(57)【要約】  本発明は、対象におけるメラトニンの産生に使用するための、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株に関する。そのような使用のための好ましい菌株は、アデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる。そのような菌株の治療的使用には、メラトニン欠乏症に関連する疾患、例えば乳児疝痛の治療又は予防が含まれる。新規菌株も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるメラトニンの産生に使用するための、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株。
【請求項２】
菌株がアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
乳酸菌株が５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を有するか、又は活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素を有する、請求項１又は請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
菌株が２ユニット／Ｌ又は８ユニット／Ｌを超える５’−ヌクレオチダーゼ活性を有する、及び／又は２μｍｏｌ  Ｌ−１分−１又は８μｍｏｌ  Ｌ−１分−１を超えるレベルでアデノシンを産生することができるか若しくは産生を誘導することができる、及び／又は１０又は２０ｐｇ／ｍｌを超えるレベルでメラトニンを産生することができるか若しくは産生を誘導することができる、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のための菌株。
【請求項５】
使用が、メラトニンの欠乏又は減少に関連する疾患の治療又は予防にある、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のための菌株。
【請求項６】
使用が乳児疝痛の治療又は予防である、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための菌株。
【請求項７】
対象が生後１２ヶ月まで、好ましくは生後６又は５ヶ月まで、又は好ましくは生後３又は４ヶ月までの乳児である、及び／又は対象が母乳で育てられているか、又は調合乳で育てられているか、又はそれらの組み合わせである、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための菌株。
【請求項８】
使用が過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、睡眠障害、又は神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病又は他のタイプの認知症の治療又は予防である、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための菌株。
【請求項９】
菌株がラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）であり、好ましくは菌株がラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８ではない、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための菌株。
【請求項１０】
菌株がラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９及び／又はＤＳＭ３３１９８である、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用のための菌株。
【請求項１１】
菌株が、ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８と比較して増加したレベルで、５’−ヌクレオチダーゼ活性を有する、及び／又はアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる、及び／又はメラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のための菌株。
【請求項１２】
使用が、少なくとも１つのさらなる作用剤の投与をさらに含み、好ましくは、さらなる作用剤がＡＭＰ又はＡＭＰの供給源である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の使用のための菌株。
【請求項１３】
メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株であって、菌株がラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８ではない、上記乳酸菌株。
【請求項１４】
菌株がアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができ、菌株がラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８ではない、乳酸菌株、又は請求項１３に記載の菌株。
【請求項１５】
菌株が５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を有するか、又は活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素を有する、請求項１３又は請求項１４に記載の菌株。
【請求項１６】
菌株が２ユニット／Ｌ又は８ユニット／Ｌを超える５’−ヌクレオチダーゼ活性を有する、及び／又は２μｍｏｌ  Ｌ−１分−１又は８μｍｏｌ  Ｌ−１分−１を超えるレベルでアデノシンを産生することができるか若しくは産生を誘導することができる、及び／又は１０又は２０ｐｇ／ｍｌを超えるレベルでメラトニンを産生することができるか若しくは産生を誘導することができる、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１７】
菌株がラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、好ましくはラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９、又はＤＳＭ３３１９８である、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項１８】
菌株がラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９、又はＤＳＭ３３１９８である細菌株。
【請求項１９】
治療に使用するための請求項１８に記載の菌株。
【請求項２０】
菌株が乳児疝痛の治療又は予防に使用するためのものである、請求項１８又は請求項１９に記載の菌株。
【請求項２１】
菌株が過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、睡眠障害、又は神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病又は他のタイプの認知症の治療又は予防に使用するためのものである、請求項１８又は請求項１９に記載の菌株。
【請求項２２】
メラトニンの産生方法における請求項１３から２１のいずれか一項に記載の菌株の使用、又はアデノシンの産生方法における請求項１４から２１のいずれか一項に記載の菌株の使用。
【請求項２３】
菌株によって産生されたアデノシンがメラトニンに変換される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
アデノシンを産生することができる乳酸菌株を選択する方法であって、方法が
ａ）５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子の存在について乳酸菌株をスクリーニングすること、及び／又は
ｂ）活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素の存在について、乳酸菌株又はその上清をスクリーニングすること、及び
ｃ）アデノシンを産生することができる菌株を選択すること、及び任意選択で
ｄ）そのような菌株を培養又は増殖させること
を含む、上記方法。
【請求項２５】
菌株が、２ユニット／Ｌを超える５’−ヌクレオチダーゼ活性を有する、及び／又は２μｍｏｌ  Ｌ−１分−１を超えるレベルでアデノシンを産生することができる、好ましくは８ユニット／Ｌを超える活性を有する、及び／又は８μｍｏｌ  Ｌ−１分−１を超えるレベルでアデノシンを産生することができるように選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
菌株がラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
菌株がアデノシンを産生することができる、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法によって選択される乳酸菌株。
【請求項２８】
菌株が、ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９、又はＤＳＭ３３１９８である、請求項２７に記載の菌株。
【請求項２９】
対象におけるアデノシンの産生に使用するため、又は対象におけるメラトニンの産生に使用するために、乳酸菌株が５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を有するか、又は活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素を有し、及びアデノシンを産生することができ、好ましくは、使用は請求項５から８のいずれか一項に定義される通りである、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法により選択される菌株。
【請求項３０】
（ｉ）メラトニン又はアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる最初の乳酸菌株と、
（ｉｉ）メラトニン及び／又はアデノシンのさらなる供給源、又は乳酸菌株によるメラトニン及び／又はアデノシンの産生又は誘導を増加又は増強するための１又は複数の基質成分又は作用剤であって、好ましくは、菌株は請求項１３から１８のいずれか一項に定義されている通りであり、及び／又は基質成分がＡＭＰ又はＡＭＰの供給源である、と
を含む、対象におけるメラトニン又はアデノシンの産生を増加させるのに適した組み合わせ製品。
【請求項３１】
対象においてメラトニンを産生する方法であって、方法が、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる有効量の乳酸菌株を対象に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項３２】
対象におけるメラトニンの産生に使用するための薬剤又は組成物の製造における、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株の使用。
【請求項３３】
対象における、乳児疝痛、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、睡眠障害、及び神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病又は他のタイプの認知症から選択される疾患の治療における、請求項３１又は請求項３２に記載の方法又は使用。
【請求項３４】
菌株又は疾患又は対象又は投与が、請求項２から１８のいずれか一項に定義されている、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書において、メラトニン放出の前駆体及び他の重要な成分を産生する能力を含む、疝痛（又はメラトニンレベルの減少に関連する他の疾患）の予防及び／又は治療のためにメラトニンレベルを増加させる能力のために選択される乳酸菌の特定の菌株、そのような菌株を選択する方法、及びそのような菌株を含む製品を提供する。さらに、本発明は、そのような菌株の効力を増強するために特別に選択される基質成分を含む調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
有病率と窮状の両方の点におけるその顕著性にもかかわらず、乳児疝痛の性質と原因はよくわからないままである。状態を説明するために使用される異なる用語もある。これらの用語には、「乳児疝痛」、痛みが主に夕方に限定されるために「夕方疝痛」、及び生後約３ヶ月で消失するという理屈を受けて「３ヶ月疝痛」が含まれる。異なる著者が異なる定義を使用している。疝痛が、少なくとも３週間の期間中に１日３時間以上、１週間に３日以上泣く発作であるというウェッセルの定義は、ほとんどの文献で受け入れられている。２００６年に、ローマＩＩＩ基準が発表され、明白な原因なしに開始及び停止する過敏性、騒ぎ、又は泣き声の発作があり、１日３時間以上続き、１週間に少なくとも３日発生し、ただし少なくとも１週について発生する乳児に適用可能な「乳児疝痛」の診断を検討するようにこの基準が修正された（修正ウェッセルの基準と呼ばれることもある）。ローマＩＶ基準でさらに微調整された（Ｂｅｎｎｉｎｇａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１６；１５０：１４４３−１４５５）。これらの定義（ローマＩＩＩ又はローマＩＶ）のいずれかが本発明に関連している。
【０００３】
今日まで、主に議論されている乳児疝痛の考えられる原因因子は、心理社会的障害、微生物性腸内毒素症を含む胃腸障害、及び神経発達障害に分けられてきた。
【０００４】
心理社会的要因には、通常の泣き声の変種、非定型の子育てによる行動への影響、親と乳児の相互作用における問題の発現が含まれる。
【０００５】
胃腸障害は、乳児の脚の位置と泣いている間に顔をしかめることから疝痛に関係があるとされてきた。胃腸の要因を以下に簡単に概説する。
【０００６】
