(57)【要約】  マイクロ流体システムは、未処理の卵胞液などの、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）を含む液体試料を、自動的かつ連続的な様式にて処理して、周囲を覆っている卵丘細胞から分離されたまたは「裸化された」卵母細胞を生成するように構成される。当該システムは、基体と、２つ以上のサブチャネルを有してよいチャネルとを含む。各チャネルは、入口、出口、および直列に配置された１つ以上のステージを含む。各ステージは、１つ以上の拡張ユニットと１つ以上のくびれユニットとを含む。少なくとも１つのステージは、ＣＯＣから卵丘細胞を除去するのを助けるぎざぎざの内側表面（たとえば、歯）を有するくびれユニットを含む。
2021520785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムであって、
基体と、
入口、出口、および前記入口と前記出口との間に直列に配置された１つ以上のステージを備えるチャネルとを備え、
各ステージは、次のステージと流体接続しており、
各ステージは、１つ以上の拡張ユニットと１つ以上のくびれユニットとを備え、
前記ステージのうち少なくとも１つは、２つの対向壁をそれぞれ有する１つ以上のくびれユニットを備え、前記２つの対向壁のうち少なくとも１つは、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備える、システム。
【請求項２】
各くびれユニットにおける前記２つの対向壁の各々は複数の歯を備え、第１の対向壁上の複数の歯は、第２の対向壁上の複数の歯の方を向いている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記第１の対向壁上の複数の歯の先端と前記第２の対向壁上の複数の歯の先端とは平行に配置されている、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記第１の対向壁上の歯の先端と前記第２の対向壁上の歯の先端との間隔は、裸化される卵母細胞の直径に近い、請求項２または３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
前記ステージのうち少なくとも１つは、１つ以上のくびれユニットと互い違いに配置された１つ以上の拡張ユニットを備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記複数の歯のうち１つ以上は、前記チャネル内を通る流れの方向に逆らって約３０度〜約９０度の角度に設定されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
前記１つ以上のステージのうち少なくとも１つのステージは、滑らかな内側表面を有する１つ以上のくびれユニットを備える、請求項１〜６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
少なくとも１つの拡張ユニットは、約２５０〜約６００ミクロンの幅を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項９】
少なくとも１つのくびれユニットは、約１００〜約３５０ミクロンの幅を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムであって、
基体と、
入口、出口、および直列に配置された３つのステージを備え、各ステージが次のステージと流体接続している、チャネルとを備え、
第１のステージは、第１のくびれユニットと互い違いに配置された一連の第１の拡張ユニットを備え、前記第１の拡張ユニットは第１の幅を有し、前記第１のくびれユニットは第２の幅と滑らかな内側表面とを有し、
第２のステージは、第２のくびれユニットと互い違いに配置された一連の第２の拡張ユニットを備え、前記第２の拡張ユニットは第３の幅を有し、前記第２のくびれユニットは第４の幅と滑らかな内側表面とを有し、
第３のステージは、第３のくびれユニットと互い違いに配置された一連の第３の拡張ユニットを備え、前記第３の拡張ユニットは第５の幅を有し、前記第３のくびれユニットは第６の幅と少なくとも２つの対向壁とを有し、
前記２つの対向壁の各々は、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備え、前記第３のくびれユニットの第１の対向壁上の複数の歯は、前記第３のくびれユニットの第２の対向壁上の複数の歯の方を向くように配置されており、前記第１の対向壁上の複数の歯の先端と前記第２の対向壁上の複数の歯の先端とは平行に配置されている、システム。
【請求項１１】
前記チャネルは約２００〜３００ミクロンの高さを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記歯は、前記チャネル内を通る流れの方向に逆らって約３０度〜約９０度の角度に設定されている、請求項１０および１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記第１の幅は約２５０〜約６００ミクロンであり、前記第２の幅は約２００〜約３５０ミクロンである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第３の幅は約２５０〜約６００ミクロンであり、前記第４の幅は約１００〜約２５０ミクロンであり、前記第５の幅は約２５０〜約６００ミクロンである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第６の幅は約７０〜約１２０ミクロンである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記歯の先端同士の間隔は約８０〜１１０ミクロンである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記第１の幅は約５００ミクロンであり、前記第２の幅は約２３０〜２６０ミクロンであり、前記第３の幅は約５００ミクロンであり、前記第４の幅は約１３０〜約１６０ミクロンであり、前記第５の幅は約５００ミクロンであり、前記第６の幅は約９０〜約１２０ミクロンであり、前記歯の先端同士の間隔は約９０〜約１１０ミクロンである、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１８】
液体試料中において、付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムであって、
基体と、
入口、出口、および前記入口と前記出口との間に直列に配置された１つ以上のステージを備えるチャネルとを備え、
各ステージは、次のステージと流体接続しており、
各ステージは、前記チャネルにわたって配置された複数のポストからなる１つ以上の列を備え、所与の列におけるポストと当該列内における隣りのポストとの間に間隔があいて、隣り合う２つのポストの間にサブチャネルが画定されており、
少なくとも１つのステージにおける複数のポストの各々は、同じ列内における隣りのポストの対向壁に向き合うように、または前記チャネルの内壁に向き合うように配置された１対の壁を含み、前記複数のポストの各々における壁の少なくとも１つは、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備える、システム。
【請求項１９】
１つの列における隣り合うポストの対向壁の各々は、互いに向き合うように配置された複数の歯を備える、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
第１のステージの少なくとも１つのサブチャネルは、約２４０〜２６０ミクロンの幅を備え、前記第１のステージは、流体試料から細片をろ過するように配置されたポストの列を備える、請求項１８または１９に記載のシステム。
【請求項２１】
第２のステージの少なくとも１つのサブチャネルは、約１４０〜１６０ミクロンの幅を備え、前記第２のステージは、流体試料から細片をろ過するように配置されたポストの列を備える、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２２】
第３のステージにおける少なくとも１つのサブチャネルは、約９０〜１１０ミクロンの幅を備え、前記第３のステージは、卵母細胞を裸化するように配置されたポストの列を備え、各列における１つ以上のポストは、複数のぎざぎざの歯を備える、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２３】
前記第３のステージにおけるすべてのポストは、同じ列内における隣りのポストの対向壁に向き合うように、または前記チャネルの内壁に向き合うように配置された１対の壁を含み、前記第３のステージにおける各ポストの各壁は、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備える、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
第１のステージのすべてのサブチャネルは第１の幅を備え、第２のステージのすべてのサブチャネルは、前記第１の幅よりも小さい第２の幅を備える、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２５】
前記複数のポストからなる１つ以上の列は、前記チャネルの長軸に対して垂直に配置されている、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２６】
液体試料中において卵母細胞から卵丘細胞を除去する方法であって、
１つ以上の卵母細胞を備える液体試料を得る工程と、
請求項１〜２５のいずれか１項に記載のシステムの前記入口に前記液体試料を注入する工程と、
前記チャネルの１つ以上のステージ内に前記液体試料をある流速にて流す工程と、
前記出口から卵母細胞を回収する工程と、を備える、方法。
【請求項２７】
前記液体試料は卵胞液を備える、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記液体試料は、培養媒体またはバッファー媒体を備える、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記流速はほぼ一定であり、約０．５〜約５．０ｍｌ／分である、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記流速は、約１．０ｍｌ／分〜約４．０ｍｌ／分である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記卵母細胞はヒト卵母細胞であり、前記対向壁上の複数の歯の先端同士の間隔は約１００〜１１０ミクロンである、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本願は、２０１８年９月１８日付で提出された米国仮特許出願第６２／７３２，８８４号および２０１８年４月４日付で提出された米国仮特許出願第６２／６５２，６４８号の利益を主張する。これら２つの先行出願の全記載内容を、引用により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
