(57)【要約】  本発明は、ＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性がある腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体活性化抗体融合タンパク質、及びそれに関連する組成物及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）  抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分、及び
ｉｉ）  細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメイン、
を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
構造が、ＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞の細胞表面の構造、又はＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞表面の構造である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
構造が、ＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞の細胞外マトリクスの構造、又はＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞外マトリクスの構造である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
構造が、細胞表面のタンパク質又は糖、好ましくは細胞表面タンパク質である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
構造が、細胞外マトリクスのタンパク質又は糖、好ましくは細胞外マトリクスタンパク質である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、モノクローナルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、全長抗体、Ｆａｂ２断片、Ｆａｂ断片、又はＶＨ及びＶＬがＴＮＦＲＳＦ受容体特異的ｓｃＦｖ断片で置換された抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、Ｆｃドメインを含まない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、１又はそれ以上のＦｃγＲ型、好ましくはＮ２９７Ａ変異を含む、全長抗体への結合能が低下した抗体変異体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、二価抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、抗ＴＮＦＲ２抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ４０抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ９５抗体若しくはその抗原結合部分、抗Ｆｎ１４抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＴＲＡＩＬＲ１抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合部分、抗４−１ＢＢ抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＢａｆｆＲ抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＴＡＣＩ抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗ＢＣＭＡ抗体又はその抗原結合部分からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、抗ＴＮＦＲ２抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ４０抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ９５抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗Ｆｎ１４抗体若しくはその抗原結合部分からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、前記ｓｃＴＮＦＳＦリガンドが、好ましくはＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ、ＣＤ４０、Ｆｎ１４又はＯＸ４０のリガンドである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ｉｉ）のドメインが、抗体の抗原結合部分を含み、前記抗原結合部分が、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、１又はそれ以上のＦｃγＲ型、好ましくはＦａｂ２断片、ｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片、より好ましくはｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片への結合能が低下した抗原結合部分である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、Ｆａｂ断片である、請求項１５又は１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、ｓｃＦｖ断片である、請求項１５又は１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
細胞表面の構造及び／若しくは細胞外マトリクスの構造又はその抗原結合部分に結合しうる抗原結合部分が、抗ＣＤ２０抗原結合部分、抗ＣＤ７０抗原結合部分、抗ＣＤ１９抗原結合部分、抗ＥＧＦＲ抗原結合部分、抗Ｈｅｒ２抗原結合部分、抗Ｆｎ１４抗原結合部分、抗ＣＤ４０Ｌ抗原結合部分、又は抗ＰＤ１Ｌ抗原結合部分からなる群より選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
ｉｉ）のドメインが、Ｆｃドメインを含まない、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
ｉｉ）のドメインが、抗体又はその抗原結合断片を含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ｉｉ）のドメインの細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造への結合が抗原非依存性である、請求項１〜１４又は２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
ｉｉ）のドメインが、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分を含まない、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
ｉｉ）のドメインが、インターフェロンドメイン又はインターロイキンドメインを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
ｉｉ）のドメインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＩＦＮβ又はＩＦＮγを含み、好ましくは、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうる、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＩＦＮβ又はＩＦＮγの変異体からなり、かつ、ここで、前記ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＩＦＮβ又はＩＦＮγは、好ましくは、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−４、ヒトＩＬ−１０、ヒトＩＦＮα、ヒトＩＦＮβ又はヒトＩＦＮγである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
融合タンパク質は、ｉ）の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分を含むが、ｉｉ）のドメインは含まないタンパク質と比較して、ＴＮＦＲＳＦ受容体の刺激を高めるうる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうる、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分の融合タンパク質。
【請求項２８】
構造に結合すると、ＴＮＦＲＳＦ受容体の刺激を高めうる、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ受容体である、ＴＮＦＲ２、ＣＤ４０、ＣＤ９５、Ｆｎ１４、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに結合しうる、請求項２７又は２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
融合タンパク質が、細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるｓｃＦｖドメイン、又は細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるｓｃＴＮＦＳＦリガンド若しくは他のタンパク質ドメインとの融合である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、Ｆａｂ２又はＦａｂ断片である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
前記融合タンパク質が、配列番号１９及び２３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２１及び２３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２２及び２３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２４及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２５及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２６及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２８及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２９及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号３０及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号３２及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号３４及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号３５及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１１８及び２３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１１９及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１２０及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１２１及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１２２及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１２３及び１２４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、及び配列番号１２５及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、から選択される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号３７のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３８のＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＣＤＲ３アミノ酸配列ＬＤＹを含む重鎖を含み、並びに、配列番号３９のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４０のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号４１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４２のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４３のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号４４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号４５のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４６のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号４７のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＣＤ９５抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４９のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５０のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号５１のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＤＲ５抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号５４のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５５のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５６のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号５７のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５８のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Ｆｎ１４抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号８４のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８５のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８６のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号８７のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８８のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Ｆｎ１４抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号６０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６１のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号６３のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６４のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１２６のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１２７のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１２８のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号１２９のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３０のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗４−１ＢＢ抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＨＢＢＫ４又はその４−１ＢＢ結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＣＤ４０への結合について、請求項３３に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＣＤ９５への結合について、請求項３４に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＤＲ５への結合について、請求項３５に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、Ｆｎ１４への結合について、請求項３６に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、Ｆｎ１４への結合について、請求項３７に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＴＮＦＲ２への結合について、請求項３８に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、４−１ＢＢへの結合について、請求項３９に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、４−１ＢＢへの結合について、請求項４０に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号６６のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６７のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６８のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号６９のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７０のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号７１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号７２のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７３のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号７４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号７５のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７６のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号７７のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＣＤ１９抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号７８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８０のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号８１のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号９０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９１のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号９３のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９４のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、ａ）ＣＤ２０への結合について、請求項４９に記載の抗ＣＤ２０抗体と交差競合しうる、抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合部分、又はｂ）ＣＤ１９への結合について、請求項５０に記載の抗ＣＤ１９抗体と交差競合しうる、抗ＣＤ１９抗体又はその抗原結合部分、又はｃ）ＣＤ７０への結合について、請求項５１に記載の抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分と交差競合しうる、抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分、又はｄ）ＣＤ７０への結合について、請求項５２に記載の抗−ＣＤ７０抗体と交差競合しうる、抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分である、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号９６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ断片、又は配列番号９６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ断片である、請求項１〜２６及び３３〜５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号９８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ断片、又は配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ断片である、請求項１〜２６及び３３〜５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５６】
ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ断片、又は配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ断片である、請求項１〜２６及び３３〜５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５７】
ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ断片、又は配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ断片である、請求項１〜２６及び３３〜５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、ここで、前記ｓｃＴＮＦＳＦリガンドは、ＴＮＦＲ２のリガンドであり、前記リガンドは、アミノ酸配列が、配列番号１０２のアミノ酸配列又は配列番号１０２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるｓｃＴＮＦ８０である、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、かつｓｃＴＮＦＳＦリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号１０３のアミノ酸配列又は配列番号１０３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるｓｃＢａｆｆである、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、前記ｓｃＴＮＦＳＦリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号１０４のアミノ酸配列又は配列番号１０４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるｓｃＧＩＴＲＬである、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６１】
ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、かつｓｃＴＮＦＳＦリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号１０５のアミノ酸配列又は配列番号１０５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるｓｃ４１ＢＢＬである、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６２】
ｉｉ）のドメインが、ＴＮＦＳＦリガンドを含み、前記ＴＮＦＳＦリガンドが、アミノ酸配列が、配列番号１０６のアミノ酸配列又は配列番号１０６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるＧＩＴＲＬである、請求項１〜２６及び３３〜４８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６３】
細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、免疫細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６４】
細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、線維芽細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６５】
細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、腫瘍細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６６】
請求項１〜６５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項６７】
請求項１〜６５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸又は核酸のセット。
【請求項６８】
少なくとも１のタイプの宿主細胞において、請求項６７に記載の核酸又は核酸セットを発現させて、前記融合タンパク質を回収することを含む、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦｃγＲ非依存性アゴニスト活性がある腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体活性化抗体融合タンパク質（略称ＴＲＡＡＦＦＩＡＡ）、及びそれに関連する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーの受容体とその活性化
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）の受容体の大部分は、細胞外ドメインに１〜６の構造的に保存されたシステインリッチドメイン（ＣＲＤｓ）がある１型又は３型の膜貫通タンパク質である。さらに、少数の分泌型又はＧＰＩアンカー型受容体分子が存在し、それらにはＣＲＤがある事実からＴＮＦＲＳＦの一部と考えられる。上記以外、ＴＮＦＲＳＦのすべての受容体に共通する構造的性質はない。構造的及び機能的な類似性によれば、ＴＮＦＲＳＦ内で、以下の３つのサブグループが定義されうる（図１）。
【０００３】
１．細胞死受容体のサブグループのＴＮＦＲＳＦ受容体は、その細胞内ドメインの構造的に保存されたタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、その名前の由来でもある「細胞死ドメイン」（ＤＤ）により定義される。当該受容体のすべてではなく、しかしいくつかは、アポトーシス又は壊死を誘導しうるが、他の効果／シグナル伝達経路をも誘発しうる。例としては、ＣＤ９５（Ｆａｓ又はＡｐｏ１ともいう）、ＴＲＡＩＬＲ１（ＤＲ４）及びＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５）があげられる。
【０００４】
２．ＴＲＡＦ相互作用サブグループのＴＮＦＲＳＦ受容体には、ＤＤはないものの、短いアミノ酸配列モチーフがあり、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）ファミリーのアダプタータンパク質を動員する。当該ＴＮＦＲＳＦサブグループの受容体は、当該ＴＲＡＦタンパク質により、様々なシグナル伝達経路を活性化しうる。例としては、ＴＮＦＲ２、ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、Ｆｎ１４及びＢａｆｆＲがあげられる。
【０００５】
３．デコイＴＮＦＲＳＦ受容体は、細胞内ドメインがなく、各細胞膜の外表面上のＧＰＩ部分により、分泌され、固定される。当該ＴＮＦＲＳＦ受容体は、それ自体はシグナルを伝達しないが、サブグループ１及び２のいくつかの受容体の活性を制御する。
【０００６】
通常、ＴＮＦＲＳＦのシグナル伝達能がある受容体は、ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）のリガンドとの相互作用により自然に活性化される。ＴＮＦＳＦへのリガンドの配分は、Ｃ末端保存ドメイン、ＴＮＦ相同性ドメイン（ＴＨＤ）の存在に支配される。ＴＮＦＳＦのリガンドはＴＨＤを介してホモ三量体分子を形成するが、ヘテロ三量体分子を形成する場合もある。分泌されたＬＴαホモ三量体は別として、ＴＮＦファミリーのすべてのリガンドは、最初はＩＩ型膜タンパク質として発現される。したがって、ＴＨＤは細胞外に局在する。しかし、これらの場合、ＴＨＤとＴＮＦＳＦリガンドの膜貫通ドメインとの間のタンパク質分解プロセシングにより、可溶性の三量体リガンド分子も形成される（図１）。単一のＴＮＦＲＳＦ受容体分子は、リガンド三量体の隣接プロトマー間で形成される接触表面領域に動員される。したがって、ＴＮＦＳＦリガンド分子はＴＮＦＲＳＦの３つの受容体に結合し、これは可溶性のＴＮＦＳＦリガンド分子と膜結合型のＴＮＦＳＦリガンド分子の両方に当てはまる。知られている限りでは、膜結合型ＴＮＦＳＦリガンドの結合は常に強力な受容体活性化をもたらす。しかし、可溶性ＴＮＦＳＦリガンドの結合後の細胞内シグナル伝達経路の安定かつ効率的な活性化の程度は、特異的ＴＮＦＲＳＦ受容体に依存する。したがって、ＴＮＦＲＳＦ受容体（例えば、ＴＮＦＲ１、ＧＩＴＲ、ＬＴｂＲ又はＤＲ３）は、可溶性リガンド三量体の結合により強く活性化されるが、一方、ＴＮＦＲＳＦ受容体（例えば、ＴＮＦＲ２、Ｆｎ１４、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＣＤ９５、ＯＸ４０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ及びＣＤ４０）は、可溶性リガンド三量体により刺激されないか、又は刺激されたとしても極めてわずかである。その場合、可溶性ＴＮＦリガンドは膜結合型の競合的阻害剤として作用しさえしうる。当該第２グループのＴＮＦＲＳＦ受容体の膜結合型リガンドによる刺激が、なぜ可溶性リガンド分子による刺激よりもはるかに優れているのかという課題は、まだ完全には解明されていない。しかしながら、現在では、三量体リガンド−受容体複合体は、ほとんどのシグナル伝達経路の刺激に十分ではないと考えられており、当該複合体のうちの少なくとも２つがシグナル伝達を効率的に開始するには、二次的に相互作用しなければならない。このため、ＴＮＦＲＳＦのいくつかの受容体は、微弱ながらもリガンド非依存的な自己親和性があることが示された。膜結合型リガンド三量体の膜局在化により、空間的な予備配向がおこり、可溶性リガンドと比較すると拡散は低下し、及びＴＮＦＲＳＦ受容体とＴＮＦＳＦリガンド発現細胞との間の接触領域における相互作用パートナーの濃度は局所的に非常に高くなる。したがって、三量体リガンド−受容体複合体を最初に形成する自然発生的な二次凝集は、おそらく膜結合型リガンドの結合のすべての場合に起こりうる。しかし、可溶性リガンド三量体の結合の場合、おそらく第２グループのＴＮＦＲＳＦ受容体の自己親和性は微弱すぎて、この二次凝集は確実ではない。当該モデルによれば、２つ以上の三量体リガンドドメインを含む可溶性融合タンパク質及びＴＮＦＳＦリガンド複合体は各々、第２グループのＴＮＦＲＳ���受容体を、膜結合型リガンドと同様に活性化しうる。さらに、細胞又は他の表面上へ三量体可溶性ＴＮＦＳＦリガンドの単なる固定により、第２グループのＴＮＦＲＳＦ受容体が十分に活性化されることも示された（総説では、非特許文献１参照）。
【０００７】
ＴＮＦＲＳＦの受容体を活性化する第２の可能性は、抗体の使用である。これは、様々な臨床概念、特に腫瘍疾患の治療との関連で、ＴＮＦＲＳＦの細胞死誘導性又は免疫刺激性受容体の活性化を目的とすることを考慮すると、非常に重要である。従って、特に、ＴＮＦＲＳＦ受容体ＴＲＡＩＬＲ２、ＣＤ４０、Ｆｎ１４、ＣＤ２７、ＯＸ４０及び４−１ＢＢを標的とする抗体が、臨床試験で試験されているか、又は試験されてきた。これに関連して、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体特異的抗体が受容体を刺激させて作用するのは、いつ、どのような状況下であるかという問題は、長い間顧みられなかった。通常、これは主として抗体により具体的に認識されるエピトープの問題であると仮定された。特に、これまで長い間、この点に関して、可溶性ＴＮＦＳＦリガンドと同様に、主として分子が提示される原子価及び方法が、受容体活性化の発生、すなわち、抗体のアゴニストとしての作用性を決定することを示す。従って、可溶性リガンドでは十分には刺激されないＴＮＦＲＳＦ受容体を認識する様々な二価ＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体に関して、それらが二次的に第２抗体又はタンパク質Ｇにより架橋される場合、又は当該抗体が細胞結合Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に同時に結合できる場合にのみ、それらがアゴニストとして効果的に作用することが見出された（総説について、非特許文献２、特に、図２及び３を参照のこと）。
【０００８】
このことは、とりわけ、リガンド結合を遮断するアンタゴニスト抗体が、ＦｃγＲへの結合に際して、強力なアゴニストとして作用する、すなわち、認識されたエピトープではなく、むしろ抗体がその抗原に結合する形態が、抗体の効果に主としてかかわるという一見矛盾した状況につながる（全ての目的のために参照により本明細書に援用される非特許文献３を参照のこと）。さらに、本発明者らは、可溶性リガンドにより既に効率的に活性化されているＴＮＦＲＳＦ受容体を認識するＩｇＧ抗体が、一般に、さらなる架橋又はＦｃγＲ結合を伴わず、アゴニスト的に作用することを見出した（図２、αＴＮＦ１及びαＬＴβＲに関する例を含むパネルを参照のこと）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wajant  et  al.,  Cancer  Lett.  2013  May  28;332(2):163-74
【非特許文献２】Wajant  2015,  Cell  Death  Differ.  2015  Nov;22(11):1727-41
【非特許文献３】Trebing  et  al.,  MAbs.  2014  Jan-Feb;6(1):297-308
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
可溶性ＴＮＦリガンド及び抗体によっては、各々刺激されないＴＮＦＲＳＦ受容体を認識する二価ＩｇＧ抗体のアゴニスト活性に対する条件により、臨床的アプローチでそれらを用いるのが困難になるか、又は使用できない場合さえある。当該抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体のＦｃγＲ結合により、ＴＮＦＲＳＦ受容体が活性化され、かつＦｃγ受容体も刺激するため、望ましくない作用が生じる可能性があり、それにより臨床適用が困難になるか、又は適用できない場合さえある。活性化ＦｃγＲへ結合した場合、例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ又は食作用を介して、ＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞が除去／破壊されうる。これを防ぐため、阻害するＦｃγＲ、ＣＤ３２Ｂと、より強く作用する、又は好ましくは相互作用するＩｇＧ突然変異体を用いうる。しかし、ＣＤ３２Ｂの免疫抑制活性も同様に問題がある。より詳細には、標的ＴＮＦＲＳＦ受容体を発現する標的細胞の近傍に、十分数のＣＤ３２Ｂ発現細胞が常に見出されうるとは限らない。自己凝集しやすいＩｇＭ抗体及びＩｇＧ３抗体は、結合活性（二次的にオリゴマー化された可溶性リガンド三量体に類似）が高く、ＦｃγＲ結合の非存在下でアゴニスト的に作用しうるが、当該抗体の開発は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体よりも困難であり、確立もされてない。
【００１１】
したがって、ＴＮＦＲＳＦの受容体を標的とする改良剤が必要である。特に、ＴＮＦＲＳＦの受容体を効果的に、より高い精度で標的化し、既存のＴＮＦＲＳＦ標的化剤よりも望ましくない副作用がおこる可能性が低い薬剤を得ることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記課題を解決し、本技術分野における上記要望に応える。
【００１３】
本発明の抗−ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体融合タンパク質は、抗体部分の抗原結合ドメイン及びおそらく存在する天然又は変異Ｆｃドメインとは独立して、細胞結合構造又は細胞外マトリクスの構造に結合する。驚くべきことに、本発明者らは、当該融合タンパク質について、これらの融合タンパク質に含まれる抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体（又はその抗原結合部分）が、標的化された細胞構造又は細胞外マトリクスと相互作用した後、強力なアゴニストとして、すなわち、ＦｃγＲ結合とは独立したＴＮＦＲＳＦ受容体刺激的に作用することを見出した（例えば、非限定的な例として図４〜１２を参照されたい）。
【００１４】
これは、以下のいくつかの理由から有利であり、例えば、ＦｃγＲ非依存的な刺激は、ＦｃγＲが発現される状況に限定されず、有利である。さらに、ＦｃγＲの刺激に起因する副作用を回避しうる点でも有利である。当該副作用としては、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ又は食作用を介するＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞の除去／破壊、及びＦｃγＲ  ＣＤ３２Ｂの免疫阻害活性があげられる。
【００１５】
従って、一態様では、本発明は、ＦｃγＲに結合せず、効率的にＴＮＦＲＳＦの受容体を刺激しうる、抗体融合タンパク質の形態を開示する。抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体に融合されるドメインの適当な選択に際して、本発明によるＦｃγＲ非依存的なアゴニスト活性（ＴＲＡＡＦＦＩＡＡ）がある腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体活性化抗体融合タンパク質には、また、二機能的及び／又はプロドラッグ様特性がありうる。本明細書の記載のように、「二機能的」とは、構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメインにより結合される場合、細胞表面又は細胞外マトリクス（例えば、細胞表面又は細胞外マトリクスのタンパク質）の構造が阻害又は刺激される状態をいう。このような場合、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡは、ＴＮＦＲＳＦ受容体シグナル伝達を活性化するだけでなく、標的分子構造の活性を調節するため、二機能的である。本明細書の記載のように、プロドラッグは、腫瘍関連因子（例えば、酵素、低酸素症）により活性化される。例えば、腫瘍抗原を標的とするＴＲＡＡＦＦｉＡＡは、腫瘍においてのみアゴニスト活性を獲得するため、プロドラッグのように作用する。
【００１６】
本発明者らの研究から、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡに用いられる適当に選択された固定化ドメインを用いて、標的構造に限定される局所アゴニスト効果がｉｎ  ｖｉｖｏで達成されうることは直ちに明らかである。これにより、治療が限定される全身性の副作用を回避しうる。すなわち、ＴＲＡＡＦＩＡＡは、抗体でＴＮＦＲＳＦ受容体を有利にＦｃγＲ非依存的に刺激し、臨床応用を含む新たな応用分野が展開される。
【００１７】
そこで、本発明は、以下の好ましい実施形態を含む。
１．  ｉ）  抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分、及び
ｉｉ）  細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメイン、を含む、融合タンパク質。
２．構造が、ＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞の細胞表面の構造、又はＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞表面の構造である、１に記載の融合タンパク質。
３．構造が、ＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞の細胞外マトリクスの構造、又はＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞に隣接する細胞の細胞外マトリクスの構造である、１に記載の融合タンパク質。
４．構造が、細胞表面のタンパク質又は糖、好ましくは細胞表面タンパク質である、２に記載の融合タンパク質。
５．構造が、細胞外マトリクスのタンパク質又は糖、好ましくは細胞外マトリクスタンパク質である、３に記載の融合タンパク質。
６．ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、モノクローナルである、１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
７．ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、全長抗体、Ｆａｂ２断片、Ｆａｂ断片、又はＶＨ及びＶＬがＴＮＦＲＳＦ受容体特異的ｓｃＦｖ断片で置換された抗体である、１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
８．ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、Ｆｃドメインを含まない、１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
９．ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、１又はそれ以上のＦｃγＲ型、好ましくはＮ２９７Ａ変異を含む、全長抗体への結合能が低下した抗体変異体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
１０．ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４抗体又はその抗原結合部分である、１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
１１．ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、二価抗体又はその抗原結合部分である、１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
１２．ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、抗ＴＮＦＲ２抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ４０抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ９５抗体若しくはその抗原結合部分、抗Ｆｎ１４抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＴＲＡＩＬＲ１抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ２７抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＯＸ４０抗体若しくはその抗原結合部分、抗４−１ＢＢ抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＢａｆｆＲ抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＴＡＣＩ抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗ＢＣＭＡ抗体又はその抗原結合部分からなる群より選択される、１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