哺乳瓶による授乳、水平位置での授乳、及び授乳後のげっぷの不足などの不適切な授乳技術が原因と考えられている。最初の６ヶ月間の母乳育児は、保護因子であることがわかっている。乳児疝痛のリスクは、母乳で育てられていない乳児で１．８６倍高くなっている（Ｓａａｖｅｄｒａ  ＭＡ、Ｄａｃｏｓｔａ  ＪＳ、Ｇａｒｃｉａｓ  Ｇ、Ｈｏｒｔａ  ＢＬ、Ｔｏｍａｓｉ  Ｅ、Ｍｅｎｄｏｃａ  Ｒ．「乳児疝痛の発生率と関連する危険因子：コホート研究（Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｃｏｌｉｃ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ：ａ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ．）」Ｐｅｄｉａｔｒ（Ｒｉｏ  Ｊ）２００３；７９（２）：１１５−１２２）。
【０００７】
現在、疝痛の完全な治療法はない。疝痛の現在の治療パラダイムは、薬理学的及び／又は非薬理学的方法のいずれかからなり、症状を最大限に軽減する。親に提供される疝痛の典型的な治療的介入は、食事、身体、行動、薬理学を含む４つのカテゴリーに分類される。食事の操作には、さまざまな授乳技術、あるいは低刺激性ミルク、大豆又はラクトースフリーの調合乳の使用、さまざまなプロバイオティクスやプレバイオティクスなどの栄養補助食品、及び固形物の早期導入に関する専門家の助言が含まれる。
【０００８】
疝痛の治療のための処方箋のいらない薬物治療には、主に、シメチコン又はジメチルポリシロキサン、腸の気泡のサイズを縮小する非吸収性の市販薬の投与が含まれている。シメチコンは安全なプロファイルを有し、乳児疝痛に対するシメチコンの有効性がプラセボよりも優れていないことを示すいくつかの研究にもかかわらず、頻繁に推奨されている。
【０００９】
疝痛のある乳児の微生物叢パターンの変化を示唆するいくつかの報告があることから、何人かの研究者がさまざまな無作為化臨床対照試験（ＲＣＴ）を実施及び公開し、これらの乳児の泣く時間を短縮するラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８などの能力が評価されている。例えば、Ｓａｖｉｎｏら（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ２０１０；１２６：ｅ５２６−３３）は、乳児疝痛に対するこの菌株の有効性を試験するために２０１０年にＲＣＴを実施した。修正ウェッセルの基準に従って診断された母乳だけで育てられている疝痛のある乳児５０人を無作為に割り付け、Ｌロイテリ（Ｌ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８（１０８コロニー形成単位）又はプラセボのいずれかを２１日間毎日投与した。親の質問票で、毎日の泣く時間と悪影響を監視した。乳児４６人（Ｌロイテリ（Ｌ  ｒｅｕｔｅｒｉ）群２５人、プラセボ群２１人）が試験を完了した。毎日の泣く時間（分／日（中央値））は、０日目で３７０対３００、２１日目で３５．０対９０．０（ｐ＝．０２２）であった。
【００１０】
２０１３年、Ｓｚａｊｅｗｓｋａら（Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  ２０１３；１６２：２５７−６２）は、同様の設計で５ヶ月未満の乳児８０人を対象としたＲＣＴを発表し、治療に対する反応者の割合が、プラセボ群と比較してプロバイオティック群で有意に高いことを明らかにした。分／日（中央値）は、７日目で１８０対１８０、１４日目で７５対１２８、２１日目で５２対１２０（ｐ＜０．０５）であった。母乳育児の乳児の泣く時間を大幅に短縮することで、疝痛のある乳児におけるＬロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８の効果を示すいくつかの他の研究もある。しかし、疝痛のある子供たちがより高い率で泣くこと（調合乳で育てられている子供たちにおけるより高い率を含む）を減らすために、さらに効果的な介入が必要である。
【００１１】
したがって、現在、乳児の疝痛の治療に有用であることが証明されている、新しい（そして好ましくは改善された）安全で効果的な化合物及び組成物及び技術が必要とされている。本発明の組成物及び方法は、この必要性に応答し、乳児の疝痛（又は疝痛に関連する症状）を安全かつ効果的に予防及び治療することができる製品を提供する。
【００１２】
他の目的及び利点は、以下の開示からより完全に明らかになるであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
新生児のホルモンの未熟さは、腸運動の発達の早期問題における主な要因に関係があるとされ、それにより乳児疝痛などの乳児の痛みや泣き声も引き起こす。メラトニンは、生体リズムを支援する能力を有し、人間や動物の多くの機能に重要な影響を与えるホルモンである。メラトニンの前駆体はセロトニンであり、セロトニンは、アミノ酸のトリプトファンに由来する神経伝達物質そのものである。
【００１４】
メラトニンは、以前は主に松果体から分泌されると考えられていた神経伝達物質である。しかし、網膜や胃腸管など、メラトニンを産生する松果体外の部位がある。
【００１５】
乳児疝痛（ＩＣ）などの腸の運動障害や痛みを避けるためには、幼児におけるセロトニン及びメラトニンの産生、さまざまな概日リズムとの同期、及びそれに続く放出が潜在的に重要である。
【００１６】
セロトニンは腸の平滑筋の収縮を増加させ、メラトニンは腸の平滑筋を弛緩させる。セロトニン濃度のピークは、他の因子とバランスが取れていない場合に腸のけいれんを引き起こす可能性があり、メラトニンは重要な因子の１つである。セロトニンとメラトニンはどちらも概日リズムを有する。乳児が生まれるときにセロトニンが産生され、セロトニンの概日リズムが発達するが、内因性のメラトニン産生とメラトニンの概日リズムは、多くの乳児において生後３ヶ月が経過するまでは開始する準備ができていない。この時間は、乳児疝痛の正常な消失の時間と一致する。
【００１７】
乳児疝痛はメラトニン欠乏症と言うことができる。したがって、ＩＣのある乳児に外因性メラトニンを与えることが提案されているが、多くの医師や親は乳児にホルモンを与えることに消極的である。
【００１８】
すべての新生児のうち、ＩＣの推定有病率は５％〜２５％であり、これはいくつかの点で社会、両親、及び乳児自身にとって負担であり、費用がかかる。
【００１９】
したがって、一部の子供たちは、食物及び／又は腸内細菌から必要なメラトニンを産生及び放出できるように見え、したがって乳児疝痛を発症する可能性は低いようであるが、そうではなく、したがってＩＣを予防又は治療するための追加の支援を必要とする多くの他の子供たちもいる。
【００２０】
したがって、ＩＣを発症するリスクのある子供たち、又はＩＣに罹患した子供たちのメラトニンの産生及び放出を支援するための製品及び方法を見つけて開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、アデノシンを産生することができる細菌、例えば乳酸菌を選択できるという発見に基づいている。アデノシンを産生する乳酸菌は当技術分野で報告されておらず、そのような細菌は、例えば、メラトニン合成の律速酵素であるアリールアルキルアミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＮＡＴ）の産生を増加させるために使用することができる。ＡＡＮＡＴ酵素は松果体に見出されるが、胃腸管など、メラトニン産生の松果体外部位でも産生される。したがって、ＡＡＮＡＴ産生の増加（例えば、アデノシン産生の増加を介して）は、メラトニン産生を増加させる手段、又は胃腸管内のメラトニンレベルを増加させる手段を提供する。したがって、そのような細菌は、乳児疝痛あるいはメラトニンの産生又は合成の減少、低下又は欠乏に関連する、又はそれらを特徴とする他の疾患の治療又は予防に使用することができる。
【００２２】
したがって、本発明は、細菌株、例えば、対象におけるアデノシンの産生（例えば、アデノシンのレベルの増加又はアデノシンの産生の増加もしくは促進）に使用するための、又は対象におけるメラトニンの産生（例えば、メラトニンのレベルの増加又はメラトニンの産生の増加もしくは促進）に使用するための、アデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、対象においてアデノシン又はメラトニンを産生するための方法（例えば、アデノシン又はメラトニンのレベルの増加、又はアデノシン又はメラトニンの産生の増加もしくは促進）を提供し、方法は、有効量の細菌株、例えばアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株を対象に投与するステップを含む。
【００２４】
本発明はさらに、対象におけるアデノシン又はメラトニンの産生（例えば、アデノシン又はメラトニンのレベルの増加、又はアデノシン又はメラトニンの産生の増加もしくは促進）に使用するための薬剤又は組成物の製造における、細菌株、例えばアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株の使用を提供する。
【００２５】
より一般的に見ると、本発明はまた、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる細菌、例えば乳酸菌を提供する。したがって、そのような細菌は、メラトニンの産生のために、例えば、対象におけるメラトニンの産生又はレベルを増加させるために使用することができる。
【００２６】
したがって、一態様では、本発明は、対象におけるメラトニンの産生（例えば、メラトニンのレベルの増加又はメラトニンの産生の増加もしくは促進）に使用するための、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、対象においてメラトニンを産生（例えば、メラトニンのレベルの増加又はメラトニンの産生の増加もしくは促進）する方法を提供し、方法は、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる有効量の乳酸菌株を対象に投与するステップを含む。
【００２８】
別の態様では、本発明は、対象におけるメラトニンの産生（例えば、メラトニンのレベルの増加、又はメラトニンの産生の増加もしくは促進）に使用するための薬剤又は組成物の製造における、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株の使用を提供する。
【００２９】
上記のように、そのような菌株は、乳児疝痛、あるいはメラトニンの産生、合成又はレベルの減少、低下又は欠乏に関連する、又はそれらを特徴とする他の疾患の治療又は予防に使用することができる。
【００３０】
したがって、本発明はさらに、乳児疝痛、又は対象におけるメラトニンの産生又は合成又はレベルの減少、低下又は欠乏に関連する、又はそれらを特徴とする他の疾患の治療又は予防に使用するための、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株を提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、対象において、乳児疝痛、又はメラトニン産生又は合成又はレベルの減少、低下又は欠乏に関連する、又はそれらを特徴とする他の疾患を治療又は予防する方法を提供し、方法は、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる有効量の乳酸菌株を対象に投与するステップを含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、対象における乳児疝痛、あるいはメラトニン産生又は合成又はレベルの減少、低下又は欠乏に関連する、又はそれらを特徴とする他の疾患の治療又は予防に使用するための薬剤又は組成物の製造における、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株の使用を提供する。
【００３３】
そのような菌株は、アデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができてもよく、それにより、本明細書の他の場所に記載されるように、メラトニンを産生（例えば、下流産生）するか又は産生を誘導し得る。
【００３４】
本発明の他の目的及び利点は、読者に明らかになり、これらの目的及び利点は、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】メラトニン産生経路を示す概略図である。
【図２】本発明のアデノシンを産生することができる細菌がメラトニン産生経路にどのように影響するかを示す概略図である。
【図３】Ｌロイテリ（Ｌ  ｒｅｕｔｅｒｉ）細菌細胞の上清中の５’−ヌクレオチダーゼ活性の測定値を示す図である。
【図４】Ｌロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）細菌細胞の上清を添加した腸エンテロイドモデルでのメラトニン産生を示す図である。
【図５Ａ】ＤＳＭ１７９３８細菌細胞と比較したＬロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３３１９８細菌細胞の上清中の５’−ヌクレオチダーゼ活性の測定値を示す図である。
【図５Ｂ】ＤＳＭ１７９３８細菌細胞と比較した、さまざまなＬロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）細菌細胞の上清中の５’−ヌクレオチダーゼ活性の測定値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
したがって、上記で概説したように、本発明は、例えば特に胃腸（ＧＩ）管でメラトニンのレベルを増加させるために、メラトニンを産生することができるか、或いは産生を刺激、誘導又は支援することができる細菌株、例えば乳酸菌株を提供する。そのような菌株はそれ自体がメラトニンを産生、例えばメラトニンを分泌してもよく、したがって、メラトニンを直接供給又は産生する。
【００３７】
