(57)【要約】  3体以上の異なるドナーからの、3種以上の造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞、周皮細胞、もしくは衛星細胞、またはそれらの組み合わせのex vivo融合によって創出されたマルチキメラ細胞が、移植治療ならびに免疫不全および遺伝性障害の処置において使用されるように、これらの細胞が提供される。
2021503961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3体以上の異なるドナーからの3種以上の造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞、周皮細胞、衛星細胞、またはそれらの組み合わせのex vivo融合体を含む、マルチキメラ細胞。
【請求項２】
造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞とのex vivo融合体からなる、請求項1に記載のマルチキメラ細胞。
【請求項３】
造血幹細胞が、骨髄、臍帯血、末梢血、またはそれらの組み合わせから単離されたものである、請求項1に記載のマルチキメラ細胞。
【請求項４】
ドナー同士が、血縁関係にあるか、血縁関係にないか、またはそれらの組み合わせである、請求項1に記載のマルチキメラ細胞。
【請求項５】
造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞、間葉系幹細胞、および周皮細胞から選択される2種以上の細胞とのex vivo融合体からなる、請求項1に記載のマルチキメラ細胞。
【請求項６】
造血幹細胞、間葉系幹細胞、および周皮細胞のex vivo融合体からなる、請求項5に記載のマルチキメラ細胞。
【請求項７】
3種の造血幹細胞のex vivo融合体からなる、請求項5に記載のマルチキメラ細胞。
【請求項８】
筋原細胞と、独立して、間葉系幹細胞、筋原細胞、および衛星細胞から選択される2種の細胞とのex vivo融合体からなる、請求項1に記載のマルチキメラ細胞。
【請求項９】
筋原細胞、間葉系幹、および衛星細胞のex vivo融合体からなる、請求項8に記載のマルチキメラ細胞。
【請求項１０】
3種の筋芽細胞のex vivo融合体からなる、請求項8に記載のマルチキメラ細胞。
【請求項１１】
免疫不全または遺伝性障害を処置する方法であって、請求項1に記載のマルチキメラ細胞の有効量を、処置を必要とする対象へ投与すること、それによって対象の免疫不全または遺伝性障害を処置することを含む、前記方法。
【請求項１２】
マルチキメラ細胞が、骨内の、静脈内の、または筋肉内の注射によって投与される、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
免疫不全または遺伝性障害が、骨髄不全、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症、重症複合免疫不全症(SCID)、ディジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、筋ジストロフィー、I型糖尿病、ゴーシェ病、白血病、再生不良性貧血、鎌状赤血球貧血、リンパ腫、および多発性骨髄腫から選択される、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝性障害が、筋ジストロフィーである、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
マルチキメラ細胞が、筋原細胞と、独立して、間葉系幹細胞、筋原細胞、および衛星細胞から選択される2種以上の細胞とのex vivo融合体を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
免疫不全または遺伝性障害が、鎌状赤血球貧血である、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
マルチキメラ細胞が、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞とのex vivo融合体を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
同種異系間の造血幹細胞移植もしくは臓器移植を受けている対象においてGvHDの発症を予防するかまたはGvHDの重症度を低減する方法であって、請求項1に記載のマルチキメラ細胞の有効量を対象へ投与すること、それによって対象におけるGvHDの発症を予防するかまたはGvHDの重症度を低減することを含む、前記方法。
【請求項１９】
マルチキメラ細胞が、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞とのex vivo融合体を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
（a）膜融合剤、および
（b）3体以上の異なるドナーからの造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞、周皮細胞、衛星細胞の群から選択される3種以上のドナー細胞
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
導入
本出願は、2017年11月28日出願の米国仮特許出願第62/591,397号(この内容はその全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に対する優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、国防総省によって授与された認可番号W81XWH-13-2-0053の下、政府の支援でなされた。政府は本発明においてある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
幹細胞移植は、多くのヒト障害の処置のための有望な新ストラテジーである。造血幹細胞(HSC)移植は、幹細胞をベースとした治療(therapies)の治療可能性(curative potential)についての最もためになる例である。自己HSCは多くの血液病にとって処置選択肢にはなり得ない一方で、同種異系間の幹細胞移植片の入手可能性は、血縁関係にある(related)適合ドナーの不足(lack)に起因し限定されている。加えて、血縁関係にない(unrelated)適合HSC移植は、前処置レジメン(conditioning regimens)および移植片対宿主病(GvHD)の毒性効果に起因するしばしば酷く高い(prohibitive)死亡率および罹患率によって阻まれる。GvHDのリスクなく組織適合性という障壁を越えて、生着率または有効性および移植実施能を改善することは、多くの、しばしば不治の疾患にとって、選り抜きの新しい処置モダリティ(modality)としてのHSC移植の適用を大いに増大させるであろう。
