(57)【要約】  本発明は、光誘導性キナーゼおよび応答調節因子を用いて、生物体における標的遺伝子の発現を精確に制御する方法に関する。本発明はまた、光誘導性キナーゼおよび応答調節因子をコードする核酸構築物および核酸、ならびにこれらの構築物を発現する生物体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光応答性ヒスチジンキナーゼをコードする核酸および／または応答調節因子をコードする核酸を含む、核酸構築物であって、前記核酸が配列番号1、3、5、7、9もしくは11のいずれか一つに定義される光応答性ヒスチジンキナーゼまたはその機能的バリアントをコードし、前記応答調節因子が配列番号13もしくは15に定義される応答調節因子またはその機能的バリアントをコードする、核酸構築物。
【請求項２】
光応答性ヒスチジンキナーゼをコードする前記核酸が、配列番号2、4、6、8、10もしくは12もしくはその機能的バリアントを含むかもしくはそれからなり、または、配列番号47、48、49もしくは50もしくはその機能的バリアントを含むかもしくはそれからなる、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
応答調節因子をコードする前記核酸が、配列番号14もしくは16もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記構築物が、前記光応答性ヒスチジンキナーゼおよび前記応答調節因子のうちの少なくとも1つと作動可能に連結された少なくとも1つの調節配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記調節配列が、前記光応答性ヒスチジンキナーゼおよび前記応答調節因子に作動可能に連結されている、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項６】
レポーター配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記レポーター配列が調節配列に作動可能に連結されている、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記光応答性ヒスチジンキナーゼ、前記応答調節因子、および前記レポーター配列が、単一の調節配列に作動可能に連結されている、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記構築物が、前記光応答性ヒスチジンキナーゼ、前記応答調節因子、およびレポーター配列のうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは3つ全てに作動可能に連結された少なくとも1つのターミネーター配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記調節配列が構成的プロモーターである、請求項１〜９のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記プロモーターがUBQ10プロモーターである、請求項１０に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記構築物が、前記応答調節因子によって特異的に活性化される調節配列に作動可能に連結された標的配列をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１３】
前記調節配列が、配列番号17に定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含む、請求項１２に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記標的配列がターミネーター配列に作動可能に連結されている、請求項１２または１３に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸構築物または請求項１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１７】
前記細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記真核細胞が植物細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸構築物または請求項１５に記載のベクターを発現する、トランスジェニック生物体。
【請求項２０】
前記生物体が植物である、請求項１９に記載のトランスジェニック生物体。
【請求項２１】
請求項１９に記載のトランスジェニック生物体を作製する方法であって、
a. 生物体の一部分を選択すること；
b. 請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸構築物または請求項１５に記載のベクターを用いて、(a)の生物体の部分の少なくとも一つの細胞をトランスフェクトすること；および
c. 前記トランスフェクトされた細胞に由来する少なくとも1つの生物体を再生すること
を含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法によって取得されたかまたは取得可能である、生物体。
【請求項２３】
前記生物体が植物である、請求項２１に記載の方法または請求項２２に記載の生物体。
【請求項２４】
生物体において標的遺伝子の発現を調節する方法であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸構築物または請求項１５に記載のベクターを前記生物体に導入して発現させることと、少なくとも1つの波長の光を適用することとを含み、好ましくは、光の前記波長はLRHKを活性化させるかまたはその活性を抑制する、方法。
【請求項２５】
生物体における生化学的応答を調節する方法であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸構築物または請求項１５に記載のベクターを前記生物体に導入して発現させることと、少なくとも1つの波長の光を適用することとを含み、好ましくは光の前記波長がLRHKを活性化させるかまたはその活性を抑制する、方法。
【請求項２６】
前記生化学的応答が発生プロセスまたは生理的応答である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1つの第1波長の光を適用することによって標的遺伝子の発現を増加または減少させることができる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも1つの第2波長の光を適用することによって標的遺伝子の発現を減少もしくは増加させ、またはさらに減少もしくは増加させることができ、ここで、光の第1波長は光の第2波長とは異なる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
光の前記波長が、430〜495 nm（青色光）、495〜570 nm（緑色光）、600〜750 nm（赤色光）、白色光、または、赤色光、青色光もしくは緑色光のうちの少なくとも1つで富化された白色光のうちのいずれか1つの範囲を有し得る、請求項２４〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
光の前記波長が暗光（可視光なし）である、請求項２４〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記標的遺伝子の発現を増加させる前記第1波長の光が、好ましくは、緑色光、白色光もしくは赤色光であるか、または赤色光で富化された白色光である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的遺伝子の発現を減少させる前記第1波長の光が、好ましくは青色光であるか、または青色光で富化された白色光である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
標的遺伝子の発現をさらに増加させる第2波長の光が赤色光である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
標的遺伝子の発現を減少させる第2波長の光が青色光である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物体が、光中および／または暗所中で生育または培養される、請求項２４〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
フィトクロムおよび発色団を含む光受容体分子であって、前記フィトクロムが配列番号1、3、5、7、9および11のいずれかに定義されるアミノ酸配列を含む、光受容体分子。
【請求項３７】
前記発色団が、PCB（フィコシアノビリン）、PφB（フィトクロモビリン）、およびBV（ビリベルジン）から選択される、請求項３６に記載の光受容体分子。
【請求項３８】
前記発色団がPφBである、請求項３７記載の光受容体分子。
【請求項３９】
生物体における標的遺伝子の発現を調節するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸構築物または請求項１５に記載のベクターの使用。
【請求項４０】
生物体における生化学的応答、好ましくは発生的応答または生理的応答を調節するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸構築物または請求項１５に記載のベクターの使用。
【請求項４１】
調節配列に作動可能に連結された標的配列を含む核酸構築物であって、前記調節配列は、応答調節因子によって特異的に活性化される調節配列である、核酸構築物。
【請求項４２】
前記調節配列が、配列番号17に定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含む、請求項４１に記載の核酸構築物。
【請求項４３】
以下のものを含む核酸：
a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13および15のいずれかに定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、17、47、48、49もしくは50のいずれかに定義される核酸配列またはその相補配列；
c. (a) または (b) の前記核酸配列に対して少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の全体的配列同一性を有する核酸；または
d. 本明細書中で定義されるストリンジェントな条件下で、(a)〜(c)のいずれかの核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光誘導性キナーゼおよび応答調節因子を用いて、生物体（organism）における核酸配列（例えば標的遺伝子）の発現レベルを正確に制御するための方法に関する。本発明はまた、光誘導性キナーゼおよび応答調節因子をコードする核酸構築物および核酸、ならびにこれらの構築物を発現する生物体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発生過程および生理的活動を統制するように調節されている何千もの遺伝子が細胞中に存在する。ある文脈では遺伝子の機能が知られていないものもあり、そしてあるものは、よく定義されており、有利な効果を生じさせるように操作するために着目される。従って、遺伝子発現を選択的に調節できるようにすることへの関心が高まっている。研究においては、遺伝子の機能および／または遺伝子によって制御されるプロセス（発生学的プロセスや生化学的活性を含む）を追跡することは重要なツールである。植物の場合では、商業的および農業経済的目的のために、開花や発芽のような生理的プロセスや害虫抵抗性に関係する遺伝子を操作することが特に関心事項となる。
【０００３】
遺伝子の発現を誘導または抑制することを含む、遺伝子操作のための現行のシステムは、主に、ドキシサイクリンのような小分子誘導因子に依存している（Motta-Mena et al, 2014, Nature Chemical Biology）。これらの化学的誘導因子はいくつかの不利な点を伴っている。化学物質は薬理学的に活性であり得、従ってオフターゲット効果を有し得、多くの場合、組織への拡散によって制限され、小さな領域に局在化させたり適用後に除去したりできず、そして、標的生物と人間との両方および環境にとって有毒であり得るからである。
【０００４】
より最近になって、遺伝子発現の調節のための「オプトジェネティクス（光遺伝学）」の分野が発達してきた。これらのオプトジェネティクス系は、時空間選択性の高い態様で、侵襲性が最小限である光刺激に晒すことにより、遺伝子発現を選択的に制御することを可能にする。この技術は、過去に記述されてきた化学的誘導系の問題を回避する。それに加えて、光刺激は安価で産生でき、環境的に無害であり、大きな領域および長い時間に渡り繰り返し適用できる可能性があり（そのことは農作植物において特に有利となり得る）、あるいはレーザーを用いれば信じられないくらいの精度で光刺激を適用することができる。いくつかのオプトジェネティクス系が記述されてきたが、しかしそれらは以下のことを含むいくつかの制約または問題を伴っている：転写活性化の低さ、不活性化時間の長さ、内因的には見出されない外来の発色団の使用、内因的シグナル伝達経路への干渉の可能性、および複数のタンパク質成分の必要性（Motta-Mena et al, 2014）。適切な光感受性タンパク質の開発を含め、オプトジェネティクス系に関連する多くの生物学的課題が存在することが本分野でよく知られている（Hunter, 2016, EMBO reports）。特に、植物は成長および発生のために光を必要とするという点で、植物におけるオプトジェネティクス的ツールの適用にはさらなる困難があり、これまでのところ、赤色／遠赤色光誘導性の「オン／オフ」システムが植物に適用されただけである（Ochoa-Fernandez et al. 2016, Methods in Molecular Biology）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、植物を含め任意の生物体において使用され得る、改良されたオプトジェネティクス系のニーズに対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、「ハイライター（Highlighter）システム」と名付けられた、光で遺伝子発現を操作するための新しいツールを開発した。このシステムは、元々は天然シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803に由来する、CcaS-CcaRと呼ばれる光可逆的二成分シグナル伝達系を、細胞および生物個体（植物を含む）における使用のために転用する。自然界では、シアノバクテリアはこの系を使用して、緑色光と赤色光に反応して光合成目的または光損傷に対する抵抗性のためにその集光色素の組成を変化させる（Hirose et al.2010, PNAS, Abe et al., 2014, Microbial Biotechnology）。例えば、シアノバクテリアが緑色光に暴露されると、CcaSが、発色団依存性、光誘導性のコンフォメーション変化によって活性化されてCcaRをリン酸化し、それが次いで、集光性色素フィコエリトリンの合成を調節するための転写調節因子の転写を駆動するプロモーター領域へのCcaRの結合を誘導する。
【０００７】
本発明は、この自然現象を利用し、その最も単純な形態では、CcaSバリアント（本発明において光応答性ヒスチジンキナーゼ（light-responsive histidine kinase：LRHK）として知られる）およびCcaRバリアント（本発明において応答調節因子（response regulator：RR）として知られる）を、応答調節因子特異的プロモーターの制御下にある目的の標的遺伝子と共に、標的細胞または生物体で発現させることによって機能する。このようにして、LRHKが活性化波長の光にさらされたときにRRをリン酸化し、それが同族のプロモーターに結合して標的遺伝子の転写を駆動できるというように、標的遺伝子の発現が制御される。CcaS-CcaRシステムの一つの強力な利点は、CcaS-CcaRシステムの成分が植物には存在せず、従ってこのシステムは植物のシグナル伝達経路に直交しており、従って、内因性シグナル伝達経路に干渉したり干渉されたりする可能性がより低いことである。このシステムは、シアノバクテリアおよび大腸菌において、緑色光刺激を受けて標的遺伝子発現を駆動することに使用されてきた（Abe et al, 2014; Tabor et al, 2011）。しかしながら、本発明者らは、いくつかの修正を通じて、特に植物においてこのシステムを利用することを視野に入れて、このシステムをさらに改変し、異なる光波長の範囲でシステムを活性化することができるようにした。
【０００８】
これらの改善には、CcaSに対する改変（コドン最適化、植物に存在するPΦB発色団による光スイッチングの改善、細胞膜からのCcaSの切り離し、および核局在化シグナルの付加）およびCcaRに対する改変（コドン最適化、C末端核局在化シグナルの付加、真核生物のトランス活性化ドメインの付加）が含まれる。また、システムを植物に送達するための植物ベクター発現系も構築し、これは、応答調節因子を介して活性レベルを調節することができる合成プロモーターと、任意で正規化目的のための蛍光出力リーダーと、ベクターサイズを減少させるリボソームスキップ配列とを含む。本システムは、通常の明暗サイクルにおける植物成長の際には1つの標的遺伝子発現状態を示し、園芸環境では見られない光スペクトルによる処理後には、変化した標的遺伝子発現状態を示すように設計されている。
【０００９】
このシステムには多くの応用の可能性があり、遺伝子発現を正確かつ効果的に操作して、幅広い生物学的プロセスを研究したり、生物体において有利な特性を誘導したりすることができる。このシステムは、空間的にも時間的にも精確な態様で使用することができ、例えば、葉のような植物の特定の領域を標的とすることができ、あるいは例えば、所定の時間において開花または発芽のタイミングのような生物学的プロセスを引き起こすことができる。このことは、農業的成果を改善させるための特定的な介入を可能とする。
【００１０】
したがって、ここに記載される発明は、細胞および生物体における光制御された遺伝子発現ならびに関連する方法を提供し、かくして研究および農業上重要な製品および方法を提供することを企図している。
【００１１】
本発明の一態様において、光応答性ヒスチジンキナーゼをコードする核酸および／または応答調節因子をコードする核酸を含む核酸構築物が提供され、該核酸は、配列番号1、3、5、7、9もしくは11のいずれかに定義される光応答性ヒスチジンキナーゼまたはその機能的バリアントをコードし、応答調節因子は、配列番号13もしくは15のいずれかに定義される応答調節因子またはその機能的バリアントをコードする。
【００１２】
一実施形態において、光応答性ヒスチジンキナーゼをコードする核酸は、配列番号2、4、6、8、10もしくは12もしくはその機能的バリアントを含むか、もしくはそれからなり、または配列番号47、48、49もしくは50もしくはその機能的バリアントを含むか、もしくはそれからなる。
【００１３】
別の実施形態において、応答調節因子をコードする核酸は、配列番号14もしくは16もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれからなる。
【００１４】
さらなる実施形態において、構築物は、光応答性ヒスチジンキナーゼおよび応答調節因子のうちの少なくとも1つに作動可能に連結された少なくとも1つの調節配列を含む。好ましくは、調節配列は、光応答性ヒスチジンキナーゼおよび応答調節因子に作動可能に連結される。
【００１５】
別の実施形態において、構築物は、レポーター配列をさらに含む。好ましくは、レポーター配列は調節配列に作動可能に連結される。より好ましくは、光応答性ヒスチジンキナーゼ、応答調節因子、およびレポーター配列が、単一の調節配列に作動可能に連結される。
【００１６】
さらなる実施形態において、構築物は、光応答性ヒスチジンキナーゼ、応答調節因子、およびレポーター配列のうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは3つ全てに作動可能に連結された少なくとも1つのターミネーター配列をさらに含む。
【００１７】
1つの実施形態において、調節配列は構成的（constitutive）プロモーターである。例えば、プロモーターは、UBQ10プロモーターまたはその機能的バリアントである。
【００１８】
さらなる実施形態において、構築物は、応答調節因子によって特異的に活性化される調節配列に作動可能に連結された標的配列をさらに含む。
