(57)【要約】  本発明は、産物及び組成物並びにそれらの使用に関する。本発明は特に、1つ又は複数の鉄キレート剤及びその他の可能性のある活性剤と組み合わせた、TMPRSS6遺伝子発現に干渉するか又はその発現を阻害する核酸産物、並びにヘモクロマトーシス、ポルフィリン症及び血液障害、例えばβ-サラセミア、鎌状赤血球症、及び輸血性鉄過剰症又は骨髄異形成症候群、及び骨髄移植に関連する感染及び非再発死亡の処置等の治療的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含む組み合わせであって、
前記核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び前記第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列を含む、組み合わせ。
【請求項２】
ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡、好ましくはヘモクロマトーシスの処置において使用するための組み合わせであって、
前記組み合わせがTMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含み、前記核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び前記第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列を含む、組み合わせ。
【請求項３】
ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡、好ましくはヘモクロマトーシスの処置において使用するための核酸であって、
前記核酸がTMPRSS6の発現を阻害し、前記核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び前記第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列を含み、
前記核酸が1つ又は複数の鉄キレート剤と共に投与される、核酸。
【請求項４】
TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含むキットであって、
前記核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び前記第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列を含む、キット。
【請求項５】
TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含む医薬組成物であって、
前記核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び前記第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列を含み、
前記核酸、鉄キレート剤又は両方が生理学的に許容される賦形剤と組み合わされている、医薬組成物。
【請求項６】
ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡、好ましくはヘモクロマトーシスの処置において使用するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物がTMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含み、前記核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び前記第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列を含み、
前記核酸、鉄キレート剤又は両方が生理学的に許容される賦形剤と組み合わされている、医薬組成物。
【請求項７】
前記第2の鎖が配列番号334、318、320、322、324、326、328、330、332、336、338、340、342、344、346、357、359. 361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435,437、439、441又は443のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の組み合わせ、請求項2に記載の使用のための組み合わせ、請求項3に記載の使用のための核酸、請求項4に記載のキット、請求項5に記載の組成物又は請求項6に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記1つ又は複数の鉄キレート剤がデフェロキサミン、デフェリプロン、デフェラシロクス(エクジェイド)及びデフェラシロクス(ジャドニュ)から選択され、任意選択で前記鉄キレート剤がデフェリプロンである、請求項1から7のいずれか一項に記載の組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。
【請求項９】
前記第1の鎖及び/又は第2の鎖の1つ又は複数のヌクレオチドが修飾されて修飾されたヌクレオチドを形成している、請求項1から8のいずれか一項に記載の組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。
【請求項１０】
前記第1の鎖が配列番号17のヌクレオチド配列を含み、前記第2の鎖が配列番号18のヌクレオチド配列を含み、
【表１】
2021531029.tif 000127
ここで、特定の修飾は次の番号、
1=2'F-dU、
2=2'F-dA、
3=2'F-dC、
4=2'F-dG、
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG
によって示される、請求項9に記載の組み合わせ、使用のための組み合わせ又は使用のための核酸。
【請求項１１】
TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及びデフェリプロンを含む組み合わせであって、
前記核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び前記第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が、配列番号17のヌクレオチド配列を含み、前記第2の鎖が配列番号18のヌクレオチド配列を含む、組み合わせ。
【請求項１２】
ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡、好ましくはヘモクロマトーシスの処置における使用のための組み合わせであって、
TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及びデフェリプロンを含み、前記核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び前記第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が配列番号17のヌクレオチド配列を含み、前記第2の鎖が配列番号18のヌクレオチド配列を含む、組み合わせ。
【請求項１３】
ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡、好ましくはヘモクロマトーシスの処置における使用のための核酸あって、
前記核酸がTMPRSS6の発現を阻害し、前記核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び前記第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、前記第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、前記第1の鎖が配列番号17のヌクレオチド配列を含み、前記第2の鎖が配列番号18のヌクレオチド配列を含み、前記核酸がデフェリプロンと共に投与される、核酸。
【請求項１４】
前記核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤が同時、別々又は順次投与される、請求項1から13のいずれか一項に記載の組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。
【請求項１５】
前記核酸がリガンドに、任意選択で前記第2の鎖の5'末端でコンジュゲートされ、任意選択で前記リガンドが(i)1つ又は複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分及びそれらの誘導体、並びに(ii)リンカーを含み、前記リンカーがGalNAc部分を核酸にコンジュゲートしている、請求項1から14のいずれか一項に記載の組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。
【請求項１６】
前記コンジュゲートされた核酸が構造:
【化１−１】
2021531029.tif 000128
【化１−２】
2021531029.tif 000129
【化１−３】
2021531029.tif 000130
【化１−４】
2021531029.tif 000131
(式中、Zが請求項1から14のいずれか一項に記載の核酸である)
を有する、請求項15に記載の組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。
【請求項１７】
前記核酸が鎖のいずれか又は両方の5'末端及び/又は3'末端で安定化されており、任意選択で
前記核酸が前記第1の鎖の3つの末端3'ヌクレオチドのそれぞれの間及び3つの末端5'ヌクレオチドのそれぞれの間に2つのホスホロチオエート結合を含み、前記第2の鎖の3'末端の3つの末端ヌクレオチドの間の2つのホスホロチオエート結合が構造、
【表２】
2021531029.tif 000132
を有し、ここで、特定の修飾は次の番号、
1=2'F-dU、
2=2'F-dA、
3=2'F-dC、
4=2'F-dG、
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG
(ps)=ホスホロチオエート結合
によって示される、請求項1から14のいずれか一項に記載の組み合わせ、使用のための組み合わせ、又は使用のための核酸、或いは請求項15又は16に記載のコンジュゲートされた核酸。
【請求項１８】
処置を必要とする個体に、請求項1から17のいずれか一項に記載の核酸又はコンジュゲートされた核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含む組み合わせを投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産物及び組成物並びにそれらの使用に関する。本発明は特に、その他の活性剤と組み合わせた、TMPRSS6遺伝子発現に干渉するか又はその発現を阻害する核酸産物、並びにヘモクロマトーシス、ポルフィリン症及び血液障害、例えばβ-サラセミア、鎌状赤血球症、及び輸血性鉄過剰症、及び骨髄移植に関連する感染及び非再発死亡の処置等の治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発現したmRNAに相補的に結合することができる二本鎖RNA(dsRNA)は、RNA干渉(RNAi)と名付けられた機構によって遺伝子発現を遮断できることが示されている(Fire、1998年、Nature、1998年2月19日、391(6669):806〜11頁、及びElbashirら、2001年、Nature、2001年5月24日、411(6836):494〜8頁)。短いdsRNAは、脊椎動物をはじめとする多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを指示し、遺伝子機能を研究するための有用なツールとなっている。RNAiは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)によって媒介され、これは、RISC複合体に負荷されたサイレンシングトリガーと相同のメッセンジャーRNAを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼである。siRNA、アンチセンスRNA、及びマイクロRNA等の干渉RNA(iRNA)は、遺伝子サイレンシングによってタンパク質の形成を防止する、すなわちmRNA分子の分解によってタンパク質の遺伝子翻訳を阻害するオリゴヌクレオチドである。遺伝子サイレンシング剤は、医学における治療的応用のためにますます重要になっている。
【０００３】
Watts及びCorey、Journal of Pathology(2012年、226巻、365〜379頁)によれば、核酸サイレンシングトリガーをデザインするために使用することができるアルゴリズムがあるが、これらのすべてに厳しい制約がある。アルゴリズムは標的mRNAの三次構造又はRNA結合タンパク質の関与といった因子を考慮に入れないため、強力なsiRNAを識別するためには様々な実験的方法が必要でありうる。したがって、オフターゲット効果が最小限である強力な核酸サイレンシングトリガーの発見は、複雑なプロセスである。これらの高電荷分子の医薬開発には、それらが経済的に合成され、標的組織に分配され、細胞に入り、毒性の許容限界内で機能しうることが必要である。
【０００４】
マトリプターゼ-2(MT-2)は、TMPRSS6遺伝子の産物である。MT-2は、鉄恒常性の制御において重要な役割を果たすII型膜貫通セリンプロテアーゼである。MT-2は、ペプチドホルモンであるヘプシジンの遺伝子発現の負の制御因子である。ヘプシジンは、主に肝臓で産生及び分泌される。ヘプシジンは、胃腸管系による鉄の吸収及び細胞内貯蔵からの鉄の放出の負の制御因子として作用することにより、体内の鉄のバランスを制御する。ヘプシジンの上方制御は、体内の鉄利用能の低減につながる(McDonaldら、American Journal of Physiology、2015年、08巻7号、C539〜C547頁)。ヘプシジンのレベルは、鉄過剰の患者において低い。したがって、鉄過剰を低減させるための可能性のある標的は、肝臓内のTMPRSS6遺伝子発現をサイレンシングすることにより、ヘプシジンを増加させることである。
【０００５】
TMPRSS6は主に肝臓内で発現するが、高レベルのTMPRSS6 mRNAは腎臓内でも見られ、子宮内ではより低いレベルで、そしてはるかに低い量で多くの他の組織内で検出される(Ramsayら、Haematologica(2009年)、94(*6)、84〜849頁)。
【０００６】
血液及び組織中の鉄レベルの上昇によって特徴付けられる状態である鉄過剰には、遺伝性ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、及び血液障害、例えばβ-サラセミア、先天性鉄芽球性貧血(CSA)、先天性赤血球異形成貧血(CDA)、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、及び鎌状赤血球症(SCD)等の様々な障害が関連している。加えて、定期的な輸血を受けるすべての患者集団には、輸血性鉄過剰症を発症するリスクがある(Coates、Free Rad Biol Med、2014年、72巻、23〜40頁、Bulajら、Blood、2000年、95巻、1565〜71頁)。Naiら(Blood、2012年、119巻、21号、5021〜5027頁)及びGuoら(The Journal of Clinical Investigation、2013年、123巻、4号、1531〜1541頁)による論文はいずれも、TMPRSS6発現の欠失又は低減がマウスのβ-サラセミアを処置するのにいかに効果的であったかを示す。Schmidt(2013年、Blood、121巻、7号、1200〜1208頁)による論文は、遺伝性ヘモクロマトーシス及びβ-サラセミアのマウスモデルにおける鉄過剰を減少させるためのTMPRSS6核酸の使用を探究している。両モデルにおいて同著者らは、脂質ナノ粒子-TMPRSS6核酸による処置がヘプシジンを誘導し、組織及び血清中の鉄レベルを最長21日間にわたって低下させたと判定した。更に、Schmidtら(American Journal of Hematology、2015年、90巻、4号、310〜313頁)による論文は、LNP-TMPRSS6核酸と経口鉄キレート剤デフェリプロンの併用療法により、β-サラセミアのマウスモデルにおける二次的鉄過剰が低減したことを示した。更に、骨髄移植を経験した鉄過剰症の患者は感染及び非再発死亡の高い危険性を経験する。高い全身鉄レベルは、免疫障害及び高い微生物病原性による感染の危険性を増加させる。骨髄移植を受けている患者は、移植のために患者を準備するのに必要な細胞傷害的前治療が骨髄を破壊し、赤血球生成を障害して全身鉄レベルも増加させるので、感染に対して特に脆弱である。更に、高い全身鉄レベルは、移植したドナー幹細胞の移植及び増殖に負の影響を及ぼし得る。
【０００７】
骨髄移植を受ける患者の前処理前及び前処理中の鉄過剰及び全身鉄レベルの低減は、感染及び非再発死亡の危険性を低減させることができる(Wermke等、2018, Lancet Haematol. May; 5 (5):e201〜e210頁)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第5,885,968号
【特許文献２】WO2017/174657
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Fire、1998年、Nature、1998年2月19日、391(6669):806〜11頁
【非特許文献２】Elbashirら、2001年、Nature、2001年5月24日、411(6836):494〜8頁
【非特許文献３】Watts及びCorey、Journal of Pathology、2012年、226巻、365〜379頁)
【非特許文献４】McDonaldら、American Journal of Physiology、2015年、08巻7号、C539〜C547頁
【非特許文献５】Ramsayら、Haematologica、2009年、94(*6)、84〜849頁
【非特許文献６】Coates、Free Rad Biol Med、2014年、72巻、23〜40頁
【非特許文献７】Bulajら、Blood、2000年、95巻、1565〜71頁
【非特許文献８】Naiら、Blood、2012年、119巻、21号、5021〜5027頁
【非特許文献９】Guoら、The Journal of Clinical Investigation、2013年、123巻、4号、1531〜1541頁
【非特許文献１０】Schmidt、2013年、Blood、121巻、7号、1200〜1208頁
【非特許文献１１】Schmidtら、American Journal of Hematology、2015年、90巻、4号、310〜313頁
【非特許文献１２】Wermkeら、2018, Lancet Haematol. May; 5 (5):e201〜e210頁
【非特許文献１３】Takeiら、2002年、JBC、277巻(26号):23800〜06頁
【非特許文献１４】Dubberら、2003年、Bioconjug. Chem、2003年1月〜2月、14巻(1号):239〜46頁
【非特許文献１５】Weigel, P.Hら、Biochim. Biophys. Acta.、2002年9月19日;1572巻(2〜3号):341〜63頁
【非特許文献１６】Ishibashi,Sら、J Biol. Chem.、1994年11月11日;269巻(45号):27803〜6頁
【非特許文献１７】Chalmers AW, Shammo JM. 2016. 'Evaluation of a new tablet formulation of deferasirox to reduce chronic iron overload after long-term blood transfusions', Ther Clin Risk Manag, 12: 201〜8頁
【非特許文献１８】Mobarra N, Shanaki M, Ehteram H, Nasiri H, Sahmani M, Saeidi M, Goudarzi M, Pourkarim H, Azad M. 2016. 'A Review on Iron Chelators in Treatment of Iron Overload Syndromes', Int J Hematol Oncol Stem Cell Res, 10: 239〜47頁
【非特許文献１９】Harasztiら、Nuc. Acids Res.、45巻(13号)、2017年、7581〜7592頁
【非特許文献２０】Kuhlaら、2015年、Apoptosis、4巻、500〜11頁
【非特許文献２１】Herrmannら、J. Mol. Med (Berl)、2004年、82巻、39〜48頁
【非特許文献２２】Yangら、1995年、PNAS、92巻、11608〜11612頁
【非特許文献２３】Siwaponananら、2017年、Blood、129巻、3087〜3099頁
【非特許文献２４】Herrmannら、Mol. Med, 2004. 82 (1): 1〜3頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、鉄過剰に関連する障害を効果的に処置するための方法が現在必要とされており、本発明はこの必要に応える。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本開示のいずれかの態様に係る核酸又はコンジュゲートされた核酸に関する。
核酸及びコンジュゲートされた核酸
【００１２】
本書において開示される第1の態様は、TMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、若しくは442から選択されるヌクレオチド配列を含むか、又は第1の鎖が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、67、69、71、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、85、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、270、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、309、311、312、313、314、若しくは315から選択される配列、例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、若しくは215を含む、
核酸に関する。
【００１３】
更なる関連した態様は、TMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第2の鎖が、次の配列:配列番号318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、若しくは443から選択されるヌクレオチド配列を含むか、又は第2の鎖が、次の配列:配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、68、70、72、75、84、86、89、100、101、102、103、104、105、106、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、226、228、230、232、234、236、238、240、242、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、310、312、314、若しくは316から選択されるヌクレオチド配列、例えば、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、若しくは216から選択される配列を含む、
核酸である。
【００１４】
ある特定の核酸が、本発明の態様のすべてにおいて好ましい。特に、次のものである。
【００１５】
第1の鎖は、配列番号333のヌクレオチド配列を含んでよく、かつ/又は、第2の鎖は、配列番号334のヌクレオチド配列を含んでよい。
【００１６】
【表１】
2021531029.tif 000002
【００１７】
第1の鎖は、配列番号17のヌクレオチド配列を含んでよく、かつ/又は、第2の鎖は、配列番号18のヌクレオチド配列を含んでよい。具体的には、次の配列を含んでよい。
【００１８】
【表２】
2021531029.tif 000003
【００１９】
第1の鎖は、配列番号422のヌクレオチド配列を含んでよく、かつ/又は、第2の鎖は、配列番号423のヌクレオチド配列を含んでよい。
【００２０】
【表３】
2021531029.tif 000004
【００２１】
第1の鎖は、配列番号199のヌクレオチド配列を含んでよく、かつ/又は、第2の鎖は、配列番号200のヌクレオチド配列を含んでよい。
【００２２】
【表４】
2021531029.tif 000005
【００２３】
第1の鎖は、配列番号429のヌクレオチド配列を含んでよく、かつ/又は、第2の鎖は、配列番号430のヌクレオチド配列を含んでよい。
【００２４】
【表５】
2021531029.tif 000006
【００２５】
第1の鎖は、配列番号207のヌクレオチド配列を含んでよく、かつ/又は、第2の鎖は、配列番号208のヌクレオチド配列を含んでよい。
【００２６】
【表６】
2021531029.tif 000007
【００２７】
核酸は、本書の配列表において特定のリンカー及び/又はリガンドに関連して開示される場合があり、これらの特徴が好ましいが、配列表との関連におけるリンカー又はリガンドへの言及は、いずれも任意選択である。ある特定の好ましいリンカーは、ある特定の核酸配列と組み合わせて開示される。
【００２８】
第1の鎖及び/又は該第2の鎖はそれぞれ、17〜35ヌクレオチド長であってよく、少なくとも1つの二重鎖領域は、10〜25ヌクレオチド長であってよい。二重鎖は、2本の別々の鎖を含んでもよいし、第1の鎖及び第2の鎖を含む一本鎖を含んでもよい。
【００２９】
核酸は、a)両末端が平滑末端であるか、b)一方の末端にオーバーハングを有し、他方に平滑末端を有するか、又はc)両末端にオーバーハングを有することができる。
【００３０】
第1の鎖及び/又は第2の鎖上の1個又は複数のヌクレオチドは修飾されて、修飾されたヌクレオチドを形成していてもよい。第1の鎖の奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数が修飾されていてよい。第1の鎖の偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数は、少なくとも第2の修飾によって修飾されていてよく、ここで少なくとも第2の修飾は、1個又は複数の奇数のヌクレオチドに対する修飾とは異なる。1個又は複数の修飾された偶数のヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、1個又は複数の修飾された奇数のヌクレオチドのうちの少なくとも1個に隣接していてよい。
【００３１】
本書において開示される核酸において、第1の鎖における複数の奇数のヌクレオチドが修飾されていてよい。第1の鎖における複数の偶数のヌクレオチドは、第2の修飾によって修飾されていてよい。第1の鎖は、共通の修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含みうる。第1の鎖は、第2の異なる修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含んでもよい。
【００３２】
第2の鎖の奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数は、第1の鎖上の奇数のヌクレオチドの修飾とは異なる修飾によって修飾されていてよく、かつ/或いは、第2の鎖の偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数は、第1の鎖の奇数のヌクレオチドと同じ修飾によって修飾されていてよい。第2の鎖の1個又は複数の修飾された偶数のヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、1個又は複数の修飾された奇数のヌクレオチドに隣接していてよい。第2の鎖の複数の奇数のヌクレオチドは、共通の修飾によって修飾されていてよく、かつ/又は、複数の偶数のヌクレオチドは、第1の鎖の奇数のヌクレオチド上に存在する同じ修飾によって修飾されていてよい。第2の鎖上の複数の奇数のヌクレオチドは、第2の修飾によって修飾されていてよく、ここで第2の修飾は、第1の鎖の奇数のヌクレオチドの修飾とは異なる。
【００３３】
第2の鎖は、共通の修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含んでよく、この修飾は、第1の鎖の奇数のヌクレオチドの修飾とは異なる第2の修飾でありうる。
【００３４】
本書において開示される核酸において、第1の鎖における奇数のヌクレオチドのそれぞれ、及び第2の鎖における偶数のヌクレオチドのそれぞれは、共通の修飾で修飾されていてよく、第1の鎖における偶数のヌクレオチドのそれぞれは、第2の修飾で修飾されていてよく、第2の鎖における奇数のヌクレオチドのそれぞれは、第2の異なる修飾で修飾されていてよい。
【００３５】
本書において開示される核酸では、第1の鎖の修飾されたヌクレオチドが、第2の鎖の修飾されていないヌクレオチド又は異なって修飾されたヌクレオチドに対して、少なくとも1ヌクレオチドだけシフトしていてよい。
【００３６】
修飾及び/又は複数の修飾は、それぞれ個別に、3'末端デオキシ-チミン、2'-O-メチル、2'-デオキシ修飾、2'-アミノ修飾、2'-アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホルアミデート修飾、5'-ホスホロチオエート基修飾、5'ホスフェート修飾若しくは5'ホスフェート模倣物修飾、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群から選択されてよく、かつ/又は、修飾されたヌクレオチドは、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、若しくは非天然塩基を含むヌクレオチドのうちいずれか1つであってよい。
【００３７】
少なくとも1つの修飾は、2'-O-メチルであってよく、かつ/又は、少なくとも1つの修飾は、2'-Fであってよい。
【００３８】
本開示は更に、第2の態様として、TMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:
配列番号317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、若しくは442から選択されるか、
又は
配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、67、69、71、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、85、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、270、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、309、311、312、313、314、若しくは315から選択される、ヌクレオチド配列、
例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、若しくは215を含み、
第1の鎖のヌクレオチドは、奇数のヌクレオチドが第1の修飾によって修飾され、かつ偶数のヌクレオチドが第2の修飾によって修飾されており、第2の鎖のヌクレオチドは、偶数のヌクレオチドが第3の修飾によって修飾され、奇数のヌクレオチドが第4の修飾によって修飾されており、少なくとも第1の修飾が、第2の修飾とは異なり、第3の修飾が、第4の修飾とは異なる、
核酸を提供する。
【００３９】
本開示は更に、関連した第2の態様として、TMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第2の鎖が、次の配列:配列番号318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、若しくは443から選択されるか、
又は配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、68、70、72、75、84、86、89、100、101、102、103、104、105、106、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、226、228、230、232、234、236、238、240、242、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、310、312、314、若しくは316から選択されるヌクレオチド配列、
例えば、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、若しくは216から選択される配列を含んでよく、
第1の鎖のヌクレオチドは、奇数のヌクレオチドが第1の修飾によって修飾され、かつ偶数のヌクレオチドが第2の修飾によって修飾されており、第2の鎖のヌクレオチドは、偶数のヌクレオチドが第3の修飾によって修飾され、奇数のヌクレオチドが第4の修飾によって修飾されており、少なくとも第1の修飾が、第2の修飾とは異なり、第3の修飾が、第4の修飾とは異なる、
核酸を提供する。
【００４０】
第3の修飾及び第1の修飾は、同じであってよく、かつ/又は、第2の修飾及び第4の修飾は、同じであってよい。
【００４１】
第1の修飾は、2'OMeであってよく、第2の修飾は、2'Fであってよい。
【００４２】
いずれかの態様、例えば第2の態様の核酸において、第1の鎖は、配列番号17のヌクレオチド配列を含んでよく、第2の鎖は、配列番号18のヌクレオチド配列を含んでよい。配列及び修飾は、以下の表に示すものでありうる。
【００４３】
【表７】
2021531029.tif 000008
【００４４】
ここで特定の修飾は、次の番号によって示され、
1=2'F-dU、
2=2'F-dA、
3=2'F-dC、
4=2'F-dG、
5=2'-OMe-rU、
6=2'-OMe-rA、
7=2'-OMe-rC、
8=2'-OMe-rG
である。
【００４５】
上記に教示したように、これらは、他の好ましい配列と共に好ましい配列である。
【００４６】
本書において開示される核酸は、第1の鎖及び/又は第2の鎖の1個、2個、又は3個の3'末端ヌクレオチド及び/又は1個、2個、又は3個の5'末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含みうる。これは、第1の鎖上の3個の3'末端ヌクレオチドのそれぞれの間、及び3個の5'末端ヌクレオチドのそれぞれの間に2つのホスホロチオエート結合を含み、第2の鎖の3'末端の3個の末端ヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエート結合を含んでよい。
【００４７】
そのような核酸は、リガンドにコンジュゲートされていてよい。
【００４８】
本開示は更に、第3の態様として、TMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:
配列番号317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、353、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、若しくは442から選択されるか、
又は