【０００４】
キメラ細胞は、様々なex vivo融合方法によって開発されてきた(Siemionow, et al. (2012) Ann. Plast. Surg. 69(5):575-9；Cwykiel & Siemionow (2015) Plastic and Reconstructive Surgery: Experimental Models and Research Design, Siemionow (Ed.), Springer-Verlag London, Ltd., Chapters 71-72)。血管柄付複合組織移植(vascularized composite allotransplantation)(VCA)、照射、および筋ジストロフィーの動物モデルを包含する種々の実験モデルに適用されたキメラ細胞治療が記載されている(Arslan, et al. (2007) Microsurgery 27:190-9；Kulahci, et al. (2010) Transplantation 90(8):843-52；Hivelin, et al. (2016) Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 64(4):299-310；Siemionow, et al. (2016) Microsurgery 36(8):676-683)。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の概要
本発明は、3体以上の異なるドナーからの、3種以上の造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞(myoblasts)、周皮細胞、衛星細胞、またはそれらの組み合わせの融合体(fusion)から構成される(composed of)マルチキメラ細胞(multi-chimeric cell)である。ある態様において、造血幹細胞は、骨髄、臍帯血、末梢血、またはそれらの組み合わせから単離されたものである。他の態様において、ドナー同士(donors)は、血縁関係にあるか、血縁関係にないか、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、融合体は、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞との組み合わせである。他の態様において、融合体は、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞、間葉系幹細胞、および周皮細胞から選択される2種以上の細胞との組み合わせである。他の態様において、融合体は、筋原細胞と、独立して、間葉系幹細胞、筋原細胞、および衛星細胞から選択される2種の細胞との組み合わせである。具体的な態様において、融合体は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、および周皮細胞；3種の造血幹細胞；筋原細胞、間葉系幹、および衛星細胞；または、3種の筋芽細胞(myoblast cells)の組み合わせである。膜融合剤(fusogenic agent)、および3体以上の異なるドナーからの、造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞、周皮細胞、衛星細胞の群から選択される3種以上のドナー細胞を包含するキットもまた提供される。
【０００６】
本発明はまた、有効量の本発明のマルチキメラ細胞を、処置を必要とする対象へ投与することによって、免疫不全または遺伝性障害を処置する方法をも提供する。いくつかの態様において、マルチキメラ細胞は、骨内の、静脈内の、または筋肉内の注射によって投与される。他の態様において、免疫不全または遺伝性障害は、骨髄不全、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症、重症複合免疫不全症(SCID)、ディジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、筋ジストロフィー、I型糖尿病、ゴーシェ病、白血病、再生不良性貧血、鎌状赤血球貧血、リンパ腫および多発性骨髄腫から選択される。筋ジストロフィーの処置へ向けられる態様において、マルチキメラ細胞は、筋原細胞と、独立して、間葉系幹細胞、筋原細胞、および衛星細胞から選択される2種以上の細胞との融合体から構成されることが好ましい。鎌状赤血球貧血の処置へ向けられる態様において、マルチキメラ細胞は、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞との融合体であることが好ましい
【０００７】
本発明は、同種異系間の造血幹細胞移植または臓器移植を受けている対象において、有効量の本発明のマルチキメラ細胞を対象へ投与することによってGvHDの発症を予防するかまたはGvHDの重症度を低減する方法をさらに提供する。本発明のこの側面に従うと、マルチキメラ細胞は、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞との融合体であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の簡単な記載
【図１】図1は、ヒトマルチキメラ細胞(MCC)を創出するためのex vivo融合手順を示す。ヒト造血幹細胞(HSC)は、少なくとも3体以上の血縁関係のあるドナーおよび/または血縁関係のないドナーから得られたものである。融合に先立ち、細胞は、PKH26(赤色)またはPKH67(緑色)、またはeFluor670(赤紫色(magenta))の色素(dyes)で夫々蛍光標識されている。蛍光標識された細胞の細胞融合は、ポリエチレングリコール(PEG)を使用して実施される。融合を経る、三重に(PKH26およびPKH67およびeFluor670)染色された細胞は、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を介して選択される。マルチキメラ(トリメラ(trimera))細胞は、移植患者または免疫不全の患者の中へ全身性-骨内注射を通して送達される。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の詳細な記載
