(57)【要約】本開示は、特に、細胞産物、例えば、組み換えタンパク質、例えば、糖タンパク質、例えば、抗体薬剤または融合タンパク質を生成するための連続培養方法を提供する。場合によっては、本明細書における方法は、連続培養方法を使用した組み換えタンパク質の大規模生成を可能にする。本開示は、特定の細胞の大規模培養では、不十分な生細胞濃度及び低下した細胞生存率を有する現行の連続細胞培養技術の課題を特定し、それに対処する。本開示は、部分的に、せん断に敏感な細胞の大規模連続培養のための方法及びシステムを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２５Ｌの培養培地及び最大２０ｍ／ｓである気体流出速度を有するバイオリアクターシステムにおいて、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団を培養して、２０×１０６細胞／ｍＬから１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内の前記培養培地中の定常状態生細胞濃度を達成することを含む、方法。
【請求項２】
前記気体流出速度は、１５ｍ／ｓ、１４ｍ／ｓ、１３ｍ／ｓ、１２ｍ／ｓ、１１ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、９ｍ／ｓ、８ｍ／ｓ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記気体流出速度は、少なくとも前記バイオリアクターシステムが定常状態条件に達するまで制御される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記定常状態条件は、５日間の期間にわたり最大２０％変動する生細胞濃度を有することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記気体流出速度は、培養工程全体をとおして制御される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオリアクターシステムは、灌流バイオリアクターシステムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記灌流バイオリアクターシステムにおいて、前記せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団を培養して、前記定常状態生細胞濃度を達成することは、過剰な細胞及び／または非生細胞を排出または除去することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地は、最大１２０ｍｍＨｇ、最大１１５ｍｍＨｇ、最大１１０ｍｍＨｇ、最大１０５ｍｍＨｇ、最大１００ｍｍＨｇ、最大９５ｍｍＨｇ、最大９０ｍｍＨｇ、最大８５ｍｍＨｇ、または最大８０ｍｍＨｇであるレベルの溶存二酸化炭素を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）前記気体流出速度は、１０ｍ／ｓ以下であり、
（ｉｉ）前記培養培地は、最大８０ｍｍＨｇであるレベルの溶存二酸化炭素を有する、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオリアクターシステムは、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、または少なくとも２，０００Ｌの培養培地を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
培養することは、少なくとも１０日間の期間実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
培養することは、３０から６０日間の期間実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は、前記生細胞濃度を測定することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定された生細胞濃度は、少なくとも３０×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも４０×１０６細胞／ｍＬ、または少なくとも５０×１０６細胞／ｍＬである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記せん断に敏感な細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記せん断に敏感な細胞は、ヒト細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記せん断に敏感な細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、線維肉腫ＨＴ１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＡＰ細胞、ＨＫＢ−１１細胞またはＨｕＨ−７細胞である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記せん断に敏感な細胞は、ネズミ科動物細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記せん断に敏感な細胞は、マウス骨髄腫細胞株である、請求項１〜１５及び１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記せん断に敏感な細胞は、ＮＳ０細胞またはＳＰ  ２／０細胞である、請求項１〜１５、１８、及び１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオリアクターシステムは、細胞保持デバイスを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞保持デバイスは、連続式遠心分離機、交互タンジェンシャルフローフィルター（ＡＴＦ）、タンジェンシャルフローメンブランフィルター（ＴＦＦ）、動的フィルター、スピンフィルター、超音波及び誘電泳動セパレーター、及び／または重力沈降器であるか、またはそれらを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞保持デバイスは、１つ以上のＡＴＦであるか、またはそれを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオリアクターシステムは、バイオリアクタータンクを含み、前記バイオリアクタータンクは、少なくとも５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、または２，０００Ｌの容量を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオリアクタータンクは、撹拌タンク型バイオリアクターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記バイオリアクターシステムは、スパージャーを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記スパージャーは、ドリルホールスパージャーまたはオープンパイプスパージャーである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞の集団を前記培養することは、細胞産物を発現する条件下で実施される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞産物は、核酸、脂質、ペプチド、及び／またはタンパク質であるか、またはそれらを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞産物は、組み換えタンパク質である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組み換えタンパク質は、糖タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記糖タンパク質は、Ｆｃ含有糖タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記糖タンパク質は、抗体薬剤である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体薬剤は、モノクローナル抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記モノクローナル抗体は、ウステキヌマブである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法は、前記せん断に敏感な細胞の少なくとも一部から前記細胞産物を単離すること、及び／または前記培養培地の少なくとも一部から前記細胞産物を単離することをさらに含む、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
２０ｍ／ｓの率を上回らないようにバイオリアクターシステムの気体流出速度を制御することを含む、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団を培養するための連続培養プロセスであって、
前記バイオリアクターシステムは、少なくとも２５Ｌの培養培地を含み、前記細胞の集団は、２０×１０６細胞／ｍＬから１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内の定常状態生細胞濃度を達成する、前記プロセス。
【請求項３８】
前記バイオリアクターシステムは、１５ｍ／ｓ、１４ｍ／ｓ、１３ｍ／ｓ、１２ｍ／ｓ、１１ｍ／ｓ、１０ｍ／ｓ、９ｍ／ｓ、８ｍ／ｓ以下である気体流出速度を有する、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項３９】
前記気体流出速度は、少なくとも前記バイオリアクターシステムが定常状態条件に達するまで制御される、請求項３７または３８に記載のプロセス。
【請求項４０】
前記定常状態条件は、５日間の期間にわたり最大２０％変動する生細胞濃度を有することを含む、請求項３９に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記気体流出速度は、前記培養プロセス全体をとおして制御される、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４２】
前記バイオリアクターシステムは、灌流バイオリアクターシステムである、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４３】
前記灌流バイオリアクターシステムにおいて、前記せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団を培養して、前記定常状態生細胞濃度を達成することは、過剰な細胞及び／または非生細胞を排出または除去することを含む、請求項４２に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記細胞培養培地の溶存二酸化炭素レベルを制御することをさらに含む、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記培養培地は、１２０ｍｍＨｇ、１１５ｍｍＨｇ、１１０ｍｍＨｇ、１０５ｍｍＨｇ、１００ｍｍＨｇ、９５ｍｍＨｇ、９０ｍｍＨｇ、８５ｍｍＨｇ、または８０ｍｍＨｇ以下であるレベルの溶存二酸化炭素を有する、請求項４４に記載のプロセス。
【請求項４６】
（ｉ）前記気体流出速度は、１０ｍ／ｓ以下であり、
（ｉｉ）前記溶存二酸化炭素レベルは、８０ｍｍＨｇ以下である、
請求項４４または４５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４７】
前記灌流バイオリアクターシステムは、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、または少なくとも２，０００Ｌの培養培地を含む、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４８】
前記連続培養プロセスは、少なくとも１０日間の期間実施される、請求項３７〜４７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４９】
連続培養プロセスは、３０から６０日間の期間実施される、請求項３７〜４８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５０】
前記プロセスは、前記生細胞濃度を測定することを含む、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５１】
前記測定された生細胞濃度は、少なくとも３０×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも４０×１０６細胞／ｍＬ、または少なくとも５０×１０６細胞／ｍＬである、請求項５０に記載のプロセス。
【請求項５２】
前記せん断に敏感な細胞は、哺乳動物細胞である、請求項３７〜５１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５３】
前記せん断に敏感な細胞は、ヒト細胞である、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５４】
前記せん断に敏感な細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、線維肉腫ＨＴ１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＡＰ細胞、ＨＫＢ−１１細胞またはＨｕＨ−７細胞である、請求項３７〜５３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５５】
前記せん断に敏感な細胞は、ネズミ科動物細胞である、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５６】
前記せん断に敏感な細胞は、マウス骨髄腫細胞株である、請求項３７〜５２及び５５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５７】
