも約１６時間後まで、少なくとも約１４時間後まで、少なくとも約１２時間後まで、少なくとも約１０時間後まで、少なくとも約８時間後まで、少なくとも約６時間後まで、少なくとも約４時間後まで、または少なくとも約２時間後までに行うことができ、いずれの場合も、CAR T細胞組成物は、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含む。
【０５１８】
リンカーを介して標的化部分に連結されたリガンドが葉酸類である場合、本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載の方法による治療を行う前に、葉酸欠乏食を患者に与えることができ、または患者の食事に葉酸類を添加することができる。患者に葉酸類を投与する実施形態において、葉酸類の投与量は、たとえば、患者の体重あたり約50nmol/kg〜約3000nmol/kg、約50nmol/kg〜約2000nmol/kg、約50nmol/kg〜約1000nmol/kg、約50nmol/kg〜約900nmol/kg、約50nmol/kg〜約800nmol/kg、約50nmol/kg〜約700nmol/kg、約50nmol/kg〜約600nmol/kg、約50nmol/kg〜約500nmol/kg、約50nmol/kg〜約400nmol/kg、約50nmol/kg〜約300nmol/kg、約50nmol/kg〜約200nmol/kg、約50nmol/kg〜約100nmol/kg、約100nmol/kg〜約300nmol/kg、約100nmol/kg〜約500nmol/kg、約100nmol/kg〜約1000nmol/kgまたは約100nmol/kg〜約2000nmol/kgの範囲であってもよい。別の実施形態において、葉酸類の投与量は、患者の体重あたり約100nmol/kg、約150nmol/kg、約200nmol/kg、約250nmol/kg、約300nmol/kg、約350nmol/kg、約400nmol/kg、約450nmol/kg、約500nmol/kg、約600nmol/kg、約700nmol/kg、約800nmol/kg、約900nmol/kg、約1000nmol/kg、約2000nmol/kg、または約3000nmol/kgであってもよい。これらの実施形態において、「kg」は、患者のキログラム体重である。一態様において、葉酸類は、たとえば、毎日、週１回、２週に１回もしくは週３回投与することができ、または葉酸類の投与のための適切なレジメンに従って投与することもできる。
【０５１９】
本明細書に記載の様々な実施形態において、循環CAR T細胞の数は、CAR T細胞の投与後、約10日間、約15日間、約20日間、約25日間、約30日間、約35日間、約40日間、約45日間、約50日間、約55日間、約60日間、約65日間、約70日間、約75日間または約80日間といった長期間にわたって高いまま維持されうる。
【０５２０】
本明細書に記載の様々な実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の半数効果濃度（EC50）は、約1pM〜約2nM、約1pM〜約5nM、約1pM〜約10nM、約1pM〜約20nM、約1pM〜約30nM、約1pM〜約40nM、約1pM〜約50nM、約1pM〜約60nM、約1pM〜約70nM、約1pM〜約80nM、約1pM〜約90nM、約1pM〜約100nM、約1pM〜約200nM、約1pM〜約300nM、約1pM〜約400nM、約1pM〜約500nM、約1pM〜約600nM、約1pM〜約700nM、約1pM〜約800nM、約1pM〜約900nM、約1pM〜約1nM、約1pM〜約900pM、約1pM〜約800pM、約1pM〜約700pM、約1pM〜約600pM、約1pM〜約500pM、約1pM〜約400pM、約1pM〜約300pM、約1pM〜約200pM、約1pM〜約100pM、約1pM〜約90pM、約1pM〜約80pM、約1pM〜約70pM、約1pM〜約60pM、約1pM〜約50pM、約1pM〜約40pM、約1pM〜約30pM、約1pM〜約20pM、約1pM〜約10pM、または約1pM〜約5pMであってもよい。
【０５２１】
本明細書に記載の様々な実施形態において、CAR T細胞への前記化合物またはその薬学的に許容される塩の結合のKdは、約1nM〜約100nM、約1nM〜約200nM、約1nM〜約300nM、約1nM〜約400nM、約1nM〜約500nM、約1nM〜約600nM、約1nM〜約700nM、約1nM〜約800nM、約1nM〜約900nM、約100nM〜約500nM、約100nM〜約400nM、約100nM〜約300nM、約100nM〜約200nM、約100nM〜約150nM、または約130nMであってもよい。
【０５２２】
本明細書に記載の例示的な様々な実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩の患者への１回目の投与は、CAR T細胞を投与する約１日前、約２日前、約３日前、約４日前、約５日前、約６日前、約７日前、約８日前、約９日前または約１０日前に行うことができ、あるいはCAR T細胞を投与した約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後または約１０日後に行うことができ、あるいはCAR T細胞を投与する前またはその後の適切な日に行うことができる。
【０５２３】
本明細書に記載の様々な実施形態において、EGFRtでソートしたCAR T細胞またはソートしていないCAR T細胞を使用することができる。別の一実施形態において、低分化型のプロファイルを有する「臨床模擬」バッチのCAR T細胞を使用することができる。別の一実施形態において、「研究バッチ」のCAR T細胞を使用することができる。「臨床模擬」バッチ（EGFRt+約39%）は、TSCM約66%およびTCM約32%からなるCD4+サブセットと、TSCM約95%およびTCM約3%からなるCD8サブセットを含んでいてもよい。また、研究バッチ（EGFRt+約23%）は、TSCM約32%、TCM約53%、TEM約11%およびTEFF約3.7%からなるCD4サブセットと、TSCM約44%、TCM約0.28%、TEM約3.4%およびTEFF約52%からなるCD8サブセットを含んでいてもよい。
【０５２４】
前記前治療の実施形態に関する様々なさらなる実施形態において、患者においてオフターゲット毒性を引き起こすサイトカイン放出は起こらず、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞が、がんに対して毒性を発揮するか；患者の組織に対するオフターゲット毒性は起こらず、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞が、がんに対して毒性を発揮するか；がんが腫瘍を含み、患者の腫瘍の大きさが縮小され、オフターゲット毒性は起こらないか；または、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を投与する前に、前記化合物またはその薬学的に許容される塩で前治療を行った患者の腫瘍の大きさが、この前治療を行っていない患者と比べて縮小する。当業者であれば理解できるように、「標的」はがん（たとえば腫瘍）であってもよい。
【０５２５】
別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含み、
前記小分子リガンドはPSMAリガンドであり、前記標的化部分はFITCである。
この実施形態において、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドは、以下の式を有していてもよい。
【化１７】
2021511826.tif 000028
【０５２６】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドを含む化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、および
ii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含み、
前記小分子リガンドはCAIXリガンドであり、前記標的化部分はFITCである。
この実施形態において、リンカーを介して標的化部分に連結された小分子リガンドは、以下の式を有していてもよい。
【化１８】
2021511826.tif 000029
【０５２７】
さらに別の一実施形態において、がんの治療方法を提供する。この方法は、
ｉ）リンカーを介してFITCに連結されたPSMAリガンドを含む第１の化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する工程、
ii）リンカーを介してFITCに連結されたCAIXリガンドを含む第２の化合物またはその薬学的に許容される塩を前記患者に投与する工程、および
iii）抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を前記患者に投与する工程
を含む。
この実施形態において、第１の化合物は以下の式
【化１９】
2021511826.tif 000030
を有していてもよく、
第２の化合物は以下の式
【化２０】
2021511826.tif 000031
を有していてもよい。
【０５２８】
本明細書に記載の方法の一実施形態において、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与する前、または抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を含むCARを含むCAR T細胞を含むCAR T細胞組成物を患者に投与する前に、がんの画像検査を行う。例示的な一実施形態において、画像検査は、PETイメージングによって行う。例示的な別の実施形態において、画像検査は、MRIイメージングまたはSPECT/CTイメージングによって行う。画像検査法は、当技術分野で公知の適切な画像検査法であれば、どのようなものであってもよい。一実施形態において、画像検査法は、本明細書に記載の画像検査法の種類に応じて適切な造影剤に連結された本明細書に記載の小分子リガンドを使用することを含んでいてもよい。
【０５２９】
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞が、がんに対する毒性を発揮したとしても、患者においてオフターゲット毒性を引き起こすサイトカイン放出は起こらないと考えられる。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、抗フルオレセイン抗体クローンE2の断片を発現するCAR T細胞が、がんに対する毒性を発揮したとしても、患者の組織に対するオフターゲット毒性は起こらないと考えられる。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、がんは腫瘍を含んでいてもよく、オフターゲット毒性が起こらなくても、患者の腫瘍の大きさが縮小しうる。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、サイトカイン放出症候群（CRS）を抑制または予防することができ、前記方法によって患者の腫瘍の体積を減少させることができる。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、サイトカイン放出症候群（CRS）による体重減少を抑制または予防することができる。本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、がんは腫瘍を含んでいてもよく、該腫瘍の完全奏効を得ることができる。
【０５３０】
本明細書に記載の方法の別の実施形態において、本明細書に記載の方法はいずれも単独で使用することができ、本明細書に記載の別の方法または別の複数の方法と組み合わせて使用することもできる。
【実施例】
【０５３１】
実施例１
EC17の投与量を低減することにより、CAR-T療法に関連する毒性を低減することができる
CAR-T療法の抗腫瘍活性および毒性（体重の変化）に対するEC17の投与量低減の効果を調査した。２種の抗フルオレセインscFvを使用してCARコンストラクトを作製した（図１）。第１のCARコンストラクトは、抗FL(FITC-E2)scFv-IgG4ヒンジ(CH2(L235D,N297Q)-CH3)-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2A-EGFRtを含む。第２のCARコンストラクトは、抗FL(FITC-4M5.3)scFv-IgG4ヒンジ(CH2(L235D,N297Q)-CH3)-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2A-EGFRtを含む。各CARコンストラクトの核酸配列およびアミノ酸配列を配列番号１〜４に示す。ヒトT細胞を単離し、活性化し、適切なCAR遺伝子を含むレンチウイルスベクターで形質導入した。CAR修飾CD4+T細胞とCAR修飾CD8+T細胞をそれぞれ単離し、インビトロで別々に約7日間培養した。動物試験において静脈内投与する前に、CD4+CAR-T細胞とCD8+CAR-T細胞を１：１の比率で混合した。
【０５３２】
MDA-MB-231腫瘍（150〜250mm3）を有するマウスを使用したインビボ研究を実施し、E2-CAR-T細胞を評価した。本研究の第１段階では、1000万個または2000万個のE2-CAR-T細胞を投与し、その後2日目、9日目、16日目、23日目などに、500nmol/kgのEC17を週１回静脈内投与した（図２Ａに示す）。2000万個のE2-CAR-T細胞を投与したマウスは、２回目のEC17の投与後に重度のサイトカイン放出症候群（CRS）を示し、6μmol/kgのフルオレセインナトリウム（NaFL）でレスキューする必要があった。1000万個のCAR-Tを投与した群および2000万個のCAR-Tを投与した群は、いずれも３回目および４回目のEC17の投与後に重度のCRSを示し、NaFLでレスキューする必要があった（図５Ａおよび図５Ｂに示す）。これらの２つの群では、E2-CAR-T療法中に重度の体重減少（約20%）が示され、1000万個または2000万個のE2 CAR-T細胞の投与と500nmol/kgのEC17の週１回投与による治療法は、重度の毒性を有することが示された。（2000万個のE2-CAR-T細胞の単独投与でも抗腫瘍活性が示されたが（図５Ａ、中抜きの円）、これは恐らく、インビトロで短時間培養した「幼若な」T細胞で見られることが多い、同種HLAが不一致のTCRによって引き起こされたものであると考えられる。）
【０５３３】
本研究の第２段階では、前記E2-CAR-T細胞をインビトロで約２週間培養した。3000万個のE2-CAR-T細胞を投与し、投与量を低減してEC17を投与した。図２Ｂに示すように、CAR-T細胞を投与した2日後に500nmol/kgのEC17を投与した後、投与量を低減したEC17（5nmol/kg、20nmol/kgまたは100nmol/kg）を週１回（CAR-T細胞の投与後9日目、16日目、23日目など）投与した。図３Ａに示すように、３つのEC17投与量低減群はすべて完全奏効に至り、架橋剤であるEC17を低減してもCAR-T細胞の抗腫瘍活性に影響は見られないことが示された。より重要なことには、これら３つのEC17投与量低減群のいずれにおいても重度のCRSは示されなかった。また、図３Ｂに示すように、本研究の第１段階で投与したCAR-T細胞（1000万個または2000万個のCAR-T細胞）よりも多くのCAR-T細胞（3000万個）を投与したにもかかわらず、いずれの投与量低減群でも、体重の減少はごくわずかであった。これらのデータから、架橋剤（EC17）の投与量を低減する（高い負荷投与量を１回投与後、投与量を下げて維持投与を行う）ことによって、CAR-T細胞の良好な抗腫瘍活性を維持しながら、毒性を低減できることが示された。
【０５３４】
第２のコンストラクトである4M5.3-CAR（抗FL(FITC-4M5.3)scFv-IgG4ヒンジ(CH2(L235D,N297Q)-CH3)-CD28 TM-4-1BB-CD3z-T2A-EGFRt）も評価した。MDA-MB-231腫瘍（150〜250mm3）を有するマウスを使用したインビボ研究を実施し、4M5.3-CAR-T細胞を評価した。本研究の第１段階では、1000万個または2000万個の4M5.3-CAR-T細胞を投与し、その後2日目、9日目、16日目、23日目などに、500nmol/kgのEC17を週１回静脈内投与した（図２Ａに示す）。1000万個または2000万個の4M5.3-CAR-T細胞を投与したマウスは、EC17の投与後に重度のCRSも体重減少も示さず（図６Ｂ）、腫瘍はすべて縮小し、最終的に消失した（図６Ａ）。2000万個のCAR-T細胞（上の曲線）は、1000万個のCAR-T細胞（中央の曲線）よりも良好な抗腫瘍活性を示した。
【０５３５】
本研究の第２段階では、前記4M5.3-CAR-T細胞をインビトロで約２週間培養した。3000万個の4M5.3-CAR-T細胞を投与し、EC17の投与量を低減して投与した。図２Ｂに示すように、CAR-T細胞を投与した2日後に500nmol/kgのEC17を投与した後、投与量を低減したEC17（5nmol/kg、20nmol/kgまたは100nmol/kg）を週１回（CAR-T投与後9日目、16日目、23日目など）投与した。図４Ａに示すように、100nmol/kgのEC17を投与した投与量低減群において、最も良好な抗腫瘍活性が示され、腫瘍がすべて治癒した（１番下の曲線）。一方、5nmol/kg EC17群（上から２番目の曲線）や20nmol/kg EC17群（上から３番目の曲線）では、CAR-T療法による完全奏効は示されなかった。これらのデータから、投与量を低減してEC-17を投与することによって、CAR-T細胞の活性を制御できることが示された。さらに、図４Ｂに示すように、３つの投与量低減群におけるマウスの体重減少も、EC17の投与量に依存していた。100nmol/kgのEC17を投与した投与量低減群は、5nmol/kgまたは20nmol/kgのEC17を投与した他の２つの群よりも、体重の減少が顕著であった。これらのデータから、架橋剤（EC17）の投与量を低減する（高い負荷投与量を１回投与後、投与量を下げて維持投与を行う）ことによって、CAR-T療法の抗腫瘍活性と毒性を制御することができることが示された。
