(57)【要約】【課題】毒性が低いかまったくなく、生体適合性が高く、有用な生物学的効果と用途を提供できる新しいグラフェンベースの材料および当該材料を用いた化粧品を提供する。【解決方法】グラフェンナノファイバー（ＧＮＦ）に対して結晶構造が変化し、所定の粒子径分布を有するグラフェン生成物に関する。この生成物は毒性がなく、脂肪細胞の表現型の変化などの有用な生物学的特性を備えており、化粧品に使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラフェンナノファイバーから選択されたグラフェンナノ材料であって、
前記グラフェンナノ材料は、レーザ回折粒子分析器で測定した場合に、粒子数についてｄｎ（９０）が０．６０μｍ以下であり、かつ、粒子体積についてｄｖ（９０）が８０．００μｍ以下である粒子径分布を有することを特徴とする、グラフェンナノ材料。
【請求項２】
ＢＥＴ比表面積が１００から５００ｍ２／ｇの範囲であることを特徴とする、請求項１に記載のグラフェンナノ材料。
【請求項３】
ＢＥＴ比表面積が３００〜３５０ｍ２／ｇの間であることを特徴とする、請求項２に記載のグラフェンナノ材料。
【請求項４】
細孔容積が０．３５〜０．４０ｃｍ３／ｇの範囲であることを特徴とする、請求項１に記載のグラフェンナノ材料。
【請求項５】
ＢＥＴ比表面積が３００〜３５０ｍ２／ｇの間であり、細孔容積が０．３５〜０．４０ｃｍ３／ｇの範囲であることを特徴とする、請求項１に記載のグラフェンナノ材料。
【請求項６】
前記ナノ材料中の不純物が０．０１重量％未満であることを特徴とする、請求項１から５のいずれかに記載のグラフェンナノ材料。
【請求項７】
化粧品としての請求項１から６のいずれかに記載のグラフェンナノ材料の使用方法。
【請求項８】
皮膚を治療するための請求項７に記載の化粧品の使用方法。
【請求項９】
皮膚の脂肪組織を減少させるため、好ましくは皮下組織の脂肪を減少させるための、請求項７または８に記載の化粧品の使用方法。
【請求項１０】
脂肪組織の体積の増加および／または脂肪塊の形成を防止または低減するための美容処理方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載のグラフェンナノ材料またはそれを含む組成物が皮膚に適用されることを特徴とする美容方法。
【請求項１１】
セルライト、しわおよび／または静脈瘤の減少のための請求項１０に記載の美容方法。
【請求項１２】
脂肪組織の体積の増加および／または脂肪塊の形成を防止または低減する化粧品用途のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のグラフェンナノ材料、または当該グラフェンナノ材料を含む組成物であって、
前記ナノ材料または前記組成物を皮膚に適用することを特徴とする、グラフェンナノ材料又は組成物。
【請求項１３】
前記グラフェンナノ材料または前記組成物は、セルライト、しわおよび／または静脈瘤の低減のために使用されることを特徴とする、請求項１２に記載のグラフェンナノ材料または組成物。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれか一項に記載のグラフェンナノ材料製品および賦形剤を含む化粧品組成物。
【請求項１５】
局所使用に適したことを特徴とする、請求項１４に記載の化粧品組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、クリーム、ローション、軟膏、マイクロエマルジョン、脂肪軟膏、ゲル、エマルジョンゲル、ペースト、フォーム、着色剤、パッチ、包帯、膜、および経皮治療システムからなる群より選択される形態であることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の化粧品組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、クリーム、ヒドロゲル、または乳化ゲルから選択される形態であることを特徴とする、請求項１６に記載の化粧品組成物。
【請求項１８】
グラフェンナノファイバー原料から、請求項１から６のいずれかに記載の生成物を製造する方法であって、
ａ）グラフェン原料に存在する金属または不純物を除去するために、好ましくは強酸を使用して、グラフェン原料を精製する工程と、
ｂ）精製されたグラフェンナノ材料の粒子径を、好ましくは剥離プロセスによって、レーザ回折粒子分析器によって測定した場合に、ｄｎ（９０）が０．６０μｍ以下であり、かつ、ｄｖ（９０）が８０．００μｍ以下である粒子径分布を有するように縮減する工程と、
ｃ）必要に応じて、得られた生成物を発熱物質除去プロセスにかける工程と、
を含むことを特徴とする、グラフェンナノファイバーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しいグラフェン生成物、それらの組成物、及びそれを用いた化粧品に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラフェンベースまたはグラフェン関連材料は、２０１０年のノーベル物理学賞を受賞した後脚光を浴び、その後、エネルギー、電子機器、センサー、光処理、医療、環境分野でこれらの材料の多数のアプリケーションの開発が爆発的に増加した。この材料系の「根幹」をなすグラフェンは、六角形のハニカム格子に配置されたｓｐ２混成炭素原子でできた２次元材料である。
【０００３】
グラフェン関連材料には、グラフェン（単層および多層）、グラファイト、多環式芳香族炭化水素、カーボンナノチューブ、フラーレン、さまざまな次元のさまざまなグラフェンナノ構造（グラフェンナノファイバー、グラフェンナノ粒子、グラフェン量子ドット、グラフェンナノリボン、グラフェンナノメッシュ、グラフェンナノディスク、グラフェンフォーム、グラフェンナノピラー等）、他のグラフェン関連材料の任意の組み合わせ、置換グラフェン関連材料（たとえば、炭素原子のＮ、Ｂ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉなどへの置換）、および反応性官能基（例えば、カルボキシル基、エステル、アミド、チオール、ヒドロキシル基、ジオール基、ケトン基、スルホネート基、カルボニル基、アリール基、エポキシ基、フェノール基、ホスホン酸、アミン基、ポルフィリン、ピリジン、ポリマーおよびそれらの組み合わせで官能化されたグラフェン関連材料が含まれる。
【０００４】
医療用途のためのグラフェン材料の使用について種々の出版物が発行されている。ＵＳ２００６／０１３４０９６は、グラフェン含有組成物、特にフラーレンまたはナノチューブ以外の、グラフェンを含む非多孔質炭素の医学的使用のための組成物および方法を記載している。それらは、毒素の吸着剤として、または血液透析において、創傷に局所的に使用される。
【０００５】
ＥＰ３１３３５３は、神経変性疾患を予防または治療するためのグラフェンナノ構造ベースの医薬組成物を開示している。グラフェンナノ構造は、タンパク質の誤った折り畳みによって引き起こされるフィブリル形成を抑制する。
【０００６】
ＵＳ２０１４／０１２００８１は、酸化ストレスを処理するためのカーボンナノ材料の使用方法を開示している。当該使用方法によれば、活性酸素種のレベルを下げることによって対象物中の酸素ストレスを処理することができる。カーボンナノ材料は、ナノチューブ、グラフェン、グラフェンナノリボン、グラファイト、酸化グラファイトなどから選択でき、これらの材料には官能基を付与することができる。
【０００７】
ＧＢ２５３２４４９は、癌幹細胞の増殖を阻害することによる癌の治療、予防、または予防に使用するための機能化ナノ材料について開示している。そして、ナノ材料は、単層グラフェン、数層グラフェン、ナノグラフェン、単層または多層カーボンの形態を有する。そして、ナノチューブ、フラーレン、カーボンナノホーン、カーボンナノファイバー、またはアモルファスまたは部分的にアモルファス化されたナノカーボンまたはそれらの混合物が好ましいことが開示されている。