前記せん断に敏感な細胞は、ＮＳ０細胞またはＳＰ  ２／０細胞である、請求項３７〜５２、５２、及び５６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５８】
前記バイオリアクターシステムは、細胞保持デバイスを含む、請求項３７〜５７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５９】
前記細胞保持デバイスは、連続式遠心分離機、交互タンジェンシャルフローフィルター（ＡＴＦ）、タンジェンシャルフローメンブランフィルター（ＴＦＦ）、動的フィルター、スピンフィルター、超音波及び誘電泳動セパレーター、または重力沈降器であるか、またはそれらを含む、請求項５８に記載のプロセス。
【請求項６０】
前記細胞保持デバイスは、１つ以上のＡＴＦであるか、またはそれらを含む、請求項５８または５９に記載のプロセス。
【請求項６１】
前記バイオリアクターシステムは、バイオリアクタータンクを含み、前記バイオリアクタータンクは、少なくとも５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、または２，０００Ｌの容量を有する、請求項３７〜６０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６２】
前記バイオリアクタータンクは、撹拌タンク型バイオリアクターである、請求項６１に記載のプロセス。
【請求項６３】
前記バイオリアクターシステムは、スパージャーを含む、請求項３７〜６２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６４】
前記スパージャーは、ドリルホールスパージャーまたはオープンパイプスパージャーである、請求項６３に記載のプロセス。
【請求項６５】
前記細胞の集団を培養するための前記連続培養プロセスは、細胞産物を発現する条件下で実施される、請求項３７〜６４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６６】
前記細胞産物は、核酸、脂質、ペプチド、及び／またはタンパク質であるか、またはそれらを含む、請求項６５に記載のプロセス。
【請求項６７】
前記細胞産物は、組み換えタンパク質である、請求項６６に記載のプロセス。
【請求項６８】
前記組み換えタンパク質は、糖タンパク質である、請求項６７に記載のプロセス。
【請求項６９】
前記糖タンパク質は、Ｆｃ含有糖タンパク質である、請求項６８に記載のプロセス。
【請求項７０】
前記糖タンパク質は、抗体薬剤である、請求項６８または６９に記載のプロセス。
【請求項７１】
前記抗体薬剤は、モノクローナル抗体である、請求項７０に記載のプロセス。
【請求項７２】
前記モノクローナル抗体は、ウステキヌマブである、請求項７１に記載のプロセス。
【請求項７３】
前記プロセスは、前記せん断に敏感な細胞の少なくとも一部から前記細胞産物を単離すること、及び／または前記培養培地の少なくとも一部から前記細胞産物を単離することをさらに含む、請求項６５〜７２のいずれか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月６日に出願された米国仮出願第６２／７２７，９７６号の利益を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
連続細胞培養方法及びシステムがバイオマニュファクチャリングにおいて普及してきている。しかしながら、連続細胞培養方法及びシステムは、多くの注意及び厄介な問題と関連づけられる。したがって、連続細胞培養方法及びシステムを改善する必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、特に、細胞産物、例えば、組み換えタンパク質、例えば、糖タンパク質、例えば、抗体薬剤または融合タンパク質を生成する（例えば、製造する）ための連続培養方法を提供する。場合によっては、本明細書における方法は、連続培養方法（例えば、灌流培養方法）を使用した組み換えタンパク質の大規模生成を可能にする。本開示は、特定の細胞の大規模培養（例えば、少なくとも２５Ｌ、例えば、少なくとも１００Ｌ）では、不十分な生細胞濃度及び低下した細胞生存率を有する現行の連続細胞培養技術（例えば、灌流細胞培養）の課題を特定し、それに対処する。本開示は、部分的に、せん断に敏感な細胞の大規模（例えば、少なくとも２５Ｌ、例えば、少なくとも１００Ｌ）連続培養のための方法及びシステムを提供する。
【０００４】
本開示は、せん断に敏感な細胞の大規模培養が、バイオリアクターシステムの気体流出速度を制御することによって達成することができるという見識を提供する。例えば、最大２０ｍ／ｓであるよう、規定された量及び／または範囲内に制御及び／または維持される気体流出速度を有するバイオリアクターシステム（例えば、灌流バイオリアクターシステム）におけるせん断に敏感な細胞の大規模培養は、約２０×１０６細胞／ｍＬから約１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内のせん断に敏感な細胞の定常状態生細胞濃度をもたらすことができる。
【０００５】
場合によっては、バイオリアクターシステム（例えば、灌流バイオリアクターシステム）においてせん断に敏感な細胞を含むか、またはそれからなる細胞の集団を培養して、定常状態生細胞濃度を達成することを含む、方法であって、定常状態生細胞濃度は、２０×１０６細胞／ｍＬから１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内であり、バイオリアクターシステムは、少なくとも２５Ｌの培養培地及び最大２０ｍ／ｓである気体流出速度を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、約１５ｍ／ｓ以下、１４ｍ／ｓ以下、１３ｍ／ｓ以下、１２ｍ／ｓ以下、１１ｍ／ｓ以下、１０ｍ／ｓ以下、９ｍ／ｓ以下、または８ｍ／ｓ以下の率に制御される気体流出速度を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、スパージャーを含む。いくつかの実施形態では、スパージャーは、約１５ｍ／ｓ以下、１４ｍ／ｓ以下、１３ｍ／ｓ以下、１２ｍ／ｓ以下、１１ｍ／ｓ以下、１０ｍ／ｓ以下、９ｍ／ｓ以下、または８ｍ／ｓ以下の率に制御される気体流出速度を有する。
【０００６】
場合によっては、少なくとも２５Ｌの培養培地を含むバイオリアクターシステム（例えば、灌流バイオリアクターシステム）においてせん断に敏感な細胞を培養することを含む、方法であって、バイオリアクターシステムは、最大２０ｍ／ｓである気体流出速度を有し、せん断に敏感な細胞は、約２０×１０６細胞／ｍＬから約１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内の定常状態生細胞濃度で存在する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステム（例えば、灌流バイオリアクターシステム）は、１５ｍ／ｓ以下、１４ｍ／ｓ以下、１３ｍ／ｓ以下、１２ｍ／ｓ以下、１１ｍ／ｓ以下、１０ｍ／ｓ以下、９ｍ／ｓ以下、または８ｍ／ｓ以下である気体流出速度を有する。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、培養工程全体をとおして制御される。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、少なくともバイオリアクターシステムが定常状態条件に達するまで制御される。
【０００７】
場合によっては、少なくとも２５Ｌ（例えば、少なくとも２００Ｌ）の培養培地及び最大２０ｍ／ｓ（例えば、最大１０ｍ／ｓ）である気体流出速度を有するバイオリアクターシステムにおいてせん断に敏感な細胞からなる細胞の集団を培養して、２０×１０６細胞／ｍＬから１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内の培養培地中の定常状態生細胞濃度を達成する方法が提供される。いくつかの実施形態では、定常状態生細胞濃度は、５日間の期間にわたり最大２０％変動する生細胞濃度である。
【０００８】
場合によっては、２０ｍ／ｓの率を上回らないように、バイオリアクターシステムの気体流出速度を制御することを含む、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団を培養するための連続培養プロセスであって、バイオリアクターシステムは、少なくとも２５Ｌの培養培地を含み、細胞の集団は、２０×１０６細胞／ｍＬから１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内の定常状態生細胞濃度を達成する、プロセスが提供される。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、約１５ｍ／ｓ以下、１４ｍ／ｓ以下、１３ｍ／ｓ以下、１２ｍ／ｓ以下、１１ｍ／ｓ以下、１０ｍ／ｓ以下、９ｍ／ｓ以下、または８ｍ／ｓ以下の率に制御される。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、スパージャーを含む。いくつかの実施形態では、スパージャー気体流出速度は、約１５ｍ／ｓ以下、１４ｍ／ｓ以下、１３ｍ／ｓ以下、１２ｍ／ｓ以下、１１ｍ／ｓ以下、１０ｍ／ｓ以下、９ｍ／ｓ以下、または８ｍ／ｓ以下の率に制御される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、気体流出速度は、せん断に敏感な細胞が培養される少なくとも一部の期間制御される。いくつかの実施形態では、気体流出速度の制御は、細胞の集団（例えば、せん断に敏感な細胞の集団、例えば、接種）がバイオリアクターシステムに添加されるとき（例えば、細胞の集団がバイオリアクターシステムの培養培地と混合されるとき）に開始する。いくつかの実施形態では、気体流出速度の制御は、細胞の集団（例えば、せん断に敏感な細胞の集団、例えば、接種）がバイオリアクターシステムに添加された後（例えば、細胞の集団がバイオリアクターシステムの培養培地と混合されるとき）の約２時間、６時間、１２時間、２４時間、または４８時間後に開始する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、気体流出速度の制御は、培養プロセス中の培養されている細胞が特定の密度に達したときに開始する。いくつかの実施形態では、気体流出速度の制御は、バイオリアクターシステムが、少なくとも１×１０６細胞／ｍＬ、２×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、または１０×１０６細胞／ｍＬであるせん断に敏感な細胞の濃度を有するときに開始する。Ｉ
【００１１】
いくつかの実施形態では、気体流出速度は、少なくともバイオリアクターシステムが定常状態条件に達するまで制御される。いくつかの実施形態では、定常状態条件は、５日間の期間にわたり最大２０％変動する生細胞濃度を有することを含む。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、細胞の集団（例えば、せん断に敏感な細胞の集団、例えば、接種）が、バイオリアクターシステムに添加されるようなとき（例えば、細胞の集団がバイオリアクターシステムの培養培地と混合されるとき）から、培養が（例えば、５日間の期間にわたり最大２０％変動する生細胞濃度を有する）定常状態条件に達するまで制御される。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、バイオリアクターシステムが少なくとも１×１０６細胞／ｍＬであるせん断に敏感な細胞の濃度を有するようなときから、培養が（例えば、５日間の期間にわたり最大２０％変動する生細胞濃度を有する）定常状態条件に達するまで制御される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、気体流出速度は、培養工程全体をとおして制御される。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約５０日間、または少なくとも約６０日間の培養の間制御される。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、細胞の集団（例えば、せん断に敏感な細胞の集団、例えば、接種）がバイオリアクターシステムに添加されるようなとき（例えば、細胞の集団がバイオリアクターシステムの培養培地と混合されるとき）から制御され、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約５０日間、または少なくとも約６０日間の培養の間継続する。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、バイオリアクターシステムが少なくとも１×１０６細胞／ｍＬであるせん断に敏感な細胞の濃度を有するようなときから、培養が（例えば、５日間の期間にわたり最大２０％変動する生細胞濃度を有する）定常状態条件に達するまで制御され、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約５０日間、または少なくとも約６０日間の培養の間継続する。
【００１３】
場合によっては、２０ｍ／ｓの率を上回らないように、灌流バイオリアクターシステムの気体流出速度を制御することを含む、せん断に敏感な細胞を培養するための灌流培養プロセスであって、灌流バイオリアクターシステムは、少なくとも２５Ｌの培養培地を含み、培養培地は、せん断に敏感な細胞を含み、せん断に敏感な細胞は、約２０×１０６細胞／ｍＬから約１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内の定常状態生細胞濃度で存在する、プロセスが提供される。いくつかの実施形態では、灌流バイオリアクターシステムの気体流出速度は、１０ｍ／ｓの率を上回らないよう制御される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞の定常状態生細胞濃度は、上限が下限よりも大きい、下限及び上限によって制限された範囲内の量である。いくつかの実施形態では、下限は、約２０×１０６細胞／ｍＬ、約２５×１０６細胞／ｍＬ、約３０×１０６細胞／ｍＬ、約３５×１０６細胞／ｍＬ、約４０×１０６細胞／ｍＬ、約４５×１０６細胞／ｍＬ、約５０×１０６細胞／ｍＬ、約６０×１０６細胞／ｍＬ、約７０×１０６細胞／ｍＬ、約８０×１０６細胞／ｍＬ、または約９０×１０６細胞／ｍＬであってもよい。いくつかの実施形態では、上限は、約４０×１０６細胞／ｍＬ、約４５×１０６細胞／ｍＬ、約５０×１０６細胞／ｍＬ、約６０×１０６細胞／ｍＬ、約７０×１０６細胞／ｍＬ、約８０×１０６細胞／ｍＬ、約９０×１０６細胞／ｍＬ、約１０×１０７細胞／ｍＬ、約１１×１０７細胞／ｍＬ、約１２×１０７細胞／ｍＬ、約１３×１０７細胞／ｍＬ、約１４×１０７細胞／ｍＬまたは約１５×１０７細胞／ｍＬであってもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、灌流バイオリアクターシステムは、制御されたレベルの溶存二酸化炭素を有する。いくつかの実施形態では、培養培地は、１２０ｍｍＨｇ以下、１１５ｍｍＨｇ以下、１１０ｍｍＨｇ以下、１０５ｍｍＨｇ以下、１００ｍｍＨｇ以下、９５ｍｍＨｇ以下、９０ｍｍＨｇ以下、８５ｍｍＨｇ以下、または８０ｍｍＨｇ以下であるレベルの溶存二酸化炭素を含む。