一実施形態において、調節配列は、配列番号17に定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含む。さらなる実施形態において、標的配列は、ターミネーター配列に作動可能に連結される。
【００１９】
本発明の別の態様において、本明細書に記載の核酸構築物を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。
【００２０】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載の核酸構築物または本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞が提供される。好ましくは、細胞は真核細胞または原核細胞である。より好ましくは、真核細胞は植物細胞である。
【００２１】
本発明の別の態様において、本明細書に記載の核酸構築物または本明細書に記載のベクターを発現するトランスジェニック生物体が提供される。好ましい一実施形態において、生物体は植物である。
【００２２】
本発明の別の態様では、本明細書に記載のトランスジェニック生物体を作製する方法が提供され、該方法は、
a. 生物体の一部分を選択することと；
b. (a)の生物体の一部分の少なくとも1つの細胞を、本明細書に記載された核酸構築物または本明細書に記載されたベクターでトランスフェクトすることと；
c. トランスフェクトされた細胞（複数可）に由来する少なくとも1つの生物体を再生することと
を含む。
【００２３】
さらなる態様において、本明細書に記載の方法によって取得されるまたは取得可能な生物体が提供される。好ましくは、生物体は植物である。
【００２４】
本発明の別の態様では、生物体における標的遺伝子の発現を調節する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載の核酸構築物または本明細書に記載のベクターを上記生物体において導入し発現させることと、少なくとも1つの波長の光を適用（照射）することとを含む。一実施形態では、光のこの波長が、LRHKを活性化させ、またはLRHKの活性化を抑制する。
【００２５】
本発明のさらなる態様では、生物体におけるいずれかの生化学的応答を調節する方法も提供され、該方法は、本明細書に記載の少なくとも1つの核酸構築物または本明細書に記載のベクターを上記生物体において導入し発現させることと、少なくとも1つの波長の光を適用することとを含む。1つの実施形態において、生化学的応答は、発生プロセスまたは生理的応答である。好ましくは、少なくとも1つの標的遺伝子の発現を調節することによって、生化学的応答が調節される。一実施形態では、光のその波長が、LRHKを活性化させ、またはLRHKの活性化を抑制する。
【００２６】
光のこの波長は、活性化波長または抑制波長と呼ばれ得る。
【００２７】
一実施形態では、光の波長は、370〜400（紫外光）、430〜495 nm（青色光）、495〜570 nm（緑色光）、570 nm〜600 nm（黄色／オレンジ色光）、600〜750 nm（赤色光）もしくは遠赤（750〜850 nm）のうちのいずれかの範囲を有するか、または白色光（下記）であり得る。別の実施形態では、光の波長は、暗光（下記）であり得る。さらなる実施形態では、光の波長は、赤色光、青色光または緑色光のうちの少なくとも1つで富化された白色光であり得る。
【００２８】
1つの実施形態において、標的遺伝子の発現は、少なくとも1つの第1波長の光を適用することによって増加または減少され得る。
【００２９】
さらなる実施形態において、標的遺伝子の発現は、少なくとも1つの第2波長の光を適用することによって、減少されるか、またはさらに増加され得、ここで、光の第1波長は、光の第2波長とは異なる。
【００３０】
1つの実施形態において、標的遺伝子の発現を増加させる第1波長の光は、好ましくは、緑色光、白色光、暗光もしくは赤色光であるか、または赤色光で富化された白色光である。
【００３１】
別の実施形態では、標的遺伝子の発現を減少させる第1波長の光は、好ましくは青色光であるか、または青色光で富化された白色光である。
【００３２】
さらなる実施形態において、標的遺伝子の発現をさらに増加させる第2波長の光は、赤色光である。この実施形態では、第1波長の光は好ましくは白色光、緑色光または暗光である。
【００３３】
別の実施形態では、標的遺伝子の発現を減少させる第2波長の光は青色光である。この実施形態では、第1波長は、赤色光、緑色光、白色光または暗光であってもよい。
【００３４】
別の実施形態では、第1波長の光が青色光で第2波長の光が赤色光であり得、またはその逆であってもよい。
【００３５】
本発明の別の態様において、フィトクロムおよび発色団を含む光受容体分子が提供され、該フィトクロムは配列番号1、3、5、7、9および11のいずれかに定義されるアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。好ましくは、該発色団は、PCB（フィコシアノビリン）、PφB（フィトクロモビリン）およびBV（ビリベルジン）から選択される。より好ましくは、発色団はPφBである。
【００３６】
本発明のさらなる態様では、生物体における標的遺伝子の発現を調節するための、上記核酸構築物または上記ベクターの使用が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様において、生物体における任意の生化学的応答、好ましくは発生的または生理的応答を調節するための、上記核酸構築物または上記ベクターの使用が提供される。
【００３８】
本発明のさらなる態様において、調節配列に作動可能に連結された標的配列を含む核酸構築物であって、該調節配列が、応答調節因子によって特異的に活性化される調節配列である、核酸構築物が提供される。一実施形態において、調節配列は、配列番号17に定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含む。
【００３９】
本発明の最後の態様において、
a. 配列番号1、3、5、7、9、11、13および15のいずれかに定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
b. 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16もしくは17のいずれかに定義される核酸配列またはその相補配列；
c. (a)または(b)の核酸配列に対して少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の全体的配列同一性を有する核酸；または
d. 本明細書中で定義されるストリンジェントな条件下で、(a)〜(c)のいずれかの核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列
を含む核酸が提供される。
【００４０】
本発明は、以下の非限定的な図においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図1は、大腸菌（E. coli）における遺伝子発現の制御のために転用されたCcaS-CcaRシステムを示す。暗所において、または赤色光照射の際に、CcaS-CcaR系は、sfGFP発現が最低になる不活性状態に入る／留まる。緑色光が照射されると、CcaSのキナーゼ活性が活性化され、CcaSがCcaRをリン酸化し、従ってCcaRを活性化させる（CcaR-P）。CcaR-Pは、PcpcG2-172プロモーター配列内のccaR CREに結合してsfgfp転写を誘導する。
【００４２】
【図２】図2は、大腸菌における光スイッチングアッセイを示す。CcaS-CcaR系を発現する大腸菌培養物の一連の希釈物を、96ウェルプレート（LB培地、37℃で振盪）中で、光処理（ここでは、青色光（Blue）、緑色光（Blue）、赤色光（Red）、および暗処理（Dark））を施しながら増殖させた。蛍光計でGFP蛍光を、細胞密度（OD600）とともに定量した。次いで、蛍光を細胞密度に対してプロットした (A)。次いで、蛍光をOD600=0.2で推定し、ヒートマップに変換した (B)。
【００４３】
【図３】図3は、大腸菌におけるCcaS-CcaR系の発色団依存性を示す。RGB白色光（White）、青色光、緑色光、または赤色光、および暗所（Dark）での4時間処理という、5つの光レジメンで系を試験した。CcaSは、PCB、PΦB、BVを産生するまたは発色団を産生しない（斜線付きＯ）生合成機構と組み合わせて、常にCcaRと共発現させた。ヒートマップにおける緑色の強度は、試験条件下で観察されたsfGFP発現のレベルに対応する。
【００４４】
【図４】図4は、A92V突然変異がPΦBを用いたCcaS光スイッチングを増強することを示す。PΦBを伴うCcaS（A92V）は、青色光およびRGB白色光（White）によって抑制され、緑色光および赤色光によって活性化される。CcaS（A92V）は、BVの存在下および発色団の非存在下ではCcaSと同様に挙動する。
【００４５】
【図５】図5は、植物で機能させるためにCcaSに加えられた改変の、細菌における検証を示す。CcaSの光スイッチング特性に対する、以下の改変の効果を同時に試験した：PΦBを用いた光スイッチングを可能にするA92変異、膜貫通ドメインの除去（Δ22またはΔ23）、およびN末端NLSの付加。表中の数字は、百万単位の蛍光カウントである。
【００４６】
【図６】図6は、CcaS機能に対する2Aテールの効果の細菌試験を示す。
【００４７】
【図７】図7は、pHighlighter植物発現ベクターの概略図を示す。インプットカセットは、光応答性ヒスチジンキナーゼ（LRHK）、レポーター（Rconst）、および応答調節因子（RR）を構成的に（constitutively）発現する。インプットカセットからのこれら三つのタンパク質の構成的発現は、UBQ10プロモーター（PUBQ10）（配列番号44）およびrbcSターミネーター（TrbcS）（配列番号42）によって制御される。アウトプットカセットは、応答調節因子（PRR）、目的の標的遺伝子（Target）、およびNOSターミネーター（TNOS）のための同族プロモーターを保持する（配列番号43）。LRHKが活性化波長の光にさらされると、RRをリン酸化し、それが同族のプロモーターPRRに結合してTargetが発現される。構成的に発現されるレポーターRconstは、植物の一過性トランスフェクションの際のトランスフェクト細胞の検出、および蛍光タンパク質が標的として使用される場合の正規化コントロールを可能にする。LBとRBは左と右の境界である。ColEIとOriVは複製起点、trfAは複製開始タンパク質、AmpRはアンピシリンに対する細菌耐性遺伝子である。
【００４８】
【図８】図8は、応答調節因子のための同族プロモーターPRRを示す。PRRは、スペーサーによって分離された三つのccaR CRE配列から構成されており、-51 35S最小プロモーター（P35Smin(-51)）に融合されている。+1は転写開始位置（TSS）を示す。
【００４９】
【図９】図9はタバコにおけるリボソームスキップ効率を示す。P2A、F2AおよびF2A30についてのリボソームスキップの効率を、一過性トランスフェクトされたタバコにおいて試験した。このグラフは、核内の平均TagRFPシグナル／細胞質内の平均TagRFPシグナルを示している。この実験では、LRHK、MM:NLS:CcaS（Δ23 A92V）が、三つの異なる2A配列、P2A、F2AおよびF2A30を介して下流のTagRFPに連結され、PUBQ-TrbcSカセットから発現された。完全なリボソームスキッピングおよびスキップの完全な失敗についての対照は、TagRFPおよびNLS:TagRFPである。n=4〜6、エラーバーはS.D.である。
【００５０】
【図１０】図10は、タバコにおけるハイライター（Highlighter）システムの一過性発現を示す：植物発現ベクターであるpHighlighterをアグロバクテリウム中に形質転換して、タバコの葉に浸透させるために使用した。温室中で植物にシステムを2日間に渡り発現させ、最低18時間光処理した。
【００５１】
【図１１】図11は、青色光、緑色光および暗処理に応答した、四つのハイライター系バリアントによるNLS:Venus発現の光制御誘導を示す。これらの系は、図6に記載されているように、タバコにおいて一過性発現された。数値は、与えられた光条件下での植物核についてのYFP平均／RFP平均の平均値である。±はS.D.、n=3生物学的レプリカ（各nは15〜20個の核について計算されたYFP平均／RFP平均の平均値である）。
【００５２】
【図１２】図12は、タバコにおけるハイライター系の一過性発現を示す：植物発現ベクターであるpHighlighterをアグロバクテリウムに形質転換し、タバコの葉に浸透させるために使用した。連続的青色光条件下で植物にシステムを2日間発現させ、光処理（RGB-白色光（White）、青色光、緑色光、赤色光、および暗処理（Darkness））を最低24時間行った。
【００５３】
【図１３】図13は、青色光、緑色光、および暗処理に応答した、四つのハイライター系バリアントによるNLS:Venus発現の光制御誘導を示す。これらの系は、図7に記載されているように、タバコにおいて一過性発現された。数値は、与えられた光条件下での植物核についてのYFP平均／RFP平均（具体的には、NLS:Venus平均シグナル／NLS:TagRFP平均シグナル）の平均値である。表中の値は、22〜209個の核について計算されたYFP平均／RFP平均の平均値であり、±は95%信頼区間である。
【００５４】
【図１４】図14は、3つのハイライター系バリアントによる、NLS:Venus発現の光制御誘導を示している。NLS:Venus発現の誘導は、ヒトの眼が純粋な赤色光（RRR）、非常に赤色に富んだ白色光（RRW）、わずかに赤色に富んだ白色光（RWW、すなわち赤色光比率42%および青色光比率32%）、わずかに青色に富んだ白色光（WWB、すなわち赤色光比率18%および青色光比率60%）、非常に青色に富んだ白色光（WBB）、および純粋な青色光（BBB）として知覚するものへの応答で測定された。システムは、図12に示すようにタバコで一過性発現された。タバコ表皮細胞の共焦点蛍光画像を取得し、IMARISソフトウェアを用いて個々の核からの蛍光シグナルをセグメント化し定量化した。表中の値は、12〜132個の核について算出されたたYFP／RFPの平均蛍光発光値±95%信頼区間である。
【００５５】
【図１５】図15は大腸菌におけるLRHKバリアントの定量化を示している。LRHKバリアントを発現するE. coli株を、暗所および八種類の異なる光レジメン（紫外光（370 nmまたは400 nm）、青色光（450 nm）、緑色光（520 nm）、黄色光（590 nm）、オレンジ色光（610 nm）、赤色光（630 nm）、遠赤光（700 nm））で四時間処理した後、定量した。LRHKは、CcaR、CcaS/CcaR応答性プロモーターの制御下のsfGFP、およびPΦBを産生するための生合成機構と共発現された。数値は、百万単位の蛍光カウントであり、試験された光レジメン下で観察されたsfGFP発現のレベルに相当する。
【００５６】
【図１６】図16は、ハイライターシステムを用いて青色および赤色に豊んだ白色光でAtGA3OX1発現レベルを制御することによる、ga3ox1-3, ga3ox2-1, nGPS1シロイヌナズナ（Arabidopsis）株の半矮性表現型の条件的相補性を示す。(A) 連続的な青色富化白色光中で成長させたga3ox1-3, ga3ox2-1, nGPS1株。(B) GA3OX1発現レベルを制御するためにハイライターシステムで形質転換され、連続的な青色富化白色光中で成長させた、ga3ox1-3, ga3ox2-1, nGPS 1株。(C) 連続的な赤色富化白色光中で成長させたga3ox1-3, ga3ox2-1, nGPS 1株。(D) AtGA3OX1発現レベルを制御するためにハイライターシステムで形質転換され、連続的な赤色富化白色光中で成長させた、ga3ox1-3, ga3ox2-1, nGPS 1株。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
次に、本発明についてさらに説明する。以下の節では、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。このように定義された各態様は、別段の明示がない限り、任意の他の態様（複数可）と組み合わせられ得る。特に、好ましいまたは有利であるものとして示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であるものとして示された任意の他の特徴（複数可）と組み合わせられ得る。
【００５８】
本発明の実施は、別段の表示がない限り、植物学、微生物学、組織培養、分子生物学、化学、生化学、組換えDNA技術、およびバイオインフォマティクスの従来の技術を利用するが、これらの技術は当業者の技量の範囲内である。そのような技術は文献において完全に説明されている。
【００５９】
本明細書中で用いられる場合、用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、DNA分子（例えばcDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（例えばmRNA）、天然、突然変異型、合成のDNAまたはRNA分子、およびヌクレオチド類縁体を用いて生成されるDNAまたはRNAの類縁体を含むことが意図される。それは一本鎖でも二本鎖でもあり得る。そのような核酸またはポリヌクレオチドには、構造遺伝子のコード配列、アンチセンス配列、および、mRNAまたはタンパク質産物をコードしない非コード調節配列が含まれるが、これらに限定されない。これらの用語は遺伝子も包含する。用語「遺伝子」または「遺伝子配列」は、生物学的機能に関連するDNA核酸を表すために広く使用される。したがって、遺伝子は、ゲノム配列におけるようにイントロンおよびエクソンを含み得、またはcDNAにおけるようにコード配列のみを含み得、および／または調節配列と組み合わされたcDNAを含み得る。
【００６０】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ペプチド結合によって互いに連結された任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を表す。
【００６１】
本発明の一態様において、光応答性ヒスチジンキナーゼ（LRHK）および／または応答調節因子（RR）を含む核酸構築物が提供される。好ましい実施形態において、LRHKはシアノバクテリオクロム（cyanobacteriochrome）であり、より好ましくはシアノバクテリオクロムCcaS（補色順化センサー（complementary chromatic acclimation sensor））である。さらなる好ましい実施形態において、CcaSは核局在化シグナルを含み、および／または膜アンカーを欠き、および／またはA92V突然変異を有する。より好ましくは、上記のように、CcaSは、配列番号1、3、5、7、9、もしくは11のいずれかに定義される光応答性ヒスチジンキナーゼまたはその機能的バリアントをコードする核酸を含むかまたはそれからなる。好ましくは、該構築物はLRHKとRRの両方を含む。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、RRは、転写調節タンパク質であり、好ましくはOmpRクラス応答調節因子であり、より好ましくはCcaR（補色順化調節因子（complementary chromatic acclimation regulator））である。好ましい一実施形態において、CcaRは、C末端核局在化シグナルおよび／または転写活性化もしくは抑制ドメイン、好ましくはVP64真核生物トランス活性化ドメインを含む。特に好ましい実施形態において、応答調節因子は、配列番号13もしくは15のいずれかに定義される応答調節因子またはその機能的バリアントをコードする核酸配列を含む。
【００６３】
一実施形態において、光応答性ヒスチジンキナーゼをコードする核酸は、配列番号2、4、6、8、10、12、47、48、49もしくは50またはその機能的バリアントを含むか、またはそれからなる。さらなる実施形態において、応答調節因子をコードする核酸は、配列番号14もしくは16またはその機能的バリアントを含むか、またはそれからなる。
【００６４】
配列番号1〜12および47〜50は、本発明において使用され得るCcaSの例示的バリアントに関する。同様に、配列番号13〜16は、本発明において使用され得るCcaRの例示的バリアントに関する。
【００６５】
［CcaSバリアント］
配列番号1および2（それぞれ、アミノ酸配列および核酸配列）は、PΦBによる光スイッチングの改善をもたらすA92V点突然変異を有するCcaS突然変異体に対応する。
【００６６】
