(57)【要約】  本発明は、腫瘍免疫療法の分野にある。特に、本発明は、患者の１つ以上の癌細胞で過度に上方制御されるＲＮＡ転写物についての患者の腫瘍標本におけるトランスクリプトーム分析に基づく、前記患者の腫瘍に特異的な個別化された癌ワクチンを提供する。これらの個別化癌ワクチンは、患者に投与された場合、患者の１つ以上の癌細胞で過度に上方制御されるＲＮＡ転写物によって前記患者の腫瘍において発現される腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導する。ＲＮＡ転写物の過度の上方制御により、個別化癌ワクチンは、対象のワクチン接種のため、および前記対象の自己タンパク質である腫瘍関連抗原に対する自己寛容を破壊するために有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個別化された癌ワクチンを製造するための方法であって、
（ａ）癌患者の腫瘍標本中に存在する１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する工程であって、前記１つ以上のＲＮＡ転写物のそれぞれがアミノ酸配列をコードし、前記１つ以上のＲＮＡ転写物のそれぞれが所定の発現閾値を超えるコピー数で前記腫瘍標本中に存在する、工程；および
（ｂ）前記１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされる前記アミノ酸配列（１つまたは複数）に由来する少なくとも１つのエピトープを特徴とするワクチンを提供する工程
を含む方法。
【請求項２】
１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する前記工程が、癌患者の腫瘍標本中に存在するＲＮＡ転写物のコピー数を決定し、前記ＲＮＡ転写物のそれぞれのコピー数をそれぞれの所定の発現閾値と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍標本中の前記ＲＮＡ転写物のコピー数が、非腫瘍組織におけるよりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１０００倍多い、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する前記工程が、１つ以上の癌細胞の単一細胞配列決定を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌細胞が循環腫瘍細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する前記工程が、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する前記工程が、前記腫瘍標本のＲＮＡおよび／または前記腫瘍標本のＲＮＡから得られたＤＮＡライブラリを配列決定することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
癌ワクチン接種のための前記１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされるエピトープの有用性を決定するさらなる工程を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ワクチンが、前記１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされる１つ以上のエピトープを含むポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが最大３０個までのエピトープを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、前記１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされていないが、癌細胞によって発現される１つ以上のエピトープをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされていない前記１つ以上のエピトープが癌特異的ネオエピトープである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エピトープが、ワクチン配列を形成するようにそれらの天然の配列状況にある、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチン配列が約３０アミノ酸長である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記エピトープおよび／またはワクチン配列が頭部から尾部に並んでいる、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記エピトープおよび／またはワクチン配列がリンカーによって隔てられている、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記エピトープおよび／またはワクチン配列が、前記腫瘍標本において非腫瘍組織と同じアミノ酸配列を有する、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ワクチンがＲＮＡワクチンである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ワクチンが予防用および／または治療用ワクチンである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって得られる個別化癌ワクチン。
【請求項２１】
癌患者の腫瘍標本におけるＲＮＡ転写物の発現から生じるエピトープを含む組換えポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸を含む個別化癌ワクチンであって、前記ＲＮＡ転写物が所定の発現閾値を超えるコピー数で前記腫瘍標本中に存在する、個別化癌ワクチン。
【請求項２２】
前記腫瘍標本中の前記ＲＮＡ転写物のコピー数が、非腫瘍組織におけるよりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１０００倍多い、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、前記ＲＮＡ転写物によってコードされていないが、癌細胞によって発現されるエピトープをさらに含む、請求項２１または２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
癌患者を治療する方法であって、
（ａ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって個別化癌ワクチンを提供する工程；および
（ｂ）前記ワクチンを前記患者に投与する工程
を含む方法。
【請求項２５】
癌患者を治療する方法であって、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のワクチンを前記患者に投与することを含む方法。
【請求項２６】
前記ワクチンが、静脈内、皮膚、筋肉、または皮下に投与される、請求項２４または２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍免疫療法の分野にある。特に、本発明は、患者の１つ以上の癌細胞で過度に上方制御されるＲＮＡ転写物についての患者の腫瘍標本におけるトランスクリプトーム分析に基づく、上記患者の腫瘍に特異的な個別化された癌ワクチンを提供する。これらの個別化癌ワクチンは、患者に投与された場合、患者の１つ以上の癌細胞で過度に上方制御されるＲＮＡ転写物によって上記患者の腫瘍において発現される腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導する。ＲＮＡ転写物の過度の上方制御により、個別化癌ワクチンは、対象のワクチン接種のため、および上記対象の自己タンパク質である腫瘍関連抗原に対する自己寛容を破壊するために有効である。
【背景技術】
【０００２】
癌は死亡の主要な原因であり、全死亡の４分の１を占める。癌の治療は、伝統的に平均の法則−すなわち最も多数の患者に最も有効であるものに基づいてきた。しかし、癌の分子的不均一性のために、しばしば治療を受けた個体の２５％未満しか、承認された治療法から利益を得られない。患者に合わせた治療に基づく個別化医療は、医薬品開発における革新のための低い効率と高いコストに対する潜在的な解決策と見なされている。
【０００３】
抗原特異的免疫療法は、悪性疾患を制御するために患者における特異的免疫応答を増強または誘導することを目的とする。ますます多くの病原体関連および腫瘍関連抗原の同定により、免疫療法のための適切な標的の幅広いコレクションがもたらされた。これらの抗原に由来する免疫原性ペプチド（エピトープ）を提示する細胞は、能動免疫または受動免疫戦略のいずれかによって特異的に標的化することができる。能動免疫は、疾患細胞を特異的に認識し、死滅させることができる抗原特異的Ｔ細胞を患者において誘導し、拡大させる傾向がある。対照的に、受動免疫は、インビトロで拡大させ、任意で遺伝的に操作したＴ細胞の養子移入（養子Ｔ細胞療法；ＡＣＴ）に基づく。
【０００４】
腫瘍ワクチンは、能動免疫によって内因性の腫瘍特異的免疫応答を誘導することを目的とする。腫瘍ワクチン接種には、疾患細胞全体、タンパク質、ペプチド、または患者への移入後にＤＣをパルスすることによってインビボもしくはインビトロで直接適用できるＲＮＡ、ＤＮＡもしくはウイルスベクターなどの免疫化ベクターを含む、様々な抗原形式を使用することができる。
【０００５】
複数の病原体関連抗原および腫瘍関連抗原の発見は、抗原特異的免疫療法の概念の基礎を提供した。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、遺伝的不安定性のために腫瘍細胞上に発現される異常なタンパク質であり、正常細胞では発現されないかまたは発現が限られている。これらのＴＡＡは、免疫系による悪性細胞の特異的認識をもたらすことができる。さらに、癌は、ゲノム変異と後成的変化の蓄積から生じる可能性があり、その一部が原因となる役割を果たし得る。腫瘍関連抗原に加えて、ヒトの癌は平均して１００〜１２０の非同義変異を担持し、その多くがワクチンによって標的可能である。腫瘍の変異の９５％超がユニークであり、患者に特異的である。腫瘍特異的Ｔ細胞エピトープをもたらし得るタンパク質変化体細胞変異の数は、３０〜４００の範囲である。変異は、癌免疫療法の理想的な標的と見なされている。健常組織では発現が厳密に欠如しているネオエピトープとして、それらは安全であると予想され、中枢性寛容機構を迂回する可能性がある。本発明者は最近、個々の変異のスペクトルを標的とする個別化された免疫療法アプローチを提案した（Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２，１０８１（２０１２））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２，１０８１（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫療法アプローチの魅力的な標的構造体の数が増加しつつあるにもかかわらず、免疫療法のための適切なエピトープの定義は依然として課題となっている。自己タンパク質に対する免疫応答の誘導には、免疫学的自己寛容が破られることが必要である。自己タンパク質またはそのペプチドは、免疫寛容のために弱く免疫原性であるにすぎない。
【０００８】
したがって、癌患者のワクチン接種のための標的構造体を提供する必要がある。ワクチンアプローチで使用される場合、これらの標的構造体は、特に、自己寛容機構を克服するはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、多くの腫瘍がＲＮＡ転写物の特徴的なパターンによって定義されることを見出した。具体的には、特定のＲＮＡ転写物は、特定の腫瘍および個々の患者において高度に上方制御されることが認められる。本発明は、個々の患者の腫瘍が、正常な健康細胞ならびに同じおよび異なる組織型の組織では発現されないかまたは有意に低い量で発現される過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を伴う特徴的なトランスクリプトームパターンを有するという所見に基づく。腫瘍のトランスクリプトームパターンは、腫瘍をＲＮＡレベルでユニークにし、対応する非癌性組織および他の非癌性組織を含む非癌性組織と区別可能にする。そのようなユニークなトランスクリプトームパターンは、腫瘍細胞および腫瘍組織を特異的に標的とするワクチンの生成を可能にする。本開示は、そのような過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる腫瘍関連抗原に基づく、個別化された、すなわち患者特異的な癌ワクチンの提供に関する。具体的には、本明細書で提供される個別化癌ワクチンは、そのような過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列（１つまたは複数）に由来する少なくとも１つのエピトープを含むかまたはコードする。本発明は、患者の腫瘍細胞で過度に上方制御されるが、上記患者の非腫瘍形成性細胞では発現されないかまたは有意に低い量で発現されるＲＮＡ転写物の発現産物を免疫療法的に標的化することを目的とする。例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、癌性細胞の患者特異的トランスクリプトームプロフィールの迅速で費用効率の高い同定を可能にする。
【００１０】
癌性細胞において過度に上方制御される転写物種の同定、ならびに１つ以上の過度に上方制御される転写物種によってコードされるアミノ酸配列に由来する１つ以上のエピトープを含むポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードするＲＮＡなどの核酸を、患者の癌細胞に対する適切なＴ細胞の刺激、プライミングおよび／もしくは拡大のために、前記ポリペプチドの適切なプロセシングおよび患者の免疫系に前記エピトープを表示するためのＭＨＣ分子による前記エピトープの提示後に前記エピトープに対する免疫応答を誘導することを目的として投与することによる、前記１つ以上のエピトープの患者への提供は、患者の癌に特異的な新しい戦略を提供する。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）に認められるトランスクリプトームプロフィールを利用することにより、原発腫瘍および腫瘍転移を潜在的に標的とする免疫応答を誘導するワクチンの提供が可能になる。多くの患者に存在する標的化のための共通の分子分母を探索する代わりに、本発明は、個々の患者の癌細胞に存在する特徴的なトランスクリプトームプロフィールを利用する。
【００１１】
一態様では、本発明は、
（ａ）癌患者の腫瘍標本中に存在する１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する工程であって、前記１つ以上のＲＮＡ転写物のそれぞれがアミノ酸配列をコードし、前記１つ以上のＲＮＡ転写物のそれぞれが所定の発現閾値を超えるコピー数で腫瘍標本中に存在する、工程；および
（ｂ）前記１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列（１つまたは複数）に由来する少なくとも１つのエピトープを特徴とするワクチンを提供する工程
を含む、個別化癌ワクチンを製造するための方法に関する。
【００１２】
一実施形態では、１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する工程は、癌患者の腫瘍標本中に存在するＲＮＡ転写物のコピー数を決定し、ＲＮＡ転写物のそれぞれのコピー数をそれぞれの所定の発現閾値と比較することを含む。
【００１３】
一実施形態では、腫瘍標本中のＲＮＡ転写物のコピー数は、非腫瘍組織におけるよりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１０００倍多い。
【００１４】
一実施形態では、腫瘍標本中のＲＮＡ転写物のコピー数は、１００万あたり少なくとも５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００転写物（ＴＰＭ）であり、非腫瘍組織のＲＮＡ転写物のコピー数は、腫瘍標本中のＲＮＡ転写物の前記コピー数の１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満である。
【００１５】
一実施形態では、１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する工程は、１つ以上の癌細胞の単一細胞配列決定を含む。
【００１６】
一実施形態では、癌細胞は循環腫瘍細胞である。
【００１７】
一実施形態では、１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する工程は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用することを含む。
【００１８】
一実施形態では、１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する工程は、腫瘍標本のＲＮＡおよび／または腫瘍標本のＲＮＡから得られたＤＮＡライブラリを配列決定することを含む。
【００１９】
一実施形態では、１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する工程は、少なくとも２回重複して反復される。
【００２０】
一実施形態では、この方法は、癌ワクチン接種のための１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされるエピトープの有用性を決定するさらなる工程を含む。
【００２１】
一実施形態では、ワクチンは、１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされる１つ以上のエピトープを含むポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００２２】
一実施形態では、ポリペプチドは最大３０個までのエピトープを含む。
【００２３】
一実施形態では、ポリペプチドは、１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされていないが、癌細胞によって発現される１つ以上のエピトープをさらに含む。
【００２４】
一実施形態では、１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされていない１つ以上のエピトープは、癌特異的ネオエピトープである。
【００２５】
一実施形態では、エピトープは、ワクチン配列を形成するようにそれらの天然の配列状況にある。
【００２６】
一実施形態では、ワクチン配列は約３０アミノ酸長である。
【００２７】
一実施形態では、エピトープおよび／またはワクチン配列は、頭部から尾部に並んでいる。
【００２８】
一実施形態では、エピトープおよび／またはワクチン配列は、リンカーによって隔てられている。
【００２９】
一実施形態では、エピトープおよび／またはワクチン配列は、腫瘍標本において非腫瘍組織と同じアミノ酸配列を有する。
【００３０】
一実施形態では、ワクチンはＲＮＡワクチンである。
【００３１】
一実施形態では、ワクチンは予防用および／または治療用ワクチンである。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される方法によって得られる個別化癌ワクチンに関する。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、癌患者の腫瘍標本におけるＲＮＡ転写物の発現から生じるエピトープを含む組換えポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸を含む個別化癌ワクチンに関し、前記ＲＮＡ転写物は、所定の発現閾値を超えるコピー数で腫瘍標本中に存在する。
【００３４】
一実施形態では、腫瘍標本中のＲＮＡ転写物のコピー数は、非腫瘍組織、例えば腫瘍標本と同じおよび異なる組織型の非腫瘍組織におけるよりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１０００倍多い。
【００３５】
一実施形態では、腫瘍標本中のＲＮＡ転写物のコピー数は、１００万あたり少なくとも５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００転写物（ＴＰＭ）であり、非腫瘍組織のＲＮＡ転写物のコピー数は、腫瘍標本中のＲＮＡ転写物の前記コピー数の１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満である。
【００３６】
一実施形態では、ポリペプチドは、ＲＮＡ転写物によってコードされていないが、癌細胞によって発現されるエピトープをさらに含む。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、
（ａ）本明細書に記載の方法によって個別化癌ワクチンを提供する工程；および
（ｂ）ワクチンを患者に投与する工程
を含む、癌患者を治療する方法に関する。
【００３８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のワクチンを患者に投与することを含む、癌患者を治療する方法に関する。
【００３９】
一実施形態では、ワクチンは、静脈内、皮膚、筋肉、または皮下に投与される。
【００４０】
一態様では、本発明は、各ポリペプチドが癌患者の腫瘍標本において過度に上方制御される１つ以上のＲＮＡ転写物に由来する１つ以上のエピトープを含む、１つ以上のポリペプチド、または前記１つ以上のポリペプチドをコードするＲＮＡなどの核酸を含むワクチンに関する。そのようなワクチンの好ましい実施形態は、本発明の方法の文脈において上述したとおりである。
【００４１】
本発明に従って提供されるワクチンは、薬学的に許容される担体を含んでもよく、任意で１つ以上のアジュバント、安定剤などを含んでもよい。ワクチンは、治療用または予防用ワクチンの形態であり得る。
【００４２】
別の態様は、本発明に従って提供されるワクチンを患者に投与することを含む、患者において免疫応答を誘導するための方法に関する。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の治療方法で使用するための、特に癌を治療または予防するのに使用するための、本明細書に記載のワクチンを提供する。
【００４４】
本明細書に記載の癌の治療は、外科的切除および／または放射線および／または従来の化学療法と組み合わせることができる。
【００４５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞株において差次的に発現される遺伝子の例  ３つのクラス：正常組織（ｎ＝４６）、生殖組織（ｎ＝５）、および胚組織（ｎ＝１４）に細分した、黒色腫細胞株Ｂ１６−Ｆ１０およびマウス組織における選択した遺伝子の１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）の発現値。組織あたりのすべての試料の中央値として与えられる組織発現。円は単一組織の中央値を示す。箱ひげ図の中心線はすべての組織の中央値を示し、箱は第１と第３の四分位数を示し、ひげは中央値から２．５倍の四分位数の距離である。
