(57)【要約】  ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体；又はＷＵＣＡＭ又はＶｓｔｍ３）に特異的に結合し、免疫細胞におけるＴＩＧＩＴ媒介性細胞シグナル伝達及び活動を阻害する抗体が提供される。癌、感染症、又はＴＩＧＩＴ媒介性機能によって調節されうる他の病理学的障害を治療又は診断するために、抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号３、４、５及び１３から選択される１つ、２つ若しくは３つのＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は
（ｂ）配列番号６、７及び８から選択される１つ、２つ又は３つのＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、ヒトＴＩＧＩＴに結合することができる抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
（ａ）配列番号３のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号６のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
（ｂ）配列番号３のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列番号６のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
抗体がヒト化抗体分子である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号９、１４又は１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
配列番号１１、１６又は２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｇ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｈ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、又は
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、又は
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
抗体が（ａ）〜（ｃ）の１つ以上を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：
（ａ）配列番号１４の２４位にスレオニンからアラニンへの変異を有する重鎖、
（ｂ）配列番号１４の３７位にイソロイシンからバリンへの変異を有する重鎖、
（ｃ）配列番号１６の５８位にバリンからイソロイシンへの変異を有する軽鎖。
【請求項１０】
抗原結合フラグメントがＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又は単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のサブクラスの重鎖定常領域又はその変異体、及びκタイプ若しくはλタイプの軽鎖定常領域又はその変異体を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学上許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
更に第２の治療剤を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
免疫応答の刺激に有効な量の請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の免疫応答を刺激する方法。
【請求項１５】
癌又は腫瘍の治療に有効な量の請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、癌又は腫瘍を治療する方法。
【請求項１６】
第２の治療剤又は処置との組み合わせて抗体又はその抗原結合フラグメントが投与され、前記第２の治療剤又は処置が化学療法、標的療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害剤、免疫療法、サイトカイン、外科的処置、放射線処置、共刺激性分子の活性化剤、阻害性分子の阻害剤、ワクチン、又は細胞性免疫療法から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
感染症の治療に有効な量の請求項１に記載の抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、感染症を治療する方法。
【請求項１８】
感染症がウイルス性感染症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌、腫瘍又は感染症を治療のための医薬の製造における、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１２月３０日に出願された特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１２０３９２の優先権を主張する。前記特許出願のすべての内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本出願は、ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）に特異的に結合する抗体、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）は、１型膜貫通タンパク質であり、抗腫瘍免疫においてＴ細胞及びＮＫ細胞媒介性機能的活性を阻害する重要な役割を果たすタンパク質のＣＤ２８ファミリーのメンバーである（Boles KS, et al., 2009 Eur J Immunol, 39:695-703；Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106:17858-63；Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10:48-57）。
【０００４】
ＴＩＧＩＴをコードする遺伝子及びｃＤＮＡは、マウス及びヒトでクローン化され、特徴付けられた。全長ヒトＴＩＧＩＴは、長さ２４４アミノ酸の配列（配列番号１）を有し、その最初の２１アミノ酸はシグナルペプチドである。成熟したヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸配列は、２２３アミノ酸（ａａ）残基（ＮＣＢＩアクセッション番号：NM_173799）を含む。成熟したヒトＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、１２０アミノ酸残基（配列番号２：配列番号１の２２位〜１４１位のアミノ酸に対応）と、ＶタイプのＩｇ様ドメイン（配列番号１の３９位〜１２７位のアミノ酸に対応）と、続いて２１アミノ酸膜貫通配列と、８２アミノ酸細胞質ドメインと、免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）で構成されている（Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10:48-57；Stengel KF, et al. 2012 PNAS 109:5399-04）。ＥＣＤ内で、ヒトＴＩＧＩＴは、マウス及びカニクイザルとそれぞれ５９％及び８７％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【０００５】
ＴＩＧＩＴは、Ｔ細胞（活性化Ｔ細胞、メモリＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、濾胞性Ｔヘルパー（Ｔｆｈ）細胞）上に、及びＮＫ細胞上に発現される（Boles KS, et al., 2009 Eur J Immunol, 39:695-703；Joller N, et al., 2014 Immunity 40:569-81；Levin SD, et al., 2011 Eur J Immunol, 41:902-15；Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106:17858-63；Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10:48-57）。
【０００６】
これまで、２つのＴＩＧＩＴリガンド、ＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体又はＰＶＲとしても知られている）及びＣＤ１１２（ポリオウイルス受容体関連２、ＰＶＲＬ２又はネクチン−２としても知られている）が特定されている。これらのリガンドは、主にＡＰＣ（樹状細胞、マクロファージ等）上に、及び腫瘍細胞上に発現される（Casado JG, et al., 2009 Cancer Immunol Immunother 58:1517-26；Levin SD, et al., 2011 Eur J Immunol, 41:902-15；Mendelsohn CL et al., 1989 56:855-65；Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106:17858-63；Yu X, et al. 2009 Nat. Immunol, 10:48-57）。免疫「チェックポイント」分子として、ＴＩＧＩＴは、そのリガンドのＣＤ１５５及びＣＤ１１２で結合されると、免疫細胞内で抑制性シグナル伝達を引き起こす。ＴＩＧＩＴのＣＤ１５５への結合親和性（Ｋｄ：約１ｎＭ）は、ＣＤ１１２への結合親和性よりも非常に高い。ＴＩＧＩＴ：ＣＤ１１２の相互作用が抑制性シグナルの仲介に機能的に関係するかは、まだ確定されていない。共刺激性受容体であるＣＤ２２６（ＤＮＡＭ−１）は、低い親和性（Ｋｄ：約１００ｎＭ）で同じリガンドに結合するが、陽性シグナルを提供する（Bottino C, et al., 2003 J Exp Med 198:557-67）。加えて、「ＴＩＧＩＴ様」受容体であるＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）も、同じ経路で同様の抑制性の役割を果たす（Chan CJ, et al., 2014 Nat. Immunol 15:431-8）。
【０００７】
