(57)【要約】  移植前に腎臓同種異系移植レシピエントによって発現される、移植後の急性拒絶反応（ＡＲ）のリスクを決定する遺伝子シグネチャーセット、および、急性拒絶反応のリスクがある腎臓同種異系移植レシピエントを同定するために、遺伝子シグネチャーセットを使用する方法が、本明細書に開示される。遺伝子シグネチャーセットについてのプライマー対を含む、本発明で使用するためのキットも本明細書に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性拒絶反応を起こすリスクがある腎臓同種異系移植レシピエントを同定する方法であって、
（ａ）前記腎臓同種異系移植レシピエントからの移植前血液検体中の遺伝子シグネチャーセットの発現レベルを測定するステップと、
（ｂ）前記遺伝子シグネチャーセットの発現レベルを、対照中の遺伝子シグネチャーセットの発現レベルと比較するステップと、
（ｃ）前記検体中の前記遺伝子シグネチャーセットにおける１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、前記対照中の前記遺伝子シグネチャーセットにおける同じ１つまたは複数の遺伝子の発現レベルから変化している場合、レシピエントは同種異系移植拒絶反応のリスクがあると判定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記変化が、前記対照中の前記遺伝子シグネチャーセットにおける１つまたは複数の遺伝子と比較した、前記検体中の前記遺伝子シグネチャーセットにおける同じ１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの増加または低下を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変化が、前記対照中の前記遺伝子シグネチャーセットにおける１つまたは複数の遺伝子と比較した、前記検体中の前記遺伝子シグネチャーセットにおける同じ１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの増加および低下を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子シグネチャーセットが、ＧＺＭＨ、ＡＤＧＲＧ１、Ｓ１ＰＲ５、ＦＧＦＢＰ２、ＮＫＧ７、ＰＲＦ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＬＡＧ３、ＴＡＲＰ、ＦＣＲＬ６、ＦＡＳＬＧ、ＴＢＸ２１、ＴＯＸ、ＺＮＦ８３１、ＣＤ８Ａ、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＣＲ５、ＬＤＯＣ１Ｌ、ＣＣＤＣ１０２Ａ、ＨＯＰＸ、ＰＲＫＣＨ、ＳＬＣ２５Ａ３４およびＦ１２からなる群から選択される、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記判定するステップが、患者の試料において測定される発現レベルを、加重累積リスクスコアｒ＝−（ｌｏｇ１０（ｐ１）＊ｇ１＋ｌｏｇ１０（ｐ２）＊ｇ２＋・・・＋ｌｏｇ１０（ｐｉ）＊ｇｉ＋・・・＋ｌｏｇ１０（ｐ２３）＊ｇ２３）に適用することを含み、式中、ｐｉは、トレーニングセットにおけるＥＡＲ対非ＥＡＲ群の間の遺伝子ｉ（ｉ＝１・・・２３）の発現値についてのｔ検定の有意性ｐ値であり、ｇｉは、各患者の急性拒絶反応のリスクスコアとして使用することができる、遺伝子ｉ（ｉ＝１・・・２３）の論理数であり、１（遺伝子ｉの発現値が、上方制御された遺伝子のトレーニングセットのＥＡＲ群の中間発現値より大きい場合、または、遺伝子ｉの発現値が、下方制御された遺伝子のトレーニングセットのＥＡＲ群の中間発現値より小さい場合）、または、−１（遺伝子ｉの発現値が、上方制御された遺伝子のトレーニングセットの非ＥＡＲ群の中間値より小さい場合、または、遺伝子ｉの発現値が、下方制御された遺伝子のトレーニングセットの非ＥＡＲ群の中間値より大きい場合）、または、０（遺伝子ｉの発現値が、トレーニングセットのＥＡＲ群の中間値と非ＥＡＲ群の中間値の間である場合）である、請求項１〜３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記発現レベルが、ナノストリング、ＴＲＥｘおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）からなる群から選択される方法によって測定される、請求項１〜４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
移植前に同種異系移植の急性拒絶反応のリスクがある腎臓同種異系移植レシピエントを同定する方法であって、
（ａ）前記腎臓同種異系移植レシピエントから血液検体を得るステップと、
（ｂ）前記血液検体からｍＲＮＡを単離するステップと、
（ｃ）前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するステップと、
（ｄ）前記レシピエントの血液中の遺伝子シグネチャーセットの発現レベルを測定するステップと、
（ｅ）前記同種異系移植レシピエントの血液検体中の前記遺伝子シグネチャーセットにおける１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、対照血液検体中の同じ１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して変化している場合、前記同種異系移植レシピエントを急性拒絶反応および同種異系移植喪失のリスクがあると診断し、急性拒絶反応または同種異系移植喪失のリスクがあると同定された前記レシピエントを、導入療法によって処置するステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記導入療法が、抗胸腺細胞グロブリンまたはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈの治療上有効量を投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子シグネチャーセットが、ＧＺＭＨ、ＡＤＧＲＧ１、Ｓ１ＰＲ５、ＦＧＦＢＰ２、ＮＫＧ７、ＰＲＦ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＬＡＧ３、ＴＡＲＰ、ＦＣＲＬ６、ＦＡＳＬＧ、ＴＢＸ２１、ＴＯＸ、ＺＮＦ８３１、ＣＤ８Ａ、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＣＲ５、ＬＤＯＣ１Ｌ、ＣＣＤＣ１０２Ａ、ＨＯＰＸ、ＰＲＫＣＨ、ＳＬＣ２５Ａ３４およびＦ１２からなる群から選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現レベルが、ナノストリング、ＴＲＥｘおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）からなる群から選択される方法によって測定される、請求項７〜８または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
急性拒絶反応および同種異系移植喪失のリスクがある腎臓同種異系移植レシピエントを同定するためのキットであって、１つまたは複数の別個の容器に、遺伝子シグネチャーセット：ＧＺＭＨ、ＡＤＧＲＧ１、Ｓ１ＰＲ５、ＦＧＦＢＰ２、ＮＫＧ７、ＰＲＦ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＬＡＧ３、ＴＡＲＰ、ＦＣＲＬ６、ＦＡＳＬＧ、ＴＢＸ２１、ＴＯＸ、ＺＮＦ８３１、ＣＤ８Ａ、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＣＲ５、ＬＤＯＣ１Ｌ、ＣＣＤＣ１０２Ａ、ＨＯＰＸ、ＰＲＫＣＨ、ＳＬＣ２５Ａ３４、Ｆ１２についてのプライマー対、緩衝液、陽性対照および陰性対照ならびに使用説明書を含むキット。
【請求項１２】
ハウスキーピング遺伝子パネルおよび前記ハウスキーピング遺伝子パネルについてのプライマーをさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記ハウスキーピング遺伝子パネルにおける遺伝子が、ＣＨＴＯＰ、ＹＫＴ６、ＲＥＲ１、ＰＩ４ＫＢ、ＺＤＨＨＣ５、ＴＭＥＭ２４８、Ｃ６ｏｒｆ８９、ＳＭＵ１、ＳＨＣ１、ＤＬＳＴ、ＵＢＥ２Ｑ１、ＦＢＸＯ１８およびＳＬＣ３５Ｅ１からなる群から選択される、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
加重累積スコア（ｒ＝−（ｌｏｇ１０（ｐ１）＊ｇ１＋ｌｏｇ１０（ｐ２）＊ｇ２＋・・・＋ｌｏｇ１０（ｐｉ）＊ｇｉ＋・・・＋ｌｏｇ１０（ｐ２３）＊ｇ２３）を計算することをさらに含み、式中、ｐｉは、トレーニングセットにおけるＥＡＲ対非ＥＡＲ群の間の遺伝子ｉ（ｉ＝１・・・２３）の発現値についてのｔ検定の有意性ｐ値であり、ｇｉは、各患者の急性拒絶反応のリスクスコアとして使用することができる、遺伝子ｉ（ｉ＝１・・・２３）の論理数であり、１（遺伝子ｉの発現値が、上方制御された遺伝子のトレーニングセットのＥＡＲ群の中間発現値より大きい場合、または、遺伝子ｉの発現値が、下方制御された遺伝子のトレーニングセットのＥＡＲ群の中間発現値より小さい場合）、または、−１（遺伝子ｉの発現値が、上方制御された遺伝子のトレーニングセットの非ＥＡＲ群の中間値より小さい場合、または、遺伝子ｉの発現値が、下方制御された遺伝子のトレーニングセットの非ＥＡＲ群の中間値より大きい場合）、または、０（遺伝子ｉの発現値が、トレーニングセットのＥＡＲ群の中間値と非ＥＡＲ群の中間値の間である場合）である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１５】