移植治療のための、かつ免疫不全および遺伝性障害をもつ患者を処置するためのマルチキメラ細胞が今や開発された。本発明のマルチキメラ細胞は、少なくとも3種(トリメラ（trimera）)またはそれ以上(四重キメラおよび多重生成キメラ(multi-generation chimera)等々)の血縁関係にあるかおよび/または血縁関係にないドナーに由来するヒト造血幹細胞(自己および/または同種異系)の融合によって創出された(図1)。具体的に言うと、複数生成(multiple-generations)のキメラ細胞は、造血起源(hematopoietic origin)の細胞：造血幹細胞(HSCs)または臍帯血(UCB)細胞または骨髄(BM)細胞、あるいはHSCおよび/またはUCBおよび/またはBMの組み合わせのPEG媒介ex-vivo融合を介して創出された。その結果得られたマルチキメラ細胞は、それらの表面上に、複数の細胞ドナー夫々に特異的なHLA抗原を発現していた。マルチキメラ細胞によって確立された微小環境は、免疫抑制および前処置レジメンの副作用を軽減し、かつGvHDなくHSC生着を増強する。本アプローチは、様々な免疫学的障害および遺伝性障害の処置を可能にさせるであろう。
【００１０】
結果的に、本発明は、3体以上の異なるドナーからの、3種以上の造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞、周皮細胞、もしくは衛星細胞、またはそれらの組み合わせのex vivo融合の産物であるマルチキメラ細胞であって、ここで該融合は、外的な(exogenous)膜融合剤の存在下で実行される。本発明の目的(purpose)上、「マルチキメラ細胞」は、3種以上の生体細胞(親細胞)の細胞融合またはハイブリダイゼーション(全細胞(whole cell)ハイブリダイゼーション)から構築された細胞である。本発明のマルチキメラ細胞は、「マルチキメラ細胞」と称される一方、該キメラ細胞は、単細胞または細胞の集団を意味することを意図する。
【００１１】
「造血幹細胞」または「HSCs」は、B細胞、T細胞、NK細胞、リンパ系樹状細胞、骨髄樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、巨核球、および赤血球系細胞を包含する、結局は分化して造血系のすべての細胞型になることが可能なクローン原性の自己再生多能性細胞を指す。HSCsを同定するのに有用な、マーカーとなる表現型は、一般的に当該技術分野において知られている。ヒトHSCsについては、細胞のマーカーとなる表現型は、好ましくは、CD34＋ CD38− CD90(Thy1)＋Lin−を包含する。マウスHSCsについては、細胞のマーカーとなる例示の表現型は、Sca-1＋ CD90＋(例として、Spangrude, et al. (1988) Science 1:661-673を参照)またはc-kit＋ Thylo Lin− Sca-1＋(Uchida, et al. (1998) J. Clin. Invest. 101(5):961-966を参照)である。アルデヒドデヒドロゲナーゼ(Storms, et al. (1999) Proc. Nat'l Acad. Sci. 96:9118-23を参照)、AC133(Yin, et al. (1997) Blood 90:5002-12を参照)、およびCD150(SLAM)(Kiel (2005) Cell 121(7):1109-21を参照)など代替のHSCマーカーにもまた、有利な使用が見出され得る。ある態様において、造血幹細胞は、骨髄、臍帯血、および/または末梢血から単離されたものである。
【００１２】
「間葉系幹細胞」または「MSCs」は、循環系およびリンパ系中、結合組織、骨、軟骨、および細胞を生じさせ得る細胞である。間葉系幹細胞は、間葉の、緩く充填された(loosely packed)紡錘状または星状の未分化(unspecialized)細胞からなる胚体中胚葉の一部から見出される。間葉系幹細胞は従来の方法によって得られ得、以下のマーカー：CD29、CD31−、CD34−、CD44 CD45−、CD51、CD73、CD90/Thy-1、CD105、CD166、インテグリンα1、PDGF Rα、ネスチン(Nestin)、Sca-1＋、SCF R/c-Kit、STRO-1、およびVCAM-1の1以上によって同定され得る。いくつかの態様において、間葉系幹細胞は、骨髄(BM)もしくは脂肪組織(ASC)に由来するかまたはそれから得られる。具体的な態様において、間葉系幹細胞は、ヒト骨髄に由来するかまたはそれから得られる。
【００１３】
当該技術分野において従来どおり「筋原細胞(myoblast)」は、発達して筋繊維になる潜在力を有する原始筋細胞を指す。筋原細胞はデスミンおよびCD56の発現によって特徴付けられ、当該技術分野において知られている方法を使用し胎児または成体の組織から得られ得る。例として、フローサイトメトリー(例として、FACs)による粗細胞集団からの筋原細胞の単離を開示するWO 93/03768を参照。代替的に筋原細胞は、筋生検由来筋原細胞の培養において成長および増殖させること(propagating)によって得られ得る。例として、Springer, et al. (1997) In: Current Human Genetics. Unit 13.4, Boyle Ed. John Wiley & Sons, NYを参照。
【００１４】
「周皮細胞」は、本明細書に使用されるとき、微小血管壁に結び付いた多能性細胞である。先の研究によって、周皮細胞は分化して脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、およびマクロファージなどの様々な細胞型になり得ることが示された。周皮細胞は、以下のマーカー：ビメンチン、neuro-glial 2(NG2)、血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFR-β)、およびα-平滑筋アクチン(α-SMA)のうち1種の発現によって特徴付けられる。
【００１５】
「衛星細胞」は成熟筋繊維の単核筋原細胞であり、in vivoでの出生後の筋成長および再生を担っている。衛星細胞を特徴付けるのに使用されるマーカーは、これらに限定されないが、M-カドヘリン、CD34、およびc-metを包含する。衛星細胞は、知られている方法によって筋肉組織から単離されることもある(例として、US 2007/0224168を参照)。
【００１６】
本明細書に使用されるとき、ドナーは、本発明のマルチキメラ細胞の調製に使用される細胞を提供する対象である。ドナーは、好ましくは健常ドナー、すなわち遺伝性障害も遺伝性疾患も患っていない個体である。さらに、ドナーは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ等を包含するいずれの哺乳動物であってもよい。具体的な態様において、ドナーはヒトである。
【００１７】
ドナーは、対象または細胞バンクドナーの遺伝的血縁体(genetic relative)(例として、親または兄弟姉妹(sibling))であり得る。結果的に、いくつかの態様において、マルチキメラ細胞の生成に使用される1種以上の細胞は、自己のものである。他の態様において、マルチキメラ細胞の生成に使用される細胞のすべてが、自己のものである。さらなる態様において、マルチキメラ細胞の生成に使用される1種以上の細胞は、同種異系のものである。もう1つの他の態様において、マルチキメラ細胞の生成に使用される細胞のすべてが、同種異系のものである。