１３．ｉ）の抗体又はその抗原結合部分が、抗ＴＮＦＲ２抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ４０抗体若しくはその抗原結合部分、抗ＣＤ９５抗体若しくはその抗原結合部分、又は抗Ｆｎ１４抗体若しくはその抗原結合部分からなる群より選択される、１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
１４．ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、前記ｓｃＴＮＦＳＦリガンドが、好ましくはＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ、ＣＤ４０、Ｆｎ１４又はＯＸ４０のリガンドである、１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
１５．ｉｉ）のドメインが、抗体又は抗体の抗原結合部分を含み、前記抗体又は抗原結合部分が、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
１６．細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗体又は抗原結合部分が、ＰＤ−Ｌ１に結合しうるチェックポイント阻害抗体又はその抗原結合部分、好ましくはアベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）又はそのＰＤ−Ｌ１結合部分である、１５に記載の融合タンパク質。
１７．細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗体又は抗原結合部分が、抗ＣＤ２７抗体又はその抗原結合部分である、１５に記載の融合タンパク質。
１８．細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、１又はそれ以上のＦｃγＲ型、好ましくはＦａｂ２断片、ｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片、より好ましくはｓｃＦｖ断片又はＦａｂ断片への結合能が低下した抗原結合部分である、１５〜１７に記載の融合タンパク質。
１９．細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、Ｆａｂ断片である、１５〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２０．細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分が、ｓｃＦｖ断片である、１５〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２１．細胞表面の構造及び／若しくは細胞外マトリクスの構造又はその抗原結合部分に結合しうる抗原結合部分が、抗ＣＤ２０抗原結合部分、抗ＣＤ７０抗原結合部分、抗ＣＤ１９抗原結合部分、抗ＥＧＦＲ抗原結合部分、抗Ｈｅｒ２抗原結合部分、抗Ｆｎ１４抗原結合部分、抗ＣＤ４０Ｌ抗原結合部分、又は抗ＰＤ１Ｌ抗原結合部分からなる群より選択される、１５〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２２．ｉｉ）のドメインが、Ｆｃドメインを含まない、１〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２３．ｉｉ）のドメインが、抗体又はその抗原結合断片を含まない、１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２４．ｉｉ）のドメインの細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造への結合が抗原非依存性である、１〜１４又は２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２５．ｉｉ）のドメインが、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分を含まない、１〜１６、及び１８〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２６．ｉｉ）のドメインが、インターフェロンドメイン又はインターロイキンドメインを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２７．ｉｉ）のドメインが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＩＦＮβ又はＩＦＮγを含み、好ましくは、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうる、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＩＦＮβ又はＩＦＮγの変異体からなり、かつ、ここで、前記ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＩＦＮβ又はＩＦＮγは、好ましくは、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−４、ヒトＩＬ−１０、ヒトＩＦＮα、ヒトＩＦＮβ又はヒトＩＦＮγである、１〜２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２８．融合タンパク質は、ｉ）の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分を含むが、ｉｉ）のドメインは含まないタンパク質と比較して、ＴＮＦＲＳＦ受容体の刺激を高めるうる、１〜２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
２９．細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうる、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分の融合タンパク質。
３０．構造に結合すると、ＴＮＦＲＳＦ受容体の刺激を高めうる、２９に記載の融合タンパク質。
３１．融合タンパク質は、ＴＮＦＲＳＦ受容体である、ＴＮＦＲ２、ＣＤ４０、ＣＤ９５、Ｆｎ１４、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＣＤ２７、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡに結合しうる、２９又は３０に記載の融合タンパク質。
３２．融合タンパク質が、細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるｓｃＦｖドメイン、又は細胞表面の構造若しくは細胞外マトリクスの構造に結合しうるｓｃＴＮＦＳＦリガンド若しくは他のタンパク質ドメインとの融合である、２９〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
３３．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、Ｆａｂ２又はＦａｂ断片である、２９〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
３４．前記融合タンパク質が、配列番号１９及び２３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２１及び２３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２２及び２３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２４及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２５及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２６及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２８及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号２９及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号３０及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号３２及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号３４及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号３５及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１１８及び２３のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１１９及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１２０及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１２１及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１２２及び３１のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、配列番号１２３及び１２４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、及び配列番号１２５及び３６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、から選択される、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
３５．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号３７のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号３８のＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＣＤＲ３アミノ酸配列ＬＤＹを含む重鎖を含み、並びに、配列番号３９のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４０のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号４１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
３６．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４２のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４３のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号４４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号４５のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４６のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号４７のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＣＤ９５抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
３７．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号４８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４９のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５０のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号５１のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＤＲ５抗体又はその抗原結合部分である、１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
３８．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号５４のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５５のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５６のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号５７のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５８のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号５９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Ｆｎ１４抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
３９．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号８４のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８５のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８６のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号８７のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８８のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗Ｆｎ１４抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４０．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号６０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６１のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号６３のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６４のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＴＮＦＲ２抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４１．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１２６のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１２７のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１２８のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号１２９のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３０のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗４−１ＢＢ抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４２．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＨＢＢＫ４又はその４−１ＢＢ結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４３．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１３２のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３３のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号１３５のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３６のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１３７のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗４−１ＢＢ抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４４．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ウレルマブ（ｕｒｅｌｕｍａｂ）又はその４−１ＢＢ結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４５．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、配列番号１３８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１３９のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１４０のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号１４１のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号１４３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗４−１ＢＢ抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４６．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ウトミルマブ（ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）又はその４−１ＢＢ結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４７．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＣＤ４０への結合について、３５に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４８．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＣＤ９５への結合について、３６に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
４９．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＤＲ５への結合について、３７に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５０．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、Ｆｎ１４への結合について、３８に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５１．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、Ｆｎ１４への結合について、３９に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５２．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、ＴＮＦＲ２への結合について、４０に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５３．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、４−１ＢＢへの結合について、４１に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５４．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、４−１ＢＢへの結合について、４２に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５５．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、４−１ＢＢへの結合について、４３に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５６．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、４−１ＢＢへの結合について、４４に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５７．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、４−１ＢＢへの結合について、４５に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５８．抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分が、４−１ＢＢへの結合について、４６に記載の抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体と交差競合しうる、抗体又はその抗原結合部分である、１〜３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