配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、67、69、71、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、85、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、270、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、309、311、312、313、314、若しくは315から選択されるヌクレオチド配列、
例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、若しくは215を含み、
核酸がリガンドにコンジュゲートされている、
核酸を提供する。
【００４９】
本開示は更に、更なる関連した態様として、TMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、第2の鎖が、次の配列:
配列番号318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、若しくは443から選択されるヌクレオチド配列を含むか、又は第2の鎖が、次の配列:配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、68、70、72、75、84、86、89、100、101、102、103、104、105、106、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、226、228、230、232、234、236、238、240、242、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、310、312、314、若しくは316から選択されるヌクレオチド配列、例えば、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、若しくは216から
選択される配列を含み、
核酸がリガンドにコンジュゲートされている、
核酸を提供する。
【００５０】
リガンドは、(i)1つ又は複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分及びそれらの誘導体、並びに(ii)リンカーを含んでよく、リンカーは、先行する態様のいずれかに定義された配列にGalNAc部分をコンジュゲートさせる。リンカーは、二価、又は三価、又は四価の分岐構造でありうる。ヌクレオチドは、本書に定義されるように修飾されていてよい。
【００５１】
リガンドは、式I:
[S-X1-P-X2]3-A-リンカー- (I)
[式中、
Sは、糖類を表し、ここで糖類は、N-アセチルガラクトサミンであり、
X1は、C3〜C6アルキレン又は(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-[式中、mは1、2、又は3である]であり、
Pは、ホスフェート又は修飾されたホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり、
X2は、アルキレン、又は式(-CH2)n-O-CH2-[式中、n=1〜6である]のアルキレンエーテルであり、
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、架橋ユニットを表し、
本書において開示される核酸は、ホスフェート又は修飾されたホスフェート(好ましくはチオホスフェート)を介してX3にコンジュゲートされている]
を含みうる。
【００５２】
したがって、本開示は更に、次の構造、
【化１−１】
2021531029.tif 000009
【化１−２】
2021531029.tif 000010
【化１−３】
2021531029.tif 000011
【化１−４】
2021531029.tif 000012
(式中、Zは、上文に定義された核酸を表す)
のうちの1つを有する、コンジュゲートされた核酸を提供する。
【００５３】
代替的には、本書において開示される核酸は、次の構造のリガンドにコンジュゲートされていてもよい。
【００５４】
【化２】
2021531029.tif 000013
【００５５】
本発明はまた、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた本書に定義される核酸と、
i)カチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩、
ii)ステロイド、
iii)ホスファチジルエタノールアミンリン脂質、
iv)PEG化脂質
を含む製剤とを組み合わせて含む、組成物を提供する。
【００５６】
本製剤中のカチオン性脂質成分の含有量は、脂質製剤の脂質含有量全体の約55モル%〜約65モル%、好ましくは脂質製剤の脂質含有量全体の約59モル%でありうる。
【００５７】
本製剤は、
【化３】
2021531029.tif 000014
の構造を有するカチオン性脂質、
【化４】
2021531029.tif 000015
の構造を有するステロイド、
【化５】
2021531029.tif 000016
の構造を有するホスファチジルエタノールアミンリン脂質、及び
【化６】
2021531029.tif 000017
の構造を有するPEG化脂質を含みうる。
【００５８】
鉄キレート剤
鉄キレート剤は、体内の金属鉄イオンに結合し、体から過剰な鉄を除去又は減少させ、それによって鉄媒介毒性を軽減することができる任意の分子である。
【００５９】
1つ又は複数の鉄キレート剤は、例えば、デフェロキサミン、デフェリプロン、デフェラシロクス(エクジェイド)及びデフェラシロクス(ジャドニュ)から選択することができ、好ましくはデフェリプロンである。
【００６０】
本発明はまた、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本開示のいずれかの態様の核酸又はコンジュゲートされた核酸と、生理学的に許容される賦形剤とを含む、組成物を提供する。
【００６１】
また、疾患若しくは障害の処置及び/又は疾患若しくは障害を処置するための医薬の製造における使用のための、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本開示のいずれかの態様に係る核酸又はコンジュゲートされた核酸が提供される。
【００６２】
本発明は、処置を必要とする個体に、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本開示のいずれかの態様に係る核酸又はコンジュゲートされた核酸を含む組成物を投与することを含む、疾患又は障害を処置又は防止する方法を提供する。
【００６３】
核酸又はコンジュゲートされた核酸は、皮下、静脈内、又は経口、直腸、若しくは腹腔内等の任意の他の適用ルートを使用して対象に投与されうる。
【００６４】
鉄キレート剤は、皮下、静脈内、又は経口、直腸、若しくは腹腔内等の任意の他の適用ルートを使用して、対象に投与されうる。
【００６５】
核酸又はコンジュゲートされた核酸は、1つ又は複数の鉄キレート剤と同時、別々又は順次投与されうる。
【００６６】
したがって、核酸又はコンジュゲートされた核酸は、鉄キレート剤、(固定用量の組成物等)と組み合わせて送達されうるか、或いはこの組み合わせは別々の医薬組成物として送達されうることが理解されよう。
【００６７】
疾患又は障害は、ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症及び血液障害、例えばβ-サラセミア、又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、及び輸血性鉄過剰症を含む群から選択されうる。障害は、鉄過剰に関連する場合があり、鉄過剰に関連する障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はフリートライヒ運動失調症でありうる。疾患又は障害はまた、骨髄移植に関連する感染及び非再発死亡から選択されうる。本書において開示される核酸及び1つ若しくは複数の鉄キレート剤で処置される好ましい疾患又は障害はヘモクロマトーシスである。
【００６８】
1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本開示による核酸又はコンジュゲートされた核酸を作製する方法も含まれる。
【００６９】
本発明は、二本鎖であり、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせたTMPRSS6の発現RNA転写物を標的とする核酸、及びその組成物に関する。これらの核酸は、TMPRSS6遺伝子産物の発現低減が望ましい種々の疾患及び障害の処置において使用されうる。
【００７０】
本発明は、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本明細書で開示されたいずれかの態様に係る核酸又はコンジュゲートされた核酸を提供する。
【００７１】
本書において開示される第1の態様は、細胞におけるTMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:
配列番号317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、若しくは442から選択されるか、
又は配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、67、69、71、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、85、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、270、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、309、311、312、313、314、若しくは315から選択されるヌクレオチド配列、
例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、若しくは215を含む、
核酸に関する。
【００７２】
核酸とは、ヌクレオチドを含む2本の鎖を含み、遺伝子発現に干渉することができる核酸を意味する。阻害は、完全であっても部分的であってもよく、標的を定めた様式における遺伝子発現の下方制御をもたらす。核酸は、ガイド鎖でもありうる第1の鎖と、パッセンジャー鎖でもありうる第2の鎖という、2本の別々のポリヌクレオチド鎖を含む。第1の鎖及び第2の鎖は、「フォールディングして」二本鎖分子を形成する自己相補的な同じポリヌクレオチド分子の一部でありうる。核酸は、siRNA分子でありうる。
【００７３】
核酸は、リボヌクレオチド、修飾されたリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体を含みうる。核酸は、第1の鎖(当技術分野ではガイド鎖としても公知である)のすべて又は一部分と、第2の鎖(当技術分野ではパッセンジャー鎖としても公知である)のすべて又は一部分とによって形成された、二本鎖核酸部分又は二重鎖領域を更に含むことができる。二重鎖領域は、第1の鎖と第2の鎖との間に形成された最初の塩基対から始まり、第1の鎖と第2の鎖との間に形成された最後の塩基対で終わり、両端を含むものとして定義される。
【００７４】
二重鎖領域とは、ワトソン-クリック塩基対合、又は相補的若しくは実質的に相補的なオリゴヌクレオチド鎖間の二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式のいずれかによって互いと塩基対を形成する、2つの相補的又は実質的に相補的なオリゴヌクレオチドにおける領域を意味する。例えば、21ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、21ヌクレオチド単位をもつ別のオリゴヌクレオチドと塩基対合することができるが、「二重鎖領域」が19個の塩基対からなるように、各鎖上の19個のヌクレオチドのみが相補的又は実質的に相補的である。残りの塩基対は、5'オーバーハング及び3'オーバーハングとして、又は一本鎖領域として存在しうる。更に、二重鎖領域の中で、100%の相補性は必要とされない。二重鎖領域においては実質的な相補性が許容可能である。実質的な相補性とは、生物学的条件下でアニーリングが可能であるような鎖間の相補性を指す。2本の鎖が生物学的条件下でアニーリング可能であるかどうかを経験的に判定するための技術は、当技術分野において周知である。代替的には、2本の鎖を合成し、生物学的条件下で一緒に加えて、それらが互いにアニールするかどうかを判定してもよい。
【００７５】
少なくとも1つの二重鎖領域を形成する第1の鎖及び第2の鎖の一部分は、互いと完全に相補的であってよく、少なくとも部分的に相補的である。
【００７６】
核酸の長さによっては、第1の鎖と第2の鎖との間の塩基相補性という観点での完全なマッチは、必ずしも必要であるとは限らない。しかしながら、第1の鎖及び第2の鎖は、生理学的条件下でハイブリダイズすることができなければならない。
【００７７】
少なくとも1つの二重鎖領域における第1の鎖と第2の鎖との間の相補性は、いずれの鎖にもヌクレオチドのミスマッチ又はヌクレオチドの付加/欠失が存在しないという点で完全でありうる。代替的には、相補性は完全でなくてよい。相補性は、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、又は95%であってよい。
【００７８】
第1の鎖及び第2の鎖は、それぞれ、Table 1(表18)に列記される配列のうちのいずれか1つから3個以下のヌクレオチドだけ異なる、少なくとも15個の隣接するヌクレオチドを含む相補性領域を含みうる。
【００７９】
本開示の関連した態様は、細胞におけるTMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第2の鎖が、次の配列:
配列番号318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、若しくは443から選択されるか、
又は
配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、68、70、72、75、84、86、89、100、101、102、103、104、105、106、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、226、228、230、232、234、236、238、240、242、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、310、312、314、若しくは316から選択されるヌクレオチド配列、
例えば、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、若しくは216から選択される配列を含む、
核酸に関する。
【００８０】
好適には、本開示のいずれかの態様において、第2の鎖及び第1の鎖は、あわせて、例えば配列番号1及び2、3及び4等の対といった、本書において開示される核酸の相補的な対のいずれかである。
【００８１】
配列番号17及び18からなる核酸の組み合わせは、配列番号199と200、及び配列番号207と208と同様に、好ましい組み合わせである。
【００８２】
この核酸は、第1の鎖のすべて又は一部分と標的核酸であるTMPRSS6の一部分との間の二重鎖領域の形成を必要とする。第1の鎖と標的配列との間に形成された最初の塩基対から始まり、第1の鎖と標的配列との間に形成された最後の塩基対で終わり、両端を含むものとして定義される、第1の鎖と二重鎖領域を形成する標的核酸の部分を、標的核酸配列、又は単に標的配列という。第1の鎖と第2の鎖との間に形成された二重鎖領域は、第1の鎖と標的配列との間に形成された二重鎖領域と同じである必要はない。つまり、第2の鎖は、標的配列とは異なる配列を有しうるが、第1の鎖は、第2の鎖及び標的配列の両方と二重鎖構造を形成することができなければならない。
【００８３】
第1の鎖と標的配列との間の相補性は、完全である(いずれの核酸にもヌクレオチドのミスマッチ又はヌクレオチドの付加/欠失がない)場合がある。
【００８４】
第1の鎖と標的配列との間の相補性は、完全でない場合もある。相補性は、約70%〜約100%でありうる。より明確に述べると、相補性は、少なくとも70%、80%、85%、90%、若しくは95%、又は中間値でありうる。
【００８５】
第1の鎖と標的配列の相補的な配列との間の同一性は、約75%〜約100%でありうる。より明確に述べると、相補性は、核酸がTMPRSS6の発現を低減又は阻害することが可能であることを条件として、少なくとも75%、80%、85%、90%、若しくは95%、又は中間値でありうる。
【００８６】
第1の鎖と標的配列との間の相補性が100%未満の核酸は、TMPRSS6の発現を、第1の鎖と標的配列との間の相補性が完全である核酸と同じレベルまで低減させることができうる。代替的には、完全な相補性を有する核酸によって達成される発現レベルの15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、又は100%であるレベルまでTMPRSS6の発現を低減させることができうる。
【００８７】
核酸は、それぞれ19〜25ヌクレオチド長である第1の鎖及び第2の鎖を含みうる。第1の鎖及び第2の鎖は、異なる長さであってもよい。
【００８８】
核酸は、15〜25ヌクレオチド対の長さであってよい。核酸は、17〜23ヌクレオチド対の長さであってよい。核酸は、17〜25ヌクレオチド対の長さであってよい。核酸は、23〜24ヌクレオチド対の長さであってよい。核酸は、19〜21ヌクレオチド対の長さであってよい。核酸は、21〜23ヌクレオチド対の長さであってよい。
【００８９】
核酸は、19〜25個のヌクレオチド塩基対からなる二重鎖領域を含みうる。二重鎖領域は、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個の塩基対からなっていてもよく、これらは隣接していてもよい。
【００９０】
核酸は、配列番号17の第1の鎖配列を含みうる。核酸は、配列番号18の第2の鎖配列を含みうる。本書において開示される核酸は、配列番号17及び配列番号18を含みうる。
【００９１】
更なる態様において、本書に記載される核酸は、細胞におけるTMPRSS6の発現を、核酸でありうる阻害剤の非存在下で観察されるレベルと比較して少なくとも15%低減させうる。前出の態様のいずれかの好ましい特徴はすべて、この態様にも適用される。特に、細胞におけるTMPRSS6の発現は、阻害剤(これは核酸でありうる)の非存在下で観察されるものと比べ、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、又はこれ未満及び中間値に低減しうる。
【００９２】
本開示は、提供される特定の配列番号と比較した場合に2つ以下の塩基の変化を含む、本書において開示される核酸のいずれかの第1の鎖又はいずれかの第2の鎖にも関する。例えば、いずれかの配列において、1つの塩基が変化してよい。
【００９３】
一実施形態において、この変化は、アンチセンス(第1の)鎖の最も5'側のヌクレオチドに生じてよい。一実施形態において、この変化は、アンチセンス(第1の)鎖の最も3'側のヌクレオチドに生じてよい。一実施形態において、この変化は、センス(第2の)鎖の最も5'側のヌクレオチドに生じてよい。一実施形態において、この変化は、センス(第2の)鎖の最も3'側のヌクレオチドに生じてよい。
【００９４】
一実施形態において、この変化は、アンチセンス(第1の)鎖の最も5'側のヌクレオチドに生じる。5'ヌクレオチドの塩基は、いずれの他のヌクレオチドに変化してもよい。5'末端ではA又はUが好ましく、本書においてA又はUは、本書において開示されるアンチセンス(第1の鎖)配列のすべてで可能性のある5'末端塩基として教示される。
【００９５】
オーバーハング
核酸は、両末端が平滑末端であるか、一方の末端にオーバーハングを有し、他方に平滑末端を有するか、又は両末端にオーバーハングを有することができる。
【００９６】
本書において使用される「オーバーハング」は、当技術分野におけるその通常かつ慣習的な意味を有する。すなわち、二本鎖核酸における相補鎖の末端ヌクレオチドを超えて伸びる核酸の一本鎖部分である。「平滑末端」という用語には、末端ヌクレオチドが塩基対合するかどうかにかかわらず、両方の鎖が同じ位置で終結する二本鎖核酸が含まれる。平滑末端における第1の鎖及び第2の鎖の末端ヌクレオチドは、塩基対合してもよい。平滑末端における第1の鎖及び第2の鎖の末端ヌクレオチドは、対合しなくてもよい。平滑末端における第1の鎖及び第2の鎖の2個の末端ヌクレオチドは、塩基対合してもよい。平滑末端における第1の鎖及び第2の鎖の2個の末端ヌクレオチドは、対合しなくてもよい。
【００９７】
核酸は、一方の末端にオーバーハングを有し、他方に平滑末端を有してもよい。核酸は、両末端にオーバーハングを有してもよい。核酸は、両末端が平滑末端であってもよい。核酸の末端は、第1の鎖の5'末端及び第2の鎖の3'末端、又は第1の鎖の3'末端及び第2の鎖の5'末端が平滑末端であってもよい。
【００９８】
核酸は、3'末端又は5'末端にオーバーハングを含んでよい。核酸は、第1の鎖に3'オーバーハングを有してもよい。核酸は、第2の鎖に3'オーバーハングを有してもよい。核酸は、第1の鎖に5'オーバーハングを有してもよい。核酸は、第2の鎖に5'オーバーハングを有してもよい。核酸は、第1の鎖の5'末端及び3'末端の両方にオーバーハングを有してもよい。核酸は、第2の鎖の5'末端及び3'末端の両方にオーバーハングを有してもよい。核酸は、第1の鎖に5'オーバーハングを有し、第2の鎖に3'オーバーハングを有してもよい。核酸は、第1の鎖に3'オーバーハングを有し、第2の鎖に5'オーバーハングを有してもよい。核酸は、第1の鎖に3'オーバーハングを有し、第2の鎖に3'オーバーハングを有してもよい。核酸は、第1の鎖に5'オーバーハングを有し、第2の鎖に5'オーバーハングを有してもよい。
【００９９】
第2の鎖又は第1の鎖の3'末端又は5'末端におけるオーバーハングの長さは、1、2、3、4、及び5ヌクレオチドからなる群から選択されうる。任意選択により、オーバーハングは、修飾されていても修飾されていなくてもよい1つ又は2つのヌクレオチドからなっていてもよい。
【０１００】
修飾
修飾されていないポリヌクレオチド、特にリボヌクレオチドは、細胞内のヌクレアーゼによる分解を受けやすい場合があり、したがって、修飾/修飾されたヌクレオチドが本書において開示される核酸に含まれていてよい。
【０１０１】
本書において開示される核酸の第2の鎖及び/又は第1の鎖における1個又は複数のヌクレオチドは、修飾されていてよい。
【０１０２】
本書において開示される核酸の修飾は、概して、天然のRNA分子に固有であるインビトロ及びインビボの安定性及び生物学的利用能を含むがこれらに限定されない潜在的な制限事項を克服するにあたり、強力なツールを提供する。本書においての開示に係る核酸は、化学修飾によって修飾されていてよい。修飾された核酸は、ヒトのインターフェロンの活性を誘導する可能性を最小限に抑えることもできる。修飾は、標的細胞に対する核酸の機能的送達を更に増強させることができる。本書において開示される修飾された核酸は、第1の鎖又は第2の鎖のいずれか又は両方の、1個又は複数の化学修飾されたリボヌクレオチドを含みうる。リボヌクレオチドは、塩基、糖、又はホスフェート部分の化学修飾を含みうる。リボ核酸は、核酸又は塩基の類似体での置換又はその挿入によって修飾されていてよい。
【０１０３】
修飾された核酸、特に修飾されたRNA等の開示が、「一次」核酸配列と、またその配列の修飾との両方の開示を提供することは理解されよう。したがって配列表は、一次核酸配列及び修飾された配列の両方に関する情報を提供する。疑義を避けるために付言すると、本開示は、修飾されていない核酸配列、部分的に修飾された配列、及び修飾が完全に定義されている任意の配列のすべてに関する。
【０１０４】
本書において開示される核酸の1個又は複数のヌクレオチドが修飾されていてよい。核酸は、少なくとも1個の修飾されたヌクレオチドを含みうる。修飾されたヌクレオチドは、第1の鎖上にあってもよい。修飾されたヌクレオチドは、第2の鎖内にあってもよい。修飾されたヌクレオチドは、二重鎖領域内にあってもよい。修飾されたヌクレオチドは、二重鎖領域の外、すなわち、一本鎖領域内にあってもよい。修飾されたヌクレオチドは、第1の鎖上にあってよく、二重鎖領域の外にあってよい。修飾されたヌクレオチドは、第2の鎖上にあってよく、二重鎖領域の外にあってよい。第1の鎖の3'末端ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであってよい。第2の鎖の3'末端ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであってよい。第1の鎖の5'末端ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであってよい。第2の鎖の5'末端ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであってよい。
【０１０５】
本書において開示される核酸は、1個の修飾されたヌクレオチドを有してもよく、又は本書において開示される核酸は、約2〜4個の修飾されたヌクレオチドを有してもよく、又は核酸は、約4〜6個の修飾されたヌクレオチド、約6〜8個の修飾されたヌクレオチド、約8〜10個の修飾されたヌクレオチド、約10〜12個の修飾されたヌクレオチド、約12〜14個の修飾されたヌクレオチド、約14〜16個の修飾されたヌクレオチド、約16〜18個の修飾されたヌクレオチド、約18〜20個の修飾されたヌクレオチド、約20〜22個の修飾されたヌクレオチド、約22〜24個の修飾されたヌクレオチド、24〜26個の修飾されたヌクレオチド、若しくは約26〜28個の修飾されたヌクレオチドを有してもよい。各事例において、該修飾されたヌクレオチドを含む核酸は、該修飾されたヌクレオチドを含まないことを除いては同じ核酸と比較して、その活性の少なくとも50%を保持する。核酸は、該修飾されたヌクレオチドを含まないことを除いては同じ核酸と比較して、その活性の55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、若しくは100%、又は中間値を保持する場合もあれば、該修飾されたヌクレオチドを含まない同じヌクレオチドの活性の100%超を有する場合もある。
【０１０６】
修飾されたヌクレオチドは、プリン又はピリミジンでありうる。プリンの少なくとも半分が修飾されていてよい。ピリミジンの少なくとも半分が修飾されていてよい。プリンのすべてが修飾されていてもよい。ピリミジンのすべてが修飾されていてもよい。修飾されたヌクレオチドは、3'末端デオキシ-チミン(dT)ヌクレオチド、2'-O-メチル修飾されたヌクレオチド、2'修飾されたヌクレオチド、2'-デオキシ修飾されたヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2'-アミノ修飾されたヌクレオチド、2'-アルキル修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、5'-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、5'ホスフェート又は5'ホスフェート模倣物を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドからなる群から選択されうる。
【０１０７】
核酸は、塩基が2-アミノアデノシン、2,6-ジアミノプリン、イノシン、ピリジン-4-オン、ピリジン-2-オン、フェニル、シュードウラシル、2,4,6-トリメトキシベンゼン、3-メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、5-アルキルシチジン(例えば、5-メチルシチジン)、5-アルキルウリジン(例えば、リボチミジン)、5-ハロウリジン(例えば、5-ブロモウリジン)、6-アザピリミジン、6-アルキルピリミジン(例えば6-メチルウリジン)、プロピン、キューオシン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、5'-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン、1-メチルアデノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、3-メチルシチジン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メチルカルボニルメチルウリジン、5-メチルオキシウリジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、ベータ-D-マンノシルキューオシン、ウリジン-5-オキシ酢酸、及び2-チオシチジンから選択される、修飾されたヌクレオチドを含むヌクレオチドを含みうる。
【０１０８】
本書において論述される核酸は、修飾されていないRNAだけでなく、例えば有効性を向上させるために修飾されているRNA、及びヌクレオシドサロゲートのポリマーを含む。修飾されていないRNAとは、核酸の成分、具体的には糖、塩基、及びホスフェート部分が、天然に存在するもの、例えばヒトの体内に天然に存在するものと同じか、又は本質的に同じである分子を指す。本書において使用される修飾されたヌクレオチドとは、核酸の成分、具体的には糖、塩基、及びホスフェート部分のうちの1つ又は複数が、天然に存在するものとは異なるヌクレオチドを指す。これらは修飾されたヌクレオチドと呼ばれるものの、当然ながらこれらは、修飾が原因で、ヌクレオチドではない分子、例えば、鎖間のハイブリダイゼーションを可能にする非リボリン酸構築物でリボリン酸骨格が置換されている、すなわち修飾されたヌクレオチドがリボリン酸骨格を模倣する、ポリヌクレオチド分子を含む。
【０１０９】
以下に記載する、例えば塩基、又はホスフェート部分、又はホスフェート部分の非結合Oの修飾といった、核酸内で生じる修飾の多くは、ポリヌクレオチド分子内で繰り返される。一部の事例において、修飾は、ポリヌクレオチド内の可能性のある位置/ヌクレオチドのすべてにおいて生じるが、多くの事例でこれは当てはまらない。修飾は、3'末端又は5'末端の位置のみで生じてもよいし、末端領域内、例えば末端ヌクレオチドの位置、又は鎖の最後の2、3、4、5、若しくは10ヌクレオチド内のみで生じてもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又は両方において生じてもよい。修飾は、本書において開示される核酸の二本鎖領域のみで生じてもよいし、又は本書において開示される核酸の一本鎖領域のみで生じてもよい。非結合O位におけるホスホロチオエート修飾は、一方又は両方の末端のみで生じてもよいし、末端領域内、例えば、末端ヌクレオチドの位置、又は鎖の最後の2、3、4、若しくは5ヌクレオチド内のみで生じてもよいし、或いは、二重鎖内及び/又は一本鎖領域内、特に両末端のみで生じてもよい。5'末端又は3'末端は、リン酸化されてもよい。
【０１１０】
本書において開示される核酸の安定性は、オーバーハングに特定の塩基を含めることにより、或いは一本鎖オーバーハングに、例えば5'若しくは3'のオーバーハングに、又は両方に、修飾されたヌクレオチドを含めることにより、増加させることができる。プリンヌクレオチドがオーバーハングに含まれてよい。3'又は5'オーバーハングにおける塩基のすべて又は一部は、修飾されていてよい。修飾には、リボース糖の2'OH基における修飾の使用、リボヌクレオチドの代わりのデオキシリボヌクレオチドの使用、及びホスフェート基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾が含まれうる。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【０１１１】
本書において開示されるdsRNA剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖における5'オーバーハング又は3'オーバーハングは、リン酸化されてもよい。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、2つのヌクレオチドを含有し、2つのヌクレオチド同士の間にホスホロチオエートがあり、この2つのヌクレオチドは同じであっても異なっていてもよい。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の3'末端に存在する。一実施形態において、この3'オーバーハングは、アンチセンス鎖に存在する。一実施形態において、この3'オーバーハングは、センス鎖に存在する。
【０１１２】
ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、核酸の化学修飾は、向上した特性を付与することができ、オリゴリボヌクレオチドのヌクレアーゼに対する安定性をより高くすることができる。
【０１１３】
本書において使用される、修飾された核酸は、
(i)非結合リン酸酸素の一方若しくは両方、及び/又は結合リン酸酸素の1つ若しくは複数(本書において開示される核酸の5'末端及び3'末端における場合であっても結合しているものとする)の変化、例えば置換、
(ii)リボース糖の構成成分、例えばリボース糖の2'ヒドロキシルの変化、例えば置換、
(iii)ホスフェート部分の「デホスホ」リンカーによる置換、
(iv)天然に存在する塩基の修飾又は置換、
(v)リボース-ホスフェート骨格の置換又は修飾、
(vi)RNAの3'末端又は5'末端の修飾、例えば、末端ホスフェート基の除去、修飾、若しくは置換、又はRNAの3'末端若しくは5'末端のいずれかに対する部分(例えば蛍光標識部分)のコンジュゲーション
のうちの1つ又は複数を含みうる。
【０１１４】
置換、修飾、変化という用語は、天然に存在する分子との差異を示す。
【０１１５】
特定の修飾を、以下により詳細に論述する。
【０１１６】
修飾されたホスフェート基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホン酸アルキル又はホスホン酸アリール、及びホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄によって置換されている。ホスフェート基における1つ、それぞれ、又は両方の非結合酸素は、独立して、S、Se、B、C、H、N、又はOR(Rはアルキル又はアリールである)のうちのいずれか1つでありうる。
【０１１７】
ホスフェートリンカーは、結合している酸素の、窒素での置換(架橋ホスホロアミデート)、硫黄での置換(架橋ホスホロチオエート)、及び炭素での置換(架橋メチレンホスホネート)により修飾されていてもよい。置換は、末端酸素において生じうる。非結合酸素の窒素での置換が可能である。
【０１１８】
修飾されたヌクレオチドは、糖基の修飾を含むことができる。2'ヒドロキシル基(OH)は、いくつかの異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾又は置換されていてよい。
【０１１９】
「オキシ」-2'ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ(OR、例えば、R=H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、又は糖);ポリエチレングリコール(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR;2'ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋により、同じリボース糖の4'炭素に連結している「ロックド」核酸(LNA);O-AMINE(AMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)及びアミノアルコキシ、O(CH2)nAMINE(例えば、AMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)が挙げられる。
【０１２０】
