(57)【要約】本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）活性を評価するための方法及びキットを提供し、動物及び細胞モデルにおけるのと同様に、ＡＤに対する治療またはＡＤに対する候補治療を受ける患者におけるものを含む。具体的には、本開示は、疾患活性のバイナリ予測因子であり、かつＡＤ疾患ステージ、グレード及び進行、予後、及び療法または候補療法への応答を検出及び／または評価するのに有用である、バイオマーカー（ｓＲＮＡ予測因子）を提供する。バイオマーカーは、疾患の治療に有用である候補薬学的介入（または他の療法）を特定するための、創薬及び臨床試験の状況においてさらに有用である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるアルツハイマー病を評価するための方法であって、
アルツハイマー病の１つ以上の症状を呈する対象からの生体試料を提供すること、または前記試料から抽出されたＲＮＡを提供すること、
前記試料中の１つ以上の陽性ｓＲＮＡ予測因子の存在または不在を決定することを含み、前記１つ以上の陽性ｓＲＮＡ予測因子の前記存在が、アルツハイマー病活性を示す、前記方法。
【請求項２】
前記ｓＲＮＡ予測因子が、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａ（配列番号１〜４０３）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表２Ａ（配列番号１〜４６）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表４Ａ（配列番号４７〜２５４）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表７Ａ（配列番号２５５〜４０３）からの１つ以上の予測因子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表５（配列番号５８、１８９、７８、１７２、１９３、９７、１２２、２１５、２４８、１６４、１２０、９３、１２６、２５３、１１２、１４４、２１３、２４４、１２３、２２２、１５０、２４０、５２、２２０、２２１、１６９、１６５、及び２１２）からの１つ以上の予測因子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表８（配列番号２５７、２７０、２７２、２７３、２７９、２８６、２８８、３１４、３１９、３２５、３３２、３４１、３７４、３９１、及び３９３）からの１つ以上の予測因子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１０のｓＲＮＡ予測因子の存在または不在が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａからの少なくとも２つのｓＲＮＡの存在または不在が決定される（配列番号１〜４０３）、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａからの少なくとも５つのｓＲＮＡの存在または不在が決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａからの少なくとも１０のｓＲＮＡの存在または不在が決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの陰性ｓＲＮＡ予測因子の存在または不在が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が生体液である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体液が、血液、血清、血漿、尿、唾液、または脳脊髄液から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が、固体組織であり、任意選択で脳組織である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｓＲＮＡの前記存在または不在が、定量的または定性的ＰＣＲアッセイによって決定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ｓＲＮＡの前記存在または不在が、蛍光色素または蛍光標識プローブを使用して決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ｓＲＮＡの前記存在または不在が、蛍光標識プローブを使用して決定され、前記プローブが、さらにクエンチャ部分を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｓＲＮＡが、ステムループＲＴプライマーを使用して増幅される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ｓＲＮＡの前記存在または不在が、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して決定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ハイブリダイゼーションアッセイが、ｓＲＮＡ特異的プローブを含むハイブリダイゼーションアレイを用いる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｓＲＮＡの前記存在または不在が、核酸配列決定によって決定され、かつｓＲＮＡが、個々のｓＲＮＡ配列からの３’配列決定アダプタをトリミングすることを含むプロセスによって前記試料中で特定される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、ＡＤを有すると診断されていない、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象がＢｒａａｋステージＩ／ＩＩを有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象がＢｒａａｋステージＩＩＩ／ＩＶを有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象がＢｒａａｋステージＶ／ＶＩを有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が繰り返される、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
対象が、少なくとも年に約１回、または少なくとも６か月に約１回、または少なくとも月に１回、または週に１回の頻度で評価される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が、ＡＤまたはＡＤ症状に対する療法または候補療法を受けている、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
対象におけるアルツハイマー病を評価するための方法であって、
アルツハイマー病への進行と相関する１つ以上の変異を有する対象からの生体試料を提供すること、または前記試料から抽出されたＲＮＡを提供すること、
アルツハイマー病の活性及び／または進行の指標として、１つ以上の陽性ｓＲＮＡ予測因子の存在、不在、またはレベルを決定することを含む、前記方法。
【請求項３１】
少なくとも１つのｓＲＮＡ予測因子が、表２Ａ、表４Ａ、または表７Ａ（配列番号１〜４０３）からのものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｓＲＮＡ予測因子の前記存在または不在が、ｓＲＮＡ特異的プライマー及び／またはプローブでの定量的または定性的ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションアッセイｓＲＮＡ特異的プローブ、あるいは３’配列決定アダプタの計算的トリミングでの核酸配列決定から選択されたプロセスを使用して決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｓＲＮＡ予測因子の前記存在または不在が、リアルタイムＰＣＲを使用して決定される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ｓＲＮＡの前記存在または不在が、蛍光色素または蛍光標識ｓＲＮＡ特異的プローブを使用して決定される、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ｓＲＮＡの前記存在または不在が、蛍光標識ｓＲＮＡ特異的プローブを使用して決定され、前記プローブが、さらにクエンチャ部分を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ｓＲＮＡが、ステムループＲＴプライマーを使用して増幅される、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ｓＲＮＡの前記存在または不在が、ｓＲＮＡ特異的プローブでのハイブリダイゼーションアッセイを使用して決定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ハイブリダイゼーションアッセイが、ｓＲＮＡ特異的プローブを含むハイブリダイゼーションアレイを用いる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｓＲＮＡの前記存在または不在が、核酸配列決定によって決定され、かつｓＲＮＡが、３’配列決定アダプタをトリミングすることを含むプロセスによって前記試料中で特定される、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表２Ａ（配列番号１〜４６）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表４Ａ（配列番号４７〜２４５）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表７Ａ（配列番号２５５〜４０３）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表５（配列番号５８、１８９、７８、１７２、１９３、９７、１２２、２１５、２４８、１６４、１２０、９３、１２６、２５３、１１２、１４４、２１３、２４４、１２３、２２２、１５０、２４０、５２、２２０、２２１、１６９、１６５、及び２１２）からの１つ以上の予測因子を含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記陽性ｓＲＮＡ予測因子が、表８（配列番号２５７、２７０、２７２、２７３、２７９、２８６、２８８、３１４、３１９、３２５、３３２、３４１、３７４、３９１、及び３９３）からの１つ以上の予測因子を含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも５つのｓＲＮＡ予測因子の存在または不在が決定される、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
表２Ａ、表４Ａ、または表７Ａからの少なくとも２つのｓＲＮＡの存在または不在が決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
表２Ａ、表４Ａ、または表７Ａからの少なくとも５つのｓＲＮＡの存在または不在が決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
表２Ａ、表４Ａ、または表７Ａからの少なくとも１０のｓＲＮＡの存在または不在が決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも１つの陰性ｓＲＮＡ予測因子の存在または不在が決定される、請求項３０〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
試料が、ＡＤの動物モデルであるか、または剖検試料である対象からのものである、請求項３０〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記試料が脳組織試料である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記試料が生体液である、請求項３０〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記生体液が、血液、血清、血漿、尿、唾液、または脳脊髄液から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象がＡＤに対する候補療法を受けている、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
アルツハイマー病についての試料を評価するためのキットであって、
表２Ａ、表４Ａ、または表７Ａ（配列番号１〜４０３）に列挙された複数のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む、前記キット。
【請求項５６】
表２Ａ、表４Ａ、または表７Ａ  ５（配列番号１〜４０３）に列挙された少なくとも５つのｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
表２Ａ、表４Ａ、または表７Ａ（配列番号１〜４０３）に列挙された少なくとも１０のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５８】
表２Ａ、表４Ａ、または表７Ａ（配列番号１〜４０３）に列挙された少なくとも１８のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５９】
表２Ａ、表４Ａ、または表７Ａ（配列番号１〜４０３）に列挙された少なくとも４０のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項６０】
定量的または定性的ＰＣＲアッセイに好適なプローブ及び／またはプライマーを含む、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６１】
蛍光色素または蛍光標識プローブを含む、請求項５５〜６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６２】
蛍光標識プローブを含み、前記プローブがさらにクエンチャ部分を含む、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
ステムループＲＴプライマーを含む、請求項５５〜６２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６４】
ｓＲＮＡ特異的ハイブリダイゼーションプローブのアレイを含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項６５】
