(57)【要約】  荷電したバイオポリマー分子を検出するとともにナノチャネルを規定するナノポアデバイスは、ナノチャネルの第１の端部をアドレス指定する第１のゲートナノ電極を含む。このデバイスは、ナノチャネルの第１の端部とは反対側の第２の端部をアドレス指定する第２のゲートナノ電極も含む。デバイスはさらに、第１の端部と第２の端部との間のナノチャネル内の第１の位置をアドレス指定する第１の検知ナノ電極を含む。【選択図】図１１
2021531025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電したバイオポリマー分子を検出するナノポアデバイスであって、
前記デバイスが、ナノチャネルを規定し、
前記デバイスが、
前記ナノチャネルの第１の端部をアドレス指定する第１のゲートナノ電極と、
前記第１の端部とは反対側の前記ナノチャネルの第２の端部をアドレス指定する第２のゲートナノ電極と、
前記第１の端部と前記第２の端部との間の前記ナノチャネル内の第１の位置をアドレス指定する第１の検知ナノ電極とを備えることを特徴とするデバイス。
【請求項２】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
荷電したバイオポリマー分子が、負に正味荷電されるか、または等電点とゼータ電位に基づいて規定された正味の電荷であることを特徴とするデバイス。
【請求項３】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
第１の電位が、荷電したバイオポリマー分子の流れを前記第１のゲートナノ電極から前記第２のゲートナノ電極に向けることを特徴とするデバイス。
【請求項４】
請求項３に記載のデバイスにおいて、
前記第１および第２のゲートナノ電極は、前記ナノチャネルに第２の電位を発生させて、前記ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の流れを方向付けるようにも動作可能であることを特徴とするデバイス。
【請求項５】
請求項４に記載のデバイスにおいて、
前記第２の電位が、前記第１の電位の反対であることを特徴とするデバイス。
【請求項６】
請求項４に記載のデバイスにおいて、
前記第２の電位が、荷電したバイオポリマー分子の流れを前記第２のゲートナノ電極から前記第１のゲートナノ電極に向けることを特徴とするデバイス。
【請求項７】
請求項６に記載のデバイスにおいて、
前記第１および第２のゲートナノ電極は、前記ナノチャネルに第１の電位および第２の電位を交互に生成し、それにより前記第１および第２のゲートナノ電極の間で、前記ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の交互に変わる流れを方向付けるようにも動作可能であることを特徴とするデバイス。
【請求項８】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
前記デバイスの内面が、Ａｌ２Ｏ３、ＨｆＯ２、ＳｉＯ２またはＺｎＯを含むことを特徴とするデバイス。
【請求項９】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
ＫＣｌ、ＬｉＣｌおよび脱イオン（ＤＩ）水からなる群のなかから選択される緩衝液をさらに含むことを特徴とするデバイス。
【請求項１０】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
前記ナノポアデバイスが、エンドヌクレアーゼ酵素を用いてバイオポリマーの点突然変異を検出するように構成されていることを特徴とするデバイス。
【請求項１１】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
前記ナノポアデバイスが、固定化されたｄＣａｓ９タンパク質および標的関連ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して、バイオポリマーの標的シークエンシングを実行するように構成されていることを特徴とするデバイス。
【請求項１２】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
前記ナノポアデバイスが、マイクロ流体デバイス、ナノ流体デバイス、ナノデバイスまたはｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐデバイスに組み込まれていることを特徴とするデバイス。
【請求項１３】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
前記ナノポアデバイスが、標的とするバイオポリマーの抽出および検知のためのオールインワンデバイスに組み込まれていることを特徴とするデバイス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のデバイスにおいて、
標的とするバイオポリマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ペプチド、タンパク質固定化抗原および抗体からなる群のなかから選択されることを特徴とするデバイス。
【請求項１５】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
前記ナノポアデバイスが、生体分子の増幅またはＰＣＲの使用なしで検出を実行するために、リキッドバイオプシーパネルプラットフォームに組み込まれていることを特徴とするデバイス。
【請求項１６】
請求項１に記載のデバイスにおいて、
前記ナノポアデバイスが、トンネル電流、横方向トンネル電流または容量性変化に基づいて、第１のバイオポリマープローブへの荷電したバイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するように構成されていることを特徴とするデバイス。
【請求項１７】
荷電したバイオポリマー分子を検出するための方法であって、
ナノチャネルを規定するナノポアデバイスを提供するステップを含み、前記デバイスが、前記ナノチャネルの第１の端部をアドレス指定する第１のゲートナノ電極と、前記第１の端部とは反対側の前記ナノチャネルの第２の端部をアドレス指定する第２のゲートナノ電極と、前記第１の端部と前記第２の端部との間の前記ナノチャネル内の第１の位置をアドレス指定する第１の検知ナノ電極と、前記ナノチャネルを規定する前記デバイスの内面に結合された第１のバイオポリマープローブとを備え、
前記第１および第２のゲートナノ電極が、前記ナノチャネルに第１の電位を発生させて、前記ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の流れを方向付けることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、
前記第１および第２のゲートナノ電極は、前記ナノチャネルに第１の電位および第２の電位を交互に生成し、それにより前記第１および第２のゲートナノ電極の間で、前記ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の交互に変わる流れを方向付けるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法において、
前記ナノポアデバイスが、前記第１の端部と前記第２の端部との間の前記ナノチャネル内の第２の位置をアドレス指定する第２の検知ナノ電極をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法において、
前記ナノポアデバイスが、マイクロ流体デバイス、ナノ流体デバイス、ナノデバイスまたはｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐデバイスに組み込まれていることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法において、
前記ナノポアデバイスが、標的とするバイオポリマーの抽出および検知のためのオールインワンＡＳＩＣプラットフォームシステムに組み込まれていることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１７に記載の方法において、
前記ナノポアデバイスにより、約１０フェムトモル（検出限界）の第１の荷電バイオポリマー分子の最小濃度で、前記第１のバイオポリマープローブへの第１の荷電バイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、
前記ナノポアデバイスにより、前記第１の荷電バイオポリマー分子の増幅またはＰＣＲの使用なしで、前記第１のバイオポリマープローブへの前記第１の荷電バイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法において、
