(57)【要約】  新規の抗ＳＥＺ６抗体及び抗体薬物コンジュゲート並びにこのような抗ＳＥＺ６抗体及び抗体薬物コンジュゲートを使用して、がんを処置する方法が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＳＥＺ６に特異的に結合する単離抗体であって、配列番号３の重鎖配列及び配列番号４の軽鎖配列を含む抗体。
【請求項２】
カリケアミシンペイロードとコンジュゲートされた、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
カリケアミシンペイロードが、Ｎ−Ａｃカリケアミシンを含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
カリケアミシンペイロードが、式ＩＩを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体の全部又は一部をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸又は請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
構造：
【化１】
2021508694.tif 000040
［式中、Ａｂは、配列番号３の重鎖配列及び配列番号４の軽鎖配列を有する抗ＳＥＺ６抗体を含み、ｎは２である］
のＳＥＺ６  ＡＤＣ。
【請求項９】
小細胞肺がんを処置する方法であって、請求項８に記載のＳＥＺ６  ＡＤＣを、それを必要とする対象へ投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
請求項８に記載のＳＥＺ６  ＡＤＣを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項８に記載のＳＥＺ６  ＡＤＣが、主要なＡＤＣ分子種である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
主要なＡＤＣ分子種が、組成物中に存在するＡＤＣ分子種のうちの、約７０％を超える比率を占める、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
主要なＡＤＣ分子種が、組成物中に存在するＡＤＣ分子種のうちの、約８０％を超える比率を占める、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
主要なＡＤＣ分子種が、組成物中に存在するＡＤＣ分子種のうちの、約９０％を超える比率を占める、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
小細胞肺がんを処置する方法であって、請求項８〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１６】
請求項８に記載のＡＤＣを作製する方法であって、配列番号３の重鎖配列及び配列番号４の軽鎖配列を有するｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体を、式ＩＩを含む薬物リンカーとコンジュゲートさせるステップを含む方法。
【請求項１７】
ＡＤＣを凍結乾燥させるステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
それを必要とする対象における小細胞肺がんを処置する方法であって、６を超える安全マージンを有するＳＥＺ６  ＡＤＣを投与するステップを含み、ＳＥＺ６  ＡＤＣが、構造：
【化２】
2021508694.tif 000041
［式中、Ａｂは、配列番号３の重鎖配列及び配列番号４の軽鎖配列を有する抗ＳＥＺ６抗体を含み、ｎは２である］
を含む方法。
【請求項１９】
安全マージンが、約１０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
構造：
【化３】
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を含む、カリケアミシン薬物リンカー又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下において、その内容が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１８年５月３０日に出願された、米国仮出願第６２／６７８，０６１号の利益を主張する。
【０００２】
２．配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１９年５月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、３８１４９３−７０３ＷＯ（１６７８６２）＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、２８，９９２バイトのサイズである。
【０００３】
３．技術背景
本出願は、がん及びその任意の再発又は転移の処置、診断又は予防のための、新規の抗ＳＥＺ６抗体薬物コンジュゲート、その構成要素及びこれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．発明の背景
幹細胞及び前駆細胞の分化及び増殖は、器官形成時における組織の増殖、細胞の修復及び細胞の置きかえを支援するように協同的に作用する、正常な持続的過程である。系は、生物の必要に基づき、適切なシグナルだけが発生されることを確保するように、緊密に調節されている。細胞の増殖及び分化は通常、損傷細胞若しくは死細胞の置きかえ又は増殖に必要な場合に限り生じる。しかし、これらの過程の破壊は、多様なシグナル伝達化学物質の過少若しくは過多、変更された微小環境の存在、遺伝子の突然変異又はこれらの組合せを含む、多くの因子により誘発されうる。正常な細胞の増殖及び／又は分化は、がんなどの増殖性疾患を含む、多様な障害をもたらしうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
がんのための、従来の治療処置は、化学療法、放射線療法及び免疫療法を含む。これらの処置は、無効であることが多く、手術による切除は、実行可能な臨床的代替手段たり得ない場合がある。現行のケアの標準における限界は、患者が、第一選択処置を受け、その後、再発する症例において、特に、明らかである。このような症例において、侵襲性であり、かつ、難治性であることが多い不応性腫瘍がしばしば生じる。多くの腫瘍についての全生存率は、少なくとも部分的に、既存の治療が、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）、腫瘍の再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）及び転移の防止に失敗しているために、多年にわたり、概ね変化しないままである。したがって、増殖性障害のための、よりターゲティングされ、強力な治療を開発することが、強く必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
５．発明の概要
広範な態様において、本発明は、ヒトＳＥＺ６決定基に特異的に結合する、抗体薬物コンジュゲート又はこの組成物を提供する。ある特定の実施形態において、ＳＥＺ６決定基は、腫瘍細胞上において発現するＳＥＺ６タンパク質であるが、他の実施形態において、ＳＥＺ６決定基は、腫瘍始原細胞上において発現する。好ましい実施形態において、ＳＥＺ６抗体薬物コンジュゲートは、
【０００７】
【化１】
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［式中、Ａｂは、配列番号３の重鎖及び配列番号４の軽鎖を有する抗ＳＥＺ６抗体を含み、ｎは２である］
を含む。本開示の目的のために、そうでないことが指し示されない限りにおいて、この抗体薬物コンジュゲートは、「ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１」と称されるものとする。
【０００８】
選択された実施形態において、本発明は、配列番号３の重鎖及び配列番号４の軽鎖を含む抗体を含む。ある特定の態様において、本発明は、本発明の抗ＳＥＺ６抗体の重鎖（配列番号３）若しくは軽鎖（配列番号４）又はこれらの断片をコードする核酸を含む。他の実施形態において、本発明は、上記された核酸のうちの１つ以上を含むベクター又は前記核酸若しくはベクターを含む宿主細胞を含む。
【０００９】
さらに別の実施形態において、本発明は、式ＩＩ：
【００１０】
【化２】
2021508694.tif 000004
に明示された構造を含む、カリケアミシン薬物リンカー又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を含む。
【００１１】
上記において明示された通り、本発明は、抗ＳＥＺ６抗体薬物コンジュゲートを提供するが、この場合、抗体は、式ＩＩの、１つ以上の非切断型カリケアミシンペイロードへとコンジュゲートされる。さらに、本明細書において開示された抗ＳＥＺ６  ＡＤＣを含む医薬組成物も提供される。ある特定の実施形態において、組成物は、選択された薬物−抗体比（ＤＡＲ）を含み、ここで、主要なＡＤＣ分子種（例えば、ＤＡＲ  ２種類のカリケアミシンウォーヘッドを含む）は、存在する分子種のうちの、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える比率を占める。好ましくは、主要な分子種の薬物ローディングは、２である。
【００１２】
本発明の別の態様は、がんを処置する方法であって、本明細書に記載された抗体薬物コンジュゲート又は医薬組成物などの抗体薬物コンジュゲート又は医薬組成物を、それを必要とする対象へと投与するステップを含む方法である。ある特定の実施形態において、対象は、肺がんを患っており、選択された実施形態において、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を患っている。
【００１３】
他の実施形態において、開示されたＡＤＣは、６を超える安全マージン（本明細書に記載された通りに導出された）を含む。他の実施形態において、安全マージンは、７を超え、さらに他の実施形態において、安全マージンは、８を超える、又は９を超える。さらに他の実施形態において、安全マージンは、約１０である。
【００１４】
さらに別の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞集団内の腫瘍始原細胞を低減する方法であって、腫瘍始原細胞集団を、本明細書に記載された抗体薬物コンジュゲートと接触させる（例えば、インビトロ又はインビボにおいて）ステップを含み、腫瘍始原細胞の頻度が低減される方法を含む。
【００１５】
一態様において、本発明は、細胞毒素を、細胞へと送達する方法であって、細胞を、開示された抗体薬物コンジュゲートと接触させるステップを含む方法を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明はまた、肺がんの処置において有用な、キット又はデバイス及び関連する方法も提供する。この目的のために、本発明は、好ましくは、肺がんを処置するために有用な製品であって、ＳＥＺ６  ＡＤＣ及びＡＤＣを使用して、肺がん（例えば、小細胞肺がん）を処置する、又はこれについての投与レジメンを提示するための説明書を含有する容器を含む製品を提供する。他の実施形態において、開示されたキットは、キット又はデバイスが、肺がんの処置のために使用されることを指し示す、又はこれについての投与レジメンを提示する、指示書、ラベル、添付文書、リーダーなどを含む。
【００１７】
上の記述は、概要であるので、必然的に、単純化、一般化及び詳細の省略を含むものであり、結果として、当業者は、概要が、例示的なものであるに過ぎず、いかなる限定を意図するものではないことを理解する。本明細書に記載された方法、組成物及び／若しくはデバイス並びに／又は他の対象物についての、他の態様、特色及び利点は、本明細書に明示された教示において明らかである。概要は、概念の選択を、下記の「発明を実施するための形態」において、さらに記載される、単純化された形態において導入するために提示される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１についての概略を表す図である。
【図２】Ｓ６０Ｎ突然変異を含むＳＥＺ６抗体が、Ｓ６０Ｎ突然変異を伴わないＳＥＺ６抗体と実質的に同じである、アフィニティープロファイルを有することを裏付ける結合曲線を提示する図である。
【図３】開示されたＳＥＺ６  ＡＤＣが、ｈＳＥＺ６を発現させないナイーブ対照細胞を枯渇させずに、ｈＳＥＺ６を発現させる細胞を、用量依存的に、効果的に死滅させることを裏付ける図である。
【図４Ａ】開示されたＳＥＺ６  ＡＤＣが、ＳＣＬＣ  ＬＵ  ９５を植え込まれた免疫障害マウスにおける、小細胞肺がんによる腫瘍の増殖を遅延させる能力を描示する図である。
【図４Ｂ】開示されたＳＥＺ６  ＡＤＣが、ＳＣＬＣ  ＬＵ  １４９を植え込まれた免疫障害マウスにおける、小細胞肺がんによる腫瘍の増殖を遅延させる能力を描示する図である。
【図５Ａ】ＳＣＬＣ腫瘍が、非切断型カリケアミシンリンカー薬物を含むＡＤＣによる処置に対して、特に、感受性であることを裏付ける図であり、ここで、ＳＥＺ６の、多様な腫瘍細胞株における相対発現レベルを示す。
【図５Ｂ】ＳＣＬＣ腫瘍が、非切断型カリケアミシンリンカー薬物を含むＡＤＣによる処置に対して、特に、感受性であることを裏付ける図であり、ここで、陽性対照抗原の、多様な腫瘍細胞株における相対発現レベルを示す。
【図５Ｃ】ＳＣＬＣ腫瘍が、非切断型カリケアミシンリンカー薬物を含むＡＤＣによる処置に対して、特に、感受性であることを裏付ける図であり、ここで、ＰＢＤ毒素が、異なる種類のがん細胞を、一様に死滅させることを示す。
【図５Ｄ】ＳＣＬＣ腫瘍が、非切断型カリケアミシンリンカー薬物を含むＡＤＣによる処置に対して、特に、感受性であることを裏付ける図であり、ここで、カリケアミシンが、ＳＣＬＣ細胞の殺滅において、特に、活性であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
７．本発明についての詳細な説明
本発明の原理を例示する、非限定的でありかつ例示的な本発明の実施形態が、本明細書において開示される。本明細書において使用された、任意の節見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載された対象物を限定するものとはみなされないものとする。本開示の目的のために、そうでないことが注記されない限り、全ての配列を同定する受託番号は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベース及び／又はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースにおいて見出されうる。
【００２０】
本発明は、部位特異的抗ＳＥＺ６抗体によるターゲティング剤及びカリケアミシンによる細胞傷害性ペイロードを含む、新規の抗ＳＥＺ６  ＡＤＣ及びその構成要素（ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体及び式ＩＩのカリケアミシン薬物リンカーを含む）を提供する。下記においてより詳細に論じられ、添付された実施例において明示される通り、開示された抗ＳＥＺ６  ＡＤＣは、腫瘍増殖の抑制において、他の抗ＳＥＺ６  ＡＤＣと比較された場合に、特に、有効である。
【００２１】
本明細書において開示されたＳＥＺ６  ＡＤＣの使用を介して、腫瘍幹細胞及び／又はがん幹細胞を効果的に低減するか又は消失させる能力は、オフサイト（ｏｆｆ−ｓｉｔｅ）毒性の相対的な欠如に起因し、用量の増大を可能にする。これは、腫瘍部位において、他のカリケアミシンＡＤＣより高度なカリケアミシンレベルをもたらし、細胞殺滅の増大を結果としてもたらす。添付された実施例において示される通り、腫瘍部位における毒素濃度の増大は、免疫障害マウスにおける腫瘍の抑制の延長をもたらす。したがって、本明細書において開示されたＳＥＺ６  ＡＤＣは、好適な治療指数を呈する可能性が高く、小細胞肺がん又はこの進行若しくは再発など、選択された増殖性障害の処置及び／又は防止において使用されうる。
【００２２】
ＳＥＺ６がん幹細胞
ＳＣＬＣは、由来において、気管支原性であり、部分的に、肺の神経内分泌細胞から生じることが提起されている（Ｇａｌｌｕｚｚｏ及びＢｏｃｃｈｅｔｔａ、２０１１；ＰＭＩＤ：２１５０４３２０）。これらの腫瘍の起源となる細胞供給源が何であれ、これらの腫瘍は、高度に増殖性であり、かつ、侵襲性であることが多く、しばしば、神経タンパク質を過剰発現させる低分化の内分泌表現型を示すことが、明らかである。したがって、腫瘍内でなければ、主に神経系に制約されうるか又は発生時において限定的な発現を示す場合がある、神経性発現マーカー（ＳＥＺ６に例示される）の、これらの腫瘍内において結果として生じる上昇は、神経内分泌表現型を伴う腫瘍のための、固有の治療標的をもたらす。
【００２３】
ＳＥＺ６の発現は、本明細書において明示された処置に対して、多様な腫瘍形成性細胞の亜集団を感受性にする様式で、これらと関連する。これに関して、本発明は、腫瘍形成性細胞をターゲティングし、これにより、がんの処置、管理及び／又は防止を容易とするために、特に、有用でありうる、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１を提供する。腫瘍形成性細胞の阻害又は消失によるのであれ、それらの潜在的可能性の修飾（例えば、分化の誘導又はニッチの破壊による）によるのであれ、又は代わりに腫瘍形成性細胞が腫瘍環境又は他の細胞に影響を及ぼす能力に干渉することによるのであれ、本発明は、腫瘍形成、腫瘍の維持及び／又は転移並びに再発を阻害することにより、がんの、より有効な処置を可能とする。開示された抗体の同じ特徴が、標準的な処置レジメンに耐性又は不応性であることが実証されている再発性腫瘍の処置において、それらを、特に有効とすることがさらに理解される。
【００２４】
腫瘍形成性細胞の頻度を評価するのに使用されうる方法は、好ましくは、インビトロ又はインビボにおける限界希釈解析による、サイトメトリー解析又は免疫組織化学解析（Ｄｙｌｌａら、２００８、ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２及びＨｏｅｙら、２００９、ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）を含むがこれらに限定されない。
【００２５】
したがって、本発明の抗体が、腫瘍形成性細胞の頻度を低減する能力は、当技術分野において公知の技法及びマーカーを使用して決定されうる。一部の場合において、抗ＳＥＺ６  ＡＤＣは、腫瘍形成性細胞の頻度を、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％なお又は３５％低減しうる。他の実施形態において、腫瘍形成性細胞の頻度の低減は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％のオーダーでありうる。ある特定の実施形態において、開示された化合物は、腫瘍形成性細胞の頻度を、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％なお又は９５％低減しうる。腫瘍形成性細胞の頻度の低減は、対応する腫瘍形成性、新生物の遷延性、再発及び侵襲性の低減を結果としてもたらす可能性が高いことが理解される。
