(57)【要約】  本発明は、腫瘍を診断するためのＤＮＡメチル化に関連するマーカー及びその使用を提供する。ゲノムに異常なＤＮＡメチル化がある遺伝子配列領域が開示され、腫瘍マーカーＣＴＳＭ−４Ｆ、ＣＴＳＭ−２ＢＥ、ＣＴＳＭ−３Ｃ、およびＣＴＳＭ−４Ｉと名付けられた。これらの配列領域のメチル化状態は、腫瘍組織と非腫瘍組織の間で大幅に異なり、それらのＣｐＧは腫瘍組織で高度にメチル化されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
（ｂ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
（ｃ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
（ｄ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
（ｅ）  前記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも１個の修飾されたＣｐＧサイトが存在するものと、及び／又は
（ｆ）  前記（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸、
を含むことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記修飾は、５−メチル化修飾、５−ヒドロキシメチル化修飾、５−ホルミル化修飾又は５−カルボキシル化修飾を含むことを特徴とする請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドから転換され、請求項１の配列と対応し、修飾されたＣｐＧサイトのシトシンＣが変化せず、未修飾のシトシンがＴに転換することを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
（ｇ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
（ｈ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
（ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
（ｊ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、
（ｋ）  前記（ｇ）〜（ｊ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも１個の修飾されたＣｐＧサイトが存在するものと、
を含むことを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
腫瘍検出用の試薬又はキットを調製するために用いられることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項６】
前記腫瘍が、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍；白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍；皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含むことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、該標的配列を特異性的に検出する検出試薬をデザインすることを含む腫瘍検出試薬を調製する方法であって、
前記標的配列には、少なくとも１個の修飾されたＣｐＧサイトが存在し、
好ましくは、前記検出試薬が、プライマー、プローブを含む、調製する方法。
【請求項８】
標的配列を特異的に検出し、前記標的配列は、請求項１〜４のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの全長又はフラグメントであり、
少なくとも１個の修飾されたＣｐＧサイトが存在し、
好ましくは、前記検出試薬は、プライマー、プローブを含むことを特徴とする試薬又は組み合わせた試薬。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、前記標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １の２４０〜２９６位のヌクレオチドのフラグメントを含み、好ましくは、前記プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９〜１２に示されたプライマーである；又は
前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、前記標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３の２７９〜３２３位のヌクレオチドのフラグメントを含み、好ましくは、前記プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２〜１５に示されたプライマーである；又は
前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、前記標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５の１８６〜２３５位のヌクレオチドのフラグメントを含み、好ましくは、前記プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２、１６〜１８に示されたプライマーである；又は
前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、前記標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の１６４〜１９８位のヌクレオチドのフラグメントを含み、好ましくは、前記プライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２、１９〜２１に示されたプライマーである；
ことを特徴とする請求項８に記載の試薬又は組み合わせた試薬。
【請求項１０】
腫瘍検出用のキットを調製するための、請求項８又は９に記載の試薬又は組み合わせた試薬の使用であって、好ましくは、前記腫瘍が、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍；白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍；皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含む、使用。
【請求項１１】
容器、及び容器に位置する請求項８又は９に記載の試薬又は組み合わせた試薬
を含むことを特徴とする検出キット。
【請求項１２】
（ｉ）試料を提供し、ＤＮＡを抽出するステップと、
（ｉｉ）その中の未修飾のシトシンがウラシルに転化するように、検出しようとする試料を処理し、好ましくは、前記修飾が、５−メチル化修飾、５−ヒドロキシメチル化修飾、５−ホルミル化修飾又は５−カルボキシル化修飾を含み、好ましくは、バイサルファイトでステップ（ｉ）に記載のＤＮＡを処理するステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で処理されたゲノムＤＮＡにおける請求項２又は３に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメントの修飾状況を分析するステップと、
を含むことを特徴とする生体外で試料における請求項１に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメントのメチル化プロファイルを検出する方法。
【請求項１３】
ステップ（３）には、前記分析の方法が、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、ｑＰＣＲ法、次世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、ＤＮＡ濃縮検出法、Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）技術、ＨＰＬＣ法、又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断分野に属し、より具体的に、本発明は、腫瘍を診断するためのＤＮＡメチル化に関連するマーカー及びその使用に関わる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍に関する研究が深まるにつれ、この分野でのますます多くの証拠が、エピジェネティック調節の小さな変化が、腫瘍において重要な役割を果たすことを示している。
【０００３】