前記ナノポアデバイスが、生体分子の増幅またはＰＣＲの使用なしで検出を実行するために、リキッドバイオプシーパネルプラットフォームに組み込まれていることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、バイオポリマー分子を特徴付けるためのシステムおよびデバイス、並びに、そのようなシステムおよびデバイスを使用して荷電したバイオポリマー分子を検出する方法に関する。特に、本発明は、荷電したバイオポリマー分子を検出するためのナノポアセンサに関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月２７日に弁護士整理番号ＢＴＬ．３０００５．００の下で出願された、「ＮＡＮＯＰＯＲＥ  ＤＥＶＩＣＥ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＣＨＡＲＧＥＤ  ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ  ＵＳＩＮＧ  ＳＡＭＥ」という発明の名称の米国仮出願第６２／７１１，２３４号の優先権を主張するものであり、その内容は、完全に記載されているかのように、その全体が引用により明示的かつ完全に援用されるものとする。本出願は、２０１７年９月２９日に弁護士整理番号１６５−１０１ＵＳＩＰの下で出願された、「ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＥ  ＯＦ  ＴＨＲＥＥ  ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬ  ＮＡＮＯＰＯＲＥ  ＤＥＶＩＣＥ」という発明の名称の共有の米国仮特許出願第６２／５６６，３１３号、２０１７年１２月１日に弁護士整理番号ＢＴＬ．３０００２．００の下で出願された、「ＮＡＮＯＰＯＲＥ  ＤＥＶＩＣＥ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＳＡＭＥ」という発明の名称の米国仮特許出願第６２／５９３，８４０号、並びに、２０１７年１２月３１日に弁護士整理番号ＢＴＬ．３０００３．００の下で出願された、「ＮＡＮＯＰＯＲＥ  ＤＥＶＩＣＥ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＯＦ  ＥＬＥＣＴＲＩＣＡＬ  ＡＲＲＡＹ  ＡＤＤＲＥＳＳＩＮＧ  ＡＮＤ  ＳＥＮＳＩＮＧ」という発明の名称の米国仮特許出願第６２／６１２，５３４号に記載された主題と同様の主題を含む。それらの出願の内容は、完全に記載されているかのように、本明細書に明示的かつ完全に引用により援用されるものとする。
【背景技術】
【０００３】
癌のような多くの病気は、病気が進行する前に早期に発見されれば治癒可能である。しかしながら、毎年何百万人もの人々がそのような「治癒可能な」病気で亡くなっている。低レベルのステージで癌を正確かつ早期に診断するための手頃な価格で迅速なポイントオブケア検出デバイスによって、早期治療が可能となり、それにより罹患率や死亡率を減らすことができるであろう。
【０００４】
ヒトゲノムプロジェクトの結果、遺伝子多型を調べることによって、ヒトゲノムの多くの疾患関連変異（例えば、癌関連）を検出できるようになっている。同様に、多くの病気の原因となる生物（例えば、ウイルス）も、それらの特定の遺伝子配列を調べることで検出できるようになっている。関心のある標的遺伝子／配列を約１０分で検出することで、疾患の診断、疾患の予後の判定、および／または疾患のモニタリングのためのポイントオブケア検出が容易になる。
【０００５】
突然変異は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）複製でよく見られる。実際に、突然変異は、自然淘汰と進化の背後にある原動力である。突然変異は、血液型、遺伝性疾患などに関連し得る集団の遺伝的／遺伝子多型をもたらす。遺伝子多型の検出は、分子レベルでの遺伝的変異を同定するための最も強力な方法の一つである。一塩基多型（「ＳＮＰ」）、小規模な挿入／欠失（「インデル」）、転位因子、マイクロサテライトなどの遺伝子多型を検出することで収集された情報から、遺伝性疾患の多くの兆候を検出することができる。多くの遺伝子多型検出技術は、核酸増幅（例えば、ＰＣＲを使用）および／または遺伝子プローブのタギング／ラベリング（例えば、酵素／ラジオアイソトープによる）を必要とする。それらの分子生物学的手法は、費用と時間がかかる。
【０００６】
遺伝子多型は、費用と時間のかかる別の手法である全ゲノムシークエンシングを用いて「検出」することもできる。核酸を一分子レベルで配列決定する現在の技術には、ナノポアシークエンシング技術が含まれ、これは、タグフリー、ラベルフリーおよび増幅フリーという特徴を有し、読取り長もシステムのスループットも改善されていることから、従来のシークエンシング技術に比べて優位性を有している。このため、ナノポアシークエンシング技術は、高品質の遺伝子シークエンシングアプリケーションに組み込まれている。
【０００７】
ナノポアベースのＤＮＡシークエンシングの初期の実験システムは、α−ヘモリシン（αＨＬ）タンパク質ナノポアを通過するｓｓＤＮＡの電気的挙動を検出した。それ以来、ナノポアベースの核酸シークエンシング技術は改善されてきた。例えば、後述するように、固体ナノポアベースの核酸シークエンシングは、生物学的／タンパク質ベースのナノポアを固体（例えば、半導体、金属ゲート）ナノポアで置換する。
【０００８】
ナノポアは、イオン電流および／またはトンネル電流の変化によって、ホールを通る荷電粒子（例えば、イオン、分子など）の流れを検出できる（例えば、ナノメートルの範囲の直径を有する）小さなホールである。核酸の各ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ中のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、ＲＮＡ中のウラシル）は、ナノポアを物理的に通過するときに、ナノポア全体の電流密度に特定の方法で影響を与え、移動中にナノポアを通る電流の変化を測定すると、ナノポアを通過する核酸分子を直接シークエンシングするのに使用できるデータが得られる。このように、ナノポアテクノロジーは電気的検知に基づくものであり、他の従来のシークエンシング方法に必要なものよりも遥かに小さい濃度と量で核酸分子を検出できる。ナノポアベースの核酸シークエンシングの利点には、長い読取り長、プラグアンドプレイ機能、およびスケーラビリティが含まれる。半導体製造技術の進歩に伴い、固体ナノポアは、優れた機械的、化学的、熱的特性、および他のセンシング回路やナノデバイスとの統合を可能にする半導体技術との互換性により、生物学的ナノポアに代わる安価で優れた代替品となっている。
【０００９】
図１は、最先端の固体ベースの２次元（「２Ｄ」）ナノポアシークエンシングデバイス１００を概略的に示している。デバイス１００は「２次元」とあるが、このデバイス１００は、Ｚ軸に沿っていくらかの厚さを有する。現在の最先端のナノポア技術のそれらの欠点の一部（感度および製造コストの一部）を解決するために、生体分子シークエンシングの並列処理を可能にするマルチチャネルナノポアアレイを使用して、タグフリー、ラベルフリー、増幅フリーで、迅速なシークエンシングを実現することができる。そのようなマルチチャネルナノポアアレイの例は、米国仮特許出願第６２／５６６，３１３号および第６２／５９３，８４０号に記載されており、それらの内容は引用により本明細書に援用されている。
【００１０】
ナノポアデバイスは、核酸ポリマーを効率的かつ効果的に配列決定するために使用されてきたが、全ゲノムシークエンシングは、特定の遺伝子多型および他の荷電バイオポリマーの検出には非常に複雑である。例えば、関心のある標的遺伝子の検出は、大規模なデータセットを伴う全ゲノムシークエンシングのような通常の増幅ベースの方法と比較して、遥かに小さく、管理可能なデータを伴う。遺伝子多型や他の荷電性バイオポリマーのより効率的な検出が求められている。特に、タグフリー、ラベルフリー、増幅フリーで、迅速な遺伝子多型や他の荷電バイオポリマーの検出が求められている。
【発明の概要】
【００１１】
本明細書に記載の実施形態は、ナノポアベースの電気的に支援された荷電バイオポリマー検出システム、およびそれを用いた荷電バイオポリマー（例えば、遺伝子多型）の検出方法に関する。特に、本実施形態は、様々なタイプ（２Ｄまたは３Ｄ）のナノポアベースの荷電バイオポリマー検出システム、ナノポアアレイデバイスを使用する方法、並びに、ナノポアアレイデバイスを使用して荷電ポリマーを検出する方法に関する。
【００１２】
一実施形態では、荷電バイオポリマー分子を検出しかつナノチャネルを規定するナノポアデバイスが、ナノチャネルの第１の端部をアドレス指定する第１のゲートナノ電極を含む。本デバイスは、ナノチャネルの第１の端部とは反対側の第２の端部をアドレス指定する第２のゲートナノ電極も含む。本デバイスはさらに、第１の端部と第２の端部との間のナノチャネル内の第１の位置をアドレス指定する第１の検知ナノ電極を含む。さらに、本デバイスは、ナノチャネルを規定するデバイスの内面に結合された第１のバイオポリマープローブを含む。
