(57)【要約】  ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）及び複数のPCR熱サイクルにわたる増幅シグナルの検出を利用する、工業物質に存在するバイオバーデンを定量する方法が提供される。PCRは、工業物質にしばしば見られる1つ以上のバイオファウリング物質に見られるDNAセグメントを標的とする。物質から採取したサンプルを、直接使用することもでき、又は最初に濾過、精製、溶解、希釈することも、若しくはかかる前処理の組み合わせに供することもできる。該物質は、医薬品以外の用途、医療以外の用途、製紙施設、皮革処理施設等の工業上の用途及び現場で使用される、又は使用準備のため試験される。物質若しくはかかる物質を利用するシステムを制御若しくは処理する方法、又は物質と接触することが意図されている表面を制御若しくは処理する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質に存在するバイオバーデンを定量する方法であって、
a）前記物質のサンプルを得ることと、
b）任意に、前記サンプルを濾過することと、
c）任意に、前記サンプルからDNAを抽出することと、
d）任意に前記サンプルを希釈することと、
e）前記物質にバイオバーデンを引き起こす少なくとも1つの生物のDNAセグメントを標的とし、増幅するように設計されたプライマー対を利用し、前記サンプル又はその部分を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うとともに、増幅データを形成することと、
f）前記増幅データを基準と相関させて、前記物質中の前記生物の推定される量又は濃度を決定することと、
を含み、
前記物質が、製紙工場、パルプ製造工場、皮革製造若しくは加工工場、発酵施設、石油及びガス回収場若しくは生産施設、水処理場、水冷却塔、又は下水処理場に由来する又はそこに供給される、方法。
【請求項２】
前記サンプルが内生胞子を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、生きている生物、生物に由来する生存細胞、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、内生胞子及び生存細胞を含み、前記プライマー対が少なくとも2つのプライマー対を含み、各プライマー対が、前記物質にバイオバーデンを引き起こす少なくとも1つの生物のDNAの各セグメントを標的とし、増幅する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが内生胞子及び生存細胞を含み、前記方法が、PCRを実施する前に前記サンプルから前記内生胞子を単離することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが内生胞子及び生存細胞を含み、前記方法が、PCRを実施する前に前記サンプルから前記生存細胞を分離することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記物質が主に液体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記物質が主に固体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記物質が液体及び固体を含み、前記方法が、実質的に前記工程（e）の前に前記固体を除去することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記物質中の前記生物の推定される量又は濃度に基づいて、前記物質を有する場所で、少なくとも1つの殺生物剤又は殺菌剤で前記物質を処理することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記物質中の前記生物の推定される量又は濃度に基づいて計算された投入量で適用される少なくとも1つの殺生物剤又は殺菌剤を用いて、前記物質を有し、前記物質を加工するように構成される加工施設で、前記物質を処理することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記物質がバイオファウリング生物の生存細胞を含み、前記サンプルを得ることが該生存細胞を溶解することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルを希釈して、少なくとも第1のサンプル部分及び第2のサンプル部分を形成することを更に含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応を行うことが、
プライマー対を利用して前記第1のサンプル部分を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、前記物質にバイオバーデンを引き起こすことが知られている少なくとも1つの生物のDNAセグメントを標的とし、増幅することと、
前記プライマー対を利用して前記第2のサンプル部分を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うことと、
前記第1のサンプル部分に対して行われた前記PCRから決定された前記DNAセグメントの増幅による増幅データを、基準又は基準セットと相関させて、前記物質中の前記生物の第1の推定される量又は濃度を決定することと、
前記第2のサンプル部分に対して行われた前記PCRから決定された前記DNAセグメントの増幅による増幅データを、前記基準又は基準セットと相関させて、前記物質中の前記生物の第2の推定される量又は濃度を決定することと、
前記第1の推定される量又は濃度を前記第2の推定される量又は濃度と比較するとともに、その平均の量又は濃度を決定することと、
前記平均の量又は濃度に基づいて計算される投入量で、少なくとも1つの殺生物剤又は殺菌剤を前記物質に適用することと、
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記PCRが、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施され、前記PCRの伸長期に前記プローブからクエンチされていないレポーター色素が放出され、前記方法が、
前記PCRの各熱サイクル中に、前記クエンチされていないレポーター色素を励起する励起波長を前記サンプルに対して照射することと、
前記PCRの各熱サイクル中に蛍光発光の強度を感知することと、
を更に含み、前記DNAセグメントの増幅率を相関させることが、熱サイクル当たりの検出された蛍光発光の強度の曲線をグラフ化し、定量サイクル（Cq）を決定することと、既知濃度の前記少なくとも1つの生物を有する既知の基準のCq値に前記決定されたCqを相関させることと、
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
プライマー対が、前記物質にバイオバーデンを引き起こすことが知られている2以上の異なる生物に現れる遺伝子のセグメントを増幅するように設計されたプライマー対を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライマー対が、細菌に由来する1つ以上のDNAセグメントを増幅するように設計されたプライマー対を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
プライマー対が、1つ以上の真菌に由来する1つ以上のDNAセグメントを増幅するように設計されたプライマー対を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
（1）前記DNAセグメントの存在を示し、（2）前記PCRから生じる前記DNAセグメントのアンプリコン濃度の増加に伴って強くなるシグナルを生成し、検出することを更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
