(57)【要約】  本発明は概して、試料、特に患者試料を分析し、腫瘍抗原の発現を定量することによって癌を診断し、および／または癌免疫療法に対する臨床応答を予測するための、細胞培養物を用いる診断アッセイ、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーター細胞アッセイに関する。本発明のさらなる態様は、例えば、癌免疫療法の安全性を改善することである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイであって、以下のステップ：
ａ）  前記試料をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させることであって、前記レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が、
ｉ．  前記腫瘍細胞へ特異的な結合ができるＣＡＲであって、応答要素へ作用可能に連結された、ＣＡＲと、
ｉｉ．  前記応答要素の制御下にあるレポーター遺伝子とを含む、接触させること、および
ｂ）  前記腫瘍細胞の存在を確立するために前記レポーター遺伝子の発現を測定することによってＴ細胞の活性化を判定すること
を含む、診断アッセイ。
【請求項２】
前記ＣＡＲが、腫瘍標的抗原に特異的に結合することができる標的抗原結合部分を含む、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項３】
前記標的抗原結合部分が、Ｆａｂフラグメントである、請求項２に記載の診断アッセイ。
【請求項４】
前記レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項５】
前記腫瘍標的抗原が、細胞表面抗原および／または細胞表面受容体である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項６】
前記腫瘍標的抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１、およびＷＴ１からなる群、またはこれらのフラグメントから選択される、請求項２または５に記載の診断アッセイ。
【請求項７】
前記腫瘍標的抗原が、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子へ結合したペプチドである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項８】
前記ＣＡＲが、少なくとも１つの細胞内刺激シグナル伝達および／または同時刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項９】
前記細胞内シグナル伝達および／または同時シグナル伝達ドメインの活性化が、前記応答要素の活性化をもたらす、請求項８に記載の診断アッセイ。
【請求項１０】
前記応答要素の活性化が、前記レポーター遺伝子の発現をもたらす、請求項１〜９のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項１１】
前記応答要素が、ＮＦＡＴ経路、ＮＦ−κＢ経路またはＡＰ−１経路の一部である、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【請求項１２】
前記レポーター遺伝子が、発光タンパク質についてコードしている、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【請求項１３】
前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼについてコードしている、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【請求項１４】
前記試料が、疾患に罹患している個体に由来する患者試料であり、特に前記疾患が、癌である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の診断アッセイ。
【請求項１５】
抗腫瘍ＣＡＲ−Ｔ細胞処置の有効性を予測するための方法であって、腫瘍を有する対象に由来の試料を与えることと、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の診断アッセイによって前記レポーター遺伝子の発現を測定することによってＴ細胞の活性化を判定することとを含み、前記レポーター遺伝子の活性化が、前記対象へ適用される際の前記抗腫瘍ＣＡＲ−Ｔ細胞処置の有効性を示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、試料、特に患者試料を分析し、腫瘍抗原の発現を定量することによって癌を診断し、および／または癌免疫療法に対する臨床応答を予測するための、細胞培養物を用いる診断アッセイ、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーター細胞アッセイに関する。本発明のさらなる態様は、例えば、癌免疫療法の安全性を改善することである。
【背景技術】
【０００２】
癌は、すべての年齢コホート全体での死亡に対する主たる原因のうちの１つである。癌とは、１つ以上の細胞集団の制御されていない増殖をもたらす、細胞の異常なステージである。最終的に、増殖は、複数の臨床的および非臨床的な症状をもたらす、正常な生物学的機能の異常をもたらす。腫瘍細胞は、形態学的特徴、胎児抗原の発現、接触阻止の欠如および成長因子の非依存性など、腫瘍細胞を正常細胞と区別する特性のうちの１つまたはいくつかを典型的に提示する。
【０００３】
残念なことに、たいていの癌は、例えば、肺癌については早期のなおも局在しているステージにおいて１５％しか認められない誘発的な状況をもたらす疾患の早期のステージで無症候性である。しかしながら、このような早期の診断された患者について、５年生存率は８５％と高い可能性があるのに対し、癌が他の器官に拡大した後にこのような患者の２％しか５年生存しない。癌療法に対する改善を何十年も奨励しているにもかかわらず、癌の成功する処置についての最も有意な予測因子は、疾患の早期検出および分類のままである。
【０００４】
典型的には、免疫系は、「自己」に始発するこれらの細胞の性質のため、腫瘍細胞の認知を警告および惹起しない。癌免疫療法は、腫瘍によってのみ発現する独特なタンパク質を認識し、例えば、腫瘍細胞の破壊を可能にする抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）またはＴ細胞障害作用を介して、免疫細胞の作用に同時に関与することによって、免疫系が腫瘍細胞を標的とするのを害するのを目的とする。この関与は、従来のＡＤＣＣ適格細胞および／もしくはＴ細胞の二重特異性抗体を介して、または腫瘍抗原を認識する生来のＴ細胞受容体を発現するように操作されたＴ細胞（ＴＣＲ−Ｔ）もしくは人工のキメラ抗原を発現するように操作されたＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を介して達成されることができる。抗体は、ＭＨＣ複合体の流れにおいて提示される従来の腫瘍表面タンパク質またはタンパク質由来ペプチド（ｐＭＨＣ）のいずれかを認識する。いずれかのアプローチにおいて、腫瘍細胞表面上に発現する腫瘍抗原またはｐＭＨＣの密度が、癌のすべての種類にわたって患者間で大きく異なるので、患者が必ずしも全員、診療所における療法に対して応答するわけではない。
【０００５】
それゆえ、腫瘍抗原（表面および／またはｐＭＨＣ）の量を検出および定量するための確固たるツールは、癌患者のより良好な診断を保証するであろうし、個々の癌免疫療法に対する臨床応答の尤度を予測し得る。さらに、癌免疫療法は、正常組織を標的とする望ましくない免疫応答を惹起する可能性が時折ある。免疫療法の安全性の早期予測は、医師が患者における潜在的な致死的副作用を監視するのに役立つであろう。
【０００６】
異なる体液における腫瘍抗原の検出は、例えば、リンパまたは血液における既に非常に少数の生腫瘍細胞の存在が、疾患の進行における重要な特徴を示すことがあることを考慮すると、非常に重要なままである。免疫学的診断アッセイは、種々の疾患容態を検出することができるこの目的のために重要なツールを与える。しかしながら、このようなアッセイは、例えば、ＭＨＣ提示タンパク質由来ペプチドの流れにおける腫瘍細胞を信頼して検出するのに必ずしも十分に感度があるおよび／または特異度があるわけではないことがある。
【０００７】
したがって、悪性細胞を検出する上での使用に適した癌抗原を検出しおよび／または標的オン組織オフの効果を予測して免疫療法の安全性を改善しおよび特定の免疫療法薬に対する患者の応答を予測するための非常に感度がありかつ頑強な診断アッセイについての必要性があるままである。
【０００８】
本発明者らは、従来の表面元抗原とＭＨＣ複合体提示タンパク質由来ペプチドとに両方とも適用可能な癌患者における腫瘍抗原をスクリーニングするための高処理量フォーマットについて実現可能である、集積されたかつ直接的に順方向の読み出しを備えた非常に多用途のアッセイを開発した。本発明は、癌患者の診断、免疫療法に対する臨床応答の予測、および免疫療法の安全性測定に応用される。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は概して、試料における、特に患者由来の試料における標的抗原、例えば、腫瘍標的抗原および／または腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイに関し、標的抗原の検出を腫瘍細胞への応答におけるレポーター細胞の活性化と組み合わせる。本発明のアッセイは、患者の試料をスクリーニングするのに適しており、表面抗原および／またはＭＨＣ提示タンパク質由来ペプチドの流れにおける抗原密度の正確な測定を可能にする。本発明のアッセイは、癌免疫療法に対する臨床応答の尤度を予測するのにさらに有用である。
【００１０】
したがって、試料における腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイが本明細書に与えられており、診断アッセイは、以下のステップ：
ａ）  試料をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させることであって、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が、
ｉ．  腫瘍細胞と特異的な相互作用ができるＣＡＲであって、応答要素へ作用可能に連結された、ＣＡＲと、
ｉｉ．  応答要素の制御下にあるレポーター遺伝子とを含む、接触させること、および
ｂ）  腫瘍細胞の存在を確立するためにレポーター遺伝子の発現を測定することによってＴ細胞の活性化を判定すること
を含む。
【００１１】
一実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍標的抗原に特異的に結合することができる標的抗原結合部分を含む。
【００１２】
一実施形態において、標的抗原結合部分は、Ｆａｂフラグメントである。
【００１３】
一実施形態において、レポーターＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である。
【００１４】
一実施形態において、腫瘍標的抗原は、細胞表面抗原および／または細胞表面受容体である。
【００１５】
一実施形態において、腫瘍標的抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１、およびＷＴ１からなる群、またはこれらのフラグメントから選択される。
【００１６】
一実施形態において、腫瘍標的抗原は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子へ結合したペプチドである。
【００１７】
一実施形態において、標的抗原結合部分は、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である。
【００１８】
一実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内刺激シグナル伝達ドメインおよび／または同時刺激シグナル伝達ドメインである。
【００１９】
一実施形態において、細胞内シグナル伝達および／または同時シグナル伝達ドメインの活性化は、応答要素の活性化をもたらす。
【００２０】
一実施形態において、応答要素の活性化は、レポーター遺伝子の発現をもたらす。
【００２１】
一実施形態において、応答要素は、ＮＦＡＴ経路、ＮＦ−κＢ経路またはＡＰ−１経路の一部である。
【００２２】
一実施形態において、レポーター遺伝子は、発光タンパク質についてコードしている。
【００２３】
一実施形態において、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼについてコードしている。
【００２４】
一実施形態において、試料は、疾患に罹患している個体に由来する患者試料であり、疾患は癌である。
【００２５】
一実施形態において、抗腫瘍ＣＡＲ−Ｔ細胞処置の有効性を予測するための方法であって、腫瘍を有する対象に由来の試料を与えることと、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の診断アッセイによってレポーター遺伝子の発現を測定することによってＴ細胞の活性化を判定することとを含み、レポーター遺伝子の活性化は、対象へ適用される際の抗腫瘍ＣＡＲ−Ｔ細胞処置の有効性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの概略図を図示する。図１Ａは、診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの一実施形態を図示する。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を発現する抗ＴＡＡ抗原結合受容体によって認識されることができる。この認識は、ルミネセンスを測定することによって検出することができる細胞の活性化をもたらす。図１Ｂは、診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの別の実施形態を図示する。Ｆｃ（認識ドメイン）においてジゴキシゲニンを付加した標的抗原結合ＩｇＧは、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＴ細胞を発現する抗ジゴキシゲニンＣＡＲによって認識されることができる。この認識は、ルミネセンス（ｃｐｓ）を測定することによって検出することができる細胞の活性化をもたらす。図１Ｃは、診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの別の実施形態を図示する。Ｐ３２９Ｇ突然変異を保有するＴＡＡ結合ＩｇＧは、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＴ細胞を発現する抗Ｐ３２９Ｇ  ＣＡＲによって認識されることができる。この認識は、ルミネセンス（ｃｐｓ）を測定することによって検出することができる細胞の活性化をもたらす。
【図２Ａ−Ｃ】本発明において使用される異なるＣＡＲフォーマットのアーキテクチャを図示する。図２Ａは、Ｆａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。Ｉｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。重鎖へ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｂは、重鎖と軽鎖との交換を有するＦａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。Ｉｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。軽鎖定常ドメインへ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｃは、ｓｃＦａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。いずれもリンカーによって結合しているＩｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。重鎖へ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｄは、ＶＨ−ＶＬ交換を有する交差Ｆａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。ＶＨドメインおよびＶＬドメインが交換されたＩｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。重鎖定常ドメインへ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｅは、ＣＨ−ＣＬ交換を有する交差Ｆａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。ＣＨドメインおよびＣＬドメインが交換されたＩｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。軽鎖定常ドメインへ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｆは、いずれもリンカーによって結合している可変重鎖と可変軽鎖とからなる、細胞外抗原認識ドメインを有する従来のｓｃＦｖフォーマットのアーキテクチャを示す。可変軽鎖へ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。
【図２Ｄ−Ｆ】本発明において使用される異なるＣＡＲフォーマットのアーキテクチャを図示する。図２Ａは、Ｆａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。Ｉｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。重鎖へ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｂは、重鎖と軽鎖との交換を有するＦａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。Ｉｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。軽鎖定常ドメインへ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｃは、ｓｃＦａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。いずれもリンカーによって結合しているＩｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。重鎖へ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｄは、ＶＨ−ＶＬ交換を有する交差Ｆａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。ＶＨドメインおよびＶＬドメインが交換されたＩｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。重鎖定常ドメインへ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｅは、ＣＨ−ＣＬ交換を有する交差Ｆａｂフォーマットのアーキテクチャを示す。ＣＨドメインおよびＣＬドメインが交換されたＩｇ重鎖フラグメントとＩｇ軽鎖とからなる抗原結合部分を含む細胞外ドメインが図示されている。軽鎖定常ドメインへ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。図２Ｆは、いずれもリンカーによって結合している可変重鎖と可変軽鎖とからなる、細胞外抗原認識ドメインを有する従来のｓｃＦｖフォーマットのアーキテクチャを示す。可変軽鎖へ付着すると、リンカーは、抗原認識ドメインを足場性膜貫通ドメイン（ＡＴＤ）と結合させ、ＡＴＤは、細胞内同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）へ融合し、次はＣＳＤが、刺激シグナル伝達ドメイン（ＳＳＤ）へ融合する。
【図３】本発明により使用されるＣＡＲをコードする例示的な発現コンストラクトのモジュール組成を示す概略図を図示する。図３Ａおよび図３Ｂは、例示的なＦａｂフォーマットを図示する。図３Ｃは、例示的なｓｃＦａｂフォーマットを図示する。図３Ｄおよび図３Ｅは、例示的な交差Ｆａｂフォーマットを図示する。図３Ｆは、従来のｓｃＦｖフォーマットを図示する。
【図４】ＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として使用する診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを図示する。抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の単一のクローンをレポーター細胞として使用した。
【図５】ＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として使用する診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを図示する。抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤまたは抗ＣＤ２０−交差Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のプールをレポーター細胞として使用した。
【図６】ＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として使用する診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを図示する。抗ＣＤ２０−ｓｃＦａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のプールをレポーター細胞として使用した。
【図７】ＣＤ２０発現ＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として使用する診断用Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイを図示する。抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤまたは抗ＣＤ２０−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞のプールをレポーター細胞として使用した。
【図８Ａ】ＲＭＦ−ペプチドまたはＶＬＤ−ペプチドでパルスしたＴ２細胞を用いたＦＡＣＳによるＷＴ１／ＨＬＡ−結合剤５Ｅ１１および３３Ｈ０９の特異性の評価を図示する。
【図８Ｂ】ＲＭＦ−ペプチドまたはＶＬＤ−ペプチドでパルスしたＴ２細胞を用いたＦＡＣＳによるＷＴ１／ＨＬＡ−結合剤５Ｅ１１および３３Ｈ０９の特異性の評価を図示する。
【図９】ＲＭＦ−またはＶＬＤ−ペプチドでパルスしたＴ２細胞との共インキュベーションの際のＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター抗ＷＴ１／ＨＬＡ−Ｆａｂ−ＣＡＲ−Ｔ細胞プールにおけるＣＡＲ−ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を図示する。ＲＭＦ−ペプチド（標的）対ＶＬＤ−ペプチド（オフターゲット）に関するシグナルの比較は、活性化の特異性を評価するのに役立つ。
【図１０】ＲＭＦ−またはＶＬＤ−ペプチドでパルスしたＴ２細胞との共インキュベーションの際のＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター抗ＷＴ１／ＨＬＡ−Ｆａｂ−ＣＡＲ−Ｔ細胞プールにおけるＣＡＲ−ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を図示する。ＲＭＦ−ペプチド（標的）対ＶＬＤ−ペプチド（オフターゲット）に関するシグナルの比較は、活性化の特異性を評価するのに役立つ。標的細胞なしでインキュベートされたＮＦＡＲレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞プールのシグナルは、アッセイの低い背景を示す。
【図１１】異なるペプチド／ＨＬＡ−標的へのＣＡＲ−結合剤を発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｆａｂ−ＣＡＲ−Ｔ細胞プールにおけるＣＡＲ−ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を図示する。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＪＡＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞プールＦ０６、Ｆ２９およびＦ３０は、無関連ペプチドと結合したペプチド／ＨＬＡ−標的へ結合する。
【図１２】ＭＨＣ提示ペプチドの検出のための診断用レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの概略図を図示する。
【図１３】抗ＷＴ１／ＨＬＡ−Ｆａｂ−ＣＡＲを導入したＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞を用いて急性骨髄性白血病患者の骨髄におけるＷＴ１陽性細胞を検出する診断用レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイの概略図を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
「親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体またはＣＡＲ）と、その結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗原結合部分および抗原ならびに／または受容体およびそのリガンド）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの結合対Ｙに対する分子Ｘの親和性は概して、解離定数（ＫＤ）によって表すことができ、解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じままである限り、等価の親和性は、異なる速度定数を含むことができる。親和性は、本明細書に説明するものを含め、当技術分野で公知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）であり、測定についての好ましい温度は２５℃である。
【００２８】
「アミノ酸」（「ａａ」）という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされた天然アミノ酸、ならびに後に修飾される天然アミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ塩基化学構造を有する化合物、すなわち、水素、アミノ基、およびＲ基へ結合したα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ塩基化学構造を保有している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的か化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似の様式で機能する化合物を指す。アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されるアミノ酸の一般的に公知の３文字表記によってまたは１文字表記によって本明細書で言及されてもよい。