【００２６】
抗体の構造
受容された用語法及び番号付けシステムを含む、抗体並びにその変異体及び誘導体については、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０）、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（６版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；又はＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１）、「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」（８版）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて広範に記載されている。
【００２７】
「抗体」又は「インタクト抗体」とは、典型的に、共有結合性ジスルフィド結合及び非共有結合性相互作用により併せて保持された、２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチド及び２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを含む、Ｙ字型の四量体タンパク質を指す。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）及び１つの定常ドメイン（ＣＬ）からなる。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び定常領域を含み、定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤの場合、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と称される、３つのドメインを含む（ＩｇＭ及びＩｇＥは、第４のドメインであるＣＨ４を有する）。ＩｇＧクラス、ＩｇＡクラス及びＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとは、プロリン及びシステインに富む、可変長（多様なＩｇＧサブクラスにおいて、約１０〜約６０アミノ酸）のセグメントである、可撓性のヒンジ領域により分離されている。軽鎖及び重鎖のいずれにおける可変ドメインも、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により定常ドメインへと接合されており、重鎖はまた、さらなる約１０アミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対合システイン残基により形成された、鎖間ジスルフィド結合及び鎖内ジスルフィド結合をさらに含む。
【００２８】
本明細書において使用された、「抗体」という用語は、具体的に、カッパ（κ）軽鎖を含む、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体を含む。
【００２９】
抗体の可変ドメインは、抗体から抗体へと、アミノ酸組成の大幅な変動を示し、主に、抗原の認識及び抗原への結合の一因となる。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトのＩｇＧ抗体が、２つの結合性部位を有する（すなわち、ＩｇＧ抗体は、二価である）ように、抗原結合性部位を形成する。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、可変性が極めて大きな３つの領域を含み、超可変領域又は、より一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）として公知である、４つのそれほど可変性でない領域により枠づけられ、分離されている。ＶＨ領域とＶＬ領域との非共有結合性会合は、抗体の２つの抗原結合性部位のうちの１つを含有するＦｖ（「断片可変（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）」の略）断片を形成する。
【００３０】
本明細書において使用された、アミノ酸の、各ドメイン、各フレームワーク領域及び各ＣＤＲへの割当ては、そうでないことが注記されない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（５版）、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、ＰＭＩＤ：８８７６６５０若しくはＤｕｂｅｌ編（２００７）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．又はＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）により提示されているスキームのうちの１つに従いうる。当技術分野において周知の通り、可変領域残基の番号付けは、典型的に、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＫａｂａｔにおいて明示されている通りである。Ａｂｙｓｉｓウェブサイトのデータベース（後掲）から得られた、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとしてもまた公知である）並びにＡｂＭにより規定されたＣＤＲを含むアミノ酸残基が、下記の表１に明示される。ＭａｃＣａｌｌｕｍは、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けシステムを使用することに注意されたい。
【００３１】
【表１】
2021508694.tif 000005
【００３２】
抗体配列内の可変領域及びＣＤＲは、当技術分野において開発された一般的規則（例えば、上記において明示される）に従い同定される場合もあり、配列を、公知の可変領域についてのデータベースに照らしてアライメントすることにより同定される場合もある。これらの領域を同定するための方法については、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ編、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１並びにＤｉｎａｒｅｌｌｏら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００において記載されている。抗体配列の例示的なデータベースについては、Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３（データベース特集号）：Ｄ６７１〜Ｄ６７４（２００５）に記載されている通り、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＥｎｇｌａｎｄのＡ．Ｃ．  Ｍａｒｔｉｎにより維持されている）における「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト及びｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇにおけるＶＢＡＳＥ２ウェブサイトにおいて記載されており、これらを介してアクセスすることができる。
【００３３】
配列は、好ましくは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）による配列データを、ＰＤＢによる構造データと統合する、Ａｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析される。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎによる著書の章である「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ」（ウェブサイトであるｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでもまた入手可能な、Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７）を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトは、本明細書の教示に従い使用されうるＣＤＲを同定するために開発された一般的規則もさらに含む。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本明細書において示される全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに準拠するＡｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトに従い導出される。
【００３４】
本発明において論じられた重鎖定常領域のアミノ酸位置について、番号付けは、シーケンシングされる最初のヒトＩｇＧ１であることが報告された、骨髄腫タンパク質であるＥｕのアミノ酸配列について記載する、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６３（１）：７８〜８５において最初に記載された、Ｅｕインデックスに従う。ＥｄｅｌｍａｎによるＥｕインデックスはまた、Ｋａｂａｔら、１９９１（前出）においても明示されている。したがって、重鎖の文脈における「Ｋａｂａｔにおいて明示されたＥＵインデックス」又は「ＫａｂａｔによるＥＵインデックス」又は「ＥＵ番号付け」という用語は、Ｋａｂａｔら、１９９１（前出）において明示された、ＥｄｅｌｍａｎらによるヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域のアミノ酸配列に使用された番号付けシステムも、Ｋａｂａｔら（前出）においても同様に明示されている。
【００３５】
当業者は、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体の、重鎖定常領域配列及び軽鎖定常領域配列が、本明細書において開示された通り、不対システインをもたらすように操作されていることを理解する。次いで、標準的な分子生物学法を使用して、これらの定常領域は、開示された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と作動可能に会合させて、開示されたｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１内に組み込まれた全長抗体鎖を得る。
【００３６】
抗体の作出及び作製
ヒト化抗体であるｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１は、本明細書に添付された実施例１及び２において明示された通りに作製され、結果として得られた、全長重鎖及び全長軽鎖のアミノ酸配列は、すぐ下に、配列番号３及び配列番号４として明示される。下記において論じられる通り、ヒト化抗体の重鎖は、グリコシル化部位を不活化させるようにデザインされた、Ｓ６０Ｎ突然変異及び軽鎖上の遊離システインをもたらす、Ｃ２２０Ｓ突然変異（ＫａｂａｔによるＥＵインデックスに従い番号付けされた）を含む。重鎖内において、Ｓ６０Ｎ突然変異及びＣ２２０Ｓ突然変異に下線が付されるのに対し、軽鎖内において、結果として得られる、２１４位の遊離システインに下線が付されることに注意されたい。両方の鎖の可変領域は、太字体により描示される。
【００３７】
【化３】
2021508694.tif 000006
【００３８】
【化４】
2021508694.tif 000007
【００３９】
加えて、前述の全長重鎖及び全長軽鎖をコードする、適合性の核酸配列は、すぐ下に、それぞれ、配列番号５及び配列番号６として明示される。
【００４０】
重鎖核酸配列（イントロンを伴う）
【００４１】
【化５】
2021508694.tif 000008
【００４２】
軽鎖核酸配列
【００４３】
【化６】
2021508694.tif 000009
【００４４】
本発明のＳＥＺ６抗体構成要素は、カリケアミシン毒素の効率的なコンジュゲーションを容易とするように操作されている。これに関して、本発明の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）調製物は、細胞毒素の抗体上の位置及び薬物対抗体比（ＤＡＲ）に照らして、比較的均質なＡＤＣ分子の集団を含む。本開示に基づき、当業者は、開示された、配列番号３及び４を含む、部位特異的操作構築物をたやすく作製しうる。本明細書において使用された、「部位特異的抗体」又は「部位特異的構築物」とは、少なくとも１つの遊離システインをもたらすように、重鎖内又は軽鎖内の少なくとも１つのアミノ酸を欠失させた、変更した、又は置換した（好ましくは別のアミノ酸により）抗体を意味する。同様に、「部位特異的コンジュゲート」とは、部位特異的抗体及び不対システイン又は遊離システイン（複数可）へとコンジュゲートされた、少なくとも１つの細胞毒素を含むＡＤＣを意味するように理解されるものとする。本発明において、重鎖の２２０位（ＫａｂａｔによるＥｕ番号付け）におけるシステインを、セリンへと突然変異させ、これにより、天然において、カッパ軽鎖定常領域の２１４位の末端システインを形成する、ジスルフィド架橋を破壊する。これは、２１４位におけるシステインを、本明細書の教示に従う、遊離システイン又は不対システインとし、これは、次いで、開示されたカリケアミシン薬物リンカーへとコンジュゲートされる。
【００４５】
本明細書において使用された、「遊離システイン」又は「不対システイン」という用語は、文脈により、そうでないことが指示されない限り、互換的に使用される場合があり、天然において存在するのであれ、選択された残基位置において、分子操作法を使用して、特異的に組み込まれたのであれ、生理学的条件下における、天然に存在する（又は「天然」の）ジスルフィド結合ではない、抗体のシステイン（又はチオールを含有するシステイン）構成要素（例えば、システイン残基）を意味するものとする。選択された実施形態において、遊離システインは、その、天然の、鎖間又は鎖内のジスルフィド架橋パートナーが、生理学的条件下における、天然に存在するジスルフィド架橋を破壊し、これにより、不対システインを、部位特異的コンジュゲーションに適するものとするように、置換した、消失させた、又は他の形において変更した、天然に存在するシステインを含みうる。コンジュゲーションの前に、遊離システイン又は不対システインは、系の酸化状態に応じて、チオール（還元システイン）として存在する場合もあり、キャッピングシステイン（酸化システイン）として存在する場合もあり、同じ分子上又は異なる分子上の、別のシステイン基又はチオール基との、非天然の、分子内ジスルフィド結合又は分子間ジスルフィド結合（酸化システイン）として存在する場合もあることが理解される。下記においてより詳細に論じられる通り、適切に操作された抗体構築物のマイルドな還元は、部位特異的コンジュゲーションに利用可能なチオールをもたらす。したがって、特に好ましい実施形態において、遊離システイン又は不対システインは、選択的還元及び後続のコンジュゲーションにかけられて、均質なＤＡＲ組成物をもたらす。薬物リンカーへと、共有結合的に結合されると、もはや「遊離」又は「不対」ではなくなった、このような残基位置は、「操作されたコンジュゲーション部位」と称されうる。
【００４６】
抗体及びその断片は、抗体産生細胞から得られた遺伝子素材及び組換え技術を使用して、作製又は修飾されうる（例えば、Ｄｕｂｅｌ及びＲｅｉｃｈｅｒｔ編（２０１４）、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（編）（２０００）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照されたい）。
【００４７】
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に存在する場合もあり、細胞溶解物中に存在する場合もあり、部分的に精製された形態又は実質的に純粋な形態において存在する場合もある。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当技術分野において周知の他の技法を含む標準的な技法により、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞内核酸又は細胞内タンパク質から分離されるとき、「単離」される、又は実質的に純粋とされる。本発明の核酸は、例えば、一本鎖であれ、二本鎖であれ、ＲＮＡであれ、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ及びこれらの人工的変異体（例えば、ペプチド核酸）であることが可能であり、イントロン配列を含有する場合もあり、含有しない場合もある。選択された実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【００４８】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学法を使用して得られうる。ハイブリドーマ（例えば、下記の実施例において記載される通りに調製されたハイブリドーマ）により発現された抗体について、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅法又はｃＤＮＡクローニング法により得られうる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた（例えば、ファージディスプレイ法を使用して）抗体について、抗体をコードする核酸分子は、ライブラリーから回収されうる。
【００４９】
ＶＨセグメント及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片は、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子へと転換するように、標準的な組換えＤＮＡ法によりさらに操作されうる。これらの操作において、ＶＬをコードするＤＮＡ断片又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体の定常領域又は可撓性のリンカーなど、別のタンパク質をコードする、別のＤＮＡ断片へと作動的に連結される。この文脈において使用された、「作動的に連結された」という用語は、２つのＤＮＡ断片によりコードされたアミノ酸配列が、インフレームにとどまるように、２つのＤＮＡ断片が、接合されることを意味する。
【００５０】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＩｇＧ１の場合、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長重鎖遺伝子へと転換されうる。当技術分野において、ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１年）（前出）を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られうる。