【図１Ｂ】Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞株において差次的に発現される遺伝子の例  ３つのクラス：正常組織（ｎ＝４６）、生殖組織（ｎ＝５）、および胚組織（ｎ＝１４）に細分した、黒色腫細胞株Ｂ１６−Ｆ１０およびマウス組織における選択した遺伝子の１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）の発現値。組織あたりのすべての試料の中央値として与えられる組織発現。円は単一組織の中央値を示す。箱ひげ図の中心線はすべての組織の中央値を示し、箱は第１と第３の四分位数を示し、ひげは中央値から２．５倍の四分位数の距離である。
【図２】Ｔｙｒｐ１  ＲＮＡワクチンの免疫原性試験  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝５）を、０、７および１４日目にリポプレックスとして製剤化した４０μｇのＴｙｒｐ１抗原をコードするＲＮＡまたは４０μｇの無関係なＲＮＡで免疫した（タイムライン参照）。最後のワクチン接種の５日後、マウスの脾細胞を単離し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって、ＭＨＣ  Ｉエピトープ（ＴＡＰＤＮＬＧＹＡ）およびＭＨＣ  ＩＩエピトープ（ＣＲＰＧＷＲＧＡＡＣＮＱＫＩ）をそれぞれコードする２つのＴｙｒｐ１ペプチドの認識について試験した。個々のマウスの３つ組の複製物の平均スポット数（ドット）およびすべてのマウスの平均（バー）を左側に示す。ＥＬＩＳｐｏｔプレートの写真を右側に示す。各列は１匹のマウスを表す。
【図３】Ｄｃｔ  ＲＮＡワクチンの免疫原性試験  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝５）に、２０μｇのＤｃｔをコードするＲＮＡリポプレックスまたはＮａＣｌを繰り返しワクチン接種した（ワクチン接種時点を点線で示す）。最初のワクチン接種後５、１２、１９、２６および３３日目に、Ｄｃｔ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリによるＭＨＣテトラマー（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）染色によって血液中で測定した。すべてのＣＤ８＋リンパ球におけるテトラマー＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を表示する（平均±平均の標準誤差）。
【図４】Ｐｍｅｌ  ＲＮＡワクチンの免疫原性試験  タイムラインに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝８）に、２０μｇのＰｍｅｌをコードするＲＮＡリポプレックスを繰り返しワクチン接種した。最初のワクチン接種の２７日後、マウスの脾細胞をＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによってＰｍｅｌペプチド（ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ）または無関係なペプチド（ＶＳＶ−ＮＰ、ＲＧＹＶＹＱＧＬ）に対してプローブした。個々のマウスの３つ組の複製物の平均スポット数（ドット）およびすべてのマウスの平均（バー）を表示する。
【図５】Ｆｋｂｐ６  ＲＮＡワクチンの免疫原性試験  タイムラインに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝３）に、２０μｇのＦｋｂｐ６をコードするＲＮＡリポプレックスを繰り返しワクチン接種した。最後のワクチン接種の５日後、マウスの脾細胞を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによるＦｋｂｐ６  ＲＮＡまたは無関係なＲＮＡ（対照）でエレクトロポレーションしたＢＭＤＣの認識について試験した。プールしたマウスの脾細胞の２つ組の複製物（対照）または３つ組の複製物（Ｆｋｂｐ９）の平均スポット数および標準偏差を表示する。
【図６】治療用Ｔｙｒｐ１ワクチン接種後の腫瘍制御  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝１１〜１２）に３ｘ１０５個のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を静脈内接種した。Ｔｙｒｐ１または無関係な対照ＲＮＡによるＲＮＡリポプレックスワクチン接種を、タイムラインに示すように開始した。マウスあたりの肺腫瘍結節数（左）、例示的な肺（中央）および生存率（右）を表示する。
【図７】治療用Ｔｙｒｐ１またはＤｃｔワクチン接種後の腫瘍制御  ３ｘ１０５のルシフェラーゼトランスジェニックＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞（Ｂ１６−Ｆ１０−ＬＵＣ）をナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝１２）に静脈内注射し、タイムラインに表示するように処置した。ルシフェラーゼ生物発光（左）、マウスあたりの肺腫瘍結節数（中央、平均±平均の標準誤差）、およびマウスあたりの肺重量（右、平均±平均の標準誤差）によって決定した腫瘍成長の中央値を示す。
【図８Ａ１】腫瘍モデルＣＴ２６、ＭＣ３８、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２および４Ｔ１において差次的に発現される遺伝子の例  ３つのクラス：正常組織（ｎ＝４６）、生殖組織（ｎ＝５）、および胚組織（ｎ＝１４）に細分した、マウス腫瘍細胞株ＣＴ２６（Ａ）、ＭＣ３８（Ｂ）、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２（Ｃ）および４Ｔ１（Ｄ）ならびにマウス組織における選択した遺伝子の１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）の発現値。組織あたりのすべての試料の中央値として与えられる組織発現。円は単一組織の中央値を示す。箱ひげ図の中心線はすべての組織の中央値を示し、箱は第１と第３の四分位数を示し、ひげは中央値から２．５倍の四分位数の距離である。
【図８Ａ２】腫瘍モデルＣＴ２６、ＭＣ３８、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２および４Ｔ１において差次的に発現される遺伝子の例  ３つのクラス：正常組織（ｎ＝４６）、生殖組織（ｎ＝５）、および胚組織（ｎ＝１４）に細分した、マウス腫瘍細胞株ＣＴ２６（Ａ）、ＭＣ３８（Ｂ）、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２（Ｃ）および４Ｔ１（Ｄ）ならびにマウス組織における選択した遺伝子の１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）の発現値。組織あたりのすべての試料の中央値として与えられる組織発現。円は単一組織の中央値を示す。箱ひげ図の中心線はすべての組織の中央値を示し、箱は第１と第３の四分位数を示し、ひげは中央値から２．５倍の四分位数の距離である。
【図８Ｂ１】腫瘍モデルＣＴ２６、ＭＣ３８、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２および４Ｔ１において差次的に発現される遺伝子の例  ３つのクラス：正常組織（ｎ＝４６）、生殖組織（ｎ＝５）、および胚組織（ｎ＝１４）に細分した、マウス腫瘍細胞株ＣＴ２６（Ａ）、ＭＣ３８（Ｂ）、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２（Ｃ）および４Ｔ１（Ｄ）ならびにマウス組織における選択した遺伝子の１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）の発現値。組織あたりのすべての試料の中央値として与えられる組織発現。円は単一組織の中央値を示す。箱ひげ図の中心線はすべての組織の中央値を示し、箱は第１と第３の四分位数を示し、ひげは中央値から２．５倍の四分位数の距離である。
【図８Ｂ２】腫瘍モデルＣＴ２６、ＭＣ３８、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２および４Ｔ１において差次的に発現される遺伝子の例  ３つのクラス：正常組織（ｎ＝４６）、生殖組織（ｎ＝５）、および胚組織（ｎ＝１４）に細分した、マウス腫瘍細胞株ＣＴ２６（Ａ）、ＭＣ３８（Ｂ）、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２（Ｃ）および４Ｔ１（Ｄ）ならびにマウス組織における選択した遺伝子の１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）の発現値。組織あたりのすべての試料の中央値として与えられる組織発現。円は単一組織の中央値を示す。箱ひげ図の中心線はすべての組織の中央値を示し、箱は第１と第３の四分位数を示し、ひげは中央値から２．５倍の四分位数の距離である。
【図８Ｃ】腫瘍モデルＣＴ２６、ＭＣ３８、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２および４Ｔ１において差次的に発現される遺伝子の例  ３つのクラス：正常組織（ｎ＝４６）、生殖組織（ｎ＝５）、および胚組織（ｎ＝１４）に細分した、マウス腫瘍細胞株ＣＴ２６（Ａ）、ＭＣ３８（Ｂ）、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２（Ｃ）および４Ｔ１（Ｄ）ならびにマウス組織における選択した遺伝子の１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）の発現値。組織あたりのすべての試料の中央値として与えられる組織発現。円は単一組織の中央値を示す。箱ひげ図の中心線はすべての組織の中央値を示し、箱は第１と第３の四分位数を示し、ひげは中央値から２．５倍の四分位数の距離である。
【図８Ｄ】腫瘍モデルＣＴ２６、ＭＣ３８、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２および４Ｔ１において差次的に発現される遺伝子の例  ３つのクラス：正常組織（ｎ＝４６）、生殖組織（ｎ＝５）、および胚組織（ｎ＝１４）に細分した、マウス腫瘍細胞株ＣＴ２６（Ａ）、ＭＣ３８（Ｂ）、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２（Ｃ）および４Ｔ１（Ｄ）ならびにマウス組織における選択した遺伝子の１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）の発現値。組織あたりのすべての試料の中央値として与えられる組織発現。円は単一組織の中央値を示す。箱ひげ図の中心線はすべての組織の中央値を示し、箱は第１と第３の四分位数を示し、ひげは中央値から２．５倍の四分位数の距離である。
【図９】ＣＴ２６腫瘍細胞株で同定された標的の免疫原性試験  タイムラインに示すように、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝３）に、２０μｇの抗原をコードするＲＮＡリポプレックスを繰り返しワクチン接種した。最後のワクチン接種の５日後、マウスの脾細胞を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって抗原をコードするＲＮＡまたは無関係なＲＮＡ（対照）でエレクトロポレーションしたＢＭＤＣの認識について試験した。プールしたマウスの脾細胞の３つ組の複製物の平均スポット数および標準偏差を表示する。
【図１０】ＭＣ３８腫瘍細胞株で同定された標的の免疫原性試験  タイムラインに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝３）に、２０μｇの抗原をコードするＲＮＡリポプレックスを繰り返しワクチン接種した。最後のワクチン接種の５日後、マウスの脾細胞を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって抗原をコードするＲＮＡまたは無関係なＲＮＡ（対照）でエレクトロポレーションしたＢＭＤＣの認識について試験した。上のグラフは、プールしたマウスの脾細胞の平均スポット数および２つ組の複製物（対照）または３つ組の複製物（Ｇｍ１４８１９、Ｒｈｏｘ２ｈ、Ｇｍ１５０９１、Ａｓｈ２ｌ、Ｇｍ１５０９７、Ｄｐｐａ４）の平均スポット数および標準偏差を表示する。下のグラフは、個々のマウスの３つ組の複製物からの脾細胞の平均スポット数および平均の標準誤差を、標的Ｍａｇｅｂ２、Ｇｍ７７３、Ｐｒｌ２ｃ２、Ｆｍｒ１ｎｂおよびＬｕｚｐ４について示す。
【図１１】ＴＲＡＭＰ−Ｃ２腫瘍細胞株で同定された標的の免疫原性試験  タイムラインに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝３）に、２０μｇの抗原をコードするＲＮＡリポプレックスを繰り返しワクチン接種した。最後のワクチン接種の５日後、マウスの脾細胞を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって抗原をコードするＲＮＡまたは無関係なＲＮＡ（対照）でエレクトロポレーションしたＢＭＤＣの認識について試験した。プールしたマウスの脾細胞の２つ組の複製物（対照）または３つ組の複製物（抗原）の平均スポット数および標準偏差を表示する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本開示を以下で詳細に説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４８】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｅｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
【００４９】
本開示の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
【００５０】
以下において、本開示の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および実施形態は、本開示を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、記述されるすべての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されているとみなされるべきである。
【００５１】
「約」という用語はおよそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈において、一実施形態では、列挙または特許請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％、または±３％を意味する。
【００５２】
本開示を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「１つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個々に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本開示をより良く説明することを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に必須の特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【００５３】
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかし、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本開示の特定の実施形態として企図され、すなわちこの実施形態の目的のためには、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。
【００５４】
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。
【００５５】
定義
以下において、本開示のすべての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。定義されていない用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。
【００５６】
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、約２以上、約３以上、約４以上、約６以上、約８以上、約１０以上、約１３以上、約１６以上、約２０以上、および最大約５０、約１００または約１５０までの、ペプチド結合によって互いに連結された連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５１アミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
【００５７】
「核酸」は、本発明によれば、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。
【００５８】
本開示では、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基のすべてまたは大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されることなく、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端（１つまたは複数）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書ではまた、ＲＮＡ中のヌクレオチドは、化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることが企図される。本開示では、これらの改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と見なされる。
【００５９】
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関連するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは一般に、５'非翻訳領域（５'−ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３'非翻訳領域（３'−ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写によって生成され、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸を指す。
【００６０】
本開示によれば、「ＲＮＡがコードする」という用語は、ＲＮＡが、標的組織の細胞内などの適切な環境に存在する場合、翻訳過程中にそれがコードするペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸の集合体に指令できることを意味する。一実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用することができる。細胞は、コードされたペプチドもしくはタンパク質を細胞内で（例えば細胞質内および／もしくは核内で）産生し得るか、コードされたペプチドもしくはタンパク質を分泌し得るか、またはそれを表面上で産生し得る。
【００６１】
所定の発現閾値などの「参照」は、腫瘍標本から本発明の方法で得られた結果を相互に関連付け、比較するために使用し得る。典型的には、「参照」は、１つ以上の正常組織、特に腫瘍または癌疾患に罹患していない組織（すなわち非腫瘍組織）に基づいて得られ得、通常、腫瘍標本が由来する患者とは異なる１つ以上の個体、好ましくは健常個体、特に同じ種の個体から得られ得る。非腫瘍組織は、典型的には、腫瘍標本が由来する組織とは異なる組織を含み、腫瘍標本が由来する組織に対応する組織を含み得る。
【００６２】
本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」などの用語は、例えば約５％以上、約１０％以上、約２０％以上、約５０％以上、または約７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力を意味する。「阻害する」という用語または同様の語句には、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減が含まれる。
【００６３】
一実施形態における「増加する」または「増強する」などの用語は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約１００％の増加または増強に関する。
【００６４】
本開示の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。一実施形態では、本開示の文脈における「組換え物」は、天然には存在していない。
【００６５】
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。「自然界で見出される」という用語は、「自然界に存在する」ことを意味し、公知の物体ならびに自然からまだ発見および／または単離されていないが、天然源から将来発見および／または単離される可能性がある物体を含む。
【００６６】
「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  Ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ」または「ＴＰＭ」という用語は、ＲＮＡ−ｓｅｑの正規化方法であり、「試料中の１，０００，０００個のＲＮＡ分子ごとに、ｘはこの遺伝子／転写物に由来する」と読むべきである。
【００６７】
過度に上方制御されたＲＮＡ転写物
本発明は、
（ａ）癌患者の腫瘍標本中に存在する１つ以上のＲＮＡ転写物を同定する工程であって、前記１つ以上のＲＮＡ転写物のそれぞれがアミノ酸配列をコードし、前記１つ以上のＲＮＡ転写物のそれぞれが所定の発現閾値を超えるコピー数で腫瘍標本中に存在する、工程；および
（ｂ）前記１つ以上のＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列（１つまたは複数）に由来する少なくとも１つのエピトープを特徴とするワクチンを提供する工程