プロットされ、グラフ化され、保存され若しくは作表された結果を含む基準セット、又はそれらの任意の組み合わせを作製することを更に含み、該作製することが、それぞれが既知濃度の既知のバイオファウリング物質を含む既知のサンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することを含み、それぞれの既知のサンプルに対する前記PCRが、前記プライマー対を使用して、前記少なくとも1つの生物の前記DNAセグメントを増幅し、前記既知のサンプルが異なる濃度の前記少なくとも1つの生物の少なくとも2つの既知のサンプルを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅データが、増幅率、Cq値、Ct値、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、前記製紙工場、パルプ製造工場、皮革製造若しくは加工工場、発酵施設、石油及びガス回収場若しくは生産施設、水処理場、水冷却塔、又は下水処理場で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が実施され、前記サンプルの前記取得から3時間以内に結果が得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が任意のDNA抽出工程が存在しない状況で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法がDNA抽出工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2018年3月26日に出願された先行米国仮特許出願第62/648,013号及び2018年5月11日に出願された先行米国仮特許出願第62/670,056号の米国特許法第119条（e）項に基づく利益を主張するものであり、この出願の全体は引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、工業物質又は工業用途におけるバイオバーデンに関するものである。より詳細には、本発明は、限定されないが、製紙、パルプ生産、皮革加工、油及びガスの回収若しくは生産、発酵プロセス、水処理、及び／又は下水処理等の工業用途において存在する又は使用される物質においてバイオバーデンを定量又は理解又は決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオバーデンの定量は、コロニー形成単位（CFU）で表すことができる。バイオバーデンは、例えば微生物が機器の表面又はファン冷却装置の内部に集まるバイオファウリング（biofouling：生物汚損）にも関連している。これは、ヒト感染のリスクを高める可能性がある。バイオバーデンは、通常、滅菌されていない表面に生息する細菌の数として定義される。米国で製造又は使用される医療機器のバイオバーデン検査は、米国連邦行政規則集第21巻に準拠し、世界ではISO 11737に準拠している。
【０００４】
バイオバーデン検査の目的は、生存可能な微生物の総数（総微生物数）を測定することである。製造及び生産及び処理の工業施設では、生産される製品のバイオファウリングを回避又は制御し、及び／又は製造及び生産及び処理の施設で使用される機械若しくはシステム、又は原材料若しくは加工材料のバイオファウリングを回避するための適切な工程を検討する及び／又は講じることができるよう、バイオバーデンを理解することが重要である。
【０００５】
現在、製造及び生産及び処理の工業施設において、バイオバーデンは、ほとんどの場合、ペトリフィルム又はATP試験を用いて調査又は推定される。ATP試験は、アデノシン三リン酸の検出により、活発に増殖する微生物を迅速に測定するプロセスである。ATP試験は高速であるが、得られる結果の感度は低いと考えられ、及び／又は得られる結果のばらつきが大きく、及び／又は得られる結果には「ノイズ」がある。別の言い方をすれば、ATP試験ではバイオバーデンの全般的な理解を得ることはできるが、例えば、バイオバーデンの処理が十分となり得て、過剰な使用（overdosing）によって処理化学薬品を無駄にすることがないように、バイオバーデンの詳細に関してバイオバーデンの定量に使用することができる非常に正確な理解は得られない場合がある。
【０００６】
工業用途で一般的に使用される他の方法は、寒天を調製する従来のプレーティング法の使用、又はオールインワンプレーティングシステムを提供するペトリフィルムプレートを使用することである。それらの費用対効果、単純性、利便性、及び使いやすさのためペトリフィルムプレート及び方法が使用されるが、この方法は結果を得るまで時には24時間〜48時間の時間がかかることがあり、さらに、この方法は、ペトリフィルム上で増殖又は繁殖している生物に厳密には特異的でないことに悩まされる。プレーティング法は、典型的には、実際のサンプルに似ていない規定された培地に限定されるため、正常に増殖することができる生物は限定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、バイオバーデンを理解するため、現在の方法による課題に対処することができる方法に対する必要性が存在する。さらに、バイオバーデンをより正確及び／又は迅速に定量することができ、及び／又は特定の生物種に関してバイオバーデンの詳細を提供することができる方法を提供することが必要であり、これらはいずれも、バイオバーデンを理解して、処理又は制御するためのより効果的な能力につながる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の特徴は、様々な工業プロセスにおけるバイオファウリング物質の迅速な計数法（method for enumeration）を提供することである。本発明に従って試験及び計数され得るバイオファウリング物質としては、細菌、藻類、真菌、及び／又は酵母が挙げられるが、これらに限定されない。細菌等のバイオファウリング物質を計数することは、液体、パルプ、水、塩水、なめし溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、汚泥、又はその他の物質の処理が必要又は推奨されるかどうか、また、どれくらいの処理剤を使用すべきかを決定する上で重要となり得る。例えば、製紙パルプ等の工業サンプル中の細菌のコロニーを計数又は定量することにより、細菌を制御及び／又は死滅させる目的で、製紙パルプに投入することができる有効かつ最小量の殺生物剤を計算、算出、又は他の方法で決定することができる。過剰な殺生物剤の使用を避けることができ、費用対効果の高い処理により、殺生物剤の汚染及び消費を最小限に抑えることができる。
【０００９】
本教示による検出方法及び処理は、製紙パルプ生産、皮革加工、石油及びガスの回収若しくは生産、発酵プロセス、冷却水塔、水処理、及び／又は下水処理を含むがこれらに限定されない産業で使用され得る。本発明によれば、多くの異なるバイオファウリング物質を迅速に同時に試験し、計数することができる。計数は、特定の工業物質に一般的に若しくはしばしば見られる特定のバイオファウリング物質、又は一連の若しくは一群のバイオファウリング物質に限定することができる。例えば、冷却水塔に由来する水の分析は、細菌及び藻類の計数を含む場合があり、皮革処理の塩水又は洗浄液（wash）の分析は細菌及び真菌の計数を含む場合があり、製紙パルプの分析は細菌、藻類、及び真菌の計数を含む場合がある。分析は、例えば、特定の工業物質、環境、以前の試験結果、その他の履歴データ、又はそれらの組み合わせに合わせて調整することができる。
【００１０】
本教示による方法を、物質に存在するバイオバーデンを定量するために使用することができる。上記方法は、物質のサンプルを取得することと、任意に該サンプルを濾過することと、任意に該サンプルを希釈することと、該サンプル又はその部分を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することとを含み得る。PCRを、物質にバイオバーデンを引き起こす疑いがある少なくとも1つの生物のDNAの配列又はセグメントを増幅するように構成されたプライマー対の存在下で、実施することができる。既知の種類又は種の細菌又は他のバイオファウリング生物が存在する可能性が高い又は存在することがわかっているサンプルでは、特異的プライマー対を使用してその種類又は種を標的にすることができる。どの種類又は種の生物（複数の場合もある）が存在し、バイオバーデンを引き起こす可能性が高いか又はそうでないかがわからないサンプルでは、様々なプライマー対を用いて、又はユニバーサルプライマー対を用いて少なくとも1つの生物のDNAの配列又はセグメントを増幅することができる。
【００１１】
特定の生物を標的とするか、又は特定の遺伝子を標的とするプライマー対を使用することができる。例えば、プライマー対を使用して、実質的に全ての既知の細菌に見られる16S遺伝子を計数することができる。したがって、特定の種類の細菌を標的としていなくても、細菌全般に起因するバイオファウリングを分析することができる。同様に、実質的に全ての既知の真核生物に見られる18S遺伝子を標的とするプライマー対は、特定の種類の藻類を標的としていなくても藻類を計数するために使用することができる。
【００１２】
上記方法は、当該技術分野でよく知られているように、多くの熱サイクルにわたって少なくとも1つの生物のDNAの配列又はプローブセグメントを増幅することを含むことができる。熱サイクル数に対する増幅率は、例えば、よく知られている蛍光検出法によって検出することができ、蛍光発光をサイクル数に対してグラフ化（又はその他の場合はプロット若しくは分析）して、基準、検量線、ルックアップテーブル、又はその他の所定の値と比較又は相関させることができる蛍光曲線又はシグナルを生成して、物質中のバイオファウリング生物の推定される量又は濃度を決定することができる。
