(57)【要約】増大したＲＮＡポリメラーゼ活性および／または熱安定性を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント（Ｔ７ＲＮＡＰバリアント）、およびその使用方法が、本明細書に提供される。
2021520815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列中の少なくとも３つのアミノ酸置換を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントであって、３つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８から選択される位置にある、前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項２】
配列番号１によって同定されるアミノ酸配列中にＩ３２０Ｌ置換を含む、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項３】
配列番号１によって同定されるアミノ酸配列中にＩ３９６Ｌ置換を含む、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項４】
配列番号１によって同定されるアミノ酸配列中にＦ５４６Ｗ置換を含む、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項５】
配列番号１によって同定されるアミノ酸配列中にＳ６８４Ａ置換を含む、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項６】
配列番号１によって同定されるアミノ酸配列中にＧ７８８Ａ置換を含む、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項７】
置換Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３９６Ｌ、Ｆ５４６Ｗ、Ｓ６８４Ａ、およびＧ７８８Ａを含む、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項８】
配列番号２によって同定されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項９】
置換Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３９６Ｌ、およびＧ７８８Ａを含む、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１０】
配列番号３によって同定されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１１】
置換Ｉ３９６Ｌ、Ｓ６８４Ａ、およびＧ７８８Ａを含む、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１２】
配列番号４によって同定されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１３】
置換Ｉ３２０Ｌ、Ｓ６８４Ａ、およびＧ７８８Ａを含む、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１４】
配列番号５によって同定されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントを、ヌクレオシド三リン酸および関心対象のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートと組み合わせること；および、関心対象のＲＮＡを生成することを含む、リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するための方法。
【請求項１６】
生成するステップが、３７℃以上の温度で遂行される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生成するステップが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントを発現する細胞からの細胞ライセート、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントを発現する細胞からの酵素調製物を使用することを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡテンプレートが、環状のＤＮＡテンプレートである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡテンプレートが、直鎖のＤＮＡテンプレートである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
生成される関心対象のＲＮＡの量が、３７℃以上の温度で野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成される関心対象のＲＮＡの量より多い、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
関心対象のＲＮＡが、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント；および
（ｉｉ）反応緩衝液
を含む、キット。
【請求項２３】
１以上のリボヌクレオシド三リン酸をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、特許法§１１９（ｅ）の下で、２０１８年４月１０日に出願の米国仮出願番号第６２／６５５，７４７号の利益を主張し、それは全体として本願明細書に参照として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
遺伝子発現の間のリボ核酸（ＲＮＡ）へのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の転写は、ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡテンプレートに付着してＲＮＡの重合を開始するときに出現する、基本の細胞のプロセスである。転写などの必須の細胞のプロセスは、３７℃で一般に起こり、そして、ＲＮＡポリメラーゼを含む多くの酵素は、３７℃より上の温度で、典型的には不活性である。従って、高温での増大した熱安定性を有するＲＮＡポリメラーゼバリアントは、高温でのＲＮＡ生成のために必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示は、増強された熱安定性を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）バリアントを提供する。ＲＮＡ合成反応のためのこれらのバリアントの使用は、（３７℃より上の温度でさえ、野生型Ｔ７ＲＮＡＰと比べて）ＲＮＡ収率および生成物プロファイルの改善に、結果としてなる。これらのバリアントは、タンパク質安定性を改善して、親和性に対する影響を最小化すると予測される個々の突然変異の同定を通して合理的に設計された。それらの突然変異の具体的な組み合わせを含むために改変されたバリアントは、改善された特性、例えば、高温での改善されたＲＮＡ生成を伴うＴ７ＲＮＡＰバリアントを同定するために、次いでテストされた。
【０００４】
よって、本開示のいくつかの態様は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＴ７ＲＮＡＰバリアントを提供し、ここで、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置にある。
【０００５】
いくつかの態様において、本開示は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の少なくとも２つのアミノ酸置換を含むＴ７ＲＮＡＰバリアントを提供し、ここで、少なくとも２つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置にある。
【０００６】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置：Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８（Ｍ１）のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置：Ｉ３２０、Ｉ３９６、およびＧ７８８（Ｍ２）のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置：Ｉ３９６、Ｓ６８４、およびＧ７８８（Ｍ３）のアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置：Ｉ３２０、Ｓ６８４、およびＧ７８８（Ｍ４）のアミノ酸置換を含む。配列番号１のアミノ酸配列は、Ｔ７ＲＮＡＰの野生型配列である。
【０００７】
本開示は、いくつかの態様において、本明細書に記載のＴ７ＲＮＡＰバリアントを含む組成物、キット、システム、および方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、リボ核酸（ＲＮＡ）を生成するため方法を、提供する。これらの方法は、いくつかの態様において、本明細書に提供されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントをヌクレオシド三リン酸と関心対象のＲＮＡをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）テンプレートとを組み合わせて、関心対象のＲＮＡを生成することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図面の簡単な記載
【図１】図１は、２５Ｌの反応における反応温度での２時間インキュベーション後のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントによって生成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）生成物力価（ｎｇ／μＬ）を示すグラフである（ｎ＝３）。
【図２】図２は、温度に基づいてＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントによって生成される、％ＲＮＡの比較を示す、グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な記載
バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）は、ＤＮＡポリメラーゼＩファミリーに帰属する、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。野生型Ｔ７ＲＮＡＰは、８８３のアミノ酸を含み、配列番号１に対応する。野生型Ｔ７ＲＮＡＰは、３７℃、ｐＨ７．５でポリメラーゼ活性を有し、より高い温度で不活性である。よって、この開示のいくつかの側面は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して、高温で増大した熱安定性および改善されたＲＮＡ生成を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントを、提供する。本明細書に開示のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、３７℃以上の温度で遂行される様々な方法において、使用されてもよい。
【００１０】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント
この開示のいくつかの側面は、配列番号１によって同定される、天然に存在するＴ７ＲＮＡＰのアミノ酸配列と異なるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）バリアントを、提供する。
いくつかの態様において、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＴ７ＲＮＡＰバリアントが、本明細書中に提供され、ここで、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置にある。
【００１１】
いくつかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０にある。いくつかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３９６にある。いくつかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｆ５４６にある。いくつかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｓ６８４にある。いくつかの態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｇ７８８にある。
【００１２】
いくつか態様において、配列番号１のアミノ酸配列中の少なくとも２つ、少なくとも３つ、または、少なくとも４つのアミノ酸置換を含むＴ７ＲＮＡＰバリアントが、本明細書中に提供され、ここで、少なくとも３つ、少なくとも４つのアミノ酸、またはすべての５つの置換は、Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置にある。
【００１３】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列中に少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも２つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置にある。
【００１４】
いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０およびＩ３９６にある。いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０およびＦ５４６にある。いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０およびＳ６８４にある。いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３９６およびＦ５４６にある。いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３９６およびＳ６８４にある。いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３９６およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｆ５４６およびＳ６８４にある。いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｆ５４６およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも２つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｓ６８４およびＧ７８８にある。
【００１５】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列中に少なくとも３つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも３つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置にある。
【００１６】
いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、およびＦ５４６にある。いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、およびＳ６８４にある。いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｆ５４６、およびＳ６８４にある。いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｆ５４６、およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｓ６８４、およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３９６、Ｆ５４６、およびＳ６８４にある。いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３９６、Ｓ６８４、およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３９６、Ｆ５４６、およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも３つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８にある。
【００１７】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列中に少なくとも４つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも２つのアミノ酸置換が、Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置にある。
【００１８】
いくつかの態様において、少なくとも４つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、およびＳ６８４にある。いくつかの態様において、少なくとも４つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも４つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも４つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｓ６８４、およびＧ７８８にある。いくつかの態様において、少なくとも４つのアミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８にある。
【００１９】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列中に５つのアミノ酸置換を含み、ここで、５つのアミノ酸置換は、位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８にある。
【００２０】
一定のアミノ酸は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８で、別のアミノ酸によって置換されてもよい。例えば、アミノ酸置換は、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列のＩ３２０Ｌ、Ｉ３２０Ｖ、Ｉ３９６Ｌ、Ｉ３９６Ｖ、Ｆ５４６Ｗ、Ｆ５４６Ｙ、Ｓ６８４Ａ、Ｓ６８４Ｖ、Ｇ７８８Ａ、およびＧ７８８Ｖを含むが、これに限定されない。
【００２１】
従って、いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１中のＩ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、ここで、位置Ｉ３２０のアミノ酸置換は、Ｉ３２０ＬまたはＩ３２０Ｖである、ここで、位置Ｉ３９６のアミノ酸置換は、Ｉ３９６ＬまたはＩ３９６Ｖである、ここで、位置Ｆ５４６のアミノ酸置換は、Ｆ５４６ＷまたはＦ５４６Ｙである、ここで、位置Ｓ６８４のアミノ酸置換は、Ｓ６８４ＡまたはＳ６８４Ｖである、および／または、ここで、位置Ｇ７８８のアミノ酸置換は、Ｇ７８８ＡまたはＧ７８８Ｖである。
【００２２】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１中のＩ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置で、少なくとも２つのアミノ酸置換を有し、ここで、位置Ｉ３２０のアミノ酸置換は、Ｉ３２０ＬまたはＩ３２０Ｖである、ここで、位置Ｉ３９６のアミノ酸置換は、Ｉ３９６ＬまたはＩ３９６Ｖである、ここで、位置Ｆ５４６のアミノ酸置換は、Ｆ５４６ＷまたはＦ５４６Ｙである、ここで、位置Ｓ６８４のアミノ酸置換は、Ｓ６８４ＡまたはＳ６８４Ｖである、および／または、ここで、位置Ｇ７８８のアミノ酸置換は、Ｇ７８８ＡまたはＧ７８８Ｖである。
【００２３】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１中のＩ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置で、少なくとも３つのアミノ酸置換を有し、ここで、位置Ｉ３２０のアミノ酸置換は、Ｉ３２０ＬまたはＩ３２０Ｖである、ここで、位置Ｉ３９６のアミノ酸置換は、Ｉ３９６ＬまたはＩ３９６Ｖである、ここで、位置Ｆ５４６のアミノ酸置換は、Ｆ５４６ＷまたはＦ５４６Ｙである、ここで、位置Ｓ６８４のアミノ酸置換は、Ｓ６８４ＡまたはＳ６８４Ｖである、および／または、ここで、位置Ｇ７８８のアミノ酸置換は、Ｇ７８８ＡまたはＧ７８８Ｖである。
【００２４】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１中のＩ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置で、少なくとも４つのアミノ酸置換を有し、ここで、位置Ｉ３２０のアミノ酸置換は、Ｉ３２０ＬまたはＩ３２０Ｖである、ここで、位置Ｉ３９６のアミノ酸置換は、Ｉ３９６ＬまたはＩ３９６Ｖである、ここで、位置Ｆ５４６のアミノ酸置換は、Ｆ５４６ＷまたはＦ５４６Ｙである、ここで、位置Ｓ６８４のアミノ酸置換は、Ｓ６８４ＡまたはＳ６８４Ｖである、および／または、ここで、位置Ｇ７８８のアミノ酸置換は、Ｇ７８８ＡまたはＧ７８８Ｖである。