ＴＩＧＩＴは、異なるメカニズムを介して免疫応答を阻害することができる。第１に、樹状細胞（ＤＣ）上でのＴＩＧＩＴとＰＶＲの相互作用によって、ＤＣ内で「リバースシグナル伝達」が提供され、ＩＬ−１０のアップレギュレーションとＩＬ−１２分泌の減少がもたらされ、それによってＴ細胞の活性化が抑制される（Yu X, et al. Nat Immunol. 2009 10:48-57）。第２に、ＴＩＧＩＴがより高い親和性でＣＤ１５５に結合し、それによってＤＮＡＭ−１−ＣＤ１５５の相互作用を外して競合する。第３に、Ｔ細胞上へのＴＩＧＩＴの直接の連結がＴＣＲ媒介性活性化をダウンレギュレーションすることができ、それに続くＮＫ細胞上でのＴＩＧＩＴの増殖と会合がＮＫ細胞の細胞毒性を阻止することができる（Joller N, et al. 2011 186: 1338-42；Stanietsky N, et al., 2009 PNAS 106:17858-63）。第４に、Ｔｒｅｇ細胞上のＴＩＧＩＴ発現が、腫瘍組織での高度に活性化された抑制性の表現型と関連付けられ、Ｔｒｅｇ細胞内のＴＩＧＩＴシグナル伝達がＴｒｅｇ細胞の安定性に好都合でありうる（Joller N, et al. Immunity 2014 40:569-81；Kurtulus S, et al. J Clin Invest. 2015 125: 4053-4062）。
【０００８】
ＴＩＧＩＴは、免疫グロブリンテールチロシン（ＩＴＴ）様のモチーフに続いて、その細胞質側テイル内の免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する（Yu X, et al. Nat Immunol. 2009 10:48-57；Engels N, et al. Curr Opin Immunol 2011 23: 324-329）。これらのモチーフは、ホスファターゼＳＨＩＰ−１とβ−アレスチン２の補充を仲介することができ（Li M, et al. J Biol Chem. 2014 289:17647-17657；Liu S, et al. Cell death and differentiation 2013 20: 456-464）、それによって、ＴＩＧＩＴが本質的に抑制性シグナルを提供して活性化シグナルを弱めるメカニズムを提供する。
【０００９】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＴＩＧＩＴ発現のアップレギュレーションは、肺癌（Tassi, et al., Cancer Res. 2017 77: 851-861）、食道癌（Xie J, et al., Oncotarget 2016 7:63669-63678）、乳癌（Gil Del Alcazar CR, et al. 2017 Cancer Discov.）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22:3057-66）と黒色腫（Chauvin JM, et al., J Clin Invest. 2015 125:2046-2058）等の多種類の癌で報告されている。ＡＭＬでのＴＩＧＩＴの発現増加は、患者の生存成績の予後不良に関連する（Kong Y et al., Clin Cancer Res. 2016 22:3057-66）。ＴＩＧＩＴシグナル伝達のアップレギュレーションは、癌に対する免疫寛容だけでなく、慢性ウイルス感染に対する免疫寛容にも、重要な役割を果たす。ＨＩＶ感染の間、Ｔ細胞上でのＴＩＧＩＴの発現は、著しく高く、ウイルス量及び疾患の進行と正の相関があった（Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349）。更に、ＴＩＧＩＴ受容体を単独で又は他の遮断と組み合わせて遮断することによって、インビトロ及びインビボの両方で機能的に「使い果たされた」Ｔ細胞を救済することができる（Chauvin JM, et al., J Clin Invest. 2015 125:2046-2058；Chew GM, et al., 2016 PLoS Pathog. 12:e1005349；Johnston RJ, et al. Cancer Cell 2014 26:923-937）。癌及びウイルス感染の場合、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の活性化は免疫細胞の機能不全を促進し、癌の増殖又はウイルス感染の拡大を引き起こす。治療剤によるＴＩＧＩＴ媒介性抑制性シグナル伝達の阻害は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）を含む免疫細胞の機能的な活性を回復させ、従って、癌又は慢性ウイルス感染に対する免疫を増強させることができる。
【００１０】
従って、拮抗分子によるＴＩＧＩＴシグナル伝達の調節によって、免疫細胞が寛容から救われ、腫瘍又は慢性ウイルス感染を根絶するための効率的な免疫応答が誘発されうる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、少なくとも一部は、免疫細胞内のＴＩＧＩＴ媒介性細胞内シグナル伝達を阻害し、免疫細胞を再活性化し、特異的にＴＩＧＩＴに結合することで免疫を高めるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のセットの発見に基づく。従って、最初の側面において、本出願は、ヒトＴＩＧＩＴ（配列番号１）に結合することができる抗ＴＩＧＩＴ抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。本発明はまた、最初の側面の抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのヒト化型に関する。
【００１２】
特別の態様において、本出願の抗体は、配列番号３、４、５及び１３又は１つ以上の保存的置換（例えば、配列番号３、４、５又は１３のアミノ酸配列の１つ又は２つの保存的置換）を含むそれらの変異体から選択されるアミノ酸配列を有する、１つ、２つ若しくは３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び／又は、配列番号６、７及び８又は１つ以上の保存的置換（例えば、配列番号６、７又は８アミノ酸配列の１つ又は２つの保存的置換）を含むそれらの変異体から選択されるアミノ酸配列を有する、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００１３】
より具体的な態様において、本出願の抗体は、配列番号３又は１つ以上の保存的置換（例えば、１つ又は２つの保存的置換）を含むその変異体のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ１、配列番号４若しくは配列番号１３又は１つ以上の保存的置換（例えば、１つ又は２つの保存的置換）を含むそれらの変異体のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号５又は１つ以上の保存的置換（例えば、１つ又は２つの保存的置換）を含むその変異体のアミノ酸配列を有するＶＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び／又は、配列番号６又は１つ以上の保存的置換（例えば、１つ又は２つの保存的置換）を含むその変異体のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ１、配列番号７又は１つ以上の保存的置換（例えば、１つ又は２つの保存的置換）を含むその変異体のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ２、及び配列番号８又は１つ以上の保存的置換（例えば、１つ又は２つの保存的置換）を含むその変異体のアミノ酸配列を有するＶＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００１４】
本出願の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＩＧＩＴに結合することができ、配列番号９、１４及び１９から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号９、１４若しくは１９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。１つの態様において、配列の相違はフレームワーク領域にある。１つの態様において、本抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、１５及び２０、又はその変異体から選択されるヌクレオチド配列でコードされる重鎖可変領域を含む。
【００１５】
本出願の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＩＧＩＴに結合することができ、配列番号１１、１６、２１及び２４から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１１、１６、２１若しくは２４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。１つの態様において、配列の相違はフレームワーク領域にある。１つの態様において、本抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１２、１７及び２２、又はその変異体から選択されるヌクレオチド配列でコードされる重鎖可変領域を含む。
【００１６】
１つの態様において、本抗体又はその抗原結合フラグメントは、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１２ＭのＫｄ値でヒトＴＩＧＩＴに結合することができる。例えば、本抗体又は抗原結合そのフラグメントは、約１×１０−９Ｍ未満、約１×１０−１０Ｍ未満、約１×１０−１１Ｍ未満、又は約１×１０−１２Ｍ未満のＫｄ値でヒトＴＩＧＩＴに結合することができる。
【００１７】
１つの態様において、本抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４のサブクラスの重鎖定常領域又はその変異体、及びκタイプ若しくはλタイプの軽鎖定常領域又はその変異体を含む。より具体的な態様において、本抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ又はその変異体、例えば、配列番号１８のＦｃ領域である。
【００１８】
１つの態様において、本抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗原特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの生成を促進する。より具体的な態様において、本抗体又は抗原結合フラグメントは、用量依存的に抗原特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの生成を促進する。
【００１９】
より具体的な態様において、本出願の抗体は、ＦｃγＲ媒介性トロゴサイトーシス、特にＦｃγＲＩＩＢ媒介性トロゴサイトーシスを介して、ＴＩＧＩＴ受容体の表面発現を低下させる。
【００２０】
