(57)【要約】本開示は、タウオパチーの治療及び／または予防のためのタウタンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物を対象とする。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を作製し、使用する方法、及びペプチド免疫原構築物によって作り出される抗体も対象とする。【選択図】図１Ａ
2021508673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（タウ断片）−Ｘ
または
（タウ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
によって表すことができるタウペプチド免疫原構築物であって、
式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり；
Ａは異種スペーサーであり；
（タウ断片）は配列番号１００の完全長タウタンパク質に由来する約１５〜約４０のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり；
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり；
ｍは１〜約４であり、
ｎは０〜約１０である、前記タウペプチド免疫原構築物。
【請求項２】
前記タウ断片が配列番号１〜２１及び１０１〜１２４から成る群から選択される請求項１に記載のタウペプチド免疫原構築物。
【請求項３】
前記Ｔｈエピトープが配列番号２２〜５０から成る群から選択される請求項１または２に記載のタウペプチド免疫原構築物。
【請求項４】
前記ペプチド免疫原構築物が配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５から成る群から選択される請求項１に記載のタウペプチド免疫原構築物。
【請求項５】
タウペプチド免疫原構築物であって、
配列番号１００の完全長タウタンパク質配列に由来する約１５〜約４０のアミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープと、
配列番号２２〜５０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＴヘルパーエピトープと、
アミノ酸、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α、ε−Ｎ）Ｌｙｓ、及びε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１０２）から成る群から選択される任意の異種スペーサーとを含み、
前記Ｂ細胞エピトープが直接または前記任意の異種スペーサーを介して前記Ｔヘルパーエピトープに共有結合される、前記タウペプチド免疫原構築物。
【請求項６】
前記Ｂ細胞エピトープが配列番号１〜２１及び１０１〜１２４から成る群から選択される、請求項５に記載のタウペプチド免疫原構築物。
【請求項７】
前記Ｔヘルパーエピトープが配列番号２２〜５０から成る群から選択される請求項５に記載のタウペプチド免疫原構築物。
【請求項８】
前記任意の異種スペーサーが（α、ε−Ｎ）Ｌｙｓまたはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１０２）である請求項５に記載のタウペプチド免疫原構築物。
【請求項９】
前記Ｔヘルパーエピトープが前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合される請求項５に記載のタウペプチド免疫原構築物。
【請求項１０】
前記Ｔヘルパーエピトープが前記任意の異種スペーサーを介して前記Ｂ細胞エピトープの前記アミノ末端に共有結合される請求項５に記載のタウペプチド免疫原構築物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物を含む組成物。
【請求項１２】
（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物と
（ｂ）薬学上許容できる送達媒体及び／またはアジュバントと
を含む医薬組成物。
【請求項１３】
（ａ）前記タウペプチド免疫原構築物が配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５から成る群から選択され、且つ
（ｂ）前記タウペプチド免疫原構築物がＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化された免疫賦活複合体を形成する請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
【請求項１５】
前記タウペプチド免疫原構築物に結合される請求項１４に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体として参照によって本明細書に組み入れられる、２０１７年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５７８，１２４号の利益を主張するＰＣＴ国際出願である。
【０００２】
技術分野
本開示は、タウタンパク質の一部に基づくペプチド免疫原構築物及びタウオパチーの予防及び治療のためのその製剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
タウタンパク質（またはその名を持つギリシャ文字にちなんだτタンパク質）は微小管を安定化するタンパク質である（ウェブサイト：ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｔａｕ＿ｐｒｏｔｅｉｎにて概説されている）。それらは中枢神経系の神経細胞にて豊富であり、他の場所ではあまり一般的ではないが、ＣＮＳの星状細胞や乏突起膠細胞でも非常に低レベルで発現される。たとえば、アルツハイマー病やパーキンソン病のような神経系の病態及び認知症には、正常に機能しなくなり、もはや微小管を適正に安定化しないタウタンパク質が関連している。
【０００４】
タウタンパク質は、ヒトではＭＡＰＴ（微小管関連タンパク質タウ）と名付けられ、第１７染色体に位置する単一遺伝子からの選択的スプライシングの産物である。タウタンパク質は微小管重合に必須である熱安定性タンパク質として１９７５年に同定されたが、以来、天然変性タンパク質として特徴づけられている。
【０００５】
タウタンパク質は高度に可溶性の微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）である。ヒトでは、これらのタンパク質は非神経細胞に比べて神経細胞にて主に見いだされる。タウの主要な機能の１つは軸索微小管の安定性を調節することである。タウノックアウトマウスが脳の発生で異常を示さなかったことによって示唆されたように、他の神経系ＭＡＰが、恐らく、他のＭＡＰによるタウ欠損の代償のために類似の機能を実施している場合がある。タウは樹状突起には存在せず、それが微小管の安定化を提供するが、必要に応じて柔軟性も提供する軸索の遠位端側にて主として活性がある。これは、微小管を基本的に封じ込める軸索の近位端側におけるＭＡＰ６（ＳＴＯＰ）タンパク質及び樹状突起にて微小管を安定化するＭＡＰ２とは対照的である。
【０００６】
タウタンパク質はチューブリンと相互作用して微小管を安定化し、微小管へのチューブリンの重合を促進する。タウは微小管の安定性を制御する２つの手段：アイソフォーム及びリン酸化を有する。
【０００７】
長さ３５２から４４１までに及ぶアミノ酸の６つのタウのアイソフォームが成体の脳で発現されている；これらはＭＡＰＴからの転写物の選択的ｍＲＮＡスプライシングによって作り出される（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０１７；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１０６３６）。
【０００８】
アイソフォームは結合ドメインの数によって区別される。３つのアイソフォームは３つの結合ドメインを有し、他の３つは４つの結合ドメインを有する。結合ドメインはタンパク質のカルボキシ末端に位置し、正に荷電する（それが負に荷電した微小管に結合できるようにする）。４つの結合ドメインを持つアイソフォームは３つの結合ドメインを持つものよりも微小管の安定化に優れる。アイソフォームは、Ｎ末端半分における２９または５８のアミノ酸の挿入断片の存在または非存在、及びＣ末端半分におけるＭＡＰＴの第１０エクソンによってコードされる３１アミノ酸の微小管結合反復の包含または非存在で異なる。第１０エクソンの包含は、それぞれ４つの反復（４Ｒ）を持つ３つのタウアイソフォームの産生を生じ、その排除はさらにそれぞれ３つの反復（３Ｒ）を持つ３つのアイソフォームを生じる。４つの反復（Ｒ１〜Ｒ４）は４４１アミノ酸のタウアイソフォームにて残基２４４〜３６８を含む。
【０００９】
タウは最長のタウアイソフォームにて７９の潜在的なセリン（Ｓｅｒ）及びスレオニン（Ｔｈｒ）のリン酸化部位を伴ったリン酸化タンパク質である。リン酸化は正常なタウタンパク質にておよそ３０のこれらの部位で報告されている。タウのリン酸化はＰＫＮである、セリン／スレオニンキナーゼを含む多数のキナーゼによって調節される。ＰＫＮが活性化されると、それはタウをリン酸化し、微小管組織化の破壊を生じる。タウのリン酸化は発生上でも調節される。たとえば、胎児性タウは成体のタウよりも胚性ＣＮＳにてより高度にリン酸化される。６つのアイソフォームすべてにてリン酸化の程度はホスファターゼの活性化に起因して年齢と共に低下する。キナーゼと同様に、ホスファターゼもタウのリン酸化を調節することにおいて役割を担う。たとえば、ＰＰ２Ａ及びＰＰ２Ｂは双方ともヒトの脳組織に存在し、Ｓｅｒ３９６を脱リン酸化する能力を有する。タウへのこれらホスファターゼの結合はタウのＭＴとの会合に影響を及ぼす。
【００１０】
タウタンパク質の過剰リン酸化（タウ封入体、ｐタウ）は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症及び他のタウオパチーの病態形成に関与する対らせんフィラメントと直線状フィラメントのもつれの自己重合を生じる得る。６つのタウアイソフォームのすべてがアルツハイマー病の脳由来の対らせんフィラメントでは大抵過剰リン酸化した状態で存在する。他の神経変性疾患では、特定のタウアイソフォームで豊富な凝集体の沈着が報告されている。上手く折り畳まれない場合、さもなければこの非常に可溶性のタンパク質は、多数の神経変性疾患に寄与する極端に不溶性の凝集体を形成する場合がある。
【００１１】
最近の研究は、アルツハイマー病におけるエクソソームに基づくメカニズムによってタウが細胞外に放出され得ることを示唆している。ヒト脳の様々な領域にわたる性別特異的なタウ遺伝子の発現は近年になってタウオパチーの兆候及びそのリスクにおける性差に関わっている。疾患がどのように機能するかの一部の態様もそれがプリオンタンパク質に対する若干の類似性を有することを示唆している。
【００１２】
豊富なフィラメント状のタウ封入体を伴った神経変性疾患はタウオパチーと呼ばれる。アルツハイマー病に加えて、これらの疾患には、神経原線維変化優位型認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、嗜銀顆粒病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、球状グリア細胞タウオパチー、及びピック病が挙げられる。アルツハイマー病とは異なって、これら他の疾患はアミロイドβプラークを欠いている。アルツハイマー病、神経原線維変化優位型認知症及び慢性外傷性脳症では、６つのタウアイソフォーム（３Ｒ及び４Ｒ）はすべて疾患のフィラメントに存在する。嗜銀顆粒病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び球状グリア細胞タウオパチーでは、４Ｒのタウアイソフォームのみが見いだされるのに対してピック病では、３Ｒタウ封入体だけが存在する。異なるフィラメント形態を持つヒトタウオパチーの存在は、凝集したタウの異なる分子配座異性体が存在するという考えにつながっている。複数の分子配座異性体の存在は、アルツハイマー病の人の脳に由来するフィラメントが、マウスの脳にてタウ病態を誘導することにおいて組換えタンパク質の試験管内で重合したフィラメントよりも効果的である理由を説明し得る。
【００１３】
反復性の軽度外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は今や、接触型スポーツ、特にアメリカンフットボール、及び軍隊での爆風の震盪における脳損傷の中心的要素として認識されている。それは、過剰リン酸化されたタウの原線維変化を特徴とする慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）につながり得る。脳を浸している流体における高レベルのタウタンパク質は頭部外傷後の不十分な回復に関連付けられている。
【００１４】
タウ仮説は、タウの過剰なまたは異常なリン酸化が正常な成体タウのＰＨＦ−タウ（対らせんフィラメント）及びＮＦＴ（神経原線維変化）への形質転換を生じると述べている。タウタンパク質は高度に可溶性の微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）である。そのアイソフォーム及びリン酸化を介して、タウタンパク質はチューブリンと相互作用し、微小管重合を安定化する。タウタンパク質は、３５２〜４４１アミノ酸の範囲で６つのアイソフォームのファミリーを構成する。ＣＮＳにおける最長のアイソフォームは４つの反復（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４）及び２つの挿入断片を有する（合計４４１のアミノ酸）のに対して、最小のアイソフォームは３つの反復（Ｒ１、Ｒ３及びＲ４）を有し、挿入断片を有さない（合計３５２のアミノ酸）。６つのタウアイソフォームのすべてはＡＤ由来の対らせんフィラメントにて大抵過剰リン酸化された状態で存在する。
【００１５】
タウの機能及びアイソフォーム発現を変える突然変異は過剰リン酸化につながる。突然変異の非存在下でのタウ凝集の過程は知られていないが、上昇したリン酸化、プロテアーゼの作用、または、たとえば、グリコサミノグリカンのようなポリアニオンへの曝露から生じ得る。過剰リン酸化されたタウは微小管を分解し、正常なタウ、ＭＡＰ１（微小管関連タンパク質１）、ＭＡＰ２及びユビキチンをＰＨＦのもつれに隔絶する。この不溶性構造は細胞質の機能を損傷し、軸索輸送を妨げ、それは細胞死につながり得る。
【００１６】
現在の時点では、タウオパチーを患っている患者の費用効率のよい治療のための部位特異的なペプチド免疫原及びその製剤を開発する満たされていないニーズがまだ存在する。
【００１７】
参考文献
1. “Tau protein,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/wiki/Tau_protein (accessed September 29,2017).
2. Fitzpatrick, AWP, et al., “Cryo-EM structures of Tau filaments from Alzheimer’s disease”, Nature, 547 (7662): 185-190(2017).