しかしながら、例えば、メラトニン合成経路の上流成分（又はメラトニンの前駆体）を産生するか産生を刺激又は誘導し、それによってメラトニン産生を支援又は増加させることによって、間接的にメラトニンの産生をもたらす菌株も提供される。好ましい例は、アリールアルキルアミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＮＡＴ）の産生又は誘導であり、ＡＡＮＡＴは、セロトニンからＮ−アセチルセロトニンへの変換における律速酵素であり、Ｎ−アセチルセロトニンは次にメラトニンに変換される。
【００３８】
上記で概説したように、別の特に好ましい乳酸菌株は、対象において、特に胃腸（ＧＩ）管においてアデノシンを産生又は誘導することができるものである。そのようなアデノシンは、適切な細胞表面アデノシン受容体（例えば、Ａ２Ａ受容体、Ａ２Ｂ受容体、Ａ３又はＡ４受容体、好ましくはＡ２Ａ受容体）に作用し、細胞内ｃＡＭＰのレベルの上昇をもたらすことができる。Ａ２Ａ及びその他のアデノシン受容体は、胃腸管に見出される細胞に存在することが知られている。次に、細胞内ｃＡＭＰは、ＡＡＮＡＴの産生に関与する（図２を参照）。したがって、細胞内ｃＡＭＰレベルの増加は、ＡＡＮＡＴレベルの増加、したがってメラトニンレベルの増加をもたらすことができる。したがって、アデノシンは、細胞表面のアデノシン受容体に結合できるようにするために、好ましくは細胞外に提供されるべきである。この目的のために、アデノシンは細菌細胞内で産生され、細胞外に輸送され（又は分泌され）得る。あるいは、アデノシンは、細胞外で、例えば、細菌細胞表面又は上清中で産生され得る。このような細胞外産生は、例えば、適切な基質をアデノシンに変換することができる、細胞壁（又は細胞表面）に固定された５’−ヌクレオチダーゼ酵素（又はエクト５’−ヌクレオチダーゼ酵素）の存在によって便利に起こり得る。このような細胞外産生は、細胞上清又は細胞外空間に５’−ヌクレオチダーゼ酵素（又はエクト５’−ヌクレオチダーゼ酵素）が存在することによっても同様に起こり得る。本明細書に示されるように、細菌株は、そのような５’−ヌクレオチダーゼ酵素（又はエクト５’−ヌクレオチダーゼ酵素）を細胞上清又は細胞外空間に提供、産生又は放出することができ、そこで適切な基質をアデノシンに変換することができる。適切な基質にはＡＭＰが含まれる。
【００３９】
したがって、細菌株が本明細書でアデノシンを産生することができると言及される場合、これは、細菌細胞自体によるアデノシンの直接産生を含み、また活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素を有する細胞（例えば、細菌の細胞表面に存在するか、細胞の上清又は細胞外空間に放出される）による細菌細胞によるアデノシンの産生を含み、それにより、例えばＡＭＰなどの適切な基質をアデノシンに変換する、又は変換することができる。そのような基質は、例えば環境内で内因的に、自然に存在することができるか、又は、例えば外因性の手段によって、細菌に提供され得る。
【００４０】
したがって、そのような菌株は、例えば、そのような菌株が存在しないレベルと比較して、メラトニンのレベルの増加をもたらすことができる。
【００４１】
メラトニンは胃腸管で産生されることが知られているため、この領域での産生又は産生の増加は生理学的に効果的であるはずである。好ましくは、産生されるメラトニンの量は、臨床的又は治療的に有意である。したがって、本発明の菌株は、メラトニンのレベルの減少又は低下に関連する（又はそれらを特徴とする）、又はメラトニン欠乏に関連する（又はそれらを特徴とする）任意の疾患又は状態を治療するために使用することができ、あるいはメラトニンのレベルの増加から利益を得るであろう任意の疾患又は状態を治療するために使用することができる。そのような疾患又は状態（及び実際にそのような疾患又は状態に苦しむ対象）は当業者によって容易に認識され、例えば、正常又は健康な対象のレベル、例えば同じ、同等又は比較できる年齢の正常又は健康な対象のレベルと比較して、低下した、減少した、例えば大幅に減少した（又は異常な）メラトニンのレベル、又はメラトニン欠乏症を有する状態又は対象が含まれる。そのような疾患の好ましい例は乳児疝痛である。そのような治療用途に好ましい菌株は、メラトニン又はアデノシンを産生する菌株である。
【００４２】
したがって、本発明のさらに別の態様は、例えば、アデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる菌株、又はアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株により、メラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる乳酸菌株を提供する。そのような菌株の治療的使用も提供される。好ましくは、菌株は５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を有するか、又はそのような菌株は、例えばＡＭＰ（又は他の適切な基質）をアデノシンに変換するための活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素を有する。アデノシン産生の例示的なレベル又は５’−ヌクレオチダーゼ活性又はメラトニン産生のレベルは、本明細書の他の場所に記載されている。
【００４３】
本発明の好ましい菌株は、Ｌロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株、より好ましくは、Ｌロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９、及び／又はＤＳＭ３３１９８（その寄託の詳細は本明細書の他の場所に提供される）であり、そのような菌株、例えば単離された菌株又はそのような菌株の生物学的に純粋な培養物又は調製物は本発明のさらなる態様を形成し、この菌株を含む組成物（例えば医薬又は栄養の、例えば栄養補助食品、又はプロバイオティクス、組成物、例えば薬学的又は栄養的に許容される希釈剤及び／又は賦形剤）、又は、例えば本明細書の他の場所に記載されているような、特に乳児疝痛（又は本明細書の他の場所に記載されている他の疾患）の治療又は予防のための、そのような菌株の治療的使用も本発明のさらなる態様を形成する。いくつかの実施形態では、ＤＳＭ１７９３８菌株は使用されない。したがって、本発明は、例えば本明細書の他の場所に記載されているような疾患を治療又は予防するために、治療で使用するためのラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９及び／又はＤＳＭ３３１９８を提供する。本発明はさらに、乳児疝痛の治療又は予防に使用するためのラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９、及び／又はＤＳＭ３３１９８を提供する。
【００４４】
したがって、本発明のさらに別の態様は、対象における乳児疝痛又は本明細書の他の場所に記載されている他の疾患を治療又は予防する方法を提供し、方法は、有効量のラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９及び／又はＤＳＭ３３１９８を対象に投与するステップを含む。
【００４５】
別の態様では、本発明は、対象における乳児疝痛又は本明細書の他の場所に記載されている他の疾患の治療又は予防に使用するための薬剤又は組成物の製造におけるラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９、及び／又はＤＳＭ３３１９８の使用を提供する。
【００４６】
本明細書の他の場所に記載されている本発明の代替の好ましい実施形態及び特徴は、本明細書及び本明細書の他の場所に記載されている本発明の治療方法及び使用に等しく適用される。
【００４７】
Ｌロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９、及び／又はＤＳＭ３３１９８は、例えば、５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子、及び  ＡＭＰ基質をアデノシンに変換することができる活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素を有することにより、アデノシンを産生する能力のために選択されており、アデノシンのレベルを増加させるだけでなく（例えば、菌株が存在しない場合のレベルと比較して）、例えば本明細書の他の場所に記載されているようにＡＡＮＡＴのレベルを増加させることによって、メラトニンのレベルを増加させるためにも適している。これらの菌株は、活性細胞壁に固定された５’−ヌクレオチダーゼ酵素を含み、それぞれの上清で５’−ヌクレオチダーゼ酵素活性も示す（図３及び図５Ａ／Ｂを参照）。
【００４８】
Ｌロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）のこれらの菌株は、天然に存在する菌株から開発され（言い換えれば、改変、適応、又は進化）、また、胆汁に対する耐性の増加や粘膜表面（例えば胃腸管の表面）への付着の増加など、１又は複数の他の改善された特性のために選択されている。したがって、ＤＳＭ３２８４６及びＤＳＭ３２８４７は、胆汁酸に対してより耐性があり、それによって、例えば胃腸管内でより多数が生存するように進化している。ＤＳＭ３２８４８及びＤＳＭ３２８４９は、例えば本発明によれば、胃腸管内でより良好にコロニー形成し、それによってより良好に機能することを目的として、粘液によりよく付着するように進化している。Ｌロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＤＳＭ３３１９８はまた、凍結乾燥手順の繰り返しを含む多段階の選択プロセスで変更されており、ネイティブ分離株（親株）よりも耐性が高く、生産プロセスでの生存率がより高くなっている。したがって、そのような菌株は、自然界に存在する菌株に対応せず、進化を余儀なくされており、非天然菌株である。ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９、ＤＳＭ３３１９８のすべての菌株が選択される。好ましい菌株は、ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４９、又はＤＳＭ３３１９８である。より好ましい菌株は、ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、又はＤＳＭ３３１９８である。
【００４９】
一実施形態では、ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８及び／又はＤＳＭ３２８４９株が選択又は使用される。好ましい菌株は、ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、又はＤＳＭ３２８４９である。より好ましい菌株は、ＤＳＭ３２８４６又はＤＳＭ３２８４７であり、例えば、いくつかの実施形態ではＤＳＭ３２８４６が好ましい。いくつかの実施形態では、菌株ＤＳＭ３３１９８が選択又は使用される。
【００５０】
本発明は、対象におけるアデノシンの産生に使用するための薬剤又は組成物の製造において、アデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる（例えば、アデノシンのレベルを増加させる、又はアデノシンの産生を増加させるか促進する）細菌株、例えば乳酸菌株の使用を提供する。
【００５１】
そのような方法及び使用は、乳児疝痛、又は本明細書の他の場所に記載されているような他の疾患、例えば過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、睡眠障害、又は神経変性疾患又は障害、例えばアルツハイマー病又は他のタイプの認知症、例えば他のタイプの老人性認知症の治療又は予防に使用することができる。そのような疾患は、メラトニンの欠乏又は減少に関連する（又はそれらを特徴とする）疾患、又は例えばメラトニンのレベルの上昇又は増加から利益を得るであろう疾患の例でもある。
【００５２】
胃腸運動とは、消化されている食物を移動させるための胃腸管の筋肉の伸縮を意味する。これらの筋肉の同期した収縮は蠕動と呼ばれる。
【００５３】
運動と分泌を調節する胃腸管内のホルモンを含む、局所的に放出される多くの因子が存在する。消化器系の動き、及びその中の内容物の通過が、運動を定義する。消化管のいずれかの部分の神経及び／又は筋肉、胃腸の運動機能が正常な強さで、かつ協調して機能しない場合、人は運動障害に関連する症状を発症する。
【００５４】
運動機能の障害は、例えば乳児疝痛のある対象において、さまざまな腸領域でさまざまな症状を引き起こすことが報告されている。
【００５５】
乳児疝痛は、生後３ヶ月の間に明らかな理由もなく過度に泣く乳児を表すために使用される用語である。疝痛は乳児期の最も困った問題の１つである。疝痛は乳児、親、そして医療提供者にとって苦痛である。疝痛の原因は完全には理解されていない。
【００５６】
新生児のホルモンの未熟さは、腸運動の発達の早期問題における主な要因に関係があるとされ、それにより乳児疝痛などの乳児の痛みや泣き声も引き起こす。
【００５７】
メラトニンは、生体リズムを支援する能力を有し、人間や動物の多くの機能に重要な影響を与えるホルモンである。ホルモンは、胃腸管の平滑筋と腸筋神経叢細胞に発現する選択的受容体（メラトニン受容体）によって胃腸運動に影響を与える。胃腸平滑筋収縮の根底にある基本的なメカニズムは、電流の周期的な生成である。胃腸管の筋電活動は、筋電移動複合体で組織化される徐波と棘波の２種類の電位からなる。
【００５８】
メラトニンの前駆体はセロトニンであり、セロトニンは、アミノ酸のトリプトファンに由来する神経伝達物質そのものである。
【００５９】
セロトニンによって誘発される食物輸送の低下は、メラトニンによって部分的に阻止されることが示されている。これは、腸活動の調節におけるメラトニンとセロトニンの平衡システムである。
【００６０】
さらに、機能的でバランスの取れたメラトニン−セロトニンシステムは、脳と胃腸管の両方でのパラクリン効果だけでなく、内分泌による食欲と消化のプロセスにも影響を与える。
【００６１】
２つのホルモンの作用は運動に相反する影響を与えるようであり、最終的な影響は用量に依存する。メラトニンとセロトニンは、過敏症のプロセスと痛みの伝導に関与していることも知られている。
【００６２】
