(57)【要約】遠赤染料プローブおよび非線形界面活性剤またはフォームバンを含む、液体および凍結乾燥された製剤の両方を含む製剤が開示されている。また、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を調製するための関連方法、ならびに関連キットおよび診断製品も開示されている。本発明は、例えば、安定化された遠赤染料プローブ製剤であって、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度の非線形界面活性剤と、少なくとも１つの緩衝剤と、を含み、前記製剤が、水溶液である、製剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化された遠赤染料プローブ製剤であって、
担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、
約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度の非線形界面活性剤と、
少なくとも１つの緩衝剤と、を含み、
前記製剤が、水溶液である、製剤。
【請求項２】
前記遠赤染料が、遠赤シアニン染料である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記遠赤シアニン染料が、シアニン５およびシアニン５．５からなる群から選択される、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
前記非線形界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびジギトニンからなる群から選択される、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記非線形界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、およびポリソルベート６０からなる群から選択されるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
前記非線形界面活性剤濃度が、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約０．１％（ｖ／ｖ）〜約３％（ｖ／ｖ）である、請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
前記非線形界面活性剤濃度が、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約３％（ｖ／ｖ）である、請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
前記少なくとも１つの緩衝剤が、トリスである、請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
前記トリス緩衝剤が、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在する、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
前記担体分子が、核酸である、請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
前記核酸担体分子が、ＲＮＡである、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１２】
前記遠赤染料プローブが、消光剤をさらに含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
前記遠赤染料プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎプローブからなる群から選択される、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
第１の増幅オリゴマーをさらに含み、
前記遠赤染料プローブが、標的核酸の標的領域内に含有される第１の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１の増幅オリゴマーが、前記標的領域内に含有される第２の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１の増幅オリゴマーが、鋳型として標的核酸を含む増幅アッセイにおいて、前記標的領域を含有する増幅産物を産出するように構成される、請求項１０に記載の製剤。
【請求項１５】
第２の増幅オリゴマーをさらに含む、請求項１４に記載の製剤であって、
前記第２の増幅オリゴマーが、前記標的領域内に含有される第３の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、
前記第１および第２の増幅オリゴマーが、増幅アッセイの複数のサイクルで前記標的領域を増幅するように構成される、製剤。
【請求項１６】
前記第１の増幅オリゴマーが、前記第１の標的ハイブリダイズ配列の５’に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモーターベースの増幅オリゴマーである、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１７】
前記増幅アッセイを行うのに好適な１つ以上のヌクレオチド三リン酸をさらに含む、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１８】
前記増幅アッセイを行うのに好適な１つ以上の塩または補因子をさらに含む、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１９】
安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤を調製する方法であって、
請求項１に記載の製剤を提供することと、
前記水溶液を凍結乾燥して、前記凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を形成することと、を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法によって調製された、安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年２月６日に出願された仮出願番号６２／６２７，０４０号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、配列表を含有する。２０１９年２月５日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、「ＤＩＡ．００４１−０３−ＰＣＴ＿＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられ、サイズは、５ＫＢである。
【背景技術】
【０００３】
遠赤色蛍光染料を含むプローブは、例えば、インビトロ検出アッセイ、従来のおよび超解像局在性の顕微鏡法、および生細胞イメージングを含む、多くのバイオサイエンスの用途で広く使用されている。遠赤色蛍光染料はまた、他の一般的に使用されているフルオロフォアおよび蛍光タンパク質とのスペクトルの重なりが限られているため、多重化に特に便利である。しかしながら、遠赤染料プローブの製剤は、再構成および／または水性形態での保存後の蛍光信号の有意な損失のために、重大な課題を提示する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本発明は、安定化された遠赤染料プローブ製剤を提供する。いくつかの実施形態では、製剤は、一般に、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度の非線形界面活性剤と、少なくとも１つの緩衝剤とを含み、製剤は、水溶液である。他の実施形態では、製剤は、一般に、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度のフォームバンと、少なくとも１つの緩衝剤とを含み、製剤は、水溶液である。好適な緩衝剤は、トリスであり、いくつかのそのような変形例では、トリス緩衝剤は、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在する。特に好適な遠赤染料には、例えば、シアニン５またはシアニン５．５などの遠赤シアニン染料が含まれる。
【０００５】
上記のような非線形界面活性剤を含む安定化された遠赤染料プローブ製剤の特定の実施形態では、非線形界面活性剤は、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、またはポリソルベート６０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。他の変形例では、非線形界面活性剤は、ジギトニンである。好適な非線形界面活性剤濃度には、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、または約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度が含まれる。いくつかの実施形態では、非線形界面活性剤濃度は、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約２％（ｖ／ｖ）である。
【０００６】
上記のような安定化された遠赤染料プローブ製剤のいくつかの実施形態では、担体分子は、例えば、ＲＮＡなどの核酸である。他の非相互排他的な実施形態では、遠赤染料プローブは、消光剤をさらに含み、いくつかのそのような変形例では、遠赤染料プローブは、分子トーチ、分子ビーコン、またはＴａｑＭａｎプローブである。いくつかの核酸プローブの実施形態では、製剤は、第１の増幅オリゴマーをさらに含み、（ｉ）遠赤染料プローブは、標的核酸の標的領域内に含有される第１の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｉｉ）第１の増幅オリゴマーは、標的領域内に含有される第２の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｉｉｉ）第１の増幅オリゴマーは、鋳型として標的核酸を含む増幅アッセイにおいて、標的領域を含有する増幅産物を産出するように構成される。上記のような第１の増幅オリゴマーをさらに含有するいくつかの実施形態では、製剤は、標的領域内に含有される第３の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーをさらに含み、第１および第２の増幅オリゴマーは、増幅アッセイの複数のサイクルで標的領域を増幅するように構成される。第１の増幅オリゴマーをさらに含有する製剤のいくつかの変形例では、第１の増幅オリゴマーは、第１の標的ハイブリダイズ配列の５’に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモーターベースの増幅オリゴマーである。核酸遠赤染料プローブを含み、上記のような第１の増幅オリゴマーをさらに含有する製剤は、例えば、１つ以上のヌクレオチド三リン酸および／または１つ以上の塩もしくは補因子などの増幅アッセイを行うのに好適な１つ以上の追加の成分をさらに含み得る。
【０００７】