【００２９】
本明細書で使用される場合の「アミノ酸の突然変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および修飾を包含することを意味している。置換、欠失、挿入、および修飾の何らかの組合せは、最終コンストラクトに到達するように行うことができ、ただし、最終コンストラクトが、所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸配列の欠失および挿入は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端のアミノ酸の欠失および挿入を含む。特定のアミノ酸の突然変異は、アミノ酸の置換である。アミノ酸の置換には、非天然アミノ酸による置き換え、または２０種類の標準的なアミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸突然変異は、当技術分野で周知の遺伝的方法または化学的方法を用いて生じさせることができる。遺伝的方法とには、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれ得る。遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変える方法、例えば、化学修飾も有用な場合があることが想定される。
【００３０】
本明細書の「抗体」という用語は、最も広範な意味で使用されており、所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。したがって、本発明の脈絡において、抗体という用語は、完全な免疫グロブリン分子およびこのような免疫グロブリン分子の部分に関する。さらに、本用語は、本明細書で考察される場合、修飾されたおよび／または変更された抗体分子、特に修飾された抗体分子に関する。本用語はまた、組換えでまたは合成で生じた／合成された抗体にも関する。本発明の脈絡において、抗体という用語は、免疫グロブリンという用語と相互交換可能に使用される。
【００３１】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、乗換えＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）、および単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体フラグメントの総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖフラグメントの総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、また、国際公開第９３／１６１８５号ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および第５，５８７，４５８号を参照されたい。ダイアボディとは、二価または二重特異性であることができる、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）に説明されている。単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６  Ｂ１号を参照されたい）。抗体フラグメントは、本明細書に説明されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化、および組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むがこれらに限定されない種々の技術によって作製されることができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、最も広範な意味で、抗原決定基を特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体／免疫グロブリンおよびその誘導体、例えばフラグメントである。さらに、本用語は、本明細書で考察される場合、修飾されたおよび／または変更された抗原結合分子、特に修飾された抗体分子に関する。本用語はまた、組換えでまたは合成で生じた／合成された抗体にも関する。本発明の脈絡において、抗原結合分子は好ましくは、抗体またはそのフラグメントである。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施形態において、抗原結合部分は、標的部位に、例えば、抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞または腫瘍間質に付着する部分（例えば、免疫グロブリンまたはＣＡＲ）に、または腫瘍細胞上の抗原決定基に結合している免疫グロブリンに、向かわせることができる。別の実施形態において、抗原結合部分は、その標的抗原を経てシグナル伝達を活性化することができ、例えば、シグナル伝達は、Ｔ細胞上のＣＡＲへの抗原決定基の結合の際に活性化される。本発明の脈絡において、抗原結合部分は、本明細書にさらに定義されるような抗体およびそのフラグメントならびに抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）およびそのフラグメントに含まれていてもよい。抗原結合部分には、例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域と免疫グロブリン軽鎖可変領域とを含む抗原結合ドメインが含まれる。
【００３４】
本発明の脈絡において、「抗原結合受容体」という用語は、足場性膜貫通ドメインと、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインとを含む分子に関する。抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）は、異なる源由来のポリペプチド部分からつくられることができる。したがって、抗原結合受容体はまた、「融合タンパク質」および／または「キメラタンパク質」としても理解されることもできる。通常、融合タンパク質とは、元々別個のタンパク質についてコードした２つ以上の遺伝子（または好ましくはｃＤＮＡ）の結合を経て創出されるタンパク質である。この融合遺伝子（または融合ｃＤＮＡ）の翻訳は結果的に、好ましくは元々のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する一本鎖ポリペプチドを生じる。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療薬において使用するための組換えＤＮＡ技術によって人工的に創出される。本発明の脈絡において、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）は、スペーサー配列によって、例えば、ＣＤ３ｚおよびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインにそれ自体が融合した足場性膜貫通ドメインに融合した抗原結合部分を含む細胞外部分を含む抗原結合受容体であると理解されている。
【００３５】
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を与える抗原結合分子の部位、すなわち、１つ以上のアミノ酸残基を指す。天然の免疫グロブリン分子は、典型的には、２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子またはｓｃＦｖ分子は、典型的には、単一の抗原結合部位を有する。
【００３６】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部または全部に特異的に結合し、かつこれらに相補的である領域を含む、抗体または抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ以上の免疫グロブリン可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。特に、抗原結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
【００３７】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原を結合することに関与する免疫グロブリン重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，９１ページ（２００７）を参照されたい。単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに通常十分である。
【００３８】
本明細書で使用される「ＡＴＤ」という用語は、細胞の細胞膜（複数可）において組み込むことのできるポリペプチド鎖を規定する「足場性膜貫通ドメイン」を指す。ＡＴＤは、さらなる細胞外ポリペプチドドメインおよび／または細胞内ポリペプチドドメインに融合することができ、この中でこれらの細胞外ポリペプチドドメインおよび／または細胞内ポリペプチドドメインは、細胞膜に同様に閉じ込められることになる。本発明において使用されるような抗原結合受容体の脈絡において、ＡＴＤは、抗原結合受容体、例えば、本発明により使用されるＣＡＲの膜への付着および閉じ込めを与える。
【００３９】
本発明により使用される抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）の脈絡において使用されるような「に結合する」という用語は、「抗原相互作用部位」および抗原の互いの結合（相互作用）を規定する。「抗原相互作用部位」という用語は、特定の抗原または抗原の特定の基との特異的相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを規定する。結合／相互作用はまた、「特異的認識」を規定するためにも理解される。「特異的に認識する」という用語は、本発明に従って、抗原結合受容体が認識ドメイン、すなわち、本明細書で定義するような修飾された分子と特異的に相互作用することができるおよび／または認識ドメインへ特異的に結合することができるのに対し、非修飾分子は認識されないことを意味する。抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）の抗原結合部分は、同じ分子上の異なるエピトープを認識することができ、エピトープと相互作用することができ、および／またはエピトープに結合することができる。本用語は、抗原結合受容体の特異性に、すなわち、分子の特定の領域間で識別する能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば、抗原を含むポリペプチドの閉じ込めの変化の誘導、抗原を含むポリペプチドのオリゴマー化、抗原結合受容体のオリゴマー化などにより、シグナルの開始を結果的に生じることができる。したがって、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列における特定のモチーフは、それらの一次構造、二次構造または三次構造の結果および構造の二次修飾の結果として、互いに結合する。「に結合する」という用語は、線状エピトープだけに関するのではなく、立体配座エピトープ、構造エピトープ、または標的分子もしくはその部分の２つの領域からなる不連続なエピトープにも関することがある。本発明の脈絡において、立体配座エピトープは、ポリペプチドが天然タンパク質へ折りたたまれるとき、分子の表面上で互いにやってくる一次配列において分離される２つ以上の離散したアミノ酸配列によって規定される（Ｓｅｌａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６６（１９６９），１３６５およびＬａｖｅｒ，Ｃｅｌｌ  ６１（１９９０），５５３−５３６）。その上、「に結合する」という用語は、本発明の脈絡において、「と相互作用する」という用語と相互交換可能に使用される。ＣＡＲまたは抗体の抗原結合部分（例えば、ＦａｂドメインまたはｓｃＦｖドメイン）が特異的標的抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者になじみのある他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７、３２３−３２９（２０００））、および従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８、２１７−２２９（２００２））のいずれかを経て測定することができる。一実施形態において、関連のないタンパク質に対する抗原結合部分の結合度は、特にＳＰＲによって測定されるような標的抗原に対する抗原結合部分の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態において、標的抗原に結合する抗原結合部分は、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）である。抗原結合部分は、ＫＤが１μＭ以下であるとき、標的抗原に「特異的に結合する」といわれており、このような相互作用は、「特異的結合」と本明細書で呼ばれる。したがって、本発明により使用される抗原結合受容体（例えば、ＣＡＲ）は、腫瘍標的抗原に特異的に結合し／それと相互作用する。検査下のコンストラクトのパネルの交差反応性は、例えば、従来の条件下で（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）およびＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９９）を参照されたい）、目的の標的抗原に対する抗原結合部分のパネルの結合を評価することによって検査することができる。これらの方法は、とりわけ、構造上および／または機能上密接に関連しているドメインを用いた結合試験、ブロッキングおよび競合試験を含むことができる。結合試験はまた、ＦＡＣＳ解析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ，例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを使用）、分析用超遠心、等温滴定熱量測定、蛍光アニソトロピー、蛍光分光法、または放射性標識リガンド結合アッセイによるものも含む。
【００４０】
本明細書で採用されるような「ＣＤＲ」という用語は、当技術分野で周知である「相補性決定領域」に関する。ＣＤＲは、分子の特異性を決定しおよび特異的リガンドと接触させる免疫グロブリン、抗原結合部分および／または抗原結合受容体の部分である。ＣＤＲは、分子の最も可変的な部分であり、これらの分子の抗原結合多様性に寄与する。各Ｖドメインにおいては３つのＣＤＲ領域、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がある。ＣＤＲ−Ｈは、可変重鎖のＣＤＲ領域を示し、ＣＤＲ−Ｌは、可変軽鎖のＣＤＲ領域に関する。ＶＨは、可変重鎖を意味し、ＶＬは、可変軽鎖を意味する。Ｉｇ由来領域のＣＤＲ領域は、「Ｋａｂａｔ」（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，第５版．．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２  Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７）または「Ｃｈｏｔｈｉａ」（Ｎａｔｕｒｅ  ３４２（１９８９），８７７−８８３）において説明されるように決定されることができる。
【００４１】
「ＣＤ３ｚ」という用語は、「Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖」および「ＣＤ２４７」としても公知のＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖を指す。
【００４２】
「キメラ抗原受容体」または「キメラ受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、スペーサー配列によって（例えば、ＣＤ３ｚおよびＣＤ２８の）細胞内シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合部分（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）の細胞外部分から構成された抗原結合受容体を指す。
【００４３】
抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、抗体または免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５種類の主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらのうちのいくつかは、下位クラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００４４】
「クロスオーバーＦａｂ分子」（「交差Ｆａｂ」または「クロスオーバーＦａｂフラグメント」とも呼ばれる）が意味するのは、Ｆａｂ分子であり、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換され、すなわち、交差Ｆａｂフラグメントは、軽鎖可変領域および重鎖定常領域から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変領域および軽鎖定常領域から構成されるペプチド鎖とを含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変領域が交換された交差Ｆａｂフラグメントにおいて、重鎖定常領域を含むペプチド鎖は、本明細書ではクロスオーバーＦａｂ分子の重鎖と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の定常領域が交換された交差Ｆａｂフラグメントにおいて、重鎖可変領域を含むペプチド鎖は、本明細書では、交差Ｆａｂフラグメントの重鎖と呼ばれる。したがって、交差Ｆａｂフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖定常領域（ＶＨ−ＣＬ）から構成された重鎖または軽鎖と、軽鎖可変領域および重鎖定常領域（ＶＬ−ＣＨ１）から構成された重鎖または軽鎖とを含む。これとは対照的に、「Ｆａｂ」または「従来のＦａｂ分子」が意味するのは、すなわち、重鎖可変領域および定常領域（ＶＨ−ＣＨ１）から構成された重鎖と、軽鎖可変領域および定常領域（ＶＬ−ＣＬ）から構成された軽鎖とを含むその天然のフォーマットにおけるＦａｂ分子である。
【００４５】
本明細書で使用する場合の「ＣＳＤ」という用語は、同時刺激シグナル伝達ドメインを指す。
【００４６】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指し、抗体のアイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる。すなわち、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の低下調節、およびＢ細胞活性化である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「操作する」、「操作された」、「操作すること」という用語は、天然または組換えポリペプチドまたはこれらのフラグメントのペプチド骨格の何らかの操作または翻訳後修飾を含むと考えられる。操作することは、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、およびこれらのアプローチの組合せを含む。
【００４８】
「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定の核酸の転写が可能な一連の特定の核酸要素を有する、組換えでまたは合成で生じるポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、または核酸フラグメントへと組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列と、プロモーターとを含む。
【００４９】
「Ｆａｂ分子」は、抗原結合分子の重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨおよびＣＨ１ドメインと、軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬおよびＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
【００５０】
「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。本用語は、天然配列Ｆｃ領域と可変Ｆｃ領域とを含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長するよう規定されている。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１において説明されるような、ＥＵインデックスとも呼ばれる「ＥＵ番号付け」システムによる。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書で使用される場合、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定した自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２とＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインとを含む。
【００５１】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、概して、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ配列およびＦＲ配列は、概して、ＶＨ（またはＶＬ）における次の配列において現れる。すなわち、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４である。
【００５２】
「完全長の抗体」という用語は、２つの「完全長の抗体重鎖」および２つの「完全調の抗体軽鎖」からなる抗体を示す。「完全長の抗体重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなるポリペプチドであり、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略記され、ならびに場合により、下位クラスＩｇＥの抗体の場合においては抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）からなる。好ましくは、「完全長の抗体重鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端への方向においてＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２およびＣＨ３からなるポリペプチドである。「完全長の抗体軽鎖」とは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであり、ＶＬ−ＣＬと略記される。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）であり得る。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の、および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介してまとまって連結される。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのような天然の抗体である。）抗体は、単一の種、例えば、ヒトに由来し得、または抗体は、キメラ化抗体またはヒト化抗体であり得る。完全長抗体は通常、一対のＶＨおよびＶＬによって各々形成される２つの抗原結合部位を含み、いずれも同じ抗原に特異的に結合する。さらに、完全長抗体は、一対のＶＨおよびＶＬによって各々形成される２つの抗原結合部位を含むことができ、２つの抗原結合部位は、異なる抗原に結合し、例えば、抗体は二重特異的である。完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端は、重鎖または軽鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を示す。
【００５３】
「融合した」が意味するのは、構成要素（例えば、Ｆａｂおよび膜貫通ドメイン）が、ペプチド結合によって直接的にまたは１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されていることである。
【００５４】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は、相互交換可能に使用され、外来性核酸が導入された細胞の継代を含む、細胞を指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代形質転換細胞および細胞に由来する継代を含む。後代は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、突然変異を含有していてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるかまたは選択されるのと同じ機能または生物活性を有する突然変異体の後代は、本発明に含まれる。宿主細胞とは、本発明により使用される抗体を生じるのに使用されることができる何らかの型の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養された植物組織もしくは動物組織内に含まれる細胞も挙げられる。
【００５５】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり、および／または構造上規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。概して、ネイティブの４本鎖抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨにおいては３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬにおいては３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは、概して、超可変ループ由来および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、および／または抗原認識に関与している。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、概して、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して相互交換可能に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって説明されており、ここで、この定義は、互いに対して比較したときに、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体および／もしくは抗原結合受容体のＣＤＲまたはこれらの変異形を指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書に定義されおよび使用される用語の範囲内であることが意図されている。先に引用した参考文献の各々によって定義されるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として、表１において以下に明らかにする。特定のＣＤＲを包含する実際の残基数は、ＣＤＲの配列および大きさによって変わることになる。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを、定められた方法で決定することができる。
