(57)【要約】本発明は、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体及びその使用を開示し、前記突然変異体は、配列番号１で示される１６６位のアミノ酸残基Ａ、及び／又は３７６位のアミノ酸残基Ｖを親水性又は小さい立体障害のアミノ酸残基に突然変異させ、その使用はＬ−アミノ酸脱水素酵素突然変異体、無機アミノ基供与体、及び還元型補酵素ＮＡＤＰＨの存在下で、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩をアンモニア化反応させて得られたＬ−グルホシネート塩を酸性化反応させて、Ｌ−グルホシネートを得ることである。前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体は、野生型Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素と比較して、Ｌ−グルホシネートを製造する際に、より高濃度の基質を触媒することができ、これにより酵素の作用効率が向上し、反応のコストが低減させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される１６６位のアミノ酸残基Ａ、
及び／又は３７６位のアミノ酸残基Ｖが塩基性、親水性又は小さい立体障害のアミノ酸残基に突然変異された配列を含み；
配列番号８または配列番号２２で示される配列ではないことを特徴とするＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体。
【請求項２】
前記Ｌ−グルタミン脱水素酵素変異体は、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸又はその塩を触媒できる活性を有することを特徴とする請求項１に記載のＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体。
【請求項３】
前記１６６位のアミノ酸残基ＡはＧ、Ｃ、Ｅ、Ｈ又はＴに突然変異され、
及び／又は３７６位のアミノ酸残基ＶはＡ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｑ又はＳに突然変異され、
好ましくは、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体の配列は、配列番号１で示される１９６位のアミノ酸残基ＴがＶ、Ｓ又はＣに突然変異された配列をさらに含み、
より好ましくは、前記１６６位のアミノ酸残基ＡはＧ、Ｈ又はＴに突然変異され、
及び／又は３７６位のアミノ酸残基ＶはＥ、Ｇ、Ｑ又はＳに突然変異され、
及び／又は１９６位のアミノ酸残基ＴはＳ又はＣに変異されることを特徴とする請求項１又は２に記載のＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体。
【請求項４】
前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８で示される通りであり、好ましくは、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体のヌクレオチド配列は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７又は配列番号３９で示される通りであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体。
【請求項５】
単離された核酸であって、
前記核酸は、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体をコードし、
好ましくは、前記核酸をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７又は配列番号３９で示されることを特徴とする単離された核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸又は請求項６に記載の組換え発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
反応溶媒中で、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体、無機アミノ基供与体及び還元型補酵素ＮＡＤＰＨの存在下で、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩をアミノ化反応させてＬ−グルホシネート塩を得るステップを含み、
ここで、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体は、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体であることを特徴とするＬ−グルホシネート塩の製造方法。
【請求項９】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの存在下で、Ｄ−グルホシネート塩を酸化反応させて、前記２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩を得るステップを含み、
好ましくは、前記Ｄ−グルホシネート塩は単独で存在してもよく、或いは、Ｌ−グルホシネート塩と共存してもよく、前記Ｌ−グルホシネート塩と共存する形は、Ｄ体に富むグルホシネート塩、Ｌ体に富むグルホシネート塩又はラセミ体グルホシネート塩であり、
及び／又は、前記Ｄアミノ酸オキシダーゼの濃度は、０．６〜６Ｕ／ｍＬであり、好ましくは３．６Ｕ／ｍＬであり、
及び／又は、前記酸化反応は、通気条件下で行い、前記通気は、好ましくは空気又は酸素を通させることであり、前記通気の速度は、好ましくは０．５ＶＶＭ〜１ＶＶＭであり、
及び／又は、前記酸化反応は、カタラーゼの存在下で行い、
及び／又は、前記Ｄ−グルホシネート塩の濃度は１００〜６００ｍｍであり、好ましくは３００ｍｍであり、
及び／又は、前記酸化反応の反応系のｐＨは７〜９であり、好ましくは８であり、
及び／又は、前記酸化反応の反応系の温度は２０〜５０℃であり、好ましくは３７℃であることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体の濃度は０．０９〜３Ｕ／ｍＬであり、好ましくは０．３−１．５Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは０．９Ｕ／ｍＬであり、
及び／又は、前記無機アミノ基供与体の濃度は１００〜２０００ｍＭであり、好ましくは６００ｍＭであり、
及び／又は、前記２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩の濃度は１００〜６００ｍＭであり、好ましくは３００ｍＭであり、
及び／又は、前記還元型補酵素ＮＡＤＰＨと前記２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩のモル比は、１：３００００〜１：１０００であり、好ましくは１：２００００〜１：５０００であり、より好ましくは１：１００００であり、
及び／又は、前記無機アミノ基供与体は、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、及び重炭酸アンモニウム中の１つ又は複数であり、前記アンモニアの使用形態は、好ましくはアンモニア水であり、
及び／又は、前記反応溶媒は水であり、
及び／又は、前記アミノ化反応の反応系のｐＨは７〜９であり、好ましくは８であり、
及び／又は、前記アミノ化反応の反応系の温度は２０〜５０℃であり、好ましくは３７℃であることを特徴とする請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１１】
脱水素酵素と水素供与体の存在下で酸化型補酵素ＮＡＤＰ+を還元反応させて、前記還元型補酵素ＮＡＤＰＨを得るステップを含み、
好ましくは、前記脱水素酵素は、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素又はギ酸脱水素酵素であり、
及び／又は、前記水素供与体は、グルコース、イソプロパノール又はギ酸塩であり、
より好ましくは、前記脱水素酵素がアルコール脱水素酵素である場合、前記水素供与体はイソプロパノールであり、前記脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である場合、前記水素供与体はグルコースであり、前記脱水素酵素がギ酸脱水素酵素である場合、前記水素供与体はギ酸塩であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記脱水素酵素の濃度は０．６〜６Ｕ／ｍＬであり、好ましくは２Ｕ／ｍＬであり、