【００１３】
１または複数の実施形態では、本デバイスが、第１の端部と第２の端部との間のナノチャネル内の第２の位置をアドレス指定する第２の検知ナノ電極も含む。荷電したバイオポリマー分子は、負に荷電していてもよい。
【００１４】
１または複数の実施形態では、第１および第２のゲートナノ電極が、ナノチャネルに第１の電位を生成して、ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の流れを方向付けるように動作可能である。第１の電位は、第１のゲートナノ電極から第２のゲートナノ電極に荷電したバイオポリマー分子の流れを向けることができる。また、第１および第２のゲートナノ電極は、ナノチャネルに第２の電位を生成して、ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の流れを方向付けるようにも動作可能である。第２の電位は、第１の電位の反対であってもよい。第２の電位は、荷電したバイオポリマー分子の流れを第２のゲートナノ電極から第１のゲートナノ電極に向けることができる。第１および第２のゲートナノ電極は、ナノチャネルに第１の電位および第２の電位を交互に生成し、それにより第１および第２のゲートナノ電極の間で、ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の交互に変わる流れを方向付けるようにも動作可能である。
【００１５】
１または複数の実施形態では、第１の検知ナノ電極が、第１のバイオポリマープローブに対する第１の荷電バイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するように構成されている。第１のバイオポリマープローブは、第１の予め設定された長さを有することができる。
【００１６】
１または複数の実施形態では、本デバイスが、第１および第２のゲートナノ電極および第１の検知ナノ電極が配置される緩衝液も含む。緩衝液は、ＫＣｌ、ＬｉＣｌおよび脱イオン（ＤＩ）水からなる群のなかから選択することができる。緩衝液は、ＤＩ水であり、第１の検知ナノ電極は、ＤＮＡの水和メカニズムを用いて、第１のバイオポリマープローブに対する荷電したバイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するように構成されるものであってもよい。
【００１７】
１または複数の実施形態では、ナノポアデバイスが、３次元（３Ｄ）アレイを含む。ナノポアデバイスは、エンドヌクレアーゼ酵素ベースのＳＮＰ検出アレイを使用して、バイオポリマーの点突然変異を検出するように構成されるものであってもよい。ナノポアデバイスは、固定化されたｄＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いて、ＤＮＡバイオポリマーの標的シークエンシングを行うように構成されるものであってもよい。第１および第２のゲートナノ電極および第１の検知ナノ電極の各々は、ナノチャネルを取り囲む帯状部をそれぞれ含むことができる。ナノポアデバイスは、小型の超高感度センサに組み込まれるようにしてもよい。ナノポアデバイスは、マイクロ流体デバイス、ナノ流体デバイス、ナノデバイスまたはｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐデバイスに組み込まれるようにしてもよい。ナノポアデバイスは、標的とするバイオポリマーの抽出および検知のためのオールインワンデバイスに組み込まれるようにしてもよい。標的とするバイオポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ペプチド、タンパク質固定化抗原および抗体からなる群のなかから選択することができる。
【００１８】
１または複数の実施形態では、ナノポアデバイスは、約１０フェムトモル（検出限界）の荷電バイオポリマー分子の最小濃度で、第１のバイオポリマープローブに対する荷電バイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するように構成されている。ナノポアデバイスは、第１の荷電バイオポリマー分子の増幅またはＰＣＲの使用なしで、第１のバイオポリマープローブに対する荷電バイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するように構成されるものであってもよい。
【００１９】
１または複数の実施形態では、ナノポアデバイスが、生体分子の増幅またはＰＣＲの使用なしで検出を実行するために、リキッドバイオプシーパネルプラットフォームに組み込まれている。ナノポアデバイスは、タグフリーセンサプラットフォームに組み込まれるようにしてもよい。ナノポアデバイスは、荷電バイオポリマー分子の負電荷に基づいて、第１のバイオポリマープローブへの荷電バイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するように構成されるものであってもよい。第１のバイオポリマープローブは、プラズマ加速化学蒸着（ＰＥＣＶＤ）または分子層堆積（ＭＬＤ）を使用して、ナノチャネルを規定するデバイスの内面に結合されるものであってもよい。ナノポアデバイスは、トンネル電流、横方向トンネル電流または容量性変化に基づいて、第１のバイオポリマープローブに対する荷電バイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するように構成されるようにしてもよい。
【００２０】
別の実施形態では、荷電したバイオポリマー分子を検出する方法が、ナノチャネルを規定するナノポアデバイスを提供するステップを含む。このデバイスは、ナノチャネルの第１の端部をアドレッシングする第１のゲートナノ電極と、第１の端部とは反対側のナノチャネルの第２の端部をアドレッシングする第２のゲートナノ電極と、第１の端部と第２の端部の間のナノチャネル内の第１の位置をアドレッシングする第１の検知ナノ電極と、ナノチャネルを規定するデバイスの内面に結合された第１のバイオポリマープローブとを含む。この方法は、第１および第２のゲートナノ電極が、ナノチャネルに第１の電位を発生させて、ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の流れを方向付けるステップも含む。
【００２１】
１または複数の実施形態では、本方法が、ナノチャネルに第１の電位を生成して、第１のゲートナノ電極から第２のゲートナノ電極へとナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の流れを方向付けるステップも含む。本方法は、ナノチャネルに第２の電位を発生させて、ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の流れを方向付けるステップも含むことができる。第２の電位は、第１の電位の反対であってもよい。本方法はさらに、ナノチャネルに第２の電位を生成して、第２のゲートナノ電極から第１のゲートナノ電極へとナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の流れを方向付けるステップも含むことができる。さらに、本方法は、ナノチャネルに第１の電位および第２の電位を交互に生成し、それにより第１および第２のゲートナノ電極の間で、ナノチャネルを通る荷電したバイオポリマー分子の交互に変わる流れを方向付けるステップを含むことができる。
【００２２】
１または複数の実施形態では、ナノポアデバイスが、第１の端部と第２の端部との間のナノチャネル内の第２の位置をアドレッシングする第２の検知ナノ電極を含む。荷電したバイオポリマー分子は、負に荷電していてもよい。
【００２３】
１または複数の実施形態では、第１のバイオポリマープローブが、第１の予め設定された長さを有する。デバイスは、ナノチャネルを規定するデバイスの内面に結合された第２のバイオポリマープローブを含むことができる。１または複数の実施形態では、ナノポアデバイスが、第１および第２のゲートナノ電極および第１の検知ナノ電極が配置された緩衝液も含む。緩衝液は、ＫＣｌ、ＬｉＣｌおよび脱イオン（ＤＩ）水からなる群のなかから選択することができる。緩衝液は、ＤＩ水であり、第１の検知ナノ電極は、ＤＮＡの水和メカニズムを使用して、第１の荷電したバイオポリマー分子と第１のバイオポリマープローブとのハイブリダイゼーションを検出するようにしてもよい。
【００２４】
１または複数の実施形態では、ナノポアデバイスが、３次元（３Ｄ）アレイを含む。本方法は、ナノポアデバイスが、エンドヌクレアーゼ酵素を使用して、バイオポリマー中の点突然変異を検出するステップも含むことができる。本方法は、ナノポアデバイスが、固定化されたｄＣａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用して、バイオポリマーの標的シークエンシングを実行するステップも含むことができる。第１および第２のゲートナノ電極および第１の検知ナノ電極の各々は、ナノチャネルを取り囲む帯状部をそれぞれ含むことができる。