背景
体外受精（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ＩＶＦ）などの生殖補助技術（Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＡＲＴ）は、不妊症または遺伝学的問題の処置、および子の受胎の補助に使用できる。ＩＶＦにおいては、成熟した卵子（卵母細胞）を卵巣から回収し、実験室で精子によって受精させることができる。次いで、受精卵（胚として知られる）を子宮内に移植することができる。ＩＶＦは、排卵誘発、卵母細胞回収、精子回収、受精、および胚移植という工程を伴う。従来のＩＶＦにおいては、卵子と、準備した精子とを、シャーレ中の培養媒体に入れ、その中で卵子と精子とを一晩かけて自発的に受精させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
卵細胞質内精子注入（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐｅｒｍ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：ＩＣＳＩ）は、ごく細い注射針を使用して顕微鏡下で卵子１個に精子１個を注入できるという点で、慣習的なＩＶＦとは異なり得る。ＩＣＳＩは、男性不妊症の唯一の処置法であるとして認識されている。効果的なＩＣＳＩ手順のためには、微量注入の前に卵母細胞を裸化しておくことが重要であり得る、というのは、卵母細胞の周囲が特殊な顆粒膜細胞（卵丘細胞）からなるいくつかの層で覆われて卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を形成し得るためである。典型的な診療所での手術では、酵素的方法（ヒアルロニダーゼ）および力学的方法（手作業によるピペッティング）を組み合わせて使用して卵母細胞を裸化し得るが、これは、熟練した技術者による実施が必要であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
本開示は、ヒト生殖補助の分野において広い用途を有する、周囲を覆っている卵丘細胞および冠細胞から卵母細胞を裸化するためのマイクロ流体システムを提供する。このシステムは、くびれユニットおよび拡張ユニットの繰り返しを有する１つ以上のチャネルを含む。一般的に、ＣＯＣを含有する試料（ＣＯＣのみをバッファーもしくは他の液体中に採取したもの、またはＣＯＣ、血餅、および多様なサイズの組織細片を含有する患者由来の未処理の卵胞液、のいずれか）をシステムの入口に注入し、試料がシステムの１つまたは複数のチャネル内を流れる際に、くびれユニットと拡張ユニットとが連携して卵母細胞の裸化を容易化する。たとえば、くびれユニットは、ＣＯＣに力学的ストレスをかけるために、ぎざぎざのまたは滑らかな内表面などの表面特徴を含み得る。いくつかの実現例において、拡張ユニットは、ＣＯＣがシステム内を転がりながら通ることができるように促す。いくつかの実施形態において、システムは、ＣＯＣが連続的に流れ得るように構成される。
【０００５】
一態様において、本開示は、付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムを提供する。システムは、基体と、チャネルまたは２つ以上のサブチャネルとを含む。各チャネルは、入口、出口、およびチャネル内に直列に配置された１つ以上のステージを含む。１つ以上のステージの各々は、次のステージと流体接続している。１つ以上のステージの各々は、１つ以上の拡張ユニットと１つ以上のくびれユニットとを含む。１つ以上のステージのうち少なくとも１つのステージは、２つの対向壁を有する１つ以上のくびれユニットを含む。対向壁の１つまたはその各々は、チャネルの内側に向いたぎざぎざの表面を含む。ぎざぎざの内側表面は複数の歯を含み、第１の対向壁上の複数の歯は、第２の対向壁上の複数の歯の方を向くように配置されている。第１の対向壁上の複数の歯の先端は、第２の対向壁上の複数の歯の先端から等間隔である、たとえば、歯は平行に配置されている。
【０００６】
別の一態様において、本開示は、付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムであって、基体と、入口、出口、および入口と出口との間に直列に配置された１つ以上のステージを有するチャネルとを含み、各ステージは、次のステージと流体接続しており、各ステージは、１つ以上の拡張ユニットと１つ以上のくびれユニットとを含み、ステージのうち少なくとも１つは、２つの対向壁をそれぞれ有する１つ以上のくびれユニットを含み、２つの対向壁のうち少なくとも１つは、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備える、システムを提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、各くびれユニットにおける２つの対向壁の各々は複数の歯を含み、第１の対向壁上の複数の歯は、第２の対向壁上の複数の歯の方を向いている。たとえば、第１の対向壁上の複数の歯の先端と第２の対向壁上の複数の歯の先端とは平行に配置されていてよく、第１の対向壁上の歯の先端と第２の対向壁上の歯の先端との間隔は、裸化される卵母細胞の直径に近くてよい。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ステージのうち少なくとも１つは、１つ以上のくびれユニットと互い違いに配置された１つ以上の拡張ユニットを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、複数の歯のうち１つ以上、たとえばすべての歯は、チャネル内を通る流れの方向に逆らって約３０度〜約９０度の角度に設定されている。
【００１０】
多様な実施形態において、１つ以上のステージのうち少なくとも１つのステージは、滑らかな内側表面を有する１つ以上のくびれユニットを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの拡張ユニットは約２５０〜約６００ミクロンの幅を有する、および／または少なくとも１つのくびれユニットは約１００〜約３５０ミクロンの幅を有する。
【００１１】
別の一態様において、本開示は、付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムであって、基体と、入口、出口、および直列に配置された３つのステージを含むチャネルとを含み、各ステージが次のステージと流体接続しており、第１のステージは、第１のくびれユニットと互い違いに配置された一連の第１の拡張ユニットを備え、第１の拡張ユニットは第１の幅を有し、第１のくびれユニットは第２の幅と滑らかな内側表面とを有し、第２のステージは、第２のくびれユニットと互い違いに配置された一連の第２の拡張ユニットを備え、第２の拡張ユニットは第３の幅を有し、第２のくびれユニットは第４の幅と滑らかな内側表面とを有し、第３のステージは、第３のくびれユニットと互い違いに配置された一連の第３の拡張ユニットを備え、第３の拡張ユニットは第５の幅を有し、第３のくびれユニットは第６の幅と少なくとも２つの対向壁とを有し、２つの対向壁の各々は、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備え、第３のくびれユニットの第１の対向壁上の複数の歯は、第３のくびれユニットの第２の対向壁上の複数の歯の方を向くように配置されており、第１の対向壁上の複数の歯の先端と第２の対向壁上の複数の歯の先端とは平行に配置されている、システムを提供する。
【００１２】
本明細書中に記載されるシステムの特定の実施形態において、チャネルは約２００〜３００ミクロンの高さを有する。いくつかの実施形態において、歯は、チャネル内を通る流れの方向に逆らって約３０度〜約９０度の角度に設定されている。
【００１３】
特定の実施形態において、第１の幅は、約２５０〜約６００ミクロン、たとえば、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、または６００ミクロンであってよい。第１の幅は、約５００ミクロンであってよい。第２の幅は、約２００〜約３５０ミクロン、たとえば、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３５０ミクロンであってよい。第２の幅は、約２３０〜２６０ミクロン、たとえば、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、または２６０ミクロンであってよい。第３の幅は、約２５０〜約６００ミクロンであってよく、上述されるとおりの実現可能な大きさを有していてよい。第３の幅は、約５００ミクロン、たとえば、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、または６００ミクロンであってよい。第４の幅は、約１００〜約２５０ミクロン、たとえば、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、または２５０ミクロンであってよい。第４の幅は、約１３０〜約１６０ミクロン、たとえば、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、または１６０ミクロンであってよい。第５の幅は、約２５０〜約６００ミクロンであってよく、上述されるとおりの実現可能な大きさを有していてよい。第５の幅は、約５００ミクロン、たとえば、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、または６００ミクロンであってよい。第６の幅は、約７０〜約１２０ミクロン、たとえば、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０ミクロンであってよい。第６の幅は、約９０〜約１２０ミクロン、たとえば、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０ミクロンであってよい。
【００１４】
特定の実施形態において、第１の幅は約５００ミクロンであり、第２の幅は約２３０〜２６０ミクロンであり、第３の幅は約５００ミクロンであり、第４の幅は約１３０〜約１６０ミクロンであり、第５の幅は約５００ミクロンであり、第６の幅は約９０〜約１２０ミクロンであり、歯の先端同士の間隔は約９０〜約１１０ミクロンである。
【００１５】