【００２５】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１中のＩ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８からなる群から選択される位置で、少なくとも５つのアミノ酸置換を有し、ここで、位置Ｉ３２０のアミノ酸置換は、Ｉ３２０ＬまたはＩ３２０Ｖである、ここで、位置Ｉ３９６のアミノ酸置換は、Ｉ３９６ＬまたはＩ３９６Ｖである、ここで、位置Ｆ５４６のアミノ酸置換は、Ｆ５４６ＷまたはＦ５４６Ｙである、ここで、位置Ｓ６８４のアミノ酸置換は、Ｓ６８４ＡまたはＳ６８４Ｖである、および／または、ここで、位置Ｇ７８８のアミノ酸置換は、Ｇ７８８ＡまたはＧ７８８Ｖである。
【００２６】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも２つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３２０Ｖ、Ｉ３９６Ｌ、Ｉ３９６Ｖ、Ｆ５４６Ｗ、Ｆ５４６Ｙ、Ｓ６８４Ａ、Ｓ６８４Ｖ、Ｇ７８８Ａ、およびＧ７８８Ｖからなる群から、選択される。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の少なくとも３つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも３つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３２０Ｖ、Ｉ３９６Ｌ、Ｉ３９６Ｖ、Ｆ５４６Ｗ、Ｆ５４６Ｙ、Ｓ６８４Ａ、Ｓ６８４Ｖ、Ｇ７８８Ａ、およびＧ７８８Ｖからなる群から、選択される。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の少なくとも４つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも４つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３２０Ｖ、Ｉ３９６Ｌ、Ｉ３９６Ｖ、Ｆ５４６Ｗ、Ｆ５４６Ｙ、Ｓ６８４Ａ、Ｓ６８４Ｖ、Ｇ７８８Ａ、およびＧ７８８Ｖからなる群から、選択される。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列の少なくとも５つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも５つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３２０Ｖ、Ｉ３９６Ｌ、Ｉ３９６Ｖ、Ｆ５４６Ｗ、Ｆ５４６Ｙ、Ｓ６８４Ａ、Ｓ６８４Ｖ、Ｇ７８８Ａ、およびＧ７８８Ｖからなる群から、選択される。
【００２７】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列中に少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも２つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３９６Ｌ、Ｆ５４６Ｗ、Ｓ６８４Ａ、およびＧ７８８Ａからなる群から、選択される。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列中に少なくとも３つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも３つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３９６Ｌ、Ｆ５４６Ｗ、Ｓ６８４Ａ、およびＧ７８８Ａから選択される位置にある。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１によって同定されるアミノ酸配列中に少なくとも４つのアミノ酸置換を含み、ここで、少なくとも４つのアミノ酸置換は、Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３９６Ｌ、Ｆ５４６Ｗ、Ｓ６８４Ａ、およびＧ７８８Ａからなる群から、選択される。
【００２８】
いくつかの態様において、Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３９６Ｌ、およびＧ７８８Ａアミノ酸置換を含むＴ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号３によって同定されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｉ３９６Ｌ、Ｓ６８４Ａ、およびＧ７８８Ａアミノ酸置換を含むＴ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号４によって同定されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｉ３２０Ｌ、Ｓ６８４Ａ、およびＧ７８８Ａアミノ酸置換を含むＴ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号５によって同定されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｉ３２０Ｌ、Ｉ３９６Ｌ、Ｆ５４６Ｗ、Ｓ６８４Ａ、およびＧ７８８Ａアミノ酸置換を含むＴ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号２によって同定されるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号３によって同定されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号４によって同定されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号５によって同定されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号２によって同定されるアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本開示は、配列番号１の位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、またはＧ７８８にないアミノ酸の少なくとも１の置換をさらに含むＴ７ＲＮＡＰバリアントを、包含する。いくつかの態様において、追加のアミノ酸置換は、保存アミノ酸または保存モチーフの範囲内にあるアミノ酸でなされるものではなく、そこでのかかる残基は、タンパク質活性のために必須である。いくつかの態様において、追加のアミノ酸置換は、しかしながら、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントがその活性を保持するように、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントの非保存領域に、組み込まれてもよい。いくつかの態様において、本開示のＴ７ＲＮＡバリアントは、本明細書に記載のない少なくとも１つのアミノ酸置換を、さらに含むが、ただし、追加のアミノ酸置換は、ポリメラーゼ活性を阻害しない。よっていくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡバリアントは、位置Ｉ３２０でのアミノ酸置換と、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換とを含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡバリアントは、位置Ｉ３９６でのアミノ酸置換と、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換とを含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡバリアントは、位置Ｆ５４６でのアミノ酸置換と、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換とを含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡバリアントは、位置Ｓ６８４でのアミノ酸置換と、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換とを含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡバリアントは、位置Ｇ７８８でのアミノ酸置換と、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換とを含む。
【００３１】
位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、および／またはＧ７８８のアミノ酸置換は、いくつかの態様において、配列番号１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列に、組み込まれる。従って、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、配列番号１に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列中のＩ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４およびＧ７８８から選択される位置の、２つ、３つ、４つ、または５つのアミノ酸置換を含む。
【００３２】
用語「同一性」は、配列を比較する（アラインメントする）ことによって決定される、２以上のポリペプチドの配列の関係を指す。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータープログラム（例として、「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアラインメント（もしあれば）を有する２以上の配列のより小さいものの間の同一の一致のパーセントを、測定する。関連した分子の同一性は、公知の方法によって、容易に算出されることができる。アミノ酸配列に適用されるとき「パーセント（％）同一性」は、最大のパーセント同一性を達成するための、配列を（必要ならばギャップを導入して）アラインメントした後の、第２の配列のアミノ酸配列中の残基と同一である候補アミノ酸配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。同一性は、パーセント同一性の算出に依存するが、算出において導入されるギャップおよびペナルティに起因する値において異なってもよい。