【０５３６】
E2-CARと4M5.3-CARの唯一の差異は、使用しているscFv配列である。同じ条件下でのこれら２種のCARの比較において、EC17の投与量を低減して（5nmol/kg、20nmol/kgまたは100nmol/kg）評価した場合、1000万個の4M5.3-CAR-T細胞よりも1000万個のE2-CAR-T細胞の方が、良好な抗腫瘍活性を有し、3000万個の4M5.3-CAR-T細胞よりも3000万個のE2-CAR-T細胞が良好な抗腫瘍活性を示すことが分かった。
【０５３７】
本明細書において、「配列番号４」は、下線を引いた「gac」コドンから始まり、下線を引いた「ggc」コドンで終わる配列を意味する。以下の長い配列のこの部分は、一例としての4M5.3 CARをコードする。このCARはT細胞の細胞膜に挿入される。この長い配列のその他の部分には、シグナルペプチドやEGFRtドメインなどのコード配列が含まれ、これらのシグナルペプチドやEGFRtドメインは、細胞膜に挿入されてキメラ抗原受容体として機能するCARの一部ではない。本明細書において、「配列番号３」は、下線を引いた「Ｄ」から始まり、下線を引いた「Ｇ」で終わる配列を意味する。以下の長い配列のこの部分は、T細胞の細胞膜に挿入されるCARのアミノ酸配列である。この長い配列のその他の部分には、シグナルペプチドやEGFRtドメインなどのアミノ酸配列が含まれ、これらのシグナルペプチドやEGFRtドメインは、細胞膜に挿入されてキメラ抗原受容体として機能するCARの一部ではない。さらに別の一実施形態において、配列番号３は、ヒト化アミノ酸配列またはヒトアミノ酸配列を含んでいてもよく、ヒト化アミノ酸配列またはヒトアミノ酸配列からなっていてもよい。配列番号３および配列番号４は前述の通りである。以下の長い核酸配列において、開始コドンと終止コドンを下線で示し、この長い配列は、T細胞に形質導入することによって4M5.3 CARを作製することができる配列の一例である。
配列番号３［4M5.3-CARのアミノ酸配列（インサート）］
2021511826.tif 000032
配列番号４［4M5.3-CARの核酸配列（インサート）］
2021511826.tif 000033
【０５３８】
実施例２
CAR T細胞の分化の評価
NSGマウスへの注入前の表現型
マルチカラーフローサイトメトリーを使用して、腫瘍を有するマウスに注入するためのCAR T細胞製剤の表現型を決定した。図７Ａに示す特定の表面マーカーの組み合わせを使用して、CD4+サブセットおよびCD8+サブセットの分化状態を分析した。ソートしていない臨床模擬E2 CAR T細胞製剤は、自己複製するTscm/Tcm表現型から主に構成されていた（図７Ｂ）。図７Ｂにおいて、最も高い棒が「Tscm」であり、低い棒が「Tcm」である。図８Ａに示すように、本発明の臨床模擬E2 CAR T細胞は、過去に報告されているソートされたE2 CAR-T細胞および4M5.3 CAR-T細胞ならびに初期のインビボ研究用GFP+4M5.3 CAR T細胞製剤とCD8：CD4の比率が異なるだけでなく、その表現型も異なっていた（図８Ｂの円グラフにまとめた）。図８Ａに示す10個の群の各棒グラフは、左から右に順に、１（高い棒：Tscm、低い棒：Tcm）、２（高い棒：Tscm、低い棒：Tcm）、３（高い棒：Teff、低い棒：Tem）、４（高い棒：Tem、これよりも低い棒：Teff、最も低い棒：Tcm）、５（高い棒：Teff、低い棒：Tem）、６（高い棒：Tem、これよりも低い棒：Teff、最も低い棒：Tcm）、７（高い棒：Teff、低い棒：Tscm）、８（高い棒：Teff、低い棒：Tem）、９（高い棒：Teff、低い棒：Tscm）、１０（高い棒：Teff、これよりも低い棒：Tsm、その次に低い棒：Tem、最も低いTcm）を示す。したがって、Tscm/Tcmの表現型から主に構成されているCAR T細胞は、より分化が進んだTem/Teffの表現型を持つ過去に報告されているCAR T細胞製剤よりも優れた抗腫瘍表現型を持つと予想された。同様の理由から、同じEC17の投薬レジメンとした場合、本発明のCAR-T細胞製剤の使用による重度のサイトカイン放出症候群は、過去に報告されているCAR-T細胞製剤を使用した場合よりも遅くに発症する。
凍結保存後のCAR T細胞の回復
凍結保存していたCAR T細胞を、37℃の水浴中で急速解凍し、50U/mL組換えヒトIL-2を加えたT細胞回復培地（2%ヒトAB型血清を添加したグルタミン含有TexMACSTM培地（ミルテニーバイオテク、カタログNo.130-097-196））に直ちに播種し、インビトロで約3〜5日間培養してT細胞を回復させた。
【０５３９】
フローサイトメトリー分析
インビトロの回復培地からCAR T細胞を回収し、400×gで5分間遠心分離してペレットを得た。次に、抗マウスFcγIII/II受容体（CD16/CD32）ブロック［クローン2.4G2；BDバイオサイエンス、カタログNo.553142、1：100（v/v）希釈］と抗ヒトFcブロック［BDバイオサイエンス、カタログNo.564220、1：50（v/v）希釈］を添加したフローサイトメトリー染色液［1%ウシ血清アルブミン、50mg/mLヒトIgG（Equitech Bio、カタログNo.SLH56-0001）および0.9%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水、pH=7.4］にCAR T細胞を再懸濁した。各試料に蛍光色素標識モノクローナル抗体を加え、氷上、暗所で20分間インキュベートして表面マーカーを染色した。使用した蛍光色素標識モノクローナル抗体は、抗ヒトCD45RA-APCeF780［クローンHI100、サーモフィッシャー、No.47-0458-42、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトCD45RO-eF450［クローンUCHL1、サーモフィッシャー、No.48-0457-42、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトCD8α-PECy7［クローンRPA-T8、BDバイオサイエンス、カタログNo.557746、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトCD4-Percpe710［クローンSK3、eBioscience、カタログNo.46-0047-42、1：20（v/v）希釈］、およびビオチン標識抗ヒトEGFR（セツキシマブ；R&Dシステムズ、No.FAB9577B-100、1：10（v/v）希釈、次いでPE標識抗ビオチン（BioLegend、No.53-9895-82、1：400（v/v）希釈）を使用）であった。表面マーカーの染色後、T細胞をPBSで洗浄し、3μMヨウ化プロピジウムを含む冷PBS中に再懸濁し、フローサイトメトリー用回収試験管に移した。Galliosフローサイトメーター（ベックマン・コールター、カリフォルニア州ブレア）を使用して、フローサイトメトリーデータを取得した。最低でも20,000イベントを取得し、Kaluza v1.5ソフトウェアを使用してデータを分析した。
【０５４０】
実施例３
抗FITC抗体クローンE2はヒト正常組織には結合しない
抗FITCクローンE2 CARコンストラクトと同じ可変領域断片配列を有する抗FITC IgG抗体クローンE2を使用して、抗FITC抗体クローンE2がヒト正常組織と結合するか否かを試験した。HEK293細胞において組換えヒト抗FITCクローンE2 IgG1λ1を発現させ、プロテインAアフィニティーカラムを使用して精製した。SEC-HPLCで分析したところ、抗体の純度は98%を超えていた。Mix-N-Stain DIG antibody labeling kit（Biotium）を使用して、ジゴキシゲニン（DIG）で抗体を標識した。FITC固相化ビーズに対するDIG標識抗FITC抗体クローンE2の結合親和性をFACSで測定した。様々な濃度のDIG標識抗FITC IgG抗体クローンE2をFITC固相化ビーズに加え、室温で30分間インキュベートした。ビーズを洗浄後、モノクローナル抗DIG抗体を加え、30分間インキュベートした。ビーズを洗浄し、eF660標識抗マウス二次抗体を加え、インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、FACSでeF660の蛍光シグナルを分析した。ネガティブコントロールビーズとして、PE固相化ビーズを使用した。添加したDIG標識E2 IgGの濃度に対してeF660の蛍光強度をプロットし、図９に示した。PRISMソフトウェアを使用して、FITCに対するDIG30標識抗FITC抗体クローンE2の結合親和性を算出した。図９Ｂに挿入した表に示すように、Kdは約0.66nMであり、DIG標識抗FITC抗体クローンE2は、FITCに対して高い結合親和性を有し、ヒト正常組織と抗FITC抗体クローンE2の結合の評価に使用できることが示された。
【０５４１】
免疫組織染色（IHC）アッセイを構築して、ヒト組織に対する抗FITC抗体クローンE2の結合を試験した。ポジティブコントロールとして、FITC標識KB細胞の寒天ブロックをホルマリン固定しパラフィン包埋した（FFEP）組織切片を使用し、ネガティブコントロールとして、非標識KB細胞のFFPE組織切片を使用した。組織切片を脱パラフィンし、再水和した。次に、抗原賦活バッファー（pH6.0）を組織切片に加えて91℃で24分間インキュベートすることにより抗原を賦活化した。次に、再水和した組織切片にDIG標識抗FITC抗体クローンE2を加えてインキュベートした後、抗DIG抗体による免疫組織（IHC）染色を行った。簡潔に述べると、モノクローナル抗DIG抗体を加えてインキュベートした後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス二次抗体を加えてインキュベートした。図１０Ａに示すように、FITC標識KB細胞は陽性染色を示し、このことから、FITC標識KB細胞上のFITCに抗FITC抗体クローンE2が結合することが示された。非標識KB細胞は染色を示さなかった（図１０Ｂ）。
【０５４２】
ヒトmultiple organ normal tissue microarray（FDA999、US Biomax, Inc）にDIG標識抗FITC抗体クローンE2を加えてインキュベートし、前記と同じ条件で同じIHC手順を実施して、ヒト正常組織に対する抗FITC抗体クローンE2の結合を評価した。このmultiple organ normal tissue microarrayは、28種類の正常ヒト臓器からなる99個コアを備え、具体的には、副腎（図１１）、骨髄（図１２）、乳房（図１３）、小脳組織（図１４）、子宮頸部（図１５）、結腸（図１６）、食道（図１７）、眼（図１８）、心臓（図１９）、下垂体（図２０）、腎臓（図２１）、喉頭（図２２）、肝臓（図２４）、肺（図２５）、リンパ節（図２６）、神経（図２７）、卵巣（図２８）、膵臓（図２９）、前立腺（図３０）、皮膚（図３１）、小腸（図３２）、脾臓（図２３）、胃（図３３）、横紋筋（図３４）、精巣（図３５）、胸腺（図３６）、舌（図３７）、および子宮（図３８）が含まれている。マイクロアレイパネルには、少なくとも３人の正常ヒトから採取された臓器が含まれていた。図１１〜３８に示すように、試験したこれら28種類の正常ヒト臓器のいずれにおいても、陽性のIHC染色は認められず、抗FITC抗体クローンE2が正常ヒト臓器の組織に結合しないことが示された。いくつかの形質細胞は、DIG標識抗FITC抗体クローンE2とともにプレインキュベートした試験切片およびDIG標識抗FITC抗体クローンE2とプレインキュベートしなかったネガティブコントロール切片のいずれでも、ある程度の染色強度を示し、この弱い染色は非特異的であったことが示された。
【０５４３】
結論として、抗FITC抗体クローンE2は、試験した正常ヒト臓器の組織のいずれにも結合せず、このことから、抗FITC抗体クローンE2 CAR-T細胞は、インビボにおいてヒト正常組織に対して結合も攻撃もしないと見られることが示された。
【０５４４】
実施例４
FITC-葉酸の合成
【化２１】
2021511826.tif 000034
テトラメチルグアニジンおよびジイソプロピルアミンの存在下、無水ジメチルスルホキシド（DMF）中において、葉酸−γ−エチレンジアミンをフルオレセインイソチオシアネート（FITC）異性体Ｉ（シグマ アルドリッチ）に結合させた。Xterra RP18分取HPLCカラム（Waters）に粗生成物をロードし、流速20mL/分において、5mMリン酸ナトリウム（移動相Ａ、pH7.4）99%、アセトニトリル（移動相Ｂ）1%から開始し、10分間で移動相Ａ90%、移動相Ｂ10%となるグラジエント条件で溶出した。この条件下において、FITC-葉酸のメインピークは通常27〜50分に溶出される。UV検出器を備えた分析用逆相HPLCを使用して、FITC-葉酸画分の品質をモニターした。98.0%を超える純度の画分（LCMS）を凍結乾燥し、FITC-葉酸の最終生成物を得た。当技術分野で知られているように、この構造を有する化合物はEC17とも呼ばれる。
【０５４５】
実施例５
FITC-PEG12-葉酸の合成
【化２２】
2021511826.tif 000035
Universal polyethylene glycol（PEG）Nova TagTM樹脂（0.2g）をペプチド合成容器に入れ、イソプロピルアルコール（i-PrOH）（10mL×3回）およびジメチルホルムアミド（DMF、10mL×3回）で洗浄した。20%ピペリジンDMF溶液（10mL×3回）を使用して、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基を脱保護した。Kaiser試験を実施して、反応の進行度を評価した。次に、Fmoc-L-グルタミン酸5-tert-ブチルエステル（Fmoc-Glu-(O-t-Bu)-OH）（23.5mg）のDMF溶液、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（i-Pr2NEt）（4当量）、およびベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（PyBOP）（2当量）をペプチド合成容器に導入した。20%ピペリジンDMF溶液（10mL×3回）を使用して、Fmoc基を脱保護した。次に、N10-TFA-Pte-OH（22.5mg）のDMF溶液、i-Pr2NEt（4当量）およびPyBOP（2当量）をペプチド合成容器に導入した。アルゴンを２時間バブリングし、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。ジクロロメタン（DCM）中で樹脂を膨潤させた後、1Mヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）のDCM／トリフルオロエタン（TFE）（1：1）溶液（3mL×2回）を加えた。アルゴンを１時間バブリングし、溶媒を除去し、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。DMF中で樹脂を膨潤させた後、Fmoc-NH-(PEG)12-COOH（46.3mg）のDMF溶液、i-Pr2NEt（4当量）およびPyBOP（2当量）を加えた。アルゴンを２時間バブリングし、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。20%ピペリジンDMF溶液（10mL×3回）を使用して、Fmoc基を脱保護した。Kaiser試験を実施して、反応の進行度を評価した。次に、FITC（ライフテクノロジーズ、21.4mg）のDMF溶液およびi-Pr2NEt（4当量）をペプチド合成容器に導入した後、アルゴンを２時間バブリングし、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。次に、2%NH2NH2のDMF溶液（2mL×2回）をペプチド合成容器に加えた。TFA：H2O：トリイソプロピルシラン（TIS）（95：2.5：2.5）（切断溶液）を使用して、最終化合物を樹脂から切断し、減圧下で濃縮した。濃縮物をEt2O中で沈殿させ、減圧下で乾燥した。分取RP-HPLCで粗生成物を精製した（移動相：A=10mM酢酸アンモニウム（pH=7）、B=アセトニトリル；方法：流速13mL/分でB0%から30分間でB30%）。純粋な画分をプールし、凍結乾燥して、FITC-PEG12-葉酸を得た。
【０５４６】
実施例６
FITC-PEG20-葉酸の合成
【化２３】
2021511826.tif 000036
エチレンジアミンおよびポリマー結合樹脂（200〜400メッシュ）（50mg）をペプチド合成容器に入れ、DCM（3mL）中で樹脂を膨潤させ、次いでDMF（3mL）中で樹脂を膨潤させた。次に、Fmoc-PEG20-COOH（131mg、1.0当量）のDMF溶液、i-Pr2NEt（6.0当量）およびPyBOP（4.0当量）をペプチド合成容器に導入した。アルゴンを６時間バブリングし、カップリング溶液を排出し、DMF（10mL×3回）およびi-PrOH（10mL×3回）で樹脂を洗浄した。Kaiser試験を実施して、反応の進行度を評価した。各アミノ酸カップリング工程を行う前に、20%ピペリジンDMF溶液（10mL×3回）を使用してFmoc基を脱保護した。前記手順を繰り返して、Fmoc-Glu-OtBu（72mg、2.0当量）とのカップリング工程、およびトリフルオロアセチルプテロイン酸（41mg、1.2当量）とのカップリング工程を実施し、反応を完了させた。2%ヒドラジンDMF溶液（10mL×3回）で樹脂を洗浄して（5分間）、プテロイン酸上のトリフルオロアセチル保護基を切断し、i-PrOH（10mL×3回）で洗浄し、次いでDMF（10mL×3回）で洗浄した。樹脂をアルゴン下で30分間乾燥させた。前記切断溶液を使用して、得られた葉酸−ペプチドを樹脂から切断した。切断混合物10mLを樹脂に導入し、アルゴンを1.5時間バブリングした。切断混合物を清潔なフラスコに排出した。さらに多くの量の切断混合物で樹脂を3回洗浄した。切断混合物を合わせて減圧下で濃縮して体積を減らし（約5mL）、エチルエーテル中で沈殿させた。
