(57)【要約】  野生型ＮｉｃＡ２と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を呈するニコチン分解酵素変異体、変異体を含む組成物、ならびにそれらを使用する方法を記載する。
2021532761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の野生型ＮｉｃＡ２酵素のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含むニコチン分解酵素変異体であって、前記変異体配列が、配列番号１の位置１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、および４２６のうちの１つ以上に少なくとも１つの置換、付加、または欠失を有する、ニコチン分解酵素変異体。
【請求項２】
前記変異体配列が、配列番号１の１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、および／または４２６から選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つの置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記置換が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較して、前記変異体の前記ニコチン分解活性を増加させる、請求項２に記載の変異体。
【請求項４】
前記変異体配列が、置換Ｆ１０４Ｒ、Ｆ１０４Ｋ、Ｆ１０４Ｉ、Ｆ１０４Ｌ、Ｆ１０４Ｓ、またはＦ１０４Ｔを含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号２８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体配列が、置換Ｇ１０６ＳまたはＧ１０６Ａを含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体配列が、配列番号１１および配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項８】
前記変異体配列が、置換Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｇ、Ａ１０７Ｈ、またはＡ１０７Ｐを含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体配列が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体配列が、置換Ｅ２４９ＷまたはＥ２４９Ｄを含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１１】
前記変異体配列が、配列番号１９および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１２】
前記変異体配列が、置換Ｆ３５５Ｈ、Ｆ３５５Ｋ、またはＦ３５５Ｅを含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１３】
前記変異体配列が、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１４】
前記変異体配列が、置換Ａ４２６Ｑ、Ａ４２６Ｗ、Ａ４２６Ｐ、またはＡ４２６Ｃを含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１５】
前記変異体配列が、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の変異体。
【請求項１６】
前記変異体が、Ｆ１０４Ｒ置換、Ｆ１０４Ｉ置換、Ｆ１０４Ｓ置換、Ｆ１０４Ｔ置換、Ｇ１０６Ａ置換、Ａ１０７Ｔ置換、Ａ１０７Ｇ置換、Ｆ３５５Ｈ置換、およびＡ４２６Ｃ置換から選択される置換のうちの１つ以上を含む、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項１７】
前記変異体配列が、配列番号１の１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、および／または４２６から選択される２つ以上のアミノ酸位置に少なくとも２つの置換を含む、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項１８】
前記変異体配列が、配列番号１の１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、および／または４２６から選択される３つ以上のアミノ酸位置に少なくとも３つの置換を含む、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項１９】
前記変異体の前記ニコチン分解活性が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素の前記ニコチン分解活性の少なくとも約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、または約１０００％である、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項２０】
前記変異体が、配列番号１の位置９１、２１７、２５０、３４０、３６６、３８１、４２７、４６２、または４６３のうちの１つ以上に保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失をさらに含む、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項２１】
前記変異体が、Ｆ１０４Ｌ、Ｇ１０６Ｓ、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｋ、Ａ１０７Ｔ、Ｆ３５５Ｃ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ４２７Ｑ、Ｗ４２７Ｅ、Ｗ４２７Ｓ、Ｗ４２７Ｍ、Ｗ４２７Ｈ、Ｗ４２７Ｌ、Ｗ４２７Ｒ、Ｒ９１Ａ、Ｒ９１Ｑ、Ｒ９１Ｆ、Ｒ９１Ｇ、Ｒ９１Ｔ、Ｒ９１Ｌ、Ｒ９１Ｓ、Ｒ９１Ｎ、Ｔ２５０Ｇ、Ｔ２５０Ｌ、Ｔ２５０Ｒ、Ｔ２５０Ｖ、Ｔ２５０Ｐ、Ｋ３４０Ｐ、Ｋ３４０Ｉ、Ｋ３４０Ｖ、Ｋ３４０Ｄ、Ｋ３４０Ｅ、Ｑ３６６Ｋ、Ｑ３６６Ｅ、Ｑ３６６Ｖ、Ｑ３６６Ｌ、Ｑ３６６Ｉ、Ｑ３６６Ｙ、Ｔ３８１Ｐ、Ｔ３８１Ｉ、Ｔ３８１Ｖ、Ｔ３８１Ｑ、Ｔ３８１Ｎ、Ｔ３８１Ｌ、Ｔ３８１Ｍ、Ｎ４６２Ｌ、Ｎ４６２Ｙ、Ｎ４６２Ｓ、Ｎ４６２Ｆ、Ｎ４６２Ｇ、Ｎ４６２Ｅ、Ｎ４６２Ａ、Ｎ４６２Ｍ、Ｉ４６３Ｆ、Ｉ４６３Ｙ、Ｉ４６３Ａ、Ｉ４６３Ｖ、Ｉ４６３Ｌ、Ｌ２１７Ｑ、Ｌ２１７Ｇ、Ｌ２１７Ｅ、Ｌ２１７Ｉ、Ｌ２１７Ｃ、およびＬ２１７Ｓから選択される１つ以上の置換をさらに含む、請求項１または２に記載の変異体。
【請求項２２】
前記変異体が、前記野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性の低減を呈する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２３】
前記野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した前記免疫原性が、７５％以上低減する、請求項２２に記載の変異体。
【請求項２４】
前記変異体が、前記変異体の前記免疫原性を低減させる、配列番号１の７４、７７、７８、８０、２６２−２６６、３０３、３０４、３０６、３１０、３７４、３７７、３７８、３８２、３８３、４５０〜４５２、および４５７から選択されるアミノ酸位置に少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項２５】
前記置換が、前記変異体の前記免疫原性を低減させる、請求項２４に記載の変異体。
【請求項２６】
前記変異体が、アミノ酸位置２６２または２６３に置換をさらに含む、請求項２４に記載の変異体。
【請求項２７】
前記変異体が、アミノ酸位置２６２および２６３に置換をさらに含む、請求項２４に記載の変異体。
【請求項２８】
前記変異体が、配列番号１のアミノ酸１０〜３２、６８〜９４、１８９〜２２５、２４８〜２８５、２９６〜３２７、３３６〜３９１、および４３５〜４５９から選択される領域内の免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に少なくとも１つの置換、付加、または欠失をさらに含む、請求項２６または２７に記載の変異体。
【請求項２９】
前記変異体が、配列番号１のアミノ酸１６〜２４、７３〜８１、２５８〜２６６、３０２〜３１０、３７３〜３８１、および４４７〜４５５から選択される免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に少なくとも１つの置換、付加、または欠失をさらに含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３０】
前記変異体が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基７４、７７、７８、もしくは８０、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基２６２、２６３、２６４、もしくは２６６、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３０３、３０４、３０６、もしくは３１０、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基３７４、３７７、３７８、３８２、もしくは３８３、および／または
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基４５０、４５１、４５２、もしくは４５７、から選択される位置に、少なくとも１つの置換、付加、または欠失をさらに含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３１】
前記変異体が、
（ａ）Ｌ７４ＮおよびＹ７７Ｒ、
（ｂ）Ｌ７４ＮおよびＹ７７Ｋ、
（ｃ）Ｌ７４ＱおよびＹ７７Ｒ、
（ｄ）Ｌ７４ＱおよびＹ７７Ｎ、
（ｅ）Ｌ７４ＮおよびＹ７７Ｑ、
（ｆ）Ｌ７４ＮおよびＹ７７Ｈ、
（ｇ）Ｌ７４ＮおよびＬ８０Ｈ、
（ｈ）Ｌ８０Ｆ、
（ｉ）Ｙ７７Ｒ、ならびに
（ｊ）Ｒ７８Ｑ、から選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３２】
前記変異体が、
（ａ）Ｉ２６２ＡおよびＡ２６４Ｑ、
（ｂ）Ｉ２６２ＫおよびＬ２６６Ｄ、
（ｃ）Ｉ２６２Ｔ、
（ｄ）Ｉ２６２Ｓ、
（ｅ）Ｉ２６２ＤおよびＬ２６６Ｋ、
（ｆ）Ｉ２６２Ａ、
（ｇ）Ｉ２６２ＴおよびＡ２６４Ｌ、
（ｈ）Ｉ２６２ＴおよびＮ２６３Ｒ、
（ｉ）Ｍ２６５Ｈ、ならびに
（ｊ）Ｉ２６２ＡおよびＡ２６４Ｎ、から選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３３】
前記変異体が、
（ａ）Ｖ３０３Ｔ、Ｖ３０４Ｎ、およびＭ３０６Ｉ、
（ｂ）Ｖ３０４ＡおよびＭ３０６Ｑ、
（ｃ）Ｖ３０４Ａ、Ｍ３０６Ｎ、
（ｄ）Ｖ３０４Ａ、
（ｅ）Ｖ３０４ＡおよびＭ３０６Ｈ、
（ｆ）Ｖ３０４ＮおよびＭ３０６Ｈ、
（ｇ）Ｖ３０４ＱおよびＭ３０６Ｈ、
（ｈ）Ｖ３０４Ｎ、Ｍ３０６Ｉ、
（ｉ）Ｖ３０４ＴおよびＭ３０６Ｉ、ならびに（ｊ）Ｍ３０６ＩおよびＬ３１０Ｒ、から選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３４】
前記変異体が、
（ａ）Ｌ３７４ＱおよびＩ３７７Ｓ、
（ｂ）Ｌ３７４ＡおよびＩ３７７Ａ、
（ｃ）Ｌ３７４ＱおよびＩ３７７Ａ、
（ｄ）Ｌ３７４ＮおよびＩ３７７Ａ、
（ｅ）Ｌ３７４ＮおよびＩ３８２Ｑ、
（ｆ）Ｉ３７７ＡおよびＩ３８２Ｔ、
（ｇ）Ｉ３７７ＡおよびＬ３７８Ｎ、
（ｈ）Ｉ３７７ＴおよびＩ３８２Ｔ、
（ｉ）Ｉ３７７Ｔ、ならびに
（ｊ）Ｌ３７４ＮおよびＡ３８３Ｑ、から選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３５】
前記変異体が、
（ａ）Ｉ４４８ＱおよびＦ４５０Ｓ、
（ｂ）Ｉ４４８ＥおよびＦ４５０Ｎ、
（ｃ）Ｉ４４８ＡおよびＦ４５０Ｎ、
（ｄ）Ｉ４４８ＱおよびＦ４５０Ｑ、
（ｅ）Ｉ４４８ＴおよびＦ４５０Ｑ、
（ｆ）Ｉ４４８ＥおよびＦ４５０Ｌ、
（ｇ）Ｔ４５５Ｋ、
（ｈ）Ｌ４４９ＨおよびＦ４５０Ａ、
（ｉ）Ｆ４５０Ａ、ならびに
（ｊ）Ｉ４４８ＡおよびＦ４５０Ｙ、から選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３６】
前記変異体が、
（ａ）Ｉ２６２Ｔ、
（ｂ）Ｉ２６２Ｓ、
（ｃ）Ｉ２６２Ａ、
（ｄ）Ｉ２６２ＴおよびＡ２６４Ｌ、ならびに
（ｅ）Ｉ２６２ＴおよびＮ２６３Ｒ、から選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３７】
配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３８の欠失をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３８】
配列番号１のアミノ酸１〜５０の欠失をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項３９】
Ｆ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ３６４Ｖ、Ｆ３５３Ａ、Ｆ３５５Ａ、およびＷ３６４Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異をさらに含み、任意選択で、前記変異体が、Ａ１０７Ｒ、Ｆ１０４Ｉ＋Ａ１０７Ｒ、もしくはＡＦ１０４Ｉ＋Ａ１０７Ｒ＋Ａ４２６ＣおよびＦ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、ならびにＷ３６４Ｖを含み得るか、または前記変異体が、Ｆ３５５ＨもしくはＡ１０７Ｒ＋Ｆ３５５ＨおよびＦ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、ならびにＷ３６４Ｖを含み得る、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４０】
配列番号１に記載の前記野生型ＮｉｃＡ２酵素の前記アミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含むニコチン分解酵素変異体であって、前記変異体配列が、Ｆ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ３６４Ｖ、Ｆ３５３Ａ、Ｆ３５５Ａ、およびＷ３６４Ａからなる群から選択される少なくとも１つの置換を有し、１〜５２アミノ酸のＮ末端欠失を含む、ニコチン分解酵素変異体。
【請求項４１】
前記Ｎ末端欠失が、２５、３８、または５０アミノ酸である、請求項４０に記載の変異体。
【請求項４２】
前記変異体が、長時間作用型変異体である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４３】
前記変異体が、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質ドメイン、ヒト血清アルブミン、または不活性ポリペプチドに融合された前記変異体を含む、長時間作用型変異体である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４４】
前記変異体が、組み換えＰＥＧ（ＸＴＥＮ）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン−アラニンセリンポリマー（ＰＡＳ）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）から選択される不活性ポリペプチドに融合された前記変異体を含む、長時間作用型変異体である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４５】
前記変異体が、ＰＥＧ化されている、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項４７】
注射または注入用に処方された、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
経口投与用に処方された、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記変異体が、Ｈｉｓタグをさらに含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の変異体。
【請求項５０】
ニコチン嗜癖を治療する、または禁煙を促進する方法であって、治療有効量の請求項１〜４５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、方法。
【請求項５１】
前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ニコチン嗜癖が、タバコ製品および電子タバコから選択されるニコチン製品の消費と関連している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
ニコチン嗜癖を治療するか、または禁煙を促進するための、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
前記ニコチン嗜癖の治療または禁煙の促進のための薬物の製造における、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項５５】
ニコチン中毒またはニコチン毒性を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜４５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、方法。
【請求項５６】
前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒト対象が、子供である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ニコチン中毒またはニコチン毒性を治療するための、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
前記ニコチン中毒またはニコチン毒性の治療のための薬物の製造における、請求項１〜４５のいずれか一項に記載のニコチン分解酵素変異体または請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ§１１９（ｅ）に基づき、２０１８年８月２日に出願された米国仮出願第６２／７１３，８１４号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、概して、ニコチン嗜癖またはニコチン中毒を治療する分野に関する。野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を呈するニコチン分解酵素変異体、それらを含む組成物、ならびにそれらを使用する方法を記載する。
【背景技術】
【０００３】
以下の考察は、読者が本開示を理解するのを助けるために提供されており、それに対する先行技術を記載または構成することは認められていない。
【０００４】
喫煙は世界的な医療問題である。世界保健機関（ＷＨＯ）は、今日、世界中で１３億人の喫煙者がおり、毎年約５００万人のタバコ関連死があると推定している。現在の喫煙パターンが続くと、喫煙により、２０２０年までに毎年約１０００万人の死亡が生じるであろう。米国疾病管理センター（ＣＤＣ）によると、タバコの使用は、米国で唯一の主要な予防可能な死因であり、毎年約４３８，０００人が死亡している。加えて、喫煙により、健康に関連した年間の経済的費用が約１，５７０億ドル生じていると推定されている。ＣＤＣは、米国の４，５００万人の成人喫煙者のうち、７０％が禁煙を希望しているが、禁煙を試みる人のうち、１年後に禁煙を継続しているのは５％未満であると推定している。
【０００５】
喫煙を辞めるのが困難である理由の１つは、タバコおよび他のタバコ製品のニコチン嗜癖である。ニコチンは、体内に吸入されるとすぐに血流に入り、続いて血液脳関門を通過することによって脳に到達する小分子である。脳内に入ると、ニコチンはニコチン性受容体に結合し、その結果、ドーパミンなどの興奮剤が放出され、報酬システムが活性化され、喫煙者に積極的で快い強化経験がもたらされ、これが嗜癖につながる。
【０００６】
