(57)【要約】  本出願は、電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）、その製造、および感染症を治療するためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
総塩素含有量が１〜５００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜４５０ｍｇ／ｌであり、
塩化物含有量が２〜８ｇ／ｌ、好ましくは３〜７ｇ／ｌであり、
酸化還元電位が＋１５０〜＋１，３５０ｍＶ、好ましくは＋６００〜＋１，１００ｍＶ、より好ましくは＋７００〜＋１，０５０ｍＶ、より好ましくは＋７００〜＋１，０００ｍＶであり、
浸透圧が２０〜８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、
ｐＨ値が６．０〜７．８、好ましくは７．１〜７．４であり、
任意選択的に少なくとも１種のホウ酸（の塩）および／または少なくとも１種のリン酸（の塩）を含む、
電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項２】
少なくとも１種のリン酸（の塩）を、好ましくは０．０１〜１０００ｇ／ｌの量で、より好ましくは０．１〜１００ｇ／ｌの量で含有する、請求項１記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項３】
少なくとも１種のホウ酸（の塩）を、好ましくは０．０１〜１０００ｇ／ｌの量で、より好ましくは０．１〜５００ｇ／ｌの量で含有する、請求項１または２記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項４】
次亜塩素酸イオンおよび／または次亜塩素酸を、特には１〜１００００ｍｇ／ｌの総濃度、より好ましくは１０〜１０００ｍｇ／ｌの総濃度で含む、請求項１から３までのいずれか１項記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項５】
少なくとも１種の増粘剤、例えば有機物と無機物のいずれかのポリマーをさらに含有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項６】
追加の治療効果のある薬剤、例えば医薬品を含有しない、請求項１から５までのいずれか１項記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項７】
追加の防腐剤を含有しない、請求項１から６までのいずれか１項記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項８】
好ましくは、少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤をさらに含有する、請求項１から７までのいずれか１項記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）を含有する医薬製剤。
【請求項９】
感染症、好ましくは例えば細菌、真菌、および／またはウイルスによって引き起こされる眼の感染症の治療における使用のための、請求項１から７までのいずれか１項記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項１０】
前記細菌および／または真菌が、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ブラシリエンシス（Aspergillus brasiliensis）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、およびアシネトバクター・ピティー（Acinetobacter pitii）からなる群から選択される、請求項９記載の使用のための電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項１１】
前記ウイルスが、アデノウイルス、エンテロウイルス、ならびにヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス１型および単純ヘルペスウイルス２型からなる群から選択される、請求項９記載の使用のための電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項１２】
結膜炎、特に細菌性結膜炎、角膜炎、眼瞼炎、および／または眼内炎の治療における、請求項９から１１までのいずれか１項記載の使用のための、電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項１３】
眼に、好ましくは感染直後に投与される、請求項９から１２までのいずれか１項記載の使用のための、電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
【請求項１４】
（ｉ）円筒形のアノード内に同軸状に取り付けられた円筒形のカソードを好ましくは含む電気分解反応器中で、塩化物水溶液を電気分解する工程、
（ｉｉ）任意選択的に少なくとも１種のホウ酸（の塩）および／または少なくとも１種のリン酸（の塩）を添加する工程、ならびに
（ｉｉｉ）任意選択的に注射用水を添加することによって前記ＥＣＡＳを希釈する工程、
を含む、請求項１から７までのいずれか１項記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）の製造方法。
【請求項１５】
前記電気分解を、１０．０〜３０．０Ａ、好ましくは１５．０〜２０．０Ａの電流で行う、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）、その製造、および感染症を治療するためのその使用に関する。
【０００２】
電気化学的に活性化された塩溶液は、通常、塩化ナトリウム溶液の電気分解によって得られる。電気化学的に活性化された塩溶液は、例えば農業、歯科、医薬、および食品産業における洗浄剤または消毒剤として知られている。これは、例えば作業板やテーブルや床などの表面消毒のような用途において、農業における低温殺菌処置のために、微生物の除去のために、洗浄および洗濯用途のために、スイミングプールにおいて、さらには水虫の予防として、使用することができる。
【０００３】
国際公開第２００４／０３１０７７号には、塩水溶液の電気分解処理によって殺生物性溶液を生成するための装置が開示されている。国際公開第２００５／０６５３８８号には、酸化還元電位水溶液および創傷治療の消毒剤としてのその使用が開示されている。
【０００４】
特開１９９７／００４０４４４号公報には、眼科用製剤として使用するための、２．０〜６．０のｐＨを有する酸性ＥＣＡＳが開示されている。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１０／０３３０２０４号明細書には、白内障、眼角膜炎、角膜血管新生、上皮欠損、および慢性混濁から選択される外眼部の障害の治療のための、１．０〜４．０のｐＨを有する酸性ＥＣＡＳが開示されている。
【０００６】
国際公開第２００９／０１３０１９号には、医療用途のための有効成分とＥＣＡＳとを含有する二相医薬製剤が開示されている。ＥＣＡＳは、医薬製剤製造用の担体としても提案されている。
【０００７】
眼の感染症は、（ほとんどの場合積極的な）治療が迅速に開始されない場合、重大な視力を脅かす結果を伴う深刻な眼の問題を引き起こす可能性がある。ここ数年、感染性眼疾患の第一選択治療としてはセファロスポリンとアミノグリコシドが使用されてきた。しかしながら、局所抗生物質および抗生物質耐性菌の出現に関連する問題により、代替治療法の調査に対する関心が高まっている（Romanowski et al., 2005, Willcox, 2011）。
【０００８】
また、眼科において塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）などの防腐剤を使用することについて、アレルギー反応のため最近議論を呼んでいる。他方で、防腐剤を含まない医薬品は、通常、単回使用単位でのみ提供される。さらに、防腐剤を含まない製剤は典型的には５未満の酸性のｐＨ値を有する一方で、眼への刺激を防ぎ、患者の高いコンプライアンスを可能にするために、眼科の推奨されるｐＨ値は中性からわずかにアルカリ性である。
【０００９】
上の事項を考慮して、公知の薬剤の欠点を克服する眼の感染症の治療のための新しい製剤が緊急に必要とされている。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、長期間にわたって安定であり、かつそれを使用する際に有害な副作用を最小限にすることによって患者のコンプライアンスを改善する、有効な薬剤の提供である。