【０００８】
Ｇｕｒａｎａｔｈａｎ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｉｍ  Ｊ−Ｈ．  ｉｎ  Ｉｎｔｅｍａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｍａｌ  ｏｆＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１６：１１，ｐａｇｅｓ  １９２７−１９４５には、グラフェンおよびグラフェン関連材料の合成、毒性、生体適合性、および生物医学的応用について概説している。この論文で説明されているように、これらの生成物の多くは、毒性および生体適合性の問題を依然として抱えている。グラフェンの毒性効果は、サイズと分布、表面電荷、表面積、層数、横方向の寸法、表面化学、純度、粒子状態、表面官能基、形状などの物理化学的特性によって影響を受ける。抗癌療法、光熱療法、薬物送達、遺伝子トランスフェクション、バイオセンシング、イメージング、および組織工学は、上記論文中で言及されている生物医学的応用の１つである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、毒性が低いかまったくなく、生体適合性が高く、有用な生物学的効果と用途を提供できる新しいグラフェンベースの材料および当該材料の化粧品への用途の開発が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、毒性が低いか毒性が全くなく、化粧品に有用な、優れた特性を備えた新しいグラフェン生成物を発見した。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、グラフェンナノファイバーから選択されるグラフェンナノ材料に関する。ここで、グラフェンナノ材料は、レーザ回折粒子分析器で測定した場合において、ｄｎ（９０）が０．６０μｍ以下であり、かつ、ｄｖ（９０）が８０．００μｍ以下である粒子径分布を有する。
【００１２】
好ましくは、グラフェンナノ材料のＢＥＴ比表面積は、１００から５００ｍ２／ｇ、より好ましくは３００から３５０ｍ２／ｇである。
【００１３】
別の実施形態では、グラフェンナノ材料の細孔容積は、０．３５〜０．４０ｃｍ３／ｇである。
【００１４】
グラフェンナノ材料中の不純物は０．０１重量％未満であることが好ましい。
【００１５】
別の態様では、本発明は、化粧品として定義されるグラフェンナノ材料の使用に関する。好ましくは、化粧品は皮膚の処理用である。
【００１６】
別の態様では、本発明は、皮膚の外観を改善するために、好ましくは皮膚の脂肪組織を減少させるために、好ましくは皮下組織の脂肪を減少させるために、上記で定義されたグラフェンナノ材料の使用に関する。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のグラフェンまたはそれを含む組成物を特徴とする、皮下脂肪組織の体積の増加および／または脂肪塊の形成を防止または低減するための美容治療方法に関する。好ましくは、化粧品は皮膚の局所療用である。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、脂肪組織の体積の増加および／または脂肪塊の形成を防止または低減する化粧品用途のために、本発明のグラフェンナノ材料またはそれを含む組成物を企図するものである。ここで、前記ナノ材料または前記組成物は、皮膚に適用される。
【００１９】
別の態様では、本発明は、上記で定義されたグラフェンナノ材料を含む化粧品組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＧＭＣ−１のラマンスペクトル。
【図２】ＧＭＣ−１のＮ２の吸着―離脱。
【図３Ａ】ＧＮＦ原料のＸ線回折。
【図３Ｂ】ＧＭＣ−１のＸ線回折。
【図４Ａ】ＧＮＦ原料およびＧＭＣ−１の数基準の粒子径分布の比較。
【図４Ｂ】ＧＮＦ原料及びＧＭＣ−１の体積基準における粒子径分布の比較。
【図５】２ｘＧＭＣ−１またはビヒクル（ＣＴ）で２４時間処理した培養脂肪細胞（３ｔ３ｌ１細胞株から分化）での毒性分析。Ａ）トリパンブルー細胞排除によって決定された生存率およびＢ）ビヒクルおよび１０倍濃度のＧＭＣ−１を用いたＭＴＴによって決定された細胞代謝。これらの値は平均値＋／−標準誤差として表示。
【図６】培養脂肪モデルにおける脂肪分化マーカーの発現。培養脂肪細胞（３Ｔ３Ｌ１細胞株から分化）またはげっ歯類（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）から単離された内臓白色脂肪組織外植片を２ｘＧＭＣ−１またはビヒクル（ＣＴ）で２４時間処理。ｍＲＮＡ発現倍率の変化は、内臓白色脂肪組織における分化マーカーＰＰＡＲγ（Ａ、Ｂ）およびＣ）炎症アディポカインＩＬ−６（Ｃ）およびインスリン感受性マーカーＧＬＵＴ４（Ｄ）のＲＴ−ｑＰＣＲによって決定。値は平均値＋／−標準誤差として表示され、統計的に処理される（＊  Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣＴ、値は統計的に有意と見なされる）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
グラフェン原料
本発明において、「グラフェン」という用語は、互いに共有結合した複数の炭素原子を有する多環芳香族分子を形成する材料を指す。共有結合した炭素原子は、繰り返し単位として６員環を形成する。
【００２２】
「グラフェンナノファイバー」（ＧＮＦ）という用語は、積み重ねられたコーン、カップ、またはプレートとして配置されたグラフェン層を備えた円筒形のナノ構造を指す。グラフェン面はファイバー軸から傾斜しており、カーボンナノファイバーの内面と外面とに平面エッジが露出している。
【００２３】
「グラフェンナノチューブ」（ＧＮＴ）という用語は、グラフェンの単層または多層同心円筒を指す。グラフェンナノチューブは円筒形で中空であり、グラフェンナノファイバーはロッド状で稠密となっているため、グラフェンナノチューブの基底面はグラフェンナノファイバーの基底面に比べて反応性が低くなっている。
【００２４】
本発明の生成物は、ＧＮＦに由来する炭素ベースのナノ材料であり、一連の精製および処理を経て、予期しない生物学的特性を有する医療グレードの材料が得られる。
【００２５】
出発カーボンナノ材料は、グラフェンベースの材料（グラフェンナノファイバー）である。一実施形態では、本発明の生成物を調製するために使用されるグラフェンナノファイバーは、粒子数についてｄｎ（９０）が４．０μｍ以下であり、かつ、粒子体積についてｄｖ（９０）が１０５．００μｍ以下の粒子径分布を有する。好ましくは、上記グラフェンナノファイバーは約２５０〜４００ｍ２／ｇの表面積を有する。
【００２６】
本発明の生成物を得るために使用される原料は、炭化ケイ素上でのエピタキシャル成長、化学蒸着、グラファイトのマイクロメカニカルまたは機械的剥離、熱的、化学的あるいは多段階還元を利用したグラファイトの化学酸化、金属触媒上での炭化水素の触媒分解、カーボンナノチューブの展開、エレクトロスピニングを使用した酸化グラファイトの還元などの多種多様な方法に従って合成することができる。
【００２７】
炭化ケイ素上でのエピタキシャル成長は、グラフェンから分離された単分子層を、基板として使用される単結晶炭化ケイ素結晶（ＳｉＣ）上で合成する方法である。この方法は、ＳｉＣウェーハを高真空下、高温（＞１１００℃）で加熱して行うことができる。上記の条件下で、シリコン原子は昇華し、その表面でグラフェンのエピタキシャル成長が実現される（炭素原子は再配列してグラフェンを形成する）［Ｓｕｔｔｅｒ，Ｐ．，Ｅｐｉｔａｘｉａｌ  ｇｒａｐｈｅｎｅ：Ｈｏｗ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｌｅａｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｃｅｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２００９．  ８（３）：ｐ．１７１−１７２．］。