を含む、個別化癌ワクチンを製造するための方法に関する。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「発現閾値」という用語は、ＲＮＡ転写物の発現のレベル、すなわちコピー数に関連する定量限界／値に関し、本明細書に記載の方法を実施するために考慮されるべきである。ＲＮＡ転写物の発現閾値は、典型的には前記ＲＮＡ転写物に特徴的である。典型的には、発現閾値を下回る発現レベルは、ＲＮＡ転写物の過度の上方制御を反映するとは見なされず（例えば腫瘍または癌組織において）、特に健常組織でのＲＮＡ転写物の（潜在的な）発現を反映すると見なされる。典型的には、発現閾値を超える発現レベルは、ＲＮＡ転写物の過度の上方制御を反映すると見なされ（例えば腫瘍または癌組織において）、特に健常組織におけるＲＮＡ転写物の（潜在的な）発現を反映するとは見なされない。したがって、「発現閾値」という用語は、それを超えると、ＲＮＡ転写物が、ＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列に由来する少なくとも１つのエピトープを特徴とするワクチンを提供するのに適すると見なされる、ＲＮＡ転写物の発現レベルを指す。発現閾値は、典型的には、健常組織におけるＲＮＡ転写物の発現が前記閾値を超えないレベルで予想されるように選択される。むしろ、発現閾値は、典型的には、健常組織におけるＲＮＡ転写物の発現が前記閾値をはるかに下回るように選択される。前記発現閾値を超える癌組織などの病変組織（例えば腫瘍標本）における前記ＲＮＡ転写物の発現レベルは、典型的には、ＲＮＡ転写物が、ＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列に由来する少なくとも１つのエピトープを特徴とするワクチンを提供するのに適することを示す。発現閾値は、典型的には、（健常）組織、好ましくは異なる組織型の組織、任意で異なる対象、好ましくは同じ種の対象の組織のコホートにおけるＲＮＡ転写物の発現レベルに関する情報を取得し、ＲＮＡ転写物の発現レベルに関する得られた情報を考慮して閾値を定義することによって決定される。そのような組織のコホートは、１０以上、例えば１００以上の異なる組織型を含み得る。ＲＮＡ転写物の発現レベルに関する情報は、例えばＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄ  Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ）などの公的に利用可能なデータベースから取得し得る。発現閾値は、典型的には、ＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列に由来する少なくとも１つのエピトープを特徴とするワクチンを提供するのに適したＲＮＡ転写物の有効性および／または安全性に関して有用な予測を達成するために計算される。典型的には、発現閾値は、健常組織のＲＮＡ転写物について決定された最も高い発現レベルを十分に上回り、安全域、例えば健常組織のＲＮＡ転写物について決定された発現のレベル（例えば最高または中央値）の特定の増倍率を含む。そのような安全率は、例えば健常組織における発現レベルを１０倍、１００倍、または１０００倍上回り得る。発現閾値は、好ましくは、多数のＲＮＡ転写物、特にコード転写物、例えば少なくとも１００、少なくとも１０００、または少なくとも１００００のＲＮＡ転写物について、本明細書に記載の方法で利用可能である。典型的には、そのような発現閾値は所定の値であり、「所定の」または「事前に定義された」という用語は、腫瘍標本におけるＲＮＡ転��物の発現レベルの決定とは独立した一定の値を指定し、すなわち腫瘍標本におけるＲＮＡ転写物の発現レベルが決定されるときには決定されず、腫瘍標本で決定されたＲＮＡ転写物の発現レベルと比較するべき値として選択される。したがって、発現閾値は、対象における、特に対象の異なる組織におけるＲＮＡ転写物の発現レベルに関連し、それについての情報を提供する定量値である。本明細書に記載の方法において、対象の非腫瘍標本におけるＲＮＡ転写物の発現レベルを決定する必要はなく、対象の腫瘍標本で決定されたＲＮＡ転写物の発現レベルを、同じ対象の非腫瘍標本における同じＲＮＡ転写物の発現レベルと比較する必要はない。むしろ、対象の腫瘍標本において、多数のＲＮＡ転写物（例えば少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０００、または少なくとも１００００のＲＮＡ転写物）の発現レベルを決定し、例えば上記のように、多数のＲＮＡ転写物（例えば少なくとも１００、少なくとも１０００、または少なくとも１００００のＲＮＡ転写物）のそれぞれについて所定の発現閾値と比較する。したがって、本発明の方法は、多数のＲＮＡ転写物、特にコード転写物、例えば少なくとも１００、少なくとも１０００、または少なくとも１００００のＲＮＡ転写物の発現閾値に関する情報を含むデータベースなどのデータのコレクションの使用を含み得る。本発明の方法は、対象の腫瘍標本における多数のＲＮＡ転写物のそれぞれの発現レベルを、多数のＲＮＡ転写物の発現閾値に関する情報を含むデータのコレクションと比較して、比較した発現レベルが、データのコレクションに含まれるそれぞれの発現閾値を超えるどうかを決定することを含み得る。発現レベルがデータのコレクションに含まれるそれぞれの発現閾値を超えるＲＮＡ転写物は、ワクチンを提供するのに適切であるかまたは潜在的に適切であると見なされ得る。一実施形態では、本発明の方法は、ワクチンを提供するのに適切であるかまたは潜在的に適切であると見なされる十分な数のＲＮＡ転写物が得られるまで、時間をかけて実施することができる。ひとたびこのポイントに達すると、方法を停止することができる。
【００６９】
「過度に上方制御されたＲＮＡ転写物」、「所定の発現閾値を超えるコピー数で腫瘍標本中に存在するＲＮＡ転写物」または同様の用語は、腫瘍標本におけるその存在または発現が非腫瘍組織と比較して強力に増加しているＲＮＡに関する。様々な実施形態では、ＲＮＡの存在または発現は、非腫瘍組織における存在または発現と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０３倍、少なくとも１０４倍、少なくとも１０５倍またはさらにより高い。本発明によれば、胸腺および／または心臓、脳などの重要な器官では発現されないかまたは少量しか発現されないＲＮＡ転写物が好ましい。
【００７０】
一実施形態では、本発明の方法は、
ｉ）癌患者からの腫瘍標本を提供する工程；
ｉｉ）腫瘍標本における過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を同定する工程；
ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で決定された過度に上方制御されたＲＮＡ転写物の１つ以上によってコードされるアミノ酸配列（１つまたは複数）のエピトープを含むポリペプチドを設計する工程；
ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で設計されたポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸、好ましくはＲＮＡを提供する工程；および
ｖ）工程（ｉｖ）で提供されたポリペプチドまたは核酸を含むワクチンを提供する工程
を含む。
【００７１】
本発明によれば、「腫瘍標本」は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍または癌細胞を含むかまたは含むことが疑われる患者に由来する身体試料などの試料、特に血液などの体液を含む組織試料および／または細胞試料であり、腫瘍組織に由来し得る。一実施形態では、腫瘍標本は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つ以上の単離された腫瘍もしくは癌細胞、または循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの１つ以上の単離された腫瘍もしくは癌細胞を含む試料に関する。
【００７２】
本発明によれば、「非腫瘍組織」は、腫瘍または癌に罹患しておらず、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などの腫瘍または癌細胞を含まない組織である。
【００７３】
身体試料は、パンチ生検を含む組織生検、および血液、気管支吸引物、痰、尿、糞便または他の体液を採取することなどによる従来の方法で入手し得る。本発明によれば、「試料」という用語には、生物学的試料の画分または単離物などの処理された試料、例えば核酸または細胞単離物も含まれる。
【００７４】
本発明は、患者の１つ以上の癌細胞に存在するすべての過度に上方制御されたＲＮＡ転写物の同定を含み得るか、または患者の１つ以上の癌細胞に存在する過度に上方制御されたＲＮＡ転写物の一部のみの同定を含み得る。一般に、本発明の方法は、ワクチンに含まれるのに十分な数のエピトープを提供する、多数の過度に上方制御されたＲＮＡ転写物の同定を提供する。
【００７５】
本発明の文脈において、トランスクリプトームは、１つの細胞、細胞の集団、好ましくは癌細胞の集団、または特定の時点での所与の個体のすべての細胞において産生される、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および他の非コードＲＮＡを含むすべてのＲＮＡ分子のセットを意味する。したがって、本発明の方法は、１つ以上の癌細胞のトランスクリプトーム、好ましくはトランスクリプトーム全体の過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を同定することを含み得る。一実施形態では、癌患者の腫瘍標本において過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を同定する工程は、トランスクリプトーム全体の過度に上方制御されたＲＮＡ転写物プロフィールを同定することを含む。
【００７６】
トランスクリプトームは、特定の細胞または細胞集団に認められるＲＮＡ分子のみを含み、それらの分子同一性に加えて各ＲＮＡ分子の量または濃度も含み得るという点でエクソームとは異なる。所与の細胞株（変異を除く）についておおよそ固定されているゲノムとは異なり、トランスクリプトームは外部環境条件によって変化し得る。
【００７７】
一実施形態では、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を同定する工程は、１つ以上、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはさらにそれ以上の癌細胞の単一細胞配列決定を含む。したがって、本発明の方法は、前記１つ以上の癌細胞のトランスクリプトームシグネチャを同定することを含み得る。一実施形態では、癌細胞は循環腫瘍細胞である。循環腫瘍細胞などの癌細胞は、単一細胞配列決定の前に単離し得る。
【００７８】
一実施形態では、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を同定する工程は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用することを含む。
【００７９】
一実施形態では、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を同定する工程は、腫瘍標本のＲＮＡを配列決定することを含む。
【００８０】
過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を明らかにするために、腫瘍標本から得られたＲＮＡ転写物の性質およびレベルに関する情報を所定の発現閾値と比較する。そのような発現閾値は、典型的には、正常な非癌性細胞または組織におけるその発現レベルに基づいて、ＲＮＡ転写物について決定される。一実施形態では、対応する情報はデータベースから得られる。一実施形態では、対応する情報は、複数の組織型、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも５０、または少なくとも１００の組織型の非腫瘍組織（およびそのそれぞれのＲＮＡ発現レベル）を含む。一実施形態では、対応する情報は、例えばＲＮＡ発現レベルがデータベースで利用可能である、利用可能なすべての組織型の非腫瘍組織（およびそのそれぞれのＲＮＡ発現レベル）を含む。一実施形態では、対応する情報は、１つ以上の重要な器官、例えば肺、心臓、脳、ＣＮＳ、腎臓および肝臓の１つ以上、好ましくはすべての非腫瘍組織（およびそのそれぞれのＲＮＡ発現レベル）を含む。一実施形態では、そのような重要な器官の１つ以上、好ましくはすべての非腫瘍組織に対する、腫瘍標本におけるＲＮＡ転写物の過度の上方制御が必要であり、好ましくはそのような重要な器官の非腫瘍標本におけるＲＮＡ転写物は、発現されないかまたは有意に発現されない。一実施形態では、対応する情報は、１つ以上の生殖器官、例えば精巣、卵巣および胎盤の１つ以上、好ましくはすべての非腫瘍組織（およびそのそれぞれのＲＮＡ発現レベル）を除外する。一実施形態では、そのような生殖器官の１つ以上、好ましくはすべての非腫瘍組織に対する、腫瘍標本におけるＲＮＡ転写物の過度の上方制御は必要ではない。
【００８１】
任意の適切な方法を使用して、癌患者の腫瘍標本中の過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を決定し得る。一般に、そのような方法は、部分的または完全なトランスクリプトームプロフィール、すなわち癌患者の腫瘍組織または腫瘍細胞の１つ以上の転写物の相対的または絶対的な量を決定することを含む。次に、そのようなトランスクリプトームプロフィールを、調節不全の、または過度に上方制御されたＲＮＡ種に関して評価する。
【００８２】
トランスクリプトミクスの研究（発現プロファイリング、スプライス変異体分析などを含む）は、所与の細胞集団における転写物の発現レベルを検討し、多くの場合、ｍＲＮＡに焦点を合わせるが、時にはｔＲＮＡ、ｓＲＮＡなどの他の細胞集団も含まれる。
【００８３】
トランスクリプトミクス技術は、生物のすべてのＲＮＡ転写物の総計であるトランスクリプトームを研究するために使用される技術である。生物の情報内容は、そのゲノムのＤＮＡに記録され、転写を介して発現される。ここで、ｍＲＮＡは情報ネットワークの一時的な中間分子として機能し、非コードＲＮＡはさらなる多様な機能を実行する。トランスクリプトームは、細胞内に存在する全転写物の特定の時点のスナップショットを捕捉する。全トランスクリプトームを研究する最初の試みは１９９０年代初期に始まり、１９９０年代後半以降の技術の進歩により、トランスクリプトミクスは幅広い分野になった。この分野には２つの重要な現代的手法があり、すなわち所定の配列のセットを定量化するマイクロアレイと、ハイスループットシーケンシングを使用してすべての配列を捕捉するＲＮＡ−Ｓｅｑである。転写は、単一細胞トランスクリプトミクスによって個々の細胞のレベルで研究することもできる。
【００８４】
マイクロアレイ
相補的プローブのアレイへのハイブリダイゼーションを介して、定義された転写物のセットの存在量を測定するマイクロアレイは、１９９５年に最初に公開された。マイクロアレイ技術は、遺伝子あたりのコストを大幅に削減し、労力を節約しながら、数千の転写物を同時にアッセイすることを可能にした。スポットオリゴヌクレオチドアレイおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ高密度アレイの両方が、２０００年代後半まで転写プロファイリングのための選択法であった。この期間に、モデル生物または経済的に重要な生物における公知の遺伝子をカバーするために、一連のマイクロアレイが生成された。アレイの設計と製造の進歩は、プローブの特異性を改善し、単一のアレイでより多くの遺伝子を試験することを可能にした。蛍光検出の進歩は、存在量の少ない転写物についての感度と測定精度を高めた。
【００８５】
ＲＮＡ−Ｓｅｑ
ＲＮＡ−Ｓｅｑは、転写物のｃＤＮＡの配列決定を指し、存在量は各転写物のカウント数から導き出される。したがって、この技術は、ハイスループットシーケンシング技術の開発に大きく影響されてきた。超並列シグネチャシーケンシング（ＭＰＳＳ）は、複雑な一連のハイブリダイゼーションを介して１６〜２０ｂｐの配列を生成することに基づく初期の例であり、２００４年にシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の１万個の遺伝子の発現を検証するために使用された。最も初期のＲＮＡ−Ｓｅｑの研究は２００６年に公開され、４５４技術を使用して１０万の転写物が配列決定された。これは、相対的な転写物の存在量を定量化するのに十分な範囲であった。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、新しいＳｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ技術によって１０億の転写物配列を記録することが可能になった２００８年以降、人気が高まり始めた。この成果は現在、ヒトトランスクリプトームを定量化し、比較することを可能にしている。
【００８６】
公的に利用可能なトランスクリプトームデータベース
ほとんどの遺伝子の機能はまだわかっていない。トランスクリプトームデータベースを検索すると、遺伝子が発現されるすべての組織のリストが研究者に与えられ、その可能性のある機能についての手がかりを得ることができる。例えば、トランスクリプトームデータベースが、未知の遺伝子の発現レベルが健康な細胞よりも癌細胞で劇的に高いことを示す場合、未知の遺伝子は細胞増殖に役割を果たす可能性がある。トランスクリプトームデータは、当業者に、癌性細胞における過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を同定するための関連情報を提供する。
【００８７】
米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ））傘下の米国国立ヒトゲノム研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＨＧＲＩ）は、世界中の研究者向けのトランスクリプトームリソースを作成した２つのプロジェクト：哺乳類遺伝子コレクション（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）イニシアチブおよびマウストランスクリプトームプロジェクト（Ｍｏｕｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）に参加している。哺乳類遺伝子コレクションイニシアチブは、ヒト、マウス、およびラットのｍＲＮＡ配列の無料の公開ライブラリを構築しており、本発明の文脈内での適切なデータベースとして役立ち得る。このプロジェクトは、ＮＨＧＲＩおよび同じくＮＩＨ傘下の米国国立がん研究所（ＮＣＩ）によって主導された。マウスとラットは、ヒト生物学を研究するための重要なモデルである。マウストランスクリプトームプロジェクトは、多くのマウス組織の遺伝子転写物の無料の公開データベースを作成した、ＮＩＨが支援する取り組みであり、本発明の文脈内での適切なデータベースとして役立ち得る。マウスゲノムにマッピングされているこれらの組織特異的遺伝子発現データは、マウスリファレンストランスクリプトームデータベース（Ｍｏｕｓｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）で検索可能な形式で入手できる。遺伝子型−組織発現プロジェクト（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）（ＧＴＥｘ）およびＤＮＡ要素百科事典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（ＥＮＣＯＤＥ）などのＮＩＨプログラムのリソースを含む、他のいくつかのトランスクリプトームリソースが存在し、それらはすべて、本発明の文脈内での適切なデータベースとして役立ち得る。これにより、ＧＴＥｘは、様々な異なる組織におけるヒト遺伝子発現のカタログを作成している。ＥＮＣＯＤＥの研究者は、トランスクリプトームを含むゲノムの機能部分を特徴付け、理解することを目指している。Ｎｏｖａｒｔｉｓおよび欧州分子生物学研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の両方が、十分に確立された遺伝子発現データベースを有しており、それらはすべて、本発明の文脈内での適切なデータベースとして役立ち得る。
【００８８】
多数の生物特異的トランスクリプトームデータベースが構築され、異なる細胞集団で差次的に発現される遺伝子の同定を助けるために注釈が付けられており、それらはすべて、本発明の文脈内での適切なデータベースとして役立ち得る。
【００８９】
ＲＮＡ−Ｓｅｑは、生物のトランスクリプトームを測定するための選択法として浮上しつつあるが、より古いＤＮＡマイクロアレイの技術もまだ使用されている。本発明によれば、ＲＮＡ−Ｓｅｑは、好ましくは、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物を同定するために使用される。
【００９０】
任意の適切な配列決定方法を本発明に従って使用することができ、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術が好ましい。将来的には、方法の配列決定工程の速度を上げるために、第三世代シーケンシング方法がＮＧＳ技術に取って代わる可能性がある。明確にするために、本発明の文脈における「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学として公知の「従来の」シーケンシング方法とは対照的に、ゲノム全体を小片に分割することによって核酸鋳型をゲノム全体に沿ってランダムに並行して読み取る、すべての新規ハイスループットシーケンシング技術を意味する。そのようなＮＧＳ技術（超並列シーケンシング技術としても公知である）は、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムのすべての転写配列）またはメチローム（ゲノムのすべてのメチル化配列）の核酸配列情報を非常に短い時間で、例えば１〜２週間以内に、好ましくは１〜７日以内に、または最も好ましくは２４時間未満で送達することができ、原理上は、単一細胞配列決定アプローチを可能にする。市販されているかまたは文献で言及されている複数のＮＧＳプラットフォーム、例えばＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１：Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ．Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３８（３），９５−１０９；またはＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００９：Ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｆｒｏｍ  ｂａｓｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５，６４１−６５８に詳述されているものを本発明の文脈において使用することができる。そのようなＮＧＳ技術／プラットフォームの非限定的な例は以下のものである：
１）最初にＲｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８：Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（５３７５），３６３−３６５に記載された、例えばＲｏｃｈｅ関連会社である４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）のＧＳ−ＦＬＸ  ４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（商標）で実行される、パイロシーケンシングとして公知の合成による配列決定技術。この技術は、エマルジョンＰＣＲ増幅のための油に取り囲まれたＰＣＲ反応物を含有する水性ミセル中に激しくボルテックスすることによって一本鎖ＤＮＡ結合ビーズを封入する、エマルジョンＰＣＲを使用する。パイロシーケンシング工程では、ポリメラーゼがＤＮＡ鎖を合成するときに、ヌクレオチドの取り込み中にリン酸分子から放出された光が記録される。
