(57)【要約】本発明は、ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。本発明の抗体又はその抗原結合断片はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、本発明の抗体又は断片とハーセプチンを併用した場合、ハーセプチンとパージェタを併用する場合に比べてＨＥＲ２過剰発現が確認された腫瘍細胞の増殖をより効率よく阻害することができる。また、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、周知のヒトＨＥＲ２に結合する抗体とは異なる抗原結合エピトープを有し、ＨＥＲ２過剰発現が確認された疾患（例えば、癌症）を治療するための薬物の製造に適用可能であり、臨床での実用化が期待される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＨＥＲ２における結合エピトープがヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩ内に位置し、かつ配列番号１のＤ５０２、Ｖ５０５、Ｅ５０７およびＬ５０９から選ばれる１個又は２個以上のアミノ酸残基を含むことを特徴とする、ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記結合エピトープは、下記ａ〜ｎから選ばれるアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
ａ）配列番号１のＤ５０２
ｂ）配列番号１のＶ５０５
ｃ）配列番号１のＥ５０７
ｄ）配列番号１のＬ５０９
ｅ）配列番号１のＤ５０２とＶ５０５
ｆ）配列番号１のＤ５０２とＥ５０７
ｇ）配列番号１のＤ５０２とＬ５０９
ｈ）配列番号１のＶ５０５とＥ５０７
ｉ）配列番号１のＶ５０５とＬ５０９
ｊ）配列番号１のＥ５０７とＬ５０９
ｋ）配列番号１のＤ５０２、Ｖ５０５とＥ５０７
ｌ）配列番号１のＤ５０２、Ｖ５０５とＬ５０９
ｍ）配列番号１のＶ５０５、Ｅ５０７とＬ５０９
ｎ）配列番号１のＤ５０２、Ｖ５０５、Ｅ５０７とＬ５０９
【請求項３】
前記結合エピトープは、ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩ内に位置し、かつ配列番号１の第４９９位〜第５１０位に示すアミノ酸配列を有することを特徴とする、ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩは、配列番号１の第３４３位〜第５１０位に示すアミノ酸配列を有する、請求項１〜３の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
ａ）重鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号１１で表されるＨＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号１２で表されるＨＣＤＲ２、およびアミノ酸配列が配列番号１３で表されるＨＣＤＲ３と、
ｂ）軽鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号１４で表されるＬＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号１５で表されるＬＣＤＲ２、およびアミノ酸配列が配列番号１６で表されるＬＣＤＲ３と
を含むことを特徴とする、ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１〜５の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗体は、マウス由来抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１〜５の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）及びシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜５の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＨＥＲ２過剰発現が確認された腫瘍細胞の増殖を阻害することができる、請求項１〜５の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記腫瘍細胞は、乳がん細胞ＢＴ４７４、乳がん細胞ＳＫＢＲ３、胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７又は乳がん細胞ＨＣＣ１９５４である、請求項９に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、又は重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１９で表され、又は重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２３で表される、請求項１〜５の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される、請求項１１に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片をコードすることを特徴とする、単離されたヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードし且つ配列番号４で表されるヌクレオチド配列と、軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号６で表されるヌクレオチド配列とを有し、または重鎖可変領域をコードし且つ配列番号１８で表されるヌクレオチド配列と、軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号２０で表されるヌクレオチド配列とを有し、または重鎖可変領域をコードし且つ配列番号２２で表されるヌクレオチド配列と、軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号２４で表されるヌクレオチド配列とを有する、請求項１３に記載のヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ヌクレオチドは、重鎖定常領域をコードし且つ配列番号８で表されるヌクレオチド配列と、軽鎖定常領域をコードし且つ配列番号１０で表されるヌクレオチド配列とを有する、請求項１３又は請求項１４に記載のヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１３〜１５の何れか１項に記載のヌクレオチドを含んでなることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターを含んでなることを特徴とする、ホスト細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１２の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、
発現条件下で請求項１７に記載のホスト細胞を培養することにより、ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を発現するステップａと、ステップａで発現したヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を分離、精製するステップｂとを含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体とを含んでなることを特徴とする、薬物組成物。
【請求項２０】
ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片を含んでなる、請求項１９に記載の薬物組成物。
【請求項２１】
前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩに結合せず、前記第３機能ドメインＤＩＩＩは、配列番号１の第３４３位〜第５１０位に示すアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の薬物組成物。
【請求項２２】
前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第４機能ドメインＤＩＶに結合し、前記第４機能ドメインＤＩＶは、配列番号１の第５１１位〜第５８２位に示すアミノ酸配列を有する、請求項２０に記載の薬物組成物。
【請求項２３】
前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２５で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２６で表される、請求項２０に記載の薬物組成物。
【請求項２４】
前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、トラスツズマブである、請求項２０〜２３の何れか１項に記載の薬物組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１２の何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片又は請求項１９〜２４の何れか１項に記載の薬物組成物の、ＨＥＲ２過剰発現が確認された疾患を治療するための薬物の製造における用途。
【請求項２６】
前記ＨＥＲ２過剰発現が確認された疾患は、癌である、請求項２５に記載の用途。
【請求項２７】
前記癌は、乳がん、胃がん又は卵巣がんである、請求項２６に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体工学に関し、より具体的には、ヒトＨＥＲ２に結合する抗体、その製造方法および用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体２、以下では「ｅｒｂＢ２」とも称する）は、チロシンプロテインキナーゼ活性を持ち、ヒト上皮成長因子受容体ファミリーメンバーの１つであり、成人の幾つかの正常組織に限って低レベルで発現する。一方、研究により複数の腫瘍でＨＥＲ２が過剰発現していることが発見され、例えば約３０％の乳がん患者および１６％の胃がん患者でＨＥＲ２が過剰発現する現象があり、腫瘍におけるＨＥＲ２の過剰発現は、腫瘍血管の新生や腫瘍成長を著しく加速化し、腫瘍の浸潤や転移能を亢進させることができるため、不良予後の可能性を示す重要な指標である。そのため、早くから１９９８年にＨＥＲ２を標的とした最初のモノクローナル抗体薬品としてトラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社製、商品名：ハーセプチン）がＦＤＡより販売許可が認められ、その重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列がそれぞれ配列番号２５および配列番号２６（米国特許ＵＳ５８２１３３７では、配列番号４１および配列番号４２）で表され、ＨＥＲ２過剰発現が確認された乳がんおよび胃がんの治療に用いられる。臨床で長期に渡って治療経験を積み重ねた結果、ハーセプチンを乳がんの第一選択薬とし且つ化学療法薬を併用した場合、患者の生存期間を著しく伸ばし、同時に腫瘍の再発を低減することが確認されたが、治療後期に患者の約７０％がハーセプチン治療に対して応答を示さず、若しくは薬物耐性を示すことも確認されている。２０１２年、ＨＥＲ２を標的としたもう１つのモノクローナル抗体薬品としてペルツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社製、商品名：パージェタ）がＦＤＡによって販売許可が認められ、ペルツズマブとトラスツズマブの作用機構が異なり、例えばトラスツズマブは、主にＨＥＲ２下流のシグナル伝達を遮断することで細胞増殖を抑止し、ペルツズマブは、主にＨＥＲ２とＨＥＲ３のヘテロダイマー形成を阻害する。それ故、ペルツズマブとトラスツズマブの併用は、トラスツズマブ単独投与に比較して患者に対する治療効果が顕著に向上するが、臨床現場の需要に十分対応できている訳ではない。したがって、ＨＥＲ２を標的とした新規治療薬に対する需要が依然高く、ＨＥＲ２過剰発現の患者へより広い選択肢を与えることができ且つ優れた治療効果を示す新規薬品の開発が期待されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述の技術課題を解決するため、本発明者は抗原免疫からハイブリドーマ選別、抗体の発現と精製、生体活性評価まで鋭意検討を重ねた結果、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合するマウス由来のモノクローナル抗体１９Ｈ６を取得し、さらに、該モノクローナル抗体１９Ｈ６に基づきキメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈ及びヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕを構築した。ハーセプチンやパージェタの結合エピトープと異なり、ヒトＨＥＲ２における上記モノクローナル抗体１９Ｈ６の結合エピトープはヒトＨＥＲ２細胞外領域（ＨＥＲ２−ＥＣＤ）の機能ドメインＤＩＩＩ内に存在する。つまり、本発明に係るマウス由来のモノクローナル抗体１９Ｈ６は、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤの機能ドメインＤＩＩＩに特異的に結合するモノクローナル抗体として前例がなく、これ以前にヒトＨＥＲ２−ＥＣＤの機能ドメインＤＩＩＩに結合するモノクローナル抗体の構造や特性は何れも不明であり、本発明において標的抗原であるヒトＨＥＲ２−ＥＣＤにおける１９Ｈ６の結合サイトを更に解明した。細胞レベルの実験では、１９Ｈ６とハーセプチンの併用が乳がん細胞ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ３および胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７の体外増殖を著しく阻害し、その效果がパージェタとハーセプチンを併用する場合に比べて遥かに優位であることが実証され、さらに、キメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈ及びヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕが１９Ｈ６と同等レベルの抗腫瘍活性を示すことも実証された。また、動物レベルの実験では、ハーセプチン単独投与に比較して１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンの併用がハーセプチン投与に応答を示す細胞ＮＣＩ−Ｎ８７と薬物耐性を示す細胞ＨＣＣ１９５４を移植した腫瘍モデルにおいてより高い抗腫瘍活性を示し、かつＨＣＣ１９５４を移植した腫瘍モデルにおいて１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンの併用がパージェタとハーセプチンを併用する場合に比較して薬効が遥かに上回ることが実証された。したがって、本発明に係る斬新なＨＥＲ２結合エピトープを有するヒトＨＥＲ２に結合する抗体は、ＨＥＲ２過剰発現が確認された患者を治療するための薬物として有望である。