【００２５】
１または複数の実施形態では、本方法が、ナノポアデバイスにより、約１０フェムトモル（検出限界）の第１の荷電バイオポリマー分子の最小濃度で第１のバイオポリマープローブへの第１の荷電バイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するステップをさらに含む。本方法は、ナノポアデバイスにより、第１の荷電バイオポリマー分子の増幅またはＰＣＲの使用なしで、第１のバイオポリマープローブへの第１の荷電バイオポリマー分子のハイブリダイゼーションを検出するステップをさらに含むことができる。本方法は、生体分子の増幅またはＰＣＲの使用なしで検出を実行するために、ナノポアデバイスをリキッドバイオプシーパネルプラットフォームに組み込むステップをさらに含むことができる。ナノポアデバイスは、タグフリーセンサプラットフォームに組み込まれるものであってもよい。本方法は、ナノポアデバイスにより、ハイブリダイゼーションを検出するステップも含むことができる。
【００２６】
本発明の上記および他の実施形態を、以下の詳細な説明に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
上記実施形態および他の実施形態の態様を、添付の図面を参照してさらに詳細に説明する。それら図面では、異なる図面の同じ構成要素を共通の符号で参照する。
【００２８】
【図１】図１は、先行技術の固体２Ｄナノポアデバイスを概略的に示している。
【図２】図２は、様々な実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを概略的に示している。
【図３】図３は、様々な実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを概略的に示している。
【図４】図４は、様々な実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを概略的に示している。
【図５】図５は、いくつかの実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを使用して荷電した生体分子を検出するための方法を概略的に示している。
【図６】図６は、いくつかの実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを使用して荷電した生体分子を検出するための方法を概略的に示している。
【図７】図７は、いくつかの実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを使用して荷電した生体分子を検出するための方法を概略的に示している。
【図８】図８は、いくつかの実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを使用して荷電した生体分子を検出するための方法を概略的に示している。
【図９】図９は、いくつかの実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを使用して荷電した生体分子を検出するための方法を概略的に示している。
【図１０】図１０は、いくつかの実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを使用して荷電した生体分子を検出するための方法を概略的に示している。
【図１１】図１１は、いくつかの実施形態に係る３Ｄナノポアデバイスを使用して荷電した生体分子を検出するための方法を概略的に示している。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、いくつかの実施形態に係るナノポアデバイスを製造するための方法を概略的に示している。
【図１３】図１３は、いくつかの実施形態に係るナノポア荷電バイオポリマー検出デバイスにおける標的生体分子の濃度と電流の関係を例示するグラフである。
【図１４】図１４は、様々な実施形態に係るナノポア荷電バイオポリマー検出デバイスにおける標的荷電バイオポリマーを加えた後の時間と電流との間の関係を例示するグラフである。
【図１５】図１５は、様々な実施形態に係るナノポア荷電バイオポリマー検出デバイスにおける標的荷電バイオポリマーを加えた後の時間と電流との間の関係を例示するグラフである。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｃは、様々な実施形態に係るナノポア荷電バイオポリマー検出デバイスにおける標的荷電バイオポリマーを加えた後の時間と電流との間の関係を例示するグラフである。
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、様々な実施形態に係るナノポア荷電バイオポリマー検出デバイスにおける標的荷電バイオポリマーを加えた後の時間と電流との間の関係を例示するグラフである。
【００２９】
様々な実施形態の上記および他の利点および目的を獲得する方法をより良好に理解するために、実施形態のより詳細な説明が、添付の図面を参照して提供される。図面は一定の縮尺で描かれておらず、同様の構造または機能の構成要素は全体を通して同様の符号によって表されていることに留意されたい。これらの図面は、特定の例示された実施形態のみを示しており、したがって、実施形態の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
タグフリー、ラベルフリー、増幅フリーで、荷電したバイオポリマーの迅速な（例えば、１０分未満の）検出を達成するための方法が本明細書に記載されている。以下に、電位を操作して荷電生体分子のハイブリダイゼーションを増加させるとともに、荷電生体分子のハイブリダイゼーションにより生成される電気的特性を検出することによって、荷電バイオポリマーを効率的かつ効果的に検出するナノポア電気支援荷電バイオポリマー検出デバイスを説明する。そのような検出デバイスおよび方法は、マイクロアレイ、ＣＭＯＳアレイおよびナノポアアレイ（例えば、固体ナノポアアレイ、ハイブリッドナノポアアレイ）を含む様々な生体分子アレイで使用することができる。そのような検出デバイスおよび方法は、上述した３Ｄマルチチャネルナノポアアレイおよび平面マルチチャネルナノポアアレイを含む様々なマルチチャネルナノポアアレイとともに使用することもできる。
【００３１】
荷電生体分子検出の並列処理を可能にするマルチチャネルナノポアアレイは、タグフリー、ラベルフリー、増幅フリーで、迅速な生体分子検出を達成するために使用することができる。そのようなマルチチャネルナノポアアレイの例は、米国仮特許出願第６２／５６６，３１３号および第６２／５９３，８４０号に記載されており、それらの内容は引用により援用されている。そのようなマルチチャネルナノポアアレイは、荷電粒子（例えば、生体分子）をそれらのマルチチャネルナノポアアレイ内の特定のチャネルに誘導するように電気的にアドレス指定することができる。他のアレイは、アレイの外側のマイクロ流体チャネルに結合される。その内容が引用により援用される米国仮特許出願第６２／６１２，５３４号に記載されているように、マルチチャネルナノポアアレイ内の個々のナノポアチャネルを電気的にアドレス指定および検知することは、荷電粒子（例えば、生体分子）の低コストで、高スループットで、タグフリー、ラベルフリー、増幅フリーの検出を達成するために、マルチチャネルナノポアアレイのより効率的かつ効果的な使用を容易にすることができる。
【００３２】
例示的なナノポアデバイス
図２は、一実施形態に係る３次元（「３Ｄ」）アレイアーキテクチャを有するナノポアデバイス２００を概略的に示している。デバイス２００は、Ｚ軸２０４に沿って積層された複数の２Ｄアレイまたは層２０２Ａ〜２０２Ｄを含む。２Ｄアレイ２０２Ａ〜２０２Ｄは「２次元」と呼ぶが、２Ｄアレイ２０２Ａ〜２０２Ｄの各々は、Ｚ軸に沿ってある程度の厚さを有する。
【００３３】
最上部の２Ｄアレイ２０２Ａは、第１および第２の選択（抑制ナノ電極）層２０６、２０８を含み、第１および第２の選択層２０６、２０８は、それらに形成されたナノポア２１０（ピラー、ナノチャネル）を通る荷電粒子（例えば、バイオポリマー）の動きを方向付けるように構成されている。第１の選択層２０６は、２Ｄアレイ２０２Ａの複数の横列（Ｒ１〜Ｒ３）のなかから選択するように構成されている。第２の選択層２０８は、２Ｄアレイ２０２Ａの複数の縦列（Ｃ１〜Ｃ３）のなかから選択するように構成されている。一実施形態では、第１および第２の選択層２０６、２０８は、選択された横列および縦列に隣接する電荷、および／または選択されていない横列および縦列に隣接する電荷を変更することによって、横列および縦列のなかからそれぞれ選択するように構成されている。他の２Ｄアレイ２０２Ｂ〜２０２Ｄは、速度制御／電流検知ナノ電極を含む。速度制御／検知ナノ電極は、導電性の高い金属およびポリシリコン、例えばＡｕ−Ｃｒ、ＴｉＮ、ＴａＮ、Ｔａ、Ｐｔ、Ｃｒ、グラフェン、Ａｌ−Ｃｕなどで作ることができる。速度制御／検知ナノ電極は、約０．３〜約１０００ｎｍの厚さを有することができる。また、速度制御／検知ナノ電極は、ハイブリッドナノポア内の生物学的層に形成されるものであってもよい。各検知ナノ電極は、各ナノポア２１０のピラーが特定のメモリセルに動作可能に結合され得るように、ナノポア２１０のピラーに動作可能に結合／アドレス指定されるものであってもよい。ナノポアデバイスにおける電気的アドレッシングは、米国仮特許出願第６２／６１２，５３４号に記載されており、その内容は引用により援用されている。