及び／又は、前記酸化型補酵素ＮＡＤＰ+の濃度は０．０２〜０．１ｍＭであり、好ましくは０．０３ｍｍであり、
及び／又は、前記水素供与体の濃度は１００〜１０００ｍＭであり、好ましくは３６０ｍＭであり、
及び／又は、前記還元反応の反応系のｐＨは７〜９であり、好ましくは８であり、
及び／又は、前記還元反応の反応系の温度は２０〜５０℃であり、好ましくは３７℃であることを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
（１）請求項８〜１２のいずれか一項に記載の製造方法によって、Ｌ−グルホシネート塩を得るステップ；
（２）ステップ（１）で製造されたＬ−グルホシネート塩を酸化反応させて、Ｌ−グルホシネートを得るステップ；
を含むことを特徴とするＬ−グルホシネートの製造方法。
【請求項１４】
Ｌ−グルホシネート又はその塩の製造における、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権主張］
本願は、２０１８年４月３日に出願された中国特許出願ＣＮ２０１８１０２９１９００．４号に対する優先権を主張するものである。前記中国特許出願は参照により本明細書に組み入れられる。
［発明の詳細な説明］
【０００２】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、具体的には、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
グルホシネートは、ハースト社より１９８０年代に開発された広域スペクトル接触型除草剤である。現在、世界の３大除草剤は、グリホサート、グルホシネート、パラコートであり、グリホサート、パラコートと比較して、グルホシネートは、除草性能に優れ、副作用が少ない。グルホシネートには、Ｄ−グルホシネートとＬ−グルホシネートの２種類の光学異性体があるが、除草活性を有するのはＬ−グルホシネートしかないため、Ｌ−グルホシネートの開発方法は、アトム経済の向上、使用コストの削減、環境圧力の低減にとって重要である。
【０００４】
現在、Ｌ−グルホシネートを製造する主な方法としては、キラル分割法、化学合成法及び生体触媒法がある。
【０００５】
キラル分割法としては、例えばＣＮ１０５３６６９Ｃなどには、分割剤としてキニーネアルカロイドを用いる方法を開示し、当該方法には、Ｌ−グルホシネートキニーネ塩を再結晶化し、次いで酸で塩を中和してＬ−グルホシネートを得る。同時に、５−ニトロサリチルアルデヒド又は３，５−ジニトロサリチルアルデヒドをラセミ化試薬として使用して未反応のＤ−グルホシネートをラセミ化し、ＤＬ−グルホシネートを得て、それを次に分割反応で使用する。しかしながら、この方法は、高価なキラル分割試薬や多段階の再結晶が必要で、操作が煩雑であり、理想的な方法ではない。
【化１】
2021520230.tif 000002
【０００６】
化学合成方法としては、例えばＵＳ６９３６４４４にはルテニウム触媒による２−アセトアミド−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−ブテン酸の不斉水素化で、Ｌ−２−アセトアミド−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−酪酸を得、さらに脱アセチル化してＬ−グルホシネートを得ることを開示した。当該方法は、高価な金属触媒が必要であるため、コストが高く、かつ、重金属が残るため環境を深刻に汚染する。
【化２】
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【０００７】
キラル分割法、化学合成法と比較して、生体触媒法は特異性が強く、反応条件が穏やかであるなどの利点があり、Ｌ−グルホシネートの製造に有利な方法である。
【０００８】
現在、ＵＳ４３８９４８８（Ａ）に開示された、基質としてＮ−フェニルアセチル−ＤＬ−グルホシネートを使用し、大腸菌由来のペニシリン−Ｇ−アシルトランスフェラーゼを触媒として使用して、Ｌ−グルホシネートを得る方法があるが、グルホシネートフェニルアセテートの合成コストは比較的高く、且つ反応終了後、得られるのはＬ−グルホシネート、Ｎ−フェニルアセチル−Ｄ−グルホシネート及びフェニル酢酸の混合溶液であるため、強酸カチオン交換樹脂でＬ−グルホシネートを分離する必要があり、操作は比較的に複雑である。
【化３】
2021520230.tif 000004
【０００９】
ＥＰ０３８２１１３Ａには、アシルトランスフェラーゼによってＮ−アセチル−グルホシネートのカルボン酸エステルを触媒分解してＬ−グルホシネートを得る方法を記載したが、この方法の酵素は遊離のＮ−アセチル−グルホシネートに特異的ではないため、Ｎ−アセチル−グルホシネートをエステル化する必要があり、反応ステップが増加し、それに応じて生産コストが高くなった。
【００１０】
もう一部は、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（ＰＰＯ）を基質として用い、トランスアミナーゼによって触媒され、Ｌ−グルホシネートを製造する方法で、ここで、ＵＳ５２２１７３７ＡとＥＰ０３４４６８３Ａには、グルタミン酸をアミノ基供与体として使用し、大腸菌由来のアミノトランスアミナーゼの作用により、対応するケト酸４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸からＬ−グルホシネートを得る方法を開示し、反応系には、アミノ供与体として同量または過剰量のグルタミン酸が必要であるため、生成物の精製が困難になる。ＣＮ１２８４８５８Ｃは、上記方法に対して改善し、アスパラギン酸をアミノ基供与体として使用し、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの作用により、対応するケト酸４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸からＬ−グルホシネートを得る方法で、当該方法において、アスパラギン酸がオキサロ酢酸に変換され、オキサロ酢酸は水性媒体中で不安定であり、かつ、自然に脱炭酸されてピルビン酸になり、ピルビン酸は酵素反応によって除去され、逆反応が不可能になるため、反応には等モルのアミノ供与体とアミノ受容体のみが必要である。しかしながら、トランスアミナーゼを用いる方法で使用されるほとんどのアミノ基供与体はアミノ酸であり、コストが高い。
【化４】
2021520230.tif 000005
【００１１】
また、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（ＰＰＯ）を基質として使用し、アミノ酸脱水素酵素によって触媒され、Ｌ−グルホシネートを製造する方法は、例えばＣＮ１０６９７８４５３Ａのように、無機アミノ基供与体を使用するため、製品の分離が簡単で、コストが低い。ただし、ＣＮ１０６９７８４５３Ａ中、酵素によって触媒され得る基質の濃度の範囲は１０〜１００ｍＭにすぎず、酵素の触媒効率は高くない。
【化５】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする技術的課題は、従来のＬ−グルタミン酸脱水素酵素がＬ−グルホシネートを製造する際に触媒効率が低いなどの欠点があるという問題であり、本発明は、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体、及びＬ−グルホシネート又はその塩の製造におけるその使用を提供する。野生型Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素と比較して、本発明のＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体により、Ｌ−グルホシネートを製造する際に、より高濃度の基質を触媒することができ、酵素の作用効率が向上し、反応のコストが低減され、工業化生産に有利になる。
【００１３】
本発明に用いられる野生型Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍであり、ＰＤＢ番号は５ＩＪＺである。当該野生型Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素は４４７個のアミノ酸残基で構成され、基質である２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩（ＰＰＯ）を触媒する場合、酵素活性は非常に低く、工業化生産に不適である。本発明者らは、基質ＰＰＯに対する飽和突然変異について野生型酵素の異なるアミノ酸位置をスクリーニングし、Ａ１６６位、Ｖ３７６位、及びＴ１９６位の部分的な突然変異体が新しい基質ＰＰＯに対する酵素活性を有意に改善できることを見出した。さらに、これらの位置を組み合わせて突然変異させ、突然変異ライブラリーを構築し、そこから本発明のＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体をスクリーニングする。