５９．ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号６６のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６７のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号６８のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号６９のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７０のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号７１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合部分である、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６０．ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号７２のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７３のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号７４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖を含み、並びに、配列番号７５のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７６のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号７７のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖を含む、抗ＣＤ１９抗体又はその抗原結合部分である、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６１．ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号７８のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７９のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８０のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号８１のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８２のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号８３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分である、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６２．ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号９０のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９１のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号９３のＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９４のＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列番号９５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分である、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６３．ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、ａ）ＣＤ２０への結合について、５９に記載の抗ＣＤ２０抗体と交差競合しうる、抗ＣＤ２０抗体又はその抗原結合部分、又はｂ）ＣＤ１９への結合について、６０に記載の抗ＣＤ１９抗体と交差競合しうる、抗ＣＤ１９抗体又はその抗原結合部分、又はｃ）ＣＤ７０への結合について、６１に記載の抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分と交差競合しうる、抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分、又はｄ）ＣＤ７０への結合について６２に記載の抗−ＣＤ７０抗体と交差競合しうる、抗ＣＤ７０抗体又はその抗原結合部分である、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６４．ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号９６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ断片、又は配列番号９６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖ断片である、１〜２８及び３５〜６３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６５．ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号９８のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ断片、又は配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ断片である、１〜２８及び３５〜６３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６６．ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１４４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ断片、又は配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ断片である、１〜２８及び３５〜６３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６７．ｉｉ）のドメインが、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる、抗体又はその抗原結合部分を含み、ここで、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１４５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ断片、又は配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ断片である、１〜２８及び３５〜６３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６８．ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、ここで、前記ｓｃＴＮＦＳＦリガンドは、ＴＮＦＲ２のリガンドであり、前記リガンドは、アミノ酸配列が、配列番号１０２のアミノ酸配列又は配列番号１０２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるｓｃＴＮＦ８０である、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
６９．ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、かつｓｃＴＮＦＳＦリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号１０３のアミノ酸配列又は配列番号１０３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるｓｃＢａｆｆである、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
７０．ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、前記ｓｃＴＮＦＳＦリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号１０４のアミノ酸配列又は配列番号１０４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるｓｃＧＩＴＲＬである、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
７１．ｉｉ）のドメインが、ｓｃＴＮＦＳＦリガンドを含み、かつｓｃＴＮＦＳＦリガンドは、アミノ酸配列が、配列番号１０５のアミノ酸配列又は配列番号１０５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるｓｃ４１ＢＢＬである、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
７２．ｉｉ）のドメインが、ＴＮＦＳＦリガンドを含み、前記ＴＮＦＳＦリガンドが、アミノ酸配列が、配列番号１０６のアミノ酸配列又は配列番号１０６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列であるＧＩＴＲＬである、１〜２８及び３５〜５８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
７３．細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、免疫細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、１〜７２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
７４．細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、線維芽細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、１〜７３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
７５．細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造が、腫瘍細胞の細胞表面の構造又は細胞外マトリクスの構造である、１〜７４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
７６．１〜７５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
７７．１〜７５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸又は核酸のセット。
７８．少なくとも１のタイプの宿主細胞において、７７に記載の核酸又は核酸セットを発現させて、前記融合タンパク質を回収することを含む、１〜７５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を作製する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＴＮＦＳＦ及びＴＮＦＲＳＦのリガンド及び受容体を示す図である。
【図２】受容体特異的ＩｇＧによるＴＮＦＲＳＦ受容体のＦｃγＲ依存性刺激を示すグラフである。
【図３】受容体特異的ＩｇＧによるＴＮＦＲＳＦ受容体ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ依存性刺激を示すグラフである。
【図４】抗ＣＤ４０  ＩｇＧ１  Ｇ２８．５のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質は、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡへの結合後にＣＤ４０刺激活性が高まったことを示すグラフ等である。
【図５】抗ＣＤ９５  ＩｇＧ１  Ｅ０９のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質は、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡへの結合後にＣＤ９５刺激活性が高まったことを示すグラフ等である。
【図６】ＴＮＦＲ２結合性抗ＣＤ４０−ＩｇＧ１融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２結合後にＣＤ４０刺激活性が高まったことを示すグラフである。
【図７】ＣＤ１９結合性抗ＣＤ９５−ＩｇＧ１融合タンパク質は、ＣＤ１９発現細胞と共培養したＨＴ１０８０細胞において細胞死誘導が高まったことを示すグラフである。
【図８】ＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４のＩＬ２融合タンパク質は、ＩＬ２Ｒ依存的にＴＮＦＲ２をより刺激したことを示すグラフである。
【図９】ＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４のＧＩＴＲ及び４１ＢＢアンカー融合タンパク質は、ＧＩＴＲ及び４１ＢＢ結合においてＴＮＦＲ２活性化が高まったことを示すグラフ等である。
【図１０】細胞表面抗原ＣＤ２０に固定（アンカー）するＣＤ４０特異的抗体Ｇ２８．５のｓｃＦｖ融合タンパク質は、ＣＤ２０依存的なＣＤ４０への刺激がより高まったことを示すグラフ等である。
【図１１】抗体Ｅ０９の抗ＣＤ９５−ＩｇＧ１  Ｆａｂ２断片のｓｃＦｖ：ＣＤ２０融合タンパク質は、ＣＤ２０発現細胞と共培養したＨＴ１０８０細胞において細胞死誘導が高まったことを示すグラフである。
【図１２】ＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４の細胞表面抗原標的ｓｃＦｖ融合タンパク質は、抗原依存的なＴＮＦＲ２への刺激がより高まったことを示すグラフ等である。
【図１３】抗ＣＤ４０  Ｇ２８．５のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質の生化学的特徴を示す写真等である。
【図１４】抗ＣＤ４０  Ｇ２８．５のＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）及びＦＡＢ２変異体のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質は、ＢａｆｆＲ及びＴＡＣＩの内因性発現を伴うリンパ腫／骨髄腫細胞への結合後に、ＣＤ４０刺激活性が高まったことを示すグラフである。
【図１５】可溶性Ｂａｆｆ（ＴＮＣ−Ｂａｆｆ）との競合により、抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ及び抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆによるＩＬ８産生が阻害されたことを示すグラフである。
【図１６】抗ＣＤ９５  ＩｇＧ１  Ｅ０９又はそのＦＡＢ２断片のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質は、ＢａｆｆＲ及びＴＡＣＩの内因性発現があるリンパ腫／骨髄腫懸濁細胞に結合後、接着性ＨＴ１０８０細胞において細胞死を誘導することを示すグラフである。
【図１７】可溶性Ｂａｆｆ（ＴＮＣ−Ｂａｆｆ）との競合により、抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ及び抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆが、ＨＴ１０８０細胞及びＢａｆｆ相互作用受容体発現細胞の共培養においてＨＴ１０８０殺傷の誘導が阻害されることを示すグラフである。
【図１８】抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆはＢａｆｆＲ発現細胞においてアポトーシスカスパーゼを活性化するが、抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）は活性化しないことを示す写真である。
【図１９】細胞表面抗原ＣＤ２０に固定するＩｇＧ２アイソフォーム中のＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４のｓｃＦｖ融合タンパク質は、ＣＤ２０依存的にＴＮＦＲ２をより刺激することを示すグラフである。
【図２０】細胞表面抗原ＣＤ７０に固定するＩｇＧ１アイソフォーム中のＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４のｓｃＦｖ融合タンパク質は、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０依存的にＴＮＦＲ２をより刺激することを示すグラフ等である。
【図２１】４−１ＢＢ特異的抗体ＨＢＫ４、ＣＤ４０特異的抗体Ｇ２８．５及びＣＤ９５特異的アニオイＥ０９のＩｇＧ１（Ｎ２９７）変異体のｓｃＦｖ：ＣＤ２０融合タンパク質は、ＣＤ２０発現細胞と共培養したＨＴ１０８０−４１ＢＢ、ＨＴ１０８０−ＣＤ４０及びＨＴ１０８０（内因性ＣＤ９５発現）細胞においてＩＬ８産生を誘導するグラフ等である。
【図２２】４−１ＢＢ特異的抗体ＨＢＫ４、ＣＤ４０特異的抗体Ｇ２８．５及びＣＤ９５特異的抗体Ｅ０９のＩｇＧ１（Ｎ２９７）変異体のｓｃＦｖ：ＣＤ２０融合タンパク質は、ＣＤ２０陽性ＢＪＡＢ細胞と共培養したＨＴ１０８０−４１ＢＢ、ＨＴ１０８０−ＣＤ４０及びＨＴ１０８０（内因性ＣＤ９５発現）細胞によりＩＬ８産生の増強を誘導することを示すグラフである。
【図２３】ＣＤ７０特異的ｓｃＦｖ  ９Ｇ２があるＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）アイソフォーム中のＴＲＡＩＬＲ２特異的抗体コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ；Ｃｏｎａ）の融合タンパク質は、ＣＤ７０依存的に炎症誘発性（Ａ）及び細胞毒性（Ｂ）ＴＲＡＩＬＲ２シグナル伝達をより刺激することを示すグラフ等である。
【図２４】ＣＤ４０特異的抗体ＣのＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）又はＦａｂ２フォーマットと、チェックポイント阻害剤であるアベルマブ（Ａｖｅ）を標的とするＰＤ−Ｌ１から誘導されたｓｃＦｖとの融合タンパク質は、ＰＤ−１Ｌ制限的にＣＤ４０を活性化することを示すグラフ等である。
【図２５】ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）又はＦａｂ２フォーマットの４１ＢＢ特異的抗体ＨＢＢＫと、チェックポイント阻害剤であるアベルマブ（Ａｖｅ）から誘導されたｓｃＦｖとの融合タンパク質は、ＰＤ−１Ｌ制限的に４１ＢＢを活性化することを示すグラフ等である。
【図２６】４１ＢＢに特異的なｓｃＦｖがあるＩｇＧ２フォーマットにおけるＰＤ−１Ｌ特異的抗体アベルマブ（Ａｖｅ）の融合タンパク質は、ＰＤ−１Ｌ制限的に増強された４１ＢＢ活性化を示すことを示すグラフ等である。
【図２７】Ｆｎ１４特異的ｓｃＦｖ  １８Ｄ１があるＩｇＧ（Ｎ２９７Ａ）フォーマットのマウスＣＤ２７特異的抗体の融合タンパク質は、マウスＣＤ２７制限的に増強されたＦｎ１４活性化を示すことを示すグラフ等である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図１は、ＴＮＦＳＦ及びＴＮＦＲＳＦのリガンド及び受容体を示す図である。図２は、受容体特異的ＩｇＧによるＴＮＦＲＳＦ受容体のＦｃγＲ依存性刺激を示すグラフである。マウスＦｃγＲ２Ｂの発現プラスミド又は空ベクターのいずれかでトランスフェクトされたＨｅｋ２９３細胞を、示されたＴＮＦＲＳＦ受容体の刺激がＩＬ８を産生することが示された細胞系の細胞と共培養した。様々なＴＮＦＲＳＦ受容体特異的ＩｇＧ（クローン名を示す）と一晩インキュベートした後、ＩＬ８の産生を、ＥＬＩＳＡを用いて獲得した。ＴＮＦＲ１及びＬＴβＲは、可溶性リガンド三量体によりすでに強力に活性化されているＴＮＦＲＳＦメンバーの例であり、ＦｃγＲ発現細胞の非存在下で、受容体特異的抗体によっても強力に活性化され得ることに留意されたい。示される他のＴＮＦＲＳＦ受容体は、活性化せず、又は単に限定的に活性化して可溶性ＴＮＦリガンドと結合し、ＦｃγＲ結合の非存在下では抗体により活性化されないか、又は活性化されたとしても非効率的である。しかし、当該抗ＴＮＦＲＳＦ受容体は、抗体がＦｃγＲ結合した場合に強く活性化される。
【００２０】
〔材料及び方法〕
示されたＴＮＦＲＳＦ受容体を発現しない（又は発現したとしてもせいぜい中等度）Ｈｅｋ２９３細胞（ＡＴＣＣ）及びＦｃγＲを、マウスＦｃγＲ２Ｂ又は空ベクターをコードするｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６（Source  Bicoscience）発現プラスミドで一過性トランスフェクトした。Kums  et  al.，MAbs．2017  Apr；9(3)：506-520に記載されているように、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、ＦｃγＲ発現プラスミド又は空ベクターによるＨｅｋ２９３細胞のトランスフェクションを行った。翌日、Ｈｅｋ２９３トランスフェクタントを回収し、２００００個の細胞のアリコートを、前日の細胞が播種された９６穴プレートのウェルに加えた（１００００〜２００００個細胞／穴）。このウェル（穴）には、ＩＬ８産生により目的のＴＮＦＲＳＦ受容体の活性化に応答する細胞が播種されている。次に、共培養物を、示された抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体（３μｇ／ｍｌ）を用いて一晩で三連反復刺激し、最後に、共培養上清のＩＬ８含有量をＥＬＩＳＡ（BD  Biosciences）で評価した。
【００２１】
図３は、受容体特異的ＩｇＧによるＴＮＦＲＳＦ受容体ＴＮＦＲ２のＦｃγＲ依存性刺激を示す。示されたＦｃγＲの発現プラスミドをトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞、又は空ベクターをトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を、ＴＮＦＲ２の刺激によりＩＬ８の産生が誘導される細胞と共培養した。示されたＴＮＦＲ２特異的ＩｇＧと一晩インキュベートした後、ＩＬ８産生を、ＥＬＩＳＡを用いて獲得した。
【００２２】
〔材料及び方法〕
ＴＮＦＲ２又はＦｃγＲを発現しないＨｅｋ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を、ヒト活性化ＦｃγＲ  ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲ２ＩＩＡ）、ヒト阻害性ＦｃγＲ  ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）又は空ベクターをコードするｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６（Source  Bicoscience）発現プラスミドで一過性トランスフェクトした。Kums  et  al.，MAbs．2017  Apr；9(3)：506-520に記載されているように、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、ＦｃγＲ発現プラスミド又は空ベクターによるＨｅｋ２９３細胞のトランスフェクションを行った。翌日、Ｈｅｋ２９３トランスフェクタントを回収し、２００００細胞のアリコートを、前日のＴＮＦＲ２が安定発現されたＨＴ１０８０細胞を２００００細胞／穴の密度で播種した９６穴プレートのウェルに添加した。次いで、共培養物を、細胞内で生成・産生された、示された抗ヒトＴＮＦＲ２抗体（１μｇ／ｍｌ）と共に三連反復刺激した。抗体により認識されるＴＮＦＲ２のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）サブドメインを示す（ＣＲＤ１〜ＣＲＤ４）。用いた細胞でＴＮＦＲ２を活性化すると、ＩＬ８産生が増強される。従って、共培養上清のＩＬ８含量を最終的にＥＬＩＳＡ（BD  Biosciences）で評価して、ＴＮＦＲ２活性を測定した。
