(57)【要約】  本開示は、脂質成分とＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子に関する。本開示の態様は、さらに、対象における創傷治癒を向上させるための、脂質成分とＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子の使用に関する。【選択図】  図３
2021508434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）構造
【化１】
2021508434.tif 000017
を有する化合物を含む脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３〜５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含むナノ粒子。
【請求項２】
前記脂質成分が、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記リン脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミサクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される；及び／又は
前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される；及び／又は
前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、
請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記脂質成分が、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＰＥＧ−ＤＭＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記Ｎ：Ｐ比が、約２：１から約３０：１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記Ｎ：Ｐ比が、約５．６７：１である、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記Ｎ：Ｐ比が、約３：１である、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記脂質成分と前記改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１から約１００：１である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記脂質成分と前記改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約２０：１である、請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記脂質成分と前記改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１である、請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
約５０ｎｍから１００ｎｍの平均直径を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
（ａ）（ｉ）構造
【化２】
2021508434.tif 000018
を有する化合物を含む脂質成分と、（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３〜５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡとを含む少なくとも１種のナノ粒子；と
（ｂ）薬学的に許容し得る賦形剤と
を含む医薬組成物。
【請求項１３】
前記脂質成分が、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記リン脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミサクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される；
前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される；及び／又は
前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、
請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記脂質成分が、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＰＥＧ−ＤＭＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記Ｎ：Ｐ比が、約２：１から約３０：１である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記Ｎ：Ｐ比が、約５．６７：１である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記Ｎ：Ｐ比が、約３：１である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記脂質成分と前記改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１から約１００：１である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記脂質成分と前記改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約２０：１である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記脂質成分と前記改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ナノ粒子が、約５０ｎｍから１００ｎｍの平均直径を有する、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
哺乳類組織又は対象に投与された場合に、最大約４５０ｐｇ／ｍｌ（血漿）又はｐｇ／ｍｇ（組織）の、配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの観察される最大の血漿及び／又は組織濃度Ｃｍａｘをもたらす、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
哺乳類組織又は対象に投与された場合に、最大約５，５００ｐｇ＊ｈ／ｍｌ（血漿）又はｐｇ＊ｈ／ｍｇ（組織）の、配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの血漿及び／又は組織の曲線下総面積ＡＵＣ０−ｔをもたらす、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
哺乳類組織又は対象に投与された場合に、８時間以内の約４００ｐｇ／ｍｇ（組織）超の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生をもたらす、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
哺乳類組織又は対象に投与された場合に、最大６日間の約１ｐｇ／ｍｇ（組織）超の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生をもたらす、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記薬学的に許容し得る賦形剤が、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びそれらの混合物から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
対象における創傷治癒を促進する及び／又は向上させるための方法であって、有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項１２〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項２９】
前記ナノ粒子の脂質成分が、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記リン脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２コレステリルヘミサクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される；
前記構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される；及び／又は
前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記脂質成分が、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＰＥＧ−ＤＭＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ナノ粒子のＮ：Ｐ比が、約２：１から約３０：１である、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ナノ粒子のＮ：Ｐ比が、約５．６７：１である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ナノ粒子のＮ：Ｐ比が、約３：１である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記脂質成分と前記改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１から約１００：１である、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記脂質成分と前記改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約２０：１である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記脂質成分と前記改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ナノ粒子が、約７０ｎｍから約８０ｎｍの平均直径を有する、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ナノ粒子が、約７２ｎｍの平均直径を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記投与が、最大約４５０ｐｇ／ｍｌ（血漿）又はｐｇ／ｍｇ（組織）の、配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの観察される最大の血漿及び／又は組織濃度Ｃｍａｘをもたらす、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記投与が、最大約５，５００ｐｇ＊ｈ／ｍｌ（血漿）又はｐｇ＊ｈ／ｍｇ（組織）の、配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの血漿及び／又は組織の曲線下総面積ＡＵＣ０−ｔをもたらす、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記投与が、８時間以内の約４００ｐｇ／ｍｇ（組織）超の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生をもたらす、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記投与が、最大６日間の約１ｐｇ／ｍｇ（組織）超の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生をもたらす、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ナノ粒子又は前記医薬組成物が、皮内投与される、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記改変ＲＮＡの濃度が、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記投与が、クエン酸生理食塩水緩衝液中の改変ＲＮＡの投与と比較した場合に、約５から約１００倍の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生の増大をもたらす、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記対象が、糖尿病を患っている、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記創傷が、手術創、熱傷、擦過傷、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷（例えば、外傷性損傷の創傷）、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍）、褥瘡、床ずれ、及びそれらの組み合わせである、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記医薬組成物が、薬学的に許容し得る賦形剤、好ましくは、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びそれらの混合物を含む、請求項２８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳類組織又は対象における血管新生を誘導するための方法であって、有効量の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項１２〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、前記哺乳類組織又は対象に投与することを含む方法。