【００２８】
化学蒸気分解法では、炭素源は触媒基質上で触媒反応によって分解される。触媒表面は、炭化水素の熱分解後、金属内部で生成された炭素原子の溶解を引き起こす［Ｊａｃｏｂｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｍｐｌｅ  Ｇｒａｐｈｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｖｉａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，２０１５．９２（１１）：  ｐ．１９０３−１９０７，Ｌａｖｉｎ−Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ｏｖｅｒ  ｐｏｌｙｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｎｉｃｋｅｌ．Ｎｅｗ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５．３９（６）：ｐ．４４１４−４４２３］。
【００２９】
グラファイトのマイクロメカニカル剥離は、固体表面物体または粘着テープを使用して、微細な削り取りによってフレーク中の前記固体の最外層を分離することからなる［Ｇｅｉｍ，  Ａ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｋ．Ｓ．  Ｎｏｖｏｓｅｌｏｖ，  Ｔｈｅ  ｒｉｓｅ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  ２００７．  ６（３）：  ｐ．  １８３−１９１］。機械的剥離は、超音波によって有機または水性溶媒中で懸濁グラファイトを形成するシートを分離することによって行う。得られた材料は高品質であるものの、収率が低く、製造コストが高いため、工業的観点からは不向きである［Ｌｏｔｙａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｑｕｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｂｙ  ｅｘｆｏｌｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｉｔｅ  ｉｎ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ／ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００９．１３１（１０）：ｐ．３６１１−３６２０］。
【００３０】
グラフェンナノファイバー（ＧＮＦ）を合成するために多種多様な方法を使用することもでき、これは本発明の生成物を調製するために特に好ましい。たとえば、カーボンナノファイバーの化学蒸着法は、触媒の存在下で炭素源を分解して成長したＧＮＦに対する触媒法である。この場合、鉄、ニッケル、コバルト、銅などの遷移金属触媒粒子が触媒として使用される。ＣＶＤプロセスは５００〜１２００℃の範囲の温度で行われる［Ｍａｒｔｉｎ−Ｇｕｌｌｏｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｕｓｉｎｇ  Ｆｅ  ａｎｄ  Ｎｉ  ｃａｔａｌｙｓｔｓ  ｉｎ  ａ  ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ｒｅａｃｔｏｒ．  Ｃａｒｂｏｎ，２００６．４４（８）：ｐ．１５７２−１５８０］。
【００３１】
エレクトロスピニングは、ＧＮＦの代替製造方法である。この方法では、細い先端を用いたゾルゲル法が適用される。この場合、針の先端に高電圧が印加されるとともに、針の先端からターゲットに向けて溶液が吐出される。溶液の表面張力が十分に高いので、微細な液滴となることなく、上記針の先端から繊維状の構造として抽出することができる［Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒｅｖｉｅｗ：Ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４．４９（２）：ｐ．４６３−４８０］。
【００３２】
本発明の複合材料を調製するために使用される多孔質黒鉛材料の平均直径および長さは、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって測定される。
【００３３】
精製と療法
上記の方法に従って合成されたグラフェンナノ材料は、本発明のグラフェンベースの医療グレードの材料を合成するための原料として使用される。グラフェンナノ原材料は、合成プロセス中にグラフェンナノ材料構造に導入された金属または不純物を除去するために、好ましくは強酸（Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ、ＨＦ、ＨＮＯ３、ＨＢｒ等）を使用して精製プロセスにかけられる。また、グラフェン材料の特性に影響を与えることなく不純物を除去できる任意のプロセスを使用できる。酸の中でも、塩酸またはフッ化水素酸が特に好ましいが、当業者は、存在する不純物の量および種類に応じて酸および条件を選択する。精製プロセスは、低温（２０〜５０℃）で数時間（１２〜２４時間）行うことが好ましい。溶液を精製プロセスに使用する場合、精製されたグラフェンナノ材料は、中性のｐＨになるまでミリポア水で洗浄され、その後、乾燥、たとえば真空乾燥される。
【００３４】
精製されたグラフェンナノ材料は、粒子径分布が小さくなるように処理されているため、医療および化粧品の用途に適している。精製されたグラフェンナノ材料は、例えば、そのサイズを縮小し、その特性を変更するプロセスにかけらる。一実施形態では、前記プロセスは、例えば超音波処理、湿式粉砕またはハイブリッドプロセスを介して、室温で剥離プロセスにかけられる。超音波処理は、プロセスが単純であるため特に好ましい。超音波処理は、所定のサンプルが目的の粒子径分布を有しているか否かをモニタリングすることができる。その後、粒子径を１０〜１００μｍに制御するための方割プロセスを選択的に実行することができる。当業者であれば、粒子径分布を選択するために必要な技術を直ちに決定できるであろう。例えば、このステップは、濾過または遠心分離によって、好ましくは真空濾過によって、例えば焼結ガラスフィルターを通して達成することができる。方割プロセスは、有利には、ｄｎ（９０）が０．６０μｍ以下であり、かつ、ｄｖ（９０）が８０．００μｍ以下である粒子径分布を有する粒子をもたらすことができる。
【００３５】
最後に、グラフェンナノ材料が細菌学的汚染やエンドトキシンを含む他の有毒化合物の痕跡を引きずらないように制御し、無菌状態を維持するために、当該材料を、好ましくは５００℃で１０〜６０分間加熱して、標準的な発熱物質除去プロセスにかけることもできる。
【００３６】
結果として得られる粒子径分布は、粒子サイズ分析器、例えば、実施例で使用されるようなマルバーンパナナリティカルのマスターサイザー２０００などの手段によって決定することができる。
【００３７】
したがって、本発明のさらなる目的は、グラフェンナノファイバー原料から、
ａ）グラフェン原料に存在する金属または不純物を除去するために、好ましくは強酸を使用して、グラフェン原料を精製する工程と、
ｂ）精製されたグラフェンナノ材料の粒子径を、好ましくは剥離プロセスによって、レーザ回折粒子分析器によって測定した場合に、ｄｎ（９０）が０．６０μｍ以下であり、かつ、ｄｖ（９０）が８０．００μｍ以下である粒子径分布を有するように縮減する工程と、