配列番号3および4（それぞれ、アミノ酸配列および核酸配列）は、切り詰め（塩基1〜69の除去）およびNLS配列の付加（配列番号26および27に記載）を伴うCcaS突然変異体に対応する。
【００６７】
配列番号5および6（それぞれ、アミノ酸配列および核酸配列）は、PΦBによる光スイッチングの改善をもたらすA92V点突然変異および切り詰め（塩基4〜69の除去）を有するCcaS突然変異体に対応する。
【００６８】
配列番号7および8（それぞれ、アミノ酸配列および核酸配列）は、PΦBによる光スイッチングの改善をもたらすA92V点突然変異、NLS配列の付加、および切り詰め（塩基1〜69の除去）を有するCcaS突然変異体に対応する。
【００６９】
配列番号9および10（それぞれ、アミノ酸配列および核酸配列）は、PΦBによる光スイッチングの改善をもたらすA92V点突然変異、NLS配列の付加、切り詰め（塩基1〜69の除去）、および2Aリボソームスキップ配列をコードするペプチドテール（アミノ酸1〜20）の付加を有するCcaS突然変異体に対応する。
【００７０】
配列番号11および12（それぞれ、アミノ酸配列および核酸配列）は、PΦBによる光スイッチングの改善をもたらすA92V点突然変異、NLS配列の付加、切り詰め（塩基1〜69の除去）、および2Aリボソームスキップ配列をコードするペプチドテール（アミノ酸1〜29）の付加をを有するCcaS突然変異体に対応する。
【００７１】
［CcaRバリアント］
配列番号13および14（それぞれ、アミノ酸配列および核酸配列）は、N末端に融合されたNLSおよびVP64ドメインならびにN末端プロリンを有するCcaRバリアントに対応する。
【００７２】
配列番号15および16（それぞれ、アミノ酸配列および核酸配列）は、C末端に融合されたNLSおよびVP 64ドメインならびにN末端プロリンを有するCcaRバリアントに対応する。
【００７３】
配列番号1〜50のいずれかに関して全体を通して使用される用語「バリアント」または「機能的バリアント」は、完全な非バリアント（非変異）配列の生物学的機能を保持するバリアント（変異）遺伝子配列または遺伝子配列の一部を表す。機能的バリアントはまた、（例えば保存されていない残基において）機能に影響を及ぼさない配列変化を有する、対象遺伝子のバリアントを含む。また、本明細書中に示される野生型配列と比較して実質的に同一である、すなわち、例えば保存されていない残基においていくらかの配列変異を有するだけで、生物学的に活性であるバリアントも包含される。所与の部位で異なるアミノ酸の産生をもたらし、コードされたポリペプチドの機能的特性に影響を及ぼさない核酸配列の変化は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、グリシンのような別の、より疎水性の低い残基、またはバリン、ロイシン、もしくはイソロイシンのようなより疎水性の高い残基をコードするコドンによって置換され得る。同様に、1つの負に荷電した残基から別の負に荷電した残基への置換（例えば、グルタミン酸からアスパラギン酸）、または1つの正に荷電した残基から別の正に荷電した残基への置換（例えば、アルギニンからリジン）をもたらす変化もまた、機能的に等価な産物を生成すると予想され得る。ポリペプチド分子のN末端およびC末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化もまた、ポリペプチドの活性を変化させるとは予想されない。これら提示された改変の各々は、当技術分野のルーチン的技能の範囲内に十分に収まることであり。コードされた産物の生物学的活性の保持を決定することも同様である。
【００７４】
全体を通して記載される本発明のいずれかの態様において使用される「バリアント」または「機能的バリアント」は、非バリアントの核酸またはアミノ酸配列に対して少なくとも25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の全体的配列同一性を有する。 
【００７５】
1つの実施形態において、「CcaS」タンパク質は、光応答性ヒスチジンキナーゼをコードし、このキナーゼは、いくつかのドメインまたはモチーフによって特徴付けられる。例えば、CcaSタンパク質は、GAFドメインまたはGAFドメインバリアント（例えばAnPixjg2、slr1393g2、NpR1597g4、およびUirSg由来のもの）、Hisキナーゼドメイン、および核局在化シグナル（nuclear localisation signal）すなわちNLSのうちの少なくとも一つ、ならびに任意で少なくとも一つ、好ましくは二つのPAS（すなわちPer-Arnt-Sim）ドメインを含み得る。
【００７６】
1つの実施形態において、これらのドメインの配列は、以下の配列またはその機能的バリアントを含むか、またはこれらからなる：
【００７７】
GAFドメイン（核酸配列）：（配列番号１８）：
ATCAGACAATCTCTTAATTTGGAGACTGTTTTGAACACTACAGTTGCTGAAGTTAAGACACTTTTGCAGGTTGATAGAGTTCTTATCTATAGAATCTGGCAAGATGGTACAGGATCTGTTATCACTGAGTCTGTTAATGCTAACTACCCTTCTATTTTGGGTAGAACTTTTTCTGATGAGGTTTTCCCAGTTGAATATCATCAAGCTTACACAAAGGGAAAAGTTAGAGCTATTAATGATATCGATCAGGATGATATCGAAATCTGTCTTGCTGATTTCGTTAAACAATTCGGTGTTAAGTCTAAACTTGTTGTTCCTATCTTGCAGCATAATAGAGCTTCTTCTTTGGATAACGAATCTGAGTTTCCATATCTTTGGGGACTTTTGATTACACATCAGTGTGCTTTCACTAGACCTTGGCAACCTTGGGAAGTTGAGCTTATGAAGCAGTTGGCTAACCAAGTTGCTATTGCTATC
【００７８】
GAFドメイン（アミノ酸配列）：（配列番号１９）：
IRQSLNLETVLNTTVAEVKTLLQVDRVLIYRIWQDGTGSVITESVNANYPSILGRTFSDE
VFPVEYHQAYTKGKVRAINDIDQDDIEICLADFVKQFGVKSKLVVPILQHNRASSLDNESEFPYLWGLLITHQCAFTRPWQPWEVELMKQLANQVAIAI
【００７９】
PASドメイン（核酸配列）；ドメイン１：（配列番号２０）：
ACTAACCATACACTTCAGTCTTTGATTGCTGCTTCTCCTAGAGGTATCTTTACTCTTAATTTGGCTGATCAAATTCAGATCTGGAACCCAACAGCTGAGCGAATCTTCGGATGGACTGAAACAGAGATTATCGCTCATCCTGAGCTTTTGACATCTAACATCCTTTTGGAAGATTACCAACAGTTTAAGCAAAAGGTTCTTTCTGGTATGGTTTCTCCATCT
【００８０】
PASドメイン（アミノ酸配列）；ドメイン１：（配列番号２１）：
TNHTLQSLIAASPRGIFTLNLADQIQIWNPTAERIFGWTETEIIAHPELLTSNILLEDYQ
QFKQKVLSGMVSPS
【００８１】
PASドメイン（核酸配列）；ドメイン２：（配列番号２２）：
ATCGATGATCCTGGACCAAGAATCCTTTATGTTAATGAGGCTTTCACTAAGATCACAGGATACACTGCTGAAGAGATGTTGGGAAAGACTCCTAGAGTTCTTCAAGGACCAAAAACTTCAAGAACTGAGTTGGATAGAGTTAGACAGGCTATCTCTCAATGG
【００８２】
PASドメイン（アミノ酸配列）；ドメイン２：（配列番号２３）：
IDDPGPRILYVNEAFTKITGYTAEEMLGKTPRVLQGPKTSRTELDRVRQAISQW
【００８３】
Hisキナーゼドメイン（核酸配列）：（配列番号２４）
ATGGCTTCTCATGAGTTTAGAACACCACTTTCTACTGCTTTGGCTGCTGCTCAACTTCTTGAAAATTCTGAAGTTGCTTGGCTTGATCCTGATAAGAGATCAAGAAACCTTCATAGAATCCAAAATTCTGTTAAAAACATGGTTCAACTTTTGGATGATATCTTGATTATCAACAGAGCTGAGGCTGGAAAGCTTGAGTTTAATCCAAACTGGCTTGATTTGAAGCTTTTGTTCCAACAGTTCATTGAAGAGATCCAGCTTTCTGTTTCTGATCAATACTACTTCGATTTCATCTGTTCTGCTCAAGATACTAAGGCTCTTGTTGATGAAAGATTGGTTAGATCTATCCTTTCTAATCTTTTGTCTAACGCTATCAAGTACTCTCCTGGAGGTGGACAGATTAAAATCGCTCTTTCTTTGGATTCTGAGCAGATTATCTTCGAAGTTACAGATCAAGGTATTGGAATCTCTCCTGAGGATCAAAAGCAGATCTTTGAACCATTCCATAGAGGAAAGAATGTTAGAAACATTACTGGTACAGGACTTGGTTTGATGGTTGCTAAGAAATGTGTTGATCTTCATTCTGGATCTATCCTTTTGAAGTCTGCTGTGGATCAAGGAACAACTGTGACCATCTGTCTCAAAAGGTACAAC
【００８４】
Hisキナーゼドメイン（アミノ酸配列）：（配列番号２５）
MASHEFRTPLSTALAAAQLLENSEVAWLDPDKRSRNLHRIQNSVKNMVQLLDDILIINRAEAGKLEFNPNWLDLKLLFQQFIEEIQLSVSDQYYFDFICSAQDTKALVDERLVRSILSNLLSNAIKYSPGGGQIKIALSLDSEQIIFEVTDQGIGISPEDQKQIFEPFHRGKNVRNITGTGLGLMVAKKCVDLHSGSILLKSAVDQGTTVTICLKRYN
【００８５】
NLS（核酸配列）：（配列番号２６）
TTACAACCAAAGAAGAAAAGGAAGGTGGGTGGA
【００８６】
NLS（アミノ酸配列）：（配列番号２７）
LQPKKKRKVGG
【００８７】
従って、一実施形態において、CcaSバリアントは、GAFドメイン、NLSおよびHisキナーゼドメインのうちの少なくとも一つ、ならびに任意で、上記で定義された少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つのPASドメイン、または配列番号18〜27のいずれか一つに対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の全体的配列同一性を有するドメインを有し得る。
【００８８】
1つの実施形態において、「CcaR」タンパク質は、転写調節タンパク質をコードし、ここで、該調節因子は、いくつかのドメインまたはモチーフによって特徴付けられる。例えば、CcaRは、RECドメイン（レシーバードメイン、好ましくはN末端RECドメイン）、転写活性化または抑制ドメイン、およびDNA結合ドメイン（好ましくはC末端DNA結合ドメイン）のうちの少なくとも一つを含み得る。好ましくは、CcaRはVP64トランス活性化ドメインを含む。
【００８９】
1つの実施形態において、これらのドメインの配列は、以下の配列を含むか、またはこれらの配列からなる：
【００９０】
RECドメイン（核酸配列）：（配列番号２８）
AGAATACTCCTCGTGGAAGATGATTTGCCATTAGCAGAAACCCTCGCAGAAGCTTTGTCTGATCAACTTTACACTGTTGATATTGCTACAGATGCTTCTTTGGCTTGGGATTATGCTTCTAGACTTGAATACGATTTGGTTATTCTTGATGTTATGTTGCCTGAGCTTGATGGAATTACTCTTTGTCAGAAGTGGAGATCTCATTCTTATTTGATGCCAATCCTTATGATGACTGCTAGAGATACAATTAATGATAAGATCACAGGACTTGATGCTGGTGCTGATGATTACGTTGTTAAACCTGTTGATTTGGGTGAACTTTTTGCTAGAGTTAGAGCTCTTTTG
【００９１】
RECドメイン（アミノ酸配列）：（配列番号２９）
RILLVEDDLPLAETLAEALSDQLYTVDIATDASLAWDYASRLEYDLVILDVMLPELDGIT
LCQKWRSHSYLMPILMMTARDTINDKITGLDAGADDYVVKPVDLGELFARVRALL
【００９２】
DNA結合ドメイン（核酸配列）：（配列番号３０）：
CAACCAGTTTTGGAGTGGGGTCCTATTAGACTTGATCCATCTACTTATGAAGTTTCTTACGATAATGAGGTTTTGTCTCTTACAAGAAAGGAATACTCTATCTTGGAGCTTTTGCTTAGAAACGGAAGAAGAGTTCTTTCTAGATCTATGATCATCGATTCTATCTGGAAGTTGGAGTCTCCTCCAGAAGAGGATACAGTTAAAGTTCATGTTAGATCTTTGAGACAAAAGCTTAAGTCTGCTGGACTTTCTGCTGATGCTATTGAAACTGTTCATGGAATCGGTTACAGATTGGCTAAT
【００９３】
DNA結合ドメイン（アミノ酸配列）：（配列番号３１）：
QPVLEWGPIRLDPSTYEVSYDNEVLSLTRKEYSILELLLRNGRRVLSRSMIIDSIWKLES
PPEEDTVKVHVRSLRQKLKSAGLSADAIETVHGIGYRLAN
【００９４】
NLＳ（核酸配列）：（配列番号３２）
CTCCAGCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTTGGAGGT
【００９５】
NLＳ（アミノ酸配列）：（配列番号３３）
LQPKKKRKVGG
【００９６】
VP64ドメイン（核酸配列）：（配列番号３４）：
GATGCCCTCGACGATTTCGACCTCGATATGCTCGGTTCTGATGCTCTCGATGACTTTGACCTTGACATGCTTGGATCAGACGCTTTGGACGACTTCGACTTGGACATGTTGGGATCTGATGCACTTGATGATTTTGACCTTGATATGCTT
【００９７】
VP64ドメイン（アミノ酸配列）：（配列番号３５）：
DALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDML
【００９８】
したがって、一実施形態において、CcaRバリアントは、RECドメイン、NLS、および配列番号28〜35に定義される転写活性化または抑制ドメイン、または配列番号28〜35へに対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の全体的配列同一性を有するドメインのうちの少なくとも一つを有する。
【００９９】
二つの核酸配列またはポリペプチドは、下記に説明されるように最大一致となるように整列させたときに、二つの配列中のそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基の配列が同じである場合、「同一」であると言われる。二つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一」またはパーセント「同一性」は、下記の配列比較アルゴリズムの一つを用いて、または手動アラインメントおよび目視検査によって測定されるところにより、比較ウィンドウにわたって最大一致となるように比較され整列された場合に、同じであるか、または特定されたパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、二つ以上の配列またはサブ配列を表す。タンパク質またはペプチドに関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基位置は、しばしば保存的アミノ酸置換によって異なっていることが認識され、そこでは、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば電荷や疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質について補正するために上方に調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者によく知られている。配列比較のためには、典型的には1つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォールトのプログラムパラメータを使用してもよいし、代替パラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。パーセント配列同一性および配列類似性を決定することに適したアルゴリズムの非限定的な例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。
【０１００】
さらなる実施形態において、本明細書で使用されるバリアントは、本明細書で定義されるLRHKまたはRRをコードし、配列番号1〜50のいずれかに定義される核酸配列に対して、本明細書で定義されるストリンジェントな条件下で結合またはハイブリダイズすることができる核酸を含むことができる。
【０１０１】
このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行われ得る。「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが他の配列よりも標的配列に対して、検出可能により高い程度（例えば、バックグラウンドより少なくとも2倍）でハイブリダイズする条件を意図している。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況によって異なる。ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対して100%相補的である標的配列を同定することができる（相同プロービング）。あるいは、配列におけるいくらかのミスマッチを許容するようにストリンジェンシー条件を調節して、より低い程度の類似性が検出されるようにすることができる（異種プロービング）。一般に、プローブの長さは約1000ヌクレオチド未満であり、好ましくは500ヌクレオチド未満である。
【０１０２】
典型的に、ストリンジェントな条件は、pH 7.0〜8.3で塩濃度が約1.5 M Naイオン未満、典型的には約0.01〜1.0 M Naイオン濃度（またはその他の塩）、温度は、短いプローブ（例えば10〜50ヌクレオチド）については少なくとも約30℃であり、長いプローブ（例えば50ヌクレオチド超）については少なくとも約60°Cであるような条件である。ハイブリダイゼーションの時間は一般に約24時間未満であり、通常は約4〜12時間である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成することができる。
【０１０３】
別の実施形態では、構築物は、光応答性ヒスチジンキナーゼおよび応答調節因子のうちの少なくとも1つに作動可能に連結された少なくとも1つの調節配列をさらに含む。一実施形態では、構築物は、LRHKに作動可能に連結された第1の調節配列を含む。第2の実施形態では、構築物は、第2の調節配列に作動可能に連結された第2の調節配列を含む。しかしながら、好ましくは、構築物は、LRHKとRRの両方に作動可能に連結された単一の調節配列を含む。
【０１０４】
単一のmRNA分子から2つのタンパク質を個別のタンパク質として発現させるために、リボソームスキップ配列をLRHKおよび／またはRR遺伝子の5’および／または3’末端に加えてもよい。翻訳の際に、リボソームがリボソームスキップ配列に遭遇すると、リボソームスキップ配列の最後のプロリンとペプチド結合を形成することが妨げられる。その結果、翻訳が停止し、新生ポリペプチドが放出され、翻訳が再び開始されて第2のポリペプチドが産生される。その結果、最初のポリペプチド鎖にはC末端リボソームスキップ配列（またはそのような配列の大部分）が付加され、次のポリペプチド鎖にはN末端プロリンが付加される。
【０１０５】
従って、さらなる実施形態において、核酸構築物は、少なくとも1つのリボソームスキップ配列を含む。
【０１０６】
一例において、リボソームスキップ配列は、以下のうちの1つから選択され得る：
【０１０７】
F2A；2つのCDS間で使用される2A DNA配列バリアント。
F2A: GGACAACTTCTCAACTTTGACTTGCTAAAGTTAGCTGGTGATGTTGAATCTAA
TCCTGGACCA（配列番号36）。
【０１０８】
F2A配列の使用は、リボソームスキッピング部位の上流のタンパク質のC末端にF2Aaa1-20ポリペプチド配列が付加され、下流のタンパク質にプロリン残基（F2Aaa21）が付加されることをもたらす。
