(57)【要約】【課題】メラノーマの転移及び患者の予後を予測するための遺伝子シグネチャーに関する。【解決手段】本開示は、皮膚メラノーマに罹患している個体を分類する遺伝子シグネチャーを提供する。本明細書に提供される「ＳＬＮ遺伝子シグネチャー」は、予後に基づいて個体を分類する、及び／又は転移陽性若しくは陰性のセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）を有するとして個体を分類する。本明細書に提供される「Ｎ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャー」は、転移陽性又は陰性の非センチネルリンパ節（Ｎ−ＳＬＮ）を有するとして個体を分類する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体を分類する方法であって、前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することを含み、前記遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む、方法。
【請求項２】
皮膚メラノーマに罹患している個体のための治療及び／又は診断ワークアップスケジュールを決定する方法であって、前記個体からのサンプルにおいて、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上の発現レベルを決定することと、前記発現レベルに基づいて治療及び／又は診断ワークアップスケジュールを決定することとを含む方法。
【請求項３】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体の予後を予測する方法であって、前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することを含み、前記遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む、方法。
【請求項４】
前記個体は、転移陽性ＳＬＮを有するとして分類されるか、又は転移陰性ＳＬＮを有するとして分類される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記個体は、前記分類及び／又は発現レベルに基づいてＳＬＮＢのために選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
転移陽性ＳＬＮを有するとして分類された個体は、ＳＬＮＢを実施することによって治療される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記個体の予後は、前記遺伝子発現レベルに基づいて決定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記個体は、不良な予後又は良好な予後を有するとして分類される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＭＬＡＮＡ、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＡＤＩＰＯＱをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＰＲＫＣＢ、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１をさらに含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体を分類することであって、前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することを含む、分類すること、をさらに含み、前記遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１、ＬＯＸＬ３の少なくとも１つを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体を分類する方法であって、前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することを含み、前記遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３の少なくとも１つを含む、方法。
【請求項１６】
前記個体は、転移陽性Ｎ−ＳＬＮを有するか又は転移陰性Ｎ−ＳＬＮを有するとして分類される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
転移陽性Ｎ−ＳＬＮを有するとして分類された個体は、外科リンパ節郭清などの外科手順を実施することによって治療される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
転移陽性Ｎ−ＳＬＮを有するとして分類された個体は、前記個体に癌治療を提供することによって治療される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体を治療する方法であって、
−  前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することであって、前記遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む、決定することと、
−  前記遺伝子発現シグネチャーに基づいて、転移陽性ＳＬＮ及び／又は不良な予後を有するとして前記個体を分類することと、
−  ＳＬＮＢを実施することによって前記個体を治療すること、及び／又は前記個体に癌治療を提供することと
を含む方法。
【請求項２０】
前記遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＭＬＡＮＡ、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子発現は、ＡＤＩＰＯＱをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＰＲＫＣＢ、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１をさらに含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体を治療する方法であって、
−  前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することであって、前記遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３の少なくとも１つを含む、決定することと、
−  前記遺伝子発現シグネチャーに基づいて、転移陽性Ｎ−ＳＬＮを有する高いリスクとして前記個体を分類することと、
−  完全リンパ節郭清を実施することによって前記個体を治療すること、及び／又は前記個体に癌治療を提供することと
を含む方法。
【請求項２６】
前記分類する方法は、前記個体の年齢及び／又はブレスロー深さを決定すること、任意選択的にまたメラノーマ病変の潰瘍化を決定することをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルは、原発皮膚メラノーマ病変からの生検である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記発現は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの検出によって決定される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体において遺伝子シグネチャーを解析する方法であって、
−  前記個体からの原発皮膚メラノーマ病変からＲＮＡを抽出することと、
−  以下の遺伝子ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の少なくとも３つのＲＮＡ転写物を逆転写することであって、前記ＲＮＡ転写物のｃＤＮＡを生成する、ことと、
−  前記ＲＮＡ転写物の発現レベルの決定のために、前記ｃＤＮＡを増幅することであって、前記ｃＤＮＡからアンプリコンを生成する、ことと
を含む方法。
【請求項３０】
前記遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＭＬＡＮＡ、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＡＤＩＰＯＱをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子発現シグネチャーは、ＰＲＫＣＢ、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１をさらに含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
以下の遺伝子ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３の少なくとも１つのＲＮＡ転写物を逆転写することであって、前記ＲＮＡ転写物のｃＤＮＡを生成する、ことをさらに含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体において遺伝子シグネチャーを解析する方法であって、
−  前記個体からの原発皮膚メラノーマ病変からＲＮＡを抽出することと、
−  以下の遺伝子ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３の少なくとも１つのＲＮＡ転写物を逆転写することであって、前記ＲＮＡ転写物のｃＤＮＡを生成する、ことと、
−  前記ＲＮＡ転写物の発現レベルの決定のために、前記ｃＤＮＡを増幅することであって、前記ｃＤＮＡからアンプリコンを生成する、ことと
を含む方法。
【請求項３７】
定量ＰＣＲを用いて実施される、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記アンプリコン発現レベルは、前記サンプル中の少なくとも１つの参照ＲＮＡ転写物のｃＤＮＡからのアンプリコンのレベルに対して正規化されており、好ましくは、前記参照ＲＮＡ転写物は、ＡＣＴＢ、ＲＰＬＰ０及び／又はＲＰＬ８から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記アンプリコン発現レベルは、閾値サイクル（Ｃｔ）値である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記個体は、Ｔ１ａ又はＴ１ｂの薄いメラノーマを有し、好ましくは、前記個体は、Ｔ１ａの薄いメラノーマを有する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体の分類に使用するためのキットであって、
ａ）以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上、及び／又は
ｂ）以下の遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３の少なくとも１つ、並びに任意選択的に、
ｃ）少なくとも１つの参照遺伝子
を増幅するためのプライマー対を含むキット。
【請求項４２】
前記参照遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＲＰＬＰ０及び／又はＲＰＬ８である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、緩衝剤及びＭｇ２＋の１つ以上をさらに含む、請求項４１又は４２に記載のキット。
【請求項４４】
ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を増幅するためのプライマー対を含む、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４５】
ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を増幅するためのプライマー対を含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
ＭＬＡＮＡ、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１を増幅するためのプライマー対を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
ＡＤＩＰＯＱを増幅するためのプライマー対をさらに含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
ＰＲＫＣＢ、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１を増幅するためのプライマー対をさらに含む、請求項４６又は４７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、皮膚メラノーマに罹患している個体を分類する遺伝子シグネチャーを提供する。本明細書に提供される「ＳＬＮ遺伝子シグネチャー」は、予後に基づいて個体を分類し、及び／又は転移陽性若しくは陰性のセンチネルリンパ節（ＳＬＮ）を有するとして個体を分類する。本明細書に提供される「Ｎ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャー」は、転移陽性又は陰性の非センチネルリンパ節（Ｎ−ＳＬＮ）を有するとして個体を分類する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
皮膚メラノーマは、皮膚の表皮の基底層に主に位置する色素生成メラノサイト系細胞から生じる悪性腫瘍である。ほとんどの病変は、ＡＢＣＤＥルール：非対称性、境界不規則性、色ムラ、６ｍｍ超の直径及び進化（すなわち迅速変化傾向）によって記述される徴候を伴って現れる（Abbasi NR, Shaw HM, Rigel DS, et al. Early Diagnosis of Cutaneous Melanoma Revisiting the ABCD Criteria. JAMA. 2004;292(22):2771-2776）。部位は、典型的には、無症状であるが、掻痒及び／又は出血を引き起こすことがある（とりわけより後期のステージにおいて）。疑わしい病変の検出は、ＡＢＣＤＥ基準又は「アグリーダックリング徴候(ugly duckling sign)」に基づいてルーチンで実施することが推奨される皮膚の自己検査によって通常行われる（Grob J. The’Ugly Duckling’Sign: Identification of the Common Characteristics of Nevi in an Individual as a Basis for Melanoma Screening. Arch Dermatol. 1998;134:103-104）。複数の既知の臨床的及び病理学的な変種が存在するため、続いて医師によって正式にメラノーマと診断されたとき、特定のサブタイプを決定することが重要である。最も一般的な形態は、皮膚メラノーマであり（症例の約７０％を占める表在拡大型メラノーマ）、これは、色白の人々でとりわけ頻発している。病態の重症度は、原発領域からマイグレートするメラノーマ細胞の能力に大きく依存する。こうした理由から、腫瘍が局在しているか又はリンパ節若しくは器官に広がっているかを評価することは、最優先事項である。