【００５１】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子へと作動的に連結することにより、全長軽鎖遺伝子へと転換されうる。当技術分野において、ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列が公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１年）（前出）を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られうる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域又はラムダ定常領域でありうるが、最も好ましくは、カッパ定常領域である。
【００５２】
各場合において、ＶＨドメイン又はＶＬドメインは、それらのそれぞれの定常領域（ＣＨ又はＣＬ）に作動可能に連結されることが可能であり、この場合、定常領域は、部位特異的定常領域であり、部位特異的抗体をもたらす。選択された実施形態において、結果として得られる部位特異的抗体は、ＣＬドメイン内に、２つの不対システインを含む。
【００５３】
組換えタンパク質の、長期にわたる高収率の産生のために、安定的な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定的に発現させる細胞株は、本発明のうちの、当技術分野において認識された、標準的な技法及び形態の部分を使用して操作されうる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター配列又はエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡ及び選択マーカーにより形質転換されうる。当技術分野において周知の選択系のうちのいずれかであって、選択された条件下において、発現を増強するための効率的な手法をもたらす、グルタミンシンセターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）を含む選択系を使用することができる。ＧＳ系は、ＥＰ０２１６８４６、ＥＰ０２５６０５５、ＥＰ０３２３９９７及びＥＰ０３３８８４１並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５／５９１，６３９及び同５，８７９，９３６との関連において、全体又は部分において論じられている。安定的な細胞株を作出するための、別の適合性の発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【００５４】
本発明の抗体は、組換え発現又は他の開示された技法のうちのいずれかにより作製されたら、それが、同定され、その天然環境から分離及び／又は回収され、抗体又は関連するＡＤＣの診断的使用又は治療的使用に干渉する夾雑物から分離される点において、当技術分野において公知の方法により精製又は単離されうる。単離抗体は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。
【００５５】
これらの単離調製物は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ除外クロマトグラフィー、透析、透析濾過及びアフィニティークロマトグラフィー、特に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーなど、当技術分野において認知された、多様な技法を使用して精製されうる。
【００５６】
抗体コンジュゲート
上記において論じられた通り、本発明の抗体は、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）又は「抗体コンジュゲート」を形成するように、２つのカリケアミシン毒素とコンジュゲートされうる。「コンジュゲート」という用語は、広義において使用され、カリケアミシンの、本発明の抗体との共有結合的会合を意味する。本明細書において、会合は、軽鎖定常領域の２１４位におけるシステイン残基によりなされる。
【００５７】
本発明のＡＤＣは、所定のカリケアミシンウォーヘッドを、腫瘍形成性細胞及び／又はＳＥＺ６発現細胞へと選択的に送達するのに使用されうることが理解される。本明細書において明示された通り、「薬物」又は「ウォーヘッド」という用語は、互換的に使用される場合があり、カリケアミシン分子を意味する。「ペイロード」は、ＡＤＣが標的に達するまで、安定的な医薬複合体をもたらす、非切断型リンカー化合物と組み合わせた薬物又はウォーヘッドを含む。コンジュゲート上のウォーヘッドは、ペプチド、タンパク質、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて活性薬剤へと代謝されるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、低分子、結合剤、模倣剤、合成薬、無機分子、有機分子、及び放射性同位元素を含みうる。式ＩＩ（上記において明示された）は、カリケアミシンウォーヘッドを伴う、例示的なペイロードである。
【００５８】
好ましい実施形態において、開示されたＡＤＣは、結合させたペイロード（例えば、式ＩＩ）を、比較的非反応性、非毒性の状態において、標的部位へと方向付けてから、カリケアミシン毒素を放出し、活性化させる。このウォーヘッドの、ターゲティングされた放出は、好ましくは、ペイロードの安定的なコンジュゲーション及び毒性ＡＤＣ分子種の過剰コンジュゲートを最小化する、ＡＤＣ調製物の比較的均質な組成により達成される。腫瘍部位へと送達されたら、ウォーヘッドを放出するようにデザインされた、安定的な非切断型薬物リンカーとカップリングされているので、本発明のコンジュゲートは、所望されない非特異的毒性を実質的に低減しうる。これは、腫瘍部位には、比較的高レベルの活性細胞毒素をもたらす一方、ターゲティングされない細胞及び組織の曝露を最小化し、これにより、効能の増強をもたらすので有利である。
【００５９】
本発明のコンジュゲートは一般に、式ＩＩＩ：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
［式中、
ａ）Ａｂは、配列番号３の重鎖及び配列番号４の軽鎖を有する抗ＳＥＺ６抗体を含み；
ｂ）［Ｌ−Ｄ］は、Ａｂへと共有結合的に接合された、式ＩＩのリンカー薬物を含み；
ｃ）ｎは２である］
により表されうる。
【００６０】
一部の好ましい実施形態において、本発明は、安定化剤を、本明細書に記載された、マイルドな還元剤と組み合わせて使用する、カリケアミシンペイロードの、遊離システインへの選択的コンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーション及び夾雑物が少なく、これに応じて、毒性も小さい、より均質な調製物をもたらす傾向がある。
【００６１】
カリケアミシンウォーヘッド
本明細書において論じられた通り、本発明の抗体は、カリケアミシン毒素へとコンジュゲートされる。すなわち、開示された本発明のＳＥＺ６  ＡＤＣは、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ（式ＩＩＩ）又は薬学的に許容されるその塩［式中、Ｄは、本明細書において提示された分子構造のうちのいずれかにある、カリケアミシン又はこの類似体である］を含みうる。当技術分野において公知の通り、細菌であるミクロモノスポラ・エキノスポラに由来し、カリケアミシンγ１Ｉ、カリケアミシンβ１Ｂｒ、カリケアミシンγ１Ｂｒ、カリケアミシンα２Ｉ、カリケアミシンα３Ｉ、カリケアミシンβ１ｉ及びカリケアミシンδ１ｉを含む、エネジイン抗腫瘍抗生剤のクラスであるカリケアミシンが、単離され、特徴づけられた。当技術分野において、前出のカリケアミシン類似体の各々の構造は周知であり（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、Ｌｅｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、１９８９年７月を参照されたい）、本明細書において開示された、カリケアミシン薬物リンカー構築物及び抗体薬物コンジュゲートに適合性である。
【００６２】
一般に、カリケアミシンγ１は、各々が、化合物の生物学的活性において、特異的な役割を果たす、２つの別個の構造領域を含有する。２つの領域のうちの大きい方の領域は、４つの単糖単位及び１つの六置換ベンゼン環を含む、伸長糖残基からなり；これらは、高度に稀少な、グリコシド連結、チオエステル連結及びヒドロキシルアミン連結の連鎖を介して、一体に接続される。第２の構造的領域である、アグリコン（カリケアミシノンとして公知である）は、歪みのあるエネジイン単位を、架橋性の１０員環内に有する、稠密かつ高度に官能化された二環性のコアを含有する。このアグリコンサブユニットは、下記において記載される通り、分子の細胞傷害性形態を生じる活性化因子として機能するアリルトリスルフィドをさらに含む。
【００６３】
トリスルフィドの構造を例示するために、カリケアミシンγ１Ｉが、すぐ下の式ＩＶ：
【００６４】
【化７】
2021508694.tif 000010
に示される。
【００６５】
本明細書において使用された、「カリケアミシン」という用語は、Ｎ−アセチル誘導体、スルフィド類似体及びこれらの類似体と共に、カリケアミシンγ１Ｉ、カリケアミシンβ１Ｂｒ、カリケアミシンγ１Ｂｒ、カリケアミシンα２Ｉ、カリケアミシンα３Ｉ、カリケアミシンβ１ｉ及びカリケアミシンδ１のうちのいずれか１つを意味するように理解されるものとする。したがって、本明細書において使用された、「カリケアミシン」という用語は、天然において見出される、任意のカリケアミシンのほか、別の分子（例えば、抗体薬物コンジュゲート）との接合点を有するジスルフィド部分を伴うカリケアミシン分子及びこれらの類似体を包含するように理解される。例を目的として述べると、本明細書において使用されたカリケアミシンγＩは、以下の分子：
【００６６】
【化８】
2021508694.tif 000011
［式中、Ｒ１は、下記の通りに規定される］
を含むとみなされるように理解されるものとする。
【００６７】
前述の化合物のうちのいずれかは、本明細書の教示に適合性であり、開示されたカリケアミシン薬物リンカー構築物及び抗体薬物コンジュゲートを作製するのに使用されうることが理解される。式ＩＩにおいて示された実施形態など、ある特定の実施形態において、開示された抗体薬物コンジュゲートのカリケアミシン構成要素は、Ｎ−アセチルカリケアミシンγ１Ｉ（Ｎ−Ａｃカリケアミシン）を含む。
【００６８】
カリケアミシンは、核酸をターゲティングし、鎖の切断を引き起こし、これにより、標的細胞を死滅させる。より具体的に、カリケアミシンは、ＤＮＡの副溝に結合し、次いで、そこにおいて、バーグマン環化と類似する反応を経て、ジラジカル分子種を生じることが見出されている。これに関して、Ｃｒｏｔｈｅｒｓら（１９９９）により裏付けられている通り、アリール四糖サブユニットは、二重螺旋ＤＮＡの副溝に緊密に結合する薬物を、その標的へと送達するのに用いられる。求核剤（例えば、グルタチオン）が、トリスルフィド基の中心硫黄原子を攻撃すると、これは、構造形状の著明な変化を引き起こし、１０員エネジイン環に対して、多大な歪みを付与する。この歪みは、エネジインが芳香環化反応を起こし高反応性の１，４−ベンゼノイドジラジカルを発生させることにより完全に緩和され、これは最終的に、デオキシリボースＤＮＡ骨格から水素原子を引きつける結果として鎖の切断を生じることにより、ＤＮＡの切断をもたらす。本発明の、カリケアミシンジスルフィド類似体構築物内において、求核剤は、保護されたジスルフィド結合を切断して、所望のジラジカルをもたらすことに注意されたい。
【００６９】
より具体的に、Ｄ［式中、末端の−Ｓ−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３部分は、−Ｓ−Ｓ−
【００７０】
【化９】
2021508694.tif 000012
［式中、記号
【００７１】
【化１０】
2021508694.tif 000013
は、リンカーへの接合点を表す］により置きかえられうる］は、当技術分野において公知であるカリケアミシンのクラスを含むことが理解される。
【００７２】
したがって、ある特定の実施形態において、Ｄは、式Ｖ：
【００７３】
【化１１】
2021508694.tif 000014
［式中、Ｒ１は、水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のヘテロアリール、−ＣＦ３、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３、−ＣＩ３、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１Ｅ、−ＯＲ１Ａ、−ＮＲ１ＢＲ１Ｃ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１Ａ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１ＢＲ１Ｃ、−ＳＲ１Ｄ、−ＳＯｎ１Ｒ１Ｂ又は−ＳＯｖ１ＮＲ１ＢＲ１Ｃである］
のＤである。ある特定の選択された実施形態において、Ｒ１は、Ｈを含む。他の選択された実施形態において、Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３を含む。
【００７４】
Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ１Ｃ、Ｒ１Ｄ及びＲ１Ｅは、独立に、水素、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＣｌ３、−ＣＢｒ３、−ＣＩ３、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−Ｎ（Ｏ）２、−ＳＨ、−Ｓ（Ｏ）３Ｈ、−Ｓ（Ｏ）４Ｈ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−ＮＨＮＨ２、−ＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）−ＯＨ、−ＮＨＯＨ、−ＯＣＦ３、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＢｒ３、−ＯＣＩ３、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＨＣｌ２、−ＯＣＨＢｒ２、−ＯＣＨＩ２、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール又は置換若しくは非置換のヘテロアリールである。
【００７５】
一部の実施形態において、同じ窒素原子へと結合された、Ｒ１Ｂ及びＲ１Ｃの置換基は、任意選択的に、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル又は置換若しくは非置換のヘテロアリールを形成するように接続される。記号ｎ１は、独立に、０〜４の整数であり、記号ｖ１は、独立に、１又は２であり、記号
【００７６】
【化１２】
2021508694.tif 000015
は、リンカーへの接合点を表す。
【００７７】
式Ｖに関して、例示された化合物は、好ましくは、リンカーの残余部分に共有結合的に結合されたジスルフィド保護基に結合された（
【００７８】
【化１３】
2021508694.tif 000016
により表された接合点において）、ジスルフィドカリケアミシン類似体（例えば、式ＩＩに示された類似体などのＮ−アセチルカリケアミシン類似体）を含むことが理解される。ジスルフィド保護基は、血流中のジスルフィド結合の安定性を改善し、開示されたカリケアミシン−リンカー構築物の効果的な合成を可能とする。ある特定の実施形態において、カリケアミシンのジスルフィド基は、好ましくは、ＡＤＣが、標的細胞に到達するまで、安定性（例えば、血漿安定性）をもたらす、置換若しくは非置換の、短鎖二官能性の脂肪族基又はアリール基（「ジスルフィド保護基」）により保護される。より具体的に、ジスルフィド保護基の立体配置は、ジスルフィド結合に対する、ある程度の立体障害をもたらし、これにより、チオール−ジスルフィド交換反応を介する切断に対するその感受性を低減する。この位置において、ジスルフィド保護基は、カリケアミシンジスルフィド基を、非切断型リンカーの残余部分と、共有結合的に連結する。
【００７９】
標的（例えば、がん細胞）に到達すると、リンカーは、好ましくは、切り離される、又は分解されて、ジスルフィド保護基を介してリンカーの一部へと接合されたカリケアミシンを放出する。ある特定の実施形態において、リンカーが、ジスルフィド保護基の向こう側（すなわち、カリケアミシンから遠位側）において、まず切断されると、カリケアミシンへと接合されたリンカーの残余部分は、生理学的条件下において、ジスルフィド結合が切り離される（好ましくは、細胞内において）のに続き、活性のビラジカルカリケアミシン分子種の再配置及び形成がなされるところまで分解される。細胞内ＤＮＡの副溝に結合し、所望の細胞傷害性効果を誘導するのは、この形態のカリケアミシンウォーヘッドである（参照によりその全体において本明細書に組み込まれた、Ｗａｌｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８９：４６０８〜４６１２、５／９２を参照されたい）。
【００８０】
リンカー化合物
上記において示された通り、本発明に適合性のペイロードは、１つ以上のウォーヘッド及びウォーヘッドを、抗体によるターゲティング剤と会合させる非切断型リンカーを含む。適合性の非切断型リンカーは、ジスルフィド部分を介して、抗体上の反応性の残基（好ましくは、システイン又はリシン）及びカリケアミシンと、共有結合的に結合する。
【００８１】
特に好ましい実施形態において、リンカーは、選択された非切断型リンカーを含む。ある特定の実施形態において、ＡＤＣは、標的細胞内のリソソームによるＡＤＣ分解時に、カリケアミシンペイロードを遊離させる、アミド連結されたポリエチレングリコール又はアルキルによるスペーサーを含有する、適合性の非切断型リンカーを含む。式ＩＩにおいて使用された、特に適合性の非切断型リンカーは、すぐ下の式ＶＩＩ：
【００８２】
【化１４】
2021508694.tif 000017
［式中、波線は、カリケアミシンのジスルフィド基への接合点を指し示す］
に示される。リンカー構成要素を含む式ＩＩの合成は、付帯条件と共に、下記の実施例３に示される。
【００８３】
コンジュゲーション
当技術分野において、治療用化合物を、システイン残基へとコンジュゲートさせるための多様な方法が公知であり、当業者に明らかである。塩基性条件下において、システイン残基は、脱プロトン化されて、マレイミド及びヨードアセトアミドなど、ソフトな求電子剤と反応させうるチオレート求核剤を発生させる。一般に、このようなコンジュゲーションのための試薬は、システインのチオールと直接反応して、コンジュゲートタンパク質を形成する場合もあり、リンカー薬物と反応して、リンカー薬物中間体を形成する場合もある。リンカーの場合、当業者に、有機化学反応、有機化学条件及び有機化学試薬を利用する、以下を含むいくつかの経路が公知である：（１）本発明のタンパク質のシステイン基の、リンカー試薬との反応であって、共有結合を介して、タンパク質−リンカー中間体を形成する反応、及びこれに続く、活性化化合物との反応；並びに（２）化合物の求核基の、リンカー試薬との反応であって、共有結合を介して、薬物リンカー中間体を形成する反応、及びこれに続く、本発明のタンパク質のシステイン基との反応。