エピジェネティクスとは、遺伝子のＤＮＡ配列を変更せずに、遺伝子機能における遺伝可能な変化、及び最終的にもたらされた表現型の変化を研究する学科である。エピジェネティクスには、主にＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、マイクロＲＮＡレベルの変化などの生化学的プロセスが含まれる。ＤＮＡメチル化とは、生体内で、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの触媒作用下で、Ｓ−アデノシルメチオニンをメチルドナーとし、メチル基を特定の塩基に転移させるプロセスを指す。ＤＮＡメチル化は、アデニンのＮ−６位、シトシンのＮ−４位、グアニンのＮ−７位、またはシトシンのＣ−５位などで発生する可能性がある。ただし、哺乳類では、ＤＮＡメチル化は主に５’−ＣｐＧ−３’のＣで発生し、５−メチルシトシン（５ｍＣ）を生成する。
【０００４】
ゲノム内のＣｐＧジヌクレオチドの９８％以上が、転写依存性の転移可能な反復配列に散在している。正常細胞では、これらのＣｐＧは、高メチル化／転写沈黙の状態にあるが、腫瘍細胞では、これらのＣｐＧは広範な脱メチル化を受け、反復配列の転写、トランスポゾンの活性化、および高度なゲノム不安定性と癌原遺伝子の転写の増強をもたらす。全体の約２％を占める残りのＣｐＧは、小さな領域（ＣｐＧアイランド）に密に分布している。遺伝子プロモーター領域の約４０％〜５０％またはその近くに、ＣｐＧアイランドがあり、これは、ＤＮＡメチル化が、このような遺伝子の転写調節メカニズムに関与している可能性があることを示唆している。一部の腫瘍では、これらの元々正常細胞では低メチル化状態にあるＣｐＧアイランドが高メチル化を受け、遺伝子転写が不活性化される。影響を受ける遺伝子には、ＤＮＡ修復遺伝子、細胞周期制御遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、その他の腫瘍抑制遺伝子が含まれる。
【０００５】
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）などの臨床診療で一般的に使用される腫瘍マーカーの高い偽陽性および偽陰性を考慮すると、この分野では、さらに、マーカーを開発することが急務である。腫瘍細胞ＤＮＡの異常なメチル化プロファイルを見つけることは、腫瘍バイオマーカーを研究するための新しい方法である。しかし、腫瘍に確実に関連する異常なメチル化プロファイルを見つけるには、多くの研究と、多数の患者の遺伝子に対する長期的な同定・比較が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的としては、腫瘍を診断するためのＤＮＡメチル化に関連するマーカー及びその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の様態では、以下を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する：
（ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；
（ｂ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；
（ｃ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；
（ｄ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも１個（例えば２〜４０個、より具体的に３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５個）の修飾されたＣｐＧサイトが存在するもの；及び／又は
（ｆ）  上記（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸（アンチセンス鎖）。
【０００８】
一つの好ましい例では、上記の修飾が、５−メチル化修飾（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチル化修飾（５ｈｍＣ）、５−ホルミル化修飾（５−ｆＣ）又は５−カルボキシル化修飾（５−ｃａＣ）を含む。
【０００９】
本発明のもう一つの様態では、上記に記載されたポリヌクレオチドから転換される、前記の（ａ）〜（ｅ）の配列と対応する単離されたポリヌクレオチドを提供し、ただし、修飾されたＣｐＧサイトのシトシンＣが変化しなく、未修飾のシトシンがＴ（Ｕ）に転換する。
一つの好ましい例では、それが、バイサルファイトで処理された前記の（ａ）〜（ｅ）と対応するポリヌクレオチドから転換されてなる。
【００１０】
好ましい例のもう一つにおいて、上記のポリヌクレオチドは、
（ｇ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；
（ｈ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；
（ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；
（ｊ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；
（ｋ）上記（ｇ）〜（ｊ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも１個（例えば２〜４０個、より具体的に３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５個）の修飾されたＣｐＧサイトが存在するものを含む。
【００１１】
本発明のもう一つの様態では、腫瘍検出用の試薬又はキットを調製するための、前記のいずれか一つに記載されたポリヌクレオチドの用途を提供する。
【００１２】
一つの好ましい例では、上記の腫瘍が、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍；白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍；皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含む。
【００１３】
本発明のもう一つの様態では、腫瘍検出試薬を調製する方法を提供し、上記の方法が、以下を含む：前記のいずれか一つに記載された（例えば１、２、３、４本の）ポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、当該標的配列を特異的に検出する検出試薬をデザインする；ただし、上記の標的配列には、少なくとも１個（例えば２〜４０個、より具体的に３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５個）の修飾されたＣｐＧサイトが存在する；好ましくは、上記の検出試薬が、プライマー、プローブを含むが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明のもう一つの様態では、試薬又は組み合わせた試薬を提供し、それが、標的配列を特異的に検出し、上記の標的配列は、前記のいずれか一つに記載されたポリヌクレオチドの全長又はフラグメントであり、かつその中に少なくとも１個の（例えば２〜４０個、より具体的に３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５個）修飾されたＣｐＧサイトが存在する；好ましくは、上記の検出試薬が、プライマー、プローブを含むが、これらに限定されない。
【００１５】
一つの好ましい例では、上記のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、上記の標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １の２４０〜２９６位のヌクレオチドのフラグメントを含む；好ましくは、上記のプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９〜１２に示されたプライマーである。
【００１６】
もう一つの好ましい例では、上記のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、上記の標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３の２７９〜３２３位のヌクレオチドのフラグメントを含む；好ましくは、上記のプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２〜１５に示されたプライマーである；又は
【００１７】
もう一つの好ましい例では、上記のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、上記の標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５の１８６〜２３５位のヌクレオチドのフラグメントを含む；好ましくは、上記のプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２、１６〜１８に示されたプライマーである；又は