【００１８】
本明細書に使用されるとき「自己」は、細胞の単離および移植に関する場合、ドナーおよびレシピエントが同じ個体における細胞を指す。よって、自己の細胞は対象から回収され、次いで同じ対象へ戻される。対照的に、「同種異系の」細胞は、ドナーおよびレシピエントが同じ種からの遺伝子学的に非同一個体における細胞である。比較すると、「異種の」細胞は、ドナーおよびレシピエントが異なる種における細胞である。
【００１９】
指摘のとおり、本発明のマルチキメラ幹細胞は、3種以上の造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞、周皮細胞、もしくは衛星細胞、またはそれらの組み合わせの融合体である。いくつかの態様において、マルチキメラ幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞、周皮細胞、および衛星細胞の群から選択される3種の細胞を含むかまたはこれらからなる融合体である。他の態様において、マルチキメラ幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞、周皮細胞、および衛星細胞の群から選択される4種、5種、6種、7種、8種、9種、もしくは10種の細胞を含むかまたはこれらからなる融合体である。3種の細胞の融合体へ向けられる態様において、細胞の具体的な組み合わせは、表1に提供される。
【表１】
2021503961.tif 000003
【００２０】
4種の細胞の融合体へ向けられる態様において、4種の細胞の組み合わせは、表2に提供される。
【表２】
2021503961.tif 000004
【００２１】
いくつかの態様において、マルチキメラ幹細胞は、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞、間葉系幹細胞、および周皮細胞から選択される2種の細胞とのex vivo融合体である。具体的な態様において、マルチキメラ幹細胞は、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種の細胞とのex vivo融合体である。別の態様において、マルチキメラ幹細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、および周皮細胞のex vivo融合体である。別の具体的な態様において、マルチキメラ幹細胞は、3種の造血幹細胞のex vivo融合体である。
【００２２】
他の態様において、マルチキメラ幹細胞は、筋原細胞と、独立して、間葉系幹細胞、筋原細胞、および衛星細胞から選択される2種の細胞、またはそれらの組み合わせとのex vivo融合体である。具体的な態様において、マルチキメラ幹細胞は、筋原細胞、間葉系幹、および衛星細胞のex vivo融合体である。別の具体的な態様において、マルチキメラ幹細胞は、3種の筋原細胞のex vivo融合体である。
【００２３】
本発明のマルチキメラ幹細胞の調製に使用される細胞は単離され得、任意に精製され得る。本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、その要素が天然に存在する環境とは異なる環境中にある目的の細胞(cell of interest)を記載することが意図される。「精製された」は、本明細書に使用されるとき、細胞が産生された環境から除去され、かつ他の構成要素(細胞が天然に関連しているものか、またはそうでなければ、細胞が産生の最中に関連していたもの)が、少なくとも60％フリー（60% free）、好ましくは75％フリー（75% free）、最も好ましくは90％フリー（90% free）である細胞を指す。
【００２４】
目的の細胞の精製および/または同定は、当該技術分野において知られているいずれの手段、例えば免疫学的な手段を通しても達成され得る。組織化学的染色、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、ウェスタンブロット分析、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、密度勾配分離(例として、フィコール(登録商標)、ポリスクロース400)、免疫磁気ビーズ分離、またはそれらの組み合わせが使用されてもよい。フロー免疫細胞化学(Flow immunocytochemistry)は、細胞表面マーカーを検出するために使用されてもよく、(例えば、固定された細胞の)免疫組織化学は、細胞内マーカーまたは細胞表面マーカーのために使用されてもよい。ウェスタンブロット分析は、細胞抽出物に対して行われてもよい。酵素結合免疫吸着アッセイは、培地中へ分泌された細胞の抽出物または産物について使用されてもよい。幹細胞マーカーの同定のための抗体は、商業的供給源から、例えばChemicon International(Temecula, CA)から得られてもよい。
【００２５】
本発明のマルチキメラ幹細胞は、3体以上の異なるドナーからの3種以上の細胞を、外的な膜融合剤にex vivoで接触させること、それによって3種以上の異なるドナー細胞のex vivo融合を促進することによって調製される。「ex vivo」とは、細胞が生体の外部(outside)で操作されることを意味する。細胞融合は、3種以上の細胞を、それらの原形質膜を融合することによって、まとめて1つにするプロセスである。マルチキメラ幹細胞は、膜融合剤、ならびにこれらに限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)などの融合促進化学物質への細胞の曝露；センダイウイルスなどの不活化ウイルスの使用；および、電気刺激の使用を包含する当該技術分野において知られている方法を使用して調製され得る。センダイウイルス誘導細胞融合またはポリエチレングリコール(PEG)によって誘導される細胞融合に基づいて一般的に使用される方法の総説については、例として、Kennett (1979) Methods Enzymol. 58:345-359を参照。手短に言えば、融合されることになっている細胞は、センダイウイルスまたはPEGなどの膜融合剤とともにインキュベートされる。遠心分離または撹拌は、凝集塊および細胞膜の近い並置を促すために使用されてもよい。時間、温度、細胞濃度、および膜融合剤濃度などの変数は、各細胞組み合わせにとって最適化されていてもよい。電気融合(electro fusion)に関し、短い電気パルスは、細胞の混合物を通過し融合を刺激する。例として、Neil & Zimmermann (1993) Methods Enzymol. 220:174-196を参照。ある態様において、マルチキメラ幹細胞は、ポリエチレングリコール細胞融合によって調製される。