【００３３】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成されることができる。同一性を決定するための技法は、公に入手できるコンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の相同性を決定する例示のコンピュータソフトウェアは、ＧＣＧプログラムパッケージ含むが、これに限定されない（Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387, 1984), the BLAST suite (Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997), and FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403, 1990)。他の技法は、以下を含む:Smith-Watermanアルゴリズム(Smith, T.F. et al., J. Mol. Biol. 147: 195, 1981:;Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman, S.B. et al., J. Mol. Biol. 48: 443, 1970;および、Fast Optimal Global Sequence Alignmentアルゴリズム(FOGSAA)(Chakraborty, A. et al., Sci Rep. 3: 1746, 2013）。
【００３４】
位置Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８のアミノ酸置換が、活性およびＲＮＡポリメラーゼの熱安定性に対する類似の影響を有する他のＲＮＡポリメラーゼへ移されてもよいということが、理解されるべきである。ＲＮＡポリメラーゼの例は、バクテリオファージＴ３（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿５２３３０１．１、配列番号１１）からのＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＰ６（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０６２２１、配列番号：１２）からのＲＮＡポリメラーゼ、エルウィニアファージＦＥ４４（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００８７６６７１９．１、配列番号１３）からのＲＮＡポリメラーゼ、クライベラバクテリオファージＫｖｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＪ１４５４８．１、配列番号１４）からのＲＮＡポリメラーゼ、およびエルシニアバクテリオファージｐｈｉＹｅＯ３−１２（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９Ｔ１４５、配列番号１５）からのＲＮＡポリメラーゼを含むが、これに限定されない。
【００３５】
本開示のいくつかの側面において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントをコードする核酸は、本明細書に提供される。いくつかの態様において、核酸は、配列番号２のＴ７ＲＮＡＰバリアントをコードする。いくつかの態様において、核酸は、配列番号３のＴ７ＲＮＡＰバリアントをコードする。いくつかの態様において、核酸は、配列番号４のＴ７ＲＮＡＰバリアントをコードする。いくつかの態様において、核酸は、配列番号５のＴ７ＲＮＡＰバリアントをコードする。
ＲＮＡポリメラーゼ活性および熱安定性
本開示のいくつかの側面は、天然に存在するＴ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して、増大したＲＮＡポリメラーゼ活性を有するＴ７ＲＮＡＰバリアントを、提供する。
【００３６】
ＲＮＡポリメラーゼ活性は、ＲＮＡポリマーを合成するための、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントの特性を指す。Ｔ７ＲＮＡＰバリアントの活性は、例えば、適合度および重合速度論（例として、重合速度）に基づいて、評価される。例えば、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントの１ユニットは、３７℃の温度で３０分、ＮＴＰの１０ｎｍｏｌを、酸不溶性物質（例として、ＲＮＡ生成物）の中に組み込んでもよい。
【００３７】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、活性（３７℃以上の温度で重合反応を触媒することが可能である）を維持したままでもよい。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、４２℃以上の温度で活性を維持してもよい。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７の℃、７８℃、７９℃、または８０℃の温度で、活性を維持してもよい。
【００３８】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、１５分間から４８時間以上まで、３７℃より高い温度で、活性を維持してもよい。例えば、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、３６、４２、または４８時間、３７℃より高い温度で、活性を維持してもよい。
【００３９】
本明細書に記載のＴ７ＲＮＡＰバリアントは、対照のＲＮＡポリメラーゼを変性させる高温で、活性を維持してもよい。よって、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、いくつかの態様において、そうでない場合に対照のＲＮＡポリメラーゼを不活性化（すなわち、その本来の活性の２０％より低く、１０％より低く、５％より低く、２％より低く、１％より低く、または０％に）するような高温（例として、３７℃より高い）で、その活性を１０％より高く保持する。
【００４０】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、そうでない場合に対照のＲＮＡポリメラーゼを不活性化するような高温（例として、３７℃より高い）で、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の活性を、保持してもよい。
【００４１】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、そうでない場合に対照のＲＮＡポリメラーゼを不活性化するような高温（例として、３７℃より高い）で、１０〜１００％、２５〜１００％、または５０〜１００％の活性を、保持してもよい。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、そうでない場合に対照ＲＮＡポリメラーゼを不活性化する高温（例として、３７の℃より上の）で、１０〜９０％、１０〜８５％、１０〜８０％、１０〜７５％、１０〜７０％、１０〜６５％、１０〜６０％、１０〜５５％、２５〜９０％、２５〜８５％、２５〜８０％、２５〜７５％、２５〜７０％、２５〜６５％、２５〜６０％、２５〜５５％、５０〜９０％、５０〜８５％、５０〜８０％、５０〜７５％、５０〜７０％、５０〜６５％、５０〜６０％、または５０〜５５％の活性を、保持してもよい。
よって、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、いくつかの態様において、３７℃以上の温度で、対照のＲＮＡポリメラーゼより少なくとも１０％多くのＲＮＡ生成物を、生成してもよい。
【００４２】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、３７℃より高い温度で、対照のＲＮＡポリメラーゼより少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％多くのＲＮＡ生成物を生成する。
【００４３】
この開示のいくつかの側面は、天然に存在するＴ７ＲＮＡポリメラーゼである対照のＴ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性を改善していたＴ７ＲＮＡＰバリアントを提供する。熱安定性は、高温で変性に抵抗するＴ７ＲＮＡＰバリアントの特性を指す。例えば、対照のＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、４２℃の温度で、部分的に、または、完全に変性（不活化）してもよく、そして、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、「熱安定性である」と考えられ、４２℃で変性しない。
【００４４】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、対照のＲＮＡポリメラーゼと比較して、３７℃より高い、３８℃より高い、３９℃より高い、４０℃より高い、４１℃より高い、４２℃より高い、４３℃より高い、４４℃より高い、４５℃より高い、４６℃より高い、４７℃より高い、４８℃より高い、４９℃より高い、５０℃より高い、５１℃より高い、５２℃より高い、５３℃より高い、５４℃より高い、５５℃より高い、５６℃より高い、５７℃より高い、５８℃より高い、５９℃より高い、６０℃より高い、６１℃より高い、６２℃より高い、６３℃より高い、６４℃より高い、６５℃より高い、６６℃より高い、６７℃より高い、６８℃より高い、６９℃より高い、７０℃より高い、７１℃より高い、７２℃より高い、７３℃より高い、７４℃より高い、７５℃より高い、７６℃より高い、７７℃より高い、７８℃より高い、７９℃より高い、８０℃より高い温度で、熱安定性（例として、変性に対する増大された抵抗）を増大させた。
使用方法
【００４５】
本開示は、ＲＮＡを生成する方法（例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写、ｉｎ  ｖｉｖｏ転写）、標識されたＲＮＡプローブ（例として、放射性標識されたＲＮＡプローブ）を生成する方法、ＲＮＡワクチンを調製するための方法、ヌクレオチドを重合させる方法、ＲＮＡを増幅するための方法、およびタンパク質を生成するための方法を含むがこれに限定されず、様々な方法のＴ７ＲＮＡＰバリアントの使用を、包含する。
【００４６】
本明細書に記載のＴ７ＲＮＡＰバリアントは、対照のＲＮＡポリメラーゼと比較して、増大した熱安定性を有し、したがって、本明細書に記載のＴ７ＲＮＡＰバリアントの使用方法は、３７℃より高い温度で遂行されてもよい。
【００４７】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントの使用の方法は、３７℃より高い、３８℃より高い、３９℃より高い、４０℃より高い、４１℃より高い、４２℃より高い、４３℃より高い、４４℃より高い、４５℃より高い、４６℃より高い、４７℃より高い、４８℃より高い、４９℃より高い、５０℃より高い、５１℃より高い、５２℃より高い、５３℃より高い、５４℃より高い、５５℃より高い、５６℃より高い、５７℃より高い、５８℃より高い、５９℃より高い、６０℃より高い、６１℃より高い、６２℃より高い、６３℃より高い、６４℃より高い、６５℃より高い、６６℃より高い、６７℃より高い、６８℃より高い、６９℃より高い、７０℃より高い、７１℃より高い、７２℃より高い、７３℃より高い、７４℃より高い、７５℃より高い、７６℃より高い、７７℃より高い、７８℃より高い、７９℃より高い、８０℃より高い温度で、遂行される。