【００１１】
第１の態様では、本発明は、
−  総塩素含有量が１〜５００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜４５０ｍｇ／ｌであり、
−  塩化物含有量が２〜８ｇ／ｌ、好ましくは３〜７ｇ／ｌであり、
−  酸化還元電位が＋１５０〜＋１，３５０ｍＶ、好ましくは＋６００〜＋１，１００ｍＶ、より好ましくは＋７００〜＋１，０５０ｍＶ、より好ましくは＋７００〜＋１，０００ｍＶであり、
−  浸透圧が２０〜８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、
−  ｐＨ値が６．０〜７．８、好ましくは６．２〜７．６、より好ましくは７．１〜７．４である、
電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）に関する。
【００１２】
本発明のＥＣＡＳは、少なくとも１種のホウ酸（の塩）および／または少なくとも１種のリン酸（の塩）をさらに含んでいてもよい。本発明のＥＣＡＳは、好ましくは、少なくとも１種のホウ酸の塩および／または少なくとも１種のリン酸の塩、より好ましくは少なくとも１種のリン酸の塩をさらに含む。別の実施形態では、本発明のＥＣＡＳは、少なくとも１種のホウ酸の塩をさらに含む。別の実施形態では、本発明のＥＣＡＳは、少なくとも１種のホウ酸の塩および少なくとも１種のリン酸の塩をさらに含む。
【００１３】
ホウ酸の塩は通常ホウ酸塩（ＢＯ３３−）である。リン酸の塩としては、リン酸塩（ＰＯ４３−）、リン酸水素塩（ＨＰＯ４２−）、および／またはリン酸二水素塩（Ｈ２ＰＯ４−）を挙げることができる。上の塩の適切な対イオンは、ナトリウム（Ｎａ＋）およびカリウム（Ｋ＋）、アンモニウム（ＮＨ４＋）、またはＣａ２＋などのアルカリイオンである。好ましい実施形態では、本発明のＥＣＡＳは、リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウムをさらに含む。
【００１４】
リン酸（の塩）は、存在する場合、好ましくは０．０１〜１０００ｇ／ｌの合計量で、より好ましくは０．１〜１００ｇ／ｌの合計量で存在する。ホウ酸（の塩）は、存在する場合、好ましくは０．０１〜１０００ｇ／ｌの合計量で、より好ましくは０．１〜５００ｇ／ｌの合計量で存在する。
【００１５】
電気化学的に活性化された塩溶液は、密閉された高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）容器内で２０℃で保管された場合、好ましくは１年にわたって、より好ましくは２年にわたって安定である。驚くべきことに、少なくとも１種のホウ酸（の塩）および／または少なくとも１種のリン酸（の塩）を含有するＥＣＡＳが、少なくとも１種のホウ酸（の塩）および／または少なくとも１種のリン酸（の塩）を含有しない本発明のＥＣＡＳと比較して、本発明のＥＣＡＳの安定性をさらに改善し得ることが見出された。加えて、高密度ポリエチレン材料（ＨＤＰＥ）中で保管すると、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）やポリプロピレン（ＰＰ）などの他の材料と比較して優れた安定性が得られることが見出された。
【００１６】
一実施形態では、本発明の意味における「安定」または「安定性」は、それぞれの保管条件下で６ヶ月保管した後に本発明のＥＣＡＳの酸化還元電位が最大で２０％、好ましくは１〜１０％減少することを意味する。あるいは、本発明のＥＣＡＳの酸化還元電位は、それぞれの保管条件下で１２ヶ月保管した後に最大で２５％、好ましくは１〜１０％減少する。あるいは、本発明のＥＣＡＳの酸化還元電位は、それぞれの保管条件下で２４ヶ月保管した後に最大で３０％、好ましくは２〜１５％減少する。
【００１７】
酸化還元電位は、当業者に公知の既存の方法により決定することができる。
【００１８】
さらなる態様では、本発明によるＥＣＡＳは、特に１〜１００００ｍｇ／ｌの総濃度で、より好ましくは１０〜１０００ｍｇ／ｌの総濃度で、次亜塩素酸イオンおよび／または次亜塩素酸を含んでいてもよい。
【００１９】
亜塩素酸イオンおよび／または塩素酸イオンの総含有量は、好ましくは毒性レベル未満であり、例えば１０ｍｇ／ｌ未満、より好ましくは０．００１〜１０ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは０．００１〜４ｍｇ／ｌである。
【００２０】
さらに、本発明によるＥＣＡＳ中の重金属および重金属イオンの総含有量は、好ましくは毒性レベル未満であり、例えば１０μｇ／ｇ未満、好ましくは６μｇ／ｇ未満、より好ましくは０．００１〜６μｇ／ｇであり、個々の重金属および重金属イオンのそれぞれの含有量は好ましくは０．５μｇ／ｇ未満である。重金属および重金属イオンは、銀、ヒ素、金、イリジウム、パラジウム、白金、ロジウム、タリウム、カドミウム、コバルト、水銀、鉛、ルテニウム、クロム、モリブデン、アンチモン、スズ、銅、ニッケル、オスミウム、またはバナジウムであるか、これら由来であってもよい。重金属（イオン）は、ＩＳＯ１７０２５によるＩＣＰ−ＭＳ分析によって検出することができる。
【００２１】
さらなる態様では、本発明のＥＣＡＳは、ポリマーなどの少なくとも１種の増粘剤を含有していてもよい。有機物または無機物のいずれかの任意のポリマーを使用することができる。適切なポリマーは、セルロース、セルロール誘導体（カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）など）、多糖（例えばヒアルロン酸（ＨＡ）のようなグルコサミノグリカンなど）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、シリカゲル、メタケイ酸マグネシウム、および／またはメタケイ酸アルミニウムとすることができる。
【００２２】
本発明のＥＣＡＳは、好ましくは、医薬品などの追加の治療効果のある薬剤を含有しない、すなわち含まない。驚くべきことに、本発明のＥＣＡＳは、追加の治療効果のある薬剤を必要とせずに、眼の感染症の治療に有効であることが見出された。
【００２３】
本発明のＥＣＡＳは、好ましくは、ＢＡＫ、過ホウ酸ナトリウム、オキシクロロ錯体、ホウ酸亜鉛錯体などの追加の防腐剤を含有しない、すなわち含まない。驚くべきことに、本発明のＥＣＡＳは、それ自体が微生物の増殖を防ぐのに十分な殺菌力を有することが見出された。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ）電気分解反応器中で塩化物水溶液を電気分解する工程、
（ｉｉ）任意選択的に少なくとも１種のホウ酸（の塩）および／または少なくとも１種のリン酸（の塩）を添加する工程、ならびに
（ｉｉｉ）任意選択的に、好ましくは注射用水を添加することによってＥＣＡＳを希釈する工程、
を含む、上述した電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）の製造方法に関する。
【００２５】
電気分解反応器は、好ましくは、円筒形のアノード内に同軸状に取り付けられた円筒形のカソードを含む。カソードとアノードは、微孔性膜によって分離されていてもよく、その状態で電流が電極に印加される。電気分解は、１０．０〜３０．０Ａの電流で、好ましくは１５．０〜２０．０Ａの電流で行われる。電気分解反応器は、好ましくは連続電気分解用に構成される。前述の反応器のうちの１つ以上を並列または直列に組み合わせることができる。
【００２６】
工程（ｉ）で使用される塩化物水溶液は、好ましくは、注射用水（滅菌水）の中で最大１０ｇ／ｌ、好ましくは２〜９ｇ／ｌの濃度を有する。
【００２７】
工程（ｉ）または（ｉｉ）で得られたＥＣＡＳは、水性媒体、好ましくは滅菌水で希釈されてもよい。工程（ｉ）または（ｉｉ）で得られたＥＣＡＳは、例えば、１：６〜６：１、好ましくは１：０．５〜１：３の、ＥＣＡＳ：水性媒体の比率で水性媒体で希釈されてもよい。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、本発明の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）と任意選択的な少なくとも１種の治療に有効な薬剤とを含有する医薬製剤に関する。本発明による医薬製剤は、少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される添加剤は、例えば緩衝剤、アジュバント、補助剤、賦形剤、希釈剤などから選択することができる。