【０００３】
メラノーマのステージ判定は、患者の予後並びにさらなるモニタリング及び治療のストラテジーの決定にきわめて重要である。これは、欧州９ヵ国の系統的文献レビューで報告された５年間の全生存数：９５％〜１００％（ステージＩ）、６５％〜９２．８％（ステージＩＩ）、４１％〜７１％（ステージＩＩＩ）及び９％〜２８％（ステージＩＶ）の顕著な対比にも反映される。これらの差は、局在メラノーマ病変に対比されるメラノーマの転移能に大きく依存する。異なるステージクラス間の正確な識別は、重要であり、最も一般的には、原発腫瘍の厚さ（Ｔ）、腫瘍細胞の存在及び／又はリンパ節への広がり（Ｎ）並びに他の器官への遠隔転移の存在（Ｍ）を参照するＴＮＭ系に基づく。原発腫瘍ステージの広がりを評価するとき、医師は、腫瘍の厚さだけでなく、潰瘍の存在及び原発腫瘍細胞の有糸分裂速度などの追加の特性を考慮に入れる。通常、厚いメラノーマ及び／又は他の変数、例えば潰瘍に基づいて、高い腫瘍ステージの患者でのみリンパ節及び転移の広がりが評価されるであろう。当技術分野で理解されているように、予後とは、患者の医学的アウトカムの予測を意味する。例えば、個体は、不良な予後又は良好な予後を有するとして分類され得る。メラノーマに罹患している患者の予後は、例えば、長期生存、全生存、無進行生存、再発対疾患寛解予測及び疾患進行の可能性を示唆する。
【０００４】
現在、患者の正確な層別化及び予後の予測に広く適用されている手順は、ＳＬＮＢ（センチネルリンパ節生検）法により、ＳＬＮにおける転移の存在を決定することである。皮膚メラノーマ患者の管理は、１９９０年代前半にＳＬＮＢ手順によるリンパ系マッピングが含められたことから著しく進歩した（Morton DL, Wen DR, Wong JH, et al. Technical details of intraoperative lymphatic mapping for early stage melanoma. Arch Surg. 1992;127(4):392-399）。外科技術は、青色色素と、γプローブ検出によるラジオトレーサーとを用いたデュアルモダリティー手術中アプローチの実現によって改善されてきた。加えて、病理学的評価は、ＳＬＮのシリアルセクショニングの採用と免疫組織化学とによってアップグレードされた。この結果、腫瘍に密に近接して位置する最初の所属リンパ節又はリンパ節群（すなわちＳＬＮ）、したがって転移疾患の可能性の高い部位が、より良好に同定されるようになった。この手順は、「センチネルリンパ節マッピング」ともいう。
【０００５】
ＳＬＮ陽性の有意な影響は、ＭＳＬＴ−１試験でも示され、腫瘍陽性ＳＬＮの患者及び腫瘍陰性ＳＬＮの患者の５年生存率がそれぞれ７２．３％及び９０．２％であり、差が示唆された（Morton DL, Thompson JF, Cochran AJ, et al. Sentinel-Node Biopsy or Nodal Observation in Melanoma. new engl J Med. 2006;355(13):1307-1317）。米国癌合同委員会（ＡＪＣＣ）メラノーマガイドライン第８版によれば、ＳＬＮＢ手順は、≧０．８ｍｍの皮膚メラノーマを有する患者について推奨される（Gershenwald JE, Scolyer RA, Hess KR, et al. Melanoma Staging: Evidence-Based Changes in the American Joint Committee on Cancer Eighth Edition Cancer Staging Manual. CA Cancer J Clin. 2017;67(6):472-492）。この患者群では、ＳＬＮＢ手順が一般に実施され、さらに、治療は、転移レベルに依存する。ボーダーライン群内では、ＳＬＮＢは、特にメラノーマが追加の有害予後パラメーターを伴って現れる場合に考慮され得る。＜０．８ｍｍのメラノーマの厚さを有する患者では、標準的治療で十分であると一般に考えられ、ＳＬＮＢは、推奨されない。標準的治療は、マージンを広くとった原発メラノーマの局所切除、すなわち腫瘍の外科切除を含む。本明細書で用いられる場合、「切除」とは、ヒト患者からのメラノーマ特有悪性組織の外科除去を意味するものと理解される。一実施形態によれば、切除とは、利用可能な方法で前記患者内の残留悪性組織の存在が検出不能であるような悪性組織の除去を意味すると理解されるものとする。
【０００６】
ＳＬＮＢが陽性として分類される割合は、かなり変動しやすく、原発腫瘍の既知の予後因子にかなりの程度依存する。臨床ステージＩ又はＩＩの患者では、ＳＬＮ転移のパーセントは、１５〜３０％であるが、薄いメラノーマでは５．２％であることが示される。メラノーマ専門家パネルステージ判定ガイドラインの現行版には、０．８ｍｍのＴ１メラノーマのサブカテゴリー化の臨床的意義が指摘された。これは、０．７〜０．８ｍｍの領域に潜在的臨床インターセプトが存在するという、Ｔ１メラノーマのいくつかの生存試験で検出された傾向に基づく。しかしながら、ＳＬＮＢ後の患者の長期フォローアップに基づいて、当初、腫瘍フリーであったセンチネル節を有する患者において局所節再発が起こることが示された。この情報は、ＳＬＢＮ試験性能の計算を可能にし、１２．５％の全偽陰性率を有することが確立された。より最近、Mortonらは、１６．０％陽性のＳＬＮＢを有する中間厚さのメラノーマでは、１０年間のフォローアップ期間内の再発に基づいて４．８％が偽陰性試験結果を有すると報告した。厚いメラノーマの３２．９％陽性のＳＬＮＢでは、偽陰性率は、１０．３％であった。
【０００７】
ＳＬＮＢは、皮膚メラノーマのステージを潜在的に判定する方法であるだけでなく、ＳＬＮの転移分類に依存して必要であることもそうでないこともある治療の一部でもある。ＳＬＮＢ手順は、患者に合併症を引き起こす可能性があるうえにコストがかかる。したがって、この手順は、（低リスク病変の大多数から）転移の広がるリスクがより高いと考えられる選択された患者群のみに実施される。転移リスクは、ブレスロー深さとして知られる腫瘍浸潤深さ及び腫瘍表面の潰瘍化をはじめとする臨床病理学的因子の評価によって評価され得る。皮膚中に垂直により深く成長する腫瘍及びメラノーマの潰瘍化は、有害アウトカムのより高いリスクに関連付けられる。例えば、ＳＬＮ生検は、Ｔ１ａの薄いメラノーマで推奨されず、Ｔ１ｂの薄いメラノーマの患者では「推奨されることがあり」、Ｔ２及びＴ３の中間厚さのメラノーマ患者では推奨され、且つＴ４の厚いメラノーマ患者では「推奨されることがある」。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
臨床病理学的変数を用いたこの概念では、腫瘍スペクトルの最端の高リスク患者の同定は、一般に可能であるが、本方法は、中間病変には正確でない。さらに、高又は低リスク群内に例外も存在する。例えば、「薄い」メラノーマ（＜０．８ｍｍの浸潤深さ）は、標準臨床病理学的変数に基づいて低リスクプロファイルを有すると通常分類されるという事実にもかかわらず、その５％は、局所転移することが知られている。９５％の生物学的緩慢病変からより高リスクの病変をより良好に識別するために、腫瘍の有糸分裂速度（有糸分裂／ｍｍ２）などの追加の組織学的変数及び蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などの追加の分子的方法が導入されてきた。残念ながら、これらの技術は、部分的にのみ成功したにすぎず、ＳＬＮＢの９５％まで陰性であるという事実をもたらす結果となった。結果として、現在の診断基準では過剰治療が見られ、患者の大多数は、不必要なＳＬＮＢ手術を受け、回避することができた関連副作用を発生させる。逆に、臨床病理学的因子に基づいて現在のところＳＬＮＢではないとみなされる患者の一部は、それでもなおより後期のステージでＳＬＮ転移又は遠隔転移を呈する可能性がある。したがって、ＳＬＮＢ手順は、切除組織でＳＬＮ陽性節を正確に同定するが、このＳＬＮＢ手順の適格患者の選択には、依然として課題が残っている。本発明の１つの目的は、転移陽性ＳＬＮを有するリスク、したがってＳＬＮＢ手順の必要性に関して個体を分類することである。本発明のさらなる目的は、原発皮膚メラノーマに罹患している個体の予後を予測することである。この情報は、例えば、最適な治療ストラテジーの決定に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、原発皮膚メラノーマに罹患している個体を分類する方法であって、前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することを含み、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む、方法を提供する。好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を含む。好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む。同様に好ましいのは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む遺伝子シグネチャーである。
【００１０】
皮膚メラノーマに罹患している個体のための治療及び／又は診断ワークアップスケジュールを決定する方法であって、前記個体からのサンプルにおいて、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上の発現レベルを決定することと、発現レベルに基づいて治療及び／又は診断ワークアップスケジュールを決定することとを含む方法も提供される。好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を含む。好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む。同様に好ましいのは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む遺伝子シグネチャーである。
【００１１】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体の予後を予測する方法であって、前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することを含み、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む、方法も提供される。好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む。同様に好ましいのは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む遺伝子シグネチャーである。
【００１２】
一態様では、個体は、転移陽性ＳＬＮを有するとして分類されるか、又は転移陰性ＳＬＮを有するとして分類される。一態様では、個体の予後は、遺伝子発現レベルに基づいて決定される。好ましくは、個体は、不良な予後又は良好な予後を有するとして分類される。個体は、前記分類及び／又は発現レベルに基づいてＳＬＮＢのために選択され得る。転移陽性ＳＬＮを有するか又はさもなければ不良な予後を有するとして分類された個体は、ＳＬＮＢ及び／又はアジュバント治療を実施することによって治療される。
【００１３】
本発明は、原発皮膚メラノーマに罹患している個体を分類する方法であって、前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することを含み、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３の少なくとも１つを含む、方法も提供する。
【００１４】
さらに提供されるのは、原発皮膚メラノーマに罹患している個体を治療する方法であって、
−  前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することであって、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む、決定することと、
−  遺伝子発現シグネチャーに基づいて、転移陽性ＳＬＮ及び／又は不良な予後を有するとして前記個体を分類することと、
−  ＳＬＮＢを実施することによって前記個体を治療すること、及び／又は前記個体に癌治療を提供することと
を含む方法である。
【００１５】
好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を含む。好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む。同様に好ましいのは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む遺伝子シグネチャーである。
【００１６】
本発明は、原発皮膚メラノーマに罹患している個体を治療する方法であって、
−  前記個体からのサンプルにおいて遺伝子発現シグネチャーを決定することであって、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３の少なくとも１つを含む、決定することと、
−  遺伝子発現シグネチャーに基づいて、転移陽性Ｎ−ＳＬＮを有する高いリスクとして前記個体を分類することと、
−  完全リンパ節郭清を実施することによって前記個体を治療すること、及び／又は前記個体に癌治療を提供することと
を含む方法も提供する。
【００１７】
原発皮膚メラノーマに罹患している個体において遺伝子シグネチャーを解析する方法であって、
−  前記個体からの原発皮膚メラノーマ病変からＲＮＡを抽出することと、
−  以下の遺伝子ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の少なくとも３つのＲＮＡ転写物を逆転写することであって、ＲＮＡ転写物のｃＤＮＡを生成する、ことと、
−  ＲＮＡ転写物の発現レベルの決定のために、ｃＤＮＡを増幅することであって、ｃＤＮＡからアンプリコンを生成する、ことと
を含む方法も提供される。
【００１８】
本発明は、原発皮膚メラノーマに罹患している個体において遺伝子シグネチャーを解析する方法であって、
−  前記個体からの原発皮膚メラノーマ病変からＲＮＡを抽出することと、
−  以下の遺伝子ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３の少なくとも１つのＲＮＡ転写物を逆転写することであって、ＲＮＡ転写物のｃＤＮＡを生成する、ことと、
−  ＲＮＡ転写物の発現レベルの決定のために、ｃＤＮＡを増幅することであって、ｃＤＮＡからアンプリコンを生成する、ことと