【００５６】
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１表１におけるすべてのＣＤＲ定義の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌによって明らかにされた番号付けによる。（以下を参照されたい）。
２表１において使用されるような小文字「ｂ」が付いた「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデリングソフトウェアによって定義されるようなＣＤＲを指す。
【００５７】
Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．はまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体以外のいかなる実験データにも頼ることなく、このＫａｂａｔ番号付けのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって明らかにされた番号付けシステムを指す。特に指定されない限り、抗原結合部分可変領域における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けに関する参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる。配列表のポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされていない。しかしながら、配列表の配列の番号付けをＫａｂａｔ番号付けに変換することは十分に、当業者の通常の技術内である。
【００５８】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、個体または対象は、ヒトである。
【００５９】
「単離された核酸」分子またはポリヌクレオチドが意図するのは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡである。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種性宿主細胞において維持された組換えポリヌクレオチド、または溶液中の精製された（部分的にまたは実質的に）、ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、元々ポリヌクレオチド分子を含有する細胞において含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物と、陽性および陰性の鎖形態と、二本鎖形態とを含む。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成によって産生されるこのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節要素であってもよく、または調節要素を含んでいてもよい。
【００６０】
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５個までの点突然変異を含んでいてもよいことを除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列内のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、もしくは別のヌクレオチドで置換されていてもよく、または参照配列内の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列内へと挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位置もしくは３’末端位置で、または、５’末端位置と３’末端位置との間の、参照配列内の残基間で個々にもしくは参照配列内での１つ以上の連続した基においてかのいずれかに点在しているどこかで起こってもよい。実際問題  として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて後で考察するもの（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）のような公知のコンピュータプログラムを用いて、従来通りに決定することができる。
【００６１】
「単離されたポリペプチド］またはその変異形、もしくはその誘導体が意図するのは、その天然の環境にはないポリペプチドである。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その生来の環境または天然環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現する組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって、分離され、分画され、または部分的にもしくは実質的に精製された、未変性ポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されると考えられる。
【００６２】
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列の同一率（％）」は、参照ポリペプチド配列と、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列とを整列させ、必要な場合にギャップを導入して、最大の配列同一率を達成した後で、かつ配列同一性の部分としてのいかなる保存的置換も考慮されることなく、候補配列内のアミノ酸残基率と定義される。アミノ酸配列の同一率を決定する目的のための整列は、当技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大整列度を達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるのに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書では目的のために、アミノ酸配列同一％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生じる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、またはそのソースコードからコンパイルされてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、かつ変わらない。ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に採用されている状況においては、（あるいは所与のアミノ酸配列Ｂに対する、配列Ｂとの、または配列Ｂに対向するある特定のアミノ酸配列同一％を有するかまたは含む所与のアミノ酸配列Ａとして購入することができる）所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、配列Ｂとの、または配列Ｂに対向するアミノ酸配列同一％は、次のように計算される。分数Ｘ／Ｙの１００倍、式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によるＡとＢとの整列において、プログラムによる同一性一致として点数化されたアミノ酸残基の数であり、かつＹは、Ｂにおけるアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一％に等しくはないことになることは理解されるだろう。別途具体的に述べられていない限り、本明細書で使用されるアミノ酸配列同一％の値はすべて、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いた直前の段落において説明されたように得られる。
【００６３】
「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチドによって含まれるプリン塩基およびピリミジン塩基を含む塩基の配列に関し、それにより塩基は、核酸分子の一次構造を表す。本明細書では、核酸分子という用語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡの合成形態、およびこれらの分子のうちの２つ以上を含む混合ポリマーを含む。加えて、核酸分子という用語は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む。その上、本明細書に説明される核酸分子は、当業者に容易に理解されるように、非天然のまたは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有することができる。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「ＮＦＡＴ」は、「活性化型Ｔ細胞の核因子」を指し、たいていの免疫細胞内で発現する転写因子のファミリーである。ＮＦＡＴファミリーの転写因子の活性化は、カルシウムシグナル伝達に依存している。例として、Ｔ細胞シナプスを経たＴ細胞の活性化は結果的に、カルシウムの流入を生じる。細胞内カルシウムレベルの上昇は、カルシウム感受性ホスファターゼであるカルシニューリンを活性化させ、ＮＦＡＴタンパク質のアミノ末端におけるセリンの豊富な領域（ＳＲＲ）およびＳＰリピートを迅速に脱リン酸化する。このことは結果的に立体配座の変化を生じ、変化によって、ＮＦＡＴ核移入と標的遺伝子の活性化とを促進する核局在シグナルが露出する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「ＮＦＡＴ経路」は、転写因子のＮＦＡＴファミリーのメンバーの活性化の変調をもたらす刺激を指す。ＮＦＡＴ  ＤＮＡ要素は、当技術分野で公知であり、本明細書ではまた、「ＮＦＡＴ経路の応答要素」とも呼ばれる。この故に、「ＮＦＡＴ経路の受容体」は、ＮＦＡＴ活性の変調を惹起することができる受容体を指す。「ＮＦＡＴ経路の受容体」の例は、例えば、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体である。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「ＮＦ−κＢ」は、「活性化したＢ細胞の核因子カッパ−軽鎖−エンハンサー」を指し、アポトーシス、ウイルス複製、腫瘍形成、種々の自己免疫疾患および炎症性応答のメディエーターについてコードする多くの遺伝子の調節に関与する転写因子である。ＮＦκＢは、ほぼすべての真核細胞において存在する。概して、ＮＦκＢは、阻害性カッパＢ（ＩκＢ）タンパク質との複合体を形成するので、不活性状態でサイトゾル内に局在する。内在性膜受容体（「ＮＦ−κＢ経路の受容体」とも呼ばれる）に対するリガンドの結合を経て、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）は活性化される。ＩＫＫとは、２つのキナーゼと１つの調節サブユニットとからなる酵素複合体である。この複合体は、ＩκＢタンパク質をリン酸化し、これがユビキチン化を、それゆえ、プロテアソームによるタンパク質の分解をもたらす。最終的に、遊離ＮＦκＢは不活性状態にあり、核へ移動し、κＢ  ＤＮＡ要素へ結合し、かつ標的遺伝子の転写を誘導する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「ＮＦ−κＢ経路」は、ＮＦ−κＢの活性の変調をもたらす刺激を指す。例えば、リガンドまたは抗体のいずれかの結合を経たＴｏｌｌ様受容体シグナル伝達の活性化、ＴＮＦ受容体シグナル伝達、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体シグナル伝達は結果的に、ＮＦ−κＢの活性化を生じる。その後、リン酸化したＮＦ−κＢ二量体は、κＢ  ＤＮＡ要素へ結合し、標的遺伝子の転写を誘導する。κＢ  ＤＮＡ要素は、当技術分野で公知であり、本明細書ではまた、「ＮＦ−κＢ経路の応答要素」とも呼ばれる。この故に、「ＮＦ−κＢ経路の受容体」は、ＮＦ−κＢ活性の変調を惹起することができる受容体を指す。「ＮＦ−κＢ経路の受容体」の例は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＮＦ受容体、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体である。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「ＡＰ−１」は、「活性化因子タンパク質１」を指し、分化、増殖、およびアポトーシスを含む、いくつかの細胞過程を包含した転写因子である。ＡＰ−１機能は、ＡＰ−１二量体に寄与する特定のＦｏｓサブユニットおよびＪｕｎサブユニットに依存している。ＡＰ−１は、パリンドロームＤＮＡモチーフ（５’−ＴＧＡ  Ｇ／Ｃ  ＴＣＡ−３’）へ結合して、遺伝子発現を調節する。
【００６９】
「医薬組成物」という用語は、医薬組成物の中に含有される有効成分の生物活性を有効にするような形態にあり、かつ製剤が投与される対象に対して許容し得ないほど毒性である追加の構成要素を含有しない調製物を指す。医薬組成物は通常、１つ以上の医薬的に許容される担体（複数可）を含む。
【００７０】
「医薬的に許容される担体」は、有効成分以外の医薬組成物中の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。医薬的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としても公知）によって線状に連結された単量体（アミノ酸）から構成された分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの生成物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アミノ酸鎖、または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、ポリペプチドの定義内に含まれており、ポリペプチドという用語は、これらの用語のうちのいずれかの代わりに、または相互交換可能に使用されることができる。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、または非天然アミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことも意図されている。ポリペプチドは、天然の生物源から誘導されてもよく、または組換え技術によって産生されてもよいが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含め、任意の様式で生じてもよい。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸の大きさであってよい。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有することができるが、ポリペプチドは、このような構造を必ずしも有するものではない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると呼ばれ、規定の三次元構造を有していないがむしろ多数の異なる立体配座を採用することができるポリペプチドは、折りたたまれていないと呼ばれる。
【００７２】
「ポリヌクレオチド」といの用語は、単離された核酸分子またはコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において認められるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、１つ以上の任意の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡフラグメントを指す。
【００７３】
「内在性蛍光を有するタンパク質」という用語は、タンパク質内の内部アミノ酸の環化および酸化を経るかまたは蛍光共因子の酵素による付加を介するかのいずれかで、非常に蛍光性のある内在性発色団を形成することができるタンパク質を指す。「内在性蛍光を有するタンパク質」という用語は、スペクトル特性または物理的特性の変化を呈する野生型蛍光タンパク質および変異体を含む。本用語は、タンパク質内の非修飾のチロシン基、トリプトファン基、ヒスチジン基およびフェニルアラニン基の蛍光寄与にのみ起因する弱い蛍光を呈するタンパク質を含まない。内在性蛍光を有するタンパク質は、当技術分野で公知であり、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，１９９６）、ＣＦＰとしても公知のシアン蛍光変異形（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｔｓｉｅｎ  １９９８）、ＹＦＰとしても公知の黄色蛍光変異形（Ｏｒｍｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｗａｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、サファイアとして公知の紫色励起性緑色蛍光変異形（Ｔｓｉｅｎ  １９９８、Ｚａｐａｔａ−Ｈｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、および高感度緑色蛍光タンパク質またはＥＧＦＰとして公知のシアン励起性緑色蛍光変異形（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）であり、例えば、生細胞撮像（例えば、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）または蛍光分光測光によって測定することができる。
【００７４】
「結合低減」は、例えばＳＰＲによって測定されるような、ここの相互作用についての親和性における低下を指す。明確性のために、本用語はまた、親和性がゼロ（または分析方法の検出限界を下回る）までの低減、すなわち、相互作用の完全な終止も含む。逆に、「結合上昇」は、個々の相互作用に対する結合親和性における上昇を指す。
【００７５】
「調節配列」という用語は、ライゲートされたコード配列の発現をもたらすのに必要であるＤＮＡ配列を指す。このような制御配列の性質は、生物によって異なる。原核生物において、制御配列は概して、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含む。真核生物において、概して、制御配列は、プロモーター、ターミネーター、およびいくつかの場合においてはエンハンサー、転写活性化因子または転写因子を含む。「制御配列」という用語は、最低限のすべての構成要素において、発現に必要である存在を含むことが意図されており、また、追加の有利な構成要素も含むことができる。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「レポーター遺伝子」は、発現をアッセイすることができる遺伝子を意味する。好ましい一実施形態において、「レポーター遺伝子」は、産生および欠失が検査される抗体またはリガンドの活性を間接的に検出するためのサロゲートとして使用されるタンパク質をコードする遺伝子である。レポータータンパク質とは、レポーター遺伝子によってコードされたタンパク質である。好ましくは、レポーター遺伝子は、触媒活性が単純なアッセイ方法によって検出されることができる酵素、または内在性の蛍光もしくはルミネセンスなどの特性を有し、それによりレポーター遺伝子の発現が最低限の試料調製を必要とする単純かつ迅速なアッセイにおいて検出されることができるタンパク質をコードする。触媒活性を検出することができる酵素の非限定例は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼである。ルシフェラーゼとは、分子量（ＭＷ）が６１ｋＤａの単量体酵素である。ルシフェラーゼは、触媒因子として作用し、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびＭｇ２＋の存在下でＤ−ルシフェリンをルシフェニルアデニラートへ転化することができる。加えて、ピロリン酸（ＰＰｉ）およびアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）は、副産物として生じる。次に、中間体であるルシフェリルアデニラートは、オキシルシフェリン、二酸化炭素（ＣＯ２）および光へ酸化される。オキシルシフェリンとは、反応から放出された光によって照度計に置いて定量的に測定することができる生物発光産物である。ルシフェラーゼレポーターアッセイは、市販されており、当技術分野で公知であり、例えば、ルシフェラーゼ１０００アッセイシステムおよびＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムである。
【００７７】
「応答要素」は、ある特定の転写因子の結合の際に活性化されることができるかまたはサイレンシングされることができる特異的転写結合要素またはシス作用性要素を指す。一実施形態において、応答要素とは、転写因子結合の際にレポーター遺伝子の発現を駆動する最小プロモーター（例えば、ＴＡＴＡボックスプロモーター）の上流に位置するシス作用性エンハンサー要素である。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「一本鎖」という用語は、ペプチド結合によって線状に連結されたアミノ酸単量体を含む分子を指す。ある特定の実施形態において、抗原結合部分のうちの１つは、ｓｃＦｖフラグメント、すなわち、ペプチドリンカーによって接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインである。ある特定の実施形態において、抗原結合部分のうちの１つは、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって接続されて単一のペプチド鎖を形成するＦａｂ分子である。特定のこのような実施形態において、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、一本鎖Ｆａｂ分子におけるＦａｂ重鎖のＮ末端に接続される。
【００７９】
本明細書で使用する場合の「ＳＳＤ」という用語は、刺激シグナル伝達ドメインを指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「処置」（およびその文法的な変化形、例えば、「処置する」または「処置すること」）は、処置される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症または再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解または緩和、および回復または改良された予後が挙げられる。
【００８１】
本発明の脈絡において、「タグ」という用語は、タンパク質、特に抗原結合分子などの生体分子へ付着したもしくは移植された、または生体分子上へ付着したもしくは移植された分子を指す。タグの機能とは、「タグ付けした」タンパク質（例えば、免疫グロブリンまたはそのフラグメント）を指標付けまたは標識し、それによりタンパク質が、タグへ結合することができる特異的抗原結合部分によって認識されることができるが、タグ付けされていないタンパク質経は結合することができないことである。本用語は、「分子タグ」と同義であり、蛍光タグ、タンパク質タグ、親和性タグ、可溶化タグ、クロマトグラフィータグ、エピトープタグ、およびハプテンタグなど小分子タグを含むが、これらに限定されない。小分子タグ、例えば、ハプテンは、生体分子へ化学的に共有結合または非共有結合することができるのに対し、「タンパク質タグ」または「ポリペプチドタグ」とは、タンパク質上へ遺伝的に移植することができ、その後、タグへ結合することができる特異的抗原結合部分によって認識されることができるが、タグ付けされていないタンパク質へ結合することはできないペプチド配列である。ハプテンタグは、担体タンパク質へ付着したとき、免疫応答を誘起することができ、それゆえタンパク質などの担体上のタグを認識することができる特異的抗原結合部分を生じるのに適している。本発明の好ましい実施形態において、タグは、ハプテンタグまたはポリペプチドタグである。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「標的抗原決定基」という用語は、「標的抗原」、「標的エピトープ」および「標的細胞抗原」と同義であり、抗体が結合して抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続鎖、または異なる領域の非連続アミノ酸から構成された配座立体配置）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の罹患した細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。本明細書で抗原と呼ばれるタンパク質（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１、およびＷＴ１）は、特に示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の生来の形態のタンパク質であり得る。特定の実施形態において、標的抗原は、ヒトタンパク質である。本発明の特定のタンパク質について言及される場合、本用語は、「完全長」の未処理の標的タンパク質、および標的細胞における処理から結果的に生じる任意の形態の標的タンパク質を包含する。用語はまた、標的タンパク質の天然の変異形、例えば、スプライス変異形または対立遺伝子変異形も包含する。抗原として有用な例示的なヒト標的タンパク質には、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１、およびＷＴ１。
【００８３】
抗体は、１、２、３またはそれより多数の結合ドメインを有することができ、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。抗体は、単一の種に由来する完全長であり得、または、キメラ化もしくはヒト化することができる。２つを超える抗原結合ドメインを有する抗体について、いくつかの結合ドメインは、同一であってもよく、および／または同じ特異性を有していてもよい。
【００８４】
本明細書で使用する場合の「Ｔ細胞の活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞障害性エフェクター分子の放出、細胞障害性活性、および活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞障害性Ｔリンパ球の１つ以上の細胞応答を指す。Ｔ細胞の活性化を判定するのに適したアッセイは、当技術分野で公知であり、本明細書で説明されている。
【００８５】