【請求項５１】
哺乳類組織又は対象における血管形成を誘導するための方法であって、有効量の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項１２〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、前記哺乳類組織又は対象に投与することを含む方法。
【請求項５２】
哺乳類組織又は対象における毛細血管及び／又は細動脈密度を増大させるための方法であって、有効量の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項１２〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を、前記哺乳類組織又は対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／５７９，６７１号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
２．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、且つ、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。２０１８年１０月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０９９６３＿００９２−００３０４＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１１，３９６バイトである。
【０００３】
３．分野
本開示は、脂質成分とＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子に関する。本開示の態様は、さらに、対象における創傷治癒を向上させるための、脂質成分とＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．背景
血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）経路は、損傷を受けた組織の血行再建、血管透過性を向上させること及び新しい血管の形成（血管形成）を含めた創傷治癒過程における中心的役割を果たす。対象における創傷治癒を向上させることなどの治療効果の可能性のためにＶＥＧＦ−Ａ経路を増強するための薬剤を与えることは、難しいままである。
【０００５】
標的組織におけるＶＥＧＦ−Ａタンパク質を増大させるための臨床的に扱いやすい手法を可能にするための、多くの多様な方法が試みられている。しかし、これらの手法はそれぞれ、重大な欠点を有する。例えば、全身的ＶＥＧＦ−Ａタンパク質送達は、重大な低血圧をもたらす可能性があり、且つＶＥＧＦ−Ａは急速に分解される。ウイルスカプセル化及びネイキッドＶＥＧＦ−Ａ  ＤＮＡプラスミドは、タンパク質発現の時間的制御が限定的であり、且つインビボ発現の効率は、非常に様々且つ非用量依存性であり得る。結果として、これらの制約が、治療薬としてＶＥＧＦ−Ａレベルを増強する適用可能性を制限している。
【０００６】
別の最近の発展は、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質をコードする治療用ＲＮＡを送達することである。しかし、天然のＲＮＡの細胞への送達は、こうしたＲＮＡ分子の相対的不安定性及び低細胞透過性に起因して、難しい可能性がある。また、天然のＲＮＡは、免疫活性化を誘発する可能性があり（例えば、Ｋａｃｚｍａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｆｒｏｍ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅａｌｉｔｙ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．，２０１７，９：６０を参照のこと）、これによって、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質を標的組織に送達するための天然のＲＮＡの使用が制限される。
【０００７】
したがって、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質をコードするＲＮＡの有効且つ安全な送達を可能にする組成物の必要性が、依然として存在する。さらに、対象における創傷治癒を向上させることなどの治療効果の可能性のためにＶＥＧＦ−Ａ経路を増強するための代替方法の必要性が、依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
５．概要
本開示は、脂質成分とＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子に関する。本開示の態様は、さらに、対象における創傷治癒を向上させるための、脂質成分とＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子の使用に関する。
【０００９】
本開示のある種の実施態様を、以下の段落にまとめて示す。このリストは、例示的に過ぎず、この開示によって提供される実施態様のすべてを網羅しない。
【００１０】
実施形態１．（ｉ）構造
【化１】
2021508434.tif 000003
を有する化合物を含む脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３〜５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含むナノ粒子。
【００１１】
実施形態２．脂質成分が、リン脂質、構造脂質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｌｉｐｉｄ）、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１のナノ粒子。
【００１２】
実施形態３．リン脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミサクシノイル（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される；
構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される；及び／又は
ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、
実施形態２のナノ粒子。
【００１３】
実施形態４．脂質成分が、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＰＥＧ−ＤＭＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１のナノ粒子。
【００１４】
実施形態５．Ｎ：Ｐ比が、約２：１から約３０：１である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のナノ粒子。
【００１５】
実施形態６．Ｎ：Ｐ比が、約５．６７：１である、実施形態５のナノ粒子。
【００１６】
実施形態７．Ｎ：Ｐ比が、約３：１である、実施形態５のナノ粒子。
【００１７】
実施形態８．脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１から約１００：１である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のナノ粒子。
【００１８】
実施形態９．脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約２０：１である、実施形態８のナノ粒子。
【００１９】
実施形態１０．脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１である、実施形態８のナノ粒子。
【００２０】
実施形態１１．約５０ｎｍから１００ｎｍの平均直径を有する、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のナノ粒子。
【００２１】
実施形態１２．（ａ）（ｉ）構造
【化２】
2021508434.tif 000004
を有する化合物を含む脂質成分と、（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３〜５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡとを含む少なくとも１種のナノ粒子；と
（ｂ）薬学的に許容し得る賦形剤と
を含む医薬組成物。
【００２２】
実施形態１３．脂質成分が、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１２の医薬組成物。
【００２３】
実施形態１４．リン脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミサクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される；
構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される；及び／又は
ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、
実施形態１３の医薬組成物。
【００２４】
実施形態１５．脂質成分が、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＰＥＧ−ＤＭＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１２の医薬組成物。
【００２５】
実施形態１６．Ｎ：Ｐ比が、約２：１から約３０：１である、実施形態１２〜１５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００２６】
実施形態１７．Ｎ：Ｐ比が、約５．６７：１である、実施形態１６の医薬組成物。
【００２７】
実施形態１８．Ｎ：Ｐ比が、約３：１である、実施形態１６の医薬組成物。
【００２８】
実施形態１９．脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１から約１００：１である、実施形態１２〜１８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００２９】
実施形態２０．脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約２０：１である、実施形態１９の医薬組成物。
【００３０】
実施形態２１．脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１である、実施形態１９の医薬組成物。
【００３１】
実施形態２２．ナノ粒子が、約５０ｎｍから１００ｎｍの平均直径を有する、実施形態１２〜２１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００３２】
実施形態２３．哺乳類組織又は対象に投与された場合に、最大約４５０ｐｇ／ｍｌ（血漿）又はｐｇ／ｍｇ（組織）の、配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの観察される最大の血漿及び／又は組織濃度Ｃｍａｘをもたらす、実施形態１２〜２２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００３３】
実施形態２４．哺乳類組織又は対象に投与された場合に、最大約５，５００ｐｇ＊ｈ／ｍｌ（血漿）又はｐｇ＊ｈ／ｍｇ（組織）の、配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの血漿及び／又は組織の曲線下総面積ＡＵＣ０−ｔをもたらす、実施形態１２〜２２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００３４】
実施形態２５．哺乳類組織又は対象に投与された場合に、８時間以内の約４００ｐｇ／ｍｇ（組織）超の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生をもたらす、実施形態１２〜２２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００３５】
実施形態２６．哺乳類組織又は対象に投与された場合に、最大６日間の約１ｐｇ／ｍｇ（組織）超の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生をもたらす、実施形態１２〜２２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【００３６】
実施形態２７．薬学的に許容し得る賦形剤が、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びそれらの混合物から選択される、実施形態１２の医薬組成物。
【００３７】
