(57)【要約】  本発明では、無細胞系におけるカンナビノイド、カンナビノイド前駆体及び他のプレニル化された化学物質の産生のためのプレニル化及び組換え経路に有用な酵素、ならびに前記反応を触媒する組換え微生物が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)少なくとも1つのY288X変異を有する配列番号:30（ここで、Xは、A、N、S、またはVである）；
(b)少なくとも1つのY288X変異（ここで、Xは、A、N、S、またはVである）、及びV49Z1、F213Z2、A232S、I234T、V271Z3、及び/またはG286Sから選択される少なくとも1つの他の変異（ここで、Z1はS、N、TまたはGであり、Z2はH、N、またはGであり、また、Z3はNまたはHである）を有する配列番号:30；
(c)1〜20の保存的なアミノ酸置換をさらに含み、かつNphB活性を有する(a)または(b)のいずれか；
(d)配列番号:30と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一である配列、かつ少なくとも(a)または(b)に記載の変異を有する配列；
(e)アミノ酸21に始まる配列番号:1〜28または29に列挙された配列；及び
(f)(e)の配列と少なくとも85〜90%同一であり、かつNphB活性を有する配列 
）からなる群から選択される配列を含み、(a)〜(f)のいずれかのポリペプチドを用いて、プレニル化反応を行うことができる、組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号:30を含み、かつ
(i)         V288A；
(ii)      Y288N；
(iii)     Y288N及びF213H；
(iv)      Y288A及びF213N；
(v)       Y288N及びV49S；
(vi)      Y288S及びV49N；
(vii)     Y288A及びV49S；
(viii)    Y288N及びG286S；
(ix)      Y288N、F213N及びV49G；
(x)       Y288A、F213N及びI234T；
(xi)      Y288S、F213N及びV49N；
(xii)     Y288A、F213N及びA232S；
(xiii)    Y288N、F213G及びV49T；
(xiv)     Y288N、F213N、V49S及びV271N；
(xv)      Y288N、F213G、V49T及びV271H；
(xvi)     Y288A及びG286S；
(xvii)    Y288A、G286S及びA232S；
(xviii)   Y288A、G286S、A232S及びF213H；
(xix)     Y288V及びG286S；
(xx)      Y288A及びA232S；及び
(xxi)     Y288V及びA232S
からなる群から選択される変異を有する、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
配列番号:30の配列を有し、かつY288A及びG286S変異を有する、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
前記プレニル化反応が、GPP及びオリーブトレートからCBGAの産生、またはGPP及びジバリニン酸からCBGVAの産生、またはGPP及び2,4-ジヒドロキシ安息香酸またはその誘導体からCBGXAの産生を含む、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチド及びグルコースをゲラニルピロリン酸エステル(GPP)に変換する複数の酵素を含む、組換え経路。
【請求項６】
ピルビン酸塩酸化酵素及びアセチルリン酸塩転移酵素を含むピルビン酸脱水素酵素バイパス酵素経路をさらに含む、請求項５に記載の組換え経路。
【請求項７】
前記経路が、NADH/NADをリサイクルする"パージバルブ"を含む、請求項５または６に記載の組換え経路。
【請求項８】
前記経路が、以下の酵素を含む、請求項５〜７のいずれか1項に記載の組換え経路。
(i)        ヘキソキナーゼ(Hex)； 
(ii)     グルコース-6-リン酸塩異性化酵素(Pgi)； 
(iii)     ホスホフルクトキナーゼ(Pfk)； 
(iv)     フルクトース-1,6-ビスリン酸塩アルドラーゼ(Fba)； 
(v)      トリオースリン酸エステル異性化酵素(Tpi)； 
(vi)     Gald-3-P脱水素酵素(Gap)； 
(vii)    変異型Gald-3-P脱水素酵素(mGap)； 
(viii)   NADH酸化酵素(Nox) 
(ix)     ホスホグリセレートキナーゼ(Pgk) 
(x)      ホスホグリセレートムターゼ(2,3 BPG依存性またはMn2+依存性)(dPgmまたはiPgm)； 
(xi)     エノラーゼ(eno)； 
(xii)    ピルビン酸塩キナーゼ(FBP依存性/pykFまたはAMP依存性/pykA)； 
(xiii)   ピルビン酸塩酸化酵素(PyOx)； 
(xiv)    アセチル-リン酸エステル転移酵素(PTA)； 
(xv)     アセチル-CoAアセチル転移酵素(PhaA)； 
(xvi)    HMG-CoA合成酵素(HMGS)； 
(xvii)   HMG-CoA還元酵素(HMGR)； 
(xviii)  メバロン酸塩キナーゼ(MVK)； 
(xix)    ホスホメバロン酸塩キナーゼ(PMVK)； 
(xx)     ジホスホメバロン酸塩脱炭酸酵素(MDC)； 
(xxi)    ゲラニル-PP合成酵素(GPPS)またはファルネシル-PP合成酵素異性体S82F；及び 
(xxii)   変異型芳香族プレニル転移酵素
【請求項９】
前記経路が、ATP及びオリーブトレートで補充され、かつ該経路が、カンナビノイド前駆体を産生する、請求項５〜８のいずれかに記載の組換え経路。
【請求項１０】
前記経路が、カンナビジオール酸合成酵素をさらに含む、請求項９に記載の組換え経路。
【請求項１１】
前記経路が、カンナビジオール酸を産生する、請求項１０に記載の組換え経路。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリペプチド、及び(イソ)プレノールをゲラニルピロリン酸エステル(GPP)に変換する複数の酵素を含む、組換え経路。
【請求項１３】
請求項１に記載の組換えポリペプチドの存在下で、基質を、一般構造
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を有するプレニル基と接触させ、該プレニル基が、該基質に添加されることを含む、プレニル化化合物の製造方法。
【請求項１４】
グルコースからゲラニルピロリン酸エステルを製造するための無細胞酵素系であって、その経路が
(i)ピルビン酸塩からアセチルリン酸エステルへの変換； 
(ii)アセチルリン酸エステルからアセチル-CoAへの変換；
(iii)グリセルアルデヒド-3-リン酸エステルを1,3-ビスホスホグリセレートへ変換する第1補助因子依存性酵素（ここで、不均衡な産生及び補助因子の利用）； 
(iv)グリセルアルデヒド-3-リン酸エステルを1,3-ビスホスホグリセレートへ変換する第２補助因子依存性酵素（ここで、該第２補助因子依存性酵素が、その補助因子優先度が変化するように変異されている）、及び
（v）補助因子をリサイクルする酵素（ここで、該補助因子がNAD+/NADH、NADP+/NADPH、及びFAD+/FADHからなる群から選択される）
を含む、無細胞酵素系。
【請求項１５】
前記第1補助因子依存性酵素が、NAD+を補助因子として用いる脱水素酵素活性を含み、前記第２補助因子依存性酵素が、NADP+を補助因子として用いる脱水素酵素活性を含む、請求項１４に記載の無細胞酵素系。
【請求項１６】
前記補助因子をリサイクルする酵素が、NAD(P)H酸化酵素である、請求項１４または１５に記載の無細胞酵素系。
【請求項１７】
酵素的プロセスが、3グルコースを1ゲラニルピロリン酸エステルに変換する、請求項１４に記載の無細胞酵素系。
【請求項１８】
前記経路が、以下の酵素を含む、請求項１４に記載の無細胞酵素系。
(i)        ヘキソキナーゼ(Hex)；
(ii)     グルコース-6-リン酸エステル異性化酵素(Pgi)；
(iii)    ホスホフルクトキナーゼ(Pfk)；
(iv)     フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(Fba)；
(v)      トリオースリン酸エステル異性化酵素(Tpi)；
(vi)     Gald-3-P脱水素酵素(Gap)；
(vii)    変異型Gald-3-P脱水素酵素(mGap)；
(viii)   NADH酸化酵素(Nox)
(ix)     ホスホグリセレートキナーゼ(Pgk)
(x)      ホスホグリセレートムターゼ(2,3 BPG依存性またはMn2+依存性)(dPgmまたはiPgm)；
(xi)     エノラーゼ(eno)；
(xii)    ピルビン酸塩キナーゼ(FBP依存性/pykFまたはAMP依存性/pykA)；
(xiii)   ピルビン酸塩酸化酵素(PyOx)；
(xiv)    アセチル-リン酸エステル転移酵素(PTA)；
(xv)     アセチル-CoAアセチル転移酵素(PhaA)；
(xvi)    HMG-CoA合成酵素(HMGS)；
(xvii)   HMG-CoA還元酵素(HMGR)；
(xviii)  メバロン酸塩キナーゼ(MVK)； 
(xix)    ホスホメバロン酸塩キナーゼ(PMVK)；
(xx)     ジホスホメバロン酸塩脱炭酸酵素(MDC)；及び
(xxi)    ゲラニル-PP合成酵素(GPPS)またはファルネシル-PP合成酵素変異体S82F
【請求項１９】
非特異的プレニル転移酵素をさらに含む、請求項１４に記載の無細胞酵素系。
【請求項２０】
前記非特異的プレニル転移酵素が、適切な基質の存在下で、GPPをプレニル化合物に変換するために、NphB、AtaPTまたはNovQ酵素またはそれらの変異体を含む、請求項１９に記載の無細胞酵素系。
【請求項２１】
前記適切な基質が、アピゲニン、オリベトール酸、ジバリニン酸及びレスベラトロールからなる群から選択される、請求項２０に記載の無細胞酵素系。
【請求項２２】
前記基質が、ジバリニン酸である、請求項２１に記載の無細胞酵素系。
【請求項２３】
前記基質が、2,4-ジヒドロキシ安息香酸またはその誘導体である、請求項２１に記載の無細胞酵素系。
【請求項２４】
(a)少なくとも1つのY288X変異を有する配列番号:30（ここで、Xは、A、N、S、またはVである）；
(b)少なくとも1つのY288X変異（ここで、Xは、A、N、S、またはVである）、及びV49Z1、F213Z2、A232S、I234T、V271Z3、及び/またはG286Sから選択される少なくとも1つの他の変異（ここで、Z1はS、N、TまたはGであり、Z2はH、N、またはGであり、また、Z3はNまたはHである）を有する配列番号:30；
(c)1〜20の保存的なアミノ酸置換をさらに含み、かつNphB活性を有する(a)または(b)のいずれか；
(d)配列番号:30と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一である配列、かつ(a)または(b)に記載の変異を有するもの； 
(e)アミノ酸21に始まる配列番号:1〜28または29に列挙された配列；及び
(f)(e)の配列と少なくとも85〜99%同一であり、かつNphB活性を有する配列
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載の該単離されたポリヌクレオチドを含む、組換え微生物。
【請求項２７】
請求項２５に記載のベクターを含む、組換え微生物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
本願は、2018年8月1日に出願された米国仮出願シリアル番号62/713,348の優先権を主張する。その開示の全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【政府援助研究に関する陳述】
【０００２】
本発明は、米国エネルギー省から助成番号DE-FC02-02ER63421、及び国立衛生研究所から助成番号GM008496の政府支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【配列情報】
【０００３】
本願は、ASCIIフォーマットの電子形態で提出された配列表を含む。その全体が参照により本明細書に組み込まれる。2019年8月1日に作成された該ASCIIコピーは、Sequence_ST25.txtと命名され、そのサイズは287,021バイトである。
【技術分野】
【０００４】
適切な基質を、本開示の代謝的に修飾された微生物または酵素的な調製物と接触させることにより、カンナビノイド、他のプレニル化された化学物質や化合物を製造する方法が提供される。
【背景】
【０００５】
天然化合物をプレニル化することによって、構造的な多様性が増し、生物学的活性が変化し、また治療的潜在力が高まる。プレニル化化合物は、しばしば、天然における存在量が少ないか、または単離が困難である。いくつかのプレニル化天然物には、薬効が実証された生物活性分子の大きなクラスが含まれる。その例としては、プレニルフラバノイド、プレニルスチルベノイド、及びカンナビノイドが挙げられる。
【０００６】
カンナビノイドは、ヒトのエンドカンナビノイド系のカンナビノイド受容体(CB1及びCB2)を調節する天然物由来の生物活性植物の大きなクラスである。カンナビノイドは、有望な薬理学的作用を有し、抗ウイルス剤、抗痙攣薬、鎮痛薬、及び抗うつ薬としての治療効果を調べる臨床試験が100以上行われている。さらに、3つのカンナビノイド製剤は、化学療法に誘発された悪心、MS痙攣、及び重症てんかん関連の発作を治療するためFDAに承認された。
【０００７】
治療上の可能性にもかかわらず、医薬品級のカンナビノイド(>99%)の生産は、依然として大きな技術的課題に直面している。マリファナ及びアサのような大麻植物は、種々のより少量のカンナビノイドと共に、大量のテトラヒドロカンナビノール酸(THCA)及びカンナビジオール酸(CBDA)を産生する。しかし、汚染させるカンナビノイドと構造的によく類似し、また、作物によってカンナビノイドの組成が変動することから、CBDA及びTHCAのような大量に発現されたカンナビノイドでさえ単離することが困難である。稀なカンナビノイドを単離しようとする際に、これらの問題はさらに顕著に現れる。さらに、現在大麻の栽培は、重大な環境問題を直面している。従って、カンナビノイド及びその類縁物質を製造するための代替法の開発にはかなりの関心がある。
【概要】
【０００８】
本開示は、以下からなる群より選択された配列を含む組換えポリペプチドを提供する：(a)少なくとも1つのY288X変異を有する配列番号:30（ここで、Xは、A、N、S、Vまたは１つの非天然アミノ酸である）；(b)少なくとも1つのY288X変異（ここで、Xは、A、N、S、Vまたは１つの非天然アミノ酸である）、及び少なくとも1つのV49Z1、F213Z2、A232S、I234T、V271Z3、及び/またはG286Sから選択された他の変異（ここで、Z1はS、N、TまたはGであり、Z2はH、N、またはGであり、また、Z3はNまたはHである）を有する配列番号:30；(c)表１に記載のいずれかの変異組合せ；(d)1〜20の保存的なアミノ酸置換を含み、かつNphBプレニル転移酵素活性を有する(a)、(b)または(c)のいずれか；(e)配列番号:30と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一である配列、かつ少なくとも１つの(a)、(b)または(c)に記載の変異を有するもの；(f)アミノ酸21に始まる配列番号:1〜28または29に列挙された配列；及び(g)配列番号:1〜28または29のいずれかと少なくとも99%同一である任意の配列。ここで、(a)〜(g)のいずれかのポリペプチドがプレニル化反応を行う。一実施形態では、前記プレニル化反応は、GPP及びオリーブトレートからのCBGAの産生、またはGPP及びジバリン酸からのCBGVAの産生、または2,4-ジヒドロキシ安息香酸またはその6位炭素に化学基を有する誘導体からのCBGXAの産生を含む(例えば、式Iを参照)。
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式I
ここで、Xは、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、エステル、アルコキシ、アミノ、チオール、スルフィニル、スルホニル、スルフィノ、スルホ、チオシアナト、イソチオシアナト、チアール、ボロノ、ボロネート、ホスフェート、アルデヒド、カルボキシル、カルボキサミド、アジド、シアナト、イソシアナト、置換されていてもよい(C1〜C10)アルキル、置換されていてもよい(C2〜C10)アルケニル、置換されていてもよい(C2〜C10)アルキニル、置換されていてもよい(C1〜C10)ヘテロアルキル、置換されていてもよい(C2〜C10)ヘテロアルケニル、置換されていてもよい(C2〜C10)ヘテロアルキニル、置換されていてもよい(C3〜C10)シクロアルキル、置換されていてもよいアリール、及び置換されていてもよい複素環であってもよい。一実施形態では、Xは炭素数2〜10を含む置換されたもしくは無置換のアルキル基である。
【０００９】