１つの態様において、本出願の抗体はｐＨ依存的な抗原結合を示し、本抗体は、生理学的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）でのヒトＴＩＧＩＴへの結合と比較すると、腫瘍の微小環境での穏やかな酸性ｐＨ（例えばｐＨ６．０）でヒトＴＩＧＩＴに対してより強い結合を示す。より具体的な態様において、本出願の抗体は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）又は類似の技術で測定した際、（１）２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上よりも大きいｐＨ７.４／ｐＨ６．０のＫＤ比、及び／又は（２）ｐＨ７．４でのＲｍａｘ（ＲＵ）値よりも、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍高いｐＨ６．０でのＲｍａｘ（ＲＵ）値を有する。
【００２１】
本明細書に開示される抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂは、癌の治療、ウイルス感染、及び免疫寛容又は「疲弊」に機構的に関与する他のヒトの疾患をの制御する潜在的な治療用途を有する。従って、更なる態様において、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、癌の治療に使用するためのものである。別の具体的な態様において、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、感染の治療、感染症の治療、及び／又はウイルス感染の制御に使用するためのものである。別の具体的な態様において、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、免疫寛容に関連する、若しくは免疫寛容によって引き起こされる他のヒトの疾患の治療、又は免疫細胞の活性化を上昇させることで改善することができる疾患の治療に使用するためのものである。
【００２２】
更なる側面において、本出願は、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、薬学上許容される賦形剤を含む、組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＴＩＧＩＴ−ｍＩｇＧ２ａ（上段）とＴＩＧＩＴ−ｈｕＩｇＧ１（下段）の概略図である。ＴＩＧＩＴ ＥＣＤ：ＴＩＧＩＴ細胞外ドメイン。Ｎ：Ｎ末端。Ｃ：Ｃ末端。
【図２Ａ】抗ＴＩＧＩＴ抗体Ｖｈ領域の系統樹である。候補の抗ＴＩＧＩＴ抗体のＶｈ配列は、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを用いて整列された。配列相同性が系統樹に示される。
【図２Ｂ】抗ＴＩＧＩＴ抗体Ｖκ領域の系統樹である。候補の抗ＴＩＧＩＴ抗体のＶκ配列は、ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを用いて整列された。配列相同性が系統樹に示される。
【図３】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による精製されたネズミ抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和性の決定を示す。
【図４】フローサイトメトリーによるＴＩＧＩＴ結合の決定を示す。
【図５】図５Ａは、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂによるＴＩＧＩＴリガンドの相互作用の阻害を示す概略図である。図５Ｂは、ＴＩＧＩＴリガンド発現ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ＰＶＲ又はＨＥＫ２９３／ＰＶＲ−Ｌ２）への可溶性ＴＩＧＩＴ（ＴＩＧＩＴ−ｈｕＩｇＧ１融合タンパク質）の結合を、フローサイトメトリーで決定した。ＴＩＧＩＴ−リガンドの相互作用の遮断を、連続希釈された抗ＴＩＧＩＴ抗体を加えることで定量的に測定した。その結果をデュプリケートの平均±ＳＤで示した。
【図６】抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂによるＣＭＶ特異的ヒトＴ細胞の活性化を示す。ヒトＣＭＶペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ，４９５〜５０３）で感作されたＨＬＡ−Ａ２．１＋ ＰＢＭＣ（４×１０４）を、抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下、ＣＭＶペプチドでパルスされた標的細胞であるＨＣＴ１１６細胞（１０４）で一晩刺激した。培養上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで決定した。すべての条件はトリプリケートで実行された。その結果を平均±ＳＤで示した。
【図７】抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂは、ＮＫ細胞媒介性細胞毒性を促進する。図７Ａは、設計されたＮＫ９２ＭＩ／ＴＩＧＩＴ−ＤＮＡＭ−１安定細胞株上のＴＩＧＩＴ及びＤＮＡＭ−１の発現を示す。図７Ｂでは、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆ（０．００７〜３０μｇ／ｍｌ）の存在下でのＳＫ−ＭＥＳ−１／ＰＶＲ細胞に対するＮＫ９２ＭＩ／ＴＩＧＩＴ−ＤＮＡＭ−１細胞の死滅を、実施例８に記載されたＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）放出アッセイで決定した。その結果をトリプリケートの平均±ＳＤで示した。
【図８】抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｗｔは、ＦｃγＲ媒介性トロゴサイトーシスを介して、ＴＩＧＩＴ受容体の表面発現を低下させる。Ｊｕｒｋａｔ／ＴＩＧＩＴ細胞を、完全培地中、ビオチン標識抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの存在下、ＦｃγＲ発現ＨＥＫ２９３細胞と共に、一晩、インキュベートした。一部のケースでは、１０％のヒトＡＢ血清を加え、トロゴサイトーシスに対する大量のヒトＩｇＧの影響を決定した。ＴＩＧＩＴ受容体の表面発現を、ＳＡ−ＡＰＣ（Biolegend）で染色することで決定した。ＭＦＩをフローサイトメトリーで決定した。すべてのデータポイントはデュプリケートであった。その結果を平均値±ＳＤで示した。
【図９】ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのＡＤＣＣ効果を示す。図９Ａにおいて、健康なドナーからのＰＨＡ刺激ＰＢＭＣのＴＩＧＩＴ発現を、フローサイトメトリーで決定した。ＣＤ４＋（ＣＤ４＋ Ｆｏｘｐ３−）エフェクターＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ細胞、ＣＤ４＋ Ｆｏｘｐ３＋）はすべて、有意なレベル（１８〜４１％）のＴＩＧＩＴを発現した。示されたデータは、３人の健康なドナーからの代表的な結果である。図９Ｂにおいて、ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（３０μｇ／ｍＬ）又はコントロール抗体（陽性コントロールとして５μｇ／ｍｌのＯＫＴ３、及び陰性コントロールとして３０μｇ／ｍｌのｈｕＩｇＧ）の存在下、４２時間、エフェクター細胞としてＣＤ１６＋ヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ、及び標的細胞としてＰＨＡ刺激ＰＢＭＣを用いて、ＡＤＣＣアッセイを行った。ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇ細胞の割合は、フローサイトメトリーで決定した。
【図１０】ヒトＰＢＭＣに対する抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのＣＤＣ効果を示す。標的細胞としてＰＨＡ刺激ＰＢＭＣを用い、補体ソースとして自己血清を用いて、ＣＤＣアッセイを行った。１５％の最終濃度の自家血清中、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（０．０１〜１００μｇ／ｍｌ）と共に事前活性化されたＰＢＭＣを３日間共培養した後、ＣＤＣ（ｙ軸）の百分率をｃｅｌｌ−ｔｉｔｅｒ ｇｒｏｗアッセイで測定し、実施例１１の記載に従って計算した。ドナーＡとＢからのデータを示す。ｈｕＩｇＧを陰性コントロールとして用い、抗ＭＨＣ−Ａ、Ｂ、Ｃを陽性コントロールとして用いた。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
アミノ酸の保存的アミノ酸置換は、当技術分野で一般に知られている。下表に例示的に示す。一般に、保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似する側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられることを意味する。
【００２５】
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【００２６】
本明細書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味を有する。
【００２７】
本明細書の記載が明確に指定しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で用いられる「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」等の単数形の単語は、それらの対応する複数のものも含む。
【００２８】
本明細書の記載が明確に指定しない限り、用語「又は」は、用語「及び／又は」を意味するように用いられ、それと互換的に用いられる。
【００２９】
本明細書の記載が明確に指定しない限り、本明細書及び特許請求の範囲を通して、用語「含む（comprise）」並びに「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載されたアミノ酸配列、ＤＮＡ配列、工程、又はその群を包含することを意味し、他のアミノ酸配列、ＤＮＡ配列、工程を排除することを意味しないと理解される。本明細書で用いられる場合、用語「含んでいる（comprising）」は、用語「含んでいる（containing）」、「含んでいる（including）」、又は「有している（having）」で置き換えることができる。
【００３０】
