(57)【要約】  本発明は、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６の発現を調節するための組成物であって、１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物、スプライシング因子の発現を減弱させるための組成物であって、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６の発現調節因子を含む組成物、細胞老化および／もしくは細胞周期への再進入を減弱させるための組成物であって、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６の発現調節因子もしくはスプライシング因子の発現に関連するそれらの下流の標的を含む組成物、またはスプライシング因子の発現を調節することが可能な組成物であって、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６遺伝子もしくはスプライシング因子の発現に関連するそれらの下流の標的に結合し、もしくはこれらを阻害することができる１種以上の化合物を含む組成物に関する。このような組成物は、加齢に関連する疾患もしくは状態もしくは癌の予防、管理、改善もしくは治療において、または研究ツール／試薬としても治療上の利益を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
加齢に関連する疾患もしくは状態もしくは癌の予防、管理、改善または治療における使用のための、ＥＴＶ６の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物。
【請求項２】
前記加齢に関連する疾患もしくは状態または癌が、スプライシング因子の発現の調節異常、および／または細胞老化の調節異常を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
加齢に関連する疾患もしくは状態もしくは癌の予防、管理、改善または治療における使用のための、ＦＯＸＯ１の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物であって、前記加齢に関連する疾患もしくは状態または癌は、スプライシング因子の発現の調節異常、および／または細胞老化の調節異常を含む組成物。
【請求項４】
前記加齢に関連する疾患または状態が、アルツハイマー病、心血管疾患、高血圧、骨粗鬆症、２型糖尿病、癌、パーキンソン病、認知機能障害、虚弱またはプロゲロイド症候群から選択される請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が２種以上の前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子が、ｍｉＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡ模倣物またはアンタゴミルを含む請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子が、２種以上の異なる相補的なアンチセンスｍｉＲＮＡ配列に結合することができる２種以上のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣物またはアンタゴミルを含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子が、以下の、ＭＩＲ１４２；ＭＩＲ３１２４；ＭＩＲ３１８８；ＭＩＲ３１９６；ＭＩＲ３２０Ｅ；ＭＩＲ３３０；ＭＩＲ３６７５；ＭＩＲ４３１６；ＭＩＲ４４８８；ＭＩＲ４４９６；ＭＩＲ４５１３；ＭＩＲ４６７４；ＭＩＲ４７０７；ＭＩＲ４７７２；ＭＩＲ６０８８；ＭＩＲ６１２９；ＭＩＲ６７８０Ａ；ＭＩＲ６７９７；ＭＩＲ６８０３；ＭＩＲ６８１０；ＭＩＲ６８４２；またはＭＩＲ７１５５のうちの１つ以上から選択される請求項５から請求項７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子が、以下の、ＭＩＲ３１２４；ＭＩＲ３６７５；ＭＩＲ４４９６；ＭＩＲ６７８０Ａ；ＭＩＲ６８１０；ＭＩＲ６８４２；またはＭＩＲ７１５５のうちの１つ以上から選択される請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
細胞培養物においてスプライシング因子の発現を増加させ、細胞老化を減少させ、かつ／または細胞周期への再進入を促進する方法であって、前記細胞培養物に、ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の発現を調節する中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物を投与する工程を備える方法。
【請求項１１】
前記組成物が、２種以上の前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子が、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣物またはアンタゴミルを含む請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の発現調節因子が、２種以上の異なる相補的なアンチセンスｍｉＲＮＡ配列に結合することができる２種以上のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣物またはアンタゴミルを含む請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
加齢の影響の美容的治療のための、ＥＴＶ６の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物の使用。
【請求項１５】
前記加齢の影響が、スプライシング因子の発現の調節異常、および／または細胞老化の調節異常を含む請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
加齢の影響の美容的治療のための、ＦＯＸＯ１の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物の使用であって、前記加齢の影響は、スプライシング因子の発現の調節異常、および／または細胞老化の調節異常を含む使用。
【請求項１７】
前記組成物が２種以上の前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む請求項１４から請求項１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子が、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣物またはアンタゴミルを含む請求項１４から請求項１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＦＯＸＯ１またはＥＴＶ６の発現調節因子が、２種以上の異なる相補的なアンチセンスｍｉＲＮＡ配列に結合することができる２種以上のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣物またはアンタゴミルを含む請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子が、以下の、ＭＩＲ１４２；ＭＩＲ３１２４；ＭＩＲ３１８８；ＭＩＲ３１９６；ＭＩＲ３２０Ｅ；ＭＩＲ３３０；ＭＩＲ３６７５；ＭＩＲ４３１６；ＭＩＲ４４８８；ＭＩＲ４４９６；ＭＩＲ４５１３；ＭＩＲ４６７４；ＭＩＲ４７０７；ＭＩＲ４７７２；ＭＩＲ６０８８；ＭＩＲ６１２９；ＭＩＲ６７８０Ａ；ＭＩＲ６７９７；ＭＩＲ６８０３；ＭＩＲ６８１０；ＭＩＲ６８４２；またはＭＩＲ７１５５のうちの１つ以上から選択される請求項１４から請求項１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子が、以下の、ＭＩＲ３１２４；ＭＩＲ３６７５；ＭＩＲ４４９６；ＭＩＲ６７８０Ａ；ＭＩＲ６８１０；ＭＩＲ６８４２；またはＭＩＲ７１５５のうちの１つ以上から選択される請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
スプライシング因子の発現を回復および／もしくは増加させるため、または細胞老化および／もしくは細胞周期への再進入を減少もしくは逆転させるための研究ツールとしての、ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物の使用。
【請求項２３】
細胞培養物のための、ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物の使用。
【請求項２４】
前記組成物が、細胞培養における生存可能な継代数を増加させ、および／または老化細胞集団を減少させるためのものである請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６またはスプライシング因子の制御に関わるそれらの標的の発現を調節する組成物に関する。このような組成物は、加齢に関連する疾患もしくは状態、または癌の予防、管理、改善または治療において、また研究ツール／試薬として治療上の可能性を有する。
【背景技術】
【０００２】
老化細胞は、細胞分裂の複数回のラウンドを経て増殖する能力を失い、複数の組織および複数の種において加齢プロセスの間に蓄積することが示されている、生存可能で代謝的に活性な存在である（Ｆａｒａｇｈｅｒら、２０１７）。老化細胞は、細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）と呼ばれる、炎症促進性サイトカインとリモデリング（組織修復）タンパク質のカクテルを放出し、これは、パラクリン（傍分泌）的な方法で近隣の細胞の老化の確立を誘発し、周囲の組織の炎症をさらに刺激するように作用する（Ｓａｌａｍａら、２０１４）。老化細胞負荷の増加が、生命体の老化（ｄｅ  Ｍａｇａｌｈａｅｓ、２００４）および加齢に関連する疾患（ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ、２０１４）に直接寄与することを示唆する証拠が多数存在し、トランスジェニックマウスにおける老化細胞の標的枯渇は、複数の老化表現型を改善し、寿命を延ばす（Ｂａｋｅｒら、２０１６；Ｂａａｒら、２０１７）。したがって、細胞老化の基本的な生物学、および重要なことに、細胞老化に寄与する因子を理解することは、非常に大きな重要性を有する。
【０００３】
細胞老化および老化表現型の潜在的な推進因子（ドライバー）として浮上している領域の１つは、オルタナティブスプライシングの調節異常である（ＤｅｓｃｈｅｎｅｓおよびＣｈａｂｏｔ、２０１７；ＬａｔｏｒｒｅおよびＨａｒｒｉｅｓ、２０１７）。遺伝子発現の微細な制御は、細胞機能、可塑性、および細胞の同一性の制御に不可欠である。スプライス部位の選択を支配する制御機構の発現の変化は、老化したヒト集団において見られ（Ｈａｒｒｉｅｓら、２０１１）、多系統の老化細胞において見られ（Ｈｏｌｌｙら、２０１３）、動物モデルにおいても寿命と関連している（Ｈｅｉｎｔｚら、２０１６；Ｌｅｅら、２０１６）。アルツハイマー病、パーキンソン病または癌などの加齢に関連する疾患もまた、スプライシングの大規模な調節異常によって特徴づけられ、ライフコース全体にわたる健康のための正しいスプライシングの重要性を強調している（ＬａｔｏｒｒｅおよびＨａｒｒｉｅｓ、２０１７）。スプライシング因子は、細胞老化に影響を与える標的遺伝子の良い候補である。なぜなら、いくつかのスプライシング因子は増殖の制御と密接に関連しており、いくつかはテロメア機能の維持に関与しているからである（Ｋａｎｇら、２００９；Ａｎｃｚｕｋｏｗら、２０１２）。それゆえ、老化していく組織におけるオルタナティブスプライシングの制御の喪失は、複数の生物種における加齢を特徴づける内在性および外在性の細胞ストレス因子への応答の悪化を支えている可能性があり（ＫｏｕｒｔｉｓおよびおよびＴａｖｅｒｎａｒａｋｉｓ、２０１１）、生理的虚弱性の増加に大きく寄与する可能性がある。
【０００４】
加齢に伴うスプライシングの調節異常の上流の推進因子はまだ解明されていない。スプライシング因子をコードする遺伝子は、それ自体がオルタナティブスプライシングによって制御されており、これは、当然のことながら、その発現に強く寄与していることを表す（ＬａｒｅａｕおよびＢｒｅｎｎｅｒ、２０１５）。タンパク質レベルでのスプライシング因子の活性の制御は、ＳＲＰＫプロテインキナーゼの作用によって、また、リン酸化と細胞内局在化のレベルでＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ／ＡＫＴシグナル伝達によって決定されることも知られている（Ｂｌａｕｓｔｅｉｎら、２００５；ＢｕｌｌｏｃｋおよびＯｌｔｅａｎ、２０１７）。以前の研究では、いくつかのスプライシング因子がＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の変化によって制御される可能性があることが示唆されている（Ｔａｒｎ、２００７）。老化中の細胞シグナル伝達の調節異常の概念は新しいものではない。老化におけるインスリン／インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１／ＩＮＳ）シグナル伝達の役割は周知であり、老化に関連した最初の分子経路である（ＣｏｈｅｎおよびＤｉｌｌｉｎ、２００８）。この経路内の多くの遺伝子変異が寿命を延ばすことが示されている（Ｓｕｈら、２００８）。遺伝子改変または食事制限によるＩＧＦ−１／ＩＮＳ経路の操作もまた、ヒトの寿命延長におけるこれらの経路の重要性を実証しており（ｖａｎ  Ｈｅｅｍｓｔら、２００５）、モデル系における長寿命との関連性も示されている（Ｓｌａｃｋら、２０１５）。ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ／ＡＫＴシグナル伝達は、ＩＧＦ−１／ＩＮＳシグナル伝達のすぐ下流で交差しており、ＤＮＡ損傷、調節異常の成長因子および炎症などの古典的な「老化」刺激によっても活性化される（Ｆｏｎｔａｎａら、２０１２；Ｌｉｎら、２０１３）。
【０００５】
いくつかの研究では、ＭＥＫまたはＰＩ３Ｋ阻害剤の使用は、細胞老化および老化の誘導を防ぐことができることが示唆されている（Ｄｅｍｉｄｅｎｋｏら、２００９；Ｃｈａｐｐｅｌｌら、２０１１）。ＮＦκＢ経路は細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）を制御する（Ｓａｌｍｉｎｅｎら、２０１２）が、このＮＦκＢ経路は、ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達と交差することも知られており（Ｌｉｎら、２０１２）、炎症性変化がＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の上流および下流の両方に存在し得ることを示唆している。しかしながら、これらの経路間の関係は単純ではない。これらの間にはクロストーク（相互干渉）があり、また、投与量、細胞型、文脈の影響もある（Ｒｈｉｍら、２０１６）。それゆえ、ＤＮＡ損傷、炎症または成長因子などの古典的な老化刺激によるＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達の活性化は、スプライシング因子の発現およびオルタナティブスプライシングの調節異常を誘導し、細胞老化に影響を及ぼす可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆａｒａｇｈｅｒ  ＲＧら、Ｆ１０００Ｒｅｓ．  ６、１２１９（２０１７）