【００９１】
２）可逆的な色素ターミネータに基づいており、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）およびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）で実行される、Ｓｏｌｅｘａ（現在はＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．の一部、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって開発された合成による配列決定アプローチ。この技術では、４つすべてのヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼと共にフローセルチャネル中のオリゴプライミングクラスタ断片に同時に添加する。配列決定のために、架橋増幅によって４つすべての蛍光標識ヌクレオチドを有するクラスタ鎖を伸長させる。
【００９２】
３）例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（現在のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＳＯＬｉｄ（商標）プラットフォームで実行される、ライゲーションによる配列決定アプローチ。この技術では、固定長のすべての可能なオリゴヌクレオチドのプールを、配列決定された位置に従って標識する。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、連結する；ＤＮＡリガーゼによる一致する配列の選択的な連結によって、その位置のヌクレオチドの情報を与えるシグナルが得られる。配列決定する前に、ＤＮＡをエマルジョンＰＣＲによって増幅する。それぞれが同じＤＮＡ分子のコピーのみを含む得られたビーズをスライドガラス上に載せる。２番目の例として、Ｄｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｌｅｍ，Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ）のＰｏｌｏｎａｔｏｒ（商標）Ｇ．００７プラットフォームも、並列シーケンシングのために、ランダムに配置されたビーズに基づくエマルジョンＰＣＲを使用してＤＮＡ断片を増幅することによる、ライゲーションによる配列決定アプローチを用いる。
【００９３】
４）例えばＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＰａｃＢｉｏ  ＲＳシステム、またはＨｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）プラットフォームで実行されるような単一分子配列決定技術。この技術の明確な特徴は、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシーケンシングと定義される、増幅なしで単一のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を配列決定するその能力である。例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅは、高感度の蛍光検出システムを使用して、それぞれのヌクレオチドが合成されるときに直接それを検出する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく同様のアプローチが、Ｖｉｓｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）から開発されている。他の蛍光に基づく単一分子技術は、Ｕ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅ（商標））およびＧｅｎｏｖｏｘｘ（ＡｎｙＧｅｎｅ（商標））からのものである。
【００９４】
５）例えば複製中の一本鎖上のポリメラーゼ分子の動きを監視するためにチップ上に配置された様々なナノ構造体を使用する、単一分子配列決定のためのナノ技術。ナノ技術に基づくアプローチの非限定的な例は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）のＧｒｉｄＯＮ（商標）プラットフォーム、Ｎａｂｓｙｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）によって開発されたハイブリダイゼーション支援ナノポアシーケンシング（ＨＡＮＳ（商標））プラットフォーム、およびコンビナトリアルプローブアンカーライゲーション（ｃＰＡＬ（商標））と呼ばれるＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）技術による特許保護されたリガーゼベースのＤＮＡ配列決定プラットフォームである。
６）単一分子配列決定のための電子顕微鏡検査に基づく技術、例えばＬｉｇｈｔＳｐｅｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＨａｌｃｙｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって開発されたもの。
【００９５】
７）ＤＮＡの重合中に放出される水素イオンの検出に基づくイオン半導体シーケンシング。例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、微細加工されたウェルの高密度アレイを使用して、この生化学的工程を超並列方式で実行する。各ウェルは異なるＤＮＡ鋳型を保持する。ウェルの下にはイオン感受性層があり、その下に特許保護されたイオンセンサーがある。
【００９６】
ＲＮＡ調製物はＮＧＳの出発物質として役立ち得る。そのような核酸は、生物学的物質などの試料から、例えば新鮮な急速凍結された組織もしくはホルマリン固定されたパラフィン包埋腫瘍組織（ＦＦＰＥ）から、または新鮮単離された細胞から、または患者の末梢血に存在するＣＴＣから、容易に得ることができる。
【００９７】
本発明によれば、ハイスループットの全ゲノム単一細胞ジェノタイピング法を適用することができる。そのようなアプローチは以下の工程を含み得る：
１．所与の患者から腫瘍標本を入手する。
２．腫瘍細胞からトランスクリプトーム（ＲＮＡ）を抽出し、それをｃＤＮＡに変換し、配列決定して、腫瘍細胞によって発現される転写物の量を決定する。
３．過度に上方制御されたＲＮＡ転写物の同定。
【００９８】
ワクチン
本明細書に記載の癌治療用のワクチンは、１つ以上の過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列（１つまたは複数）に由来する少なくとも１つのエピトープを特徴とする。一実施形態では、ワクチンは、１つ以上の過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる１つ以上のエピトープを含むポリペプチドを含む。一実施形態では、ワクチンは、１つ以上の過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる１つ以上のエピトープを含むポリペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡを含む。
【００９９】
したがって、ワクチン接種のために、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物の１つ以上のエピトープが、１つ以上のエピトープを含むポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡの形態で患者に提供される。そのようなポリペプチドは、モノエピトープ性またはポリエピトープ性であり得る。さらに、そのようなポリペプチドは、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によって発現される腫瘍関連抗原に対応し得るか、または組換えポリペプチド、例えば過度に上方制御されたＲＮＡ転写物（１つまたは複数）によって発現される１つ以上の腫瘍関連抗原に由来するエピトープを含むポリペプチドであり得る。核酸は、患者の細胞、特に抗原提示細胞で翻訳されて、ポリペプチドを産生し得る。細胞によるポリペプチドの適切なプロセシング後に、エピトープがＭＨＣによって提示され、適切なＴ細胞の刺激のために患者の免疫系に表示される。
【０１００】
本発明の方法に従って提供されるワクチンは、患者に投与された場合、好ましくは、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列に由来するＭＨＣ提示エピトープのコレクション、例えば２つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、好ましくは最大６０まで、５５まで、５０まで、４５まで、４０まで、３５まで、または３０までのＭＨＣ提示エピトープを提供するワクチンに関する。患者の細胞、特に抗原提示細胞によるこれらのエピトープの提示は、好ましくは、ＭＨＣに結合したときにエピトープを標的とする、したがって、ＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現し、腫瘍細胞の表面上に同じエピトープを提示する患者の腫瘍、好ましくは原発性腫瘍および腫瘍転移を標的とするＴ細胞をもたらす。
【０１０１】
ワクチンを提供するために、本発明の方法は、１つ以上の癌特異的な過度に上方制御されたＲＮＡ転写物（好ましくはコード核酸の形態）によってコードされる十分な数のエピトープをワクチンに恣意的に含めることを含み得るか、または癌ワクチン接種のための過度に上方制御されたＲＮＡ転写物および／またはエピトープの有用性を決定するさらなる工程を含み得る。したがって、さらなる工程は、以下のうちの１つ以上を含み得る：（ｉ）例えば過度の上方制御のレベルに従って、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物に優先順位を付けるかまたはランク付けすること；一般に、ＲＮＡ転写物が過度に上方制御されるほど、ワクチンを提供するのに適する、（ｉｉ）過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列が、公知のまたは予想されるＭＨＣ提示エピトープを含むかどうかを評価すること、（ｉｉｉ）過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列がＭＨＣ提示エピトープを含むかどうかをインビトロおよび／またはインシリコで試験する、例えば過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされるアミノ酸配列が、ＭＨＣ提示エピトープにプロセシングされるおよび／またはＭＨＣ提示エピトープとして提示される配列を含むかどうかを試験すること、ならびに（ｉｖ）想定されるエピトープが、特にそれらの天然配列状況で存在する場合、例えば天然に存在するタンパク質においても前記エピトープに隣接するアミノ酸配列に隣接する場合、および抗原提示細胞において発現される場合に、所望の特異性を有する患者のＴ細胞を刺激することができるかどうかをインビトロで試験すること。そのような隣接配列は、それぞれ３個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、好ましくは最大５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、または３０個までのアミノ酸を含んでもよく、Ｎ末端および／またはＣ末端でエピトープ配列に隣接し得る。
【０１０２】
潜在的に免疫原性であるエピトープを同定する工程は、それらのＭＨＣ結合能力、好ましくはＭＨＣクラスＩ結合能力の予測に従ってエピトープを決定するおよび／またはランク付けすることを含み得る。
【０１０３】
本発明に従って同定され、本発明のワクチンによって提供されるエピトープのコレクションは、好ましくは、前記エピトープを含むポリペプチド（ポリエピトープもしくはマルチエピトープポリペプチド）、または前記ポリペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡの形態で存在する。本開示の特定の実施形態では、ポリペプチドは、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる同じまたは異なる腫瘍関連抗原に由来する少なくとも２つのエピトープ、少なくとも３つのエピトープ、少なくとも４つのエピトープ、少なくとも５つのエピトープ、少なくとも６つのエピトープ、少なくとも７つのエピトープ、少なくとも８つのエピトープ、少なくとも９つのエピトープ、または少なくとも１０のエピトープを含む。エピトープは、ワクチン配列の形態でポリペプチド内に存在し得る、すなわちそれらの天然の配列状況で、例えば天然に存在するタンパク質においても前記エピトープに隣接するアミノ酸配列に隣接して存在し得る。そのような隣接配列は、それぞれ３個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、好ましくは最大５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、または３０個までのアミノ酸を含んでもよく、Ｎ末端および／またはＣ末端でエピトープ配列に隣接し得る。したがって、ワクチン配列は、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、好ましくは最大５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、または３０個までのアミノ酸を含み得る。一実施形態では、エピトープおよび／またはワクチン配列は、ポリペプチドの頭部から尾部に並んでいる。
【０１０４】
特に好ましい一実施形態では、本発明によるポリエピトープまたはマルチエピトープポリペプチドは、抗原提示細胞などの患者の細胞で発現されてポリペプチドを産生し得る核酸、好ましくはインビトロ転写または合成ＲＮＡなどのＲＮＡの形態で患者に投与される。
【０１０５】
一実施形態では、エピトープおよび／またはワクチン配列は、リンカー、特に中性リンカーによって隔てられている。本発明による「リンカー」という用語は、エピトープまたはワクチン配列などの２つのペプチドドメインの間に付加されて前記ペプチドドメインを接続するペプチドに関する。リンカー配列に関して特に制限はない。しかし、リンカー配列は、２つのペプチドドメインの間の立体障害を低減し、良好に翻訳され、エピトープのプロセシングを支援するまたは可能にすることが好ましい。さらに、リンカーは、免疫原性の配列要素を全く有さないかまたはごくわずかしか有さないべきである。リンカーは、好ましくは、望ましくない免疫反応を生じ得る、隣接するエピトープ間の接合部縫合から生じるもののような非内因性エピトープを生成すべきではない。したがって、ポリエピトープワクチンは、好ましくは、望ましくないＭＨＣ結合接合部エピトープの数を減らすことができるリンカー配列を含むべきである。Ｈｏｙｔ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．２５（８），１７２０−９，２００６）およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１０），８６３５−４１，２００４）は、グリシンリッチ配列がプロテアソームプロセシングを損なうこと、したがってグリシンリッチリンカー配列の使用は、プロテアソームによってプロセシングされ得るリンカー含有ペプチドの数を最小限に抑えるように作用することを示した。さらに、グリシンは、ＭＨＣ結合溝の位置で強い結合を阻害することが観察された（Ａｂａｓｔａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（７），３５６９−７５，１９９３）。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，６１（１），１１５−２６，２００５）は、アミノ酸配列に含まれるアミノ酸グリシンおよびセリンが、プロテアソームによってより効率的に翻訳およびプロセシングされるより柔軟なタンパク質をもたらし、コードされているエピトープへのより良好なアクセスを可能にすることを見出した。リンカーは、それぞれ３個以上、６個以上、９個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、好ましくは最大５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、または３０個までのアミノ酸を含み得る。好ましくは、リンカーはグリシンおよび／またはセリンアミノ酸に富む。好ましくは、リンカーのアミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％はグリシンおよび／またはセリンである。好ましい一実施形態では、リンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから実質的に構成される。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＳ）ａ（ＧＳＳ）ｂ（ＧＧＧ）ｃ（ＳＳＧ）ｄ（ＧＳＧ）ｅを含み、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０から選択される数であり、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは、０とは異なり、好ましくは２以上、３以上、４以上、または５以上である。一実施形態では、リンカーは、配列ＧＧＳＧＧＧＧＳＧを含む。
【０１０６】
本発明の別の実施形態では、本発明に従って同定され、本発明のワクチンによって提供されるエピトープのコレクションは、好ましくは異なるポリペプチド上に前記エピトープを含むポリペプチドのコレクションの形態で存在し、前記ポリペプチドはそれぞれ、重複していてもよい１つ以上のエピトープ、または前記ポリペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡのコレクションを含む。複数のポリエピトープおよび／またはマルチエピトープポリペプチドの投与の場合、異なるポリペプチドによって提供されるエピトープは、異なってもよく、または部分的に重複していてもよい。
【０１０７】
ひとたび抗原提示細胞などの患者の細胞に存在すると、本発明によるポリペプチドは、プロセシングされて、本発明に従って同定されたエピトープを産生する。本発明に従って提供されるワクチンの投与は、ＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現する細胞に対してＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発することができる、ＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープを提供し得る。あるいはまたはさらに、本発明に従って提供されるワクチンの投与は、ＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現する細胞に対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができる、ＭＨＣクラスＩ提示エピトープを提供し得る。好ましくは、本発明に従って提供されるワクチンは、細胞傷害性および／またはヘルパーＴ細胞応答のポリエピトープ刺激に有用である。
【０１０８】
ワクチン接種に使用される本明細書に記載のポリペプチドをコードする１つ以上のエピトープ、または核酸、特にＲＮＡを含むポリペプチドは、好ましくは、ポリペプチドまたは核酸が投与される対象においてＴ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。前記刺激された、プライミングされた、および／または拡大されたＴ細胞は、好ましくは標的抗原、特に癌細胞、組織および／または器官によって発現される標的抗原、すなわち過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によって発現される腫瘍関連抗原に対して向けられる。したがって、１つ以上のエピトープを含むポリペプチドは、腫瘍関連抗原もしくはその断片（例えばエピトープまたはワクチン配列）を含み得るか、または腫瘍関連抗原もしくはその断片の変異体を含み得る。一実施形態では、そのような変異体は、腫瘍関連抗原または断片と免疫学的に等価である。本開示の文脈において、「腫瘍関連抗原またはその断片の変異体」という用語は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす配列を意味し、刺激された、プライミングされた、および／または拡大されたＴ細胞は、特に疾患細胞、組織および／または器官によって提示された場合、腫瘍関連抗原を標的とする。したがって、１つ以上のエピトープを含むポリペプチドは、腫瘍関連抗原に対応し得るもしくはそれを含み得るか、腫瘍関連抗原の断片に対応し得るもしくはそれを含み得るか、または腫瘍関連抗原もしくはその断片に相同であるアミノ酸配列に対応し得るもしくはそれを含み得る。１つ以上のエピトープを含むポリペプチドが、腫瘍関連抗原の断片または腫瘍関連抗原の断片に相同であるアミノ酸配列を含む場合、前記断片またはアミノ酸配列は、腫瘍関連抗原のＴ細胞エピトープなどのエピトープまたは腫瘍関連抗原のＴ細胞エピトープなどのエピトープに相同である配列を含み得る。したがって、本開示によれば、１つ以上のエピトープを含むポリペプチドは、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる腫瘍関連抗原の免疫原性断片、または過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる腫瘍関連抗原の免疫原性断片に相同であるアミノ酸配列を含み得る。本開示による「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞を刺激、プライミングおよび／または拡大することができる抗原の断片に関する。Ｔ細胞による結合のための関連エピトープを提供するために、１つ以上のエピトープ（腫瘍関連抗原と同様）を含むポリペプチドが、抗原提示細胞などの細胞によって提示され得ることが好ましい。
【０１０９】
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じもしくは本質的に同じ免疫学的特性を示し、および／または、例えば免疫学的作用の種類に関して、同じもしくは本質的に同じ免疫学的作用を発揮することを意味する。本開示の文脈において、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは、免疫化のために使用される抗原または抗原変異体の免疫学的作用または特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列に結合するＴ細胞または参照アミノ酸配列を発現する細胞などの対象の免疫系に曝露されたときに、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。したがって、抗原と免疫学的に等価である分子は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大に関して、Ｔ細胞が標的とする抗原と同じもしくは本質的に同じ特性を示し、および／または同じもしくは本質的に同じ作用を発揮する。