【０５４７】
沈殿物を遠心分離で回収し、エチルエーテル（3回）で洗浄し、高減圧下で乾燥した。乾燥した葉酸-PEG20-EDA（1.0当量）を、FITC（50mg、1.5当量）のDMSO溶液とN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）で室温にて処理した。LCMSにより反応の進行度をモニターした。８時間後、出発物質が消費され、生成物が得られた。分取HPLCで粗反応混合物を精製し（移動相Ａ=10mM酢酸アンモニウム、pH=7；有機相B=アセトニトリル；方法：流速13mL/分でB0%から35分間でB30%）、60%の収率でFITC-PEG20-葉酸を得た。
【０５４８】
実施例７
FITC-PEG108-葉酸の合成
【化２４】
2021511826.tif 000037
エチレンジアミンおよびポリマー結合樹脂（200〜400メッシュ）（50mg）をペプチド合成容器に入れ、DCM（3mL）中で樹脂を膨潤させ、次いでDMF（3mL）中で樹脂を膨潤させた。次に、Fmoc-PEG36-COOH（161mg、1.0当量）のDMF溶液、i-Pr2NEt（6.0当量）およびPyBOP（4.0当量）をペプチド合成容器に導入した。アルゴンを６時間バブリングし、カップリング溶液を排出し、DMF（10mL×3回）およびi-PrOH（10mL×3回）で樹脂を洗浄した。Kaiser試験を実施して、反応の進行度を評価した。各アミノ酸カップリング工程を行う前に、20%ピペリジンDMF溶液（10mL×3回）を使用してFmoc基を脱保護した。前記手順を繰り返して、2×Fmoc-PEG36-COOH（161mg、1.0当量）とのカップリング工程、Fmoc-Glu-OtBu（72mg、2.0当量）とのカップリング工程、およびトリフルオロアセチルプテロイン酸（41.0mg、1.2当量）とのカップリング工程を実施し、反応を完了させた。反応終了後、2%ヒドラジンDMF溶液（10mL×3回）で樹脂を洗浄して（5分間）、プテロイン酸上のトリフルオロアセチル保護基を切断し、i-PrOH（10mL×3回）で洗浄し、次いでDMF（10mL×3回）で洗浄した。樹脂をアルゴン下で30分間乾燥させた。前記切断溶液を使用して、得られた葉酸−ペプチドを樹脂から切断した。切断混合物10mLを樹脂に導入し、アルゴンを1.5時間バブリングした。切断混合物を清潔なフラスコに排出した。さらに多くの量の切断溶液で樹脂を3回洗浄した。切断混合物を合わせて減圧下で濃縮して体積を減らし（約5mL）、エチルエーテル中で沈殿させた。
【０５４９】
沈殿物を遠心分離で回収し、エチルエーテル（3回）で洗浄し、高減圧下で乾燥した。乾燥した葉酸-PEG108-EDA（1.0当量）を、FITC（50mg、1.5当量）のDMSO溶液とN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）で室温にて処理した。LCMSにより反応の進行度をモニターした。10時間後、出発物質が消費され、生成物が得られた。分取HPLCで粗反応混合物を精製し（移動相Ａ=10mM酢酸アンモニウム、pH=7；有機相Ｂ=アセトニトリル；方法：流速13mL/分でB0%から35分間でB30%）、64%の収率でFITC-PEG108-葉酸を得た。
【０５５０】
実施例８
FITC-DUPAの合成
【化２５】
2021511826.tif 000038
固相法によってDUPA-FITCを以下のように合成した。Universal Nova TagTM樹脂（50mg、0.53mM）をDCM（3mL）中で膨潤させ、次いでDMF（3mL）中で膨潤させた。20%ピペリジンDMF溶液（3mL×3回）を樹脂に加え、アルゴンを5分間バブリングした。DMF（3mL×3回）およびイソプロピルアルコール（i-PrOH、3mL×3回）で樹脂を洗浄した。DMF中で樹脂を膨潤させた後、DUPA-(OtBu)-OH（1.5当量）とHATU（2.5当量）とi-Pr2NEt（4.0当量）を含むDMF溶液を加えた。アルゴンを２時間バブリングし、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。DCM中で樹脂を膨潤させた後、1Mヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）のDCM／TFE（1：1）溶液（3mL×2回）を加えた。アルゴンを１時間バブリングし、溶媒を除去し、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。DMF中で樹脂を膨潤させた後、Fmoc-Phe-OH（2.5当量）とHATU（2.5当量）とDIPEA（4.0当量）を含むDMF溶液を加えた。アルゴンを２時間バブリングし、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。この一連の手順を繰り返して、カップリング工程をさらに2回実施し、8-アミノオクタン酸と、フルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンBイソチオシアネートを付加した。前記切断溶液を使用して、最終化合物を樹脂から切断し、減圧下で濃縮した。濃縮物をジエチルエーテル中で沈殿させ、減圧下で乾燥した。分取RP-HPLCで粗生成物を精製した［λ=488nm；溶媒グラジエント：B1%から25分間でB80%、B80%を30分間送液して洗浄；A=10mM NH4OAc、pH=7；B=アセトニトリル（ACN）］。減圧下でACNを除去し、精製画分を凍結乾燥して、赤褐色固体としてFITC-DUPAを得た。RP-HPLC：tR=8.0分（A=10mM NH4OAc、pH=7.0；B=ACN、溶媒グラジエント：B1%から10分間でB50%、B80%を15分間送液して洗浄）。1H NMR (DMSO-d6/D2O): δ 0.98-1.27 (ms, 9H); 1.45 (b, 3H); 1.68-1.85 (ms, 11H); 1H NMR (DMSO-d6/D2O): δ 0.98-1.27 (ms, 9H); 1.45 (b, 3H); 1.68-1.85 (ms, 11H); 2.03 (m, 8H); 2.6-3.44 (ms, 12H); 3.82 (b, 2H); 4.35 (m, 1H); 6.53 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.61 (dd, J = 5.3, 3.5 Hz, 2H); 6.64 (s, 2H); 7.05 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.19 (m, 5H); 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 8.38 (s, 1H). HRMS (ESI) (m/z): (M + H)+ calcd for C51H59N7O15S, 1040.3712, found, 1040.3702. UV/vis: λ max = 491 nm.
【０５５１】
実施例９
FITC-PEG12-DUPAの合成
【化２６】
2021511826.tif 000039
1,2-ジアミノエタントリチル樹脂（0.025g）をペプチド合成容器に入れ、イソプロピルアルコール（i-PrOH）（10mL×3回）およびジメチルホルムアミド（DMF、10mL×3回）で洗浄した。次に、Fmoc-NH-(PEG)12-COOH（42.8mg）のDMF溶液、i-Pr2NEt（2.5当量）およびPyBOP（2.5当量）をペプチド合成容器に導入した。得られた溶液にアルゴンを１時間バブリングし、カップリング溶液を排出し、DMF（10mL×3回）およびi-PrOH（10mL×3回）で樹脂を洗浄した。Kaiser試験を実施して、反応の進行度を評価した。20%ピペリジンDMF溶液（10mL×3回）を使用して、Fmoc基を脱保護した。この手順を繰り返して、すべてのカップリング工程を完了させた（2×1.5当量のFmoc-Phe-OHを使用したカップリング工程、1.5当量の8-アミノオクタン酸を使用したカップリング工程、および1.2当量のDUPAを使用したカップリング工程を実施した）。DUPAのカップリング後、DMF（10mL×3回）およびi-PrOH（10mL×3回）で樹脂を洗浄し、減圧下で乾燥した。前記切断溶液を使用して、ペプチド合成容器内でペプチドを樹脂から切断した。切断溶液15mLをペプチド合成容器に加え、反応液にアルゴンを15分間バブリングした。切断溶液10mLで樹脂を5分間処理する工程をさらに2回行った。切断混合物を濃縮して約5mLとし、エチルエーテル中で沈殿させた。沈殿物を遠心分離で回収し、エチルエーテル（3回）で洗浄し、高減圧下で乾燥して、粗生成物を回収した。粗生成物であるDUPA-(PEG)12-EDA（10mg）とFITC（5.6mg）を含むジメチルスルホキシド（DMSO、1mL）溶液を攪拌しながら、i-Pr2NEt（5当量）を室温で加え、アルゴン下で６時間攪拌した。LCMSにより反応をモニターし、分取HPLCで精製した（移動相：A=10mM酢酸アンモニウム（pH=7）、B=アセトニトリル（ACN）；方法：流速13mL/分でB0%から30分間でB50%）。精製画分をプールし、凍結乾燥して、FITC-PEG12-DUPAを得た。
【０５５２】
実施例１０
FITC-PEG11-NK1の合成
【化２７】
2021511826.tif 000040
NK-1（0.02g、0.0433mmol、1.0当量）とO-(2-アミノエチル)-O’-[2-(Boc-アミノ)エチル]デカエチレングリコール（BocNH-PEG11-NH2）（シグマ、0.0336g、0.0521mmol、1.2当量）とベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（PyBOP）（0.027g、0.0521mmol、1.2当量）を含む無水CHCl2溶液を攪拌しながら、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（0.076mL、0.4338mmol、10当量）をアルゴン下、室温で加えた。LCMSにより反応の進行度をモニターし、分取RP-HPLCで精製した（Waters、XBridgeTM Prep C18、5μm；カラム：19×100mm、移動相Ａ=20mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH7）、移動相Ｂ=アセトニトリル、グラジエント：B10％から30分間でB100%、流速=13mL/分、λ=220nm、254nm）。純粋な画分を回収し、有機溶媒をすべて留去し、試料を48時間凍結乾燥して、NK1-PEG11-NHBocを得た。収率は40.13mg（97%）であった。NK1-PEG11-NHBoc（0.0165g、0.015mmol）の無水DCM溶液にトリフルオロ酢酸（TFA、20当量）を加え、反応混合物を室温で４時間攪拌した。過剰なTFAを除去し、残った溶液を水で希釈し、CH2Cl2（5mL×3回）で抽出した。有機層を合わせ、生理食塩水で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、濃縮した。得られた残渣を減圧下で乾燥し、それ以上精製することなく次の工程に使用した。NK1-PEG11-NH2（0.008g、0.0081mmol、1.0当量）およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）（シグマ、0.0037g、0.0097mmol、1.2当量）を含む無水ジメチルスルホキシド（DMSO、0.3mL）溶液を攪拌しながら、ジイソプロピルエチルアミン（0.0028mL、0.0162mmol、2.0当量）をアルゴン下、室温で加えた。LCMSにより反応の進行度をモニターし、生成物を分取RP-HPLCで精製した（Waters、XBridgeTM Prep C18、5μm；カラム：19×100mm、移動相Ａ=20mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH7）、移動相Ｂ=アセトニトリル、グラジエント：B10%から30分間でB100%、流速=13mL/分、λ=280nm）。純粋な画分を回収し、有機溶媒をすべて留去し、試料を48時間凍結乾燥して、8.54mg（77%）の収率でFITC-PEG11-NK1を得た。
【０５５３】
*注：NK-1化合物は、過去の文献に記載の手順により作製したベースとなるリガンドを出発物質として、２段階の手順で合成した（参考文献：DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES、出願番号：PCT/US2015/44229；この文献は参照により本明細書に援用される）。
【０５５４】
実施例１１
FITC-PEG2-CA9の合成
【化２８】
2021511826.tif 000041
50mLの丸底フラスコ中において、テフロン製のマグネチックスターラーバーを使用し、CA9リガンド（53.6mg）をDMF（2〜3mL）中に溶解した。減圧を使用して、空気を除去して窒素ガスと置換し、これを３サイクル行った。丸底フラスコを一定の窒素ガス圧下で維持した。N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）28.9mgをフラスコに加えた後、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（HOBt）21.6mgとBoc-PEG2-NH2（シグマ アルドリッチ）18.9μLを加えた。次に、トリエチルアミン（TEA）5.4μLを加えて、反応混合物を一晩攪拌した。反応混合物をHPLCで精製し、UHPLC-MSで確認した（ターゲット：m/z＝831）。ロータリーエバポレーターを使用した高減圧下でアセトニトリルを除去し、生成物を凍結乾燥した。得られた化合物にTFAとDCMの1：1混合溶媒を加え、30分間混合した。ロータリーエバポレーターを使用した高減圧下でTFA/DCMを除去し、さらに高減圧下で30分間処理した。次に、得られた化合物をDMF中に溶解し、5モル当量のi-Pr2Netとフルオレセインイソチオシアネート（ライフテクノロジーズ）16mgを加えて、１時間攪拌した。反応混合物をHPLCで精製し、UHPLC-MSで目的化合物を確認した（ターゲット：m/z=1120）。得られた試料を凍結乾燥し、-20℃で保存した。
【０５５５】
実施例１２
FITC-DUPA
固相法によってDUPA-FITCを以下のように合成した。Universal Nova Tag樹脂（50mg、0.53mM）をジクロロメタン（DCM）（3mL）中で膨潤させ、次いでジメチルホルムアミド（DMF、3mL）中で膨潤させた。20%ピペリジンDMF溶液（3mL×3回）を樹脂に加え、アルゴンを5分間バブリングした。DMF（3mL×3回）およびイソプロピルアルコール（i-PrOH、3mL×3回）で樹脂を洗浄した。DMF中で樹脂を膨潤させた後、DUPA-(OtBu)-OH（1.5当量）とHATU（2.5当量）とDIPEA（4.0当量）を含むDMF溶液を加えた。アルゴンを２時間バブリングし、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。DCM中で樹脂を膨潤させた後、1Mヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）のDCM／トリフルオロエタン（TFE）（1：1）溶液（3mL×2回）を加えた。アルゴンを１時間バブリングし、溶媒を除去し、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。DMF中で樹脂を膨潤させた後、Fmoc-Phe-OH（2.5当量）とHATU（2.5当量）とDIPEA（4.0当量）を含むDMF溶液を加えた。アルゴンを２時間バブリングし、DMF（3mL×3回）およびi-PrOH（3mL×3回）で樹脂を洗浄した。この一連の手順を繰り返して、カップリング工程をさらに2回実施し、8-アミノオクタン酸と、フルオレセインイソチオシアネートまたはローダミンBイソチオシアネートを付加した。トリフルオロ酢酸（TFA）：H2O：トリイソプロピルシランカクテル（95：2.5：2.5）を使用して、最終化合物を樹脂から切断し、減圧下で濃縮した。濃縮物をジエチルエーテル中で沈殿させ、減圧下で乾燥した。分取RP-HPLCで粗生成物を精製した［λ=488nm；溶媒グラジエント：B1%から25分間でB80%、B80%を30分間送液して洗浄；A=10mM NH4OAc、pH=7；B=アセトニトリル（ACN）］。減圧下でACNを除去し、純粋な画分を凍結乾燥して、赤褐色固体としてDUPA-FITCを得た。RP-HPLC：tR=8.0分（A=10mM NH4OAc、pH=7.0；B=ACN、溶媒グラジエント：B1%から10分間でB50%、B80%を15分間送液して洗浄）。1H NMR (DMSO-d6/D2O): δ 0.98-1.27 (ms, 9H); 1.45 (b, 3H); 1.68-1.85 (ms, 11H); 2.03 (m, 8H); 2.6-3.44 (ms, 12H); 3.82 (b, 2H); 4.35 (m, 1H); 6.53 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.61 (dd, J = 5.3, 3.5 Hz, 2H); 6.64 (s, 2H); 7.05 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.19 (m, 5H); 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 8.38 (s, 1H). HRMS (ESI) (m/z): (M + H)+ calcd for C51H59N7O15S, 1040.3712, found, 1040.3702. UV/vis: λ max = 491 nm.