【００２６】
融合に先立ち、ドナー細胞はそれらの数を増加させるために、培養されても、または培養されなくてもよい。さらに、ドナー細胞は、ドナー細胞の融合を監視するために、(例として、膜色素で)標識されていても、または標識されていなくてもよい。例証として、融合の際に融合細胞が502nm、567nm、および670nmにて蛍光を発することができるように、第1のドナーからのHSCsはPKH26(567nmにて放射)で標識されており、第2のドナーからのMSCsはeFluor670(670nmにて放射)で標識されており、および第3のドナーからの周皮細胞はPKH67(502nmにて放射)で標識されている(図1)。本発明のマルチキメラ細胞を同定するために、融合細胞は、セルソーティング、例として、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を介して選択される。一旦同定されたら、マルチキメラ細胞は、細胞株として、凍結保存され、保管され、およびバンクに預けられ(banked)得る。代替的に3種以上の細胞の成功した融合は、形態学的な、表現型の、または遺伝子型の特徴付けによって査定され得る。
【００２７】
本発明のマルチキメラ幹細胞は、免疫不全および遺伝性障害を処置することにおいて具体的に使用される。結果的に、本発明はまた、マルチキメラ幹細胞を免疫不全もしくは遺伝性障害を処置するのに有効な量で含有する本発明のマルチキメラ幹細胞または組成物を対象へ投与することによって、免疫不全または遺伝性障害の処置を、これを必要とする対象においてする方法をも提供する。疾患または障害を有する対象を「処置すること」は、以下：(a)疾患の重症度を低減すること；(b)疾患または障害の進行を遅滞させること；(e)疾患または障害の悪化を阻害すること；(d)これまでに疾患もしくは障害を有していた患者における疾患または障害の再発を限定あるいは予防すること；(e)疾患または障害の退行を引き起こすこと；(f)疾患もしくは障害の症状を改善または解消すること；および、(g)生存時間(survival)を改善すること、の1以上を遂行することを意味する。いくつかの態様において、本発明の方法において使用されるは、3体以上の異なるドナーからの、3種以上の造血幹細胞、間葉系幹細胞、または筋原細胞の融合体である。
【００２８】
本発明に従って処置されてもよい免疫不全および遺伝性障害は、骨髄不全、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症、重症複合免疫不全症(SCID)、ディジョージ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、筋ジストロフィー、I型糖尿病、ゴーシェ病、白血病、再生不良性貧血、リンパ腫、および多発性骨髄腫を包含する。ある態様において、免疫不全および遺伝性障害は、骨髄不全、筋ジストロフィー、鎌状赤血球貧血、白血病、およびI型糖尿病から選択される。他の態様において、遺伝性障害は、筋ジストロフィーである。
【００２９】
筋ジストロフィーは、運動を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性によって特徴付けられる一群の遺伝的疾患である。筋ジストロフィーの例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯筋ジストロフィー、筋緊張性(Myotonic)筋ジストロフィー、顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュス型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー、三好ミオパチー、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、シュタイネルト(Steinert)の筋ジストロフィーを包含する。ある態様において、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)である。具体的な態様において、筋ジストロフィーは、筋原細胞と、独立して、間葉系幹細胞、筋原細胞、および衛星細胞から選択される2種以上の細胞との融合体であるマルチキメラ細胞で処置される。
【００３０】
別の態様において、免疫不全または遺伝性障害は、鎌状赤血球貧血である。この態様に従うと、鎌状赤血球貧血は、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞との融合体であるマルチキメラ細胞で処置される。
【００３１】
本発明のマルチキメラ細胞が、臓器およびHSCの移植という文脈において免疫寛容を生じさせる効果および免疫調節効果(tolerogenic and immunomodulatory effects)を提供する限りにおいて、本発明はまた、同種異系間の造血幹細胞移植または臓器移植を受けている対象において、GvHDの発症を予防するかまたはGvHDの重症度を低減する方法をも包含する。当該技術分野において知られているように、「移植片対宿主応答（Graft-versus-host response）」または「GVH」もしくは「GVHD」は、異なるMHCクラスのリンパ球が宿主中へ導入されたときに生じる細胞応答を指し、宿主に対してリンパ球の反応をもたらす。この方法に従うと、同種異系間の造血幹細胞移植または臓器移植を受けている対象は、GvHDの発症を予防するかまたはGvHDの重症度を低減するのに有効な量のマルチキメラ細胞が投与される。
【００３２】
マルチキメラ細胞は、個別に対象へ投与されてもよく、および/または造血幹細胞移植または臓器移植の一部として包含されてもよい。本発明のマルチキメラ細胞での処置は、有意に、GvHDの発生およびその重症度を低減し得、および同種移植術片拒絶を予防し得、免疫応答を向上し得、および/または移植患者における生涯にわたる免疫抑制の必要性を低減/解消し得る。この点において、本発明のマルチキメラ細胞は、皮膚、爪、口、目、女性器、胃腸管、肝臓、肺、筋肉、筋膜、関節等を包含する様々な臓器および系のGvHD関連の症状ならびに兆候の発症を予防するのに使用される。具体的な態様において、GvHDは、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞との融合体であるマルチキメラ細胞で処置される。
【００３３】