ｃ）必要に応じて、得られた生成物を発熱物質除去プロセスにかける工程と、
を含む本発明のグラフェンナノ材料を製造する方法を提供することである。
【００３８】
工程（ｂ）は、工程（ｃ）の前に、粒子径に従って粒子を方割する工程をさらに含むことができる。一実施形態では、方割工程は、濾過または遠心分離、好ましくは真空濾過によって達成される。
【００３９】
本発明において、粒子数についてｄｎ（９０）が０．６０μｍ以下であり、かつ、粒子体積について粒子径ｄｖ（９０）が８０．００μｍ以下である粒子径分布は、選択的に濾過等の方割工程を含む工程（ｂ）によって得ることができる。好ましくは、濾過は、１から２０μｍ、好ましくは４から２０μｍの間、より好ましくは５から１６μｍの間からなる孔径の焼結ガラスフィルターを用いた真空濾過である。
【００４０】
生成物  
本発明の生成物は、ｄｎ（９０）が約０．６０μｍ以下であり、かつ、ｄｖ（９０）が８０．００μｍ以下、好ましくは７０．００μｍ以下である粒子径分布を有する精製グラフェンナノ材料である。
【００４１】
粒子径分布は、レーザ回折粒度分析装置によって測定される。粒度分布Ｄ５０は、累積分布の５０％での粒子径の値である。Ｄ５０が所定の値をとる場合、サンプル内の粒子の５０％がこの値より大きく、５０％が小さいことになる。粒子径分布は、対象のサンプル内のすべてのサイズの総数のパーセンテージとして示される、種々のサイズ範囲のそれぞれに該当する粒子の数である。粒子径分布を記述するために最も広く使用されている方法は、累積質量の１０％、５０％、および９０％の切片であるｄ値（ｄ１０、ｄ５０、およびｄ９０）である。
【００４２】
これらの値は、粒子が質量の昇順で配置されている場合に、サンプルの質量を指定されたパーセンテージに分割する材料の直径と考えることができる。ｄ１０は、サンプルの質量の１０％がこの値よりも小さい直径の粒子で構成されている直径である。ｄ５０は、サンプルの質量の５０％が小さく、サンプルの質量の５０％が大きい粒子の直径である。ｄ９０は、サンプルの質量の９０％がこれよりも小さい直径の粒子で構成されている直径である。これらの値は、累計粒子数についての粒子径（ｄｎ）と累計粒子体積についての粒子径（ｄｖ）に適用できる。
【００４３】
粒子数についてｄｎ（９０）を有する分布とは、サンプルにおける材料の総数の９０％が含まれるようなサイズ分布におけるポイントを意味する。
【００４４】
粒子体積についてｄｖ（９０）を有する分布とは、サンプルにおける材料の総体積の９０％が含まれるようなサイズ分布におけるポイントを意味する。
【００４５】
本発明の生成物の粒子径分布は、マルバーンパナナリティカルのマスターサイザー３０００で測定されたものである。
【００４６】
本発明において、「比表面積（ＳＳＡ）」という用語は、単位質量あたりの材料の総表面積を指す。
【００４７】
本出願に記載されている多孔性および比表面積の特性は、吸着材料として窒素を使用する物理吸着技術に適用される、当業者にとって周知であるブルナウアー・エメット・テラー（「ＢＥＴ」）法を使用して測定されたものである。
【００４８】
本発明の一実施形態では、本発明の生成物のＢＥＴ表面積は、３００〜３５０ｍ２／ｇである。
【００４９】
別の実施形態では、本発明の生成物の細孔容積は、０．３５〜０．４０ｃｍ３／ｇである。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明の生成物は、３００〜３５０ｍ２／ｇの間のＢＥＴ表面積および０．３５〜０．４０ｃｍ３／ｇの間の細孔容積を有する。
【００５１】
本発明の生成物は、グラフェンナノファイバーの形態である。
【００５２】
組成物
別の態様では、本発明は、本発明のグラフェン生成物および１つまたは複数の化粧品として許容される賦形剤を含む化粧品組成物に関する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「化粧品組成物」という用語は、皮膚の状態を調節するため、および／または皮下組織での脂肪の減少を含む皮膚の外観を改善するために、消費者の皮膚に適用されることを意図する組成物を意味する。
【００５４】
本発明の化粧品組成物は、有効成分である本発明によるグラフェン生成物に加えて、安定剤、可溶化剤、ビタミン、顔料、および香料などの従来の補助賦形剤を含み得る。
【００５５】
化粧品組成物は、当技術分野で従来から使用されている任意の配合物で調製することができる。例えば、化粧品組成物は、例えば、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、粉末、油、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、およびスプレーの配合物で調製することができるが、その配合物は、これに限定されない。すなわち、化粧品組成物は、日焼け止めクリーム、軟化化粧品水、収束化粧品水、栄養化粧品水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、パック、スプレー、または粉末の配合で調製することができる。
【００５６】
「賦形剤」という用語は、有効成分と共に投与されるビヒクル、希釈剤またはアジュバントを指す。化粧品添加剤は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油などの石油、動物、植物または合成由来のものを含む、水および油などの無菌液体であり得る。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明の化粧品組成物は、例えば、クリーム、ローション、軟膏、マイクロエマルジョン、脂肪軟膏、ゲル、エマルジョンゲル、ペースト、フォーム、着色剤、溶液、パッチ、包帯および経皮治療システムなどの皮膚への局所投与に適している。最も好ましいのは、クリーム、ヒドロゲル、またはエマルジョンゲルである。
【００５８】
クリームやローションは水中油型エマルジョンである。使用できる油性塩基は、脂肪アルコール、特に１２〜１８個の炭素原子を含むもの、例えばラウリル、セチルまたはステアリルアルコール、脂肪酸、特に１０〜１８個の炭素原子を含むもの、例えばパルミチン酸またはステアリン酸、脂肪酸性エステル、例えばグリセリルトリカプリロカプレート（中性油）またはパルミチン酸セチル、液体から固体のワックス、例えばミリスチン酸イソプロピル、ウールワックスまたは蜜蝋、および／または炭化水素、特に液体、半固体または固体の物質またはそれらの混合物、例えば石油ゼリー（鉱油、ワセリン）またはパラフィンオイルである。
【００５９】
適切な乳化剤は、対応する非イオン性乳化剤、例えば、多価アルコールの脂肪酸エステルおよび／またはそのエチレンオキシド付加物、特に（ポリ）エチレングリコール、（ポリ）との対応する脂肪酸エステルなど、主に親水性を有する表面活性物質である。プロピレングリコールまたはソルビトール、特に１０〜１８個の炭素原子を含む脂肪酸部分、特にポリグリセロール脂肪酸エステルまたはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎｓ）などのポリヒドロキシエチレンソルビタンの部分的グリセロール脂肪酸エステルまたは部分的脂肪酸エステル、また、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルまたは脂肪酸エステル、特に１２〜１８個の炭素原子を含む脂肪アルコール部分、および特に１０〜１８個の炭素原子を含む脂肪酸部分、例えば、ポリヒドロキシエチレングリセロール脂肪酸エステル（例えば、タガットＳ）、または脂肪アルコール硫酸塩のアルカリ金属塩、特にハビなどの対応するイオン乳化剤脂肪アルコール部分の１２から１８の炭素原子、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウム、またはステアリル硫酸ナトリウムである。これらは通常、脂肪アルコール、例えばセチルアルコールまたはステアリルアルコールの存在下で使用される。水相への添加剤は、とりわけ、クリームが乾燥するのを防ぐ薬剤、例えば、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコールおよび／またはポリエチレングリコールなどのポリアルコールなどの保湿剤、ならびに防腐剤、香料、ゲル化剤などである。