【００２３】
図４は、抗ＣＤ４０  ＩｇＧ１  Ｇ２８．５のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質は、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡへの結合後、ＣＤ４０刺激活性が増強したことを示し、具体的には、図４（Ａ）は融合タンパク質の構造を示す。Ｈｅｋ２９３細胞に空のベクター及びＢａｆｆＲ  ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを各々コードする発現プラスミドをトランスフェクトした。翌日、トランスフェクタントを、ＢａｆｆＲ、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを発現しないが、ＣＤ４０刺激後にＩＬ８を強力に産生するＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞と共培養した。抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆを所定の濃度で、共培養物に三連反復刺激した。翌日、様々な共培養物の上清中のヒトＩＬ８の量を測定した（同（Ｂ））。ＢａｆｆＲ及びＴＡＣＩを発現するＨｅｋ２９３細胞（ＢａｆｆＲ、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ陰性）及びＬ３６３細胞を、ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞と共培養し、次に、示された濃度の抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆで共培養物を刺激した。翌日、再度、共培養の上清中のヒトＩＬ８の量を測定した（同（Ｃ））。ｓｃＢａｆｆ中のＢａｆｆの３つのプロトマーは、全長Ｂａｆｆ分子の細胞外ＴＮＦ相同性ドメインのみを含むことに注意されたい。
【００２４】
〔材料及び方法〕
ＣＤ４０、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡを発現しないＨｅｋ２９３細胞を、Ｈｅｋ２９３細胞及びＦｃｇＲ発現ベクター用には、Kums  et  al.，MAbs．2017Apr；9(3)：506-520に記載されるように、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡをコードする発現プラスミド又は空ベクター（＝陰性対照）で一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、３０．０００細胞のアリコートを、前日のＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞（ＣＤ４０で安定トランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞）が２００００細胞／穴の密度で播種された９６穴プレートのウェルに添加した。あるいは、ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞を、ＢａｆｆＲ及びＴＡＣＩを内因性発現する骨髄腫細胞株Ｌ３６３の５０．０００細胞／穴と共培養した。ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞は、ＣＤ４０の活性化に応答し、大量に産生される。ＴＲＡＦＦＩＡＡ抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７）−ｓｃＢａｆｆを用いて共培養物を一晩で三連反復刺激し、最後にＥＬＩＳＡでＩＬ８産生を測定した。
【００２５】
図５は、抗ＣＤ９５  ＩｇＧ１  Ｅ０９のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質は、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡへの結合後、ＣＤ９５刺激活性が増強することを示す。同（Ａ）は融合タンパク質の構造を示す。Ｈｅｋ２９３細胞に空ベクター又はＢａｆｆ、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩをコードする発現プラスミドをトランスフェクトした。翌日、トランスフェクタントを、ＢａｆｆＲ、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを発現せず、ＣＤ９５刺激後にアポトーシスを起こすＨＴ１０８０細胞と共培養した。共培養物を、示された濃度の抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆで処理し、接着増殖ＨＴ１０８０細胞の翌日の生存率を、クリスタルバイオレット染色により評価した（同（Ｂ））。Ｈｅｋ２９３細胞（ＢａｆｆＲ、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ陰性）及びＢａｆｆＲ及びＴＡＣＩを発現するＬ３６３細胞をＨＴ１０８０細胞と共培養した。共培養物を再び抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆで一晩刺激し、ＨＴ１０８０生存率を最終的にクリスタルバイオレット染色により評価した（同（Ｃ））。ｓｃＢａｆｆ中のＢａｆｆの３つのプロトマーは、全長Ｂａｆｆ分子の細胞外ＴＮＦ相同性ドメインのみを含むことに注意されたい。
【００２６】
〔材料及び方法〕
ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡを発現しないＨｅｋ２９３細胞及び陰性量のＣＤ９５を、ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡをコードする発現プラスミド又は空ベクター（＝陰性対照）で、Ｈｅｋ２９３細胞及びＦｃｇＲ発現ベクター用に、Kums  et  al.，MAbs．2017Apr；9(3)：506-520に記載のように、一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、３０，０００細胞のアリコートを、前日のＨＴ１０８０細胞を２００００細胞／穴の密度で播種した９６穴プレートのウェルに添加した。あるいは、ＨＴ１０８０細胞を、内因性にＢａｆｆＲ及びＴＡＣＩを発現する骨髄腫細胞株Ｌ３６３の５０．０００細胞／穴と共培養した。ＨＴ１０８０細胞は、感作物質の非存在下でＣＤ９５誘導細胞死に対して感受性を示す。共培養物を、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡ抗−ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７）−ｓｃＢａｆｆを用いて一晩で三連反復刺激し、最後に、細胞死誘導を、接着成長ＨＴ１０８０細胞のクリスタルバイオレット染色により判定した。
【００２７】
図６は、ＴＮＦＲ２結合性抗ＣＤ４０−ＩｇＧ１融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２結合後にＣＤ４０刺激活性が増強することを示す。ＴＮＦＲ２もＣＤ４０も発現しないＨｅＬａ細胞、及びＴＮＦＲ２の刺激後に中等度のレベルのＩＬ８しか産生しないＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２トランスフェクタントを、ＴＮＦＲ２もＣＤ４０も発現しないＨＴ１０８０細胞、及びＣＤ４０刺激後に非常に高レベルのＩＬ８を産生するＨＴ１０８０−ＣＤ４０トランスフェクタントと共培養し、示された濃度のＴＮＦＲ２標的化抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＨＣ：ｓｃＴＮＦ８０で刺激した。翌日、異なる共培養物の上清中のＩＬ８量を測定した。ｓｃＴＮＦ８０におけるＴＮＦ８０の３つのプロトマーは、ＴＮＦＲ２特異性を付与する突然変異を含む全長マウスＴＮＦ分子の細胞外ＴＮＦ相同性ドメインのみを含むことに留意されたい。これまで同様、試験は、９６穴フォーマットの技術的三連反復で行った。
【００２８】
図７は、ＣＤ１９結合性抗ＣＤ９５−ＩｇＧ１融合タンパク質は、ＣＤ１９発現細胞と共培養したＨＴ１０８０細胞において細胞死誘導が高まることを示す。ＣＤ１９を発現しないＣＤ９５感受性細胞株ＨＴ１０８０を、Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ１９−陰性）細胞及びＢＪＡＢ（ＣＤ１９−陽性）細胞と共培養し、指示された濃度でＣＤ１９結合抗ＣＤ９５融合タンパク質抗−ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ１９と共にインキュベートした。翌日、接着増殖ＨＴ１０８０細胞の生存率を、クリスタルバイオレット染色で測定した。
【００２９】
〔材料及び方法〕
試験は、９６穴プレートの技術的三連反復で行った。ＨＴ１０８０細胞をウェル当たり２００００細胞で播種した。Ｊｕｒｋａｔ及びＢＪＡＢ細胞（ウェル当たり３００００）を、示された濃度の抗−ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ１９と共に次の細胞に添加した。細胞死誘導は、接着成長ＨＴ１０８０細胞のクリスタルバイオレット染色により判定した。生存率は、未処理のＨＴ１０８０細胞（＝１００％生存率）及びＣＨＸ、ベルケイド、及びＦｃ−ＣＤ９５Ｌ（＝０生存率）を含む高毒性混合物で処理したＨＴ１０８０細胞を用いて正規化した。
【００３０】
図８は、ＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４のＩＬ２融合タンパク質は、ＩＬ２Ｒ依存的にＴＮＦＲ２を次第に刺激することを示す。ＴＮＦＲ２もＩＬ２Ｒも発現しないＨｅｋ２９３細胞を、ＩＬ２Ｒのサブユニットをコードする発現プラスミドの混合物又は空のベクターでトランスフェクトした。次に、Ｈｅｋ２９３トランスフェクタントを、ＴＮＦＲ２を発現するＨｅＬａトランスフェクタントと共培養し、示された濃度の抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＨＣ：ＩＬ２で刺激した。翌日、ＴＮＦＲ２を介して誘導され得るＩＬ８の産生を、ＥＬＩＳＡを用いて記録した。
【００３１】
〔材料及び方法〕
Ｈｅｋ２９３細胞を、Ｈｅｋ２９３細胞及びＦｃｇＲ発現ベクター用にKums  et  al.，MAbs．2017Apr；9(3)：506-520に記載のように、ＩＬ−２受容体のサブユニットをコードする発現プラスミドの混合物、又は陰性対照としての空ベクターで一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、２０．０００細胞のアリコートを、前日のＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２細胞を２００００細胞／穴の密度で播種した９６穴プレートのウェルに添加した。ＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２細胞は、ＴＮＦＲ２活性化に応答してＩＬ８を産生する。ＴＲＡＦＦＩＡＡ抗−ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＨＣ：ＩＬ２を用いて、共培養物を一晩で三連反復刺激し、最後にＥＬＩＳＡでＩＬ８産生を測定した。
【００３２】
図９は、ＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４のＧＩＴＲ及び４１ＢＢアンカー融合タンパク質は、ＧＩＴＲ及び４１ＢＢ結合において、ＴＮＦＲ２活性化が増強されたことを示す。図９（Ａ）は用いたヒトＧＩＴＲ及びマウス４−１ＢＢをアンカーするＴＮＦＲ２刺激ＴＲＡＦＦＩＡＡのドメイン構造を示す。同Ｂ及びＣは、細胞はＧＩＴＲ又は４１ＢＢを発現しないが、空のベクター又はヒトＧＩＴＲ（Ｂ）又はマウス４１ＢＢ（Ｃ）をコードする発現プラスミドをトランスフェクトしたことを示す。次に、トランスフェクタントを、ＴＮＦＲ２活性化に応答してＩＬ８を産生するＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２細胞と共培養した。抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＨＣ：ｓｃＧＩＴＲＬ（Ｂ）及び抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＨＣ：ｓｃ（ｍｕ）４−１ＢＢＬ（Ｃ）の指示濃度で共培養を刺激した。翌日、ＩＬ８の産生を、ＩＬ８特異的ＥＬＩＳＡを用いて測定した。図９（Ｄ）は、用いたマウスＧＩＴＲアンカーＴＮＦＲ２刺激ＴＲＡＦＦＩＡＡのドメイン構造を示す。空ベクター又はマウスＧＩＴＲ発現プラスミドでトランスフェクトした細胞を、ＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２細胞と共培養した（図９（Ｅ））。抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＨＣ：（ｍｕ）ＧＩＴＲＬによる刺激後、ＩＬ８の産生をＥＬＩＳＡにより翌日モニターした。マウスのＧＩＴＲＬは、ヒトのＧＩＴＲＬ及びＴＮＦＳＦの他のすべてのヒト及びマウスのリガンドとは対照的に、二量体分子であり、３つの受容体分子ではなく２つの受容体分子と相互作用することに注意されたい。それにより、単一のマウスＧＩＴＲＬプロトマーを重鎖のＣ末端に融合させて、対応する抗体−（ｍｕ）ＧＩＴＲＬのアンカードメインとして作用する単一の（ｍｕ）ＧＩＴＲＬ二量体を構成しうる。対照的に、重鎖に融合されたアンカードメインとしてのｓｃＴＮＦＳＦリガンド（例えば、ｓｃＧＩＴＲＬ、ｓｃ（ｍｕ）４１ＢＢＬ、ｓｃＴＮＦ８０）を用いると、１の抗体融合タンパク質あたり２つのアンカードメインが生じる。ｓｃＧＩＴＲＬ及びｓｃ（ｍｕ）４１ＢＢＬ中のＧＩＴＲＬ及び（ｍｕ）４１ＢＢＬの３つのプロトマーは、全長リガンド分子の細胞外ＴＮＦ相同性ドメインのみを含むことに留意されたい。同様に、（ｍｕ）ＧＩＴＲＬは、マウス全長ＧＩＴＲＬのＴＨＤのみをいう。
【００３３】
〔材料及び方法〕
ＧＩＴＲ、４１ＢＢ又はＴＮＦＲ２を発現しないＨｅｋ２９３細胞を、Ｈｅｋ２９３細胞及びＦｃｇＲ発現ベクター用に、Kums  et  al.，MAbs．2017Apr；9(3)：506-520に記載のように、ヒト又はマウスＧＩＴＲ又はマウス４１ＢＢ又は空ベクター（＝陰性対照）をコードする発現プラスミドで一過性トランスフェクトした。トランスフェクタントを回収し、２００００細胞のアリコートを９６穴のｐｌｅＬａ−ＴＮＦＲ２のウェルに２００００細胞／穴の密度で播種した。ＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２細胞はＴＮＦＲ２活性化に応答してＩＬ８を産生する。共培養物を、示されたＴＲＡＡＦＦＩＡＳを用いて一晩で三連反復刺激し、最後に、ＥＬＩＳＡでＩＬ８産生を測定した。
【００３４】
図１０は、細胞表面抗原ＣＤ２０にアンカーするＣＤ４０特異的抗体Ｇ２８．５のｓｃＦｖ融合タンパク質は、ＣＤ２０依存的にＣＤ４０を刺激がより高まったことを示すグラフ等である。ＣＤ２０陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＣＤ２０陽性ＢＪＡＢ細胞をＣＤ４０応答性ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞と共培養し、示された濃度の抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０で刺激した。翌日、ＣＤ４０を介して誘導されうるＩＬ８の産生を、ＥＬＩＳＡで記録した。インビボでＦｃドメインのＡＤＣＣ活性を低下させるＮ２９７Ａ変異があるＩｇＧ１分子の変異体を用いた。
【００３５】
〔材料及び方法〕
試験は、９６穴プレートの技術的三連反復で行った。ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞をウェル当たり２００００細胞で播種した。Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ２０−）及びＢＪＡＢ細胞（ＣＤ２０＋）（ウェル当たり３００００）を、示された濃度の抗ＣＤ４０−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０と共に翌日に添加した。共培養上清のＩＬ８含量を最終的にＥＬＩＳＡ（BD  Biosciences）で評価した。
【００３６】
図１１は、抗体Ｅ０９の抗ＣＤ９５−ＩｇＧ１  Ｆａｂ２断片のｓｃＦｖ：ＣＤ２０融合タンパク質は、ＣＤ２０発現細胞と共培養したＨＴ１０８０細胞において、細胞死誘導を高めることを示す。ＣＤ９５感受性細胞株ＨＴ１０８０をＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２０陰性）及びＢＪＡＢ細胞（ＣＤ２０陽性）と共培養した。共培養物を、指示された濃度で、ＣＤ２０結合性抗ＣＤ９５融合タンパク質抗ＣＤ９５−Ｆａｂ２−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０で処理した。翌日、接着増殖ＨＴ１０８０細胞の生存率を、クリスタルバイオレット染色で測定した。
【００３７】
〔材料及び方法〕
試験は、９６穴プレートの技術的三連反復で行った。ＨＴ１０８０細胞をウェル当たり２００００細胞で播種した。Ｊｕｒｋａｔ及びＢＪＡＢ細胞（ウェル当たり３００００）を、示されたＴＲＡＡＦＦＩＡＡと共に次の細胞に添加した。ＨＴ１０８０生存率は、未処理のＨＴ１０８０細胞（＝１００％生存率）及びＣＨＸ、ベルケイド、及びＦｃ−ＣＤ９５Ｌ（＝０生存率）を含む高毒性混合物で処理したＨＴ１０８０細胞を用いて正規化した。
【００３８】
図１２は、ＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４の細胞表面抗原標的ｓｃＦｖ融合タンパク質は、抗原依存的にＴＮＦＲ２を次第に刺激することを示す。ＣＤ１９及びＣＤ２０陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞並びにＣＤ１９及びＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞を、ＴＮＦＲ２発現ＨｅＬａトランスフェクタントと共培養し、示された濃度の抗ＴＮＦＲ２−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ１９（上部）又は抗ＴＮＦＲ２−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０（下部）で各々刺激した。翌日、ＴＮＦＲ２を介して誘導されうるＩＬ８の産生を、ＥＬＩＳＡを用いて記録した。ＡＤＣＣを誘発できないＩｇＧ１変異体Ｎ２９７Ａの変異体を用いた。ここで用いた親ＴＮＦＲ２特異的ｍＡｂ  Ｃ４は、細胞内で作製された。
【００３９】
〔材料及び方法〕
試験は、９６穴プレートの技術的三連反復で行った。上部：ＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２細胞にウェル当たり２００００細胞を播種した。Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ１９−／ＣＤ２０−）及びＲＡＪＩ細胞（ＣＤ１９−／ＣＤ２０−）（ウェル当たり３００００）を、示された濃度の抗ＴＮＦＲ２−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ１９（上部）又は抗ＴＮＦＲ２−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０（下部）と共に翌日に添加した。ＴＮＦＲ２活性化により産生されたＩＬ８含量は、最後に共培養上清のＥＬＩＳＡ（BD  Biosciences）分析により評価した。
【００４０】
図１３（Ａ）は、抗ＣＤ４０  Ｇ２８．５のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質の生化学的特徴を示す。精製された抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７）（Ｉ）、抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ（ＩＩ）、抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＦＡＢ２（ＩＩＩ）及び抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ（ＩＶ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。その後、様々な抗体融合タンパク質の重鎖及び軽鎖に存在するフラッグエピトープを認識するｍＡｂ  Ｍ２を用いたウェスタンブロット法（左パネル）又は銀染色（右パネル）によりタンパク質を可視化した。構築物ＩＩの２つの鎖は、大きさが極めて類似し、したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっては分離されないことに注意されたい。図１３（Ｂ）はマーカータンパク質混合物及びタンパク質Ｉ〜ＩＶのゲルろ過分析を示し、同（Ｃ）はタンパク質Ｉ〜ＩＶの図式である。
【００４１】
〔材料及び方法〕
抗体融合タンパク質を作製し、以下のＫｕｍｓら、２０１６に記載されているように精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色及びウェスタンブロット法を、Ｌａｎｇら、２０１６に記載のように実施した。
【００４２】
【化１】
2021508478.tif 000002
図１４は、抗ＣＤ４０  Ｇ２８．５のＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）及びＦＡＢ２変異体のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質は、ＢａｆｆＲ及びＴＡＣＩの内因性発現を伴うリンパ腫／骨髄腫細胞への結合後、ＣＤ４０刺激活性が高まることを示す。ＭＭ１Ｓ（ＢＣＭＡ及び中等度のＴＡＣＩを発現）、Ｌ３６３（ＢＣＭＡ及び中等度のＴＡＣＩを発現）及びＢＪＡＢ（ＢａｆｆＲを発現）細胞、又はすべてのＢａｆｆ結合受容体の発現が欠損する対照Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＢａｆｆＲ、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩを発現せず、ＣＤ４０刺激後にＩＬ８を強力に産生するＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞と共培養した。示された濃度の抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ又は抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆで、共培養物を三連反復刺激した。翌日、異なる共培養物の上清中のヒトＩＬ８の量を測定した。
【００４３】
〔材料及び方法〕
ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞を９６穴プレート（ウェル当たり２０．０００細胞）で一晩培養した。翌日、ＭＭ１Ｓ、Ｌ３６３、ＢＪＡＢ又はＪｕｒｋａｔ細胞をウェル当たり２０．０００個添加し、得られた共培養物を、示された濃度の抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ及び抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆでさらに三連反復刺激した。次いで、細胞上清のＩＬ８産生についてＥＬＩＳＡで分析した。ＭＭ１Ｓ、Ｌ３６３、ＢＪＡＢ及びＪｕｒｋａｔ細胞は、ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞と比較して、ＩＬ８は産生されないか、又は産生されたとしても無視できる量であったことに注意されたい。
【００４４】
図１５は、可溶性Ｂａｆｆ（ＴＮＣ−Ｂａｆｆ）との競合で、抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ及び抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆによるＩＬ８産生が阻害されることを示す。ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞を、ＭＭ１Ｓ（ＢＣＭＡ及び中等度のＴＡＣＩを発現）、Ｌ３６３（ＢＣＭＡ及び中等度のＴＡＣＩを発現）及びＢＪＡＢ（ＢａｆｆＲを発現）細胞と、又は対照Ｊｕｒｋａｔ細胞として共培養した。ＨＴ１０８０−ＣＤ４０及びＪｕｒｋａｔ細胞は、Ｂａｆｆ−相互作用受容体（ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ）を発現しないことに注意されたい。過剰の可溶性ＴＮＣ−Ｂａｆｆ（５μｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下で、２００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ又は抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆを用いて、共培養物を三連反復刺激した。翌日、種々の共培養物の上清中のヒトＩＬ８の量を測定した。
【００４５】
〔材料及び方法〕
ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞を９６穴プレート（ウェル当たり２０．０００細胞）で一晩培養した。翌日、ＭＭ１Ｓ、Ｌ３６３、ＢＪＡＢ又はＪｕｒｋａｔ細胞をウェル当たり２０．０００個添加し、得られた共培養物を、２００ｎｇ／ｍｌのＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ及び抗−ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆと共に、可溶性ＴＮＣ−Ｂａｆｆ（５μｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下で、テネイシン−Ｃの三量体化ドメインを含む可溶性Ｂａｆｆの安定化形態（Ｂｅｒｇら，２００７）でさらに一晩刺激した。次いで、細胞上清のＩＬ８産生についてＥＬＩＳＡで分析した。ＭＭ１Ｓ、Ｌ３６３、ＢＪＡＢ及びＪｕｒｋａｔ細胞は、ＨＴ１０８９０−ＣＤ４０細胞と比較して、ＩＬ８は産生されないか、又は産生されたとしても無視できる量であったことに注意されたい。
【００４６】
【化２】
2021508478.tif 000003
図１６は、抗ＣＤ９５  ＩｇＧ１  Ｅ０９又はそのＦＡＢ２断片のｓｃＢａｆｆ融合タンパク質が、ＢａｆｆＲ及びＴＡＣＩを内因性発現するリンパ腫／骨髄腫懸濁細胞に結合した後、接着性ＨＴ１０８０細胞において細胞死を誘導することを示す。接着増殖ＨＴ１０８０細胞を、ＭＭ１Ｓ（ＢＣＭＡ及び中等度のＴＡＣＩを発現する）、Ｌ３６３（ＢＣＭＡ及び中等度のＴＡＣＩを発現する）及びＢＪＡＢ（ＢａｆｆＲを発現する）懸濁細胞と、又は対照Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養した。ＨＴ１０８０及びＪｕｒｋａｔ細胞は、Ｂａｆｆ−相互作用受容体（ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ）を発現しないことに注意されたい。抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ又は抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆの指示された濃度で、１μｇ／ｍｌのＣＨＸの存在下で共培養を三連反復刺激した。翌日、残存する付着ＨＴ１０８０細胞のクリスタルバイオレット染色により、細胞生存率を測定した。
【００４７】
〔材料及び方法〕
ＨＴ１０８０細胞を２０，０００細胞／穴の密度で播種した。翌日、ＭＭ１Ｓ、Ｌ３６３、ＢＪＡＢ又はＪｕｒｋａｔ懸濁液細胞をウェル当たり２０．０００個添加し、得られた共培養物を、１μｇ／ｍｌの存在下で抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ又は抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆと一晩刺激した。最後に、接着成長ＨＴ１０８０細胞のクリスタルバイオレット染色により細胞死誘導を判定した。生存率は、０．０３％アジド、５０μｇ／ｍｌのＣＨＸ及び５００ｎｇ／ｍｌのＦｃ−ＣＤ９５Ｌ（＝０％生存率）の高毒性混合物で処理した未処理のＨＴ１０８０細胞（＝１００％生存率）及びＨＴ１０８０細胞に対して正規化した。
【００４８】
図１７は、可溶性Ｂａｆｆ（ＴＮＣ−Ｂａｆｆ）との競合で、抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ及び抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆが、ＨＴ１０８０細胞及びＢａｆｆ相互作用受容体発現細胞の共培養においてＨＴ１０８０の細胞死誘導を阻害することを示す。ＨＴ１０８０細胞を、ＭＭ１Ｓ（ＢＣＭＡ及び中等度のＴＡＣＩを発現）、Ｌ３６３（ＢＣＭＡ及び中等度のＴＡＣＩを発現）及びＢＪＡＢ（ＢａｆｆＲを発現）細胞と、又は対照Ｊｕｒｋａｔ細胞と共培養した。ＨＴ１０８０−ＣＤ４０及びＪｕｒｋａｔ細胞は、Ｂａｆｆ−相互作用受容体（ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ）を発現しないことに注意されたい。過剰の可溶性ＴＮＣ−Ｂａｆｆ（５μｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下、抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ又は抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆを２０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆを用いて、１μｇ／ｍｌのＣＨＸの存在下で、共培養を三連反復刺激した。翌日、残存する付着ＨＴ１０８０細胞のクリスタルバイオレット染色により、細胞生存率を測定した。
【００４９】
〔材料及び方法〕
ＨＴ１０８０細胞を２０，０００細胞／穴の密度で播種した。翌日、ＭＭ１Ｓ、Ｌ３６３、ＢＪＡＢ又はＪｕｒｋａｔ懸濁液細胞をウェル当たり２０．０００個添加し、得られた共培養物を、２０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ又は抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＦＡＢ２−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆで、可溶性ＴＮＣ−Ｂａｆｆ（５μｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下で、三連反復刺激した。最後に、細胞死誘導を、接着成長ＨＴ１０８０細胞のクリスタルバイオレット染色により決定した。生存率は、０．０３％アジド、５０μｇ／ｍｌのＣＨＸ及び５００ｎｇ／ｍｌのＦｃ−ＣＤ９５Ｌ（＝０％生存率）の高毒性混合物で処理した未処理のＨＴ１０８０細胞（＝１００％生存率）及びＨＴ１０８０細胞に対して正規化した。ＴＮＣ−Ｂａｆｆは、テネイシンＣの三量体化ドメインを含む可溶性Ｂａｆｆの安定化形態である（Ｂｅｒｇら，２００７）。
【００５０】
【化３】
2021508478.tif 000004
図１８は、抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆはＢａｆｆＲ発現細胞においてアポトーシスカスパーゼを活性化するが、抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）は活性化しないことを示す。ＢＪＡＢ細胞（ＢａｆｆＲを発現）、及びＢａｆｆ受容体（ＢａｆｆＲ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ）を全く発現しない陰性対照Ｊｕｒｋａｔ細胞として、示された濃度の抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＢａｆｆ及び抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）で一晩処理した。翌日、これらのカスパーゼのアポトーシス活性化を示すカスパーゼ−８のｐ１８断片及びカスパーゼ−３のｐ１７断片の生成に関して、全細胞溶解物をウェスタンブロット法で分析した。陽性対照として、Ｊｕｒｋａｔ及びＢＪＡＢ細胞に５００ｎｇ／ｍｌのＦｃ−ＣＤ９５Ｌを負荷し、両細胞株でアポトーシスを誘導させた。
【００５１】
図１９は、細胞表面抗原ＣＤ２０にアンカーされるＩｇＧ２アイソフォーム中のＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４のｓｃＦｖ融合タンパク質は、ＣＤ２０依存的にＴＮＦＲ２をより刺激することを示す。ＣＤ２０陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＣＤ２０陽性ＢＪＡＢ細胞をＴＮＦＲ２応答性ＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２細胞と共培養し、示された濃度の抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＩｇＧ２−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０で刺激した。翌日、ＴＮＦＲ２を介して誘導されたＩＬ８産生を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００５２】
〔材料及び方法〕
ウェル当たり２０．０００のＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２トランスフェクタント（Ｗｅｉｓｓら、１９９７）を９６穴プレートに播種した。翌日、ＣＤ２０陽性ＢＪＡＢ細胞又は内因性ＣＤ２０発現を欠損するＪｕｒｋａｔ細胞２０，０００個を陰性対照として添加した。次いで、共培養物を、示された濃度の抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＩｇＧ２−ＨＣ：ｓｃＦｖＣＤ２０で処理し、その翌日に、ＩＬ８産生をＥＬＩＳＡで測定した。
【００５３】
【化４】
2021508478.tif 000005
図２０は、細胞表面抗原ＣＤ７０に固定化されたＩｇＧ１アイソフォーム中のＴＮＦＲ２特異的抗体Ｃ４のｓｃＦｖ融合タンパク質が、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０依存的にＴＮＦＲ２をより刺激することを示す。図（Ａ）は融合タンパク質の構造を示す。（Ｂ）（Ｃ）は、Ｈｅｋ２９３細胞に空のベクター又は発現プラスミドをコードするＣＤ２７Ｌ（別名ＣＤ７０）をトランスフェクトしたことを示す。翌日、トランスフェクタントをＴＮＦＲ２発現時にＩＬ８を産生するＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２トランスフェクタントと共培養した。共培養物を、示された濃度の抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ７０（１Ｆ６）（Ｂ）又は抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ７０（２Ｈ５）（Ｃ）で処理した。最後に、ＩＬ８産生をＥＬＩＳＡで評価した。
【００５４】
〔材料及び方法〕
ＴＮＦＲ２又はＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）を発現しないＨｅｋ２９３細胞を、Kums  et  al.，MAbs．2017  Apr；9(3)：506-520に記載されているように、ＣＤ２７Ｌ（＝陰性対照）をコードする発現プラスミドで一過性トランスフェクトした（Ｈｅｋ２９３細胞及びＦｃｇＲ発現ベクター）。トランスフェクタントを回収し、２０，０００細胞のアリコートを、その前日のＨｅＬａ−ＴＮＦＲ２細胞を２０，０００細胞／穴の密度で播種した９６穴プレートのウェルに添加した。ＴＲＡＡＦＦＩＡＡｓ抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ７０（１Ｆ６）（Ｂ）及び抗ＴＮＦＲ２（Ｃ４）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ７０（２Ｈ５）（Ｃ）を用いて、共培養物を一晩刺激した。２Ｈ５及び１Ｆ６は、２つの異なるヒトＣＤ７０特異的抗体である。
【００５５】
図２１は、４−１ＢＢ特異的抗体ＨＢＫ４、ＣＤ４０特異的抗体Ｇ２８．５及びＣＤ９５特異的アニオイＥ０９のＩｇＧ１（Ｎ２９７）変異体のｓｃＦｖ：ＣＤ２０融合タンパク質は、ＣＤ２０発現細胞と共培養したＨＴ１０８０−４１ＢＢ、ＨＴ１０８０−ＣＤ４０及びＨＴ１０８０（内因性ＣＤ９５発現）細胞においてＩＬ８産生を誘導することを示す。（Ａ）は融合タンパク質を示す。（Ｂ）〜（Ｄ）は、以下の図式である。すなわち、示されたＨＴ１０８０変異体を、空のベクター又はＣＤ２０発現プラスミドでトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞と共培養した。次いで、共培養物を、指示された濃度で、ＣＤ２０結合性ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）融合タンパク質抗４１ＢＢ（ＨＢＢＫ４）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０（Ｂ）、抗ＣＤ４０（Ｂ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０（Ｃ）及び抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０（Ｄ）で処理した。翌日、ＩＬ８産生をＥＬＩＳＡで測定した。抗ＣＤ９５変異体の場合、カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤを添加してアポトーシスを阻害した。
【００５６】
〔材料及び方法〕
ＨＴ１０８０−４１ＢＢトランスフェクタント（Ｗｙｚｇｏｌら，２００９）、ＨＴ１０８０−ＣＤ４０トランスフェクタント（Ｗｙｚｇｏｌら，２００９）及びＨＴ１０８０細胞（内因性ＣＤ９５発現）を２０．０００細胞／穴の密度で播種した。翌日、前日に空ベクター（ＥＶ）又はＣＤ２７Ｌ（＝ＣＤ７０）発現プラスミドをトランスフェクトした２０，０００個のＨｅｋ２９３細胞を添加した。得られた共培養物を、示された濃度の抗４１ＢＢ（ＨＢＢＫ４）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖＣＤ２０（Ｂ）、抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖＣＤ２０（Ｃ）及び抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ（Ｄ）で一晩刺激した。後者を２０μｇ／ｍｌのＺＶＡＤの存在下で添加して、アポトーシス誘導を阻害した。ＩＬ８をＥＬＩＳＡで評価した。
【００５７】
【化５】
2021508478.tif 000006
図２２は、４−１ＢＢ特異的抗体ＨＢＫ４、ＣＤ４０特異的抗体Ｇ２８．５及びＣＤ９５特異的抗体Ｅ０９のＩｇＧ１（Ｎ２９７）変異体のｓｃＦｖ：ＣＤ２０融合タンパク質が、ＣＤ２０陽性ＢＪＡＢ細胞と共培養したＨＴ１０８０−４１ＢＢ、ＨＴ１０８０−ＣＤ４０及びＨＴ１０８０（内因性ＣＤ９５発現）細胞により増強されたＩＬ８産生を誘導することを示す。（Ａ）〜（Ｃ）は、示されたＨＴ１０８０変異体を、ＣＤ２０陽性ＢＪＡＢ細胞と、又は内因性ＣＤ２０発現を欠損するＪｕｒｋａｔ細胞との陰性対照と共培養した。次いで、共培養物を、指示された濃度で、ＣＤ２０結合性ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）融合タンパク質抗４１ＢＢ（ＨＢＢＫ４）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０（Ａ）、抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０（Ｂ）及び抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ２０（Ｃ）で処理した。翌日、ＩＬ８産生をＥＬＩＳＡで測定した。抗ＣＤ９５変異体の場合は、カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤを添加してアポトーシスを阻害した。
【００５８】
〔材料及び方法〕
ＨＴ１０８０−４１ＢＢトランスフェクタント（Ｗｙｚｇｏｌら，２００９）、ＨＴ１０８０−ＣＤ４０トランスフェクタント（Ｗｙｚｇｏｌら，２００９）及びＨＴ１０８０細胞（内因性ＣＤ９５発現）を２０．０００細胞／穴の密度で播種した。翌日、２０，０００個のＢＪＡＢ細胞（ＣＤ２０陽性）又は２０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２０陰性）のいずれかを添加した。得られた共培養物を、示された濃度の抗４１ＢＢ（ＨＢＢＫ４）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖＣＤ２０（Ａ）、抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖＣＤ２０（Ｂ）及び抗ＣＤ９５（Ｅ０９）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ（Ｃ）で一晩刺激した。後者を２０μｇ／ｍｌのＺＶＡＤの存在下で添加して、アポトーシス誘導を阻害した。ＩＬ８をＥＬＩＳＡで評価した。
【００５９】
【化６】
2021508478.tif 000007
図２３は、ＣＤ７０特異的ｓｃＦｖ  ９Ｇ２を備えるＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）アイソフォーム中のＴＲＡＩＬＲ２特異的抗体コナツムマブ（Ｃｏｎａ）の融合タンパク質が、ＣＤ７０依存的に炎症誘発性（Ａ）及び細胞毒性（Ｂ）ＴＲＡＩＬＲ２シグナル伝達をますます刺激する。ＣＤ７０をコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を一過性トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を、ＴＲＡＩＬＲ２応答性ＨＴ１０８０細胞と共培養した（ＣＤ７０発現なし）。共培養物を２．５μｇ／ｍｌのＣＨＸ（Ｂ）又はＣＨＸ＋２０μＭのカスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤ（Ａ）で処理して、ＴＲＡＩＬＲ２シグナル伝達用のＨＴ１０８０細胞を感作した。ＣＨＸは、代謝回転が高いＴＲＡＩＬＲ２シグナル伝達阻害性ＦＬＩＰタンパク質の発現を抑制する。ＺＶＡＤはアポトーシスを予防し、ＴＲＡＩＬＲ２の遺伝子誘導特性の評価が可能となる。次いで、共培養物を、示された濃度の抗−ＴＲＡＩＬＲ２（Ｃｏｎａ）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＣＤ７０（９Ｇ２）でさらに処理し、その翌日、ＩＬ８産生を、ＥＬＩＳＡ（Ａ）、又はクリスタルバイオレット染色（Ｂ）で、生存率により測定した。
【００６０】
図２４は、ＣＤ４０特異的抗体ＣのＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）又はＦａｂ２フォーマットと、チェックポイント阻害剤であるアベルマブ（Ａｖｅ）を標的とするＰＤ−Ｌ１から誘導されたｓｃＦｖとの融合タンパク質が、ＰＤ−１Ｌ制限的にＣＤ４０を活性化することを示す。ＰＤ−１Ｌをコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を一過性トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を、ＣＤ４０応答性ＨＴ１０８０−ＣＤ４０細胞と共培養した。次いで、共培養物を、示された濃度の抗ＣＤ４０（Ｃ）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＰＤ−Ｌ１（Ａ）又は抗ＣＤ４０（Ｃ）−Ｆａｂ２−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＰＤ−Ｌ１（Ｂ）で処理した。翌日、ＣＤ４０活性化の指標としてのＩＬ８産生をＥＬＩＳＡで測定した。
【００６１】
図２５は、ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）又はＦａｂ２フォーマットの４１ＢＢ特異的抗体ＨＢＢＫと、チェックポイント阻害剤であるアベルマブ（Ａｖｅ）から誘導されたｓｃＦｖとの融合タンパク質が、ＰＤ−１Ｌ制限的に４１ＢＢを活性化することを示す。ＰＤ−１Ｌをコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を一過性トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を、４１ＢＢ応答性ＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞と共培養した。次に共培養物を、示された濃度の抗４１ＢＢ（ＨＢＢＫ）−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＰＤ−Ｌ１（Ａ）又は抗４１ＢＢ（ＨＢＢＫ）−Ｆａｂ２−ＨＣ：ｓｃＦｖ：ＰＤ−Ｌ１（Ｂ）で処理した。翌日、４１ＢＢ活性化の指標としてのＩＬ８産生をＥＬＩＳＡで測定した。
【００６２】
図２６は、４１ＢＢに特異的なｓｃＦｖを備えるＩｇＧ２フォーマットにおけるＰＤ−１Ｌ特異的抗体アベルマブ（Ａｖｅ）の融合タンパク質が、ＰＤ−１Ｌ制限的に増強された４１ＢＢを活性化することを示す。ＰＤ−１Ｌをコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を一過性トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を、４１ＢＢ応答性ＨＴ１０８０−４１ＢＢ細胞と共培養した。次に、共培養物を、示された濃度の抗ＰＤ−Ｌ１（Ａｖｅ）−ＩｇＧ２−ＨＣ：ｓｃＦｖ：４１ＢＢ（ＨＢＢＫ）で処理した。翌日、４１ＢＢ活性化の指標としてのＩＬ８産生をＥＬＩＳＡで測定した。この実施例は、ＴＮＦＲＳＦの受容体に対する抗体から誘導されたｓｃＦｖが、細胞表面露出抗原を認識する抗体と融合した後、アンカー依存性アゴニスト活性を獲得することを示す。このように、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡの原理は、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体をＴＮＦＲＳＦ受容体刺激エフェクタードメインとして、ｓｃＦｖをアンカードメインとして作用させるが、抗体をアンカードメインとして、ＴＮＦＲＳＦ受容体特異的ｓｃＦｖをエフェクタードメインとして、ミラーフォーマットで作用する。