【発明の概要】
【００１８】
本開示は、タウオパチーの治療及び／または予防のためのタウタンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物を対象とする。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を作製し、使用する方法、及びペプチド免疫原構築物によって作られる抗体も対象とする。
【００１９】
開示されているペプチド免疫原構築物は約１５以上のアミノ酸を含有する。ペプチド免疫原構築物は、表８に示す配列番号１００のアミノ酸配列を有するヒトタウタンパク質の最長アイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＧＦ１９２４６.１）の一部に由来するＢ細胞エピトープを含有する。Ｂ細胞エピトープは、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに連結することができる。開示されているペプチド免疫原構築物はタウに対して向けられた高度に特異的な抗体の生成を刺激する。開示されているペプチド免疫原構築物はタウオパチーを患っている患者のための免疫療法として使用することができる。
【００２０】
ペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ部分は完全長のタウタンパク質（配列番号１００）に由来するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、Ｂ細胞エピトープは表１に示すような配列番号１〜２１及び１０１〜１２４のいずれかを含有する配列を有する。
【００２１】
本開示のペプチド免疫原構築物は、表２に示すような病原体タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープのアミノ酸配列（たとえば、配列番号２２〜５０）を含有することができる。特定の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、たとえば、ジフテリア毒素（配列番号２６）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（配列番号２７）、コレラ毒素（配列番号２９）のような天然の病原体に由来する。他の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、単一配列または組み合わせ配列（たとえば、配列番号３３、３２及び３４）の形態での麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１〜５）またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１〜３）に由来する理想的な人工Ｔｈエピトープである。
【００２２】
一部の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意の異種スペーサーを介して異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに連結されるタウ由来のＢ細胞エピトープを含有する。特定の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（たとえば、配列番号２２〜５０）に連結されるタウ由来のアミノ酸配列（配列番号１〜２１及び１０１〜１２４）を有するＢ細胞抗原部位を含有する。一部の実施形態では、任意の異種スペーサーは２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に連結することができる分子または化学構造である。特定の実施形態では、スペーサーは天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、またはそれらの組み合わせである。具体的な実施形態では、ペプチド免疫原構築物は表３に示す配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物を含有する組成物も対象とする。一部の実施形態では、開示されている組成物はタウ由来の複数のＢエピトープを対象にする１を超えるタウペプチド免疫原構築物を含有する。特定の実施形態では、組成物は、患者における広い遺伝的背景を対象にするために病原体タンパク質に由来する１を超える異種Ｔｈエピトープを持つタウペプチド免疫原構築物の混合物（たとえば、配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５の任意の組み合わせ）を含有する。ペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物は、単一のＴｈペプチド免疫原構築物のみを含有する組成物と比べて、タウオパチーの治療のための免疫の際の有効率での高い比率につながり得る。
【００２４】
本開示はまた、タウオパチーの治療及び／または予防のための医薬組成物も対象とする。一部の実施形態では、医薬組成物は、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物とＣｐＧオリゴマーを混合することによって静電会合を介して形成される安定化された免疫賦活複合体の形態で開示されているペプチド免疫原構築物を含有する。そのような安定化された免疫賦活複合体はペプチド免疫原構築物の免疫原性をさらに高めることができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、たとえば、ミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）、リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含む無機塩、またはＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１もしくは７２０を含む油中水エマルションのようなアジュバントを含有する。
【００２５】
本開示はまた、開示されているタウペプチド免疫原構築物に対して向けられた抗体も対象とする。特に、本開示のペプチド免疫原構築物は対象に投与されるとタウのアミノ酸配列（配列番号１〜２１及び１０１〜１２４）と交差反応性である高度に特異的な抗体の生成を刺激することができる。ペプチド免疫原構築物によって作り出される高度に特異的な抗体は組換えタウ含有タンパク質と交差反応性である。開示されている抗体は高い特異性でタウに結合し、免疫原性強化のために採用される異種Ｔｈエピトープに向けられることは多くなく、あってもわずかであり、それはそのようなペプチド抗原性の強化に使用される従来のタンパク質または他の生物学的キャリアとは際立って対照的である。
【００２６】
本開示はまた、開示されているペプチド免疫原構築物及び／またはペプチド免疫原構築物に向けられた抗体を用いてタウオパチーを治療する及び／または予防する方法も含む。一部の実施形態では、開示されているペプチド免疫原構築物を含有する組成物を宿主に投与することを含む、タウオパチーを治療する及び／または予防する方法。特定の実施形態では、方法で利用される組成物は、静電会合を介したＣｐＧオリゴマーのような負に荷電したオリゴヌクレオチドとの安定した免疫賦活複合体の形態で開示されているペプチド免疫原構築物を含有し、その複合体はさらに、タウオパチーの患者に投与するために任意でアジュバントとしての無機塩または油によって補完される。開示されている方法はまた、タウオパチーのリスクがある宿主またはタウオパチーの宿主にペプチド免疫原構築物を投与するための投薬計画、剤形、及び経路も含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】タウの抗原性領域で解析した場合の非リン酸化タウペプチドに対する最初の注射の６週後（ｗｐｉ）での複数のタウ免疫原構築物から得られた免疫血清についてのＬｏｇ１０力価で表したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図１Ｂ】タウの抗原性領域で解析した場合のリン酸化タウペプチドに対する最初の注射の６週後（ｗｐｉ）での複数のタウ免疫原構築物から得られた免疫血清についてのＬｏｇ１０力価で表したＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図２】タウタンパク質の単量体、二量体、三量体及びオリゴマーを含有する細胞溶解物のウエスタンブロット解析を示す図である。種々のレーンは各レーンの上で示す非リン酸化タウペプチド免疫原構築物によって導出されたＩｇＧ抗体を示す（左側）。これらのペプチド免疫原構築物は表３に示す構築物に相当する。各抗体の結合特性を解析し、棒グラフで要約した（右側）。タウ免疫原構築物に対する代表的な免疫血清は複数種のタウ（単量体、二量体、三量体、オリゴマー及びポリマー）に対する結合反応性を実証した。
【図３Ａ】免疫前血清由来の抗体と比べた、各グラフの上に示す０から５μｇ／ｍＬに及ぶ濃度でのリン酸化タウペプチド免疫原に向けられた種々の抗体に曝露した後の完全長タウ（タウ４４１アミノ酸）の凝集のレベルを示すグラフである。タウ凝集のレベルは凝集体のチオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）染色によって測定した。
【図３Ｂ】５μｇ／ｍＬのリン酸化タウペプチド免疫原構築物に向けられた抗体及び陽性対照として使用され、試験管内でタウを脱凝集することが知られるメチレンブルーの存在下での試験管内タウ凝集のレベルを示す棒グラフである。
【図４】各グラフの上に示すように、リン酸化タウペプチド免疫原または非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体への曝露の後のタウ凝集のレベルを示すグラフである。タウ凝集のレベルは凝集体のチオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）染色によって測定した。リン酸化タウ免疫原または非リン酸化タウ免疫原に向けられた抗体について種々の程度の阻害が見いだされた。
【図５】各グラフの下に示すように、代表的なリン酸化タウペプチド免疫原または非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体への曝露の際の予め形成された人工的なタウ原線維のタウ脱凝集のレベルを示すグラフである。タウ凝集のレベルは凝集体のチオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）染色によって測定した。代表的なリン酸化タウ免疫原または非リン酸化タウ免疫原に由来する免疫血清由来の抗体で種々の程度までの脱凝集が見いだされた。
【図６】左側に示すように、本開示のタウペプチド免疫原によって作り出された抗リン酸化タウＩｇＧ及び抗非リン酸化タウＩｇＧのウエスタンブロット解析（変性条件下）を示す図である。右のパネルに示すように、本開示の代表的なタウペプチド免疫原によって作り出された抗リン酸化タウＩｇＧ及び抗非リン酸化タウＩｇＧのドットブロット解析（非変性条件下）を示す図である。リン酸化タウペプチド免疫原によって導出された抗体はタウの原線維及びオリゴマーに対して優先的な結合を示した。
【図７】本開示のリン酸化タウペプチド免疫原及び非リン酸化タウペプチド免疫原の双方によって生成された代表的な抗体による免疫組織化学染色を示す図である。左のパネルは正常な脳切片に対比したアルツハイマー病特異的な切片の結合特性を示すのに対して、右のパネルは正常組織にて交差反応がないことを示す。
【図８Ａ】本開示のリン酸化タウペプチド免疫原及び非リン酸化タウペプチド免疫原の双方によって生成された代表的な抗体による原線維タウに対する神経細胞の保護を示す組織染色である。
【図８Ｂ】本開示のリン酸化タウペプチド免疫原及び非リン酸化タウペプチド免疫原の双方によって生成された代表的な抗体による原線維タウに対する神経細胞の保護を定量化するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示は、アルツハイマー病及び／またはタウオパチーの治療及び／または予防のためのタウタンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物を対象とする。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を作製し、使用する方法、及びペプチド免疫原構築物によって作られる抗体も対象とする。
【００２９】
開示されているペプチド免疫原構築物は約１５以上のアミノ酸を含有する。ペプチド免疫原構築物は、表８に示す配列番号１００のアミノ酸配列を有するヒトタウタンパク質の最長アイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＧＦ１９２４６.１）の一部に由来するＢ細胞エピトープを含有する。Ｂ細胞エピトープは、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに連結することができる。開示されているペプチド免疫原構築物はタウに対して向けられた高度に特異的な抗体の生成を刺激する。開示されているペプチド免疫原構築物はアルツハイマー病及び／またはタウオパチーを患っている患者のための免疫療法として使用することができる。
【００３０】
ペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ部分は完全長のタウタンパク質（配列番号１００）に由来するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、Ｂ細胞エピトープは表１に示すような配列番号１〜２１及び１０１〜１２４のいずれかを含有する配列を有する。
【００３１】
本開示のペプチド免疫原構築物は、表２に示すような病原体タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープのアミノ酸配列（たとえば、配列番号２２〜５０）を含有することができる。特定の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、たとえば、ジフテリア毒素（配列番号２６）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（配列番号２７）、コレラ毒素（配列番号２９）のような天然の病原体に由来する。他の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、単一配列または組み合わせ配列（たとえば、配列番号３３、３２及び３４）の形態での麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１〜５）またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１〜３）に由来する理想的な人工Ｔｈエピトープである。
【００３２】
一部の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意の異種スペーサーを介して異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに連結されるタウ由来のＢ細胞エピトープを含有する。特定の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（たとえば、配列番号２２〜５０）に連結されるタウ由来のアミノ酸配列（配列番号１〜２１及び１０１〜１２４）を有するＢ細胞抗原部位を含有する。一部の実施形態では、任意の異種スペーサーは２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に連結することができる分子または化学構造である。特定の実施形態では、スペーサーは天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、またはそれらの組み合わせである。具体的な実施形態では、ペプチド免疫原構築物は表４に示す配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５のアミノ酸配列を有する。
【００３３】
本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物を含有する組成物も対象とする。一部の実施形態では、開示されている組成物はタウ由来の複数のＢエピトープを対象にする１を超えるタウペプチド免疫原構築物を含有する。特定の実施形態では、組成物は、患者における広い遺伝的背景を対象にするために病原体タンパク質に由来する１を超える異種Ｔｈエピトープを持つタウペプチド免疫原構築物の混合物（たとえば、配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５の任意の組み合わせ）を含有する。ペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物は、単一のペプチド免疫原構築物のみを含有する組成物と比べて、アルツハイマー病及び／またはタウオパチーの治療のための免疫の際の有効率での高い比率につながり得る。
【００３４】
本開示はまた、アルツハイマー病及び／またはタウオパチーの治療及び／または予防のための医薬組成物も対象とする。一部の実施形態では、医薬組成物は、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物とＣｐＧオリゴマーを混合することによって静電会合を介して形成される安定化された免疫賦活複合体の形態で開示されているペプチド免疫原構築物を含有する。そのような安定化された免疫賦活複合体はペプチド免疫原構築物の免疫原性をさらに高めることができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、たとえば、ミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）、リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含む無機塩、またはＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１もしくは７２０を含む油中水エマルションのようなアジュバントを含有する。
【００３５】
本開示はまた、開示されているタウペプチド免疫原構築物に対して向けられた抗体も対象とする。特に、本開示のペプチド免疫原構築物は対象に投与されるとタウのアミノ酸配列（配列番号１〜２１及び１０１〜１２４）と交差反応性である高度に特異的な抗体の生成を刺激することができる。ペプチド免疫原構築物によって作り出される高度に特異的な抗体は組換えタウ含有タンパク質と交差反応性である。開示されている抗体は高い特異性でタウに結合し、免疫原性強化のために採用される異種Ｔｈエピトープに向けられることは多くなく、あってもわずかであり、それはそのようなペプチド抗原性の向上に使用される従来のタンパク質または他の生物学的キャリアとは際立って対照的である。
【００３６】
本開示はまた、開示されているペプチド免疫原構築物及び／またはペプチド免疫原構築物に向けられた抗体を用いてアルツハイマー病及び／またはタウオパチーを治療する及び／または予防する方法も含む。一部の実施形態では、開示されているペプチド免疫原構築物を含有する組成物を宿主に投与することを含む、アルツハイマー病及び／またはタウオパチーを治療する及び／または予防する方法。特定の実施形態では、方法で利用される組成物は、静電会合を介したＣｐＧオリゴマーのような負に荷電したオリゴヌクレオチドとの安定した免疫賦活複合体の形態で開示されているペプチド免疫原構築物を含有し、その複合体はさらに、アルツハイマー病及び／またはタウオパチーの患者に投与するために任意でアジュバントとしての無機塩または油によって補完される。開示されている方法はまた、アルツハイマー病及び／またはタウオパチーのリスクがある宿主またはアルツハイマー病及び／またはタウオパチーの宿主にペプチド免疫原構築物を投与するための投薬計画、剤形、及び経路も含む。