Ｎ−アセチル−５−メトキシトリプタミンとしても知られるメラトニンは、主に松果体から分泌されると以前は考えられていたホルモンであり神経伝達物質である。しかし、網膜や胃腸管など、メラトニン産生の重要な松果体外部位がある。現在、胃腸管において松果体の少なくとも４００倍多くのメラトニンを示す報告がある。胃腸のメラトニンの概日変動は、（松果体のように）光への曝露によって制御されているようには見えず、食事と食物組成によって制御されているように見える。
【００６３】
乳児疝痛（ＩＣ）などの腸の運動障害や痛みを避けるためには、幼児におけるセロトニン及びメラトニンの産生、さまざまな概日リズムとの同期、及びそれに続く放出が重要である。
【００６４】
セロトニンは腸の平滑筋の収縮を増加させ、メラトニンは腸の平滑筋を弛緩させる。セロトニン濃度のピークは、他の因子とバランスが取れていない場合に腸のけいれんを引き起こす可能性があり、メラトニンは重要な因子の１つである。セロトニンとメラトニンはどちらも概日リズムを有する。乳児が生まれるときにセロトニンが産生され、セロトニンの概日リズムが発達するが、内因性のメラトニン産生とメラトニンの概日リズムは、多くの乳児において生後３ヶ月が経過するまでは開始する準備ができていない。この時間は、乳児疝痛の正常な消失の時間と一致する。メラトニンは、疝痛のある乳児では幼いとき午前中に低く、疝痛のない乳児では高いことが示されている（Ｃｅｎｇｉｚら、２０１５、Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃａｒｅ；９（１）／１０−１５）。そのような乳児（例えば、メラトニン又はメラトニンバランスの欠乏、例えば、午前中（例えば午前６時、午前８時、午前１０時又は正午、あるいはそれらの時間の前）のメラトニンレベルの欠乏に関連する乳児疝痛の形態を有する乳児）は、本発明を使用して治療することができる対象の例である。
【００６５】
したがって、一部の子供たちは必要なメラトニンを食物及び／又は腸内細菌から内因的に産生及び放出できるように見え、したがって乳児疝痛を発症する可能性は低いようであるが、そうではなく、したがってＩＣを予防又は治療するための追加の支援を必要とする多くの他の子供たちもいる。そのような乳児（例えば、完全に発達していない腸内マイクロバイオームによって引き起こされるメラトニンの欠乏を有する乳児、あるいは栄養問題又は摂食問題に苦しむ乳児）も本発明を使用して治療することができる対象の例である。
【００６６】
乳児疝痛はメラトニン欠乏症と言うことができる。これは、ストレスの多い状況にある子供たち、又は完全な妊娠期間の前に生まれた子供たちや食物代謝が完全に機能していないなど、ストレスに対処する能力が低い子供たちにとって特に重要である。そのような乳児（例えば、完全な妊娠期間の前に、又は帝王切開によって、又は完全に機能する食物代謝を持たずに生まれた、メラトニンの欠乏を有する乳児）も、本発明を使用して治療することができる対象の例である。
【００６７】
メラトニン機能のバランスに関連する状態の別の例は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）であり、これは、特定の原因がない排便習慣の乱れを伴う反復性腹痛又は不快感を特徴とする一般的な障害である。メラトニンは、痛みの知覚と排便習慣に正の効果を示すことが示唆されている（Ｓｉａｈ  ＫＴＨら、２０１４、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ；２０（１０）：２４９２−２４９８）。したがって、ＩＢＳ、特にメラトニン又はメラトニンバランスの欠乏に関連するＩＢＳの形態を有する対象も、本発明を使用して治療することができる対象の例である。
【００６８】
メラトニン欠乏症は、主に松果体、循環、唾液、脳脊髄液で、また尿中の代謝物である６−スルファトキシメラトニンを測定することによって、調査されてきた。
【００６９】
腸内には２０種類以上の腸内分泌細胞があり、人体で最大の内分泌器官となっている。腸クロム親和性（ＥＣ）細胞は、腸内分泌細胞及び神経内分泌細胞の一種である。それらは消化管の内腔を裏打ちする上皮と並んで存在し、胃腸の調節、特に腸運動と分泌において重要な役割を果たす。ＥＣ細胞は、神経伝達物質であるセロトニンやその他のペプチドの分泌を介して腸管神経系（ＥＮＳ）のニューロンシグナル伝達を調節し、さらにアデノシン受容体を発現し、メラトニンを活発に合成する。
【００７０】
不十分なメラトニンシグナル伝達の一般的な症状は睡眠障害であり、メラトニンは我々の時代の最も人気のある自然の健康補助食品の１つである。メラトニンは、その合成と分泌が暗闇によって強化され、光によって抑制される身体のいくつかの場所にあるため、しばしば「暗闇のホルモン」と呼ばれる。睡眠障害は子供たちに非常に蔓延しており、適切な治療を行わないと、慢性的になり、何年も続く可能性がある（Ｅｓｐｏｓｉｔｏら、２０１９、Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ、１７：７７）。高齢者でさえ睡眠障害を経験すると報告されている夜間のメラトニンのピークは、加齢とともに低下することが通常観察される。したがって、睡眠障害（ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）又は睡眠障害（ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、特にメラトニン又はメラトニンバランスの欠乏に関連する形態の睡眠障害（ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）又は睡眠障害（ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を有する又は罹患している対象も、本発明を使用して治療することができる対象の例である。
【００７１】
メラトニンのレベルの低下は、神経変性障害、特にアルツハイマー病や他のタイプの老人性認知症でも繰り返し報告されている（Ｂｌｕｍｅｎｂａｃｈ  Ｊｏｈａｎｎ  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ、２０１２、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１２、Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ６４０３８９）。したがって、そのような神経変性障害、特にメラトニン又はメラトニンバランスの欠乏に関連するそのような神経変性障害の形態を有する対象も、本発明を使用して治療することができる対象の例である。
【００７２】
メラトニン形成の速度は、松果体だけでなく、胃腸管など、メラトニン産生の松果体外部位においても酵素アリールアルキルアミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＮＡＴ）（図１及び図２）の活性に依存する。
【００７３】
アデノシンは、アデノシン受容体を介して細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させ、メラトニン合成の律速酵素であるＡＡＮＡＴの産生を増加させる。
【００７４】
本発明の目的は、乳児疝痛を予防及び／又は治療するためにアデノシン産生乳酸菌株を使用することである。
【００７５】
本発明の別の目的は、ＩＢＳを予防及び／又は治療するためにアデノシン産生乳酸菌株を使用することである。
【００７６】
本発明の別の目的は、睡眠障害を予防及び／又は治療するためにアデノシン産生乳酸菌株を使用することである。
【００７７】
本発明の別の目的は、神経変性障害、例えば、アルツハイマー病及び他のタイプの認知症、例えば他のタイプの老人性認知症を予防及び／又は治療するためにアデノシン産生乳酸菌株を使用することである。
【００７８】
本発明はまた、アデノシンを産生することができる乳酸菌株を含む特定の細菌株を選択する方法、及び疝痛を有する又は疝痛のリスクがある乳児に有益な効果をもたらすためのそのような菌株の使用に関する。本発明のさらなる目的は、アデノシンを産生することができる新しい細菌株を提供することである。
【００７９】
人体における重要な代謝プロセスの１つはプリン代謝であり、プリンは特定の酵素によって代謝及び分解される。これらの酵素の一例は、アデノシンの産生における重要な酵素であると考えられているエクト−５’−ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）である。
【００８０】
本発明者らは、驚くべきことに、いくつかの特定のプロバイオティクス細菌株がアデノシンを産生することができることを発見した。
【００８１】
したがって、本発明は、アデノシンの産生に有効である乳酸菌の菌株を含む、特定の細菌株を選択する新しい方法を含む。特定の細菌株を選択する目的は、乳児疝痛（又は本明細書の他の場所に記載されている他の疾患）などの特定の障害を治療するためにそれらを使用することである。
【００８２】
本発明は、プロバイオティクスとして、及び治療において、例えば医薬品として又は栄養補助食品として有用である細菌株、特に乳酸菌株を選択する方法を提供する。
【００８３】
したがって、本発明の一態様は、アデノシンを産生することができる細菌株、好ましくは乳酸菌株を選択する方法を提供し、方法は、
ａ）５’−ヌクレオチダーゼ、例えば細胞壁に固定された５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子の存在について、細菌株、例えば乳酸菌株をスクリーニングすること、及び／又は
ｂ）活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素、例えば細胞壁に固定された５’−ヌクレオチダーゼ酵素の存在について、例えば乳酸菌株などの細菌株、又はその上清をスクリーニングすること
を含む。
このような５’−ヌクレオチダーゼ（５’ＮＴ）酵素は、エクト−５’ヌクレオチダーゼ酵素又はＣＤ７３（分化クラスター７３）と呼ばれることもある。次に、アデノシンを産生することができる菌株を選択することができる。
【００８４】
あるいは、本発明は、アデノシンを産生する能力について例えば乳酸菌株などの細菌株をスクリーニングし、その能力を有する菌株を選択することによって、細菌株、好ましくは乳酸菌株を選択する方法を提供する。
【００８５】
本発明の方法を使用して適切な菌株が選択されると、それを次に、対象におけるアデノシンの産生、例えば局所産生のために使用することができる。
【００８６】
本発明の方法によって選択される、産生される、得られる、又は得ることができる例えば乳酸菌株などの細菌株であって、この菌株が、例えば対象におけるアデノシンの局所産生など、アデノシンを産生することができる、細菌株が本発明のさらに別の態様である。
【００８７】
本発明によって選択された菌株の乳児疝痛（又は本明細書の他の場所に記載されている他の疾患）における治療的使用も提供される。
【００８８】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の方法によって選択される、産生される、得られる、又は得ることができる例えば乳酸菌株などの細菌株を提供し、この菌株は、５’−ヌクレオチダーゼ遺伝子又は活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素を有し、対象におけるアデノシンの産生、例えば局所産生に使用するためのアデノシンを産生することができる。
【００８９】
本発明の代替の実施形態は、例えば乳酸菌株などの細菌株を提供し、この菌株は、５’−ヌクレオチダーゼ遺伝子又は活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素を有し、対象におけるアデノシンの産生、例えば局所産生に使用するためのアデノシンを産生することができる。この菌株の好ましい特徴及びその使用は、本明細書の他の場所に記載されている。
【００９０】
本明細書の他の場所で概説されるように、本発明の特定の実施形態は、乳児疝痛（又は本明細書の他の場所に記載されている他の疾患）の予防及び／又は治療である。
【００９１】
治療方法又は対象におけるアデノシンの産生、例えば局所産生の方法も提供され、方法は、対象におけるアデノシンの例えば局所産生などの産生を可能にするための有効量で対象に、本発明の選択方法によって選択される、産生される、得られる、又は得ることができる、例えば乳酸菌株などの細菌株を投与すること、又は例えば乳酸菌株などの細菌株を投与することであって、この菌株が５’ヌクレオチダーゼ遺伝子又は活性５’ヌクレオチダーゼ酵素を有し、アデノシンを産生することができることを含む。例えば乳児疝痛（又は本明細書の他の場所に記載されている他の疾患）における、菌株の好ましい特徴及びその治療用途は、本明細書の他の場所に記載されている。
【００９２】
また、本発明によって提供されるのは、本発明の選択方法によって選択される、産生される、得られる、又は得ることができる、例えば乳酸菌株などの細菌株の使用であって、この菌株は、５’ヌクレオチダーゼ遺伝子又は活性５’ヌクレオチダーゼ酵素を有し、対象におけるアデノシンの産生、例えば局所産生に使用するための組成物又は薬剤の製造において、アデノシンを産生することができる。代替の実施形態は、例えば乳酸菌株などの細菌株の使用を提供し、この菌株は、５’ヌクレオチダーゼ遺伝子又は活性５’ヌクレオチダーゼ酵素を有し、対象におけるアデノシンの産生、例えば局所産生に使用するための組成物又は薬剤の製造において、アデノシンを産生することができる。例えば乳児疝痛（又は本明細書の他の場所に記載されている他の疾患）における、菌株の好ましい特徴及びその治療用途は、本明細書の他の場所に記載されている。
【００９３】
本明細書に記載されるような細菌株（例えば、アデノシン、メラトニンなどを産生又は誘導することができる細菌株）を含む（例えば、１又は複数の細菌株を含む）、例えば医薬組成物、プロバイオティクス組成物、又は食事／栄養補助食品組成物などの製品又は組成物、ならびに本明細書に記載の方法及び使用における製品又は組成物の使用は、本発明のさらに別の態様を形成する。
【００９４】
国連食糧農業機関は、プロバイオティクスを「適切な量で投与されたときに宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」と定義している。今日では、例えば、ラクトバチルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）やビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの乳酸産生細菌など、多くの異なる細菌がプロバイオティクスとして使用されている。