確率スコアが、コンピューターベースのシステムを使用して測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記確率スコアが、カットオフ値を決定するために使用される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
腎臓急性拒絶反応または同種異系移植喪失のリスクを低減するために、移植前の導入療法のための腎臓同種異系移植患者を選択する方法であって、
前記患者から得られた遺伝子シグネチャーセットの発現レベルを、急性拒絶反応を患わなかった同種異系移植レシピエントから得られた対照試料中の遺伝子シグネチャーセットの発現レベルと比較するステップと、前記患者からの前記遺伝子シグネチャーセットにおける１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、前記対照中の前記遺伝子シグネチャーセットにおける前記遺伝子の１つまたは複数の発現レベルと比較して変化している場合、導入療法による処置のために前記患者を選択するステップと、
前記患者に導入療法を実施するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
前記導入療法が、抗胸腺細胞グロブリンまたはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈの治療上有効量を投与することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子シグネチャーセットが、少なくとも、遺伝子ＧＺＭＨ、ＡＤＧＲＧ１、Ｓ１ＰＲ５、ＦＧＦＢＰ２、ＮＫＧ７、ＰＲＦ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＬＡＧ３、ＴＡＲＰ、ＦＣＲＬ６、ＦＡＳＬＧ、ＴＢＸ２１、ＴＯＸ、ＺＮＦ８３１、ＣＤ８Ａ、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＣＲ５、ＬＤＯＣ１Ｌ、ＣＣＤＣ１０２Ａ、ＨＯＰＸ、ＰＲＫＣＨ、ＳＬＣ２５Ａ３４およびＦ１２を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野、およびより詳細にはｍＲＮＡ分子シグネチャーを検出することに関する。より詳細には、本発明は、腎臓同種異系移植レシピエントの急性拒絶反応および同種異系移植喪失を起こすリスクを診断するための方法に関する。本方法は、そのような患者を移植の前後に同定し、処置するために、２３個の予め選択されたｍＲＮＡを含むｍＲＮＡシグネチャーセットの発現レベルを測定することによって腎臓同種異系移植レシピエントの血液を分析することを含む。各患者で得ることができる、急性拒絶反応および同種異系移植喪失のリスクについての加重累積リスクスコアを導くために、選択された遺伝子の正規化された発現読み取りカウント（例えば、次世代シークエンシング技術からの遺伝子の読み取りカウント）値に、示差的発現分析を適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
腎移植は、末期の腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する対象のための最良の処置である。しかし、最近の１０年にわたる１年の移植片喪失における著しい改善にもかかわらず、移植後の各翌年に、腎臓同種異系移植レシピエントの概ね３％が透析に戻るか、または再移植を必要とする。近年のデータは、２００６年以来より優れた腎臓機能と関連した中間期移植喪失の改善を示しているかもしれないが、遅い移植不全の割合は１９９０年代から比較的不変である。
【０００３】
慢性的同種異系移植損傷、または未知の原因の間質性線維症および管萎縮が、移植喪失の症例の大部分の原因である。これは、とりわけ、同種異系抗体の形成および一次疾患の再発を含む、これらの後期の事象の原因の機構を理解し、比較することを目指す研究を促進した。実際、急性拒絶反応の劇的な低減にもかかわらず長期改善が欠如することは、急性拒絶反応が長期移植転帰の主要な決定因子であるとの仮定に疑問を呈する。しかし、この仮定は、移植の６カ月後より前に得られる腎生検に基づいて、臨床的に明らかな無症状の１以上の炎症／尿細管炎スコアを有する早期の急性拒絶反応（ＥＡＲ）が、現行の免疫抑制レジメンを受けている患者において長期の移植喪失に負の影響を与えるという証拠と対照をなす。したがって、ＥＡＲはなお移植後の免疫抑制療法の主要な標的の１つである。
【０００４】
現在の免疫抑制プロトコールの主要な問題の１つは、それらが単一の患者の必要性を満たすように調整されていないという事実である。現在の医療慣行は、移植後の個々の免疫学的リスクを予測するために、抗ＨＬＡ抗体、人種、以前の移植およびレシピエント年齢を含む広い臨床判定基準に依存する。これらの指標は、性能が十分でない。その結果、ほとんどの患者は標準化された免疫抑制プロトコールを受け、一部の個体は多過ぎるかまたは少な過ぎる免疫抑制に曝露させられ、結果として合併症をもたらす。急性拒絶反応のリスクが最も高い個体の早期の同定は、長期の転帰を改善することを目的とする標的療法を可能にするかもしれない。
【０００５】
腎移植の前の患者における免疫系の組成および機能が、移植後の以降の急性拒絶反応（ＡＲ）のリスクに影響を及ぼすとの証拠が存在するが、このリスクを定量化するバイオマーカーは同定されていない。急性の拒絶反応エピソードを予測するために、腎臓移植の前の患者の血液の転写物プロファイリングに使用することができる遺伝子シグネチャーセットが必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＥＡＲのリスクを予測し、後期のＡＲおよび同種異系移植喪失と関連する血液ベースの２３遺伝子セットを、移植前の同種異系移植レシピエントにおいて同定し、検証した。この遺伝子セットの適用は、移植前の移植患者の免疫の層別化を可能にし、それによって免疫抑制療法への個人別アプローチを可能にする。
【０００７】
移植前に腎臓同種異系移植レシピエントによって発現される、移植後の急性拒絶反応（ＡＲ）のリスクを決定する遺伝子プロファイルが、本明細書に開示される。
【０００８】
一態様では、本発明は、急性拒絶反応を起こすリスクがある腎臓同種異系移植レシピエントを同定する方法であって、（ａ）レシピエントから得た血液検体中の遺伝子シグネチャーセットにおける遺伝子の発現レベルを測定するステップと、（ｂ）遺伝子シグネチャーセットにおける遺伝子の発現レベルを、対照遺伝子セットにおける遺伝子シグネチャーセットにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較するステップと、（ｃ）検体中の遺伝子シグネチャーセットにおける１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、対照中の遺伝子シグネチャーセットにおける同じ１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して変化している場合、レシピエントは急性拒絶反応および同種異系移植喪失のリスクがあると判定するステップと、を含む方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、ＥＡＲのリスクを加重累積スコア（ｒ）として要約するために、アッセイの遺伝子発現レベルの結果が適用される。リスクアセスメントのために用いられる式は、ｒ＝−（ｌｏｇ１０（ｐ１）＊ｇ１＋ｌｏｇ１０（ｐ２）＊ｇ２＋・・・＋ｌｏｇ１０（ｐｉ）＊ｇｉ＋・・・＋ｌｏｇ１０（ｐ２３）＊ｇ２３）であり、ここで、ｐｉは、トレーニングセットにおけるＥＡＲ対非ＥＡＲ群の間の遺伝子ｉ（ｉ＝１・・・２３）の発現値についてのｔ検定の有意性ｐ値であり、ｇｉは、遺伝子ｉ（ｉ＝１・・・２３）の論理数であり、１（遺伝子ｉの発現値が、上方制御された遺伝子のトレーニングセットのＥＡＲ群の中間発現値より大きい場合、または遺伝子ｉの発現値が、下方制御された遺伝子のトレーニングセットの非ＥＡＲ群の中間発現値より小さい場合）、または−１（遺伝子ｉの発現値が、上方制御された遺伝子のトレーニングセットの非ＥＡＲ群の中間値より小さい場合、または遺伝子ｉの発現値が、下方制御された遺伝子のトレーニングセットの非ＥＡＲ群の中間値より大きい場合）、または０（遺伝子ｉの発現値が、トレーニングセットのＥＡＲ群の中間値と非ＥＡＲ群の中間値の間である場合）である。加重累積スコア（ｒ）は、各患者の急性拒絶反応のリスクスコアとして使用することができる。患者のリスクスコアがトレーニングデータセットから規定される三分位発現値カットオフより高いならば、患者は急性拒絶反応のリスクがある。
【００１０】