【００２９】
別の態様では、本発明の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）は、細菌、真菌、および／またはウイルスなどの微生物によって引き起こされる感染症、特には眼の感染症の治療に使用するためのものである。細菌感染症および真菌感染症は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ブラシリエンシス（Aspergillus brasiliensis）、セラチア・マルセッセンス（Aerratia marcescens）、およびアシネトバクター・ピティー（Acinetobacter pitii）からなる群から選択される１種以上の種によって引き起こされる可能性がある。ウイルス感染は、ヒトアデノウイルスＢおよびヒトアデノウイルスＣなどのアデノウイルス、エンテロウイルス７０またはコクサッキーウイルスなどのエンテロウイルス、ならびに単純ヘルペスウイルス１型および単純ヘルペスウイルス２型などのヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる可能性がある。
【００３０】
さらなる態様では、本発明の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）は、眼の感染症を治療するために、好ましくは結膜炎、角膜炎、眼瞼炎、眼内炎、より好ましくは角膜炎および／または結膜炎、さらに好ましくは結膜炎を治療するために特に使用することができる。驚くべきことに、本発明のＥＣＡＳは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの研究によって、細菌性結膜炎および細菌性角膜炎の治療において有害な副作用を引き起こすことなく最適な有効性を示すことが見出された。
【００３１】
したがって、非常に好ましい実施形態では、本発明の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）は、例えば細菌、真菌、またはウイルスなどの例えば微生物により引き起こされる結膜炎を治療するために、より好ましくは細菌性結膜炎を治療するために使用することができる。
【００３２】
したがって、別の好ましい実施形態では、本発明の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）は、例えば細菌性角膜炎などの角膜炎を治療するために使用することができる。
【００３３】
本発明の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）は、眼の感染症を治療するために、眼、涙嚢、および／または眼瞼に局所的に投与することができる。好ましい実施形態では、本発明のＥＣＡＳは、感染直後に眼に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａの力価の図である。ベロ細胞を試験製品で処理（感染前２４時間と２時間、感染中、感染後２時間と６時間）し、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａに感染させた。感染した細胞を感染後２４時間（ｈｐｉ）で回収し、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。ＭＯＣＫ−  感染した未処理の細胞；１：１−  １：１に希釈した１００μｌのＥＣＡＳ２で処理した感染細胞；１：２−  １：２に希釈した１００μｌのＥＣＡＳ２で処理した感染細胞；ＡＣＶ−  １００μＭのアシクロビルで処理した感染細胞。
【図２】ＨＳＶ−１株ＡＮＧｐａｔｈの力価の図である。ベロ細胞を試験製品で感染前２４時間と２時間、感染中、感染後２時間と６時間に処理し、０．０１のＭＯＩでＨＳＶ−１株ＡＮＧｐａｔｈに感染させた。感染した細胞を２４ｈｐｉで回収し、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。ＭＯＣＫ−  感染した未処理の細胞；１：１−  １：１に希釈した１００μｌのＥＣＡＳ２で処理した感染細胞；１：２−  １：２に希釈した１００μｌのＥＣＡＳ２で処理した感染細胞；ＡＣＶ−  １００μＭのアシクロビルで処理した感染細胞。
【図３】ＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａの力価の図である。ＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａ（ＭＯＩ０．０１）を、ベロ細胞に感染させる前に、２、６、８、または１２時間試験製品と共にインキュベートした。感染した細胞を２４ｈｐｉで回収し、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。ＭＯＣＫ−  未処理のウイルスに感染した細胞；１：１−  １：１に希釈した１００μｌのＥＣＡＳ２で処理した感染細胞；１：２  −１：２に希釈した１００μｌのＥＣＡＳ２で処理した感染細胞；ＡＣＶ−  １００μＭのアシクロビルで処理した感染細胞。
【図４】ＨＳＶ−１株ＡＮＧｐａｔｈの力価の図である。ＡＮＧｐａｔｈ（ＭＯＩ０．０１）を、ベロ細胞に感染させる前に、２、６、８、または１２時間試験製品と共にインキュベートした。感染した細胞を２４ｈｐｉで回収し、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。ＭＯＣＫ−  未処理のウイルスに感染した細胞；１：１−  １：１に希釈した１００μｌのＥＣＡＳ２で処理した感染細胞；１：２  −１：２に希釈した１００μＭのＥＣＡＳ２で処理した感染細胞；ＡＣＶ−  １００μＭのアシクロビルで処理した感染細胞。
【図５】ＥＣＡＳ２およびＦｌｏｘａｌ（登録商標）で治療した、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）に感染したウサギの眼の眼科的評価のサマリースコアの図である。ウサギの目は６日以内に治療した。２４、４８、７２、９６、１４４、および１６８ｈｐｉで眼科的評価を行った。結膜炎の主なパラメータを、それぞれ四分割で１、２、３、または４に等級付けした。観察結果をグループごとにまとめた。１グループあたりの目の数ｎは８であった。
【図６】ＥＣＡＳ２およびＦｌｏｘａｌ（登録商標）で治療した、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）に感染したウサギの眼の眼科的評価の平均スコアの図である。ウサギの目は６日間治療した。２４、４８、７２、９６、１４４、および１６８ｈｐｉで眼科的評価を行った。結膜炎の主なパラメータを、それぞれ四分割で１、２、３、または４に等級付けした。観察結果をグループごとの平均スコアとして表した。１グループあたりの目の数ｎは８であった。
【図７】ＥＣＡＳ２およびＦｌｏｘａｌ（登録商標）で治療した、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）に感染したウサギの眼で見られるコロニー形成単位（ＣＦＵ）の図である。ウサギの目は６日間治療した。２４、４８、７２、９６、および１４４ｈｐｉで眼科的評価を行った。観察結果をグループごとにまとめた。１グループあたりの目の数ｎは８であった。
【図８】ＥＣＡＳ２およびＦｌｏｘａｌ（登録商標）（０．３％オフロキサシン）で治療した、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）に感染したウサギの眼である。ウサギの眼は、感染後６時間から１９時間まで１時間ごとに治療した。ウサギを殺処分した後、角膜１００ｍｇあたりの生存しているシュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）の数を定量化した。グループあたりの目の数ｎは５であった。
【００３５】
以下の実施例により本発明を詳しく例示するが、本発明は以下の実施例によっては限定されない。
【００３６】
実施例
実施例１：電気化学的に活性化された塩溶液の調製および特性評価
ＥＣＡＳの調製のために、６つの組み合わされた電気分解反応器（同軸電極）を使用した。タンクに保管された飽和塩化ナトリウム溶液を、注射用の純水の流れに対して所定の比率で、例えば２．８３ｌ／分の流量でバルブを通して入れ、その後ポンプで反応器を通した。アノードとカソードによって生成された２つの活性化溶液を回収し、所定の比率で混合することで純粋なＥＣＡＳを得た。
【００３７】
任意選択的に、注射用水で希釈する前に、ホウ酸塩および／またはリン酸塩を純粋なＥＣＡＳに添加した。