F2Aaa1-20: GQLLNFDLLKLAGDVESNPG（配列番号37）
F2Aaa21: P
【０１０９】
F2A30；2つのCDS間で使用される2A DNA配列バリアント。
F2A30: CACAAACAGAAAATTGTGGCACCGGTGAAGCAGACTCTCAACTTTGACTT
GCTAAAGTTAGCTGGTGATGTTGAATCTAATCCTGGACCA（配列番号38）。
【０１１０】
F2A30配列を使用すると、リボソームスキッピング部位の上流のタンパク質のC末端にF2A30aa1-29ポリペプチド配列が付加され、下流のタンパク質にプロリン残基（F2A30aa30）が付加される。
【０１１１】
F2Aaa1-20: HKQKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPG（配列番号39）
F2Aaa21: P
【０１１２】
一実施形態では、LRHKは、C末端スキップ配列、好ましくはF2A30(aa1-29)を含む。このようなスキップ配列を有するCcaSの核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号9および11および10および12に示される。従って、核酸構築物がLRHKおよびRRのための単一配列を含む場合、LRHKは好ましくは配列番号10もしくは12を含むかまたはそれからなる配列を含む。
【０１１３】
さらなる実施形態において、RRは、N末端スキップ配列およびF2A30(aa30)、すなわちプロリンアミノ酸残基を含む。このようなスキッピング配列を含むCcaRの核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号14および16および13および15に示される。従って、核酸構築物がLRHKおよびRRのための単一配列を含む場合、RRは好ましくは配列番号14もしくは16を含むかまたはそれからなる配列を含む。
【０１１４】
さらなる代替的な実施形態において、内部リボソーム侵入部位（internal ribosomal entry site：IRES）、tRNA配列、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド（Hammerhead：HH）リボザイムユニットおよび／または肝炎デルタウイルス（hepatitis delta virus：HDV）リボザイムユニット）または直接反復（direct repeat：DR）配列が、リボソームスキップ配列の代わりに使用され得る。やはり、そのような配列はLRHKおよび／またはRR遺伝子の5’および／または3’末端に付加されて、単一のmRNA転写物および単一の調節配列（プロモーター）から2つのタンパク質を個別のタンパク質として発現させることを可能にし得る。
【０１１５】
さらなる実施形態において、核酸構築物は、レポーター配列をさらに含み得る。レポーター配列は、該核酸構築物で首尾よく形質転換された細胞を標識する手段として使用することができる。レポーター配列はまた、LRHKおよび／またはRRを含むベクターと（同じ発現ベクター上または異なる発現ベクター上のいずれかで）同時に発現される標的遺伝子の発現レベルの定量を可能にするための対照として使用することもできる。従って、レポーター配列は、この機能を実行することができる任意の配列であり得る。例として、一般的なタグには、GFP、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、アザミグリーン、mWasabi、TagGFP、TurboGFP、AcGFP、ZsGreen、T-Sapphire、EBFP、EBFP 2、アズライト、mTagBFP、ECFP、mECFP、Cerulean、mTurquoise、CyPet、AmCyan 1、Midori-Isi Cyan、TagCFP、mTFT1、EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、TagYFP、PhiYFP、ZsYelllow 1、mBanana、Kusabira Orange、Kusabira Orange 2、mOrange、mOrange 2、dTomato、dTomato-Tandem、TagRFP、TagRFP-T、DsRed、DsRed2、DsRed-Express (T 1)、DsRed-Monomer、mTangerine、mRuby、mApple、mStrawberry、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、HcRed1、mRaspberry、dKeima-Tandem、HcRed-Tandem、mPlum、およびAQ143が含まれる。
【０１１６】
さらなる実施形態において、調節配列は、調節配列に作動可能に連結される。好ましくは、調節配列は、LRHKおよび／またはRRにも作動可能に連結された単一の調節配列に作動可能に連結される。上述のように、レポーター配列はまた、上述したスキップ配列の1つのような、5’または3’リボソームスキップ配列を含んでもよい。
【０１１７】
全体を通して使用される用語「作動可能に連結される」は、プロモーター配列が対象の遺伝子の転写を開始することができるような、プロモーター配列と対象の遺伝子との間の機能的連結を表す。
【０１１８】
さらなる実施形態において、構築物は、オペロンの末端を示し転写を停止させる少なくとも1つのターミネーター配列を含む。適切なターミネーター配列は当業者によく知られ、Rho依存性の配列およびRho非依存性の配列を含み得る。一例において、配列は、配列番号42および／または43、またはその機能的バリアントを含むか、またはそれからなり得る。
【０１１９】
1つの実施形態において、調節配列はプロモーターである。上記の方法を含め、また後述の植物、方法および使用も含め、本発明の全ての態様によれば、「調節配列」という用語は、本明細書において「プロモーター」と互換的に使用され、全ての用語は、それらが連結される配列の発現をもたらすことができる調節核酸配列を表すものとして広い文脈において解されるべきである。用語「調節配列」はまた、細胞、組織または器官において核酸分子の発現を付与、活性化または増強する合成融合分子または誘導体も包含する。
【０１２０】
用語「プロモーター」は、典型的には、遺伝子の転写開始点の上流に位置し、RNAポリメラーゼその他のタンパク質の結合に関与し、それによって作動可能に連結された核酸の転写を誘導する、核酸制御配列を表す。古典的な真核生物ゲノム遺伝子に由来する転写調節配列（正確な転写開始に必要なTATAボックスを含み、これはCCAATボックス配列を伴うこともあれば伴わないこともある）、ならびに、発生学的および／または外的刺激に応答して、または組織特異的態様で、遺伝子発現を変化させる付加的調節エレメント（すなわち、上流活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）が前述の用語に包含される。また、古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列もその用語に含まれ、その場合は、それは-35ボックス配列および／または-10ボックス転写調節配列を含み得る。
【０１２１】
好ましい態様において、プロモーターは、構成的プロモーター、強いプロモーター、または組織特異的プロモーターである。
【０１２２】
「構成的プロモーター」とは、少なくとも一つの細胞、組織または器官において、成長および発生の（必ずしもすべてではなくても）ほとんどの段階のあいだ、そしてほとんどの環境条件下で、転写的に活性であるプロモーターを指す。構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（CaMV35Sもしくは19S）、イネアクチンプロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、ポリユビキチン（UBQ10）プロモーター、ルビスコ小サブユニット、トウモロコシもしくはアルファルファのH3ヒストン、OCS、SAD1もしくは2、GOS2、または発現を増強するあらゆるプロモーターが挙げられる。
【０１２３】
「強いプロモーター」は、標的遺伝子の発現増加または過剰発現をもたらすプロモーターを指す。強いプロモーターの例としては、CaMV-35S、CaMV-35Somega、ArabidopsisユビキチンUBQ1、イネユビキチン、アクチン、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ1プロモーター（Adh-1）、AtPyk10、BdEF1α、FaRB7、HvIDS2、HvPht1.1、LjCCaMK、MtCCaMK、MtIPD3、MtPT1、MtPT2、OsAPX、OsCC1、OsCCaMK、OsCYCLOPS、OsPGD1、OsR1G1B、OsRCC3、OsRS1、OsSCP1、OsUBI3、SbCCaMK、SiCCaMK、ToB7、ZmCaMK、ZmEF1α、ZmPIP2.1、ZmRsyn7、ZmTUB1α、ZmTUB2αおよびZmUBIが挙げられるが、これらに限定されない、。
【０１２４】
組織特異的プロモーターは、植物発生の特定の時期に特定の細胞または組織でのみ活性化される転写制御エレメントである。
【０１２５】
機能的に等価なプロモーターの同定のために、候補プロモーターのプロモーター強度および／または発現パターンを、例えば、そのプロモーターをレポーター遺伝子に作動可能に連結し、植物の種々の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルおよびパターンをアッセイすることによって、分析することができる。適切な周知のレポーター遺伝子は当業者に知られており、例えば、ベータ-グルクロニダーゼまたはベータ-ガラクトシダーゼが挙げられる。
【０１２６】
1つの実施形態において、核酸構築物は、応答調節因子によって特異的に活性化される調節配列に作動可能に連結された標的配列をさらに含む。別の実施形態では、調節配列は構成的に活性であり、RRの結合は調節配列の活性を抑制する。好ましくは、調節配列はプロモーターであり、より好ましくは誘導可能プロモーターである。好ましい実施形態において、プロモーターは、コアプロモーターエレメント（隣接または遠位の活性化配列がないとほとんどまたは全く活性をもたないようなプロモーター）と、CcaRによって認識されるおよびシス調節エレメント（cis-regulatory element：CRE）（非バリアントまたはバリアント）とを含む。一例において、コアプロモーターエレメントは、配列番号41に定義される配列もしくはそのバリアントを含むかまたはそれらなり得、CREは、配列番号40に定義される配列もしくはそのバリアントを含むかまたはそれらからなり得る。さらなる好ましい一実施形態において、プロモーターは、配列番号17に定義される核酸配列もしくはその機能的バリアントを含むか、またはそれからなる。一実施形態において、標的配列は、過剰発現を駆動するプロモーターを用いて発現され得る。本発明による過剰発現とは、標的遺伝子が、その内因性対応物によって発現が駆動される内因性標的遺伝子の発現よりも高いレベルで発現されることを意味する。
【０１２７】
本明細書中で使用される場合、「標的配列」とは、転写レベルを制御することが有用となる可能性があるおよび／または有用となる任意の核酸配列または遺伝子を表し得る。
【０１２８】
構築物は、標的配列オペロンの末端を規定する第2のターミネーター配列をさらに含むことができる。ターミネーター配列は上記で定義されている。好ましくは、ターミネーター配列は、配列番号43もしくはそのバリアントを含むか、またはそれからなる。
【０１２９】
下記に詳細に説明するように、使用時に、(LRHK)が活性化波長の光にさらされると、それがRRをリン酸化し、次いで、RRはその同族プロモーター（RRによって特異的に認識される調節配列）に結合して、標的配列の転写をもたらす。
【０１３０】
本発明の別の態様において、本明細書に記載の核酸構築物を含むベクターまたは発現ベクターが提供される。一実施形態において、ベクター骨格はpEAQである。
【０１３１】
本発明の別の態様において、核酸構築物またはベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、細菌細胞または植物細胞である。最も好ましくは、細胞は植物細胞である。
【０１３２】
本発明の別の態様において、トランスジェニック生物体が提供され、該トランスジェニック生物体は該核酸構築物またはベクターを発現する。ここでも、生物体は任意の原核生物または真核生物であるが、好ましい実施形態では、生物体は植物である。
【０１３３】
1つの実施形態において、子孫（progeny）生物体が、該核酸構築物またはベクターで一過的に形質転換される。別の実施形態では、子孫生物体は、本明細書に記載の核酸構築物で安定的に形質転換され、その生物体の少なくとも1つの細胞において遺伝的に維持される外因性ポリヌクレオチドを含む。その方法は、構築物が安定的に組み込まれていることを確認するステップを含むことができる。生物体が植物である場合、その方法はまた、選択された子孫植物から種子を収集するさらなるステップを含み得る。
【０１３４】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載のトランスジェニック生物体を作製する方法が提供される。異なる態様において、標的配列の光調節性発現をすることができる生物体を作製する方法が提供される。いずれの態様においても、方法は、少なくとも以下のステップを含む：
a. 生物体の一部分を選択すること；
b. 部分 (a) の生物体の部分の少なくとも1つの細胞を、核酸構築物またはベクターでトランスフェクトすること；および
c. トランスフェクトされた1つまたは複数の細胞に由来する少なくとも1つの生物体を再生すること。
【０１３５】
本発明のトランスジェニック生物体を作製するための、形質転換またはトランスフェクションの方法は、当該技術分野において公知である。したがって、本発明の種々の態様によれば、本明細書で定義される核酸構築物が生物体に導入され、トランスジーンとして発現される。核酸構築物は、形質転換と呼ばれるプロセスを介して前記生物体に導入される。本明細書において言及される「トランスフェクション」、「導入」または「形質転換」という用語は、移入のために使用される方法にかかわらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの移入を包含する。このような用語は本文脈において互換的にも使用され得る。生物体が植物である場合、器官形成あるいは胚形成のいずれによるかにかかわらずその後のクローン増殖が可能な組織が、本発明の遺伝子構築物で形質転換され得、そこから植物全体が再生され得る。選択される具体的な組織は、形質転換される具体的な種について利用可能であり最も適したクローン増殖系に依存して変化する。組織標的の例としては、リーフディスク、花粉、胚、子葉、胚軸、雌性配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、根分裂組織）、および誘導分裂組織（例えば、子葉分裂組織と胚軸分裂組織）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、一過的にまたは安定的に宿主細胞に導入され得、例えば、プラスミドとして、非組込み状態で維持され得る。あるいはそれは宿主ゲノム中に組み込まれ得る。次いで、得られた形質転換植物細胞を用いて、当業者に知られる方法で形質転換植物を再生することができる。
【０１３６】
植物の形質転換は今や多くの種で日常的な技術となっている。有利なことに、目的の遺伝子を適切な祖先（ancestor）細胞に導入するために、いくつかの形質転換法のいずれをも用いることができる。生物体の細胞の形質転換のために記述された方法は、一過性の形質転換または安定的な形質転換のために利用することができる。形質転換法には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離DNAの取り込みを増加させる化学物質、植物へのDNAの直接注入、粒子銃打ち込み（bombardment）、ウイルスまたは花粉を用いた形質転換、およびマイクロプロジェクションが含まれる。方法は、プロトプラストのためのカルシウム／ポリエチレングリコール法、プロトプラストのエレクトロポレーション、植物材料へのマイクロインジェクション、DNAまたはRNA被覆粒子打ち込み、（非組込み性）ウイルスによる感染などから選択され得る。トランスジェニック植物（トランスジェニック作物を含む）は、好ましくは、Agrobacterium tumefaciens媒介形質転換を介して作製される。
【０１３７】
形質転換植物を選抜するために、形質転換で得られた植物材料を、形質転換植物を非形質転換植物から区別できるような選択条件に付す。例えば、上記のようにして得られた種子を植えて、初期生育期間を経た後、噴霧により適切な選択に付すことができる。さらなる可能性としては、種子を（適切であれば滅菌後に）、適切な選択剤を用いた寒天プレート上で成長させて、形質転換された種子のみが植物に成長できるようにすることである。あるいは、形質転換植物を、上述のように、選択マーカーの存在または構成的に発現されたレポーター遺伝子の発現に関してスクリーニングする。DNA移入および再生の後に、推定的形質転換植物を、例えばサザンブロット分析を用いて、目的の遺伝子の存在、コピー数、および／またはゲノム構成について評価することもできる。それに代えて、またはそれに加えて、新たに導入されたDNAの発現レベルを、ノザンブロットおよび／またはウェスタンブロット分析を用いてモニターすることができ、どちらの技術も当業者にはよく知られている。
【０１３８】
生成された形質転換植物は、クローン増殖または古典的育種技術などの種々の手段によって増殖させることができる。例えば、第一世代（あるいはT1）形質転換植物を自殖させて、ホモ接合の第二世代（あるいはT2）形質転換体を選択し、次いでT2植物を古典的育種技術によってさらに増殖させることができる。生成された形質転換生物体は様々な形態をとり得る。例えば、それらは、形質転換細胞と非形質転換細胞とのキメラ；クローン形質転換体（例えば、全ての細胞が発現カセットを含むように形質転換されている）；形質転換組織と非形質転換組織との接ぎ木（例えば、植物において、形質転換された台木が非形質転換の穂木に接ぎ木される）であり得る。
【０１３９】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載の方法によって取得されたまたは取得可能な植物が提供される。
【０１４０】
本発明の別の態様では、生物体における標的遺伝子の発現を調節する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載された少なくとも一つの核酸構築物またはベクターを生物体において導入し発現させることと、少なくとも一つの（活性化および／または抑制）波長の光を適用することとを含み、ここで好ましくは、光の波長が、本明細書に記載されたように標的遺伝子の発現を調節する。1つの実施形態において、光の波長は、LRHKの活性を活性化または抑制する。上述のように、好ましくは、光の波長は、LRHKを活性化してRRのリン酸化を引き起こし、次いでそれがその同族プロモーターに結合して、標的遺伝子の転写を駆動する。従って、全体を通して使用される「活性化」波長とは、LRHKを活性化させるものであり、好ましくは標的遺伝子の発現を引き起こすかまたは増加させるものである（しかしながら別の実施形態では、活性化波長は標的遺伝子の発現を減少させ得る）。同様に、やはり全体を通して使用される、光の「抑制」波長とは、LRHKの活性化を抑制または防止するものであり、好ましくは標的遺伝子の発現を減少または防止するものであるが、ただし、やはり別の実施形態では、抑制波長は標的遺伝子の発現を増加させ得る。
【０１４１】
好ましくは、標的遺伝子は、上述のように、応答調節因子によって特異的に活性化され得る調節配列に作動可能に連結されている。より好ましくは、標的遺伝子は、調節配列に作動可能に連結されたトランスジーン（外因性または内因性のトランスジーン）である。
【０１４２】
1つの実施形態において、核酸構築物は、本明細書に記載されるように、少なくとも1つの調節配列に作動可能に連結されたLRHKおよびRRを含む。好ましくは、構築物はまた、上述したように、応答調節因子によって特異的に活性化され得る調節配列に作動可能に連結された標的遺伝子を含む。
【０１４３】
さらなる実施形態において、本方法は、第1および第2の核酸構築物を導入し発現させることを含み得、ここで、第1の核酸構築物は、調節配列に作動可能に連結されたLRHKを含み、第2の核酸構築物は、調節配列に作動可能に連結されたRRを含む。さらなる好ましい実施形態において、本方法は、第3の核酸構築物を導入することをさらに含み得、ここで、第3の核酸構築物は、応答調節因子によって特異的に活性化され得る調節配列に作動可能に連結された標的遺伝子を含む。あるいは、標的遺伝子および調節配列は、第1または第2の核酸構築物上に存在し得る。