実施形態２８．対象における創傷治癒を促進する及び／又は向上させるための方法であって、有効量の実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のナノ粒子又は実施形態１２〜２７のいずれか１つに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
【００３８】
実施形態２９．ナノ粒子の脂質成分が、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態２８の方法。
【００３９】
実施形態３０．リン脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２コレステリルヘミサクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される；
構造脂質が、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される；及び／又は
ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、
実施形態２９の方法。
【００４０】
実施形態３１．脂質成分が、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＰＥＧ−ＤＭＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態２８の方法。
【００４１】
実施形態３２．ナノ粒子のＮ：Ｐ比が、約２：１から約３０：１である、実施形態２８〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【００４２】
実施形態３３．ナノ粒子のＮ：Ｐ比が、約５．６７：１である、実施形態３２の方法。
【００４３】
実施形態３４．ナノ粒子のＮ：Ｐ比が、約３：１である、実施形態３２の方法。
【００４４】
実施形態３５．脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１から約１００：１である、実施形態２８〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【００４５】
実施形態３６．脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約２０：１である、実施形態３５の方法。
【００４６】
実施形態３７．脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比が、約１０：１である、実施形態３５の方法。
【００４７】
実施形態３８．ナノ粒子が、約７０ｎｍから約８０ｎｍの平均直径を有する、実施形態２８〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【００４８】
実施形態３９．ナノ粒子が、約７２ｎｍの平均直径を有する、実施形態３８の方法。
【００４９】
実施形態４０．投与が、最大約４５０ｐｇ／ｍｌ（血漿）又はｐｇ／ｍｇ（組織）の、配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの観察される最大の血漿及び／又は組織濃度Ｃｍａｘをもたらす、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５０】
実施形態４１．投与が、最大約５，５００ｐｇ＊ｈ／ｍｌ（血漿）又はｐｇ＊ｈ／ｍｇ（組織）の、配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの血漿及び／又は組織の曲線下総面積ＡＵＣ０−ｔをもたらす、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５１】
実施形態４２．投与が、８時間以内の約４００ｐｇ／ｍｇ（組織）超の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生をもたらす、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５２】
実施形態４３．投与が、最大６日間の約１ｐｇ／ｍｇ（組織）超の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生をもたらす、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５３】
実施形態４４．ナノ粒子又は医薬組成物が、皮内投与される、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５４】
実施形態４５．改変ＲＮＡの濃度が、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇである、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５５】
実施形態４６．投与が、クエン酸生理食塩水緩衝液中の改変ＲＮＡの投与と比較した場合に、約５から約１００倍の配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの産生の増大をもたらす、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５６】
実施形態４７．対象が、糖尿病を患っている、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５７】
実施形態４８．創傷が、手術創、熱傷、擦過傷（ａｂｒａｓｉｖｅ  ｗｏｕｎｄ）、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷（例えば、外傷性損傷の創傷）、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍）、褥瘡、床ずれ、及びそれらの組み合わせである、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５８】
実施形態４９．医薬組成物が、薬学的に許容し得る賦形剤、好ましくは、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びそれらの混合物を含む、実施形態２８〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【００５９】
実施形態５０．哺乳類組織又は対象における血管新生を誘導するための方法であって、有効量の、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のナノ粒子又は実施形態１２〜２７のいずれか１つに記載の医薬組成物を、哺乳類組織又は対象に投与することを含む方法。
【００６０】
実施形態５１．哺乳類組織又は対象における血管形成を誘導するための方法であって、有効量の、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のナノ粒子又は実施形態１２〜２７のいずれか１つに記載の医薬組成物を、哺乳類組織又は対象に投与することを含む方法。
【００６１】
実施形態５２．哺乳類組織又は対象における毛細血管及び／又は細動脈密度を増大させるための方法であって、有効量の、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のナノ粒子又は実施形態１２〜２７のいずれか１つに記載の医薬組成物を、哺乳類組織又は対象に投与することを含む方法。
【００６２】
６．図面の説明
当分野の技術者は、以下に記載される図面が、例示目的にすぎないことを理解するであろう。これらの図面は、本発明の教示の範囲を制限することを決して意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】実施例で使用される脂質化合物（化合物Ａ）を示す。
【図２】改変されたＶＥＧＦ−Ａ  ＲＮＡ構築物の構造の図（図２Ａ）及び典型的なＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの配列（配列番号１、図２Ｂ）。
【図３】それぞれ、クエン酸生理食塩水中に配合された１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（三角形、破線）及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に配合された３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（円、実線）の皮内注射の１４４時間後までの時間の関数としての、皮膚生検材料中のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質含有量。線は、各時点での中央値を表す。
【図４】それぞれ、クエン酸生理食塩水中に配合された１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（三角形、破線）及びＬＮＰ中に配合された３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（円、実線）の皮内注射の４８時間後までの時間の関数としての、皮膚生検材料中のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質含有量。線は、各時点での中央値を表す。
【図５】次の組成物：（１）１μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物（ｎ＝６）、（２）３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（ｎ＝６）を含む脂質ナノ粒子組成物、（３）３μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ  ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物（ｎ＝６）、及び（４）１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含むクエン酸生理食塩水組成物（ｎ＝７）の皮内注射の後の創傷治癒（パーセント）。
【図６】次の組成物：（１）３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物（ｎ＝５）、（２）３μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物（ｎ＝５）、及び（３）いずれの改変ＲＮＡも含まないクエン酸生理食塩水組成物（ｎ＝５）の皮内注射の後の創傷治癒（パーセント）。
【図７】次の組成物：（１）３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物（ｎ＝６）、（２）いずれの改変ＲＮＡも含まない脂質ナノ粒子組成物（ｎ＝５）、（３）３μｇ  ＧＦＰ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物（ｎ＝６）、及び（４）いずれの改変ＲＮＡも含まないクエン酸生理食塩水組成物（ｎ＝６）の皮内注射の後の創傷治癒（パーセント）。
【図８】次の組成物：（１）３μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物（ｎ＝７）、（２）１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含むクエン酸生理食塩水組成物（ｎ＝７）、（３）１００μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含むクエン酸生理食塩水組成物（ｎ＝７）、及び（４）いずれの改変ＲＮＡも含まないクエン酸生理食塩水組成物（ｎ＝７）の皮内注射の後の創傷治癒（パーセント）。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
７．詳細な説明
本開示にて言及したすべての参考文献の全体を、参照によって本明細書に組み込む。
【００６５】
前述の説明及び付随する図面において与えられる教示の利益を有する、本明細書で説明する本開示の多くの改変及び他の実施態様は、これらの開示が属する分野の技術者に思い浮かぶであろう。したがって、本開示は、開示される具体的実施態様に限定されるべきではないこと、また、改変及び他の実施態様が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることが理解されよう。本明細書では特定の用語が用いられるが、これらは、一般的且つ説明的な意味でのみ使用され、限定の目的では使用されない。
【００６６】
単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳＩ承認形で表示することができる。別に示されない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’方向に左から右に書かれ；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。数値範囲には、範囲を定義する数字が含まれる。本明細書の値の範囲の記述は、単に、範囲内にあるそれぞれ別の値を個々に言及する簡便表記方法としての役割を果たすことを意図するに過ぎない。本明細書において別に示されない限り、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。アミノ酸は、本明細書では、その一般に知られている３文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨されている１文字記号によって称することができる。ヌクレオチドも同様に、その一般に受け入れられている１文字コードによって称することができる。