【非特許文献２】Ｓａｌａｍａ  Ｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２８、９９−１１４（２０１４）
【非特許文献３】ｄｅ  Ｍａｇａｌｈａｅｓ  ＪＰ、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ３００、１−１０（２００４）
【非特許文献４】ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ  ＪＭ、Ｎａｔｕｒｅ．  ５０９、４３９−４４６（２０１４）
【非特許文献５】Ｂａｋｅｒ  ＤＪら、Ｎａｔｕｒｅ．  ５３０、１８４−１８９（２０１６）
【非特許文献６】Ｂａａｒ  Ｍら、Ｃｅｌｌ  １６９、１３３−１４７（２０１７）
【非特許文献７】Ｄｅｓｃｈｅｎｅｓ  ＭおよびＣｈａｂｏｔ  Ｂ、Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ（２０１７）
【非特許文献８】Ｌａｔｏｒｒｅ  ＥおよびＨａｒｒｉｅｓ  ＬＷ、Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．  ３６、１６５−１７０（２０１７）
【非特許文献９】Ｈａｒｒｉｅｓ  ＬＷら、Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．  １０、８６８−８７８（２０１１）
【非特許文献１０】Ｈｏｌｌｙ  ＡＣら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  １３４、３５６−３６６（２０１３）
【非特許文献１１】Ｈｅｉｎｔｚ  Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ．  ５４１、１０２−１０６（２０１６）
【非特許文献１２】Ｌｅｅ  ＢＰら、Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．  １５、９０３−９１３（２０１６）
【非特許文献１３】Ｋａｎｇ  Ｘら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２８、５６５−５７４（２００９）
【非特許文献１４】Ａｎｃｚｕｋｏｗ  Ｏら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９、２２０−２２８（２０１２）
【非特許文献１５】Ｋｏｕｒｔｉｓ  ＮおよびＴａｖｅｒｎａｒａｋｉｓ  Ｎ、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３０、２５２０−２５３１（２０１１）
【非特許文献１６】Ｌａｒｅａｕ  ＬＦおよびＢｒｅｎｎｅｒ  ＳＥ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ．  ３２、１０７２−１０７９（２０１５）
【非特許文献１７】Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ  Ｍら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １２、１０３７−１０４４（２００５）
【非特許文献１８】Ｂｕｌｌｏｃｋ  ＮおよびＯｌｔｅａｎ  Ｓ、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２４１、４３７−４４０（２０１７）
【非特許文献１９】Ｔａｒｎ  ＷＹ、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．  １４、５１７−５２２（２００７）
【非特許文献２０】Ｃｏｈｅｎ  ＥおよびＤｉｌｌｉｎ  Ａ、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．  ９、７５９−７６７（２００８）
【非特許文献２１】Ｓｕｈ  Ｙら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．  １０５、３４３８−３４４２（２００８）
【非特許文献２２】ｖａｎ  Ｈｅｅｍｓｔ  Ｄら、Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．  ４、７９−８５（２００５）
【非特許文献２３】Ｓｌａｃｋ  Ｃら、Ｃｅｌｌ．  １６２、７２−８３（２０１５）
【非特許文献２４】Ｆｏｎｔａｎａ  Ｌら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．  １１０、１１３９−１１５０（２０１２）
【非特許文献２５】Ｌｉｎ  Ｘら、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．  ２８、１５４７−１５５４（２０１３）
【非特許文献２６】Ｄｅｍｉｄｅｎｋｏ  ＺＮら、Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ．  ８、１８９６−１９００（２００９）
【非特許文献２７】Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ＷＨら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．  ２、１３５−１６４（２０１１）
【非特許文献２８】Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ａら、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．  ２４、８３５−８４５（２０１２）
【非特許文献２９】Ｌｉｎ  Ｇら、Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．  ２７、１５２７−１５３４（２０１２）
【非特許文献３０】Ｒｈｉｍ  ＪＨら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ６、２６５４７（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、以下のうちの１つ以上の機能を有する組成物を提供することである：ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６の遺伝子発現を減弱させること、スプライシング因子の発現を調節すること、または細胞老化および／もしくは細胞周期への再進入（復帰）を減少もしくは逆転させること。理想的には、そのような組成物は、加齢に関連する疾患もしくは状態、または癌を標的とする治療薬として使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、加齢に関連する疾患もしくは状態もしくは癌の予防、管理、改善または治療における使用のための、ＥＴＶ６の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物が提供される。
【０００９】
上記加齢に関連する疾患もしくは状態または癌は、スプライシング因子の発現の調節異常および／または細胞老化の調節異常を含み得る。
【００１０】
本発明のさらなる態様によれば、加齢に関連する疾患もしくは状態もしくは癌の予防、管理、改善または治療における使用のための、ＦＯＸＯ１の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物であって、この加齢に関連する疾患もしくは状態または癌は、スプライシング因子の発現の調節異常および／または細胞老化の調節異常を含む組成物が提供される。
【００１１】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の発現を調節するための組成物であって、１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、スプライシング因子の発現を減弱させるための組成物であって、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６またはスプライシング因子の調節に関連するそれらの下流標的の発現調節因子を含む組成物が提供される。
【００１３】
本発明のなおさらなる態様によれば、細胞老化および／もしくは細胞周期への再進入を減少または逆転させるための組成物であって、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６またはスプライシング因子の調節に関連するそれらの下流標的の発現調節因子を含む組成物が提供される。
【００１４】
上記の態様の組成物は、ＦＯＸＯ１の別個の調節因子（モジュレーター）とＥＴＶ６の別個の調節因子、またはそれらの個別のまたは組み合わせた標的遺伝子を含んでもよいことは、当業者には明らかであろう。あるいは、当該組成物は、単にＦＯＸＯ１とＥＴＶ６の複合調節因子、またはそれらの標的遺伝子を含んでもよい。
【００１５】
本発明者らは、有利なことに、ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の発現を調節することが、スプライシングおよび老化の下流エフェクターの活性を標的としており、それゆえ、将来の治療法の範囲の有望な標的を表す可能性があることを見出した。
【００１６】
上記の態様におけるＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６またはそれらの標的遺伝子の調節は、阻害剤のようないくつかのタイプの分子を使用することによって行うことができる。阻害剤は、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６、もしくは任意の下流のエフェクター分子の作用もしくは機能を制限、防止またはブロックする任意の分子（１種もしくは複数種）である。
【００１７】
ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の発現調節因子は、１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含んでいてもよい。この１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子は、２種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含んでもよい。
【００１８】
上記中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣物（ミミック）、またはアンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉＲ）を含んでもよい。特定の実施形態では、中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子は、以下の、ＭＩＲ１４２；ＭＩＲ３１２４；ＭＩＲ３１８８；ＭＩＲ３１９６；ＭＩＲ３２０Ｅ；ＭＩＲ３３０；ＭＩＲ３６７５；ＭＩＲ４３１６；ＭＩＲ４４８８；ＭＩＲ４４９６；ＭＩＲ４５１３；ＭＩＲ４６７４；ＭＩＲ４７０７；ＭＩＲ４７７２；ＭＩＲ６０８８；ＭＩＲ６１２９；ＭＩＲ６７８０Ａ；ＭＩＲ６７９７；ＭＩＲ６８０３；ＭＩＲ６８１０；ＭＩＲ６８４２；またはＭＩＲ７１５５うちの１つ以上から選択される。より好ましくは、中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子は、以下の、ＭＩＲ３１２４；ＭＩＲ３６７５；ＭＩＲ４４９６；ＭＩＲ６７８０Ａ；ＭＩＲ６８１０；ＭＩＲ６８４２；またはＭＩＲ７１５５うちの１つ以上から選択される。
【００１９】
ＦＯＸＯ１またはＥＴＶ６の標的遺伝子に富む生化学的および機能的経路は、下記表Ａに例示される。潜在的に、表Ａに概説された遺伝子または経路のいずれか１つを破壊することは、ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の発現の調節をもたらす可能性がある。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
細胞可塑性は、オルタナティブスプライシングの正しい時間的および空間的パターンを必要とする細胞恒常性の重要な因子である。このプロセスを統合制御するスプライシング因子は、加齢に伴う発現異常を示しており、老化と長寿命に影響を及ぼす可能性のある因子として浮上してきている。これらの変化の上流の推進因子はまだ明らかにされていないが、異常な細胞内シグナル伝達が関与している可能性がある。
【００２２】
本発明者らは、初期および後期の継代のヒト初代線維芽細胞の複数のシグナル伝達経路におけるタンパク質のリン酸化状態を比較し、ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達の活性化因子として知られるサイトカインに対する「若い」細胞の応答を決定した。次に、ＥＲＫおよびＡＫＴ経路の直接下流標的の化学的阻害、または標的ノックダウンが、老化したヒト初代線維芽細胞におけるスプライシング因子発現、細胞老化および増殖動態に与える影響を評価した。
【００２３】
驚くべきことに、そして予想外のことに、ＥＲＫとＡＫＴの両方のシグナル伝達経路の成分が、細胞の老化に伴って活性化が高められていることが示された。サイトカインに曝露された初期継代細胞でも、スプライシング因子の発現に変化が見られた。ＡＫＴとＥＲＫの経路を阻害すると、スプライシング因子の発現が上方制御され、老化細胞負荷が減少し、複数の細胞老化表現型が用量依存的に逆転することが示された。
【００２４】
上記組成物中のＥＲＫの阻害剤および／またはＡＫＴの阻害剤の用量は、好ましくは低用量である。実験中、本発明者らは、１μＭでのＥＲＫまたはＡＫＴシグナル伝達のいずれかの低用量化学的阻害を２４時間行うと、スプライシング因子の発現が、若い継代細胞で見られるレベルと一致するレベルまで回復し、試験した細胞のある割合で、老化の逆転および細胞周期への再進入がもたらされることを、予想外にも見出した。
【００２５】
本発明のさらなる態様では、スプライシング因子の発現を調節することが可能な組成物であって、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６遺伝子に結合し、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６遺伝子と結合し、またはＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６遺伝子を阻害することが可能な１種以上の化合物を含む組成物が提供される。好ましくは、当該組成物は、ＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６遺伝子（もしくは他のＦＯＸＯもしくはＥＴＳファミリーメンバーの遺伝子）もしくはその遺伝子産物に結合することが可能な、またはそれを阻害することが可能な１種以上の化合物を含む。
【００２６】
本発明者らは、有利にも、下流の標的ＦＯＸ０１またはＥＴＶ６をコードする遺伝子の標的ノックダウンは、ＥＲＫおよびＡＫＴの阻害に関して見出された観察結果を模倣するのに十分であることを有利に指摘した。
【００２７】