【０００４】
以上の点に鑑み、本発明の第１側面では、ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００５】
本発明の第２側面では、ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００６】
本発明の第３側面では、ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【０００７】
本発明の第４側面では、前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本発明の第５側面では、前記ヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【０００９】
本発明の第６側面では、前記発現ベクターを含むホスト細胞を提供する。
【００１０】
本発明の第７側面では、前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を製造するための製造方法を提供する。
【００１１】
本発明の第８側面では、前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む薬物組成物を提供する。
【００１２】
本発明の第９側面では、前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体、その抗原結合断片又は前記薬物組成物の用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記目的を達成すべく、本発明は、以下の技術案により構成される。
【００１４】
本発明の第１側面において、ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、該抗体又はその抗原結合断片が結合するヒトＨＥＲ２エピトープは、ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩ内に位置し、かつ配列番号１のＤ５０２、Ｖ５０５、Ｅ５０７およびＬ５０９から選ばれる１個又は２個以上のアミノ酸残基を含む。
【００１５】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＨＥＲ２エピトープは、下記ａ〜ｎから選ばれるアミノ酸残基を含む。
ａ）配列番号１のＤ５０２
ｂ）配列番号１のＶ５０５
ｃ）配列番号１のＥ５０７
ｄ）配列番号１のＬ５０９
ｅ）配列番号１のＤ５０２とＶ５０５
ｆ）配列番号１のＤ５０２とＥ５０７
ｇ）配列番号１のＤ５０２とＬ５０９
ｈ）配列番号１のＶ５０５とＥ５０７
ｉ）配列番号１のＶ５０５とＬ５０９
ｊ）配列番号１のＥ５０７とＬ５０９
ｋ）配列番号１のＤ５０２、Ｖ５０５とＥ５０７
ｌ）配列番号１のＤ５０２、Ｖ５０５とＬ５０９
ｍ）配列番号１のＶ５０５、Ｅ５０７とＬ５０９
ｎ）配列番号１のＤ５０２、Ｖ５０５、Ｅ５０７とＬ５０９
【００１６】
本発明の第２側面では、ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片を提供し、該抗体又はその抗原結合断片が結合するヒトＨＥＲ２エピトープは、ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩ内に位置し、かつ配列番号１の第４９９位〜第５１０位に示すアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩは、配列番号１の第３４３位〜第５１０位に示すアミノ酸配列を有する。
【００１８】
本発明の第３側面では、ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片を提供し、該抗体又はその抗原結合断片は、
ａ）重鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号１１で表されるＨＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号１２で表されるＨＣＤＲ２、およびアミノ酸配列が配列番号１３で表されるＨＣＤＲ３と、
ｂ）軽鎖相補性決定領域としてアミノ酸配列が配列番号１４で表されるＬＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号１５で表されるＬＣＤＲ２、およびアミノ酸配列が配列番号１６で表されるＬＣＤＲ３と、を含む。
【００１９】
本発明の一好適な実施形態において、前記抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり、モノクローナル抗体であることがより好ましい。
【００２０】
本発明の一好適な実施形態において、前記抗体は、マウス由来抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体などである。
【００２１】
本発明の一好適な実施形態において、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）及びシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群より選ばれる少なくとも１種である。
【００２２】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＨＥＲ２過剰発現が確認された腫瘍細胞の増殖を阻害することができ、そのうち前記腫瘍細胞は、乳がん細胞ＢＴ４７４、乳がん細胞ＳＫＢＲ３、胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７、乳がん細胞ＨＣＣ１９５４である。
【００２３】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、又は重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１９で表され、又は重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２３で表される。
【００２４】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖定常領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される。
【００２５】
本発明の第４側面では、単離されたヌクレオチドを提供し、前記ヌクレオチドは、上記何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片をコードする。
【００２６】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードし且つ配列番号４で表されるヌクレオチド配列と、軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号６で表されるヌクレオチド配列とを有し、または重鎖可変領域をコードし且つ配列番号１８で表されるヌクレオチド配列と、軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号２０で表されるヌクレオチド配列とを有し、または重鎖可変領域をコードし且つ配列番号２２で表されるヌクレオチド配列と、軽鎖可変領域をコードし且つ配列番号２４で表されるヌクレオチド配列とを有する。
【００２７】
本発明の一好適な実施形態において、前記重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８で表され、前記軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０で表される。
【００２８】
本発明の第５側面では、上記何れか１項に記載のヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを提供する。
【００２９】
本発明の第６側面では、上記発現ベクターを含んでなるホスト細胞を提供する。
【００３０】
本発明の第７側面では、前記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を製造するための製造方法を提供し、前記製造方法は、発現条件下で上記ホスト細胞を培養することにより、上記ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を発現するステップａと、ステップａで発現したヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を分離、精製するステップｂと、を含む。
【００３１】
本発明の第８側面では、上記何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容可能な担体とを含む薬物組成物を提供する。
【００３２】
本発明の一好適な実施形態において、前記薬物組成物は、ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片を含む。
【００３３】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩに結合せず、前記第３機能ドメインＤＩＩＩは、配列番号１の第３４３位〜第５１０位に示すアミノ酸配列を有する。
【００３４】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第４機能ドメインＤＩＶに結合し、前記第４機能ドメインＤＩＶは、配列番号１の第５１１位〜第５８２位に示すアミノ酸配列を有する。
【００３５】
本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２５で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２６で表される。さらに、本発明の一好適な実施形態において、前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、トラスツズマブである。
【００３６】
本発明の第９側面では、上記何れか１項に記載のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片、又は上記何れか１項に記載の薬物組成物の、ＨＥＲ２過剰発現が確認された疾患を治療するための薬物を製造する用途を提供する。
【００３７】
本発明の一好適な実施形態において、前記ＨＥＲ２過剰発現が確認された疾患は、乳がん、胃がん、卵巣がん等の癌である。
【発明の効果】
【００３８】
本発明に係るヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＨＥＲ２に特異的に結合することができ、既知のパージェタに比較してハーセプチンと併用することでＨＥＲ２過剰発現が確認された腫瘍細胞の増殖をより効果的に阻害することができ、かつ従来のヒトＨＥＲ２に結合する抗体とは異なる抗原結合エピトープを有し、ＨＥＲ２過剰発現が確認された疾患（例えば、癌）を治療するための薬物の製造に適用可能であり、臨床での実用化が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】１４株のマウス由来抗ヒトＨＥＲ２モノクローナル抗体候補とハーセプチンをそれぞれ併用するときの乳がん細胞ＢＴ４７４の増殖に対する阻害効果を示す図であり、そのうち図１Ａは１９Ｈ６、１８Ｂ６、１７Ｄ４、１４Ｆ４および１２Ｄ８とハーセプチンの併用組であり、図１Ｂは３３Ｂ５、３０Ａ１、２７Ｄ１および２５Ｈ１０とハーセプチンの併用組であり、図１Ｃは１１Ｄ１０、１０Ｃ４、４Ａ４、２Ｃ５および１Ｈ１０とハーセプチンの併用組である。
【図２】１４株のマウス由来抗ヒトＨＥＲ２モノクローナル抗体候補とハーセプチンをそれぞれ併用する場合の乳がん細胞ＳＫＢＲ３の増殖に対する阻害効果を示す図であり、そのうち図２Ａは１９Ｈ６、１８Ｂ６、１７Ｄ４、１４Ｆ４および１２Ｄ８とハーセプチンの併用組であり、図２Ｂは１１Ｄ１０、１０Ｃ４、４Ａ４、２Ｃ５および１Ｈ１０とハーセプチンの併用組であり、図２Ｃは３３Ｂ５、３０Ａ１、２７Ｄ１および２５Ｈ１０とハーセプチンの併用組である。
【図３】ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対するマウス由来抗体１９Ｈ６の結合性をＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図である。
【図４】乳がん細胞ＢＴ４７４に対するマウス由来抗体１９Ｈ６の結合性をＦＡＣＳ法で測定したときの結果を示す図である。
【図５】マウス由来抗体１９Ｈ６とハーセプチンを併用するときの乳がん細胞ＢＴ４７４の増殖に対する阻害効果を示す図である。
【図６】マウス由来抗体１９Ｈ６とハーセプチンを併用するときの乳がん細胞ＳＫＢＲ３の増殖に対する阻害効果を示す図である。
【図７】マウス由来抗体１９Ｈ６とハーセプチンを併用するときの胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７の増殖に対する阻害効果を示す図である。
【図８】ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤにおけるマウス由来抗体１９Ｈ６、ハーセプチン及びパージェタの結合エピトープの競合関係を競合ＥＬＩＳＡ法で測定する結果を示す図であり、そのうち図８Ａは濃度勾配を形成した１９Ｈ６、ハーセプチンおよびパージェタをそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬのビオチン化１９Ｈ６と１：１で混ぜ合わせた後、ＨＥＲ２−ＥＣＤとインキュベートした場合の測定結果であり、図８Ｂは濃度勾配を形成した１９Ｈ６、ハーセプチン及びパージェタをそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬのビオチン化パージェタと１：１で混ぜ合わせた後、ＨＥＲ２−ＥＣＤとインキュベートした場合の測定結果であり、図８Ｃは濃度勾配を形成した１９Ｈ６、ハーセプチンをそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ハーセプチンと１：１で混ぜ合わせた後、ＨＥＲ２−ＥＣＤとインキュベートした場合の測定結果である。