【００１６】
いくつかの特定の実施形態では、灌流バイオリアクターシステムは、１０ｍ／ｓ以下である気体流出速度を有し、８０ｍｍＨｇ以下であるレベルの溶存二酸化炭素を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、細胞培養システムは、１２０ｍｍＨｇ以下であるレベルの溶存二酸化炭素を有する。いくつかの実施形態では、連続細胞培養システム（例えば、灌流細胞培養システム）は、約２０ｍｍＨｇから約１２０ｍｍＨｇの範囲内のレベルの溶存二酸化炭素を有する。いくつかの実施形態では、溶存二酸化炭素は、上限が下限よりも大きい、下限及び上限によって制限された範囲内の量で連続細胞培養培地中に存在する。いくつかの実施形態では、下限は、約２０ｍｍＨｇ、約３０ｍｍＨｇ、約４０ｍｍＨｇ、約５０ｍｍＨｇ、約６０ｍｍＨｇ、または約７０ｍｍＨｇであってもよい。いくつかの実施形態では、上限は、約５０ｍｍＨｇ、約６０ｍｍＨｇ、約７０ｍｍＨｇ、約８０ｍｍＨｇ、約９０ｍｍＨｇ、約１００ｍｍＨｇ、約１１０ｍｍＨｇ、または約１２０ｍｍＨｇであってもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、灌流バイオリアクターシステムは、少なくとも５０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１，０００Ｌ、または少なくとも２，０００Ｌの培養培地を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞の連続培養は、少なくとも１０日間の期間実施される。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞の連続培養は、約３０から約６０日間の期間実施される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞の連続培養は、１０日間から１８０日間の範囲内の期間実施される。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞の連続培養は、上限が下限よりも大きい、下限及び上限によって制限された範囲内の時間の量の間実施される。いくつかの実施形態では、下限は、約１０日間、約１５日間、約２０日間、約２５日間、約３０日間、約３５日間、約４０日間、約５０日間、または約６０日間であってもよい。いくつかの実施形態では、上限は、約３０日間、約３５日間、約４０日間、約５０日間、約６０日間、約７０日間、約８０日間、約９０日間、約１００日間、約１２０日間、約１４０日間、約１６０日間、または約１８０日間であってもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本開示の連続培養の方法は、生細胞濃度を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、測定された生細胞濃度は、少なくとも３０×１０６細胞／ｍＬ、少なくとも４０×１０６細胞／ｍＬ、または少なくとも５０×１０６細胞／ｍＬである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本開示による培養するためのせん断に敏感な細胞は、哺乳動物細胞である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、ネズミ科動物細胞である。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、マウス細胞株由来である。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞株は、マウス骨髄腫細胞株である。いくつかの特定の実施形態では、せん断に敏感な細胞は、ＮＳ０細胞及びＳＰ  ２／０細胞から選択される。いくつかの特定の実施形態では、本開示による使用するためのせん断に敏感な細胞は、ＳＰ  ２／０細胞である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、せん断に敏感なヒト細胞株は、ＨＥＫ２９３：ヒト胎児由来腎臓２９３；ＨＴ−１０８０：上皮様表現型を有する線維肉腫由来；ＰＥＲ．Ｃ６：アデノウイルスＥ１遺伝子によるトランスフェクションにより不死化されたヒト胚性網膜細胞由来；ＣＡＰ：アデノウイルス５型Ｅ１遺伝子により不死化されたヒト羊膜細胞由来；ＨＫＢ−１１：ＨＥＫ２９３−Ｓ及びヒトＢ細胞株のポリエチレングリコール融合により作製された；ならびにＨｕＨ−７：ヒト肝細胞癌由来から選択される。いくつかの特定の実施形態では、せん断に敏感な細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、線維肉腫ＨＴ１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＡＰ細胞、ＨＫＢ−１１細胞及びＨｕＨ−７細胞から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本開示による使用するためのせん断に敏感な細胞は、細胞産物を含むか、またはそれを発現するよう操作される。いくつかの実施形態では、培養されたせん断に敏感な細胞は、細胞産物を含むか、またはそれを発現する。いくつかの実施形態では、細胞産物は、核酸、脂質、ペプチド、及び／またはタンパク質であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、細胞産物は、組み換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質は、糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、糖タンパク質は、Ｆｃ含有糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、糖タンパク質は、抗体薬剤である。いくつかの実施形態では、抗体薬剤は、モノクローナル抗体である。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ウステキヌマブである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、ヒトまたは動物における治療的または診断的使用のための、例えば、二次承認プロセスにおいて認可された抗体薬剤をコードする核酸を含む。いくつかの特定の実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、ウステキヌマブをコードする核酸を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本開示の方法及び／またはプロセスは、細胞の少なくとも一部から細胞産物を単離すること、及び／または培養培地の少なくとも一部から細胞産物を単離することを含む。いくつかの実施形態では、細胞産物は、組み換えタンパク質、例えば、糖タンパク質、例えば、Ｆｃ含有糖タンパク質、例えば、抗体薬剤、例えば、モノクローナル抗体である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、１ｐｐｍから５００ｐｐｍの範囲内の濃度で消泡剤（例えば、アンチフォームＣ）も含む。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、せん断力保護剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）を含む細胞培養培地において培養される。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞（例えば、せん断に敏感な細胞の集団）は、１ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌの範囲内の濃度でＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含む細胞培養培地において培養される。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞の集団は、消泡剤（例えば、アンチフォームＣ）を１ｐｐｍから５００ｐｐｍの範囲内の濃度で及びせん断力保護剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）を１ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌの範囲内の濃度で含む培養培地において培養される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、灌流バイオリアクターシステムは、バイオリアクタータンクを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタータンクは、撹拌型バイオリアクタータンクである。いくつかの実施形態では、バイオリアクタータンクは、少なくとも５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、８００Ｌ、１，０００Ｌ、または２，０００Ｌの容量を有する。いくつかの特定の実施形態では、バイオリアクタータンクは、約２００Ｌ、約２５０Ｌ以上の容量を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステム（例えば、灌流バイオリアクターシステム）は、細胞保持デバイスを含む。いくつかの実施形態では、細胞保持デバイスは、連続式遠心分離機、交互タンジェンシャルフローフィルター（ＡＴＦ）、タンジェンシャルフローメンブランフィルター（ＴＦＦ）、動的フィルター、スピンフィルター、超音波及び誘電泳動セパレーター、もしくは重力沈降器であるか、またはそれらを含む。いくつかの特定の実施形態では、細胞保持デバイスは、ＡＴＦであるか、またはそれを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、撹拌タンク型バイオリアクター、細胞保持デバイス、培地供給、及び排出廃棄物回収を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステム（例えば、灌流バイオリアクターシステム）は、スパージャーを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、ドリルホールスパージャーを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、オープンパイプスパージャーを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、焼結スパージャーを含む。
【００３３】
場合によっては、せん断に敏感な細胞の大規模（例えば、少なくとも２５Ｌ、例えば、少なくとも１００Ｌ）連続培養の方法であって、組み換えタンパク質コード核酸を含むせん断に敏感な細胞を準備するか、または得ることと、制御された気体流出速度を有するバイオリアクターシステムにおいて、組み換えタンパク質の発現に十分な条件下で細胞を培養することとを含む、方法が提供される  。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、システムが定常状態条件に達するまで最大２０ｍ／ｓ（例えば、約５ｍ／ｓから約１０ｍ／ｓ）の率に制御される気体流出速度を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、培養の間中、最大２０ｍ／ｓ（例えば、約５ｍ／ｓから約１０ｍ／ｓ）の率に制御される気体流出速度を有する。いくつかの実施形態では、定常状態条件における生細胞濃度は、約２０×１０６細胞／ｍＬから約１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内である。いくつかの実施形態では、定常状態条件における生細胞濃度は、少なくとも４０×１０６細胞／ｍＬである。
【００３４】
場合によっては、せん断に敏感な細胞のタンパク質調製物連続培養を生成する方法であって、制御された気体流出速度を有するバイオリアクターシステムにおいてせん断に敏感な細胞を連続培養することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、少なくとも２５Ｌ、少なくとも１００Ｌ、または少なくとも２００Ｌである容量を有するバイオリアクタータンクを含む。いくつかの実施形態では、システムが定常状態条件に達するまで最大２０ｍ／ｓ（例えば、約５ｍ／ｓから約１０ｍ／ｓ）の率に制御される気体流出速度。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、培養の間中、最大２０ｍ／ｓ（例えば、約５ｍ／ｓから約１０ｍ／ｓ）の率に制御される気体流出速度を有する。いくつかの実施形態では、定常状態条件における生細胞濃度は、約２０×１０６細胞／ｍＬから約１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内である。いくつかの実施形態では、定常状態条件における生細胞濃度は、少なくとも４０×１０６細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、タンパク質調製物を生成する方法は、細胞及び／または細胞培地からタンパク質またはタンパク質の混合物を単離することを含む。
【００３５】
本発明のこれら、及びその他の態様が、下記及び特許請求の範囲においてさらに詳細に記載される。
【００３６】
