(57)【要約】  本発明は、ベロ細胞での成長に適合していない親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株に由来する、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株であって、前記親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株ほどには神経毒性でない弱毒生黄熱ウイルス株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベロ細胞での成長に適合していない親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株に由来する、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株であって、前記親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株ほどには神経毒性でない、前記弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項２】
親黄熱ウイルス株は、卵での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株である、請求項１に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項３】
親黄熱ウイルス株は、黄熱ウイルス１７Ｄ−２０４亜株である、請求項１または２に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項４】
親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株は、配列番号２のＲＮＡ配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項５】
前記弱毒生黄熱ウイルス株は、マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）試験において、親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株ほどには神経毒性でない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項６】
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、または
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項７】
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む、請求項６に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項８】
核酸は、ＡＡＡからＡＡＧへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む、請求項６または７に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項９】
核酸は、ＧＵＡからＧＵＵへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１０】
バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる４８０位での突然変異を含むエンベロープタンパク質を含む、弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１１】
配列番号１５の４８０位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質を含む、弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１２】
前記エンベロープタンパク質は、配列番号１５の配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、または１００％同一な配列を含む、請求項１１に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１３】
（ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる４８０位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
（ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる６５位での突然変異を含むＮＳ２ａタンパク質
をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１４】
核酸は、ＡＡＡからＡＡＧへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む、請求項１３に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１５】
核酸は、ＧＵＡからＧＵＵへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む、請求項１３または１４に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１６】
（ｉ）配列番号１５の４８０位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質；および
（ｉｉ）配列番号１６の６５位に対応するタンパク質内の位置でバリン残基を含むＮＳ２ａタンパク質
をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１７】
前記エンベロープタンパク質は、配列番号１５の配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、または１００％同一な配列を含み、かつ前記ＮＳ２ａタンパク質は、配列番号１６の配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、または１００％同一な配列を含む、請求項１６に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１８】
核酸は、配列番号１７の５７位に対応する、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）をコードする核酸内の位置にあるＧヌクレオチドをさらに含む、請求項１６または１７に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項１９】
核酸は、配列番号１８の４３５位に対応する、エンベロープタンパク質（Ｅ）をコードする核酸内の位置にあるＵヌクレオチドをさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株および薬学的に許容可能な媒体を含む、免疫原性組成物。
【請求項２１】
−  ａ）ベロ細胞での成長に適合していない、かつ場合により卵での成長に適合している、親弱毒生黄熱ウイルス株のウイルスゲノムＲＮＡを精製する工程；
−  ｂ）工程ａ）で精製されたウイルスゲノムＲＮＡをベロ細胞にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされたベロ細胞を得る工程；
−  ｃ）工程ｂ）で得られたトランスフェクトされたベロ細胞を培養培地において成長させ、これによって、第１の黄熱ウイルス集団を得、さらに回収する工程；
−  ｄ）工程ｃ）の最後で得られた回収された第１の黄熱ウイルス集団を、新鮮なベロ細胞で２回またはそれ以上増幅し、これによって、第２の黄熱ウイルス集団を得る工程；
−  ｅ）工程ｄ）で得られた第２の黄熱ウイルス集団を、ベロ細胞での２回またはそれ以上の連続的なプラーク精製によってクローニングし、これによって、複数の黄熱ウイルスクローンを得る工程；
−  ｆ）工程ｅ）の最後で得られた回収された黄熱ウイルスクローンのそれぞれを、新鮮なベロ細胞で２回またはそれ以上別個に増幅し、これによって、複数の黄熱ウイルス株を得る工程；および
−  ｇ）マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）試験において、工程ｆ）で回収された前記複数の黄熱ウイルス株から、親弱毒生黄熱ウイルス株ほどには神経毒性でない１つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択する工程
を含む、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株を得るための方法。
【請求項２２】
前記培養培地は無血清であり、場合により、いかなるヒトまたは動物由来の物質も含まない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の方法によって得られる弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項２４】
ワクチンの製造において使用するための、請求項１〜１９または請求項２３のいずれか１項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株。
【請求項２５】
黄熱ウイルスによる感染の予防において使用するための、請求項１〜１９または請求項２３のいずれか１項に記載の弱毒生黄熱ウイルス株を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒生黄熱ウイルス（ＹＦＶ）株、およびＹＦＶによる感染に対するワクチン組成物の製造のためのその使用に関する。
【０００２】
特に、弱毒生ＹＦＶ株は、ベロ細胞での成長に適合しており、ベロ細胞での成長に適合していないがむしろ胚発育卵での成長に適合している親弱毒生ＹＦＶ株から得られている。弱毒生ＹＦＶ株は、親弱毒生ＹＦＶ株と比較して神経毒性（ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）が低減していることをさらに特徴とする。
【背景技術】
【０００３】
黄熱は、アフリカ、中央アメリカ、および南アメリカの熱帯地域における５０を超える国々で広がっている、ウイルス介在性の致命的な疾患である。
【０００４】
黄熱は、急性のウイルス性出血性疾患であり、一部の患者は黄疸を患い、これが「黄」という用語を使用する理由である。黄熱の特徴である症候としては、発熱、頭痛、黄疸、筋肉痛、吐き気、嘔吐、および疲労が含まれる。さらに、ウイルスに感染している患者のごく一部は重度の症候を発生し、これらのおよそ半分は、７から１０日以内に死亡する。
【０００５】
黄熱ウイルス（ＹＦＶ）は、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）のファミリーに属し、このファミリーの中では、デングウイルス（ＤＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ダニ媒介脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、およびジカウイルス（ＺＶ）が他のメンバーである。ＹＦＶは、カプシドタンパク質および１０８６２ヌクレオチドの長さを有する一本鎖のプラス鎖ＲＮＡから構成されるヌクレオカプシドを囲む、リポタンパク質エンベロープからなる。５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）との間で、ＲＮＡは、５’末端から３’末端までで、３つの構造タンパク質、すなわち、カプシドタンパク質（Ｃタンパク質）、プレ膜／膜タンパク質（ｐｒＭ／Ｍタンパク質）、エンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）、ならびに、８つの非構造（ＮＳ）タンパク質、すなわち、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、Ｐ２ｋペプチド、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５タンパク質をコードしている。
【０００６】
野生型ＹＦＶは、アフリカではヤブカ属の種（Ａｅｄｅｓ  ｓｐｐ．）の蚊によって、南アメリカではヘマゴガス属（Ｈａｅｍｏｇｏｇｕｓ  ｓｐｐ．）の種およびサベテス属の種（Ｓａｂｅｔｈｅｓ  ｓｐｐ．）によって主に媒介されており、地理的領域によって異なる非ヒト霊長類宿主がいる。ＹＦＶの伝染は主に、（１）都市パターン、および（２）森林パターン（ジャングルサイクルまたは森サイクルとしても公知である）という２つの疫学的パターンに従ってなされる。２つのパターンの伝染があるにもかかわらず、同定されているのは１つの臨床的に関連する疾患のみであり、このことは、同一のウイルスが関与していることを説明する。アメリカ大陸では、ＹＦＶは今日、風土性の森林パターンによって循環し、免疫のない森林労働者において１年当たり最大数百の感染が報告されている。並行して、ウイルスは、アフリカにおいて、都市パターンおよび森林パターンの両方で循環しており、その風土性のパターンから周期的に逸脱して、大きな流行の過程で、多数の免疫のない人々に感染する。
【０００７】
現在、黄熱病のための抗ウイルス薬はなく、ワクチン接種が、この疾患の予防において重要である。この点について、早くも１９３０年代には、２種類の弱毒生ＹＦＶワクチンが開発された。
【０００８】
最初の１つは、野生型フランス内臓向性ウイルス（ＦＶＶ、１９２８年にセネガルでＦｒａｎｃｏｉｓｅ  Ｍａｙａｌｉから単離された）から製造され、マウスの脳において継代された、フランス神経向性ワクチン（ＦＮＶ）に対応する。しかし、ＦＮＶは、小児におけるワクチン接種後脳炎の発症を悪化させ、神経毒性が過ぎることがすぐに分かり、１９８０年代の初期に廃止された（Ｂａｒｒｅｔｔ、２０１７）。
【０００９】
第２のアプローチは、野生型株Ａｓｉｂｉ（１９２７年にガーナにおいてヒトの軽度のケースから単離された−「Ｍｒ．Ａｓｉｂｉ」）から製造され、マウスおよびニワトリの組織において継代された、「１７Ｄ」株に対応する。ワクチン株１７Ｄは、内臓向性および神経毒性の両方を失っている（Ｍｏｎａｔｈ、２００５）。
【００１０】
現在、６つの国が、１７Ｄ株に由来する亜株、すなわち、ブラジル（１７ＤＤ亜株）、中国（１７Ｄ−２０４亜株）、フランス（１７Ｄ−２０４亜株Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標））、ロシア（１７Ｄ−２１３亜株）、セネガル（１７Ｄ−２０４亜株）、およびＵＳＡ（１７Ｄ−２０４亜株ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標））から、弱毒生ＹＦＶワクチン組成物を生産している（Ｂａｒｒｅｔｔ、２０１７）。
【００１１】
これまで、全ての現在市販されているワクチンは、過去にはロバスト性の問題で複雑であった生産プロセスである、胚発育鶏卵において生産されている（Ｂａｒｒｅｔｔ、２０１７）。特に、製造の問題に起因してＹＦＶワクチンが不足することが多々ある。実際、アンゴラおよびコンゴ民主共和国における２０１６年の流行の際には、利用可能なワクチンロットの不足によって、初めて、緊急の状況に適応するための部分用量の必要性が生じた（Ｂａｒｒｅｔｔ；２０１７）。さらに、胚発育鶏卵で生産されたＹＦＶワクチンは、卵に対してアレルギーを有する人々において禁忌である。
【００１２】
胚発育卵に基づくワクチン生産の代替は、ウイルスを継代するための適切な細胞系、例えば哺乳動物細胞系の使用である。哺乳動物細胞系の中で、ベロ細胞系は、最も研究されているものの１つでありながら、安定性、ならびにウイルス収量の質および量における良く文献に記載された性能を提供する。ベロ細胞は、ＦＤＡの承認を受けており、世界中で使用されている。例えば、ベロ細胞は、日本脳炎に対するワクチン（ＩＸＩＡＲＯ（登録商標）という商品名で市販されている）、インフルエンザウイルスに対するワクチン、ポリオウイルスに対するワクチン、および狂犬病に対するワクチンの製造に使用されている。
【００１３】
ＹＦＶワクチンを製造するためにベロ細胞を利用するための過去および現行の戦略が存在するが、これらの戦略が単に、不活化ウイルスに基づくＹＦＶワクチンの製造の実現可能性を目的としたものにすぎないということに注目すべきである（Ｈａｙｅｓ、２０１０；Ｂｅａｓｌｅｙら、２０１３；Ｐｅｒｅｉｒａら、２０１５）。それでも、黄熱不活化ワクチンは理論的にはより安全であると思われるが、現行の弱毒生黄熱ワクチンの単回用量によって提供される長期の防御に完全に見合う可能性は低い（Ｈａｙｅｓ、２０１０）。さらに、最近の黄熱の流行の背景では、弱毒生ワクチンは、流行地域において黄熱に対する高い集団カバー率の長期の防御免疫を提供するために、より適していると思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ワクチンにおいて弱毒生ウイルスを使用することの具体的な制約は、その弱毒化を維持することであり、すなわち、黄熱ウイルスは、対応する疾患から患者を防御するために十分に免疫原性でありながら、神経毒性および内臓向性に関して、現在販売されている弱毒生黄熱ワクチンと少なくとも同程度に弱毒化されていなければならない。この点について、所与の黄熱株で両方の特徴、すなわち、弱毒化および免疫原性を達成することは、例えばＭｏｎａｔｈ、２００５で見ることができるように、容易ではなかった。
【００１５】
したがって、胚発育鶏卵に基づいて弱毒生ＹＦＶワクチンを生産することに関連する様々な欠点に起因して、弱毒生ＹＦＶワクチンを提供するための代替的な生産方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様において、本発明は、ベロ細胞での成長に適合していない親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株に由来する、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株であって、前記親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株ほどには神経毒性ではない、弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明はさらに：
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、または
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる４８０位での突然変異を含むエンベロープタンパク質を含む、弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、配列番号１５の４８０位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質を含む、弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【００２０】
別の態様において、本発明はさらに：
（ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる４８０位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
（ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる６５位での突然変異を含むＮＳ２ａタンパク質
をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は：
（ｉ）配列番号１５の４８０位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質、および
（ｉｉ）配列番号１６の６５位に対応するタンパク質内の位置でバリン残基を含むＮＳ２ａタンパク質
をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【００２２】
本発明の別の態様はまた、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株および薬学的に許容可能な媒体を含む免疫原性組成物に関する。
【００２３】
さらに他の態様において、本発明はさらに：
−  ａ）ベロ細胞での成長に適合していない、かつ場合により卵での成長に適合している、親弱毒生黄熱ウイルス株のウイルスゲノムＲＮＡを精製する工程；
−  ｂ）工程ａ）で精製されたウイルスゲノムＲＮＡをベロ細胞にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされたベロ細胞を得る工程；
−  ｃ）工程ｂ）で得られたトランスフェクトされたベロ細胞を培養培地において成長させ、これによって、第１の黄熱ウイルス集団を得、さらに回収する工程；
−  ｄ）工程ｃ）の最後で得られた回収された第１の黄熱ウイルス集団を、新鮮なベロ細胞で２回またはそれ以上増幅し、これによって、第２の黄熱ウイルス集団を得る工程；
−  ｅ）工程ｄ）で得られた第２の黄熱ウイルス集団を、ベロ細胞での２回またはそれ以上の連続的なプラーク精製によってクローニングし、これによって、複数の黄熱ウイルスクローンを得る工程；
−  ｆ）工程ｅ）の最後で得られた回収された黄熱ウイルスクローンのそれぞれを、新鮮なベロ細胞で２回またはそれ以上別個に増幅し、これによって、複数の黄熱ウイルス株を得る工程；および
−  ｇ）マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）試験において、工程ｆ）で回収された前記複数の黄熱ウイルス株から、親弱毒生黄熱ウイルス株ほどには神経毒性でない１つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択する工程
を含む、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株を得るための方法に関する。
【００２４】
本発明の別の態様はまた、本発明に従った方法によって得られる弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【００２５】
別の態様において、本発明はまた、ワクチンの製造において使用するための、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、黄熱ウイルスによる感染の予防において使用するための、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株を含むワクチンに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】プレマスターシードロット（ｐＭＳＬ）ステージでの、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株（ｖＹＦ）の調製を示す図である。
【図２】Ａ１２９マウスモデルでの内臓向性アッセイを示す図である。
【図３】０日目にＰＢＳで（白のバー）；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照で（黒のバー）、または、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統（ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、およびＴＶ２２４１；濃い灰色のバー）もしくはＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統（ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１；薄い灰色のバー）に由来するｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補で免疫化されたＡ１２９マウスから４日目および６日目に回収された血清における、ＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたウイルス血症を示すプロットである。
【図４】０日目にＰＢＳで（白のバー）；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照で（黒のバー）、または、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統（ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、およびＴＶ２２４１；濃い灰色のバー）もしくはＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統（ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１；薄い灰色のバー）に由来するｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補で免疫化されたＡ１２９マウスから６日目および１１日目に回収された肝臓サンプルにおける、ＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたウイルス負荷を示すプロットである。