【化２９】
2021511826.tif 000042
【０５５６】
実施例１３
FITC-CA9
50mLの丸底フラスコにおいて、テフロン製のマグネチックスターラーバーを使用し、CA9リガンド（53.6mg、研究室で合成したもの）を、所望量のN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）（2〜3mL）中に溶解した。減圧を使用して、空気を除去して窒素ガスと置換し、これを３サイクル行った。その後、丸底フラスコを一定の窒素ガス圧下で維持した。N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）28.9mgをフラスコに加えた後、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（HOBt）21.6mgとBoc-PEG2-NH2（シグマ アルドリッチから購入）18.9μLを加えた。最後にトリエチルアミン（TEA）5.4μLを加えて、反応混合物を一晩攪拌した。反応混合物をHPLCで精製し、UHPLC-MSで確認した（ターゲット：m/z=831）。ロータリーエバポレーターを使用した高減圧下でアセトニトリルを除去し、凍結乾燥機に48時間かけた。TFAとDCMの1：1混合溶媒を使用して30分間処理することによりBocを脱保護した。ロータリーエバポレーターを使用した高減圧下でTFA/DCMを除去し、さらに高減圧下で30分間処理した。次に、得られた化合物をDMF中に溶解し、5モル当量のN,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を加えた。得られた溶液に、フルオレセインイソチオシアネート（ライフテクノロジーズから購入）16mgを加え、１時間攪拌した。反応混合物をHPLCで精製し、UHPLC-MSで目的化合物を確認した（ターゲット：m/z=1120）。得られた試料を凍結乾燥機に48時間かけ、-20℃で保存した。
【化３０】
2021511826.tif 000043
【０５５７】
実施例１４
FITC-NK1R
NK-1（0.02g、0.0433mmol、1.0当量）とO-(2-アミノエチル)-O’-[2-(Boc-アミノ)エチル]デカエチレングリコール（BocNH-PEG11-NH2）（シグマ、0.0336g、0.0521mmol、1.2当量）とベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（PyBOP）（0.027g、0.0521mmol、1.2当量）を含む無水CH2Cl2溶液を攪拌しながら、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（0.076mL、0.4338mmol、10当量）をアルゴン下、室温で加えた。LCMSにより反応の進行度をモニターし、分取RP-HPLCで精製した（Waters、XBridgeTM Prep C18、5μm；カラム：19×100mm、移動相Ａ=20mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH7）、移動相Ｂ=アセトニトリル、グラジエント：B10%から30分間でB100%、流速=13mL/分、λ=220nm、254nm）。純粋な画分を回収し、有機溶媒をすべて留去し、試料を48時間凍結乾燥して、NK1-PEG11-NHBocを得た。収率は40.13mg（97%）であった。NK1-PEG11-NHBoc（0.0165g、0.015mmol）の無水CH2Cl2溶液にトリフルオロ酢酸（TFA、20当量）を加え、反応混合物を室温で4時間攪拌した。過剰なTFAを除去し、水で希釈し、CH2Cl2（5mL×3回）で抽出した。有機層を合わせ、生理食塩水で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、濃縮した。得られた残渣を減圧下で乾燥し、それ以上精製することなく次の工程に使用した。NK1-PEG11-NH2（0.008g、0.0081mmol、1.0当量）およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）（シグマ、0.0037g、0.0097mmol、1.2当量）を含む無水ジメチルスルホキシド（DMSO、0.3mL）溶液を攪拌しながら、ジイソプロピルエチルアミン（0.0028mL、0.0162mmol、2.0当量）をアルゴン下、室温で加えた。LCMSにより反応の進行度をモニターし、分取RP-HPLCで精製した（Waters、XBridgeTM Prep C18、5μm；カラム：19×100mm、移動相Ａ=20mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH7）、移動相Ｂ=アセトニトリル、グラジエント：B10%から30分間でB100%、流速=13mL/分、λ=280nm）。純粋な画分を回収し、有機溶媒をすべて留去し、試料を48時間凍結乾燥して、NK1-PEG11-FITC（5）を得た。収率は8.54mg（77%）であった。
【０５５８】
NK-1化合物は、過去の文献に記載の手順により作製したベースとなるリガンドを出発物質として、２段階の手順で合成した。（参考文献：DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEUROKININ-1 RECEPTOR-BINDING AGENT DELIVERY CONJUGATES、出願番号：PCT/US2015/44229；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。）
【０５５９】
実施例１５
インビトロ共培養によるE2 CAR T細胞の活性化およびその標的
細胞殺傷アッセイ
E2 CAR T細胞を解凍し、T細胞増殖培地（TexMACS培地＋2%ヒトAB型血清＋50U/mL組換えヒトIL-2）1mlあたり50万個〜200万個の細胞密度で４日間培養することによって、凍結保存から回復させた。また、様々な発現量で葉酸受容体を細胞表面に発現する標的細胞を解凍し、増殖培地で培養することによって（葉酸非含有RPMI1640＋10%FCS＋ペニシリン／ストレプトマイシン中で４日間）、凍結保存から回復させた。
【０５６０】
−１日目に、12ウェル組織培養プレートの各ウェルに増殖培地2mlを加え、１ウェルあたり100,000個の標的細胞を播種して接着培養し、凍結保存から回復させた。０日目に、組織培養インキュベーター内において、EC17架橋剤分子を添加した各ウェルに、100nMのEC17を加えて30分間インキュベートした。その後、培地をすべて洗い流し、葉酸もEC17も含んでいない新鮮な増殖培地に置換した。EC17の存在下でのインキュベーション中に、T細胞を回収し、計数した。EC17による処理の終了後、全量3mlの増殖培地を含む各ウェルの標的細胞に対して、1：1（E：T）の比率となるように100,000個のE2 CAR T細胞を直接添加し、湿潤下、5%CO2、37℃の標準的な組織培養条件で１日または２日間インキュベートした。１日の共培養条件は、標的細胞によるE2 CAR T細胞の活性化を分析するために使用し、２日間のインキュベーション条件は、標的細胞の死滅を分析するために使用した。
【０５６１】
様々な発現量で葉酸受容体を細胞表面に発現する標的細胞と１日共培養した後のE2 CAR T細胞の活性レベルを測定するため、浮遊細胞を回収し、0.25%トリプシンで5分間消化して組織培養プレートから剥がした接着細胞とプールした。プールした浮遊細胞と接着細胞を、400×ｇで5分間遠心分離してペレットとし、フローサイトメトリー染色液中に再懸濁した。フローサイトメトリーによるE2 T細胞の同定のための表面マーカー染色として、抗ヒトEGFRおよび抗ヒトCD3を使用し、フローサイトメトリーによるCAR T細胞の活性化の検出では、抗ヒトCD137染色を使用した。E2 CAR T細胞は、EGFR+CD3+細胞として同定され、活性化されたCAR T細胞はCD137をさらに共発現していた（フローサイトメトリー法の節を参照されたい）。
【０５６２】
２日間の共培養した後の、様々な発現量で葉酸受容体を細胞表面に発現する標的細胞に対するE2 CAR T細胞の殺傷効率を測定するため、前述の１日共培養アッセイと同様にして、プールした浮遊細胞と接着細胞をペレットとし、E2 CAR T細胞マーカーとしてのEGFRとCD3を染色した。次に、これらのフローサイトメトリー抗体で染色した細胞を洗浄した後、Alexa Fluor 647標識組換えアネキシンV（インビトロジェン、カタログNo.A23204、メーカーにより提供された１×アネキシン染色バッファーで1：50に希釈）および3μMヨウ化プロピジウムを含む染色バッファー中に再懸濁して、アポトーシスマーカーとしてアネキシンVで染色した。
【０５６３】
E2 CAR T細胞の活性化は標的細胞のEC17染色に依存する
E2 CAR T細胞の活性化に必要な葉酸受容体の発現量を解明するため、様々な発現量で葉酸受容体（FR）を細胞表面に発現する標的細胞を使用した１日共培養を実施した（図３９）。１日共培養後に活性化されたE2 CAR T細胞のパーセンテージをｙ軸に示し、アッセイ時の標的細胞における葉酸受容体の発現量をｘ軸に示す。葉酸受容体の発現量データは、EC17で処理したものと同じ種類の標的細胞を使用することにより、アッセイを実施した当日に得られたが、重要な点として、この際、葉酸受容体を高発現する細胞がCAR T細胞により選別されることによるアーチファクトを回避するため、CAR T細胞の非存在下で標的細胞の培養を行った。様々な発現量で葉酸受容体を発現する５種の標的細胞株のうち、４種がCAR T細胞を同程度に活性化した。興味深いことに、葉酸受容体を低発現する細胞株であるOV90（逆三角形の印）は、葉酸受容体の発現量がSKOV3細胞（菱形の印）の約50%であり、CAR T細胞の活性化の程度もSKOV3細胞の約50%である。また、実験データから、EC17の濃度を広範囲に変えても、E2 CAR T細胞の活性化は同程度となることが示されたことから、E2 CAR T細胞の完全な活性化に必要な、標的細胞へのEC17の結合には一定の閾値があることが示唆された。さらに、至適以下のE2 CAR T細胞反応を誘導する葉酸受容体の発現にも閾値が存在することが示唆された。
【０５６４】
E2 CAR T細胞による標的細胞の殺傷
E2 CAR T細胞の活性化によって標的細胞を殺傷できるか否かを確認するため、２日間の共培養アッセイを行った。次に、フローサイトメトリーを実施して標的細胞（EGFR-CD3-）のイベントを分析し、アポトーシスの表面マーカーであるアネキシンV染色で染色される標的細胞のパーセンテージを測定した。図４０に、前記と同じ５種の標的細胞（ｘ軸に凡例を示す）を３種の異なる条件でそれぞれ２日間培養した結果を３種の棒グラフで示す。各群の第１の棒グラフは、標的細胞のアポトーシスの基底レベルを示し、標的細胞をEC17で処理し、E2 CAR T細胞の非存在下で培養した。各群の第２の棒グラフは、事前にEC17で処理していない標的細胞とCAR T細胞の共培養を示す。各群の第３の棒グラフは、事前にEC17で処理した標的細胞とCAR T細胞の共培養を示す。ｙ軸は、アポトーシスを起こした（アネキシンV+）標的細胞のパーセンテージを示す。これらのデータから、CAR T細胞の活性化によって、葉酸受容体の発現量が最も高い３種の標的細胞（MDA-MB231、HOS-FRαおよびIGROV1）が良好に殺傷されることが見出された。一方、葉酸受容体の発現量が上から４番目のSKOV3細胞（図３９、ｘ軸）では、同様にE2 CAR T細胞を活性化させても、同程度の標的細胞の殺傷には至らなかった（図４０）。SKOV3細胞で観察された、CAR T細胞の活性化と標的細胞のアポトーシスの間のこの不一致は、葉酸受容体の発現量が低いこととは無関係である可能性がある。過去に報告されているように、各がん細胞は、独自の抗アポトーシス機構を発展させている場合があり、別の種類のがん細胞株では、SKOV3細胞と同等の葉酸受容体の発現量であっても、標的細胞における高頻度なアポトーシスの誘導に十分である可能性がある。
【０５６５】
以上のことから、図３９および図４０に示したデータでは、がん細胞を殺傷するには、がん細胞へのEC17の結合が必要であることが示されている。また、これらデータから、標的細胞に結合したEC17が一定の閾値未満の場合、標的細胞の表面に結合したEC17と、E2 CAR T細胞の活性化およびそれによる殺傷との間には直線関係が存在することも示唆される。
【０５６６】
実施例１６
3H-葉酸結合アッセイ
10%熱不活化ウシ胎児血清を含む葉酸非含有RPMI培地中に、各腫瘍細胞株を播種し、一晩培養した。翌日、冷却した10μM葉酸の存在下または非存在下において、細胞に100nM 3H-葉酸を加えて氷上で15分間インキュベートした。冷1×PBSで細胞を３回リンスした後、細胞全体を溶解し、シンチレーションカウンターを使用して、細胞内に取り込まれた総放射能量を計測した。葉酸と競合させた試料のカウント数を差し引くことによって、葉酸受容体に特異的に結合した3H-葉酸を測定し、3H-葉酸の比放射能から、細胞１個あたりの葉酸分子の数として算出した。
【０５６７】
図４１は、前記細胞株における葉酸受容体の発現量が異なることを示す。葉酸受容体の発現量は、IGROV1＞MDA-MB-231、HOS-FRα＞OV90、SKOV3の順である。
【０５６８】
実施例１７
MDA-MB-231腫瘍を皮下移植したNSGマウスおよびMDA-MB-231腫瘍を移植しなかったNSGマウスにおけるEC17/E2-CAR T細胞療法
腫瘍移植
5〜10%FBSを添加した葉酸非含有RPMI1640培地において、湿潤雰囲気下、5%CO2、37℃でMDA-MB-231腫瘍細胞を増殖させた。マウス１匹あたり2.5×106個のMDA-MB-231腫瘍細胞を皮下接種した。66匹のマウスのうち、42匹にのみ腫瘍細胞を皮下接種し、残りの22匹のマウスには腫瘍を接種しなかった。
【０５６９】
CAR-T細胞の投与
EGFRtでソートした抗FITC E2 scFv-CAR T細胞を、T細胞凍結保存培地中で凍結した。凍結したCAR-T細胞のバイアルを直ちに-80℃で保存した。CAR-T細胞を37℃で速やかに解凍し、PBSで２回洗浄し、マウス１匹あたり1000万個の生きたEGFRt+E2 CAR-T細胞（CD4：CD8＝約1：1）を注射した。CAR-T細胞の注入を行った当日に、CAR-T細胞を少量採取して、フローサイトメトリーによりE2-CAR T細胞の表現型を分析した。
【０５７０】
ヒト／マウスサイトカインの分析