１つ以上の疾患状態について対象を評価するための方法であって、
前記対象の生体試料を提供すること、及びｓＲＮＡパネルにおいて複数のｓＲＮＡの存在または不在を決定すること、
疾患分類器を使用して、１つ以上の疾患状態の間で前記対象の前記状態を分類することを含み、
前記疾患分類器が、トレーニング試料のセット中の前記ｓＲＮＡパネルにおいて前記ｓＲＮＡの前記存在及び不在に基づいてトレーニングされ、前記トレーニング試料が、前記１つ以上の疾患状態に対して陽性または陰性として注釈付けされる、前記方法。
【請求項６６】
前記パネルにおける前記ｓＲＮＡの前記存在または不在が、ｓＲＮＡ配列データからの前記トレーニングセットにおいて決定され、かつｓＲＮＡ配列が、５’及び３’配列決定アダプタをトリミングすることによって、ｓＲＮＡ配列バリアントを参照配列または遺伝子座に統合することなく前記ｓＲＮＡ配列データにおいて特定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記試料中のｓＲＮＡの前記存在または不在が、定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって決定される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記疾患分類器が、少なくとも３つの疾患状態、または少なくとも５つの疾患状態間で試料を分類する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患分類器が、少なくとも１０の疾患状態の間で試料を分類する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記パネルが、約４〜約２００のｓＲＮＡ、または約４〜約１００のｓＲＮＡ、または約４〜約５０のｓＲＮＡを含有する、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記トレーニング試料が、固体組織試料、生体液試料、または培養細胞のうちの１つ以上を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記対象前記の生体試料が、血液、血清、血漿、尿、唾液、または脳脊髄液である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象の生体試料が固体組織生検である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
前記トレーニングセットが、各疾患状態について少なくとも１０の試料を含む、少なくとも１００の試料を有する、請求項６５〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患分類器が、パラメトリック／ノンパラメトリック距離測定法、ロジスティック回帰、サポートベクトルマシン、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、プロビット回帰、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、二次分類器、カーネル推定、ｋ近傍法、学習ベクトル量子化、及び主成分分析などの、教師あり、教師なし、半教師ありの機械学習モデルのうちの１つ以上を使用してトレーニングされる、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記疾患状態が中枢神経系の疾患である、請求項６５〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
少なくとも２つの疾患状態が、認知症の症状を伴う神経変性疾患である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
少なくとも２つの疾患状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、軽度認知障害、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、及び血管性認知症から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
少なくとも２つの疾患状態が、運動制御の喪失の症状を伴う神経変性疾患である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
少なくとも２つの疾患状態が、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、及び脊髄性筋萎縮症である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
少なくとも２つの疾患状態が、脱髄疾患であり、任意選択で、多発性硬化症、視神経炎、横断性脊髄炎、及び視神経脊髄炎を含む、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
少なくとも１つの疾患状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及び脊髄性筋萎縮症から選択され、トレーニング試料が、疾患ステージ、疾患重症度、薬物応答性、または疾患進行の経過について注釈付けされる、請求項６５〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記疾患状態が、異なる組織または細胞起源のがんである、請求項６５〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記疾患状態が、薬物感受性及び薬物抵抗性のがんである、請求項６５〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記対象からの前記生体試料が、腫瘍またはがん細胞の生検である、請求項８３または８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記疾患状態が、炎症性または免疫の疾患であり、任意選択で、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、自己免疫性血管炎、糖尿病（１型または２型）、グレーブス病、Ａｄｄｉｓｏｎ病、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群、甲状腺炎、関節リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、線維筋痛症、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、及びセリアック病のうちの１つ以上を含む、請求項６５〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記生体試料が、血液、血清、または血漿である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記疾患状態が、心血管疾患であり、任意選択で、急性事象のリスクに対する層別化を含む、請求項６５〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記心血管疾患が、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、心筋梗塞、脳卒中、うっ血性心不全、高血圧性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、及び静脈血栓症のうちの１つ以上を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記パネルにおける少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも５つ、または少なくとも１０のｓＲＮＡが、陽性ｓＲＮＡ予測因子であり、前記トレーニングセットにおいて疾患状態に対して陽性として注釈付けされた複数の試料に存在し、前記トレーニングセットにおいて前記疾患状態に対して陰性として注釈付けされたすべての試料に不在であると特徴付けられる、請求項６５〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１８年７月２５日に出願された米国仮出願第６２／７０３，１７２号の利益及びそれに対する優先権を主張するものであり、その内容物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の全症例の７０％近くを占め、かつ８０歳超の個人の最大２０％に罹患させるため、最も一般的な神経変性疾患である。脳における様々な形態学的及び組織学的変化は、現代のＡＤ神経病理学の特徴として役立つ。具体的には、２つの神経学的現象が観察されており、アミロイド斑及び神経原線維変化である。疾患進行は、Ｂｒａａｋステージとして分類され得、疾患伝播の６つのステージが、タングル担持ニューロンの位置及び脳における変化の重症度に関して区別されている：ＢｒａａｋステージＩ／ＩＩ：移行嗅内（側頭葉）ステージ、臨床的に無症状である例、ＢｒａａｋステージＩＩＩ／ＩＶ：辺縁系ステージ、初期アルツハイマー病、及びＢｒａａｋステージＶ／ＶＩ：新皮質ステージ、完全に発生したアルツハイマー病。
【０００３】
アルツハイマー病の患者は、最近の出来事を思い出すこと、また新しい記憶を形成することのような記憶障害などの初期症状を示し始める。視空間及び言語の問題は、多くの場合、記憶を伴う初期症状の発症に続くか、それに伴う。疾患が進行するにつれて、個人はゆっくりと日常生活の活動を行う能力を失い、最終的には、注意、言語能力、問題解決、推論、及びすべての形態の記憶が深刻に損なわれるようになる。実際、ＡＤの進行は、多くの場合、無気力、怒り、依存、攻撃性、妄想症、時には不適切な性行動などの、性格の変化を伴う。ＡＤの後期ステージでは、個人は、コミュニケーションをすることができず、完全な混乱の兆候を示し、寝たきりになる場合がある。
【０００４】
２つの型のアルツハイマー病、早期発症及び後期発症があり、両方の型は、遺伝的要素を有する。早期発症ＡＤ患者は、３０代〜６０代半ばに症状を示し始め、かつ非常にまれである一方で、最も一般的な型である後期発症ＡＤでは、患者は６０代半ばに徴候及び症状を示す。後期発症ＡＤは、人のリスクを増加させる遺伝的リスク因子であり、１９番染色体上のアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）の形態であるＡＰＯＥ  ε４が関与することが知られている。
【０００５】
現時点では、ＡＤに対する治療法はなく、利用可能な治療は、通常、症状の悪化を一時的に遅らせることしか提供しない。加えて、アルツハイマー病は、死後、脳組織及び剖検での病理学の検査によってのみ絶対的に診断され得る。
【０００６】
したがって、疾患修飾療法の特定は、薬学的介入及び創薬に対する主な目的である。しかし、これらの取り組みは、創薬及び開発を支援する臨床的に意味のあるバイオマーカーがないという事実によって妨げられている。かかるバイオマーカーは、アクセス可能で、予後的で、及び／または疾患特異的である必要がある。薬学的介入を含む治療的介入の発見及び調査は、根底にある疾患プロセスと相関するバイオマーカーの利用可能性から利益を得るであろう。
【０００７】
アルツハイマー病活性を評価するための診断試験は、例えば、罹患した個人において治療及び意思決定を支援するため、同様に、患者登録、層別化、及び疾患モニタリングを含む、創薬及び臨床試験におけるバイオマーカーとしての使用のために必要とされる。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）活性を評価するための方法及びキットを提供し、動物及び細胞モデルにおけるのと同様に、ＡＤに対する治療またはＡＤに対する候補治療を受ける患者におけるものを含む。具体的には、本開示は、疾患活性のバイナリ予測因子であり、かつＡＤ疾患ステージ、グレード、進行、予後、及び療法または候補療法への応答を検出及び／または評価するのに有用である、バイオマーカー（ｓＲＮＡ予測因子）を提供する。バイオマーカーは、疾患の治療または管理（例えば、治療または進行のモニタリング）に有用である候補薬学的介入（または他の療法）を特定するための、創薬及び臨床試験の状況においてさらに有用である。
【０００９】
様々な態様及び実施形態では、本発明は、細胞中の、または対象または患者からの生体試料中のアルツハイマー病またはアルツハイマー病活性のバイナリ低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）予測因子を検出することを伴う。ｓＲＮＡ配列は、ＡＤ実験コホートの試料に存在するものとして特定される一方で、対照薬コホート（「陽性ｓＲＮＡ予測因子」）のいずれの試料にも存在しない。本発明は、それによって、二元予測因子であるｓＲＮＡを検出し、アルツハイマー病に対して１００％の特異性を呈する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象または患者におけるＡＤ活性を評価するための方法を提供する。方法は、ＡＤの症状及び徴候を示す対象または患者からの生体試料を提供すること、及び試料中の１つ以上のｓＲＮＡ予測因子の存在、不在、またはレベルを決定することを含む。ｓＲＮＡ予測因子の存在またはレベルは、疾患活性と相関する。
【００１１】
陽性ｓＲＮＡ予測因子は、表２Ａ、表４Ａ、及び表７Ａ（配列番号１〜４０３）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む。例えば、陽性ｓＲＮＡ予測因子は、ＡＤ患者の脳組織試料のｓＲＮＡ配列データにおいて特定されたが、非疾患対照、及び様々な他の非アルツハイマー病の神経変性疾患対照（例えば、パーキンソン病）に不在であった、表２Ａ（配列番号１〜４６）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の予測因子の相対的または絶対的量は、疾患のステージまたは重症度と相関する。いくつかの実施形態では、陽性ｓＲＮＡ予測因子は、ＡＤ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料のｓＲＮＡ配列データにおいて特定されたが、健常対照、及び様々な他の非アルツハイマー病の神経変性疾患対照（例えば、パーキンソン病）に不在であった、表４Ａ（配列番号４７〜２５４）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む。いくつかの実施形態では、陽性ｓＲＮＡ予測因子は、ＡＤ患者の血清試料のｓＲＮＡ配列データにおいて特定されたが、健常対照及び様々な他の非アルツハイマー病の神経変性疾患対照（例えば、パーキンソン病）に不在であった、表４Ａ（配列番号２５５〜４０３）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、試料に存在する予測因子の数、または１つ以上の予測因子の蓄積は、ＡＤの進行または疾患もしくは活性症状の根底にある重症度と直接相関する。いくつかの実施形態では、陽性ｓＲＮＡ予測因子は、表５（配列番号５８、１８９、７８、１７２、１９３、９７、１２２、２１５、２４８、１６４、１２０、９３、１２６、２５３、１１２、１４４、２１３、２４４、１２３、２２２、１５０、２４０、５２、２２０、２２１、１６９、１６５、及び２１２）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含み、ＡＤ進行のＢｒａａｋステージと相関する（例えば、ＣＳＦ試料中で）。いくつかの実施形態では、陽性ｓＲＮＡ予測因子は、表８（配列番号２５７、２７０、２７２、２７３、２７９、２８６、２８８、３１４、３１９、３２５、３３２、３４１、３７４、３９１、及び３９３）からの１つ以上を含み、ＡＤ進行のＢｒａａｋステージと相関する（例えば、血清試料中で）。