【図５】０日目にＰＢＳで（白のバー）；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照で（黒のバー）、または、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統（ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、およびＴＶ２２４１；濃い灰色のバー）もしくはＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統（ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１；薄い灰色のバー）に由来するｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補で免疫化されたＡ１２９マウスから６日目および１１日目に回収された脳サンプルにおける、ＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたウイルス負荷を示すプロットである。
【図６】０日目にＰＢＳで（白のバー）；Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照で（黒のバー）、または、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統（ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、およびＴＶ２２４１；濃い灰色のバー）もしくはＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統（ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１；薄い灰色のバー）に由来するｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補で免疫化されたＡ１２９マウスから６日目および１１日目に回収された脾臓サンプルにおける、ＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたウイルス負荷を示すプロットである。
【図７】Ａ１２９マウスを、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）、ｖＹＦ株ＴＶ２２１２、ＴＶ２２４１、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、ＴＶ４２２１（点線）、またはＴＶ２２３２（実線）で単回免疫化した後の、カプラン・マイヤー生存曲線を示すプロットである。
【図８】ハムスターモデルでの免疫原性アッセイを示す図である。
【図９】２．５または５．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／用量のｖＹＦ株（ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、ＴＶ２２４１、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１）、またはＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンで０日目に免疫化されたハムスターから２６日目に回収された血清における、ベロ細胞での血清中和アッセイによって測定された弱毒生黄熱ウイルス株に特異的な中和抗体力価を示すプロットである。水平な線は、レスポンダー閾値を表す。
【図１０】２．５または５．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／用量のｖＹＦ株（ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、ＴＶ２２４１、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１）、またはＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンで０日目および２６日目に免疫化されたハムスターから４１日目に回収された血清における、ベロ細胞での血清中和アッセイによって測定された弱毒生黄熱ウイルス株に特異的な中和抗体力価を示すプロットである。水平な線は、レスポンダー閾値を表す。
【図１１】現行のワクチンであるＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と比較した、ｖＹＦ株ＴＶ３１１２をワクチン接種されたサルにおける中和抗体応答を示すプロットである。水平な線は、検出限界を表す。
【図１２】現行の参照ワクチンであるＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と比較した、弱毒生ｖＹＦ株ＴＶ３１１２をワクチン接種されたサルの末梢血におけるメモリーＢ細胞からのＹＦ特異的なＩｇＭ応答を示すプロットである。結果は、ＩｇＭ集団全体におけるＩｇＭ抗体分泌細胞のパーセンテージとして表されている。
【図１３】現行の参照ワクチンであるＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と比較した、弱毒生ｖＹＦ株ＴＶ３１１２をワクチン接種されたサルの末梢血におけるメモリーＢ細胞からのＹＦ特異的なＩｇＧ応答を示すプロットである。結果は、ＩｇＧ集団全体におけるＩｇＧ抗体分泌細胞のパーセンテージとして表されている。
【図１４】エンベロープタンパク質（ＥＮＶ；左側のパネル）で刺激した際、または非構造タンパク質３（ＮＳ３；右側のパネル）で刺激した際の、ならびに現行のワクチンであるＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と比較した、ｖＹＦ株ＴＶ３１１２をワクチン接種されたサルの末梢血におけるＩＦＮ−γ（上部のパネル）およびＩＬ−２（下部のパネル）特異的なＴ細胞応答を示すプロットである。
【図１５】現行の参照ワクチンであるＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と比較した、弱毒生ｖＹＦ株ＴＶ３１１２をワクチン接種されたサルの器官におけるウイルス負荷を示すプロットである。薄い灰色のバーおよび丸形は、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）をワクチン接種されたサルの結果を表す。中程度の灰色のバーおよび四角形は、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）をワクチン接種されたサルの結果を表す。濃い灰色のバーおよび三角形は、弱毒生ｖＹＦ株ＴＶ３１１２をワクチン接種されたサルの結果を表す。水平な線は、検出限界を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、胚発育卵での成長に適合している親弱毒生ＹＦＶ株から得られた、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生ＹＦＶ株を提供する。弱毒生ＹＦＶ株は、親弱毒生ＹＦＶ株と比較して、マウスＬＤ５０試験（ＭＬＤ５０）においてその神経毒性が低減していることで選択されている。
【００２９】
本発明から分かるように、ベロ細胞を継代することによるＹＦＶの生産によって、後にＹＦ感染に対するワクチンの製造にとって適切である、安定な、非常に再現可能な、質および量が高水準の弱毒生ＹＦＶ株の提供が可能となる。
【００３０】
−  種々の定義
本発明の範囲内では、「ＹＦＶ」は「黄熱ウイルス」に関連し、その一方で、用語「ｖＹＦ」は、ベロ細胞適合型黄熱ウイルス、すなわち、ベロ細胞での成長に適合している黄熱ウイルスを示す。
【００３１】
したがって、本発明の範囲内では、「ベロ細胞適合型黄熱ウイルス」（ｖＹＶ）および「ベロ細胞での成長に適合している黄熱ウイルス」は、同義の表現を意図する。
【００３２】
本発明の範囲内では、ベロ細胞での成長に適合しているウイルスは、ベロ細胞で少なくとも３回連続継代されているウイルスである。一部の実施形態において、ウイルスは、ベロ細胞で約３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、または１５回連続継代されている。
【００３３】
「継代」は、ウイルスがベロ細胞において少なくとも１回の複製サイクルを受ける任意の工程、特に、ベロ細胞におけるウイルスのトランスフェクション、増幅、またはクローニングの任意の工程であると理解される。
【００３４】
表現「弱毒生黄熱ウイルス」は、本明細書において使用される場合、当業者によって公知の一般的な意味を有する。一部の実施形態において、この表現は、神経毒性が弱毒化されたおよび／または内臓向性が弱毒化された生黄熱ウイルスを指す。
【００３５】
本発明の範囲内では、用語「神経毒性」は、ウイルスが血液−脳関門を通過する能力（神経侵襲性）、脳組織において複製する能力（神経向性）、ならびに炎症、ニューロン損傷、および脳炎を生じさせる能力（狭義の神経毒性）を指すものである。
【００３６】
本発明の範囲内では、用語「内臓向性」は、ウイルスが神経外組織において複製し、ウイルス血症および肝臓を含む重要器官の損傷を生じさせる能力を指す（Ｍｏｎａｔｈ、２００５）。
【００３７】
一部の実施形態において、前記弱毒生黄熱ウイルスは、現在市販されている弱毒生黄熱ワクチン株の１つ、例えば、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）またはＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と少なくとも同程度に弱毒化されている。
【００３８】
一部の実施形態において、前記弱毒生黄熱ウイルスは、現在市販されている弱毒生黄熱ワクチン株の１つ、例えば、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）またはＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と少なくとも同程度に神経毒性が弱毒化されている。
【００３９】
一部の実施形態において、前記弱毒生黄熱ウイルスは、現在市販されている弱毒生黄熱ワクチン株の１つ、例えば、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）またはＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と少なくとも同程度に内臓向性が弱毒化されている。
【００４０】
一部の実施形態において、前記弱毒生黄熱ウイルスは、現在市販されている弱毒生黄熱ワクチン株の１つ、例えば、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）またはＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と少なくとも同程度に神経毒性および内臓向性が弱毒化されている。
【００４１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）／「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」／「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」／「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」／「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」をそれぞれ包含し、また同様に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」／「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」／「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」／「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ）」をそれぞれ包含し、例えば、成分Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）」組成物は、排他的に成分Ｘからなり得る、または、１つもしくはそれ以上のさらなる成分、例えば、成分Ｘおよび成分Ｙを含み得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「ＣＣＩＤ５０」は、５０％細胞培養感染量、すなわち、単層細胞培養物におけるエンドポイント希釈アッセイで決定される、接種された複製細胞培養物の５０％において細胞変性効果を生じさせるために十分なウイルス量を指す。
【００４３】
世界保健機関（ＷＨＯ）の標準的な定義に従って、本発明は、以下の定義を参照する（ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｓｅｒｉｅｓ、第８７２号、１９９８）。
【００４４】
「マスターシードロット」（「ＭＳＬ」）または「プライマリーシードロット」は、本明細書において使用される場合、単回の生産運転で処理されており、均一の組成を有する、一定量のウイルス懸濁液を指す。
【００４５】
「ワーキングシードロット」（「ＷＳＬ」）または「セカンダリーシードロット」は、本明細書において使用される場合、単回の生産運転で処理されており、かつ、組成に関しては均一であり、完全に特徴付けされており、ＭＳＬからただ１回の継代である、一定量のウイルス懸濁液を指す。本発明の範囲内では、ＷＳＬから取り出された材料は、ワクチンの製造における胚発育卵または適切な細胞系の接種に使用される。
【００４６】
「プラーク形成単位」（ＰＦＵ）は、本明細書において使用される場合、単層細胞培養物においてプラークを生産するウイルス懸濁液の最少量を指す。
【００４７】
「マウス半数致死量」（マウスＬＤ５０またはＭＬＤ５０）は、本明細書において使用される場合、それを注射されたマウスの５０％が死亡するウイルス懸濁液の量を指す。
【００４８】
−  ベロ細胞での成長に適合している弱毒生ＹＦＶ（ベロ細胞適合型ＹＦウイルスに関して「ｖＹＦウイルス」とも呼ばれる）
一態様において、本発明は、ベロ細胞での成長に適合していない親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株に由来する、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株に関する。様々な実施形態において、前記弱毒生黄熱ウイルス株は、前記親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株ほどには神経毒性でない。
【００４９】
一部の実施形態において、親黄熱ウイルス株は、卵での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株である。
【００５０】
一部の実施形態において、卵は、胚発育鶏卵である。
【００５１】
「１７Ｄ亜株」は、１７Ｄ株をその祖先とする黄熱株である。
【００５２】
「１７Ｄ株」は、当業者によって公知の一般的な意味を有する。一部の実施形態において、「１７Ｄ株」は、Ｍｏｎａｔｈ（２００５）において記載されているように、１９２７年にガーナにおいてヒトの軽度のケース「Ｍｒ．Ａｓｉｂｉ」から単離され、ミンチされたマウス胚組織において１８回継代され、次いで、ミンチされたニワトリ胚組織において５８回継代された、黄熱株を指す。
【００５３】
一部の実施形態において、１７Ｄ亜株は、Ｍｏｎａｔｈ（２００５）において記載されているように、１７Ｄ−２０４亜株、１７ＤＤ亜株、および／または１７Ｄ−２１３亜株を包含する。典型的な実施形態において、ＹＦＶ  １７Ｄ−２０４株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０３７００）のＲＮＡ配列は、１９８５年にＲｉｃｅらによって以前に開示されているように、配列番号１のＲＮＡ配列によって表される。
【００５４】
一部の実施形態において、親黄熱ウイルス株は、黄熱ウイルス１７Ｄ−２０４亜株である。
【００５５】
一部の実施形態において、親ＹＦＶウイルス株は、市販されているワクチンＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）において使用されている参照ＹＦＶ株である、ＹＦＶ  １７Ｄ−２０４に由来するＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）株である。
【００５６】
典型的な実施形態において、ＹＦＶ  １７Ｄ−２０４に由来するＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）株のＲＮＡ配列は、配列番号２のＲＮＡ配列によって表される。
【００５７】
一部の実施形態において、親ＹＦＶウイルス株は、市販されているワクチンＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）において使用されている参照ＹＦＶ株である、ＹＦＶ  １７Ｄ−２０４に由来するＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）株である。
【００５８】
典型的な実施形態において、ＹＦＶ  １７Ｄ−２０４に由来するＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）株のＲＮＡ配列は、配列番号３のＲＮＡ配列によって表される。
【００５９】
典型的な実施形態において、親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株は、配列番号２のＲＮＡ配列を含む。
【００６０】
典型的な実施形態において、親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株は、配列番号３のＲＮＡ配列を含む。
【００６１】
典型的な実施形態において、ＹＦＶ  １７Ｄ−２１３株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１７０６７）のＲＮＡ配列は、１９９５年にＤｏｓ  Ｓａｎｔｏｓらによって以前に開示されているように、配列番号４のＲＮＡ配列によって表され、また、ＹＦＶ  １７ＤＤ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ１７０６６）のＲＮＡ配列は、１９９５年にＤｏｓ  Ｓａｎｔｏｓらによって同様に以前に開示されているように、配列番号５のＲＮＡ配列によって表される。
【００６２】
典型的な実施形態において、Ａｓｉｂｉ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＫＦ７６９０１６）のＲＮＡ配列は、配列番号６のＲＮＡ配列によって表される。
【００６３】
一部の実施形態において、弱毒生黄熱ウイルス株は、マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）試験において、親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株ほどには神経毒性でない。
【００６４】
一部の実施形態において、適切なマウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）試験は、ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｓｅｒｉｅｓ、第８７２号、１９９８年の第６８頁（参照によって組み入れる）において開示されているプロトコルに従って行われる。
【００６５】
本発明の範囲内では、ＭＬＤ５０は、脳内接種されたマウスの５０％において致命的な特異的脳炎を生じさせると推定されるウイルス懸濁液の量である。
【００６６】
一部の実施形態において、再構成されたワクチンの適切な連続希釈は、リン酸バッファー、０．７５％の血清アルブミンにおいて行われる。
【００６７】
典型的な実施形態において、４〜６週齢のマウスの脳内に、麻酔下で、即席ワクチン希釈物を注射する。少なくとも６頭のマウスからなる群を各希釈に使用し、一連の希釈は、接種後に、０〜１００％の範囲にわたる死亡率をもたらす。死亡の発生は、２１日間にわたり記録される。関連しない原因で死亡したマウスは、死亡率計算の分子および分母の両方から除去される。２１日目に活動不能となっているマウスは生存としてカウントされる。
【００６８】
ある特定の実施形態において、マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）試験における神経毒性は、パラメータｌｏｇ１０ＭＬＤ５０／ｍＬによって測定される。
【００６９】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株は、マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）試験において、４以下、３．５以下、３以下、または２．５以下のｌｏｇ１０ＭＬＤ５０／ｍＬを達成する。
【００７０】
一実施形態において、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株は、ベロ細胞での成長に適合しており、その親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株ほどには神経毒性でなく、かつ、その親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株と少なくとも同程度に内臓向性が弱毒化されている。
【００７１】
一実施形態において、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株は、ベロ細胞での成長に適合しており、その親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株ほどには神経毒性でなく、その親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株と少なくとも同程度に内臓向性が弱毒化されており、かつ、その親黄熱ウイルス１７Ｄ亜株と少なくとも同程度に免疫原性である。
【００７２】
様々な実施形態において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のＲＮＡ配列を含む弱毒生ＹＦＶ株であって、１つまたはそれ以上のヌクレオチドが突然変異している、弱毒生ＹＦＶ株を提供する。
【００７３】
本発明の範囲内では、表現「１つまたはそれ以上のヌクレオチド」は、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを超えるヌクレオチドを包含するものである。
【００７４】
言い換えると、表現「１つまたはそれ以上のヌクレオチド」は、１つのヌクレオチド、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、および１５個、またはそれを超えるヌクレオチドを包含するものである。
【００７５】
一部の実施形態において、突然変異は、ヌクレオチド置換である。
【００７６】
一部の他の実施形態において、突然変異は、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチド欠失を包含しない。
【００７７】
一部の実施形態において、ヌクレオチド置換はサイレントである。あるいは、ヌクレオチド置換は、アミノ酸置換を促進し得る。
【００７８】
一実施形態において、２つのヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のＲＮＡ配列において突然変異している。
【００７９】
別の実施形態において、３つのヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のＲＮＡ配列において突然変異している。
【００８０】
さらなる実施形態において、４つのヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のＲＮＡ配列において突然変異している。
【００８１】
さらなる実施形態において、５つのヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のＲＮＡ配列において突然変異している。
【００８２】
本発明の別の態様はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択されるＲＮＡ配列を含む弱毒生黄熱ウイルス株であって、少なくとも２４１１位、３７０１位、または６４９６位のヌクレオチドが突然変異している、弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【００８３】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも２４１１位のヌクレオチドおよび３７０１位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択されるＲＮＡ配列を含む。
【００８４】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも２４１１位のヌクレオチドおよび６４９６位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択されるＲＮＡ配列を含む。