本開示はまた、以下からなる群から選択された配列を有するポリペプチドを含む組換え経路を提供する：(a)少なくとも1つのY288X変異を有する配列番号:30（ここで、Xは、A、N、S、Vまたは１つの非天然アミノ酸である）；(b)少なくとも1つのY288X変異（ここで、Xは、A、N、S、Vまたは１つの非天然アミノ酸である）、及びV49Z1、F213Z2、A232S、I234T、V271Z3、及び/またはG286Sから選択される少なくとも1つの他の変異（ここで、Z1はS、N、TまたはGであり、Z2はH、N、またはGであり、また、Z3はNまたはHである）を有する配列番号:30；(c)表１に記載のいずれかの変異組合せ；(d)1〜20の保存的なアミノ酸置換を含み、かつNphBプレニル転移酵素活性を有する(a)、(b)または(c)のいずれか；(e)配列番号:30と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一である配列、かつ(a)、(b)または(c)に記載の変異を少なくとも１つを有するもの；(f)アミノ酸21に始まる配列番号:1〜28または29に列挙された配列；(g)配列番号:1〜28または29のいずれかと少なくとも99%同一である配列、及びグルコースをゲラニルピロリン酸エステルに変換する複数の酵素；及び(h)配列番号:1〜28または29のいずれかと少なくとも99%同一である任意の配列、及び(イソ)プレノールをゲラニルピロリン酸エステルに変換する複数の酵素。別の実施形態では、本方法は、ピルビン酸塩酸化酵素及びアセチルリン酸エステル転移酵素を含む、ピルビン酸塩脱水素酵素バイパス酵素経路をさらに含む。別のまたはさらなる実施形態では、該経路は、NADH/NAD及びNADPH/NADPをリサイクルする"パージバルブ"を含む。別のまたは前記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、該経路は次の酵素を含む：(i)ヘキソキナーゼ(Hex)；(ii)グルコース-6-リン酸エステル異性化酵素(Pgi)；(iii)ホスホフルクトキナーゼ(Pfk)；(iv)フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(Fba)；(v)トリオースリン酸エステル異性化酵素(Tpi)；(vi)Gald-3-P脱水素酵素(Gap)；(vii)変異型Gald-3-P脱水素酵素(mGap)；(viii)NADH酸化酵素(Nox)；(ix)ホスホグリセレートキナーゼ(Pgk)；(x)ホスホグリセレートミューターゼ(2,3 BPG依存)(dPgm))；(xi)エノラーゼ(eno)；(xii)ピルビン酸塩キナーゼ(FBP依存)；(xiii)ピルビン酸塩酸化酵素(PyOx)；(xiv)アセチル-リン酸エステル転移酵素(PTA)；(xv)アセチル-CoAアセチル転移酵素(PhaA)；(xvi)HMG-CoA合成酵素(HMGS)；(xvii)HMG-CoA還元酵素(HMGR)；(xviii)メバロン酸塩キナーゼ(MVK)；(xix)ホスホメバロン酸塩キナーゼ(PMVK)；(xx)ジホスホメバロン酸塩脱炭素酵素(MDC)；(xxi)イソペンテニル二リン酸エステル異性化酵素(IDI)；(xxii)ゲラニル-PP合成酵素(GPPS)；及び(xxiii)変異型芳香族プレニル転移酵素。上記の実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、該経路は、ホスホメバロン酸脱炭酸酵素(PMDC)及びイソペンテニル-リン酸エステルキナーゼ(IPK)の他に、上記(i)〜(xviii)及び(xxii)〜(xxiii)の酵素を含む。さらに別のまたはさらなる実施形態では、該経路は、ATPを用いてイソプレノールまたはプレノールをGPPに変換するための4ステップの経路、及びADP/ATPをリサイクルするための1つまたは複数のステップを含む。別のまたは前記実施形態のいずれかのさらなる実施形態では、該記経路は、(a)(イソ)プレノールキナーゼ(PRK)；(b)イソペンテニルリン酸エステルキナーゼ(IPK)；(c)イソペンテニル二リン酸エステル異性化酵素(IDI)；及び(d)ゲラニルピロリン酸エステル合成酵素(GPPS)を含む。さ��に別のまたはさらなる実施形態では、該経路は、ATP及びオリーブトレート(または2,4-ジヒドロキシ安息香酸またはその誘導体)で補充され、カンナビノイド前駆体を生成する。さらなる実施形態では、該経路は、カンナビノール酸合成酵素をさらに含む。さらに別のまたはさらなる実施形態では、該経路は、カンナビノール酸を産生する。
【００１０】
本開示はまた、(a)少なくとも1つのY288X変異を有する配列番号:30（ここで、Xは、A、N、S、Vまたは１つの非天然アミノ酸である）；(b)少なくとも1つのY288X変異（ここで、Xは、A、N、S、Vまたは１つの非天然アミノ酸である）、及びV49Z1、F213Z2、A232S、I234T、V271Z3、及び/またはG286Sから選択される少なくとも1つの他の変異（ここで、Z1はS、N、TまたはGであり、Z2はH、N、またはGであり、また、Z3はNまたはHである）を有する配列番号:30；(c)表１に記載のいずれかの変異組合せ；(d)1〜20の保存的なアミノ酸置換を含み、かつNphB活性を有する(a)、(b)または(c)のいずれか；(e)配列番号:30と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一である配列、かつ少なくとも(a)、(b)または(c)に記載の変異を有するもの；(f)アミノ酸21に始まる配列番号:1〜28または29に記載された配列；及び(g)配列番号:1〜28または29のいずれかと少なくとも99%同一である配列からなる群から選択される配列を有する組換えポリペプチドの存在下で、基質を、一般構造
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を有するプレニル基と接触させることを含む、（ここで、該プレニル基が、該基質に添加される）プレニル化化合物の製造方法も提供する。
【００１１】
以下に本開示の1つまたは複数の実施形態の詳細は、図面及び説明と共に記載される。他の特徴、目的及び利点は、本明細書及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本明細書に組み込まれ、また本明細書の一部を構成する添付図面は、詳細な説明とともに本開示の1つまたは複数の実施形態を説明し、本発明の原理及び実施態様を説明する役割を果たす。
【００１３】
【図１Ａ−Ｂ】は、本開示の例示的な生合成経路を示す。(A-1)と(A-2)プレニル天然物を製造するための合成生化学プラットフォーム。まず、グルコースは、NADPHレベルを調節するように改変された解糖経路（12酵素工程)を介してピルビン酸塩に分解される。次いで、PDHまたはPDHバイパスのいずれかがピルビン酸塩をアセチル-CoAに変換させる。アセチル-CoAは、メバロン酸塩経路(8酵素工程)を介してGPPに変換される。同一の中央経路を用いて、芳香族プレニル転移酵素(aPT)及び芳香族基質を変えることで種々のプレニルフラボノイド及びプレニルスチルベノイドを製造できる。CBGAまたはCBGVAを製造するために、該プレニル転移酵素の変異体NphB(dNphB)を開発した。CBGAは、カンナビジオール酸(CBDA)に変換され、CBGVAは、カンナビジオール酸合成酵素(CBDAS)を介してカンナビジバル酸(CBDVA)に変換される。異なるカンナビノイド合成酵素(THCAS及びCBCAS)を用いて他のカンナビノイドを製造できる。(B)は、(A)の経路をより詳細に示している。グルコースは、解糖によりピルビン酸塩に分解される(濃い青色)。濃い青色に示されたパージバルブは、NADPHを過剰に構築させずに、炭素が解糖経路を通って流動し続けることを可能にする。ピルビン酸塩は、淡い青色で示されたPDHバイパスを介してアセチル-CoAに変換される。アセチル-CoAは、メバロン酸塩経路(aqua)を介して高エネルギーのリン酸分子に構築され、GPPを生成する。次いで、メバロン酸塩経路からのGPPを用いて、芳香族ポリケチドをプレニル化する。ここに示されたのは、オリーブトレートのプレニル化でCBGAを生成することであるが、オリーブトレートを広範囲の基質(芳香族及び非芳香族)で置換し、様々なプレニル化生成物を生成することができる。最後に、CBGAはCBDASでCBDAに変換される。CBDAへの生合成経路は自然脱炭酸で完了する。緑色で示されたカンナビノイドモジュールは、CBDAの産生で完成となる。
【００１４】
【図２Ａ−Ｄ】は、芳香族ポリケチドのプレニル化のためのPDHバイパスの開発を示す。(A)種々の芳香族ポリケチド及び2%エタノール(媒体)の存在下で、ピルビン酸塩脱水素酵素(Ec PDH)の活性を測定した(n=3)。(B)異なる1,6 DHN濃度におけるPDH(PDHシステム-灰色点線)とPDHバイパスシステム(青色点線)を利用した全経路で得られた最終力価の比較。エラーバーは、試料間(n=3)の標準偏差を表す。(C)WT NphBを用いたPDHバイパスシステムで経時的に生成された5-プレニル-l,6-DHN（青色点線）及びCBGA（灰色点線）の量。エラーバーは、試料間(n=3)の標準偏差を表す。(D)NphB、AtaPT、またはNovQプレニル転移酵素のいずれかを用いて、種々の芳香族基質を該経路に加えた(生物学的繰り返し、n=3)。その結果、様々なC5及びC10プレニル天然物が得られる(*は力価未測定を示す)。
【００１５】
【図３Ａ−Ｃ】は、CBGAの製造を改良するためのNphBの遺伝子操作を示している。(A)WT NphBの活性部位におけるオリーブトレートのモデル。残基A288、G286、A232、I234、V271、及びV49については、設計プロセス中に変化可能にした。残基A288、G286及びA232は、OAでの活性に対する最大の影響を有し、目的ライブラリーにおいて標的となる位置であった。(B)オリーブトレートを基質として測定したNphB変異体の概ねの活性アッセイの結果。倍率の改善は、GPP(2.5 mM)、オリーブトレート(5 mM)、MgCl2(5 mM)、1 mg/mL WT NphB及び変異体との3連の反応の平均値である。(C)CBGA標準と比較し、M23及びWT NphBを用いた全経路の反応生成物のGC-MSクロマトグラム。M23変異体は、正しい生成物に対する特異性を劇的に改善する。
【００１６】
【図４Ａ−Ｃ】は、種々のカンナビノイドの産生のための無細胞プレニル化システムの評価を示す。(A)経時的なカンナビノイド前駆体の無細胞酵素産生(グルコースから)。M23を用いたCBGAの産生は、淡い緑色の点線で示され、WT NphBの産生は濃い緑色の点線で示されている。M31を用いたCBGVAの産生が淡い青色の点線で示されている。WT、M23及びM31の場合のNphB濃度を0.5 mg/mL(n=3)に固定した。(B)ノナンフローCBGA捕捉システムを使用して、CBGAのより高い力価(1.2 g/L)が得られた。蠕動ポンプを用いてノナン層を交換し、これにより矢印で示す方向にノナンを循環させた。該システムはCBGAを数ミリリットルのノナン及び緩衝液に希釈することができ、これにより反応におけるCBGAの量を減少させる。(C)CBDASを用いた経時的なカンナビノイドの産生。CBDAの産生は、濃い紫色の点線で示され、CBDVAの産生は、淡い紫色の点線で示されている。
【００１７】
【図５Ａ−Ｃ】は、MatB及びMdcA(転移酵素)経路の経路図を示している。(A)はMatB経路の模式図である。マロニル-CoAの産生はATP依存性であるが、そうでない場合には経路と関連しない。該経路における力価は12 mg/Lである。(B)はMdcA転移酵素経路の模式図である。マロニル-CoAの産生は、もはやATP依存性ではなく、ピルビン酸塩酸化経路及びメバロン酸塩経路に関連される。該システムの力価は42 mg/Lである。(C)は、(A)及び(B)に示される経路のポリケチドモジュールにおける例示的なステップの追加の詳細を示す。
【００１８】
【図６】は、(イソ)プレノールからGPPまでの経路の模式図を示す。ATP及び必要なキナーゼを用いて、イソプレノールまたはプレノールをゲラニルピロリン酸エステルに変換できる。
【００１９】
【図７】は、アセチル-CoA(またはメバロン酸塩)からIPP/DMAPPを生成するために使用できる様々な古典の(真核生物)及び非古典の(古細菌I及びII)メバロン酸塩経路を示す。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形"1つの"及び"該"は、文脈が明確に指示しない限り、複数の対象を含む。従って、例えば、"ポリヌクレオチド"に言及することは、複数のこのようなポリヌクレオチドを含み、また"該酵素"に言及することは、1つまたは複数の酵素を参照することを含む等。
【００２１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と類似または同等のものを用いて、本開示の方法及び組成物を実施できるが、本明細書には例示的な方法、装置及び材料を記載する。
【００２２】
また、特に断らない限り、"または"は、"及び/または"に意味する。同様に、"含む"、"含んでいる"、"包含する"、及び"包含している"は、互いに交換可能であり、限定を意図するものではない。
【００２３】
さらに理解されたいこととして、様々な実施形態の記載において"含んでいる"という表現が用いられる場合、特定の場合では、"本質的に・・・からなる"、または"・・・からなる"との表現を用いて一実施形態を代替的に記述できることを当業者が理解するであろう。
【００２４】
上記及び本文を通して論じられる刊行物は、本願の出願日以前の開示のためのみ提供される。本明細書のいかなるものも、発明者が事前の開示により、そのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００２５】
プレニル化(イソプレニル化または脂質化としても知られている)は、タンパク質または化学化合物に疎水性分子を加えることである。通常に考えられるように、プレニル基(3-メチルブト-2-エン-l-イル)が、GPIアンカーのような脂質アンカーと同様に、細胞膜への付着を容易にする。プレニル基は、特殊なプレニル結合ドメインを介してタンパク質-タンパク質結合にとって重要であることが示されている。
【００２６】
プレニル化天然物は、薬効が実証された大きなクラスの生物活性分子である。その例として、プレニルフラバノイド、プレニルスチルベノイド、及びカンナビノイドが挙げられる。植物由来のプレニル化合物は、汚染分子と構造上の類似性及び作物による組成の変動のため単離することが困難である。存在量の少ない化合物を単離しようとする際にこれらの課題がさらに顕著に現れる。プレニル化天然物の製造に関する課題を解決するために多くの化学合成法が開発されているが、これらは、一般にその繁雑さ及び低収率のため薬物製造には実用的なものではない。
【００２７】
プレニル化天然物に関して、微生物的な製法は、天然抽出法を代替する有用な方法であるが、それにたくさんの課題が伴っている。例えば、中心代謝から炭素の流動を迂回させる必要性及び生成物の毒性等。例えば、プレニル-ナリンゲニン、プレニルレスベラトロール、及びカンナビジオール酸(CBDA)のようなプレニル化天然物が、脂肪酸、イソプレノイド、及びポリケチド生合成の代謝経路の組み合わせから由来する。従って、高濃度の産生には、長くて重要な、かつ高度に調節された経路に効率的に改良する必要がある。これらの問題にもかかわらず、多くのグループは、微生物を遺伝子操作し、ナリンゲニン、レスベラトロール、及びオリーブトレートのような非プレニル化ポリケチドを製造するが、その濃度が比較的に低かった（それぞれ110、391、及び80 mg/L）。さらに、ゲラニル-ピロリン酸エステル(GPP)は、必須な代謝物であるが、中程度の濃度で細胞に毒性があることから、高濃度の微生物法での生産にとって大きな障壁となる。そのため、プレニル化生成物を得ることはさらに困難になる。
【００２８】
カンナビノイドは、特に治療上に莫大な潜在力を示し、抑制剤、抗痙攣剤、抗うつ剤、及び鎮痛剤として臨床試験が100試験以上も実施されている。しかし、プレニル化天然物は治療上の潜在力があるが、その低コストの製造方法がないことから、それらの研究及び使用は限られている。
【００２９】
植物に基づくカンナビノイドの製造法を代替する２つの主要な方法は、有機合成法及び代謝的に遺伝子操作された宿主(例えば、植物、酵母、または細菌)における製造法である。いくつかのカンナビノイド（例えば、THCA及びCBDA）の製造には、全合成法が解明されているが、これらは、医薬品製造には実用的でないものが多い。さらに、該合成法は、モジュール化されておらず、各カンナビノイドに独自の合成法を必要とする。天然の生合成経路を用いることでモジュール化された方法が得られるであろう。
【００３０】
３大カンナビノイド(THCA、CBDA、及びカニビクロメンまたはCBCA)は、一つの前駆体CBGAから由来する。さらに、存在量が少ない３つのカンナビノイドがCBGVAから由来する(図1A)。従って、異種ホストにおいてCBGA及びCBGVAを製造できることは、カンナビノイド系の製造につながる。残念ながら、微生物を遺伝子操作してCBGA及びCBGVAを製造することは極めて困難であることが証明されている。
【００３１】
カンナビノイドは、脂肪酸、ポリケチド、及びテルペン生合成経路の組み合わせから由来する(図1A)。該生合成経路は、重要な構築ブロックであるゲラニルピロリン酸エステル(GPP)及びオリベトール酸(OA)を生成する。高濃度のCBGA生合成には、長くて必須な、かつ高度に調節された経路に改良する必要がある。さらに、GPPは細胞に対して毒性であり、微生物における高濃度の生産に大きな障壁を生じる。一方、Gagneら(Proc. Natl. Acad. Sci., 109:12811, 2012)は、酵母においてOAを産生するための経路を設計したが、その力価は非常に低かった(0.5 mg/L)。該経路で中間体を高い濃度で産生することは容易ではないことが示唆された。別の研究では、Zirpelらは、GPP及びオリベトール酸(OA)を補充した乱交雑プレニル転移酵素(NphB)及びTHCA合成酵素を含有する酵母溶菌液中でTHCAを製造した(J. Biotechnol., 259:204-212, 2017)。しかし、低コストの原料から遺伝子操作された生細胞におけるカンナビノイドの製造を公表した報告がいまだにない。
【００３２】
酵素の混合物を用いて複雑な生化学的変換が無細胞で実施される合成生化学は、従来の代謝工学よりも潜在的な利点をもたらす。具体的に、経路設計におけるより高度な柔軟性、成分の最適化をより制御できること、設計-構築-テストのサイクルをより迅速に行うこと、及び中間体または生成物の細胞毒性から解放されることが含まれる。本開示は、カンナビノイドを製造するための無細胞系を提供する。
【００３３】
本開示は、カンナビノイドの産生を含む化合物のプレニル化のための酵素変異体及び該変異体を含む経路を提供する。また、本明細書に記載の生合成経路は、"パージバルブ"を使用して、NAD(P)Hレベルを調節する。このような"パージバルブ"は、グルコースからモノテルペンを高濃度で製造できることを示す (国際特許公開WO2017/015429を参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。これらのパージバルブを用いて元のシステムを改良し、多様化して、カンナビノイドのような複雑な天然物を産生した。図1A、1B、5A、及び5Bには、合成生化学的方法が概説されている。一実施形態では、本開示は、グルコースから由来のGPPを用いたプレニル化のための無細胞系を提供する(図1A、1B、5A、5B、及び7を参照)。別の実施形態では、本開示は、(イソ)プラノールまたはプレノールから由来のGPPを用いたプレニル化のための無細胞系を提供する(図6を参照)。図6の経路を、任意のATP生成システムに結合させ、反応に必要なATPを産生することができる。例えば、該経路を、クレアチンキナーゼATP生成系、アセテートキナーゼ系、解糖系、及びその他のシステムに結合させることができる。図6は、配列番号:54〜65の酵素(核酸コード配列及びポリペプチド)を提供している(例えば、PRK酵素は配列番号:54-57で;IPK酵素は配列番号:58〜61で；IDI酵素は配列番号:62〜63で；またFPPS酵素は配列番号:64〜65でそれぞれ提供されている)。
【００３４】