【００１３】
いくつかの実施形態では、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａのうちの１つ以上からの少なくとも１、２、３、４、もしくは５つのｓＲＮＡ、または少なくとも１０のｓＲＮＡ、または少なくとも４０のｓＲＮＡの存在、不在、またはレベルが決定される（配列番号１〜４０３）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの陰性ｓＲＮＡ予測因子の存在または不在も決定され、健常対照などの非ＡＤ試料において一意に特定される。いくつかの実施形態では、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａからの陽性予測因子を含むｓＲＮＡのパネルは、試料に対して試験される。いくつかの実施形態では、パネルは、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａからの少なくとも２つ、または少なくとも５つ、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも２５のｓＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、パネルは、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７ＡからのすべてのｓＲＮＡを含む。例えば、試料は、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａの少なくとも約２、３、４、または５つのｓＲＮＡ予測因子に対して陽性であり得、活性疾患を示し、より重症の、または進行した疾患は約１０、１５、または約２０のｓＲＮＡ予測因子と相関している。いくつかの実施形態では、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７ＡにおけるｓＲＮＡ予測因子の相対的または絶対的量は、疾患グレードまたは重症度（例えば、Ｂｒａａｋステージ）と直接相関する。
【００１４】
一般に、少なくとも１、２、３、４、または５つの陽性予測因子の存在は、ＡＤ活性を予測する。いくつかの実施形態では、５〜約１００、または約５〜約６０のｓＲＮＡ予測因子のパネルが、試料に対して試験される。各実験試料は各陽性予測因子に対して陽性になるわけではない一方で、パネルは、トレーニングコホート（例えば、実験コホート）に対して１００％の感度を提供するのに十分な大きさである。つまり、実験コホートにおける各試料は、１つ以上の陽性ｓＲＮＡ予測因子の存在を有する。かかる実施形態では、パネルにおけるｓＲＮＡ予測因子の存在または不在は、トレーニングセット（すなわち、実験コホート）に対して１００％の特異性及び１００％の感度を提供する（定義上）。さらに他の実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子は、非ブートストラップ及び／またはブートストラップ分類アルゴリズムを含む、計算分類器アルゴリズムにおいて用いられる。例は、パラメトリック／ノンパラメトリック距離測定法、ロジスティック回帰、サポートベクトルマシン、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、プロビット回帰、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、二次分類器、カーネル推定、ｋ近傍法、学習ベクトル量子化、及び主成分分析などの、教師あり、教師なし、半教師ありの機械学習モデルを含む。これらの分類アルゴリズムは、ｓＲＮＡ予測因子以外の他のｓＲＮＡの存在及び不在に依存する場合がある。例えば、分類器は、アイソフォームのパネル（「ｉｓｏｍｉＲ」として知られるマイクロＲＮＡアイソフォームを含むが、これらに限定されない）の存在または不在に依存する場合があり、任意選択で１つ以上のｓＲＮＡ予測因子（すなわち、疾患状態に特有であるとｓＲＮＡ配列データにおいて特定された）を含み得る。
【００１５】
ｓＲＮＡは、固体組織及び／または生体液を含む、任意の生体試料中で特定または検出され得る。ｓＲＮＡは、動物（例えば、脊椎動物及び無脊椎動物）、またはいくつかの実施形態では、培養細胞または培養細胞の培地において特定または検出され得る。例えば、試料は、血液、血清、血漿、尿、唾液、または脳脊髄液などの、ヒトまたは動物の対象（例えば、哺乳動物の対象）からの生体液試料であり得る。いくつかの実施形態では、試料は、脳組織などの固体組織である。
【００１６】
様々な実施形態では、ｓＲＮＡの検出は、逆転写、増幅、及び／またはプローブのハイブリダイゼーションを用いることができ、定量的もしくは定性的ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲを含む、様々な検出プラットフォームのうちの１つを伴う。ＰＣＲ検出フォーマットは、いくつかの実施形態では、かつ任意選択で、蛍光標識されたプローブと関連して、ＲＴ−ＰＣＲのためのステムループプライマーを用いることができる。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡは、ハイブリダイゼーションアッセイまたはＲＮＡ配列決定（例えば、ＮｅｘｔＧｅｎ配列決定）によって検出される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列決定は、パネルにおけるｓＲＮＡ予測因子または他のｓＲＮＡを増幅する特異的プライマーに関連して使用される。
【００１７】
本発明は、ＡＤの症状及び徴候を示す細胞または動物（またはそれらに由来する試料）におけるｓＲＮＡ（ｉｓｏｍｉＲなどの）の検出を伴う。いくつかの実施形態では、本発明は、アポリポプロテインＥ（ＡＰＯＥ）の形態であるＡＰＯＥ  ε４を含有する細胞または動物（またはそれらに由来する試料）における、ｓＲＮＡ予測因子の検出を伴う。様々な実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子の数及び／または同一性、またはそれらの相対量は、ＡＰＯＥ  ε４対立遺伝子を有する患者、対象、または細胞に対する疾患活性と相関する。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子は、他の点では無症候性と見なされる患者または対象におけるＡＤ生物学的プロセスを示す。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、２〜約１００のｓＲＮＡ予測アッセイ、または約５〜約７５のｓＲＮＡ予測アッセイ、または５〜約２０のｓＲＮＡ予測アッセイからのパネルを含むキットを提供する。これらの実施形態では、キットは、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７ＡからのｓＲＮＡ予測因子の存在または不在を決定するためのｓＲＮＡ予測因子アッセイ（例えば、かかるアッセイのための試薬）を含み得る。かかるアッセイは、他の非予測配列よりもｓＲＮＡ予測因子に対して特異的な逆転写（ＲＴ）プライマー、増幅プライマー、及びプローブ（蛍光プローブまたは二重標識プローブなどの）を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーションによるｓＲＮＡ予測因子の検出のためのプローブを含有するアレイまたは他の基質の形態にある。
【００１９】
いくつかの態様では、本発明は、アルツハイマー病活性について試料を評価するためのキットを提供する。様々な実施形態では、キットは、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａ（配列番号１〜４０３）に列挙された複数のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａ（配列番号１〜４０３）に列挙された少なくとも５つ、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも４０のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む。
【００２０】
さらに他の実施形態では、本発明は、特定のｓＲＮＡ分子（例えば、ｉｓｏｍｉＲまたは他の型のｓＲＮＡ）の存在または不在に基づいて疾患分類器を構築することを伴う。これらの疾患分類器は、同様の症状を示す疾患状態を鑑別すること、同様に、疾患の経過を予測すること、治療への応答を予測すること、及び疾患モニタリングを含む、疾患サブタイプを決定することのための強力なツールである。一般に、ｓＲＮＡパネル（例えば、別個のｓＲＮＡバリアントのパネル）は、目的の１つ以上の疾患状態を表す１つ以上のトレーニングセットにおける配列データから決定されるであろう。ｓＲＮＡパネル及び分類器アルゴリズムは、例えば、パラメトリック／ノンパラメトリック距離測定法、ロジスティック回帰、サポートベクトルマシン、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、プロビット回帰、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、二次分類器、カーネル推定、ｋ近傍法、学習ベクトル量子化、及び主成分分析などの、教師あり、教師なし、半教師ありの機械学習モデルを使用して構築され得る。分類器がトレーニングされると、独立した対象は、対象からの生体試料中でパネルにおけるｓＲＮＡマーカーの存在または不在を検出すること、及び分類アルゴリズムを適用することによって、疾患状態について評価され得る。分類器は、バイナリ分類器（すなわち、２つの状態の間で分類する）であり得るか、または３、４、５、もしくはそれ以上の疾患状態の間で分類できる。分類器は、ｓＲＮＡの正常レベルと異常レベルとを鑑別するよりもむしろ、パネルにおけるｓＲＮＡの存在及び不在に依存する。
【００２１】
例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上の疾患状態について対象を評価するための方法を提供する。方法は、対象の生体試料を提供すること、及びｓＲＮＡパネルにおける複数のｓＲＮＡの存在または不在を決定することを含む。この「存在及び不在」ｓＲＮＡ（バイナリマーカー）のプロファイルは、疾患分類器を使用して、２つ以上の疾患状態の間で対象の状態を分類するために使用される。疾患分類器は、トレーニング試料のセット中のｓＲＮＡパネルにおけるｓＲＮＡの存在及び不在に基づいてトレーニングされているであろう。例えば、トレーニング試料は、パネルにおけるｓＲＮＡの存在または不在（及びいくつかの実施形態では、レベル）と同様に、１つ以上の疾患状態に対して陽性または陰性として注釈付けされる（かつ疾患のサブタイプ、グレード、または治療レジメンについて注釈付けされ得る）。
【００２２】
パネルにおけるｓＲＮＡの存在または不在は、ｓＲＮＡ配列データからのトレーニングセットにおいて決定される。つまり、個々のｓＲＮＡ配列は、３’配列決定アダプタをトリミングすることによって、ｓＲＮＡ配列バリアントを参照配列または遺伝子座に統合することなく、ｓＲＮＡ配列データにおいて特定される。例えば、トリミング後、各疾患状態または対照薬状態内の特有配列読み取り値は、コンパイルされる（すなわち、各特有配列についての読み取り計数が準備される）。したがって、ｉｓｏｍｉＲなどの特定のｓＲＮＡ配列の存在または不在は、各疾患状態において決定され、これらのバリアントは、参照配列に統合されない。これらの配列は、「バイナリ」マーカーとして使用され得、つまり、正常レベルと異常レベルとを鑑別することとは反対に、試料中のそれらの存在または不在に基づいて評価され得る。
【００２３】
配列データにおいて特定され、計算分類器に含めるために選択されると、パネルにおけるｓＲＮＡに対する分子検出試薬が、調製され得る。かかる検出プラットフォームは、ステムループプライマー及び蛍光プローブを用いるものを含む、定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む。
【００２４】
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明から明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ａは、様々なＩＢＤクラス及び対照：対照についてのＲＯＣ／ＡＵＣ曲線を示す。Ｂは、様々なＩＢＤクラス及び対照：クローン病についてのＲＯＣ／ＡＵＣ曲線を示す。Ｃは、様々なＩＢＤクラス及び対照：潰瘍性大腸炎についてのＲＯＣ／ＡＵＣ曲線を示す。Ｄは、様々なＩＢＤクラス及び対照：憩室症についてのＲＯＣ／ＡＵＣ曲線を示す。
【図２】正確な多クラス疾患予測のそれらの真の参照同一性に対する割合を示しているヒートマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
表の簡単な説明
表１Ａ〜１Ｂは、アルツハイマー病（ＡＤ）コホート（表１Ａ）と、健常対照及び他の様々な非アルツハイマー神経障害対照（表１Ｂ）を含む対照コホートと、を含む、脳組織試料コホートを特徴付ける。
【００２７】
表２Ａは、ＡＤに対する脳組織試料中のｓＲＮＡ陽性予測因子（配列番号１〜４６）を、読み取り計数、特異性、及び感度（例えば、頻度）とともに示す。表２Ｂは、脳組織試料全体のＡＤに対する陽性予測因子を、試料あたりのバイオマーカーの数及びカバレッジパーセントとともに示す。
【００２８】
表３Ａ〜３Ｂは、アルツハイマー病（ＡＤ）コホート（表３Ａ）と、健常対照及び他の様々な非アルツハイマー神経障害対照（表３Ｂ）を含む対照コホートと、を含む、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料コホートを特徴付ける。