別の態様では、本発明は、安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤を調製する方法を提供する。この方法は、一般に、（ａ）上記のような安定化された遠赤染料プローブ製剤を提供することと、（ｂ）水溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を形成することと、を含む。別の態様では、本発明は、前述の方法によって調製された、安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、上述のような水性製剤への再構成を可能にする、安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、（ｉ）上記のような凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を含有する第１の密封容器と、（ｉｉ）希釈剤を含有する第２の密封容器と、を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、希釈剤は、非線形界面活性剤またはフォームバンを含み、いくつかのそのような実施形態では、非線形界面活性剤またはフォームバンは、希釈剤中に約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える（例えば、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約０．５％（ｖ／ｖ）〜約０．５％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ））濃度で存在する。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、安定化された水性遠赤染料プローブ製剤を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、一般に、（ａ）上記のような凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を提供することと、（ｂ）凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を希釈剤に溶解して、再構成された製剤を提供することと、を含む。いくつかの実施形態では、希釈剤は、非線形界面活性剤またはフォームバンを含み、いくつかのそのような実施形態では、非線形界面活性剤またはフォームバンは、希釈剤中に約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える（例えば、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約０．５％（ｖ／ｖ）〜約０．５％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ））濃度で存在する。
【００１１】
他の実施形態では、安定化された水性遠赤染料プローブ製剤を調製する方法は、一般に、（ａ）少なくとも１つの緩衝剤と、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、を含む水溶液への再構成を可能にする凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を提供することと、（ｂ）凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を希釈剤に溶解して、再構成された製剤を提供することと、を含み、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤のうちの少なくとも１つが、非線形界面活性剤またはフォームバンを含み、再構成された製剤が、約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度の非線形界面活性剤またはフォームバンを含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤の両方とも、非線形界面活性剤またはフォームバンを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、遠赤染料プローブおよび少なくとも１つの緩衝剤を含む水溶液を凍結乾燥することによって、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を調製することをさらに含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つの緩衝剤と、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、を含む水溶液への再構成を可能にする凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を含有する第１の密封容器と、（ｉｉ）希釈剤を含有する第２の密封容器と、を含むキットを提供し、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤のうちの少なくとも１つが、非線形界面活性剤またはフォームバンを含み、希釈剤中での凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤の再構成が、約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える最終的な非線形界面活性剤またはフォームバン濃度を提供する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤の両方とも、非線形界面活性剤またはフォームバンを含む。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、上述のような安定化された遠赤染料プローブ製剤を含有する密封容器を含む診断製品を提供する。
これらの態様および本発明の他の態様は、本発明の以下の詳細な説明を参照すると明らかになるであろう。
【００１４】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、特に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。
【００１５】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「遠赤染料」という用語は、約６３０ｎｍ〜約８００ｎｍの最大発光を有する蛍光分子を指す。いくつかの実施形態では、遠赤染料は、約６３０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約６４０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約６３０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６４０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約６３０ｎｍ〜約６８０ｎｍ、または約６４０ｎｍ〜約６８０ｎｍの最大発光を有する。典型的には、遠赤染料は、長波長の励起源（例えば、約６２５ｎｍ〜約６５５ｎｍの波長を提供するレーザー源）によって励起される。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「担体分子」という用語は、遠赤染料に共有結合することができる生物学的または非生物学的成分を指す。標識担体分子は、１つ以上のインビトロ、原位置、またはインビボの生物学的または生化学的標的、プロセス、または反応を監視または検出するためのプローブとして有用である。そのような成分には、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、薬物、ホルモン、脂質、リポタンパク質、脂質集合体、合成ポリマー、高分子微粒子、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。いくつかの変形例では、担体分子は、別の分子との特異的結合相互作用が可能な部分または領域（例えば、核酸担体分子の標的ハイブリダイズ配列、または例えば抗体の抗原結合部位などのタンパク質の結合部位）を含む。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「共有結合」は、直接共有結合、またはリンカー部分に対応するいくつかの原子を介する共有結合を示す。
【００１９】
本明細書に記載されるような界面活性剤を含有する凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤に関して「安定化された」という用語は、遠赤染料プローブ製剤が、検出アッセイで使用されるとき、凍結乾燥形態から水性形態への再構成時（０日目）、ならびに再構成後３０日目かつ再構成された製剤を２〜８℃で３０日間保存した後（３０日目）に、０日目に対する３０日目の相対蛍光単位（ＲＦＵ）の約２０％未満の低下を示すことを意味する。本明細書に記載されるような界面活性剤を含有する水性遠赤染料プローブ製剤を指すために使用される場合、「安定化された」という用語は、水性遠赤染料プローブ製剤が、（ａ）上記で定義されたような安定化された凍結乾燥製剤から再構成されるか、または（ｂ）上記で定義されたような安定化された凍結乾燥製剤を得るために凍結乾燥することができるかのいずれかを意味する。いくつかの変形例では、安定化された遠赤染料プローブ製剤は、約１５％未満のＲＦＵ低下、約１２％未満の低下、または約１０％未満のＲＦＵ低下を示す。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「非線形界面活性剤」という用語は、分岐鎖構造を有する界面活性剤を意味する。非線形界面活性剤は、例えば、主鎖および／または１つ以上の分岐鎖にあり得る１つ以上の環構造を含み得る。例示的な非線形界面活性剤には、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、およびジギトニンが含まれる。ある変形例では、非線形界面活性剤は、非イオン性である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「安定化界面活性剤」という用語は、非線形界面活性剤またはフォームバンを意味する。
【００２２】
「核酸」は、窒素ヘテロ環塩基または塩基類似体を有する２つ以上の共有結合したヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指し、ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合または他の結合によって互いに結合されて、ポリヌクレオチドを形成する。核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマーもしくはオリゴヌクレオチド、およびそれらの類似体が含まれる。核酸「骨格」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ中の、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号を参照されたい）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む様々な結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボースもしくはデオキシリボースのいずれか、または既知の置換、例えば、２’メトキシ置換および２’ハライド置換（例えば２’−Ｆ）を有する同様の化合物であり得る。窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えば、イノシン、５−メチルイソシトシン，イソグアニン；Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈ  ｅｄ．，１９９２、Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３：６１７−２４）であってもよく、これは、プリンまたはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン、デアザ−またはアザ−ピリミジン、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２、６、および／または８位に改変または置き換え置換基を有するプリン塩基、例えば、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、ならびにピラゾロ−化合物、例えば、非置換または３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号、およびＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）を含む。