「デオキシ」修飾としては、水素、ハロ;アミノ(例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸);NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ)、-NHC(O)R(R=アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、又は糖)、シアノ;メルカプト;アルキル-チオ-アルキル;チオアルコキシ;並びに、例えばアミノ官能基で任意選択により置換されていてよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルが挙げられる。ある特定の実施形態の他の置換基としては、2'-メトキシエチル、2'-OCH3、2'-O-アリル、2'-C-アリル、及び2'-フルオロが挙げられる。
【０１２１】
糖基は、リボース中の対応する炭素のものとは反対の立体化学的構成を有する1つ又は複数の炭素を含有してもよい。したがって、修飾されたヌクレオチドは、アラビノース等の糖を含有しうる。
【０１２２】
修飾されたヌクレオチドは、C-I'における核酸塩基が欠失している「脱塩基」糖を含むこともできる。こうした脱塩基糖は、糖を構成する原子のうちの1つ又は複数に修飾を更に含有することができる。
【０１２３】
2'修飾は、1つ又は複数のホスフェートリンカー修飾(例えば、ホスホロチオエート)と組み合わせて使用されうる。
【０１２４】
ホスフェート基は、リンを含有しない連結因子によって置換されていてよい。
【０１２５】
ホスフェート基を置換することができる部分の例としては、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。ある特定の実施形態において、置換は、メチレンカルボニルアミノ及びメチレンメチルイミノ基を含みうる。
【０１２６】
ホスフェートリンカー及びリボース糖は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドによって置換されていてよい。
【０１２７】
例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸(PNA)ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。ある特定の実施形態において、PNAサロゲートが使用されうる。
【０１２８】
オリゴヌクレオチドの3'末端及び5'末端が修飾されていてよい。そのような修飾は、分子の3'末端、又は5'末端、又は両末端にあってよい。これらは、末端ホスフェート全体の修飾若しくは置換、又はホスフェート基の原子のうちの1つ若しくは複数の修飾若しくは置換を含みうる。例えば、オリゴヌクレオチドの3'末端及び5'末端は、標識部分、例えばフルオロフォア(例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3、又はCy5色素)又は保護基(例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、又はエステルに基づくもの)といった他の機能的分子実体にコンジュゲートされていてよい。機能的分子実体は、ホスフェート基及び/又はリンカーによって糖に結合させることができる。リンカーの末端原子は、ホスフェート基の結合原子、又は糖のC-3'若しくはC-5'O、N、S、若しくはC基に連結するか、或いはこれらを置換することができる。代替的には、リンカーは、ヌクレオチドサロゲート(例えば、PNA)の末端原子に連結するか、又はこれを置換することができる。これらのスペーサー又はリンカーは、例えば、-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH(例えば、n=3又は6)、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、又はモルホリノ、又はビオチン及びフルオレセイン試薬を含みうる。3'末端は、-OH基でありうる。
【０１２９】
末端修飾の他の例としては、色素、インターカレート剤(例えば、アクリジン類)、架橋剤(例えば、プソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン類(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性担体(例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン)及びペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロサイクルのEu3+錯体)が挙げられる。
【０１３０】
末端修飾は、活性を調節するため、又は分解に対する耐性を調節するためを含め、いくつかの理由で付加されうる。活性を調節するのに有用な末端修飾としては、ホスフェート又はホスフェート類似体での5'末端の修飾が挙げられる。本書において開示される核酸は、第1又は第2の鎖において、5'リン酸化されているか、又は5'プライム末端にホスホリル類似体を含む場合がある。5'-ホスフェート修飾には、RISC媒介性遺伝子サイレンシングと適合するものが含まれる。好適な修飾としては、5'-モノホスフェート((HO)2(O)P-O-5');5'-ジホスフェート((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5');5'-トリホスフェート((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5');5'-グアノシンキャップ(7-メチル化されているか又はメチル化されていない)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5');5'-アデノシンキャップ(Appp)、及び任意の修飾されているか若しくは修飾されていないヌクレオチドキャップ構造(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5');5'-モノチオホスフェート(ホスホロチオエート;(HO)2(S)P-O-5');5'-モノジチオホスフェート(ホスホロジチオエート;(HO)(HS)(S)P-O-5')、5'-ホスホロチオレート((HO)2(O)P-S-5');モノホスフェート、ジホスフェート、及びトリホスフェートで置換された酸素/硫黄の任意の更なる組み合わせ(例えば、5'-アルファ-チオトリホスフェート、5'-ガンマ-チオトリホスフェート等)、5'-ホスホルアミデート類((HO)2(O)P-NH-5'、(HO)(NH2)(O)P-O-5')、5'-アルキルホスホネート類(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えば、RP(OH)(O)-O-5'-、(OH)2(O)P-5'-CH2-)、5'ビニルホスホネート類、5'-アルキルエーテルホスホネート類(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2-)、エトキシメチル等、例えば、RP(OH)(O)-O-5'-)が挙げられる。
【０１３１】
本書において開示される核酸は、第1の鎖及び/又は第2の鎖の末端のうちの1つ又は複数に、1つ又は複数のホスホロチオエート修飾を含みうる。任意選択により、第1の鎖のそれぞれ又はいずれかの末端は、1つ、又は2つ、又は3つのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドを含んでよい。任意選択により、第2の鎖のそれぞれ又はいずれかの末端は、1つ、又は2つ、又は3つのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドを含んでよい。任意選択により、第1の鎖の両末端及び第2の鎖の5'末端は、2つのホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドを含んでよい。ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドとは、ヌクレオチドと隣接したヌクレオチドとの間の結合が、標準的なホスフェート基の代わりにホスホロチオエート基を含むことを意味する。
【０１３２】
末端修飾はまた、分布をモニタリングするのに有用である場合があり、そのような場合、付加される基は、フルオロフォア、例えば、フルオレセイン又はAlexa色素を含みうる。末端修飾はまた、取り込みを増強させるのに有用である場合があり、このための有用な修飾には、コレステロールが含まれる。末端修飾はまた、RNA剤を別の部分に架橋するのに有用である場合がある。
【０１３３】
ヌクレオチド
アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルは、RNAに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、向上した特性を有するRNAを提供するために、修飾又は置換されうる。例えば、これらの塩基、又は合成及び天然の核酸塩基(例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン(nubularine)、イソグアニシン、又はツベルシジン)、及び上記の修飾のうちのいずれか1つを用い、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドを調製することができる。代替的には、上記の塩基及び「ユニバーサル塩基」のうちのいずれかの置換又は修飾された類似体を用いてもよい。例としては、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-アミノアリルウラシル、8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン及びN-2、N-6及びO-6置換プリン、例えば2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3-デアザ-5-アザシトシン、2-アミノプリン、5-アルキルウラシル、7-アルキルグアニン、5-アルキルシトシン、7-デアザアデニン、N6,N6-ジメチルアデニン、2,6-ジアミノプリン、5-アミノ-アリル-ウラシル、N3-メチルウラシル、置換1,2,4-トリアゾール、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、5-メトキシウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウラシル、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N<4>-アセチルシトシン、2-チオシトシン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、N-メチルグアニン、又はO-アルキル化塩基が挙げられる。
【０１３４】
本書において使用される場合、「非対合ヌクレオチド類似体」という用語は、6デスアミノアデノシン(ネブラリン)、4-Me-インドール、3-ニトロピロール、5-ニトロインドール、Ds、Pa、N3-MeリボU、N3-MeリボT、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-エチル-dC、N3-Me dCを含むがこれらに限定されない、塩基対合しない部分を含むヌクレオチド類似体を意味する。一部の実施形態では、非塩基対合ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドである。他の実施形態では、デオキシリボヌクレオチドである。
【０１３５】
本書において使用される場合、「末端官能基」という用語は、限定されるものではないが、ハロゲン基、アルコール基、アミン基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、アルデヒド基、ケトン基、エーテル基を含む。
【０１３６】
ある特定の部分は、第1の鎖又は第2の鎖の5'末端に結合することができ、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾脱塩基リボース、及び2'Oアルキル修飾を含む脱塩基デオキシリボース部分;逆位脱塩基リボース及び脱塩基デオキシリボース部分並びにそれらの修飾、C6-イミノ-Pi;L-DNA及びL-RNAを含むミラーヌクレオチド;5'OMeヌクレオチド;及びヌクレオチド類似体、例えば4',5'-メチレンヌクレオチド;1-(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド;4'-チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド;5'-アミノ-アルキルホスフェート;1,3-ジアミノ-2-プロピルホスフェート、3-アミノプロピルホスフェート;6-アミノヘキシルホスフェート;12-アミノドデシルホスフェート;ヒドロキシプロピルホスフェート;1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド;アルファ-ヌクレオチド;トレオ-ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3',4'-セコヌクレオチド;3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド;3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5'-5'-逆位脱塩基部分;1,4-ブタンジオールホスフェート;5'-アミノ;並びに架橋又は非架橋メチルホスホネート及び5'-メルカプト部分を含む。
【０１３７】
本書において開示される核酸は、1個又は複数の逆位ヌクレオチド、例えば逆位チミジン又は逆位アデニンを含んでもよい(例えば、Takeiら、2002年、JBC、277巻(26号):23800〜06頁を参照されたい)。
【０１３８】
本書において使用される場合、遺伝子発現に関する「阻害する」、「下方制御する」、又は「低減する」という用語は、遺伝子の発現、又は1つ若しくは複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットをコードするRNA分子若しくは同等のRNA分子(例えば、mRNA)のレベル、又は1つ若しくは複数のタンパク質、タンパク質サブユニット、若しくはペプチドの活性が、本書において開示される核酸の非存在下で、又はヒト転写物に対する公知の相同性がないsiRNA分子(本書では非サイレンシング対照と呼ぶ)との関連で観察されるものを下回って低減することを意味する。そのような対照は、本書において開示される分子と類似した様式でコンジュゲート及び修飾され、同じルートで標的細胞に送達されうる。例えば、その発現は、本書において開示される核酸若しくはコンジュゲートされた核酸の非存在下で、又は非サイレンシング対照の存在下で、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、又は中間値まで低減しうる。
【０１３９】
本開示の核酸は、脱塩基ヌクレオチドを含みうる。本書において使用される「脱塩基」という用語は、1'位の塩基が欠如しているか、又はその代わりに他の化学基を有する部分、例えば3',3'-結合又は5',5'-結合デオキシ脱塩基リボース誘導体を指す。
【０１４０】
核酸は、第2の鎖及び/又は第1の鎖上に修飾されている1つ又は複数のヌクレオチドを含みうる。交互になったヌクレオチドが修飾されて、修飾されたヌクレオチドを形成していてもよい。
【０１４１】
交互とは、本書に記載される場合、規則的に続けて起こることを意味する。換言すると、交互とは、順番に繰り返し起こることを意味する。例えば、1個のヌクレオチドが修飾される場合、次の隣接するヌクレオチドは修飾されず、その次に隣接するヌクレオチドは修飾される等ということである。1個のヌクレオチドは、第1の修飾で修飾されていてよく、次の隣接するヌクレオチドは、第2の修飾で修飾されていてよく、その次に隣接するヌクレオチドは、第1の修飾で修飾される等ということである。ここで、第1の修飾と第2の修飾とは異なる。
【０１４２】
本書において開示される核酸の第1の鎖の奇数のヌクレオチドのうち、1個又は複数が修飾されていてよく、ここで第1の鎖は、5'から3'の順に付番されている。本書に記載される「奇数の」という用語は、2で割り切れない数を意味する。奇数の例は、1、3、5、7、9、11等である。本書において開示される核酸の第1の鎖の偶数のヌクレオチドのうち、1個又は複数が修飾されていてよく、ここで第1の鎖は、5'から3'の順に付番されている。本書に記載される「偶数の」という用語は、2で割り切れる数を意味する。偶数の例は、2、4、6、8、10、12、14等である。本書において開示される核酸の第2の鎖の奇数のヌクレオチドのうち、1個又は複数が修飾されていてよく、ここで第2の鎖は、3'から5'の順に付番されている。本書において開示される核酸の第2の鎖の偶数のヌクレオチドのうち、1個又は複数が修飾されていてよく、ここで第2の鎖は、3'から5'の順に付番されている。
【０１４３】
第1の鎖及び/又は第2の鎖上の1個又は複数のヌクレオチドは修飾されて、修飾されたヌクレオチドを形成していてもよい。第1の鎖の奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数が修飾されていてよい。第1の鎖の偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数は、少なくとも第2の修飾によって修飾されていてよく、ここで少なくとも第2の修飾は、1個又は複数の奇数のヌクレオチドに対する修飾とは異なる。1個又は複数の修飾された偶数のヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、1個又は複数の修飾された奇数のヌクレオチドのうちの少なくとも1個に隣接していてよい。
【０１４４】
本書において開示される核酸において、第1の鎖における複数の奇数のヌクレオチドが修飾されていてよい。第1の鎖における複数の偶数のヌクレオチドは、第2の修飾によって修飾されていてよい。第1の鎖は、共通の修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含みうる。第1の鎖は、第2の異なる修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含んでもよい。
【０１４５】
第2の鎖の奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数は、第1の鎖上の奇数のヌクレオチドの修飾とは異なる修飾によって修飾されていてよく、かつ/或いは、第2の鎖の偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数は、第1の鎖の奇数のヌクレオチドと同じ修飾によって修飾されていてよい。第2の鎖の1個又は複数の修飾された偶数のヌクレオチドのうちの少なくとも1個は、1個又は複数の修飾された奇数のヌクレオチドに隣接していてよい。第2の鎖の複数の奇数のヌクレオチドは、共通の修飾によって修飾されていてよく、かつ/又は、複数の偶数のヌクレオチドは、第1の鎖の奇数のヌクレオチド上に存在する同じ修飾によって修飾されていてよい。第2の鎖上の複数の奇数のヌクレオチドは、第2の修飾によって修飾されていてよく、ここで第2の修飾は、第1の鎖の奇数のヌクレオチドの修飾とは異なる。
【０１４６】
第2の鎖は、共通の修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含んでよく、この修飾は、第1の鎖の奇数のヌクレオチドの修飾とは異なる第2の修飾でありうる。
【０１４７】
本書において開示される核酸において、第1の鎖における奇数のヌクレオチドのそれぞれ、及び第2の鎖における偶数のヌクレオチドのそれぞれは、共通の修飾で修飾されていてよく、第1の鎖における偶数のヌクレオチドのそれぞれは、第2の修飾で修飾されていてよく、第2の鎖における奇数のヌクレオチドのそれぞれは、第2の修飾で修飾されていてよい。
【０１４８】
本書において開示される核酸では、第1の鎖の修飾されたヌクレオチドが、第2の鎖の修飾されていないヌクレオチド又は異なって修飾されたヌクレオチドに対して、少なくとも1ヌクレオチドだけシフトしていてよい。
【０１４９】
第1の鎖において、奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、修飾されていてよく、第2の鎖において、偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、修飾されていてよい。いずれか又は両方の鎖において、交互になったヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、第2の修飾によって修飾されていてよい。第1の鎖において、偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、修飾されていてよく、第2の鎖において、偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、修飾されていてよい。いずれか又は両方の鎖において、交互になったヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、第2の修飾によって修飾されていてよい。第1の鎖において、奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、修飾されていてよく、第2の鎖において、奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数は、共通の修飾によって修飾されていてよい。いずれか又は両方の鎖において、交互になったヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、第2の修飾によって修飾されていてよい。第1の鎖において、偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、修飾されていてよく、第2の鎖において、奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、共通の修飾によって修飾されていてよい。いずれか又は両方の鎖において、交互になったヌクレオチドのうちの1個又は複数又はそれぞれは、第2の修飾によって修飾されていてよい。
【０１５０】
本書において開示される核酸は、鎖の一方又は両方に、交互になった修飾の少なくとも2つの領域を含む、一本鎖又は二本鎖の構築物を含みうる。これらの交互になった領域は、最大約12個のヌクレオチドを含みうるが、好ましくは、約3個〜約10個のヌクレオチドを含む。交互になったヌクレオチドの領域は、本書において開示される核酸の一方又は両方の鎖の末端に位置しうる。核酸は、4〜約10ヌクレオチドの交互になったヌクレオチドを各末端(3'及び5')に含んでよく、これらの領域は、修飾されていない、又は異なって修飾された、若しくは共通して修飾された、約5個〜約12個の隣接するヌクレオチドによって分離されていてよい。
【０１５１】
第1の鎖の奇数のヌクレオチドは、修飾されていてよく、偶数のヌクレオチドは、第2の修飾で修飾されていてよい。第2の鎖は、共通の修飾で修飾されている隣接したヌクレオチドを含んでよく、この修飾は、第1の鎖の奇数のヌクレオチドの修飾と同じであってよい。第2の鎖の1個又は複数のヌクレオチドも、第2の修飾で修飾されていてよい。第2の修飾を有する1個又は複数のヌクレオチドは、互いに、また、第1の鎖の奇数のヌクレオチドの修飾と同じである修飾を有するヌクレオチドに隣接していてよい。第1の鎖は、3'末端及び5'末端における2個のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含んでもよい。第2の鎖は、5'末端における2個のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含んでよい。第2の鎖は、5'末端においてリガンドにコンジュゲートされていてもよい。
【０１５２】
本書において開示される核酸は、共通の修飾で修飾されている隣接したヌクレオチドを含む第1の鎖を含みうる。そのようなヌクレオチドのうちの1個又は複数は、第2の修飾で修飾されていてよい1個又は複数のヌクレオチドに隣接していてよい。第2の修飾を有する1個又は複数のヌクレオチドは、隣接していてよい。第2の鎖は、共通の修飾で修飾されている隣接したヌクレオチドを含んでよく、この修飾は、第1の鎖の1個又は複数のヌクレオチドの修飾のうちの1つと同じであってよい。第2の鎖の1個又は複数のヌクレオチドも、第2の修飾で修飾されていてよい。第2の修飾を有する1個又は複数のヌクレオチドは、隣接していてよい。第1の鎖は、5'末端及び3'末端における2個のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含んでもよい。第2の鎖は、3'末端における2個のヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含んでよい。第2の鎖は、5'末端においてリガンドにコンジュゲートされていてもよい。
【０１５３】
第1の鎖では5'から3'の順に、そして第2の鎖では3'から5'の順に、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、及び25と付番されたヌクレオチドは、第1の鎖における修飾によって修飾されていてよい。2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、及び24と付番されたヌクレオチドは、第1の鎖における第2の修飾によって修飾されていてよい。1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23と付番されたヌクレオチドは、第2の鎖における修飾によって修飾されていてよい。2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、及び24と付番されたヌクレオチドは、第2の鎖における第2の修飾によって修飾されていてよい。本開示の核酸において、ヌクレオチドは、第1の鎖では5'から3'の順に、そして第2の鎖では3'から5'の順に付番されている。
【０１５４】
2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、及び24と付番されたヌクレオチドは、第1の鎖における修飾によって修飾されていてよい。1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23と付番されたヌクレオチドは、第1の鎖における第2の修飾によって修飾されていてよい。1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23と付番されたヌクレオチドは、第2の鎖における修飾によって修飾されていてよい。2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、及び24と付番されたヌクレオチドは、第2の鎖における第2の修飾によって修飾されていてよい。
【０１５５】
明らかに、第1の鎖及び/又は第2の鎖が25ヌクレオチド長よりも短い場合、例えば19ヌクレオチド長である場合、修飾対象となる20、21、22、23、24、及び25と付番されたヌクレオチドは存在しない。当業者であれば、上記の説明がより短い鎖に適切に適用されることを理解する。
【０１５６】
第1の鎖上の1個又は複数の修飾されたヌクレオチドは、共通の修飾を有する第2の鎖上の修飾されたヌクレオチドと対合しうる。第1の鎖上の1個又は複数の修飾されたヌクレオチドは、異なる修飾を有する第2の鎖上の修飾されたヌクレオチドと対合してもよい。第1の鎖上の1個又は複数の修飾されたヌクレオチドは、第2の鎖上の修飾されていないヌクレオチドと対合してもよい。第2の鎖上の1個又は複数の修飾されたヌクレオチドは、第1の鎖上の修飾されていないヌクレオチドと対合してもよい。換言すると、交互になったヌクレオチドは、2本の鎖上でアラインされうる。例えば、第2の鎖の交互になった領域におけるすべての修飾が、第1の鎖における同一の修飾と対合するか、又は代替的には、修飾は、他方の鎖における異種の修飾(すなわち、第2の又は更なる修飾)と対合する1本の鎖の交互になった領域における共通の修飾を有する1個のヌクレオチドによって相殺されうる。別の選択肢は、鎖のそれぞれに異種の修飾を有することである。
【０１５７】
第1の鎖における修飾は、共通する修飾されたヌクレオチドが互いと対合しないように、第2の鎖上の修飾されたヌクレオチドに対して1個のヌクレオチドだけシフトしていてよい。
【０１５８】
修飾及び/又は複数の修飾は、それぞれ個別に、3'末端デオキシ-チミン、2'-O-メチル、2'-デオキシ修飾、2'-アミノ修飾、2'-アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホルアミデート修飾、5'-ホスホロチオエート基修飾、5'ホスフェート修飾若しくは5'ホスフェート模倣物修飾、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群から選択されてよく、かつ/又は、修飾されたヌクレオチドは、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、若しくは非天然塩基を含むヌクレオチドのうちいずれか1つであってよい。
【０１５９】
少なくとも1つの修飾は、2'-O-メチルであってよく、かつ/又は、少なくとも1つの修飾は、2'-Fであってよい。
【０１６０】
本書に記載される更なる修飾が第1の鎖及び/又は第2の鎖に存在してもよい。
【０１６１】
本発明および開示の説明全体を通して、「同じ又は共通の修飾」とは、メチル基又はフルオロ基等の基で修飾されたA、G、C、又はUのいずれにしろ、任意のヌクレオチドに対するものと同じ修飾を意味する。同じヌクレオチドにおける同じ付加を意味するものとは解釈されない。例えば、2'F-dU、2'F-dA、2'F-dC、2'F-dGはすべて、同じ又は共通の修飾であるとみなされ、2'-OMe-rU、2'-OMe-rA、2'-OMe-rC、2'-OMe-rGも同様である。2'F修飾は、2'OMe修飾とは異なる修飾である。
【０１６２】
本開示の一部の代表的な修飾された核酸配列を例に示す。これらの例は代表例であり、限定を意図するものではない。
【０１６３】
好ましくは、核酸は、2'-O-メチル修飾及び2'-F修飾を含む群からそれぞれ個別に選択される、修飾及び第2又は更なる修飾を含みうる。核酸は、第1の修飾でありうる2'-O-メチル(2'OMe)である修飾と、2'-Fである第2の修飾とを含んでよい。本書において開示される核酸は、各鎖又は両方の鎖のそれぞれ又は任意の末端における1個、2個、又は3個の末端ヌクレオチドにおいて、又はそれらの間に存在しうる、ホスホロチオエート修飾及び/又はデオキシ修飾を含んでもよい。
【０１６４】
本開示は、更なる態様として、TMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、配列番号317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、若しくは442、
又は配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、67、69、71、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、85、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、270、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、309、311、312、313、314、若しくは315、例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、若しくは215のヌクレオチド配列を含み、
第1の鎖のヌクレオチドは、奇数のヌクレオチドが第1の修飾によって修飾され、かつ偶数のヌクレオチドが第2の修飾によって修飾されており、第2の鎖のヌクレオチドは、偶数のヌクレオチドが第3の修飾によって修飾され、奇数のヌクレオチドが第4の修飾によって修飾されており、少なくとも第1の修飾が、第2の修飾とは異なり、第3の修飾が、第4の修飾とは異なる、
核酸を提供する。第3及び第1の修飾は、同じであっても異なっていてもよく、第2及び第4の修飾は、同じであっても異なっていてもよい。第1及び第2の修飾は、互いと異なっていてよく、第3及び第4の修飾は、互いと異なっていてよい。
【０１６５】
更なる態様では、TMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第2の鎖が、配列番号318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、若しくは443のヌクレオチド配列、
又は配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、68、70、72、75、84、86、89、100、101、102、103、104、105、106、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、226、228、230、232、234、236、238、240、242、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、310、312、314、若しくは316のヌクレオチド配列、例えば、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、若しくは216のヌクレオチド配列を含み、
第1の鎖のヌクレオチドは、奇数のヌクレオチドが第1の修飾によって修飾され、かつ偶数のヌクレオチドが第2の修飾によって修飾されており、第2の鎖のヌクレオチドは、偶数のヌクレオチドが第3の修飾によって修飾され、奇数のヌクレオチドが第4の修飾によって修飾されており、少なくとも第1の修飾が、第2の修飾とは異なり、第3の修飾が、第4の修飾とは異なる、
核酸が提供される。第3及び第1の修飾は、同じであっても異なっていてもよく、第2及び第4の修飾は、同じであっても異なっていてもよい。第1及び第2の修飾は、互いと異なっていてよく、第3及び第4の修飾は、互いと異なっていてよい。好適には、第2の鎖のヌクレオチド配列は、第1の鎖と相補的である。第1の鎖のヌクレオチドは、奇数のヌクレオチドが第1の修飾によって修飾され、かつ偶数のヌクレオチドが第2の修飾で修飾されていてよく、第2の鎖は、奇数のヌクレオチドが第2の修飾で修飾され、偶数のヌクレオチドが第1の修飾で修飾されていてよい。第1の修飾は、2'OMeであってよく、第2の修飾は、2'Fであってよい。第1の鎖は、配列番号17のヌクレオチド配列を含んでよく、かつ/又は、第2の鎖は、配列番号18のヌクレオチド配列を含んでよい。修飾は、table 1(表18)に提示するものでありうる。
【０１６６】
一態様では、核酸の第1の鎖の偶数のヌクレオチドすべてが第1の修飾によって修飾されており、第1の鎖の奇数のヌクレオチドすべてが第2の修飾によって修飾されており、第1の鎖のヌクレオチド11〜13に対応する位置の第2の鎖のヌクレオチドすべてが第4の修飾によって修飾されており、第1の鎖のヌクレオチド11〜13に対応するヌクレオチド以外の第2の鎖のヌクレオチドすべてが第3の修飾によって修飾されており、ここで第1及び第4の修飾は好ましくは2'-Fであり、第2及び第3の修飾は好ましくは2'-OMeである。
【０１６７】
本書において開示される核酸は、リガンドにコンジュゲートされていてよい。
【０１６８】