【００８４】
コンジュゲーションの前に、抗体は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又は（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤を伴う処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションについて反応性とされうる。他の実施形態において、リシンの、２−イミノチオラン（トラウト試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はＳＡＴ（ＰＥＧ）４を含むがこれらに限定されない試薬との反応であって、アミンのチオールへの転換を結果としてもたらす反応により、さらなる求核基が、抗体へと導入されうる。
【００８５】
コンジュゲーション試薬は一般に、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル及びホスホロアミダイトを含むが、他の官能基もまた使用されうる。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、システインのチオールと反応して、化合物と反応性のチオエーテルをもたらす、マレイミド、ヨードアセトイミド又はハロゲン化ハロアセチル／アルキル、アジリジン、アクリロイル誘導体の使用を含む。また、遊離チオールの、活性化ピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換（例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）も、コンジュゲートを作製するのに有用である。好ましくは、マレイミドが使用される。
【００８６】
上記において論じられた通り、部位特異的抗体又は操作抗体は、少なくとも部分的に、本明細書において明示された、操作遊離システイン部位（複数可）及び／又は新規のコンジュゲーション手順についての規定に照らして、安定性及び実質的な均質性の増強を呈するコンジュゲート調製物を可能とする。コンジュゲーション部位をもたらすのに、抗体の鎖内又は鎖間のジスルフィド結合の各々を、完全に、又は部分的に還元する（そして、本発明に完全に適合性である）、従来のコンジュゲーション法と異なり、本発明は加えて、ある特定の、調製された遊離システイン部位の選択的還元及び薬物リンカーの遊離システイン部位への接合をもたらす。
【００８７】
これに関して、操作部位及び選択的還元により促進されたコンジュゲーションの特異性が、所望の位置における、高百分率の部位指向性コンジュゲーションを可能とすることが理解される。重要なことに、軽鎖定常領域の末端領域内に存在するコンジュゲーション部位など、これらのコンジュゲーション部位の一部は、他の遊離システインと交差反応するので、効果的にコンジュゲートさせるのが典型的に困難である。しかし、分子的操作及び結果として得られる遊離システインの選択的還元を介して、効率的なコンジュゲーション率が得られ、これは、望ましくない高ＤＡＲ夾雑物及び非特異的毒性が大幅に低減しうる。より一般に、操作構築物、及び開示された、新規のコンジュゲーション法であって、選択的還元を含むコンジュゲーション法は、薬物動態及び／又は薬力学が改善されたＡＤＣ調製物をもたらし、潜在的に、治療指数の改善をもたらす。
【００８８】
ある特定の実施形態において、部位特異的構築物は、遊離システイン（複数可）を提示するが、これは、還元されると、求核基であり、上記において開示された求電子基など、リンカー部分上の求電子基と反応して、共有結合を形成することが可能であるチオール基を含む。上記において論じられた通り、本発明の抗体は、好ましくは、鎖間の還元可能な不対システイン、すなわち、このような求核基をもたらすシステインを有する。したがって、ある特定の実施形態において、還元された遊離システインの遊離スルフヒドリル基と、適合性の薬物リンカーの末端のマレイミド基又はハロアセトアミド基との反応は、所望のコンジュゲーションをもたらす。このような場合において、抗体の遊離システインは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤を伴う処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションについて反応性とされうる。各遊離システインは、これにより、理論的に、反応性チオールである求核剤を提示する。このような試薬が適合性であるが、部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に一般に公知である、多様な反応、条件及び試薬を使用して達成されうることが理解される。
【００８９】
加えて、操作抗体の遊離システインは、部位指向性コンジュゲーションの増強及び望ましくない、潜在的に毒性の夾雑物の低減をもたらすように、選択的に還元されうることも見出された。より具体的に、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質内の分子内相互作用及び分子間相互作用をモジュレートし、選択された還元剤（好ましくは、比較的マイルドな）で、本明細書において明示される通り、遊離システインを選択的に還元し、部位特異的コンジュゲーションを容易とするのに使用されうることが見出されている。本明細書において使用された、「選択的還元」又は「を選択的に還元すること」という用語は、互換的に使用される場合があり、操作抗体内に存在する天然のジスルフィド結合を実質的に破壊することのない、遊離システインの還元を意味するものとする。選択された実施形態において、これは、ある特定の還元剤又はある特定の還元剤濃度の使用により実行されうる。他の実施形態において、操作構築物の選択的還元は、還元剤（マイルドな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。「選択的コンジュゲーション」という用語は、選択的に還元された操作抗体の、本明細書に記載された細胞毒素とのコンジュゲーションを意味するものとすることが理解される。これに関して、このような安定化剤（例えば、アルギニン）の、選択された還元剤と組み合わせた使用は、抗体重鎖上及び抗体軽鎖上のコンジュゲーションの程度並びに調製物のＤＡＲ分布により決定される、部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善しうる。適合性の抗体構築物及び選択的コンジュゲーション技術及び試薬は、ＷＯ２０１５／０３１６９８において広範に記載されており、これは、特にそのような方法及び構築物との関連で、本明細書に組み込まれる。
【００９０】
いかなる特定の理論により束縛されることも望まないが、このような安定化剤は、所望されるコンジュゲーション部位において、静電微小環境をモジュレートし、かつ／又はコンフォメーション変化をモジュレートするように作用することが可能であり、これにより、比較的マイルドな還元剤（インタクトの天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）が、所望の遊離システイン部位（複数可）におけるコンジュゲーションを容易とすることを可能とする。このような薬剤（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩架橋（水素結合及び静電相互作用を介する）を形成することが公知であり、タンパク質間相互作用を、好適なコンフォメーション変化を引き起こし、かつ／又は好適でないタンパク質間相互作用を低減しうる、安定化効果を付与するような形においてモジュレートしうる。さらに、このような薬剤は、還元後における、所望されない分子内（及び分子間）システイン間結合の形成を阻害し、これにより、操作部位特異的システインが、薬物に結合する（好ましくはリンカーを介して）、所望のコンジュゲーション反応を容易とするようにも作用しうる。選択的還元条件は、インタクトの天然のジスルフィド結合の著明な還元をもたらさないので、後続のコンジュゲーション反応は、当然ながら、遊離システイン上の比較的少数の反応性チオール（例えば、好ましくは、抗体１つ当たり２つずつの遊離チオール）へと駆動される。既に示唆した通り、このような技法は、本開示に従い作製されたコンジュゲート調製物中の、非特異的コンジュゲーション及び対応する望ましくないＤＡＲ分子種のレベルを大幅に低減するのに使用されうる。
【００９１】
選択された実施形態において、本発明に適合性の安定化剤は一般に、塩基性のｐＫａを有する、少なくとも１つの部分を伴う化合物を含む。ある特定の実施形態において、部分は、一級アミンを含むが、他の実施形態において、アミン部分は、二級アミンを含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、三級アミン又はグアニジニウム基を含む。他の選択された実施形態において、アミン部分は、アミノ酸を含むが、他の適合性の実施形態において、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質構成性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、非タンパク質構成性アミノ酸を含む。一部の実施形態において、適合性の安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリン及びシステインを含みうる。ある特定の好ましい実施形態において、安定化剤は、アルギニンを含む。加えて、適合性の安定化剤は、グアニジン及び塩基性ｐＫａを伴う窒素含有ヘテロ環を含みうる。
【００９２】
ある特定の実施形態において、適合性の安定化剤は、約７．５を超えるｐＫａを有する、少なくとも１つのアミン部分を伴う化合物を含み、他の実施形態において、対象のアミン部分は、約８．０を超えるｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、アミン部分は、約８．５を超えるｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約９．０を超えるｐＫａを有するアミン部分を含む。他の実施形態は、アミン部分が、約９．５を超えるｐＫａを有する安定化剤を含むが、ある特定の他の実施形態は、約１０．０を超えるｐＫａを有する、少なくとも１つのアミン部分を呈する安定化剤を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１０．５を超えるｐＫａを伴うアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態において、安定化剤は、約１１．０を超えるｐＫａを伴うアミン部分を有する化合物を含むが、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１１．５を超えるｐＫａを伴うアミン部分を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．０を超えるｐＫａを伴うアミン部分を有する化合物を含むが、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．５を超えるｐＫａを伴うアミン部分を含む。当業者は、標準的な技法を使用して、関連するｐＫａが、容易に計算又は決定される場合があり、選択された化合物を、安定化剤として使用する適用可能性を決定するのに使用されうることを理解する。
【００９３】
開示された安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わされると、コンジュゲーションを、部位特異的遊離システインへとターゲティングするのに特に有効であることが示されている。本発明の目的のために、適合性の還元剤は、操作抗体の天然のジスルフィド結合を著明に破壊せずに、還元された部位特異的遊離システインをもたらす、任意の化合物を含みうる。選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされる、このような条件下において、活性化薬物リンカーは、大部分、所望の部位特異的遊離システイン部位（複数可）への結合へと制限される。比較的マイルドな還元剤又はマイルドな条件をもたらすように、比較的低濃度において使用される還元剤が、特に好ましい。本明細書において使用された、「マイルドな還元剤」又は「マイルドな還元条件」という用語は、操作抗体内に存在する天然のジスルフィド結合を実質的に破壊せずに、遊離システイン部位においてチオールをもたらす還元剤（任意選択的に、安定化剤の存在下における）によりもたらされる、任意の薬剤又は状態を意味するように理解されるものとする。すなわち、マイルドな還元剤又はマイルドな還元条件（好ましくは、安定化剤と組み合わせた）は、タンパク質の天然のジスルフィド結合を著明に破壊せずに、遊離システイン（複数可）を効果的に還元する（チオールをもたらす）ことが可能である。所望の還元条件は、選択的なコンジュゲーションに適切な環境を確立する、多数のスルフヒドリルベースの化合物によりもたらすことができる。複数の実施形態において、マイルドな還元剤は、１つ以上の遊離チオールを有する化合物を含みうるが、一部の実施形態において、マイルドな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明の選択的還元法に適合性の還元剤の非限定例は、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオール及び２−ヒドロキシエタン−１−チオールを含む。
【００９４】
さらに、コンジュゲーションが可能な操作抗体は、抗体が作製又は保存されるときに、保護又はキャッピングされるスルフヒドリル基を含む、遊離システイン残基を含有しうることがさらに理解される。このようなキャップは、スルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲートの形成を防止又は阻害する、低分子、タンパク質、ペプチド、イオン及び他の材料を含む。場合によって、コンジュゲートされていない操作抗体は、同じ抗体上又は異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含みうる。本明細書において論じられる通り、このような交差反応性は、作製手順において、多様な夾雑物をもたらしうる。一部の実施形態において、操作抗体は、コンジュゲーション反応の前に、キャッピング解除を必要としうる。具体的な実施形態において、本明細書の抗体は、キャッピング解除され、コンジュゲーションが可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。具体的な実施形態において、本明細書の抗体は、天然に存在するジスルフィド結合を攪乱又は再構成しないキャッピング解除反応にかけられる。大半の場合に、キャッピング解除反応は、通常の還元反応（還元又は選択的還元）時に生じることが理解される。
【００９５】
ＤＡＲ分布及び精製
選択された実施形態において、本発明と適合性である、コンジュゲーション法及び精製法は、緊密なＤＡＲ分布を含む、比較的均質なＡＤＣ調製物を作出する能力をもたらすので有利である。これに関して、開示された構築物（例えば、部位特異的構築物）及び／又は選択的コンジュゲーションは、試料中のＡＤＣ分子種の、薬物と操作抗体との間の当量比についての均質性及び毒素の場所に関する均質性をもたらす。上記において略述された通り、「薬物対抗体比」又は「ＤＡＲ」という用語は、ＡＤＣ調製中の、薬物の抗体に対するモル比を指す。ある特定の実施形態において、コンジュゲート調製物は、そのＤＡＲ分布に関して、実質的に均質でありうるが、これは、ＡＤＣ調製物中に、特定の薬物ローディングを伴う（例えば、薬物ローディングを２とする）部位特異的ＡＤＣの主要な分子種であって、ローディング部位（すなわち、遊離システイン上）に関してもまた均質な分子種が存在することを意味する。本発明のある特定の他の実施形態において、部位特異的抗体及び／又は選択的還元及びコンジュゲーションの使用により、所望の均質性を達成することが可能である。他の実施形態において、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた、部位特異的構築物の使用により達成されうる。さらに他の実施形態において、適合性の調製物は、所望の均質性をもたらすように、解析用クロマトグラフィー法又は分取クロマトグラフィー法を使用して精製されうる。これらの実施形態の各々において、ＡＤＣ試料の均質性は、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ除外ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）、又はキャピラリー電気泳動を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の多様な技法を使用して解析されうる。
【００９６】
ＡＤＣ調製物の精製に関して、所望の純度を得るのに、標準的な医薬調製法が利用されうることが理解される。本明細書において論じられる通り、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法は、混合物中の化合物を、薬物ローディング値により分離しうる。場合によって、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）又は混合式クロマトグラフィー（ＭＭＣ）もまた、特異的薬物ロードを伴う分子種を単離するのに使用されうる。
【００９７】
いずれにせよ、開示されたＡＤＣ及びこの調製物は、薬物と抗体部分とを、抗体の立体配置と、少なくとも部分的に、コンジュゲーションを実行するのに使用される方法とに応じて、多様な当量モル比で含みうる。ある特定の実施形態において、ＡＤＣ１つ当たりの薬物ローディングは、カリケアミシンウォーヘッドによる２を含みうる。
【００９８】
本発明により提供された、比較的高レベルの均質性にも拘らず、開示された組成物は、実際に、ある範囲の薬物化合物を伴うコンジュゲートの混合物を含む。このように、開示されたＡＤＣ組成物は、構成要素である抗体の大半が、１つ以上の薬物部分へと、共有結合的に連結され（操作構築物及び選択的還元によりもたらされる、コンジュゲートの相対的な特異性にも拘わらず）、薬物部分が、多様なチオール基により、抗体へと接合されうる、コンジュゲートの混合物を含む。すなわち、コンジュゲーションの後、本発明の組成物は、異なる薬物ロードを、多様な濃度において伴う、ＡＤＣの混合物（遊離システインの交差反応性により主に引き起こされた、ある特定の反応夾雑物と共に）を含む。しかし、選択的還元及び作製後精製を使用して、コンジュゲート組成物は、それらが大体において、単一の、主要な、所望されるＡＤＣ分子種（例えば、薬物ローディングを２とする）を含有し、他のＡＤＣ分子種（例えば、薬物ローディングを１、４、６などとする）を比較的低レベルとする地点へと駆動されうる。平均ＤＡＲ値は、全体としての組成物（すなわち、一まとめにされた、全てのＡＤＣ分子種）に対する薬物ローディングの加重平均を表す。当業者は、許容可能なＤＡＲ値又は仕様は、平均、範囲又は分布として（すなわち、平均ＤＡＲを、２±０．５として）提示されることが多いことを理解する。好ましくは、測定された平均ＤＡＲを、範囲（すなわち、１．５〜２．５の）内において含む組成物は、薬学的に状況において使用される。