【００３７】
セクションの見出しは本明細書で使用されるとき、構成目的のみのためのものであって、記載されている主題を限定すると解釈されるべきではない。本出願で引用されている参考文献すべてまたは参考文献の一部はあらゆる目的で全体として参照によって本明細書に明白に組み入れられる。
【００３８】
特に説明されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数表現「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または」は文脈が明瞭に指示しない限り、「及び」を含むように意図される。従って、「ＡまたはＢを含むこと」はＡまたはＢまたはＡ及びＢを含むことを意味する。ポリペプチドについて示されるアミノ酸のサイズすべて、及び分子量または分子質量の値すべては近似であり、記載のために提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されているものと類似するまたは同等である方法及び材料を開示されている方法の実践及び検査で使用することができるが、好適な方法及び材料は以下に記載されている。本明細書で言及されている出版物、特許出願、特許及び他の参考文献はすべて全体として参照によって組み入れられる。矛盾がある場合、用語の説明を含めて本明細書が統制するであろう。加えて、材料、方法及び実施例は説明に役立つだけであり、限定するようには意図されない。
【００３９】
タウペプチド免疫原構築物
本開示は、直接または任意の異種スペーサーを介して異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合されるタウ由来のアミノ酸配列を持つＢ細胞エピトープを含有するペプチド免疫原構築物を提供する。
【００４０】
語句「タウペプチド免疫原構築物」または「ペプチド免疫原構築物」は本明細書で使用されるとき、（ａ）最長のタウアイソフォームの完全長配列（配列番号１００）由来の約１５以上のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープと、（ｂ）異種Ｔｈエピトープと、（ｃ）任意の異種スペーサーとを含有するペプチドを指す。
【００４１】
特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物は式
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（タウ断片）−Ｘ
または
（タウ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
によって表すことができ、
式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり；
Ａは異種スペーサーであり；
（タウ断片）は配列番号１００に由来する約１５〜約４０のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり；
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり；
ｍは１〜約４であり；
ｎは０〜約１０である。
【００４２】
開示されているタウペプチド免疫原構築物の種々の成分が以下に記載されている。
【００４３】
ａ．タウ断片
開示されているペプチド免疫原構築物は約１５以上のアミノ酸を含有する。ペプチド免疫原構築物は、表８に示す配列番号１００のアミノ酸配列を有するヒトのタウタンパク質の最長アイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＧＦ１９２４６．１）の一部に由来するＢ細胞エピトープを含有する。Ｂ細胞エピトープは、任意の異種スペーサーを介して病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに連結することができる。開示されているペプチド免疫原構築物は、タウに向けられた高度に特異的な抗体の生成を刺激する。開示されているペプチド免疫原構築物はアルツハイマー病及び／またはタウオパチーを患っている患者のための免疫療法として使用することができる。
【００４４】
ペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープの部分は完全長のタウタンパク質（配列番号１００）に由来するアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、Ｂ細胞エピトープは表１に示すような配列番号１〜２１及び１０１〜１２４のいずれかを含有する配列を有する。
【００４５】
一部の実施形態では、タウ断片は表１に示すように、非リン酸化アミノ酸を含有する（たとえば、配列番号:２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１）。他の実施形態では、タウ断片は表１に示すように、リン酸化されたセリンアミノ酸及び／またはスレオニンアミノ酸を含有する（たとえば、配列番号:１、３、５、７、９、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０）。表１のペプチドで示されたタウ断片と同様にリン酸化部位は例示であり、本開示は、配列番号１００の完全長タウタンパク質の他の断片及び／またはリン酸化部位を含む。
【００４６】
ｂ．異種Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）
本開示は、直接または任意の異種スペーサーを介して異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合されるタウ由来のＢ細胞エピトープを含有するペプチド免疫原構築物を提供する。
【００４７】
タウペプチド免疫原構築物における異種Ｔｈエピトープはタウ断片の免疫原性を強化し、それは合理的設計を介して最適化された標的Ｂ細胞エピトープ（すなわち、タウ断片）に対して向けられた特異的な力価が高い抗体の産生を促す。
【００４８】
用語「異種の」は本明細書で使用されるとき、タウの野生型配列の一部ではないまたはそれと相同ではないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。従って、異種Ｔｈエピトープはタウでは天然に見いだされないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープである（すなわち、Ｔｈエピトープはタウに対して自己ではない）。Ｔｈエピトープはタウに対して異種なので、異種Ｔｈエピトープがタウ断片に共有結合すると、タウの天然のアミノ酸配列は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれかでは伸長されない。
【００４９】
本開示の異種Ｔｈエピトープはタウにて天然に見いだされるアミノ酸配列を有さない任意のＴｈエピトープであることができる。Ｔｈエピトープは、どんな種（たとえば、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス、モルモット、等）に由来するアミノ酸配列も有することができる。Ｔｈエピトープは複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子に対して無差別な結合モチーフも有することができる。特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは複数の無差別なＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを含んで、免疫応答の開始及び調節につながるＴヘルパー細胞の最大の活性化を可能にする。Ｔｈエピトープは好ましくはそれ自体免疫サイレントであり、すなわち、タウペプチド免疫原構築物によって生成される抗体はＴｈエピトープに向けられることはほとんどなく、あってもわずかなので、タウ断片の標的とされるＢ細胞エピトープに向けられた非常に集中した免疫応答を可能にする。
【００５０】
本開示のエピトープには、表２で例示されているような外来病原体に由来するアミノ酸配列（配列番号２２〜５０）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、Ｔｈエピトープには、理想的な人工Ｔｈエピトープ及び組み合わせの理想的な人工Ｔｈエピトープ（たとえば、配列番号２３及び３０〜３６）が含まれる。組み合わせ配列（たとえば、配列番号３１〜３４）として提示される異種Ｔｈエピトープペプチドは、その特定のペプチドについてのホモログの可変残基に基づくペプチドのフレームワーク内での特定の位置で表されるアミノ酸残基の混合物を含有する。合成過程の間で特定された位置にて特定のアミノ酸１つの代わりに指定された保護したアミノ酸の混合物を加えることによって１つのプロセスにて組み合わせペプチドの集合体を合成することができる。そのような組み合わせ異種Ｔｈエピトープのペプチド集合体は、多様な遺伝的背景を有する動物についての広いＴｈエピトープの適用範囲を可能にすることができる。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的な組み合わせ配列には表２に示される配列番号３１〜３４が挙げられる。本発明のＴｈエピトープペプチドは遺伝的に多様な集団に由来する動物及び患者に対する広い反応性及び免疫原性を提供する。
【００５１】
Ｔｈエピトープを含むタウペプチド免疫原構築物はタウ断片と並行して単一の固相ペプチド合成にて同時に作り出される。ＴｈエピトープはまたＴｈエピトープの免疫類似体も含む。Ｔｈ免疫類似体には、タウ断片に対する免疫応答を増強するまたは刺激するのに十分であるこれらＴｈエピトープのいずれかの免疫増強類似体、交差反応性類似体及びセグメントが含まれる。
【００５２】
Ｔｈエピトープペプチドの機能的な免疫類似体も効果的であり、本発明の一部として含まれる。機能的なＴｈ免疫類似体は、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に修飾しない、Ｔｈエピトープにおける１〜約５のアミノ酸残基の保存的な置換、付加、欠失及び挿入を含むことができる。保存的な置換、付加、及び挿入はタウ断片について上記に記載されているように天然のアミノ酸及び非天然のアミノ酸によって達成することができる。表２はＴｈエピトープペプチドについての機能的類似体の別の変形型を同定している。特に、ＭｖＦ１及びＭｖＦ２のＴｈの配列番号２３及び３０は、それらが、それぞれＮ末端及びＣ末端における２つのアミノ酸の欠失（配列番号２３及び３０）または包含（配列番号３３及び３５）によってアミノ酸の枠組みで異なるという点で、ＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号３３及び３５の機能的類似体である。これら２組の類似体配列の間での差異はこれらの配列内に含有されるＴｈエピトープの機能に影響を及ぼさない。従って、機能的なＴｈ免疫類似体には、麻疹ウイルス融合タンパク質ＭｖＦ１〜４のＴｈ（配列番号２３、３０、３１、３３及び３５）及び肝炎表面タンパク質ＨＢｓＡｇ１〜３のＴｈ（配列番号３２、３４及び３６）に由来するＴｈエピトープの幾つかのバージョンが含まれる。
【００５３】
タウペプチド免疫原構築物におけるＴｈエピトープはタウペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに共有結合することができる。一部の実施形態では、ＴｈエピトープはタウペプチドのＮ末端に共有結合する。他の実施形態では、ＴｈエピトープはタウペプチドのＣ末端に共有結合する。特定の実施形態では、１を超えるＴｈエピトープがタウ断片に共有結合される。１を超えるＴｈエピトープがタウ断片に結合される場合、各Ｔｈエピトープは同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有することができる。加えて、１を超えるＴｈエピトープがタウ断片に結合される場合、Ｔｈエピトープはどんな順序でも配置することができる。たとえば、Ｔｈエピトープは、タウ断片のＮ末端に連続して結合することができ、またはタウ断片のＣ末端に連続して結合することができ、またはＴｈエピトープはタウ断片のＮ末端に共有結合されることができる一方で、別のＴｈエピトープはタウ断片のＣ末端に共有結合される。タウ断片に関してＴｈエピトープの配置での制限はない。
【００５４】
一部の実施形態では、Ｔｈエピトープはタウ断片に直接共有結合される。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、以下でさらに詳細に記載されている異種スペーサーを介してタウ断片に共有結合される。
【００５５】
ｃ．異種スペーサー
開示されているタウペプチド免疫原構築物は任意で、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープにタウ由来のＢ細胞エピトープを共有結合する異種スペーサーを含有する。
【００５６】
上記で議論されたように、用語「異種」はタウの野生型配列の一部ではない、またはそれと相同ではないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。従って、スペーサーがタウ配列にとって異種であるので異種スペーサーがタウ由来のＢ細胞エピトープに共有結合するとタウの天然のアミノ酸配列は、Ｎ末端方向またはＣ末端方向のいずれかで伸長されない。
【００５７】
スペーサーは２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に結合することができる任意の分子または化学構造である。スペーサーは適用に応じて長さまたは極性で変化することができる。スペーサーの連結はアミド結合またはカルボキシル結合を介することができるが、他の官能基も同様に可能である。スペーサーは化合物、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。
【００５８】
スペーサーはタウペプチド免疫原構築物に対して構造的な特徴を提供することができる。構造的に、スペーサーはタウ断片のＢ細胞エピトープからのＴｈエピトープの物理的分離を提供する。スペーサーによる物理的分離はＢ細胞エピトープにＴｈエピトープを結合することによって作り出される人工的な二次的構造を壊すことができる。さらに、スペーサーによるエピトープの物理的分離はＴｈ細胞及び／またはＢ細胞の反応間の干渉を排除することができる。さらに、スペーサーはペプチド免疫原構築物の二次構造を作り出すまたは修飾するように設計することができる。たとえば、スペーサーは柔軟なヒンジとして作用してＴｈエピトープとＢ細胞エピトープの分離を強化するように設計することができる。柔軟なヒンジのスペーサーは提示されるペプチド免疫原と適当なＴｈ細胞及びＢ細胞との間のさらに効率的な相互作用を可能にしＴｈエピトープ及びＢ細胞エピトープに対する免疫応答を増強することもできる。柔軟なヒンジをコードする配列の例は、プロリンが豊富であることが多い免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域にて見いだされる。スペーサーとして使用することができる特に有用な柔軟なヒンジの１つは、配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号１０１）によって提供され、その際、Ｘａａは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。
【００５９】
スペーサーはタウペプチド免疫原構築物に対して機能的な特徴を提供することもできる。たとえば、スペーサーはタウペプチド免疫原構築物の電荷全体を変えるように設計することができ、それはペプチド免疫原構築物の溶解度に影響を及ぼすことができる。さらに、タウペプチド免疫原構築物の電荷全体を変えることは他の化合物及び試薬と会合するペプチド免疫原構築物の能力に影響を及ぼすことができる。以下でさらに詳細に議論されているように、タウペプチド免疫原構築物は静電会合を介して、たとえば、ＣｐＧオリゴマーのような高度に荷電したオリゴヌクレオチドとの安定な免疫賦活複合体を形成することができる。タウペプチド免疫原構築物の電荷全体はこれら安定な免疫賦活複合体の形成にとって重要である。
【００６０】
スペーサーとして使用することができる化合物には、（２−アミノエトキシ）酢酸（ＡＥＡ）、５−アミノ吉草酸（ＡＶＡ）、６−アミノカプロン酸（Ａｈｘ）、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡ、ミニ−ＰＥＧ１）、１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸（ミニ−ＰＥＧ２）、１５−アミノ−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタ−デカン酸（ミニ−ＰＥＧ３）、トリオキサトリデカン−スクシナミン酸（Ｔｔｄｓ）、１２−アミノ−ドデカン酸、Ｆｍｏｃ−５−アミノ−３−オキサペンタン酸（Ｏ１Ｐｅｎ）、等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
天然に存在するアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。
【００６２】
天然に存在しないアミノ酸には、ε−Ｎリシン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６−アミノカプロン酸（Ａｃａ；６−アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３−ニトロ−チロシン、ピログルタミン酸、等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
タウペプチド免疫原構築物におけるスペーサーはＴｈエピトープ及びタウペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかで共有結合することができる。一部の実施形態では、スペーサーはＴｈエピトープのＣ末端に共有結合され、且つタウペプチドのＮ末端に共有結合される。他の実施形態では、スペーサーはタウペプチドのＣ末端に共有結合され、且つＴｈエピトープのＮ末端に共有結合される。特定の実施形態では、たとえば、ペプチド免疫原構築物にて１を超えるＴｈエピトープが存在する場合、１を超えるスペーサーを使用することができる。１を超えるスペーサーが使用される場合、各スペーサーは互いに同一であることができ、または異なることができる。さらに、ペプチド免疫原構築物にて１を超えるＴｈエピトープが存在する場合、Ｂ細胞エピトープからＴｈエピトープを分離するのに使用されるスペーサーと同一であることができる、または異なることができるスペーサーでＴｈエピトープを分離することができる。Ｔｈエピトープ及びタウ断片との関連でスペーサーの配置には制限はない。
【００６４】
特定の実施形態では、異種スペーサーは天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは１を超える天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸を含有する。具体的な実施形態では、スペーサーはＬｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α、ε−Ｎ）Ｌｙｓ、またはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１０２）である。
【００６５】
ｄ．タウペプチド免疫原構築物の具体的な実施形態
タウペプチド免疫原構築物は式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（タウ断片）−Ｘ
または