【００８５】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも３７０１位のヌクレオチドおよび６４９６位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択されるＲＮＡ配列を含む。
【００８６】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも２４１１位のヌクレオチド、３７０１位のヌクレオチド、および６４９６位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択されるＲＮＡ配列を含む。
【００８７】
ある特定の実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の２４１１位のヌクレオチドＧ（グアノシン）は、ヌクレオチドＵ（ウリジン）によって置き換えられている。
【００８８】
ある特定の実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の３７０１位のヌクレオチドＡ（アデノシン）は、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている。
【００８９】
ある特定の実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の６４９６位のヌクレオチドＡ（アデノシン）は、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている。
【００９０】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、以下を特徴とする：
−  （ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の２４１１位のヌクレオチドＧ（グアノシン）が、ヌクレオチドＵ（ウリジン）によって置き換えられている、かつ
−  （ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の３７０１位のヌクレオチドＡ（アデノシン）が、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている。
【００９１】
一部の他の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、以下を特徴とする：
−  （ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の２４１１位のヌクレオチドＧ（グアノシン）が、ヌクレオチドＵ（ウリジン）によって置き換えられている、かつ
（ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の６４９６位のヌクレオチドＡ（アデノシン）が、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている。
【００９２】
一部の他の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、以下を特徴とする：
−  （ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の３７０１位のヌクレオチドＡ（アデノシン）が、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている、かつ
−  （ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の６４９６位のヌクレオチドＡ（アデノシン）が、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている。
【００９３】
ある特定の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、以下を特徴とする：
−  （ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の２４１１位のヌクレオチドＧ（グアノシン）が、ヌクレオチドＵ（ウリジン）によって置き換えられている、
−  （ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の３７０１位のヌクレオチドＡ（アデノシン）が、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている；かつ
−  （ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の６４９６位のヌクレオチドＡ（アデノシン）が、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている。
【００９４】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株はさらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の１４０８位に位置する突然変異を含む。
【００９５】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも１４０８位のヌクレオチドおよび２４１１位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５を含む群において選択されるＲＮＡ配列を含む。
【００９６】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも１４０８位のヌクレオチドおよび３７０１位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５を含む群において選択されるＲＮＡ配列を含む。
【００９７】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも１４０８位のヌクレオチドおよび６４９６位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５を含む群において選択されるＲＮＡ配列を含む。
【００９８】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも１４０８位のヌクレオチド、２４１１位のヌクレオチド、および３７０１位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５を含む群において選択されるＲＮＡ配列を含む。
【００９９】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも１４０８位のヌクレオチド、２４１１位のヌクレオチド、および６４９６位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５を含む群において選択されるＲＮＡ配列を含む。
【０１００】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも１４０８位のヌクレオチド、３７０１位のヌクレオチド、および６４９６位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５を含む群において選択されるＲＮＡ配列を含む。
【０１０１】
一部の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、少なくとも１４０８位のヌクレオチド、２４１１位のヌクレオチド、３７０１位のヌクレオチド、および６４９６位のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５を含む群において選択されるＲＮＡ配列を含む。
【０１０２】
一部の実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の１４０８位のヌクレオチドＡ（アデニン）は、ヌクレオチドＵ（ウリジン）によって置き換えられている。
【０１０３】
ある特定の実施形態において、弱毒生ＹＦＶ株は、以下を特徴とする：
−  （ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の２４１１位のヌクレオチドＧ（グアノシン）が、ヌクレオチドＵ（ウリジン）によって置き換えられている、
−  （ｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の３７０１位のヌクレオチドＡ（アデノシン）が、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている；
−  （ｉｉｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の６４９６位のヌクレオチドＡ（アデノシン）が、ヌクレオチドＧ（グアノシン）によって置き換えられている；かつ
−  （ｉｖ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の１４０８位のヌクレオチドＡ（アデニン）が、ヌクレオチドＵ（ウリジン）によって置き換えられている。
【０１０４】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株は、Ａｓｉｂｉ遺伝子型（配列番号６のＲＮＡ配列によって表される）への復帰変異を生じさせる方式で突然変異しているヌクレオチドがないという条件で、２４１１位、３７０１位、６４９６位、および場合により１４０８位にある少なくとも１つまたはそれ以上のヌクレオチドが突然変異している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５から選択されるＲＮＡ配列を含む。言い換えると、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５内のヌクレオチドが、Ａｓｉｂｉゲノム内（配列番号６内）の同一の位置にあるヌクレオチドと異なる場合、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株のＲＮＡ配列内のこのヌクレオチドは、Ａｓｉｂｉゲノム内（配列番号６内）の同一の位置にあるヌクレオチドとなるような方式で突然変異しない。Ａｓｉｂｉゲノム内の同一の位置にあるヌクレオチドと異なる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５とＡｓｉｂｉ配列（配列番号６）との間の配列アラインメントによって容易に同定することができる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０））。
【０１０５】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株は、配列番号２内の以下の位置にあるヌクレオチドが、Ａｓｉｂｉ遺伝子型（配列番号６）への復帰変異を生じさせる方式で突然変異していないという条件で、２４１１位、３７０１位、６４９６位、および場合により１４０８位にある少なくとも１つまたはそれ以上のヌクレオチドが突然変異している、配列番号２を含むＲＮＡ配列を含む：３０４、３７０、８５４、８８３、１１２７、１１４０、１４３１、１４８２、１４９１、１５７２、１７５０、１８１９、１８７０、１８８７、１９４６、１９６５、２１１２、２１９３、２２１９、２３５６、２６８７、３３７１、３６１３、３８１７、３８６０、３９２５、４００７、４０１３、４０２２、４０５４、４０５６、４２８９、４３８７、４５０５、４５０７、４６１２、４８６４、４８７３、５１５３、５１９４、５３６２、５４３１、５４７３、５９２６、６０２３、６４４８、６８７６、７１７１、７４９６、７５７１、７５８０、７６４２、７７０１、７９４５、８００８、８６２９、１０１４２、１０２８５、１０３１２、１０３３８、１０３６７、１０４１８、１０５５０、および１０８００。
【０１０６】
【表１】
2021520384.tif 000002
【表２】
2021520384.tif 000003
【０１０７】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株は、配列番号７のＲＮＡ配列を含む。有利には、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株は、限られた数の突然変異、例えば、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下の突然変異によって配列番号７と異なる、ＲＮＡ配列を含む。有利には、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株は、Ａｓｉｂｉ遺伝子型への復帰変異を生じさせる方式で突然変異しているヌクレオチドがないという条件で、限られた数の突然変異、例えば、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下の突然変異によって配列番号７と異なる、ＲＮＡ配列を含む。典型的な実施形態において、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株のゲノムＲＮＡ配列は、配列番号７のヌクレオチド配列からなり得る。
【０１０８】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株は、配列番号８のＲＮＡ配列を含む。有利には、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株は、限られた数の突然変異、例えば、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下の突然変異によって配列番号８と異なる、ＲＮＡ配列を含む。有利には、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株は、Ａｓｉｂｉ遺伝子型への復帰変異を生じさせる方式で突然変異しているヌクレオチドがないという条件で、限られた数の突然変異、例えば、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下の突然変異によって配列番号８と異なる、ＲＮＡ配列を含む。典型的な実施形態において、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株のゲノムＲＮＡ配列は、配列番号８のヌクレオチド配列からなり得る。
【０１０９】
上記のように、ＹＦＶ核酸は、以下の１１個のタンパク質をコードする：
−  前駆体が１２１ａａ長であり、かつ成熟タンパク質が１０１ａａ長である、カプシドタンパク質（Ｃタンパク質）、
−  ７５ａａ長の膜タンパク質（Ｍタンパク質）の前駆体である、１６４ａａ長のプレ膜タンパク質（ｐｒＭタンパク質）、
−  ４９３ａａ長であるエンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）、
−  ３５２ａａ長である非構造タンパク質１（ＮＳ１）、
−  ２２４ａａ長である非構造タンパク質２ａ（ＮＳ２ａ）、
−  １３０ａａ長である非構造タンパク質２ｂ（ＮＳ２ｂ）、
−  ６２３ａａ長である非構造タンパク質３（ＮＳ３）、
−  １２６ａａ長である非構造タンパク質４ａ（ＮＳ４ａ）、
−  ２３ａａ長である非構造ペプチドＰ２ｋ、
−  ２５０ａａ長である非構造タンパク質４ｂ（ＮＳ４ｂ）、
−  ９０５ａａ長である非構造タンパク質５（ＮＳ５）。
【０１１０】
一部の実施形態において、弱毒生黄熱ウイルス株は、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および／またはエンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異を含む核酸を含む。
【０１１１】
一部の実施形態において、弱毒生黄熱ウイルス株は、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異を含む核酸を含む。
【０１１２】
一部の実施形態において、弱毒生黄熱ウイルス株は、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異を含む核酸を含む。
【０１１３】
一部の実施形態において、弱毒生黄熱ウイルス株は、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、およびエンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異を含む核酸を含む。
【０１１４】
一部の実施形態において、弱毒生黄熱ウイルス株は：
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、または
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む。
【０１１５】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株は：
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む。
【０１１６】
一部の実施形態において、核酸は、ＡＡＡからＡＡＧへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む。
【０１１７】
一部の実施形態において、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異は、ＧＵＡからＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、またはＣＵＧへのコドン変化を生じさせる。一実施形態において、コドン変化は、ＧＵＡからＵＵＡである。
【０１１８】
一部の実施形態において、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異は、ＡＵＧからＧＵＧ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、またはＧＵＡへのコドン変化を生じさせる。一実施形態において、コドン変化は、ＡＵＧからＧＵＧである。
【０１１９】
一部の実施形態において、核酸は、ＧＵＡからＧＵＵへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む。
【０１２０】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株は：
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異；
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異；および
ｉｉｉ）ＡＡＡからＡＡＧへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む。
【０１２１】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株は：
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異；
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異；
ｉｉｉ）ＡＡＡからＡＡＧへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異；および
ｉｖ）ＧＵＡからＧＵＵへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む。
【０１２２】
一部の実施形態において、弱毒生黄熱ウイルス株は、４８０位での突然変異を含むエンベロープタンパク質を含む。特に、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株は、バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる４８０位での突然変異を含むエンベロープタンパク質を含む。
【０１２３】
一部の実施形態において、弱毒生黄熱ウイルス株は、配列番号１５の４８０位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含む、エンベロープタンパク質を含む。特に、前記エンベロープタンパク質は、配列番号１５の配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、または１００％同一な配列を含む。
【０１２４】
特に、本発明の弱毒生黄熱ウイルス株の核酸において、Ａｓｉｂｉ遺伝子型（配列番号６）への復帰変異を生じさせる方式で突然変異しているヌクレオチドはない。例えば、弱毒生黄熱ウイルス株の核酸は、Ａｓｉｂｉ遺伝子型（配列番号６）への復帰変異を生じさせる方式の、配列番号２内の以下の位置にあるヌクレオチドの突然変異を含まない：３０４、３７０、８５４、８８３、１１２７、１１４０、１４３１、１４８２、１４９１、１５７２、１７５０、１８１９、１８７０、１８８７、１９４６、１９６５、２１１２、２１９３、２２１９、２３５６、２６８７、３３７１、３６１３、３８１７、３８６０、３９２５、４００７、４０１３、４０２２、４０５４、４０５６、４２８９、４３８７、４５０５、４５０７、４６１２、４８６４、４８７３、５１５３、５１９４、５３６２、５４３１、５４７３、５９２６、６０２３、６４４８、６８７６、７１７１、７４９６、７５７１、７５８０、７６４２、７７０１、７９４５、８００８、８６２９、１０１４２、１０２８５、１０３１２、１０３３８、１０３６７、１０４１８、１０５５０、および１０８００。
【０１２５】
一部の実施形態において、弱毒生黄熱ウイルス株は：
（ｉ）４８０位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
（ｉｉ）６５位での突然変異を含むＮＳ２ａタンパク質
をコードする核酸分子を含む。
【０１２６】
特に、弱毒生黄熱ウイルス株の核酸分子はさらに、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および／またはエンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異を含む。
【０１２７】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株は：
（ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる４８０位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
（ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる６５位での突然変異を含むＮＳ２ａタンパク質
をコードする核酸分子を含む。
【０１２８】
特に、核酸は、ＡＡＡからＡＡＧへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および／またはＧＵＡからＧＵＵへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む。
【０１２９】
特に、本発明の弱毒生黄熱ウイルス株の核酸において、Ａｓｉｂｉ遺伝子型（配列番号６）への復帰変異を生じさせる方式で突然変異しているヌクレオチドはない。例えば、弱毒生黄熱ウイルス株の核酸は、Ａｓｉｂｉ遺伝子型（配列番号６）への復帰変異を生じさせる方式の、配列番号２内の以下の位置にあるヌクレオチドの突然変異を含まない：３０４、３７０、８５４、８８３、１１２７、１１４０、１４３１、１４８２、１４９１、１５７２、１７５０、１８１９、１８７０、１８８７、１９４６、１９６５、２１１２、２１９３、２２１９、２３５６、２６８７、３３７１、３６１３、３８１７、３８６０、３９２５、４００７、４０１３、４０２２、４０５４、４０５６、４２８９、４３８７、４５０５、４５０７、４６１２、４８６４、４８７３、５１５３、５１９４、５３６２、５４３１、５４７３、５９２６、６０２３、６４４８、６８７６、７１７１、７４９６、７５７１、７５８０、７６４２、７７０１、７９４５、８００８、８６２９、１０１４２、１０２８５、１０３１２、１０３３８、１０３６７、１０４１８、１０５５０、および１０８００。
【０１３０】
一部の実施形態において、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株は：
（ｉ）配列番号１５の４８０位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質、および
（ｉｉ）配列番号１６の６５位に対応するタンパク質内の位置でバリン残基を含むＮＳ２ａタンパク質
をコードする核酸分子を含む。
【０１３１】
特に、前記エンベロープタンパク質は、配列番号１５の配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、または１００％同一な配列を含み、前記ＮＳ２ａタンパク質は、配列番号１６の配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、または１００％同一な配列を含む。
【０１３２】