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有しうる。エンドソーム溶解性リガンドは、エンドソームの溶解、及び/又は、本発明の組成物若しくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解性リガンドは、pH依存性膜活性及び膜融合性を示すポリアニオン性ペプチド又はペプチド模倣薬でありうる。エンドソーム溶解性成分は、pHの変化に応答して電荷の変化又はプロトン化を受ける化学基を含有しうる。エンドソーム溶解性成分は、直鎖状であっても分岐状であってもよい。
【０１６９】
リガンドは、例えば取り込みを増強させるための治療用修飾因子、例えば分布をモニタリングするための診断用化合物又はレポーター基、架橋剤、及びヌクレアーゼ耐性付与部分を含みうる。一般的な例としては、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、及びペプチド模倣物が挙げられる。リガンドとしては、タンパク質、炭水化物、又は脂質等の天然に存在する物質を挙げることができる。リガンドは、組換え又は合成の分子であってよい。
【０１７０】
リガンドとしては、標的化基、例えば、細胞標的化剤又は組織標的化剤を挙げることもできる。標的化リガンドは、レクチン、糖タンパク質、脂質、又はタンパク質でありうる。
【０１７１】
リガンドの他の例としては、色素、インターカレート剤、架橋剤、ポルフィリン、多環式芳香族炭化水素、人工エンドヌクレアーゼ若しくはキレート剤、親油性分子、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG、MPEG、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン、輸送/吸収促進剤、合成リボヌクレアーゼ、又はイミダゾールクラスターが挙げられる。
【０１７２】
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質又はペプチドであってよい。リガンドは、ホルモン又はホルモン受容体であってもよい。これらには、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、又は補因子も含まれうる。
【０１７３】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することにより、核酸の細胞への取り込みを増加させうる薬物等の物質であってよい。
【０１７４】
リガンドは、炎症応答を活性化させることにより、核酸の細胞への取り込みを増加させうる。そのようなリガンドとしては、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-アルファ)、インターロイキン-1ベータ、又はガンマインターフェロンが挙げられる。
【０１７５】
リガンドは、脂質又は脂質に基づく分子でありうる。脂質又は脂質に基づく分子は、好ましくは、血清タンパク質に結合する。好ましくは、脂質に基づくリガンドは、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合する。脂質又は脂質に基づく分子は、コンジュゲートの分解に対する耐性を増加させ、標的細胞への標的化若しくは輸送を増加させ、かつ/又は血清タンパク質への結合を調整することができる。脂質に基づくリガンドは、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節するために使用されうる。
【０１７６】
リガンドは、ステロイドでありうる。好ましくは、リガンドは、コレステロール又はコレステロール誘導体である。
【０１７７】
リガンドは、標的細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンでありうる。例示的なビタミンとしては、ビタミンA、E、K、及びビタミンB群が挙げられる。ビタミンは、増殖性細胞によって取り込まれることが可能であり、これは、悪性又は非悪性の腫瘍細胞といった細胞に核酸を送達するために有用でありうる。
【０１７８】
リガンドは、ヘリカル細胞透過剤等の細胞透過剤でありうる。好ましくは、そのような薬剤は両親媒性である。
【０１７９】
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣薬でありうる。ペプチド模倣薬は、天然のペプチドと同様の定義された三次元構造にフォールディングすることが可能な分子である。ペプチド又はペプチド模倣薬リガンドは、天然に存在するペプチド若しくは修飾されたペプチド、又は両方を含みうる。ペプチド又はペプチド模倣薬は、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチドであってよい。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束性ペプチド、又は架橋ペプチドでありうる。ペプチド部分は、疎水性膜移行配列を含みうる。ペプチド部分は、細胞膜を横断してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質等の大きな極性分子を運ぶことが可能なペプチド、例えば、HIV Tatタンパク質の配列(GRKKRRQRRRPPQ)及びショウジョウバエ(Drosophila)のアンテナペディアタンパク質(RQIKIWFQNRRMKWKK)でありうる。好ましくは、ペプチド又はペプチド模倣薬は、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)-ペプチドである。
【０１８０】
リガンドは、例えば、微生物細胞又は哺乳動物細胞を投下することが可能な細胞透過ペプチドでありうる。
【０１８１】
リガンドは、薬物動態調節因子でありうる。薬物動態調節因子は、親油性物質(lipophiles)、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、PEG、ビタミン等でありうる。
【０１８２】
2つ以上のリガンドが存在する場合、これらのリガンドは、すべてが同じ特性を有してもよいし、すべてが異なる特性を有してもよいし、又は一部のリガンドが同じ特性を有し、その他が異なる特性を有してもよい。例えば、リガンドは、標的化特性を有するか、エンドソーム溶解活性を有するか、又はPK調節特性を有する場合がある。好ましい一実施形態では、リガンドはすべて異なる特性を有する。
【０１８３】
リガンドは、3'末端、5'末端、及び/又は末端位で核酸に結合していてもよい。好ましくは、リガンドは、介在するテザー又はリンカーによって核酸に結合している。
【０１８４】
一部の実施形態では、核酸は二本鎖核酸である。二本鎖核酸において、リガンドは、一方又は両方の鎖に結合していてよい。一部の実施形態では、二本鎖核酸は、センス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。他の実施形態では、二本鎖核酸は、アンチセンス鎖にコンジュゲートされたリガンドを含有する。
【０１８５】
リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合にコンジュゲートされていてよい。プリン核酸塩基又はそれらの誘導体へのコンジュゲーションは、環内原子及び環外原子を含め、いずれの位置で生じてもよい。ピリミジンヌクレオチド又はそれらの誘導体へのコンジュゲーションも、いずれの位置で生じてもよい。ヌクレオシドの糖部分へのコンジュゲーションは、任意の炭素原子において生じうる。ヌクレオシド間結合へのコンジュゲーションは、リン含有結合のリン原子において、又はリン原子に結合した酸素、窒素、若しくは硫黄原子において生じうる。アミン又はアミドを含有するヌクレオシド間結合については、コンジュゲーションは、アミン若しくはアミドの窒素原子において、又は隣接した炭素原子に対して生じうる。
【０１８６】
リガンドは、典型的には、炭水化物、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、又は多糖である。リガンドは、リンカーによって核酸にコンジュゲートされていてよい。リンカーは、一価、二価、又は三価の分岐状リンカーでありうる。
【０１８７】
オリゴヌクレオチド、特に本書において開示される二本鎖核酸を、細胞にインビボで効率的に送達することは重要であり、特異的な標的化、並びに細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的な保護を必要とする。特異的な標的化を達成する1つの方法は、リガンドを核酸にコンジュゲートさせることである。リガンドは、必要とされる標的部位に核酸の標的を定めるのに役立つ。コンジュゲートされた分子が、異なる受容体によって媒介されるエンドサイトーシス経路又は機能的に類似するプロセス等の機構によって標的細胞に取り込まれるように、所望の受容体分子に適切なリガンドをコンジュゲートさせる必要がある。標的化部分又はリガンドは、特定の受容体を標的とすることが可能な任意の部分又はリガンドでありうる。
【０１８８】
例えば、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP-R)は、肝細胞において非常に豊富な高容量の受容体である。三本触角性クラスターグリコシドの最初の開示のうちの1つは、米国特許第5,885,968号においてであった。3つのGalNAcリガンドを有し、ホスフェート基を含むコンジュゲートは公知であり、Dubberら(2003年、Bioconjug. Chem、2003年1月〜2月、14巻(1号):239〜46頁)に記載されている。ASGP-Rは、N-アセチル-D-ガラクトシルアミン(GalNAc)に対し、D-Galよりも50倍高い親和性を示す。
【０１８９】
グリコシル化されたタンパク質又は他のオリゴ糖の末端β-ガラクトシルサブユニットを特異的に認識する(Weigel, P.Hら、Biochim. Biophys. Acta.、2002年9月19日;1572巻(2〜3号):341〜63頁)、レクチン(アシアロ糖タンパク質受容体;ASGPR)を発現する肝細胞は、ガラクトース又はガラクトースアミンの薬物物質との共有結合により、薬物の標的を肝臓に定めるために使用されうる(Ishibashi,Sら、J Biol. Chem.、1994年11月11日;269巻(45号):27803〜6頁))。更に、結合親和性は、標的化ユニットの反復によって達成される多価性効果により、著しく増加しうる(E. A. L. Biessenら、1995年)。
【０１９０】
ASGPRは、末端β-ガラクトシルを含有する糖タンパク質の活発なエンドソーム輸送の媒介物であり、したがってASGPRは、細胞内に送達される必要がある核酸のような薬物候補の標的を定めた送達に非常に好適である(Akincら)。
【０１９１】
リガンドは、二価若しくは三価、又は四量体の分岐状リンカーでありうるリンカーを介し、本書において開示される核酸に結合していてよい。
【０１９２】
リガンドと呼ばれることもある糖類は、標的細胞上の少なくとも1種の受容体に対する親和性を有するように選択されうる。特に、受容体は、哺乳動物の肝臓細胞の表面上にある、例えば、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体(ASGP-R)である。
【０１９３】
糖類は、N-アセチルガラクトースアミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミン、及びフコースから選択されうる。糖類は、N-アセチルガラクトースアミン(GalNAc)でありうる。
【０１９４】
したがって、本開示において使用されるリガンドは、(i)1つ又は複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分及びそれらの誘導体、並びに(ii)リンカーを含んでよく、リンカーは、先行する態様のいずれかに定義された配列にGalNAc部分をコンジュゲートさせる。リンカーは、二価、又は三価、又は四価の分岐構造でありうる。ヌクレオチドは、本書に定義されるように修飾されていてよい。
【０１９５】
「GalNAc」とは、文献では一般的にN-アセチルガラクトサミンと呼ばれる、2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-D-ガラクトピラノースを指す。「GalNAc」又は「N-アセチルガラクトースアミン」への言及は、β形態:2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノースと、α形態:2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノースとの両方を含む。β形態:2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノースと、α形態:2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノースとの両方は、交換可能に使用されうる。好ましくは、本書において開示される化合物は、β形態の2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノースを含む。
【０１９６】
リガンドは、GalNAcを含みうる。
【０１９７】
リガンドは、式Iの化合物:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
[式中、
Sは、糖類を表し、ここで糖類は、N-アセチルガラクトサミンであり、
X1は、C3〜C6アルキレン又は(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-[式中、mは1、2、又は3である]であり、
Pは、ホスフェート又は修飾されたホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり、
X2は、アルキレン、又は式(-CH2)n-O-CH2-[式中、n=1〜6である]のアルキレンエーテルであり、
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、架橋ユニットを表し、
本書において開示される核酸は、ホスフェート又は修飾されたホスフェート(好ましくはチオホスフェート)を介してX3にコンジュゲートされている]
を含みうる。
【０１９８】
式I中、分岐ユニット「A」は、3つの糖類部分に適応するために3つに分岐する。分岐ユニットは、リガンド及び核酸の残りの拘束された(tethered)部分に共有結合する。分岐ユニットは、アルキル基、アミド基、ジスルフィド基、ポリエチレングリコール基、エーテル基、チオエーテル基、及びヒドロキシアミノ基から選択される基を含む、分岐状脂肪族基を含みうる。分岐ユニットは、アルキル基及びエーテル基から選択される基を含みうる。
【０１９９】
分岐ユニットAは、
【化７】
2021531029.tif 000018
(式中、各A1は、独立して、O、S、C=O、又はNHを表し、
各nは、独立して、1〜20の整数を表す)
から選択される構造を有することができる。
【０２００】
分岐ユニットは、
【化８】
2021531029.tif 000019
(式中、各A1は、独立して、O、S、C=O、又はNHを表し、
各nは、独立して、1〜20の整数を表す)
から選択される構造を有することができる。
【０２０１】
分岐ユニットは、
【化９】
2021531029.tif 000020
(式中、A1は、O、S、C=O、又はNHであり、
各nは、独立して、1〜20の整数を表す)
から選択される構造を有することができる。
【０２０２】
分岐ユニットは、
【化１０】
2021531029.tif 000021
の構造を有してもよい。
【０２０３】
分岐ユニットは、
【化１１】
2021531029.tif 000022
の構造を有してもよい。
【０２０４】
分岐ユニットは、
【化１２】
2021531029.tif 000023
の構造を有してもよい。
【０２０５】
任意選択により、分岐ユニットは、炭素原子のみからなる。
【０２０６】
式Iの化合物の「X3」部分は、架橋ユニットである。架橋ユニットは直鎖状であり、分岐ユニット及び核酸に共有結合している。
【０２０７】
X3は、-C1〜C20アルキレン-、-C2〜C20アルケニレン-、式-(C1〜C20アルキレン)-O-(C1〜C20アルキレン)-のアルキレンエーテル、-C(O)-C1〜C20アルキレン-、-C0〜C4アルキレン(Cy)C0〜C4アルキレン-[式中、Cyは、置換又は未置換の、5員又は6員のシクロアルキレン環、アリーレン環、ヘテロシクリレン環、又はヘテロアリーレン環を表す]、-C1〜C4アルキレン-NHC(O)-C1〜C4アルキレン-、-C1〜C4アルキレン-C(O)NH-C1〜C4アルキレン-、-C1〜C4アルキレン-SC(O)-C1〜C4アルキレン-、-C1〜C4アルキレン-C(O)S-C1〜C4アルキレン-、-C1〜C4アルキレン-OC(O)-C1〜C4アルキレン-、-C1〜C4アルキレン-C(O)O-C1〜C4アルキレン-、及び-C1〜C6アルキレン-S-S-C1〜C6アルキレン-から選択されうる。
【０２０８】
X3は、式-(C1〜C20アルキレン)-O-(C1〜C20アルキレン)-のアルキレンエーテルでありうる。X3は、式-(C1〜C20アルキレン)-O-(C4〜C20アルキレン)-[式中、該(C4〜C20アルキレン)は、Zに結合している]のアルキレンエーテルでありうる。X3は、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-、及び-CH2-O-C8H16-、特に-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-、及び-CH2-O-C8H16-(各事例において、-CH2-基はAに結合している)からなる群から選択することができる。
【０２０９】
リガンドは、式(II)の化合物:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
[式中、
Sは、糖類を表し、
X1は、C3〜C6アルキレン又は(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-[式中、mは1、2、又は3である]であり、
Pは、ホスフェート又は修飾されたホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり、
X2は、C1〜C8アルキレンであり、
Aは、
【化１３】
2021531029.tif 000024
から選択される分岐ユニットであり、
X3は、架橋ユニットであり、
本書において開示される核酸は、ホスフェート又は修飾されたホスフェート(好ましくはチオホスフェート)を介してX3にコンジュゲートされている]
を含みうる。
【０２１０】
分岐ユニットAは、
【化１４】
2021531029.tif 000025
の構造を有しうる。
【０２１１】
分岐ユニットAは、
【化１５】
2021531029.tif 000026
(式中、X3は、窒素原子に結合している)
の構造を有しうる。
【０２１２】
X3は、C1〜C20アルキレンでありうる。好ましくは、X3は、-C3H6-、-C4H8-、-C6H12-、及び-C8H16-、特に-C4H8-、-C6H12-、及び-C8H16-からなる群から選択される。
【０２１３】
リガンドは、式(III)の化合物:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
[式中、
Sは、糖類を表し、
X1は、C3〜C6アルキレン又は(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-[式中、mは1、2、又は3である]であり、
Pは、ホスフェート又は修飾されたホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり、
X2は、式-C3H6-O-CH2-のアルキレンエーテルであり、
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、-CH2-O-CH2-、-CH2-O-C2H4-、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-、及び-CH2-O-C8H16-(各事例において、-CH2-基はAに結合している)からなる群から選択される式のアルキレンエーテルであり、
Zは、核酸であり、
X3とZとの間の結合は、ホスフェート又はチオホスフェートである]
を含みうる。
【０２１４】
分岐ユニットは、炭素を含みうる。好ましくは、分岐ユニットは炭素である。
【０２１５】
X3は、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-、及び-CH2-O-C8H16-からなる群から選択することができる。好ましくは、X3は、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-、及び-CH2-O-C8H16からなる群から選択されうる。
【０２１６】
上記態様のいずれについても、Pが修飾されたホスフェート基を表す場合、Pは、
【化１６】
2021531029.tif 000027
によって表すことができ、式中、Y1及びY2は、それぞれ独立して、=O、=S、-O-、-OH、-SH、-BH3、-OCH2CO2、-OCH2CO2Rx、-OCH2C(S)ORx、及び-ORXを表し、ここでRxは、C1〜C6アルキルを表し、かつ、
【化１７】
2021531029.tif 000028
は、化合物の残部への結合を示す。
【０２１７】
修飾されたホスフェートとは、酸素のうちの1つ又は複数が置換されているホスフェート基を意味する。修飾されたホスフェート基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホン酸アルキル又はホスホン酸アリール、及びホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄によって置換されている。ホスフェート基における1つ、それぞれ、又は両方の非結合酸素は、独立して、S、Se、B、C、H、N、又はOR(Rはアルキル又はアリールである)のうちのいずれか1つでありうる。
【０２１８】
ホスフェートリンカーは、結合している酸素の、窒素での置換(架橋ホスホロアミデート)、硫黄での置換(架橋ホスホロチオエート)、及び炭素での置換(架橋メチレンホスホネート)により修飾されていてもよい。置換は、末端酸素において生じうる。非結合酸素の窒素での置換が可能である。
【０２１９】
例えば、Y1は、-OHを表す場合があり、Y2は、=O若しくは=Sを表す場合がある、又は、
Y1は、-O-を表す場合があり、Y2は、=O若しくは=Sを表す場合があり、
Y1は、=Oを表す場合があり、Y2は、-CH3、-SH、-ORX、若しくは-BH3を表す場合があり、
Y1は、=Sを表す場合があり、Y2は、-CH3、ORX、若しくは-SHを表す場合がある。
【０２２０】
当業者には、ある特定の事例において、Y1とY2との間の非局在化があることが理解されよう。
【０２２１】
好ましくは、修飾されたホスフェート基は、チオホスフェート基である。チオホスフェート基としては、ビチオホスフェート(すなわち、Y1が=Sを表し、Y2が-S-を表す場合)、及びモノチオホスフェート(すなわち、Y1が-O-を表し、Y2が=Sを表す場合、又はY1が=Oを表し、Y2が-S-を表す場合)が挙げられる。好ましくは、Pはモノチオホスフェートである。本発明者らは、ホスフェート基の代わりにチオホスフェート基を有するコンジュゲートが、インビボで向上した効力及び作用持続時間を有することを見出した。
【０２２２】
Pは、エチルホスフェート(すなわち、Y1が=Oを表し、Y2がOCH2CH3を表す場合)であってもよい。
【０２２３】
糖類は、標的細胞上の少なくとも1種の受容体に対する親和性を有するように選択されうる。特に、受容体は、哺乳動物の肝臓細胞の表面上にある、例えば、肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体(ASGP-R)である。
【０２２４】
上記態様のいずれについても、糖類は、ガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミン、及びフルクトースのうちの1つ又は複数を有するN-アセチルから選択されうる。好ましくは、糖類は、2分子のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)である。本書において開示される化合物は、それぞれN-アセチルガラクトサミンであることが好ましい3つのリガンドを有しうる。
【０２２５】
「GalNAc」とは、文献では一般的にN-アセチルガラクトサミンと呼ばれる、2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-D-ガラクトピラノースを指す。「GalNAc」又は「N-アセチルガラクトサミン」への言及は、β形態:2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノースと、α形態:2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノースとの両方を含む。ある特定の実施形態において、β形態:2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノースと、α形態:2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノースとの両方は、交換可能に使用されうる。好ましくは、本書において開示される化合物は、β形態の2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノースを含む。
【０２２６】
【化１８】
2021531029.tif 000029
2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-D-ガラクトピラノース
【０２２７】
【化１９】
2021531029.tif 000030
2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノース
【０２２８】
【化２０】
2021531029.tif 000031
2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノース
【０２２９】
上記の式(III)の化合物のいずれについても、X1は、(-CH2-CH2-O)(-CH2)2-でありうる。X1は、(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-であってもよい。X1は、(-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-であってもよい。好ましくは、X1は、(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-である。代替的には、X1は、C3〜C6アルキレンを表す。X1は、プロピレンであってもよい。X1は、ブチレンであってもよい。X1は、ペンチレンであってもよい。X1は、へキシレンであってもよい。好ましくは、アルキルは、直鎖状アルキレンである。特に、X1は、ブチレンであってよい。
【０２３０】
式(III)の化合物について、X2は、式-C3H6-O-CH2-、すなわちC3アルコキシメチレン、又は-CH2CH2CH2OCH2-のアルキレンエーテルを表す。
【０２３１】
本開示は、次の構造、
【化２１−１】
2021531029.tif 000032
【化２１−２】
2021531029.tif 000033
【化２１−３】
2021531029.tif 000034
【化２１−４】
2021531029.tif 000035
(式中、Zは、上文又は下文に定義された核酸である)
のうちの1つを有する、コンジュゲートされた核酸を提供する。
【０２３２】
次の構造、
【化２２】
2021531029.tif 000036
(式中、Zは本書において前後で定義された核酸である)
のうちの1つを有する核酸が好ましいが、これら2つの構造の最初を有する核酸が特に好ましい。
【０２３３】
本開示は、別の態様として、細胞におけるTMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、若しくは442から選択されるか、
又は配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、67、69、71、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、85、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、270、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、309、311、312、313、314、若しくは315から選択される、
例えば、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、若しくは215から選択される、ヌクレオチド配列を含み、核酸が、リンカーを介して間接的に、又は直接的にリガンドにコンジュゲートされている、
核酸を提供する。
【０２３４】
第2の鎖は、配列番号318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、若しくは443のヌクレオチド配列、
又は配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、68、70、72、75、84、86、89、100、101、102、103、104、105、106、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、226、228、230、232、234、236、238、240、242、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、310、312、314、若しくは316から選択される、
例えば、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、若しくは216から選択される、ヌクレオチド配列を含みうる。
【０２３５】
核酸は、本書に記載されるように、リガンドにコンジュゲートされていてよい。
【０２３６】
第1の鎖及び/又は第2の鎖のヌクレオチドは、本書に記載されるように、修飾されていてよい。
【０２３７】
好ましくは、核酸は、式I(上記に提示したとおり)、特に図8aにおいて示された式のリガンドにコンジュゲートされた配列番号17及び配列番号18を含み、第1の鎖は、奇数のヌクレオチドが2'OMe修飾で修飾され、かつ偶数のヌクレオチドが2'Fで修飾されており、第2の鎖は、偶数のヌクレオチドが2'OMeで修飾され、奇数のヌクレオチドが2'Fで修飾されている。
【０２３８】
より好ましくは、核酸は、配列番号17及び配列番号18を含み、核酸は、式I(上記に提示したとおり)のリガンドにコンジュゲートされており、更に核酸は、本書において提供されるTable 1(表18)の抜粋である下記に示す修飾パターンを有する。
【０２３９】
【表８】
2021531029.tif 000037
【０２４０】
ここで特定の修飾は、次の番号によって示され、
1=2'F-dU、
2=2'F-dA、
3=2'F-dC、
4=2'F-dG、
5=2'-OMe-rU、
6=2'-OMe-rA、
7=2'-OMe-rC、
8=2'-OMe-rG
である。
【０２４１】
リガンドは、GalNAcを含んでよく、図8a又は図8b又は図8cは、本発明を更に説明する。
【０２４２】
他の好ましい核酸は、上及び下に列記されている。
【０２４３】
切断可能な結合基とは、細胞外では安定しているが標的細胞に入ると切断されるリンカーである。切断は、リンカーがひとつにまとめている2つの部分を遊離させる。
【０２４４】
好ましい一実施形態では、本書において開示される核酸は、標的細胞内又は第1の基準条件下(これは例えば、細胞内条件を模倣又は表すように選択されうる)において、対象の血液中又は第2の基準条件下(これは例えば、血液又は血清に見られる条件を模倣又は表すように選択されうる)よりも少なくとも10倍又はそれ以上、好ましくは少なくとも100倍速く切断される、切断可能な結合基を含む。
【０２４５】
切断可能な結合基は、切断因子、例えばpH、酸化還元電位、又は分解性分子の存在の影響を受けやすい。分解性分子としては、酸化性若しくは還元性の酵素、還元剤(例えばメルカプタン)、エステラーゼ、酸性環境を作り出すことができるエンドソーム又は薬剤、一般酸として作用することによって酸切断可能な結合基を加水分解若しくは分解することができる酵素、ペプチダーゼ、及びホスファターゼが挙げられる。
【０２４６】
切断可能な結合基は、pHの影響を受けやすいジスルフィド結合でありうる。
【０２４７】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な結合基を含みうる。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基の種類は、標的細胞に依存しうる。例えば、肝臓細胞が標的である場合、エステル基を含むリンカーが好ましい。ペプチダーゼが豊富な細胞、例えば肝臓細胞及び滑膜細胞等を標的とする場合は、ペプチド結合を含有するリンカーが使用されうる。
【０２４８】
一般的に、候補となる切断可能な結合基の好適性は、候補の結合基を切断する分解性薬剤(又は条件)の能力を試験することによって評価することができる。また、候補となる切断可能な結合基を、血液中又は他の非標的組織との接触時に切断に耐える能力について試験することも望ましい。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、細胞内(又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)で、血液又は血清(又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)と比較して少なくとも2、4、10、又は100倍速く切断される。
【０２４９】
一態様において、切断可能な結合基は、酸化還元切断可能な結合基であってよい。酸化還元切断可能な結合基は、ジスルフィド結合基であってよい。
【０２５０】
一態様において、結合基は、ホスフェートに基づく切断可能な結合基であってよい。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-0-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-である。
【０２５１】
一態様において、切断可能な結合基は、酸切断可能な結合基であってよい。好ましくは、酸切断可能な結合基は、pHが6.5以下である環境で切断されるか、又は一般酸として作用することができる酵素等の薬剤によって切断される。酸切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)O、又は-OC(O)を有しうる。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素(アルコキシ基)が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはt-ブチル等の三級アルキル基である結合基である。
【０２５２】
一実施形態において、切断可能な結合基は、エステルに基づく切断可能な結合基であってよい。エステルに基づく切断可能な結合基の例としては、アルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５３】
一実施形態において、切断可能な結合基は、ペプチドに基づく切断可能な結合基であってよい。ペプチドに基づく切断可能な結合基は、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチド等)及びポリペプチドをもたらすようにアミノ酸間に形成されたペプチド結合である。ペプチドに基づく切断基は概して、アミノ酸間に形成され、ペプチド及びタンパク質をもたらすペプチド結合(すなわちアミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドに基づく切断可能な結合基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-を有し、式中、RA及びRBは、2つの隣接したアミノ酸のR基である。