核酸は、骨格が１つ以上の残基に対して窒素塩基を含まない「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られるような従来の糖、塩基、および結合のみを含んでもよく、または従来の成分および置換（例えば、２’メトキシ骨格によって結合される従来の塩基、または従来の塩基および１つ以上の塩基類似体の混合物を含む核酸）を含んでもよい。核酸は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含んでもよく、ここで、１つ以上のヌクレオチドモノマーは、ＲＮＡ模倣糖立体構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、これは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相補的配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する（Ｖｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１３２３３−４１，２００４）。核酸は、核酸の機能または挙動を変化させるための修飾塩基、例えば、さらなるヌクレオチドが核酸に付加されるのを阻止するための３’−末端ジデオキシヌクレオチドの付加を含み得る。インビトロで核酸を作製するための合成方法は、当該技術分野において周知であるが、核酸は、日常的な技術を使用して天然源から精製されてもよい。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭素糖、および窒素塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭素糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５炭素糖は、２’−デオキシリボースである。この用語はまた、リボースの２’位にあるメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）などのそのようなサブユニットの類似体も含む。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「標的核酸」は、検出されるべき標的配列を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載されるようなＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、標的配列以外の他の配列を含んでもよい。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、検出されるべき標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」には、検出プロセス（例えば、ＴＭＡまたはＰＣＲなどの増幅ベースの検出アッセイ）中にオリゴヌクレオチド（例えば、プローブオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合する複合配列が含まれる。標的核酸がもともと一本鎖である場合、「標的配列」という用語はまた、標的核酸中に存在するような「標的配列」に相補的な配列を指すであろう。標的核酸がもともと二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（−）鎖の両方を指す。標的配列を選択する際、当業者は、無関係な標的核酸と密接に関連する標的核酸とを区別するために「特有な」配列が選択されるべきであることを理解するであろう。
【００２６】
「標的ハイブリダイズ配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの部分を指すために本明細書において使用される。好ましくは、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成される。標的ハイブリダイズ配列は、それらがハイブリダイズするように構成された標的配列の部分に１００％相補的であってもよいが、必ずしもそうでなくてよい。標的ハイブリダイズ配列はまた、標的配列に対して挿入、欠失、および／または置換されたヌクレオチド残基を含んでもよい。例えば、標的核酸が種（例えば、細菌またはウイルス種の様々な株）内の複数の株である場合、標的ハイブリダイゼーション配列の標的配列に対する１００％未満の相補性が生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有するように標的ハイブリダイズ配列を構成する他の理由が存在することが理解される。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「領域」という用語は、核酸の一部分を指し、該一部分は、全核酸よりも小さい。例えば、参照される核酸がプロモーターベースの増幅オリゴマーである場合、「領域」という用語は、全オリゴヌクレオチドのより小さいプロモーター部分を指すために使用され得る。同様に、かつまた単なる例として、核酸が標的核酸である場合、「領域」という用語は、核酸のより小さい領域を指すために使用され得、より小さい領域は、１つ以上のオリゴヌクレオチドによって標的化される。
【００２８】
「オリゴマー」、「オリゴ」、および「オリゴヌクレオチド」という互換性のある用語は、一般に１，０００未満のヌクレオチド（ｎｔ）残基を有する核酸を指し、約５ｎｔの残基の下限および約５００〜９００ｎｔの残基の上限を有する範囲内のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１２〜１５ｎｔの下限および約５０〜６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲にあり、他の実施形態は、約１５〜２０ｎｔの下限および約２２〜１００ｎｔの上限を有する範囲にある。オリゴヌクレオチドは、自然発生源から精製されてもよく、または様々な周知の酵素的または化学的方法のいずれかを使用して合成されてもよい。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対するいかなる特定の機能も示さず、むしろ、本明細書に記載される全てのそのような試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、オリゴヌクレオチドが相補鎖に対して特異的、それにハイブリダイズすることが可能であり、核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長することができる場合、それは、プライマーとして機能し得、オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含有し、転写を可能にする場合、それは、プライマーとして機能し、プロモーターを提供し得（例えば、Ｔ７プライマー）、オリゴヌクレオチドが標的核酸またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることが可能であり、検出可能な部分（例えば、遠赤染料）をさらに提供する場合、それは、標的核酸を検出するように機能し得る。
【００２９】
「増幅オリゴマー」は、少なくともその３’末端が標的核酸に相補的であり、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの例は、標的核酸にハイブリダイズし、増幅プロセスにおいてポリメラーゼによって伸長される３’ＯＨ末端を含有する「プライマー」である。増幅オリゴマーの別の例は、ポリメラーゼによって伸長されない（例えば、それが３’ブロック化末端を有するため）が、増幅に関与するかまたは増幅を促進するオリゴマーである。例えば、増幅オリゴヌクレオチドの５’領域は、標的核酸に非相補的であるプロモーター配列（これは、「プロモータープライマー」または「プロモータープロバイダー」と称され得る）を含み得る。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが５’プロモーター配列を含むように修飾され得、したがってプロモータープライマーとして機能することを理解するであろう。３’ブロック化末端を組み込むことは、今や標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始するのに役立つ上流プロモーター配列を提供することが可能であるが、オリゴ伸長のためのプライマーを提供しないプロモータープライマーをさらに修飾する。そのような修飾オリゴは、本明細書において「プロモータープロバイダー」オリゴマーと称される。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲は、約１０〜約７０ｎｔの長さであり（いかなるプロモーター配列またはポリＡテールも含まない）、標的核酸配列（またはその相補鎖）の領域に相補的である少なくとも約１０個の連続した塩基、さらには少なくとも１２個の連続した塩基を含有するものを含む。連続した塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または完全に相補的である。増幅オリゴマーは、修飾されたヌクレオチドもしくは類似体、または増幅反応に関与するが、標的核酸もしくは鋳型配列に相補的でも含有されてもいない、さらなるヌクレオチドを任意に含んでもよい。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「プロモーターベースの増幅オリゴマー」は、プロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーのいずれかを意味する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、核酸に結合し、特異的部位でＲＮＡの転写を開始する信号として、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって認識される特異的核酸配列である。
【００３２】
「増幅」とは、標的核酸配列、またはその相補体もしくはそのフラグメントの複数のコピーを得るための任意の既知の手順を指す。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物と称され得る。既知の増幅方法としては、熱サイクル増幅法および等温増幅法の両方が挙げられる。いくつかの実施形態では、等温増幅法が好ましい。レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介または転写関連増幅が、核酸増幅法の非限定的な例である。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対、および熱サイクルを使用して、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成するか、またはｃＤＮＡから合成する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号）。ＬＣＲ増幅は、４つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する（例えば、米国特許第５，４２７，９３０号および米国特許第５，５１６，６６３号）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼ、および標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマー使用し、それにより、一連のプライマー伸長および鎖置換ステップで増幅が生じる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号、米国特許第５，５４７，８６１号、および米国特許第５，６４８，２１１号）。増幅方法には、転写媒介増幅（ＴＭＡ）またはＮＡＳＢＡなどのＲＮＡ標的核酸の増幅に好適な実施形態が含まれる
【００３３】