別の態様では、本発明は、急性拒絶反応のリスクがある腎臓同種異系移植レシピエントを同定するためのキットであって、１つまたは複数の別個の容器に、遺伝子シグネチャーセット：ＧＺＭＨ、ＡＤＧＲＧ１、Ｓ１ＰＲ５、ＦＧＦＢＰ２、ＮＫＧ７、ＰＲＦ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＬＡＧ３、ＴＡＲＰ、ＦＣＲＬ６、ＦＡＳＬＧ、ＴＢＸ２１、ＴＯＸ、ＺＮＦ８３１、ＣＤ８Ａ、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＣＲ５、ＬＤＯＣ１Ｌ、ＣＣＤＣ１０２Ａ、ＨＯＰＸ、ＰＲＫＣＨ、ＳＬＣ２５Ａ３４、Ｆ１２についてのプライマー対、緩衝液、ハウスキーピング遺伝子パネル、ハウスキーピング遺伝子パネルについてのプライマー、陰性対照および使用説明書を含むキットを提供する。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、移植前に同種異系移植の急性拒絶反応のリスクがある腎臓同種異系移植レシピエントを同定する方法であって、（ａ）腎臓同種異系移植レシピエントからの血液検体からｍＲＮＡを単離するステップと、（ｂ）ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するステップと、（ｃ）前記レシピエントの血液中の２３メンバーの遺伝子シグネチャーセットの発現レベルを測定するステップと、（ｄ）２３メンバーの遺伝子セットの発現レベルから計算される加重累積リスクスコア（ｒ）が三分位カットオフより高い場合、同種異系移植レシピエントは急性拒絶反応および同種異系移植喪失のリスクがあると診断するステップと、（ｅ）急性拒絶反応または同種異系移植喪失のリスクがあると同定されたレシピエントを、導入療法またはカルシニューリン阻害剤のより高い標的投与などのより高い維持免疫抑制の実施によって処置するステップと、を含む方法を提供する。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、急性拒絶反応および／または移植喪失の低いリスクがある患者を処置する方法であって、ラパマイシンまたはベラタセプトなどのより低いリスクの維持免疫抑制を実施し、それによって感染症および悪性腫瘍のリスクを低下させるステップを含む方法を提供する。
【００１３】
なおさらなる態様では、本発明は、腎臓急性拒絶反応または同種異系移植喪失のリスクを低減するために、移植前の導入療法のための腎臓同種異系移植患者を選択する方法であって、患者から得られた２３メンバーの遺伝子シグネチャーセットの発現レベルを、急性拒絶反応を患わなかった同種異系移植レシピエントから得られた対照試料中の同じ遺伝子シグネチャーセットの発現レベルと比較するステップと、患者からの遺伝子シグネチャーセットにおける１つまたは複数の遺伝子の発現レベルが、対照中の遺伝子シグネチャーセットにおける同じ１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと比較して変化している場合、導入療法によって患者を処置するステップとを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の態様は、本明細書および添付の特許請求の範囲に照らして当業者にとって明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義：
本明細書で使用されるように、同種異系移植の急性拒絶反応および同種異系移植喪失の「リスクが高い」同種異系移植レシピエントは、介入無しの場合、「低リスク」の対象より同種異系移植を拒絶する可能性が有意により高い。
【００１６】
本発明に従って、従来の分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、免疫学、細胞生物学および当分野の技術の範囲内の他の関連技術を用いることができる。例えば、とりわけ、Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.；Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.；Ausubel et al., eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.；Bonifacino et al., eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.；Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.；Coico et al., eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.；Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.；Enna et al., eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.；Hames et al., eds. (1999) Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford；Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4th ed. Wiley-Lissを参照する。上掲の現在のプロトコールは、毎年、数回更新される。
【００１７】
本明細書で使用されるように、本明細書に開示されるｍＲＮＡの「発現レベル」は、マーカーのｍＲＮＡ発現レベルまたは試料中のマーカーの測定可能なレベルを意味し、これは、限定されずにノーザンブロット、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ、「ｑＲＴ−ＰＣＲ」、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＴＲＥｅｘ（ｍｉＳＥＱ）、ナノストリング分析等によって測定することができる。本明細書で使用されるように、用語「約」または「概ね」は、測定の値および方法のタイプのために許容できる誤差範囲内にあることを通常意味する。例えば、それは、所与の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、なお最も好ましくは５％以内にあることを意味することができる。あるいは、特に生物系では、用語「約」は、所与の値のｌｏｇ（すなわち、１桁）の範囲内、好ましくは２の係数の範囲内にあることを意味する。
【００１８】
用語「減少」、「減少した」、「低減した」、「低減」または「下方制御された」は、全て、統計的に有意な量の減少を一般的に意味するために本明細書で使用される。しかし、誤解を避けるため、「低減した」、「低減」、「下方制御された」、「減少した」または「減少」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の減少、または１００％を含めそれまでの減少（すなわち、参照試料と比較して皆無のレベル）、または１０〜１００％の間の任意の減少、または、参照レベルと比較して、少なくとも約０．５倍、または少なくとも約１．０倍、または少なくとも約１．２倍、または少なくとも約１．５倍、または少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍の減少、または１．０倍から１０倍以上の間の任意の減少を意味する。
【００１９】
用語「増加した」、「増加」または「上方制御された」は、全て、統計的に有意な量の増加を一般的に意味するために本明細書で使用される。いかなる誤解も避けるために、用語「増加した」または「増加」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の増加、または１００％を含むそれまでの増加、または１０〜１００％の間の任意の増加、または、参照レベルと比較して、少なくとも約０．５倍、または少なくとも約１．０倍、または少なくとも約１．２倍、または、少なくとも約１．５倍、または少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍の増加、または１．０倍から１０倍以上の間の任意の増加を意味する。
【００２０】
本明細書で使用されるように、例えば「遺伝子の発現レベルを測定する」におけるように、「発現のレベルを測定する」、「発現レベルを測定する」または「発現レベルを検出する」は、試料中に存在するｍＲＮＡの量を定量化することを指す。特異的ｍＲＮＡの発現を検出することは、本明細書に記載されるように、当技術分野で公知の任意の方法を使用して達成することができる。一般的に、ｍＲＮＡ検出方法は、例えばＲＴ−ＰＣＲによる配列特異的検出を含む。ｍＲＮＡ特異的プライマーおよびプローブは、当技術分野で公知である核酸配列を使用して設計することができる。
【００２１】
本明細書で使用されるように、参照レベルまたは対照レベルと比較したｍＲＮＡの発現の「変化した」レベルは、ｍＲＮＡの発現の少なくとも０．５倍（例えば、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００または１０，０００倍）変化したレベルである。変化は、増加または減少であってよいことが理解される。あるいは、変化した発現レベルは、トレーニング患者群から確立されたロジスティック回帰モデルのパラメータを使用した、リスク確率スコアの増加であると規定され、確率スコアはトレーニングセットから導かれるカットオフと比較される。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「併用療法」は、ある特定の組成物または薬物による処置を必要とする対象の処置を意味し、ここで、対象は、第１のものと一緒におよび／または１つまたは複数の他の療法、例えば、免疫抑制療法もしくは他の抗拒絶療法と一緒に、疾患のための１つまたは複数の他の組成物もしくは薬物で処置されるかまたは与えられる。そのような併用療法は、患者が先ず１つの処置モダリティー（例えば、薬物または療法）で処置され、次に他のもの（例えば、薬物または療法）で処置される、などの連続した療法であってもよく、または、全ての薬物および／または療法は同時に投与されてもよい。いずれの場合も、これらの薬物および／または療法は、「同時投与される」と言われる。「同時投与される」は、薬物および／または療法が組み合わせた形態で投与されることを必ずしも意味するとは限らないことを理解すべきである（すなわち、それらは、同じかまたは異なる時間に同じかまたは異なる部位に別々に、または一緒に投与されてもよい）。