マウス血液試料から血漿を分離し、使用まで-20℃で保存した。ヒトTH1サイトカインパネル（Biolegend、カタログNo.740009）およびヒト造血幹細胞サイトカインパネル（Biolegend、カタログNo.740610）を使用して、マウス血液中のヒトサイトカインを検出した。また、マウス炎症性サイトカインパネル（13-plex）（Biolengend、No.740150）を使用して、マウスサイトカインを検出した。分析はすべてメーカーの説明書に従って実施した。
【０５７１】
フローサイトメトリー分析
全血中細胞分析：
EDTAで処理した所定量の全血から血漿を分離し、赤血球溶解液で赤血球を溶解した。次に、白血球ペレットをフローサイトメトリー染色液（リン酸緩衝生理食塩水中、1%ウシ血清アルブミン、50mg/mLヒトIgG（Equitech Bio、カタログNo.SLH56-0001）、0.9%アジ化ナトリウム、pH=7.4）中に再懸濁し、抗体を使用して白血球表面マーカー染色を行った。使用した抗体は、抗ヒトCD45［クローンHI30、eBioscience、カタログNo.47-0459-42、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトCD137［クローン4B4-1、BDバイオサイエンス、カタログNo.564092、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトCD8α［クローンRPA-T8、BDバイオサイエンス、カタログNo.557746、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトCD4［クローンSK3、eBioscience、カタログNo.46-0047-42、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトEGFR［R&Dシステムズ、クローンHu1、カタログNo.FAB9577B、1：10（v/v）希釈］、抗ヒトPD1［BDバイオサイエンス、クローンEH12.1、カタログNo.562511、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトLAG3［BDバイオサイエンス、クローンT47-530、カタログNo.565616、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトTIM3［BDバイオサイエンス、クローン7D3、カタログNo.565558、1：20（v/v）希釈］、抗ヒトCD3ε［BDバイオサイエンス、クローンSK7、カタログNo.557832、1：20（v/v）希釈］であった。白血球染色後、PBSで細胞を洗浄し、53,000個のCountBrightTMビーズ（インビトロジェン、カタログNo.C36950）を含む冷PBS中に再懸濁し、フローサイトメトリー用回収試験管に移した。Galliosフローサイトメーター（ベックマン・コールター、カリフォルニア州ブレア）を使用して、フローサイトメトリーデータを取得した。各血液試料中のCAR T細胞の濃度は、インビトロジェン社による説明書に従って算出した。CAR T細胞は、ヒトCD3ε+EGFRt+イベントとして同定し、KaluzaTMフローサイトメトリーソフトウェアを使用することにより容易に識別し、計数することができた。次に、注入を行った各マウスの循環CAR T細胞の数を、分析に使用した全血100μLあたりのCAR T細胞の総数としてグラフに示した。p<0.05を有意性ありとした対応のない両側スチューデントのｔ検定を使用して、統計学的有意差を求めた。
【０５７２】
腫瘍および組織の分析：
固形腫瘍（100〜1000mm3）を採取し、重量を測定し、細片に切断して腫瘍消化カクテル20mLを入れた50mLの試験管に移した。酵素含有腫瘍消化カクテルは、抗生物質を添加した葉酸非含有無血清RPMI1640培地中に、0.5mg/mLコラゲナーゼIV（シグマ アルドリッチ、カタログNo.C5138）、0.5mg/mLヒアルロニダーゼ（シグマ アルドリッチ、カタログNo.H3506）、および0.1mg/mL DNase I（シグマ アルドリッチ、カタログNo.DN25）を含んでいた。腫瘍の細片を、水平シェーカー上において300rpm、37℃で１時間振盪することによって消化した。その後、消化した腫瘍を400×gで5分間遠心分離し、腫瘍細胞のペレット中の赤血球を溶解し、冷却したリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で洗浄し、40μmのナイロン製セルストレーナーに通して濾過した。
【０５７３】
インビボにおけるE2-CAR-T細胞の表現型および増殖
臨床試験において、血液中におけるCAR T細胞の増殖および持続性は、CD19特異的CAR T療法の奏効と相関することが報告されている。本発明のインビボモデルにおいて、血液中を循環するE2 CAR T細胞プールが大きいほど、EC17によって指向される葉酸受容体陽性腫瘍に対する攻撃の奏効がより高くなると推定することは何ら不合理ではない。EC17に対するE2 CAR T細胞療法の反応を測定するため、全血100μLあたりの循環E2 CAR T細胞の数を定量したところ、EC17を投与して刺激したコホート（コホート２、コホート３、コホート４およびコホート５）では、EC17を投与しなかったコホート（コホート１およびコホート６）と比べて、循環E2 CAR T細胞数が少なくとも10倍を超えて増加していたことが観察された。血液中を循環するCAR T細胞の増殖が、抗原依存的なCAR T細胞の増殖と一致することは重要である。さらに、増加した循環CAR T細胞数が、CAR T細胞の注入後54日間もの長期間にわたって維持されたことも観察され、EC17を投与しなかったコホート１およびコホート６と比べたところ、CAR T細胞の持続性も、EC17に依存することが確認された（コホート２、コホート３、コホート４およびコホート５）。
【０５７４】
腫瘍を持つマウスと腫瘍を持たないマウスの比較
図４２に示すように、腫瘍を持たないナイーブNSGマウスまたはMDA-MB-231腫瘍を持つNSGマウスに、1000万個のE2 CAR-T細胞を静脈内注射した。CAR-T細胞の注射後２日目および10日目に500nmol/kgのEC17を静脈内投与し、２回目のEC17の投与（11日目）の20時間後にマウスを安楽死させ、臓器の評価および血液分析を行った。血漿試料を血液から直ちに分離し、サイトカインの分析まで-20℃で保存した。CAR-T細胞注射後12日目に、別個のマウス群から細胞を採取し、前記と同様にしてFACS分析を行った。
【０５７５】
図４３に示すように、腫瘍を有するマウスにおけるサイトカインの産生はEC17に依存していた。EC17を投与しなかった腫瘍担持マウスと比べて、EC17を投与した腫瘍担持マウスにおけるサイトカイン濃度（IL-2、IFN-γ、IL-10を含む）はいずれも増加していた。腫瘍を持たないナイーブマウスでも、EC17を投与した群において、サイトカイン産生のアップレギュレーションが観察されたが、腫瘍を持たないマウスにおけるサイトカイン濃度の上昇は、MDA-MB-231腫瘍を持つマウスと比べて非常に低かった（たとえば、IFN-γでは23分の１であった）。
【０５７６】
腫瘍を有するマウスにおけるIFN-γの産生は、腫瘍を持たないマウスの約23倍であった。腫瘍を持たないマウス（葉酸欠乏（FD）飼料で約２ヶ月間飼育）は、500nmol/kg EC17の週１回の投与を２回行った後に、ある程度のサイトカインの産生が示されたが、FACSで検出可能なCAR-T細胞の増殖は認められなかった。
【０５７７】
実施例１８
ヒト化抗FITC scFv E2-CARコンストラクトとCAR修飾T細胞を使用することによりインビトロで示された標的特異的活性
細胞株：
別途の記載がない限り、細胞株はいずれも、2mM L-グルタミン（Cellgro）、25mM HEPES（Irvine Scientific）および10%加熱不活性化FBS（Hyclone）を添加したRPMI1640培地（Irvine Scientific）中で維持した。K562標的細胞株は、Stanley Riddell博士（FHCRC）の好意により提供された。このK562 OKT3細胞株は、OKT3導入遺伝子含むレンチウイルスを形質導入することによって作製された。OKT3は、CD3ε鎖を標的とする膜結合型scFvである。MDA-MB-231はEndocyte社から提供され、葉酸非含有DMEM中で培養した。アリゾナ大学のGenetics CoreによるDSMZデータベースと照合したショートタンデムリピート（STR）によるプロファイリングにより、すべての細胞株を認証した。
【０５７８】
細胞傷害性およびサイトカインの分泌：
４時間のクロム放出アッセイを行った。簡潔に述べると、51Cr（パーキンエルマー）で標的細胞を一晩かけて標識し、PBSで３回洗浄し、96ウェルプレートのRPMI培地中に5×103個／ウェルの密度になるように三連で播種し、エフェクター細胞と標的細胞の比率（E：T）を様々に変えて、T細胞とともにインキュベートした。上清を回収してγ放射線を計測し、特異的な溶解を算出した。また、サイトカインの分泌を分析するため、5×105個のT細胞を標的細胞とともにE：T=2：1の比率で96ウェルプレートに三連で播種して24時間培養し、製造元の説明書に従ってBio-Plex Human Cytokine Panel（Bio-Rad）を使用して、cytometric bead arrayにより上清を分析した。さらに、EC17で標識した標的細胞を分析するため、ウェルに播種する前に、標的細胞にPBS中100nM EC17を加え、暗所において室温で１時間インキュベートした。各アッセイにおいてEC17を使用する場合、葉酸非含有RPMI中で細胞をインキュベートした。
【０５７９】
サイトカイン放出アッセイ：
T細胞と標的細胞の比率を2：1として、CD4+T細胞と標的細胞を24時間共培養した後、エフェクターサイトカインであるIL-2、IFN-γおよびTNF-αが上清中に存在するか否かを分析した。アッセイは三連で行い、データは平均値±SEとして示した。図４４に示すように、Mock T細胞および抗FL CAR T細胞は、ポジティブコントロール細胞株であるK562-OKT3との共培養に応答して、定量的に類似した濃度のサイトカインを産生したことが観察された。K562と共培養した場合、Mock T細胞も抗FL CAR T細胞もサイトカインを産生しなかった。サイトカインの放出は、EC17を加えてMDA-MB-231細胞株を事前にインキュベートするか否かに依存しており、EC17で標識したMDA-MB-231細胞に対して、IL-2、IFN-γおよびTNF-αの各サイトカインの分泌を誘導することができた細胞は、抗FL CAR T細胞のみであった。
【０５８０】
クロム放出アッセイ：
CD8+T細胞と標的細胞を、30：1の比率、10：1の比率、3：1の比率または1：1の比率で共培養した。三連ウェルにおける細胞溶解率（％）（平均値±SE）を示す。図４５に示すように、抗FL CAR T細胞は、ネガティブコントロール（K562）に対しても、非標識MDA-MB-231細胞株に対しても、細胞傷害性を示さなかった。一方、mock形質導入T細胞および抗FL CAR T細胞はいずれも、ポジティブコントロールであるK562-OKT3細胞株に対して特異的な溶解を同程度に誘導することができた。さらに、EC17で標識したMDA-MB-231細胞は、抗FL CAR T細胞によって効率的に認識され、溶解されたが、これに対してmock T細胞は溶解を誘導することができなかった。
【０５８１】
実施例１９
CAR-T細胞用アダプターの構造
図４６〜４９は、CAR-T細胞の実験に使用した架橋剤の構造およびそれらの親和性を示す。架橋剤の親和性は、架橋剤が指向性を示す種類の細胞に対する親和性をインビトロで測定した（たとえば、架橋剤が葉酸-FITCである場合、葉酸受容体を発現するがん細胞を使用した）。図５０は、インビボモデルにおいて使用した場合の、架橋剤の小分子リガンドに対する受容体を発現する腫瘍細胞への架橋剤の結合を示す（FACS分析）。
【０５８２】
実施例２０〜３０については、図５５〜６３を参照されたい。
【０５８３】
実施例２０
細胞株および試薬
特に記載がない限り、葉酸受容体陽性がん細胞株および葉酸受容体陰性がん細胞株はいずれも、10%熱不活化ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地（Gibco BRL）中で維持し、葉酸非含有RPMI1640培地（FFRPMI）の場合は葉酸を添加せず、葉酸含有RPMI1640培地（RPMI）の場合は、2.4mMの葉酸（FA）を添加した。放射リガンド結合アッセイにおいて、KB細胞（HeLaマーカーと葉酸受容体α（FRa）を発現するヒト子宮頸癌）を葉酸受容体α（FRa）の供給源として使用し、CHO-b（ヒト葉酸受容体β（FRb）をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞）を葉酸受容体β（FRb）の供給源として使用した。MDA-MB-231は、ヒトトリプルネガティブ乳がん（TNBC）細胞株のFRaサブクローンを示す。急性骨髄性白血病（AML）における研究では、FRb陽性細胞株（THP1-FRb）とFR陰性細胞株（THP1-FG12）の緑色蛍光タンパク質（GFP）発現同種同系ペアを使用した。いずれの細胞株も、小児AMLの研究に一般的に使用されている細胞モデルであるTHP-1（ATCC、TIB-202）から樹立したものであり、THP-1細胞株は、急性単球性白血病を有する１歳の男児から最初に得られたものである。骨肉腫における研究では、FR陰性HOS-143b（ATCC、CRL8303）に、ヒトFRaをコードするFOLR1遺伝子をレンチウイルスで形質導入することによってHOS-FRaを樹立した。HOS-143bは、13歳の白人女児の原発腫瘍から最初に樹立されたものであり、NSGマウスにおける腫瘍形成性が非常に高い。FR陽性HOS-FRαfLuc細胞とFR陰性HOS-143bfLuc細胞のGFP発現生物発光ペアには、ホタルルシフェラーゼをレンチウイルスで形質導入した。
【０５８４】
