(57)【要約】本開示は、試験試料中のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在を決定するために有用なオリゴヌクレオチドに関する。本開示のオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および増幅プライマーに組み込まれ、それらの様々な組み合わせにおいて使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、
配列番号２またはその補体からなり、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号２の塩基６と７との間に位置する非ヌクレオチドリンカーを有する、塩基の標的ハイブリダイズ配列と、
前記非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識と、を含む、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
前記塩基の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２の塩基配列からなり、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
前記塩基の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２の塩基配列からなる、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
前記検出可能な標識が、化学発光標識を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
前記化学発光標識が、アクリジニウムエステルを含む、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、それにハイブリダイズされる場合Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの核酸を検出しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、２２個以下のヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、１８個以下のヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブであって、
配列番号３の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号３の塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する、塩基の標的ハイブリダイズ配列を含むオリゴヌクレオチドと、
前記非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識と、を含む、ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１０】
前記塩基の標的ハイブリダイズ配列が、最大２２個の塩基の長さであり、配列番号１の配列またはその補体内に完全に含有され、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、請求項９に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１１】
前記塩基の標的ハイブリダイズ配列が、塩基位置６と７との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２、塩基位置１０と１１との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号１、塩基位置６と７との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号３、および塩基位置５と６との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号４からなる群から選択される、請求項９または請求項１０のいずれかに記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１２】
前記検出可能な標識が、化学発光標識を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１３】
前記化学発光標識が、アクリジニウムエステルを含む、請求項１２に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１４】
前記塩基の標的ハイブリダイズ配列が、塩基位置６と７との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが、２２個以下のヌクレオチドを含む、請求項９〜１４に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが、１８個以下のヌクレオチドを含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２である、請求項１６に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１８】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸分析物を増幅および検出するためのオリゴヌクレオチドの組み合わせであって、
１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８４の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に前記核酸分析物に相補的ではない第１の上流塩基配列を有する第１の増幅オリゴマーであって、前記第１の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第１の増幅オリゴマーと、
１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８５の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に前記核酸分析物に相補的ではない第２の上流塩基配列を有する第２の増幅オリゴマーであって、前記第２の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第２の増幅オリゴマーと、を含む、組み合わせ。
【請求項１９】
請求項９〜１７のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、請求項１８に記載の組み合わせ。
【請求項２０】
前記第１の増幅オリゴマーの前記塩基の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２３であり、前記第１の増幅オリゴマーが、前記第１の上流塩基配列を含み、前記第１の上流塩基配列が、プロモーター配列を含む、請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項２１】
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５からなる群から選択される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項２２】
試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むかを決定する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記試料を増幅オリゴマーの対と接触させるステップであって、
前記対の第１の増幅オリゴマーが、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８４の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、ならびに任意に増幅および検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸配列に相補的ではない第１の上流塩基配列を含み、前記第１の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さであり、
前記対の第２の増幅オリゴマーが、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８５の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、ならびに任意に増幅および検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの前記核酸配列に相補的ではない第２の上流塩基配列を含み、前記第２の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、接触させるステップと、
（ｂ）インビトロ核酸増幅反応において増幅オリゴマーの前記対を使用して前記試料中に存在し得るＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの任意の核酸を増幅し、
これによって前記試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含む場合に増幅産物が産生されるステップと、
（ｃ）前記増幅産物を検出し、それによって前記試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むことを決定するステップと、を含む、方法。
【請求項２３】
ステップ（ｃ）が、標識されたハイブリダイゼーションプローブで前記増幅産物を検出することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標識されたハイブリダイゼーションプローブが、２２個以下のヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標識されたハイブリダイゼーションプローブが、配列番号３の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号３の塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する、オリゴヌクレオチドと、前記非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識と、である、請求項２３または請求項２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記標識されたハイブリダイゼーションプローブが、塩基位置６と７との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２、塩基位置１０と１１との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号１、塩基位置６と７との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２、および塩基位置５と６との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号４からなる群から選択される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列が、塩基位置６と７との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２である、請求項２５または２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の増幅オリゴマーの前記塩基の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２３であり、前記第１の増幅オリゴマーが、前記第１の上流塩基配列を含み、前記第１の上流塩基配列が、プロモーター配列を含み、ステップ（ｂ）における前記インビトロ核酸増幅反応が、転写媒介増幅反応である、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５からなる群から選択される、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブであって、
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸に相補的である最大２３個の塩基の長さの塩基の標的ハイブリダイズ配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、
前記塩基の標的ハイブリダイズ配列の塩基配列が、配列番号５の２０個の連続する塩基を含み、前記塩基の標的ハイブリダイズ配列の塩基配列が、配列番号５の塩基配列またはその補体内に完全に含有され、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、
前記オリゴヌクレオチドが、検出可能な標識に結合した非ヌクレオチドリンカーをさらに含む、ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３１】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、最大２３個のヌクレオチドの長さである、請求項３０に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３２】
前記検出可能な標識が、化学発光標識である、請求項３１に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３３】
前記化学発光標識が、アクリジニウムエステル部分を含む、請求項３２に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３４】
前記ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列が、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上のヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３６】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブであって、
２０個以下の塩基の長さのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４またはその補体からなり、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号１４の塩基１４と１５との間に位置する非ヌクレオチドリンカーを有する、オリゴヌクレオチドと、
前記非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識と、を含む、ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３７】
前記検出可能な標識が、化学発光標識を含む、請求項３６に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３８】
前記化学発光標識が、アクリジニウムエステルを含む、請求項３６または請求項３７のいずれかに記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３９】
修飾された糖残基を含む少なくとも１つのヌクレオシド類似体をさらに含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項４０】
前記少なくとも１つのヌクレオシド類似体が、リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む、請求項３９に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項４１】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸分析物を増幅および検出するためのオリゴヌクレオチドの組み合わせであって、
１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８７の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に前記核酸分析物に相補的ではない第１の上流塩基配列を有する第１の増幅オリゴマーであって、前記第１の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第１の増幅オリゴマーと、
１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８８の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に前記核酸分析物に相補的ではない第２の上流塩基配列を有する第２の増幅オリゴマーであって、前記第２の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第２の増幅オリゴマーと、を含む、組み合わせ。
【請求項４２】
請求項３６〜４０のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、請求項４１に記載の組み合わせ。
【請求項４３】
前記第１の増幅オリゴマーが、前記第１の上流塩基配列を含み、前記第１の上流塩基配列が、プロモーター配列である、請求項４１または請求項４２のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項４４】
前記第１の増幅オリゴマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項４５】
前記第２の増幅オリゴマーが、最大２５個の塩基の長さである、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項４６】
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４６、配列番号４９、および配列番号５０からなる群から選択される、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項４７】
試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むかを決定する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記試料を増幅オリゴマーの対と接触させるステップであって、
前記対の第１の増幅オリゴマーが、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８７の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸配列に相補的ではない第１の上流塩基配列を含み、
前記対の第２の増幅オリゴマーが、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８８の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの前記核酸配列に相補的ではない第２の上流塩基配列を含む、接触させるステップと、
（ｂ）インビトロ核酸増幅反応において増幅オリゴマーの前記対を使用して前記試料中に存在し得るＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの任意の核酸を増幅し、
これによって前記試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含む場合に増幅産物が産生されるステップと、
（ｃ）前記増幅産物を検出し、それによって前記試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むことを決定するステップと、を含む、方法。
【請求項４８】
ステップ（ｃ）が、標識されたハイブリダイゼーションプローブで前記増幅産物を検出することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記標識されたハイブリダイゼーションプローブが、２０個以下の塩基の長さのオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４またはその補体からなり、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号１４の塩基１４と１５との間に位置する非ヌクレオチドリンカー、および前記非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標識されたハイブリダイゼーションプローブが、修飾された糖残基を含む少なくとも１つのヌクレオシド類似体を含む、請求項４８または請求項４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのヌクレオシド類似体が、前記リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１の増幅オリゴマーが、前記第１の上流塩基配列を含み、前記第１の上流塩基配列が、プロモーター配列である、請求項４７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１の増幅オリゴマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記第２の増幅オリゴマーが、最大２５個の塩基の長さである、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項５５】
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４６、配列番号４９、および配列番号５０からなる群から選択される、請求項５４に記載の組み合わせ。
【請求項５６】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブであって、
前記ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列が、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２２、またはその補体、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２１、またはその補体、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２０、またはその補体からなる群から選択され、
検出可能な標識が、塩基１３と１４との間で前記非ヌクレオチドリンカーに結合している、ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項５７】
前記ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列が、塩基１３と１４との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２２、塩基１３と１４との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２１、
および塩基１３と１４との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２０からなる群から選択される、請求項５６に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項５８】
前記検出可能な標識が、化学発光標識である、請求項５６または５７のいずれかに記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項５９】
前記化学発光標識が、アクリジニウムエステルを含む、請求項５８に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項６０】
修飾された糖残基を含む少なくとも１つのヌクレオシド類似体をさらに含む、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項６１】
前記少なくとも１つのヌクレオシド類似体が、前記リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む、請求項６０に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項６２】
前記ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列が、塩基１３と１４との間に前記非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２２である、請求項５６〜６１のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項６３】
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸分析物を増幅および検出するためのオリゴヌクレオチドの組み合わせであって、
１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号９０の配列内に完全に含有される塩基配列を含む塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に前記核酸分析物に相補的ではない第１の上流塩基配列を有する第１の増幅オリゴマーであって、
前記第１の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第１の増幅オリゴマーと、
１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号９１の配列内に完全に含有される塩基配列を含む塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に前記核酸分析物に相補的ではない第２の上流塩基配列を有する第２の増幅オリゴマーであって、前記第２の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第２の増幅オリゴマーと、を含む、組み合わせ。
【請求項６４】
請求項５６〜６２のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーションプローブをさらに含む、請求項６３に記載の組み合わせ。
【請求項６５】
前記第１の増幅オリゴマーが、前記第１の上流塩基配列を含み、前記第１の上流塩基配列が、プロモーター配列を含み、前記第１の増幅オリゴマーが、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３２からなる群から選択される塩基配列をさらに含む、請求項６３または請求項６４のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項６６】
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３を含む、請求項６３または請求項６５のいずれかに記載の組み合わせ。
【請求項６７】
修飾された糖残基を含む少なくとも１つのヌクレオシド類似体をさらに含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項６８】
前記少なくとも１つのヌクレオシド類似体が、前記リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む、請求項６７に記載の組み合わせ。
【請求項６９】
試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むかを決定する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記試料を増幅オリゴマーの対と接触させるステップであって、
前記対の第１の増幅オリゴマーが、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号９０の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、ならびに任意に増幅および検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸配列に相補的ではない第１の上流塩基配列を含み、前記第１の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さであり、
前記対の第２の増幅オリゴマーが、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号９１の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、ならびに任意に増幅および検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの前記核酸配列に相補的ではない第２の上流塩基配列を含み、前記第２の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、接触させるステップと、
（ｂ）インビトロ核酸増幅反応において増幅オリゴマーの前記対を使用して前記試料中に存在し得るＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの任意の核酸を増幅し、
これによって前記試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含む場合に増幅産物が産生されるステップと、
（ｃ）前記増幅産物を検出し、それによって前記試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むことを決定するステップと、を含む、方法。
【請求項７０】
ステップ（ｃ）が、標識されたハイブリダイゼーションプローブで前記増幅産物を検出することを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記標識されたハイブリダイゼーションプローブが、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２２、またはその補体、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２１、またはその補体、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２０、またはその補体からなる群から選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、検出可能な標識が、塩基１３と１４との間で前記非ヌクレオチドリンカーに結合している、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記標識されたハイブリダイゼーションプローブが、修飾された糖残基を含む少なくとも１つのヌクレオシド類似体をさらに含む、請求項７０または請求項７１のいずれかに記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項７３】
前記少なくとも１つのヌクレオシド類似体が、前記リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む、請求項７２に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項７４】
前記第１の増幅オリゴマーが、前記第１の上流塩基配列を含み、前記第１の上流塩基配列が、プロモーター配列である、請求項６９〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１の増幅オリゴマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３２からなる群から選択される、請求項６９〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３を含む、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月８日に出願された、米国仮特許出願第６２／７１６，２４１号の利益を主張する。先行出願の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、試験試料中のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在を決定するために有用な組成物、方法、およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
マイコプラズマは、モリクテス綱に属する小さな原核生物（０．２〜０．３μｍ）であり、そのメンバーは、細胞壁を欠き、小さなゲノムサイズを有する。モリクテス綱には少なくとも１００種のマイコプラズマが含まれ、そのうち１３種はヒトに感染することが知られている。