を含む方法も提供する。
【００１９】
さらに提供されるのは、原発皮膚メラノーマに罹患している個体の分類に使用するためのキットであって、
ａ）以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上、及び／又は
ｂ）以下の遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３の少なくとも１つ、並びに任意選択的に、
ｃ）少なくとも１つの参照遺伝子
を増幅するためのプライマー対を含むキットである。
【００２０】
好ましくは、キットは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を増幅するためのプライマー対を含み、より好ましくは、キットは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を増幅するためのプライマー対を含む。好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む。同様に好ましいのは、以下の遺伝子：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の３つ以上を含む遺伝子シグネチャーである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】１）ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８遺伝子シグネチャー（分子モデル）、２）臨床病理学的変数（年齢及びブレスロー深さ）、３）ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８遺伝子シグネチャーと臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされたロジスティック回帰分類器の平均ＲＯＣ曲線である。ｘ軸は、偽陽性発見率（すなわち１−特異度）を表し、ｙ軸は、真発見率（すなわち感度）を表す。
【図２】全７７０名の患者コホートにおけるＩＴＬＰスコア及びＳＬＮ遺伝子シグネチャー（「ロジスティック回帰モデル」という）についてのＲＯＣ曲線である。ｘ軸は、偽陽性発見率（すなわち１−特異度）を表し、ｙ軸は、真発見率（すなわち感度）を表す。
【図３】異なるＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８遺伝子のサブセット、５つのＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８遺伝子のフルセット並びにＩＴＬＰシグネチャーについてのＲＯＣ曲線下面積のボックスプロットである。
【図４】１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされたロジスティック回帰分類器の平均ＲＯＣ曲線である。ｘ軸は、偽陽性発見率（すなわち１−特異度）を表し、ｙ軸は、真発見率（すなわち感度）を表す。
【図５】異なる遺伝子のサブセット及び４つの遺伝子のフルセットについてのＲＯＣ曲線下面積のボックスプロットである。
【図６】全体性能比較：ＣＬ対ＧＥ対ＧＥＣＬ。１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされたロジスティック回帰分類器のＲＯＣ曲線である。
【図７】ＮＰＶ対ＳＬＮＢＲＲ。１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされたロジスティック回帰分類器の陰性的中率（ＮＰＶ）対センチネルリンパ節低減率（ＳＬＮＢ  ＲＲ）である。
【図８】遺伝子サブセット−ＡＵＣボックスプロットである。全コホートでトレーニングされた２、３、４、５、６、７、８つの遺伝子のサブセットを用いたロジスティック回帰分類器のＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）のボックスプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
開示される実施形態の詳細な説明
本開示は、部分的には、原発皮膚メラノーマ腫瘍組織サンプルの解析を行う方法、キット、遺伝子シグネチャー及びかかる遺伝子シグネチャーの検出手段を提供する。一態様では、本開示は、「ＳＬＮ遺伝子シグネチャー」を提供する。ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、原発皮膚メラノーマに罹患している個体を分類し、特に、遺伝子シグネチャーは、転移陽性ＳＬＮ及び／又は不良な予後を有する個体のリスクを分類する。このリスク評価は、ＳＬＮＢ手順及び／又は代替治療ストラテジーが必要とされるかを決定するときに医師及び患者に有用である。この評価は、臨床試験に含めるべき患者を選択するときにも有用である。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、ＳＬＮは、腫瘍からリンパ排液を受け取る最初のリンパ節（又は最初のリンパ節セット）であり、癌の広がる可能性が高い最初のリンパ節（又は最初のリンパ節セット）である。Ｎ−ＳＬＮは、腫瘍からリンパ排液を受け取る最初のリンパ節ではないリンパ節である。かかるＮ−ＳＬＮは、多くの場合、同一節区域にあるか又はＳＬＮに密に近接する節である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、転移陽性ＳＬＮのリスクを分類する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、転移陽性ＳＬＮを有するか又は転移陰性ＳＬＮを有するとして個体を分類する。いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、個体の予後を分類する。本明細書で用いられる場合、予後は、医学的アウトカムの予測を意味し、全生存、メラノーマ特異的生存、無再発生存、無再燃生存、無遠隔再燃生存(distant relapse free survival)などの尺度に基づき得る。
【００２５】
ＳＬＮ遺伝子シグネチャーの利点の１つは、転移陰性ＳＬＮとして分類された（及び／又は良好な予後を有するとして分類された）患者に対する外科手順の回数を低減させ得ることである。特に、中間病変を有する患者は、ＳＬＮが事実上転移陰性の可能性が十分にあっても、ＳＬＮＢ手順を受けた可能性が高いであろう。ＳＬＮ遺伝子シグネチャーを用いたかかる患者の正確な分類は、ＳＬＮＢ手順の必要性を回避し、ＳＬＮＢを置き換えて、中間病変に対する現在の標準ケアとして使用され得る。不必要なＳＬＮＢの低減は、全ヘルスケアコストを低減し、ＳＬＮの除去に起因して合併症を抱える患者数を低減する。加えて、ＳＬＮ転移陽性又は陰性の個体の分類は、予後情報も提供し、治療又は診断ワークアップスケジュールを決定するために使用され得る。
【００２６】
驚くべきことに、ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、標準ケアＳＬＮ生検よりも正確に予後を予測することができる（実施例７を参照されたい）。理論によって拘束されることを望むものではないが、ＳＬＮ生検を上回る遺伝子シグネチャーの改善された予後予測能についての可能な説明の１つは、かかる生検を実施する技術的限界（例えば、生検についての適正リンパ節の同定、腫瘍細胞検出の限界、サンプル処理／分類のヒューマンエラー）に関する。追加的又は代替的に、本開示の遺伝子シグネチャーは、生検で検出可能になる前のステージでＳＬＮ転移を予測可能であり得る（例えば、腫瘍が転移しており、腫瘍細胞は、ＳＬＮに至る経路にある）。これに関連して、ＳＬＮシグネチャーは、ＳＬＮＢを置き換えて、臨床試験及び／又は追加治療に含めるべき基準として使用され得る。
【００２７】
ＳＬＮ遺伝子シグネチャーのさらなる利点は、現在の標準ケアでは臨床パラメーターに基づいてＳＬＮＢに適格でないことがあり得るが、遺伝子シグネチャーに基づいて、転移陽性ＳＬＮのリスクが高い、薄い厚さのメラノーマを有する患者を同定できることである。特に、遺伝子シグネチャーは、現在のところガイドラインに準拠してＳＬＮＢ手順に適格でない薄い（＜０．８ｍｍ）メラノーマ患者において、転移陽性ＳＬＮの同定を大幅に増加させるであろう。かかる患者の早期検出及び治療は、この患者サブ集団について無進行生存及び全生存を増加させるであろう。
【００２８】
本明細書に開示される実施例は、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の１つ以上を含む遺伝子発現シグネチャー（すなわちＳＬＮ遺伝子シグネチャー）が、個体の分類及び予後の予測、特に転移陽性又は陰性のＳＬＮの分類に有用であることを実証する。そのため、一態様では、本開示は、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の１つ以上、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上を含む遺伝子シグネチャーを提供する。好適な遺伝子シグネチャーは、以下の組合せ：ＩＴＧＢ３及びＰＬＡＴ、ＩＴＧＢ３及びＳＰＰ１、ＩＴＧＢ３及びＧＤＦ１５、ＩＴＧＢ３及びＩＬ８、ＰＬＡＴ及びＳＰＰ１、ＰＬＡＴ及びＧＤＦ１５、ＰＬＡＴ及びＩＬ８、ＳＰＰ１及びＧＤＦ１５、ＳＰＰ１及びＩＬ８、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ並びにＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の４つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８のすべてを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子発現シグネチャーは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を含む。好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、以下：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＳＰＰ１及びＩＬ８の少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つを含む。好ましくは、遺伝子シグネチャーは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、以下：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ又はすべてを含む。本発明者らは、ＡＤＩＰＯＱの欠如した遺伝子シグネチャーが同様の性能を示すことも実証する。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、以下：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ又はすべてを含む。ある実施形態では、遺伝子シグネチャーは、
−  ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＩＬ８、ＭＬＡＮＡ並びにＬＯＸＬ４及びＳＥＲＰＩＮＥ２の一方又は両方、
−  ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＩＬ８、ＭＬＡＮＡ並びにＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１の一方又は両方、
−  ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＩＬ８並びにＭＬＡＮＡ及びＴＧＦＢＲ１の一方又は両方、
−  ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＩＬ８並びにＴＧＦＢＲ１及びＳＥＲＰＩＮＥ２の一方又は両方、
−  ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＩＬ８、ＳＥＲＰＩＮＥ２並びにＬＯＸＬ４及びＴＧＦＢＲ１の一方又は両方、
−  ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＩＬ８、ＬＯＸＬ４、
−  ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＩＬ８、ＳＥＲＰＩＮＥ２、
−  ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＩＬ８、ＴＧＦＢＲ１、又は
−  ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＩＬ８、ＭＬＡＮＡ
を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、以下：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１又はすべてを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、以下：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０又はすべてを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、上述の遺伝子からなる。当業者に理解されるように、ＳＬＮ遺伝子シグネチャーが上述の遺伝子からなるとき、解析を実施する方法は、追加の遺伝子（例えば、正規化用）の発現を測定することを含み得るが、個体を分類するために遺伝子シグネチャーのみが使用される。
【００３３】
ＩＴＧＢ３遺伝子は、インテグリンβ−３をコードする。例示的なホモ・サピエンス（Homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿０００２１２．２（２０１８年６月１７日）の下に見出され得る。
【００３４】
ＰＬＡＴ遺伝子は、プラスミノーゲンアクチベーター（組織型）をコードする。例示的なホモ・サピエンス（Homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００１３１９１８９．１（２０１８年７月１日）の下に見出され得る。
【００３５】
ＳＰＰ１遺伝子は、分泌リンタンパク質１をコードする。例示的なホモ・サピエンス（Homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００１０４００５８．１（２０１８年６月２４日）の下に見出され得る。
【００３６】
ＧＤＦ１５遺伝子は、成長分化因子１５をコードする。例示的なホモ・サピエンス（Homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００４８６４．３（２０１８年６月１７日）の下に見出され得る。
【００３７】
ＩＬ８遺伝子は、インターロイキン８をコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＡＦ０４３３３７．１（２００１年２月１日）の下に見出され得る。