【００６７】
７．１．定義
別に具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本開示が属する分野の技術者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。別に言及しない限り、本明細書で用いられる又は企図される技術は、当分野の技術者に周知の標準の方法論である。本開示の実施は、別に示されない限り、当分野の技術内である、微生物学、組織培養、分子生物学、化学、生化学、及び組換えＤＮＡ技術の従来の技術を用いることとなる。材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定ではない。以下のものは、例示の目的で示され、本開示の範囲を限定することを意図しない。
【００６８】
いくつかの実施態様では、本明細書（それに特許請求の範囲全体が組み込まれる）に記述する数値パラメータは、概数であり、特定の実施態様によって得られることが求められる所望される特性に応じて変動し得る。いくつかの実施態様では、数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして、また、通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本開示の広範にわたるいくつかの実施態様を記述する数値範囲及びパラメータは概数であるが、具体的な例において記述される数値は、可能な限り正確に報告される。本開示のいくつかの実施態様において示される数値は、そのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差に必然的に起因する、いくらかの誤差を含有する可能性がある。本明細書の値の範囲の記述は、単に、範囲内にあるそれぞれ別の値を個々に言及する簡便表記方法としての役割を果たすことを意図するに過ぎない。本明細書において別に示されない限り、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。
【００６９】
便宜のために、本出願全体（明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲を含む）において用いられるある種の用語を、ここに集める。別に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本開示が属する分野の技術者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本開示のある種の実施形態を説明及び主張するために使用される成分、特性、例えば分子量、反応条件、及び結果などの量を表す数は、場合によっては、用語「約」によって修飾されるものと理解するべきである。当業者は、それが修飾する値に照らして、用語「約」の意味を理解するであろう。いくつかの実施形態では、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために用いられている装置又は方法に対する平均値の標準偏差を含むことを示すために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書（それに特許請求の範囲全体が組み込まれる）に記述する数値パラメータは、概数であり、これは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望される特性に応じて変動し得る。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして、また、通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本開示の広範にわたるいくつかの実施形態を記述する数値範囲及びパラメータは概数であるが、具体的な例において記述される数値は、可能な限り正確に報告される。本開示のいくつかの実施形態において示される数値は、そのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差に必然的に起因する、いくらかの誤差を含有する可能性がある。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「投与すること」は、所望される部位又は組織位置でのナノ粒子及び／又は組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路による、ナノ粒子、及び／又は少なくとも１つのナノ粒子を含む医薬組成物の、哺乳類組織又は対象への配置を指す。いくつかの実施形態では、脂質成分と改変ＲＮＡとを含むナノ粒子は、皮内経路を介して投与することができる。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡによって発現される少なくとも１部分のタンパク質は、皮内経路を介して、所望される標的組織又は標的細胞位置に位置される。
【００７２】
用語「医薬組成物」は、治療的に活性な構成成分と、当技術分野で通常である薬学的に許容し得る担体又は賦形剤などの担体又は賦形剤とを含有する混合物を指す。例えば、本明細書で使用される医薬組成物は、通常、少なくとも１種の脂質成分、本開示に記載の改変ＲＮＡ、及び適切な賦形剤を含む。
【００７３】
用語「化合物」には、表された構造のすべての同位体及び異性体が含まれる。同位体は、原子番号は同じだが核内の異なる中性子数に起因して質量数が異なる原子を指す。例えば、水素の同位体には、トリチウム及び重水素が含まれる。さらに、本開示の化合物、塩、又は複合体は、溶媒又は水分子と組み合わせて調製して、通例の方法によって溶媒和物及び水和物を形成することができる。「異性体」は、化合物の、あらゆる幾何異性体、互変異性体、双性イオン、立体異性体、鏡像異性体、又はジアステレオマーを意味する。化合物は、１つ以上のキラル中心及び／又は二重結合を含むことができ、したがって、二重結合異性体又はジアステレオマーなどの立体異性体として存在することができる。本開示は、立体異性体的に（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）純粋な形態及び鏡像異性体及び立体異性体混合物、例えばラセミ体を含めた、本明細書に記載した化合物の、ありとあらゆる異性体を包含する。化合物の鏡像異性体及び立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ）混合物、及びこれらをその構成要素の鏡像異性体又は立体異性体に分割する手段は、当技術分野で周知である。
【００７４】
用語「含む」、「有する」、及び「含まれる」は、制約のない連結動詞である。これらの動詞の１つ以上のあらゆる形態又は時制、例えば、「含む（三人称単数現在形）」、「含むこと」、「有する（三人称単数現在形）」、「有すること」、「含まれる（三人称単数現在形）」、及び「〜を含めて」なども、制約がない。例えば、１つ以上のステップ「を含む（三人称単数現在形）」、「を有する（三人称単数現在形）」、又は「が含まれる（三人称単数現在形）」いずれかの方法は、それらの１つ以上のステップのみを有することに限定されず、他の列挙していないステップも包含することができる。同様に、１つ以上の特徴「を含む（三人称単数現在形）」、「を有する（三人称単数現在形）」、又は「が含まれる（三人称単数現在形）」いずれかの組成物は、それらの１つ以上の特徴のみを有することに限定されず、他の列挙していない特徴も包含することができる。ある種の実施態様に関して提供される、ありとあらゆる例、又は例示的な言葉（例えば「などの」）の使用は、本明細書では、本開示を、単に、より明らかにするためのものであり、別に主張される本開示の範囲に対する制限を与えない。本明細書中の言葉は、本開示の実施に不可欠であるものとしてのいずれかの主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００７５】
用語「本質的に〜からなる」は、主張される発明の「基本の及び新規の特性に実質的に影響を与えない」追加の材料又はステップの存在を可能にする。
【００７６】
用語「からなる」は、実施態様の説明において列挙されていないあらゆる要素を除外する、本明細書に記載した通りの組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素を指す。
【００７７】
用語「送達すること」は、実体を目的部位に提供することを意味する。例えば、治療薬を対象に送達することは、改変ＲＮＡを含む少なくとも１種のナノ粒子を含む医薬組成物を、（例えば皮内経路によって）対象に投与することを含むことができる。少なくとも１種のナノ粒子を含む医薬組成物の、哺乳類組織又は対象への投与は、１つ以上の細胞を医薬組成物と接触させることを含むことができる。
【００７８】
用語「疾患」又は「障害」は、本明細書では互換的に使用され、体の又はいくつかの器官の状態の、いずれかの変化、機能の実行の中断又は妨害、及び／又は悩んでいる人又は人と接触するものに、不快、機能障害、苦痛、又はさらには死亡などの症状が起こることを指す。疾患又は障害はまた、不健康（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ）、病的状態（ａｉｌｉｎｇ）、慢性的な軽い病気（ａｉｌｍｅｎｔ）、慢性病（ｍａｌａｄｙ）、不調（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）、疾病（ｉｌｌｎｅｓｓ）、愁訴（ｃｏｍｐｌａｉｎｔ）、体調不良（ｉｎｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、又は病気（ａｆｆｅｃｔｉｏｎ）に関連し得る。
【００７９】
用語「有効量」は、本明細書で使用する場合、疾患又は障害の少なくとも１つ以上の症状を軽減させるのに、又は所望される効果を提供するのに十分な、治療薬（例えば改変ＲＮＡ）又は医薬組成物の量を指す。例えば、これは、創傷治癒と関連する症状又は臨床マーカーの治療的に有意な低下をもたらす量であり得る。
【００８０】
本明細書で使用する場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からの（例えば転写による）ＲＮＡ鋳型の産生；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡのポリペプチド又はタンパク質への翻訳；及び（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「脂質成分」は、１種以上の脂質を含むナノ粒子の構成成分である。例えば、脂質成分は、１種以上のカチオン性の／イオン化可能な脂質、ＰＥＧ化された脂質、構造脂質、又は他の脂質（リン脂質など）を含むことができる。一実施形態では、脂質成分は、化合物Ａを含む（図１）。
【００８２】
本明細書で使用する場合、用語「改変ＲＮＡ」は、アデノシン（Ａ）（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３，４−ジオール）、グアノシン（Ｇ）（２−アミノ−９−［３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３Ｈ−プリン−６−オン）、シチジン（Ｃ）（４−アミノ−１−［３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２−イル］ピリミジン−２−オン）、及びウリジン（Ｕ）（１−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］ピリミジン−２，４−ジオン）と比較して、又は、ＲＮＡ分子内のＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、及びＵＭＰと比較して、１つ、２つ、又は２つよりも多いヌクレオシド改変を含有するＲＮＡ分子、又はその部分を指す。ヌクレオシド改変の非限定的な例は、本明細書内の他の場所に提供される。主張される特定のＲＮＡのヌクレオチド配列が、天然に存在するＲＮＡ分子の配列と他の点で同一である場合、改変ＲＮＡは、天然の対応物中に存在するものとは異なる少なくとも１つの改変を有するＲＮＡ分子であると理解されよう。相違は、ヌクレオシド／ヌクレオチドに対する化学変化、又は配列内のその変化の位置であり得る。一実施態様では、改変ＲＮＡは、改変されたメッセンジャーＲＮＡ（又は「改変されたｍＲＮＡ」）である。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡには、改変されてＮ１−メチル−シュードＵＭＰが形成される少なくとも１つのＵＭＰが含まれる。いくつかの実施形態では、すべてのＵＭＰが、Ｎ１−メチル−シュードＵＭＰによって置き換えられている。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」は、１種以上の脂質と１種以上の治療薬とを含む粒子である。ナノ粒子は、典型的には、およそ数マイクロメートル又はそれよりも小さいサイズであり、脂質二重層を含むことができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、動的光散乱によって測定される場合に、約５０ｎｍから約１００ｎｍ、例えば約６０ｎｍから約９０ｎｍ、７０ｎｍから８０ｎｍの平均直径（例えば流体力学的直径）を有する（ＮＩＳＴ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  １２００−６，“Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｉｚｅ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂａｔｃｈ  Ｍｏｄｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ”を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約７１ｎｍ、７２ｎｍ、７３ｎｍ、７４ｎｍ、７５ｎｍ、７６ｎｍ、７７ｎｍ、７８ｎｍ、７９ｎｍ、８０ｎｍ、８１ｎｍ、８２ｎｍ、８３ｎｍ、８４ｎｍ、８５ｎｍ、８６ｎｍ、８７ｎｍ、８８ｎｍ、８９ｎｍ、又は９０ｎｍの平均流体力学的直径を有する。