【００６３】
図２７は、Ｆｎ１４特異的ｓｃＦｖ  １８Ｄ１を備えるＩｇＧ（Ｎ２９７Ａ）フォーマットのマウスＣＤ２７特異的抗体の融合タンパク質が、マウスＣＤ２７制限的に増強されたＦｎ１４を活性化することを示す。マウスＣＤ２７をコードする発現プラスミド又は空ベクターでトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を一過性トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞（Ｆｎ１４応答性が低い）を、高度にＦｎ１４応答性のＨＴ１０８０細胞と共培養した。次いで、共培養物を、示された濃度の抗ｍｕＣＤ２７−ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）−ＨＣ：ｓｃＦｖ１４（１８Ｄ１）で処理した。翌日、Ｆｎ１４活性化の指標としてのＩＬ８産生をＥＬＩＳＡで測定した。この実施例は、ＴＮＦＲＳＦの受容体に対する抗体から誘導されたｓｃＦｖが、細胞表面提示抗原を認識する抗体と融合した後に、アンカー依存性アゴニスト活性を獲得することを再度示す。このように、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡの原理は、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体をＴＮＦＲＳＦ受容体刺激エフェクタードメインとして、ｓｃＦｖをアンカードメインとして作用させるが、抗体をアンカードメインとして、ＴＮＦＲＳＦ受容体特異的ｓｃＦｖをエフェクタードメインとして、ミラーフォーマットで作用する。
【００６４】
発明の詳細な説明
定義及び一般技術
以下に特段の定めがない限り、本発明で用いられる用語は、当業者に公知の共通の意味に従って理解されるべきである。
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００６５】
本明細書中で用いられる用語「ｓｃＴＮＦＳＦ」は、単鎖系機能性（受容体結合性を意味する）ＴＮＦＳＦリガンドをいう。通常、ｓｃＴＮＦＳＦは、ＴＮＦＳＦプロトマーの受容体結合ドメインの３つのポリペプチドリンカーにより連結され、分子内三量体を形成するユニットを含む。
【００６６】
用語「抗体」は、本明細書中で用いられる場合、目的の抗原に特異的に結合しうるいかなる機能性抗体をも意味し、Paul,  W.E.  (Ed.)：Fundamental  Immunology  2nd  Ed.  Raven  Press,  Ltd.,  New  York  1989の第７章に一般的に概説されており、これは、本明細書中に参考として援用される。用語「抗体」は、モノマー抗体（例えば、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ）又はオリゴマー抗体（例えば、ＩｇＡ又はＩｇＭ）を包含する。用語「抗体」はまた、特に限定されず、単離された抗体及び修飾された抗体、例えば遺伝子操作された抗体、例えばキメラ抗体又はヒト化抗体を包含する。
【００６７】
抗体のドメインの命名法は、当業界で公知の用語に従う。抗体の各モノマーは、当業界で一般的に公知なように、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。これらのうち、各重鎖及び軽鎖は、抗原結合に重要な可変ドメイン（重鎖ではＶＨ、軽鎖ではＶＬという）を含む。当該重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４（ＦＲ、フレームワーク領域；ＣＤＲ、超可変領域としても知られる相補性決定領域）領域を（Ｎ末端からＣ末端の順に）含む。抗体配列内の上記の抗体領域の同定及び譲渡は、一般に、Ｋａｂａｔら（Sequences  of  proteins  of  immunological  interest,  U.S.  Dept.  of  Health  and  Human  Services,  Public  Health  Service,  National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  Md.  1983）、又はＣｈｏｔｈｉａら（Conformations  of  immunoglobulin  hypervariable  regions.  Nature.  1989  Dec  21-28;342(6252):877-83.）に従うか、又はＧｉｕｄｉｃｅｌｌｉら（IMGT/V-QUEST,  an  integrated  software  program  for  immunoglobulin  and  T  cell  receptor  V-J  and  V-D-J  rearrangement  analysis.  Nucleic  Acids  Res.  2004  Jul  1;32(Web  Server  issue)：W435-40.）に従う。好ましくは、上記の抗体領域は、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴソフトウェアを用いて同定され、割り当てられる。
【００６８】
用語「モノクローナル抗体」は、本質的に均質な抗体集団由来の抗体であって、当該抗体は、配列が実質的に同一であり（すなわち、Ｎ末端及びＣ末端におけるアミノ酸修飾等の配列の自然発生修飾を含む抗体の少数の画分を除き、同一である）、単一のエピトープ又は多数の異なるエピトープに対する異なる抗体の混合物を含むポリクローナル抗体と異なり、モノクローナル抗体は、同一のエピトープを指向するため、高度に特異的である。用語「モノクローナル抗体」は、単一の細胞クローンに由来するモノクローナル細胞集団から得られる（ただし、これに限定されない）抗体を含み、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Nature,  1975  Aug  7;256(5517):495-7)）又はＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（“Antibodies:  A  Laboratory  Manual”  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  New  York  1988）に記載されたハイブリドーモノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Nature.  1991  Aug  15;352(6336):624-8）又はＭａｒｋｓら（J  Mol  Biol.  1991  Dec  5;222(3):581-97）に記載されるようなファージディスプレイ技術を含む他の適当な方法からも獲得しうる。モノクローナル抗体は、当業界で公知の方法により、Ｋｄ値の低下、会合の最適化及び解離動態等の抗原結合特性について最適化された抗体でありうる。例えば、Ｋｄ値は、ファージディスプレイを含むディスプレイ法により最適化されてよく、その結果、アフィニティー成熟モノクローナル抗体が得られる。用語「モノクローナル抗体」は、特定起源の種又は単一起源の種に由来する抗体配列に限定されず、用語「モノクローナル抗体」は、ヒト化モノクローナル抗体及びヒト抗体等のキメラモノクローナル抗体を包含する。
【００６９】
「ヒト化抗体」とは、ヒト配列及び対象となる抗原に対する結合特異性を付与する非ヒト配列の少数部分を含む抗体である。通常、ヒト化抗体は、ヒト受容体抗体からの超可変領域配列を、目的の抗原に結合する非ヒトドナー抗体（例えば、マウス、ウサギ、ラットのドナー抗体）からの超可変領域配列で置換されて生成される。いくつかの場合、受容体抗体のフレームワーク領域配列はまた、ドナー抗体の対応する配列により置換されうる。「ヒト化抗体」は、ドナー及び受容体の抗体に由来する配列及び、他の（付加された、又は置換された）残基又は配列を含有してよく、又は含有しなくてもよい。当該他の残基又は配列は、結合特性（例えば、Ｋｄ値を低下させる）及び／又は免疫原性特性（例えば、ヒトにおける抗原性を低下させる）等の抗体特性のさらなる改善に貢献しうる。ヒト化抗体を作製する方法の非限定的な例は、当業界で公知であり、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Nature.  1988  Mar  24;  332(6162):323-7）又はＪｏｎｅｓら（Nature.  1986  May  29-Jun  4;  321(6069):522-5）から公知である。
【００７０】
用語「ヒト抗体」は、ヒト可変ドメイン配列及び定常ドメイン配列を含む抗体に関し、この定義は、結合特性（例えば、Ｋｄ値を低下させる）及び／又は免疫原性特性（例えば、ヒトにおける抗原性を低下させる）等の抗体特性をさらに高めるのに貢献しうる単一アミノ酸が置換又は修飾されたヒト配列を備える抗体を包含し、用語「ヒト抗体」は、非ヒト配列の一部が対象抗原に対して結合特異性を付与するようなヒト化抗体を除く。
【００７１】
本明細書中で用いられる抗体の「抗原結合部分」とは、抗体の抗原に対する特異的結合能が保持された抗体の部分をいう。当該能力は、例えば、当業界で公知の方法で、抗体と競合する抗原結合部分の抗原への特異的結合能を判定して決定しうる。抗原結合部分は、抗体の１又はそれ以上の断片を含んでよい。特に限定されることなく、抗原結合部分は、組換えＤＮＡ法及び抗体の化学的又は酵素的断片化による調製を含め、当業界で公知のいかなる適当方法により作製しうる。抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ２断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体、二重特異性抗体、又は抗体の抗原に対する特異的結合能が保持された抗体のいかなる他の部分であってよい。当業界で公知の用語「Ｆａｂ２」の意味によれば、用語「Ｆａｂ２」は、用語「Ｆａｂ２」、「Ｆａｂ２」、及び「ＦＡＢ２」と同義であることが理解されるであろう。従って、本出願の目的のため、用語「Ｆａｂ２」は、「Ｆａｂ２」、「Ｆａｂ２」、及び「ＦＡＢ２」という用語と互換的に用いられる。本発明に関する「細胞表面の前記構造及び／又は細胞外マトリクスの前記構造に結合しうる抗原結合部分」は、特に限定されない。例えば、腫瘍抗原に結合しうる抗原結合部分でありうる。「細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分」は、好ましくは、抗ＣＤ２０抗原結合部分、抗ＣＤ７０抗原結合部分、抗ＣＤ１９抗原結合部分、抗ＣＤ１９抗原結合部分、ＥＧＦＲ抗原結合部分、抗Ｈｅｒ２抗原結合部分、抗Ｆｎ１４抗原結合部分、抗ＣＤ４０Ｌ抗原結合部分、及び抗ＰＤ１Ｌ抗原結合部分からなる群から選択される。あるいは、本発明の「細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうる抗原結合部分」は、抗ＦＡＰ抗原結合部分、抗ＢＣＭＡ抗原結合部分、又は抗Ｆｌｔ３抗原結合部分であってよい。
【００７２】
「抗体」（例えば、モノクローナル抗体）又は「抗原結合部分」は、誘導体化されていてもよく、又は異なる分子に結合されてよい。例えば、抗体に結合されうる分子は、他のタンパク質（例えば、他の抗体）、分子標識（例えば、蛍光、発光、着色又は放射性分子）、医薬である。当該抗体又は抗原結合部分は、直接的に（例えば、２つのタンパク質が融合された形態で）、又はリンカー分子（例えば、当業界で公知のいかなる適当タイプの化学的リンカー）を介して連結されうる。
【００７３】
融合タンパク質に関する本発明の記載「抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分」は、少なくとも１つのＴＮＦＲＳＦ受容体に対する抗体又はその抗原結合部分であれば、特に限定されない。本発明の全ての他の態様による好ましい態様では、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分は、単一型のＴＮＦＲＳＦ受容体に対する抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分でありうる。本発明の他の全ての態様による別の好ましい態様では、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分は、２つの異なるタイプのＴＮＦＲＳＦ受容体に対する二価抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分でありうる。
【００７４】
用語「結合」又は「結合」は、本明細書中で用いられる場合、目的の抗原への特異的結合をいう。好ましくは、Ｋｄ値は、１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満、さらにより好ましくは１０ｎＭ未満、さらにより好ましくは５ｎＭ未満、最も好ましくは２ｎＭ未満である。
【００７５】
用語「エピトープ」は、本明細書中で用いられる場合、抗体の結合部位を形成する抗原の小部分をいう。
【００７６】
本発明の文脈では、抗体又は抗体融合タンパク質の結合特性を特徴付ける目的で、対象の抗原、ＦｃγＲ、又は細胞表面若しくは細胞外マトリクスの構造に対する本発明の抗体又は融合タンパク質（例えば、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡ）の結合又は競合結合は、好ましくは、抗体又は融合タンパク質のルシフェラーゼ標識（例えば、Gaussia  princeps  luciferase  （ＧｐＬ））変異体を用いて、細胞結合試験（例えば、Kums  et  al.，MAbs．2017  Apr；9(3)：506-520に記載されているように）により、又は参照標準アッセイとして表面プラズモン共鳴測定により、測定される。
【００７７】
用語「ＫＤ」又は「ＫＤ値」は、当業界で公知の平衡解離定数に関する。本発明の文脈では、当該用語は、対象の特定の抗原又は対象のＦｃγＲに関して、又は細胞表面若しくは細胞外マトリクスの構造に関して、本発明の抗体又は融合タンパク質（例えば、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡ）の平衡解離定数に関する。平衡解離定数は、複合体（例えば、抗原−抗体複合体）がその成分（例えば、抗原と抗体）に可逆的に解離する傾向の評価基準である。本発明による抗体又は融合タンパク質について、ＫＤ値は、好ましくは、抗体又は所望の融合タンパク質（例えば、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡ）及び非修飾抗体又は融合タンパク質（例えば、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡ）のＧｐＬタグ付き変異体を用いた細胞競合結合試験により、又は表面プラズモン共鳴測定を行って、測定される。
【００７８】
本明細書で本発明による抗体又はその抗原結合部分に関連して用いられる、ＴＮＦＲＳＦ受容体等の特定のタンパク質への結合について「抗体と交差競合しうる」との用語は、一般に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の当業界で公知のアッセイを行う場合に、抗体又はその抗原結合部分が交差競合しうることをいう。当業者であれば、当該特異的結合のための相互競合を検出するための適当な条件を決定しうるであろう。
【００７９】
用語「単離（された）抗体」又は「単離（された）ＴＲＡＡＦＦＩＡ」又は「単離（された）融合タンパク質」は、本明細書中で用いられる場合、例えば、その産生に用いたハイブリドーマ細胞培養又は異なる細胞培養の成分（例えば、ＴＲＡＡＦＦＩＡ等の抗体又は融合タンパク質を組換え発現するＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞等のプロデューサー細胞）から、その起源環境の大部分の成分（重量）から同定され、分離される。当該分離は、所望の用途（例えば、本発明に関するＴＲＡＡＦＦＩＡ等の抗体又は融合タンパク質の治療用途）に対する抗体又は融合タンパク質の適合性を阻害しうる成分を十分に除去するように行われる。単離された抗体又は抗体融合タンパク質を調製する方法は当業界で公知であり、プロテインＡクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ウイルス保持濾過及び限外濾過を含む。好ましくは、ＴＲＡＡＦＦＩＡ調製物等の単離された抗体又は融合タンパク質は、Ｌｏｗｒｙタンパク質アッセイを用いて測定すると、少なくとも７０％の純度（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも８０％の純度（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは少なくとも９０％の純度（ｗ／ｗ）、さらに好ましくは少なくとも９５％の純度（ｗ／ｗ）、最も好ましくは少なくとも９９％の純度（ｗ／ｗ）である。
【００８０】
用語「二価抗体」は、本明細書中で用いられる場合、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対合しえないペプチドリンカーにより連結された、同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変ドメインに連結された重鎖可変ドメインを含む、小さな二価抗原結合抗体部分である。このため、他鎖の相補的ドメインと対合し、二量体分子が二つの抗原結合部位と会合する。二価抗体は、二価及び一特異的であってよく（例えば、抗原に対する２つの抗原結合部位がある二価抗体）、又は二価及び二特異的であってよい（例えば、２つの抗原結合部位があり、その一方は抗原に対する結合部位であり、他方は異なる抗原に対する結合部位である、二価抗体）。二価抗体の詳細な説明は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐら（  ““Diabodies”：small  bivalent  and  bispecific  antibody  fragments.”Proc  Natl  Acad  Sci  USA．1993Jul15；90(14)：6444-8.）に記載される。
【００８１】
用語「単一ドメイン抗体」（「Nanobody（商標）」ともいう）は、本明細書中で用いられる場合、単一のモノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片である。単一ドメイン抗体の構造及びその作製方法は、当業界で公知であり、例えば、Ｈｏｌｔ  ＬＪら（“Domain  antibodies：proteins  for  therapy.”Trends  Biotechnol.2003Nov；21(11)：484-90.）、Ｓａｅｒｅｎｓ  Ｄら（“Single-domain  antibodies  as  building  blocks  for  novel  therapeutics.”Curr  Opin  Pharmacol．2008Oct；8(5)：600-8．Epub2008Aug22.）、及びＡｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  Ｍ  ら（“Selection  and  identification  of  single  domain  antibody  fragments  from  camel  heavy-chain  antibodies．”FEBS  Lett．1997Sep15；414(3):521-6.）から公知である。
【００８２】
本発明に関連して本明細書中で言及される「融合タンパク質」は、融合タンパク質の部分が共有結合により融合されるのであれば、特定のタイプの融合タンパク質に限定されない。例えば、融合タンパク質の部分は、１又はそれ以上の単一ポリペプチド鎖中での発現、１又はそれ以上のジスルフィド結合、化学的結合（好ましくは、クリック化学を用いた化学的結合）及び／又はタンパク質に適した結合として当業界で公知のいかなる他の共有結合により融合させうる。好ましくは、融合タンパク質の部分は、１又はそれ以上の単一ポリペプチド鎖における発現及び／又は１又はそれ以上のジスルフィド結合により融合される。従って、本発明の融合タンパク質において、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分、及び細胞表面構造及び／又は細胞外マトリクス構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメインは、１又はそれ以上の単一ポリペプチド鎖における発現、１又はそれ以上のジスルフィド結合、化学的結合（好ましくはクリック化学を用いた化学的結合）、及び／又はタンパク質に適した結合として当業界で公知のいかなる他の共有結合によりも融合しうる。好ましくは、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分、及び細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメインを、１又はそれ以上の単一ポリペプチド鎖における発現及び／又は１又はそれ以上のジスルフィド結合により融合させる。本発明の全ての実施形態において、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメインは、以下の：
−抗体の抗原結合部分であって、前記抗原結合部分は、細胞表面の前記構造及び／又は細胞外マトリクスの前記構造に結合でき、前記抗原結合部分は、１又は複数のＦｃγＲ型への結合能が低下しており、前記抗原結合部分は、Ｆａｂ２断片である；又は
−細胞表面の前記構造及び／又は細胞外マトリクスの前記構造に結合しうる全長抗体；
を含む。
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分は、化学的結合により、好ましくはクリック化学を用いた化学的結合により融合されることが非常に好ましい。
【００８３】
一般に、本発明の全ての融合タンパク質に関して、融合タンパク質の部分（例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分、及び細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメイン）は、リンカー配列を用いて融合されうることが理解されるであろう。その場合、本発明の融合タンパク質は当該リンカー配列を含むであろう。適当なリンカー配列は、当業界で公知であり、例えば、ペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分と、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメインとが、１又は複数の単一ポリペプチド鎖における発現により融合される本発明の融合タンパク質では、前記１又は複数の単一ポリペプチド鎖は、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又はその抗原結合部分と、細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメインとの間の１又は複数のペプチドリンカー配列を含みうる。