【００３４】
ハイブリッドナノポアは、ナノポアの安定性を高めるために、半合成膜ポーリンを形成するための固体成分を有する安定した生物学的／生化学的成分を含む。例えば、生物学的成分は、αＨＬ分子であってもよい。αＨＬ分子は、ＳｉＮベースの３Ｄナノポアに挿入することができる。（例えば、最上部の２Ｄアレイ２０２Ａの）ナノ電極にバイアスを印加することにより、αＨＬ分子を誘導して、αＨＬ分子をＳｉＮベースの３Ｄナノポアと確実に整列させる構造をとることができる。
【００３５】
ナノポアデバイス２００は、３Ｄ垂直ピラースタックアレイ構造を有し、平面構造を有する従来のナノポアデバイスよりも遥かに大きな電荷検出のための表面積を提供する。荷電粒子（例えば、バイオポリマー）がデバイス内の各２Ｄアレイ２０２Ａ〜２０２Ｅを通過するときに、その電荷は、いくつかの２Ｄアレイ２０２Ｂ〜２０２Ｅの検出器（例えば、ナノ電極）で検出することができる。したがって、デバイス２００の３Ｄアレイ構造は、より高い感度を実現し、それにより、低信号の検出器／ナノ電極を補償することができる。メモリセルを３Ｄアレイ構造に組み込むことにより、（例えば、外部メモリデバイスを使用した場合の）メモリに関連する性能制限を最小限に抑えることができる。さらに、高度に集積化されたスモールフォームファクタの３Ｄ構造は、製造コストを最小限に抑えながら、高密度のナノポアアレイを提供する。
【００３６】
使用時には、ナノポアデバイス２００は、上部および下部チャンバ（図示省略）がナノポアピラー２１０によって流体的に結合されるように、上部および下部チャンバ（図示省略）の間に配置され、それらを分離している。上部および下部チャンバは、ナノ電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ２など）と、検出対象の荷電粒子（例えば、ＤＮＡ）を含む緩衝液（電解質溶液またはＫＣｌを含むＤＩ水）とを含む。様々な荷電粒子の検出に、様々なナノ電極および電解質溶液を使用することができる。
【００３７】
ナノポアデバイス２００の最上部２Ｄアレイ２０２Ａに隣接する上部チャンバ（図示省略）およびナノポアデバイス２００の底部２Ｄアレイ２０２Ｅに隣接する下部チャンバ（図示省略）に配置されたナノ電極にバイアスを印加することによって、電気泳動による荷電粒子の転位を生じさせることができる。いくつかの実施形態では、ナノポアデバイス２００は、ナノポアデバイス２００のナノポアピラー２１０によって上部チャンバおよび下部チャンバ（図示省略）が流体的および電気的に結合されるように、上部チャンバおよび下部チャンバ（図示省略）の間に配置されている。上部チャンバおよび下部チャンバは、電解質溶液を含むことができる。
【００３８】
図３は、一実施形態に係るナノポアデバイス３００を概略的に示している。ナノポアデバイス３００は、絶縁膜層（Ｓｉ３Ｎ４）と、それに続いて、横列および縦列選択（抑制ナノ電極）３０６、３０８（例えば、金属またはドープされたポリシリコン）と、複数（第１〜第Ｎ）のセルナノ電極３１０（例えば、金属またはドープされたポリシリコン）とを含む。ナノポアデバイス３００のナノ電極３０６、３０８、３１０は、絶縁体誘電体膜３１２（例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＨｆＯ２、ＳｉＯ２、ＺｎＯ）で覆われている。
【００３９】
縦列および横列電圧（例えば、Ｖｄ）について転位速度制御バイアス信号４１０が３Ｄナノポアセンサアレイ４００に印加されると、後述するように、横列および縦列抑制電圧／バイアスパルスの後に、ベリファイ（検知）電圧／バイアスパルス（例えば、Ｖｇ１、Ｖｇ２）が続く。Ｖｇ３およびそれに続く電極（Ｖｇ４〜ＶｇＮ）は、検知電極および転位電極である。図４には、例示的な信号４１０が、３Ｄナノポアセンサアレイ４００の最上部に重ねて描かれている。抑制バイアスは、様々な縦列および横列のナノポアピラーチャネル／ナノチャネルをそれぞれ選択解除するために適用される。検知動作中、縦列および横列（抑制）選択ナノ電極の両方が選択される。結果として生じる表面電荷４１２は、電流などの電気的特性の変化として検出することができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ナノ電極は、イオン遮断、トンネリング、容量性検知、圧電およびマイクロ波検知を含む様々な原理を使用して電流変調を検出することができる。また、図４に示すように、（参照電極によって検出される）電極のイオン濃度またはいわゆるイオン電流の変化を、付属のＣＭＯＳトランジスタによって増幅して正確に検知することも可能である。
【００４１】
例示的なナノポア電気支援荷電バイオポリマー検出デバイスおよび方法
図５は、いくつかの実施形態に係るナノポア電気支援荷電バイオポリマー検出デバイスを示している。図５には単一のナノチャネル５１０を含むナノポア検出デバイス５００の一部が示されているが、ナノポア電気支援荷電バイオポリマー（例えば、遺伝子多型）検出デバイスは、複数のナノチャネルを有する３Ｄアレイを含むことができる。図５に示すナノポア検出デバイス５００のような荷電バイオポリマー検知構造は、ナノチャネルの電荷感度および並列処理および３Ｄアレイから生じる大きな表面積を利用して、荷電バイオポリマーの迅速な増幅フリー、タグフリーおよびラベルフリーの検出を容易にする。
【００４２】
ナノポア検出デバイス５００は、ナノ電極５２２、５２４、５２６、５２８を含む。これらのナノ電極５２２、５２４、５２６、５２８は、ナノチャネル５１０（第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４）を通る流れを制御し、ナノチャネル５１０（第１および第２の検知ナノ電極５２６、５２８）内の電荷を検出するために、独立して電気的にアドレス指定されている。
【００４３】
また、ナノポア検出デバイス５００は、ナノチャネル５１０の内面５３０に結合された中性プローブ（ＰＮＡ、ＤＮＡモルホリノオリゴマー）５３２を含む。内面５３０は、Ａｌ２Ｏ３を含むことができる。Ａｌ２Ｏ３は、多数のヒドロキシル基を含み、ナノチャネル５１０の内面５３０上の中性プローブ５３２の固定化のための官能化を容易にする。中性プローブ５３２は、遺伝子内の標的領域に相補的であるように、既知の分子生物学的手法を用いて生成することができる  中性プローブ５３２は、様々な長さ（例えば、２４塩基対、４０塩基対など）を有することができる。
【００４４】
中性プローブ５３２は、気相シラン化を用いて内面に結合／共有結合することができる。また、中性プローブ５３２の有機コーティングの厚さは、気相シラン化の時間を変更することによって調節することもできる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、先ず、ナノポアデバイスをＯ２プラズマで処理して、Ａｌ２Ｏ３基板上に−ＯＨ基を生成し、それにより、基板を活性化して標的官能基を結合する。その後、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）をシラン化のために使用する。これは、様々な可能性のある表面構造に対して有効であり、かつ反応性が非常に高いためである。中性プローブ５３２の共有結合前に、ナノポアデバイス５１０を、周囲温度および約３０ｋＰａのベース圧力で、５０μｌのＡＰＴＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むガラスホルダに隣接する動的に送り出される低真空チャンバ内に置くことによって、気相中のシラン（例えば、エタノール中にＡＰＴＥＳおよびＯＴＭＳを１：３の比率）に曝す。その後、ナノポアデバイス５１０を真空チャンバから取り出し、２．５％グルタルアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に１時間浸漬する。次に、ナノポアデバイス５１０を架橋剤から取り出し、ＩＰＩで２回、再蒸留水で２回洗浄する。最後に、ナノポアデバイス５１０を、１００ｎＭのアミノ修飾中性プローブで３７℃で一晩（例えば、浸漬によって）処理する。各ステップの後、ウルトラピュアＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー蒸留水（洗浄緩衝液として使用）でナノポアデバイスを洗浄する。このような方法を用いて、中性プローブ５３２の共有結合／固定化を約２４時間で達成することができ、４５℃では８時間で達成することができる。
【００４６】