いくつかの実施形態では、治療薬は、改変ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、図１に示す通りの化合物Ａと、改変ＲＮＡとを含む。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）（ｐＤＩ）」は、ナノ粒子状試料中のナノ粒子径の分布の尺度である（ＮＩＳＴ  Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  １２００−６，“Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｉｚｅ  ｏｆ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂａｔｃｈ  Ｍｏｄｅ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ”を参照のこと）。いくつかの実施形態では、多分散性指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）は、約０．１０から約０．２０、例えば、約０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、又は０．２０である。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「Ｎ：Ｐ比」は、例えば脂質成分と改変ＲＮＡとを含むナノ粒子における、脂質中の（生理学的ｐＨ範囲で）イオン化可能な窒素原子と、ＲＮＡ中のリン酸基とのモル比である。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」には、その最も広い意味では、ホスホジエステル結合を介して連結されたヌクレオチドのポリマーを含む、あらゆる化合物及び／又は物質が含まれる。これらのポリマーは、しばしば、サイズに応じてオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと称される。用語「ポリヌクレオチド配列」及び「ヌクレオチド配列」はまた、本明細書では互換的に使用される。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ脂質」又は「ＰＥＧ化された脂質」は、ポリエチレングリコール成分を含む脂質を指す。
【００８８】
語句「薬学的に許容し得る」は、本明細書では、妥当なベネフィット／リスク比に相応する、過剰な毒性、刺激性、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わない、ヒト及び動物の組織と接触する使用に適した、適切な医学的判断の範囲内である、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために用いられる。薬物承認機関（例えば、ＥＭＡ、ＵＳ−ＦＤＡ）は、ガイドラインを提供し、薬学的に許容し得る化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を承認する。例は、薬局方に列挙される。
【００８９】
語句「薬学的に許容し得る賦形剤」は、本明細書では、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びそれらの混合物から選択される、薬学的に許容し得る材料を指すために用いられる。いくつかの実施態様では、溶媒は、水性溶媒である。
【００９０】
本明細書で使用する場合、「リン脂質」は、リン酸部分と、不飽和脂肪酸鎖などの１つ以上の炭素鎖とを含む脂質である。リン脂質は、１つ以上の多重（例えば、二重又は三重）結合（例えば、１つ以上の不飽和）を含むことができる。特定のリン脂質は、膜への融合を容易にすることができる。例えば、カチオン性のリン脂質は、膜（例えば、細胞膜又は細胞内膜）の負の電荷を持つ１つ以上のリン脂質と相互作用することができる。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物の１つ以上の要素を膜に通過させて、例えば、１つ以上の要素の細胞への送達を可能にすることができる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合ペプチド結合によって共に連結される、アミノ酸残基（天然又は非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用する場合、あらゆるサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを意味する。ポリペプチドは、単一分子でもあり得るし、二量体、三量体、又は四量体などの多分子複合体でもあり得る。これらは、抗体又はインスリンなどの単鎖又は多連鎖ポリペプチドを含むこともでき、また、会合又は連結され得る。最も一般的には、多連鎖ポリペプチド中に、ジスルフィド結合が見られる。用語ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的類似体である、アミノ酸ポリマーにも適用することができる。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」は、本質的に２０種のアミノ酸のいずれかからなるポリマーである。「ポリペプチド」は、多くの場合、比較的大きいポリペプチドに関して使用され、「ペプチド」は、多くの場合、小さいポリペプチドに関して使用されるが、これらの用語の使用法は、当技術分野で重なり合っており、また、多様である。用語「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」は、本明細書では、時として互換的に使用される。
【００９３】
用語「対象」は、本明細書に記載した方法及び組成物を用いた、予防的治療を含めた治療が提供される動物、例えばヒトを指す。ヒト対象などの特定の動物に対して特異的である状態又は疾患状態の治療については、用語「対象」は、その特定の動物を指す。
【００９４】
用語「組織」は、ある種の特別な機能を共に実施する、同様に特化された細胞の群又は層を指す。
【００９５】
本明細書で使用する場合、用語「治療する」、「治療」、又は「治療すること」は、疾患若しくは又は障害又はその少なくとも１つの認識可能な症状の回復又は消失を指す。いくつかの実施形態では、「治療」又は「治療すること」は、必ずしも患者によって認識可能とは限らない少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの回復又は消失を指す。
【００９６】
本開示が、本明細書に記載した特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、したがって変わり得ることを理解するべきである。本明細書で使用される用語法は、特定の実施態様を説明する目的のためだけであり、本開示の範囲を限定することを意図せず、本開示は、もっぱら特許請求の範囲によって定義される。
【００９７】
７．２．脂質成分
ナノ粒子は、化合物Ａ（図１）を含む脂質成分を含む。追加の化合物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０４９２４５  Ａ２号パンフレットに開示されている（例えば、国際公開第２０１７／０４９２４５  Ａ２号パンフレット中の化合物１−１４７を参照のこと）。脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質などの様々な他の脂質も含むことができる。
【００９８】
リン脂質
ナノ粒子の脂質成分は、１種以上の（多価）不飽和脂質などの、１種以上のリン脂質を含むことができる。リン脂質は、１つ以上の脂質二重層に構築することができる。一般に、リン脂質は、リン脂質部分と１つ以上の脂肪酸部分とを含むことができる。
【００９９】
これらの組成物及び方法において有用なリン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０  Ｄｉｅｔｈｅｒ  ＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミサクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６  Ｌｙｓｏ  ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６．０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリンからなる、非限定的な群から選択することができる。いくつかの実施形態では、脂質成分は、ＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、ＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、ＤＳＰＣとＤＯＰＥの両方を含む。
【０１００】
構造脂質
ナノ粒子の脂質成分は、１種以上の構造脂質を含むことができる。構造脂質は、限定はされないが、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、α−トコフェロール、及びそれらの混合物から選択することができる。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロール及び副腎皮質ステロイド（プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾンなど）、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、コレステロールを含む。
【０１０１】
ＰＥＧ脂質
ナノ粒子の脂質成分は、１種以上のＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質を含むことができる。こうした脂質は、代わりにＰＥＧ化された脂質と称することもできる。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる、非限定的な群から選択することができる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ＯＴ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能））、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、又はＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。いくつかの実施形態では、脂質成分は、ＰＥＧ−ＤＭＧを含む。
【０１０２】
７．３．ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡ
インビトロ、インビボ、インサイチュ、又はエクスビボにかかわらず、核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）を、細胞に送達すること、例えば核酸の細胞内翻訳及びコードされた対象となるポリペプチドの産生を引き起こすことができることは、治療法、診断法、試薬の分野において、また、生物検定にとって非常に興味深い。
【０１０３】
天然に存在するＲＮＡは、４種の基本のリボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、及びＧＴＰから合成されるが、転写後に改変されたヌクレオチドも含有する可能性がある。さらに、ＲＮＡ内には、およそ１００種の異なるヌクレオシド改変が特定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ  ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．，Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９  ｕｐｄａｔｅ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，（１９９９）２７：１９６−１９７）。
【０１０４】
本開示によれば、これらのＲＮＡは、当分野の他のＲＮＡ分子の（例えば、投与時の自然免疫応答及び急速分解を活性化する）欠点を回避するためのものとして改変されることが好ましい。したがって、これらのポリヌクレオチドは、改変ＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、対象への投与時の自然免疫応答を回避する。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡの半減期は、非改変ＲＮＡと比較して延長される。
【０１０５】
好ましい実施態様では、ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書で使用する場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、対象となるポリペプチドをコードする、また、インビトロ、インビボ、インサイチュ、又はエクスビボで、翻訳されて、コードされた対象となるポリペプチドを産生する能力がある、あらゆるポリヌクレオチドを指す。
【０１０６】