【００２３】
本明細書で使用されるように、用語「薬学的に許容される誘導体」は、レシピエントへの投与の後に、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残留物を提供する（直接または間接的に）ことが可能である、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグ、例えば、エステルを意味する。そのような誘導体は、過度の実験無しで当業者が認識できる。それにもかかわらず、Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th Edition, Vol. 1: Principles and Practiceの教示が参照され、それは、そのような誘導体を教示する範囲で、参照により本明細書に組み込まれる。薬学的に許容される誘導体には、塩、溶媒和物、エステル、カルバミン酸および／またはリン酸エステルが含まれる。
【００２４】
本明細書で使用されるように、用量または量に適用される、互換的に使用される用語「治療上有効な」および「有効量」は、それを必要とする対象への投与の後に所望の活性をもたらすのに十分である、組成物、化合物または医薬製剤の量を指す。本発明の文脈内で、用語「治療上有効な」は、有効成分の組合せが投与されるとき、本明細書で指定される疾患または状態の少なくとも１つの症状、例えば、急性拒絶反応および／または同種異系移植拒絶反応を低減または排除するのに十分である、組成物、化合物または医薬製剤の量を指し、組合せの有効量は、個々に投与された場合でも有効であったと予想される各成分の量を含むことも、含まないこともできる。治療製剤の投薬量は、疾患または状態の性質、患者の病歴、投与の頻度、投与の様式、宿主からの薬剤のクリアランスなどによって異なる。最初の用量はより大きくてよく、より小さい維持用量がそれに続く。有効薬量レベルを維持するために、用量は、例えば、毎週、隔週、毎日、週２回等、投与することができる。
【００２５】
「対照」は、同種異系移植を受けた、急性拒絶反応を患っていない患者から得られた試料と規定される。
【００２６】
「導入療法」は、移植の前、または好ましくは当日に始まる急性拒絶反応の高いリスクがある患者への、免疫抑制剤の投与と本明細書で規定される。薬剤は、下記のようにリンパ球枯渇剤またはインターロイキン２受容体アンタゴニスト（ＩＬ２−ＲＡ）のいずれかの生物剤である。導入療法の目的は、移植時に急性拒絶反応の高いリスクがある患者においてＴ細胞応答を減少またはモジュレートし、急性拒絶反応のリスクを低減することである。
【００２７】
本明細書で使用されるように、早期の急性拒絶反応（ＥＡＲ）は、移植の６カ月後より前に起こる拒絶反応と規定される。
【００２８】
本発明に従って、腎臓移植のために評価される患者は、彼らの移植前評価の一環として実行される、本発明のアッセイを受ける。末梢血が採取され、ｍＲＮＡが抽出され、標的化増幅およびシークエンシングライブラリー生成のための試薬およびプライマーを使用して、ＴＲｅｘ（ｍｉＳＥＱ）が実行される。このアッセイは、特異的な２３個の遺伝子およびハウスキーピング遺伝子のパネルの標的化シークエンシングを実行する。２３個の遺伝子のために発現レベルが測定され、移植後の急性拒絶反応のリスクがある患者のためにリスクアセスメントスコアを測定するために、リスクアルゴリズムが適用される。患者のスコアが３２を超える場合、患者はリスクが高いと分類され、その場合、患者は、高リスク患者のために用いられるのと同じ方法で、例えば、カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）などの免疫抑制薬のより緩慢な漸減、ステロイド中止の回避、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス／テムシロリムスまたはエベロリムス）またはベラタセプトの回避で管理される、導入療法および維持免疫抑制を受ける。スコアが−２３未満である場合、患者はＡＲのリスクが低いとみなされ、その場合、患者は導入療法を必要としないと予想され、または彼らはステロイド中止、ｍＴＯＲ阻害剤もしくはベラタセプトのための候補である可能性もある。正確なカットオフはＴＲｅｘ（ｍｉＳＥＱ）アッセイに基づき、他の技術、例えばナノストリングおよびｑＰＣＲに基づいて変動する。注目すべきは、患者のために免疫抑制プロトコールを計画するとき、アッセイは、候補を高リスクであると前に規定する他の臨床因子、例えば、ＨＬＡ対応、および抗ＨＬＡ抗体の存在との関係で行われるべきである。
【００２９】
本発明は、移植前に腎臓同種異系移植レシピエントによって発現される、移植後の急性拒絶反応のリスクを決定する遺伝子発現プロファイルの同定に基づく。遺伝子発現プロファイルは、移植後の無症状のならびに臨床的な急性拒絶反応を予測する。このことは、移植時に免疫抑制レジメンへのアプローチをパーソナライズする能力を臨床医に与え、それによって、リスクが高い者における免疫抑制を最大にし、リスクの低い者における免疫抑制を減らす。具体的には、例えば、サイログロブリン／抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）または抗ＩＬ−２ＲブロッカーまたはＣａｍｐａｔｈ−１Ｈ（アレムツズマブまたはＴリンパ球の表面に存在する抗原に対して誘導される抗ＣＤ５２モノクローナル抗体）を使用した導入療法は、急性拒絶反応のリスクが高い患者に実施され、急性拒絶反応のリスクが低い患者で回避される。導入療法は、移植当日に開始される。維持免疫抑制のために、より低いリスクの個体は、他の免疫学的因子によって、より弱い免疫抑制薬、例えばラパマイシンまたはベラタセプトで処置することができる。これらは当業者によってより強力でないと認識されているが、その理由は、それらが高率の急性拒絶反応に関連付けられているからである。「より強力な」免疫抑制剤には、ＣＮＩ、例えばタクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）およびＡｄｖａｇｒａｆ（登録商標）／Ａｓｔａｇｒａｆ  ＸＬ（Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．）、およびＰｒｏｇｒａｆ（登録商標）の非専売薬、ならびにシクロスポリン（Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）およびＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ）および非専売薬が含まれる。
【００３０】
さらに、ドナー／レシピエントの組合せに関する決定は、他の制御可能な免疫学的因子を最小にするように導くことができる。例えば、レシピエントがドナーＨＬＡに対して誘導される抗体を有するドナー／レシピエントの組合せに基づいて、移植は回避されるかもしれない。この実施形態では、患者が脱感作、すなわち、ドナー特異的抗体の血漿交換法および静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）投与を必要とした場合、移植を回避することができる。しかし、これは、生きているドナー同種異系移植に大部分適用されると予想される。この実施形態では、ドナー／レシピエントのミスマッチを回避することは、かなりの費用節約をもたらすことができる。
【００３１】
さらに、遺伝子発現プロファイルが急性拒絶反応のリスクがある個体を同定する場合、無症状の急性拒絶反応の診断のために、臨床検査結果または遺伝子発現プロファイルのより集中的なモニタリングを患者に受けさせることができる。
【００３２】
本発明は、移植前に急性拒絶反応および移植喪失のリスクがある腎臓同種異系移植レシピエントを同定する方法であって、移植前に腎臓同種異系移植レシピエントからの血液検体を用意するステップと、血液検体からｍＲＮＡを単離するステップと、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するステップと、血液検体に存在する２３メンバーの遺伝子シグネチャーセットの発現レベルを測定するステップと、を含む方法を提供する。発現レベルを測定する方法の非限定的な例には、ＲＮＡ−ｓｅｑ、標的化ＲＮＡ発現（ＴＲＥｘ）シークエンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ナノストリング（ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ｍＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ−Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）またはｑＰＣＲが含まれる。遺伝子シグネチャーセット分析の結果は、対照と比較される。対照と比較した患者の発現レベルの変化がより大きいほど、急性拒絶反応のリスクはより大きい。これらの方法は、下の実施例１〜６に記載される。