【００９５】
本明細書の他の場所に記載されている本発明の代替の好ましい実施形態及び特徴は、本発明の治療方法、使用及び製品に等しく適用される。
【００９６】
上記のように、本発明は、アデノシンを産生することができる細菌株の選択及び使用に関する。
【００９７】
アデノシンの産生に有効である菌株は、例えば哺乳類、好ましくはヒトの対象におけるアデノシンの局所産生のために使用することができる。
【００９８】
したがって、上記で概説したように、本発明は、アデノシンを産生することができる細菌株を選択又はスクリーニングするためのさまざまな方法を提供する。
【００９９】
いくつかの方法は、例えば細胞壁に固定された５’−ヌクレオチダーゼなどの５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子の存在についてスクリーニングするステップ（例えば、ステップａ））を含む。このようなスクリーニングは、任意の適切な方法を使用して実行することができ、５’−ヌクレオチダーゼ遺伝子に陽性の菌株が選択される。そのような方法は、インビトロで都合よく実行され、例えば、その配列が当技術分野で知られている、細胞壁に固定された５’ヌクレオチダーゼ（又はその識別フラグメント）など、５’ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子の存在を検出するための遺伝的又は核酸ベースの方法であろう。例えば、ＰＣＲプロトコル（又は他の核酸ベースの技術）は、酵素をコードする既知の核酸配列に基づいてこれを行うように容易に設計することができ、あるいは、代替として、候補菌株のゲノム配列を、例えば、以下に論じられるようなＬＰＸＴＧモチーフ（配列番号１）の存在などを含む、既知の５’ヌクレオチダーゼ配列との相同性に基づいて、例えば細胞壁に固定された５’ヌクレオチダーゼなどの５’ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を同定する目的で精査することができる。
【０１００】
本発明の方法で検出される例示的な遺伝子は、Ｌロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）由来の細胞壁固定（エクト）５’ヌクレオチダーゼ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥＩ５６２７０．１、ＬＰＸＴＧモチーフ細胞壁アンカードメインタンパク質［ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＳＤ２１１２］）、又は他の種の細菌、例えば他の乳酸菌に由来する適切なホモログ／５’ヌクレオチダーゼである。例示的な技術は、実験例に記載されている。
【０１０１】
いくつかの方法は、例えば細胞壁に固定された５’ヌクレオチダーゼ酵素などの活性（機能的）５’−ヌクレオチダーゼ酵素の存在についてスクリーニングするステップ（例えば、ステップｂ））を含む。そのようなステップは、任意の適切な方法を使用して、例えば酵素アッセイを使用して実行することができる。５’−ヌクレオチダーゼ酵素は次の反応：
【数１】
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（ＡＭＰはアデノシン一リン酸）を触媒し、この反応を測定するアッセイは、活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素の存在（又は５’−ヌクレオチダーゼ活性）を決定するために容易に使用できる。言い換えれば、本明細書における活性又は機能的５’−ヌクレオチダーゼ酵素への言及は、適切な条件下で、例えばＡＭＰなどの適切な基質が供給される場合に、この反応を触媒することができるものである。５’−ヌクレオチダーゼ酵素の活性は、例えばそのような酵素アッセイで、例えば、反応で産生され、測定又は定量化することができるリン酸、アデノシン、又はアデノシンの他の適切な下流産生物の量又は濃度を測定することによって、必要に応じて定量化することができる。活性は、細菌細胞のサンプル、又は細菌細胞からの上清で便利に測定することができる。
【０１０２】
そのようなアッセイを実施するための方法は、当業者によく知られているであろう。例えば、ＡＭＰのアデノシンへの変換の下流産生物として（すなわち、アデノシンの産生の結果として）形成される色素（キノン色素）の産生によって５’−ヌクレオチダーゼ酵素活性が測定されるＣｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ  ５’−ヌクレオチダーゼアッセイキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ、カタログ番号８０２２９、ダウナーズグローブ、イリノイ州、米国）など、適切なキットが市販されている。ＡＭＰは基質として提供される。例示的な手法は、例のセクションに記載されている。適切な方法論は、他の試薬サプライヤー、例えばＳｉｇｍａからも５’−ヌクレオチダーゼ酵素試薬と合わせて、容易に入手できる。
【０１０３】
５’−ヌクレオチダーゼ酵素（又は５’−ヌクレオチダーゼ活性）の産生レベルが高い又は有意な菌株、例えば、５’−ヌクレオチダーゼ活性が２ユニット／Ｌ（リットルあたりのユニット）以上である、及び／又はアデノシンを２μｍｏｌ  Ｌ−１  分−１（μｍｏｌ／リットル／分）以上のレベルで産生することができる菌株が好ましい。したがって、好ましい実施形態において、菌株は、５’−ヌクレオチダーゼ活性が３、４、５、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ユニット／Ｌ以上のレベルである、及び／又はアデノシンを３、４、５、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、又は１５０μｍｏｌＬ−１分−１以上のレベルで産生することができるように選択される。いくつかの実施形態では、そのような値は上限を表すことができる。このような値は、一般に、細菌細胞のサンプル、例えば細菌細胞の表面、又は培養中の細菌細胞の上清中、好ましくは上清中で測定される５’−ヌクレオチダーゼ活性の値を指す。そのような値は、一般に、細菌細胞のサンプル、例えば培養中の細菌細胞の上清中で測定されるアデノシンレベル（好ましくは細胞外アデノシンレベル）を指す。そのような値は、一般に、１０９細菌／ｍｌの濃度、又はそのような培養物からの上清で測定されたときの５’−ヌクレオチダーゼ活性（又はアデノシンレベル）の値を指す。１ユニットは、１μｍｏｌ産生物／分（例えば、１μｍｏｌ産生物／リットル／分）を産生するために必要な酵素の量として定義される。ユニット／リットルの濃度は、１μＭ／分（例えば１μＭ／リットル／分）で濃度を上げるために必要な酵素濃度に対応する。この活性を測定するための適切で例となるアッセイは、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃの５’−ヌクレオチダーゼキット（＃８０２２９）を使用した例に示されている。したがって、好ましい実施形態では、上記の単位及び値は、このキット、及び／又は、特に１０９細菌／ｍｌの濃度又はそのような培養物からの上清を用いて例に記載された条件、又は同等のアッセイを使用して測定したときの単位及び値を指す。したがって、そのような方法は、インビトロで都合よく実行されるであろう。
【０１０４】
５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子の存在は、活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素の存在を常に示すとは限らないため、少なくともステップｂ）を含む方法が好ましいであろう。本発明の方法、使用及び乳酸菌において、アデノシン産生又はアデノシン活性は、例えば、上清又は乳酸菌によって産生される他の細胞外液中に存在することができるように、細胞外で、すなわち乳酸菌の外側又は表面で起こるべきである。したがって、例えば細胞壁に固定された５’−ヌクレオチダーゼの形態での細胞表面上の、又は細菌細胞からの細胞外、例えば上清中の活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素の存在は、アデノシンを産生する反応が細胞の外側、例えば細菌細胞の表面で起こるようになっている有用な特徴であり得る。
【０１０５】
したがって、良好なレベルのアデノシンの産生（例えば、５’−ヌクレオチダーゼ酵素によって産生される細胞外アデノシン）はまた、５’−ヌクレオチダーゼ遺伝子の存在又は活性５’−ヌクレオチダーゼ酵素の存在の指標となり得る。したがって、本発明の選択方法はまた、アデノシンを産生している菌株を選択するステップを含み得る。アデノシン（例えば細胞外アデノシン）の産生レベルが高い又は有意な菌株、例えば、対象において治療的に有効なレベルで、又はメラトニンの増加した（そして好ましくは治療的に有効な）レベルが観察されるようなレベルでアデノシンを産生する菌株が好ましい。そのような値は、一般に、培養中の菌株の上清又は培養中の菌株の細胞表面（インビトロ）で測定されたアデノシンの値を指し、いくつかの例示的な特定の値が上記に提供されている。
【０１０６】
しかしながら、いくつかの実施形態では、対象において、例えば投与部位で、例えば胃腸管内で、例えば局所的に産生されるアデノシンの値、レベル、又は量を指すことが適切である。例えば、好ましい菌株は、例えば、菌株が投与されていないときのアデノシンのレベル、又は特定の対象におけるアデノシンのベース又は自然のレベルなど、本明細書の他の場所に記載されている関連対照と比較した場合に、アデノシンの産生の増加、例えば、アデノシンのインビボ産生の増加、例えば局所産生（例えば、胃腸管内）を可能にすることができる。
【０１０７】
本明細書に記載の本発明のすべての態様において、局所産生は、投与部位でのアデノシンの産生又はレベル、例えば、（例えば投与が経口である場合）胃腸管でのアデノシンの産生又はレベルを指すことができる。一態様では、アデノシンの局所産生は、全身性の下流効果を有する可能性があり、循環系、例えば、血液又は血漿、又は胃腸管外の他の場所におけるアデノシン又はメラトニンのレベルを増加させ得る。
【０１０８】
したがって、例えば対象の胃腸管において、アデノシン（又はメラトニン又は５’ヌクレオチダーゼ活性）の局所レベルの増加を生じさせることができる菌株は、特に、菌株が経口投与されたときにそのような効果が観察される場合に好ましい。好ましくは、増加は、測定可能又は有意な増加であり、例えば、統計的又は臨床的に有意である。例として、アデノシン（又はメラトニン又は５’ヌクレオチダーゼ活性）のレベル、例えばアデノシン（又はメラトニン又は５’ヌクレオチダーゼ活性）の局所レベルにおいて、少なくとも、又は最大で、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍の増加を生じさせることができる菌株が好ましい。例えば、菌株が投与されていないときに観察されたレベル、又は対照製剤、例えば関連する菌株を含まない対照製剤が投与されるときのレベルと比較した場合の増加など、任意の適切な比較を使用することができる。
【０１０９】
アデノシン（又はメラトニン又は５’ヌクレオチダーゼ活性）産生のレベルを測定する適切な方法は、当業者によく知られているであろう。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、選択方法は、候補菌株によって産生されるアデノシンの量又はレベル（例えば、濃度）を検出又は決定するステップを含むであろう。
【０１１０】
必要に応じて、アデノシン産生又は５’ヌクレオチダーゼ活性のレベル（又は実際には本明細書に記載の菌株の任意の他の適切な特性）を、陽性又は陰性対照菌株と都合よく比較することができる。適切な陽性対照菌株は、例えば細菌細胞の上清において、有意なレベルのアデノシン／５’ヌクレオチダーゼ活性を産生することが例に示されているＤＳＭ１７９３８であり得る。一部の菌株は、例えば細菌細胞の上清において、ＤＳＭ１７９３８よりも高いレベル、時には著しく高いレベルのアデノシン／５’ヌクレオチダーゼ活性を産生する。したがって、例えば細菌細胞の上清において、例えばインビトロで評価した場合に、ＤＳＭ１７９３８よりも高い（増加した）レベル又は有意に高い（増加した）レベルの５’ヌクレオチダーゼ活性を産生することができる菌株は、本発明のなおさらなる態様を形成する。例示的な菌株は、ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４９、及びＤＳＭ３３１９８である（図３及び図５Ａ／Ｂを参照）。あるいは、例えば細菌細胞の上清において、例えばインビトロで評価した場合に、ＤＳＭ１７９３８よりも高い（増加した）レベル、又は有意に高い（増加した）レベルのアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる菌株は、本発明のなおさらなる態様を形成する。例えば、インビボで評価した場合にＤＳＭ１７９３８に比べて対象におけるアデノシンの局所レベルが例えばより高いなど、例えば、対象においてより高い（増加した）レベル又は有意に高い（増加した）レベルのアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる菌株は、特に菌株が経口投与されるときにそのような効果が観察される場合に、本発明のなおさらなる態様を形成する。
【０１１１】
一般に、ＤＳＭ１７９３８と比較した場合に１又は複数の改善された（例えば、著しく改善された）特性を有する菌株が、いくつかの実施形態に好ましい。
【０１１２】