【００９９】
したがって、一部の実施形態において、本発明は、平均ＤＡＲを、２±０．５とする組成物を含む。他の実施形態において、本発明は、２±０．４の平均ＤＡＲ又は２±０．３の平均ＤＡＲ又は２±０．２の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、比較的低レベル（すなわち、３０％未満）の副次的ＡＤＣ分子種（例えば、薬物ローディングを、０、１、３、４、５などとするＡＤＣ）を伴う組成物を含む。一部の実施形態において、ＡＤＣ組成物は、比較的低レベル（＜３０％）の副次的ＡＤＣ分子種を伴う、２±０．４の平均ＤＡＲを含む。一部の実施形態において、ＡＤＣ組成物は、比較的低レベル（＜３０％）の副次的ＡＤＣ分子種を伴う、２±０．３の平均ＤＡＲを含む。さらに他の実施形態において、主要なＡＤＣ分子種（例えば、ＤＡＲを２とする）は、組成物中に存在する、他の全てのＤＡＲ分子種に照らして測定する場合、５０％を超える濃度、５５％を超える濃度、６０％を超える濃度、６５％を超える濃度、７０％を超える濃度、７５％を超える濃度、８０％を超える濃度、８５％を超える濃度、９０％を超える濃度、９３％を超える濃度、９５％を超える濃度、なお又は９７％を超える濃度において存在する。
【０１００】
下記の実施例において詳述される通り、コンジュゲーション反応に由来するＡＤＣ調製物中の、抗体１つ当たりの薬物の分布は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡ及び電気泳動など、従来の手段により特徴づけられうる。また、抗体１つ当たりの薬物に照らしたＡＤＣの定量的分布も決定されうる。
【０１０１】
医薬調製物及び治療的使用
本発明の抗体又はＡＤＣは、当技術分野において認知された技法を使用して、多様な方式において製剤化されうる。一部の実施形態において、本発明の治療用組成物は、さらなる成分を伴わずに、又は最小限のさらなる成分を伴って投与されうるが、他の成分は、任意選択的に、適切な、薬学的に許容される担体を含有するように製剤化されうる。本明細書において使用された、「薬学的に許容される担体」は、当技術分野において周知の賦形剤、媒体、アジュバント及び希釈剤を含む。
【０１０２】
投与量及び投与レジメン
特定の投与レジメン、すなわち、用量、投与時期、及び投与回数は、特定の個体に依存するほか、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）などの経験的な検討事項にも依存する。投与頻度の決定は、主治医などの当業者により、処置される状態及び状態の重症度、処置される対象の年齢及び全般的健康状態などの検討に基づき下されうる。投与頻度は、治療コースにわたり、選択された組成物及び投与レジメンの効能についての評価に基づき調整されうる。このような評価は、特異的な疾患、障害又は状態についてのマーカーに基づき行われうる。個体ががんを有する実施形態において、これらは、触診若しくは目視観察を介する腫瘍サイズの直接的な測定；ｘ線若しくは他のイメージング法を介する腫瘍サイズの間接的な測定；直接的な腫瘍の生検及び腫瘍試料の顕微鏡観察により評価された改善；当技術分野において認知された技法に従い同定された、間接的な腫瘍マーカー若しくは抗原についての測定；増殖性細胞若しくは腫瘍形成性細胞の数の低減、このような新生物性細胞の低減の維持；新生物性細胞の増殖の低減又は転移の発症の遅延を含む。
【０１０３】
適応
本発明は、本発明のＡＤＣの、多様な新生物性障害の処置のための使用を提供する。ある特定の実施形態において、処置される疾患は、充実性腫瘍を含む新生物性状態である。選択された実施形態において、本発明のＡＤＣは、ＳＥＺ６決定基を発現させる腫瘍又は腫瘍形成性細胞を処置するのに使用されうる。ある特定の他の実施形態において、開示されたＡＤＣは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を患う対象を処置するのに使用されうる。処置される「対象」又は「患者」は、好ましくは、ヒトであるが、本明細書において使用された通り、用語は、明示的に、任意の哺乳動物種を含むものと考えられる。
【０１０４】
選択された実施形態において、ＡＤＣは、限局期疾患を呈する患者に投与される場合もあり、拡張期疾患を呈する患者に投与される場合もある。他の実施形態において、開示されたＡＤＣは、不応性患者（すなわち、初期治療のコースの間に、又はこれを完了した直後に、その疾患が再発する不応性患者）；感受性の患者（すなわち、その再発が一次治療の２〜３カ月より長期間後である患者）又は白金ベースの薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）及び／又はタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル又はカバジタキセル）に対する耐性を呈する患者へと投与される。ある特定の好ましい実施形態において、本発明のＳＥＺ６  ＡＤＣは、第一選択患者へと投与されうる。他の実施形態において、本発明のＳＥＺ６  ＡＤＣは、第二選択患者へと投与されうる。さらに他の実施形態において、本発明のＳＥＺ６  ＡＤＣは、第三選択患者又は第四選択患者へと投与されうる。
【０１０５】
製品
本発明は、１つ以上の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ又はｒｅｃｅｐｔａｃｌｅｓ）を含む、医薬パック及び医薬キットを含み、この場合、容器は、投与１回以上分の、本発明のＡＤＣを含みうる。ある特定の実施形態において、パック又はキットは、単位投与量を含有するが、これは、例えば、１つ以上のさらなる薬剤と、任意選択的に、１つ以上の抗がん剤とを伴う、又は伴わずに、本発明のＡＤＣを含む、所定量の組成物を意味する。
【０１０６】
キットの構成要素が、１つ以上の溶液により用意される場合、水溶液又は非水溶液であるが、典型的に、水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キット内の製剤はまた、適切な液体を添加すると復元されうる、乾燥粉末（複数可）形態又は凍結乾燥形態としても用意されうる。復元のために使用される液体は、別個の容器内に含有されうる。このような液体は、注射用の静菌水など、滅菌の、薬学的に許容される緩衝剤（複数可）又は他の希釈剤（複数可）を含みうる。キットが、本発明のＡＤＣを、さらなる治療剤又は薬剤と組み合わせて含む場合、溶液は、モル等量の組合せにおいて、あらかじめ混合される場合もあり、１つの構成要素を、他の構成要素に対する過剰量において、あらかじめ混合される場合もある。代替的に、本発明のＡＤＣ及び任意選択による任意の抗がん剤又は他の薬剤は、患者への投与の前に、別個の容器内に、個別に維持される場合もある。
【０１０７】
ある特定の好ましい実施形態において、本発明の組成物を組み込む、前述のキットは、キットの内容物が、がんの処置のために使用されうることを指し示す、ラベル、マーカー、パッケージ添付文書、バーコード及び／又はリーダーを含む。他の好ましい実施形態において、キットは、キットの内容物が、がんを患う対象を処置するための、ある特定の投与量又は投与レジメンに従い投与されうることを指し示す、ラベル、マーカー、パッケージ添付文書、バーコード及び／又はリーダーを含みうる。他の特に好ましい態様において、ラベル、マーカー、パッケージ添付文書、バーコード及び／又はリーダーは、キットの内容物が、小細胞肺がんの処置のために使用されうること又は小細胞肺がんの処置のための投与レジメンを指し示す。
【０１０８】
適切な容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ又はｒｅｃｅｐｔａｃｌｅｓ）は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、注入バッグ（ｉ．ｖ．バッグ）などを含む。容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）は、ガラス又は薬学的に適合性のプラスチックなど、様々な材料から形成されうる。ある特定の実施形態において、容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）（複数可）は、滅菌アクセスポートを含みうる。例えば、容器は、静脈内注射用溶液バッグの場合もあり、皮下注射用注射針により穿刺されうる止栓を有するバイアルの場合もある。
【０１０９】
一部の実施形態において、キットは、ＡＤＣ及び任意選択による任意の構成要素を患者に投与するための手段、例えば、１つ以上の注射針若しくはシリンジ（あらかじめ充填された、又は空の）又は他のこのような装置であって、それにより、製剤が、対象へと注入若しくは導入される、又は身体の疾患領域へと適用される装置を含有しうる。本発明のキットはまた、バイアルなど及び他の構成要素を、市販用の密閉容器であって、例えば、所望のバイアル及び他の装置が、それらの中へと入れられ、保持される、吹込成形されたプラスチック容器などの密閉容器に格納するための手段も含むことが典型的である。
【０１１０】
その他
本明細書において、そうでないことが規定されない限りにおいて、本発明との関連において使用された科学技術用語は、当業者により一般的に理解された意味を有するものとする。さらに、文脈によりそうでないことが要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。加えて、本明細書及び添付の特許請求の範囲において提示された範囲は、端点及び端点の間の全ての点の両方を含む。したがって、２．０〜３．０の範囲は、２．０、３．０及び２．０〜３．０の間の全ての点を含む。
【０１１１】
一般に、本明細書に記載された、細胞及び組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びに化学の技法は、当技術分野において周知であり、一般に使用されている。本明細書において、このような技法との関連において使用された用語法はまた、当技術分野においても一般に使用されている。そうでないことが指し示されない限りにおいて、本発明の方法及び技法は一般に、当技術分野において周知であり、本明細書を通して引用される、多様な参考文献において記載されている、従来の方法に従い実施される。
【０１１２】
参考文献
本明細書において引用された、全ての特許、特許出願及び刊行物並びに電子的に入手可能な素材（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける、ヌクレオチド配列の寄託並びに、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤにおけるアミノ酸配列の寄託並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける、注釈を施されたコード領域からの翻訳を、例えば、含む）についての完全な開示は、特定の参考文献との関連において、「参照により組み込まれた」という語句が使用されているのかどうかに関わらず、参照により組み込まれる。前出の詳細な記載及び後続の実施例は、理解の明確さのためだけに与えられている。そこから不要な限定がなされるわけではないものと理解されたい。本発明は、示され、記載された、正確な詳細に限定されるわけではない。特許請求の範囲により規定された本発明に、当業者に明白な変動も含まれる。本明細書において使用された、任意の節見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載された対象物を限定するとはみなさないものとする。
【実施例】
【０１１３】
８．実施例
上記において一般的に記載された本発明は、例示を目的として提示されたものであり、本発明を限定することを意図されたものではない、以下の実施例を参照することにより、よりたやすく理解される。実施例は、下記の実験が、実施された全ての実験又は唯一の実験であることを表すように意図されたものではない。そうでないことが指し示されない限りにおいて、部分は、重量による部分であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧又は大気圧近傍の圧力である。
【０１１４】
配列表の概要
表２は、本明細書に含まれたアミノ酸配列及び核酸配列についての概要を提示する。
【０１１５】
【表２】
2021508694.tif 000018
【０１１６】
［実施例１］  ＳＥＺ６抗体の作出
ＳＥＺ６マウス抗体は、本明細書の教示に従い、ヒトＳＥＺ６−Ｆｃの接種を介して作製した。これに関して、３つのマウス株を使用して、多様な増殖性障害を防止及び／又は処置するために、ヒトＳＥＺ６（例えば、ＮＰ＿８４９１９１：ＳＥＺ６（ｓｅｉｚｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６）相同体アイソフォーム１前駆体；ＮＰ＿００１０９２１０５：ＳＥＺ６（ｓｅｉｚｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６）相同体アイソフォーム２前駆体）に会合し、かつ／又はこの作用を阻害するのに使用されうる、高アフィニティーの、マウスモノクローナル抗体によるモジュレーターを作出した。具体的に、Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１及びＦＶＢのマウス株を、ヒト組換えＳＥＺ６−Ｆｃにより免疫化し、ハイブリドーマを作製するのに使用した。
【０１１７】
ＳＥＺ６−Ｆｃ抗原を、ＳＥＺ６−Ｆｃ構築物を過剰発現させるＣＨＯ−Ｓ細胞に由来する上清から精製した。１０μｇのＳＥＺ６−Ｆｃ免疫原を、初回の免疫化に使用するのに続き、５μｇ及び２．５μｇのＳＥＺ６−Ｆｃ免疫原を、それぞれ、後続の、３回の免疫化及び５回の免疫化に使用した。全ての免疫化は、等容量のＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）アジュバント又はアラムアジュバントにより乳化された免疫原により実施した。マウス抗体は、全ての注射のために、足蹠経路を介して、６匹の雌マウス（各々２匹ずつ：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）を免疫化することにより作出した。
【０１１８】
固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、マウス血清を、ヒトＳＥＺ６に特異的なマウスＩｇＧ抗体についてスクリーニングした。バックグラウンドを上回る正のシグナルは、ＳＥＺ６に特異的な抗体を示した。略述すると、９６ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ｃａｔ＃６１０７４４）を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中に０．５μｇ／ｍｌの組換えＳＥＺ６−Ｈｉｓにより、一晩にわたりコーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳによる洗浄の後、ウェルを、ＰＢＳ中に３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、ウェル１つ当たり２００μＬにより、室温（ＲＴ）において、１時間にわたりブロッキングした。マウス血清を滴定（１：１００、１：２００、１：４００及び１：８００）し、ＳＥＺ６によりコーティングしたプレートへと、ウェル１つ当たり５０μＬにおいて添加し、ＲＴにおいて、１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ又はＰＢＳ中に２％のＦＣＳ中、１：１０，０００に希釈された、ウェル１つ当たり５０μＬの、ＨＲＰにより標識されたヤギ抗マウスＩｇＧと共に、ＲＴにおいて、１時間にわたりインキュベートした。再度、プレートを洗浄し、ウェル１つ当たり４０μＬのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：３４０２８）を、ＲＴにおいて、１５分間にわたり添加した。発色の後、等容量の２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、基質の発色を停止させ、プレートを、ＯＤ  ４５０において、分光光度計により解析した。
【０１１９】
血清陽性の免疫化マウスを屠殺し、流入領域リンパ節（膝窩リンパ節及び鼠径リンパ節並びに、肥大した場合、内側外腸骨リンパ節）を切出し、抗体産生細胞のための供給源として使用した。Ｂ細胞（細胞２２８．９×１０６個）の単一細胞懸濁液を、非分泌性Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ  ＃ＣＲＬ−１５８０）と、電気融合により、１：１の比において融合させた。電気融合は、製造元の指示に従い、ＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ（商標）システム（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して実施した。融合手順の後、細胞を、アザセリン（Ｓｉｇｍａ＃Ａ９６６６）、ピルビン酸ナトリウムを伴う高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ  ｃａｔ＃１５−０１７−ＣＭ）であって、１５％の胎仔クローンＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトアビジン及び５０μＭの２−メルカプトエタノールを含有する高グルコースＤＭＥＭ培地を補充したハイブリドーマ選択培地中に再懸濁させ、次いで、３つのＴ２２５フラスコの、フラスコ１つ当たり９０ｍＬの選択培地中に播種した。次いで、フラスコを、５％ＣＯ２及び９５％の空気を含有する、３７℃の加湿型インキュベータ内に、６〜７日間にわたり入れた。
【０１２０】
増殖の６〜７日後、Ａｒｉａ  Ｉ細胞分取器を使用して、Ｔ２２５内、バルクにおいて増殖させた細胞からなるライブラリーを、ウェル１つ当たりの細胞１個において、Ｆａｌｃｏｎ  ９６ウェルＵ字底プレート内に播種した。次いで、選択されたハイブリドーマを、１５％の胎仔クローンＩ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％のＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトアビジン、５０μＭの２−メルカプトエタノール及び１００μＭのヒポキサンチンを含有する、２００μＬの培養物培地中に増殖させた。未使用のハイブリドーマライブラリー細胞の任意の残りは、将来のライブラリー試験のために凍結させた。増殖の１０〜１１日後、各ウェルの播種された細胞に由来する上清を、ＥＬＩＳＡアッセイ及びＦＡＣＳアッセイにより、ＳＥＺ６に対して反応性の抗体についてアッセイした。
【０１２１】
