(57)【要約】  本発明は、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）の発現に関する。本発明は、遺伝子操作およびワクチン技術の分野における進歩を表す。本発明は、切断型ＰｓｐＡペプチドの発現のための発現ベクターおよび組換え宿主細胞を開示する。本発明はまた、担体タンパク質として切断型ペプチドを含むワクチン組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列を含む、切断型肺炎球菌表面タンパク質Ａ１（ＰｓｐＡ１）をコードする核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を含む、発現構築物。
【請求項３】
配列番号３または配列番号４に示される切断型肺炎球菌表面タンパク質Ａ１（ＰｓｐＡ１）の高レベル発現を可能にする、発現構築物。
【請求項４】
ａ．配列番号５または配列番号６に示される、切断型ｐｓｐＡ１をコードする遺伝子、
ｂ．複製開始点、
ｃ．抗生物質耐性遺伝子、
ｄ．プロモーター、および
ｅ．リボソーム結合部位
を含む、配列番号３または配列番号４に示される切断型ＰｓｐＡ１（肺炎球菌表面タンパク質Ａ１）の高レベル発現のための発現構築物。
【請求項５】
抗生物質耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子である、請求項４に記載の発現構築物。
【請求項６】
ａ．ｏｒｉＲ複製開始点、
ｂ．カナマイシン耐性遺伝子、
ｃ．Ｐｔａｃプロモーター、および
ｄ．配列番号５に示される、切断型ｐｓｐＡ１をコードする目的の遺伝子
を含む、請求項４に記載の発現構築物。
【請求項７】
ａ．ｐＵＣ複製開始点、
ｂ．カナマイシン耐性遺伝子、
ｃ．ＰＴ７プロモーター、および
ｄ．配列番号６に示される、切断型ｐｓｐＡ１をコードする目的の遺伝子
を含む、請求項４に記載の発現構築物。
【請求項８】
配列番号７に示されるトリオースリン酸イソメラーゼリボソーム結合部位をさらに含む、請求項７に記載の発現構築物。
【請求項９】
ａ．切断型ｐｓｐＡ１をコードする遺伝子（配列番号５）、
ｂ．ｏｒｉＲ複製開始点（配列番号１２）、
ｃ．カナマイシン耐性遺伝子（配列番号１）、
ｄ．Ｐｔａｃプロモーター（配列番号２）、および
ｅ．トリオースリン酸イソメラーゼリボソーム結合部位
を含む、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける切断型ＰｓｐＡ１（配列番号３）の高レベル発現のための発現構築物。
【請求項１０】
ａ．切断型ｐｓｐＡ１をコードする遺伝子（配列番号６）、
ｂ．ｐＵＣ複製開始点、
ｃ．カナマイシン耐性遺伝子（配列番号１）、
ｄ．ＰＴ７プロモーター（配列番号１１）、および
ｅ．リボソーム結合部位
を含む、大腸菌における切断型ＰｓｐＡ１（配列番号４）の高レベル発現のための発現構築物。
【請求項１１】
請求項２〜１０のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
【請求項１２】
宿主がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたは大腸菌である、請求項１１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
請求項２〜１０のいずれか１項に記載の発現構築物で形質転換した細菌を培養するステップと、それによって発現したそのタンパク質を精製するステップとを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ切断型ＰｓｐＡ１（肺炎球菌表面タンパク質Ａ１）の高レベル発現のための方法。
【請求項１４】
切断型ｐｓｐＡ１の収量が、約５００ｍｇ／Ｌ、約４００ｍｇ／Ｌ、約３００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約２２０ｍｇ／Ｌ、約２００ｍｇ／Ｌ、約１８０ｍｇ／Ｌ、約１６０ｍｇ／Ｌ、約１５０ｍｇ／Ｌ、約１２０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌである、請求項１３に記載の切断型ＰｓｐＡ１の高レベル発現および精製の方法。
【請求項１５】
配列番号３もしくは配列番号４に示される切断型ＰｓｐＡ１または切断型ＰｓｐＡ１とＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、百日咳トキソイドおよびＰｓａＡを含む群から選択されるその他の担体タンパク質との組み合わせとコンジュゲートした、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、３８、３９、および４５から選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型の少なくとも１つの多糖類を含む、肺炎球菌コンジュゲートワクチン。
【請求項１６】
ワクチンが、１０価、１４価、１５価、１７価、１８価、１９価、２０価、２２価、２３価、２４価および２５価から選択される多価ワクチンである、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
配列番号３または配列番号４に示される切断型ＰｓｐＡ１にコンジュゲートしたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、６Ａおよび６Ｂ、ならびにＣＲＭ１９７にコンジュゲートしたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来する少なくとも３つの多糖類を含む、請求項１５に記載の多価コンジュゲートワクチン。
【請求項１８】
コンジュゲートワクチンにおける担体タンパク質としての配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含む切断型肺炎球菌表面タンパク質Ａ１（ＰｓｐＡ１）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌における切断型肺炎球菌表面タンパク質Ａ１（ＰｓｐＡ１）の高レベル表現に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、中耳炎、髄膜炎、菌血症および肺炎の重要な原因であり、高齢者や基礎疾患のある人における致死的な感染症の主な原因となっている。連鎖球菌ワクチン接種の魅力的な目標は、ワクチンを接種した集団における保菌を減らし、その後、肺炎球菌疾患の発生率を低下させることである。
【０００３】
Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ２３の商品名で販売されている肺炎球菌多糖類ワクチンは、２歳未満の小児には効果がない。この集団において多糖類ワクチンが無効であることは、Ｂ細胞受容体の発現における小児免疫系の未熟さに起因している。多糖類（ＰＳ）を担体タンパク質にコンジュゲートさせると、Ｔ細胞非依存性抗原からＴ細胞依存性抗原に変化する。多糖類は、Ｔ細胞依存性抗原として、アイソタイプの切り替えを伴う応答、記憶細胞の生成および追加免疫可能な免疫応答を起こすことができる。
【０００４】
膜タンパク質は膜の中および膜を横切って存在し、分子を輸送したり、細胞接着を促進したりする役割を果たしている。タンパク質は、拡散促進（すなわち、受動的輸送）または能動的輸送によって物質の移動を補助することができる。肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）は、膜タンパク質であり、すべてのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株の細胞壁に結合して見いだされるもう１つの重要な病原性因子である。