ナノチャネル５１０の内面５３０に共有結合した中性プローブ５３２に対する荷電生体分子５４０（例えば、負に荷電した核酸）のナノポア検出デバイス５００のハイブリダイゼーションの感度は、結果として生じる電荷の違いに基づいて、単一塩基の不一致を検出することができる程度である。ナノポアデバイスの３Ｄアレイ構造から生じる並列処理は、ナノポアデバイスと検出される荷電生体分子との間の界面面積を劇的に増加させ、それにより、様々な疾患（例えば、遺伝性疾患）のポイントオブケア診断および予後の判定に十分なレベルまで感度を増加させる。
【００４７】
第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４は、独立してアドレス指定され、よって迅速に電気的に変更して、荷電生体分子５４０と中性プローブ５３２とのハイブリダイゼーションを増加させる荷電生体分子５４０の「ピンポン」運動を発生させることができる。ナノチャネル５１０の第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４間の電位は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４に電流を流すことによって急速に反転させることができる。また、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４は、ナノチャネル５１０を通る荷電生体分子５４０の転位を制御するためにアドレッシングすることもできる。
【００４８】
標的荷電生体分子５４０は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの多くの種類の核酸であり得る。中性プローブ５３２は、相補的ＤＮＡ鎖、ロック核酸（ＬＮＡ）オリゴマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような中性骨格オリゴマー、ＤＮＡモルホリノオリゴマー、または標的電荷生体分子５４０とハイブリダイズすることができる任意のタイプの相補的な鎖であり得る。
【００４９】
図５に示すように、電流／電位がナノポア検出デバイス５００に印加される前は、荷電生体分子５４０はナノチャネル５１０に引き寄せられない。図６は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４に正の電位を生成するための電流の印加を示している。この正の電位は、負に荷電した生体分子５４０をナノチャネル５１０内に引き寄せる。
【００５０】
図７は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４に正の電位を生成するための電流の継続的な印加を示している。時間の経過とともに、負に荷電した生体分子５４０の一部がナノチャネル５１０内に入り、ナノチャネル５１０の内面５３０に共有結合した中性プローブ５３２と相互作用する。負に荷電した生体分子５４０と中性プローブ５３２との間のこの相互作用は、２つの分子間のハイブリダイゼーションをもたらす。これにより、負に荷電した生体分子５４０が第１および第２の検知ナノ電極５２６、５２８に電気的に接続され、負に荷電した生体分子５４０に関連する負の電荷５３４を検出することができる。
【００５１】
図５は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４における電位の変更を示している。図５では、第１のゲートナノ電極５２２には電流がもはや印加されておらず、正の電位が除去されている。しかしながら、第２のゲートナノ電極５２４には電流が維持されて、正の電位が維持されている。この電位の変化は、流れの矢印５５０で示すように、ナノチャネル５１０内の負に荷電した生体分子５４０を第２のゲートナノ電極５２４に向かって引き寄せる。図５は、より多くの負に荷電した生体分子５４０が、ナノチャネル５１０内の中性プローブ５３２にハイブリダイズしたことを示している。
【００５２】
図９は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４における電位の別の変更を示している。図９では、第２のゲートナノ電極５２４には電流がもはや印加されておらず、正の電位が除去されている。しかしながら、第１のゲートナノ電極５２２には電流が維持されて、正の電位が維持されている。この電位の変化は、流れの矢印５５２で示すように、ナノチャネル５１０内の負に荷電した生体分子５４０を第１のゲートナノ電極５２２に向かって引き戻す。図９は、荷電した生体分子５４０がナノチャネル５１０内の中性プローブ５３２にさらに曝されることにより、より多くの負に荷電した生体分子５４０が中性プローブ５３２にハイブリダイズしたことも示している。
【００５３】
図１０は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４における電位のさらに別の変更を示している。図９では、第１のゲートナノ電極５２２にはもはや電流が印加されておらず、正の電位が取り除かれている。しかしながら、第２のゲートナノ電極５２４には電流が印加されて、正の電位が維持されている。この電位の変化は、流れの矢印５５０で示すように、ナノチャネル５１０内の負に荷電した生体分子５４０を第２のゲートナノ電極５２４に向かって引き戻す。図１０は、荷電した生体分子５４０がナノチャネル５１０内の中性プローブ５３２にさらに曝されることにより、より多くの負に荷電した生体分子５４０が中性プローブ５３２にハイブリダイズしたことも示している。
【００５４】
図５〜図１０の流れの矢印５５０、５５２で示す方向の変化は、荷電した生体分子５４０の「ピンポン」運動における最初の２つの方向変化を示しており、それにより荷電した生体分子５４０と中性プローブ５３２とのハイブリダイゼーションが増加する。方向の変化は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４の電位を変化させることによって制御され、それらゲートナノ電極は、交互に電流を印加することによって変更される。電流は、プロセッサの制御下で、個別に電気的にアドレス指定された第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４に印加することができるため、電流および電位の交代は、迅速に実行することができる。荷電生体分子５４０の「ピンポン」運動は、荷電生体分子５４０がナノチャネル５１０内の中性プローブ５３２に曝される時間を増加させ、それによって２つの分子間のハイブリダイゼーションの量を増加させる。図５〜図１０では２つの方向の変化のみが示されているが、生体分子検出方法は、標的荷電生体分子５４０のハイブリダイゼーションを増加させるために、より多くの方向の変化を含むことができる。
【００５５】
図１１は、生体分子検出方法における一連の「ピンポン」運動の終わりを示している。検出方法の終了時に、複数の負に荷電した生体分子５４０は、中性プローブ５３２にハイブリダイズし、それら中性プローブ自体は、ナノチャネル５１０の内面５３０に共有結合している。負に荷電した各生体分子５４０が中性プローブ５３２にハイブリダイズすると、その追加の負電荷５３４は、第１および／または第２の検知ナノ電極５２６、５２８によって検出される。検知ナノ電極５２６、５２８は、単一の塩基対のミスマッチを区別するのに十分な感度を有する。このため、検知ナノ電極５２４、５２８は、各荷電生体分子５４０のハイブリダイゼーションに関連する負電荷５３４を検出することができる。したがって、ナノポア検出デバイス５００は、タギングまたはラベリングプローブを用いることなく、溶液中の標的荷電生体分子を迅速に（例えば、１０分未満で）検出し、定量することができる。この方法は、通常の方法ではシークエンシングが困難なＧＣリッチ領域を有する標的荷電生体分子も検出することができる。
【００５６】
図５〜図１１に示すナノポア検出デバイス５００は、特定の手順中に単一の負に荷電した標的生体分子５４０のみを検出するように構成されているが、他の実施形態に係るナノポア検出デバイスは、複数の負に荷電した標的生体分子を検出するように構成することができる。そのようなナノポア検出デバイスは、複数の中性プローブを含み、それらが、（１）負に荷電した様々な標的生体分子とハイブリダイズし、（２）様々な長さを有する。中性プローブは様々な長さを有するため、負に荷電した様々な標的生体分子のハイブリダイゼーションによって、ナノチャネルの内面に様々な量の負電荷が電気的に付加されることになる。検知ナノ電極は、そのような様々な量の負電荷を区別するのに十分な感度を有し、それにより、負に荷電した様々な標的生体分子のハイブリダイゼーションを区別する。
【００５７】
例示的なナノポアデバイスの製造方法
図１２Ａおよび図１２Ｂは、いくつかの実施形態に係る、上述したナノポア検出デバイス５００、６００のようなナノポアデバイスを製造する方法１２１０を概略的に示している。
【００５８】