ＥＬＩＳＡによるスクリーニングのために、９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中０．３μｇ／ｍＬのＳＥＺ６−Ｆｃにより、４℃において、一晩にわたりコーティングした。プレートを、洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中３％のＢＳＡにより、３７℃において、１時間にわたりブロッキングし、速やかに使用した、又は４℃において保存した。未希釈のハイブリドーマ上清を、プレート上、ＲＴにおいて、１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、３％のＢＳＡ−ＰＢＳ中、１：１０，０００に希釈された、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧにより、ＲＴにおいて、１時間にわたりプローブした。次いで、プレートを、上記において記載した通りに、基質溶液と共にインキュベートし、ＯＤ  ４５０において読み取った。バックグラウンドを上回るシグナルにより決定される通り、ヒトＳＥＺ６に優先的に結合した免疫グロブリンを含有するウェルを移し、拡大した。
【０１２２】
マウス免疫グロブリンを分泌する、選択された増殖陽性ハイブリドーマウェルはまた、選択された種特異的抗原を過剰発現させるように操作された２９３細胞を伴うフローサイトメトリーベースのアッセイを使用して、ヒトＳＥＺ６への特異性並びにカニクイザル、ラット及びマウスのＳＥＺ６への交差反応性についてもスクリーニングした。
【０１２３】
フローサイトメトリーアッセイのために、ヒト、カニクイザル、ラット又はマウスのＳＥＺ６を、それぞれ、形質導入された、５０×１０４個のｈ２９３細胞を、２５〜１００μＬのハイブリドーマ上清と共に、３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、ＰＢＳ、２％のＦＣＳにより、２回にわたり洗浄し、次いで、ＰＢＳ／２％のＦＣＳ中、１：２００に希釈されたＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９へとコンジュゲートされた、５０μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。１５分間にわたるインキュベーションの後、細胞を、ＰＢＳ、２％ＦＣＳにより、２回にわたり洗浄し、ＤＡＰＩを伴う、同じ緩衝液中に再懸濁させ、製造元の指示書に従い、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを使用して、フローサイトメトリーにより解析した。ＳＥＺ６＋ＧＦＰ＋細胞に優先的に結合した免疫グロブリンを含有するウェルを移し、拡大した。結果として得られるｈＳＥＺ６特異的クローンハイブリドーマを、ＣＳ−１０非含有亜鉛培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中に低温保存し、液体窒素中に保存した。ヒト、カニクイザル、ラット又はマウスのＳＥＺ６細胞と結合した抗体は、交差反応性であることが認められた。
【０１２４】
ＥＬＩＳＡ解析及びフローサイトメトリー解析は、これらのハイブリドーマに由来する大半又は全てから精製した抗体が、ＳＥＺ６に、濃度依存的に結合することを確認した。ＳＥＺ６  ＧＦＰ細胞に結合した免疫グロブリンを含有するウェルを移し、拡大した。結果として得られるクローンハイブリドーマを、ＣＳ−１０非含有亜鉛培地（Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中に低温保存し、液体窒素中に保存した。
【０１２５】
１回の融合を実施し、４８のプレート（約４０％のクローニング効率における、４６０８ウェル）内に播種した。初回のスクリーニングは、ヒトＳＥＺ６と会合する、６３のマウス抗体をもたらした。その後、２回目のスクリーニングを実施し、ヒトＳＥＺ６と会合する、１３４の抗体をもたらした。
【０１２６】
［実施例２］  ヒト化部位特異的ＳＥＺ６抗体の作製
実施例１による抗体を、さらなる加工及びヒト化のために選び出した。当技術分野において認知された標準的技法を使用して、選択された抗体を発現させるハイブリドーマから、ＲＮＡを、単離、増幅及びシーケンシングした。ヌクレオチド配列情報から、対象のマウス抗体の、重鎖及び軽鎖のＶ、Ｄ及びＪの遺伝子セグメントに関するデータを得た。Ｖ−（Ｄ）−Ｊ配列を、マウスＩｇ生殖細胞系列配列とアライメントし、対象のマウスフレームワーク配列との、それらの最高の配列相同性及びそのＣＤＲグラフティングのためのカノニカル構造に基づき、アクセプターヒト可変フレームワーク領域を選択した。結果として得られる、抗体のヒト化可変領域のための遺伝子配列を、すぐ下の表３Ａに示す。
【０１２７】
【表３】
2021508694.tif 000019
【０１２８】
次いで、操作可変領域を使用して、天然カッパ軽鎖定常（ＬＣ）領域及び不対システインをもたらすように突然変異させた重鎖定常（ＨＣ）領域を含む、ヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＳＥＺ６部位特異的抗体を作出した。これに関して、ＨＣの上部ヒンジ領域内のシステイン２２０（Ｃ２２０）を、セリン（Ｃ２２０Ｓ）により置換して、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体をもたらした。アセンブルされると、ＨＣ及びＬＣは、治療剤へのコンジュゲーションに適する軽鎖定常領域のＣ末端（例えば、Ｃ２１４）において、２つの遊離システインを含む抗体を形成する。そうでないことが注記されない限り、定常領域残基についての全ての番号付けは、Ｋａｂａｔらにおいて明示された、ＥＵ番号付けスキームに従う。
【０１２９】
部位特異的構築物を作出するために、ＶＨ核酸を、Ｃ２２０Ｓ突然変異ＨＣ定常領域を含有する発現ベクターへとクローニングした。ＣＨＯ−Ｓ細胞に、結果として得られる、突然変異体であるＣ２２０Ｓ  ＨＣをコードするベクターを、野生型ＩｇＧ１カッパＬＣと作動可能に会合させた、選択された軽鎖可変領域をコードするベクターと共にコトランスフェクトし、一過性の哺乳動物発現系を使用して発現させた。
【０１３０】
定常領域内に遊離システインをもたらす、Ｃ２２０Ｓ突然変異に加えて、２つのさらなる修飾を、重鎖上に施した。第一に、発現における不均質性を低減するために、Ｃ末端のリシンを欠失させた。第二に、重鎖可変領域内に、保存的突然変異を施して、分子の安定性を改善し、抗体の産生を容易とした。より具体的に、保存的突然変異を、重鎖ＣＤＲ２（Ｋａｂａｔにより規定された）内に組み込んで、カノニカルのグリコシル化部位を消失させた。この部位におけるグリコシル化は、発現するタンパク質内に、結合アフィニティーの低減を結果としてもたらしうる不均質性を、潜在的に付与しうる。したがって、Ｋａｂａｔによる６０位における、セリンのアスパラギンへの置換（Ｓ６０Ｎ）を、重鎖へと組み込んで、グリコシル化部位を消失させた。これらの突然変異を伴う、結果として得られるヒト化抗体を、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１と称した。下記において、より詳細に論じられる通り、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１の、親ヒト化抗体及びマウス供給源抗体との実質的な同等性を、アフィニティーに関して確認した。
【０１３１】
突然変異抗体のヒト化可変領域についての、結果として得られる遺伝子配列を、すぐ下の表３Ｂに示す。
【０１３２】
【表４】
2021508694.tif 000020
【０１３３】
全長ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１部位特異的抗体重鎖のアミノ酸配列は、可変領域の突然変異部位であるＳ６０Ｎ及び定常領域の突然変異部位であるＣ２２０Ｓを有する、配列番号３である。重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下線を付されたＳ６０Ｎ突然変異を有する、配列番号７として下記に示す。
【０１３４】
【化１５】
2021508694.tif 000021
【０１３５】
全長ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１部位特異的抗体軽鎖のアミノ酸配列は、Ｃ２１４において、毒素コンジュゲーション残基を有する、配列番号４である。軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号８として下記に示す。
【０１３６】
【化１６】
2021508694.tif 000022
【０１３７】
［実施例３］  ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１薬物リンカーの調製
式ＩＩ：
【０１３８】
【化１７】
2021508694.tif 000023
に従う薬物リンカー化合物は、すぐ下に明示される通りに合成した。
【０１３９】
【化１８】
2021508694.tif 000024
【０１４０】
ステップ１．  ｔｅｒｔ−ブチル［３４−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４，３２−ジオキソ−７，１０，１３，１６，１９、２２，２５，２８−オクタオキサ−３，３１−ジアザテトラトリアコンタン−１−イル］カルバメート
３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−｛２７−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−２７−オキソ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−１−イル｝プロパンアミド（４３４ｍｇ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中に溶解させ、ｔｅｒｔ−ブチル（２−アミノエチル）カルバメート（１０８．１ｍｇ）により処置した。６時間後、反応混合物を濃縮し、残留物を、０％のＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２〜１０％のＣＨ３ＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２により溶離される、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物（１５４．２ｍｇ）をもたらした。ＬＣ／ＭＳ（解析法Ａ）：Ｒｔ＝１．６５分、ｍ／ｚ：７３５．４６［Ｍ＋Ｈ］＋である。
【０１４１】
【化１９】
2021508694.tif 000025
【０１４２】
ステップ２．  Ｎ−（２−アミノエチル）−３１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−２９−オキソ−４，７，１０，１３、１６，１９，２２，２５−オクタオキサ−２８−アザヘントリアコンタン−１−アミド
ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル保護アミン（ステップ１、１５４．２ｍｇ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中に溶解させ、トリフルオロ酢酸（５００μＬ）を、３０秒間にわたり添加し、結果として得られる混合物を、３０分間にわたり攪拌した。反応完了後、反応混合物を濃縮し、さらに精製せずに使用した。ＬＣ／ＭＳ（解析法Ａ）：Ｒｔ＝１．２９分、ｍ／ｚ：６３５．３９［Ｍ＋Ｈ］＋である。
【０１４３】
【化２０】
2021508694.tif 000026
【０１４４】
ステップ３．  ４−｛［（２Ｅ）−２−｛（１Ｒ，４Ｚ，８Ｓ）−８−（｛（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３−（｛（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−５−［アセチル（エチル）アミノ］−４−メトキシオキサン−２−イル｝オキシ）−５−［（｛（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−５−［（４−｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−４−メトキシ−６−メチルオキサン−２−イル］オキシ｝−３−ヨード−５，６−ジメトキシ−２−メチルベンゾイル）スルファニル］−４−ヒドロキシ−６−メチルオキサン−２−イル｝オキシ）アミノ］−４−ヒドロキシ−６−メチルオキサン−２−イル｝オキシ）−１−ヒドロキシ−１０−［（メトキシカルボニル）アミノ］−１１−オキソビシクロ［７．３．１］トリデカ−４，９−ジエン−２，６−ジイン−１３−イリデン｝エチル］ジスルファニル｝−４−メチルペンタン酸
Ｎ−アセチルカリケアミシンγ１（０．２ｇ、０．１４２ミリモル、１当量）を、アセトニトリル（３０ｍＬ）中に溶解させ、結果として得られる溶液を、−１５℃に冷やした。４−メルカプト−４−メチルペンタン酸（０．４２０ｍＬ、２．８３７ミリモル、２０当量）を、アセトニトリル（１０ｍＬ）中に溶解させ、冷却されたＮ−アセチルカリケアミシンγ１溶液へと、ゆっくりと添加した。トリエチルアミン（０．３７７ｍＬ、２．８３７ミリモル、２０当量）を、反応混合物へと添加し、次いで、反応混合物を、３〜１８時間にわたり、室温へと暖めた。反応が完了したら、混合物を濃縮し、残留物を、乾燥させて、２〜２０％のメタノール／ジクロロメタンにより溶離される、フラッシュクロマトグラフィー精製のために、シリカゲルへとロードして、標題化合物をもたらした。標題化合物は、低温のジエチルエーテルから沈殿させた。ＬＣ／ＭＳ（解析法Ａ）：Ｒｔ＝１．９２分、ｍ／ｚ：１４７８．６４［Ｍ＋Ｈ］＋である。
【０１４５】
【化２１】
2021508694.tif 000027
【０１４６】
ステップ４．  Ｓ−［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，６Ｓ）−６−（｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−５−（｛（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ）−５−［アセチル（エチル）アミノ］−４−メトキシオキサン−２−イル｝オキシ）−６−｛［（２Ｓ，５Ｚ，９Ｒ，１３Ｅ）−１３−［４３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−５，５−ｄｉメチル−８，１３，４１−トリオキソ−１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７−オクタオキサ−３，４−ジチア−９，１２，４０−トリアザトリテトラコンタン−１−イリデン］−９−ヒドロキシ−１２−［（メトキシカルボニル）アミノ］−１１−オキソビシクロ［７．３．１］トリデカ−１（１２），５−ジエン−３，７−ジイン−２−イル］オキシ｝−４−ヒドロキシ−２−メチルオキサン−３−イル］アミノ｝オキシ）−４−ヒドロキシ−２−メチルオキサン−３−イル］４−｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−３，５−ジヒドロキシ−４−メトキシ−６−メチルオキサン−２−イル］オキシ｝−３−ヨード−５，６−ジメトキシ−２−メチルベンゼン−１−カルボチオエート
Ｎ−アセチルカリケアミシン酸（ステップ３、１００ｍｇ、０．０６８ミリモル、１当量）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３．４ｍＬ）中に溶解させ、０℃に冷却した。次いで、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１７６μＬ、１．０１ミリモル、１５当量）及び（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ、４３ｍｇ、０．１ミリモル、１．５当量）を、逐次的に添加した。２分後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００μＬ）中の、Ｎ−（２−アミノエチル）−３１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−２９−オキソ−４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５−オクタオキサ−２８−アザヘントリアコンタン−１−アミド（ステップ２、５１．４ｍｇ、０．０８ミリモル、１．２当量）を添加した。１時間後、反応混合物を濃縮し、残留物を、分取ＨＰＬＣ（方法ｐＡ）により精製して、標題化合物（１６．８ｍｇ、１２％の収率）をもたらした。ＬＣ／ＭＳ（解析法Ｂ又はＣ）：Ｒｔ＝８．１８分である。ＨＲＭＳによる計算［Ｍ＋Ｈ］＋＝２０９４．７０４９であり、観察［Ｍ＋Ｈ］＋＝２０９４．６９０２である。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.03 (s, 1H), 8.01 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.86 (s, 2H), 7.01 (s, 3H), 6.80 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.30 - 6.18 (m, 1H), 6.13 (dd, J = 9.5, 7.1 Hz, 1H), 6.09 - 5.99 (m, 2H), 5.56 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.45 (s, 1H), 5.43 - 5.37 (m, 2H), 5.12 (dd, J = 13.4, 5.1 Hz, 2H), 4.94 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 4.63 - 4.47 (m, 2H), 4.27-4.13 (m, 2H), 4.11 (s, 1H), 4.08 - 3.97 (m, 1H), 3.91 (dd, J = 10.8, 6.1 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.78 - 3.81 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.73 - 3.63 (m, 1H), 3.63 - 3.55 (m, 7H), 3.55 - 3.46 (m, 30H), 3.41 (s, 3H), 3.25 (d, J = 2.3 Hz, 3H), 3.15 (q, J = 5.8 Hz, 2H), 3.07 (s, 5H), 2.93 (d, J = 17.7 Hz, 1H), 2.47 - 2.38 (m, 1H), 2.36 - 2.26 (m, 7H), 2.15 - 2.06 (m, 2H), 2.01 (d, J = 2.7 Hz, 3H), 1.87 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 1.80 - 1.62 (m, 3H), 1.26 (dd, J = 6.1, 3.3 Hz, 4H), 1.24 - 1.19 (m, 2H), 1.19 - 1.12 (m, 7H), 1.09 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 0.95 (t, J = 6.9 Hz, 1H).