【００３３】
２３個の予め選択された遺伝子を含む遺伝子シグネチャーセットを使用した、末梢血シグネチャーが同定された。これらの予め選択された遺伝子シグネチャーセットは、移植片拒絶反応移植手術の前に急性拒絶反応および以降の移植片拒絶反応のリスクがある腎臓同種異系移植レシピエントを正確に同定するために使用することができる。
【００３４】
本明細書に開示される方法の実施で使用するための２３メンバーの遺伝子シグネチャーセットは、以下の遺伝子を含む：ＧＺＭＨ、ＡＤＧＲＧ１、Ｓ１ＰＲ５、ＦＧＦＢＰ２、ＮＫＧ７、ＰＲＦ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＬＡＧ３、ＴＡＲＰ、ＦＣＲＬ６、ＦＡＳＬＧ、ＴＢＸ２１、ＴＯＸ、ＺＮＦ８３１、ＣＤ８Ａ、Ｃ１ｏｒｆ２１、ＣＣＲ５、ＬＤＯＣ１Ｌ、ＣＣＤＣ１０２Ａ、ＨＯＰＸ、ＰＲＫＣＨ、ＳＬＣ２５Ａ３４およびＦ１２。
【００３５】
これに関連して、同種異系移植レシピエントが急性拒絶反応のリスクが低いが、彼らが５つまたは６つのＨＬＡミスマッチを有する場合、彼らは急性拒絶反応のリスクが高くなることが見出されている。ＨＬＡタイピングは、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡ−Ｓｅｑによって実行することができる。（参照：Methods. 2012 Apr; 56(4):471-6. doi: 10.1016/j.ymeth.2012.03.025. Epub 2012 Mar 28. HLA techniques: typing and antibody detection in the laboratory of immunogenetics. Bontadini A.）。
【００３６】
本明細書に開示される方法の一部では、試料中に存在するｍＲＮＡを検出し、定量化することが望ましい。ＲＮＡ発現の検出および定量化は、当技術分野で周知であるいくつかの方法のいずれか１つによって達成することができる。ＲＮＡファミリーメンバーの公知の配列を使用して、適宜下に記載される検出方法で使用するために、特異的プローブおよびプライマーを設計することができる。ナノストリング、ＲＮＡｓｅｑまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または標的化ＲＮＡシークエンシング（ＴＲＥｘ）のいずれか１つを、本明細書に開示される方法で使用することができる。一部の場合には、ＲＮＡ発現の検出および定量化は、細胞または組織などの試料からの核酸の単離を必要とする。ＲＮＡおよび具体的にはｍＲＮＡを含む核酸は、当技術分野で公知の任意の好適な技術を使用して単離することができる。例えば、フェノールベースの抽出は、ＲＮＡの単離のための一般的な方法である。フェノールベースの試薬は、細胞および組織破壊ならびに混入物からのＲＮＡの以降の分離のための変性剤およびＲＮＡａｓｅ阻害剤の組合せを含有する。さらに、ＴＲＩＺＯＬ（商標）またはＴＲＩ  ＥＡＧＥＮＴ（商標）を使用するものなどの抽出手順は、大小の全てのＲＮＡを精製し、ｍＲＮＡを含有する生体試料から全ＲＮＡを単離するための効率的な方法である。ＱＩＡＧＥＮ−ＡＬＬプレップキットを使用したものなどの抽出手順も、企図される。
【００３７】
一部の実施形態では、定量的ＲＴ−ＰＣＲの使用が望ましい。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、核酸の量を迅速に測定するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応方法の改変形である。ｑＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子配列が試料中に存在するかどうか、およびそれが存在する場合、試料中のコピー数を測定するために一般的に使用される。ｍＲＮＡを含む核酸分子の発現を測定することができるＰＣＲの任意の方法が、本発明の範囲内に含まれる。当業者に周知であるｑＲＴ−ＰＣＲ方法にはいくつかの種類がある。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ発現プロファイルは、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して測定することができる。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）分析システムは、数百のｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはＤＮＡ標的を高い感度および精度で同時にプロファイリングする。標的分子は、デジタル的に検出される。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析システムは、単一の反応における数百の特異転写物を検出し、数えるために、分子「バーコード」および単一分子画像化を使用する。プロトコールは、いかなる増幅ステップも含まない。これは、ｍＲＮＡの発現レベルの迅速検出のための好ましい方法である。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、腎臓同種異系移植を受ける患者が同種異系移植の急性拒絶反応のリスクがあるかどうか判定するためのキットであって、１つまたは複数の容器の中に、２３遺伝子シグネチャーセットについてのプライマー対、陽性対照および陰性対照、緩衝液および印刷された使用説明書を含むキットを提供する。キットは、ハウスキーピング遺伝子についてのアッセイおよびプライマーの品質を試験するための、ハウスキーピング遺伝子パネルを含有することもできる。ハウスキーピング遺伝子パネルは、下の実施例６に記載される。
【００３９】
一般的な実施形態では、臨床検査室は、患者の血液試料を使用して発現値を得、患者の医師にそれを提供する。医師は次に、彼のウェブベースのサービスプロバイダに、この値を伝達する。サービスプロバイダは、予め選択された遺伝子シグネチャーセットの各遺伝子のＥＡＲおよび非ＥＡＲ群のｐ値加重パラメータおよび中間発現値、ならびに、トレーニングセットから規定される三分位カットオフを既に有するバイオインフォマティクスシステムにその値を入力する。バイオインフォマティクスシステムは、患者のリスクスコアを計算するためにこの情報を使用する。計算されたリスクスコアは、患者のＡＲ状態を反映する。
【００４０】
代替の実施形態では、アッセイは一検査室で主に実行され、結果は医師に直接、すなわち、ウェブベースの適用無しで提供される。
【００４１】
ＡＲのリスクの予測における遺伝子シグネチャーセットの使用の非限定的な例は、２３遺伝子シグネチャーセットを使用して下に記載される。
１）トレーニング群を選択する：既知の早期急性拒絶反応（ＥＡＲ、移植の６カ月後より前に１以上の炎症／尿細管炎スコア）を有する一群の腎臓移植患者、および非ＥＡＲ対照（移植の６カ月後の前に０の炎症／尿細管炎スコアを有する、診断は病状に基づく；総数Ｎ＝約１００）が注意深く選択される。トレーニング群は、良く特徴付けられた人口統計、臨床データ、および少なくとも２人の病理学者によって審査される病理学的結果を有する。トレーニングセットの遺伝子発現レベルは、各遺伝子のリスクスコア計算のためにＥＡＲまたは非ＥＡＲ群におけるｐ値および中間発現値を導くために使用される。
２）遺伝子の発現を測定する：トレーニング群における各患者の移植前血液試料からの２３個の遺伝子の発現レベルが、いくつかの周知の技術のいずれか１つを使用して、好ましくはＴＲＥｘ、ＲＴ−ＰＣＲまたはナノストリング技術を使用して測定される。ＴＲＥｘ、ナノストリングまたはｑＰＣＲ技術の使用は、下の実施例２、３および４に記載される。発現レベルは、適用される技術によって異なって表される。ＴＲＥｘは、遺伝子にマッピングされる配列読み取りデータの数を使用する。ｑＰＣＲは、ＣＴ（サイクル時間）値を使用し、ナノストリングは転写物の数を使用する。
３）累積リスクスコアおよびカットオフを確立する：上記のトレーニングセットにおける各遺伝子のＥＡＲおよび非ＥＡＲ群の間の発現値の差のｐ値を計算するために、示差的発現分析が実行され、加重累積スコアが各患者のために測定される。リスクアセスメントのために用いられる式は、ｒ＝−（ｌｏｇ１０（ｐ１）＊ｇ１＋ｌｏｇ１０（ｐ２）＊ｇ２＋・・・＋ｌｏｇ１０（ｐｉ）＊ｇｉ＋・・・＋ｌｏｇ１０（ｐ２３）＊ｇ２３）であり、ここで、ｐｉは、トレーニングセットにおけるＥＡＲ対非ＥＡＲ群の間の遺伝子ｉ（ｉ＝１・・・２３）の発現値についてのｔ検定の有意性ｐ値であり、ｇｉは、遺伝子ｉ（ｉ＝１・・・２３）の論理数であり、１（遺伝子ｉの発現値が、上方制御された遺伝子のトレーニングセットのＥＡＲ群の中間発現値より大きい場合、または、遺伝子ｉの発現値が、下方制御された遺伝子のトレーニングセットのＥＡＲ群の中間発現値より小さい場合）、または、−１（遺伝子ｉの発現値が、上方制御された遺伝子のトレーニングセットの非ＥＡＲ群の中間値より小さい場合、または遺伝子ｉの発現値が、下方制御された遺伝子のトレーニングセットの非ＥＡＲ群の中間値より大きい場合）、または、０（遺伝子ｉの発現値が、トレーニングセットのＥＡＲ群の中間値と非ＥＡＲ群の中間値の間である場合）である。