喫煙および他のタバコの使用に関連した有害な健康への影響に加えて、ニコチンの摂取または吸入が多すぎることに起因するニコチン中毒も、もう１つのニコチン関連の健康問題である。ニコチンのＬＤ５０は、ラットで５０ｍｇ／ｋｇ、マウスで３ｍｇ／ｋｇである。３０〜６０ｍｇ（０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ）の低用量でも、成人のヒトにとって致命的である場合があり、一方、子供は１本のタバコの摂取後に健康を損なう可能性があり、それ以上の摂取は子供を深刻な病気にする可能性がある。一方、ヒト成人では、致命的な用量は５００ｍｇ（１．０〜７．１ｍｇ／ｋｇ）以上の高用量となり得る。いずれの場合も、ニコチンガムもしくはパッチを誤って噛んだり、または電子タバコの「電子液体」を摂取したりした子供には、通常、急性ニコチン中毒が起こる。まれに、子供がタバコを摂取した後に健康を損なうことも知られている。米国だけで毎月数百件の急性ニコチン中毒が報告されている。
【０００７】
典型的には、ニコチン中毒の初期治療は、胃腸吸収を低減させることを試みるための活性炭の投与を含み得るが、さらなる治療は、ニコチン中毒から生じる症状に対処し得る。
【０００８】
禁煙のための野生型ＮｉｃＡ２酵素の使用が提案されている（例えば、Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７：１０１３６−３９（２０１５）を参照）。それにもかかわらず、ニコチン嗜癖を治療するための追加の薬剤、組成物、および方法、ならびにニコチン中毒を治療するための薬剤、組成物、および方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３７：１０１３６−３９（２０１５）
【発明の概要】
【００１０】
野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を呈するニコチン分解酵素変異体、それらを含む組成物、ならびにそれらを使用する方法を本明細書に記載する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、配列番号１に記載の野生型ＮｉｃＡ２酵素のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含み、変異体配列は、ニコチン分解活性を増加させる、配列番号１の位置１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、および４２６のうちの１つ以上における少くとも１つの置換、付加、または欠失を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加を呈する。いくつかの実施形態では、野生型ＮｉｃＡ２配列の変異体は、置換Ｆ１０４Ｒ、Ｆ１０４Ｋ、Ｆ１０４Ｉ、Ｆ１０４Ｌ、Ｆ１０４Ｓ、Ｆ１０４Ｔ、Ｇ１０６Ｓ、Ｇ１０６Ａ、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｇ、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｐ、Ｅ２４９Ｗ、Ｅ２４９Ｄ、Ｆ３５５Ｈ、Ｆ３５５Ｋ、Ｆ３５５Ｅ、Ａ４２６Ｑ、Ａ４２６Ｗ、Ａ４２６Ｐ、またはＡ４２６Ｃのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号５〜１２または１５〜２８のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ１０４Ｒ置換、Ｆ１０４Ｉ置換、Ｆ１０４Ｓ置換、Ｆ１０４Ｔ置換、Ｇ１０６Ａ置換、Ａ１０７Ｔ置換、Ａ１０７Ｇ置換、Ｆ３５５Ｈ置換、またはＡ４２６Ｃ置換のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、変異体のニコチン分解活性は、野生型ＮｉｃＡ２酵素のニコチン分解活性の少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％である。いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号１の位置１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、および４２６から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの位置に置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体は、ペプチドのＮ末端に１〜５２個のアミノ酸の欠失を有し得る。例えば、配列番号１に由来する変異体は、ペプチドのＮ末端から５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５１、または５２個のアミノ酸の欠失を含み得る。いくつかの実施形態では、変異体は、追加的または代替的に、Ｃ末端残基の欠失など、ペプチドのＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１の位置９１、２１７、２５０、３４０、３６６、３８１、４２７、４６２、または４６３のうちの１つ以上に保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、変異体は、Ｆ１０４Ｌ、Ｇ１０６Ｓ、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｋ、Ａ１０７Ｔ、Ｆ３５５Ｃ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ４２７Ｑ、Ｗ４２７Ｅ、Ｗ４２７Ｓ、Ｗ４２７Ｍ、Ｗ４２７Ｈ、Ｗ４２７Ｌ、Ｗ４２７Ｒ、Ｒ９１Ａ、Ｒ９１Ｑ、Ｒ９１Ｆ、Ｒ９１Ｇ、Ｒ９１Ｔ、Ｒ９１Ｌ、Ｒ９１Ｓ、Ｒ９１Ｎ、Ｔ２５０Ｇ、Ｔ２５０Ｌ、Ｔ２５０Ｒ、Ｔ２５０Ｖ、Ｔ２５０Ｐ、Ｋ３４０Ｐ、Ｋ３４０Ｉ、Ｋ３４０Ｖ、Ｋ３４０Ｄ、Ｋ３４０Ｅ、Ｑ３６６Ｋ、Ｑ３６６Ｅ、Ｑ３６６Ｖ、Ｑ３６６Ｌ、Ｑ３６６Ｉ、Ｑ３６６Ｙ、Ｔ３８１Ｐ、Ｔ３８１Ｉ、Ｔ３８１Ｖ、Ｔ３８１Ｑ、Ｔ３８１Ｎ、Ｔ３８１Ｌ、Ｔ３８１Ｍ、Ｎ４６２Ｌ、Ｎ４６２Ｙ、Ｎ４６２Ｓ、Ｎ４６２Ｆ、Ｎ４６２Ｇ、Ｎ４６２Ｅ、Ｎ４６２Ａ、Ｎ４６２Ｍ、Ｉ４６３Ｆ、Ｉ４６３Ｙ、Ｉ４６３Ａ、Ｉ４６３Ｖ、Ｉ４６３Ｌ、Ｌ２１７Ｑ、Ｌ２１７Ｇ、Ｌ２１７Ｅ、Ｌ２１７Ｉ、Ｌ２１７Ｃ、およびＬ２１７Ｓから選択される１つ以上の置換をさらに含み得る。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＮｉｃＡ２変異体は、追加として、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性の低減を呈する。いくつかの実施形態では、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した免疫原性は、７５％以上低減する。いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号１のアミノ酸１０〜３２、６８〜９４、１８９〜２２５、２４８〜２８５、２９６〜３２７、３３６〜３９１、または４３５〜４５９から選択される領域内の免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に、少なくとも１つの置換、付加、または欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、変異体配列は、配列番号１のアミノ酸１６〜２４、７３〜８１、２５８〜２６６、３０２〜３１０、３７３〜３８１、または４４７〜４５５から選択される免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に、少なくとも１つの置換、付加、または欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、変異体配列は、（ａ）配列番号１のアミノ酸残基７４、７７、７８、もしくは８０、（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基２６２、２６３、２６４、もしくは２６６、（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基３０３、３０４、３０６、もしくは３１０、（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基３７４、３７７、３７８、３８２、もしくは３８３、および／または（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基４５０、４５１、４５２、もしくは４５７、から選択される位置に、少なくとも１つの置換、付加、または欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、変異体配列は、表２のエピトープＢについて列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体配列は、表２のエピトープ１について列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体配列は、表２のエピトープ２について列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体配列は、表２のエピトープ３について列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体配列は、表２のエピトープ４について列挙されたものから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、変異体は、（ａ）Ｉ２６２Ｔ、（ｂ）Ｉ２６２Ｓ、（ｃ）Ｉ２６２Ａ、（ｄ）Ｉ２６２ＴおよびＡ２６４Ｌ、ならびに／または（ｅ）Ｉ２６２ＴおよびＮ２６３Ｒから選択される少なくとも１つの置換または置換の組み合わせをさらに含む。
【００１４】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１の少なくともアミノ酸１〜３８、または配列番号１のアミノ酸１〜５０、または配列番号１のアミノ酸１〜５１、または配列番号１のアミノ酸１〜５２の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨｉｓタグなどのＨｉｓタグをさらに含み得る。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体は、野生型配列のＳ４８２に対応する残基の欠失など、１つ以上のＣ末端アミノ酸の欠失を含む。実施形態のうちのいずれにおいても、変異体は、変異体がアルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質ドメイン、ヒト血清アルブミン、または組み換えＰＥＧ（ＸＴＥＮ（登録商標））、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン−アラニンセリンポリマー（ＰＡＳ）、もしくはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）などの不活性ポリペプチドに接合されるような、長時間作用型変異体であり得る。特定の実施形態では、長時間作用型変異体は、ポリエチレングリコールに接合されている（すなわち、変異体はＰＥＧ化されている）。
【００１５】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体は、Ｆ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ３６４Ｖ、Ｆ３５３Ａ、Ｆ３５５Ａ、およびＷ３６４Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）をさらに含み得る。別の態様では、本開示は、配列番号１に記載の野生型ＮｉｃＡ２酵素のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含むニコチン分解酵素変異体を提供し、変異体配列は、Ｆ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ３６４Ｖ、Ｆ３５３Ａ、Ｆ３５５Ａ、およびＷ３６４Ａからなる群から選択される少なくとも１つの置換を有し、１〜５２アミノ酸のＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端欠失は、例えば、２５、３８、または５０アミノ酸であり得る。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、注射または注入用に処方される。いくつかの実施形態では、組成物は、経口投与用に処方される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体または組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、ニコチン嗜癖を治療するか、または禁煙を促進する方法を提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態では、ニコチン嗜癖は、タバコ製品および電子タバコから選択されるニコチン製品の摂取に関連している。
【００１８】
いくつかの実施形態では、治療有効量の本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体または組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む、ニコチン中毒を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物対象は、ヒト対象、またはより具体的には、ヒト子供である。いくつかの実施形態では、ニコチン中毒は、タバコ製品および電子タバコから選択されるニコチン製品の消費と関連している。
【００１９】
ニコチン嗜癖の治療または禁煙の促進に使用するための、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体および組成物も提供する。
【００２０】
ニコチン嗜癖の治療または禁煙の促進のための薬物の製造における、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体および組成物の使用も提供する。
【００２１】
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載は、例示的かつ説明的なものであり、本発明のさらなる説明を提供することを企図する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】野生型ＮｉｃＡ２（配列番号１）およびＮｉｃＡ２Δ５０（配列番号２）のＨｉｓタグ付きバージョンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１：ＭＷマーカー（Ｂｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、レーン２：野生型ＮｉｃＡ２（配列番号１）、およびレーン３：ＮｉｃＡ２Δ５０（配列番号２）。
【図２】野生型ＮｉｃＡ２と本明細書に記載される変異体ニコチン分解酵素とを比較したニコチン分解活性アッセイの結果を示す。アッセイは、８０ｎＭの最終濃度の精製タンパク質を使用した。
【図３】ＮｉｃＡ２結晶構造中の活性部位周辺の残基を示す（Ｔａｒａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：６５９５−９８（２０１６）より出典）。シェル１は、濃い灰色で示され、シェル２は、薄い灰色で示される。第１および第２のシェルを構成する残基を表２に示す。
【図４Ａ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を低減させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表２に列挙されるような）の突然変異を担持する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図４Ｂ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を低減させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表２に列挙されるような）の突然変異を担持する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図４Ｃ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を低減させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表２に列挙されるような）の突然変異を担持する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図４Ｄ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を低減させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表２に列挙されるような）の突然変異を担持する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図４Ｅ】野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の可能性を低減させると予測された、エピトープＢ（図４Ｅ）、１（図４Ａ）、２（図４Ｂ）、３（図４Ｃ）、および４（図４Ｄ）（表２に列挙されるような）の突然変異を担持する特異的ＮｉｃＡ２変異体の相対活性を示す。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用したＮｉｃＡ２のランダムＰＥＧ化を示す。これらの結果は、モル過剰のＰＥＧ化試薬およびＰＥＧ鎖長の増加によってＰＥＧ化を増加させることができることを示す。
【図６】ＰＥＧ化ＮｉｃＡ２を投与された動物の血清中で、ＰＥＧ化がＮｉｃＡ２の薬物動態（ＰＫ）特性を増強することを示す。
【図７】サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットでの非接合ＮｉｃＡ２の検出またはＰＥＧ化ＮｉｃＡ２の様々な調製を使用して、ＰＥＧ化がＮｉｃＡ２上の潜在的に免疫原性のエピトープをマスクすることができることを示す。
【図８】免疫原性の遺伝子組み換えＨＬＡ−ＤＲ４マウスモデルにおいて、ＰＥＧ化がＮｉｃＡ２特異的抗体の力価を減少させ得ることを示す。ＮｉｃＡ２のＰＥＧ化が、遺伝子組み換えＤＲ４マウスにおける平均ＮｉｃＡ２特異的抗体力価の有意な（≧１０倍）減少をもたらし（それぞれ、ＮｉｃＡ２−ＰＥＧ１、−ＰＥＧ２、および−ＰＥＧ３群からの４、２、および２匹の動物が、検出限界（ＬＯＤ）未満の力価を有した）、これは臨床設定におけるより低い免疫原性の可能性を示唆する。＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．００１、および＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図９】ＰＥＧ化が、ヒトＴ細胞増殖応答、およびＮｉｃＡ２への曝露によって媒介されるサイトカインＴＮＦγの放出を弱めることを示す。ＮｉｃＡ２のＰＥＧ化が、平均Ｔ細胞増殖刺激指数（左パネル）ならびにＩＦＮγ分泌レベル（右パネル）の有意な減少をもたらした。３≧（破線）の増加は、有意な増加および肯定的な反応と考えられる。＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．００１、および＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図１０】ＰＥＧ化ＮｉｃＡ２酵素が血清中で完全なニコチン分解活性を保持することを示す。ＰＥＧ化は、ラット血清中のニコチンを分解するＮｉｃＡ２の能力を妨げなかった。＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＝ｐ＜０．００１、および＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図１１Ａ】位置１０４、１０６、１０７、３５５、および４２６に置換を有する本開示のＮｉｃＡ２変異体が、野生型ＮｉｃＡ２と比較して、低ニコチン濃度で血清中の活性の増加を有することを示す。具体的には、変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｇ、Ｆ１０４Ｔ、Ｆ１０４Ｉ、Ｆ１０４Ｒ、Ｇ１０６Ａ、Ｆ３５５Ｈ、およびＡ４２６Ｃは、ＮｉｃＡ２  Ｆ１０４Ｓ（図１１Ｂ）と同様に、野生型ＮｉｃＡ２（図１１Ａ）と比較してアッセイ条件下でニコチン分解活性の増加を有する。対照的に、変異体Ｅ２４９Ｗは、このアッセイにおいてニコチン分解活性が改善されているようには見えない（図１１Ａ）。