図２Ａに表す通り、従来、ｍＲＮＡ分子の基本構成要素には、少なくとも、翻訳領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、５’キャップ、及びポリＡ鎖が含まれる。この野生型モジュール構造の構築に関して、本開示は、モジュール構造化を維持するが、ポリヌクレオチドに有用な特性（いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的誘発の欠如が含まれる）を付与する１つ以上の構造的及び／又は化学的改変若しくは変更を含む、ポリヌクレオチド又は一次ＲＮＡ構築物を提供することによって、従来のｍＲＮＡ分子の機能性の範囲を拡大する。
【０１０７】
改変ＲＮＡは、例えば糖、核酸塩基（例えば、ピリミジン核酸塩基の原子を、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたチオール、任意に置換されたアルキル（例えば、メチル若しくはエチル）、又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）と置き換える又は置換することによるものなどの、核酸塩基の１つ以上の改変）、又はヌクレオシド間結合（例えば、ホスホジエステル骨格に対する１つ以上の改変）に対するものなどの、標準のＲＮＡヌクレオチド鎖と比較した場合の、いずれかの有用な改変を含むことができる。改変ＲＮＡは、他の薬剤（例えば、ＲＮＡｉ誘発剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒活性ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどを任意に含むことができる。
【０１０８】
非限定的な例としては、いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡには、例えば、改変されてＮ１−メチル−シュードＵＭＰが形成される、少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）が含まれ得る。いくつかの実施態様では、Ｎ１−メチル−シュードＵＭＰは、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、及び１００％という、配列中のＵＭＰの割合で、ＵＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施態様では、すべてのＵＭＰが、Ｎ１−メチル−シュードＵＭＰによって置き換えられている。
【０１０９】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、５’ジグアノシンキャップなどの５’キャップに対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、翻訳領域に対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、５’ＵＴＲに対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、３’ＵＴＲに対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、ポリＡ鎖に対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、翻訳領域、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はポリＡ鎖に対する改変のいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、アルカリホスファターゼで任意に処理することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、一般に創傷治癒の調節において中心的役割を果たす、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチド、すなわちＶＥＧＦタンパク質の大きなファミリーのいずれか１つをコードする。ＶＥＧＦの役割には、一酸化窒素（ＮＯ）シグナル伝達、発生上及び出生後の血管形成、腫瘍血管形成、動脈形成、内皮複製、及び多能性心血管前駆細胞のための細胞運命スイッチの活性化も含まれる。
【０１１１】
ある特定のＶＥＧＦ遺伝子について、１以上のバリアント又はアイソフォームが存在し得ることが、当分野の技術者によって理解されよう。本開示によるＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの非限定的な例を、表１に列挙する。表１に開示する配列が、隣接領域の可能性を含むことが、当分野の技術者によって理解されよう。これらは、オープンリーディングフレームの５’（上流）又は３’（下流）のいずれかに対して各ヌクレオチド配列内にコードされる。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド参照配列を教示することによって明確且つ具体的に開示される。１つ以上の利用可能なデータベース又はアルゴリズムを利用することによって、５’及び３’隣接領域をさらに特徴付けることも可能である。データベースは、ＮＣＢＩ配列の隣接領域に含まれる特徴に注釈を施しており、これらは、当技術分野で利用可能である。
【０１１２】
【表１】
2021508434.tif 000005
【０１１３】
【表１−２】
2021508434.tif 000006
【０１１４】
【表１−３】
2021508434.tif 000007
【０１１５】
ＶＥＧＦ−Ａポリペプチド、例えばヒトＶＥＧＦ−ＡポリペプチドをコードするＲＮＡ分子が、表１に列挙したＶＥＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡアイソフォームにしたがって設計できることが、当分野の技術者によって理解されよう。当業者は、一般に、残りのＶＥＧＦファミリーメンバーの複数のアイソフォームを熟知している。
【０１１６】
一実施態様では、本開示は、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチド（例えば配列番号２）をコードする改変ＲＮＡを提供する。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードし、ここでは、改変ＲＮＡは、配列番号１及び３〜５のいずれか一つを含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリＡ鎖、又はこれらのいずれかの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施態様では、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリＡ鎖、又はこれらのいずれかの組み合わせは、１以上の改変されたヌクレオチドを含むことができる。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡは、配列番号１である、図２Ｂに表す通りの構造を有することができる。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡは、配列番号３〜５のいずれか１つの配列を有することができる。
【０１１８】
７．４．脂質成分と改変ＲＮＡとを含む組成物
いくつかの実施形態は、脂質成分と改変ＲＮＡとを含むナノ粒子に関する。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、化合物Ａ（図１）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、本明細書に開示した通りのリン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びそれらの混合物を含むことができる。
【０１２０】
脂質成分の要素は、特定の比率で提供することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、化合物Ａ、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、総モル％が１００％を超えないという条件で、約３０モル％から約６０モル％の化合物Ａ、約０モル％から約３０モル％のリン脂質、約１８．５モル％から約４８．５モル％の構造脂質、及び約０モル％から約１０モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、約３５モル％から約５５モル％の化合物Ａ、約５モル％から約２５モル％のリン脂質、約３０モル％から約４０モル％の構造脂質、及び約０モル％から約１０モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、約５０モル％の化合物Ａ、約１０モル％のリン脂質、約３８．５モル％の構造脂質、及び約１．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧであり得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子の改変ＲＮＡ成分は、本明細書に開示した通りのＶＥＧＦ−Ａポリペプチド（例えば配列番号２）をコードする改変ＲＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の改変ＲＮＡ成分は、配列番号１及び３〜５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリＡ鎖、又はこれらのいずれかの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリＡ鎖、又はこれらのいずれかの組み合わせは、１つ以上の改変されたヌクレオチドを含むことができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子中の脂質成分と改変ＲＮＡの相対量は、変動し得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子中の脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比は、約５：１から約１００：１、例えば５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、及び１００：１であり得る。例えば、脂質成分と改変ＲＮＡのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１から約４０：１であり得る。いくつかの実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１である。いくつかの実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子中の脂質成分と改変ＲＮＡの相対量は、特定のＮ：Ｐ比によって提供することができる。組成物のＮ：Ｐ比は、１つ以上の脂質中の窒素原子と、ＲＮＡ中のリン酸基の数とのモル比を指す。一般に、より小さいＮ：Ｐ比が好ましい。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１から約３０：１、例えば２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、又は３０：１であり得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１から約８：１であり得る。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約３．０：１、約３．５：１、約４．０：１、約４．５：１、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、又は約７．０：１であり得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約３：１であり得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１であり得る。
【０１２４】
脂質ナノ粒子は、当技術分野で周知の方法を使用して調製することができる（例えば、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２０１２，１（８）：ｅ３７；Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔ  ｓｉｚｅ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  ａｑｕｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｃｏｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｍｉｘｉｎｇ，”Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１２，２８（７）：３６３３−３６４０を参照のこと）。
【０１２５】