【０００５】
破傷風トキソイド（ＴＴ）またはＣＲＭ１９７などの汎用担体タンパク質を、肺炎球菌タンパク質、特にＰｓｐＡ１またはその断片によって置き換えることもまた、ワクチンの適用範囲の拡大に加えて、コンジュゲートワクチンに同じ担体タンパク質を過剰使用することによって引き起こされる免疫応答の障害を防止するだろう。発現プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用する調節配列を含有し、発現ベクターで運ばれる遺伝子が効率的に転写されるように操作されている。うまく設計された発現ベクターの目標は、タンパク質の効率的な生産であり、これは著しい量の安定したメッセンジャーＲＮＡを合成することによって達成され得る。発現を強く制御する発現ベクターを設計することは可能であり、タンパク質は適切な発現条件を用いて必要なときにのみ大量に産生され得る。遺伝子発現が強く制御されていない場合、タンパク質はまた、構成的に発現され得る。
【０００６】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、グルタミン酸一ナトリウムの多量生産において広く使用されているグラム陽性発酵菌である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、その安定した遺伝的特性と内毒素がないことから、ＧＲＡＳ生物（一般的に安全と考えられている）に分類されている。この細菌は細胞外プロテアーゼを分泌しないことが知られているので、培地において異種タンパク質を産生するための魅力的なプラットフォームとなる。これは、組換えタンパク質を大量に合成することができる発現プラスミド構築物を用いて達成することができる。
【０００７】
欧州特許第２３１０５０２号は、構築物におけるＰｔａｃプロモーターの使用を開示しており、ＩＰＴＧ誘導性ｆｔｓＺおよびｍｉｎＣＤＥ欠失変異を含有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）株をＬＢ培地において増殖させた。
【０００８】
Ｎｏｋａｎｏら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８４  Ｊａｎ；１５７（１）：７９〜８３は、カナマイシンに対する耐性の特性を獲得した形質転換株を作製するために、プラスミド構築物におけるカナマイシン耐性遺伝子の使用を開示している。
【０００９】
Ｍａｓａｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８７  Ｊｕｌ；８４（１４）：４７８１〜５は、Ｒ１プラスミド複製の開始およびｏｒｉＲ配列との相互作用についてＲｅｐＡタンパク質を開示している。
【００１０】
Ｎａｙａｋら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９８、Ｎａｙａｋ、３７４４〜５１は、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）を発現する生きた経口組換えサルモネラワクチン株を開示している。
【００１１】
Ｎａｂｏｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８（２０００）１７４３〜５４は、大腸菌における細胞質タンパク質としての組換え切断型ＰｓｐＡの発現を開示している。
Ｆｉｇｕｅｒｅｄｏら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１７）１０１：２３０５〜２３１７は、タグ付けされていない組換え肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ４Ｐｒｏ）の産生および精製を開示している。
【００１２】
前記文献は、発現ベクターの遺伝子要素または大腸菌もしくはサルモネラ菌における肺炎球菌表面タンパク質Ａの発現のいずれかを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、肺炎球菌表面タンパク質の免疫原性断片を同定した。その後、本発明者らは、細菌における高レベルでの切断型肺炎球菌表面タンパク質Ａ１（ＰｓｐＡ１）の安定的かつ構成的または誘導的発現を可能にする発現構築物を開発するために多大な努力をしてきた。
【００１４】
したがって、本発明は、切断型肺炎球菌表面タンパク質の発現のための発現ベクターおよび組換え宿主細胞を調製することによって、先行技術の課題を克服することを企図している。さらに、本発明者らは、担体タンパク質として、切断型タンパク質を含むワクチン組成物を調製した。
【００１５】
本発明の主な目的は、細菌における切断型肺炎球菌表面タンパク質Ａ１（ＰｓｐＡ１）の高レベル発現のための発現構築物を提供することである。
本発明の別の目的は、細菌において高レベルの切断型肺炎球菌表面タンパク質Ａ１（ＰｓｐＡ１）を安定的かつ構成的または誘導的に発現させることを可能にする発現構築物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、配列番号３および４に示される切断型肺炎球菌表面タンパク質Ａ１（ＰｓｐＡ１）の高レベル発現を可能にする発現構築物を提供する。
本発明は、配列番号５および６に示される切断型ｐｓｐＡ１をコードする遺伝子を含む発現構築物を提供する。
【００１７】
本発明は、
ａ）配列番号５または６に示される切断型ｐｓｐＡ１をコードする遺伝子、
ｂ）複製開始点、
ｃ）抗生物質耐性遺伝子、
ｄ）プロモーター、および
ｅ）リボソーム結合部位
を含む、細菌における配列番号３または４に示される切断型ＰｓｐＡ１（肺炎球菌表面タンパク質Ａ１）の高レベル発現のための発現構築物を提供する。
【００１８】
本発明はまた、切断型ＰｓｐＡ１（肺炎球菌表面タンパク質Ａ１）の高レベル発現の方法も対象としており、これは、発現構築物で形質転換された細菌を培養するステップと、それによって発現したタンパク質を精製ステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１−１】パネルＡは、ｐＢＥ３１Ｃの模式図である。パネルＢは、Ｒｘ１  ｐｓｐＡ１の推定アミノ酸配列から描写されたｐｓｐＡのドメインの配置図である。パネルＣは、ｐＢＥ１１７の模式図である。パネルＤは、ＲＢＳ、天然のシグナルペプチド、切断型ｐｓｐＡ１、天然のターミネーターおよびｔｒｒｎＢを含有するＰＣＲアンプリコンを示す。
【図１−２】同上。
【図２】ペプチドフィンガープリント解析における切断型ＰｓｐＡ１のタンパク質配列包括度を示した図である。
【図３】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍで発現した切断型ＰｓｐＡ１のインタクト質量分析を示した図である。
【図４】セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ−ＩＩ）カラムから溶出した切断型ＰｓｐＡ１を示した図である。
【図５】アニオン交換カラムから溶出した切断型ＰｓｐＡ１を示した図である。
【図６】ダイアフィルトレーション後の切断型ＰｓｐＡ１を示した図である。
【図７】肺炎球菌多糖類血清型３（Ａ）、６Ａ（Ｂ）および６Ｂ（Ｃ）のコンジュゲーション反応速度論のためのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示した図である。
【図８】切断型ｐｓｐＡ１の担体タンパク質と血清型３、６Ａ、６ＢのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖類（２．２ｍｃｇ）との様々なコンジュゲートに対して免疫したウサギの血清抗体力価を示した図である。