【０００４】
臨床的関連を有する１つのマイコプラズマ種は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍである。性感染症である非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）の原因であると考えられるこの生物は、無症候性の男性よりも症候性の男性において有意により多く検出されている。Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｓ  ｆｒｏｍ  Ｕｒｅｔｈｒｉｔｉｓ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０：１０５−１１０（２００２）を参照されたい。ＮＧＵに加えて、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍは、骨盤内炎症性疾患（重度の場合、女性において不妊症につながり得る）、有害な出産転帰、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染のリスクの増加に関与していると考えられる。Ｍａｎｉｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ４１７（ＡＳＭ  １９９２）、およびＭａｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  ＯＢ／ＧＹＮ（Ｊｕｌｙ  ２０１７）を参照されたい。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍはまた、気道における疾患を引き起こし得るため、いくつかのアッセイではＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＭ．ｇｅｎｔｉａｌｉｕｍの存在を区別することが重要である。Ｌｅｅ  Ｈ．Ｈｉｌｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ａｓ  ｉｔ  Ｐｅｒｔａｉｎｓ  ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｇｕｌｆ  Ｗａｒ  Ｉｌｌｎｅｓｓｅｓ，Ｖｏｌ．１：ＩＮＦＥＣＴＩＯＵＳ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＣＨ．３（Ｒａｎｄ  ２０００）を参照されたい。
【０００５】
重要なことに、Ｍ．ｇｅｎｔｉａｌｉｕｍは、多くの他の性感染症病原体よりも一般的である。低リスク個体の研究は、女性の中ではＭ．ｇｅｎｔｉａｌｉｕｍの有病率は０．８％〜４．１％の範囲であり、男性の中では１．１％〜１．２％の範囲であると推定した。ＳＴＩクリニックに通う女性の人口の中では、Ｍ．ｇｅｎｔｉａｌｉｕｍの有病率は、２つの主要米国都市において１９％にも達した。ＳＴＩクリニックに通う男性について有病率は１５％にも達した。最近の研究では、Ｍ．ｇｅｎｔｉａｌｉｕｍ有病率は、実際には全ての他の細菌性性感染症よりも高かった。
【０００６】
Ｍ．ｇｅｎｔｉａｌｉｕｍの核酸についての高感度および高度に特異的な分子試験は、米国特許第７，３４５，１５５号に記載されており、その開示は参照によって組み込まれる。重要なことに、異なるマイコプラズマ種の核酸間の密接な配列関係は、互いに区別することを難しくする。
Ｍ．ｇｅｎｔｉａｌｉｕｍを検出するための既存の核酸ベース試験の利用可能性にもかかわらず、独立して、または確認アッセイとして使用することができる補足アッセイの必要性が残っている。本開示は、この必要性に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｓ  ｆｒｏｍ  Ｕｒｅｔｈｒｉｔｉｓ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０：１０５−１１０（２００２）
【非特許文献２】Ｌｅｅ  Ｈ．Ｈｉｌｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ａｓ  ｉｔ  Ｐｅｒｔａｉｎｓ  ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｇｕｌｆ  Ｗａｒ  Ｉｌｌｎｅｓｓｅｓ，Ｖｏｌ．１：ＩＮＦＥＣＴＩＯＵＳ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＣＨ．３（Ｒａｎｄ  ２０００）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブに関する。一般的に言えば、オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２またはその補体からなり、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号２の塩基６と７との間に位置する非ヌクレオチドリンカーを有する、塩基の標的ハイブリダイズ配列と、非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識と、を含む。いくつかの実施形態では、塩基の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２の塩基配列からなり、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。いくつかの実施形態では、塩基の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２の塩基配列からなる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、化学発光標識を含む。例えば、化学発光標識は、アクリジニウムエステルを含むことができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、それにハイブリダイズされる場合、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの核酸を検出しない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、２２個以下のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、１８個以下のヌクレオチドを含む。
【０００９】
第２の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブに関する。一般的に言えば、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号３の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号３の塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する、塩基の標的ハイブリダイズ配列を有するオリゴヌクレオチドと、非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識と、を含む。いくつかの実施形態では、塩基の標的ハイブリダイズ配列は、最大２２個の塩基の長さであり、配列番号１の配列またはその補体内に完全に含有され、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。いくつかの実施形態では、塩基の標的ハイブリダイズ配列は、塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２、塩基位置１０と１１との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号１、塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号３、および塩基位置５と６との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、化学発光標識を含む。いくつかの実施形態では、化学発光標識は、アクリジニウムエステルを含む。いくつかの実施形態では、塩基の標的ハイブリダイズ配列は、塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２２個以下のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１８個以下のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２である。
【００１０】
第３の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸分析物を増幅および検出するためのオリゴヌクレオチドの組み合わせに関する。一般的に言えば、組み合わせは、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８４の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に核酸分析物に相補的ではない第１の上流塩基配列を有する第１の増幅オリゴマーであって、第１の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第１の増幅オリゴマーと、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８５の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に核酸分析物に相補的ではない第２の上流塩基配列を有する第２の増幅オリゴマーであって、第２の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第２の増幅オリゴマーと、を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、本開示の上記の第２の態様によるハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの塩基の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２３であり、第１の増幅オリゴマーは、第１の上流塩基配列を含み、第１の上流塩基配列は、プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５からなる群から選択される。
【００１１】
第４の態様では、本開示は、試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むかを決定する方法に関する。一般的に言えば、方法は、（ａ）試料を増幅オリゴマーの対と接触させるステップを含み、対の第１の増幅オリゴマーは、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８４の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、ならびに任意に増幅および検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸配列に相補的ではない第１の上流塩基配列を含み、第１の増幅オリゴマーは、最大６０個の塩基の長さであり、第２の増幅オリゴマーは、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８５の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、ならびに任意に増幅および検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸配列に相補的ではない第２の上流塩基配列を有し、第２の増幅オリゴマーは、最大６０個の塩基の長さである。（ｂ）試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含む場合に増幅産物が産生されるように、インビトロ核酸増幅反応において増幅オリゴマーの対を使用して試料中に存在し得るＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの任意の核酸を増幅するステップもある。（ｃ）増幅産物を検出し、それによって試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むことを決定するステップもある。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、標識されたハイブリダイゼーションプローブで増幅産物を検出することを含む。いくつかの実施形態では、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、２２個以下のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、配列番号３の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号３の塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する、オリゴヌクレオチドと、非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識と、である。いくつかの実施形態では、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２、塩基位置１０と１１との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号１、塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２、および塩基位置５と６との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は、塩基位置６と７との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２である。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの塩基の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２３であり、第１の増幅オリゴマーは、第１の上流塩基配列を含み、第１の上流塩基配列は、プロモーター配列を含み、ステップ（ｂ）におけるインビトロ核酸増幅反応は、転写媒介増幅反応である。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、配列番号４３、配列番号４４、および配列番号４５からなる群から選択される。
【００１２】
第５の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブに関する。一般的に言えば、ハイブリダイゼーションプローブは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸に相補的である最大２３個の塩基の長さの塩基の標的ハイブリダイズ配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、塩基の標的ハイブリダイズ配列の塩基配列は、配列番号５の２０個の連続する塩基を含み、塩基の標的ハイブリダイズ配列の塩基配列は、配列番号５の塩基配列またはその補体内に完全に含有され、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識に結合した非ヌクレオチドリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、最大２３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、化学発光標識である。例えば、化学発光標識は、アクリジニウムエステル部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は、配列番号５、配列番号６、および配列番号７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオチド類似体をさらに含む。
【００１３】
第６の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブに関する。一般的に言えば、ハイブリダイゼーションプローブは、２０個以下の塩基の長さのオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４またはその補体からなり、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号１４の塩基１４と１５との間に位置する非ヌクレオチドリンカーを有する、オリゴヌクレオチドと、非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識と、を含む。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、化学発光標識を含む。いくつかの実施形態では、化学発光標識は、アクリジニウムエステルを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、修飾された糖残基を含む少なくとも１つのヌクレオシド類似体をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド類似体は、リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む。
【００１４】
第７の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸分析物を増幅および検出するためのオリゴヌクレオチドの組み合わせに関する。一般的に言えば、組み合わせは、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８７の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に核酸分析物に相補的ではない第１の上流塩基配列を有する第１の増幅オリゴマーであって、第１の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第１の増幅オリゴマーと、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８８の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に核酸分析物に相補的ではない第２の上流塩基配列を有する第２の増幅オリゴマーであって、第２の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第２の増幅オリゴマーと、を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、本開示の第６の態様によるハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、第１の上流塩基配列を含み、第１の上流塩基配列は、プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、最大２５個の塩基の長さである。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４６、配列番号４９、および配列番号５０からなる群から選択される。
【００１５】
第８の態様では、本開示は、試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むかを決定する方法に関する。一般的に言えば、方法は、（ａ）試料を増幅オリゴマーの対と接触させるステップを含み、対の第１の増幅オリゴマーは、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８７の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸配列に相補的ではない第１の上流塩基配列を含み、対の第２の増幅オリゴマーは、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号８８の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸配列に相補的ではない第２の上流塩基配列を含む。（ｂ）試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含む場合に増幅産物が産生されるように、インビトロ核酸増幅反応において増幅オリゴマーの対を使用して試料中に存在し得るＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの任意の核酸を増幅するステップもある。（ｃ）増幅産物を検出し、それによって試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むことを決定するステップもある。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、標識されたハイブリダイゼーションプローブで増幅産物を検出することを含む。いくつかの実施形態では、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、２０個以下の塩基の長さのオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１４またはその補体からなり、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号１４の塩基１４と１５との間に位置する非ヌクレオチドリンカーを有する、オリゴヌクレオチドと、非ヌクレオチドリンカーに結合した検出可能な標識と、である。いくつかの実施形態では、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、修飾された糖残基を含む少なくとも１つのヌクレオシド類似体を含む。例えば、少なくとも１つのヌクレオシド類似体は、リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、第１の上流塩基配列を含み、第１の上流塩基配列は、プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、最大２５個の塩基の長さである。例えば、第２の増幅オリゴマーは、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４６、配列番号４９、および配列番号５０からなる群から選択することができる。
【００１６】
第９の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブに関する。一般的に言えば、ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２２、またはその補体、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２１、またはその補体、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２０、またはその補体からなる群から選択され、検出可能な標識は、塩基１３と１４との間で非ヌクレオチドリンカーに結合している。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は、塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２２、塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２１、および塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、化学発光標識である。例えば、化学発光標識は、アクリジニウムエステルを含むことができる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブは、修飾された糖残基を含む少なくとも１つのヌクレオシド類似体をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド類似体は、リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションプローブの塩基配列は、塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２２である。
【００１７】
第１０の態様では、本開示は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸分析物を増幅および検出するためのオリゴヌクレオチドの組み合わせに関する。一般的に言えば、組み合わせは、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号９０の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に核酸分析物に相補的ではない第１の上流塩基配列を有する第１の増幅オリゴマーであって、第１の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第１の増幅オリゴマーと、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号９１の配列内に完全に含有される塩基配列を含む、塩基の標的ハイブリダイズ配列、および任意に核酸分析物に相補的ではない第２の上流塩基配列を有する第２の増幅オリゴマーであって、第２の増幅オリゴマーが、最大６０個の塩基の長さである、第２の増幅オリゴマーと、を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、本開示の第９の態様によるハイブリダイゼーションプローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、第１の上流塩基配列を含み、第１の上流塩基配列は、プロモーター配列を含み、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３２からなる群から選択される塩基配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３を含む。いくつかの実施形態では、組み合わせは、修飾された糖残基を含む少なくとも１つのヌクレオシド類似体をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド類似体は、リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む。
【００１８】
第１１の態様では、本開示は、試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むかを決定する方法に関する。一般的に言えば、方法は、（ａ）試料を増幅オリゴマーの対と接触させるステップを含み、対の第１の増幅オリゴマーは、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号９０の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、ならびに任意に増幅および検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸配列に相補的ではない第１の上流塩基配列を含み、第１の増幅オリゴマーは、最大６０個の塩基の長さであり、対の第２の増幅オリゴマーは、１９〜２５個の塩基の長さであり、配列番号９１の配列内に完全に含有される塩基配列を有する塩基の標的ハイブリダイズ配列、ならびに任意に増幅および検出されるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸配列に相補的ではない第２の上流塩基配列を含み、第２の増幅オリゴマーは、最大６０個の塩基の長さである。（ｂ）試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含む場合に増幅産物が産生されるように、インビトロ核酸増幅反応において増幅オリゴマーの対を使用して試料中に存在し得るＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの任意の核酸を増幅するステップもある。（ｃ）増幅産物を検出し、それによって試料がＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を含むことを決定するステップもある。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は、標識されたハイブリダイゼーションプローブで増幅産物を検出することを含む。いくつかの実施形態では、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２２、またはその補体、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２１、またはその補体、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする塩基１３と１４との間に非ヌクレオチドリンカーを有する配列番号２０、またはその補体からなる群から選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、検出可能な標識は、塩基１３と１４との間で非ヌクレオチドリンカーに結合している。いくつかの実施形態では、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、修飾された糖残基を有する少なくとも１つのヌクレオシド類似体をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレオシド類似体は、リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、第１の上流塩基配列を含み、第１の上流塩基配列は、プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および配列番号３２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３を含む。
【００１９】
序論および概要
本開示は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに特異的な高感度アッセイの臨床的必要性に対する解決策を提供する。例えば、この性感染細菌について試験されている個体から採取されたスワブから得られる試験試料中にＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍが存在するかを決定するために有用なオリゴヌクレオチドが特徴とされる。例えば、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在を決定するための検体は、生殖管、ならびに実験溶液、培養物、および他の試料培地から得られ得る。
【００２０】
本開示はまた、例えば、ヒトの尿道、肛門管、気道、または下部生殖管から得られる試験試料中にＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍが存在するかを決定するために有用なオリゴヌクレオチドを特徴とすることによってＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに特異的なアッセイの臨床的必要性に対する解決策を提供する。特徴とされるオリゴヌクレオチドは、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸配列を検出、固定化、および／または増幅するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーに含有され得る。２３Ｓ  ｒＲＮＡまたはその補体中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを検出するための２つの異なる標的領域、および１６Ｓ  ｒＲＮＡまたはその補体中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを検出するための１つの標的領域が特に開示される。
【００２１】