NphBは、炭素10のゲラニル基が芳香族基質へ付着することを触媒する芳香族プレニル転移酵素である。NphBは、高い基質選択性及び生成物の位置選択性を示す。ストレプトマイセスから同定されたNphBは、炭素１０のゲラニル基が多数の小分子有機芳香族の基質へ付加することを触媒する。NphBは、２つの基質分子、ゲラニル二リン酸エステル(GPP)及び1,6-ジヒドロキシナフタレン(1,6- DHN)が結合することができる空間的及び溶媒にアクセス可能な結合ポケットを有する。GPPは、その負に荷電された二リン酸エステル部分と、Mg2+に加えて、Lysll9、Thr171、Arg228、Tyr216及びLys284を含むいくつかのアミノ酸側鎖との間の相互作用によって安定化される。NphBの活性にはMg2+補助因子が必要である。ストレプトマイセス由来のNphBは、配列番号:30に記載の配列を有する。
【００３５】
NovQ(受託番号AAF67510、参照により本明細書に組み込まれる)は、プレニル転移酵素のCloQ/NphBクラスに属している。NovQ遺伝子はストレプトマイセスニビウスからクローニングすることができ、これはアミノクマリン抗生物質、ノボビオシンを産生する。組換えNovQを大腸菌で発現させ、均質に精製することができる。精製された酵素は、2価カチオンとは別にジメチルアリル基が4-ヒドロキシフェニルピルベート(4-HPP)に転移し、ノボビオシンの中間体である3-ジメチルアリル-4-HPPを産生することを触媒する可溶性の単量体の40-kDaタンパク質である。4-HPPのプレニル化に加えて、NovQは、フェニルプロパノイド、フラボノイド及びジヒドロキシナフタレンの多様な集合体の炭素-炭素及び炭素-酸素をベースしたプレニル化を触媒した。その触媒活性にもかかわらず、NovQに触媒されたプレニル化が位置特異的に起こった。NovQは、最初に報告された、ジメチルアリル基の、p-クマル酸やコーヒー酸などのフェニルプロパノイド及びフラボノイドのB環の両方への転移を触媒できるプレニル転移酵素である。NovQは、プレニル化フェニルプロパノイド及びプレニル化フラボノイドの合成に有用な生体触媒として機能できる。
【００３６】
最近発見され、特徴付られた麹菌芳香族プレニル転移酵素(AtaPT；受託番号AMB20850、参照により本明細書に組み込まれる)は、種々の芳香族化合物のプレニル化に関与している。組換えAtaPTは、大腸菌で過剰発現され、精製され得る。麹菌芳香族プレニル転移酵素(AtaPT)は、異なるプレニル二リン酸エステルの存在下でアシルフロログルシノールの主にC-モノプレニル化を触媒する。
【００３７】
オリベトール酸(OA)は、野生型NphBにとって比較的貧弱な基質である。その結果、より好ましいNphB基質、1,6ジヒドロキシナフタレン(1,6 DHN)を用いて、共基質をプレニル化するための無細胞系の能力を試験した。2.5 mMの1,6 DHN及び500 mMのグルコースで開始させた場合、約400 mg/L(1.3 mM)のプレニル化生成物が得られた。しかし、1,6 DHNの開始濃度が2.5から5 mMに増加した場合には、最終力価は2倍減少した。これは、1,6 DHNが1つまたは複数の酵素を阻害していることを示唆する。酵素アッセイにより、E.coliピルビン酸塩脱水素酵素(EcPDH)が、1,6 DHNだけでなく、いくつかの他の芳香族ポリケチドによって阻害されたことが明らかになった(図2B)。1 mM 1,6 DHN、オリベトール、またはレスベラトロールのいずれかにおいて、PDHの活性は2倍減少した(図2B)。従って、PDHバイパスを実施することによってPDHを除去するための実験を設計した(図1A及び2Bを参照)。PDHバイパスにおいて、ピルビン酸塩酸化酵素(PyOx)及びアセチル-リン酸塩転移酵素(PTA)を用いて、ピルビン酸塩をアセチル-CoAに変換し、PDHを除去した(図1A)。図2Aに示すように、この新しいシステムは、より高い濃度の1,6 DHNで見られる阻害を除去し、5 mMの1,6 DHNで開始したときに、PDHシステム上で5-プレニル-l,6 DHNの力価をPDHシステムより4倍増加させた(図2B)。図2Cは、PDHバイパスを利用して、5 mMの1,6 DHNで開始したときの5-プレニル-1,6 DHN生合成の時間経過を示す。最初の24時間に約50%の1,6 DHNが変換し、最終的に705±12 mg/Lの最終力価に到達した。
【００３８】
NphBによる芳香族ポリケチドのプレニル化は、カルボカチオン中間体を介して進行すると考えられる。その最初のステップでは二リン酸塩がGPPから解離し、GPPのCl炭素上にカルボカチオンを生成し、その後、近くの求核試薬を攻撃する。プレニル転移の位置特異性を改善するために、1,6 DHN、Mg2+及びGPPの非加水分解性類縁体（ゲラニルS-チオロ二リン酸エステル）と複合体を形成したNphBの結晶構造を開始点（PDBID 1ZB6; Protein Data Bankリファレンス1ZB6）として用い、OAをNphBの活性部位にモデル化した。設計のために、1,6 DHNをガイドとして用いて、結合ポケットにOAを入れ、所望のプレニル化部位、即ちOAのC3炭素を、新生ゲラニルClカルボカチオンの上方3.7オングストローム (に位置させた(図3A)。選択された距離は、GPPのCl炭素に対する1,6 DHNのC5炭素の距離に基づいた。次に、ROSETTAソフトウェアを用いて、OAに接触している残基を変化させ、OAを結合するためのNphBの活性部位を最適化した。GPPと接触しているか、または、潜在的に触媒機能を提供する側鎖を残して、固定した。その結果は示唆されたNphB変異体の集合であった。
【００３９】
実験的に試験する変異体の数を減らすために、スコアリングシステムを用いて、OA結合に最も顕著に影響を与える可能性のある変化をランク付けした。変異体の代表群を取り(表1)、各残基を他の変異背景の野生型側鎖に系統的に戻し、その変化をエネルギースコアで評価した(表2)。Y288置換は、エネルギースコアに最も大きな影響を与えた。そのため、実験的に評価された全ての構築物においてY288AまたはY288N変異体を使用した。変異の頻度、複数の突然変異がどのように協調して作用するか、及びNphBライブラリーをさらに形作るための計算エネルギースコアをすべて考慮した。これらの考慮により、表1に示すように、1点の突然変異体から構築物当たり6個までの変異に及ぶ29個の構築物からなるライブラリーを作製した(配列番号:1〜29も参照；配列番号:1〜29は、発現構築物からのヘキサヒスチジンリーダー、即ち、生物学的活性に不必要なアミノ酸1〜20を含む）。
【００４０】
表1は、例示的な変異及び野生型(即ち、配列番号:30のポリペプチド)に対する改善倍率、NphBライブラリー構築物及び変異(配列番号:30を参照したアミノ酸位置)を示す。
（表１）
2021532747.tif 000005
2021532747.tif 000006
【００４１】
（表２）：NphB変異体の動態パラメーター
2021532747.tif 000007
ｂ:ジバリン酸の動態パラメーター
【００４２】
ここで、本開示の改変されたNphBポリペプチドを製造・単離するための組換え方法を説明する。組換え生産に加えて、該ポリペプチドは、固相技術(例えば、Stewartら(1969)による固相ペプチド合成(WH Freeman Co、San Francisco); 及びMerrifieldによる(1963) J. Am. Chem. Soc. 85：2149-2154; これらは、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。)を用いた直接ペプチド合成で製造できる。ペプチド合成は、手動技術または自動化で行うことができる。自動化合成は、例えば、応用バイオシステム431Aペプチド合成機器(Perkin Elmer, Foster City、Calif.)を使用して、製造業者が提供した取扱説明書に従って行うことができる。
【００４３】
粗精製されたNphB変異体を得、野生型NphBを飽和させた濃度のGPP及びOAを用いてCBGA生産のための初期スクリーニングを行った。６つの構築物(Ml、M3、M6、M10、及びM15)は、WT NphBと比較した場合に、活性が10倍以上顕著に増強し、４つの構築物(M5、M7、M12及びM20)は、2〜10倍の顕著な改善があって、一方、残りの構築物は、WT NphBと同様な活性を有していたことが確認された。初回スクリーンからのトップヒット(Ml、M3、M10、及びM15)を精製し、より慎重に特徴付けした(図3B)。初回スクリーンの観察からいくつかのことが明らかとなった：(1)計算で予測されたように、Y288A(Ml)及びY288N(M2)は、自身で活性を増強した。(2)あらゆる構築物は、Y288Nの存在により、精製収率が低下した。これは、Y288Nは不安定化変異である可能性があり、Y288Aをより望ましい変異にすることを示唆した。(3)Y288N(M10)背景にG286Sを添加することにより、Y288N(M2)よりもさらに活性を改善するように思われ、G286Sが別の好ましい変異であり得ることを示唆した。(4)F213Nが、Y288A/F213N(M5)構築物において中性または有害な効果を有することにもかかわらず、Y288A/F213N/A232S(M15)は、Y288A(Ml)よりわずかに活性が改善された。これは、A232Sも好ましい変異である可能性を示唆した。
【００４４】
これらの初期観察から、変異体Y288A、GS86S及びA232Sの様々な組み合わせを含む目的ライブラリーを設計した。Y288側鎖のサイズを依然として小さくしながらも、Y288Vが安定性を向上させることができるという原理により、Y288Vとの他の組み合わせを追加した。第2ライブラリー中の構築物のうちの1つは、1時間の終点アッセイにおいて、WT NphBよりも少なくとも100倍高い活性を示した。第１ラウンドからの最良の変異体と第２ラウンドからの最良の変異体との比較が図3Bに示されている。明らかに、第１ラウンドからの有益な変異の組み合わせは、CBGAの産生を改良した。さらに、Y288A及びY288V構築物は、活性を犠牲にすることなく、Y288Nと比べてNphBの発現を改良した。
【００４５】
目的ライブラリーからの最良の３つの構築物だけでなく、初回スクリーンからの最良の２つの変異体をさらに特徴付けした。その動態パラメーターは表2に要約されている。全ての変異体が、Kmに対して比較的に適度な効果を有するが、kcat値の劇的な改善が観察された。M23(配列番号:23のNphB)は、特に、kcatが0.0021±0.00008 min-1から1.58±0.05 min-1になり、750倍改良された。M23及びM31の触媒効率(kcat/Km)は、野生型酵素と比べて、いずれも1000倍以上改良された。M31はM23よりも高いkcat/Kmを有したが、M31ではなく、M23を採用した。なぜなら、M23はより高いkcatを有し、また、合成の生化学システムは一般に飽和OAの条件において動作するからである。
【００４６】
設計された変異体M23は、OAのプレニル化に対する触媒効率を劇的に改善するだけでなく、これは非常に特異的であり、正しいCBGA生成物のみを生成する。WT NphBはCBGAを生成するが、優性生成物はプレニル化異性体である(図3C)。これに対して、設計された変異体M23は、CBGAをほぼ排他的に生成する。全体として、設計された酵素は、非特異的なプレニル化野生型酵素よりもはるかに有効なCBGA合成酵素である。
【００４７】
従って、本開示は、以下を含む変異型NphB変異体を提供する：(i) 少なくとも1つのY288X変異を有する配列番号:30（ここで、Xは、A、N、S、Vまたは１つの非天然アミノ酸である）；(ii)少なくとも1つのY288X変異（ここで、Xは、A、N、S、Vまたは１つの非天然アミノ酸である）、及びV49Z1、F213Z2、A232S、I234T、V271Z3、及び/またはG286Sから選択される少なくとも1つの他の変異（ここで、Z1はS、N、TまたはGであり、Z2はH、N、またはGであり、また、Z3はNまたはHである）を有する配列番号:30;(iii)表１に記載のいずれかの変異組合せ；(iv) 1〜20(例えば、2、5、10、15または20、または1〜20間の任意の値の保存的なアミノ酸置換を含み、かつNphB活性を有する(i)、(ii)または(iii)のいずれか；(v)配列番号:1〜29または30と少なくとも85%、90%、95%、98%または99%同一であり、かつ(i)、(ii)または(iii)に記載の変異を少なくとも１つを有する配列；(vi)アミノ酸21で始まる配列番号:1〜28または29に記載の配列のいずれかを含むNphB変異;または(vii)配列番号:1〜28または29のいずれかと少なくとも99%同一であり、かつNphB活性を有する任意の配列。"NphB活性"は、基質をプレニル化する酵素の能力、より具体的にはOAからCBGAを生成する能力を意味する。
【００４８】
本明細書で用いる非天然アミノ酸は、N-メチルアミノ酸(例えば、N-メチルL-アラニン、N-メチルL-バリン等)、またはα-メチルアミノ酸、β-ホモアミノ酸、ホモ-アミノ酸、及びD-アミノ酸等の天然に存在しないアミノ酸を指す。特定の実施形態では、本開示において有用な非天然アミノ酸には、低分子の疎水性非天然アミノ酸(例えば、N-メチルL-アラニン、N-メチルL-バリン等)が含まれる。
【００４９】
さらに、本開示は、前述のNphB変異体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。遺伝子コードの変性のため、実際のコード配列は、NphB突然変異種及び変異体のための列挙されたポリペプチドに依然として到達しながら、変化することがある。例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号:66、67及び68(それぞれ、配列番号:23、29及び69のポリペプチド配列に対応する)に提供される。また明らかなこととして、遺伝子コードの縮重は、依然として配列番号:23、29及び69のポリペプチドをコードしながら、配列番号:66、67及び68に対する同一性百分率の大きな変化を可能にする。
【００５０】
本開示はまた、組換え宿主細胞及び本開示のNphB変異酵素のいずれかを含む無細胞系を提供する。いくつかの実施形態では、該組換え細胞及び無細胞系は、プレニル化プロセスの実施に使用される。
【００５１】
本開示の目的は、グルコース、またはプレノール及び/またはイソプレノールから前駆体GPPを製造することである。次に、該前駆体を用いて、本開示の変異体NphBと共に添加されたOAをプレニル化し、CBGAを生成することができる。
【００５２】
このように、本開示は、グルコースをゲラニルピロリン酸エステルに変換する複数の酵素工程を含む無細胞系を提供する。該経路は、パージバルブ及びPDHバイパス酵素処理を含む。
【００５３】
図1Bに示すように、本開示の1つの経路は、ヘキソキナーゼを用いて、グルコースをグルコース-6-リン酸エステルに変換することを含む。ヘキソキナーゼ(EC 2.7.1.1)は、ヘキソース(6-炭素糖)をリン酸化して、ヘキソースリン酸エステルを形成する酵素である。ヘキソキナーゼは、ATPから基質に無機リン酸塩基を転移させる能力を有する。様々な生物由来の多数のヘキソキナーゼ蛋白質がクローニングされ、発現されている。いくつかの実施形態では、ヘキソキナーゼは、UniProtKB受託番号P04806に記載のSaccharomyces cerevisiae(Sc)から(本明細書に参照として組み込まれる)、ならびにそれと少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%が同一であり、かつヘキソキナーゼ活性を有する配列を含む。
【００５４】
次に、グルコース-6-リン酸エステルは、ホスホグルコ異性化酵素(Pgi)(EC 5.3.1.9)によりフルクトース-6-リン酸エステルに変換される。従って、上記に加えて、用語"ホスホグルコ異性化酵素"または"Pgi"は、グルコース-6-リン酸エステルからフルクトース-6-リン酸エステルの形成を触媒でき、かつ、配列番号:31と少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性、または、初期状態のパラメーターを用いてNCBI BLASTによって計算した結果、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有し、かつ該酵素がホスホグルコ異性化酵素活性を有する、タンパク質を指す。
【００５５】
別のまたはさらなる実施形態では、本明細書で提供されるシステムまたは組換え微生物は、ホスホフルクトキナーゼ(Pfk、ポリリン酸エステル依存性Pfkまたはその相同体または変異体)の発現を含む。この発現は、代謝経路中の他の酵素と組み合わせることができる。Pfkは、G.stearothermophilus(配列番号:32)から誘導することができる。別の実施形態では、Pfkの遺伝子操作された変異体を、それがホスホフルクトキナーゼ活性を有する限り、使用することができ、フルクトース-6-リン酸エステルをフルクトース-1,6-ビスホスフェートに変換することができる。このような遺伝子操作された変異体は、部位特異的な突然変異誘発、指向性進化等によって得ることができる。従って、本開示内に含まれるポリペプチドは、配列番号:32に示される配列と少なくとも85〜99%同一であり、かつホスホフルクトキナーゼ活性を有する、ポリペプチドである(例えば、配列番号:33〜34を参照)。
【００５６】
上記に加えて、用語"フルクトース1,6ビスリン酸アルドラーゼ"または"Fba"は、フルクトース1,6-ビスホスフェートからジヒドロキシアセトンリン酸エステル及びグリセルアルデヒド-3-リン酸エステルの形成を触媒でき、かつ配列番号:35と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、または、NCBI BLASTによる初期状態のパラメーターを用いた計算した結果、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有する、タンパク質を指す。他の相同体には、配列番号:35と26%の同一性を有するSynechococcus elongatus PCC 6301 YP_170823.1、配列番号:35と80%の同一性を有するVibrio nigripulchritudo ATCC 27043 ZP_08732297.1、配列番号:35と76%の同一性を有する)Methylomicrobium album BG8 ZP_09865128.1、配列番号:35と25%の同一性を有するPseudomonas fluorescens Pf0-1 YP_350990.1、及び配列番号:35と24%の同一性を有するMethylobacterium nodulans ORS 2060 YP_002502325.1が含まれる。従って、本開示には、配列番号:35と26%〜100%の同一性を有するポリペプチドの使用が含まれ、該ポリペプチドは、ビスリン酸アルドラーゼ活性を有する。上記の受託番号に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