【図９】還元型ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対するマウス由来抗体１９Ｈ６の結合性をウエスタンブロット法で測定したときの結果を示す図である。
【図１０】ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤの各機能ドメインに対するマウス由来抗体１９Ｈ６の結合性をウエスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図であり、そのうち図１０Ａはウエスタンブロット法による測定結果であり、図１０ＢはＥＬＩＳＡ法による測定結果である。
【図１１】ＨＥＲ２−ＥＣＤＤＩＩＩ領域内の６つのペプチド配列に対するマウス由来抗体１９Ｈ６の結合活性をＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図である。
【図１２】ペプチドＨＡ−２１領域内の４つのペプチド配列に対するマウス由来抗体１９Ｈ６の結合活性をＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図である。
【図１３】アラニン変異を網羅的に導入した（アラニンスキャニング）１２個のペプチド配列に対するマウス由来抗体１９Ｈ６の結合活性をＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図である。
【図１４】部位特異的変異を導入したヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質に対する１９Ｈ６の結合活性をＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図である。
【図１５】キメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法で検出したときの検出結果を示す図である。
【図１６】ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質に対するキメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈの結合活性をＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図である。
【図１７】乳がん細胞ＢＴ４７４に対するキメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈの結合活性をＦＡＣＳ法で測定したときの結果を示す図である。
【図１８】キメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈとハーセプチンを併用するときの乳がん細胞ＢＴ４７４の増殖に対する阻害効果を示す図である。
【図１９】キメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈとハーセプチンを併用するときの乳がん細胞ＳＫＢＲ３の増殖に対する阻害効果を示す図である。
【図２０】キメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈとハーセプチン併用するときの胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７の増殖に対する阻害効果を示す図である。
【図２１】ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕおよび１９Ｈ６−ｇｒａｆｔをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法で検出した結果を示す図であり、そのうち図２１ＡはＤＴＴを加える還元電気泳動の結果であり、図２１ＢはＤＴＴを加えない非還元電気泳動の結果である。
【図２２】ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕおよび１９Ｈ６−ｇｒａｆｔの結合活性をＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図である。
【図２３】乳がん細胞ＢＴ４７４に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの結合活性をＦＡＣＳ法で測定したときの結果を示す図である。
【図２４】ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンを併用するときの乳がん細胞ＢＴ４７４の増殖に対する阻害効果を示す図である。
【図２５】ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンを併用するときの乳がん細胞ＳＫＢＲ３の増殖に対する阻害効果を示す図である。
【図２６】ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンを併用するときの胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７の増殖に対する阻害効果を示す図である。
【図２７】各種由来のＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの結合活性をＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図である。
【図２８】各ファミリーメンバーＨＥＲ１、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの選択性をＥＬＩＳＡ法で測定したときの結果を示す図である。
【図２９】乳がん細胞ＢＴ４７４を用い、ＨＥＲ２下流シグナル伝達経路に対する１９Ｈ６−Ｈｕの影響をウエスタンブロット法で測定したときの結果を示す図である。
【図３０】ＳＫＢＲ３細胞を用い、ＨＥＲ２下流シグナル伝達経路に対する１９Ｈ６−Ｈｕの影響をウエスタンブロット法で測定したときの結果を示す図である。
【図３１】胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７を用い、ＨＥＲ２下流シグナル伝達経路に対する１９Ｈ６−Ｈｕの影響をウエスタンブロット法で測定したときの結果を示す図である。
【図３２】ＢＴ４７４細胞を用い、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体化に対する１９Ｈ６−Ｈｕの阻害効果を測定したときの結果を示す図である。
【図３３】ＳＫＢＲ３細胞を用い、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体化に対する１９Ｈ６−Ｈｕの阻害効果を測定したときの結果を示す図である。
【図３４】ＮＣＩ−Ｎ８７移植腫瘍モデルを用い、１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンを併用するときの抗腫瘍効果を測定したときの結果を示す図である。
【図３５】ＨＣＣ１９５４移植腫瘍モデルを用い、１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンを併用するときの抗腫瘍効果を測定したときの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明において、「抗体（Ａｂ）」および「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）」とは、同じ構造特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２つの同じ軽鎖（Ｌ）と２つの同じ重鎖（Ｈ）で構成される。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合を介して重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンにおいて同型重鎖の間のジスルフィド結合数が異なる。各重鎖および軽鎖は規則的な間隔で鎖内ジスルフィド結合を有し、各重鎖の一端に可変領域（ＶＨ）を有し、可変領域に続いて定常領域を有する。各軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ）を有し、他端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域と重鎖の第１定常領域が対向し、かつ軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域が対向して構成される。本発明の抗体としては、マウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などが挙げられ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種類の抗体からなる多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体の抗原結合断片などを含む。
【００４１】
本発明において、「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均一な群から得られる抗体を指し、すなわち極一部が自然変異を形成する以外、該群に含まれる単一抗体が同じであることを意味する。モノクローナル抗体は、１つの抗原サイトを高い特異性で認識して結合する。そして、通常のポリクローナル抗体製剤（通常、異なる決定基を認識する複数の抗体を含む）と異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一決定基を認識して結合する。こうした特異性に加え、モノクローナル抗体の利点としてはハイブリドーマを培養することにより得られ、他の免疫グロブリンによって汚染されないことが挙げられる。また、「モノクローナル」とは抗体の特性を指し、すなわちほぼ均一な抗体群から得られ、何ら特別な方法で製造されるものと解釈してはいけない。
【００４２】
本発明において、「マウス由来抗体」とはラット由来抗体又はモウス由来抗体を指し、その中でマウス由来抗体が好ましい。本発明に係るマウス由来抗体は、ヒトＨＥＲ２細胞外領域を抗原としてマウスを免疫し、ハイブリドーマ細胞を選別して得られるものである。本発明のマウス由来抗体としては、１Ｈ１０、２Ｃ５、４Ａ４、１０Ｃ４、１１Ｄ１０、１２Ｄ８、１４Ｆ４、１７Ｄ４、１８Ｂ６、１９Ｈ６、２５Ｈ１０、２７Ｄ１、３０Ａ１および３３Ｂ５が挙げられ、その中でも１９Ｈ６が好ましい。
【００４３】
本発明において、「キメラ抗体」とは、ある種に由来の重鎖および軽鎖の可変領域配列と、別の種に由来の定常領域配列を含む抗体を指し、例えばヒト定常領域と連結したマウス重鎖および軽鎖の可変領域を有する抗体が挙げられる。好ましくは、本発明のキメラ抗体は、マウス由来抗体１９Ｈ６の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列とヒト定常領域を繋ぐことで得られる。より好ましくは、本発明のキメラ抗体としては、重鎖がマウス由来抗体１９Ｈ６の重鎖可変領域配列とヒトＩｇＧ１定常領域を繋ぐことで得られ、軽鎖がマウス由来抗体１９Ｈ６の軽鎖可変領域配列とヒトｋａｐｐａ鎖を繋ぐことで得られる。より好ましくは、本発明のキメラ抗体は１９Ｈ６−ｃｈである。
【００４４】
本発明において、「ヒト化抗体」とは、ＣＤＲがヒト以外の物種（例えば、マウス）の抗体から得られ、抗体分子においてＣＤＲ以外の部分（フレームワーク領域および定常領域を含む）がヒト抗体から得られるものを指す。なお、フレームワーク領域のアミノ酸残基については、結合性が維持できる限り種々の変更を加えることができる。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、マウス由来抗体１９Ｈ６のＣＤＲ領域とヒト由来抗体の非ＣＤＲ領域を組み合せ、さらに埋込み残基、ＣＤＲ領域に直接作用する残基、並びに１９Ｈ６のＶＬ及びＶＨの空間構造に対して重要な影響を与える残基に復帰変異を導入することで得られる。好ましくは、本発明のヒト化抗体は１９Ｈ６−Ｈｕおよび１９Ｈ６−ｇｒａｆｔであり、より好ましくは、本発明のヒト化抗体は１９Ｈ６−Ｈｕである。
【００４５】
本発明において、「抗原結合断片」とは、ヒトＨＥＲ２のエピトープに特異的に結合しうる抗体断片を指す。本発明の抗原結合断片としは、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などが挙げられる。Ｆａｂ断片は、抗体をパパインで消化して得られ、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで消化して得られる。Ｆｖ断片は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域が非共有結合を介して緊密に連結されたダイマーで形成される。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をアミノ酸１５〜２０個からなるペプチドリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で連結して得られる抗体である。シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は重鎖のみで形成され、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）又は重鎖抗体とも呼ばれ、その抗原結合領域はヒンジ領域を介してＦｃ領域に連結されたシングルドメインである。
【００４６】