上記の態様の組成物は、実験室試薬および研究ツールから医薬品まで、いくつかの用途を有し得る。実験室試薬に関して、当該組成物は、ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の遺伝子発現の低下の効果を調査するため、またはスプライシング因子の発現を回復および／もしくは増加させるため、または細胞の老化および／もしくは細胞周期への再進入を減少もしくは逆転させるための研究ツールとして使用することができる。当該組成物はまた、研究および治療への応用のための幹細胞培養を含む細胞培養のために細胞老化および／もしくは細胞周期への再進入を減少または逆転させる方法として使用することができる。当該組成物は、細胞培養における生存可能な継代数を増加させ、および／または老化細胞集団を減少させるために使用することができよう。
【００２８】
当該組成物は、ＥＲＫまたはＡＫＴシグナル伝達の阻害剤を含んでいてもよい。
【００２９】
当該組成物は、医薬製剤の形態であってもよい。
【００３０】
当該組成物は、医薬として使用するためのものであってもよい。
【００３１】
有利にも、本発明者らによって生み出された結果は、加齢に関連するスプライシング因子の発現の調節異常および細胞老化が、部分的には、ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達の変化した活性に由来し、ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１転写因子を介して作用する可能性があることを示唆している。それゆえ、ＥＲＫおよびＡＫＴの下流エフェクターの活性を標的とすることは、将来の治療的介入のための有望なターゲットとなり得る。
【００３２】
当該組成物は、加齢に関連する疾患もしくは状態の予防、管理、改善または治療における使用のためのものであってもよい。
【００３３】
当該組成物は、加齢に関連する疾患もしくは状態の予防、管理、改善または治療の方法における使用のためのものであってもよく、この方法は、治療上有効な量の当該組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を備える。
【００３４】
関連する態様では、本発明は、加齢に関連する疾患もしくは状態の予防、管理、改善または治療のための医薬品の製造における使用のための組成物を含んでいてもよい。
【００３５】
上記加齢に関連する疾患または状態は、アルツハイマー病、心血管疾患、高血圧症、関節炎、骨粗鬆症、２型糖尿病、癌、パーキンソン病、認知機能障害または虚弱性などの多くの加齢に関連する状態を包含してもよい。上記加齢に関連する疾患または状態はまた、ウェルナー（Ｗｅｒｎｅｒ）症候群およびハッチンソン−ギルフォード（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ）早老症候群などのような、プロゲロイド症候群（早老症候群）と呼ばれる早期老化を生じる特定の状態に罹患している若い対象が苦しんでいるいくつかの状態を包含してもよい。
【００３６】
当該組成物は、癌の予防、管理、改善または治療における使用のためのものであってもよい。
【００３７】
当該組成物は、癌の予防、管理、改善または治療の方法における使用のためのものであってもよく、その方法は、治療上有効な量の当該組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を備える。
【００３８】
関連する態様では、本発明は、癌の予防、管理、改善または治療のための医薬品の製造における使用のための組成物を含んでいてもよい。
【００３９】
当該組成物はまた、加齢の影響を低減するための栄養補助食品または化粧品としての使用のためのものであってもよい。
【００４０】
本発明のさらなる態様によれば、
ａ）ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６もしくはそれらの標的遺伝子の遺伝子発現を調節するため、
ｂ）スプライシング因子の発現を回復および／もしくは増加させるため、または
ｃ）細胞老化および／もしくは細胞周期への再進入を減少もしくは逆転させるため
のＥＲＫ阻害剤およびＡＫＴ阻害剤の関連する組み合わせが提供される。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防ぐという点で予防的であってよく、かつ／または疾患および／もしくはその疾患に起因する悪影響を部分的にまたは完全に治癒するという点で治療的であってよい。本明細書で使用される場合の「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を対象とし、（ａ）疾患に対する素因を有する可能性があるが、まだその疾患を有すると診断されていない対象においてその疾患が発生することを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、疾患の発達を阻止するかまたは遅らせること、および（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００４２】
本明細書で使用される用語「対象」には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどのすべての哺乳類を含む。
【００４３】
「治療上有効な量」とは、疾患を治療するために対象に投与したときに、その疾患に対するそのような治療に影響を与えるのに十分な組成物の量を指す。この「治療上有効な量」は、使用される薬剤活性成分、疾患およびその重症度、ならびに治療されるべき対象の年齢、体重などに応じて変化するであろう。
【００４４】
一般に、本発明によって企図される投与経路には、経腸経路、非経口経路、または吸入経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００４５】
吸入投与以外の非経口投与経路には、外用（局所）経路、経皮経路、皮下経路、筋肉内経路、眼窩内経路、関節包内経路、脊髄内経路、胸骨内経路、髄腔内経路、および静脈内経路、すなわち、消化管を通るもの以外のあらゆる投与経路が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。非経口投与は、全身的または局所的な送達をもたらすために実施することができる。全身送達が望まれる場合、投与は、典型的には、医薬製剤の侵襲的もしくは全身吸収性の局所投与または粘膜投与を含む。経腸投与経路には、経口送達および直腸（例えば、座薬を使用する）送達が含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００４６】
従来のおよび薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内投与、筋肉内投与、気管内投与、髄腔内投与、頭蓋内投与、皮下投与、皮内投与、外用（局所）投与、静脈内投与、腹腔内投与、動脈内投与（例えば、頸動脈を介して）、脊髄送達または脳内送達、直腸投与、経鼻投与、経口投与、ならびに他の経腸投与経路および非経口投与経路が含まれる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物または本発明の組み合わせは、加齢に関連する疾患もしくは状態もしくは癌の予防、管理、改善または治療に有効な１種以上の他の化合物と一緒に投与されてもよい。
【００４８】
本発明の代替的な態様では、加齢の影響の美容的治療のための、ＥＴＶ６の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物の使用が提供される。この加齢の影響は、スプライシング因子の発現の調節異常および／または細胞老化の調節異常を含み得る。
【００４９】
本発明のなおさらなる態様では、加齢の影響の美容的治療のためのＦＯＸＯ１の発現を調節する１種以上の中間体ノンコーディングＲＮＡ制御因子を含む組成物の使用であって、この加齢の影響がスプライシング因子の発現の調節異常および／または細胞老化の調節異常を含む使用が提供される。
【００５０】
用語「美容的治療」は、ヒトまたは動物に全身的または局所的に施され得る任意の非医学的治療を意味することが意図されている。
【００５１】
用語「加齢の影響」は、老化、または生物学的機能の低下、および代謝ストレスに適応する能力の低下をもたらすヒトまたは動物における進行性の（ただし、疾患に基づくものではない）生理学的変化を意味することが意図されている。
【００５２】
上記ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６の調節因子（１種もしくは複数種）またはその標的遺伝子は、人為的に生成されたものであってもよい。つまり、それは天然に存在していないものである。しかしながら、ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の調節因子（１種もしくは複数種）ならびにそれらの標的遺伝子は、天然に存在する分子（１種または複数種）であってもよいが、医薬品または医薬製剤または組み合わせにおけるその濃度と配合は、その分子が加齢に関連する疾患もしくは状態もしくは癌の予防、管理、改善または治療のために使用されることを可能にする一方で、そうでなければ、その分子は何の効果も有さないか、または限られた効果しか持たないであろう。阻害剤（１種または複数種）は、天然に存在する分子（１種または複数種）であってもよいが、治療的に有効であることが見出されたその分子（１種または複数種）の濃度および配合は、そのような濃度で、または他の成分を含む配合で天然に存在するわけではないことが理解されるであろう。
【００５３】
阻害剤（１種または複数種）は、抗体（１種もしくは複数種）または抗体の混合物を含んでもよい。そのような抗体（１種または複数種）は、ポリクローナルであってもよいし、モノクローナルであってもよい。阻害剤として作用するであろう抗体をどのようにして製造するかは、当業者には明らかであろう。好ましくは、抗体はヒト化される。
【００５４】
他の実施形態では、阻害剤（１種または複数種）は、ペプチドまたはそのペプチド模倣体、またはそのＣ末端アミド化ペプチドを含む。
【００５５】
用語「ペプチド」（１種および複数種）は、アミノ酸残基（Ｈ−Ｃα−［側鎖］）を有するが、このアミノ酸残基がペプチド（−ＣＯ−ＮＨ−）または非ペプチド結合によって結合されていてもよい化合物を含む。
【００５６】
ペプチドは、Ｆｍｏｃ−ポリアミドモードの固相ペプチド合成法によって合成されてもよい。
【００５７】
ペプチドは、ペプチドアプタマーであってもよい。ペプチドアプタマーは、典型的には、特定の標的分子に結合することができる、短い５〜２０アミノ酸残基長の配列からなる。
【００５８】
アミド結合を含まないペプチド組成物の設計および合成には、いくつかの異なるアプローチがある。１つのアプローチにおいて、１つ以上のアミド結合は、本質的に異性体的な方法で、様々な化学的官能基によって置換される。
【００５９】
ペプチド結合が逆になっているレトロインバーソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド模倣体は、当該技術分野で公知の方法によって合成することができる。このアプローチは、側鎖の配向ではなく、骨格に関与する変化を含む疑似ペプチドを作ることを含む。ＣＯ−ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロインバーソペプチドは、タンパク質分解に対してより耐性がある。
【００６０】
ペプチドは直鎖状であってもよい。しかし、ペプチドベースのフレームワークに環状部位を導入することは有利である場合がある。環状部位は、ペプチド構造のコンフォメーション空間を制限し、これは、有効性の増大につながる可能性がある。この戦略の付加的な利点は、ペプチドへの環状部位の導入が、細胞性ペプチダーゼに対する感受性の低下を有するペプチドをもたらす可能性もあることである。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態では、ペプチドは、別の部位に結合されてもよい。ペプチドが結合されてもよい好都合な部位としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに細胞への送達を増強するＴＡＴおよびアンテナペディアなどのペプチド配列が挙げられる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、阻害剤（１種または複数種）は、ペプチドのプロドラッグである。プロドラッグは、タンパク質などの分子を産生するために生体内で代謝される化合物である。当業者であれば、プロドラッグの調製に精通しているであろう。
【００６３】
ペプチドは、ペプチド模倣体であってもよい。ペプチド模倣体は、本明細書で定義される分子と類似の構造（ジオメトリ）および極性を有し、実質的に類似の機能を有する有機化合物である。模倣体は、１つ以上のペプチド連結のＮＨ基がＣＨ２基で置換されている分子であってもよい。模倣体は、１つ以上のアミノ酸残基が、ナプチル基のようなアリール基で置換されている分子であってもよい。
【００６４】
他の実施形態では、阻害剤（１種または複数種）は、ＦＯＸＯ１および／もしくはＥＴＶ６の下流エフェクターまたはそれらの標的遺伝子に結合して阻害することができる一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸を含む。同じ標的は、ペプチドを用いた標的指向化（ターゲティング）にも適しており、ペプチドアプタマーは、ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡアプタマーを用いた標的指向化にも適していることが想定される。ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６の下流エフェクターまたはそれらの標的遺伝子に結合し阻害する一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸が提供されてもよい。典型的には、この核酸は一本鎖であり、１００〜５００００塩基を有する。
【００６５】
さらに他の実施形態では、阻害剤（１種または複数種）は、低分子または低分子を含む。
【００６６】
当該組成物が、ＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６遺伝子の発現またはその遺伝子産物に結合し、または調節することができる１つ以上の化合物を含むことが意図されている場合、当業者には明らかであろう。
【００６７】
本発明の特定の態様、実施形態または例に関連して記載された特徴、整数、特性、化合物、分子、化学的部位または基は、それと相容れない場合を除き、本明細書に記載された他の態様、実施形態または例にも適用可能であると理解されるべきである。本明細書（任意の付随する特許請求の範囲、要約および図を含む）に開示された特徴のすべて、ならびに／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程のすべては、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、上述の任意の実施形態の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書（任意の付随する特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規な１つ、もしくは任意の新規な組み合わせ、またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程の任意の新規な１つ、もしくは任意の新規な組み合わせにも及ぶ。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、初期継代細胞培養物と後期継代（老化）細胞培養物との間の増殖性細胞画分の差を示す。初期継代細胞培養物および後期継代細胞培養物は、活発に成長している細胞を選択的に染色するために、Ｓ期マーカーＢｒｄＵを用いる２４時間の標識にさらされた。＊＊＊＝ｐ＝＜０．０００１、ｎ＝３の生物学的複製物、複製物ごとに数えた３００核。