【００１８】
もう一つの好ましい例では、上記のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、上記の標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の１６４〜１９８位のヌクレオチドのフラグメントを含む；好ましくは、上記のプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２、１９〜２１に示されたプライマーである。
【００１９】
本発明のもう一つの様態では、上記の試薬又は組み合わせた試薬の、腫瘍を検出するためのキットの調製における用途を提供する；好ましくは、上記の腫瘍が、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍；白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍；皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含む。
【００２０】
本発明のもう一つの様態では、以下を含む検出キットを提供する：
容器、及び容器に位置する前記の試薬又は試薬の組み合わせ；好ましくは、各試薬は別々の容器に位置する。
【００２１】
一つの好ましい例では、上記のキットは、さらに、バイサルファイト、ＤＮＡ精製試薬、ＤＮＡ抽出試薬、ＰＣＲ増幅試薬及び／又はユーザーマニュアル（検出操作ステップと結果判定標準を表示するもの）を含む。
【００２２】
本発明のもう一つの様態では、生体外で試料における上記のポリヌクレオチド又はそのフラグメントのメチル化プロファイルを検出する方法を提供し、上記の方法が、以下を含む：
（ｉ）試料を提供し、ＤＮＡを抽出すること；
（ｉｉ）その中の未修飾のシトシンがウラシルに転化するように、検出しようとする試料を処理する；好ましくは、上記の修飾が、５−メチル化修飾（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチル化修飾（５ｈｍＣ）、５−ホルミル化修飾又は５−カルボキシル化修飾を含む；好ましくは、バイサルファイトでステップ（ｉ）に記載されたＤＮＡを処理すること；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で処理されたゲノムＤＮＡにおける上記のポリヌクレオチド又はそのフラグメントの修飾状況を分析すること。
【００２３】
一つの好ましい例では、上記のメチル化プロファイル異常とは、当該ポリヌクレオチドＣｐＧにおけるＣが、高度にメチル化されることを意味する。
【００２４】
もう一つの好ましい例では、上記のメチル化プロファイルの方法は、疾患の診断結果を直接取得することを目的としたものではなく、診断的な方法ではない。
【００２５】
もう一つの好ましい例では、ステップ（３）には、分析する方法が、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、ｑＰＣＲ法、次世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、ＤＮＡ濃縮検出法、Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）技術、ＨＰＬＣ法、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００２６】
本文に開示された内容に基づき、当業者にとって、本発明の他の面は自明なものである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】結腸直腸がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｆの検出結果。
【図２】肝臓がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｆの検出結果。
【図３】頭頸部腫瘍におけるＣＴＳＭ−４Ｆの検出結果。
【図４】肺がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｆの検出結果。
【図５】乳がんにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥの検出結果。
【図６】頭頸部腫瘍におけるＣＴＳＭ−２ＢＥの検出結果。
【図７】肺がんにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥの検出結果。
【図８】膵臓がんにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥの検出結果。
【図９】結腸直腸がんにおけるＣＴＳＭ−３Ｃの検出結果。
【図１０】頭頸部がんにおけるＣＴＳＭ−３Ｃの検出結果。
【図１１】肺がんにおけるＣＴＳＭ−３Ｃの検出結果。
【図１２】乳がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｉの検出結果。
【図１３】結腸直腸がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｉの検出結果。
【図１４】頭頸部がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｉの検出結果。
【図１５】肺がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｉの検出結果。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明者らは、腫瘍マーカーの研究に取り組んで、広範な研究とスクリーニングの上に、ゲノムに異常なＤＮＡメチル化がある遺伝子配列領域を特定し、腫瘍マーカーであるＣＴＳＭ−４Ｆ、ＣＴＳＭ−２ＢＥ、ＣＴＳＭ−３Ｃ、ＣＴＳＭ−４Ｉと名付けた。臨床サンプルに関する研究は、これらの配列領域のメチル化状態が腫瘍組織と非腫瘍組織の間で有意差があり、それらのＣｐＧが高度にメチル化されていることを示している。したがって、これらの遺伝子は腫瘍マーカーであり、腫瘍診断試薬を設計するための基礎として使用できる。
【００２９】
用語
本明細書で使用される場合、「単離」とは、物質をその元の環境から単離することを指す（天然物質である場合、元の環境は自然環境である）。例えば、生細胞において、自然状態にあるポリヌクレオチドとポリペプチドは、単離・精製されないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然状態で共存する他の物質から単離される場合、それは単離・精製されるものである。
本明細書で使用される場合、「サンプル」または「試料」は、任意の個体または単離された組織、細胞、または体液から得られる、ＤＮＡメチル化状態の検出に適した物質を含む。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「高（度）メチル化」は、遺伝子配列におけるＣｐＧの高度的なメチル化、ヒドロキシメチル化、ホルミル化またはカルボキシル化修飾の存在を指す。たとえば、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）分析法の観点から、メチル化特異的プライマーを使用したＰＣＲ反応では、陽性のＰＣＲ結果が得られると、テスト対象のＤＮＡ（遺伝子）領域が高メチル化状態にあることを意味する。例えば、リアルタイム定量的メチル化特異的ＰＣＲの場合、高メチル化状態の判定は、コントロール試料のメチル化状態の相対値に基づく統計的差異について分析することができる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、上記の腫瘍が、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍；白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍；皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含むが、これらに限定されない。
【００３２】
遺伝子マーカー
腫瘍の診断のための有用な標的を見つけるために、本発明者らは、広範囲かつ詳細な研究を経て、最終に、一連の遺伝子配列領域であるＣＴＳＭ−４Ｆ、ＣＴＳＭ−２ＢＥ、ＣＴＳＭ−３Ｃ、ＣＴＳＭ−４Ｉを見つけた。これらの遺伝子配列領域のメチル化状態が、腫瘍組織と非腫瘍組織では有意差があるので、上記遺伝子のいずれかのプロモーター領域に異常なメチル化状態（高メチル化）が検出されると、当該受検者が、がんのハイリスクグループであることを判定できる。