【００１４】
上記技術的問題を解決するための本発明の技術案の１つは、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体であり、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体の配列は、配列番号１で示される１６６位のアミノ酸残基Ａ、及び／又は３７６位のアミノ酸残基Ｖが塩基性、親水性又は小さい立体障害のアミノ酸残基に突然変異された配列を含む。
【００１５】
ここで、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体の配列は、配列番号８で示される配列ではなく、かつ、配列番号２２で示される配列ではない。
【００１６】
好ましくは、前記Ｌ−グルタミン脱水素酵素変異体は、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸又はその塩を触媒できる活性を有する。
【００１７】
本発明によれば、前記塩基性、親水性又は小さい立体障害とは、突然変異後のアミノ酸残基が、野生配列のアミノ酸残基よりも塩基性が強く、親水性が強く、又は立体障害が少ないことを意味する。一般的には、１６６位又は３７６位のいずれかの変異後のアミノ酸残基が上記特徴を満たしている限り、他の変異後のアミノ酸残基は上記特徴を有すると限定する必要はない。前記アミノ酸は、修飾された又は修飾されていない天然アミノ酸であってもよい。本発明は、天然アミノ酸を例とする。
【００１８】
好ましくは、１６６位のアミノ酸残基ＡはＧ、Ｃ、Ｅ、Ｈ又はＴに突然変異することができ、及び／又は３７６位のアミノ酸残基ＶはＡ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｑ又はＳに突然変異することができる。
【００１９】
より好ましくは、本発明の突然変異体は、配列番号１で示される１９６位のアミノ酸残基ＴがＶ、Ｓ又はＣに突然変異された配列をさらに含む。
【００２０】
より好ましくは、前記１６６位のアミノ酸残基ＡはＧ、Ｈ又はＴに突然変異され、３７６位のアミノ酸残基ＶはＥ、Ｇ、Ｑ又はＳに突然変異され、及び／又は１９６位のアミノ酸残基ＴはＳ又はＣに突然変異される。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、前記１６６位のアミノ酸残基ＡがＴに突然変異され、又は３７６位のアミノ酸残基ＶがＧに突然変異する。
【００２２】
上記大文字の英語の単一文字は、当業者に周知のアミノ酸を表し、本発明において、ここでは対応するアミノ酸残基を表する。
【００２３】
好ましくは、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８で示される通りである。
【００２４】
好ましくは、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体のヌクレオチド配列は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、  配列番号３５、配列番号３７又は配列番号３９に示されている通りである。
【００２５】
上記技術的問題を解決するための本発明の第２の技術案は、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体をコードする単離された核酸である。
【００２６】
好ましくは、前記核酸をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７又は配列番号３９で示される通りである。
【００２７】
上記技術的問題を解決するための本発明の第３の技術案は、前記核酸を含む組換え発現ベクターである。
【００２８】
上記技術的問題を解決するための本発明の第４の技術案は、前記核酸又は前記組換え発現ベクターを含む形質転換体である。
【００２９】
上記技術的問題を解決するための本発明の第５の技術案は、反応溶媒中で、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体、無機アミノ基供与体及び還元型補酵素ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の存在下で、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩をアミノ化反応させてＬ−グルホシネート塩を得るステップを含むＬ−グルホシネート塩の製造方法である。
【００３０】
前記製造方法において、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素変異体は本発明によって得られるが、その他の原料、反応工程及び条件は当該分野で通常の選択であり、具体的には、上記ＣＮ１０６９７８４５３Ａ及び本出願者の出願番号ＣＮ２０１８１０１６２６２９．４を参照することができ、これら文献の全文は本出願で引用されている。
【００３１】
前記Ｌ−グルホシネート塩の製造方法は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）の存在下で、Ｄ−グルホシネート塩を酸化反応させて、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩を得るステップをさらに含むことができる。
【００３２】
前記酸化反応において、前記Ｄ−グルホシネート塩のカチオンは、例えば、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン及び／又はカリウムイオンなどの当該技術分野における通常のカチオンであってもよい。また、使用される緩衝液のカチオンであってもよい。
【００３３】
前記酸化反応において、前記Ｄ−グルホシネート塩は単独で存在してもよく、又は、Ｌ−グルホシネート塩と共存してもよく（この場合、Ｌ−グルホシネート塩は反応しなくてもよい）、例えば、Ｄ体に富むグルホシネート塩（即ち、ここで、Ｄ体の鏡像異性体の含有量が５０％より多く、１００％Ｄ−グルホシネート塩まで）、Ｌ体に富むグルホシネート塩（即ち、ここで、Ｌ−グルホシネートの含有量が５０％より多く、１００％Ｌ−グルホシネート塩の場合は除く）又はラセミグルホシネート塩などである。
【００３４】
前記酸化反応において、Ｄアミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）の濃度は、当技術分野において通常の選択であってもよく、好ましくは０．６〜６Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは３．６Ｕ／ｍＬである。
【００３５】
前記酸化反応において、Ｄ−グルホシネート塩の濃度は、当該技術分野において通常の選択であってもよく、好ましくは１００〜６００ｍＭであり、より好ましくは３００ｍＭである。
【００３６】
また、前記酸化反応は、カタラーゼの存在下で行うことができる。
【００３７】
また、前記酸化反応は、通気条件下で行うことができる。前記通気は、好ましくは空気又は酸素を通させることであり、前記通気の速度は、好ましくは０．５ＶＶＭ〜１ＶＶＭである。前記酸化反応は、通気条件下で行得る際に、前記酸化反応は消泡剤の存在下で行うこともできる。
【００３８】
本発明において、前記空気は、当該分野における従来の空気であってもよく、一般的には、酸素を含み、前記含まれる酸素の含有量も、当該分野において通常の選択である。反応する時、反応に参加するのは空気中の酸素である。
【００３９】
前記酸化反応において、前記反応系のｐＨは、好ましくは７〜９であり、より好ましくは８である。前記ｐＨは、緩衝液を使用することで実現することができる。また前記ｐＨは、アルカリ（又はアルカリ溶液）を使用して調整することで実現できる。前記緩衝液は、好ましくはリン酸緩衝液又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液であり、前記リン酸塩緩衝液は、好ましくはリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液又はリン酸水素二カリウム−リン酸二水素カリウム緩衝液である。前記アルカリ溶液は、好ましくはアンモニア水である。
【００４０】
前記酸化反応において、前記反応系の温度は、当該分野で通常の選択であってもよく、好ましくは２０〜５０℃であり、より好ましくは３７℃である。