本発明の弱毒生黄熱ウイルス株の核酸は、配列番号１７の５７位に対応する、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）をコードする核酸内の位置にある、Ｇヌクレオチド、および／または、配列番号１８の４３５位に対応する、エンベロープタンパク質（Ｅ）をコードする核酸内の位置にある、Ｕヌクレオチドをさらに含み得る。特に、本発明の弱毒生黄熱ウイルス株は、配列番号１７の配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、もしくは１００％同一な配列を含む、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）をコードする核酸を含む核酸分子、および／または、配列番号１８の配列に少なくとも９０％、９５％、９８％、もしくは１００％同一な配列を含む、エンベロープタンパク質（Ｅ）をコードする核酸を含み得る。
【０１３３】
特に、本発明の弱毒生黄熱ウイルス株の核酸において、Ａｓｉｂｉ遺伝子型（配列番号６）への復帰変異を生じさせる方式で突然変異しているヌクレオチドはない。例えば、弱毒生黄熱ウイルス株の核酸は、Ａｓｉｂｉ遺伝子型（配列番号６）への復帰変異を生じさせる方式の、配列番号２内の以下の位置にあるヌクレオチドの突然変異を含まない：３０４、３７０、８５４、８８３、１１２７、１１４０、１４３１、１４８２、１４９１、１５７２、１７５０、１８１９、１８７０、１８８７、１９４６、１９６５、２１１２、２１９３、２２１９、２３５６、２６８７、３３７１、３６１３、３８１７、３８６０、３９２５、４００７、４０１３、４０２２、４０５４、４０５６、４２８９、４３８７、４５０５、４５０７、４６１２、４８６４、４８７３、５１５３、５１９４、５３６２、５４３１、５４７３、５９２６、６０２３、６４４８、６８７６、７１７１、７４９６、７５７１、７５８０、７６４２、７７０１、７９４５、８００８、８６２９、１０１４２、１０２８５、１０３１２、１０３３８、１０３６７、１０４１８、１０５５０、および１０８００。
【０１３４】
一部の実施形態において、核酸は、上記のような本発明に従った突然変異を含む、１７Ｄ亜株のＲＮＡ配列を含む。
【０１３５】
一部の実施形態において、核酸は、上記のような本発明に従った突然変異を含む、１７Ｄ−２０４亜株のＲＮＡ配列を含む。
【０１３６】
一部の実施形態において、核酸は、上記のような本発明に従った突然変異を含む、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のＲＮＡ配列を含む。
【０１３７】
典型的な実施形態において、核酸は、上記のような本発明に従った突然変異を含む、配列番号２のＲＮＡ配列を含む。
【０１３８】
以下の実施例の節から明らかとなるように、上記で規定される突然変異によって、ベロ細胞での成長に適合しており、かつ、親ＹＦＶ株と比較して病原性が弱毒化されており、例えば神経毒性が弱毒化されており、かつ、病原性が、これらの株をワクチンとしてまたはワクチン組成物中で使用することに適合している、ＹＦＶ株を提供することが可能となる。一実施形態において、上記で規定される突然変異によって、ベロ細胞での成長に適合しており、かつ親ＹＦＶ株と比較して神経毒性ではなく、かつ、親ＹＦＶ株と比較して少なくとも同程度に内臓向性が弱毒化されている、ＹＦＶ株を提供することが可能となる。一実施形態において、上記で規定される突然変異によって、ベロ細胞での成長に適合しており、かつ親ＹＦＶ株と比較して神経毒性ではなく、かつ親ＹＦＶ株と比較して少なくとも同程度に内臓向性が弱毒化されており、かつ親ＹＦＶ株と比較して少なくとも同程度に免疫原性の、ＹＦＶ株を提供することが可能となる。
【０１３９】
−  免疫原性のワクチンおよび医薬組成物
別の態様において、本発明はまた、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株を含む免疫原性組成物に関する。
【０１４０】
本発明の範囲内では、用語「免疫原性の」は、組成物が抗体介在性のおよび／または細胞介在性の免疫性および／または免疫記憶を促進する能力に関する。
【０１４１】
一部の実施形態において、免疫原性組成物は、黄熱ウイルスに対する中和抗体を生成するために利用される。
【０１４２】
別の態様において、本発明はさらに、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株および薬学的に許容可能な媒体を含む免疫原性組成物に関する。
【０１４３】
一部の実施形態において、本発明はまた、本発明に従った弱毒生ウイルス株を含むワクチン組成物、および／または本発明に従った免疫原性組成物を含むワクチン組成物に関する。
【０１４４】
一部の実施形態において、ワクチン組成物は、いかなるアジュバントも含まない。
【０１４５】
本発明の範囲内では、「アジュバント」は、ワクチンの関連する免疫応答およびその後の臨床的効能を増強させることを目的とした任意の物質を指す。
【０１４６】
あるいは、ワクチン組成物はさらに、１つまたはそれ以上のアジュバントを含み得る。
【０１４７】
一部の実施形態において、アジュバントとしては、無機塩、エマルジョン、微生物性の天然誘導体または合成誘導体、組み合わせアジュバント、サイトカイン由来のまたはアクセサリー分子由来のアジュバント、微粒子製剤、およびそれに類するものが含まれる。アジュバントの製造および使用は、当技術分野において周知である。
【０１４８】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書において記載される弱毒生ＹＦＶ株および薬学的に許容可能な担体を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１４９】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書において記載される弱毒生ＹＦＶ株および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１５０】
本発明の文脈において、表現「薬学的に許容可能な媒体」は、本発明に従った免疫原性組成物の生理学的活性、すなわち、免疫応答を誘発するその能力を保持しながらも、人間への投与のために生理学的に許容可能である、媒体を指す。１つの典型的な薬学的に許容可能な媒体は、緩衝生理食塩水である。他の生理学的に許容可能な媒体は当業者に公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．において記載されている。本明細書において記載される免疫原性組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、およびそれに類するものなどの、薬学的に許容可能な補助物質を、必要に応じて生理学的状態に近づけるために、場合により含有し得る。さらに、ワクチン組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および防腐剤を含む、薬学的に許容可能な添加物を、場合により含み得る。
【０１５１】
様々な実施形態において、免疫原性組成物のｐＨは、５．５から８の間、例えば、６．５から７．５の間（例えば約７）である。安定なｐＨは、バッファーの使用によって維持される。したがって、一部の実施形態において、免疫原性組成物はバッファーを含む。免疫原性組成物は、ヒトに対して等張であり得る。免疫原性組成物はまた、ＮａＣｌなどの１つまたはいくつかのさらなる塩を含み得る。薬学的に許容可能な担体の製造および使用は、当技術分野において周知である。
【０１５２】
実際には、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株を含む免疫原性組成物および／またはワクチン組成物および／または医薬組成物は、本分野における従来のかつ良好な慣例を使用して製造することができる。
【０１５３】
一部の実施形態において、本発明に従った免疫原性組成物、ワクチン組成物、および／または医薬組成物は、１つまたはそれ以上の適切な希釈剤および／または賦形剤を含み得る。
【０１５４】
様々な実施形態において、医薬組成物、免疫原性組成物、およびワクチン組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されるか、または滅菌濾過される。得られた水溶液は、液体形態でパッケージおよび保存されるか、または凍結乾燥され、凍結乾燥された製造物は、投与の前に無菌水性担体で再構成される。典型的な実施形態において、医薬組成物、免疫原性組成物、およびワクチン組成物は、ＷＯ２００９／１０９５５０において記載されているプリルプロセス（ｐｒｉｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を介してマイクロペレットとしてパッケージおよび保存される。一実施形態において、医薬組成物、免疫原性組成物、および／またはワクチン組成物は、凍結乾燥または噴霧凍結乾燥される。
【０１５５】
−  弱毒生ＹＦＶ株を得るための方法
本発明のさらなる態様は：
−  ａ）ベロ細胞での成長に適合していない、かつ場合により卵での成長に適合している、親弱毒生黄熱ウイルス株のウイルスゲノムＲＮＡを精製する工程；
−  ｂ）工程ａ）で精製されたウイルスゲノムＲＮＡをベロ細胞にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされたベロ細胞を得る工程；
−  ｃ）工程ｂ）で得られたトランスフェクトされたベロ細胞を培養培地において成長させ、これによって、第１の黄熱ウイルス集団を得、さらに回収する工程；
−  ｄ）工程ｃ）の最後で得られた回収された第１の黄熱ウイルス集団を、新鮮なベロ細胞で２回またはそれ以上増幅し、これによって、第２の黄熱ウイルス集団を得る工程；
−  ｅ）工程ｄ）で得られた第２の黄熱ウイルス集団を、ベロ細胞での２回またはそれ以上の連続的なプラーク精製によってクローニングし、これによって、複数の黄熱ウイルスクローンを得る工程；
−  ｆ）工程ｅ）の最後で得られた回収された黄熱ウイルスクローンのそれぞれを、新鮮なベロ細胞で２回またはそれ以上別個に増幅し、これによって、複数の黄熱ウイルス株を得る工程；および
−  ｇ）マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）試験において、工程ｆ）で回収された前記複数の黄熱ウイルス株から、親弱毒生黄熱ウイルス株ほどには神経毒性でない１つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択する工程
を含む、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株を得る方法に関する。
【０１５６】
一部の実施形態において、上記の本発明の方法の工程ｄ）は、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれを超える回数、行われる。一部の実施形態において、上記の本発明の方法の工程ｅ）でのクローニングは、ベロ細胞での２回、３回、４回、５回、６回、またはそれを超える回数の連続的なプラーク精製によって行われる。一部の実施形態において、上記の本発明の方法の工程ｆ）は、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれを超える回数、行われる。
【０１５７】
本発明のさらなる態様は：
−  ａ）ベロ細胞での成長に適合していない、かつ場合により卵での成長に適合している、親弱毒生黄熱ウイルス株のウイルスゲノムＲＮＡを精製する工程；
−  ｂ）工程ａ）で精製されたウイルスゲノムＲＮＡをベロ細胞にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされたベロ細胞を得る工程；
−  ｃ）工程ｂ）で得られたトランスフェクトされたベロ細胞を培養培地において成長させ、これによって、第１の黄熱ウイルス集団を得、さらに回収する工程；
−  ｄ）工程ｃ）の最後で得られた回収された第１の黄熱ウイルス集団を、新鮮なベロ細胞で２回またはそれ以上増幅し、これによって、第２の黄熱ウイルス集団を得る工程；
−  ｅ）工程ｄ）で得られた第２の黄熱ウイルス集団を、ベロ細胞での２回またはそれ以上の連続的なプラーク精製によってクローニングし、これによって、複数の黄熱ウイルスクローンを得る工程；
−  ｆ）工程ｅ）の最後で得られた回収された黄熱ウイルスクローンのそれぞれを、新鮮なベロ細胞で２回またはそれ以上別個に増幅し、これによって、複数の黄熱ウイルス株を得る工程；および
−  ｇ）工程ｆ）で回収された前記複数の黄熱ウイルス株から：
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、または
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む、１つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択する（このような選択は、当技術分野において周知のシーケンシング方法で容易に行われる）工程
を含む、ベロ細胞での成長に適合している弱毒生黄熱ウイルス株を得る方法に関する。
【０１５８】
一部の実施形態において、工程ｇ）は：
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む、１つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択することを含み得る。
【０１５９】
一部の実施形態において、工程ｇ）は、ＡＡＡからＡＡＧへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む核酸を含む、上記のような１つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択することを含み得る。
【０１６０】
一部の実施形態において、工程ｇ）は、ＧＵＡからＧＵＵへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異をさらに含む核酸を含む、上記のような１つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択することを含み得る。
【０１６１】
一部の実施形態において、工程ｇ）は：
ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、
ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、
ｉｉｉ）ＡＡＡからＡＡＧへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、および／または
ｉｖ）ＧＵＡからＧＵＵへのコドン変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異
を含む核酸を含む、１つまたはそれ以上の弱毒生黄熱ウイルス株を選択することを含み得る。
【０１６２】
一実施形態において、工程ａ）の親弱毒生黄熱ウイルス株は、黄熱１７Ｄ−２０４亜株などの黄熱１７Ｄ亜株である。
【０１６３】
実際には、ベロ細胞は、ＡＴＣＣなどの細胞コレクション（ｃｅｌｌ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）で入手可能である。無血清培地を使用する方法を含む、インビトロでの細胞培養でベロ細胞を成長させるために適切な方法は、当業者に周知である（Ｋｏｌｅｌｌ  Ｋ．ら、２００７）。一実施形態において、ベロ細胞は、任意のウイルス培養の前の、無血清培地での成長に適合している。
【０１６４】
一部の実施形態において、ベロ細胞を成長させるために使用される培養培地は、無血清であり、場合により、いかなるヒトまたは動物由来の物質も含まない。
【０１６５】
本発明の範囲内では、表現「ヒトまたは動物由来の物質」は、ヒトまたは非ヒト動物に由来する、タンパク質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、単糖、または多糖などの物質、例えば、ヒトまたは非ヒト動物から得られる、例えば抽出される、成長因子、ホルモンを指す。組換え分子は、ヒトまたは動物由来の物質とは見なされない。このような無血清培地および／またはいかなるヒトもしくは動物由来の物質も含まない培地は、供給業者のカタログ（例えば、ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）のカタログ）で容易に入手可能である。
【０１６６】
一部の実施形態において、ベロ細胞を成長させるために使用される培養培地はまた、抗生物質も含んでいない。
【０１６７】
一部の実施形態において、ベロ細胞を成長させるために使用される培養培地は、細菌、酵母、および／または植物に由来する１つまたはそれ以上の抽出物を含み得る。
【０１６８】
一部の実施形態において、ベロ細胞での成長に適合していない親弱毒生黄熱ウイルス株のゲノムは、ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡの形態であり得る。
【０１６９】
ある特定の実施形態において、ｃＤＮＡは、例えばプラスミドなどの適切なベクター上にある。
【０１７０】
一部の他の態様において、本発明は、本明細書において記載される突然変異が存在する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のＲＮＡ配列を含む核酸を含むベクターに関する。
【０１７１】
一部の他の態様において、本発明は、本明細書において記載される突然変異に対応する突然変異が存在する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の配列に対応するｃＤＮＡ配列を含む核酸を含むベクターに関する。
【０１７２】
さらなる態様において、本発明に従った弱毒生黄熱ウイルス株は、本発明において記載されている突然変異をゲノム配列に導入するための、黄熱ウイルスのこの前記ゲノム配列の突然変異によって得られる。一部の実施形態において、黄熱１７Ｄ亜株のゲノム配列は、本発明において記載されている突然変異をこの前記ゲノム配列に導入するように突然変異されている。一部の実施形態において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、もしくは配列番号５のＲＮＡ配列、または対応するｃＤＮＡ配列を含む核酸は、本発明において記載されている突然変異を導入するように突然変異されている。突然変異は、任意の適切な遺伝子編集技術の使用を含む、当業者に周知の方法を介する部位特異的突然変異生成によって、ゲノム配列に導入される。本発明において記載されている突然変異が導入されるゲノム配列は、黄熱ウイルスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡ、例えば、黄熱１７Ｄ亜株のゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡ、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５をコードするｃＤＮＡであり得る。一部の実施形態において、ｃＤＮＡは、適切なプラスミド上にある。黄熱ウイルスのゲノム配列に導入される、本発明において記載されている突然変異は、ゲノム配列の２４１１位、３７０１位、もしくは６４９６位にあるヌクレオチドの突然変異、またはこれらのあらゆる組合せから選択される。一部の実施形態において、これらの突然変異は、ゲノム配列の２４１１位にあるヌクレオチドＧ（グアノシン）の、ヌクレオチドＵ（ウリジン）による置き換え、ゲノム配列の３７０１位にあるヌクレオチドＡ（アデノシン）の、ヌクレオチドＧ（グアノシン）による置き換え；もしくはゲノム配列の６４９６位にあるヌクレオチドＡ（アデノシン）の、ヌクレオチドＧ（グアノシン）による置き換え、またはこれらのあらゆる組合せを含み得る。一部の実施形態において、ゲノム配列の１４０８位に位置するさらなる突然変異が導入される。一部の実施形態において、このさらなる突然変異は、ゲノム配列の１４０８位のヌクレオチドＡ（アデニン）の、ヌクレオチドＵ（ウリジン）による置き換えである。一部の実施形態において、他の突然変異が、Ａｓｉｂｉ遺伝子型への復帰変異を生じさせる方式で突然変異しているヌクレオチドがないという条件で、黄熱ウイルスのゲノム配列に導入される。別の態様において、黄熱ウイルスのゲノム配列に導入される、本発明において記載されている突然変異は、バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、もしくはＡＡＡからＡＡＧへのコドン変化を生じさせる、非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４ａ）の１９位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、またはこれらのあらゆる組合せから選択される。一部の実施形態において、ＧＵＡからＧＵＵへのコドン変化を生じさせるさらなる突然変異が、エンベロープタンパク質（Ｅ）の１４５位にあるアミノ酸のコドンに導入される。一部の実施形態において、他の突然変異が、Ａｓｉｂｉ遺伝子型への復帰変異を生じさせる方式で突然変異しているヌクレオチドがないという条件で、黄熱ウイルスのゲノム配列に導入される。特に、黄熱ウイルスのゲノム配列に導入される、本発明において記載されている突然変異は、バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる、エンベロープタンパク質（Ｅ）の４８０位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異、およびメチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる、非構造タンパク質２Ａ（ＮＳ２ａ）の６５位にあるアミノ酸のコドンにおける突然変異である。
【０１７３】
さらなる態様において、本発明はまた、本発明に従った方法によって得られる弱毒生黄熱ウイルス株に関する。
【０１７４】
本発明に従った方法によって得られる弱毒生黄熱ウイルス株もまた、本明細書において開示されている。
【０１７５】
−  種々の方法および使用
本発明はまた、それを必要とする個体への本発明に従ったワクチン組成物の投与を含む、ＹＦＶによる感染に対して前記個体を免疫化するための方法に関する。
【０１７６】
本発明の範囲内では、表現「それを必要とする個体」は、ＹＦＶによって感染するリスクがある個体を指すものである。
【０１７７】
本発明のさらなる態様はまた、ワクチンの製造のための、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株の使用に関する。一部の実施形態において、本発明はまた、ｐＭＳＬとしての、ＭＳＬとしての、またはＷＳＬとしての、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株の使用に関する。特に、本発明はまた、ワクチン製造プロセスにおける、ｐＭＳＬとしての、ＭＳＬとしての、またはＷＳＬとしての、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株の使用に関する。
【０１７８】
別の態様において、本発明は、ワクチンの製造において使用するための、本発明に従った弱毒生ＹＦＶ株に関する。
【０１７９】
本発明のさらなる態様はまた、ＹＦＶによる感染の予防において使用するための、本発明に従ったワクチン組成物に関する。
【０１８０】
一部の実施形態において、本発明は、個体への、本発明に従った有効量の弱毒生ＹＦＶ、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチン組成物の投与を含む、前記個体においてＹＦＶによる感染を予防するための方法に関する。
【０１８１】
一部の実施形態において、本発明は、個体への、有効量の本発明に従った弱毒生ＹＦＶ、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチン組成物の投与を含む、前記個体において黄熱ウイルスに対する中和抗体を生成するための方法に関する。
【０１８２】
一部の実施形態において、本発明は、ＹＦＶによる感染を予防するための薬剤を製造するための、本発明に従った弱毒生ウイルスの使用に関する。
【０１８３】
一部の実施形態において、本発明は、ＹＦＶ感染の予防において使用するための本発明に従った弱毒生ウイルスに関する。
【０１８４】
一部の実施形態において、本発明は、ＹＦＶによる感染を予防するための薬剤を製造するための、本発明に従った免疫原性組成物の使用に関する。
【０１８５】
一部の実施形態において、本発明は、ＹＦＶによる感染を予防するためのワクチン組成物を製造するための、本発明に従った免疫原性組成物の使用に関する。
【０１８６】
一部の実施形態において、本発明は、ＹＦＶによる感染の予防において使用するための、本発明に従った免疫原性組成物に関する。
【０１８７】
本発明に従ったワクチン組成物および免疫原性組成物は、任意の適切な投与経路によって、それを必要とする個体に投与される。
【０１８８】
本発明に従った免疫原性組成物またはワクチンは、粘膜投与（例えば、鼻腔内もしくは舌下）、非経口投与（例えば、筋肉内経路、皮下経路、経皮経路、もしくは皮内経路）、または経口投与によるものなどの任意の適切な経路を介して、投与することができる。当業者には明らかであるように、本発明のワクチンは、意図した投与経路に適合するように適切に製剤される。典型的な実施形態において、本発明の組成物は、筋肉内にまたは皮下に投与される。
【０１８９】
本発明に従ったワクチンは、複数回用量で投与される。例えば、本発明に従ったワクチンは、１回用量、２回用量、３回用量で投与される。一実施形態において、本発明に従ったワクチンは、単回用量で投与される。
【０１９０】
本発明に従ったワクチンは、当業者によって容易に決定される量で投与される。一部の実施形態において、ワクチン用量は、４ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０から６ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０の間である。