特に、開示されたオリゴヌクレオチドプローブ、プライマー、および捕捉オリゴヌクレオチドは、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在を検出または決定するために特に好ましいが、同じオリゴヌクレオチドは、試験試料中のＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を検出または決定するために組み合わせて使用することもできる。例えば、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍまたはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのいずれかの存在を示すプローブハイブリダイゼーションアッセイの第１の結果は、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅではなくＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸を検出するプローブハイブリダイゼーションアッセイを使用して得られる結果と組み合わせて、決定を下すことができる。より具体的には、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍまたはＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのいずれかの存在を（すなわち、互いに区別することなく）示す結果は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在についての陰性結果と共に、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を示すであろう。
【００２２】
本開示の一実施形態では、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸、またはその補体に存在する１６Ｓ  ｒＲＮＡ標的領域にハイブリダイズして、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在を示す検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するハイブリダイゼーションアッセイプローブが提供される。この実施形態のプローブは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、ＡＴＡＣＣＣＴＡＧＴＡＧＴＣＣＡＣＡＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＡＧＡＴＡＣＴＡＧＣＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＡＴＣＣＣＴＴＣＧＧＴＡＧＴＧＡＡＧＴＴＡＡＣＡＣＡＴＴＡＡＧＴＡＴＣＴＣＧＣＣＴＧＧＧＴＡＧＴＡＣＡＴＴ（配列番号８１）の塩基配列またはその補体内に含有される。配列番号８１の配列は、本明細書ではA標的領域１」と呼ばれることがある。
【００２３】
本開示の別の実施形態では、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸、またはその補体に存在する第１の２３Ｓ  ｒＲＮＡ標的領域にハイブリダイズして、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在を示す検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するハイブリダイゼーションアッセイプローブが提供される。この実施形態のプローブは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、ＧＡＴＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＡＧＡＧＡＡＴＡＧＧＴＡＧＧＡＧＣＡＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＧＴＴＣＧＣＡＡＧＧＡＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＡＣＴＡＣＣＣＴＴＧＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＧＴＴＣＴＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＴＴＴＧＡＣＴＧＧＧＧＣＧＧＴＣＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＡＧＧＴＡＡＣＧＧＡＧＧＣＧＣＡＣＡＡＡＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＣＧＧ（配列番号８２）の塩基配列またはその補体内に含有される。配列番号８２の配列は、本明細書では「標的領域２」と呼ばれることがある。
【００２４】
本開示のさらに別の実施形態では、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸、またはその補体に存在する第２の２３Ｓ  ｒＲＮＡ標的領域にハイブリダイズして、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在を示す検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するハイブリダイゼーションアッセイプローブが提供される。この実施形態のプローブは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、ＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＣＧＴＧＴＧＴＡＧＴＧＧＣＧＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＡＴＣＴＧＡＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＧＧＣＴＴＧＣＡＴＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＧＴＧＡＴＡＧＣＣＣＣＧＴ（配列番号８３）の塩基配列またはその補体内に含有される。配列番号８３の配列は、本明細書では「標的領域３」と呼ばれることがある。
【００２５】
プローブは、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下、特にＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する核酸よりも、非Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ生物に由来する核酸よりも標的核酸を優先的に検出するために使用することができる。
【００２６】
好ましいプローブの標的結合領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせからなり得るか、または核酸類似体（例えば、ペプチド核酸）であり得るか、または１つ以上の修飾ヌクレオシド（例えば、リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシド）を含有し得る。本開示のプローブは、好ましくは、少なくとも１７個の塩基、および最大１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、５０、またはさらに１００個の塩基の長さのオリゴヌクレオチドである。最も好ましくは、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、列挙された配列からなる核酸または核酸類似体であり、任意に検出可能な標識またはレポーター基を含む。
【００２７】
本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ストリンジェントな条件下で標的生物（すなわち、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）に由来する核酸に安定して結合しない標的結合領域領域の塩基配列に加えて、１つ以上の塩基配列を含み得る。追加の塩基配列は、ストリンジェントな条件下で標的生物に由来する核酸に安定して結合しないか、またはプローブの標的核酸への安定したハイブリダイゼーションを防止しない限り、任意の所望の塩基配列を含み得る。例として、追加の塩基配列は、捕捉プローブの固定化プローブ結合領域を構成し得、固定化プローブ結合領域は、例えば、ストリンジェントな条件下で固体支持体に直接的または間接的に結合したポリヌクレオチドの５’ポリｄＴ（チミン）領域にハイブリダイズする３’ポリｄＡ（アデニン）領域で構成される。追加の塩基配列はまた、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７プロモーター）による開始もしくは伸長を増強する５’配列であり得る。第１の配列が、例えば、「分子ビーコン」プローブに組み込まれる場合、複数の追加の塩基配列が含まれ得る。分子ビーコンは、Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ”、米国特許第５，９２５，５１７号によって開示されており、少なくとも部分的に互いに相補的な領域を有する２つの塩基配列によって結合される標的結合領域を含む。追加の塩基配列は、標的結合領域に直接、または、例えば、非ヌクレオチドリンカーによって結合され得る。
【００２８】
必要ではないが、プローブは、検出可能な標識または相互作用する標識の群を含むことができる。標識は、放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、クロモフォア、記載された条件下で標的核酸に安定して結合することができない塩基配列領域、およびこれらの混合物を含むが、これらに限定されない任意の好適な標識物質であり得る。相互作用する標識の群には、酵素／基質、酵素／補因子、フルオロフォア／クエンチャー、発光物／付加物、色素二量体、およびＦｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
特定の実施形態では、プローブは、均一なアッセイ形式で検出することができる化学発光標識などの均一な検出可能な標識を含む。好ましい標識の例には、本明細書に記載されるものなどのアクリジニウムエステル標識が含まれる。
【００３０】
別の実施形態では、本開示は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ生物が試験試料中に存在するかを決定するために有用なプローブ混合物を企図する。例えば、これらの生物の存在を決定するために、プローブ混合物は、上記のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプローブのうちの１つ以上を含み得る。
【００３１】
本開示はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、上記のハイブリダイゼーションアッセイプローブとプローブの標的核酸との間に形成される安定な核酸二本鎖を含む組成物を企図する。
【００３２】
さらなる実施形態では、本開示は、固定化プローブ結合領域および標的結合領域を含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む捕捉プローブを提供する。捕捉プローブの固定化プローブ結合領域は、ストリンジェントな条件下で試験試料中に存在する固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに安定してハイブリダイズすることができる任意の塩基配列で構成され得る。好ましくは、固定化プローブ結合領域は、捕捉プローブの３’末端に位置するポリ（ｄＡ）、ホモポリマーテールである。この実施形態では、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、アッセイ条件下で捕捉プローブのポリ（ｄＡ）テールに安定して結合するのに十分な長さの５’ポリ（ｄＴ）テールを含むであろう。好ましい実施形態では、固定化プローブ結合領域は、約３０個のアデニンの長さであるポリ（ｄＡ）テールを含み、捕捉プローブは、標的結合領域および固定化プローブ結合領域を互いに結合するための約３個のチミンの長さであるスペーサー領域を含む。
【００３３】
本開示はまた、増幅アッセイにおいてマイコプラズマ生物の存在を検出するために有用な増幅プライマーを特徴とする。１つの好ましい実施形態では、各増幅プライマーは、オリゴヌクレオチドを含み、プライマーの標的結合領域の塩基配列は、配列番号８１またはその補体（すなわち、標的領域１）、配列番号８２またはその補体（すなわち、標的領域２）、および配列番号８３またはその補体（すなわち、標的領域３）内に含有される塩基配列を有するか、またはこれに実質的に対応する。本開示の増幅プライマーは、任意に、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する５’プロモーター配列を含む。含まれる場合、ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号８０）などのＴ７プロモーターが好ましい。
【００３４】
本開示の増幅プライマーは、好ましくは、少なくとも２つの増幅プライマーのセットで使用される。好ましいセットは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマーを含み、標的結合領域の塩基配列は、配列番号８１、配列番号８２、および配列番号８３からなる群から選択される標的配列に存在する少なくとも１９個の連続する塩基領域に少なくとも約８０％相補的である（より好ましくは少なくとも約９０％相補的であり、最も好ましくは１００％相補的である）少なくとも１９個の連続する塩基領域を含有する。任意に、第１の増幅プライマーは、その５’末端に結合したプロモーター配列を含む。これらの好ましいセットの第２の増幅プライマーは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、配列番号８１、配列番号８２、および配列番号８３からなる群から選択される標的配列に存在する少なくとも１９個の連続する塩基領域に少なくとも約８０％相補的である（より好ましくは少なくとも約９０％相補的であり、最も好ましくは１００％相補的である）少なくとも１９個の連続する塩基領域を含有する。
【００３５】
本開示はさらに、増幅条件下で、上記の増幅プライマーとプライマーの標的核酸との間に形成される安定な核酸二本鎖を含む組成物を企図する。
【００３６】
本開示はさらに、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍが試験試料中に存在するかを決定するための方法を特徴とする。一実施形態では、本開示は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸が試験試料中に存在するかを決定するための方法を提供し、方法は、（ａ）試験試料を、プローブがＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件下で、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを検出するための上記ハイブリダイゼーションアッセイプローブのうちの１つと接触させ、それによって検出のために安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成するステップ、および（ｂ）ハイブリッドが試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または不在の指標として試験試料中に存在するかを決定するステップを含む。この方法は、試験試料中に存在するＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの量を推定するための手段として、試験試料中に存在するハイブリッドの量を定量化するステップをさらに含み得る。好ましくは、プローブは、検出可能な標識を含み、標識は、プローブが別の種ではなくＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸にハイブリダイズされることを示す検出可能なシグナルを産生する。例えば、シグナルは、プローブがＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する核酸にハイブリダイズされる場合と比較して、プローブがＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸にハイブリダイズされる場合、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも５００倍強くなり得る。
【００３７】
本開示はまた、試験試料中に存在するマイコプラズマ生物に由来する核酸に存在する標的核酸配列を増幅するための方法を企図し、方法は、（ａ）試験試料を、増幅条件下で、上記増幅プライマーのうちの少なくとも１つと接触させるステップ、および（ｂ）標的核酸配列を増幅するステップを含む。好ましい増幅方法は、上記増幅プライマーのうちの少なくとも２つのセットを含むであろう。
【００３８】
一実施形態では、マイコプラズマ生物に由来する核酸に存在する標的核酸配列を増幅するための方法は、（ａ）試験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸配列、またはその補体に優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ、それによって検出のための安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成するステップ、および（ｂ）ハイブリッドが試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または不在の指標として試験試料中に存在するかを決定するステップをさらに含むであろう。上記ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、この方法に特に好ましい。
【００３９】
本開示はまた、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍが試験試料中に存在するかを決定するためのキットを企図する。これらのキットは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸に特異的な上記ハイブリダイゼーションアッセイプローブのうちの少なくとも１つを含み、任意に、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または量を決定するための書面の説明書を含む。別の実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブに加えて、マイコプラズマ生物に由来する核酸に存在する標的核酸配列を増幅するために適切な上記増幅プライマーのうちの少なくとも１つを含む。さらに別の実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブに加えて、上記捕捉プローブのうちの少なくとも１つをさらに含む。さらに別の実施形態では、キットは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブに加えて、上記捕捉プローブのうちの少なくとも１つおよび上記増幅プライマーのうちの少なくとも１つをさらに含む。捕捉プローブを含むキットは、捕捉プローブを、直接的または間接的のいずれかで、試験試料中に固定化するための固体支持体材料（例えば、磁気的に誘引可能な粒子）をさらに含み得る。
【００４０】
本開示はまた、マイコプラズマ生物に由来する核酸に存在する標的核酸配列を増幅するためのキットを企図し、キットは、マイコプラズマ生物の核酸を検出するための上記増幅プライマーのうちの少なくとも１つおよび少なくとも２つのハイブリダイゼーションプローブを含む。さらなる実施形態では、これらのキットは、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーションプローブに加えて、上記捕捉プローブのうちの少なくとも１つを含み得る。そのようなキットは、捕捉プローブを試験試料中に固定化するための固体支持体材料をさらに含み得る。
【００４１】
当業者は、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブが、増幅プライマーまたは捕捉プローブとして使用され得ること、本開示の増幅プライマーの標的結合領域が、特定のアッセイによって必要とされる特異性の程度に応じて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは捕捉プローブとして使用され得ること、本開示の捕捉プローブの標的結合領域が、特定のアッセイによって必要とされる特異性の程度に応じて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーとして使用され得ることを理解するであろう。よって、本開示は、上記ヌクレオチド塩基配列およびその類似体のいずれかを含む、これから本質的になる、またはこれからなる試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または不在の決定における使用のためのオリゴヌクレオチドを企図する。
【００４２】
別段の指示がない限り、「〜を含む」という句は、以下の開示において「〜から本質的になる」または「〜からなる」という句で置換され、それによって本開示によって企図される様々な程度の範囲を示し得る。しかしながら、各請求項は、列挙される特定の移行句によって限定されることを意図している。
【００４３】
本開示の他の特徴および利点は、その好ましい実施形態の以下の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
マイコプラズマ生物に由来する核酸を標的とするオリゴヌクレオチドが本明細書に開示され、オリゴヌクレオチドは、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または不在を決定するために有用である。オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーとして機能することなどによって、異なる方法でＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出を補助することができる。本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸に存在する標的核酸配列に優先的にハイブリダイズして、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在を示す検出可能な二本鎖を形成することができる。プローブのうちのいくつかは、標的生物とその既知の系統発生学的最近隣生物とを区別することができると考えられる。本開示の捕捉プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でマイコプラズマ生物に由来する核酸中に存在する標的核酸配列にハイブリダイズすることができ、臨床検体から標的核酸を分離するために使用することができる。本開示の増幅プライマーは、増幅条件下でマイコプラズマ生物に由来する核酸中に存在する標的核酸配列にハイブリダイズすることができ、マイコプラズマ由来の核酸を生成するために増幅反応においてプライマーとして使用することができる。プローブおよび増幅プライマーは、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出および／または定量化のためのアッセイで使用され得る。
【００４５】
定義
以下の用語は、異なる意味を有することが明示的に示されない限り、本明細書において示された意味を有する。
【００４６】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、本明細書で使用される場合、「核酸」は、１つ以上の核酸を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００４７】
「試料」または「試験試料」とは、標的生物または標的生物に由来する核酸を含有することが疑われる任意の物質を意味する。物質は、例えば、喀痰または尿道検体などの未処理の臨床検体、検体を含有する緩衝媒体、検体および標的生物に属する核酸を放出するための溶解剤を含有する媒体、あるいは反応容器中または反応材料もしくは装置上で単離および／または精製された標的生物に由来する核酸を含有する媒体であり得る。特許請求の範囲では、「試料」および「試験試料」という用語は、その生の形態の検体、または検体中の標的生物に由来する核酸を放出、単離、および精製するための処理の任意の段階を指し得る。
【００４８】
「標的核酸」または「標的」とは、標的核酸配列を含有する核酸を意味する。
【００４９】
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、または「標的領域」とは、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、およびそれらに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。しかしながら、特許請求の範囲は、その相補配列を除外する但し書きで、標的配列を列挙された配列の特定の意味に限定し得る。
【００５０】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、およびそれらの類似体であるポリマーを含む、ポリヌクレオチドを形成するために一緒に結合した窒素含有複素環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指す。核酸「バックボーン」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換（例えば、２’メトキシもしくは２’ハロゲン化物置換）を有する類似の化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらの類似体（例えば、イノシンまたは他のもの、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈｅｄ．，１９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン、デアザ−またはアザ−ピリミジン、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２位、６位、または８位に置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号およびＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１３１２１号）であり得る。核酸は、バックボーンがポリマーの位置（複数可）に窒素含有塩基を含まない、１つ以上の「非塩基性」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基、および結合のみを含み得るか、または従来の成分および置換の両方（例えば、２’メトキシバックボーンを有する従来の塩基、もしくは従来の塩基および１つ以上の塩基類似体の両方を含有するポリマー）を含み得る。核酸は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）、糖立体構造を模倣するＲＮＡ中にロックされた二環式フラノース単位を有する１つ以上のＬＮＡヌクレオチド単量体を含有する類似体を含み、これは相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する（Ｖｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１）。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼし得るオリゴマーの実施形態は、ＰＮＡオリゴマー、２’−メトキシもしくは２’−フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、または荷電結合（例えば、ホスホロチオエート）もしくは中性基（例えば、メチルホスホネート）を含有するオリゴマーを含む、ハイブリダイゼーション複合体の全電荷、電荷密度、もしくは立体会合に影響を及ぼすオリゴマーを含む。別に示さない限り、５−メチルシトシンは、ＲＮＡまたはＤＮＡバックボーン（またはそれらの混合物）を含む前述のバックボーン／糖／結合のいずれかと共に使用され得る。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸��長さについての範囲に言及する場合、その範囲は全ての整数を含む（例えば、１９〜２５個の連続するヌクレオチドの長さは、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、および２５個を含む）ことが理解される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭素糖、および窒素含有塩基（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭素糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５炭素糖は、２’−デオキシリボースである。用語はまた、リボースの２’位にあるメトキシ基（本明細書ではあるいは「２’−Ｏ−メチル」または「２’−Ｏ−Ｍｅ」または「２’−メトキシ」または「２’−ＯＭｅ」とも呼ばれる）などのそのようなサブユニットの類似体も含む。
【００５２】
「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴ」は、一般に、１，０００個のヌクレオチド（ｎｔ）未満の核酸を指し、約２〜５個のヌクレオチドの下限および約５００〜９００個のヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のものを含む。いくつかの特定の実施形態は、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個のヌクレオチドの下限および約５０〜６０個のヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のオリゴマーであり、他の特定の実施形態は、約１０〜２０個のヌクレオチドの下限および約２２〜１００個のヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲である。オリゴマーは、天然に存在する供給源から精製されてもよいが、任意の周知の酵素的または化学的方法を使用することによって合成されてもよい。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬の任意の特定の機能を示さず、むしろ、本明細書に記載される全てのそのような試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、それは、相補鎖に特異的であり、これにハイブリダイズすることができ、核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長され得る場合、プライマーとして機能し得、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含有し、転写を可能にする場合、プライマーとして機能し、プロモーターを提供し得（例えば、Ｔ７プライマー）、標的核酸、またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができ、検出可能な部分（例えば、アクリジニウム−エステル化合物）をさらに提供する場合、標的核酸を検出するように機能し得る。オリゴマーは、機能名（例えば、捕捉プローブ、プライマー、またはプロモータープライマー）によって呼ばれ得るが、当業者は、そのような用語がオリゴマーを指すことを理解するであろう。
【００５３】
定義された配列のオリゴヌクレオチドは、例えば、化学または生化学合成によって、および組換え核酸分子（例えば、細菌またはレトロウイルスベクター）からのインビトロまたはインビボ発現によって、当業者に既知の技法によって産生され得る。本開示によって意図されるように、オリゴヌクレオチドは、野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からならない場合があり得る。例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、天然に存在する核酸には見られない非ヌクレオチドリンカーおよび／または検出可能な標識を含むことができる。
【００５４】