本発明に従って、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、当技術分野で一般的に公知である。特に、本明細書では、「Ｔ細胞受容体」という用語は、任意のＴ細胞受容体を指すが、ただし、次の３つの基準が満たされていることを条件とする。（ｉ）腫瘍特異性、（ｉｉ）抗原または標的が（たいていの）腫瘍細胞において発現すべきであることを意味する、（たいていの）腫瘍細胞の認識、かつ（ｉｉｉ）ＴＣＲが、処置される対象のＨＬＡ型と一致していること。この脈絡において、先に言及した３つの基準を満たす適切なＴ細胞受容体は、ＮＹ−ＥＳＯ−１（配列情報（複数可）については、例えば、ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９２４を参照されたい）および／またはＨＥＲ２ｎｅｕ（配列情報（複数可）については、ＷＯ−Ａ１  ２０１１／０２８０８９４を参照されたい）を認識する受容体など、当技術分野で公知である。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子は、外来性抗原由来のペプチドをＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞に提示し、それゆえ、ＭＨＣ−ペプチド複合体は、免疫治療アプローチに適した標的である。ＭＨＣ−ペプチド複合体は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって標的とされることができる。しかしながら、たいていのＴＣＲは、免疫療法にとって低過ぎる親和性を有することがある一方で、ＴＣＲ特異性を有する高い親和性結合部分は有益であろう。この目的に向けて、ＴＣＲ様特異性を有する高親和性可溶性抗体分子は、例えば、ファージディスプレイライブラリ（例えば、コンビナトリアルライブラリ）を生じかつ本明細書でさらに説明するようなライブラリをスクリーニングすることによって生じることができる。本明細書に説明するようなＴＣＲ様特異性を有するこれらの抗原結合部分、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂは、「Ｔ細胞受容体様抗原結合部分」または「ＴＣＲＬ抗原結合部分」と呼ばれる。
【００８６】
作用剤、例えば、医薬組成物の「治療有効量」は、所望の治療結果または予防結果を達成するための、必要な薬用量かつ必要な時間で、有効な量を指す。作用剤の治療有効量は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、または予防する。
【００８７】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義語であり、標的細胞において作用可能に会合する特定の遺伝子の発現を導入しかつ指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。本用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、およびベクターが導入された宿主細胞のゲノム内へと組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。いったん発現ベクターが標的細胞内に入ると、リボ核酸分子または遺伝子によってコードされたタンパク質は、細胞の転写機構および／または翻訳機構によって産生される。一実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の抗原結合受容体をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む発現カセットを含む。
【００８８】
この脈絡において、診断方法、特に試料中の細胞、特に腫瘍細胞を検出するためのインビトロでの方法が本明細書に与えられる。好ましい実施形態において、試料は、例えば、異常な細胞が検出されることを必要とする生検または体液に由来する、患者試料である。本発明のアッセイは、抗原結合部分、特にｓｃＦｖフラグメントおよび／またはＦａｂフラグメント、を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の高い特異性を、受容体シグナルのルミネセンス検出の感度と組み合わせる。本明細書で説明される方法およびアッセイにおいて、標的抗原結合部分は、標的細胞、特に癌細胞と、レポーター細胞、特にＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞との間の接触を媒介する。この脈絡において、本明細書に説明する方法は、適切なレポーター細胞、好ましくはレポーターＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞内に導入されるＣＡＲの結合の特異性により、癌細胞を検出するのに有用である。
【００８９】
したがって、一実施形態において、試料における腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイが与えられており、診断アッセイは、以下のステップ：
ａ）  試料をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させることであって、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が、
ｉ．  腫瘍細胞と特異的な相互作用ができるＣＡＲであって、応答要素へ作用可能に連結された、ＣＡＲと、
ｉｉ．  応答要素の制御下にあるレポーター遺伝子とを含む、接触させること、および
ｂ）  腫瘍細胞の存在を確立するためにレポーター遺伝子の発現を測定することによって、Ｔ細胞の活性化を判定すること
を含む。
【００９０】
本明細書で説明するＣＡＲ分子（複数可）の発現が可能な導入されたＴ細胞は、本発明にさらに与えられおよび使用される。導入されたＴ細胞は、応答要素の制御下でレポーター遺伝子を含み、ＣＡＲは、本明細書に説明するように、応答要素に関連付けられて連結されている。標的抗原結合部分を標的細胞、例えば、腫瘍細胞に結合する際、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞が活性化され、レポーター遺伝子が発現する。レポーター遺伝子の発現はそれゆえ、Ｔ細胞を標的細胞に、例えば、腫瘍細胞上へ結合することによって誘導されるＴ細胞活性化の脈絡において、ＣＡＲの（特異的）結合について示す。
【００９１】
この脈絡において、腫瘍標的抗原に特異的結合をすることができるＣＡＲが、本発明の方法についてさらに説明されおよび使用される。一実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍標的抗原に特異的に結合することができる標的抗原結合部分を含む。適切な腫瘍標的の例は、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１、およびＷＴ１、またはこれらのフラグメントなどだがそれらに限定されない、腫瘍細胞の表面上にのみ発現するかまたは表面上に主に発現するタンパク質である。
【００９２】
本発明はさらに、本明細書に説明するレポーターシステムおよび本明細書に説明するＣＡＲ（複数可）を導入するための、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、γδ  Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および不死化細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞などの、Ｔ細胞の導入および使用、ならびに標的細胞の表面上の、例えば腫瘍細胞の表面上の標的抗原への直接的な結合ができる、本明細書に説明するＣＡＲによって媒介される、Ｔ細胞を標的とする動員および活性化を説明する。
【００９３】
したがって、本発明は、ＣＡＲが免疫細胞に特異的な誘導として使用され得る、特にＴ細胞が本明細書に説明するＣＡＲによって腫瘍細胞を特異的に標的とする、多用途の診断用プラットフォームを与える。腫瘍細胞の表面上の標的抗原に対するＣＡＲの結合の後、レポーター細胞は活性化され、活性化は、例えば、蛍光シグナルまたは発光シグナルの読出しによって測定することができる。プラットフォームは、多様な既存のまたは新たに開発された標的抗原結合部分の使用を可能にすることによって、可撓性かつ特異的である。
【００９４】
標的抗原、例えば、腫瘍抗原に対して特異的に結合することができる抗原結合部分は、例えば、哺乳動物免疫系の免疫化によって生じることができる。このような方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２９５：１−１２（２００５）におけるＢｕｒｎｓにおいて説明されている。あるいは、所望の活性の抗原結合部分は、所望の１つまたは複数の活性を有する抗体について、コンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離されることができる。コンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １６：４９８−５０８（２０１６）におけるＬｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．においてまとめられている。例えば、ファージディスプレイライブラリを生じ、所望の結合特徴を有する抗原結合部分について、このようなライブラリをスクリーニングするための種々の方法が、当技術分野で公知である。このような方法は、例えば、ｍＡｂｓ  ８：１１７７−１１９４（２０１６）におけるＦｒｅｎｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８：１８１７−１８２８（２０１２）におけるＢａｚａｎ  ｅｔ  ａｌ．、およびＣｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３６：２７６−２８９（２０１６）におけるＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．において、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ編，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）においてまとめられており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）において、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ編，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）におけるＭａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）においてさらに説明されている。ある特定のファージディスプレイ法において、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって個別にクローニングされ、ファージライブラリにおいて無作為に組換えられており、次いで、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：４３３−４５５（１９９４）におけるＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．において説明されたように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、一本��Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントとして、またはＦａｂフラグメントとしてのいずれかで、抗体フラグメントを呈する。免疫化された源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗原結合部分を与える。あるいは、生来のレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングし、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １２：７２５−７３４（１９９３）におけるＧｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．によって説明されるようないかなる免疫化をすることもなく、広範囲な非自己および自己抗原にも対する抗原結合部分の単一の源を与えることができる。最終的に、生来のライブラリはまた、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２７：３８１−３８８（１９９２）におけるＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒによって説明されるように、再整列していないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、およびランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを用いて、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再整列を達成することによって、合成により作成することができる。ヒト抗体ファージライブラリを説明する特許公表物としては、例えば、以下のものが挙げられる：米国特許第５，７５０，３７３号、第７，９８５，８４０号、第７，７８５，９０３号および第８，６７９，４９０号、ならびに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号および第２００９／０００２３６０号。所望の１つまたは複数の活性を有する抗原結合部分についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための、当技術分野で公知の方法のさらなる例としては、リボソームおよびｍＲＮＡディスプレイ、ならびに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞または酵母細胞上での抗体の呈示および選択のための方法が挙げられる。酵母表面ディスプレイの方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５０３：１３５−５６（２０１２）におけるＳｃｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．において、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １３１９：１５５−１７５（２０１５）におけるＣｈｅｒｆ  ｅｔ  ａｌ．において、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８８９：７３−８４（２０１２）におけるＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．においてまとめられている。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：５１３２−５１３４（１９９７）ａｎｄ  ｉｎ  Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ、ＰＮＡＳ９４：４９３７−４９４２（１９９７）に記載される。
【００９５】
本発明の第１の実例となる実施形態において、概念の証拠として、レポーター細胞、例えば、標的抗原ヒトＣＤ２０に対して特異的に結合することができるＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞の使用が与えられる。
【００９６】
一実施形態において、ＣＤ２０に特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号１、配列番号２および配列番号３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、配列番号５および配列番号６の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００９７】
１つの好ましい実施形態において、ＣＤ２０に対して特異的に結合することができるＣＡＲは、以下を含む重鎖可変領域：
（ａ）  ＹＳＷＩＮ（配列番号１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列、
（ｂ）  ＲＩＦＰＧＤＧＤＴＤＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号２）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列、
（ｃ）  ＮＶＦＤＧＹＷＬＶＹ（配列番号３）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列と、
以下を含む軽鎖可変領域：
（ｄ）  ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号４）の軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列、
（ｅ）  ＱＭＳＮＬＶＳ（配列番号５）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列、および
（ｆ）  ＡＱＮＬＥＬＰＹＴ（配列番号６）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列とを含む。
【００９８】
一実施形態において、ＣＤ２０に特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【００９９】
一実施形態において、ＣＤ２０に特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１００】
一実施形態において、少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、交差ＦａｂまたはｓｃＦａｂフラグメントである。一実施形態において、ＣＤ２０に特異的に結合することができるＣＡＲは、Ｆａｂフラグメントを含む。好ましい実施形態において、ＣＤ２０に特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号８の重鎖と配列番号９の軽鎖とを含むＦａｂフラグメントを含む。
【０１０１】
一実施形態において、ＣＤ２０に特異的に結合することができる抗原結合部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる重鎖と、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる軽鎖とを含むＦａｂフラグメントである。
【０１０２】
特定の実施形態において、抗原結合部分は、ＣＤ２０に特異的に結合することができるＦａｂフラグメントであって、抗原結合受容体が、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む、Ｆａｂフラグメントである。
【０１０３】
好ましい実施形態において、抗原結合部分は、ＣＤ２０に特異的に結合することができるＦａｂフラグメントであって、抗原結合受容体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む、Ｆａｂフラグメントである。
【０１０４】
一実施形態において、ＣＤ２０に特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、リンカーとからなるポリペプチドであるｓｃＦｖフラグメントを含み、可変ドメインおよびリンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向において次の立体配置のうちの１つを有する：ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬ、またはｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨ。好ましい実施形態において、ｓｃＦｖフラグメントは、立体配置ＶＨ−リンカー−ＶＬを有する。
【０１０５】
本発明の別の実例となる実施形態において、概念の証拠として、レポーター細胞、例えば、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対して特異的に結合することができるＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞の使用が与えられる。
【０１０６】
一実施形態において、ＣＥＡに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１０７】
１つの好ましい実施形態において、ＣＥＡに対して特異的に結合することができるＣＡＲは、以下を含む重鎖可変領域：
（ａ）  ＥＦＧＭＮ（配列番号３６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列、
（ｂ）  ＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹＶＥＥＦＫＧ（配列番号３７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列、
（ｃ）  ＷＤＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹ（配列番号３８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列と、
以下を含む軽鎖可変領域：
（ｄ）  ＫＡＳＡＡＶＧＴＹＶＡ（配列番号３９）の軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列、
（ｅ）  ＳＡＳＹＲＫＲ（配列番号４０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列、および
（ｆ）  ＨＱＹＹＴＹＰＬＦＴ（配列番号４１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列とを含む。
【０１０８】
一実施形態において、ＣＥＡに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１０９】
一実施形態において、ＣＥＡに特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１１０】
一実施形態において、少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、交差ＦａｂまたはｓｃＦａｂフラグメントである。一実施形態において、ＣＥＡに特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、リンカーとからなるポリペプチドであるｓｃＦｖフラグメントを含み、可変ドメインおよびリンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向において次の立体配置のうちの１つを有する：ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬ、またはｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨ。好ましい実施形態において、ｓｃＦｖフラグメントは、立体配置ＶＨ−リンカー−ＶＬを有する。
【０１１１】
好ましい実施形態において、ＣＥＡに対して特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号４３のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖフラグメントを含む。
【０１１２】
本発明の別の実例となる実施形態において、概念の証拠として、レポーター細胞、例えば、ペプチドがヒトウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）に由来するペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞の使用が与えられる。
【０１１３】
一実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号４６、配列番号４７および配列番号４８の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１１４】
別の実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号４６、配列番号４７および配列番号５７の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５８の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１１５】
１つの好ましい実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＣＡＲは、以下を含む重鎖可変領域：
（ａ）  ＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳ（配列番号４６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列、
（ｂ）  ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列、
（ｃ）  ＳＩＥＬＷＷＧＧＦＤＹ（配列番号４８）およびＧＳＹＤＬＦＳＬＤＹ（配列番号５７）からなる群から選択されるＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列と、
以下を含む軽鎖可変領域：
（ｄ）  ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡ（配列番号４９）の軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列、
（ｅ）  ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列、および
（ｆ）  ＱＱＹＥＤＹＴＴ（配列番号５１）およびＱＱＹＹＤＧＩＴ（配列番号５８）からなる群から選択されるＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列とを含む。
【０１１６】
１つの具体的な実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＣＡＲは、以下を含む重鎖可変領域：
（ｇ）  ＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳ（配列番号４６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列、
（ｈ）  ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列、
（ｉ）  ＳＩＥＬＷＷＧＧＦＤＹ（配列番号４８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列と、
以下を含む軽鎖可変領域：
（ｊ）  ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡ（配列番号４９）の軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列、
（ｋ）  ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列、および
（ｌ）  ＱＱＹＥＤＹＴＴ（配列番号５１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列とを含む。