以下の図で構成される、本明細書に含まれる図面は、例示目的に過ぎず、限定するためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】細胞保持デバイスとして例となる交互タンジェンシャルフローを備えた灌流培養システムの例となる概略図を示す。示されるとおり、例となる灌流培養システムは、生成バイオリアクター（例えば、撹拌型バイオリアクタータンク）、細胞保持デバイス（例えば、交互タンジェンシャルフロー）、供給培地供給、及び排出廃棄物を含んでもよい。
【００３８】
【図２】３Ｌから１００Ｌの規模で灌流培養によって培養される例となるせん断に敏感な細胞（例えば、ＳＰ２／０細胞）の生細胞濃度（１０６細胞／ｍＬ単位）を示す。３Ｌ（四角）、５Ｌ（塗りつぶされた三角）、１５Ｌ（菱形）及び１００Ｌ（白抜きの三角）の培養において増殖させられた細胞は、同等の細胞増殖及び定常状態生細胞濃度を示した。
【００３９】
【図３】３Ｌから２００Ｌの規模で灌流培養によって培養された例となるせん断に敏感な細胞（例えば、ＳＰ２／０細胞）の生細胞濃度（１０６細胞／ｍＬ単位）（上のパネル）及び生存率パーセント（下のパネル）を示す。塗りつぶされた円は、１００Ｌの培養プロセスを表し、白抜きの四角は、従来の３Ｌの対照培養データを表し、塗りつぶされた三角及び白抜きの三角は、さらなる３Ｌの培養プロセスを表し、白抜きの菱形は、２００Ｌの培養プロセスを表す。初期の細胞増殖は、すべてのサンプルで観察されたが、２００Ｌの培養システムは、４日目から始まった低下した細胞増殖及び生細胞濃度の低下の両方を示した。
【００４０】
【図４】異なる規模で、変化する気体流出速度を用いた灌流培養によって培養された例となるせん断に敏感な細胞（例えば、ＳＰ２／０細胞）の生細胞濃度（１０６細胞／ｍＬ単位）を示す。塗りつぶされた円は、１００Ｌの培養プロセスを表し、白抜きの四角は、３Ｌの対照培養物を表し、白抜きの菱形は、２００Ｌの培養プロセスを表す。時点（１）で、２００Ｌの培養プロセスの培養培地のうちの２Ｌが、３Ｌの培養に移され、この培養条件は、塗りつぶされた三角によって表される。時点（２）で、２００Ｌの培養の制御気体流出速度が１０ｍ／ｓ以下に低減される。時点（３）で、２００Ｌの培養の制御気体流出速度は、再び少なくとも２０ｍ／ｓのレベルに増加させられる。
【００４１】
【図５】３Ｌの灌流バイオリアクターを用いたいくつかの連続細胞培養実行をさまざまな気体流出速度（ＧＥＶ）で行ったことを示す。上のパネルは、経時的な生細胞濃度（ＶＣＣ）を示し、下のパネルは、経時的な生存率パーセントを示す。ＦＵ２７（菱形）は、対照サンプルを表す。ＦＵ２８（白抜きの四角）は、９日目まで１０ｍ／ｓで、その後、それから１６ｍ／ｓのＧＥＶを表す。ＦＵ２９（白抜きの三角）は、１３ｍ／ｓのＧＥＶを表し、培養が１２日目に急激に低下した。ＦＵ３０（Ｘ’ｓ）は、９日目まで１６ｍ／ｓで、その後、それから１０ｍ／ｓに低下させられたＧＥＶを表す。
【００４２】
【図６】灌流培養システムにおいて異なる溶存ＣＯ２のレベルで培養された例となるせん断に敏感な細胞（例えば、ＳＰ２／０細胞）の生細胞濃度（１０６細胞／ｍＬ単位）（上のパネル）及び生存率パーセント（下のパネル）を示す。
【００４３】
【図７Ａ】ＧＥＶ及び溶存ＣＯ２を制御しながらさまざまな規模でのせん断に敏感な細胞の連続培養性能の比較を示す。図７Ａの上のパネルは、経時的な生細胞濃度（ＶＣＣ）を示し、図７Ａの下のパネルは、経時的な生存率パーセントを示す。
【図７Ｂ】ＧＥＶ及び溶存ＣＯ２を制御しながらさまざまな規模でのせん断に敏感な細胞の連続培養性能の比較を示す。図７Ｂの上のパネルは、経時的な気体流出速度を示し、図７Ｂの下のパネルは、経時的な溶存ＣＯ２を示す。
【００４４】
【図８】（例えば、ＳＵＢ２５０バイオリアクターシステムを使用した）２５０Ｌの培養に対するさまざまなパラメーターについての予測モデルの概要を示す表を示す。
【００４５】
【図９】さまざまな規模でのせん断に敏感な細胞の連続細胞培養に関する合計グリカンレベル（上のパネル）及びシアル酸含有量（下のパネル）を示す。それぞれに関して左端のバーは、３Ｌの培養プロセスを表し、それぞれに関して中央のバーは、１００Ｌの培養プロセスを表し、右端のバーは、２５０Ｌの培養プロセスを表す。
【００４６】
【図１０】実証された２５０Ｌの（三角によって表される）及び１００Ｌの（円によって表される）培養プロセスと比較した、せん断に敏感な細胞の１０００Ｌの連続培養に対して予測される溶存ＣＯ２（上のパネル）及び気体流出速度（下のパネル）（黒い実線）を示す。
【００４７】
【図１１】（例えば、ＳＵＢ１０００バイオリアクターシステムを使用した）１０００Ｌの培養に対するさまざまなパラメーターについての予測モデルの概要を示す表を示す。
【００４８】
【図１２】気体流出速度を求めるための例となる方程式を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
特定の定義
一般に、本明細書中で使用される専門用語は、明確に別のことが示されていない限り、当該技術分野において理解される意味と一致する。特定の用語の明確な定義を下に示す。これら及びその他の用語の意味は、特定の場合、本明細書全体をとおして文脈から当業者には明らかであろう。
【００５０】
本明細書中で引用される参考文献、またはその関連部分は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５１】
本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を、まず下に定義する。以下の用語及びその他の用語に関するさらなる定義は、明細書全体をとおして記載される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、対象の１つ以上の値に適用される、「約」または「およそ」という用語は、記述される基準値と類似する値を指す。特定の実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、記述される基準値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の範囲内にある値の範囲を指す。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、当該技術分野で理解される意味を有し、特定の抗原と特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）を指す。当業者には既知であるとおり、自然界で産生される抗体は、一般に、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖である４つのポリペプチド鎖から構成される。各重鎖及び軽鎖は、可変領域（本明細書中では、それぞれＨＣＶＲまたはＶＨ及びＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）及び定常領域から構成される。重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（ならびに任意に、ＩｇＭ及びＩｇＥの場合、ＣＨ４ドメイン）を含む。軽鎖の定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が間に挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域をさらに含む。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「抗体薬剤」という用語は、特定の抗原と特異的に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリン構造的要素を有する任意のポリペプチドを包含する。さまざまな実施形態において、適した抗体薬剤としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性抗体、単一ドメイン抗体（例えば、サメ単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはそのフラグメント））、結合抗体（すなわち、その他のタンパク質、放射標識、細胞毒素などと結合または融合した抗体）、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、単鎖抗体、ラクダ科抗体、抗体フラグメントなどを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この用語は、ステープルペプチドを指すことがある。いくつかの実施形態では、この用語は、抗体様結合ペプチドミメティクスを指すことがある。いくつかの実施形態では、この用語は、抗体様結合足場タンパク質を指すことがある。いくつかの実施形態では、この用語は、モノボディまたはアドネクチンを指すことがある。多くの実施形態では、抗体薬剤は、アミノ酸配列が、当業者によって相補性決定領域（ＣＤＲ）と認識される１つ以上の構造的要素を含む、ポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗体薬剤は、アミノ酸配列が、参照抗体で見られるものと実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含む、ポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、この場合、それは、配列が同一であるか、または参照ＣＤＲと比較した場合に１から５個の間のアミノ酸置換を含むかのいずれかである。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、この場合、それは、参照ＣＤＲと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、この場合、それは、参照ＣＤＲと少なくとも９６％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、この場合、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較した場合に欠失、付加、または置換されているが、含まれるＣＤＲが、その他の点では参照ＣＤＲのものと同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、この場合、含まれるＣＤＲ内の１から５個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較した場合に欠失、付加、または置換されているが、含まれるＣＤＲが、その他の点では参照ＣＤＲと同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと実質��に同一であり、この場合、含まれるＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較した場合に置換されているが、含まれるＣＤＲが、その他の点では参照ＣＤＲのものと同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、含まれるＣＤＲは、参照ＣＤＲと実質的に同一であり、この場合、含まれるＣＤＲ内の１から５個のアミノ酸が、参照ＣＤＲと比較した場合に欠失、付加、または置換されているが、含まれるＣＤＲが、その他の点では参照ＣＤＲと同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体薬剤は、アミノ酸配列が、当業者によって免疫グロブリン可変ドメインと認識される構造的要素を含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗体薬剤は、免疫グロブリン結合ドメインと一致するか、または大部分が一致する、結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体薬剤は、特定の参照抗体鎖または複数の鎖（例えば、重鎖及び／または軽鎖）に見られるすべてのＣＤＲを含むポリペプチドであるか、またはそれを含む。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「生物製剤」、「生物学的治療」及び「生物製剤製品」という用語は同義に使用され、ポリペプチド及びタンパク質製品を指す。例えば、本明細書において生物製剤は、例えば、タンパク質、糖タンパク質、融合タンパク質、増殖因子、ワクチン、血液因子、血栓溶解剤、ホルモン、インターフェロン、インターロイキンベースの製品、抗体薬剤、（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体など）、及び治療用酵素などの細胞において発現される天然由来または組み換え生成物を含む。一部の生物製剤は、公衆衛生（ＰＨＳ）法の第３５１（ａ）条のもとで、「生物製剤認可申請」または「ＢＬＡ」に基づいて認可されるが、参照製品としてＢＬＡを参照するバイオ後続品及び代替可能な生物製剤は、ＰＨＳ法第３５１（ｋ）条のもとで認可される。ＰＨＳ法第３５１条は、４２  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  ２６２として成文化されている。他の生物製剤は、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ａｃｔの第５０５（ｂ）（１）条のもとで、またはＨａｔｃｈ  Ｗａｘｍａｎ  Ａｃｔの第５０５（ｂ）（２）及び５０５（ｊ）条に基づく簡略申請として認可される場合もあり、第５０５条は２１  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  ３５５として成文化されている。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「気体流出速度」は、バイオリアクターシステムの気体供給源、例えば、培養培地に通気する（例えば、空気及び／または酸素を供給する）ための気体供給源からの気体流出の率を指す。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、気体が１つ以上の気体供給源開口部（複数可）（例えば、穴）から流出し、培養培地に入る率を指す。いくつかの実施形態では、気体流出速度は、図１２に示される方程式を使用して算出される。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、スパージャーを含み、気体流出速度は、１つ以上のスパージャー開口部（複数可）（例えば、穴）からの気体流出の率を指す。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、スパージャーを含み、気体流出速度は、上記スパージャーの開口部からの気体流出の率の平均を指す。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「糖タンパク質」は、アミノ酸配列に共有結合した１つ以上のオリゴ糖鎖（例えば、グリカン）を含むアミノ酸配列を指す。例となるアミノ酸配列としては、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質が挙げられる。例となる糖タンパク質としては、グリコシル化抗体、抗体薬剤、及び抗体様分子（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）が挙げられる。例となる抗体としては、モノクローナル抗体及び／またはそのフラグメント、ポリクローナル抗体及び／またはそのフラグメント、ならびにＦｃドメイン含有融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ領域、またはそのグリコシル化部分を含む融合タンパク質）が挙げられる。