ステップ１２１２では、ナノポアデバイスの（ナノチャネル内の）内面を、Ｏ２プラズマ処理、洗浄および活性化する。ステップ１２１４では、デバイスの表面を（３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で処理して官能化することにより、シラン化する。ステップ１２１６では、官能化された表面にアルデヒドリンカーを付着させる。ステップ１２１８（図１２Ｂ）では、アルデヒドを介してプローブ（例えば、ＰＮＡ）を表面に付着させる。ステップ１２２０では、負に荷電した標的生体分子（例えば、ＤＮＡ）が表面上のプローブに付着して、表面の電荷を変化させ、それにより、上述したように、負に荷電した標的生体分子が電気的に検出される。
【００５９】
例示的なＤＮＡ検知の実施形態
以下、荷電したバイオポリマー／標的分子としてのＤＮＡの検知に関する実施形態を説明する。
【００６０】
第１の実施形態は、標的分子としての人工ＤＮＡを検知することを含む。第２の実施形態は、標的分子としてラムダファージＤＮＡを検知することを含む。それらの実施形態は、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを検知／検出するナノポア検知／検出システムの能力を実証している。
【００６１】
図１３は、いくつかの実施形態に係る、上述したデバイス５００、６００などのナノポア電気支援荷電バイオポリマー検出デバイスにおける標的生体分子の濃度（「モル濃度」）と電流（Ｉｄ）との間の関係を例示するグラフである。この関係は、約１０−９モルおよび−１０００ｐＡの位置に単一の変曲点を有するほぼ逆対数的なものである。このため、検出された電流に基づいて溶液中の標的生体分子の濃度を定量するために、この関係を使用することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態における検出下限は、標的生体分子のフェムトモル（１０−１５）の範囲である。図１４〜図１７Ｂは、いくつかの実施形態に係る、上述したデバイス５００、６００などのデバイスにおいてある濃度（１０フェムトモル）の標的生体分子（ＤＮＡ）を加える前後の時間（サンプル）と電流（ｎＡ）との間の様々な関係を示している。
【００６３】
図１４〜図１７Ｂに示す実施形態では、ナノポア検出デバイスからの出力信号に基づいて検出限界を求めるために、感度を測定した。純度９９．９％（ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により定量）のアミノ修飾ＰＮＡプローブ（ＰＡＮＡＧｅｎｅ  Ｋｏｒｅａ）、付着部位としてのＮＨ２末端、およびキャップされたＣ末端を、ナノポア検出デバイスに使用した。プローブ間の不要な結合を防ぐために、ＰＮＡプローブのＣ末端をＣＯＮＨ２基でキャップした。プローブと表面との間の障害を防ぐために、Ｏリンカーを使用した。いくつかの実施形態では、２つの異なるタイプのプローブが利用され、その一方は、合成ＤＮＡを検出するためのものであり、他方は、ラムダファージのゲノムＤＮＡであるラムダＤＮＡを検出するためのものである。１７ｂｐ合成ＤＮＡ検出プローブ（ＣＯＳＭＯ  ＧＥＮＥＴＥＣＨ  Ｋｏｒｅａ）は、
ＮＨ２−Ｏ−ＧＧＧＧＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＣＡＡ−ＣＯＮＨ２であり、標的配列は、５’ＴＴＧＴＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＣＣＣ３’である。
２０ｂｐラムダＤＮＡ検出プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、
ラムダＤＮＡに相補的な標的配列を有するＮＨ２−Ｏ−ＣＧＴＡＡＣＣＴＧＴＣＧＧＡＴＣＡＣＣＧ−ＣＯＮＨ２である。
図１４〜図１７Ｂのグラフに示すように、検出下限は約１０フェムトモルである。
【００６４】
１９８２年のＭａｎｉａｔｉｓの知見によれば、プローブの１７ｂｐの長さは、次の式を用いてオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする、一定の複雑性を有するゲノム上の位置の数に基づいて計算された１６ｂｐの最小プローブ長よりも１つ大きくなる。
Ｐ０＝［１／４］Ｌ×２Ｃ
ここで、Ｐ０は独立した完全一致の数、Ｌはオリゴヌクレオチドプローブの長さ、Ｃは標的ゲノムの複雑さを表している（この値に２を乗じたものは、プローブにハイブリダイズする可能性のある２本の相補的なＤＮＡ鎖を表している）。この式によれば、長さ１６ｂｐのオリゴヌクレオチドは、１つの位置でヒトゲノムの付着すると予想される。このため、そのようなプローブは、特定のタイプの癌または感染症に関連する特定の部位の検出に使用することができる。したがって、ヒトゲノム中の関心のある標的をシークエンシングするための検出システムにおいて、またはリキッドバイオプシープラットフォームにおいて、１７ｂｐのプローブは、プローブの最小サイズである。
【００６５】
図１４は、上述した標的ＤＮＡを約１０フェムトモル濃度で加えたときに、検知ナノ電極の電流が約１０．５８ｎＡから約１１．３５ｎＡに上昇することを示している。図１５は、上述した標的ＤＮＡを約１ピコモルの濃度で加えたときに、１０フェムトモルの１００倍に増加することを示している。したがって、約１０フェムトモルの標的ＤＮＡの添加に起因する検知ナノ電極の電流の検出可能な０．７７ｎＡの増加は、検出の最小限界を表している。
【００６６】
図１６Ａ〜図１６Ｃは、最上部のゲートナノ電極において、電流が、ＤＮＡを添加してから２０分後には約１．７２ｎＡから約２ｎＡまで増加し、ＤＮＡ添加してから３０分後には約３ｎＡまで増加することを示している。図１７Ａおよび図１７Ｂは、最下部のゲートナノ電極において、ＤＮＡ添加後に、電流が約１ｎＡから約１．６ｎＡまで増加することを示している。ナノポア検出システムのそれらのナノ電極のすべての電流は、標的ＤＮＡに加えられることにより検出可能なレベルで増加する。
【００６７】
本明細書に記載のナノポア検出システムは、緩衝液としてＤＩ水を用いて機能する３Ｄセンサである。ナノスケールの小空間内の水分子のための機能および正確な作用メカニズムは、これまでに調査および理解されていないが、本明細書に記載の３Ｄアレイの高感度で明確な分解能は、電解質または他の緩衝液の代わりにＤＩ水を使用することの利点を証明する可能性があり、それにより、そのような感度の高いセンサ内のノイズレベルが増加する。
【００６８】
本明細書に記載のナノポア検出システムにおける反応および信号発生のメカニズムは、上述した中性プローブに付着するＤＮＡ分子の水和に起因して表面の電荷分布が変化することに基づくものである。この水和により、ゲートナノ電極の電荷密度の再分布に伴う電極の変化が生じる。ナノポア内のナノ電極は、ナノポアを取り巻く全周または帯状の形態を有しており、それによりナノポアセンサの感度が高められる。
【００６９】
各ナノポアで異なる電位勾配を使用することにより、ユーザは、各ナノポア内および各ナノポアを通って移動する荷電した生体分子の速度を制御することができる。低濃度の緩衝液／電解質またはＤＩ水を使用してナノポアの検知領域のデバイ長を増加させることは、本明細書に記載の３Ｄナノポア検出システムの固有の特性の１つである。ユーザは、上述したように、各ナノ電極に対する電位の量および持続時間を変化させて、荷電した標的バイオポリマーの動きおよびナノ電極間でのそれらのピンポン運動を電気泳動的に制御することにより、ナノポア検出システムを広範囲に制御することができる。このように、荷電した標的バイオポリマーがナノ電極の電位を変更／変化させながらナノ電極間を往復運動すると、荷電ターゲットバイオポリマーが中性プローブに付着するまでの時間が１０分未満に短縮される。この付着時間の短縮は、標的とプローブ間の相互作用が増加して、より短い時間で互いに結合できるようになるためである。
【００７０】
本明細書に記載されているようなナノポア検出システムのいくつかの実施形態では、ナノポア構造のサイズ、形状および深さは、中性プローブのサイズに基づいて変更することができる。例えば、直径５０ｎｍ（５００Å）のポアサイズは、４０ｂｐの中性プローブを有する標的バイオポリマーを検知するために使用することができる。他の実施形態では、直径１００ｎｍのポアサイズは、１００ｂｐを超える中性プローブを有する標的バイオポリマーを検知するために使用することができる。さらに他の実施形態では、直径２００ｎｍのポアサイズは、さらに長い中性プローブを有する標的バイオポリマーを検知するために使用することができる。
【００７１】
本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサは、ナノポアの３Ｄアレイが表面対体積比を増加させてナノポアアレイのナノチャネル内のスマート表面の小型化を可能にするため、２Ｄまたは平面構造センサと比較して、より高感度でコンパクトなセンサとなる。高い表面積対体積比は、荷電したバイオポリマーの非常に低い濃度（例えば、１０フェムトモル）の検知を可能にする。
【００７２】
本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサは、誘電体層が各ナノチャネルの内面を絶縁して各ナノチャネルに対する静電容量効果および電界効果の制御が強化されるため、電荷摂動または電気化学ベースのセンサシステムと比較して、より優れた制御を提供することができる。