【図２】図２は、ＥＲＫおよびＡＫＴ経路内の標的についてのタンパク質リン酸化における加齢に伴う変化を示す。Ａは、ＡＫＴおよびＥＲＫ経路からの主要な標的のリン酸化されたタンパク質の発現が若い（ＰＤ＝２５）細胞と老化（ＰＤ＝６３）細胞で評価されたことを示すグラフである。白色と灰色のバーはそれぞれ若い細胞と老化細胞の溶解物を表している。Ｂは、ＡＫＴおよびＥＲＫ経路における老化に関連するリン酸化の差について試験した遺伝子を示す模式図である。リン酸化レベルが有意に異なることを示す標的は、太字の下線で強調表示されている。タンパク質のリン酸化に有意差を示さない標的は、通常の書体で表示されている。統計的有意性は＊ｐ＜０．０５の星印で示される。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。
【図３】図３は、ＥＲＫまたはＡＫＴシグナル伝達の化学的阻害が、細胞老化の表現型からの救済に関連していることを示す。Ａ．１μＭまたは１０μＭのトラメチニブおよびＳＨ−６で処理した後の老化に関連するβ−ガラクトシダーゼ（ＳＡ−β−Ｇａｌ）活性を陽性に染色した細胞の割合を、ＳＡ−β  ｇａｌ陽性細胞の割合を手動で数えることによって決定した。各サンプルについてＮ＝３００細胞超。Ｂ．老化マーカーｐ１６をコードする老化関連転写物ＣＤＫＮ２Ａのレベルを、ｑＲＴＰＣＲにより老化細胞中で評価した。データは、安定な内因性対照遺伝子ＧＵＳＢ、ＩＤＨ３ＢおよびＰＰＩＡとの相対的な表現であり、ビヒクルのみで処理した対照細胞に存在する個々の転写物のレベルに正規化して与えられている。倍数変化は、３つの生物学的複製物に対して三つ組で計算された。統計的有意性は、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００１（二元配置ＡＮＯＶＡ）で示されている。Ｃ．１μＭおよび１０μＭのＥＲＫおよびＡＫＴ阻害剤で処理した後の様々な炎症促進性ＳＡＳＰ因子のタンパク質レベル。Ｄ．ＤＮＡ損傷応答タンパク質ｐ２１をコードするＣＤＫＮ１Ａ転写物の発現レベル。Ｅ．ＳＡＳＰタンパク質発現の倍数変化を示すヒートマップである。緑色は上方制御を示し、赤色は下方制御を示す。統計的に有意な変化のみがヒートマップに表示されている。色のスケールは、発現のパーセント変化を指す。実験は、合計６つの生物学的複製物に対して重複して実施された。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。
【図４】図４は、細胞増殖を許可しない条件下でのスプライシング因子の発現および老化細胞負荷に対するＥＲＫまたはＡＫＴ阻害剤の効果を示す。老化細胞培養物の見かけの「若返り」が、培養物中の非老化細胞の増殖動態の変化に由来するか、または処理に応答した真の救済から生じるかを確証するために、選択した実験を、細胞が分裂するのを阻止された血清飢餓の条件下で繰り返した。Ａ．Ｋｉ６７染色は、細胞が非増殖性であることを示したのに対し、Ｂ．ＳＡ−ｂ−Ｇａｌ染色は救助がまだ明白であったことを明らかにした。＊＊＊＝ｐ＝＜０．０００１、ｎ＝３の生物学的複製物、複製物ごとに数えた３００核。
【図５】図５は、低用量のＥＲＫまたはＡＫＴの阻害に応答して、ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達タンパク質、およびリンクされたシグナル伝達経路のタンパク質のリン酸化状態の変化を示す。白色、薄灰色、薄灰色ハッチング、濃灰色および濃灰色ハッチングのボックスは、それぞれ対照、低用量トラメチニブ、高用量トラメチニブ、低用量ＳＨ−６および高用量ＳＨ−６を表す。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５の星印で示される。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。＊＊＊＝ｐ＝＜０．０００１。データは３つの生物学的複製物と２つの技術的複製物から得られたものである。
【図６】図６は、ＡＫＴまたはＥＲＫ経路の阻害がスプライシング因子転写物の発現および細胞増殖率に影響を与えることを示す。Ａ．１μＭおよび１０μＭのＥＲＫまたはＡＫＴ阻害剤による２４時間の処理に応答したスプライシング因子ｍＲＮＡレベルの変化を示す。緑色は上方制御された遺伝子を示し、赤色は下方制御された遺伝子を表す。色のスケールは発現の倍数変化を示す。統計的に有意な変化のみがヒートマップに表示されている。Ｂ．増殖指数は、Ｋｉ６７免疫蛍光（サンプルあたり４００個以上の核を数えた）によって評価され、処理された細胞について評価された。Ｃ．１μＭおよび１０μＭのＥＲＫまたはＡＫＴ阻害剤で処理した後の細胞数。Ｄ．３６Ｂ４内因性対照との相対的にｑＰＣＲによって定量され、ビヒクルのみの対照におけるテロメア長に正規化されたテロメア長。Ｅ．ＴＵＮＥＬアッセイにより決定された、阻害剤で処理された老化細胞のアポトーシス指数。データは、３つの生物学的複製物の二重反復試験に由来する。統計的有意性は、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００１で示される。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。
【図７】図７は、ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１遺伝子の標的ノックダウンの細胞効果および分子効果を示す。Ａ．ＦＯＸ０１、ＥＴＶ６またはＥＴＶ６／ＦＯＸ０１遺伝子ノックダウン後のスプライシング因子の発現のレベル。緑色は上方制御された遺伝子を示し、赤色は下方制御された遺伝子を表す。色のスケールは発現の倍数変化を示す。統計的に有意な変化のみがヒートマップに表示されている。Ｂ．ＦＯＸ０１、ＥＴＶ６およびＥＴＶ６／ＦＯＸ０１遺伝子ノックダウン後のＳＡ−β−Ｇａｌで示される老化細胞負荷。各サンプルについてｎ＞３００の細胞。Ｃ．ＦＯＸ０１、ＥＴＶ６およびＥＴＶ６／ＦＯＸ０１遺伝子ノックダウン後のＣＤＫＮ２Ａ遺伝子発現によって示される老化細胞負荷。データは、安定な内因性対照遺伝子ＧＵＳＢ、ＩＤＨ３ＢおよびＰＰＩＡとの相対的な表現であり、ビヒクルのみの対照における個々の転写物のレベルに正規化されている。Ｄ．増殖指数は、ＦＯＸ０１、ＥＴＶ６およびＥＴＶ６／ＦＯＸ０１遺伝子ノックダウン後に、Ｋｉ６７免疫蛍光（サンプルあたり４００個以上の核を数えた）によって評価した。Ｅ．ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１遺伝子のそれぞれの相互発現に対するＦＯＸ０１またはＥＴＶ６遺伝子ノックダウンの効果。データは、安定な内因性対照遺伝子ＧＵＳＢ、ＩＤＨ３ＢおよびＰＰＩＡとの相対的な表現であり、対照中の個々の転写物のレベルに正規化されている。データは、３つの生物学的複製物の二重反復試験に由来する。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００１で示される。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。
【図８】図８は、第２の方法論であるｓｉＲＮＡによって達成されたＦＯＸＯ１および／またはＥＴＶ６ノックダウンの効果を示す。ＥＴＶ６またはＦＯＸＯ１遺伝子ノックダウンの効果は、注目する遺伝子に対するｓｉＲＮＡによって確認された。ノックダウンのレベルは、ＥＴＶ６については４３％、ＦＯＸＯ１については６５％と決定された。スプライシング因子の発現に対する遺伝子ノックダウンの効果（Ａ）、ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１発現に対する効果（Ｂ）。操作した遺伝子の識別名はＸ軸に与えられている。最初の４本のバーはＦＯＸＯ１遺伝子発現に対する効果、後半はＥＴＶ６発現に対する効果を示す。老化細胞負荷（Ｃ）およびＣＤＫＮ２Ａ発現（Ｄ）に対する効果も調べた。統計的に有意な変化のみがヒートマップに表示されている。＊＊＊＝ｐ＝＜０．０００１、ｎ＝３の生物学的複製物。データは、３つの独立した生物学的複製物からのものである。
【図９】図９は、ＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６転写物の発現ならびに細胞内局在化に対するＥＲＫまたはＡＫＴ阻害の効果を示す。Ａ．ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１発現に対するＥＲＫおよびＡＫＴ阻害の効果を示す。処理は、Ｘ軸上に示されている。最初の５本のバーはＦＯＸＯ１発現に対する効果を示し、２番目の５本のバーはＥＴＶ６発現に対する効果を示す。データは、３つの独立した生物学的複製物からのものであり、それぞれ３つの技術的複製物を有する。Ｂ．ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１タンパク質の細胞内局在化に対するＥＲＫおよびＡＫＴ阻害の効果。処理は、Ｘ軸上に示されている。最初の５本のバーはＥＴＶ６の局在化に対する効果を示し、２番目の５本のバーはＦＯＸＯ１の局在化に対する効果を示す。＊＊＊＝ｐ＝＜０．０００１。データは、３つの独立した生物学的複製物のそれぞれからの少なくとも５０個の細胞からのものである。
【図１０】図１０は、本発明者らが実施した実験により解明された老化の間接制御を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明の実施形態を、例示のためだけに、添付の図を参照して以下に説明する。
【実施例】
【００７０】
本例の実験の目的は、化学的阻害または標的遺伝子ノックダウンによるＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達経路の操作が、後期継代ヒト初代線維芽細胞におけるスプライシング因子の発現および細胞老化および増殖動態に及ぼす影響を調べることであった。
【００７１】
１．  老化細胞におけるＭＥＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の標的タンパク質のリン酸化の増加
細胞培養物は、集団の倍化時間が１週間あたり０．５個未満の細胞分裂まで遅くなったときに老化とみなした。この時点では、Ｓ期マーカーであるＢｒｄＵ（ＤＮＡの複製が活発に行われていることを示す）に対して陽性に染色されている細胞は３％程度であった（図１）。後期継代初代ヒト真皮線維芽細胞は、ＰＤ＝６３で老化に達していることが判明した。より初期の継代細胞はＰＤ＝２５のものであった。本発明者らは、後期継代の線維芽細胞では、ＡＫＴ、ＣＲＥＢ、ＥＲＫ、ＧＳＫ３α、ＭＥＫ、ＭＳＫ２シグナル伝達タンパク質のリン酸化が増加していることを指摘したが、これらの細胞では、ＧＳＫ３β、ＨＰＳ２７、ＪＮＫ、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、ｍＴＯＲ、ｐ３８、ｐ５８、ｐ７０ＳＫ６またはＲＳＫ１タンパク質のリン酸化は増加していないことが明らかになった（図２Ａ）。これらの標的のいくつかは、ＡＫＴまたはＥＲＫシグナル伝達経路に存在する（図２Ｂ）。
【００７２】
２．  ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の阻害は、細胞老化の表現型を救済する
本発明者らは、特定の阻害剤を用いて、後期継代のヒト初代線維芽細胞におけるＡＫＴまたはＭＥＫ／ＥＲＫの標的阻害の効果を評価した。１μＭおよび１０μＭの両方のＳＨ−６（ＡＫＴ）またはトラメチニブ（ＭＥＫ／ＥＲＫ）で処理すると、ＳＨ−６およびトラメチニブは、高用量および低用量の両方で、それぞれＡＫＴまたはＥＲＫタンパク質のリン酸化の特異的な減少をもたらした（図３Ａ）。これは、ＳＡ−β−Ｇａｌ染色の低下（ｐ＝＜０．０００１；図３Ｂ）ならびにｐ１６およびｐ２１の両方の発現の減少（図３Ｃおよび図３Ｄ）によって示されるように、わずかではあるが確実な老化細胞集団の減少を伴っていた。低用量および高用量のトラメチニブとＳＨ−６の両方で処理した細胞では、いくつかの分泌されたＳＡＳＰタンパク質のレベルの低下も認められた（下記表１；図３Ｅ）。
【００７３】
【表２】
2021531317.tif 000003
（細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）の炎症促進性成分のタンパク質レベルは、１μＭまたは１０μＭのＥＲＫ阻害剤トラメチニブまたはＡＫＴ阻害剤ＳＨ−６で２４時間処理した老化細胞からの培地中で、メソスケール（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）ＥＬＩＳＡプラットフォームを使用して測定した。結果は、３つの独立した実験の対照値（ビヒクルのみ）のパーセンテージとして表されている。平均値の標準誤差（ＳＥＭ）は括弧内に与えられている。統計的有意性は、対応する対照値と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５および＊＊＊ｐ＜０．００１の星印で示されている。）
【００７４】
老化細胞画分における低下が積極的な「救済」によるものか、あるいは単に培養物中の増殖停止した細胞の増殖の増加によるものかを確証するために、本発明者らは、細胞増殖を阻害する血清飢餓の条件下で処理を繰り返した。血清飢餓下の細胞では、ＳＡ−β−Ｇａｌ陽性細胞が約２０％減少しており、これは、上記効果は単に培養細胞の分裂速度の変化に由来するものではないことを示した（図４）。これは、本発明者らの以前の知見（Ｌａｔｏｒｒｅら、２０１７）と一致している。
【００７５】
３．  ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＰ１３Ｋ／ＡＫＴの阻害は、ＥＲＫおよびＡＫＴの上流および下流の両方の標的タンパク質のリン酸化状態を変化させる
細胞老化に影響を与えている可能性のある有望な下流の標的を調べるために、本発明者らは、下流のシグナル伝達標的に対するＥＲＫとＡＫＴの阻害の効果を評価した。予想通り、高用量および低用量の経路阻害に応答して、ＥＲＫおよびＡＫＴのリン酸化レベルの変化が、ＧＳＫ３α、ＧＳＫ３β、ｐ７０ＳＫ６およびＣＲＥＢの下流標的のリン酸化状態の変化とともに観測された。ＧＳＫ３βの下方制御は高濃度および低濃度のトラメチニブの両方については明らかであったが、高用量ＳＨ−６のみで認められ、一方、ＧＳＫ３αのリン酸化は、トラメチニブ単独とＳＨ−６単独の両方において、低用量では減少したレベルを示し、高用量では増加したレベルを示したが、高用量のＳＨ−６と低用量のトラメチニブでのみ統計的に有意であった（図５Ａ）。この拮抗作用のパターンは、ｐ３８を含む上流のキナーゼに対しても明らかであった。ｐ５３、ＭＫＫ３、ＭＫＫ６、およびＭＥＫを含む他のいくつかの上流の標的は、処理後のリン酸化状態の差を示し、効果は高用量で最も一般的であった（図５Ｂ）。ｐ５３のリン酸化の変化は、ＡＫＴまたはＥＲＫ阻害剤で処理することで、細胞がより増殖性でより老化しにくい状態に回復すること（Ｐｉｓｅ−Ｍａｓｉｓｏｎら、１９９８）と一致している。
【００７６】
４．  ＥＲＫおよびＡＫＴ経路はスプライシング因子の発現に影響を与える
スプライシング因子の発現の調節異常は、ヒト集団および細胞における（Ｈａｒｒｉｅｓら、２０１１；Ｈｏｌｌｙら、２０１３）、および動物モデルにおける（Ｈｅｉｎｔｚら、２０１６；Ｌｅｅら、２０１６）細胞老化および加齢に関連づけられてきた。さらには、低分子を用いたスプライシング因子の発現の回復は、本発明者らの以前の研究において、細胞老化の救済と関連していた（Ｌａｔｏｒｒｅら、２０１７）。それゆえ、本発明者らは、低用量（１μＭ）および高用量（１０μＭ）のＡＫＴおよびＥＲＫ阻害剤（それぞれＳＨ−６およびトラメチニブ）で処理した後期継代ヒト線維芽細胞において老化に関連する変化を示すことが以前に実証された２０種のスプライシング制御因子遺伝子の先験的リストの発現を評価した。低用量（１μＭ）でのトラメチニブおよびＳＨ−６の両方での処理は、複数のスプライシング因子の上方制御と関連していた（図６Ａ；下記表２）。