本発明において、「可変」とは、抗体可変領域の一部に配列差異があり、特定抗原に対する各抗体の結合性や特異性を決定する構成である。ところが、可変度は抗体可変領域全体に渡って均一に分布せず、軽鎖および重鎖の可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と称される３つのフラグメントに集中して存在する。可変領域で保存性が比較的高い部分は、フレームワーク領域（以下、「ＦＲ領域」とも称する）と称される。天然重鎖および軽鎖の可変領域にそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、これらのＦＲ領域はβ−折り畳み構造を形成し、接続リングを構成する３つのＣＤＲによって互いに連結され、ある状況では部分的なβ−折り畳み構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域を介して緊密に隣接し、かつ他鎖のＣＤＲと共同で抗体の抗原結合サイトを形成する［ＫＡＢＡＴ等、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２、第Ｉ巻６４７−６６９頁（１９９１）］。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接に関与しないが、抗体依存性細胞介在性の細胞毒性（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）などの他の生体作用機序を示す。
【００４７】
本発明において、「エピトープ」および「ヒトＨＥＲ２エピトープ」とは、ヒトＨＥＲ２に存在し且つ抗体に特異的に結合する領域を指す。好ましくは、本発明のヒトＨＥＲ２エピトープはヒトＨＥＲ２細胞外領域内に存在し、前記ヒトＨＥＲ２細胞外領域は配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、本発明のヒトＨＥＲ２エピトープはヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩ内に存在し、前記第３機能ドメインＤＩＩＩは配列番号１の第３４３位〜第５１０位に示すアミノ酸配列を有する。より好ましくは、本発明のヒトＨＥＲ２エピトープは、配列番号１のＤ５０２、Ｖ５０５、Ｅ５０７およびＬ５０９から選ばれるアミノ酸残基１個又は２個以上を含む。より好ましくは、本発明のヒトＨＥＲ２エピトープは配列番号１の第４９９位〜第５１０位に示すアミノ酸配列を有する。
【００４８】
本発明において、「ヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片」および「抗ヒトＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片」とは、ヒトＨＥＲ２エピトープに特異的に結合しうる抗体又はその抗原結合断片であって、他のヒト上皮成長因子受容体ファミリーメンバー（ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）と交叉反応を起こさないものを指す。好ましくは、本発明のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＨＥＲ２過剰発現が確認された腫瘍細胞（例えば、乳がん細胞ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ３およびＨＣＣ１９５４、胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７等）の増殖を阻害しうるものである。
【００４９】
本発明において、発現ベクターについては特に制限がなく、例えばｐＴＴ５、ｐＳＥＣｔａｇ系、ｐＣＧＳ３系、ｐＣＤＮＡ系ベクター等、並びに他の哺乳動物発現系に用いるベクターを使用することができ、発現ベクターに適切な転写調節配列や翻訳調節配列が連結された融合ＤＮＡ配列が含まれる。
【００５０】
本発明に適用可能なホスト細胞として、上記発現ベクターを発現しうる細胞が挙げられ、例えば哺乳類動物や昆虫ホスト細胞培養系を利用して本発明の融合タンパク質を発現してもよく、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＢＨＫ及びこれら由来の誘導細胞などを本発明に利用可能である。また、本発明において、「細胞」と「細胞系」は同じ意味を有し、互いに置き換えることができる。
【００５１】
本発明において、「薬物組成物」とは、本発明のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容可能な担体とで構成される薬物製剤を指し、本発明に係る薬物組成物は、安定な治療効果を確保すると同時に本発明のヒトＨＥＲ２に結合する抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸コア配列の構造完全性を維持することができ、さらに、タンパク質の多官能基を分解（例えば、凝集、脱アミノ化や酸化）から免れるようにすることができる。
【００５２】
好ましくは、本発明の薬物組成物は、ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片を更に含む。より好ましくは、前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第３機能ドメインＤＩＩＩに結合せず、前記第３機能ドメインＤＩＩＩは、配列番号１の第３４３位〜第５１０位に示すアミノ酸配列を有する。より好ましくは、前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＨＥＲ２細胞外領域の第４機能ドメインＤＩＶに結合し、前記第４機能ドメインＤＩＶは配列番号１の第５１１位〜第５８２位に示すアミノ酸配列を有する。より好ましくは、前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２５で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２６で表される。より好ましくは、前記ヒトＨＥＲ２に結合するもう１つの抗体又はその抗原結合断片は、トラスツズマブである。
【００５３】
本発明において、「ＨＥＲ２過剰発現が確認された疾患」とは、同一組織の正常細胞のＨＥＲ２発現レベルに比べて疾患状態細胞のＨＥＲ２発現レベルが異常上昇することを意味する。本発明のＨＥＲ２過剰発現が確認された疾患については特に制限がなく、乳がん、胃がん、卵巣がん等のＨＥＲ２過剰発現が確認された癌が挙げられる。
【００５４】
以下、実施例や実験例を挙げて本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例や実験例に制限されない。以下においてベクターやプラスミドの構築方法、タンパク質をコードする遺伝子を前記ベクターやプラスミドに導入する方法、プラスミドをホスト細胞に導入する方法など、従来周知の操作については説明を省略する。これらの操作は当業者が熟知するものであり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓなどの出版物に詳細な説明がある。
【００５５】
以下において、ＨＥＲ２高発現細胞系とは、乳がん細胞ＢＴ４７４、乳がん細胞ＳＫＢＲ３、胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７及び乳がん細胞ＨＣＣ１９５４などを指し、そのうちＨＣＣ１９５４（カタログ番号：ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２３３８ＴＭ）及びＳＫＢＲ３（カタログ番号：ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３０ＴＭ）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入し、ＢＴ４７４（カタログ番号：ＴＣＨｕ１４３）及びＮＣＩ−Ｎ８７（カタログ番号：ＳＣＳＰ−５３４）は、中国科学院細胞バンクから購入し、細胞培養は各自関連のマニュアルに従って行った。
【００５６】
また、以下において特に説明がない限り、陽性対照抗体としてハーセプチン（規格４４０ｍｇ／２０ｍＬ、ロット番号Ｎ３７２３、Ｒｏｃｈｅ社製）及びパージェタ（規格４２０ｍｇ／１４ｍＬ、ロット番号Ｈ０２４８Ｂ０２、Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。
【００５７】
また、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質については、特に説明がない限り、以下の手順に従って調製したものを使用した。つまり、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤ（ＮＣＢＩ登録番号：ＮＰ＿００４４３９．２の第１位〜第６５２位アミノ酸配列からなり、アミノ酸配列が配列番号１で表され、ヌクレオチド配列が配列番号２で表される）のＣ−末端に６×Ｈｉｓタグを付けた核酸配列をｐＴＴ５ベクター（ＮＲＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）に導入してＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓ−ｐＴＴ５を構築し、中国ハムスター卵巣細胞ＣＨＯに導入して発現させ、導入後の七日目に上澄み液を回収してタンパク質を精製し、後の使用に備えて低温で保存した。
【００５８】
以下において、略語を用いて実施例で使われる試薬を表する場合があるが、各略語は、具体的に以下のものを指す。
ＨＡＴ：ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）及びチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎ）
ＰＢＳ：１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）
ＰＢＳＴ：Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％含む１０ｍＭのリン酸塩緩衝液
ＴＢＳ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．５
ＴＢＳＴ：Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％含むＴＢＳ溶液
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）
ＴＭＢ：３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）
ＤＴＴ：ジチオトレイトール（ＤＬ−Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）
【００５９】
実施例１：ヒトＨＥＲ２に特異的に結合するマウス由来モノクローナル抗体の調製
１．１）マウス免疫
哺乳類動物細胞であるＣＨＯ細胞で発現したヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質（自ら調製したもの、純度＞９５％）を用い、通常の手順に従ってＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢バイオテック社製）を免疫した。１日目に、可溶性ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質とフロイント完全アジュバントを混合して乳化した後、Ｂａｌｂ／ｃマウス１匹当たりにヒトＨＥＲ２−ＥＣＤを５０μｇ／０．５ｍＬ、皮下数箇所に注射した。２１日目に、可溶性ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質とフロイント不完全アジュバントを混合して乳化した後、Ｂａｌｂ／ｃマウス１匹当たりにヒトＨＥＲ２−ＥＣＤを５０μｇ／０．５ｍＬ、皮下数箇所に注射し、４１日目に、Ｂａｌｂ／ｃマウス１匹当たりに可溶性ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質を５０μｇ／０．２ｍＬ、腹腔内注射を行って免疫刺激を強化し、３日〜４日後にマウス脾臓を採って融合実験を実施した。
【００６０】
１．２）ハイブリドーマ細胞の調製と選別
マウスに対して最終免疫を行ってから３日〜４日目に、通常のハイブリドーマ技術を利用してマウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０を電気融合装置（ＢＴＸ社製）にて細胞融合を行った。融合が終わると、細胞を完全培地［すなわち、ＲＰＭＩ１６４０とＤＭＥＭ  Ｆ１２培地を１：１で十分混ぜ合わせた後、１％のグルタミン（Ｇｌｕｔaｍｉｎｅ）、１％のピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）、１％のＭＥＭ−ＮＥＡＡ（最小必須培地−非必須アミノ酸溶液）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、５０μＭのβ−メルカプトエタノールおよび２０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を加えたもの、試薬は全てＧｉｂｃｏ社製］に均一に懸濁させ、各ウェルに１０５個細胞／１００μＬにし、９６ウェルプレート３６枚に分注して一晩培養した。翌日に各ウェル２×ＨＡＴを含む完全培地１００μＬを加え、９６ウェルプレートの各ウェル内の培養液が２００μＬ（１×ＨＡＴを含む）になるようにした。７日〜１２日後に上澄み液を回収し、間接ＥＬＩＳＡ法でヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対して結合活性を示すハイブリドーマ株を選別した結果、陽性ハイブリドーマを８３９株取得した。乳がん細胞ＢＴ４７４の増殖に対するハイブリドーマの阻害活性を測定することにより、さらに陽性ハイブリドーマを３６株選別した。そして、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対して結合活性を示すと同時にＢＴ４７４細胞増殖に対して阻害活性を示す陽性ハイブリドーマを有限希釈法によってサブクローン化を２回行い、陽性ハイブリドーマを１４株取得し、それぞれ１Ｈ１０、２Ｃ５、４Ａ４、１０Ｃ４、１１Ｄ１０、１２Ｄ８、１４Ｆ４、１７Ｄ４、１８Ｂ６、１９Ｈ６、２５Ｈ１０、２７Ｄ１、３０Ａ１および３３Ｂ５と名付けた。
【００６１】