LEGENDplexTMヒトサイトカインパネルはBioLegend社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。乳酸脱水素酵素（LDH）を使用したCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイキットは、プロメガ社（ウイスコンシン州マディソン）から購入した。マルチカラーフローサイトメトリーに使用した市販の抗ヒト抗体は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（マサチューセッツ州ウォルサム）から購入したCD45RA（クローンHI100）、CD45RO（クローンUCHL1）、CD4（クローンSK3）およびCD69（クローンFN50）；BDバイオサイエンス社（カリフォルニア州サンノゼ）から購入したCD3ε（クローンSK7）、CD8α（クローンRPA-T8）、CD137/4-1BB（クローン4B4-1）、CD25（クローンMA251）、PD1（クローンEH12.1）、LAG3（クローンT47-530）およびTIM3（クローン7D3）；R&Dシステムズ社（ミネソタ州ミネアポリス）から購入したビオチン標識抗ヒトEGFR（セツキシマブ、クローンHu1）；およびBioLegend社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入したFRα（クローンLK26）であった。蛍光色素標識抗ビオチンも、BioLegend社から購入した。APC標識抗FITCマウスIgG2a/κ抗体（クローンNAWESLEE）、CountBrightTMビーズ（インビトロジェン）、アネキシンV染色バッファー、およびAlexaFluor-647標識アネキシンVは、サーモフィッシャーサイエンティフィック社から購入した。腫瘍組織の酵素消化に使用した、コラゲナーゼIV、ヒアルロニダーゼおよびDNase Iは、いずれもシグマ アルドリッチ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【０５８５】
EC17すなわち葉酸-FITC［FA-(g)-エチレンジアミン-FITC］は、Endocyte社において合成した。3H-EC17は、約0.952Ci/mmolの比放射能のものをMoravek biochemicals社（カリフォルニア州ブレア）から購入するか、あるいはViTrax社（カリフォルニア州プラセンシア）により調製された約1.2Ci/mmolの比放射能の3H-FA-(g)-エチレンジアミンでFITCを標識することによってEndocyte社において調製した。3H-FAも、59Ci/mmolの比放射能のものをViTrax社から購入した。サイトカイン放出症候群（CRS）のレスキューを行うため、Purdue Pharmacy社から購入したAK FLUOR（登録商標）25%（フルオレセイン注射、USP）（NDC 17478-250-25）を希釈して、フルオレセインナトリウム投与液とした。
【０５８６】
実施例２１
ヒト化CARコンストラクトおよびCAR修飾T細胞
過去の研究では、CD8aのヒンジ配列および膜貫通配列と4-1BB/CD3ζシグナル伝達ドメインを含むGFP+第２世代抗FITC scFv（クローン4M5.3）CAR（すなわちFITC-4M5.3-scFv-CD8aヒンジ-CD8atm-4-1BB/CD3z）が使用されていた。ヒトでの試験に初めて移行するため、第２世代完全ヒト型FITC特異的（クローンE2）CARコンストラクト（本明細書においてE2と呼ぶ）が構築された（図５５、上の略図）。CAR修飾T細胞を図５５の下の円グラフに示す。
【０５８７】
本明細書に記載のコンストラクトは、（１）完全ヒト型抗FITC scFv（クローンE2、Kd=0.75nM）、（２）CD28膜貫通ドメインと融合したIgG4ヒンジ-CH2(L235D,N297Q)-CH3スペーサー、（３）第２世代4-1BB/CD3ζ細胞内ドメイン、および（４）細胞表面ヒトEGFRtタグを含むFITC特異的CARコンストラクトである（図５５、上の略図）（配列番号１に核酸配列を示し、配列番号２にアミノ酸配列を示す）。CAR修飾T細胞を作製するため、CARをコードするepHIV7レンチウイルスベクターを共トランスフェクトした293T細胞においてレンチウイルスを作製した。ドナー由来のCD4+T細胞およびCD8+T細胞を免疫磁気選択で精製し、別々に形質導入するか、または約50：50の比率で混合して形質導入した。全般的に、CD3/CD28ビーズによる活性化を１回のみ実施した後、インビトロにおける急速増殖を１回または２回行った。前臨床評価では、EGFRtでソートしたCD4 CAR-T細胞のバッチ、EGFRtでソートしたCD8 CAR-T細胞のバッチ、およびソートしていないCD4/CD8 CAR-T細胞のバッチを複数使用した。CAR-T細胞製剤はすべて凍結保存前および解凍後にフローサイトメトリーで分析し、EGFRtの発現とCD4/CD8の比率を測定した。CAR-T細胞製剤を注入する当日に、表面マーカーの組み合わせを使用して、CD4+CAR-T細胞サブセットおよびCD8+CAR-T細胞サブセットの分化状態を分析し、TN（CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95-ナイーブT細胞）；TSCM（CD45RA+CD45RO-CD62L+CD95+幹細胞メモリーT細胞）；TCM（CD45RA-CD45RO+CD62L+CD95+セントラルメモリーT細胞）；TEM（CD45RA-CD45RO+CD62L-CD95+エフェクターメモリー細胞）；およびTEFF（CD45RA+CD45RO-CD62L-CD95+エフェクターT細胞）として定義した。以下の前臨床試験では、EGFRtでソートした純粋なCD4サブセットとCD8サブセット（約1：1の比率で混合したもの）からなる２つのバッチと、ソートしていないEGFRt+CD4とEGFRt+CD8を約1：1の比率で混合した複数のバッチ（低分化型のプロファイルを有する「臨床模擬」製剤を含む）が含まれていた。
【０５８８】
合成され評価された一連の様々なCARコンストラクトのうち、完全ヒト型抗FITC scFv（FITC-E2）CARを選択して前臨床開発を行った（図５５）。この第２世代完全ヒト型CARは、抗FITC scFv（クローンE2）と、FcγRへの結合を抑制するためにCH2領域に二重突然変異（L235D、N297Q）を有するIgG4-Fcスペーサー／ヒンジと、CD28膜貫通ドメインと、4-1BB/CD3zシグナル伝達ドメインと、T2Aリボソームスキップ配列を介してこのシグナル伝達ドメインに連結された細胞表面EGFRtタグとから構成されていた（すなわちFITC-E2-scFv-IgG4ヒンジ-CD28tm-4-1BB/CD3z-T2A-EGFRt）。前臨床研究では、EGFRtでソートしたE2 CAR-T細胞とソートしていないE2 CAR-T細胞を、いずれもCD4とCD8の比率が約1：1になるように作製し、各インビボ実験におけるCAR T細胞の注入時（０日目）に、フローサイトメトリーを実施してT細胞のサブタイプ表現型解析を必ず行った。EGFRtでソートしたCAR-T細胞の通常の発現パターンは、CD4サブセットおよびCD8サブセットがいずれも、TSCM約42%、TCM約10%、TEM約12%およびTEFF約34%で構成されていた（図５５、左側の円グラフ）。共培養（図５３、図５４、図５６、図５８、図５９および図６１）および薬理学的動態研究（図６２）では、EGFRtでソートしたCAR-T細胞のみを使用した。腫瘍の治療では、低分化型のプロファイルを有する「臨床模擬」バッチ（図５５、右側の円グラフ）を使用し、MDA-MB-231腫瘍を用いた研究（図６３）でも、この「臨床のバッチ」を使用し、THP1-FRb細胞およびHOS-FRa細胞を用いた研究（図５７）では研究バッチを使用した。「臨床模擬」バッチ（EGFRt+約39%）は、TSCM約66%およびTCM約32%からなるCD4+サブセットと、TSCM約95%およびTCM3%からなるCD8サブセットから構成されていた。研究バッチ（EGFRt+約23%）は、さらに分化したものであり、TSCM32%、TCM53%、TEM11%およびTEFF3.7%からなるCD4サブセットと、TSCM44%、TCM0.28%、TEM3.4%およびTEFF52%からなるCD8サブセットで構成されていた。
【０５８９】
実施例２２
EC17 CAR-Tアダブター分子（CAM）の二重特異性親和性
細胞を使用した放射性リガンド結合アッセイにおいて、3H-EC17を使用することによりEC17 CAR-Tアダブター分子（CAM）の二重特異性親和性を評価した。葉酸受容体陽性（FR+）標的細胞に対する結合性を調べるため、KB細胞およびCHO-β細胞を事前に24ウェルの組織培養プレートに播種して一晩培養し、葉酸非含有RPMI1640培地（FFRPMI）中に3H-EC17を0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、20nMおよび40nMの濃度で添加して37℃で２時間インキュベートした。その後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で細胞をリンスし、1%ドデシル硫酸ナトリウムで溶解した。全細胞溶解物中の放射能量を測定し、Pierce社の標準的なBCAタンパク質アッセイにより細胞中のタンパク質含量を測定した。細胞１個あたりに結合した3H-EC17分子の数を算出して、FRα（KB細胞）およびFRβ（CHO-b細胞）に対する解離定数（Kd）をそれぞれ決定した（図５６）。
【０５９０】
CAR-Tアダブター分子（CAM）により制御されるCAR T細胞療法の主要な構成要素
CAR-T細胞療法の基本的な構成要素には、偽腫瘍抗原としてのFITC、高親和性EC17 CAR-Tアダブター分子（CAM）（本願において、CAMは、架橋剤および前記「化合物」と同義である）、合理的に設計された抗FITC CAR、およびCARで修飾されたT細胞が含まれる。EC17は、免疫療法および光学イメージングの用途で既に臨床で試験されている。二重特異性結合の親和性を直接定量するため、3H-EC17を合成し、FRα+標的細胞としてのKB細胞およびFRβ+標的細胞としてのCHO-β細胞株、ならびにエフェクター細胞としてのソートしていないEGFRt CAR-T細胞に対する放射性リガンド結合アッセイを行った。EC17は、標的であるFRα細胞およびFRβ細胞への結合に対して同程度の親和性を示し、FRα細胞に対して1.7nMという低いKd値を示し、FRβ細胞に対しては0.8nMという低いKd値を示した（図５６、パネルＡ）。ソートしていないE2-CAR-T細胞（EGFRt+約24%、CD8：CD4の比率=約95：5）への結合に対するKd値は約130nMと推定された（図５６、パネルＢ）。
【０５９１】
実施例２３
腫瘍モデル
動物の飼育および使用は、米国国立衛生研究所（NIH）のガイドラインおよびパデュー大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って行った。４〜５週齢の雌性NOD/SCIDγ（NSGTM）マウス（ストック番号：005557）を、ジャクソン研究所（メイン州バー・ハーバー）から購入した。特に記載がない限り、マウスはいずれも、到着後から研究全体を通して、葉酸欠乏飼料（TestDiet、ミズーリ州セントルイス）を与えて飼育した。皮下異種移植片を樹立するため、マウス１匹あたり2.5×106個のMDA-MB-231細胞またはマウス１匹あたり1×106個のHOS-FRa細胞を右脇腹領域に移植した。静脈内異種移植では、マウス１匹あたり5×106個のTHP1-FRb細胞を接種した。皮下腫瘍の大きさは、ノギスで週に２〜３回測定し、楕円体の体積を求める計算式：（長径×短径２）／２を使用して算出した。安楽死は研究計画ごとに実施するか、あるいは（ｉ）マウスが体重の20%を失うか、もしくは瀕死に近い状態に陥った場合、（ii）皮下腫瘍の大きさが1500mm3以上に達した場合、または（iii）マウスが腹部の膨張および激しい苦痛の徴候を示した場合（すなわちTHP1-FRβ腫瘍）に安楽死を行った。マウスへの投与（CAR-T細胞、EC17、フルオレセインナトリウム）は、すべて静脈内投与により行った。
【０５９２】
実施例２４
腫瘍の治療
治療セッティングにおいて、理論上、EC17 CAR-Tアダブター分子（CAM）は、CAR-T細胞注射の前でもその後でも投与することができる。本明細書で述べるように、腫瘍を有するマウスにおけるヒトT細胞の観察期間を見込んで、CAR-T細胞を投与した２〜３.５日後にEC17の１回目の投与を行う。ソートしていないE2 CAR-T細胞の２つのバッチ（EGFRt+23%または39%、CD4とCD8の比率=1：1）をインビボ研究に使用した。各実験における注入の当日（０日目）に、凍結CAR-T細胞を37℃で速やかに解凍し、ダルベッコの1×PBS（pH7.4）で２回洗浄し、所望の投与量のEGFRt+E2-CAR-T細胞を尾静脈に注射した。さらに、CAR-T細胞を少量採取して、フローサイトメトリーによりCD4とCD8の比率、およびCAR-T細胞の分化状態を分析した。EC17の投与の１日目に、腫瘍の大きさに従って、または静脈内移植（すなわちTHP1-FRβ細胞の移植）後の経過日数が同じであることに基づいて、腫瘍を有するマウスを各群にランダムに割り付けた。
【０５９３】
実施例２５
毒性およびサイトカイン放出症候群（CRS）からのレスキュー
FITC特異的CAR-T細胞を投与した腫瘍担持マウスは、CAR-T細胞の投与量およびEC17の投与方法に応じて、重度のサイトカイン放出症候群（CRS）および様々な程度の体重減少を起こす可能性がある。これを踏まえ、経験則に基づいて、動物の全体的な形態学的特徴および社会的行動からCRS毒性を評価し、それによってCRSからのレスキューのタイミングを良好に見極めるため、CRS評価尺度（０〜５段階）を作製した。グレード０は正常状態（CRSなし）を示し、グレード５は（重度のCRSによる）死亡を示し、グレード１は最軽度のCRSを示し、グレード２は軽度〜中程度のCRSを示し、グレード３〜４は重度のCRSを示す（図５７Ａ、表の説明）。さらに、EC17の投与はいずれも、起こりうるCRSの症状が一晩で発症することを見越して、所定の投与日の終わり頃に行った。EC17の投与を行った翌日にマウスを段階評価し、フルオレセインナトリウム、葉酸、ロイコボリンなどのレスキュー剤を使用してCRS毒性を緩和した。この特定の例では、０日目に、約250万個のCD8 CAR-T細胞と約3300万個のCD4 CAR-T細胞を混合したCD4とCD8の比率が約93：7のEGFRt+高発現E2 CAR-T細胞バッチを、HOS-FRα腫瘍を有するマウスに投与した（図５７Ａ、略図）。３日目、10日目および12日目に、500nmol/kg、100nmol/kgまたは500nmol/kgのEC17を投与した場合、軽度のCRS（グレード１〜２）が４日目および11日目に確認され、重症度の高いCRS（グレード３）が13日目に確認された。重度のCRS毒性を緩和するため、13日目の午前中に約96mg/kgのフルオレセインナトリウムを静脈内投与し、６時間後にマウスの血漿試料を採取してCRSに関連するサイトカインを分析した。
【０５９４】