【００４１】
前記酸化反応と前記アミノ化反応は、別々に又は同時に（同じ反応系で）行うことができる。前記同時に行うこととは、例えば、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体、無機アミノ基供与体及び還元型補酵素ＮＡＤＰＨの存在下で、Ｄ−グルホシネート塩を酸化反応、及びアミノ化反応させて、Ｌ−グルホシネート塩を得ればよい。
【００４２】
前記アミノ化反応において、前記Ｌ−グルホシネート塩のカチオンは、例えば、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン及び／又はカリウムイオン等の当該技術分野における通常のカチオンであってもよい。また、使用される緩衝液のカチオンであってもよい。
【００４３】
前記アミノ化反応において、前記２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩のカチオンは、例えば、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン及び／又はカリウムイオンなどの当技術分野における通常のカチオンであってもよい。また、使用される緩衝液のカチオンであってもよい。
【００４４】
前記アミノ化反応では、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体の使用量は、当技術分野の通常選択であってもよく、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体の濃度は０．０９〜３  Ｕ／ｍＬであり、好ましくは０．３〜１．５Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは０．９Ｕ／ｍＬである。
【００４５】
前記アミノ化反応において、前記無機アミノ基供与体の使用量は、当技術分野の通常選択であってもよく、前記無機アミノ基供与体の濃度は、１００〜２０００ｍＭであり、好ましくは６００ｍＭである。
【００４６】
前記アミノ化反応において、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩の濃度は、１００〜６００ｍＭであり、好ましくは３００ｍＭである。
【００４７】
前記アミノ化反応において、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩の量は、当技術分野の通常選択であってもよく、前記還元型補酵素ＮＡＤＰＨ及び前記２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩のモル比は、１：３００００〜１：１０００であり、好ましくは１：２００００〜１：５０００であり、より好ましくは１：１００００である。
【００４８】
前記アミノ化反応において、無機アミノ基供与体は、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム及び炭酸水素アンモニウム中の１つ又は複数である。
【００４９】
前記アンモニア化反応において、前記反応の温度は、当技術分野の通常選択であってもよく、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体の触媒効率を確実にするために、前記アンモニア化反応を行うための温度は、好ましくは２０〜５０℃であり、より好ましくは３７℃であり、前記アンモニア化反応の温度が２０℃未満の場合、アンモニア化反応は遅く、前記アンモニア化反応の温度が５０℃を超える場合、酵素は不可逆的変性で不活化になる。
【００５０】
前記アミノ化反応において、前記反応溶媒は水である。
【００５１】
前記製造方法において、前記アミノ化反応を行うためのｐＨは、好ましくは７〜９であり、より好ましくは８である。前記ｐＨは、緩衝液を使用することで実現することができる。また前記ｐＨは、アルカリ（又はアルカリ溶液）を使用して調整することで実現できる。前記緩衝液は、好ましくはリン酸塩緩衝液又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等であり、前記リン塩酸緩衝液は、好ましくはリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液又はリン酸水素二カリウム−リン酸二水素カリウム緩衝液である。前記アルカリ溶液は、好ましくはアンモニア水である。
【００５２】
前記Ｌ−グルホシネート塩の製造方法は、脱水素酵素（例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素）と水素供与体（グルコース、イソプロパノール、又はギ酸塩等）の存在下で、酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋を還元反応させて、前記還元型補酵素ＮＡＤＰＨを得るステップをさらに含むことができる。
【００５３】
前記還元反応において、前記脱水素酵素は前記水素供与体とは１対１対応し、例えば、
前記脱水素酵素がアルコール脱水素酵素である場合、前記水素供与体はイソプロパノールであり、
前記脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である場合、前記水素供与体はグルコースであり、
前記脱水素酵素がギ酸脱水素酵素である場合、前記水素供与体はギ酸塩である。
【００５４】
前記還元反応において、前記脱水素酵素の濃度は、当該技術分野において通常の選択であったもよく、好ましくは０．６〜６Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２Ｕ／ｍＬである。
【００５５】
前記還元反応において、前記水素供与体の濃度は、当該技術分野において通常の選択であってもよく、好ましくは１００〜１０００ｍＭであり、より好ましくは３６０ｍＭである。
【００５６】
前記還元反応において、前記酸化型補酵素ＮＡＤＰ+の濃度は、当技術分野において通常の選択である。
【００５７】
前記還元反応において、前記還元反応を行うためのｐＨは、好ましくは７〜９、より好ましくは８である。前記ｐＨは、緩衝液を使用することで実現できる。また前記ｐＨは、アルカリ（又はアルカリ溶液）を使用して調整することで実現できる。前記緩衝液は、好ましくはリン酸塩緩衝液又はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液であり、前記リン酸塩緩衝液は、好ましくはリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液又はリン酸水素二カリウム−リン酸二水素カリウム緩衝液等である。前記アルカリ溶液は、好ましくはアンモニア水である。
【００５８】
前記還元反応において、前記反応系の温度は、当該技術分野において通常の選択であってもよく、好ましくは２０〜５０℃であり、より好ましくは３７℃である。
【００５９】
前記酸化反応と前記アミノ化反応は、別々に又は同時に（同じ反応系で）行うことができる。前記同時に行うこととは、例えば、本発明の好ましい実施形態に示されているように、グルコース脱水素酵素、グルコース、酸化型補酵素ＮＡＤＰ+、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体、無機アミノ基供与体の存在下で、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩をアミノ化反応（ＮＡＤＰ+の還元反応が同時に存在する）させて、Ｌ−グルホシネート塩を得ればよい。
【００６０】
前記還元反応と前記アミノ化反応を同時に行う場合、前記アミノ化反応に用いられるＮＡＤＰＨは、前記還元反応サイクルを通じて生成され得る。前記酸化型補酵素ＮＡＤＰ+の濃度は、当技術分野において通常の選択であってもよく、前記反応が正常に行うためには、０．０２〜０．１ｍＭが好ましく、０．０３ｍＭがより好ましい。
【００６１】
前記還元反応、前記酸化反応及び前記アミノ化反応は、別々に又は同時に（同じ反応系で）行うことができる。前記同時に行うこととは、本発明の好ましい実施形態に示されているように、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）、脱水素酵素、水素供与体、酸化型補酵素ＮＡＤＰ+、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体、無機アミノ基供与体の存在下で、Ｄ−グルホシネート塩を酸化反応とアミノ化反応（ＮＡＤＰ+の還元反応が同時に存在する）させて、Ｌ−グルホシネート塩を得ればよい。
【００６２】