好ましくは、（アデノシン産生又は５’ヌクレオチダーゼ活性の）増加は、測定可能又は有意な増加であり、例えば、統計的又は臨床的に有意である。例として、ＤＳＭ１７９３８のレベルと比較したアデノシンのレベル、例えば、アデノシンの局所又はインビトロレベル、又は５’ヌクレオチダーゼ活性のレベル（例えば、インビトロで評価した場合）において、少なくとも、又は最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、又はそれ以上の増加を引き起こすことができる菌株が好ましい。あるいは、ＤＳＭ１７９３８のレベルと比較したアデノシンのレベル、例えば、アデノシンの局所的又はインビトロレベル、又は５’ヌクレオチダーゼ活性のレベルにおいて、少なくとも、又は最大で、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍の増加を引き起こすことができる菌株が好ましい。インビトロレベルは、例えば細菌培養物中で、本明細書の他の場所に記載されているように便利に測定することができる。好ましくは、そのような増加は、例えばインビトロで、例えば細菌培養物の上清で測定されるような、アデノシン又は５’ヌクレオチダーゼ活性の細胞外レベルの増加である。
【０１１３】
適切な陰性対照菌株は、５’ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を含まないか、又は活性５’ヌクレオチダーゼ酵素を含まない（又は本明細書の他の場所に記載されているように５’ヌクレオチダーゼ活性を有していない）菌株であり得る。
【０１１４】
本発明の方法によって選択される菌株の下流での使用のために、アデノシン産生菌株が選択又は単離された後、他の実施形態はさらに、そのような菌株を培養又は増殖又は産生するステップ、及び任意選択で、例えば本明細書の他の場所に記載されているように、培養又は増殖又は産生された菌株をこの菌株を含む組成物、例えば医薬又は栄養組成物に製剤化するステップ、あるいは、そのような菌株を将来の使用のために、例えばリュフィリゼーション（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）又は凍結乾燥によって、保存するステップを含むであろう。一実施形態では、細菌株は凍結乾燥形態で提供される。
【０１１５】
本発明の方法の選択ステップ（及び実際には本明細書に記載されているような治療的方法）は、一般に、アデノシン産生を支援する適切な培養培地（又はインビボ環境）で実施する必要がある。好ましい培養培地（又はインビボ環境）は適切な炭素源を含み、炭素源は、好ましくは５’ヌクレオチダーゼ酵素によるアデノシン産生のための適切な基質（例えばＡＭＰ）と共に、菌株によるアデノシンの産生を支援する。
【０１１６】
このようなアッセイはインビトロで都合よく実行できるが、別のオプションは、例えば適切な腸エンテロイドモデルを使用して（例えばメラトニンのレベルを評価することができる、例５に記載の腸エンテロイドモデル及びアッセイを参照）、適切なエクスビボアッセイで菌株を評価することであろう。
【０１１７】
したがって、菌株を評価するための、例えば菌株によるアデノシン又はメラトニン産生の誘導を評価するための、任意の適切なインビトロ又はエクスビボモデル、菌株を評価するための好ましいインビトロ又はエクスビボモデルは、腸エンテロイドモデル、好ましくはヒト腸エンテロイドモデルであるが、例えばこれをメラトニンレベルを評価するために使用することができる。そのようなモデルは、例えば例５に記載されるように、腸内分泌細胞を含むことが好ましい。
【０１１８】
本発明の好ましい菌株は、少なくとも又は最大１０、２０、３０、４０、５０、６０又は７０ｐｇ／ｍｌのメラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる。いくつかの実施形態では、そのような値は上限を表すことができる。そのような値は、一般に、適切なインビトロ又はエクスビボアッセイで測定されたときに菌株によって誘導されるメラトニン産生のレベルを指し、例えば、細胞が本発明の菌株又は菌株から採取された上清と接触するときに、腸内分泌細胞（好ましくはヒト細胞）によって産生される、又は（例えば、本明細書の他の場所に記載されているような腸内分泌細胞のパーセンテージで）腸内分泌細胞を含む腸エンテロイドモデル、好ましくはヒト細胞を含むモデルで産生されるメラトニンのレベルを指す。この活性を測定するための適切で例となるアッセイは、腸内分泌細胞、例えば少なくとも２０％又は３０％、例えば２０〜４０％、３０〜４０％、又は最大４０％の腸内分泌細胞を含むヒト腸エンテロイドモデルを使用する例に示されている。したがって、好ましい実施形態では、上記の値は、このアッセイ（又は例えば上記パーセンテージの腸内分泌細胞を用いた同等のアッセイ）及び／又は例に記載の条件を使用して測定した場合の値を指す。
【０１１９】
いくつかの菌株は、例えば腸内分泌細胞から、又は上記の腸エンテロイドモデルにおいて、ＤＳＭ１７９３８よりも高いレベル、時には著しく高いレベルのメラトニンを産生又は誘導することができる。したがって、例えば上記のように、例えば腸内分泌細胞又は腸エンテロイドモデルを使用して、評価した場合に、ＤＳＭ１７９３８よりも高い（増加した）レベル、又は有意に高い（増加した）レベルのメラトニンを産生又は誘導することができる菌株は、本発明のなおさらなる態様を形成する。例示的な菌株は、ＤＳＭ１７９３８のレベルと比較して、メラトニン産生のレベルにおいて少なくとも、又は最大、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、又は１０倍の増加を生じさせることができ、また好ましい。
【０１２０】
したがって、本発明のスクリーニング方法は、任意選択で、例えば上記の方法論又は任意の他の適切な方法論を使用してメラトニンを産生することができるか又は産生を誘導することができる菌株を選択するさらなるステップを含むことができる。選択された菌株は、好ましくは、上記のレベルでメラトニンの産生を誘導することができる。
【０１２１】
本発明の方法を使用して２以上の細菌株をスクリーニングする実施形態では、生成されたアデノシン又は５’ヌクレオチダーゼ活性（又はメラトニン）の量を任意選択で定量化することができ、細菌株、例えば、最も高い活性又はレベルの５’−ヌクレオチダーゼ酵素あるいは十分に高い活性又はレベルの５’−ヌクレオチダーゼ酵素を有する、例えば、本明細書の他の場所に記載されているような活性又はレベルを有する、例えば、ＤＳＭ１７９３８よりも高い（好ましくは有意に高い）活性又はレベルを有する乳酸菌株、もしくは、最高量又は最高レベルのアデノシン又はメラトニンあるいは十分に高い量又はレベルのアデノシン又はメラトニンを産生する菌株、例えば、本明細書の他の場所に記載されている量又はレベルを有する、例えば、ＤＳＭ１７９３８よりも高い（好ましくは有意に高い）量又はレベルを有する菌株を選択することができる。
【０１２２】
したがって、
ａ）５’−ヌクレオチダーゼ、例えば細胞表面に固定された５’ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子の存在について、乳酸菌株をスクリーニングすること、及び
ｂ）５’−ヌクレオチダーゼ酵素の活性を定量化すること、及び任意選択で、
ｃ）５’−ヌクレオチダーゼ酵素の活性が最も高い又は十分に高い乳酸菌株を選択すること
を含む、アデノシン（又はメラトニン）の産生に有効な細菌株、好ましくは乳酸菌株を選択するための方法を提供することは、本発明のなおさらなる態様である。
【０１２３】
本明細書に記載の特定のステップを含む方法には、適切な場合、これらのステップからなる方法も含まれる。
【０１２４】
上述のように、細菌株、例えば、本発明の方法によって選択される、産生される、得られる、又は得ることができる乳酸菌株であって、この菌株が、アデノシンを産生することができ、好ましくは、メラトニンを産生するか、産生、例えば増加した産生を支援することができることは、本発明のなおさらなる態様である。
【０１２５】
任意の適切な細菌株、例えばプロバイオティクス細菌株、例えば任意のプロバイオティクス細菌を本発明の選択方法に供することができ、アデノシンを産生することができる任意の適切な細菌株、例えばプロバイオティクス細菌株を本発明の方法又は使用において、例えば本明細書に記載の治療的方法又は使用において使用することができる。
【０１２６】
好ましい細菌株は、乳酸菌、例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又はビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である。特に好ましい細菌株は、ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）であり、特に、２０１８年７月４日のＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）でブダペスト条約に基づいて寄託されたラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８及びＤＳＭ３２８４９、ならびに２０１９年７月９日のＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）でブダペスト条約に基づいて寄託されたラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３３１９８の菌株である。これらの細菌株又は単離された細菌株（及び、これらの寄託株の１又は複数における１又は複数の特徴、例えば、アデノシン及び／又は５’ヌクレオチダーゼ活性及び／又はメラトニンを産生するか産生に対する効果を誘導する能力を有する他の菌株、例えばＬロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株、特に関連するＬロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株）は、本発明の好ましい態様を形成し、例えば、本明細書の他の場所に記載されているような疾患又は状態を治療するために、あるいは本明細書に記載されているような任意の他の用途に使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｌロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＤＳＭ１７９３８は使用されない。
【０１２７】
したがって、本発明のなおさらなる態様は、本明細書に記載されているような１又は複数の疾患を治療又は予防するためのそのような菌株の使用を提供する。
【０１２８】
本発明の別の目的は、例えば乳酸菌株など、選択された菌株の５’−ヌクレオチダーゼの活性を最大化、増加又は改善することを含む、本明細書に記載される特定の障害の治療の使用及び効果を改善するための方法を提供することであり、これは、アデノシンの産生の増加又は改善につながることが好ましい。これは、特定の増殖条件で細菌を培養して、アデノシンの高収量（又は、例えば特定の増殖条件がない場合に観察される収量と比較して、より高い、例えば著しく高いアデノシンの収量）を可能にすることによって達成することができる。本発明の一実施形態では、特定の増殖条件は、例えば、５’ヌクレオチダーゼ酵素によるアデノシン産生のための適切な基質、例えばＡＭＰ、又はＡＤＰ及び／又はＡＴＰなどＡＭＰの適切な上流成分を補充した通常の増殖培地で乳酸菌を培養することであり得る。
【０１２９】
本発明のさらなる関連する実施形態では、５’−ヌクレオチダーゼの活性を最大化するために、より高濃度の細菌、例えば乳酸菌を投与することができる。例示的な濃度は、従来の用量よりも２〜１０倍高くなり得る。
【０１３０】
本発明のさらなる関連する実施形態では、５’−ヌクレオチダーゼ遺伝子は、適切な方法、例えば、適切なプロモーター、例えば誘導性プロモーターの制御下で５’−ヌクレオチダーゼ遺伝子を含むプラスミドベクターを挿入することによって細菌株で過剰発現させるか誘導することができる。あるいは、５’−ヌクレオチダーゼ遺伝子は、適切なプロモーター、例えば誘導性又はネイティブプロモーターの制御下で、例えば細菌細胞の染色体上に挿入するなど、細菌細胞に遺伝子の１又は複数の追加のコピーを挿入することによって過剰発現させることができる。
【０１３１】
上記のように、本発明の菌株、又は本発明の方法によって選択される、産生される、得られる、又は得ることができる菌株は、治療に使用される。したがって、本発明のさらなる態様は、対象におけるアデノシン、及びそれにより好ましくはメラトニンの産生、例えば局所産生に使用するための本発明のアデノシン産生株、又は本発明の選択方法を使用して選択される、得られる、又は得ることができる菌株を提供する。本発明の好ましい実施形態では、アデノシンなど、及び好ましくはメラトニンの産生は、アデノシン及びそれによるメラトニンの産生又は産生の増加、例えば局所産生から利益を得る乳児疝痛（及び本明細書に記載の他の疾患）の治療に使用される。
【０１３２】
本発明の治療方法及び使用における細菌株の投与は、治療を必要とする対象（動物／哺乳類）に対して、薬学的、治療的、又は生理学的に有効な量で実施される。したがって、方法及び使用は、治療を必要とする対象を特定する追加のステップを含み得る。
【０１３３】
本発明による疾患又は状態の治療（例えば、既存の疾患の治療）は、疾患又は状態の治癒、又は疾患又は疾患の症状の軽減又は緩和（例えば、疾患の重症度の低下）を含む。
【０１３４】
本発明の方法及び使用は、疾患又は状態の予防ならびに疾患又は状態の治療に適している。したがって、予防的治療も本発明に含まれる。このため、本発明の方法及び使用において、治療又は療法はまた、適切な場合、予防法又は予防を含む。
そのような予防的（又は保護的）態様は、本明細書に記載されるように健康又は正常な対象に対して都合よく実行することができ、完全な予防及び有意な予防の両方を含むことができる。同様に、有意な予防には、治療を行わない場合に予想される重症度又は症状と比較して、疾患の重症度又は疾患の症状が軽減される（例えば、測定可能に又は大幅に軽減される）シナリオが含まれ得る。
【０１３５】
本発明のなおさらなる態様は、本明細書の他の場所で定義される治療用途のための菌株又は製品を提供し、ここで、使用は、少なくとも１つのさらなる作用剤、例えばさらなる治療薬又は栄養剤の投与をさらに含む。例示的な作用剤は、アデノシンの産生を増加又は増強させる基質成分（例えば、アデノシンの産生を増加又は増強することができる成分）、又はそのような成分の供給源であり得る。
【０１３６】
したがって、アデノシン産生細菌が関係する本発明のなおさらなる実施形態では、菌株又は産生物の投与は、基質成分、例えばＡＭＰ、及び／又はこの成分を産生する材料又は作用剤の投与をさらに含む。好ましい基質は、ＡＭＰ、又はＡＭＰの供給源であろう。
【０１３７】
