(57)【要約】  本発明は、以下の工程：始めに、ＲＯＮＡ法により得られたニューロスフェアが、アキュターゼによって単一細胞へと分離され、計数後、細胞培養プレート上に蒔かれ、第７日目まで培地Ａ中で培養される；ニューロスフェアが第２５〜３５日目まで培地Ｂ中で培養され、そしてその後、それらがマトリゲルによってカプセル化される；ニューロスフェアがさらに第５５〜６５日目まで培地Ｂ中で培養された時、それらがマトリゲルによって再度カプセル化され、そしてその後継続的に培養される、を含む３Ｄ脳オルガノイドの調製のための方法を提供する。本発明は、ＲＯＮＡ法によって得られる高度に精製されたニューロスフェアで開始され、そして、神経幹細胞は、制御され、かつ、相対的に平易な方法によって均一なサイズおよび構造をもつ真の３Ｄ脳オルガノイドを達成するように培養され得る。３Ｄ脳オルガノイドは、６層皮質の脳の構造、および、抑制性介在ニューロン細胞の様々なサブタイプを有しており、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの疾患研究、薬剤スクリーニングなどに適切であり、産業化において大きな意義がある。
2021516997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
始めに、ＲＯＮＡ法により得られたニューロスフェアが、アキュターゼによって単一細胞へと分離され、細胞が計数後、細胞培養プレート上に蒔かれ、第７日目まで培地Ａ中で培養される；ニューロスフェアが第２５〜３５日目まで培地Ｂ中で培養され、そしてその後、それらがカプセル化される；ニューロスフェアが第５５〜６５日目まで培地Ｂ中で培養された時、それらが再度カプセル化され、そしてその後継続的に培養される
を含み、
前記培地Ａが、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメントを含み；
前記培地Ｂが、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメントを含む
３Ｄ脳オルガノイドの調製のための方法。
【請求項２】
前記ＲＯＮＡ法により得られた前記ニューロスフェアが、アキュターゼによって単一細胞へと分離され、計数後に１０００〜５００００個での細胞がマルチウェル細胞培養プレート上に平均的に蒔かれ、そして前記培地Ａ中で培養される請求項１記載の調製のための方法。
【請求項３】
前記培地Ａ中での培養条件が、以下：
細胞は３７℃、５％ＣＯ2で加湿されたインキュベーター中で低速オービタルシェーカー上で培養される
である請求項２記載の調製のための方法。
【請求項４】
前記培地Ａが、１〜５μＭのレチノイン酸、１０〜３０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、１０〜３０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．１〜０．５ｍＭのアスコルビン酸、５〜１５μＭのｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、
前記培地Ｂが、１０〜３０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、１０〜３０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．１〜０．５ｍＭのアスコルビン酸、５〜１５μＭのｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントを含む
請求項１〜３のいずれか１項に記載の調製のための方法。
【請求項５】
前記培地Ａが、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１０μＭのｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントを含み、
前記培地Ｂは、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１０μＭのｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、およびビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントを含む
請求項４記載の調製のための方法。
【請求項６】
ニューロスフェアが、第２５〜３５日目まで培養された時、マトリゲルを用いてカプセル化され；ニューロスフェアが、第５５〜６５日目まで培養された時、マトリゲルを用いて二度目にカプセル化され、そしてその後継続的に培養される、請求項１記載の調製のための方法。
【請求項７】
前記調製のための方法が、さらに以下の工程：
ニューロスフェアが、第８５〜１００日目まで培養された時、三度目にカプセル化され、そしてその後継続的に培養される
を含む請求項１記載の調製のための方法。
【請求項８】
ニューロスフェアが、第８５〜１００日目まで培養された時、マトリゲルを用いて三度目にカプセル化され、そしてその後継続的に培養される請求項７記載の調製のための方法。
【請求項９】