前記還元反応、前記酸化反応、及び前記アミノ化反応が同時に行う場合、前記アミノ化反応に用いられるＮＡＤＰＨは、前記還元反応サイクルを通じて生成され得る。前記酸化型補酵素ＮＡＤＰ＋の濃度は、当技術分野において通常の選択であってもよく、前記反応が正常に行うためには、０．０２〜０．１ｍＭが好ましく、０．０３ｍＭがより好ましい。
【００６３】
前記製造法の反応時間は、従来の方法により測定する場合、原料の最終濃度、生成物の最終濃度又は転化率が、目的レベルになる時点で停止すればよく、前記従来の方法は、プレカラム誘導体化による高速液体クロマトグラフィー又はイオンペアクロマトグラフィーなどが含まれる。
【００６４】
上記技術的問題を解決する本発明の第６の技術案は、以下のステップを含むＬ−グルホシネート塩の製造方法である。
（１）上記Ｌ−グルホシネート塩の製造方法によって、Ｌ−グルホシネート塩を得るステップ；
（２）ステップ（１）で製造されたＬ−グルホシネート塩を酸化反応させて、Ｌ−グルホシネートを得るステップ。
【００６５】
上記技術的問題を解決するための本発明の第７の技術案は、Ｌ−グルホシネート又はその塩の製造におけるＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体の使用である。
【００６６】
前記Ｌ−グルホシネート塩の製造における使用は、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素、無機アミノ基供与体、及び還元型補酵素の存在下で、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸を反応させるステップを含み、ここで、前記Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体は、上記製造されたＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体である。
【００６７】
前記Ｌ−グルホシネートの製造における使用は、Ｌ−アミノ酸脱水素酵素、無機アミノ基供与体及び還元型補酵素の存在下で、２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩を反応させて、Ｌ−グルホシネートを得るステップを含み、ここで、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体は、上記製造されたＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体である。
【００６８】
上記化合物の濃度は、特に説明しない限り、いずれも反応前の全反応系に占める化合物の濃度である。
【００６９】
当該分野の常識に基づいて、上記好ましい条件を任意に組み合わせて、本発明の好ましい例を得ることができる。
【００７０】
本発明で使用される試薬及び原材料はすべて市販されている。
【００７１】
本発明の進歩的な効果は以下の通りである。
野生型Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素と比較して、本発明のＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体は、Ｌ−グルホシネートを製造するときに、触媒できる基質の濃度はより高い。関連特許ＣＮ１０６９７８４５３Ａの最も好ましい実施例では、１０ｍＬのＬ−グルタミン酸脱水素酵素によって触媒され得る基質の濃度は１０〜１００ｍＭであるのに対して、本発明の最も好ましい実施例では、１５ｍＬのＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体によって触媒できる基質濃度はすでに３００ｍＭに達している。本発明のＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体は、反応のコストを低減させ、工業化生産に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
図１は、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体１４を反応に使用した場合に製造された製品におけるＤ−グルホシネートとＬ−グルホシネートのマーフェイ試薬によるプレカラム誘導体化ＨＰＬＣ分析結果である。
図２は、ラセミグルホシネート塩標準品のマーフェイ試薬によるプレカラム誘導体化ＨＰＬＣ分析結果であり、ここで、最後の２つのピークは、マーフェイ試薬のブランクのピークである。
図３は、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体１４を反応に使用した場合に製造されたＬ−グルホシネートのイオンペアＨＰＬＣ分析結果である。
図４は、ＰＰＯ標準品のイオンペアＨＰＬＣ分析結果である。
図５は、ラセミグルホシネート塩標準品のイオンペアＨＰＬＣ分析結果である。
図６は、ＰＰＯ標準品の質量スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下では、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明を本願明細書に記載の実施例の範囲に限定するものではない。以下の実施例では、特定の条件のない限り、従来の方法と条件、又は製品明細書に従って実験方法を選択する。
【００７４】
本発明における実験方法は、特に説明しない限り、従来の方法を採用し、具体的な遺伝子クローニング作業は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらが編著した「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｇｕｉｄｅ」を参照することができる。
【００７５】
本発明におけるアミノ酸の略語は、特に説明しない限り、当分野において通常であり、具体的な略語に対応するアミノ酸を表１に示す。
【００７６】
【表１】
2021520230.tif 000007
【００７７】
前記アミノ酸に対応するコドンも当分野で通常の選択であり、具体的なアミノ酸とコドンの間の対応関係を表２に示す。
【００７８】
【表２】
2021520230.tif 000008
【００７９】
ｐＥＴ２８ａ、ｐＥＴ２１ａ及びｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔはＮｏｖａｇｅｎ会社から購入され、ＤｐｎＩ酵素はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社から購入され、ＮｄｅＩ酵素、ＨｉｎｄＩＩＩ酵素はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  会社から購入され、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルはＢｅｉｊｉｎｇ  Ｄｉｎｇｇｕｏ  Ｃｈａｎｇｓｈｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入され、カタラーゼはＳｈａｎｄｏｎｇ  Ｆｅｎｇｔａｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入された。
【００８０】
生成物のキラル分析は、プレカラム誘導体化による高速液体クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）によって実行され、具体的な分析方法は以下の通りである。
（１）クロマトグラフィー条件：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｐｌｕｓ  Ｃ１８、３．５μｍ、１５０  ＊  ４．６ｍｍ。移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ  ＋  Ｈ2Ｏ、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ  ＋  ＣＡＮ。検出波長：３４０ｎｍ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３０℃。
（２）誘導体化試薬：マーフェイ試薬。Ｎ−α−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）−Ｌ−アラニンアミド５０ｍｇを秤量し、アセトニトリルで溶解して、２５ｍＬの溶液に製造して、待機させた。
（３）誘導体化反応：反応液を１００倍に希釈し、同じ容積のマーフェイ試薬を添加して誘導体化した。１０μｌの試薬を注入して、分析した。
変換率＝（反応物質−残りの反応物質）／反応物質×１００％