別の一態様において、本開示は、液体試料中において、付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのシステムであって、基体と、入口、出口、および入口と出口との間に直列に配置された１つ以上のステージを有するチャネルとを含み、各ステージは、次のステージと流体接続しており、各ステージは、チャネルにわたって配置された複数のポストからなる１つ以上の列を備え、所与の列におけるポストと当該列内における隣りのポストとの間に間隔があいて、隣り合う２つのポストの間にサブチャネルが画定されており、少なくとも１つのステージにおける複数のポストの各々は、同じ列内における隣りのポストの対向壁に向き合うように、またはチャネルの内壁に向き合うように配置された１対の壁を含み、複数のポストの各々における壁の少なくとも１つは、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を備える、システムを提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、１つの列における隣り合うポストの対向壁の各々は、互いに向き合うように配置された複数の歯を含む。多様な実施形態において、第１のステージの少なくとも１つのサブチャネルは約２４０〜２６０ミクロンの幅を有し、第１のステージは、流体試料から細片をろ過するように配置されたポストの列を含む。いくつかの実施形態において、第２のステージの少なくとも１つのサブチャネルは約１４０〜１６０ミクロンの幅を有し、第２のステージは、流体試料から細片をろ過するように配置されたポストの列を含む。特定の実施形態において、第３のステージにおける少なくとも１つのサブチャネルは約９０〜１１０ミクロンの幅を有し、第３のステージは、卵母細胞を裸化するように配置されたポストの列を含み、各列における１つ以上のポストは、複数のぎざぎざの歯を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、第３のステージにおけるすべてのポストは、同じ列内における隣りのポストの対向壁に向き合うように、またはチャネルの内壁に向き合うように配置された１対の壁を含み、第３のステージにおける各ポストの各壁は、複数の歯を備えるぎざぎざの内側表面を含む。
【００１８】
特定の実施形態において、第１のステージのすべてのサブチャネルは第１の幅を有し、第２のステージのすべてのサブチャネルは、第１の幅よりも小さい第２の幅を有する。いくつかの実施形態において、第３のステージのすべてのサブチャネルは、第２の幅よりも小さい第３の幅を有する。
【００１９】
別の一態様において、本開示は、液体試料中において卵母細胞から卵丘細胞を除去する方法を提供する。当該方法は、１つ以上の卵母細胞を含む液体試料を得る工程と、本明細書中に記載されるいずれかのシステムの入口に液体試料を注入する工程と、チャネルの１つ以上のステージ内に液体試料をある流速にて流す工程と、出口から卵母細胞を回収する工程とを含む。
【００２０】
こうした方法の特定の実施形態において、液体試料は、卵胞液、培養媒体、もしくはバッファー媒体であってよい、またはこれらを含んでよい。
【００２１】
いくつかの実施形態において、流速はほぼ一定であり、約０．５〜約５．０ｍｌ／分、たとえば約１．０ｍｌ／分〜約４．０ｍｌ／分であり、たとえば、流速は、約０．５〜約２．０ｍｌ／分、たとえば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０ｍｌ／分であってよい。流速は、約１．０ｍｌ／分であってよい。卵母細胞は、哺乳類卵母細胞、たとえばヒト卵母細胞であってよい。第３のステージのくびれユニット（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）の幅は、約１００〜１１０ミクロン、たとえば、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、または１１０ミクロンであってよい。いくつかの実施形態において、卵母細胞はヒト卵母細胞であり、対向壁上の複数の歯の先端同士の間隔は約１００〜１１０ミクロンである。
【００２２】
多様な実施形態において、１つ以上のステージのうち少なくとも１つは、１つ以上のくびれユニットと互い違いに配置された１つ以上の拡張ユニットを含む。１つ以上のステージのうち少なくとも１つのステージは、滑らかな内側表面を有する１つ以上のくびれユニットを含んでよい。少なくとも１つの拡張ユニットは、約２５０〜約６００ミクロン、たとえば、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、または６００ミクロンの幅を有してよい。少なくとも１つのくびれユニットは、約２００〜約３５０ミクロン、たとえば、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、または３５０ミクロンの幅を有してよい。少なくとも１つのくびれユニットは、約１００〜２５０ミクロン、たとえば、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、もしくは２５０ミクロン、またはそれ以上の幅を有してよい。
【００２３】
別の一態様において、本開示は、付着している卵丘細胞から卵母細胞を裸化するための複数のサブチャネルを含むチャネルを有するシステムを提供する。当該システムは、基体とチャネルとを含む。チャネルは、入口、出口、およびチャネル内に直列に配置された１つ以上のステージを含む。１つ以上のステージの各々は、次のステージと流体接続している。１つ以上のステージの各々は、チャネルにわたって（たとえばチャネルに対して垂直に）列に並んだ１つ以上のポストを含む。ポストは、２つの細長い（たとえば、まっすぐな）（たとえば、互いに平行である）壁を有する限り、楕円形、正方形、または矩形などであってよい。各列は、複数のポスト（たとえば２つ以上、たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のポスト）を含む。所与の列の各ポストと当該所与の列内における隣りのポストとの間に間隔があいて、サブチャネルが画定されている。１つの列における１つ以上のポストは、当該ポストの、チャネルの壁に向き合うまたは当該列における別のポストに向き合う細長いまっすぐな壁上に、複数のぎざぎざの歯または他の表面粗さを含む。
【００２４】
少なくとも１つのサブチャネルは、約２４０ミクロン、たとえば、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、または２８０ミクロンの幅を有してよい。少なくとも１つのサブチャネルは、１４０ミクロン、たとえば、１２０、１３０、１４０、１５０、または１６０ミクロンの幅を有してよい。少なくとも１つのサブチャネルは、約９０ミクロン、たとえば、８０、８５、９０、９５、１００、または１０５ミクロンの幅を有してよい。
【００２５】
すべてのポストは、たとえば当該ポストのまっすぐな（ｓｔｒａｉｔ）壁に沿って、複数のぎざぎざの歯を含んでよい。第１のステージのすべてのサブチャネルは第１の幅を有してよく、第２のステージのすべてのサブチャネルは、第１の幅よりも小さい第２の幅を有してよい。第３のステージのすべてのサブチャネルは、第２の幅よりも小さい第３の幅を含んでよい。
【００２６】
本開示は、ＡＲＴ分野における不利な点を解決しようとするシステムおよび方法に関する。本明細書中に記載されるシステムの少なくとも１つの利点は、連続的な流体の流れを使用する卵母細胞の裸化手段を提供できるという点である。本システムの別の利点は、より単純で自動式の卵母細胞裸化方法を実施可能とする点である。加えて、当該新たなシステムは、未処理の卵胞液、または血液細胞、血餅、組織片などの形態の細片を著しく含む液体試料を扱うことができ、かつ、優れた裸化卵母細胞収量を提供できる。また、卵母細胞を裸化するための他のデバイス、システム、および従来の手作業による手順と比較して、本システムおよび方法は、卵母細胞の受精または発生能力が損なわれる確率を低減する。したがって、当該新たなシステムおよび方法は、自動式で標準化された連続的な様式にてヒト卵母細胞を処理するための高効率かつ効果的な方法を提供する。
【００２７】
特に定義がなければ、本明細書中において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験の際に使用できるが、好適な方法および材料が以下に記載される。本明細書中において言及されるすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考資料の全体を、引用により本明細書に援用する。万一矛盾がある場合には、本明細書（定義を含む）が支配する。これに加えて、材料、方法、および例示は、例証することのみを目的とし、限定を意図しない。
【００２８】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および請求項によって明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本開示の少なくとも１つの例示的な実施形態に係るマイクロ流体システムを使用するための方法の概略的かつ例証的な全体図である。
【図２Ａ】本開示に係る、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）から卵丘細胞を除去するための１つのチャネルを有するマイクロ流体システムの概略的な例証である。
【図２Ｂ】本開示に係る、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）から卵丘細胞を除去するための１つのチャネルを有するマイクロ流体システムの概略的な例証である。
【図２Ｃ】本開示に係る、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）から卵丘細胞を除去するための１つのチャネルを有するマイクロ流体システムの概略的な例証である。
【図３Ａ】本開示の一実施形態に係るマイクロ流体システム内のチャネルの第１のステージ内に位置する滑らかなくびれユニットとこれに最も近い拡張ユニットとを拡大して示す概略的な略図である。
【図３Ｂ】本開示の一実施形態に係るマイクロ流体システム内のチャネルの第２のステージ内に位置する滑らかなくびれユニットとこれに最も近い拡張ユニットとを拡大して示す概略的な略図である。
【図３Ｃ】本開示の一実施形態に係るマイクロ流体システム内のチャネルの第３のステージ内に位置するぎざぎざのくびれユニットとこれに最も近い拡張ユニットとを拡大して示す概略的な略図である。
【図４Ａ】本開示の一実施形態に係る、チャネルを有し、このチャネルが当該チャネル内のポストの列によって確定された複数のサブチャネルを含む、ＣＯＣから卵丘細胞を除去するためのマイクロ流体システムの概略的な例証である。
【図４Ｂ】本開示の一実施形態に係る、チャネルを有し、このチャネルが当該チャネル内のポストの列によって確定された複数のサブチャネルを含む、ＣＯＣから卵丘細胞を除去するためのマイクロ流体システムの概略的な例証である。
【図４Ｃ】本開示の一実施形態に係る、チャネルを有し、このチャネルが当該チャネル内のポストの列によって確定された複数のサブチャネルを含む、ＣＯＣから卵丘細胞を除去するためのマイクロ流体システムの概略的な例証である。
【図５】本開示の少なくとも１つの実施形態に係る、本明細書中に記載されるマイクロ流体システムを使用する方法の例を示すフローチャートである。
【図６Ａ】本開示の少なくとも１つの実施形態に係る、３つの別個のぎざぎざのくびれユニット内を流れるＣＯＣを示す拡大画像の図示である。
【図６Ｂ】本開示の少なくとも１つの実施形態に係る１つのぎざぎざのくびれユニット内を流れるＣＯＣを示す概略的な例証である。
【図７】ステージ３のくびれユニットの幅（Ｗ３）が、処理されたＣＯＣの収率および裸化効率に及ぼす効果を示す棒グラフである。
【図８Ａ】チャネル内におけるくびれユニットに沿って傾斜したぎざぎざの歯の４つの異なる実現例（θ＝０°、３９°、９０°、および１４１°）の例証である。