ニューロスフェアが、第３０日目まで培養された時にカプセル化され、および、ニューロスフェアが、第６０日目まで培養された時に再度カプセル化され；ニューロスフェアが、９０日目まで培養された時に三度目カプセル化され、そしてその後継続的に培養される請求項７記載の調製のための方法。
【請求項１０】
３Ｄ脳オルガノイドを培養するために使用される培地であって、培地Ａおよび培地Ｂを含み、
前記培地Ａが、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み；
前記培地Ｂが、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む、培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３Ｄ脳オルガノイドの技術分野に属し、および、特には、ヒトニューロスフェアから３Ｄ脳オルガノイドを調整する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト神経幹細胞または脳組織は、入手することが困難であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することがほとんど不可能であり、良好なヒト化モデルが入手可能でないために、神経学的研究および薬剤開発を停滞させている。胚性幹細胞または人工多能性幹細胞により得られるヒト神経幹細胞が、神経学的疾患モデルとして使用されてきており、これは近年における国際的イノベーションおよびホットスポットである。一方、３Ｄ培養は、脳組織環境および細胞間情報伝達をシミュレーションできるだけでなく、神経細胞の成熟および機能の促進において重要な役割も果たす。さらに、ヒト脳の発達および関連する疾患の研究において３Ｄ脳オルガノイドの役割は代わりとなるものがない。近年、様々なヒト３Ｄ脳オルガノイドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が新たなホットスポットとなった。
【０００３】
ヒト３Ｄ脳オルガノイドを調製するための従来の方法は、一般的に胚芽期の組織から開始され、例えば、Ｌａｎｃａｓｔｅｒらによる２０１３年および２０１４年のＮａｔｕｒｅおよびＮａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌに発表された３Ｄ脳オルガノイドの調製方法は、ヒト脳器官の３Ｄシミュレーションを得るための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト多能性幹細胞（胚性幹細胞および人工多能性幹細胞を含む）の利用に向かって大きな一歩となった。最近、ＱｉａｎらによってＣｅｌｌ（２０１６）に発表された類似の方法は、ヒト多能性幹細胞から脳オルガノイドを調製することによるジカウイルスによって引き起こされる小脳疾患の機序の研究に応用され、そして、攪拌装置を有する小さなマルチウェルプレートが、因子の量およびコストを低下させるためにおよび均一性を向上させるために発明された。しかしながら、生成物の再現性および構造的類似性を安定的に制御することは、これらの２つの方法によって得られる３Ｄ脳オルガノイドが他の胚葉の細胞および構造を含み得るために困難であり、それゆえ、神経学的疾患モデルおよび薬剤スクリーニングの分野における応用に限界があり、得られたデータの代表性および信頼性もまた影響を受けている。
【０００４】
Ｌｅｅらによって２０１７年にＮｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙで発表されたように、５００００〜２０００００ｍｍのサイズである薔薇状の細胞クラスター（主に、ＮＰＣ、神経前駆細胞（neural precursor cells））が手作業で選び取られ、そして、誘導された。しかしながら、得られた新しい３Ｄ大脳皮質は、後脳へ発達する可能性に欠けていた（ＮＫＸ２．１染色陰性）。加えて、この方法は複雑すぎ、平易さ、大量生産、および一様性は達成できていない。
【発明の概要】
【０００５】
上記に鑑み、本発明の目的は、３Ｄ脳オルガノイドを調製するための方法を提供することである。均一なサイズおよび構造をもつ３Ｄ脳オルガノイドが、シンプルかつ産業化に適切である本方法によって得られ得る。
【０００６】
本発明は、下記の工程を含む、３Ｄ脳オルガノイドの調製のための方法を提供する。
【０００７】
始めに、ＲＯＮＡ法により得られたニューロスフェアが、アキュターゼ（accutase）によって単一細胞へと分離される；細胞が計数後、細胞培養プレート上に蒔かれ、第７日目まで培地Ａ中で培養される；ニューロスフェアが第２５〜３５日目まで培地Ｂ中で培養され、そしてその後、ニューロスフェアはカプセル化される；ニューロスフェアが第５５〜６５日目まで培地Ｂ中で培養された時、それらは再度カプセル化され、そしてその後継続的に培養される。
【０００８】
上述の培地Ａは、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む。
【０００９】
上述の培地Ｂは、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む。
【００１０】