【実施例１】
【０１９１】
ベロ細胞への適合による弱毒生ＹＦＶ株の調製（プレマスターシードロット（ｐＭＳＬ））
１．１／方法の選択−原理
プレマスターシードロット（ｐＭＳＬ）のための全体的な戦略を図１に示す。
【０１９２】
ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ワクチンおよびＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ワクチンの両方は、クローニングされていないＹＦ１７Ｄ−２０４株調製物から開発されており、プラークサイズ表現型によって視覚化されているように、異種ウイルス集団を含有する。さらに、両ワクチンは、卵で生産された。
【０１９３】
均質な、明確に定義された、ベロ細胞での成長に適合しているウイルス株を生成するために、ならびに最終ｐＭＳＬにおける無菌状態および外来因子（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）の不存在を確実にするために：
−  （１）ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ウイルスおよびＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ウイルスのウイルスゲノムＲＮＡを精製し；
−  （２）次いで、ベロ細胞にトランスフェクトして黄熱ウイルスを回収し、これを次いで、ベロ細胞で２回増幅して、ウイルスをこの細胞基質での成長に適合させた；
−  （３）ウイルスを次いで、２回のプラーク精製サイクルによってクローニングした。この目的のために、ウイルス調製物を、ベロ細胞の感染のために希釈し、半固体のオーバーレイの下で成長させて、良く分離されたウイルスプラークを得た。各トランスフェクションで、それぞれ単一のウイルス集団に対応する２つの個別のプラークを、オーバーレイを通ってかき取り、希釈し、プラーク精製の第２のサイクルに使用し、ウイルスクローンを生成させた；
−  （４）これらのクローンを次いで増幅して、ｐＭＳＬを構成するための十分なウイルスストックを得た。
【０１９４】
ｐＭＳＬ生産に使用した全ての培地および溶液は、動物成分およびヒト成分を有していなかった。
【０１９５】
１．２／方法
１．２．１／ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ゲノムｃＤＮＡからのインビトロでの転写
ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）（ＷＯ２０１４／０１６３６０において開示されているプラスミドｐＪＳＹ２３７４．５）のＹＦＶのゲノムｃＤＮＡのインビトロでの転写を、供給業者の推奨に従って、ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ（商標）ＳＰ６キット（ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）、参照ＡＭ１３４０）で行った。プラスミドｐＪＳＹ２３７４．５から、２回のインビトロでの転写を並行して行った。
【０１９６】
簡潔に述べると、室温で解凍した後、プラスミド１０μｇを、３７±２℃で２時間、制限酵素ＮｒｕＩ（３０Ｕ／１０μｇ）で消化することによって線状化した。酵素を次いで、６５℃で２０分間インキュベートすることによって不活化した。プラスミドの線状化を、０．５％アガロースゲルでの電気泳動によって確認した。キットの反応バッファー、リボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰと７−メチル−ＧＴＰとの混合物）、酵素、ならびにプラスミド１μｇを含む、反応混合物４０μＬを調製した。得られた混合物を、３７±２℃で２時間、インキュベートした。
【０１９７】
１．２．２／ＲＮＡの精製
ａ）Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ワクチンのワーキングシードロットから
ウイルスＲＮＡの２回の精製を並行して行った。
【０１９８】
Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ワクチン（ロット番号ＦＡ２３８６６７、感染力価６．３８ｌｏｇ１０ＰＦＵ／バイアル）のワーキングシードロットの４つのバイアルを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））の溶解バッファー２００μｌにそれぞれ懸濁し、次いでプールした。ＲＮＡを次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１２５：２４：１；ｐＨ４．５）での２回シリーズの抽出によって精製した。
【０１９９】
２ｍＬのＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ  Ｈｅａｖｙチューブ（５ＰＲＩＭＥ（登録商標））を、３０秒間、１１０００×ｇで遠心分離した。ＲＮＡ／溶解バッファー混合物７５０μＬを、各チューブに入れた。等容積（７５０μｌ）のフェノール／クロロホルム／ＩＡＡ溶液を次いで、各チューブに添加した。有機相および水相を勢いよく混合して、均質な一時的な懸濁液を形成した後、チューブを１１０００×ｇで５分間遠心分離して、相を分離した。上部の相（水相）を次いで回収した。操作を、新たなＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌの２ｍＬのチューブで繰り返した。次いで、操作をクロロホルムおよびイソアミルアルコールの混合物（２４：１）で再び行って、全ての微量のフェノールを除去した。ＲＮＡを次いで濃縮し、全ての微量の有機溶媒を、シリカカラム上で、供給業者の推奨に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））で精製することによって、洗い流した。精製したＲＮＡを次いで、ヌクレアーゼを有さない水の中で溶出した。
【０２００】
ｂ）ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ゲノムｃＤＮＡのインビトロでの転写から
インビトロでの転写によって得られたＲＮＡ（上記を参照されたい）に混入しているプラスミドＤＮＡを、４ＵのＤＮａｓｅによって、３７±２℃で１５分間除去した。ＳＰ６ポリメラーゼを次いで、７０℃で１０分間のインキュベーションによって不活化した。
【０２０１】
インビトロでの転写によって得られたＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））のＲＮａｓｅを有さない水６０μｌおよび溶解バッファー３５０μｌと混合した。ＲＮＡを次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１２５：２４：１；ｐＨ４．５）での２回シリーズの抽出によって精製した。このために、Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ  Ｈｅａｖｙの１．５ｍＬのチューブを、１１０００×ｇで３０秒間、遠心分離した。ＲＮＡ／溶解バッファー混合物７５０μＬを各チューブに入れた。等容積（７５０μｌ）のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液を次いで、各チューブに添加した。有機相および水相を勢いよく混合して、均質な一時的な懸濁液を形成した後、チューブを１１０００×ｇで５分間遠心分離して、相を分離した。上部の相（水相）を次いで回収した。操作を、新たなＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌの１．５ｍＬのチューブで繰り返した。次いで、操作をクロロホルムおよびイソアミルアルコールの混合物（２４：１）で再び行って、全ての微量のフェノールを除去した。ＲＮＡを次いで、シリカカラム上で、供給業者の推奨に従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））で精製した。精製したＲＮＡを次いで、ヌクレアーゼを有さない水で溶出した。
【０２０２】
１．２．３／トランスフェクション
２回のトランスフェクションを、各ＲＮＡ精製と並行して行った。
【０２０３】
ａ）ＲＮＡ／リポフェクタミン（商標）混合物の調製
リポフェクタミン（商標）２０００  ＣＤ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標））１０または１５μＬを、ＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ培地（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標））１ｍＬと混合し、室温で５分間インキュベートした。約１０ｌｏｇ１０Ｇｅｑ（Ｍａｎｔｅｌら（２００８）において記載されているようにＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定されるゲノム当量力価）の精製されたＲＮＡを次いで添加した。これらの混合物を、室温で１０分間、インキュベートした。
【０２０４】
ｂ）ベロ細胞の調製
トランスフェクションの前に、６ウェルプレートに事前に播種された（ウェル当たり３ｍＬのＶＰ−ＳＦＭ（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）中に９・１０５個細胞）Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ’ｓ  ＧＭＰバンクの無血清のベロ細胞を、ウェル当たり２ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ培地ですすいだ。
【０２０５】
ｃ）トランスフェクション反応
６ウェルプレートにおいて、細胞からすすぎ用培地を除去した後、ＲＮＡを含有するトランスフェクション混合物を、各調製物につき２つのウェルに置いた（１ｍＬ／ウェル）。ウェルを、ＲＮＡを含有しないＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ／リポフェクタミン（商標）と接触させ、最後のウェルを、ＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ培地のみにおいて細胞コントロールとして維持した。２つのプレートを並行して調製し、一方は、リポフェクタミン（商標）１０μｌを含有する混合物を有し、一方は、リポフェクタミン（商標）１５μｌを含有する混合物を有していた。リポフェクタミン（商標）およびＲＮＡを含有する混合物を、３７±２℃、５±２％ＣＯ２で４時間、ベロ細胞と接触させたままとし、次いで、事前に加熱したＶＰ−ＳＦＭ培地２ｍＬを各ウェルに添加した。６ウェルプレートを、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で１６時間、インキュベートした。培地を次いで交換し、プレートを、３７±２℃、５±２％ＣＯ２で再びインキュベートした。細胞変性効果（細胞溶解）が肉眼で確認できる場合、および培養上清からＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定されるゲノム力価（Ｍａｎｔｅｌら（２００８）において記載されているように）が８．０ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍＬよりも高い場合には、トランスフェクション上清を回収した。採取が可能になるために必要な培養時間がこれらの時間よりも長い場合には、新鮮な培地による培養培地の置き換えを５日目および８日目に行った。採取した上清をアリコートに分けた。
【０２０６】
１．２．４／ウイルスの増幅
ａ）増幅番号１（ウイルス継代番号２）
ウイルス増幅番号１の２日前に、ベロ細胞２・１０５個を、ＶＰ−ＳＦＭ培地５ｍＬを含有する２５ｃｍ２のフラスコに播種した。次いで、トランスフェクションから得られたウイルス懸濁液をＶＰ−ＳＦＭ培地中で希釈して、ゲノム多重度（ｍ．ｏ．ｇ）２（すなわち、細胞当たり２Ｇｅｑ、ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られるＲＮＡ濃度から推定される）を得た。事前に播種されたベロ細胞の培養培地を除去し、細胞を、希釈されたウイルス懸濁液１ｍＬまたはＶＰ−ＳＦＭ培地のみ１ｍＬ（細胞コントロール）と接触させた。フラスコを、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で２時間、インキュベートした。ウイルス接種物を次いで除去し、ＶＰ−ＳＦＭ培地１０ｍＬで置き換え、細胞を、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で２日間、インキュベートした。培養培地を次いで、３７±２℃に事前に加熱した新たなＶＰ−ＳＦＭ培地で交換し、フラスコを、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で２から３日間、再びインキュベートした。全部で４から５日間インキュベートした後、ウイルスを含有する培養上清を回収した。ウイルス懸濁液を、１２００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離することによって清澄化し、次いで、アリコートに分配した。このウイルス懸濁液１４０μｌを使用して、全ＲＮＡをＱｉａＡｍｐウイルスミニキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）；供給業者のプロトコルに従って）で抽出し、ウイルスＲＮＡを、ＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｍａｎｔｅｌら（２００８）において記載されているように）。
【０２０７】
第２の増幅工程が同日に行われる場合には、第２の増幅工程を行うために、ウイルスＲＮＡ力価に応じて１つまたはそれ以上のアリコートを保存し、他のものは、１０％の最終ソルビトールの存在下で≦−７０℃で凍結した。
【０２０８】
ｂ）増幅番号２（ウイルス継代番号３）
ウイルス増幅番号２の２日前に、ベロ細胞５・１０５個を、ＶＰ−ＳＦＭ培地２０ｍＬを含有する７５ｃｍ２のフラスコに播種した。次いで、第１の増幅から得られたウイルス懸濁液を、ｍ．ｏ．ｇ２（すなわち、細胞当たりＧｅｑ、ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られるＲＮＡ濃度から推定される）の割合でベロ細胞に感染するように、ＶＰ−ＳＦＭ培地中で希釈した。
【０２０９】
増幅番号２の他の工程は、増幅番号１について詳述したように行った（上記のａ）の節を参照されたい）。
【０２１０】
ｃ）ウイルスのクローニング−プレート精製（ウイルス継代４および５）
トランスフェクションおよび増幅の後に得られるウイルス懸濁液当たり、２つの６ウェルプレートが必要であった。
【０２１１】
増幅番号２の後に得られたウイルス懸濁液のアリコートを、約２．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬの懸濁液および１．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬの懸濁液を得るように希釈した。６ウェルプレートに事前に播種されたベロ細胞（ウェル当たりＶＰ−ＳＦＭ３ｍＬ中に細胞９・１０５個）を、細胞の完全性および混入物の不存在を確認するために観察し、次いで、培養培地を除去した。各希釈で、プレートの５つのウェルに、各ウェルにおいて５００μＬの希釈されたウイルス（希釈物１ｍＬ当たり２．０ｌｏｇ１０ＰＦＵまたは１．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ）を感染させ、細胞コントロールウェルは、５００μＬのＶＰ−ＳＦＭのみを含有していた。プレートを、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で２時間、インキュベートした。次いで、接種物を除去し、オーバーレイ混合物、すなわち、４２℃に事前に加熱したＶＰ−ＳＦＭ  ２Ｘの溶液４ｍＬで置き換え、即席で体積比で（ｖｏｌｕｍｅ  ｔｏ  ｖｏｌｕｍｅ）２％アガロース溶液と混合した。オーバーレイ混合物を固化した後、プレートを逆の位置で（蓋を下にして）、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で、３から６日間、インキュベートした。プレートは毎日観察した。細胞変性効果が現れたらすぐに、第１のオーバーレイ混合物と同一であるが０．００８％ニュートラルレッドをさらに含有する第２のオーバーレイ混合物を各ウェルに添加し（２ｍＬ）、プレートを逆の位置で、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で１から２日間、インキュベートした。
【０２１２】
ウイルス粒子（クローン）での細胞の感染は、これらの条件において、すぐ周辺の細胞に限定されたままであり、局所的溶解を生じさせ、その他の箇所である赤色の細胞単層よりもウイルスに富んでいる白色のスポット（溶解プラーク）を生じさせた。それぞれの増幅されたウイルス希釈物について、マイクロピペットおよび１０００μＬのコーンを使用して、カバー培地を通して２つのクローンを回収した。こうして得られたウイルスクローンを、ＶＰ−ＳＦＭ培地１ｍＬに懸濁し、次いで、勢いよく混合した。
【０２１３】
これらの懸濁液の各々を、カスケード工程で１：２から１：２０万まで希釈して、第２シリーズのプレート精製を行った。この第２のクローニングの実行の最後に、プレート当たり２つのクローンを再び採取した。系統当たり最大１６個のクローンを得、すなわち、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）親株から１６個のクローンを、およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）親株から１６個のクローンを得た。
【０２１４】
ｄ）増幅番号３（ウイルス継代番号６）
各クローン（最大３２）について、アガロースに含有されるウイルス物質の再懸濁によって得られたウイルス懸濁液を、ＶＰ−ＳＦＭ中に１／４または１／２（回収されたプラークのサイズに応じて）で希釈した。
【０２１５】
増幅番号３を、増幅番号１と同一のプロトコルに従って行った（上記のａ）の節を参照されたい）。細胞変性効果が肉眼で確認でき、ｑＲＴ−ＰＣＲにおけるゲノム力価が８．０ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍＬよりも高い場合には、増幅されたウイルスを採取した。
【０２１６】
全部で４から５日間インキュベートした後、ウイルスを含有する培養上清を回収し、アリコートに分けた。このウイルス懸濁液１４０μＬを使用して、供給業者のプロトコルに従ってＱｉａＡｍｐウイルスミニキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））で全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡをＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した（Ｍａｎｔｅｌら（２００８）において記載されているように）。次の工程の増幅を行うために、ウイルスＲＮＡ力価に応じて１つまたはそれ以上のアリコートを保存し、他のものは、１０％の最終ソルビトールの存在下で≦−７０℃で凍結した。
【０２１７】
ｅ）増幅番号４（ウイルス継代番号７）
増幅番号３で得られたウイルス懸濁液（上記のｄ）の節を参照されたい）を、ｍ．ｏ．ｇ２の割合で事前に播種されたベロ細胞に感染するように、ＶＰ−ＳＦＭ培地中で希釈し、増幅番号２と同一のプロトコルに従ってさらに処理した（上記のｂ）の節を参照されたい）。
【０２１８】
細胞変性効果が肉眼で確認でき、ｑＲＴ−ＰＣＲにおけるゲノム力価が８．０ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍＬよりも高い場合には、増幅されたウイルスを採取した。全部で４から５日間インキュベートした後、上清を回収し、ウイルス懸濁液を、１２００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離することによって清澄化し、次いで、１０％の最終ソルビトールの存在下で、≦−７０℃で凍結アリコートに分けた。
【０２１９】
こうして得られたウイルス懸濁液を使用して、感染力価測定およびウイルスゲノムのシーケンシングを行った。
【０２２０】
これらのデータから、各系統の３つの株（すなわち、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）親株からの３つの株、ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、およびＴＶ２２４１、ならびにＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）親株からの３つの株、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１）を、以下の基準に従って選択した：感染力価≧６ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍＬ、およびゲノム配列がＡｓｉｂｉオリジナル株配列への復帰変異を示していない。
【０２２１】
ウイルス懸濁液の感染力価測定を、ベロ細胞でＣＣＩＤ５０方法を使用して行った。簡潔に述べると、ウイルス懸濁液を、９６ディープウェルプレートにおいて、ＩＭＤＭ（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）＋４％ＦＣＳ中で、−４．６ｌｏｇ１０から開始して−８ｌｏｇ１０まで連続的に４倍希釈した。コントロールウイルス（ベロ細胞で１回増幅されたＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ウイルス、バッチＭＬＥ−ＪＰＯ−００００８９）を、各試験においてポジティブリファレンスとして含めた。各ウイルス希釈物１００マイクロリットルを、アッセイの３日前に平底９６ウェルプレートに播種されたベロ細胞（８０００個細胞／ウェル）を含有する１０個のウェルに添加した。＋３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートした後、上清を廃棄し、細胞を、−２０±３℃で、８５％アセトン１５０μＬで１５分間固定し、次いで、２．５％ミルクＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファー溶液で飽和させ、その後、２μｇ／ｍＬ（１／２０００希釈）のパンフラビウイルスＥ特異的４Ｇ２マウスモノクローナル抗体（ＲＤ  ＢＩＯＴＥＣＨ（登録商標）、ロット番号１３０７２６−４Ｇ２）で免疫染色した。４Ｇ２抗体で染色された感染中心を、次いで、１／１０００希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体（ＣＬＩＮＩＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）ＳＡ、参照番号１０３０−０４、ロット番号Ａ７０１３−Ｚ１４５）とインキュベートし、次いでアルカリホスファターゼ基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）、参照番号Ｂ５６５５、ロット番号ＳＬＢＮ０６８９Ｖ、およびレバミゾール、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）、参照番号Ｌ９７５６、ロット番号０９１Ｍ１２２７Ｖ）とインキュベートして可視化した。
【０２２２】
ポジティブなウェル、すなわち、黒く染色された少なくとも１つのプラークを含有するウェルを計数し、最終力価を、最小二乗回帰方法を使用して計算した。
【０２２３】
ｆ）増幅番号５（ウイルス継代番号８）−プレマスター候補（ｐＭＳＬ）
増幅番号４から選択された６つの株のそれぞれのウイルス懸濁液（上記のｅ）の節を参照されたい）を、ｍ．ｏ．ｉ０．０１でベロ細胞に感染するように、ＶＰ−ＳＦＭ培地に希釈した。
【０２２４】
ウイルス増殖番号５の２日前に、１２・１０６個のベロ細胞を、ＶＰ−ＳＦＭ培地３０ｍＬを含有する１７５ｃｍ２のフラスコに播種した。先ほど行ったように、培養培地を除去し、希釈されたウイルス懸濁液またはＶＰ−ＳＦＭのみ（コントロール細胞）１２ｍＬで置き換えた。フラスコを、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で２時間、インキュベートした。ウイルス接種物を次いで除去し、ＶＰ−ＳＦＭ培地５０ｍＬで置き換えた。フラスコを、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で２日間、インキュベートした。培養培地を次いで、３７±２℃に事前に加熱した新鮮なＶＰ−ＳＦＭ培地で交換し、フラスコを、３７±２℃；５±２％ＣＯ２で１から３日間、再びインキュベートした。細胞変性効果が肉眼で確認でき、ｑＲＴ−ＰＣＲにおけるゲノム力価が８．０ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍＬよりも高い場合には、増幅されたウイルスを採取した。
【０２２５】