【００３８】
得られたＥＣＡＳは次の表にまとめられている。
【００３９】
【表１】
2021531341.tif 000002
【００４０】
実施例２：電気化学的に活性化された塩溶液の安定性
電気化学的に活性化された塩溶液の安定性を、得られたＥＣＡＳ（表１を参照）を密閉された高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）容器の中に２０℃で保管することによって評価した。
【００４１】
【表２】
2021531341.tif 000003
【００４２】
【表３】
2021531341.tif 000004
【００４３】
【表４】
2021531341.tif 000005
【００４４】
【表５】
2021531341.tif 000006
【００４５】
全てのＥＣＡＳは優れた抗菌活性を示す。さらに、安定性の結果は、ホウ酸の塩およびリン酸の塩をそれぞれ含有するＥＣＡＳ１およびＥＣＡＳ２が、物理化学的パラメータ（表２ａ）の点で、ならびに表２ｃおよび２ｄに詳しく示されている抗菌活性の維持の点で一年後であっても、ＥＣＡＳ０よりも安定であることを示している。
【００４６】
実施例３：電気化学的に活性化された塩溶液のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性
細菌、酵母、および胞子に対するＥＣＡＳ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性を試験した。試験は、１０種の参考株および３９種の臨床分離株に対する陰性対照（塩化ナトリウム−ペプトン緩衝溶液）、ＥＣＡＳ２、および参照製品（Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）、点眼薬、０．３％オフロキサシン、塩化ベンザルコニウム、注射用水）について、それぞれ３回行った。
【００４７】
各微生物サンプルは、少なくとも１０５〜１０６ＣＦＵ／ｍｌの開始濃度に希釈した。その後、陰性対照、ＥＣＡＳ２、および参照製品にそれぞれ０．１ｍｌを接種し、各サンプルを混合した。接種後０、１５、および３０分の時間間隔で、サンプルを採取して不活化し、微生物の生存を測定した。
【００４８】
微生物集団の減少は、初期微生物濃度と各インキュベーション間隔での濃度（共にＣＦＵ／ｍＬ）とを比較することによって計算した。結果を表３に示す。
【００４９】
【表６】
2021531341.tif 000007
【００５０】
【表７−１】
2021531341.tif 000008
【表７−２】
2021531341.tif 000009
【００５１】
【表８】
2021531341.tif 000010
【００５２】
【表９−１】
2021531341.tif 000011
【表９−２】
2021531341.tif 000012
【００５３】
参考株
参考株であるスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（S. epidermidis）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、エシェリヒア・コリ（E. coli）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、およびアスペルギルス・ブラシリエンシス（Aspergillus brasiliensis）は、ＥＣＡＳ２に感受性を有していた。ＥＣＡＳ２は９／１０の微生物に対して時間０で高い活性（５０％を超える阻害）を示した。９０％を超える阻害が７種の微生物について決定された。
【００５４】
１５分後、ＥＣＡＳ２は全ての試験された参考株に対して活性を示した（９９％を超える阻害）。
【００５５】
参考株であるスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（S. epidermidis）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、エシェリヒア・コリ（E. coli）、およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）は、参照製品Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）に感受性を有していた。参照製品は５／１０の微生物に対して時間０で高い活性（５０％を超える阻害）を示した。９０％を超える阻害が３種の微生物について決定された。
【００５６】
１５分後、参照製品は８／１０の試験された参考株に対して活性を示した（９０％を超える阻害）。
【００５７】
２種の微生物、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）とアスペルギルス・ブラシリエンシス（Aspergillus brasiliensis）は、最大３０分間のインキュベーションの間、生存し続けた（５０％未満の阻害）。
【００５８】
臨床分離株
調査を行った３９の臨床分離株は、１か月以内に医療微生物学研究室で結膜炎から収集した菌株の発生率に基づいて選択した。それらのほとんど（３４）はスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）とＭＲＳＡであり、発生率が低い残りのものはエシェリヒア・コリ（E. coli）（２）、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）（１）、アシネトバクター・ピティー（Acinetobacter pitii）（１）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）（１）であった。
【００５９】
スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）およびＭＲＳＡ
ＥＣＡＳ２は、試験した３０／３４の分離株に対して時間０で高い活性（５０％を超える阻害）を示した。９０％を超える阻害がスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）／ＭＲＳＡの１６／３４の分離株について決定された。
【００６０】
１５分後、ＥＣＡＳ２は３４／３４の分離株に対して活性を示した（９９％を超える阻害）。
【００６１】
参照製品は、試験した１４／３４のスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）／ＭＲＳＡの分離株に対して時間０で高い活性（５０％を超える阻害）を示した。９０％を超える阻害が１／３４の分離株について決定された。
【００６２】
１５分の時点で、参照製品は３２／３４の試験した分離株に対して活性（９０％以上の阻害）を示した。
【００６３】
エシェリヒア・コリ（E. coli）
ＥＣＡＳ２は、試験した２／２のエシェリヒア・コリ（E. coli）の分離株に対して時間０で高い活性（５０％を超える阻害）を示した。９０％を超える阻害が２／２の分離株について決定された。
【００６４】
ＥＣＡＳ２は、試験した２／２のエシェリヒア・コリ（E. coli）の株に対して１５分の時点で活性（９９％を超える阻害）を示した。
【００６５】
参照製品は、試験した２／２のエシェリヒア・コリ（E. coli）の分離株に対して時間０で高い活性（５０％を超える阻害）を示した。９０％を超える阻害が０／２の分離株について決定された。
【００６６】
１５分の時点で、参照製品は試験した２／２のエシェリヒア・コリ（E. coli）の分離株に対して活性（９０％を超える阻害）を示した。
【００６７】
シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）
ＥＣＡＳ２は、１／１のシュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）の分離株に対して０分の時点で９０％を超える高い活性を示した。
【００６８】
１５分の時点で、ＥＣＡＳ２は試験した１／１のシュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）の株に対して活性（９９％を超える阻害）を示した。
【００６９】
参照製品は、時間０でシュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）の分離株の１／１に対して高い活性（５０％を超える阻害）を示し、０に対して９０％を超える阻害を示した。
【００７０】