【００３８】
ＭＬＡＮＡ遺伝子は、メラン−Ａをコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００５５１１（２０１８年１０月２０日）の下に見出され得る。
【００３９】
ＬＯＸＬ４遺伝子、リシルオキシダーゼ様４をコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿０３２２１１（２０１８年１１月２２日）の下に見出され得る。
【００４０】
ＡＤＩＰＯＱ遺伝子は、アディポネクチン（Ｃ１Ｑ及びコラーゲンドメイン含有）をコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００４７９７（２０１８年１２月２日）の下に見出され得る。
【００４１】
ＰＲＫＣＢ遺伝子は、プロテインキナーゼＣβをコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿２１２５３５（２０１８年１１月１２日）の下に見出され得る。
【００４２】
ＳＥＲＰＩＮＥ２遺伝子は、セルピンファミリーＥメンバー２をコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００６２１６（２０１８年１１月１７日）の下に見出され得る。
【００４３】
ＡＤＡＭ１２遺伝子は、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２をコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００３４７４（２０１８年８月５日）の下に見出され得る。
【００４４】
ＬＧＡＬＳ１遺伝子は、ガレクチン１をコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００２３０５（２０１８年１１月２２日）の下に見出され得る。
【００４５】
ＴＧＦＢＲ１遺伝子は、トランスフォーミング成長因子βレセプター１をコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００４６１２（２０１８年１０月２８日）の下に見出され得る。
【００４６】
本開示は、個体を分類する方法であって、サンプル中のＳＬＮ遺伝子シグネチャーを決定することを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、個体は、転移陽性ＳＬＮ又は転移陰性ＳＬＮを有するとして分類され得る。他の一実施形態では、個体は、良好又は不良な予後を有するとして分類され得る。ＳＬＮ転移に関連付けられた遺伝子シグネチャーは、以前に報告された（Meves et al. J Clinical Oncology 2015 33:2509-2516）。アルゴリズムは、４つの遺伝子ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＰＬＡＴ及びＴＰ５３の原発メラノーマ遺伝子発現と組み合わせて、臨床病理学的変数の年齢、ブレスロー深さ及び潰瘍化を用いることにより、ＳＬＮ転移を予測する。図３に示されるように、本ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、これまで報告されたシグネチャーよりも優れた性能を示す。
【００４７】
一態様では、本開示は、「Ｎ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャー」を提供する。Ｎ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、原発皮膚メラノーマに罹患している個体を分類し、特に、遺伝子シグネチャーは、転移陽性非センチネルリンパ節（Ｎ−ＳＬＮ）を有する個体のリスクを分類する。このリスク評価は、治療選択肢を決定するとき及び患者の予後を決定するうえで医師及び患者に有用である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、Ｎ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、転移陽性Ｎ−ＳＬＮのリスクを分類する。個体は、転移陽性Ｎ−ＳＬＮ又は転移陰性Ｎ−ＳＬＮを有するとして分類され得る。遠隔位置のリンパ節への腫瘍細胞の浸潤は、予後不良のインジケーターであり、よりアグレッシブな形態の治療の使用を示唆する。早期検出及び治療は、患者のアウトカムを改善すると予想される。
【００４９】
本明細書に開示される実施例は、以下の遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１、ＬＯＸＬ３の１つ以上を含む遺伝子発現シグネチャー（すなわちＮ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャー）が、特に転移陽性Ｎ−ＳＬＮのリスクを決定するための個体の分類に有用であることを実証する。そのため、一態様では、本開示は、以下の遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１、ＬＯＸＬ３の少なくとも１つを含む遺伝子シグネチャーを提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、以下の遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１、ＬＯＸＬ３の少なくとも２つ又は少なくとも３つを含む。いくつかの実施形態では、Ｎ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１、ＬＯＸＬ３を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、上述の遺伝子からなる。当業者に理解されるように、Ｎ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャーが上述の遺伝子からなるとき、解析を実施する方法は、追加の遺伝子（例えば、正規化用）の発現を測定することを含み得るが、個体を分類するために遺伝子シグネチャーのみが使用される。いくつかの実施形態では、Ｎ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、皮膚メラノーマの再発(recurrence)／再燃(relapse)を患っており、及び／又はすでにＳＬＮ生検を受けた個体において決定される。
【００５０】
ＫＲＴ１４遺伝子は、ケラチン１４をコードする。例示的なホモ・サピエンス（Homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿０００５２６．４（２０１８年６月１７日）の下に見出され得る。
【００５１】
ＦＮ１遺伝子は、フィブロネクチン１をコードする。例示的なホモ・サピエンス（Homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００１３０６１２９．１（２０１８年６月３日）の下に見出され得る。
【００５２】
ＬＯＸＬ３遺伝子は、リシルオキシダーゼ様３をコードする。例示的なホモ・サピエンス（homo sapiens）ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベースのＮＭ＿００１２８９１６５．１（２０１８年６月３０日）の下に見出され得る。
【００５３】
本開示は、個体を分類する方法であって、サンプル中のＮ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャーを決定することを含む方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、個体は、転移陽性Ｎ−ＳＬＮ又は転移陰性Ｎ−ＳＬＮを有するとして分類され得る。いくつかの実施形態では、ＳＬＮ遺伝子シグネチャー及びＮ−ＳＬＮ遺伝子シグネチャーの両方を決定する方法が提供される。
【００５４】
本明細書に開示される遺伝子シグネチャーの解析は、哺乳動物及びヒトを含めていずれかの個体で実施され得るが、ヒトが好ましい。いくつかの実施形態では、個体は、Ｔ１〜Ｔ３の皮膚メラノーマを有すると診断されている。いくつかの実施形態では、個体は、特に遺伝子シグネチャーがＳＬＮ遺伝子シグネチャーであるとき、原発メラノーマのＳＬＮの生検を依然として受けていない。遺伝子シグネチャーは、低年齢、高有糸分裂速度（例えば、２／ｍｍ２超）、疾患の既往歴、アウトカム不良疾患の家族歴及び／又はリンパ管浸潤を有する個体を分類するのに特に有用である。
【００５５】
遺伝子発現シグネチャーは、腫瘍細胞がＳＬＮ又はＮ−ＳＬＮに転移しているリスク又はその可能性を予測するのに有用である。当業者に明らかであるように、個体の分類とは、リスクがあると予測された全患者の１００％が、事実上、検出可能な転移を有することを意味するものでもなく（感度又は陽性パーセント一致ともいう）、転移を有していないと予測された全患者の０％が、事実上、明らかに転移があることを意味するものでもなく（特異度又は陰性パーセント一致ともいう）、その確率又は「リスク」を意味する。実施例に開示されるように、ＳＬＮ及びＮ−ＳＬＮの遺伝子発現シグネチャーは、感度及び特異度の両方で高性能レベルを呈する。実施例に開示されるように、ＳＬＮ遺伝子シグネチャーは、メラノーマに罹患している個体の予後を標準ケアＳＬＮ生検よりも良好に予測することができる。そのため、本開示は、遺伝子発現シグネチャーが個体の予後を予測するのに有用であることを実証する。
【００５６】
当業者に公知のように、転移疾患の体積によって測定される転移の負荷は、個体によって異なり得る。いくつかの実施形態では、転移は、腫瘍細胞クラスターの存在を意味し、孤立した又は稀な腫瘍細胞のみを含有するリンパ節を含まない。いくつかの実施形態では、転移は、リンパ節外浸潤(extra-capsular extension)あり又はなしのいずれかで直径が少なくとも０．１ｍｍの細胞クラスターの存在を意味する。
【００５７】
遺伝子発現を決定するのに好適なサンプルを得ることは、当業者の能力の範囲内である。好適なサンプルとしては、原発皮膚メラノーマ病変生検が挙げられる。かかる生検は、切除病変（例えば、腫瘍の広範な切除除去）を含む。サンプルは、遺伝子発現プロファイリングに適合可能であるように、当技術分野で公知のいずれかの手段によって処理又は保持され得る。例えば、サンプルは、ホルマリン固定パラフィン包埋原発皮膚メラノーマ病変生検及びフリーズサンプルであり得る。
【００５８】
好ましくは、サンプルは、ＲＮＡ含有サンプルである。ｍＲＮＡ抽出の一般的方法は、当技術分野で周知であり、Ausubel et al. (1997) Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sonsをはじめとする分子生物学の標準的教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出方法は、例えば、Rupp & Locker (1987) Lab Invest. 56:A67及びDe Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995)に開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、製造業者の説明書に従い、Qiagenなどの商業製造業者からの精製キット、緩衝剤セット及びプロテアーゼを用いて実施することができる（QIAGEN Inc., Valencia, Calif.）。例えば、全ＲＮＡは、Qiagen RNeasyミニカラムを用いて培養下の細胞から単離することができる。多くのＲＮＡ単離キットが市販されており、本発明の方法に使用され得る。
【００５９】
本明細書に開示される方法は、遺伝子発現シグネチャーを決定することを含む。特に、本方法は、遺伝子発現レベルを決定することを含む。遺伝子発現レベルは、核酸又はタンパク質の発現レベルを測定することによって決定され得る。好ましくは、ｍＲＮＡ発現レベルが決定される。いくつかの実施形態では、核酸又はタンパク質は、サンプルから精製され、遺伝子発現は、核酸又はタンパク質の発現解析によって測定される。タンパク質発現レベルは、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、プロテオミック及び質量分析をはじめとする当技術分野で公知のいずれかの方法によって決定され得る。
【００６０】
好ましくは、核酸発現レベルが決定される。核酸発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、遺伝子シーケンシング、特にＲＮＡシーケンシング及び遺伝子発現プロファイリング技術をはじめとする当技術分野で公知のいずれかの方法によって決定され得る。シーケンシングベース遺伝子発現解析の代表的方法としては、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）及び大規模並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析が挙げられる。
【００６１】
好ましくは、核酸は、ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡなどのＲＮＡである。当業者によって理解されるように、決定されるＲＮＡ発現レベルは、直接的に検出され得るか、又は最初にｃＤＮＡ生成及び／又はＲＮＡ／ｃＤＮＡ増幅などを行って間接的に決定され得る。いくつかの実施形態では、原発メラノーマサンプルを得、組織サンプルからＲＮＡを抽出し、続いて対象遺伝子（例えば、バイオマーカー及びハウスキーピング遺伝子）のＲＮＡ転写物を逆転写して、ＲＮＡ転写物のｃＤＮＡを生成し、且つＲＮＡ転写物の発現レベルの決定のために、ｃＤＮＡを増幅してｃＤＮＡからアンプリコンを生成する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、NanoString遺伝子発現解析によって決定され得る。NanoStringは、遺伝子発現を検出する多重化法であり、転写も増幅も用いないｍＲＮＡの直接測定法を提供する。NanoString及びその態様は、Geiss et al.,“Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs”Nature Biotechnology 26, 317-325 (2008)に記載されている。
【００６３】
発現レベルは、絶対値である必要はなく、むしろ正規化発現値又は相対値であり得る。例えば、発現レベルは、ハウスキーピング又は参照遺伝子発現に対して正規化され得る。かかる遺伝子としては、ＡＢＣＦ１、ＡＣＴＢ、ＡＬＡＳ１、ＣＬＴＣ、Ｇ６ＰＤ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１、ＬＤＨＡ、ＰＧＫ１、ＰＯＬＲ１Ｂ、ＰＯＬＲ２Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬＰＯ、ＳＤＨＡ、ＴＢＰ及びＴＵＢＢが挙げられる。