【０１４４】
本明細書中で使用される場合、「調節すること（modulating）」とは、標的遺伝子の発現の増加または減少を包含することができ、好ましくはそれは対照生物体における発現のレベルと比較したものである。特に、標的遺伝子の発現を、光の波長、好ましくは光の第1の活性化または抑制波長を適用することによって、増加させることができる。次いで、標的遺伝子の発現を、光の第1波長とは異なりかつ光の第1波長の後に適用される第2波長の光を適用することによって、減少（またはさらに増加）させることができる。以下同様に、続いて光の活性化波長を適用することによってこの効果を再び逆転させることなどができる。その結果、標的遺伝子の発現を制御する「オン／オフ」システムが得られる。しかし、本発明はまた、標的遺伝子発現についての単純な「オン／オフ」スイッチよりも微妙なことも行うことができる。発明者らは、異なる波長の光が、標的遺伝子発現を異なるレベルで刺激または抑制できることを見出した。
【０１４５】
したがって、さらなる実施形態において、活性化光波長は、最大活性化波長または中間活性化波長であり得る。このような例では、最大活性化波長は、標的遺伝子発現の最高レベル、すなわち、中間活性化波長よりも高い標的遺伝子発現のレベルをもたらす。同様に、中間活性化波長は、標的遺伝子の発現をもたらすが、最大活性化波長を適用することにより得られるものより低いレベルでの発現になる。対照的に、光の抑制波長は、標的遺伝子の発現の欠如または最小限の発現をもたらす。
【０１４６】
1つの実施形態において、標的遺伝子発現のレベルは、対照生物体（例えば植物）に対する相対的レベルであり得、ここで、対照植物はトランスジーンを発現しないものであり、例えば、本明細書に記載されるような核酸構築物を発現しない。
【０１４７】
光の最大波長または中間波長を規定するために特に有用であり得る代替的な実施形態において、標的遺伝子発現のレベルは、適用される光が白色光または暗光（下記で定義される）である生物体における遺伝子発現のレベルに対する相対的レベルであり得る。
【０１４８】
本明細書に記載される方法の好ましい一実施形態において、生物体は、光の中でおよび／または暗所で（この文脈で使用される暗所は、光がない状態での成長を表す）生育または培養される。言い換えると、生物体は、通常の日中および／または夜間条件（その生物体にとっての通常の日中および／または夜間条件あるいは実験的に設定された任意の条件）で培養されうる。生物体が植物である場合、これは、植物が適切な昼／夜周期にさらされることを意味し得る。このように、標的遺伝子の発現は、通常の明暗条件に加えて光の（活性化または抑制）波長を適用すること（これは例えば、富化された（enriched）白色光につながり得る（例えば、赤色光または青色光で富化された白色光））によって調節（すなわち、本明細書に定義されるように増加または減少）され得る。従って、さらなる実施形態において、活性化または抑制波長の適用後の標的遺伝子発現のレベルの増加または減少は、生物体が（活性化または抑制波長の適用なしで）光中または暗所で培養または生育されるときの遺伝子発現のレベルに対して相対的なものであり得る。
【０１４９】
従って、好ましい一実施形態では、この方法は、富化された光、好ましくは富化された白色光を適用することを含む。換言すれば、該方法は、富化された光、好ましくは富化された白色光中で生物体を生育または培養することを含む。
【０１５０】
本明細書で使用されるところの「白色光」とは、全可視光（例えば、390 nm〜700 nmの間の波長の光）、または以下に記載されるような赤色、青色および緑色の光の組合せを指すことができる。
【０１５１】
本明細書で使用されるところの「暗光」とは、非可視光を指すことができる。例えば、暗光は、スペクトルの赤外部分（およびそれより外）の光（例えば、700 nmより上、より好ましくは750 nmより上、さらに好ましくは710から850 nmの間）、またはスペクトルの紫外部分（およびそれより外）の光（例えば390 nm、より好ましくは10〜400 nm）を指すことができる。
【０１５２】
本明細書で使用されるところの「富化された光」、好ましくは、富化された白色光は、光の活性化波長または抑制波長の部分を含み得、ここで、光の活性化波長または抑制波長は、下記に定義されるようなものであり得、光の活性化波長または抑制波長の割合は、全光の少なくとも5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%である。
【０１５３】
したがって、標的遺伝子の発現を調節することは、標的遺伝子の発現をオンにすること、および任意でオフにすることの両方、ならびに標的遺伝子発現の増加または減少のレベルを調節することを包含する。上述したように、この後者の特徴は、システムが、通常の明暗サイクル中に第一のレベルの標的遺伝子発現を示し、通常の園芸環境には見られない特定の光スペクトル（赤、青、緑など）の適用後に第二の異なるレベルの標的遺伝子発現（第一のものより高いか低いかのどちらかである）を示すことを可能にする。したがって、本発明は、標的遺伝子発現のレベルの非常に精確な制御を可能にする。さらに、本発明は、遺伝子発現を調節するために光の適用に依存するので、標的遺伝子の発現を、空間的に（例えば、生物体上の特定の位置に光源を向けることによって）および時間的に（例えば、生物体の成長またはライフサイクルの任意の時点で活性化波長または抑制波長を適用することによって）制御（すなわち調節）することもできる。
【０１５４】
全体を通して使用される「増加」、「より高い」、または「活性化する」（そのような用語は互換的に使用され得る）とは、上述されたような対照と比較して、少なくとも5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%以上の標的遺伝子発現の増加を意味し得る。同様に、全体を通して使用される、第二波長の光の適用に応答させて標的遺伝子の発現を「さらに増加」させることは、第一波長の光の適用後の遺伝子発現のレベルと比較して、少なくとも5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%以上の標的遺伝子発現の増加を意味し得る。
【０１５５】
また、全体を通して使用される「減少」または「抑制」（そのような用語は互換的に使用されることもある）は、上記のような対照と比較して、少なくとも5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%以上の標的遺伝子発現の減少を意味し得る。あるいは、このような減少は、第1波長の光の適用後の遺伝子発現のレベルに対して相対的なものであり得る。
【０１５６】
一実施形態において、光の活性化波長は、430〜495 nm（青色光）、495〜570 nm（緑色光）、600〜750 nm（赤色光）のいずれかの範囲内とすることができる。あるいは、この波長は、暗光（上述）または白色光（上述）として記述され得る。別の実施形態では、光の活性化波長は、上述のような白色光が特定の波長の光（例えば青色、緑色または赤色光）で補足または富化されたものを含み得る。この後者の選択肢は、生物体が植物でありその植物が成長のために白色光を必要とするが、最小限の生理的影響で青色または赤色光等の追加的な特定光波長を許容することができる場合に、特に有用となり得る。
【０１５７】
さらなる一実施形態では、光の最大活性化波長は、好ましくは、600〜750 nm（赤色光）の範囲のうちのいずれかの範囲内にある。別の実施形態では、中間活性化波長は、好ましくは、390 nm〜700 nm（白色光）または495 nm〜570 nm（緑色光）の範囲内にある。
【０１５８】
代替的な一実施形態では、光の抑制波長は、430〜495 nm（青色光）、495〜570 nm（緑色光）、および600〜750 nm（赤色光）のいずれかの範囲内とすることができる。あるいは、当該光は、上記に定義される白色光または暗光であってもよい。好ましい一実施形態では、光の抑制波長は、430〜495 nm（青色光）の範囲内にある。別の実施形態では、光の抑制波長は、上述したような白色光が特定波長の光（例えば、青色、緑色または赤色光）で補足または富化されたものを含み得る。
【０１５９】
1つの実施形態において、光の活性化波長または抑制波長は、上記のように標的遺伝子発現を調節するために十分な時間適用される。システムおよび生物体によって、時間の長さは、数秒間、数分間、数時間、または数日間であり得る。一例において、光は、少なくとも6時間、より好ましくは少なくとも12時間、さらにより好ましくは少なくとも18時間適用され得る。
【０１６０】
可視および非可視スペクトルの両方、および／または上述した範囲内にある、他の波長の光が可能であることは、当業者には明らかであろう。上記の範囲は単に例であることを意図するに過ぎない。
【０１６１】
一実施形態では、上記のような所望の波長を有する光源を用いて、光を適用（照射）する。適切な光源は当業者に知られているが、適切なLED、レーザー、白色光源等のうちの1つ以上であり得る。
【０１６２】
一例において、生物体は、活性化波長および／または抑制波長の光が適用される前に、少なくとも1時間、好ましくは少なくとも2、6、12もしくは24時間、または2もしくは7日間、培養または生育される。
【０１６３】
1つの実施形態において、活性化波長および／または抑制波長の光は、好ましくは、生物体の外側面または外表面に適用される。生物体が植物である場合、この表面は、好ましくは、少なくとも1つの葉および／または少なくとも1つの根および／または少なくとも1つのシュートもしくは茎である。
【０１６４】
本発明のさらなる態様において、標的生物体における任意の生化学的経路または応答もしくは生物学的プロセスを調節する方法が提供され、該方法は、本明細書に記載の少なくとも一つの核酸構築物またはベクターを導入し発現させることと、上述のように光の（活性化または抑制）波長を適用することとを含む。1つの実施形態において、生化学的経路は発生経路または生理的応答である。生物体が植物である場合、この方法は、例えば、植物ホルモンの濃度を調節して、器官サイズおよび植物構造のような発生学的特性を調節すること、開花を調節すること（すなわち、同調の目的を含め、開花を防止または誘導する）、発芽を調節すること（例えば、同調の目的を含め、発芽を防止または誘導する）、老化を調節すること（例えば、保存期間を延長するために食品の老化を防止する）、ストレス応答を調節すること（例えば、干ばつ（drought）ストレス応答を誘導したり、干ばつストレス耐性を生じさせたりする）、または植物免疫を調節すること（例えば、植物病原体または寄生虫に対する免疫を増加または減少させる）のために使用され得る。あるいは、この方法を、天然または合成の代謝物（例えば、医薬）の発現または産生を制御するために用いることができる。
【０１６５】
本発明のさらなる態様において、標的遺伝子の発現を調節するための、本明細書に記載の核酸またはベクターの使用が提供される。
【０１６６】
本発明の別の態様において、光受容体分子が提供され、該光受容体は、フィトクロムまたはフィトクロム関連光受容体タンパク質と発色団とを含む。1つの実施形態において、フィトクロム関連光受容体は、本明細書に記載されるCcaSである。一例では、発色団はテトラピロールである。1つの実施形態において、テトラピロールは、PCB（フィコシアノビリン）、PφB（フィトクロモビリン）、フィコビオロビリンまたはフィコエリトリンおよびBV（ビリベルジン）から選択される。同様に、標的生物体における任意の生化学的経路または応答もしくは生物学的プロセスを調節するための、本明細書に記載の光受容体分子の使用もまた提供される。
【０１６７】
さらなる一実施形態において、上記核酸構築物は、（好ましくはヘムから）上記のような発色団を生成するために必要な少なくとも1つの生合成酵素をさらに含むことができる。一例において、生合成酵素は、例えばヘムオキシゲナーゼ1（ho1）およびフィコシアノビリン:フェレドキシン（pcyA）のようなヘムオキシゲナーゼおよび／またはオキシドレダクターゼであり得る。
【０１６８】
本発明のさらなる態様において、調節配列に作動可能に連結された標的配列を含む核酸構築物が提供され、ここで、調節配列は応答調節因子によって特異的に活性化されるものである。一実施形態において、調節配列は、配列番号17に定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含むか、またはこれらからなる。機能的バリアントは上記で定義されている。
【０１６９】
本発明の最終的態様において、以下のものを含む核酸分子が提供される。
a.  配列番号1、3、5、7、9、11、13および15のいずれかに定義されるポリペプチドをコードする核酸配列；
b.  配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、17、47、48、49または50のいずれかに定義される核酸配列またはその相補配列；
c  (a)または(b)の核酸配列に対して少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の全体的配列同一性を有する核酸；
d.  本明細書中で定義されるストリンジェントな条件下で、(a)〜(c) のいずれかの核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列。
【０１７０】
本明細書において使用される用語「生物体」は、任意の原核生物または真核生物体を指す。真核生物のいくつかの例としては、ヒト、非ヒト霊長類／哺乳動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ラクダ、ロバ、ネコ、およびイヌ）、哺乳類モデル生物体（マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、その他のげっ歯類）、両生類（例えばXenopus）、魚類、昆虫（例えばDrosophila）、線虫（例えばC. elegans）、植物、藻類、真菌が挙げられる。原核生物の例としては、細菌（例えばシアノバクテリア）および古細菌が挙げられる。
【０１７１】
本明細書で使用される「植物」という用語は、任意の植物を指すことができる。例えば、植物は、単子葉植物または双子葉植物であり得る。好ましくは、植物は作物植物である。「作物植物」とは、人または動物による消費または使用のために商業的規模で栽培される植物を意味する。好ましい実施形態において、植物は穀類である。別の実施形態では、植物はArabidopsisまたはMedicago truncatulaである。別の例において、植物はN. benthamianaであり得る。
【０１７２】
本明細書中で使用される用語「植物」は、植物全体、植物の祖先（ancestors）および子孫（progeny）、ならびに、種子、果実、シュート、茎、葉、根（塊茎を含む）、花、組織および器官を含む植物の部分を包含し、ここで、上記の各々が、本明細書中に記載される核酸構築物を含む。用語「植物」はまた、植物細胞、懸濁培養物、カルス組織、胚、分裂組織領域、配偶体、胞子体、花粉および小胞子も包含し、ここでも、上記の各々が核酸構築物を含む。
【０１７３】
本発明はまた、本明細書に記載した本発明の植物の収穫可能部分にも及ぶが、種子、葉、果実、花、茎、根、根茎、塊茎および球根に限定されない。本発明の態様はまた、このような植物の収穫可能部分に由来する、好ましくは直接由来する生成物にも及び、これらは例えば乾燥ペレットもしくは粉末、油、脂肪および脂肪酸、澱粉またはタンパク質である。本発明の植物の収穫可能部分に由来し得るもう一つの生成物は、バイオディーゼルである。本発明はまた、本発明の植物またはその一部を含む食品および栄養補助食品に関する。一実施形態では、食品は動物飼料であり得る。本発明の別の態様では、本明細書に記載の植物またはその一部に由来する製品が提供される。
【０１７４】
一つの最も好ましい実施形態では、植物部分または収穫可能産物は、種子または穀物である。従って、本発明のさらなる態様においては、本明細書に記載されるようなトランスジェニック植物あるいは遺伝子改変植物から産生された種子が提供される。
【０１７５】
代替的な実施形態において、植物部分は、本明細書に記載の遺伝子改変植物の花粉、繁殖体または子孫である。従って、本発明のさらなる態様においては、本明細書に記載されるようなトランスジェニック植物または遺伝子改変植物から産生された花粉、繁殖体または子孫が提供される。
【０１７６】
本明細書において本発明の全ての態様に従って使用される、植物などの対照生物体は、本発明の方法に従って改変されていない生物体である。
【０１７７】
上記の開示は、本発明（方法を含む）の範囲内に包含される主題、および本発明を製造し使用するその最良の態様の一般的な説明を提供するが、さらに当業者が本発明を実施できるようにしその完全な説明記載を提供するために、以下の実施例が提供される。しかしながら、これらの実施例の詳細は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではなく、本発明の範囲は、本開示に添付された特許請求の範囲およびその均等物から理解されるべきであることを、当業者は理解するであろう。本発明の種々のさらなる態様および実施形態は、本開示を考慮すれば当業者にとって明らかであろう。
【０１７８】
本明細書で使用される「および／または」は、特定されたその二つの特徴または構成要素の各々の、他方を伴うまたは伴わない具体的な開示として理解されるべきである。例えば、「Aおよび／またはB」は、(i) A、(ii) B、および(iii) AとB、の各々が、本明細書に個別に記載されているのと同じように、具体的に開示されているものとして解釈されるべきである。
【０１７９】
文脈に反しない限り、上述の特徴の説明および定義は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されず、記載されるすべての態様および実施形態に等しく適用される。
【０１８０】
上記の出願、およびそれらの出願中にまたはそれらの審査手続の際に引用された全ての文献および配列アクセス番号（「出願引用文献」）、および出願引用文献で引用または参照される全ての文献、ならびに、本明細書において引用または参照される全ての文献（
「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書または参照により本明細書に組み込まれる何れかの文献で言及されるあらゆる製品についての製造会社指示書、説明書、製品仕様書、および製品シートと共に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において利用することができる。より具体的には、全ての参照文書は、各個々の文書が参照によって組み込まれる旨が具体的かつ個別的に示されている場合と同じ程度に、参照によって組み込まれる。
【０１８１】
ここで、以下の非限定的な実施例において本発明を説明する。
【実施例】
【０１８２】
実施例１
【０１８３】
［CcaS-CcaRシステム］
CcaS-CcaRシステムは、Synechocystis PCC6803由来の、緑色／赤色光スイッチ可能な二成分系であり、光応答性ヒスチジンキナーゼ（LRHK）であるCcaS、およびその同族応答調節因子（RR）であるCcaRから成る。CcaSは、膜結合型のシアノバクテリオクロムであり、そのGAFドメインにおける保存されたシステイン残基に、直鎖状テトラピロール分子であるフィコシアノビリン（PCB）を共有結合させる。これにより、CcaSの可逆的な光活性化が可能となり、緑色光（〜535 nm）に応答した最大の活性化と赤色光（〜672 nm）による最大の抑制が可能となる。活性化光波長は、CcaSによるCcaRのリン酸化および活性化を引き起こし、続いてCcaRが同族のDNA認識エレメントであるシス調節エレメント（CRE）に結合して、シスにおける標的遺伝子（複数可）の転写を促進する。
【０１８４】
［E. coliにおける異種発現によるCcaS-CcaR系の発色団依存性の特徴付け］
植物では、CcaSの本来の発色団（chromophore）であるPCBは産生されないが、ほぼ同一の発色団であるフィトクロモビリン（PΦB）が産生される。そこで発明者らは、大腸菌においてPΦBによりCcaS-CcaRシステムが光スイッチをするかどうかの試験に着手した。
【０１８５】
E. coliにおいて、CcaS-CcaRシステムは、2ベクター系として設計される。1つのベクターからは、ヘムから発色団PCBを産生するHO1およびPCYAという2つのタンパク質とともに、CcaSが合成される。第2のベクターからは、CcaRが生成される。第2のベクターはまた、Pcpcg2-172プロモーターの制御下にあるsfgfp遺伝子も保持する。PCBの代わりにPΦBを産生するために、発明者らは、Mukougawa et al. (2006)4によって記述されたようにトランジットペプチドを欠く（mHY2）シロイヌナズナ由来PΦBシンターゼをコードする遺伝子でpcyA遺伝子を置き換えた。発明者らはまた、PCBとPΦBの前駆体分子であるビリベルジン（BV）の存在下、および発色団の非存在下（斜線付きＯ）でも、この系の光スイッチングを調べた。これを試験するために、発明者らはpcyAおよびho1にそれぞれ停止突然変異を導入した。