１５分の時点で、参照製品は試験した１／１のシュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）の分離株に対して活性（９０％を超える阻害）を示した。
【００７１】
グラム陰性菌（セラチア（Serratia）、アシネトバクター・ピティー（Acinetobacter pitii））
ＥＣＡＳ２は、列挙したグラム陰性菌の２／２の分離株に対して時間０で高い活性（５０％を超える阻害）を示した。
【００７２】
１５分の時点で、ＥＣＡＳ２は２／２の分離株に対して活性（９９％を超える阻害）を示した。
【００７３】
参照製品は、列挙した２／２のグラム陰性菌に対して時間０で高い活性（５０％を超える阻害）を示した。
【００７４】
１５分の時点で、参照製品は試験した１／２の分離株に対して活性（９０％を超える阻害）を示した。
【００７５】
考察
結果は、ＥＣＡＳ２が強力な抗菌活性を有していることを示している。活性のスペクトルは、グラム陽性菌とグラム陰性菌、酵母菌、およびカビを網羅している。試験接種物（１０５〜１０６）をＥＣＡＳ２と混合した直後に、全ての参考株（１０株）および結膜炎からの全ての臨床分離株（３９株）に対して阻害活性が検出された。２例（スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ＧＡＯＣ９５５／１およびセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）ＤＯＣ９２０）を除き、１５分間のインキュベーション後、全ての試験株で９９％を超える阻害が決定された。
【００７６】
ＥＣＡＳ２と比較した参照製品Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）の抗菌活性の違いは、特に時間０で観察された。時間０でＥＣＡＳ２について決定された阻害は、参照製品による阻害よりも有効であった。さらに、アスペルギルス・ブラシリエンシス（Aspergillus brasiliensis）およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）は、最大３０分間の時間間隔で参照製品に感受性を有していなかった。
【００７７】
実施例４：電気化学的に活性化された塩溶液のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルス活性
Ａ．ベロ細胞を２４ウェルプレートに播種し、ＥＣＡＳ２のＤｉｌ．１：１およびＤｉｌ．１：２のいずれかの希釈液で処理した。
Ｉ．感染前２４時間；
ＩＩ．感染前２時間；
ＩＩＩ．感染中；
ＩＶ．感染後２時間；または
Ｖ．感染後６時間。
【００７８】
細胞を、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）でＨＳＶ−１株ＫｕｐｋａおよびＡＮＧｐａｔｈに感染させた。感染の２４時間後（ｈｐｉ）に細胞を回収し、ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。簡潔に説明すると、サンプルを段階希釈し、２４ウェルまたは６ウェルの組織プレート中の１日目のベロ細胞単層２つずつにプレーティングした。その後、１％メチルセルロースを含む通常の増殖培地で細胞を覆った。感染から５日後、細胞を固定し、２０％エタノール中の２％クリスタルバイオレットで染色し、個々のプラークをカウントして、各サンプルのウイルス力価を決定した。処理なしのサンプル（モック、陰性対照）と、ＡＣＶで処理したサンプル（アシクロビル、１００μｍｏｌ／ｌ、基準対照）は、同じ方法で処理した。試験は２つの独立した実験で行い、各サンプルは並列ウェルで試験した。
【００７９】
Ｂ．ＨＳＶ−１株ＫｕｐｋａおよびＡＮＧｐａｔｈを、以下のいずれかの間、最終容量１００μｌで、ＥＣＡＳ２のＤｉｌ．１：１またはＤｉｌ．１：２のいずれかの希釈液を用いて０．０１のＭＯＩでインキュベートした：
Ｉ．１２時間；
ＩＩ．８時間；
ＩＩＩ．６時間；または
ＩＶ．２時間。
【００８０】
その後、感染の２４時間前に２４ウェルプレートに播種した細胞を、上述したプレインキュベートしたウイルスに感染させた。２４ｈｐｉで細胞を回収し、ウイルス力価を上述したプラークアッセイによって決定した。処理なしのサンプル（モック、陰性対照）と、アシクロビルで処理したサンプル（１００μｍｏｌ／ｌ、基準対照として）は、同じ方法で処理した。試験は２つの独立した実験で行い、各サンプルは並列ウェルで試験した。
【００８１】
結果
Ａ．全ての時点で１：１に希釈したＥＣＡＳ２で細胞を処理した場合、ＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａの力価の大幅な低下が検出された（図１）。興味深いことに、感染中、または２および６ｈｐｉにＥＣＡＳ２（１：１）で処理した細胞のウイルス力価の低下は、ＡＣＶ処理された同じ時点のものと比較してさらに大きかった。ＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａの力価の最大の低下は、６．２９ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ（ｐ≦０．０１）であり、１：１に希釈されたＥＣＡＳ２で感染中に処理された細胞で検出された（表４）。
【００８２】
１：２に希釈されたＥＣＡＳ２は、１：１の希釈で観察される程度までウイルスの複製を阻害しなかった。それにもかかわらず、感染中に細胞を処理した場合、モック処理した感染細胞と比較して、３．２６ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ（ｐ≦０．０１）の力価の低下が検出された。
【００８３】
細胞をＡＣＶで処理した場合、ＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａの力価の最大の低下は４．５２  ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ（ｐ≦０．０１）であり、２ｈｐｉに処理した細胞で検出された。
【００８４】
【表１０】
2021531341.tif 000013
【００８５】
ＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａと同様に、全ての時点で１：１に希釈したＥＣＡＳ２で細胞を処理すると、ＨＳＶ−１  ＡＮＧｐａｔｈの力価の大幅な低下が検出された（図２）。興味深いことに、処理の全ての時点でＥＣＡＳ（１：１）で処理した細胞のウイルス力価の低下は、ＡＣＶを用いた細胞の処理と比較してさらに大きかった。ＨＳＶ−１株ＡＮＧｐａｔｈの力価の最大の低下は６．１１ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ（ｐ≦０．０１）であり、１：１に希釈されたＥＣＡＳ２で感染中に処理された細胞で検出された（表５）。
【００８６】
１：２に希釈されたＥＣＡＳ２は、１：１の希釈で観察される程度までウイルスの複製を阻害しなかった。それにもかかわらず、６ｈｐｉに細胞を処理した場合、モック処理した感染細胞と比較して、２．２４ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ（ｐ≦０．０１）の力価の低下が検出された。
【００８７】
細胞をＡＣＶで処理した場合、ＨＳＶ−１株ＡＮＧｐａｔｈの力価の最大の低下は２．４５、２．８１、および２．３８ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ（ｐ≦０．０１）であり、感染中、２ｈｐｉ、および６ｈｐｉにそれぞれ処理した細胞で検出された。
【００８８】
【表１１】
2021531341.tif 000014
【００８９】
ウイルス力価が対照と比較して少なくとも１ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ低下した場合、製品はウイルスに対して少し活性を有するとみなされる。ウイルス力価が少なくとも４ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ低下すると、製品が強い抗ウイルス効果を有するとみなされる。
【００９０】
これらの結果は、感染中または感染後の早い時期に１：１に希釈したＥＣＡＳ２で細胞を処理すると、ウイルス力価を少なくとも４ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ低下させることができ、ＥＣＡＳのこの潜在能力はＨＳＶ−１株に依存しないことを示唆している。したがって、本発明によるＥＣＡＳ２は、細胞が感染中または感染後の早い時期に処理される場合、ウイルス力価を低下させる可能性を有している。