そのような実施形態では、基質成分又は他の追加の成分は、対象に投与する直前に細菌調製物に添加され得る。あるいは、製造プロセスの終わり、例えば発酵の終わりに細菌調製物に添加され得、その後、細菌を将来の使用のために例えばリュフィリゼーション（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）又は凍結乾燥によって保存することができる。あるいは、以下に説明するように別々に投与することができる。
【０１３８】
そのような実施形態では、さらなる治療薬は、問題の疾患の治療に有用な任意のさらなる作用剤であり得る。
【０１３９】
さらなる作用剤は、本発明の菌株又は産生物と一緒に（例えば、組み合わせた調製物として）投与することができ、又は別々に投与することができる。これに加えて、さらなる作用剤は、本発明の菌株又は産生物と同時に、又は異なる時点で、例えば順次、投与することができる。適切な投与レジーム及びタイミングは、問題のさらなる作用剤に応じて当業者によって容易に決定され得る。
【０１４０】
本発明はまた、
（ｉ）細菌株、例えば本発明の選択方法によって選択される、産生される、得られる、又は得ることができる乳酸菌株（又は本明細書で別途定義されるようにアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる細菌株）であって、細菌株が、細胞表面に固定された５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子又は活性５’ヌクレオチダーゼ酵素を有し、アデノシンを産生することができる、細菌株と、
（ｉｉ）アデノシンの産生を増加又は増強させる１又は複数の基質成分又は作用剤、あるいはそのような成分又は作用剤の供給源と
を含む組成物（又は組み合わせ製品又はキット）を提供する。
例示的な成分又は作用剤は上記に概説されている。好ましい成分は、ＡＭＰ又はＡＭＰの供給源である。
【０１４１】
本発明はまた、
（ｉ）本明細書に記載されるようにメラトニン又はアデノシンを産生することができるか又は産生を誘導することができる最初の細菌株、例えば乳酸菌株と、
（ｉｉ）乳酸菌株によるメラトニン及び／又はアデノシンのさらなる供給源、又はメラトニン及び／又はアデノシンの産生又は誘導を増加又は増強するための１又は複数の基質成分又は作用剤、又は必要に応じて、そのような成分又は作用剤の供給源と
を含む、対象においてメラトニン又はアデノシンの産生を増加させるのに適した組成物（又は組み合わせ製品又はキット）を提供する。
好ましい成分は、ＡＭＰ又はＡＭＰの供給源である。
【０１４２】
本発明のキット又は組み合わせ製品では、構成要素（ｉ）及び（ｉｉ）は、一般に、別個の区画又は容器内に、又はキット又は製品の別個の構成要素として提供される。キットはさらなる構成要素を含んでもよく、それも別個の区画又は容器内にあり得る。好ましくは、キット（又は組み合わせ製品）は、本明細書に記載の本発明の方法又は使用に使用するためのものであり、例えば、本明細書に記載の他の疾患、特に乳児疝痛の治療又は予防に使用するためのものである。本発明の方法及び使用におけるキット又は製品の使用に関する指示は、任意選択で提供され得る。
【０１４３】
本明細書で使用される「対象」という用語は、哺乳類、特にヒト、特に乳児（例えば、予防又は治療される疾患が疝痛である場合）を含む。本発明の好ましい実施形態では、選択された菌株、例えば乳酸菌株は、ヒトに投与される。疝痛以外の疾患の場合、疾患に罹患している、又は疾患に罹患していることが疑われる、又は疾患のリスクがある任意の対象、例えばヒト対象、例えば成人又は子供又は乳児の対象が適切である。
【０１４４】
本発明による好ましい対象は、生後１２ヶ月未満又は以下、好ましくは生後５又は６ヶ月未満又は以下、好ましくは生後３又は４ヶ月未満又は以下の乳児である。そのような対象は、治療又は予防される疾患が乳児疝痛である場合に特に適切である。したがって、対象は、出生から、又は生後最初の数週間以内（例えば、最初の１、２、３又は４週間以内）又は最初の数ヶ月以内（例えば、最初の１、２、３又は４ヶ月以内）に治療することができる。
【０１４５】
本明細書の他の場所に記載されているように、好ましい対象は、乳児疝痛（又は本明細書に記載されている他の疾患の１つ）に罹患している、あるいは乳児疝痛（又は本明細書に記載されている他の疾患の１つ）に罹患していると信じられる又は疑われる対象である。本発明の治療的使用は疾患を予防するために使用することもできるため、適切な対象には、乳児疝痛（又は本明細書に記載されている他の疾患の１つ）に罹患するリスクのある対象が含まれる。
【０１４６】
例示的な対象には、母乳だけ（のみ）で育てられている乳児、及び調合乳だけ（のみ）で育てられている乳児（母乳で育てられていない乳児）、又は母乳と調合乳の両方で育てられている乳児が含まれる。
【０１４７】
他の例示的な対象には、まだメラトニンを産生又は放出していない、あるいはそうでなければメラトニンを産生又は放出することができない乳児、特に疝痛を有する乳児、疝痛を有すると疑われる乳児、又は疝痛を発症するリスクがある乳児、例えば、メラトニン概日周期がまだ発達していないか開始されていない乳児、あるいは必要なメラトニンを食物及び／又は腸細菌から産生又は放出することができない乳児が含まれ、あるいは、例えば正常又は健康な対象のレベル、例えば同じ、同等又は比較できる年齢の正常又は健康な対象のレベルと比較して、低下した、減少した、例えば大幅に減少した（又は異常な）メラトニンのレベル、又はメラトニン欠乏症を有する乳児が含まれる。
【０１４８】
疝痛以外の疾患の場合、例示的な対象には、例えば、正常又は健康な対象のレベル、例えば同じ、同等、又は比較できる年齢の正常又は健康な対象のレベルと比較して、低下した、減少した、例えば大幅に減少した（又は異常な）メラトニンのレベル、又はメラトニン欠乏症を有する対象が含まれる。
【０１４９】
他の例示的な対象には、例えばメラトニンのレベルが低いか不十分である、ある種の栄養的又は食事上の問題点又は問題を抱えている乳児が含まれる。そのような対象には、完全な妊娠期間よりも前に生まれた乳児、例えば未熟児又は妊娠３６週よりも前に生まれた乳児、あるいは完全に機能する食物代謝がない乳児、あるいは摂食問題又は栄養問題を有する乳児が含まれる場合がある。
【０１５０】
他の例示的な対象には、例えば同じ年齢の正常な乳児又は対象と比較して、ホルモンが未熟（すなわち、ホルモン産生が最適以下、正常以下、未発達、欠乏、低下又は未熟）、例えばメラトニンが未熟な対象、好ましくは乳児、特に、上記のホルモンの未熟さの結果として腸運動に欠陥がある対象が含まれる。そのようなホルモンの未熟さ、例えばメラトニンの未熟さ又はメラトニンの減少又は欠乏は、例えば、乳児疝痛に苦しむ一部の乳児に関連している可能性がある。治療されるべき他の好ましい疾患（したがって対象）は、メラトニン欠乏症に関連する疾患又は状態（又はこの疾患に罹患している対象）である。
【０１５１】
そのようなすべての対象において、適切又は必要な場合、対象におけるメラトニンのレベルは、当技術分野で容易に利用可能かつ既知の技術を使用して容易に測定することができる。例えば、メラトニンのレベルは、血清／血液又は唾液サンプルで容易に測定できる。このような測定用の市販キットも利用可能である。
【０１５２】
任意の適切な投与様式を使用することができる。便利なことに、投与は経口、直腸、又は経管栄養によるものである。したがって、細菌は、所望に応じて、又は適切に、胃腸管又は口腔に投与することができる。細菌は、乳児用調合乳、栄養補助食品、オイルドロップ、及び医薬製剤に含めることができる。
【０１５３】
本明細書で定義される本発明の菌株、産生物及び組成物の適切な用量は、治療される疾患（又は状態）、投与様式、及び関連する製剤に応じて容易に選択することができる。
【０１５４】
例えば、投与量及び投与レジームは、本発明に従って対象に投与される細菌が、アデノシン（又はメラトニン）の産生、例えば局所産生の増加をもたらすことができ、また乳児疝痛（又は治療される他の疾患）において望ましい治療効果又は健康上の利益を生じさせることができるように選択される。したがって、好ましくは、投薬量は、治療される哺乳類のタイプ及び状態に適切であり、例えば、それを必要とする対象に投与される治療上有効な投薬量である。例えば、日用量は、例えば、細菌の総ＣＦＵで１０４から１０１２、例えば１０５から１０９、又は１０６から１０８、又は１０８から１０１０、又は１０１０から１０１２の１日１回投与が使用され得る。
【０１５５】
一実施形態では、日用量（例えば、ＣＦＵで１０５から１０９、又は１０６から１０８、又は１０８から１０１０、又は１０１０から１０１２）は、数回の投与、例えば２〜８回の投与（３〜５回の投与など）に、あるいは対象の各摂食（母乳及び／又は調合乳）に関連して分割される。一実施形態では、対象におけるより速い緩和を得るために、開始期間後に２〜１０倍、又は１０〜１００の用量などのより高い用量、及び／又はより頻繁に投与される用量が開始用量として３〜１４日間（例えば、５〜１０日間、７日間など）投与される。
【０１５６】
本明細書に記載される用語「増加する」又は「増強する」又は「より高い」（又は同等の用語）は、適切な対照と比較した場合の任意の測定可能な増加又は上昇を含む。適切な対照は、当業者によって容易に識別され、菌株が存在しない場合のレベル、あるいは未治療又はプラセボ治療対象のレベル、あるいは健康又は正常な対象のレベル（例えば年齢が一致する対象、又は治療前の同じ対象）を含み得る。好ましくは、増加は有意であり、例えば臨床的又は統計的に有意であり、例えば確率値が０．０５以下である。
【０１５７】
好ましくは、適切な対照レベル又は値と比較した場合（例えば、未治療又はプラセボ治療対象と比較した場合、あるいは健康又は正常な対象と比較した場合、あるいは治療前の同じ対象と比較した場合）、そのような増加（及び実際に本明細書の他の場所で言及されている他の増加、改善又は正の効果）は、測定可能な増加などであり（適切な場合）、より好ましくは、それらは有意な増加であり、好ましくは臨床的に有意又は統計的に有意な増加であり、例えば確率値が０．０５以下である。
【０１５８】
本明細書に記載される用語「低下する」又は「減少する」（又は同等の用語）は、適切な対照と比較した場合の任意の測定可能な低下又は減少を含む。適切な対照は、当業者によって容易に識別され、菌株が存在しない場合のレベル、あるいは未治療又はプラセボ治療対象のレベル、あるいは健康又は正常な対象のレベル（例えば年齢が一致する対象、又は治療前の同じ対象）を含み得る。好ましくは、低下又は減少は有意であり、例えば臨床的又は統計的に有意であり、例えば確率値が０．０５以下である。
【０１５９】
したがって、好ましくは、適切な対照レベル又は値と比較した場合（例えば、未治療又はプラセボ治療対象と比較した場合、あるいは健康又は正常な対象と比較した場合、あるいは治療前の同じ対象と比較した場合）、そのような低下（及び実際に本明細書の他の場所で言及されている他の低下、減少又は負の効果）は、測定可能な低下などであり（適切な場合）、より好ましくは、それらは有意な低下であり、好ましくは臨床的に有意又は統計的に有意な低下であり、例えば確率値が０．０５以下である。
【０１６０】
本出願全体で使用されるように、「ａ」及び「ａｎ」という用語は、上限がその後具体的に述べられる場合を除いて、参照される構成要素又はステップの「少なくとも１つ」、「少なくとも最初」、「１又は複数」又は「複数」を意味するという意味で使用される。
【０１６１】
さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」又は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語、又は他の同等の用語が本明細書で使用される場合、いくつかのより具体的な実施形態においてこれらの用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語あるいは他の同等の用語を含む。
本明細書で論じられるようなさまざまな構成要素及び特徴「からなる」リストはまた、さまざまな構成要素及び特徴を「含む」リストを指すことができる。
【０１６２】
他の目的及び利点は、以下の非限定的な例及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
【０１６３】
例
例１
５’−ヌクレオチダーゼに位置する細胞表面をコードする遺伝子を有する菌株を同定する方法
細菌をＭＲＳプレート上で嫌気性雰囲気中３７℃で１６時間培養する。滅菌プラスチックループで１０個の細菌コロニーを収集し、１００マイクロリットルの滅菌水（ＰＣＲ品質）に懸濁する。（代替法では、適切な方法を使用して細菌培養物からＤＮＡを調製する。）
【０１６４】
５’−ヌクレオチダーゼ遺伝子の存在は、例えばＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ  ＰＣＲビーズ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）及び以下に説明するプライマーペアのいずれか（それぞれ０．４ｍＭ）を使用することにより、ＰＣＲによって調べることができる。細菌懸濁液又はＤＮＡ調製物（０．５マイクロリットル）をＰＣＲミックスに添加し、９５℃で５分、３０ｘ（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒）、７２°で１０分のプログラムを行ってＰＣＲ反応を実行する必要がある。ＰＣＲ産物は、標準的なアガロースゲル電気泳動と、標準的なサンガーシーケンシング（ＰＣＲに使用されるフォワードプライマーを使用）によって決定されたシーケンスを使用して分離及び視覚化できる。
【０１６５】
遺伝子は、以下のプライマーのいずれかを使用して検出され得る。
プライマーペア１（産物のサイズ２３３ｂｐ）
ＬｒＮｕｃ１ｆ：ＧＧＡＡＣＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡ（配列番号２）
ＬｒＮｕｃ１ｒ：ＣＧＧＧＣＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＴＣＡＣＴ（配列番号３）
プライマーペア２（産物のサイズ２１２ｂｐ）
ＬｒＮｕｃ２ｆ：ＴＡＣＴＣＧＴＧＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＴＧ（配列番号４）
ＬｒＮｕｃ２ｒ：ＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＴＴＴＣＡＡＣＴ（配列番号５）