【００７７】
【表３】
2021531317.tif 000004
（１μＭまたは１０μＭのＥＲＫ阻害剤（トラメチニブ）またはＡＫＴ阻害剤（ＳＨ−６）を用いた２４時間の処理に応答した、老化した初代ヒト線維芽細胞におけるｍＲＮＡレベルの変化。データは、３つの生物学的複製物の二重反復試験に由来する。平均値の標準誤差（ＳＥＭ）は括弧内に与えられている。統計的有意性は、対応する対照値と比較して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５および＊＊＊ｐ＜０．０００１の星印で示されている。）
【００７８】
効果は、ＡＫＴを阻害した細胞よりもＭＥＫ／ＥＲＫを阻害した細胞の方が顕著であった。驚くべきことに、高用量の阻害剤（１０μＭ）は、スプライシング因子の発現に対して拮抗的な効果を明らかにした（図６Ａ；表２）。この用量依存性の応答は、増殖動態についても認められた（図６Ｂ、Ｃ）。低用量のトラメチニブは、増殖指数の３１％の増加をもたらしたのに対し、低用量のＳＨ−６は、Ｋｉ６７染色の２７％の増加をもたらした（それぞれｐ＝＜０．０００１および＜０．０００１）。いずれの阻害剤での高用量処理は、増殖の再活性化をもたらさなかった（図６Ｂ、Ｃ）。これらのデータは、細胞周期への再進入とスプライシング因子の発現との間の明確な関連を示している。いずれの処置を行ってもテロメアの救済は明らかではなく（図７Ｄ）、アポトーシス指数の増加はいずれの処置を行っても認められなかった（図７Ｅ）。
【００７９】
５．  ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１は、スプライシング因子の発現および細胞老化の表現型の制御因子である
ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達は、複数の下流エフェクター経路を有し、クロストークおよび自己制御の有意な証拠を有する（Ｒｈｉｍら、２０１６）。メカニズムを明らかにするために、操作時の表現型のより明快な評価を与えるために、下流のエフェクター遺伝子を特定する必要があった。ＦｏｘｏおよびＡｏｐ遺伝子の標的欠失は、キイロショウジョウバエ（Ｄ．Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）における寿命の延長と関連していることが報告されており（Ｓｌａｃｋら、２０１５）、これらの最も近いヒト同族体はＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６である（Ｊｏｕｓｓｅｔら、１９９７；Ｋｒａｍｅｒら、２００３）。モルフォリノオリゴヌクレオチドを用いた標的遺伝子ノックダウンは、後期継代ヒト初代線維芽細胞におけるＦＯＸＯ１またはＥＴＶ６のいずれかの下方制御が、ＡＫＴまたはＥＲＫ阻害で見られるのと同様のスプライシング因子遺伝子発現の救済をもたらすことを明らかにしたが、今回の結果はＦＯＸＯ１についてより顕著であった（図７Ａ）。スプライシング因子の発現の変化は、ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１ノックダウンについては、ＳＡ−β−Ｇａｌ染色で測定される場合、それぞれ約１８％および４０％の老化細胞負荷の減少を伴っており（ｐ＝＜０．０００１および０．０００１；図７Ｂ）、ＣＤＫＮ２Ａ発現の対応する２４％および４３％の減少も認められた（それぞれＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１のｐ＝＜０．０５および＜０．００５；図７Ｃ）。これは、全体としてのＥＲＫまたはＡＫＴシグナル伝達のいずれかを阻害した場合よりも顕著な変化を示している。ここでも、本発明者らがスプライシング因子の発現について述べたように、効果はＦＯＸＯ１発現が操作された細胞で最も強くなった。ＥＴＶ６またはＦＯＸＯ１の発現が阻害された後期継代線維芽細胞では、細胞増殖も回復した。ＥＴＶ６のノックダウンは、増殖指数の３６％の増加をもたらしたのに対し、ＦＯＸ０１を阻害すると１９％の増加をもたらした（それぞれｐ＝＜０．０００１および＜０．００５；図４Ｄ）。また、ＥＴＶ６またはＦＯＸＯ１遺伝子のノックダウンの効果は、注目する遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡを用いて、スプライシング因子の発現、細胞老化、ＣＤＫＮ２Ａ発現のレベルでも確認された（図８）。
【００８０】
６．  ＡＫＴシグナル伝達経路とＥＲＫシグナル伝達経路との間には有意な交差制御が存在する
ＥＲＫシグナル伝達経路とＡＫＴシグナル伝達経路の両方との間、またＥＴＶ６とＦＯＸＯ１自体の間には、交差制御的な関係が明らかになった。ＥＴＶ６とＦＯＸＯ１の両方の遺伝子を二重にノックダウンすると、複数の老化表現型からの救済が阻害された（図７Ｂ〜Ｄ）。共制御の一部は、部分的に転写相互作用のレベルにある可能性がある。ＥＴＶ６遺伝子のノックダウンはＥＴＶ６とＦＯＸＯ１遺伝子の両方の発現に影響を与えたのに対し、ＦＯＸＯ１遺伝子のノックダウンはＦＯＸＯ１レベルの下方制御のみに関連していた（図８Ｂ）。同様の交差制御は、ＥＲＫまたはＡＫＴ阻害剤に対するＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６遺伝子発現の応答にも見られる。低用量のトラメチニブで老化細胞を処理すると、ｍＲＮＡレベルでＥＴＶ６とＦＯＸＯ１の両方の発現が誘導され、一方、低用量のＳＨ−６で処理すると、ＦＯＸＯ１だけの上方制御を引き起こした（図９Ａ）。これは、ｍＲＮＡ発現レベルでの代償的な逆制御を表している可能性があるが、これはまだ確証されていない。高用量のＳＨ−６はＦＯＸＯ１とＥＴＶ６の両方の発現の有意な下方制御を引き起こしたが、高用量のトラメチニブはＦＯＸＯ１の発現の変化のみに関連していた（図９Ａ）。トラメチニブまたはＳＨ−６での処理はまた、ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１タンパク質の細胞内局在において、何らかのわずかではあるが有意な変化を引き起こした。低用量のトラメチニブは、ＥＴＶ６タンパク質のより多くの核内保持と関連していたが、ＦＯＸＯ１タンパク質の核内保持は減少していた。高用量のトラメチニブは、より少ない核内ＦＯＸＯ１タンパク質のみと関連していた。低用量のＳＨ−６はＥＴＶ６の核内保持量の有意な低下と関連していたが、ＦＯＸＯ１の細胞内局在は影響を受けなかった。高用量のＳＨ−６は、ＥＴＶ６とＦＯＸＯ１タンパク質の両方の核局在の減少を引き起こした（図９Ｂ）。これらのデータは、ＦＯＸＯ１とＥＴＶ６の間の相互作用が、転写およびタンパク質局在の両方のレベルで起こること、ならびに本明細書で、および以前に発表されたデータ（Ｒｈｉｍら、２０１６）で示されたように、タンパク質活性のレベルでの交差制御が起こることを示している。交差制御は、これらのシグナル伝達経路の典型的なものであり、将来的には探索する価値がある。
【００８１】
７．  スプライシング因子は、ＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６の間接的な標的である
ＦＯＸＯ１とＥＴＶ６の標的遺伝子を、ヒト細胞型から公開されているクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）データセットの解析によって比較した。ＥＴＶ６の標的遺伝子は４１９個、ＦＯＸ０１の標的遺伝子は２４２個特定された。ＦＯＸ０１の標的２４２個はすべてＥＴＶ６の標的でもあった。２つのスプライシング因子（ＨＮＲＮＰＦおよびＨＮＲＮＰＬＬ）はＥＴＶ６の直接的な標的であったが、ほとんどのスプライシング因子は直接的には標的にされておらず、これらのタンパク質による制御は間接的であることが示唆された。ＦＯＸＯ１とＥＴＶ６の標的遺伝子は、いくつかの分子機能を含んでいたが、驚くべきことに、ＥＴＶ６とＦＯＸＯ１の両方で標的とされた遺伝子のほぼ４分の１（５８／２４２）が、ノンコーディングＲＮＡ制御因子（ｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ）、転写因子、または細胞シグナル伝達タンパク質を含んでいた（下記表３）。
【００８２】
【表４（１）】
2021531317.tif 000005
【００８３】
【表４（２）】
2021531317.tif 000006
【００８４】
【表４（３）】
2021531317.tif 000007
【００８５】
【表４（４）】
2021531317.tif 000008
【００８６】
【表４（５）】
2021531317.tif 000009
【００８７】
【表４（６）】
2021531317.tif 000010
【００８８】
また、興味深いのは、４つの場合において、コーディングＲＮＡの共役モジュールとその同族のノンコーディングＲＮＡ制御因子の両方がＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６によって標的化されている（ＡＰ４Ｂ１およびＡＰ４Ｂ１−ＡＳ１；ＣＤ２７およびＣＤ２７−ＡＳ１；ＰＣＯＬＣＥおよびＰＣＯＬＣＥ−ＡＳ１；ＲＡＭＰ２およびＲＡＭＰ２−ＡＳ１）という観察であった。遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）により、ＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６標的遺伝子は、老化プロセスに関与する経路にクラスター化されていることが示唆された。両遺伝子の標的との関連性が高い上位４つの経路は、「細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）」（ＥＴＶ６についてはｐ＝０．０００２、ＦＯＸＯ１については０．０００３）、「有糸分裂前期」（ＥＴＶ６についてはｐ＝０．０００４、ＦＯＸＯ１については０．０００３）、「細胞老化」（ＥＴＶ６についてはｐ＝０．００２１、ＦＯＸＯ１については０．０００１）、および「Ｍ期」（ＥＴＶ６についてはｐ＝０．００４５、ＦＯＸＯ１については０．０００１）であった（下記表４を参照）。
【００８９】
【表５】
2021531317.tif 000011
【００９０】
考察
受容体チロシンキナーゼは、細胞内外からの複数のシグナルを統合し、この情報を細胞制御機構に伝達する。本発明者らのデータは、ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達経路に含まれるタンパク質が後期継代細胞でより高いレベルのリン酸化を示し、有意な交差制御および自己調節を示すことを示唆している。本発明者らは、これの下流の主要な結末は、主にＦＯＸ０１とＥＴＶ６の転写因子の活性と交差反応性の変化を媒介とした、後期継代細胞におけるスプライシング因子の発現の調節異常である可能性があり、これらの変化がこの系の老化表現型と関連していることを提案する。後期継代ヒト初代線維芽細胞におけるＥＲＫシグナル伝達もしくはＡＫＴシグナル伝達のいずれかの低用量の化学的阻害、またはＦＯＸＯ１もしくはＥＴＶ６遺伝子の発現の低下は、スプライシング因子の発現を、より若い継代細胞で見られるレベルと一致するレベルにまで回復させ、試験した細胞のある割合で、老化の逆転と細胞周期への再進入をもたらした。
【００９１】
ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達経路は、ＤＮＡ損傷、栄養シグナル伝達の調節異常、老化に伴う慢性炎症などの古典的な老化刺激によって活性化される可能性がある（Ｆｏｎｔａｎａら、２０１２；Ｌｉｎら、２０１３）。細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）の主な原因であるＮＦ−ｋβ経路は、ＥＲＫとＡＫＴの両方のシグナル伝達によって活性化されることも知られており（Ｌｉｎら、２０１２）、正のフィードバックの悪循環の可能性を高めている。正常なスプライシングプロセスの調節異常は、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌などの多くの加齢に関連する疾患の重要な特徴である（ＬａｔｏｒｒｅおよびＨａｒｒｉｅｓ、２０１７）。変化したスプライシング調節は、それ自体、ヒト集団における老化（Ｈａｒｒｉｅｓら、２０１１）、インビトロモデルにおける細胞老化（Ｈｏｌｌｙら、２０１３）、およびマウスモデルにおける長寿命（Ｌｅｅら、２０１６）と関連している。いくつかの研究は、特定のスプライシング因子の標的化された破壊が無脊椎動物モデルにおいて寿命を調節することができるので、スプライシング制御が老化の原因経路上にある可能性を示唆している（Ｈｅｉｎｔｚら、２０１６）。本発明者らの最近の研究は、細胞老化の特徴が、スプライシング因子レベルの低分子修復によって逆転され得ることを示唆している（Ｌａｔｏｒｒｅら、２０１７）。最近の考え方は、正確にどのアイソフォームが遺伝子から発現されるかを取り巻く意思決定プロセスの変化が、老化および加齢に関連する表現型に直接寄与する可能性があることを示唆している（ＤｅｓｃｈｅｎｅｓおよびＣｈａｂｏｔ、２０１７）。
【００９２】
変化した細胞シグナル伝達は、老化の重要な特徴である。ｍＴＯＲおよびＩＧＦ−１シグナル伝達などの経路の作用は周知であり、明確になっている（ＣｏｈｅｎおよびＤｉｌｌｉｎ、２００８）。ＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達は共に、以前に、老化および老化表現型に関連するとされており（Ｄｅｍｉｄｅｎｋｏら、２００９；Ｃｈａｐｐｅｌｌら、２０１１）、これらの経路の改変もまた、動物モデルにおける寿命延長および老化表現型に関連している（Ｓｌａｃｋら、２０１５）。ＥＲＫおよびＡＫＴの両方がスプライシング因子活性の制御と関連していることは以前にも知られており（ＳｈｉｎおよびＭａｎｌｅｙ、２００４；Ｔａｒｎ、２００７）、ＡＫＴはキナーゼ活性化レベルでのスプライシング因子遺伝子の制御に役割を持つことが知られている（Ｂｌａｕｓｔｅｉｎら、２００５）。しかしながら、これらの経路がスプライシング因子の発現を制御し、老化表現型に影響を及ぼす可能性がある正確な基礎的メカニズムの研究は、本発明者らが実証したように、これらの経路が組織、用量および文脈に明確な影響を示すこと、ならびにそれらの間に重要なクロストークも存在すること（Ｒｈｉｍら、２０１６）から、困難に満ちている。このことは、阻害剤の異なる用量では結果が一貫していない可能性があり、ある細胞型で見られた効果が別の細胞型では必ずしも当てはまらない可能性があることを示唆している。このことは、用量の明確な影響を指摘した本発明者らのデータから明らかである。低用量では、いくつかのスプライシング因子の発現の増加、老化表現型の救済（回復）や細胞周期への再進入が見られたが、高用量では、スプライシング因子の発現は減少し、増殖指数の上昇は見られなかった。このことは、高用量で活性化した場合には、スプライシング因子の発現や増殖の阻害につながるＡＫＴシグナル伝達経路やＥＲＫシグナル伝達経路内の他のフィードバックループが活性化している可能性を示唆している。ここでも、これは、より高濃度で活性化される可能性のあるスプライシング因子の発現および増殖の阻害につながるＡＫＴまたはＥＲＫシグナル伝達経路内のフィードバックループから生じる可能性がある。これ自体は珍しいことではない。というのも、投与量または組織応答の点での拮抗効果は細胞内シグナル伝達経路では珍しくないからである（Ｐａｒｄｏら、２００３；Ｗａｎｇら、２０１７）。実際、本発明者らのデータは、いくつかの交差制御および自己制御のフィードバックループの存在を示しており、これは、スプライシング因子の発現が、かなり狭い発現限界内で、恒常的なメカニズムによって厳密に制御されていることを示している可能性があり、これは、増殖の制御におけるそれらの既知の役割、およびそれらがオルタナティブスプライシングを制御する組み合わせ的な用量応答的な性質と一致するであろう（Ｋａｎｇら、２００９；Ａｎｃｚｕｋｏｗら、２０１２；ＦｕおよびＡｒｅｓ、２０１４）。