【図８Ｂ】異なる傾斜角度θを有するマイクロ流体システムの収率および裸化効率を示すグラフである。裸化効率は、傾斜角度が、矢印で示される流れの方向に逆らって１４１°である場合に、最も高い。
【図８Ｃ】異なる傾斜角度θを有するマイクロ流体システムの収率および裸化効率を示すグラフである。裸化効率は、傾斜角度が、矢印で示される流れの方向に逆らって１４１°である場合に、最も高い。
【図９】列に並んだ楕円形のポスト同士の間に画定された複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システムのサブチャネルにおいて捕捉されている細片を示す拡大画像の図示である。
【図１０】複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システムの収率および裸化効率に及ぼす流速の効果を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
体外受精（ＩＶＦ）および卵細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）などの生殖補助技術（ＡＲＴ）は、不妊症の処置方法としてますます広く用いられている。しかしながら、典型的なＡＲＴの手順は、高価である、時間がかかるといった、様々な制約を有し得る。また、典型的なＡＲＴの手順は、胚培養士などの高度な技術を有する技術者に依存しており、その結果、施術者による差異や標準化の欠如といったことが起こり得る。効果的なＩＣＳＩのためには、卵母細胞中への精子の注入を容易化して、卵母細胞の形態、特に核成熟期の評価を可能とする目的で、典型的には、当該手順よりも前に卵母細胞を裸化しておくことが重要である。
【００３１】
臨床でのＩＣＳＩの実施において、胚培養士は、まず、顕微鏡下において約１５０ｍＬの卵胞液からおよそ十数個の卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）を手作業で選ぶ必要がある。最初に卵巣から回収した卵母細胞は、典型的には、特殊な顆粒膜細胞（卵丘細胞）からなるいくつかの層に周囲が覆われていて、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）として知られる秩序のある構造を形成している。卵胞液試料は、典型的には体積が２０〜２００ｍＬであり、いくつかの細片、いくつかの組織片、凝固した血液細胞、血液細胞、およびＣＯＣを含有している。次いで、胚培養士は、卵細胞質内精子注入よりも前に、酵素的方法（たとえば、ヒアルロニダーゼ）および力学的方法（手作業によるピペッティング）を組み合わせて使用して卵母細胞を裸化する必要がある。
【００３２】
卵母細胞と密接に接触している卵丘細胞は、冠細胞としても知られるが、これらによって、透明帯を通過する細胞質の突出が生じ、卵細胞膜とのギャップ結合が形成され得る。典型的な手順においては、卵母細胞を、ヒアルロニダーゼの酵素作用および手作業によるピペッティングによって、卵丘−冠細胞の集まりから裸化できる。しかしながら、こうした型の手順は、非効率であり得て、かつ施術者による差異があり得る。他の手順においては、接合体を１つずつ処理して、流体の流れを手作業で制御するが、これには時間がかかり、施術者による差異もある。本明細書中に記載される新たな方法およびシステムは、ＡＲＴにおけるこうした問題を回避または克服できる。
【００３３】
本開示は、ヒト生殖補助の分野において広い用途を有する、周囲を覆っている卵丘細胞および冠細胞から卵母細胞を裸化するためのマイクロ流体システムおよび方法を提供する。一般的なレベルにおいて、当該システムは、１つ以上のステージを有する少なくとも１つのチャネルを含み、各ステージはくびれユニットおよび拡張ユニットの繰り返しを有する。ＣＯＣを含有する液体試料（たとえば、未処理の卵胞液試料）を、たとえば連続的な流速にて、システムの入口に注入してよい。この流速によって、ＣＯＣがシステムのチャネル内を通過する。くびれユニットと拡張ユニットとが連携して、卵母細胞の裸化を容易化する。たとえば、くびれユニットは、外側の細胞をＣＯＣから剥ぎ取るまたは剥がすために、滑らかなまたはぎざぎざの内表面などの表面特徴を含む。拡張ユニットは、ＣＯＣがシステム内を転がりながら通ることができるように促す。システムは、ＣＯＣが連続的に流れ得るように構成される。
【００３４】
他の実施形態において、本開示は、多様なサイズの細片を含有し得る多量の液体試料からＣＯＣを回収し、周囲を覆っている卵丘細胞から卵母細胞を裸化するためのマイクロ流体システムおよび方法を提供する。いくつかの実施形態において、卵丘細胞に特異的な酵素（たとえば、ヒアルロニダーゼ）を、試料（たとえば、卵胞液試料）に添加して、ＣＯＣを緩め、他の細片は緩めず、次いで、液体試料を、本明細書中に記載されるシステム内に流す。大きな細片（凝固血液など）がチャネルおよび／または上流の粗いフィルタにおいて捕捉され、ＣＯＣは裸化されてチャネル内を通る。このようにして、当該デバイスは、大きな細片を除去し、かつＣＯＣを裸化して、システムの出口で卵母細胞が集められる。この新たなシステムは以下の目的を達成する：１）酵素（たとえば、ヒアルロニダーゼ）処理により卵母細胞から卵丘細胞を緩めて、周囲を覆っている卵丘細胞から卵母細胞を自動的に裸化する、２）多量の流体懸濁液（卵胞液など）を、詰まりを生じることなく、１回の操作で処理する、３）大き過ぎる血餅および組織細片を選択的に捕集する、ならびに４）処理時間を縮小して標準化を改善するとともに、人間の介入を最小限とする。特に、この多チャネルシステムは、凝固血液などの大きな細片を上流の粗いフィルタおよび／またはチャネルにおいて捕捉し、かつ、ＣＯＣが裸化されてチャネル内を通過できる。したがって、当該新たなシステムは、大きな細片を除去し、かつＣＯＣを自動的に裸化して、出口において卵母細胞を得る。
【００３５】
図１は、本開示の少なくとも１つの実施形態に係るマイクロ流体システム１００を使用するための方法の概略的な全体図である。マイクロ流体システム１００は、自動式で標準化された様式にて、周囲を覆っている卵丘マトリックスから卵母細胞を剥ぎ取ることができる。一般的に、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ）１７０ａの懸濁液をバッファーまたは培養媒体と混合できる。媒体は、卵母細胞を健康なままで生かしておくために重要である。一般的に、懸濁液は、約１０〜５０マイクロリットルの体積を有してよい。混合物は、約５００マイクロリットルの総体積を有してよい。一般的に、混合物は、培養媒体（たとえば、体積上限約５００マイクロリットル）を満たした容器（たとえばチューブ）にＣＯＣ懸濁液を添加することによって調製される。得られる液体を、たとえばポンプの使用により、マイクロ流体システム１００中に注入する。得られる液体を、たとえば連続的な流速にて、マイクロ流体システム１００中に注入する。多様な実施形態において、ポンプは、シリンジポンプまたは圧力駆動ポンプのような電動式システムであってよい。いくつかの実施形態において、出口から真空を引くことによって、必要な流速を達成してもよい。
【００３６】
いくつかの実現例において、懸濁液は、多様なサイズの細片を含む。たとえば、懸濁液は、ＣＯＣよりも大きいおよび／またはＣＯＣよりも小さい細片を含んでよい。いくつかの実現例において、懸濁液を、マイクロ流体システム１００中に注入する前に、ヒアルロニダーゼなどの酵素と共にプレインキュベートする。たとえば、懸濁液を、０．３ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼと共にプレインキュベートしてよい。
【００３７】
連続的な流速を注意深く選択することが、最終的な結果のために重要である。たとえば、流速が遅すぎると、マイクロ流体システム１００内を通る混合物の動きが妨げられる傾向があり、デバイスによる卵母細胞の裸化が非効果的なものとなり得る。一方、流速が速すぎると、システム１００が卵母細胞に損傷を与える可能性がある。本明細書中に記載されるとおり、最適な流速は、使用されるマイクロ流体システムの具体的な構成に依存して、約０．５〜約２．０ｍｌ／分（０．５．０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０ｍｌ／分）、および／または約３．０ｍｌ／分〜約５．０ｍｌ／分（３．０．３．２．３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、または５．０ｍｌ／分）である。ＣＯＣ  １７０ａがマイクロ流体システム１００内を通る際、マイクロ流体システム１００の特徴によって、ＣＯＣ  １７０に力学的な力がかかり、ＣＯＣ  １７０ａ卵丘細胞の裸化を容易化する。ＣＯＣ  １７０ａは、マイクロ流体システム１００の終点に到達すると、部分的に、または完全に、裸化卵母細胞１７０ｂとなる。裸化卵母細胞１７０ｂは、マイクロ流体デバイス１００の出口槽の中に集められる。
【００３８】
システムの全体像
図２Ａ〜図２Ｃは、本開示に係る、卵母細胞から卵丘細胞を除去するためのマイクロ流体システム１００の概略的な例証である。図２Ａはシステム全体を示し、図２Ｂおよび図２Ｃは、マイクロ流体システム１００のいくつかの部分を拡大して示す。図２Ａを参照して、マイクロ流体システム１００は、入口１０１、出口１０２、第１のステージ１１０、第２のステージ１２０、および第３のステージ１３０を含む。第１のステージ１１０、第２のステージ１２０、および第３のステージ１３０は、連携して、長く蛇行したチャネルを画定している。入口１０１は、ＣＯＣ  １７０ａを受け、ＣＯＣ  １７０ａを第１のステージ１１０へと導くように構成される。ＣＯＣ  １７０ａは、バッファーまたは培養媒体と懸濁および／または混合されてよい。当該例証において、長く蛇行したチャネルは３つの「列」を含む。第１の（すなわち、上の）列は第１のステージ１１０および第２のステージ１２０を含み、第２および第３の（すなわち、下の）列は第３のステージ１３０を含む。チャネルは蛇行しているように示されているが、チャネルは、直線状、環状、または多様な他の形状であってもよい。また、チャネルは、マイクロ流体システム１００の所望の用途に依存して、より多い、またはより少ない列を含んでもよい。
【００３９】
蛇行したチャネルは、滑らかなくびれユニット１４１および／またはぎざぎざのくびれユニット１４２と互い違いに配置された一連の繰り返しの拡張ユニット１４０に分かれている。これらユニット１４０、１４１、１４２の形状および大きさは、チャネルの全長にわたって変化してよい。たとえば、この特定の例証において、第１のステージ１１０は正方形の拡張ユニット１４０を有し、第２のステージ１２０および第３のステージ１３０は八角形の拡張ユニット１４０を有する。しかしながら、各ステージは、多様な形状の拡張ユニット１４０を任意の数にて含んでよく、正方形、八角形、および／または円形を含んでよい。示されている実施形態において、第１のステージ１１０は、２５個の拡張ユニット１４０および２５個の滑らかなくびれユニット１４１を含む。第２のステージ１２０は、２５個の拡張ユニット１４０および２５個の滑らかなくびれユニット１４１を含む。第３のステージ１３０は、１００個の拡張ユニット１４０および１００個のぎざぎざのくびれユニット１４２を含む。