そして、本発明が、単離されたポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドは、ヒトゲノムから由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７に示されたヌクレオチド配列を有し、腫瘍患者の腫瘍細胞において、当該ポリヌクレオチド配列の複数箇所の５’−ＣｐＧ−３’の塩基Ｃポジションに、５−メチルシトシン（５ｍＣ）が生成される。本発明が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつ少なくとも１個（例えば２〜４０個、より具体的に３、５、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５個）のメチル化ＣｐＧサイトが存在するものも含む。上記のポリヌクレオチド又はフラグメント又は相補鎖（アンチセンス鎖）は、検出試薬又は検出キットのデザインに用いられても良い。
【００３３】
上記のポリヌクレオチドは、メチル化状態を分析するためのゲノムの重要な領域として使用することができ、それらのメチル化状態は、当技術分野で既知された様々な技術によって分析することができる。メチル化状態を分析するために使用することができる任意の技術を本発明に適用することができる。
【００３４】
上記のポリヌクレオチドをバイサルファイトで処理した後に、メチル化されないシトシンは、ウラシルに転化され、メチル化されたシトシンは、変化しない。
【００３５】
そして、本発明が、上記ポリヌクレオチド（それと相補する鎖（アンチセンス鎖）を含む）をバイサルファイトで処理して得るポリヌクレオチドも提供し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、検出試薬又は検出キットのデザインに用いられても良い。
【００３６】
本発明が、上記ポリヌクレオチド（その相補鎖（アンチセンス鎖）を含む）をバイサルファイトで処理して得るポリヌクレオチドのフラグメントも含み、ただし、少なくとも１個のメチル化ＣｐＧサイトが存在する。
【００３７】
検出試薬及キット
本発明の新たな発見に基づき、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出するための、ポリヌクレオチド配列に基づいてデザインされた検出試薬も提供する。本分野に既知された確定なゲノムの配列とメチル化状態の検出方法と試薬は、いずれも本発明に適用できる。
【００３８】
そして、本発明が、腫瘍検出試薬を調製する方法を提供し、以下を含む：（例えば１、２、３、４本の）上記のポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、当該標的配列を特異的に検出する検出試薬をデザインする；ただし、上記の標的配列には、少なくとも１個のメチル化ＣｐＧサイトが存在する。
【００３９】
本発明の好ましい形態において、上記の標的配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １の２４０〜２９６位のヌクレオチドのフラグメントを含む；或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３の２７９〜３２３位のヌクレオチドのフラグメントを含む；或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５の１８６〜２３５位のヌクレオチドのフラグメントを含む；好ましくは、上記のプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２、１６〜１８に示されたプライマーである；或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の１６４〜１９８位のヌクレオチドのフラグメントを含む。
【００４０】
上記の検出試薬が、プライマー、プローブなどを含むが、これらに限定されない。
【００４１】
上記の試薬は、例えばプライマーペアであり、ポリヌクレオチドの配列を知っている場合、プライマーのデザインは当業者に既知されたものであり、２つのプライマーが、増幅される標的遺伝子の特定の配列の両側に隣接している（ＣｐＧ配列を含み、その中のＣｐＧと相補するのは、元のメチル化された遺伝子領域を標的とするものであり、その中のＴｐＧと相補するのは、元の脱メチル化された遺伝子領域を標的とするものである）。
【００４２】
上記の試薬は、試薬の組み合わせ（プライマー組み合わせ）であっても良く、複数グループのプライマーを含み、複数の上記ポリヌクレオチドを別々に増幅することができる。
【００４３】
本発明の好ましい形態として、上記のプライマーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９〜１２に示されたプライマーである；或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２〜１５に示されたプライマーである；或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２、１６〜１８に示されたプライマーである；或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２、１９〜２１に示されたプライマーである。上記のプライマーはネステッドＰＣＲに使用するプライマーであり、２回のＰＣＲ増幅反応で得られた増幅産物を、配列の同定に使用される。上記のプライマーで増幅することにより得られた産物は、適切な長さと高い特異性を有し、複雑なシステムの増幅にも優れた特異性を有し、メチル化特異的ＰＣＲに特に適している。
【００４４】
本発明が、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出するキットも提供し、当該キットが、容器、及び容器に位置する上記のプライマーペアを含む。
また、上記のキットには、さらに、ＤＮＡの抽出、ＤＮＡの精製、ＰＣＲ増幅などに必要な様々な試薬も含んでも良い。
【００４５】
さらに、上記のキットは、当業者の使用を便利にするための、検出操作ステップおよび結果判断基準を示すユーザーマニュアルを含むことができる。
【００４６】
検出方法
ポリヌクレオチドのメチル化プロファイルは、既存の技術（例えばメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）またはリアルタイム定量的メチル化特異的ＰＣＲ、Ｍｅｔｈｙｌｉｇｈｔ）、または開発中と開発予定の他の技術によって測定することができる。
【００４７】
定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）を使用して、メチル化レベルを検出することもできる。この方法は、ＭＳＰ法よりも感度の高い、蛍光ＰＣＲの連続光学モニタリングに基づくものである。それが高いスループットを有し、かつその結果を分析するための電気泳動の使用を避ける。
【００４８】
他の使用できる技術は、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、ｑＰＣＲ法、次世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、ＤＮＡ濃縮検出法、Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）技術、ＨＰＬＣ法、及び組み合わせた遺伝子グループ検出法などの、当技術分野の通常方法がある。本発明の新たな開示に基づいて、当技術分野で公知されたこれらの技術ならびに開発しようとする技術は、いずれも本発明に適用できることを理解すべきである。
【００４９】
本発明の好ましい様態として、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出する方法も提供する。上記の方法は、以下の原理に基づくものである：バイサルファイトは、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換でき、その後のＰＣＲ増幅プロセスでチミンに変換されるが、メチル化されたシトシンは変化しない；したがって、ポリヌクレオチドをバイサルファイトで処理した後、メチル化されたサイトには、Ｃ／Ｔのようなポリヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が生成される。上記の原理に基づいて試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出すると、メチル化シトシンと非メチル化シトシンを効果的に区別できる。
本発明に記載された方法が、以下を含む：（ａ）試料を提供し、ゲノムＤＮＡを抽出する；（ｂ）バイサルファイトでステップ（ａ）のゲノムＤＮＡを処理し、ゲノムＤＮＡにおけるメチル化されていないシトシンをウラシルに転化する；（ｃ）ステップ（ｂ）で処理されたゲノムＤＮＡにメチル化プロファイル異常の存在の有無を分析する。
【００５０】