【００９３】
ＥＲＫおよびＡＫＴのシグナル伝達の変化、スプライシング因子の発現、細胞老化との正確な関係をより理解するには、より詳細な分子解析が必要である。本発明者らのデータは、スプライシング因子の発現および細胞老化表現型に対するＡＫＴとＥＲＫの活性化の特徴の多くが、ＥＲＫまたはＡＫＴシグナル伝達の２つの主要な下流エフェクターであるＦＯＸＯ１とＥＴＶ６を標的とした破壊によって再現される可能性があることを示唆している。このＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６遺伝子は共に転写因子をコードし、そのうちの最も近いショウジョウバエ同族体（ＦｏｘｏおよびＡｏｐ）は、キイロショウジョウバエにおける寿命に対するＥＲＫおよびＡＫＴ活性化の効果に寄与することが報告されている（Ｓｌａｃｋら、２０１５）。ＦＯＸＯタンパク質は、老化経路への関与の長い歴史を持っている。ＦＯＸＯタンパク質は、線虫、ハエ、哺乳類の長寿命に関与していることはよく知られているが（ＳａｌｉｈおよびＢｒｕｎｅｔ、２００８）、本発明者らの知る限りでは、これまでスプライシング因子の制御と結びついたことはなかった。
【００９４】
いずれかの遺伝子を標的としたノックアウトは、スプライシング因子の発現増加と老化からの救済の両方をもたらした。ここでも、両遺伝子の同時ノックアウトは、スプライシング因子の発現と老化細胞負荷に対する加算的または乗算的な効果を生じず、効果が完全に消失するため、これらの遺伝子間の関係は相乗的なものではない可能性がある。このことは、転写とタンパク質の細胞内局在のレベルでのＦＯＸＯ１とＥＴＶ６遺伝子の相互制御によって部分的に説明できる可能性がある。つまり、ＦＯＸＯ１のノックダウンはＥＴＶ６の発現を増加させ、特定の阻害剤によるいずれかのシグナル伝達経路の調節は両遺伝子の核内局在に影響を与える。いくつかのスプライシング因子は、それらのプロモーター領域に進化的に保存されたＦＯＸＯ結合モチーフを有し（Ｗｅｂｂら、２０１６）、ＦＯＸＯ１タンパク質は、スプライシングが起こる細胞内の核斑と共局在化することが報告されている（Ａｒａｉら、２０１５）。ＥＴＶ６は、転写因子のＥＴＳファミリーのメンバーであり、細胞増殖の制御および造血器癌の制御における周知の役割を有する（ＨｏｃｋおよびＳｈｉｍａｍｕｒａ、２０１７）が、おそらく長寿命遺伝子としてはそれほど自明ではない候補である。ＦＯＸＯ１と同様に、ＥＴＶ６は、スプライシング因子の発現の制御因子としては以前に報告されていないが、非常に類似した結合部位を有する遺伝子のより広いＥＴＳファミリーの他のメンバーは、そのような活性を有することが報告されている（Ｋａｊｉｔａら、２０１３）。ＦＯＸＯ１とＥＴＶ６の両方が腫瘍抑制遺伝子としての活性を有することが報告されている（ＤａｎｓｅｎおよびＢｕｒｇｅｒｉｎｇ、２００８；ＲａｓｉｇｈａｅｍｉおよびＷａｒｄ、２０１７）ので、細胞増殖に必要な遺伝子の発現を負に制御する役割は予想外ではない。
【００９５】
ＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６がいくつかのスプライシング因子（ＨＮＲＮＰＦ、ＨＮＲＮＰＬ）を直接制御する可能性があるが、スプライシング因子の発現のほとんどの制御因子は、むしろ一連の中間体を介して作用し、そのうちのほぼ２５％はノンコーディングＲＮＡであることを、ＣｈＩＰ解析は示している。共通の標的のうちの９つがＵ１またはＵ５スプライソソーム複合体の構成要素であるため、スプライシングプロセスは直接関与している。ＦＯＸＯ１とＥＴＶ６によって制御されている遺伝子の間には驚くほどの重複があり、制御は協調的または競合的に行われている可能性があることを示唆している。この制御には他のＦＯＸＯや他のＥＴＳファミリーメンバーの作用も含まれているのではないかと推測される。これらの遺伝子が老化プロセスを媒介する役割を果たしていることは、本発明者らのＧＳＥＡの結果からも示唆されている。ＦＯＸＯ１とＥＴＶ６の標的は、老化の基本的な経路（「細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）」、「細胞老化」、「Ｍ期」、「有糸細胞分裂周期」）にクラスター化している。このように、本発明者らのデータは、ＦＯＸＯ１とＥＴＶ６がスプライシング因子の制御に関与しそれらの老化との関係に影響を与えるメディエーター遺伝子のモジュールを協調的に制御する可能性があるという証拠を提供する。
【００９６】
本発明者らのデータは、ＥＴＶ６とＦＯＸＯ１がスプライシング因子の発現の新規な制御因子としての活性を持っている可能性を示唆しているが、これらのネットワークにおける他の遺伝子の寄与を排除するものではない。実際、全体像は似ているが、経路全体の阻害に挑戦した場合、いくつかのスプライシング因子遺伝子は、ＦＯＸＯ１やＥＴＶ６の特異な不活性化と比較して、異なる挙動を示す（例えば、ＥＲＫシグナル伝達についてのＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ６、およびＡＫＴシグナル伝達についてのＡＫＡＰ１７Ａ、ＬＳＭ２およびＬＳＭ１４Ａ）。これは、他の制御因子の存在を強く示唆している。また、細胞集団全体が元に戻らないので、細胞のサブセットのみが救済されることも明らかである。老化細胞の「クローン」培養物でさえも、パラクリン阻害の程度に応じて、成長が停止しているが、老化していない細胞と老化細胞を含む不均一なものである。成長停止時の老化細胞の百分率は、同じ組織型の異なる細胞株であっても、約４０％から８０％超に及ぶことがある。
【００９７】
結論として、本発明者らは、加齢に伴う現象によるＥＲＫおよび／またはＡＫＴシグナル伝達の活性化が、ＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６転写因子の活性変化に至るイベントのカスケードにつながる可能性があるという証拠をここに提示する。本発明者らは、本研究で、ＥＴＶ６とＦＯＸＯ１がスプライシング因子の発現の新規な制御因子であること、およびそれらの活性の加齢による変化がスプライシングの調節異常や最終的には細胞老化につながることを初めて明らかにした。ＡＫＴおよびＥＲＫシグナル伝達経路の阻害剤は、すでに癌の治療薬として使用されており、これらの経路の遺伝子は、将来的に健康的な老化のための早期介入のターゲットとなる可能性があるという興味深い可能性を示している。
【００９８】
実験手順
ヒト初代線維芽細胞の培養
単一ドナーからの新生児包皮由来の正常ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ；Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（プロモセル）、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｕｒｇ）、ドイツ）を、２％ＦＢＳ、成長因子（組換え線維芽細胞成長因子および組換えヒトインスリン）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充した線維芽細胞増殖培地（Ｃ−２３０２０、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、ハイデルベルク、ドイツ）中で、６×１０３細胞／ｃｍ２の播種密度で培養した。集団倍加（ＰＤ）＝２５での初期継代細胞（８５％の成長画分および７％の老化画分）またはＰＤ＝６３での後期継代細胞（３３％の成長画分および５８％の老化画分）を、その後の実験に先立って１０日間培養して維持した。ＭＥＫ／ＥＲＫの阻害剤（トラメチニブ）およびＡＫＴの阻害剤（ＳＨ−６）を、文献（Ｋｒｅｃｈら、２０１０；Ｓｌａｃｋら、２０１５）の以前の研究に基づいて、１μＭまたは１０μＭで２４時間添加した。ビヒクルのみ（ＤＭＳＯ）の対照を各実験に含めた。変化した増殖動態から老化救済を分化させるために血清飢餓が必要とされた場合には、細胞を、線維芽細胞特異的な補充物がない状態で０．１％の血清および１％のペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマアルドリッチ）、ドーセット（Ｄｏｒｓｅｔ）、英国）中で、処理の前に２４時間維持した。
【００９９】
細胞老化の間の主要なシグナル伝達経路におけるリン酸化変化の評価
早期および後期継代初代ヒト線維芽細胞を２５ｃｍ２フラスコに６×１０３細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし、１０日間増殖させた。次いで、老化で活性化されると考えられている主要なシグナル伝達経路のタンパク質のリン酸化状態を、製造業者の使用説明書に従ってヒトＭＡＰＫリン酸化抗体アレイ（ａｂ２１１０６１、Ａｂｃａｍ（アブカム）、ブリストル（Ｂｒｉｓｔｏｌ）、英国）を使用して、初期継代（ＰＤ＝２５）または後期継代（ＰＤ＝６３）初代ヒト線維芽細胞からの細胞溶解物中で評価した。試験したリン酸化部位は以下の通りであった。ＡＫＴ（ｐＳ４７３）、ＣＲＥＢ（ｐＳ１３３）、ＥＲＫ１（ｐＴ２０２／Ｙ２０４）、ＥＲＫ２（ｐＴ１８５／Ｙ１８７）、ＧＳＫ３ａ（ｐＳ２１）、ＧＳＫｂ（ｐＳ９）、ＨＳＰ２７（ｐＳ８２）、ＪＮＫ（ｐＴ１８３）、ＭＥＫ（ｐＳ２１７／２２１）、ＭＫＫ３（ｐＳ１８９）、ＭＫＫ６（ｐＳ２０７）、ＭＳＫ２（ｐＳ３６０）、ｍＴＯＲ（ｐＳ２４４８）、ｐ３８（ｐＴ１８０／Ｙ１８２）、ｐ５３（ｐＳ１５）、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐＴ４２１／Ｓ４２４）、ＲＳＫ１（ｐＳ３８０）。簡単に言うと、膜を、ブロッキングバッファーを用いて室温で３０分間ブロッキングし、１ｍｌの細胞溶解物を４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、検出抗体カクテルを添加して２時間インキュベートし、次いで室温でＨＲＰ抗ウサギＩｇＧと２時間インキュベートした。膜を検出バッファーとインキュベートし、結果を化学発光イメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＬＩ−ＣＯＲバイオサイエンシーズ）、ネブラスカ州、米国）上で記録した。信号強度は、Ｉｍａｇｅ  ＳｔｕｄｉｏソフトウェアＶ５．２（ＬＩ−ＣＯＲ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ネブラスカ州、米国）を使用して定量化した。結果は、全細胞タンパク質含有量に対して正規化し、陽性対照との相対的な表現とした。
【０１００】
細胞老化の評価
ＰＤ＝６３の後期継代初代ヒト線維芽細胞を、６ウェルプレートに１ウェルあたり６×１０４個の細胞を３つの生物学的複製物で播種した。細胞は、１μＭおよび１０μＭのＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤トラメチニブまたはＡＫＴ阻害剤ＳＨ−６で、またはそれぞれ１μＭの２つの阻害剤の組み合わせで２４時間処理した。次に、細胞老化を、市販のキット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）を使用して３回に分けて試験した生化学的老化マーカーＳＡ  β−Ｇａｌを使用して評価した。製造業者の使用説明書に従って、複製物ごとに最低４００個の細胞を評価した。また、老化を、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）遺伝子の発現を評価することによって分子的に、および本発明者らの以前の研究（Ｈｏｌｌｙら、２０１３）と同様に、老化に典型的な細胞形態の変化によって定量化した。ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘプラットフォーム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライド・バイオシステムズ）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、米国）上で、ＧＵＳＢ、ＰＰＩＡおよびＧＡＤＰＨ内因性対照遺伝子に対する相対的なｑＲＴＰＣＲにより測定した。ＰＣＲ反応物は、合計５μｌの体積の中に２．５μｌ  ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＡＭＰｅｒａｓｅなし）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、米国）、０．２５μＭプローブ、および上記のように逆転写される０．５μｌ  ｃＤＮＡを含んでいた。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の１回のサイクルに続いて、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクルを行った。ｐ１６およびｐ２１の定量的ＲＴＰＣＲアッセイのアクセッション番号を下記表５に与える。
【０１０１】
【表６】
2021531317.tif 000012
【０１０２】
ＳＡＳＰタンパク質発現に対する処理関連の変化の定量化
ＰＤ＝６３の後期継代初代ヒト線維芽細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり６×１０４細胞で播種し、１０日間培養した後、１μＭまたは１０μＭのトラメチニブ（ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤）またはＳＨ−６（ＡＫＴ阻害剤）で２４時間処理した。その後、細胞上清を収穫し、−８０℃で保存した。ＧＭＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ−１２ｐ７０およびＴＮＦα  ＳＡＳＰ成分のレベルを、Ｋ１５００７Ｂ  ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙマルチプレックスＥＬＩＳＡイムノアッセイ（ＭＳＤ、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、米国）を用いて、４つの生物学的複製物で、処理した細胞およびビヒクルのみの対照細胞の細胞上清中で測定した。タンパク質は、製造業者の使用説明書に従い、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＳＩ−６０００を用いて標準曲線に対する相対定量を行った。
【０１０３】
ＥＲＫまたはＡＫＴ阻害で処理した後期継代初代ヒト線維芽細胞におけるスプライシング因子の発現の評価