本発明は、ＲＯＮＡ法によって得られる高度に精製されたニューロスフェアで開始され、９９％より多い細胞が神経幹細胞であることを保証し、したがって、他の方法において存在する課題、例えば後続の培養において非神経幹細胞および非脳組織を含むことなどが良好に解決され得る。本発明により、ニューロスフェアは単一の細胞へと分離され、これは、計数された後に固定された数で蒔かれ、９０日間培養の後に３Ｄ脳オルガノイドのサイズおよび構造が顕著に異なっていなくとも、細胞質量サイズおよび組成の均一性は確保され得る。一方、本発明の培養方法において使用される培地Ａおよび培地Ｂは、培養された３Ｄ脳オルガノイドが、前脳、中脳、および後脳の脳組織ならびに６層皮質の大脳皮質の細胞および構造へと誘導され得ることを確実なものとする。
【００１１】
本発明は、ＲＯＮＡ法によって得られる高度に精製されたニューロスフェアで開始され、９９％より多い細胞が神経幹細胞であることを保証する。ＲＯＮＡ法によるニューロスフェアの精製の特定のプロセスは、Ｘｕ  ＪＣおよびＦａｎ  Ｊによる２０１６年４月にScience Translational Medicineに発表された文献“Cultured Networks of Excitatory Projection Neurons and Inhibitory Interneurons for Studying Human Cortical Neurotoxicity”が参照される。
【００１２】
本発明において、ＲＯＮＡ法によって精製されたニューロスフェアは、アキュターゼによって単一細胞へと分離され、これは、計数された後に細胞培養プレート上に蒔かれる。具体的には、細胞クラスターサイズの均一性を確保するために、計数後に、１０００〜５００００個である同じ数の細胞がマルチウェル細胞培養プレート上に蒔かれる。一実施形態において、１０００〜１００００個である等しい数の細胞が、超低接着９６ウェル細胞培養プレートＵ底上に蒔かれる。
【００１３】
蒔かれた後、ニューロスフェアは培地Ａ中で培養され、そして、記載の培地Ａは、レチノイン酸、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む。一実施形態において、記載の培地Ａは、１〜５μＭのレチノイン酸、１０〜３０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、１０〜３０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．１〜０．５ｍＭのアスコルビン酸、５〜１５μＭのｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む。一実施形態において、記載の培地Ａは、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１０μＭのｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）との用量比は、５０：１である。
【００１４】
蒔かれた後、細胞は培地Ａ中で培養され、３７℃、５％ＣＯ2で加湿されたインキュベーター中で低速オービタルシェーカー上で振とうされ、そしてその後、３〜５日毎に培地の半量交換が行われた。第２日目に、均一なサイズをもつニューロスフェアがそれぞれのウェル中に形成されていることが観察され得る。第７日目まで、ニューロスフェアは培地Ａ中で培養され、そしてその後、ニューロスフェアは培地Ｂ中へと移され、そして、同じ培養条件下で培養される。
【００１５】
本発明において、培地Ｂは、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、アスコルビン酸、ｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む。一実施形態において、記載の培地Ｂは、１０〜３０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、１０〜３０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．１〜０．５ｍＭのアスコルビン酸、５〜１５μＭのｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含む。一実施形態において、記載の培地Ｂは、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１０μＭのｃＡＭＰ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）との用量比は、５０：１である。
【００１６】
ニューロスフェアは、第２５〜３５日目まで培地Ｂ中で培養され、そしてその後、それらはカプセル化される；ニューロスフェアが第５５〜６５日目まで培地Ｂ中で培養された時、それらは再度カプセル化され、そしてその後第約８５〜１００日目まで培養される。人工ヒト脳組成をもつ均一な３Ｄオルガノイドが得られ得、そして、さらなるカプセル化および培養が要件に応じて行われ得る。
【００１７】
特には、本発明において、ニューロスフェアは、第２５〜３５日目まで培養され、そしてその後、マトリゲル（登録商標）によってカプセル化される；それらが第５５〜６５日目まで培地Ｂ中で培養された時、ニューロスフェアは再度マトリゲルによってカプセル化され、そしてその後継続的に培養される。
【００１８】