（タウ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
によって表すことができ、
式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり；
Ａは異種スペーサーであり；
（タウ断片）は配列番号１００の完全長タウタンパク質に由来する約１５〜約４０のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり；
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり；
ｍは１〜約４であり；
ｎは０〜約１０である。
【００６６】
特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物における異種Ｔｈエピトープは、表３に示す、配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５のいずれか及びそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸配列を有する。具体的な実施形態では、Ｔｈエピトープは配列番号３０〜３６のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物は１を超えるＴｈエピトープを含有する。
【００６７】
特定の実施形態では、任意の異種スペーサーはＬｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α、ε−Ｎ）Ｌｙｓ、ε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１０２）のいずれか、及びそれらの組み合わせから選択される。具体的な実施形態では、異種スペーサーはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１０２）である。
【００６８】
特定の実施形態では、タウ断片は、配列番号１００の完全長タウタンパク質に由来する約１５〜約４０のアミノ酸残基を有する。具体的な実施形態では、タウ断片は、表１に示すような配列番号１〜２１及び１０１〜１２４によって表されるアミノ酸配列を有する。
【００６９】
特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物は表３に示すような配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
【００７０】
ａ．変異体、ホモログ及び機能的な類似体
タウタンパク質の好まれるエピトープに対する抗体を誘導する及び／またはそれと交差反応する上記免疫原性ペプチドの変異体及び類似体も使用することができる。対立遺伝子変異体、種変異体及び誘導された変異体を含む類似体は通常、多くは保存的置換によって１、２またはわずかな位置で天然に存在するペプチドとは異なる。類似体は通常、天然のペプチドとの少なくとも８０％または９０％の配列同一性を示す。一部の類似体は１、２またはわずかな位置で非天然のアミノ酸またはＮもしくはＣ末端アミノ酸の修飾も含む。
【００７１】
機能的な類似体である変異体は、アミノ酸の位置での保存的置換；電荷全体での変化；別の部分への共有結合；またはアミノ酸の付加、挿入、もしくは欠失；及び／またはそれらの任意の組み合わせを有することができる。
【００７２】
保存的置換は、１つのアミノ酸残基が類似の化学的特性を持つもう１つのアミノ酸残基で置換される場合である。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ；極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ；負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
【００７３】
特定の実施形態では、機能的な類似体は元々のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。別の実施形態では、機能的な類似体は元々のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能的な類似体は元々のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能的な類似体は元々のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する。
【００７４】
変異体はリン酸化された残基に対する変異も含む。たとえば、変異体はリン酸化されているペプチド内で様々な残基を含むことができる。変異体免疫原性タウペプチドは偽リン酸化ペプチドを含むことができる。偽リン酸化ペプチドはタウペプチドのリン酸化されたセリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の１以上を、たとえば、グルタミン酸及びアスパラギン酸のような酸性アミノ酸残基で置換することによって生成される。
【００７５】
組成物
本開示はまた、開示されているタウ免疫原構築物を含む組成物も提供する。
【００７６】
ａ．ペプチド組成物
開示されているタウペプチド免疫原構築物を含有する組成物は液体形態または固体形態であることができる。液体組成物は水、緩衝液、溶媒、塩及び／またはタウペプチド免疫原構築物の構造的特性または機能的特性を変化させない他の許容できる試薬を含むことができる。ペプチド組成物は、開示されているタウペプチド免疫原構築物の１以上を含有することができる。
【００７７】
ｂ．医薬組成物
本開示はまた、開示されているタウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物も対象とする。
【００７８】
医薬組成物は、薬学上許容できる送達系にてキャリア及び／または他の添加剤を含有することができる。さらに、医薬組成物は、薬学上許容できるキャリア、アジュバント及び／または、たとえば、希釈剤、添加剤、安定剤、保存剤、可溶化剤、緩衝液、等のような他の賦形剤と一緒に薬学上有効な量のタウペプチド免疫原構築物を含有することができる。
【００７９】
医薬組成物は、それ自体任意の特異的な抗原性効果を有することなく、タウペプチド免疫原構築物に対する免疫応答を加速する、延長するまたは強化するように作用する１以上のアジュバントを含有することができる。医薬組成物で使用されるアジュバントには、油、アルミニウム塩、ビロソーム、リン酸アルミニウム（たとえば、ＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（たとえば、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）、モノホスホリル液体Ａ（ＭＰＬ）、ＱＳ２１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ７２０、と同様に他のアジュバント及び乳化剤を挙げることができる。
【００８０】
一部の実施形態では、医薬組成物は、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（油中水エマルションの製造のための植物油とオレイン酸マンニドで構成される油アジュバント組成物）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）モノオレイン酸ソルビタンとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及び／またはそれらの任意の組み合わせを含有する。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてのエマルシゲンまたはエマルシゲンＤを伴った水中油中水（すなわち、ｗ／ｏ／ｗ）エマルションである。
【００８１】
医薬組成物は、即時放出製剤としてまたは徐放性製剤用に製剤化することができる。さらに、医薬組成物は、免疫原の封入及び微粒子との同時投与を介した全身性免疫または局在粘膜免疫の誘導のために製剤化することができる。そのような送達系は当業者によって容易に決定される。
【００８２】
医薬組成物は、液体溶液または懸濁液としての注射剤として調製することができる。注射に先立って、タウペプチド免疫原構築物を含有する液体媒体も調製することができる。医薬組成物は、適用の任意の好適な方式、たとえば、ｉ．ｄ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、鼻内、経口、皮下、等によって且つ任意の好適な送達用具にて投与することができる。特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与用、皮下投与用、皮内投与用または筋肉内投与用に製剤化される。経口及び鼻内の適用を含む投与の他の方式に好適な医薬組成物も調製することができる。
【００８３】
医薬組成物は、即時放出製剤としてまたは徐放性製剤用に製剤化することができる。さらに、医薬組成物は、免疫原の封入及び微粒子との同時投与を介した全身性免疫または局在粘膜免疫の誘導のために製剤化することができる。そのような送達系は当業者によって容易に決定される。
【００８４】
医薬組成物は、好適な単位剤形にて製剤化することもできる。一部の実施形態では、医薬組成物は、体重ｋｇ当たり約０．５μｇ〜約１ｍｇのタウペプチド免疫原構築物を含有する。医薬組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の身体的状態、患者がヒトであるか、または動物であるか、投与される他の薬物、及び処置が予防的であるか、または治療上であるかを含む多数の様々な因子に応じて変化する。普通、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類も治療することができる。複数回用量で送達される場合、医薬組成物は便宜上、単位剤形当たり適当な量に分割されてもよい。投与される投与量は、治療技術では周知のように対象の年齢、体重及び全身状態に左右されるであろう。
【００８５】
一部の実施形態では、医薬組成物は１を超えるタウペプチド免疫原構築物を含有する。構築物の免疫有効性の相乗的な強化を可能にする１を超えるタウペプチド免疫原構築物の混合物を含有する医薬組成物。１を超えるタウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩの広い適用範囲によりさらに大きな遺伝的集団ではさらに効果的であり得るので、タウペプチド免疫原構築物に対する改善された免疫応答を提供する。
【００８６】
一部の実施形態では、医薬組成物は配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５から選択されるタウペプチド免疫原構築物、と同様にそれらのホモログ、類似体及び／または組み合わせを含有する。具体的な実施形態では、医薬組成物は配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５から選択されるタウペプチド免疫原構築物及びそれらの任意の組み合わせを含有する。
【００８７】
タウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を使用して免疫応答を引き出し、投与の際、宿主にて抗体を作り出すことができる。
【００８８】
ｃ．免疫賦活複合体
本開示はまた、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫賦活複合体の形態でタウペプチド免疫原の構築物を含有する医薬組成物も対象とする。そのような免疫賦活複合体は特異的に適合し、アジュバントとして及びペプチド免疫原の安定剤として作用する。免疫賦活複合体は微粒子の形態であり、それは、免疫系の細胞にタウペプチド免疫原を効率的に提示して免疫応答を生じることができる。免疫賦活複合体は非経口投与用に懸濁液として製剤化されてもよい。免疫賦活複合体は、非経口投与に続く宿主の免疫系の細胞へのタウペプチド免疫原の効率的な送達のために、無機塩との組み合わせまたは原位置ゲル化ポリマーとの組み合わせでの懸濁液としてｗ／ｏエマルションの形態で製剤化されてもよい。
【００８９】
安定化された免疫賦活複合体は、静電会合を介してアニオン系の分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそれらの組み合わせと共にタウペプチド免疫原構築物を複合体化することによって形成することができる。安定化された免疫賦活複合体は、免疫原の送達系として医薬組成物に組み込まれてもよい。
【００９０】
特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物は５．０〜８．０の範囲でのｐＨにて正に荷電するカチオン系の部分を含有するように設計される。タウペプチド免疫原構築物または構築物の混合物のカチオン系部分の正味電荷は、配列内でそれぞれリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）に対して＋１の電荷を割り当て、それぞれアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）に対して−１の電荷を割り当て、他のアミノ酸に対して０の電荷を割り当てることによって算出する。タウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分内で電荷を合計し、正味平均電荷として表現する。好適なペプチド免疫原は＋１の正味の平均正電荷を持つカチオン系部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は＋２より大きい範囲での正味の正電荷を有する。一部の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分は異種スペーサーである。特定の実施形態では、スペーサー配列が（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、ε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１０２）である場合、タウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分は＋４の電荷を有する。
【００９１】
本明細書に記載されている「アニオン系分子」は５．０〜８．０の範囲のｐＨにて負に荷電する任意の分子を指す。特定の実施形態では、アニオン系分子はオリゴマーまたはポリマーである。オリゴマーまたはポリマーの正味の負電荷はオリゴマーにおけるそれぞれホスホジエステル基またはホスホロチオエート基に対して−１の電荷を割り当てることによって算出される。好適なアニオン系オリゴヌクレオチドは、１〜１０の範囲でのＣｐＧモチーフの反復数を持つ、８〜６４のヌクレオチド塩基を伴った一本鎖ＤＮＡ分子である。好ましくは、ＣｐＧ免疫賦活一本鎖ＤＮＡ分子は３〜８の範囲でのＣｐＧモチーフの反復数を持つ１８〜４８のヌクレオチド塩基を含有する。
【００９２】
さらに好ましくは、アニオン系オリゴヌクレオチドは式５’  Ｘ１ＣＧＸ２  ３’によって表され、式中、Ｃ及びＧはメチル化されず、Ｘ１はＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）及びＴ（チミン）から成る群から選択され、Ｘ２はＣ（シトシン）またはＴ（チミン）である。または、アニオン系オリゴヌクレオチドは式５’（Ｘ３）２ＣＧ（Ｘ４）２３’によって表され、式中、Ｃ及びＧはメチル化されず、Ｘ３はＡ、ＴまたはＧから成る群から選択され、Ｘ４はＣまたはＴである。
【００９３】
得られる免疫賦活複合体は、通常１〜５０ミクロンの範囲でのサイズを持つ粒子の形態であり、相対的な電荷化学量論及び相互作用する種の分子量を含む多数の因子の関数である。微粒子状の免疫賦活複合体は、生体内で特異的な免疫応答のアジュバント処理及び上方調節を提供するという利点を有する。さらに、安定化された免疫賦活複合体は、油中水エマルション、無機塩懸濁液及び高分子ゲルを含む種々のプロセスによって医薬組成物を調製するのに好適である。
【００９４】
抗体
本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物によって導出される抗体も提供する。
【００９５】
タウ断片と、異種Ｔｈエピトープと、任意で異種スペーサーとを含む開示されているタウペプチド免疫原構築物は、宿主に投与すると免疫応答及び抗体の産生を導出することができる。タウペプチド免疫原構築物の設計は自己タウに対する寛容性を破ることができ、線状ではない立体構造のエピトープを認識する部位特異的な抗体の産生を導出することができる。
【００９６】
タウペプチド免疫原構築物によって作られる抗体は単量体、二量体、三量体及びオリゴマーの形態でのタウを認識し、それに結合する。
【００９７】
タウペプチド免疫原構築物によって導出される抗体は驚くべきことに、タウの凝集を妨げることができ（抗凝集活性）、且つ予め形成されたタウ凝集体を解離することができる（脱凝集活性）。
【００９８】
本発明のタウペプチド免疫原構築物で免疫した動物から得られる免疫応答は、単量体、二量体、三量体及びオリゴマーの形態でのタウと反応性である強力な部位特異的な抗体を作る構築物の能力を実証した。
【００９９】
方法
本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物、組成物及び医薬組成物を作製し、使用する方法も提供する。
【０１００】
ａ．タウペプチド免疫原構築物を製造する方法
本開示のタウペプチド免疫原構築物は当業者に周知の化学合成法（たとえば、Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３  ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，ｅｄ．Ｇｒａｎｔ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２，ｐ．７７を参照のこと）によって作製することができる。タウペプチド免疫原構築物は、たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒモデル４３０Ａまたは４３１にて側鎖保護したアミノ酸を用い、ｔ−Ｂｏｃ化学またはＦ−ｍｏｃ化学のいずれかよる保護されたα−ＮＨ２との固相合成の自動化されたＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を用いて合成することができる。Ｔｈエピトープのための組み合わせライブラリペプチドを含むタウペプチド免疫原構築物の調製は所与の可変位置でのカップリングのために代替アミノ酸の混合物を提供することによって達成することができる。
【０１０１】
所望のタウペプチド免疫原構築物の完全な重合の後、標準の手順に従って樹脂を処理し、樹脂からペプチドを切断することができ、アミノ酸側鎖における官能基を脱ブロックすることができる。遊離のペプチドをＨＰＬＣによって精製し、たとえば、アミノ酸解析または配列決定によって生化学的に特徴付けることができる。ペプチドの精製及び特徴付けの方法は当業者に周知である。
【０１０２】
この化学的プロセスによって作製されたペプチドの品質を制御し、規定することができ、その結果、タウペプチド免疫原構築物の再現性、免疫原性及び収率を保証することができる。固相ペプチド合成を介してタウペプチド免疫原構築物を製造することの詳細な説明は実施例１に示されている。
【０１０３】
意図された免疫学的活性の保持を可能にする構造的変異の範囲は、小分子薬剤による特定の薬剤活性の保持または生物学的に導き出される薬剤と同時に作製される大きな分子で見いだされる所望の活性及び望ましくない毒性の保持を可能にする構造的変異の範囲よりもはるかに融通が利くことが見いだされている。従って、意図されたペプチドに類似するクロマトグラフィー特性及び免疫学的特性を有する生成物による欠失配列の混合物として意図的に設計されたペプチド類似体、またはその混合物の合成過程のエラーによって必然的に生じたペプチド類似体は、所望のペプチドの精製された調製物と同様に効果的であることが多い。これらのペプチドを用いる最終製品の再現性及び有効性を保証するように製造過程及び製品評価過程の双方をモニターするために洞察力のあるＱＣ手順が開発される限り、設計される類似体及び意図されない類似体混合物は有効である。