【００２９】
表４Ａは、ＡＤに対するＣＳＦ中のｓＲＮＡ陽性予測因子（配列番号４７〜２５４）を、読み取り計数、特異性、及び感度（例えば、頻度）とともに示す。表４Ｂは、ＣＳＦ試料全体のＡＤに対する陽性予測因子を、試料あたりのバイオマーカーの数及びカバレッジパーセントとともに示す。
【００３０】
表５は、ＡＤのモニタリングに使用され得るＢｒａａｋステージとの相関を示すＣＳＦからの２８の特定されたｓＲＮＡバイオマーカーのパネルを示す。
【００３１】
表６Ａ〜６Ｂは、アルツハイマー病（ＡＤ）コホート（表６Ａ）と、健常対照及び他の様々な非アルツハイマー神経障害対照（表６Ｂ）を含む対照コホートと、を含む、血清試料コホートを特徴付ける。
【００３２】
表７Ａは、ＡＤに対する血清中のｓＲＮＡ陽性予測因子（配列番号２５５〜４０３）を、読み取り計数、特異性、及び感度（例えば、頻度）とともに示す。表７Ｂは、血清試料全体のＡＤに対する陽性予測因子を、試料あたりのバイオマーカーの数及びカバレッジパーセントとともに示す。
【００３３】
表８は、ＡＤのモニタリングに使用され得るＢｒａａｋステージとの相関を示す血清からの１５の特定されたｓＲＮＡバイオマーカーのパネルを示す。
【００３４】
表９は、炎症性腸疾患の対照（「正常な」個人）に対する結腸上皮組織からのｓＲＮＡバイオマーカーのパネルを示す。
【００３５】
表１０は、クローン病に対する結腸上皮組織からのｓＲＮＡバイオマーカーのパネルを示す。
【００３６】
表１１は、潰瘍性大腸炎に対する結腸上皮組織からのｓＲＮＡバイオマーカーのパネルを示す。
【００３７】
表１２は、憩室症に対する結腸上皮組織からのｓＲＮＡバイオマーカーのパネルを示す。
【００３８】
本発明の詳細な説明
本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）活性を評価するための方法及びキットを提供し、動物及び細胞モデルにおけるのと同様に、ＡＤに対する治療またはＡＤに対する候補治療を受ける患者におけるものを含む。具体的には、本開示は、疾患活性のバイナリ予測因子であり、かつ根底にある疾患プロセス、疾患グレード、進行、及び療法または候補療法への応答を検出及び／または評価するのに有用である、バイオマーカー（ｓＲＮＡ予測因子）を提供する。バイオマーカーは、ＡＤまたはＡＤ症状の治療に有用である候補療法を特定し、同様に、患者を選択または層別化し、疾患進行または治療をモニタリングするための、創薬及び臨床試験の状況においてさらに有用である。
【００３９】
様々な態様及び実施形態では、本発明は、細胞または生体試料中の、アルツハイマー病またはアルツハイマー病活性のバイナリ低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）予測因子を検出することを伴う。ｓＲＮＡ配列は、ＡＤ実験コホートの試料に存在するものとして特定される一方で、対照薬コホートにおけるどの試料にも存在しない。これらのｓＲＮＡマーカーは「陽性ｓＲＮＡ予測因子」と呼ばれ、定義上、１００％の特異性を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、さらに、対照薬コホートの１つ以上の試料に存在し、かつ実験コホートの試料のうちのいずれにも存在しない、１つ以上のｓＲＮＡ配列を検出することを含む。これらの予測因子は、「陰性ｓＲＮＡ予測因子」と呼ばれ、予測に追加的なレベルの信頼性を提供する。調節不全ｓＲＮＡ（上方または下方調節されるｍｉＲＮＡなどの）を検出することとは対照的に、本発明は、アルツハイマー病活性に対するバイナリ予測因子であるｓＲＮＡを提供する。
【００４０】
低分子ＲＮＡ種（「ｓＲＮＡ」）は、２００ヌクレオチド未満の長さの非コードＲＮＡであり、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（ｉｓｏ−ｍｉＲを含む）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヴォールトＲＮＡ（ｖｔＲＮＡ）、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、転移ＲＮＡ由来低分子ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ由来低分子ＲＮＡ断片（ｒｓＲＮＡ）、低分子ｒＲＮＡ由来ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、及び低分子核ＲＮＡ（Ｕ−ＲＮＡ）、同様に、新規の特徴のないＲＮＡ種を含む。一般に、「ｉｓｏ−ｍｉＲ」は、参照ｍｉＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＢａｓｅによって使用される）に関して変種を有するそれらの配列を指す。ｍｉＲＢａｓｅでは、各ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ前駆体、及び１つまたは２つの成熟ｍｉＲＮＡ（−５ｐ及び−３ｐ）に関連する。ディープ配列決定は、ｍｉＲＮＡ生合成における大きなばらつきを検出しており、同じｍｉＲＮＡ前駆体から多くの異なる配列が生成され得ることを意味する。ｉｓｏ−ｍｉＲの４つの主な変種がある：（１）５’切断部位が参照ｍｉＲＮＡ配列から上流または下流にある、５’トリミング、（２）３’切断部位が参照ｍｉＲＮＡ配列から上流または下流にある、３’トリミング、（３）ヌクレオチドが参照ｍｉＲＮＡの３’末端に付加される、３’ヌクレオチド付加、（４）ヌクレオチドがｍｉＲＮＡ前駆体から変更される、ヌクレオチド置換。
【００４１】
２０１８年１月２３日に出願されたＵ．Ｓ．２０１８／０２５８４８６、及び２０１８年１月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１４８５６（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）は、ｓＲＮＡ予測因子を特定するためのプロセスを開示する。プロセスは、ＲＮＡ配列決定データからの３’アダプタの計算的トリミング、及び特有配列読み取り値に従ってデータをソートすることを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）活性を評価するための方法を提供する。方法は、ＡＤの症状及び徴候を示す対象もしくは患者からの細胞もしくは生体試料を提供すること、またはそこから抽出されたＲＮＡを提供すること、ならびに細胞もしくは試料中の１つ以上のｓＲＮＡ予測因子の存在もしくは不在を決定することを含む。１つ以上のｓＲＮＡ予測因子の存在は、アルツハイマー病活性を示す。
【００４３】
「アルツハイマー病活性」という用語は、ＡＤ症状と、認知、行動、及び／または運動能力ならびに協調性の全体的な低下と、をもたらす（直接的または間接的に）活性疾患プロセスを指す。アルツハイマー病活性という用語は、罹患した細胞の相対的な健康をさらに指すことができる。いくつかの実施形態では、ＡＤ活性は、ニューロン生存能力を示す。
【００４４】
陽性ｓＲＮＡ予測因子は、表２Ａ、４Ａ、または７Ａ（配列番号１〜４０３）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む。本明細書に開示される配列は、逆転写されたＤＮＡ配列として示される。例えば、陽性ｓＲＮＡ予測因子は、脳組織試料の配列データにおいて特定された、ＡＤ及び／またはＡＤステージを示す表２Ａ（配列番号１〜４６）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含み得る。いくつかの実施形態では、陽性ｓＲＮＡ予測因子は、ＣＳＦ試料の配列データにおいて特定された、ＡＤ及び／またはＡＤステージを示す表４Ａ（配列番号４７〜１５４）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む。いくつかの実施形態では、陽性ｓＲＮＡ予測因子は、血清試料の配列データにおいて特定された、ＡＤ及び／またはＡＤステージを示す表７Ａ（配列番号１５５〜４０３）からの１つ以上を含む。
【００４５】
具体的には、表２Ａ及び２Ｂは、脳組織試料中で特定された、ＡＤに対するｓＲＮＡ陽性予測因子を示す。これらのｓＲＮＡ予測因子は、ＡＤ脳組織試料のコホート（実験群として）に存在したが、非疾患試料、同様に他の様々な非アルツハイマー神経疾患試料で構成された対照薬群試料のうちのいずれにも存在しなかった。表２Ａは、Ｂｒａａｋステージに関係なく、ＡＤに対する陽性予測因子を示す。陽性予測因子は、各々、コホートにおけるＡＤの存在に対して１００％の特異性を提供する。表２Ａ及び２Ｂは、陽性予測因子に対するＡＤ脳組織試料全体の平均読み取り計数を示す。いくつかの実施形態では、試料に存在する予測因子の数は、ＡＤのＢｒａａｋステージと直接相関する。
【００４６】
表４Ａ及び４Ｂは、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中で特定された、ＡＤに対するｓＲＮＡ陽性予測因子を示す。これらのｓＲＮＡ予測因子は、ＡＤ  ＣＳＦ試料のコホート（実験群として）に存在したが、健常者試料、同様に他の様々な非アルツハイマー神経疾患試料で構成された対照薬群試料のうちのいずれにも存在しなかった。表４Ａは、Ｂｒａａｋステージに関係なく、ＡＤに対する陽性予測因子を示す。陽性予測因子は、各々、コホートにおけるＡＤの存在に対して１００％の特異性を提供する。表４Ａ及び４Ｂは、陽性予測因子のＡＤ  ＣＳＦ試料全体の平均読み取り計数を示す。いくつかの実施形態では、試料に存在する予測因子の数は、ＡＤのＢｒａａｋステージと直接相関する。
【００４７】
表７Ａ及び７Ｂは、血清試料中で特定された、ＡＤに対するｓＲＮＡ陽性予測因子を示す。これらのｓＲＮＡ予測因子は、ＡＤ血清試料のコホート（実験群として）に存在したが、健常試料、同様に他の様々な非アルツハイマー神経疾患試料で構成された対照薬群試料のうちのいずれにも存在しなかった。表７Ａは、Ｂｒａａｋステージに関係なく、ＡＤに対する陽性予測因子を示す。陽性予測因子は、各々、コホートにおけるＡＤの存在に対して１００％の特異性を提供する。表７Ａ及び７Ｂは、陽性予測因子のＡＤ血清試料全体の平均読み取り計数を示す。いくつかの実施形態では、試料に存在する予測因子の数は、ＡＤのＢｒａａｋステージと直接相関する。
【００４８】
様々な実施形態では、少なくとも５つのｓＲＮＡの存在、不在、またはレベルは、陽性及び陰性の予測因子ならびに他の可能な対照を含めて、決定される。いくつかの実施形態では、少なくとも８つのｓＲＮＡ、または少なくとも１０のｓＲＮＡ、または少なくとも約５０のｓＲＮＡの存在または不在が、決定される。いくつかの実施形態では、決定されたｓＲＮＡの総数は、約１０００未満、または約５００未満、または約２００未満、または約１００未満、または約５０未満である。したがって、ｓＲＮＡの存在、不在、またはレベルは、任意の数の特定の分子検出アッセイを使用して決定され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａからの少なくとも２つ、または少なくとも５つ、または少なくとも１０のｓＲＮＡの存在、不在、またはレベルが、決定される（配列番号１〜４０３）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの陰性ｓＲＮＡ予測因子の存在、不在、またはレベルも決定される。いくつかの実施形態では、表２Ａからの陽性予測因子を含むｓＲＮＡのパネルが決定され、パネルは、表２Ａからの少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または少なくとも２０のｓＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、パネルは、表２ＡからのすべてのｓＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、表４Ａからの陽性予測因子を含むｓＲＮＡのパネルが決定され、パネルは、表４Ａからの少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または少なくとも２０のｓＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、パネルは、表４ＡからのすべてのｓＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、表７Ａからの陽性予測因子を含むｓＲＮＡのパネルが決定され、パネルは、表７Ａからの少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、または少なくとも２０のｓＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、パネルは、表７ＡからのすべてのｓＲＮＡを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、１つ以上（またはすべて）の陽性ｓＲＮＡ予測因子は、各々、実験コホートにおけるＡＤ試料の少なくとも約１０％、または実験コホートにおけるＡＤ試料の少なくとも約２０％、または実験コホートにおけるＡＤ試料の少なくとも約３０％、または実験コホートにおけるＡＤ試料の少なくとも約４０％に存在する。いくつかの実施形態では、特定された予測因子の同一性及び／または数は、活性疾患プロセス（例えば、Ｂｒａａｋステージ）と相関する。例えば、試料は、表２Ａ、４Ａ、及び／または７Ａにおける少なくとも１、２、３、４、または５つのｓＲＮＡ予測因子に対して陽性であり得、脳組織、ＣＳＦ、及び／または血清試料からの疾患を示し、より重症または進行性の疾患プロセスは、表４Ａまたは７Ａの約１０、少なくとも約１５、または少なくとも約２０のｓＲＮＡ予測因子と相関する。いくつかの実施形態では、絶対レベル（例えば、配列決定読み取り計数）または相対レベル（例えば、リアルタイムＰＣＲなどの定性的アッセイを使用する）は、Ｂｒａａｋステージと相関し得る表４Ａまたは表７ＡにおけるｓＲＮＡ予測因子について決定される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、陽性ｓＲＮＡ予測因子の存在について陰性であると試験される試料は、少なくとも１つ、または少なくとも約５つ、または少なくとも約１０、または少なくとも約２０、または少なくとも約３０、または少なくとも約４０、または少なくとも約５０、または少なくとも約１００の陰性ｓＲＮＡ予測因子について陽性であると試験される。陰性予測因子は、健常個人または他の病状（ＰＤまたは認知症などの）に対して特異的であり得る。ＡＤについて陽性であると試験された個人は、典型的には、いずれの陰性予測因子の存在についても陽性であると試験されない。
【００５２】