用語「ＴＩＧＩＴ」は、多様な哺乳類のアイソフォーム、例えば、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＴＩＧＩＴの種相同体、及びＴＩＧＩＴ内の少なくとも１つのエピトープを含む類似体を含む。そして、ヒトＴＩＧＩＴ等のＴＩＧＩＴのアミノ酸配列、及びそれをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「投与」、「投与する」、「治療する」及び「治療」は、動物、ヒト、実験の対象、細胞、組織、臓器、又は生物学的流体に適用される場合、外因性医薬、治療剤、診断剤又は組成物の、その動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、又は生物学的流体への接触を意味する。細胞の治療は、試薬のその細胞への接触、及び試薬のその細胞が接触している流体への接触を含む。用語「投与」又は「治療」はまた、例えば、試薬、診断化合物、結合化合物、又は他の細胞によるインビトロ及びエクソビボの治療を含む。本明細書における用語「対象」は、全ての生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳類（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを意味する。
【００３２】
抗体又は抗体分子
本明細書には、高い親和性及び特異性でＴＩＧＩＴに結合する抗体分子が開示される。
【００３３】
いくつかの態様において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ヒトＴＩＧＩＴに結合し、配列番号３、４、５、１３又は配列番号６、７、８のアミノ酸配列を含む、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。特別な態様において、本出願の抗体は、配列番号３、４、５及び１３又は１つ以上の保存的置換を含むそれらの変異体から選択されるアミノ酸配列を有する、１つ、２つ若しくは３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）；及び／又は、配列番号６、７及び８又は１つ以上の保存的置換を含むそれらの変異体から選択されるアミノ酸配列を有する、１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００３４】
いくつかの態様において、抗ＴＩＧＩＴは、単離された抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は組換え抗体である。
【００３５】
いくつかの態様において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位、又は少なくとも可変領域を含む。いくつかの態様において、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、本明細書に記載の抗体に由来する抗原結合フラグメントを含む。
【００３６】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、具体的には抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、及びＴＩＧＩＴ等の抗原を認識する抗体フラグメントを含む。抗体は、通常、単一特異的であるが、特定抗原特異的（idiospecific）、異種特異的、又は多重特異的として記載されてもよい。抗体分子は、特定の結合部位によって、特定の抗原決定基又は抗原のエピトープに結合する。
【００３７】
本明細書における用語「モノクローナル抗体」、「ｍＡｂ」又は「Ｍａｂ」は、実質的に同種の抗体の集団を意味する。すなわち、その集団に含まれる抗体分子は、少量存在しうる天然に存在する可能性がある突然変異を除いて、アミノ酸配列が同一である。一方、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、通常、異なるエピトープに対してしばしば特異的である、それらの可変領域が、特にそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）が異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に同種の集団から得られるという抗体の特徴を示し、いずれか特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は当業者に周知の方法によって取得することができる。参照、例えば、Kohler G et al., Nature 1975 256:495-497；ＵＳ４３７６１１０；Ausubel FM et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992；Harlow E et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold spring Harbor Laboratory 1988；及びColligan JE et al., CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY 1993。本明細書に開示されたｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらのいずれかのサブクラスを含む、いかなる免疫グロブリンクラスのものであってもよい。ｍＡｂを製造するハイブリドーマを、インビトロ又はインビボで培養してもよい。個々のハイブリドーマからの細胞をプリスティンプライム化Ｂａｌｂ／ｃマウス等のマウスに腹腔内注射し、高濃度で所望のｍＡｂを含む腹水液を製造するインビボの製造によって、高い力価のｍＡｂを取得することができる。当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を用いて、上記の腹水液又は培養物の上清から、アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧのＭＡｂを精製することができる。
【００３８】
一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同一の組を含み、各組は１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は、抗原認識に本質的に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部は、エフェクター機能に本質的に関与する定常領域を規定してもよい。通常、ヒト軽鎖はκ軽鎖及びλ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、一般にα、δ、ε、γ又はμとして分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプがＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭとして定義される。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は更に約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。
【００３９】
各重鎖／軽鎖（ＶＬ／ＶＨ）の組の可変領域は抗体結合部位を形成する。従って、一般に、完全な状態の抗体は２つの結合部位を有する。二官能性抗体又は二重特異性抗体を除くと、上記の２つの結合部位は通常、同一である。
【００４０】
通常、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の間に配置される「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、順次、ＦＲ−１（又はＦＲ１）、ＣＤＲ−１（又はＣＤＲ１）、ＦＲ−２（ＦＲ２）、ＣＤＲ−２（ＣＤＲ２）、ＦＲ−３（又はＦＲ３）、ＣＤＲ−３（ＣＤＲ３）、及びＦＲ−４（又はＦＲ４）を含む。一般に、各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md., 5th ed., NIH Publ. No. 91-3242 (1991)；Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75；Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616；Chothia, et al, (1987) J Mol. Biol. 196:901-917；又はChothia, et al, (1989) Nature 342:878-883の定義に従っている。
【００４１】
用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３、並びに重鎖可変ドメイン中のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３）からのアミノ酸残基を含む。参照、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（抗体のＣＤＲ領域を配列によって定義）。参照、Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917（抗体のＣＤＲ領域を構造によって定義）。用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書でＣＤＲ残基として定義された超可変領域残基以外の可変領域残基を意味する。
【００４２】
特に明示されない限り、「抗体フラグメント」又は「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合フラグメント、すなわち、全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、例えば１つ以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメントを意味する。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線形抗体；単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）等の単鎖抗体分子；抗体フラグメントから形成されたナノボディ及び多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
特定の標的タンパク質に特異性を持って結合する抗体はまた、特定の標的タンパク質に特異的に結合するとも記載される。これは、抗体が他のタンパク質に比べて標的タンパク質に優先的に結合を示すことを意味するが、この特異性は絶対的な結合特異性を必要とするものではない。例えば、偽陽性等の望ましくない結果を生じることなく、抗体の結合がサンプル中の標的タンパク質の存在を決定する場合、該抗体はその意図した標的に対して「特異的」であると見なされる。本発明に有用な抗体又はその結合フラグメントは、非標的タンパク質との親和性の少なくとも２倍以上、好ましくは少なくとも１０倍以上、より好ましくは少なくとも２０倍以上、最も好ましくは少なくとも１００倍以上の親和性で標的タンパク質に結合する。本明細書の抗体は、所与のアミノ酸配列、例えば、成熟ヒトＴＩＧＩＴ分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合し、その配列を欠くタンパク質に結合しない場合に、所与のアミノ酸配列、例えば、成熟ヒトＴＩＧＩＴ分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合すると記載される。
【００４４】