本明細書の処置の方法に従うと、マルチキメラ細胞または同細胞を含有する組成物は、処置を必要とする対象へ投与される。いくつかの態様において、本発明のマルチキメラ細胞の組み合わせが投与され得る。マルチキメラ細胞または細胞の組み合わせは、生着によって投与され得るが、ここで細胞は、対象中へ、例えば、静脈内に、筋肉内に、動脈内に、骨内等に注射される。具体的な態様において、マルチキメラ幹細胞は、骨内の、静脈内の、または筋肉内の注射によって投与される。ある態様において、投与は、約102、104、106、107、108、109、1010、1012、またはそれ以上の細胞を生着させることを伴う。生着させる細胞数は、細胞が生着されるための投与ルートおよび/または疾病(condition)の重症度に基づき選ばれてもよい。有利なことに、本発明のマルチキメラ幹細胞は、成功裏に生着し、および遺伝的な/免疫原性の欠陥を補完し、ならびに臓器およびHSCの移植という文脈において免疫寛容を生じさせる効果および免疫調節効果を提供する。
【００３４】
マルチキメラ細胞またはマルチキメラ細胞の組み合わせを含有する組成物は、細胞または細胞の組み合わせを、薬学的に許容し得る担体または水性媒体と組み合わせることによって調製され得る。句「薬学的にまたは薬理学的に許容し得る」は、動物またはヒトへ投与されたとき、薬害(adverse)反応も、アレルギー反応も、他の厄介な(untoward)反応も産生しない分子実体および組成物を指す。本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容し得る担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング剤(coatings)、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤(isotonic)等を包含する。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および剤の使用は、当該技術分野において周知である。従来のいずれかの媒体または剤が本開示の細胞と不適合である(incompatible)限りを除き、治療組成物におけるその使用が企図される。医薬組成物は、例えば、意図する投与ルート、送達形式、および所望の投薬量に応じて、当業者によって投与され得る。例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012を参照。
【００３５】
本発明の組成物は、注射可能な製剤中に組み込まれ得る。製剤はまた、必要な、生理学的に許容し得る担体材料、賦形剤、潤滑剤、緩衝剤、界面活性剤、抗細菌、増量剤(マンニトールなど)、抗酸化剤(アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム)等を包含していてもよい。
【００３６】
許容し得る製剤材料は、好ましくは、採用される投薬量および濃度ではレシピエントに対して非毒性である。医薬組成物は、例えば、組成物のpH、モル浸透圧濃度、粘度、透明さ、色、等張性、匂い、無菌状態、安定性、溶解もしくは放出、吸着もしくは浸透の速度を修飾、維持、または持続する(preserving)ために製剤材料を含有していてもよい。好適な製剤材料は、これらに限定されないが、アミノ酸(グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシンなど)；抗微生物；抗酸化剤(アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウムなど)；緩衝剤(ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス-HCl、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸など)；増量剤(マンニトールもしくはグリシンなど)；キレート剤(エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)など)；錯化剤(カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリンなど)；充填剤；単糖類、二糖類、および他の炭水化物(グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど)；タンパク質(血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど)；着色料、フレーバー剤、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー(ポリビニルピロリドンなど)；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン(ナトリウムなど)；防腐剤(塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など)；溶媒(グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど)；糖アルコール(マンニトールもしくはソルビトールなど)；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤(PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20およびポリソルベート80などのポリソルベート、TRITON(登録商標)(界面活性剤)、トリメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサパールなど)；安定性増強剤(stability enhancing agents)(スクロースもしくはソルビトールなど)；等張化増強剤(tonicity enhancing agents)(アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、もしくはソルビトールなど)；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および/または医薬アジュバントを包含してもよい。例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Idを参照。
【００３７】
医薬組成物中の主なビヒクルまたは担体は、水性または非水性のいずれかの性質であってもよい。例えば、好適なビヒクルまたは担体は、おそらく非経口投与用の組成物によく見られる他の材料で補充された、注射用の水、生理食塩溶液(physiological saline solution)、または人工の脳脊髄液であってもよい。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水は、さらなる例示のビヒクルである。医薬組成物は、約pH 7.0〜8.5のトリス緩衝剤または約pH 4.0〜5.5の酢酸塩緩衝剤を含み得るが、これらは、ソルビトールまたはその好適な代替物(substitute)をさらに包含していてもよい。本発明の医薬組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、任意の製剤化剤(formulation agents)(Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Id.)と混合することによって、凍結乾燥されたケーク(cake)または水性溶液の形態で保管するために調製されてもよい。