【００６０】
軟膏は、最大７０％、好ましくは約２０％から約５０％の水または水相を含む油中水型エマルジョンである。脂肪相として適切なのは、特に炭化水素、例えばワセリン、パラフィン油および／または硬質パラフィンであり、これらは、水結合能力を改善するために、好ましくは、脂肪アルコールまたはそのエステル、例えばセチルアルコールまたはウールワックスアルコール、ウールワックスまたは蜜蝋を含む。乳化剤は、ソルビタン脂肪酸エステル（スパン）、例えばオレイン酸ソルビタンおよび／またはイソステアリン酸ソルビタンなどの、例えば上記のタイプの対応する親油性物質である。水相への添加剤は、とりわけ、ポリアルコール、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールおよび／またはポリエチレングリコールなどの保湿剤、ならびに防腐剤、香料などである。
【００６１】
マイクロエマルジョンは、次の４つの成分に基づく等方性システムである：水、たとえば張力活性剤等の界面活性剤、非極性または極性油などの脂質、たとえばパラフィン油、オリーブ油やトウモロコシ油などの天然油、および例えば、２−オクチルドデカノールまたはエトキシル化グリセロールまたはポリグリセロールエステル等の親油性基を含むアルコールまたはポリアルコール。必要に応じて、他の添加剤をマイクロエマルジョンに加えることができる。マイクロエマルジョンは、２００ｎｍ未満のサイズのミセルまたは粒子を持ち、透明または半透明のシステムであり、自発的に形成され、安定している。脂肪軟膏は水を含まず、例えばパラフィン、石油ゼリーおよび／または液体パラフィン、また天然または部分的に合成された脂肪等の炭化水素、例えばココナッツ脂肪酸トリグリセリド等のグリセロールの脂肪酸エステル、水素化落花生油、ヒマシ油またはワックス等の硬化物油を含む。また、例えば、モノステアリン酸およびジステアリン酸グリセロール油等のグリセロールの脂肪酸部分エステル、および例えば、吸水能力を増加させる脂肪酸アルコール、乳化剤および／または軟膏に関連して言及された添加物を含むことができる。
【００６２】
ゲルに関しては、水性ゲル、水を含まないゲル、および膨潤性のゲル形成材料からなる低含水率のゲルがあり、特に、無機または有機高分子系の透明なヒドロゲルが使用されている。ゲル形成特性を有する高分子量無機成分は、主に、ベントナイトなどのケイ酸アルミニウム、ビーガムなどのケイ酸マグネシウムアルミニウム、またはアエロジルなどのコロイド状ケイ酸などの含水ケイ酸塩である。高分子量の有機物質として、例えば、天然、半合成、または合成高分子が使用される。天然および半合成ポリマーは、例えば、セルロース、デンプン、トラガカンス、アラビアゴムおよび寒天などの多種多様な炭水化物成分、ならびにゼラチン、アルギン酸、およびアルギン酸ナトリウム等の塩、低級アルキルセルロース、メチルまたはエチルセルロース、カルボキシ−またはヒドロキシ−低級アルキルセルロース、例えば、カルボキシメチルまたはヒドロキシエチル−セルロース等の誘導体である。合成ゲル形成高分子の成分は、例えば、ビニルアルコール、ビニルピロリジン、アクリル酸またはメタクリル酸などの適切に置換された不飽和脂肪族化合物である。
【００６３】
エマルジョンゲル（「エマルゲル」とも呼ばれる）は、ゲルの特性と水中油型エマルジョンの特性とを組み合わせた組成物である。ゲルとは対照的に、それらは脂質相を含み、その脂肪回復特性により、脂質の塊をマッサージすることができ、同時に、皮膚へ直接吸収される。さらに、親油性有効成分の溶解度が増加する。水中油型エマルジョンに対するエマルジョンゲルの利点の１つは、追加のアルコール成分が存在する場合、その蒸発時の冷却効果が挙げられる。
【００６４】
泡は、例えば、加圧容器において形成され、エアロゾル形態の水中油型エマルジョンである。アルカン、例えばプロパンおよび／またはブタンなどの非置換炭化水素が促進剤として使用される。油相として、とりわけ炭化水素、例えばパラフィン油、脂肪アルコール、例えばセチルアルコール、脂肪酸エステル、例えばミリスチン酸イソプロピル、および／または他のワックスが使用される。乳化剤として、とりわけ、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）などの主に親水性を有する乳化剤と、ソルビタン脂肪酸エステル（スパン）などの主に親油性を有する乳化剤との混合物が使用される。防腐剤などの通常の添加物も添加される。着色剤および溶液は、一般にエタノールベースであり、これに水を加えることができ、とりわけ、蒸発を低減するための吸湿剤としてのポリアルコール、例えば、グリセロール、グリコールおよび／またはポリエチレングリコール、および脂肪回復物質が加えられる。当該脂肪回復物質としては、低分子ポリエチレングリコール、プロピレングリコールまたはグリセロールを含む脂肪酸エステル、すなわち、エタノールによって皮膚から除去された脂肪物質の代わりとして、水性混合物に可溶な親油性物質、および必要に応じて、その他の添加剤および添加剤を挙げることができる。適切なチンキ剤または溶液はまた、適切な装置によってスプレー形態で適用され得る。
【００６５】
本発明のグラフェン生成物の局所送達を伴う経皮治療システムは、有効量のグラフェン生成物を任意選択で担体と共に含む。有用な担体は、皮膚を通る有効成分の通過を助けるための吸収性の薬理学的に適切な溶媒を含む。経皮送達システムは、例えば、（ａ）基質（＝裏打ち層またはフィルム）、（ｂ）有効成分、任意選択で担体、および任意選択で（しかし好ましくは）システムを皮膚に取り付けるための特殊接着剤を含むマトリックス、および（ｃ）保護フォイル（＝剥離ライナー）を有するパッチの形態である。マトリックス（ｂ）は通常、すべての成分の混合物として存在するか、分離した層の形態で存在する。
【００６６】
本発明のグラフェン生成物を含む膜およびマトリックスは、それ自体で、または創傷被覆材、包帯などのより複雑な生成物の一部として、生成物の局所適用に適している。そのような膜の例またはマトリックスは、多糖類（アルギネート、キチン、キトサン、ヘパリン、コンドロイチン、カラゲナン）、プロテオグリカン、タンパク質（コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、ケラチン、シルクフィブロイン、卵殻膜）などの天然ポリマー、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリアクリル酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールからなるヒドロゲルまたは生体模倣細胞外マトリックスマイクロ／ナノスケール繊維などの合成ポリマーである。
【００６７】
これらのシステムはすべて、当業者によく知られている。局所投与可能な医薬品または化粧品の製造は、それ自体が知られている方法で、例えば、本発明のグラフェン生成物をベースに、または必要に応じてその一部に懸濁することによって行われる。
【００６８】