上記に加えて、用語"トリオスリン酸エステル異性化酵素"または"Tpi"は、ジヒドロキシアセトンリン酸エステル(DHAP)からグリセルアルデヒド-3-リン酸エステルの形成を触媒でき、かつ配列番号:36と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、またはNCBI BLASTによる初期状態のパラメーターを用いた計算した結果、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有する、タンパク質を指す。他の相同体には、配列番号:36と45%の同一性を有するRattus norvegicus AAA42278.1、配列番号:36と45%の同一性を有するHomo sapiens AAH17917.1、配列番号:36と40%の同一性を有するBacillus subtilis BEST7613 NP_391272.1、配列番号:36と40%の同一性を有するSynechococcus elongatus PCC 6301 YP_171000.1、及び配列番号:36と98%の同一性を有するSalmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. AG3 ZP_06540375.1が含まれる。従って、本開示は、配列番号:36と40%〜100%の同一性を有し、かつトリオトリン酸エステル異性化酵素活性を有するポリペプチドの使用を含む。上記の受託番号に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５８】
経路のさらなる工程において、グリセルアルデヒド-3-リン酸エステルは、1,3-ビスホスホグリセレートに変換することができる。(本明細書の他の場所で説明するように)この酵素工程は、"パージバルブシステム"を含むことができる。例えば、グリセルアルデヒド-3-リン酸エステル脱水素酵素(Gap、Tdh)は、グリセルアルデヒド-3-リン酸エステルを1,3-ビスホスホグリセレートに変換する。一実施形態では、NAD+を補助因子として用いる野生型Gap(例えば、配列番号:37を参照)、またはP191D変異を含む変異型Gap(配列番号:37の配列に対して、また配列番号:38に示すように)が使用される。別の実施形態では、NADP+を補助因子として用いる変異型Gap(mGap;例えば、D34A/L35R/T35K変異を有する；配列番号:37の配列に対して、また配列番号:39に示すように)が使用される。さらに別の実施形態では、GapとmGap(GapM6)の組み合わせが使用される。NAD+を優先的に使用する野生型GapまたはP118D変異型Gapを用いた場合に、水を産生し、NADPHではなく、NADHを特異的に酸化するNADH酸化酵素(NoxE)を含む分子パージバルブを用いて("パージ")NADHをリサイクルすることができる。
【００５９】
上記に加えて、用語"NADH酸化酵素"または"NoxE"は、NADHをNAD+に酸化でき、かつ配列番号:18と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性、または、NCBI BLASTによる初期状態のパラメーターを用いた計算した結果、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列類似性を共有する、タンパク質を指す。
【００６０】
該経路は、ホスホグリセレートキナーゼ(EC 2.7.2.3) (PGK；例えば、配列番号:40に提供されているような、またはそれと少なくとも80%同一である相同体または変異体)を用いて、1,3-ビスホスホグリセレートを3-ホスホグリセレートにさらに変換することができる。該酵素が、1,3-ビスホスホグリセレート(1,3-BPG)からリン酸塩基を可逆的にADPに変換することを触媒し、3-ホスホグリセレート(3-PG)及びATPを生成する。ATPの分子パージバルブは、例えば、GTPaseまたは他の酵素またはその相同体または変異体を用いて、ADPをリサイクルするために存在することができる。
【００６１】
次いで、3-ホスホグリセレートは、ホスホグリセレートミューターゼ(pgm;例えば、配列番号:41に提供されるような、またはそれと少なくとも80%同一である相同体または変異体)で2-ホスホグリセレートに変換され得る。
【００６２】
次いで、エノラーゼ(eno;例えば、配列番号:42に提供されるような、またはそれと少なくとも80%同一であるその相同体または変異体)は、2-ホスホグリセレートをホスホフェノールピルベート(PEP)に変換することができる。
【００６３】
ピルビン酸塩キナーゼ(pyk;例えば、配列番号:43、44、及び45に提供されるような、または配列番号:43、44または45のいずれかと少なくとも80%同一である相同体または変異体)は、PEPをピルビン酸塩に変換する。
【００６４】
上記のように、ピルビン酸塩脱水素酵素(PDH)は、該経路の生成物によって阻害される。従って、PDHバイパスを用いて、ピルビン酸塩をアセチル-CoAに変換することができる。PDHバイパスは、２つの酵素工程を含む：(i)ピルビン酸塩酸化酵素(例えば、Aerococcus viridans由来のPyOx；EC 1.2.3.3；配列番号:46を参照)によって触媒されたピルビン酸塩→アセチルリン酸塩；及び(ii)アセチルリン酸エステル転移酵素(aka アセチルリン酸エステル転移酵素)(例えば、G. stearothermophilusからのPTA)によって触媒されたアセチアルリン酸エステル→アセチル-CoA。
【００６５】
本明細書に使用されるように、本開示の組成物及び方法に用いられるPyOxは、配列番号:46と少なくとも85%、90%、95%、98%、99%同一であり、かつピルビン酸塩酸化酵素活性を有する、配列を含む。
【００６６】
リン酸塩アセチル転移酵素(EC 2.3.1.8)は、アセチル-CoA+リン酸塩からCoA+アセチルリン酸エステルへの化学反応（その逆も同様である）を触媒する酵素である。アセチルリン酸エステル転移酵素は、ptaにより大腸菌にコードされる。PTAは、アセテートからアセチル-CoAへの変換に関与する。具体的には、PTAは、アセチル-CoAからアセチル-リン酸エステルへの変換を触媒する。PTA相同体及び変異体が知られている。約1075種の細菌リン酸塩アセチル転移酵素がNCBI上で利用可能である。例えば、そのような相同体及び変異体には、リン酸塩アセチル転移酵素 Pta (Rickettsia felis URRWXCal2) gi|67004021|gb|AAY60947.1|(67004021); リン酸塩アセチル転移酵素 (Buchnera aphidicola str. Cc (Cinara cedri)) gi|116256910|gb|ABJ90592.1|(116256910); pta (Buchnera aphidicola str. Cc (Cinara cedri)) gi|116515056|ref|YP_802685.1|(116515056); pta (Wigglesworthia glossinidia endosymbiont of Glossina brevipalpis) gi|25166135|dbj|BAC24326.1|(25166135); Pta (Pasteurella multocida subsp. multocida str. Pm70) gi|12720993|gb|AAK02789.1|(12720993); Pta (Rhodospirillum rubrum) gi|25989720|gb|AAN75024.1|(25989720); pta (Listeria welshimeri serovar 6b str. SLCC5334) gi|116742418|emb|CAK21542.1|(116742418); Pta (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10) gi|41398816|gb|AAS06435.1|(41398816); リン酸塩アセチル転移酵素 (pta) (Borrelia burgdorferi B31) gi|15594934|ref|NP_212723.1|(15594934); リン酸塩アセチル転移酵素 (pta) (Borrelia burgdorferi B31) gi|2688508|gb|AAB91518.1|(2688508); リン酸塩アセチル転移酵素 (pta) (Haemophilus influenzae Rd KW20) gi|1574131|gb|AAC22857.1|(1574131); リン酸塩アセチル転移酵素 Pta (Rickettsia bellii RML369-C) gi|91206026|ref|YP_538381.1|(91206026); リン酸塩アセチル転移酵素 Pta (Rickettsia bellii RML369-C) gi|91206025|ref|YP_538380.1|(91206025); リン酸塩アセチル転移酵素 pta (Mycobacterium tuberculosis F11) gi|148720131|gb|ABR04756.1|(148720131); リン酸塩アセチル転移酵素 pta (Mycobacterium tuberculosis str. Haarlem) gi|134148886|gb|EBA40931.1|(134148886); リン酸塩アセチル転移酵素 pta (Mycobacterium tuberculosis C) gi|124599819|gb|EAY58829.1|(124599819); リン酸塩アセチル転移酵素 Pta (Rickettsia bellii RML369-C) gi|91069570|gb|ABE05292.1|(91069570); リン酸塩アセチル転移酵素 Pta (Rickettsia bellii RML369-C) gi|91069569|gb|ABE05291.1|(91069569); リン酸塩アセチル転移酵素 (pta) (Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nichols) gi|15639088|ref|NP_218534.1|(15639088); 及びリン酸塩アセチル転移酵素 (pta) (Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nichols) gi|3322356|gb|AAC65090.1|(3322356)が含まれ、受託番号に関連する各配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
再び図1Bに戻ると、該経路は、アセチル-CoAからアセトアセチル-CoAへの変換を含む。アセチル-CoAからアセトアセチル-CoAへの変換は、アセチル-CoAアセチル転移酵素(例えば、PhaA)で行われる。多くのアセチル-CoAアセチル転移酵素が当該技術分野で知られている。例えば、R.eutrophaからのアセチル-CoAアセチル転移酵素。別の実施形態では、該アセチル-CoAアセチル転移酵素は、配列番号:47と少なくとも85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を有する。
【００６８】
アセトアセチル-CoA及びアセチル-CoAは、A110G変異を有する酵素HMG-CoA合成酵素(例えば、配列番号:48を参照)、またはそれと85〜99%の配列同一性を有する相同体またはその変異体でHMG-CoAに変換することができる。
【００６９】
次いで、該HMG-CoAは、NADPH及びHMG-CoA還元酵素(例えば、配列番号:49を参照)、またはそれと85〜99%の配列同一性を有する相同体または変異体の作用により、メバロン酸塩に還元される。
【００７０】
次いで、メバロン酸塩は、ATP及びメバロン酸塩キナーゼ(MVK)の作用により、リン酸化され、メバロン酸塩-5-リン酸エステル及びADPを生成する。メバロン酸塩キナーゼは、当該技術分野で公知であり、配列番号:50の配列と少なくとも85〜100%(例えば、85%、90%、95%、98%、99%)同一であり、かつメバロン酸塩キナーゼ活性を有する配列を含む。
【００７１】
前記メバロン酸塩-5-リン酸エステルが、ATP及びホスホメバロン酸塩キナーゼ(PMVK)の作用により、さらにリン酸化され、メバロン酸塩-5-二リン酸エステル及びADPを生成する。ホスホメバロン酸塩キナーゼは、当該技術分野で公知であり、配列番号:51の配列と少なくとも85〜100%(例えば、85%、90%、95%、98%、99%)同一であり、かつホスホメバロン酸塩キナーゼ活性を有する配列を含む。
【００７２】
メバロン酸塩-5-二リン酸エステルは、ATP及びジホスホメバロン酸塩脱炭酸酵素(MDC)の作用により、脱カルボキシル化され、ADP、CO2及びイソペンチルピロリン酸エステルを生成する。ジホスホメバロン酸塩脱炭酸酵素は、当該技術分野で公知であり、配列番号:52の配列と少なくとも85〜100%(例えば85%、90%、95%、98%、99%)同一であり、かつジホスホメバロン酸塩キナーゼ活性を有する配列を含む。
【００７３】
様々な他のメバロン酸塩経路を使用することができる(例えば、図7を参照)。
【００７４】
次いで、ゲラニルピロリン酸エステル（GPP）が、配列番号:53に対してS82F変異を有するファルネシル-PP合成酵素の存在下で、DMAPPとイソペンチルピロリン酸エステルとの組み合わせから形成される。一実施形態では、ファルネシル二リン酸塩合成酵素は、S82F変異を有する配列番号:53と少なくとも95%、98%、99%または100%同一の配列を有し、かつDMAPP及びイソペンチルピロリン酸エステルからゲラニルピロリン酸エステルを形成できる。
【００７５】
次に、GPPは、プレニルフラビノイド、ゲラニルフラボノイド、プレニルスチルベノイド、ゲラニル-スチルベノイド、CBGA、CBGVA、CBDA、CBDVA、CBGVA、CBCVA、THCA及びTHCVAに至る多数の経路のための基質として使用することができる(例えば、図1Aを参照)。
【００７６】
例えば、PDHバイパスを含む生化学全合成システムを用いて、上記のようにNphB変異体で(例えば、M23変異体)、グルコース及びOAから直接にCBGAを産生する能力を試験した(図1A及び図1Bを参照)。該システムにおけるM23を用いた初期生産力は、67 mg/L/hrで、CBGAの最終力価は744±34 mg/Lであった。これは、WT NphBを用いたCBGA生産よりも100倍速く、力価は21倍高かった。留意されたいこととして、変異体NphB酵素では、最大力価が24時間以内に達し、産生が停止したが、野生型酵素では、該システムが4日間まで連続運転した。これは、該酵素及び補助因子が活性を維持し、より長い期間にわたって生存可能であることを示唆している。約500 mg/LのCBGAが一旦生成されると、該反応物が濁っていたことに留意されたい。その沈殿物を収集し、SDS-PAGE分析により沈殿物中の酵素混合物を同定した結果、溶液中の高濃度のCBGAが酵素を沈殿させることが示された。反応中に生成物を除去するために、より効果的なシステムが開発された。
【００７７】
反応にノナンオーバーレイを用いてCBGAを抽出したが、CBGAはノナンよりも水溶性であり、簡単なオーバーレイで抽出できるCBGAの量を制限する。このようにして、ノナン層からCBGAを捕捉し、それを別の水槽に閉じ込めるフローシステムを設計した(図4B)。該フローシステムを実施することによって、反応容器内により低濃度のCBGAを維持し、酵素の沈殿を緩和した。該フローシステムは、実際に最終力価を1.2 g/Lまで改善した。
【００７８】
次に、該システム内のOAをジビリン酸(DA)で置換し、多くの希少カンナビノイドの前駆体CBGVAを製造する実験を実施した(例えば、図1Bを参照)。最初に、設計された酵素は、DA基質上で活性であるかどうかを定めるために試験した。２つの最良の変異体M23及びM31、並びにWT NphBを、CBGVAを産生する能力について試験した。表2に示された動態データは、M31がはるかに優れて、その触媒効率は、M23より15倍高く、また、WT NphBよりも650倍高いことを示した。従って、さらなる実験に、グルコース及びジバリ酸からCBGVAを生成するためにM31を用いた。図4Aに示すように、約107 mg/L/hrの最大生産性でCBGVAを製造し、最終力価は1.74±0.09 g/Lに達し、CBGVAに添加されたジバリ酸の92%を変換した。酵素を沈殿させることに関してCBGVAが弱かったため、CBGVAの産生のためにノナンフローシステムは必要とされなかった。
【００７９】
最終的に追加のカンナビノイドを調製するために該アプローチを使用できることを実証するために、CBDA合成酵素を用いてCBGAをCBDAへ、またCBGVAをCBDVAに変換した。CBDAの場合、ノナンオーバーレイは大量のCBGAを含有し、これにより、CBDA合成酵素を含む溶液にノナンオーバーレイを単に転写することにより、4日間で14.4±0.8 mg/L/hr/mg総タンパク質の定速でCBGAをCBDAに変換した。
【００８０】
ノナンにおけるCBGVAの溶解度に限界があるため、CBGVAを抽出し、CBDA合成酵素を含む反応に添加した。GC-MSを用いた結果、CBDA合成酵素の生成物は、実際にはCBDVAであった。
【００８１】
従って、本開示は、GPPを製造するための無細胞システムを提供する。さらに、本開示は、変異型NphBと組み合わせたGPP経路を用いて、または本開示の変異型NphBの基質を用いて、純粋なカンナビノイド及び他のプレニル化天然物のアレイを製造するための無細胞アプローチを提供する。該成功した方法は、本開示の遺伝子操作されたプレニル転移酵素(例えば、上記のNphB変異体)を使用する。これは、活性及び高度な特異性を有し、天然の膜貫通性のプレニル転移酵素の必要性を排除している。本明細書で提供される合成生化学プラットフォームのモジュール性及び柔軟性は、バイオに基づくアプローチの利点を有するが、満足された現存のシステムの複雑さを排除している。例えば、GPPの毒性は、設計プロセスに影響を与えなかった。また、OAが酵母に代替されないので、これを外因的に加えるアプローチは細胞内では必ずしも可能ではない。実際、無細胞系の柔軟性により、さらなる最適化、追加的な経路の酵素や試薬、及び共因子修飾に必要な設計-構築-試験のサイクルが大幅に容易になった。
【００８２】
図1の全体的な経路に移ると、本開示は、酵素によって触媒され、"基質"を製品に変換する多数の工程を提供する。いくつの場合には、ある工程は、補助因子を利用することができるが、いくつかの工程は、補助因子(例えば、NAD(P)H、ATP/ADP等)を使用しない。表3は、酵素、生物、及び反応での使用量、ならびに受託番号のリストを示す(該受託番号に関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる)。
【００８３】
（表３）：酵素プラットフォームに使用される酵素 
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【００８４】