【００６４】
正規化は、マイクロアレイデータに基づいて発現が決定されるときにも有用である。正規化は、異なるチップからのデータの同時解析が可能であるように、マイクロアレイ内及びサンプル全体の変動の補正を可能にする。ロバストマルチアレイ解析（ＲＭＡ）アルゴリズムは、すべてのサンプルについてプローブセットデータを遺伝子発現レベルに前処理するために使用され得る。（Irizarry R A, et al., Biostatistics (2003)及びIrizarry R A, et al., Nucleic Acids Res. (2003)）。加えて、Affymetrixデフォルト前処理アルゴリズム（MAS 5.0）も採用され得る。発現データを正規化する追加の方法は、米国特許出願公開第２００６０１３６１４５号に記載されている。
【００６５】
いくつかの実施形態では、発現レベルは、リアルタイムＰＣＲ（すなわち定量ＰＣＲ又はｑＰＣＲ）を用いて決定される。リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）では、反応は、固定サイクル数後の標的蓄積量ではなく、標的の増幅が最初に検出されるサイクル処理時の時間点によって特徴付けられる。シグナルが最初に検出されるこの点は、閾値サイクル（Ｃｔ）といわれる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャー発現は、ハウスキーピング遺伝子の平均Ｃｔからシグネチャー遺伝子のＣｔを減算して、ハウスキーピング遺伝子発現に対する正規化によって互いに定量される。いくつかの実施形態では、次いで、これらのΔＣｔ値は、ＳＬＮ転移の予測を計算するアルゴリズムで患者の年齢及びメラノーマ病変のブレスロー深さと組み合わされる。いくつかの実施形態では、正規化に使用されるハウスキーピング遺伝子は、ＡＣＴＢ、ＲＰＬＰ０及びＲＰＬ８である。しかしながら、他のハウスキーピング遺伝子も使用され得る。続いて、遺伝子発現シグナルの比は、患者ＳＬＮＢのアウトカム予測を計算するアルゴリズムで臨床変数と組み合わされる。結果は、二元分類（陰性又は陽性）で表される。「陰性」結果は、個体が転移陽性ＳＬＮの低いリスクを有するか、又はさもなければ個体が良好な予後を有することを示唆するが、「陽性」結果は、個体が転移陽性ＳＬＮの高いリスク又はさもなければ不良な予後を有することを示唆する。
【００６７】
本明細書に記載の方法は、遺伝子発現シグネチャーに基づいて個体を分類する。いくつかの実施形態では、個体における１つ以上のシグネチャー遺伝子の差次的発現は、個体が転移のリスクがあることを示唆するか又はさもなければ個体の予後を示唆する。本明細書で用いられる場合、「差次的発現」とは、対象において測定される発現レベルが参照と有意に異なることを意味する。参照は、単一値又は数値範囲であり得る。適切な参照値を決定することは、当業者の可能な範囲内である。いくつかの実施形態では、参照値は、あらかじめ決められた値である。いくつかの実施形態では、参照値は、特定の患者クラスの発現値の平均である。例えば、参照値は、臨床的に確認されたＳＬＮ転移を有する患者（又はＮ−ＳＬＮシグネチャーでは、臨床的に確認されたＮ−ＳＬＮ転移を有する患者）のクラスにおける発現値の平均であり得る。参照値はまた、式の形態をとり得るか又は式から導出され得る。患者における発現レベルが参照と「有意に」異なるかを決定することは、当業者の可能な範囲内である。
【００６８】
例示的な実施形態では、参照値は、実施例に記載のようにＳＬＮＢを受けたメラノーマ患者のコホートから決定される。類似の試験からのデータも使用し得ることは、当業者に明らかである。
【００６９】
差次的発現遺伝子の発現レベルと特異的患者反応クラスとの間の相関強度は、統計的有意性検定によって決定され得る。例えば、χ２検定を用いてχ２値を各差次的発現マーカーに割り当てることにより、特異的患者反応クラスについてのそのマーカーの発現の相関強度を示唆し得る。同様に、ｔ−統計メトリック及びWilkinsメトリックの両方は、マーカーの発現とその特異的患者反応クラスとの間の相関強度の指標となる値又はスコアを提供する。加えて、相関強度を決定するためにＳＡＭ又はＰＡＭ解析ツールが使用され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、個体からの遺伝子発現シグネチャーは、個体からの遺伝子発現シグネチャーが参照プロファイルに十分に類似しているかを決定するために参照発現シグネチャーと比較される。代替的に、個体からの遺伝子発現シグネチャーは、個体からの遺伝子発現プロファイルに最も類似した参照発現プロファイルを選択するために複数の参照発現シグネチャーと比較される。２つ以上のデータセットを比較してそれらの間の類似性を検出する当技術分野で公知のいずれの方法も、個体からの遺伝子発現シグネチャーを参照発現プロファイルと比較するために使用され得る。
【００７１】
機械学習及び統計学では、分類とは、カテゴリーメンバーシップが既知である観測（又はインスタンス）を含有するトレーニングデータセットに基づいて、新たな観測がいずれのカテゴリーセットに属するかを同定することを意味する。とりわけ、具体的な実現形態で分類を実現するアルゴリズムは、分類器として知られる。限定されるものではないが、ＣｌａＮＣ、最近傍平均識別器、加重投票法、単純ベイズ分類器、線形判別分析（ＬＤＡ）、二次判別分析（ＱＤＡ）、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）、ｋ最近傍（ｋ−ｎｎ）分類器など、線形又は非線形の分類器境界を用いた多くの分類器が当技術分野で公知である。好ましい実施形態では、ロジスティック回帰分類器が使用される。ロジスティック回帰分類器を実現する例示的な実施形態は、実施例に記載される。
【００７２】
当業者によって理解されるように、遺伝子発現シグネチャーのトレーニングは、感度又は特異度に有利であるように実施され得る。感度とは、それ自体適正に同定される実陽性の割合を意味し、偽陰性（例えば、事実上陽性である転移陰性として分類された患者）を回避するために高感度が望まれる。特異度とは、それ自体適正に同定される実陰性の割合を意味し、偽陽性（例えば、事実上陰性である転移陽性として分類された患者）を回避するために高特異度が望まれる。好ましくは、分類器は、転移を有する個体を同定するために高感度になるようにトレーニングされる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、個体を分類する本方法は、個体の年齢及び／又は腫瘍のブレスロー深さをさらに利用する。任意選択的に、潰瘍化及び／又は有糸分裂速度が決定され得る。ブレスロー深さは、表皮の顆粒層のトップから（又は表面が潰瘍化されている場合には潰瘍の底部から）腫瘍（真皮／皮下）の広い底部にわたって最も深い浸潤細胞まで測定される。潰瘍化とは、死滅組織の皮膚脱落を意味し、迅速腫瘍成長を反映してメラノーマの中心にある細胞の死をもたらすと考えられる。有糸分裂速度は、切除された腫瘍を調べて、有糸分裂を呈する細胞数をカウントすることによって測定され得る。有糸分裂数が多いほど、腫瘍が転移している可能性が高い。特定の実施形態では、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１を含む遺伝子シグネチャーと、年齢及びブレスロー深さの臨床変数とを含む組合せモデルが使用される。いくつかの実施形態では、遺伝子シグネチャーは、ＡＩＤＰＯＱを追加的に含む。
【００７４】
本開示は、本明細書に開示される遺伝子発現シグネチャーを決定するキットも提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示される遺伝子シグネチャーにｑＰＣＲを実施するためのプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、キットは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の２つ以上、好ましくは３つ以上及び／又は以下の遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１、ＬＯＸＬ３の１つ以上にｑＰＣＲを実施するためのプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＡＣＴＢ、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬ８などのハウスキーピング遺伝子のためのプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、キットは、以下：ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、緩衝剤及びＭｇ２＋の１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８の３つ以上を増幅するためのプライマー対を含み、より好ましくは、キットは、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５及びＩＬ８を増幅するためのプライマー対を含む。好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１を含み、より好ましくは、遺伝子発現シグネチャーは、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１を含む。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上のプライマー対について、好ましくは各プライマーについて対照核酸を含む。好ましくは、対照核酸は、ｃＤＮＡであり、より好ましくは、ｃＤＮＡは、それぞれの遺伝子の少なくとも１つのイントロン／エクソン境界にまたがる配列に対応する。かかるｃＤＮＡは、遺伝子発現をゲノム汚染から識別するのに有用である。いくつかの実施形態では、プライマー対の１つ以上のプライマーは、化学修飾される。かかる修飾プライマーは、蛍光標識又は放射性標識されたプライマーを含む。
【００７５】
本明細書に開示される遺伝子発現解析の結果は、診断ワークアップスケジュールを決定するのに有用である。例えば、転移陽性ＳＬＮ又は不良な予後を有するとして分類された個体は、ＳＬＮＢを受けることができ。いくつかの実施形態では、ＳＬＮ陽性であると予測されたか又はさもなければ不良な予後を有すると予測された個体に免疫療法が施される。後続ＳＬＮＢリードアウトは、免疫療法に対する反応の尺度であり得る。
【００７６】
遺伝子発現シグネチャーに基づいて適切な治療レジームを決定することができる。本明細書で用いられる場合、「治療」、「治療する」及び「治療すること」という用語は、メラノーマ又はその１つ以上の症状の発生の逆転、軽減、遅延又はその進行の阻害を意味する。いくつかの実施形態では、転移陽性ＳＬＮを有するか又はさもなければ不良な予後を有するとして分類された個体は、ＳＬＮＢによって治療され得る。ＳＬＮの位置は、当業者に公知のように及び本明細書に記載のように、メラノーマの位置に基づいて及び／又は「ＳＬＮマッピング」などの方法を用いて決定され得る。
【００７７】
転移陽性Ｎ−ＳＬＮは、外科手順、例えば外科リンパ節郭清を実施することによって治療され得る。転移Ｎ−ＳＬＮは、完全リンパ節郭清及び／又はメラノーマを治療する他の療法によって治療され得る。いくつかの実施形態では、癌治療が個体に施される。いくつかの実施形態では、「アジュバント治療」が個体に施される。本明細書で用いられるアジュバント治療とは、１つ以上の癌性腫瘍の外科切除後の患者への１つ以上の薬剤の投与を意味し、この場合、すべての検出可能且つ切除可能な疾患（例えば、癌）が患者から除去されているが、再燃の統計的リスクが残されている。アジュバント治療は、疾患の再発の可能性又は重症度を減少させるのに有用である。
【００７８】
遺伝子発現シグネチャーに基づいて示唆され得る公知のメラノーマ療法としては、
−  化学療法：例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、テモゾロミド（Temodal）、カルボプラチン（Paraplatin、Paraplatin AQ）、パクリタキセル（Taxol）、シスプラチン（Platinol AQ）及びビンブラスチン（Velbe）、
−  標的療法薬剤：例えば、ＢＲＡＦ阻害剤（ベムラフェニブ（Zelboraf）及びダブラフェニブ（Tafinlar））並びにＭＥＫ阻害剤（コビメチニブ（Cotellic）及びトラメチニブ（Mekinist））、
−  放射線療法、
−  免疫療法：例えば、サイトカイン（例えば、インターフェロンα−２ｂ又はインターロイキン−２）、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、イピリムマブ（Yervoy）、ニボルマブ（Opdivo）、ペムブロリズマブ（Keytruda））又は腫瘍溶解性免疫療法
が挙げられる。
【００７９】
好適な薬剤療法の施行は、いずれかの適切な経路によって施され得る。好適な経路としては、経口、経直腸、経鼻、局所（経頬及び舌下を含む）、経膣並びに非経口（皮下、筋肉内、静脈内、真皮内、髄腔内及び硬膜外を含む）が挙げられる。
【００８０】
本明細書で用いられる場合、「含む」及びその活用形は、その非限定的な意味で用いられ、その単語に続くアイテムを含むが、特に挙げられていないアイテムを除外するものではないことを意味する。加えて、動詞の「からなる」は、「から本質的になる」で置き換えられ得る。すなわち、本明細書に定義される化合物又は補助化合物は、本発明のユニークな特徴を変化させない前記追加の成分であれば、特に明記された以外の追加の成分を含み得る。
【００８１】
冠詞の「１つの（a）」及び「１つの（an）」は、本明細書では、冠詞の文法上の目的語の１つ以上（すなわち少なくとも１つ）を意味するものとして用いられる。例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
【００８２】
数値との関連で用いられるときの「およそ」又は「約」という語（およそ１０、約１０）は、好ましくは、その値が、１０の所与の値よりも１％大きい又は小さい値であり得ることを意味する。
【００８３】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、単に本発明を明確化する役割を果たすにすぎない。
【実施例】
【００８４】
実施例１：ＳＬＮ転移ステータスを予測する遺伝子シグネチャー
本発明者らは、三次ケアセンターでＳＬＮ生検を受けた８１３名の継続メラノーマ患者のコホートを集めた。対象アウトカムは、ＳＬＮ生検で組織学的に同定されたＳＬＮ及び転移であった。原発メラノーマ診断生検組織での２９の転移促進間質反応遺伝子の発現は、ポリメラーゼ連鎖反応によった。二重ループ交差検証（ＤＬＣＶ）トレーニング検証スキームで正則化ロジスティック回帰を臨床病理学的変数及び分子データに適用した。
【００８５】
臨床データセット
以上の臨床変数のうちの６つのみがＳＬＮＢ陽性とＳＬＮＢ陰性との間で有意差を示す。
・年齢
・ブレスロー深さ
・潰瘍化