【０１８６】
E. coliにおける光スイッチングアッセイ
E. coliにおけるCcaS-CcaR系およびそのバリアント（variant）の挙動を調べるために、この系を発現する細胞を規定の光レジメン中で培養し、次いで蛍光計でGFP蛍光について試験する。GFP蛍光は、CcaSの光活性化およびCcaRを介したシグナル伝達の成功についてのレポーターとして作用する。このような実験から得られたデータの一例を下記に示す（図2）。
【０１８７】
PCBを用いると、CcaS-CcaRシステムは、白色光をシミュレートする赤・緑・青色光の混合（RGB白色光）、青色光、および緑色光によって活性化され、赤色光および暗所では活性が低い（表１）。PΦBを用いると、この系は試験したすべての光条件下で構成的に活性であると見られる。異なる光レジメンに応答して、活性のわずかな変化が観察されるだけである。BVを用いると、システムはRGB白色および青色光の処理により不活性化される。緑色光および赤色光の条件下ならびに暗所では低い活性が観察される。発色団なしでは、系はRGB白色および青色光処理によって不活性化され、緑色および赤色光条件下ならびに暗所では非常に低い活性を示すのみである（図3）。
【０１８８】
［E. coliでのエンジニアリングによる、植物内機能のためのCcaS-CcaR系の転用］
a. 植物で機能するシステムを創出する目的のために、CcaS-CcaR系にいくつかの改変を加えた。これらの改変のいくつかを大腸菌中で試験して、光スイッチ機能が損なわれていないことを確認した。また、いくつかの改変を植物中で試験した（後述する）。
【０１８９】
b. CcaSの改変
a. PΦBによりCcaSの光スイッチングを改良した
b. 66塩基のN末端削除を介して膜アンカーを除去することにより、細胞膜からCcaSをリリースした
c. CcaSにN末端核局在化シグナル（NLS）を付加した
d. リボソームスキップ配列によって付加されたペプチドテールは、CcaSsによって許容されることを確認した
【０１９０】
［PΦBによるCcaSの光スイッチングの改良］
最初に、発色団結合ポケット中の残基の部位特異的変異誘発により、PΦBによる改善された光スイッチングのためにCcaSを適応させることを試みた。四つのシアノバクテリオクロム（TePixJ、FdRcaE、SyCcaS、およびSyCph1）、二つのバクテリオフィトクロム（PsBphPおよびDrBphP）、および二つの植物フィトクロム（AtPhyAおよびAtPhyB）を含め、フィコビオロビリン（PVB）、PCB、PΦBまたはBVを発色団として利用するタンパク質の配列を比較することにより、PΦBによるCcaS光スイッチングを改善するために変異させ得る候補アミノ酸残基を同定した。CcaSの部位特異的変異誘発により、L80M、I84F、A92V、I104Y、V113D、F114I、L142HおよびF149Mという8つの単一アミノ酸残基変異を創出した。A92V変異は、PΦBによるCcaS光スイッチングを改善したが、青色光および赤色光に関するタンパク質の光化学特性も変化させた（図4）。A92V変異を有するCcaSを以下ではCcaS (A92V)と呼ぶ。PΦBを伴うCcaS(A92V)の系は、青色光とRGB白色光によって活性化されて赤色光によって抑制されるのではなくて、青色光とRGB白色光によって抑制されて赤色光によって活性化される。RGB白色光における活性が低いのは、青色光の応答が支配的であることの結果かもしれない。
【０１９１】
［CcaSの膜貫通ドメインを除去してそれを可溶性にし、N末端の核局在化シグナルを付加する］
CcaS(A92V)を細胞膜からリリースするために、バイオインフォマティクスソフトウェア（PhobiusおよびTMHMM-2.0）を用いて膜貫通ドメイン（transmembrane domain：TMD）を予測した。PhobiusはTMDが第16〜69塩基または第16〜87塩基でコードされると予測し、TMHMM-2.0は第13〜69であると予測した。切り詰め（truncation）を作成して、ccaSの第4〜69塩基を除去した（Δ22と呼ばれる、CcaSにおけるG2_H23delに相当する）。Δ22はCcaSによって十分に許容されなかった。しかしながら、ccaSにおける第1〜69塩基を除去し（Δ23と呼ばれる、CcaSにおけるM1_H23delに相当する）、それらをNLS配列で置き換えると、光スイッチング特性が回復した（図5）。
【０１９２】
［CcaS機能性に対する2Aペプチドテールの効果の試験］
リボソームスキッピングは、真核生物において単一のmRNAから複数のタンパク質を発現するために用いられる技術であり、したがって、必要とされるプロモーターおよびターミネーターの配列がより少ないので、発現ベクターのサイズを最小化するために用いることができる。この技術が本発明者らの系に適合するかどうか調べることを発明者らは望んだ。翻訳の際に、2A配列は翻訳を停止させ、新生ペプチド鎖を放出させ、そして翻訳を再開させて第2のペプチド鎖を産生させる。この過程で、2Aリボソームスキップ配列の大部分をコードするペプチドテール（尾部）が上流のタンパク質のC末端に付加される一方、1つのプロリンが下流のタンパク質のN末端に付加される。2Aペプチドテールの付加がCcaS機能に影響し得るかどうかを試験するために、発明者らは、E. coli光スイッチアッセイにおいて、P2A、F2AおよびF2A30の2A配列に相当する三つのペプチドテールを伴わせてCcaSを試験した（表4）。2A配列はE. coliでは機能しないので、2Aテールをコードする配列を、試験されたCcaSバリアントの3’末端に加えた（MM:NLS:CcaS (Δ23 A92V)）。F2Aテールはあまり耐容されなかったが、P2AおよびF2A30配列はどちらもよく耐容された（図6）。
【０１９３】
［タバコにおけるエンジニアリングによる、植物内機能のためのCcaS-CcasaRシステムの転用］
植物中で機能するシステムのために、植物発現ベクターを作成し、いくつかのさらなる改変を系に加えなければならなかった。
【０１９４】
・CcaSへのさらなる改変
・Arabidopsisにおける発現のためにccaSはコドン最適化された。
・CcaRへのさらなる改変
・C末端NLSシグナルがCcaRに付加された
・VP64真核生物トランス活性化ドメインがCcaRに付加された
・Arabidopsisにおける発現のためにccaRはコドン最適化された。
・CcaRのための合成同族プロモーター、あるいは最小CaMV 35Sプロモーター配列に融合された3コピーのCcaR認識エレメントからなる「上流活性化配列」(upstream activation sequence：UAS)を構築した。
・新しい系のための光誘導遺伝子発現に関する蛍光アウトプットレポーターとして、GFPバリアント（NLS:Venus）を追加。
・植物における系の発現のための正規化対照として、GFPホモログ（NLS:TagRFP）を追加。
・F2A30：三つのシステム構成要素すべてを同じプロモーター-ターミネーターカセットから発現させるために、リボソームスキップ配列（例えばF2A30）を、ccaSとtagrfpの間およびtagrfpとccaRの間に追加。
【０１９５】
［植物発現ベクターの設計］
植物においてハイライター系のバリアントを発現し試験するために、インプットカセットとアウトプットカセットを有する植物発現ベクターを設計した。原理的に、ハイライターシステムが植物内で標的遺伝子（Target）の発現をアウトプットカセットを介して制御するために必要なタンパク質を、インプットカセットが発現する。インプットカセットは、光応答性ヒスチジンキナーゼ（CcaSバリアント）、レポーター遺伝子（TagRFP）および応答調節因子（CcaRバリアント）という3つのタンパク質の構成的発現のために設計された。アウトプットカセットは、植物内で応答調節因子が結合し標的遺伝子発現を誘導できる、合成同族プロモーター（PRR）を伴って設計された（図7）。
【０１９６】
［発明者らの植物発現ベクターを作製するために使用されたベクター骨格］
発明者らの植物発現ベクターを構築するために用いたベクター骨格はDynaMo Centerにおける協力者から得た（コペンハーゲン大学のMeike Burow准教授）。このベクターはpEAQ-HTに基づいているが、RBとLBの間の領域が、PUBQ 10、USERカセットおよびTrbcSを含むカセットで置き換えられている。
【０１９７】
［アウトプットカセットの設計：光制御性遺伝子発現カセット］
ハイライターシステムのためのアウトプットカセットは、（発現遺伝子の容易な交換を可能にするために）ゲートウェイカセットとして設計され、カセットの上流にRRのための同族プロモーター配列、下流にTNOS配列を伴った。最初の試験では、光誘導性遺伝子発現を評価するためのレポーターとしてNLS:Venus（NLS:edAFPt9）を用いることにした。
【０１９８】
［合成植物プロモーターおよび同族転写アクチベーターの設計］
エストロゲン誘導性XVEシステム5の背景にある考え方に基づいて、ハイライター系のために合成植物プロモーターおよび転写アクチベーターを設計した。XVE系は、キメラ転写アクチベーターであるXVE（細菌のリプレッサーLexAのDNA結合ドメイン（X）と、VP16の酸性トランス活性化ドメイン（V）と、ヒトエストロゲン受容体の調節領域（E）とのフュージョン）、および、-46 35S最小プロモーターの上流に8コピーLexAオペレーターが融合したものからなるその同族プロモーターから構成される。エストロゲンの存在下ではXVEがその同族のプロモーターに結合し、下流の遺伝子が転写される。
【０１９９】
発明者らの合成プロモーターの設計は、-51 35 S最小プロモーターの上流に3コピーのccaR CREが融合したものからなる（図8）。Qilai Huang et al.6の研究に触発されて、ccaR CREが120°の角度でオフセットされてDNAらせんの周りに均等に間隔をあけて配置されるように、彼らの構築物191を模倣した。それは真核細胞HEK293T細胞において転写機構成分をTATAボックスに効果的に動員して転写開始複合体を形成していたものであるため、このデザインを選択した。
【０２００】
［インプットカセットの設計：LRHKとRRのための発現カセット］
発現ベクターのサイズを最小に保ち、LRHKとRRの発現のバランスをとることを試みるために、LRHKとRRのバリアントの両方を、発現レポーター（TagRFP）と共に、PUBQ10およびTrbcSにより制御される単一カセットから発現させた。1つのmRNAから3つのタンパク質を個別のタンパク質として発現させることを可能にするために、F2A30リボソームスキッピング配列をccaSとtagrfpの間およびtagrfpとccaRの間に含ませた。TagRFPはインプットカセットから構成的に発現されるので、YFPシグナルをRFPシグナルで割ることにより比測定的に蛍光標的（例えばNLS:Venus）の誘導を定量化できる。TagRFPは、ハイライター系を発現する細胞についてのレポーターとしても作用する。
【０２０１】
［植物における2A配列のリボソームスキップ効率の試験（タバコにおける一過性発現）］
N. benthamiana（タバコ）における一過性発現により、植物中での‘2A型’配列のリボソームスキッピングの効率を試験した。p2a、f2aおよびf2a30配列のスキップ効率を評価するために、tagrfpを、これら3つの異なる2A配列を介して、MM:NLS:CcaS(Δ23 A92V)をコードするLRHK遺伝子の3’末端に連結し、PUBQ-TrbcSカセットから発現させた。完全にスキップすると、TagRFP蛍光が核に限定されないはずである。スキップに失敗すると、TagRFPはMM:NLS:CcaS(Δ23 A92V)と融合し、核に局在する。完全なリボソームスキッピング、およびスキッピングの完全な失敗についての理論的対照として、TagRFPおよびNLS:TagRFPをPUBQ-TrbcSカセットから発現させた。3つの2A配列はすべて植物中で高い効率で機能した（図9）。F2A30配列をさらなる実験のために選択した。
【０２０２】
［植物におけるハイライターシステムの試験］
【０２０３】
［緑色光、青色光、および暗処理に応答したハイライターシステム（複数可）の光スイッチング］
タバコ葉の一過性トランスフェクションによりハイライターを試験した。ハイライターシステムのバリアントで形質転換されたAgrobacterium tumefaciens（アグロバクテリウム）をタバコ葉に浸透させるために用いた。葉を温室で〜2日間放置してハイライターシステムを発現させ、その後最低18時間にわたり光処理（青色光、緑色光、または暗処理）した（図10）。光処理のために、葉を植物から切り取り、プラスチック容器内の湿潤環境に維持した。
【０２０４】
植物細胞核における平均YFP蛍光強度を平均RFP蛍光強度で割って分析することによる共焦点イメージングにより、YFP発現の光制御誘導を評価した。YFP発現は誘導可能でありTagRFP発現は構成的であるので、2つのシグナル間の低い比は低い標的遺伝子発現として解釈することができ、高い比率は高い標的遺伝子発現として解釈することができる。
【０２０５】
ハイライターシステムの4つのバリアント、すなわちハイライター209、ハイライター210、ハイライター213、およびハイライター214を試験した（表5）。これらの系は、A92V変異の重要性と（系209および213はA92V変異を有する一方、210および214はA92V変異を有さない）、CcaRのN末端またはC末端にNLSおよびVP64ドメインを付加する方がよいかどうかということ（系209および210はN末端フュージョンであり、213および214はC末端フュージョンである）を試験するものである。
【０２０６】
結果は、全ての構築物について、青色光処理が、緑色光処理および暗処理と比較して標的遺伝子発現を低下させたことを明らかにした。光処理間の発現変化の最大倍数は、ハイライター213および214に関して観察され、これらはVP64ドメインとNLSがCcaRのC末端に融合したものである（図11）。
【０２０７】
［第2の試験  ―  RGB白色、青色、緑色、赤色、および暗処理］
次に、さらなる光レジメンの下でハイライター系213および214を評価した。今回は赤色光およびRGB白色光を含む。葉が植物に付いたままでシステムが発現するあいだに、植物は連続的な青色光中で成長させた（図12）。
【０２０８】
この実験では、NLS:Venusのみの対照とNLS:TagRFPのみの対照を含めた。これら二つの対照は、当該実験条件と解析方法の下で当該撮像システムを用いて達成され得る最大比（NLS:Venusのみ）と最小比（NLS:TagRFPのみ）を近似する。これらの系、すなわちハイライター213とハイライター214は二重試験においてテストされた。
【０２０９】
一般に、この系は、青色光条件下では不活性であり、緑色光およびRGB白色光条件下では中間的に活性であり、赤色光条件下および暗条件下では完全に活性である。A92V変異を有するハイライター系であるハイライター213は、様々な光処理レジメンで広くNLS:Venus標的の低発現を示し、それとともに光処理間での発現の変化倍数がより高かった。
【０２１０】
［ハイライターシステムの潜在的な応用］
植物において、化学物質を用いず侵襲性が最小限である標的遺伝子発現制御に対する大きな要求がある。そのようなツールは、園芸システムだけでなく基礎的な実験室研究にとっても大きな価値がある。発明者らはハイライターシステムによってこれを達成し、植物宿主N. benthamianaでの標的遺伝子発現の誘導においてその有効性を実証した。我々はここでArabidopsis thalianaとMedicago truncatulaを含む他のモデルシステムでその機能の実証を続ける。
【０２１１】
植物では、光遺伝学的ツールの利用可能性は現在限られており、ハイライターは現在の技術（例えば細胞型特異的プロモーターまたは化学誘導システム）を超える大きな改善を表す。高度な空間的および時間的分解能を提供するレーザーベースの光源と組み合わせることで、ハイライターシステムは、生物学研究者がかつてない精度で遺伝子発現を誘導することを可能にする。さらに、光は、遺伝子発現の無害かつ低コストの調節因子として利用することができ、植物成長調節性化学物質と比較して、作物の発生学的および生理学的変化を誘導するために理想的である。
【０２１２】
［基礎研究におけるハイライターシステムの応用］
ハイライターを発現する植物宿主および潜在的に他の真核生物宿主は、青色光処理を用いて、標的遺伝子のより低い発現レベルへと可逆的に導くことができる。この特徴により、生物学者は、細胞、組織、器官、および生物体レベルでのほぼあらゆる生物学的プロセスの撹乱に対する生物体の発生学的および生理学的応答を調べることができる。直近の関心事として、植物ホルモン濃度の変化を誘導することがある。以下に例を示す（表1）。
【０２１３】
【表１】
2021516065.tif 000002
【０２１４】
［園芸におけるハイライターシステムの応用］
ハイライターを発現する植物宿主は、光処理の適用を通して、鍵となる発生的移行または生理的状態変化を受けるように誘導することができる。開発された当該技術は、農業的成果の改善のために特定の介入をできるようにする可能性を持っている。直近の関心事としては、発芽、開花、老化、耐干性、免疫活性化、および合成代謝物産生（すなわち「代謝弁」としての使用）のタイミングを誘導することがある。以下に例を示す（表2）。
【０２１５】
【表２】
2021516065.tif 000003
【０２１６】
実施例２
【０２１７】
［混合光環境に対するハイライター応答］
園芸環境は、典型的には、単色光ではなく混合光環境である。したがって、白色光を赤色光（活性化波長）または青色光（不活性化波長）のいずれかで富化した光レジメン下で、ハイライター系の応答性を評価した。系の最大応答を確立するために、単色の赤色光と青色光を対照条件として用いた。混合光環境において、赤色光が控えめに富化された白色光から青色光の控えめな富化への切り替えは、ハイライターシステム213（4重に試験された）を遺伝子発現の活性化から不活性化に変換するのに十分である（図14）。
【０２１８】
［遺伝子調節の多色制御のためのLRHKのスペクトルバリアントの作製］
多色光遺伝学システムを開発することにより、遺伝子調節ネットワークの高度な制御を達成し得る。そこで、発明者らは、開発したLRHKが代替的な光刺激に応答するように適応させることができるかどうかを試験した。LRHKのGAFドメインの一セグメント（β1シートの最N末端部分（DRVモチーフ）からβ6シートのC末端部分（WGLモチーフ）まで）を、以下のGAFドメインの対応セグメントで置き換えた；AnPixJg2、slr1393g2、NpR1597g4、およびUirSg。得られたLRHKは、それぞれLRHK1-01、LRHK1-05、LRHK1-10およびLRHK1-12と呼ばれる。暗処理、紫外光（370 nmおよび400 nm）、青色光（450 nm）、緑色光（520 nm）、黄色光（590 nm）、オレンジ色光（610 nm）、赤色光（630 nm）、および遠赤光（700 nm）に応答する、合成LRHKの下流の遺伝子誘導（すなわちsfGFP蛍光）を評価した（図15）。
【０２１９】
元のLRHKはほとんどの光レジメンで不活性であるが、緑色（520 nm）、黄色（590 nm）およびオレンジ色（610 nm）の光レジメンでsfGFP発現を強く誘導する。対照的に、LRHK1-01は、紫外（370 nmおよび400 nm）および青色（450 nm）の光レジメンを除いて、全ての光領域でsfGFP発現を誘導した。LRHK1-05は、特異的に青色光を除いて全ての光レジメンでsfGFP発現を誘導した。LRHK1-10は、試験した全ての光レジメンでsfGFP発現を強く誘導したが、青色光（450 nm）への応答ではやはり幾分低下されたsfGFP発現誘導を示した。LRHK1-12はすべての光レジメンで構成的に不活性である。これらの結果は、ハイライターシステムのために開発されたLRHKは新しい光応答特性を示すように適応させることができることを明確に示している。
【０２２０】
［安定的に形質転換されたArabidopsisにおける、ハイライター系を用いた光依存的態様による遺伝子発現の制御］