【図９】切断型ｐｓｐＡ１の担体タンパク質と血清型３、６Ａ、６ＢのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖類（４．４ｍｃｇ）との様々なコンジュゲートに対して免疫したウサギの血清抗体力価を示した図である。
【図１０】パネルＡは、ｐＢＥ１１４ｋの模式図である。パネルＢは制限消化によって確認したｐＢＥ１１４ｋを示した図である。
【図１１】ＣＨＴ  Ｉクロマトグラフィーから溶出した切断型ＰｓｐＡ１を示した図である。
【図１２】Ｃａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓｓクロマトグラフィーから溶出した切断型ＰｓｐＡ１を示した図である。
【図１３】ＭＡＬＤＩによるＰｓｐＡ１のタンパク質包括度を示した図である。
【図１４】大腸菌で発現した切断型ＰｓｐＡ１のインタクト質量分析である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ＰｓｐＡ１という用語は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の肺炎球菌表面タンパク質Ａ１を意味する。
本発明は、細菌における切断型ＰｓｐＡ１（肺炎球菌表面タンパク質Ａ１）の高レベル発現に関する。ｐｓｐＡ１の高レベル発現に適した細菌は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび大腸菌である。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける配列番号３に示される切断型ＰｓｐＡ１（肺炎球菌表面タンパク質Ａ１）の高レベル発現に関する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、大腸菌における配列番号４に示される切断型ＰｓｐＡ１（肺炎球菌表面タンパク質Ａ１）の高レベル発現に関する。
本発明は、配列番号３に示される表面タンパク質の高レベル発現を可能にする発現構築物を提供する。
【００２３】
本発明はまた、配列番号４に示される表面タンパク質の高レベル発現を可能にする発現構築物をも提供する。
別の実施形態では、本発明は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける配列番号３に示される切断型ＰｓｐＡ１（肺炎球菌表面タンパク質Ａ１）の高レベル発現のための発現構築物に関する。
【００２４】
さらに別の実施形態では、本発明は、大腸菌における配列番号４に示される切断型ＰｓｐＡ１（肺炎球菌表面タンパク質Ａ１）の高レベル発現のための発現構築物に関する。
本発明は、
ｉ．ｏｒｉＲ複製開始点、
ｉｉ．カナマイシン耐性遺伝子、
ｉｉｉ．Ｐｔａｃプロモーター、
ｉｖ．切断型ｐｓｐＡ１をコードする目的の遺伝子（配列番号５）
を含む、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける切断型ＰｓｐＡ１の高レベル発現のために使用される発現構築物に関する。
【００２５】
本発明はまた、
ｉ．ｐＵＣ複製開始点、
ｉｉ．カナマイシン耐性遺伝子、
ｉｉｉ．ＰＴ７プロモーター、
ｉｖ．切断型ｐｓｐＡ１をコードする目的の遺伝子（配列番号６）
を含む、大腸菌における切断型ＰｓｐＡ１の高レベル発現のために使用される発現構築物に関する。
【００２６】
一実施形態では、切断型ｐｓｐＡ１の高レベル発現のための発現構築物は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）をさらに含む。ＲＢＳは、フォワードプライマーに含まれ、天然のターミネーターを含有するＤＮＡの短区間は、切断型ｐｓｐＡ１のさらなる増幅のために使用されるリバースプライマーに含まれる。ＲＢＳ（リボソーム結合部位）は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける切断型ＰｓｐＡ１の発現のための発現構築物ではトリオースリン酸イソメラーゼである。
【００２７】
本発明の一実施形態では、発現構築物は、ＰｓｐＡ１シグナルペプチドをコードする領域（天然）、切断型ｐｓｐＡ１、Ｐｔａｃプロモーターおよびトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明は、
ａ．切断型ｐｓｐＡ１をコードする遺伝子（配列番号５）、
ｂ．ｏｒｉＲ複製開始点（配列番号１２）、
ｃ．カナマイシン耐性遺伝子（配列番号１）、
ｄ．Ｐｔａｃプロモーター（配列番号２）、および
ｅ．トリオースリン酸イソメラーゼリボソーム結合部位
を含む、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける切断型ＰｓｐＡ１（配列番号３）の高レベル発現のための発現構築物を提供する。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、
ａ）切断型ｐｓｐＡ１をコードする遺伝子（配列番号６）、
ｂ）ｐＵＣ複製開始点、
ｃ）カナマイシン耐性遺伝子（配列番号１）、
ｄ）ＰＴ７プロモーター（配列番号１１）、および
ｅ）リボソーム結合部位
を含む、大腸菌における切断型ＰｓｐＡ１（配列番号４）の高レベル発現のための発現構築物を提供する。
【００３０】
肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）は膜タンパク質であり、全Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株の細胞壁に結合して見いだされる重要な病原性因子であり、免疫原性が高いことが示されていることから、有望な成分である。
【００３１】
本発明の特定の実施形態では、切断型ＰｓｐＡ１は担体タンパク質として使用される。コンジュゲートワクチンで採用される担体タンパク質は、毒性がなく、反応源性がなく、大量かつ高純度で得ることができるタンパク質が好ましい。担体タンパク質は、多糖類の免疫原性を高めるために、病原性細菌から単離された莢膜多糖類にコンジュゲートさせることもある。担体タンパク質は、標準的な化学的コンジュゲーション手順に適していなければならない。
【００３２】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける切断型ＰｓｐＡ１は、細胞外培地に分泌される。細胞外媒体への分泌は、効率的な精製に役立つ。
本発明は、切断型ｐｓｐＡ１遺伝子のプロリンリッチ領域と共にＮ末端領域が、上流の領域と一緒に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの２３Ｆ莢膜血清型から増幅される、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける切断型ＰｓｐＡ１の高レベル発現に関する。
【００３３】
本発明の一実施形態では、発現構築物は切断型ｐｓｐＡ１、Ｐｔａｃプロモーターおよびトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。
本発明の一実施形態では、発現構築物は切断型ｐｓｐＡ１、ＰＴ７プロモーターおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。
【００３４】
発現構築物はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにエレクトロポレーションされ、選択可能なマーカーとしてカナマイシンを含むＬＢプレートで選択される。
【００３５】
Ｐｔａｃはｔｒｐプロモーターの−３５領域およびｌａｃＵＶ５プロモーター／オペレーターの−１０領域から構成される強力なハイブリッドプロモーターである。