「検出プローブオリゴマー」、「検出プローブ」、または「プローブ」とは、標的核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅配列を含む標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴマーを指す。検出は、直接的（すなわち、標的に直接ハイブリダイズするプローブ）または間接的（すなわち、プローブを標的に結合する中間構造体にハイブリダイズするプローブ）のいずれかであり得る。検出プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ）であってもよく、それらは、標識または非標識であってもよい。検出プローブは、代替バックボーン結合（例えば、２’−Ｏ−メチル結合）をさらに含み得る。プローブの標的配列は、一般に、プローブが特異的にハイブリダイズするより大きい配列内の特異的な配列を指す。検出プローブは、標的特異的配列（複数可）および非標的特異的配列（複数可）を含み得る。そのような非標的特異的配列は、検出および／または増幅を容易にするために使用することができる、ヘアピン構造などの所望の二次または三次構造を付与するであろう配列を含むことができる（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８３５，５４２号、および同第６，８４９，４１２号を参照されたい）。定義された配列のプローブは、例えば、化学合成によって、および組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現によって、当業者に既知の技法によって産生され得る。
【００５５】
「標識」または「検出可能な標識」とは、検出されるか、または検出可能なシグナルをもたらす、プローブに直接的または間接的に結合した部分または化合物を指す。直接的結合は、共有結合または非共有相互作用（例えば、水素結合、疎水性もしくはイオン性相互作用、およびキレートもしくは配位錯体形成）を使用し得るが、間接的結合は、架橋部分またはリンカーを（例えば、抗体もしくは追加のオリゴヌクレオチド（複数可）を介して）使用し得る。放射性核種、リガンド、例えば、ビオチンもしくはアビジン、またはさらにポリヌクレオチド配列、酵素、酵素基質、反応性基、クロモフォア、例えば、検出可能な色を与える色素または粒子（例えば、ラテックスまたは金属ビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、または化学発光化合物）、および蛍光化合物または部分（すなわち、フルオロフォア）を含む、任意の検出可能な部分が使用され得る。フルオロフォアの実施形態には、約４９５〜６５０ｎｍの範囲の光を吸収し、約５２０〜６７０ｎｍの範囲の光を放出するものが含まれ、これらには、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ  ＦＬＵＯＲ（商標）（ＯｒａｎｇｅまたはＲｅｄ）、およびＱＵＡＳＡＲ（商標）化合物として知られるものが含まれる。フルオロフォアは、フルオロフォアに近接したときに光を吸収して、バックグラウンド蛍光を減少させる、クエンチャー分子と組み合わせて使用され得る。そのようなクエンチャーは、当該技術分野で周知であり、例えば、ＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（もしくはＢＨＱ（商標））またはＴＡＭＲＡ（商標）化合物を含む。特定の実施形態は、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブと比較して検出可能な変化を示す均一なシステムにおいて検出可能である「均一な検出可能な標識」を含み、これは、ハイブリダイズしていない標識プローブからハイブリダイズしたものを物理的に除去することなく、標識を検出することを可能にする（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。特定の均一な検出可能な標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、周知の標準的ＡＥまたはＡＥ誘導体を含む、化学発光化合物が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号）。標識を合成し、標識を核酸に結合し、標識からのシグナルを検出する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）第１０章、ならびに米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号、ならびに欧州特許出願第０７４７７０６号）。ＡＥ化合物を核酸に結合する特定の方法は、既知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および米国特許第５，６３９，６０４号、第１０列、第６行〜第１１列、第３行、および実施例８を参照されたい）。特定のＡＥ標識位置は、プローブの中央領域およびＡ／Ｔ塩基対の領域付近、プローブの３’もしくは５’末端、またはプローブが所望の標的配列と比較して検出すべきではない既知の配列とのミスマッチ部位もしくはその付近である。他の検出可能に標識されたプローブには、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子トーチ、および分子ビーコンが含まれる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ドナーおよびアクセプター標識を含み、クエンチャーの存在からフルオロフォアを放出するために増幅中にプローブを酵素的に分解すると蛍光が検出される。分子トーチおよびビーコンは、開放および閉鎖構成で存在し、閉鎖構成は、フルオロフォアを消光し、開放位置は、フルオロフォアをクエンチャーから分離して蛍光を可能にする。標的核酸へのハイブリダイゼーションは、そうでなければ閉鎖されているプローブを開放する。
【００５６】
「安定して」、「安定した」、または「検出のために安定した」とは、反応混合物の温度が核酸二本鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことを意味する。反応混合物の温度は、より好ましくは、核酸二本鎖の融解温度よりも少なくとも５℃低く、さらにより好ましくは、反応混合物の融解温度よりも少なくとも１０℃低い。
【００５７】
「実質的に相同性」、「実質的に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」、または「実質的に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）」とは、対象オリゴヌクレオチドが、参照塩基配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物を除く）に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域と少なくとも約８０％相同性、好ましくは少なくとも約９０％相同性、最も好ましくは１００％相同性である、少なくとも１０個の連続する塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する。（当業者は、標的核酸の検出に干渉するのに十分な非特異的ハイブリダイゼーションのレベルを防止しながら、オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために、相同性の様々なパーセンテージでのハイブリダイゼーションアッセイ条件に行うことができる適切な変更を容易に理解するであろう。）類似性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定され、構造的な差が相補塩基との水素結合を防止しない限り、２つの配列間に存在し得る他の構造的な差を考慮しない。２つの配列間の相同性の程度はまた、比較される少なくとも１０個の連続する塩基の各セット間の塩基の差の数に関して表すことができ、これは０、１、または２個の塩基の差であり得る。
【００５８】
「実質的に相補的な」とは、対象オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物を除く）に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域に、少なくとも８０％相補的、好ましくは少なくとも９０％相補的、最も好ましくは１００％相補的である、少なくとも１０個の連続する塩基領域を含有する塩基配列を有することを意味する。当業者は、標的核酸の検出に干渉するのに十分な非特異的ハイブリダイゼーションのレベルを防止しながら、オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために、相補性の様々なパーセンテージでのハイブリダイゼーションアッセイ条件に行うことができる適切な変更を容易に理解するであろう。相補性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定され、構造的な差が相補塩基との水素結合を防止しない限り、２つの配列間に存在し得る他の構造的な差を考慮しない。２つの配列間の相補性の程度はまた、比較される少なくとも１０個の連続する塩基の各セットに存在する塩基ミスマッチの数に関して表すことができ、これは０、１、または２個の塩基ミスマッチであり得る。
【００５９】
本開示で論じられる温度、濃度、および時間の前に暗黙の「約」があり、わずかな非実質的な逸脱が、本教示の範囲内であることが理解されるであろう。一般に、「約」という用語は、組成物の活性または安定性に任意の有意な効果を有しない組成物の成分の量における非実質的な変動を示す。全ての範囲は、「端点を含まない」などの明示的な除外がない場合に端点を包含すると解釈されるべきであり、よって、例えば、「１０〜１５以内」には、１０および１５の値が含まれる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定的であることを意図しない。前述の概要および詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、教示を限定するものではないことを理解されたい。参照によって組み込まれる任意の資料が本開示の明示的内容と矛盾する限りにおいて、明示的内容が優先する。
【００６０】
「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物」とは、本質的に同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物は、異なる糖部分（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、ＲＮＡ中のウラシルおよびＤＮＡ中のチミンの存在によって異なり得る。等価物は、特定の配列に対して同程度の相補性を有するので、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物間の差は、相同性の差には寄与しない。
【００６１】
「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡにおいて同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するヌクレオチド塩基を意味する。ここでは、塩基チミンの代わりに塩基ウラシルを使用することができ、またはその逆も可能であり、したがって、ウラシルおよびチミンは、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基である。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするポリヌクレオチド塩基配列５’−ＡＧＣＴ−３’は、配列５’−ＡＧＣＵ−３’も説明するであろう。等価物は、特定の配列に対して同程度の相補性を有するので、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基間の差は、相同性の差には寄与しない。
【００６２】
「補体」という用語は、別の核酸分子の連続する核酸配列と相補的である連続する核酸配列（標準的なヌクレオチドについてＡ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｃ：Ｇ）を含む核酸分子を指す。例えば、５’−ＡＡＣＴＧＵＣ−３’は、５’−ＧＡＣＡＧＴＴ−３’の補体である。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「標的核酸」は、増幅される標的配列を含む核酸である。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、増幅されない場合がある、標的配列以外の他の配列を含んでもよい。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、増幅および／または検出される標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、増幅プロセス（例えば、ＰＣＲ、ＴＭＡ）中にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体化する複合体化配列を含む。標的核酸が元は一本鎖である場合、「標的配列」という用語はまた、標的核酸中に存在するような「標的配列」に相補的な配列を指すであろう。標的核酸が元は二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（−）鎖の両方を指す。
【００６５】
「塩基の標的ハイブリダイズ配列」または「標的ハイブリダイズ配列」または「標的特異的配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されるオリゴマーの部分を指すために本明細書において使用される。好ましくは、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成される。標的ハイブリダイズ配列は、それらがハイブリダイズするように構成される標的配列の部分に１００％相補的であってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。標的ハイブリダイズ配列はまた、標的配列に対して挿入、欠失、および／または置換されたヌクレオチド残基を含んでもよい。標的配列に対する標的ハイブリダイズ配列の１００％未満の相補性は、例えば、配列バリアントにハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの場合のように、標的核酸が種内の複数の株である場合に生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有するように標的ハイブリダイズ配列を構成する他の理由が存在することが理解される。
【００６６】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、２つの完全または部分的に相補的な核酸鎖が、平行または逆平行方向で、指定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下で一緒になって、二本鎖領域を有する安定な構造を形成する能力を意味する。ハイブリッドと呼ばれることもある、この二本鎖構造の２つの構成鎖は、水素結合によって結合される。これらの水素結合は、最も一般的には、単一核酸鎖上の塩基アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含有するヌクレオチド間に形成されるが、塩基対合は、これらの「カノニカル」対のメンバーではない塩基間に形成することもできる。非カノニカル塩基対合は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｒ．Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（１１ｔｈ  ｅｄ．１９９２）を参照されたい。
【００６７】
「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、それらの標的核酸にハイブリダイズして、少なくとも１つの目的の生物の存在を示す安定なプローブ：標的ハイブリッド（「検出可能なハイブリッド」）を形成することができ、非標的化生物（「非検出可能なハイブリッド」）、特に系統発生学的に密接に関連する生物の存在を示すのに十分な数の検出可能な安定なプローブ：非標的ハイブリッドが形成されていないことを意味する。よって、プローブは、非標的核酸よりも十分にかなりの程度まで標的核酸にハイブリダイズして、当業者が、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸の存在（または不在）を正確に検出し、その存在を試験試料中の系統発生学的に密接に関連する生物のそれから区別することを可能にする。一般に、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度を低減することは、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度または割合を低下させるであろう。しかしながら、１つ以上の非相補的塩基の包含は、非標的生物に対して区別するオリゴヌクレオチドの能力を促進し得る。
【００６８】
優先的ハイブリダイゼーションは、発光、質量変化、および伝導度または濁度の変化に基づくものを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で知られる様々な技法のいずれかを使用して測定することができる。本明細書ではいくつかの検出手段が説明され、特に１つが以下に提供される実施例で使用される。好ましくは、試験試料中の標的および非標的ハイブリダイゼーションシグナル間に少なくとも１０倍の差、より好ましくは、少なくとも１００倍の差、最も好ましくは、少なくとも５００倍の差がある。好ましくは、試験試料中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベル以下である。
【００６９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」、または「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、密接に関連する非標的微生物に由来する核酸よりもＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸（好ましくは、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件は、プローブのＧＣ含有量および長さ、プローブ配列と試験試料中に存在し得る非標的配列の配列、および標的配列との間の類似性の程度を含む因子に応じて変動し得る。ハイブリダイゼーション条件には、温度およびハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成が含まれる。以下の実施例セクションは、本開示のプローブを使用してＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸を検出するための好ましいハイブリダイゼーションアッセイ条件を提供するが、他のストリンジェントな条件は、当業者によって容易に確認され得る。
【００７０】
「アッセイ条件」とは、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの安定したハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。アッセイ条件は、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの優先的ハイブリダイゼーションを必要としない。
【００７１】
「均一の検出可能な標識」は、標識が標的配列にハイブリダイズされたプローブ上にあるかを決定することによって均一の様式で検出することができる標識を指す。すなわち、均一の検出可能な標識は、ハイブリダイズされていない形態の標識または標識されたプローブからハイブリダイズされたものを物理的に除去することなく検出することができる。増幅された核酸を検出するために標識されたプローブを使用する場合、均一の検出可能な標識が好ましい。均一標識の例は、Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２８３，１７４号、Ｗｏｏｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５６，２０７号、およびＮｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５８，７３７号によって詳細に記載されている。均一アッセイにおける使用のための好ましい標識には、化学発光化合物が含まれる（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５６，２０７号、Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５８，７３７号、およびＡｒｎｏｌｄ，Ｊｒ．  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６３９，６０４号を参照されたい）。好ましい化学発光標識は、標準ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）などのアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物である。
【００７２】
「均一アッセイ」とは、特定のプローブハイブリダイゼーションの程度を決定する前に、ハイブリダイズしていないプローブからハイブリダイズしたプローブを物理的に分離する必要のない検出手順を指す。本明細書に記載されるものなどの、例示的な均一アッセイは、適切な標的にハイブリダイズされる場合蛍光シグナルを放出する分子ビーコンまたは他の自己報告プローブ、ハイブリッド二本鎖に存在しない限り化学的手段によって選択的に破壊され得る化学発光アクリジニウムエステル標識、および当業者によく知られているであろう他の均一に検出可能な標識を使用することができる。
【００７３】
「示差加水分解」とは、アルカリ選択試薬の存在下でアクリジニウムエステル（ＡＥ）分子のエステル結合が加水分解される異なる速度を意味し、これはＡＥ分子が溶液中で遊離しているプローブまたは標的核酸に結合したプローブと会合しているかに依存するであろう。一般に、標的核酸に結合したプローブと会合したＡＥ分子は、選択試薬の存在下で溶液中で遊離しているプローブと会合したＡＥ分子よりもゆっくりと加水分解するであろう。
【００７４】
「示差加水分解比」とは、アルカリ性選択試薬の存在下で溶液中で遊離している同一のプローブと会合したＡＥ分子のエステル結合の加水分解速度に対する、標的核酸に結合したプローブと会合したＡＥ分子のエステル結合の加水分解速度の比を意味する。ＡＥ標識プローブの示差加水分解比が大きいほど、標的核酸についてのＡＥ標識プローブの感度および区別能力が大きくなる。
【００７５】
「〜から本質的になる」とは、本発明の基本的および新規特徴を実質的に（ｍａｔｅｒｉａｌｌｙ）変化させない追加の成分（複数可）、組成物（複数可）、または方法ステップ（複数可）が、本発明の組成物またはキットまたは方法に含まれ得ることを意味する。本発明の基本的および新規特徴に対する実質的効果を有する任意の成分（複数可）、組成物（複数可）、または方法ステップ（複数可）は、この用語から逸脱するであろう。例えば、オリゴヌクレオチドへの付加または欠失は、オリゴヌクレオチドがその特許請求される特性を有することを妨げない非実質的変動であり得る（すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、非標的核酸よりも標的核酸に優先的にハイブリダイズする）。オリゴヌクレオチドは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションに関与せず、そのようなハイブリダイゼーションに影響を及ぼさない他の核酸分子を含み得る。
【００７６】
「核酸二本鎖」、「二本鎖」、「核酸ハイブリッド」、または「ハイブリッド」とは、二本鎖の水素結合領域を含む安定な核酸構造を意味する。そのようなハイブリッドには、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、およびＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子、ならびにそれらの類似体が含まれる。構造は、任意の既知の手段によって検出可能であるのに十分に安定である。
【００７７】
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」とは、標的核酸、またはその補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与する（例えば、プライマーまたはプロモーター−プライマーとして機能する）オリゴヌクレオチドである。特定の増幅オリゴマーは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域に相補的である、少なくとも約１０個の連続する塩基、および任意に少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、または２３個の連続する塩基を含有する。連続する塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または完全に相補的であり得る。当業者は、列挙された範囲が、その範囲内の全ての整数および有理数（例えば、９２％または９８．３７７％）を含むことを理解するであろう。特定の増幅オリゴマーは、約１０〜約６０個の塩基の長さ、またはより好ましくは約１８〜約２６個の塩基の長さであり、任意に修飾されたヌクレオチドを含み得る。
【００７８】
「プライマー」とは、テンプレート核酸にハイブリダイズし、ポリメラーゼ酵素によって伸長される３’末端を有するオリゴマーである。プライマーは、例えば、標的配列に対して非相補的である５’領域を含めることによって、任意に修飾され得る。そのような修飾は、タグ、プロモーター、またはプライマーもしくは標的オリゴヌクレオチドを操作もしくは増幅するために使用されるか、もしくは有用な、他の非標的特異的配列などの、機能的付加を含むことができる。
【００７９】
転写媒介増幅の文脈内では、５’プロモーター配列で修飾されたプライマーは、本明細書において「プロモーター−プライマー」と呼ばれる。分子生物学または生化学の分野における当業者は、プライマーとして機能する（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）ことができるオリゴマーが、５’プロモーター配列を含むように修飾され、プロモーター−プライマーとして機能することができ、同様に、任意のプロモーター−プライマーが、その５’プロモーター配列の有無にかかわらずプライマーとして機能する（ｓｅｒｖｅ）ことができることを理解するであろう。３’遮断末端を組み込むように修飾されたプロモーター−プライマーは、本明細書において「プロモータープロバイダー」と呼ばれ、これは、標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始するように機能する上流プロモーター配列を提供することができるが、オリゴ伸長のためのプライマーは提供しない。
【００８０】
「核酸増幅」または「標的増幅」または単に「増幅」とは、標的核酸配列、もしくはその相補配列、またはそれらの断片の複数のコピー（すなわち、完全標的核酸よりも少なく含有する増幅配列）を生成する任意のインビトロ手順を指す。核酸増幅手順の例には、転写関連方法、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、および他のもの（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，４３７，９９０号、同第５，１３０，２３８号、同第４，８６８，１０５号、および同第５，１２４，２４６号）、レプリカーゼ媒介増幅（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、欧州特許第０３２０３０８号）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、米国特許第７，２８２，３２８号）、ならびに鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号）が含まれる。増幅は、線形または指数関数的であり得る。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、および熱サイクリングステップを使用して、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成する。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別々のオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する。ヘリカーゼ依存性増幅は、ヘリカーゼを使用して、ＤＮＡ二本鎖の２つの鎖を分離して一本鎖テンプレートを生成し、続いてテンプレートにハイブリダイズする配列特異的プライマーのハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼによる伸長を行い、標的配列を増幅する。ＳＤＡは、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の１つの鎖にニックを入れる制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを使用し、続いて、一連のプライマー伸長および鎖置換ステップにおける増幅を行う。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する。特定の実施形態はＰＣＲまたはＴＭＡを使用するが、本明細書に開示されるオリゴマーが他の増幅方法におけるプライマーとして容易に使用され得ることは当業者には明らかであろう。
【００８１】
転写関連増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、プロモーター含有オリゴヌクレオチドを使用し、任意に他のオリゴヌクレオチドを含んで、最終的に核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写物を産生し得る（例えば、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号、Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４３７，９９０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１３０２号および同第ＷＯ８８／１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０３４７２号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０３４３０号（Ｒｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）において詳細に記載される）。ＴＭＡを使用する方法は、以前に詳細に記載されている（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号）。
【００８２】
「増幅条件」とは、核酸増幅を可能にする条件を意味する。以下の実施例セクションは、転写媒介増幅方法において本開示のプライマーを使用してマイコプラズマ生物に由来する標的核酸配列を増幅するための好ましい増幅条件を提供するが、他の許容される増幅条件は、所望の増幅の特定の方法に応じて、当業者によって容易に決定され得る。
【００８３】
「反対方向」または「反対鎖」とは、参照、またはセンス、核酸鎖に完全に相補的な核酸分子を意味する。
【００８４】
「センス」、「同センス」、または「プラスセンス」とは、参照核酸分子と完全に相同性の核酸分子を意味する。
【００８５】
「アンプリコン」とは、核酸増幅反応において生成される核酸分子を意味し、これは標的核酸に由来する。アンプリコンは、標的核酸と同じかまたは反対方向のものであり得る標的核酸配列を含有する。
【００８６】
「由来する」とは、言及された核酸が、標的生物から直接的に、または核酸増幅の産物として間接的に得られることを意味し、その産物は、例えば、標的生物に存在しないアンチセンスＲＮＡ分子であり得る。
【００８７】
「捕捉プローブ」とは、標的核酸および固定化プローブにハイブリダイズし、それによって試験試料中の標的核酸を固定化および単離するための手段を提供することができる、オリゴヌクレオチドまたは一緒に結合された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセットを意味する。標的核酸にハイブリダイズする捕捉プローブのその部分は、「標的結合領域」と呼ばれ、固定化プローブにハイブリダイズする捕捉プローブのその部分は、「固定化プローブ結合領域」と呼ばれる。好ましい捕捉プローブは、アッセイ条件下で標的核酸および固定化プローブの両方にハイブリダイズするが、標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、異なるハイブリダイゼーション条件下でそれらのそれぞれの標的配列にハイブリダイズするように設計され得る。このようにして、捕捉プローブは、固定化プローブ結合領域の固定化プローブへのハイブリダイゼーションを可能にする条件を調整する前に、溶液動力学においてより好ましい条件下で標的核酸にまずハイブリダイズするように設計され得る。標的結合および固定化プローブ結合領域が同じ捕捉プローブ上に提供される場合、それらは同じオリゴヌクレオチド上で互いに直接隣接してもよく、それらは１つ以上の任意に修飾されたヌクレオチドによって互いに分離されてもよく、またはそれらは非ヌクレオチドリンカーによって互いに結合されてもよい。