【０１１０】
一実施形態では、本明細書に記載のワクチンは、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物（１つもしくは複数）、または腫瘍関連抗原（１つもしくは複数）をコードする１つ以上の核酸、特に１つ以上のＲＮＡによってコードされる１つ以上の腫瘍関連抗原を含む。一実施形態では、本明細書に記載のワクチンは、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる２つ以上の腫瘍関連抗原、または腫瘍関連抗原をコードする２つ以上の核酸、特に２つ以上のＲＮＡを含む。異なる実施形態では、２つ以上は、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上を含む。２つ以上の腫瘍関連抗原または核酸は、混合物中に存在してもよく、またはワクチンにおいて互いに別々に存在してもよく、その結果、例えば異なる時点でおよび／または異なる経路によって、互いに別々に患者に投与されてもよい。
【０１１１】
「プライミング」という用語は、Ｔ細胞がその特異的抗原と最初に接触し、エフェクタＴ細胞への分化を引き起こす過程を指す。
【０１１２】
「クローン拡大」または「拡大」という用語は、特定の実体が増加する過程を指す。本開示の文脈において、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増幅される免疫学的応答の文脈で使用される。好ましくは、クローン拡大はリンパ球の分化をもたらす。
【０１１３】
過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、本明細書では「腫瘍関連抗原」または「腫瘍抗原」とも称される。一実施形態では、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、癌組織と健常組織との間でそのアミノ酸配列が異ならない、「標準」抗原であり得る。あるいはまたはさらに、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされるペプチドまたはポリペプチドは、個体の腫瘍に特異的であり、それまでは免疫系によって認識されていなかった「ネオ抗原」であり得る。ネオ抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化をもたらす癌細胞のゲノムにおける１つ以上の癌特異的変異から生じ得る。しかしながら、本開示の目的のために、標準抗原をコードする過度に上方制御されたＲＮＡ転写物およびネオ抗原をコードする対応する過度に上方制御されたＲＮＡ転写物は、同じ転写物と見なされ、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物の量またはコピー数の両方に寄与する。
【０１１４】
癌の変異は各個人によって異なる。したがって、新規エピトープ（ネオエピトープ）をコードする癌変異は、ワクチン組成物および免疫療法の開発における魅力的な標的である。腫瘍免疫療法の有効性は、宿主内で強力な免疫応答を誘導することができる癌特異的抗原およびエピトープの選択に依存する。
【０１１５】
「変異」という用語は、参照と比較した核酸配列の変化または相違（ヌクレオチド置換、付加または欠失）を指す。「体細胞変異」は、生殖細胞（精子および卵子）を除く身体のいずれの細胞でも起こる可能性があり、したがって子供には受け継がれない。これらの変化は、（常にではないが）癌または他の疾患を引き起こし得る。好ましくは、変異は非同義変異である。「非同義変異」という用語は、翻訳産物におけるアミノ酸置換などのアミノ酸変化をもたらす変異、好ましくはヌクレオチド置換を指す。
【０１１６】
本発明によれば、「変異」という用語は、点変異、インデル、融合、クロモスリプシスおよびＲＮＡ編集を含む。
【０１１７】
本発明によれば、「インデル」という用語は、共局在化された挿入および欠失ならびにヌクレオチドの正味の増加または減少をもたらす変異として定義される、特別な変異クラスを表す。ゲノムのコード領域では、インデルの長さが３の倍数でない限り、フレームシフト変異を生じさせる。インデルは点変異と対比させることができる；インデルが配列にヌクレオチドを挿入するおよび配列からヌクレオチドを欠失させる場合、点変異はヌクレオチドの１つを置き換える置換の形態である。
【０１１８】
融合は、以前は別々であった２つの遺伝子から形成されたハイブリッド遺伝子を生成することができる。これは、転座、中間部欠失、または染色体逆位の結果として起こり得る。多くの場合、融合遺伝子は癌遺伝子である。発癌性融合遺伝子は、新しい機能または２つの融合パートナーとは異なる機能を有する遺伝子産物をもたらし得る。あるいは、癌原遺伝子は強力なプロモータに融合し、それにより、上流の融合パートナーの強力なプロモータによって引き起こされる上方制御によって発癌機能が機能し始める。発癌性融合転写物は、トランススプライシングまたはリードスルー事象によっても引き起こされ得る。
【０１１９】
本発明によれば、「クロモスリプシス」という用語は、単一の壊滅的な事象によってゲノムの特定の領域が粉砕され、その後縫い合わされる遺伝的現象を指す。
【０１２０】
本発明によれば、「ＲＮＡ編集」または「ＲＮＡ編集する」という用語は、ＲＮＡ分子の情報内容が塩基構成の化学的変化によって改変される分子過程を指す。ＲＮＡ編集には、シチジン（Ｃ）からウリジン（Ｕ）およびアデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化などのヌクレオシド修飾、ならびに非鋳型ヌクレオチドの付加および挿入が含まれる。ｍＲＮＡでのＲＮＡ編集は、コードされているタンパク質のアミノ酸配列を、ゲノムＤＮＡ配列によって予測されるものとは異なるように有効に改変する。
【０１２１】
「抗原」という用語は、免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む作用物質に関する。「抗原」という用語には、特にタンパク質およびペプチドが含まれる。一実施形態では、抗原は、樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞などの免疫系の細胞によって提示される。抗原またはＴ細胞エピトープなどのそのプロセシング産物は、一実施形態では、Ｔ細胞もしくはＢ細胞受容体によって、または抗体などの免疫グロブリン分子によって結合される。したがって、抗原またはそのプロセシング産物は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応し得る。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり、エピトープはそのような抗原に由来する。
【０１２２】
「腫瘍関連抗原」という用語は、腫瘍または癌に関連する任意の抗原を指すためにその最も広い意味で使用される。腫瘍関連抗原は、好ましくは過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされ、宿主の免疫系を刺激して腫瘍または癌に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含む分子であり得る。したがって、腫瘍関連抗原またはそのエピトープは、治療目的に使用され得る。
【０１２３】
「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原などの分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体によって認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約５〜約１００、例えば約５〜約５０、より好ましくは約８〜約３０、最も好ましくは約１０〜約２５アミノ酸の長さであり得、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の長さであり得る。一実施形態では、エピトープは、約１０〜約２５アミノ酸の長さである。「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞エピトープを含む。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「ネオエピトープ」という用語は、正常な非癌性細胞または生殖系列細胞などの参照中には存在しないが、癌細胞に見出されるエピトープを指す。これには、特に、正常な非癌性細胞または生殖系列細胞中に対応するエピトープが見出されるが、癌細胞における１つ以上の変異のために、エピトープの配列が変化してネオエピトープを生じさせる状況が含まれる。
【０１２５】
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。
【０１２６】
「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、Ｔ細胞に対して自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）と非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方を表示する。クラスＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約８〜約１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。クラスＩＩ  ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約１０〜約２５アミノ酸長であり、特に約１３〜約１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドも有効であり得る。
【０１２７】
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。「抗原特異的Ｔ細胞」という用語または同様の用語は、特にＭＨＣ分子に関連して抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面に提示された場合、Ｔ細胞が標的とする抗原を認識し、好ましくはＴ細胞のエフェクタ機能を発揮するＴ細胞に関する。Ｔ細胞が抗原を発現する標的細胞を死滅させる場合、Ｔ細胞は抗原に特異的であると見なされる。Ｔ細胞の特異性は、例えばクロム放出アッセイまたは増殖アッセイ内で、様々な標準的技術のいずれかを使用して評価し得る。あるいは、リンホカイン（インターフェロンγなど）の合成を測定することができる。
【０１２８】
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列である配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えばオープンリーディングフレームの３'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得られる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、例えばオープンリーディングフレームの５'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得られる。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、好ましくはアミノ酸配列からの少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。
【０１２９】
本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。「変異体」という用語は、すべてのスプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体配座変異体、アイソフォーム変異体および種ホモログ、特に細胞によって天然に発現されるものを含む。
【０１３０】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失はタンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置き換えることが好ましい。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換が含まれる。天然に存在するアミノ酸は一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。
【０１３１】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸について与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最適な配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して行うことができる。
【０１３２】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。
【０１３３】
「同一性パーセント」という用語は、最適なアラインメント後に得られる、比較する２つの配列間で同一であるアミノ酸残基の割合を示すことが意図されており、この割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違はそれらの全長にわたってランダムに分布している。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、通常、これらの配列を最適に整列させた後に比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウィンドウ」ごとに行われる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動のほかに、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  ＡｐｐＭａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
【０１３４】
同一性パーセントは、比較する２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除し、得られた結果に１００を乗じて、これら２つの配列間の同一性パーセントを得ることによって計算される。
【０１３５】
相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８、または少なくとも９９％の同一性を示す。
【０１３６】
本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、当業者によって、例えば組換えＤＮＡ操作によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載のペプチドおよびアミノ酸変異体は、例えば固相合成および類似の方法などによる公知のペプチド合成技術を用いて容易に調製され得る。
【０１３７】
一実施形態では、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の断片または変異体は、好ましくは「機能的断片」または「機能的変異体」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の１つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価の任意の断片または変異体に関する。
【０１３８】
指定されたアミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列の変異体またはその断片であり得る。例えば、本明細書での使用に適したエピトープは、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在するまたは天然の配列とは配列が異なるように改変され得ることが当業者に理解されるであろう。
【０１３９】
本明細書に記載の１つ以上のエピトープを含むポリペプチドをコードするＲＮＡを使用して、過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる腫瘍関連抗原に由来するエピトープを患者に送達することができる。脾臓に存在する樹状細胞（ＤＣ）は、エピトープのＲＮＡ発現のための特に興味深い抗原提示細胞である。
【０１４０】
一実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
【０１４１】
一実施形態では、ＲＮＡは修飾リボヌクレオチドを有し得る。修飾リボヌクレオチドの例には、限定されることなく、５−メチルシチジン、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）または５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）が含まれる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは５'キャップを含む。一実施形態では、本開示のＲＮＡは、キャップされていない５'−三リン酸を有さない。一実施形態では、ＲＮＡは５'キャップ類似体によって修飾され得る。「５'キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に認められる構造を指し、一般に独特の５'−５'三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。ＲＮＡに５'キャップまたは５'キャップ類似体を提供することは、５'キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写によって達成され得るか、またはキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに付加され得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、５'−ＵＴＲおよび／または３'−ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５'側（上流）（５'−ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３'側（下流）（３'−ＵＴＲ）に存在し得る。５'−ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の５'末端に位置する。５'−ＵＴＲは、５'キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５'キャップに直接隣接している。３'−ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の３'末端に位置するが、「３'−ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）尾部を含まない。したがって、３'−ＵＴＲは、ポリ（Ａ）配列（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）配列に直接隣接している。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは３'−ポリ（Ａ）配列を含む。「ポリ（Ａ）配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関する。本開示によれば、一実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約８０、または少なくとも約１００、および最大約５００、最大約４００、最大約３００、最大約２００、または最大約１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含む。
【０１４５】
本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
【０１４６】
ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列の集合体に指令する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
【０１４７】
ＲＮＡ含有粒子
投与されるＲＮＡは、ＲＮＡおよびＲＮＡと会合してＲＮＡ粒子を形成する１つ以上の成分を含む粒子内に存在し得る。ＲＮＡ粒子は、複合体化および／または封入された形態のＲＮＡを含み得る。本明細書に記載の粒子は、好ましくは、ウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわちそれらは細胞にウイルス感染することができない。ＲＮＡ含有粒子は、例えばタンパク質性粒子の形態または脂質含有粒子の形態であり得る。適切なタンパク質または脂質は、「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語に含まれる。「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語は、ＲＮＡと会合してＲＮＡ粒子を形成する任意の成分に関する。
【０１４８】
本開示の文脈において、「粒子」という用語は、分子または分子複合体によって形成される構造化された実体に関する。一実施形態では、「粒子」という用語は、マイクロサイズまたはナノサイズのコンパクトな構造体などの、マイクロサイズまたはナノサイズの構造体に関する。
【０１４９】
本開示の文脈において、「ＲＮＡ粒子」という用語は、ＲＮＡを含む粒子に関する。ポリマーおよび脂質などの正に帯電した分子と負に帯電したＲＮＡとの間の静電相互作用は、複合体化およびＲＮＡ粒子の自発的形成をもたらす。一実施形態では、ＲＮＡ粒子はナノ粒子である。
【０１５０】
本開示で使用される場合、一実施形態における「ナノ粒子」は、静脈内投与に適した平均直径を有する粒子を指す。
【０１５１】
脂質、ポリマー、または両親媒性物質（ａｍｐｈｉｐｉｌｅｓ）は、ＲＮＡ粒子製剤の典型的な構成要素である。
【０１５２】
タンパク質性粒子および脂質含有粒子は、粒子形態でのＲＮＡの送達に適することが以前に記載されている（例えばＫａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９，６０）。非ウイルスＲＮＡ送達ビヒクルの場合、ＲＮＡのナノ粒子封入はＲＮＡを分解から物理的に保護し、特定の化学的性質に応じて、細胞の取り込みおよびエンドソーム脱出を助けることができる。ポリマーは、それらの高度な化学的柔軟性を考えると、ナノ粒子ベースの送達のために一般的に使用される材料である。典型的には、カチオン性ポリマーは、負に帯電したＲＮＡを静電的にナノ粒子に凝縮するために使用される。これらの正に帯電した基は、多くの場合、生理学的ｐＨ（ｐＫａ約７．４）でプロトン化されるアミンからなり、エンドソームの破裂をもたらすイオンの不均衡につながると考えられている。ポリ−Ｌ−リジン、ポリアミドアミン、プロタミンおよびポリエチレンイミンなどのポリマー、ならびにキトサンなどの天然に存在するポリマーはすべて、ＲＮＡ送達に適用されている。さらに、一部の研究者は、特に核酸送達のためのポリマーを合成した。ポリ（β−アミノエステル）は、特に、それらの合成の容易さと生分解性のために、核酸送達において広く使用されている。