【００４８】
本明細書に開示のＴ７ＲＮＡＰバリアントは、例えば、３７℃以上の温度で、関心対象のＲＮＡを生成するために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに勝る一定の利点を、提供する。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、３７℃以上の温度で対照のＲＮＡポリメラーゼより多くの、関心対象のＲＮＡを生成する。
【００４９】
いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントによって生成される関心対象のＲＮＡの量は、３７℃以上の温度で、対照のＲＮＡポリメラーゼを使用して生成された関心対象のＲＮＡの量より、少なくとも１．２倍多い。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントによって生成される関心対象のＲＮＡの量は、３７℃以上の温度で、対照ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成した、関心対象のＲＮＡの量より、少なくとも１．３倍多く、少なくとも１．４倍多く、少なくとも１．５倍多く、少なくとも１．６倍多く、少なくとも１．７倍多く、少なくとも１．８倍多く、少なくとも１．９倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも２．５倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く、少なくとも１１倍多く、少なくとも１２倍多く、少なくとも１３倍多く、少なくとも１４倍多く、少なくとも１５倍多く、少なくとも２０倍多く、少なくとも２５倍多い。
【００５０】
ＲＮＡ（例として、ＲＮＡ生成物、標識されたＲＮＡ、ＲＮＡワクチン、または増幅されたＲＮＡ）の生成のために好適な条件は、当該技術分野において公知であるか、または、例えば、ｐＨ（例として、ｐＨ８）、温度（例として、１５℃〜７０℃）、時間の長さ（例として、５分〜７２時間）、塩濃度（例として、５ｍＭ〜１Ｍの濃度の塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、および／または酢酸カリウム）、および反応混合物のホスファートおよび二価のイオン（例として、Ｍｇ２＋）ならびにいずれかの外来性補因子の存在を含む、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ活性のための最適条件を考慮に入れて、当業者によって決定されてもよい。
【００５１】
いくつかの態様において、緩衝液は、反応混合物に加えられ、例えば、特定のｐＨ値および／または塩濃度を、達成する。緩衝液の例は、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、リンゴ酸塩緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ビス‐トリス緩衝液、およびエタノールアミン緩衝液が挙げられるが、これに限定されない。
【００５２】
いくつかの態様において、安定性改善剤は、反応混合物に加えられ、例えば、様々なタンパク質の活性および／または安定性を、改善する。安定性改善剤の非限定的な例は、ポリアミン（例として、スペルミジン、プトレシン、カダベリン等々）、担体タンパク質（例として、ＢＳＡ等々）、ピロホスファターゼ、グリセロール、ジオール（例として、１，２−プロパンジオール等々）、ＤＭＳＯ、塩（例として、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２）、還元剤（例として、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ベータ−メルカプトエタノール）を含む。
【００５３】
いくつかの態様において、ＲＮＡ重合反応の間の反応混合物は、３７℃の、３７℃より高い、３８℃より高い、３９℃より高い、４０℃より高い、４１℃より高い、４２℃より高い、４３℃より高い、４４℃より高い、４５℃より高い、４６℃より高い、４７℃より高い、４８℃より高い、４９℃より高い、５０℃より高い、５１℃より高い、５２℃より高い、５３℃より高い、５４℃より高い、５５℃より高い、５６℃より高い、５７℃より高い、５８℃より高い、５９℃より高い、６０℃より高い、６１℃より高い、６２℃より高い、６３℃より高い、６４℃より高い、６５℃より高い、６６℃より高い、６７℃より高い、６８℃より高い、６９℃より高い、７０℃より高い、７１℃より高い、７２℃より高い、７３℃より高い、７４℃より高い、７５℃より高い、７６℃より高い、７７℃より高い、７８℃より高い、７９℃より高い、８０℃より高い温度で、遂行される。
【００５４】
本明細書に提供される方法によって生成されるＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む、いずれかのＲＮＡであってもよい。一本鎖ＲＮＡの非限定的な例は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、およびアンチセンスＲＮＡを、含む。二本鎖ＲＮＡは、一本鎖領域（例として、ループまたは突出）を含有しない完全に二本鎖の分子、ならびに二本鎖領域および一本鎖領域（例として、ループまたは突出）を含有する部分的に二本鎖の分子を、本明細書に含む。よって、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、本開示の方法によって生成されてもよい。いくつかの態様において、ＲＮＡ生成物は、標的核酸に結合して、例えば、治療、予防、または診断の剤として使用されてもよい。いくつかの態様において、関心対象のＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
【００５５】
本明細書に記載のとおり、本明細書に提供される方法によって生成されるＲＮＡは、修飾されてもよい。いくつかの態様において、ＲＮＡは、本明細書に記載の、そして、続いて修飾される方法に従って、生成される。いくつかの態様において、ＲＮＡは、修飾された出発材料を使用して、本明細書に記載の方法に従って、生成される。いくつかの態様において、修飾された出発材料は、修飾された核酸塩基である。いくつかの態様において、修飾された出発材料は、修飾されたヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾された出発材料は、修飾されたヌクレオチドである。
【００５６】
いくつかの態様において、修飾されたＲＮＡは、主鎖修飾を含む。いくつかの例において、主鎖修飾は、還元されたヌクレアーゼ媒介分解により、ＲＮＡに関するより長い半減期に、結果としてなる。これは、より長い半減期のターン結果である。好適な主鎖修飾の例は、ホスホチオナート修飾、ホスホロジチオナート修飾、ｐ−エトキシ修飾、メチルホスホナート修飾、メチルホスホチオナート修飾、アルキルおよびアリールホスファート（荷電ホスホナート酸素が、アルキルまたはアリール基と置き換えられた）、アルキルリン酸トリエステル（荷電酸素部分が、アルキル化された）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）主鎖修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）主鎖修飾などを含むが、これに限定されない。これらの修飾は、互いにおよび／またはホスホジエステル骨格結合と組み合わせて、使用されてもよい。
【００５７】
あるいは、または、加えて、ＲＮＡは、塩基または糖部分での修飾を包含する、他の修飾を含んでもよい。例は、３位のヒドロキシル基以外および５位のホスファート基以外の低分子量有機基に共有結合する糖（例として、２’−Ｏアルキル化リボース）を有するＲＮＡ、リボースの代わりにアラビノースなどの糖を有するＲＮＡを、包含する。ＲＮＡは、置換プリンおよびＣ−５プロピン修飾塩基などのピリミジンも包括する（Wagner et al., Nature Biotechnology 14:840-844, 1996）。他のプリンおよびピリミジンは、５‐メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６‐クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、およびヒポキサンチンを含むが、これに限定されない。修飾されたＲＮＡ生成の他の形は、５’−メチル−ＣＴＰ、シュードウリジン、２’−Ｏ−メチル−ＵＴＰ、２−フルオロ修飾ピリミジンなどの、修飾されたヌクレオチドの使用を、反応混合物中に含んでもよい。他のかかる修飾は、当業者に周知である。
【００５８】
関心対象のＲＮＡをコードするいかなる好適なＤＮＡテンプレートも、本明細書に記載の方法において使用されてもよい。ＤＮＡテンプレートは、所望のＲＮＡ生成物、および、任意には、転写ターミネーターをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された、プロモーター、任意には誘導性プロモーターを含む。他のテンプレートフォーマットが、使用されてもよいが、ＤＮＡテンプレートは、プラスミドなどのベクター上に、典型的には提供される（例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、化学物合成、または当該技術分野において公知の他の手段によって生じる直鎖ＤＮＡテンプレート）。いくつかの態様において、１以上のＤＮＡテンプレートが、反応混合物において使用される。いくつかの態様において、２、３、４、５以上の異なるＤＮＡテンプレートが、反応混合物において使用される。
プロモーターまたはターミネーターは、天然に存在する配列または改変された配列でもよい。いくつかの態様において、改変された配列は、転写活性を増強するために修飾される。
【００５９】
いくつかの態様において、プロモーターは、天然に存在する配列である。他の態様において、プロモーターは、改変された配列である。いくつかの態様において、ターミネーターは、天然に存在する配列である。他の態様において、ターミネーターは、改変された配列である。
【００６０】