プライマーペア３（産物のサイズ２３２ｂｐ）
ＬｒＮｕｃ３ｆ：ＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＴＧＡＣＣＣＴＧＡ（配列番号６）
ＬｒＮｕｃ３ｒ：ＴＴＧＡＴＡＴＴＡＧＧＣＧＣＡＴＣＣＴＴＴＴ（配列番号７）
【０１６６】
シーケンス
細胞表面に固定された５’−ヌクレオチダーゼをコードする遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥＩ５６２７０．１、ＬＰＸＴＧ−モチーフ細胞壁アンカードメインタンパク質［ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＳＤ２１１２］（配列番号：８）
2021531739.tif 000003
2021531739.tif 000004
細胞表面に固定された５’−ヌクレオチダーゼタンパク質、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＥＩ５６２７０．１、ＬＰＸＴＧ−モチーフ細胞壁アンカードメインタンパク質［ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＳＤ２１１２］（配列番号：９）
2021531739.tif 000005
【０１６７】
例２
５’−ヌクレオチダーゼ活性を分析するための手順
Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ  ５’−ヌクレオチダーゼアッセイキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ、エルクグローブヴィレッジ、イリノイ州、米国）を使用して、細菌細胞及び発酵上清の５’−ヌクレオチダーゼ活性を測定した。要するに、手順は次の通りであった。
【０１６８】
２つのステップで、試薬ＣＣ１及びＣＣ２を細菌又は上清を含むサンプルに添加した。試薬１には、細菌の５’−ヌクレオチダーゼ酵素によってアデノシンに変換されたＡＭＰが含まれている。アデノシンは、試薬１の成分によってイノシンとヒポキサンチンにさらに加水分解された。第２のステップでは、ヒポキサンチンを尿酸と過酸化水素に変換し、これを使用してキノン色素を生成し、分光光度計で５５０ｎｍで速度論的に測定した。活性は、３〜５分間の吸光度の変化を計算し、キャリブレーターサンプルの値と比較することによって決定した。
【０１６９】
例３
ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株の５’−ヌクレオチダーゼ活性
ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９、及びラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８（２００６年１月３０日のＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）でブダペスト条約に基づいて寄託）における５’−ヌクレオチダーゼ活性を示す実験データは、上記の例２で説明した方法を使用して生成した。結果を図３に示す。
【０１７０】
例４
菌株の選択
上記の例３のすべての新しい菌株、すなわち、ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、及びＤＳＭ３２８４９は、細菌上清において５’−ヌクレオチダーゼ活性を示す。分析は、１ｍｌあたり１０９個の細菌の濃度を有する細菌培養物の上清で実施した。
【０１７１】
ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、及びＤＳＭ３２８４９は、特性を改善するために開発／進化されている。ＤＳＭ３２８４６及びＤＳＭ３２８４７は、胆汁酸に対してより耐性があり、それによって胃腸管内でより多く生き残るように進化するように作られている。ＤＳＭ３２８４８及びＤＳＭ３２８４９は、胃腸管においてより良好にコロニー形成し、それにより本発明に従ってより良好に機能することを目的として、粘液によりよく付着するように進化している。
【０１７２】
ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、ＤＳＭ３２８４８、ＤＳＭ３２８４９のすべての菌株が選択されている。好ましい菌株は、ＤＳＭ３２８４６、ＤＳＭ３２８４７、及びＤＳＭ３２８４９である。
【０１７３】
例５
ヒト腸エンテロイドモデルにおけるメラトニン産生に対するプロバイオティクス細菌株の影響
背景
腸陰窩幹細胞に由来するヒト腸エンテロイド（ＨＩＥ）は、腸上皮のインビトロモデルに生物学的に関連している。ＨＩＥにはすべての腸上皮細胞タイプが含まれているが、ヒトの腸と同様に、ＨＩＥは通常、腸内分泌細胞（ＥＥＣ）を少量（約１％）産生するため、研究が制限される。ＨＩＥのＥＥＣ数を増やすために、レンチウイルス形質導入を使用して、ＥＥＣ分化を駆動する転写因子（ｔｅｔＮＧＮ３−ＨＩＥ）であるニューロゲニン−３（ＮＧＮ３）のドキシサイクリン誘導性発現を伴う空腸ＨＩＥを安定的に操作した。この遺伝子操作された細胞株では、培養物中に存在する腸内分泌細胞の数が１％以下から約４０％に増加する。
【０１７４】
材料及び方法
ヒト腸エンテロイド
ＨＩＥ培養物は、肥満手術を受けている成人患者の空腸組織から分離された陰窩から生成された。これらの確立された培養物は、テキサス医療センター消化器疾患センター研究デザイン及び臨床研究コアを通じてベイラー医科大学で取得した。三次元ＨＩＥ培養物は、組織サンプルから調製され、培養物中に維持された。ＨＩＥのＥＥＣ数を増やすために、レンチウイルス形質導入を使用して、ＥＥＣ分化を駆動する転写因子（ｔｅｔＮＧＮ３−ＨＩＥ）であるニューロゲニン−３（ＮＧＮ３）のドキシサイクリン誘導性発現を伴う空腸ＨＩＥを安定的に操作した。この遺伝子操作された細胞株では、培養物中に存在する腸内分泌細胞の数が１％以下から約４０％に増加する。すべてのエンテロイドは、標準的なプロトコルに従って、９６ウェル単層形態で増殖及び分化された。このエンテロイド株、その培養方法、及びアッセイの一般的な方法論の詳細については、Ｃｈａｎｇ−Ｇｒａｈａｍら（Ｃｈａｎｇ−Ｇｒａｈａｍら「細胞及び分子の胃腸病学及び肝臓学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）」２０１９、Ｓ２３５２−３４５Ｘ（１９）３００４９−９、印刷中、オンライン出版が利用可能）に記載されている。
【０１７５】
細菌株及び調製
この実験では、２つの異なるラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株（ＤＳＭ１７９３８及びＤＳＭ３２８４６）を、腸内のメラトニン産生を増加させる能力に関して研究した。
【０１７６】
この研究では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉａ  ４（ＬＤＭ４）培地で静止期に達するまで増殖させたラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８及びラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３２８４６の馴化培地（上清）を使用した（詳細は以下を参照）。
【０１７７】
細菌株の単一のコロニーをＭＲＳ寒天プレートから選び、１０ｍＬのＭＲＳブロスに接種するために使用し、３７℃の水浴中の密閉されたコニカルチューブ内でインキュベートした。８時間後、培養物の１：１０希釈を行い、６００ｎｍでの光学密度を分光光度計で読み取った後、２５ｍＬの予熱したＬＤＭ４を開始ＯＤ  ０．１（以下の計算）で接種し、水浴中に配置して１６時間インキュベートした。
○ＯＤ＝０．３０７。１：１０希釈＝３．０７のＯＤ
２５ｍＬ＊（０．１  ＯＤ）＝３．０７ｘ  ｘ＝０．８１４ｍＬ
○８１４ｕＬを２４．１９ｍＬのＬＤＭ４と組み合わせた。
【０１７８】
１６時間後に培養物を取り出した。最終的なＯＤは２．６であった。細胞を４７００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化し、上清を新しい５０ｍＬコニカルチューブに移した。上清を−２０℃で一晩保存した。
【０１７９】
使用した化学薬品
ＡＭＰ＝アデノシン５’−一リン酸、９９％（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）コード：１０２７９０２５９、ロット：Ａ０３９５２７４。
１０ｍＬのストック溶液（２ｍＭ＝６．９ｍｇ／ｍｌ（ＦＷ＝３４７．２２４）のストック溶液）をＭｉｌｉＱ水で作成し、０．２２ｕＭフィルターでフィルター滅菌した。
【０１８０】
実験のセットアップ
誘発されたエンテロイドの対照処理：
●ＬＤＭ４（培養培地）、
●ＬＤＭ４＋２０ｕＭ  ＡＭＰ、
●ＬＤＭ４＋２００ｕＭ  ＡＭＰ
【０１８１】
誘発されたエンテロイドに対するＤＳＭ３２８４６及びＤＳＭ１７９３８上清の実験的処理：
●ＤＳＭ３２８４６上清のみ
●ＤＳＭ３２８４６上清＋２０ｕＭ  ＡＭＰ
●ＤＳＭ３２８４６上清＋２００ｕＭ  ＡＭＰ
●ＤＳＭ１７９３８上清のみ
●ＤＳＭ１７９３８上清＋２０ｕＭ  ＡＭＰ
●ＤＳＭ１７９３８上清＋２００ｕＭ  ＡＭＰ
【０１８２】
上清又は他の添加物をエンテロイドに適用する準備ができる前に、ｐＨを中和し、上清をフィルター滅菌した。１０〜３０ｕＬの１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨを７．０に調整し、２ｕＬの上清をｐＨペーパー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｒａｎｄ  −  Ｃａｔ．１３−６４０−５１０範囲６．０〜８．０）に塗布してｐＨを測定した。上清を０．２２ｕＭフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｆｌｏｗ  ０．２２ｕＭフィルターコード：００１５８）を使用してフィルター滅菌した。
【０１８３】
１００ｕＬ（総量）の処理をエンテロイドに配置した。インキュベーションは、エンテロイド上で３７℃、５％ＣＯ２組織培養インキュベーターで１時間行った。インキュベーション後、上清を除去し、下流分析まで−２０℃で保存した。
【０１８４】
メラトニンはＥＬＩＳＡ（Ｅａｇｌｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ、アムハースト、ニューハンプシャー州、米国）で検出した。標準プロトコルに従う前に行った唯一のステップは、上清を解凍し、室温に到達させることであった（摂氏約２０〜２１度）。
【０１８５】
結果
ヒト腸エンテロイド（ＨＩＥ）は、腸上皮のインビトロモデルとして生物学的に関連している。図４に示すように、ＤＳＭ３２８４６だけでは大きな影響はないが、ＡＭＰを追加すると、ＨＩＥからのメラトニン産生に顕著な影響が見られる。より高い濃度のＡＭＰは、さらに高いメラトニン産生をもたらした。ＤＳＭ１７９３８のメラトニン産生は、対照と比較して増加しているが、ＤＳＭ３２８４６よりも少ない。したがって、ＤＳＭ３２８４６は、腸内でのメラトニンの産生に使用するのに適した候補菌株である。
【０１８６】
例６
ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株の５’−ヌクレオチダーゼ活性
ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３３１９８の５’−ヌクレオチダーゼ活性を示す実験データは、上記の例２で説明した方法を使用して生成された。結果は図５Ａに示されており、図５Ａでは、同じ実験のＤＳＭ１７９３８の５’−ヌクレオチダーゼ活性（ＤＳＭ１７９３８活性＝１）に関連して正規化されている。ＤＳＭ１７９３８の５’−ヌクレオチダーゼ活性（ＤＳＭ１７９３８活性＝１）に関連する同じタイプの正規化を図３の結果にも行い、これは図５Ｂに示されており、異なる細菌株についてＤＳＭ１７９３８に関連する５’−ヌクレオチダーゼ活性の倍率変更の比較を容易にしている。
【０１８７】
例７
菌株の選択
上記の例６の新しい菌株、すなわちラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３３１９８は、細菌の上清で高い５’−ヌクレオチダーゼ活性を示す。分析は、１ｍｌあたり１０９個の細菌の濃度を有する細菌培養物の上清で実施した。
【０１８８】
ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３３１９８は、特性を改善するために開発された。Ｌロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＤＳＭ３３１９８は、凍結乾燥手順の繰り返しを含む多段階の選択プロセスで変更されており、ネイティブ分離株よりも耐性が高く、製造プロセスでの生存率が高くなっている。
【０１８９】
ラクトバチルスロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ３３１９８が選択されている。
【配列表フリーテキスト】
【０１９０】
配列表１  ＜２２３＞モチーフ
＜２２３＞任意のアミノ酸
配列表２  ＜２２３＞プライマーＬｒＮｕｃ１ｆ
配列表３  ＜２２３＞プライマーＬｒＮｕｃ１ｒ
配列表４  ＜２２３＞プライマーＬｒＮｕｃ２ｆ
配列表５  ＜２２３＞プライマーＬｒＮｕｃ２ｒ
配列表６  ＜２２３＞プライマーＬｒＮｕｃ３ｆ
配列表７  ＜２２３＞プライマーＬｒＮｕｃ３ｒ
【図１】
2021531739.tif 000006
【図２】
2021531739.tif 000007
【図３】
2021531739.tif 000008
【図４】
2021531739.tif 000009
【図５】
2021531739.tif 000010
【配列表】
2021531739000001.app
【国際調査報告】
2021531739.tif 000011
2021531739.tif 000012
2021531739.tif 000013
2021531739.tif 000014
2021531739.tif 000015
2021531739.tif 000016
2021531739.tif 000017
2021531739.tif 000018