一般に、少なくとも１、２、３、４、または５つの陽性予測因子の存在、及びすべての陰性予測因子の不在は、ＡＤ活性を予測する。いくつかの実施形態では、５〜約１００、または約５〜約６０のｓＲＮＡ予測因子のパネルは、試料中で検出される。各実験試料が各陽性予測因子に対して陽性であるとは限らない一方で、パネルは、ＡＤコホートにおける状態に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％のカバレッジを提供するのに十分に大きい。複数のｓＲＮＡ予測因子が実験コホートの各試料に存在するパネルを選択することによって、パネルは、トレーニング試料（実験コホート及び対照薬コホート）に対する１００の感度及び１００の特異性を提供するように調整されるであろう。
【００５３】
様々な実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子の検出は、逆転写、増幅、及び／またはプローブのハイブリダイゼーションを用いることができ、定量的もしくは定性的ＰＣＲ、またはリアルタイムＰＣＲを含む、様々な検出プラットフォームのうちの１つを含む。ＰＣＲ検出フォーマットは、いくつかの実施形態では、かつ任意選択で、蛍光標識されたプローブと関連して、ＲＴ−ＰＣＲのためのステムループプライマーを用いることができる。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡは、３’配列決定アダプタの計算的トリミングを伴うＲＮＡ配列決定によって検出される。配列決定は、バイナリ予測因子に対して最大１つの特異的プライマーを使用する逆転写及び／または増幅を用いることができる。
【００５４】
一般に、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、ＰＣＲ中、つまり、リアルタイムで、標的ＤＮＡ分子の増幅をモニタリングする。リアルタイムＰＣＲは、定量的かつ半定量的に使用され得る。リアルタイムＰＣＲにおけるＰＣＲ産物の検出のための２つの一般的な方法は、（１）任意の二本鎖ＤＮＡに介在する非特異的蛍光色素（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＩまたはＩＩ）、または臭化エチジウム）、及び（２）プローブのその相補的配列（例えばＴＡＱＭＡＮ）とのハイブリダイゼーション後にのみ検出を可能にする蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、アッセイフォーマットは、ＴＡＱＭＡＮリアルタイムＰＣＲである。ＴＡＱＭＡＮプローブは、定量的ＰＣＲの特異性を増加させるように設計された加水分解プローブである。ＴＡＱＭＡＮプローブの原理は、相補的標的配列へのハイブリダイゼーション中に、フルオロフォアベースの検出で二重標識プローブを切断するための、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性に依存する。ＴＡＱＭＡＮプローブは、フルオロフォア及びクエンチャで二重標識されており、フルオロフォアがＴａｑエキソヌクレアーゼ活性によってオリゴヌクレオチドプローブから切断される際に、フルオロフォアシグナルが、検出される（例えば、もはやシグナルはラベルの近接によってクエンチされない）。他の定量的ＰＣＲ法におけるように、得られた蛍光シグナルは、ＰＣＲの指数関数的ステージ中に産物の蓄積の定量的測定を可能にする。ＴＡＱＭＡＮプローブフォーマットは、検出の高い感度及び特異性を提供する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、試料に存在するｓＲＮＡ予測因子は、特異的プライマー、例えば、ｓＲＮＡの一端または両端を調べるステムループプライマーを使用して、ｃＤＮＡに変換される。次いで、ｃＤＮＡの増幅は、例えば、蛍光レポーティング分子からのシグナルを検出することによってリアルタイムで定量化され得、シグナル強度は、各増幅サイクルでのＤＮＡのレベルと相関する。
【００５７】
代替的には、パネルにおけるｓＲＮＡ予測因子、またはそれらのアンプリコンは、ハイブリダイゼーションによって検出される。例示的なプラットフォームは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及びマイクロアレイ技術を含む。検出プラットフォームは、簡便な試料処理及びｓＲＮＡ検出のために、いくつかの実施形態では、マイクロフルイディクスを使用できる。
【００５８】
一般に、試料中のｓＲＮＡの存在を決定するための任意の方法が、用いられ得る。かかる方法は、さらに、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、フラップエンドヌクレアーゼベースのアッセイ、同様に、分岐ＤＮＡによる直接ＲＮＡキャプチャ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（商標））、Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）（Ｄｉｇｅｎｅ）、またはｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）ｍｉＲＮＡ検出（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）を含む。アッセイフォーマットは、ｍｉＲＮＡ及び他のｓＲＮＡの存在を決定することに加えて、とりわけ、固有のシグナル強度変動の制御も提供できる。かかる制御は、例えば、バックグラウンドシグナル強度及び／または試料処理、及び／またはハイブリダイゼーション効率のための制御、同様に、患者試料中のｓＲＮＡを検出するための他の望ましい制御（例えば、集合的に「正規化制御」と呼ばれる）を含み得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、アッセイフォーマットは、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのフラップエンドヌクレアーゼベースのフォーマットである。インベーダー法を使用する場合、標的部位の３’領域に特異的な配列を含むインベーダープローブと、テンプレートの標的部位の５’領域に特異的な配列及び無関係のフラップ配列を含む一次プローブと、が調製される。次いで、クリベースは、これらのプローブ、標的分子の存在下で、ならびに、フラップ配列に相補的な配列と、蛍光色素及びクエンチャの両方で標識された自己相補的配列と、を含むＦＲＥＴプローブの存在下で、作用することが可能である。一次プローブがテンプレートとハイブリダイズする際に、インベーダープローブの３’末端は標的部位を貫通し、この構造はクリベースによって切断され、フラップの解離をもたらす。フラップはＦＲＥＴプローブに結合し、蛍光色素部分は、クリベースによって切断され、蛍光の発光をもたらす。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、検出のためのｓＲＮＡ処理の前に試料から抽出される。ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｅ．Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｊｒ．，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載されるような様々な標準手順を使用して精製され得る。加えて、ｍｉｒＶＡＮＡ（商標）Ｐａｒｉｓ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）、ｍｉＲＮｅａｓｙ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）、ＭａｇＭＡＸ（商標）キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｕｒｅ  Ｌｉｎｋ  （商標）キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む、低分子量ＲＮＡの単離のための市販の製品と同様に、様々なプロセスがある。例えば、低分子量のＲＮＡは、グラスファイバーフィルタ上での精製が後に続く有機抽出によって単離され得る。ｍｉＲＮＡを単離するための代替方法は、磁気ビーズへのハイブリダイゼーションを含む。代替的には、検出のためのｍｉＲＮＡ処理（例えば、ｃＤＮＡ合成）は、生体液試料において、すなわち、ＲＮＡ抽出ステップを伴わずに実施され得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡの存在または不在は、核酸配列決定によって対象試料において決定され、個々のｓＲＮＡは、個々のｓＲＮＡ配列からの３’配列決定アダプタの計算的トリミングを含むプロセスによって特定される。参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年１月２３日に出願されたＵ．Ｓ．２０１８／０２５８４８６、及び２０１８年１月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１４８５６を参照されたい。いくつかの実施形態では、配列決定プロセスは、バイオマーカーに対して特異的なプライマーを使用して、ｓＲＮＡ予測因子を逆転写及び／または増幅できる。
【００６２】
一般に、アッセイは、各アッセイが、注釈付き配列及び／または他の非予測ｉｓｏ−ｍｉＲ及びｓＲＮＡよりもｓＲＮＡ（例えば、ｉｓｏ−ｍｉＲ）に対して少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％特異的であるように構築され得る。注釈付き配列は、ｍｉＲＢａｓｅを参照して決定され得る。例えば、ｓＲＮＡ予測因子特異的リアルタイムＰＣＲアッセイを調製する際、ＰＣＲプライマー及び蛍光プローブは、調製され得、それらの特異性のレベルについて試験され得る。二環式ヌクレオチドまたは２’位置に関与する他の修飾（例えば、ＬＮＡ、ｃＥＴ、及びＭＯＥ）、または他のヌクレオチド修飾（塩基修飾を含む）は、検出の感度または特異性を増加させるためにプローブに用いられ得る。ｉｓｏｍｉＲ及びｓＲＮＡの特異的検出は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１８／０２５８４８６に開示される。
【００６３】
ｓＲＮＡ予測因子は、固体組織及び／または生体液を含む任意の生体試料中で特定できる。ｓＲＮＡ予測因子は、動物（例えば、脊椎動物及び無脊椎動物の対象）、またはいくつかの実施形態では、培養細胞または培養細胞からの培地において特定され得る。例えば、試料は、血液、血清、血漿、尿、唾液、または脳脊髄液などの、ヒトまたは動物の対象（例えば、哺乳動物対象）からの生体液試料である。ｍｉＲＮＡは、細胞間シグナル伝達において重要な役割を果たす場合がある分泌メカニズムの結果として、生体液中に見いだされることができる。Ｋｏｓａｋａ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｉｎ  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄ：  ａ  ｎｅｗ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２０１０；１０１：２０８７−２０９２を参照されたい。脳脊髄液及び血清からのｍｉＲは、病状及び病理学的特徴について患者を層別化する目的とともに、従来の方法に従ってプロファイリングされている。Ｂｕｒｇｏｓ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉＲＮＡ  ｉｎ  Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｒｕｍ  ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  Ｖｏｌ．９，Ｉｓｓｕｅ  ５（２０１４）。いくつかの実施形態では、試料は、固体組織試料であり、ニューロンを含み得る。いくつかの実施形態では、組織試料は、前頭皮質領域からなどの脳組織試料である。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子は、脳組織及び血液などの生体液を含む、少なくとも２つの異なる型の試料中で特定される。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子は、脳組織、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び血液を含む、少なくとも３つの異なる型の試料中で特定される。
【００６４】
本発明は、アルツハイマー病の遺伝子型または表現型を呈する細胞または動物におけるｓＲＮＡ予測因子の検出に関与する。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子は、他の点では非アルツハイマー病の患者または対象と見なされる患者または対象におけるＡＤ生物学的プロセスを示す。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子は、ＡＤの特定のＢｒａａｋステージを示す。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子は、アルツハイマー病プロセスのＢｒａａｋステージＩ及び／またはＩＩを示す。ＢｒａａｋステージＩ／ＩＩは、ＡＤ進行の経過で嗜銀神経原線維変化及びニューロピルスレッドを発達させる脳の移行嗅内（側頭葉）分野を指す。ＢｒａａｋステージＩ／ＩＩは、ＡＤプロセスにおけるこの点では臨床的に無症状であることが知られている。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子は、アルツハイマー病プロセスのＢｒａａｋステージＩＩＩ及び／またはＩＶを示す。ＢｒａａｋステージＩＩＩ／ＩＶは、ＡＤの進行の経過で嗜銀神経原線維変化及びニューロピルスレッドを発達させる脳の辺縁系分野を指す。ＢｒａａｋステージＩＩＩ／ＩＶは、ＡＤプロセスにおけるこの点では初期アルツハイマー病であることが知られている。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ予測因子は、アルツハイマー病プロセスのＢｒａａｋステージＶ及び／またはＶＩを示す。ＢｒａａｋステージＶ／ＶＩは、ＡＤの進行の経過で嗜銀神経原線維変化及びニューロピルスレッドを発達させる脳の新皮質分野を指す。ＢｒａａｋステージＶ／ＶＩは、ＡＤプロセスにおけるこの点では完全に発生したアルツハイマー病であることが知られている。
【００６８】