【００５８】
「単離された」という用語は、本明細書中で使用される場合、（１）（自然界において及び／または実験環境においてにかかわらず）最初に生成されたときに関連した成分の少なくとも一部から分離され、及び／または（２）人手によって設計、生成、調製、及び／または製造された物質及び／または要素を指す。単離される物質及び／または要素は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超の最初に関連したその他の成分から分離されてもよい。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書中で使用される場合、物質が実質的に他の成分を含まない場合、それは「純粋」である。いくつかの実施形態では、当業者によって理解されるであろうとおり、物質は、例えば、１つ以上の担体または賦形剤（例えば、バッファー、溶媒、水など）などの特定のその他の成分と混合された後でも依然として、「単離された」またはさらには「純粋」とさえ見なされる場合もある。そのような実施形態において、物質の単離パーセントまたは純度は、そのような担体または賦形剤を含まずに算出される。一例に過ぎないが、いくつかの実施形態では、天然に生じるポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生体高分子は、ａ）その起源または由来元が自然界における天然の状態においてそれを伴う成分の一部またはすべてと関連しないため；ｂ）それが、自然界でそれを産生する種からの同じ種のその他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない；ｃ）自然界でそれを産生する種ではない細胞または他の発現系によって発現されるか、または別の方法でそれからの成分と関連する場合に「単離された」と見なされる。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、化学合成されたか、またはそれを自然界で産生するものとは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドであると見なされる。あるいは、またはさらに、いくつかの実施形態では、１つ以上の精製技術に供されたポリペプチドは、ａ）それが自然界で関連する；及び／またはｂ）それが最初に生成されたときに関連したその他の成分から分離された程度において「単離された」ポリペプチドであると見なされる場合もある。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「回収すること」とは、例えば、当該技術分野において知られている精製技術を使用した、例えば、単離によって薬剤または要素が他の予め関連する成分を実質的に含まない状態にするプロセスを指す。いくつかの実施形態では、薬剤または要素は、天然の供給源及び／または細胞を含む供給源から回収される。
【００６０】
一般に、「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、ポリペプチドである（すなわち、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸の鎖）。タンパク質は、アミノ酸以外の部分（例えば、糖タンパク質であってもよい）を含んでもよく、かつ／または別の方法で処理もしくは修飾されてもよい。当業者は、「タンパク質」が、（シグナル配列を有する、または有さない）細胞によって産生される完全なポリペプチド鎖であってもよく、またはその機能タンパク質であってもよいことを理解するであろう。当業者は、タンパク質が、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって連結されるか、または他の手段によって関連づけられる２つ以上のポリペプチド鎖を含み得る場合があることをさらに理解する。
【００６１】
「タンパク質調製物」という用語は、本明細書中で使用される場合、特定の生成方法に従って得られたタンパク質の混合物を指す。タンパク質調製物中のタンパク質は、同じであっても、または異なっていてもよく、すなわち、タンパク質調製物は、同じタンパク質の複数のコピー及び／または異なるタンパク質の混合物を含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質調製物は、糖タンパク質調製物を含む。糖タンパク質調製物は、少なくとも１つの糖タンパク質を含む組成物または混合物である。場合によっては、糖タンパク質調製物は、同じタンパク質（すなわち、同じアミノ酸配列を有する）の複数のコピーを含むが、タンパク質と関連するグリカンの混合物を有する。場合によっては、糖タンパク質調製物は、本明細書において提供される方法及び／またはシステムを使用して調製される。生成方法は、タンパク質調製物中のタンパク質を発現するように（または適切なレベルもしくは適切な条件下でタンパク質を発現するように）操作された培養細胞を使用した組み換え調製工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、生成方法は、タンパク質が、操作された細胞の特定の成分から（例えば、細胞を溶解させ、遠心分離によりタンパク質成分をペレットにすることによって）単離される単離工程を含んでもよい。いくつかの実施形態では、生成方法はまた、タンパク質調製物中のタンパク質が、その他の細胞の成分、例えば、その他のタンパク質または前の工程で使用された有機成分から（例えば、クロマトグラフィーによって）分離される精製工程を含んでもよい。これらの工程は非限定的であり、任意の数の追加の生成工程が含まれてもよいことが理解されるであろう。異なるタンパク質調製物は、同じ生成方法によってであるが、異なる機会（例えば、異なる実行または調製）で調製されてもよい。あるいは、異なるタンパク質調製物は、異なる生成方法によって調製されてもよい。２つの生成方法はどのように異なってもよい（例えば、発現ベクター、操作された細胞タイプ、培養条件、単離手順、精製条件など）。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「サンプル（複数可）」は、別個に得られたサンプルを指す。いくつかの実施形態では、分離されたサンプルの評価は、同じ培養実行（例えば、調製中の異なる時点における）から、または異なる培養実行（例えば、培養の異なる循環）からのサンプルの評価を含む。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「スパージング」または「気体スパージング」は、細胞培養培地への気体（例えば、空気及び／またはＯ２）の通気または添加を指す。一般に、気体スパージングとは、気体を直接培養培地に（例えば、スパージャーによって）バブリングするプロセスを指す。いくつかの実施形態では、スパージングは、少なくとも約２０％、または約２０％から約１００％の間の溶存Ｏ２濃度を達成するよう使用される。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「定常状態」または「定常状態条件」とは、細胞培養システムまたはプロセスに対する言及に使用される場合、細胞培養が、少なくとも５日間（例えば、５日間から約６０日間）の期間にわたり最大２０％変動する生細胞濃度を有することを意味する。いくつかの実施形態では、細胞培養システムは、５日間の期間にわたり最大２０％変動する生細胞濃度を有する。いくつかの実施形態では、細胞培養システムは、少なくとも５日間（例えば、５日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間）の期間にわたり最大１５％、最大１０％、または最大５％変動する生細胞濃度を有する。いくつかの実施形態では、細胞培養システムは、５日間の期間にわたり最大１５％、最大１０％、または最大５％変動する生細胞濃度を有する。いくつかの実施形態では、細胞培養システムは、少なくとも５日間（例えば、５日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間）の期間にわたり最大１０％（すなわち、プラスまたはマイナス１０％の範囲内で）変動するせん断に敏感な細胞の生細胞濃度を有する。いくつかの実施形態では、細胞培養システムは、５日間の期間にわたり最大１０％（すなわち、プラスまたはマイナス１０％の範囲内で）変動するせん断に敏感な細胞の生細胞濃度を有する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムからの排出（例えば、過剰な細胞の除去）により、定常状態生細胞濃度が達成及び／または維持される。
【００６５】
特許、特許出願、論文、書籍、専門書、及びウェブページが含まれるが、それらに限定されない、本出願中で引用されるすべての文献及び類似の資料は、そのような文献及び類似の資料の形式にかかわらず、その全体が明確に参照により組み込まれる。定義された用語、用語の使用法、記載される技術などを含むが、これらに限定されない、組み込まれる文献及び類似の資料の１つ以上が本出願と異なるか、または矛盾する場合、本出願が優先される。本明細書中で使用する節の見出しは編成を目的としたものに過ぎず、記載される主題をいかようにも限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６６】
本開示は、部分的に、大きな培養体積（例えば、少なくとも１００Ｌ、例えば、少なくとも２００Ｌ）では、特定の細胞は、不十分な生細胞濃度及び低下した細胞生存率を有するという現行の連続細胞培養技術（例えば、灌流細胞培養）の課題を特定し、それに対処する。本開示は、高細胞密度連続細胞培養プロセスのスケールアップが、酸素供給及び溶存二酸化炭素（ｐＣＯ２）除去に対する高い要求のため困難な場合があるという認識を包含する。本開示は、大規模連続細胞培養に関連する多くの異なる可変物を分析した。
【００６７】
本開示は、バイオリアクター体積及び細胞濃度に伴い通気の重要性が増すという認識を包含する。特に、本開示は、バイオリアクターシステムの気体流出速度を制御することが、（例えば、せん断に敏感な細胞などの）特定の細胞の大規模連続培養の性能を改善することが可能であるという見識を提供する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示は、せん断に敏感な細胞の大規模（例えば、少なくとも１００Ｌ、例えば、少なくとも２００Ｌ）連続培養（例えば、灌流培養）のための方法及びプロセスであって、バイオリアクターシステムの気体流出速度は、規定された量及び／または範囲内に制御及び／または維持される、方法及びプロセスを提供する。例えば、最大２０ｍ／ｓ（例えば、最大１０ｍ／ｓ）である気体流出速度を有するバイオリアクターシステム（例えば、灌流バイオリアクターシステム）におけるせん断に敏感な細胞の大規模培養の方法が提供される。提供される方法は、（例えば、２０×１０６細胞／ｍＬから１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内の定常状態生細胞濃度を有する）高密度細胞培養の形成を可能にする。
【００６９】
連続培養方法及びプロセス
本開示は、部分的に、せん断に敏感な細胞（例えば、せん断に敏感な細胞を含む細胞の集団、例えば、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団）の大規模（例えば、少なくとも２５Ｌ、例えば、少なくとも１００Ｌ、例えば、少なくとも２００Ｌ）連続培養（例えば、灌流細胞培養）のための方法、プロセス、及び／またはシステムを提供する。いくつかの実施形態では、大規模培養は、２５Ｌから３，０００Ｌである。いくつかの実施形態では、大規模培養は、２５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、８００Ｌ、１０００Ｌ、１２００Ｌ、１５００Ｌ、２０００Ｌ、３０００Ｌ以上である。いくつかの実施形態では、大規模培養は、１００Ｌ以上である。いくつかの特定の実施形態では、大規模培養は、２００Ｌ以上である。いくつかの特定の実施形態では、大規模培養は、２５０Ｌ以上である。
【００７０】
場合によっては、連続細胞培養システム（例えば、灌流細胞培養システム）は、高密度のせん断に敏感な細胞（例えば、少なくとも２０×１０６細胞／ｍＬ、例えば、少なくとも３０×１０６細胞／ｍＬ、例えば、少なくとも４０×１０６細胞／ｍＬである定常状態生細胞濃度）を生成することができる大規模培養（例えば、２００Ｌ以上）である。
【００７１】
場合によっては、連続細胞培養システムの方法、プロセス及び／またはシステムは、約２０×１０６細胞／ｍＬから約１５×１０７細胞／ｍＬの範囲内であるせん断に敏感な細胞の定常状態生細胞濃度を有する、かつ／または達成する。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞の定常状態生細胞濃度は、上限が下限よりも大きい、下限及び上限によって制限された範囲内の量である。いくつかの実施形態では、下限は、約２０×１０６細胞／ｍＬ、約２５×１０６細胞／ｍＬ、約３０×１０６細胞／ｍＬ、約３５×１０６細胞／ｍＬ、約４０×１０６細胞／ｍＬ、約４５×１０６細胞／ｍＬ、約５０×１０６細胞／ｍＬ、約６０×１０６細胞／ｍＬ、約７０×１０６細胞／ｍＬ、約８０×１０６細胞／ｍＬ、または約９０×１０６細胞／ｍＬであってもよい。いくつかの実施形態では、上限は、約４０×１０６細胞／ｍＬ、約４５×１０６細胞／ｍＬ、約５０×１０６細胞／ｍＬ、約６０×１０６細胞／ｍＬ、約７０×１０６細胞／ｍＬ、約８０×１０６細胞／ｍＬ、約９０×１０６細胞／ｍＬ、約１０×１０７細胞／ｍＬ、約１１×１０７細胞／ｍＬ、約１２×１０７細胞／ｍＬ、約１３×１０７細胞／ｍＬ、約１４×１０７細胞／ｍＬまたは約１５×１０７細胞／ｍＬであってもよい。