本発明による組成物は、特にメチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンのようなパラベンエステル等の防腐剤；塩化ベンザルコニウムのような四級アンモニウム化合物；イミダゾニジニル尿素のようなホルムアルデヒド供与体；ベンジルアルコール、フェノキシエタノールアルコールなどのアルコール；安息香酸、ソルビン酸などの酸；ｐＨ緩衝液賦形剤として使用される酸；特にヒドロキノン、トコフェロールおよびそれらの誘導体のようなフェノール性抗酸化剤；フラボノイド、またはアスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビルのような雑多な抗酸化剤；香水；カオリンやでんぷんなどのフィラー；顔料または着色剤；ＵＶスクリーニング剤；特にグリセリン、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、尿素、ヒアルロン酸またはそれらの誘導体等の保湿剤；ビタミンＥまたはその誘導体等の抗フリーラジカル剤；特にプロピレングリコール等の浸透促進剤；エタノール；イソプロパノール；ジメチルスルホキシド；Ｎ−メチル−２−ピロリドン；オレイン酸、オレイルアルコールなどの脂肪酸／アルコール；リモネン、メントール、１−８シネオールなどのテルペン；酢酸エチル、酢酸ブチルなどのアルキルエステル；サリチル酸などのイオンペア剤保湿剤等の従来の添加剤およびアジュバントを含み得る。
【００６９】
この組成物は、顔または体のためのマスク、クレンジング、保護、処理またはケアクリーム（例えば、デイクリーム、ナイトクリーム、メイクアップ除去クリーム、ファンデーションクリームまたはアンチサンクリーム）、メイクアップ除去ミルク、クレンジングローション等の、肌をケアするためのローション、ジェルまたはフォームを構成することができる。
【００７０】
適切な局所製剤に関するさらなる詳細は、「ハリーの化粧品学」第９版（２０１５）、ケミカルパブリッシング社などの標準的な教科書を参照することによって得ることができる。
【００７１】
配合物中の本発明のグラフェンナノ材料生成物の量は、０．０１％から１０％ｗ／ｗ、好ましくは０．０１％から５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．１％から３％ｗ／ｗの範囲である。
【００７２】
有益な効果と用途
以下の実施例によって証明されるように、本発明の生成物は、局所適用の場合にも毒性がなく、良好な生体適合性を有する。
【００７３】
さらに、そして驚くべきことに、本発明の生成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏで脂肪組織組織を実質的に改変し、美容用途における脂肪減少剤として有用である。
【００７４】
したがって、本発明のグラフェン生成物、およびそれを含む組成物は、化粧品として有用である。「化粧品」という用語は、皮膚またはその付属肢の美的外観を改善することを意図している。
【００７５】
肉付きがよくなり、体重が過剰になると、体型が変化するようになる。このとき、トリグリセリドを形成する遊離脂肪酸とグリセロールとを蓄積または遊離する動的プロセスが不均衡になる［Ｓａｐｏｎａｒｏ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ  ２０１５，  ７，  ９４５３−９４７４；  Ｔｏｎｔｏｎｏｚ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００８．  ７７：２８９−３１２］。
【００７６】
過度に豊富な食事を採ったり、運動をしていない人の場合、蓄積された脂肪の実質的な不均衡が体内に確立され、身体内の脂肪の蓄積度合いが不均衡となり、脂肪組織領域が増加するようになる。この結果、皮下脂肪の肥厚によって、皮膚が徐々に変形するようになる。
【００７７】
本発明のグラフェン生成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの両方で、培養脂肪細胞および脂肪蓄積物の改変に有効であることが証明された。
【００７８】
したがって、本発明のグラフェン生成物、およびそれを含む化粧品組成物は、皮膚の脂肪沈着物の美容的治療、セルライトの減少およびしわの減少に有用である。
【００７９】
上記を考慮して、本発明は、本発明のグラフェン生成物を含む組成物を適用することにより、身体全体あるいは身体の一部において、脂肪組織の体積の増加および／または脂肪塊の形成を防止または低減することを目的とする美容治療方法および／または適用を含む痩身方法に関する。適用は、腹部、大腿部または腕の上部などの脂肪異栄養症の対象となる領域、または顔の下部などの顔の特定の領域に対して実行することができる。この方法は、脂肪細胞の表現型を変更することにより、人と皮膚の外観を改善する。
【００８０】
したがって、本発明のグラフェン生成物は、非治療的（例えば、化粧品）治療（「非治療的使用」）、例えば、例えば手足、腹部および／または臀部の脂肪分布等の美的効果のために脂肪分布を強化するために用いることができる。本発明のグラフェン生成物の美容上の用途の中には、皮下脂肪の減少があり、これは、皮下脂肪の蓄積によるセルライトすなわち皮下脂肪の蓄積による皮膚の外観を改善し、他の皮膚欠陥の除去に寄与するものである。
【００８１】
セルライトは真皮に局在している。皮下組織では、真皮の深層、脂肪細胞、または脂肪細胞が集まって、互いに平行で皮膚表面に垂直な仕切り（コラーゲン線維の列）で区切られた小葉を形成する。脂肪細胞は大きな細胞であり、その体積の８０％が１つまたは複数の脂質液胞で構成されている。サイズは可変であり、液胞が脂肪で過負荷になると、脂肪細胞の体積が増加し、真皮の結合組織が厚くなる。
【００８２】
脂肪細胞における脂肪蓄積の別の効果は、組織に到達する血液の減少であり、これは、液体の蓄積、腫れ、組織の損傷、および壊死をもたらす可能性がある。これは、例えば静脈瘤の形成など、体および一般的な外観に悪影響を及ぼす。したがって、本発明の生成物およびそれを含む組成物は、この損傷を防止または修復するのに有用である。好ましくは、本発明の生成物は、静脈瘤の美容治療において有用である。
【００８３】
別の実施形態では、本発明のグラフェン生成物、およびそれを含む化粧品組成物は、化粧品の皮膚の修復に有用である。
【００８４】
投与方法
本方法で使用される組成物は、好ましくは局所的に適用される。
【００８５】
本発明のグラフェン生成物を含む局所製剤の１日投与量は、性別、年齢、体重、および患者の個々の状態などの様々な要因に依存し得る。
【実施例】
【００８６】
例１：ＧＭＣ−１の準備と物理的−化学的特性
【００８７】
原材料
本発明のグラフェンナノ材料を調製するために使用することができる原材料のテクスチャー特性、黒鉛化の程度、および材料の物理化学的および熱的特性は、以下の表１に示されている。
【００８８】
【表１】
2021532046.tif 000002
表１：ＧＮＦ原料の物理化学的特性
【００８９】
本実施例では、グラフェンナノファイバー（ＧＮＦ）を使用して、本発明による材料を調製した。
【００９０】
グラフェンベースのカーボンナノ材料（ＧＮＦ）は、合成プロセス中にＧＮＦ構造に導入された金属と不純物を除去するためにＨＦを使用した精製プロセスにかけられる。精製プロセスは、低温（２０〜５０℃）で数時間（１２〜２４時間）行われる。その後、精製されたカーボンナノ材料を真空乾燥し、中性のｐＨになるまでミリポア水で洗浄する。
【００９１】
次に、精製されたＧＮＦは、水または他の溶媒を含む溶液中で、室温で数時間（２〜５時間）剥離プロセスにかけられた。最後に、材料は熱による標準的な脱ピロゲン化プロセスにかけられる（２００−５００℃で１０−６０分）。
【００９２】
得られた製品（ＧＭＣ−１）は次のように特徴付けられている。
【００９３】
ＧＭＣ−１の元素分析
ＧＭＣ−１と原材料の主な違いは、元素分析で確認できる（表２）。原料と比較すると、ＧＭＣ−１は炭素と酸素のみで構成されている。毒物学実験で確認されたように、人の健康に害を及ぼす可能性のある不純物の痕跡はない。
【００９４】
【表２】
2021532046.tif 000003
表２：ＣＮＦ原料とＧＭＣ−１との元素分析
【００９５】
ＧＭＣ−１のラマン分光法