「転写関連増幅」はまた、本明細書では「転写媒介増幅」（ＴＭＡ）と称され、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅を指す。これらの方法は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター配列を含む鋳型相補オリゴヌクレオチドを用い、任意に１つ以上の他のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。転写関連増幅の変形は、以前に詳細に開示されているように（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号、同第５，１２４，２４６号、同第５，１３０，２３８号、同第５，３９９，４９１号、同第５，４３７，９９０号、同第５，５５４，５１６号、および同第７，３７４，８８５、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１３０２号、同第ＷＯ８８／１０３１５号、および同第ＷＯ９５／０３４３０号）、当該技術分野において周知である。
【００３４】
「増幅産物」と互換的に使用される「アンプリコン」という用語は、標的配列内に含有される配列に相補的または相同である、増幅手順の間に産生される核酸分子を指す。これらの用語は、一本鎖増幅産物、二本鎖増幅産物、または二本鎖増幅産物の鎖のうちの一方を指すために使用することができる。
【００３５】
「検出オリゴヌクレオチド」および「検出プローブオリゴマー」は、標的配列または増幅された核酸の検出を可能にするために、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸中または増幅された核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを指すために本明細書において互換的に使用される。検出は、直接的（例えば、その標的配列に直接ハイブリダイズされたプローブ）または間接的（例えば、中間分子構造を介してその標的に結合されたプローブ）のいずれかであってもよい。検出プローブオリゴマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの組み合わせであり得る。検出プローブオリゴマーの「標的配列」は、一般に、標準的な塩基対合によってプローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、より大きい核酸配列内のより小さい核酸配列を指す。検出プローブオリゴマーは、標的特異的配列、およびプローブの三次元立体構造に寄与する他の配列を含み得る（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６／００６８４１７号）。
【００３６】
「ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ」という用語は、典型的には５’塩基に蛍光染料、典型的には３’塩基に非蛍光消光染料（消光剤）を含有する検出オリゴヌクレオチドを指す。照射されると、励起された蛍光染料は、蛍光ではなく近くの消光染料分子にエネルギーを移動し、非蛍光基質をもたらす。増幅中、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎプローブが切断されて、フルオロフォアが消光剤から分離され、それにより、増幅の指標としてフルオロフォアから非消光信号が放出される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「分子トーチ」と称される構造は、結合領域（「標的結合ドメイン」）によって接続され、かつ所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性の異なる領域（「閉鎖ドメイン」）を含むように設計されている。標的閉鎖ドメインを含むヌクレオチド配列の全部または一部はまた、標的結合ドメインとして機能し得る。したがって、標的閉鎖配列は、標的結合配列、非標的結合配列、およびこれらの組み合わせを含むことができる。
【００３８】
「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」は、自然に生成されたもの、または合成によって生成されたものにかかわらず、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約２５個以下のアミノ酸残基のポリペプチドは、一般に「ペプチド」と称される。
【００３９】
「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、炭水化物基などの非ペプチド成分を含み得る。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加されてもよく、細胞の種類によって異なる。
【００４０】
「ペプチドアプタマー」は、標的タンパク質に特異的に結合し、タンパク質足場内にループとして埋め込まれているペプチドである。一般的に、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８：４２１５−４２２２、２０１１を参照されたい。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する任意の免疫グロブリンタンパク質、ならびにその抗原結合断片およびその組み換え変異体を指す。したがって、「抗体」という用語には、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦ（ｖ）断片などの無傷の抗体のパラトープを含有する抗原結合抗体断片が含まれる。キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖフラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ、線状抗体、多価または多特異的ハイブリッド抗体などの遺伝子組み換えされた無傷抗体および断片も含まれる。したがって、「抗体」という用語は、抗体の抗原結合部位を含み、その抗原に結合することができる任意のタンパク質を含むように広範に使用される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「希釈剤」という用語は、本明細書で説明される例示的または適切な濃度を変更または達成するのに好適な溶液を指す。
【００４３】
「容器」という用語は、例えば保存のために、物体または液体をその中に配置または収容することができるもの（例えば、ホルダー、容器、器など）を指す。
【００４４】
本明細書における数値範囲（例えば、「Ｘ〜Ｙ」または「Ｘ〜Ｙ」）への言及は、範囲を定義する端点および範囲内に入る全ての値を含む。
【００４５】
文脈からそうでないことが明らかでない限り、値が「約」Ｘまたは「およそ」Ｘとして表現される場合、Ｘの記載値は、±１０％まで正確であると理解されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、非線形界面活性剤およびフォームバンから選択される界面活性剤を含む遠赤染料プローブの安定化された製剤を提供する。製剤は、部分的には、界面活性剤含有製剤が、安定化界面活性剤を含有していない製剤と比較して、水性形態で長期にわたって保存された場合に、遠赤染料プローブの蛍光信号強度（ＲＦＵ）の損失の減少を示すという驚くべき観察に基づいている。理論に拘束されるつもりはないが、本発明者らは、安定化界面活性剤の非存在下での緩衝剤中の遠赤染料プローブは、時間の経過とともに凝集して、組織化された構造（例えば、ミセル）を形成し、そこで、より多くの非極性フルオロフォア分子が非常に密接に接触し、自己消光する傾向があり、安定化界面活性剤（例えば、非極性の非線形界面活性剤）の存在下では、フルオロフォア分子がもう近接せず、そのため自己消光できないように、遠赤染料プローブの凝集が破壊されると考える。特に好適な非線形界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、およびポリソルベート６０）およびジギトニンが含まれる。
【００４７】
特定の実施形態では、安定化された遠赤染料プローブ製剤は、水性製剤である。そのような製剤は、例えば、事前に凍結乾燥された製剤、または凍結乾燥された形態から再構成されたものであってもよい。いくつかの変形例では、製剤は、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、非線形界面活性剤およびフォームバンから選択される、約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度の界面活性剤と、少なくとも１つの緩衝剤とを含有する水溶液として提供される。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約３％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約３％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約３％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約３％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。より具体的な変形例では、界面活性剤は、約０．４１％（ｖ／ｖ）、約０．６２％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約１．２４％（ｖ／ｖ）、約１．５％（ｖ／ｖ）、約１．６％（ｖ／ｖ）、または約３％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。
【００４８】
緩衝剤は、典型的には、例えばインビトロまたは原位置アッセイなどの生物系における遠赤染料プローブの使用に好適なｐＨを維持するのに十分な濃度で存在する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約５．５〜約８．５、約６．０〜約８．０、約６．５〜約８．０、または約６．５〜約７．５の範囲のｐＨを維持するのに十分な濃度で存在する。好適な緩衝剤には、トリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、およびヒスチジンが含まれる。特定の実施形態では、Ｔｒｉｓ緩衝剤は、約５ｍＭ〜約５０ｍＭまたは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在する。本発明による製剤のための緩衝剤の他の好適な濃度は、当業者によって容易に決定され得る。
【００４９】
特定の変形例では、製剤、例えば凍結乾燥に好適なもの、凍結乾燥形態から再構成されたもの、または本明細書に記載されるような水性製剤に再構成するための凍結乾燥された製剤は、凍結保護剤を含有し得る。例示的な凍結保護剤には、グリセロール、非還元糖、例えば、スクロース、ラフィノース、またはトレハロース、およびアミノ酸、例えば、グリシン、アルギニン、またはメチオニンが含まれる。凍結乾燥時の担体分子の許容できない量の分解および／または凝集を防止するための好適な濃度の選択を含む、凍結保護剤の使用は、当技術分野において一般に周知である。凍結保護剤がグリセロールであるいくつかの変形例では、水性製剤中の凍結保護剤濃度は、約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）〜約８％（ｖ／ｖ）、または約２％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）の範囲にある。
【００５０】
本明細書に記載される安定化された製剤中の遠赤染料プローブの濃度は、特定のプローブ担体分子および所望の用途に応じて異なり、好適なプローブ濃度は、特定の用途に関連して当業者によって容易に決定され得る。特定の変形例では、遠赤染料プローブ（例えば、核酸担体分子を含む遠赤染料プローブ）は、約０．０１μＭ〜約５０ｍＭ、約０．０１μＭ〜約５ｍＭ、約０．０５μＭ〜約５００μＭ、約０．０５μＭ〜約１００μＭ、約０．１μＭ〜約１００μＭ、または約０．１μＭ〜約５０μＭの濃度で安定化された製剤中に存在する。他の変形例では、遠赤染料プローブ（例えば、核酸担体分子を含む遠赤染料プローブ）は、約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、または約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で安定化された製剤中に存在する。