表現「ｐＨ依存的な結合」、「ｐＨ依存的な標的結合」、「ｐＨ依存的な抗原結合」は、本明細書において交換可能であり、本出願の抗体がその標的／抗原、つまりヒトＴＩＧＩＴにｐＨ依存的に結合することを示す。具体的には、本出願の抗体は、生理学的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）での結合親和性及び／又は結合シグナルと比較すると、腫瘍の微小環境で通常見られる穏やかな酸性ｐＨ（例えばｐＨ６．０）でその抗原に対してより高い結合親和性及び／又は結合シグナルを示す。本出願の抗体の結合親和性及び／又は結合シグナルの強度を決定する方法は、当技術分野でよく知られており、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）又は類似の技術を含むが、これらに限定されない。より具体的には、本出願の抗体は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）又は類似の技術で測定した際、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上よりも大きいｐＨ７.４／ｐＨ６．０のＫＤ比を有する。あるいは、又は更に、本出願の抗体は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）又は類似の技術で測定した際、ｐＨ７．４でのＲｍａｘ（ＲＵ）値よりも、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍高いｐＨ６．０でのＲｍａｘ（ＲＵ）値を有する。抗体の結合親和性は、２５℃又は３７℃で測定することができる。腫瘍の微小環境が、生理学的な状態又は正常な組織よりも比較的より酸性のｐＨを示すことが見出された（Zhang et al. Focus on molecular Imaging 2010；Tannock and Rotin et al. Cancer Res 1989）。従って、上記のｐＨ依存的な結合を有する本出願の抗体は、選択性を有し、リンパ球の周辺活性化に伴われる毒性がより低い、腫瘍の微小環境内のＴＩＧＩＴ陽性リンパ球を標的化するための抗ＴＩＧＩＴ治療剤として有利である。
【００４５】
本明細書における用語「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体は、マウス中で、マウス細胞中で、又はマウス細胞に由来するハイブリドーマ中で製造されれば、ネズミ糖鎖を含むことができる。同様に、「マウス抗体」又は「ラット抗体」は、それぞれマウス又はラットの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。
【００４６】
用語「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、ネズミ）抗体からの配列、及びヒト抗体からの配列を含む抗体の形態を意味する。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限度の配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含む。必要に応じて、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部を含む。ヒト化抗体を親のげっ歯類の抗体と区別するために必要である場合、抗体クローンの名称に接頭語「ｈｕｍ」、「ｈｕ」、「Ｈｕ」又は「ｈ」を加える。一般に、げっ歯類の抗体のヒト化形態は、親のげっ歯類の抗体と同一のＣＤＲ配列を含むが、親和性を高めるため、ヒト化抗体の安定性を高めるため、又は他の理由のために特定のアミノ酸置換を含んでもよい。
【００４７】
本出願の抗体は、癌の治療に潜在的な治療用途を持っている。本明細書における用語「癌」又は「腫瘍」は、通常、無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる哺乳類における生理学的状態を意味し又は表現する。癌の例としては、肺癌（小細胞肺癌又は非小細胞肺癌を含む）、副腎癌、肝臓癌、胃癌、子宮頸癌、黒色腫、腎臓癌、乳癌、大腸癌、白血病、膀胱癌、骨肉腫、脳腫瘍、子宮内膜癌、頭頸部癌、リンパ腫、卵巣癌、皮膚癌、甲状腺腫瘍、又は癌の転移性病変が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
更に、本出願の抗体は、ウイルス感染、及び免疫寛容又は「疲弊」に機構的に関与する他のヒトの疾患を制御するための潜在的な治療用途を有する。本出願の記載における用語「疲弊」は、長期にわたる慢性的なウイルス感染の間に、感染ウイルスに対する免疫細胞の能力の枯渇が起こるプロセスを意味する。
【００４９】
医薬組成物及びキット
いくつかの側面において、本出願は、組成物、例えば、少なくとも１つの薬学上許容される賦形剤と共に製剤化される、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体を含む薬学上許容される組成物を提供する。本明細書で用いられる用語「薬学上に許容される賦形剤」は、生理学的に適合性のある全ての溶媒、分散媒、等張及び吸収遅延剤等を含む。賦形剤は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与、又は経皮投与（注射又は注入等による）に適している。
【００５０】
本明細書の組成物は、多様な形態であることができる。これらの形態は、例えば、液体、半固体、及び固体剤の投与形態、例えば、液体溶液（例えば、注射可能な溶液及び点滴溶液）、分散液又は懸濁液、リポソーム、及び坐剤等を含む。適切な形態は、意図した投与の様式及び治療用途によって異なる。典型的な適切な組成物は、注射可能な溶液又は点滴溶液の形態である。１つの適切な投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。いくつかの態様において、抗体は、静脈内点滴又は注射によって投与される。特定の態様において、抗体は、筋肉内注射又は皮下注射によって投与される。
【００５１】
本明細書で用いられる用語「治療上有効な量」は、病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の臨床症状の少なくとも１つを治療するために対象に投与する際、病気、疾患又は症状に対する治療が有効であるのに十分な抗体の量を意味する。「治療上有効な量」は、抗体、病気、疾患、及び／又は、病気若しくは疾患の症状、病気若しくは疾患及び／又は病気若しくは疾患の症状の重症度、治療を受ける対象の年齢、及び／又は治療を受ける対象の体重によって、変更することができる。所与の事例における適切な量は、当業者に明白であるか、又はルーチンの実験で決定することができる。併用療法の場合、「治療上有効な量」は、病気、疾患又は状態の有効な治療のために組合せに含まれる活性成分の総量を意味する。
【００５２】
本明細書で用いられる「対象」は、げっ歯類又は霊長類等の哺乳類、好ましくはヒト等のより高等な霊長類（例えば、本明細書に記載の疾患を有する、又は疾患を有する可能性のある患者）である。
【実施例】
【００５３】
実施例１  抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体の作製
小さな変更を加えた、従来のハイブリドーマ融合技術（de StGroth and Sheidegger, 1980 J Immunol Methods 35:1；Mechetner, 2007 Methods Mol Biol 378:1）に基づいて、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイで高い結合活性を有するｍＡｂを選択して、更に特性を調べた。
【００５４】
免疫化及び結合アッセイのためのＴＩＧＩＴ組換えタンパク質
全長ヒトＴＩＧＩＴ（配列番号１）をコードするｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ配列（アクセッション番号：NM_173799）に基づいて、Sino Biological（北京，中国）によって合成され、及びSino Biologicalから購入した。配列番号１のアミノ酸（ＡＡ）１〜１４１に対応する全長ヒトＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のコード領域をＰＣＲ増幅し、Ｃ末端をマウスＩｇＧ２ａのＦｃドメイン又はヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃドメインに融合させて、ｐｃＤＮＡ３．１に基づく発現ベクター（Invitrogen，カールスバッド，ＣＡ，米国）にクローン化した。その結果、それぞれ、２つの組換え融合タンパク質発現プラスミドであるＴＩＧＩＴ−ｍＩｇＧ２ａ及びＴＩＧＩＴ−ｈｕＩｇＧ１を得た。ＴＩＧＩＴ融合タンパク質の概略図を図１に示す。組換え融合タンパク質の製造のために、ＴＩＧＩＴ−ｍＩｇＧ２ａプラスミド及びＴＩＧＩＴ−ｈｕＩｇＧ１プラスミドを、２９３Ｇ細胞（社内で開発）に一過性に導入し、回転式撹拌機を備えたＣＯ２インキュベーター中で７日間培養した。組換えタンパク質を含む上清を遠心分離で収集し、透明にした。プロテインＡカラム（Cat. No.：17127901，GE Life Sciences）を用いて、ＴＩＧＩＴ−ｍＩｇＧ２ａ及びＴＩＧＩＴ−ｈｕＩｇＧ１を精製した。ＴＩＧＩＴ−ｍＩｇＧ２ａ及びＴＩＧＩＴ−ｈｕＩｇＧ１の両方のタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に対して透析し、アリコートで−８０℃の冷凍庫に保存した。
【００５５】
安定な発現細胞株
全長ヒトＴＩＧＩＴ（ｈｕＴＩＧＩＴ）又は全長サルＴＩＧＩＴ（ｍｋＴＩＧＩＴ，アクセッション番号：XM_005548101.2）を発現する安定な細胞株を確立するために、ＴＩＧＩＴ遺伝子（Genescriptで合成，南京，中国）をレトロウイルスベクターｐＦＢ−Ｎｅｏ（Cat. No.：217561，Agilent，米国）にクローン化した。以前のプロトコル（Zhang T, et al. 2005, Blood）に従って、ｄｕａｌ−ｔｒｏｐｉｃレトロウイルスベクターを作製した。ｈｕＴＩＧＩＴ及びｍｋＴＩＧＩＴを含むベクターを、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ，マナサス，ＶＡ，米国）に形質導入して、それぞれＪｕｒｋａｔ／ｈｕＴＩＧＩＴ細胞株及びＮＫ９２ＭＩ／ｍｋＴＩＧＩＴ細胞株を作製した。Ｇ４１８及びＦＡＣＳ結合アッセイを用いて培地中の培養によって、高発現細胞株を選択した。
【００５６】
免疫化、ハイブリドーマ融合及びクローニング