【０１０４】
タウペプチド免疫原構築物は、核酸分子、ベクター及び／または宿主細胞を含む組換えＤＮＡ法を用いて作製することもできる。そのようなものとして、タウペプチド免疫原構築物をコードする核酸分子及びその免疫学的に機能的な類似体も本発明の一部として本開示によって包含される。同様に、核酸分子を含む発現ベクターを含むベクターと同様にベクターを含有する宿主細胞も本発明の一部として本開示によって包含される。
【０１０５】
種々の例となる実施形態はタウペプチド免疫原構築物及びその免疫学的に機能的な類似体を作製する方法も包含する。たとえば、方法は、ペプチド及び／または類似体が発現されるような条件下でタウペプチド免疫原構築物及び／またはその免疫学的に機能的な類似体をコードする核酸分子を含有する発現ベクターを含有する宿主細胞をインキュベートする工程を含むことができる。周知の組換えＤＮＡ法によってさらに長い合成ペプチド免疫原を合成することができる。そのような技法は、詳細なプロトコールと共に周知の標準マニュアルにて提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、好ましくは遺伝子が発現されることになる生物にとって最適であるコドンでの、アミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、通常、ペプチド及び必要に応じて任意の調節要素をコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって合成遺伝子を作製する。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞に形質移入する。次いで選択された発現系及び宿主に適する好適な条件下でペプチドを発現させる。常法によってペプチドを精製し、特徴付ける。
【０１０６】
ｂ．免疫賦活複合体の製造方法
種々の例となる実施形態はタウペプチド免疫原構築物とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子とを含む免疫賦活複合体を作製する方法も包含する。安定化した免疫賦活複合体（ＩＳＣ）はタウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分とポリアニオン系ＣｐＧ  ＯＤＮ分子とに由来する。自己集合系は電荷の静電中和によって推進される。タウペプチド免疫原構築物のカチオン系部分のアニオン系オリゴマーに対するモル電荷比の定比性が会合の程度を決定する。タウペプチド免疫原構築物とＣｐＧ  ＯＤＮとの非共有結合性静電会合は完全に再現性のプロセスである。ペプチド／ＣｐＧ  ＯＤＮの免疫賦活複合体は凝集し、それは免疫系の「プロの」抗原提示細胞（ＡＰＣ）への提示を促すので、複合体の免疫原性をさらに強化する。これらの複合体は製造の間での品質管理のために容易に特徴付けられる。ペプチド／ＣｐＧ  ＩＳＣは生体内で上手く認容される。ＣｐＧ  ＯＤＮとタウ断片に由来するペプチド免疫原構築物とを含むこの新規の微粒子状の系は、ＣｐＧ  ＯＤＮの使用と関連する一般化されたＢ細胞の分裂促進性を利用し、バランスの取れたＴｈ１／Ｔｈ２型の反応をさらに促進するように設計された。
【０１０７】
開示されている医薬組成物におけるＣｐＧ  ＯＤＮは相対する電荷の静電中和が介在するプロセスにて免疫原に１００％結合し、結果としてミクロンサイズの微粒子の形成を生じる。微粒子形態は、ＣｐＧアジュバントの従来の使用から顕著に低下したＣｐＧの投与量、有害な自然免疫応答の可能性の低下を可能にし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替の免疫原プロセッシング経路を円滑に進める。その結果、そのような製剤は概念的に新規であり、代替メカニズムにより免疫応答の刺激を促進することによって潜在的な利点を提供する。
【０１０８】
ｃ．医薬組成物の製造方法
種々の例となる実施形態はタウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物も包含する。特定の実施形態では、医薬組成物は、油エマルションにて及び無機塩との懸濁液にて水を採用する。
【０１０９】
医薬組成物が大きな集団によって使用され、投与の目標の一部でもあるタウ凝集の阻止で使用されるために、安全性が検討事項について別の重要な因子になる。臨床試験における多数の製剤についてヒトでは油中水エマルションが使用されるにもかかわらず、その安全性に起因して製剤での使用についてミョウバンが主要なアジュバントのままである。従って、ミョウバンまたはその無機塩であるリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）は臨床応用にための調製にてアジュバントとして使用されることが多い。
【０１１０】
他のアジュバント及び免疫賦活剤には、３  Ｄｅ−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−ＤＭＰ、高分子または単量体のアミノ酸、たとえば、ポリグルタミン酸またはポリリシンが挙げられる。そのようなアジュバントは、他の具体的な免疫賦活剤、たとえば、ムラミルペプチド（たとえば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）  Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））、または他の細菌細胞壁成分の有無にかかわらず使用することができる。水中油エマルションには、微小流動化剤を用いてサブミクロンの粒子に製剤化した５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、及び０．５％Ｓｐａｎ８５（任意で種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含有する）を含有するＭＦ５９（全体として参照によって本明細書に組み入れられる、Ｖａｎ  Ｎｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，へのＷＯ  ９０／１４８３７を参照のこと）；サブミクロンのエマルションに微小流動化した、またはボルテックスしてさらに大きな粒子サイズのエマルションを生成した、１０％スクアレン、０．４％ツイーン８０、５％プルロニックでブロックしたポリマーＬ１２１、及びｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；ならびに２％スクアレン、０．２％ツイーン８０、及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））から成る群から選択される１以上の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）が挙げられる。他のアジュバントには、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ならびにサイトカイン、たとえば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、及びＩＬ−１２）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。
【０１１１】
アジュバントの選択は、アジュバントを含有する免疫原製剤の安定性、投与の経路、投薬スケジュール、ワクチン接種される種にとってのアジュバントの有効性に左右され、ヒトでは、薬学上許容できるアジュバントは、関連する規制機関によってヒトへの投与について認可されているまたは認可可能であるものである。たとえば、ミョウバン、ＭＰＬまたは不完全フロイントアジュバント（全体として参照によって本明細書に組み入れられるＣｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，３２：１７３−１８６（１９９８））は単独で、または任意でその組み合わせすべてでヒトへの投与に好適である。
【０１１２】
組成物は、動物またはヒトへの投与のために医薬組成物を製剤化するのに一般に使用される媒体として定義される、薬学上許容できる非毒性のキャリアまたは希釈剤を含むことができる。希釈剤は組み合わせの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液及びハンクス溶液である。加えて、医薬組成物または製剤はまた、他のキャリア、アジュバントまたは非毒性で非治療的で非免疫原性の安定剤、等も含んでもよい。
【０１１３】
医薬組成物はまた、大型のゆっくり代謝される高分子、たとえば、タンパク質、キトサンのような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー（たとえば、ラテックスで官能化されたセファロース、アガロース、セルロース、等）、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び脂質凝集体（たとえば、油液滴またはリポソーム）も含むことができる。さらに、これらのキャリアは免疫賦活剤（すなわち、アジュバント）として機能することができる。
【０１１４】
本発明の医薬組成物はさらに、好適な送達媒体を含むことができる。好適な送達媒体には、ウイルス、細菌、生分解性ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、コラーゲンのミニペレット、及びコクリエートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
ｄ．医薬組成物を使用する方法
本開示はまた、タウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を使用する方法も含む。
【０１１６】
特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は
（ａ）宿主にてタウの凝集を阻害すること；
（ｂ）宿主にて予め形成されたタウ凝集体の脱凝集を誘導すること；
（ｃ）宿主にて外来性のタウ凝集体によって引き起こされる神経変性を軽減すること；
（ｄ）タウを過剰発現する細胞における神経変性を軽減すること；
（ｅ）宿主における血清タウのレベルを低下させること；
（ｆ）宿主の脳におけるオリゴマータウのレベルを低下させること；
（ｇ）宿主における神経病変を減らすこと及び運動活動の回復、等
のために使用することができる。
【０１１７】
上記の方法は、薬学上有効な量のタウペプチド免疫原構築物を含む医薬組成物をそれを必要とする宿主に投与することを含む。
【０１１８】
本明細書で使用されるとき、「タウオパチー」は、脳内での微小管タンパク質タウの病的な凝集が関与する任意の神経変性疾患を包含する。従って、家族性及び散発性双方のアルツハイマー病に加えて、本発明の方法を用いて治療することができる他のタウオパチーには、限定することなく、前頭側頭型認知症、第１７染色体に連鎖するパーキンソン病（ＦＴＤＰ−１７）、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性皮質下グリオーシス、神経原線維変化優位型認知症、石灰沈着を伴ったびまん性神経原線維変化病、嗜銀顆粒性認知症、筋委縮性側索硬化症、パーキンソン認知症複合、ボクサー認知症、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、亜急性硬化性汎脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴った非グアム型運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソン病、及び慢性外傷性脳症が挙げられる。
【０１１９】
本開示の別の態様は、対象の脳からのタウ凝集体のクリアランスを促進する方法を対象とする。方法には、対象の脳からのタウ凝集体のクリアランスを促進するのに有効な条件下で対象に、配列番号１〜２１及び１０１〜１２４から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する１以上の免疫原性タウペプチド、または配列番号１〜２１及び１０１〜１２４及び５１〜７１及び１２５〜１５５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原性タウエピトープを認識する１以上の抗体を投与することを含む。
【０１２０】
タウ凝集体のクリアランスには、神経原線維変化のクリアランス及び／または神経原線維変化に対する病的タウ前駆体のクリアランスが含まれる。神経原線維変化は、たとえば、散発性及び家族性のアルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症、嗜銀顆粒性認知症、ボクサー認知症、慢性外傷性脳症、石灰沈着を伴ったびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・スパッツ病、遺伝性前頭側頭型認知症、第１７染色体に連鎖するパーキンソン病（ＦＴＤＰ−１７）、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病Ｃ型、ピック病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、散発性大脳皮質基底核変性症、進行性核上麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、筋強直性ジストロフィー、神経原線維変化を伴った運動ニューロン疾患、神経原線維変化優位型認知症、及び進行性皮質下グリオーシスを含む神経変性疾患に関連することが多い。
【０１２１】
本開示の別の態様は、対象にてタウ病理が関連する行動的表現型の進行を減速する方法を対象とする。この方法には、対象にてタウ病理が関連する行動的表現型を減速する有効な条件下で配列番号１〜２１及び１０１〜１２４及び５１〜７１及び１２５〜１５５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む１以上の免疫原性タウペプチド、または配列番号１〜２１及び１０１〜１２４及び５１〜７１及び１２５〜１５５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む免疫原性タウエピトープを認識する１以上の抗体を対象に投与することを含む。
【０１２２】
本明細書で使用されるとき、タウ病理が関連する行動的表現型には限定することなく、認知障害、早期の人格の変化及び脱抑制、無気力症、無為、無言症、失行症、固執、常同運動／行動、口愛過度、無秩序、連続作業を計画するまたは組織化することができないこと、身勝手さ／無神経さ、非社交的な特質、共感の欠如、頻繁な錯語型エラーを伴うが、相対的に温存された理解力を持つ途切れがちな失文法型の会話、損傷した理解力及び喚語欠陥、緩慢な進行性の歩行不安定性、後方突進、フリージング、頻繁な転倒、レボドパ非応答性軸剛性、核上性注視麻痺、矩形波眼球運動、緩慢垂直衝動性運動、仮性球麻痺、四肢の失行、筋失調症、皮質性感覚消失、及び振戦が挙げられる。
【０１２３】
本開示の方法によれば、一実施形態では、免疫原性タウペプチドまたは免疫原性タウペプチドの組み合わせが必要とする対象に投与される。タウタンパク質の好適な免疫原性タウペプチド断片はタウタンパク質の病的形態を模倣する１以上の抗原性エピトープを含有する。例となる免疫原性タウエピトープは、タウの病的形態ではリン酸化されるが、タウの正常な形態または非病的形態ではリン酸化されない１以上のアミノ酸にてリン酸化される。
【０１２４】
一部の実施形態では、免疫原性タウペプチドの投与は対象にて免疫原性タウペプチド及びタウの病的形態に対する活発な免疫応答を誘導し、それによって関連するタウ凝集体のクリアランスを促し、タウ病理に関連する行動の進行を減速し、基礎にあるタウオパチーを治療する。本発明のこの態様によれば、免疫応答には、免疫原性タウペプチドに向けられた有益な液性（抗体が介在する）の応答及び／または細胞性（抗原特異的なＴ細胞またはその分泌産物が介在する）の応答の発生を含む。
【０１２５】
液性免疫応答の存在は、免疫原性タウペプチドに向けられた抗体の存在について対象由来の生体試料（たとえば、血液、血漿、血清、尿、唾液、糞便、ＣＳＦまたはリンパ液）を調べることによって判定し、モニターすることができる。生体試料にて抗体を検出する方法は当該技術で周知である、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、またはＥＬＩＳＰＯＴ。細胞介在性の免疫応答の存在は、当該技術で容易に知られる増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイによって判定することができる。
【０１２６】
本発明の単離された免疫原性タウペプチドは以下の表１及び表３に示す配列番号１〜２１及び１０１〜１２４及び５１〜７１及び１２５〜１５５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。リン酸化されている各配列のアミノ酸残基を太字及び下線で示す。表１におけるペプチドの名称は、表８に示すような配列番号１００のアミノ酸配列を有するヒトタウタンパク質の最長アイソフォーム内でのこれらのペプチドのアミノ酸の位置に相当する。
【０１２７】
具体的な実施形態
（１）タウペプチド免疫原構築物は、式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（タウ断片）−Ｘ
または
（タウ断片）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
によって表すことができ、
式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり；
Ａは異種スペーサーであり；
（タウ断片）は配列番号１００の完全長タウタンパク質に由来する約１５〜約４０のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり；
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり；
ｍは１〜約４であり、
ｎは０〜約１０である。
（２）タウ断片が配列番号１〜２１及び１０１〜１２４から成る群から選択される、（１）に記載のタウペプチド免疫原構築物。
（３）Ｔｈエピトープが配列番号２２〜５０から成る群から選択される、（１）または（２）のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物。
（４）ペプチド免疫原構築物が配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５から成る群から選択される（１）に記載のタウペプチド免疫原構築物。
（５）タウペプチド免疫原構築物であって、
配列番号１００の完全長タウタンパク質配列に由来する約１５〜約４０のアミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープと、
配列番号２２〜５０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むＴヘルパーエピトープと、
アミノ酸、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α、ε−Ｎ）Ｌｙｓ、及びε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１０２）から成る群から選択される任意の異種スペーサーとを含み、