【０１１７】
別の具体的な実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＣＡＲは、以下を含む重鎖可変領域：
（ａ）  ＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳ（配列番号４６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列、
（ｂ）  ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号４７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列、
（ｃ）  ＧＳＹＤＬＦＳＬＤＹ（配列番号５７）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列と、
以下を含む軽鎖可変領域：
（ｄ）  ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡ（配列番号４９）の軽鎖（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列、
（ｅ）  ＤＡＳＳＬＥＳ（配列番号５０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列、および
（ｆ）  ＱＱＹＹＤＧＩＴ（配列番号５８）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列とを含む。
【０１１８】
一実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号５６および配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号５５及び配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１１９】
一実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１２０】
一実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１２１】
一実施形態において、少なくとも１つの抗原結合部分は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、交差ＦａｂまたはｓｃＦａｂフラグメントである。
【０１２２】
特定の実施形態において、抗原結合部分は、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＦａｂフラグメントであり、抗原結合受容体は、配列番号５２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０１２３】
好ましい実施形態において、抗原結合部分は、ＷＴ１／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＦａｂフラグメントであり、抗原結合受容体は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドと、配列番号５４のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドとを含む。
【０１２４】
一実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＣＡＲは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、リンカーとからなるポリペプチドであるｓｃＦｖフラグメントを含み、可変ドメインおよびリンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向において次の立体配置のうちの１つを有する：ａ）ＶＨ−リンカー−ＶＬ、またはｂ）ＶＬ−リンカー−ＶＨ。好ましい実施形態において、ｓｃＦｖフラグメントは、立体配置ＶＨ−リンカー−ＶＬを有する。
【０１２５】
好ましい実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号６０のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖフラグメントを含む。
【０１２６】
特定の実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣに対して特異的に結合することができるＣＡＲは、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
好ましい実施形態において、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣに対して特異的に結合するＣＡＲｃａｐａｂｌｅは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
本明細書に説明するようなＦａｂフラグメント、交差Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントおよびｓｃＦａｂフラグメントなど、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む抗原結合部分は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に鎖間ジスルフィド架橋を導入することによってさらに安定し得る。したがって、一実施形態において、本発明による抗原結合受容体において含まれる交差Ｆａｂフラグメント（複数可）、ｓｃＦｖフラグメント（複数可）および／またはｓｃＦａｂフラグメント（複数可）は、システイン残基の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定し得る（例えば、Ｋａｂａｔの番号付けによる可変重鎖における位置４４および可変軽鎖における位置１００）。このような安定した抗原結合部分は、本明細書で「ｄｓ」という用語によって言及される。
【０１２９】
本明細書で与えられおよび使用されるＣＡＲは、標的抗原に対して特異的に結合することができる抗原結合部分と、足場性膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または少なくとも１つの同時刺激シグナル伝達ドメインとを含む細胞外ドメインを含む。足場性膜貫通ドメインは、レポーター細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞膜へのＣＡＲの閉じ込めを媒介する。細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または少なくとも１つの同時刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの結合を細胞内シグナル、例えば、Ｔ細胞活性化へと移し、このことは、レポーター遺伝子の発現を測定することによって評価することができる。本発明の脈絡において、本明細書に説明するようなレポーター遺伝子の発現は、標的抗原に対する標的抗原結合部分の結合、および結果として生じる本明細書に説明するようなＴ細胞活性化について示す。
【０１３０】
ＣＡＲの足場性膜貫通ドメインは、哺乳動物プロテアーゼについての開裂部位を有さないことを特徴とすることができる。プロテアーゼは、プロテアーゼの開裂部位を含む膜貫通ドメインのアミノ酸配列を加水分解することができるタンパク質分解性酵素を指す。プロテアーゼという用語は、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼの両方を含む。本発明の脈絡において、とりわけＣＤ命名法によって定められるような膜貫通タンパク質の任意の足場性膜貫通ドメインを使用して、本発明により適切なＣＡＲを生じてもよく、ＣＡＲは、本明細書で説明されるように、標的細胞への結合の際にＴ細胞を活性化する。
【０１３１】
したがって、本発明の脈絡において、足場性膜貫通ドメインは、ネズミ／マウスまたは好ましくはヒト膜貫通ドメインの部分を含むことができる。このような足場性膜貫通ドメインについての例は、例えば、（配列番号２９に示されるＤＮＡ配列によってコードされるような）本明細書に配列番号１４において示されるようなアミノ酸配列を有する、ＣＤ２８の膜貫通ドメインである。本発明の脈絡において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、（配列番号２９に示されるＤＮＡ配列によってコードされるような）配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列を含んでもよい／からなってもよい。
【０１３２】
あるいは、とりわけ、ＣＤ命名法によって与えられるように、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質は、本明細書において与えられおよび使用されるＣＡＲの足場性膜貫通ドメインとして使用してもよい。先に説明したとおり、ＣＡＲは、（配列番号６７に示されるｃＤＮＡ配列によってコードされるような）配列番号６８に示されるようなヒト完全長ＣＤ２８タンパク質のアミノ酸１５３〜１７９、１５４〜１７９、１５５〜１７９、１５６〜１７９、１５７〜１７９、１５８〜１７９、１５９〜１７９、１６０〜１７９、１６１〜１７９、１６２〜１７９、１６３〜１７９、１６４〜１７９、１６５〜１７９、１６６〜１７９、１６７〜１７９、１６８〜１７９、１６９〜１７９、１７０〜１７９、１７１〜１７９、１７２〜１７９、１７３〜１７９、１７４〜１７９、１７５〜１７９、１７６〜１７９、１７７〜１７９または１７８〜１７９に位置するＣＤ２８の足場性膜貫通ドメインを含んでもよい。したがって、本発明の脈絡において、足場性膜貫通ドメインは、（配列番号２９に示されるようなＤＮＡ配列によってコードされるような）配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列を含んでもよいかまたはアミノ酸配列からなってもよい。
【０１３３】
本明細書で説明される場合、本発明により使用されるＣＡＲは、少なくとも１つの刺激シグナル伝達ドメインおよび／または同時刺激シグナル伝達ドメインを含む。刺激シグナル伝達ドメインおよび／または同時刺激シグナル伝達ドメインは、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）において、腫瘍標的抗原に対するＣＡＲの結合を細胞内シグナルに変換する。したがって、ＣＡＲは好ましくは、刺激シグナル伝達ドメインを含み、これがＴ細胞活性化を与える。好ましい実施形態において、標的に対する標的抗原結合部分の結合は、細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または同時シグナル伝達ドメインの活性化をもたらす。ある特定の実施形態において、本明細書に与えられるＣＡＲは、ネズミ／マウスもしくはヒトＣＤ３ｚ（ヒトＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ２０９６３のフラグメント部分／ポリペプチド部分（配列番号２のバージョン番号１７７、ネズミ／マウスＣＤ３ｚのＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ２４１６１（一次引用可能受入番号）またはバージョン番号１４３および配列番号１のＱ９Ｄ３Ｇ３（二次引用可能受入番号）である））、ＦＣＧＲ３Ａ（ヒトＦＣＧＲ３ＡのＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ０８６３７である（配列番号２のバージョン番号１７８））、またはＮＫＧ２Ｄ（ヒトＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ２６７１８である（配列番号１のバージョン番号１５１）、ネズミ／マウスＮＫＧ２ＤのＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｏ５４７０９である（配列番号２のバージョン番号１３２））である刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、ＣＡＲにおいて含まれる刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３ＡまたはＮＫＧ２Ｄの完全長のフラグメント／ポリペプチド部分であってもよい。ＣＤ３ｚのネズミ／マウス完全長のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号６５として示される（配列番号６６に示されるＤＮＡ配列によってコードされるようなネズミ／マウス）。ヒト完全長ＣＤ３ｚのアミノ酸配列は、本明細書に配列番号６３として示される（配列番号６４に示されるＤＮＡ配列によってコードされるようなヒト）。本発明により与えられおよび使用されるＣＡＲは、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３ＡまたはＮＫＧ２Ｄのフラグメントを刺激ドメインとして含んでもよく、ただし、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれることを条件とする。特に、ＣＤ３ｚ、ＦＣＧＲ３Ａ、またはＮＫＧ２Ｄの任意の部分／フラグメントは、少なくとも１つのシグナル伝達の原因が含まれる限り、刺激ドメインとして適切である。しかしながら、より好ましくは、ＣＡＲは、ヒト起源に由来するポリペプチドを含む。好ましくは、ＣＡＲは、本明細書に配列番号６３として示されるようなアミノ酸配列（ＣＤ３ｚ）を含む（配列番号６４に示されるＤＮＡ配列によってコードされるようなヒト（ＣＤ３ｚ））。例えば、ＣＡＲにおいて含まれることができるヒトＣＤ３ｚのフラグメント／ポリペプチド部分は、（配列番号３１に示されるＤＮＡ配列によってコードされるような）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでもよいかまたはアミノ酸配列からなってもよい。したがって、一実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１６に示されるような配列、または配列番号１６と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個までの置換、欠失もしくは挿入を有しかつ刺激シグナル伝達活性を有することを特徴とする配列を含む。刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの具体的な立体配置は、本明細書で以下にならびに実施例および図面において与えられる。刺激シグナル伝達活性は、例えばＥＬＩＳＡによって測定されるようなサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）放出の増強、（細胞数の増強によって測定されるような）増殖活性の増強、またはＬＤＨ放出アッセイによって測定されるような溶解活性の増強によって決定することができる。
【０１３４】
ＣＡＲは好ましくは、追加の活性をレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞に与える少なくとも１つの同時シグナル伝達ドメインをさらに含む。ＣＡＲは、ネズミ／マウスまたはヒトＣＤ２８（ヒトＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ１０７４７であり（配列番号１のバージョン番号１７３）、ネズミ／マウスＣＤ２８のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ３１０４１である（配列番号２のバージョン番号１３４））、ＣＤ１３７（ヒトＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｑ０７０１１であり（配列番号１のバージョン番号１４５）、ネズミ／マウスＣＤ１３７のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ２０３３４である（配列番号１のバージョン番号１３９））、ＯＸ４０（ヒトＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ２３５１０であり（配列番号１のバージョン番号１３８）、ネズミ／マウスＯＸ４０のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ４３４８８である（配列番号１のバージョン番号１１９））、ＩＣＯＳ（ヒトＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｑ９Ｙ６Ｗ８であり（配列番号１のバージョン番号１２６））、ネズミ／マウスＩＣＯＳのＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｑ９ＷＶ４０（一次引用可能受入番号）もしくはＱ９ＪＬ１７（二次引用可能受入番号）であり、バージョン番号１０２および配列バージョン２））、ＣＤ２７（ヒトＣＤ２７のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ２６８４２であり（配列番号２のバージョン番号１６０）、ネズミ／マウスＣＤ２７のＵｎｉｐｒｏｔ登録は、Ｐ４１２７２である（配列バージョン１のバージョン番号１３７））、４−１−ＢＢ（ネズミ／マウス４−１−ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｐ２０３３４であり（配列バージョン１のバージョン番号１４０）、ヒト４−１−ＢＢのＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｑ０７０１１である（配列バージョンのバージョン番号１４６））、ＤＡＰ１０（ヒトＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｑ９ＵＢＪ５であり（配列番号１のバージョン番号２５）、ネズミ／マウスＤＡＰ１０のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｑ９ＱＵＪ０（一次引用可能受入番号）もしくはＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能受入番号）であり、バージョン番号１０１および配列番号１））またはＤＡＰ１２（ヒトＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｏ４３９１４であり（バージョン番号１４６および配列番号１）、ネズミ／マウスＤＡＰ１２のＵｎｉＰｒｏｔ登録は、Ｏ０５４８８５（一次引用可能受入番号）もしくはＱ９Ｒ１Ｅ７（二次引用可能受入番号）であり、バージョン番号１２３および配列番号１）のフラグメント／ポリペプチド部分である同時刺激シグナル伝達ドメインを含んでもよい。ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、本明細書で定義される同時刺激シグナル伝達ドメインを１個以上、すなわち、１、２、３、４、５、６または７個含んでもよい。したがって、本発明の脈絡において、ＣＡＲは、ネズミ／マウスまたは好ましくはヒトＣＤ２８のフラグメント／ポリペプチド部分を第１の同時刺激シグナル伝達ドメインとして含んでもよく、第２の同時刺激シグナル伝達ドメインは、ネズミ／マウスまたは好ましくはヒトＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２、またはこれらのフラグメントからなる群から選択される。好ましくは、ＣＡＲは、ヒト起源に由来する同時刺激シグナル伝達ドメインを含む。したがって、より好ましくは、ＣＡＲにおいて含まれる同時刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）は、（配列番号３０に示されるＤＮＡ配列によってコードされるような）配列番号１５に示されるようなアミノ酸配列を含んでもよいかまたはアミノ酸配列からなってもよい。
【０１３５】
したがって、ＣＡＲにおいて任意に含まれてもよい同時刺激シグナル伝達ドメインは、完全長のＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２のフラグメント／ポリペプチド部分である。ネズミ／マウス完全長ＣＤ２８のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号７０として示される（配列番号６９に示されるＤＮＡ配列によってコードされるようなネズミ／マウス）。しかしながら、ヒト配列は、本発明の脈絡において最も好ましいので、ＣＡＲタンパク質において任意に含まれ得る同時刺激シグナル伝達ドメインは、ヒト完全長ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１２のフラグメント／ポリペプチド部分である。ヒト完全長ＣＤ２８のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号６８として示される（配列番号６７に示されるＤＮＡ配列によってコードされるようなヒト）。
【０１３６】
１つの好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８またはそのフラグメントを同時刺激シグナル伝達ドメインとして含む。ＣＡＲは、ＣＤ２８のフラグメントを同時刺激シグナル伝達ドメインとして含んでもよく、ただし、ＣＤ２８の少なくとも１つのシグナル伝達ドメインが含まれることを条件とする。特に、ＣＤ２８の任意の部分／フラグメントは、ＣＤ２８のシグナル伝達の原因のうちの少なくとも１つが含まれる限り、ＣＡＲに適切である。例えば、ＣＡＲにおいて含まれるヒトＣＤ２８ポリペプチドは、（配列番号３０に示されるＤＮＡ配列によってコードされるような）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含んでもよいかまたはアミノ酸配列からなってもよい。本発明において、同時刺激シグナル伝達ドメインとして機能するＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列（複数可）ＹＭＮＭ（配列番号７１）および／またはＰＹＡＰ（配列番号７２）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含んでもよい。好ましくは、ＣＡＲは、ヒト起源に由来するポリペプチドを含む。例えば、ＣＡＲにおいて含まれることができるヒトＣＤ２８のフラグメント／ポリペプチド部分は、（配列番号３０に示されるＤＮＡ配列によってコードされるような）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含んでもよいかまたはアミノ酸配列からなってもよい。したがって、一実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１５に示されるような配列、または配列番号１５と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個までの置換、欠失もしくは挿入を有しかつ同時刺激シグナル伝達活性を有することを特徴とする配列を含む。同時刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＳＤ）を含むＣＡＲの具体的な立体配置は、本明細書で以下にならびに実施例および図面において与えられる。同時刺激シグナル伝達活性は、例えばＥＬＩＳＡによって測定されるようなサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）放出の増強、（細胞数の増強によって測定されるような）増殖活性の増強、またはＬＤＨ放出アッセイによって測定されるような溶解活性の増強によって決定することができる。
【０１３７】
先に記載のとおり、本発明の実施形態において、ＣＡＲの同時刺激シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ１０７４７（登録バージョン１７３および配列のバージョン１の受入番号）に由来し得、転換されたＴ細胞のように、本明細書に説明する転換された細胞のサイトカイン産生、増殖および溶解活性として定義されるＣＤ２８活性を与える。ＣＤ２８活性は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）もしくはインターロイキン２（ＩＬ−２）などのサイトカインのＥＬＩＳＡもしくはフローサイトメトリーによるサイトカインの放出、例えばｋｉ６７測定によって測定されるＴ細胞の増殖、フローサイトメトリーによる細胞の定量、または（例えば、Ｔｈａｋｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．３５（１）（２０１２），５０３−５０６、Ｋｒｕｔｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．６９９（２０１１），１７９−２０２、Ｅｋｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７５（５）（２００７），２２９１−２２９６、Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９９（５）（２００２），２９８３−２９８８、Ｄｕｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２１（１２）（２０１４），１８２５−１８３７，訂正：Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２１（１２）（２０１４），１６１において説明されるようなＩＣＥＬＬｌｉｇｅｎｃｅ機を用いることによる）標的細胞のリアルタイムインピーダンス測定によって評価されるような溶解活性によって測定することができる。同時刺激シグナル伝達ドメインＰＹＡＰおよびＹＭＮＭは、先に列挙したＣＤ２８ポリペプチドの機能および該機能の効果について有益である。ＹＭＮＭドメインのアミノ酸配列は、配列番号７１に示されており、ＰＹＡＰドメインのアミノ酸配列は、配列番号７２に示されている。したがって、本明細書に与えられおよび説明されるようなＣＡＲにおいて、ＣＤ２８ポリペプチドは好ましくは、配列ＹＭＮＭ（配列番号７１）および／または配列ＰＹＡＰ（配列番号７２）を有するＣＤ２８ポリペプチドの細胞内ドメインに由来する配列を含む。これらのシグナル伝達の原因は、ＣＡＲの細胞内ドメイン内の任意の部位に存在し得る。
【０１３８】