【００１３】
蛍光検出は、当該技術分野でよく知られているように、PCR産物（アンプリコン）の量を測定するために使用することができる。インターカレート色素、例えば、SYBR（商標）グリーン（マサチューセッツ州ウォルサムのThermoFisher Scientific）、及びEvaGreen（商標）（カリフォルニア州フレモントのBiotium）を使用することができる。例えば、レポーター色素及びクエンチャー色素を有するFRET色素を含む蛍光プローブを使用することができ、当該技術分野でよく知られている。既知のバイオファウリング物質の既知のDNA配列又はセグメントにアニールするように構成された特異的プローブを使用することができ、特異的レポーター色素を用いて作製して、例えば、特定の検出システムを使用することで検出を最適化することができる。異なるレポーター色素を異なるプローブで使用することができるため、例えば、励起放射、発光放射（emission radiation）、又はそれらの両方に波長フィルタを使用することで、2以上のバイオファウリング物質を単一のサンプルで検出することができ、また単一のサンプルからそれらを計数することができる。
【００１４】
本発明の別の特徴は、物質中のバイオファウリング生物の推定される量又は濃度を決定する迅速で効率的で安価な方法であって、実験室にサンプルを送って結果を待つ必要なく、工業現場（オンサイト（on-site）及び携帯型）で実施することができる、方法を提供することである。かかる特徴は、一部では、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法及びPCR機械における最近の開発によって可能となっており、この開発は、オンサイトで3時間以内、例えば2時間以内又は1時間以内に携帯可能な状態でPCRを行うための低コストの選択肢を提供している。
【００１５】
本発明の更なる特徴は、物質中のバイオファウリング生物の推定される量又は濃度を推測又は計算するため、定量的PCR（qPCR）の結果を比較又は相関させるための基準を生成する方法である。既知の工業物質中に既知濃度のバイオファウリング生物種を調製することができ、特異的プライマー対、特定のセットの試薬、特異的検出が可能な色素の存在下で、及び／又は特定のサーモサイクル温度プロファイルで、例えば、特定のポリメラーゼ酵素を含む一連の特定の条件の下でPCR（例えば、qPCR）に供して、サンプル中の種の初期濃度に応じて異なる閾値サイクル値を生成することができる。異なる初期濃度に対して検出される定量サイクル（Cq）又は閾値サイクル（Ct）は、サーマルサイクリング及びポリメラーゼ連鎖反応アッセイの技術分野でよく知られているように、蛍光検出によって決定することができる。生成された基準グラフ、基準勾配、検量線、又はその他の基準値は、印刷、表示、メモリに保存、ルックアップテーブルに収載することができ、又は別の場合には未知のサンプルによって生成されたCq値、Cqグラフ、Cq勾配、Cq曲線、Ct値、Ctグラフ、Ct勾配、若しくはCt曲線との比較に利用可能とされ得る。基準又は基準セットを、濃度がわからない同じバイオファウリング物質を有する工業現場からのサンプルを同一の条件に供して得られた結果と比較することができる。
【００１６】
本発明の更なる特徴及び利点は、以下の明細書で一部説明され、本明細書から一部明らかとなるか、又は本発明の実施により認識することができる。本発明の目的及び他の利点は、本明細書及び添付の特許請求の範囲において具体的に指摘された要素及び組み合わせを用いて実現及び達成される。
【００１７】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方が例示的及び説明的なものに過ぎず、請求項に記載の本発明を更に説明することを意図すると理解されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】工業物質に見られる既知のバイオファウリング生物のDNA配列を複製するためのプライマー対として使用することができるプライマーを示す、表の第1部及び第2部である。各図は、図に収載されている配列に対応する配列番号を示している。
【図１Ｂ】同上
【図２】1マイクロリットル（μL）当たりのバイオファウリング物質の細胞濃度がわかっている工業サンプルのCqの基準値を示し、Cq測定に基づいて計算された濃度が既知の実際の所与の濃度と良好に対応していることを示す表である。量の尺度として使用するため、サンプルのCqを別のサンプル（キャリブレーターと呼ばれることが多い）のCqに関連づけて相対定量を決定するか、又は既知のコピー数の基準セットのCqに関連づけて絶対定量を決定することができる。
【図３】図2に示す細胞の様々な連続希釈の定量サイクル値（Cq）を相関させる検量線又は基準線を示すグラフである。細胞は既知のバイオファウリング生物のものである。データ及び／又はグラフを、例えば、工業物質に由来するサンプルのオンサイト試験結果を比較するため、基準若しくは基準セットとして使用することもでき、又は基準若しくは基準セットを作製するために使用することもできる。Cq又はサイクル閾値（Ct）に基づく基準を、基準として使用することができ、又は基準を生成するために使用することもできる。
【図４】PCRに供すると、表に示す物質の濃度を示すCq値を生成する、バイオファウリング物質を含む皮革の塩水サンプル及び洗浄サンプルを示す表である。Cq値を生成するために使用されるPCRを実行する前に、各サンプルを1000倍に希釈した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本教示は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）及び複数のPCR熱サイクルにわたるPCRアンプリコン数の変化率の検出を利用する、工業物質に存在するバイオバーデンを定量又は計数する方法を提供する。PCRを、かかる工業物質によく見られる1つ以上のバイオファウリング物質に見られる1つ以上のDNAセグメントを標的とするように設計することができる。例として、エンテロバクター菌が見られることが多く、製紙パルプを生物汚損する場合がある。本教示は、パルプ中の細菌の存在及び濃度を決定する目的で、エンテロバクターの1つ以上のシグネチャDNAセグメントを標的とする方法を包含する。次いで、1つ以上の適切な殺生物剤をパルプに添加し、又はそれと混合し、そうしなければ細菌の存在から生じるであろうバイオバーデンを制御、低減、又は除去することができる。したがって、パルプ中の細菌の計算又は算出された濃度に基づいて、正しい投入量の殺生物剤を使用することができる。過剰な殺生物剤の使用、及びそれに伴う超過コストを避けることができる。
【００２０】
サンプルを物質から採取して直接使用してもよく、又は最初に濾過し、精製し、溶解し、希釈し、若しくはかかる前処理の組み合わせに供してもよい。サンプルサイズは、任意の好適な容量、例えば、0.1マイクロリットル（μl）〜10ミリリットル（ml）、1 μl〜5 ml、10 μl〜2 ml、100 μl〜1 ml、又は約1 mlにすることができる。その後、サンプルを希釈するか、そのまま使用することができる。例として、1 mlのサンプルを採取した後、10倍、100倍、又は1000倍に希釈し、次いで、1 mlの希釈されたサンプルの1 μlのアリコート等の希釈したサンプルのアリコートを使用することができる。この物質は、医薬品以外の用途、医療以外の用途、製紙施設、アルコール製造施設、発酵施設、皮革処理施設等の工業上の用途及び現場等において、又はそこで使用される多種多様な工業物質のいずれかであり得る。本発明の方法はまた、実験室又はその他の遠隔地で、追加的に又は代わりに実施することができる。該方法を使用して、物質若しくは物質を利用するシステムを防除若しくは処理することができ、又は物質と接触することが意図される表面を防除若しくは処理することができる。
【００２１】
本発明は、様々な工業プロセスにおいて細菌を迅速に計数する方法に関する。細菌又は微生物を計数することは、液体、パルプ、水、塩水、なめし溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、混合物、汚泥、又はその他の物質の処理が必要とされる又は推奨されるかどうか、及びどれくらいの処理剤を使用すべきかを決定する上で重要となり得る。例えば、製紙パルプ等の工業サンプル中の細菌（及び／又は他の微生物）のコロニーを計数又は定量することにより、微生物数を制御又は減少させる目的で、製紙パルプに投入することができる有効かつ最小量の殺生物剤（又は殺菌剤）を決定することができる。過剰な殺生物剤の使用を避けることができ、費用対効果の高い処理により、殺生物剤の汚染及び消費を最小限に抑える。
【００２２】