【００５１】
本発明に従って使用するのに好適な遠赤染料には、Ｃｙａｎｉｎｅ５（Ｃｙ５）、Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（Ｃｙ５．５）、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６３５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７、ＱＵＡＳＡＲ（登録商標）７０５、ＱＵＡＳＡＲ（登録商標）６５０、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６４９、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）６５０、ＨＩＬＹＴＥ（商標）６４７、ＡＴＴＯ（商標）６４７、およびＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）が含まれる。ＣｙＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ染料およびＨＩＬＹＴＥ  Ｆｌｕｏｒ染料は、カリフォルニア州フリーモントのＡｎａＳｐｅｃ、Ｉｎｃ．から入手可能である。ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ染料は、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能である。ＡＴＴＯ（商標）６４７、およびＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）は、ミズーリ州セントルイスのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｓｉｇｍａから入手可能である。Ｃｙａｎｉｎｅ５とＣｙａｎｉｎｅ５．５は、バージニア州スターリングのＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能である。ＱＵＡＳＡＲ６５０およびＱＵＡＳＡＲ７０５は、カリフォルニア州ペタルマのＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である。その他の供給会社には、Ｄｙｏｍｉｃｓ（イエナ、ドイツ）およびＡｔｔｏ−Ｔｅｃ  ＧｍｂＨ（ジーゲン−ワイデナウ、ドイツ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、遠赤染料は、例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ６４７、またはＡＴＴＯ６４７などの遠赤シアニン染料である。
【００５２】
本発明に従って、様々な担体分子を使用することができる。好適な担体分子には、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）、アミノ酸、タンパク質（例えば、ペプチド、抗体）、多糖類、ホルモン、薬物、脂質、リポタンパク質、脂質集合体、合成ポリマー、高分子微粒子、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。別の分子との特異的結合相互作用が可能な部分または領域を含む担体分子が特に好適である。
【００５３】
特定の変形例では、プローブ担体分子は、例えば標的核酸などの標的分子に特異的に結合する核酸である。特に好適な核酸担体分子には、標的核酸の標的領域に含有される標的配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチド担体は、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴマー、またはＤＮＡとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせを含有するオリゴマー、または修飾骨格で合成されたオリゴマー、例えば、１つ以上の２’−メトキシ置換リボヌクレオチドを含むオリゴマーであり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド担体分子を含むプローブは、遠赤染料に加えて消光剤を含み、この組み合わせは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイにおいて特に有用であり、そのようなプローブの具体的な変形例には、例えば、ＴａｑＭａｎ検出プローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および「分子ビーコン」（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３，１９９８、米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号を参照されたい）が含まれる。
【００５４】
標的ハイブリダイズ配列を含むオリゴヌクレオチド担体分子は、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含み得る。非標的ハイブリダイズ配列を含むオリゴヌクレオチドプローブの具体的な実施形態は、例えば、一般にヘアピンと称される立体構造などの、分子内ハイブリダイゼーションによって保持される立体構造を形成するプローブを含む。特に好適なヘアピンプローブには、「分子トーチ」（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および第６，３６１，９４５号を参照されたい）、および「分子ビーコン」（例えば、Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．、上記、ＵＳ５，１１８，８０１およびＵＳ５，３１２，７２８、上記を参照されたい）が含まれる。そのようなヘアピンプローブを使用するための方法は、当技術分野で周知である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド担体分子は、分子内結合によって保持される立体構造を実質的に形成しない線状オリゴマーである。
【００５５】
他の実施形態では、プローブ担体分子は、タンパク質である。特に好適なタンパク質担体分子には、抗体、ならびに例えばペプチド（例えば、神経ペプチド、ペプチドホルモン）、ペプチドアプタマー、抗体結合タンパク質、毒素、レクチン、成長因子、サイトカイン、酵素、および酵素基質などの別の分子に対して結合特異性を有する他のタンパク質が含まれる。抗体結合タンパク質は、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、可溶性Ｆｃ受容体、プロテインＬ、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＤ、抗ＩｇＥ、およびそれらの断片を含み得る。いくつかの変形例では、ペプチド担体分子は、細胞輸送メカニズムによる特定の細胞下部構造内の局在化のために結合した遠赤染料を標的化することにより、オルガネラ局在化ペプチドとして機能することができる。いくつかの変形例では、タンパク質担体分子（例えば、抗体、ペプチド、ペプチドアプタマー、レクチン）は、細胞表面分子に特異的に結合し、抗体などの細胞表面結合タンパク質が、例えば、顕微鏡法、細胞計数、細胞選別、およびバイオマーカー検出を含む、例えば、様々な細胞画像化およびフローサイトメトリー用途で使用され得る。
【００５６】
さらに他の実施形態では、担体分子は、糖脂質、リン脂質、およびスフィンゴ脂質を含む脂質（例えば、６〜２５個の炭素を有する脂質）を含む。いくつかの変形例では、担体分子は、脂質集合体（例えば、リポソーム）であるか、またはリポタンパク質である。いくつかの親油性置換基は、結合された遠赤染料の細胞または細胞小器官への輸送を促進するのに有用である。
【００５７】
核酸およびタンパク質などの生体分子を含む担体分子に蛍光標識を結合させて、標識プローブを生成するための方法は、一般に当技術分野で周知であり、本発明に従って遠赤染料プローブを調製する際に当業者によって容易に利用される。
【００５８】
本明細書に記載されるような遠赤染料プローブを含む安定化された製剤は、プローブを利用するアッセイを行うための１つ以上の追加の成分をさらに含み得る。例えば、オリゴヌクレオチド担体分子を含む安定化された遠赤染料プローブ製剤のいくつかの実施形態では、製剤は、増幅および検出アッセイにおいてオリゴヌクレオチドによって特異的にハイブリダイズ可能な増幅産物を産生するための１つ以上の増幅オリゴマーをさらに含む。したがって、いくつかの変形例では、遠赤染料プローブに結合したオリゴヌクレオチドを含む遠赤染料プローブ製剤は、第１の増幅オリゴマーをさらに含み、（ｉ）オリゴヌクレオチドは、標的核酸の標的領域内に含有される第１の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｉｉ）第１の増幅オリゴマーは、標的領域内に含有される第２の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｉｉｉ）第１の増幅オリゴマーは、鋳型として標的核酸を含む増幅アッセイにおいて、標的領域を含有する増幅産物を産出するように構成される。いくつかのそのような実施形態では、製剤は、標的領域内に含有される第３の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーをさらに含み、第１および第２の増幅オリゴマーは、増幅アッセイの複数のサイクルで標的領域を増幅するように構成される。１つ以上の増幅オリゴマーをさらに含有する製剤のいくつかの変形例では、増幅オリゴマー（複数可）は、標的領域の転写関連増幅を行うように構成され、例えば、上記のような第１の増幅オリゴマーをさらに含むいくつかの態様では、第１の増幅オリゴマーは、第１の標的ハイブリダイズ配列の５’に位置するプロモーター配列（例えば、Ｔ７プロモーター配列）をさらに含むプロモーターベースの増幅オリゴマーである。１つ以上の増幅オリゴマーをさらに含有する製剤のさらに他の非相互排他的な実施形態では、増幅オリゴマー（複数可）は、２つ以上の別個の相（本明細書では、「多相性」核酸増幅）とも称される）を含む増幅手順の別個の相を行うように構成され、そのような増幅システムは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｅｌｓｏｎらの米国特許第９，１３９，８７０号に記載されている。上記のような１つ以上の増幅オリゴマーをさらに含有する製剤は、例えば、塩、補因子、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）、および／または酵素（例えば、逆転写酵素および／またはＲＮＡポリメラーゼ）などの、増幅アッセイを行うのに好適な１つ以上の追加の成分をさらに含み得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような安定化された遠赤染料プローブ製剤は、遠赤染料プローブの濃縮調製物であり（例えば、任意に、増幅および検出アッセイを行うための１つ以上の追加の成分を有する含むオリゴヌクレオチド遠赤染料プローブ）、しばしばアッセイで使用するためのバルク生成物として有用である。
【００６０】
典型的な変形例では、製剤は、長期間にわたって安定している。例えば、製剤は、少なくとも約２週間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、または少なくとも約６ヶ月間安定であり得る。いくつかの実施形態では、製剤は、少なくとも約１２ヶ月、少なくとも約１８ヶ月、少なくとも約２４ヶ月、または少なくとも約３０ヶ月安定している。
【００６１】