【００４０】
また、示されている実施形態において、第１のステージ１１０および第２のステージ１２０は、長さが等しい。しかしながら、第１のステージ１１０および第２のステージ１２０は、異なる長さを有してもよい。一実施形態において、第１および第２のステージ１１０、１２０の長さは、拡張およびくびれユニット１４０、１４１の数に依存して、約１０〜５０ｍｍである。第３のステージ１３０は、最初の２つのステージ１１０、１２０より長くてもよい。示されている実施形態において、第３のステージ１３０は、第１または第２のステージ１１０、１２０の約４倍の長さである。示されている実施形態において、第３のステージ１３０は、約４０〜２００ｍｍの長さである。
【００４１】
図２Ａは拡張ユニット１４０、滑らかなくびれユニット１４１、およびぎざぎざのくびれユニット１４２の特定の配置を有する各ステージを示すが、マイクロ流体システム１００は、これらのユニット１４０、１４１、１４２の多様な組み合わせを含むステージを任意の数にて含んでよい。たとえば、第２のステージ１２０は、複数のぎざぎざのくびれユニット１４２を含んでもよい。第３のステージ１３０は、複数の滑らかなくびれユニット１４１を含んでもよく、これらは、ぎざぎざのくびれユニット１４２と互い違いに配置されていても、されていなくてもよい。これらのユニット１４０、１４１、１４２の数および位置は、マイクロ流体システム１００の具体的な用途に基づいて最適化されてよい。ステージ１１０、１２０、１３０の具体的な設計は、ステージ１１０、１２０、１３０に所望される機能に基づき得る。たとえば、例証されている実施形態において、第１および第２のステージ１１０、１２０の構成は、ＣＯＣ  １７０ａからの、かさ高でゆるく付着している卵丘細胞の除去を容易化する。また、例証されている実施形態において、第３のステージ１３０の構成は、ＣＯＣ  １７０ａの放射冠（細胞の、透明帯に直接隣接する最内層を指す）の除去を容易化する。
【００４２】
拡張ユニット１４０、滑らかなくびれユニット１４１、およびぎざぎざのくびれユニット１４２は、多様な高さを有してよい。本明細書中に記載される場合、高さとは、所与の時においてユニットがどちらを向いているかに応じて、ユニット１４０、１４１、および１４２の「上」の内表面と「下」の内表面との間の間隔を指す（所与の時にユニットが向いている空間的方向によっては、「上」を「下」と見ることもできるということが理解される）。したがって、たとえば、高さは、断面（たとえば、正方形または八角形のユニットの場合）、または直径（たとえば、円形のユニットの場合）であってよい。いくつかの実施形態において、拡張ユニット１４０、滑らかなくびれユニット１４１、およびぎざぎざのくびれユニット１４２は、１５０〜５００ミクロンの高さを有する。いくつかの実施形態において、拡張ユニット１４０、滑らかなくびれユニット１４１、およびぎざぎざのくびれユニット１４２のすべては、高さが一定である。いくつかの実施形態において、拡張ユニット１４０、滑らかなくびれユニット１４１、およびぎざぎざのくびれユニット１４２は、著しいチャネル詰まりを生じずにＣＯＣのサイズを収容できる十分な高さを有するように構成される。ユニット１４０、１４１、１４２は、広範囲の幅を有するように構成されていてよい。たとえば、特定の実施形態において、拡張ユニット１４０は、２５０〜６００ミクロンまたはそれ以上の幅を有する。一般的に、拡張ユニット１４０の幅は、ＣＯＣ  １７０ａが転がって、ＣＯＣの全表面が後続のくびれユニット１４１、１４２の内壁と接触できるように選択されてよい。いくつかの実施形態において、滑らかなくびれユニット１４１は１００〜３００ミクロンの幅を有するように構成され、ぎざぎざのくびれユニット１４２は９０〜１３０ミクロンの幅を有するように構成される。また、ユニット１４０、１４１、１４２は、広範囲の長さを有するように構成されてもよい。たとえば、特定の実施形態において、拡張ユニット１４０は４００〜６００ミクロンの長さを有し、滑らかなくびれユニットおよびぎざぎざのくびれユニット１４１、１４２は５５０〜７５０ミクロンの長さを有する。
【００４３】
図２Ｂは、第２のステージ１２０から第３のステージ１３０に移行する湾曲１５０（この例において、長く蛇行したチャネルの２番目の２つの列を形成している）を拡大して示す。また、湾曲１５０は、図２Ａ中に示されるとおり、第２の列から第３の列にも移行する。
【００４４】
図２Ｃは、第３のステージ１３０内に位置するぎざぎざのくびれユニット１４２を拡大して示す。ぎざぎざのくびれユニット１４２は、いくつかのぎざぎざの歯１４２ａを含む。以下に図８Ａを参照して説明されるとおり、ぎざぎざの歯１４２ａは、チャネル内を通る流れの方向に沿ったまたはこれに逆らったいくつかの異なる角度のうち１つ以上にて設定されていてよい。たとえば、いくつかの実施形態において、ぎざぎざの歯１４２ａは、チャネル内を通る流れの方向に逆らって約３０度〜約９０度の角度（たとえば、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、または８５度）にて設定されている。他の実施形態において、ぎざぎざの歯１４２ａは、チャネル内を通る流れの方向に逆らって約４０度〜約１５０度の角度にて設定されている。
【００４５】
ぎざぎざの歯１４２ａの先端同士の間隔は、変動してもよい。一般的に、ぎざぎざの歯１４２ａの先端同士の間隔は、ヒト（または他の動物、たとえば、哺乳類）の卵母細胞の平均直径（たとえば、１００ミクロン）に基づいて選択され、したがって約８０〜１１０ミクロンに設定されている。ぎざぎざの歯１４２ａの先端同士の間隔はいくつかの間隔にて設定されてもよいが、歯１４２ａの先端同士の間隔は、卵母細胞を過度に損傷せずに裸化を容易化することができるように設定されていることが好ましい。たとえば、歯１４２ａの先端同士の間隔が小さ過ぎると、卵母細胞は損傷を受けずに間に入り込むことができない可能性がある。歯１４２ａの先端同士の間隔が大き過ぎると、歯１４２ａがＣＯＣ  １７０ａから卵丘細胞を除去できない可能性がある。歯１４２ａの先端同士の間隔は、少なくとも部分的に、歯１４２ａの長さによって画定されてよい。したがって、ぎざぎざの歯１４２ａの各々は、いくつかの長さのうち１つを有するように構成されていてよい。たとえば、いくつかの実施形態において、ぎざぎざの歯１４２ａは、約０．５〜２０ミクロンの長さ（たとえば、１、２、３、４、５、１０、１５、または２０ミクロンの長さ）である。
【００４６】
マイクロ流体システム１００は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）または他の硬質かつ不活性のプラスチックまたは他の材料でできた基体で作られていてよく、基体は、標準的な技術を用いてエッチングまたは切断して基体内にチャネルを形成した後、スライドガラスなどのカバーに接着させることにより、水密に封止される。基体およびカバーの材料を選択する際、チャネル内を通過する卵母細胞を傷つけないように適合性かつ生物学的に不活性であることが重要である。
【００４７】
くびれおよび拡張ユニット
図３Ａは、本開示の一実施形態に係るマイクロ流体システム１００の第１のステージ１１０に位置する滑らかなくびれユニット１４１とこれに最も近い拡張ユニット１４０とを拡大して示す。図３Ｂは、本開示の一実施形態に係るマイクロ流体システム１００の第２のステージ１２０に位置する滑らかなくびれユニット１４１とこれに最も近い拡張ユニット１４０とを拡大して示す。図３Ｃは、本開示の一実施形態に係るマイクロ流体システム１００の第３のステージ１３０に位置するぎざぎざのくびれユニット１４２とこれに最も近い拡張ユニット１４０とを拡大して示す。
【００４８】
図３Ａ中に示されるとおり、滑らかなくびれユニット１４１は拡張ユニット１４０に先行および後続される。この実施形態において、第１のステージ１１０の拡張ユニット１４０は矩形であり、幅Ｗ０を有する。この実施形態において幅Ｗ０は約５００ミクロンであるが、図２Ａ〜図２Ｃを参照して前述されるとおり、幅Ｗ０は、いくつかの他のサイズのうちの１つであってもよい。３つのステージ１１０、１２０、１３０のすべてにおいて、拡張ユニット１４０は、ＣＯＣが転がるのを容易化して、ＣＯＣの表面の実質的に全体が、後続の滑らかなくびれユニット１４１またはぎざぎざのくびれユニット１４２の内表面と相互作用できるようにしてもよい。滑らかなくびれユニット１４０は滑らかな内表面を含み、これは、一般的に、卵母細胞の周囲を覆う卵丘層中に入り込む可能性のあるぎざぎざの歯および他の粗さまたは突出部を有さない表面を指す。第１のステージ１１０の滑らかなくびれユニット１４１は、また、幅Ｗ１をも有する。この例証的な実施形態において、幅Ｗ１は約２４０ミクロンであり、これによって、ＣＯＣ中に存在するゆるく付着した大きな卵丘クラスタの除去を容易化することができる。しかしながら、幅Ｗ１は、図２Ａ〜図２Ｃを参照して前述されるとおり、いくつかの他のサイズのうちの１つであってもよい。また、図２Ａ〜図２Ｃを参照して上述されるとおり、第１のステージ１１０は、滑らかなくびれユニット１４１に加えて、またはこれの代わりに、１つ以上のぎざぎざのくびれユニット１４２を含んでよい。
【００４９】
図３Ｂ中に示されるとおり、第２のステージ１２０の滑らかなくびれユニット１４１は、幅Ｗ２を有する。第２のステージ１２０の滑らかなくびれユニット１４１は、第１のステージ１１０の滑らかなくびれユニット１４１の幅Ｗ１よりも小さい幅Ｗ２を有してよい。しかしながら、第２のステージ１２０の滑らかなくびれユニット１４１の幅Ｗ２は、第１のステージ１１０の滑らかなくびれユニット１４１の幅Ｗ１よりも大きくてもよい、またはこれと等しくてもよい。いくつかの実施形態において、幅Ｗ２は、第１のステージ１１０の滑らかなくびれユニット１４１によって除去されなかった可能性のある中程度のサイズの卵丘クラスタの除去を容易化するように選択される。この例証的な実施形態において、幅Ｗ２は約１４０ミクロンであり、したがって、第１のステージ１１０の滑らかなくびれユニット１４１の幅Ｗ１よりも小さい。しかしながら、幅Ｗ２は、図２Ａ〜図２Ｃを参照して前述されるとおり、いくつかの他のサイズのうちの１つであってもよい。第２のステージ１２０の滑らかなくびれユニット１４１は、また、滑らかな内表面をも有する。滑らかなくびれユニット１４１は、拡張ユニット１４０に先行および後続される。
【００５０】
第２のステージ１２０の拡張ユニット１４０は、八角形の形状である。しかしながら、第２のステージ１２０の拡張ユニット１４０は、正方形または円形でもよい。八角形および／または円形の拡張ユニット１４０は、正方形の拡張ユニット１４０の四隅において見られ得る渦の発生を防止し得る。第２のステージ１２０の拡張ユニット１４０は、また、５００ミクロンの幅Ｗ０を有する。しかしながら、第２のステージ１２０の拡張ユニット１４０は、第１のステージ１１０の拡張ユニット１４０の幅Ｗ０よりも大きいまたは小さい幅を有してもよい。たとえば、一実施形態において、第２のステージ１２０の拡張ユニット１４０は、第１のステージ１１０の拡張ユニット１４０の幅Ｗ０よりも大きな幅を有する。本実施形態において、第２のステージ１２０の拡張ユニット１４０は、第１のステージ１１０の拡張ユニット１４０の幅Ｗ０よりも小さいが第２のステージ１２０の滑らかなくびれユニット１４１の幅Ｗ２よりも大きい幅を有する。