本発明の方法は、（ｉ）受験者の試料に検出を行い、受験者が腫瘍を罹患しているかどうかを分析すること；（ｉｉ）腫瘍のハイリスクグループを区別することに用いられても良い。上記の方法は、直接的な疾患診断結果を得ることを目的としない状況でもあり得る。
【００５１】
本発明の好ましい実施例において、ＤＮＡメチル化は、ＰＣＲ増幅およびパイロシーケンシングによって検出されるが、当業者は、実際の使用には、当該方法に限定されず、他のＤＮＡメチル化検出方法も可能であることを理解すべきである。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、実施例で提供されるものに限定されない。
【００５２】
本発明の好ましい実施例において、ゲノムＤＮＡはバイサルファイトで処理された後に、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、その後のＰＣＲプロセスでチミンに変換されることが、ゲノムの配列の複雑さを軽減するので、ＰＣＲによる特定の標的フラグメントの増幅がより困難になる。本発明者らは、ネステッドＰＣＲ増幅を採用し、外周と内周に２ペアのプライマーをデザインし、２回のＰＣＲ増幅反応を行ってもよく、１回目の増幅産物を２回目の増幅のテンプレートとして使用し、増幅の効率と特異性を効果的に改善することができることを見出す。本発明で利用可能な検出方法はこれに限定されないことを理解すべきである。
【００５３】
臨床サンプルに関する研究および検証によって、本発明の方法は、臨床腫瘍の診断に使用される場合、非常に高い精度と、高い臨床使用価値を有する。
【００５４】
以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ、２００２に記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。
【００５５】
実施例１、腫瘍マーカーＣＴＳＭ−４Ｆ
一、検出配列に対する説明
この実施例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示されるＣＴＳＭ−４Ｆ腫瘍マーカーの配列を提供し、ただし、ボックスによって示される塩基は潜在的なメチル化ＣｐＧサイトであり、最適な検出領域は中央の下線が引かれた領域である。
【００５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、以下に示される：
CGCCCAGTAAGTTACGGAAAAGGCGGAGACAGAGGTTTCGTTCCCGCCCCTCCAATTCAGTCTCCAAAAAGGTCCGCATAATTGATATATAAGGGGCTTCAGTGTGTAGCAAAGTTGCAAAAGTTAAGAGTTGTTGTTTGTCTTCGATCATGTCTGGTAGAGGCAAAGGTGGTAAAGGTTTAGGAAAGGGAGGCGCCAAGCGCCATCGCAAAGTGCTGCGTGACAACATACAGGGCATCACGAAGCCCGCCATCCGTCGCTTGGCCCGACGCGGCGGCGTGAAACGCATTTCGGGCCTCATTTATGAGGAGACCCGCGGTGTTCTTAAGGTGTTCCTGGAGAATGTGATACGGGACGCCGTAACCTACACGGAGCACGCCAAGCGTAAGACAGTCACTGCAATGGATGTTGTCTACGCGCTCAAGCGCCAGGGACGCACTCTGTACGGCTTTGGTGGCTGAGCCTCACCCCGGCTTTTTATTTAACAGCTCACCCATAAAAGGCCCTTTTCAGGGCCACCTCCTTCGTCACACGAAGGGCTGTAACTGATGACGACTTGGGTTTCGTTTTGTAAATTTGGGATTCTAACTGAGTTAAACCGAGCCGTTTTTAGCGATCTTCCTAAGATGGCGGATGTGCTAAGGAGAAAGGGAAGGCGAAACATTAGAAACTTGTTCAGGTATTTCGATCGCAAACATT
【００５７】
二、検出ステップ
１、検出しようとするサンプルの入手：がん組織及び相応する腫瘍随伴コントロール組織を含む臨床組織サンプルを選択した。
【００５８】
２、ＤＮＡ抽出：一般的なフェノールクロロホルムで検出しようとするサンプルのゲノムＤＮＡを抽出した。
【００５９】
３、パイロシーケンス法でＤＮＡのメチル化を検出し、ＤＮＡメチル化の検出ステップは、以下に示された：
【００６０】
（１）  バイサルファイト処理操作：５〜２００ｎｇの上記の抽出で得られたゲノムＤＮＡに対し、バイサルファイト処理を行って、本ステップには、ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ会社のＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ（TM）  Ｋｉｔキット（商品番号Ｄ５００６）を使用し、ユーザーマニュアルに従って厳密に操作し、最後に２０ｕｌの溶離液で溶出し、その後のＰＣＲ増幅のテンプレートとした。
【００６１】
（２）バイサルファイト処理の後に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２を得、ただし、ＹはＣ（シトシン）またはＴ（チミン）を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対応し、元のメチル化修飾シトシンＣは変化せず、元の非メチル化修飾シトシンはＴ（Ｕ）に変換されるため、ＹはＣまたはＴを表す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、以下に示される：
YGTTTAGTAAGTTAYGGAAAAGGYGGAGATAGAGGTTTYGTTTTYGTTTTTTTAATTTAGTTTTTAAAAAGGTTYGTATAATTGATATATAAGGGGTTTTAGTGTGTAGTAAAGTTGTAAAAGTTAAGAGTTGTTGTTTGTTTTYGATTATGTTTGGTAGAGGTAAAGGTGGTAAAGGTTTAGGAAAGGGAGGYGTTAAGYGTTATYGTAAAGTGTTGYGTGATAATATATAGGGTATTAYGAAGTTYGTTATTYGTYGTTTGGTTYGAYGYGGYGGYGTGAAAYGTATTTYGGGTTTTATTTATGAGGAGATTYGYGGTGTTTTTAAGGTGTTTTTGGAGAATGTGATAYGGGAYGTYGTAATTTATAYGGAGTAYGTTAAGYGTAAGATAGTTATTGTAATGGATGTTGTTTAYGYGTTTAAGYGTTAGGGAYGTATTTTGTAYGGTTTTGGTGGTTGAGTTTTATTTYGGTTTTTTATTTAATAGTTTATTTATAAAAGGTTTTTTTTAGGGTTATTTTTTTYGTTATAYGAAGGGTTGTAATTGATGAYGATTTGGGTTTYGTTTTGTAAATTTGGGATTTTAATTGAGTTAAATYGAGTYGTTTTTAGYGATTTTTTTAAGATGGYGGATGTGTTAAGGAGAAAGGGAAGGYGAAATATTAGAAATTTGTTTAGGTATTTYGATYGTAAATATT
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２に基づき、ネステッドＰＣＲ及びパイロシーケンスの特徴によって、増幅プライマーとシーケンシングプライマーのセットを提供し、表１に示された（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２の二重下線または太字の配列に対応する）：
【表１】
2021532823.tif 000002
【００６２】
（３）ネステッドＰＣＲ増幅：使用されたＰＣＲ増幅試薬は、莱楓会社製の２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ試薬（商品番号はＰＴ１０２である）が、この試薬に限定されない。
１回目のＰＣＲ増幅システム：
【表２】
2021532823.tif 000003
１回目のＰＣＲ増幅プログラム：
【表３】
2021532823.tif 000004
１回目のＰＣＲ増幅が完了した後、１回目のＰＣＲ増幅の産物をテンプレートとし、２回目のＰＣＲ増幅を行い、そのシステムは次のとおり：
【表４】
2021532823.tif 000005
２回目の増幅プログラムは次のとおり：
【表５】
2021532823.tif 000006
【００６３】
（４）アガロースゲル電気泳動：ＰＣＲ増幅産物の特異性を確認するために、アガロースゲル電気泳動で同定した結果として、増幅産物の長さは１７７ｂｐであるはず。
【００６４】
（５）パイロシーケンス：ＱＩＡＧＥＮ会社が製造したパイロシーケンスマシンを使用し、特定の手順に従って、標的領域の各ＣｐＧサイトのメチル化値を検出した。
【００６５】
（６）分析と計算：パイロシーケンスステップによって、１１個のＣｐＧサイトのメチル化値を検出し、それらの平均値を、サンプルの該領域内の最終的なメチル化値とした。ここで、平均値法を使用したが、加算や中央値などの他の計算方法も使用できる。