標的抗原に対して特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインまたは修飾された認識ドメイン、哺乳動物プロテアーゼについての開裂部位を有さない足場性膜貫通ドメイン、同時刺激シグナル伝達ドメインおよび刺激シグナル伝達ドメインは、一本鎖多機能性ポリペプチドにおいて含まれることができる。一本鎖融合コンストラクトは、例えば、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメイン（複数可）、足場性膜貫通ドメイン（複数可）、同時刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）および／または刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）を含むポリペプチド（複数可）からなってもよい。代替的な実施形態において、ＣＡＲは、一本鎖融合コンストラクトではない抗原結合部分を含み、すなわち、抗原結合部分は、Ｆａｂフラグメントまたは交差Ｆａｂフラグメントである。このような実施形態において、ＣＡＲは、唯一のポリペプチド鎖を含む一本鎖融合コンストラクトではない。好ましくは、このようなコンストラクトは、免疫グロブリン軽鎖と組み合わされた一本鎖重鎖融合ポリペプチドを含むことになり、例えば、重鎖融合ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖（複数可）、足場性膜貫通ドメイン（複数可）、同時刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）および／または刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）を含み、かつ免疫グロブリン軽鎖（複数可）と組み合わされている。したがって、細胞外ドメイン、足場性膜貫通ドメイン、同時刺激シグナル伝達ドメインおよび刺激シグナル伝達ドメインは、１つ以上の同一のまたは異なるペプチドリンカーによって接続されてもよい。例えば、認識ドメインに対して特異的に結合することができる少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインと足場性膜貫通ドメインとの間のリンカーは、配列番号２０に示されるようなアミノ酸配列を含んでもよいかまたはアミノ酸配列からなってもよい。したがって、足場性膜貫通ドメイン、同時刺激シグナル伝達ドメインおよび／または刺激ドメインは、ペプチドリンカーによってまたはそれに代わるものとしてドメインの直接的な融合によって互いに接続されてもよい。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、細胞外ドメインにおいて含まれる抗原結合部分は、１０〜約２５個のアミノ酸の短鎖リンカーペプチドで接続された抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリンまたはトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを、またはその逆で接続することができる。例えば、リンカーは、配列番号１９に示されるようなアミノ酸アミノ酸配列を有してもよい。ｓｃＦｖ抗原結合部分は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６）において説明されている。
【０１４０】
ＣＡＲまたはその部分は、シグナルペプチドを含んでもよい。このようなシグナルペプチドは、Ｔ細胞膜の表面にタンパク質をもたらすことになる。例えば、シグナルペプチドは、（配列番号７４に示されるＤＮＡ配列によってコードされるような）配列番号７３に示されるようなアミノ酸アミノ酸配列を有してもよい。
【０１４１】
ＣＡＲの構成要素は、種々の立体配置において互いに融合して、Ｔ細胞を活性化するＣＡＲを生じることができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、足場性膜貫通ドメインへ結合した、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とから構成された細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、任意にペプチドリンカーを経て、ＶＬドメインのＮ末端へ融合する。他の実施形態において、ＣＡＲはさらに、刺激シグナル伝達ドメインおよび／または同時刺激シグナル伝達ドメインを含む。具体的なこのような実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上のペプチドリンカーによって結合したＶＨドメインおよびＶＬドメインと、足場性膜貫通ドメインと、任意で刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、ＶＬドメインのＮ末端に融合し、かつＶＬドメインは、Ｃ末端で足場性膜貫通ドメインのＮ末端に融合し、足場性膜貫通ドメインは、Ｃ末端で刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合する。任意で、ＣＡＲはさらに、同時刺激シグナル伝達ドメインを含む。１つのこのような具体的な実施形態において、抗原結合受容体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインと、足場性膜貫通ドメインと、刺激シグナル伝達ドメインと、１つ以上のペプチドリンカーによって結合した同時刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、ＶＬドメインのＮ末端に融合し、かつＶＬドメインは、Ｃ末端で足場性膜貫通ドメインのＮ末端に融合し、足場性膜貫通ドメインは、Ｃ末端で刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合し、刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で同時刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合する。代替的な実施形態において、同時刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりに、足場性膜貫通ドメインに結合する。好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインと、足場性膜貫通ドメインと、同時刺激シグナル伝達ドメインと、１つ以上のペプチドリンカーによって結合した刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、ＶＨドメインは、Ｃ末端で、ＶＬドメインのＮ末端に融合し、かつＶＬドメインは、Ｃ末端で足場性膜貫通ドメインのＮ末端に融合し、足場性膜貫通ドメインは、Ｃ末端で同時刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合し、同時刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合する。
【０１４２】
好ましい実施形態において、結合部分のうちの１つは、Ｆａｂフラグメントまたは交差Ｆａｂフラグメントである。１つの好ましい実施形態において、抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖または交差Ｆａｂ重鎖のＣ末端で足場性膜貫通ドメインのＮ末端に、任意でペプチドリンカーを経て融合する。代替的な実施形態において、抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖または交差Ｆａｂ軽鎖のＣ末端で足場性膜貫通ドメインのＮ末端に、任意でペプチドリンカーを経て融合する。他の実施形態において、ＣＡＲはさらに、刺激シグナル伝達ドメインおよび／または同時刺激シグナル伝達ドメインを含む。具体的なこのような実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上のペプチドリンカーによって結合したＦａｂフラグメントまたは交差Ｆａｂフラグメントと、足場性膜貫通ドメインと、任意で刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、Ｆａｂフラグメントまたは交差Ｆａｂフラグメントは、その重鎖または軽鎖のＣ末端で、足場性膜貫通ドメインのＮ末端に融合し、足場性膜貫通ドメインは、Ｃ末端で刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合する。好ましくは、ＣＡＲはさらに、同時刺激シグナル伝達ドメインを含む。１つのこのような実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上のペプチドリンカーによって結合したＦａｂフラグメントまたは交差Ｆａｂフラグメントと、足場性膜貫通ドメインと、刺激シグナル伝達ドメインと、同時刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、Ｆａｂフラグメントまたは交差Ｆａｂフラグメントは、その重鎖または軽鎖のＣ末端で、足場性膜貫通ドメインのＮ末端に融合し、足場性膜貫通ドメインは、Ｃ末端で同時刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合する。好ましい実施形態において、同時刺激シグナル伝達ドメインは、刺激シグナル伝達ドメインの代わりに、足場性膜貫通ドメインに結合する。最も好ましい実施形態において、ＣＡＲは、Ｆａｂフラグメントまたは交差Ｆａｂフラグメントと、足場性膜貫通ドメインと、同時刺激シグナル伝達ドメインと、刺激シグナル伝達ドメインとから本質的になり、Ｆａｂフラグメントまたは交差Ｆａｂフラグメントは、重鎖のＣ末端で、足場性膜貫通ドメインのＮ末端にペプチドリンカーを経て融合し、足場性膜貫通ドメインは、Ｃ末端で同時刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合し、同時刺激シグナル伝達ドメインは、Ｃ末端で同時刺激シグナル伝達ドメインのＮ末端に融合する。
【０１４３】
抗原結合部分、足場性膜貫通ドメインおよび同時刺激シグナル伝達ドメインおよび／または同時刺激シグナル伝達ドメインは、互いに直接的に、または１つ以上のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含む１つ以上のペプチドリンカーを経て融合してもよい。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であり、本明細書に説明される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー、（ＳＧ４）ｎペプチドリンカー、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカーまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられ、「ｎ」は概して、１〜１０の、典型的には２〜４の数である。抗原結合部分と足場性膜貫通ドメインとを結合させるための好ましいペプチドリンカーは、配列番号２０によるＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）である。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）とを結合させるのに適した例示的なペプチドリンカーは、配列番号１９によるＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）４である。
【０１４４】
加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、抗原結合部分が、足場性膜貫通ドメインのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域またはその一部を介して、追加のペプチドリンカーを用いて、または用いずに融合することができる。
【０１４５】
本明細書に説明するように、本発明により与えられおよび使用されるＣＡＲは、少なくとも１つの抗原結合部分を含む細胞外ドメインを含む。単一の抗原結合部分を有するＣＡＲは、特にＣＡＲの多量の発現が必要とされる場合において、有用でありかつ好ましい。このような場合において、１つを超える抗原結合部分の存在は、ＣＡＲの発現効率を制限することがある。しかしながら、その他の場合においては、標的部位へのターゲティングを最適化するために、または標的細胞抗原の架橋を可能にするために、２つ以上の抗原結合部分を含むＣＡＲを有することは有利であることとなる。
【０１４６】
本発明による方法の脈絡において、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）を標的細胞（例えば、腫瘍細胞）の表面上に標的抗原を含む標的細胞と接触させることは、本明細書に説明するようなレポーター遺伝子の発現をもたらす。したがって、一実施形態において、本明細書に説明するような細胞内シグナル伝達および／または同時シグナル伝達ドメインの活性化は、本明細書に説明するように、応答要素の活性化をもたらす。好ましい実施形態において、応答要素は、レポーター遺伝子の発現を制御する。好ましい実施形態において、応答要素の活性化は、レポーター遺伝子の発現をもたらす。したがって、レポーター細胞におけるレポーター遺伝子は、標的抗原結合部分を標的に結合する際に発現する。一実施形態において、レポーター遺伝子の発現は、標的抗原結合部分を標的抗原に結合していることを示す。この脈絡において、ＣＡＲがその標的に結合することは、細胞の応答を誘起し、このことが結果的に、応答要素の活性の変調を直接的にまたは細胞のシグナル伝達のカスケードを経てのいずれかで生じる。応答要素は、サイレンシングすることができるかまたは転写因子もしくはそれに類するものによって活性化することができるＤＮＡ要素である。応答要素は、当技術分野で公知であり、例えば、レポーターベクターにおいて市販されている。通常、応答要素は、ＤＮＡ反復要素を含んでおり、転写因子結合の際にレポーター遺伝子の発現を駆動する最小プロモーターの上流に位置するシス作用性エンハンサー要素である。
【０１４７】
標的抗原に対するＣＡＲの結合は、応答要素を活性化する。一実施形態において、応答要素は、細胞の核内に位置する核応答要素である。別の実施形態において、応答要素は、レポーター細胞内のプラスミド上に位置する。一実施形態において、アッセイは、応答要素の制御下のレポーター遺伝子についてコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターを、レポーター細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクトする予備ステップを含む。加えて、レポーター細胞には、ＣＡＲについてコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターをトランスフェクトすることができる。レポーター細胞には、シグナル伝達カスケードのすべての要素を含む発現ベクター、または異なる構成要素を個々に発現する異なるベクターをトランスフェクトすることができる。一実施形態において、レポーター細胞は、応答要素の制御下にあるレポーター遺伝子についてコードするＤＮＡ配列と、ＣＡＲについてコードするＤＮＡ配列とを含む。
【０１４８】
したがって、本明細書で説明されるように、ＣＡＲは、応答要素へ機能的に連結される。一実施形態において、応答要素は、レポーター遺伝子の発現を制御する。一実施形態において、応答要素は、ＮＦＡＴ経路、ＮＦ−κＢ経路またはＡＰ−１経路、好ましくはＮＦＡＴ経路の一部である。
【０１４９】
一実施形態において、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質についてコードする遺伝子、または触媒活性を欠失させることができる酵素についてコードする遺伝子から選択される。一実施形態において、レポーター遺伝子は、発光タンパク質についてコードしている。さらなる実施形態において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，１９９６）、ＣＦＰとしても公知のシアン蛍光変異形（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｔｓｉｅｎ  １９９８）、ＹＦＰとして公知の黄色蛍光変異形（Ｏｒｍｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｗａｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、サファイアとして公知の紫色励起性緑色蛍光変異形（Ｔｓｉｅｎ  １９９８、Ｚａｐａｔａ−Ｈｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、および高感度緑色蛍光タンパク質またはＥＧＦＰとして公知のシアン励起性緑色蛍光変異形（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）から選択され、例えば、生細胞撮像（例えば、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）または蛍光分光測光によって測定することができる。一実施形態において、その触媒活性を検出することができる酵素は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群から選択される。一実施形態において、レポーター遺伝子は、ＧＦＰについてコードしている。好ましい実施形態において、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼについてコードしている。ルシフェラーゼの活性は、市販のアッセイによって、例えば、ルシフェラーゼ１０００アッセイシステムまたはＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（いずれもＰｒｏｍｅｇａ）によって検出することができる。ルシフェラーゼ１０００アッセイシステムは、補酵素Ａ（ＣｏＡ）をルシフェリンの他に基質として含有し、結果として、強い光強度が少なくとも１分間持続する。細胞内ルシフェラーゼを圧制するために、細胞を検出前に溶解することが必要である。反応の副産物として生じる光は、照度計によって可視スペクトル全体から収集される。本明細書に示される実施例において、シグナルは、生じたルシフェラーゼの量に比例しており、それゆえＮＦＡＴプロモーターの活性化の強度に比例していた。別の実施形態において、細胞から分泌されたルシフェラーゼのアッセイが使用される。この故に、アッセイは、細胞の溶解をすることなく実施することができる。
【０１５０】
本明細書で説明されるように、レポーター遺伝子の発現は、標的細胞、およびレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞、例えば、形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞の結果として生じる活性化に対する標的抗原結合部分の結合と直接相関することができる。例えば、ルシフェラーゼについてコードする遺伝子をレポーター遺伝子として使用するとき、細胞から検出された光の量は、標的抗原結合と直接相関しており、適切な制御状況と比較すると、標的抗原結合を示す。
【０１５１】
一実施形態において、標的抗原は、細胞表面抗原および／または細胞表面受容体である。一実施形態において、標的抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１、およびＷＴ１からなる群、またはこれらのフラグメントから選択される。しかしながら、標的抗原は、細胞表面上に位置するタンパク質に限定されないが、一次的にまたは永久的に細胞内に位置するポリペプチドまたはタンパク質にも由来し得る。このような場合において、細胞内ポリペプチドまたは細胞内タンパク質に由来する標的抗原は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の１つまたはいくつかの分子によって細胞表面上に提示することができる。実際、言に利用可能な診断アッセイは通常、細胞表面上に提示された蛋白質に限定されるが、ＭＨＣ複合体によって提示されるペプチドは、検証標的のままである。ペプチド／ＭＨＣ複合体が高感度で特異的に検出することができることは、本発明の診断アッセイが特に有利である。したがって、一実施形態において、標的抗原は、ＭＨＣの分子に結合したペプチドである。一実施形態において、ＭＨＣは、ヒトＭＨＣである。一実施形態において、ＭＨＣの分子に結合したペプチドは、８〜１００個のアミノ酸、好ましくは８〜３０個のアミノ酸、およびより好ましくは８〜１６個のアミノ酸からなる全体長を有する。一実施形態において、標的抗原は、腫瘍組織においてのみまたは腫瘍組織内に主に発現するタンパク質に由来する。一実施形態において、タンパク質は、細胞内タンパク質であり、ペプチドは、ＭＨＣ−Ｉ経路またはＭＨＣ−ＩＩ経路によって生じ、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ複合体によって提示される。一実施形態において、ペプチドは、ＭＨＣ−Ｉ経路によって生じ、ＭＨＣクラスＩ複合体によって提示される。一実施形態において、標的抗原結合部分は、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である。ＴＣＲＬ抗原結合部分は、腫瘍組織内においてのみまたは腫瘍組織内に主に発現するペプチド抗原に特異的に結合することができ、ペプチド抗原は、標的細胞、特に癌細胞の表面上に位置するＭＨＣの分子に結合している。この脈絡において、本発明の方法は、標的細胞、例えば、腫瘍細胞の存在を、標的細胞の表面上の特定のペプチド／ＭＨＣ複合体の存在に基づいて、確立されたまたは新規のＴＣＲＬ標的抗原結合部分を用いて検出するのに適している。
【０１５２】
標的抗原に対するＣＡＲの結合は、定性的にまたは定性的に、すなわちレポーター遺伝子の発現の有無によって、結合がないことを示す任意の蛍光またはルミネセンスの非存在を用いて、決定することができる。結合および活性化の定量的特性のために、レポーター遺伝子の活性化の量は、基準と比較することができる。したがって、本明細書に説明される診断アッセイは、レポーター遺伝子の発現のレベルを基準と比較するステップを追加で含むことができる。適切な基準は通常、アッセイまたは方法の１つまたはいくつかの本質的な構成要素（複数可）を省略する参照アッセイと実質的に同一である陰性対照を含む。本発明の方法について、省略された構成要素は、例えば、標的抗原を発現しない細胞を含む標的細胞の省略であり得る。あるいは、標的細胞および／または抗原結合分子の認識ドメインに対して結合することができないレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）を使用することができる。一実施形態において、基準は、標的細胞の非存在下でのレポーター遺伝子の発現である。別の実施形態において、基準は、標的細胞に対して特異的に結合することができるＣＡＲを発現しないＪｕｒｋａｔ細胞の存在下でのレポーター遺伝子の発現である。具体的な実施形態において、レポーター遺伝子の発現は、基準の存在下でのレポーター遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、または１００００倍多い。
【０１５３】
あるいは、レポーター遺伝子発現の非存在は、ある特定の閾値によって、すなわち、背景シグナルの差し引き後に規定することができる。背景シグナルは通常、全部の試薬を用いるが標的抗原の非存在下でアッセイを実施することによって測定される。本発明による診断アッセイからの陽性シグナルは、標的抗原の非存在下でのレポーター遺伝子の発現に関する標的抗原の存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルが、事前に規定した閾値よりも高い場合に得られる。具体的な実施形態において、閾値は、２、３、４、５、１０、１００、１０００、または１００００である。
【０１５４】
本明細書に説明する新規の診断アッセイは、頑強で、高スループットフォーマットにおける使用に適しており、アッセイを達成するのに必要とされる所要時間の点で効率的である。さらに、本発明の診断アッセイは、分析される試料における死細胞の存在を許容する。このことは、抗原結合分子の結合および機能性が細胞生存度または細胞死を測定することによって決定される細胞アッセイとは対照的である。
【０１５５】
本明細書に説明する新たな診断アッセイの１つのさらなる利点は、洗浄ステップが必要とされないことである。検査されるレポーター細胞および／または抗原結合分子は、標的細胞、例えば、腫瘍細胞に、いずれかの順序でまたは同時に添加することができる。一実施形態において、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞および腫瘍試料は、適切な細胞培養フォーマットにおいて、例えば、２４ウェルプレートのウェル内のまたは９６ウェルプレートのウェル内の細胞培養培地へ添加される。好ましくは、検査培地は、細胞が４８時間まで生存可能な条件を与える培地である。一実施形態において、診断アッセイは、マイクロタイタープレートにおいて実施される。一実施形態において、マイクロタイタープレートは、高スループットスクリーニングに適している。本発明の診断アッセイは、複数の反応の迅速な調製、プロセシング、および分析を可能にする任意のフォーマットにおいて実施することができる。このことは、例えば、多重ウェルアッセイプレート（例えば、２４ウェル、９６ウェルまたは３８４ウェル）において可能である。種々の作用剤のためのストック溶液は、手動でまたはロボットで行うことができ、その後のピペット操作、希釈、混合、分注、洗浄、インキュベーション、試料読出し、データ収集および解析は、市販の分析ソフトウェア、ロボット技術、蛍光シグナルおよび／または発光シグナルを検出することができる検出機器を用いてロボットで行うことができる。
【０１５６】
一実施形態において、２４ウェルプレートの１つのウェルあたり約１０００００〜約１００００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。好ましい実施形態において、２４ウェルプレートの１つのウェルあたり約３０００００〜約７０００００個の細胞または約４０００００〜約６０００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。一実施形態において、２４ウェルプレートの１つのウェルあたり約５０００００個のＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。一実施形態において、９６ウェルプレートの１つのウェルあたり約１００００〜約１０００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。好ましい実施形態において、９６ウェルプレートの１つのウェルあたり約３００００〜約７００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞または約４００００〜約６００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。一実施形態において、９６ウェルプレートの１つのウェルあたり約５００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。一実施形態において、３８４ウェルプレートの１つのウェルあたり約３０００〜約３００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。好ましい実施形態において、３８４ウェルプレートの１つのウェルあたり約５０００〜約１５０００個の細胞または約８０００〜約１２０００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。一実施形態において、３８４ウェルプレートの１つのウェルあたり約１００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。一実施形態において、細胞培養培地１ｍｌあたり約２０００００〜約２００００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。好ましい実施形態において、細胞培養培地１ｍｌあたり約６０００００〜約１４０００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）または約８０００００〜約１２０００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。一実施形態において、細胞培養培地１ｍｌあたり約１００００００個のレポーターＣＡＲ−Ｔ（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）が、ステップｃ）において与えられる。