【図１１Ｂ】位置１０４、１０６、１０７、３５５、および４２６に置換を有する本開示のＮｉｃＡ２変異体が、野生型ＮｉｃＡ２と比較して、低ニコチン濃度で血清中の活性の増加を有することを示す。具体的には、変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｇ、Ｆ１０４Ｔ、Ｆ１０４Ｉ、Ｆ１０４Ｒ、Ｇ１０６Ａ、Ｆ３５５Ｈ、およびＡ４２６Ｃは、ＮｉｃＡ２  Ｆ１０４Ｓ（図１１Ｂ）と同様に、野生型ＮｉｃＡ２（図１１Ａ）と比較してアッセイ条件下でニコチン分解活性の増加を有する。対照的に、変異体Ｅ２４９Ｗは、このアッセイにおいてニコチン分解活性が改善されているようには見えない（図１１Ａ）。
【図１２Ａ】二次バイオセンサーアッセイ分析を示す。図１２Ａは、Ｓ−（−）−ニコチンのセンサーグラムを示す。図１２Ｂは、定常状態のセンサー応答ユニット（ＲＵ）対Ｓ−（−）−ニコチン濃度のプロットを示す。
【図１２Ｂ】二次バイオセンサーアッセイ分析を示す。図１２Ａは、Ｓ−（−）−ニコチンのセンサーグラムを示す。図１２Ｂは、定常状態のセンサー応答ユニット（ＲＵ）対Ｓ−（−）−ニコチン濃度のプロットを示す。
【図１３Ａ】喫煙者に見られるニコチン濃度での二次酵素スクリーニングアッセイおよび精製酵素変異体の活性を示す。図１３Ａは、Ｈｉｓタグ付き野生型ＮｉｃＡ２酵素（丸）または変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ（四角）が抗ＨｉｓタグｍＡｂによって大腸菌溶解物から捕捉されたことを示す。図１３Ｂは、４０ｎｇ／ｍＬのＳ−（−）−ニコチンを含有するラット血清に添加された精製酵素または変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒを示す。図１３Ｃは、血清中の４０ｎｇ／ｍＬニコチンでの野生型ＮｉｃＡ２に対する１０の変異体の増強された活性を示す。
【図１３Ｂ】喫煙者に見られるニコチン濃度での二次酵素スクリーニングアッセイおよび精製酵素変異体の活性を示す。図１３Ａは、Ｈｉｓタグ付き野生型ＮｉｃＡ２酵素（丸）または変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ（四角）が抗ＨｉｓタグｍＡｂによって大腸菌溶解物から捕捉されたことを示す。図１３Ｂは、４０ｎｇ／ｍＬのＳ−（−）−ニコチンを含有するラット血清に添加された精製酵素または変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒを示す。図１３Ｃは、血清中の４０ｎｇ／ｍＬニコチンでの野生型ＮｉｃＡ２に対する１０の変異体の増強された活性を示す。
【図１３Ｃ】喫煙者に見られるニコチン濃度での二次酵素スクリーニングアッセイおよび精製酵素変異体の活性を示す。図１３Ａは、Ｈｉｓタグ付き野生型ＮｉｃＡ２酵素（丸）または変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ（四角）が抗ＨｉｓタグｍＡｂによって大腸菌溶解物から捕捉されたことを示す。図１３Ｂは、４０ｎｇ／ｍＬのＳ−（−）−ニコチンを含有するラット血清に添加された精製酵素または変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒを示す。図１３Ｃは、血清中の４０ｎｇ／ｍＬニコチンでの野生型ＮｉｃＡ２に対する１０の変異体の増強された活性を示す。
【図１４】Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｒ＋Ｆ３５５Ｈ、およびＡ１０７Ｒ＋Ｆ１０４Ｉ＋Ａ４２６Ｃを含む複数の酵素変異体のニコチン分解活性の比較を示す。グラフは、ラット血清中のニコチン濃度（μｇ／ｍｌ）が経時的に減少することを示す。
【図１５】インビボでの血中および脳内ニコチンレベルの低下における、ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒの野生型ＮｉｃＡ２に対する効力の比較を示す。０．０３ｍｇ／ｋｇニコチンの３分後の（Ａ）血中および（Ｂ）脳内ニコチンレベルに対する野生型ＮｉｃＡ２またはＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ治療（０．６２５ｍｇ／ｋｇ静脈内投薬）の効果（静脈内、Ｎ＝群当たり８匹のラット）。対照と比較した残りの割合は、各列の上に記載される。対照群にはＢＳＡを投薬した。平均ニコチンレベル±ＳＤ。野生型ＮｉｃＡ２とＮｉｃＡ２１０７Ｒとの違いは有意であった：＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊ｐ＜０．０５。破線はＬＯＱであり、血液の場合は２ｎｇ／ｍＬ、脳の場合は２ｎｇ／ｇである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
野生型ＮｉｃＡ２と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を呈するニコチン分解酵素変異体、それらを含む組成物、ならびにニコチン嗜癖を治療するための方法およびそれを必要とする対象においてニコチン中止（例えば、禁煙）を促進するための方法を含む、それらを使用する方法を本明細書に記載する。
【００２４】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、互換的に使用され、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含み、ならびに各意味に該当することを企図している。また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、列挙される項目のうちの１つ以上のありとあらゆる可能な順列および組み合せを指し、それらを包含する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者に理解され、使用される文脈に応じてある程度変化するであろう。当業者に明確ではない用語が使用されている場合、使用される文脈を考慮して、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「治療レベル」という語句は、ニコチン分解酵素が、そのような治療、すなわち対象におけるニコチンを分解すること、および／またはニコチン嗜癖を治療すること、および／または禁煙を促進すること、ならびに／またはニコチン中毒を治療することを必要とする対象に投与される特定の薬理学的効果を提供する、対象におけるニコチン分解酵素投薬量もしくは血漿濃度を意味する。そのような投薬量が当業者によって治療有効量であると見なされている場合であっても、治療有効量または治療レベルのニコチン分解酵素は、所与の対象のニコチン嗜癖の治療または禁煙の促進に常に有効であるとは限らないことが強調される。単に便宜上、例示的な量を以下に提供する。
【００２７】
当業者は、特定の対象を治療するために必要とされるような標準的な実践に従って、そのような量を調節することができる。治療有効量は、投与経路および剤形、対象の年齢および体重、ならびに／またはニコチン嗜癖の程度、対象によって一般に消費／摂取されるニコチンの量、および／または治療時の対象の血漿内ニコチンレベル、および／または治療時に脳内に局在するニコチン量を含む、対象の状態に基づいて変化し得る。
【００２８】
ニコチン嗜癖または禁煙に関して本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」という用語は、ニコチン離脱の１つ以上の症状もしくは効果を軽減、改善、もしくは排除すること、対象によって消費されるタバコの数もしくはニコチンの量を低減させること、ならびに／または対象の血漿内ニコチンレベルを低減させること、および／もしくは対象の特定の組織（例えば、脳／中枢神経系、心臓および血管系など）に局在するニコチンの量を低減させることのうちの１つ以上を指す。
【００２９】
ニコチン中毒に関して本明細書で使用される場合、「治療」もしくは「治療すること」という用語は、ニコチンの１つ以上の症状もしくは効果を軽減、改善、もしくは排除すること、および／または対象の血漿内ニコチンレベルを低減させること、ならびに／または対象の特定の組織に局在する（例えば、脳／中枢神経系、心臓および血管系など）ニコチンの量を低減させることを指す。
【００３０】
「個体」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の個々の哺乳動物対象、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、またはヒトを指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、ＦＤＡ指針に従って、「子供」は、０歳〜約１９歳のヒト対象を指す。たとえ対象が１９歳を超えて治療を続けていたとしても、子供は約１９歳になる前に一連の治療を始める対象であり得る。
【００３２】
ＩＩ．ニコチン、ニコチン嗜癖、およびニコチン毒性
ニコチンは、タバコおよびナス科の他のメンバーを含む、数種類の植物によって作られる窒素含有化学物質である。ヒト、哺乳動物、および他のほとんどの種類の動物はニコチンに曝露されると、心拍数、心筋の酸素消費量、および一回拍出量が増加する。ニコチンの消費は、注意力の高まり、多幸感、およびリラックスしているという感覚にも関係する。しかしながら、ニコチンは中毒性が高い。
【００３３】
脳内のニコチン性アセチルコリン受容体に結合することによって、ニコチンは、その精神活性作用を引き出し、様々な脳構造におけるいくつかの神経伝達物質のレベルを上昇させる。ニコチンは、骨格筋よりも脳内のニコチン受容体に対して高い親和性を示すが、有毒量では収縮および呼吸麻痺を引き起こす可能性がある。ニコチンの選択性は、これらの受容体サブタイプの特定のアミノ酸の違いによるものと考えられている。ニコチンの構造は以下の式Ｉに示される。
【化１】
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【００３４】
ニコチンを定期的に摂取し、その後突然停止する人々には、欲求、空虚感、不安感、鬱病、苛立ち、過敏性、および不注意を含み得る、離脱症状を経験する。全米心臓協会は、ニコチン（タバコの喫煙による）は、中止するのが最も困難な物質のうちの１つであり、少なくともヘロインと同じくらい困難であると述べている。
【００３５】
ニコチン中毒は、個人が刻みタバコ、タバコ、ニコチンガム、パッチ、もしくは電子タバコの「電子液体」（例えば、電子タバコおよび他の気化装置で使用されるニコチン含有液体）またはタバコもしくはタバコ抽出物を含む他の製品、あるいはニコチンを含む他の製品、供給品、もしくは中間体を摂取した場合に生じ得る。実際、最近の研究によって、電子タバコへの曝露によるニコチン中毒の発生率が、２０１２年１月〜２０１５年４月の間に１４９２．９％増加したことが示された（Ｋａｍｂｏｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ１３７（６）：ｅ２０１６００４１（２０１６））。曝露はタバコの煙の吸入（直接的または間接的のいずれか）を通して起こる可能性があるが、ニコチン中毒またはニコチン過剰摂取は、より一般的には、対象（典型的には子供）が、例えばニコチンガムを噛むかもしくは摂取し、タバコもしくは他のタバコ葉製品を摂取し、ニコチンパッチを摂取し、または電子液体を摂取することによって、ニコチンを摂取するときに生じる。加えて、ニコチンは皮膚から吸収される可能性があるため、ニコチン中毒は、毒性レベルのニコチンが皮膚と直接接触することによって生じる可能性がある。
【００３６】
ニコチン中毒は、神経学的症状（痙攣、昏睡、鬱病、錯乱、失神、頭痛）、心血管症状（急速な心拍、高血圧）、呼吸器症状（呼吸困難、急速な呼吸）、消化器症状（唾液分泌の増加、腹部痙攣、嘔吐）、および筋骨格症状（筋痙攣、脱力感）、ならびに死をもたらす可能性がある。
【００３７】
ＩＩＩ．ニコチン分解酵素変異体
配列番号１に記載の野生型ＮｉｃＡ２酵素のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含むニコチン分解酵素変異体であって、変異体配列が、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較して、変異体のニコチン分解活性を増加させ、および／または免疫原性を減少させる、配列番号１と比較した少なくとも１つの置換、付加、または欠失を有する、ニコチン分解酵素変異体を本明細書に記載する。
【００３８】
ＮｉｃＡ２（ニコチンオキシドレダクターゼ、ＰＰＳ＿４０８１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥＪ１４６２０．１）は、シュードモナス・プチダＳ１６株から単離された。例えば、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９（１０）：ｅ１００３９２３（２０１３）を参照されたい。ＮｉｃＡ２の活性は、Ｓ１６によるニコチン分解の最初の重要な工程であり、ニコチンのＮ−メチルミオスミンへの酸化を触媒する。それは、ニコチンを分解する役割を担うシュードモナス・プチダＳ１６代謝カスケードの必須酵素であると報告されている。野生型ＮｉｃＡ２酵素の構造分析は、Ｔａｒａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：６５９５−９８（２０１６）に報告されている。
【００３９】
本開示は、活性の改善および／または免疫原性の減少を伴う野生型ＮｉｃＡ２の変異体を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の変異体は、野生型ＮｉｃＡ２の約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９パーセントのアミノ酸同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の変異体は、野生型ＮｉｃＡ２と約８０、約８５、約９０、約９５、約９６、約９７、約９８、または約９９パーセントの相同性を共有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の変異体は、ＮｉｃＡ２の間で保存されているアミノ酸残基を含み得る。
【００４０】
野生型ＮｉｃＡ２およびそれらの例示的な変異体のアミノ酸配列を以下の表１に記載する。本開示の変異体は、Ｃ末端にリンカーおよびＨｉｓタグ（ＧＧＧＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨ、配列番号３２）を用いて産生され、これをその後除去した。Ｈｉｓタグは、変異体の精製を補助するために使用されたが、Ｈｉｓタグを必要としない他の精製手段または精製方法もまた使用され得る。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【００４１】
上記のように、ニコチン分解酵素変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加および／または免疫原性の減少を呈し得る。変異体は、１つ以上の欠失、付加、または置換を含む、野生型ＮｉｃＡ２のアミノ酸配列に対する１つ以上の突然変異を含み得る。置換変異は、「保存的」または「非保存的」であり得る。「保存的」とは、同じアミノ酸ファミリー内の置換を指し、「非保存的」とは、アミノ酸ファミリー全体にわたる置換を指す。アミノ酸のファミリーならびにそれに対する「保存的」および「非保存的」置換は当該技術分野において知られている。例えば、天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分けることができ、それらのファミリー内で保存的置換が起こり、一方、異なるファミリーにわたって非保存的置換が起こる。
１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン。
２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸
３）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン。
４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、そのニコチン分解活性に関連する野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性部位に、位置１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、または４２６における１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１のアミノ酸残基１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、または４２６のうちのいずれかから選択される１つ以上の位置における突然変異などの、１つ以上の突然変異を含み、図３の構造に示される。図３で同定されたシェル１残基は、空洞表面を構成している。いくつかの実施形態では、変異体は、１、２、または３つ以上の置換を含み得る。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させるか、または酵素の触媒活性を増加させる少なくとも１つの突然変異が変異体に導入され、変異体がより迅速および／またはより効率的にニコチンを分解することを可能にする。いくつかの実施形態では、そのような突然変異は、ｋｃａｔの増加、ＫＭの低下、ｋｃａｔ／ＫＭの増加、および／またはＶｍａｘの増加を含むがこれらに限定されない、酵素性能の様々な尺度を改善し得る。したがって、いくつかの実施形態では、変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性部位に、および／または芳香族ケージに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個以上の突然変異を含み得、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較して、ｋｃａｔの増加、ＫＭの低下、ｋｃａｔ／ＫＭの増加、および／またはＶｍａｘの増加によって測定されるようなニコチン分解活性の増加を呈する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置１０４のフェニルアラニン（Ｆ）、配列番号１の位置１０６のグリシン（Ｇ）、配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）、配列番号１の位置２４９のグルタミン酸（Ｅ）、配列番号１の位置３５５のフェニルアラニン（Ｆ）、および／または配列番号１の位置４２６のアラニン（Ａ）における突然変異を含む１つ以上の突然変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解活性を増加させる突然変異は、配列番号１の位置１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、または４２６のうちの１つ以上における保存的置換、非保存的置換、付加、または欠失などの、配列番号１の位置１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、または４２６のうちの１つ以上にある。好ましい実施形態では、変異体は、Ｆ１０４Ｒ置換、Ｆ１０４Ｉ置換、Ｆ１０４Ｓ置換、Ｆ１０４Ｔ置換、Ｇ１０６Ａ置換、Ａ１０７Ｔ置換、Ａ１０７Ｇ置換、Ｆ３５５Ｈ置換、またはＡ４２６Ｃ置換のうちの１つ以上を含み得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、位置１０４の突然変異は、置換Ｆ１０４Ｒであり、ここで配列番号１の位置１０４のフェニルアラニン（Ｆ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されている。配列番号５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０４の突然変異は、置換Ｆ１０４Ｋであり、ここで配列番号１の位置１０４のフェニルアラニン（Ｆ）は、リジン（Ｋ）で置換されている。配列番号６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０４の突然変異は、置換Ｆ１０４Ｉであり、ここで配列番号１の位置１０４のフェニルアラニン（Ｆ）は、イソロイシン（Ｉ）で置換されている。