いかなる好適な形でのＴ７ＲＮＡＰバリアントも、本明細書に記載の方法において、使用されてもよい。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントを発現する細胞からの細胞ライセートとして提供される。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントを発現する細胞からの酵素調製物として、提供される。酵素調製物は、精製されても、部分的に精製されても、または、精製されなくてもよい。いくつかの態様において、酵素調製物は、Ｔ７ＲＮＡＰバリアント、および、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントを発現するために使用される細胞または細胞の構成要素を含む。いくつかの態様において、酵素調製物は、細胞または細胞の構成要素から精製される（例として、本質的に細胞または細胞の構成要素を含まない）Ｔ７ＲＮＡＰバリアントを含む。いくつかの態様において、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントは、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントをコードする核酸によって、提供される。
キット
【００６１】
本明細書に記載のＴ７ＲＮＡＰバリアントのいずれかは、キットで提供されてもよい。いくつかの態様において、キットは、本明細書に提供されるＴ７ＲＮＡＰバリアントを含む。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載のとおり、Ｔ７ＲＮＡＰバリアントを発現するための核酸ベクターを含む。
【００６２】
いくつかの態様において、キットは、ＲＮＡを生成する方法、標識されたＲＮＡプローブの方法、ＲＮＡワクチンを調製する方法、ヌクレオチドを重合させる方法、およびＲＮＡを増幅させるための方法を、これらに限定されず含む、本明細書に記載される方法を遂行するための少なくとも１つの試薬を、さらに含む。いくつかの態様において、少なくとも１つの試薬は、リボヌクレオシド三リン酸、反応緩衝液、およびＤＮＡテンプレートを含むが、これに限定されない。
【００６３】
本明細書に記載のキットは、本明細書に記載の方法を遂行するための１以上の構成要素、および任意に使用説明書を収容する容器を、含んでもよい。本明細書に記載のキットのいずれかは、アッセイ方法を遂行するために必要な構成要素を、さらに含んでもよい。キットの各構成要素は、該当する場合、液体状態において（例として、溶液において）、または、固体の状態（例として、乾燥粉末）において、提供されてもよい。あるケースにおいて、構成要素のいくつかは、例えば、好適な溶媒または他の種類（例として、水または緩衝液）の添加によって、（例として、活性化状態へ）再構成可能であるかまたは別様に処理可能でもよく、それは、キットで提供されてもよいかまたは提供されなくてもよい。
【００６４】
いくつかの態様において、キットは、提供される構成要素の使用のための取扱説明書および／または宣伝を、任意に含んでもよい。本明細書に使用されるとき、「取扱説明書」は、取扱説明書および／または宣伝の構成要素を定義することができて、典型的には書面での取扱説明書を開示のパッケージング上にまたはそれとともに、含むことができる。取扱説明書は、使用者が、取扱説明書がキット、例えば視聴覚手段（例として、ビデオテープ、ＤＶＤ等々）、インターネット、および／またはウェブに基づく通信等々に関連すると明確に認識するだろういずれかの方法で提供される、いかなる口頭または電子取扱説明書も、含むことができる。書面での取扱説明書は、医薬または生物学的生成物の製造、使用、または販売を規制している政府機関によって定められた形であってもよく、それは、動物投与のための製造、使用、または販売の機関によって、承認を反映することもできる。本明細書に使用されるとき、「推進された」は、本開示と関連する、教育方法、病院および他のクリニックの取扱説明書、科学的な質問、薬物の発見または開発、アカデミックな調査、医薬品販売を含む医薬品工業活動、および、書面での、口頭での、および電子での通信のいずれかの形を含むいずれかの広告または他の推進活動を含む事業を行うすべての方法を、含む。加えて、キットは、本明細書に記載のとおり、具体的な適用に応じて、他の構成要素を含んでもよい。
【００６５】
キットは、１以上の容器において本明細書に記載の構成要素のいずれか１以上を、含有してもよい。構成要素は、無菌的に調製されてもよく、シリンジ中に包装されてもよく、冷却されて出荷されてもよい。あるいは、それは、保存のためのバイアルまたは他の容器中に、収容されてもよい。第２容器は、無菌的に調製される他の構成要素を、有してもよい。
あるいは、キットは、バイアル、管、または他の容器中に、前もって混合され出荷された活性剤を、含んでもよい。
【００６６】
キットは、パウチ、１以上の管、容器、箱、またはバッグの中で、ゆるく詰められた付属品とともに、ブリスターパウチ、収縮包装パウチ、密封可能な熱成型トレイ、または、類似のパウチまたはトレイなどの、様々な形を有してもよい。キットは、付属品が加えられたあと、滅菌されてもよく、それによって、容器中の個々の付属品が、別途開けられるのを許す。キットは、当該技術分野において公知の放射線滅菌、加熱殺菌、または他の滅菌方法などの、いずれかの適切な滅菌技法を使用して、滅菌されることができる。キットは、具体的な適用、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝液、試薬、シリンジ、針、ガーゼなどの生地に応じて、殺菌剤、使い捨て可能な手袋、投与前の剤のための支持体等々を適用するかまたは取り除くために、他の構成要素を含んでもよい。
【００６７】
例
本明細書に記載の発明が、より完全に理解されてもよいために、以下の例が、規定される。この出願で記載の例は、本明細書に提供される方法および組成物を図示するために提示され、どんな形であれ、それらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６８】
例１−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント
本開示は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼバリアント、例えば、１以上の生物からのＲＮＡポリメラーゼタンパク質を提供し、それは、本明細書に記載のとおり、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様において、ＲＮＡポリメラーゼタンパク質の、少なくとも、アミノ酸残基のうち以下に点で同定されているものは、変異していてもよい。いくつかの態様において、配列番号１において提供されるＩ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４およびＧ７８８残基か、または配列番号１１〜１５において提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する突然変異は、変異している。
【００６９】
配列番号１のＩ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８の対応する相同アミノ酸残基が、相同アミノ酸残基の対応する突然変異を伴うＲＮＡポリメラーゼバリアントを生じさせ、他のＲＮＡポリメラーゼタンパク質において同定されることができることを実証するために、様々な種からの多数のＲＮＡポリメラーゼ配列をアラインメントした。アラインメントは、以下のパラメーターによって、NCBI Constraintに基づくMultiple Alignment Tool（COBALT（st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobaltにアクセス可能）を使用して実行した。Alignment parameters: Gap penalties-11,-1; End-Gap penalties-5,-1. CDDParameters: Use RPS BLASTをオン; Blast E-value 0.003;Find Conserved columns and Recomputeをオン. Query Clustering Parameters: Use query clusters をオン; Word Size 4; Max cluster distance 0.8; Alphabet はRegular.
【００７０】
４つのＲＮＡポリメラーゼ配列の典型的なアラインメントを、以下で提供する。アラインメントのＲＮＡポリメラーゼ配列は、以下の通りである：（Ｔ７）：バクテリオファージＴ７からの野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＦＪ８８１６９４．１、配列番号１；
【００７１】
（Ｔ３）：バクテリオファージＴ３からのＲＮＡポリメラーゼ：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿５２３３０１．１、配列番号１１；（ＳＰ６）バクテリオファージＳＰ６からのＲＮＡポリメラーゼ：ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０６２２１、配列番号１２；および（ＦＥ４４）エルウィニアファージＦＥ４４からのＲＮＡポリメラーゼ：ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００８７６６７１９．１、配列番号１３。野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにおけるアミノ酸残基Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８、およびアラインメントした配列における相同アミノ酸を、アミノ酸残基上の点によって同定する。
【化１】
2021520815.tif 000003
2021520815.tif 000004
【００７２】
アラインメントは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列に相同のアミノ酸配列およびアミノ酸残基を、当該技術分野において公知のアラインメントプログラムおよびアルゴリズムを使用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸配列またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ残基と揃うアミノ酸配列または残基を同定することによって、種々異なる種からのＲＮＡポリメラーゼ配列を含むがこれらに限定されないＲＮＡポリメラーゼ配列全体にわたって同定することができるということを実証する。
【００７３】
本開示は、配列番号１１〜１３（例として、それぞれＴ３、ＳＰ６、およびＦＥ４４）における点によって同定されるアミノ酸残基の１以上が、本明細書に記載のとおり変異しているＲＮＡポリメラーゼバリアントを提供する。点によって配列番号１１〜１３において同定される残基に対応する配列番号１のＴ７ＲＮＡポリメラーゼにおける残基Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４およびＧ７８８を、本明細書において、「相同の」または「対応する」残基と称する。かかる相同残基は、例として上記の通り、配列アラインメントによって、および、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ配列または残基と揃う配列または残基を同定することによって、同定することができる。同様に、本明細書中の配列番号１において同定される突然変異、例として配列番号１における残基Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびのＧ７８８の突然変異に対応するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ配列における突然変異は、本明細書中に、「相同の」または「対応する」突然変異として、言及される。