【００５１】
図３Ｃ中に示されるとおり、第３のステージ１３０のぎざぎざのくびれユニット１４２は、幅Ｗ３を有する。ぎざぎざのくびれユニット１４２の幅Ｗ３は、一般的に、第２のステージ１２０の滑らかなくびれユニット１４１の幅Ｗ２よりも小さい。たとえば、この例証的な実施形態において、ぎざぎざのくびれユニット１４２は、１３０ミクロンの最大幅Ｗ３を有する。しかしながら、幅Ｗ３は、図２Ａ〜図２Ｃを参照して前述されるとおり、いくつかの他のサイズのうちの１つであってもよい。ぎざぎざのくびれユニット１４２は、複数のぎざぎざの歯１４２ａを含む。複数のぎざぎざの歯１４２ａは、蛇行したチャネルの連続的な流れ（右向きの太い矢印で示される）に沿って傾斜している。ぎざぎざのくびれユニット１４２は、拡張ユニット１４０に先行および後続される。第３のステージ１３０の拡張ユニット１４０はまた、幅Ｗ０をも有し、これは、他のステージにおける拡張ユニット１４０のそれに等しい。しかしながら、第２のステージ１２０の拡張ユニット１４０と類似して、第３のステージ１３０の拡張ユニット１４０は、他のステージ１１０、１２０の拡張ユニット１４０の幅Ｗ０よりも小さいまたは大きい幅を有してもよい。図２Ｂ、図２Ｃ、および図３Ａ〜図３Ｃ中に例証される実施形態において、くびれユニット１４１、１４２の幅は、後続の各ステージにおけるものよりも小さい。たとえば、第１のステージの滑らかなくびれユニット１４１は、第２のステージ１２０における滑らかなおよび／またはぎざぎざのくびれユニットの幅Ｗ２よりも大きい幅Ｗ１を有し、続いて、後者は、第３のステージ１３０のぎざぎざのくびれユニット１４２の幅Ｗ３よりも大きい幅（Ｗ２）を有する。これにより、ＣＯＣからの卵丘層の漸進的な除去が容易化され得る。卵丘層の除去に対してさらに漸進的なアプローチを可能とすることによって、例証されている実施形態の設計は、ステージ間において生じ得る詰まりを防止し得て、かつ、後続の各ステージにおける仕事量を軽減し得る。
【００５２】
いくつかの実現例において、マイクロ流体システム１００は、たとえば平行に配置された、複数のチャネルを含み（たとえば、各チャネルが、ＣＯＣ  １７０ａを裸化するために、第１のステージ１１０、第２のステージ１２０、および第３のステージ１３０を含む）、いくつかのＣＯＣ  １７０ａを含む液体試料が複数のチャネル内を流れ得る。当該複数のチャネルは、同じまたは異なる基体上に形成されていてよく、たとえば主たる入口に多様な入口を一緒にかつシステムの主たる出口に多様な出口を一緒に接続する導管またはマニホールドを使用して、平行に接続されていてよい。平行な複数のチャネルを含むことにより、万一１つのチャネルが欠陥を有する場合または詰まった場合にも、ＣＯＣ  １７０ａの連続的な流れが容易化され得る。
【００５３】
複数のサブチャネルを有するチャネルを有するマイクロ流体システム
図４Ａ〜図４Ｃは、本開示の一実施形態に係る、ＣＯＣから卵丘細胞を除去するための複数のサブチャネルを有するチャネルを有するマイクロ流体システム６００の概略的な例証である。複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システム６００は、たとえばＣＯＣを含有する液体試料が１つのチャネルを遮断し得るまたは詰まらせ得るさらなる細片を含有し得る場合に、使用できる。多様なサブチャネルは、１つの通路が遮断された際または詰まった際にＣＯＣが流れる多様な通路を提供し得る。
【００５４】
図４Ａはシステム全体を示し、図４Ｂおよび図４Ｃは、マイクロ流体システム６００のいくつかの部分を拡大して示す。図４Ａを参照して、マイクロ流体システム６００は、入口６０１、出口６０２、第１のステージ６１０、第２のステージ６２０、および第３のステージ６３０を含む。第１のステージ６１０、第２のステージ６２０、および第３のステージ６３０は、連携して、長く蛇行したチャネルを画定する。当該例証において、長く蛇行したチャネルは３つの区画を含む。第１の（すなわち、上の）区画は第１のステージ６１０および第２のステージ６２０を含み、これらは両方とも、液体試料からの細片の除去を助けるろ過ステージであり、第２および第３の（すなわち、下の）区画は第３のステージ６３０を含み、これは裸化効果を提供する。チャネルは蛇行しているように示されているが、チャネルは、直線状、環状、または多様な他の形状であってもよい。また、チャネルは、マイクロ流体システム６００に所望の長さおよび／または用途に依存して、より多い、またはより少ない区画を含んでもよい。
【００５５】
蛇行したチャネルは、ポスト６４０ａの複数の列６４０を含む。各列６４０は、複数のポスト６４０ａを含む。これらのポスト６４０ａの形状および大きさは、チャネルの全長にわたって、一定であってもよい、または変化してもよい。たとえば、この特定の例証において、第１のステージ６１０、第２のステージ６２０、および第３のステージ６３０は、楕円形のポスト６４０ａを含む。しかしながら、各ステージは、多様な形状のポスト６４０ａを任意の数にて含んでよく、正方形、矩形、および／または八角形のポストを含んでよい。また、各ステージは、ポスト６４０ａの列６４０を任意の数にて含んでよく、各列６４０は任意の数のポスト６４０ａを有してよい。示されている実施形態において、第１のステージ６１０は、７つのポスト６４０ａを有するいくつかの列６４０と、６つのポスト６４０ａを有するいくつかの列６４０とを含む。第２のステージ６２０は、６つのポスト６４０ａを各々有するいくつかの列６４０と、５つのポスト６４０ａを各々有するいくつかの列６４０とを含む。第３のステージ６３０は、６つのポスト６４０ａを各々有するいくつかの列と、５つのポスト６４０ａを各々有するいくつかの列６４０とを含む。すべての実施形態において、ポストの列は、チャネルにわたって、たとえば、チャネルの長軸に対して垂直に、またはチャネルの長軸に対して角度（たとえば、わずかな角度）をつけて、配置されている。
【００５６】
第１のステージ６１０、第２のステージ６２０、および第３のステージ６３０は、すべてが等しい長さを有してもよい、または異なる長さを有してもよい。いくつかの実現例において、第１および第２のステージ６１０、６２０の長さは、ポストの列６４０の数に依存して、約１０〜５０ｍｍである。第３のステージ６３０は、最初の２つのステージ６１０、６２０より長くてもよい。示されている実施形態において、第３のステージ６３０は、第１または第２のステージ６１０、６２０の約４倍の長さである。多様な実施形態において、第３のステージ６３０は、約４０〜２００ｍｍの長さであってよい。一実施形態において、各ポストは、約８００ミクロンの長さであってよく、システムは、効果的な裸化を達成するために、第３のステージにおいてこれらのポストを約１００個を含んでよい。ポストの列同士の間の水平方向の間隔は約４００ミクロンであってよいが、この間隔は決定的なものではなく、ＣＯＣがポストの列の間を転がるまたは回転するための十分な空間および時間がある限り、変動してもよい。たとえば、この実施形態において、第３のステージは、１２０ｍｍの全長であってよい。
【００５７】
重要なパラメータは、１つのサブチャネルに沿ってすべてのポストをカウントした際の、ぎざぎざの表面の長さの総計であり、上述される実施形態において、これは約８０ｍｍである。各ポストのぎざぎざの表面の長さをより短くすることも可能ではあるが、その場合、第３のステージにおいて、より多くのポストが必要となり得る。代替的には、第３のステージにおいて、各ポストのぎざぎざの表面の長さを長くしてポストの数を少なくすることもできる。しかしながら、第３のステージにおけるぎざぎざの表面の長さの総計は約８０ｍｍよりも長くするべきである。ぎざぎざの表面の長さの総計は、たとえば１００ｍｍ、１２０ｍｍ、または１５０ｍｍのように、より長くてもよいが、ぎざぎざの表面の長さの総計が長すぎると、卵母細胞が過度に損傷を受け得る。
【００５８】
図４Ｂは、第３のステージ６３０内に位置するポストの列６４０を拡大して示す。所与の列６４０における各ポスト６４０ａと、隣りのポスト６４０ａとの間に間隔があいて、幅（Ｗ）を有するサブチャネル６４０ｂが画定されている。列６４０の両端のポスト６４０ａと、チャネルの壁との間に間隔があいて、さらなるサブチャネル６４０ｂが画定されている。これらのサブチャネルの幅は、約８０〜１１０ミクロン、たとえば、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、または１１０ミクロンであってよく、これは一般的に、裸化される卵母細胞の直径に基づく。
【００５９】
第１のステージ６１０、第２のステージ６２０、および第３のステージ６３０はすべて、等しい幅（Ｗ）または変動する幅（Ｗ）を有するサブチャネル６４０ｂを有するポスト列６４０を含んでよい。示されている実施形態において、第１のステージ６１０における各サブチャネル６４０ｂは２４０ミクロンの幅（Ｗ）を有し、第２のステージ６２０における各サブチャネル６４０ｂは１４０ミクロンの幅（Ｗ）を有し、第３のステージ６３０における各サブチャネル６４０ｂは９０ミクロンの幅（Ｗ）を有する。
【００６０】
図４Ｃは、第３のステージ６３０内に位置する２〜３個のポスト６４０ａを拡大して示す。各ポスト６４０ａは、当該ポストの細長い壁に沿って複数のぎざぎざの歯６４０ｃを含む。ぎざぎざの歯６４０ｃは、サブチャネル内を通る流れの方向に沿った、または好ましくはこれに逆らった、いくつかの異なる傾斜角度のうちの１つ以上にて設定されていてよい。たとえば、いくつかの実施形態において、ぎざぎざの歯６４０ｃは、チャネル内を通る流れの方向に逆らって約３０度から約９０度未満の角度にて設定されている。また、ぎざぎざの歯６４０ｃの先端同士の間隔は変動してもよいが、一般的には、ぎざぎざの歯６４０ｃの先端同士の間隔は、ヒト（または他の動物、たとえば、哺乳類）の卵母細胞の平均直径（たとえば、１００ミクロン）に基づいて選択され、したがって約８０〜１１０ミクロンに設定されている。
【００６１】
ぎざぎざの歯６４０ｃの先端同士の間隔はいくつかの異なる間隔にて設定されてよいが、卵母細胞を過度に損傷せずに裸化を容易化することができるように歯６４０ｃの先端同士の間隔が設定されていることが好ましい。たとえば、歯６４０ｃの先端同士の間隔が小さ過ぎると、卵母細胞は損傷を受けずに間に入り込むことができない可能性がある。歯６４０ｃの先端同士の間隔が大き過ぎると、歯６４０ｃがＣＯＣから卵丘細胞を除去できない可能性がある。歯６４０ｃの先端同士の間隔は、少なくとも部分的に、歯６４０ｃの長さによって画定されてよい。したがって、ぎざぎざの歯６４０ｃの各々は、いくつかの長さのうちの１つを有するように構成されていてよい。たとえば、いくつかの実施形態において、ぎざぎざの歯６４０ｃは、約０．５〜２０ミクロンの長さ（たとえば、１、２、３、４、５、１０、１５、または２０ミクロンの長さ）である。
【００６２】
図４Ａ〜図４Ｃ中に示されている実施形態において、ステージ６１０、６２０、６３０のすべてにおける各ポスト６４０ａは、ぎざぎざの歯６４０ｃを含む。しかしながら、これらのステージのうち任意のものは、さらにまたは代替的に、任意の数の滑らかなポスト６４０ａを含んでもよい。さらに、各ステージにおける各ポスト６４０ａのぎざぎざの歯６４０ｃは、多様な長さと、先端同士の間の空間とを含んでよい。加えて、蛇行したチャネルの壁はこの実施形態においては滑らかであるが、ステージ６１０、６２０、６３０のうちの任意のものまたはこれらのすべては、ぎざぎざの歯６４０ｃをも有する壁を含んでもよい。