【００３８】
細胞または組成物は、持続放出システムによって、カプセル化によって、または埋め込みデバイスによって、提供され得る。組成物は、ボーラス注射によって、もしくは注入によって絶え間なく、または埋め込みデバイスによって、投与されてもよい。組成物はまた、膜、海綿、または別の適切な材料(これらの上へ、細胞(単数)または細胞(複数)が吸収またはカプセル化されている)の埋め込みを介して局部的にも投与され得る。埋め込みデバイスが使用される場合、デバイスは、いずれの好適な組織または臓器中へ埋め込まれていてもよい。注射は、1回の処置として与えられ、所望される治療効果を獲得するために繰り返されてもよい(毎日、毎週、毎月、毎年等々)。
【００３９】
パーキンソン病(Tresco, et al. (1992) ASAIO J. 38:17-23)または筋萎縮性側索硬化症(Aebischer, et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7:851-860)の処置において、カプセル化された細胞の移植を可能にさせる細胞カプセル化の方法論が、これまでに記載されてきた。この態様に従うと、細胞は、微多孔膜を形成する化合物によってカプセル化されている。目的の細胞を含有するカプセル(例えば、およそ長さ1cm)は、ポリ-エーテル-スルホン(PES)から製作された中空微多孔膜を採用して調製されていてもよい(Akzo Nobel Faser AG, Wuppertal, Germany; Deglon, et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7:2135-2146)。
【００４０】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントをも含有していてもよい。微生物作用の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の包含によって確保され得る。たとえば、糖、塩化ナトリウム等の等張剤を包含することもまた、所望されることもある。
【００４１】
補助的な(supplementary)活性成分もまた、組成物中へ組み込まれ得る。本開示の活性組成物は、古典的な医薬調製物を包含していてもよい。これらの組成物の投与は、本開示に従うと、そのルートを介して標的組織が利用可能(available)である限り、いずれの一般的なルートをも介するであろう。
【００４２】
本明細書に使用されるとき、用語「有効な量」、「有効量」、または「治療的に有効な量」は、所望の結果を達成するのに充分な細胞または組成物の量を指す。「有効量」または「治療的に有効な量」を構成する(consititutes)細胞または組成物の量は、疾患の重症度、処置されることになっている患者の状態(condition)、重量、もしくは年齢、投薬の頻度、または投与ルートに応じて変動することもあるが、当業者によって定型的に決定され得る。臨床医は、最適な治療効果をえるための投薬量または投与ルートをタイターする（titer）こともある。
【００４３】
本発明はまた、免疫不全もしくは遺伝性障害の処置および/またはGvHDを予防もしくは緩和するためのキットにも向けられる。キットは、本明細書に記載の独創的な(inventive)方法を実践するのに有用である。キットは、独創的な組成物の少なくとも1つを包含する材料または構成要素の集合体である。よって、いくつかの態様において、キットは、ex vivo細胞融合を実行するための膜融合剤、および異なるドナーからの造血幹細胞、間葉系幹細胞、筋原細胞、周皮細胞、衛星細胞の群から選択される3種以上のドナー細胞(例として、細胞バンクからのドナー細胞)、および任意に、上に記載のとおりのドナー細胞を得るための材料を包含している。
【００４４】
独創的なキットにおいて構成されている(configured)構成要素の正確な性質は、その本来の目的に依存する。例えば、いくつかの態様は、筋ジストロフィーを処置する目的のために構成されている。一態様において、キットは、具体的にヒト対象を処置する目的のために構成されている。別の態様において、キットは、具体的に成体のヒト対象を処置する目的のために構成されている。別の態様において、キットは、具体的に子どもらを処置する目的のために構成されている。別の態様において、キットは、具体的にDMDを処置する目的のために構成されており、筋原細胞と、独立して、間葉系幹細胞、筋原細胞、および衛星細胞から選択される2種以上の細胞とを包含し得る。別の態様において、キットは、具体的にGvHDを処置する目的のために構成されており、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞とを包含し得る。別の態様において、キットは、具体的に鎌状赤血球貧血を処置する目的のために構成されており、造血幹細胞と、独立して、造血幹細胞および間葉系幹細胞から選択される2種以上の細胞とを包含し得る。別の態様において、キットは、具体的に継続的な日常使用の投薬量を提供する目的のために構成されている。別の態様において、キットは、具体的に随時使用の投薬量を提供する目的のために構成されている。さらなる態様において、キットは、これらに限定されないが、家畜(farm animals)、飼育動物(domestic animals)、および実験動物などの対象を処置する獣医学用途のために構成されている。
【００４５】
使用のための指示が、キット中に包含されていてもよい。「使用のための指示」は、典型的には、筋ジストロフィーを処置するか、鎌状赤血球貧血を処置するか、またはGvHDを処置するなど、所望の成果に影響を及ぼす、キット構成要素の使用において採用される技法を記載する有形の表現を包含する。任意に、キットはまた、希釈剤、緩衝剤、薬学的に許容し得る担体、シリンジ、カテーテル、アプリケーター、ピペット操作用(pipetting)もしくは測定用(measuring)ツール、包帯材料などの他の有用な構成要素、または当業者によって容易に認識されるであろう他の有用な道具一式をも含有する。
【００４６】
キット中に集められた材料または構成要素は、それらの操作性および実用性を持続させるいずれの便利かつ好適な形でも保管されて、実践者へ提供され得る。例えば、構成要素は、溶解形態、脱水形態、または凍結乾燥形態であり得る；それらは、室温、冷蔵温度、または冷凍温度にて提供され得る。構成要素は、典型的には、好適なパッケージング材料(単数または複数)中に含有されている。本明細書に採用されるとおり、句「パッケージング材料」は、キットの内容物を収納するのに使用される1以上の物理的な構造体を指す。パッケージング材料は、好ましくは夾雑物のない滅菌された環境を提供するために、周知の方法によって構築されている。キット中に採用されるパッケージング材料は、治療的な処置において習慣的に利用されているものである。本明細書に使用されるとき、用語「パッケージ」は、個々のキット構成要素を保持することが可能な、たとえば、ガラス、プラスチック、紙、箔等の好適な固体マトリックスまたは材料を指す。パッケージング材料は、一般に、内容物、および/または、キットおよび/またはその構成要素の目的を表示する外側の標識を有する。