上記のように、GPPによるオリーブトレートのプレニル化は、ここ及び上記に記載された変異型NphBポリペプチドの活性によって行われる。
【００８５】
本開示は、プレニル化化合物のin vitroでの製造方法を提供し、さらに、カンナビノイド及びカンナビノイド前駆体(例えば、CBGA、CBGVAまたはCBGXA、ここで、"X"は、任意の化学基を指す)のin vitroでの製造方法を提供する。本開示の一実施形態では、無細胞調製物は、例えば、３つの方法で製造できる。一実施形態では、該経路の酵素を、本明細書に記載されるように、購入し、適切な緩衝液中で混合する。それに適切な基質を添加し、プレニル化化合物またはカンナビノイドやカンナビノイド前駆体(該当する場合に)の製造に適した条件下でインキュベートする。いくつかの実施形態では、該酵素は、支持体に結合でき、またはファージディスプレイまたは他の表面発現系で発現させることができ、例えば、代謝経路のサイクルにおけるポイントに対応する流体経路に固定できる。
【００８６】
図5A-Bは、経路を様々な"モジュール"(例えば、解糖モジュール、メバロン酸塩/イソプレノイドモジュール、カンナビノイドモジュール、ポリケチドモジュール)として示す。例えば、イソプレノイドモジュールは、メバロン酸塩経路を介してアセチル-CoAからイソプレノイドゲラニルピロリン酸エステル(GPP)を生成する。芳香族ポリケチドモジュールは、III型ポリケチド合成酵素(PKS)を用いて、ヘキサノイル-CoA及びマロニル-CoA(アセチル-CoAに由来)をオリベトリン酸(OA)に変換するする。カンナビノイドモジュールは、イソプレノイドモジュール及びポリケチドモジュールからの生成物を用いて、カンナビゲロリン酸を生成する。次に、これは、カンナビノイド合成酵素で最終のカンナビノイドに変換される。
【００８７】
別の実施形態では、該経路の1つまたは複数の酵素をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを、酵素が発現される条件下で、1つまたは複数の微生物にクローニングする。次いで、該細胞を溶解し、該細胞由来の1種または複数の酵素を含む溶解調製物を適切な緩衝液及び基質(必要な場合に、及び該経路の1つまたは複数の追加の酵素)と合わせ、プレニル化化合物、またはカンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体を製造する。あるいは、該酵素を溶解した調製物から単離し、次いで適切な緩衝液中で再度合わせることができる。さらに別の実施形態では、購入された酵素と発現された酵素との組み合わせを用いて、適切な緩衝液中の経路を提供する。一実施形態では、該経路の熱安定化ポリペプチド/酵素をクローニングし、発現させる。一実施形態では、該経路の酵素を好熱性の微生物から誘導する。次いで、該微生物を溶解し、該経路の熱安定化ポリペプチドが活性であり、かつ他のポリペプチド(目的でないもの)が変性して不活性となる温度に調製物を加熱する。それによって、該調製物は、微生物中の全ての酵素の小グループを含み、活性のある熱安定性酵素を含む。次いで、該調製物を用いて該経路を実施し、プレニル化化合物、またはカンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体を産生できる。
【００８８】
例えば、in vitroシステムを構築するため、全ての酵素は、購入し、または親和性クロマトグラフィーにより精製し、活性について試験し、適切に選択した反応緩衝液中で一緒に混合することができる。
【００８９】
また、組換え微生物を得るために、微生物に遺伝子操作された生合成経路中の前記酵素の全部または一部を用いてin vivoシステムを完成させる。
【００９０】
本開示はまた、プレニル化化合物の産生のための変異型nphBを含み、また、カンナビノイドを産生するための酵素を発現する1つまたは複数のさらなる生物(例えば、部分経路を発現する一組の微生物及びさらなるまたは最終的な部分の経路を発現するもう一組の微生物の共培養)をさらに包含してもよい代謝的に遺伝子操作された生合成経路を含む組換え生物を提供する。
【００９１】
一実施形態において、本開示は、親微生物と比較して少なくとも1つの標的酵素の発現上昇を含み、または親生物に見出されない酵素をコードする組換え微生物を提供する。別のまたはさらなる実施形態において、該微生物は、所望の代謝物の産生に必要な代謝物と競合し、または望ましくない生成物を生成する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子の還元、破壊またはノックアウトを含む。該組換え微生物は、例えば、プレニル化化合物、またはカンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体の産生のための生合成経路に関与する少なくとも1つの代謝物を生成する酵素を発現する。一般に、該組換え微生物は、標的酵素を含む少なくとも1つの組換え代謝経路を含み、また、競合的な生合成経路における酵素の活性または発現の低下をさらに含み得る。該経路は、例えば、プレニル化化合物、またはカンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体の生成における基質または代謝中間体を修飾するように作用する。該標的酵素は、適切な生物源に由来したポリヌクレオチドによりコードされ、発現される。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、細菌または酵母源由来の遺伝子を含み、本開示の微生物に遺伝子組換え的に操作される。別の実施形態では、所望の標的酵素をコードするポリヌクレオチドは、生物において天然に存在するが、自然発現レベルと比較して過剰発現されるように遺伝子組換え的に操作される。
【００９２】
用語"微生物"は、原核生物及びドメイン古細菌、細菌、及び真核生物からの真核生物の微生物種を含む。後者には、酵母、糸状菌、原生動物、藻類、またはより高等な原生生物が含まれる。用語"微生物細胞"及び"微生物"(microbs)は、用語微生物(microorganism)と互換的に使用される。
【００９３】
用語"原核生物"は、当該分野において認識されており、核または他の細胞小器官を含まない細胞を指す。一般に、原核生物は、２つのドメイン、即ち、細菌及び古細菌のうちの1つに分類される。古細菌の生物と細菌ドメインとの間の定義上の差異は、16SリボソームRNAにおけるヌクレオチド塩基配列での基本的な差異に基づいている。
【００９４】
"細菌"、または"真正細菌"は、原核生物のドメインを指す。細菌は、次の少なくとも11の明確なグループを含む：(1)グラム陽性(グラム+)細菌、それに２つの主要な下位区分がある：(1)高G+C群(放線菌、マイコバクテリア、ミクロコッカス、その他)、(2)低G+C群(バチルス、クロストリジウム、乳酸菌、ブドウ球菌、連鎖球菌マイコプラズマ)、(2)プロテオバクテリア、例えば、紫色光合成+非光合成グラム陰性細菌(最も"一般的な"グラム陰性細菌を含む)、(3)シアノバクテリア、例えば、酸素生成性フォトトロフ、(4)スピロヘータ及び関連種、(5)プラントミー、(6)バクテロイド、フラボバクテリア、(7) クラミジア、(8)緑色硫黄細菌、(9)緑色非硫黄細菌(嫌気性フォトトロフィも)、(10) Radioresistant micrococci及び関連族、及び(11)サーモトガ及びサーモシフォ好熱菌。
【００９５】
"グラム陰性細菌"は、球菌、非腸内杆状体、及び腸内杆状体を含む。グラム陰性細菌の属には、例えば、Neisseria、Spirillum、Pasteurella、Brucella、Yersinia、Francisella、Haemophilus、Bordetella、Escherichia、Salmonella、Shigella、Klebsiella、Proteus、Vibrio、Pseudomonas、Bacteroides、Acetobacter、Aerobacter、Agrobacterium、Azotobacter、Spirilla、Serratia、Vibrio、Rhizobium、Chlamydia、Rickettsia、Treponema、及びFusobacteriumが含まれる。
【００９６】
"グラム陽性細菌"は、球菌、非胞子化杆状体、及び胞子形成杆状体を含む。グラム陽性細菌の属には、例えば、Actinomyces、Bacillus、Clostridium、Corynebacterium、Erysipelothrix、Lactobacillus、Listeria、Mycobacterium、Myxococcus、Nocardia、Staphylococcus、Streptococcus、及びStreptomycesが含まれる。
【００９７】
本明細書で使用される酵素の"活性"は、代謝物を産生する、反応を触媒する、即ち"機能"する能力の尺度であり、反応の代謝物が生成される速度として表され得る。例えば、酵素活性は、単位時間当たりまたは酵素単位(例えば、濃度または重量)当たり生成される代謝物の量、または親和性または解離定数で表すことができる。
【００９８】
用語"生合成経路"は、"代謝経路"とも呼ばれるが、1つの化学種を別の化学種に変換(変異)するための同化または異化生化学反応のセットを指す(例えば、図1A-Bを参照)。遺伝子産物は、並行してまたはシリーズで、同じ基質上に作用し、同じ産物を生成する場合、または同じ基質と代謝物末端生成物との間の代謝中間体(即ち、代謝物)に作用するか、または産生する場合、同じ"代謝経路"に属する。本開示は、所望の生成物または中間体の生成のための代謝的に遺伝子操作された経路を有する組換え微生物を提供する。
【００９９】
従って、代謝的に"遺伝子操作された"または"改変された"微生物は、遺伝子材料を選択された宿主または親微生物へ導入することを介して産生される。それによって微生物の細胞生理学及び生化学の性質を修飾または改変する。遺伝子材料を導入することにより、親微生物は、新しい特性を得る。例えば、新たな、またはより大量の細胞内代謝物の生産力、または通常に発現されるポリペプチドを発現させる能力。例示的な実施形態では、親微生物への遺伝子材料の導入は、ピルビン酸塩酸化酵素及びアセチルリン酸エステル転移酵素を用いてPDHバイパスを介してアセチル-リン酸エステル及び/またはアセチル-CoAを産生するための新たなまたは改変された能力をもたらす。前記親微生物に導入された遺伝子材料は、プレニル化化合物、またはカンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体の産生のための生合成経路に関与する1種または複数種の酵素をコードする、遺伝子、または遺伝子の一部を含み、また、該遺伝子の発現及び/または発現を調節するためのさらなる要素、例えばプロモーター配列も含んでもよい。
【０１００】
宿主または親微生物への遺伝子材料の導入の代わりまたはそれに加えて、遺伝子操作され、または改変された微生物はまた、遺伝子またはポリヌクレオチドの破壊、欠失、またはノックアウトを包含し、該微生物の細胞生理学及び生化学的性質を変化させる。該遺伝子またはポリヌクレオチドの還元、破壊、またはノックアウトを介して、該微生物は、新規のまたは改善された性質(例えば、新規のまたはより多くの細胞内代謝物を生成する能力、所望の経路への代謝物の流動を改善する能力、かつ/または望ましくない副産物の産生を減少させる能力)を取得し、または
溶解した調製物から開発された生合成経路と競合し得る無細胞調製物からの酵素を排除する。
【０１０１】
"酵素"は、典型的には、1つまたは複数の化学的または生化学的反応をある程度で特異的に触媒または促進するタンパク質またはポリペプチドを構成する全てまたは大部分のアミノ酸から構成される任意の物質を意味する。
【０１０２】
本明細書で互換的に使用される"タンパク質"または"ポリペプチド"は、ペプチド結合と呼ばれる化学結合によって互いに連結されたアミノ酸と呼ばれる化学的構築ブロックの1つまたは複数の鎖を含む。タンパク質またはポリペプチドは、酵素として機能することができる。
【０１０３】
本明細書で使用される用語"代謝的に遺伝子操作された"または"代謝的な遺伝子操作"は、合理的な経路設計及び生合成遺伝子、オペロン関連遺伝子、ならびに微生物におけるアセチル-リン酸エステル及び/またはアセチル-CoA、高級アルコールまたは他の化学物質のような所望の代謝物の産生のための遺伝子オペロンに関連する遺伝子、及びそのようなポリヌクレオチドの制御要素の集合を含む。"代謝的に遺伝子操作された"は、所望の経路に至る中間体と競合する競合的な代謝経路の還元、破壊、ノックアウトを含む、遺伝的操作及び適切な培養条件を用いて、転写、翻訳、タンパク質安定性及びタンパク質機能の調節及び最適化による代謝的な流動の最適化をさらに含むことができる。生合成の遺伝子は、宿主に外来性であるか、または突然変異誘発、組換え、及び/または内因性宿主細胞内の異種発現制御配列との関連によって改変されることによって、宿主微生物に対して異種であり得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドが宿主生物に対して異種遺伝子である場合、ポリヌクレオチドはコドン最適化され得る。
【０１０４】
"代謝物"とは、代謝によって産生される任意の物質、または所望の代謝物、化学品、アルコールまたはケトンの増加をもたらす特定の代謝過程に関わる、またはその一部に必要な物質を指す。代謝物は、出発物質(例えば、グルコース等)、中間体(例えば、アセチル-CoA)、または代謝の最終生成物(例えば、CBDA)となる有機化合物であり得る。代謝物を用いて、より複雑な分子を構築することができ、または、これらはより単純なものに分解できる。中間代謝物は、他の代謝物から合成されてもよく、おそらくより複雑な物質を産生するために使用され、またはしばしば化学エネルギーの放出を伴ってより単純な化合物に分解されてもよい。
【０１０５】
"突然変異"は、変異型のタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞をもたらす任意のプロセスまたはメカニズムを意味する。これは、タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、または遺伝子配列が改変される任意の突然変異、及びそのような突然変異から生じる細胞における任意の検出可能な変化を含む。典型的には、突然変異は、点突然変異、欠失、または単一または複数のヌクレオチド残基の挿入によって、ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列に起きる。突然変異は、タンパク質をコードする遺伝子の領域内で生じるポリヌクレオチド変化、ならびに、限定されないが、調節配列またはプロモーター配列のような、タンパク質をコードする配列の外側の領域における変化を含む。遺伝子における突然変異は、"サイレント"であってもよく、即ち、発現の際にアミノ酸変化に反映されず、遺伝子の"配列保存的"変異体につながる。一般的に、これは、1つのアミノ酸が1以上のコドンに対応する場合に生じる。タンパク質の異なる一次配列をもたらす突然変異を、変異型タンパク質またはタンパク質変異体と呼ぶことができる。
【０１０６】
"天然の"または"野生型"タンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞は、自然界に存在するタンパク質、酵素、ポリヌクレオチド、遺伝子、または細胞を意味する。
【０１０７】
"親微生物"は、組換え微生物を生成するために使用される細胞を指す。一実施形態では、用語"親微生物"は、自然界に存在する細胞、即ち、遺伝的に改変されていない"野生型の"細胞を指す。用語"親微生物"は、さらに、さらなる遺伝子操作のために"親"として機能する細胞を指す。この後者の実施形態では、該細胞は遺伝子操作されていてもよいが、さらなる遺伝子操作のための供給源として機能する。
【０１０８】
例えば、野生型の微生物を、ヘキソキナーゼのような第1標的酵素を発現または過剰発現するように遺伝的に改変することができる。該微生物は、第2標的酵素(例えば、フルクトース-1,6-ビスリン酸エステルアルドラーゼ)を発現または過剰発現するように改変された微生物の生成において親微生物として作用することができる。次に、該微生物を、例えば、NADH酸化酵素及びGald-3-リン酸塩脱水素酵素(及びそれらの変異体)を、発現または過剰発現のために改変することができる。これをさらに修飾して、例えば、ホスホグリセレートキナーゼ等の第3標的酵素を発現または過剰発現させることができる。本明細書に使用される"発現"または"過剰発現"は、所望の遺伝子産物の表現型発現を指す。一実施形態では、生物中の天然に存在する遺伝子を、異種プロモーターまたは調節ドメインに連結するように遺伝子操作することができ、ここで、該調節ドメインは、遺伝子の発現を引き起こし、それによって野生型の生物に対する正常な発現を改変する。あるいは、該生物を遺伝子操作して、遺伝子上の抑制因子の機能を除去または減少させ、それによってその発現を改変できる。さらに別の実施形態では、所望の発現制御/調節要素に作動可能に連結された遺伝子配列を含むカセットが微生物において遺伝子操作される。
【０１０９】
従って、親微生物は、連続的な遺伝的改変事象のための参照細胞として機能する。各改変事象は、1つまたは複数の核酸分子を参照細胞に導入することによって達成され得る。該導入は、1つまたは複数の標的酵素の発現または過剰発現を促進するか、または1つまたは複数の標的酵素の減少または除去を促進する。理解されるように、用語"促進する"は、例えば親微生物におけるプロモーター配列の遺伝的改変によって標的酵素をコードする内因性ポリヌクレオチドの活性化を包含する。さらに理解されるように、用語"促進する"は、標的酵素を親微生物にコードする外因性ポリヌクレオチドの導入を包含する。
【０１１０】
相同体、変異体、フラグメント、関連の融合タンパク質、またはそれらの機能的等価物を含む代謝物の生成に有用な酵素をコードするポリヌクレオチドは、細菌または酵母細胞のような適切な宿主細胞中でこのようなポリペプチドの発現を誘導する組換え核酸分子に使用される。本明細書に提供される配列及び受託番号から、当業者は、容易に入手可能なソフトウェア及び生物学の基礎知識を用いて、本開示の様々な酵素のコード配列を得ることができる。
【０１１１】
本明細書に添付された配列リストは、本明細書に記載の方法において有用な例示的なポリペプチドを提供する。理解されるように、非機能性または非コード配列(例えば、ポリHISタグ)の追加のような、ポリペプチド分子の活性を変化させない配列の追加は、塩基性分子の保存的な変化である。
【０１１２】
理解されるように、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、"遺伝子"を含み、また、上記の核酸分子は、"ベクター"または"プラスミド"を含む。
【０１１３】
用語"ポリヌクレオチド"、"核酸"または "組換え核酸"は、デオキシリボ核酸(DNA)、及び適切な場合では、リボ核酸(RNA)のようなポリヌクレオチドを指す。
【０１１４】