配列番号７および２８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０４の突然変異は、置換Ｆ１０４Ｌであり、ここで配列番号１の位置１０４のフェニルアラニン（Ｆ）は、ロイシン（Ｌ）で置換されている。配列番号８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０４の突然変異は、置換Ｆ１０４Ｓであり、ここで配列番号１の位置１０４のフェニルアラニン（Ｆ）は、セリン（Ｓ）で置換されている。配列番号９のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０４の突然変異は、置換Ｆ１０４Ｔであり、ここで配列番号１の位置１０４のフェニルアラニン（Ｆ）は、トレオニン（Ｔ）で置換されている。配列番号１０のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、位置１０６の突然変異は、置換Ｇ１０６Ｓであり、ここで配列番号１の位置１０６のグリシン（Ｇ）は、セリン（Ｓ）で置換されている。配列番号１１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０６の変異は、置換Ｇ１０６Ａであり、ここで配列番号１の位置１０６のグリシン（Ｇ）は、アラニン（Ａ）で置換されている。配列番号１２のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、位置１０７の突然変異は、置換Ａ１０７Ｒであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、アルギニン（Ｒ）で置換されている。配列番号１３、１４、２８、３４、および３５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０７の突然変異は、置換Ａ１０７Ｔであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、トレオニン（Ｔ）で置換されている。配列番号１５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０７の突然変異は、置換Ａ１０７Ｋであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、リジン（Ｋ）で置換されている。配列番号３６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０７の突然変異は、置換Ａ１０７Ｇであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、グリシン（Ｇ）で置換されている。配列番号１６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０７の変異は、置換Ａ１０７Ｈであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、ヒスチジン（Ｈ）で置換されている。配列番号１７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置１０７の突然変異は、置換Ａ１０７Ｐであり、ここで配列番号１の位置１０７のアラニン（Ａ）は、プロリン（Ｐ）で置換されている。配列番号１８のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、位置２４９の突然変異は、置換Ｅ２４９Ｗであり、ここで配列番号１の位置２４９のグルタミン酸（Ｅ）は、トリプトファン（Ｗ）で置換されている。配列番号１９のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置２４９の突然変異は、置換Ｅ２４９Ｄであり、ここで配列番号１の位置２４９のグルタミン酸（Ｅ）は、アスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。配列番号２０のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、位置３５５の突然変異は、置換Ｆ３５５Ｈであり、ここで配列番号１の位置３５５のフェニルアラニン（Ｆ）は、ヒスチジン（Ｈ）で置換されている。配列番号２１のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３５５の突然変異は、置換Ｆ３５５Ｋであり、ここで配列番号１の位置３５５のフェニルアラニン（Ｆ）は、リジン（Ｋ）で置換されている。配列番号２２のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３５５の突然変異は、置換Ｆ３５５Ｅであり、ここで配列番号１の位置３５５のフェニルアラニン（Ｆ）は、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている。配列番号２３のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置３５５の突然変異は、置換Ｆ３５５Ｃであり、ここで配列番号１の位置３５５のフェニルアラニン（Ｆ）は、システイン（Ｃ）で置換されている。配列番号３７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、位置４２６の突然変異は、置換Ａ４２６Ｑであり、ここで配列番号１の位置４２６のアラニン（Ａ）は、グルタミン（Ｑ）で置換されている。配列番号２４のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４２６の突然変異は、置換Ａ４２６Ｗであり、ここで配列番号１の位置４２６のアラニン（Ａ）は、トリプトファン（Ｗ）で置換されている。配列番号２５のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４２６の突然変異は、置換Ａ４２６Ｐであり、ここで配列番号１の位置４２６のアラニン（Ａ）は、プロリン（Ｐ）で置換されている。配列番号２６のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。いくつかの実施形態では、位置４２６の突然変異は、置換Ａ４２６Ｃであり、ここで配列番号１の位置４２６のアラニン（Ａ）は、システイン（Ｃ）で置換されている。配列番号２７のアミノ酸配列を有する変異体は、この種の変異体の例である。
【００５１】
加えて、ニコチン分解活性を増加させる前述の置換のいずれかを、ニコチン分解活性をさらに増加させるために、１つ以上の追加の置換と組み合わせてもよい。本開示の置換を追加の活性増加置換と組み合わせると、所与の変異体のニコチン分解活性に相乗効果があり得ると考えられている（例えば、実施例１の表１または表３のＮｉｃＡ２Δ５０＋Ｆ１０４Ｉ、Ａ１０７Ｒ（配列番号２８）、ＮｉｃＡ２＋Ａ１０７Ｒ、Ｆ３５５Ｈ（配列番号３４）、ＮｉｃＡ２＋Ａ１０７Ｒ、Ｆ１０４Ｉ、Ａ４２６Ｃ（配列番号３５）を参照）。例えば、表１に開示される置換に加えて、いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１の位置９１、２１７、２５０、３４０、３６６、３８１、４２７、４６２、または４６３に、１つまたは２つまたは３つ以上の置換を含み得る。いくつかの実施形態では、さらなる置換は、任意の１つまたは２つまたは３つ以上のＦ１０４Ｌ、Ｇ１０６Ｓ、Ａ１０７Ｈ、Ａ１０７Ｐ、Ａ１０７Ｒ、Ａ１０７Ｋ、Ａ１０７Ｔ、Ｆ３５５Ｃ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ４２７Ｑ、Ｗ４２７Ｅ、Ｗ４２７Ｓ、Ｗ４２７Ｍ、Ｗ４２７Ｈ、Ｗ４２７Ｌ、Ｗ４２７Ｒ、Ｒ９１Ａ、Ｒ９１Ｑ、Ｒ９１Ｆ、Ｒ９１Ｇ、Ｒ９１Ｔ、Ｒ９１Ｌ、Ｒ９１Ｓ、Ｒ９１Ｎ、Ｔ２５０Ｇ、Ｔ２５０Ｌ、Ｔ２５０Ｒ、Ｔ２５０Ｖ、Ｔ２５０Ｐ、Ｋ３４０Ｐ、Ｋ３４０Ｉ、Ｋ３４０Ｖ、Ｋ３４０Ｄ、Ｋ３４０Ｅ、Ｑ３６６Ｋ、Ｑ３６６Ｅ、Ｑ３６６Ｖ、Ｑ３６６Ｌ、Ｑ３６６Ｉ、Ｑ３６６Ｙ、Ｔ３８１Ｐ、Ｔ３８１Ｉ、Ｔ３８１Ｖ、Ｔ３８１Ｑ、Ｔ３８１Ｎ、Ｔ３８１Ｌ、Ｔ３８１Ｍ、Ｎ４６２Ｌ、Ｎ４６２Ｙ、Ｎ４６２Ｓ、Ｎ４６２Ｆ、Ｎ４６２Ｇ、Ｎ４６２Ｅ、Ｎ４６２Ａ、Ｎ４６２Ｍ、Ｉ４６３Ｆ、Ｉ４６３Ｙ、Ｉ４６３Ａ、Ｉ４６３Ｖ、Ｉ４６３Ｌ、Ｌ２１７Ｑ、Ｌ２１７Ｇ、Ｌ２１７Ｅ、Ｌ２１７Ｉ、Ｌ２１７Ｃ、およびＬ２１７Ｓから選択され得る。いくつかの実施形態では、さらなる置換は、Ａ１０７Ｒを含み得る。
【００５２】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、本開示のＮｉｃＡ２変異体は、１つ以上の追加の置換突然変異と組み合わせた、上記に開示された置換および／または欠失突然変異のうちの少なくとも１つの組み合わせを含み得る。言い換えれば、いくつかの実施形態では、本開示のＮｉｃＡ２変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の追加の置換突然変異と組み合わせた、本明細書に開示された置換および／または欠失突然変異のうちの１つ以上の組み合わせを含み得る。例えば、上記に開示されたニコチン分解酵素の１つ以上（例えば、表１または図１３および１４に開示された変異体）は、突然変異Ｆ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、およびＷ３６４Ｖを有するＮｉｃＡ２変異体（Ｕ．Ｓ．２０１９／０１５３４０３ではＭ９と表示）、突然変異Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、およびＷ３６４Ｖ（Ｕ．Ｓ．２０１９／０１５３４０３ではＭ３Ｖと表示）、突然変異Ｆ３５３Ａ、Ｆ３５５Ａ、およびＷ３６４Ａ（Ｕ．Ｓ．２０１９／０１５３４０３ではＭ３Ａと表示）、突然変異Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ３６４Ｖ、Ｙ２１４Ａ、およびＹ２１８Ａ（Ｕ．Ｓ．２０１９／０１５３４０３ではＭ５と表示）、または突然変異Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、Ｗ３６４Ｖ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｆ１６３Ａ、Ｅ２４９Ａ（Ｕ．Ｓ．２０１９／０１５３４０３ではＭ７と表示）を含むがこれらに限定されない、他のニコチン分解酵素に基づく１つ以上の他の置換をさらに含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、例えば、Ａ１０７Ｒ置換（例えば、配列番号１３、１４、２８、３４、または３５）に加えて、Ｆ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、Ｆ３５５Ｖ、およびＷ３６４Ｖ置換のうちの１つ以上またはすべてを含み得る。いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、例えば、本明細書に開示されるＦ３５５置換のうちの１つ（例えば、配列番号２１〜２３、３４、または３７）に加えて、Ｆ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、およびＷ３６４Ｖ置換のうちの１つ以上またはすべてを含み得る。いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、例えば、上記に開示された二重または三重置換（例えば、配列番号２８、３４、または３５、例えば、図１４を参照）に加えて、Ｆ１６３Ａ、Ｙ２１４Ａ、Ｙ２１８Ａ、Ｙ２４２Ａ、Ｍ２４６Ａ、Ｅ２４９Ａ、Ｆ３５３Ｖ、およびＷ３６４Ｖ置換のうちの１つ以上またはすべてを含み得る。いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、例えば、上記に記載され、かつＵＳ２０１９／０１５３４０３に示されるように、Ｍ９、Ｍ３Ｖ、Ｍ３Ａ、Ｍ５、またはＭ７突然変異を含み、５０残基欠失（すなわち、△５０骨格）、２５残基欠失（すなわち、△２５骨格）、または３８残基欠失（すなわち、△３８骨格）などの、１〜５２アミノ酸残基のＮ末端欠失を有し得る。
【００５３】
追加的または代替的に、上記に開示されたニコチン分解酵素変異体のうちの１つ以上（例えば、表１または図１３および１４に開示される変異体）は、配列番号１の位置９１、１０４、１０６、１０７、２１７、２５０、３４０、３５５、３６６、３８１、４２７、４６２、および４６３のうちの１つ以上またはすべてに、１つ以上の置換突然変異をさらに含み得る。ＷＯ２０１８／１４４８７９を参照されたい。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、変異体の免疫原性を減少させる１つ以上の突然変異をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の変異体は、これらの領域のうちの１つ以上における１つ以上の保存的置換、非保存的置換、付加、もしくは欠失などの、配列番号１の位置１６〜２４、７３〜８１、２５８〜２６６、３０２〜３１０、３７３〜３８１、もしくは４４７〜４５５から選択される免疫原性Ｔ細胞エピトープ内の１つ以上の突然変異などの、配列番号１の位置１０〜３２、６８〜９４、１８９〜２２５、２４８〜２８５、２９６〜３２７、３３６〜３９１、もしくは４３５〜４５９から選択される領域内の免疫原性Ｔ細胞エピトープ内の１つ以上の突然変異などの、免疫原性Ｔ細胞エピトープ内に１つ以上の付加、置換、または欠失を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、変異体は、１、２、３、４、５、６、または７つの免疫原性Ｔ細胞エピトープ中に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の突然変異をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、そのような変異体は、哺乳動物対象に投与されたときに野生型ＮｉｃＡ２と比較して免疫原性の低減を呈する。いくつかの実施形態では、そのような変異体は、哺乳動物対象に投与されたときに、Ｔ細胞エピトープ中に１つ以上の突然変異を含まない対応する変異体酵素と比較して免疫原性の低減を呈する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、すべての順列およびそれらの組み合わせを含む、配列番号１の７４、７７、７８、８０、２６２〜２６６、３０３、３０４、３０６、３１０、３７４、３７７、３７８、３８２、３８３、４５０〜４５２、または４５７から選択される１つ以上の位置において免疫原性Ｔ細胞エピトープ中の突然変異をさらに含み得る。例えば、変異体は、エピトープＢ中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、エピトープ１中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、エピトープ２中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、エピトープ３中の例示的な突然変異のうちの１つ以上、および／またはエピトープ４中の例示的な突然変異のうちの１つ以上を含む、以下に記載の突然変異のうちの任意の１つ以上をさらに含み得る。
【表２】
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【００５６】
追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、配列番号１の１〜５２のアミノ酸残基のＮ末端欠失を含む。例えば、いくつかの実施形態では、変異体は、配列番号１のアミノ酸残基１〜１６、１〜２５、１〜３８、１〜５０、１〜５１、または１〜５２のＮ末端欠失を含む。したがって、本開示の変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、または５２個の連続するアミノ酸のＮ末端欠失を含み得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本開示の変異体は、追加的または代替的に、ペプチドのＣ末端に欠失を含み得る。例えば、本開示の変異体は、ペプチドのＣ末端に１つ以上のアミノ酸の欠失を含み得る。例えば、ＮｉｃＡ２変異体では、野生型配列のＳ４８２に対応するアミノ酸を欠失させることができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素（配列番号１）、または配列番号１の最大５２個のＮ末端アミノ酸残基の欠失を有するそのＮ末端欠失変異体と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号９の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１９であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号１９の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２０であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２０の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２１であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２１の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２２であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２２の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２３であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２３の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２４であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２４の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号２８の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３４であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３４の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３５であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３５の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３６であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３６の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３７であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体は、配列番号３７の変異体配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変異体は、ＡＭＰＬＥＸ（登録商標）Ｒｅｄアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などのアッセイによって判定される場合、野生型ＮｉｃＡ２と比較したニコチン分解活性の増加を呈し、その活性は、野生型ＮｉｃＡ２よりも、少なくとも約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、約５００％、約５５０％、約６００％、約６５０％、約７００％、約７５０％、約８００％、約８５０％、約９００％、約９５０％、約１０００％、約１１００％、約１２００％、約１３００％、約１４００％、約１５００％、約１６００％、約１７００％、約１８００％、約１９００％、約２０００％、約２２５０％、約２５００％、約２７５０％、約３０００％、約３２５０％、約３５００％、約３７５０％、約４０００％、約４２５０％、約４５００％、約４７５０％、または約５０００％以上である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変異体は、野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較したニコチン分解活性の増加を呈し、その活性は、緩衝液またはラット血清のいずれか中に３７℃で固定濃度の酵素とインキュベートし、固定時点でＭｅＯＨと混合することによって活性をクエンチした後に、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ；Ｈｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４３，１５０−１５７，１９９９）を使用して残留ニコチン濃度を測定するアッセイによって判定される場合、野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性よりも、少なくとも約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、約５００％、約５５０％、約６００％、約６５０％、約７００％、約７５０％、約８００％、約８５０％、約９００％、約９５０％、約１０００％、約１１００％、約１２００％、約１３００％、約１４００％、１５００％、約１６００％、約１７００％、約１８００％、約１９００％、約２０００％、約２２５０％、約２５００％、約２７５０％、約３０００％、約３２５０％、約３５００％、約３７５０、約４０００％、約４２５０％、約４５００％、約４７５０％、または約５０００％以上である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変異体は、野生型ＮｉｃＡ２と比較した哺乳動物対象における免疫原性の減少を呈し、それは、野生型ＮｉｃＡ２酵素よりも、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％未満、免疫原性が低い。別段特定されない限り、本明細書で使用される野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した場合の「免疫原性の減少」とは、インシリコアプローチ、インビトロアッセイ、インビボ研究（例えば、遺伝子組み換え動物を使用する）、ヒトＴ細胞を使用したエクスビボ研究、またはヒト対象を用いた臨床研究のうちの１つ以上によって示される、免疫原性の減少を指す。