【００４７】
以下の非限定例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【００４８】
例1：ヒトマルチキメラ細胞のEx Vivo生成
マルチキメラ細胞(MCC)を、3体以上の血縁関係にあるかおよび/または血縁関係にないドナーからの、ならびに1種以上の造血幹細胞の供給源、すなわち骨髄(「BM」)、末梢血(「PB」)、および/または臍帯血(「UCB」)、例として、市販の供給源からの、ヒト造血細胞のex vivo細胞融合によって生成する。
【００４９】
単核細胞を、3体の血縁関係にないドナーから単離、精製した。続いて、3体のドナーからの単核細胞を各々、異なる蛍光細胞膜色素(すなわちPKH 26およびPKH 67およびCELLVUE(登録商標)Claret(近赤外蛍光色素)；Sigma Aldrich)で事前染色した(pre-stained)。蛍光標識された細胞を1:1:1の比率で混合し、ポリエチレングリコールを使用して融合させた。三重染色に基づき、MCCをソートした(sorted)(純度80〜90％)。
【００５０】
融合を確認するため、三重標識された(PKH26、PKH67、およびCELLVUE(登録商標)Claret)キメラ細胞を、共焦点顕微鏡法およびフローサイトメトリーを使用して評価する。マルチキメラ細胞の生存率、遺伝子型および表現型の安定性を、標準的なアッセイを使用して評価した。とりわけ、ショートタンデムリピート(short tandem repeat)PCRを遺伝子型の特徴付けのために使用した。これらの分析結果を表3に提示する。
【表３】
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【００５１】
目下、免疫抑制の副作用およびGvHDの発症もなく、臓器およびHSCの移植をサポートする利用可能な治療はない。マルチキメラ細胞治療は、臓器およびHSCの移植拒絶反応を予防するのに要求される免疫調整プロトコルの副作用の除去に多大な影響を有するであろう。この治療は、移植患者の寿命および生活の質を有意に増大させるであろう。HSC移植の最も制限されかつ危険な合併症であるGvHDのリスクは、マルチキメラ細胞で処置された患者において有意に減少するであろう。免疫特権のある(immuno-privileged)キメラ細胞での治療は、より有効なHSCの生着および骨髄(BM)区画の再構成を提供し、よって免疫寛容の誘導ならびに移植レシピエントおよび免疫不全患者のより良好な成果に繋がるであろう。
【００５２】
MCCsのユニークな特徴は、造血マーカーおよび/または親細胞の他のマーカー(例として、筋原細胞)ならびに免疫寛容原性サイトカインの、それらの発現能を包含する。加えて、キメラ細胞は、凍結保存され、保管され、およびバンクに預けられ得、これによって、緊急の(acute)治療ならびに追加的(boosting)かつ長期的な治療のために、これらを即時に入手可能なものにさせる。これらのユニークな特性に起因して、MCC治療は、他の幹細胞をベースとしたストラテジーに対して重要な利点を有する。
【００５３】
例2：ヒト臍帯血細胞の融合および表現型の特徴付け
血縁関係にない3体のドナーからのヒトUCB細胞の30の個々の融合を図1に示されるとおり実施した。共焦点顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって、ex vivo融合が生じたことが、三重(PKH26/PKH67/eFluor 670)蛍光標識されたMCCsの存在によって確認された。MCCsの表現型の追加の特徴もまた評価した。とりわけ、ex vivo融合手順は、対照(すなわちeFluor670増殖色素標識されたUCB細胞)と比較しても、MCCsによるCD4、CD90、CD45、およびCD19の発現を変化させなかったことが見出された。さらにまた、MCCsの90〜95％は、トリパンブルー染色によって決定されるとおり、生存能力があった。増殖性の特性を、多中心性の(multicentric)、多能性の(multipotential)顆粒球・赤芽球・マクロファージ・巨核球コロニー形成単位(granulocyte, erythroid, macrophage, megakaryocyte colony forming units)(CFU-GEMM)、顆粒球コロニー形成単位(CFU-G)、顆粒球-マクロファージコロニー形成単位(CFU-GM)、マクロファージコロニー形成単位(CFU-M)、および赤芽球バースト形成単位(BFU-E)アッセイを包含するin vivoでのコロニー形成単位アッセイによって決定した。血清学的HLAタイピングを使用するMCCsの遺伝子型分析によって、MCCの遺伝物質(genetic material)中に、血縁関係にない3体のドナー各々に特異的なアレルが存在していたことが確認された(表4)。
【表４】
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【００５４】
STR PCRを使用するMCCsの遺伝子型分析によって、MCCの遺伝物質中に、血縁関係にない3体のドナー各々に特異的なマーカーが存在していたことがさらに確認された(表5)。
【表５】
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【００５５】
NSGマウスモデルにおけるMCCsの腫瘍原性もまた評価した。表6に概説されるとおり、マウスにMCCを骨内(IO)または静脈内(IV)ルートを介して投与した。
【表６】
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【００５６】
注射後90日でのNSGマウスの臨床的所見によって、動物は、正常な重量増、正常な毛皮をもち、腫瘍状の成長(触診によって決定されたとおり注射部位での腫瘍状の成長を包含する)はなく、活発であったことが指し示された。さらに、細胞送達から90日後のNSGマウスの磁気共鳴画像法(MRI)によって、血縁関係にない3体のドナーに由来する非融合ヒト臍帯血細胞の混合物を受けているマウスまたは融合MCCを受けているマウスにおいて腫瘍状の構造体はなかったことが指し示された。
【図１】
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【国際調査報告】
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