【０１５３】
本明細書で使用される「ポリマー」は、その通常の意味を与えられる、すなわち共有結合によって接続された１つ以上の繰り返し単位（モノマー）を含む分子構造体である。繰り返し単位はすべて同一であり得るか、または場合によっては、複数の種類の繰り返し単位がポリマー内に存在し得る。場合によっては、ポリマーは生物学的に誘導される、すなわちタンパク質などの生体高分子である。場合によっては、さらなる部分、例えば本明細書に記載されるような標的化部分もポリマー中に存在し得る。
【０１５４】
複数の種類の繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、そのポリマーは「コポリマー」であると言われる。ポリマーを使用する任意の実施形態において、使用されるポリマーは、場合によってはコポリマーであり得ることが理解されるべきである。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の方法で配置することができる。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、または「ブロック」コポリマー、すなわちそれぞれが第１の繰り返し単位（例えば第１ブロック）を含む１つ以上の領域とそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば第２ブロック）を含む１つ以上の領域などを含む「ブロック」コポリマーとして配置することができる。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ以上の数の異なるブロックを有することができる。
【０１５５】
特定の実施形態では、ポリマーは生体適合性である。生体適合性ポリマーは、典型的には中程度の濃度では有意な細胞死を引き起こさないポリマーである。特定の実施形態では、生体適合性ポリマーは生分解性であり、すなわちポリマーは、体内などの生理学的環境内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。特定の実施形態では、ポリマーは、プロタミンまたはポリエチレンイミンであり得る。
【０１５６】
ＲＮＡは、カチオン性脂質および任意でさらなる脂質またはヘルパー脂質を含むリポソームに結合して注射可能なナノ粒子製剤を形成する、いわゆるリポプレックス製剤によって脾臓に送達され得る。リポソームは、エタノール中の脂質の溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得る。ＲＮＡリポソー粒子は、リポソームをＲＮＡと混合することによって調製することができる。脾臓標的化ＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１４３６８３に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的化するために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現するために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、全く起こらないかまたは本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現するために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
【０１５７】
本開示の文脈において、「ＲＮＡリポプレックス粒子」という用語は、脂質、特にカチオン性脂質、およびＲＮＡを含む粒子に関する。正に帯電したリポソームと負に帯電したＲＮＡとの間の静電相互作用は、ＲＮＡリポプレックス粒子の複合体化と自発的形成をもたらす。正に帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質、およびＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成し得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」は、正味の正電荷を有する脂質を指す。カチオン性脂質は、静電相互作用によって負に帯電したＲＮＡを脂質マトリックスに結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシルまたはジアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭基は、典型的には正電荷を担持する。カチオン性脂質の例には、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、２，３−ジ（テトラデコキシ）プロピル−（２−ヒドロキシエチル）−ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、ｌ，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＳＰＡが好ましい。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＴＡＰである。
【０１５９】
ＲＮＡリポプレックス粒子の正電荷と負電荷の全体的な比率および物理的安定性を調整するために、さらなる脂質を組み込んでもよい。特定の実施形態では、さらなる脂質は中性脂質である。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、ゼロの正味電荷を有する脂質を指す。中性脂質の例には、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、およびセレブロシドが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、さらなる脂質は、ＤＯＰＥ、コレステロールおよび／またはＤＯＰＣである。
【０１６０】
特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質とのモル比は、約１０：０〜約１：９、約４：１〜約１：２、または約３：１〜約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質とのモル比は、約２：１である。
【０１６２】
本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、一実施形態では、約２００ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ〜約８００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約４００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ〜約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ〜約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。
【０１６３】
「平均直径」という用語は、長さの次元を持ついわゆるＺ平均および無次元である多分散性指数（ＰＩ）を結果として提供する、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用したデータ分析を伴う動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される、粒子の平均流体力学的直径を指す（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，１９７２，ｐｐ  ４８１４−４８２０，ＩＳＯ  １３３２１）。ここで、粒子についての「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ平均の値と同義で使用される。
【０１６４】
「多分散性指数」という用語は、本明細書では粒子、例えばナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度として使用される。多分散性指数は、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて計算される。
【０１６５】
「押し出す」または「押し出し」という用語は、固定された断面プロフィールを有する粒子の作製を指す。特に、この用語は粒子の小型化を指し、それによって粒子は定義された細孔を有するフィルタを強制的に通過する。
【０１６６】
本開示のＲＮＡ−脂質粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する電荷とＲＮＡに存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷の比である。少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって計算される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（ｍｏｌ））＊（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（ｍｏｌ））＊（ＲＮＡ中の負電荷の総数）］。
【０１６７】
生理的ｐＨでの本明細書に記載の脾臓標的化ＲＮＡリポプレックス粒子は、好ましくは、正電荷と負電荷の電荷比が約１．９：２〜約１：２などの正味の負電荷を有する。特定の実施形態では、生理的ｐＨでのＲＮＡリポプレックス粒子における正電荷と負電荷の電荷比は、約１．９：２．０、約１．８：２．０、約１．７：２．０、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。
【０１６８】
本明細書で使用される「生理学的ｐＨ」は、約７．５のｐＨを指す。
【０１６９】
医薬組成物
本明細書に記載の作用物質は、医薬組成物または薬剤、特に治療的または予防的治療のためのワクチンとして、またはそれらを調製するために有用である。
【０１７０】
「医薬組成物」という用語は、治療上有効な作用物質を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に含む製剤に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患または障害を治療する、予防する、またはその重症度を軽減するのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても公知である。本開示の文脈において、医薬組成物は、ＲＮＡ、ＲＮＡ粒子および／または本明細書に記載のさらなる作用物質を含み得る。
【０１７１】
本発明によれば、「ワクチン」という用語は、投与時に、病原体または癌細胞などの疾患細胞を認識して攻撃する免疫応答、特に細胞性免疫応答を誘導する医薬製剤（医薬組成物）または製品に関する。ワクチンは、疾患の予防または治療に使用し得る。「個別化癌ワクチン」という用語は、特定の癌患者に関係し、癌ワクチンが個々の癌患者の必要性または特別な状況に適合していることを意味する。
【０１７２】
本開示の医薬組成物は、好ましくは１つ以上のアジュバントを含むか、または１つ以上のアジュバントと共に投与され得る。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、または免疫刺激複合体などの不均一な化合物の群を含む。アジュバントの例には、限定されることなく、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、成長因子、およびモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインなどのサイトカインが含まれる。ケモカインは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＴ−ａであり得る。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１などの油である。本開示で使用するための他の適切なアジュバントには、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドが含まれる。
【０１７３】
本開示による医薬組成物は、一般に「薬学的に有効な量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。
【０１７４】
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
【０１７５】
「薬学的に有効な量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻止に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される実質的により高い用量）を使用し得る。
【０１７６】
本開示の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、および任意で他の治療薬を含み得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。
【０１７７】
本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤には、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
【０１７８】
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例には、限定されることなく、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤が含まれる。
【０１７９】
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする作用物質に関する。さらに、「希釈剤」という用語には、流体、液体もしくは固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上が含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロールおよび水が含まれる。
【０１８０】
「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体には、限定されることなく、滅菌水、リンガー液、乳酸リンガー液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが含まれる。一実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。
【０１８１】
治療的使用のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
【０１８２】
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準製薬法に関して選択することができる。
【０１８３】
医薬組成物の投与経路
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与は、胃腸管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与を含み得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、胃腸管を介する以外の任意の方法での投与を指す。好ましい実施形態では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。別の好ましい実施形態では、全身投与は静脈内投与による。
【０１８４】
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物の投与後、活性物質である、１つ以上のエピトープを含むそのようなポリペプチドまたは核酸、特に、任意でＲＮＡ粒子の形態で、前記ポリペプチドをコードするＲＮＡの少なくとも一部が、標的細胞に送達される。一実施形態では、ＲＮＡの少なくとも一部は、標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されてポリペプチドを生成する。一実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。一実施形態では、標的細胞は、脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。一実施形態では、標的細胞は脾臓の樹状細胞である。したがって、本明細書に記載のＲＮＡ粒子は、そのような標的細胞にＲＮＡを送達するために使用され得る。したがって、本開示はまた、本明細書に記載のＲＮＡ粒子を対象に投与することを含む、対象の標的細胞にＲＮＡを送達するための方法に関する。一実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上のエピトープを含むポリペプチドをコードするＲＮＡであり、ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されてポリペプチドを生成する。
【０１８５】
一実施形態では、本開示は、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることを含む。
【０１８６】
「リンパ系」は循環系の一部であり、リンパを運ぶリンパ管のネットワークを含む免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ器官、リンパ管の伝導ネットワーク、および循環リンパからなる。一次または中枢リンパ器官は、未成熟な前駆細胞からリンパ球を生成する。胸腺および骨髄は一次リンパ器官を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ器官は、成熟したナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。
【０１８７】
医薬組成物の使用
本明細書に記載のワクチンは、癌疾患の治療的または予防的治療に使用され得る。
【０１８８】
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるようにワクチンを対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘導するための方法に関する。例示的な実施形態では、免疫応答は癌に対するものである。
【０１８９】
「疾患」という用語は、個体の身体を侵す異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部からの要因によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能不全によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能不全、苦痛、社会問題、もしくは死を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型のバリエーションを含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリーと見なされ得る。多くの疾患を患い、それと共に生活することは人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的にだけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。
【０１９０】
本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療的介入」という用語は、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした、対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことを意図しており、予防は、疾患、状態または障害と闘う目的での個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。
【０１９１】
「治療的治療」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長（増加）させる任意の治療に関する。前記治療は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体における症状の頻度もしくは重症度を減少させ、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。
【０１９２】
「予防的治療」または「防止的治療」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的治療」または「防止的治療」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１９３】
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害（例えば癌）に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していてもよくまたは有していなくてもよいヒトまたは別の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、子供、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。
【０１９４】
「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に罹患した個体または対象を意味する。
【０１９５】
本開示の一実施形態では、目的は、腫瘍抗原を発現する癌細胞などの抗原を発現する疾患細胞に対する免疫応答を提供し、腫瘍抗原などの抗原を発現する細胞が関与する癌疾患などの疾患を治療することである。
【０１９６】