・有糸分裂速度
・クラークレベル
・血管リンパ管浸潤
【００８６】
６つの変数のうち、本発明者らは、クラークレベル及び血管リンパ管浸潤を対象外とし、年齢、ブレスロー深さ、潰瘍化及び有糸分裂速度のみを考慮するように決定する。なぜなら、後者の変数は、必ずしも利用可能であるとは限らないうえに、それらの品質は、ＳＬＮＢを実施するヘルスケア提供者に依存して異なり得るからである。
【００８７】
本発明者らは、Meves et al. 2015にあるようなコピー数によるのではなく、ΔＣｔによって遺伝子発現を定量した。なぜなら、本発明者らのシグネチャーでコピー数を用いても有意差が見られず、単に実験負荷を増加させるにすぎないからである。Meves et al. 2015と比較して、ＫＲＴ１４バックグラウンド補正も省略した。いわゆるＩＴＬＰ正規化も省略した。なぜなら、それは、測定された発現のアドホックオーバールーリングに基づいており、主に閾値の形態で多くの任意パラメーターを必要とするからである。
【００８８】
【表１】
2021531831.tif 000003
【００８９】
直径０．１ｍｍ未満の細胞クラスターを有するサンプルを転移陽性とみなすべきであるか、また臨床的視点から一般に陰性とみなされるかについて議論の余地がある。したがって、本発明者らは、分類器のトレーニングセットから、１又は２に等しい転移疾患の体積を有する８１３名中４３名の患者を除外するように決定し、このセットについて分類器の性能を個別に評価した。以下の２９の遺伝子を測定した：
ＫＲＴ１４、ＭＬＡＮＡ、ＭＩＴＦ、ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＬＡＭＢ１、ＴＰ５３、ＡＧＲＮ、ＴＨＢＳ２、ＰＴＫ２、ＳＰＰ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＬＯＤ３、ＧＤＦ１５、ＦＮ１、ＴＮＣ、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ３、ＩＴＧＡ５、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ２、ＣＳＲＣ、ＣＸＣＬ１、ＩＬ８、ＬＡＭＢ。
【００９０】
性能尺度
分類器の性能を評価するために、分割表を構築した。これらの分割表から、２つの基準、すなわちＰＰＡ（陽性パーセント一致）及びＮＰＡ（陰性パーセント一致）を導出した。これらは、以下のように定義される。
【数１】
2021531831.tif 000004
式中、ＴＰは、真陽性の数を表し、ＦＮは、偽陰性の数を表し、ＴＮは、真陰性の数を表し、及びＦＰは、偽陽性の数を表す。ＰＰＡ及びＮＰＡ基準の式は、それぞれ感度及び特異度と均等である。しかしながら、非ゴールデンスタンダード参照（ＦＩＳＨデータ）に対して比較が行われるため、ＰＰＡ及びＮＰＡという用語を使用することにする。
【００９１】
分類器のトレーニングを最適化するために、最大化（又は誤差基準の場合には最小化）されるべき単一性能基準が必要である。この目的のため、ＰＰＡ及びＮＰＡの平均を使用する。
【数２】
2021531831.tif 000005
式中、ｐは、性能を表す。ｐ＝５０は、ランダム性能を示唆し、ｐ＝１００は、完全分類を示唆する。
【００９２】
他の性能尺度：
・陰性的中率
・陽性的中率
・確度
・バランス確度
・陰性アウトカムの対数尤度比
・陽性アウトカムの対数尤度比
・ＲＯＣ曲線下面積。
【００９３】
分類器
分類器は、すべて２９遺伝子の発現レベル、臨床病理学的変数及びそれらの両方についてトレーニングされる。
【００９４】
分類器：ペナルティー付き最大尤度によるロジスティック回帰
本発明者らは、Rパッケージglmnetで実現されるロジスティック回帰分類器を使用した。パラメーターは、パーシモニアス表現を得るために、Ｌ１ノルムペナルティー項（ＬＡＳＳＯ正則化）を用いて最尤推定によって推定される。
【００９５】
分類器の二重ループ交差検証
Wesselsら［Wessels et al. Bioinformatics, Volume 21, Issue 19, 2005, Pages 3755-3762］は、二重ループ交差検証（ＤＬＣＶ）を利用して高スループットデータから診断分類器を構築するために、広く適用可能なフレームワークを記載した。ＤＬＣＶエクササイズにより、開発者は、トレーニングデータセットとは独立したデータに将来適用できるように、分類器の性能（一般化誤差による）を推定／予測することができる。この方法は、特徴セレクターとしてフォワードフィルタリング、個別遺伝子を評価する基準としてｔ−統計及び様々な分類器と組み合わされて採用された。トレーニング及び検証手順は、外側（検証）ループで３分割交差検証及び内側ループで１０分割交差検証を１００回繰返し利用して実施された。内側ループでは、アルゴリズムは、ＬＡＳＳＯ正則化のための最適パラメーターλを学習する。すべてのポイントにおいて、データスプリットは、クラス事前確率に関して層別化された。
【００９６】
二重ループ交差検証法は、少数の工程で記述され得る：
１．繰返しごとにデータが３つの部分にスプリット（層別化）される（繰返しごとに異なるスプリット）。
２．分割ごとに２つの部分が内側ループに使用され（トレーニングセット）、検証のために第３の部分が外側ループに使用される（検証セット）。
３．トレーニングセットデータでは、ＬＡＳＳＯペナルティー項に用いられる最適λを推定するために１０分割交差検証が実施される（学習曲線の構築）。
４．次いで、分類器は、トップの最適λを用いて完全トレーニングセットでトレーニングされる。
５．最後に、その分類器の性能が検証セットで評価される。
６．すべての繰返しが終了した後、最終分類器は、すべてのサンプルを用いて平均最適λで作成される。得られたｎの平均数は、分類器をトレーニングするために使用される。次いで、この分類器は、外部検証セットで適用されるであろう。
【００９７】
典型的には、データセットは、クラス事前確率に関して非平衡である。したがって、バランス確度は、クラス事前確率を考慮に入れるため、確度よりも良好な分類性能である。本発明者らは、繰返しごとに、内側ループにおいて性能基準としてブライアスコアを使用した。
【００９８】
【表２】
2021531831.tif 000006
【００９９】
表１は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、全７７０名の患者コホート分類器でトレーニングされた最終分類器の性能を表す。係数が正である場合、より高い値は、リスクの増加を示唆する。係数が負である場合、低減値は、リスクの減少を示唆する。より大きい（絶対量）係数を有する変数は、より大きい寄与を有する。
【０１００】
表２は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１０１】
【表３】
2021531831.tif 000007
【０１０２】
表３  パラメーター「年齢」が年単位で導入され、且つ「ブレスロー深さ」がミリメートル単位で導入される。潰瘍化は、ブール変数（あり／なし）である。表は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、全７７０名の患者コホート分類器でトレーニングされた最終分類器の性能を表す。表４は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１０３】
【表４】
2021531831.tif 000008
【０１０４】
表５は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、全７７０名の患者コホート分類器でトレーニングされた最終分類器の性能を表す。
【０１０５】
表６は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１０６】
図１は、１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされたロジスティック回帰分類器のＲＯＣ曲線を表す。
【０１０７】
表７は、１）遺伝子発現（「ＧＥ」、すなわちＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８遺伝子シグネチャー）、２）臨床病理学的変数（「ＣＬ」、すなわち年齢及びブレスロー深さ）、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せ（「ＧＥＣＬ」）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の平均性能を表す。３つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶが考慮された。
【０１０８】
実施例２  比較例
ＩＴＬＰスコア（ＩＴＧＢ３、ＬＡＭＢ１、ＰＬＡＴ及びＴＰ５３）に基づく分類器
表８は、全７７０名の患者コホートについてのＩＴＬＰスコアの性能を表す。
【０１０９】
【表５】
2021531831.tif 000009
【０１１０】
表９は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、全７７０名の患者コホート分類器でトレーニングされた最終分類器の性能を表す。
【０１１１】
表１０は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１１２】
実施例３  比較分析
ＩＴＬＰ対ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＳＰＰ１及びＩＬ８遺伝子シグネチャー
図２は、ＩＴＬＰスコア並びにＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＳＰＰ１及びＩＬ８遺伝子シグネチャー（図中では「ロジスティック回帰」という）についてのＲＯＣ曲線を表す。ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＳＰＰ１及びＩＬ８遺伝子シグネチャーは、明らかにＩＴＬＰシグネチャーよりも優れた性能を示す。
【０１１３】
実施例４：遺伝子サブセットの性能
前の実施例では、５つの遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＳＰＰ１及びＩＬ８を遺伝子シグネチャーに使用した。本発明者らは、２つ、３つ及び４つの遺伝子のすべての可能なサブセットの性能を調べた。以下のシグネチャーについて、遺伝子の全数から選択可能な特定の次元のサブセットの数は、以下の通りである：２つの遺伝子のシグネチャーから１０サブセット、３つの遺伝子のシグネチャーから１０サブセット、４つの遺伝子のシグネチャーから５サブセット及び５つすべてを含む１シグネチャー。本発明者らは、ＲＯＣ曲線下面積に関して、ＩＴＬＰシグネチャーと比較して性能を評価した。ＡＵＣ（又はその範囲）は、ＩＴＬＰでは０．６８、２のすべてサブセットでは０．７２〜０．７５、３のすべてサブセットでは０．７４〜０．７７、４のすべてサブセットでは０．７６〜０．７７及び５遺伝子シグネチャーでは０．７７であった。これは、図３にも示される。そのため、以下の遺伝子：ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＳＰＰ１及びＩＬ８の少なくとも２つを含むすべての遺伝子シグネチャーは、ＩＴＬＰシグネチャーよりも優れた性能を示す。
【０１１４】
実施例５：小体積の転移疾患を有する４３サンプルでの性能
第１のインスタンスでは、小体積（体積１及び２）の転移疾患を有する患者は、分類器のトレーニングに使用されるコホートから除外された。直径０．１ｍｍ未満の細胞クラスターを有するサンプルを転移陽性とみなすべきであるか及び臨床的視点から一般に陰性とみなされるかについて議論の余地がある。本試験では、４３名の患者は、体積１又は２を有するため、最初に解析から除外された。かかる患者にＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＧＤＦ１５、ＳＰＰ１及びＩＬ８分類器を適用したところ、陽性として２９名及び陰性として１４名の分類をもたらした。
【０１１５】
実施例６：誤分類解析
偽陰性。誤分類された陽性サンプルは、主に、潰瘍化なし且つ血管リンパ管浸潤なしで薄いメラノーマ（２ｍｍ未満）を有する患者からのものである。換言すると、これらは、転移を発生する非常に低いアプリオリリスクを呈する患者である。アルゴリズムの１００回の繰返しをすべて行うと誤分類されるサンプルは、少数である。
【０１１６】
偽陽性。誤分類された陰性サンプルは、主に、潰瘍化あり且つ血管リンパ管浸潤ありで厚いメラノーマ（２ｍｍ超）を有する患者からのものである。換言すると、これらは、転移を発生する高いアプリオリリスクを呈する患者である。アルゴリズムの１００回の繰返しをすべて行うと誤分類されるサンプルは、少数である。
【０１１７】
分類器出力分布
予想確率分布は、ガウス型ではなく、単一モードで長い右側テールを有する。操作ポイントを選択するために使用される閾値は、分布の平均近傍となる。推定確率は、０．６を超えない。
【０１１８】
実施例７：ＳＬＮ遺伝子シグネチャーの予後関連
３つのタイプの生存についてのカプラン・マイヤー生存推定値は、遺伝子ＩＴＧＢ３、ＰＬＡＴ、ＳＰＰ１、ＧＤＦ１５及びＩＬ８（実施例では「ＧＥＣＬ」という）（表１９〜２１（ａ））、ＳＬＮＢステータス（表１９〜２１（ａ））並びにそれらの２つの組合せ（表２２〜２４（ａ））を含むＳＬＮ分類器で発生された。文献で公知のように、陽性ＳＬＮＢステータスは、劣った生存に関連付けられる。注目すべき点として、ＧＥＣＬモデルは、より大きいハザード比からも明らかなかなり強い分離を生存推定値で提供した（表２５（ａ））。加えて、多変量解析では、ＧＥＣＬ分類器は、かなり大きいハザード比及びより有意なｐ値も有する（表２６を参照（ａ）されたい）。特に注目すべきであるのは、ＧＥＣＬ陰性群の非常に良好なメラノーマ特異的生存であり、１６０ヶ月間で０．９６６の生存推定値を有する（表１９（ａ））。
【０１１９】
同様に、３つのタイプの生存についてのカプラン・マイヤー生存推定値は、遺伝子ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１（実施例では「ＧＥＣＬ」という）（表１９〜２１）、ＳＬＮＢステータス（表１９〜２１）及びそれらの２つの組合せ（表２２〜２４）を含むＳＬＮ分類器で発生された。表１９〜２６（ｂ）は、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶによる結果を記載する一方、表１９〜２６（ｃ）は、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶによる結果を記載する。この分類器に関するさらなる考察については、実施例８を参照されたい。
【０１２０】
ＧＥＣＬ分類器出力からの結果とＳＬＮＢステータスとを組み合わせて、真陽性（ＴＰ）、偽陽性（ＦＰ）、偽陰性（ＦＮ）及び真陰性（ＴＮ）の４つの群を提供した。先に示唆されたように、非常にわずかなＦＮ症例及び実質的パーセントのＦＰ症例が存在する。注目すべき点として、偽陽性群（ＧＥＣＬで陽性の陰性ＳＬＮＢステータス）は、真陰性群に非常に類似した生存推定値を有する。このことから、ＧＥＣＬ分類器出力は、メラノーマ患者に予後を提供する手段としてＳＬＮＢステータスよりも優れていることが示唆される。