【００８８】
「標的結合領域」とは、アッセイ条件下で、標的核酸、標的配列のＤＮＡもしくはＲＮＡ等価物、または標的配列の補体中に存在する標的配列に安定して結合するオリゴヌクレオチドの部分を意味する。アッセイ条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件または増幅条件であり得る。
【００８９】
「固定化プローブ結合領域」とは、アッセイ条件下で固定化プローブにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの部分を意味する。
【００９０】
特許請求の範囲における「ホモポリマーテール」とは、少なくとも１０個の同一の塩基（例えば、１０個の連続するアデニンまたはチミン）の連続する塩基配列を意味する。
【００９１】
「固定化プローブ」とは、捕捉プローブを固定化支持体に結合するためのオリゴヌクレオチドを意味する。固定化プローブは、結合または相互作用によって直接的または間接的のいずれかで固体支持体に結合され、それらの条件が同じか異なるかにかかわらず、捕捉プローブを標的核酸および固定化プローブにハイブリダイズするために使用される条件下で安定したままである。固定化プローブは、試料中の非結合材料からの結合標的核酸の分離を促進する。
【００９２】
「単離する」または「単離すること」とは、試験試料中に存在する標的核酸の少なくとも一部分が、反応容器内、または反応装置もしくは固体担体（例えば、試験管、キュベット、マイクロタイタープレートウェル、ニトロセルロースフィルター、スライド、またはピペットチップ）上で、容器、装置、または担体からの標的核酸の大幅な喪失なしに標的核酸を精製することができるように、固定または放出可能な方法で濃縮されることを意味する。
【００９３】
「分離する」、「分離」、「分離すること」、または「精製する」、「精製された」、もしくは「精製すること」とは、容器、装置、または担体中またはその上に含有される試料の１つ以上の成分が、容器、装置、または担体中またはその上に存在する１つ以上の他の試料成分から物理的に除去されることを意味する。分離または精製ステップ中に除去され得る試料成分は、タンパク質、炭水化物、脂質、阻害剤、非標的核酸、および非結合プローブを含む。好ましくは、固定化捕捉プローブに結合した標的核酸は、分離または精製ステップ中に試料に保持される。
【００９４】
「マイコプラズマ生物」とは、生物の１つとしてＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを含む、マイコプラズマの２種以上を意味する。
【００９５】
「系統発生学的に密接に関連する」とは、生物が進化の意味で互いに密接に関連しており、したがって、より遠く関連する生物よりも高い総核酸配列相同性を有するであろうことを意味する。系統樹上の隣接する位置および隣接する位置の隣を占める生物は、密接に関連する。密接に関連する生物の例は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍおよびＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ種である。系統樹上の隣接する位置または隣接する位置の隣よりも遠い位置を占める生物は、それらが有意な総核酸配列相同性を有する場合、依然として密接に関連するであろう。
【００９６】
「種特異的」とは、言及されるハイブリダイゼーションアッセイプローブが、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ種に属する生物に由来する核酸に存在する標的核酸配列を優先的に（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で）検出することができることを意味する。
【００９７】
ハイブリダイゼーション条件およびプローブ設計
ハイブリダイゼーション反応条件、最も重要なことには、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩の濃度は、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブが、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸配列を有する核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にするように選択することができる。減少した塩濃度および／または増加した温度（増加したストリンジェンシーの条件）では、二本鎖ハイブリッド分子における対合されたヌクレオチド塩基間の水素結合が破壊されると、核酸ハイブリダイゼーションの程度は低下する。このプロセスは、「溶融」として知られる。
【００９８】
一般的に言えば、最も安定したハイブリッドは、最も大きな連続する、完全に一致した（すなわち、水素結合した）ヌクレオチド塩基対の数を有するものである。そのようなハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが増加するにつれて、最後に融解すると予想される。しかしながら、１つ以上のミスマッチ、「非カノニカル」、または不完全な塩基対を含有する（核酸のヌクレオチド配列においてその位置でより弱い、または存在しない塩基対合をもたらす）二本鎖核酸領域は依然として、試験試料中に存在し得る他の選択されていない核酸と交差反応することなく、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて核酸ハイブリッドが形成および検出されることを可能にするために、比較的高ストリンジェンシーの条件下で十分に安定であり得る。
【００９９】
したがって、標的核酸のヌクレオチド配列と、一方では系統発生学的に異なるが密接に関連する生物に属する非標的核酸のヌクレオチド配列との間の類似性の程度、および特定のプローブのヌクレオチド配列と、他方では標的および非標的核酸のヌクレオチド配列との間の相補性の程度に応じて、１つ以上のミスマッチは、プローブまたはプライマーに含有されるオリゴヌクレオチドが非標的核酸ではなく標的核酸にハイブリダイズする能力を必ずしも無にするわけではないであろう。
【０１００】
本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）（Ｔｍは、所与の反応混合物中の潜在的に二本鎖の分子の半分が一本鎖の変性状態にある温度として定義される）と、プローブと、検出されることを求められていないが、試験試料中に存在することが予想される系統発生学的に最も密接に関連する生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとの間に形成されるミスマッチハイブリッドのＴｍとの間の差を最大化するように選択（ｃｈｏｓｅｎ）、選択（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）、および／または設計された。非標識増幅プライマーおよび捕捉プローブは、本開示において有用であるためにハイブリダイゼーションアッセイプローブとして非常に高度な特異性を有する必要はないが、それらは、指定された増幅またはハイブリダイゼーションアッセイ条件下で他の核酸よりも１つ以上の標的核酸に優先的にハイブリダイズするように同様に設計される。この比較に使用される配列は、実験室において決定されたか、または公開されたソースから取得された。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍおよびＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの配列は、それぞれ、アクセッション番号Ｘ７７３３４およびＭ２９０６１でＧｅｎＢａｎｋデータベースから取得された。
【０１０１】
ｒＲＮＡ分子内では、二次構造（分子内水素結合によって部分的に引き起こされる）と機能との間に密接な関係がある。この事実は、一次ヌクレオチド配列における進化的変化に制限を課し、二次構造を維持させる。例えば、二重ヘリックスの一方の「鎖」において塩基が変化する（分子内水素結合により、両方の「鎖」が同じｒＲＮＡ分子の一部である）場合、補償置換は通常、相補性（これは共分散と呼ばれる）、よって必要な二次構造を保存するために、他方の「鎖」の一次配列において起こる。これは、保存された一次配列およびまた保存された二次構造要素の両方に基づいて、２つの非常に異なるｒＲＮＡ配列を整列させる。本明細書に記載されるハイブリダイゼーションアッセイプローブの潜在的標的配列は、整列された配列の相同性の変動に注目することによって特定された。
【０１０２】
可変領域の各々での配列進化は、ほとんどが分岐である。この分岐の結果として、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのより遠い系統発生学的近縁種の対応するｒＲＮＡ可変領域は、より近い系統発生学的近縁種のｒＲＮＡよりもこれらの生物のｒＲＮＡとのより大きな差を示す。好ましい標的部位を特定し、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍおよびＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと他の密接に関連する生物とを区別するために有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計するために、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍおよびＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと他の生物との間の十分な変動が観察された。
【０１０３】
推定上の固有の潜在的標的ヌクレオチド配列を単に特定することは、機能的に種特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブが、その配列を含むＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズするように作製され得ることを保証しない。様々な他の因子は、種特異的プローブの標的部位としての核酸遺伝子座の適合性を決定するであろう。本明細書に記載されるものなどの、ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性は、多数の因子によって影響を受けるため、それらの因子のうちの１つ以上の操作は、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわらず、特定のオリゴヌクレオチドの正確な感度および特異性を決定するであろう。様々なアッセイ条件の重要性および効果は、当業者に知られており、以下：Ｋｏｈｎｅ，“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”、米国特許第４，８５１，３３０号、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅ”、米国特許第５，２１６，１４３号、およびＨｏｇａｎ，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”、米国特許第５，８４０，４８８号によって開示される。
【０１０４】
ハイブリダイゼーションの所望の温度およびハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度、界面活性剤および他の溶質など）はまた、二本鎖ハイブリッドの安定性に影響を及ぼし得る。イオン強度およびプローブが標的にハイブリダイズすることが可能であろう温度などの条件は、種特異的プローブの構築において考慮されなければならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度と共に増加する。他方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド、およびアルコールなどの水素結合を破壊する化学試薬は、ハイブリッドの熱安定性を大幅に低減することができる。
【０１０５】
その標的についてのプローブの特異性を最大化するために、本開示のプローブは、高ストリンジェンシーの条件下でそれらの標的にハイブリダイズするように設計された。そのような条件下で、高度の相補性を有する単一の核酸鎖（または領域）のみは、互いにハイブリダイズするであろう。そのような高度の相補性を有しない単一の核酸鎖は、ハイブリッドを形成しないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、ハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖間に存在するべきである相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドと、プローブと試験試料中に存在する任意の非標的核酸との間の潜在的なハイブリッドとの間の安定性の差を最大化するように選択される。
【０１０６】
適切な特異性は、非標的生物の配列に対して完全な相補性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの長さを最小化することによって、非標的核酸に対して相補性のＧおよびＣ富化領域を回避することによって、および非標的配列に対してできるだけ多くの不安定化ミスマッチを含有するようにプローブを構築することによって達成され得る。プローブが特定のタイプの生物のみを検出するために適しているかは、プローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッドとの間の熱安定性の差に大きく依存する。プローブの設計において、これらのＴｍ値の差は、できるだけ大きくなるべき（好ましくは２〜５℃以上）である。Ｔｍの操作は、ＧＣ含有量対ＡＴ含有量、またはヌクレオチド類似体（例えば、リボフラノシル部分への２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオチド）の包含などのプローブ長およびプローブ組成の変更によって達成することができる。
【０１０７】
一般に、オリゴヌクレオチドプローブのための最適なハイブリダイゼーション温度は、所与の二本鎖の融解温度よりも約５℃低い。最適温度よりも低い温度でのインキュベーションは、ミスマッチの塩基配列がハイブリダイズすることを可能にし得、したがって特異性を低下させることができる。プローブがより長く、塩基対間の水素結合がより多いと、一般に、Ｔｍはより高い。Ｇ−Ｃ塩基対は、追加の水素結合、したがってＡ−Ｔ塩基対よりも高い熱安定性を示すので、ＧおよびＣのパーセンテージを増加させることもＴｍを増加させる。そのような考慮事項は、当該技術分野で知られる。例えば、Ｊ．ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ＥＴ  ＡＬ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＣＨ．１１（２ｄ  ｅｄ．１９８９）を参照されたい。
【０１０８】
Ｔｍを決定するための好ましい方法は、Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ”、米国特許第５，２８３，１７４号によって開示される周知のハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）を使用してハイブリダイゼーションを測定する。Ｔｍは、以下の方法でＨＰＡを使用して測定することができる。プローブ分子は、アクリジニウムエステルで標識され、過剰な量の標的を使用してコハク酸リチウム緩衝液（０．１Ｍのコハク酸リチウム緩衝液、ｐＨ４．７、２０ｍＭのＥＤＴＡ、１５ｍＭのアルドリチオール−２、１．２ＭのＬｉＣｌ、３％（体積／体積）絶対エタノール、２％（重量／体積）ラウリル硫酸リチウム）中のプローブ：標的ハイブリッドを形成させる。プローブ：標的ハイブリッドを含有する溶液のアリコートは、次いでコハク酸リチウム緩衝溶液で希釈され、予想されるＴｍ（典型的には５５℃）よりも低く開始し、２〜５℃増分で増加する様々な温度で５分間インキュベートされる。次いで、この溶液は、弱アルカリ性ホウ酸緩衝液（６００ｍＭのホウ酸、２４０ｍＭのＮａＯＨ、１％（体積／体積）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ８．５）で希釈され、同等またはより低い温度（例えば、５０℃）で１０分間インキュベートされる。
【０１０９】
これらの条件下で、一本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルは、加水分解されるが、ハイブリダイズされたプローブに結合したアクリジニウムエステルは、加水分解から比較的に保護される。よって、加水分解処理後に残っているアクリジニウムエステルの量は、ハイブリッド分子の数に比例する。残りのアクリジニウムエステルは、過酸化水素およびアルカリを溶液に加えることによって残りのアクリジニウムエステルから産生される化学発光を監視することによって測定することができる。化学発光は、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉルミノメーター（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などの、ルミノメーターで測定することができる。得られるデータは、（通常は最低温度からの）最大シグナル対温度のパーセントとしてプロットすることができる。Ｔｍは、最大シグナルの５０％が残る温度として定義される。上記の方法に加えて、Ｔｍは、当業者に知られる同位体方法によって決定され得る（例えば、米国特許第５，８４０，４８８号を参照されたい）。
【０１１０】
所与のハイブリッドのＴｍは、使用されるハイブリダイゼーション溶液の性質に応じて変動することに留意されたい。塩濃度、界面活性剤、および他の溶質などの因子は、熱変性中のハイブリッド安定性に影響を及ぼし得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ＥＴ  ＡＬ．、上記、第１１章を参照されたい）。イオン強度およびプローブが標的にハイブリダイズすることが可能であろう温度などの条件は、プローブ構築において考慮されるべきである。一般的に言えば、ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度と共に増加する。他方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド、およびアルコールなどの水素結合を破壊する化学試薬は、ハイブリッド熱安定性を大幅に低減することができる。
【０１１１】
その標的についてのハイブリダイゼーションアッセイプローブの特異性を確保するために、高ストリンジェンシーの条件下で標的核酸にのみハイブリダイズするプローブを設計することが好ましい。高度に相補的な配列のみは、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリッドを形成するであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、安定したハイブリッドを形成するために２つの配列間に必要な相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドと潜在的なプローブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性の差を最大化するように選択されるべきである。
【０１１２】
特定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例が本明細書に提供される。もちろん、代替のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本開示に基づいて当業者によって決定され得る。（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ＥＴ  ＡＬ．、上記、第１１章を参照されたい。）
【０１１３】
標的核酸配列領域の長さ、したがって、プローブ配列の長さも重要であり得る。いくつかの場合では、特定の領域からのいくつかの配列があり得、位置および長さが異なり、これは所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブを設計するために使用され得る。他の場合では、１つのプローブは、単一の塩基だけが異なる別のものよりも特異性に関して有意に良好であり得る。完全に相補的ではない核酸がハイブリダイズすることが可能であるが、完全に相同性の塩基、および塩基組成物の最長のストレッチは、一般に、ハイブリッド安定性を決定するであろう。
【０１１４】
ハイブリダイゼーションに阻害性である強力な内部構造を形成することが知られるｒＲＮＡの領域は、あまり好ましくない標的領域である。同様に、広範な自己相補性を有するプローブは、一般的に回避される。しかしながら、以下で論じられる分子ビーコンおよび分子トーチなどのヘアピンプローブのように、プローブにおけるいくらかの程度の自己相補性が望ましい場合がある。鎖が完全にまたは部分的に分子内または分子間ハイブリッドに含まれる場合、反応条件の変更なしに、新しい分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成に関与することができなくなるであろう。リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によって非常に安定した分子内ヘリックスおよび二次構造を形成することが知られている。ハイブリダイゼーション条件下で実質的に一本鎖のままである標的核酸の領域に対してプローブを設計することによって、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの速度および程度が増加され得る。
【０１１５】
ゲノムリボソーム核酸（ｒＤＮＡ）標的は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物と同様に、二本鎖形態で自然に発生する。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーションに自然に阻害性であり、ハイブリダイゼーションの前に変性を必要とする。適切な変性およびハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５）を参照されたい）。
【０１１６】
それらの標的核酸に完全に一致したオリゴヌクレオチドの融解温度の推定値を提供するであろう多くの式が利用可能である。１つのそのような式は、次のとおりである：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（分率Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎ＝ヌクレオチドの数におけるオリゴヌクレオチドの長さ）は、１４個と６０〜７０個との間のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドについてのＴｍの良好な推定値を提供する。そのような計算から、Ｔｍのその後の経験的検証または「微調整」は、当該技術分野で周知のスクリーニング技法を使用して行われ得る。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報については、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ＥＴ  ＡＬ．、上記、第１１章が参照され得る。この参考文献は、とりわけ当該技術分野で周知のものの中でも、ハイブリッドのＴｍに対するミスマッチの効果の推定値を提供する。よって、２つ以上の生物のリボソームＲＮＡ（またはｒＤＮＡ）の所与の領域の既知のヌクレオチド配列から、これらの生物を互いに区別するであろうオリゴヌクレオチドが設計され得る。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドの調製
本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、および捕捉プローブは、当該技術分野で知られる方法によって容易に調製することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、固相法を使用して合成される。ホスホジエステル結合によってヌクレオチドを結合するための標準的なホスホルアミダイト固相化学は、“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  Ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：２８７（１９８７）においてＣａｒｕｔｈｅｒｓらによって開示される。シアノエチルホスホルアミダイト前駆体を使用した自動固相化学合成は、Ｂａｒｏｎｅによって記載されている。Ｂａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓ−ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｈｉｎｅｓ−−ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２（１０）：４０５１（１９８４）を参照されたい。Ｂａｔｔは、“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”と題された米国特許第５，４４９，７６９号において、ホスホロチオエート結合を含有するオリゴヌクレオチドを合成するための手順を開示する。加えて、Ｒｉｌｅｙらは、“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ”と題された米国特許第５，８１１，５３８号において、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有するオリゴヌクレオチドの合成を開示する。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成のための方法は、当業者に知られており、例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ＥＴ  ＡＬ．、上記、第１０章に記載される。
【０１１８】
特定のオリゴヌクレオチドの合成および精製後、オリゴヌクレオチドの品質を精製および制御するために、いくつかの異なる手順が利用され得る。好適な手順は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーを含む。これらの手順の両方は、当業者に周知である。
【０１１９】
本開示のオリゴヌクレオチドの全ては、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、または捕捉プローブであるかにかかわらず、それらの性能を増強するため、または増幅産物の特徴付けを促進するために化学基で修飾され得る。例えば、オリゴヌクレオチドを特定のポリメラーゼの核酸分解活性またはヌクレアーゼ酵素に対して耐性にするホスホロチオエート、メチルホスホネート、２’−Ｏ−アルキル、またはペプチド基を有するものなどのバックボーン修飾オリゴヌクレオチドは、増幅または他の反応におけるそのような酵素の使用を可能にし得る。修飾の別の例は、プローブまたはプライマーの核酸鎖におけるヌクレオチド間に組み込まれ、プローブのハイブリダイゼーションまたはプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を防止しない非ヌクレオチドリンカーを使用することを含む。Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ”、米国特許第６，０３１，０９１号を参照されたい。本開示のオリゴヌクレオチドはまた、所望の修飾および天然ヌクレオチドの混合物を含有し得る。
【０１２０】
増幅プライマーの３’末端は、米国特許第５，５５４，５１６号においてＫａｃｉａｎらによって開示される、ＤＮＡ合成の開始を防止または阻害するように修飾またはブロックすることができる。プライマーの３’末端は、当該技術分野で周知の様々な方法で修飾することができる。例として、プライマーへの適切な修飾は、リボヌクレオチド、３’デオキシヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド残基、ホスホロチオエートなどの修飾ヌクレオチド、および米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるものまたはアルカン−ジオール修飾（Ｗｉｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂａｃｋｂｏｎｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ−１，３  Ｍｏｉｅｔｙ  ａｓ  ａ’Ｖｉｃａｒｉｏｕｓ  Ｓｅｇｍｅｎｔ’ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｙｌ  Ｍｏｉｅｔｙ−−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８（８）：２０６５（１９９０）を参照されたい）などの非ヌクレオチド結合の付加を含み得るか、または修飾は、単純に標的核酸配列に対して非相補的であるプライミング配列の領域３’からなり得る。加えて、異なる３’ブロックプライマーまたは３’ブロックもしくは非ブロックプライマーの混合物は、その中で開示されるように、核酸増幅の効率を増加させ得る。
【０１２１】
プライマーの５’末端は、いくつかの核酸ポリメラーゼに存在する５’−エキソヌクレアーゼ活性に耐性を示すように修飾することができる。そのような修飾は、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるものなどの技法を使用して、プライマーの末端５’ヌクレオチドに非ヌクレオチド基を付加することによって実施することができる。鎖置換を促進するために、５’末端はまた、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ，“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、米国特許第６，０８７，１３３号によって開示されるように、非相補ヌクレオチドを含むように修飾され得る。
【０１２２】
合成されると、選択されたオリゴヌクレオチドは、いくつかの周知の方法のいずれかによって標識され得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ、上記、第１０章を参照されたい）。有用な標識には、放射性同位体および非放射性レポート基が含まれる。同位体標識としては、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、５７Ｃｏ、および１４Ｃが挙げられる。同位体標識は、ニック翻訳、末端標識、第２鎖合成、逆転写の使用などの当該技術分野で知られる技法によって、および化学的方法によってオリゴヌクレオチドに導入することができる。放射性標識プローブを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー、シンチレーションカウンティング、またはガンマカウンティングによって検出することができる。選択される検出方法は、標識に使用される特定の放射性同位体に依存するであろう。
【０１２３】
非同位体材料も標識に使用することができ、核酸配列の内部または核酸配列の末端に導入され得る。修飾ヌクレオチドは、酵素的または化学的に組み込まれ得る。プローブの化学的修飾は、例えば、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、非ヌクレオチドリンカー基の使用を通して、プローブの合成中または合成後に実施され得る。非同位体標識には、蛍光分子（米国特許第５，９２５，５１７号においてＴｙａｇｉらによって開示される蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対などの個々の標識または相互作用標識の組み合わせ）、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテン、または他のリガンドが含まれる。本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブでは、プローブは、好ましくは、標準的なＡＥなどのアクリジニウムエステル（ＡＥ）を有する非ヌクレオチドリンカーによって標識される。アクリジニウムエステル標識は、Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ”、米国特許第５，１８５，４３９号によって開示されるように実施され得る。
【０１２４】
核酸増幅