１つ以上の過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる１つ以上のエピトープを含むポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸を含む本明細書に記載のワクチンは、治療的または部分的もしくは完全に保護的であり得る、対象における前記１つ以上のエピトープに対する免疫応答を誘発するために対象に投与され得る。当業者は、免疫療法およびワクチン接種の原理の１つが、治療される疾患に関して免疫学的に関連する抗原またはエピトープで対象を免疫することによって疾患に対する免疫防御反応が生じるという事実に基づくことを理解するであろう。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、免疫応答を誘導または増強するために適用可能である。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防的および／または治療的治療において有用である。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を指す。細胞性免疫応答には、限定されることなく、抗原を発現し、クラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子による抗原の提示を特徴とする細胞に向けられる細胞応答が含まれる。細胞応答はＴリンパ球に関連し、Ｔリンパ球は、免疫応答を制御することによって中心的な役割を果たすヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）、または感染した細胞もしくは癌細胞におけるアポトーシスを誘導するキラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、もしくはＣＴＬとも称される）として分類され得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物を投与することは、１つ以上の腫瘍抗原を発現する癌細胞に対する抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激を含む。特定の実施形態では、腫瘍抗原はクラスＩ  ＭＨＣ分子と共に提示される。
【０１９８】
本開示は、保護的、防御的、予防的および／または治療的であり得る免疫応答を企図する。本明細書で使用される場合、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」は、特定の抗原に対する免疫応答が誘導前に存在しなかったことを示し得るか、または誘導前に特定の抗原に対する基礎レベルの免疫応答があり、これが誘導後に増強されたことを示し得る。したがって、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」には、「免疫応答を増強する（または増強すること）」が含まれる。
【０１９９】
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導または増強することによる疾患または状態の治療に関する。「免疫療法」という用語は、抗原免疫または抗原ワクチン接種を含む。
【０２００】
「免疫」または「ワクチン接種」という用語は、例えば治療的または予防的理由により、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与する過程を表す。
【０２０１】
一実施形態では、本開示は、脾臓組織を標的とする本明細書に記載のＲＮＡ粒子が投与される実施形態を想定する。ＲＮＡは、例えば本明細書に記載されるように、１つ以上の過度に上方制御されたＲＮＡ転写物によってコードされる１つ以上のエピトープを含むポリペプチドをコードする。ＲＮＡは、樹状細胞などの脾臓の抗原提示細胞によって取り込まれて、ポリペプチドを発現する。抗原提示細胞による任意のプロセシングおよび提示に続いて、１つ以上のエピトープに対する免疫応答が生成され、癌の予防的および／または治療的治療をもたらし得る。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ粒子によって誘導される免疫応答は、樹状細胞および／またはマクロファージなどの抗原提示細胞による１つ以上のエピトープの提示、ならびにこの提示による細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を含む。例えば、ＲＮＡによってコードされるポリペプチドまたはそのプロセシング産物は、抗原提示細胞上に発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示され得る。次に、ＭＨＣペプチド複合体はＴ細胞またはＢ細胞などの免疫細胞によって認識され、それらの活性化をもたらすことができる。
【０２０２】
したがって、一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ粒子中のＲＮＡは、投与後、脾臓に送達され、および／または脾臓で発現される。一実施形態では、ＲＮＡ粒子は、脾臓抗原提示細胞を活性化するために脾臓に送達される。したがって、一実施形態では、ＲＮＡ粒子の投与後、ＲＮＡの送達および／または抗原提示細胞におけるＲＮＡの発現が起こる。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞またはノンプロフェッショナル抗原提示細胞であり得る。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージ、さらにより好ましくは脾臓樹状細胞および／または脾臓マクロファージであり得る。
【０２０３】
したがって、本開示は、癌に対する免疫応答を誘導または増強するための、本明細書に記載のＲＮＡ粒子またはＲＮＡ粒子を含む医薬組成物に関する。
【０２０４】
さらなる実施形態では、本開示は、癌疾患の予防的および／または治療的治療において使用するための、本明細書に記載のＲＮＡ粒子またはＲＮＡ粒子を含む医薬組成物に関する。
【０２０５】
さらなる実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＲＮＡ粒子またはＲＮＡ粒子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、１つ以上のエピトープを脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞に送達するための方法、または脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞において１つ以上のエピトープを発現するための方法に関する。１つ以上のエピトープは、好ましくはＲＮＡ粒子中のＲＮＡによってコードされる。
【０２０６】
一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ粒子またはＲＮＡ粒子を含む医薬組成物を全身投与すると、脾臓におけるＲＮＡ粒子またはＲＮＡの標的化および／または蓄積がもたらされ、肺および／または肝臓での標的化および／または蓄積は起こらない。一実施形態では、ＲＮＡ粒子は、脾臓でＲＮＡを放出し、および／または脾臓の細胞に入る。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ粒子またはＲＮＡ粒子を含む医薬組成物を全身投与すると、脾臓の抗原提示細胞にＲＮＡが送達される。特定の実施形態では、脾臓における抗原提示細胞は、樹状細胞またはマクロファージである。
【０２０７】
さらなる実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＲＮＡ粒子またはＲＮＡ粒子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における癌に対する免疫応答を誘導または増強するための方法に関する。
【０２０８】
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって産生される食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物によって活性化されるマクロファージは、マクロファージ内に外来病原体を非特異的に飲み込み、病原体の分解をもたらす加水分解および酸化攻撃によって死滅させる。分解されたタンパク質からのペプチドは、Ｔ細胞によって認識され得るマクロファージ細胞表面に表示され、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用して、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化と免疫応答のさらなる刺激をもたらすことができる。マクロファージは抗原提示細胞のクラスに属する。一実施形態では、マクロファージは脾臓マクロファージである。
【０２０９】
「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞の別のサブタイプを指す。一実施形態では、樹状細胞は造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初は未成熟な樹状細胞に変化する。これらの未成熟細胞は、高い食作用と低いＴ細胞活性化能を特徴とする。未成熟な樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体の周囲環境を絶えずサンプリングしている。それらは、提示可能な抗原と接触すると、活性化されて成熟樹状細胞となり、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小さな断片に分解し、成熟すると、ＭＨＣ分子を使用してそれらの断片を細胞表面に提示する。同時に、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化の共受容体として機能する細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を大幅に増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓に、またはリンパ系を通ってリンパ節に移動するように誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７を上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として機能し、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞、ならびに非抗原特異的共刺激シグナルと共に抗原を提示することによってＢ細胞も活性化する。したがって、樹状細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞関連の免疫応答を積極的に誘導することができる。一実施形態では、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
【０２１０】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、その細胞表面上に（またはその細胞表面で）少なくとも１つの抗原または抗原性断片を表示、獲得、および／または提示することができる様々な細胞の１つである。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞とに区別することができる。
【０２１１】
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
【０２１２】
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現しないが、インターフェロンγなどの特定のサイトカインによる刺激を受けると発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞には、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞が含まれる。
【０２１３】
「抗原プロセシング」は、抗原の、前記抗原の断片であるプロセシング産物への分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）、および抗原提示細胞などの細胞による特定のＴ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
【０２１４】
「抗原が関与する疾患」または「エピトープが関与する疾患」という用語は、抗原またはエピトープが関係する任意の疾患、例えば抗原またはエピトープの存在によって特徴付けられる疾患を指す。抗原またはエピトープが関与する疾患は、癌疾患または単に癌であり得る。上記のように、抗原は、腫瘍関連抗原などの疾患関連抗原であり得る。
【０２１５】
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする個体の生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例には、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれる。本開示による「癌」という用語は、癌転移も含む。一般に、「腫瘍」および「癌」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０２１６】
「循環腫瘍細胞」または「ＣＴＣ」という用語は、原発性腫瘍または腫瘍転移から分離して血流中を循環する細胞に関する。ＣＴＣは、異なる組織におけるさらなる腫瘍のその後の成長（転移）のための種子を構成し得る。循環腫瘍細胞は、転移性疾患を有する患者の全血１ｍＬあたり１〜１０個程度のＣＴＣの頻度で認められる。ＣＴＣを単離するための研究方法が開発されている。ＣＴＣを単離するためのいくつかの研究方法、例えば上皮細胞が、正常な血液細胞には存在しない細胞接着タンパク質ＥｐＣＡＭを一般に発現するという事実を利用する技術が当技術分野で記述されている。免疫磁気ビーズに基づく捕捉は、磁性粒子と結合したＥｐＣＡＭに対する抗体で血液標本を処理し、続いて、タグ付けされた細胞を磁場内で分離することを含む。次いで、単離された細胞を、別の上皮マーカであるサイトケラチンに対する抗体、および一般的な白血球マーカＣＤ４５で染色して、まれなＣＴＣを混入白血球から区別する。この堅固で半自動化されたアプローチは、ＣＴＣを約１  ＣＴＣ／ｍＬの平均収率および０．１％の純度で同定する（Ａｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４：Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０，６８９７−６９０４）。ＣＴＣを単離するための２番目の方法は、ＥｐＣＡＭに対する抗体で被覆することによって機能的にした８０，０００個のマイクロポストを包埋したチャンバに全血を流すことを含む、マイクロ流体に基づくＣＴＣ捕捉装置を使用する。次いで、ＣＴＣを、サイトケラチンまたは前立腺癌のＰＳＡもしくは乳癌のＨＥＲ２などの組織特異的マーカのいずれかに対する二次抗体で染色し、マイクロポストを三次元座標に沿って複数の平面で自動走査することによって可視化する。ＣＴＣチップは、５０細胞／ｍｌの収率中央値および１〜８０％の範囲の純度で患者のサイトケラチン陽性循環腫瘍細胞を同定することができる（Ｎａｇｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７：Ｎａｔｕｒｅ  ４５０，１２３５−１２３９）。ＣＴＣを単離するための別の可能性は、血液チューブ内のＣＴＣを捕捉、同定、および計数するＶｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ（Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）のＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）試験を使用することである。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）システムは、免疫磁気標識および自動デジタル顕微鏡検査の組合せに基づく、全血中のＣＴＣの計数のための米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された方法である。ＣＴＣを単離するための他の方法が文献に記載されており、そのすべてが本発明と併せて使用することができる。
【０２１７】
癌治療における併用戦略は、結果として生じる相乗効果のために望ましい場合があり、これは単剤療法アプローチの影響よりもかなり強力であり得る。一実施形態では、医薬組成物は免疫療法剤と共に投与される。本明細書で使用される場合、「免疫療法剤」は、特定の免疫応答および／または免疫エフェクタ機能（１つまたは複数）の活性化に関与し得る任意の作用物質に関する。本開示は、免疫療法剤としての抗体の使用を企図する。理論に拘束されることを望むものではないが、抗体は、アポトーシスを誘導する、シグナル伝達経路の成分をブロックする、または腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、様々な機構を通して癌細胞に対する治療効果を達成することができる。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して細胞死を誘導し得るか、または補体タンパク質に結合して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として知られる直接的な細胞傷害性をもたらし得る。本開示と組み合わせて使用し得る抗癌抗体および潜在的な抗体標的（括弧内）の非限定的な例には、アバゴボマブ（ＣＡ−１２５）、アブシキシマブ（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴル（ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテテート（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ＭＯＲＡｂ−００９）、アナツモマブマフェナトクス（ＴＡＧ−７２）、アポリズマブ（ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、アテゾリズマブ（ＰＤ−Ｌ１）、バビツキシマブ（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ＣＤ２２）、ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ＣＤ４４  ｖ６）、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、ブレンツキシマブベドチン（ＣＤ３０  ＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブメルタンシン（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（前立腺癌細胞）、カルルマブ（ＣＮＴ０８８８）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトクス（ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、クローディキシマブ（クローディン）、クリバツズマブテトラキセタン（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダロツズマブ（インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（ＮＰＣ−１Ｃ）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（インテグリンανβ３）、ファルレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ＳＣＨ  ９００１０５）、フィギツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、フランボツマブ（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（ＴＧＦ−β）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガニツマブ（ＩＧＦ−Ｉ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（ＩＬ−Ιβ）、ギレンツキシマブ（炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ））、グレムバツムマブベドチン（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（ＶＥＧＦＲ−１）、イゴボマ（ＣＡ−１２５）、インダツキシマブラブタンシン（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（ＣＤ５１）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＤ２２）、イピリムマブ（ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（ＣＥＡ）、レクサツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、リビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、ロルボツズマブメルタンシン（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（ＩＬ−５）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミツモマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（５Ｔ４）、ナマツマブ（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦ−Ｒ  ａ）、オナルツズマブ（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オポルツズマブモナトクス（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ−１２５）、オキセルマブ（ＯＸ−４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パトリツマブ（ＨＥＲ３）、ペムツモマ（ＭＵＣ１）、ペルツズマ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（腺癌抗原）、プリツムマブ（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（フィブロネクチンエクストラドメインＢ）、ラフィビルマブ（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（ＨＧＦ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（ＩＧＦ−１受容体）、サマリズマブ（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（ＦＡＰ）、シルツキシマブ（ＩＬ−６）、タバルマブ（ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（α−フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（ＣＤ１９）、テナツモマブ（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（ＣＤ２２１）、チシリムマブ（ＣＴＬＡ−４）、ティガツズマブ（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（ＩＬ−１３）、トシツモマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（４−１  ＢＢ）、ボロキシマブ（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（腫瘍抗原ＣＴＡＡ  １６．８８）、ザルツムマブ（ＥＧＦＲ）、およびザノリムマブ（ＣＤ４）が含まれる。