全部で３から５日インキュベートした後、上清を回収し、ウイルス懸濁液を、１２００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離することによって清澄化し、次いでアリコートに分配し、これを、１０％の最終ソルビトールの存在下で、≦−７０℃で凍結した。６つの選択された株から得られた増幅されたウイルスは、６つの候補ｐＭＳＬを構成した。
【実施例２】
【０２２６】
マウスモデルにおける候補の神経毒性
２．１／マウスモデルにおけるｐＭＳＬ候補の神経毒性
ｖＹＦ（ベロ細胞適合型黄熱ウイルス）のプレマスターシードロット（ｐＭＳＬ）候補の神経毒性を、ＷＨＯ  ＴＲＳ  ８７２、付録２（１９９８）において記載されている、マウス５０％致死量（ＭＬＤ５０）の決定を介して評価した。
【０２２７】
ｐＭＳＬ候補の神経毒性の研究では、８頭のメスＯＦ１マウス（接種時点で４週齢）からなる群に、０．４％  ＮａＣｌ、２．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）バッファー中の５から７個のウイルス希釈物３０μｌを、脳内経路によって注射した。４つのｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補、ＴＶ２２１２、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１を、これらの神経毒性について評価し、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンおよびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）参照ワクチンと比較した。マウスを２１日間モニタリングし、生存しているマウスの数を２１日目に記録した。３回の独立した実験を、ランダム分布の試料で行った。注射された量を、各実験の接種日に、ＣＣＩＤ５０逆力価測定によってチェックした。
【０２２８】
臨床モニタリングを毎日行って、生存率を毎日記録した。ＭＬＤ５０を、最小二乗回帰を使用して、マウスの５０％生存を誘発する用量として計算し、ｌｏｇ１０ＭＬＤ５０／ｍＬで表した。各株のＭＬＤ５０を、３つの決定値の加重平均および９５％信頼区間として決定したが、ＴＶ３１１１およびＴＶ３１１２は除き、それは、ＴＶ３１１１株およびＴＶ３１１２株を投与された群では最高用量（０．７ｌｏｇ１０希釈３０μｌ）であっても生存マウスが１００％であると記録されたために、ＭＬＤ５０が計算できなかったためである。
【０２２９】
結果を以下の表２に示す。
【０２３０】
【表３】
2021520384.tif 000004
【０２３１】
Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統に由来するｖＹＦ株ＴＶ２２１２に関して、これは、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンと比較して類似の神経毒性を示した。
【０２３２】
ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統に由来するｖＹＦ株ＴＶ４２２１は、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）参照ワクチンと比較して類似の神経毒性を示した。最後に、共にＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統に由来するｖＹＦ株、ＴＶ３１１１およびＴＶ３１１２は、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）参照ワクチンと比較して神経毒性の影響を示さなかった。これらの２つのｖＹＦ株では、ＭＬＤ５０力価は計算できなかった（少なくとも＜２．２ｌｏｇ１０ＭＬＤ５０／ｍＬ）。
【０２３３】
結果として、２つのｖＹＦ株、ＴＶ２２１２およびＴＶ４２２１は、これらのそれぞれの親参照であるＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と類似の神経毒性プロファイルおよびＭＬＤ５０力価を示した。共にＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統に由来する２つの他のｖＹＦ株、ＴＶ３１１１およびＴＶ３１１２は、これらのＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）親株と比較して神経毒性が著しく弱毒化しており、そのため、これらのＭＬＤ５０力価は評価することができなかった。
【０２３４】
２．２．／マウスモデルにおけるＴＶ３１１２株のＭＳＬおよびＷＳＬの神経毒性
２．２．１／ＴＶ３１１２株のＭＳＬおよびＷＳＬ
ＭＳＬおよびＷＳＬの生産に使用した全ての培地および溶液は、動物成分およびヒト成分を有していなかった。
【０２３５】
静的条件下でベロ細胞を増幅した後、細胞をバイオリアクターに播種した。細胞をバイオリアクター内で３日間成長させた後、培地を、細胞成長培地からウイルス生産培地に変更した。シードロット（ＴＶ３１１２  ＭＳＬを生産するためのＴＶ３１１２  ｐＭＳＬ、またはＴＶ３１１２  ＷＳＬを生産するためのＴＶ３１１２  ＭＳＬ）をバイオリアクターに添加することによって、ウイルスを接種した。ウイルスを２日間増殖させた後、ウイルス生産培地を廃棄し、同容積の新鮮なウイルス生産培地で置き換えた。ウイルス接種の４日後、バイオリアクターの内容物を採取し、清澄化し、安定化し、充填し、凍結保存した。
【０２３６】
２．２．２／ＴＶ３１１２株のＭＳＬおよびＷＳＬの神経毒性
上記の実施例２、２．１項において記載されているものと同一のプロトコルを使用した。
【０２３７】
【表４】
2021520384.tif 000005
【０２３８】
ＴＶ３１１２  ｐＭＳＬについては、ＴＶ３１１２  ＭＳＬおよびＴＶ３１１２  ＷＳＬは、神経毒性の影響を示さなかった。ＭＬＤ５０力価は、ＴＶ３１１２  ＭＳＬおよびＴＶ３１１２  ＷＳＬでは計算することができなかった（少なくとも＜２．２ｌｏｇ１０ＭＬＤ５０／ｍＬ）。
【０２３９】
ＴＶ３１１２  ＭＳＬおよびＴＶ３１１２  ＷＳＬは、これらのＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）親株と比較して神経毒性が著しく弱毒化しており、そのため、これらのＭＬＤ５０力価は評価することができなかった。
【実施例３】
【０２４０】
マウスモデルにおけるｖＹＦ株候補の内臓向性および神経向性
６つのｖＹＦ（ベロ細胞適合型黄熱ウイルス）のプレマスターシードロット（ｐＭＳＬ）候補の内臓向性および神経向性を、病原性ワクチン株と弱毒化ワクチン株との間の区別を可能にするように開発されたＩ型ＩＦＮ受容体欠損マウスへの接種に基づくアッセイにおいて評価した（Ｍｅｉｅｒら、２００９；ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＰｆｅｉｆｆｅｒ、２０１５）。Ｉ型ＩＦＮ受容体がＫＯされたＡ１２９免疫欠損マウスは、霊長類およびヒトにおける野生型ＹＦウイルスの感染を模倣することが記載されている（Ｍｅｉｅｒら、２００９）。したがって、このようなマウスモデルは、非弱毒化黄熱ウイルスによって生じる内臓向性疾患を研究するために適切であると考えられる。
【０２４１】
３．１／方法
３．１．１／群の定義
６頭の４〜８週齢のメスＡ１２９マウスからなる１５の群（群ＡからＯ）に、以下の表４に記載するように、６つのｐＭＳＬ候補のそれぞれまたはＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチン４ｌｏｇ１０ＣＣＩＤＣＣＩＤ５０／用量を投与した（アジュバントなし；皮下投与経路；０日目で２００μｌ）。
【０２４２】
【表５】
2021520384.tif 000006
【０２４３】
３．１．２／研究スケジュール
研究スケジュールを図２に記載する。
【０２４４】
群Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｏの６頭のマウスを安楽死させ、それらの器官を６日目にサンプリングし、群Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、Ｎの６頭のマウスを安楽死させ、それらの器官を１１日目にサンプリングした。中間血液サンプリングを、４日目に、群Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、およびＮにおいて回収した。ＰＢＳコントロールでは、６頭のマウスのみが含まれ、１１日目にサンプリングした（群Ａ）。
【０２４５】
３．１．３／マウスの臨床的所見およびスコアリング
動物を、接種後１１日間、毎日、以下の表５に記載するスコアリンググリッドに従って観察した。体温を、３日目から実験の最後の１１日目まで毎日モニタリングし、記録した。
【０２４６】
【表６】
2021520384.tif 000007
【０２４７】
実験の最中に、以下の事象のいずれかが生じた場合には、動物を安楽死させた：
−  罹患の徴候（悪液質、衰弱、運動の困難性、または飼料摂取の困難性）
−  化合物毒性（こぶ、けいれん）
−  全身状態スコア＝３＋刺激に対する反応＝３
−  体重減少＞２０％
【０２４８】
死亡していることが分かった全ての動物は、剖検した。
【０２４９】
３．１．４／生物学的サンプリング
ａ）４日目に、中間血液サンプルを麻酔下で顎下静脈から採取した。血液およそ２００μＬを、血栓活性化剤および血清分離剤（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ）を含有するバイアルに回収した。
【０２５０】
ｂ）６日目および１１日目に、血液サンプルを、麻酔下で、頸動脈の切開による瀉血の後に、全ての動物から採取した。血液およそ１ｍＬを、血栓活性化剤および血清分離剤（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ）を含有するバイアルに回収した。
【０２５１】
ｃ）器官の回収を無菌条件下で行った。動物の解剖に使用した機器は、ＲＮａｓｅＺａｐ（商標）汚染除去溶液で事前にすすいだ。以下に列挙する全ての器官：脳、肝臓、および脾臓は、瀉血の後できるだけすぐに全てのマウスからサンプリングし、その後、麻酔下での頚部脱臼によって動物を安楽死させた。
【０２５２】
肝臓については、ウイルス負荷検出のための７ｍｍ直径の２つの生検パンチを、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）溶液１ｍＬを含有するバイアル内に置いた。
【０２５３】
脳および脾臓については、ウイルス負荷検出のための２つの半切片を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）溶液１ｍＬを含有するバイアル内に置いた。
【０２５４】
３．１．７／分析試験
ａ）ウイルス血症
全ゲノムＲＮＡを、各個体の血清サンプル１４０μＬから、製造者の指示に従って、Ｔｅｃａｎ  Ｅｖｏｗａｒｅ自動ＲＮＡ抽出ワークステーションでＭａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）９６ウイルスキットを用いて抽出し、最終容積が１４０μＬのヌクレアーゼを有さない水の中に、２工程で溶出した。
【０２５５】
抽出の直後、ＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡの定量を行った（Ｍａｎｔｅｌら（２００８）において記載されているように）。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＹＦウイルスゲノムの存在を検出するために、ＹＦ  ＮＳ５遺伝子の保存領域を標的化する。
【０２５６】
ｂ）器官におけるウイルス負荷
生検パンチをＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（商標）溶液中で、−８０℃で凍結した。解凍時に、器官の各サンプルを秤量した。
【０２５７】
全ＲＮＡを、組み合わせＴｒｉｚｏｌ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））／ＲＮｅａｓｙ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））方法を供給業者の推奨によって定められている通りに使用して、器官のパンチから抽出した。
【０２５８】
精製されたＲＮＡサンプルにおけるウイルスＲＮＡの存在を、次いで、Ｍａｎｔｅｌら（２００８）において記載されている通りにＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して定量した。ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＹＦウイルスゲノムの存在を検出するために、ＹＦ  ＮＳ５遺伝子の保存領域を標的化する。
【０２５９】
各ｑＲＴ−ＰＣＲの実行は、２つの非鋳型コントロール（ネガティブｑＲＴ−ＰＣＲコントロール）およびＣＹＤ−３ウイルス懸濁液に基づく２つのポジティブコントロールを含んでいた。
【０２６０】
実行を確認するためには、全てのネガティブコントロールは検出限界（ＬＯＤ）を下回らなくてはならず、ポジティブコントロールはコントロールチャートに含まれなくてはならなかった。
【０２６１】
希釈係数に起因して、また、器官１００ｍｇのサンプルについて、検出限界を器官１ｍｇ当たり１Ｇｅｑと計算した。
【０２６２】
３．２／結果
３．２．１／臨床的徴候
全ての動物を、上記の表５に記載されているスコアリンググリッドに従って、接種後に毎日観察した：群ＡからＯの全てのマウスは、３日目から６日目まで、毎日スコアリングし、群Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、およびＮの全てのマウスは、１１日目まで毎日、さらにスコアリングした。
【０２６３】
各基準、すなわち、全身状態（ＧＡ）、刺激に対する反応（ＲＳ）、神経学的徴候（ＮＳ）、および呼吸（Ｂ）について、３日目から１１日目まで、各群について各時点で、平均スコアを計算した。予想した通り、生理食塩水コントロールを注射された全てのＡ１２９マウス（ＰＢＳ、群Ａ）では、全ての動物で、全てのモニタリング期間の間、具体的な臨床スコアは記録されなかった。
【０２６４】
Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチン、またはｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補の１つを投与された全てのＡ１２９群では、臨床的徴候は軽度であり、各基準についての平均スコアは、どの時点でも、およびどの基準でも、１．５より小さかった（ＧＡ＜１．５；ＲＳ、ＮＳ、およびＢ＜１）。
【０２６５】
具体的な臨床スコアは、３日目、４日目、および５日目には記録されなかった；その後、多少のスコア１／０／０／０または２／０／０／０（ＧＡ／ＲＳ／ＮＳ／Ｂ）が、６日目および７日目までに、わずかなマウスで記録された。１０日目および１１日目に、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチン、またはｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補の１つを投与された全てのＡ１２９マウスが、低いスコアを示し（一部のマウスは、ＧＡのスコア＝１または２であり、ＲＳ、ＮＳ、およびＢのスコア＝１であった）、ただし、１０日目に多少の震えの表現型、運動合併症、衰え、および呼吸窮迫を示した（スコア３／２／３／２）、ＴＶ２２３２を投与された１頭のマウス（群Ｆ）は除き、このマウスは、倫理的理由で安楽死させた。
【０２６６】
３．２．２／体重のモニタリング
全てのマウス（群ＡからＯ）を、０日目、３日目、４日目、５日目、および６日目に秤量し；７日目、１０日目、および１１日目に、残っている群（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、およびＮ）の全てのマウスを秤量した。０日目と比較した体重減少のパーセンテージを、各時点で、それぞれの個々のマウスについて計算した。
【０２６７】
Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンで免疫化した後、１１日間のモニタリング期間の間にわずかな体重減少が見られた（１１日目で平均５％未満の体重減少）。
【０２６８】
Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統に由来するｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補で免疫化した後、Ｓｔａｍａｒｉｌコントロールでのように、クローンＴＶ２２３２で免疫化した１頭のマウスが１０日目にその体重の２０％超を失ったことを除いて、体重の大きな減少は見られなかった。このマウスは、倫理的理由で安楽死させなくてはならなかった（上記の３．２．１を参照されたい）。
【０２６９】
ＹＦＶＡＸ（登録商標）系統に由来するｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１で免疫化した後、５日目から６日目までに安定した体重が見られ、記録され、わずかな体重の増加がモニタリング期間の終わりまでに見られた（１１日目で平均５％未満の体重増加）。
【０２７０】
３．２．３／血清および器官におけるウイルス負荷
ａ）血清中−図３
個々のウイルス血症、ならびに各群および各時点で計算された幾何平均力価（ＧＭＴ）および標準偏差を、図３に示す。
【０２７１】
予想した通り、０日目にＰＢＳを投与されたＡ１２９マウスでは、ウイルス血症は４日目に検出されず（３ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍＬのＬＯＤ未満）、その一方で、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンを投与されたＡ１２９マウスにおいては、４ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍＬから５ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍＬの間の幾何平均ウイルス血症力価が、４日目および６日目に検出された。
【０２７２】
ｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補で免疫化した後、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統に由来するＴＶ４２２１が注射後４日目にＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）コントロールよりも有意に高レベルのウイルス血症を誘発したことを除いて（ｐ値＝０．００１）、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）コントロールで免疫化した後に誘発されたウイルス血症と比較して、有意に高レベルのウイルス血症は見られなかった（どの時点でも、ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、ＴＶ２２４１、ＴＶ３１１１、およびＴＶ３１１２で、全てのｐ値＞０．２）。
【０２７３】
ｂ）肝臓内−図４
結果は、器官１ｍｇ当たりのｌｏｇ１０Ｇｅｑで表す。個々のウイルス負荷、ならびに各群および各時点で計算された幾何平均および標準偏差を、図４に示す。
【０２７４】
予想した通り、０日目にＰＢＳを投与されたＡ１２９マウスでは、肝臓ウイルス負荷は１１日目に検出されず（１ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍｇのＬＯＤ未満）、同様に、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンを投与されたＡ１２９マウスにおいては、肝臓ウイルス負荷は検出されなかったかまたはわずかに検出された（６日目にＧＭＴ＝０．８、１１日目に＜ＬＯＤ）。
【０２７５】
ｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補で免疫化した後、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）コントロールで免疫化した後に誘発された肝臓ウイルス負荷と比較して、有意に高レベルの肝臓ウイルス負荷は見られなかった（６日目に、ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、ＴＶ２２４１、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１で、全てのｐ値＞０．１、非レスポンダーの多くが＜ＬＯＤであったために１１日目に統計分析は行われなかった）。
【０２７６】
ｃ）脳内−図５
結果は、器官１ｍｇ当たりのｌｏｇ１０Ｇｅｑで表す。個々のウイルス負荷、ならびに各群および各時点で計算された幾何平均力価および標準偏差を、図５に示す。
【０２７７】
予想した通り、０日目にＰＢＳを投与されたＡ１２９マウスでは、脳ウイルス負荷は１１日目に検出されず（１ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍｇのＬＯＤ未満）、その一方で、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンを投与されたＡ１２９マウスにおいては、脳ウイルス負荷が検出された（６日目にＧＭＴ＝０．６、１１日目に３．７）。
【０２７８】
ｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補で免疫化した後、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）コントロールで免疫化した後に誘発された脳ウイルス負荷と比較して、有意に高レベルの脳ウイルス負荷は見られなかった（ＴＶ２２１２およびＴＶ２２３２でｐ値＞０．０６）。さらに、ＴＶ２２４１、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１は、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）コントロールよりも有意に低い脳ウイルス負荷を１１日目に誘発した（ｐ値≦０．００３）。
【０２７９】
ｄ）脾臓内−図６
結果は、器官１ｍｇ当たりのｌｏｇ１０Ｇｅｑで表す。個々のウイルス負荷、ならびに各群および各時点で計算された幾何平均力価および標準偏差を、図６に示す。
【０２８０】
予想した通り、０日目にＰＢＳを投与されたＡ１２９マウスでは、脾臓ウイルス負荷は１１日目に検出されず（１ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍｇのＬＯＤ未満）、その一方で、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンを投与されたＡ１２９マウスにおいては、脾臓ウイルス負荷が検出された（６日目にＧＭＴ＝４．１、１１日目に２）。
【０２８１】
ｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補で免疫化した後、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）コントロールで免疫化した後に誘発された脾臓ウイルス負荷と比較して、有意に高レベルの脾臓ウイルス負荷は見られなかった（どの時点でも、ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、ＴＶ２２４１、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１で、全てのｐ値＞０．０９）。
【０２８２】
３．２．４／生存
各群（群Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ、およびＮ）の生存率を計算するために、生存しているマウスの数を、４ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／用量のＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）または６つのｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補の１つで皮下免疫化した後１１日間にわたり、毎日記録した。
【０２８３】
カプラン・マイヤー曲線で示されるように（図７）、ＰＢＳバッファー、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）、または５つのｖＹＦ株、ＴＶ２２１２、ＴＶ２２４１、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１の１つを投与すると、１００％のマウス（６頭のマウスのうち６頭）が、全て研究期間を通して生存した。
【０２８４】
逆に、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統に由来するＴＶ２２３２株を投与した群Ｆでは、１０日目に１頭のマウスが倫理的理由で安楽死させられたため、８０％のマウスのみが生存した。
【実施例４】
【０２８５】
−  ハムスターモデルにおけるｖＹＦ株候補の免疫原性