特には、本発明においてまた、ニューロスフェアは第８５〜１００日目まで培養された時、それらに三度目のカプセル化が行われ、好ましくは、マトリゲルを用いることによって、三度目のカプセル化が行われる。
【００１９】
本発明の一実施形態において、ニューロスフェアは、それらが第３０日目まで培養された時にカプセル化され、そして、ニューロスフェアは、それらが第６０日目まで培養された時に再度カプセル化される。ニューロスフェアは、それらが９０日目まで培養された時に三度目カプセル化され、そしてその後継続的に培養される。
【００２０】
実験結果は、本発明がＲＯＮＡ法によって得られる高度に精製されたニューロスフェアで開始され、そして、相対的に均一なサイズおよび構造をもつ３Ｄ大脳小体が得られ得ることを示している。３Ｄ大脳小体は、第８８日目に直径４ｍｍの大きさに達し得、成長を継続し得る；一方、例えばＮｅｓｔｉｎ、Ｔｕｊ１、Ｆｏｘｇ１、ＴＢＲ２およびＮＫＸ２．１などのマーカーが、前大脳、中大脳、および後大脳に発達し得る３Ｄ大脳小体中に発現し得る；加えて、３Ｄ大脳小体はまた、脳中のマーカーと類似の分布および割合でＢＲＮ２、ＳＡＴＢ２、ＣＴＩＰ２およびＴＢＲ１などのマーカーもまた発現し得、そして大脳皮質構造を安定的に得る能力を有している。
【００２１】
本発明は、ＲＯＮＡ法によって得られる高度に精製されたニューロスフェアで開始され、そして、神経幹細胞は、制御され、かつ、相対的に平易な方法によって均一なサイズおよび構造をもつ真の３Ｄ脳オルガノイドを達成するように培養され得る。３Ｄ脳オルガノイドは、６層皮質の脳の構造、および、抑制性介在ニューロン細胞の様々なサブタイプを有しており、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの疾患研究、薬剤スクリーニングなどに適切であり、産業化において大きな意義がある。
【００２２】
本発明の実施形態、または従来存在する技術への技術的解法をより明確に示すために、実施形態の記載または従来技術において使用される図面が簡単に説明される。明らかに、以下の記載における図面は、本発明の実施形態にのみ関する。他の添付の図面はまた、当該技術分野における通常の技術者によっていかなる創造的な努力もすることなしに、本発明で提供されている図面から、得られ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本発明の実施例１で提供される３Ｄ脳オルガノイドの調製方法のフローチャートを示す図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１で提供される、第１７日目まで培養された３Ｄ大脳小体のイメージを示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施例１で提供される、第５０日目まで培養された３Ｄ大脳小体のイメージを示す図である。
【図４】図４は、本発明の実施例１で提供される、第５０日目まで培養された３Ｄ大脳小体のイメージを示す図である。
【図５】図５は、本発明の実施例１で提供される、第８８日目まで培養された３Ｄ大脳小体のイメージを示す図である。
【図６】図６は、第１０週まで培養された３Ｄ大脳小体の種々の脳領域の組織生検および前駆細胞の染色像を示す図である。
【図７】図７は、第８８日目まで培養された３Ｄ大脳小体の種々の大脳皮質の組織生検および神経細胞の染色像を示す図である。
【図８】図８は、第６３日目まで培養された３Ｄ大脳小体の組織生検ならびにグリア細胞および神経細胞の染色像を示す図である。
【図９】図９は、第６３日目まで培養された３Ｄ大脳小体の組織生検ならびにグリア細胞および神経細胞の染色像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施形態における技術的解法は、以下に明確かつ完全に記載されるであろう。明らかに、本発明の実施形態の一部分のみが本明細書中には記載されている。当該技術分野における通常の技術者によっていかなる創造的な努力もすることなしに本発明の実施形態に基づいて取得される全ての他の実施形態は、本発明の保護の範囲内である。
【００２５】
実施例１
図１は、本発明の実施例１で提供される３Ｄ脳オルガノイドの調製方法のフローチャートである。
【００２６】
工程１：ＲＯＮＡ法によって得られるニューロスフェア（Ｘｕ  ＪＣおよびＦａｎ  Ｊによる２０１６年４月にScience Translational Medicineに発表された文献“Cultured Networks of Excitatory Projection Neurons and Inhibitory Interneurons for Studying Human Cortical Neurotoxicity”を参照のこと。）がアキュターゼによって単一細胞へと分離され、そして、細胞が計数された後、５０００個である同じ数の細胞が、超低接着９６ウェル細胞培養プレートＵ底上に蒔かれた。
【００２７】
細胞は、３７℃、５％ＣＯ2で加湿されたインキュベーター中のオービタルシェーカー上に置かれた培地Ａ中で７日間培養され、３〜５日毎に培地の半量交換が行われた。培地Ａは、２μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦおよびＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１０μＭのｃＡＭＰを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、ここで、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）との用量比は、５０：１であった。