１０μｇのＴＩＧＩＴ−ｍＩｇＧ２ａ及び水溶性アジュバント（Cat. No.：KX0210041，KangBiQuan，北京，中国）を含む１００μｌの抗原混合物で、８〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（HFK BIOSCIENCE, Co.Ltd.，北京，中国）を腹腔内（i.p.）で免疫化した。３週間後にこの手順を繰り返した。２回目の免疫から２週間後、マウスの血清を、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによってＴＩＧＩＴ結合について評価した。血清スクリーニングから１０日後、最も高い抗ＴＩＧＩＴ抗体抗体血清力価を有するマウスを、５０μｇのＴＩＧＩＴ−ｍＩｇＧ２ａの腹腔内注射で追加免疫した。追加免疫の３日後、脾臓細胞を単離し、標準的技術（1977 Somat Cell Genet, 3:231）を用いてネズミ骨髄腫細胞株ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ）に融合させた。
【００５７】
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによる抗体のＴＩＧＩＴ結合活性の評価
最初に、いくつかの変更を加えた「Methods in Molecular Biology (2007) 378:33-52」に記載されたＥＬＩＳＡによって、ハイブリドーマクローンの上清をスクリーニングした。簡単に言うと、ＴＩＧＩＴ−ｈｕＩｇＧ１タンパク質を９６ウェルプレートにコーティングした。ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Cat. No.：7076S，Cell Signaling Technology，米国）及び基質（Cat. No.：00-4201-56，eBioscience，米国）を用いて、４５０ｎｍの波長で色吸収シグナルを生成させ、これをプレートリーダー（SpectraMax Paradigm，Molecular Device，米国）を用いて測定した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、上記のＮＫ９２ＭＩ／ｈｕＴＩＧＩＴ細胞又はＮＫ９２ｍｉ／ｍｋＴＩＧＩＴ細胞のいずれかを用いて、ＦＡＣＳによって更に検証した。ＴＩＧＩＴ発現細胞（１０５細胞／ウェル）を、ＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマ上清と共にインキュベートし、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｒｏ−６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Cat. No.：A0473，Beyotime Bitechonlogy，中国）に結合させた。フローサイトメーター（Guava easyCyte ８HT，Merck-Millipore，米国）を用いて、細胞の蛍光を定量した。
【００５８】
ＥＬＩＳＡスクリーニング及びＦＡＣＳスクリーニングの両方で陽性シグナルを示したハイブリドーマからの調節された培地を、機能的アッセイに付し、ヒト免疫細胞に基づくアッセイ（下記参照）で良好な機能的活性を有する抗体を特定した。望ましい機能的活性を有する抗体を、更にサブクローン化し、特徴付けらた。
【００５９】
ハイブリドーマのサブクローニング及び無血清又は低血清培地への適応
上記のＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ及び機能的アッセイによる一次スクリーニングの後、限界希釈によって陽性ハイブリドーマクローンをサブクローニングした。各プレートからのＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳスクリーニングに基づいて、３つの陽性サブクローンが選択され、機能的アッセイによって特徴付けられた。機能的アッセイで検証された上位の抗体サブクローンは、３％ＦＢＳを含むＣＤＭ４ＭＡｂ培地（Cat. No.：SH30801.02，Hyclone，米国）中で増殖のために適応された。
【００６０】
モノクローナル抗体の発現と精製
抗体発現プラスミド（Cat. No.：R79007，1nvitorogen）で一過性に導入したハイブリドーマ細胞又は２９３Ｇ細胞を、ＣＤＭ４ＭＡｂ培地（Cat. No.：SH30801.02，Hyclone）中、又はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Cat. No.：12338018，Invitorogen）中のいずれかで培養し、３７℃で５〜７日間、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。調節された培地を、遠心分離で収集し、精製前に０．２２μｍのメンブレンを通過させてろ過した。製造会社の説明書に従って、上澄みを含むネズミ抗体又は組換え抗体を適用し、プロテインＡカラム（Cat. No.：17127901，GE Life Sciences）に結合させた。この手順で、通常、純度が９０％を超える抗体が得られた。プロテインＡ親和性精製抗体を、ＰＢＳに対して透析したか、又はＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Cat. No.：17531801，GE Life Sciences）を用いて更に精製し、凝集体を除去した。２８０ｎｍでの吸光度を測定することで、タンパク質濃度を決定した。最終の抗体調製物を、アリコートで−８０℃の冷凍庫に保存した。
【００６１】
実施例２  ＴＩＧＩＴ抗体のクローニング及び配列分析
Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＲＮＡキット（Cat. No.：74104，QIAGEN，ドイツ）を用いて、製造会社のプロトコルに基づいて、ネズミハイブリドーマクローンを採取し、すべての細胞性ＲＮＡを調製した。InvitrogenからのｃＤＮＡ合成キット（Cat. No.：18080-051）を用いて、１番目のストランドｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲキット（Cat. No.：CW0686，CWBio，北京、中国）を用いて、ネズミｍＡｂの重鎖可変領域（Ｖｈ）及びκ鎖可変領域（Ｖκ）をコードするヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅を行った。ＶｈとＶκの抗体ｃＤＮＡのクローニングに使用されたオリゴプライマーは、先に報告された配列（Brocks et al. 2001 Mol Med 7:461）に基づいて、Invitrogen（北京、中国）によって合成された。次に、ＰＣＲ生成物をｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Cat. No.：C B101-02，TransGen，中国）にサブクローン化し、Genewiz（北京，中国）でシークエンスした。Ｖｈ領域とＶκ領域のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の結果から推定されたものである。
【００６２】
ネズミｍＡｂを、配列相同性の比較によって分析し、配列類似性（図２）に基づいてグループ化した。Ｋａｂａｔ（Wu and Kabat 1970 J. Exp. Med. 132:211-250）とＩＭＧＴ（Lefranc 1999 Nucleic Acids Research 27:209-212）のシステムに基づいて、配列注釈とインターネットに基づく配列分析（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html）によって、相補性決定領域（ＣＤＲ）を定めた。代表的な上位のクローンのｍｕ１２１７（Ｖｈ及びＶκ）のアミノ酸配列を表１（配列番号９及び１１）に記す。ｍｕ１２１７のＣＤＲ配列を表２（配列番号３〜８）に記す。
【００６３】
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【００６４】
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【００６５】
実施例３  ＳＰＲによる精製されたネズミ抗ＴＩＧＩＴ抗体の親和性決定
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳで高い結合活性と細胞に基づくアッセイ（実施例１及び２で記載）で強力な機能的活性を有するＴＩＧＩＴ抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ−２００（GE Life Sciences）を用いるＳＰＲアッセイによって、それらの結合動態学で特徴付けされた。簡単に言うと、抗ヒトＩｇＧ抗体を、活性化されたＣＭ５バイオセンサーチップ（Cat. No.：BR100530，GE Life Sciences）上に固定化した。ヒトＦｃタグ付きＴＩＧＩＴをチップ表面上に流し、抗ヒトＩｇＧ抗体に捕捉させた。次に、精製されたネズミ抗体の連続希釈（０．１２ｎＭ〜１０ｎＭ）をチップ表面上に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化を分析して、１：１ラングミュア結合モデル（one to one Langmuir binding model：BIA Evaluation Software，GE Life Sciences）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算した。ｍｕ１２１７、ｍｕ１２５７、ｍｕ１２２６及びｍｕ２４２を含む上位のｍＡｂの結合親和性プロファイルを、図３及び表３に示す。
【００６６】
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【００６７】
実施例４  ネズミ抗ヒトＴＩＧＩＴ ｍＡｂ ｍｕ１２１７のヒト化
ｍＡｂのヒト化と設計
ｍｕ１２１７のヒト化のために、ＩＭＧＴ（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html）及びＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast）ウェブサイトのヒト免疫グロブリン遺伝子データベースをブラスト（blast）することによって、ｍｕ１２１７可変領域のｃＤＮＡ配列と高度の相同性を有する配列を求めて、ヒト生殖細胞系ＩｇＧ遺伝子を検索した。頻度の高いヒト抗体レパートリー（Glanville 2009 PNAS 106:20216-20221）に存在し、ｍｕ１２１７と高い相同性を有するヒトＩＧＶＨ遺伝子及びヒトＩＧＶκ遺伝子を、ヒト化のためのテンプレートとして選択した。
【００６８】