【００９１】
Ｂ．全ての時点で１：１に希釈されたＥＣＡＳ２で処理した感染細胞で、ＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａの力価の完全な低下が検出された。興味深いことに、１：２に希釈したＥＣＡＳ２で処理した感染細胞のウイルス力価の低下は、ＡＣＶ処理と比較してさらに大きかった（図３）。ＨＳＶ−１株Ｋｕｐｋａの力価の最大の低下は５．７４ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ（ｐ≦０．０１）であり、全ての時点で１：１に希釈されたＥＣＡＳ２および１：２に希釈されたＥＣＡＳ２で１２時間処理した感染細胞で検出された（表６）。
【００９２】
【表１２】
2021531341.tif 000015
【００９３】
ＨＳＶ−１株ＡＮＧｐａｔｈの力価の完全な低下が、１：１に希釈されたＥＣＡＳ２で２、８、および１２時間処理した感染細胞で検出された。興味深いことに、６〜１２時間の時点の１：２に希釈したＥＣＡＳ２で処理した感染細胞のウイルス力価の低下は、ＡＣＶ処理と比較してさらに大きかった（図４）。ＨＳＶ−１株ＡＮＧｐａｔｈの力価の最大の低下は、７．５０ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍｌ（ｐ≦０．０１）であり、１：１に希釈したＥＣＡＳ２で２、８、および１２時間処理した感染細胞で検出された（表７）。
【００９４】
【表１３】
2021531341.tif 000016
【００９５】
結果は、ウイルスを１：１に希釈したＥＣＡＳ２と２時間以上プレインキュベートすると、ＨＳＶ−１株ＫｕｐｋａおよびＡＮＧｐａｔｈの力価が大幅に低下することを明確に示している。まとめると、ウイルスが感染前に２時間以上試験製品と共にプレインキュベートされた場合、ＥＣＡＳ２はウイルスに直接影響を及ぼし、ＨＳＶ−１複製の阻害を媒介する潜在能力を有している。
【００９６】
ＥＣＡＳ２は、感染中または感染後の早い時期に細胞をＥＣＡＳ２で処理した場合にウイルス力価を低下させる潜在能力を有している。さらに、ＥＣＡＳ２は、ウイルスを感染前にＥＣＡＳ２で２時間以上処理した場合に、ウイルス力価を低下させる潜在能力を有している。
【００９７】
細胞をＨＳＶ−１感染中または感染後の早い時期にＥＣＡＳ２で処理した場合に、ＥＣＡＳ２がウイルス力価の低下として表されるウイルス複製の阻害を行うことができ、またウイルスをＨＳＶ−１感染前にＥＣＡＳ２で２時間以上処理した場合に、ＥＣＡＳ２がウイルス力価の低下として表されるウイルス複製の阻害を行うことができるため、ここで示された結果は、ＥＣＡＳ２が基本的にＡＣＶと同じ抗ウイルス効果を有していることを明確に示している。
【００９８】
実施例５：電気化学的に活性化された塩溶液のｉｎ  ｖｉｖｏ抗菌活性
スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）に対するｉｎ  ｖｉｖｏ活性
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＣＡＳ２の抗菌効果を、若い雌のニュージーランドアルビノウサギの眼球で調べた。イソフルラン麻酔の条件下で、ウサギの右眼の結膜を傷付けた。接種用のスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ＤＯＣ８４５／１を、遠心分離後の終夜懸濁液から調製し、生理食塩水で洗浄し、１０６ＣＦＵの懸濁液まで適切に希釈し、分枝損傷を模倣するために注入（５０μｌの量で注入）した。スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）を４８時間インキュベートした。
【００９９】
４８時間後、感染したウサギの眼球を調べた。眼科医によって確認された結膜炎を除いて、全ての動物（雌のニュージーランドアルビノウサギ２４匹）は、ドレイズ眼試験（角膜および虹彩を含む）に従って検査した際に最初の治療前に所見を示さなかった。４８時間後、結膜炎の等級付け（W. Behrens-Baumann and T. Begall, 1997）に基づいて、動物を３つのグループ（グループＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）に分け、各グループで同等の結膜の炎症（conjunctive inflammatory）のスコアを得た。
【０１００】
感染した眼の治療は感染の４８時間後に開始した。グループＩの動物は通常の無菌生理食塩水で治療し（陰性対照／未治療グループ）；グループＩＩの動物はＥＣＡＳ２で治療し；グループＩＩＩの動物はオフロキサシンを含有する市販の点眼薬Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）（注射用水中０．３％ｗ／ｖ、防腐剤フリー、陽性対照）で治療した。３つのグループ全てで眼球あたりそれぞれ３０μＬの治療液を投与した。溶液をスケジュールに従って（３時間ごとに６日間）マイクロピペットで右結膜嚢に滅菌注入し、眼球全体に広げ、数秒間保持した。左目を対照とした。異なるグループの治療が表８にまとめられている。
【０１０１】
【表１４】
2021531341.tif 000017
【０１０２】
眼科検査
眼科検査は、治療４日目を除いては最初の治療の直前に毎日行った。主なパラメータである結膜充血は、ドレイズ眼試験（J. Draize et al., 1944）に従って、それぞれ四分割で１、２、３、または４に等級付けした（表９）。評価は２名で行い、左眼を対照として使用した。最初の治療前の眼科検査と最後の眼科検査には角膜と虹彩も含まれていた。
【０１０３】
【表１５】
2021531341.tif 000018
【０１０４】
微生物学的評価
接種の４８時間後および２日ごとに感染した眼からぬぐい液を採取した。ぬぐい液を希釈前に滅菌輸送培地中で輸送し、平板塗抹法を使用して培養した。回収した寒天中の残留抗菌剤は、生存細胞の回収を人為的に抑制する可能性がある。このため、以下に記載の通りに希釈することにより残留抗菌活性を失活させた。
【０１０５】
０．１ｍＬのアリコートを、滅菌緩衝生理食塩水で１０倍に段階希釈した。Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）で処理したウサギからのサンプルを、塩化ナトリウムペプトン緩衝溶液、ｐＨ７．０＋５％Ｔｗｅｅｎ＋０．３％レシチン＋０．１％ヒスチジンで不活化した。各希釈液のサンプルを、トリプトンソイ寒天培地に１００μＬをピペットで入れて広げることにより３回プレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。ＣＦＵの数をカウントした。
【０１０６】
結果
動物あたり３枚のプレート／希釈液のそれぞれで観察されたコロニー形成単位をカウントした。得られた個々のＣＦＵ値は、統計的評価の前に対数に変換した。スチューデントのｔ検定を適用して、３つの治療グループで観察されたＬｏｇＣＦＵを比較した。Ｐ＜０．０５の有意水準を採用した。マン・ホイットニー（ウィルコクソン）検定を採用して、構成グループの結膜の臨床スコアを比較した。統計分析は、Statgraphics（商標）Centurionソフトウェアを使用して行った。
【０１０７】
・眼科的評価
接種の２４時間後、感染プロセスの開始を確認するために最初の眼科検査を行った。結果を表１０に示す。
【０１０８】
治療開始直前（４８時間）の検査で、全ての動物に結膜炎の発症が確認された。また、研究に関与したいずれの動物においても、角膜および虹彩に病理学的所見がないことも確認された（表１１）。
【０１０９】
感染した目は６回検査した。サマリースコアとして表される眼科検査の結果を表１０に示す。最後の評価（１４４時間）後、写真で記録した。
【０１１０】
全ての時点のサマリースコアと平均スコアを図５と図６に示す。
【０１１１】
【表１６】
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【０１１２】
【表１７】
2021531341.tif 000020
【０１１３】
ＥＣＡＳ２とＦｌｏｘａｌ（登録商標）の治療は共に、９６時間後に症状の増加を示した対照と比較して、感染後の期間中に症状の減少を示した。臨床スコアの結果（表１０）に基づいて、治療の初日の後（７２時間）、３つのグループ全てで充血、結膜浮腫、および分泌物の症状がわずかに減少したと推測される。
【０１１４】