好ましくは、本開示の増幅プライマーは、オリゴデオキシヌクレオチドであり、核酸ポリメラーゼによる伸長産物の合成のための基質として使用されるのに十分に長い。最適なプライマーの長さは、反応の温度、プライマーの構造および塩基組成、ならびにプライマーの使用方法を含む、いくつかの因子を考慮に入れるべきである。例えば、最適な特異性のために、オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、標的核酸配列の複雑さに応じて、少なくとも１２個の塩基の長さであるべきである。そのような特異性が必須でない場合、より短いプライマーが使用され得る。そのような場合、テンプレート核酸と安定したハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度で反応を行うことが望ましい場合がある。
【０１２５】
所望の特徴を有する増幅プライマーを設計するための有用なガイドラインは、上記の「オリゴヌクレオチドの調製」というタイトルのセクションに記載される。増幅およびプロービングのための最適な部位は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ核酸の少なくとも２つ、好ましくは３つの保存領域を含有する。これらの領域は、約１５〜３５０個の塩基の長さ、好ましくは約１５〜１５０個の塩基の長さである。
【０１２６】
増幅プライマーのセット（プライマーおよび／またはプロモーター−プライマー）で観察される増幅の程度は、プライマーがそれらの特定の標的配列にハイブリダイズする能力、および酵素的に伸長またはコピーされるそれらの能力を含む、いくつかの因子に依存する。異なる長さおよび塩基組成の増幅プライマーが使用され得るが、本開示において好ましい増幅プライマーは、１８〜４０個の塩基の標的結合領域を有し、予測されるＴｍは、４２℃超、好ましくは少なくとも約５０℃を標的とする。
【０１２７】
標的配列の融解温度、相補性、および二次構造などのプローブハイブリダイゼーションに影響を及ぼすパラメータはまた、増幅プライマーハイブリダイゼーションに影響を及ぼし、したがって増幅プライマーの性能に影響を及ぼす。非特異的伸長（プライマー−二量体または非標的コピー）の程度も増幅効率に影響を及ぼし得る。よって、増幅プライマーは、一般に、特にそれらの配列の３’末端に、低い自己相補性または交差相補性を有するように選択される。それにもかかわらず、Ｎａｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ”、米国特許第５，９５８，７００号によって開示される自己報告「シグナルプライマー」、およびＮａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｌａｂｅｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒｅｏｎ”、米国特許第５，８６６，３３６号によって開示される「ヘアピンプライマー」などの自己相補性の領域を含む増幅プライマーが有用であり得る。スプリアスプライマー伸長を低減するために、長いホモポリマーのランおよび高いＧＣ含有量は回避される。コンピュータプログラムは、Ｏｌｉｇｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｌｉｇｏ  Ｔｅｃｈ（登録商標）分析ソフトウェアを含む、設計のこの態様における補助に利用可能である。
【０１２８】
本開示の増幅プライマーと併せて使用される核酸ポリメラーゼは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または両方を、テンプレート依存的に核酸ポリマー、または鎖に組み込む化学的、物理的、または生物学的薬剤を指す。核酸ポリメラーゼの例には、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレート依存的に、５’から３’の方向で核酸合成をもたらす。二本鎖核酸における２つの鎖の典型的な逆平行配向のために、この方向は、テンプレート上の３’領域からテンプレート上の５’領域である。ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）からのＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片が含まれる。例えば、Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ”、米国特許第６，０６６，４８３号を参照されたい。ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素などの様々なレトロウイルス逆転写酵素が含まれる。
【０１２９】
ほとんどの核酸増幅反応中、核酸ポリメラーゼは、標的核酸をテンプレートとして使用してプライマーの３’末端にヌクレオチド残基を付加し、よって標的核酸の領域に部分的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有する第２の核酸鎖を合成する。多くの核酸増幅反応では、増幅反応を進行させるために、得られる二本鎖構造を構成する２つの鎖は、化学的または物理的手段によって分離されなければならない。あるいは、新たに合成されたテンプレート鎖は、鎖置換または元の標的鎖の一部または全部を消化する核酸分解酵素の使用などの他の手段によって、第２のプライマーまたはプロモーター−プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能にされ得る。このようにして、プロセスは、いくつかのサイクルを通して繰り返され、標的ヌクレオチド配列を有する核酸分子の数の大幅な増加をもたらし得る。
【０１３０】
第１または第２の増幅プライマーのいずれか、または両方は、プロモーター−プライマーであり得る。いくつかの用途では、増幅プライマーは、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｋｉｔ”、米国特許第５，５５４，５１６号によって開示されるように、センス鎖に相補的であるプロモーター−プライマーのみからなり得る。プロモーター−プライマーは、通常、標的核酸分子またはプライマー伸長産物（複数可）中に存在するヌクレオチド配列に相補的ではないオリゴヌクレオチドセグメントを含有する（例えば、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”、米国特許第５，３９９，４９１号を参照されたい）。これらの非相補配列は、増幅プライマー上の相補配列に５’で位置し得、核酸ポリメラーゼの作用を通して二本鎖にされる場合ＲＮＡ合成の開始のための遺伝子座を提供し得る。そのように提供されるプロモーターは、標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーのインビトロ転写を可能にし得る。本明細書におけるプライマーへの全ての言及は、文脈が別段に明らかに示さない限り、プライマーおよびプロモーター−プライマーを含むことが理解されるであろう。
【０１３１】
試料処理
標的配列の増幅または検出の前の試料処理は、試料中に存在する非標的核酸から標的配列を区別するために必要または有用であり得る。試料処理手順は、例えば、不均一アッセイにおける液相からの核酸および／またはオリゴヌクレオチドの直接的または間接的固定化を含み得る。いくつかの手順では、そのような固定化は、複数のハイブリダイゼーション事象を必要とし得る。“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ａ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ”、米国特許第４，４８６，５３９号および同第４，５６３，４１９号においてＲａｎｋｉらは、例えば、標的相補配列および標的核酸の別個の領域に相補的である標識された核酸プローブを有する固相結合核酸の使用を含む一段階核酸「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション法を開示する。Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ”、米国特許第４，７５１，１７７号は、固体支持体からの固定化プローブの漏出に起因するＲａｎｋｉの方法に関連する感度問題を報告によれば克服する「メディエーター」ポリヌクレオチドを含む方法を開示する。標的核酸を直接的に固定化する代わりに、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙのメディエーターポリヌクレオチドは、溶液中で遊離して形成した標的ポリヌクレオチド：プローブポリヌクレオチド複合体を結合および間接的に固定化するために使用される。
【０１３２】
溶液中に遊離しているマトリックスおよび粒子などの、任意の既知の固体支持体は、試料処理に使用され得る。固体支持体は、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および好ましくは、試料の回収および／または非結合核酸または他の試料成分の除去を促進する磁気的に誘引可能な粒子であり得る。特に好ましい支持体は、単分散である（すなわち、サイズが±５％で均一である）磁性球であり、それによって一貫した結果を提供し、これは自動化された手順での使用に特に有利である。１つのそのような自動化された手順は、Ａｍｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ａ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ”、米国特許第６，３３５，１６６号によって開示される。
【０１３３】
固体支持体上に標的核酸を固定化するためのオリゴヌクレオチドは、アッセイ条件（例えば、増幅および／または検出のための条件）下で安定である任意の結合または相互作用によって、固体支持体に直接的または間接的に結合され得る。本明細書では「固定化プローブ」と呼ばれるこのオリゴヌクレオチドは、標的核酸に直接結合し得るか、またはホモポリマートラクト（例えば、ポリｄＴ）もしくは単純な短い反復配列（例えば、ＡＴリピート）などの塩基配列領域を含み得、これは、捕捉プローブ上に存在する相補塩基配列領域にハイブリダイズする。直接結合は、固定化プローブが中間基の不在下で固体支持体に結合されるときに発生する。例えば、直接結合は、共有結合、キレート化、またはイオン相互作用を介し得る。間接結合は、固定化プローブが１つ以上のリンカーによって固体支持体に結合されるときに発生する。「リンカー」は、少なくとも２つの異なる分子を安定な複合体に結合するための手段であり、結合パートナーセットの１つ以上の成分を含有する。
【０１３４】
結合パートナーセットのメンバーは、互いに認識および結合することができる。結合パートナーセットは、例えば、受容体およびリガンド、酵素および基質、酵素および補因子、酵素および補酵素、抗体および抗原、糖およびレクチン、ビオチンおよびストレプトアビジン、リガンドおよびキレート剤、ニッケルおよびヒスチジン、実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、およびポリマー核酸の相補的なホモポリマー核酸またはホモポリマー部分であり得る。結合パートナーセットの成分は、結合に関与するメンバーの領域である。
【０１３５】
その使いやすさおよび迅速さの点で実用的な利点を有する好ましい試料処理システムは、本明細書において「固定化プローブ結合領域」と呼ばれる、捕捉プローブの塩基配列に相補的な塩基配列を含有する固定化プローブを含む。捕捉プローブは、アッセイ条件下で標的核酸に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズし得る、本明細書において「標的結合領域」と呼ばれる、塩基配列をさらに含有する。標的核酸の領域についての捕捉プローブの標的結合領域の特異性は、分離ステップ後に試料から残る非標的核酸の数を最小化するために望ましいが、それは、捕捉プローブが標的核酸を単離するためだけに使用されている場合、本開示の捕捉プローブの要件ではない。捕捉プローブが、標的配列のその後の増幅のために標的核酸を単離するために使用されていない場合、捕捉プローブは、置換または非置換アクリジニウムエステルなどの、標的結合領域内またはその近くに結合した検出可能な標識をさらに含み得る。標識された捕捉プローブは、捕捉プローブなどの一本鎖核酸を検出することなくハイブリッド核酸を特異的に検出するために、均一または半均一アッセイにおいて使用され得る。このシステムで使用することができる好ましい均一アッセイは、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）であり、これは、「ハイブリダイゼーション条件およびプローブ設計」というタイトルのセクションにおいて上で論じられる。ＨＰＡ形式に従って、標的核酸にハイブリダイズしていない捕捉プローブと会合した標識は、弱塩基の添加で加水分解され、捕捉プローブ：標的ハイブリッドと会合した標識は、加水分解から保護される。
【０１３６】
この後者のアッセイシステムの利点は、本明細書に記載される他の試料処理手順において必要とされる複数のそのような事象（例えば、捕捉プローブ：標的およびプローブ：標的またはプローブ：アンプリコン）ではなく、単一の標的特異的ハイブリダイゼーション事象（捕捉プローブ：標的）のみが標的検出に必要であることである。また、標的核酸が捕捉され、検出される全体的な速度は、最も遅いハイブリダイズオリゴヌクレオチドによって制限されるため、アッセイ中のオリゴヌクレオチドが少ないと、アッセイがより速く、より簡単に最適化される傾向がある。捕捉プローブの標的結合領域は、代替アッセイシステムでは特異性が低い場合があるが、それは依然として、非標的核酸での捕捉プローブの有意な飽和を回避するのに十分にまれでなければならない。よって、２つの別々の特異的な標的配列がこれらの代替システムにおいて特定されるという要件は、適切な標的の特定に制約を課し得る。対照的に、捕捉プローブが同時に検出プローブとして機能する場合、１つのみのそのような標的配列が必要とされる。
【０１３７】
どちらのアプローチを採用する場合でも、アッセイは、試験試料中の標的核酸の存在を検出するための手段を含む必要がある。検出可能な標識の存在を必要としない手段を含む、標的核酸を検出するための様々な手段が、核酸検出の当業者に周知である。それにもかかわらず、検出可能な標識を含むプローブが好ましい。標的核酸の存在を検出するための標識プローブは、標的核酸に含有される標的配列に実質的に相補的であり、これに特異的にハイブリダイズする塩基配列を含まなければならないであろう。プローブが標的核酸に安定して結合し、得られる標的：プローブハイブリッドが直接的または間接的に固定化されると、非結合プローブは、洗い流すか、または不活性化することができ、残る結合プローブは、検出および／または測定することができる。
【０１３８】
好ましい試料処理システムは、検出および核酸増幅の要素を組み合わせる。これらのシステムは、捕捉プローブを使用して標的核酸を直接的または間接的にまず固定化し、捕捉された標的核酸は、細胞破片、非標的核酸、および増幅阻害剤を試料含有容器から除去することによって精製され、続いて標的核酸に含有される標的配列の増幅が行われる。次いで、増幅産物が、標識されたプローブで、好ましくは溶液中で検出される。標的核酸は、増幅中に固定化状態のままであり得るか、または捕捉プローブ：標的複合体のＴｍ、および／もしくは捕捉プローブ：固定化プローブ複合体のＴｍを超える温度でまずインキュベートするなどの、適切な条件を使用して増幅する前に固体支持体から溶出され得る。このシステムの好ましい実施形態は、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”、米国特許第６，１１０，６７８号によって開示される。このシステムでは、捕捉プローブは、標的核酸にハイブリダイズし、固定化プローブは、異なるハイブリダイゼーション条件下で捕捉プローブ：標的複合体にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件の第１のセットの下では、捕捉プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、捕捉プローブの固定化プローブへのハイブリダイゼーションよりも好ましい。よって、この条件の第１のセットの下では、捕捉プローブは、固体支持体に結合されるのではなく溶液中にあり、それによって遊離捕捉プローブの濃度を最大化し、標的核酸へのハイブリダイゼーションに好ましい液相動力学を利用する。捕捉プローブが標的核酸にハイブリダイズするのに十分な時間を有した後、ハイブリダイゼーション条件の第２のセットが課され、捕捉プローブ：標的複合体において固定化プローブにハイブリダイズすることを可能にし、それによって試料溶液中の標的核酸を単離する。次いで、固定化された標的核酸が精製され得、標的核酸に存在する標的配列が増幅および検出され得る。粗製試料（例えば、臨床、環境、工業、食品、水など）を処理して、試料中に存在する物質による酵素阻害および／または核酸分解を防止する場合、１つ以上の洗浄ステップを含む精製手順が一般に望ましい。
【０１３９】
好ましい増幅方法は、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”、米国特許第５，４８０，７８９号によって開示される転写媒介増幅方法である。この方法によれば、標的の一部分に相補的な３’領域および５’プロモーター領域を有するプロモーター−プライマー、ならびに標的の一部分と同じヌクレオチド配列を有するプライマーは、標的ＲＮＡ分子と接触させる。プライマーおよびプロモーター−プライマーは、標的分子上に存在するセンスおよびその補体の両方、ならびによってアンプリコンの長さおよび配列を含む、増幅される標的領域の境界を定義する。この好ましい実施形態では、増幅オリゴヌクレオチドおよび固定化標的ＲＮＡは、有効量のモロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の両方、ならびに必要な塩および補因子の存在下、４２℃で接触させる。これらの条件下では、核酸増幅が起こり、主に、標的核酸とは反対のセンスのＲＮＡアンプリコンの産生をもたらす。これらのアンプリコンは、次いで、例えば、米国特許第５，２８３，１７４号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、ＨＰＡを使用して、標的核酸と同じセンスのアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションアッセイプローブを使用することによって、溶液中で検出することができる。
【０１４０】
固定化プローブおよび捕捉プローブの３’末端は、好ましくは、核酸ポリメラーゼ活性のテンプレートとしてのそれらの使用を防止または阻害するために「キャップ」またはブロックされる。キャッピングは、３’デオキシリボヌクレオチド（コルジセピンなど）、３’，２’−ジデオキシヌクレオチド残基、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるものなどの、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオール修飾、または非３’末端の非相補ヌクレオチド残基を含み得る。
【０１４１】
当業者は、上記方法論が、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ媒介増幅、自家持続配列複製（３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む、様々な他の増幅スキームに、記載されるように、または明らかな修飾有するかのいずれかで、適していることを認識するであろう。
【０１４２】
リボソーム核酸を単離するための捕捉プローブ
本開示の捕捉プローブは、非標的核酸の存在下で、マイコプラズマ生物の１６Ｓまたは２３Ｓリボソーム核酸のいずれかに由来する核酸に結合し、これを単離するように設計される。そのようなものとして、捕捉プローブは、標的結合領域および固定化プローブ結合領域の両方を含む。捕捉プローブの標的結合領域は、アッセイ条件下でマイコプラズマ生物からの１６Ｓまたは２３Ｓリボソーム核酸のいずれかに由来する標的配列にハイブリダイズする塩基配列を含む。必須ではないが、標的結合領域は、好ましくは、アッセイ条件下、非標的核酸の存在下で標的配列について特異性を示す。固定化プローブ結合領域は、ポリヌクレオチド、または直接的または間接的のいずれかで、試験試料中に存在する固体支持体に結合される、ポリヌクレオチド配列を含有するキメラを含む固定化プローブにハイブリダイズする塩基配列を有する。標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、直接、または例えば、ヌクレオチド塩基配列、脱塩基配列、または非ヌクレオチドリンカーによって、互いに結合され得る。
【０１４３】
好ましい実施形態では、本開示による捕捉プローブは、本明細書に開示される捕捉プローブのうちの１つに対して少なくとも約８５％相同性（好ましくは少なくとも約９０％相同性、より好ましくは少なくとも約９５％相同性、最も好ましくは１００％相同性）である塩基配列領域を含む標的結合領域を含む。これらの好ましい捕捉プローブの固定化プローブ結合領域は、アッセイ条件下で試験試料に提供される固体支持体に直接的または間接的に結合した固定化プローブにハイブリダイズする塩基配列を含む。固定化プローブ結合領域は、好ましくは、固定化プローブの５’末端に位置するホモポリマー領域（例えば、ポリ（ｄＴ））に相補的である捕捉プローブの３’末端に位置するホモポリマー領域（例えば、ポリ（ｄＡ））を含む。他の塩基配列は、例えば、短い反復配列を含む、固定化プローブ結合領域に組み込まれ得る。
【０１４４】
望ましくないクロスハイブリダイゼーション反応を防止するために、本開示の捕捉プローブは、好ましくは、標的結合領域のヌクレオチド塩基配列以外のヌクレオチド塩基配列を除外し、これは、アッセイ条件下での試験試料中に存在し得る任意の生物に由来する核酸に安定して結合することができる。このアプローチと一貫して、形成される捕捉プローブ：標的複合体の固定化を最大化するために、固定化プローブ結合領域のヌクレオチド塩基配列は、好ましくは、試験試料中に存在し得る任意の生物に由来する核酸ではなく、アッセイ条件下で固定化プローブ中に存在するヌクレオチド塩基配列に安定して結合することができるように設計される。
【０１４５】
捕捉プローブの標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、捕捉プローブ：標的複合体が捕捉プローブ：固定化プローブ複合体のＴｍよりも高いＴｍを有するように選択され得る。このようにして、固定化プローブよりも標的配列への捕捉プローブのハイブリダイゼーションを好む条件の第１のセットが課され、それによって捕捉プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに最適な液相ハイブリダイゼーション動力学を提供し得る。捕捉プローブが標的配列に結合するのに十分な時間が経過すると、固定化プローブへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にする、あまりストリンジェントではない条件の第２のセットが課され得る。これらの用途に有用な条件のセットは、日常的な実験のみを使用して当業者によって確立することができる。
【０１４６】
本開示の捕捉プローブはまた、試験試料中の標的配列の直接検出のための標識または相互作用標識対を含み得る。標識、標識の組み合わせ、およびプローブを標識するための手段の非限定的な例は、上記に記載される。標的核酸にハイブリダイズされた捕捉プローブの存在を検出するための特に有用な方法は、本明細書に記載される、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）である。ＨＰＡは、標的核酸にハイブリダイズされたプローブと、ハイブリダイズされていないままであるプローブとの間を区別する均一アッセイである。ＨＰＡ反応容器から検出されたシグナルは、試験試料中の標的生物の存在または量の指標を提供する。
【０１４７】
直接検出アッセイにおけるそれらの適用にかかわらず、捕捉プローブの最も一般的な使用は、標的核酸に含有される標的配列を増幅する前の標的核酸の単離および精製におけるものである。増幅の前に標的核酸を単離および精製することによって、意図されない増幅反応（すなわち、非標的核酸の増幅）の数は、厳しく制限することができる。増幅試薬の存在下および増幅条件下で、捕捉プローブ自体が核酸ポリメラーゼ活性のテンプレートとして機能することを防止または阻害するために、捕捉プローブの３’末端をキャップまたはブロックすることができる。キャッピング剤の例には、３’デオキシリボヌクレオチド、３’，２’−ジデオキシヌクレオチド残基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオール修飾、および３’末端の非相補ヌクレオチド残基が含まれる。
【０１４８】
マイコプラズマリボソーム核酸の増幅
本開示の増幅プライマーは、マイコプラズマ生物に由来する１６Ｓまたは２３Ｓリボソーム核酸のいずれかの領域を対象としている。増幅プライマーは、核酸増幅アッセイにおいてマイコプラズマ生物の存在を検出するために使用されるハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的核酸配列（またはその補体）のうちの少なくとも１つに隣接、重複、またはこの内に含有され得る。上記に示されるように、増幅プライマーはまた、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、標的核酸をテンプレートとして使用してＲＮＡ転写を誘導することができるプロモーター配列（例えば、Ｔ７プロモーター配列）を含むそれらの５’末端における非相補塩基を含み得る。
【０１４９】
本開示の増幅プライマーは、増幅条件下でマイコプラズマ生物に由来する核酸中に存在する標的核酸配列を増幅することができる。第１鎖増幅プライマーは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、任意に５’プロモーター配列（例えば、配列番号３３）（標的領域１）を含む、配列番号２３、これらの配列の各々が任意に５’プロモーター配列（例えば、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、もしくは配列番号３７）（標的領域２）を含む、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、もしくは配列番号２７、またはこれらの配列の各々が任意に５’プロモーター配列（例えば、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、もしくは配列番号４２）（標的領域３）を含む、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、もしくは配列番号３２の塩基配列を有するか、またはこれに実質的に対応する。反対鎖増幅プライマーは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、配列番号４３、配列番号４４、もしくは配列番号４５（標的領域１）、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、もしくは配列番号５０（標的領域２）、または配列番号５１、配列番号５２、もしくは配列番号５３（標的領域３）の塩基配列を有するか、またはこれに実質的に対応する。本開示による増幅プライマーの標的結合領域は、好ましくは、列挙された塩基配列に対して少なくとも約８０％相同性（より好ましくは少なくとも約９０％相同性、最も好ましくは１００％相同性）である。本開示の増幅プライマーは、好ましくは少なくとも１５個の塩基の長さであり、より好ましくは１９〜２５個の塩基の長さである標的結合領域を有する。
【０１５０】
本開示の増幅プライマーは、（上で論じられる）ブロックされた３’および／または５’末端、あるいはＲＮＡポリメラーゼによって認識される特定のヌクレオチド配列（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列）、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の開始もしくは伸長を増強する配列、または分子内塩基対合を提供し、二次もしくは三次核酸構造の形成を促進し得る配列を含むが、これらに限定されない配列付加などの修飾を有し得る。
【０１５１】
増幅プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ媒介増幅、自家持続配列複製（３ＳＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）などの核酸増幅手順で使用され、これらの各々は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｍｕｌｌｉｓ，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”、米国特許第４，６８３，２０２号、Ｅｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”、米国特許第６，１９７，５６３号、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−−ａｎ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０（７）：１６９１−１６９６（１９９２）、Ｆａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）：Ａｎ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ＰＣＲ，”ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：２５−３３（１９９１）、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，３９９，４９１号、Ｄａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ”、米国特許第５，５５４，５１７号、Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇａｐ  Ｆｉｌｌｉｎｇ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”、米国特許第５，４２７，９３０号、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”、米国特許第５，６８６，２７２号、Ｗａｌｋｅｒ，“Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、米国特許第５，７１２，１２４号、Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ”、米国特許第６，４１０，２７８号、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、米国特許第６，２１４，５８７号、およびＨｅｌｅｎ  Ｈ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（１９９７）を参照されたい。特に示されないが、「核酸増幅」の定義を満たす他の増幅手順もまた、本発明者らによって企図される。
【０１５２】
本開示の増幅プライマーは、好ましくは非標識であるが、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと組み合わせて、またはこれを除いて、標的核酸の検出を促進するために１つ以上のレポーター基を含み得る。増幅標的配列を直接検出するために、多種多様な方法が利用可能である。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマーは、新たに合成されたＤＮＡに組み込まれる検出可能な標識を含むことができる。得られる標識増幅産物は、次いで一般に、使用されていない標識されたヌクレオチドまたはプライマーから分離され、標識は、分離された産物画分で検出される。例えば、Ｗｕ，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ”、米国特許第５，３８７，５１０号を参照されたい。
【０１５３】
プライマーが、例えば、ドナー／アクセプター色素対を形成する２つの色素に結合することによって修飾される場合、分離ステップは必要とされない。修飾されたプライマーは、プライマーが標的核酸にハイブリダイズしない限り、一方の色素対メンバーの蛍光が他方の色素対メンバーによって消光されたままであり、それによって２つの色素を物理的に分離するように設計することができる。さらに、プライマーは、２つの色素間に配置された制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むようにさらに修飾することができるので、修飾されたプライマーと標的核酸との間にハイブリッドが形成される場合、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖になり、適切な制限エンドヌクレアーゼによる切断またはニッキングに利用可能になる。ハイブリッドの切断またはニッキングは、次いで２つの色素を分離し、消光の減少による蛍光の変化をもたらし、これは、試験試料中の標的生物の存在の指標として検出することができる。そのような修飾プライマーは、Ｎａｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ”、米国特許第５，９５８，７００号および同第６，０５４，２７９号によって開示されている。