【００４２】
リスクスコアに基づいて、様々な閾値設定における真の陽性率対偽陽性率のＲＯＣ（レシーバー動作特性）曲線の予測ＡＵＣ（曲線下面積）などの、予測統計量が得られる。ＲＯＣ分析は、カットオフまたは最適なモデルを決定するために、ならびに、曲線下面積、感度／特異性、正の予測値（ＰＰＶ）および負の予測値（ＮＰＶ）の計算によって全体的予測精度を測定するために使用することができる。所与の特異性（９０％）では、急性拒絶反応の存在を最も良く検出するリスクスコアカットオフが確立される。患者が上位群にいる場合、彼らは急性拒絶反応を有する可能性が高く、検査は陽性であると判定されるが、彼らが下位群にいる場合、彼らは急性拒絶反応を有する可能性が非常に低く、検査は陰性であると判定されるという点で、２つの群の間の明確なカットオフがあると予想される。
【００４３】
あるいは、上で測定される彼らの確率スコアに基づいて患者は三分位値に分割される。この場合、患者が（１）上位三分位にあるならば、彼らは急性拒絶反応を有する可能性が高く、検査は陽性であると判定され；（２）第２の三分位または中間群にあるならば、彼らのリスクは正確に判定することができず；（３）下位三分位にあるならば、彼らは急性拒絶反応を有する可能性が非常に低く（したがって、移植が成功する優れた候補である）、検査は陰性であると判定される。
【００４４】
各遺伝子についてのＥＡＲおよび非ＥＡＲ群のｐ値、中間発現値、ならびにトレーニング群から導かれるリスクスコアカットオフは、ウェブベースのバイオインフォマティクスコンピューターシステムに入力および保存され、それらは、インターネットを通して臨床検査室および／または医師診療室からアクセスすることができる。
【００４５】
４）診断：診断が未知の新規患者のための遺伝子シグネチャーセットの発現レベルは、臨床検査室におけるトレーニングセットに使用されるのと同じ技術によって測定される。ウェブベースのバイオインフォマティクスシステムを使用して、リスクスコアは、２３個の遺伝子のＥＡＲ群の中間値および非ＥＡＲ群の中間値にトレーニングセットから導かれるｌｏｇ  ｐ値を掛けたものと比較して、発現論理値（１、０または−１）を要約することによって計算される。ＡＲ状態を判定するために、リスクスコアはカットオフと比較される。患者におけるリスクスコアの、対照におけるリスクスコアと比較した増加は、患者が急性拒絶反応のリスクが増加したことを示す。臨床検査室は、検査結果を医師に提供する。
【００４６】
発現レベルおよび／または参照発現レベルは好適なデータ記憶媒体（例えば、データベース）に保存することができ、したがって、将来の診断でも利用可能である。対応する参照試料が得られた対象が急性拒絶反応に直面することが（将来）確認されたならば、好適な参照結果をデータベースで同定することができるので、これは、疾患の発生率を効率的に診断することも可能にする。
【００４７】
本明細書で使用されるように、「データベース」は、好適な記憶媒体の上に収集されるデータ（例えば、分析物および／または参照レベルの情報および／または患者情報）を含む。さらに、データベースは、データベース管理システムをさらに含むことができる。このデータベース管理システムは、好ましくは、ネットワークベースの階層的またはオブジェクト指向データベース管理システムである。より好ましくは、データベースは、分散型（連邦）システムとして、例えばクライアントサーバーシステムとして実行される。より好ましくは、データベースは、検索アルゴリズムが検査データセットをデータ集に含まれるデータセットと比較することを可能にするように構造化される。具体的には、そのようなアルゴリズムを使用して、腎臓同種異系移植拒絶反応のリスクを示す、類似しているかまたは同一のデータセットについてデータベースを検索することができる。したがって、同一であるかまたは類似しているデータセットをデータ集の中で同定することができる場合、検査データセットは腎臓同種異系移植拒絶反応リスクと関連付けられる。その結果として、データ集から得られる情報は、同種異系移植レシピエントの同種異系移植喪失のリスクを診断するために使用することができるか、または対象から得られる検査データセットに基づくことができる。より好ましくは、データ集は、上に列挙される群のいずれか１つに含まれる全ての分析物の特性値を含む。
【００４８】
本発明は、例えば、技術者、医師または患者へのアッセイ結果または診断または両方の伝達をさらに提供する。ある特定の実施形態では、利害関係者、例えば、医師および彼らの患者にアッセイ結果または診断または両方を伝達するために、コンピューターが使用される。
【００４９】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、進行中の急性拒絶反応および／または同種異系移植喪失のリスクがあるレシピエントを同定するために、レシピエントの臨床記録を改変することをさらに含む。臨床記録は、任意の好適なデータ記憶媒体（例えば、コンピューター可読媒体）に保存することができる。
【００５０】
本発明の一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に基づく診断は、診断が得られてからできるだけ早く同種異系移植レシピエントに伝達される。診断は、レシピエントの治療にあたる医師によってレシピエントに伝達されてもよい。あるいは、診断は、電子メールでレシピエントに送られてもよく、または電話で対象に伝達されてもよい。診断は、報告書の形でレシピエントに送られてもよい。電子メールまたは電話で診断を伝達するために、コンピューターを使用することができる。ある特定の実施形態では、診断検査の結果を含むメッセージを作成して、テレコミュニケーションの熟練者になじみがあるコンピューターハードウェアおよびソフトウェアの組合せを使用してレシピエントに自動的に送達することができる。
【００５１】
本発明の態様は、腎臓同種異系移植を受けておらず、急性拒絶反応のリスクがある対象を同定するためのコンピュータープログラム製品を含み、ここで、コンピュータープログラム製品は、コンピューターにロードされるとき、腎臓同種異系移植を受ける対象が急性拒絶反応のリスクがあるかどうか判定するために、対象に由来する試料からの遺伝子発現結果を用いるように構成され、ここで、遺伝子発現結果は少なくとも１つの遺伝子シグネチャーセットについての発現データを含む。
【００５２】
以下の１つである表現型についての参照発現プロファイルも提供される：（ａ）急性拒絶反応のリスクが低い；または（ｂ）急性拒絶反応のリスクが高い。ここで、発現プロファイルは、ユーザーによってアクセス可能である、例えば、ユーザー可読フォーマットのコンピューター可読媒体の上に記録される。ある特定の実施形態では、発現プロファイルは、低リスクである表現型についてのプロファイルである。ある特定の実施形態では、発現プロファイルは、高リスクである表現型についてのプロファイルである。
【００５３】
発現プロファイルおよびそのデータベースは、それらの使用を容易にするために様々な媒体で提供することができる。「媒体」は、本発明の発現プロファイル情報を含有する製造品を指す。本発明のデータベースは、コンピューター可読媒体、例えば、コンピューターを用いるユーザーが読み出し、直接アクセスすることができる任意の媒体の上に記録することができる。そのような媒体には、限定されずに、以下のものが含まれる：磁気記憶媒体、例えばフロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープ；ＣＤ−ＲＯＭなどの光学式記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭなどの電気記憶媒体；ならびに、磁気／光学式記憶媒体などのこれらのカテゴリーの組み合わせ。当業者は、現在のデータベース情報の記録を含む製造品を作製するために、現在公知のコンピューター可読媒体のいずれかをどのように使用することができるかを容易に理解することができる。
【００５４】
「記録された」は、当技術分野で公知のそのような方法を使用して、コンピューター可読媒体の上に情報を保存するプロセスを指す。保存された情報にアクセスするために使用される手段に基づいて、任意の便利なデータ記憶構造を選択することができる。保存のために、様々なデータ処理装置プログラムおよびフォーマット、例えばワードプロセシングテキストファイル、データベースフォーマット等を使用することができる。したがって、対象発現プロファイルデータベースは、ユーザーにアクセス可能である、すなわち、データベースファイルはユーザー可読フォーマット（例えば、ユーザーがコンピューターを制御するコンピューター可読フォーマット）で保存される。
【００５５】
本明細書で使用されるように、「コンピューターベースのシステム」は、本発明の情報を分析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段を指す。本発明のコンピューターベースのシステムの最小限のハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段およびデータ記憶手段を含む。今日利用できるコンピューターベースのシステムのいずれか１つが本発明で使用するのに好適であることを、当業者は容易に理解することができる。データ記憶手段は、上記の本情報の記録を含む任意の製造品、またはそのような製造品にアクセスすることができるメモリアクセス手段を含むことができる。
【００５６】
キット