ＧＭＣ−１のラマンスペクトルは５１２ｎｍレーザを使用して得、石炭材料の特徴的なピークを示した（図１）。すなわち、ピークＤ、１３３２ｃｍ−１、およびピークＧ、１５８０ｃｍ−１である。Ｇバンドは炭素原子のネットワーク、つまり理想的なグラファイト構造に対応し、Ｄバンドは基底面とエッジの両方に欠陥が存在するために出現する。グラフェンナノファイバーは、バンドＧよりも大きな強度のバンドＤを有する。これらのナノファイバーの場合のように、エッジが多数含まれている場合、グラファイト材料に大きなＤピークが現れる可能性がある。ピークＤとＧの両方の帯域幅が高すぎないという事実も、ナノファイバーの結晶性を示している。
【００９６】
ＧＭＣ−１の吸収−窒素脱着分析
ガスの物理吸着によって固体の総表面積を測定するためには、固体の表面を覆うのに必要なガス分子数を検出することである。分子が占める面積がわかれば、固体の表面積は、吸収されたガスの分子の数から推定でき、体積または重量分析で測定できる（Ｂｒｕｎａｕｅｒ，  Ｅｍｍｅｔｔ  ａｎｄ  Ｔｅｌｌｅｒ）。
【００９７】
総表面積はマルチポイントＢＥＴ方程式によって計算され、総細孔容積は、細孔がその後液体吸着物で満たされると仮定して、相対圧力Ｐ／Ｐｏ＝０．９９で吸着された蒸気の量によって決定した。
【００９８】
円筒形であると仮定した平均細孔径は、１未満の相対圧力で充填されなかった細孔が細孔サンプルの体積と表面積に寄与しなかったと仮定して、総細孔容積値と表面積から推定した。
【００９９】
表面積、細孔容積、および細孔面積の分析は、相対値を収集するソフトウェア（ＱＵＡＤＲＡＷＩＮ）で制御されるｓ１ｘ脱気ポートと３つの分析ポートを備えたＱＵＡＮＴＡＣＨＲＯＭモデルであるＱＵＡＤＲＡＳＯＲＢ  ＳＩモデルを使用して、７７ＫでのＮ２の吸着脱着によって行った。図２に、ＧＭＣ−１の表面積、細孔容積、細孔径を示す。
ＢＥＴ表面積：３００−３５０ｍ２／ｇ
細孔容積：０，３５−０，４ｃｍ３／ｇ
細孔径：５−６ｎｍ
【０１００】
ＧＭＣ−１のＸ線回折
ＧＮＦのサンプルに対するＸ線回折が実行された（図３Ａ）。図３Ａから分かるように、グラファイトの平面００２間の距離、またはグラフェンのシート間の距離に対応する２５．９o付近にピークを示す。結晶性の高いグラファイトの層間距離は０．３３４ｎｍである。本例では、ナノファイバーの距離はわずかに長く、０．３４３ｎｍである。これは、ナノファイバーが短距離では結晶化度を保つが、乱層構造であることを示している。平面００２（Ｌｃ）に垂直な方向の結晶サイズは４．６４ｎｍであり、上記の事実を示している。
【０１０１】
図３Ｂは、本発明の材料サンプルに対応する回折図である。ＧＮＦとＧＭＣ−１とは同じピークを示しているが、ＧＭＣ−１ではこれらのピークは２θの低い値を示している。
【０１０２】
表３は、ＧＮＦおよびＧＭＣ−１の特徴的な結晶学的パラメータを示している。
層間空間（ｄ００２）
結晶スタック高さ（Ｌｃ）
面内結晶子サイズ（Ｌａ）
結晶中のグラフェン層の数（ｎｐｇ）
2021532046.tif 000004
ここで、
λ、放射波長（λ＝０．１５４０４ｎｍ）
θ１、回折ピーク位置（o）
θ２、回折ピーク位置（o）
ｋｌ、形状因子（ｋ＝０，９）
ｋ２、ウォーレンフォームファクタ定数（ｋ＝１，８４）
ＦＷＨＭ、ピーク半値幅（ｒａｄ）
【０１０３】
【表３】
2021532046.tif 000005
表３：ＧＮＦおよびＧＭＣ−１のＸ線回折パラメータ
【０１０４】
ＧＮＦがＧＭＣ−１に変換されると、材料の結晶構造が変化する。このように、ＧＭＣ−１では、精製、洗浄、剥離により、結晶スタック高さ（Ｌｃ）、面内結晶子サイズ（Ｌａ）、結晶中のグラフェン層数（Ｎｃ）の減少が見られる。ＧＭＣ−１の層間距離は、材料の剥離プロセスに起因して増加している。結晶スタックの高さ（Ｌｃ）と面内の結晶子サイズ（Ｌａ）は、精製と剥離のプロセスに起因して減少した。
【０１０５】
粒度分布
原料ＧＮＦおよび本発明ＧＭＣ−１による製品の粒子径分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＰａｎａｌｙｔｉｃａｌのＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ３０００を用いて測定された。Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ３０００は、レーザ回折の技術を使用して粒子のサイズを測定する。これは、レーザービームが分散した粒子状サンプルを通過するときに散乱する光の強度を測定することによって行われる。次に、このデータを分析して、散乱パターンに由来する粒子のサイズを計算する。
【０１０６】
図４Ａは、ＧＮＦとＧＭＣ−１の数基準における粒子径分布の比較を示している。
【０１０７】
図４Ｂは、ＧＮＦとＧＭＣ−１の体積基準における粒子径分布の比較を示してる。
【０１０８】
パラメータｄ（０．１）、ｄ（０．５）、およびｄ（０．９）は図から確認することができる。ｄｎは粒子数を基準とした場合を表わし、ｄｖは粒子体積を基準とした場合を表わしている。
【０１０９】
ＧＮＦの場合、ｄｎ（１０）パラメータは粒子数の１０％が１．１２１μｍ以下の粒子径であることを意味し、ｄｎ（５０）パラメータは粒子数の５０％が１．５７３μｍ以下の粒子径であることを意味している。ｄｎ（９０）パラメータは、粒子数の９０％が３．９０９μｍ以下の粒子径であることを意味している。ＧＮＦの場合、ｄｖ（１０）パラメータはサンプルの体積の１０％が１９．７６４μｍ以下の粒子径の粒子で占められていることを意味し、ｄｖ（５０）パラメータはサンプルの体積の５０％が５７．７１１μｍ以下の粒子径の粒子で占められていることを意味している。ｄｖ（９０）パラメータは、サンプルの９０％が１０３．１１４μｍ以下の粒子径の粒子によって占められていることを意味している。
【０１１０】
ＧＭＣ−１の場合、ｄｎ（１０）パラメータは粒子数の１０％が０．３１３μｍ以下であることを意味し、ｄｎ（５０）パラメータは粒子数の５０％が０．３９４μｍ以下であることを意味している。ｄｎ（９０）パラメータは、粒子数の９０％が０．５７７μｍ以下の粒子径であることを意味している。ＧＭＣ−１の場合、ｄｖ（１０）パラメータはサンプルの体積の１０％が１０．５４９μｍ以下の粒子径で占められていることを意味し、ｄｖ（５０）パラメータはサンプルの体積の５０％が３９．６９３μｍ以下の粒子径の粒子で占められ、ｄｖ（９０）パラメータは、サンプルの９０％が６９．５７６μｍ以下の粒子径の粒子で占められていることを意味している。
【０１１１】
ＧＮＦおよびＧＭＣ−１の数基準および体積基準の粒度分布を比較すると、ＧＭＣ−１の粒度分布が低くなっていることが分かる。要約すると、ＧＮＦのｄｎ（９０）は３．９０９μｍ以下、ｄｖ（９０）は１０３，１１４μｍ以下であるが、ＧＭＣ−１のｄｎ（９０）は０．５７７μｍ以下、ｄｖ（９０）は６９．５７６μｍ以下である。図４Ａおよび４Ｂは、使用される原材料（ＧＮＦ）と比較した、ＧＭＣ−１のｄｎ及びｄｖが減少していることを明確に示している。
【０１１２】
生物活性
統計
示されているデータは、可変数の実験の平均値±標準誤差として表されている。スチューデントｔ検定は、２つのサンプルに使用され、一元配置または二元配置分散分析は、ペアまたは非ペアの設計に続いて多重比較検定を使用して、＞２サンプル（ＡＮＯＶＡ）に使用された。Ｐ＜０．０５の値は統計的に有意であると見なした。
【０１１３】
例２：脂肪細胞に対するＧＭＣ−１の毒性分析
脂肪組織は、皮下領域から腹腔（内臓脂肪）まで、さまざまな箇所に分布している。組織は脂肪細胞によって形成されますが、前脂肪細胞および免疫細胞によっても形成される。脂肪組織の主な機能は、トリグリセリドを調節および代謝し、調節ホルモンを産生することである。デポの局在化に加えて、伝統的に脂肪組織は、Ａ）エネルギー保存のための脂質滴を蓄積することを主な機能とする白色脂肪組織、Ｂ）多数のミトコンドリアを介した熱発生を主な機能とする褐色脂肪組織、およびＣ）ＷＡＴに存在するが、ＢＡＴの形態学的および機能的特徴を備えたベージュ脂肪組織に分けられる。完全に成熟した脂肪細胞から未分化の脂肪細胞までの脂肪細胞の分化状態を考慮すると、それらの発現パターンは変更可能であり、体型に重要な影響を及ぼす［Ｌｕｏ  Ｌ．，Ｌｉｕ  Ｍ．；Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１６  Ｄｅｃ；２３１（３）：Ｒ７７−Ｒ９９．］。