【０１５７】
本明細書に説明されるようなＣＡＲを発現することができる形質転換したＴ細胞、すなわち、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞（例えば、形質転換したＪｕｒｋａｔ細胞）、および本発明による診断アッセイにおける細胞の使用がさらに与えられる。ＣＡＲは、Ｔ細胞の表面の中および／または上に天然には含まれずかつ正常な（非形質転換）Ｔ細胞の中または上に（内在性に）発現していない分子に関する。したがって、本明細書でＴ細胞の中および／または上で使用されるようなＣＡＲは、人為的にＴ細胞内へと導入される。Ｔ細胞、例えば、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞の表面の中および／または上に人為的に導入され、かつその後に提示されるＣＡＲ分子は、抗原に対して（インビトロでまたはインビボで）接近可能な１つ以上の抗原結合部分を含むドメインを含む。この脈絡において、これらの人為的に導入された分子は、本明細書でいかに説明されるような形質転換後にＴ細胞の表面の中および／または上に提示される。したがって、形質転換後、本開示によるＴ細胞は、標的抗原によって活性化することができる。
【０１５８】
また、本明細書に説明されるＣＡＲをコードする核酸分子（複数可）によってコードされるＣＡＲを発現する形質転換されたＴ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）も本明細書に与えられる。したがって、本発明の脈絡において、形質転換された細胞は、本明細書に与えられおよび使用されるＣＡＲをコードする核酸分子を含むことができる。
【０１５９】
本発明の脈絡において、「形質転換されたＴ細胞」（例えば、形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞）という用語は、遺伝的に修飾されたＴ細胞（すなわち、核酸分子が意図的に導入されたＴ細胞）に関する。特に、本明細書に説明されるＣＡＲをコードする核酸分子は、レトロウイルスまたはレンチウイルスの形質転換を用いることによって、Ｔ細胞のゲノム内へと安定して組込むことができる。ＣＡＲの細胞外ドメインは、本明細書に説明される抗原結合部分の完全な細胞外ドメインを含むことができ、その部分もまたそうである。必要とされる最小限の大きさは、ＣＡＲにおける抗原結合部分の抗原結合部位である。ＣＡＲの細胞外部分（すなわち、抗原結合部分を含む細胞外ドメイン）は、細胞表面上で検出できるのに対し、細胞内部分（すなわち、同時刺激シグナル伝達ドメイン（複数可）および刺激シグナル伝達ドメイン）は、細胞表面上で検出することができない。ＣＡＲの細胞外ドメインの検出は、この細胞外ドメインに特異的に結合する抗体を用いることによって実施することができ、標的抗原を細胞外ドメインは結合することができる。細胞外ドメインは、これらの抗体または抗原を用いて、フローサイトメトリーまたは顕微鏡法によって検出することができる。
【０１６０】
形質転換された細胞は、任意の免疫細胞であってよい。これらは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、γδＴ細胞、自然リンパ球、マクロファージ、単球、樹状細胞、または好中球、およびこれらの不死化細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）を含むが、それらに限定されない。優先的に、免疫細胞は、リンパ球、優先的にはＮＫ細胞またはＴ細胞であろう。Ｔ細胞は、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞を含む。白血球の表面上のＣＡＲの惹起によって、細胞は、細胞が生来する系譜とは無関係の標的細胞に対して応答性にする。活性化は、ＣＡＲに対して選択された刺激シグナル伝達ドメインまたは同時刺激シグナル伝達ドメインとは無関係に起こることになっており、追加のサイトカインの外来性供給に依存していない。
【０１６１】
形質転換された細胞は、さらなる核酸分子を、例えば、本明細書に説明されるような応答要素をコードする核酸分子を同時形質導入されてもよい。
【０１６２】
形質転換された１つの／複数の細胞は好ましくは、その天然環境の外側の、制御されていない条件下で成長する。特に、「培養すること」という用語は、細胞（例えば、形質転換された細胞（複数可））がインビトロであることを意味する。細胞を培養することは、生来の組織源から分離された細胞を活きたままにする実験技術である。本明細書では、本発明により使用される形質転換された細胞は、形質転換された細胞の中または上で、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で培養される。導入遺伝子の発現を可能にする条件は、当技術分野で一般的に公知である。
【０１６３】
本発明により使用される１つまたはいくつかのＣＡＲをコードする核酸およびベクターは、本明細書でさらに与えられる。核酸分子は、調節配列の制御下であってよい。例えば、ＣＡＲの発現誘導を可能にするプロモーター、転写エンハンサーおよび／または配列を採用してもよい。本発明の脈絡において、核酸分子は、構成プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下で発現する。適切なプロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＵＢＣプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＰＧＫ（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＥＦ１Ａプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＡＧＧプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＳＶ４０プロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＣＯＰＩＡプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＡＣＴ５Ｃプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、ＴＲＥプロモーター（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．５（５）（２０１０），ｅ１０６１１）、Ｏｃｔ３／４プロモーター、Ｓ３６７−Ｓ３６７（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９（２００４），Ｓ３６７−Ｓ３６７（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００４．０６．９０４））、またはＮａｎｏｇプロモーター（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５（５）（２００５），３１７−２４）である。本明細書では、ベクターという用語は、導入された細胞において（すなわち、形質転換された細胞において）自己複製することができる環状または線状の核酸分子に関する。選択が所望の機能に依存するであろう多くの適切なベクターは、分子生物学における当業者に公知であり、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子工学において従来より使用されている他のベクターを含む。当業者に周知である方法は、種々のプラスミドベクターを構築するために使用することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｌｏｃ  ｃｉｔ．）ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），（１９９４）において説明されている技術を参照されたい。あるいは、ポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソーム内へと再構成することができる。関連する配列は、特定のポリペプチドの発現を必要とする発現ベクター内へと移すことができる。典型的なクローニングベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、ｐＧＡ１８およびｐＧＢＴ９を含む。典型的な発現ベクターは、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳ��−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴを含む。ベクターは、ポリシストロン性であり得る。このような調節配列（制御要素）は、当業者に公知であり、プロモーター、スプライスカセット、翻訳開始コドン、ならびにベクター（複数可）内へインサートを導入するための翻訳および挿入部位を含むことができる。本発明の脈絡において、核酸分子（複数可）は、真核細胞または原核細胞における発現を可能にする発現制御配列へ作用するように連結される。ベクター（複数可）は、本明細書に定義されるようなＣＡＲをコードする核酸分子（複数可）を含む発現ベクター（複数可）であると想定される。作用可能に連結されたとは、そのように説明される構成要素が、意図する様式で機能することができる関係性にある事実を指す。コード配列へ作用可能に連結された制御配列は、コード配列の発現が制御配列と互換性のある条件下で達成されるような方法でライゲートされる。制御配列がプロモーターである場合、二本鎖核酸が好ましくは使用されることは当業者に明白である。
【０１６４】
本発明の脈絡において、列挙されたベクター（複数可）は、発現ベクター（複数可）である。発現ベクターとは、選択された細胞を形質転換するのに使用することができるコンストラクトであり、選択された細胞におけるコード配列の発現を準備する。発現ベクター（複数可）は、例えば、ベクター（複数可）、バイナリーベクター（複数可）または組込みベクター（複数可）をクローニングすることであり得る。発現は、核酸分子から好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡ内への転写を含む。原核細胞および／または真核細胞における発現を確保する調節要素は、当業者に周知である。真核細胞の場合において、細胞は普通、転写の開始を確保するプロモーターと、任意に、転写の終結および転写産物の安定化を確保するポリＡシグナルとを含む。原核宿主細胞における発現を可能にする考えられ得る調節要素は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーターもしくはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例は、酵母におけるＡＯＸ１プロモーターもしくはＧＡＬ１プロモーターであり、または哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。
【０１６５】
転写の開始の原因となる要素の他に、このような調節要素はまた、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位のような、転写終結シグナルも含むことができる。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞区画へ差し向けることができる、またはポリペプチドを培地中へと分泌することができる、リーダー配列をコードするシグナルペプチドは、列挙された核酸配列のコード配列へ付加されてもよく、当技術分野で周知であり、また、例えば、添付の実施例も参照されたい。
【０１６６】
リーダー配列（複数可）は、適切な相において、翻訳配列、開始配列および終止配列、ならびに好ましくは、翻訳されたタンパク質またはその部分を細胞周辺腔または細胞外培地内へと分泌するのを差し向けることができるリーダー配列と重合する。任意で、異種性配列は、所望の特徴、例えば、発現した組換え産物の安定化または簡素化した精製を付与するＮ末端特定ペプチドを含むＣＡＲをコードすることができる。この脈絡において、適切な発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、ｐＥＦ−ＤＨＦＲ、ｐＥＦ−ＡＤＡもしくはｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｒａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０（２００１），１４１−１５０）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）など、当技術分野で公知である。
【０１６７】
Ｔ細胞またはその前駆細胞の中に導入される説明された核酸分子（複数可）またはベクター（複数可）は、細胞のゲノム内へと組込むことができるかまたは染色体外で維持することができる。
【０１６８】
例示的な実施形態
１．試料における腫瘍細胞の存在を判定するための診断アッセイであって、以下のステップ：
ａ）  試料をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現レポーターＴ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞と接触させることであって、レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が、
ｉ．  腫瘍細胞へ特異的な結合ができるＣＡＲであって、応答要素へ作用可能に連結された、ＣＡＲと、
ｉｉ．  応答要素の制御下にあるレポーター遺伝子とを含む、接触させること、および
ｂ）  腫瘍細胞の存在を確立するためにレポーター遺伝子の発現を測定することによってＴ細胞の活性化を判定すること
を含む、診断アッセイ。
【０１６９】
２．ＣＡＲが、腫瘍標的抗原に特異的に結合することができる標的抗原結合部分を含む、実施形態１または２に記載の診断アッセイ。
【０１７０】
３．腫瘍標的抗原が、細胞表面抗原および／または細胞表面受容体である、実施形態２に記載の診断アッセイ。
【０１７１】
４．腫瘍標的抗原が、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ２、ＬｅＹ、ＭＣＳＰ、ＳＴＥＡＰ１、ＴＹＲＰ１、およびＷＴ１からなる群、またはこれらのフラグメントから選択される、実施形態２または３に記載の診断アッセイ。
【０１７２】
５．腫瘍標的抗原が、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子へ結合したペプチドである、実施形態２〜４のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１７３】
６．標的抗原結合部分が、Ｔ細胞受容体様（ＴＣＲＬ）抗原結合部分である、実施形態２〜５のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１７４】
７．標的抗原結合部分が、Ｆａｂフラグメントである、実施形態２〜６のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１７５】
８．前記レポーターＣＡＲ−Ｔ細胞が、Ｊｕｒｋａｔ細胞である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１７６】
９．ＣＡＲが、少なくとも１つの細胞内刺激シグナル伝達および／または同時刺激シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１７７】
１０．標的抗原に対する標的抗原結合部分の結合が、細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または同時シグナル伝達ドメインの活性化をもたらす、実施形態９に記載の診断アッセイ。
【０１７８】
１１．細胞内シグナル伝達および／または同時シグナル伝達ドメインの活性化が、応答要素の活性化をもたらす、実施形態９または１０に記載の診断アッセイ。
【０１７９】
１２．応答要素が、レポーター遺伝子の発現を制御する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１８０】
１３．応答要素の活性化が、レポーター遺伝子の発現をもたらす、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１８１】
１４．応答要素が、ＮＦＡＴ経路、ＮＦ−κＢ経路またはＡＰ−１経路の一部である、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１８２】
１５．レポーター遺伝子が、発光タンパク質についてコードしている、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１８３】
１６．レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼについてコードしている、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１８４】
１７．試料が、疾患に罹患している個体に由来する患者試料であり、特に疾患が、癌である、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１８５】
１８．以下のステップ：
ｃ）レポーター遺伝子の発現を基準と比較すること
を追加で含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１８６】
１９．基準が、基準試料の存在下でのレポーター遺伝子の発現であり、基準試料が、腫瘍細胞を含まない、実施形態１８に記載の診断アッセイ。
【０１８７】
２０．患者試料の存在下でのレポーター遺伝子の発現が、基準試料の存在下でのレポーター遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、または１００００倍多い、実施形態１９に記載の診断アッセイ。
【０１８８】
２１．試料が、患者試料である、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１８９】
２２．以下のステップ：
ｄ）基準の存在下でのレポーター遺伝子の発現と関連した患者試料の存在下でのレポーター遺伝子の発現が、事前に規定した閾値よりも高い場合、腫瘍細胞の存在を確立すること
を追加で含む、実施形態２１に記載の診断アッセイ。
【０１９０】
２３．基準が、基準試料の存在下でのレポーター遺伝子の発現であり、基準試料が、腫瘍細胞を含まない、実施形態２２に記載の診断アッセイ。
【０１９１】
２４．閾値が、２、３、４、５、１０、１００、１０００、または１００００である、実施形態２２または２３に記載の診断アッセイ。
【０１９２】
２５．患者が、哺乳動物であり、特に患者が、ヒトである、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１９３】
２６．癌の診断における使用のための、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の診断アッセイ。
【０１９４】
２７．抗腫瘍処置の有効性を監視するための方法であって、抗腫瘍処置を受けた対象からの試料を与えることと、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の診断アッセイを用いて、腫瘍細胞の存在を判定することとを含む、方法。
【０１９５】
２８．抗腫瘍ＣＡＲ−Ｔ細胞処置の有効性を予測するための方法であって、腫瘍を有する対象に由来の試料を与えることと、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載の診断アッセイによってレポーター遺伝子の発現を測定することによってＴ細胞の活性化を判定することとを含む、方法であって、レポーター遺伝子の活性化が、対象へ適用される際の抗腫瘍ＣＡＲ−Ｔ細胞処置の有効性を示す、方法。
【０１９６】
２９．実施例のいずれかに、または添付の図面のいずれか１つに関して先に説明された、診断アッセイおよび方法。
【実施例】
【０１９７】
以下は、本発明の方法及および組成物の例である。先に与えた一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態が実施されてもよいことは理解される。
【０１９８】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９において説明されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ  ９１−３２４２に示されている。
【０１９９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
【０２００】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用したＰＣＲによって生じたか、またはＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。すべてのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
【０２０１】
タンパク質精製
タンパク質は、標準プロトコルに言及される、フィルタにかけた細胞培養物上清から精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶離は、ｐＨ２．８で達成され、その後、試料を即時中和した。凝集したタンパク質は、ＰＢＳ中での、または２０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、単量体抗体から分離した。単量体抗体画分をプールし、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０分子量カットオフ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し、凍結させ、−２０℃または−８０℃で保存した。試料の一部を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるその後のタンパク質分析および分析による特徴づけに準備した。
【０２０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の説明書により使用した。特に、１０％または４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）、およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元型ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）酸化防止剤ランニングバッファー助剤を添加）またはＭＯＰＳ（非還元型ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２０３】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。簡潔に述べると、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムの３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、またはＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１−１９０１を標準物質として供した。
【０２０４】
抗体作製
個々の抗体は、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、ポリエチレンイミンを用いて哺乳動物発現ベクターを同時トランスフェクトすることによって作製した。細胞に、重鎖および軽鎖について対応する発現ベクターを１：１の比においてトランスフェクトした。
【０２０５】
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のレンチウイルス形質転換
レンチウイルスベクターを作製するために、ＣＡＲの正確な集合体のための個々のＤＮＡ配列を、構成的に活性のあるヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）の下で、レンチウイルスポリヌクレオチドベクターにおいてインフレームでクローニングした。レトロウイルスベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）要素、ｐＵＣ複製起点、ならびに細菌における増殖および選択を容易にする抗生物質耐性についてコードする遺伝子を含有していた。
【０２０６】
機能的ウイルス粒子を作製するために、リポフェクタミンＬＴＸ（商標）系トランスフェクションを、６０〜７０％集密的Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ３２１６）、ならびに３：１：１：１の比のＣＡＲ含有ベクターおよびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ移動ベクター：ｐＲＳＶ−ＲＥＶ移動ベクター：ｐＣｇｐＶ移動ベクターを用いて実施した。４８時間後、上清を収集し、２５０ｇで５分間遠心分離して、細胞デブリを除去し、０．４５μｍまたは０．２２μｍのポリエーテルスルホンフィルタにかけた。濃縮したウイルス粒子（Ｌｅｎｔｉ−ｘ−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，Ｔａｋａｒａ）を用いて、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞を形質転換した（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ）。陽性形質転換細胞を、ＦＡＣＳ−ＡＲＩＡ選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、プールまたは単一のクローンとして選別した。適切な密度まで細胞を増殖させた後、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞を実験に使用した。
【実施例１】
【０２０７】