本教示による検出方法及び処理は、製紙パルプ生産、皮革加工、石油及びガスの回収若しくは生産、発酵プロセス、水処理、冷却水システム、及び／又は下水処理を含むがこれらに限定されない産業で使用され得る。
【００２３】
本教示による方法を、物質に存在するバイオバーデンを定量するために使用することができる。上記方法は、物質のサンプルを取得することと、任意にサンプルを濾過することと、任意に該サンプルを希釈することと、物質にバイオバーデンを引き起こす疑いがある少なくとも1つの生物のDNAの配列又はセグメントを検出する増幅用プライマー対及び検出試薬の存在下で、サンプル又はその一部を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うこととを含んでもよい。既知の種類の細菌又はその他の汚損生物が存在する可能性が高い、又は存在がわかっているサンプルでは、特異的プライマー対を用いて、その種の細菌又はその他の汚損生物を標的にすることができる。どの種が存在し、バイオバーデンを引き起こす可能性が高いか又はそうでないかがわからないサンプルでは、様々なプライマー対を用いて、ユニバーサルプライマー対を用いて、又は共通の遺伝子に向けられたプライマー対を用いて少なくとも1つの生物又は遺伝子のDNAの配列又はセグメントを増幅することができる。
【００２４】
上記方法は、当該技術分野でよく知られているように、多くの熱サイクルにわたって少なくとも1つの生物のDNAの配列又はセグメントを増幅することを含むことができる。熱サイクル数に対する増幅率は、例えば、よく知られている蛍光検出方法によって検出することができる。蛍光発光は、サイクル数に関してグラフ化、又は他の方法でプロットして、基準、基準セット、検量線、ルックアップテーブル、保存された値、又はその他の所定の値と比較又は相関させることができる蛍光曲線又はシグナルを生成して、物質中のバイオファウリング生物の推定される量又は濃度を決定する、すなわち、バイオファウリング物質を計数することができる。
【００２５】
本発明の教示によれば、上記方法は、物質のサンプルを取得することと、任意に該サンプルを濾過することと、任意に該サンプルを希釈することと、該サンプルを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うこととを含み得る。DNAの配列又はセグメントの増幅によって得られた増幅データを、次いで、測定、決定又は計算した後、1つ以上の基準と相関させて物質中の生物の推定される量又は濃度を決定することができる。増幅データは、増幅率、Cq値、Ct値、蛍光発光強度データ、又はそれらの組み合わせを含み得る。上記物質は、製紙工場、パルプ製造工場、皮革製造若しくは加工工場、発酵施設、石油及びガス回収場若しくは生産施設、水処理場、水冷却施設、又は下水処理場に由来する、又はそれらに供給される工業物質であってもよい。必要に応じて、サンプルを洗浄、精製、単離、又はその他の場合は処理して、そうしなければPCRに干渉する可能性のある成分を除去することができる。例として、PCRに供する前にサンプルを溶解して濾過することができる。
【００２６】
サンプルは、細胞、内生胞子、生きている生物若しくは生物に由来する生存細胞、又はそれらの組み合わせを含み得る。例えば、サンプルが内生胞子及び生存細胞を含む場合、少なくとも2つのプライマー対を使用することができ、各プライマー対は、工業物質にバイオバーデンを引き起こす少なくとも1つの生物のDNAのそれぞれのセグメントを標的として増幅することができる。サンプルは、内生胞子及び生存細胞を含むことができ、上記方法は、内生胞子画分に対してPCRを実施する前に、サンプルから内生胞子を単離することを含み得る。上記方法は、生存細胞画分に対してPCRを実施する前に、サンプルから生存細胞を単離することを含み得る。上記方法は、サンプルを調製することを含むことができる。サンプルがバイオファウリング生物の生存細胞を含む場合、調製には生存細胞を溶解することが含まれ得る。
【００２７】
工業物質は、主に液体、パルプ、水、塩水、なめし液、溶液、分散液、懸濁液、エマルジョン、混合物、固体、汚泥、又はそれらの組み合わせを含み得る。物質は液体及び固体を含み得て、該方法は、PCRを実施する前に固体を実質的に除去することを含み得る。該方法は、物質のある場所で、例えばサンプルを採取した場所で直接、物質を処理することを含み得る（例えば、オンサイトでの分析及び処理）。処理には、物質中に検出されたバイオファウリング生物の推定される量又は濃度に基づいて、すなわち、計算又は算出されたバイオバーデンに基づいて、少なくとも1つの殺生物剤又は殺菌剤を適用することが含まれ得る。処理には、物質を保持する、物質を含有する、又は物質を加工するように構成された加工施設で物質を処理することが含まれ得る。少なくとも1つの殺生物剤又は殺菌剤による処理は、物質にいる生物（複数の場合もある）又は物質のバイオバーデンの推定される量又は濃度に基づいて計算された投入量で適用され得る。
【００２８】
上記方法は、少なくとも第1のサンプル部分及び第2のサンプル部分を形成するため、サンプルを希釈することを更に含んでもよい。サンプルを、例えば、連続希釈で希釈することができる。3回、4回、又はそれ以上の連続希釈を行い、試験することができる。場合によっては、1の希釈度で、標準偏差がより小さく、より良好で、より明確な結果が得られることがある。異なる希釈率のサンプルを用いてPCRを実施することは、プライマー対を利用して第1のサンプル部分に対してPCRを実施して、上記物質にバイオバーデンを引き起こすことが知られている少なくとも1つの生物のDNAセグメントを標的とし、増幅することと、該プライマー対又は異なるプライマー対を利用して第2のサンプル部分を用いてPCRを実施することとを含み得る。第1のサンプル部分に対して実施されたPCRによって決定されたDNAセグメントの増幅率、Cq又はCtを基準又は基準セットと相関させて、物質中の生物の第1の推定される量又は濃度を決定することができる。第2のサンプル部分に対して実施されたPCRによって決定されたDNAセグメントの増幅率、Cq又はCtを同じ基準又は基準セットと相関させて、物質中の生物の第2の推定される量又は濃度を決定することができる。さらに、第1の推定される量又は濃度を、第2の推定される量又は濃度と比較することができ、標準偏差と共に、量又は濃度の平均を決定することができる。結果より、殺生物剤又は殺菌剤の投入量を物質に適用することができ、投入量は量又は濃度の平均に基づいて計算される。より高濃度のバイオファウリング物質が存在すると判断された場合、より多い投入量の殺生物剤を用いてその物質を処理することができる。一例として、Cqを5減らすごとに殺生物剤の投入量を2倍にすることができるため、Cqが15を示す製紙パルプ等の工業物質の場合、別の同じ物質であるがCqが20を示す物質に対して適用される殺生物剤の量の2倍の殺生物剤を適用することができる。
【００２９】
プライマー対は、少なくとも1つの共役した又は結合した蛍光色素を有するプローブと一緒に使用することができる。当該技術分野でよく知られているように、プライマー対及びプローブをDNAセグメントにアニーリングした後、伸長させると、蛍光色素がクエンチされない可能性がある。励起波長を使用してクエンチされていない色素を励起することができ、蛍光発光のスペクトル及び強度を使用してCq又はCtのグラフを熱サイクル数に対してプロットすることができる。クエンチされていない蛍光色素を励起する該方法の励起波長を、PCRの各熱サイクルの間にサンプルに向けることができる。蛍光発光の強度を、PCRの各熱サイクル中に検出、測定、又は感知することができる。DNAセグメントの増幅率、又はCq若しくはCtを、熱サイクル当たりの蛍光発光強度の曲線をグラフ化することによって決定することができる。閾値サイクル（Ct）を決定する場合、それを既知濃度の少なくとも1つの生物を有する既知の基準又は基準セットのCt値と相関させることができる。定量サイクル（Cq）を決定する場合、それを既知濃度の少なくとも1つの生物を有する既知の基準又は基準セットのCq値と相関させることができる。該方法は、（1）DNAセグメントの存在を示し、（2）PCRから生じるDNAセグメントのアンプリコン濃度の増加に伴って強くなるシグナルを生成し、検出することを更に含むことができる。
【００３０】
プライマー対は、物質にバイオバーデンを引き起こすことが知られている2以上の異なる生物のDNAのセグメントを増幅するように設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むユニバーサルプライマー対を含むことができる。プライマー対を、細菌から1つ以上のDNAセグメントを増幅するように設計することができる。プライマー対は、1つ以上の真菌から1つ以上のDNAセグメントを増幅するように設計されたプライマー対を含むことができる。プライマーは、16S遺伝子又は18S遺伝子の1つ以上のセグメントを増幅するように設計されたプライマーを含むことができる。
【００３１】