Ｂ細胞エピトープが直接、または任意の異種スペーサーを介してＴヘルパーエピトープに共有結合される、当該タウペプチド免疫原構築物。
（６）Ｂ細胞エピトープが配列番号１〜２１及び１０１〜１２４から成る群から選択される、（５）のタウペプチド免疫原構築物。
（７）Ｔヘルパーエピトープが配列番号２２〜５０から成る群から選択される、（５）のタウペプチド免疫原構築物。
（８）任意の異種スペーサーが（α、ε−Ｎ）Ｌｙｓまたはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１０２）である、（５）のタウペプチド免疫原構築物。
（９）ＴヘルパーエピトープがＢ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合される、（５）のタウペプチド免疫原構築物。
（１０）Ｔヘルパーエピトープが任意の異種スペーサーを介してＢ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合される、（５）のタウペプチド免疫原構築物。
（１１）（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物を含む組成物。
（１２）ａ．（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物と
ｂ．薬学上許容できる送達媒体及び／またはアジュバントと
を含む医薬組成物。
（１３）ａ．タウペプチド免疫原構築物が配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５から成る群から選択され、且つ
ｂ．タウペプチド免疫原構築物がＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化された免疫賦活複合体を形成する、（１２）の医薬組成物。
（１４）（１）〜（１０）のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
（１５）タウペプチド免疫原構築物に結合される（１４）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
（１６）（１）〜（１０）のいずれかに記載のタウペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはそのエピトープ結合断片。
（１７）請求項（１４）〜（１６）のいずれかに記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合断片を含む組成物。
【実施例】
【０１２８】
実施例１
非リン酸化タウペプチド免疫原構築物によって導出される抗体及び結合特性
ａ．タウ断片の合成及び免疫
非リン酸化タウペプチド免疫原構築物及びリン酸化タウペプチド免疫原構築物の開発努力に含まれたデザイナータウ断片を合成する方法は詳細な説明に記載されている。一般に、ペプチドは、血清学的なアッセイ、現場のための実験室での試験的な規模または臨床試験については小規模で、ならびに医薬組成物の工業的な／商業的な製造については大規模（キログラム）で合成された。広範な血清学的スクリーニングと免疫原性のためのタウペプチド免疫原構築物の設計で組み込むための候補Ｂ細胞エピトープとしての選択とタウワクチン製剤で使用するための機能検査とのために、およそ１０からおよそ４０アミノ酸に及ぶ長さの配列を有する大きなレパートリーのタウ関連の抗原性Ｂ細胞エピトープペプチドを設計した。
【０１２９】
これらの血清学試験で組換えタンパク質として使用した完全長のタウ（表８）はｒＰｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した（Ｔａｕ−４４１、Ｔ−１００１−２）。種々の血清学アッセイにおけるエピトープマッピングで採用したタウペプチドのセグメントは表１にて特定されている（配列番号１〜２１及び１０１〜１２４）。麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）、インフルエンザ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を含む病原体タンパク質に由来する慎重に設計したヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープにタウペプチドを合成で連結することによって、選択したタウペプチドの断片をタウペプチド免疫原構築物に加工した。設計したＴｈエピトープを表２に示す（配列番号２２〜５０）。
【０１３０】
油中水エマルションを採用する製剤及び無機塩との懸濁液における製剤は詳細な説明に記載されているように調製した。疾患を予防する目的で大集団によって使用される適当な医薬組成物を設計することにおいて、組成物の安全性を考慮することが重要である。臨床試験における多数の医薬組成物へのヒトにおける油中水エマルションの使用にもかかわらず、ミョウバンはその安全性ゆえに医薬組成物での使用のための主要なアジュバントのままである。ミョウバンまたはＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）のようなその無機塩は臨床応用のための調製でアジュバントとして使用されることが多い。非リン酸化タウペプチド免疫原構築物は、（ｉ）ヒトでの使用について認可された油としてのＳｅｐｐｉｃ  ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１を伴った油中水エマルションにて調製した、または（ｉｉ）特定されているように、種々の量のペプチド構築物にて無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（ミョウバン）とともに混合した。組成物は通常、約４００μｇ／ｍＬにて水にタウペプチド免疫原構築物を溶解することによって調製され、油中水エマルションにおけるＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（体積で１：１）または無機塩（体積で１：１）と共に製剤化された。組成物は約３０分間室温で保持し、免疫に先立って約１０〜１５秒間ボルテックスで混合した。何匹かの動物に１回を超える用量での具体的な組成物で免疫したが、それは、０時（初回抗原刺激）と、最初の免疫の３週後（ｗｐｉ）（追加免疫）と、任意で６ｗｐｉでの二度目の追加免疫とで筋肉内経路によって投与した。これらの免疫した動物は次いで、選択したＢ細胞エピトープペプチド（複数可）で試験して製剤に存在する種々のタウペプチド免疫原構築物の免疫原性と同様に関連する標的のペプチドまたはタンパク質との交差反応性を評価した。モルモットにおける最初のスクリーニングにて強力な免疫原性を持つそれらタウペプチド免疫原構築物を次いでさらに、免疫プロトコールによって指示されたように特定の期間にわたって投薬計画について霊長類にて油中水エマルション、無機塩の製剤及びミョウバンに基づく製剤の双方で試験した。
【０１３１】
溶媒（ＩＳＡ  ５１  ＶＧ、ＣｐＧ３  ５０μｇ／ｍＬ、０．２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）に溶解した非リン酸化タウペプチド免疫原構築物（配列番号：５２、５４、５６、５８、６１、６３、６５、６７、６９、及び７１）を特定されたスケジュールでモルモットに注射し、広範な血清学的な解析のために免疫血清を採取した。
【０１３２】
ｂ．ＥＬＩＳＡアッセイ及び結果
免疫した動物の血清を最初の免疫後、種々の時点で採取し、先ずＥＬＩＳＡによって結合特性を分析し、それ自体のＢ細胞エピトープ標的に対する対応する構築物の免疫原性を判定した。他の機能的な領域に由来するタウペプチドの間での血清学的な交差反応性の評価を、表９ａ〜９ｅに示すものから選択した様々なペプチドでコーティングしたプレートによるＥＬＩＳＡによって広範に評価した。
【０１３３】
免疫血清試料を評価するためにＥＬＩＳＡプロトコールを開発したが、以下の実施例にそれを記載する。手短には、１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．５（特に言及されない限り）における２μｇ／ｍＬ（特に言及されない限り）での標的ペプチドタウ断片Ａ１４５−Ｐ１６０、Ｐ１７２−Ｐ１８９、Ｐ１８２−Ｐ２００、Ｓ１９５−Ｐ２１３、Ｒ２０９−Ｌ２２４、Ｖ２２８−Ｌ２４３、Ｋ２５７−Ｋ２７４、Ｒ３７９−Ｌ４０８、Ｖ２７５−Ｋ３１１、及びＶ３９３−Ｌ４２５ペプチド（それぞれ配列番号：２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１)の１００μＬによって９６ウェルプレートのウェルを個々に３７℃で１時間コーティングした。ペプチドでコーティングしたウェルをＰＢＳ中３重量％のゼラチン２５０μＬと共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質の結合部位をブロックし、その後、０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、次いで乾燥させた。２０体積％の正常ヤギ血清と１重量％のゼラチンと０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０とを含有するＰＢＳで、解析される血清を１：２０（特に言及されない限り）に希釈した。希釈した検体（たとえば、血清、血漿）の１００マイクロリットル（１００μＬ）をウェルのそれぞれに加え、３７℃で６０分間反応させた。次いで未結合の抗体を取り除くためにＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄した。標識したトレーサーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した種（たとえば、マウス、モルモットまたはヒト）特異的ヤギ抗ＩｇＧを使用して、陽性のウェルで形成される抗体／ペプチド抗原の複合体と結合させた。予め滴定した最適な希釈での且つＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を伴った１体積％の正常ヤギ血清におけるペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ＩｇＧの１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄して未結合の抗体を取り除き、クエン酸ナトリウム緩衝液にて０．０４重量％の３’，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と０．１２体積％の過酸化水素とを含有する基質混合物１００μＬとさらに１５分間反応させた。この基質混合物を用いて着色生成物を形成することによってペルオキシダーゼ標識を検出した。１．０ＭのＨ２ＳＯ４１００μＬの添加によって反応を止め、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を測定した。種々のタウ由来のペプチド免疫原を投与して免疫した動物の抗体力価の決定のために、１：１００〜１：１０，０００の血清の１０倍連続希釈を試験し、０．５に設定したカットオフＡ４５０を持つＡ４５０の線形回帰解析によって、Ｌｏｇ１０として表現される試験した血清の力価を算出した。表９ａ〜表９ｅに示すＥＬＩＳＡの結果を図１Ａに示すように棒グラフにプロットすることによってさらに解析した。
【０１３４】
一般に、それ自体のＢ細胞エピトープに対して試験すると、高い免疫原性は選択したタウペプチド構築物のそれぞれと関連することが見いだされた（表９ａ〜表９ｅ及び図１Ａ）。高い交差反応性は配列番号５２、５４、５６、５８、及び６１のペプチド免疫原構築物によって導出された抗体で見いだされた（図１Ａを参照のこと）。
【０１３５】
興味深いことに、Ｂ細胞エピトープＫ２５７〜Ｋ２７４（配列番号１５）を含有する配列番号６５は設計されたタウペプチド構築物の間で高度に免疫原性の配列であることが見いだされ、さらにこの構築物から導出された抗体は他のＢ細胞エピトープのいずれに対しても大きな交差反応がなく、最も特異的だった（図１Ａを参照のこと）。これに反して、Ｂ細胞エピトープＲ３７９〜Ｌ４０８（配列番号１７）を含有する配列番号６７のタウペプチド免疫原構築物はそれ自体のＢエピトープとの高い反応性を有して最も免疫原性であったが、また他のタウＢ細胞エピトープに対して妥当な交差反応性も有した（図１Ａを参照のこと）。
【０１３６】
実施例２
リン酸化タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体及び結合特性
リン酸化タウペプチド免疫原構築物に対して生成された抗体をそのリン酸化Ｂ細胞エピトープに結合するその能力について最初の免疫の６週後（ｗｐｉ）でのＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１３７】
ａ．免疫
非リン酸化タウペプチド免疫原についての実施例１にて議論された同じ条件下でリン酸化タウペプチド免疫原（配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６０、６２、６４、６６、６８、及び７０）を製剤化し、モルモットに投与した。リン酸化タウペプチド免疫原を含有する製剤は０、３及び６ｗｐｉに投与した。
【０１３８】
ｂ．ＥＬＩＳＡアッセイ及び結果
１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．５（特に言及されない限り）における２μｇ／ｍＬ（特に言及されない限り）でのリン酸化タウ標的ペプチド断片Ａ１４５−Ｐ１６０、Ｐ１７２−Ｐ１８９、Ｐ１８２−Ｐ２００、Ｓ１９５−Ｐ２１３、Ｒ２０９−Ｌ２２４、Ｖ２２８−Ｌ２４３、Ｋ２５７−Ｋ２７４、Ｒ３７９−Ｌ４０８、Ｖ２７５−Ｋ３１１及びＶ３９３−Ｌ４２５ペプチド（それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０）の１００μＬによって９６ウェルプレートのウェルを個々に３７℃で１時間コーティングした。ペプチドでコーティングしたウェルをＰＢＳ中３重量％のゼラチン２５０μＬと共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質の結合部位をブロックし、その後、０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、次いで乾燥させた。２０体積％の正常ヤギ血清と１重量％のゼラチンと０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０とを含有するＰＢＳで、解析される血清を１：２０（特に言及されない限り）に希釈した。希釈した検体（たとえば、血清、血漿）の１００マイクロリットル（１００μＬ）をウェルのそれぞれに加え、３７℃で６０分間反応させた。次いで未結合の抗体を取り除くためにＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄した。標識したトレーサーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した種（たとえば、マウス、モルモットまたはヒト）特異的ヤギ抗ＩｇＧを使用して、陽性のウェルで形成される抗体／ペプチド抗原の複合体と結合させた。予め滴定した最適な希釈での且つＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を伴った１体積％の正常ヤギ血清におけるペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ＩｇＧの１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄して未結合の抗体を取り除き、クエン酸ナトリウム緩衝液にて０．０４重量％の３’，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と０．１２体積％の過酸化水素とを含有する基質混合物１００μＬとさらに１５分間反応させた。この基質混合物を用いて着色生成物を形成することによってペルオキシダーゼ標識を検出した。１．０ＭのＨ２ＳＯ４１００μＬの添加によって反応を止め、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を測定した。種々のタウ由来のペプチド免疫原を投与して免疫した動物の抗体力価の決定のために、１：１００〜１：１０，０００の血清の１０倍連続希釈を試験し、０．５に設定したカットオフＡ４５０を持つＡ４５０の線形回帰解析によって、Ｌｏｇ１０として表現される試験した血清の力価を算出した。免疫した動物の血清を注射後種々の時点で採取し、ＥＬＩＳＡによって結合特性を解析した。種々のタウ断片によってＥＬＩＳＡプレートをコーティングしたが、結果を表１０ａ〜表１０ｄに示す。
【０１３９】
表１０ａ〜表１０ｄに示すＥＬＩＳＡの結果を図１Ｂに示すような棒グラフでプロットすることによってさらに解析した。リン酸化タウペプチド構築物を免疫原として使用した場合、Ｂ細胞エピトープの間での交差反応性を含めて類似の免疫原性及び血清学的な特性が見いだされた。
【０１４０】
実施例３
リン酸化タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体及びその非リン酸化ペプチド対応物に対する結合特性
リン酸化タウペプチドに対して生成された抗体を対応する非リン酸化対応物ペプチドに結合するその能力について、以下にさらに詳細に記載されているように注射の６週後（６ｗｐｉ）でのＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１４１】
ａ．免疫
非リン酸化タウペプチド免疫原についての実施例１にて記載された条件下でリン酸化タウペプチド免疫原（配列番号５１、５３、５５、５７、５９、６０、６２、６４、６６、６８、及び７０）を製剤化し、モルモットに投与した。
【０１４２】
ｂ．ＥＬＩＳＡアッセイ及び結果
１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．５（特に言及されない限り）における２μｇ／ｍＬ（特に言及されない限り）での標的ペプチドタウ断片Ａ１４５−Ｐ１６０、Ｐ１７２−Ｐ１８９、Ｐ１８２−Ｐ２００、Ｓ１９５−Ｐ２１３、Ｒ２０９−Ｌ２２４、Ｖ２２８−Ｌ２４３、Ｋ２５７−Ｋ２７４、Ｒ３７９−Ｌ４０８、Ｖ２７５−Ｋ３１１及びＶ３９３−Ｌ４２５ペプチド（それぞれ配列番号：２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９、及び２１）の１００μＬによって９６ウェルプレートのウェルを個々に３７℃で１時間コーティングした。ペプチドでコーティングしたウェルをＰＢＳ中３重量％のゼラチン２５０μＬと共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質の結合部位をブロックし、その後、０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、乾燥させた。２０体積％の正常ヤギ血清と１重量％のゼラチンと０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０とを含有するＰＢＳで、解析される血清を１：２０（特に言及されない限り）に希釈した。希釈した検体（たとえば、血清、血漿）の１００マイクロリットル（１００μＬ）をウェルのそれぞれに加え、３７℃で６０分間反応させた。次いで未結合の抗体を取り除くためにＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄した。標識したトレーサーとして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合した種（たとえば、マウス、モルモットまたはヒト）特異的ヤギ抗ＩｇＧを使用して、陽性のウェルで形成される抗体／ペプチド抗原の複合体と結合させた。予め滴定した最適な希釈での且つＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を伴った１体積％の正常ヤギ血清におけるペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ＩｇＧの１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄して未結合の抗体を取り除き、クエン酸ナトリウム緩衝液にて０．０４重量％の３’，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）と０．１２体積％の過酸化水素とを含有する基質混合物１００μＬとさらに１５分間反応させた。この基質混合物を用いて着色生成物を形成することによってペルオキシダーゼ標識を検出した。１．０ＭのＨ２ＳＯ４１００μＬの添加によって反応を止め、４５０ｎｍでの吸光度（Ａ４５０）を測定した。種々のタウ由来のペプチド免疫原を投与して免疫した動物の抗体力価の決定のために、１：１００〜１：１０，０００の血清の１０倍連続希釈を試験し、０．５に設定したカットオフＡ４５０を持つＡ４５０の線形回帰解析によって、Ｌｏｇ１０として表現される試験した血清の力価を算出した。免疫した動物の血清を注射後種々の時点で採取し、ＥＬＩＳＡによって結合特性を解析した。