【００７２】
一般に、本開示の細胞培養方法は、２５℃から４０℃の範囲内の温度で、それが地球上で遭遇する重力で培養することを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、連続細胞培養システム（例えば、灌流細胞培養システム）は、約１ｍ／ｓから約２０ｍ／ｓの範囲内である気体流出速度を有する。いくつかの実施形態では、連続細胞培養システム（例えば、灌流細胞培養システム）は、約１ｍ／ｓから約１０ｍ／ｓの範囲内である気体流出速度を有する。いくつかの実施形態では、連続細胞培養システム（例えば、灌流細胞培養システム）は、２０ｍ／ｓを上回らない気体流出速度を有する。いくつかの実施形態では、連続細胞培養システム（例えば、灌流細胞培養システム）は、１０ｍ／ｓを上回らない気体流出速度を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、連続細胞培養システム（例えば、灌流細胞培養システム）は、上限が下限よりも大きい、下限及び上限によって制限された範囲内の率の気体流出速度を有する。いくつかの実施形態では、下限は、約１ｍ／ｓ、約２ｍ／ｓ、約３ｍ／ｓ、約４ｍ／ｓ、約５ｍ／ｓ、約６ｍ／ｓ、約７ｍ／ｓ、約８ｍ／ｓ、約９ｍ／ｓまたは約１０ｍ／ｓであってもよい。いくつかの実施形態では、上限は、約５ｍ／ｓ、約６ｍ／ｓ、約７ｍ／ｓ、約８ｍ／ｓ、約９ｍ／ｓ、約１０ｍ／ｓ、約１１ｍ／ｓ、約１２ｍ／ｓ、約１３ｍ／ｓ、約１４ｍ／ｓ、約１５ｍ／ｓ、約１６ｍ／ｓ、約１８ｍ／ｓ、または約２０ｍ／ｓであってもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、連続細胞培養システム（例えば、灌流細胞培養システム）は、１２０ｍｍＨｇを上回らないレベルの溶存二酸化炭素を有する。いくつかの実施形態では、連続細胞培養システム（例えば、灌流細胞培養システム）は、約２０ｍｍＨｇから約１２０ｍｍＨｇの範囲内のレベルの溶存二酸化炭素を有する。いくつかの実施形態では、溶存二酸化炭素は、上限が下限よりも大きい、下限及び上限によって制限された範囲内の量で連続細胞培養培地中に存在する。いくつかの実施形態では、下限は、約２０ｍｍＨｇ、約３０ｍｍＨｇ、約４０ｍｍＨｇ、約５０ｍｍＨｇ、約６０ｍｍＨｇ、または約７０ｍｍＨｇであってもよい。いくつかの実施形態では、上限は、約５０ｍｍＨｇ、約６０ｍｍＨｇ、約７０ｍｍＨｇ、約８０ｍｍＨｇ、約９０ｍｍＨｇ、約１００ｍｍＨｇ、約１１０ｍｍＨｇ、または約１２０ｍｍＨｇであってもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞（例えば、せん断に敏感な細胞を含む細胞の集団、例えば、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団）の連続培養は、約１０日間から約１８０日間の範囲内の期間実施される。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞（例えば、せん断に敏感な細胞を含む細胞の集団、例えば、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団）の連続培養は、上限が下限よりも大きい、下限及び上限によって制限された範囲内の時間の量の間実施される。いくつかの実施形態では、下限は、約１０日間、約１５日間、約２０日間、約２５日間、約３０日間、約３５日間、約４０日間、約５０日間、または約６０日間であってもよい。いくつかの実施形態では、上限は、約３０日間、約３５日間、約４０日間、約５０日間、約６０日間、約７０日間、約８０日間、約９０日間、約１００日間、約１２０日間、約１４０日間、約１６０日間、または約１８０日間であってもよい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞（例えば、せん断に敏感な細胞を含む細胞の集団、例えば、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団）の連続培養は、少なくとも１０日間の期間実施される。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞（例えば、せん断に敏感な細胞を含む細胞の集団、例えば、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団）の連続培養は、約３０日間から約６０日間の期間実施される。
【００７８】
バイオリアクターシステム
本開示は、大規模連続細胞培養のため、例えば、せん断に敏感な細胞（例えば、せん断に敏感な細胞を含む細胞の集団、例えば、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団）を培養するためのバイオリアクターシステムを提供する。本開示のバイオリアクターシステムは、連続培養方法に適している。いくつかの実施形態では、本開示のバイオリアクターシステムは、灌流培養に適している。本開示の培養方法に適したバイオリアクターシステムの例となる概略図を図１に示す。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、バイオリアクタータンク及び細胞保持デバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、バイオリアクタータンク、細胞保持デバイス、培地供給、及び排出廃棄物回収を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、細胞の集団（例えば、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団、例えば、接種）及び細胞培養培地をさらに含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、撹拌タンク型バイオリアクターを含む。いくつかの実施形態では、（例えば、撹拌タンク型バイオリアクターの）バイオリアクタータンクは、２５Ｌから３，０００Ｌの範囲内の容量を有する。いくつかの実施形態では、（例えば、撹拌タンク型バイオリアクターの）バイオリアクタータンクは、少なくとも２５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、３００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、６００Ｌ、８００Ｌ、１０００Ｌ、１２００Ｌ、１４００Ｌ、１５００Ｌ、１６００Ｌ、１８００Ｌ、２０００Ｌ、２４００Ｌ、２５００Ｌ、２６００Ｌ、２８００Ｌ、または３０００Ｌの容量を有する。いくつかの実施形態では、撹拌タンク型バイオリアクターは、少なくとも１００Ｌである容量を有する。いくつかの実施形態では、撹拌タンク型バイオリアクターは、少なくとも２００Ｌである容量を有する。いくつかの実施形態では、撹拌タンク型バイオリアクターは、少なくとも２５０Ｌである容量を有する。いくつかの実施形態では、撹拌タンク型バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌである容量を有する。いくつかの実施形態では、撹拌タンク型バイオリアクターは、少なくとも１０００Ｌである容量を有する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、スパージャーを含む。一般に、スパージャーは、空気及び／または酸素を細胞培養培地に導入するために使用することができる。本開示は、スパージャーの選択が、通気の率及び程度ならびに発泡を最小限にすることにも影響を与える可能性があるという認識を包含する。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、オープンパイプスパージャー及び／またはまたはドリルホールスパージャーを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、ドリルホールスパージャーを含む。いくつかの実施形態では、ドリルホールスパージャーは、０．０５ｍｍから５．０ｍｍの範囲内のサイズである穴を有する。いくつかの実施形態では、ドリルホールスパージャーは、０．１ｍｍから１．０ｍｍの穴を有する。いくつかの実施形態では、ドリルホールスパージャーは、上限が下限よりも大きい、下限及び上限によって制限された範囲内のサイズである穴を有する。いくつかの実施形態では、下限は、約０．０５ｍｍ、約０．０６ｍｍ、約０．０７ｍｍ、約０．０８ｍｍ、約０．０９ｍｍ、約０．１ｍｍ、約０．２ｍｍ、約０．３ｍｍ、約０．４ｍｍ、約０．５ｍｍ、約０．６ｍｍ、約０．７ｍｍ、約０．８ｍｍ、約０．９ｍｍ、または約１．０ｍｍであってもよい。いくつかの実施形態では、上限は、約０．２ｍｍ、約０．３ｍｍ、約０．４ｍｍ、約０．５ｍｍ、約０．６ｍｍ、約０．７ｍｍ、約０．８ｍｍ、約０．９ｍｍ、約１．０ｍｍ、約１．２５ｍｍ、約１．５ｍｍ、約１．７５ｍｍ、約２．０ｍｍ、約２．２５ｍｍ、約２．５ｍｍ、約２．７５ｍｍ、約３．０ｍｍ、約３．５ｍｍ、約４．０ｍｍ、約４．５ｍｍ、または約５．０ｍｍであってもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、焼結スパージャーを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、バイオリアクタータンクの底に配置されたスパージャーを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、バイオリアクタータンク内のほぼ中心に配置されたスパージャーを含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、細胞保持デバイスを含む。本開示のバイオリアクターシステムに使用するのに適した細胞保持デバイスは、連続式遠心分離機、交互タンジェンシャルフローフィルター（ＡＴＦ）、タンジェンシャルフローメンブランフィルター（ＴＦＦ）、動的フィルター、スピンフィルター、超音波及び誘電泳動セパレーター、ならびに重力沈降器を含む。いくつかの実施形態では、本開示のバイオリアクターシステムは、細胞交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）デバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、１つ以上のＡＴＦを備えた細胞保持デバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、２つのＡＴＦを備えた細胞保持デバイスを含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、３つ以上のＡＴＦを備えた細胞保持デバイスを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターシステムは、インペラーデバイスを含む。いくつかの実施形態では、インペラーは、バイオリアクタータンク内に取り付けられた底部である。いくつかの実施形態では、インペラーは、バイオリアクタータンク内のほぼ中心に配置される。いくつかの実施形態では、インペラーデバイスは、磁気的に駆動される。バイオリアクターシステムは、約５Ｗ／ｍ３から約５００Ｗ／ｍ３の体積電力入力Ｐ／Ｖを発揮するインペラー撹拌率を有する。
【００８５】
せん断に敏感な細胞
場合によっては、本開示の培養の方法、プロセス及びシステムは、せん断に敏感な細胞の連続培養のためのものである。本開示は、細胞壁のない動物細胞が、撹拌タンク型バイオリアクターにおける培養の流体による機械的応力、例えば、細胞に酸素を供給するために撹拌タンク中の培養培地内で生じるインペラーによるならびに気泡の発生及び破裂のよる撹拌などに敏感であるという認識を包含する。過剰な場合、これらの流体による機械的応力は、動物細胞の損傷／死滅をもたらすことがある。さらに、本開示は、特定の動物細胞が他のものよりも機械的応力によるせん断に敏感であるという認識を包含する。例えば、マウス骨髄腫細胞は、特定のＣＨＯ細胞株よりもせん断に敏感であることがある。本開示は、せん断に敏感な細胞の大規模高密度培養に適した方法、プロセス及びシステムを提供する。
【００８６】
特定の細胞、例えば、動物細胞は、培養中の特定の機械的及び／または通気条件に対して敏感であることが当該技術分野において知られている（例えば、Ｇｏｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ４：１９３−１９６  （１９９３）を参照）。本明細書中で使用される場合、せん断に敏感な細胞は、従来の培養条件（例えば、従来の大規模培養条件）下においてせん断に対するあるレベルの敏感さを示す（例えば、低下した細胞生存率を示す）任意の動物細胞である。本明細書において述べられているとおり、特定の例において、そのようなせん断に敏感な細胞が、本明細書に記載されている条件下において培養される場合、そのような細胞は、増加したレベルの生存率を示す。
【００８７】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、ネズミ科動物細胞である。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、マウス細胞株由来である。せん断に敏感なネズミ科動物（例えば、マウス）細胞株としては、例えば、マウス骨髄腫細胞株が挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、せん断に敏感な細胞は、ＮＳ０細胞及びＳＰ  ２／０細胞から選択される。
【００８８】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、ヒト細胞である。せん断に敏感なヒト細胞株としては、例えば、ＨＥＫ２９３：ヒト胎児由来腎臓２９３；ＨＴ−１０８０：上皮様表現型を有する線維肉腫由来；ＰＥＲ．Ｃ６：アデノウイルスＥ１遺伝子によるトランスフェクションにより不死化されたヒト胚性網膜細胞由来；ＣＡＰ：アデノウイルス５型Ｅ１遺伝子により不死化されたヒト羊膜細胞由来；ＨＫＢ−１１：ＨＥＫ２９３−Ｓ及びヒトＢ細胞株のポリエチレングリコール融合により作製された；ならびにＨｕＨ−７：ヒト肝細胞癌由来が挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、せん断に敏感な細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、線維肉腫ＨＴ１０８０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＡＰ細胞、ＨＫＢ−１１細胞及びＨｕＨ−７細胞から選択される。