【０２５４】
本書に記載される核酸は、リポソームの形態で脂質と共に製剤化されうる。そのような製剤は、当技術分野ではリポプレックスとして説明される場合がある。脂質/リポソームを含む製剤は、本書において開示される核酸の標的細胞への送達を補助するために使用されうる。本書に記載される脂質送達系は、コンジュゲートされたリガンドの代替物として使用されうる。本書において開示される核酸を脂質送達系又はリガンドコンジュゲート送達系と共に使用する場合、本書に記載される修飾が存在してよい。
【０２５５】
そのようなリポプレックスは、
i)カチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩、
ii)ステロイド、
iii)ホスファチジルエタノールアミンリン脂質、
iv)PEG化脂質
を含む、脂質製剤を含みうる。
【０２５６】
カチオン性脂質は、アミノカチオン性脂質でありうる。
【０２５７】
カチオン性脂質は、式(IV):
【化２３】
2021531029.tif 000038
又はその薬学的に許容される塩を有することができ、式中、
Xは、O、S、又はNHを表し、
R1及びR2は、それぞれ独立して、C4〜C22直鎖状若しくは分岐状アルキル鎖、又は1つ若しくは複数の二重結合を有するC4〜C22直鎖状若しくは分岐状アルケニル鎖を表し、アルキル鎖又はアルケニル鎖は、任意選択により、介在するエステル、アミド、又はジスルフィドを含有し、
XがS又はNHを表す場合、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素、メチル、エチル、モノアミン若しくはポリアミン部分を表すか、又はR3及びR4は一緒にヘテロシクリル環を形成し、
XがOを表す場合、R3及びR4は、それぞれ独立して、水素、メチル、エチル、モノアミン若しくはポリアミン部分を表すか、又はR3及びR4は一緒にヘテロシクリル環を形成するか、又はR3は水素を表し、R4はC(NH)(NH2)を表す。
【０２５８】
カチオン性脂質は、式(V):
【化２４】
2021531029.tif 000039
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【０２５９】
カチオン性脂質は、式(VI):
【化２５】
2021531029.tif 000040
又はその薬学的に許容される塩を有してもよい。
【０２６０】
カチオン性脂質成分の含有量は、製剤の脂質含有量全体の約55モル%〜約65モル%でありうる。特に、カチオン性脂質成分は、製剤の脂質含有量全体の約59モル%である。
【０２６１】
本製剤は、ステロイドを更に含む。ステロイドは、コレステロールでありうる。ステロイドの含有量は、脂質製剤の脂質含有量全体の約26モル%〜約35モル%でありうる。より具体的には、ステロイドの含有量は、脂質製剤の脂質含有量全体の約30モル%でありうる。
【０２６２】
ホスファチジルエタノールアミンリン脂質は、1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPhyPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE)、1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DLPE)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE)、1,2-ジリノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DLoPE)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(POPE)、1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DEPE)、1,2-ジスクアレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSQPE)、及び1-ステアロイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(SLPE)からなる群から選択されうる。リン脂質の含有量は、製剤の脂質含有量全体の約10モル%でありうる。
【０２６３】
PEG化脂質は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール(DMG-PEG)、及びC16-セラミド-PEGからなる群から選択されうる。PEG化脂質の含有量は、製剤の脂質含有量全体の約1〜5モル%でありうる。
【０２６４】
組成物中のカチオン性脂質成分の含有量は、脂質製剤の脂質含有量全体の約55モル%〜約65モル%、好ましくは脂質製剤の脂質含有量全体の約59モル%でありうる。
【０２６５】
本製剤の成分i):ii):iii):iv)のモル比は、55:34:10:1、56:33:10:1、57:32:10:1、58:31:10:1、59:30:10:1、60:29:10:1、61:28:10:1、62:27:10:1、63:26:10:1、64:25:10:1、及び65:24:10:1から選択されうる。
【０２６６】
本組成物は、
【化２６】
2021531029.tif 000041
の構造を有するカチオン性脂質、
【化２７】
2021531029.tif 000042
の構造を有するステロイド、
【化２８】
2021531029.tif 000043
の構造を有するホスファチジルエタノールアミンリン脂質、及び
【化２９】
2021531029.tif 000044
の構造を有するPEG化脂質を含みうる。
【０２６７】
中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)又はジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)から形成されていてよい。アニオン性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されていてよく、アニオン性膜融合リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から形成されていてよい。別の種類のリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン(PC)、例えば、ダイズPC、及び卵PC等から形成されていてよい。別の種類は、リン脂質及び/又はホスファチジルコリン及び/又はコレステロールの混合物から形成される。
【０２６８】
正に帯電した合成カチオン性脂質であるN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)を使用すると、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合することが可能な脂質-核酸複合体を形成する、小さなリポソームを形成することができる。DOTMA類似体を使用してリポソームを形成することもできる。
【０２６９】
本書に記載される脂質の誘導体及び類似体を使用して、リポソームを形成してもよい。
【０２７０】
核酸を含有するリポソームは、種々の方法によって調製することができる。一例において、脂質成分を含むミセルが形成されるように、リポソームの脂質成分を洗剤中に溶解させる。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質又は脂質コンジュゲートであってよい。洗剤は高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性でありうる。例示的な洗剤としては、コール酸塩、CHAPS、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、及びラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、脂質成分を含むミセルに核酸調製物を添加する。脂質のカチオン性基が核酸と相互作用し、核酸の周りに凝集してリポソームを形成する。凝集後、例えば透析によって洗剤を除去すると、核酸のリポソーム調製物が得られる。
【０２７１】
必要であれば、凝集を補助する担体化合物を、例えばコントロールされた添加により、凝集反応中に添加してもよい。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー(例えば、スペルミン又はスペルミジン)でありうる。凝集に有利に働くようにpHを調整してもよい。
【０２７２】
核酸製剤は、界面活性剤を含みうる。一実施形態において、核酸は、界面活性剤を含むエマルションとして製剤化される。
【０２７３】
イオン化されていない界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。例としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル等の非イオン性エステル、非イオン性アルカノールアミド、並びに脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化/プロポキシル化ブロックポリマー等のエーテルが挙げられる。
【０２７４】
水中に溶解又は分散すると負の電荷を帯びる界面活性剤は、アニオン性界面活性剤である。例としては、カルボキシレート類、例えばセッケン、アシルアクリレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルサルフェート及びエトキシル化アルキルサルフェート等の硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート、及びスルホサクシネート等のスルホネート類、並びにホスフェート類が挙げられる。
【０２７５】
水中に溶解又は分散すると正の電荷を帯びる界面活性剤は、カチオン性界面活性剤である。例としては、四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられる。
【０２７６】
正或いは負の電荷を帯びる能力を有する界面活性剤は、両性界面活性剤である。例としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタイン、及びホスファチドが挙げられる。
【０２７７】
本書において「ミセル」とは、分子のうち疎水性部分のすべてが内向きになり、親水性部分が周囲の水性相と接触した状態になるよう、両親媒性分子が球状構造に配置されている、特定の種類の分子集合体として定義される。環境が疎水性であれば逆の配置が存在する。ミセルは、核酸、アルカリ金属アルキルサルフェート、及び少なくとも1つのミセル形成化合物の水溶液を混合することによって形成されうる。
【０２７８】
例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ボリジオイル、月見草オイル、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン及びその薬学的に許容される塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテル及びそれらの類似体、ポリドカノールアルキルエーテル及びそれらの類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、並びにそれらの混合物が挙げられる。
【０２７９】
フェノール及び/又はm-クレゾールを混合されたミセル組成物に添加して、安定剤及び保存剤として機能させてもよい。グリセリン等の等張化剤を添加してもよい。
【０２８０】
核酸調製物は、微粒子等の粒子に組み込んでもよい。微粒子は、噴霧乾燥、凍結乾燥、蒸発、流動層乾燥、真空乾燥、又はこれらの方法の組み合わせによって生成することができる。
【０２８１】
鉄キレート剤
鉄キレート療法は鉄過剰を低減するために使用される。鉄は、様々な組織から様々な速度で除去される。キレート療法の目的は、鉄の蓄積過剰並びにその合併症、例えば、肝臓内分泌不全及び心機能不全を防止することである。いくつかの鉄キレート剤は、複合体を形成することによって尿又は糞便から組織鉄を排泄するように設計されている。
1.デフェロキサミン:これは臨床上承認されているキレート剤で、β-サラセミア及び鉄過剰症を伴うその他の疾患における長期鉄キレート療法のために有効である。血漿半減期が短いため、有効であるために持続的な静脈内又は皮下注入によって投与される。
2.デフェリプロン:これは通常1日に3回摂取される経口キレート剤である。
3.デフェラシロクス(エクジェイド):これは半減期が長い別の経口鉄キレート剤である。日常使用のために処方される。
4.デフェラシロクス(ジャドニュ):これは、デフェラシロクス(エクジェイド)とは異なる処方のフィルムコーティング錠である。利点は、軽食と一緒に摂取することができることである。
【０２８２】
本開示の関連において好ましい鉄キレート剤は、デフェリプロンである。
【０２８３】
様々なキレート剤は、様々な範囲の副作用、すなわち、デフェロキサミンによる注射部位の反応、デフェロキサミン及びデフェラシロクスによる腎不全、デフェリプロンによる関節痛及び好中球減少症を有する。胃腸障害は全種のキレート剤によって報告されている副作用である。キレート療法に対する患者の服薬遵守は依然として課題であるが、経口的に摂取することができる鉄キレート剤が利用可能であることで向上している(Chalmers AW, Shammo JM. 2016. 'Evaluation of a new tablet formulation of deferasirox to reduce chronic iron overload after long-term blood transfusions', Ther Clin Risk Manag, 12: 201〜8頁;及びMobarra N, Shanaki M, Ehteram H, Nasiri H, Sahmani M, Saeidi M, Goudarzi M, Pourkarim H, Azad M. 2016. 'A Review on Iron Chelators in Treatment of Iron Overload Syndromes', Int J Hematol Oncol Stem Cell Res, 10: 239〜47頁)。
【０２８４】
特にヘモクロマトーシス処置のための、キレート剤とTMPRSS6を阻害するsiRNAとの本発明の組み合わせを使用する1利点は、この併用処置が鉄肝臓レベルの迅速及び効率的な低減を可能にすることである(実施例47を参照のこと)。初期の併用処置後、キレート剤用量の量を劇的に低減させ、処置を実質的にはsiRNAのみで継続し、必要なときにキレート剤を補給することができる。このことは、患者が鉄キレート剤によって経験する副作用のため、患者にとって非常に有益である。したがって、本発明の一態様は、組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物、使用のための組成物又は治療の方法であり、ここで、本書に記載されるような核酸及び鉄キレート剤は処置の第1の段階で組み合わせて投与され、鉄キレート剤の投与量は、第1の段階と比較して処置の第2の段階で強く低減される。この場合の強い低減とは、第1及び第2の段階の比較できる時間量の少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、最も好ましくは少なくとも80%の低減を意味する。第1の段階の期間は、好ましくは3週間以下、より好ましくは2週間以下である。
【０２８５】
本発明はまた、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本開示の核酸又はコンジュゲートされた核酸を含む、医薬組成物を提供する。本医薬組成物は、医薬又は診断剤として、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用されうる。例えば、核酸又はコンジュゲートされた核酸及び／又は鉄キレート剤は、送達ビヒクル(例えば、リポソーム)、及び担体、希釈剤等の賦形剤と組み合わせることができる。保存剤及び安定剤といった他の薬剤を添加することもできる。核酸の送達のための方法は当技術分野で公知であり、当業者の知識の範疇である。
【０２８６】
核酸又はコンジュゲートされた核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤は、別々、順次又は同時に、例えば、併用単位用量として投与されうる。
【０２８７】
本開示の関連における組み合わせは、必ずしも2つの要素(例えば、核酸及びキレート剤)を単一の組成物に組み合わせることを意味するのではないことを注意されたい。むしろ、2つの要素、例えば、核酸及びキレート剤は併用投与のためであり、併用投与は両要素について同時に、又は互いに短い期間内に行ってもよいことを意味することが好ましい。短い期間は、好ましくは1週間であるが、より好ましくは6日、より好ましくは5日、より好ましくは4日、より好ましくは3日、より好ましくは2日、より好ましくは1日、最も好ましくは1日未満、例えば、12時間、6時間、4時間、2時間又は1時間である。
【０２８８】
1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた本開示の核酸又はコンジュゲートされた核酸はまた、その他の治療化合物と組み合わせて投与され、別々又は同時のいずれかで、例えば、併用単位用量として投与されうる。本発明はまた、安定化剤、保存剤、希釈剤、バッファー等の生理学的/薬学的に許容される賦形剤中に、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせて、本開示の核酸又はコンジュゲートされた核酸を含む、医薬組成物を含む。本発明はまた、安定化剤、保存剤、希釈剤、バッファー等の生理学的/薬学的に許容される賦形剤中に、核酸又はコンジュゲートされた核酸を含む医薬組成物、並びに安定化剤、保存剤、希釈剤、バッファー等の生理学的/薬学的に許容される賦形剤中に、1つ又は複数の鉄キレート剤を含む医薬組成物を含む。
【０２８９】
本医薬組成物は、固体又は液体形態における投与のために特別に製剤化されていてよい。本組成物は、経口投与、非経口投与(例えば、皮下、筋肉内、静脈内、又は硬膜外注射を含む)、局所適用、腟内若しくは直腸内投与、舌下投与、点眼投与、経皮投与、又は鼻腔投与のために製剤化されていてよい。皮下又は静脈内方法を使用した送達が好ましい。
【０２９０】
一実施形態において、単位用量は、約0.01mg/体重1kgから約100mg/体重1kgの間の核酸又はコンジュゲートされた核酸を含有しうる。代替的には、用量は、10mg/体重1kg〜25mg/体重1kg、又は1mg/体重1kg〜10mg/体重1kg、又は0.05mg/体重1kg〜5mg/体重1kg、又は0.1mg/体重1kg〜5mg/体重1kg、又は0.1mg/体重1kg〜1mg/体重1kg、又は0.1mg/体重1kg〜0.5mg/体重1kg、又は0.5mg/体重1kg〜1mg/体重1kgでありうる。投与量レベルは、例えば体表面積といった他のパラメータによって計算されてもよい。
【０２９１】
本医薬組成物は、無菌の注射用水性懸濁液若しくは水溶液、又は凍結乾燥形態であってもよい。一実施形態において、本医薬組成物は、凍結乾燥されたリポプレックス又はリポプレックスの水性懸濁液を含みうる。リポプレックスは、好ましくは、本書において開示される核酸を含む。そのようなリポプレックスは、インビトロ又はインビボのいずれかで標的細胞に本書において開示される核酸を送達するために使用されうる。
【０２９２】
本発明の医薬組成物及び医薬は、薬学的有効量で哺乳動物対象に投与されうる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、サル若しくは原猿、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、ハムスター、ハリネズミ、及びモルモット、又は他の関連性のある種から選択されうる。これに基づき、本書において使用される「TMPRSS6」という用語は、上述の種のいずれかにおける核酸又はタンパク質を表すが、好ましくはこの用語は、ヒトの核酸又はタンパク質を表す。
【０２９３】
本発明の更なる態様は、疾患又は障害の処置又は防止において使用するための、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本書において開示される核酸又は本書において開示される核酸を含む医薬組成物に関する。疾患又は障害は、ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症及び血液障害、例えばβ-サラセミア、又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、及び輸血性鉄過剰症を含む群から選択されうる。障害は、鉄過剰に関連する場合があり、鉄過剰に関連する障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はフリートライヒ運動失調症でありうる。好ましくは、障害はヘモクロマトーシスである。
【０２９４】
特に、本発明の好ましい態様は、
(i)任意選択により、本書における方法によって開示されるように、ヘモグロビン若しくはヘマトクリットの増加、又は網状赤血球の減少によって好適に判定される、貧血の処置、及び/又は
(ii)任意選択により、本書における方法によって開示されるように、質量による脾臓のサイズの低減によって判定される、脾腫の低減、及び/又は
(iii)任意選択により、本書に記載されるように、FACS分析により判定された脾臓における未熟な赤血球細胞の相対的割合の低減によって判定される、脾臓における赤血球生成不良の改善、及び/又は
(iv)任意選択により、本書に記載されるように、FACS分析により判定された赤血球前駆細胞の相対的割合の減少及び除核赤血球細胞の増加によって判定される、骨髄中の赤血球成熟/赤血球生成の向上
(v)ヘモクロマトーシスの処置
(vi)鉄過剰症の処置
のうちの1つ又は複数又すべてにおける使用のための、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた本書において開示される任意の核酸を含む。
【０２９５】
本発明は、例えば、安定化剤、保存剤、希釈剤、バッファー等の生理学的/薬学的に許容される賦形剤中に、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本書において開示される1つ又は複数のRNAi分子を含む、医薬組成物を含む。
【０２９６】
本発明は、例えば、安定化剤、保存剤、希釈剤、バッファー等の生理学的/薬学的に許容される賦形剤中に、本書において開示される1つ又は複数のRNAi分子を含む、医薬組成物、並びに、例えば、安定化剤、保存剤、希釈剤、バッファー等の生理学的/薬学的に許容される賦形剤中に、1つ又は複数の鉄キレート剤を含む、医薬組成物を含む。
【０２９７】
本医薬組成物は、無菌の注射用水性懸濁液若しくは水溶液、又は凍結乾燥形態であってもよい。
【０２９８】
薬学的に許容される組成物は、本発明に係るいずれかの実施形態における治療有効量の1つ又は複数の核酸を、単独で、或いは1つ又は複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、及び/又は希釈剤と共に製剤化された状態で含みうる。
【０２９９】
薬学的に許容される担体として機能しうる材料の例としては、(1)ラクトース、グルコース、及びスクロース等の糖類、(2)トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン等のデンプン、(3)セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース、(4)トラガント末、(5)麦芽、(6)ゼラチン、(7)ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルク等の滑沢剤、(8)カカオバター及び坐薬ワックス等の賦形剤、(9)ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びダイズ油等の油類、(10)プロピレングリコール等のグリコール類、(11)グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール等のポリオール類、(12)オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル、(13)寒天、(14)水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝剤、(15)アルギン酸、(16)パイロジェンフリー水、(17)等張食塩水、(18)リンゲル液、(19)エチルアルコール、(20)pH緩衝溶液、(21)ポリエステル、ポリカーボネート、及び/又はポリ酸無水物、(22)ポリペプチド及びアミノ酸等の増量剤、(23)血清アルブミン、HDL、及びLDL等の血清成分、並びに(22)医薬製剤に用いられる他の無毒の適合性物質が挙げられる。
【０３００】
安定剤は、核酸剤を安定化させる薬剤、例えば、核酸と複合体を形成することができるタンパク質、キレート剤(例えばEDTA)、塩、RNAse阻害剤、及びDNAse阻害剤でありうる。
【０３０１】
一部の事例では、薬物の効果を延長するために、皮下又は筋肉内注射からの薬物の吸収を減速させることが望ましい。これは、低い水溶性を有する結晶性材料又は非晶質材料の液体懸濁液を使用することによって達成されうる。これで薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、この溶解速度は、結晶サイズ及び結晶形態に依存しうる。代替的には、非経口投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクルに溶解又は懸濁することによって達成される。
【０３０２】
本書に記載される核酸は、TMPRSS6の発現を阻害することが可能でありうる。本書に記載される核酸は、細胞におけるTMPRSS6の発現を部分的に阻害することが可能でありうる。阻害は、完全、すなわち本書において開示される核酸の非存在下におけるTMPRSS6発現の発現レベルの0%であってもよい。TMPRSS6発現の阻害は、部分的であってもよく、すなわち、本書において開示される核酸の非存在下におけるTMRPSS6発現の15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%であってもよい。阻害は、ヒト対象等の対象において使用されたとき、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、10週間、11週間、12週間、13週間、14週間、又は最長6か月にわたって持続しうる。本書において開示される核酸若しくはコンジュゲートされた核酸、又はそれを含む組成物は、1週間に1回若しくは2回、毎週、2週間毎、3週間毎、4週間毎、5週間毎、6週間毎、7週間毎、又は8週間毎の処置を含むレジメン、或いは前述の間隔の組み合わせ等の様々な投薬頻度のレジメンにおける使用のためのものでありうる。核酸は、皮下、静脈内、又は経口、直腸、若しくは腹腔内等の任意の他の適用ルートを使用した使用のためのものでありうる。
【０３０３】
本書において開示される核酸で処置される、又はそれを受ける細胞及び/又は対象において、TMPRSS6発現は、無処置の細胞及び/又は対象と比較して、15%から最大100%だが少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は100%の範囲だけ阻害されうる。阻害のレベルは、TMPRSS6の発現若しくは過剰発現と関連する疾患の処置を可能にすることができるか、又はTMPRSS6遺伝子産物の機能に関する更なる調査を可能にすることができる。
【０３０４】
本書において開示される核酸又はコンジュゲートされた核酸で処置された細胞及び/又は対象におけるヘプシジン遺伝子の発現は、TMPRSS6遺伝子発現の完全又は部分的な阻害に起因して、無処置の細胞及び/又は対象と比較して少なくとも約1.2倍、約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、又は約5倍増加しうる。これは、本書において開示される核酸又はコンジュゲートされた核酸を処置された対象における血清ヘプシジン濃度が、無処置の対象と比較して少なくとも約10%、約25%、約50%、約100%、約150%、約200%、約250%、約300%、又は約500%増加しうることにつながりうる。
【０３０５】
本書において開示される核酸又はコンジュゲートされた核酸で処置された対象の血清又は血漿中の鉄濃度は、無処置の対象と比較して少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%減少しうる。トランスフェリン飽和度は、鉄に結合したトランスフェリンの量を測定する医学的臨床検査である。トランスフェリン飽和度は、パーセンテージとして測定され、血清鉄を全トランスフェリンの鉄結合能で除算した値を測定する医学的臨床検査値である。本書において開示される核酸又はコンジュゲートされた核酸で処置された対象におけるトランスフェリン飽和度は、無処置の対象と比較して少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%減少しうる。
【０３０６】
本発明の更なる態様は、疾患又は障害、例えば上に列記した疾患又は障害を処置又は防止するための医薬の製造における、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた本書において開示される核酸に関する。
【０３０７】
本発明には、処置を必要とする個体に、1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた、本書において開示される核酸又はコンジュゲートされた核酸を含む医薬組成物を投与することを含む、疾患又は障害、例えば上に列記したものを処置又は防止する方法も含まれる。本組成物は、毎週2回、毎週1回、2週間毎、3週間毎、4週間毎、5週間毎、6週間毎、7週間毎、又は8週間毎に投与されうる。1つ又は複数の鉄キレート剤と組み合わせた核酸又はコンジュゲートされた核酸は、皮下若しくは静脈内、又は経口、直腸、若しくは腹腔内等のその他の適用ルートでの使用のためのものでありうる。核酸及びキレート剤は、両方を含む単一の組成物として、又は同じルート若しくは異なるルートのいずれかによって別々に、同じ若しくは異なる投与量で、同じ若しくは異なる投与頻度で投与される異なる組成物で、投与されうる。
【０３０８】
一実施形態において、対象は、初期用量及び1つ又は複数の維持用量の核酸剤を投与される。維持用量(単数又は複数)は、初期用量と同じであっても、又はそれ未満、例えば、初期用量の1/2未満であってもよい。維持用量は、例えば、2、5、10、又は30日毎に1回以下投与される。処置レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度、及び患者の全体的状態に応じて異なる期間にわたって持続してよい。対象は、siRNAでの処置を通じて、又はsiRNAでの処置の一部だけのいずれかで、siRNAと組み合わせてキレート剤を投与されうる。siRNAと組み合わせて投与されるキレート剤の投与量は、対象の特定の必要性に適応しうる。対象の必要性は、例えば、肝臓鉄レベル又は併用処置の必要性を示すその他のマーカーの測定に基づいて判定されうる。
【０３０９】
一実施形態において、本組成物は、複数の核酸剤種を含む。別の実施形態では、核酸剤種は、天然に存在する標的配列に対して別の種と重複せず、かつ隣接していない配列を有する。別の実施形態では、複数の核酸剤種は、異なる天然に存在する標的遺伝子に対して特異的である。別の実施形態では、核酸剤は、アレル特異的である。
【０３１０】
1つ又は複数の鉄キレート剤を組み合わせた、本開示の核酸又はコンジュゲートされた核酸は、別々又は同時のいずれかで、例えば、合わせた単位用量として投与される、他の治療用化合物と組み合わせて投与されるか、又はそのような使用のためのものであってもよい。
【０３１１】
1つ又は複数の鉄キレート剤を組み合わせた、本開示の核酸又はコンジュゲートされた核酸は、化学合成、又はインビトロ(例えば、ランオフ転写)若しくはインビボでの核酸の発現をはじめとする、当技術分野でルーチンの方法を使用して産生することができる。例えば、固相化学合成の使用、或いはウイルス派生物を含む核酸に基づく発現ベクター又は部分的若しくは完全に合成の発現系の使用である。一実施形態において、発現ベクターは、本書において開示される核酸をインビトロで、中間の宿主生物又は細胞型において、中間若しくは最終の生物において、又は所望の標的細胞において産生するために使用されうる。本書に記載される核酸の産生(合成又は酵素的転写)のための方法は、当業者に公知である。
【０３１２】
本発明の更なる実施形態では、本発明は、本書における任意の開示による任意の核酸、コンジュゲートされた核酸、使用のための核酸、方法、組み合わせ、使用のための組み合わせ、キット、組成物、又は使用に関し、ここで核酸は、5'ビニル-(E)-ホスホネート修飾、好ましくは第1の鎖の第2位における2'-F修飾と組み合わせた5'ビニル-(E)-ホスホネート修飾等のビニル-(E)-ホスホネート修飾を含む。
【０３１３】
本発明の更なる実施形態では、本発明は、本書における任意の開示による任意の核酸、コンジュゲートされた核酸、使用のための核酸、方法、組み合わせ、使用のための組み合わせ、キット、組成物、又は使用に関し、ここで、第1の鎖及び第2の鎖のうちの少なくとも1つの3'末端における末端ヌクレオチドは、逆位ヌクレオチドであり、かつ末端ヌクレオチドの3'炭素及び隣接したヌクレオチドの3'炭素を介して隣接したヌクレオチドに結合しており、かつ/又は、第1の鎖及び第2の鎖のうちの少なくとも1つの5'末端における末端ヌクレオチドは、逆位ヌクレオチドであり、かつ末端ヌクレオチドの5'炭素及び隣接したヌクレオチドの5'炭素を介して隣接したヌクレオチドに結合しており、
任意選択により、
a.第1の鎖及び/又は第2の鎖の3'及び/又は5'の逆位ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合の手段により、ホスフェート基を介して隣接したヌクレオチドに結合しているか、又は
b.第1の鎖及び/又は第2の鎖の3'及び/又は5'の逆位ヌクレオチドは、ホスホロチオエート基を介して隣接したヌクレオチドに結合しているか、又は
c.第1の鎖及び/又は第2の鎖の3'及び/又は5'の逆位ヌクレオチドは、ホスホロジチオエート基を介して隣接したヌクレオチドに結合している。
【０３１４】
本発明の更なる実施形態では、本発明は、本書における任意の開示による任意の核酸、コンジュゲートされた核酸、使用のための核酸、方法、組み合わせ、使用のための組み合わせ、キット、組成物、又は使用に関し、ここで核酸は、ホスホロジチオエート結合を含み、
任意選択により、結合は、第2の鎖の最も5'側の2個のヌクレオチド及び/又は最も3'側の2個のヌクレオチドの間にあり、かつ/又は
任意選択により、核酸は更に、いかなる内部ホスホロチオエート結合も含まない。
【０３１５】
本発明の更なる実施形態では、本発明は、1つ又は複数の鉄キレート剤を組み合わせた、本書において開示される核酸配列であって、核酸の第1の鎖及び/又は第2の鎖が、少なくとも第1及び第2の種類の修飾されたリボヌクレオチドを含み、各鎖で個別に、或いは第1の鎖及び第2の鎖の両方で計数した場合、第2の種類の修飾されたヌクレオチドよりも多くの第1の種類の修飾されたリボヌクレオチド(例えば、2'フルオロ修飾よりも多くの2'Oメチル修飾)が存在する、核酸配列に関する。
【０３１６】
疑義を避けるために付言すると、核酸は、3種類以上の修飾を有しうる。