ｐｓｐＡ配列はＧｅｎＢａｎｋから得られ、タンパク質データベースに整列させた。プライマーは、天然のシグナルペプチドのコーディング領域、ファミリー１および２に属するｐｓｐＡ遺伝子のプロリンリッチ領域と共にＮ末端領域を特異的に増幅するように設計された。ｐｓｐＡ１およびｐｓｐＡ２の必要な領域は、利用可能なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの臨床単離物から増幅された。ＭＨＣペプチド分析は、ｐｓｐＡ１はｐｓｐＡ２よりも比較的免疫原性が高いことを示した。
【００３６】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて発現および産生される切断型ＰｓｐＡ１をコードするアミノ酸配列は、配列番号３で記載され、インタクトな質量は３５４５２ダルトンであることが観察されている。
【００３７】
大腸菌で発現および産生される切断型ＰｓｐＡ１をコードするアミノ酸配列は、配列番号４で記載され、インタクトな質量は４１９６６ダルトンであることが観察されている。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび大腸菌で発現される切断型ｐｓｐＡ１をコードするＤＮＡ配列はそれぞれ、配列番号５および６で記載される。
【００３８】
切断型ｐｓｐＡ１を発現するために使用されるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（以前は、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓとして知られていた）は、ＧＲＡＳ生物のグラム陽性桿菌である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、ＧＲＡＳ生物である。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２の全ゲノム配列は利用可能で、高い細胞密度まで増殖させることができ、組換え修復系が欠如しているので遺伝的にも安定している。この細菌の制限修飾系は限定されている。自己融解を示さず、成長抑止条件下で代謝活性を維持することができる。プロテアーゼ活性は低く、組換えタンパク質の産生に有利である。代謝の可塑性と強力な二次代謝特性、広範な炭素源（ペントース、ヘキソース、および他の炭素源）を利用する能力、炭素源へのストレス耐性により、異種タンパク質産生の有望な宿主となっている。これらの生理学的特性により、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、安定した産業条件での操作および培養がしやすくなり、工業的生産を成功させる戦力となっている。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは、α−アミラーゼ、エンドグルカナーゼ、エンドキシラナーゼ、ＧＦＰ、キシラナーゼなどのタンパク質の異種発現が報告された。
【００３９】
本発明の一実施形態では、切断型ＰｓｐＡ１の収量は、約５００ｍｇ／Ｌ、約４００ｍｇ／Ｌ、約３００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約２２０ｍｇ／Ｌ、約２００ｍｇ／Ｌ、約１８０ｍｇ／Ｌ、約１６０ｍｇ／Ｌ、約１５０ｍｇ／Ｌ、約１２０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌである。
【００４０】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の切断型ｐｓｐＡ１または切断型ＰｓｐＡ１とＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、ＰｓａＡなどのその他の担体タンパク質との組み合わせとコンジュゲートさせた１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、３８、３９、および４５から選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型の少なくとも１つの多糖類を含む肺炎球菌コンジュゲートワクチンを提供する。
【００４１】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の切断型ｐｓｐＡ１または切断型ＰｓｐＡ１とＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、ＰｓａＡなどのその他の担体タンパク質との組み合わせとコンジュゲートさせた１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ｆ、１９Ａ、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｆ、２４Ｂ、２４Ｆ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、３８、３９、および４５から選択されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型の多糖類を含む、１０価、１４価、１５価、１７価、１８価、１９価、２０価、２２価、２３価、２４価または２５価から選択される多価肺炎球菌ワクチン組成物を提供する。
【００４２】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の切断型ＰｓｐＡ１にコンジュゲートさせたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、６Ａおよび６Ｂの少なくとも３つの多糖類を含む多価コンジュゲートワクチンを提供する。
【００４３】
一実施形態において、本発明は、本発明の切断型ＰｓｐＡ１にコンジュゲートさせたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３、６Ａおよび６ＢならびにＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆの多糖類を含む多価コンジュゲートワクチンを提供する。
【００４４】
本発明は、本発明の切断型ＰｓｐＡ１にそれぞれコンジュゲートさせた血清型３、６Ａおよび６Ｂの肺炎球菌多糖類それぞれの２．２μｇまたは４．４μｇ、ならびにＣＲＭ１９７にそれぞれコンジュゲートさせた血清型１、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆの肺炎球菌多糖類それぞれの約２．２μｇを含有する製剤を提供する。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、肺炎球菌ワクチン組成物を０．５ｍＬ単回用量として提供し、この単回用量は、１つまたは複数の肺炎球菌多糖類約２．２から４．４μｇ、１つまたは複数の肺炎球菌多糖類のそれぞれにコンジュゲートさせた本発明の切断型ＰｓｐＡ１約１μｇから約５０μｇ、リン酸アルミニウムアジュバント約０．２ｍｇから約１ｍｇおよび賦形剤を提供する。
【００４６】
別の実施形態では、本発明は、肺炎球菌ワクチン組成物を０．５ｍＬ単回用量として提供し、この単回用量は、１つまたは複数の肺炎球菌多糖類約２．２から４．４μｇ、１つまたは複数の肺炎球菌多糖類のそれぞれにコンジュゲートさせた本発明の切断型ＰｓｐＡ１約１μｇから約３０μｇ、１つまたは複数の肺炎球菌多糖類のそれぞれにコンジュゲートさせたＣＲＭ１９７約１μｇから約３０μｇ、リン酸アルミニウムアジュバント約０．２ｍｇから約１ｍｇおよび賦形剤を含む。
【００４７】