ＰＤ＝６３の後期継代初代ヒト線維芽細胞を６ウェルプレートに３つの生物学的複製物として１ウェルあたり６×１０４細胞で播種し、１０日間増殖させた後、１μＭまたは１０μＭのＥＲＫ阻害剤トラメチニブまたはＡＫＴ阻害剤ＳＨ−６で２４時間処理した。ビヒクル（ＤＭＳＯ）のみの対照もまた、同じ成長条件で含めた。次に、本発明者らの以前の研究（Ｈａｒｒｉｅｓら、２０１１；Ｈｏｌｌｙら、２０１３；Ｌｅｅら、２０１６）において、以前に年齢、複製老化または寿命と関連づけられた２０種のスプライシング因子転写物の発現レベルを、ｑＲＴＰＣＲによって評価した。スプライシング因子アッセイのためのアクセッション番号は表５に与えられている。ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ライフ・テクノロジーズ）、フォスターシティー、米国）を製造業者の使用説明書に従って用いて抽出した。総ＲＮＡ（１００ｎｇ）を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＶＩＬＯキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２０μｌ反応物中で逆転写した。次いで、転写物発現を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  １２Ｋ  Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、米国）でＴａｑＭａｎ  Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ（ＴＬＤＡ）を用いて、各生物学的複製物について二重に定量した。サイクル条件は、５０℃で２分間、９４．５℃で１０分間の各１サイクルと、その後９７℃で３０秒間、５７．９℃で１分間の４０サイクルであった。反応混合物は、５０μｌ  ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、３０μｌ  ｄＨ２Ｏおよび２０μｌ  ｃＤＮＡテンプレートを含んでいた。１００μｌの反応混合物をＴＬＤＡカードチャンバーに分注し、１０００ｒｐｍで１分間２回遠心した。転写物発現を、ＩＤＨ３Ｂ、ＧＵＳＢおよびＰＰＩＡ内因性対照遺伝子との相対的な比較Ｃｔアプローチにより評価し、未処理の後期継代細胞からのＲＮＡ中のそれらの発現に正規化した。
【０１０４】
細胞増殖の評価
処理した細胞の増殖能は、Ｋｉ６７およびＢｒｄＵ染色によって、ならびに細胞数によって評価した。ＰＤ＝６３での後期継代初代ヒト線維芽細胞を２４ウェルプレートに３つの生物学的複製物で１ウェルあたり１×１０４細胞で播種し、１０日間増殖させた後、ｋｉ６７染色により細胞増殖についてアッセイした。Ｓ期の細胞の評価のために、ＰＤ＝６３の後期継代初代ヒト線維芽細胞を２４ウェルプレートに３つの生物学的複製物としてカバースリップあたり１×１０４細胞で播種し、１０日間増殖させた後、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）と２４時間インキュベートした。ＢｒｄＵの取り込みは、製造業者（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ））の使用説明書に従って、５−Ｂｒｏｍｏ−２’−デオキシ−ウリジン標識および検出キットＩによって決定した。ＢｒｄＵ陽性細胞を蛍光顕微鏡で可視化し、計数した。細胞数は、細胞のトリプシン化および懸濁後、処理した培養物およびビヒクルのみの培養物において、３つの生物学的複製物で手動で実施し、平均値（＋／ＳＥＭ）として提示する。処理後、細胞を４％ＰＦＡで１０分間固定し、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ（トリトン）と１０％血清を含むＰＢＳで１時間透過させた。Ｋｉ−６７染色は、ウサギモノクローナル抗体（ａｂ１６６６７、Ａｂｃａｍ、英国）を１：４００希釈して実施し、サンプルを４℃で一晩インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合二次ヤギ抗ウサギ抗体（１：４００）で１時間インキュベートし、核をＤＡＰＩでカウンター染色した。カバースリップを、ＤＡＫＯ蛍光マウント培地（Ｓ３０２３；Ｄａｋｏ（ダコ）、サンタクララ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ）、米国）中でスライドにマウントした。増殖指数は、Ｌｅｉｃａ  Ｄ４０００蛍光顕微鏡下で４００×倍率で各生物学的複製物から少なくとも４００個の核からのＫｉ６７陽性細胞の割合を数えることによって決定した。
【０１０５】
ＴＵＮＥＬアッセイを用いたアポトーシスの評価
末端ＤＮＡ切断点インサイツ３−ヒドロキシ末端標識（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＤＮＡ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ：ＴＵＮＥＬ）アッセイは、ＮＨＤＦ細胞におけるアポトーシスのレベルを定量するために行った。ＰＤ＝６３での後期継代初代ヒト線維芽細胞を２４ウェルプレート内に３つの生物学的複製物としてウェルあたり１×１０４細胞で播種し、１０日間成長させ、ＴＵＮＥＬアッセイをＣｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）  ＴＵＮＥＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー）、英国）を製造業者の使用説明書に従って用いて実施した。陰性（ビヒクルのみ）対照および陽性（ＤＮａｓｅ１）対照も実施した。アポトーシス指数は、４００×倍率で各生物学的複製物から少なくとも４００個の核からの陽性細胞の割合を数えることによって決定した。
【０１０６】
ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１遺伝子のノックダウン
無脊椎動物系におけるこれまでの研究では、キイロショウジョウバエにおける寿命の決定因子として、それぞれＥＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達に関与するＡｏｐおよびＦｏｘｏ遺伝子が特定されている（Ｓｌａｃｋら、２０１５）。これらの遺伝子の最も近いヒト同族体は、ＦＯＸ０１（Ｋｒａｍｅｒら、２００３）およびＥＴＶ６／ＴＥＬ（Ｊｏｕｓｓｅｔら、１９９７）である。本発明者らは、ＦＯＸＯ１またはＥＴＶ６遺伝子発現のノックダウンが、後期継代初代ヒト線維芽細胞における細胞老化およびスプライシング因子の発現に及ぼす影響を評価した。ＰＤ＝６３での後期継代細胞を６ウェルプレートに１ウェルあたり６×１０４細胞で播種し、１０日間培養した。アンチセンスオリゴヌクレオチド（モルフォリノ、ＭＯ）を、開始コドンの近傍にあるＦＯＸＯ１遺伝子またはＥＴＶ６遺伝子の５’非翻訳領域に設計した（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ  ＬＬＣ（ジーン・ツールズ）、フィロマス（Ｐｈｉｌｌｏｍａｔｈ）、米国）。モルフォリノオリゴヌクレオチド（１０μＭ）を、製造業者の使用説明書に従って、エンドポーター（ｅｎｄｏ−ｐｏｒｔｅｒ）送達により細胞に導入した。フルオレセイン結合スクランブル陰性対照モルフォリノも陰性対照として、また構築物の送達をモニターするために含めた。トランスフェクション効率は顕微鏡法で評価した。次いで、スプライシング因子の発現および細胞老化を上記のように決定した。結果は、遺伝子ノックダウンの別の方法、ｓｉＲＮＡによって確認した。本研究のために、ＰＤ＝６３での後期継代初代ヒト線維芽細胞を、６ウェルプレート中にウェルあたり６×１０４細胞の３つの生物学的複製物で播種し、１５ｎＭ  ＦＯＸＯ１、ＥＴＶ６  ｓｉＲＮＡまたは１５ｎＭ対照ｓｉＲＮＡ（Ｔｈｅｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）、ペーズリー（Ｐａｉｓｌｅｙ）、英国）を用いて４８時間トランスフェクションを実施した。ｓｉＲＮＡおよびモルフォリノ配列は表５に与えられている。
【０１０７】
ＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６の細胞内局在の評価
ＥＴＶ６およびＦＯＸＯ１タンパク質の細胞内局在を免疫蛍光により評価した。ＰＤ＝６３での後期継代初代ヒト線維芽細胞を２４ウェルプレートに３つの生物学的複製物としてカバースリップあたり１×１０４細胞で播種し、１０日間増殖させた後、細胞内局在化についてアッセイした。１μＭのトラメチニブまたはＳＨ−６で処理した後、細胞を４％ＰＦＡで１０分間固定し、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎおよび１０％血清を含むＰＢＳで１時間透過させた。抗ウサギＥＴＶ６（ａｂ６４９０９）および抗ウサギＦＯＸＯ１（Ａｂｃａｍ、英国）をそれぞれ１：１０００および１：１００の希釈で加え、サンプルを４℃で一晩インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合二次ヤギ抗ウサギ抗体（１：４００）で１時間インキュベートし、核をＤＡＰＩでカウンター染色した。カバースリップを、ＤＡＫＯ蛍光マウント培地（Ｓ３０２３；Ｄａｋｏ、サンタクララ、米国）中でスライドにマウントした。核局在は、Ｌｅｉｃａ  Ｄ４０００蛍光顕微鏡下で４００×倍率で各生物学的複製物から少なくとも５０個の細胞からの核染色の割合を数えることによって決定した。
【０１０８】
テロメア長の評価
３つの生物学的複製物にプレーティングし、次いで１μＭのＥＲＫ阻害剤トラメチニブまたはＡＫＴ阻害剤ＳＨ−６のいずれかで２４時間処理したＰＤ＝６３での２×１０５の後期継代初代ヒト線維芽細胞から、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州、米国）を製造業者の使用説明書に従って用いて、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの品質および濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ナノドロップ）分光光度法（ＮａｎｏＤｒｏｐ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州、米国）により確認した。相対的なテロメア長は、改変されたｑＰＣＲプロトコル（Ｏ’ＣａｌｌａｇｈａｎおよびＦｅｎｅｃｈ、２０１１）を用いて決定した。ＰＣＲ反応物は、３８４ウェルプレート中の５μｌの総体積の中に、１μｌのＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｓｏｌｉｓ  Ｂｉｏｄｙｎｅ（ソリス・バイオダイン）、タルトゥ（Ｔａｒｔｕ）、エストニア）、２μＭの各プライマーおよび２５ｎｇのＤＮＡを含んでいた。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応テロメアアッセイをＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ上で実行し、サイクル条件は次の通りであった：９５℃で１５分間の１回のサイクルに続いて、９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分間の４５サイクル。平均相対テロメア長は、単一コピー数遺伝子（３６Ｂ４）に対するテロメアリピートコピー数の比として計算し、未処理細胞のテロメア長に正規化した。
【０１０９】
統計解析
別段の記載がない限り、処理した培養物とビヒクルのみの対照培養物の間の差は、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって統計的有意性を評価した。統計解析は、コンピュータ支援のＰｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄプログラム（Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（グラフパッド・ソフトウェア）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州）を用いて実施した。
【０１１０】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）および遺伝子セットエンリッチメント解析
本研究の入力データは、ＥＴＶ６については４つの公開されているヒトＣｈＩＰデータセット、ＦＯＸＯ１については３つのデータセットであった。ＥＴＶ６のデータセットは、Ｋ５６２細胞由来の２セット（ＧＳＥ９１５１１およびＧＳＥ９５８７７）とＧＭ１２８７８細胞由来の２セット（ＧＳＥ９１９０４およびＧＳＥ９６２７４）を含んでいた。ＦＯＸＯ１データセットは、ヒト子宮内膜間質細胞（ＧＳＥ６９５４２）、ヒト白血病前Ｂ細胞（ＧＳＥ８０７７３）および正常ヒトＢ細胞（ＧＳＥ６８３４９）由来のデータセットを含んでいた。これらのデータセットをＣｉｓｔｒｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔソフトウェア（ｗｗｗ．ｃｉｓｔｒｏｍｅ．ｏｒｇ）にインポートし、デフォルトパラメータを使用したＢＥＴＡ（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔａｒｇｅｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）マイナスアプリケーションを使用して、ＦＯＸＯ１およびＥＴＶ６標的遺伝子の特定を行った。このソフトウェアは、シグナル対バックグラウンド比が５倍未満のピークをフィルタリングした後、制御可能性スコアに基づいて入力データ中の転写因子結合部位を検出する。次いで、２０１６  ｒｅａｃｔｏｍｅ（リアクトーム）インターフェースを使用して、Ｅｎｒｉｃｈｒプログラムを使用してＧＳＥＡ経路解析を実施した。
【０１１１】
上記の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護の範囲を制限することを意図するものではなく、むしろ、本発明がどのようにして実施され得るかの例を説明することを意図している。
【０１１２】
参考文献
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Ｈａｒｒｉｅｓ  ＬＷ、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｄ、Ｈｅｎｌｅｙ  Ｗ、Ｗｏｏｄ  ＡＲ、Ｈｏｌｌｙ  ＡＣ、Ｂｒａｄｌｅｙ−Ｓｍｉｔｈ  ＲＭ、Ｙａｇｈｏｏｔｋａｒ  Ｈ、Ｄｕｔｔａ  Ａ、Ｍｕｒｒａｙ  Ａ、Ｆｒａｙｌｉｎｇ  ＴＭ、Ｇｕｒａｌｎｉｋ  ＪＭ、Ｂａｎｄｉｎｅｌｌｉ  Ｓ、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  Ａ、Ｆｅｒｒｕｃｃｉ  Ｌ、Ｍｅｌｚｅｒ  Ｄ（２０１１）．  Ｈｕｍａｎ  ａｇｉｎｇ  ｉｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｆｏｃｕｓｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．  １０、８６８−８７８．
Ｈｅｉｎｔｚ  Ｃ、Ｄｏｋｔｏｒ  ＴＫ、Ｌａｎｊｕｉｎ  Ａ、Ｅｓｃｏｕｂａｓ  ＣＣ、Ｚｈａｎｇ  Ｙ、Ｗｅｉｒ  ＨＪ、Ｄｕｔｔａ  Ｓ、Ｓｉｌｖａ−Ｇａｒｃｉａ  ＣＧ、Ｂｒｕｕｎ  ＧＨ、Ｍｏｒａｎｔｔｅ  Ｉ、Ｈｏｘｈａｊ  Ｇ、Ｍａｎｎｉｎｇ  ＢＤ、Ａｎｄｒｅｓｅｎ  ＢＳ、Ｍａｉｒ  ＷＢ（２０１６）．  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＴＯＲＣ１  ｐａｔｈｗａｙ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ５４１、１０２−１０６．
Ｈｏｃｋ  Ｈ、Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  Ａ（２０１７）．  ＥＴＶ６  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ５４、９８−１０４．