【０１４３】
ＥＬＩＳＡプレートを種々の非リン酸化タウペプチド断片でコーティングしたが、結果を表１１ａ〜表１１ｅに示す。免疫血清を対応する非リン酸化タウのＢ細胞エピトープペプチドで試験した場合、リン酸化タウペプチド構築物に対して生成された抗体すべてについて類似する血清学的な結合特性が得られた。実施例１、２及び３で実施された広範な免疫原性試験及び血清学的試験から、タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体が類似の特性を示すことは明らかである。これらの特性のほとんどはアミノ酸配列に起因し得る。交差反応性試験を用いた立体構造評価がペプチドのリン酸化によって引き起こされる微妙な差異しかなかったことを示すということは、非リン酸化ペプチド免疫原構築物に対比して対応するリン酸化ペプチド免疫原構築物によって産生させたこれらの免疫血清の類似する機能的特性があることを示唆している。
【０１４４】
実施例４
非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体の結合特性
ａ．様々なサイズの様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗非リン酸化タウ抗体の特異性
実施例１に記載されているように、非リン酸化タウペプチド免疫原構築物をモルモットに免疫した。様々なサイズのタウ分子複合体に対する結合特異性についてウエスタンブロットを用いて、様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗非リン酸化タウ抗体（抗非ｐ−タウ抗体）を選別した。タウの種々の形態（単量体、二量体、三量体、オリゴマー及びポリマー）（２０μＭ）を１２％トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、光誘導の架橋（ＰＩＣＵＰ）処理の前にニトロセルロース（ＮＣ）膜に移した。モルモットの抗血清から精製した抗非ｐ−タウ抗体１μｇ／ｍＬと共に膜をインキュベートし、次いでロバ抗モルモット抗体を結合したＨＲＰ（７０６−０３５−１４８，Ｊａｃｋｓｏｎ）と共にインキュベートした。化学発光試薬Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ＥＣＬ  Ｐｒｏ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でブロットを可視化した。
【０１４５】
ｂ．結果
タウの単量体、二量体、三量体、及びオリゴマーを含有する溶解物のウエスタンブロット解析を図２（左のパネル）に示す。単量体タウは６０ｋＤａ前後であると思われ、二量体、三量体はオリゴマーと同様に相当する分子量で現れた。市販のモノクローナル抗体Ｍａｂタウ５及びＭａｂタウ４６はタウの単量体形態を検出することができ、わずかに二量体形態を検出することができた（図２のレーン１及び２）。Ｍａｂタウ５はタウ全体のマーカーとして採用され、タウ４６はタウ４０４−４４１のマーカーである。
【０１４６】
非リン酸化ペプチド免疫原構築物（配列番号５２、５４、５６、５８、６１、６３、６５、６７、６９、及び７１）によって導出されたＩｇＧ抗体は様々な効率でタウの単量体、二量体、三量体、及びオリゴマーを検出した（図２のレーン４〜１３）。各抗体の結合特性を解析し、棒グラフで定量的に要約した（図２、右のパネル）。一般に、Ｃ末端領域からのタウペプチド免疫原構築物に由来する抗体は、Ｎ末端領域からのものに対してさらに高い優先的結合特性を持つ抗体を導出することができた（データは示さず）。
【０１４７】
実施例５
非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体はタウの凝集を阻害する
ａ．免疫及びタウへの曝露
実施例１に記載されているような非リン酸化タウ免疫原構築物（配列番号５２、５４、５６、５８、６１、６３、６５、６７、６９、及び７１）または実施例２に記載されているようなリン酸化タウ免疫原構築物（配列番号５１、５３、５５、５７、６０、６２、６４、６６、６８、及び７０）のいずれかを動物に免疫した。
【０１４８】
次いで、免疫から生成した抗体を、タウの凝集を促進する条件下で市販の完全長タウ４４１組換えタンパク質を含有する試料に曝露した。タウ４４１βシート原線維は、１０単位／ｍＬのヘパリンによって３７℃で７日間、１００μＬの１×ＰＢＳにて凝集させた６０μｇのタウを使用して生成し、次いで４℃にて３００ｋＤａカットオフのフィルター（Ｐａｌｌ）に移し、βシート原線維を単離した。これらの凝集はチオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ，Ｓｉｇｍａ）蛍光によって検証した。
【０１４９】
タウは、タウペプチド免疫原構築物から導出されたＩｇＧ抗体の有無にかかわらず５μＭの濃度でのヘパリンによって２００μＬのＰＢＳ緩衝液にて３日間で凝集した。遠心分離（１３，０００×ｇ、４℃、３０分）の後、タウ凝集体を回収し、ＴｈＴアッセイで確認した。
【０１５０】
ｂ．結果
図３Ａは、各グラフの上で示すリン酸化タウペプチド免疫原構築物に向けられた抗体の存在下での完全長タウ（タウ４４１）凝集のレベルを示すグラフを含有する。図３Ａに示す点線は免疫前ＩｇＧを用いてタウの凝集を評価した対照試料を表す。結果は、リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体のすべてが免疫前血清対照試料と比べてタウの凝集を阻害したことを示している。抗体は様々な比率でタウの凝集を阻害することができた。
【０１５１】
図３Ｂは、棒グラフの下で示す非リン酸化タウペプチド免疫原構築物に向けられた抗体の存在下での凝集体のＴｈＴ染色によって完全長タウ（タウ４４１）の凝集のレベルを定量化している。結果は、非リン酸化タウペプチド免疫原に向けられた抗体が免疫前血清対照試料と比べてタウの凝集を阻害したことを示している。抗体は様々な比率でタウの凝集を阻害することができた。
【０１５２】
結果は、タウのＣ末端領域にさらに近接するＢ細胞エピトープを有するタウペプチド免疫原構築物を用いた場合、タウの重合でさらに大きな抗凝集能力があることを示唆している。
【０１５３】
実施例６
タウペプチド免疫原に向けられた抗体はタウの凝集を阻害する
ａ．免疫及びタウへの曝露
実施例１に記載されているように非リン酸化タウ免疫原構築物を動物に免疫した。実施例２に記載されているようにリン酸化タウ免疫原構築物も動物に免疫した。
【０１５４】
次いで、免疫から生成された抗体を、（ａ）過剰リン酸化タウとしてのオカダ酸（ＯＫＡ）で処理した神経細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）、または（ｂ）非リン酸化タウとしてのＯＫＡ処理していない神経細胞に由来する細胞溶解物に曝露した。ｗｐｉ６及びｗｐｉ９での抗血清の存在下で１００ｎＭの最終濃度までＯＫＡを培地に３時間加えてタウの凝集に対する阻害における抗血清の効果の用量依存性効果を測定した。
【０１５５】
ｂ．結果
図４は、各グラフの上に示すタウペプチド免疫原に向けられた抗体への曝露後の種々の溶解物のタウ凝集のレベルを示すグラフを含有する。タウ凝集のレベルは凝集体のＴｈＴ染色によって測定された。再び、リン酸化タウペプチド免疫原構築物または非リン酸化タウペプチド免疫原構築物の双方に由来する抗体はタウの凝集を阻害することができたが、それは前の実施例に記載されている血清学的な解析と一致する。
【０１５６】
結果は、タウの中央領域及びＣ末端領域に由来するタウエピトープによるタウの重合に対するさらに大きな抗凝集能力があることを示唆している。
【０１５７】
実施例７
タウペプチド免疫原に向けられた抗体への曝露後の予め形成されたタウ凝集体の脱凝集
ａ．免疫及び予め形成されたタウ凝集体への曝露
実施例１に記載されているように非リン酸化タウ免疫原構築物を動物に免疫した。実施例２に記載されているようにリン酸化タウ免疫原構築物も動物に免疫した。
【０１５８】
免疫から生成した抗体を次いで、予め形成されたタウ原線維に曝露した。次いで、予め形成されたタウ凝集体を、モルモット抗血清から精製した抗ｐ−タウ抗体または抗非ｐ−タウ抗体のいずれかと共にまたはそれを含まずに２日間及び４日間インキュベートした。インキュベートの後、４℃での３０分間の１３，０００×ｇの遠心分離後、凝集体を回収し、次いでＴｈＴアッセイによって定量した。
【０１５９】
ｂ．結果
図５は、図５（右のパネル）の上に示すように、タウペプチド免疫原（配列番号６６及び６７の代表的なペプチド構築物）に向けられた抗体への曝露後のタウの脱凝集のレベルを示すグラフを含有する。タウ凝集のレベルはＴｈＴ染色及びウエスタンブロットによって測定した。
【０１６０】
ウエスタンブロット及びＴｈＴアッセイ双方のデータは、配列番号６７及び６６からそれぞれ導出された抗非ｐ／ｐ−タウ３７９−４０８ＩｇＧが組換えタウ原線維の凝集を壊す能力を有することを示している。
【０１６１】
実施例８
リン酸化タウペプチド免疫原構築物及び非リン酸化タウペプチド免疫原構築物の双方によって生成された代表的な抗体によるタウの原線維、オリゴマー及び単量体の非変性形態の特異的な結合についてのドットブロット解析
ａ．免疫、抗タウ抗体の結合特性のウエスタンブロット解析及びドットブロット解析
実施例１に記載されているように非リン酸化タウ免疫原構築物を動物に免疫した。実施例２に記載されているようにリン酸化タウ免疫原構築物も動物に免疫した。
【０１６２】
タウタンパク質の様々な種（すなわち、αらせん単量体、βシート単量体、βシートオリゴマー及びβシート原線維）を実施例５に記載されているように調製した。様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗ｐ−タウ抗体または抗非ｐ−タウ抗体を一次抗体として用いてタウタンパク質の様々な種によるウエスタンブロット及びドットブロットのアッセイを行った。βシートの原線維、オリゴマー、単量体、αらせん単量体、及び他の対照試薬を厳格な特異的対照のためにブロット上でドットにした。血清学的な検査及び評価のためのこれらの試薬の調製についての詳細な手順は実施例１１にてさらに記載されている。
【０１６３】
ｂ．結果
図６（左のパネル）は、タウペプチド免疫原（配列番号５９、６６及び７０）によって作られた抗ｐ−タウＩｇＧ及びタウペプチド免疫原（配列番号６７）によって作られた抗非ｐ−タウＩｇＧのウエスタンブロット解析（変性条件下）を含有する。ウエスタンブロットの結果はタウのＣ末端に向けられた抗ｐ−タウＩｇＧが高分子量のタウ凝集体を特異的に認識するが、タウ単量体を認識しないことを示している。
【０１６４】
図６（右のパネル）は、配列番号６６及び６７のタウペプチド免疫原によってそれぞれ作られた抗ｐ−タウＩｇＧ及び抗非ｐ−タウＩｇＧのドットブロット解析（非変性条件下）を含有する。結果は、抗非ｐ−／ｐ−タウ３７９−４０８ＩｇＧは双方ともタウの種々の形態に対して特異的な結合を有するが、他のアミロイド生成性タンパク質（すなわち、Ａβ１−４２及びアルファ−シヌクレイン）に対しては有さないことを示している。また、モノクローナル抗体Ｍａｂタウ５及びタウの非Ｃ末端領域に対する別のＩｇＧと比べると、本発明（それぞれ配列番号６６及び６７）に由来する抗ｐ／抗非ｐ−タウ３７９−４０８ＩｇＧは単量体ではなく原線維及びオリゴマーに対して高い親和性を有する。さらに、抗ｐ−タウ３７９−４０８ＩｇＧはβシート単量体には結合しない。
【０１６５】
実施例９
タウペプチド免疫原に向けられた抗体の組織結合特性
ａ．免疫及び組織染色
実施例１に記載されているように非リン酸化タウ免疫原構築物を動物に免疫した。実施例２に記載されているようにリン酸化タウ免疫原構築物も動物に免疫した。
【０１６６】
次いで、免疫から生成された抗体を用いて健常（正常）な脳及びアルツハイマー病（ＡＤ）の脳に由来する組織を染色した。ヒト組織のパネル（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ）をキシレンで脱パラフィン化し、エタノールで再水和し、次いでＰＢＳ中にて０．５％のＣａＣｌ２を伴った０．２５％トリプシン溶液で３０分間処理し、メタノール中１％の過酸化水素にてインキュベートして内在性のペルオキシダーゼ活性をブロックした後、ＰＢＳ中１０％のＢｌｏｃｋＡｃｅ（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートし、その後、組織に抗タウ３４９−４０８（配列番号６６または６７）または免疫前血清のいずれかを適用した。切片を３,３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で発色させ、ヘマトキシリンで対比染色した後、顕微鏡で調べた。
【０１６７】
ｂ．結果
図７はこの実験の染色画像を示す。非リン酸化タウ３７９−４０８（配列番号６７）及びリン酸化タウ３７９−４０８（配列番号６６）に向けられた抗体は正常組織に由来する切片と交差反応性を有さなかったが、アルツハイマー病の脳組織と交差反応性だった。リン酸化ペプチド（配列番号６６）に向けられた抗体はＡＤの脳の海馬領域にてさらに強い結合を示した。
【０１６８】
実施例１０
タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体及びその製剤：外来性タウ原線維によって誘発される神経変性の軽減に対する神経保護効果
様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体の神経保護効果を評価するために、ＮＧＦ処理した神経分化したＰＣ１２細胞における外来性で予め形成されたタウ凝集体による試験管内での神経変性モデルを採用した。
【０１６９】
ＰＣ１２細胞をＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で６日間処理して神経分化を誘導した。神経分化した細胞の形態をｃｅｌｌ３  ｉＭａｇｅｒ  ｄｕｏｓ高処理能力画像化システム（Ｓｃｒｅｅｎ）によって確認し、解析した。フルオレセイン色素を用いて細胞死を標識し、細胞数ソフトウェアを用いて細胞を数えた。タウペプチド免疫原構築物によって導出された抗体は細胞に入り、タウ凝集体に結合することができた（データは示さず）。ＮＧＦの神経栄養効果は神経突起伸長に反映し、神経分化した細胞の数を定量した。神経突起伸長のレベル及び神経分化した細胞の数を基準化した後、比率（平均値±ＳＥＭ）で示した。ＮＧＦ処理を伴った及びＮＧＦ処理を伴わないＰＣ１２細胞の神経突起の長さをそれぞれ１００％及び０％として解釈した。ＮＧＦ処理の６日間での神経分化したＰＣ１２細胞の数を１００％に基準化した。
【０１７０】
３７℃で１週間ヘパリンによって処理した外来性の予め形成されたタウ凝集体を神経分化したＰＣ１２細胞に加えることによって神経変性を観察した。予め形成されたタウ凝集体の存在下で、神経分化したＰＣ１２細胞では神経突起の長さは短縮し、細胞の数は減少した。このタウ原線維が推進した神経変性は加えた外来性のタウ凝集体の量に濃度依存性に比例した。市販の抗タウ抗体（たとえば、Ｍａｂタウ５及びＭａｂタウ４６）はタウ原線維が推進する神経変性を減弱したが、無感作のモルモットから精製した抗体は減弱しなかった。このモデルをスクリーニングプラットフォームとして採用して、様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体のどれが濃度依存性に神経細胞の生存を回復することにて神経保護効果を持つのかを同定した（図８Ａ及びＢ）。
【０１７１】
その結果、過半数の様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体が神経突起成長を復元した。以前最適化した濃度である５ｕｇ／ｍＬでタウ原線維を提供して病変を引き起こした（図８Ａ）。リン酸化タウペプチド構築物または非リン酸化タウペプチド構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体は神経分化したＰＣ１２細胞をタウ原線維が引き起こす神経細胞死から保護した。図８Ｂは、配列番号６５、６７及び６９による免疫から得られた抗非ｐ−タウ抗体からのデータを示す。
【０１７２】
図８Ａ及び図８Ｂからの結果は、抗タウ抗体（配列番号６５、６７及び６９）はタウ原線維の神経毒性に対して神経細胞を保護することができることを実証している。タウペプチド免疫原構築物（配列番号６５、６７及び６９）によって導出された抗タウ抗体の抗神経変性効果が観察され、培養にて生き残った細胞の数についてのＣｅｌｌ３  Ｉｍａｇｅｒ  ｄｕｏｓソフトウェア（Ｍｉｔｅｋｌａｂ）による計算を介してそれを定量した。
【０１７３】
試験管内の機能的アッセイの評価を介した抗タウ抗体の神経保護に関して、Ｙａｎａｍａｎｄｒａ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎｅｕｒｏｎ，８０：４０２−４１４，２０１３）によって報告されたように、試験管内でのタウ凝集のシーディングは生体内で病変を顕著に減らし、認知力を改善することができたことが示されている。タウ単量体は元々構造化されていないと考えられており、タウの凝集及び関連する細胞の細胞傷害性にて大した機能的役割を有さないかもしれない。最近の知見は、病的な凝集の開始はタウ単量体の不活性形態から凝集核成分の形態への変換で始まり得ることを示している（Ｍｉｒｂａｈａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，２０１８；７：ｅ３６５８４；ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．３６５８４）。これらの知見に基づいて、我々は、シーディング活性を低下させるその能力についてタウペプチド免疫原構築物によって導出した抗タウ抗体を試験した。具体的には、タウペプチド免疫原構築物に向けられた抗タウ抗体をアルツハイマー病（ＡＤ）患者に由来する脳ホモジネートと共にインキュベートし、これらの抗体がそのようなシーディング活性を低下させる能力を有することを見いだした（データは示さず）。我々の広範なタウ免疫原の設計、免疫原性解析及び血清学的な解析は、深刻なタウオパチーの治療のための分子レベル及び血清学レベル双方でワクチンとしての神経保護介入の開発を促進している。
【０１７４】
実施例１１
追加の血清学的アッセイ及び試薬
合成ペプチド構築物及びその製剤の機能的な免疫原性を評価するための血清学的なアッセイ及び試薬が以下で詳細に記載されている。
【０１７５】
ａ．Ｂ細胞エピトープクラスターペプチドに基づくＥＬＩＳＡ検査によるタウ断片に対する詳細な特異性解析及びエピトープマッピング