遺伝子またはポリヌクレオチドに関する用語"発現"は、遺伝子またはポリヌクレオチドの転写、また適切な場合では、得られたmRNA転写物のタンパク質またはポリペプチドへの翻訳を指す。従って、文脈から明らかになるように、タンパク質またはポリペプチドの発現は、翻訳領域の転写及び翻訳から生じる。
【０１１５】
当業者が分かるように、遺伝子コードの縮重性質のために、それらのヌクレオチド配列が異なる種々のコドンを用いて、所定のアミノ酸をコードすることができる。上記で説明した生合成酵素またはポリペプチドをコードする特定のポリヌクレオチドまたは遺伝子配列は、単に本開示の実施形態を例示するために参照される。また本開示は、本開示の方法で利用される酵素のポリペプチド及びタンパク質の同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする任意の配列のポリヌクレオチドを含む。同様に、ポリペプチドは、典型的には、所望の活性を失う、または著しく失うことなく、そのアミノ酸配列における1つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を許容することができる。本開示は、代替のアミノ酸配列を有するこのようなポリペプチドを含み、また、本明細書に示されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列は、本開示の例示的な実施形態を単に例示するにすぎない。
【０１１６】
本開示は、本明細書の他の場所でより詳細に記載されるように、1つまたは複数の標的酵素をコードする組換えDNA発現ベクターまたはプラスミドの形態でのポリヌクレオチドを提供する。一般に、このようなベクターは、宿主微生物の細胞質中で複製するか、または宿主微生物の染色体DNAの中に組み込むことができる。いずれの場合においても、該ベクターは、安定なベクター(即ち、該ベクターは、選択的な圧力のみでさえも、多くの細胞分裂にわたって存在したままである)、または一過性のベクター(即ち、該ベクターは、細胞分裂の数が増加することにつれて、宿主微生物によって徐々に失われる)であり得る。本開示は、単離された状態(即ち、純粋ではないが、天然に見られない存在及び/または濃度の調製物中に存在する)、及び精製された状態(即ち、実質的に汚染物質を含まないか、または対応するDNAが天然に見出される物質を実質的に含まない)でのDNA分子を提供する。
【０１１７】
標準的なPCR増幅技術及び以下の実施例の項に記載された手順に従って、cDNA、mRNAまたは代替的にゲノムDNAを鋳型及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、本開示のポリヌクレオチドを増幅することができる。このように増幅された核酸を適切なベクターにクローニングし、DNA配列解析によって特徴づけすることができる。さらに、ゴヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術（例えば、DNA自動合成器を用いて）によって調製することができる。
【０１１８】
本開示は、本願に付随する配列リストにおいて、多数のポリペプチド配列を提供する。この配列リスト及び遺伝子コードの縮重を用いてポリヌクレオチド配列を設計、合成、及び/または単離することができる。また、公的に入手可能なデータベースを用いてコーディング配列を検索することができる。
【０１１９】
また理解されるように、1つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、1つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を特定のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に導入することで、本明細書に記載の酵素に相同なポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子は生成され得る。部位特異的突然変異誘発及びPCRにより媒介される突然変異誘発のような標準的な技術により、突然変異をポリヌクレオチドに導入することができる。非保存的なアミノ酸置換を行うことが望ましい位置とは対照的に、いくつかの位置において保存的なアミノ酸置換を行うことが好ましい。
【０１２０】
当業者に理解されるように、特定の宿主におけるその発現を増強するためにコード配列を改変することが有利であり得る。遺伝子コードは、64個の可能なコドンで冗長であるが、ほとんどの生物は、典型的には、これらのコドンのサブセットを使用する。ある種において最も頻繁に利用されるコドンは最適なコドンと呼ばれ、頻繁に利用されないコドンは、希少または低使用コドンとして分類される。コドンは、宿主の好ましいコドン使用を反映するように置換することができる。これは、時々"コドン最適化"、または"種コドンバイアスの制御"と呼ばれるプロセスである。
【０１２１】
特定の原核細胞または真核生物宿主に好まれるコドンを含む最適化されたコーディング配列(Murrayら、(1989) Nucl. Acids Res. 17：477-508も参照)を調製し、例えば、翻訳速度を増加させるか、または最適化されていない配列から生成される転写物と比べて、より長い半減期のような望ましい特性を有する組換えRNA転写物を生成することができる。翻訳停止コドンはまた、宿主の好みを反映するように改変することができる。例えば、S.cerevisiae及び哺乳動物の典型的な停止コドンはそれぞれUAA及びUGAである。単子葉植物の典型的な停止コドンはUGAであるが、昆虫及び大腸菌は通常UAAを停止コドンとして使用する(Dalphinら,(1996) Nucl. Acids Res. 24：216-218)。植物における発現のためのヌクレオチド配列の最適化方法は、例えば、米国特許第6,015,891号及びその引用文献に提供されている。
【０１２２】
用語"基質"または"適切な基質"は、酵素の作用により他の化合物に変換されまたは変換されるように意図される任意の物質または化合物を指す。この用語は、単一の化合物だけでなく、溶液、混合物、及び少なくとも1つの基質またはその誘導体を含む他の材料のような化合物の組合せも含む。さらに、用語"基質"は、出発原料を提供する化合物だけでなく、本明細書に記載の代謝的に遺伝子操作された微生物に関連する経路で用いられる中間体及び最終生成物の代謝物も提供する化合物も包含する。
【０１２３】
"形質変換"は、ベクターを宿主細胞に導入するプロセスを指す。形質転換(または形質導入、または遺伝子導入)は、多数の手段のいずれかによって達成され得る。これには、電気穿孔法、微量注入法、遺伝子銃（または粒子照射媒体性デリバリー）、またはアグロバクテリウム媒介性形質変換が含まれる。
【０１２４】
"ベクター"は、一般に、生物、細胞、または細胞成分の間で増殖及び/または転移できるポリヌクレオチドを指す。ベクターには、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、及びYAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌の人工染色体)、及びPLACS(植物人工染色体)等の人工染色体が含まれる。これらは"エピソーム"であり、即ち、自律的に複製するか、宿主細胞の染色体に統合することができる。ベクターは、裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同一鎖内のDNA及びRNAの両方からなるポリヌクレオチド、ポリ-リジン-共役DNAまたはRNA、ペプチド-結合DNAまたはRNA、リポソーム-共役DNA等であってもよい。これらは、本質的にエピソームではないか、またはアグロバクテリウムまたは細菌等の上記のポリヌクレオチド構築物の1つまたは複数を含む生物であり得る。
【０１２５】
発現ベクターの様々な成分は、ベクターの意図される用途及びベクターが複製または駆動発現を意図する宿主細胞に依存して、大きく変化することができる。遺伝子の発現及び大腸菌、酵母、ストレプトミセス及び他の一般的に使用される細胞におけるベクターの維持に適した発現ベクター成分は、広く知られており、商業的に入手可能である。例えば、本開示の発現ベクターに含めるのに適したプロモーターには、真核生物または原核生物の宿主微生物において機能するものが含まれる。プロモーターは、宿主微生物の増殖に対する発現の調節を可能にするか、または化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフさせる調節配列を含むことができる。大腸菌及び特定の他の細菌宿主細胞の場合、生合成酵素、抗生物質耐性付与酵素及びファージタンパク質の遺伝子に由来するプロモーターを使用することができる。これには、例えば、ガラクトース、ラクトース(lac)、マルトース、トリプトファン(trp)、β-ラクタマーゼ(bla)、バクテリオファージラムダPL、及びT5プロモーターが含まれる。さらに、tacプロモーター(米国特許第4,551,433号、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)のような合成プロモーターも使用できる。大腸菌発現ベクターの場合、pUC、plP、pl及びpBRからのような大腸菌に由来する複製を含むことが有用である。
【０１２６】
従って、組換え発現ベクターは、少なくとも１つの発現系を含む。該発現系は、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子コード配列の少なくとも一部、及び任意に適合した宿主細胞におけるコード配列の発現を影響するように動作する終結配列から構成される。宿主細胞は、本開示の組換えDNA発現ベクターで形質転換することにより改変され、染色体外要素としてまたは染色体に組み込まれた発現系配列を含むことができる。
【０１２７】
さらに、上記のように、代謝物を生成するのに有用な酵素の相同体が、本明細書で提供される微生物及び方法に包含される。第1のファミリーまたは種のオリジナル酵素または遺伝子に関して使用される用語"相同体"は、機能的、構造的またはゲノム的な解析により、第1ファミリーまたは種のオリジナル酵素または遺伝子に対応する第2ファミリーまたは種の酵素または遺伝子であることと測定される第2のファミリーまたは種の明確な酵素または遺伝子を指す。最も多くの場合、相同体は、機能的、構造的またはゲノム的な類似性有するであろう。遺伝子プローブ及びPCRを用いて酵素または遺伝子の相同体を容易にクローニングすることができる技術が知られている。相同体としてのクローン化配列の同一性は、機能的なアッセイ及び/または遺伝子のゲノムマッピングを用いて確認することができる。
【０１２８】
タンパク質をコードする核酸配列が、第2タンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、該タンパク質は、第2タンパク質との"相同性"を有し、またはそれと"相同である"。あるいは、２つのタンパク質が"類似の"アミノ酸配列を有する場合、該タンパク質は、第2タンパク質と相同性を有する。（従って、用語"相同なタンパク質"は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味するように定義される。)
【０１２９】
本明細書で使用される場合、２つのタンパク質(または該タンパク質の領域)の配列が、少なくとも約30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する場合に、該２つのアミノ酸配列は、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列の同一性の百分率、または２つの核酸配列の同一性の百分率を測定するために、最適に比較するように該配列を整列する(例えば、ギャップを、最適な整列のために第１及び第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、相同ではない配列は、比較のため無視することができる)。一実施形態では、比較するために整列された基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも30%、典型的には少なくとも40%、より典型的には少なくとも50%、さらに典型的には少なくとも60%、さらにより典型的には少なくとも70%、80%、90%、100%である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。最初の配列の位置が2番目の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、該分子はその位置で同一である(本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である)。２つの配列間の同一性の百分率は、配列で共有される同一の位置の数、２つの配列の最適な整列のために導入される必要のあるギャップの数、及び各ギャップの長さの関数である。
【０１３０】
タンパク質またはペプチドに関して"相同（の）"が使用される場合、同一ではない残基位置は、しばしば保存的なアミノ酸置換によって異なることが認識される。"保存的なアミノ酸置換"は、アミノ酸残基が化学的性質(例えば、電荷または疎水性)が類似な側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基によって置換されたことである。一般に、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能的な特性を実質的に変化させない。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が保存的な置換によって互いに異なる場合には、配列同一性の百分率または相同性の程度を上方に修正し、置換の保存的性質のため補正することができる。該修正の手段は当業者に周知されている(例えば、Pearsonら、1994、参照により本明細書に組み込まれる)。
【０１３１】
いくつかの例では、同じ機能変換/反応を実行するには、"アイソザイム"を使用することができる。しかし、これらは構造的に非常に異なるため、通常は"相同"ではないと判定される。
【０１３２】
"保存的なアミノ酸置換"は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。次の6つのグループには、それぞれ、相互に保存的に置換されたアミノ酸が含まれる：(1)セリン(S)、スレオニン(T)、(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、(4)アルギニン(R)、リジン(K)、(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、アラニン(A)、バリン(V)、及び(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
【０１３３】
配列同一性の百分率とも呼ばれるポリペプチドの配列相同性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、遺伝学コンピューターグループ（GCG）の配列分析ソフトウェアパッケージ(910 University Avenue, Madison, Wis. 53705,ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター)を参照されたい。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的なアミノ酸置換を含む種々の置換、欠失及び他の改変に割り当てられた相同性の測定を用いて、類似の配列と一致する。例えば、GCGは、"Gap"及び"Bestfit"のようなプログラムを含む。これらのプログラムを初期状態のパラメーターと共に用いて、異なる生物種、または野生型タンパク質とそのムテインとの間からの相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を測定することができる。例えば、GCGバージョン6.1を参照されたい。
【０１３４】
異なる生物由来の大量な配列を含むデータベースと分子配列を比較するために使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータプログラムBLAST(Altschul、1990；Gish、 1993；Madden、1996；Altschul、1997；Zhang、1997)であり、特にblastpまたはtblastn(Altschul、1997)。BLASTpの典型的なパラメーターは、期待値：10(初期状態)；フィルター：seg(初期状態)；ギャップを開始するコスト：11(初期状態)；ギャップを拡大するコスト：1(初期状態)；最大アライメント：100(初期状態)；ワードサイズ：11(初期状態)；記載数：100(初期状態)；ペナルティマトリックス：BLOWSUM62である。
【０１３５】
多数の異なる生物から配列を含むデータベースを探索する場合、アミノ酸配列を比較することが典型的である。アミノ酸配列を用いたデータベース検索は、当該技術分野で知られているBLASTp以外に、アルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列を、FASTA（GCGバージョン6.1のプログラム）用いて比較することができる。FASTAは、クエリーと検索配列との間の最良の重複領域のアライメント及び配列同一性百分率を提供する(Pearson、1990、参照により本明細書に組み込まれる)。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性百分率は、GCGバージョン6.1（参照により本明細書に組み込まれる）の初期状態パラメーター(単語サイズ2及びPAM250スコリング化マトリクス)を有するFASTAを用いて測定できる。
【０１３６】
本開示は、in vitro系で使用するための組換え微生物及びタンパク質の産生に有用な種々の遺伝子、相同体及び変異体のための受託番号及び配列を提供する。理解されるべきこととして、本明細書に記載の相同体及び変異体は例示的であり、非限定的である。当業者には、例えば、（ウェブ上でアクセス可能な国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター(NCBI)のようなものを含む種々のデータベースを用いて、付加的な相同体、変異体及び配列は入手可能である。
【０１３７】
本明細書に記載の配列及び受託番号を利用し、本明細書で使用されるポリペプチドのいずれかに使用または置換され得る相同体及びアイソザイムを同定することは、当業者のスキル範囲内である。実際に、本明細書において提供されるいずれの配列をBLASTで検索することで、複数の関連相同体の識別は可能であろう。
【０１３８】
本明細書に提供された組換え微生物の成長及び維持に適した培養条件は公知である(例えば、FreshneyとWiley-Lissによる「動物細胞の培養―基礎技術マアニュアル」、第3版、N.Y.(1994))。当業者は、このような条件が、各微生物の要求に適合させるように改変できることを認識するであろう。