【０２１８】
一実施形態では、免疫療法剤は、ＰＤ−１軸結合アンタゴニストである。ＰＤ−１軸結合アンタゴニストには、ＰＤ−１結合アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストおよびＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。「ＰＤ−１」の別名には、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２が含まれる。「ＰＤ−Ｌ１」の別名には、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４、およびＢ７−Ｈが含まれる。「ＰＤ−Ｌ２」の別名には、Ｂ７−ＤＣ、Ｂｔｄｃ、およびＣＤ２７３が含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１がそのリガンド結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ−１リガンド結合パートナーは、ＰＤ−Ｌｌおよび／またはＰＤ−Ｌ２である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌｌ結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌｌがその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌｌ結合パートナーは、ＰＤ−１および／またはＢ７−１である。別の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２結合パートナーはＰＤ−１である。ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えばヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。抗ＰＤ−１抗体の例には、限定されることなく、ＭＤＸ−１１０６（ニボルマブ、ＯＰＤＩＶＯ）、Ｍｅｒｃｋ  ３４７５（ＭＫ−３４７５、ペンブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＧＢ−１０８、およびＢＧＢ−Ａ３１７が含まれる。
【０２１９】
一実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、定常領域に融合したＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外部分またはＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。一実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、国際公開第２０１０／０２７８２７号および国際公開第２０１１／０６６３４２号に記載されている融合可溶性受容体である、ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇとしても知られ、ＰＤ−Ｌ２−Ｆｃである）である。
【０２２０】
一実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、限定されることなく、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、ＭＤＸ−１１０５、およびＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０２２１】
一実施形態では、免疫療法剤は、ＰＤ−１結合アンタゴニストである。別の実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。例示的な実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はアテゾリズマブである。
【０２２２】
本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認を意図するものではない。これらの文書の内容に関するすべての記述は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さについての承認を構成しない。
【０２２３】
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。特定の機器、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な修正は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書で説明され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。
【実施例】
【０２２４】
（実施例１）
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞株において差次的に発現される遺伝子の選択
黒色腫細胞株Ｂ１６−Ｆ１０のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの配列を決定した（Ｃａｓｔｌｅ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２，１０８１−１０９１（２０１２））。遺伝子発現量を、疑似アラインメントソフトウェアｋａｌｌｉｓｔｏ（Ｂｒａｙ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３４，５２５−５２７（２０１６））を使用して推定し、１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）として報告した。次に、遺伝子発現値を、同じ方法で処理した、選択した正常組織の参照遺伝子発現データベースと比較した。参照データベースには、Ｍｏｕｓｅ  ＥＮＣＯＤＥプロジェクト（ｎ＝４８７）（Ｐｅｒｖｏｕｃｈｉｎｅ，Ｄ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．６，５９０３（２０１５））からの試料、Ｍｏｕｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ＢｏｄｙＭａｐ（ｎ＝７２）（Ｌｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（１）：４２００（２０１７））からの試料、Ｃｉｒｃａｄｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｔｌａｓからのマウス試料（ｎ＝９６）（Ｚｈａｎｇ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １１１（４５）：１６２１９−２４（２０１４））、および内部で配列決定したマウス組織からの試料（ｎ＝６７）が含まれた。試料を組織源および組織クラスに関して注釈付けた。組織クラスには、胚組織（「胚」と注釈付けされたすべての試料）、生殖組織（精嚢腺、子宮、卵巣、胎盤、および精巣）、ならびに正常組織（その他すべて）が含まれる。各固有の組織について、すべての試料の発現中央値を計算した。次に、Ｂ１６−Ｆ１０標的は、
ｃ＝１０＊Ｍ＋１
として計算したカットオフｃを超えた場合、事前に選択し、ここで、Ｍはすべての正常組織の中央値の９５パーセンタイルに等しい。最後に、潜在的な標的リストを、正常組織での発現値の合計と比較した、Ｂ１６−Ｆ１０で発現された遺伝子の倍率変化によって分類した。生殖器官および胚組織での発現は許容した（これらのいわゆる癌生殖細胞系抗原は、腫瘍、雄性生殖細胞、胎盤、または胚発生の初期段階にのみ存在する）。
【０２２５】
マウスＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞株で差次的に発現される上位遺伝子の中に、いくつかの周知の黒色腫分化抗原が見出された（図１）。例えば、本発明者のアルゴリズムによってランク付けした上位１０の遺伝子の中に、公知の免疫原性抗原であるチロシナーゼ関連タンパク質１（Ｔｙｒｐ１、１位、Ｗａｎｇ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３，１１３１−４０（１９９６））、溶質担体ファミリー４５、メンバー２（Ｓｌｃ４５ａ２、２位、Ｐａｒｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．５，６１８−６２９（２０１７））、チロシナーゼ（Ｔｙｒ、３位、Ｗｏｅｌｆｅｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４，７５９−６４（１９９４））、ドーパクロームトートメラーゼ（Ｄｃｔ、５位、Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４，２２０７−１６（１９９６））、ｍｌａｎ−Ａ（Ｍｌａｎａ、６位、Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，３４７−５２（１９９４））およびプレメラノソームタンパク質（Ｐｍｅｌ、９位、Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，３９６１−８（１９９５））が見出された。これは、関連する腫瘍抗原を濃縮する本発明者のアルゴリズムの効力を印象的に示す。上記の標的の中から、最初の概念実証試験のためにＴｙｒｐ１、Ｔｙｒ、Ｄｃｔ、ＰｍｅｌおよびＦｋｂｐ６を選択した。Ｔｙｒを除くすべての標的に対するワクチン接種は、強力なＴ細胞免疫応答を誘発した（実施例２〜５）。
【０２２６】
（実施例２）
Ｔｙｒｐ１  ＲＮＡワクチンの免疫原性試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝５）を、Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３４，３９６−４０１（２０１６）に記載されているように、０、７および１４日目にリポプレックスとして製剤化した４０μｇのＴｙｒｐ１抗原をコードするＲＮＡまたは４０μｇの無関係なＲＮＡで免疫した。最後のワクチン接種の５日後、マウスの脾細胞を単離し、５ｘ１０５個の細胞をＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって、ＭＨＣ  Ｉエピトープ（ＴＡＰＤＮＬＧＹＡ、２μｇ／ｍｌ）およびＭＨＣ  ＩＩエピトープ（ＣＲＰＧＷＲＧＡＡＣＮＱＫＩ、２μｇ／ｍｌ）をそれぞれコードする２つのＴｙｒｐ１ペプチドの認識について試験した。Ｔｙｒｐ１に対するワクチン接種は、強力なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答をもたらした（図２）。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用した一元配置分散分析とダネットの多重比較検定によって決定した。有意差なし：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２２７】
（実施例３）
Ｄｃｔ  ＲＮＡワクチンの免疫原性試験
実施例２と同様に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝５）に、図３に示すように２０μｇのＤｃｔをコードするＲＮＡリポプレックスまたはＮａＣｌを繰り返しワクチン接種した（点線）。最初のワクチン接種後５、１２、１９、２６および３３日目に、Ｄｃｔ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリによるＭＨＣテトラマー（ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）染色によって血液中で測定した（Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３４，３９６−４０１（２０１６）に記載されているように）。反復ワクチン接種は、３３日目までにすべての末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の４％を超える抗原特異的Ｔ細胞の持続的な増加をもたらした。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用した二元配置分散分析とシダックの多重比較検定によって決定した。有意差なし：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２２８】
（実施例４）
Ｐｍｅｌ  ＲＮＡワクチンの免疫原性試験
実施例２におけるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝８）に、図４に示すように２０μｇのＰｍｅｌをコードするＲＮＡリポプレックスを繰り返しワクチン接種した。最初のワクチン接種の２７日後、マウスの脾細胞をＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによってＰｍｅｌペプチド（ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ、２μｇ／ｍｌ）または無関係なペプチド（ＶＳＶ−ＮＰ、ＲＧＹＶＹＱＧＬ、２μｇ／ｍｌ）に対してプローブした。対応のある両側スチューデントＴ検定によって決定されるように、有意なＰｍｅｌ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が検出された。有意差なし：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２２９】
（実施例５）
Ｆｋｂｐ６  ＲＮＡワクチンの免疫原性試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝３）を、実施例２に記載されるように、０、７および１４日目にリポプレックスとして製剤化した２０μｇのＦｋｂｐ６抗原をコードするＲＮＡで免疫した。最後のワクチン接種の５日後、マウスの脾細胞を単離し、５ｘ１０５個の細胞をＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって、１０μｇのＦｋｂｐ６  ＲＮＡまたは無関係なＲＮＡ（対照）でエレクトロポレーションした同系骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の認識について試験した。ＢＭＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で骨髄由来細胞を培養することによって生成した（Ｌｕｔｚ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２３，７７−９２（１９９９））。Ｆｋｂｐ６に対するワクチン接種は強力なＴ細胞応答をもたらした（図５）。
【０２３０】
（実施例６）
治療的Ｔｙｒｐ１ワクチン接種後の腫瘍制御
選択したワクチン標的が治療的に意味があるかどうかを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝１１〜１２）に３ｘ１０５個のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）接種した。腫瘍細胞注射の４日後、図６に示すように、Ｔｙｒｐ１または無関係な対照（抗原を含まない骨格）ＲＮＡ（４０μｇ）によるＲＮＡリポプレックスワクチン接種を開始した。実験開始から２６日後にマウスの肺を切除し、腫瘍結節を計数した。すべての対照ＲＮＡ処置マウスは数えきれないほどの腫瘍結節を示し（マウスあたり最低５００結節を超える）、大多数のマウスは、疾病のために２６日目までに犠死させなければならなかった。著しく対照的に、Ｔｙｒｐ１ワクチン接種マウスは２６日目まで生存し、大多数のマウスは肉眼で見える腫瘍の徴候を示さなかった。有意性は、対応のない両側マン−ホイットニー検定（腫瘍結節の比較）とログランク検定（生存率）を使用して決定した。有意差なし：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２３１】
（実施例７）
治療的Ｔｙｒｐ１またはＤｃｔワクチン接種後の腫瘍制御
腫瘍増殖動態の定義を可能にする同様の実験設定を使用して、Ｔｙｒｐ１ワクチン接種の治療可能性を確認し、さらに腫瘍増殖に対するＤｃｔ  ＲＮＡ処置の効果を試験した。３ｘ１０５個のルシフェラーゼトランスジェニックＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞（Ｂ１６−Ｆ１０−ＬＵＣ）をナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝１２）に静脈内注射し、図７に示すように４０μｇのＲＮＡリポプレックスをワクチン接種した。ルシフェラーゼ生物発光によって決定される腫瘍増殖を、４、７、１２、１７、１９および２５日目にＩＶＩＳ生物発光イメージングシステムによって測定した（Ｋｒａｎｚ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５３４，３９６−４０１（２０１６）に記載されているように）。腫瘍量の減少を示す、未処置群または無関係なＲＮＡ処置群と比較して有意に低い生物発光シグナルが、Ｔｙｒｐ１およびＤｃｔワクチン接種によって達成された。これは、腫瘍接種の２５日後の腫瘍結節数または肺重量を比較する独立した読み出しによって確認された。有意性は、二元配置分散分析とダネットの多重比較検定（経時的なルシフェラーゼ生物発光の比較）またはクラスカル−ウォリス検定とそれに続くダネット検定（腫瘍結節または肺重量の比較）を使用して決定した。有意差なし：Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２３２】
（実施例８）
腫瘍モデルＣＴ２６、ＭＣ３８、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２および４Ｔ１における複数のこれまでに記述されていない差次的に発現される遺伝子の同定
実施例１〜７は、ＲＮＡ配列決定に基づく遺伝子発現を健常組織の遺伝子発現データベースと比較することによって、個々の腫瘍において差次的に発現される遺伝子を同定することが可能であることを実証した。上位のＢ１６−Ｆ１０遺伝子の中で、いくつかの公知の腫瘍抗原が見出された。本発明者は、試験した５つの候補のうち４つに対するＲＮＡリポプレックスワクチン接種が強力なＴ細胞応答をもたらすことを示した。これらの候補のうちの２つについては、治療的ワクチン接種が強力な抗腫瘍免疫応答をもたらし、完全な腫瘍拒絶につながることを示した。
【０２３３】
その後、腫瘍モデルを拡大して、他の腫瘍型でも差次的に発現される遺伝子を同定することが実行可能であるかどうかを試験した。したがって、マウス結腸腫瘍細胞株ＣＴ２６およびＭＣ３８、前立腺癌細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃ２、および乳癌細胞株４Ｔ１を配列を決定し（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，６９２−６９６（２０１５）に記載されている配列決定法）、細胞株のＲＮＡ遺伝子発現を本発明者の健常組織データベースと比較した。複数の差次的に発現される遺伝子が各細胞株で同定され、その選択を図８に示す。選択した候補の免疫原性試験を実施例９に記載する。
【０２３４】
（実施例９）
ＣＴ２６、ＭＣ３８およびＴＲＡＭＰ−Ｃ２における選択した標的の免疫原性試験
ＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝３、ＣＴ２６）またはＣ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝３、ＭＣ３８およびＴＲＡＰＭ−Ｃ２）を、実施例２に記載されるように、０、７および１４日目にリポプレックスとして製剤化した２０μｇの抗原をコードするＲＮＡで免疫した。ほとんどの群について、マウスごとに２つの抗原を注射した。最後のワクチン接種の５日後、マウスの脾細胞を単離し、５ｘ１０５個の細胞をＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって、１０μｇの抗原ＲＮＡまたは無関係なＲＮＡ（対照）でエレクトロポレーションした同系骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の認識について試験した。ＢＭＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で骨髄由来細胞を培養することによって生成した（Ｌｕｔｚ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２３，７７−９２（１９９９））。ＣＴ２６由来の標的Ｒｈｏｘ５およびＮｄｓｔ４（図９）、ＭＣ３８由来の標的ＧＭ１４８１９、Ｒｈｏｘ２ｈ、Ｇｍ１５０９１、Ｇｍ１５０９７、Ｄｐｐａ４、ＧＭ７７３、Ｐｒｌ２ｃ２、Ｆｍｒ１ｎｂおよびＬｕｚｐ４（図１０）、ならびにＴＲＡＰＭ−Ｃ２由来の標的Ａｍｏｔｌ２（図１１）に対する免疫応答を同定した。
【０２３５】
（実施例１０）
ヒトにおける個別化癌免疫療法のための差次的に発現される遺伝子の選択
個々の患者の潜在的な標的を決定するために、腫瘍のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを配列決定し、遺伝子発現量を推定する。次に、遺伝子発現値を、同じ方法で処理した、選択した正常組織の参照遺伝子発現データベースと比較する。参照データベースには、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）データベースの正常試料、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ（ＨＰＡ）、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の正常組織、Ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅデータベース、および他のコホートからのＲＮＡ−Ｓｅｑデータが含まれ得る。高度に発現される抗原の選択は、実施例１に従って実施する。選択後、ワクチン接種療法の最終選択の前に、潜在的な標的を検証する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ１】
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【図８Ａ２】
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【図８Ｂ１】
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【図８Ｂ２】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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