そのうち、間接ＥＬＩＳＡ法を利用し、以下の手順に従ってヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対して結合活性を示す陽性ハイブリドーマ株を選別した。つまり、コーティング液（５０ｍＭの炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）を用いて組換えヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質を濃度が１μｇ／ｍＬになるように希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ加え、４℃で一晩静置してコーティングを行った。プレートをＰＢＳＴで３回洗い流し、各ウェルにブロッキング液（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を２００μＬ加え、３７℃、１時間静置してからプレートをＰＢＳＴ１回洗い流して後に備えた。上記ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、得られたハイブリドーマ上澄み液を１００μＬずつ順に加え、３７℃、１時間静置した。プレートをＰＢＳＴで３回洗い流し、ＨＲＰ標識のヒツジ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品番号ＡＰ１８１Ｐ）を加え、３７℃、３０分間静置した。プレートをＰＢＳＴで５回洗い流し、吸水紙に軽く叩いて残液をほぼ完全に取り除き、各ウェルにＴＭＢ（ＢＤ社製、商品番号５５５２１４）を１００μＬ加え、室温（２０±５℃）、暗所で５分間静置した。各ウェルに２ＭのＨ２ＳＯ４終止液を５０μＬ加えて反応を中止させ、プレートリーダーでＯＤ４５０値を測定することにより試料抗体と標的抗原ＨＥＲ２−ＥＣＤの結合性を解析した。
【００６２】
また、乳がん細胞ＢＴ４７４の増殖に対するハイブリドーマ株の阻害活性は、以下の通りにして測定した。つまり、対数増殖期の乳がん細胞ＢＴ４７４をトリプシンで消化し、細胞数を計測してからウシ胎児血清を１０％含む完全培地に懸濁し、１ウェル当たりにＢＴ４７４細胞５０００個、１５０μＬずつにして９６ウェル培養プレートに播種し、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで１６時間培養した。試料抗体を異なる濃度で加え、各濃度に平行ウェルを３つ設け、６日後に培養液を捨て、各ウェルにＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製の細胞計測キット−８、商品番号Ｃａｔ＃ＣＫ０４）反応液を１００μＬずつ加え、所期の色になるまで３７℃で反応させた。細胞を蒔いていないウェルをブランクウェルとし、かつ細胞を蒔いたが試料抗体を入れないウェルを対照ウェルとしてＯＤ４５０値を測定して各組の細胞活性を確定し、下記式に従って細胞生存率と増殖阻害率を算出し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトで整理、解析した。
【００６３】
生存率＝（ＯＤ投与−ＯＤブランク）／（ＯＤ対照−ＯＤブランク）×１００％
増殖阻害率＝１−生存率
【００６４】
１．３）マウス由来抗ヒトＨＥＲ２モノクローナル抗体の大量製造と評価
上記１．２で得られた１４株のハイブリドーマ細胞を、血清を添加した完全培地で拡大培養した。遠心することにより培養液を血清フリーのＳＦＭ培地（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、商品番号１２０４５−０７６）に置き換え、細胞密度が１〜２×１０７／ｍＬになるようにして５％のＣＯ２、３７℃条件下で１週間培養し、遠心して上澄み液を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムで精製してマウス由来抗ヒトＨＥＲ２モノクローナル抗体を１４株取得した。
【００６５】
上記１４株のマウス由来抗ヒトＨＥＲ２モノクローナル抗体候補については、以下の手順に従ってハーセプチンを併用するときの乳がん細胞ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３の増殖に対する阻害活性を測定することで更に選別を行った。具体的には、各ウェルに１５０μＬずつ、５０００個細胞となるように９ＢＴ４７４又は３０００个ＳＫＢＲ３細胞を９６ウェル培養プレートに播種し、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで１６時間インキュベートし、完全培地で３倍の濃度勾配に希釈した試料抗体とハーセプチンを加え、各抗体の最高作業濃度が２０μｇ／ｍＬとなるようにした。ハーセプチン併用組およびハーセプチン単独投与組をそれぞれ設け、上記実施例１．２と同様にしてデータ処理と解析を行った。
【００６６】
図１Ａ〜図１Ｃに示すように、３つのモノクローナル抗体２７Ｄ１、２５Ｈ１０、４Ａ４および１９Ｈ６４については、ハーセプチンと併用することでＢＴ４７４細胞の増殖を著しく抑制し、かつＢＴ４７４に対するハーセプチンの最大阻害率を大きく向上させ、最大阻害率を達したときのハーセプチン使用量を大きく減らすことのできることが確認でき、そのうち１９Ｈ６の効果が特に顕著であった。
【００６７】
図２Ａ〜図２Ｃに示すように、モノクローナル抗体１９Ｈ６とハーセプチンを併用することでＳＫＢＲ３細胞の増殖を著しく抑制し、ＳＫＢＲ３細胞増殖に対する最大阻害率を大きく向上させることが確認でき、一方、モノクローナル抗体４Ａ４、２５Ｈ１０、２７Ｄ１の場合、ハーセプチンと併用することでＢＴ４７４細胞の増殖を阻害することができるが、ＳＫＢＲ３細胞の増殖についてはハーセプチンとの併用でそれなりの効果が見られなかった。
【００６８】
以上のことから、マウス由来抗ヒトＨＥＲ２モノクローナル抗体１９Ｈ６を選んで上記方法に従って大量製造し、体内活性やその他の評価を行うことにした。
【００６９】
実施例２：モノクローナル抗体１９Ｈ６の体外活性評価
２．１）標的抗原に対するマウス由来抗体１９Ｈ６の結合性
本実施例では、ＥＬＩＳＡ法を用いてヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対する１９Ｈ６の結合性を測定した。具体的には、上記実施例１．２と同様にして測定した。図３に示すように、１９Ｈ６がヒトＨＥＲ２に特異的に結合することのできることが確認でき、本発明の測定方法によって得られたに結合ＥＣ５０は０．２８ｎＭであった。
【００７０】
２．２）標的細胞に対するマウス由来抗体１９Ｈ６の結合性
本実施例では、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）法で乳がん細胞ＢＴ４７４に対する１９Ｈ６の結合性を測定した。具体的には、標的細胞として乳がん細胞ＢＴ４７４を用い、一次抗体として１０００ｎＭから３倍率で１２個の濃度勾配に希釈した１９Ｈ６号抗体１００μＬを、それぞれＲＰＭＩ−１６４０無血清培地（Ｇｉｂｃｏ社製、商品番号２２４０００８９）１００μＬに３×１０５個細胞の密度で分散したＢＴ４７４細胞と混ぜ合わせ、４℃で１時間インキュベートした（１９Ｈ６の最高作業濃度：５００ｎＭ）。ＰＢＳで細胞を２回洗浄して結合しなかった遊離１９Ｈ６を除去し、さらに、細胞を２μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識の抗マウスＦｃ的二次抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、商品番号５５４００１）２００μＬと混ぜ合わせて４℃、３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄することで結合しなかった二次抗体を除去した後、２００μＬのＰＢＳに懸濁させた。該細胞に対する１９Ｈ６の結合性を測定し、測定データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトで整理して解析した。
【００７１】
図４に示すように、細胞表面においてＨＥＲ２を高発現する乳がん細胞ＢＴ４７４に１９Ｈ６が特異的に結合し、そのＥＣ５０が１．１ｎＭであることが確認できた。
【００７２】
２．３）標的細胞増殖に対するマウス由来抗体１９Ｈ６の阻害活性
本実施例では、上記実施例１．２と同様にしてＨＥＲ２高発現の標的細胞（乳がん細胞ＢＴ４７４、乳がん細胞ＳＫＢＲ３、胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７）の増殖に対する１９Ｈ６とハーセプチンを併用するときの阻害活性を測定した。具体的には、９６ウェルプレートの各ウェルにＢＴ４７４、ＮＣＩ−Ｎ８７又は３０００のＳＫＢＲ３細胞を５０００個の細胞密度で播種し、同時に完全培地を用いて３倍率で試料抗体を希釈して濃度勾配を形成した。そのうち最高工作濃度１０μｇ／ｍＬを単独投与組とし、ハーセプチンを含む完全培地（ハーセプチンの終濃度：１μｇ／ｍＬ）で試料抗体を希釈して３倍率の濃度勾配を形成し、ハーセプチン併用組とした。
【００７３】
図５に示すように、１９Ｈ６と１μｇ／ｍＬのハーセプチンを併用した場合、乳がん細胞ＢＴ４７４の増殖を効率よく阻害し、かつその阻害效果がパージェタとハーセプチンの併用やハーセプチン単独投与の場合を遥かに上回り、最大阻害效果がパージェタとハーセプチンノの併用時およびハーセプチン単独投与時に比べて２倍以上であることが確認できた。
【００７４】
図６に示すように、１９Ｈ６と１μｇ／ｍＬのハーセプチンを併用した場合、乳がん細胞ＳＫＢＲ３の増殖を効率よく阻害し、かつその阻害效果がパージェタとハーセプチンの併用時やハーセプチン単独投与の場合を遥かに上回り、最大阻害效果がパージェタとハーセプチンの併用時およびハーセプチン単独投与時に比べて１．５倍以上であることが確認できた。
【００７５】
図７に示すように、１９Ｈ６と１μｇ／ｍＬのハーセプチンを併用した場合、胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７の増殖を効率よく阻害し、かつその阻害效果がパージェタとハーセプチンの併用やハーセプチン単独投与の場合を遥かに上回り、最大阻害效果がパージェタとハーセプチンの併用時に比べて約４倍、ハーセプチン単独投与時に比べて約４．５倍であることが確認できた。
【００７６】
実施例３：モノクローナル抗体１９Ｈ６の抗原結合エピトープの同定
３．１）マウス由来抗体１９Ｈ６とハーセプチンやパージェタの競合エピトープの同定
本実施例では、競合ＥＬＩＳＡ法を用いてヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対する１９Ｈ６、ハーセプチン及びパージェタのエピトープ関係を確定し、具体的には、以下の通りにして測定を行った。
【００７７】
Ｓｉｇｍａ社製のＮＨＳ活性化ビオチン（商品番号Ｃａｔ＃Ｈ１７５９）を用い、製品マニュアルに従って１９Ｈ６、パージェタ及びハーセプチンにそれぞれビオチン標識を付けた。具体的には、ＮＨＳ活性化ビオチンを終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶かし、１９Ｈ６、パージェタ及びハーセプチンをそれぞれ１ｍｇ（１ｍＬ）取ってビオチン５０μｇ（５μＬ）と十分混ぜ合わせ、室温で２時間静置してからＴｒｉｓ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）１００μＬを加えて４℃で一晩インキュベートし、大量のＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて透析して後に備えた。
【００７８】
標的抗原ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤをコーティング液で１μｇ／ｍＬになるように希釈した後、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬ加えて４℃で一晩静置し、ＰＢＳＴで３３回洗い流した。そして、各ウェルに２％のＢＳＡ−ＰＢＳを２００μＬ加え、３７℃で１時間ブロッキングすることによりＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。１９Ｈ６、パージェタ及びハーセプチンをそれぞれ希釈して濃度勾配を形成し、さらに、ビオチン化１９Ｈ６、パージェタ及びハーセプチンをそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬに希釈した。希釈して濃度勾配を形成した１９Ｈ６、パージェタ及びハーセプチン試料を、それぞれ希釈したビオチン化的１９Ｈ６、パージェタ及びハーセプチンと体積比１：１で混ぜ合わせ、同時に濃度勾配を形成した１９Ｈ６、パージェタ及びハーセプチン試料をそれぞれ希釈液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ）と体積比１：１で混合してブランク対照とした。ＥＬＩＳＡプレートの１ウェル当たりに上記混合液を１００μＬ加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで３回洗い流し、ＨＲＰ標識のストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｓ４６７２−５ＭＧ）を添付のマニュアルに従って希釈して各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ５回洗い流し、各ウェルにＴＭＢを１００μＬ加えて室温、暗所で５分間反応させた後、２ＭのＨ２ＳＯ４を５０μＬ更に加え、プレートリーダーでＯＤ４５０値を測定した。
【００７９】
図８Ａ〜図８Ｃに示すように、１９Ｈ６は、ビオチン化１９Ｈ６とヒトＨＥＲ２−ＥＣＤの結合を効率よく阻害するが、ハーセプチン及びパージェタは、ビオチン化１９Ｈ６とヒトＨＥＲ２−ＥＣＤの結合を阻害しないことが確認できた。また、１９Ｈ６は、ビオチン化ハーセプチン又はパージェタとヒトＨＥＲ２−ＥＣＤの結合を阻害せず、つまり、１９Ｈ６とハーセプチン又はパージェタのエピトープとはヒトＨＥＲ２−ＥＣＤの結合エピトープからして相関性がなく、１９Ｈ６がハーセプチン及びパージェタとは異なる結合エピトープに結合することが確認できた。
【００８０】
３．２）１９Ｈ６と還元型ＨＥＲ２−ＥＣＤの結合性