【０１３９】
理解されるように、微生物の範囲を改変し、プレニル化化合物、またはカンナビノイド、またはカンナビノイド前駆体の産生に適した組換え代謝経路の全部または一部を包含するようにすることができる。また、理解されるように、種々の微生物が、本明細書で提供される組換え微生物での使用に適した標的酵素をコードする遺伝子材料の"供給源"として作用できる。
【０１４０】
先に論じたように、ベクター、プロモーター及び多くの他の関連トピックの使用を含む、本明細書で有用な分子生物学的技術を記載する一般的なテキストには、BergerとKimmelによる「分子クロニング技術、酵素学における方法」、Vol.152、(Academic Press,Inc.,San Diego, Calif.), ("Berger")；Sambrookらによる「分子クロニング―実験マニュアル」第2版、Vol.1-3、Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989, ("Sambrook");及びF.M.Ausubelらによる「分子生物学における最新プロトコル」、最新のプロトコル、Greene Publishing Associates,Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.,とのジョイントベンチャー, (1999に追加版), ("Ausubel")が含まれる。そのいずれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅、及び本開示の相同核酸を製造するための他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA)を含む、in vitro増幅法に介して当業者の指導に十分なプロトコルの例として、Berger、Sambrook、及びAusubel、ならびにMullisら(1987)の米国特許第4,683,202号；Innisらの(1990)PCRプロトコル：「方法及び用途への指南」(Academic Press、San Diego、Calif.) ("Innis")；Arnheim &；Levinson (Oct. 1、1990年10月1日) C&EN 36-47；The Journal Of NIH Research (1991) 3：81-94；Kwohら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：1173；Guatelliら (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87：1874；Lomellら (1989) J. Clin. Chem 35：1826；Landegrenら (1988) Science 241：1077-1080；Van Brunt (1990) Biotechnology 8：291-294；Wu及びWallace (1989) Gene 4：560；Barringerら (1990) Gene 89：117；及びSooknananとMalek(1995) Biotechnology 13：563-5464を参照することができる。
【０１４２】
In vitroで増幅された核酸のクローニング改良法は、Wallaceらの米国特許第5,426,039号に記載されている。
【０１４３】
PCRによる高分子核酸の増幅改良法は、ChengらによるNature(1994)369：684-685及びその引用文献に要約されている。それには、40 kbのPCRアンプリコンが生成されている。当業者に理解されるように、本質的に任意のRNAを、制限消化、PCR伸長、及び逆転写酵素やポリメラーゼを用いた配列決定に適した二本鎖DNAに変換することができる。例えば、Ausubel、Sambrook及びBergerを全て参照されたい。
【０１４４】
本発明を以下の実施例で例示するが、これらは、例示として提供され、限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１４５】
化学品及び試薬  酵母ヘキソキナーゼ及びCorynebacterium glutamicumカタラーゼは、Sigma Aldrich社から、Aerococcus viridiansピルビン酸塩酸化酵素は、A. G.Scientific社から、全ての補助因子及び試薬は、Sigma Aldriich社、またはThermon Fisher Scientific社のいずれかから、ただし、オリベトール酸は、Santa Cruz Biotechnology社から、またジバリニン酸は、Toronto Research Chemicals社から購入した。
【０１４６】
酵素のクローニング及び精製  NphB遺伝子をIDT DNA社から遺伝子ブロックとして購入し、ギブソン組立法を用いてpET 28(+)ベクターにクローニングした。残りの酵素をゲノムDNAまたはプラスミドから増幅し、同じギブソン組立法を用いてpET28(+)にクローニングした。全てのプラスミドをBL21(DE3) Goldに形質転換し、酵素を50 μg/mLカナマイシンでLB培地で発現させた。1 Lの培養物に、同じ培地中で2 mLの飽和培養物を接種し、37℃でOD600が0.5〜0.8になるまで増殖させた。該培養物を1 mMのIPTGで誘導し、18℃で16時間発現させた。2,500×gで遠心分離することにより細胞を回収し、約20 mLの溶解緩衝液：50 mMトリス[pH8.0]、150 mM NaCl及び10 mMイミダゾール中に再懸濁した。Emulsiflex 装置を用いて細胞を溶解した。該溶解物を20,000×gで遠心分離することにより清澄化し、上清を4℃で1 mLのNiNTA樹脂に30分間バッチ結合させた。該樹脂を重力フローカラムに移した。10倍カラム容量の洗浄緩衝液：50 mMトリス[pH8.0]、150 mM NaCl及び10 mMイミダゾールで該樹脂を洗浄した。次いで、タンパク質を2倍カラム容量の溶出緩衝液：50 mMトリス[pH8.0]、150 mM NaCl、250 mMイミダゾール及び30%(v/v)グリセロールで溶出させた。液体N2を用いて溶出緩衝液中で酵素をフラッシュ凍結させ、該酵素を-80℃で保存した。
【０１４７】
PDH無細胞反応  PDH反応を２つの部分に組み立てた。最初に、補助因子と基質を一つの試験管に結合させ、酵素を別の試験管に結合させた。最終容量200 μLに補助因子と酵素を混合して反応を開始させた。最終基質及び補助因子の濃度は次の通りである：500 mMグルコース、1 mM 1,6フルクトースビスホスフェート、4 mM ATP、0.5 mM 2,3ビスホスホグリセレート、0.5 mM NAD+、1.5 mM CoA、1.5 mM NADP+、0.5 mM TPP、6 mM MgCl2、10 mM KC1、 50 mMトリス[pH8.0]及び20 mMリン酸塩緩衝液[pH8.0]、5 mMグルタチオン、及び0.5〜5 mM 1,6 DHN。24時間に該反応を急冷させた。
【０１４８】
PDH活性アッセイ  いくつかの芳香族ポリケチドの存在下でPDH活性をアッセイした。媒体対照は1%エタノールであった。その活性を芳香族ポリケチドを含まないアッセイの結果と比較した。最終反応容積は200 μLであった。反応には、2 mM NAD+、2 mM CoA、1 mM TPP、5 mM MgCl2、5 mM KC1、50 mM Tris pH8.0、及び5μLの1.25 mg/mL PDHが含まれていた。該反応を96ウェルプレートにセットした。最終濃度1 mMになるように芳香族ポリケチドを添加し、最終濃度1%(v/v)になるようにエタノール対照を添加した。該プレートを室温で10分間インキュベートし、10 μLの100 mMピルビン酸塩で反応を開始させた。M200分光計を用いて340 nmでの吸光度を10分間モニターした。芳香族分子は340 nmでバックグラウンド吸光度を有するので、反応混合物及び芳香族分子を用いて反応をブランキングしたが、ピルビン酸塩で反応を開始させる代わりに、水を添加した。線形適合の初期勾配を用いて初期速度を測定した。ビールの法則を用いて、吸光係数6.22×103/M/cmで単位時間当たりに生成されたNADHの量を計算した。反応を3連で行い、その平均値と標準誤差を算出した。
【０１４９】
RyOx/PTA無細胞反応  PyOx/PTA反応を２片に組み立てた。最初に、補助因子及び基質を一つの試験管に結合させ、酵素を別の試験管に結合させた。最終的な補助因子及び200 μLの反応における基質の濃度は、以下の通りであった：500 mMグルコース、1 mM 1,6フルクトースビスホスフェート、4 mM ATP、0.5 mM 2,3ビスホスホグリセレート、0.5 mM NAD+、1.5 mM CoA、3 mM NADP+、0.5 mM TPP、6 mM MgCl2、10 mM KC1、50 mMトリスpH8.0、及び50 mMリン酸塩緩衝液[pH8.0]。各反応に添加される酵素の量は表3に詳細に記載されている。共因子及び酵素を混合し、反応を開始させ、500 μLのノナンオーバーレイを上部に添加した。該反応物を室温でゲルシェーカー上で穏やかに振盪しながらインキュベートした。
【０１５０】
1,6 DHN/5-p-1,6 DHNについて：芳香族基質が変動要因である場合、0.5〜5 mMの芳香族基質を反応に加え、24時間に該反応を急冷させた。時間が変動要因である場合、5 mMの1,6 DHNを加え、約12、24、48及び72時間にそれぞれの反応を急冷させた。
【０１５１】
オリーブトレート/CBGAについて：カンナビノイド経路の最適化から、より少ないグルコースで同じ力価が達成され得ることが示されたので、グルコースの濃度を150 mMに低下させた。また、NADP+の濃度を6 mMに高くし、ATPの濃度を1 mMに低下させたことにより、より高い力価のCBGAが得られた。オリーブトレートの濃度を5 mMに設定した。反応に添加されるNphBの量は可変であった。図2Cに示されたデータの場合は、1.5 mg/mLのNphBを用いて、約4、8、14、24、48、72及び96時間に反応物を急冷させた。図4Aに示されたデータの場合、0.5 mg/mlのWT NphB及びM23を用いて、約6、9、12、24、48、72及び96時間に反応物を急冷させた。
【０１５２】
ジバリニン酸/CBGVAについて：条件は上記の一般法と非常に類似していた。ただし、150 mMグルコース、1 mM ATP及び6 mM NADP+を用い、約6、9、12、24、及び48時間に反応物を急冷させた。さらに、プレニル転移酵素の最終濃度は1 mg/mLであった。アピゲニン、ダイゼイン、ゲニステイン、ナリンゲニン及びレスベラトロールを用いて、AtaPT、NovQ及びNphBについて試験した。また、オリベトール、オリーブトレート、及び1,6 DHNでNphBについても試験した。24時間にこれらの反応物を急冷させた。
【０１５３】
急冷反応  反応物を急冷させるために、水層及び有機層を1.5 mLのマイクロ遠心分離管に移した。反応バイアルを200 μLの酢酸エチルで洗浄し、次いでマイクロ遠心管中に反応液とプールした。該試料を5〜10秒間ボルテックスした後、13,000 rpmで3分間遠心分離した。有機層を除去し、残りの水層を200 μLの酢酸エチルでさらに2回抽出した。各試料について有機抽出物をプールし、次いで真空遠心分離機を用いて蒸発させた。HPLC分析のために該試料をメタノールに再溶解した。
【０１５４】
オリーブトレート/CBGAについて：タンパク質沈殿が観測されたため、0.12 gの尿素(固体)の存在下で図4Aに示されたCBGA反応物を抽出した。CBGAの抽出が促進された。図2Cに示されたWT NphB CBGAの場合には、タンパク質が沈殿しなかったため、これは不必要であった。
【０１５５】
生成物の定量  Thermo Ultimate 3000 HPLCを用いて、C18カラム(4.6×100 mm)を備えた逆相クロマトグラフィーにより、反応物を分画した。カラムコンパートメントの温度を40℃に設定し、流速を1 mL/分とした。水+0.1%TFA(溶媒A)とアセトニトリル+0.1%TFA(溶媒B)との勾配溶出を移動相として化合物を分離した。最初の１分間に溶媒Bを20%に保持した後、4分間かけて95%まで増加させ、次いで95% Bを3分間保持した。次いで、カラムを20% Bに3分間再平衡させ、総稼働時間が11分間であった。
【０１５６】
Sigma Aldrich社から購入した分析標準品による外挿検量線を用いて、カンナビノイド(CBGA、CBDA、及びCBDVA)を定量した。確証的な標準品が利用できなかったため、5-p-1,6-DHN及びCBGVA核磁気共鳴(NMR)試料を用いて外挿検量線を作成した。濃度が既知の標準品を水に溶解した後、上記の方法を用いて抽出した。
【０１５７】
プレニル生成物の定量（確証的な標準品を使用せずに）  プレニル生成物（プレニル-アピゲニン、プレニル-ダイゼイン、プレニル-ナリンゲニン、プレニル-ゲニステイン、プレニル-レスベラトロール、及びプレニル-オリベトール）の確証的な標準品がないため、基質の消費量に基づいてプレニル生成物を定量した。標準検量線を作成するために、各芳香族基質の連続希釈液を反応混合物に供したが、生成物の生成を防止するために、プレニル転移酵素を残した。液体クロマトグラフ質量分析を用いて、標準検量線と比較し、反応によって消費された基質の量を定量した。
【０１５８】
エレクトロスプレーイオン化飛行時間型測定は、MassLynx 4.1ソフトウェアによって制御されるWaters LCT-Premier XE飛行時間型装置(Waters Corporation、Milford、MA)を用いて実施した。該装置は、エレクトロスプレーモードで動作するマルチモードイオン化源を備えていた。正確な質量測定のため、ロイシンエンケファリン(Sigma Chemical、L9133)の溶液をロックスプレーに用いた直接ループ注入器を用いて、試料をWaters Acuity UPLCシステムに注入した。Acquity BEH C18 1.7 μmカラム(50×2.1 mm)を用いて、試料をWaters Acuity UPLCシステム上で分離し、溶媒Bの30〜95%勾配(溶媒A：水、溶媒B：アセトニトリル、両方とも0.2%ギ酸(vol/vol)を含む)で10分間溶出させた。質量300〜2000 Daで質量スペクトルを記録した。
【０１５９】
NMR分光法  NMR分光法を用いて、プレニル生成物を同定し、また5-p-1,6-DHNを定量した。
【０１６０】
1,6 DHN/5-p-1,6 DHNについて：PyOx/PTA無細胞系を用いてプレニル-DHNを産生した。200 μLの反応物をプールし、等量のノナンで3回抽出し、次いでノナンを蒸発させた。内部標準として2 mMの1,3,5-トリメトキシベンゼン(TMB)を用い、該反応生成物を500 μlの重水素化メタノール(CD3OD)に懸濁させた。AV400 Bruker NMR分光計を用いてスペクトルを収集した。内部標準TMBを参照して、試料におけるプレニル化化合物の量を測定した。6.05 ppmでのTMB(3H、s)からのプロトン信号を、7.27 ppmでの5-p-1,6-DHN(1H、d)に対応する芳香族プロトンと比較した。
【０１６１】
ジバリニン酸/CBGVAについて：またNMRを用いて、芳香族基質としてジバリニン酸を用いた酵素系の生成物を同定した。上記のようにPyOx/PTA系を設定し、24時間に反応物を急冷させた。該反応物を上記のように抽出し、HPLCで分析した。6.7分に新たな主要なピークがあった。これは、プレニル化されたジバリニン酸であると予測した。該HPLCピークを精製し、溶媒を除去し、600 μLのCD3OD中に該純粋な成分を再溶解した。CBGVAについて、AV500 Bruker NMR分光計で収集されたプロトンスペクトルを、Shoyamaらによって公表されたプロトンスペクトルと比較し、主要な生成物がCBGVAであることを確認した。Shoyamaら及びBohlmanらの論文に基づいて、ジバリニン酸のプレニル化はそのC3の炭素で起きると結論づけた。
【０１６２】
NphBの結合ポケットを改変してオリーブトレートを受容するためのROSETTA設計  表4においてオリーブトレートP1-6と示された６つの異なる開始位置におけるNphBの活性部位にオリーブトレートを置いた。各オリーブトレート位置について、ROSETTAを5回、合計30回の設計行った。各設計において予測された変異を表4に列挙した。各オリーブトレート位置について、変異のコンセンサスセット(即ち、最も頻繁に選択された残基)を選択し、コンセンサスグループA〜F(表4)をさらに評価した。次いで、各ROSETTAに示唆された変異の相対的重要性を評価した。各コンセンサスグループについて、変異をWT残基に戻し、一度に１つを設定し、ROSETTAを用いてエネルギースコアの変化を計算した(表5を参照)。エネルギーの最大変化を引き起こしたものは、実験用ライブラリーに含まれる最も重要な変異体であるとみなした。
【０１６３】
（表４）
2021532747.tif 000009
【０１６４】
（表５）
2021532747.tif 000010
【０１６５】
オリベトール酸をモデル化するために、5B09結晶構造からのオリーブトレートの4MX.sdf 3-D構造を使用した。Open Babel 2.3.1.を用いて、pH7と仮定した該構造に水素原子を加えた。バイオケミカルライブラリー(BCL)分子: PDBライブラリーを用いる配座異性体生成器3.5で、オリベトール酸のための回転異性体ライブラリーを作成した。最後に、Rosetta 3.7リリースのスクリプトmain/source/python/public/molfile_to_params.pyを用いて、Rosettaが読み取るパラメーターファイルを作成する前に、芳香族結合を手動でファイルに注解した。1ZB6結晶構造からのGST.sdfファイルを用いて、回転異性体ライブラリーなしでゲラニルs-チオールジホスフェート（GST）のパラメーターファイルを作成した。次に、手動でGSTを有するNphBとDHNを有するDHN(1ZB6)との共結晶構造にオリベトール酸分子を置き、pymolを用いて結晶水を除去した。オリべトール酸を、活性部位の6個の異なる位置に置いた。これにより、オリーブトレート芳香環の平面がGSTアルキルの尾部と平行し、所望のプレニル化部位が、1ZB6結晶構造中のDHNの配置を写す最終的なカルボカチオンから3.7オングストローム離れた。Rosetta設計中に、残基49、162、213、224、232、233、234、271、286、及び288を任意のアミノ酸であってもよいこととし、他の側鎖を固定の位置に保持し、骨格を固定した。設計された残基を、オリーブトレートと直接に接触させ、GSTと直接に接触させなかった。入力側鎖(-use_input_sc)、設計後に最小化された側鎖(minimize_sidechains)、線形メムノード相互作用グラフ(-linmem_ig 10)、及びリガンド加重スコア関数の有無(-score：weights ligand)を使用し、Rosetta 3.7からの固定された骨格スクリプトmain/source/bin/fixbb.static.linuxgccreleaseを全ての可能な回転変異体（-ex4）について実行した。同一の出発点から、それぞれの設計が-nstruct入力を用いて5回実行した。Rosettaにより示唆された変異セットから、最も頻繁に発生し、かつRosettaスコア機能に最も寄与する変異を選択し、試験用に22の変異体のライブラリーを作成した。