治療の２日後（９６時間）、対照のグループとは対照的に、ＥＣＡＳ２（ＩＩ）およびＦｌｏｘａｌ（登録商標）（ＩＩＩ）のグループでは結膜浮腫の進行は観察されなかった（表１２）。両方の治療グループ（ＩＩおよびＩＩＩ）で、結膜浮腫は減少した範囲内であった。
【０１１５】
４日間の治療後、ＥＣＡＳ２のグループは４／８匹の動物で有効な臨床的治癒を示した（スコア０〜１）一方で、Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）で治療したグループは６／８匹の動物で有効な臨床的治癒を示した。感染から８日後（６回の投与日）にＥＣＡＳ２のグループの６／８匹の動物で完全な臨床的治癒が観察された一方で、Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）で治療したグループでは７／８匹の動物で結膜炎の臨床的に軽度の症状がないことが観察された。感染根絶のプロセスは比較的速く、より多くの時点で比較を行うことはできなかった。
【０１１６】
【表１８】
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【０１１７】
・微生物学的検査
２日間の治療の後（９６時間）、ＥＣＡＳ２を用いた治療は、治療開始時と比較してスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）の数を約１．２ｌｏｇ  ＣＦＵ減少させた（図７）。この減少は、主にデータのばらつきが大きいことに起因して、Ｐ＝０．０５（Ｐ＝０．２６７９）で未処理の対照と比較して統計的に有意ではなかった。ぬぐい液は２／８匹のウサギで陰性であった（表１３）。
【０１１８】
２日間の治療の後（９６時間）、Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）は、治療開始時に決定された数と比較してＣＦＵを約１．６ｌｏｇ減少させた（図７）。この減少は、Ｐ＝０．０５（Ｐ＝０．０７６８）で、未処理の対照と比較して減少は統計的に有意ではなかった。この場合も得られたデータのばらつきは大きかった。ぬぐい液は３／８匹のウサギで陰性であった。
【０１１９】
【表１９】
2021531341.tif 000022
【０１２０】
・結論
この調査では、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）により誘発された結膜炎を有するウサギを使用して、ＥＣＡＳ２の活性をＦｌｏｘａｌ（登録商標）の活性と比較して分析することに焦点が当てられている。有効性研究は、臨床分離株であるスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ＤＯＣ８４５／１の対数増殖期培養物に感染させた若い雌のニュージーランドアルビノウサギの右眼球で行った。抗結膜炎の有効性は、各グループの症状を観察してスコアリングすることによって評価した。１、２、３、４、６、および７日目に眼科的評価を行い、平均細菌数についてのぬぐい液試験を２日ごとに行った。
【０１２１】
ＥＣＡＳで治療されたグループでは、５日目（９６時間）と区別されるかなりの治療効果があった。ＥＣＡＳ２およびＦｌｏｘａｌ（登録商標）で治療されたグループの両方で、対照のグループと比較した場合に結膜に関するスコアは臨床的に減少した。
【０１２２】
７日目（１４４時間）に登録された臨床スコアの結果から、細菌の除去を達成した治療されたグループと未治療のグループとの間に明らかな違いがあることが明らかになった。
【０１２３】
さらに、ＥＣＡＳ２のグループにおいて局所的な不耐症の証拠は観察されなかった。
【０１２４】
シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）に対するｉｎ  ｖｉｖｏ活性
シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）は、コンタクトレンズに関連した潰瘍の症例から最も一般的に分離される病原体の１つである。シュードモナス・エルギノーザ（P. aeruginosa）に感染した患者は重度の潰瘍を発症し、多くの場合他の病原体によって引き起こされる感染症の患者よりも広範囲の治療を必要とする。シュードモナス・エルギノーザ（P. aeruginosa）感染時の角膜破壊は速く、２４時間以内に穿孔および／または視力喪失が起こる可能性がある。
【０１２５】
細菌の実質内注入は、接種経路の点で最も一般的な形態のヒト角膜炎と類似していない。角膜表面からの細菌による組織への侵入が感染を開始するより自然な手段である。しかしながら、局所接種はしばしば感染を生じさせないか、不正確な形式で感染させる（組織内の細菌数の大きなばらつき）（O’Callaghan et al., 1999）。
【０１２６】
ウサギの角膜は多くの眼の研究の標準モデルであることから、データはヒトの角膜炎の治療に当てはめることができる（O’Brien et al., 2003）。実験的細菌性角膜炎の研究は、組織の損傷が細菌宿主因子の組み合わせによって媒介されることを示した。
【０１２７】
この研究の目的は、実験的角膜炎におけるＥＣＡＳの効果を評価することであった。実質内シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）を１５匹のウサギの右眼に投与した。ウサギは、生理食塩水（対照グループＩ）、ＥＣＡＳ２（試験製品グループＩＩ）、およびＦｌｏｘａｌ（登録商標）（参照グループＩＩＩ）の３つの治療グループ（ｎ＝５）に均等に分けた。
【０１２８】
シュードモナス（Pseudomonas）に感染した角膜の治療は、臨床症状に基づき感染してから６時間後に開始した。治療用製品は６０分ごとに合計１９回投与した。ＥＣＡＳ治療を受けた非感染ウサギの評価のために、同じ治療スケジュールをグループＩＶに適用した。
グループＩ（感染、治療なし−Ｉ）：生理食塩水で治療
グループＩＩ（感染、治療あり−ＩＩ）：動物はＥＣＡＳ２による治療を受けた。４０μｌのＥＣＡＳ２を、スケジュールに従ってマイクロピペットで右結膜嚢に滅菌注入した。瞼を１０〜１５秒間優しく閉じた。左目を対照とした。
グループＩＩＩ（感染、治療あり−ＩＩＩ）：動物は、スケジュールに従ってマイクロピペットで右結膜嚢に滅菌注入された４０μｌの量のＦｌｏｘａｌ（登録商標）による治療を受けた。瞼を１０〜１５秒間優しく閉じた。左目を対照とした。
グループＩＶ（感染なし、治療あり−ＩＶ）：動物は、スケジュールに従ってマイクロピペットで右結膜嚢に滅菌注入された４０μｌのＥＣＡＳ２による治療を受けた。瞼を１０〜１５秒間優しく閉じた。左目を対照とした。
【０１２９】
最初の治療の直前、接種してから６、１７、および１９時間後、スリットランプで眼を検査し、感染の進行を評価した。最後の適用から１時間後、チオペンタールの過剰投与によってウサギを殺処分し、細菌数をカウントするために角膜を回収した。
【０１３０】
微生物学的評価
角膜を無菌で取り出し、解剖し、チューブに移し、秤量し、複数の断片に切断した。組織を、０．５ｍＬの滅菌リン酸緩衝生理食塩水中で、組織ホモジナイザーにより２００００ｒｐｍで３０秒間２回、氷浴中でホモジナイズし、アリコートを滅菌塩化ナトリウムペプトン緩衝溶液で１０倍に段階希釈した。参照製品で治療した動物は、残留参照製品の不活化のために、塩化ナトリウムペプトン緩衝溶液＋５％Ｔｗｅｅｎ＋０．３％レシチン＋０．１％ヒスチジンで段階希釈した。各希釈液のサンプルを、トリプトンソイ寒天培地（ＴＳＡ）およびセトリミド寒天培地に１００μＬをピペットで入れて広げることにより３回プレーティングし、３７℃で４８時間インキュベートした。生存ＣＦＵをカウントした。生存シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）の数を、角膜１００ｍｇあたりで表した（表１４および図８）。
【０１３１】
感染プロセスが眼の構造のみに位置することを確認し、二次汚染を排除するために、全ての動物から感染の１０時間後に結膜嚢（conjunctive sack）からぬぐい液を採取した。
【０１３２】
【表２０】
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【０１３３】
シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）に感染したウサギの眼を感染後６〜１９時間にＥＣＡＳ２で治療すると、未治療の対照グループと比較して、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）微生物の数が約１．６ｌｏｇ  ＣＦＵ／１００ｍｇだけ減少した（４．４×１０６ＣＦＵ／角膜１００ｍｇから１．１×１０５ＣＦＵ／角膜１００ｍｇ）（図８）。ＥＣＡＳ２で処理した後の細菌の％残存数は対照グループの２．６％であった。