上記方法を使用して、内生胞子を検出することができる。内生胞子とは、最も一般的にはフィルミクテス（Firmicutes）門の或る特定の細菌により産生される、休眠状態の頑丈な非生殖構造である。これは、細菌が変わることができる必要最低限の休眠形態である。内生胞子の形成は、通常、栄養素の欠乏によって引き起こされ、通常はグラム陽性細菌で起こる。内生胞子は、細菌が長期間、更には何世紀にもわたって休眠することを可能にする。環境がより良好になると、内生胞子は自身を栄養状態（vegetative state）に再活性化することができる。内生胞子を検出可能なことで、細菌自体の検出ができない場合に細菌の形態を検出することができる。
【００３２】
幾つかの分類の細菌は、内生胞子の代わりに細菌性嚢胞（microbial cysts）としても知られる外生胞子に変わることがある。外生胞子及び内生胞子は、幾つかの分類の微生物に見られる2種類の「冬眠」又は休眠の段階である。上記方法は、内生胞子又は外生胞子に存在する細菌のDNAを検出し、定量化することができる。
【００３３】
本発明の別の特徴は、物質中のバイオファウリング生物の推定される量又は濃度を決定する迅速で効率的で安価な方法であって、実験室にサンプルを送って結果を待つ必要がなく、工業現場で実施することができる、方法を提供することである。本発明は、オンサイトの（分析される物質の場所での）分析を可能にし、3時間以内、2時間以内、1時間以内、20分〜3時間、30分〜2時間、又は30分〜1時間での定量を可能にする。
【００３４】
本発明は、時間がかかる場合があるDNAの抽出又は精製を回避する能力又は選択肢を更に可能にする。
【００３５】
本発明は、オンサイトで3時間以内、例えば2時間以内又は1時間以内のPCRを携帯可能な状態で実施するための低価格の選択肢を提供している、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法及び機械を使用する。例として、磁気誘導サーマルサイクラーを用いることができる。携帯性、工業現場でサンプルに対してPCRを行う能力、及び非常に速いサイクル時間、例えば、3時間以内、2時間以内、又は1時間以内に30回の熱サイクルを提供することができる例示的な機械は、Bio Molecular Systemsによって製造され、マサチューセッツ州トーントンのBioline USA Incから入手可能なMIC磁気誘導サイクラーである。任意の適切なサーモサイクリングPCR機を使用することができ、磁気誘導サイクラー以外の装置を使用することができる。液体で加熱及び冷却されるサーモサイクリングブロックを有するサーモサイクラーを使用することができ、ペルチェ加熱素子を有するサーモサイクラーを使用すること等もできる。基準又は基準セットの生成に使用される同じ機械又は同じモデルの機械を使用して、基準又は基準セットと比較することにより工業物質の試験を行うことができる。結果の生成に比較的長い時間を要する、よく知られているPCR装置を使用して、実験室内で基準又は基準セットを生成することができる。オンサイトの検査、及び基準又は基準セットとの比較では、携帯型の比較的高速な機械、例えば上記のMIC磁気誘導サイクラーを使用することができる。
【００３６】
本発明の更なる特徴は、物質中のバイオファウリング生物の推定される量又は濃度を推測又は計算するため、定量的PCR（qPCR）の結果を比較又は相関させるための基準を生成する方法である。既知の濃度のバイオファウリング生物種を既知の工業物質中で調製することができ、例えば、特異的プライマー対の存在下で、特定の試薬セットの存在下で、特定の蛍光色素の存在下で、及び特定のサーモサイクル温度プロファイルで、特定のポリメラーゼ酵素を含む特定の一連の条件下でPCRに供して、サンプル中の種の初期濃度に応じて異なる閾値サイクル値を生成することができる。異なる初期濃度に対して検出される定量サイクル（Cq）又は閾値サイクル（Ct）は、サーマルサイクリング及びポリメラーゼ連鎖反応アッセイの技術分野でよく知られているように、蛍光検出によって決定することができる。生成される基準グラフ、基準勾配、検量線、又はその他の基準値は、印刷、表示、メモリに保存することができ、又はその他の場合は同じ条件下で、オンサイトで試験された、濃度がわからない同じ種を有するサンプルを供することによって生成されるCq値、Cqグラフ、Cq勾配、Cq曲線、Ct値、Ctグラフ、Ct勾配、若しくはCt曲線との比較に利用可能とすることができる。
【００３７】
基準を生成するために、サーマルサイクリングに使用する温度を較正する方法を実施することができる。較正は、例えば、Gunstream et al.に対する米国特許第7,875,425号（引用することでその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるように、スペクトル的に識別可能な種を使用して一連のウェルの温度を繰り返し変化させ、異なる温度サイクル中に各ウェルからのシグナルを測定することを含むことができる。
【００３８】
上記方法は、PCR増幅効率を推定するために検量線の傾きを使用することを含むことができる。qPCR検量線を、半対数回帰直線プロットとしてグラフにより表すことができる。開始テンプレートがRNAである場合、qPCR検量線を入力cDNAの対数に対するCq値の半対数回帰直線プロットとしてグラフで表すことができる。Enke, R., qPCR Primer Efficiency Standard Curve Analysis, CSHL DNALC RNA-Seq for the Next Generation Working Group (2016), http://www.rnaseqforthenextgeneration.org/profiles/raymond-enke.html#teaching（Enkeの論文)に記載されるように、-3.32の傾きは100%のPCR反応効率を示す。より大きな負の傾きは、効率が100%未満の反応を示す。より大きな正の傾きは、サンプルの品質又はピペッティングの問題を示す。効率が100%の反応は、増幅の指数期の間、3.32サイクルごとにPCRアンプリコンが10倍増加する（log2 10=3.3219）。次いで、傾きからパーセントPCR効率を計算することができる。
PCR効率=[10（-1/m）]-1
式中、m＝傾き；効率100＝1である。Enkeの論文は、引用することでその全体が本明細書の一部をなす。また、例えばEnkeの論文にも記載されているように、PCRから生じる増幅産物が単一の産物であるか又は複数の異なる種若しくはDNAセグメントの結果であるかどうかを判定するため、更に又は代わりに融解曲線解析を使用することもできる。
【００３９】
上記方法は、例えば、製紙パルプ又は他の物質中のバイオバーデンの細菌又は微生物（複数の場合もある）を検出するため、細胞内の少なくとも1つの標的核酸を検出することを含むことができる。該方法は、（a）多機能溶解バッファーで細胞を溶解して細胞溶解液を生成することと、（b）定量的核酸検出アッセイを使用して、細胞溶解液中の少なくとも1つの標的核酸を検出することとを含むことができる。使用することができる例示的な定量的核酸検出アッセイとしてはqPCR、及び例えば、Shannon et al.に対する米国特許第8,012,685号（引用することでその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるその他の方法が挙げられる。
【００４０】
増幅産物、すなわちアンプリコンを検出するため、インターカレート色素又は検出可能なプローブを使用することができる。当該技術分野で知られているように、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）色素を対にしてDNAプローブのオリゴヌクレオチド配列の両端に付けて、検出可能なプローブを形成することができる。この対には、レポーター色素及びクエンチャー色素を含めることができる。浮動状態では、すなわち、標的配列にアニールされ、ポリメラーゼによって切断される前に、レポーター色素からの蛍光発光は、レポーター色素に近接したままのクエンチャー色素によってクエンチされる。しかしながら、プローブが標的に対してアニールされると、PCRの伸長期中に、ポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性がプローブを破壊し、レポーター色素をクエンチャー色素から物理的に分離して、蛍光が永続的に増加する。蛍光を、Ct値及びCq値の測定及び／又は算出を可能にする方法でモニターし、記録し、図表にすることができる。蛍光レポーター色素は、励起波長で照射すると励起され、検出可能であり、標的DNA配列の存在を示す、蛍光の増加を生じることができる。存在している標的分子が多いほど、反応するプライマー及びプローブが増え、クエンチされない蛍光レポーター色素の分子が増える。標的分子又は標的DNA配列の開始濃度が高いサンプルでは、最大又はプラトーの蛍光シグナルを生成するのにかかる熱サイクルが少なくなり、閾値サイクル（Ct）及び定量サイクル（Cq）の数が少なくなる。