【００７４】
例えば、上記のアラインメントされた配列に関する配列番号１における位置Ｉ３２０でのアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換は、Ｔ３に関するＶ３２１、ＳＰ６に関するＩ２９３、およびＦＥ４４に関するＶ３２０である。
【００７５】
種々異なる種からのＲＮＡポリメラーゼ配列は、当該技術分野において公知である。配列番号１のＴ７ＲＮＡポリメラーゼにおける残基Ｉ３２０、Ｉ３９６、Ｆ５４６、Ｓ６８４、およびＧ７８８に対応するアミノ酸残基は、当該技術分野において公知のＲＮＡポリメラーゼ配列に関して、本明細書に記載のとおり同定してもよい。同定されたＲＮＡポリメラーゼ配列のいずれかは、本開示に従って使用してもよい。
【００７６】
例２―野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたは熱安定性のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用するＲＮＡの無細胞合成
材料および方法
バリアントポリメラーゼのクローニング
突然変異を、プライマーを使用して部位定方向突然変異誘発を介して、作成した。本明細書に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼバリアントの突然変異を、表１において示す。ポリメラーゼのバリアントバージョンは、テンプレートとして具体的なプライマーおよび天然のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００５７３）を使用するオーバーラップＰＣＲ反応を介して生じさせた。さらにその上、６のヒスチジン残基を、カスタムプライマーを介するＰＣＲステップの間、タンパク質精製によって促進するために、Ｎ末端で、これらのバリアントポリメラーゼに導入した。得られたＰＣＲ生成物を、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を使用してベクターｐＢＡＤ２４中に、クローニングした。かかるプロセスを、各個々の突然変異のために実行した。複数の突然変異を生じさせるために、このプロセスを、ＰＣＲテンプレートとして既存のバリアントを使用して繰り返した。精製後に、タンパク質レベルと同様にＤＮＡレベルで正確さを確保するために、各バリアントポリメラーゼについて配列決定した。野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを同様に、天然の活性のための対照として役立てるために、Ｈｉｓタグ付けし、そして、ｐＢＡＤ２４においてクローニングした。
【００７７】
【表１】
2021520815.tif 000005
【００７８】
タンパク質発現および細胞成長
種々異なるｈｉｓタグ付けされたバリアントポリメラーゼ配列を担持するプラスミドを、染色体Ｔ７ＲＮＡＰを欠く大腸菌ＢＬ２１株に形質転換し、タンパク質発現のための宿主株を生じさせた。形質転換された大腸菌株を、２５０ｒｐｍの定常撹拌により、３７℃で、（カルベニシリン抗生物質とともに）Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ中の１％の接種菌を使用して、増殖させた。培養物を、ＯＤ６００が０．６に達したときに、４時間０．２％のアラビノースによって誘導した。４時間の誘導の終わりに、培養物を、遠心分離を介して収穫し、そして、収集したバイオマスを、今後のテストのため、−８０℃で凍結保存した。試料を、誘導の前に、および（タンパク質発現を確認するための）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のためのおよびＯＤ６００決定のための検討終了後に、収集した。
【００７９】
培地、化学物質、および緩衝液
Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、細胞成長のために使用した（１０ｇ／ＬＴｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、および５ｇ／ＬＮａＣｌ）。タンパク質精製のために、１Ｘ洗浄緩衝液（ｐＨ７．４で、２０ｍＭナトリウムホスファート、５００ｍＭＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール）を、バイオマスを再懸濁するために、カラム平衡化のために、および、カラムを洗浄するために使用した。使用した溶離緩衝剤の組成物は、以下の通りである：ｐＨ７．４での、２０ｍＭナトリウムホスファート、５００ｍＭＮａＣｌ、７５０ｍＭイミダゾール。使用した２Ｘ透析緩衝液の組成物は、以下の通りである：２ＸＰＢＳ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％トリトンＸ１００。
【００８０】
熱安定性／活性テストのために、以下の商業的に入手可能な化学物質／試薬を、使用した：リボヌクレオチド溶液（ＡＴＰ／ＧＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ）；スペルミジン；ＭｇＳＯ４、熱安定性の無機ピロホスファターゼ（ＴＩＰＰ）。１０Ｘ反応緩衝液（１０ＸＲＢ）の組成物は、以下の通りである：３００ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２０ｍＭスペルミジン。クエンチ緩衝液組成物は、以下の通りである：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＥＤＴＡｐＨ８。反応をクエンチした後に、デオキシリボヌクレアーゼＩを、バックグラウンドのＤＮＡテンプレートを取り除くために、使用した。アガロースゲルを流すと共に、ＲＮＡローディング色素（２Ｘ）を、使用した。使用したＤＮＡテンプレートは、コード配列を担持する線形プラスミドであった（５２４ｂｐ）。
【００８１】
粗ライセートの発生およびタンパク質精製
関心対象のタンパク質を精製するために、最初に、バイオマスを、溶解し、そして、生じた粗ライセートを、透明化して、関心対象の標的タンパク質を精製するために、使用した。粗ライセートを生じさせるために、バイオマスを、最初に１Ｘ洗浄緩衝液中で再懸濁し、および次いで高圧ホモジナイゼーションを使用して、溶解した。溶解につづいて、粗ライセートを、４℃、１５，０００ｇで６０分間、遠心分離した。遠心分離の後、上清（透明化されたライセート）を、精製のために別の容器に移して、使用した。
【００８２】
透明化されたライセートを、イオン交換／グラジエント溶離プロトコルを使用したＦＰＬＣ（ＡＫＴＡプライムプラス）を使用して、Ｎｉイオン親和性クロマトグラフィーに基づく精製のために、使用した。１ｍＬのｈｉｓ−カラムを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。使用したすべての緩衝液を、上でリストする。精製につづいて、該タンパク質を、５０％グリセロール（最終的な濃度）を使用して、−２０℃において保存した最後に、該タンパク質を、１６時間、終夜透析した。
【００８３】
活性および熱安定性テスト
突然変異体ポリメラーゼの活性テストを、（本明細書に記載の）ＩＶＴ反応混合物を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応を介して、遂行した。候補の突然変異体ポリメラーゼの活性テストを、３７℃〜５４℃の間で、遂行した。該反応は、ＰＣＲプレートにおいて２５μＬスケールでセットアップし、そして、サーマルサイクラーを使用して、テスト温度で、２時間インキュベートした。この後、該反応を、クエンチして、下流の分析のために処理した。ＩＶＴ反応混合物を、表２中に記載する。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
２時間後反応をクエンチするために、２．５μＬのデオキシリボヌクレアーゼＩを該反応に加え、３７℃で３０分間インキュベートして、バックグラウンドのテンプレートを取り除いた。次に、２２．５μＬの水を、混合物に加えた。この混合物を、クエンチした反応混合物として役立たせ、そして、アガロースゲル電気泳動またはＨＰＬＣを介する、ＲＮＡ生成物の検証／定量化のための下流分析のために、使用した。
【００８６】
アガロースゲル電気泳動のために、５μＬを、クエンチした反応混合物から取り除き、１０μＬのクエンチ緩衝液およびＰＣＲプレートの混合ウェルに加えた。次に、１５μＬ２ＸＲＮＡ色素を加え、そして、この混合物を、サーマルサイクラー中で、７０℃で１０分間加熱した。おおよそ、この混合物の１０μＬを、次いで、画像化の前に、１４０Ｖで６０分間安全なＳＹＢＲで染色した２％のアガロースゲル上で、流した。
【００８７】
該反応において合成したＲＮＡは、記載の逆相イオン対クロマトグラフィーを使用して、適応したＲＮＡＳｗｉｆｔ抽出プロトコルを介して精製した（Nwokeji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., & Dickman, M. J. (2016). RNASwift: A rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry,512,36-46）。
【００８８】
精製した生成物のＨＰＬＣ分析
ｄｓＲＮＡを定量化するために、個体相抽出プロトコルを、不必要なタンパク質を取り除くために遂行した。一次分離機構は、逆相イオン対クロマトグラフィーであった。シグナルは、ダイオードアレイ検出器を使用して、２６０  ｎｍで測定した。内部標準応答に領域を標準化することによって、結果を、抽出過程に出現し得る何らかのロスのために修正し、そして、濃度を、外部較正曲線から生じさせた傾きに基づき算出した。
結果
【００８９】
突然変異体Ｔ７ＮＡポリメラーゼの活性をテストするために、ＩＶＴ反応を、本明細書に記載のとおり２時間セットアップし、そして、生成したＲＮＡ量を、ＨＰＬＣを介して定量した。野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、天然のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ活性のための参照対照として、役だてた。陰性対照も含めた。ここで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、水によって置き換えた。ｄｓＲＮＡ生成物を、陰性対照反応から検出した（図１）。
【００９０】