いくつかの実施態様では、ナノ粒子は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含むことができ、これには、本明細書で使用する場合、限定はされないが、所望される特定の剤形に適合された、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤などが含まれる。賦形剤はまた、限定はされないが、ポリマー、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせを含むことができる。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤、及びその組成物を調製するための技術は、当技術分野で公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｌｌｅｎ，Ｌｏｙｄ  Ｖ．，Ｊｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと；その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）。従来の賦形剤媒体の使用は、いずれかの従来の賦形剤媒体が、いずれかの望ましくない生物学的影響をもたらす又は別の方式で医薬組成物のいずれかの他の成分と有害な方式で相互作用することによって物質又はその誘導体と適合しない可能性がある場合を除いて、本開示の範囲内であると考えることができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、薬学的に有効な量の脂質成分及び改変ＲＮＡを含むことができ、ここでは、組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、薬学的に許容し得る賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びそれらの混合物から選択される。いくつかの実施態様では、溶媒は、水性溶媒である。いくつかの実施態様では、溶媒は、非水性溶媒である。
【０１２７】
本開示はまた、本明細書に開示した通りの脂質成分と改変ＲＮＡとを含む１種以上の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示した通りの複数の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む。いくつかの実施態様では、薬学的に許容し得る賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びそれらの混合物から選択される。いくつかの実施態様では、溶媒は、水性溶媒である。いくつかの実施形態では、溶媒は、非水性溶媒である。
【０１２８】
７．５．対象における創傷治癒を向上させること
ＶＥＧＦ−Ａ経路は、損傷を受けた組織の血行再建、血管透過性を向上させること、及び新しい血管の形成を含めた創傷治癒過程における中心的役割を果たす。不完全な創傷治癒過程に起因する疾患を患う対象を治療することが、本開示の目標である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本開示によるナノ粒子は、血管構造に影響を与える疾患を患う対象に投与される。血管構造は、最も一般的には、穿通性の外傷、熱傷、又は手術によって損傷される。糖尿病は、創傷治癒の多数の要素を損ない、糖尿病性の創傷治癒を有する患者は一般に、血管機能障害が原因で、血流が変化している。したがって、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍を有する患者は、通常、創傷治癒の低下又は遅延を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示した通りのナノ粒子は、糖尿病を患う対象に投与される。本開示の文脈では、創傷は、手術創、熱傷、擦過傷、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷（例えば、外傷性損傷の創傷）、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍）、褥瘡、床ずれ、及びそれらの組み合わせであり得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、脂質成分と改変ＲＮＡ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５）とを含むナノ粒子は、哺乳類組織又は対象における創傷治癒を向上させるために使用することができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示した通りのナノ粒子は、哺乳類組織又は対象における血管新生を誘導するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示した通りのナノ粒子は、哺乳類組織又は対象における血管形成を誘導するために使用することができる。
【０１３２】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に開示した通りのナノ粒子は、外傷又は手術による血管損傷を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示した通りのナノ粒子は、皮膚移植及び組織移植を必要とする疾患を治療するために使用することができる。
【０１３３】
本開示の他の態様は、それを必要とする対象へのナノ粒子の投与に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示した通りのナノ粒子は、哺乳類組織又は対象における創傷治癒を向上させるために、皮内経路を介して投与される。
【０１３４】
ある種の実施形態では、本明細書に開示した通りのナノ粒子は、所望される治療効果を得るために、１日あたり対象の体重あたり、約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの改変ＲＮＡを送達するのに十分な投薬量レベルで、１日１回以上投与することができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示した通りのナノ粒子は、単回投与で対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示した通りのナノ粒子は、固定投薬量での複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、又はそれ以上の）投与で、対象に投与される。この段落内のそれぞれの実施態様では、「複数回投与」は、互いに、短い（１〜５分）、中程度の（６〜３０分）、又は長い（３０分よりも長い、数時間、さらには数日）時間間隔だけ離すことができる。
【０１３６】
ナノ粒子は、疾患、障害、及び／又は状態を治療するのに有効な、いずれかの投薬量の投与を使用して、対象に投与することができる。必要とされる厳密な投薬量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、個別の製剤、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象ごとに変わることとなる。しかし、組成物の１日の総使用量は、正確な医学的判断の範囲内で主治医によって決定することができることが理解されよう。いずれかの特定の患者にとっての、薬学的に有効な具体的な投与レベルは、疾患の重症度、用いられる具体的な組成物、患者の年齢、体重、全身の健康、性別、及び食事、投与時刻、投与経路、治療の期間、並びに医療分野で周知の同様の因子を含めた、様々な要因に応じて決まることとなる。
【０１３７】
請求項リスト中の請求項はすべて、追加的実施形態として、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１３８】
８．実施例
８．１．実施例１
ナノ粒子及びクエン酸生理食塩水組成物の調製
脂質及び改変ＲＮＡ：化合物Ａ、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、及びポリエチレングリコール修飾脂質（ＮＯＦ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧ）から、エタノール中の脂質のストック溶液を調製した。これらの脂質は、１２．５ｍＭの総脂質濃度となるように、エタノール９９．５％に混合した。その組成は、５０：１０：３８．５：１．５％モルの比の化合物Ａ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧであった。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５）を解凍し、最終配合物における５．６７又は３の電荷比（Ｎ：Ｐ）に相当する濃度の酢酸ナトリウム緩衝液及びＨｙＣｌｏｎｅ水で６．２５ｍＭに希釈した。希釈後の最終配合物は、次の通りであった。
【０１３９】
【表１−４】
2021508434.tif 000008
【０１４０】
【表１−５】
2021508434.tif 000009
【０１４１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物：ＬＮＰ組成物は、脂質を含有するエタノール溶液と、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの水溶液とを、マイクロ流体デバイス上で素早く混合し、それに続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での透析を行うことによって調製した。簡単に言うと、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ溶液と脂質溶液を、シリンジポンプによって制御される２つのシリンジを使用して、水とエタノール３：１の体積比及び１２〜１４ｍＬ／分の流速で、マイクロ流体混合デバイスに注入した。ＬＮＰ組成物を、１０ＫＤカットオフを有する膜を使用して一晩、ＰＢＳ緩衝液に対して透析することによって、エタノールを除去した。ＬＮＰ組成物を、３０ＫＤカットオフを有する遠心分離フィルターデバイスを使用することによって濃縮し、粒径（７２ｎｍ）、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ濃度（０．３５ｍｇ／ｍＬ）、多分散性指数（０．１４）、及び封入（９４％）によって特徴付けた。ＬＮＰ組成物を、ＰＢＳ及び濾過滅菌を用いて、０．３３ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。ＬＮＰ組成物は、冷蔵保管した。
【０１４２】
クエン酸生理食塩水組成物：クエン酸生理食塩水組成物は、解凍したＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ溶液を、ＨｙＣｌｏｎｅ水及び濃縮した緩衝液で希釈して、ｐＨ６．５の１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム及び１３０ｍＭ  塩化ナトリウムの最終組成物とすることによって調製した。
【０１４３】
８．２．実施例２
マウスにおけるヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射後のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の評価
ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡと化合物Ａを含む、ナノ粒子及びクエン酸生理食塩水組成物は、実施例１と同様に調製した。この実施例では、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡは、配列番号３の配列を有していた。
【０１４４】
雄のｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ，ＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／ＢｏｍＴａｃ  Ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ，Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｄｅｎｍａｒｋ）を、イソフルランで麻酔した。これらのマウスは、ＩＩ型糖尿病の樹立されたモデルであり、野生型マウスと比較した場合に創傷治癒障害を有する。マウスの背中を剃毛し、残った毛を脱毛クリームを用いて除去した。クエン酸生理食塩水中に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１００μｇ）又はＬＮＰ（実施例１参照）中に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（３μｇ）を、０．７８５ｍｍ２の円領域内に、４本の別の注射（各１０μＬ、総体積４０μＬ）として皮内注射した。皮内注射後のあらかじめ決定した時点で、マウスを麻酔し、注射を受けた皮膚領域を採取し、液体窒素中で瞬間凍結し、８０℃で保管した。すべての試料を、ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質について分析した。
【０１４５】
クエン酸生理食塩水中に配合された１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを注射されたｄｂ／ｄｂマウスからの試料を、注射の６、２４、４８、７２、及び１４４時間後に採取した。ＬＮＰ中に配合された３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを注射されたｄｂ／ｄｂマウスからの試料を、注射の３、６、２４、４８、７２、１４４時間後に採取した。
【０１４６】
マウス皮膚におけるヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の定量化
ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質含有量の分析のための皮膚試料を調製するために、ホスファターゼ阻害剤Ｉ及びＩＩとプロテアーゼ阻害剤とを含有するＴｒｉｓ溶解緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、凍結された組織生検材料に添加し、ホモジナイゼーションまでおよそ２０℃で凍結した。次いで、ステンレス鋼ビーズ（３ｍｍ）を添加し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー装置を使用して試料をホモジナイズした。ホモジネートを遠心し、上清を分析まで８０℃で保管した。