【０３１７】
本発明の別の実施形態は、好ましくは第1の鎖及び第2の鎖の両方の全ヌクレオチドに対するパーセンテージとして測定した場合、第1の鎖及び/又は第2の鎖のヌクレオチドの50%超が2'O-メチル修飾を含む、例えば、第1の鎖及び/又は第2の鎖の55%、60%、65%、70%、75%、80%、若しくは85%超、又はそれ以上が2'O-メチル修飾を含む、1つ又は複数の鉄キレート剤を組み合わせた、本書において開示される任意の核酸配列に関する。
【０３１８】
本発明の別の実施形態は、好ましくは第1の鎖及び第2の鎖の両方の全ヌクレオチドに対するパーセンテージとして測定した場合、第1の鎖及び/又は第2の鎖のヌクレオチドの50%超が、天然に存在するRNA修飾を含む、例えば、第1の鎖及び/又は第2の鎖の55%、60%、65%、70%、75%、80%、若しくは85%超、又はそれ以上がそのような修飾を含む、1つ又は複数の鉄キレート剤を組み合わせた、本書において開示される任意の核酸配列に関する。好適な天然に存在する修飾としては、2-O'メチルの他に、他の2'糖修飾、特にDNAヌクレオチドをもたらす2'-H修飾が挙げられる。
【０３１９】
本発明の別の実施形態は、好ましくは第1の鎖及び第2の鎖の両方の全ヌクレオチドに対するパーセンテージとして、2'Oメチル修飾ではない2'修飾を第1の鎖及び/又は第2の鎖に有する、20%以下、例えば15%以下、例えば10%以下のヌクレオチドを含む、1つ又は複数の鉄キレート剤を組み合わせた、本書において開示される任意の核酸配列に関する。
【０３２０】
本発明の別の実施形態は、好ましくは両方の鎖の全ヌクレオチドに対するパーセンテージとして、20%以下(例えば15%以下又は10%以下)の2'フルオロ修飾を第1の鎖及び/又は第2の鎖に含む、1つ又は複数の鉄キレート剤を組み合わせた、本書において開示される任意の核酸配列に関する。
【０３２１】
本発明の別の実施形態は、1つ又は複数の鉄キレート剤を組み合わせたTMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、以下のとおりのHC18Aのヌクレオチド配列を含み、任意選択により、該第2の鎖が、以下のとおりのHC18bのヌクレオチド配列を含む、核酸に関する。
【０３２２】
【表９】
2021531029.tif 000045
【０３２３】
任意選択により、核酸配列は、以下のとおりのTMPRSS6-hc-18Aであるか、又はTMPRSS6-hc-18A及び18Bの両方であるかのいずれかである。
【０３２４】
【表１０】
2021531029.tif 000046
【０３２５】
任意選択により、核酸配列は、以下に列記する配列のいずれか又は両方である。
【０３２６】
【表１１】
2021531029.tif 000047
【０３２７】
すべての配列は、5'-3'で列記されている。TMPRSS6の発現を阻害するためのある核酸は、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖は、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖は、以下のとおりのHC23Aのヌクレオチド配列を含み、任意選択により、該第2の鎖は、以下のとおりのHC23Bのヌクレオチド配列を含む。
【０３２８】
【表１２】
2021531029.tif 000048
【０３２９】
任意選択により、核酸配列は、以下のとおりのTMPRSS6-hc-23Aであるか、又はTMPRSS6-hc-23A及び23Bの両方であるかのいずれかである。
【０３３０】
【表１３】
2021531029.tif 000049
【０３３１】
任意選択により、核酸配列は、以下に列記する配列のいずれか又は両方である。
【０３３２】
【表１４】
2021531029.tif 000050
【０３３３】
本発明の別の実施形態は、細胞における、1つ又は複数の鉄キレート剤を組み合わせたTMPRSSの発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、細胞におけるTMPRSSの発現が、核酸若しくはコンジュゲートされた核酸の非存在下又は非サイレンシング対照の存在下であることを除いては同じ試験条件で観察される発現レベルより少なくとも15%低いレベルまで低減する、核酸である。
【０３３４】
核酸は、本書において開示される任意のものであってよい。
【０３３５】
ある特定の好ましい実施形態
1。TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含む組み合わせであって、核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号333を含む、組み合わせ。
【０３３６】
2。ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡の処置において、好ましくはヘモクロマトーシスの処置のために使用するための組み合わせであって、
組み合わせ(又は組成物)がTMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含み、核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号333を含む、組み合わせ。
【０３３７】
3。医薬として使用するための核酸、好ましくはヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡の処置において、好ましくはヘモクロマトーシスの処置のために使用するための核酸であって、
核酸がTMPRSS6の発現を阻害し、核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号333を含み、
核酸が1つ又は複数の鉄キレート剤と共に投与される、核酸。
【０３３８】
4。TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含むキットであって、
核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号333を含む、キット。
【０３３９】
5。TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含む医薬組成物であって、
核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号333を含み、
核酸、鉄キレート剤又は両方が生理学的に許容される賦形剤と組み合わされている、医薬組成物。
【０３４０】
6。ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡の処置において、好ましくはヘモクロマトーシスの処置のために使用するための医薬組成物であって、
医薬組成物がTMPRSS6の発現を阻害するための核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含み、核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号333、317、319、321、323、325、327、329、331、335、337、339、341、343、345、353、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、407、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440又は442から選択されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号333を含み、
核酸、鉄キレート剤又は両方が生理学的に許容される賦形剤と組み合わされている、医薬組成物。
【０３４１】
7。第2の鎖が配列番号334、318、320、322、324、326、328、330、332、336、338、340、342、344、346、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435,437、439、441又は443、好ましくは配列番号334のヌクレオチド配列を含む、好ましい実施形態1の組み合わせ、好ましい実施形態2の使用のための組み合わせ、好ましい実施形態3の使用のための核酸、好ましい実施形態4のキット、好ましい実施形態5の組成物又は好ましい実施形態6の使用のための組成物。
【０３４２】
8。1つ又は複数の鉄キレート剤がデフェロキサミン、デフェリプロン、デフェラシロクス(エクジェイド)及びデフェラシロクス(ジャドニュ)から選択され、任意選択で鉄キレート剤がデフェリプロンである、好ましい実施形態1〜7のいずれかに係る組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。
【０３４３】
9。第1及び/又は第2の鎖の1つ又は複数のヌクレオチドが修飾されて、修飾されたヌクレオチドを形成している、好ましい実施形態1〜8のいずれかに係る組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。核酸は、第1の修飾でありうる2'-O-メチル(2'OMe)である修飾及び2'-Fである第2の修飾を含んでいてもよい。修飾されたヌクレオチドは明らかに、そこでの塩基同一性(A、C、G、T、U)は保存しているが、例えば、糖に1つ又はいくつかの修飾、例えば、2'-OHから2'OMe又は2'Fへの修飾を有するヌクレオチドである。
【０３４４】
10。該第1の鎖が配列番号17のヌクレオチド配列を含み、該第2の鎖が配列番号18のヌクレオチド配列を含み、
【０３４５】
【表１５】
2021531029.tif 000051
【０３４６】
ここで、特定の修飾は、次の番号、
1=2´F-dU、
2=2‘F-dA、
3=2´F-dC、
4=2´F-dG、
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG
によって示される、好ましい実施形態9に係る組み合わせ、使用のための組み合わせ、又は使用のための核酸。
【０３４７】
11。TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及びデフェリプロンを含む組み合わせであって、
核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、第1の鎖が配列番号17のヌクレオチド配列を含み、第2の鎖が配列番号18のヌクレオチド配列を含む、組み合わせ。
【０３４８】
12。ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡の処置において、好ましくはヘモクロマトーシスの処置のために使用するための組み合わせであって、
TMPRSS6の発現を阻害するための核酸及びデフェリプロンを含み、核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、第1の鎖が配列番号17のヌクレオチド配列を含み、第2の鎖が配列番号18のヌクレオチド配列を含む、組み合わせ。
【０３４９】
13。医薬として使用するための核酸、好ましくは、ヘモクロマトーシス、晩発性皮膚ポルフィリン症、血液障害、例えばβ-サラセミア又は鎌状赤血球症、先天性赤血球異形成貧血、骨髄不全症候群、脊髄形成異常症、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連する障害、鉄過剰に関連するパーキンソン病、アルツハイマー病又はフリートライヒ運動失調症、並びに骨髄移植に関連する感染症及び非再発死亡の処置において使用するため、好ましくはヘモクロマトーシスの処置のために使用するための核酸あって、
核酸がTMPRSS6の発現を阻害し、核酸が、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、第1の鎖が配列番号17のヌクレオチド配列を含み、第2の鎖が配列番号18のヌクレオチド配列を含み、
核酸がデフェリプロンと共に投与される、核酸。
【０３５０】
14。核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤が同時、別々又は順次投与される、好ましい実施形態1〜13のいずれかに係る組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。好ましくは、核酸及びキレート剤は、単回投薬ではなく、別々に投与される。これは、核酸及び特にキレート剤の投与量の対象の必要性への適応を可能にする。
【０３５１】
15。核酸がリガンドに、任意選択で第2の鎖の5'末端でコンジュゲートされ、任意選択でリガンドが(i)1つ又は複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分及びそれらの誘導体、並びに(ii)リンカーを含み、リンカーがGalNAc部分を核酸にコンジュゲートしている、好ましい実施形態1〜14のいずれかに係る組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。
【０３５２】
16。コンジュゲートされた核酸が構造、
【化３０−１】
2021531029.tif 000052
【化３０−２】
2021531029.tif 000053
【化３０−３】
2021531029.tif 000054
【化３０−４】
2021531029.tif 000055
(式中、Zは好ましい実施形態1から14のいずれかに係る核酸である)
を有する、好ましい実施形態15に係る組み合わせ、使用のための組み合わせ、使用のための核酸、キット、組成物又は使用のための組成物。
【０３５３】
17。核酸が鎖のいずれか若しくは両方の5'及び/又は3'末端で安定化されており、任意選択で、
核酸が第1の鎖の3つの末端3'ヌクレオチドのそれぞれの間及び3つの末端5'ヌクレオチドのそれぞれの間に2つのホスホロチオエート結合を含み、第2の鎖の3'末端の3つの末端ヌクレオチドの間の2つのホスホロチオエート結合を含み、構造、
【０３５４】
【表１６】
2021531029.tif 000056
【０３５５】
を有し、ここで、特定の修飾が次の番号、
1=2'F-dU、
2=2'F-dA、
3=2'F-dC、
4=2'F-dG、
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG
(ps)=ホスホロチオエート結合
によって示される、好ましい実施形態1から14のいずれか1つに係る組み合わせ、使用のための組み合わせ若しくは使用のための核酸、又は好ましい実施形態15若しくは16に係るコンジュゲートされた核酸。
【０３５６】
18。処置を必要とする個体に、好ましい実施形態1〜17のいずれかに係る核酸又はコンジュゲートされた核酸及び1つ又は複数の鉄キレート剤を含む組み合わせを投与することを含む、疾患又は障害、好ましくはヘモクロマトーシスを処置する方法。
【０３５７】
核酸の第1の鎖は、好ましくは配列番号17で修飾されたような、任意選択で配列番号217で示されたようにホスホロチオエート結合で安定化されたような、配列番号333のヌクレオチド配列を含むか、又はからなることが好ましい。
【０３５８】
核酸の第2の鎖は、好ましくは配列番号18で修飾されたような、任意選択で配列番号218で示されたようにホスホロチオエート結合で安定化されたような、配列番号334のヌクレオチド配列を含むか、又はからなることが好ましい。リガンドは、配列番号218で示されたようなリガンド又は異なるリガンドであってもよいが、リガンドは配列番号218で示されたようであることが好ましい。
【０３５９】
核酸は、リガンドに、任意選択で第2の鎖の5'末端でコンジュゲートされることが好ましく、任意選択でリガンドはGN(図8a)、GN2(図8b)又はGN3(図8c)、より好ましくはGN2である。
【０３６０】
核酸の第1の鎖は配列番号217を含むか、又はからなることが好ましく、及び/又は核酸の第2の鎖は配列番号218を含むか、又はからなることが好ましく、ヌクレオチド間修飾を含むすべての修飾のいずれの場合でも、リガンドは示した通りである。
【０３６１】
好ましくは、処置する疾患又は障害はヘモクロマトーシスであり、最も好ましくは遺伝性ヘモクロマトーシスである。或いは、又は更に、疾患又は障害は、好ましくは鉄過剰症、例えば、輸血性鉄過剰症、鉄過剰に関連した障害又は鉄過剰に関連したフリードライヒ運動失調症である。
【０３６２】
好ましくは、siRNAの多回用量が投与される。本書において開示される核酸又はそれを含む組成物は、1週間に1回若しくは2回、毎週、2週間毎、3週間毎、4週間毎、5週間毎、6週間毎、7週間毎、又は8週間毎の処置を含むレジメン、或いは前述の間隔の組み合わせ等の様々な投薬頻度のレジメンにおける使用のためのものであってもよい。一実施形態では、対象は、初期用量及び1回又は複数回の維持用量の核酸剤を投与される。維持用量(単数又は複数)は、初期用量と同じであっても、又はそれ未満、例えば、初期用量の1/2未満であってもよい。維持用量は、例えば、2、5、10、又は30日毎に1回以下投与される。
【０３６３】
好ましい実施形態は、本書において開示される任意のその他の態様、実施形態、記述及び特徴と組み合わせることができる。
【０３６４】
ある特定の好ましい特徴は以下に列記される:
【０３６５】
記述
1。TMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、又は215から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸。
【０３６６】
2。第2の鎖が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、若しくは216のヌクレオチド配列を含む、記述1に係る核酸。
【０３６７】
3。該第1の鎖が、配列番号17のヌクレオチド配列を含む、記述1又は記述2に係る核酸。
【０３６８】
4。該第2の鎖が、配列番号18のヌクレオチド配列を含む、記述1から3のいずれか1つに係る核酸。
【０３６９】
5。該第1の鎖及び/又は該第2の鎖が、それぞれ17〜35ヌクレオチド長である、記述1から4のいずれか1つに係る核酸。
【０３７０】
6。少なくとも1つの二重鎖領域が、19〜25個の連続するヌクレオチド塩基対からなる、記述1から5のいずれか1つに係る核酸。
【０３７１】
7。
a)両末端が平滑末端であるか、又は
b)一方の末端にオーバーハングを有し、他方に平滑末端を有するか、又は
c)両末端にオーバーハングを有する、
先行する記述のいずれかに係る核酸。
【０３７２】
8。第1の鎖及び/又は第2の鎖上の1個又は複数のヌクレオチドが修飾されて、修飾されたヌクレオチドを形成している、先行する記述のいずれかに係る核酸。
【０３７３】
9。第1の鎖の奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数が修飾されている、記述8に係る核酸。
【０３７４】
10。第1の鎖の偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数が、少なくとも第2の修飾によって修飾されており、少なくとも第2の修飾が、記述9の修飾とは異なる、記述9に係る核酸。
【０３７５】
11。1個又は複数の修飾された偶数のヌクレオチドのうちの少なくとも1個が、1個又は複数の修飾された奇数のヌクレオチドのうちの少なくとも1個に隣接している、記述10に係る核酸。
【０３７６】
12。複数の奇数のヌクレオチドが修飾されている、記述9から11のいずれか1つに係る核酸。
【０３７７】
13。複数の偶数のヌクレオチドが、第2の修飾によって修飾されている、記述10から12に係る核酸。
【０３７８】
14。第1の鎖が、共通の修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含む、記述8から13のいずれかに係る核酸。
【０３７９】
15。第1の鎖が、記述9の修飾とは異なる第2の修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含む、記述9から14のいずれかに係る核酸。
【０３８０】
16。第2の鎖の奇数のヌクレオチドのうちの1個又は複数が、記述9の修飾とは異なる修飾によって修飾されている、記述9から15のいずれかに係る核酸。
【０３８１】
17。第2の鎖の偶数のヌクレオチドのうちの1個又は複数が、記述9の修飾によって修飾されている、記述9から15のいずれかに係る核酸。
【０３８２】
18。第2の鎖の1個又は複数の修飾された偶数のヌクレオチドのうちの少なくとも1個が、第2の鎖の1個又は複数の修飾された奇数のヌクレオチドに隣接している、記述16又は17に係る核酸。
【０３８３】
19。第2の鎖の複数の奇数のヌクレオチドが、共通の修飾によって修飾されている、記述16から18のいずれかに係る核酸。
【０３８４】
20。複数の偶数のヌクレオチドが、記述9に係る修飾によって修飾されている、記述16から19のいずれかに係る核酸。
【０３８５】
21。第2の鎖上の複数の奇数のヌクレオチドが、第2の修飾によって修飾されており、第2の修飾が、記述9の修飾とは異なる、記述16から20のいずれかに係る核酸。
【０３８６】
22。第2の鎖が、共通の修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含む、記述16から21のいずれかに係る核酸。
【０３８７】
23。第2の鎖が、記述9の修飾とは異なる第2の修飾によって修飾されている隣接したヌクレオチドを含む、記述16から22のいずれかに係る核酸。
【０３８８】
24。第1の鎖における奇数のヌクレオチドのそれぞれと、第2の鎖における偶数のヌクレオチドのそれぞれとが、共通の修飾で修飾されている、記述8から23のいずれか1つに係る核酸。
【０３８９】
25。第1の鎖における偶数のヌクレオチドのそれぞれが、第2の修飾で修飾されており、第2の鎖における奇数のヌクレオチドのそれぞれが、第2の修飾で修飾されている、記述24に係る核酸。
【０３９０】
26。第1の鎖の修飾されたヌクレオチドが、第2の鎖の修飾されていないヌクレオチド又は異なって修飾されたヌクレオチドに対して、少なくとも1個のヌクレオチドだけシフトしている、記述8から25のいずれか1つに係る核酸。
【０３９１】
27。修飾及び/又は複数の修飾が、それぞれ個別に、3'末端デオキシ-チミン、2'-O-メチル、2'-デオキシ修飾、2'-アミノ修飾、2'-アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホルアミデート修飾、5'-ホスホロチオエート基修飾、5'ホスフェート修飾若しくは5'ホスフェート模倣物修飾、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群から選択される、記述8から26のいずれか1つに係る核酸。
【０３９２】
28。修飾が、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、又は非天然塩基を含むヌクレオチドのうちのいずれか1つである、記述8から27のいずれか1つに係る核酸。
【０３９３】
29。少なくとも1つの修飾が2'-O-メチルである、記述8から28のいずれか1つに係る核酸。
【０３９４】
30。少なくとも1つの修飾が2'-Fである、記述8から29のいずれか1つに係る核酸。
【０３９５】
31。細胞におけるTMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、又は215から選択されるヌクレオチド配列を含み、第1の鎖のヌクレオチドは、奇数のヌクレオチドが第1の修飾によって修飾され、かつ偶数のヌクレオチドが第2の修飾によって修飾されており、第2の鎖のヌクレオチドは、偶数のヌクレオチドが第3の修飾によって修飾され、かつ奇数のヌクレオチドが第4の修飾によって修飾されており、少なくとも第1の修飾が、第2の修飾とは異なり、第3の修飾が、第4の修飾とは異なる、核酸。
【０３９６】
32。第2の配列が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、又は216のヌクレオチド配列を含む、記述31に係る核酸。
【０３９７】
33。第4の修飾及び第2の修飾が同じである、記述31又は32に係る核酸。
【０３９８】
34。第1の修飾及び第3の修飾が同じである、記述31から33のいずれか1つに係る核酸。
【０３９９】
35。第1の修飾が2'O-Meであり、第2の修飾が2'Fである、記述31から34のいずれか1つに係る核酸。
【０４００】
36。第1の鎖が、配列番号17のヌクレオチド配列を含み、第2の鎖が、配列番号18のヌクレオチド配列を含む、記述31から35のいずれか1つに係る核酸。
【０４０１】
37。以下の表に示される配列及び修飾を含み、
【０４０２】
【表１７】
2021531029.tif 000057
【０４０３】
ここで特定の修飾は、番号によって示され、
1=2'F-dU、
2=2'F-dA、
3=2'F-dC、
4=2'F-dG、
5=2'-OMe-rU、
6=2'-OMe-rA、
7=2'-OMe-rC、
8=2'-OMe-rG
である、記述31から36のいずれか1つに係る核酸。
【０４０４】
38。リガンドにコンジュゲートされた、記述1から37のいずれか1つに係る核酸。
【０４０５】
39。第1の鎖及び/又は第2の鎖の1個、2個、又は3個の3'末端ヌクレオチド及び/又は5'末端ヌクレオチドの間にホスホロチオエート結合を含む、記述1から38のいずれか1つに係る核酸。
【０４０６】
40。第1の鎖上の3個の3'末端ヌクレオチドのそれぞれの間、及び3個の5'末端ヌクレオチドのそれぞれの間に2つのホスホロチオエート結合を含み、第2の鎖の3'末端の3個の末端ヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエート結合を含む、記述1から39のいずれか1つに係る核酸。
【０４０７】
41。細胞におけるTMPRSS6の発現を阻害するための核酸であって、第1の鎖の少なくとも一部分、及び第1の鎖と少なくとも部分的に相補的な第2の鎖の少なくとも一部分を含む、少なくとも1つの二重鎖領域を含み、該第1の鎖が、TMPRSS6遺伝子から転写されるRNAの少なくとも一部分と少なくとも部分的に相補的であり、該第1の鎖が、次の配列:配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、又は215から選択されるヌクレオチド配列を含み、該核酸が、リガンドにコンジュゲートされている、核酸。
【０４０８】
42。リガンドが、(i)1つ又は複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分及びそれらの誘導体、並びに(ii)リンカーを含み、リンカーが、記述41に定義された核酸にGalNAc部分をコンジュゲートさせる、記述41に係る核酸。
【０４０９】
43。リンカーが、二価、又は三価、又は四価の分岐構造でありうる、記述41又は42に係る核酸。
【０４１０】
44。ヌクレオチドが、先行する記述のいずれかに定義されたように修飾されている、記述41から43のいずれかにに係る核酸。
【０４１１】
45。リガンドが、式I:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
[式中、
Sは、糖類を表し、ここで糖類は、N-アセチルガラクトサミンであり、
X1は、C3〜C6アルキレン又は(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-[式中、mは1、2、又は3である]であり、
Pは、ホスフェート又は修飾されたホスフェート(好ましくはチオホスフェート)であり、
X2は、アルキレン、又は式(-CH2)n-O-CH2-[式中、n=1〜6である]のアルキレンエーテルであり、
Aは、分岐ユニットであり、
X3は、架橋ユニットを表し、
本発明に係る核酸は、ホスフェート又は修飾されたホスフェート(好ましくはチオホスフェート)を介してX3にコンジュゲートされている]
を含む、先行する記述のいずれかに係る核酸。
【０４１２】
46。次の構造、
【化３１−１】
2021531029.tif 000058
【化３１−２】
2021531029.tif 000059
【化３１−３】
2021531029.tif 000060
【化３１−４】
2021531029.tif 000061
(式中、Zは、記述1から40のいずれかに係る核酸である)
のうちの1つを有する、コンジュゲートされた核酸。
【０４１３】
47。次の構造、
【化３２】
2021531029.tif 000062
のリガンドにコンジュゲートされている、記述1から40のいずれかに係る核酸。
【０４１４】
48。二重鎖が、別々の鎖を含む、先行する記述のいずれかに係る核酸又はコンジュゲートされた核酸。
【０４１５】
49。二重鎖が、第1の鎖及び第2の鎖を含む一本鎖を含む、先行する記述のいずれかに係る核酸又はコンジュゲートされた核酸。
【０４１６】
50。先行する記述のいずれかに定義された核酸又はコンジュゲートされた核酸と、
i)カチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩、
ii)ステロイド、
iii)ホスファチジルエタノールアミンリン脂質、
iv)PEG化脂質
を含む製剤と
を含む、組成物。
【０４１７】
51。製剤中、カチオン性脂質成分の含有量が、脂質製剤の脂質含有量全体の約55モル%〜約65モル%、好ましくは脂質製剤の脂質含有量全体の約59モル%である、記述50に係る組成物。
【０４１８】
52。製剤が、
【化３３】
2021531029.tif 000063
の構造を有するカチオン性脂質を含み、
ステロイドが、
【化３４】
2021531029.tif 000064
の構造を有し、
ホスファチジルエタノールアミンリン脂質が、
【化３５】
2021531029.tif 000065
の構造を有し、
PEG化脂質が、
【化３６】
2021531029.tif 000066
の構造を有する、
記述50に記述された組成物。
【０４１９】
53。先行する記述のいずれかに係る核酸又はコンジュゲートされた核酸と、生理学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
【０４２０】
54。疾患又は障害の処置における使用のための、先行する記述のいずれかに係る核酸又はコンジュゲートされた核酸。
【０４２１】
55。疾患又は障害を処置するための医薬の製造における、先行する記述のいずれかに係る核酸又はコンジュゲートされた核酸の使用。
【０４２２】
56。処置を必要とする個体に、先行する記述のいずれか1つに係る核酸又はコンジュゲートされた核酸を含む組成物を投与することを含む、疾患又は障害を処置する方法。
【０４２３】
57。核酸又はコンジュゲートされた核酸が、対象の皮下又は静脈内に投与される、記述55に係る方法。
【０４２４】
58。該疾患又は障害が、ヘモクロマトーシス、赤血球生成性ポルフィリン症、輸血性鉄過剰症、及び血液障害を含む群から選択される、記述54から56のいずれかに係る使用又は方法。
【０４２５】
59。血液障害が、β-サラセミア、鎌状赤血球貧血、先天性鉄芽球性貧血、再生不良性貧血、又は骨髄異形成症候群である、記述58に係る使用又は方法。
【０４２６】
60。障害が、鉄過剰に関連する、記述54から59のいずれかに係る使用又は方法。
【０４２７】
61。鉄過剰に関連する障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はフリートライヒ運動失調症である、記述60に係る使用又は方法。
【０４２８】
62。記述1から49のいずれかに係る核酸又はコンジュゲートされた核酸を作製するためのプロセス。
【０４２９】
以降、以下の非限定的な図及び実施例を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０４３０】
【図１】ヒトHep3B細胞におけるTMPRSS6発現の阻害についてのRNAi分子スクリーンの結果を示す図である。
【図２】ヒトHep3B細胞におけるTMPRSS6 RNAi分子の用量応答を示す図である。
【図３】異なる用量のGalNAc siRNA分子によるマウス肝臓組織中のTMPRSS6発現の低減を示す図である。
【図４】マウスにおけるTMPRSS6 siRNA分子によるTMPRSS6標的遺伝子の阻害及びHAMP mRNA発現の誘導の持続時間を示す図である。
【図５】TMPRSS6 siRNA分子での処置によるTMPRSS6発現の阻害が、血清中の鉄レベルを長時間にわたって低下させることを示す図である。
【図６】GalNAcコンジュゲートRNAi分子の受容体媒介性取り込みによる1°マウス肝細胞におけるTMRPSS6発現の低減を示す図である。
【図７】実施例1、3、4、26〜31及び34〜38で使用したGalNAcコンジュゲートRNAi分子を示す図である。
【図８Ａ】オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされた、本書においてそれぞれGN、GN2、及びGN3と呼ばれるGalNAcリガンドの構造を示す図である(この命名法については、TMPRSS6 hcm-9がGN、GN2、及びGN3のそれぞれにコンジュゲートされる以下の実施例も参照されたい)。
【図８Ｂ】オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされた、本書においてそれぞれGN、GN2、及びGN3と呼ばれるGalNAcリガンドの構造を示す図である(この命名法については、TMPRSS6 hcm-9がGN、GN2、及びGN3のそれぞれにコンジュゲートされる以下の実施例も参照されたい)。
【図８Ｃ】オリゴヌクレオチドがコンジュゲートされた、本書においてそれぞれGN、GN2、及びGN3と呼ばれるGalNAcリガンドの構造を示す図である(この命名法については、TMPRSS6 hcm-9がGN、GN2、及びGN3のそれぞれにコンジュゲートされる以下の実施例も参照されたい)。
【図９】ヒトHep3B細胞における様々なsiRNA修飾変異体によるTMPRSS6発現の低減を示す図である。
【図１０】受容体媒介性取り込みによる、様々なGalNAc-siRNAコンジュゲートによるTMPRSS6発現の低減を示す図である。
【図１１】マウスにおける様々なGalNAc-siRNAコンジュゲートによるTMPRSS6の低減及びHAMP発現の誘導を示す図である。
【図１２】実施例8、9、及び10のGalNAc-siRNA分子の配列及び修飾を示す図である。
【図１３】siRNAコンジュゲートの単回注射後の様々な時点でのマウスにおける、肝臓組織中のTMPRSS6発現の低減、及び血清鉄レベルの低下を示す図である。
【図１４】異なる用量のGalNAcコンジュゲートsiRNA分子によるマウスの肝臓中のTMPRSS6 mRNAレベルの低下及び血清鉄レベルの低下を示す図である。
【図１５】ヒトHep3B細胞におけるsiRNA分子の活性に対する、様々な修飾パターンの効果を示す図である。
【図１６】ヒトHep3B細胞におけるTMPRSS6発現の阻害に対する、GalNAcコンジュゲートsiRNA分子の様々な修飾変異体の効果を示す図である。
【図１７】初代マウス肝細胞内の受容体媒介性取り込みによるTMPRSS6発現の阻害に対する、GalNAcコンジュゲートsiRNAの修飾変異体の効果を示す図である。
【図１８】ヒトHep3B細胞における様々なsiRNA修飾変異体によるTMPRSS6発現の低減を示す図である。
【図１９】ヒトHep3B細胞におけるRNAi活性に対する、逆位A及びGヌクレオチドの影響を示す図である。
【図２０】siRNA安定性に対する、逆位RNAヌクレオチドの影響を示す図である。
【図２１】ヒトHep3B細胞におけるsiRNA活性に対する、逆位RNAヌクレオチドの影響を示す図である。
【図２２】ヒトHep3B細胞におけるRNAi活性に対する、逆位RNAヌクレオチドの影響を示す図である。
【図２３】受容体媒介性取り込みによる初代マウス肝細胞におけるGalNAcコンジュゲートsiRNAの活性に対する、逆位RNAヌクレオチドの影響を示す図である。
【図２４】GalNAcコンジュゲートsiRNA分子の安定性に対する、ホスホロジチオエート結合の効果を示す図である。