【００６６】
三、結果の分析
サンプルのメチル化値を分析することにより、腫瘍サンプルとコントロールサンプルを効果的に区別することができ、コントロールサンプルでは、ＣＴＳＭ−４Ｆは低メチル化状態にあり、腫瘍サンプルでは、ＣＴＳＭ−４Ｆは高メチル化状態にある。
【００６７】
四、臨床試験と分析
１、直腸がんの検出と分析
病院から得られた直腸がんに診断されたサンプルから、ランダムに４つの結腸直腸がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【００６８】
上記のステップ二〜三の方法を採用し、上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【００６９】
図１に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−４Ｆのメチル化は、結腸直腸がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、結腸直腸がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｆは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた結腸直腸がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００７０】
２、肝臓がんの検出と分析
病院から得られた肝臓がんに診断されたサンプルから、ランダムに８つの肝臓がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【００７１】
上記のステップ二〜三の方法を採用し、上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【００７２】
図２に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−４Ｆのメチル化は、肝臓がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、肝臓がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｆは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた肝臓がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００７３】
３、頭頸部腫瘍の検出と分析
病院から得られた頭頸部腫瘍に診断されたサンプルから、ランダムに５つの頭頸部腫瘍サンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【００７４】
上記のステップ二〜三の方法を採用し、上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【００７５】
図３に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−４Ｆのメチル化は、頭頸部腫瘍サンプルのメチル化よりも有意に低かったが、頭頸部腫瘍におけるＣＴＳＭ−４Ｆは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた頭頸部腫瘍マーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００７６】
４、肺がんの検出と分析
病院から得られた肺がんに診断されたサンプルから、実験グループとして、ランダムに５つの肺がん血漿サンプルを選択し、コントロールグループとして、５つの正常なヒト血漿サンプルを選択した。
【００７７】
上記のステップ二〜三の方法を採用し、上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【００７８】
図４に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−４Ｆのメチル化は、実験グループのメチル化よりも有意に低かったが、肺がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｆは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた肺がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００７９】
実施例２、腫瘍マーカーＣＴＳＭ−２ＢＥ
一、検出配列に対する説明
この実施例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるＣＴＳＭ−２ＢＥ腫瘍マーカーの配列を提供し、ただし、ボックスによって示される塩基は潜在的なメチル化ＣｐＧサイトである。最適な検出領域は中央の下線が引かれた領域である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３は、以下に示される：
AGCTGTTTGTTAAATAGGCTTTCATTTTAATTTTTTAAAAAATATTTTCACTAGTTAGACGGAATATTTATTTCTGATCCTCGTTGTAGGGCTAAACTAGGTGTGACTTGCTTTTCCATTAAGGACTGTAGCCATTTTGGCTAAGAAAGTCTTTCCTGTCTTAGCTCTCTTCAAGAGATGCTATTTACTTTTTTGTTGTTGTTTTCTCCGGAGCTTTATTGCCTACCCTTTATTTTCACGATGTGTTTGTGCATTCTGTAAAAAGTGGGAAACACTGTTCTCCGGATTGTGTGGGTGATCGCCGGTCGCCTAGCTTGCCGTTCTTCAGGTATCTCCTGCTGCTCCAGAATCTACATCTGAATGTCAAGGCATAGCTTTTCCAGGAGCTTTTAAACCGACCTTTCAATTCGAAGACGTAACTGCGCCAGGAGCTTTGTCTCCCTGGCATATAAAAGCATAGAAGAGAGCAACTTCTGGTTTTTAAAATAAGTAAACTAATCTGAATTGTTTGCAATGGTAGGAACTTGTTATATAAAATGTTAATTAGGTGGCCCGTGCTCGAAAACTGCTCTCAGGATATGACCAATGGGAGAGTAGACCTAAGCTCCTTCATTTGCATGCAGA
【００８０】
バイサルファイト処理の後に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４を得、ただし、ＹはＣ（シトシン）またはＴ（チミン）を表す。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４は、以下に示される：
AGTTGTTTGTTAAATAGGTTTTTATTTTAATTTTTTAAAAAATATTTTTATTAGTTAGAYGGAATATTTATTTTTGATTTTYGTTGTAGGGTTAAATTAGGTGTGATTTGTTTTTTTATTAAGGATTGTAGTTATTTTGGTTAAGAAAGTTTTTTTTGTTTTAGTTTTTTTTAAGAGATGTTATTTATTTTTTTGTTGTTGTTTTTTTYGGAGTTTTATTGTTTATTTTTTATTTTTAYGATGTGTTTGTGTATTTTGTAAAAAGTGGGAAATATTGTTTTTYGGATTGTGTGGGTGATYGTYGGTYGTTTAGTTTGTYGTTTTTTAGGTATTTTTTGTTGTTTTAGAATTTATATTTGAATGTTAAGGTATAGTTTTTTTAGGAGTTTTTAAATYGATTTTTTAATTYGAAGAYGTAATTGYGTTAGGAGTTTTGTTTTTTTGGTATATAAAAGTATAGAAGAGAGTAATTTTTGGTTTTTAAAATAAGTAAATTAATTTGAATTGTTTGTAATGGTAGGAATTTGTTATATAAAATGTTAATTAGGTGGTTYGTGTTYGAAAATTGTTTTTAGGATATGATTAATGGGAGAGTAGATTTAAGTTTTTTTATTTGTATGTAGA
【００８１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に基づき、ネステッドＰＣＲ及びパイロシーケンスの特徴によって、増幅プライマーとシーケンシングプライマーのセットを提供し、表２に示された。
【表６】
2021532823.tif 000007
上記のプライマーを採用し、実施例１と同じ方法で検出しようとするサンプルのＤＮＡを抽出し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ増幅、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【００８２】