【０１５４】
有用な検出可能な標識として機能することができる物質は、当該技術分野で周知であり、放射性同位体、蛍光分子、化学発光分子、クロモフォア、ならびにビオチンおよびハプテンなどのリガンドを含み、これは、直接検出可能ではないが、それらの特定の結合パートナー、例えば、それぞれ、アビジンおよび抗体の標識された形態との反応によって容易に検出することができる。
【０１５５】
別のアプローチは、検出可能に標識されたプローブとのハイブリダイゼーション、および得られるハイブリッドを任意の従来の方法で測定することによって増幅産物を検出することである。特に、産物は、化学発光性のアクリジニウムエステル標識プローブを標的配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされていないプローブ上に存在するアクリジニウムエステルを選択的に加水分解し、ルミノメーターで残りのアクリジニウムエステルから産生される化学発光を測定することによってアッセイすることができる。例えば、Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２８３，１７４号、およびＮｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｃｈ．１７（Ｌａｒｒｙ  Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ  ｅｄ．，２ｄ  ｅｄ．１９９５）を参照されたい。
【０１５６】
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍリボソーム核酸へのハイブリダイゼーションアッセイプローブ
本開示は、新規ハイブリダイゼーションアッセイプローブを含む。ハイブリダイゼーションは、水素結合した二本鎖を形成する相補核酸の２つの一本鎖の会合である。検出されることが求められる核酸配列（「標的配列」）にハイブリダイズすることができる核酸配列は、標的配列のプローブとして機能することができる。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、およびＲＮＡ／ＲＮＡを含む、相補核酸鎖間で起こり得る。ヌクレオチド（塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、イノシン（Ｉ）、およびそれらの類似体を含む）から形成された、デオキシリボ−（ＤＮＡ）またはリボ−（ＲＮＡ）核酸の２つの一本鎖は、ハイブリダイズして、２つの鎖が相補塩基の対の間の水素結合によって一緒に保持される二本鎖構造を形成し得る。一般に、Ａは、ＴまたはＵに水素結合され、Ｇは、Ｃに水素結合される。したがって、ハイブリダイズされた鎖に沿った任意の点で、古典的な塩基対ＡＴまたはＡＵ、ＴＡまたはＵＡ、ＧＣまたはＣＧが見られ得る。よって、核酸の第１の一本鎖が第２に対する十分な連続する相補塩基を含有し、それらの２つの鎖がそれらのハイブリダイゼーションを促進するであろう条件下で一緒にされる場合、二本鎖核酸が生じるであろう。適切な条件下で、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成され得る。
【０１５７】
ハイブリダイゼーションの速度および程度は、多くの因子によって影響される。例えば、２つの鎖のうちの１つが完全にまたは部分的にハイブリッドに含まれる場合、それは新しいハイブリッドの形成に関与することができなくなることを暗示している。関心のある配列のかなりの部分が一本鎖になるようにプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および程度は、大幅に増加され得る。また、標的が統合されたゲノム配列である場合、ＰＣＲの産物の場合のように、それは二本鎖形態で自然に発生するであろう。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーションに自然に阻害性であり、ハイブリダイゼーションステップの前に変性を必要とする。加えて、十分な自己相補性がある場合、プローブ内に形成される分子内ハイブリッドがあり得る。ハイブリダイゼーションに阻害性である強力な内部構造を形成することが知られる核酸の領域は、典型的には、あまり好ましくない。そのような構造の例には、ヘアピンループが含まれる。ハイブリダイゼーションアッセイプローブにおける望ましくない二次構造は、慎重なプローブ設計を通して回避することができ、Ｏｌｉｇｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｌｉｇｏ  Ｔｅｃｈ（登録商標）分析ソフトウェアなどの、商業用コンピュータプログラムは、これらのタイプの相互作用について検索するために利用可能である。
【０１５８】
均一アッセイなどのいくつかの用途では、少なくともいくらかの程度の自己相補性を示すプローブが、試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を促進するために望ましい場合がある。そのようなプローブには、「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と呼ばれる自己相補性の別個の領域を含むように設計される「分子トーチ」が含まれる。これらの２つのドメインは、分子トーチにおける結合領域によって接続され、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする。結合領域は、ポリエチレングリコールなどの非ヌクレオチドリンカーであり得る。分子トーチは、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｒｃｈｅｓ”、米国特許第６，３６１，９４５号によって開示される。
【０１５９】
変性条件に曝露されると、分子トーチの２つの相補的な領域（完全にまたは部分的に相補的であり得る）が融解し、標的結合ドメインを、元のハイブリダイゼーションアッセイ条件が回復したときに標的配列へのハイブリダイゼーションに利用可能にする。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインよりも標的配列へのハイブリダイゼーションを優先するように設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズされるときとはよりも、分子トーチが自己ハイブリダイズされるときに異なるシグナルが産生されるように配置される相互作用標識（例えば、フルオロフォア／クエンチャー）を含み、それによって、それと会合した存続可能な標識を有するハイブリダイズされていないプローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を可能にする。
【０１６０】
米国特許第６，３６１，９４５号におけるＢｅｃｋｅｒらの教示に従って、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸間を区別することができる「標的結合ドメイン」に加えて、「標的閉鎖ドメイン」、「結合領域」、および分子トーチに特徴的な相互作用標識を含むように設計および構築され得る。
【０１６１】
自己相補ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的補体配列、標的核酸配列の不在下で閉鎖立体構造にプローブを保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉鎖立体構造にある場合に相互作用する標識対を有する核酸分子を含む。標的核酸および標的補体配列のハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、それによってプローブを開放立体構造にシフトさせる。開放立体構造へのシフトは、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であり得る、標識対の相互作用の低減により検出可能である。様々な分子ビーコン構成および用途の例は、米国特許第５，９２５，５１７号においてＴｙａｇｉらによって開示されている。Ｔｙａｇｉらの教示に従って、本開示によるプローブは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸間を区別することができる「標的補体配列」に加えて、「親和性対」、および分子ビーコンに特徴的な二重標識を含むように設計および構築され得る。
【０１６２】
ハイブリダイゼーションアッセイの場合では、標的核酸配列の長さ、したがって、プローブ配列の長さは、重要であり得る。いくつかの場合では、特定の領域からのいくつかの配列があり得、位置および長さが異なり、これは所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブをもたらすであろう。他の場合では、１つの配列は、単一の塩基のみが異なる別のものよりも良好なハイブリダイゼーション特性を有し得る。完全に相補的ではない核酸がハイブリダイズすることが可能であるが、完全に相同性の塩基配列の最長のストレッチは、通常、主にハイブリッド安定性を決定するであろう。異なる長さおよび塩基組成のプローブが使用され得るが、好ましいプローブは、最大１００個の塩基の長さ、より好ましくは１２〜５０個の塩基の長さ、さらにより好ましくは１８〜３５個の塩基の長さであるオリゴヌクレオチドを有する。
【０１６３】
ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの核酸中に存在するか、またはこれに由来する１６Ｓまたは２３Ｓ  ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ標的配列に実質的に相補的な塩基配列を含む。よって、プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ標的配列に安定して結合することができる。上で論じられるように、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標的核酸に安定して結合しない追加の塩基配列を有し得る。
【０１６４】
自己相補プローブに加えて、本開示のプローブは、捕捉プローブの固定化プローブ結合領域を含むように設計および構築され得、固定化プローブ結合領域は、所定のハイブリダイゼーション条件下で、固体支持体に直接的または間接的に結合した固定化プローブに含有される実質的に相補的なヌクレオチド塩基配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基配列で構成される。固体支持体およびオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合するための手段の例は、上記に「試料処理」というタイトルのセクションにおいて記載される。固定化プローブ結合領域は、好ましくは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを含む、試験試料中に存在し得る任意の生物からの核酸に安定して結合しないように選択される。よって、本開示による捕捉プローブの固定化プローブ結合領域について好ましいヌクレオチド塩基配列は、固定化プローブ上の５’ポリｄＴテールに一致する３’ポリｄＡテールなどのホモポリマーテールである。これらのテールは、所定のハイブリダイゼーション条件下で安定したハイブリダイゼーションを促進するために十分な任意の長さであり得、好ましくは約３０個の塩基の長さである。
【０１６５】
固定化プローブは、好ましくは、プローブが試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズするために十分な時間を有すると、精製ステップ中に反応容器において単離され得る磁気的に誘引可能な粒子に結合される。Ａｃｏｓｔａらは、米国特許第６，２５４，８２６号（“Ａｓｓａｙ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ”）において、そのような精製ステップを行うために使用することができる機器を開示する。捕捉プローブは、好ましくは、捕捉プローブ：標的ハイブリッドの融解温度が捕捉プローブ：固定化プローブハイブリッドの融解温度よりも高くなるように設計される。このようにして、異なるセットのハイブリダイゼーションアッセイ条件を使用して、捕捉プローブの固定化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの前に、捕捉プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを促進し、それによって遊離プローブの濃度を最大化し、好ましい液相ハイブリダイゼーション動力学を提供することができる。この「二段階」標的捕捉方法は、上で論じられており、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，１１０，６７８号によって開示される。本開示に容易に適合させることができる他の標的捕捉スキームは、当該技術分野で周知であり、限定なしに、以下：Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，“Ｍａｐｐｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｍＲＮＡｓ  ｂｙ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，”６５（１）：４６８−４７８（１９８０）、Ｒａｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，４８６，５３９号、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７５１，１７７号、およびＢｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，１３０，０３８号によって開示されるものを含む。
【０１６６】
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプローブについて、「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、および「標的領域」という用語は全て、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ中に存在する核酸配列、またはそれに相補的な配列を指し、これは密接に関連する非Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ種の核酸中に存在しない。
【０１６７】
本開示のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプローブは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、配列番号８１、配列番号８２、または配列番号８３からなる群から選択される塩基配列内に含有される。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ生物に由来する核酸よりもＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸に優先的にハイブリダイズする。プローブは、好ましくは、同じ条件下でＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができる標的結合領域と重複して、またはそれに加えて、任意の他の標的相補塩基配列領域を含まない。
【０１６８】
合成されると、プローブは、任意の周知の方法によって、検出可能な標識またはレポーター基で標識され得る。例えば、プローブは、標的配列の検出を促進するために、放射性同位体、抗原、または化学発光部分などの検出可能な部分で標識され得る。有用な標識には、放射性同位体および非放射性レポート基が含まれる。同位体標識としては、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、５７Ｃｏ、および１４Ｃが挙げられる。同位体標識は、ニック翻訳、末端標識、第２鎖合成、逆転写などの当該技術分野で知られる技法によって、および化学的方法によってオリゴヌクレオチドに導入することができる。放射性標識プローブを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー、シンチレーションカウンティング、またはガンマカウンティングなどの技法によって検出することができる。選択される検出方法は、標識に使用される特定の放射性同位体に依存する。
【０１６９】
非同位体材料も標識に使用することができ、ヌクレオチド間の内部またはオリゴヌクレオチドの末端に導入され得る。修飾ヌクレオチドは、酵素的または化学的に組み込まれ得る。オリゴヌクレオチドの化学修飾は、当該技術分野で知られる技法を使用して、オリゴヌクレオチドの合成中または合成後に実施され得る。例えば、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示される非ヌクレオチドリンカー基の使用による。非同位体標識には、蛍光分子、化学発光分子、蛍光化学発光分子、リン光分子、電気化学発光分子、クロモフォア、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、およびハプテン、または他のリガンドが含まれる。別の有用な標識技法は、ストリンジェントな条件下で標的核酸に安定して結合することができない塩基配列である。本開示のプローブは、好ましくは、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合されるアクリジニウムエステルで標識される。アクリジニウムエステル標識技法は、米国特許第５，１８５，４３９号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示される。結合試薬は、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示される。
【０１７０】
好ましい実施形態では、本開示によるＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプローブは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、ヌクレオチド１０と１１との間に位置する非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合したアクリジニウムエステル標識を有する配列番号１、またはヌクレオチド６と７との間（標的領域１）に位置する非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合したアクリジニウムエステル標識を有する配列番号２の塩基配列からなる。
【０１７１】
別の好ましい実施形態では、本開示によるＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプローブは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、ヌクレオチド１４と１５との間（標的領域２）に位置する非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合したアクリジニウムエステル標識を有する配列番号１４の塩基配列からなる。
【０１７２】
別の好ましい実施形態では、本開示によるＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍプローブは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、各々、ヌクレオチド１３と１４との間（標的領域３）に位置する非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合したアクリジニウムエステル標識を有する、配列番号２２、配列番号２１、または配列番号２０のいずれかの塩基配列からなる。
【０１７３】
選択されるハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを含有する疑いのある試験試料と接触させることができる。一般的に、試験試料は、未知の生物も含有する供給源に由来する。プローブをＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する増幅核酸を含み得る試験試料と接触させた後、試験試料は、試験試料中の非標的生物に由来する核酸よりもＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸へのプローブの優先的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートすることができる。
【０１７４】
プローブが試験試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズした後、得られるハイブリッドは、ヒドロキシアパタイト吸着および放射性モニタリングなどの当該技術分野で周知の様々な技法によって分離および検出され得る。他の技法は、米国特許第５，２８３，１７４号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、ハイブリダイズされていないプローブと会合した標識を選択的に分解し、次いでハイブリダイズされたプローブと会合した残りの標識の量を測定することを含むものを含む。この後者の技法が特に好ましい。
【０１７５】
核酸組成物
別の関連態様では、本開示は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと標的核酸との間（「プローブ：標的」）に形成される核酸ハイブリッドを含む組成物を特徴とする。プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの１つの使用は、試験試料中の標的生物または生物の群の存在または量の指標を提供することである。例えば、核酸ハイブリッドに存在するアクリジニウムエステル（ＡＥ）は、アルカリ溶液中での加水分解に耐性を示すが、一本鎖核酸に存在するＡＥは、アルカリ溶液中での加水分解を受けやすい（Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２８３，１７４号を参照されたい）。よって、標的核酸の存在は、非結合ＡＥ標識プローブの加水分解後、核酸ハイブリッドと会合したままのアクリジニウムエステルの化学発光を測定することによって検出することができる。
【０１７６】
本開示はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で捕捉プローブと標的核酸との間（「捕捉プローブ：標的」）に形成される核酸ハイブリッドを含む組成物を企図する。捕捉プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの１つの使用は、標的核酸に含有される標的配列の増幅または、例えば、不均一アッセイにおける、標的核酸の検出の前に、試験試料中の標的核酸を単離および精製することである。増幅または検出の前に標的核酸を単離および精製することによって、非特異的結合または増幅の機会が大幅に最小化される。
【０１７７】
本開示はさらに、増幅条件下で増幅プライマーと標的核酸との間（「プライマー：標的」）に形成される核酸を含む組成物を特徴とする。プライマーと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの１つの使用は、増幅プライマーの３’末端に核酸ポリメラーゼの開始部位を提供することである。例えば、ハイブリッドは、逆転写酵素、ＴａｑポリメラーゼまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼなどのようなＲＮＡポリメラーゼの開始部位を形成し得る。
【０１７８】
本開示の組成物は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸と、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含むプローブとの間で形成された核酸ハイブリッドを含む試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または量を決定するための組成物を含み、標的結合領域の塩基配列は、本明細書に開示されるプローブのいずれかの塩基配列からなる。これらの組成物のオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸に安定して結合しない少なくとも１つの追加のヌクレオチド塩基配列領域を含み得る。
【０１７９】
標的核酸と標的結合領域を有する捕捉プローブとの間に形成された核酸ハイブリッドを含む試験試料中に存在するマイコプラズマ生物に由来する標的核酸を固定化するための組成物も本開示によって企図され、標的結合領域の塩基配列は、本明細書に開示される任意の標的捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して少なくとも約８５％相同性（好ましくは少なくとも約９０％相同性、より好ましくは少なくとも約９５％相同性、最も好ましくは１００％相同性）である。さらなる実施形態では、これらの組成物は、捕捉プローブの固定化プローブ結合領域と固定化プローブとの間に形成された核酸ハイブリッドをさらに含む。
【０１８０】
本開示は、標的核酸と１２〜３０個の塩基の長さの標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含む増幅プライマーとの間に形成された核酸ハイブリッドを含むマイコプラズマ生物に由来する標的核酸中に存在する標的配列を増幅するための組成物をさらに企図し、標的結合領域の塩基配列は、標的領域１（配列番号８１）、標的領域２（配列番号８２）、もしくは標的領域３（配列番号８３）、またはそれらの補体のいずれかの塩基配列に対して少なくとも約８０％相同性（好ましくは少なくとも約９０％相同性、より好ましくは１００％相同性）である。これらの組成物の増幅プライマーは、任意に、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する５’配列を含む。含まれる場合、配列番号８０のヌクレオチド塩基配列などのＴ７プロモーターが好ましい。
【０１８１】
アッセイ法
本開示は、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸の存在または量についてアッセイするための様々な方法を企図する。当業者は、使用される正確なアッセイ条件、プローブ、および／またはプライマーが、使用される特定のアッセイ形式および試料の供給源に応じて異なることを理解するであろう。
【０１８２】
本開示の一態様は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で試験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試験試料中に存在する非Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ生物に由来する核酸よりもＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによって、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または量を決定するための方法に関する。この方法のプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸に安定して結合しない少なくとも１つの追加の塩基配列領域を含み得る。
【０１８３】
本開示のさらなる態様は、増幅条件下で試験試料を１つ以上の増幅プライマーと接触させることによって、試験試料中に存在するマイコプラズマ生物に由来する核酸を増幅するための方法に関し、各増幅プライマーは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、表２に示されるオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列を有するか、またはこれに実質的に対応する。この実施形態の増幅プライマーは、任意に、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する５’配列を含む。含まれる場合、配列番号８０のヌクレオチド塩基配列などのＴ７プロモーターが好ましい。この増幅するための方法で使用することができる増幅プライマーの特定の組み合わせは、「マイコプラズマリボソーム核酸の増幅」というタイトルのセクションに記載される。
【０１８４】
好ましい実施形態では、試験試料中のマイコプラズマ由来核酸を増幅するための方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下の試験試料を、ストリンジェントな条件下で試験試料中に存在する非Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ生物からの核酸よりも増幅されたＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させるステップをさらに含む。試験試料は、増幅のために十分な期間が経過した後、一般にハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させるが、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブは、特にハイブリダイゼーションアッセイプローブが、分子トーチまたは分子ビーコンなどの自己ハイブリダイズプローブである場合、任意の順序で試料に添加され得る。分子ビーコンは、標的核酸のリアルタイム検出に特に有用であり得る。
【０１８５】
試験試料は、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または量を決定することができるように、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させる。
【０１８６】
本開示のさらに別の態様は、試験試料中のマイコプラズマ生物に由来する標的核酸を固定化するための方法に関し、これは、試験試料に、捕捉プローブが標的核酸に安定して結合し、それによって捕捉プローブ：標的複合体を形成することを可能にするハイブリダイゼーション条件の第１のセット、および捕捉プローブが試験試料中の固定化プローブに安定して結合し、それによって固定化プローブ：捕捉プローブ：標的複合体を形成することを可能にするハイブリダイゼーション条件の第２のセットの下、標的結合領域および固定化プローブ結合領域を有する捕捉プローブを提供することを含む。ハイブリダイゼーション条件の第１および第２のセットは、同じであっても異なっていてもよく、捕捉プローブ：標的複合体は、ハイブリダイゼーション条件の第２のセット下で安定したままである。この捕捉プローブの標的結合領域は、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６の塩基配列に対して少なくとも約８５％相同性（好ましくは少なくとも約９０％相同性、より好ましくは少なくとも約９５％相同性、最も好ましくは１００％相同性）である塩基配列領域を含む。これらの標的結合領域配列を組み込むオリゴヌクレオチドセグメントは、オリゴヌクレオチドバックボーンの糖残基上に２’−Ｏ−メチル置換（時には「２’メトキシ」または「２’ＯＭｅ」）を含むように合成することができる。
【０１８７】
精製ステップは、好ましくは、固定化ステップに続いて、固定化標的核酸に含有される標的配列の増幅または特異的検出に干渉またはこれを防止し得る試験試料の１つ以上の成分を除去する。マイコプラズマ由来の核酸を固定化および任意に精製するためのこの方法は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸の存在を増幅および／または検出するための上記の方法のいずれかに先行し得る。精製ステップが含まれる場合、標的核酸は、標的配列を増幅または検出する前に試料条件を変更することによって、固定化プローブから間接的に溶出されるか、または固定化プローブ：捕捉プローブ：標的複合体の捕捉プローブから直接的に溶出され得る。
【０１８８】
診断システム
本開示はまた、キット形態の診断システムを企図する。本開示の診断システムは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、包装材料中に本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーのいずれかを含有するキットを含み得る。典型的には、キットはまた、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または量を決定するための増幅および／または検出アッセイにおいて包装されたプローブおよび／またはプライマーを使用するための有形の形態で記録された（例えば、紙または電子媒体上に含有された）説明書を含むであろう。