別の実施形態では、本発明はまた、本発明の切断型ＰｓｐＡ１を肺炎球菌多糖類とコンジュゲートさせることによって調製されたコンジュゲートワクチンを投与することによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって引き起こされる侵襲性疾患の予防のためのワクチンを提供する。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供されており、単なる例示のために過ぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける切断型ＰｓｐＡ１の組換え発現。
【００４９】
ｐＢＥ３１Ｃの構築
２．６９２ＫｂのｐＮＧ２  ｏｒｉＲ配列を有する合成プラスミドを使用して、安定して複製し広い宿主範囲を持つ小さなプラスミドｐＢＥ３０を生成した。このプラスミドＤＮＡを鋳型として使用して、１．８ＫｂのｏｒｉＲ領域をプライマーｐＥＰ−Ｆ１（５’−ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＧＴＡ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＣＡＧ−３’）およびｐＥＰ−Ｒ１（５’−ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＧＴＴ  ＡＴＧ  ＧＣＧ−３’）を用いて増幅した。
【００５０】
同時に、１．０３３ＫｂのｋａｎＲ配列を、ｐＵＣ４−ＫＩＸＸ鋳型ＤＮＡおよびＫａｎ−Ｆ２（５’−ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＣＧＡ  ＴＡＧ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＧＴ−３’）およびＫａｎ−Ｒ２（５’−ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＣＣＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＧＧ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＧＧ−３’）プライマーを使用して増幅した。ｋａｎＲ遺伝子アンプリコンおよびｏｒｉＲアンプリコンの両方は平滑末端で連結して、ｐＢＥ３０ベクターを作製した。さらに、タンデムのｔａｃ  ｌａｃ  ＵＶ５プロモーター、多数のクローニング部位、ｌａｃＺα成分およびＴｒｒｎＢターミネーター配列を含有する０．８５１Ｋｂの発現カセットは、それぞれＳｐｅＩ制限部位を付加したＰｔａｃ−Ｆ１（５’−ＧＧ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＣ  ＡＡＴ  ＴＡＡ  ＴＣ−３’）およびＰｔａｃ−Ｒ１（５’−ＧＧ  ＡＧＣ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＴＧＡ  Ａ−３’）プライマーを使用して増幅した。発現カセットの増幅に使用した鋳型ＤＮＡは、ｐＭＭＢ２０６（ＡＴＣＣ３７８０８）である。その後、発現カセットは、ｐＢＥ３０プラスミド中に設計された特有のＳｐｅＩ部位にクローニングされた。このようにして得られたプラスミドをｐＢＥ３１Ｃ（図１Ａ；配列番号１４）と称する。
【００５１】
ｐＢＥ１１７の構築
切断型ｐｓｐＡ１遺伝子（プロリンリッチ領域と共に、Ｎ末端領域  図１Ｂ）は、上流の領域と一緒に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの２３Ｆ莢膜血清型から増幅した。これをＴＡベクター（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓから入手したｐＴＺ５７Ｒ／Ｔ）において、プライマーＰＳＰＡＦ１＿ＦＰ（５’ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＡＣＡ  ＡＧＴ  ＣＴＡ  ＧＣＣ  ３’）およびＰＳＰＡＦ１＿ＲＰ（５’ＣＧＡ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＴＴＡ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣ  ３’）および検証された配列を使用してクローニングした。これをｐＴＺ−ｐｓｐＡ１と称した。天然のターミネーター配列は、リバースプライマーＰＳＰＡＦ１＿ＲＰに含まれていた。クレード確認領域は、それがＰｓｐＡタンパク質のファミリー１に属することを確認するために、得られた切断型ｐｓｐＡ１配列にマッピングされた。
【００５２】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて切断型ｐｓｐＡ１を発現するために、Ｐｔａｃプロモーター（配列番号２）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍに属するトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）（配列番号７）が選択された。ＲＢＳ、天然のシグナルペプチド（配列番号８）、切断型ｐｓｐＡ１遺伝子、天然のターミネーター（配列番号１０）を含むカセット全体と共にｐｓｐＡ１遺伝子は、プライマーＳＤＴＩＣＧＲ０９４９＿ＦＰ５（５’ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＡＡ  ３’）およびＰＳＰＡ２＿２ＲＰ  （５’ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＴＴＧ  ３’）および鋳型としてｐＴＺ−ｐｓｐＡ１を使用して増幅した。ＲＢＳはフォワードプライマーＳＤＴＩＣＧＲ０９４９＿ＦＰ５に含まれた。ｒｒｎＢターミネーター（配列番号１３）領域は、社内で入手可能なｐＢＥ３１Ｃから増幅し、オーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲによるスプライシングを使用して切断型ｐｓｐＡ１をコードする遺伝子に連結された。ｒｒｎＢ遺伝子は、ＴＥＲ  ＦＰ２（５’ＡＴＧ  ＴＴＡ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＴＣＧ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＧＴＴ  ３’）およびＴＥＲ＿ＲＰ３（５’ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＡＣＡ  ３’）を使用して増幅した。ＰＳＰＡ２＿２ＲＰおよびＴＥＲ  ＦＰ２は、１７塩基の重複があるように設計された。アンプリコンｐｓｐＡ１およびｒｒｎＢはいずれも１：１のモル比で加え、ＳＯＥ  ＰＣＲの鋳型として、プライマーＳＤＴＩＣＧＲ０９４９＿ＦＰ５（５’ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＡＡ  ３’）およびＴＥＲ＿ＲＰ３（５’ＧＣＧ  ＡＴＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＡＣＡ  ３’）と共に使用した。その後、ＲＢＳ、天然のシグナルペプチド（配列番号８）、切断型ｐｓｐＡ１遺伝子、天然のターミネーター（配列番号１０）、ｒｒｎＢターミネーターを含むアンプリコン全体を、フォワード（ＳＤＴＩＣＧＲ０９４９＿ＦＰ５）およびリバースプライマー（ＴＥＲ＿ＲＰ３）に付加された制限酵素で消化し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のために作られた発現ベクターｐＢＥ３１Ｃにクローニングした。得られたクローンを発現構築物ｐＢＥ１１７（図１Ｃ、配列番号１５）と称した。以後、切断型ｐｓｐＡ１と共に、発現ベクターは発現構築物を示す。挿入物（図１Ｄ）の向きはＰＣＲ分析によって確認した。その発現カセットと共に、切断型ｐｓｐＡ１遺伝子の配列はＤＮＡ配列決定により確認した。