免疫した宿主における抗タウ抗体の詳細な特異性解析はエピトープマッピングによって判定した。手短には、ウェル当たり０．１ｍＬ当たり０．５μｇでのマッピングされるタウ２７５−３１１領域（配列番号１９）に由来する個々のタウ断片ペプチド（配列番号１１５及び１５６〜１７１）によって９６ウェルプレートのウェルをコーティングし、次いで２つ組にて１００μＬの血清試料（ＰＢＳにて１：１００希釈）をプレートのウェルにてインキュベートし、それに上記に記載されている抗体ＥＬＩＳＡ法の工程が続いた。タウペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ及び免疫した宿主における免疫血清の抗タウ抗体の関連する詳細な特異性解析も、追加の反応性及び特異性の確認のために、スペーサー及びＴｈ配列を含まない対応するタウペプチド（たとえば、表１に示すような配列番号１〜２１及び１０１〜１２４、表４〜７に示すような配列番号７２〜９９、及び表８に示すような配列番号１００）で試験した。
【０１７６】
ｂ．免疫原性の評価
実験的免疫プロトコールに従って、動物に由来する免疫前血清及び免疫血清の試料を採取し、５６℃で３０分間加熱して血清の補体因子を不活化した。タウペプチド免疫原構築物の投与に続いて、プロトコールに従って血液試料を入手し、特異的な標的部位（複数可）に対するその免疫原性を評価した。連続希釈した血清を試験し、陽性の力価を希釈率の逆数のＬｏｇ１０として表した。特定のタウペプチド免疫原構築物の免疫原性は、所望のＢ細胞反応の増強を提供するために採用される「ヘルパーＴ細胞エピトープ」に向けた低い抗体の反応性から無視できる抗体の反応性を維持する一方で、標的抗原の範囲内で所望のエピトープ特異性に対して向けられた高い力価のＢ細胞抗体反応を引き出すその能力によって評価した。
【０１７７】
ｃ．組換えタウタンパク質によるタウ凝集体（二量体、三量体、オリゴマー、及び原線維）の調製
凝集したタウを調製するために、１００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ凝集緩衝液（１×ＰＢＳにおける２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）における精製した組換えタウタンパク質（０．１μｇ／ｍＬ）を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブにて３７℃で振盪することなくサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で７日間インキュベートした。凝集したタウを直ちに−８０℃で後の使用まで凍結した。
【０１７８】
ｄ．抗タウ抗体の精製
様々な配列（配列番号５１〜７１及び１２５〜１５５）のペプチドを含有するタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの最初の免疫の３〜１５週後（ｗｐｉ）で採取した血清からアフィニティーカラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用することによって抗タウ抗体を精製した。手短には、緩衝液（０．１Ｍのリン酸塩及び０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）の平衡化の後、４００μＬの血清をＮａｂ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｐｉｎカラムに加え、それに１０分間の転倒混合及び５，８００×ｇでの１分間の遠心分離が続いた。カラムを結合緩衝液（４００μＬ）で３回洗浄した。続いて、溶出緩衝液（４００μＬ、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．０）をスピンカラムに加え、５，８００×ｇで１分間遠心分離した後、抗体を溶出した。溶出した抗体を中和緩衝液（４００μＬ、０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．０）と混合し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を標準としてＮａｎ−Ｄｒｏｐを用いてＯＤ２８０にてこれらの精製した抗体の濃度を測定した。
【０１７９】
ｅ．様々なサイズの様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体の特異性
様々なサイズのタウ分子複合体に対する結合特異性について、ウエスタンブロットを用いて、様々なタウペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体を選別した。タウの種々の形態（２０μＭ）を１２％トリス・グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース（ＮＣ）膜に移した後、光誘導の架橋（ＰＩＣＵＰ）処理を行った。モルモットの抗血清から精製した抗タウ抗体１μｇ／ｍＬと共に膜をインキュベートし、次いでロバ抗モルモット抗体を結合したＨＲＰ（７０６−０３５−１４８，Ｊａｃｋｓｏｎ）と共にインキュベートした。化学発光試薬Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ＥＣＬ  Ｐｒｏ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によってブロットを可視化した。単量体タウが６０ｋＤａ前後のサイズでブロットした一方で、二量体、三量体またはオリゴマーは単量体タウよりも数倍大きい各分子量を有した。たとえば、二量体、三量体及びさらに大きなオリゴマーのような種々のオリゴマー種を検出することができる市販の抗体、たとえば、Ｍａｂタウ５またはＭａｂタウ４６を陽性対照として採用した。
【０１８０】
ｆ．アミロイド生成性タンパク質の様々な種によるドットブロットアッセイ
Ａβ１−４２、タウ及びα−Ｓｙｎのαらせん単量体、βシート単量体、βシートオリゴマー、及びβシート原線維の調製を以下のように説明する。
１．Ａβ１−４２α−らせん単量体：２０％のトリフルオロ酢酸と２０％のヘキサフルオロイソプロパノール（１０μＬ）とを含有する１×ＰＢＳに２０μｇのＡβ１−４２βシート単量体（５０μＬ）を加え、４℃で２４時間インキュベートしてα−らせん単量体を形成した。
２．Ａβ１−４２βシート単量体：３７℃で２４時間凝集させた５％ＴＦＡを含有する１２０μＬの１×ＰＢＳにおける６０μｇのＡβ１−４２を１０ｋＤａカットオフのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、βシート単量体を回収した。
３．Ａβ１−４２βシートオリゴマー：３７℃で３日間凝集させた１２０μＬの１×ＰＢＳにおける６０μｇのＡβ１−４２を氷上で超音波処理し、１０及び３０ｋＤａカットオフのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、３５ｋＤａ未満のβシートオリゴマー原線維を回収した。
４．Ａβ１−４２βシート原線維：３７℃で３日間凝集させた１２０μＬの１×ＰＢＳにおける６０μｇのＡβ１−４２を氷上で超音波処理し、３０ｋＤａカットオフのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、βシート原線維を単離した。
５．α−Ｓｙｎαらせん単量体：４０μｇの新しく調製したα−Ｓｙｎを４℃にて低温の１００μＬの１×ＰＢＳに溶解し、直ちに１０ｋＤａカットオフのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、αらせん単量体を回収した。
６．α−Ｓｙｎβシート単量体：３７℃で２４時間１００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ緩衝液にてインキュベートした４０μｇのα−Ｓｙｎを１０ｋＤａカットオフのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、βシート単量体を回収した。
７．α−Ｓｙｎβシートオリゴマー：３７℃で８日間１００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ緩衝液にて凝集させた４０μｇのα−Ｓｙｎを氷上で超音波処理し、次いで３０及び１００ｋＤａカットオフのフィルターに移し、βシートオリゴマーを回収した。
８．α−Ｓｙｎβシート原線維：３７℃で８日間１００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ緩衝液にて凝集させた４０μｇのα−Ｓｙｎを氷上で超音波処理し、次いで３０及び１００ｋＤａカットオフのフィルターに移し、βシート原線維を単離した。
９．タウ４４１αらせん単量体：４℃にて１００μＬの１×ＰＢＳで調製した６０μｇのタウを１００ｋＤａカットオフに移してαらせん単量体を回収した。
１０．タウ４４１βシート単量体：２５℃で４８時間１０単位／ｍＬのヘパリンによって１００μＬの１×ＰＢＳにて凝集させた６０μｇのタウを４℃で１００ｋＤａカットオフのフィルターに移し、βシート単量体を回収した。
１１．タウ４４１βシートオリゴマー：３７℃で４８時間１０単位／ｍＬのヘパリンによって１００μＬの１×ＰＢＳにて凝集させた６０μｇのタウを４℃で１００及び３００ｋＤａカットオフのフィルター（Ｐａｌｌ）に移し、βシートオリゴマーを回収した。
１２．タウ４４１βシート原線維：３７℃で６日間１０単位／ｍＬのヘパリンによって１００μＬの１×ＰＢＳにて凝集させた６０μｇのタウを４℃で３００ｋＤａカットオフのフィルター（Ｐａｌｌ）に移し、βシート原線維を単離した。
【０１８１】
これらの単量体及びオリゴマーをチオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ、Ｓｉｇｍａ）蛍光またはＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって検証した。アミロイド生成性タンパク質の濃度は市販のアミロイド生成性Ａβ１−４２のストックを標準としてＮａｎｏ−Ｄｒｏｐによって測定した。これらの単量体及びオリゴマーを、Ａβ１−４２については３μｇ、α−Ｓｙｎについては４μｇ及びタウについては７μｇの量でＰＶＤＦ膜上にて個々にスポットにした。一次抗体としてのモルモット抗血清から精製した抗タウ抗体（１：１，０００の希釈）と共に膜をインキュベートし、それに抗モルモットＨＲＰ結合の二次抗体（１：５，０００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのハイブリッド形成が続いた。膜をＬｕｍｉｎａｔａ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって処理し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ−Ｉｔ  ８１０デジタル画像システム（ＵＶＰ  Ｉｎｃ．，Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）によってシグナルを検出した。
【０１８２】
実施例１２
免疫原性及び有効性の試験に使用された動物
ａ．モルモット
免疫原性試験は成熟無感作の成体オス及びメスのＤｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ系モルモット（３００〜３５０ｇ／ＢＷ）で実施した。実験は群当たり少なくとも３匹のモルモットを利用した。Ｄｕｎｃａｎ−Ｈａｒｔｌｅｙ系モルモット（８〜１２週齢、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を含むプロトコールは契約動物施設と同様に試験依頼者としてのＵｎｉｔｅｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（ＵＢＩ）にて認可されたＩＡＣＵＣ適用のもとで行われた。
【０１８３】
実施例１３
標的とされるＢ細胞エピトープに対するタウペプチド免疫原構築物によって導出された着目される抗体反応の同定：代表的な試験
そのタウ２７５−３１１領域（配列番号１９）に向けられたタウペプチド免疫原構築物によって導出される抗体の特定残基に対する結合部位を決定するための代表的な詳細なエピトープマッピング試験（表１６）では、この領域（配列番号１１５及び１５６〜１７１）に由来する漸増する長さの重複するペプチドを合成し、固相免疫吸着として９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを個々にコーティングした。ペプチド（ウェル当たり０．１ｍＬ当たり０．５μｇ）をプレートにコーティングし、次いで１００μＬの血清試料（ＰＢＳにて１：１００希釈）を２つ組でプレートのウェルにてインキュベートし、それに上記に記載されている抗体ＥＬＩＳＡ法の工程が続いた。
【０１８４】
配列番号６８のタウペプチド免疫原構築物に向けられたプールした６ｗｐｉのモルモット抗血清を検体希釈緩衝液での１：１００希釈で、２．０μｇ／ｍＬにてこの領域由来のタウ重複ペプチドによってコーティングしたプレートのウェルに加え、次いで３７℃で１時間インキュベートした。プレートのウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したプロテインＡ／Ｇを加え、３０分間インキュベートした。ＰＢＳで再び洗浄した後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによる４５０ｎｍでの吸光度の測定のために基質をウェルに加え、試料を２つ組で解析した。Ｂエピトープ免疫原構築物の対応する長さのタウペプチドとの抗血清の結合は最大の結合を表す。
【０１８５】
表１６に示すように、プールした６ｗｐｉのモルモット免疫血清は、長さで２つのアミノ酸だけが異なり、ペプチド配列番号１１５の方が長い配列番号１６４及び１１５を持つ２つのタウペプチドがこの過剰リン酸化及び凝集の領域に由来する強いタウエピトープを提示することができた高精度の結合特性を実証した。しかしながら、プールした免疫血清は、２つのＮ末端アミノ酸（Ｉ２９７及びＫ２９８）の欠失に起因して配列番号１６４のペプチドを認識することができなかったということは、これら２つのアミノ酸が免疫優勢なエピトープとしてこの領域を提示することにおいて決定的であることを示している。
【０１８６】
免疫原性評価のために３０１位のプロリンのトランス構造を組み込むペプチド免疫原構築物を含む表１２、１３ａ、１３ｂ及び１５に示すような免疫原性試験のために、この領域をタウペプチド構築物のさらに慎重な設計に供した。一般に、高い免疫原性は、この過剰リン酸化及び凝集の領域における配列番号１２８を除く配列番号１２６〜１３２、１３５、１３６、１４０及び１４１の慎重に設計したタウ免疫原ペプチド構築物で見いだされた。
【０１８７】
タウの異性体から欠失されることが多いＮ末端領域に位置するタウの「ファジーコート」領域に追加のタウペプチド免疫原構築物の設計を使用した。表３に示すようなこの領域（配列番号１３７〜１３９）に由来するタウペプチド免疫原構築物も設計し、その対応する免疫原性について評価した。
【０１８８】
表１４は、ファジーコート領域に由来するタウペプチド免疫原構築物が高度に免疫原性であったことを示す。これらの結果は、Ｎ末端のファジーコート領域に由来するタウペプチド免疫原構築物が、タウ凝集につながる単量体タウのシーディングの開始を減らす可能性に加えてタウ凝集の阻止のために抗体を導出するための組成物への組み込みに有用であり得ることを示唆している。
【０１８９】
【表１】
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【０１９０】
【表２】
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【０１９１】
【表３】
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【０１９２】
【表４】
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【０１９３】
【表５】
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【０１９４】
【表６】
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【０１９５】
【表７】
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【０１９６】
【表８】
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【０１９７】
【表９】
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【０１９８】
【表１０】
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【０１９９】
【表１１】
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【０２００】
【表１２】
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【０２０１】
【表１３】
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【０２０２】
【表１４】
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【０２０３】
【表１５】
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【０２０４】
【表１６】
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【０２０５】
【表１７】
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【０２０６】
【表１８】
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【０２０７】
【表１９】
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【０２０８】
【表２０】
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【０２０９】
【表２１】
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【０２１０】
【表２２】
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【０２１１】
【表２３】
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【０２１２】
【表２４】
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【０２１３】
【表２５】
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【０２１４】
【表２６】
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【０２１５】
【表２７】
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【０２１６】
【表２８】
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【０２１７】
【表２９】
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【０２１８】
【表３０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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