フルオレセインナトリウムを使用してCRSからのレスキューが可能か否かを精査することを目的とした、EC17の投与後に重度のCRS（グレード３またはグレード４）の発症を把握することが可能なCRS採点法を作製することができた（図５７Ａ）。合計で3500万個という非常に高用量のCAR-T細胞（CD4：CD8＝93：7）を投与したことからCRSが急速に発症したHOS-FRα腫瘍担持マウスの治療困難な症例で示されたように、ヒト等価用量（マウスでは約95mg/kg）のフルオレセインナトリウムを静脈内投与したところ、非常に速やかに作用して、CAR-T細胞由来ヒトサイトカインが抑制された（図５７Ｂ）。
【０５９５】
実施例２６
統計分析
統計分析は、コンピュータプログラムであるGraphPad Prism（GraphPad Software Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して行った。データは、スチューデントのｔ検定または一元配置分散分析を使用して分析した。可能な場合、事後比較として適切な多重比較検定を使用して各治療群のデータをさらに分析した。すべての試験において、*=p<0.05を統計学的に有意であるとした。
【０５９６】
実施例２７
共培養実験
インビトロでEC17 CAR-Tアダブター分子（CAM）の作用を調査するため、EGFRtでソートした純粋なCD4 CAR-T細胞とCD8 CAR-T細胞を1：1の比率で混合し、これらのCAR-T細胞とマッチするmock形質導入T細胞を各実験計画に含めた。急性骨髄性白血病（AML）細胞株のFR+/-同種同系ペアと骨肉腫細胞株のFR+/-同種同系ペア以外にも、異なる組織学的特徴を有する腫瘍および葉酸受容体発現量が異なる細胞株として、KB細胞株、MDA-MB-231細胞株およびOV90細胞株を使用した。FR+標的細胞株はすべて直接3H-FA結合アッセイを実施し、細胞１個あたりの、葉酸受容体分子に結合した葉酸分子の数を測定した（図５８）。共培養実験を行う前に、凍結保存していたCAR-T細胞を２〜３日かけてT細胞培地中で回復させた。また、すべてのエフェクター細胞および標的細胞は、葉酸非含有RPMI1640培地（FFRPMI）で事前に洗浄して、EC17と競合しうる外因性葉酸を除去した。外因性サイトカインを添加していない葉酸非含有RPMI1640培地（FFRPMI）中で３日間以内の短期共培養研究を行った。
【０５９７】
EC17の用量反応性についての研究（図５９、パネルＡおよびパネルＢ）を行うため、0.1pM〜100μMの範囲で10倍ずつ濃度を上昇させたEC17の存在下において、エフェクター細胞と標的細胞の比率（E/T）を1：1として、FR+細胞株（KB、MDA-MB-231、HOS-FRα、THP1-FRβおよびOV90）を、EGFRtでソートしたE2-CAR-T細胞と共培養した。24時間共培養後、上清を回収して腫瘍細胞の殺傷を測定した。また、T細胞の活性化の動態と葉酸受容体の相関性をインビトロで調査するため（図６０、パネルＡ〜E）、10nMのEC17が常に存在する条件下において、E/T比を様々に変えて（1：27、1：9、1：3、1：1または3：1）、FR+/-細胞株との共培養を実施した。16時間および48時間の共培養後に、腫瘍細胞の殺傷の動態を測定した。これと同時に、共培養の44時間後に上清の一部を採取して、IFN-γ、IL-2およびTNFαを測定した。プロメガ社製のCytoTox 96（登録商標）LDHアッセイキットを使用して、標的細胞の殺傷を定量し、EC17の非存在下における所定のE/T比の基底レベルで正規化した特異的溶解率（%）として示した。LEGENDplexTMヒトTh1サイトカインパネル（BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、CAR-T細胞由来サイトカインを測定した。
【０５９８】
FR陽性標的腫瘍細胞の存在下におけるCAR-T細胞の活性化を調査するため（図５３）、まず、MDA-MB-231細胞、THP1-FRβ細胞またはHOS-FRα細胞との共培養実験を行った。すべての標的細胞を100nMのEC17を含む培地に30分間暴露させた後、洗浄し、EGFRtでソートしたE2-CAR-T細胞（CD4：CD8＝1：1）またはmock形質導入コントロールT細胞とともにE/T比＝1：1でインキュベートした。24時間共培養後、T細胞活性化マーカーであるCD69、CD137（4-1BB）およびPD1の細胞表面発現をフローサイトメトリーで分析した。T細胞疲弊研究では（図５４）、FR陽性腫瘍細胞株（KB、MDA-MB-231、HOS-FRαfLuc、THP1-FRβ）およびFR陰性腫瘍細胞株（HOS-143bfLuc、THP1-FG12）を標的として使用した。この研究では、０日目に、0.1nMまたは10nMのEC17の存在下または非存在下において、標的細胞を37℃で30分間インキュベートし、細胞表面のEC17を抗FITC抗体で対比染色することによってEC17の「プレローディング」の状態を評価した（図６１、パネルＡ）。３日後に、共培養したCAR-T細胞におけるPD1抑制性受容体、LAG3抑制性受容体およびTIM3抑制性受容体の細胞表面発現を分析し、高頻度の二重陽性細胞および三重陽性細胞を疲弊表現型に近い表現型として考えた。本研究において使用した腫瘍細胞は、倍加時間の変動を示したことから、２日間の共培養後に標的細胞のアポトーシス（%）をアネキシンV+として測定し、T細胞の非存在下において同じ条件下で培養した標的細胞のアポトーシスのバックグラウンドレベルで正規化した（図６１、パネルＢ）。
【０５９９】
機能性葉酸受容体の評価
前述した機能性葉酸受容体の評価は、本明細書に記載のいくつかの例にも適用可能である。FRa（HOS-FRα）またはFRβ（THP1-FRβ）をトランスフェクトした小児がん細胞株以外にも、様々な組織構造および葉酸受容体発現量のがん細胞株（図５８）を使用した。放射性リガンド結合アッセイ（100nM 3H-FA、37℃で１時間）により推定したところ、これらの細胞株において利用可能な葉酸受容体の総数は、少ない方から順に、細胞１個あたりに結合した葉酸分子の数として、9×104個（OV90、葉酸受容体を低発現する卵巣がん細胞株）、1.9×105個（THP1-FRβ）、2.4×105個（HOS-FRαfLuc）、7×105個（HOS-FRα）、2.1×106個（MDA-MB-231）、4.8×106個（KB）であった。葉酸受容体陰性コントロールとして、HOS-143b(fLuc)親細胞株およびTHP1-FG12親細胞株も使用した。したがって、共培養に使用したFR+がん細胞株における機能性葉酸受容体の発現の総体的な順位は、KB＞MDA-MB-231＞HOS-FRα＞HOS-FRαfLuc＞THP1-FRβ（AML）＞OV90であった。
【０６００】
標的細胞の溶解およびサイトカインの産生と、葉酸受容体発現量との相関性
葉酸受容体に対する依存性を分析するため、10nMのEC17が常に存在する条件下において、E/T比を様々に変えて（1：27、1：9、1：3、1：1または3：1）、５種のFR陽性細胞株（MDA-MB-231、KB、HOS-FRα、THP1-FRβ、OV90）および１種のFR陰性細胞株（HOS-143b）をE2-CAR-T細胞と共培養した。16時間および48時間の共培養後に、特異的溶解率（%）を定量し、44時間の共培養後に培地中のTh1サイトカイン（IFN-γ、IL-2、TNFa）を測定した。特異的な溶解（約16時間）の発生は、様々な腫瘍細胞間で異なっていたが、48時間には、すべてのFR陽性がん細胞株において特異的な細胞溶解の増加が観察された（図６０、パネルＡ）。全体的に、FRの発現が最も低いOV90細胞において有意な活性を得るには、CAR-T細胞に対する暴露時間を長くし（48時間）、E/T比を高くする（≧1：1）必要があった（図６０、パネルＡ）。FRを高発現するKB細胞は非常にゆっくりとした反応を示し、この細胞でも、有意な細胞死を誘導するには、E/T比を高くし（≧1：3）、CAR-T細胞に対する暴露時間を長くする必要があった（図６０、パネルＢ、左のグラフ）。十分な量のエフェクター細胞が存在する場合（E/T比＝≧1：1）、48時間の共培養後にすべてのFR陽性がん細胞が反応を示した。注目すべきことに、実質的に細胞溶解が起こらなかったのは、FR陰性のHOS-143b細胞のみであった（図６０、パネルＢ、右のグラフ）。
【０６０１】
葉酸受容体の発現とCAR-T細胞の活性の間の相関性をインビトロで確立するため、各腫瘍細胞において検出された機能性葉酸受容体の発現量（図５８）に対して、E/T比＝1：1で16時間培養した特異的溶解率の数値をプロットした。通常と異なり、初めのうちは溶解抵抗性が認められたKB細胞以外の細胞株では、葉酸受容体の発現量と細胞溶解の発生の間においてR値＝0.98の半対数の強い相関性が認められた（図６０、パネルＣ）。同様に、E/T比＝1：1でのE2-CAR-T細胞との44時間の共培養後に、FR陰性であるHOS-143b腫瘍細胞以外のすべての細胞株において、高濃度のIFN-γ、IL-2およびTNFαの産生が誘導された（図６０、パネルＤ）。Th1サイトカインの産生でも、すべての細胞株において半対数の相関性が認められ、R値はそれぞれ0.88（IFN-γ）、0.89（IL-2）および0.89（TNFα）であった（図６０、パネルＥ）。短期間の共培養では、MDA-MB-231細胞が、CAR-T細胞による殺傷に最も高い感受性を示したが、HOS-FRa骨肉腫細胞およびTHP1-FRα急性骨髄性白血病（AML）細胞でも、葉酸受容体の発現量に依存して急速な反応が認められた（図６０、パネルＣ）。
【０６０２】
インビトロのエフェクター細胞と標的細胞の会合におけるEC17 CAR-Tアダブター分子（CAM）の高い効果
遊離状態の１価のEC17（すなわち葉酸リガンド１個あたり１個のFITC）では、必ずしも抗FITC CAR-T細胞を活性化することはできない。CAR-T細胞の活性化の堅牢性を調査するため、EC17濃度を広範囲に設定し（0.1pM〜100μM）、E/T比＝1：1として、５種のFR+細胞株（KB、MDA-MB-231、HOS-FRα、THP1-FRβ、OV90）を使用して実験を行った（図５９、パネルＡおよびパネルＢ）。24時間の共培養後に、プロメガ社製のLDH細胞傷害アッセイキットを使用して特異的溶解率（%）を定量した。すべての細胞株において、EC17依存性の細胞溶解が起こり、釣り鐘型の用量反応曲線が得られ、ある程度幅広い濃度範囲でプラトーとなった（約0.1nM〜1mM）（図５９、パネルＡ）。用量反応曲線の頂点（最大100nM）に合わせてグラフを作成することによって、半数効果濃度（EC50）が得られ、各細胞株における半数効果濃度（EC50）は、4.5pM（MDA-MB-231）、5.3pM（KB）、15pM（THP1-FRβ）、30pM（HOS-FRα）および418pM（OV90）となった。しかしながら、各細胞株における最大溶解率は異なる順位となり、45%（MDA-MB-231）、27%（THP1-FRb）、18%（HOS-FRα）、15%（OV90）および11%（KB）の順となった（図５９、パネルＢ）。EC50値が全体的に低いことから、EC17は、活性化されたE2-CAR-T細胞による葉酸受容体特異的な標的細胞の溶解の誘導において、非常に強力な効果を発揮することが示唆された。
【０６０３】
インビトロにおけるEC17／葉酸受容体依存性のCAR-T細胞の活性化および疲弊
抗原依存性のCAR-T細胞の活性化を調査するため、MDA-MB-231細胞、THP1-FRβ細胞およびHOS-FRα細胞に、100nMのEC17を30分間かけてプレロードした。すべての標的細胞を洗浄し、EGFRtでソートしたE2-CAR-T細胞（CD4：CD8=1：1）またはmock形質導入コントロールT細胞とともにE/T比=1：1でインキュベートした。24時間共培養後、T細胞活性化マーカーであるCD69、CD137（4-1BB）およびPD1の細胞表面発現を測定した（図５３）。EC17をプレロードしたMDA-MB-231またはHOS-Fraとの共培養では、本発明のCAR-T細胞が強力に活性化された。葉酸受容体の発現がMDA-MB-231細胞の11分の1と低いTHP1-FRb細胞でもCAR-T細胞の活性化が誘導されたが、活性化の程度は低かった。これらの条件の下において、mockコントロールT細胞が活性化されなかったことは重要である。いくつかのFR陽性腫瘍細胞株（たとえばKB）は、EC17指向性CAR T細胞による殺傷に対して自然抵抗性を示したため（図５６、図５８、図５９および図６０）、EC17 CAR-Tアダブター分子（CAM）の作用機序としてのT細胞の活性化と疲弊を調査した。この試験を行うため、FR陽性腫瘍細胞株（KB、MDA-MB-231、HOS-FRαfLuc、THP1-FRβ）およびFR陰性腫瘍細胞株（HOS-143bfLuc、THP1-FG12）を選択した。HOS-FRαfLuc細胞は、その親細胞のHOS-FRαよりも機能性葉酸受容体の発現が約5.6分の1と低く、HOS-143bfLuc細胞は、その親細胞のHOS-143bと同じく葉酸受容体が陰性であった（図５９、パネルＡ）。この実験では、事前にEC17をロードして（0.1nMまたは10nM、37℃で30分間パルス）、またはEC17をロードせずに、EGFRtでソートしたCAR-T細胞（CD4：CD8＝1：1）とともにFR陽性腫瘍細胞およびFR陰性腫瘍細胞をE/T比＝1：2でインキュベートした（図５４および図６１、パネルＢ）。０日目に、細胞膜に結合したEC17をAPC標識抗FITC抗体（クローンNAWESLEE）で対比染色したところ、EC17用量に依存的なプレローディングが確認された（図６１、パネルＡ）。３日後に、共培養したCAR-T細胞において、T細胞の活性化／疲弊マーカーであるPD1、LAG3およびTIM3のアップレギュレーションと共発現を測定した。標的細胞の非存在下での培養では、E2-CAR-T細胞の分化の程度は低く、二重陽性細胞または三重陽性細胞の頻度は低かった。興味深いことに、腫瘍細胞のみが存在する条件（EC17のプレローディングなし）では、CAR-T細胞が様々な程度で「休息する」と見られた。しかし、EC17をプレロードしたFR陽性標的腫瘍細胞に遭遇すると、E2-CAR-T細胞が有意に分化し、疲弊マーカーの共発現が増加した（一方、FR陰性標的腫瘍細胞との遭遇ではこのような分化や疲弊マーカーの共発現の増加は認められなかった）。三重陽性細胞および二重陽性細胞の頻度が増加したことによって、共培養したCAR-T細胞において疲弊表現型の発現が増加し、その順序は、KB＞HOS-FRαfLuc＞THP1-FRβ＞MDA-MD-231となった。２日目に、すべてのFR陽性腫瘍細胞株において、EC17用量に依存的なアポトーシス（アネキシンV+）が見られたが、ここでも、FRを高発現するKB細胞では、不釣り合いも低アポトーシスが示された（図６１、パネルＢ）。