【００８８】
ＩＶ．薬学的組成物
本明細書に開示されるニコチン分解酵素変異体は、以下により詳細に考察されるように、所定の投与経路を介した標的対象（すなわち、ヒトまたは他の哺乳動物）への投与に好適な薬学的組成物に処方することができる。
【００８９】
薬学的組成物は、本明細書に記載される１つ以上の変異体および薬学的に許容される担体または希釈剤を含み得る。
【００９０】
組成物は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、経口、経鼻、肺内、眼内、膣内、または直腸内投与用に処方され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、リポソーム製剤などの静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内投与用に処方される。薬学的組成物は、当該分野で知られている技術を使用して、即時放出組成物、持続放出組成物、遅延放出性組成物などに処方することができる。
【００９１】
様々な剤形のための薬学的に許容される担体が当該技術分野において知られている。例えば、固形製剤用の賦形剤、潤滑剤、結合剤、および崩壊剤が知られており、液体製剤用の溶媒、可溶化剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、および無痛化剤が知られている。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１つ以上の防腐剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料／着香料、吸着剤、湿潤剤などの１つ以上の追加の成分を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、組成物は注射または注入による投与用に処方される。いくつかの実施形態では、組成物は経口投与用に処方される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、インビボ（投与後）でのその半減期を延長するために修飾されている、長時間作用型変異体である。ペプチドの循環半減期を延長するための様々な技術が当該技術分野において知られている。例えば、いくつかの実施形態では、変異体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または半減期を引き延ばす類似のポリマーに接合されている。ＰＥＧを本開示のニコチン分解酵素変異体に接合させることにより、変異体の薬物動態特性を改善することができる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化は、変異体の１つ以上の免疫原性エピトープをマスキングすること、変異体特異的抗体力価を減少させること、ならびにＴ細胞増殖および／またはサイトカイン応答を弱めることから選択される１つ以上の効果を有する。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、変異体をＰＥＧに接合しても、ニコチン分解酵素変異体の酵素活性を減少させないか、または酵素活性を有意に減少させないか、あるいは酵素活性を排除しない。
【００９４】
下記の実施例に例示されるように、ＰＥＧ鎖の長さおよび構造（すなわち、直鎖状対分岐状）を選択し、変化させて、異なる特性に影響を与え、これらを付与し、または促進することができる。ＰＥＧは、以下の実施例に例示されているものを含む、ＰＥＧをタンパク質に接合するための既知の方法によって変異体に接合され得る。本明細書に記載される変異体のうちのいずれも、配列番号５〜１２および１５〜２８のうちのいずれかによって定義されるか、またはこれを含む変異体を含めて、ＰＥＧ化することができる。本開示の酵素変異体にＰＥＧを接合する目的のために、ＰＥＧポリマーのサイズまたは長さは変動し得る。例えば、本開示の酵素変異体に接合された直鎖状ＰＥＧは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｋＤａなど、１〜５０ｋＤａ、５〜４０ｋＤａ、または１０〜２０ｋＤａの範囲であり得る。加えて、ＰＥＧポリマーは、２０、４０、６０、または８０ｋＤａなど、２０〜８０ｋＤａの範囲のサイズで分岐してもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、変異体は、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質ドメイン、ヒト血清アルブミン、または不活性ポリペプチドと融合される。ペプチドの循環半減期を増加させるために使用されてきた例示的な不活性ポリペプチドとしては、ＸＴＥＮ（登録商標）（組み換えＰＥＧまたは「ｒＰＥＧ」としても知られる）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ、ＨＡＰ化）、プロリン−アラニンセリンポリマー（ＰＡＳ、ＰＡＳ化）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ、ＥＬＰ化）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「に融合される」とは、直接のまたはリンカーを介した遺伝子融合を含み、別段特定されない限り、多数のドメインを含む単一のポリペプチドをもたらす。
【００９６】
Ｖ．ニコチン嗜癖の治療方法または禁煙の促進方法
上記のように、本明細書に記載される変異体は、ニコチン嗜癖の治療および／もしくは禁煙（または他のタバコ製品の使用の中止）の促進または喫煙の再開（または他のタバコ製品の消費）の防止方法であって、それを必要とする哺乳動物対象における方法に有用である。（便宜上、以下の考察において、これらの方法は、ニコチン中毒の治療または禁煙の促進と総称される。）いくつかの実施形態では、対象は、ニコチン嗜癖であるか、あるいは喫煙をやめるかまたは喫煙もしくは他のニコチン製品の消費の自制を維持すること、または喫煙もしくは他のニコチン製品の消費の再発を防止することを望んでいる、ヒト対象である。
【００９７】
本方法は、概して、治療有効量の本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体（またはそれらを含む薬学的組成物）を対象に投与することを伴う。しかしながら、いくつかの実施形態では、本方法は、インビボで変異体を発現する構築物中にニコチン分解酵素変異体をコードする核酸を投与することを含む。例えば、そのような実施形態では、核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子導入ベクターなどの好適なベクター中に提供され得る。そのような方法での使用に好適な他の例示的なベクターは、当該技術分野において知られている。例えば、Ｌｕｋａｓｈｅｖ  ａｎｄ  Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８１（７）：７００−８（２０１６）を参照されたい。例示的なベクターは、１つ以上のエンハンサー（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー）、プロモーター（例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター）、および／または発現カセットの特性を増強する他の要素を含み得る。好適なベクターを作製する方法およびインビボで発現ベクターを使用する一般的な方法は当該技術分野において知られている。例えば、Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，４（１４０）：１４０ｒａ８７（２０１２）を参照されたい。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ニコチン嗜癖または禁煙の促進のための治療を必要とする対象は、喫煙タバコ、噛みタバコ、電子タバコ、および／または他のニコチン送達デバイスなどのニコチン製品を消費するヒト対象である。そのような対象は、ニコチンに身体的に嗜癖する、および／またはニコチン製品を消費することに心理的に嗜癖していても、またはしていなくてもよい。禁煙治療を必要とする典型的な対象は、１０未満、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、または４０本以上（または他のタバコ製品もしくはニコチン製品の同等の使用）を含む、１日当たり少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０本以上のタバコなど、１日に少なくとも１本以上のタバコを喫煙するなど、タバコもしくは他のニコチン製品を毎日喫煙または使用する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、治療有効量のニコチン分解酵素変異体は、血漿内ニコチンレベルを低下させるため、脳内に局在するニコチンレベルを低下させるため、またはその両方に有効な量である。
【０１００】
ニコチンは、血液脳関門を通過した後、その重要な効果のうちの多くを発揮する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および使用は、ニコチンが血液脳関門を通過するのを低減させるか、または防止する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるニコチン分解酵素変異体の投与は、対象の血流中を循環するニコチンを分解し、それによってニコチンが血液脳関門を通過するのを低減させるか、または防止する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、脳に由来するニコチンの生理学的および心理的効果を低減させるか、または防止する。対象はこれらの効果の減少または中止を経験するので、彼／彼女はニコチン製品を消費したいという欲求を失うであろう。追加的または代替的に、本開示されるニコチン分解酵素変異体は、末梢神経系を刺激するニコチンの能力に影響を及ぼすことによって効果を発揮し得る。
【０１０１】
投与されるニコチン分解酵素の具体的な量は、対象の年齢および／もしくは体重、定期的に摂取される（例えば、喫煙される、噛まれる、または吸入される）ニコチンの量、ならびに／または治療時の対象の脳もしくは血漿中のニコチンレベルのうちの１つ以上に依存し得る。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１６ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１４ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８／５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０．５ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１３．５ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１４．５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５．５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１６．５ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１７．５ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１８．５ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約１９．５ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１１５０ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９５０ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２１００、約２１５０ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２２５０ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２３５０ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２４５０ｍｇ、または約２５００ｍｇの用量で投与される。２つ以上の変異体を投与する場合、投与される全ての量の変異体は、前述の指針に従い得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本方法は、単一用量のニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ニコチン嗜癖の症状もしくは効果が軽減、改善、または排除されるまで、または対象が喫煙もしくは別様にニコチンの摂取を中止するまでの所定の期間など、反復用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、徴候／症状／効果が持続する場合、または対象がニコチン欲求を続けているか、もしくはそれらを新たに経験している場合は、追加の用量の変異体（複数可）を用いて治療を繰り返す。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本方法は、ニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）を１日３回以上、１日２回、または１日１回投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）を、隔日に１回、週に３回、週に２回、週に１回、隔週に１回、３週毎に１回、月に１回、またはそれ未満頻繁に投与することを含む。そのような実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、上記に記載されるような長時間作用型ニコチン分解酵素変異体であり得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、治療は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１日間以上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、もしくは１８週以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２か月以上、または１、２、もしくは３年以上、あるいは対象がニコチン欲求もしくは他のニコチン離脱症状を経験しなくなるまで、または喫煙もしくは他のタバコ製品の使用を中止するまで、継続し得る。
【０１０５】
ＶＩ．ニコチン中毒の治療方法
本開示されるニコチン分解酵素変異体を使用して、ニコチン中毒、ニコチン過剰摂取、またはニコチン毒性を治療することができる。便宜上、これらの方法は、本明細書ではニコチン中毒の治療と総称される。いくつかの態様では、本明細書に記載されるニコチン中毒を治療する方法は、本明細書に開示されるニコチン分解酵素変異体またはそれを含む薬学的組成物を、それを必要とする哺乳動物対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、毒性量のニコチンを摂取または消費した対象にニコチン分解酵素変異体を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ニコチン分解酵素変異体と、活性炭もしくは他の薬剤などのニコチン中毒の治療に有用な他の化合物との両方を投与することを含み得る。そのような実施形態では、酵素変異体および第２の化合物（例えば、活性炭）は、同じまたは異なる組成物から、順次または同時に投与されることができる。したがって、治療は、ニコチン中毒の症状および／または効果に対処するために活性炭および／または他の支持療法を施すことを含み得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、治療有効量のニコチン分解酵素変異体は、ニコチン中毒もしくは過剰摂取の１つ以上の症状もしくは効果を軽減、改善、または排除するのに有効である。投与される具体的な量は、対象の年齢および／もしくは体重、摂取されたと考えられるニコチンの量、ならびに／または治療時の対象の血漿中のニコチンレベル、および／もしくは治療時の対象の脳内ニコチンレベルのうちの１つ以上に依存し得る。いくつかの実施形態では、ニコチン中毒の治療を受けている対象は成人であり、いくつかの実施形態では、対象は子供（すなわち、１９歳未満）である。いくつかの実施形態では、治療有効量のニコチン分解酵素変異体は、血漿内ニコチンレベルを低下させるため、および／または対象の特定の組織（例えば、脳／中枢神経系、心臓および血管系など）に局在するニコチンの量を低減させるために有効な量である。特定の実施形態では、治療有効量のニコチン分解酵素変異体は、血漿内ニコチンレベルを低下させるため、脳内に局在するニコチンレベルを低下させるため、またはその両方に有効な量である。
【０１０７】