【図２５】マウス初代肝細胞におけるTMPRSS6発現に対するGalNAcコンジュゲートsiRNA分子の活性に対する、ホスホロジチオエート結合の効果を示す図である。
【図２６】GalNAcコンジュゲートsiRNA分子の安定性に対する、ホスホロジチオエート結合の効果を示す図である。
【図２７】ホスホロジチオエート結合を含有するGalNAc siRNAコンジュゲートによる、マウス初代肝細胞におけるTMPRSS6発現の阻害を示す図である。
【図２８】遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、異なる用量のGalNAc siRNAによるTMPRSS6発現の低減を示す図である。
【図２９】遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、異なる用量のGalNAc siRNAによる血清ヘプシジンレベルの上昇を示す図である。
【図３０】遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、異なる用量のGalNAc siRNAによる血清鉄レベルの低下を示す図である。
【図３１】遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、異なる用量のGalNAc siRNAによるトランスフェリン飽和度の低減を示す図である。
【図３２】遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、異なる用量のGalNAc siRNAによる不飽和鉄結合能の増加を示す図である。
【図３３】遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、GalNAc siRNAによる組織鉄レベルの低下を示す図である。
【図３４】43種の更なるsiRNAのリポソーム送達による、Hep3B細胞におけるヒトTMPRSS6 mRNAレベルの低下を示す図である。
【図３５−１】Hep3B細胞におけるTMPRSS6発現の阻害に対する、様々なsiRNAの用量応答曲線を示す図である。
【図３５−２】図３５−１の続きである。
【図３５−３】図３５−２の続きである。
【図３６】異なる濃度でのGalNAc siRNAコンジュゲートの受容体媒介性取り込みによる初代ヒト肝細胞におけるTMPRSS6発現の低減を示す図である。
【図３７】中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおけるGalNAc siRNAコンジュゲートでの処置によるヘマトクリット値の増加を示す図である。
【図３８】中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおけるGalNAc siRNAコンジュゲートでの処置による赤血球分布幅の低減を示す図である。
【図３９】中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおけるGalNAc siRNAコンジュゲートでの処置による血液中の網状赤血球の割合の低減を示す図である。
【図４０】中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおけるGalNAc siRNAコンジュゲートでの処置による赤血球中の反応性酸素種の低減を示す図である。
【図４１】GalNAc TMPRSS6 siRNAが、中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおけるヘモグロビンレベルを上昇させることを示す図である。
【図４２】GalNAc TMPRSS6が、中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおける脾腫を低減させることを示す図である。
【図４３】GalNAc TMPRSS6が、骨髄中の赤血球成熟を向上させることを示す図である。
【図４４】GalNAc TMPRSS6が、脾臓における赤血球生成不良を低減させることを示す図である。
【図４５Ａ】初代ヒト肝細胞におけるTMPRSS6に対するsiRNAコンジュゲートの用量応答曲線を示す図である。
【図４５Ｂ】初代ヒト肝細胞におけるTMPRSS6に対するsiRNAコンジュゲートの用量応答曲線を示す図である。
【図４６】初代ヒト肝細胞におけるsiRNAコンジュゲートによるTMPRSS6 mRNA発現の阻害を示す図である。
【図４７】初代ヒト肝細胞におけるTMPRSS6発現の阻害について試験したGalNAc siRNAコンジュゲートの配列及び修飾パターンを示す図である。
【図４８】実施例44で使用した核酸の特異的な配列を示す図である。
【図４９】異なる末端安定化化学基(ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホジエステル)を含有するTMPRSS6を標的とするGalNAc siRNAコンジュゲートによる、初代マウス肝細胞における受容体媒介性取り込みを示す図である。
【図５０】ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及びホスホジエステルを末端位及びGalNAc部分に有するGalNAc-siRNAコンジュゲートの血清安定性を示す図である。
【図５１】アンチセンス鎖の5'位にビニル-(E)-ホスホネート2'OMe-ウラシルを有し、最初の3個のヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエート結合を有するTMPRSS6-siRNA(X0204)か、アンチセンス鎖の5'位にビニル-(E)-ホスホネート2'OMe-ウラシルを有し、最初の3個のヌクレオチドの間にホスホジエステル結合(X0205)、(X0139)、又は四量体GalNAcクラスター(X0140)若しくは樹状の三量体GalNAcクラスターを有するTMPRSS6-siRNA(X0004)、又は非標的化GalNAc-siRNA(X0028)による、示されている濃度での処置の24時間後の初代マウス肝細胞、或いは無処置のままにしたもの(UT)における、TMPRSS6遺伝子発現の阻害を示す図である。
【図５２】比較的安定化されていないヌクレアーゼ分解の陽性対照と対比したsiRNAコンジュゲートの血清安定性を示す図である。
【図５３】遺伝性ヘモクロマトーシス1型の動物モデルにおけるTMPRSS6 siRNA処置によるトランスフェリン飽和度の低減を示す図である。
【図５４】TMPRSS6 siRNAによる処置が鉄キレート剤による組織鉄レベルの低減を増強させることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０４３１】
(実施例1)
以下の表に提示するオリゴを使用して、本開示による核酸を合成した。
【０４３２】
合成方法は次のとおりであり、本開示の配列のうちの1つを例として使用した。
【０４３３】
STS012(GN-TMPRSS6-hcm-9)
【０４３４】
第1の鎖
5'mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3'
【０４３５】
第2の鎖
5'[ST23 (ps)]3ロングトレブラー(ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU 3'
【０４３６】
fN(N=A、C、G、U)は、2'フルオロ、2'デオキシヌクレオシドを表す。
mN(N=A、C、G、U)は、2'Oメチルヌクレオシドを表す。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を示す。
【０４３７】
ST23は、GalNAc C4ホスホラミダイト(以下の構造成分)である。
【０４３８】
【化３７】
2021531029.tif 000067
【０４３９】
ロングトレブラー(STKS)
【０４４０】
更なる例は、GN2-TMPRSS6-hcm-9(STS12009L4)である。
第1の鎖
5'mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3'
【０４４１】
第2の鎖
5'[ST23 (ps)]3 ST41 (ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU 3'
【０４４２】
fN(N=A、C、G、U)は、2'フルオロ、2'デオキシヌクレオシドを表す。
mN(N=A、C、G、U)は、2'Oメチルヌクレオシドを表す。
(ps)は、ホスホロチオエート結合を示す。
【０４４３】
ST23は上記のとおりである。
【０４４４】
ST41は次のとおり(かつWO2017/174657に記載のとおり)である。
【０４４５】
【化３８】
2021531029.tif 000068
【０４４６】
すべてのオリゴヌクレオチドは、商業的なオリゴヌクレオチド製造元(Eurogentech社、Belgium;Biospring社、Germany)から得たか、或いは標準的なホスホラミダイト化学を使用してAKTA oligopilot合成機で合成した。市販の固体支持体、及び2'O-メチルRNAホスホラミダイト、2'フルオロDNAホスホラミダイト(すべて標準的な保護)、及び市販のロングトレブラーホスホラミダイト(Glen research社)を使用した。ホスホラミダイトの0.1M無水アセトニトリル溶液を使用して合成を行い、ベンジルチオテトラゾール(BTT)を活性化剤として使用した(アセトニトリル中0.3M)。他の試薬はすべて、市販の標準的試薬であった。
【０４４７】
PS2含有オリゴヌクレオチドの合成を、製造元(Glen Research社、AM Biotech社)の説明に従って行った。ビニル-(E)-ホスホネート2'OMe-ウラシルホスホアミダイトを合成し、文献で公表された方法(Harasztiら、Nuc. Acids Res.、45巻(13号)、2017年、7581〜7592頁)に従い、オリゴヌクレオチド合成に使用した。
【０４４８】
GalNAcシントン(ST23)のコンジュゲーションは、標準的なホスホラミダイト結合条件下で、それぞれのホスホラミダイトをオリゴ鎖の5'末端に結合させることによって達成した。標準的な市販のチオール化試薬(EDITH、Link technologies社)を使用して、ホスホロチオエートを導入した。
【０４４９】
メチルアミンを使用してCPGから一本鎖を切断した。TBDMS保護されたRNAヌクレオシドを使用した場合、TEA*3HFでの更なる処置を行ってシリル保護を除去した。結果として得られた粗オリゴヌクレオチドを、塩化ナトリウム勾配を使用したAKTA Pure HPLC Systemでのイオン交換クロマトグラフィ(Resource Q、6mL、GE Healthcare社)によって精製した。産物を含有する画分をプールし、サイズ排除カラム(Zetadex、EMP Biotech社)で脱塩し、凍結乾燥した。
【０４５０】
アニーリングのために、等モル量の各一本鎖を水中に溶解させ、80℃まで5分間加熱した。冷却後、結果として得られた二重鎖を凍結乾燥した。
【０４５１】
結果として得られた核酸(siRNA)の配列をTable 1(表18)に提示する。
【０４５２】
【表１８Ａ】
2021531029.tif 000069
【０４５３】
【表１８Ｂ】
2021531029.tif 000070
【０４５４】
【表１９】
2021531029.tif 000071
【０４５５】
ヒトHep3B細胞におけるTMPRSS6発現の阻害についてのスクリーン。
6ウェルディッシュ当たり80,000細胞の細胞密度で細胞を播種した。翌日、20nMの核酸(Table 1(表18)に列記されている)と、1μg/mlのAtuFECT(カチオン性脂質Atufect01と膜融合性脂質DPhyPEとの50:50製剤)とを、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞を溶解させ、Table 3(表20)中のアンプリコンを使用したq-RT-PCRによってTMPRSS6 mRNAレベルを判定した。TMPRSS6 mRNAレベルを、ハウスキーピング遺伝子PTENの発現レベルに対して正規化した。ルシフェラーゼ及びPTENの核酸を非標的化対照核酸として使用した。結果は図1に示してある。
【０４５６】
【表２０】
2021531029.tif 000072
【０４５７】
(実施例2)
ヒトHep3B細胞におけるTMPRSS6発現の阻害に対するTMPRSS6核酸の用量応答。
6ウェルディッシュ当たり150,000細胞の細胞密度で細胞を播種した。翌日、1μg/mlのAtuFECT(カチオン性脂質Atufect01と膜融合性脂質DPhyPEとの50:50製剤)と、図2のグラフのX軸によって示されるように様々な量のTMPRSS6核酸(それぞれ30、10、3、1、0.3、0.1、0.003nM)とを、細胞にトランスフェクトした。非標的化対照試料では、ルシフェラーゼの核酸を30及び10nMで細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞を溶解させ、q-RT-PCRによってmRNAレベルを判定した。TMPRSS6 mRNAレベルを、ハウスキーピング遺伝子PTENの発現レベルに対して正規化した。TMPRSS6 mRNA発現の最も高い低減は、TMPRSS6-hcm9核酸によって観察された。ルシフェラーゼ核酸のトランスフェクションは、TMPRSS6 mRNAレベルに影響を与えなかった。結果は図2に示してある。RNAi分子の配列は、Table 1(表18)に示してある。
【０４５８】
(実施例3)
肝臓組織における、異なる用量のGalNAc核酸によるTMPRSS6発現の阻害。
皮下投与による10、3、又は1mg/kgのGalNAc核酸コンジュゲートの単回投薬でC57/BL6マウスを処置した。それぞれのsiRNAコンジュゲートの配列及び修飾は、図7に示してある。siRNAは、図8aに示され、そこに記載されているGalNAcリンカー(GN)にコンジュゲートされている。対照群は、それぞれ、等張食塩水又は非標的化対照コンジュゲートGN-TTR-hcで処置した。コンジュゲートの皮下注射の3日後、肝臓組織における標的遺伝子の発現をqRT PCRによって評価した。急速凍結組織試料から全RNAを単離し、過去に説明されているように(Kuhlaら、2015年、Apoptosis、4巻、500〜11頁)、qRT-PCRを行った。使用したTaqManプローブは、Table 3(表20)に示してある。結果は図3に示してある。
【０４５９】
(実施例4)
TMPRSS6 RNAi分子による標的遺伝子阻害の持続時間。
皮下注射により、3mg/kgのGalNAc-TMPRSS6 RNAi分子でマウスを処置した。それぞれのsiRNAコンジュゲートの配列及び修飾は、図7に示してある。処置後7日目、14日目、21日目、27日目、34日目、又は41日目(注射後日数、dpi)の肝臓組織において、標的mRNAの発現を評価した。肝臓中のTMPRSS6発現の低減が、注射後41日目まで観察される。HAMP(ヘプシジン)mRNA発現は、GN-TMPRSS6 RNAi分子で処置したマウスの肝臓において上方制御されている。結果は図4に示してある。
【０４６０】
(実施例5)
TMPRSS6 siRNAでの処置によるTMPRSS6発現の阻害は、血液中の鉄レベルを低下させる。
3mg/kgのGalNAc核酸コンジュゲートをマウスの皮下に処置した7日後、14日後、21日後、27日後、34日後、及び41日後の血清中で鉄レベルを分析した。血清鉄レベルは、最長で注射後41日目(dpi 41)まで低下した。それぞれのsiRNAコンジュゲートの配列及び修飾は、図7に示してある。結果は図5に示してある。
【０４６１】
(実施例6)
受容体媒介性取り込みによるTMPRSS6発現の阻害。
コラーゲンコーティングディッシュに初代マウス肝細胞を播種し、示されているように100nM〜0.03nMの濃度で細胞培養培地に希釈したsiRNAコンジュゲートと共にインキュベートした。細胞をsiRNAコンジュゲートに曝露した24時間後、全RNAを抽出し、TMPRSS6発現をTaqman qRT-PCRによって定量化した。TMPRSS6 mRNAレベルを、アクチンmRNAレベルに対して正規化した。TMPRSS6発現の用量依存性阻害が、両方のGalNAc-TMPRSS6 siRNAコンジュゲートによって観察された。GN2-Luc-siRNA1 GalNAcコンジュゲート(GN2-Luc)を非標的化対照として使用し、これはTMPRSS6 mRNA発現に影響を与えなかった。それぞれのsiRNAコンジュゲートの配列及び修飾は、図7に示してある。結果は図6に示してある。
【０４６２】
(実施例7)
上述の方法に従い、更なるTMPRSS6 siRNAを合成した。配列及び修飾は、以下のTable 4(表21)に示してある。
【０４６３】
TMPRSS6を標的とするsiRNAの修飾変異体(配列番号17及び18)各二重鎖について、第1の配列(A鎖)は上に列記され、第2の配列(B鎖)は下に列記されている。すべての配列は、配列番号17(上)及び配列番号18(下)に対応する。修飾コードは、Table 4(表21)の最後に列記されている。
【０４６４】
【表２１Ａ】
2021531029.tif 000073
【０４６５】
【表２１Ｂ】
2021531029.tif 000074
【０４６６】
【表２１Ｃ】
2021531029.tif 000075
【０４６７】
【表２１Ｄ】
2021531029.tif 000076
【０４６８】
【表２１Ｅ】
2021531029.tif 000077
【０４６９】
TMPRSS6を標的とする1つのsiRNAの様々な修飾変異体を、ヒトHep3B細胞において試験した。PTEN及びルシフェラーゼを標的とするsiRNAを、それぞれ無関係の対照及び非標的化対照として使用した。すべてのsiRNAは、1μg/mlのAtufectと共に、1nM(示されている場合は0.1nM)でトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に全RNAを抽出し、TMPRSS6 mRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって定量化した。TMPRSS6 mRNAレベルを、アクチンmRNAレベルに対して正規化した。各棒は、3つの技術的複製物の平均+/-SDを表す。結果は図9に示してある。
【０４７０】
(実施例8)
TMPRSS6を標的とするGalNAcコンジュゲートsiRNAの修飾変異体を合成した。これらは図12に示してある。各二重鎖について、第1の鎖の配列は上に列記され、第2の鎖の配列は下に列記されている。修飾は番号として示してあり、次のとおりである。GNは、図8aに従うGalNAcリンカーへのコンジュゲーションを示す。STS12(GN-TMPRSS6-hcm9)の配列及び修飾もまた、図7に示してある。
【０４７１】
(実施例9)
TMPRSS6を標的とする1つのGalNAcコンジュゲート配列(STS012)の様々な修飾変異体は、マウス初代肝細胞におけるTMPRSS6発現を低減させる。受容体媒介性取り込みのため、細胞を100、10、1、及び0.1nMのsiRNAコンジュゲートと共に24時間インキュベートした。全RNAを抽出し、TMPRSS6 mRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって定量化した。TMPRSS6 mRNAレベルを、アクチンmRNAレベルに対して正規化した。3つの技術的複製物それぞれの平均+/- SDを図10に示してある。
【０４７２】
(実施例10)
TMPRSS6を標的とする1つのGalNAcコンジュゲート配列(STS012、GN-TMPRSS6-hcm9)の様々な修飾変異体を、インビボで試験した。1mg/kg及び3mg/kgのGalNAc-siRNAコンジュゲートを雄C57BL/6JOIaHsdマウスの皮下に注射した。処置の14日後、肝臓中のTMPRSS6(A)及びHAMP(B)のmRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって分析した。棒は、少なくとも4匹の動物の平均+/-SDを表す。結果は図11に示してある。
【０４７３】
(実施例11)
TMPRSS6を標的とする1つのGalNAcコンジュゲート配列(STS012)の2つの異なる修飾変異体を、インビボで試験した。1mg/kgのGalNAc-siRNAコンジュゲートを雄C57BL/6JOIaHsdマウスの皮下に注射した。処置の14日後及び28日後、肝臓中のTMPRSS6 mRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって分析した(A)。加えて、血清鉄レベルを分析した(B)。結果は図13に示してある。箱ひげ図は、4匹の動物の中央値を表す。統計分析は、PBS群に対するダンの多重比較検定を用いたクラスカル-ウォリス検定に基づく。
【０４７４】
配列は実施例10にあるとおりである。
【０４７５】
(実施例12)
TMPRSS6を標的とする1つのGalNAcコンジュゲート配列(STS12009L4、GN2-TMPRSS6-hcm9)の2つの異なる修飾変異体を、インビボで試験した。1mg/kg及び0.3mg/kgのGalNAc-siRNAコンジュゲートを雄C57BL/6JOIaHsdマウスの皮下に注射した。処置の14日後、肝臓中のTMPRSS6 mRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって分析した(A)。加えて、血清鉄レベルを分析した(B)。結果は図14に示してある。箱ひげ図は、4匹の動物の中央値を表す。統計分析は、PBS群に対するダンの多重比較検定を用いたクラスカル-ウォリス検定に基づく。
【０４７６】
使用した二重鎖は、以下のTable 5(表22)に示してある。すべての配列は、配列番号17及び配列番号18に対応する。
【０４７７】
【表２２】
2021531029.tif 000078
【０４７８】
(実施例13)
TMPRSS6を標的とする1つのsiRNAの様々な修飾変異体を、ヒトHep3B細胞において試験した。ルシフェラーゼを標的とするsiRNAを非標的化対照として使用した。すべてのsiRNAは、1μg/mlのAtufectと共に、1nM及び0.1nMでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に全RNAを抽出し、TMPRSS6 mRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって定量化した。TMPRSS6 mRNAレベルを、PTEN mRNAレベルに対して正規化した。結果は図15に示してある。各棒は、3つの技術的複製物の平均+/-SDを表す。
【０４７９】
配列は、以下のTable 6(表23)に示してある。すべての配列は、配列番号17(上)及び配列番号18(下)に対応する。
【０４８０】
【表２３】
2021531029.tif 000079
【０４８１】
(実施例14)
TMPRSS6を標的とするGalNAcコンジュゲートsiRNAの修飾変異体を、ヒトHep3B細胞において試験した。6ウェル当たり150,000細胞を蒔いた。24時間後、siRNAコンジュゲートを、1μg/mlのAtufectと共に、10、1、0.1、0.01、及び0.001nM(A)、又は5、0.5、0.05、0.005nM(B)でトランスフェクトした。ルシフェラーゼに対するGalNAc-siRNAを非標的化対照として使用した。トランスフェクションの72時間後に全RNAを抽出し、TMPRSS6 mRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって定量化した。TMPRSS6 mRNAレベルを、PTEN mRNAレベル(A)又はアクチンmRNAレベル(B)に対して正規化した。結果は図16に示してある。各棒は、3つの技術的複製物の平均+/-SDを表す。
【０４８２】
配列は以下のtable 7(表24)に示してある。
【０４８３】
【表２４】
2021531029.tif 000080
【０４８４】
(実施例15)
TMPRSS6を標的とするGalNAcコンジュゲート配列(STS12009L4)の修飾変異体を、マウス初代肝細胞において試験した。受容体媒介性取り込みのため、細胞を100、25、5、1、0.25及び0.05nMのsiRNAコンジュゲートと共に24時間インキュベートした。無関連配列を標的とするGalNAc-siRNA(GN-TTR)及び非標的化GalNAc-siRNA(GN-Luc)を対照として使用した。全RNAを抽出し、TMPRSS6 mRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって定量化した。TMPRSS6 mRNAレベルを、PTEN mRNAレベルに対して正規化した。結果は図17に示してある。3つの技術的複製物それぞれの平均+/-SDを示してある。
【０４８５】
配列は上記のTable 7(表24)に示してある。
【０４８６】
(実施例16)
TMPRSS6を標的とする1つのsiRNAの様々なDNA含有変異体及びLNA含有変異体を、ヒトHep3B細胞において試験した。したがって、6ウェル当たり150,000細胞を蒔いた。24時間後、siRNAを、1μg/mlのAtufectと共に、0.1nM siRNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に全RNAを抽出し、TMPRSS6 mRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって定量化した。TMPRSS6 mRNAレベルを、アクチンmRNAレベルに対して正規化した。結果は図18に示してある。各棒は、3つの技術的複製物の平均+/-SDを表す。
【０４８７】
配列は、以下のTable 8(表25)に示してある。すべての配列は配列番号17(上)及び配列番号18(下)に対応する。
【０４８８】
【表２５】
2021531029.tif 000081
【０４８９】
(実施例17)
TMPRSS6に対するsiRNAを使用して、末端3'位における逆位A及びG RNAヌクレオチドの影響を分析した。TMP70は、すべての末端にホスホロチオエートを含有するが、TMP82及びTMP83は、アンチセンスの3'末端及びセンスの3'末端にivA(TMP82)及びivG(TMP83)を含有する。それぞれの鎖の末端ヌクレオチドに加えて、両方の逆位ヌクレオチドが存在し、ホスホロチオエート結合を介して結合している。無関連のsiRNA(PTEN)及び非標的化siRNA(Luci)を対照として含めた。試験した変異体はすべて、試験条件下で比較可能な活性を示す。
【０４９０】
この実験はHep3B細胞において行った。細胞を6ウェル当たり150,000細胞の密度で蒔き、24時間後に1nM及び0.1nMのsiRNA並びに1μg/mlのAtufectをトランスフェクトし、48時間後に溶解させた。全RNAを抽出し、TMPRSS6及びアクチンのmRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって判定した。結果は図19に示してある。各棒は、3つの技術的複製物からの平均±SDを表す。
【０４９１】
配列は、以下のTable 9(表26)に示してある。配列は、配列番号17(上)又は配列番号18(下)に対応する。
【０４９２】
【表２６】
2021531029.tif 000082
【０４９３】
(実施例18)
両方の3'末端に逆位RNAヌクレオチドを含有する様々なsiRNA二重鎖を血清安定性について試験した。TMP84-TMP87は、センス鎖の最後のヌクレオチドに加えて、かつアンチセンス鎖の最後のヌクレオチドの代わりに、逆位RNAを含有する。TMP88-TMP91は、アンチセンス鎖の最後のヌクレオチドに加えて、かつセンス鎖の最後のヌクレオチドの代わりに、逆位RNAを含有する。すべての逆位RNAヌクレオチドは、末端に使用されるホスホロチオエートを置換する。TMP84-TMP87のデザインにおいて、ivA及びivGは、試験した配列に対して、ivU及びivCよりも高い安定性を与える(パートA)。TMP88-TMP91のデザインでは、二重鎖安定性に対する塩基同一性の影響はない(パートB)。
【０４９４】
結果は図20に示してある。「UT」は、無処置の試料を示す。「FBS」は、5μMの最終濃度で50%のFBSと共に3日間インキュベートし、フェノール/クロロホルム抽出し、エタノールで沈殿させたsiRNA二重鎖を示す。天然ゲル電気泳動において、20%のTBEポリアクリルアミドゲルで試料を分析した。
【０４９５】
配列は、以下のTable 10(表27)に示してあり、配列番号17(上)及び配列番号18(下)に対応する。
【０４９６】
【表２７】
2021531029.tif 000083
【０４９７】
(実施例19)
TMPRSS6に対するsiRNAを使用して、末端3'位における逆位RNAヌクレオチドの影響を分析した。TMP70は、すべての末端にホスホロチオエートを含有するが、TMP84-TMP87は、センス鎖の3'末端にivGを含有する。逆位RNAヌクレオチドは、最後のヌクレオチドに加えて存在し、2つのホスホロチオエートを置換する。アンチセンス3'末端では、ivA(TMP84)、ivU(TMP85)、ivC(TMP86)、及びivG(TMP87)を試験した。これらの逆位RNAヌクレオチドは末端ヌクレオチドの代わりに付加され、ホスホロチオエートを置換する。無関連のsiRNA(PTEN)及び非標的化siRNA(Luci)を対照として含めた。試験した変異体はすべて、試験条件下で比較可能な活性を示す。
【０４９８】
この実験はHep3Bにおいて行った。細胞を6ウェル当たり150,000細胞の密度で蒔き、24時間後に1nM及び0.1nMのsiRNA並びに1μg/mlのAtufectをトランスフェクトし、48時間後に溶解させた。全RNAを抽出し、TMPRSS6及びアクチンのmRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって判定した。結果は図21に示してある。各棒は、3つの技術的複製物からの平均±SDを表す。
【０４９９】
配列は、上記のTable 10(表27)にあるとおりである。
【０５００】
(実施例20)
TMPRSS6に対するsiRNAを使用して、末端3'位における逆位RNAヌクレオチドの影響を分析した。TMP70は、すべての末端にホスホロチオエートを含有するが、TMP88-TMP91は、アンチセンス鎖の3'末端にivGを含有する。逆位RNAヌクレオチドは、最後のヌクレオチドに加えて存在し、2つのホスホロチオエートを置換する。センス3'末端では、ivA(TMP88)、ivU(TMP89)、ivC(TMP90)、及びivG(TMP91)を試験した。これらの逆位RNAヌクレオチドは末端ヌクレオチドの代わりに付加され、ホスホロチオエートを置換する。無関連のsiRNA(PTEN)及び非標的化siRNA(Luci)を対照として含めた。試験した変異体はすべて、試験条件下で比較可能な活性を示す。
【０５０１】
この実験はHep3Bにおいて行った。細胞を6ウェル当たり150,000細胞の密度で蒔き、24時間後に1nM及び0.1nMのsiRNA並びに1μg/mlのAtufectをトランスフェクトし、48時間後に溶解させた。全RNAを抽出し、TMPRSS6及びアクチンのmRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって判定した。結果は図22に示してある。各棒は、3つの技術的複製物からの平均±SDを表す。
【０５０２】
配列は、上記のTable 10(表27)に示したとおりである。
【０５０３】
(実施例21)
リポソームトランスフェクションにおいて、TMPRSS6を標的とするGalNAc-siRNAコンジュゲートを使用して、末端3'位における逆位RNAヌクレオチドの影響を分析した。STS12009-L4は、コンジュゲートされていないすべての末端にホスホロチオエートを含有するが、試験した変異体は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方の3'末端に逆位RNAヌクレオチドを含有する。逆位RNAは、最後のヌクレオチドに加えて存在し、2つの末端ホスホロチオエートを置換するか(STS12009V10-L4及び-V11-L4)、又は末端ホスホロチオエートに加えて使用される(STS12009V29-L4及びSTS12009V30-L4)。逆位A(STS12009V10-L4及び-V29-L4)及び逆位G(STS12009V11-L4及び-V30-L4)を使用した。試験した変異体はすべて、試験条件下で比較可能な活性を示す。
【０５０４】
この実験はHep3Bにおいて行った。細胞を6ウェル当たり150,000細胞の密度で蒔き、24時間後に5nM〜0.0016nMのsiRNA及び1μg/mlのAtufectをトランスフェクトし、48時間後に溶解させた。全RNAを抽出し、TMPRSS6及びアクチンのmRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって判定した。結果は図23に示してある。各棒は、3つの技術的複製物の平均±SDを表す。
【０５０５】
配列は、以下のTable 11(表28)に提示してあり、配列番号17(上)及び配列番号18(下)に対応する。
【０５０６】
【表２８】
2021531029.tif 000084
【０５０７】
(実施例22)
個々の末端に1つのPS2を含有するGalNAc-siRNAコンジュゲートの血清安定性アッセイ。GalNAcをセンス鎖の5'末端にコンジュゲートさせ、4つのPSによって内部で安定化させた。ホスホロジチオエート修飾は、アンチセンス5'末端(STS12009V37L4)、アンチセンス3'末端(STS12009V36L4)、及びセンス3'末端(STS12009V34L4)に配置した。STS12009L4は、アンチセンス5'末端、アンチセンス3'末端、及びセンス3'末端にそれぞれ2つの末端PSを含有し、センス5'末端にはGalNAcが結合し、4つの内部PSによって安定化されている。5μMのGalNAc-siRNAコンジュゲートを、50%のFBSと共に3日間37℃でインキュベートした。RNAを抽出し、20%のTBEポリアクリルアミドゲルで分析した。結果は図24に示してある。「UT」は無処置の試料を示し、「FBS」はFBS処置を示す。「対照」は、異なる配列の比較的安定化されていないGalNAc-siRNAコンジュゲートを示す。
【０５０８】
配列は、以下のTable 12(表29)に示してあり、配列番号17(上)及び配列番号18(下)に対応する。
【０５０９】
【表２９】
2021531029.tif 000085
【０５１０】
(実施例23)
個々の末端に1つのPS2を含有するGalNAc-siRNAコンジュゲートの活性。GalNAcをセンス鎖の5'末端にコンジュゲートさせ、4つのPSによって内部で安定化させた。ホスホロジチオエート修飾は、アンチセンス5'末端(STS12009V37L4)、アンチセンス3'末端(STS12009V36L4)、及びセンス3'末端(STS12009V34L4)に配置した。この実験はマウス初代肝細胞において行った。細胞を6ウェル当たり250,000細胞の密度で蒔き、100nM、10nM、及び1nMのGalNAc-siRNAで処置した。10nMのGalNAc-siRNA及び1μg/mlのAtufectのトランスフェクションを対照とした。24時間後に細胞を溶解させ、全RNAを抽出し、TMPRSS6及びPTENのmRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって判定した。結果は図25に示してある。各棒は、3つの技術的複製物からの平均±SDを表す。
【０５１１】
配列は、上記のTable 12(表29)に提示したとおりである。
【０５１２】
(実施例24)
第2の鎖の5'末端及び第2の鎖の3'末端にそれぞれ1つのPS2を含有するGalNAc-siRNAコンジュゲート(STS12009V40L4)の血清安定性アッセイ。GalNAcを第2の鎖の5'末端にコンジュゲートさせ、いかなる内部PSによっても安定化させなかった。STS12009L4は、アンチセンス5'末端、アンチセンス3'末端、及びセンス3'末端にそれぞれ2つの末端PSを含有し、センス5'末端にはGalNAcが結合し、4つの内部PSによって安定化されている。5μMのGalNAc-siRNAコンジュゲートを、50%のFBSと共に3日間37℃でインキュベートした。RNAを抽出し、20%のTBEポリアクリルアミドゲルで分析した。結果は図26に示してある。「UT」は無処置の試料を示し、「FBS」はFBS処置を示す。「対照」は、異なる配列の比較的安定化されていないGalNAc-siRNAコンジュゲートを示す。