【０１１４】
ＧＭＣ−１の機能的活性を研究する前に、まず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した脂肪細胞のモデルとして、脂肪芽細胞株３Ｔ３Ｌ１の培養条件を操作して得られた培養脂肪細胞の生存率と毒性について懸濁液中の製品をテストした。６ウェル培養皿では、ウェルあたり３００，０００個の細胞を播種し、１０％ウシ胎児血清を添加した培地（デフォルトではＤＭＥＭ）で培養した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２、湿度の制御されたインキュベーター条件下で維持した。細胞が合体すると、これらの細胞中の１６ハウスから血清が失われた。生成物は２４時間、同じ条件下で保持された後、異なる濃度で懸濁液として加えられた。その後、細胞は処理され、薬理学的および毒物学的研究で説明されている２つのテストによって生存率と毒性について補完的に試験された。
ａ）生細胞と死細胞を区別するトリパンブルー排除
ｂ）ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）による細胞染色による代謝活性
【０１１５】
結果を図５に示す。データは、ＧＭＣ−１が培養脂肪細胞に対して無毒であることを示している。
【０１１６】
例３：ｅｘ  ｖｉｖｏでの脂肪細胞に対するＧＭＣ−１の機能分析
蓄積された脂肪細胞は種々の慢性炎症に関連しており、脂肪症と脂肪蓄積との増加は、２型糖尿病やメタボリックシンドロームなどのいくつかの病的状態に関連している。これは、より低い保護ホルモン（レプチン、アディポネクチンとして）を生成していることを意味し、インターロイキン−６（ＩＬ−６）としての炎症誘発性ホルモン（またはシトカイン）の生成を増加することになる［Ｌｕｏ  Ｌ．，Ｌｉｕ  Ｍ．；Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１６  Ｄｅｃ；２３１（３）：Ｒ７７−Ｒ９９．］。
【０１１７】
美容的には、皮下脂肪組織が見られる皮下組織の肥厚によって引き起こされる皮膚の変形によって、皮下脂肪組織の増加が徐々に反映される可能性があり、これは、望ましくない皮膚の外観およびセルライトをもたらす可能性がある。
【０１１８】
脂肪細胞の分化状態を考慮すると、脂肪生成促進転写因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の発現が重要である。別の側面は、インスリン依存性グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）の発現の増加が、インスリン感受性の改善に関連していることである。
【０１１９】
したがって、ＷＡＴでのＰＰＡＲγ発現の増加は、肥満促進状態の増加を意味し、ＷＡＴでのＧＬＵＴ４の増加は、インスリン抵抗性の減少を意味する。我々は、脂肪組織の表現型を改変するＧＭＣ−１の能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで研究した。
【０１２０】
機能研究は、このセクションで紹介したように、脂肪細胞の表現型の変容性に基づいている。したがって、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−ガンマ（ＰＰＡＲγ）、グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）などの遺伝子の発現を測定した［Ｊｕｎｇ，Ｕ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｃｈｏｉ，  Ｍ．Ｓ．  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，  ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ  ａｎｄ  ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．  ２０１４  Ａｐｒ  １１；１５（４）：６１８４−２２３；  Ａｒｍｏｎｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＬＵＴ４  ｇｅｎｅ：  ｆｒｏｍ  ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ＦＯＸＯ１  ｔｏ  ＦＦＡ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２００７  Ａｐｒ；１８（３）：１００−７．］。
【０１２１】
非毒性濃度の懸濁液２ｘＧＭＣ−１（２０ｍｉｃｒｏｇ／ｍｌ）または２つのモデルのコントロールとしてのプレーンビヒクルによる治療（２４時間の持続時間）を行った後、第一に、脂肪芽細胞株３Ｔ３ｌ１の培養条件の操作によって得られた、コンフルエントな完全に分化した脂肪細胞を使用し、次いで、体重３００〜５００（ｎ＝１８）の３〜８か月齢の、正常体重のげっ歯類（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）のオスまたはメスから、同重量かつ同方法で内臓デポー（表皮領域）を機械的に分離した［Ｇａｏ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｗｈｉｔｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍ１ｃｅ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １８５１  （２０１５）  １５２−１６２］。
【０１２２】
発現変化は、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用して決定した。異なるサンプルから抽出された元のｍＲＮＡの１００ｎｇの変換されたＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、市販の遺伝子発現アッセイ（ＴａｑＭａｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増幅した。値は内因性コントロール（ベータアクチン）に対して正規化され、倍数変化はメソッド２  ＾  −ｄｅｌｔａｄｅｌｔａＣｔを使用して実行された。
【０１２３】
結果を図６に示す。ＧＭＣ−１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの両方で脂肪細胞の表現型が変更されていることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ）】
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【図５Ｂ）】
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【図６Ａ）】
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【図６Ｂ）】
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【図６Ｃ）】
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【図６Ｄ）】
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【国際調査報告】
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