【００４１】
非常に厳格な温度制御、及びサーマルサイクリングのサイクル温度をわずかに変化させることにより、最適な結果を生成することができる。アニーリング温度又は変性温度を摂氏1度以下変化させるだけで、増幅結果及び検出可能なシグナル強度を向上させ得ることがある。基準又は基準セットの生成中に温度及びその他の条件を最適化することは、工業サンプルを試験するためにオンサイトで使用する必要がある同じ温度及びその他の条件を決定する際に役立つ場合がある。サーマルサイクリングの温度プロファイルを最適化するために使用することができる機器、システム、及び方法としては、例えば、Atwood et al.に対する米国特許第7,238,517号（引用することでその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるものが挙げられる。
【００４２】
好適なキットには、複数のシングルプレックスの定量的又はリアルタイムの増幅反応を行うのに適した試薬を含めることができる。かかる試薬には、一連の定量的又はリアルタイムの増幅プライマー、FRETプローブ等の定量的でリアルタイムの増幅反応をモニターするのに適した標識システムで標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、シングルプレックス増幅に適した濃度のDNAポリメラーゼ、及びテンプレート依存性DNA合成に適したdNTPの混合物を含めることができる。
【００４３】
サンプルのqPCR検査、及び基準を生成するために使用されるqPCRサンプルのプロセッシングは、かかる増幅に適した試薬及びキットを使用して行われ得る。かかるキットには、シングル又はマルチプレックスの増幅を行うのに適した複数の増幅プライマーセットを含めることができる。プライマーセットを、個別に包装することもでき、又は単一の容器に包装することもできる。キットは、任意にDNAポリメラーゼ酵素、逆転写酵素、及びテンプレート依存性DNA合成によるプライマーの伸長に適したヌクレオシド三リン酸（「dNTP」）の混合物等の増幅を行うための1つ以上の追加の試薬を含んでもよい。キットに含まれる任意のポリメラーゼの量が、増幅反応の効率を最適化するのに適している場合がある。利便性を最大限に高めるために様々な試薬を組み合わせて包装することができ、従来のPCR及び／又はRT-PCR増幅反応を実行するために商業的に入手可能な試薬の組み合わせに従ってモデル化することができる。カリフォルニア州フォスターシティのApplied Biosystemsから入手可能なTAQMAN（商標）Universal PCR Master Mix及び／又はTAQMAN（商標）Gold RT-PCR Kitをキットの例として挙げることができ、またこれを上記方法で使用することができる。キットには、例えば、Bengra et al., 2002, Clin, Chem. 48:2131-2140、Myakishev et al., 2001, Genome Res. 11:163-169、及び米国特許第6,395,486号）（引用することでそれらの全体が本明細書の一部をなす）に記載される「テールド（tailed）」プライマー等の他の試薬を更に含めることもできる。
【００４４】
上記方法は、2以上の標的又は生物の存在及び量を同時に決定するため、目的のポリヌクレオチド配列をマルチプレックス方式で増幅することを含み得る。かかる目的に有用な方法、試薬、及びキットとしては、例えば、Anderson et al.に対する米国特許第8,323,897号（引用することでその全体が本明細書の一部をなす）に記載されるものが挙げられる。1つ以上のポリヌクレオチドは、例えば、各標的に1つずつ、各々が目的のポリヌクレオチドの異なる配列を増幅するのに適しているか又は有効である複数の増幅プライマー対又はセットを用い、異なる検出可能なプローブを用いる、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「RT-PCR」）によって増幅され得る。異なる波長で蛍光を発するプローブを選択することができることから、複数の異なる標的配列のうちのどれが存在し、増幅されているかを識別することができる。マルチプレックス増幅法により、単一の反応容器内で目的の複数の異なる配列の同時増幅及び検出が可能になる。マルチプレックス増幅は、定量分析に利用可能なサンプルの濃度又は量を効果的に増加させるため、様々な状況で使用され得る。
【００４５】
DNAとRNAとの両方の標的ポリヌクレオチドを、低プライマー濃度を用いてマルチプレックス増幅することができる。具体的には、逆転写反応によるcDNAへのRNAの逆転写、及び後続する得られたcDNAのDNAポリメラーゼによるマルチプレックス増幅を、低濃度のプライマー（例えば、各プライマーについて45 nM）を用いて行うことができる。DNAとRNAとの両方の標的ポリヌクレオチドの増幅を、それぞれ従来のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）の原理を用いてマルチプレックス方式で行うことができる。
【００４６】
さらに、個々のプライマー濃度を最適化する必要はなく、全てのプライマーをほぼ等モル濃度で使用して、良好な結果を得ることができる。低プライマー濃度の使用は、非特異的なプライマー相互作用の可能性を減少させる。時間のかかる最適化工程を伴わずに、事実上あらゆる組み合わせの配列のマルチプレックス増幅を迅速に実現することができる。
【００４７】
マルチプレックス化により、商業的に入手可能な既製試薬を用いてマルチプレックス増幅反応を行うことができる。増幅プライマー及びプローブを含む既製試薬は、プローブを事前に除去せずに、一緒にプールして、マルチプレックス増幅反応に使用することができる。かかるオリゴヌクレオチドプローブが存在しない場合に行われるマルチプレックス増幅と同様に、かかるオリゴヌクレオチドプローブの存在下で行われるマルチプレックス増幅は、事前の希釈の有無に関わらず、更なる精製又は操作を行わずに後続する分析のため、アリコートに分けることができる。
【００４８】
シングルプレックス又はマルチプレックスの増幅法は、二本鎖ポリヌクレオチドに対する結合の際に、検出可能なシグナルを生成することができる1つ以上のインターカレート色素（例えば、SYBR（商標）Green I若しくはII、SYBR（商標）Gold、エチジウムブロマイド、又はYO-PRO-1；オレゴン州ユージンのMolecular Probes）の存在下で行われ得る。
【００４９】
プライマー対が複製したいDNAの配列又はセグメントの両端のそれぞれにアニールするように設計された各配列を持っている限り、任意の好適なプライマー対を使用することができる。例えば、工業物質にバイオバーデンを引き起こすことが知られている既知のバイオファウリング物質のDNAを増幅して検出することが望ましい場合がある。複製及び増幅される配列又はセグメントは、（1）特定の生物、（2）特定の遺伝子、（3）生物の種、属、科、目、綱、門、界、若しくはドメイン等の生物の種類、又は（4）特定の種類の生物に見られる遺伝子に見られるDNAの既知の又は所定の配列であってもよい。
【００５０】
図面を参照すると、図1A及び図1Bは、工業物質に見られる既知のバイオファウリング生物のDNA配列を複製及び増幅するためのプライマー対として使用することができるプライマーを示す2部表の1部及び2部である。また、図1A及び図1Bは、かかるプライマーが記載及び同定され、それぞれのプライマーによって標的とされるそれぞれの配列又は遺伝子が同定される文献の対応する情報源を「注釈」欄に示す。収載されるプライマーは、ほぼ完全に対として分類され、各対は「F-」と指定されるフォワードプライマー、及び「R-」と指定されるリバースプライマーを含む。「F-」及び「R-」の標識はヌクレオチドではなく、単に、ハイフン（-）に続く配列が、その対のフォワードプライマーであるかリバースプライマーであるかを示すものである。図1Bに示されている最後の群は、3つのプライマーのセットであり、2つのリバースプライマーのいずれかを1つのフォワードプライマーと対にすることができ、いずれも1つの端部の同じ端部から始まる、異なった長さの配列を、どちらのリバースプライマーを使用するかに応じて試験及び計数することができる。
【００５１】