２−オキソ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸塩（ＰＰＯと略称）は、イオンペア高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析され、具体的な分析方法は下記のようである。
クロマトグラフィー条件：ＵＬｔｉｍａｔｅ  ＡＱ−Ｃ１８、５μｍ、４．６  ＊  ２５０ｍｍ；移動相：０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二アンモニウムＰＨ  ＝  ３．６：１０％水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液：アセトニトリル＝  ９１：１：８；検出波長：２０５  ｎｍ；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：２５℃。
【００８１】
実施例１  Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体ライブラリーの構築
配列表中の配列番号１の１６６位、３７６位及び１９６位での突然変異を有する突然変異ライブラリーを構築するために設計されたプライマーの配列を表３に示す。
【００８２】
【表３】
2021520230.tif 000009
【００８３】
ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかのヌクレオチドを表し、ＭはＡ又はＣを表し、ＫはＧ又はＴを表し、これらは、位置により、突然変異が必要なアミノ酸をコードするヌクレオチドに従って選択され、例えば、Ａ１６６フォワードプライマーのＮＮＫは、ＡＡＧ（リジン）、ＡＡＴ（アスパラギン酸）、ＡＧＧ（アルギニン）、又はＡＧＴ（セリン）などを表することができ、アミノ酸に対応するヌクレオチドは、具体的に表２に示す。
【００８４】
配列表の配列番号１の配列に従って、遺伝子ｃｇＧＬＵＤＨ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を合成し、遺伝子を合成する会社は、ＧＥＮＥＷＩＺ  Ｃｈｉｎａ  ＆  Ｓｕｚｈｏｕ  Ｌａｂ（Ｓｕｚｈｏｕ  Ｌａｂ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｂ１  ａｎｄ  Ｃ３、２１８  Ｘｉｎｇｈｕ  Ｒｏａｄ、Ｓｕｚｈｏｕ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐａｒｋ、Ｃｈｉｎａ）で、ｃｇＧＬＵＤＨのＰＤＢ番号は５ＩＪＺである。次に、プラスミドｐＥＴ２１ａを、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ酵素切断部位に導入し、プラスミドｐＥＴ２１ａ−ｃｇＧＬＵＤＨを構築した。プラスミドｐＥＴ２１ａ−ｃｇＧＬＵＤＨをテンプレートとして使用して、ターゲットバンドをＰＣＲで増幅した。
ＰＣＲ増幅システムは以下のとおりである。
【００８５】
【表４】
2021520230.tif 000010
ＰＣＲ増幅ステップは以下のとおりである。
【００８６】
【表５】
2021520230.tif 000011
【００８７】
ＰＣＲ生成物を３７℃で２時間ＤｐｎＩで消化させた。反応終了後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地に塗布し、３７℃で一晩培養し、集菌し、突然変異体ライブラリーを含む形質転換体を得た。
【００８８】
実施例２  突然変異ライブラリーのハイスループットスクリーニング
以下の実験ステップに従ってスクリーニングする。
形質転換体を９６ウェルプレートに接種して培養し、ＩＰＴＧを添加して３０℃で一晩誘導した。その後、集菌し、バグバスタータンパク質抽出試薬（ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）で溶解し、遠心分離して酵素溶液を得た。
最終濃度が２０ｍＭのＰＰＯ、２００ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、及び０．３７ｍＭのＮＡＤＰＨの反応液を製造し、マイクロプレートに上記反応液を１８０μＬ取り、酵素溶液を２０μＬ添加し、系全体は２００μＬになり、マイクロプレートリーダーでＯＤ340のデータを読み取った。野生型を参照系として、陽性クローン子を選択し、配列測定し、それらの酵素活性を測定した。測定の会社は、Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｎｏ．６９８、Ｘｉａｎｇｍｉｎ  Ｒｏａｄ、Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）である。
陽性クローンを選択して培養し、方法は以下の通りである。
ＬＢ液体培地の組成：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、脱イオン水で溶解して容量を一定にし、１２１℃で２０分間殺菌して、待機させた。
単一のクローンを選択し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１２時間振とう培養した。２％の接種量で５０ｍＬの同じく１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む新しいＬＢ液体培地に移し、ＯＤ600値が約０．８に達するまで３７℃で振とうし、最終濃度が０．５ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、１８℃で１６時間誘導培養した。培養終了後、培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、集菌し、−２０℃の超低温冷蔵庫に保存して、待機させた。
培養終了後収集した菌体を５０ｍＭのｐＨ８．０のリン酸緩衝液で２回洗浄した後、ｐＨ８．０のリン酸緩衝液に懸濁し、低温高圧でホモジナイズし、破砕液を遠心分離して沈殿物を除去し、得られた上清は、組換えＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体を含む粗酵素液であった。
酵素活性検出法：２５ｇ／Ｌのウェットセル（ホモジナイザーで破砕）、１０ｍＭのＰＰＯ、２０ｍＭのコエンザイム（ＮＡＤＰＨ）、７５０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、系全体は４００μＬで、反応媒体はｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液である。反応は金属浴振とう反応器内で３０℃で６時間行い、反応終了後、２倍量のアセトニトリルを添加して反応を停止させた。試料を特定の倍数で希釈した後、Ｌ−グルホシネート塩の濃度をプレカラム誘導体化による高速液体クロマトグラフィーで測定し、酵素活性を計算した。結果を表４に示す。
単位酵素活性の定義：特定の反応条件下（３０℃）で１分あたり１μｍｏｌのＬ−グルホシネートを生成するのに必要な酵素の量。
【００８９】
【表６】
2021520230.tif 000012
【００９０】
ここで、＊は１Ｕ／ｍＬ未満であることを、＊＊は酵素活性が３〜５Ｕ／ｍＬであることを、＊＊＊は酵素活性が５〜１０Ｕ／ｍＬであることを、＊＊＊＊は酵素活性が１０Ｕ／ｍＬ以上であることを意味する。
【００９１】
以下の実施例で使用するＬ−グルタミン酸脱水素酵素の粗酵素液の製造方法はすべて上記方法を採用している。
【００９２】
実施例３  Ｄアミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）遺伝子の取得
特許ＵＳ９８３４８０２Ｂ２に記載されているＡＣ３０２  ＤＡＡＯ酵素遺伝子配列により、ＤＡＡＯ酵素遺伝子は完全に合成された。合成した会社は、ＧＥＮＥＷＩＺ  Ｎａｎｊｉｎｇ（２１１  Ｐｕｂｉｎ  Ｒｏａｄ、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｐａｒｋ、Ｊｉａｎｇｂｅｉ  Ｎｅｗ  Ａｒｅａ、Ｎａｎｊｉｎｇ、Ｊｉａｎｇｓｕ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ、Ｃｈｉｎａ、Ｎａｎｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）である。
【００９３】
実施例４  Ｄアミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）遺伝子の発現