【０６０４】
実施例２８
CAR-T細胞の増殖と腫瘍による取り込みの動態
インビボにおけるCAR-T細胞の増殖を調査するため、０日目に、EGFRtでソートした約480万個のE2-CAR-T細胞（CD4：CD8＝1：1）を、15匹のMDA-MB-231腫瘍担持マウスに注射することにより分析を開始した（図６２、パネルＡ）。２日目に、腫瘍の大きさが平均で約350±60mm3に達したら、２日目、９日目、16日目、23日目および30日目に、500nmol/kgのEC17を週１回、最大で6回投与した。エクスビボ分析では、９日目、16日目、23日目および30日目に、次のEC17を投与する前に、３匹のマウスを選抜し、計４回の選抜を行った。比較を行うため、２日目に4.4倍大きい腫瘍（約1555±79mm3）が認められた３匹のCAR-Tマウスに同じ用量のEC17を投与した。各回のマウスの選抜では、フローサイトメトリーにより、新鮮血および腫瘍試料（採取可能な場合）におけるヒトCD3ε+EGFRt+CAR-T細胞の有無を分析した。さらに、循環血液中のE2-CAR-T細胞の表現型の変化（TSCM、TCM、TEMおよびTEFF）および腫瘍に浸潤したCAR-T細胞の活性化状態（すなわちCD137/4-1BB、PD1）を分析した。
【０６０５】
インビボにおけるEC17媒介性CAR-T細胞の増殖および腫瘍による取り込み
葉酸受容体の発現が膜タンパク質あたり103±15pmol/mgという最も高い発現量を示す腫瘍であることが過去に報告されているMDA-MB-231腫瘍モデルを使用して、3H-FAを使用した放射性リガンド結合アッセイにより、インビボにおけるEC17とCAR-T細胞の間の動的な相互作用をさらに分析した。本研究では、EGFRtでソートした約480万個のE2-CAR-T細胞を腫瘍担持マウスに投与し（図６２、パネルＡ）、CAR-T細胞の増殖の動態を調査した。EC17を１回投与した７日後（すなわち実験の９日目）に、マウスの血液中のヒトCD3ε+EGFRt+CAR-T細胞を検出したところ、大きな腫瘍を有するマウスにおいて循環CAR-T細胞数が増加していることが示された（図６２、パネルＢ）。さらに、大きな腫瘍を有するマウスでは、インビボにおける血液中のCAR-T細胞の増殖が、小さい腫瘍を有するマウスよりも高い傾向が認められ、これに加えて、分化プロファイルでも、小さい腫瘍を有するマウスよりも分化が進んでいることが示された（図６２、パネルＢ、2504±441mm3の大きさの腫瘍を有するマウスと422±16mm3の大きさの腫瘍を有するマウスの比較）。小さな腫瘍を有するマウスは、500nmol/kgのEC17を週１回、計５回投与して実験を継続した。図６２のパネルＣに示すように、MDA-MB-231腫瘍は、２回目のEC17の投与後に反応を示し始めた。マウスは、EC17の投与後、特に３回目の投与後に軽度の体重減少を示した。15日目ごろに循環CAR-T細胞の数がピークに達し、最長で30日間維持され（フローサイトメトリーによる最終分析）、腫瘍に浸潤したCAR-T細胞が安定に増加したことが観察された（図６２、パネルＤ、上のグラフ、破線）。さらに、血液中のCAR-T細胞は、EC17による処置を継続的に行うことによって、TSCMの表現型から主に構成された９日目から、後日のより分化が進んだプロファイルへと、動的に表現型が変化した（図６２、パネルＤ、下の棒グラフ）。前述のように、腫瘍に浸潤したCAR-T細胞は活性化され、早期T細胞活性化マーカー（CD137/4-1BB）と後期T細胞活性化マーカー（PD1）を発現した（図６２、パネルＥ）。CD137/4-1BBの発現は、９日目ごろにピークに達し、PD1の発現は９日目以降も高いまま維持された。したがって、EC17 CAR-Tアダブター分子（CAM）の投与によって、インビボにおけるCAR-T細胞の活性化、増殖および腫瘍による取り込みが誘導され、これによって堅牢な抗腫瘍免疫が得られる。
【０６０６】
実施例２９
エクスビボにおけるフローサイトメトリー
循環血液中のCAR-T細胞を分析するため、抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸を含む試験管に採取した所定量の全血から血漿を分離した。赤血球を溶解した後、1%ウシ血清アルブミン、50mg/mLヒトIgG（Equitech Bio）および0.9%アジ化ナトリウムを含むフローサイトメトリー染色液中に白血球ペレットを再懸濁した。ヒト白血球表面マーカー（CD3ε、CD4、CD8α、CD45RA、CD62L）およびビオチン標識抗ヒトEGFR（セツキシマブ）で試料を染色した後、蛍光色素標識抗ビオチン二次抗体で染色した。腫瘍に浸潤したCAR-T細胞を分析するため、事前に計量した新鮮な腫瘍断片を細片に切断し、葉酸非含有無血清RPMI1640培地（FFRPMI）中に0.5mg/mLコラゲナーゼIV、0.5mg/mLヒアルロニダーゼおよび0.1mg/mL DNase Iを含む酵素消化カクテル中において37℃で激しく振盪しながら１時間かけて酵素消化した。その後、腫瘍細胞ペレット中の赤血球を溶解し、冷PBSで洗浄し、40μmのナイロン製セルストレーナーに通して濾過した。得られた単一細胞懸濁液のEGFRtマーカー、ヒト白血球マーカー、CD137/4-1BBおよびPD1を染色した。Galliosフローサイトメーターで少なくとも20,000個のヨウ化プロピジウム陰性生細胞イベントを回収し、Kaluzaソフトウェアバージョン2.1（ベックマン・コールター、カリフォルニア州ブレア）で解析した。マウス血液中のCAR陽性T細胞は、ヒトCD3ε+EGFRt+イベントとして同定し、血液量あたりの絶対数は、各試料に加えた同数のCountBrightTMビーズ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して算出した。腫瘍に浸潤したCD3ε+EGFRt+CAR-T細胞の数は、分析した生存可能な腫瘍細胞の総数に対する割合（%）として示した。
【０６０７】
実施例３０
腫瘍の治療
食餌中に含まれる高濃度葉酸の影響を調査するため（図６３、パネルＡ〜D）、到着した２群のNSGマウスに、高葉酸（FA）飼料（4mg/kg、Envigo、インディアナ州インディアナポリス）または葉酸（FA）欠乏飼料（TestDiet、ミズーリ州セントルイス）を与えた。０日目に、両群のマウスに同じ「臨床模擬」CAR-T細胞を約1000万個投与し、３日目から500nmol/kg EC17の週１回の投与を開始するか、またはEC17を投与しなかった。EC17投与の１日目のMDA-MB-231腫瘍の平均の大きさは、高FAマウスで約549±184mm3（280〜918mm3）であり、FA欠乏マウスで約559±165mm3（356〜961mm3）であった。
【０６０８】
サイトカイン放出症候群（CRS）および抗腫瘍活性に対する食餌中の高濃度葉酸の影響
過去の報告では、MDA-MB-231腫瘍担持マウスに葉酸または葉酸リガンドを投与することによって、CRSの重症度の低下が促進されることが示されている。食餌中に含まれる葉酸の長期間にわたる効果を試験するため、各飼料でマウスを約73日間で飼育し、高FAマウスの腫瘍が約549±184mm3（280〜918mm3）に達し、FA欠乏マウスの腫瘍が約559±165mm3（356〜961mm3）に達してから、各マウスを使用した（図６３、パネルＡ〜Ｄ）。０日目に、すべてのマウスに同じ「臨床模擬」のE2-CAR-T細胞を約1000万個投与し、EC17処置コホートには、２日目（高FA）または３日目（FA欠乏）から、週１回、計８回の500nmol/kg EC17の投与を開始した。先の試験で見られたように、１回目のEC17のフルドーズでの投与は概して安全であり、いずれの飼料で飼育したマウスでもCRSや体重の減少は起こらなかった。実際に、高FAマウスは、EC17処置を通してCRSの症状を示さなかったが、FA欠乏マウスは、２回目以降の各EC17の投与でグレード２〜３のCRSおよび体重の減少（最大で約11.4%）を示した（図６３、パネルＡ、下パネル）。同じ期間のEC17処置において、FA欠乏飼料で飼育したマウスにおけるCD3ε+EGFRt+CAR-T細胞の数は、高FA飼料で飼育したマウス（59日目において血液100μL中0.027〜4.3×103個）と比較して、非常に多いことが分かった（52日目において血液100μL中1.6〜20.4×104個）（図６３、パネルＢ〜Ｃ）。EC17による処置をしなかったFA欠乏マウスでは、CAR-T細胞の増殖は検出されなかったことは重要である（図６３、パネルＣ）。
【０６０９】
先の研究よりも大きなサイズのMDA-MB-231腫瘍で試験を開始したため、1000万個の「臨床模擬」CAR-T細胞の投与での同種反応による腫瘍の退縮は明確には示されなかった（図６３、パネルＡ、上段）。高FAマウスのコントロール腫瘍（EC17なし）の増殖動態は、FA欠乏マウスのコントロール腫瘍よりも速いようであった。しかし、全体として、EC17を投与した高FAマウスでは、５匹中２匹が治癒し、５匹中２匹が完全奏効し、５匹中１匹が部分奏効した（図６３、パネルＡ、左上のグラフ）。FA欠乏飼料で飼育したマウスでは、より堅牢なインビボT細胞増殖が見られ、CRSの発症により各マウスの健康状態は悪化したものの、５匹中５匹が治癒した（図６３、パネルＡ、右上のグラフ）。
【０６１０】
EC17で継続的に処置したにもかかわらず再発を起こした複数の高FA飼料マウスから３つの腫瘍を採取し、酵素で消化し、次いで抗ヒトEGFR（クローンHu1）を使用してマウス腫瘤内のMDA-MB-231がん細胞を同定し、FRαタンパク質の発現（クローンLK26）を分析した。フローサイトメトリーで検出したところ、最も小さい腫瘍（21mg）から単離されたEGFR+がん細胞においてFRαが発現されていたが、２つの大きな腫瘍（90mgおよび363mg）から単離されたEGFR+がん細胞では、FRaの発現が完全に欠失していた（図６３、パネルＤ）。3H-FAを使用した定量放射性リガンド結合アッセイを行ったところ、これらの腫瘍から得られた組織ホモジネートにおいて機能性葉酸受容体の発現が欠失していることが確認された（未処置マウスから得た腫瘍において約103pmol/mgの結合能が示されたのに対して、約2.1pmol/mgの結合能が示された）。したがって、葉酸の欠乏は、CAR-T細胞の活性とCRS毒性を高めると考えられ、一方、非生理学的な葉酸の摂取によってCRSが予防され、継続的な葉酸の摂取によってCAR-T細胞の活性が抑制されると考えられる。
【図１】
2021511826.tif 000044
【図２】
2021511826.tif 000045
【図３】
2021511826.tif 000046
【図４】
2021511826.tif 000047
【図５】
2021511826.tif 000048
【図６】
2021511826.tif 000049
【図７】
2021511826.tif 000050
【図８】
2021511826.tif 000051
【図９】
2021511826.tif 000052
【図１０】
2021511826.tif 000053
【図１１】
2021511826.tif 000054
【図１２】
2021511826.tif 000055
【図１３】
2021511826.tif 000056
【図１４】
2021511826.tif 000057
【図１５】
2021511826.tif 000058
【図１６】
2021511826.tif 000059
【図１７】
2021511826.tif 000060
【図１８】
2021511826.tif 000061
【図１９】
2021511826.tif 000062
【図２０】
2021511826.tif 000063
【図２１】
2021511826.tif 000064
【図２２】
2021511826.tif 000065
【図２３】
2021511826.tif 000066
【図２４】
2021511826.tif 000067
【図２５】
2021511826.tif 000068
【図２６】
2021511826.tif 000069
【図２７】
2021511826.tif 000070
【図２８】
2021511826.tif 000071
【図２９】
2021511826.tif 000072
【図３０】
2021511826.tif 000073
【図３１】
2021511826.tif 000074
【図３２】
2021511826.tif 000075
【図３３】
2021511826.tif 000076
【図３４】
2021511826.tif 000077
【図３５】
2021511826.tif 000078
【図３６】
2021511826.tif 000079
【図３７】
2021511826.tif 000080
【図３８】
2021511826.tif 000081
【図３９】
2021511826.tif 000082
【図４０】
2021511826.tif 000083
【図４１】
2021511826.tif 000084
【図４２】
2021511826.tif 000085
【図４３】
2021511826.tif 000086
【図４４】
2021511826.tif 000087
【図４５】
2021511826.tif 000088
【図４６】
2021511826.tif 000089
【図４７】
2021511826.tif 000090
【図４８】
2021511826.tif 000091
【図４９】
2021511826.tif 000092
【図５０】
2021511826.tif 000093
【図５１】
2021511826.tif 000094
【図５２】
2021511826.tif 000095
【図５３】
2021511826.tif 000096
【図５４】
2021511826.tif 000097
【図５５】
2021511826.tif 000098
【図５６】
2021511826.tif 000099
【図５７】
2021511826.tif 000100
【図５８】
2021511826.tif 000101
【図５９】
2021511826.tif 000102
【図６０】
2021511826.tif 000103
【図６１】
2021511826.tif 000104
【図６２】
2021511826.tif 000105
【図６３】
2021511826.tif 000106
【配列表】
2021511826000001.app
【国際調査報告】
2021511826.tif 000107
2021511826.tif 000108
2021511826.tif 000109