【０１２１】
カプラン・マイヤー法は、いくつかの時間インターバルで生存確率を推定するために使用される。ログランク検定は、２つ以上の群間で生存曲線の比較に使用されるノンパラメトリック検定である。
【０１２２】
ハザード比（ＨＲ）は、所与の時間インターバルで発生する（一方の群におけるアウトカムのリスク）／（他方の群におけるアウトカムのリスク）の比として定義される。ハザード比１は、関連の欠如を意味し、１超のハザード比は、リスクの増加を示唆し、且つ１未満のハザード比は、より小さいリスクを示唆する。ハザード比は、２群間のみで相対差を表すために使用される。
【０１２３】
実施例８：ＳＬＮ分類器のリファインメント
合計１０９ユニーク遺伝子について、全８５５コホートで４つの遺伝子パネルを測定した。しかしながら、解析時にサンプルを取り出せなかったため又は十分なＲＮＡが存在しなかったため、サンプルのいくつかでは遺伝子発現を測定できなかった。したがって、７７０名の代わりに７５４名の患者のコホートで探索が行われた。探索コホートは、小体積の転移疾患を有する患者を含まない。
【０１２４】
各分類器について、本発明者らは、以下を報告する。
・全コホートでトレーニングされた最終分類器の性能
・交差検証の平均性能（外部ループでは３分割及び内部ループでは１０分割を有する二重ループ交差検証の１００回の繰返し）。３分割の性能は、全コホートをカバーするためにコンカチネートされる。
【０１２５】
各分類器について、４つの異なる操作ポイントで性能が計算される。
・ＭａｘｂＡＣＣ：最大バランス確度
・ＳＥｅｑＳＰ：特異度に等しい感度
・ＮＰＶ９７：トレーニングで９７％に等しい陰性的中率
・ＮＰＶ９８：トレーニングで９８％に等しい陰性的中率
【０１２６】
臨床病理学的モデル（ＣＬ）
臨床病理学的変数に基づくロジスティック分類器モデルのパラメーターは、以下の通りである。
特徴  パラメーター
（切片）  −２．０５４７０８３
年齢  −０．０１１２９１３
ブレスロー深さ  ０．６１１６３３５
血管リンパ管浸潤あり  ０．１２０５２３８
【０１２７】
表２７は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＮＰＶ９８、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶについて、全７５４名の患者コホートでトレーニングされた最終分類器の性能を表す。係数が正である場合、より高い値は、リスクの増加を示唆する。係数が負である場合、低減値は、リスクの減少を示唆する。より大きい（絶対量）係数を有する変数は、より大きい寄与を有する。
【０１２８】
表２８は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＮＰＶ９８、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶについて、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１２９】
【表６】
2021531831.tif 000010
【０１３０】
表２９は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＮＰＶ９８、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶについて、全７５４名の患者コホートでトレーニングされた最終分類器の性能を表す。係数が正である場合、より高い値は、リスクの増加を示唆する。係数が負である場合、低減値は、リスクの減少を示唆する。より大きい（絶対量）係数を有する変数は、より大きい寄与を有する。
【０１３１】
表３０は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＮＰＶ９８、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶについて、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１３２】
【表７】
2021531831.tif 000011
【０１３３】
表３１は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＮＰＶ９８、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶについて、全７５４名の患者コホートでトレーニングされた最終分類器の性能を表す。係数が正である場合、より高い値は、リスクの増加を示唆する。係数が負である場合、低減値は、リスクの減少を示唆する。より大きい（絶対量）係数を有する変数は、より大きい寄与を有する。
【０１３４】
表３２は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＮＰＶ９８、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶについて、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１３５】
図６は、１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされたロジスティック回帰分類器のＲＯＣ曲線を表し、且つ図７は、１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされたロジスティック回帰分類器の陰性的中率（ＮＰＶ）対センチネルリンパ節低減率（ＳＬＮＢ  ＲＲ）を表す。
【０１３６】
異なる操作ポイント（ＯＰ）での比較：ＣＬ対ＣＥ対ＧＥＣＬ
表３３は、１）遺伝子発現（「ＧＥ」、すなわちＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１遺伝子シグネチャー）、２）臨床病理学的変数（「ＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ及び血管リンパ管浸潤の存在）、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せ（「ＧＥＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の平均性能を表す。操作ポイントについて、最大バランス確度（ｍａｘ  ｂＡＣＣ）である。
【０１３７】
表３４は、１）遺伝子発現（「ＧＥ」、すなわちＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１遺伝子シグネチャー）、２）臨床病理学的変数（「ＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ及び血管リンパ管浸潤の存在）、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せ（「ＧＥＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の平均性能を表す。操作ポイントについて、特異度（ＳＥｅｑＳＰ）に等しい感度を使用する。
【０１３８】
表３５は、１）遺伝子発現（「ＧＥ」、すなわちＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１遺伝子シグネチャー）、２）臨床病理学的変数（「ＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ及び血管リンパ管浸潤の存在）、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せ（「ＧＥＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９７）を使用する。
【０１３９】
表３６は、１）遺伝子発現（「ＧＥ」、すなわちＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１遺伝子シグネチャー）、２）臨床病理学的変数（「ＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ及び血管リンパ管浸潤の存在）、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せ（「ＧＥＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９８）を使用する。
【０１４０】
Ｔステージ判定によって層別化される性能
表３７は、臨床病理学的変数（「ＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ及び血管リンパ管浸潤の存在）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器のＴステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９７）を使用する。
【０１４１】
表３８は、遺伝子発現（「ＧＥ」、すなわちＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器のＴステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９７）を使用する。
【０１４２】
表３９は、遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せ（「ＧＥＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器のＴステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９７）を使用する。
【０１４３】
表４０は、臨床病理学的変数（「ＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ及び血管リンパ管浸潤の存在）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器のＴステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９８）を使用する。
【０１４４】
表４１は、遺伝子発現（「ＧＥ」、すなわちＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器のＴステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９８）を使用する。
【０１４５】
表４２は、遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せ（「ＧＥＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器のＴステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９８）を使用する。
【０１４６】
臨床ステージ判定によって層別化される性能
表４３は、臨床病理学的変数（「ＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ及び血管リンパ管浸潤の存在）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の臨床ステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９７）を使用する。
【０１４７】
表４４は、遺伝子発現（「ＧＥ」、すなわちＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の臨床ステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９７）を使用する。
【０１４８】
表４５は、遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せ（「ＧＥＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の臨床ステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９７）を使用する。
【０１４９】
表４６は、臨床病理学的変数（「ＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ及び血管リンパ管浸潤の存在）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の臨床ステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９８）を使用する。
【０１５０】
表４７は、遺伝子発現（「ＧＥ」、すなわちＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＰＲＫＣＢ、ＳＥＲＰＩＮＥ２、ＡＤＡＭ１２、ＬＧＡＬＳ１及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の臨床ステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９８）を使用する。
【０１５１】
表４８は、遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せ（「ＧＥＣＬ」、すなわち年齢、ブレスロー深さ、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１）について、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の臨床ステージによって層別化される平均性能を表す。操作ポイントについて、トレーニングで０．９８に設定されたＮＰＶ（ＮＰＶ９８）を使用する。
【０１５２】
遺伝子サブセット
図８は、ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＡＤＩＰＯＱ、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１から選択される２、３、４、５、６、７、８遺伝子のサブセットを用いて、全コホートでトレーニングされたロジスティック回帰分類器についてのＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）のボックスプロットを表す。
【０１５３】
表４９は、各々シグネチャーの遺伝子の全数から選択可能な特定の次元のサブセットの数並びにＲＯＣ曲線下の最小及び最大面積による性能を表す。
【０１５４】
実施例９：非センチネルリンパ節（Ｎ−ＳＬＮ）プロファイラー。