ＣＤＲ移植（Methods in Molecular Biology, Vol 248: Antibody Engineering, Methods and Protocols, Humana Press）によって、ヒト化を行った。また、ヒト化抗体（ｈｕ１２１７）を、社内で開発した発現ベクターを用いて、ヒトＩｇＧ１ｍｆのフォーマットとして設計した。ヒト化の最初の段階において、フレームワーク領域内のネズミアミノ酸残基からヒトアミノ酸残基への変異を、シミュレートされた３Ｄ構造によって導いた。最初の型のヒト化抗体１２１７（配列番号３、１３、５（重鎖ＣＤＲ）と配列番号６、７、８（軽鎖ＣＤＲ）のアミノ酸配列を有する６つのＣＤＲと、配列番号１４のアミノ酸配列を有し、配列番号１５のヌクレオチド配列でコードされた重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を有し、配列番号１７のヌクレオチド配列でコードされた軽鎖可変領域とを有する、ｈｕ１２１７−１−１）の中に、ＣＤＲの標準的な構造を維持するために構造的に重要なネズミのフレームワーク残基を維持した。具体的には、ｍｕ１２１７ＶκのＣＤＲ（配列番号６〜８）を、１つのネズミフレームワーク残基（Ｖ５８）を保持して、ヒト生殖細胞系可変遺伝子ＩＧＶκ３−１５のフレームワークに移植し、それによって、ｈｕ１２１７−１−１のヒト化Ｖκ配列（アミノ酸配列の配列番号１６、ヌクレオチド配列の配列番号１７）を得た。ｍｕ１２１７ ＶｈのＨ−ＣＤＲ２（配列番号４）のＮ末端、Ｈ−ＣＤＲ１（配列番号３）及びＨ−ＣＤＲ３（配列番号５）を、２つのネズミフレームワークの残基（配列番号１０のＴ２４とＩ３７）を保持して、ヒト生殖細胞系可変遺伝子ＩＧＶＨ３−７のフレームワークに移植した。Ｋａｂａｔ Ｈ−ＣＤＲ２のＮ末端の半分のみがシミュレートされた３Ｄ構造による抗原結合に重要であると予測されていたため、ｈｕ１２１７のヒト化変異体において、Ｋａｂａｔ Ｈ−ＣＤＲ２のＮ末端の半分のみが移植された。ｈｕ１２１７−１−１の得られたヒト化Ｖｈ配列のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１４及び配列番号１５に示される。
【００６９】
ＩｇＧ１ｍｆ（配列番号１８）と呼ぶヒトＩｇＧ１変異体の定常領域及びκ鎖をそれぞれ含み、容易に適応するサブクローニング部位を有する、社内で開発された発現ベクターを用いて、ｈｕ１２１７−１−１をヒト全長抗体のフォーマットとして構築した。上記の２つの構造物を２９３Ｇ細胞に同時導入し、プロテインＡカラム（Cat. No.：17543802，GE Life Sciences）を用いて精製することで、ｈｕ１２１７−１−１抗体の発現及び調製を達成した。精製された抗体をＰＢＳ中で０．５〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、アリコートで−８０℃の冷凍庫に保存した。
【００７０】
ｈｕ１２１７−１−１のテンプレートに基づいて、Ｖκのフレームワーク領域中に保持されたネズミの残基を、対応するヒト生殖細胞系の残基に変換するいくつかの単一変異を行った。その単一変異はＶκ中のＶ５８Ｉ及びＶｈ中のＴ２４ＡとＩ３７Ｖを含む。得られたｈｕ１２１７−２Ａ−１（Ｔ２４Ａ）、ｈｕ１２１７−２Ｂ−１（Ｉ３７Ｖ）及びｈｕ１２１７−１−２ａ（Ｖ５８Ｉ）はすべて、ｈｕ１２１７−１−１と同様の結合活性及び機能的活性を有した。すべてのヒト化変異体は、特定の位置の変異を含むプライマーと、部位特異的突然変異誘発キット（Cat. No.：FM111-02，TransGen，北京，中国）を用いて作製された。所望の変異は、配列分析で検証された。これらのｈｕ１２１７由来変異体抗体を、前記の結合アッセイ及び機能アッセイで試験した。
【００７１】
ヒトの治療用途のための分子的及び生物物理学的特性を改善するために、ｈｕ１２１７抗体は、ＣＤＲとフレームワーク領域に変異を導入することで更に設計された。機能的活性を維持しながら、アミノ酸組成、熱安定性（Ｔｍ）、表面疎水性、及び等電子点（ｐＩ）が、考慮事項に含まれた。
【００７２】
まとめると、上記の変異プロセスから、ヒト化モノクローナル抗体の適切に設計された型、ｈｕ１２１７−２−２（配列番号３、５〜８、１３及び１９〜２１）が得られ、詳細に特徴付けられた。その結果、ｈｕ１２１７−２−２及びｈｕ１２１７−１−１の両方がＴＩＧＩＴ媒介性下流シグナル伝達の抑制等の結合親和性及び機能的活性の点で非常に類似することが示された。
【００７３】
親和性の決定のために、抗体が抗ヒトＦｃ表面で捕捉され、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術に基づく親和性アッセイに使用された。ＳＰＲで決定された抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合プロファイルの結果を表４にまとめた。ｈｕ１２１７−２−２及びｈｕ１２１７−１−１は、それぞれ０．４１５ｎＭ及び０．２６６ｎＭの平均解離定数を有し、非常に類似した結合プロファイルを示した。また、この結合プロファイルはｃｈ１２１７に近い。
【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
上記のすべてのヒト化抗体はまた、健康なドナーから単離された主要なヒト免疫細胞の機能的活性について確認された（実施例７に記載）。
【００７７】
実施例５  天然ＴＩＧＩＴへの１２１７の異なる型の結合親和性
生細胞上の天然ＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合活性を評価するために、ヒトＴＩＧＩＴを過剰発現するようにＮＫ９２ｍｉ細胞を設計した。生きているＮＫ９２ｍｉ／ＴＩＧＩＴ細胞を９６ウェルプレートに播種し、抗ＴＩＧＩＴ抗体の連続希釈液とインキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧを二次抗体として用いて、細胞表面に結合した抗体を検出した。用量反応データをグラフパッドプリズム（GraphPad Prism）を有する４係数ロジスティックモデル（four-parameter logistic model）に当てはめることで、ヒト天然ＴＩＧＩＴへの用量依存的な結合のＥＣ５０値を決定した。図４及び表６に示すように、ヒト化１２１７抗体であるｈｕ１２１７−１−１及びｈｕ１２１７−２−２の両方が、生細胞上の天然ＴＩＧＩＴに対する良好な結合親和性を示した。
【００７８】
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【００７９】
実施例６  抗ＴＩＧＩＴ抗体はＴＩＧＩＴとそのリガンドのＰＶＲ及びＰＶＲ−Ｌ２との相互作用を遮断する
ＴＩＧＩＴは高い親和性（Ｋｄ：約１ｎＭ）でＰＶＲに結合する。それによって、ＣＤ２６６−ＰＶＲの相互作用と競合することができる（Yu et al., 2009）。
【００８０】
抗ＴＩＧＩＴ抗体がＴＩＧＩＴ−ＰＶＲの相互作用及びＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ−Ｌ２の相互作用を遮断できるか否かを決定するために、高レベルのＰＶＲ又はＰＶＲ−Ｌ２を発現するように、ＨＥＫ２９３細胞を設計した。得られた細胞株を、それぞれＨＥＫ２９３／ＰＶＲ及びＨＥＫ２９３／ＰＶＲ−Ｌ２と名付けた。フローサイトメトリーで、ＰＶＲ又はＰＶＲ−Ｌ２への可溶性ＴＩＧＩＴ（ＴＩＧＩＴ−ｍＩｇＧ２ａ融合タンパク質）の結合を決定した（図５Ａ）。連続希釈された抗ＴＩＧＩＴ抗体を加えることで、ＴＩＧＩＴ−リガンド相互作用の遮断を定量的に測定した。図５Ｂに示すように、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１（野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、及びｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆと同じＶＨ配列及びＶＬ配列を含むヒト化型）及びｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆは、それぞれ０．６４μｇ／ｍＬ及び０．５５μｇ／ｍＬのＩＣ５０で用量依存的に、ＰＶＲへのＴＩＧＩＴの結合を遮断することができた。同様に、ＴＩＧＩＴ−ＰＶＲ−Ｌ２の相互作用を遮断する際のｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１及びｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆのＩＣ５０は、それぞれ０．２５μｇ／ｍＬ及び０．１８μｇ／ｍＬであった。
【００８１】
実施例７  抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＣＭＶ特異的ヒトＴ細胞の活性化
ヒトＣＭＶ ＰＰ６５ペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ，４９５〜５０３，ＨＬＡ−Ａ２．１−restricted）（Boeckh M, Boeckh M and Geballe AP, 2011 J Clin Invest. 121:1673-80）を認識する天然由来のＴ細胞を用いて、ＴＩＧＩＴ抗体の機能的活性を更に評価した。簡単に言うと、１０％ＦＢＳを有する完全なＲＰＭＩ中、ＰＰ６５ペプチド（＞９８％の純度，GL Biochem，上海が合成）で、１週間、ＨＬＡ−Ａ２．１＋の健康なドナーからのＰＢＭＣがシミュレートされた。ｐｐ６５でプライムされたＰＢＭＣを、エフェクター細胞として用いた。アッセイの前に、標的細胞のＨＣＴ１１６細胞（ＨＬＡ−Ａ２．１＋、１０４）をｐｐ６５ペプチド（５μｇ／ｍＬ）で３０分間パルスし、抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下、若しくは不存在下、又はブランクコントロール（培地のみ）で、９６ウェルプレート内で同数のｐｐ６５感作ＰＢＭＣと共に、一晩、共培養した。図６に示すように、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１は、両方のドナーで細胞培養上清にＩＦＮ−γを用量依存的に分泌するようにｐｐ６５特異的Ｔ細胞を促進した。
【００８２】
実施例８  抗ＴＩＧＩＴ抗体はＮＫ細胞媒介性細胞毒性を増強した
ＴＩＧＩＴは比較的高いレベルでナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に恒常的に発現することが知られており、ＴＩＧＩＴとそのリガンドとの間の相互作用はＮＫ細胞媒介性細胞毒性を阻害する（Wang F, et al. 2015 Eur. J. Immunology 45:2886-97；Stanietsky N et al., 2009 Proc Natl Acad Sci USA 106:17858-63）。
【００８３】
ヒト化抗ＴＩＧＩＴ抗体がＮＫ細胞媒介性細胞毒性を促進できるか否かを確認するために、前記のプロトコル（Zhang et al, 2006 Cancer Res. 66: 5927-5933）に従ってレトロウィルス形質導入によって、エフェクター細胞として、ＴＩＧＩＴ及びＤＮＡＭ−１受容体の両方を共発現するように、ＮＫ細胞株ＮＫ９２ＭＩ（ＮＫ９２ＭＩ／ＴＩＧＩＴ−ＤＮＡＭ−１）を設計した。同様に、標的としてＰＶＲ発現肺癌細胞株ＳＫ−ＭＥＳ−１／ＰＶＲを確立した。
【００８４】
ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞毒性アッセイキット（Promega，マディソン，ＷＩ）を用いるＬＤＨ放出アッセイによって、ＳＫ−ＭＥＳ−１／ＰＶＲ細胞に対するＮＫ−ＭＩ／ＴＩＧＩＴ−ＤＮＡＭ−１細胞の細胞毒性を決定した。簡単に説明すると、９６ウェルＶ底プレート中、抗ＴＩＧＩＴ抗体（０．００７〜３０μｇ／ｍＬ）の存在下、５時間、ＮＫ９２ＭＩ／ＴＩＧＩＴ−ＤＮＡＭ−１細胞（８×１０５）を、ＳＫ−ＭＥＳ−１／ＰＶＲ細胞（２×１０４）と共培養した。ＬＤＨ放出アッセイの特異的溶解は、下式を用いて決定された：
特異的溶解の百分率＝［（実験的エフェクター自発的−標的自発的）／（標的最大−標的自発的）］×１００
その結果、抗ＴＩＧＩＴ抗体ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆがＮＫ細胞の死滅を用量依存的に増加させること（ＥＣ５０：０．１８５μｇ／ｍＬ）（図７）が示された。
【００８５】
実施例９  抗ＴＩＧＩＴ抗体はＦｃγＲ媒介性トロゴサイトーシスによってＴＩＧＩＴ受容体の表面発現を低下させることができる
トロゴサイトーシスは、細胞表面分子がドナー細胞からアクセプター細胞に転移する現象である（Joly E, et al. 2003 Nat. Immunol；Machlenkin A, et al. 2008 Cancer Res.；Beum PV et al. 2008 J. Immunol；Rossi EA, et al. 2013 Blood）。Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を介した抗体誘発性トロゴサイトーシスは、細胞表面上の受容体のダウンモジュレーションを引き起こす（Carlsten M, et al. 2016 Clin Cancer Res；Beum PV, et al. 2011 J. Immunology）。従って、トロゴサイトーシスによる標的受容体のダウンレギュレーションは、シグナル伝達の低下を引き起こすことができる。これらの観察結果を考慮すると、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１は、ＦｃγＲ＋細胞の存在下、ＴＩＧＩＴ受容体のトロゴサイトーシスを誘導し、それによって、より低い表面発現をもたらすことが可能である。この可能性に対処するために、様々なＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡＨ１３１、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８を含む）発現ＨＥＫ細胞と、ビオチン標識ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｗｔ（ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆと同じＶＬ及びＶＨと野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ領域とを含むヒト化抗体）又はｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆと共に、一晩、Ｊｕｒｋａｔ／ＴＩＧＩＴ細胞を培養した。ＳＡ−ＡＰＣ（Biolegend）によって、ＴＩＧＩＴ受容体の表面発現が決定された。図８に示すように、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆではなく、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１では、陰性コントロールのヒトＩｇＧ処理細胞と比較してＴＩＧＩＴ表面発現が大幅に低下する。このことは、Ｊｕｒｋａｔ／ＴＩＧＩＴ細胞上の表面ＴＩＧＩＴの低下がＦｃγＲ結合に依存的であることを示す。加えて、１０％のヒト血清（高レベルの内因性ＩｇＧを含む）の存在は、ＴＩＧＩＴ受容体のＦｃγＲＩＩＡＨ１３１媒介性トロゴサイトーシス又はＦｃγＲＩＩＩＡＶ１５８媒介性トロゴサイトーシスを部分的に低下させることができるが、ＦｃγＲＩＩＢ媒介性ロゴサイトーシスを低下させることができない。このことは、ＦｃγＲＩＩＢが、インビボで抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（例えば、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｗｔ）によるＴＩＧＩＴ表面発現を低下させる重要な役割を果たすことができることを示唆する。これらの観察結果はまた、以前の研究結果（Ganesan LP, et al. 2012 J Immunol 189:4981-8; Taylor RP, et al. 2015 Blood 125:762-6）と一致する。
【００８６】
実施例１０  抗ＴＩＧＩＴ抗体のＡＤＣＣ及びＣＤＣエフェクター機能
ヒトの主要なＰＢＭＣ中でＡＤＣＣとＣＤＣを誘導する抗ＴＩＧＩＴ抗体の能力を、以下に記載するインビトロアッセイを用いて決定した。
【００８７】
標的細胞としてヒトＰＢＭＣを用いるＡＤＣＣ
ＴＩＧＩＴ抗体がＴＩＧＩＴ＋Ｔ細胞のＡＤＣＣを誘導することができるか否かを決定するために、フローサイトメトリーに基づくＡＤＣＣアッセイを準備した。ＣＤ１６Ｖ１５８（Ｖ１５８対立遺伝子）及びＦｃγＲｃＤＮＡを含む発現プラスミドを共形質導入することで、ＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ）からアッセイエフェクター細胞株であるＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞を作製した。健康なドナーからのヒトＰＢＭＣをＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、ＴＩＧＩＴ発現をアップレギュレートさせた。図９に示すように、ＣＤ４＋エフェクター（ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ Ｆｏｘｐ３−）Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ Ｆｏｘｐ３＋）のすべてを含むＴ細胞は、多量のＴＩＧＩＴを発現した。これらの活性化ＰＢＭＣ（３つの健康なドナーからのもの）を標的細胞として用いた。ＴＩＧＩＴ抗体（ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆ又はｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｗｔ、３０μｇ／ｍＬ）又はコントロール抗体（陽性コントロールの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（５μｇ／ｍｌ，Biolegend）又は陰性コントロールのヒトＩｇＧ（３０μｇ／ｍＬ）の存在下、４０時間、蛍光色素ＣＦＳＥ標識ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞（５×１０４）を同じ数の標的細胞と共培養した。ヒトＩｇＧ及びｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆと比較すると、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｗｔはＡＤＣＣを介してＴｒｅｇ細胞の適度な低下を導くことができる。しかし、全Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞では、有意なＡＤＣＣ効果は観察されなかった（図９）。
【００８８】
標的細胞としてヒトＰＢＭＣを用いるＣＤＣ
事前に活性化されたヒトＰＢＭＣ及び健康なドナーからの新鮮な自己血清を用いることで、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆ及びｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｗｔがＣＤＣを誘発するか否かを決定した。ＣＤＣによる細胞溶解を、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ ｇｌｏアッセイキット（Promega，北京，中国）で決定した。簡単に言うと、ＰＢＭＣをＰＨＡ（１０μｇ／ｍＬ）で３日間事前活性化し、ＲＰＭＩ１６４０及び自己血清（１５％）及び抗ＴＩＧＩＴ抗体又はコントロール抗体（０．０１〜１００μｇ／ｍＬ）中、３７℃で、一晩、インキュベートした。反応終了時の細胞溶解後の生存細胞から放出されるＡＴＰの減少によって、ＣＤＣによる細胞死を評価した。陽性コントロールとして抗ＭＨＣ−Ｉ Ａ、Ｂ、Ｃを用いた。９６ウェルの蛍光光度計（PHERA Star FS，BMG LABTECH）を用いて蛍光読み取りを行い、相対蛍光ユニット（ＲＦＵ）の読み取り値から下式によってＣＤＣ活性を計算した：
％ＣＤＣ活性＝［（ＲＦＵ試験−ＲＦＵバックグラウンド）／（全細胞溶解時のＲＦＵ−ＲＦＵバックグラウンド）］×１００
その実験の結果、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｍｆ及びｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１ｗｔの両方が、２つの異なるドナーから単離されたＰＢＭＣに検知可能なＣＤＣを持たないことが示された。対照的に、陽性コントロール抗体である抗ＭＨＣ−Ｉは有意なＣＤＣ活性を誘導した（図１０）。
【００８９】
実施例１１  Ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１のｐＨ依存的結合親和性
ｐＨがｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１の結合特性に影響するか否かを調査するため、比較のためにｐＨ７．４及びｐＨ６．０の流動する緩衝液中で標的結合ＳＰＲ試験を行った。抗体ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１をＣＭ５チップ（GE）に固定化した。ＴＩＧＩＴ−ｈｉｓの連続希釈液を、ｐＨ７．４又はｐＨ６．０の流動する緩衝液ＨＢＳ中、固定化されたｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１上に流した。
【００９０】
以下の表７に記載された結果が示すように、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１は、ｐＨ７．４（生理学的ｐＨ）で取得されたデータと比較すると、ｐＨ６．０（腫瘍の微小環境のｐＨと同等の酸性ｐＨ）でヒトＴＩＧＩＴに対してより高い結合親和性（ＫＤ）及びより強い結合シグナル（Ｒｍａｘ）を示した。これらの結果から、ｈｕ１２１７−２−２／ＩｇＧ１が、末梢リンパ球の活性化に伴われる潜在的な毒性がより低いまま、より選択的に腫瘍微小環境内のＴＩＧＩＴ陽性リンパ球を標的とすることができるため、腫瘍環境内のＴＩＧＩＴ陽性リンパ球を標的とする治療剤としての抗体の潜在的な利点を示す。
【００９１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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