いくつかの実施形態では、方法は、繰り返して、経時的にｓＲＮＡ予測因子プロファイルを決定する。例えば、治療レジメンまたは候補治療レジメンの影響を決定するために、繰り返される。例えば、対象または患者は、少なくとも年に１回、または少なくとも６か月に１回、または少なくとも月に１回、または少なくとも週に１回の頻度で評価され得る。いくつかの実施形態では、経時的に存在する予測因子の数の低下、または経時的に検出された予測因子の数のより遅い増加は、より遅い疾患進行またはより軽度の疾患症状を示す。本発明の実施形態は、ＡＤ治療のための動物モデルを構築するために有用であり、同様に、ヒト臨床試験におけるバイオマーカーとしても有用である。
【００６９】
いくつかの態様では、本発明は、アルツハイマー病活性について試料を評価するためのキットを提供する。様々な実施形態では、キットは、表２Ａ、４Ａ、及びまたは７Ａ（配列番号１〜４０３）に列挙された複数のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、表２Ａ、４Ａ、及びまたは表７Ａ（配列番号１〜４０３）に列挙された少なくとも２、少なくとも５、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも４０のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、表２Ａ（配列番号１〜４６）に列挙された少なくとも２、３、４、５つ、または少なくとも１０、または少なくとも２０のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、表４Ａ（配列番号４７〜２５４）に列挙された少なくとも２、３、４、５つ、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも４０のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、表７Ａ（配列番号２５５〜４０３）に列挙された少なくとも２、３、４、５つ、または少なくとも１０、または少なくとも２０のｓＲＮＡを検出するために構成されたｓＲＮＡ特異的プローブ及び／またはプライマーを含む。
【００７０】
キットは、定量的または定性的ＰＣＲアッセイ、つまり特異的ｓＲＮＡ予測因子に好適なプローブ及び／またはプライマーを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、蛍光色素または蛍光標識プローブを含み、このプローブは、任意選択で、クエンチャ部分を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ステムループＲＴプライマーを含み、いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡ末端の各々を調べるためのステムループプライマーを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ｓＲＮＡ特異的ハイブリダイゼーションプローブのアレイを含み得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明は、５〜約１００のｓＲＮＡ予測因子、または約５〜約５０のｓＲＮＡ予測因子、または５〜約２０のｓＲＮＡ予測因子のパネルを検出するための試薬を含むキットを提供する。これらの実施形態では、キットは、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２０のｓＲＮＡ予測因子アッセイ（例えば、かかるアッセイのための試薬）を含み得る。様々な実施形態では、キットは、少なくとも１０の陽性予測因子及び少なくとも５つの陰性予測因子を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも５つ、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも４０のｓＲＮＡ予測因子アッセイのパネルを含み、ｓＲＮＡ予測因子は、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａから選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｓＲＮＡ予測因子は、表４Ｂまたは表７Ｂから選択される。かかるアッセイは、注釈付き配列ならびに他の（非予測）変種よりもｓＲＮＡ予測因子に対して特異的な、逆転写（ＲＴ）プライマー、増幅プライマー及びプローブ（蛍光プローブまたは二重標識プローブなどの）を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーションによるｓＲＮＡ予測因子の検出のためのプローブを含有するアレイまたは他の基質の形態にある。
【００７２】
さらに他の実施形態では、本発明は、特定のｓＲＮＡ分子の存在または不在に基づいて試料を分類する疾患分類器を構築することを伴う。これらの疾患分類器は、同様の症状を示す疾患状態を鑑別すること、同様に、疾患の経過を予測すること、治療への応答を予測すること、及び疾患モニタリングを含む、疾患サブタイプを決定することのための強力なツールである。一般に、ｓＲＮＡパネル（例えば、別個のｓＲＮＡバリアントのパネル）は、目的の１つ以上の疾患状態を表す１つ以上のトレーニングセットにおける配列データから決定されるであろう。ｓＲＮＡパネル及び分類器アルゴリズムは、例えば、パラメトリック／ノンパラメトリック距離測定法、ロジスティック回帰、サポートベクトルマシン、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、プロビット回帰、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、二次分類器、カーネル推定、ｋ近傍法、学習ベクトル量子化、及び主成分分析などの、教師あり、教師なし、半教師ありの機械学習モデルのうちの１つ以上を使用して構築され得る。分類器がトレーニングされると、独立した対象は、対象からの生体試料中でパネルにおけるｓＲＮＡマーカーの存在または不在を検出すること、及び分類アルゴリズムを適用することによって、疾患状態について評価され得る。分類器は、バイナリ分類器（すなわち、２つの状態の間で分類する）であり得るか、または３、４、５、もしくはそれ以上の疾患状態の間で分類できる。いくつかの実施形態では、分類器は、少なくとも１０の疾患状態の間で分類できる。
【００７３】
例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上の疾患状態について対象を評価するための方法を提供する。方法は、対象の生体試料を提供すること、及びｓＲＮＡパネルにおける複数のｓＲＮＡの存在または不在を決定することを含む。この「存在及び不在」ｓＲＮＡ（バイナリマーカー）のプロファイルは、疾患分類器を使用して、２つ以上の疾患状態の間で対象の状態を分類するために使用される。疾患分類器は、トレーニング試料のセット中のｓＲＮＡパネルにおけるｓＲＮＡの存在及び不在に基づいてトレーニングされているであろう。例えば、トレーニング試料は、パネルにおけるｓＲＮＡの存在または不在（またはレベル）と同様に、１つ以上の疾患状態に対して陽性または陰性として注釈付けされる。いくつかの実施形態では、試料は、疾患グレードまたはステージ、疾患サブタイプ、治療レジメン、及び薬物の感受性または抵抗性のうちの１つ以上について注釈付けされる。
【００７４】
パネルにおけるｓＲＮＡの存在または不在は、ｓＲＮＡ配列データからのトレーニングセットにおいて決定される。つまり、個々のｓＲＮＡ配列は、５’及び／または３’配列決定アダプタをトリミングすることによって、ｓＲＮＡ配列バリアントを参照配列または遺伝子座に統合することなく、ｓＲＮＡ配列データにおいて特定される。例えば、トリミング後、各試料内の特有配列読み取り値と、疾患状態または対照薬状態は、各々コンパイルされる。したがって、アイソフォームなどの特異的ｓＲＮＡ配列の存在または不在は、各試料中で、かつ各疾患状態について決定され、これらのバリアントは、参照配列に統合されない。これらの配列は、「バイナリ」マーカーとして使用され得、つまり、正常レベルと異常レベルとを鑑別することとは反対に、試料中のそれらの存在または不在に基づいて評価され得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、分類器の構築中に、ｓＲＮＡは、トレーニングのために事前選択される。例えば、変動が、疾患状態において増加する、及び／または疾患状態の重症度とともに増加する、及び／または変動が治療レジメンに応答して正常化するか、または改善され得るｓＲＮＡファミリーが、特定され得る。例えば、ｓＲＮＡ事前選択は、下限及び上限閾値の外側にある生物学的に関連する配列高次特徴（例えば、ｓＲＮＡアイソフォームの５’末端からの「シード配列」ヌクレオチド２〜８、及び／または一塩基多型）に基づいて、ｓＲＮＡアイソフォーム（ｉｓｏｍｉＲなどの）を「ファミリー」に群化させることを伴うことができ、下限閾値は、１００万読み取り値あたり０〜１００のトリミングされた読み取り値であり、上限閾値は、１００万読み取り値あたり０〜１００のトリミングされた読み取り値である。これらのファミリーは、疾患活性と相関する変種について評価され、これらのファミリー全体、または閾値超か、または閾値未満の読み取り計数を有する変種は、分類器に含めるための候補として選択される。いくつかの実施形態では、これらのファミリーは、疾患状態のうちの少なくとも１つに特有である少なくとも１つのｓＲＮＡ予測因子を含む。
【００７６】
配列データにおいて特定され、計算分類器に含めるために選択されると、パネルにおけるｓＲＮＡに対する分子検出試薬が、調製され得る。かかる検出プラットフォームは、本明細書に記載されるように、ステムループプライマー及び蛍光プローブを用いるものを含む、定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを含む。いくつかの実施形態では、独立した試料は、分子検出プラットフォームに移行するよりもむしろ、ｓＲＮＡ配列決定によって評価される。
【００７７】
ｓＲＮＡパネル（例えば、分類のために使用されるバイナリｓＲＮＡマーカー）は、約４〜約２００のｓＲＮＡ、またはいくつかの実施形態では、約４〜約１００のｓＲＮＡを含有できる。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡパネルは、約１０〜約１００のｓＲＮＡ、または約１０〜約５０のｓＲＮＡを含有する。
【００７８】
分類器は、いくつかの実施形態では、固体組織試料、生体液試料、または培養細胞を含む、様々な型の試料に対してトレーニングされ得る。対象を評価する際に、ｓＲＮＡが評価される生体試料は、血液、血清、血漿、尿、唾液、または脳脊髄液などの体液を含み得る。代替的には、対象の生体試料は、固体組織生検である。
【００７９】
様々な実施形態では、トレーニングセットは、少なくとも５０の試料、または少なくとも１００の試料、または少なくとも２００の試料を有する。いくつかの実施形態では、トレーニングセットは、各疾患状態について少なくとも１０の試料、または各疾患状態について少なくとも２０もしくは少なくとも５０の試料を含む。試料の数がより多いことは、より良い統計学的力を提供できる。
【００８０】
本開示に従う疾患分類器は、様々な型の疾患状態に対して構築され得る。例えば、いくつかの実施形態では、疾患状態は、中枢神経系の疾患である。かかる疾患は、認知症の症状を伴う少なくとも２つの神経変性疾患を含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの疾患状態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、軽度認知障害、進行性核上性麻痺、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、及び血管性認知症から選択される。代替的には、少なくとも２つの疾患状態は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、及び脊髄性筋萎縮症などの運動制御の喪失の症状を伴う神経変性疾患である。さらに他の実施形態では、少なくとも２つの疾患状態は、脱髄疾患であり、任意選択で、多発性硬化症、視神経炎、横断性脊髄炎、及び視神経脊髄炎を含む。
【００８１】
したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの疾患状態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及び脊髄性筋萎縮症から選択され、トレーニング試料は、疾患ステージ、疾患重症度、薬物応答性、または疾患進行の過程について注釈付けされる。
【００８２】
さらに他の実施形態では、疾患状態は、異なる組織または細胞起源のがんである。いくつかの実施形態では、疾患状態は、薬物感受性対薬物抵抗性のがんであるか、または２つ以上の治療剤にわたる感受性である。かかる実施形態では、対象からの生体試料は、腫瘍またはがん細胞の生検であり得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、疾患は、炎症性または免疫の疾患であり、任意選択で、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、自己免疫性血管炎、糖尿病（１型または２型）、グレーブス病、Ａｄｄｉｓｏｎ病、Ｓｊｏｇｒｅｎ症候群、甲状腺炎、関節リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、線維筋痛症、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、憩室症、及びセリアック病のうちの１つ以上を含む。例えば、分類器は、限定されないが、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び憩室症などの胃腸の炎症状態を区別できる。かかる実施形態では、試験される対象からの生体試料は、血液、血清、もしくは血漿などの生体液試料であり得るか、または結腸上皮組織などの生検組織であり得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、疾患状態は、心血管疾患であり、任意選択で、急性事象のリスクに対する層別化を含む。いくつかの実施形態では、心血管疾患は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、心筋梗塞、脳卒中、うっ血性心不全、高血圧性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、及び静脈血栓症のうちの１つ以上を含む。
【００８５】