【００６３】
ステージ６１０、６２０、６３０の具体的な設計は、ステージ６１０、６２０、６３０に所望される機能に基づいていてよい。たとえば、例証されている実施形態において、第１および第２のステージ６１０、６２０のポスト列６４０の構成は、サブチャネル６４０ｂ内を流れるＣＯＣの、かさ高でゆるく付着している卵丘細胞の除去を容易化し、かつ、液体試料中に含まれる大きな細片を捕捉する。加えて、示されている実施形態において、第３のステージ６３０の構成は、チャネル内を流れるＣＯＣの放射冠の除去を容易化し、かつ、液体試料中に含まれるより小さな細片を捕捉する。
【００６４】
示される実施形態の各ステージはポストのいくつかの列６４０を含むが、これらのステージのうちの任意のものまたはこれらのすべては、いくつかの縦長のポスト６４０ａを有するポストの列を１つだけ含んでもよい。しかしながら、各列６４０同士の間にいくらかの空間を有する複数の列６４０を有する場合には、より高効率の裸化が容易化され得る、というのは、ポストの列同士の間の空間が、チャネル内を流れるＣＯＣの回転を容易化するためである。
【００６５】
図９は、マイクロ流体システムのサブチャネルによって捕捉されている細片を示す拡大画像の図示である。示されるとおり、マイクロ流体デバイス６００の多様なサブチャネル６４０ｃは、液体試料中に含まれ得る細片を捕捉し得て、試料のＣＯＣは他のサブチャネル６４０内を流れて裸化され得る。
【００６６】
使用方法
図５は、本開示の少なくとも１つの実施形態に係るマイクロ流体システム１００の使用方法を示すブロック図である。例証する目的から、以下には、当該方法が、図２Ａ〜図２Ｃを参照して上述されるマイクロ流体システム１００と共に使用されるとして記載される。しかしながら、当該方法は、図４Ａ〜図４Ｃを参照して上述される複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システム６００などの他のマイクロ流体システムと共に使用することもできる。当該方法は、液体試料を生成する工程（ブロック５１０）と、マイクロ流体システム１００中に液体試料を注入する工程（ブロック５２０）と、マイクロ流体システム１００内に液体試料を流す工程（ブロック５３０）と、裸化卵母細胞を回収する工程（ブロック５４０）とを含む。
【００６７】
ブロック５１０において、ＣＯＣ  １７０ａを含有する懸濁液を、培養媒体を予め充填してあってよいチューブ中に入れる。いくつかの実施形態において、チューブにはバッファーが予め充填してある。ＣＯＣ  １７０ａの懸濁液を培養／バッファー媒体と混合して、液体試料を生成する。液体試料は、約３００〜７００マイクロリットルの総体積を有してよい。いくつかの実施形態において、液体試料は、約５００マイクロリットルの総体積を有する。いくつかの実施形態において、懸濁液は、多様なサイズの細片を含む。たとえば、懸濁液は、ＣＯＣよりも大きいおよび／またはＣＯＣよりも小さい細片を含んでよい。いくつかの実現例において、懸濁液を、マイクロ流体システム中に注入する前に、ヒアルロニダーゼと共にプレインキュベートする。たとえば、懸濁液を、０．３ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼと共にプレインキュベートしてよい。懸濁液をヒアルロニダーゼと共にインキュベートすることによって、ＣＯＣの卵丘細胞同士の間の結合を緩めることによる卵丘細胞の除去が容易化され得る。
【００６８】
ブロック５２０において、チューブをポンプに、たとえばポンプにより（たとえば注射針により）制御されるシリンジなどに、接続する。シリンジは、一定の流速をかけることができるポンプに搭載される。チューブの他端を、マイクロ流体システム１００の入口１０１に差し込む。次いで、ＣＯＣ  １７０ａを含有する液体試料を、一定の流速にて、マイクロ流体システム１００の入口１０１に注入する。当該一定の流速は、０．１〜２．０ｍＬ／分であってよい。いくつかの実施形態において、当該一定の流速は、０．５ｍＬ／分である。他の実施形態において、当該一定の流速は、０．７５ｍＬ／分または１ｍＬ／分である。
【００６９】
本明細書中において図４Ａ〜図４Ｃを参照して記載される複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システム６００を使用する場合、多くのサブチャネルがあるために、より高い一定の流速を使用できる。いくつかの実施形態において、当該一定の流速は３ｍＬ／分〜５ｍＬ／分である。
【００７０】
ブロック５３０において、ポンプ流の作用によって、液体試料がマイクロ流体システム１００内を流れる。液体試料がマイクロ流体システム１００内を流れる際、ＣＯＣが、マイクロ流体システム１００のいくつかの拡張ユニット１４０、滑らかなくびれユニット１４１、およびぎざぎざのくびれユニット１４２内を通過する。一般的に、拡張ユニット１４０は、ＣＯＣ  １７０ａを転がらせるように設計され、これが、ＣＯＣの表面のできるだけ多くが後続のくびれチャネル１４１、１４２の内壁と接触するのを助ける。一般的に、滑らかなくびれユニット１４１は、ＣＯＣ  １７０ａのかさ高でゆるく付着している卵丘細胞の除去を容易化し、かつ、ぎざぎざのくびれユニット１４２は、ＣＯＣ  １７０ａの放射冠の除去を容易化する。
【００７１】
たとえば、図６Ｂは、ぎざぎざのくびれユニット１４２内を流れるＣＯＣ  １７０ａを示す。くびれユニットは、ＣＯＣ  １７０ａの流れに沿って傾斜したぎざぎざの歯を含み、この流れは、右向きの太い矢印で示される。ＣＯＣ  １７０ａがぎざぎざのくびれユニット１７０ａを通過する際、ぎざぎざの歯によってＣＯＣ  １７０ａに剪断応力がかかり、ＣＯＣ  １７０ａにおける卵母細胞の裸化が容易化される。ＣＯＣ  １７０ａがマイクロ流体システム１００内を通る際、ＣＯＣ  １７０ａはさらに裸化される。たとえば、図６Ａは、それぞれ３、２５、および９７という番号のついた３つの別個のぎざぎざのくびれユニット１４２内を流れるＣＯＣ  １７０ａを示す。上のぎざぎざのくびれユニット１４２は、マイクロ流体システム１００の第３のステージ１３０における３個めのぎざぎざのくびれユニット１４２を表す。中央のぎざぎざのくびれユニット１４２は、マイクロ流体システム１００の第３のステージ１３０における２５個めのぎざぎざのくびれユニット１４２を表す。下のぎざぎざのくびれユニット１４２は、マイクロ流体システム１００の第３のステージ１３０における９７個めのぎざぎざのくびれユニット１４２を表す。示されるとおり、ＣＯＣ  １７０ａは、ぎざぎざのくびれユニット１４２の各々を通過する際に、さらに裸化される。ＣＯＣ  １７０ａが最後の一連のぎざぎざのくびれユニット１４２を通過する際に、卵母細胞は大部分または完全に裸化されている。
【００７２】
再び図５を参照して、図４Ａ〜図４Ｃを参照して上述される複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システム６００を使用する場合、ＣＯＣは、ポストの列６４０の複数のサブチャネル６４０ｃを通過し得る。サブチャネル６４０ｃは、くびれユニット１４２に類似する様式にて（たとえば、卵丘細胞に力学的な力をかけることによって）、ＣＯＣの卵丘細胞を除去するように構成される。
【００７３】
ブロック５４０において、ＣＯＣ  １７０ａが一連のユニット１４０、１４１、１４２内を通って処理された後、ＣＯＣ  １７０ａは十分に裸化された卵母細胞１７０ｂになっている。しかしながら、ＣＯＣ  １７０ａは、マイクロ流体システム１００の具体的な設計および意図される用途に基づいて、部分的にのみ裸化された卵母細胞１７０ｂになっていてもよい。部分的におよび／または十分に裸化された卵母細胞１７０ｂは、マイクロ流体システム１００の出口１０２（すなわち、出口槽１０２）で集められる。
【００７４】
実施例
以下の実施例において本発明がさらに記載されるが、これらの実施例は請求項中に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００７５】
実施例１−マイクロ流体式卵母細胞裸化システムの操作
約７〜１２個のマウスＣＯＣを含有する懸濁液１０μｌを０．３ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼと共にプレインキュベートしたものを、培養媒体０．５ｍｌを予め充填しておいたＴｙｇｏｎ（登録商標）チューブ中に移した。このチューブは、約１．２７ｍｍの内径を有するものであった。１５ゲージの鈍針を用いて、チューブの一端をシリンジポンプに接続した。ポンプにより、一定の流速１ｍｌ／分をかけた。チューブの他端をマイクロ流体システムの入口に挿入した。次いで、試料を、本明細書中に記載されるようにマイクロ流体システム中に注入した。マイクロ流体システムを７５ｍｍ×２５ｍｍスライドガラス１枚に接着した。マイクロ流体システムは３つのステージを有し、第３のステージは、くびれユニットの幅が８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、または１４０μｍのいずれかであった。３０秒以内に、処理された卵母細胞を出口槽において集めた。チューブ中に移した全ＣＯＣのうちの処理された卵母細胞の数として、収量を計算した。出口槽において集めた処理されたすべての卵母細胞のうちの裸化卵母細胞の割合として、効率を計算した。
【００７６】
図７は、ステージ３のくびれの幅（Ｗ３）が、処理されたＣＯＣの収率および裸化効率に及ぼす効果を示す棒グラフである。示されるとおり、裸化効率は、９０および１００ミクロンの幅では１００％またはこれに近かったが、１００ミクロンを超える幅では急速に低下した。図示はされていないが、効率は、８０ミクロンの幅についても１００％であったが、典型的なマウス卵母細胞は直径が約９０ミクロンであるため、卵母細胞の損傷を回避するには、第３のステージのくびれユニットにおける歯の先端同士の間隔が卵母細胞のおよその幅よりも小さくないことが重要である。したがって、マウス卵母細胞について、第３のステージのくびれユニットにおける歯の先端同士の有用な間隔は、このシステムにおいて約９０〜１００ミクロンである。ヒト卵母細胞は典型的には約１００ミクロンの幅を有するため、マイクロ流体システムにおいて、ヒト卵母細胞について、第３のステージのくびれユニットにおける歯の先端同士の有用な間隔は、約１００〜１１０ミクロンである。
【００７７】
実施例２−幾何学的配置および流量パラメータの選択
卵核胞（ＧＶ）期の卵母細胞およびこれに関連するＣＯＣを、裸化デバイスにおいて使用した。ＧＶ期のＣＯＣは、広がっていない密集した卵丘−冠細胞の集まりを特徴とし、一方、中期ＩＩ（ＭＩＩ）のＣＯＣは、広がっていてそれほど密集していない卵丘−冠細胞の集まりを有し、冠細胞が透明帯から放射状に広がっている。マウスのＭＩＩ期のＣＯＣは、典型的には、大きなクラスタを形成している。ＧＶ期のＣＯＣについて得られる最適化されたパラメータを、体外受精実験のための成熟したＭＩＩ期のＣＯＣに対して使用した。
【００７８】