【００５３】
切断型ＰｓｐＡ１の発現
発現構築物をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２にエレクトロポレーションし、選択可能なマーカーとしてカナマイシンを含むＬＢプレートで選択した。２０個の組換えＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍコロニーを採取し、ＰＣＲによって分析した。切断型ｐｓｐＡ１の構成的発現のために５つのコロニーを選択した。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２（陰性対照として）と共に組換えコロニーをカナマイシン最終濃度２５μｇ／ｍｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃブロス１０ｍｌに接種し、２００ｒｐｍで震盪しながら３５℃でインキュベートした。１６時間後、最終ＯＤが０．１になるように、上記と同じ培地１０ｍｌで二次接種を行った。培養物は、２００ｒｐｍで振盪しながら３５℃で１８〜２０時間インキュベートした。１８時間後、培養上清を切断型ｐｓｐＡ１の発現について調べた。上清３０μｌを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付与し、切断型ｐｓｐＡ１発現について分析した。４５ｋＤａ付近に顕著なバンドが認められた。
【００５４】
Ｎ末端エピトープ特異的ｐｓｐＡポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を用いたウエスタン解析により、切断型ｐｓｐＡ１の発現が確認された。組換えクローン５の発現分析を５００ｍｌまで拡大し、切断型ｐｓｐＡ１の発現は少なくとも３回確認した。切断型ｐｓｐＡ１は、最初にＣＨＴ１型およびＣａｐｔｏ  Ｑ  ｉｍｐｒｅｓｓを使用して震盪フラスコ実験から、ほぼ９９％の純度まで精製した。その後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて切断型ＰｓｐＡ１の一貫した発現を確認した後、発現を１．５Ｌまで拡大した。
【００５５】
切断型ＰｓｐＡ１の精製および検証
上流から得られた１．６Ｌからの切断型ＰｓｐＡ１（０．６６ｍｇ／ｍｌ）を含有する培養上清８００ｍｌを、１０ｋＤａを通して透析し、２６０ｍｌ（１．９２ｍｇ／ｍｌ）まで濃縮した。この透析濃縮液７０ｍｌに、ＣＨＴ１型およびＣａｐｔｏ  Ｑ  ｉｍｐｒｅｓｓを使用して精製を行った。切断型ｐｓｐＡ１の最終回収量は、１６２ｍｇ／Ｌであった。
【００５６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから精製された切断型ＰｓｐＡ１を含有するゲルプラグのＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ分析によって、肺炎球菌表面タンパク質Ａで２３３の明確なヒットスコアが得られた。ＰｓｐＡタンパク質の配列包括度は、ＮＣＢＩタンパク質ｉｄ  ＡＢＹ６７１８７．１では３１％（図２）で示された。インタクト分子量分析は、発現した切断型ｐｓｐＡ１の分子量が３５．４ｋＤａであることを示した。この質量は、切断型ｐｓｐＡ１の理論分子量と一致する。１７７２５．４のピークは、２つの電荷を持つ分子のピークであるため、ｍ／ｚでは、切断型ｐｓｐＡ１のインタクト質量の半分でピークが出現する（図３）。
【００５７】
実施例２
切断型ＰｓｐＡ１の産生
切断型ｐｓｐＡ１（以下、ｐｓｐＡ１とする）遺伝子を含む発現構築物を保有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２を、保存源からＬＢ培地で起眠させた。これは、発酵容器（５Ｌ；ＣＳＴＲ）に接種するために使用された。産生工程中にモニターされたパラメーターは、ｐＨ、ＤＯ、温度（ΔＴ）、炭素源、代謝物であった。工程自動化技術（ＰＡＴ）をベースにした供給戦略が、切断型ＰｓｐＡ１発酵のショートフェドバッチを実行するために採用された。これは増殖関連産物であるため、産物（切断型ＰｓｐＡ１）の誘導をベースにした制御は行わなかった。半合成培地での回収時の回収ＯＤは約９０（ＯＤ６００ｎｍ）であった。細胞を回収してＰＢＳで洗浄してから、フレンチプレスで細胞を破壊した。
【００５８】
切断型ＰｓｐＡ１の精製
総タンパク質濃度が０．８ｍｇ／ｍＬの使用済み培地１６．２Ｌを、２０Ｌの発酵バッチから収集した。使用済み培地１６．２Ｌを、１０ｋＤａ  ０．５ｍ２カセットを使用して２．６Ｌ（３．６ｍｇ／ｍＬ）に濃縮した後、２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．８、導電率３．２ｍｓ／ｃｍに対してダイアフィルトレーションした。この２．６Ｌを、２つのロット、すなわち、１．４Ｌのロット１と１．２Ｌのロット２に分割し、さらに精製を続行した。ＣＨＴ  Ｉ樹脂５００ｍｌをＨｉＳｃａｌｅ５０／４０カラムに充填した。樹脂を滅菌蒸留水で洗浄した後、８カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．８（緩衝液Ａ）で平衡化した。使用済み培地濃縮液１４００ｍＬ（３．６ｍｇ／ｍＬ）（ロット１）をカラムに付与し、素通り画分を収集した。カラムを５カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。ＰｓｐＡ１は、２５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．８（緩衝液Ｂ）を使用したステップ勾配で溶出された。ステップ勾配には、５ＣＶのステップ−４０％Ｂ、５ＣＶのステップ−８０％Ｂ、および３ＣＶの０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液が含まれた。流速は、操作全体で８０ｍＬ／分に維持した。ＰｓｐＡ１はステップ−８０％Ｂの画分１に収集され、画分容量は１２５０ｍＬであった（図４）。
【００５９】
ＰｓｐＡ１精製の第２のクロマトグラフィーステップとして、Ｃａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓｓを使用した。Ｃａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓｓ樹脂２５０ｍｌをＸＫ５０／２０カラムに充填した。樹脂を滅菌蒸留水で洗浄した後、５カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭリン酸カリウムおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８（緩衝液Ａ）で平衡化した。ＣＨＴ  Ｉ画分１２５０ｍＬを２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．８で２３００ｍＬに希釈し、カラムに付与して、素通り画分を収集した。カラムを５カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。ＰｓｐＡ１は、１２ＣＶの緩衝液Ｂ（ＮａＣｌ  １Ｍを含む２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．２）を使用して、０から４０％Ｂの直線勾配および３ＣＶの１００％Ｂの最終ステップで溶出された。各画分２５０ｍＬを収集した。流速は、４０ｍＬ／分に維持した。ＰｓｐＡ１は４０％Ｂの直線勾配で収集し、プールした画分容量は１２５０ｍＬであった（図５）。
【００６０】