【０５１３】
配列は、以下のTable 13(表30)に提示してあり、配列番号17(上)及び配列番号18(下)である。
【０５１４】
【表３０】
2021531029.tif 000086
【０５１５】
(実施例25)
センス鎖の5'末端及びセンス鎖の3'末端にそれぞれ1つのPS2を含有するGalNAc-siRNAコンジュゲート(STS12009V40L4)の活性。GalNAcをセンス鎖の5'末端にコンジュゲートさせ、いかなる内部PSによっても安定化させなかった。STS12009L4は、アンチセンス5'末端、アンチセンス3'末端、及びセンス3'末端にそれぞれ2つの末端PSを含有し、センス5'末端にはGalNAcが結合し、4つの内部PSによって安定化されている。この実験はマウス初代肝細胞において行った。細胞を6ウェル当たり250,000細胞の密度で蒔き、100nM、10nM、及び1nMのGalNAc-siRNAで処置した。ルシフェラーゼに対するsiRNAのGalNAcコンジュゲート(「GalNAc-Luc」)を対照とした。24時間後に細胞を溶解させ、全RNAを抽出し、TMPRSS6及びPTENのmRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって判定した。結果は図27に示してある。各棒は、3つの技術的複製物からの平均±SDを表す。
【０５１６】
配列は、上記のTable 13(表30)に提示したとおりである。
【０５１７】
(実施例26)
遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、異なる用量のGalNAc siRNAによるTMPRSS6発現の阻害。HFE-/-雌マウス(Herrmannら、J. Mol. Med (Berl)、2004年、82巻、39〜48頁)を、それぞれ1又は3mg/kgのGalNAc siRNAコンジュゲートの単回投薬で皮下処置した。対照群は、皮下注射によるPBS又は非標的化対照GN2-Luc siRNA1(GN2-Luc)で処置した。コンジュゲートの注射の3週間後、肝臓組織における標的遺伝子の発現をqRT PCRによって評価した。群平均及び+/-SD。統計:補正なしダン検定を用いたクラスカル-ウォリス検定。siRNAコンジュゲートの配列及び修飾は、図7に示してある。結果は図28に示してある。P値:****P<.001、***P<0.005、**.01、*P<.05。
【０５１８】
(実施例27)
遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、異なる用量のGalNAc siRNAによる血清ヘプシジンレベルの上昇。皮下注射による1又は3mg/kgのGalNAc siRNAコンジュゲートの単回投薬でHFE-/-マウスを処置した。対照群は、PBS又は非標的化対照コンジュゲートGN2-Luc siRNA 1(GN2-Luc)で処置した。ELISAキット(Intrinsic Life Science社)を使用し、コンジュゲートの注射の3週間後に収集された血清試料中のヘプシジンレベルを判定した。群平均とSD。対照群(GN2-Luc siRNA)に対する補正なしダン検定を用いたクラスカル-ウォリス検定。結果は図29に示してある。P値:****P<.001、***P<0.005、**.01、*P<.05。
【０５１９】
(実施例28)
遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、異なる用量のGalNAc siRNAによる血清鉄レベルの低下。皮下投与による1又は3mg/kgのGalNAc siRNAコンジュゲートの単回投薬でHFE-/-マウスを処置した。対照群は、PBS又は非標的化対照コンジュゲート(GN2-Luc siRNA)で処置した。処置の3週間後に血清鉄レベルを判定した。群平均+/-SD。対照群(GN2-Luc)に対する補正なしダン検定を用いたクラスカル-ウォリス検定。siRNAコンジュゲートの配列及び修飾は、図7に示してある。結果は図30に示してある。P値:****P<.001、***P<0.005、**.01、*P<.05。
【０５２０】
(実施例29)
遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、異なる用量のGalNAc siRNAによるトランスフェリン飽和度の低減。皮下投与による1又は3mg/kgのGalNAc siRNAコンジュゲートの単回投薬でHFE-/-マウスを処置した。対照群は、PBS又は非標的化対照コンジュゲートGN2-Luc siRNA1(GN2-Luc)で処置した。処置の3週間後、血液試料中のトランスフェリン飽和度%を判定した。群平均とSD。対照群(GN2-Luc)に対する補正なしダン検定を用いたクラスカル-ウォリス検定。siRNAコンジュゲートの配列及び修飾は、図7に示してある。結果は図31に示してある。P値:****P<.001、***P<0.005、**.01、*P<.05。
【０５２１】
(実施例30)
遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける不飽和鉄結合能(UIBC)の増加。皮下投与による1又は3mg/kgのGalNAc siRNAコンジュゲートの単回投薬でHFE-/-マウスを処置した。対照群は、PBS又は非標的化対照コンジュゲートGN2-Luc siRNA1(GN2-LUC)で処置した。UIBCの判定のため、処置の3週間後に血清試料を収集した。群平均とSD。対照群(GN2-Luc)に対する補正なしダン検定を用いたクラスカル-ウォリス検定。結果は図32に示してある。P値:****P<.001、***P<0.005、**.01、*P<.05。
【０５２２】
(実施例31)
遺伝性ヘモクロマトーシスの動物モデルにおける、GalNAc siRNAによる組織鉄レベルの低下。皮下投与による1又は3mg/kgのGalNAc siRNAコンジュゲートの単回投薬でHFE-/-マウスを処置した。対照群は、PBS又は非標的化対照コンジュゲートGN2-Luc siRNA1(GN2-Luc)で処置した。処置の3週間後、腎臓組織中の鉄レベルを評価した。箱ひげ図(チューキー、中央値)。対照群(GN2-Luc)に対する補正なしダン検定を用いたクラスカル-ウォリス検定。結果は図33に示してある。
【０５２３】
(実施例32)
Hep3B細胞における様々なsiRNAによるTMPRSS6 mRNA発現の低減。
【０５２４】
ウェル当たり8000細胞を96ウェルプレートに播種した。翌日、20nMのsiRNA及び1μg/mlのAtuFECTを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞を溶解させ、q-RT-PCRによってTMPRSS6 mRNAレベルを判定した。TMPRSS6 mRNAレベルを、ハウスキーピング遺伝子ApoBの発現レベルに対して正規化した。ルシフェラーゼに対するsiRNAを非標的化対照として使用した。無処置の細胞に対する三つ組値の平均阻害率及び標準偏差を図34に示してある。siRNAの配列は、以下のTable 14(表31)に示してある。
【０５２５】
【表３１Ａ】
2021531029.tif 000087
【０５２６】
【表３１Ｂ】
2021531029.tif 000088
【０５２７】
【表３１Ｃ】
2021531029.tif 000089
【０５２８】
【表３１Ｄ】
2021531029.tif 000090
【０５２９】
(実施例33)
Hep3B細胞におけるTMPRSS6に対するsiRNAの用量応答。
【０５３０】
ウェル当たり8000細胞を96ウェルプレートに播種した。翌日、示されている濃度(100nM〜0.03nM)のsiRNA及び1μg/mlのAtuFECTを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞を溶解させ、q-RT-PCRによってTMPRSS6 mRNAレベルを判定した。TMPRSS6 mRNAレベルを、ハウスキーピング遺伝子ApoBの発現レベルに対して正規化した。100nMの非標的化ルシフェラーゼ対照siRNAで処置した細胞に対する三つ組値の平均阻害率及び標準偏差を図35に示してある。以下のTable 15(表32)は、図35に示した用量応答曲線に従う最大阻害率、IC50、及び95%信頼区間を示す。
【０５３１】
【表３２】
2021531029.tif 000091
【０５３２】
(実施例34)
1°ヒト肝細胞における受容体媒介性取り込みによるTMPRSS6 mRNA発現の阻害。
【０５３３】
コラーゲンコーティングディッシュに初代ヒト肝細胞を播種し、示されているように300nM〜1nMの濃度で細胞培養培地に希釈したsiRNAコンジュゲートと共にインキュベートした。細胞をsiRNAコンジュゲートに曝露した24時間後、全RNAを抽出し、TMPRSS6発現をTaqman qRT-PCRによって定量化した。TMPRSS6 mRNAレベルを、アクチンmRNAレベルに対して、また、非標的化対照siRNAコンジュゲートGN2-Luc siRNA1(GN2-Luc)で処置した細胞の標的mRNAレベルに対して正規化した。TMPRSS6発現の用量依存性阻害が、GalNAc-TMPRSS6 siRNAコンジュゲートによって観察された。コンジュゲートの配列及び修飾は、図7に示してある。結果は図36に示してある。
【０５３４】
(実施例35)
GalNAc TMPRSS6 siRNAは、中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおけるヘマトクリット値を上昇させる。
【０５３５】
Hbbth3/+マウス(Yangら、1995年、PNAS、92巻、11608〜11612頁)を、1日目(d1)及び15日目に、それぞれ、3mg/kgのGN2-TMPRSS6-hcm9(GN2-TMP)、GN2-Luc siRNA1(GN2-Luc)、又は非標的化対照若しくはビヒクル対照としてのPBSで皮下処置した。36日目、全血の検査のため、ヘパリンコーティング管に全血を収集した。Hbbth3/+マウスは、Jackson Laboratory社(Bar Harbor、ME)から取得し、C57BL/6バックグラウンドで維持した。無処置の野生型(WT)マウス(C57BL/6)から血液試料を収集し、比較のために分析した。散布ドットプロット、平均+/-SD;n=3〜6。統計:ウェルチの補正を用いた独立t検定。結果は図37に示してある。
【０５３６】
(実施例36)
GalNAc TMPRSS6 siRNAは、中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおける赤血球分布幅を低減させる。
【０５３７】
Hbbth3/+マウス(Yangら、1995年、PNAS、92巻、11608〜11612頁)を、1日目及び15日目に、それぞれ、3mg/kgのGN2-TMPRSS6-hcm9(GN2-TMP)、GN2-Luc siRNA1(GN2-Luc)、又は非標的化対照若しくはビヒクル対照としてのPBSで皮下処置した。36日目、全血の検査のため、ヘパリンコーティング管に全血を収集した。Hbbth3/+マウスは、Jackson Laboratory社(Bar Harbor、ME)から取得し、C57BL/6バックグラウンドで維持した。無処置の野生型(WT)マウス(C57BL/6)から血液試料を収集し、比較のために分析した。散布ドットプロット、平均+/-SD;n=3〜6。統計:ウェルチの補正を用いた独立t検定。結果は図38に示してある。
【０５３８】
(実施例37)
GalNAc TMPRSS6 siRNAは、中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおける網状赤血球の割合を低減させる。
【０５３９】
Hbbth3/+マウス(Yangら、1995年、PNAS、92巻、11608〜11612頁)を、1日目(d1)及び15日目に、それぞれ、3mg/kgのGN2-TMPRSS6 hcm9(GN2-TMP)、GN2-Luc siRNA1(GN2-Luc)、又は非標的化対照若しくはビヒクル対照としてのPBSで皮下処置した。36日目、全血の検査のため、ヘパリンコーティング管に全血を収集した。Hbbth3/+マウスは、Jackson Laboratory社(Bar Harbor、ME)から取得し、C57BL/6バックグラウンドで維持した。無処置の野生型(WT)マウス(C57BL/6)から血液試料を収集し、比較のために分析した。散布ドットプロット、平均+/-SD;n=3〜6。統計:ウェルチの補正を用いた独立t検定。結果は図39に示してある。
【０５４０】
(実施例38)
GalNAc TMPRSS6 siRNAは、中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおける反応性酸素種(ROS)の量を低減させる。Hbbth3/+マウス(Th3/+;Yangら、1995年、PNAS、92巻、11608〜11612頁)を、1日目及び15日目に、3mg/kgのGN2-TMPRSS6 hcm9(GN2-TMP)又は非標的化対照としてのGN2-Luc1 siRNA(GN2-Luc)で皮下処置した。36日目、全血の検査のため、ヘパリンコーティング管に全血を収集した。指示薬としての2'7'ジクロロ-フルオレセインを添加した5分後にROS測定を行った(Siwaponananら、2017年、Blood、129巻、3087〜3099頁)。GN2-TMPRSS6 hcm9処置マウスの血液試料は2回測定した。Hbbth3/+マウス(Th3/+)は、Jackson Laboratory社(Bar Harbor、ME)から取得し、C57BL/6バックグラウンドで維持した。無処置の野生型(WT)マウス(C57BL/6)から血液試料を収集し、比較のために分析した。散布ドットプロット、平均+/-SD;n=4〜6。統計:ウェルチの補正を用いた独立t検定。結果は図40に示してある。
【０５４１】
(実施例39)
GalNAc TMPRSS6 siRNAは、中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおけるヘモグロビンレベルを上昇させる。Hbbth3/+マウス(Yangら、1995年、PNAS、92巻、11608〜11612頁)を、1日目(d1)及び15日目に、それぞれ、3mg/kgのGN2-TMPRSS6-hcm9(GN2-TMP)、GN2-Luc-siRNA1(GN2-Luc)、又は非標的化対照若しくはビヒクル対照としてのPBSで皮下処置した。36日目、全血の検査のため、ヘパリンコーティング管に全血を収集した。Hbbth3/+マウスは、Jackson Laboratory社(Bar Harbor、ME)から取得し、C57BL/6バックグラウンドで維持した。無処置の野生型(wt)マウス(C57BL/6)から血液試料を収集し、比較のために分析した。散布ドットプロット、平均+/-SD;n=5〜7。統計:多重比較のための補正なしのウェルチのt検定。結果は図41に示してある。siRNAコンジュゲートは図7に示してある。
【０５４２】
(実施例40)
GalNAc TMPRSS6は、中間型β-サラセミアの齧歯動物モデルにおける脾腫を低減させる。Hbbth3/+マウス(Yangら、1995年、PNAS、92巻、11608〜11612頁)を、1日目及び15日目に、それぞれ、3mg/kgのGN2-TMPRSS6-hcm9(GN2-TMP)、GN2-Luc-siRNA1(GN2-Luc)、又は非標的化対照若しくはビヒクル対照としてのPBSで皮下処置した。39日目に脾臓質量を評価した。Hbbth3/+マウスは、Jackson Laboratory社(Bar Harbor、ME)から取得し、C57BL/6バックグラウンドで維持した。PBSで処置した野生型(wt)マウス(C57BL/6)の脾臓質量を比較のために評価した。散布ドットプロット、平均+/-SD;n=5〜7。統計:多重比較のための補正なしのウェルチのt検定。結果は図42に示してある。siRNAコンジュゲートは図7に示してある。
【０５４３】
(実施例41)
GalNAc TMPRSS6は、骨髄中の赤血球の成熟を向上させる。Hbbth3/+マウス(Yangら、1995年、PNAS、92巻、11608〜11612頁)を、1日目及び15日目に、3mg/kgのGN2-TMPRSS6-hcm9(GN2-TMP)、GN2-Luc-siRNA1(GN2-Luc)、又は非標的化対照若しくはビヒクル対照としてのPBSで皮下処置し、39日目に骨髄から細胞を収集し、FACS分析によって分析した。CD71、Ter119、及びCD44染色に基づき、生存能力のある赤血球細胞を別個の集団に分離させた。Hbbth3/+マウスは、Jackson Laboratory社(Bar Harbor、ME)から取得し、C57BL/6バックグラウンドで維持した。PBSで処置した野生型(wt)マウス(C57BL/6)の骨髄における赤血球細胞を比較のために評価した。棒グラフ、平均+/-SD;n=5〜7。統計:多重比較のための補正なしのウェルチのt検定。結果は図43に示してある。siRNAコンジュゲートは図7に示してある。
【０５４４】
(実施例42)
GalNAc TMPRSS6は、脾臓における赤血球生成不良を低減させる。Hbbth3/+マウス(Yangら、1995年、PNAS、92巻、11608〜11612頁)を、1日目及び15日目に、それぞれ、3mg/kgのGN2-TMPRSS6 hcm9(GN2-TMP)、GN2-Luc siRNA1(GN2-Luc)、又は非標的化対照若しくはビヒクル対照としてのPBSで皮下処置した。39日目に脾臓から細胞を収集し、FACS分析によって分析した。CD71、Ter119、及びCD44染色に基づき、生存能力のある赤血球細胞を別個の集団に分離させた。Hbbth3/+マウスは、Jackson Laboratory社(Bar Harbor、ME)から取得し、C57BL/6バックグラウンドで維持した。PBSで処置した野生型(wt)マウス(C57BL/6)の赤血球細胞を比較のために評価した。棒グラフ、平均+/-SD;n=5〜7。統計:多重比較のための補正なしのウェルチのt検定。結果は図44に示してある。siRNAコンジュゲートは図7に示してある。
【０５４５】
(実施例43)
GalNAc siRNAコンジュゲートによるヒト肝細胞におけるTMPRSS6発現の低減。
【０５４６】
コラーゲンでコーティングされた96ウェルプレートに、30,000cpwのヒト初代肝細胞を蒔いた。播種直後に、示されている量のsiRNAコンジュゲートで細胞を処置した。処置の24時間後に細胞を溶解させ、TMPRSS6 mRNA発現をTaqMan qRT-PCRによって分析した。ApoB(ハウスキーパー)及び無処置の細胞の平均に対して正規化されたTMPRSS6の三つ組値を示してある。
【０５４７】
結果は図45a、45b、及び図46に示してあり、配列は図47に示してある。記載されているGN3リンカーは、図8Cに示してある。
【０５４８】
(実施例44)
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及びホスホジエステルを末端位及びGalNAc部分に有するGalNAc-siRNAコンジュゲートの血清安定性アッセイ。GalNAcをセンス鎖の5'末端にコンジュゲートさせ、4つのPSによって内部で安定化させたか(STS12009L4)、又は安定化させず、その代わりにホスホジエステル結合を使用した(STS12009V54L50〜V57L50)。ホスホロジチオエート修飾は、二重鎖のうち第1の鎖の5'末端を除いたすべての末端位に配置したか(-V54L50)、3'末端のみに配置したか(-V55L50、-V57L50)、又は第2の鎖の3'末端のみに配置した(-V56L50)。ある特定のデザインでは、siRNA二重鎖の末端位にホスホジエステルを使用した(-V56L50、-V57L50)。5μMのGalNAc-siRNAコンジュゲートを、50%のFBSと共に3日間37℃でインキュベートした。RNAを抽出し、20%のTBEポリアクリルアミドゲルで分析した。「UT」は無処置の試料を示し、「FBS」はFBS処置を示す。「対照」は、異なる配列の比較的安定化されていないGalNAc-siRNAコンジュゲートを示す。
【０５４９】
異なる末端安定化化学基(ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホジエステル)を含有する、TMPRSS6を標的とするsiRNAのGalNAcコンジュゲートを、初代マウス肝細胞における受容体媒介性取り込みによって試験した。GalNAcを第2の鎖の5'末端にコンジュゲートさせ、4つのPSによって内部で安定化させたか(STS12009L4)、又は安定化させず、その代わりにホスホジエステル結合を使用した(STS12009V54L50〜V57L50)。ホスホロジチオエート修飾は、二重鎖のうち第1の鎖の5'末端を除いたすべての末端位に配置したか(-V54L50)、3'末端のみに配置したか(-V55L50、-V57L50)、又は第2の鎖の3'末端のみに配置した(-V56L50)。ある特定のデザインでは、siRNA二重鎖の末端位にホスホジエステルを使用した(-V56L50、-V57L50)。この実験はマウス初代肝細胞において行った。細胞を96ウェル当たり20,000細胞の密度で蒔き、125nM〜0.2nMのGalNAc-siRNAで処置した。24時間後に細胞を溶解させ、全RNAを抽出し、TMPRSS6及びPTENのmRNAレベルをTaqman qRT-PCRによって判定した。各棒は、3つの技術的複製物の平均±SDを表す。
【０５５０】
結果及び関連する配列は、図48〜図50に示してある。
【０５５１】
(実施例45)
第1の鎖の5'位における2'-O-メチル-アデニンを置換する2'-O-メチル-ウリジン又は5'-(E)-ビニルホスホネート-2'-O-メチル-ウリジンを有するGalNAc siRNAコンジュゲートによる、初代マウス肝細胞におけるTMPRSS6発現の低減。
【０５５２】
コラーゲンで予めコーティングされた96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific社、#A1142803)に、ウェル当たり30,000細胞の細胞密度でマウス初代肝細胞を蒔き、100nMから0.1nMに及ぶ濃度のsiRNAコンジュゲートで処置した。処置の24時間後に細胞を溶解させ、InviTrap(登録商標)RNA Cell HTS 96 Kit/C24×96プレップ(Stratec社#7061300400)を製造元のプロトコールに従って用い、RNAを抽出した。TMPRSS6及びハウスキーピングmRNA(PtenII)の転写物レベルをTaqMan分析によって定量化した。
【０５５３】
siRNAコンジュゲート:
【０５５４】
【表３３Ａ】
2021531029.tif 000092
【０５５５】
【表３３Ｂ】
2021531029.tif 000093
【０５５６】
TaqManプライマー及びプローブ
【０５５７】
【表３４】
2021531029.tif 000094
【０５５８】
インビトロ用量応答
アンチセンス鎖の5'位にビニル-(E)-ホスホネート2'OMe-ウラシルを有し、最初の3個のヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエート結合を有するTMPRSS6-siRNA(STS12209V4L4)、アンチセンス鎖の5'位にビニル-(E)-ホスホネート2'OMe-ウラシルを有し、最初の3個のヌクレオチドの間にホスホジエステル結合を有するTMPRSS6-siRNA(STS12209V5L4)、5'位の最初の3個のヌクレオチドの間に2'-O-メチル-ウラシル及び2つのホスホロチオエート結合を有するTMPRSS6-siRNA(STS12209L4)、又は5'位の最初の3個のヌクレオチドの間に2'-O-メチル-ウラシル及び2つのホスホジエステル結合を有するTMPRSS6-siRNA(STS12209V1L4)若しくは参照としての(STS12009L4)、又は非標的化GalNAc-siRNA(STS18001)による、示されている濃度での処置の24時間後の初代マウス肝細胞、或いは無処置のままにしたもの(UT)における、標的遺伝子の発現。
【０５５９】
結果は図51に示してある。
【０５６０】
血清安定性
50%のFCS中37℃で4時間(4h)若しくは3日間(3d)インキュベートしたsiRNAコンジュゲート、又は無処置のままにしたもの(0h)の血清安定性。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出によって次のRNAを抽出した。TBE-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びSybrGoldでのRNAの染色により、分解を可視化した。
【０５６１】
結果は、図52:比較的安定化されていないヌクレアーゼ分解の陽性対照と対比したsiRNAコンジュゲートの血清安定性に示してある。
【０５６２】
(実施例46)
遺伝性ヘモクロマトーシス1型の動物モデルにおける、TMPRSS6 siRNA処置によるトランスフェリン飽和度の低減。この試験では、3カ月齢C57BL6/Jコンジェニック雌HFEノックアウトマウス(-/-)及び3カ月齢雌C57BL6/J野生型マウス(+/+)を使用した(Herrmannら、Mol. Med, 2004. 82 (1): 1〜3頁)。HFE-/-マウス(n=8)を1日目(1X)又は1日目及び22日目(2X)に、PBS(PBS)又はTMPRSS6 siRNAコンジュゲート(TMP)3mg/kg又は非標的化siRNAコンジュゲート(Luc)3mg/kgのいずれかで皮下処置した。更に、コホート7から10は、飲用水に0.5mg/mlの濃度で補給したデフェリプロンを与えた。コホート1及び2は1日目(投与前)に、その他のコホートはすべて43日目(処置開始6週間後)に殺処分し、分析のために血清及び組織試料を収集した。
【０５６３】
血清鉄レベル(SFBC)及び不飽和鉄結合結合能UIBCは、比色法によって評価した。トランスフェリン飽和度(Tf Sat)は、以下の式:Tf Sat=(SFBC/TIBC)×100を使用して計算した。トランスフェリン飽和度は、処置段階開始時に3カ月齢HFE-/-マウスで上昇していた(コホート2、投与前)。TMPRSS6 siRNAコンジュゲート単独、又はデフェリプロンと組み合わせによる処置は、遺伝性ヘモクロマトーシス及び鉄過剰症のこの齧歯類モデルにおいてトランスフェリン飽和度を低減させた。
【０５６４】
結果は図53に示してある。
siRNAコンジュゲート:
【０５６５】
【表３５】
2021531029.tif 000095
【０５６６】
(実施例47)
TMPRSS6 siRNAによる処置は、鉄キレート剤による組織鉄レベルの低減を増強させる。3カ月齢HFE-/-(遺伝性ヘモクロマトーシス及び鉄過剰症の齧歯類モデル)又は野生型マウスをこの試験のために使用し、実施例46に記載したように処置した。肝臓組織試料を収集し、処置開始前(投与前)及び43日目の試験終了時(処置開始6週間後)に肝臓鉄濃度を評価した。肝臓組織試料を乾燥させ、酸抽出法によって乾燥重量から鉄濃度を判定した。試験開始時に、肝臓鉄レベルはHFE-/-では野生型対象マウスと比較して既に上昇していた(投与前)。デフェリプロンと組み合わせたTMPRSS6 siRNAコンジュゲートによるHFE-/-マウスの処置は、鉄キレート剤による組織鉄レベルの低減を増強させた。換言すると、siRNA/鉄キレート剤併用処置は、siRNA又はキレート剤単独による処置によって実現されるよりも肝臓における鉄含量の遙かに多い低減を引き起こした(カラム5と9又は6と10を比較すること)。siRNA単独(カラム3とカラム5及び6とを比較すること)又は鉄キレート剤単独(カラム7)による処置は肝臓鉄含量にほとんど又は全く影響を及ぼさないので、これは驚くべきことである。肝臓鉄含量は、多回用量のsiRNAの投与によって更に低減される(カラム9と10を比較すること)。
【０５６７】
siRNAコンジュゲートは実施例46に記載された通りであり、結果は図54に示してある。
【０５６８】
【表３６Ａ】
2021531029.tif 000096
【０５６９】
【表３６Ｂ】
2021531029.tif 000097
【０５７０】
【表３６Ｃ】
2021531029.tif 000098
【０５７１】
【表３６Ｄ】
2021531029.tif 000099
【０５７２】
【表３６Ｅ】
2021531029.tif 000100
【０５７３】
【表３６Ｆ】
2021531029.tif 000101
【０５７４】
【表３６Ｇ】
2021531029.tif 000102
【０５７５】
【表３６Ｈ】
2021531029.tif 000103
【０５７６】
【表３６Ｉ】
2021531029.tif 000104
【０５７７】
【表３６Ｊ】
2021531029.tif 000105
【０５７８】
【表３６Ｋ】
2021531029.tif 000106
【０５７９】
【表３６Ｌ】
2021531029.tif 000107
【０５８０】
【表３６Ｍ】
2021531029.tif 000108
【０５８１】
【表３６Ｎ】
2021531029.tif 000109
【０５８２】
【表３６Ｏ】
2021531029.tif 000110
【０５８３】
【表３６Ｐ】
2021531029.tif 000111
【０５８４】
【表３６Ｑ】
2021531029.tif 000112
【０５８５】
【表３６Ｒ】
2021531029.tif 000113
【０５８６】
【表３６Ｓ】
2021531029.tif 000114
【０５８７】
【表３６Ｔ】
2021531029.tif 000115
【０５８８】
【表３６Ｕ】
2021531029.tif 000116
【０５８９】
【表３６Ｖ】
2021531029.tif 000117
【０５９０】
【表３６Ｗ】
2021531029.tif 000118
【０５９１】
【表３６Ｘ】
2021531029.tif 000119
【０５９２】
【表３６Ｙ】
2021531029.tif 000120
【０５９３】
【表３６Ｚ】
2021531029.tif 000121
【０５９４】
【表３６ａ】
2021531029.tif 000122
【０５９５】
重要語
1=2'F-dU
2=2'F-dA
3=2'F-dC
4=2'F-dG
5=2'OMe-rU
6=2'OMe-rA
7=2'OMe-rC
8=2'OMe-rG
T=dT
mA、mU、mC、mG-2'-OMe RNA
fA、fU、fC、fG-2'-F DNA
(ps)-ホスホロチオエート
GN=図8Aに係るGalNAcリンカーGN
GN2=図8Bに係るGalNAc構造
GN3=図8Cに係るGalNAcリンカー構造
GNo=(ps)の代わりにホスホジエステルを有するGN2
[A]、[T]、[C]、[G]-DNA
{A}、{U}、{C}、{G}-LNA
ivA、ivC、ivU、ivG-逆位RNA(3'-3')
(ps2)-ホスホロジチオエート
ビニルホスホネート  ビニル-(E)-ホスホネート
FAM-6-カルボキシフルオレセイン
TAMRA-5-カルボキシテトラメチルローダミン
BHQ-ブラックホールクエンチャー1
【０５９６】
RNA配列内においてPS、PS2、GN、GN2、GN3等の特定のリンカー及び又は修飾された結合が教示されている場合、これらはその配列の任意選択の部分であるが、その配列の好ましい実施形態である。
【０５９７】
以下の略語を使用することができる:
【０５９８】
【表３７Ａ】
2021531029.tif 000123
【０５９９】
【表３７Ｂ】
2021531029.tif 000124
【０６００】
【表３７Ｃ】
2021531029.tif 000125
【０６０１】
【表３７Ｄ】
2021531029.tif 000126
【図１】
2021531029.tif 000133
【図２】
2021531029.tif 000134
【図３】
2021531029.tif 000135
【図４】
2021531029.tif 000136
【図５】
2021531029.tif 000137
【図６】
2021531029.tif 000138
【図７】
2021531029.tif 000139
【図８ａ】
2021531029.tif 000140
【図８ｂ】
2021531029.tif 000141
【図８ｃ】
2021531029.tif 000142
【図９】
2021531029.tif 000143
【図１０】
2021531029.tif 000144
【図１１】
2021531029.tif 000145
【図１２】
2021531029.tif 000146
【図１３】
2021531029.tif 000147
【図１４】
2021531029.tif 000148
【図１５】
2021531029.tif 000149
【図１６】
2021531029.tif 000150
【図１７】
2021531029.tif 000151
【図１８】
2021531029.tif 000152
【図１９】
2021531029.tif 000153
【図２０Ａ】
2021531029.tif 000154
【図２０Ｂ】
2021531029.tif 000155
【図２１】
2021531029.tif 000156
【図２２】
2021531029.tif 000157
【図２３】
2021531029.tif 000158
【図２４】
2021531029.tif 000159
【図２５】
2021531029.tif 000160
【図２６】
2021531029.tif 000161
【図２７】
2021531029.tif 000162
【図２８】
2021531029.tif 000163
【図２９】
2021531029.tif 000164
【図３０】
2021531029.tif 000165
【図３１】
2021531029.tif 000166
【図３２】
2021531029.tif 000167
【図３３】
2021531029.tif 000168
【図３４】
2021531029.tif 000169
【図３５−１】
2021531029.tif 000170
【図３５−２】
2021531029.tif 000171
【図３５−３】
2021531029.tif 000172
【図３６】
2021531029.tif 000173
【図３７】
2021531029.tif 000174
【図３８】
2021531029.tif 000175
【図３９】
2021531029.tif 000176
【図４０】
2021531029.tif 000177
【図４１】
2021531029.tif 000178
【図４２】
2021531029.tif 000179
【図４３】
2021531029.tif 000180
【図４４】
2021531029.tif 000181
【図４５Ａ】
2021531029.tif 000182
【図４５Ｂ】
2021531029.tif 000183
【図４６】
2021531029.tif 000184
【図４７】
2021531029.tif 000185
【図４８】
2021531029.tif 000186
【図４９】
2021531029.tif 000187
【図５０】
2021531029.tif 000188
【図５１】
2021531029.tif 000189
【図５２】
2021531029.tif 000190
【図５３】
2021531029.tif 000191
【図５４】
2021531029.tif 000192
【配列表】
2021531029000001.app
【国際調査報告】
2021531029.tif 000193
2021531029.tif 000194
2021531029.tif 000195
2021531029.tif 000196