非センチネルリンパ節（Ｎ−ＳＬＮ）の除去を伴う完全リンパ節郭清（ＣＬＮＤ）は、陽性センチネルリンパ節（ＳＬＮ）を有する臨床的節陰性メラノーマ患者のための標準であった。ＳＬＮ生検及びその直後のＣＬＮＤは、局所疾患管理を改善し、ランダム化臨床試験は、より小体積のＳＬＮ陽性疾患の早期手術が節再燃時の手術よりも少ない長期後遺症（例えば、リンパ浮腫）をもたらすことを示した。さらに、ＳＬＮ及びＮ−ＳＬＮ転移は、アジュバント療法のための患者を選択するために使用される予後不良因子である。しかしながら、ＭＳＬＴ−ＩＩに登録された患者では、ＣＬＮＤによって延命効果が得られず、ＳＬＮ手術単独よりも高い合併症率を有する。ＣＬＮＤのための患者選択を改善するために、ＣＬＮＤが奏効する可能性の高い患者、すなわちＮ−ＳＬＮへの局所転移のリスクのある者を同定する新しい方法が必要である。ここで、Ｎ−ＳＬＮのステータス、すなわち転移の存在又は不在を予測するために、本発明者らは、遺伝子発現（ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３）、臨床病理学的変数（年齢、陽性ＳＬＮの数、ＳＬＮの最大寸法、最大ブレスロー深さ及び最大有糸分裂速度）並びにその両方に基づいて３つの分類器を設計する。これらの分類器は、いずれの患者がＣＬＮＤ手順を受けるべきかを選択するために使用され得る。
【０１５５】
使用された方法は、実施例１に示されるものとほぼ同一であった。同一の２９遺伝子が評価された。遺伝子発現に基づくロジスティック回帰分類器モデルのパラメーターは、以下の通りである。
【０１５６】
【表８】
2021531831.tif 000012
【０１５７】
モデルの性能
全コホート中の患者数は、１４０名であった。
【０１５８】
表１１は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１５９】
表１２は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１６０】
【表９】
2021531831.tif 000013
【０１６１】
表１３は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、全１４０名の患者コホート分類器でトレーニングされた最終分類器の性能を表す。
【０１６２】
表１４は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１６３】
【表１０】
2021531831.tif 000014
【０１６４】
遺伝子発現に基づくロジスティック分類器モデルのパラメーター。
表１５は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、全１４０名の患者コホート分類器でトレーニングされた最終分類器の性能を表す。
【０１６５】
表１６は、４つの異なる操作ポイント：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ、４）ＬＲＮｎ０２５、トレーニングで０．２５に設定された陰性試験結果の対数尤度比について、１００回の繰返しで平均されたＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の性能を表す。
【０１６６】
図４は、１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされたロジスティック回帰分類器の平均ＲＯＣ曲線を表す。ｘ軸は、偽陽性発見率（すなわち１−特異度）を表し、ｙ軸は、真発見率（すなわち感度）を表す。
【０１６７】
図５：異なる遺伝子のサブセット及び４つの遺伝子のフルセットについてのＲＯＣ曲線下面積のボックスプロット。
【０１６８】
表１７は、１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の平均性能を表す。３つの異なる操作ポイントが考慮された：１）ｍａｘ  ｂＡＣＣ：最大バランス確度、２）ＳＥｅｑＳＰ、特異度に等しい感度、３）ＮＰＶ９７、トレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶ。
【０１６９】
Ｎ−ＳＬＮプロファイラーシグネチャーは、４つの遺伝子：ＫＲＴ１４、ＳＰＰ１、ＦＮ１及びＬＯＸＬ３を含む。本発明者らは、２つ、３つ及び４つの遺伝子のすべての可能なサブセットも同様に調べた。
【０１７０】
【表１１】
2021531831.tif 000015
【０１７１】
本発明者らは、ＲＯＣ曲線下面積に関して性能を評価した（表及び図を参照されたい）。
【０１７２】
【表１２】
2021531831.tif 000016
【０１７３】
図５は、異なる遺伝子サブセット及び４つの遺伝子のフルセットについてのＲＯＣ曲線下面積のボックスプロットを示す。
【０１７４】
本発明者らは、Ｎ−ＳＬＮプロファイラーの探索、設計及び開発を記載する。本発明者らは、いずれの患者がＣＬＮＤ手順を受けるべきかを選択するためにＮ−ＳＬＮプロファイラーが使用され得ることを示した。
【０１７５】
現在のところ、（ｉ）ＣＬＮＤ手順が奏効すると思われる患者の選択に利用可能な方法が存在しないうえに、（ｉｉ）分類器によって使用される臨床病理学的変数が常に利用可能とは限らないため、遺伝子発現に基づく分類器の性能は、興味深い。
【０１７６】
実施例１０
ブレスロー深さ（ＢＤ≦２対ＢＤ＞２）に基づく事前選択
ブレスロー深さ（ＢＤ）は、原発皮膚メラノーマを特徴付ける重要な臨床病理学的変数であり、薄いメラノーマ（ＢＤ≦２ｍｍ）は、厚いメラノーマ（ＢＤ＞２ｍｍ）と比較して分子的及び生理学的に異なる特性を有し得ることが知られている。したがって、薄い及び厚いメラノーマについて２つの異なる操作ポイントを選択することが合理的であろう。ブレスロー深さ≦２ｍｍを有する薄いメラノーマ（５６１サンプルのコホート）では、本発明者らは、ＮＰＶがトレーニングで０．９７であるように選択される操作ポイントを用いて、前のセクション（７．８）に記載の分類器の使用を継続した。
【０１７７】
表１８ａは、１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の平均性能を表す。選択される操作ポイントは、ＮＰＶ９７、すなわちトレーニングで０．９７に設定されたＮＰＶである。
【０１７８】
ＢＤ＞２ｍｍを有する厚いメラノーマ（２０９サンプルのコホート）では、本発明者らは、同一の分類器を使用するが、異なる操作ポイント、すなわちバランス確度を最大化するように選択されるポイントを使用する。
【０１７９】
表１８ｂは、１）遺伝子発現、２）臨床病理学的変数、３）遺伝子発現と臨床病理学的変数との組合せについて、ＤＬＣＶでトレーニングされた分類器の平均性能を表す。選択される操作ポイントは、バランス確度を最大化するように選択された。
【０１８０】
ブレスロー深さ＞２についての性能は、ブレスロー深さ≦２ｍｍについての性能よりも劣っているが、依然として許容できる。なぜなら、分類器は、３５％のＳＬＮＢ陽性の事前確率を有するサブ集団で９０％のＮＰＶを達成し、試験を受けて陰性アウトカムを有するとき、陽性ＳＬＮを有する確率は、３５％から１０％に低下するからである。
【０１８１】
対象がリンパ節陽性又はリンパ節陰性として分類されるかを決定する方法
分類方法の例として、仮想データ（表を参照されたい）を使用し、簡単にするために２つの遺伝子を用いて、サンプルがリンパ節陽性又はリンパ節陰性としてラベルされるかを分類器によって予測する（方法／モデルは、ＳＬＮプロファイラー及びＮ−ＳＬＮプロファイラーの両方で同一であり、単にパラメーター及び遺伝子のアイデンティティー及び臨床変数が異なるのみである）。表は、２つの遺伝子（ｘ，ｙ）トイモデルのモデルパラメーターβ０、β１、β２、仮想遺伝子発現データΔＣｔ、推定対数オッズ比
【数３】
2021531831.tif 000017
、推定確率ｐ及びカットオフθ＝０．１９に基づく推定出力クラスラベルを記載する。対数オッズ比及び確率は、式１に基づいて計算され、且つ確率は、式２を用いて計算される。出力ラベルは、推定確率とカットオフθとを比較することによって割り当てられる：推定確率がθ以上である場合、サンプルは、節陽性として分類され、推定確率がθ未満である場合、サンプルは、節陰性として分類される。
【０１８２】
【表１３】
2021531831.tif 000018
【０１８３】
表。モデルパラメーターβ０、β１、β２遺伝子ｘ、ｙの遺伝子発現データΔＣｔ、推定対数オッズ比
【数４】
2021531831.tif 000019
、推定確率ｐ及びカットオフθ＝０．１９に基づく推定出力クラス。
【数５】
2021531831.tif 000020
【０１８４】
実施例１１
実施例８で実施された解析と同じように、８つの遺伝子並びに２つの臨床病理学的変数（年齢及びブレスロー深さ）を利用し、以下の遺伝子セット：ＧＤＦ１５、ＭＬＡＮＡ、ＰＬＡＴ、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＬＯＸＬ４、ＳＥＲＰＩＮＥ２及びＴＧＦＢＲ１を含む、本発明の好ましい実施形態が見出された。ロジスティック回帰モデルのパラメーターは、以下に提供される通りである。
【０１８５】
【表１４】
2021531831.tif 000021
【０１８６】
様々な操作ポイントが評価され、複数の操作ポイントは、高いＮＰＶ及びＳＬＮＢ手順数の大幅な低減（ＳＬＮＢ．ＲＲ＝ＳＬＮＢ低減率）を伴って臨床関連分類器を提供することが明らかにされた。０．１１６のＮＰＶ９７５操作ポイントは、特に好ましい（以下の表を参照されたい）。
【０１８７】
【表１５】
2021531831.tif 000022
【０１８８】
８つの遺伝子及び２つの臨床病理学的変数を用いるＧＥＣＬモデルと、実施例１及び８のものとの性能比較により、発現のみ（ＧＥ）又は臨床病理学的のみ（ＣＬ）のモデルよりも優れた性能を示し（ＮＰＶ及びＳＬＮＢ．ＲＲ）、実施例１のＧＥＣＬモデルに非常に類似した性能を示すことが示唆される。
【０１８９】
ＲＦＳ、ＤＲＦＳ及びＭＳＳに関して、ＳＬＮＢを交えてＧＥＣＬモデルを評価するために、カプラン・マイヤー解析を実施した。５年／６０ヵ月生存率を以下の表に報告する。ＧＥＣＬ及びＳＬＮＢの両方は、個別に陽性／陰性群間に大きい分離を有する。より重要なことに、ＧＥＣＬで陽性と同定されたＳＬＮＢ陰性（それ自体見落としである）の患者は、非常に生存不良である。このことから、予後マーカーとしてのＧＥＣＬモデルの臨床的意義が実証される。
【０１９０】
【表１６】
2021531831.tif 000023
【０１９１】
【表１７】
2021531831.tif 000024
【０１９２】
【表１８】
2021531831.tif 000025
【０１９３】
【表１９】
2021531831.tif 000026
【０１９４】
【表２０】
2021531831.tif 000027
【０１９５】
【表２１】
2021531831.tif 000028
【０１９６】
【表２２】
2021531831.tif 000029
【０１９７】
【表２３】
2021531831.tif 000030
【０１９８】
【表２４】
2021531831.tif 000031
【０１９９】
【表２５】
2021531831.tif 000032
【０２００】
【表２６】
2021531831.tif 000033
【０２０１】
【表２７】
2021531831.tif 000034
【０２０２】
【表２８】
2021531831.tif 000035
【０２０３】
【表２９】
2021531831.tif 000036
【０２０４】
【表３０】
2021531831.tif 000037
【０２０５】
【表３１】
2021531831.tif 000038
【０２０６】
【表３２】
2021531831.tif 000039
【０２０７】
【表３３】
2021531831.tif 000040
【０２０８】
【表３４】
2021531831.tif 000041
【０２０９】
【表３５】
2021531831.tif 000042
【０２１０】
【表３６】
2021531831.tif 000043
【０２１１】
【表３７】
2021531831.tif 000044
【０２１２】
【表３８】
2021531831.tif 000045
【０２１３】
【表３９】
2021531831.tif 000046
【０２１４】
【表４０】
2021531831.tif 000047
【０２１５】
【表４１】
2021531831.tif 000048
【０２１６】
【表４２】
2021531831.tif 000049
【０２１７】
【表４３】
2021531831.tif 000050
【０２１８】
【表４４】
2021531831.tif 000051
【０２１９】
【表４５】
2021531831.tif 000052
【０２２０】
【表４６】
2021531831.tif 000053
【０２２１】
【表４７】
2021531831.tif 000054
【０２２２】
【表４８】
2021531831.tif 000055
【０２２３】
【表４９】
2021531831.tif 000056
【０２２４】
【表５０】
2021531831.tif 000057
【０２２５】
【表５１】
2021531831.tif 000058
【０２２６】
【表５２】
2021531831.tif 000059
【０２２７】
【表５３】
2021531831.tif 000060
【０２２８】
【表５４】
2021531831.tif 000061
【０２２９】
【表５５】
2021531831.tif 000062
【０２３０】
【表５６】
2021531831.tif 000063
【０２３１】
【表５７】
2021531831.tif 000064
【０２３２】
【表５８】
2021531831.tif 000065
【０２３３】
【表５９】
2021531831.tif 000066
【０２３４】
【表６０】
2021531831.tif 000067
【０２３５】
【表６１】
2021531831.tif 000068
【０２３６】
【表６２】
2021531831.tif 000069
【０２３７】
【表６３】
2021531831.tif 000070
【０２３８】
【表６４】
2021531831.tif 000071
【０２３９】
【表６５】
2021531831.tif 000072
【０２４０】
【表６６】
2021531831.tif 000073
【図１】
2021531831.tif 000074
【図２】
2021531831.tif 000075
【図３】
2021531831.tif 000076
【図４】
2021531831.tif 000077
【図５】
2021531831.tif 000078
【図６】
2021531831.tif 000079
【図７】
2021531831.tif 000080
【図８】
2021531831.tif 000081
【国際調査報告】
2021531831.tif 000082
2021531831.tif 000083
2021531831.tif 000084
2021531831.tif 000085
2021531831.tif 000086
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