安定的に形質転換された植物においてハイライター系が遺伝子発現レベルを制御できることを実証するために、核局在化GIBBERELLIN PERCEPTION SENSOR 1（nGPS1）構築物も発現するArabidopsis thalianaのga3ox1-3, ga3ox2-1二重変異体株（ga3ox1-3, ga3ox2-1, nGPS1, Rizza 2017）の半矮性表現型を補完することを試みた。ga3ox2-1変異体は目に見える成長表現型を有さないので（Mitchum 2006）、本発明者らは、ハイライターシステムによって制御されるAtGA3OX1発現を用いて光依存的態様で半矮性表現型を補完できると仮定した。Ga3ox1-3, Ga3ox2-1, nGPS1株の半矮性表現型は、連続的な青色富化白色光中、および連続的な赤色富化白色光中で生育させた場合に明瞭に認められた。AtGA3OX1発現を制御するハイライター系で形質転換されたga3ox1-3, ga3ox2-1, nGPS1株では、「不活性化」青色富化白色光中で生育された場合にのみ半矮性表現型が観察された一方、「活性化」赤色富化白色光中で生育された同じ株では非矮性表現型が観察された（図16）。これらの結果は、ハイライター系の制御下でNLS:Venus発現を駆動する一過性タバコ実験で観察された結果とよく一致している。
【０２２１】
参考文献
2021516065.tif 000004
【０２２２】
配列一覧
【０２２３】
CcaSバリアント
【０２２４】
SEQ ID NO: 1 CcaS (A92V); アミノ酸配列
MGKFLIPIEFVFLAIAMTCYLWHRQNQERRRIEISIKQQTQRERFINQITQHIRQSLNLE
TVLNTTVAEVKTLLQVDRVLIYRIWQDGTGSVITESVNANYPSILGRTFSDEVFPVEYHQAYTKGKVRAINDIDQDDIEICLADFVKQFGVKSKLVVPILQHNRASSLDNESEFPYLWGLLITHQCAFTRPWQPWEVELMKQLANQVAIAIQQSELYEQLQQLNKDLENRVEKRTQQLAATNQSLRMEISERQKTEAALRHTNHTLQSLIAASPRGIFTLNLADQIQIWNPTAERIFGWTETEIIAHPELLTSNILLEDYQQFKQKVLSGMVSPSLELKCQKKDGSWIEIVLSAAPLLDSEENIAGLVAVVADITEQKRQAEQIRLLQSVVVNTNDAVVITEAEPIDDPGPRILYVNEAFTKITGYTAEEMLGKTPRVLQGPKTSRTELDRVRQAISQWQSVTVEVINYRKDGSEFWVEFSLVPVANKTGFYTHWIAVQRDVTERRRTEEVRLALEREKELSRLKTRFFSMASHEFRTPLSTALAAAQLLENSEVAWLDPDKRSRNLHRIQNSVKNMVQLLDDILIINRAEAGKLEFNPNWLDLKLLFQQFIEEIQLSVSDQYYFDFICSAQDTKALVDERLVRSILSNLLSNAIKYSPGGGQIKIALSLDSEQIIFEVTDQGIGISPEDQKQIFEPFHRGKNVRNITGTGLGLMVAKKCVDLHSGSILLKSAVDQGTTVTICLKRYNHLPRA
【０２２５】
SEQ ID NO: 2 CcaS (A92V); 核酸配列
ATGGGCAAATTTCTAATTCCAATCGAATTTGTTTTTCTGGCGATCGCCATGACCTGTTATTTATGGCACAGACAAAACCAAGAACGCCGCAGGATTGAAATTAGCATCAAGCAACAAACCCAACGGGAACGATTTATTAACCAAATTACCCAACATATCCGCCAATCTTTAAACTTGGAAACGGTTTTAAATACCACCGTCGCTGAAGTTAAAACCCTGTTGCAAGTTGATCGAGTTCTAATTTATCGCATTTGGCAAGATGGCACGGGCAGCGTCATTACGGAATCGGTGAATGCCAATTATCCTAGTATTTTAGGGCGGACCTTTTCCGATGAAGTTTTTCCCGTTGAATACCATCAAGCCTACACCAAAGGTAAAGTACGGGCCATTAATGACATTGACCAGGATGACATAGAGATTTGCCTAGCTGATTTCGTCAAACAATTTGGCGTGAAATCAAAATTAGTAGTGCCCATTCTTCAACATAATCGTGCTTCTTCCCTAGATAATGAATCAGAATTTCCCTATCTTTGGGGGCTGTTAATTACCCATCAATGTGCTTTTACCCGGCCATGGCAACCGTGGGAAGTGGAGTTAATGAAACAGCTAGCCAATCAGGTCGCGATCGCCATCCAACAATCGGAATTATATGAGCAATTACAGCAACTCAATAAAGATTTGGAAAACCGAGTCGAAAAACGCACCCAGCAACTTGCCGCCACCAATCAATCCCTAAGAATGGAAATCAGTGAGCGACAAAAAACGGAAGCCGCTCTCCGCCACACTAACCATACTCTGCAATCCCTGATTGCGGCCTCCCCCAGGGGTATTTTTACCCTTAATTTAGCAGACCAAATTCAGATTTGGAATCCTACAGCAGAACGTATTTTTGGTTGGACAGAAACAGAAATTATTGCCCATCCAGAATTATTAACATCCAACATTTTGCTGGAAGATTATCAGCAATTTAAACAGAAAGTTTTATCAGGCATGGTTTCCCCTAGCCTAGAATTAAAATGTCAAAAAAAAGATGGTAGTTGGATTGAAATTGTCCTTTCCGCTGCTCCCCTATTGGATAGTGAAGAAAATATTGCCGGATTGGTGGCGGTTGTCGCCGATATTACCGAGCAAAAGCGGCAGGCAGAACAAATTCGTTTGCTACAATCCGTTGTGGTTAATACTAATGATGCGGTGGTGATTACGGAAGCGGAGCCCATTGATGATCCCGGGCCGAGAATTCTCTATGTCAATGAAGCATTTACTAAAATCACCGGTTATACTGCTGAAGAAATGCTAGGCAAAACCCCCCGAGTTTTACAGGGACCAAAAACTAGTCGCACTGAATTAGATAGGGTGCGGCAAGCCATTAGTCAATGGCAATCAGTTACCGTTGAAGTGATTAATTATCGTAAGGATGGCAGTGAGTTTTGGGTGGAATTTAGTCTGGTGCCCGTTGCCAATAAAACAGGTTTTTACACCCATTGGATTGCTGTGCAAAGGGATGTCACTGAGCGCCGACGCACGGAGGAAGTCCGCCTAGCTTTAGAACGGGAAAAAGAATTAAGCCGCCTAAAAACTCGTTTTTTCTCCATGGCTTCCCATGAATTTCGTACTCCCCTCAGTACGGCCTTAGCTGCTGCCCAATTACTGGAAAATTCTGAAGTGGCCTGGCTTGATCCCGATAAGCGTAGCCGGAACTTACACCGTATTCAAAATTCCGTGAAAAATATGGTACAGCTCCTGGATGATATTTTAATCATTAACCGTGCCGAAGCGGGCAAATTGGAATTTAATCCTAATTGGTTAGATTTGAAATTATTGTTCCAGCAATTTATCGAAGAAATTCAATTAAGTGTCAGTGACCAATATTATTTTGACTTTATTTGTAGCGCTCAAGATACGAAGGCATTGGTGGATGAAAGGTTAGTGCGGTCTATTTTATCTAATCTGTTATCTAATGCGATTAAATACTCTCCCGGGGGAGGGCAGATTAAAATTGCCCTAAGCCTAGATTCGGAACAGATTATTTTTGAAGTCACCGACCAGGGCATTGGCATTTCGCCAGAGGACCAAAAGCAAATTTTTGAACCCTTTCATCGGGGCAAAAATGTCAGAAATATTACGGGAACAGGACTCGGTTTAATGGTTGCCAAGAAATGTGTTGACTTACACAGTGGCAGTATCTTGCTAAAAAGTGCAGTTGACCAGGGAACAACAGTTACTATCTGTTTAAAACGCTATAACCATTTGCCTCGAGCTTAG
【０２２６】
SEQ ID NO: 3: M:NLS: CcaS (Δ23); アミノ酸配列
MLQPKKKRKVGGRQNQERRRIEISIKQQTQRERFINQITQHIRQSLNLETVLNTTVAEVKTLLQVDRVLIYRIWQDGTGSAITESVNANYPSILGRTFSDEVFPVEYHQAYTKGKVRAINDIDQDDIEICLADFVKQFGVKSKLVVPILQHNRASSLDNESEFPYLWGLLITHQCAFTRPWQPWEVELMKQLANQVAIAIQQSELYEQLQQLNKDLENRVEKRTQQLAATNQSLRMEISERQKTEAALRHTNHTLQSLIAASPRGIFTLNLADQIQIWNPTAERIFGWTETEIIAHPELLTSNILLEDYQQFKQKVLSGMVSPSLELKCQKKDGSWIEIVLSAAPLLDSEENIAGLVAVVADITEQKRQAEQIRLLQSVVVNTNDAVVITEAEPIDDPGPRILYVNEAFTKITGYTAEEMLGKTPRVLQGPKTSRTELDRVRQAISQWQSVTVEVINYRKDGSEFWVEFSLVPVANKTGFYTHWIAVQRDVTERRRTEEVRLALEREKELSRLKTRFFSMASHEFRTPLSTALAAAQLLENSEVAWLDPDKRSRNLHRIQNSVKNMVQLLDDILIINRAEAGKLEFNPNWLDLKLLFQQFIEEIQLSVSDQYYFDFICSAQDTKALVDERLVRSILSNLLSNAIKYSPGGGQIKIALSLDSEQIIFEVTDQGIGISPEDQKQIFEPFHRGKNVRNITGTGLGLMVAKKCVDLHSGSILLKSAVDQGTTVTICLKRYNHLPRA
【０２２７】
SEQ ID NO: 4 M:NLS: CcaS (Δ23); 核酸配列
ATGTTACAACCAAAGAAGAAAAGGAAGGTGGGTGGAAGACAAAACCAAGAACGCCGCAGGATTGAAATTAGCATCAAGCAACAAACCCAACGGGAACGATTTATTAACCAAATTACCCAACATATCCGCCAATCTTTAAACTTGGAAACGGTTTTAAATACCACCGTCGCTGAAGTTAAAACCCTGTTGCAAGTTGATCGAGTTCTAATTTATCGCATTTGGCAAGATGGCACGGGCAGCGCCATTACGGAATCGGTGAATGCCAATTATCCTAGTATTTTAGGGCGGACCTTTTCCGATGAAGTTTTTCCCGTTGAATACCATCAAGCCTACACCAAAGGTAAAGTACGGGCCATTAATGACATTGACCAGGATGACATAGAGATTTGCCTAGCTGATTTCGTCAAACAATTTGGCGTGAAATCAAAATTAGTAGTGCCCATTCTTCAACATAATCGTGCTTCTTCCCTAGATAATGAATCAGAATTTCCCTATCTTTGGGGGCTGTTAATTACCCATCAATGTGCTTTTACCCGGCCATGGCAACCGTGGGAAGTGGAGTTAATGAAACAGCTAGCCAATCAGGTCGCGATCGCCATCCAACAATCGGAATTATATGAGCAATTACAGCAACTCAATAAAGATTTGGAAAACCGAGTCGAAAAACGCACCCAGCAACTTGCCGCCACCAATCAATCCCTAAGAATGGAAATCAGTGAGCGACAAAAAACGGAAGCCGCTCTCCGCCACACTAACCATACTCTGCAATCCCTGATTGCGGCCTCCCCCAGGGGTATTTTTACCCTTAATTTAGCAGACCAAATTCAGATTTGGAATCCTACAGCAGAACGTATTTTTGGTTGGACAGAAACAGAAATTATTGCCCATCCAGAATTATTAACATCCAACATTTTGCTGGAAGATTATCAGCAATTTAAACAGAAAGTTTTATCAGGCATGGTTTCCCCTAGCCTAGAATTAAAATGTCAAAAAAAAGATGGTAGTTGGATTGAAATTGTCCTTTCCGCTGCTCCCCTATTGGATAGTGAAGAAAATATTGCCGGATTGGTGGCGGTTGTCGCCGATATTACCGAGCAAAAGCGGCAGGCAGAACAAATTCGTTTGCTACAATCCGTTGTGGTTAATACTAATGATGCGGTGGTGATTACGGAAGCGGAGCCCATTGATGATCCCGGGCCGAGAATTCTCTATGTCAATGAAGCATTTACTAAAATCACCGGTTATACTGCTGAAGAAATGCTAGGCAAAACCCCCCGAGTTTTACAGGGACCAAAAACTAGTCGCACTGAATTAGATAGGGTGCGGCAAGCCATTAGTCAATGGCAATCAGTTACCGTTGAAGTGATTAATTATCGTAAGGATGGCAGTGAGTTTTGGGTGGAATTTAGTCTGGTGCCCGTTGCCAATAAAACAGGTTTTTACACCCATTGGATTGCTGTGCAAAGGGATGTCACTGAGCGCCGACGCACGGAGGAAGTCCGCCTAGCTTTAGAACGGGAAAAAGAATTAAGCCGCCTAAAAACTCGTTTTTTCTCCATGGCTTCCCATGAATTTCGTACTCCCCTCAGTACGGCCTTAGCTGCTGCCCAATTACTGGAAAATTCTGAAGTGGCCTGGCTTGATCCCGATAAGCGTAGCCGGAACTTACACCGTATTCAAAATTCCGTGAAAAATATGGTACAGCTCCTGGATGATATTTTAATCATTAACCGTGCCGAAGCGGGCAAATTGGAATTTAATCCTAATTGGTTAGATTTGAAATTATTGTTCCAGCAATTTATCGAAGAAATTCAATTAAGTGTCAGTGACCAATATTATTTTGACTTTATTTGTAGCGCTCAAGATACGAAGGCATTGGTGGATGAAAGGTTAGTGCGGTCTATTTTATCTAATCTGTTATCTAATGCGATTAAATACTCTCCCGGGGGAGGGCAGATTAAAATTGCCCTAAGCCTAGATTCGGAACAGATTATTTTTGAAGTCACCGACCAGGGCATTGGCATTTCGCCAGAGGACCAAAAGCAAATTTTTGAACCCTTTCATCGGGGCAAAAATGTCAGAAATATTACGGGAACAGGACTCGGTTTAATGGTTGCCAAGAAATGTGTTGACTTACACAGTGGCAGTATCTTGCTAAAAAGTGCAGTTGACCAGGGAACAACAGTTACTATCTGTTTAAAACGCTATAACCATTTGCCTCGAGCTTAG
【０２２８】
SEQ ID NO: 5: CcaS (Δ22 A92V); アミノ酸配列
MRQNQERRRIEISIKQQTQRERFINQITQHIRQSLNLETVLNTTVAEVKTLLQVDRVLIY
RIWQDGTGSVITESVNANYPSILGRTFSDEVFPVEYHQAYTKGKVRAINDIDQDDIEICL
ADFVKQFGVKSKLVVPILQHNRASSLDNESEFPYLWGLLITHQCAFTRPWQPWEVELMKQLANQVAIAIQQSELYEQLQQLNKDLENRVEKRTQQLAATNQSLRMEISERQKTEAALRHTNHTLQSLIAASPRGIFTLNLADQIQIWNPTAERIFGWTETEIIAHPELLTSNILLEDYQQFKQKVLSGMVSPSLELKCQKKDGSWIEIVLSAAPLLDSEENIAGLVAVVADITEQKRQAEQIRLLQSVVVNTNDAVVITEAEPIDDPGPRILYVNEAFTKITGYTAEEMLGKTPRVLQGPKTSRTELDRVRQAISQWQSVTVEVINYRKDGSEFWVEFSLVPVANKTGFYTHWIAVQRDVTERRRTEEVRLALEREKELSRLKTRFFSMASHEFRTPLSTALAAAQLLENSEVAWLDPDKRSRNLHRIQNSVKNMVQLLDDILIINRAEAGKLEFNPNWLDLKLLFQQFIEEIQLSVSDQYYFDFICSAQDTKALVDERLVRSILSNLLSNAIKYSPGGGQIKIALSLDSEQIIFEVTDQGIGISPEDQKQIFEPFHRGKNVRNITGTGLGLMVAKKCVDLHSGSILLKSAVDQGTTVTICLKRYNHLPRA
【０２２９】
SEQ ID NO: 6: CcaS (Δ22 A92V); 核酸配列
ATGAGACAAAACCAAGAACGCCGCAGGATTGAAATTAGCATCAAGCAACAAACCCAACGGGAACGATTTATTAACCAAATTACCCAACATATCCGCCAATCTTTAAACTTGGAAACGGTTTTAAATACCACCGTCGCTGAAGTTAAAACCCTGTTGCAAGTTGATCGAGTTCTAATTTATCGCATTTGGCAAGATGGCACGGGCAGCGTCATTACGGAATCGGTGAATGCCAATTATCCTAGTATTTTAGGGCGGACCTTTTCCGATGAAGTTTTTCCCGTTGAATACCATCAAGCCTACACCAAAGGTAAAGTACGGGCCATTAATGACATTGACCAGGATGACATAGAGATTTGCCTAGCTGATTTCGTCAAACAATTTGGCGTGAAATCAAAATTAGTAGTGCCCATTCTTCAACATAATCGTGCTTCTTCCCTAGATAATGAATCAGAATTTCCCTATCTTTGGGGGCTGTTAATTACCCATCAATGTGCTTTTACCCGGCCATGGCAACCGTGGGAAGTGGAGTTAATGAAACAGCTAGCCAATCAGGTCGCGATCGCCATCCAACAATCGGAATTATATGAGCAATTACAGCAACTCAATAAAGATTTGGAAAACCGAGTCGAAAAACGCACCCAGCAACTTGCCGCCACCAATCAATCCCTAAGAATGGAAATCAGTGAGCGACAAAAAACGGAAGCCGCTCTCCGCCACACTAACCATACTCTGCAATCCCTGATTGCGGCCTCCCCCAGGGGTATTTTTACCCTTAATTTAGCAGACCAAATTCAGATTTGGAATCCTACAGCAGAACGTATTTTTGGTTGGACAGAAACAGAAATTATTGCCCATCCAGAATTATTAACATCCAACATTTTGCTGGAAGATTATCAGCAATTTAAACAGAAAGTTTTATCAGGCATGGTTTCCCCTAGCCTAGAATTAAAATGTCAAAAAAAAGATGGTAGTTGGATTGAAATTGTCCTTTCCGCTGCTCCCCTATTGGATAGTGAAGAAAATATTGCCGGATTGGTGGCGGTTGTCGCCGATATTACCGAGCAAAAGCGGCAGGCAGAACAAATTCGTTTGCTACAATCCGTTGTGGTTAATACTAATGATGCGGTGGTGATTACGGAAGCGGAGCCCATTGATGATCCCGGGCCGAGAATTCTCTATGTCAATGAAGCATTTACTAAAATCACCGGTTATACTGCTGAAGAAATGCTAGGCAAAACCCCCCGAGTTTTACAGGGACCAAAAACTAGTCGCACTGAATTAGATAGGGTGCGGCAAGCCATTAGTCAATGGCAATCAGTTACCGTTGAAGTGATTAATTATCGTAAGGATGGCAGTGAGTTTTGGGTGGAATTTAGTCTGGTGCCCGTTGCCAATAAAACAGGTTTTTACACCCATTGGATTGCTGTGCAAAGGGATGTCACTGAGCGCCGACGCACGGAGGAAGTCCGCCTAGCTTTAGAACGGGAAAAAGAATTAAGCCGCCTAAAAACTCGTTTTTTCTCCATGGCTTCCCATGAATTTCGTACTCCCCTCAGTACGGCCTTAGCTGCTGCCCAATTACTGGAAAATTCTGAAGTGGCCTGGCTTGATCCCGATAAGCGTAGCCGGAACTTACACCGTATTCAAAATTCCGTGAAAAATATGGTACAGCTCCTGGATGATATTTTAATCATTAACCGTGCCGAAGCGGGCAAATTGGAATTTAATCCTAATTGGTTAGATTTGAAATTATTGTTCCAGCAATTTATCGAAGAAATTCAATTAAGTGTCAGTGACCAATATTATTTTGACTTTATTTGTAGCGCTCAAGATACGAAGGCATTGGTGGATGAAAGGTTAGTGCGGTCTATTTTATCTAATCTGTTATCTAATGCGATTAAATACTCTCCCGGGGGAGGGCAGATTAAAATTGCCCTAAGCCTAGATTCGGAACAGATTATTTTTGAAGTCACCGACCAGGGCATTGGCATTTCGCCAGAGGACCAAAAGCAAATTTTTGAACCCTTTCATCGGGGCAAAAATGTCAGAAATATTACGGGAACAGGACTCGGTTTAATGGTTGCCAAGAAATGTGTTGACTTACACAGTGGCAGTATCTTGCTAAAAAGTGCAGTTGACCAGGGAACAACAGTTACTATCTGTTTAAAACGCTATAACCATTTGCCTCGAGCTTAG