様々な実施形態では、パネルにおける少なくとも１つ、または少なくとも２つ、または少なくとも５つ、または少なくとも１０のｓＲＮＡは、陽性ｓＲＮＡ予測因子である。つまり、陽性ｓＲＮＡ予測因子は、トレーニングセットにおける疾患状態に対して陽性として注釈付けされた複数の試料に存在し、トレーニングセットにおいて疾患状態に対して陰性として注釈付けされたすべての試料に不在であると特定された。いくつかの実施形態では、疾患状態としてのアルツハイマー病を含む疾患分類器に関して、ｓＲＮＡパネルは、表２Ａ、表４Ａ、及び／または表７Ａ（配列番号１〜４０３）からの１つ以上、または２つ以上、または５つ以上、または１０以上のｓＲＮＡを含み得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡパネルは、表２Ａ（配列番号１〜４６）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡパネルは、表４Ａ（配列番号４７〜２５４）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡパネルは、表４Ａ（配列番号２５５〜４０３）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含む。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡパネルは、表５（配列番号５８、１８９、７８、１７２、１９３、９７、１２２、２１５、２４８、１６４、１２０、９３、１２６、２５３、１１２、１４４、２１３、２４４、１２３、２２２、１５０、２４０、５２、２２０、２２１、１６９、１６５、及び２１２）からの１つ以上のｓＲＮＡ予測因子を含み、ＣＳＦにおけるＡＤ進行のＢｒａａｋステージと相関する。いくつかの実施形態では、ｓＲＮＡパネルは、表８（配列番号２５７、２７０、２７２、２７３、２７９、２８６、２８８、３１４、３１９、３２５、３３２、３４１、３７４、３９１、及び３９３）からの１つ以上のｓＲＮＡを含み、血清におけるＡＤ進行のＢｒａａｋステージと相関する。
【００８７】
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の実施例によって明白となるであろう。
【実施例】
【００８８】
実施例１：アルツハイマー病に対するバイナリ分類器を、脳組織、脳脊髄液、または血清の実験群または対照薬群のいずれかにおいて特定した。
アルツハイマー病に対するバイナリ低分子ＲＮＡ予測因子を特定するために、低分子ＲＮＡ配列データを、ＧＥＯ及びｄｂＧａＰデータベースからダウンロードし、ディスカバリーセットとして使用した（表１Ａ〜１Ｂ：脳試料、表３Ａ〜３Ｂ  ＣＳＦ試料、及び表６Ａ〜６Ｂ  ＳＥＲ試料）。すべての試料は、材料に関係なく、死後検証されたアルツハイマー病または非アルツハイマー病の試料（健常対照、またはパーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、ハンチントン病などの他の非アルツハイマー病関連の神経疾患）に由来した。
【００８９】
全体的なプロセスは、以下に記載される。
【表Ａ】
2021531043.tif 000003
ＣＳＦ＝脳脊髄液、ＳＥＲ＝血清。
【００９０】
ファイルを、Ｃｅｎｔｏｓ用のＳＲＡツールキットｖ２．８．０を使用して．ｓｒａから．ｆａｓｔｑ形式に変換し、．ｆａｓｔｑ形式のファイルを、２０１８年１月２３日に出願された（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）Ｕ．Ｓ．２０１８／０２５８４８６及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１４８５６号に記載されるように処理した。具体的には、すべての．ｆａｓｔｑデータファイルを、（Ｒｅｇｅｘ）正規表現ベースの検索及びトリムアルゴリズムを使用してアダプタ配列をトリミングすることによって処理し、５’  ＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＡＡ  ３’（配列番号４０４）（最大１５ヌクレオチドの３’末端トランケーションを含有する）を、３’アダプタ配列を特定するために入力し、Ｒｅｇｅｘ検索のための２のレーベンシュタイン距離または５．のハミング距離のパラメータは、ユーザ指定の検索語の１番目のヌクレオチドが、ヌクレオチド挿入、欠失、及び／または交換に関して未改変であるように要求する。
【００９１】
試料は、実験群または対照薬群のいずれか２つの群のうちの１つにコンパイルされる。ｓＲＮＡ−Ｓｐｌｉｔは、実験群または対照薬群のいずれかに特有である低分子ＲＮＡ、ならびに実験群及び対照薬群の両方に存在する低分子ＲＮＡを特定する。実験群または対照薬群のいずれかに特有である低分子ＲＮＡは、１００％の特異性を有する（定義上）。特有の（バイナリ）低分子ＲＮＡは、それらが特定された群に対する分類器として役立つ。バイナリ低分子ＲＮＡ分類器は、非ブートストラップ及び／またはブートストラップ計算分類アルゴリズム（例えば、パラメトリック／ノンパラメトリック距離測定法、ロジスティック回帰、サポートベクトルマシン、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、プロビット回帰、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、二次分類器、カーネル推定、ｋ近傍法、学習ベクトル量子化、及び主成分分析などの、教師あり、教師なし、半教師ありの機械学習モデルなど）において使用され得、それらは、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）に対する標的としても使用され得る。
【００９２】
バイナリの低分子ＲＮＡ分類器を、トリミングされた低分子ＲＮＡ読み取り値をｓＲＮＡ−Ｓｐｌｉｔで分析することによって特定した。トリミングされた読み取り値を、１００万読み取り値あたりのトリミングされた読み取り値に変換した。バイオマーカーを、各試料が、カバレッジを提供する最低１つのマーカーを有することを必要とするように、フィルタリングした。Ｂｒａａｋステージと相関するバイオマーカーを特定するために、低分子ＲＮＡは、最低３つの連続するＢｒａａｋステージに存在し、０．７５以上のピアソン相関係数を有しなければならなかった。
【００９３】
バイナリ低分子ＲＮＡ予測因子を含有する特異的バイオマーカーパネル（実験群の試料には存在するが、対照薬群のいずれの試料にも存在しない）を、以下のように特定した。
（１）ＡＤ対非ＡＤ
（Ａ）脳組織（表２）
（Ｂ）ＣＳＦ（表４）
（Ｃ）血清（表７）
（２）アルツハイマー病モニタリング
（Ａ）ＣＳＦ（表５）
（Ｂ）血清（表８）
【００９４】
確率スコア（ｐ値）を、カイ二乗２×２分割表及び片側Ｆｉｓｈｅｒの直接確率検定を使用して、各々個々のバイナリ低分子ＲＮＡ予測因子について計算した。
【００９５】
確率スコア（ｐ値）を、カイ二乗２×２分割表及び片側Ｆｉｓｈｅｒの直接確率検定（すべて１００％の特異性及び１００％の感度を与える）を使用して、各実験群に対するバイナリ低分子ＲＮＡ予測因子のパネルについて計算した。
【００９６】
実施例２：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のマルチクラス疾患分類器の構築。
特定のｓＲＮＡ分子の存在または不在に基づいてＩＢＤ試料を分類する疾患分類器を構築するために、ｓＲＮＡパネルを、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び憩室症などの、目的の異なる疾患状態を表す様々なトレーニングセットにおける配列データから決定した。
【００９７】
試料
すべての試料は、それらのそれぞれの施設内審査委員会（ＩＲＢ）の承認に従って収集され、無制限の使用について患者の同意を有する。データを、電子診療記録及びカルテ審査から収集した。臨床データは、年齢、性別、人種、民族、体重、ボディマス指数、喫煙歴、アルコール使用歴、疾患の家族歴などの情報を含む。疾患関連データは、診断、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）診断時の年齢、現在及び以前の薬物療法、併存症、大腸全摘及び回腸嚢肛門管吻合術（ＩＰＡＡ）時の年齢、同様に、パウチ年齢、イレオストミーの閉鎖からの、またはパウチ手術からの時間（これらの処置を受けている患者から該当する場合）などの情報を含む。
【００９８】
生検を、結腸上皮から採取した。手術不能の潰瘍性大腸炎（ＩＵＣ）、手術可能な潰瘍性大腸炎（ＯＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、憩室症（ＤＤ）、ポリープ／ポリポーシス（ＰＰ）、鋸歯状ポリープ／ポリポーシス（ＳＰＰ）、結腸癌（ＣＣ）、直腸癌（ＲＣ）を、臨床的、内視鏡的、組織学的、及び画像研究に従って定義した。さらなる組み入れ基準は、ＣＤ患者についての回腸炎の存在と、内視鏡検査によって見られ、ＩＵＣ患者についての組織学によって確認された正常な回腸末端を有することであった。定期的なスクリーニングのために結腸内視鏡検査を必要とし、内視鏡検査及び／または組織学によって非罹患腸組織を有するとして検証された個人を、正常対照として標識した。
【００９９】
すべての生検を、最低２名の施設内のＩＢＤ訓練された病理医によって評価し、コンセンサススコア及び診断を、臨床及び業界標準の診断プロトコルに従って提供した。簡単に説明すると、活性炎症特性を、好中球浸潤（０〜３）及び潰瘍形成の面積（０〜３）に従ってスコアリングし、各試料を、非活性、陰窩炎、陰窩膿瘍、多数の陰窩膿瘍（３超／高倍率視野）、及び潰瘍形成に分類した。元のＧｅｂｏｅｓスコア（ＯＧＳ）または簡略化Ｇｅｂｏｅｓスコア（ＳＧＳ）を、ＵＣを分類するために使用した。クローン病活性指数（ＣＤＡＩ）及びクローン病内視鏡的重症度指数（ＣＤＥＩＳ）を、ＣＤを分類するために使用した。ヒンチェイ分類を、ＤＤを特徴付けるために使用した。大腸癌、ポリープ及び鋸歯状ポリープを、Ｍｕｌｔｉ−Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ（ＣＲＣ）の最新の勧告に従って分類した。
【０１００】
使用したＩＢＤ試料の概要を、以下に示す。
【表Ｂ】
2021531043.tif 000004
【０１０１】
ＩＢＤに関連する疾患クラスに対する低分子ＲＮＡ予測因子を特定するために、低分子ＲＮＡ配列決定データを、ＧＥＯデータベースからダウンロードし、ディスカバリーセットとして使用した。低分子ＲＮＡ配列決定データを、クローン病（ＧＳＥ６６２０８）、潰瘍性大腸炎（ＧＳＥ１１４５９１）、憩室症（ＧＳＥ８９６６７）、及び正常／対照（ＧＳＥ１１８５０４）についてのジオデータベース研究からダウンロードした。
【０１０２】
ファイルを、Ｃｅｎｔｏｓ用のＳＲＡツールキットｖ２．８．０を使用して．ｓｒａから．ｆａｓｔｑ形式に変換し、．ｆａｓｔｑ形式のファイルを、２０１８年１月２３日に出願された（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）Ｕ．Ｓ．２０１８／０２５８４８６及び国際出願第ＰＣＴ／Ｕ．Ｓ．２０１８／０１４８５６号に記載されるように処理した。具体的には、すべての．ｆａｓｔｑデータファイルを、（Ｒｅｇｅｘ）正規表現ベースの検索及びトリムアルゴリズムを使用してアダプタ配列をトリミングすることによって処理し、５’  ＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＡＧＧＡＡ  ３’（配列番号４０４）（最大１５ヌクレオチドの３’末端トランケーションを含有する）を、３’アダプタ配列を特定するために入力し、Ｒｅｇｅｘ検索のための２のレーベンシュタイン距離または５．のハミング距離のパラメータは、ユーザ指定の検索語の１番目のヌクレオチドが、ヌクレオチド挿入、欠失、及び／または交換に関して未改変であるように要求する。
【０１０３】
試料は、実験群または対照薬群のいずれか２つの群のうちの１つにコンパイルされる。ｓＲＮＡ−Ｓｐｌｉｔは、実験群または対照薬群のいずれかに特有である低分子ＲＮＡ、ならびに実験群及び対照薬群の両方に存在する低分子ＲＮＡを特定する。実験群または対照薬群のいずれかに特有である低分子ＲＮＡは、１００％の特異性を有する（定義上）。特有の（バイナリ）低分子ＲＮＡは、それらが特定された群に対する分類器として役立つ。バイナリ低分子ＲＮＡ分類器は、非ブートストラップ及び／またはブートストラップ計算分類アルゴリズム（例えば、パラメトリック／ノンパラメトリック距離測定法、ロジスティック回帰、サポートベクトルマシン、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、プロビット回帰、Ｆｉｓｈｅｒの線形判別、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、二次分類器、カーネル推定、ｋ近傍法、学習ベクトル量子化、及び主成分分析などの、教師あり、教師なし、半教師ありの機械学習モデルなど）において使用され得、それらは、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）に対する標的としても使用され得る。
【０１０４】
バイナリの低分子ＲＮＡ分類器を、トリミングされた低分子ＲＮＡ読み取り値をｓＲＮＡ−Ｓｐｌｉｔで分析することによって特定した。トリミングされた読み取り値を、１００万読み取り値あたりのトリミングされた読み取り値に変換した。バイオマーカーを、各試料が、カバレッジを提供する最低１つのマーカーを有することを必要とするように、フィルタリングした。
【０１０５】
クラスあたりの評価指標
クラスあたりの評価指標を、疾患クラスを特定するために最も重要であるマーカーを特定するために、各クラスに対して決定した。ｓＲＮＡパネルを、目的の異なる疾患状態を表す様々なトレーニングセットにおける配列データから決定した。疾患クラスの低分子ＲＮＡ予測因子を含有する特異的バイオマーカーパネルを、以下のように特定した：
・対照（健常個人／「正常な」個人）：表９、
・クローン病：表１０、
・潰瘍性大腸炎：表１１、及び
・憩室症：表１２。
【０１０６】
教師あり、ノンパラメトリック、ロジスティック回帰機械学習モデルを使用することによって、最終的な選択マーカー計数を、１２８から１００に低減した。分類モデルの性能を評価するために、ＲＯＣ／ＡＵＣ曲線を、クラスあたりに特定されたマーカーの各セットについて取得したが、ここでＲＯＣは確率曲線であり、ＡＵＣは分離可能性の程度または尺度を表す。ＲＯＣ曲線は、偽陽性率に対して真陽性率でプロットされる。ＲＯＣ／ＡＵＣ曲線を、上記のように、様々なＩＢＤクラス及び対照について確立し、これらは図１に示される。
【０１０７】
マルチクラス疾患分類
疾患分類器を、ｓＲＮＡパネルの陽性または陰性マーカー、同様に、対照、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び憩室症について上で特定されたパネルにおけるｓＲＮＡの存在または不在に基づいてトレーニングした。クラスメトリックがすべて組み合わされた際の計算モデルの精度を評価するために、試験を、各クラスの参照試料に対するモデルの特定予測力を評価するために実行した。モデルは９８％の正解率を有することが見いだされた。図２は、真の参照同一性に対する疾患クラスの正確な予測の割合を示すヒートマップを示す。これらの結果は、以下のマトリックスにも示される。