【００８９】
いくつかの特定の実施形態では、本開示による使用するためのせん断に敏感な細胞は、ＳＰ  ２／０細胞である。いくつかの実施形態では、本開示による使用するためのせん断に敏感な細胞は、細胞産物を含むか、またはそれを発現するよう操作される。
【００９０】
本開示によると、当該技術分野の技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡ技術が利用されてもよい。そのような技術は文献に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  （Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ  ｅｄ．  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８５））；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｄｓ．  （１９８４））；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  ｅｄ．  （１９８６））；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６））；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  （１９９４）を参照）。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている細胞産物を発現するせん断に敏感な細胞は、組み換え法を使用して作製される。本明細書に記載されている抗体薬剤などのポリペプチドをコードする遺伝子などの遺伝子の組み換え発現は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を含んでもよい。ポリヌクレオチドが入手されたら、ポリペプチドの作製のためのベクターは、当該技術分野において知られている技術を使用した組み換えＤＮＡ技術によって作製することができる。ポリペプチドコード配列ならびに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために既知の方法を使用することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組み換えが挙げられる。
【００９２】
発現ベクターは、従来の技術によってせん断に敏感な細胞に導入されてもよく、トランスフェクション細胞は、その後、本明細書に記載されている方法によって培養されて、細胞産物（例えば、タンパク質調製物、例えば、組み換えタンパク質、例えば、糖タンパク質、例えば、融合タンパク質、例えば、抗体薬剤）を産生することができる。
【００９３】
細胞培養培地
本開示は、細胞産物の発現に十分な培養培地における（例えば、せん断に敏感な細胞、例えば、せん断に敏感な細胞を含む細胞の集団、例えば、せん断に敏感な細胞からなる細胞の集団の）連続細胞培養のための方法、プロセス、及びシステムを提供する。細胞培養培地は、一般に適切なエネルギー源及び細胞周期を調節する化合物を含む。一般に、培養培地は、例えば、当業者に既知のアミノ酸、ビタミン、無機塩、及びグルコースを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、６から８のｐＨを有する。動物細胞培養用の培地は、当該技術分野において十分に確立されており、特定の目的及び／または細胞種のために当業者によって慣行的に最適化される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、１ｐｐｍから５００ｐｐｍの範囲内の消泡剤（例えば、アンチフォームＣ）も含む。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、せん断力保護剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）を含む細胞培養培地において培養される。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、１ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌの範囲内の濃度でＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含む細胞培養培地において培養される。いくつかの特定の実施形態では、せん断に敏感な細胞の集団は、血清（例えば、ウシ胎仔血清）を含む細胞培養培地において培養されてもよい。
【００９５】
細胞産物
場合によっては、せん断に敏感な細胞またはせん断に敏感な細胞からなる細胞の集団は、本開示の方法、プロセス、及び／またはを使用して連続培養され、細胞産物を発現する。いくつかの実施形態では、細胞産物は、核酸、脂質、ペプチド、及び／またはタンパク質であるか、またはそれらを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、細胞産物は、組み換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、組み換えタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞産物は、糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質は、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、融合タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、細胞産物は、抗体薬剤である。いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、抗体薬剤をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞産物は、モノクローナル抗体である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、糖タンパク質複合物（例えば、１つ以上の異種部分と結合または融合したその１つ以上のＮ−グリコシル化部位を含むＦｃ領域またはＦｃフラグメント）をコードする核酸を含む。異種部分としては、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣薬剤、合成薬物、無機分子、及び有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、糖タンパク質複合物は、グリコシル化Ｆｃ領域などのＦｃ領域と融合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質足場、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、Ｔａｎｄａｂ、または抗体模倣物を含む融合タンパク質である。融合タンパク質は、Ｆｃ領域を異種部分と連結するリンカー領域を含んでもよい（例えば、Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４，  ５２６０−５２６８；Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８，  ７２５−７３１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓａｕｅｒ  （１９９６）を参照）。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、ヒトまたは動物における治療的または診断的使用のための、例えば、二次承認プロセスにおいて認可されたタンパク質をコードする核酸を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、ヒトまたは動物における治療的または診断的使用のための、例えば、二次承認プロセスにおいて認可されたタンパク質と同じ一次アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、認可された治療用または診断用タンパク質と１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、または３０残基を超えない残基だけ異なるタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、認可された治療用または診断用タンパク質のものと少なくとも９０、９５、９８、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。「同じ一次アミノ酸配列」、「１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、または３０残基を超えない残基だけ異なる一次アミノ酸配列」、「少なくとも９８％以上の配列同一性を有する配列」という用語、または類似の用語は、一次アミノ酸配列間の同一性のレベルに関する。いくつかの実施形態では、タンパク質調製物または生成物は、アミノ酸バリアント、例えば、末端残基、例えば、１または２つの末端残基が異なる種を含む。そのような場合のいくつかの実施形態では、比較される配列同一性は、比較される各生成物中の最も豊富な（例えば、最も豊富な活性）種の一次アミノ酸配列間の同一性である。いくつかの実施形態では、配列同一性は、生成物を生成するために使用することができる核酸によってコードされるアミノ酸配列を指す。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本開示のせん断に敏感な細胞は、ヒトまたは動物における治療的または診断的使用のために認可されていないタンパク質をコードする核酸を含む。
【０１０２】
非限定例の組み換えタンパク質としては、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標）、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｂａｙｅｒ）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ベラタセプト（Ｎｕｌｏｊｉｘ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、カナキヌマブ（Ｉｌａｒｉｓ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、セルトリズマブ（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標）、ＵＣＢ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ−Ｓｅｒｏｎｏ）、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、デニロイキンジフチトクス（Ｏｎｔａｋ（登録商標）、Ｅｉｓａｉ）、デノスマブ（Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ；Ｘｇｅｖａ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）、Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ−Ｐｆｉｚｅｒ）、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）、Ｊａｎｓｓｅｎ）、イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ムロモナブ（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（登録商標）、Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ、Ｅｌａｎ）、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ）、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、リロナセプト（Ａｒｃａｌｙｓｔ（登録商標）、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ＲｏＡｃｔｅｍｒａ、Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｇｌａｘｏ��ｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、及びウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）、Ｊａｎｓｓｅｎ）を挙げることができる。
【０１０３】
いくつかの特定の実施形態では、細胞産物は、ウステキヌマブである。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、ウステキヌマブをコードする核酸を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、配列番号１に記載されているとおりの重鎖可変ドメイン及び配列番号２に記載されているとおりの軽鎖可変ドメインを含む抗体薬剤をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、配列番号１の配列を含む重鎖及び配列番号２の配列を含む軽鎖を含む抗体薬剤をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、せん断に敏感な細胞は、配列番号１に記載されているとおりのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列ならびに配列番号２に記載されているとおりのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む抗体薬剤をコードする核酸を含む。