ＣＤ２０を発現するＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として、および抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の選別された単一のクローンを標的細胞として用いる、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞レポーターアッセイが本明細書に説明される（図４）。陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）のいくつかのウェルを、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）における１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）製）で、４℃で一晩または３７℃で少なくとも１時間のいずれかでコーティングした。ＣＤ３抗体でコーティングしたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。抗原結合受容体抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するよう操作されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  ＣＡＲ細胞（レポーター細胞とさらに称す）を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いて該細胞の生存度についてチェックした。細胞数を１×１０６個の生存可能細胞／ｍｌに調整した。それゆえ、適切な一定分量の細胞懸濁液を２１０ｇで室温（ＲＴ）で５分間ペレットにし、新鮮なＲＰＭＩ−１６０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）において再懸濁した。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、該細胞の生存度について同様にチェックした。細胞数を１×１０６個の生存可能細胞／ｍｌに成長培地において調整した。標的細胞およびレポーター細胞を９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）において三つ組で、２００μｌの最終容積で、１０：１、５：１、２：１または１：１のＥ：Ｔ比（１つのウェルあたり合計１１０，０００個の細胞）で播種した。その後、９６ウェルプレートを１９０ｇかつＲＴで２分間遠心分離し、Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封した。
【０２０８】
湿潤大気インキュベーションにおける３７℃かつ５％ＣＯ２で２０時間の後、各ウェルの内容物をマルチチャネルピペットを用いてピペット操作で１０回上下にすることによって混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新たな白色透明底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ）へ移し、１００μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。回転式振盪器上で３００ｒｐｍで暗所において１５分間のインキュベーションの後、ＲＴルミネセンスを、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いて、１秒／ウェルを検出時間として測定した。
【０２０９】
棒ダイヤグラムは、異なるＥ：Ｔ比によるかつ標的細胞との共培養の時間による、抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の活性化を示す。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の活性化は、標的細胞との共培養の持続時間に依存し、かつＥ：Ｔ比に依存することが示されている。検査したすべての条件につて、２０時間のインキュベーション時間は、最も高いルミネセンスシグナルを呈示する。さらに、異なるＥ：Ｔ比のうち、１０：１のＥ：Ｔ比は、最も高い検出可能なルミネセンスシグナルを示す。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型Ｔ細胞は、ルミネセンスシグナルにおける時間依存性上昇のみを示し、それにより、４０時間後に、最も高いルミネセンスシグナルを検出することができる。検出されたルミネセンスシグナルは、Ｅ：Ｔ比に非依存的であり、また概して、個々の時点で抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞について検出した各ルミネセンスシグナルよりも明らかに低い。概して、最も高いルミネセンスシグナルは、細胞がＣＤ３抗体でコーティングしたウェルにおいてインキュベートされたかどうかを検出することができる。抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞は、形質転換されていないＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  対照Ｔ細胞と比較して、より高いシグナルを示す。各点は、技術的な二つ組の平均を表す。
【実施例２】
【０２１０】
ＣＤ２０を発現するＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として、および抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤまたは抗ＣＤ２０−交差Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の選別されたプールを標的細胞として用いる、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞レポーターアッセイが本明細書に説明される（図５）。陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）のウェルを、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）における１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）製）で、４℃で一晩コーティングした。ＣＤ３抗体でコーティングしたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤまたは抗ＣＤ２０−交差Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するよう操作されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  ＣＡＲ細胞（レポーター細胞とさらに称す）を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いて該細胞の生存度についてチェックした。細胞数を１×１０６個の生存可能細胞／ｍｌに調整した。それゆえ、適切な一定分量の細胞懸濁液を２１０ｇで室温（ＲＴ）で５分間ペレットにし、新鮮なＲＰＭＩ−１６０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）において再懸濁した。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、該細胞の生存度について同様にチェックした。細胞数を１×１０６個の生存可能細胞／ｍｌに成長培地において調整した。標的細胞およびレポーター細胞を９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）において三つ組で、２００μｌの最終容積で、５：１のＥ：Ｔ比（１つのウェルあたり合計１１０，０００個の細胞）で播種した。その後、９６ウェルプレートを１９０ｇかつＲＴで２分間遠心分離し、Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封した。
【０２１１】
湿潤大気インキュベーションにおける３７℃かつ５％ＣＯ２で２０時間の後、各ウェルの内容物をマルチチャネルピペットを用いてピペット操作で１０回上下にすることによって混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新たな白色透明底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ）へ移し、１００μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。回転式振盪器上で３００ｒｐｍで暗所において１５分間のインキュベーションの後、ＲＴルミネセンスを、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いて、１秒／ウェルを検出時間として測定した。
【０２１２】
棒ダイヤグラムは、標的細胞との共培養の際に、抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞および抗ＣＤ２０−交差Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の活性化を示す。抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞もしくは抗ＣＤ２０−交差Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ対照Ｔ細胞を標的細胞なしで培養した場合、ルミネセンスシグナルは検出されなかった。抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞もしくは抗ＣＤ２０−交差Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ対照Ｔ細胞のいずれかを、ＣＤ３抗体でコーティングしたプレートにおいて標的細胞と共培養したとき、最も高いルミネセンスシグナルを検出した。驚くべきことに、交差Ｆａｂフォーマットは、ＣＤ３媒介性シグナル伝達と併せてＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の強い活性化をもたらす。各点は、技術的な三つ組の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーによって示されている。
【実施例３】
【０２１３】
ＣＤ２０を発現するＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として、および抗ＣＤ２０−ｓｃＦａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の選別されたプールを標的細胞として用いる、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞レポーターアッセイが本明細書に説明される（図６）。
【０２１４】
陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）のウェルを、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）における１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）製）で、４℃で一晩または３７℃で少なくとも１時間のいずれかでコーティングした。ＣＤ３抗体でコーティングしたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。抗ＣＤ２０−ｓｃＦａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するよう操作されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞（レポーター細胞とさらに称す）を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いて該細胞の生存度についてチェックした。細胞数を１×１０６個の生存可能細胞／ｍｌに調整した。それゆえ、適切な一定分量の細胞懸濁液を２１０ｇで室温（ＲＴ）で５分間ペレットにし、新鮮なＲＰＭＩ−１６０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）において再懸濁した。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、該細胞の生存度について同様にチェックした。細胞数を１×１０６個の生存可能細胞／ｍｌに成長培地において調整した。標的細胞およびレポーター細胞を９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）において三つ組で、２００μｌの最終容積で、１０：１、５：１、２：１または１：１のＥ：Ｔ比（１つのウェルあたり合計１１０，０００個の細胞）で播種した。その後、９６ウェルプレートを１９０ｇかつＲＴで２分間遠心分離し、Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封した。
【０２１５】
湿潤大気インキュベーションにおける３７℃かつ５％ＣＯ２で２０時間の後、各ウェルの内容物をマルチチャネルピペットを用いてピペット操作で１０回上下にすることによって混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新たな白色透明底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ）へ移し、１００μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。回転式振盪器上で３００ｒｐｍで暗所において１５分間のインキュベーションの後、ＲＴルミネセンスを、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いて、１秒／ウェルを検出時間として測定した。
【０２１６】
棒ダイヤグラムは、異なるＥ：Ｔ比における、ＳＵＤＨＬ４標的細胞との２０時間の共培養の後の、抗ＣＤ２０−ｓｃＦａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の活性化を示す。異なるＥ：Ｔ比のうち、１０：１および５：１のＥ：Ｔ比は、最も高いルミネセンスシグナルを示す（図６黒色バー）。また、ＣＤ３抗体でコーティングしたウェルにおいて１０：１のＥ：Ｔ比で共培養した抗ＣＤ２０−ｓｃＦａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞も、ＣＤ３刺激なしでの同じ条件に匹敵する高いルミネセンスシグナルを示す。
【０２１７】
さらなるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞は、異なるＥ：Ｔ比に非依存的ないかなる活性も示さないが、ＣＤ３抗体でコーティングしたウェルにおける１０：１のＥ：Ｔ比において共培養した場合、明らかなルミネセンスシグナルが検出可能であり、細胞の機能性を証明している。
【０２１８】
さらなる対照実験は、標的細胞単独または抗ＣＤ２０−ｓｃＦａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｔ細胞単独、およびＣＤ３抗体でコーティングしたウェルに標的細胞を入れたものが、いかなる活性も示さないことを示している。各点は、技術的な三つ組の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーによって示されている。
【実施例４】
【０２１９】
ＣＤ２０を発現するＳＵＤＨＤＬ４腫瘍細胞を標的細胞として、および抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞または抗ＣＤ２０−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の選別されたプールを標的細胞として用いる、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞レポーターアッセイが本明細書に説明される（図７）。
【０２２０】
陽性対照として、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ  Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５１８５）のウェルを、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）における１０μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）製）で、４℃で一晩または３７℃で少なくとも１時間のいずれかでコーティングした。ＣＤ３抗体でコーティングしたウェルをＰＢＳで２回洗浄し、最終洗浄ステップの後、ＰＢＳを完全に除去した。抗ＣＤ２０−Ｆａｂ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤまたは抗ＣＤ２０−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤを発現するよう操作されたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞またはＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞（レポーター細胞とさらに称す）を計数し、Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓを用いて該細胞の生存度についてチェックした。細胞数を１×１０６個の生存可能細胞／ｍｌに調整した。それゆえ、適切な一定分量の細胞懸濁液を２１０ｇで室温（ＲＴ）で５分間ペレットにし、新鮮なＲＰＭＩ−１６０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（成長培地）において再懸濁した。目的の抗原を発現する標的細胞を計数し、該細胞の生存度について同様にチェックした。細胞数を１×１０６個の生存可能細胞／ｍｌに成長培地において調整した。標的細胞およびレポーター細胞を９６ウェル懸濁培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ  ｏｎｅ）において三つ組で、２００μｌの最終容積で、１０：１、５：１、２：１または１：１のＥ：Ｔ比（１つのウェルあたり合計１１０，０００個の細胞）で播種した。その後、９６ウェルプレートを１９０ｇかつＲＴで２分間遠心分離し、Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封した。
【０２２１】
湿潤大気インキュベーションにおける３７℃かつ５％ＣＯ２で２０時間の後、各ウェルの内容物をマルチチャネルピペットを用いてピペット操作で１０回上下にすることによって混合した。１００μｌの細胞懸濁液を新たな白色透明底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ）へ移し、１００μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。回転式振盪器上で３００ｒｐｍで暗所において１５分間のインキュベーションの後、ＲＴルミネセンスを、Ｔｅｃａｎ（登録商標）Ｓｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを用いて、１秒／ウェルを検出時間として測定した。
【０２２２】
棒ダイヤグラムは、５：１のＥ：Ｔ比における、ＳＵＤＨＬ４標的細胞との２０時間の共培養の後の、抗ＣＤ２０−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞の活性化を示す。ＣＤ３抗体でコーティングしたウェルにおいて標的細胞と共培養した抗ＣＤ２０−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８ＡＴＤ−ＣＤ２８ＣＳＤ−ＣＤ３ｚＳＳＤ発現Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ  Ｔ細胞は、ＣＤ３刺激なしでの同じ条件に匹敵する最も高いルミネセンスシグナルを示した。さらなるＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ野生型細胞は、いかなる活性も示さないが、ＣＤ３抗体でコーティングしたウェルにおける１０：１のＥ：Ｔ比において共培養した場合、明らかなルミネセンスシグナルが検出可能であり、該細胞の機能性を証明している。各バーは、技術的な三つ組の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーによって示されている。
【実施例５】
【０２２３】
２つの抗体候補５Ｅ１１および３３Ｈ０９は元々、ＭＨＣＩとの複合体におけるＷＴ１−ペプチド「ＲＭＦ」に結合させるために、ファージディスプレイライブラリスクリーニングによって選択した。ＩｇＧフォーマットにおける両結合剤の連続希釈物を結合についてフローサイトメトリーによってチェックした。それゆえ、１０μＭの標的ペプチド「ＲＭＦ」、１０μＭのオフターゲットペプチド「ＶＬＤ」でパルスしたＴ２細胞、またはパルスせずのままのＴ２細胞を、抗体の連続希釈物とともに氷上で３０分間インキュベートした。結合していない結合剤を除去する洗浄ステップ後、細胞を、蛍光標識した二次抗体（抗ｈｕＦｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートした後、別の洗浄ステップおよび残存する抗体のフローサイトメトリーによる検出が続いた。重要なことに、本アッセイにおいて、いずれの評価した候補（５Ｅ１１および３３Ｈ０９）も特異性の点で類似しているようであり、オフターゲットペプチド「ＶＬＤ」でパルスしたＴ２細胞またはパルスしていないＴ２細胞に対する結合がないことと比較して、標的ペプチド「ＲＭＦ」でパルスしたＴ２細胞において、明らかな濃度依存的シグナルがあった（図８）。
【０２２４】
同じ２つの抗体候補（５Ｅ１１および３３Ｈ０９）に加えて、同じ標的ペプチド／ＭＨＣに対する２つのさらなる候補（ＥＳＫ１および１１Ｄ０６）を、図９に示すＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイにおいて評価した。
【０２２５】
このＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイは、細胞表面上に発現しているキメラ抗原受容体内へと植え込まれた４つの異なるＦａｂ（それぞれ、５Ｅ１１（配列番号１４５および配列番号１４６）、ＥＳＫ１、３３Ｈ０９（配列番号１４３および配列番号１４４）または１１Ｄ０６（配列番号１４１および配列番号１４２））を介して、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ペプチドＲＭＦを認識するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞のプールを採用する。
【０２２６】
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞との共インキュベーションに先立って、Ｔ２細胞を１０−５Ｍの個々のペプチドで３７℃で２時間パルスしたか、またはパルスせずのままとした。標的細胞およびレポーター細胞を３８４白色透明平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ）において三つ組で、５：１のＥ：Ｔ比（１つのウェルあたり２０００個の標的細胞あたり１０，０００個のエフェクター）で播種した。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞および標的細胞を３７℃で７時間共インキュベートした後、ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）のウェルあたり６μｌの添加およびＴＥＣＡＮ無限Ｍ１０００Ｐｒｏプレートリーダーを用いたルミネセンスの直接的な測定が続いた。ＲＭＦ−ペプチドでパルスしたＴ２細胞またはＶＬＤ−ペプチドでパルスしたＴ２細胞における三つ組測定からのＣＡＲ−ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を柱状グラフとして表す（図９）。ＲＭＦ−ペプチド（標的）対ＶＬＤ−ペプチド（オフターゲット）に関するシグナルの比較、およびルシフェラーゼ基質とはインキュベートしたがレポーター細胞とはインキュベートしていない異なってパルスしたＴ２細胞は、個々の結合剤の活性化の特異性を評価するのに役立つ。
【０２２７】
従来の抗体系診断アッセイと比較することができる図８に示したＦＡＣＳ系スクリーニングとは異なり、このＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞アッセイは、オフターゲットに関する特異的ではない活性化とは対照的に、標的に関して特異的なＴ細胞活性化の点で、異なる治療候補５Ｅ１１および３３Ｈ０９を明確に区別しない。したがって、本発明による診断アッセイは、従来の抗体系診断アッセイと比較して、癌の免疫療法の治療有効性を予測するのにより適している。
【０２２８】
先のようにルシフェラーゼ基質とともにインキュベートしたが、標的細胞といかなる共インキュベーションもしていない個々のＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞プールの背景シグナルは、図１０に示すように、低い。
【実施例６】
【０２２９】
このＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ−Ｔ細胞は、２つの異なるＨＬＡ−Ａ２／ペプチド標的を認識するＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞のプールを採用する。プールＦ０６、Ｆ２９およびＦ３０は、結合したペプチド／ＨＬＡ−標的に結合するよう選択された候補Ｆａｂを表すのに対し、Ｆａｂ３３Ｈ０９を有するプールは、ＨＬＡ−Ａ２／ＷＴ１ペプチドＲＭＦに特異的である。
【０２３０】
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞との共インキュベーションに先立って、Ｔ２細胞を１０−５Ｍの個々のペプチドで３７℃で２時間パルスしたか、またはパルスせずのままとした。標的細胞およびレポーター細胞を３８４白色透明平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−ｂｉｏ−ｏｎｅ）において三つ組で、５：１のＥ：Ｔ比（１つのウェルあたり２０００個の標的細胞あたり１０，０００個のエフェクター）で播種した。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞および標的細胞を３７℃で７時間共インキュベートした後、ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）のウェルあたり６μｌの添加およびＴＥＣＡＮ無限Ｍ１０００Ｐｒｏプレートリーダーを用いたルミネセンスの直接的な測定が続いた。Ｔ２細胞における三つ組測定からのＣＡＲ−ＮＦＡＴシグナル伝達の活性化を柱状グラフとして表す（図１１）。異なるペプチドに関する４つの異なる細胞プールから得られたシグナルの比較は、個々の候補の所望の標的ペプチド／ＨＬＡに対する候補の活性化の高い特異性を示す。
【０２３１】
例示的な配列
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2021520209.tif 000004
2021520209.tif 000005
【０２３２】
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【０２３３】
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【０２３４】
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【０２３５】
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【０２３６】
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【図１】
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【図２Ａ−Ｃ】
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【図２Ｄ−Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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