【表Ｃ】
2021531043.tif 000005
【０１０８】
参照文献
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【０１０９】
【表１Ａ】
2021531043.tif 000006
【０１１０】
【表１Ｂ−１】
2021531043.tif 000007
【０１１１】
【表１Ｂ−２】
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【０１１２】
【表１Ｂ−３】
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【０１１３】
【表２Ａ】
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【０１１４】
【表２Ｂ−１】
2021531043.tif 000011
【０１１５】
【表２Ｂ−２】
2021531043.tif 000012
【０１１６】
【表２Ｂ−３】
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【０１１７】
【表３Ａ−１】
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【０１１８】
【表３Ａ−２】
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【０１１９】
【表３Ａ−３】
2021531043.tif 000016
【０１２０】
【表３Ｂ−１】
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【０１２１】
【表３Ｂ−２】
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【０１２２】
【表３Ｂ−３】
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【０１２３】
【表３Ｂ−４】
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【０１２４】
【表３Ｂ−５】
2021531043.tif 000021
【０１２５】
【表４Ａ−１】
2021531043.tif 000022
【０１２６】
【表４Ａ−２】
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【０１２７】
【表４Ａ−３】
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【０１２８】
【表４Ａ−４】
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【０１２９】
【表４Ａ−５】
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【０１３０】
【表４Ｂ−１】
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【０１３１】
【表４Ｂ−２】
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【０１３２】
【表４Ｂ−３】
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【０１３３】
【表４Ｂ−４】
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【０１３４】
【表４Ｂ−５】
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【０１３５】
【表４Ｂ−６】
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【０１３６】
【表４Ｂ−７】
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【０１３７】
【表４Ｂ−８】
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【０１３８】
【表４Ｂ−９】
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【０１３９】
【表４Ｂ−１０】
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【０１４０】
【表４Ｂ−１１】
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【０１４１】
【表４Ｂ−１２】
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【０１４２】
【表４Ｂ−１３】
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【０１４３】
【表４Ｂ−１４】
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【０１４４】
【表４Ｂ−１５】
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【０１４５】
【表４Ｂ−１６】
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【０１４６】
【表４Ｂ−１７】
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【０１４７】
【表４Ｂ−１８】
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【０１４８】
【表４Ｂ−１９】
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【０１４９】
【表４Ｂ−２０】
2021531043.tif 000046
【０１５０】
【表４Ｂ−２１】
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【０１５１】
【表４Ｂ−２２】
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【０１５２】
【表４Ｂ−２３】
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【０１５３】
【表４Ｂ−２４】
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【０１５４】
【表４Ｂ−２５】
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【０１５５】
【表４Ｂ−２６】
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【０１５６】
【表４Ｂ−２７】
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【０１５７】
【表４Ｂ−２８】
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【０１５８】
【表４Ｂ−２９】
2021531043.tif 000055
【０１５９】
【表４Ｂ−３０】
2021531043.tif 000056
【０１６０】
【表４Ｂ−３１】
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【０１６１】
【表４Ｂ−３２】
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【０１６２】
【表４Ｂ−３３】
2021531043.tif 000059
【０１６３】
【表４Ｂ−３４】
2021531043.tif 000060
【０１６４】
【表４Ｂ−３５】
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【０１６５】
【表４Ｂ−３６】
2021531043.tif 000062
【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
【表６Ａ−１】
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【０１６８】
【表６Ａ−２】
2021531043.tif 000065
【０１６９】
【表６Ｂ−１】
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【０１７０】
【表６Ｂ−２】
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【０１７１】
【表６Ｂ−３】
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【０１７２】
【表６Ｂ−４】
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【０１７３】
【表６Ｂ−５】
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【０１７４】
【表７Ａ−１】
2021531043.tif 000071
【０１７５】
【表７Ａ−２】
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【０１７６】
【表７Ａ−３】
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【０１７７】
【表７Ｂ−１】
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【０１７８】
【表７Ｂ−２】
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【表７Ｂ−３】
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【０１７９】
【表７Ｂ−４】
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【０１８０】
【表７Ｂ−５】
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【０１８１】
【表７Ｂ−６】
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【０１８２】
【表７Ｂ−７】
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【０１８３】
【表７Ｂ−８】
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【０１８４】
【表７Ｂ−９】
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【０１８５】
【表７Ｂ−１０】
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【０１８６】
【表７Ｂ−１１】
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【０１８７】
【表７Ｂ−１２】
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【０１８８】
【表７Ｂ−１３】
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【０１８９】
【表７Ｂ−１４】
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【０１９０】
【表７Ｂ−１５】
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【０１９１】
【表７Ｂ−１６】
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【０１９２】
【表７Ｂ−１７】
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【０１９３】
【表７Ｂ−１８】
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【０１９４】
【表７Ｂ−１９】
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【０１９５】
【表７Ｂ−２０】
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【０１９６】
【表７Ｂ−２１】
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【０１９７】
【表７Ｂ−２２】
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【０１９８】
【表７Ｂ−２３】
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【０１９９】
【表８】
2021531043.tif 000097
【０２００】
【表９−１】
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【０２０１】
【表９−２】
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【０２０２】
【表１０−１】
2021531043.tif 000100
【０２０３】
【表１０−２】
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【０２０４】
【表１１−１】
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【０２０５】
【表１１−２】
2021531043.tif 000103
【０２０６】
【表１１−３】
2021531043.tif 000104
【０２０７】
【表１１−４】
2021531043.tif 000105
【０２０８】
【表１２】
2021531043.tif 000106
【図１】
2021531043.tif 000107
【図２】
2021531043.tif 000108
【配列表】
2021531043000001.app
【国際調査報告】
2021531043.tif 000109
2021531043.tif 000110
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