本明細書に記載されるような安定化された遠赤染料プローブ製剤は、約−８０℃〜約４０℃、約−２０℃〜約２５℃、約０℃〜約２５℃、約０℃〜約１５℃、約０℃〜約１０℃、または約２℃〜約８℃の温度で保存され得る。様々な実施形態では、製剤は、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、または１０℃で保存され得る。一般に、製剤は、安定しており、これらの範囲で活性を保持する。いくつかの変形例では、製剤は、約−８０℃〜約２５℃または約４℃〜約２５℃で安定している。より具体的な変形例では、液体製剤は、約−８０℃〜約−２０℃、約−８０℃〜約４℃、または約−８０℃〜約２５℃の温度で安定している。他の特定の変形例では、凍結乾燥された製剤は、約４℃〜約２５℃または約４℃〜約４０℃の温度で安定している。上記の温度の中間の範囲、例えば、約２℃〜約１８℃もまた、本発明の一部であることが意図される。例えば、上記の値のいずれかの組み合わせを上限および／または下限として使用する値の範囲が含まれることが意図される。
【００６２】
具体的な実施形態では、長期保存のために、本明細書に記載されるような水性製剤を、例えば、バイアル、アンプル、または他の容器に等分し、当技術分野で既知の手順に従って凍結乾燥し得る。凍結乾燥された生成物は、典型的には、粉末またはケーキのような見た目である。次に、容器を密封し、いくつかのそのような変形例では、シールは、シールを通って容器に希釈剤を後で注入することを可能にする。水性製剤からそのような安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤を調製する方法、ならびにそのような方法によって調製された、凍結乾燥された製剤は、本発明の追加の態様である。さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載されるような水性遠赤染料プローブ製剤への再構成を可能にする、安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤を提供する。
【００６３】
本明細書に記載されるような凍結乾燥された製剤から安定化された水性遠赤染料プローブ製剤を調製する方法もまた、本発明に網羅され、そのような方法は、一般に、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を好適な希釈剤に溶解して、再構成された製剤を提供することを含む。好適な希釈剤は、例えば、遠赤染料プローブの意図される使用に応じて、当業者により容易に選択され得、例えば、水または緩衝剤（例えば、トリス）を含有する水溶液を含み得る。いくつかの実施形態では、希釈剤は、安定化された凍結乾燥製剤に含有されるものなどの安定化界面活性剤を含有する。したがって、いくつかの変形例では、希釈剤は、非線形界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルまたはジギトニン）またはフォームバンを含有し、いくつかのそのような実施形態では、安定化界面活性剤は、希釈剤中に約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約０．５％（ｖ／ｖ）〜約５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。
【００６４】
関連する態様では、本明細書に記載されるような水性の安定化された遠赤染料プローブ製剤は、一般に、（ａ）少なくとも１つの緩衝剤と、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブとを含む水溶液への再構成を可能にする凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を提供するステップと、（ｂ）（ａ）の凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を希釈剤に溶解して、再構成された製剤を提供するステップと、を含む方法によって調製され、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤のうちの少なくとも１つが、非線形界面活性剤またはフォームバンを含有し、再構成された製剤が、非線形界面活性剤またはフォームバンを約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度で含有する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された製剤のみが安定化界面活性剤を含み、いくつかのそのような変形例では、安定化界面活性剤は、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で、凍結乾燥された製剤が由来する水溶液中に存在する。他の実施形態では、希釈剤のみが安定化界面活性剤を含み、いくつかのそのような変形例では、安定化界面活性剤は、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で希釈剤中に存在する。さらに他の実施形態では、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤の両方が、非線形界面活性剤またはフォームバンを含有し、いくつかのそのような変形例では、安定化界面活性剤は、希釈剤中での凍結乾燥された製剤の再構成時に、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の最終界面活性剤濃度を生成するように構成された濃度で凍結乾燥された製剤および希釈剤中に存在する。上記の方法は、遠赤染料プローブおよび少なくとも１つの緩衝剤を含む水溶液を凍結乾燥することにより、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を調製することをさらに含み得る。
【００６５】
本発明の特定の態様では、本明細書に記載されるような安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤を含有する容器が、希釈剤を含有する第２の容器を有するキットで提供される。希釈剤は、凍結乾燥された製剤からの再構成された製剤の調製に関して上記で論じたような非線形界面活性剤またはフォームバンを含有し得る。遠赤染料プローブ製剤および希釈剤は、様々な異なる実施形態でパッケージされてもよく、当業者は、本発明が多くの異なるキット構成を包含することを理解するであろう。例えば、遠赤染料プローブが、核酸標的領域に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含有するオリゴヌクレオチド担体分子を含む実施形態の場合、キットは、標的領域を増幅するための１つ以上の増幅オリゴマーを含有する第３の容器をさらに含み得る。遠赤染料プローブ製剤が、標的領域に特異的に結合する増幅オリゴマーを含むいくつかのそのような変形例では、第３の容器は、標的領域に特異的に結合し、増幅アッセイにおいて、標的領域を含有する増幅産物を産出するように構成される、第２の増幅オリゴマーを含み得、そのようなキットの実施形態は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、例えばＮｅｌｓｏｎらに対する米国特許第９，１３９，８７０号に記載されるような多相増幅システムに使用され得る。増幅および検出アッセイで使用するためのオリゴヌクレオチド遠赤得染料プローブを含むキットは、例えば、緩衝剤、塩溶液、適切な三リン酸ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）、および／または酵素（例えば、逆転写酵素および／またはＲＮＡポリメラーゼ）などのインビトロ増幅を行うのに好適な他の試薬を含有し得る。特定の実施形態では、キットは、本発明に従って方法を実践するための指示書一式をさらに含み、指示書は、パッケージ挿入物および／またはキットもしくはその構成要素のパッケージングと関連し得る。
【００６６】
関連する態様では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つの緩衝剤と、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブとを含む水溶液への再構成を可能にする凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を含有する第１の密封容器と、（ｉｉ）希釈剤を含有する第２の密封容器と、を含むキットを提供し、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤のうちの少なくとも１つが、非線形界面活性剤またはフォームバンを含み、希釈剤中での凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤の再構成が、約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える非線形界面活性剤またはフォームバンの最終濃度を提供する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥された製剤のみが安定化界面活性剤を含み、いくつかのそのような変形例では、安定化界面活性剤は、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で、凍結乾燥された製剤が由来する水溶液に存在する。他の実施形態では、希釈剤のみが安定化界面活性剤を含み、いくつかのそのような変形例では、安定化界面活性剤は、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で希釈剤中に存在する。さらに他の実施形態では、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤の両方が、非線形界面活性剤またはフォームバンを含有し、いくつかのそのような変形例では、安定化界面活性剤は、希釈剤中での凍結乾燥された製剤の再構成時に、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の最終界面活性剤濃度を生成するように構成された濃度で凍結乾燥された製剤および希釈剤中に存在する。既に述べたように、遠赤染料プローブ製剤および希釈剤は、様々な異なる実施形態でパッケージされてもよく、当業者は、本発明が多くの異なるキット構成を包含することを理解するであろう。
【００６７】
さらに別の態様では、本発明は、上記の安定化された遠赤染料プローブ製剤を含有する密封容器を含む診断製品を提供する。いくつかの変形例では、安定化された遠赤染料製剤は、本明細書に記載されるような凍結乾燥された製剤である。
【００６８】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００６９】
特に明記しない限り、本明細書に記載されるＲＴ−ＴＭＡベースのアッセイで一般的に使用される試薬には、以下が含まれる。標的捕獲試薬（ＴＣＲ）製剤：２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．８８ＭのＬｉＣｌ、３１０ｍＭのＬｉＯＨ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．４、および２５０μｇ／ｍＬの共有結合した（ｄＴ）１４オリゴマー（配列番号２０）を有する常磁性粒子（０．７〜１．０５ミクロン粒子、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（商標）ＭＧ−ＣＭ）。洗浄液製剤：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６．５ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、および０．１％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５。増幅試薬およびプロモーター試薬製剤：１１．６１ｍＭのトリス塩基、１４．９４ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２８．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２３．３０ｍＭのＫＣｌ、３．３％グリセロール、０．０２％ＰＲＯ  ＣＬＩＮ３００、０．０５ｍＭの酢酸亜鉛二水和物、各々０．７６ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、各々６．５０ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、およびＧＴＰ、７．５０ｍＭのＵＴＰ、これらにプライマーが添加される。酵素試薬製剤：５７．４６ｍＭのＨＥＰＥＳ、４９．５８ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、０．９８ｍＭのＥＤＴＡ遊離酸、０．０３９ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物、０．１０ｖ／ｖのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、４９．６１ｍＭのＫＣｌ、０．２０ｖ／ｖのグリセロール、０．０３ｗ／ｖのトレハロース二水和物、ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ。