Ｈｏｌｌｙ  ＡＣ、Ｍｅｌｚｅｒ  Ｄ、Ｐｉｌｌｉｎｇ  ＬＣ、Ｆｅｌｌｏｗｓ  ＡＣ、Ｔａｎａｋａ  Ｔ、Ｆｅｒｒｕｃｃｉ  Ｌ、Ｈａｒｒｉｅｓ  ＬＷ（２０１３）．  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｉｎｇ  ａｇｅ  ｉｎ  ｍａｎ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  １３４、３５６−３６６．
Ｊｏｕｓｓｅｔ  Ｃ、Ｃａｒｒｏｎ  Ｃ、Ｂｏｕｒｅｕｘ  Ａ、Ｑｕａｎｇ  ＣＴ、Ｏｕｒｙ  Ｃ、Ｄｕｓａｎｔｅｒ−Ｆｏｕｒｔ  Ｉ、Ｃｈａｒｏｎ  Ｍ、Ｌｅｖｉｎ  Ｊ、Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｏ、Ｇｈｙｓｄａｅｌ  Ｊ（１９９７）．  Ａ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＴＥＬ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ＥＴＳ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＥＬ−ＰＤＧＦＲ  ｂｅｔａ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６、６９−８２．
Ｋａｊｉｔａ  Ｋ、Ｋｕｗａｎｏ  Ｙ、Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｎ、Ｓａｔａｋｅ  Ｙ、Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｋ、Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｋ、Ａｋａｉｋｅ  Ｙ、Ｈｏｎｄａ  Ｍ、Ｍａｓｕｄａ  Ｋ、Ｒｏｋｕｔａｎ  Ｋ（２０１３）．  Ｅｔｓ１  ａｎｄ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  ２ｂｅｔａ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ４８、１２２２−１２３３．
Ｋａｎｇ  Ｘ、Ｃｈｅｎ  Ｗ、Ｋｉｍ  ＲＨ、Ｋａｎｇ  ＭＫ、Ｐａｒｋ  ＮＨ（２００９）．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ＭＳＨ２，  ｔｈｅ  ｈｎＲＮＰｓ  Ｋ  ａｎｄ  Ｄ，  ａｎｄ  ＧＲＨＬ２  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２８、５６５−５７４．
Ｋｏｕｒｔｉｓ  Ｎ、Ｔａｖｅｒｎａｒａｋｉｓ  Ｎ（２０１１）．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ａｇｅｉｎｇ：  ｉｎｔｒｉｃａｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３０、２５２０−２５３１．
Ｋｒａｍｅｒ  ＪＭ、Ｄａｖｉｄｇｅ  ＪＴ、Ｌｏｃｋｙｅｒ  ＪＭ、Ｓｔａｖｅｌｅｙ  ＢＥ（２００３）．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＦＯＸＯ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｐｈｅｎｏｃｏｐｙ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ．  ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  ３、５．
Ｋｒｅｃｈ  Ｔ、Ｔｈｉｅｄｅ  Ｍ、Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅ、Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｒ、Ｊｕｒｃｈｏｔｔ  Ｋ（２０１０）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＫＴ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＡＫＴ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ＳＨ−５  ａｎｄ  ＳＨ−６  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ．  ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ．  １０、２８７．
Ｌａｒｅａｕ  ＬＦ、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＳＥ（２０１５）．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＮＭＤ  ｉｓ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｋｉｎｇｄｏｍｓ  ｙｅｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ．  ３２、１０７２−１０７９．
Ｌａｔｏｒｒｅ  Ｅ、Ｂｉｒａｒ  ＶＣ、Ｓｈｅｅｒｉｎ  ＡＮ、Ｊｅｙｎｅｓ  ＪＣＣ、Ｈｏｏｐｅｒ  Ａ、Ｄａｗｅ  ＨＲ、Ｍｅｌｚｅｒ  Ｄ、Ｃｏｘ  ＬＳ、Ｆａｒａｇｈｅｒ  ＲＧＡ、Ｏｓｔｌｅｒ  ＥＬ、Ｈａｒｒｉｅｓ  ＬＷ（２０１７）．  Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｃｕｅ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．  ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １８、３１．
Ｌａｔｏｒｒｅ  Ｅ、Ｈａｒｒｉｅｓ  ＬＷ（２０１７）．  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒｓ，  ａｇｅｉｎｇ  ａｎｄ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ．  ３６、１６５−１７０．
Ｌｅｅ  ＢＰ、Ｐｉｌｌｉｎｇ  ＬＣ、Ｅｍｏｎｄ  Ｆ、Ｆｌｕｒｋｅｙ  Ｋ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＤＥ、Ｙｕａｎ  Ｒ、Ｐｅｔｅｒｓ  ＬＬ、Ｋｕｓｃｈｅｌ  Ｇ、Ｆｅｒｒｕｃｃｉ  Ｌ、Ｍｅｌｚｅｒ  Ｄ、Ｈａｒｒｉｅｓ  ＬＷ（２０１６）．  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．  １５、９０３−９１３．
Ｌｉｎ  Ｇ、Ｔａｎｇ  Ｚ、Ｙｅ  ＹＢ、Ｃｈｅｎ  Ｑ（２０１２）．  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＫＲＡＳ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｉｎ  ＳＷ６２０  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＲＡＳ−ＥＲＫ−ＩｋａｐｐａＢａｌｐｈａ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ．  ２７、１５２７−１５３４．
Ｌｉｎ  Ｘ、Ｙａｎ  Ｊ、Ｔａｎｇ  Ｄ（２０１３）．  ＥＲＫ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＩ３  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ  （ＰＩＫＫｓ）  ｉｎ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．  ２８、１５４７−１５５４．
Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ  ＮＪ、Ｆｅｎｅｃｈ  Ｍ（２０１１）．  Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｌｅｎｇｔｈ．  Ｂｉｏｌ  Ｐｒｏｃｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ．  １３、３．
Ｐａｒｄｏ  Ｒ、Ａｎｄｒｅｏｌｏｔｔｉ  ＡＧ、Ｒａｍｏｓ  Ｂ、Ｐｉｃａｔｏｓｔｅ  Ｆ、Ｃｌａｒｏ  Ｅ（２００３）．  Ｏｐｐｏｓｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＭＥＫ−ＥＲＫ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｂｙ  ＧＳＫ３  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ８７、４１７−４２６．
Ｐｉｓｅ−Ｍａｓｉｓｏｎ  ＣＡ、Ｒａｄｏｎｏｖｉｃｈ  Ｍ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  Ｋ、Ａｐｐｅｌｌａ  Ｅ、Ｂｒａｄｙ  ＪＮ（１９９８）．  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｐ５３  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７２、６３４８−６３５５．
Ｒａｓｉｇｈａｅｍｉ  Ｐ、Ｗａｒｄ  ＡＣ（２０１７）．  ＥＴＶ６  ａｎｄ  ＥＴＶ７：  Ｓｉｂｌｉｎｇｓ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  １１６、１０６−１１５．
Ｒｈｉｍ  ＪＨ、Ｌｕｏ  Ｘ、Ｇａｏ  Ｄ、Ｘｕ  Ｘ、Ｚｈｏｕ  Ｔ、Ｌｉ  Ｆ、Ｗａｎｇ  Ｐ、Ｗｏｎｇ  ＳＴ、Ｘｉａ  Ｘ（２０１６）．  Ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｒｋ−Ａｋｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ６、２６５４７．
Ｓａｌａｍａ  Ｒ、Ｓａｄａｉｅ  Ｍ、Ｈｏａｒｅ  Ｍ、Ｎａｒｉｔａ  Ｍ（２０１４）．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２８、９９−１１４．
Ｓａｌｉｈ  ＤＡ、Ｂｒｕｎｅｔ  Ａ（２００８）．  ＦｏｘＯ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｇｉｎｇ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０、１２６−１３６．
Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ａ、Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ  Ａ、Ｋａａｒｎｉｒａｎｔａ  Ｋ（２０１２）．  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  （ＳＡＳＰ）．  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．  ２４、８３５−８４５．
Ｓｈｉｎ  Ｃ、Ｍａｎｌｅｙ  ＪＬ（２００４）．  Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ５、７２７−７３８．
Ｓｌａｃｋ  Ｃ、Ａｌｉｃ  Ｎ、Ｆｏｌｅｙ  Ａ、Ｃａｂｅｃｉｎｈａ  Ｍ、Ｈｏｄｄｉｎｏｔｔ  ＭＰ、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｌ（２０１５）．  Ｔｈｅ  Ｒａｓ−Ｅｒｋ−ＥＴＳ−Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｓ  ａ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．  Ｃｅｌｌ．  １６２、７２−８３．
Ｓｕｈ  Ｙ、Ａｔｚｍｏｎ  Ｇ、Ｃｈｏ  ＭＯ、Ｈｗａｎｇ  Ｄ、Ｌｉｕ  Ｂ、Ｌｅａｈｙ  ＤＪ、Ｂａｒｚｉｌａｉ  Ｎ、Ｃｏｈｅｎ  Ｐ（２００８）．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｅｎｔｅｎａｒｉａｎｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．  １０５、３４３８−３４４２．
Ｔａｒｎ  ＷＹ（２００７）．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ．  １４、５１７−５２２．
ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ  ＪＭ（２０１４）．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｇｅｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ５０９、４３９−４４６．
ｖａｎ  Ｈｅｅｍｓｔ  Ｄ、Ｂｅｅｋｍａｎ  Ｍ、Ｍｏｏｉｊａａｒｔ  ＳＰ、Ｈｅｉｊｍａｎｓ  ＢＴ、Ｂｒａｎｄｔ  ＢＷ、Ｚｗａａｎ  ＢＪ、Ｓｌａｇｂｏｏｍ  ＰＥ、Ｗｅｓｔｅｎｄｏｒｐ  ＲＧ（２００５）．  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩＧＦ−１  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．  ４、７９−８５．
Ｗａｎｇ  Ｑ、Ｃｈｅｎ  Ｘ、Ｈａｙ  Ｎ（２０１７）．  Ａｋｔ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ｍｏｒｅ  ｉｓ  ｎｏｔ  ａｌｗａｙｓ  ｂｅｔｔｅｒ  （ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  １１７、１５９−１６３．
Ｗｅｂｂ  ＡＥ、Ｋｕｎｄａｊｅ  Ａ、Ｂｒｕｎｅｔ  Ａ（２０１６）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｆ  ＦＯＸＯ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ．  １５、６７３−６８５．
【図１】
2021531317.tif 000013
【図２】
2021531317.tif 000014
【図３】
2021531317.tif 000015
【図４】
2021531317.tif 000016
【図５】
2021531317.tif 000017
【図６】
2021531317.tif 000018
【図７】
2021531317.tif 000019
【図８】
2021531317.tif 000020
【図９】
2021531317.tif 000021
【図１０】
2021531317.tif 000022
【配列表】
2021531317000001.app
【国際調査報告】
2021531317.tif 000023
2021531317.tif 000024
2021531317.tif 000025
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2021531317.tif 000029