ハムスターモデルにおける６つのｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補の免疫原性を評価し、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンと比較した。
【０２８６】
４．１／方法
４．１．１／群の定義
１５頭の５〜６週齢のメスゴールデンシリアンハムスターを各群に含め、２つの用量、すなわち、最適用量以下の低用量である２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／用量、および高用量である５．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／用量を、６つのｐＭＳＬ候補のそれぞれについて投与した。
【０２８７】
Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照では、群当たり１０頭のハムスターのみを、上記の２つの試験用量に含めた。
【０２８８】
全部で２００頭のメスゴールデンシリアンハムスターを、以下の表６に記載する１４個の以下の群（群ＡからＮ）の１つにランダムに割り当てた（アジュバントなし；皮下投与経路；０日目および２６日目に２００μｌ）。
【０２８９】
【表７】
2021520384.tif 000008
【０２９０】
４．１．２／研究スケジュール
研究スケジュールを図８にまとめる。
【０２９１】
介入の計画および介入の詳細を、以下の表７に記載する。
【０２９２】
【表８】
2021520384.tif 000009
【０２９３】
４．１．３／生物学的サンプリングおよび血清中和アッセイ
ａ）生物学的サンプリング
中間血液サンプルを、麻酔下で、眼窩後静脈叢（ＲＯＳ）から、０日目、２６日目、および４１日目に、全ての動物から行った。最後の血液サンプリングを、麻酔下で、心臓穿刺を介して行った。麻酔は、Ｉｍａｌｇｅｎｅ（１５０ｍｇ／ｋｇ）およびＲｏｍｐｕｎ（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内経路によって２００μｌの容積で投与することによって行った。
【０２９４】
血液を、血栓活性化剤および血清分離剤（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ）を含有するバイアルに回収した。＋４℃で一晩、または３７℃で２時間の後、血液を２０００×ｇで１０分間、遠心分離し、血清を回収し、分析まで−２０℃で保存した。
【０２９５】
ｂ）血清中和アッセイ
免疫化された動物の血清中に存在する機能的な中和抗体を、最初の注射から０日目、２６日目、および４１日目に力価測定した。
【０２９６】
簡潔に述べると、加熱不活化された血清を、ＩＭＤＭ＋４％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に、１：５から開始して連続的に２倍希釈した。ベロ細胞で成長させたＹＦ−１７Ｄ  Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ウイルスを希釈して、ＩＭＤＭ中で４０００μＰＦＵ／ｍＬとし、２倍希釈した血清サンプル（ｖ／ｖ）と９０分間インキュベートした。次いで、ウイルス／血清混合物を、９６ウェルプレート内のベロ細胞に添加し、４５＋／−２時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を８５％アセトンで固定し、その後、免疫染色した。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０＋２．５％脱脂乳でブロックし、まず抗フラビウイルスモノクローナル抗体４Ｇ２と、次にヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲートとインキュベートした。最後に、プレートをＴｒｕｅｂｌｕｅ（商標）クロモゲンで染色した。プラークを、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ（商標）のＶｉｒｕｓｃｏｐｅリーダーで計数した。
【０２９７】
最終的な血清中和抗体力価は、最小二乗法を使用して計算され、５０％のウイルスプラークの中和を示す希釈の逆数に対応する。アッセイのＬＯＤは１０であり、これは、最終容積における最初の相互希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）に対応する。
【０２９８】
群当たりの平均値を計算するために、１０を下回る全ての力価に、任意の力価５（ＬＯＤの半分）を割り当てた。
【０２９９】
４．２／結果−血清中和
ベロ細胞での黄熱１７Ｄワクチン株に対する中和活性を、ベースライン（０日目）、１回の免疫化の４週間後（２６日目）、および２回の免疫化の２週間後（４１日目）に全ての動物から回収された個々の血清サンプルにおける血清中和アッセイによってモニタリングした。幾何平均力価（ＧＭＴ）、ならびに個々の中和力価および９５％信頼区間（ＣＩ）を、図９および図１０に示す。
【０３００】
予想した通り、どのｐＭＳＬ  ｖＹＦ候補でも、またはＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照でも、ベースライン（０日目）では、ナイーブハムスターにおいて中和抗体力価は検出されなかったかまたは低く（≦４０）、群のＧＭＴは≦１２であった。レスポンダー閾値を、０日目に得られた全ての個々のデータの統計分析によって、２０．８７（１．３２ｌｏｇ１０）と規定した（割合が０．９９およびアルファリスクが５％の、より優れた許容差）。
【０３０１】
応答動態に関して、１回の免疫化の１ヶ月後（２６日目；図９）、中和応答の著しい増大が全ての免疫化された群で見られ、中和ＧＭＴが、０日目のベースラインと比較して少なくとも１０倍から最大８５０倍まで増大した。２回目の免疫化の２週間後（４１日目；図１０）、中和ＧＭＴは全ての群でさらに増大し、中和ＧＭＴが２６日目と比較して０．８倍〜７．５倍まで増大した。
【０３０２】
Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照によって誘発された中和抗体応答は、５．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量（ＧＭＴは、２６日目および４１日目でそれぞれ、５０６１および１１７１４）よりも２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量（ＧＭＴは、２６日目および４１日目でそれぞれ、２８１および５４４）で有意に低かった（２６日目および４１日目でそれぞれ、ｐ値＝０．００７および０．０２３）。注目すべきことは、５．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量を投与された群のハムスターの１００％が、最初の免疫化（２６日目）からすぐにレスポンダーとして定義され（閾値２０．８７を超える）、その一方で、２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量を投与された群のハムスターの６０％および７０％のみが、それぞれ２６日目および４１日目に、レスポンダーであることが分かった。
【０３０３】
Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統のｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補、ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、およびＴＶ２２４１では、２つの試験用量の間で有意差は見られず（どのｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補でも、またどの時点でも、全てのｐ値＞０．０７）、ＧＭＴは、２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量では、２６日目に１４４から５０５の範囲、４１日目に１１５から１１５９の範囲であり、これに対し、５．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０では、ＧＭＴは、２６日目で１１５から３７３の範囲、４１日目で４６５から９５５の範囲であった。Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統のｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補のいずれも、全ての免疫化された動物において、どの試験用量でも、またどの免疫化スケジュールでも（１回または２回の免疫化の後）、持続した中和抗体応答を誘発することができなかった。レスポンダーハムスターのパーセンテージは、いずれの用量でも、１回の免疫化の後には５３％から９３％の範囲であり、ＴＶ２２１２、ＴＶ２２３２、およびＴＶ２２４１での２回の免疫化の後には４３％から９３％の範囲であることが分かった。
【０３０４】
ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統のｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１では、ＴＶ３１１１で２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量が５．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０よりも有意に高い中和抗体力価を誘発したことを除いて（２６日目および４１日目にそれぞれ、ｐ値＝０．０４および０．００３）、２つの試験用量の間で有意差は見られなかった（どのｖＹＦ株でも、またどの時点でも、全てのｐ値＞０．０６）。２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量では、誘発されたＧＭＴは高く、２６日目には３９３９から８８９８の範囲、４１日目には３７７１から１３６７４の範囲であり、その一方で、５．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量では、ＧＭＴは、２６日目では２０７１から５１４５の範囲、４１日目では１８２１から６４２１の範囲であった。ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統のｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補は、免疫化された動物のほとんどにおいて、１回の免疫化の後に、持続した中和抗体応答を誘発することができた（２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量のＴＶ３１１１では９３％のレスポンダー、およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統の全ての他のｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補では、どの試験用量でも、１００％のレスポンダー）。２回の免疫化の後、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統の全てのｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補は、どの用量でも、免疫化されたハムスターの１００％において、持続した中和抗体応答を誘発することができた。
【０３０５】
ｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補のそれぞれと、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照との比較に関して、２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０用量の、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統に由来するｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補、ＴＶ３１１１、ＴＶ３１１２、およびＴＶ４２２１によって誘発される中和応答は、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）参照ワクチンで得られるものよりも有意に非劣性であった（２６日目および４１日目でそれぞれ、ｐ値≦０．０１０および≦０．０４７）。有意な非劣性は、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統に由来するｖＹＦ株でも（どの用量および時点でも、全てのｐ値≧０．２５）、５．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０を投与されたＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統に由来するｖＹＦ株でも（どの時点でも、ｐ値≧０．４９）示されなかった。
【実施例５】
【０３０６】
−  サルモデルにおけるｖＹＦ  ＴＶ３１１２株の毒性および免疫原性
予備的な毒性研究および免疫原性研究を、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において行った。非ヒト霊長類、特にアカゲザルまたはカニクイザルは、ウイルス血症によって測定される安全性および感染性、ならびにフラビウイルス（デング、黄熱など）に対するワクチン候補の免疫原性を評価するために、従来使用されている。黄熱の背景では、サルは天然の宿主であり；ウイルスはサルにおいて最初に単離され、このモデルにおいて、ワクチン株の弱毒化が評価された。２０００年代から、「小動物」モデルが記載されており、ｖＹＦ  ｐＭＳＬ候補の選択のために行われるように、候補ワクチンのある特定の特性を評価するために使用される。しかし、これらのモデル（ハムスター、マウスＡ１２９）には限界があり、マカクは、今日まで、ヒトと比較して最も予測可能なゴールドスタンダートモデルであり続け、文献、例えば、Ｊｕｌａｎｄｅｒ（２０１６）、Ｍａｓｏｎら（１９７３）、Ｍｏｎａｔｈら（２０１０）、およびＭｏｕｌｉｎら（２０１３）において広く記載されている。さらに、このモデルは、規制ガイドラインにおいて推奨されている。
【０３０７】
５．１／方法
５．１．１／群の定義および目的
モーリシャスから輸入された９頭の２歳齢のオスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）からなる３つの群を、ＳＣ経路によって、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）５００μＬ（４．２ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／用量に対応する１ヒト用量）、１用量のＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）（６．２ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０）、または４．２ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０のｖＹＦ  ＴＶ３１１２  ＷＳＬ候補で免疫化した。
【０３０８】
第１の読み出しとして、ワクチン候補を、ｉ）ワクチンの安全性、ｉｉ）ＹＦ特異的ウイルス血症、ならびに器官：肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、および脳におけるウイルス負荷を誘発するその能力（Ｍａｎｔｅｌら（２００８）において記載されているような、ＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの定量によって評価される）、ならびにｉｉｉ）防御と相関するものとして定義される、黄熱特異的な血清中和抗体応答の誘発（μＰＲＮＴ５０アッセイによって評価される）の評価のために、参照ワクチンのそれぞれと比較した。
【０３０９】
第２の読み出しとして、ワクチン性能の他の潜在的バイオマーカーを同定するために、異なるパラメータをモニタリングした。これらの分析は、ｉ）抗体応答の持続性、ならびにｉｉ）メモリー応答を含む、Ｂ細胞およびＴ細胞の免疫応答を取り扱うものであった。
【０３１０】
５．１．２／麻酔
免疫化では、およびある特定の場合で（例えば、馴化期間の間に他の操作と組み合わされた血液サンプリング、またはサルが麻酔なしの血液サンプリングを受けられない場合）、軽い麻酔を行った。１０ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ  １０００、ＭＥＲＩＡＬ（登録商標））を、大腿部に筋肉内注射した。
【０３１１】
５．１．３／モニタリング
全ての動物を−２９日目および０日目に秤量し、７日目まで臨床的徴候について毎日観察し、その個々の体温（トランスポンダーシステム）を、−１７日目、ならびにウイルス血症予想期間の間の０日目、３日目、４日目、５日目、６日目、および７日目に記録した。血液学、生化学、および血中ウイルス血症を、全てのサルにおいて、１日目、３日目、および７日目に評価した。各群の３頭のサルを、次いで安楽死させ、その器官を、器官における病理組織学およびウイルス負荷の評価のために、７日目にサンプリングした。各群における６頭の残っているサルをさらに、２７日目、６０日目、９０日目、１２２日目、１５３日目、および１８１日目に秤量し、その個々の体温を、ウイルス血症予想期間の間の１０日目および１４日目に、さらに記録した。各群における６頭の残っているサルはまた、臨床的徴候についても２２１日目まで毎日観察した。血清中和、Ｔ細胞、およびメモリーＢ細胞のアッセイのための血液サンプルを、２７日目、６０日目、９０日目、１２２日目、１５３日目、１８１日目、および２２１日目に、各群における６頭の残っているサルから回収した。
【０３１２】
５．１．４／試験方法
ＹＦ特異的な血清中和抗体を、ベロ細胞でμＰＲＮＴ５０方法を使用して力価測定した。簡潔に述べると、加熱不活化した血清を、ＩＭＤＭ（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）＋４％ＦＣＳ中に、１：５から開始して連続的に２倍希釈した。ベロ細胞で成長させたＹＦ−１７Ｄ  Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ウイルスを希釈して、ＩＭＤＭ中で４０００μＰＦＵ／ｍＬとし、２倍希釈した血清サンプル（ｖ／ｖ）と９０分間インキュベートした。次いで、ウイルス／血清混合物を、９６ウェルプレート内のベロ細胞に添加し、４５＋／−２時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を８５％アセトンで固定し、その後、免疫染色した。プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０＋２．５％脱脂乳でブロックし、まず抗フラビウイルスモノクローナル抗体４Ｇ２と、次にヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲートとインキュベートした。最後に、プレートをＴｒｕｅｂｌｕｅ（商標）クロモゲンで染色した。プラークを、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ（商標）のＶｉｒｕｓｃｏｐｅリーダーで計数した。最終的な力価は、最小二乗法を使用して計算され、５０％のプラークの中和を示す希釈の逆数に対応する。
【０３１３】
試験対象の血清の最初の希釈が１：１０である場合には、μＰＲＮＴ５０アッセイのＬＯＤは約２０μＰＲＮＴ５０であった。群当たりの平均値を計算するために、ＬＯＤを下回る全てのサンプルに、ＬＯＤの半分である任意の値、すなわち１０μＰＲＮＴ５０を割り当てた。
【０３１４】
メモリー細胞の応答を、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。蛍光結合イムノスポット（ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴ）を、抗原特異性に関係なく（全ＩｇＭまたは全ＩｇＧ）抗体を分泌する個々のメモリーＢ細胞を検出し、数え上げるために使用した。
【０３１５】
０日目に、凍結されたＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳおよび１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを添加したＲＰＭＩ培地（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標））中で解凍し、３７℃；５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。１時間後、細胞を１００万個細胞／ｍＬで希釈し、ｒＩＬ２（１０μｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳ中で、３７℃；５％ＣＯ２で４日間インキュベートすることによって刺激した。
【０３１６】
３日目に、低蛍光ＰＶＤＦ膜（ＭＥＲＣＫ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を備えた９６ウェルＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔマイクロプレートの膜を、３５％エタノール３５μＬで１分間、事前に湿らせた。各ウェルを１×ＰＢＳ  ２００μＬで２回洗浄した。次いで、マイクロプレートを、１：８０希釈のＹＦ−１７Ｄ感染ベロ細胞溶解物（ＳＡＮＯＦＩ  ＰＡＳＴＥＵＲ（登録商標））で、または１５μｇ／ｍＬの希釈のサルＩｇＧおよびＩｇＭに特異的なモノクローナル抗体の混合物でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。
【０３１７】
４日目に、プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで、３７℃で少なくとも２時間、ＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳでブロックした。プレートを洗浄した後、２×１０５個または４×１０５個の刺激されたＰＢＭＣを、ＹＦ−１７Ｄに感染ベロ細胞溶解物でコーティングしたウェルに添加した。ある希釈範囲の刺激された細胞（５×１０３個から６．２×１０２個）を、抗ＩｇＧおよび抗ＩｇＭ抗体でコーティングされたウェルに添加した。
【０３１８】
５時間後、プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄し、４℃で一晩保存した。
【０３１９】
７日目に、プレートを１×ＰＢＳ−ＢＳＡ  ０．５％（１５０μＬ／ウェル）で６回洗浄した。洗浄工程の後、１００μＬ／ウェルの抗サルＩｇＭ−ＦＩＴＣおよびＩｇＧ−ＣＹ３抗体を、１×ＰＢＳ−ＢＳＡ  ０．５％中に１／５００の希釈で、室温で２時間、暗所で、それぞれ添加した。プレートを再び、１×ＰＢＳ−ＢＳＡ  ０．５％（１５０μＬ／ウェル）で６回洗浄した。プレートを、読み取りまで、５℃±３℃で暗所で保存した。
【０３２０】
抗体分泌細胞に対応する各スポットを、自動ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ（商標））で数え上げた。結果を、１０６個の細胞当たりのＡＣＳ分泌細胞の数として表した。
【０３２１】
Ｔ細胞応答を、単離されたＰＢＭＣで、ＩＦＮ−γ  ＩＬ−２応答Ｄｕａｌ  ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ（Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標）のＦＳ−２１２２−１０  Ｍｏｎｋｅｙ  ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２  ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔキット）によって決定した。
【０３２２】