二、臨床試験と分析
１、乳がんの検出と分析
病院から得られた乳がんを診断されたサンプルから、ランダムに８つの乳がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
図５に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥのメチル化は、乳がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、乳がんにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた乳がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００８３】
２、頭頸部腫瘍の検出と分析
病院から得られた頭頸部腫瘍を診断されたサンプルから、ランダムに６つの頭頸部腫瘍サンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
図６に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥのメチル化は、頭頸部腫瘍サンプルのメチル化よりも有意に低かったが、頭頸部腫瘍におけるＣＴＳＭ−２ＢＥは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた頭頸部腫瘍マーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００８４】
３、肺がんの検出と分析
病院から得られた肺がんを診断されたサンプルから、ランダムに８つの肺がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
図７に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥのメチル化は、肺がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、肺がんにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた肺がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００８５】
４、膵臓がんの検出と分析
病院から得られた膵臓がんを診断されたサンプルから、ランダムに８つの膵臓がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
図８に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥのメチル化は、膵臓がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、膵臓がんにおけるＣＴＳＭ−２ＢＥは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた膵臓がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００８６】
実施例３、腫瘍マーカーＣＴＳＭ−３Ｃ
一、検出配列に対する説明
この実施例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるＣＴＳＭ−３Ｃ腫瘍マーカーの配列を提供し、ただし、ボックスによって示される塩基は潜在的なメチル化ＣｐＧサイトである。最適な検出領域は中央の下線が引かれた領域である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５は、以下に示される：
TGGGGCAACTCATCCAATAAGATTGTCTAGTAATGAACCAATCAGTCTGGTCACTCTTCAGCCAATGATTTTATCGCGCGGGACTTTTGAAATATTACAGGACCAATCAGAATGTTTCTCACTATATTTAAAGGCCACTTGCTCTCAGTTCACTACACTTTTGTGTGTGCTCTCATTGCAAATGGCTCGTACGAAGCAAACAGCTCGCAAGTCTACCGGCGGCAAAGCTCCGCGCAAGCAGCTTGCTACTAAAGCAGCCCGTAAGAGCGCTCCGGCCACCGGTGGCGTGAAGAAACCTCATCGCTACCGCCCGGGCACCGTGGCCTTGCGCGAAATCCGTCGCTACCAGAAGTCCACCGAGCTGCTGATCCGGAAGCTGCCGTTCCAGCGCCTGGTGCGAGAAATCGCCCAGGACTTCAAAACCGACCTGCGTTTCCAGAGCTCTGCGGTGATGGCGCTGCAGGAGGCTTGTGAGGCCTACCTGGTGGGACTCTTCGAAGACACCAATCTGTGCGCTATTCACGCTAAACGCGTCACCATCATGCCCAAAGATATCCAGCTGGCACGTCGCATCCGTGGGGAAAGGGCATAAGTCTGCCCGTTTCTTCCTCATTGAAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACTCACAATTTCACTTAAAAACAGTTGTAACCCA
【００８７】
バイサルファイト処理の後に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を得、ただし、ＹはＣ（シトシン）またはＴ（チミン）を表す：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６は、以下に示される：
TGGGGTAATTTATTTAATAAGATTGTTTAGTAATGAATTAATTAGTTTGGTTATTTTTTAGTTAATGATTTTATYGYGYGGGATTTTTGAAATATTATAGGATTAATTAGAATGTTTTTTATTATATTTAAAGGTTATTTGTTTTTAGTTTATTATATTTTTGTGTGTGTTTTTATTGTAAATGGTTYGTAYGAAGTAAATAGTTYGTAAGTTTATYGGYGGTAAAGTTTYGYGTAAGTAGTTTGTTATTAAAGTAGTTYGTAAGAGYGTTTYGGTTATYGGTGGYGTGAAGAAATTTTATYGTTATYGTTYGGGTATYGTGGTTTTGYGYGAAATTYGTYGTTATTAGAAGTTTATYGAGTTGTTGATTYGGAAGTTGTYGTTTTAGYGTTTGGTGYGAGAAATYGTTTAGGATTTTAAAATYGATTTGYGTTTTTAGAGTTTTGYGGTGATGGYGTTGTAGGAGGTTTGTGAGGTTTATTTGGTGGGATTTTTYGAAGATATTAATTTGTGYGTTATTTAYGTTAAAYGYGTTATTATTATGTTTAAAGATATTTAGTTGGTAYGTYGTATTYGTGGGGAAAGGGTATAAGTTTGTTYGTTTTTTTTTTATTGAAAAGGTTTTTTTTAGAGTTATTTATAATTTTATTTAAAAATAGTTGTAATTTA
【００８８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に基づき、ネステッドＰＣＲ及びパイロシーケンスの特徴によって、増幅プライマーとシーケンシングプライマーのセットを提供し、表３に示された。
【表７】
2021532823.tif 000008
上記のプライマーを採用し、実施例１と同じ方法で検出しようとするサンプルのＤＮＡを抽出し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ増幅、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【００８９】
二、臨床試験と分析
１、結腸直腸がんの検出と分析
病院から得られた結腸直腸がんを診断されたサンプルから、ランダムに９つの結腸直腸がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【００９０】
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【００９１】
図９に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−３Ｃのメチル化は、結腸直腸がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、結腸直腸がんにおけるＣＴＳＭ−３Ｃは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた結腸直腸がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００９２】
２、頭頸部がんの検出と分析