本実施例では、ウエスタンブロット法を利用して１９Ｈ６と還元型ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤの結合性を測定した。具体的には、還元型ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤを含むサンプル（２ｎｇ／１ウェル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ＰＶＤＦメンブレンに電気的に転写し、３％のＢＳＡを含むＴＢＳにおいて３７℃、２時間ブロッキングした。そして、それぞれ１μｇ／ｍｌの１９Ｈ６、ハーセプチン及びパージェタ溶液（１％のＢＳＡを含むＴＢＳＴで希釈したもの）を加えて３７℃、１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで３回洗い流した後、１％のＢＳＡを含むＴＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識のヒツジ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品番号Ｃａｔ＃ＡＰ１８１Ｐ）又は１％のＢＳＡを含むＴＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識のヒツジ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品番号ＡＰ１０１Ｐ）を加えて３７℃で０．５時間インキュベートした。ＴＢＳＴで５回洗い流し、ＰＶＤＦメンブレンに適量のＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ基質溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、商品番号Ｃａｔ＃ＷＢＫＬＳ０５００）を滴下し、室温、暗所で生体分子撮像装置（ＧＥ公司社製、型番Ｌａｓ４００ｍｉｎｉ）を用いて自動撮像した。
【００８１】
図９に示すように、９５ｋＤ〜１３０ｋＤの目的区間で特異的な免疫バンドが現れ、１９Ｈ６が還元型ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに特異的に結合し、ヒトＨＥＲ２タンパク質における１９Ｈ６の結合エピトープが線状エピトープであることが確認できた。一方、ハーセプチン及びパージェタは１９Ｈ６と異なり、同じ実験で還元型ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤへの結合を示さなかった。
【００８２】
３．３）標的抗原における１９Ｈ６結合領域の同定
本実施例では、通常のウエスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ法を利用してヒトＨＥＲ２−ＥＣＤにおける１９Ｈ６の結合領域を同定した。具体的には、ヒトＨＥＲ２における１９Ｈ６の結合エピトープを確定するため、文献調査やＮＣＢＩからヒトＨＥＲ２細胞外領域に関連する情報（アミノ酸配列がＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００４４３９．２の第１位〜第６５２位に示される通りであり、本発明ではアミノ酸配列が配列番号１で表され、ヌクレオチド配列が配列番号２で表される）を取得し、そのうち配列番号１で表されるアミノ酸配列は、シグナルペプチド配列ＳＰ（第１位〜第２２位）、機能ドメインＤＩ（第２３位〜第２１７位）、機能ドメインＤＩＩ（第２１８位〜第３４２位）、機能ドメインＤＩＩＩ（第３４３位〜第５１０位）および機能ドメインＤＩＶ（第５１１位〜第５８２位）を含む。次に、ＨＥＲ２−ＥＣＤの４つの機能ドメイン（ＤＩ〜ＤＩＶ）を組み合せて発現させ、すなわちＨＥＲ２−ＥＣＤ−ＤＩ（第１位〜第２１７位）、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−ＤＩ−ＤＩＩ（第１位〜第３４２位）、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−ＤＩ−ＤＩＩＩ（第１位〜第５１０位）及びＨＥＲ２細胞外領域全長ＨＥＲ２−ＥＣＤ−ｆｌ（第１位〜第６５２位）をそれぞれ調製した。そして、通常のウエスタンブロット法およびＥＬＩＳＡ法を利用し、上記実施例３．２及び１．２と同様にしてヒトＨＥＲ２−ＥＣＤ各機能ドメインに対する１９Ｈ６の識別結合性を測定した。
【００８３】
図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、１９Ｈ６の識別サイトがヒトＨＥＲ２−ＥＣＤの第３機能ドメインＤＩＩＩ内に存在することがウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡの測定結果から確認され、これはハーセプチンの識別サイトが機能ドメインＤＩＶ内に存在し、又はパージェタの識別サイトが機能ドメインＤＩＩ内に存在することとは違う状況であることが確認できた。
【００８４】
３．４）標的抗原への１９Ｈ６結合を影響しうる重要な識別サイトの同定
上記実施例３．２および３．３の結果から１９Ｈ６が組換えＨＥＲ２−ＥＣＤやＨＥＲ２−ＥＣＤ  ＤＩＩＩに結合し、１９Ｈ６の結合エピトープが線状エピトープであることを確認したため、合成ペプチドとＥＬＩＳＡ法を用いて１９Ｈ６の結合エピトープの位置を更に確定することができる。そこで、本実施例において、ＥＬＩＳＡ法で１９Ｈ６とヒトＨＥＲ２−ＥＣＤＤＩＩＩ領域内ペプチドとの結合性を測定することにより、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤへの１９Ｈ６結合を影響しうる重要な識別サイトを同定した。
【００８５】
具体的には、まずヒトＨＥＲ−ＥＣＤ  ＤＩＩＩを互いに重なる部分がある６つのペプチド配列に分解し、下記の通り、各ペプチド配列のＮ末端にビオチン標識を付けたペプチド（ｂｉｏ−ペプチド）を合成した。
ＹＣ−２５：ｂｉｏ−ＹＧＬＧＭＥＨＬＲＥＶＲＡＶＴＳＡＮＩＱＥＦＡＧ（第３４３位〜第３６６位）
ＡＡ−２６：ｂｉｏ−ＡＧＣＫＫＩＦＧＳＬＡＦＬＰＥＳＦＤＧＤＰＡＳＮＴＡ（第３６５位〜第３９０位）
ＮＣ−３８：ｂｉｏ−ＮＴＡＰＬＱＰＥＱＬＱＶＦＥＴＬＥＥＩＴＧＹＬＹＩＳＡＷＰＤＳＬＰＤＬＳＶ（第３８８位〜第４２４位）
ＬＣ−４１：ｂｉｏ−ＬＳＶＦＱＮＬＱＶＩＲＧＲＩＬＨＮＧＡＹＳＬＴＬＱＧＬＧＩＳＷＬＧＬＲＳＬＲＥＬ（第４２２位〜第４６１位）
ＥＣ−３４：ｂｉｏ−ＥＬＧＳＧＬＡＬＩＨＨＮＴＨＬＣＦＶＨＴＶＰＷＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡ（第４６０位〜第４９２位）
ＨＡ−２１：ｂｉｏ−ＨＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡ（第４９０位〜第５１０位）
【００８６】
図１１に示すように、１９Ｈ６がＨＡ−２１ペプチドのみに、すなわちヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質のＮ末端第４９０位〜第５１０位アミノ酸配列のみに結合することから、１９Ｈ６の結合エピトープがヒトＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸残基Ｈ４９０〜Ａ５１０の間に存在することが確認できた。
【００８７】
そして、ＨＡ−２１ペプチドを更に細かく分解し、以下に示された通り、互いに重なる部分があるＮ末端ビオチン化のペプチド３−２〜ペプチド３−５を合成した。
３−２：ｂｉｏ−ＤＱＬＦＲＮＰＨＱＡＬＬ（第４８３位〜第４９４位）
３−３：ｂｉｏ−ＱＡＬＬＨＴＡＮＲＰＥＤ（第４９１位〜第５０２位）
３−４：ｂｉｏ−ＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡ（第４９９位〜第５１０位）
３−５：ｂｉｏ−ＥＧＬＡＣＨＱＬＣＡＲＧ（第５０７位〜第５１８位）
【００８８】
図１２に示すように、１９Ｈ６がペプチド３−４のみに、すなわちヒトＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質のＮ末端第４９９位〜第５１０位のアミノ酸配列のみに結合することから、１９Ｈ６の結合エピトープがヒトＨＥＲ２タンパク質のアミノ酸残基Ｒ４９９〜Ａ５１０の間に存在することが確認できた。
【００８９】
そして、アラニンスキャニング（すなわち、アラニンでないアミノ酸残基をそれぞれアラニンに置き換える）法に則って、以下に示すようなＮ末端ビオチン化の第４９９位〜第５１０位ペプチド４−１〜４−１２を合成した。
４−１：ｂｉｏ−ＡＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡ
４−２：ｂｉｏ−ＨＡＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡ
４−３：ｂｉｏ−ＨＴＡＡＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡ
４−４：ｂｉｏ−ＨＴＡＮＡＰＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡ
４−５：ｂｉｏ−ＨＴＡＮＲＡＥＤＥＣＶＧＥＧＬＡ
４−６：ｂｉｏ−ＨＴＡＮＲＰＡＤＥＣＶＧＥＧＬＡ
４−７：ｂｉｏ−ＨＴＡＮＲＰＥＡＥＣＶＧＥＧＬＡ
４−８：ｂｉｏ−ＨＴＡＮＲＰＥＤＡＣＶＧＥＧＬＡ
４−９：ｂｉｏ−ＨＴＡＮＲＰＥＤＥＡＶＧＥＧＬＡ
４−１０：ｂｉｏ−ＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＡＧＥＧＬＡ
４−１１：ｂｉｏ−ＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＡＧＬＡ
４−１２：ｂｉｏ−ＨＴＡＮＲＰＥＤＥＣＶＧＥＧＡＡ
【００９０】
図１３に示すように、１９Ｈ６は、ペプチド４−７（Ｄ５０２Ａ）、ペプチド４−１０（Ｖ５０５Ａ）及びペプチド４−１１（Ｅ５０７Ａ）にはほぼ結合せず、ペプチド４−１２（Ｌ５０９Ａ）に結合するものの、他のペプチドの場合に比べて結合性が低下することから、Ｄ５０２、Ｖ５０５、Ｅ５０７がヒトＨＥＲ２−ＥＣＤへの１９Ｈ６結合を影響しうる一番重要なアミノ酸サイトであり、重要性からして次ぎのアミノ酸サイトがＬ５０９であることが確認できた。
【００９１】
３．５）１９Ｈ６識別サイトの精確同定
本実施例では、ＨＥＲ２−ＥＣＤ部位特異的変異体を用い、ＥＬＩＳＡ法で各変異体と１９Ｈ６との結合性を測定した。具体的には、ＰＣＲ法を利用してＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓ−ｐＴＴ５発現ベクターに部位特異的変異を導入することにより、第５０２位アスパラギン酸残基をアラニン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｄ５０２Ａ）、第５０５位バリン残基をアラニン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｖ５０５Ａ）、第５０７位グルタミン酸残基をそれぞれアラニン（ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｅ５０７Ａ）に変えた発現ベクターを構築し、同時に、第５０２位アスパラギン酸残基および第５０５位バリン残基をアラニンに変えた２点変異（ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｄ５０２Ａ／Ｖ５０５Ａ）、並びに第５０２位アスパラギン酸残基、第５０５位バリン残基及び第５０７位グルタミン酸残基をアラニンに変えた３点変異（ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｄ５０２Ａ／Ｖ５０５Ａ／Ｅ５０７Ａ）を導入した発現ベクターを構築した。各ベクターについては配列測定を行って正確さを確認し、ＨＥＫ２９３Ｅ（ＮＲＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）に導入して発現させ、５日後に上澄み液を回収して精製し、次に備えて保存した。精製済みのＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質および上記各変異体を用い、実施例１．２と同様にして１９Ｈ６との結合性を測定した。
【００９２】
図１４に示すように、１９Ｈ６は、ＨＥＲ２−ＥＣＤ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｄ５０２Ａ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｅ５０５ＡおよびＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｅ５０７Ａに結合する際のＥＣ５０がそれぞれ０．０４１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０３８ｎＭ及び０．８６７ｎＭであり、一方、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｄ５０２Ａ／Ｖ５０５Ａ及びＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｄ５０２Ａ／Ｖ５０５Ａ／Ｅ５０７Ａに対してはほぼ結合性を示さないのが確認できた。この結果から、ＨＥＲ２−ＥＣＤ第５０２位のアスパラギン酸、第５０５位のバリン及び第５０７位のグルタミン酸残基がＨＥＲ２−ＥＣＤへの１９Ｈ６結合に重要であり、そのうち第５０７位のグルタミン酸残基が特に重要であると確認でき、後にヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの結合エピトープを同定、評価する際にも同じような結果が得られた。
【００９３】
実施例４：１９Ｈ６キメラ抗体（１９Ｈ６−ｃｈ）の調製と生体活性評価
４．１）キメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈの調製
本実施例では、１９Ｈ６の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に修飾を加えてキメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈを構築した。具体的には、Ｔｒｉｚｏｌで１９Ｈ６ハイブリドーマ細胞のＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。そして、ｃＤＮＡをテンプレートとし、マウス由来抗体の重鎖および軽鎖の縮重プライマー（抗体工学第１巻、Ｒｏｌａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｅｂｅｌ編集、プライマーペアの配列は第３２３頁に記載された通りであった）を用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約７００ｂｐ）について配列測定を行い、さらに、ＫＡＢＡＴ法則に従って解析することによりマウス由来抗体の可変領域配列であると確定した。その配列情報として、重鎖可変領域の遺伝子配列全長が３５１ｂｐであり、１１７個のアミノ酸残基をコードし、アミノ酸配列が配列番号３で表され、ヌクレオチド配列が配列番号４で表され、また、軽鎖可変領域の遺伝子配列全長が３３６ｂｐであり、１１２個のアミノ酸残基をコードし、アミノ酸配列が配列番号５で表され、ヌクレオチド配列が配列番号６で表される。
【００９４】