【０１４７】
ヒトＶＥＧＦ−Ａ濃度は、電気化学発光検出を用いるサンドイッチ免疫測定法を使用して決定した。ＭＳＤ（登録商標）９６ウェルＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ（登録商標）ヒトＶＥＧＦ−Ａアッセイキット（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して、組織ホモジネート中のＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定した。このアッセイは、ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質のみを検出するので、改変ＲＮＡから発現されるＶＥＧＦ−Ａのみを定量するのに役立つ。このアッセイは、キット指示書の通りに実施した。スタンダードを、ＭＳＤ希釈剤で段階希釈した。高い濃度を有する試料を、標準曲線内に適合させるために分析前にＭＳＤ希釈剤で希釈し、プレートをＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＳｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００で読み取った。
【０１４８】
結果
図３及び４は、それぞれ、クエン酸生理食塩水（１００μｇ）及びＬＮＰ（３μｇ）中に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射後の、ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生の時間プロフィール及び大きさをまとめて示す。それぞれ６及び３時間以内に、効率的なタンパク質産生が存在していた（図４）。特に、ＬＮＰ組成物は、８時間以内に、約４００ｐｇ／ｍｇを超えるＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生をもたらした（図４）。さらに、ＬＮＰ組成物は、６日までに、約１ｐｇ／ｍｇを超えるＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生をもたらした（図３）。ＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生は、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡが、ＬＮＰ中に配合された場合に、クエン酸生理食塩水中に配合された場合と比較して、実質的に増大した（図３及び４）。
【０１４９】
表２は、クエン酸生理食塩水（１００μｇ）及びＬＮＰ（３μｇ）中に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射後に得られた薬物動態パラメータをまとめて示す。ＬＮＰ中に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについては、用量がクエン酸生理食塩水中に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡのわずか３％であるという事実にもかかわらず、Ｃｍａｘが１３．７倍上昇していた。曲線下総面積、ＡＵＣ０−ｔは、クエン酸生理食塩水中に配合された１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡと比較して、ＬＮＰ中に配合された３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡで６．６倍上昇していた。
【０１５０】
【表２】
2021508434.tif 000010
【０１５１】
８．３．実施例３
ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射後の創傷治癒に対する効果
材料及び方法
ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡと化合物Ａとを含む、ナノ粒子及びクエン酸生理食塩水組成物を、実施例１と同様に調製した。この実施例では、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡは、配列番号４の配列を有していた。さらに、非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（配列番号６）を使用して、図面に示した通りのある種のナノ粒子又はクエン酸生理食塩水組成物を配合した。
【０１５２】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ  ＵＳＡからの雄の１２週齢のｄｂ／ｄｂマウス（Ｂ６．ＢＫＳ（Ｄ）−Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ）を、４時間の絶食後に、血糖について分析し、次いで、治療群に無作為に割り付けた。マウスをイソフルランで麻酔した。各マウスの背面を電気バリカンで剃毛し、それに続いて脱毛剤を用い、あらゆる残った毛を除去した。皮膚を、ｄｅｓｃｕｔａｎ及びエタノールですすいだ。１０ｍｍ生検パンチを用いる傷によって、各マウスの背中に十分な厚さの創傷を作り、次いで、滅菌条件下で切り取り、テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）絆創膏で覆った。創傷形成後の第３日に、テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）絆創膏を取り除いた。ナノ粒子又はクエン酸生理食塩水組成物を、４本の別の注射（各１０μＬ、総体積４０μＬ）として、創傷の端に近い位置に皮内注射した。次いで、創傷を、新たなテガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）絆創膏で覆った。観察期間中、マウスは、創傷治癒の妨害を避けるために、分けておいた。
【０１５３】
固定距離で且つ間接照明を用いて撮影されたデジタル写真の時系列（すなわち、創傷形成後の第１７日まで３日／４日ごと）から、創傷治癒を決定した。創傷面積は、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊを使用して創傷の縁をなぞることによって決定し、次いで、投薬の直前の、創傷形成後の第３日でのベースライン面積に対する面積（パーセント）として算出した。
【０１５４】
対応のない両側ｔ検定を用いて統計学的評価を行い、ｐ値＜０．０５は有意であるとみなされた。
【０１５５】
結果
図５に示した通り、第７日に、１μｇ又は３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物は、３μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａを含む脂質ナノ粒子組成物並びに１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含むクエン酸生理食塩水組成物と比較した場合に、創傷治癒を有意に向上させた。さらに、第１０日に、１μｇ又は３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物は、３μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物と比較した場合に、創傷治癒を有意に向上させた。第１０日に、１μｇ又は３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物と、１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含むクエン酸生理食塩水組成物との間に、有意差は存在しなかった。
【０１５６】
図６に示した別の実験では、第７日に、３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物は、３μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物並びにいかなる改変ＲＮＡも含まないクエン酸生理食塩水組成物と比較した場合に、創傷治癒を有意に向上させた。さらに、第１０日に、３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物は、３μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物と比較した場合に、創傷治癒を有意に向上させた。
【０１５７】
図７は、別の創傷治癒実験を示す。第７日に、３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物は、３μｇ  ＧＦＰ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物、いかなる改変ＲＮＡも含まない脂質ナノ粒子組成物、又はいかなる改変ＲＮＡも含まないクエン酸生理食塩水組成物と比較した場合に、創傷治癒を有意に向上させた。さらに、第１０日に、３μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物は、３μｇ  ＧＦＰ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物と比較した場合に、創傷治癒を有意に向上させた。
【０１５８】
図８に示した通り、第７日又は第１０日に、次の４つの組成物：（１）３μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物、（２）１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含むクエン酸生理食塩水組成物、（３）１００μｇ  非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを含むクエン酸生理食塩水組成物、及び（４）いかなる改変ＲＮＡも含まないクエン酸生理食塩水組成物の皮内注射後の創傷治癒に有意差は存在しなかった。
【０１５９】
９．配列
９．１．配列番号１：ＶＥＧＦ−Ａをコードする改変ＲＮＡ
【化３】
2021508434.tif 000011
ここでは：
Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ＝それぞれＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、及びＮ１−メチル−シュードＵＭＰ
Ｍｅ＝メチル
ｐ＝無機リン酸塩
【０１６０】
９．２．配列番号２：ヒトＶＥＧＦ−ＡアイソフォームＶＥＧＦ−１６５のアミノ酸配列
【化４】
2021508434.tif 000012
【０１６１】
９．３．配列番号３：ＶＥＧＦ−Ａをコードする改変ＲＮＡ
【化５】
2021508434.tif 000013
ここでは：
Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ＝それぞれＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、及びＮ１−メチル−シュードＵＭＰ
Ｍｅ＝メチル
ｐ＝無機リン酸塩
【０１６２】
９．４．配列番号４：ＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ−０１−０１２）をコードする改変ＲＮＡ
【化６】
2021508434.tif 000014
ここでは：
Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ＝それぞれＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、及びＮ１−メチル−シュードＵＭＰ
ｐ＝無機リン酸塩
【０１６３】
９．５．配列番号５：ＶＥＧＦ−Ａをコードする改変ＲＮＡ
【化７】
2021508434.tif 000015
ここでは：
Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ＝それぞれＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、及びＮ１−メチル−シュードＵＭＰ
ｐ＝無機リン酸塩
【０１６４】
９．６．配列番号６：非翻訳性ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ
【化８】
2021508434.tif 000016
ここでは：
Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ＝それぞれＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、及びＮ１−メチル−シュードＵＭＰ
ｐ＝無機リン酸塩
【図１】
2021508434.tif 000019
【図２】
2021508434.tif 000020
【図３】
2021508434.tif 000021
【図４】
2021508434.tif 000022
【図５】
2021508434.tif 000023
【図６】
2021508434.tif 000024
【図７】
2021508434.tif 000025
【図８】
2021508434.tif 000026
【配列表】
2021508434000001.xml
【国際調査報告】
2021508434.tif 000035
2021508434.tif 000036