【０１４７】
解析用ＨＰＬＣ法及び分取ＨＰＬＣ法についての一般的情報
【０１４８】
解析法Ａ：
ＭＳ：Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）Ａｃｕｉｔｙ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＥＳＩ、走査範囲：１２０〜２０４０Ｄａ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ
カラム温度：５０℃
流量：０．６ｍＬ／分
移動相Ａ：水中に０．１％のギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中に０．１％のギ酸
勾配：
【０１４９】
【表５】
2021508694.tif 000028
【０１５０】
解析法Ｂ：
ＭＳ：Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）Ａｃｕｉｔｙ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ＳＱ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＥＳＩ、走査範囲：１２０〜２０４０Ｄａ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ
カラム温度：６０℃
流量：０．４ｍＬ／分
移動相Ａ：水中に０．１％のギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中に０．１％のギ酸
勾配：
【０１５１】
【表６】
2021508694.tif 000029
【０１５２】
解析法Ｃ：
ＨＲＭＳ：ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ５６００  Ｐｌｕｓ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（ＴＯＦ（登録商標））走査範囲：２５０〜２５００Ｄａ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ
カラム温度：６０℃
流量：０．４ｍＬ／分
移動相Ａ：水中に０．１％のギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中に０．１％のギ酸
勾配：
【０１５３】
【表７】
2021508694.tif 000030
【０１５４】
解析法Ｄ
カラム：ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ（登録商標）Ｆｌａｓｈ  ＲＰ−１８  ｅｎｄｃａｐｐｅｄ  ２５〜２ｍｍ
カラム温度：４０℃
波長：２２０ｎｍ
流量：１．５ｍＬ／分
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ（１．５ｍＬのトリフルオロ酢酸を伴う４Ｌ）
移動相Ｂ：アセトニトリル（０．７５ｍＬのトリフルオロ酢酸を伴う４Ｌ）
勾配：
【０１５５】
【表８】
2021508694.tif 000031
【０１５６】
解析法Ｅ
カラム：Ｈａｌｏ  Ｃ１８  ２．１×３０ｍｍ、２．７μｍ
検出：ダイオードアレイ及び正／負エレクトロスプレーイオン化
流量：１．０ｍＬ／分
移動相Ａ：水中に０．０３７５％のトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中に０．０１８％のトリフルオロ酢酸
勾配：
【０１５７】
【表９】
2021508694.tif 000032
【０１５８】
解析法Ｆ
カラム：Ｖｅｎｕｓｉｌ  ＸＢＰ−Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、５μｍ
検出：ダイオードアレイ及び正／負エレクトロスプレーイオン化
流量：０．８ｍＬ／分
移動相Ａ：水中に０．０３７５％のトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中に０．０１８％のトリフルオロ酢酸
勾配：
【０１５９】
【表１０】
2021508694.tif 000033
【０１６０】
分取ＨＰＬＣ法ｐＡ：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ５μｍ  ＯＢＤ、１９×１００ｍｍ
カラム温度：周囲温度
流量：１５ｍＬ／分
移動相Ａ：水中に０．１％のギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中に０．１％のギ酸
勾配：
【０１６１】
【表１１】
2021508694.tif 000034
【０１６２】
分取ＨＰＬＣ法ｐＢ：
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）、２５０×５０ｍｍ  ｉ．ｄ．、１０μｍ
波長：２２０及び２５４ｎｍ
流量：８０ｍＬ／分
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ中に０．０１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３
移動相Ｂ：アセトニトリル
勾配：２０分間にわたる、３０〜５０％の移動相Ｂ
【０１６３】
分取ＨＰＬＣ法ｐＣ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）、２５０×５０ｍｍ  ｉ．ｄ．、１０μｍ
波長：２２０及び２５４ｎｍ
流量：８０ｍＬ／分
移動相Ａ：水中に０．０７５％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ：アセトニトリル
勾配：２０分間にわたる、１０〜４０％の移動相Ｂ
【０１６４】
分取ＨＰＬＣ法ｐＤ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）、２５０×５０ｍｍ  ｉ．ｄ．、１０μｍ
波長：２２０及び２５４ｎｍ
流量：８０ｍＬ／分
移動相Ａ：水中に０．０９％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸
移動相Ｂ：アセトニトリル
勾配：２０分間にわたる、１５〜４３％の移動相Ｂ
【０１６５】
［実施例４］  ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体薬物コンジュゲートの調製
抗ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣを、さらなるインビトロ試験及びインビボ試験のために、本明細書の教示に従い調製した。
【０１６６】
これに関して、実施例２によるｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１を、遊離スルフヒドリル基を伴う末端マレイミド部分を介して、非切断型カリケアミシン薬物リンカー（実施例３における通りに調製した式ＩＩ）へとコンジュゲートさせて、本明細書において、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１と称される、開示されたＳＥＺ６  ＡＤＣを創出した。加えて、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１を、同じカリケアミシンペイロードであるが、切断型リンカーを含むペイロードへとコンジュゲートさせることにより、３つの対照ＳＥＺ６  ＡＤＣ（ＡＤＣ２、ＡＤＣ３及びＡＤＣ４）を作製した。最後に、Ｓ６０Ｎ突然変異を伴わないｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１を含む、対照ＡＤＣを作った。
【０１６７】
改変型部分還元工程を使用して、部位特異的ヒト化ＳＥＺ６  ＡＤＣ（ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１）をコンジュゲートさせた。所望の生成物は、各ＬＣ定常領域上の不対システイン（Ｃ２１４）上に、最大限にコンジュゲートされ、薬物ローディングが２であるＡＤＣを最大化しながら、薬物ローディングが２を超えるＡＤＣを最小化するＡＤＣである。コンジュゲーションの特異性を、さらに改善するために、リンカー薬物とのコンジュゲーションに続く、透析濾過及び製剤化のステップの前に、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）及び弱い還元剤（例えば、グルタチオン）を含む工程を使用して、抗体を、選択的に還元した。
【０１６８】
より具体的に、各抗体の調製物を、所定濃度の還元グルタチオン（ＧＳＨ）、ｐＨ８．０を伴う、１ＭのＬ−アルギニン／５ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液中、室温において、最低２０時間にわたり部分的に還元した。次いで、３０ｋＤａ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して、全ての調製物を、２０ｍＭのトリス／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０緩衝液へと、緩衝液交換して、還元緩衝液を除去した。次いで、結果として得られる部分還元調製物を、マレイミド基を介して、それぞれのカリケアミシン薬物リンカーへと、室温において、最低６０分間にわたりコンジュゲートさせた。次いで、０．５Ｍの酢酸を添加して、ｐＨを、６．０へと調整した。３０ｋＤａ膜を使用する透析濾過により、ＡＤＣ調製物を、透析濾過緩衝液へと緩衝液交換した。次いで、透析濾過されたＳＥＺ６  ＡＤＣを、スクロース及びポリソルベート２０と共に、目標最終濃度へと製剤化した。
【０１６９】
次いで、結果として得られる製剤を、タンパク質濃度（ＵＶを測定することによる）、凝集（ＳＥＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による薬物対抗体比（ＤＡＲ）及び活性（インビトロ細胞傷害作用）について解析した。次いで、これを、使用まで、凍結させ、保存した。
【０１７０】
ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１についての概略表示を、本明細書に添付した図１に提示する。
【０１７１】
［実施例５］  インビトロにおけるｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体の特徴
実験を行って、Ｓ６０Ｎ突然変異が、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ｍＡｂと、ＳＥＺ６抗原との相互作用に影響を及ぼすのかどうかについて調べた。これに関して、Ｓ６０Ｎ突然変異を伴う場合及びこれを伴わない場合における、可溶性ＳＥＺ６−ｈｉｓ抗原の、表面に固定化させたＳＥＺ６抗体及びＳＥＺ６  ＡＤＣへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（抗ヒト捕捉チップ）上において測定した。
【０１７２】
より具体的に、５μｇ／ｍＬのＩｇＧを、５μＬ／分において、１２秒間にわたり流動させ、１１５〜１２４ＲＵの固定化応答をもたらした。２２、６６及び２００ｎＭのｈＳＥＺ６−ｈｉｓを、３０μＬ／分において、９０秒間にわたり注入するのに続き、３００秒間にわたり解離させた。各サイクルの終了時に、２Ｍの塩化マグネシウム（３０μＬ／分、３０秒間）を流動させることにより、表面を再生した。センサーグラムは、二重参照（緩衝液の注入及び対照フローセル）とし、図２に明示するが、ここで、突然変異を伴う抗体を、標識化ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体とし、突然変異を伴わない供給源抗体を、標識化ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１親抗体とした。
【０１７３】
加えて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用して、アフィニティーの測定を行い、Ｓ６０Ｎを含むｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１の結合特徴を決定した。これに関して、Ｓ６０Ｎ突然変異を伴うｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体及びこれを伴わないｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体のＦａｂ構築物を、作製及び精製した。次いで、Ｆａｂ構築物の、表面に固定化された可溶性ヒトＳＥＺ６−Ｈｉｓリガンドへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（抗Ｈｉｓ捕捉チップ）上において比較した。より具体的に、２μｇ／ｍＬのヒトＳＥＺ６−Ｈｉｓを、チップにわたり、５μＬ／分において、１２秒間にわたり流動させ、４５〜６６ＲＵの固定化応答をもたらした。２２、６６及び２００ｎＭのＦａｂの注入を、３０μＬ／分において、９０秒間にわたり行うのに続き、４００〜４５０秒間にわたり解離させた。表面は、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５を、３０ｕＬ／分において、６０秒間にわたり流動させることにより再生した。センサーグラムは、二重参照（緩衝液の注入及び対照フローセル）とした。結果を、すぐ下の表４に示す。
【０１７４】
【表１２】
2021508694.tif 000035
【０１７５】
図２の精査は、重鎖可変領域内の、Ｓ６０Ｎ突然変異及びグリコシル化部位の除去が、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体の結合特性を、突然変異を欠く親抗体と比較した場合に、実質的に変更しないことを示す。同様に、表４に示したアフィニティー測定は、導入された突然変異が、開示されたＡＤＣ内において使用された抗体の結合に、有害な影響を及ぼさないことを裏付ける。このように、潜在的な不安定化位置は、分子の薬学的有効性を損なわずに修飾することができる。
【０１７６】
［実施例６］  ｈＳＥＺ６  ＡＤＣは、インビトロにおいて、ｈＳＥＺ６発現細胞を、効果的に死滅させる
本発明の抗ＳＥＺ６  ＡＤＣが、コンジュゲートされた細胞傷害剤の、生細胞への送達を効率的に媒介するのかどうかを決定するために、上記の実施例４において作製された抗ＳＥＺ６  ＡＤＣを使用して、インビトロの細胞殺滅アッセイを実施した。
【０１７７】
ｈＳＥＺ６を過剰発現させるＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞又はナイーブＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の単一細胞懸濁液を、ウェル１つ当たりの細胞５００個において、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）へと播種した。１日後、カリケアミシンへとコンジュゲートされた、多様な濃度の精製ＡＤＣを、培養物へと添加した。細胞を、９６時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、製造元の指示書に従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、生存細胞を数えた。非処置細胞を含有する培養物を使用する生発光カウントを、１００％の参照値と設定し、他の全てのカウントは、参照値に対する百分率として計算した。
【０１７８】
図３は、処理された、全てのｈＳＥＺ６発現細胞が、抗ＳＥＺ６  ＡＤＣに対して、ナイーブＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞と比較して、はるかに強く感受性であることを示すことから、ＳＥＺ６抗原に対する、ＡＤＣの特異性を裏付ける。
【０１７９】
上記の結果は、抗ＳＥＺ６  ＡＤＣが、直接コンジュゲートされた細胞傷害性ペイロードの、ＳＥＺ６発現細胞への内部化及び送達を特異的に媒介する能力を裏付ける。
【０１８０】
［実施例７］  免疫障害マウスにおける、ＡＤＣの薬物動態
ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ２及びｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ３の薬物動態（ＰＫ）を、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおいて査定した。マウス（群１つ当たりの雌のｎ＝４）を、等しい平均体重を有する処置群へと無作為化し、次いで、単回の静脈内注射（容量を１００μＬとする）を介して、同じ量のＡＤＣにより処置した。ＦｃγＲ媒介性クリアランスを飽和させ、適切なＡＤＣ曝露をもたらすために、ＡＤＣは、各々、１０ｍｇ／ｋｇの非コンジュゲートＨｕＩｇＧ１抗体と共に共投与した。血清試料を、各投与の、５分後、４、２４、７２、１２０、１６８、２１６及び３３６時間後に回収し、全抗体（ＴＡｂ）濃度及びＡＤＣ濃度を、ＭＳＤイムノアッセイにより評価した。ノンコンパートメント解析法を使用して、最大濃度（Ｃｍａｘ）、時点＝投与の０〜１４日後に査定された曝露（曲線下面積又はＡＵＣ）及び半減期を含む薬物動態パラメータを査定した。
【０１８１】
ＡＤＣ及びＴＡｂの血清薬物動態は、全てのＡＤＣについて、双指数関数的に減衰し、ピーク濃度（Ｃｍａｘ）は、投与の５分後に観察された。被験ＳＥＺ６  ＡＤＣの間において、ＡＤＣ曝露（０〜１４日後におけるＡＵＣ）の有意差は見られなかった。ＡＤＣの血清中の終末半減期は、ＡＤＣの間において同様であった。ＡＤＣの安定性を、ＴＡｂ曝露の、ＡＤＣ曝露に対する比により測定したところ、被験化合物について同様であり、１．４〜１．６の範囲であった。まとめると、これらのデータは、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ２及びｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ３の薬物動態が、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおいて同等であることを裏付ける。
【０１８２】
［実施例８］  ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体薬物コンジュゲートは、インビボにおける腫瘍増殖を抑制する
インビボ実験を行って、実施例６において裏付けられたｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ２及びｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ３の細胞殺滅能力を確認した。この目的のために、前出の実施例において明示された通りに調製された、部位特異的ＳＥＺ６ターゲティングＡＤＣを、内因性のＳＥＺ６細胞表面タンパク質の発現を有する、皮下患者由来異種移植（ＰＤＸ）小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）腫瘍を保有する、免疫障害ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスのインビボにおける治療効果について調べた。抗ＳＥＺ６コンジュゲートである、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ２及びｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ３を、各々、２つの異なるＳＣＬＣモデルにおいて調べた。