得られた重鎖可変領域配列をヒトＩｇＧ１定常領域（アミノ酸配列が配列番号７で表され、ヌクレオチド配列が配列番号８で表される）と繋ぎ、軽鎖可変領域配列をヒトｋａｐｐａ鎖定常領域（アミノ酸配列を有する配列番号９で表され、ヌクレオチド配列如配列番号１０所示）と繋いだ後、１９Ｈ６−ｃｈの重鎖および軽鎖をそれぞれｐＴＴ５発現ベクターに導入した。そして、ＨＥＫ−２９３Ｅ細胞に導入し、キメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈを精製してからＳＤＳ−ＰＡＧＥで抗体の正確さ及び及純度を確定し、定量化して分注し、次に備えて−８０℃で保存した。
【００９５】
図１５に示すように、得られた１９Ｈ６−ｃｈが所期の分子量範囲内にあり、純度が９５％以上であった。
【００９６】
４．２）標的抗原に体するキメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈの結合性
本実施例では、ＥＬＩＳＡ法を用い、上記実施例１．２と同様にしてヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対する１９Ｈ６−ｃｈの結合性を測定した。
【００９７】
図１６に示すように、１９Ｈ６−ｃｈは、ヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対して１９Ｈ６並みの結合性を示し、ＥＣ５０が０．１ｎＭであった。
【００９８】
４．３）標的細胞に対するキメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈの結合性
本実施例では、ＦＡＣＳ法を用い、上記実施例２．２と同様にして乳がん細胞ＢＴ４７４に対する１９Ｈ６−ｃｈの結合性を測定した。
【００９９】
図１７に示すように、１９Ｈ６−ｃｈが乳がん細胞ＢＴ４７４に特異的に結合し、１９Ｈ６−ｃｈ、ハーセプチン及びパージェタのＥＣ５０がそれぞれ１．５ｎＭ、４．８ｎＭ及び２．４ｎＭであること確認できた。つまり、乳がん細胞ＢＴ４７４に対する結合性からして、１９Ｈ６−ｃｈがＨＥＲ２を標的とする市販薬物ハーセプチン及びパージェタを上回ることが確認できた。
【０１００】
４．４）キメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈの標的細胞増殖阻害活性の測定
本実施例では、上記実施例２．３と同様にして、キメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈとハーセプチンを併用するときのＨＥＲ２過剰発現が確認された標的細胞（乳がん細胞ＢＴ４７４、乳がん細胞ＳＫＢＲ３および胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７）の増殖に対する阻害活性を測定した。
【０１０１】
図１８、図１９および図２０に示すように、１９Ｈ６−ｃｈと１μｇ／ｍＬのハーセプチンを併用した場合、乳がん細胞ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ３および胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７の増殖を効率よく阻害し、その阻害效果がパージェタとハーセプチンを併用する場合、又はハーセプチンを単独投与する場合を遥かに上回り、かつ上記３種類の腫瘍細胞の増殖に対する阻害活性が１９Ｈ６と一致することが確認できた。
【０１０２】
実施例５：１９Ｈ６ヒト化抗体の調製と生体活性評価
５．１）ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕおよび１９Ｈ６−ｇｒａｆｔの調製
軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列を解析し、ＫＡＢＡＴ法則に従ってマウス由来抗体１９Ｈ６の３つの抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を確定した。そのうち、重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列としてＨＣＤＲ１がＤＹＡＩＨ（配列番号１１）、ＨＣＤＲ２がＶＦＳＩＹＹＥＮＩＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１２）、ＨＣＤＲ３がＲＤＧＧＴＩＮＹ（配列番号１３）であり、軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列としてＬＣＤＲ１がＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号１４）、ＬＣＤＲ２がＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号１５）、ＬＣＤＲ３がＳＱＳＴＨＩＰＷＴ（配列番号１６）であった。
【０１０３】
生殖系配列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）データバンクから１９Ｈ６のＣＤＲ領域外と適合性が最も高いヒト化テンプレートを選出し、選んだヒト化テンプレートに１９Ｈ６のＣＤＲ領域を移植することでヒト化テンプレートのＣＤＲ領域を置き換え、さらにＩｇＧ１定常領域と組換えを行った。同時に、該抗体の３次元構造に基づき埋込み残基、ＣＤＲ領域に直接作用する残基、及び１９Ｈ６のＶＬとＶＨの空間構造に対して重要な影響を与える残基に復帰変異を導入し、最後に２つのヒト化抗体候補１９Ｈ６−Ｈｕおよび１９Ｈ６−ｇｒａｆｔを選出した。そのうち１９Ｈ６−ｇｒａｆｔの重鎖可変領域の遺伝子配列全長が３５１ｂｐであり、１１７個のアミノ酸残基をコードし、アミノ酸配列が配列番号１７で表され、ヌクレオチド配列が配列番号１８で表され、軽鎖可変領域の遺伝子配列全長が３３６ｂｐであり、１１２個のアミノ酸残基をコードし、アミノ酸配列が配列番号１９で表され、ヌクレオチド配列が配列番号２０で表される。また、１９Ｈ６−Ｈｕの重鎖可変領域の遺伝子配列全長が３５１ｂｐであり、１１７個のアミノ酸残基をコードし、アミノ酸配列が配列番号２１で表され、ヌクレオチド配列が配列番号２２で表され、軽鎖可変領域の遺伝子配列全長が３３６ｂｐであり、１１２個のアミノ酸残基をコードし、アミノ酸配列が配列番号２３で表され、ヌクレオチド配列が配列番号２４で表される。さらに、１９Ｈ６−ｃｈと同様の定常領域を用い、１９Ｈ６−Ｈｕおよび１９Ｈ６−ｇｒａｆｔの重鎖および軽鎖をそれぞれｐＴＴ５発現ベクターに導入した。得られた組換え発現ベクターをＨＥＫ−２９３Ｅ細胞に導入して発現させ、ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕ及び１９Ｈ６−ｇｒａｆｔを精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られた抗体の分子量及び純度を確定し、定量化して分注し、後に備えて−８０℃で保存した。
【０１０４】
図２１Ａ及び図２１Ｂに示すように、以上のようにして得られた１９Ｈ６−Ｈｕ及び１９Ｈ６−ｇｒａｆｔは、分子量が所期の範囲内にあり且つ純度が９５％以上であった。
【０１０５】
５．２）標的抗原に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕ及び１９Ｈ６−ｇｒａｆｔの結合性
本実施例では、上記実施例１．２と同様にして、ＥＬＩＳＡ法でヒトＨＥＲ２−ＥＣＤに対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕ及び１９Ｈ６−ｇｒａｆｔの結合性を測定した。
【０１０６】
図２２に示すように、ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕはキメラ抗体１９Ｈ６−ｃｈと同等レベルの結合活性を示し、ＥＣ５０がそれぞれ０．０６ｎＭ及び０．０５ｎＭであった。一方、１９Ｈ６−ｇｒａｆｔの結合活性が比較的低く、ＥＣ５０が０．５ｎＭであった。したがって、ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕを選んで次の評価試験を行った。
【０１０７】
さらに、本実施例ではｂｉａｃｏｒｅ法を利用してＨＥＲ２−ＥＣＤに対する１９Ｈ６−Ｈｕの結合動態学を検討した。具体的には、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａチップ（ＧＥ社製、ロット番号１０２６１１３２）を用い、接触時間（ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｉｍｅ）を７５秒、流速（ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）を１０μＬ／分間、再生化接触時間（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｉｍｅ）を３０秒に設定して０．５μｇ／ｍＬの１９Ｈ６−Ｈｕ抗体を捕捉した。また、分析対象である抗原ＨＥＲ２−ＥＣＤについては、接触時間（ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｉｍｅ）を１８０秒、解離時間（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）を９００秒、流速（ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）を３０μＬ／分間、再生化接触時間（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｔｉｍｅ）を３０秒に設定して測定を行った。各分析パラメーターは、下記表１に示される通りである。
【０１０８】
【表１】
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【０１０９】
５．３）標的細胞に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの結合性
本実施例では、ＦＡＣＳ法を利用し、上記実施例２．２と同様にして乳がん細胞ＢＴ４７４に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの結合性を測定した。
【０１１０】
図２３に示すように、１９Ｈ６−Ｈｕは、乳がん細胞ＢＴ４７４に特異的に結合し、ＥＣ５０が１．９ｎＭであり、標的細胞に対する結合活性が１９Ｈ６−ｃｈと同等のレベルであった。
【０１１１】
５．４）標的細胞増殖に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの阻害活性
本実施例では、上記実施例２．３と同様にして、ＨＥＲ２過剰発現が確認された標的細胞（乳がん細胞ＢＴ４７４、乳がん細胞ＳＫＢＲ３、胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７）の増殖に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンを併用するときの阻害活性を測定した。
【０１１２】
図２４、図２５及び図２６に示すように、１９Ｈ６−Ｈｕと１μｇ／ｍＬのハーセプチンを併用した場合、乳がん細胞ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ３及び胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７の増殖効率よく阻害し、その阻害效果がパージェと与ハーセプチンの併用及びハーセプチン単独投与の場合に比較して遥かに上回った。また、１９Ｈ６−Ｈｕは、上記３種類の腫瘍細胞増殖に対して１９Ｈ６−ｃｈに一致した阻害活性を示し、且つハーセプチン投与時の最大阻害效果を大きく向上させた。
【０１１３】
実施例６：ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの種間交叉反応性
本実施例では、ＥＬＩＳＡ法でヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの種間交叉反応性を測定した。具体的には、カニクイザル及びラットのＨＥＲ２−ＥＣＤタンパク質（何れもＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、商品番号がそれぞれ９０２９５−Ｃ０８Ｈ−５０及び８００７９−Ｒ０８Ｈ−５０であった）、すなわちＣｙｎｏ−ＨＥＲ２−ＥＣＤ及びＲａｔ−ＨＥＲ２−ＥＣＤを１ウェル当たりにそれぞれ０．２μｇ用いて９６ウェルプレートをコーティングした以外、上記実施例１．２と同様にして２品種のＨＥＲ２に対する１９Ｈ６−Ｈｕの交叉反応を測定した。
【０１１４】
図２７に示すように、ヒト化抗体１９Ｈ６−ＨｕはカニクイザルのＨＥＲ２タンパク質を識別して特異的に結合し、ＥＣ５０が０．１ｎＭであった。一方、ラットのＨＥＲ２タンパク質に対しては識別結合性を示さなかった。
【０１１５】
実施例７：ファミリーメンバーＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの選択性
本実施例では、ＥＬＩＳＡ法を利用してファミリーメンバーＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４に対するヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの選択性を測定した。具体的には、ヒトＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４タンパク質（何れもＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製であり、商品番号がそれぞれ１０００１−Ｈ０８Ｈ−２０、１０２０１−Ｈ０８Ｈ−２０及び１０３６３−Ｈ０８Ｈ−５０であった）を１ウェル当たりにそれぞれ０．２μｇ用いて９６ウェルプレートをコーティングした以外、上記実施例１．２と同様にしてＨＥＲ２のファミリーメンバーに対する１９Ｈ６−Ｈｕの選択性を測定した。
【０１１６】
図２８に示すように、１９Ｈ６−Ｈｕは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４に対して交叉反応性を示さなかった。つまり、１９Ｈ６−ＨｕがＨＥＲ２を特異的に認識することによりＨＥＲ２過剰発現が確認された腫瘍細胞の増殖を阻害することが確認できた。
【０１１７】
実施例８：腫瘍細胞におけるヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの作用機序