適切なプライマー対を選択し、整列させ、目的の対応する生物又は遺伝子のそれぞれのDNAセグメントを複製するために使用することができる。最初の2つのエントリを、エンテロバクター属からDNAの細菌配列を複製するための一対のプライマーを構成するために使用することができる。例えば、一覧の最初のプライマーはフォワードプライマーとして作用し、リバースプライマーとして作用し得る一覧の2番目のプライマーと併用することができ、また、その対又はセットを、標的配列を複製して増幅するために使用することができる。一般に、同じ参照文献から同定された一覧上の2つの連続したプライマーを、一緒に使用することができる一対のプライマーとして使用することができ、例えば、表に収載される第1の対、第2の対、及び第3の対が挙げられる。16S遺伝子からのテンプレートの複製に使用することができる一覧にある多くのプライマーについて、一覧の同じ参照文献から同定された2つの連続するプライマーの出現を、16S遺伝子からのテンプレートを一緒に複製する一対のプライマーとして使用することができる。Tanner et al.により収載された2つのプライマーはプライマー対を表し、Liesack et al.により収載された2つのプライマーはプライマー対を表し、Medlin et al.により収載された2つのプライマーはプライマー対を表し、Giovannoni et al.により収載された2つのプライマーはプライマー対を表し、Burggraf et al.により収載された2つのプライマーはプライマー対を表す。同じ遺伝子、例えば、16S遺伝子の部分を複製するためのプライマーの一覧からの2つのプライマーの多くの組み合わせは、それらが二本鎖テンプレートに対して正しい向きで重合する限りにおいて、プライマー対として一緒に使用することができる。
【００５２】
図2は、マイクロリットル（μL）当たりの既知のバイオファウリング物質の細胞濃度を有する工業サンプルのCqの基準値を示す表であり、Cq測定に基づいて計算された濃度が、既知の実際の所与の濃度との良好な対応を示すことを示している表である。量の尺度として使用するには、サンプルのCqを別のサンプル（キャリブレーターと呼ばれることが多い）のCqに関連づけて相対定量を決定するか、又は既知のコピー数の基準セットのCqに関連づけて絶対定量を決定することができる。
【００５３】
図3は、図2に示す細胞の様々な連続希釈の定量サイクル値（Cq）を相関させる検量線又は基準線を示すグラフである。細胞は既知のバイオファウリング生物のものである。データ及び／又はグラフを、例えば、工業物質に由来するサンプルのオンサイト試験結果を比較するため、基準若しくは基準セットとして使用することもでき、又は基準若しくは基準セットを作製するために使用することもできる。Cq又はサイクル閾値（Ct）に基づく基準を、基準として使用することができ、又は基準を生成するために使用することもできる。基準は、既知濃度の既知のバイオファウリング物質又はバイオファウリング生物のサンプルに基づいて生成され得る。本方法は、最初にオンサイトでの試験結果を比較することができる基準又は基準セットを作製することを含んでもよい。基準のライブラリ及び基準セットのライブラリを、生成、保存、使用、表示、印刷、維持、保持、及び更新することができる。
【００５４】
図4は、PCRに供すると、表に示す物質の濃度を示すCq値を生成する、バイオファウリング物質が含まれている皮革の塩水サンプル及び洗浄サンプルを示す表である。Cq値を生成するために使用されるPCRを実行する前に、各サンプルを1000倍に希釈した。塩水サンプル及び各洗浄サンプルを試験した。例えば、洗浄サンプル1番を、塩水サンプル1番でなめした皮革を洗浄することによって作製し、洗浄サンプル2番を、塩水サンプル2番でなめした皮革を洗浄することによって作製した。サンプル中に存在する細菌の複製及び増幅に使用されるプライマー対は、図1Aの第1のプライマー対として示され、すなわち、Anderson et al.によって記載されるエンテロバクターに対するプライマー対である。マサチューセッツ州トーントンのBio Molecular SystemsのMIC qPCR Cyclerを用いてPCRを実施した。同様にBio Molecular Systemsから入手可能なMICソフトウェアを使用して平均Cq値を算出した。決定された濃度に基づいて、過剰な殺生物剤を使用したり無駄にしたりすることなく、有効量の殺生物剤を皮革処理塩水に投入することができることから、皮革処理プロセスをより安価で安全なものにすることができる。
【００５５】
本発明の方法によれば、生物学的処理リアクタの正確で有効な制御、殺生物剤投入プログラムの指導、飲料水の清浄度の判定、発酵プロセスの管理、土壌活性の評価、腐食／堆積プロセスの種類の決定、微生物汚染に関する機器又は製品の測定等が更に可能である。
【００５６】
本発明は以下の態様／実施形態／特徴を任意の順序及び／又は任意の組み合わせで包含する：
1．本発明は、物質に存在するバイオバーデンを定量する方法であって、
a）前記物質のサンプルを得ることと、
b）任意に、前記サンプルを濾過することと、
c）任意に、前記サンプルからDNAを抽出することと、
d）任意に前記サンプルを希釈することと、
e）前記物質にバイオバーデンを引き起こす少なくとも1つの生物のDNAセグメントを標的とし、増幅するように設計されたプライマー対を利用し、前記サンプル又はその部分を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うとともに、増幅データを形成することと、
f）前記増幅データを基準と相関させて、前記物質中の前記生物の推定される量又は濃度を決定することと、
を含み、
前記物質が、製紙工場、パルプ製造工場、皮革製造若しくは加工工場、発酵施設、石油及びガス回収場若しくは生産施設、水処理場、水冷却塔、又は下水処理場に由来する又はそこに供給される、方法に関する。
2．前記サンプルが内生胞子を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
3．前記サンプルが、生きている生物、生物に由来する生存細胞、又はそれらの組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
4．前記サンプルが、内生胞子及び生存細胞を含み、前記プライマー対が少なくとも2つのプライマー対を含み、各プライマー対が、前記物質にバイオバーデンを引き起こす少なくとも1つの生物のDNAの各セグメントを標的とし、増幅する、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
5．前記サンプルが内生胞子及び生存細胞を含み、前記方法が、PCRを実施する前に前記サンプルから前記内生胞子を単離することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
6．前記サンプルが内生胞子及び生存細胞を含み、前記方法が、PCRを実施する前に前記サンプルから前記生存細胞を分離することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
7．前記物質が主に液体を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
8．前記物質が主に固体を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
9．前記物質が液体及び固体を含み、前記方法が、実質的に前記工程（e）の前に前記固体を除去することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
10．前記物質中の前記生物の推定される量又は濃度に基づいて、前記物質を有する場所で、少なくとも1つの殺生物剤又は殺菌剤で前記物質を処理することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
11．前記物質中の前記生物の推定される量又は濃度に基づいて計算された投入量で適用される少なくとも1つの殺生物剤又は殺菌剤を用いて、前記物質を有し、前記物質を加工するように構成される加工施設で、前記物質を処理することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
12．前記物質がバイオファウリング生物の生存細胞を含み、前記サンプルを得ることが該生存細胞を溶解することを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
13．前記サンプルを希釈して、少なくとも第1のサンプル部分及び第2のサンプル部分を形成することを更に含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応を行うことが、
プライマー対を利用して前記第1のサンプル部分を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、前記物質にバイオバーデンを引き起こすことが知られている少なくとも1つの生物のDNAセグメントを標的とし、増幅することと、
前記プライマー対を利用して前記第2のサンプル部分を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うことと、