図１に示すとおり、Ｍ３が、３７℃〜４２．３℃で、ほとんどのｄｓＲＮＡを形成し；４０．１℃までのＭ４が続き；３８．５℃までのＭ２が続く。Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、３７℃〜４６．５℃の範囲にある温度で、野生型に比較してより多くのｄｓＲＮＡを形成する。一方、Ｍ１Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、４２．３℃〜４６．５℃の範囲にある温度で、野生型に比較してより多くのｄｓＲＮＡを形成する。
表３は、野生型ポリメラーゼと比較したｄｓＲＮＡ力価における増加倍数を示す。
表４は、突然変異体および野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの、平均ｄｓＲＮＡ力価（ｎｇ／μＬ）を示す。
【００９１】
【表３】
2021520815.tif 000007
【００９２】
【表４】
2021520815.tif 000008
【００９３】
ＷＴが、４０．１℃までその活性の９０％を保持して、４２．３℃でその最大と比較してわずか１２％の活性を有することが、決定された。ＷＴポリメラーゼは、４４．５℃以上で、活性を失う。対照の野生型と比較したｄｓＲＮＡ力価の増加倍数を、表３に表す。
【００９４】
Ｍ１が、４２．３℃で野生型と比較した力価の５．３倍の増加を有するということが、わかる。Ｍ２、Ｍ３、およびＭ４は、野生型ポリメラーゼに比較して、テストしたすべての温度で、大量のＲＮＡを形成する。４２．３℃で、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４は、野生型タンパク質より８．９、１３．３、および９．５倍大量のＲＮＡを、形成する。
図２に示すとおり、Ｍ１〜Ｍ４は、ＷＴに比較して、熱安定性を改善した。候補Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性は、次の通りに推定される：Ｍ３＞Ｍ２＞Ｍ１＞Ｍ４＞ＷＴ。
【００９５】
野生型ポリメラーゼが、４２．３℃で、その最大値に比較して約１２％のＲＮＡ（２１２．４２ｎｇ／μＬ）を形成し、そして、４４．５℃以上で、３８．５℃でのその最大値（１８０８．９ｎｇ／μＬ）に比較して、いかなるＲＮＡも形成しないことがわかる。
【００９６】
配列
バクテリオファージＴ７からの野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
（ＧｅｎＢａｎｋ：ＦＪ８８１６９４．１／Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００５７３）
【化２】
2021520815.tif 000009
【００９７】
改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｉ３２０Ｌ  Ｉ３９６Ｌ  Ｆ５４６Ｗ  Ｓ６８４Ａ  Ｇ７８８Ａ）（バリアント１）
【化３】
2021520815.tif 000010
【００９８】
改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｉ３２０Ｌ  Ｉ３９６Ｌ  Ｇ７８８Ａ）（バリアント２）
【化４】
2021520815.tif 000011
【００９９】
改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｉ３９６Ｌ  Ｓ６８４Ａ  Ｇ７８８Ａ）（バリアント３）
【化５】
2021520815.tif 000012
【０１００】
改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｉ３２０Ｌ  Ｓ６８４Ａ  Ｇ７８８Ａ）（バリアント４）
【化６】
2021520815.tif 000013
【０１０１】
改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｉ３２０Ｌ）
【化７】
2021520815.tif 000014
【０１０２】
改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｉ３９６Ｌ）
【化８】
2021520815.tif 000015
【０１０３】
改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆ５４６Ｗ）
【化９】
2021520815.tif 000016
【０１０４】
改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｓ６８４Ａ）
【化１０】
2021520815.tif 000017
【０１０５】
改変されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｇ７８８Ａ）
【化１１】
2021520815.tif 000018
【０１０６】
バクテリオファージＴ３からのＲＮＡポリメラーゼ
（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿５２３３０１．１）
【化１２】
2021520815.tif 000019
【０１０７】
バクテリオファージからのＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ
（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０６２２１）
【化１３】
2021520815.tif 000020
【０１０８】
ＥｒｗｉｎｉａファージＦＥ４４からの野生型ＲＮＡポリメラーゼ
（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００８７６６７１９．１）
【化１４】
2021520815.tif 000021
【０１０９】
ＫｌｕｙｖｅｒａバクテリオファージＫｖｐ１からのＲＮＡポリメラーゼ
（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＪ１４５４８．１）
【化１５】
2021520815.tif 000022
【０１１０】
ＹｅｒｓｉｎｉａバクテリオファージｐｈｉＹｅＯ３−１２からのＲＮＡポリメラーゼ
（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９Ｔ１４５）
【化１６】
2021520815.tif 000023
【０１１１】
等価物および範囲
当業者は、単にルーチン実験操作を用いて、本明細書に記載の発明の具体的態様の多くの等価物を、確認し、または確かめることができるだろう。本発明の範囲は、上記記載に限定されることを意図せず、しかし、添付の特許請求の範囲で規定された通りである。
【０１１２】
請求項において、「ａ、」「ａｎ、」「ｔｈｅ、」などの冠詞は、逆が示されない限り、または別様に文脈から明白でない限り、１または１以上を意味してもよい。逆が示されない限り、または別様に文脈から明白でない限り、群のメンバーの１以上の間の「または」を含む請求項または記載は、群のメンバーの１、１以上、または全てが、与えられた生成物またはプロセス中で存在するか、用いられるか、または別様に関連する場合に、満足されると考えられる。本発明は、群のちょうど１つのメンバーが、与えられた生成物またはプロセス中で存在するか、用いられるか、または別様に関連する、実施形態を含む。本発明は、群の１以上またはすべてのメンバーが、与えられた生成物またはプロセス中で存在するか、用いられるか、または別様に関連する、実施形態をも含む。
【０１１３】
さらにその上、本発明が、１以上の請求項からの、または記載の関連のある部分からの、１以上の限定、要素、個条、記述用語などが、別の請求項に導入される、すべてのバリエーション、組み合わせ、順列を包含することが、理解されるべきである。例えば、別の請求項に従属するいかなる請求項も、同じ基礎請求項に従属する他のいずれかの請求項に見つかる１以上の限定を含むように修飾されることができる。さらにその上、別様に示されない限り、または当業者に、矛盾または不一致が生じることが明らかでない限り、該請求項が、組成物を詳述する場合、本明細書に開示の目的のいずれかのための組成物を使用する方法が含まれ、および、本明細書に開示の作成方法または当該技術分野において公知の他の方法のいずれかに従う組成物を作る方法が含まれるということが理解されるべきである。
【０１１４】
例として、マーカッシュ群形式で、要素がリストとして提示される場合、要素の各サブグループも開示され、そして、いかなる要素も、群から取り除かれることができるということが、理解されるべきである。用語「含む」が、追加の要素またはステップを含むことに自由でありそれを許すことが意図されることにも注意すべきである。一般に、本発明、または本発明の側面が、特定の要素、特色、ステップ等々を含むと言及される場合、本発明のある実施形態または本発明の側面が、かかる要素、特色、ステップ等々からなるか、または本質的になることが、理解されるべきである。分かりやすさの目的のために、それらの態様は、本明細書中のこれらの言葉で、具体的に規定されなかった。よって、１以上の要素、特色、ステップ等々を含む本発明の態様ごとに、本発明は、それらの要素、特色、ステップ等々からなるか、または本質的になる実施形態も、提供する。
【０１１５】
範囲が与えられる場合には、エンドポイントが含まれる。さらにその上、別様に示されない限り、または文脈および／または当業者の理解から別様に明らかでない限り、範囲として表現される値は、文脈から明確に逆を指示しない限り、本発明の種々異なる実施形態において述べられている範囲の中で、該範囲の下限の単位の１０分の１まで、いかなる具体的な値も、想定することができるということが理解されるべきである。別様に示されない限り、または文脈および／または当業者の理解から別様に明らかでない限り、範囲として表現される値は、与えられた範囲の中で、部分範囲のエンドポイントが該範囲の下限の単位の１０分の１と同じ正確度まで表現されるいかなる部分範囲も、想定することができるということが理解されるべきである。
【０１１６】
加えて、本発明のいかなる特定の態様も、１以上のいずれかの請求項から明確に除外されてもよいということが理解されるべきである。範囲が与えられている場合、該範囲の中のいかなる値も、いずれか１以上の請求項から、明確に除外されてもよい。本発明の組成物および／または方法のいかなる態様、要素、特色、適用、または側面も、１以上のいずれかの請求項から除外されることができる。簡潔さの目的のために、１以上の要素、特色、目的、または側面が除外される実施形態の全てが、本明細書に明確に規定されるというわけではない。
【図１】
2021520815.tif 000024
【図２】
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【配列表】
2021520815000001.app
【国際調査報告】
2021520815.tif 000026
2021520815.tif 000027
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