ＬＢ液体培地の組成：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、脱イオン水で溶解して容量を一定にし、１２１℃で２０分間殺菌して、待機させた。
実施例３で合成したＤＡＡＯ酵素遺伝子をｐＥＴ２８ａに連結し、酵素切断部位をＮｄｅＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩとし、酵素に連結したベクターを宿主をＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、ＤＡＡＯ酵素を含む組換え菌を得た。
ＤＡＡＯ酵素遺伝子を含む組換え菌をプレート上にストリークすることにより活性化させた後、単一のコロニーを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、３７℃で振とうしながら１２時間培養した。２％接種量で５０μｇ／ｍＬの同じくカナマイシンを含む５０ｍＬの新しいＬＢ液体培地に移し、３７℃で振とうしてＯＤ６００値が約０．８に達した時、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭに添加し、１８℃で１６時間誘導し培養した。培養後、培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、集菌し、−２０℃の超低温冷蔵庫に保存して、待機させた。
【００９４】
実施例５  Ｄアミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）粗酵素溶液の製造及び酵素活性の測定
実施例４で回収した菌体を５０ｍＭのｐＨ８．０のリン酸緩衝液で２回洗浄した後、菌体をｐＨ８．０のリン酸緩衝液に再懸濁し、低温高圧でホモジナイズし、破砕液を遠心分離して沈殿を除去し、得られた上清は、組換えＤＡＡＯ酵素を含む粗酵素溶液であった。
酵素活性検出法：１００μＬのｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（Ｄ−グルホシネート５０ｍｍｏｌ／Ｌ及びペルオキシダーゼ０．１ｍｇ／ｍＬを含む）、５０μＬの発色試薬（６０μｇ／ｍＬの２，４，６−トリブロモ−３−ヒドロキシ安息香酸及び１ｍｇ／ｍＬの４−アミノアンチピリン）、５０μＬのＤＡＡＯ酵素、５１０ｎｍでのＵＶ吸収を検出して、Ｈ2Ｏ2濃度を測定し、ＰＰＯの濃度を計算し、酵素活性を計算する。
単位酵素活性の定義：特定の反応条件下（３０℃）で１分あたり１μｍｏｌのＰＰＯを生成するのに必要な酵素の量。
【００９５】
以下の実施例で使用するＤＡＡＯ酵素粗酵素液の製造方法はすべて上記方法を採用している。
【００９６】
実施例６  グルコース脱水素酵素遺伝子の取得及び発現
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＰ＿３８８２７５．１）に由来するグルコース脱水素酵素遺伝子配列によって、グルコース脱水素酵素遺伝子を完全に合成した。
ＬＢ液体培地の組成：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌの１０ｇ／Ｌ、脱イオン水で溶解して容量を一定にし、１２１℃で２０分間殺菌し、待機させた。
グルコース脱水素酵素遺伝子をｐＥＴ２８ａに連結し、部位ＮｄｅＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩを酵素切断し、酵素に連結したベクターを宿主のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換され、グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換え菌を得た。グルコース脱水素酵素遺伝子を含む組換え菌をプレートにストリーキングすることにより活性化させた後、単一のコロニーを選択し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に接種させ、３７℃で１２時間振とうしながら培養させた。２％接種量で５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む５０ｍＬの新しいＬＢ液体培地に移し、ＯＤ600が約０．８に達するまで３７℃で振とうし、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍｍまで添加して、１８℃で１６時間の誘導培養した。培養後、培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、集菌し、−２０℃の超低温冷蔵庫に保存し、待機させた。
【００９７】
実施例７  グルコース脱水素酵素の粗酵素溶液の製造及び酵素活性の測定
実施例６で収集した細胞を５０ｍＭのｐＨ８．０のリン酸緩衝液で２回洗浄した後、ｐＨ８．０もリン酸緩衝液に再懸濁し、低温高圧ホモジナイズし、破砕液を遠心分離して沈殿を除去し、得られた上清は、組換えグルコース脱水素酵素を含む粗酵素溶液であった。
酵素活性検出法：１ｍＬ反応系、２５℃の条件下で、先ずは９８０μＬのｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸二水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液（４００ｍＭのグルコースを含む）を添加し、次に１０μＬのＮＡＤＰ+（２５ｍＭ）を添加し、最後に適切な量の酵素溶液１０μＬを添加し、紫外可視分光光度計で３４０ｎｍのＯＤ値を測定した。
単位酵素活性の定義：特定の反応条件下（３０℃）で１分あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを生成するのに必要な酵素の量。
【００９８】
以下の実施例で使用するグルコース脱水素酵素の粗酵素液の製造方法は、すべて上記方法を採用する。
【００９９】
実施例８  アルコール脱水素酵素の粗酵素液の製造と酵素活性の測定
枯草菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＫＢ２９０）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＢＡＮ０５９９２．１）に由来するシクロペンタノール脱水素酵素（Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子配列により、アルコール脱水素酵素遺伝子を完全に遺伝子合成した。
アルコール脱水素酵素遺伝子をｐＥＴ２８ａベクターに接続、酵素切断部位ＮｄｅＩ＆ＨｉｎｄＩＩＩによって宿主のＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換し、アルコール脱水素酵素遺伝子を含む組換え菌を得た。アルコール脱水素酵素遺伝子を含む組換え菌をプレートにストリーキングすることにより活性化させた後、単一のコロニーを選択し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ液体培地に接種させ、３７℃で振とうしながら１２時間培養させた。２％接種量で同じく５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５０ｍＬの新しいＬＢ液体培地に移し、ＯＤ600が約０．８に達するまで３７℃で振とうし、ＩＰＴＧをその最終濃度０．１ｍｍになるまで添加し、１８℃で１６時間誘導培養した。培養後、培養液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、集菌し、−２０℃の超低温冷蔵庫に保存し、待機させた。
スラッジバクテリア１０ｇを５０ｍＬの１００ｍＭのｐＨ７．５のリン酸アンモニウム緩衝液に添加し、よくかき混ぜ、５００ｂａｒでホモジナイズした。粗酵素液として、撹拌条件下で１０％の凝集剤（最終濃度２〜２．５‰）を添加し、５分間攪拌した後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、透明な酵素溶液を得、上清を採取して酵素活性を測定した。
酵素活性検出法：３ｍＬ反応系、２５℃の条件下で、ｐＨ８．０の４００ｍＭのイソプロパノール（１００ｍＭのリン酸緩衝液で製造）２８５０μＬを添加し、５０μＬのＮＡＤＰ+（２５ｍｍ）を添加し、紫外可視分光光度計をゼロに調整し、１００倍に希釈した酵素溶液１００μＬを添加し、紫外可視分光光度計で３４０ｎｍのＯＤ値を測定した。
単位酵素活性の定義：特定の反応条件下（２５℃、ｐＨ  ８．０）で、１分あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを生成させるために必要な酵素の量を１Ｕと定義した。
以下の実施例で使用するアルコール脱水素酵素の粗酵素液の製造方法は、すべて上記方法を採用する。