【００７０】
二相性リアルタイムＴＭＡフォーマットのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３０００を使用して、増幅および検出反応を行った。簡単に言えば、試料を、標的捕獲オリゴマー（配列番号：１、７、１１、および１６、各々１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）およびＴ７プライマー（配列番号：３、４、９、１３、および１８、各々５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）を含有する１００μｌのＴＣＲで、３０分間６２℃でインキュベートし、次に室温まで２０分間降下させて、ハイブリダイゼーション複合体（磁気ビーズ−ｄＴ１４：標的捕獲オリゴマー：標的核酸：Ｔ７プライマー）を形成した。ハイブリダイゼーション複合体を洗浄し、非Ｔ７プライマー（配列番号２、８、１２、および１７、各々１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）を含有する増幅試薬に溶出した。酵素試薬（２５μｌ）の添加、および続くプロモーター試薬（２５μｌ）の添加中、試料を４３℃でインキュベートした。プロモーター試薬は、Ｔ７プライマー（配列番号３、４、９、１３、および１８、各々１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）およびトーチオリゴ（配列番号５、６、１０、１４、１５、および１９、各々１５ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）を含有した。標的アンプリコンへのトーチの結合を反映し、消光剤からの染料分離をもたらす蛍光発光を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ機器で、リアルタイムで３０秒ごとに１時間測定した。標的の増幅について蛍光曲線プロファイルを分析した。例えば、米国特許第９，１３９，８７０号Ｂ２を参照されたい。各条件の標的核酸は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ  ｌｅｎｔａからの溶解物、または捕獲、増幅、および検出反応を行うための標的のための標的捕獲オリゴマー、Ｔ７プライマー、非Ｔ７プライマー、およびトーチとのハイブリダイゼーション用の配列を少なくとも含むインビトロ転写物のいずれかであった。（溶解物を調製するための細菌株は、バージニア州マナサスのＡＴＣＣから購入した。カタログ番号ＡＴＣＣ３３８２０、ＡＴＣＣ１４０１８、およびＡＴＣＣ２５５５９）。
【００７１】
実施例１
いくつかの実験を行い、Ｃｙ５．５染料含有溶液の３０日間のインキュベーション後に見られたＣｙ５．５ＲＦＵ信号の２５〜７０％の低下が示された。インキュベートされたＣｙ５．５染料含有溶液を、概して上述されたように、リアルタイム（ＲＴ）ＴＭＡアッセイで使用した。この実施例のＣｙ５．５染料は、内在性コントロール標的核酸を検出するためにトーチオリゴヌクレオチドに取り付けた。ＦＡＭ、ＨＥＸ、およびＲＯＸトーチは、３０日間のインキュベーション後に約１０％のみ低下したが、内在性コントロールＣｙ５．５トーチでの３５％の低下を示す、いくつかの代表的なデータを以下の表１に示す。様々な遠赤染料ならびに代替の緩衝製剤で追加の研究が試され、時間の経過とともに同様の信号の低下が見られた。信頼性の低い信号が無効なアッセイ結果を提供するため、ＲＦＵ信号の大幅な減少を示す保存された遠赤染料含有試薬は、使用できなくなる。そのため、これらの染料からのＲＦＵ信号を利用するアッセイにおいて後で使用するために、遠赤染料含有溶液を保存することは推奨されず、代わりに、未使用部分を破棄することが推奨される。
【表１】
2021511838.tif 000002
【００７２】
上記のように、Ｃｙ５．５染料含有溶液を３０日間インキュベートした。リアルタイム増幅および検出反応で保存された溶液を使用する前に、Ｃｙ５．５染料含有溶液の一部を、１０分間、８０℃に加熱し、別の部分はしなかった。次に、各Ｃｙ５．５染料含有条件を増幅および検出反応に使用し、結果を表２に示す。これらの結果は、非加熱対照と比較して、８０℃／１０分の加熱ステップにより、Ｃｙ５．５ＲＦＵ信号の損失が完全に回復したことを示す。これは、インキュベートしされた溶液中の遠赤染料信号の損失が、染料の分解によるものではないことを示すが、Ｃｙ５．５フルオロフォアが互いに接近して互いに消光するミセル形成を指し示す。
【表２】
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【００７３】
時間の経過とともに発生するミセル形成を分解するために、非イオン性界面活性剤をさらに含有する遠赤染料含有溶液について、３０日間の保存測定を繰り返した。この実験では、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００またはＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ミズーリ州セントルイスのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、カタログ番号９３４４３およびＰ１３７９）を非イオン性界面活性剤として使用した。遠赤の染料を含む溶液は、上記のように、Ｃｙ５．５標識分子トーチおよび様々な濃度のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００またはＴＷＥＥＮ（登録商標）２０のいずれかを含有するプロモーター試薬であった。溶液を３８日間または４０日間保存し、その後、リアルタイム等温増幅および検出反応で使用した。結果を表３および表４に示す。
【００７４】
２３％低下した、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を使用しない対照条件と比較して、プロモーター試薬へのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００の添加により、０日間〜４０日間の保存でＣｙ５．５ＲＦＵ信号が７０％以上低下した（表３を参照されたい）。
【表３】
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【００７５】
２９％低下した、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を使用しない対照条件と比較して、プロモーター試薬へのＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の添加により、０日〜３８日間の保存でＣｙ５．５ＲＦＵ信号の最小限の低下が生じた。表４に示されるように、０日目〜３８日目で２９％低下した、対照条件（つまり、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０が添加されていない）と比較して、１％〜２０％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０では、０日目〜３８日目でＣｙ５．５ＲＦＵ信号の４．６％〜１０．４％の低下のみが見られた。
【表４】
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【００７６】
１％またはそれ以下のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の濃度をいくつかのプロモーター試薬に添加し、上記のような増幅および検出反応で試験した。標的核酸の増幅と検出に使用するためのプロモーター試薬を、Ｃｙ５．５標識トーチオリゴヌクレオチドを含み、１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、０．０３％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、または０．００１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０も含むように調製した。次に、０日目と４２日間の保存後（４２日目）に、様々なプロモーター試薬条件をリアルタイム等温増幅および検出反応に使用した。結果を表５に示す。０日目〜４２日目までのＣｙ５．５ＲＦＵ信号の低下は、プロモーター試薬がより低い濃度のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含有した条件でより顕著であった。
【表５】
2021511838.tif 000006
【００７７】
さらなる実験では、他の界面活性剤を遠赤染料含有溶液に添加した。プロモーター試薬を増幅および検出反応で使用するために調製した。Ｃｙ５．５トーチを含有するプロモーター試薬をバルク溶液で調製した。次に、バルク溶液をいくつかの条件に分離し、条件の各々は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ１５０４）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ１６２９）、シンペロニック（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７５７９）、フォームバン（Ｍｕｎｚｉｎｇ、カタログ番号ＭＳ−５７５）、およびジギトニン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ１４１）の界面活性剤（１％ｖ／ｖ）のうちの１つを含有した。次に、各条件を、０日目、保存１７日後（１７日目）、および保存３８日後（３８日目）にリアルタイム等温増幅および検出反応に使用した。表６に示されるように、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、フォームバン、およびジギトニンは、０日間〜３８日間の保存で、Ｃｙ５．５ＲＦＵ信号の最小源の低下をもたらした。シンペロニックは、Ｃｙ５．５ＲＦＵ信号の低下を減少させなかった。ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００のように、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃは、線形構造を有し、これは、遠赤染料分子のミセル形成を妨害する際にこれらの界面活性剤の効率を低下させる可能性がある。ＴＷＥＥＮ（登録商標）ならびにジギトニンは、分岐構造を有し、これは、より乱雑にするため、ミセル形成をあまり助長しないはずである。
【表６】
2021511838.tif 000007
【００７８】
追加のジギトニンおよびシンペロニック界面活性剤の構造を以下に示す。
ジギトニン：
【化１】
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シンペロニックＦ１０８：
【化２】
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【００７９】