【０１０５】
配列番号１  −  ウステキヌマブ重鎖配列（太字は、下線をつけたＣＤＲ配列を含む可変ドメイン配列を示す）
【化１】
2021536262.tif 000003
【０１０６】
配列番号２  −  ウステキヌマブ軽鎖配列（太字は、下線をつけたＣＤＲ配列を含む可変ドメイン配列を示す）
【化２】
2021536262.tif 000004
【０１０７】
医薬組成物
本明細書に記載されている任意の方法、システム及び／またはプロセスを使用して生成または製造される細胞産物（例えば、組み換えタンパク質、例えば、糖タンパク質、例えば、抗体薬剤）は、医薬組成物に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、疾患の予防及び／または処置に有用な場合もある。組み換えタンパク質（例えば、糖タンパク質、例えば、抗体薬剤）を含む医薬組成物は、当業者に既知の方法によって製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ２０ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２０００を参照）。医薬組成物は、水または他の薬学的に許容される液体中の滅菌溶液または懸濁液を含む注射可能な製剤の形態で非経口投与されてもよい。例えば、医薬組成物は、細胞産物（例えば、組み換えタンパク質、例えば、糖タンパク質、例えば、抗体薬剤）を薬学的に許容されるビヒクルまたは媒体、例えば、滅菌水及び生理的食塩水、植物油、乳化剤、懸濁化薬剤、界面活性剤、安定剤、香味賦形剤、希釈剤、ビヒクル、保存料、結合剤と適切に組み合わせ、続いて一般に受け入れられる製薬実務に必要とされる単位剤形に混合することによって製剤化することができる。医薬調製物中に含まれる活性成分の量は、指定された範囲内の適した用量が提供されるような量である。
【０１０８】
投与経路は、例えば、注射、経鼻投与、経肺投与、または経皮投与によって非経口投与が可能である。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射による全身または局所であってもよい。
【０１０９】
投与の適した手段は、患者の年齢及び状態に基づいて選択することができる。細胞産物（例えば、組み換えタンパク質、例えば、糖タンパク質、例えば、抗体薬剤）を含む医薬組成物の単回用量は、０．００１ｍｇ／体重ｋｇから１０００ｍｇ／体重ｋｇの範囲から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、用量は、０．００１ｍｇから１００，０００ｍｇの範囲内で選択されてもよいが、本開示は、そのような範囲に限定されない。投与の用量及び方法は、それを必要とする患者の体重、年齢、状態などに応じて変化し、当業者が必要に応じて適切に選択することができる。
【０１１０】
本開示は以下の実施例によってさらに説明される。実施例は単に例示の目的のために提供される。それらはいかなる方法でも本開示の範囲または内容を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：  せん断に敏感な細胞の連続培養に対する従来の条件はスケールアップしたプロセスには不適切である
この実施例は、せん断に敏感な細胞の連続培養のスケールアップ課題の特定について述べる。特に、本実施例は、気体流出速度を制御しない、せん断に敏感な細胞の大規模（例えば、２００Ｌ）灌流培養が、生物学的製造に対して低下した細胞生存率及び不十分な生細胞濃度を有したという発見を示している。具体的には、本実施例は、例となる細胞産物（例えば、抗体薬剤、例えば、モノクローナル抗体）をコードする核酸を含むよう操作された例となるせん断に敏感な細胞株、ＳＰ２／０の灌流培養方法のスケールアップを示す。
【０１１２】
例となる抗体薬剤を発現する例となるせん断に敏感な細胞（例えば、ＳＰ２／０）の連続細胞培養（例えば、灌流細胞培養）に対する従来の条件を、小規模連続培養システム（例えば、最大１００Ｌ）を用いて評価し、結果を図２に示す。具体的には、３Ｌのガラスリアクター、５Ｌのガラスリアクター、１５Ｌのガラスリアクター及び１００ＬのＳＵＢ１００使い捨てリアクターシステム中で増殖させられたせん断に敏感な細胞は、同等の細胞増殖及び定常状態生細胞濃度を示した。３Ｌ、５Ｌ、１５Ｌ及び１００Ｌで培養されたせん断に敏感な細胞はまた、同等の産生性及び生成物品質を有した（データは示していない）。
【０１１３】
例となるせん断に敏感な細胞、ＳＰ２／０の連続細胞培養（例えば、灌流細胞培養）の２００Ｌへのスケールアップを試み、結果を図３に示す。具体的には、以下の例となる撹拌タンク型バイオリアクターシステムを利用した。
【表１−１】
2021536262.tif 000005
【表１−２】
2021536262.tif 000006
【０１１４】
初期の増殖はすべてのサンプルで観察されたが、図３に示されるとおり、ＧＥ／Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ  ＸＤＲ２００使い捨てリアクターシステムを利用した２００Ｌの培養プロセスは、４日目から始まった低下した細胞増殖（せん断に敏感な細胞の生細胞濃度（１０６細胞／ｍＬ単位）（上））及び生存率（生存率パーセント（下））の低下の両方を示した。したがって、本実施例は、大規模（例えば、少なくとも２００Ｌ）でせん断に敏感な細胞を首尾よく連続培養するためには改善された方法が必要とされることを示す。
【０１１５】
実施例２：せん断に敏感な細胞のスケール変更された連続細胞培養に関する根本原因分析
本実施例は、実施例１に記載されている大規模（例えば、２００Ｌ以上）におけるせん断に敏感な細胞、ＳＰ２／０細胞の低下した細胞増殖及び生存率の原因を特定し、（例えば、少なくとも２０×１０６細胞／ｍＬ、例えば、少なくとも３０×１０６細胞／ｍＬなどである、例えば、定常状態生細胞濃度を有する）高密度のせん断に敏感な細胞を生じる大規模連続細胞培養（例えば、灌流細胞培養）の方法を提供する。
【０１１６】
２００Ｌの連続培養システムでは、なぜせん断に敏感な細胞の細胞増殖及び生存率が低下するのかを理解するために、さまざまなパラメーターを分析した。原料（例えば、培地、培地プレップフィルター、消泡剤、接種材料など）の問題がないことを確実にするためにプロトコル及び条件を見直した。溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ及び温度などのパラメーターを小規模培養と大規模培養との間で一定にした（データは示していない）。
【０１１７】
＞２０ｍ／ｓの率の気体流出速度（ＧＥＶ）が、低下した増殖及び生存率の一因である可能性があると特定した。この仮説を評価するために、培養流体の一部（具体的には、２Ｌの細胞培養液）を、培養の８日後に２００Ｌのバイオリアクター（ＸＤＲ２００バイオリアクター）から３ｍ／ｓの最大ＧＥＶを有する３Ｌのベンチトップ型バイオリアクターに移した。残りの２００Ｌの培養システム及び３Ｌのベンチトップ型バイオリアクターの生細胞濃度を監視した。図４に示されるとおり、３Ｌのベンチトップ型バイオリアクターの生細胞濃度は、急速に回復した。一方、２００Ｌのバイオリアクター中のスパージャー気体流出速度を、その後、培養９日目から１３日目まで１０ｍ／ｓ以下である率に制御した（低下させた）。この間、生細胞濃度が回復した。さらに、その後、１３日目にＧＥＶを少なくとも２０ｍ／ｓのレベルに増加させた場合、生細胞濃度が急速に低下した。これらの結果は、１０ｍ／ｓ以下であるレベルにＧＥＶを制御することが、（例えば、パイロット規模への）上首尾のスケールアップのために細胞生存率を助長することを示唆する。
【０１１８】
ＧＥＶ閾値を決定するために、３Ｌの灌流バイオリアクターを用いた連続細胞培養実行を、さまざまな気体流出速度（ＧＥＶ）を用いて行い、それを図５に示す。具体的には、１０ｍ／ｓから１６ｍ／ｓへのＧＥＶの増加は、生細胞濃度の急速な低下をもたらした。同様に、ＧＥＶを１３ｍ／ｓで維持しても、培養の１２日後に、生細胞濃度が最後に急激に低下した。一方、ＧＥＶを１６ｍ／ｓから１０ｍ／ｓに低下させると、生細胞濃度が増加した。
【０１１９】
したがって、本実施例は、スパージャー気体流出速度を２０ｍ／ｓ未満（例えば、１０ｍ／ｓ未満）に制御することによって、せん断に敏感な細胞の連続培養を、大規模培養（例えば、２００Ｌ以上、例えば、２５０Ｌ以上）に首尾よくスケールアップし、高密度のせん断に敏感な細胞を（例えば、少なくとも２０×１０６細胞／ｍＬ、例えば、少なくとも３０×１０６細胞／ｍＬである定常状態濃度で）生成することができることを示す。
【０１２０】
せん断に敏感な細胞の細胞培養生存率に対する溶存ＣＯ２の影響も評価し、その結果を図６に示す。具体的には、例となるせん断に敏感な細胞（ＳＰ２／０細胞）は、溶存二酸化炭素（ｐＣＯ２）に対して敏感であることがわかった。ｐＣＯ２が≧９０ｍｍＨｇであるときに細胞培養性能に悪影響があることがわかった。
【０１２１】
この実施例は、大規模連続培養のせん断に敏感な細胞の細胞増殖及び生存率は、気体流出速度を（例えば、１０ｍ／ｓ未満に）制御することによって元に戻すことができることを示す。さらに、この実施例はまた、ｐＣＯ２レベルを制御することも、せん断に敏感な細胞の高密度での大規模培養に有益であることを示している。
【０１２２】
実施例３：せん断に敏感な細胞の大規模連続細胞培養
本実施例は、実施例１及び２の理解を適用したせん断に敏感な細胞の上首尾の大規模連続培養を示す。具体的には、連続細胞培養実行、２５０Ｌの灌流リアクター（ＳＵＢ２５０）を、ＧＥＶ及びｐＣＯ２の両方を制御して行った。図７Ａ及び図７Ｂは、３Ｌ、５Ｌ、１５Ｌ、１００Ｌ（ＳＵＢ１００）及び２５０Ｌ（ＳＵＢ２５０）の間の細胞密度及び細胞生存率の比較を提供する。具体的には、図７Ａ及び図７Ｂは、さまざまな細胞培養規模（例えば、１００Ｌ、例えば、２５０Ｌ）でさまざまなレベルに制御したＧＥＶ及びｐＣＯ２を用いた細胞生存率のさらなる分析を提供する。ＳＵＢ１００、１００Ｌのバイオリアクターは、５７０×０．１８ｍｍの穴を含み、ＳＵＢ２５０、２５０Ｌのバイオリアクターは、７６０×０．２３３ｍｍの穴を含む。図７Ａに示されるとおり、２５０Ｌの規模（ＳＵＢ２５０）で約７ｍ／ｓに制御されたＧＥＶ及び最大８０ｍｍＨｇの溶存二酸化炭素を用いた連続細胞培養は、小規模の培養と同様の細胞生存率を示した。図８は、（例えば、ＳＵＢ２５０バイオリアクターシステムを使用した）２５０Ｌの培養に対するさまざまなパラメーターについての予測モデルの概要を提供する。特に、１００Ｌ及び２５０Ｌにおける溶存ＣＯ２に関するこれらのモデルを使用して予測されたＣＯ２のレベルは、実際に得られたデータ（示していない）と極めて類似していた。
【０１２３】
図９は、せん断に敏感な細胞の３Ｌ、１００Ｌ、及び２５０Ｌでのこれらの連続培養がすべて、同等の合計グリカンレベル（上のパネル）及び同等のシアル酸含有量（下のパネル）を示すことを示している。したがって、本実施例は、灌流培養プロセスによる高細胞密度せん断に敏感な細胞（ＳＰ２／０）の（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ／ＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＵＢ２５０（２５０Ｌ）撹拌タンク型バイオリアクターを用いた）２５０Ｌの規模への上首尾のスケールアップを示す（図７Ａ、図７Ｂ、及び図９）。
【０１２４】
したがって、本実施例はまた、ｐＣＯ２レベルを制御することも、せん断に敏感な細胞の（例えば、少なくとも２０×１０６細胞／ｍＬ、例えば、少なくとも３０×１０６細胞／ｍＬである定常状態濃度を有する）高密度での大規模培養（例えば、少なくとも１００Ｌ、例えば、２５０Ｌ）に有益であることも示す。本発明者らは、ｐＣＯ２を８０ｍｍＨｇ未満に、さらにスパージャー気体流出速度を１０ｍ／ｓ未満に制御することによって、本発明者らのプロセスを３Ｌから２５０Ｌの撹拌タンク型バイオリアクターに首尾よくスケールアップすることができた。
【０１２５】
したがって、本実施例は、せん断に敏感な細胞の灌流培養の上首尾のスケールアップのために、スパージャーからのＧＥＶを率＜１０ｍ／ｓに制御すると同時にｐＣＯ２を≦８０ｍｍＨｇに維持することを裏付ける。
【０１２６】
実施例４：連続細胞培養の生産規模へのスケール変更
この実施例は、生産規模（例えば、１０００Ｌ以上）でのせん断に敏感な細胞の大規模連続培養についてのさまざまなパラメーターのモデル化を示す。図１０に示されるとおり、せん断に敏感な細胞の１０００Ｌの連続培養に対する溶存ＣＯ２（上のパネル）及び気体流出速度（下のパネル）についての予測パラメーターは、２５０Ｌ及び１００Ｌの培養プロセスで実証されたレベルと同等である。さらに、図１１は、（例えば、ＳＵＢ１０００バイオリアクターシステムを使用した）１０００Ｌの培養に対するさまざまなパラメーターについての予測モデルの概要を示す表を示す。したがって、大規模（例えば、パイロット規模）に対して測定されたパラメーターが、１０００Ｌのバイオリアクターシステムによるものなどのさらに大きな培養でも当てはまることが予想される。
【０１２７】
均等物
本開示をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明するように意図されるのであって、限定するようには意図されないことが理解されるべきである。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
2021536262.tif 000007
【図２】
2021536262.tif 000008
【図３】
2021536262.tif 000009
【図４】
2021536262.tif 000010
【図５】
2021536262.tif 000011
【図６】
2021536262.tif 000012
【図７Ａ】
2021536262.tif 000013
【図７Ｂ】
2021536262.tif 000014
【図８】
2021536262.tif 000015
【図９】
2021536262.tif 000016
【図１０】
2021536262.tif 000017
【図１１】
2021536262.tif 000018
【図１２】
2021536262.tif 000019
【配列表】
2021536262000001.app
【国際調査報告】
2021536262.tif 000020
2021536262.tif 000021
2021536262.tif 000022