投与されるニコチン分解酵素の具体的な量は、対象の年齢および／もしくは体重、急激に摂取されたニコチンの量、ならびに／または治療時の対象の脳もしくは血漿内のニコチンレベルのうちの１つ以上に依存し得る。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１６ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１４ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８／５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０．５ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１３．５ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１４．５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５．５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１６．５ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１７．５ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１８．５ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、約１９．５ｍｇ／ｋｇ、または約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、変異体は、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１１５０ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１２５０ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１３５０ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１４５０ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１５５０ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１６５０ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１７５０ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１８５０ｍｇ、約１９００ｍｇ、約１９５０ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２１００、約２１５０ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２２５０ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２３５０ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２４５０ｍｇ、または約２５００ｍｇの用量で投与される。２つ以上の変異体を投与する場合、投与される全ての量の変異体は、前述の指針に従い得る。
【０１０８】
ニコチン中毒は嘔吐に関連しているため、非経口投与経路を使用してもよい。さらに、静脈内投与は、腹腔内投与よりも有効であり得る。したがって、ニコチン中毒を治療する方法のいくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）が静脈内投与される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本方法は、単一用量のニコチン分解酵素変異体（複数可）（またはそれを含む組成物）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、所定の期間、またはニコチン中毒もしくは毒性の症状もしくは効果が軽減、改善、もしくは排除されるまで、または対象が喫煙もしくは別様にニコチンの摂取を中止するまでなど、反復用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、徴候／症状／効果が持続する場合、追加の用量の変異体（複数可）を用いて治療を繰り返す。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、治療は、過剰摂取後１〜３日間、または１〜５日間、あるいは１、２、３、４、もしくは５日間など、過剰摂取後１日以上継続してもよい。いくつかの実施形態では、対象がニコチン中毒もしくは毒性のいかなる症状も、もはや経験しなくなるまで、または対象の血漿および／もしくは脳内のニコチンレベルが十分に安全なレベルまで低下するまで、治療を続けてもよい。いくつかの実施形態では、ニコチン分解酵素変異体は、上記に記載されるような長時間作用型ニコチン分解酵素変異体であり得る。
【０１１１】
当業者であれば、本開示が目的を実行し、言及された目的および利点、ならびにそれに固有のものを得るために上手く適合されていることを容易に認識するであろう。その中の改変および他の用途は当業者には思い浮かぶであろう。これらの改変は本開示の趣旨の範囲内に包含される。以下の実施例は本発明を例示するために与えられる。しかしながら、本発明はこれらの実施例の特定の条件または詳細に限定されないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１１２】
実施例１−ニコチン分解酵素変異体の開発および試験
３Ｄ分子の図式的視覚化
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ、ＢＩＯＶＩＡ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を使用して、ＮｉｃＡ２タンパク質を可視化し、活性部位残基を判定した。構造の検査（ＰＤＢ  ＩＤ＃５ＴＴＪ）、ＦＡＤの位置、および重要な推定活性部位残基の報告に基づいて、推定された活性部位の空洞を定義した。側鎖および骨格原子の両方を含む、この空洞の露出表面を構成するすべての残基を、活性部位残基であるＡＲＧ９、ＰＨＥ１０４、ＧＬＹ１０５、ＧＬＹ１０６、ＡＬＡ１０７、ＴＲＰ１０８、ＬＥＵ２１７、ＴＹＲ２１４、ＴＹＲ２１８、ＧＬＵ２４９、ＴＨＲ２５０、ＬＹＳ３４０、ＰＨＥ３５５、ＴＲＰ３６４、ＧＬＮ３６６、ＴＨＲ３８１、ＴＲＰ４１７、ＡＬＡ４２６、ＴＲＰ４２７、ＡＬＡ４６１、ＡＳＮ４６２、ＩＬＥ４６３として分類した。
【０１１３】
ＮｉｃＡ２の発現および精製
野生型ＮｉｃＡ２および変異体を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換された発現プラスミドに基づいて、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）からのＣ末端Ｈｉｓ６タグで発現した。精製は、製造者のプロトコルに従って、Ｃｏｂａｌｔ  ＴＡＬＯＮ（商標）Ｈｉｓ−タグ精製樹脂（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって実行した。
【０１１４】
一次スクリーニングアッセイ
Ｃ末端Ｈｉｓ６−タグを有する野生型（ｗｔ）ＮｉｃＡ２アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＥＪ１４６２０．１）のＥ．ｃｏｌｉ発現用に最適化されたコドンである合成遺伝子（ＧｅｎｅＡｒｔ／ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるカスタムＤＮＡ合成）を、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングし、発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。この構築物から発現された予測野生型ＮｉｃＡ２アミノ酸配列を表１に示す（配列番号１）。
【０１１５】
サイズの不均一性は、配列番号１をコードする構築物から発現されたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定され、製造者のプロトコルに従ってＣｏｂａｌｔ  ＴＡＬＯＮ（商標）Ｈｉｓタグ精製樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製された（図１、４９ｋＤａマーカー周辺の主要なバンドおよび小さいバンド）。タンパク質がＨｉｓタグを介して精製されたので、不均一性はＮ末端にあると推測された。オンライン検索ツールＰＲＥＤ−ＴＡＴ（ｃｏｍｐｇｅｎ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ＰＲＥＤ−ＴＡＴ；Ｐａｎｔｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｔ  ａｎｄ  Ｓｅｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ，２０１０Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を利用して、配列番号１の位置３７のアラニン（Ａ）残基に続く、関連する切断部位を有する推定ＴＡＴリーダー切断部位を同定した。
【０１１６】
非必須細菌配列（配列番号１の位置１６〜２４の特定のインシリコ予測Ｔ細胞エピトープ配列を含む）を排除するため、免疫原性リスクを低下させるため、ならびに推定Ｎ末端開裂部位および関連する産物の不均一性を排除するための試みにおいて、最初の５０個のＮ末端残基（ＮｉｃＡ２Δ５０、配列番号２）を除去する欠失構築物を作製した。
【０１１７】
この領域は触媒活性を損なうことなく潜在的に欠失され得ると考えられ、その結果、ＮｉｃＡ２Δ５０（配列番号２）をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、上記に記載されるように精製した。図１に見られるように、精製されたＮｉｃＡ２Δ５０（配列番号２）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって均一に見える。
【０１１８】
Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイ（Ｒｅｓｚｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｍｐｌｅｘ  ｒｅｄ／ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｓｓａｙ：Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４２：３２７−３３７（２００５））を使用して、精製タンパク質に対する酵素活性の分析を行った。簡単に言うと、ＮｉｃＡ２によるニコチンの酸化は、Ｈ２Ｏ２の生成をもたらし、これは無色のＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬のその赤色蛍光産物、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）によるレゾルフィンへの変換と結び付けられる。アッセイは、本質的に、１０μＭの最終アッセイ濃度までＳ−ニコチン（Ｓｉｇｍａ）を添加したことを除いて、アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃Ａ２２１８８）の供給者によって推奨されるように実行された。アッセイは、黒色の半分の面積の平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃａｔ＃３９９３）中の１００μＬ／ウェルの総容量で行われた。５５５ｎｍでの設定Ｅｘ；５９０ｎｍでのＥｍを使用してＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２マルチモードマイクロプレートプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中に蛍光の発生を検出し、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏデータ進化パッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中の各時点について無酵素対照由来の値を差し引くために「プレートブランク」ウェルを用いる。活性は、並行して実行された野生型ＮｉｃＡ２酵素と比較した時間の関数としてプロットされた蛍光の増加の相対勾配として発現された。
【０１１９】
Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイは、精製ＮｉｃＡ２Δ５０タンパク質が野生型ＮｉｃＡ２と比較した２３％の活性の低減を示すことを明らかにした（図２）。２つのより短い欠失構築物（ＮｉｃＡ２Δ２５（配列番号３）およびＮｉｃＡ２Δ３８（配列番号４）を生成して試験したが、野生型酵素と比較して、同様に活性の減少を示した。要約すると、３つすべての欠失突然変異体が、野生型と比較した活性の低減を示した。
【０１２０】
したがって、少なくとも野生型と同等のニコチン分解活性を呈するであろうＮｉｃＡ２およびＮｉｃＡ２Δ５０変異体を設計および同定することが決定された。新規変異体のライブラリを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１６６６４に示される方法に従って調製および試験した。先に記載されるようなＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄスクリーニングアッセイにおけるこのライブラリのスクリーニングによって、位置１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、および／または４２６（表３、配列番号５〜２８）における突然変異を有する、改善された変異体の同定がもたらされる。
【０１２１】
カスタム包括的飽和突然変異誘発（ＣＳＭ）ライブラリは、Ｒｅｖｏｌｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｉｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ７：ｅ５２０３１（２０１２））によって供給され、配列番号１の位置１０４、１０６、１０７、２４９、３５５、および／または４２６におけるすべての単一アミノ酸（ａａ）置換（変異体当たりに１つの突然変異）を精査する。これらの位置は、ＮｉｃＡ２の活性部位を構成する位置のサブセットである。
【０１２２】
ライブラリをＢＬ２１ゴールド（ＤＥ３）に形質転換し、単一コロニーを拾い上げ、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地中の９６ウェルプレート中で一晩増殖させた。一晩のＬＢ培養物を、４７５μｌの自動誘導マジック培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する新しい９６ウェルディープウェルプレートに希釈し、激しく振盪しながら室温で１８時間増殖させた。４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって、細菌をプレート中で回収し、ペレットを−８０℃で凍結した。１ｍｌ当たり１ＫＵのｒ−リゾチーム（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有する１００μｌの室温Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ  ＨＴ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）に溶解し、振盪プラットフォーム上で室温で２０分間インキュベートすることによって、ペレットを溶解した。Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ  ＨＴ試薬で１：１（容量：容量）に希釈し、４℃で２０分間４４００ｒｐｍで遠心分離することによって不溶性細胞片を除去することによって、清澄化した溶解物を調製した。２５μｌの清澄化した溶解物を新しい９６ウェルプレートに移し、ＰＢＳ中の２％ミルク中で１：１（容量：容量）に希釈した。希釈した溶解物を、ウェル当たり５０μｌのＰＢＳ中のアッセイプレート（５μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４℃で一晩コーティングされた黒色９６ウェルハーフエリア高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ））に移し、次に、４％ミルク（ＰＢＳ中に）で室温で２時間ブロッキングし、室温で３時間穏やかに振盪しながらインキュベートして、モル過剰の発現されたＨｉｓタグ化酵素による固定化抗Ｈｉｓ  ｍＡｂの飽和を確実にした。この工程は、本質的に、増殖、誘導条件、固有の発現レベルなどの違いによってもたらされる濃度の任意の違いを標準化し、その後の工程で一貫した量の酵素が各ウェルの活性についてアッセイされることを確実にする。これはまた、変異体の相対活性を正確に測定し、比較するために、個々のウェル中の酵素の定量化の必要性をなくす。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で６回、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ試薬緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）で１回洗浄して、未結合の物質を除去した。１０μＭのＳ−ニコチンを含む５０μｌのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ）を各ウェルに添加し、経時的に蛍光の発生をモニタリングすることによって、酵素アッセイを行った。
【０１２３】
野生型ＮｉｃＡ２を発現する含まれるコロニーからの値と比較してアッセイ活性が増強されたクローンを、一晩のＬＢ培養でマスタープレートから単離し、８つの個々のランダムコロニーを再増殖させ、上記のようにＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイで再スクリーニングした）。プラスミドＤＮＡを、活性の増加をもたらす突然変異を同定するために調製および配列決定した。Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイにおいて同定された変異体の活性のリスト（上記に記載されるように再アッセイされた各変異体の８つの個々のコロニーについての平均）を表３に示す。これらの変異体の配列は、表１に開示されている。
【表３】
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【０１２４】
表３に示されるように、これらすべての例示的な突然変異は、全長酵素において活性増強をもたらした。それに対応して、ＮｉｃＡ２Δ５０Ａ１０７Ｒ変異体（配列番号１４）において、ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ変異体（配列番号１３）の高い活性が保持されていた。結果として、全長ＮｉｃＡ２およびＮｉｃＡ２Δ５０、ＮｉｃＡ２Δ２５、ＮｉｃＡ２Δ３８などの欠失変異体の両方、または少なくとも最初の５０個のＮｉｃＡ２のＮ末端残基までを含む任意の同様の欠失、あるいはこれが全長野生型ＮｉｃＡ２の少なくとも２０％の酵素活性を有することを条件とした任意のＮもしくはＣ末端欠失変異体の文脈において、表３に列挙されるすべての突然変異が活性を改善すると予想される。
【０１２５】
部位特異的突然変異誘発によって、表３から選択される複数の残基に突然変異を有する特異的変異体を生成することができ、上記に記載されるように、表３から選択される複数の位置における複数の突然変異からなるライブラリを生成して、スクリーニングすることができる。これらの試みは、表３に列挙される個々の単一の突然変異のうちのいずれよりも高い酵素活性を有する同じ分子中のいくつかの位置に突然変異を有する変異体の同定を可能にし得る。
【０１２６】
低ニコチン濃度で血清中の触媒活性の増強を提供するように示されている以下の単一突然変異を含むコンビナトリアルライブラリを生成した（表３を参照）。
・Ｆ１０４Ｒ，Ｓ，Ｉ，Ｔ
・Ｇ１０６Ａ
・Ａ１０７Ｒ、Ｔ、Ｇ（ＮＮＫでコードされたコドンのサブセットとして）
・Ｆ３５５Ｈ
【０１２７】
以下のオリゴ（３つの縮重オリゴすべてがＧ１０６Ｇ／ＡおよびＡ１０７ＮＮＫをコードする）を使用するオーバーラップＰＣＲにより、突然変異をｐＥＴＮｉｃＡ２Δ５０発現構築物（最初の５０アミノ酸のＮ末端欠失を伴う変異体を産生する、表１参照、配列番号２）に導入した。
【０１２８】
コンビ−１：
【化２】
2021532761.tif 000017
（野生型Ｆ１０４、配列番号２９）
【０１２９】
コンビ−２：
【化３】
2021532761.tif 000018
（Ｆ１０４Ｒ、配列番号３０）
【０１３０】
コンビ−３：
【化４】
2021532761.tif 000019
（Ｆ１０４ＴＳＩ、配列番号３１）
【０１３１】