病院から得られた頭頸部がんを診断されたサンプルから、ランダムに５つの頭頸部がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【００９３】
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【００９４】
図１０に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−３Ｃのメチル化は、頭頸部がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、頭頸部がんにおけるＣＴＳＭ−３Ｃは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた頭頸部がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００９５】
３、肺がんの検出と分析
病院から得られた肺がんを診断されたサンプルから、ランダムに６つの肺がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【００９６】
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【００９７】
図１１に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−３Ｃのメチル化は、肺がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、肺がんにおけるＣＴＳＭ−３Ｃは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた肺がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【００９８】
実施例４、腫瘍マーカーＣＴＳＭ−４Ｉ
一、検出配列に対する説明
この実施例では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示されるＣＴＳＭ−４Ｉ腫瘍マーカーの配列を提供し、ただし、ボックスによって示される塩基は潜在的なメチル化ＣｐＧサイトである。最適な検出領域は中央の下線が引かれた領域である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、以下に示される：
TACCCATAAAAGAAAGCTGCCATCACAGGCAGCAGACCTTTGTTCTCTGACCACTTGATAATGTCAGGACGCGGCAAAGGAGGTAAGGGCCTGGGGAAAGGGGGTGCCAAGCGCCACCGCAAGGTGCTGCGCGACAACATCCAGGGTATCACCAAGCCAGCCATTCGGCGCCTTGCTCGCCGCGGCGGCGTGAAGCGCATTTCTGGCCTCATCTATGAGGAGACCCGCGGAGTGTTGAAGGTGTTCCTGGAGAACGTGATCCGGGACGCCGTGACCTACACGGAGCACGCCAAGCGCAAGACGGTCACCGCCATGGACGTGGTCTACGCGCTCAAGCGCCAGGGCCGCACCCTCTATGGCTTCGGCGGCTAAAT
【００９９】
バイサルファイト処理の後に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を得、ただし、ＹはＣ（シトシン）またはＴ（チミン）を表す：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、以下に示される：
TATTTATAAAAGAAAGTTGTTATTATAGGTAGTAGATTTTTGTTTTTTGATTATTTGATAATGTTAGGAYGYGGTAAAGGAGGTAAGGGTTTGGGGAAAGGGGGTGTTAAGYGTTATYGTAAGGTGTTGYGYGATAATATTTAGGGTATTATTAAGTTAGTTATTYGGYGTTTTGTTYGTYGYGGYGGYGTGAAGYGTATTTTTGGTTTTATTTATGAGGAGATTYGYGGAGTGTTGAAGGTGTTTTTGGAGAAYGTGATTYGGGAYGTYGTGATTTATAYGGAGTAYGTTAAGYGTAAGAYGGTTATYGTTATGGAYGTGGTTTAYGYGTTTAAGYGTTAGGGTYGTATTTTTTATGGTTTYGGYGGTTAAAT
【０１００】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に基づき、ネステッドＰＣＲ及びパイロシーケンスの特徴によって、増幅プライマーとシーケンシングプライマーのセットを提供し、表４に示された。
【表８】
2021532823.tif 000009
【０１０１】
二、臨床試験と分析
１、乳がんの検出と分析
病院から得られた乳がんを診断されたサンプルから、ランダムに４つの乳がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【０１０２】
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【０１０３】
図１２に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−４Ｉのメチル化は、乳がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、乳がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｉは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた乳がんマーカーとして使用できる。
【０１０４】
２、結腸直腸がんの検出と分析
病院から得られた結腸直腸がんを診断されたサンプルから、ランダムに５つの結腸直腸がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【０１０５】
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【０１０６】
図１３に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−４Ｉのメチル化は、結腸直腸がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、結腸直腸がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｉは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた結腸直腸がんマーカーとして使用できる。
【０１０７】
３、頭頸部がんの検出と分析
病院から得られた頭頸部がんを診断されたサンプルから、ランダムに６つの頭頸部がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【０１０８】
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【０１０９】
図１４に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−４Ｉのメチル化は、頭頸部がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、頭頸部がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｉは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた頭頸部がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【０１１０】
４、肺がんの検出と分析
病院から得られた肺がんを診断されたサンプルから、ランダムに７つの肺がんサンプルを選択し、相応する腫瘍随伴組織をコントロールサンプルとした。
【０１１１】
上記のサンプルのＤＮＡを取得し、バイサルファイト処理、ネステッドＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、パイロシーケンスを行い、ＣｐＧサイトのメチル化値を分析・計算した。
【０１１２】
図１５に示されたように、結果は、コントロールサンプルにおけるＣＴＳＭ−４Ｉのメチル化は、肺がんサンプルのメチル化よりも有意に低かったが、肺がんにおけるＣＴＳＭ−４Ｉは、著しく異常に高メチル化され、非常に優れた肺がんマーカーとして使用できる。さらに拡大された臨床サンプルも同じ有意性を示した。
【０１１３】
本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの均等な形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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