【００２８】
工程２：均一なサイズを有するニューロスフェアは、それぞれのウェルにおいて第２日目に観察され得た。培地Ａが第７日目に培地Ｂによって置換された。ニューロスフェアは、培地Ｂ中で継続的に培養された。培地Ｂは、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦおよびＧＤＮＦ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、１０μＭのｃＡＭＰを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）を含み、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地とＢ２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）との用量比は、５０：１である。
【００２９】
工程３：ニューロスフェアは、第３０日目まで培地Ｂ中で培養され、その後、非親水性の無菌材料の表面上でマトリゲルによってカプセル化された。ニューロスフェアは、第６０日目まで９６ウェル培養プレート上で培養され、その後、再度マトリゲルによってカプセル化された。ニューロスフェアは、第９０日目まで培地Ｂ中で培養され、人工ヒト脳組成をもつ均一な３Ｄオルガノイドが得られ得た。そして、さらなるカプセル化および培養が要件に応じて行われ得る。
【００３０】
図２、図３、図４、および図５を参照して、図２は、本発明の実施例１において提供される第１７日目まで培養された３Ｄ大脳小体のイメージを示している。図３は、本発明の実施例１において提供される第５０日目まで培養された３Ｄ大脳小体のイメージを示している。図４は、本発明の実施例１において提供される第５０日目まで培養された３Ｄ大脳小体のイメージを示している。図５は、本発明の実施例１において提供される第８８日目まで培養された３Ｄ大脳小体のイメージを示している。図２〜図５から理解され得るように、３Ｄ大脳小体は、サイズおよび形において相対的に均一であり、第８８日目に直径４ｍｍの大きさに達し得、そして成長が継続された。しかしながら、大部分の他の方法で得られる３Ｄ大脳小体においては、このようなサイズにまで成長すること、および、同じ時間の期間内健常に保たれていることは困難である。
【００３１】
図６を参照して、図６は、第１０週まで培養された３Ｄ大脳小体の種々の脳領域の組織生検および前駆細胞の染色像を示している。これらのうち、Ｎｅｓｔｉｎは、神経前駆細胞によって発現される共通のマーカータンパク質である。Ｔｕｊ１は、神経細胞によって共通に発現されるタンパク質マーカーである。Ｆｏｘｇ１は、前脳前駆細胞のマーカーである。ＴＢＲ２は、中脳の脳室下帯および海馬の神経前駆細胞のマーカーである、ＮＫＸ２．１は、後脳前駆細胞のマーカーであり、そして、ＤＡＰＩはＤＮＡ染色剤である。図６に示されるように、本発明の方法によって得られる３Ｄ大脳小体は、前脳、中脳、および後脳へ発達することができる。
【００３２】
図７を参照して、図７は、第８８日目まで培養された３Ｄ大脳小体の種々の大脳皮質の組織生検および神経細胞の染色像を示している。これらのうち、ＲＥＥＬＩＮ、ＢＲＮ２、ＳＡＴＢ２、ＣＴＩＰ２、およびＴＢＲ１は、それぞれ、大脳皮質Ｉ／II、III、IV、Ｖ、およびVIの神経細胞のマーカーである。図７に示されるように、本発明の方法によって得られる３Ｄ大脳小体は、上述の種々の皮質のマーカーを発現できる。
【００３３】
図８を参照して、図８は、第６３日目まで培養された３Ｄ大脳小体の組織生検ならびにグリア細胞および神経細胞の染色像を示している。これらのうち、ｎＮＯＳ、ＰＶ、およびＳＳＴは、抑制性介在脳ニューロン細胞のマーカーである。ＭＡＰ２は比較的成熟した神経細胞のマーカーであり、ＤＡＰＩはＤＮＡ染色剤である。図８に示されるように、本発明の方法によって得られる３Ｄ大脳小体は、これらの３つの抑制性介在脳ニューロン細胞を少なくとも含み、これは、脳の発達および機能に重要な役割を果たし、そして、３Ｄ大脳小体は、比較的成熟している。
【００３４】
統計によれば、３Ｄ大脳小体の全ての細胞中のグリア細胞の割合は、約５０〜７０％である。図９に示されるように、本発明に記載される方法によって得られる３Ｄ大脳小体は、脳の発達および機能に重要な役割を果たすグリア細胞を含んでおり、そして、それらの割合および分布は、ヒト脳のものと非常に似ている。
【００３５】
上述の実施例は、本発明の好ましい実施形態にすぎない。当該技術分野における通常の技術者であれば、本発明の原理の範囲から逸脱することなしに改変および修飾がなされ得ることが指摘されるべきであり、これら改変および修飾はまた、本発明の保護の範囲であると考えられるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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