【０１００】
実施例９  Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体によって触媒されてＬ−グルホシネートを製造
ＰＰＯ、ＮＡＤＰ+、ＮＨ4Ｃｌ、グルコースを反応フラスコに量り取り、５０ｍＭのｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液で完全に溶解させ、２５％の濃アンモニア水でｐＨを８．０に調整し、実施例２の方法に従って製造されたＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体１（１Ｕ／ｍＬ）、２（１．３Ｕ／ｍＬ）、８（２．１Ｕ／ｍＬ）、１４（３Ｕ／ｍＬ）、１５（２．８Ｕ／ｍＬ）と１６（２．５Ｕ／ｍＬ）の粗酵素溶液１５ｍＬ、及び実施例７の方法に従って製造したグルコース脱水素酵素粗酵素溶液（１００Ｕ／ｍＬ）１ｍＬを添加し、ＰＰＯの最終濃度が３００ｍＭ、塩化アンモニウムの最終濃度が６００ｍＭ、グルコースの最終濃度が３６０ｍＭ、ＮＡＤＰ+の最終濃度が０．０３ｍＭになるように、５０ｍＭのｐＨ  ８．０のリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液で５０ｍＬまで定容した。反応過程中、アンモニア水でｐＨを８．０に制御し、３７℃の水浴で１０時間磁気で攪拌反応させた後、イオンペアＨＰＬＣでＰＰＯの残存濃度を測定し、同時にプレカラム誘導体化による高速液体クロマトグラフィーでＬ−グルホシネートの生成量とｅｅ値を測定した。
反応終了時のデータを表５に示す。ＣＮ１０６９７８４５３Ａの最も好ましい実施例では、１０ｍＬのＬ−グルタミン酸脱水素酵素が触媒できる基質濃度は１０〜１００ｍＭで、この実施例では、１５ｍＬのＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体が触媒できる基質濃度が３００ｍＭに達した。
製品中のＤ−グルホシネートとＬ−グルホシネートのＨＰＬＣ分析結果を図１に示す（図中、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体１４を例として説明した）。ここで、保持時間が１３．７３５分であるものは、Ｌ−グルホシネートであり、Ｄ−グルホシネートはほとんど検出されなかった。ラセミグルホシネート標準品（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ａｌａｄｄｉｎ  Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  ＬＴＤから購入）のマーフェイ試薬プレカラム誘導体化ＨＰＬＣスペクトルを図２に示す（Ｌ−グルホシネートの保持時間は１３．６８３分、Ｄ−グルホシネートの保持時間は１２．０１６分である）。この例で製造された製品の組成は、基本的に標準品のＬ−グルホシネートのピーク時間と同じであり、これはこの例でＬ−グルホシネートが製造されたことを示している。
製造したＰＰＯのイオンペアＨＰＬＣ分析結果を図３に示す。ここで、１０．１２１分はＰＰＯのピーク位置であり、３．８３３分はＬ−グルホシネートのピーク位置である。ＰＰＯ標準品（本標準品は実験室で製造され、製造方法はＵＳ８０１７７９７Ｂを参照し、図６は対応する質量スペクトルである）のイオンペアＨＰＬＣスペクトルを図４に示す。ここで、ＰＰＯ標準品の保持時間は９．５２０分である。ラセミグルホシネート塩標準品（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ａｌａｄｄｉｎ  Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  ＬＴＤから購入）のイオンペアＨＰＬＣスペクトルを図５に示す。ここで、ラセミグルホシネート塩標準品の保持時間は３．８２９分である。この実施例におけるＰＰＯ及び生成物グルホシネートのピーク時間は、基本的に、それぞれの標準品のピーク時間と同じであることが分かる。
上記結果及び図は、いずれもＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体１４を例としたが、本発明者は他のすべての変異実験を行い、また本発明のこれらの変異が上記反応に参加する場合、いずれも基質を触媒でき、かつ、正確な生成物を生成したことを確認した。
【０１０１】
【表７】
2021520230.tif 000013
【０１０２】
実施例１０  ＤＡＡＯ酵素及びＬ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体によって触媒されてＬ−グルホシネートを製造
Ｄ、Ｌ−グルホシネート、ＮＡＤＰ+、ＮＨ4Ｃｌ、及びグルコースを反応フラスコに量り取り、５０ｍＭのｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液で完全に溶解させ、２５％の濃アンモニア水でｐＨを８．０に調整し、実施例５の方法に従って製造されたＤＡＡＯ酵素粗酵素溶液（１２Ｕ／ｍＬ）、０．２ｇの２０万Ｕ／ｇのカタラーゼ、実施例２により製造されたＬ−グルタミン酸脱水素突然変異体１（１Ｕ／ｍＬ）１５ｍＬ又はの粗酵素溶液（３Ｕ／ｍＬ）１４、及び実施例７の方法に従って製造されたグルコース脱水素酵素粗酵素液（１００Ｕ／ｍＬ）１ｍＬを添加し、グルホシネートの最終濃度が６００ｍＭ、塩化アンモニウムの最終濃度が６００ｍＭ、グルコースの最終濃度が３６０ｍＭ、ＮＡＤＰ+の最終濃度が０．０３ｍＭになるように、５０ｍＭのｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液で５０ｍＬまで定容した。反応中、アンモニア水でｐＨを８．０に制御し、３７℃の水浴で磁気で攪拌した後、空気を１ＶＶＭで通し（１分あたり１倍反応体積の空気）、泡立ちを防ぐために２００μＬの消泡剤を添加し、反応２４時間後に、イオンペアＨＰＬＣでＰＰＯの残存濃度を測定し、同時にプレカラム誘導体化による高速液体クロマトグラフィーでＬ−グルホシネートの生成量とｅｅ値を測定した。反応終了時のデータを表６に示す。
【０１０３】
【表８】
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【０１０４】
実施例１１  ＤＡＡＯ酵素及びＬ−グルタミン酸脱水素酵素変異体によって段階的触媒されてＬ−グルホシネートを製造
８０ｇのＤ、Ｌ−グルホシネートを量り取り、５０ｍＭのｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液で完全に溶解させ、５ｇの２００，０００Ｕ／ｇカタラーゼを添加し、実施例５に従って製造されたＤＡＡＯ酵素粗酵素溶液（１２Ｕ／ｍＬ）１５０ｍＬを添加し、アンモニア水でｐＨを８．０に調整し、５０ｍＭのｐＨ８．０のリン酸水素二ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム緩衝液で１Ｌに定容した。２０℃の水浴で機械で撹拌反応させた後、酸素を０．５ＶＶＭで通し（１分あたり０．５倍反応体積の酸素）、泡立ちを防ぐために１ｍＬの消泡剤を添加し、イオンペアＨＰＬＣでＰＰＯの生成濃度を測定し、同時にプレカラム誘導体化による高速液体クロマトグラフィーでＬ−グルホシネートの生成量とｅｅ値を測定し、ｅｅ値が９９％を超えると反応を停止させた。
上記反応液５０ｍＬを２等分取り、塩化アンモニウム０．５４ｇ、ＮＡＤＰ+０．４ｍｇ及びイソプロパノール０．７３ｇをそれぞれに添加し、実施例８の方法で製造されたアルコール脱水素酵素（３００Ｕ／ｍＬ）１ｍＬを添加し、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素突然変異体の粗酵素液１ｍＬをそれぞれに添加し、アンモニア水でｐＨを８．５に調整し、水浴で磁気撹拌しながら反応温度を３７℃に制御し、イオンペアＨＰＬＣでＰＰＯの残留濃度を検出し、同時にプレカラム誘導体化による高速液体クロマトグラフィーでＬ−グルホシネートの生成量とｅｅ値を測定した。反応終了時のデータを表７に示す。
【０１０５】
【表９】
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【０１０６】
以上、本発明の具体的な実施形態について説明したが、当業者であれば、これらは一例に過ぎず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の変更や修正が可能であることを理解されたい。したがって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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