ＧＶ期のＣＯＣを使用して、３つの主要なパラメータを調整し、ＧＶ期の卵母細胞の完全な裸化を達成した。当該３つの主要なパラメータは、ぎざぎざの表面を有するくびれユニットの幅（Ｗ３）、第３の区画におけるくびれ−拡張ユニットの総数（Ｎ）、およびシリンジポンプがかける流速（Ｑ）であった。マイクロ流体システムの出口槽において回収された完全または不完全に裸化された卵母細胞の割合として、収率を計算した。出口槽において回収された卵母細胞の総数のうち完全に裸化された卵母細胞の割合として、裸化効率を計算した。Ｗ３、Ｎ、およびＱとは独立して、デバイスに入ったＣＯＣからの卵母細胞のほぼ１００％が出口槽において回収された。いくつかの卵母細胞またはＣＯＣがチューブの親水性の内表面に付着している可能性がある。Ｎ＝１００およびＱ＝１ｍＬ／分とし、Ｗ３を９０μｍから１３０μｍに増大した場合に、平均裸化効率が９８．６％から２６．７％に低下した。
【００７９】
これらの結果は、裸化を行なうためには、最も狭いくびれ幅（Ｗ３）が卵丘を有さない卵母細胞の平均サイズ（すなわち、直径９０μｍ以下）に近いことが重要であることを示し、このことから、ＣＯＣと内壁との物理的な接触が必須であることが強調される。
【００８０】
幅Ｗ３に加えて、ＮおよびＱの効果についても監視した。Ｗ３＝９０μｍおよびＱ＝１ｍＬ／分とし、第３の区画におけるくびれ−拡張ユニットの数（Ｎ）を５０に減らした場合に、裸化効率が劇的に減少して２８．３％となった。これらの結果は、所与のＣＯＣの表面全体がくびれチャネルの内壁と接触し得るように十分なくびれ−拡張ユニットを有するようマイクロ流体システムを構成することが、卵母細胞の完全な裸化にとって重要であることを示唆する。
【００８１】
ＣＯＣとぎざぎざの表面の内壁との接触は重要であるが、このことのみでは、卵母細胞の完全な裸化が保証されない可能性がある。流速を０．５ｍＬ／分に低下させた場合に、裸化効率は２２．２％であった。流速が０．７５ｍＬ／分であっても、裸化効率（８６．２％）は、流速１ｍＬ／分の場合（９８．６％）よりも低かった。したがって、十分な物理的接触に加えて、剪断応力を流速と直接相関させて、卵丘−冠細胞の集まりを剥ぎ取れるほど十分に大きくすることが重要である。剪断応力の効果を調べるために、デバイス内における、または手作業によるピペッティング中にキャピラリの先端を通る流体の流れについて、数値流体力学（ＣＦＤ）シミュレーションを行なった。最大剪断応力は流速と直接相関していた。
【００８２】
一方で、繰り返しのくびれ−拡張ユニット内の流体の流れについて、流速を０．５ｍＬ／分から１ｍＬ／分に増加すると、最大剪断力（τｍａｘ）が６４．１Ｐａから１６３．５Ｐａに増加した。最大剪断力は、ぎざぎざの表面のくびれチャネルに入って最初の１対の歯において生じた。一方、手作業によるピペッティングにより生じる流速が０．５ｍＬ／分から１ｍＬ／分に増加すると、τｍａｘが１４９．８Ｐａから３９２．０Ｐａに増加した。手作業によるピペッティングについては、最大剪断力は、キャピラリ先端の内輪において生じた。裸化に使用するガラスキャピラリは、外径２００μｍおよび内径１２５μｍを有してよい。多くの胚培養士が用いる典型的な流速は、６０フレーム／秒におけるビデオ記録から推定したところ、５００〜７５０μＬ／分の範囲であり得る。手作業によるピペッティングでは、流速の変動のために、各々の上下サイクルにおいて異なる剪断応力がかかり得て、これにより、０．５〜１ｍＬ／分において、上限２５０Ｐａまでの最大剪断応力の差異が生じ得る。しかしながら、マイクロ流体デバイスは、一定の流速をかけたために、剪断応力を一定に維持することができた。オンチップと手作業による裸化との間の剪断応力における最大の差異は、１ｍＬ／分の流速の場合に、２３０Ｐａという大きな値であり得る。
【００８３】
ＣＦＤシミュレーションの結果を実証するために、流れを十分に発生させた領域においてガラスキャピラリの内壁に作用する剪断応力を予測した。キャピラリの先端から軸方向に２，５００μｍの位置において内壁に作用する剪断応力は、０．５、０．７５、および１ｍＬ／分の流速においてそれぞれ４４．９、６５．５、および８２．５Ｐａであった。この位置での剪断応力（τ）は、ポアズイユの法則τ＝４μＱ／πｒ３に基づいて理論的に計算することもでき、式中、μは流体（すなわち、水）の粘度（ｄｙｎａｍｉｃ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）、Ｑは流速、ｒはキャピラリの内半径である。理論上の計算によると、０．５、０．７５、および１ｍＬ／分の流速において剪断応力はそれぞれ３８．７、５８．０、および７７．４Ｐａであった。この結果はＣＦＤシミュレーションの結果とよく一致しており、これにより、シミュレーションモデルの精度が示された。
【００８４】
ＭＩＩ期のマウスＣＯＣが排卵されると、これらは卵管内において１つの密なクラスタを形成する。このクラスタは、０．３ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼと共に３７℃において５分間インキュベーションすると緩められ得る。典型的なＡＲＴ診療所に近い条件においてマイクロ流体システムの性能を評価するために、ＭＩＩ期のマウスＣＯＣに対する裸化実験を行なった。裸化卵母細胞を、その後、ＩＶＦおよびＩＣＳＩ実験において使用して、その受精および発生能力を調べた。Ｗ３＝９０μｍおよびＮ＝１００であるマイクロ流体システムは、ヒアルロニダーゼで処理したＭＩＩ期のＣＯＣのクラスタが流速１ｍＬ／分で当該システムを通過した際に、完全な裸化を達成するのに十分であった。平均収率は９８．９％であり、裸化効率は平均９３．７％であった。密に詰まったＭＩＩ期のＣＯＣのクラスタがヒアルロニダーゼでのインキュベーション後に様々な程度で緩められたために、クラスタを壊して個々のＣＯＣにする必要性によって、典型的には孤立した複合体であり得るＧＶ期のＣＯＣの裸化と比較して、裸化効率が低下し得るということが観察された。注目するべきことに、典型的な臨床用ヒト試料は、たとえＭＩＩ期のものであっても、このようなクラスタを有さないと考えられる。
【００８５】
実施例３−ぎざぎざの歯の傾斜角度の選択
くびれユニットの表面特徴が裸化性能にどう影響するかを調べるために、多様な傾斜角度θをシステムに導入した。「傾斜角度」とは、ＣＯＣが流れる方向とくびれユニットのぎざぎざの歯の中央線との間の角度を指す。図８Ａは、くびれチャネルに沿って傾斜したぎざぎざの歯の４つの異なる傾斜角度の例証である。図８Ａ中に示されるとおり、θが０°から１４１°に増加すると、ぎざぎざの表面の内壁の歯が、ＣＯＣの流れる方向に沿っておよびこれに従って傾斜していたものが、ＣＯＣの流れる方向に逆らって傾斜するように変化した。図７Ｂおよび図７Ｃは、異なる傾斜角度θを有するマイクロ流体システムの収率および裸化効率を示す。
【００８６】
示されるとおり、収率は傾斜角度θとは独立しているようである。しかしながら、傾斜角度θ＞９０°を有するぎざぎざの歯は冠細胞を完全に「削り」取ることができるようである。したがって、これらの結果に基づいて、最も有効な傾斜角度θの範囲は９０°＜θ＜１８０°であり、これは、歯がＣＯＣの流れる方向に逆らって傾斜している範囲を意味する。注目するべきことに、流速は１ｍＬ／分であり、マイクロ流体システムは、第３の区画において、くびれユニット幅Ｗ３＝９０μｍである繰り返しのくびれ−拡張ユニットを１００個有していた。また、傾斜角度θの効果は剪断応力とは関係がない可能性があることも観察された。ＣＦＤシミュレーションにより、θ＝３９°および１４１°について最大剪断応力がそれぞれ１４５．３Ｐａおよび１６３．５Ｐａであると推定された。いずれの場合においても、最大剪断応力は、くびれユニットに入って最初の歯において生じた。また、くびれユニットに沿った他の歯について、剪断応力の最小の差異は、傾斜角度θ＝３９°〜１４１°において生じ得る。２つめから最後の歯についての剪断応力は、傾斜角度θ＝３９°である場合に８４．１Ｐａであり、傾斜角度θ＝１４１°である場合に９４．７Ｐａであった。したがって、剪断応力は、裸化効率の差異の原因ではなかった可能性がある。したがって、裸化効率にとってより重要なのは、歯と歯の間の空間が卵丘層で満たされた際にぎざぎざの歯が卵丘細胞を剥ぎ取る、剥がす、または削り取ることができるように、歯がＣＯＣの流れる方向に逆らって（たとえば、θ＝１４１°で）傾斜していることであり得る。
【００８７】
卵母細胞の裸化における拡張ユニットの役割をさらに調べるために、第３の区画における１００個のくびれチャネルの端同士が接続されていてその間に拡張チャネルが存在しないマイクロ流体システムを設計した。このマイクロ流体システムは、図２Ａ〜図２Ｃを参照して上述されるものと同じ第１の区画および第２の区画を有するものであった。収率は１００％に近かったが、繰り返しの拡張ユニットが存在しない際の裸化効率は２０％未満になった。したがって、ＣＯＣが転がるのを促す拡張ユニットは、裸化効率の点で重要である。さらに、マイクロ流体システムによって処理したＣＯＣは、２次元画像において、典型的には、１つまたは２つの側面に透明帯が露出し、他の側面では卵丘−冠細胞が完全な状態で残った外観を有する。このことは、拡張ユニットが存在しない際には、ＣＯＣ表面の（表面全体というよりも）特定部分のみが内壁との物理的な相互作用を受けることを示唆していると考えられる。
【００８８】
実施例４−複数のサブチャネルの使用
図４Ａ〜図４Ｃを参照して上述されるマイクロ流体システム６００と類似する、複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システムを使用して、液体試料中に懸濁したＣＯＣを裸化した。懸濁液は、ＣＯＣおよび多様なサイズの細片を含有していた。懸濁液を０．３ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼと共にプレインキュベートして、卵母細胞から卵丘細胞を緩めた。懸濁液を、流速３ｍＬ／分〜５ｍＬ／分にて、マイクロ流体システム内に流した。システムの第１のステージは、２４０ミクロンの幅を有するサブチャネルを含んでいた。システムの第２のステージは、１４０ミクロンの幅を有するサブチャネルを含んでいた。システムの第３のステージは、９０ミクロンの幅を有するサブチャネルを含んでいた。どのステージも、流体の流れる方向に逆らって傾斜したぎざぎざの歯を有するポストを含んでいた。
【００８９】
図１０は、複数のサブチャネルを有するマイクロ流体システムの収率および裸化効率に及ぼす流速の効果を示すグラフである。示されるとおり、流速５ｍＬ／分とした結果、最も高い収量（すなわち、入口に入った卵母細胞の数に対する、出口で集めた卵母細胞の数）および裸化効率（すなわち、出口で集めた卵母細胞の数に対する、首尾よく裸化された卵母細胞の数）が得られた。
【００９０】
他の実施形態
ここまで、本発明が、その詳細な説明と共に説明されているが、前述される説明は例示を意図したものであり、本開示の範囲を限定するものではなく、本開示の範囲は付属の請求項の範囲によって定義されるということが理解される。他の態様、利点、および改変も、以下の請求項の範囲内である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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