４、５、６、７および８のＣａｐｔｏ  Ｑ画分をプールし、２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．８で濃縮／ダイアフィルトレーションした。ロット１から得られた最終的な回収量は、タンパク質濃度１５．５ｍｇ／ｍＬのｐｓｐＡ１  １００ｍＬ（総ＰｓｐＡ１は１５５０ｍｇ）であった。同様の工程をロット２に行い、ロット２から得られた最終的な回収量は、濃度１６ｍｇ／ｍＬのｐｓｐＡ１  ７０ｍＬ（総ＰｓｐＡ１は１１２０ｍｇ）であった。ロット１およびロット２の両方から精製したＰｓｐＡ１は、１６．２Ｌバッチで２６７０ｍｇである（精製ＰｓｐＡ１の収量は１６４ｍｇ／Ｌ）（図６）。
【００６１】
実施例３
ｐＢＥ１１４Ｋの構築
発現ベクターｐＲＳＥＴ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されているベクター）は、ＤｒａＩ制限消化を使用してアンピシリン耐性遺伝子を除去し、ＳｍａＩ消化カナマイシンコーディング遺伝子（ｐＵＣ４  ＫＩＸＸから取得）に連結することによって修飾した。この修飾ベクターは、ｐＲＳＥＴ−ｋｍと称した。切断型ＰｓｐＡ１は、ｐＲＳＥＴ−ｋｍのＰＴ７プロモーター（配列番号１１）の下で大腸菌において発現した。天然のターミネーターを含有する単鎖ＤＮＡは、ｐｓｐＡ１のさらなる増幅のために使用したリバースプライマーに含まれた。その後、切断型ｐｓｐＡ１遺伝子全体はその天然のターミネーターと共に増幅され、フォワードおよびリバースプライマーに付加された制限酵素で消化され、ｐＲＳＥＴ−ｋｍベクターにクローニングされた。得られたクローンをｐＢＥ１１４ｋと称した（図１０Ａ）。以後、切断型ＰｓｐＡ１と共に、発現ベクターは発現構築物を意味する。発現構築物ｐＢＥ１１４ｋは制限消化により確認された（図１０Ｂ）。切断型ＰｓｐＡ１遺伝子の配列はその発現カセットと共に、ＤＮＡ配列決定によって確認された。
【００６２】
切断型ＰｓｐＡ１の発現
ｐＢＥ１１４ｋで大腸菌ＤＨ５α−Ｔ１Ｒ化学物質コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）を形質転換し、選択可能なマーカーとしてカナマイシンを含むＬＢプレートで選択した。４０個の組換え大腸菌コロニーを採取し、ＰＣＲによって分析した。切断型ＰｓｐＡ１の誘導的発現のために４０個のコロニー全てを選択した。大腸菌（陰性対照として）と共に組換えコロニーをカナマイシン最終濃度２５μｇ／ｍｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ１０ｍｌに接種し、２００ｒｐｍで震盪しながら３７℃でインキュベートした。対数増殖期中期に、ＩＰＴＧ  １ｍＭを加えて、大腸菌（ｐＢＥ１１４ｋ）でのＰｓｐＡ１の発現を誘導した。誘導後、培養物を２００ｒｐｍで震盪しながら１６時間、３０℃でインキュベートした。１６時間後、培養上清を切断型ＰｓｐＡ１の発現について調べた。細胞を遠心分離によって収集し、溶解し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付与し、切断型ＰｓｐＡ１発現について分析した。６５ｋＤａ付近に顕著なバンドが認められた。Ｎ末端エピトープ特異的ＰｓｐＡポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を用いたウエスタン解析により、切断型ＰｓｐＡ１の発現が確認された。組換えクローン２９個の発現分析では、切断型ＰｓｐＡ１の発現が少なくとも３回確認された。切断型ＰｓｐＡ１は最初、ＣＨＴ１型およびＣａｐｔｏ  Ｑ  ｉｍｐｒｅｓｓを使用して震盪フラスコ実験から精製された。
【００６３】
切断型ＰｓｐＡ１の精製および検証
大腸菌（ｐＢＥ１１４ｋ）の細胞ペレット４０グラム（湿重量）を採取し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌおよびＰＭＳＦ  １ｍＭを含有する２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．８  ４００ｍｌに再懸濁した。細胞懸濁液を、高圧ホモジナイザーを使用して、１０００ｐｓｉで３回溶解した。総タンパク質濃度４ｍｇ／ｍＬの細胞溶解液４００ｍＬを２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．８で７５０ｍＬまで希釈し、ＣＨＴ  Ｉ樹脂、続いて第２のクロマトグラフィーとしてＣａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓｓを使用して精製した。
【００６４】
ＣＨＴ  Ｉ樹脂２５０ｍｌをＨｉＳｃａｌｅ５０／２０カラムに充填した。樹脂を滅菌蒸留水で洗浄した後、５カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａで平衡化した。希釈した細胞溶解液７５０ｍＬをカラムに付与し、素通り画分を収集した。カラムを５カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。ＰｓｐＡ１は、２５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．８、電導率２９．５ｍｓ／ｃｍ（緩衝液Ｂ）を使用したステップ勾配で溶出された。ステップ勾配には、５ＣＶのステップ−５０％の緩衝液Ｂ、５ＣＶのステップ−８０％の緩衝液Ｂが含まれ、カラムは３ＣＶの０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．８、電導率４８ｍｓ／ｃｍ（緩衝液Ｃ）でストリップした。流速は、操作全体で４０ｍＬ／分に維持した。ＰｓｐＡ１タンパク質ピーク画分は手動で収集し、ステップ−８０％Ｂの５、６および７の溶出画分プールの最終容量は３５０ｍＬであった（図１１）。
【００６５】
Ｃａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓｓは、ＰｓｐＡ１精製の第２のクロマトグラフィーステップとして使用した。Ｃａｐｔｏ  Ｑ  Ｉｍｐｒｅｓｓ樹脂６０ｍｌをＸＫ２６／２０カラムに充填した。樹脂を滅菌蒸留水で洗浄した後、５カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭリン酸カリウムおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８、電導率１３．６ｍｓ／ｃｍ（緩衝液Ａ）で平衡化した。ＣＨＴ  Ｉ画分３５０ｍＬを１ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．８で７００ｍＬまで希釈し、カラムに付与して素通り画分を収集した。カラムを５カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した。ＰｓｐＡ１は、１０ＣＶの緩衝液Ｂ（ＮａＣｌ  １Ｍを含む２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．２、電導率８９ｍｓ／ｃｍ）の直線勾配を使用して溶出し、０から４０％Ｂの直線勾配中の画分は手動で収集し、４から８、１０、１１は６０ｍＬ、９、１２は１００ｍＬ画分であった（図１２）。３ＣＶの１００％Ｂの最終ステップ、１８０ｍＬを画分１３として収集した。流速は、１０ｍＬ／分に維持した。ＰｓｐＡ１タンパク質は、４０％Ｂの直線勾配の画分９に収集され、１００ｍＬであった。
【００６６】
９のＣａｐｔｏ  Ｑ画分を収集し、２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．８で濃縮／ダイアフィルトレーションした。得られた最終的な回収量は、４ｍｇ／ｍＬの濃度の細胞溶解物４００ｍＬからタンパク質濃度５ｍｇ／ｍＬのＰｓｐＡ１  １００ｍＬ（総ＰｓｐＡ１タンパク質は５００ｍｇ）であった。回収％は３１．２５である。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから精製された切断型ＰｓｐＡ１を含有するゲルプラグのＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ分析では、肺炎球菌表面タンパク質Ａで２２３の明確なヒットスコアが得られた。ＰｓｐＡタンパク質の配列包括度は、ＮＣＢＩタンパク質ｉｄ  ＷＰ＿０５０２１０６５２．１では３９％（図１３）で示された。