ある特定の実施形態では、腎臓同種異系移植レシピエントの急性拒絶反応および同種異系移植喪失のリスクを判定するためのキットが提供される。
【００５７】
キットは、２３メンバー遺伝子シグネチャーセットについてのプライマー、ＴＲＥｘおよびナノストリングアッセイのためのハウスキーピング遺伝子パネル（実施例６）、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）およびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を含むｑＰＣＲアッセイのためのハウスキーピング遺伝子についてのプライマー、ならびに対照プローブ、１８ＳリボソームＲＮＡを含む。
【００５８】
キットは、１つまたは複数のｍＲＮＡ抽出試薬および／またはｃＤＮＡ合成のための試薬をさらに含むことができる。他の実施形態では、キットは、生物剤が置かれ、好ましくは適切に小分けされる、１つまたは複数の容器を含むことができる。キットは、キット材料の使用のための印刷された説明書を含むこともできる。
【００５９】
キットの構成成分は、水性媒体に、または凍結乾燥形態でパッケージすることができる。キットは、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤および／または担体を含むこともできる。薬学的に許容される賦形剤、希釈剤および／または担体の非限定的な例には、ＲＮＡａｓｅを含有しない水、蒸留水、緩衝水、生理的食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液、デキストロース溶液、反応緩衝液、標識化緩衝液、洗浄緩衝液およびハイブリダイゼーション緩衝液が含まれる。
【００６０】
本発明のキットは、様々な形態をとることができる。一般的に、キットは、試料中の遺伝子セットの発現レベル（例えば、本明細書に開示されるもの）を測定するのに適する試薬を含む。必要に応じて、キットは、１つまたは複数の対照試料を含有することができる。さらに、キットは、一部の場合には、参照（例えば、所定値）を提供する書面による情報（徴候）を含み、ここで、対象における遺伝子発現レベルと参照（所定値）の間の比較は、臨床状態を示す。
【００６１】
結論として、ベースライン時の全血におけるその発現が、腎臓移植レシピエントにおける早期および後期のＡＲならびに移植片喪失を、ベースラインの人口統計学／臨床特徴よりも正確に予測することができる、２３遺伝子セットが同定された。２つの独立したコホートで検証されたこのセットは、移植患者の大半（６０〜７０％）である、ドナーとの≦４のＨＬＡミスマッチの患者におけるこれらの事象の予測において特に正確であった。したがって、遺伝子セットは急性拒絶反応のリスクを最適に予測し、医師、腹側の人々が、移植時に患者を層別化し、それに応じて免疫抑制を手直しすることを可能にする。
【００６２】
本発明は、その範囲を制限すること無しに本発明をさらに記載するものである下の実施例において、さらに記載される。
【実施例】
【００６３】
[実施例１]
ＲＮＡシークエンシングアッセイ：２３遺伝子セットの同定およびＡＣＲを予測するためのその適用
ＲＮＡシークエンシングアッセイキットは以下を含む：
１）Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ｍＲＮＡライブラリープレップキット
２）ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ単一インデックスセット
３）高品質全ＲＮＡの抽出のためのＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット
【００６４】
ＲＮＡシークエンシングおよびデータ処理のための方法：
ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを使用して、移植前（ベースライン）に腎臓移植レシピエントから採取された全血から全ＲＮＡを抽出し、ＴｒｕＳｅｑ  ｍＲＮＡライブラリープレップキットでライブラリーを作出し、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ単一インデックスでさらに多重化した。インデックス付きのライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ４０００シーケンサーで配列決定をした。優れた品質の読み取りデータは、先ず、ｈｇ１９ヒトゲノム、エクソン、スプライシング接合部セグメントを含むヒト参照データベース、ならびに、周知のＢＷＡアラインメントアルゴリズムを使用してリボソームおよびミトコンドリア配列を含む汚染データベースと整列させた。汚染データベースにマッピングされた読み取りデータのフィルタリングの後、各転写物について最大２つのミスマッチでエクソンおよびスプライシング接合部セグメントと特異的に整列した読み取りデータは次に、各対応する転写物の発現レベルとして数えた。試料全体での転写レベルを比較するために、読み取りカウントをｌｏｇ２変換し、等しい全体的中間値で正規化した。
【００６５】
結果
ａ）患者コホート記載：この研究は、ＲＮＡシークエンシングを受けた優れた品質のベースライン血液ＲＮＡを有する合計２３５人の患者を含んだ。それらのうち、１５５人は、移植の前後に連続的に採取された調査生検に関する利用可能な情報を有し、８０人は移植の６カ月後から２４カ月後の間に採取された調査生検に関する情報だけを有した。早期調査生検の１５５人の患者のうち８１人が、早期の急性拒絶反応（ＥＡＲ）を予測するための遺伝子シグネチャーセットを同定するための発見セットとして使用するために、ランダムに選択された。患者は、移植の６カ月後より前に得た腎生検からの炎症または尿細管炎スコア（１以上）に基づいて診断された。良く特徴付けられたＥＡＲおよび非ＥＡＲ診断を有する発見セットは、遺伝子セットを同定し、リスクスコアの計算のためにＥＡＲおよび非ＥＡＲ群のｐ値および中間発現値を導くために使用された。残りの７４人の患者は、第１の検証コホート（Ｖ１）として使用した。後期の調査生検を有する８０人の患者は、第２の検証コホート（Ｖ２）として使用した。
（ｂ）２３遺伝子セットの同定：ＲＮＡシークエンシングは、８１人の患者の発見セットで実行された。一連の読み取りデータ品質制御の後、マッピングおよび正規化ステップを配列読み取り生データ（４）で実行した。得られた正規化読み取りカウントは、遺伝子の発現値として使用した。発見セット（Ｎ＝８１）におけるＥＡＲおよび非ＥＡＲ群についての発現値は、周知のＬＩＭＭＡ（５）検査によって比較した。６８８個の上方制御された、および６５３個の下方制御された示差的発現遺伝子（ＤＥＧ）が同定された。ＥＡＲ群の中間値または非ＥＡＲ群の中間値への遺伝子発現の比較に基づくリスクスコアを使用して、最良の予測値を有する２３遺伝子セットが、発見セットにおける１００反復ステップによりＤＥＧから同定された（Ｎ＝８１、ＡＵＣ＝０．８０）。リスクスコアｒのために用いられた式は、上に記載されている。
（ｃ）予測精度を推定する：遺伝子リスクスコアについての２つの三分位カットオフ（３２または−２３）が規定され、発見セットにおけるＥＡＲの予測のための正の予測値（ＰＰＶ）＞０．７０および負の予測値（ＮＰＶ）＞０．８８を実証した。
（ｄ）早期および後期の急性拒絶反応または移植片喪失の予測のための２つの検証セットへの２３遺伝子セットの適用：２３遺伝子セットによる早期の急性拒絶反応の予測は、発見セットから規定される三分位カットオフ（３２および−２３）で、Ｖ１データセット（Ｎ＝７４、ＡＵＣ＝０．７４、ＰＰＶ＝０．７０、ＮＰＶ＝０．８８）を使用して検証され、同種異系移植レシピエントにおいて４未満のＨＬＡミスマッチによってより優れた性能を発揮した（ＡＵＣ＝０．８９、ＰＰＶ＝０．７５およびＮＰＶ＝１）。遺伝子セットから導かれるリスクスコアは、２つの検証セットにおいて（Ｎ＝１５４（Ｖ１＋Ｖ２）、急性拒絶反応ではＰ＝０．０４１および移植片喪失ではＰ＝０．０３４）、特に≦４のＨＬＡミスマッチを有する同種異系移植のレシピエントにおいて、移植の６カ月後のＡＲ、および長期の移植片喪失と有意に関連していた（ＡＲの場合Ｐ＝０．００５および移植片喪失の場合Ｐ＝１．５７ｅ−４）。
【００６６】
全体的に、リスクスコアはいかなるときでも移植片喪失を正確に予測し（ＡＵＣ＝０．８０４〜０．９０４）、予測は、≦４のＨＬＡミスマッチを有する患者でＡＵＣ＞０．８０に到達した。移植から２年以内の移植片喪失だけを考慮したとき、≦４のＨＬＡミスマッチを有する患者のためのＡＵＣは０．９０４であり、５年前の移植片喪失のためのＡＵＣは０．８２０であった。
【００６７】
[実施例２]
所与の患者のためにリスクスコアを計算するための、累積リスクスコア式の使用
１）発見セットまたはトレーニングセットからの各遺伝子のために、ＥＡＲおよび非ＥＡＲ群のｐ値および中間値を計算する（添付した表の欄「ＥＡＲ＿Ｍｅｄ」、「非ＥＡＲ＿Ｍｅｄ」および「Ｐ値」を参照する）：
２）２３個の遺伝子についての発現データを有する患者（欄「患者」）について、論理数ｇ（欄「ｇ」）を計算する
３）各遺伝子のために、ｌｏｇ１０（ｐ）＊ｇを計算する（欄「−ｌｏｇ１０（ｐ）＊ｇ」）
４）３２のカットオフより高い６５．９４のリスクスコアを得るために、２３個の遺伝子のためにｌｏｇ１０（ｐ）＊ｇを合計する。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
[実施例３]
標的化ＲＮＡ発現（ＴＲＥｘ）アッセイ