【０１３４】
Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）は、細菌数を４．４×１０６ＣＦＵ／角膜１００ｍｇから３０．６ＣＦＵ／角膜１００ｍｇに減らした。すなわち、細菌の残存％数は生理食塩水の対照に対して＜０．１％に相当する。Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）によって得られた細菌の％減少はＥＣＡＳ２よりもわずかに大きかったものの、Ｆｌｏｘａｌ（登録商標）治療グループとＥＣＡＳ２治療グループとの差はＰ＝０．０５で統計的に有意ではなかった。
【０１３５】
この結果は、細菌性角膜炎の治療におけるＥＣＡＳ２の大きな治療可能性を強く証明している。
【０１３６】
本発明は、以下の項目を網羅する：
１．総塩素含有量が１〜５００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜４５０ｍｇ／ｌであり、
塩化物含有量が２〜８ｇ／ｌ、好ましくは３〜７ｇ／ｌであり、
酸化還元電位が＋１５０〜＋１，３５０ｍＶ、好ましくは＋６００〜＋１，１００ｍＶ、より好ましくは＋７００〜＋１，０５０ｍＶ、より好ましくは＋７００〜＋１，０００ｍＶであり、
浸透圧が２０〜８００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、
ｐＨ値が６．０〜７．８、好ましくは７．１〜７．４であり、
任意選択的に少なくとも１種のホウ酸（の塩）および／または少なくとも１種のリン酸（の塩）を含む、
電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
２．密閉された高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）容器中で２０℃で保管された場合に、１年にわたって、好ましくは２年にわたって安定である、項目１記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
３．少なくとも１種のリン酸（の塩）を、好ましくは０．０１〜１０００ｇ／ｌの量で、より好ましくは０．１〜１００ｇ／ｌの量で含有する、項目１または２記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
４．少なくとも１種のホウ酸（の塩）を、好ましくは０．０１〜１０００ｇ／ｌの量で、より好ましくは０．１〜５００ｇ／ｌの量で含有する、項目１から３までのいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
５．次亜塩素酸イオンおよび／または次亜塩素酸を、特には１〜１００００ｍｇ／ｌの総濃度、より好ましくは１０〜１０００ｍｇ／ｌの総濃度で含む、項目１から４までのいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
６．亜塩素酸イオンおよび塩素酸イオンの総含有量が１０ｍｇ／ｌ未満である、項目１から５までのいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
７．重金属および重金属イオンの総含有量が１０μｇ／ｇ未満、好ましくは６μｇ／ｇ未満であり、個々の重金属および重金属イオンのそれぞれの含有量が好ましくは０．５μｇ／ｇ未満である、項目１から６までのいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
８．ポリマーなどの少なくとも１種の増粘剤をさらに含有する、項目１から７までのいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
９．前記ポリマーが、セルロース、セルロール誘導体、多糖（グルコサミノグリカンなど）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、シリカゲル、ならびにメタケイ酸マグネシウムおよび／またはメタケイ酸アルミニウムからなる群から選択される、項目８記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
１０．医薬品などの追加の治療効果のある薬剤を含有しない、項目１から９までのいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
１１．追加の防腐剤を含有しない、項目１から１０までのいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
１２．項目１から１１までのいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）を含有する医薬製剤。
１３．少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤をさらに含有する、項目１２記載の医薬製剤。
１４．感染症、例えば細菌、真菌、および／またはウイルスによって引き起こされる感染症の治療における使用のための項目１から１１までのいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
１５．前記細菌および／または真菌が、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ブラシリエンシス（Aspergillus brasiliensis）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、およびアシネトバクター・ピティー（Acinetobacter pitii）からなる群から選択される、項目１４記載の使用のための電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
１６．前記ウイルスが、アデノウイルス、エンテロウイルス、ならびに単純ヘルペスウイルス１型および単純ヘルペスウイルス２型などのヘルペスウイルスからなる群から選択される、項目１４記載の使用のための電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
１７．眼の感染症の治療における、項目１４から１６までのいずれか１つに記載の使用のための電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
１８．結膜炎、角膜炎、眼瞼炎、および／または眼内炎の治療における、項目１４から１７までのいずれか１つに記載の使用のための電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
１９．結膜炎、特には細菌性結膜炎の治療における、項目１４から１８までのいずれか１つに記載の使用のための電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
２０．眼、涙嚢、および／または眼瞼に局所的に投与される、項目１４から１９までのいずれか１つに記載の使用のための電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
２１．感染直後に眼に投与される、項目１４から２０までのいずれか１つに記載の使用のための電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）。
２２．（ｉ）電気分解反応器中で塩化物水溶液を電気分解する工程、
（ｉｉ）任意選択的に少なくとも１種のホウ酸（の塩）および／または少なくとも１種のリン酸（の塩）を添加する工程、ならびに
（ｉｉｉ）任意選択的に注射用水を添加することによって前記ＥＣＡＳを希釈する工程、
を含む、項目１〜１１のいずれか１つに記載の電気化学的に活性化された塩溶液（ＥＣＡＳ）の製造方法。
２３．前記電気分解反応器が、円筒形のアノード内に同軸状に取り付けられた円筒形のカソードを含む、項目２２記載の方法。
２４．前記塩化物溶液が最大１０ｇ／ｌの濃度を有する、項目２２または２３記載の方法。
２５．前記電気分解が１０．０〜３０．０Ａ、好ましくは１５．０〜２０．０Ａの電流で行われる、項目２２〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記電気分解反応器が連続電気分解用に構成されている、項目２２〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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