【０１６６】
初期NphB変異体ライブラリースクリーニング  初期ライブラリーのスクリーニングのために、小規模な発現及び精製を実施した。25 mLのLB培地に、NphB発現プラスミドを有するBL21 DE3 Goldの飽和培養物25 μLを接種した。該培養物を、37℃でOD600が0.4〜0.6に到達するまでインキュベートした。1 mMのIPTGを添加し、NphB構築物の発現を誘導し、続いて18℃で18時間インキュベートした。2500×gで遠心分離し、細胞を回収した。ペレットを500 μLの溶解緩衝液（50 mMトリス[pH8.0]、150 mM NaCl、及び5 mMイミダゾール）中で再懸濁し、超音波処理により溶解した。4℃及び20,000×gで該細胞溶解物を10分間遠心分離し、清澄化し、4℃でその上清を50μLのNiNTA樹脂でインキュベートした。96ウェルスピンカラムプレートを用いてNphB構築物を精製した。上清/樹脂をカラムに塗布し、500×gで2分間遠心分離した。次いで、500 μLの溶解緩衝液を添加し、プレートを500×gで1分間再度遠心分離した。200 μLの溶出緩衝液(50 mMトリス[pH8.0]、150 mM NaCl、250 mMイミダゾール、及び30%(v/v)グリセロール)を用いてタンパク質を溶出させた。
【０１６７】
以下の条件で酵素をアッセイした：最終容量100 μL中に、 2.5 mMゲラニルピロリン酸エステル、5 mM オリーブトレート、5 mM MgCl2、50 mM トリスpH8.0、及び約0.1 mg/mL NphB変異体が含まれる。溶出緩衝液を用いて全ての酵素を最初に0.5 mg/mLに希釈し、各反応におけるイミダゾールの最終濃度が同じであるようにした。反応物を室温で12時間インキュベートし、次いで、100 μLの酢酸エチルで3回抽出した。各反応について有機抽出物をプールし、真空遠心分離機を用いて溶媒を除去した。試料を100 μLのメタノールに再溶解し、HPLC分析に供した。
【０１６８】
目的のNphB変異体ライブラリースクリーニング  目的ライブラリーについて、上記のNphB構築物の1 Lスケールでの発現及び精製を行った。以下の条件で酵素をアッセイした：最終容量100μL中、2.5 mM GPP、5 mMオリーブトレート、5 mM MgCl2、50 mMトリスpH8.0、及び約1 mg/mLのNphB酵素が含まれた。該反応物を室温で1時間インキュベートした。40 μLの各反応物を80 μLのアセトニトリル中で急冷させた。該試料を13,000 rpmで5分間遠心分離し、沈殿したタンパク質を除去した。その上清を上記のようにHPLCを用いて分析した。
【０１６９】
酵素動態パラメーター  反応条件を以下のように設定した：最終容量200μL中、50 mMトリス[pH8.0]、2.5 mM GPP、5 mM MgCl。約27 μM酵素、及び濃度が0.1 mM〜6 mM変動するオリーブトレートまたはジバリニン酸が含まれた。下記の時間間隔で40 μLの反応物を80 μLのアセトニトリル+0.1%TFA中で急冷させた。該反応物を13,000〜16,060×gで5分間遠心分離し、タンパク質をペレット化した。上記のHPLC法を用いて上清を分析した。初期速度を基質の濃度に対してプロットし、Michaelis-Menten方程式に適合させ、動態パラメーターkcat及びKM(OriginPro)を測定した。各Michaelis-Menten曲線を3回実行した。該動態パラメーターの平均値及び標準偏差を報告した。
【０１７０】
オリーブトレート/CBGAについて：WT、Ml、M10及びM30については、時間経過は3、6、9、及び12分であった。変異体25については、1、2、4、及び8分に反応物を急冷させ、M31については、1、2、4、及び6分に反応物を急冷させた。
【０１７１】
ジバリニン酸/CBGVAについて：M31については、時間経過は0.5、1、1.5、及び2分であった。M23については、時間経過は5、10、15、及び20分であって、WT NphBについては、時間経過は8、16、24、及び32分であった。該変異体の酵素濃度は約27 μMであって、WT NphBの濃度は約35 μMであった。
【０１７２】
WT NphB及びM23からの異性体プロファイルのGC-MS特徴付け  試料を200 μLの酢酸エチルに溶解した。Agientモデル7693のオートサンプラ、7890Bガスクロマトグラフ及び電子イオン化モードでの7250 Q-TOF質量選択検出器を用いてGC-MS測定を行った。注入温度を280℃に設定し、分割モードで試料を注入した。Agient HP5-MSカラム（寸法：30 m×250 μm×0.25 μm）で分離を実施した。キャリアガスとして超高純度級のHe(Airgas)を使用し、その流量を1.1 mL/分に設定し、定流量モードで行った。オーブンの初期温度を120℃に設定し、1分後に、続いて20℃/分の速度で最終温度300℃に上昇させ、4分間維持した。3.0分間の溶媒遅延を使用した。EIエネルギーを15 eVに設定した。MSDは50〜500 m/zの範囲を走査するように設定した。Mass Hunter Acquisition及び定性分析ソフトウェア(Agilent)を用いて、データ収集及び分析を実施した。
【０１７３】
GC入口の温度が上昇することにより、CBGAは、Radwanらの文献に記載されたように、自発的に脱炭酸し、316 m/zでM+イオンが生成された。CBGA標準品の316 m/zイオンの保持時間は10.48分であった。
【０１７４】
溶液からCBGAを抽出するためのノナンフローシステム  PyOx/PTA反応を上記のように設定した。2層の通気性細胞培養フィルムで覆われた2 mLのガラス瓶中で、500 μLのノナンオーバーレイを該反応に添加した。2本の針を15 mLのファルコンチューブの約750 μLマーク及び3.5 mLマークに挿入した。チュービングコネクタへのルアーロックをこれらの針に接続し、ビトンチュービングをルアーロックの他端に接続した。針は、ルアーロックコネクタを介してチュービングの他端に接続し、メッシュカバーを通して挿入した。これにより、これらはノナン層にのみ接触し、反応物とは接触しなかった。2 mLのトリス緩衝液[pH8.5]を15 mLの円錐管に加え、6 mLのノナンを添加した。ノナンが該反応物の上部から緩衝溶液を通って流れるように、蠕動ポンプを用いて、ノナンを、システムを通して圧送した。リザーバ内に圧送されたノナンは、15 ml円錐管の最上層に分離された。15 mL円錐管の頂部からのノナンを反応瓶の頂部に圧送した。これは、CBGAのノナン層への拡散及び反応物の外への拡散を駆動するシステム全体にわたってCBGAを実質的に希釈した。
【０１７５】
クローニングCBDAS  CBDASの遺伝子ブロックをPichia pastoris用に最適化されたIDTコドンから配列した。タンパク質配列(NPREN…)の28番目の残基から、pPICZαベクターに適合するオーバーハングを有するタンパク質の末端を介したPCR増幅によりシグナル配列を除去した。Gibsonクローニング法を用いて、このPCR産物を、EcoRI及びXbaIで消化されたpPICZαベクター中にクローン化した。該組立反応の生成物をBL21 Gold (DE3)細胞（正しい配列を単離したクローン）に形質転換した。このプラスミドをPmeIで2時間消化した後、Qiagen PCR精製プロトコルを用いて精製した。電気穿孔法で該プラスミドをPichia pastoris X33に形質転換した。電気穿孔の直後に、該細胞を1 mLの冷却した1 Mソルビトール及び1 mLのYPD培地中で2時間振盪することなくインキュベートした。該細胞を、500 μg/mLのゼオシンでYPDSプレート上に蒔いた。PCRを用いてAOX1プロモーターとターミネーターとの間のCBDAS遺伝子の存在についてコロニーをスクリーニングした。スクリーニングのために、該コロニーを15 μLの滅菌水に再懸濁し、5 μLの再懸濁したコロニーを0.2% SDSでPCR管に移した。該試料を99℃で10分間加熱した後、その1 μLをPCR用鋳型として用いた。PCRを陽性にヒットした６つのコロニーをCBDASの発現についてスクリーニングした。
【０１７６】
CBDAS発現テスト  該6つのコロニーを30℃で終夜増殖させ、飽和した培養物を得た。該終夜培養物を用いて、BMGY培地中にその25 mLを接種し、ODが約2まで増殖させた。該細胞を2,000×gで10分間遠心分離することにより回収した。細胞ペレットを90 mLのBMMY培地に再懸濁し、30℃で5日間インキュベートした。各日に1 mLの培養物をSDS-PAGE分析のために除去し、500 μLのメタノールを添加した。3日目に、該培養物をCBDAS活性についてスクリーニングした。アッセイ条件は以下の通りであった：最終容量200 μL中、100 μLの200 mMクエン酸塩緩衝液、100 μm CBGA、5 mM MgCl2、5 mM KC1、1 mM FAD、及び50 μLの発現媒体が含まれた。該反応物を室温で終夜インキュベートし、次いで200 μLの酢酸エチルで3回抽出した。該酢酸エチル抽出物を各試料についてプールし、真空遠心分離機を用いて除去した。該試料を200μLのメタノールに再懸濁し、HPLCで分析した。全てのクローンは活性のCBDASを産生した。
【０１７７】
3つのクローンからの培養物(合計で約300 mL)を採取し、CBDAS活性を得た。4℃及び約3,000×gで20分間遠心分離することにより細胞を沈渣化した。次いで、該上清を0.22 μmフィルターに通した。該培地を濃縮し、ミリポア社の50,000 MWCOタンパク質濃縮器を用いて100 mMクエン酸塩緩衝液pH5.0に交換した。Bradfordアッセイを用いて、該培地濃縮物中の総タンパク質を測定した結果、0.4 mg/mLとなった。総収率は約5 mg/L総タンパク質であった。
【０１７８】
CBDVA及びCBDAの産生  前駆体CBGA及びCBGVAをそれぞれCBDA及びCBGVAに変換するため、CBDAS合成酵素で2次反応を設定した。
【０１７９】
CBGA/CBDAについて：CBGAを産生するために、PyOx/PTA酵素系を上記のように設定した。24時間後、該CBGA反応から200 μLのノナンオーバーレイをCBDAS反応容器に移した。水層には、50 mM Hepes[pH7.0]、5 mM MgCl2、5 mM KC1、25 μM FAD、0.1 mg/mL CBDAS濃縮物が含まれた。該反応物を穏やかに振盪しながら30℃でインキュベートした。12、24、48、72及び96時間に該反応物を急冷させた。
【０１８０】
CBGVA/CBDVAについて：HPLCにより精製されたCBGVAをCBDVAに変換した。最終的な反応容積は200μLであり、50 mM Hepes[pH7.0]、5 mM MgCl2、5 mM KC1、25 μM FAD、及び0.1 mg/mL CBDAS濃縮物(総タンパク質)が含まれた。200 μLのノナンオーバーレイを添加し、該反応物を穏やかに振盪しながら30℃でインキュベートした。約24、48、72、及び96時間に該反応物を急冷させた。
【０１８１】
MatB活性アッセイ  結合された酵素アッセイを用いて、OA及びDAの存在下で、R. palustis(例えば、配列番号:82〜83を参照)由来のマロニル-CoA合成酵素(MatB)の活性を測定した。反応条件は、2.5 mMマロネート、2 mM ATP、1 mM CoA、2.5 mMホスホエノールピルベート(PEP)、1 mM NADH、5 mM MgCl2、10 mM KC1、0.35 mg/mL ADK、0.75 μg/mL MatB、1.6単位のPK、及び2.5単位のLDH、及び50 mMトリス[pH8.0]であった。基質(マロネート)を脱離させることでバックグラウンドATPase活性を制御し、1%エタノール、250 μMまたは5 mM OA、または5 mM DAのいずれかを残りの反応に添加した。M2 SpectraMaxを用いて、NADH消費による340 nmにおける吸光度の減少をモニターすることによってMatBの活性を測定した。MatBが5 mM OAまたはDAで制限することを確実にするために、MatBを2倍に増量し、1.5 μg/mLにした。反応速度は2倍になった。これは、MatBがシステム内の制限成分であることを示唆した。5 mM OA及び5 mM DAにおけるNADHの消費率を1%エタノール制御に正規化した。
【０１８２】
AAE3活性アッセイ  上記と類似した結合された酵素アッセイを用いて、OA及びDAの存在下で、アシル活性化酵素3(AAE3)(例えば、配列番号:70〜71及び相同体―配列番号:72〜75を参照)の活性を測定した。その条件は、MatBアッセイと同じであったが、以下の改変を加えた：マロネートの代わりに2.5 mMヘキサノエートを添加し、そして、MatBの代わりに15 μg/mLのAAE3を添加した。AAE3が制限することを確実にするために、5 mM OAまたはDAの存在下でAAE3を2倍に増量した。反応速度は2倍になった。これは、AAE3が制限していることを示した。
【０１８３】
ADK活性アッセイ  結合された酵素アッセイを用いて、OA及びDAの存在下でアデニレートキナーゼ(ADK)(例えば、配列番号:81を参照)の活性を測定した。その条件はMatBアッセイと類似したが、以下の改変を加えた：マロネートの代わりに2 mM AMPを添加し、CoAを添加せず、0.001 mg/mL ADKを添加した。ADKが5 mM OA及びDAで制限試薬であることを確実にするために、ADKの量を2倍に増量した。速度の倍増は、ADKが制限因子であることを示した。
【０１８４】
CPK活性アッセイ  結合された酵素アッセイを用いて、OAまたはDAの存在下でクレアチンキナーゼ(CPK)の活性を測定した。その反応条件は、5 mMクレアチンリン酸エステル、2 mM ADP、5 mMグルコース、2 mM nADP+、5 mM MgCl2、5 mM KCl、0.3 mg/mL Zwf、0.1 mg/mL Sc Hex、及び0.08単位CPKであった。陽性対照の反応は1%エタノールを含有し、残りの反応に5 mM OAまたはDAのいずれかを添加した。340 nmにおけるNADPHの吸光度をモニターした。CPKが5 mM OA及び5 mM DAで制限することを確実にするため、それを2倍に増量した。その結果、速度は2倍となった。これは、高いOA及びDAであっても、CPKが制限することを示した。
【０１８５】
OLS活性アッセイ  以下の条件を設定し、オリベトール合成酵素(OLS)(例えば、配列番号:76〜77を参照)をアッセイした：50 mMクエン酸塩緩衝液pH5.5または50 mMトリス緩衝液pH8.0のいずれかにおいて、200 μMマロニルCoA、100 μMヘキサノイル-CoA、0.65 mg/mL OASが含まれた。OASの添加により反応を開始させ、次いで、30分に150 μLのメタノールを50 μLの反応液に添加することにより急冷させた。該試料を約16,000×gで2分間遠心し、タンパク質を沈渣化した。その上清をHPLCで分析した。
【０１８６】
阻害実験のために、条件を変更した：50 mMクエン酸塩緩衝液pH5.5の最終容量200 μL中、1 mMマロニル-CoA、400 μmヘキサノイル-CoAが含まれた。1%エタノール、250 μM OAまたは1 mM DAのいずれかを反応に加え、次に、0.65 mg/mL OLSを添加することにより反応を開始させた。2、4、6、及び8分に、50 μL分量を150 μLのメタノールで急冷させた。該反応物を短時間にボルテックスし、16,000×gで2分間遠心し、タンパク質を沈渣化した。その上清をHPLCで分析した。HTAL、PDAL及びオリベトールの生ピークの面積を合計し、時間に対してプロットし、速度を測定した。OAで補足された反応の速度及びDAで補足された反応の速度をエタノール対照に対して正規化した。
【０１８７】
OLS/OAC活性アッセイ  OAを産生するために、上記のOLSの条件を使用したが、反応にオリベトール酸環化酵素(OAC)(例えば、配列番号:78〜79を参照)を0.6 mg/mLで添加した。該反応物を急冷させ、OLSアッセイと同様の方法で分析した。アセチル-リン酸エステル及びBSAを個々に最終濃度5〜40 mM及び10〜30 mg/mLでアッセイに添加した。
【０１８８】
全経路の設定  本研究で使用された酵素と最終濃度(mg/mL)を表6（MatB経路の場合）及び表7（MdcA経路の場合）に示す。MatB経路について、補助因子を次の濃度で添加した：150 mMグルコース、1 mMフルクトースビスホスフェート、2 mM ATP、0.25 mM NAD+、3 mM NADP+、2 mM CoA、0.25 mM 2,3-ビスホスホグリセレート、6 mM MgC12、10 mM KC1、0.5 mMチアミンピロリン酸エステル、50 mMリン酸塩pH8、0.5 mMヘキサノエート、15 mMマロネート、5 mMクレアチンリン酸エステル、及び50 mMトリス,pH8.0。表6に列挙した酵素を添加することで反応を開始させた。該反応物を室温で終夜インキュベートし、反応物を急冷させ、200 mlの酢酸エチルで3回抽出した。真空遠心分離機を用いて酢酸エチルを除去した。該試料を200 μLのメタノールに溶解し、HPLCを用いて分析した。
【０１８９】
（表６）全カンナビノイドMatB経路に用いられる酵素及び最終酵素濃度
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【０１９０】
（表７）全カンナビノイドMdcA経路に用いられる酵素及び最終酵素濃度
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【０１９１】
MdcA経路用の酵素は、表7に示す。MdcA反応については、上記と同じ補助因子の条件下で設定したが、以下の変更を行った：3 mM ATP、0.25 mM AMP、25 mMクレアチンリン酸、また、トリス緩衝液が含まれていなかった。
【０１９２】
MatB経路とMdcA経路の両方は、図5A-Bに示す。
【０１９３】
本発明のいくつかの実施形態を記載した。理解されたいこととして、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な改変を行うことができる。他の実施形態は、以下の請求項の範囲内である。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2021532747.tif 000026
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021532747.tif 000033
2021532747.tif 000034
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