前記第1のサンプル部分に対して行われた前記PCRから決定された前記DNAセグメントの増幅による増幅データを、基準又は基準セットと相関させて、前記物質中の前記生物の第1の推定される量又は濃度を決定することと、
前記第2のサンプル部分に対して行われた前記PCRから決定された前記DNAセグメントの増幅による増幅データを、前記基準又は基準セットと相関させて、前記物質中の前記生物の第2の推定される量又は濃度を決定することと、
前記第1の推定される量又は濃度を前記第2の推定される量又は濃度と比較するとともに、その平均の量又は濃度を決定することと、
前記平均の量又は濃度に基づいて計算される投入量で、少なくとも1つの殺生物剤又は殺菌剤を前記物質に適用することと、
を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
14．前記PCRが、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）オリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施され、前記PCRの伸長期に前記プローブからクエンチされていないレポーター色素が放出され、前記方法が、
前記PCRの各熱サイクル中に、前記クエンチされていないレポーター色素を励起する励起波長を前記サンプルに対して照射することと、
前記PCRの各熱サイクル中に蛍光発光の強度を感知することと、
を更に含み、
前記DNAセグメントの増幅率を相関させることが、熱サイクル当たりの検出された蛍光発光の強度の曲線をグラフ化し、定量サイクル（Cq）を決定することと、
既知濃度の前記少なくとも1つの生物を有する既知の基準のCq値に前記決定されたCqを相関させることと、
を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
15．プライマー対が、前記物質にバイオバーデンを引き起こすことが知られている2以上の異なる生物に現れる遺伝子のセグメントを増幅するように設計されたプライマー対を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
16．前記プライマー対が、細菌に由来する1つ以上のDNAセグメントを増幅するように設計されたプライマー対を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
17．プライマー対が、1つ以上の真菌に由来する1つ以上のDNAセグメントを増幅するように設計されたプライマー対を含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
18．（1）前記DNAセグメントの存在を示し、（2）前記PCRから生じる前記DNAセグメントのアンプリコン濃度の増加に伴って強くなるシグナルを生成し、検出することを更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
19．プロットされ、グラフ化され、保存され若しくは作表された結果を含む基準セット、又はそれらの任意の組み合わせを作製することを更に含み、該作製することが、それぞれが既知濃度の既知のバイオファウリング物質を含む既知のサンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施することを含み、それぞれの既知のサンプルに対する前記PCRが、前記プライマー対を使用して、前記少なくとも1つの生物の前記DNAセグメントを増幅し、前記既知のサンプルが異なる濃度の前記少なくとも1つの生物の少なくとも2つの既知のサンプルを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
20．前記増幅データが、増幅率、Cq値、Ct値、又はそれらの組み合わせを含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
21．前記方法が、前記製紙工場、パルプ製造工場、皮革製造若しくは加工工場、発酵施設、石油及びガス回収場若しくは生産施設、水処理場、水冷却塔、又は下水処理場で行われる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
22．前記方法が実施され、前記サンプルの前記取得から3時間以内に結果が得られる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
23．前記方法が任意のDNA抽出工程が存在しない状況で行われる、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
24．前記方法がDNA抽出工程を更に含む、任意の上記又は下記の実施形態／特徴／態様の方法。
【００５７】
本発明は、文及び／又は段落に記載される上記及び／又は下記のこれらの様々な特徴又は実施形態の任意の組み合わせを包含し得る。本明細書に開示される特徴の任意の組み合わせが本発明の一部であるとみなされ、組み合わせることができる特徴に関しては何ら限定を意図しない。
【００５８】
出願人らは、本開示における全ての引用文献の全内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値と好ましい下限値とのリストのいずれかとして与えられる場合、これは範囲が別々に開示されているかに関わらず、任意の範囲上限又は好ましい値と任意の範囲下限又は好ましい値との任意の対からなる全ての範囲を具体的に開示するものと理解される。数値の範囲が本明細書で言及されている場合、特に指定のない限り、範囲はその端点、並びに範囲内の全ての整数及び端数を含むことが意図される。本発明の範囲は、範囲を規定する場合に言及された特定の値に限定されることは意図されない。
【００５９】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考察及び本明細書に開示される本発明の実施から当業者にとって明らかであろう。本明細書及び本実施例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲及びその均等物により示されることが意図される。
【符号の説明】
【００６０】
図面訳
図1A
Sequence (5'->3')  配列（5'→3'）
Notes  注釈
Enterobacter  エンテロバクター
gene dsr  遺伝子dsr
18S fungi primer set  18S真菌プライマーセット
spoA gene  spoA遺伝子
commonly found in spore forming bacteria  芽胞形成細菌に共通して見られる
esp Bacillus sp  特にバチルス種
Bacillus subtitis 16S gene  バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）16S遺伝子
designed using NCBI sequencing database  NCBI配列決定データベースを使用して設計
Bacterial universial 16S  細菌ユニバーサル（universal）16S
literature search  文献検索
SEQ ID NO:  配列番号
図1B
Sequence (5'->3')  配列（5'→3'）
Notes  注釈
Bacterial universial 16S  細菌ユニバーサル16S
literature search  文献検索
16S gene  16S遺伝子
SEQ ID NO:  配列番号
図2
Known bacterial concentrations: standard curve  既知の細菌濃度：検量線
Sample  サンプル
Given Concentration  所与の濃度
Calculated Concentration  計算された濃度
cells  細胞
図3
Standard curve graph  検量線グラフ
Concentration (Copies/μL)  濃度（コピー／μL）
図4
Leather brine samples and wash samples  皮革の塩水サンプル及び洗浄サンプル
Description  概要
Avg Cq Value  平均Cq値
Dilution Factor  希釈係数
Concentration  濃度
Brine Sample  塩水サンプル
Wash  洗浄
【図１Ａ】
2021516985.tif 000002
【図１Ｂ】
2021516985.tif 000003
【図２】
2021516985.tif 000004
【図３】
2021516985.tif 000005
【図４】
2021516985.tif 000006
【配列表】
2021516985000001.app
【国際調査報告】
2021516985.tif 000007
2021516985.tif 000008