【００７３】
本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサは、固定化されたプローブで荷電した生体分子（例えば、ＤＮＡ）を検知するために、静電容量変化を使用することができる。標的ＤＮＡ分子がアレイ構造のナノポア内を通過すると（外部電圧によって電気泳動されると）、最上部および最下部の電極は、ナノポア構造内を通過するＤＮＡ分子に起因する電位の変化を記録し、キャパシタのようにナノポアを分極する。その結果生じる静電容量の変化を電子的に測定することで、標的ＤＮＡ分子の通過を検出することができる。また、印加される正のゲートバイアスを制御することで、ＤＮＡ分子の速度を制御することができ、それにより、３Ｄナノポアアレイセンサを単一ヌクレオチドシークエンシングに利用することができる。本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサは、トンネル電流と静電容量変化の両方を検出することにより、荷電した生体分子の通過を検出することができる。既存の生物学的ナノポアは、その構造にナノ電極が埋め込まれていないため、トンネル電流と静電容量変化を検出することができなかった。
【００７４】
本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサで使用される中性プローブは、その表面化学特性を変化させるために修飾することができ、それにより、より多くのシステム制御および設計オプションが可能になる。例えば、チオール修飾を、チオール金結合のために使用することができる。アビジン／ビオチンおよびＥＤＣ架橋剤／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、固定化技術の構造および化学特性を変えて本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサとともに使用することができる他のプローブ修飾および標的対である。
【００７５】
以下の特許請求の範囲のすべての手段またはステッププラス機能要素の対応する構造、材料、行為および等価物は、具体的に主張されるように、他の特許請求の範囲の要素と組み合わせて機能を実行するための任意の構造、材料、行為および等価物を含むことを意図している。本発明は、上記の実施形態と関連して説明されているが、前記の説明および請求項は、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されよう。本発明の範囲内の他の側面、利点および修正は、本発明が属する技術に熟練した当業者には明らかであろう。
【００７６】
本発明の様々な例示的な実施形態が本明細書で説明される。非限定的な意味でこれらの例を参照する。それらは、本発明のより広く適用可能な態様を例示するために提供される。本発明の真の意図および範囲から逸脱することなく、説明された本発明に様々な変更を加えることができ、均等物を代用することができる。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス行為またはステップを本発明の目的、意図または範囲に適合させるために、多くの修正を行うことができる。さらに、当業者によって理解されるように、本明細書で説明および図示される個々のバリエーションはそれぞれ、本発明の範囲または意図を逸脱することなく、他のいくつかの実施形態の特徴から容易に分離または組み合わせることができる個別の構成要素および特徴を有する。このような変更はすべて、この開示に関連する請求項の範囲内であることが意図されている。
【００７７】
主題の診断または介入処置を実行するための上記デバイスのいずれも、そのような介入を実行する際に使用するためにパッケージ化された組み合わせで提供されてもよい。これらの供給「キット」は、使用説明書をさらに含み、そのような目的で一般的に使用される無菌トレイまたは容器に包装されてもよい。
【００７８】
本発明は、主題のデバイスを使用して実行され得る方法を含む。この方法は、そのような適切なデバイスを提供する行為を含み得る。この提供は、エンドユーザが実行してもよい。言い換えると、「提供する」行為は、エンドユーザが主題の方法で必要なデバイスを提供するために取得、アクセス、アプローチ、配置、セットアップ、起動、電源投入、またはその他の方法で動作させることのみを必要とする。本明細書に列挙された方法は、論理的に可能である列挙されたイベントを任意の順序で実行してもよいし、列挙されたイベントの順序で実行してもよい。
【００７９】
本発明の例示的な態様が、材料の選択や製造に関する詳細とともに、上記で説明されている。本発明の他の詳細は、上記で参照された特許および刊行物に関連して理解され、ならびに当業者によって一般に知られているか評価される。同じことが、一般的または論理的に用いられる追加の動作に関して、本発明の方法ベースの態様に関しても事実であり得る。
【００８０】
さらに、本発明について、様々な特徴を任意に組み込んだいくつかの例を参照して説明したが、本発明は、本発明の各バリエーションに関して企図されるように説明または図示されたものに限定されない。開示の真の意図および範囲から逸脱することなく、記載された本発明に様々な変更を加えることができ、均等物（本明細書に記載されているか、ある程度簡潔にするために含まれていない）に置き換えることができる。さらに、値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に介在するあらゆる値と、その規定された範囲内の任意の他の規定されるか介在する値は、本発明内に含まれると理解される。
【００８１】
また、記載された本発明の変形の任意の特徴は、独立して、または本明細書に記載された特徴のいずれか１以上と組み合わせて示され、クレームされ得ることが企図される。単一のアイテムへの言及には、同じアイテムが複数存在する場合が含まれる。より具体的には、本明細書および本明細書に関連する請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｓａｉｄ」、および「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り、複数の指示対象を含む。言い換えれば、これらの用語の使用により、上記の説明および本発明に関連する請求項における主題の項目の「少なくとも１つ」が可能になる。さらに、請求項は、任意の要素を除外するように記載される場合があることに留意されたい。したがって、この記載は、クレーム要素の引用、または「否定的な」制限の使用に関連して、「単に」、「のみ」などの排他的な用語を使用するための先行詞として機能することを意図する。
【００８２】
そのような排他的な用語を使用せずに、この開示に関連する請求項で「含む」という用語は、所定の数の要素がそのような請求項で列挙されているかどうかに関係なく、追加の要素を含めることを許容するか、または機能の追加により、そのような請求項に記載されている要素の性質を変換すると見なされる。本書で具体的に規定されている場合を除き、本書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、クレームの有効性を維持しながら、できるだけ広く一般に理解されている意味で与えられるべきである。
【００８３】
本発明の範囲は、提供された実施例および／または明細書に限定されるべきではなく、むしろ本開示に添付された請求項の文言の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
2021531025.tif 000003
【図２】
2021531025.tif 000004
【図３】
2021531025.tif 000005
【図４】
2021531025.tif 000006
【図５】
2021531025.tif 000007
【図６】
2021531025.tif 000008
【図７】
2021531025.tif 000009
【図８】
2021531025.tif 000010
【図９】
2021531025.tif 000011
【図１０】
2021531025.tif 000012
【図１１】
2021531025.tif 000013
【図１２−１】
2021531025.tif 000014
【図１２−２】
2021531025.tif 000015
【図１３】
2021531025.tif 000016
【図１４】
2021531025.tif 000017
【図１５】
2021531025.tif 000018
【図１６Ａ】
2021531025.tif 000019
【図１６Ｂ】
2021531025.tif 000020
【図１６Ｃ】
2021531025.tif 000021
【図１７Ａ】
2021531025.tif 000022
【図１７Ｂ】
2021531025.tif 000023
【国際調査報告】
2021531025.tif 000024
2021531025.tif 000025
2021531025.tif 000026