遠赤染料および界面活性剤を含有するいくつかの溶液を調製し、凍結乾燥した。次に、凍結乾燥した組成物を、やはり界面活性剤を含有する希釈剤で再構成した。次に、再構成した溶液をリアルタイム増幅および検出アッセイで使用した。１つの構成では、表７に示されるように、上記のプロモーター試薬を、Ｃｙ５．５標識トーチおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０を含有するように調製した。凍結乾燥したペレットの物理的特性を評価し、次に、許容可能な特性を有するペレットを１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０を含有する希釈剤で再構成して、再構成したプロモーター試薬中に１．４１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０〜２．２４％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０を含有する溶液を調製した。次に、再構成したプロモーター試薬を、０日目および３０日目にリアルタイム増幅および検出アッセイで使用し、０日目〜３０日目の間に大幅な低下を伴わずに堅牢なＣｙ５．５ＲＦＵ信号を得た。凍結乾燥サイクル後に観察された、劣った物理的特性には、過剰な界面活性剤を含有する凍結乾燥前の溶液は、完全に凍結乾燥しなかった（部分的に液体形態のままであった）、そして界面活性剤をほとんど含有しない凍結乾燥前の溶液は、青い点を示した（遠赤染料成分のミセル形成を示す）、ということが含まれた。したがって、遠赤染料含有溶液の製剤によって、凍結乾燥前の溶液中の界面活性剤濃度は、凍結乾燥前の短いインキュベーション期間中のミセル形成を防ぐために、最小量であることだけが必要とされる。次に、遠赤染料成分のより長期のインキュベーション保護を提供するために必要な残りの界面活性剤は、界面活性剤含有再構成溶液（希釈剤）を使用して提供される。
【表７】
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【表８−１】
2021511838.tif 000011
【表８−２】
2021511838.tif 000012
【００８０】
例示的な実施形態
実施形態１安定化された遠赤染料プローブ製剤であって、
担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、
約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度の非線形界面活性剤と、
少なくとも１つの緩衝剤と、を含み、
製剤が、水溶液である、製剤。
【００８１】
実施形態２遠赤染料が、遠赤シアニン染料である、実施形態１に記載の製剤。
【００８２】
実施形態３遠赤シアニン染料が、シアニン５およびシアニン５．５からなる群から選択される、実施形態２に記載の製剤。
【００８３】
実施形態４非線形界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびジギトニンからなる群から選択される、実施形態１〜３のいずれかに記載の製剤。
【００８４】
実施形態５非線形界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、実施形態４に記載の製剤。
【００８５】
実施形態６ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルが、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、およびポリソルベート６０からなる群から選択される、実施形態５に記載の製剤。
【００８６】
実施形態７非線形界面活性剤濃度が、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約０．１％（ｖ／ｖ）〜３％（ｖ／ｖ）である、実施形態１〜６のいずれかに記載の製剤。
【００８７】
実施形態８非線形界面活性剤濃度が、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約１％（ｖ／ｖ）〜約３％（ｖ／ｖ）である、実施形態１〜６のいずれかに記載の製剤。
【００８８】
実施形態９少なくとも１つの緩衝剤が、トリスである、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の製剤。
【００８９】
実施形態１０トリス緩衝剤が、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在する、実施形態９に記載の製剤。
【００９０】
実施形態１１担体分子が、核酸である、実施形態１〜１０のいずれかに記載の製剤。
【００９１】
実施形態１２核酸担体分子が、ＲＮＡである、実施形態１１に記載の製剤。
【００９２】
実施形態１３遠赤染料プローブが、消光剤をさらに含む、実施形態１〜１０のいずれかに記載の製剤。
【００９３】
実施形態１４遠赤染料プローブが、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎプローブからなる群から選択される、実施形態１３に記載の製剤。
【００９４】
実施形態１５第１の増幅オリゴマーをさらに含み、遠赤染料プローブが、標的核酸の標的領域内に含有される第１の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、第１の増幅オリゴマーが、該標的領域内に含有される第２の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、第１の増幅オリゴマーが、鋳型として標的核酸を含む増幅アッセイにおいて、該標的領域を含有する増幅産物を産生するように構成される、実施形態１０〜１４のいずれかに記載の製剤。
【００９５】
実施形態１６第２の増幅オリゴマーをさらに含み、第２の増幅オリゴマーが、該標的領域内に含有される第３の配列に特異的に結合する標的ハイブリダイズ配列を含み、第１および第２の増幅オリゴマーが、増幅アッセイの複数のサイクルで該標的領域を増幅するように構成される、実施形態１５に記載の製剤。
【００９６】
実施形態１７第１の増幅オリゴマーが、第１の標的ハイブリダイズ配列の５’に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモーターベースの増幅オリゴマーである、実施形態１５または１６に記載の製剤。
【００９７】
実施形態１８該増幅アッセイを行うのに好適な１つ以上のヌクレオチド三リン酸をさらに含む、実施形態１５〜１７のいずれかに記載の製剤。
【００９８】
実施形態１９該増幅アッセイを行うのに好適な１つ以上の塩または補因子をさらに含む、実施形態１５〜１８のいずれかに記載の製剤。
【００９９】
実施形態２０安定化された遠赤染料プローブ製剤であって、
担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、
約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度のフォームバンと、
少なくとも１つの緩衝剤と、を含み、
製剤が、水溶液である、製剤。
【０１００】
実施形態２１安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤を調製する方法であって、
実施形態１〜２０のいずれかに記載の製剤を提供することと、
水溶液を凍結乾燥して、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を形成することと、を含む、方法。
【０１０１】
実施形態２２実施形態２１の方法によって調製された、安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤。
【０１０２】
実施形態２３実施形態１〜２０のいずれかに記載の水溶液への再構成を可能にする、安定化された凍結乾燥遠赤染料プローブ製剤。
【０１０３】
実施形態２４安定化された水性遠赤染料プローブ製剤を調製する方法であって、
（ａ）実施形態２２または２３に記載の凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を提供することと、
（ｂ）凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を希釈剤に溶解して、再構成された製剤を提供することと、を含む、方法。
【０１０４】
実施形態２５
実施形態２２または２３に記載の凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を含有する第１の密封容器と、
希釈剤を含有する第２の密封容器と、を含む、キット。
【０１０５】
実施形態２６希釈剤が、非線形界面活性剤を含む、実施形態２５に記載のキット。
【０１０６】
実施形態２７安定化された水性遠赤染料プローブ製剤を調製する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの緩衝剤と、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、を含む水溶液への再構成を可能にする凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を提供することと、
（ｂ）凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を希釈剤に溶解して、再構成された製剤を提供することと、を含み、
凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤のうちの少なくとも１つが、非線形界面活性剤を含み、再構成された製剤が、約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える濃度の非線形界面活性剤を含む、方法。
【０１０７】
実施形態２８凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤の両方が、非線形界面活性剤を含む、実施形態２７に記載の方法。
【０１０８】
実施形態２９遠赤染料プローブおよび少なくとも１つの緩衝剤を含む水溶液を凍結乾燥することにより、凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を調製することをさらに含む、実施形態２７または２８に記載の方法。
【０１０９】
実施形態３０
少なくとも１つの緩衝剤と、担体分子に結合した遠赤染料を含む遠赤染料プローブと、を含む水溶液への再構成を可能にする凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤を含有する第１の密封容器と、
希釈剤を含有する第２の密封容器と、を含む、キットであって、
凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤および希釈剤のうちの少なくとも１つが、非線形界面活性剤を含み、希釈剤中での凍結乾燥された遠赤染料プローブ製剤の再構成が、約０．０５％（ｖ／ｖ）を超える最終的な非線形界面活性剤濃度を提供する、キット。
【０１１０】
実施形態３１凍結乾燥された遠赤染料製剤および希釈剤の両方が、非線形界面活性剤を含む、実施形態３０に記載のキット。
【０１１１】
実施形態３２実施形態１〜２０、２２、および２３のいずれかに記載の安定化された遠赤染料プローブ製剤を含有する密封容器を含む診断製品。
【０１１２】
上記から、本発明の具体的な実施形態が例示目的で本明細書に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な修正が行われ得ることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いて限定されない。本明細書で引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的で参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【配列表】
2021511838000001.app
【国際調査報告】
2021511838.tif 000013
2021511838.tif 000014
2021511838.tif 000015