オーバーラップＰＣＲの突然変異を含有する精製ＰＣＲフラグメントを１：１：３の比率で混合することにより、位置Ｆ１０４の５つのコドンの同等の表現を得た。オーバーラップＰＣＲフラグメントの産物は、２つの異なるベクターフラグメントにクローン化され、１つはＮｉｃＡ２Δ５０野生型配列をコードし、もう１つはＮｉｃＡ２Δ５０Ｆ３５５Ｈ突然変異をコードした。これら２つのライゲーションからＢＬ２１  Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）の同数の形質転換体を組み合わせることによって、最終的なライブラリを得た。スクリーニングプレート上で参考としてＮｉｃＡ２Δ５０Ａ１０７Ｒを使用して、ライブラリを、実施例１に記載されているように、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ一次アッセイでスクリーニングした。ヒットの配列決定によって、変異体としてのＮｉｃＡ２Δ５０Ｆ１０４Ｉ、Ａ１０７Ｒが２つの突然変異を含有し、単一の突然変異自体よりも優れた活性、すなわちＮｉｃＡ２Δ５０Ａ１０７Ｒの１．４倍の活性の増加が明らかになった（表３）。Δ５０Ｎ末端欠失は、ＮｉｃＡ２酵素の潜在的な免疫原性領域を除去するが、わずかな活性の減少を引き起こすだけである（表３）。
【０１３２】
配列番号２〜４を有する変異体を用いて、活性に対して中程度の効果のみで最初のエピトープを欠失させることが可能であることが示され、表３に提供されたデータは、活性のこの減少が、表３に列挙される突然変異によって緩和または克服され得ることを示す。
【０１３３】
表２に記載の４つの他のエピトープ中の突然変異に基づく変異体を、エピトープＢ、エピトープ２、エピトープ３、およびエピトープ４について調製し、上記に記載されるように評価した。図４Ａ〜Ｅに見られるように、それぞれ、エピトープＢ、２、および３からの野生型ＮｉｃＡ２酵素の活性の≧９０％のアッセイ値を有する、２、４、および７つの変異体を同定し、これらの変異体（Ｌ７４Ｎ＆Ｙ７７Ｒ、Ｒ７８Ｑ、Ｖ３０４Ａ＆Ｍ３０６Ｑ、Ｖ３９４Ａ、Ｖ３０４Ｔ＆Ｍ３０６Ｉ、Ｍ３０６Ｉ＆Ｌ３１０Ｒ、Ｌ３７４Ｑ＆Ｉ３７７Ｓ、Ｌ３７４Ａ＆Ｉ３７７Ａ、Ｌ３７４Ｎ＆Ｉ３８２Ｑ、Ｉ３７７Ａ＆Ｉ３８２Ｔ、Ｉ３７７ＴおよびＩ３８２Ｔ、Ｉ３７７Ｔ、およびＬ３７４Ｎ＆Ａ３８３Ｑ、図４を参照のこと）が、野生型と同様の酵素活性を有し、インシリコ予測に基づいて、より低い免疫原性の可能性を有すると予測される。興味深いことに、エピトープ４について提案された変異体のうちのいずれも、野生型ＮｉｃＡ２と比較して４０％を超える活性を示さなかった（図４Ｄを参照のこと）。この実施例において同定された突然変異（各エピトープから１つの突然変異）は、ＮｉｃＡ２骨格に導入され得るか、または表３に記載される他の同定された単一変異変異体のうちのいずれか、もしくは突然変異の組み合わせから生じる任意の数の突然変異と組み合わされて、野生型ＮｉｃＡ２と同等またはそれよりも良好な酵素活性を有する単一の脱免疫化酵素変異体を産生し得る。
【０１３４】
実施例２−ＮｉｃＡ２  ＭＨＣＩＩエピトープの同定
８つの最も一般的なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（Ｃａｎｔｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０８：１２７２−１２７７（２０１１）；ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０４０１、およびＤＲＢ１＊０３０１）に基づいて、ＮｉｃＡ２  ＭＨＣＩＩエピトープのインシリコ検索を実行した。免疫エピトープデータベース（Ｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３：Ｄ４０５−Ｄ４１２（２０１５））および百分位数コンセンサスランク法を使用して検索を行い、ＮｉｃＡ２の予測される免疫原性の可能性を評価した。重なり合っている各１５量体ＮｉｃＡ２ペプチドについての百分位数コンセンサススコアを、８つすべてのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子にわたって平均した。次に、全体的な平均化結合スコアと比較して、ＭＨＣＩＩへのより厳密に予測された結合において、＞１の標準偏差であったすべてのＮｉｃＡ２配列を選択することによって、ＮｉｃＡ２の免疫原性の可能性を判定した。この方法は、免疫原性が高いと予測される、配列番号１の残基１０〜３２、６８〜９４、１８９〜２２５、２４８〜２８５、２９６〜３２７、３３６〜３９１、および４３５〜４５９を反映するＮｉｃＡ２配列の４５％にわたって、８つの連続した配列を明らかにした（表１に灰色で強調表示される）。
【０１３５】
ＤＲＢ１＊０４０１対立遺伝子のみを使用したより狭い検索をインシリコで実行した。この検索により、表１の配列番号１に下線を引いた６つの最高ランクの免疫原性Ｔ細胞エピトープが得られた。
【０１３６】
実施例３−ニコチン分解酵素のＰＥＧ化
ＮｉｃＡ２のＰＥＧ化
５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、≧２時間、氷上でｐＨ７．６の１００ｍＭのＮａ３ＰＯ４中の７倍もしくは２０倍のモル過剰の１０もしくは２０ｋＤａのＮＨＳ−ＰＥＧ試薬（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ−１００ＴＳもしくはＭＥ−２００ＴＳ、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、野生型ＮｉｃＡ２のランダムＰＥＧ化を実行した。５０ｋＤａカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニットを使用して、未接合のＰＥＧ試薬の排除を実行した。２μｇのタンパク質に対応する試料を、ＭＯＰＳ泳動用緩衝液中で泳動するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して染色した。
【０１３７】
ＰＥＧ化ＮｉｃＡ２の分析
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をＮｉｃＡ２および本開示の変異体などの他のニコチン分解酵素に接合するためのプロトコルを開発し、活性および半減期に対するＰＥＧ化の効果を判定するための実験を行った。
【０１３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、モル過剰のＰＥＧ化試薬およびＰＥＧ鎖長が増加するにつれて、ＰＥＧ化度が増加することを示した。５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、≧２時間、氷上でｐＨ７．６の１００ｍＭのＮａ３ＰＯ４中の７もしくは２０倍のモル過剰の１０もしくは２０ｋＤａのＮＨＳ−ＰＥＧ試薬（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＭＥ−１００ＴＳもしくはＭＥ−２００ＴＳ、ＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、野生型（ｗｔ）ＮｉｃＡ２のランダムＰＥＧ化を実行した。５０ｋＤａカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニットを使用して、未接合のＰＥＧ試薬の排除を実行した。２μｇのタンパク質に対応する試料を、ＭＯＰＳ泳動用緩衝液中で泳動するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに装填し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して染色した。図５に見られるように、ＰＥＧ化度は、ＰＥＧ化試薬の過剰モル比を制御することによって制御することができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって残留未接合タンパク質が検出されなかった調製物ＮｉｃＡ２−ＰＥＧ１、−ＰＥＧ２、および−ＰＥＧ３を、さらなる分析のために選択した。
【０１３９】
ＰＥＧ化がＮｉｃＡ２の薬物動態（ＰＫ）特性を増強し得るかどうかを判定するために、血清濃度を、ラットへの静脈内（ｉ．ｖ．）投薬後の時間の関数として判定した（５ｍｇ／ｍＬ、Ｎ＝４、２Ｍ＋２Ｆ）。これらの実験からのデータを図６に示す。簡単に言うと、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で一晩コーティングし、これは、ＮｉｃＡ２およびＰＥＧ化ＮｉｃＡ２タンパク質上のＣ末端Ｈｉｓタグに結合することができた。プレートを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％の脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）で約１時間ブロッキングした。ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中の１％のＮＦＤＭ中のＮｉｃＡ２およびＮｉｃＡ２−ＰＥＧ１−３標準および血清試料の希釈物をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。未結合物質を洗い流した後（すべての洗浄工程をＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中で行った）、ウサギ抗ＮｉｃＡ２ポリクローナル一次検出抗体を、１時間のインキュベーションのためにウェルに添加した。洗浄工程に続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）（ＫＰＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加した。プレートを洗浄し、残っている結合複合体を、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で検出した。いったん酸で停止されると、プレートを分光光度計で４５０ｎｍで読み取り、データをＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ、バージョン５．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で分析した。
【０１４０】
ＰＥＧ化によりＮｉｃＡ２上のエピトープがマスキングされるかどうかを判定するために、追加の実験を実行した。ＰＥＧ化されていないか、またはＰＥＧ化されたＮｉｃＡ２の調製物のＰＢＳ中での連続希釈物を、上記に記載されるＰＫ実験における血清濃度の測定に使用されるものと同じサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで試験し（図６）、信号（Ａ４５０）を、濃度の関数としてプロットした。ＰＥＧ化度（ＰＥＧ化されていない分子と比較して１．０のＡ４５０を得るために必要とされる約１０００倍高い濃度のＮｉｃＡ２−ＰＥＧ２および−ＰＥＧ３）の増加と共に、アッセイ感度が劇的に低下し、検出抗体試薬によって認識されるエピトープが、ＰＥＧ化された分子においてより接近しにくいことを示す。これらの結果を図７に示す。
【０１４１】
免疫原性の遺伝子組み換えＨＬＡ−ＤＲ４マウスモデルにおいて、ＰＥＧ化はＮｉｃＡ２特異的抗体の力価を減少させることが示された。具体的には、ヒトＤＲ４遺伝子組み換えマウスにおけるフロイント不完全アジュバントにおける皮下（ｓ．ｃ．）注射の１０日後のＮｉｃＡ２特異的抗体力価の低減（Ｎ＝６、３Ｍ＋３Ｆ、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を調べた。このマウスモデルは、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１（ＤＲ４スーパータイプの代表）の抗原結合ドメインを有するハイブリッドＭＨＣクラスＩＩ分子を保有し、内因性マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない。力価を、ＮｉｃＡ２コーティングプレートを使用したＥＬＩＳＡにおいてＯＤ４５０＝０．５を達成するための血清希釈度として定義し、ヤギα−マウスＩｇＧ−γ−ＨＲＰによって検出した。試験された最低血清希釈度は５０倍であった（検出限界（ＬＯＤ）、図８に破線で示す）。ＮｉｃＡ２のＰＥＧ化は、遺伝子組み換えＤＲ４マウスにおいて平均ＮｉｃＡ２特異的抗体力価の有意な≧１０倍の減少をもたらし（図８、それぞれＮｉｃＡ２−ＰＥＧ１、−ＰＥＧ２、および−ＰＥＧ３群からの４、２、および２匹の動物が、ＬＯＤ未満の力価を有した）、これは、ＰＥＧ化変異体が臨床設定においてより低い免疫原性を呈し得ることを示している。
【０１４２】
図９に示されるように、ＰＥＧ化は、ＮｉｃＡ２への曝露によって媒介されるヒトＴ細胞増殖応答およびサイトカインＴＮＦγ放出を弱めることも観察された。ＮｉｃＡ２のＰＥＧ化は、平均Ｔ細胞増殖刺激指数の有意な減少（図９、左パネル）ならびにＩＦＮγ分泌レベルの減少（図９、右パネル）をもたらした（５人の健康なボランティアからの独立した実験）。陽性対照：フィトヘマアグルチニン（ＰＨＡ）。ベースライン応答（ＰＢＭＣ）と比較した、３つの試験濃度でのＮｉｃＡ２およびＮｉｃＡ２−ＰＥＧ２についての、Ｔ細胞増殖応答刺激指数（ＳＩ、３Ｈ−チミジン取り込みによって測定される）（左）およびＩＦＮγ分泌レベルの増加倍数（フローサイトメトリーおよびＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（右）によって測定される）について、５つの独立した実験についての試験結果を示す。３≧（破線）の増加は、有意な増加および肯定的な反応と考えられる。
【０１４３】
図１０に示されるように、ＰＥＧ化酵素は血清中で完全なニコチン分解活性を保持していることも示された。３７℃で予めインキュベートされた４０ｎｇ／ｍＬのＳ−ニコチン（２５０ｎＭ、これは典型的な喫煙者において観察される血漿レベルに等しい）を含有するラット血清中に、野生型ＮｉｃＡ２またはＮｉｃＡ２−ＰＥＧ２を、０．０７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。試料を様々な時点で回収し、直ちに、メタノールの添加および急速混合によって、酵素活性をクエンチした。残留ニコチンレベルを、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって判定した。ＧＣアッセイのＬＯＤは、破線によって示される２ｎｇ／ｍＬであった。ＰＥＧ化は、ニコチンを分解するＮｉｃＡ２の能力を妨げるとは思われなかった。
【０１４４】
実施例４−血清中のニコチン分解活性
アッセイ緩衝液およびＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイの高（１０μＭ）ニコチン濃度（表３を参照）だけでなく、典型的な喫煙者に見られる濃度により関連性のあるニコチン濃度を使用した血清でも、活性が改善されたかどうかを調査するために、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイで改善された変異体を、緩衝液ではなく血清を利用したアッセイで精製および評価した。固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製を、Ｃｏｂａｌｔ  ＴＡＬＯＮ（商標）Ｈｉｓ−タグ精製樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコルに従って使用して実行し、ＰＢＳへの透析後の濃度を、２８０ｎｍでの吸光度および各変異体の理論的吸光係数に基づいて計算した。
【０１４５】
３７℃で予めインキュベートされた４０ｎｇ／ｍＬのＳ−（−）−ニコチン（２５０ｎＭ、これは典型的な喫煙者において観察される血漿レベルに等しい）を含有するラット血清中に、精製酵素を１．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。試料を様々な時点で回収し、直ちに、メタノールの添加および急速混合によって、酵素活性をクエンチした。残留ニコチン濃度を、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ；Ｈｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．：Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔｓ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１４３：１５０−１５７（１９９９））で判定した。ＧＣアッセイの検出レベルは２ｎｇ／ｍＬであった。図１１Ａおよび１１Ｂに見られるように、変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ（ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１６６６４に開示される陽性対照）、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｇ、Ｆ１０４Ｔ、Ｆ１０４Ｉ、Ｆ１０４Ｒ、Ｆ１０４Ｓ、Ｇ１０６Ａ、Ｆ３５５Ｈ、およびＡ４２６Ｃは、野生型ＮｉｃＡ２と比較して、これらの条件下でニコチン分解活性が増加した。対照的に、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイで基質濃度１０μＭでの活性が野生型の５．５倍に増加したにもかかわらず、変異体Ｅ２４９Ｗは、このアッセイでニコチン分解活性が改善したようには見えない（表３）。
【０１４６】
理論に束縛されるものではないが、１０μＭでＶｍａｘ（およびｋｃａｔ）への効果が観察されていると考えられており、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイで見られるより高い活性が、低ニコチン濃度（＜＝２５０ｎＭ）で観察される対応する結果に必ずしも変換されない理由は、突然変異がＫｍに悪影響を与える（つまり、Ｋｍを増加させる）可能性があるため、低基質濃度での速度が、野生型ＮｉｃＡ２で観察される速度よりも低くなるか、またはそれに類似することになるからである。しかしながら、これは、これまでに行われた観察に基づく単なる仮説であり、さらなる研究により、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイの活性が、一般に血清分解活性の活性も予測する傾向があることが示され得る。
【０１４７】
実施例５−二次酵素スクリーニングアッセイ
ニコチンバイオセンサーアッセイ：ＢｉＯｐｔｉｘ  ４０４ｐｉ増強ＳＰＲ機器を使用して実験を行った。ニコチン特異的ｍＡｂ、ＡＴＩ−１１１９、測定する濃度範囲の中央に好適なＫＤを有するＩｇＧ１（Ｓ−（−）−ニコチンの場合は６６ｎＭ）を、エタノールアミンによる残りの活性エステルのブロッキングとともに標準ＥＤＣ／ＮＨＳアミン結合を使用してＢｉＯｐｔｉｘ  ＣＭＤ２００ｍセンサーチップに固定化した。標準曲線では、Ｓ−（−）−ニコチンを、泳動用緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）に異なる濃度（３倍段階希釈）で注入した。各注入の後に、２５°Ｃで２０分間の緩衝液フローを行い、ｍＡｂからニコチンを解離させ、次の試料注入のためにチップを準備した。ニコチン濃度毎に３回の独立したランダム化注入を行った。定常状態での応答単位を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェアを使用して判定した。
【０１４８】
酵素活性のアッセイのために、一次スクリーニングアッセイについて記載されたように粗溶解物を調製した。固定化された抗ＨｉｓタグｍＡｂ（アッセイポイント毎に１ウェル）を使用して、溶解物から酵素を捕捉した。未結合の物質を洗い流した後、典型的な喫煙者に見られる血中濃度（４０ｎｇ／ｍＬ）を模倣するために、開始ニコチン濃度が２５０ｎＭの１００μｌの泳動用緩衝液を添加することによってアッセイを開始した。９０μｌを事前にラベル付けされたＰＣＲチューブに移し、９０°Ｃ／１０分に加熱して潜在的な残留酵素活性を不活性化することにより、反応を停止した。試料を９６ウェル試料プレートに移し、その後、ＢｉＯｐｔｉｘ機器のオートサンプラー（１０°Ｃに維持）に装填した。
【０１４９】
結果