本実施例では、ウエスタンブロット法を利用してＨＥＲ２の下流シグナル伝達経路およびＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体化に対する１９Ｈ６−Ｈｕの影響と阻害効果を検討した。
【０１１８】
具体的には、対数増殖期の乳がん細胞ＢＴ４７４、ＳＫＢＲ３又は胃がん細胞ＮＣＩ−Ｎ８７をパンクレアチンで消化してから完全培地に懸濁させ、細胞密度が５０％なるように１２ウェルプレートに播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベータで一晩培養した。翌日、細胞がウェル壁に付着すると、１２ウェルプレートを軽く叩いて各ウェルの培地を捨て、さらに室温の無菌ＰＢＳを２ｍＬ加えて培地が殆ど残らない程度までウェルを洗い流した。ＰＢＳを捨て、各ウェルに１％のウシ胎児血清を含む培地で１９Ｈ６−Ｈｕを特定の濃度(下記表２に示された通り)に希釈したもの１ｍＬをゆっくりと加え、１２ウェルプレートを軽く揺すってからインキュベータに戻して引き続き培養した。２４時間後に１２ウェルプレートを氷上に置き、培地を捨て各ウェルに予め冷やした無菌ＰＢＳを２ｍＬ加えて１回洗浄した。ＰＢＳを捨て、各ウェルに１×ＬＤＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製のＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプル緩衝液、カタログ番号ＮＰ０００８）を２００μＬ加えて十分混ぜ合わせ、数分間静置することにより溶解処理を行った。各ウェルのＬＤＳ細胞溶解液を回収して遠心チューブに入れ、体積百分率で５％のβ−メルカプトエタノールを加えて十分混ぜ合わせ、その直後に−８０℃に保存した。サンプルを一部取って、通常のウエスタンブロット法で下記生体指標物の変化を検出し、そのうち検出用抗体としてＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号５１７４）、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ｔ−ＥＲＫ１／２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号４６９５）、ｐｈｏｓｐｈｏ  ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ｐ−ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号４３７６）、ＡＫＴ（ｔ−ＡＫＴ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号４６９１）、ｐｈｏｓｐｈｏＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ  Ｓ４７３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号４０６０）、ＨＥＲ２（ｔ−ＨＥＲ２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号２１６５）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ２（ｐ−ＨＥＲ２  Ｙ１２４８）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号２２４７）、ＨＥＲ３（ｔ−ＨＥＲ３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号１２７０８）及びｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＥＲ３（ｐ−ＨＥＲ３  Ｙ１２８９）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号２８４２）を用い、ＨＲＰ標識のヤギ抗ウサギＩｇＧは、北京ｂｉｏｄｒａｇｏｎ−ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製であり、カタログ番号がＢＦ０３００８であった。また、下記表２において、Ｔｒａｓとはトラスツズマブ（ハーセプチン）を指し、Ｐｅｒｔとはペルツズマブ（パージェタ）を指し、ＮＣは何の抗体処理もしなかった陰性対照であった。
【０１１９】
【表２】
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【０１２０】
図２９、図３０および図３１に示すように、陰性対照ＮＣ対照に比較して、ハーセプチン単独投与でｐ−ＨＥＲ３（Ｙ１２８９）を著しく阻害し、阻害活性が用量依存性を示した。また、ハーセプチン単独投与では用量依存的にｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）のリン酸化を阻害するが、ｐ−ＨＥＲ２（Ｙ１２４８）を阻害しないことが確認できた。また、１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンを併用した場合、ｐ−ＨＥＲ３（Ｙ１２８９）、ｐ−ＨＥＲ２（Ｙ１２４８）、ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）及びｐ−ＥＲＫ１／２のリン酸化シグナルとｔ−ＨＥＲ２の発現を著しく阻害し、パージェタとハーセプチンを併用した場合にはｐ−ＨＥＲ３（Ｙ１２８９）及びｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）のみに対して阻害活性を示した。さらに、１９Ｈ６−ＨｕとＨｅｃｅｐｔｉｎを併用した場合、ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）及びｐ−ＥＲＫ１／２に対する阻害効果がパージェタとＨｅｃｅｐｔｉｎを併用した場合に比較して遥かに上回ることが確認できた。
【０１２１】
１９Ｈ６−Ｈｕの作用機序を更に詳しく解明するため、ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３細胞をそれぞれ用い、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体化に対する１９Ｈ６−Ｈｕの阻害効果を細胞レベルで検討した。
【０１２２】
対数増殖期のＢＴ４７４及びＳＫＢＲ３細胞をパンクレアチンで消化して懸濁させ、細胞密度が５０％となるように１２ウェルプレートに播種し、インキュベータで一晩培養して細胞がウェル壁に付着するようにした。翌日、下記表３に示された通り、測定用抗体を無血清培地で段階的に希釈して特定濃度のものとした。１２ウェルプレートの各ウェルの培地を取り除き、各ウェルに培地が殆ど残らない程度まで室温の无菌ＰＢＳを２ｍＬ加えて軽く洗浄を行った。ＰＢＳを捨て、下記表３に示された通り、各ウェルに調製済みの測定用抗体又は無血清培地をゆっくりと１ｍＬ加え、１２ウェルプレートを軽く揺すってからインキュベータに置いて暫くインキュベートした。２時間後、ＮＣウェルに無血清培地を１ｍＬ補充し、他のウェルにはそれぞれ予め無血清培地で調製した４ｎＭのＨＲＧ（Ｒ＆Ｄ社製のＨｅｒｅｇｕｌｉｎ、カタログ番号３９６−ＨＢ−０５０）を１ｍＬ加え、ＨＲＧ最終作業濃度が２ｎＭになるようにした。インキュベータで１５分間インキュベートした後、１２ウェルプレートを氷上に置き、培地を捨て各ウェルに予め冷やした無菌ＰＢＳを２ｍＬ加えて１回洗浄した。ＰＢＳを捨て、各ウェルに予め冷やしたＩＰ細胞溶解液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ社製、カタログ番号Ｐ００１３）を４００μＬ加え、十分混ぜ合わせて氷上で５〜１０分間溶解した。細胞が完全に溶解した状況を顕微鏡で観察し、溶解液を回収して１２０００ｒｍｐ、４℃で５分間遠心し、上澄み液を回収してＥＰチューブに入れてそれぞれ１００ｍＭのハーセプチンと混ぜ合わせてから４℃で１時間インキュベートした。その後、各チューブに５％のＢＳＡで一晩ブロッキングしたＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇプラスアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ番号ｓｃ−２００３）を加え、さらに最終体積が８００μＬになるようにＩＰ細胞溶解液を補充し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、各サンプルを取って４℃、２０００ｒｍｐで６分間遠心し、上澄み液を捨ててビーズを回収し、予め冷やしたＰＢＳでビーズを２回洗浄した。各サンプルに１×ＬＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号ＮＰ０００８）を８０μＬ加え、体積百分率が５％となるようにβ−メルカプトエタノールを加え、軽く叩いてから１００℃で１０分間加熱することによりビーズに結合したタンパク質を落とせ、温度が下がるまで暫く待ってから１２０００ｒｍｐ、５分間遠心し、後に備えて保存した。各生体指標物については、通常のウエスタンブロット法を利用して測定した。
【０１２３】
【表３】
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【０１２４】
図３２及び図３３に示すように、ＳＫＢＲ３及びＢＴ４７４両細胞株において、１９Ｈ６−Ｈｕ単独投与でＨＥＲ２と共に免疫沈降したｐ−ＨＥＲ３（Ｙ１２８９）及びｔ−ＨＥＲ３の量が陽性対照組（ＰＣ）の場合に比較してさほど変化がなく、一方、パージェタではｐ−ＨＥＲ３（Ｙ１２８９）及びｔ−ＨＥＲ３の沈降量が著しく低下し、ハーセプチンでは沈降が僅かに確認できる程度であった。このことから、パージェタがＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体化を著しく抑制するが、１９Ｈ６−Ｈｕはパージェタと異なる作用機序で機能し、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二量体化に対して１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンを併用するときの阻害効果がパージェタ単独又はパージェタとハーセプチンの併用時と同等のレベルであることが確認できた。
【０１２５】
実施例９：ヒト化抗体１９Ｈ６−Ｈｕの体内活性評価
本実施例では、移植腫瘍モデルとしてＮＣＩ−Ｎ８７及びＨＣＣ１９５４をそれぞれ用い、１９Ｈ６−Ｈｕとハーセプチンを併用するときの抗腫瘍効果を検討した。
【０１２６】
実験に使われるＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは、メス、生後４０〜４５日齢、体重１８〜２０ｇであり、上海霊暢バイオテック社製であった。対数増殖期のＮＣＩ−Ｎ８７及びＨＣＣ１９５４細胞を採集し、無血清培地に細胞濃度が１６×１０７個／ｍＬになるように懸濁させ、それぞれ基質ゲルと体積比１：１で混ぜ合わせ、無菌条件下で細胞懸濁液を１００μＬ取ってヌードマウスの背中皮下に１匹当たり８×１０６個細胞になるように注射した。ノギスで移植腫瘍のサイズと体積を計測し、腫瘍が１００〜２００ｍｍ３まで成長すると動物をランダムに組分けした。図３４および図３５に示された通り、マウス１匹当たり（２０ｇ）に０．２ｍＬの量で腹腔内投与を行い、週２回にして合わせて６回投与を行った。また、マウスに対して抗体アイソタイプ（Ｉｓｏｔｙｐｅ）を同じ用量で投与し、対照組とした。
【０１２７】
週２回の頻度で移植腫瘍の体積を測定すると同時にマウス体重を秤量し、腫瘍体積（ＴＶ）は、算式１／２×長さ×幅２で算出し、腫瘍抑制率（ＴＧＩ）は、算式（１−実験組腫瘍体積／対照組腫瘍体積）×１００％で算出した。得られたデータを統計学方法で解析し、ｐ≦０．０５（＊）を有意差があるとし、ｐ≦０．００１（＊＊＊）を有意差が特に顕著であるとした。
【０１２８】
図３４に示すように、ＮＣＩ−Ｎ８７はハーセプチン感受性であり、ハーセプチン単独で２０ｍｇ／ｋｇを投与した場合、ＴＧＩが６３．１４％、ｐ＜０．０５であった。一方、ハーセプチン１０ｍｇ／ｋｇと共に１９Ｈ６−Ｈｕを１０ｍｇ／ｋｇ投与した場合、腫瘍阻害効果が特に顕著であり、ＴＧＩが８６．３１％、ｐ＜０．００１であり、ハーセプチンとパージェタを同じ投与量で併用した場合（ＴＧＩが９１．７１％、ｐ＜０．００１）と同等の阻害効果を示した。
【０１２９】
図３５に示すように、ＨＣＣ１９５４はハーセプチン非感受性であり、ハーセプチン単独で１５ｍｇ／ｋｇを投与した場合に殆ど阻害効果を示さず、ＴＧＩが４．６７％、ｐ＞０．０５であった。一方、ハーセプチン５ｍｇ／ｋｇと共に１９Ｈ６−Ｈｕを５ｍｇ／ｋｇ投与した場合、腫瘍阻害効果が見られ、ＴＧＩが５９．７４％、ｐ＜０．０５であり、ハーセプチンとパージェタを同じ投与量で併用した場合（ＴＧＩが４８．０５％）と同等の阻害効果を示した。
【０１３０】
また、実験中においてモデル動物は何れも明らかな体重低下を示さず、他の毒性効果や副効果も見られなかった。このことから、ハーセプチンと１９Ｈ６−Ｈｕを併用した場合、１９Ｈ６−Ｈｕによってハーセプチンの最大腫瘍阻害效果が著しく向上することが確認できた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2021531802.tif 000006
【図１Ｃ】
2021531802.tif 000007
【図２Ａ】
2021531802.tif 000008
【図２Ｂ】
2021531802.tif 000009
【図２Ｃ】
2021531802.tif 000010
【図３】
2021531802.tif 000011
【図４】
2021531802.tif 000012
【図５】
2021531802.tif 000013
【図６】
2021531802.tif 000014
【図７】
2021531802.tif 000015
【図８Ａ】
2021531802.tif 000016
【図８Ｂ】
2021531802.tif 000017
【図８Ｃ】
2021531802.tif 000018
【図９】
2021531802.tif 000019
【図１０Ａ】
2021531802.tif 000020
【図１０Ｂ】
2021531802.tif 000021
【図１１】
2021531802.tif 000022
【図１２】
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【図１３】
2021531802.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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