【０１８３】
ＳＣＬＣ−ＰＤＸ株である、ＬＵ９５及びＬＵ１４９を、各々、解離細胞接種物として、乳腺脂肪体領域近傍の皮下に注射し、毎週、キャリパーにより測定した（楕円体容量＝ａ×ｂ２／２［式中、ａは、楕円の長径であり、ｂは、短径である］）。腫瘍が、１３０〜２００ｍｍ３の平均サイズ（範囲：１００〜３００ｍｍ３）へと増殖した後に、マウスを、腫瘍容量平均の等しい処置群（群１つ当たりのマウスのｎ＝５）へと無作為化した。マウス（群１つ当たり５匹ずつ）を、腹腔内注射（容量を１００μＬとする）を介する、媒体（滅菌水中に５％のグルコース）又はＨｕＩｇＧ１−ＡＤＣ調製物又はＳＥＺ６−ＡＤＣ調製物の、同一の単回投与により処置した。薬物動態を線形化するために、ＳＥＺ６−ＡＤＣを、１０ｍｇ／ｋｇの、ネイキッドＨｕＩｇＧ１抗体と共に共投与した。
【０１８４】
治療効果は、毎週の腫瘍容量（上記の通り、キャリパーによる）及び体重測定により評価した。個別のマウス又は処置群についての評価項目の基準は、健康評価（任意の疾病の徴候）、体重の減少（研究の開始時からの２０％を超える体重の減少）及び腫瘍負荷（腫瘍容量＞１０００ｍｍ３）を含んだ。効能は、群が、約８００〜１０００ｍｍ３の平均に達するまで、毎週の腫瘍容量の測定（ｍｍ３）によりモニタリングした。腫瘍容量は、処置群内の全てのマウスについての平均値の標準誤差を伴う平均として計算し、初期処置以来の時間（日）と対比してプロットした。処置の結果を、処置群１つ当たりのマウス５匹ずつにおける、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を伴う平均値腫瘍容量を示す、図４Ａ及び４Ｂに描示する。
【０１８５】
カリケアミシンへとコンジュゲートされたＳＥＺ６結合性ＡＤＣ（ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ２及びｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ３）を、ＳＣＬＣ  ＰＤＸ−ＬＵ９５を保有するマウス（図４Ａ）又はＰＤＸ−ＬＵ１４９を保有するマウス（図４Ｂ）において査定した。非切断型リンカーによるＡＤＣ１が、切断型リンカーによるＡＤＣ２と比較して、同等以上の効能を有したのに対し、切断型リンカーによるＡＤＣ３は、２ｍｇ／ｋｇにおいて、ＡＤＣ１と比較して、大きな効能を有した。いずれにせよ、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１及びｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ３は、ＳＣＬＣ  ＰＤＸにおいて、５０日間以上にわたり、持続的な応答を達成しうる。同じカリケアミシン薬物リンカーへとコンジュゲートされた、非結合性ＡＤＣ（ＨｕＩｇＧ１）による処置の後において、応答が観察されなかったので、応答は、ＳＥＺ６−ＡＤＣ特異的であった（データは示さない）。
【０１８６】
このような結果は、本明細書において明示された通りに作製されたｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１、が、小細胞肺がん細胞の増殖を遅延させるのに、薬学的に有効となる潜在的可能性を有することを裏付ける。
【０１８７】
［実施例９］  ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１は、頑健な安全マージンを呈する
ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１によりもたらされる安全マージンを決定するために、解析を行った。
【０１８８】
これに関して、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ２及びｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ３は、リンカー薬物の接合に差違を伴うが、同一なターゲティングｍＡｂ（ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１）及びウォーヘッド（Ｎ−アセチルガンマカリケアミシン）を含む。ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１は、他のカテプシンＢ感受性のジペプチドベースのリンカー薬物と比較して、非切断型リンカーを含む点において固有である。ＳＥＺ６  ＡＤＣを、４つの高発現ＳＥＺ６  ＳＣＬＣマウスＰＤＸモデル（ＬＵ６４、ＬＵ８６、ＬＵ９５及びＬＵ１４９）並びにカニクイザルにおける外挿反復投与毒性研究において査定した。
【０１８９】
マウスにおける、非処置時の腫瘍増殖及びＳＥＺ６  ＡＤＣ処置時の腫瘍応答データに基づく、半機構型ＰＫ／ＰＤモデルを使用して、患者において腫瘍増殖抑制を結果としてもたらすＡＤＣ濃度に対応する、腫瘍増殖抑制濃度（ＴＳＣ）を予測した。その後、カニクイザルのＰＫデータに基づき、ヒトＰＫをシミュレートした。次いで、ヒトＰＫを使用して、患者への投与間隔において、ＴＳＣと同等の血漿中トラフ濃度を達成するのに要求される用量を推定した。安全マージンは、カニクイザルへの最大耐量（ＭＴＤ）におけるＡＤＣ曝露を、予測ヒト有効用量における曝露と比較することにより推定した。この解析を、査定された各肺ＰＤＸモデル（ＬＵ６４、ＬＵ８６、ＬＵ９５及びＬＵ１４９）について繰り返した。
【０１９０】
表５は、ＳＥＺ６  ＡＤＣの各々について予測された安全マージンを提示する。この解析に基づき、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１は、同じペイロードへとコンジュゲートされているが、切断型リンカーを伴う、他のＳＥＺ６  ＡＤＣ（ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ２、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ３）より忍容性が大きいことが予測された。この解析は、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１について、約１０の安全マージンを予測したが、これは、切断型リンカーを伴う、２つの構築物より大幅に大きい。
【０１９１】
【表１３】
2021508694.tif 000036
【０１９２】
カニクイザルにおいて得られたデータ及び対応する投与の柔軟性に基づき、ヒトにおいて予測された、大きな安全マージンは、ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１が、強力な候補治療剤であることを指し示す。
【０１９３】
［実施例１０］  ｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１  ＡＤＣ１は、ＳＣＬＣにおいて、特に活性である
開示されたＡＤＣの潜在的効能を、さらに裏付けるために、多様な腫瘍異種移植細胞株を使用して、毒素特異的アッセイを行った。まず、マイクロアレイ解析を介して、それぞれによる、ＳＥＺ６抗原（図５Ａ）及び公知の陽性対照抗原であるＣＤ４６（図５Ｂ）の発現レベルを決定するために、ＳＣＬＣ、ＢＲ、ＣＲ、ＧＡ、ＮＳＣＬＣ及びＰＡの、ＰＤＸ細胞株を探査した。ヒトＰＤＸに由来する、精製ＲＮＡ試料に対する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｌａｒｉｏｍＤアッセイを使用して、マイクロアレイ解析を行った。図５Ａ及び５Ｂの精査は、ＳＥＺ６の発現が、ＳＣＬＣ腫瘍において、他の腫瘍型と比較して上方調節されるのに対し、陽性抗原対照であるＣＤ４６は、患者由来異種移植（ＰＤＸ）パネルにわたり、一貫して高ｍＲＮＡ発現レベルを呈したことを示す。したがって、ＣＤ４６抗原を、サロゲートのＡＤＣ標的として使用して、開示された新規のカリケアミシン薬物リンカー（式ＩＩ）の、多様な腫瘍型に対する影響を計測した。
【０１９４】
これに関して、ヒト化ＣＤ４６抗体であるＮ１４９（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ１０，０１７，５６５Ｂ２）を、本明細書において明示されたカリケアミシン薬物リンカー又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）による薬物リンカー対照へとコンジュゲートさせた。ＡＤＣは、上記の実施例４において実質的に明示した通りに作出した。調製の後、ＣＤ４６  ＡＤＣは、使用まで、凍結させ、保存した。
【０１９５】
ＰＤＸ細胞は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの脇腹へと接種した。腫瘍が、１００〜３００ｍｍ３の間に達したら、ＰＢＤ  ＡＤＣ調製物を、１．６ｍｇ／ｋｇの単回投与（図５Ｃ）として導入する一方、カリケアミシンＡＤＣ調製物を、ＳＣＬＣ  ＰＤＸ以外の全ての腫瘍型（図５Ｄ）について、８ｍｇ／ｋｇの単回投与として投与した。ＳＣＬＣ  ＰＤＸに対して、カリケアミシンＡＤＣ調製物は、２ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇの投与として投与した（図５Ｄ）。次いで、腫瘍を、同じウォーヘッドを伴う、非ターゲティングＡＤＣ調製物と比較した変化についてモニタリングした。腫瘍進行までのデルタ時間（ｄＴＴＰ）は、非ターゲティングＡＤＣについての進行時間を、ターゲティング剤についての進行時間から差し引くことにより計算した。腫瘍進行は、観察された測定値が、処置後の底容量を、少なくとも１００ｍｍ３超えて増大する時点として規定した。図５Ｃ及び５Ｄにおける各データ点は、それぞれの腫瘍型の、個別のＰＤＸ細胞株を表す。
【０１９６】
図５Ｃに示される通り、ＰＢＤ  ＡＤＣ調製物は、ＰＤＸ腫瘍型に関わらず、比較的均一の腫瘍応答をもたらした。特に、ＳＣＬＣ  ＰＤＸの、ＰＢＤ毒素による殺滅に対する感受性は、他の腫瘍細胞株の感受性と、大体において同等であった。これとは好対照に、ＳＣＬＣ  ＰＤＸ細胞株は、カリケアミシンＡＤＣに対して、他のＰＤＸ細胞株より、はるかに大きな感受性を実証した（図５Ｄ）。より具体的に、カリケアミシンＡＤＣの、単回の８ｍｇ／ｋｇの投与の後に、ＢＲ腫瘍、ＣＲ腫瘍、ＧＡ腫瘍及びＮＳＣＬＣ腫瘍に由来する、患者由来異種移植片の大部分は、最小応答〜無応答を呈した。膵臓腫瘍において、応答の混合が見られたが、膵臓腫瘍であってもなお、被験細胞株の大部分において、最小限の応答（＜２５日間のｄＴＴＰ）を示した。逆に、２ｍｇ／ｋｇ（黒丸）又は４ｍｇ／ｋｇ（白丸）の低用量のカリケアミシンＡＤＣは、ＳＣＬＣ腫瘍の増殖を、一貫して、高用量のカリケアミシンＡＤＣが他のＰＤＸ腫瘍に対して達成するよりも、実質的に大幅に低減した。さらに、ＳＣＬＣ腫瘍の大部分は、同じウォーヘッドを保有する非ターゲティング抗体と比較して、４０日間を超える増殖の遅延を呈した（データは示さない）。
【０１９７】
これらのデータは、ＳＣＬＣ腫瘍が、他のＤＮＡ損傷ウォーヘッドより、カリケアミシンウォーヘッドに対して、より感受性であることを示唆する。カリケアミシンウォーヘッドは、ＰＢＤウォーヘッドについて観察された結果と同様の結果をもたらすと予期されたので、この結果は、予期されないものであった。
【０１９８】
実施形態
【０１９９】
１．ヒトＳＥＺ６に特異的に結合する単離抗体であって、配列番号３の重鎖配列及び配列番号４の軽鎖配列を含む抗体。
【０２００】
２．カリケアミシンペイロードへとコンジュゲートされた、実施形態１に記載の抗体。
【０２０１】
３．カリケアミシンペイロードが、Ｎ−Ａｃカリケアミシンを含む、実施形態２に記載の抗体。
【０２０２】
４．カリケアミシンペイロードが、式ＩＩを含む、実施形態３に記載の抗体。
【０２０３】
５．小細胞肺がんを処置する方法であって、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の抗体を、それを必要とする対象へと投与するステップを含む方法。
【０２０４】
６．実施形態１〜４のいずれか一項に記載の抗体を含有する、１つ以上の容器を含むキット。
【０２０５】
７．抗体が、小細胞肺がんを有する対象を処置するためのものであることを指し示す、１つ以上の容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書をさらに含む、実施形態６に記載のキット。
【０２０６】
８．実施形態１〜４のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【０２０７】
９．実施形態８に記載の医薬組成物を含有する、１つ以上の容器を含むキット。
【０２０８】
１０．医薬組成物が、小細胞肺がんを有する対象を処置するためのものであることを指し示す、１つ以上の容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書をさらに含む、実施形態９に記載のキット。
【０２０９】
１１．実施形態１〜４のいずれか一項に記載の抗体の全部又は一部をコードする核酸。
【０２１０】
１２．実施形態１１に記載の核酸を含むベクター。
【０２１１】
１３．請求項１１に記載の核酸又は実施形態１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０２１２】
１４．構造：
【０２１３】
【化２２】
2021508694.tif 000037
［式中、Ａｂは、配列番号３の重鎖配列及び配列番号４の軽鎖配列を有する抗ＳＥＺ６抗体を含み、ｎは２である］
のＳＥＺ６  ＡＤＣ。
【０２１４】
１５．小細胞肺がんを処置する方法であって、実施形態１４に記載のＳＥＺ６  ＡＤＣを、それを必要とする対象へと投与するステップを含む方法。
【０２１５】
１６．実施形態１４に記載のＳＥＺ６  ＡＤＣを含有する、１つ以上の容器を含むキット。
【０２１６】
１７．ＳＥＺ６  ＡＤＣが、小細胞肺がんを有する対象を処置するためのものであることを指し示す、１つ以上の容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書をさらに含む、実施形態１６に記載のキット。
【０２１７】
１８．実施形態１４に記載のＳＥＺ６  ＡＤＣを含む医薬組成物。
【０２１８】
１９．請求項１４に記載のＳＥＺ６  ＡＤＣが、主要なＡＤＣ分子種である、実施形態１８に記載の医薬組成物。
【０２１９】
２０．主要なＡＤＣ分子種が、組成物中に存在するＡＤＣ分子種のうちの、約７０％を超える比率を占める、実施形態１９に記載の医薬組成物。
【０２２０】
２１．主要なＡＤＣ分子種が、組成物中に存在するＡＤＣ分子種のうちの、約８０％を超える比率を占める、実施形態１９に記載の医薬組成物。
【０２２１】
２２．主要なＡＤＣ分子種が、組成物中に存在するＡＤＣ分子種のうちの、約９０％を超える比率を占める、実施形態１９に記載の医薬組成物。
【０２２２】
２３．実施形態１８〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物を含有する、１つ以上の容器を含むキット。
【０２２３】
２４．医薬組成物が、小細胞肺がんを有する対象を処置するためのものであることを指し示す、１つ以上の容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書をさらに含む、実施形態２３に記載のキット。
【０２２４】
２５．小細胞肺がんを処置する方法であって、実施形態１８〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【０２２５】
２６．腫瘍細胞集団内の腫瘍始原細胞を低減する方法であって、腫瘍始原細胞及び腫瘍始原細胞以外の腫瘍細胞を含む腫瘍細胞集団を、実施形態１４に記載のＳＥＺ６  ＡＤＣと接触させるステップを含み、腫瘍始原細胞の頻度が低減される方法。
【０２２６】
２７．接触させるステップが、インビボにおいて実施される、実施形態２６に記載の方法。
【０２２７】
２８．接触させるステップが、インビトロにおいて実施される、実施形態２６に記載の方法。
【０２２８】
２９．細胞毒素を、細胞へと送達する方法であって、細胞を、実施形態１４に記載のＳＥＺ６  ＡＤＣと接触させるステップを含む方法。
【０２２９】
３０．実施形態１４に記載のＡＤＣを作製する方法であって、配列番号３の重鎖配列及び配列番号４の軽鎖配列を有するｈＳＥＺ６−１．ｓｓ１抗体を、式ＩＩを含む薬物リンカーとコンジュゲートさせるステップを含む方法。
【０２３０】
３１．ＡＤＣを凍結乾燥させるステップをさらに含む、実施形態３０に記載の方法。
【０２３１】
３２．それを必要とする対象における小細胞肺がんを処置する方法であって、６を超える安全マージンを有するＳＥＺ６  ＡＤＣを投与するステップを含み、ＳＥＺ６  ＡＤＣが、構造：
【０２３２】
【化２３】
2021508694.tif 000038
［式中、Ａｂは、配列番号３の重鎖配列及び配列番号４の軽鎖配列を有する抗ＳＥＺ６抗体を含み、ｎは２である］
を含む方法。
【０２３３】
３３．安全マージンが、約１０である、実施形態３２に記載の方法。
【０２３４】
３４．構造：
【０２３５】
【化２４】
2021508694.tif 000039
を含む、カリケアミシン薬物リンカー又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【０２３６】
当業者は、本発明が、その精神又は中心的属性から逸脱せずに、他の具体的な形態においても実現されうることをさらに理解する。本発明の前出の記載は、この例示的な実施形態だけを開示するという点において、他の変化形も、本発明の範囲内にあると想定されることを理解されたい。したがって、本発明は、本明細書において詳細に記載された特定の実施形態に限定されるものではない。そうではなく、本発明の範囲及び内容を示すものとして、添付の特許請求の範囲への参照がなされるべきである。
【図１】
2021508694.tif 000043
【図２】
2021508694.tif 000044
【図３】
2021508694.tif 000045
【図４Ａ】
2021508694.tif 000046
【図４Ｂ】
2021508694.tif 000047
【図５Ａ】
2021508694.tif 000048
【図５Ｂ】
2021508694.tif 000049
【図５Ｃ】
2021508694.tif 000050
【図５Ｄ】
2021508694.tif 000051
【配列表】
2021508694000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月28日(2020.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
2021508694.tif 000052
［式中、Ａｂは、配列番号３の重鎖配列及び配列番号４の軽鎖配列を有する抗ＳＥＺ６抗体を含み、ｎは２である］
のＳＥＺ６  ＡＤＣ。
【国際調査報告】
2021508694.tif 000053
2021508694.tif 000054
2021508694.tif 000055
2021508694.tif 000056
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