１）カスタム仕様のアッセイキット（２３遺伝子パネルおよびハウスキーピング遺伝子パネルについてのプライマーセット（実施例６）および試薬）
２）Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＲＮＡ試料調製キットｖ２
３）ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ単一インデックスセット
４）高品質全ＲＮＡの抽出のためのＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット
【００７０】
標的化発現ＴＲＥｘ実験：
全ＲＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを使用して抽出される。シークエンシングライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＲＮＡ試料調製キットｖ２を製造業者のプロトコールに従って使用して生成される：簡潔には、ポリＡ含有ｍＲＮＡが全ＲＮＡから最初に精製され、断片化される。第１の鎖ｃＤＮＡの合成は、ランダムヘキサマープライマーおよび逆転写酵素を使用して実行され、第２の鎖ｃＤＮＡの合成が続く。オーバーハングをｃＤＮＡの平滑末端に変換する末端修復プロセスの後、複数のインデクシングアダプターが二本鎖ｃＤＮＡの末端に加えられる。遺伝子パネルおよびハウスキーピング遺伝子に特異的なプライマー対を使用して標的を富化するために、ＰＣＲが実行される。最終的に、ＭｉＳＥＱシーケンサーでのシークエンシングのために、インデックス付きのライブラリーが検証され、正規化され、プールされる。
【００７１】
ＴＲＥｘデータ処理：
ＭｉＳＥＱシーケンサーによって生成されるＲＮＡｓｅｑ生データは、以下の手順を使用して処理される：優れた品質の読み取りデータは、先ず、ｈｇ１９ヒトゲノム、エクソン、スプライシング接合部を含むいくつかのヒト参照データベース、ならびに、ＢＷＡ１アラインメントアルゴリズムを使用してリボソームおよびミトコンドリアＲＮＡ配列を含む汚染データベースと整列させられる。汚染データベースにマッピングされた読み取りデータのフィルタリングの後、最大で２つのミスマッチで所望のアンプリコン（すなわち、対のプライマーからのＰＣＲ生成物）領域と固有に整列した読み取りデータは次に、対応する遺伝子の発現レベルとして数えられ、さらに、ハウスキーピング遺伝子の発現に基づく正規化に供される。
【００７２】
[実施例４]
ナノストリングアッセイ
１）カスタム仕様のコードセット（ナノストリングによって提供される２３遺伝子パネル、ハウスキーピング遺伝子パネル（実施例６）についてのバーコード化プローブセットおよび陰性対照）。
２）ｎＣｏｕｎｔｅｒカートリッジ、ｎＣｏｕｎｔｅｒプレートパックおよびｎＣｏｕｎｔｅｒプレップパックを含むｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）マスターキット。
３）高品質全ＲＮＡの抽出のためのＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット
【００７３】
ナノストリング実験：
全ＲＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを製造業者のプロトコールに従って使用して抽出される。バーコードプローブは、マスターキットにより６５℃の溶液の中で全ＲＮＡにアニールされる。捕捉プローブは、データ収集のために固定化されるように、標的を捕捉する。ハイブリダイゼーションの後、試料はｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｐｒｅ  Ｓｔａｔｉｏｎに移され、プローブ／標的はｎＣｏｕｎｔｅｒカートリッジの上に固定化される。プローブは次に、ｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザーによって数えられる。
【００７４】
ｍＲＮＡトランスクリプトームデータ分析
ナノストリングアナライザーからの生のカウントデータは、以下の手順を使用して処理される：生のカウントデータは、ハウスキーピング遺伝子の数に先ず正規化され、陰性対照の数の中間値プラス３の標準偏差より低い数を有するｍＲＮＡが除外される。異なる試薬ロットの使用から生じるデータ変動のために、各異なる試薬ロットからの各ｍＲＮＡの数は、異なる試薬ロットでの試料の平均された数の比の係数を掛けることによって較正される。異なる実験バッチからの較正された数は、ＣｏｍＢａｔパッケージを使用してさらに調整される。
【００７５】
[実施例５]
ｑＰＣＲアッセイ
１）プライマー容器（２３遺伝子パネルおよび２つのハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨ）および対照プローブ（１８ＳリボソームＲＮＡ）を含む、２３個の遺伝子の各々について１チューブにつき１つのｑＰＣＲアッセイを有する２６個のチューブ）。アッセイは、ＬｉｆｅＴｅｃｈから得られる。
２）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルマスターミックスＩＩ：ｑＰＣＲ反応のための試薬
３）ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＡＲＲＡＹ  ９６ウェルプレート（６×２３）。
４）Ａｇｉｌｅｎｔ  ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ＱＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット：ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する最も高い効率のため、およびリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）適用のために完全に最適化されている。
【００７６】
全ＲＮＡは、ＡＬＬｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ−ＡＬＬｐｒｅｐキット、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して同種異系移植生検試料から抽出される。ｃＤＮＡは、オリゴｄＴプライマー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）とＡｆｆｉｎｉｔｙＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキットを使用して合成される。２３遺伝子シグネチャーセット、２つのハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ）および１８ＳリボソームＲＮＡのためのＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲアッセイは、ＡＢＩ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）から購入される。ｑＰＣＲ実験は、ＴＡＱＭＡＮユニバーサルミックスを使用してｃＤＮＡで実行され、ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ７９００ＨＴシステムを使用して監視され、取得される。試料は、３反復で測定される。遺伝子セットならびに２つのハウスキーピング遺伝子の予測のためのサイクル時間（ＣＴ）値が生成される。各遺伝子のΔＣＴ値は、各遺伝子のＣＴ値からハウスキーピング遺伝子の平均ＣＴ値を引き算することによって計算される。
【００７７】
[実施例６]
本発明で使用するためのハウスキーピング遺伝子パネル
本発明のアッセイにおける品質をモニタリングするために遺伝子パネルとして使用することができる、１３個のハウスキーピング遺伝子候補が下に提示される。反応の品質をモニタリングするために、１パネルにつき１０個の遺伝子が使用される。キットは、ハウスキーピング遺伝子についてのプライマーも含有する。１０個のハウスキーピング遺伝子は、ＣＨＴＯＰ、ＹＫＴ６、ＲＥＲ１、ＰＩ４ＫＢ、ＺＤＨＨＣ５、ＴＭＥＭ２４８、Ｃ６ｏｒｆ８９、ＳＭＵ１、ＳＨＣ１、ＤＬＳＴ、ＵＢＥ２Ｑ１、ＦＢＸＯ１８およびＳＬＣ３５Ｅ１からなる群から選択される。
【００７８】
参考文献：
【００７９】
【表２】
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【００８０】
本発明のいくつかの実施形態が記載された。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変を加えることができることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の請求項の範囲内にある。
【００８１】
全ての値は近似値であり、説明のために提供されることをさらに理解すべきである。特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコールが本出願全体で引用され、その開示は全ての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【国際調査報告】
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