【００８４】
本発明に関連する用語「細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に、ＦｃγＲ非依存的に結合しうるドメイン」は、当該ドメインが、ＦｃγＲとは異なる細胞表面の構造及び／又は細胞外マトリクスの構造に結合しうることを意味する。特段の定めがない限り、これは、ドメインがＦｃγＲに結合しうるさらなる部分（例えば、Ｆｃドメイン）も含みうる可能性を除外しない。
【００８５】
本発明によれば、用語「含む」が用いられる各箇所は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ  ｏｆ）」で置換されてもよい。
【００８６】
方法及び技術
一般に、本明細書に特段の定めがない限り、本発明で用いられる方法（例えば、クローニング方法又は抗体に関する方法）は、当業界で公知の方法、例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，Cold  Spring  Harbor，New  York1989）、Ａｕｓｕｂｅｌら（“Current  Protocols  in  Molecular  Biology．”Greene  Publishing  Associates  and  Wiley  Interscience；New  York  1992）、及びＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（“Antibodies：A  Laboratory  Manual”  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，Cold  Spring  Harbor，New  York  1998）に記載される。
【００８７】
融合タンパク質及びそのドメインの各標的タンパク質への結合は、当業界で公知の方法で評価しうる。結合は、好ましくは、表面プラズモン共鳴測定により評価される。
【００８８】
本発明による配列の配列アラインメントには、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul  et  al.(1990)  “Basic  local  alignment  search  tool.”  Journal  of  Molecular  Biology  215.  p.  403-410.;  Altschul  et  al.:  (1997)  Gapped  BLAST  and  PSI-BLAST:  a  new  generation  of  protein  database  search  programs.  Nucleic  Acids  Res.  25:3389-3402.これらの全ては、参照により本明細書に援用される）が用いられる。好ましくは、以下のパラメータが用いられる：  Ｍａｘ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  １０；  Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ  ３；  ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｍａｔｒｉｘ；ギャップコスト：存在１１、拡張１；条件付き組成スコア行列調整。従って、用語「同一性」又は「同一である」等が配列に関して用いられる場合、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて得られる同一性の値をいう。
【００８９】
本発明による抗体融合タンパク質は、Ｓｉｅｇｅｌ  ＤＬ（“Recombinant  monoclonal  antibody  technology．”Transfus  Clin  Biol．2002Jan；9(1)：15-22、これは参照により本明細書に援用される）で記載の方法を含むが、これに限定されない、当業界で公知のいかなる方法により製造しうる。
【００９０】
ＴＮＦＲＳＦ受容体の刺激は、当業界で公知のいかなる方法でも測定しうる。例えば、ＴＮＦＲＳＦ受容体ＴＮＦＲ２、ＣＤ４０、ＣＤ９５、Ｆｎ１４の場合、細胞系ＩＬ８分泌アッセイ、及びその後の分泌ＩＬ８を例えば、ＥＬＩＳＡにより検出することで、刺激を測定しうる。当該細胞系ＩＬ８分泌アッセイに用いうる細胞の非限定的な例は、ＣＤ４０刺激測定用ＨＴ１０８０  ＣＤ４０トランスフェクタント、Ｆｎ１４刺激測定用Ｗｉｄｒ細胞、ＣＤ９５刺激測定用Ｈ１０８０細胞、及びＴＮＦＲ２刺激測定用ＴＮＦＲ２発現ＨｅＬａトランスフェクタントである。当該アッセイの非限定的な例は、実施例１〜３及び対応する図に見出すことができる。ＣＤ９５等の、刺激されると細胞毒性作用を呈するＴＮＦＲＳＦ受容体については、細胞死誘導を阻害するため、ＺＶＡＤ等の細胞透過性カスパーゼ阻害剤をアッセイに加えることが、好ましい。本発明の融合タンパク質（例えば、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡＳ）で処理される様々なＴＮＦＲＳＦ受容体の刺激は、古典的ＮＦκＢ経路の刺激（例えば、ＩκＢαのリン酸化及び分解、ＩＫＫ活性化、ｐ６５のリン酸化及び核移行、標的遺伝子の検出）又は代替ＮＦκＢ経路の検出（例えば、ｐ１００プロセシング、ＮＩＫ蓄積）を可能にするいかなる方法によっても測定しうる。ＴＲＡＡＦＦＩＡＳによるＣＤ９５及びＴＲＡＩＬ細胞死受容体（ＤＲ４、ＤＲ５）の刺激もまた、様々な方法により測定する細胞死誘導を評価しうる。ＴＲＡＡＦＦＩＡによるＣＤ４０刺激は、樹状細胞の成熟度を測定することで、さらに評価しうる。
【００９１】
本発明の組成物の調製
本発明による組成物は、医薬組成物の調製のための公知の基準に従って調製される。
【００９２】
例えば、組成物は、例えば、担体、賦形剤又は安定剤等の薬学的に許容される成分を添加して調製することで、適当に保存及び投与されうる。
【００９３】
当該薬学的に許容される成分は、当該医薬組成物の患者への投与量では、毒性でない。当該医薬組成物に添加される薬学上許容される成分は、当該医薬組成物の特定の意図される用途及び投与経路に依存してよい。
【００９４】
一般に、本発明に関連して使用される薬学的に許容される成分は、当業界で利用可能な知識、例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences，Ed．AR  Gennaro，20th  edition，2000，Williams&Wilkins，PA，USAから入手可能な知識により用いられる。
【００９５】
配列
本出願で記載されるアミノ酸配列は、１文字アミノ酸コードを用いてＮ末端からＣ末端の順序で表される。本出願で記載される核酸配列は、標準的な核酸コードを用いて５’から３’の順序で表される。星印はタンパク質配列の末端を示す。下線がひかれた核酸配列は、制限エンドヌクレアーゼ部位を表す。
【００９６】
本出願の実施例で、以下の非限定的な例示的配列を用いた：
【００９７】
【表１】
2021508478.tif 000008
【００９８】
【表２】
2021508478.tif 000009
【００９９】
【表３】
2021508478.tif 000010
【０１００】
【表４】
2021508478.tif 000011
【０１０１】
【表５】
2021508478.tif 000012
【０１０２】
【表６】
2021508478.tif 000013
【０１０３】
【表７】
2021508478.tif 000014
【０１０４】
【表８】
2021508478.tif 000015
【０１０５】
【表９】
2021508478.tif 000016
【０１０６】
【表１０】
2021508478.tif 000017
【０１０７】
【表１１】
2021508478.tif 000018
【０１０８】
【表１２】
2021508478.tif 000019
【０１０９】
【表１３】
2021508478.tif 000020
【０１１０】
【表１４】
2021508478.tif 000021
【０１１１】
【表１５】
2021508478.tif 000022
【０１１２】
【表１６】
2021508478.tif 000023
【０１１３】
【表１７】
2021508478.tif 000024
【０１１４】
【表１８】
2021508478.tif 000025
【０１１５】
【表１９】
2021508478.tif 000026
【０１１６】
【表２０】
2021508478.tif 000027
【０１１７】
【表２１】
2021508478.tif 000028
【０１１８】
【表２２】
2021508478.tif 000029
【０１１９】
【表２３】
2021508478.tif 000030
表２：  ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔによる）。ＣＤＲ配列の重鎖及び軽鎖は、各々「−Ｈ」及び「−Ｌ」で示される。
【０１２０】
【表２４】
2021508478.tif 000031
【０１２１】
【表２５】
2021508478.tif 000032
【０１２２】
【表２６】
2021508478.tif 000033
【０１２３】
【表２７】
2021508478.tif 000034
【０１２４】
【表２８】
2021508478.tif 000035
【０１２５】
【表２９】
2021508478.tif 000036
【０１２６】
【表３０】
2021508478.tif 000037
【０１２７】
【表３１】
2021508478.tif 000038
【０１２８】
【表３２】
2021508478.tif 000039
【０１２９】
【表３３】
2021508478.tif 000040
【０１３０】
【表３４】
2021508478.tif 000041
【０１３１】
【表３５】
2021508478.tif 000042
以下の配列番号１２６〜１４３のアミノ酸配列は、抗４−１ＢＢモノクローナル抗体ＨＢＢＫ４（本出願の非限定的な実施例で用いられる）、ＵＲＥＬＵＭＡＢ及びＵＴＯＭＩＬＵＭＡＢのＣＤＲ配列である。用語「ＣＤＲ１−Ｈ」、「ＣＤＲ２−Ｈ」及び「ＣＤＲ３−Ｈ」は各々、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖をいい、用語「ＣＤＲ１−Ｌ」、「ＣＤＲ２−Ｌ」及び「ＣＤＲ３−Ｌ」は各々、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の軽鎖をいうことに留意されたい。
【０１３２】
【表３６】
2021508478.tif 000043
【０１３３】
【表３７】
2021508478.tif 000044
【０１３４】
【表３８】
2021508478.tif 000045
【０１３５】
【表３９】
2021508478.tif 000046
【０１３６】
【表４０】
2021508478.tif 000047
【０１３７】
【表４１】
2021508478.tif 000048
【０１３８】
【表４２】
2021508478.tif 000049
【０１３９】
【表４３】
2021508478.tif 000050
【０１４０】
【表４４】
2021508478.tif 000051
【０１４１】
【表４５】
2021508478.tif 000052
【０１４２】
【表４６】
2021508478.tif 000053
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに例示される。
【実施例１】
【０１４３】
抗ＣＤ４０  ＩｇＧ１  Ｇ２８．５のＴＮＦＲ２結合融合タンパク質は、ＴＮＦＲ２結合後にＣＤ４０刺激活性が高まった。
【０１４４】
ＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０を認識するＩｇＧ１抗体Ｇ２８．５の融合タンパク質（抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＨＣ：ｓｃＴＮＦ８０）を、短いペプチドリンカー（ｓｃＴＮＦ８０（ｍｕ）ドメイン）により連結されたネズミＴＮＦのＴＮＦＲ２特異的突然変異体の３つのコピーを含む単一鎖ドメインと共に分析し、当該コピーが分子内に三量体リガンドドメインを形成する際に、本発明者らは以下の驚くべき観察を行った：
ＦｃγＲ又はＴＮＦＲ２発現を示さないＣＤ４０発現細胞又は細胞共培養物を、抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＨＣ：ｓｃＴＮＦ８０で刺激すると、その結果は、例えば、ＩＬ８の産生により反映されるＣＤ４０活性化が著しく低いか、又は単に生じない。対照的に、ＦｃγＲ発現細胞の存在下では、上記分子は予想通りＣＤ４０を極めて良好に活性化する（上記説明参照）。今回、抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＨＣ：ｓｃＴＮＦ８０は、親のＧ２８．５抗体とは異なり、ＴＮＦＲ２を発現させると、ＦｃγＲの非存在下でも強力にＣＤ４０を活性化しうることが明らかになった（図６）。抗ＣＤ４０（Ｇ２８．５）−ＨＣ：ｓｃＴＮＦ８０の細胞結合ＴＮＦＲ２へのｓｃＴＮＦ８０ドメイン媒介結合は、Ｆｃドメイン媒介性のＧ２８．５のＦｃγＲ発現細胞への結合と同様に、アゴニスト抗体効果を呈しうることが明らかである（図２）。これは、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又は抗体融合タンパク質の細胞への単なる抗原結合ドメイン非依存性結合が各々、抗体及び抗体融合タンパク質に対して高いアゴニスト活性を与えるのに十分であることを示す。
【実施例２】
【０１４５】
ＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０、ＣＤ９５及びＴＮＦＲ２に対する抗体の融合タンパク質が、細胞結合分子への結合を介在するタンパク質ドメインと融合すると、強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用する。
【０１４６】
抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体又は抗体融合タンパク質の細胞への単なる抗原結合ドメイン非依存性結合は各々、抗体及び抗体融合タンパク質に対して高いアゴニスト活性を与えるのに十分であるという仮説に従い、本発明者らは、細胞結合分子への結合を介在するタンパク質ドメインと融合されたＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０、ＣＤ９５及びＴＮＦＲ２を認識する抗体ドメインが、強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用する他の抗体融合タンパク質もまた、ＦｃγＲ非依存的に作用することを実証しえた。当該例の詳細については、図の凡例を含めて図４、５、８、９を参照のこと。
【実施例３】
【０１４７】
細胞表面抗原を標的とするｓｃＦｖドメインがあるＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０、ＣＤ９５及びＴＮＦＲ２に対する抗体の融合タンパク質は、強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用する。
【０１４８】
さらに、本発明者らは、ＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０、ＣＤ９５及びＴＮＦＲ２に対する抗体の融合タンパク質を各々、ＣＤ２０（図１０、１１及び１２）及びＣＤ１９（図７及び１２）を標的とする細胞表面抗原標的ｓｃＦｖドメインと共に試験した。当該融合タンパク質は、強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用することが見出された。当該例の詳細については、引用されている図とその図の説明文を参照されたい。
【実施例４】
【０１４９】
ＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０及びＣＤ９５に対する抗体とｓｃＢａｆｆとの融合タンパク質は、強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用する。
【０１５０】
さらに、本発明者らは、ＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０（図１３、１４及び１５）及びＣＤ９５（図１６、１７及び１８）に対する抗体の融合タンパク質又は抗体の断片をｓｃＢａｆｆで調べた。当該融合タンパク質は、融合タンパク質のｓｃＢａｆｆドメインにより認識される細胞表面発現受容体に融合タンパク質が結合しうる場合は、ＣＤ４０及びＣＤ９５に対する強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用することが見出された。当該例の詳細は、上記図及びその図の説明に示される。
【実施例５】
【０１５１】
ＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０、ＣＤ９５、ＴＮＦＲ２及び４−１ＢＢに対する抗体のｓｃＦｖ融合タンパク質は、ＦｃγＲ非依存的、ｓｃＦｖ依存的に強力なアゴニストとして作用する。
【０１５２】
さらに、本発明者らは、ＴＮＦＲＳＦ受容体ＴＮＦＲ２（図１９及び２０）、ＣＤ４０（図２１及び２２）、ＣＤ９５（図２１及び２２）及び４−１ＢＢ（図２１及び２２）に対する抗体のｓｃＦｖ融合タンパク質を試験した。用いたｓｃＦｖ断片はｓｃＦｖ：ＣＤ２０（図１９、２１及び２２）、ｓｃＦｖ：ＣＤ７０（２Ｈ５）（図２０）及びｓｃＦｖ：ＣＤ７０（１Ｆ６）（図２０）であった。これらの融合タンパク質は、ｓｃＦｖドメインにより認識される細胞表面抗原（ＣＤ２０、ＣＤ７０）にそのｓｃＦｖドメインを介して結合しうる場合は、抗体部分（ＴＮＦＲ２、ＣＤ４０、ＣＤ９５、４−１ＢＢ）により認識されるＴＮＦＲＳＦ受容体に対する強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用することが見出された。当該例の詳細は、上記の図及びその図の説明に示される。
【実施例６】
【０１５３】
ＴＮＦＲＳＦ受容体ＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５）のｓｃＦｖ融合タンパク質は、ＦｃγＲ非依存的、ｓｃＦｖ依存的に、強力なアゴニストとして作用する。
さらに、本発明者らは、ＴＮＦＲＳＦ受容体ＴＲＡＩＬＲ２に対する抗体（コナツムマブ；Conatumumab）のｓｃＦｖ融合タンパク質（ＤＲ５としても指定）を試験した（図２３）。用いたｓｃＦｖ断片はｓｃＦｖ：ＣＤ７０であった。この融合タンパク質は、そのｓｃＦｖドメインを介して、ｓｃＦｖドメインにより認識される細胞表面抗原ＣＤ７０に結合しうる場合は、抗体部分（ＴＲＡＩＬＲ２）により認識されるＴＮＦＲＳＦ受容体に対する強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用することが見いだされた。
【実施例７】
【０１５４】
アンカードメインとしてＰＤ−１Ｌ  ＰＤ−１相互作用を遮断するチェックポイント阻害剤から誘導されたｓｃＦｖがある、抗原提示細胞刺激ＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０又はＴ細胞刺激ＴＮＦＲＳＦ受容体４−１ＢＢに対する抗体の融合タンパク質は、ＦｃγＲ非依存的、ｓｃＦｖ：ＰＤ−１Ｌ依存的に強力なアゴニストとして作用する。
【０１５５】
本発明者らはまた、ＴＮＦＲＳＦ受容体ＣＤ４０（図２４）及び４−１ＢＢ  （図２５）に対する抗体の融合タンパク質、又は抗体の断片を、ＰＤ−１に結合する抗体遮断性ＰＤ−１Ｌであるチェックポイント阻害剤アベルマブ（Avelumab）由来のｓｃＦｖ：ＰＤ−１Ｌを用いて試験した。これらの融合タンパク質は、融合タンパク質のｓｃＦｖ：ＰＤ−１Ｌドメインにより認識される細胞表面発現ＰＤ−１Ｌに融合タンパク質が結合しうる場合は、ＣＤ４０及び４−１ＢＢに対する強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用することが見出された。すなわち、これらの融合タンパク質は、免疫チェックポイント遮断と、チェックポイント遮断依存性の免疫刺激性ＴＮＦＲＳＦ受容体の制限された活性化とを組み合わせた二機能的抗体の例である。当該例の詳細は、上記の図及びその図の説明に示される。
【実施例８】
【０１５６】
ＴＮＦＲＳＦ受容体Ｆｎ１４及び４−１ＢＢに特異的なｓｃＦｖは、細胞表面抗原に固着する完全抗体に融合させると、強力なアゴニストとしてＦｃγＲ非依存的に作用する。
【０１５７】
さらに、本発明者らは、ＰＤ−１Ｌ又はマウスＣＤ２７を認識する抗体を用いて、ＴＮＦＲＳＦ受容体４−１ＢＢ（図２６）及びＦｎ１４（図２７）に対するｓｃＦｖの融合タンパク質を試験した。これらの融合タンパク質は、融合タンパク質の抗体部分がそれらの細胞表面発現抗原ＰＤ−１Ｌ及びマウスＣＤ２７に結合しうる場合は、４−１ＢＢ及びＦｎ１４に対する強力なアゴニストとして、ＦｃγＲ非依存的に作用することが見出された。当該例は、抗ＴＮＦＲＳＦ受容体抗体断片（ここではｓｃＦｖｓ）が、アンカー依存的活性があるアゴニストとして作用しうるには、完全抗体がアンカードメインとして用いられうることを示す。当該例の詳細は、上記の図及びその図の説明に示される。
実施例からの結論
以下固定化ドメインともいう、抗体に融合される、ＦｃγＲ及び抗原結合ドメインに非依存性の細胞相互作用に用いられるドメインは、特に限定されない。従って、本発明者らは、細胞結合にＩＬ２リガンド又はｓｃＴＮＦＳＦリガンドを利用するＴＲＡＡＦＦＩＡＡを製造でき、及び当該ＴＲＡＡＦＦＩＡＡとしては、この目的のために異種ｓｃＦｖ抗体断片が用いられた。アゴニスト活性を得るためには、抗原結合ドメインがＦｃγＲ及び抗原非依存的に細胞に結合することも十分であると考えられる。例えば、ＣＤ２０特異的ｓｃＦｖとの融合により遺伝的に操作されたＣＤ９５特異的抗体Ｅ０９のＦａｂ２断片（図１１）により、ＣＤ２０に依存するＴＮＦＲＳＦ受容体刺激活性が強力に高まることが示された。
【０１５８】
本発明者らの研究から、ＴＲＡＡＦＦＩＡＡに用いられる適当に選択された固定化ドメインを用いると、標的構造に限定される局所アゴニスト効果がｉｎ  ｖｉｖｏで達成されうることが直ちに明らかである。これにより、治療が限定される全身性の副作用を回避しうる。従って、ＴＲＡＡＦＩＡＡによれば、抗体でＴＮＦＲＳＦ受容体は、ＦｃγＲ非依存的に有利に刺激するだけでなく、臨床応用を含む適用分野を新たに進展させる。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
本発明による抗体融合タンパク質及びそれに関連する組成物は、工業的に製造され、市販品、例えば医薬品として販売することができる。従って、本発明は産業上利用可能性がある。
〔参考文献〕
【０１６０】
【表４７】
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【０１６１】
【表４８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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