【０１８９】
診断システムの様々な成分は、様々な形態で提供され得る。例えば、必要な酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブ、および／またはプライマーは、凍結乾燥試薬として提供され得る。これらの凍結乾燥試薬は、再構成される場合、アッセイにおいてすぐに使用できる成分の各々の適切な比での完全な混合物を形成するように、凍結乾燥前に予備混合され得る。加えて、本開示の診断システムは、キットの凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含有し得る。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する標的核酸を増幅するための好ましいキットでは、酵素、ヌクレオチド三リン酸、および酵素に必要な補因子は、再構成される場合、本増幅方法における使用のための適切な試薬を形成する、単一の凍結乾燥試薬として提供される。これらのキットでは、凍結乾燥プライマー試薬も提供され得る。他の好ましいキットでは、凍結乾燥プローブ試薬が提供される。
【０１９０】
典型的な包装材料は、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーを固定限界内で保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子などのような固体マトリックスを含むであろう。よって、例えば、包装材料は、サブミリグラム（例えば、ピコグラムもしくはナノグラム）の量の企図されるプローブもしくはプライマーを含有するために使用されるガラスバイアルを含み得るか、またはそれらは、本開示のプローブもしくはプライマーが、本開示の増幅および／もしくは検出方法に関与することができるように、作動可能に取り付けられている、すなわち、結合している、マイクロタイタープレートウェルであり得る。
【０１９１】
説明書は、典型的には、試薬および／または試薬の濃度、ならびに例えば、試料の量あたりの使用する試薬の相対量であり得る、少なくとも１つのアッセイ方法パラメータを示すであろう。加えて、維持、期間、温度、緩衝液条件などの詳細も含まれ得る。
【０１９２】
本開示の診断システムは、個別にまたは上記の好ましい組み合わせのうちの１つで提供されるかにかかわらず、試験試料中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの存在または量の増幅および／または決定における使用のための、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーのいずれかを有するキットを企図する。
【０１９３】
本開示の異なる態様および実施形態を示す実施例を以下に提供する。当業者は、これらの例が、本開示をその中に記載された特定の実施形態に限定することを意図していないことを理解するであろう。
【０１９４】
生物溶解
以下の実施例における全細胞は、当業者にはよく知られている手順を使用して化学的に溶解された。
【０１９５】
標的捕捉アッセイ
以下の特定の実施例は、標的核酸配列の増幅の前に標的核酸を単離および精製するための標的捕捉ステップを組み込んだ。これらの例の捕捉プローブは、表２に示される塩基配列を有する５’標的結合領域を有し、さらに、同じく表２に示されるように、長さが３０ヌクレオチドのポリｄＡテールを有する３’固定化プローブ結合領域を含んだ。捕捉プローブの標的結合領域は、プライマー、プロモーター−プライマー、およびハイブリダイゼーションアッセイプローブによって結合された領域とは異なる標的核酸の領域に結合するように設計された。この標的捕捉アッセイの固体支持体は、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（商標）ＭＧ−ＣＭ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２４１５２１０５−０５０４５０）、１ミクロン、ハイブリダイゼーション条件下で捕捉プローブのポリｄＡテールに結合することができた共有結合オリゴ（ｄＴ）１４を有する超常磁性粒子であり得る。同様の磁性粒子は、Ｓｕｔｏｒ，“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”、米国特許第５，６４８，１２４号によって開示されている。粒子を懸濁液から取り出し、試料チューブの内壁に沿って固定化するために、チューブを、米国特許第６，２５４，８２６号においてＡｃｏｓｔａらによって開示された磁気分離ラックに移した。粒子が固定化されている間、流体をチューブから吸引し、チューブを以下に記載される洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄ステップは、標的配列を増幅するための下記の増幅試薬および酵素試薬を添加する前に繰り返すことができる。洗浄ステップ間に、粒子は、洗浄緩衝液に再懸濁することができる。
【０１９６】
転写媒介増幅
以下の実施例における標的配列の増幅は、例えば、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，４８０，７８４号においてＫａｃｉａｎらによって、ならびにＬＥＥら、上記、第８章によって開示される転写媒介増幅（ＴＭＡ）手順であった。ＴＭＡは、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを使用して、標的配列のコピー数を１０億倍超に増加させる等温増幅手順である（以下の酵素試薬を参照されたい）。ＴＭＡ反応は、センスプライマーおよび５’ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター配列を有するアンチセンスプライマーの存在下で、逆転写酵素によって一本鎖標的配列を二本鎖ＤＮＡ中間体に変換することを含む。このＤＮＡ中間体には、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、数百コピーのＲＮＡに転写される二本鎖プロモーター配列が含まれる。これらの転写されたＲＮＡ分子の各々は、次に、追加のＲＮＡを産生するために使用される二本鎖ＤＮＡ中間体に変換することができる。よって、ＴＭＡ反応は、指数関数的に進行する。以下の例で使用されるＴＭＡ反応の詳細を以下に記載する。
【０１９７】
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ
実施例では、表１に示されるヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを取り上げる。以下に記載されるハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ならびに捕捉プローブ、プライマー、およびプロモーター−プライマーの全ては、当該技術分野で周知の標準的な手順を使用する標準的なホスホルアミダイト化学を使用して合成された。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：２８７（１９８７）を参照されたい。合成は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して行われた。ハイブリダイゼーションアッセイプローブはまた、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって記載されるように、非ヌクレオチドリンカーを含むように合成され、米国特許第５，１８５，４３９号においてＡｒｎｏｌｄらによって記載されるように、化学発光アクリジニウムエステルで標識された。これらのプローブの反応性および特異性は、本質的には米国特許第５，２８３，１７４号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、単相均一アッセイ形式を使用して実証された。全てのプローブハイブリダイゼーション結果は、ルミノメーターによって検出された光子の尺度である、相対発光量（ＲＬＵ）で示される。
【０１９８】
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのリボソーム核酸を検出するための３つの異なるオリゴヌクレオチドシステムが開発された。これらは、プローブ、プライマー、捕捉オリゴヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを含んだ。３つのシステムの各々についての詳細は、以下の実施例に示す。
【０１９９】
実施例１は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍリボソーム核酸の３つの異なる標的領域の各々におけるプローブ候補についてのバックグラウンドシグナルレベルおよび特異性を評価するために使用される手順を記載する。これらの手順では、ＡＥ標識プローブは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  １６Ｓまたは２３Ｓ  ｒＲＮＡをテンプレートとして使用して作製された相補的インビトロ増幅産物にまずハイブリダイズし、続いてハイブリダイズされていないプローブと会合したＡＥ標識を不活性化する標準選択ステップありおよびなしでの化学発光シグナル決定を行った。有益な特性を有するプローブは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸の存在下で高いシグナル、およびＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍに由来する核酸の不在下で低いシグナルを示した。
【０２００】
実施例１は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍリボソーム核酸の３つの異なる標的領域の各々におけるプローブ候補についてのバックグラウンドシグナルレベルおよび特異性を評価するために使用される手順を記載する。全ての場合において、検出プローブは、均一な反応において検出された結合標識を有する約１５〜３０個のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含んだ（すなわち、結合および非結合プローブの分離を必要としないもの）。好ましいプローブには、結合した化学発光標識が含まれる（例えば、示差加水分解を、結合プローブおよび非結合プローブを区別するプロセスで使用することができる場合）。好ましくは、アクリジニウムエステル標識（例えば、米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、および同第５，６５６，７４４号に開示されるＡＥ化合物）は、米国特許第５，５８５，４８１号および同第５，６５６，７４４号に記載されるもののうちの１つなどの非ヌクレオチドリンカーを使用してプローブの中央領域に結合される。有益な特性を有するプローブは、相補標的にハイブリダイズした場合に高いシグナル、および相補標的の不在下で低いシグナルを有利に示した。
【実施例】
【０２０１】
実施例１
様々なハイブリダイゼーションプローブの示差加水分解特性
ハイブリダイゼーションプローブの特異性およびバックグラウンドシグナル産生を含む、重要な機能パラメータは、ｒＲＮＡ標的核酸の供給源として細菌溶解物を使用して評価した。全ての場合において、ｒＲＮＡ標的は、異なる検出システムの使用をより良好に反映するために、インビトロ増幅を受けた。特異性は、インビトロ増幅を受けたｒＲＮＡの供給源としてＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの系統発生学的近縁種）の溶解物を使用して評価した。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ細胞溶解物は、各反応に２０コピーのｒＲＮＡを提供する量で反応チューブに送達されたが、陰性対照反応（すなわち、０コピーのｒＲＮＡを含有）は、いずれの溶解物も入れなかった。プローブ特異性を評価するための並行試験は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ細胞溶解物の代わりにＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ溶解物を使用し、各反応は、２×１０６コピーのＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｒＲＮＡを含んだ。各チューブに、次いで１００μｌのＴａｒｇｅｔ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＣＲ）および１〜１０ｐｍｏｌの２つのＴａｒｇｅｔ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｏｌｉｇｏ（ＴＣＯ）を入れ、増幅される配列に隣接する領域においてハイブリダイズした。ＴＣＲは、ポリ−（ｄＴ１４）に共有結合した約２５μｇの０．７〜１．０５ミクロン常磁性粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含んだ。ＴＣＲは、ラウリル硫酸リチウム、塩化リチウム、およびＥＤＴＡを含有する２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液をさらに含んだ。５’−ＴＴＴ−３’スペーサー配列は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ相補配列と捕捉オリゴヌクレオチドの各々のオリゴ−（ｄＡ）テール領域との間に挿入された。チューブを６２℃で３５分間インキュベートし、次いで２３℃で３０分間インキュベートした。チューブラックを磁気ベース上に５分間置き、ＴＣＯおよびチューブの側面上のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  ｒＲＮＡに結合した磁気ビーズを凝集させた。溶液を吸引し、次いで１．０ｍｌの水性洗浄溶液を加えた。洗浄溶液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、６．５ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（体積／体積）のエタノール、０．０２％（重量／体積）のメチル−パラベン、０．０１％（重量／体積）のポリ−パラベン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．１％（重量／体積）のラウリル硫酸ナトリウムを含んだ。チューブをボルテックスし、磁気ベース上にもう一度５分間置いた後、第２の吸引を行った。次に、各チューブに、トレハロース、エチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェノールレッド、ＫＣｌ、各々２〜１２ｍＭの４つのＮＴＰ、各々０．５ｍＭの４つのｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、１０〜１５ｐｍｏｌの特異的Ｔ７プライマー、１０〜１５ｐｍｏｌの特異的ｎＴ７プライマーを含んだ７５μｌのＨＥＰＥＳ緩衝増幅試薬、および蒸発を制御する２００μｌの不活性油試薬を入れた。Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ核酸配列へのハイブリダイゼーションに特異的に設計された増幅プライマーは、目的の各領域に隣接した。反応チューブをボルテックスし、次いで６２℃で１０分間インキュベートし、続いて４２℃に下降させた。次に、チューブに、モロニーマウス白血���ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含んだ２５μｌの酵素試薬を入れた。チューブをボルテックスし、４２℃で６０分間インキュベートして、増幅反応を起こさせた。その後、各チューブに、１０ｆｍｏｌのＡＥ標識プローブ、およびコハク酸、ラウリル硫酸リチウム、水酸化リチウム、アルドリチオール−２、塩化リチウム、ＥＤＴＡ、エチルアルコールを含んだ１００μｌのハイブリダイゼーション試薬（ｐＨ４．７０）を入れた。ハイブリダイゼーション反応を、６２℃で２０分間振盪しながらチューブをインキュベートし、続いて周囲温度で５分間冷却することによって促進した。次に、ホウ酸、水酸化ナトリウム、および１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）  Ｘ−１００（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を含んだ２５０μｌの選択試薬（ｐＨ８．５）を各チューブに添加した。チューブの内容物を混合し、６２℃で１０分間インキュベートして、ハイブリダイズされていないプローブと会合したアクリジニウムエステル標識を加水分解し、次いで２３℃に冷却した。試料を１ｍＭの硝酸および０．１％（体積／体積）過酸化水素の自動注入のために備えたＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ＋ルミノメーター（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）において分析した後、１Ｎの水酸化ナトリウムを含有する溶液の注入を行った。化学発光反応の結果を相対発光量（ＲＬＵ）で測定した。手順の結果を表１に表す。表に示される場合、「Ｎ／Ａ」は、結果が得られなかったことを意味する。
【表１】
2021532808.tif 000002
【０２０２】
表１に示される結果は、特定のプローブが他のプローブよりも優れた性能特徴を示したことを確認した。例えば、配列番号２として特定された標的領域１プローブは、付加される核酸の不在下で非常に低いシグナル、増幅されたＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ核酸の存在下で非常に低いシグナル、およびＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ標的核酸の存在下で非常に高いシグナルを有利に与えた。これは、例外的な信号：雑音比をもたらす高度に特異的なプローブに特徴的であった。同様に、配列番号１４および配列番号８として特定された標的領域２プローブは共に、付加される核酸の不在下で比較的低いシグナル、増幅されたＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ核酸の存在下で低いシグナル、およびＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ標的核酸の存在下で比較的高いシグナルを示した。配列番号１４のプローブについて測定された標的特異的シグナルは、例外的に高かった。同様に、配列番号２２として特定された標的領域３プローブは、付加される核酸の不在下で比較的低いバックグラウンドシグナル、増幅されたＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ核酸の存在下で低いシグナル、およびＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ標的核酸の存在下で高いシグナルを示した。これらのプローブの各々は、それらをＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ核酸の特異的検出に有用にする例外的な特性を示した。
【０２０３】
本開示に従って核酸を検出するために異なるハイブリダイゼーションプローブを使用することができるが、特定のプローブが特に望ましかった。特定の好ましい実施形態では、標的領域１プローブは、配列番号８６の塩基配列またはその補体を含み、ＤＮＡおよびＲＮＡ等価塩基の置換（すなわち、ＴおよびＵ置換）を可能にする。特定の好ましい実施形態では、標的領域２プローブは、配列番号８９の塩基配列またはその補体を含み、ＤＮＡおよびＲＮＡ等価塩基の置換（すなわち、ＴおよびＵ置換）を可能にする。特定の好ましい実施形態では、標的領域３プローブは、配列番号９２の塩基配列またはその補体を含み、ＤＮＡおよびＲＮＡ等価塩基の置換（すなわち、ＴおよびＵ置換）を可能にする。
【０２０４】
実施例２は、本明細書に記載される３つの標的領域の各々におけるＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ核酸を検出するために使用することができる増幅プライマーを特定した方法を記載する。
【０２０５】
実施例２
増幅プライマーの特定
細菌溶解物は、プライマーの対合セットを使用した増幅反応においてＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍテンプレート配列の供給源として機能した。手順で使用された溶解物の量は、各反応について約２０コピーの各ｒＲＮＡ標的核酸を提供するのに十分であった。核酸は、テンプレートがＨＩＶ特異的オリゴヌクレオチドではなくＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ特異的オリゴヌクレオチドを使用して捕捉されたことを除き、本質的には公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０００／１８６８５号に開示される手順に従って、増幅の前に検体処理および標的捕捉を受けた。手順で使用された捕捉オリゴヌクレオチドは、表２で特定され、各反応について約２〜５ｐｍｏｌに相当する量で使用した。捕捉および洗浄されたテンプレート核酸を使用するＴＭＡ反応は、本質的には米国特許第５，３９９，４９１号においてＫａｃｉａｎらによって記載されるように実施され、この米国特許の開示は、参照によって組み込まれる。各プロモーター−プライマーは、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  ｒＲＮＡ標的に相補的な配列の上流にＴ７プロモーター配列ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号８０）を含んだ。増幅反応は様々なプライマーの組み合わせについて行われ、反応は１０〜１５ｐｍｏｌの各プライマーを含んだ。標的核酸およびプライマーをアニールし、増幅反応を実施例１に記載されるように調製した。４２℃で１時間のインキュベーション後、１００μｌの増幅反応全体を、実施例１にも記載されるように、ハイブリダイゼーションアッセイに供した。有用な増幅プライマーを特定するための手順を例示するために、異なる標的領域毎に単一のハイブリダイゼーションプローブのみを使用した。標的領域１についての増幅反応産物の検出は、プローブ配列番号２を使用して実施しれ、標的領域２についての増幅反応産物の検出は、プローブ配列番号１４を使用して実施した。標的領域３の増幅反応産物の検出は、様々な異なるプローブを使用して行った。プローブは、約１．５×１０８ＲＬＵ／ｐｍｏｌの比活性までアクリジニウムエステルで標識し、次いで各ハイブリダイゼーション反応について２×１０６ＲＬＵに等しい量で使用した。試験は、２〜２０の複製を使用して実施した。陽性結果と判断されるには、プローブハイブリダイゼーションを示す化学発光シグナルがアッセイにおいて５０，０００ＲＬＵを超えているか、または信号対雑音比（バックグラウンドノイズが陰性増幅対照反応で測定された場合）が少なくとも３０であるか、のいずれかでなければならない。
【０２０６】
表２は、増幅プライマーおよび捕捉オリゴヌクレオチドの異なる組み合わせを使用した増幅手順からの結果を表す。表の最後の列の結果は、手順で使用された陽性試行の数および複製試行の数を示す。
【表２−１】
2021532808.tif 000003
【表２−２】
2021532808.tif 000004
【表２−３】
2021532808.tif 000005
【０２０７】
表２に表される結果は、プライマーの組み合わせの多くが非常に高レベルのＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ検出能を与えたことを示した。本明細書に提示される結果において低いが測定可能なレベルのＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ検出能を与えたプライマーの組み合わせでさえ、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍテンプレートの増幅の成功を示し、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ核酸増幅アッセイの有用な成分として組み合わせを確立した。
【０２０８】
実施例３は、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを検出するための市販のＴＭＡアッセイ、ならびに自動プラットフォーム上で上記のオリゴヌクレオチド試薬および方法を使用する３つの代替アッセイの比較試験からの結果を記載する。以下で参照されるように、「Ａｌｔ−１」アッセイは、標的領域１におけるＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ核酸を増幅および検出し、「Ａｌｔ−２」アッセイは、標的領域２におけるＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ核酸を増幅および検出し、「Ａｌｔ−３」アッセイは、標的領域３におけるＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ核酸を増幅および検出した。
【０２０９】
実施例３
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍのＴＭＡアッセイの分析感度および特異性
Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを検出するための異なるＴＭＡアッセイの分析感度は、次の試験試料：膣スワブ、女性尿、男性尿、および陰茎スワブを使用して評価した。先行する実施例に開示された試薬および手順に基づいて、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍを検出するための３つの代替ＴＭＡアッセイを、ＴＭＡベースＡＰＴＩＭＡ（商標）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍアッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）と比較した。
【０２１０】
３つの「コンパレータ」アッセイ（すなわち、Ａｌｔ−１、Ａｌｔ−２、およびＡｌｔ−３アッセイ）は、上記に開示され、表３に要約されたオリゴヌクレオチド試薬のセットを使用した。
【表３】
2021532808.tif 000006
【０２１１】
試料処理、ＴＭＡによる核酸増幅、および化学発光検出は全て、ＰＡＮＴＨＥＲ（商標）自動インビトロ診断アナライザー（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）、ＡＰＴＩＭＡ（商標）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍアッセイ試薬、および表３に示されるオリゴヌクレオチド試薬を使用して行った。９５％検出限界での分析感度は、それぞれ、スクリーニング陰性臨床検体マトリックスまたは検体輸送培地（ＳＴＭ）での、Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ溶解物およびインビトロ転写物の段階希釈の標準プロビット分析によって決定した。「ＳＴＭ」とは、細胞を溶解することに加えて、試験を受ける試料中で活性であり得るＲＮａｓｅの活性を阻害することによって、放出されたＲＮＡを保護するリン酸緩衝界面活性剤溶液を指す。ＳＴＭにおいて使用され得る好ましい界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）が含まれる。分析特異性は、５４個の非標的細菌、原生動物、およびウイルスからなる１６のパネルを試験することによって決定した。特異性パネルは、低力価Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの不在および存在下で試験して、潜在的アッセイ交差反応性および干渉を評価した。３つのアッセイの臨床性能は、いくつかの米国の臨床現場の成人から得られた残余膣スワブならびに女性および男性尿検体（Ｎ＝１，４００）を試験することによって決定した。ＡＰＴＩＭＡ（商標）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍアッセイと３つのコンパレータＴＭＡアッセイとの間の一致は、個別に、および３つのアッセイのコンセンサス結果に基づく複合決定を使用して決定した。結果を表４および５に表す。
【表４】
2021532808.tif 000007
【表５】
2021532808.tif 000008
【０２１２】
これらの手順の結果は、３つのコンパレータアッセイが非常に感度が高いことを確認した。臨床検体マトリックス中のＭ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ溶解物を使用する３つのコンパレータアッセイの分析感度は、０．００２７〜０．００５７ＣＦＵ／ｍｌの範囲であった。ＳＴＭにおけるインビトロ転写物での感度は、２３．５〜６１．９ＲＮＡコピー／ｍｌの範囲であった。ＡＰＴＩＭＡ（商標）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍアッセイと３アッセイ複合コンパレータとの間の陽性、陰性、および全体一致は、それぞれ、９８．８％、１００％、および９９．９％であった。この分析では、コンセンサスは、３つのＡｌｔ  ＴＭＡアッセイのいずれか２つについて報告された同じ結果によって決定された。試験された１，４００個の検体のうち、１つの検体のみがＡＰＴＩＭＡ（商標）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍアッセイと複合コンパレータとの間で不一致の結果をもたらした。
【０２１３】
結果は、ＡＰＴＩＭＡ（商標）Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍアッセイも、３つのコンパレータアッセイのいずれも、５４個の試験された生物のいずれの核酸も検出しなかったことをさらに確認した。交差反応性について試験された微生物は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｗｏｆｆｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、ＨＩＶ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｐａｒｖｕｍ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ＨＰＶ  ６、ＨＰＶ  １１、ＨＰＶ  １６（ＳｉＨａ細胞）、ＨＰＶ  １８（ＨｅＬａ細胞）、ＨＰＶ  ５８、ＨＰＶ  ３９、ＨＰＶ  ５１、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  １型、および「微生物なし対照」（すなわち、マトリックスのみ）を含んだ。
【０２１４】
本明細書において開示および特許請求される組成物、キット、および方法の全ては、本開示に照らして過度の実験なしに作製および実行することができる。本開示は好ましい実施形態を説明するが、当業者には、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、変形が適用され得ることが明らかであろう。当業者にとって明らかな全てのそのような変形および等価物は、現在存在するか、またはその後に開発されるかにかかわらず、本開示の趣旨および範囲内にあるとみなされる。
【０２１５】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、本開示が関係する当業者のレベルを示している。全ての特許、特許出願、および出版物は、各個々の刊行物が、任意および全ての目的のためにその全体において参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されたのと同程度まで、全ての目的のためにその全体において参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
本開示は、特定の好ましい実施形態を参照して、かなり詳細に説明および図示されたが、当業者は、本開示の他の実施形態を容易に理解するであろう。したがって、本開示は、以下の添付の特許請求の範囲の要旨および範囲内に包含される全ての変更および変形を含むとみなされる。
＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊
【配列表】
2021532808000001.app
【国際調査報告】
2021532808.tif 000009
2021532808.tif 000010
2021532808.tif 000011
2021532808.tif 000012