１０μＭ基質で活性が増強された合計５８の個々の変異体（野生型ＮｉｃＡ２の公表されたＫｍの１００倍の濃度、野生型よりも増強されたｋｃａｔを反映）を用いて、新規の二次スクリーニングアッセイを設計し、喫煙者の血中に見られるより低いニコチン濃度でも活性が改善された（例えば、２５０ｎＭ、典型的な１日の最大値）これらの変異体を効率的に同定した。完全な精製および定量化を必要とせずに変異体の効率的かつ正確なスクリーニングを可能にする自動ニコチンバイオセンサーアッセイを、本明細書で簡単に記載されるように実施した。図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、センサーチップ上に固定化されたニコチン特異的ｍＡｂによって、定常状態でのＳＰＲ信号（応答単位、ＲＵで表される）が、チップ表面上を通過した緩衝液中のニコチン濃度に比例する応答曲線が与えられ得る。このアッセイにより、この特定の抗体（ＡＴＩ−１１１９）の緩衝液中の未知のニコチンレベルを１桁のｎＭから１μＭの範囲で定量することが可能になり、Ｓ−（−）−ニコチンのＫＤは６６ｎＭであった。簡単に言うと、図１２Ａは、一定範囲のニコチン濃度にわたって固定化された抗ニコチン抗体でセンサー表面上を通過した（示されるように、３回）泳動用緩衝液中のＳ−（−）−ニコチンの３倍段階希釈のセンサーグラムを示す。定常状態レベルの結合が達成された後、ニコチンを含まない泳動用緩衝液をチップ上に通過させて（ｔ＝２４０秒から開始）、ｍＡｂからニコチンを解離させた。図１２Ｂは、定常状態（パネルＣの実験から）でのセンサー応答ユニット（ＲＵ）対Ｓ−（−）−ニコチン濃度のプロットを示す。
【０１５０】
残留ニコチン濃度を酵素とのインキュベーション時間の関数として測定できるアッセイが考案された。簡単に言うと、図１３Ａ〜Ｃは、喫煙者に見られるニコチン濃度でのこれらの二次酵素スクリーニングアッセイの結果および精製された酵素変異体の活性を示す。図１３Ａは、Ｈｉｓタグ付き野生型ＮｉｃＡ２酵素（丸）または変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒ（四角）がアッセイウェルで抗ＨｉｓタグｍＡｂによって大腸菌溶解物から捕捉されたことを示す。２５０ｎＭのＳ−ニコチンを含有する緩衝液を添加し、試料を回収し、示された時点で熱を不活性化した。試料はバイオセンサー機器で実行され、応答単位は時間の関数としてプロットされた。図１３Ａに見られるように、野生型ＮｉｃＡ２の溶解物について、経時的なＲＵの減少が観察された。一次スクリーニングアッセイで最良の変異体であるＡ１０７Ｒからの溶解物の場合、ニコチン分解の速度は、野生型よりも実質的に速かった。完全に精製されたタンパク質を使用して血清中でデータが再現されることを確認するために、血清中でニコチン濃度を低減する野生型および改善された変異体の能力を、高感度かつ定量的なガスクロマトグラフィー（ＧＣ）アッセイを使用して比較した。ＧＣアッセイは、スループットが低く、すべての初期ヒットをスクリーニングするのに時間がかかるため、この最終のインビトロアッセイ工程でのみ使用された。図１３Ｂは、精製酵素または変異体ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒが、４０ｎｇ／ｍＬのＳ−（−）−ニコチンを含有するラット血清に添加され、試料が回収され、示された時点でＭｅＯＨ添加によって活性がクエンチされたことを示す。残留ニコチン濃度をＧＣで測定した。図１３Ｂに見られるように、最も高い活性変異体であるＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒでは、喫煙者に見られるニコチン濃度の血清中で、野生型ＮｉｃＡ２と比較してニコチン分解活性が増加している。この増強された活性によって、バイオセンサーアッセイの結果が再現され確認された。
【０１５１】
二次アッセイを実施して検証して、野生型ＮｉｃＡ２と比較して一次スクリーニングアッセイで少なくとも２倍の活性が増加したすべての変異体を、ＳＰＲアッセイでより低いニコチン濃度で試験し、変異体Ｆ１０４Ｔ、Ｉ、Ｒ、およびＳ、Ｇ１０６Ａ、Ａ１０７Ｒ、Ｔ、Ｇ、Ｆ３５５ＨおよびＡ４２６Ｃは、野生型よりも改善されていることがわかった。その後、これらを精製し、血清／ＧＣアッセイで試験した。図１３Ｃは、血清中の４０ｎｇ／ｍＬニコチンでの野生型ＮｉｃＡ２に対する１０の変異体の増強された活性を示す。各精製変異体（１．５μｇ／ｍＬ）を４０ｎｇ／ｍＬニコチンを含有するラット血清に３７°Ｃで添加し、様々な時点でメタノールで活性をクエンチした。白抜きの記号は、このアッセイで３倍を超える野生型と比較した活性の増加を示す。ニコチン濃度をＧＣで測定した。図１３Ｃに示されるように、これらの変異体は実際に血清中でも改善された。
【０１５２】
図１３Ｃ（表２）のデータのシミュレーションは、少なくとも１つの変異体（Ａ１０７Ｒ）について、増強されたｋｃａｔがＫＭ（最大触媒速度、Ｖｍａｘの５０％を達成するために必要な酵素濃度）の増加という代償を伴うことを示唆する。低ニコチンプログレス曲線の動力学的モデリングの検証として、我々は、野生型ＮｉｃＡ２が、前の報告とほぼ一致する６．４ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１の見掛けのｋｃａｔ／ＫＭを見出した。図１３Ｃに示される変異体は、野生型ＮｉｃＡ２よりも１．７倍（Ｇ１０６Ａ）〜３倍（Ａ１０７Ｒ）高いの範囲の改善されたｋｃａｔ／ＫＭ値を示した（表２）。シミュレーションはさらに、野生型ＮｉｃＡ２と比較して、Ａ１０７Ｒのみが有意に増加したＫＭ（８３０ｎＭ）を示したことを示唆し、これは、広範囲のニコチン濃度（データは示さず）にわたってこの変異体で実行された定常状態の動力学的分析とほぼに一致する値である。
【表４】
2021532761.tif 000020
【０１５３】
見掛けのｋｃａｔ／ＫＭ値を、ミカエリス−メンテン式（ｖ０／［Ｅ］＝ｋｃａｔ／ＫＭ＊［Ｓ］）の形式を使用して低ニコチンアッセイ結果（図１３Ｃ）を使用して計算して、見掛けのｋｃａｔ値を導くために、単純な動力学的モデル（ＫｉｎＴｅｋ）に適合させたプログレス曲線を構築する。得られたｋｃａｔ／ＫＭおよびｋｃａｔ値を使用して、見掛けのＫＭ値を計算した。
【０１５４】
実施例６−Ａ１０７Ｒ変異体の改善されたインビボ活性
ラットのニコチン分布研究
体重がそれぞれ約３００ｇと２５０ｇのオスとメスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、頸静脈カテーテルを装着した状態で購入した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）。８匹のラットの３つの群（１群当たり４匹のオス＋４匹のメス）を、０．６２５ｍｇ／ｋｇの用量で、カテーテルを介してウシ血清アルブミン、野生型ＮｉｃＡ２、またはＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒで前処理した。少なくとも５分後、各群は０．０３ｍｇ／ｋｇのニコチンを静脈内で受けた。ニコチン用量の３分後にラットを屠殺した。血液および脳の試料は、前述のように断頭およびメタノールでのクエンチによって得た。血液または脳のニコチン濃度を、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いた一元配置分散分析によって比較した。
【０１５５】
畜産
研究群毎に同数の年齢を一致させたオスとメスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＨＬＡ遺伝子組み換えマウスを使用した。手術的矯正を施した研究動物を、使い捨てのマイクロアイソレーターケージ（Ｉｎｎｏｖｉｖｅ）に個別に収容した。環境制御は、６４〜７９°Ｆの温度範囲、３０〜７０％の相対湿度範囲、１０回以上の換気／時間、および１２時間の明期／１２時間の暗期サイクルの条件を維持するように設定された。食料および水は自由に入手可能であった。動物福祉は、実験動物の管理と使用に関するＮＩＨガイド（第８版）に従い、すべてのプロトコルは、ノーブルライフサイエンス（ＮＬＳ）の動物実験委員会によって承認された。ＮＬＳは、ＡＡＡＬＡＣｉ認定およびＵＳＤＡライセンス（５１−１２−００９２）およびＯＬＡＷ保証（Ａ４６３３−０１）の施設である。動物からの採血は、イソフルラン麻酔下で行われ、動物の苦痛を最小限に抑えるために必要な措置が講じられた。研究動物は、ＡＶＭＡガイドラインと一致するイソフルラン麻酔下での開胸による終末採血後に安楽死させた。
【０１５６】
結果
以前のアッセイで示されたインビトロ有効性の増強がインビボ有効性の増強にも変換されることを確実にするために、血液および脳へのニコチン分布に対する０．６２５ｍｇ／ｋｇの野生型ＮｉｃＡ２またはＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒのいずれかの投薬の効果を試験した。群当たり８匹のラットに酵素またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、対照）を事前投薬し、１０分後に１０秒未満で送達される静脈内ボーラス注射によって０．０３ｍｇ／ｋｇのニコチン用量を与えた（ｍｇ／ｋｇベースでヒトにおける２本のタバコに相当するニコチン用量）。３分後、血液および脳を単離し、前述のように酵素活性を直ちにクエンチし、ガスクロマトグラフィーを使用してニコチン含有量について試料を分析した（図１４）。ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒは、対照（１８．８±３．３ｎｇ／ｍＬ）と比較して、ニコチン血中濃度を、３．２５±１．５ｎｇ／ｍＬ対野生型ＮｉｃＡ２の１３．６±３．１ｎｇ／ｍＬに低下させた（ｐ＜０．０００１、Ａ１０７Ｒを野生型ＮｉｃＡ２を比較したボンフェローニ補正を用いた一元配置分散分析）またはそれぞれ８３％対２７％低減した０．６２５ｍｇ／ｋｇの用量では、脳内ニコチンレベルは部分的にしか低減せず、２０ｍｇ／ｋｇの野生型ＮｉｃＡ２が投薬された場合の９５％の低減と比較して、ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒでは３５％、野生型ＮｉｃＡ２では１３％であった（ｐ＝０．０２）。これらのデータは、ＮｉｃＡ２Ａ１０７Ｒがこれらの条件下でインビボで野生型ＮｉｃＡ２よりも約３倍強力であることを示唆する。
【０１５７】
（ｉ）Ａ１０７Ｒ突然変異およびＦ３５５Ｈ変異（配列番号３４）ならびに（ｉｉ）Ａ１０７Ｒ、Ｆ１０４Ｉ、およびＡ４２６Ｃ突然変異（配列番号３５）を含む組み合わせ変異体を使用して、同じ血清ベースの分析を行った。この分析の結果を図１４に示す。
【０１５８】
実施例７−パイロット慢性毒性試験は、ニコチンの存在下でのＮｉｃＡ２が十分に忍容性があることを示す。
ニコチンの存在下でのＮｉｃＡ２の毒性試験
この研究の目的は、２０ｍｇ／ｋｇのＮｉｃＡ２−ＡＢＤ（酵素がアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）に接合している長時間作用型のＮｉｃＡ２）の７つの固定静脈内用量の反復用量忍容性を評価することであり、ラットモデルを使用して２８日間連続して静脈内に与えられた１ｍｇ／ｋｇ／日のニコチンの存在下で４日毎に１回（合計１４０ｍｇ／ｋｇ）投薬した。ラットのニコチン−ＰＫ研究で脳内ニコチンレベルを９５％低減させるには２０ｍｇ／ｋｇで十分であり、薬剤供給が限られていたため、この用量を選択した。
【０１５９】
２０匹のメスおよび２０匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２２５〜３００グラム）を１６匹の動物からなる２つの群と８匹の動物からなる１つの群とに分けた。研究期間を通して、ニコチンまたはビヒクルの連続用量を送達する浸透圧ポンプが動物に移植された。ＮｉｃＡ２−ＡＢＤ（４日毎）を静脈内注射によって送達した。利用可能な薬剤供給が限られているため、１６匹の動物が生理食塩水を受け、１６匹の動物がニコチンのみを受け、８匹の動物のみがＮｉｃＡ２−ＡＢＤを受けた。
【０１６０】
すべての動物は、注射に関連する行動変化、注射部位反応を伴わずに全用量（静脈内７ｘ２０ｍｇ／ｋｇ）を受け、どの動物にも死亡は誘発されなかった。毎日の臨床観察では、どの群でも摂食や毛づくろいの観察可能な行動の変化または修正は見られなかった。体重は試験期間中週に２回モニタリングされ、治療群間に有意差は見られなかった。研究２８日目に、血液を採取し、血液学、血清化学、および凝固について分析した。ＮｉｃＡ２−ＡＢＤの血中レベルを分析するために、血漿の追加のアリコートを採取した。採血後、動物をイソフルランで麻酔下に置き、開胸により屠殺した。
【０１６１】
毒性の評価は、２８日間の研究中の死亡率、臨床観察、および体重に基づき、研究の終了時に、臓器重量、肉眼的解剖学的病理学、血液学、血清臨床化学、および凝固に基づいた。
【０１６２】
研究の終了時に動物を剖検し、どの動物にも肉眼的病理所見は認められなかった。主要な臓器（肝臓、肺、脾臓、心臓、腎臓、精巣、または卵巣）を単離して秤量した。これらの組織では肉眼的病理所見は認められず、臓器重量の統計的に有意な変化は見られなかった（腎臓、精巣、および卵巣を一対として秤量）。血液を採取し、血液パラメータの任意の変化を判定するために全血球計算を行った。時折、動物は正常範囲外の値（リンパ球またはヘモグロビンのわずかな減少など）を示したが、どの群でも有意な変化または傾向は見られなかった。ニコチンのみを受けた対照動物のいくつかには、わずかな多染症を有する傾向があった。２３個の異なる検体の血清臨床化学および血漿凝固測定では、治療群間で顕著な変化は見られなかった。
【０１６３】
心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、骨格筋、脳、結腸、胃、卵巣、および精巣の組織の組織病理学的評価を行った。組織を、ホルマリンで直ちに固定し、パラフィンで包埋し、Ｈ＆Ｅで染色し、獣医病理学者が精査した。組織病理学的検査では、検査したどの組織にも病変に関連する試験物は見られなかった。組織を、免疫組織病理学的反応の任意の証拠について具体的に検査し、試験された２０ｍｇ／ｍＬの用量では何も観察されなかった。
【０１６４】
ヒトＨＬＡ−ＤＲ４マウスモデルにおける免疫原性の可能性の評価
ヒトＤＲ４遺伝子組み換えマウスにおけるフロイント不完全アジュバントにおける皮下（ｓ．ｃ．）注射の１０日後のＮｉｃＡ２特異的抗体力価の低減（Ｎ＝６、３Ｍ＋３Ｆ、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）について研究した。このマウスモデルは、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡおよびＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１（ＤＲ４スーパータイプの代表）の抗原結合ドメインを有するハイブリッドＭＨＣクラスＩＩ分子を保有し、内因性マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない。力価を、ＮｉｃＡ２コーティングプレートを使用したＥＬＩＳＡにおいてＯＤ４５０＝０．５を達成するための血清希釈度として定義し、ヤギα−マウスＩｇＧ−γ−ＨＲＰによって検出した。試験された最低血清希釈度は５０倍であった（検出限界（ＬＯＤ））。ＮｉｃＡ２−ＰＥＧ１、−ＰＥＧ２、およびＰＥＧ３の力価を、クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較検定を使用した一元配置分散分析を使用して非ＰＥＧ化ＮｉｃＡ２と比較した。
【０１６５】
ヒトＴ細胞におけるＴ細胞刺激およびＩＦＮ−γ分泌アッセイ
研究開始前に、地域研究倫理委員会（ＬＲＥＣ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＵＫ）の承認が与えられた。末梢血（６０ｍＬ）を、書面によるインフォームドコンセントを受けた後、健康なボランティア（ｎ＝５）から得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（商標）、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離し、次に、ＣＤ１４＋単球の正の選択に使用した。ＣＤ１４−画分を採取し、自己リンパ球の供給源として使用した。単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を、前述のように生成した。Ｔ細胞増殖アッセイを、試験化合物を自己ＭｏＤＣとインキュベートし、次に自己Ｔ細胞による５日間の活性化によって実行した。各試料をトリプレットウェルに設置した。野生型ＮｉｃＡ２およびＮｉｃＡ２−ＰＥＧ２の両方を、２４μｇ／ｍＬ、２．４μｇ／ｍＬ、および０．２４μｇ／ｍＬで試験した。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、５μｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用した。ベースライン増殖を判定するために、未治療のＭｏＤＣを自己リンパ球と共培養した。上清を、５日目に［３Ｈ］チミジンの添加前にＩＦＮ−γ分析のために採取した。
【０１６６】
Ｔ細胞増殖は、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを１分当たりのカウント数（ｃｐｍ）で測定した。試験試料について得られたｃｐｍ値をベースラインｃｐｍ値で割ることにより、Ｔ細胞増殖の刺激指数（ＳＩ）を計算することによって分析を実行した。ＩＦＮ−γレベル（ｐｇ／ｍＬ）の倍増（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙキット薬物、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを使用したフローサイトメトリーで測定）を、各薬剤で治療した細胞の値をベースライン値で割ることによって計算した。３倍の増加のカットオフ値は、肯定的な応答であると考えられた。クラスカル−ウォリス検定およびダンの多重比較検定を使用した一元配置分散分析を使用して、統計分析を実行した。
【０１６７】
結果
ニコチンの存在下でのＮｉｃＡ２の安全性を評価するために、持続性注入ポンプを介した１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのニコチンに加えて、２０ｍｇ／ｋｇのＮｉｃＡ２−ＡＢＤを４日毎に静脈内注射により投薬してラットに２８日間の反復用量毒性研究を行った（ｍｇ／ｋｇベースで１日当たりタバコ３０本を超えるニコチンに相当）。生理食塩水またはニコチンのみの２つの対照群が含まれた。長時間作用型のＮｉｃＡ２−ＡＢＤは、投薬頻度および必要な物質の量を大幅に低減することにより、この研究を可能にした。ＮｉｃＡ２−ＡＢＤの循環半減期は、６１時間である。研究終了時のＮｉｃＡ２−ＡＢＤの血清レベルは、平均８１μｇ／ｍＬであった。ＮｉｃＡ２−ＡＢＤは忍容性が高く、血液学、血清臨床化学の評価、ならびに肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓、脳、骨格筋、胃、結腸、および卵巣または精巣の組織病理学的検査を含む、治療群における病変は観察されなかった。
【０１６８】
実施例８−ニコチン嗜癖の治療および／または禁煙の促進
この実施例は、本明細書に記載される変異体を使用して、ヒト成人におけるニコチン嗜癖を治療する方法および／または禁煙を促進する方法を例示する。
【０１６９】
タバコを定期的に喫煙するが中止したい成人のヒト対象に、ニコチン分解酵素変異体（例えば、配列番号５〜２８、またはその長時間作用型）を含む治療有効量の薬学的組成物を経口投与するか、または静脈内もしくは皮下注射によって投与する。対象は、血漿中を循環するニコチンレベル、ならびに頭痛、過敏性、不安、および不眠などのニコチン離脱に関連する徴候および症状の存在および／または重症度、ならびに所与の日に喫煙したタバコの数について評価される。対象は、血漿中を循環するニコチンレベルが標的（減少）レベルに到達するまで、および／またはニコチン離脱の１つ以上の徴候／症状が軽減、改善、もしくは排除されるまで、および／または対象がニコチン製品の消費レベルを低下させるまで（例えば、１日当たりのタバコの喫煙量を減らす）、ならびに／または対象がニコチン製品の消費を中止するまで（例えば、喫煙をやめる）、反復投与で治療される。
【０１７０】
実施例９−ニコチン分解酵素変異体による小児患者の治療
この実施例は、小児患者におけるニコチン中毒の治療においてニコチン分解酵素変異体を使用する方法を例示する。
【０１７１】
ニコチンを摂取したことがある、またはその疑いがあることが知られている子供に、ニコチン分解酵素変異体を含む治療有効量の薬学的組成物を、静脈内、筋肉内、または皮下注射によって投与する。子供は、発作、昏睡、息切れ、および心拍数の上昇を含むがこれらに限定されない、ニコチン中毒に関連する徴候および症状の存在および／または重症度について評価され、子供は、１つ以上の徴候／症状が軽減、改善、または排除されるまで治療される。任意選択的に、徴候／症状が持続する場合、および／またはニコチンの血漿／脳内レベルが上昇したままである場合は、別の用量の薬学的組成物を投与する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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