簡潔に述べると、マイクロプレートを備えたＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ  ＰＶＤＦ膜を、３５％エタノールで前処理し、洗浄し、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１５μｇ／ｍＬの濃度の、サルＩＦＮ−γ（クローンＧＺ−４、Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標））に対するモノクローナル抗体およびサルＩＬ−２（クローンＩＬ２Ｍ−Ｉ／２４９、Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標））に対するモノクローナル抗体と、４℃でインキュベートすることによって、一晩コーティングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））と３７℃で２時間インキュベートすることによってブロックした。ＰＢＭＣ（４×１０５個）を、０．１μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体ＣＤ２８−Ａ（Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標））を有する各ウェルに添加した。ＹＦ−ＥｎｖおよびＹＦ−ＮＳ３ペプチドプール（ＹＦ−ＥｎｖおよびＹＦ−ＮＳ３のアミノ酸配列をカバーする、１５ｍｅｒのオーバーラップペプチド）を添加して、培養培地中の各ペプチドの最終濃度を１μｇ／ｍＬとした。抗ＣＤ３  ｍＡｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標））を２．５μｇ／ｍＬでポジティブコントロールとして使用した。プレートを、３７℃で、５％ＣＯ２を含有する雰囲気下で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳで６回洗浄した。ＦＩＴＣ抗ＩＦＮ−γ抗体（クローン７−Ｂ６−１−ＦＳ−ＦＩＴＣ、Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標））およびビオチン化された抗ＩＬ−２抗体（ＩＬ２−ビオチンＭＴ８Ｇ１０、Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標））を、ＰＢＳ中で０．５％ＢＳＡで、それぞれ１：２００および１μｇ／ｍＬの濃度で添加し；プレートを３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ中に０．５％ＢＳＡで希釈した抗ＦＩＴＣ−４９０（１：２００、Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標））およびストレプトアビジンＳＡ−５５０（１：２００、Ｍａｂｔｅｃｈ（登録商標））と、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで６回洗浄した。プレートを、読み取りまで、５℃±３℃で暗所で保存した。ＩＦＮ−γ分泌細胞またはＩＬ−２分泌細胞（ＩＦＮ−γ  ＳＣまたはＩＬ５  ＳＣ）ならびにＩＦＮ−γサイトカインおよびＩＬ−２サイトカインの両方を分泌する多機能性Ｔ細胞に対応する蛍光スポットを、自動ＦＬＵＯＲＯＳＰＯＴプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ（商標））で数え上げた。結果を、１０６個のＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ−γ分泌細胞またはＩＬ−２分泌細胞の数として表した。
【０３２３】
器官におけるＹＦワクチンのウイルス血症およびウイルス負荷を、ＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによってモニタリングした（Ｍａｎｔｅｌら（２００８）において記載されているように）。
【０３２４】
５．２／結果
弱毒生黄熱ワクチンについて、防御と相関するものは、ＷＨＯ  ＴＲＳ  ９７８、付録５において、事前に血清反応陰性であった個体における測定可能な中和抗体の誘発、例えば、ＰＲＮＴ力価＞検出限界と定義されている。事前に確立された防御閾値（ＬＯＤ＝２０）を大きく超える中和抗体が、早くも１４日目に、および少なくとも９ヶ月の間に、全てのサルにおいて検出された（図１１を参照されたい）。中和抗体力価は、現行のワクチンで免疫化した後に検出される力価と有意に異ならなかった。
【０３２５】
この長く続く中和抗体応答はまた、ｖＹＦ  ＴＶ３１１２ワクチンを接種した後１４日目から２２１日目までに末梢血においてモニタリングされた、持続するメモリーＢ細胞頻度によってもサポートされた（図１２および図１３を参照されたい）。これらのデータは、ＩｇＭメモリーＢ細胞（図１２）およびＩｇＧメモリーＢ細胞（図１３）の両方が、ワクチン接種後１４日目になるとすぐに現れ、少なくとも２２１日間の研究期間の間に継続したことを示す。ｖＹＦ  ＴＶ３１１２に関しては、誘発されたメモリーＢ細胞の動態およびパーセンテージは、参照ワクチンであるＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）の両方によって誘発されるメモリーＢ細胞のプロファイルに類似していた。
【０３２６】
さらに、ＹＦ−ＥＮＶおよびＹＦ−ＮＳ３に対する特異的Ｔｈ１細胞応答（ＩＦＮ−γ分泌細胞およびＩＬ−２分泌細胞）は、ｖＹＦ  ＴＶ３１１２のワクチン接種の後に誘発され、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）またはＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）でのワクチン接種の後に見られる細胞応答に類似していた（図１４を参照されたい）。
【０３２７】
この研究はまた、コントロールワクチンと比較した、ｖＹＦ  ＴＶ３１１２の保存された安全性プロファイル：臨床的徴候なし、体重減少なし、体温の変化なし、血液学的障害（白血球および赤血球；好中球；リンパ球；単球；好酸球；好塩基球；網状赤血球；血小板；ヘモグロビン；ヘマトクリット；平均赤血球容積；平均赤血球ヘモグロビン量）または生化学的（アルカリホスファターゼ；アラニントランスフェラーゼ；アスパルテートトランスフェラーゼ；ガンマグルタミルトランスフェラーゼ；Ｃ反応性タンパク質；胆汁酸；総ビリルビン；アルブミン；血中尿素窒素；クレアチニン）障害なし（ＰＬＳ−ＤＡ統計分析を介して、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）との間に統計上の差なし）、ウイルス血症なしまたは非常に低いウイルス血症（９頭のサルのうち１頭において＜４ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍＬ）、黄熱標的器官において検出されるウイルスＲＮＡなしまたは非常に低いウイルスＲＮＡ（野生型Ａｓｉｂｉへの感染後に見られるウイルス負荷よりも１００から１万倍低い）（図１５を参照されたい）、黄熱標的器官においてワクチンに関連する組織病理学的所見なし、も実証した。
【実施例６】
【０３２８】
−  マカクモデルにおける致死的チャレンジに対するｖＹＶ  ＴＶ３１１２株によって誘発された防御
目的は、ｖＹＦ  ＴＶ３１１２ワクチン候補で免疫化されたマカクにおける黄熱ウイルスでのチャレンジに対する防御を評価することであった。
【０３２９】
６．１／方法
６．１．１／動物
Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）、またはｖＹＦ  ＴＶ３１１２ワクチン候補で免疫化した９ヶ月後、上記の実施例５において研究された３つの動物群のそれぞれの、２２１日目に残っている６頭のサルを、Ａｓｉｂｉ毒性株で黄熱に対してチャレンジして、ワクチン効能を評価した。６頭のナイーブコントロールサルからなる別の群もチャレンジした。
【０３３０】
６．１．２／ＹＦＶおよびバッファー
チャレンジは、テキサス大学医学部（ＵＴＭＢ）から入手した黄熱ウイルス株Ａｓｉｂｉ（ＹＦＶ）で行った。ＹＦＶ（ロット１９４５５、ベロ細胞で感染力価７．７ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍＬ）を、ＮａＣｌ＋ＨＳＡバッファー（ＮａＣｌ  ０．４％＋ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）２．５％）中に希釈した。各動物を、ＮａＣｌ＋ＨＳＡバッファー１ｍＬ中で１０３  ＣＣＩＤ５０のＹＦＶで、上部右背側の部位に、皮下でチャレンジした。
【０３３１】
６．１．３／モニタリング
動物を、Ａｓｉｂｉチャレンジ後２８日間にわたり追跡した。動物を、飼料の消費および挙動について、毎日観察した。直腸体温および体重を各サンプリング時点で記録した。血液サンプリングを、以下の表８に記載するように行った。
【０３３２】
【表９】
2021520384.tif 000010
汁酸;総ビリルビン;アルブミン;血中尿素窒素;クレアチニン。
【０３３３】
６．１．４／生存中の所見
動物を週に７日観察した。採血の各時点で、臨床試験を以下の表９に記載するように行った。
【０３３４】
【表１０】
2021520384.tif 000011
【０３３５】
６．２／結果
全てのワクチン接種されたサルは、チャレンジの影響：ウイルス血症（低レベルのウイルス血症のみ、すなわち、Ｍａｎｔｅｌら（２００８）において記載されているようにＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定すると、２／６頭のサルにおいてわずか１日にわたり＜３．６ｌｏｇ１０ＧＥｑ／ｍＬ）、血液学的障害、血液の生化学的障害、および死亡、から防御された。
【０３３６】
この研究において、ワクチン接種されていないコントロール群の６頭のＮＨＰのうち３頭が、チャレンジに対して生存したが、６頭のコントロールＮＨＰの全てが、ウイルス血症（＞８ｌｏｇ１０Ｇｅｑ／ｍＬ）、リンパ球減少症、血小板減少症、ならびにトランスアミナーゼ、ＣＲＰ、ビリルビン、および胆汁酸のレベルが大きく増大する血液の生化学的障害を示した。
【０３３７】
したがって、ｖＹＦ  ＴＶ３１１２ワクチン候補は、現在利用可能なワクチンであるＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）およびＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）と同様に、黄熱ワクチンの最も予測的な動物モデルの１つであるカニクイザルを野生型Ａｓｉｂｉの感染から防御することができた。
【実施例７】
【０３３８】
−  配列分析
ＲＮＡウイルスは、高い遺伝的多様性レベルを天然に示し、これは、これらのウイルスの疑似種固有の性質の理由である。黄熱ポリメラーゼのエラー率がＲＮＡウイルスであることを理由に低いと記載されていても、ポリメラーゼのエラー率は、感染サイクル当たりゲノム当たり約１０−６個置換である。
【０３３９】
同一のウイルス成長条件を常に維持することによってこの現象を最小限に限定するために、明確に定義されたウイルス生産プロセスが設定される。しかし、統計的には、ウイルス疑似種は、細胞におけるウイルス複製の度に持続的に生産され、バリアントが成長上の利点をウイルスにもたらす際には常に、このバリアントは保存され、長期にわたり増幅し、最初の集団から徐々に置き換わる。
【０３４０】
加えて、新たなウイルス成長系が卵からベロ細胞培養物に移るにつれて、ある程度の適合突然変異が起こる可能性が予想される。特に、ＮＳ４Ｂにおけるいくつかの突然変異は、異なるフラビウイルスモデルにおいて、ベロ細胞において成長するためのウイルスの正の適合として記載されている（Ｂｌａｎｅｙら、２００３；Ｔａｎｇら、２００５；Ｂｅａｓｌｅｙら、２０１３）。
【０３４１】
さらに、現行のシードはクローニングされておらず、したがって、疑似種の混合物が現行のワクチン株の中には共存する。参照配列は、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ワクチンおよびＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ワクチンのゲノムのハイスループットシーケンシングによってまず確立され、次いで、新たなｐＭＳＬ候補のゲノムがそれらと比較された。
【０３４２】
新たなｐＭＳＬ候補は２回のクローニング工程の後に得られるため、これらは、均質なウイルス集団に相当した。
【０３４３】
７．３／方法
７．３．１／原理
黄熱ウイルスのシーケンシングは、ウイルスＲＮＡの抽出および精製の後に行った。
【０３４４】
次いで、ＲＮＡを、相補的ＤＮＡに逆転写し、次いで、ゲノムを、特異的プライマーを使用して、ＰＣＲによって完全に増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を使用して、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴ  ＤＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を利用してライブラリーを形成した。ライブラリーの形成は、いくつかの工程で行われた。まず、アンプリコンを等モルの様式でアセンブルした。次いで、これらを、トランスポソーム（Ｔａｇｍｅｎｔａｓｅ）を使用して断片化した。トランスポソームはＤＮＡを切断し、アダプターを付加した。次いで、ＰＣＲによる増幅工程を、アダプターに相補的なプライマーを利用して行った。この工程によって、断片の両側へのインデックス（サンプルのタグ付けに使用された）の付加、およびシーケンシングサポートへの断片の連結が可能となった。最後に、ライブラリーを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ビーズ（ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用して精製し、ＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標），Ｉｎｃ．）を使用してシーケンシングした。
【０３４５】
配列が得られたら、分析を次いで、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））の分析モジュール「Ｑｕａｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（レガシー）」で行った。
【０３４６】
７．３．２）ＲＮＡの抽出
ウイルスＲＮＡを、Ｑｉａｍｐ  Ｖｉｒａｌキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））で、供給業者の推奨に従って、ウイルス懸濁液１４０μｌから、１０８Ｇｅｑ／ｍＬの最小濃度（ＹＦ−ＮＳ５  ｑＲＴ−ＰＣＲによる定量）で抽出した。精製されたウイルスＲＮＡを、ヌクレアーゼを有さない水１４０μｌの中に溶出した。
【０３４７】
７．３．３）ＲＴ−ＰＣＲ
まず、ＲＮＡからｃＤＮＡへの特異的逆転写（ＲＴ）工程を、黄熱ウイルスのゲノムをオーバーラップさせることを目的として、３つのアンチセンスプライマーを使用して行った。次いで、ＰＣＲ増幅を、表１０に記載する３つのプライマー対を使用して行った。
【０３４８】
【表１１】
2021520384.tif 000012
【０３４９】
３つのアンチセンスプライマー（配列番号１０；配列番号１２、または配列番号１４）の１つを含有する３つの混合物を調製した（以下の表１１を参照されたい）。
【０３５０】
【表１２】
2021520384.tif 000013
【０３５１】
サンプルをサーモサイクラー内で、＋６５℃で５分間加熱し、熱ショックを、チューブを氷中で３分間インキュベートすることによって、すぐに行った。
【０３５２】
次いで、混合物を、以下の表１２に記載するように調製した。
【０３５３】
【表１３】
2021520384.tif 000014
【０３５４】
３つのＲＮＡ／プライマーチューブのそれぞれに、この混合物１２μｌを添加し、以下の表１３に記載するように逆転写実行を行った：
【０３５５】
【表１４】
2021520384.tif 000015
【０３５６】
ＲＮＡｓｅ  Ｈ  １μｌをチューブのそれぞれに添加し、チューブをサーモサイクラー内で、３７℃で２０分間インキュベートした。
【０３５７】
得られたｃＤＮＡから、増幅をＰＣＲによって行って３つのアンプリコンとした。
【０３５８】
３つのプライマー対（配列番号９および配列番号１０；配列番号１１および配列番号１２；配列番号１３および配列番号１４）の１つを含有する３つのＰＣＲ混合物を、以下の表１４に記載するように調製した。
【０３５９】
【表１５】
2021520384.tif 000016
【０３６０】
各混合物２０μｌを対応するｃＤＮＡ５μｌに添加した。
【０３６１】
ＰＣＲプログラムは、以下の表１５に記載する通りであった。
【０３６２】
【表１６】
2021520384.tif 000017
【０３６３】
７．３．５）アンプリコンの分析および精製
全てのアンプリコンを１．２％アガロースゲル上で分析して、増幅の質をチェックした。ＱＩＡＱｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を供給業者の推奨に従って使用して、アンプリコンを手動で精製した。
【０３６４】
７．３．６）Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＸＴキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）でのライブラリーの形成
精製されたアンプリコンを、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイキットを供給業者の推奨に従って使用して、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標））で定量した。
【０３６５】
アッセイの後、アンプリコンを、ヌクレアーゼを有さない水の中で連続希釈して、０．２ｎｇ／μＬの最終濃度とした。次いで、各サンプルについて、３つのアンプリコンを混合して、０．６ｎｇ／μＬの単一の濃縮されたＰＣＲプールを得た。
【０３６６】
ＰＣＲプログラムは、以下の表１６に記載する通りであった。
【０３６７】
【表１７】
2021520384.tif 000018
【０３６８】
アンプリコンを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰキット（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標））によって、供給業者の推奨に従って、精製し、較正した。ライブラリーは、−２０℃で１週間安定であった。
【０３６９】
７．３．７）ライブラリーの分析
ライブラリーの定量を、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイキットを供給業者の推奨に従って使用して、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標））で行った。
【０３７０】
７．３．８）ライブラリーのシーケンシング
ライブラリーを、ＭｉＳｅｑシステム（ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標））によって、供給業者の推奨に従ってシーケンシングした。配列を、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｖｉｅｗｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）によって、供給業者の推奨に従って分析した。
【０３７１】
得られた配列の分析を、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｋ  ７．５．２ソフトウェア（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））で、供給業者の推奨に従って行った。
【０３７２】
７．４／結果
７．４．１）ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ワクチンおよびＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ワクチンの参照配列
ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ワクチンの参照配列を、配列番号２で表した。Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）ワクチンの参照配列は配列番号３で見ることができる。
【０３７３】
７．４．１．１）Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）由来のｐＭＳＬ
ｐＭＳＬ候補のゲノム（継代番号８）をシーケンシングし、これらの親株のゲノムと比較した。以下の表１７は、Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）系統からの３つの株についてのハイスループットシーケンシングの結果を示す。
【０３７４】
【表１８】
2021520384.tif 000019
【０３７５】
ＴＶ２２４１およびＴＶ２２１２は、参照として使用したＳｔａｍａｒｉｌ（登録商標）親株と比較して単一の突然変異を有する（アミノ酸レベルではサイレントの、ＮＳ１コード領域内に位置するヌクレオチド２５２４）。ＴＶ２２３２は異なるプロファイルを示し、全てサイレントの、ＮＳ３およびＮＳ５における５つの突然変異を有する。
【０３７６】
７．４．１．２）ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）由来のｐＭＳＬ
以下の表１８は、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）系統からの３つのｐＭＳＬ候補（継代番号８）についてのハイスループットシーケンシングの結果を示す。
【０３７７】
【表１９】
2021520384.tif 000020
【０３７８】
ＴＶ４２２１は、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）ワクチン株の参照配列に同一である。
【０３７９】
ＴＶ３１１１は、２４１１位（Ｅ−４８０、ＶａｌからＬｅｕ）、３７０１位（ＮＳ２ａ−６５、ＭｅｔからＶａｌ）、および６４９６位（ＮＳ４ａ−１９、サイレント）に３つの突然変異を有する。
【０３８０】
ＴＶ３１１２は、ＴＶ３１１１と同一の突然変異と、１４０８位にある１つのさらなる突然変異（Ｅ−１４５、サイレント）とを有する。
【０３８１】
ＴＶ３１１２株およびＴＶ３１１１株は、配列番号１５によって表されるエンベロープタンパク質を含む（４８０位にロイシン残基を有する）。配列番号１６（６５位にバリン残基を有する）は、ＴＶ３１１２株およびＴＶ３１１１株のＮＳ２ａタンパク質の配列である。配列番号１７（５７位にＧヌクレオチドを有する）は、ＴＶ３１１２株のＮＳ４ａタンパク質をコードするＲＮＡ配列である。配列番号１８（４３５位にＵヌクレオチドを有する）は、ＴＶ３１１２株のエンベロープタンパク質をコードするＲＮＡ配列である。
【０３８２】
当業者には周知であるが、ゲノムの役割は情報のサポートとなることであり、また、タンパク質は、その機能を介して、ウイルスの表現型において役割を有する。サイレント突然変異は、タンパク質の機能に影響を与えない。したがって、ＴＶ３１１２株およびＴＶ３１１１株は、以下をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株として記載することができる：
（ｉ）バリンからロイシンへのアミノ酸変化を生じさせる４８０位での突然変異を含むエンベロープタンパク質、および
（ｉｉ）メチオニンからバリンへのアミノ酸変化を生じさせる６５位での突然変異を含むＮＳ２ａタンパク質。
または、ＴＶ３１１２株およびＴＶ３１１１株は、以下をコードする核酸分子を含む弱毒生黄熱ウイルス株として記載することができる：
（ｉ）配列番号１５の４８０位に対応するタンパク質内の位置でロイシン残基を含むエンベロープタンパク質；および
（ｉｉ）配列番号１６の６５位に対応するタンパク質内の位置でバリン残基を含むＮＳ２ａタンパク質。
【０３８３】
７．４．２）ＭＳＬステージおよびＷＳＬステージでの、ＹＦ−ＶＡＸ（登録商標）由来のＴＶ３１１２株
ＴＶ３１１２  ＭＳＬのコンセンサス配列は、そのｐＭＳＬ親（ＴＶ３１１２  ｐＭＳＬ）のコンセンサス配列と同一なままであった。ＴＶ３１１２  ＷＳＬのコンセンサス配列は、そのＭＳＬ親（ＴＶ３１１２  ＭＳＬ）と同一なままであった。ＴＶ３１１２株は遺伝的に安定であり、ｐＭＳＬステージからＷＳＬステージで、そのコンセンサス配列において、ヌクレオチド位置１４０８、２４１１、３７０１および６４９６での突然変異を維持している。
【０３８４】
参考文献
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−  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ａｓｓｕｒｅ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ，  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｓｅｒｉｅｓ，  ２０１０年，第９７８巻，補遺５，  ２４１〜３１４。
特許文献
−  ＷＯ２００９／１０９５５０
−  ＷＯ２０１４／０１６３６０
【図１】
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【図２】
2021520384.tif 000022
【図３】
2021520384.tif 000023
【図４】
2021520384.tif 000024
【図５】
2021520384.tif 000025
【図６】
2021520384.tif 000026
【図７】
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【図８】
2021520384.tif 000028
【図９】
2021520384.tif 000029
【図１０】
2021520384.tif 000030
【図１１】
2021520384.tif 000031
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2021520384.tif 000035
【配列表】
2021520384000001.app
【国際調査報告】
2021520384.tif 000036
2021520384.tif 000037
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