【００６８】
インタクト分子量分析は、発現した切断型ＰｓｐＡ１の分子量が４１．９６ｋＤａであることを示した。４１９６６Ｄａ（４１．９ｋＤａ）を示した大腸菌で発現した切断型ＰｓｐＡ１のインタクト質量分析は、切断型ＰｓｐＡ１の理論分子量と一致した。２０９８２．７Ｄａのピークは、２の電荷を持つ分子のピークであるため、ｍ／ｚでは、切断型ｐｓｐＡ１のインタクト質量の半分でピークが出現する（図１４）。
【００６９】
実施例４
多糖類−切断型ＰｓｐＡ１コンジュゲートを形成するための個々の肺炎球菌多糖類の担体タンパク質へのコンジュゲーション
血清型３の活性化および切断型ｐｓｐＡ１とのコンジュゲーション
大きさを測定した血清型３（ＰＳ  ６．０ｍＬ、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）およびＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）アセトニトリル溶液）の比約１：１をガラスバイアル中で混合し、１分間攪拌した。肺炎球菌多糖類血清型３のｐＨをトリエチルアミン０．２Ｍで９．２５に調整し、室温（ＲＴ）で３分間攪拌した。切断型ＰｓｐＡ１（濃度１５．０ｍｇ／ｍＬで４．０ｍＬ）を、活性化血清型３に１：１の比（切断型ＰｓｐＡ１：血清型３）で加えた。
【００７０】
反応のｐＨをトリエチルアミン０．２Ｍで約９．０５に調整し、撹拌しながら室温で５時間反応を継続し、最後に過剰濃度のグリシンを加えることにより反応を停止した。
反応混合物は、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を使用してダイアフィルトレーションし、サイズ排除クロマトグラフィーで精製し、クロマトグラムＡにおいて、実線は多糖類であり、破線は切断型ｐｓｐＡ１であり、５時間の反応は点線で表されている（図７）。画分はＳＥＣ−ＭＡＬＬＳアントロン法によって分析し、コンジュゲートを含有する画分はプールし、０．２μフィルターでろ過滅菌した。これ以降、この材料を一価コンジュゲートバルク（血清型３−切断型ＰｓｐＡ１コンジュゲート）と呼ぶ。
【００７１】
血清型６Ａの活性化および切断型ＰｓｐＡ１とのコンジュゲーション
大きさを測定した血清型６Ａ（ＰＳ  ６．０ｍＬ、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）およびＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）アセトニトリル溶液）の比約１：１をガラスバイアル中で混合し、１分間攪拌した。肺炎球菌多糖類血清型６ＡのｐＨをトリエチルアミン０．２Ｍで９．２５に調整し、室温（ＲＴ）で３分間攪拌した。切断型ＰｓｐＡ１（濃度１５．０ｍｇ／ｍＬで４．０ｍＬ）を、活性化血清型６Ａに１：１の比（切断型ＰｓｐＡ１：血清型６Ａ）で加えた。
【００７２】
反応のｐＨをトリエチルアミン０．２Ｍで約９．０５に調整し、撹拌しながら室温で反応を５時間継続し、最後に過剰濃度のグリシンを加えることにより反応を停止した。
反応混合物は、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を使用してダイアフィルトレーションし、サイズ排除クロマトグラフィーで精製し、クロマトグラムＢにおいて、実線は多糖類であり、破線は切断型ＰｓｐＡ１であり、５時間の反応は点線で表されている（図７）。画分はＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ、アントロン法によって分析し、コンジュゲートを含有する画分はプールし、０．２μフィルターでろ過滅菌した。これ以降、この材料を一価コンジュゲートバルク（血清型６Ａ−切断型ＰｓｐＡ１コンジュゲート）と呼ぶ。
【００７３】
血清型６Ｂの活性化および切断型ＰｓｐＡ１とのコンジュゲーション
大きさを測定した血清型６Ｂ（ＰＳ  ６．０ｍＬ、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）およびＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）アセトニトリル溶液）の比約１：１をガラスバイアル中で混合し、１分間攪拌した。肺炎球菌多糖類血清型６ＢのｐＨをトリエチルアミン０．２Ｍで９．２５に調整し、室温（ＲＴ）で３分間攪拌した。切断型ＰｓｐＡ１（濃度１５．０ｍｇ／ｍＬで４．０ｍＬ）を、活性化血清型６Ｂに１：１の比（切断型ＰｓｐＡ１：血清型６Ｂ）で加えた。
【００７４】
反応のｐＨをトリエチルアミン０．２Ｍで約９．０５に調整し、撹拌しながら室温で反応を５時間継続し、最後に過剰濃度のグリシンを加えることにより反応を停止した。
反応混合物は、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を使用してダイアフィルトレーションし、サイズ排除クロマトグラフィーで精製し、クロマトグラムＣにおいて、実線は多糖類であり、破線は切断型ＰｓｐＡ１であり、５時間の反応は点線で表されている（図７）。画分はＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ、アントロン法によって分析し、コンジュゲートを含有する画分はプールし、０．２μフィルターでろ過滅菌した。これ以降、この材料を一価コンジュゲートバルク（血清型６Ｂ−切断型ＰｓｐＡ１コンジュゲート）と呼ぶ。
【００７５】
実施例５
コンジュゲートワクチンの免疫原性試験
切断型ＰｓｐＡ１にそれぞれコンジュゲートした血清型３、６Ａおよび６Ｂの２．２μｇまたは４．４μｇを含有する２つの製剤は、それぞれＣＲＭ１９７にコンジュゲートした血清型１、４、５、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆの２．２μｇを含有して調製された。これらのコンジュゲートは、Ａｌ−ヒドロゲルに吸収させた。
【００７６】
体重１．５から２ｋｇのウサギを７匹ずつ群分けし、上記のコンジュゲート製剤で免疫した。免疫化の前後に血清試料を分析した。免疫したウサギから得られた血清を、間接ＥＬＩＳＡで多糖類特異的抗体の存在について分析した。
【００７７】
免疫したウサギの血清抗体力価は、間接ＥＬＩＳＡによって評価した。特定の多糖類でコーティングしたマイクロタイタープレートを血清抗体と反応させた。免疫前、１回目と２回目の投与後のウサギ血清を分析に使用し、Ｙ軸は抗体力価を示し、これはＥＬＩＳＡ  ＯＤ４５０がカットオフを超える最大希釈の逆数を使用して得られる。免疫前のウサギの血清抗体力価は検出限界を下回っていた。白い棒は１回目のワクチン投与後の力価を示し、黒塗りの棒は２回目のワクチン後の抗体力価を示す（図８および９）。切断型ｐｓｐＡ１をコンジュゲートした血清型およびＣＲＭ１９７をコンジュゲートした血清型力価の両方において用量依存的な増加があった。ＣＲＭ１９７をコンジュゲートした多糖類の力価は、切断型ＰｓｐＡ１コンジュゲートの存在によって阻害されず、その逆も同様であった。これは、切断型ＰｓｐＡ１が多糖類タンパク質コンジュゲートワクチンの代替担体タンパク質として使用できたことを示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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