【０２３０】
SEQ ID NO: 7 M:NLS: CcaS (Δ23 A92V); アミノ酸配列
MLQPKKKRKVGGRQNQERRRIEISIKQQTQRERFINQITQHIRQSLNLETVLNTTVAEVKTLLQVDRVLIYRIWQDGTGSVITESVNANYPSILGRTFSDEVFPVEYHQAYTKGKVRAINDIDQDDIEICLADFVKQFGVKSKLVVPILQHNRASSLDNESEFPYLWGLLITHQCAFTRPWQPWEVELMKQLANQVAIAIQQSELYEQLQQLNKDLENRVEKRTQQLAATNQSLRMEISERQKTEAALRHTNHTLQSLIAASPRGIFTLNLADQIQIWNPTAERIFGWTETEIIAHPELLTSNILLEDYQQFKQKVLSGMVSPSLELKCQKKDGSWIEIVLSAAPLLDSEENIAGLVAVVADITEQKRQAEQIRLLQSVVVNTNDAVVITEAEPIDDPGPRILYVNEAFTKITGYTAEEMLGKTPRVLQGPKTSRTELDRVRQAISQWQSVTVEVINYRKDGSEFWVEFSLVPVANKTGFYTHWIAVQRDVTERRRTEEVRLALEREKELSRLKTRFFSMASHEFRTPLSTALAAAQLLENSEVAWLDPDKRSRNLHRIQNSVKNMVQLLDDILIINRAEAGKLEFNPNWLDLKLLFQQFIEEIQLSVSDQYYFDFICSAQDTKALVDERLVRSILSNLLSNAIKYSPGGGQIKIALSLDSEQIIFEVTDQGIGISPEDQKQIFEPFHRGKNVRNITGTGLGLMVAKKCVDLHSGSILLKSAVDQGTTVTICLKRYNHLPRA
【０２３１】
SEQ ID NO: 8 M:NLS: CcaS (Δ23 A92V); 核酸配列
ATGTTACAACCAAAGAAGAAAAGGAAGGTGGGTGGAAGACAAAACCAAGAACGCCGCAGGATTGAAATTAGCATCAAGCAACAAACCCAACGGGAACGATTTATTAACCAAATTACCCAACATATCCGCCAATCTTTAAACTTGGAAACGGTTTTAAATACCACCGTCGCTGAAGTTAAAACCCTGTTGCAAGTTGATCGAGTTCTAATTTATCGCATTTGGCAAGATGGCACGGGCAGCGTCATTACGGAATCGGTGAATGCCAATTATCCTAGTATTTTAGGGCGGACCTTTTCCGATGAAGTTTTTCCCGTTGAATACCATCAAGCCTACACCAAAGGTAAAGTACGGGCCATTAATGACATTGACCAGGATGACATAGAGATTTGCCTAGCTGATTTCGTCAAACAATTTGGCGTGAAATCAAAATTAGTAGTGCCCATTCTTCAACATAATCGTGCTTCTTCCCTAGATAATGAATCAGAATTTCCCTATCTTTGGGGGCTGTTAATTACCCATCAATGTGCTTTTACCCGGCCATGGCAACCGTGGGAAGTGGAGTTAATGAAACAGCTAGCCAATCAGGTCGCGATCGCCATCCAACAATCGGAATTATATGAGCAATTACAGCAACTCAATAAAGATTTGGAAAACCGAGTCGAAAAACGCACCCAGCAACTTGCCGCCACCAATCAATCCCTAAGAATGGAAATCAGTGAGCGACAAAAAACGGAAGCCGCTCTCCGCCACACTAACCATACTCTGCAATCCCTGATTGCGGCCTCCCCCAGGGGTATTTTTACCCTTAATTTAGCAGACCAAATTCAGATTTGGAATCCTACAGCAGAACGTATTTTTGGTTGGACAGAAACAGAAATTATTGCCCATCCAGAATTATTAACATCCAACATTTTGCTGGAAGATTATCAGCAATTTAAACAGAAAGTTTTATCAGGCATGGTTTCCCCTAGCCTAGAATTAAAATGTCAAAAAAAAGATGGTAGTTGGATTGAAATTGTCCTTTCCGCTGCTCCCCTATTGGATAGTGAAGAAAATATTGCCGGATTGGTGGCGGTTGTCGCCGATATTACCGAGCAAAAGCGGCAGGCAGAACAAATTCGTTTGCTACAATCCGTTGTGGTTAATACTAATGATGCGGTGGTGATTACGGAAGCGGAGCCCATTGATGATCCCGGGCCGAGAATTCTCTATGTCAATGAAGCATTTACTAAAATCACCGGTTATACTGCTGAAGAAATGCTAGGCAAAACCCCCCGAGTTTTACAGGGACCAAAAACTAGTCGCACTGAATTAGATAGGGTGCGGCAAGCCATTAGTCAATGGCAATCAGTTACCGTTGAAGTGATTAATTATCGTAAGGATGGCAGTGAGTTTTGGGTGGAATTTAGTCTGGTGCCCGTTGCCAATAAAACAGGTTTTTACACCCATTGGATTGCTGTGCAAAGGGATGTCACTGAGCGCCGACGCACGGAGGAAGTCCGCCTAGCTTTAGAACGGGAAAAAGAATTAAGCCGCCTAAAAACTCGTTTTTTCTCCATGGCTTCCCATGAATTTCGTACTCCCCTCAGTACGGCCTTAGCTGCTGCCCAATTACTGGAAAATTCTGAAGTGGCCTGGCTTGATCCCGATAAGCGTAGCCGGAACTTACACCGTATTCAAAATTCCGTGAAAAATATGGTACAGCTCCTGGATGATATTTTAATCATTAACCGTGCCGAAGCGGGCAAATTGGAATTTAATCCTAATTGGTTAGATTTGAAATTATTGTTCCAGCAATTTATCGAAGAAATTCAATTAAGTGTCAGTGACCAATATTATTTTGACTTTATTTGTAGCGCTCAAGATACGAAGGCATTGGTGGATGAAAGGTTAGTGCGGTCTATTTTATCTAATCTGTTATCTAATGCGATTAAATACTCTCCCGGGGGAGGGCAGATTAAAATTGCCCTAAGCCTAGATTCGGAACAGATTATTTTTGAAGTCACCGACCAGGGCATTGGCATTTCGCCAGAGGACCAAAAGCAAATTTTTGAACCCTTTCATCGGGGCAAAAATGTCAGAAATATTACGGGAACAGGACTCGGTTTAATGGTTGCCAAGAAATGTGTTGACTTACACAGTGGCAGTATCTTGCTAAAAAGTGCAGTTGACCAGGGAACAACAGTTACTATCTGTTTAAAACGCTATAACCATTTGCCTCGAGCTTAG
【０２３２】
SEQ ID NO: 9 MM:NLS: CcaS (Δ23): F2A30 (aa1-29) アミノ酸配列
MMLQPKKKRKVGGRQNQERRRIEISIKQQTQRERFINQITQHIRQSLNLETVLNTTVAEVKTLLQVDRVLIYRIWQDGTGSAITESVNANYPSILGRTFSDEVFPVEYHQAYTKGKVRAINDIDQDDIEICLADFVKQFGVKSKLVVPILQHNRASSLDNESEFPYLWGLLITHQCAFTRPWQPWEVELMKQLANQVAIAIQQSELYEQLQQLNKDLENRVEKRTQQLAATNQSLRMEISERQKTEAALRHTNHTLQSLIAASPRGIFTLNLADQIQIWNPTAERIFGWTETEIIAHPELLTSNILLEDYQQFKQKVLSGMVSPSLELKCQKKDGSWIEIVLSAAPLLDSEENIAGLVAVVADITEQKRQAEQIRLLQSVVVNTNDAVVITEAEPIDDPGPRILYVNEAFTKITGYTAEEMLGKTPRVLQGPKTSRTELDRVRQAISQWQSVTVEVINYRKDGSEFWVEFSLVPVANKTGFYTHWIAVQRDVTERRRTEEVRLALEREKELSRLKTRFFSMASHEFRTPLSTALAAAQLLENSEVAWLDPDKRSRNLHRIQNSVKNMVQLLDDILIINRAEAGKLEFNPNWLDLKLLFQQFIEEIQLSVSDQYYFDFICSAQDTKALVDERLVRSILSNLLSNAIKYSPGGGQIKIALSLDSEQIIFEVTDQGIGISPEDQKQIFEPFHRGKNVRNITGTGLGLMVAKKCVDLHSGSILLKSAVDQGTTVTICLKRYNHLPRA
【０２３３】
SEQ ID NO: 10 MM:NLS: CcaS (Δ23): F2A30 (aa1-29) 核酸配列
ATGATGTTACAACCAAAGAAGAAAAGGAAGGTGGGTGGAAGACAGAACCAAGAACGAAGAAGAATAGAAATAAGTATCAAGCAGCAGACACAACGTGAGAGGTTTATCAACCAAATCACACAGCATATCAGACAATCTCTTAATTTGGAGACTGTTTTGAACACTACAGTTGCTGAAGTTAAGACACTTTTGCAGGTTGATAGAGTTCTTATCTATAGAATCTGGCAAGATGGTACAGGATCTGCTATCACTGAGTCTGTTAATGCTAACTACCCTTCTATTTTGGGTAGAACTTTTTCTGATGAGGTTTTCCCAGTTGAATATCATCAAGCTTACACAAAGGGAAAAGTTAGAGCTATTAATGATATCGATCAGGATGATATCGAAATCTGTCTTGCTGATTTCGTTAAACAATTCGGTGTTAAGTCTAAACTTGTTGTTCCTATCTTGCAGCATAATAGAGCTTCTTCTTTGGATAACGAATCTGAGTTTCCATATCTTTGGGGACTTTTGATTACACATCAGTGTGCTTTCACTAGACCTTGGCAACCTTGGGAAGTTGAGCTTATGAAGCAGTTGGCTAACCAAGTTGCTATTGCTATCCAACAGTCTGAGTTGTACGAACAACTTCAACAGTTGAATAAGGATCTTGAGAACAGAGTTGAAAAAAGAACACAACAGTTGGCTGCTACTAATCAGTCTCTTAGGATGGAAATCTCTGAAAGACAAAAGACTGAGGCTGCTTTGAGACATACTAACCATACACTTCAGTCTTTGATTGCTGCTTCTCCTAGAGGTATCTTTACTCTTAATTTGGCTGATCAAATTCAGATCTGGAACCCAACAGCTGAGCGAATCTTCGGATGGACTGAAACAGAGATTATCGCTCATCCTGAGCTTTTGACATCTAACATCCTTTTGGAAGATTACCAACAGTTTAAGCAAAAGGTTCTTTCTGGTATGGTTTCTCCATCTCTTGAGTTGAAGTGTCAGAAGAAAGATGGATCTTGGATTGAAATCGTTTTGTCTGCTGCTCCTCTTTTGGATTCTGAAGAGAACATTGCTGGTCTTGTTGCTGTTGTTGCTGATATCACTGAGCAAAAAAGACAGGCTGAACAAATCAGACTTTTGCAATCTGTTGTTGTTAACACAAACGATGCTGTTGTTATTACTGAAGCTGAACCAATCGATGATCCTGGACCAAGAATCCTTTATGTTAATGAGGCTTTCACTAAGATCACAGGATACACTGCTGAAGAGATGTTGGGAAAGACTCCTAGAGTTCTTCAAGGACCAAAAACTTCAAGAACTGAGTTGGATAGAGTTAGACAGGCTATCTCTCAATGGCAGTCTGTTACAGTTGAAGTTATTAATTACAGAAAGGATGGTTCTGAGTTTTGGGTTGAATTTTCTCTTGTTCCTGTTGCTAACAAAACAGGATTTTACACTCATTGGATTGCTGTTCAAAGAGATGTTACAGAGAGAAGAAGAACTGAAGAGGTTAGACTTGCTTTGGAAAGAGAGAAGGAACTTTCAAGATTGAAGACTAGATTTTTCTCTATGGCTTCTCATGAGTTTAGAACACCACTTTCTACTGCTTTGGCTGCTGCTCAACTTCTTGAAAATTCTGAAGTTGCTTGGCTTGATCCTGATAAGAGATCAAGAAACCTTCATAGAATCCAAAATTCTGTTAAAAACATGGTTCAACTTTTGGATGATATCTTGATTATCAACAGAGCTGAGGCTGGAAAGCTTGAGTTTAATCCAAACTGGCTTGATTTGAAGCTTTTGTTCCAACAGTTCATTGAAGAGATCCAGCTTTCTGTTTCTGATCAATACTACTTCGATTTCATCTGTTCTGCTCAAGATACTAAGGCTCTTGTTGATGAAAGATTGGTTAGATCTATCCTTTCTAATCTTTTGTCTAACGCTATCAAGTACTCTCCTGGAGGTGGACAGATTAAAATCGCTCTTTCTTTGGATTCTGAGCAGATTATCTTCGAAGTTACAGATCAAGGTATTGGAATCTCTCCTGAGGATCAAAAGCAGATCTTTGAACCATTCCATAGAGGAAAGAATGTTAGAAACATTACTGGTACAGGACTTGGTTTGATGGTTGCTAAGAAATGTGTTGATCTTCATTCTGGATCTATCCTTTTGAAGTCTGCTGTGGATCAAGGAACAACTGTGACCATCTGTCTCAAAAGGTACAACCATCTCCCAAGGGCT
【０２３４】
SEQ ID NO: 11 MM:NLS: CcaS (Δ23 A92V): F2A30 (aa1-29) アミノ酸配列
MMLQPKKKRKVGGRQNQERRRIEISIKQQTQRERFINQITQHIRQSLNLETVLNTTVAEVKTLLQVDRVLIYRIWQDGTGSVITESVNANYPSILGRTFSDEVFPVEYHQAYTKGKVRAINDIDQDDIEICLADFVKQFGVKSKLVVPILQHNRASSLDNESEFPYLWGLLITHQCAFTRPWQPWEVELMKQLANQVAIAIQQSELYEQLQQLNKDLENRVEKRTQQLAATNQSLRMEISERQKTEAALRHTNHTLQSLIAASPRGIFTLNLADQIQIWNPTAERIFGWTETEIIAHPELLTSNILLEDYQQFKQKVLSGMVSPSLELKCQKKDGSWIEIVLSAAPLLDSEENIAGLVAVVADITEQKRQAEQIRLLQSVVVNTNDAVVITEAEPIDDPGPRILYVNEAFTKITGYTAEEMLGKTPRVLQGPKTSRTELDRVRQAISQWQSVTVEVINYRKDGSEFWVEFSLVPVANKTGFYTHWIAVQRDVTERRRTEEVRLALEREKELSRLKTRFFSMASHEFRTPLSTALAAAQLLENSEVAWLDPDKRSRNLHRIQNSVKNMVQLLDDILIINRAEAGKLEFNPNWLDLKLLFQQFIEEIQLSVSDQYYFDFICSAQDTKALVDERLVRSILSNLLSNAIKYSPGGGQIKIALSLDSEQIIFEVTDQGIGISPEDQKQIFEPFHRGKNVRNITGTGLGLMVAKKCVDLHSGSILLKSAVDQGTTVTICLKRYNHLPRA
【０２３５】
SEQ ID NO: 12 MM:NLS: CcaS (Δ23 A92V): F2A30 (aa1-29) 核酸配列
ATGATGTTACAACCAAAGAAGAAAAGGAAGGTGGGTGGAAGACAGAACCAAGAACGAAGAAGAATAGAAATAAGTATCAAGCAGCAGACACAACGTGAGAGGTTTATCAACCAAATCACACAGCATATCAGACAATCTCTTAATTTGGAGACTGTTTTGAACACTACAGTTGCTGAAGTTAAGACACTTTTGCAGGTTGATAGAGTTCTTATCTATAGAATCTGGCAAGATGGTACAGGATCTGTTATCACTGAGTCTGTTAATGCTAACTACCCTTCTATTTTGGGTAGAACTTTTTCTGATGAGGTTTTCCCAGTTGAATATCATCAAGCTTACACAAAGGGAAAAGTTAGAGCTATTAATGATATCGATCAGGATGATATCGAAATCTGTCTTGCTGATTTCGTTAAACAATTCGGTGTTAAGTCTAAACTTGTTGTTCCTATCTTGCAGCATAATAGAGCTTCTTCTTTGGATAACGAATCTGAGTTTCCATATCTTTGGGGACTTTTGATTACACATCAGTGTGCTTTCACTAGACCTTGGCAACCTTGGGAAGTTGAGCTTATGAAGCAGTTGGCTAACCAAGTTGCTATTGCTATCCAACAGTCTGAGTTGTACGAACAACTTCAACAGTTGAATAAGGATCTTGAGAACAGAGTTGAAAAAAGAACACAACAGTTGGCTGCTACTAATCAGTCTCTTAGGATGGAAATCTCTGAAAGACAAAAGACTGAGGCTGCTTTGAGACATACTAACCATACACTTCAGTCTTTGATTGCTGCTTCTCCTAGAGGTATCTTTACTCTTAATTTGGCTGATCAAATTCAGATCTGGAACCCAACAGCTGAGCGAATCTTCGGATGGACTGAAACAGAGATTATCGCTCATCCTGAGCTTTTGACATCTAACATCCTTTTGGAAGATTACCAACAGTTTAAGCAAAAGGTTCTTTCTGGTATGGTTTCTCCATCTCTTGAGTTGAAGTGTCAGAAGAAAGATGGATCTTGGATTGAAATCGTTTTGTCTGCTGCTCCTCTTTTGGATTCTGAAGAGAACATTGCTGGTCTTGTTGCTGTTGTTGCTGATATCACTGAGCAAAAAAGACAGGCTGAACAAATCAGACTTTTGCAATCTGTTGTTGTTAACACAAACGATGCTGTTGTTATTACTGAAGCTGAACCAATCGATGATCCTGGACCAAGAATCCTTTATGTTAATGAGGCTTTCACTAAGATCACAGGATACACTGCTGAAGAGATGTTGGGAAAGACTCCTAGAGTTCTTCAAGGACCAAAAACTTCAAGAACTGAGTTGGATAGAGTTAGACAGGCTATCTCTCAATGGCAGTCTGTTACAGTTGAAGTTATTAATTACAGAAAGGATGGTTCTGAGTTTTGGGTTGAATTTTCTCTTGTTCCTGTTGCTAACAAAACAGGATTTTACACTCATTGGATTGCTGTTCAAAGAGATGTTACAGAGAGAAGAAGAACTGAAGAGGTTAGACTTGCTTTGGAAAGAGAGAAGGAACTTTCAAGATTGAAGACTAGATTTTTCTCTATGGCTTCTCATGAGTTTAGAACACCACTTTCTACTGCTTTGGCTGCTGCTCAACTTCTTGAAAATTCTGAAGTTGCTTGGCTTGATCCTGATAAGAGATCAAGAAACCTTCATAGAATCCAAAATTCTGTTAAAAACATGGTTCAACTTTTGGATGATATCTTGATTATCAACAGAGCTGAGGCTGGAAAGCTTGAGTTTAATCCAAACTGGCTTGATTTGAAGCTTTTGTTCCAACAGTTCATTGAAGAGATCCAGCTTTCTGTTTCTGATCAATACTACTTCGATTTCATCTGTTCTGCTCAAGATACTAAGGCTCTTGTTGATGAAAGATTGGTTAGATCTATCCTTTCTAATCTTTTGTCTAACGCTATCAAGTACTCTCCTGGAGGTGGACAGATTAAAATCGCTCTTTCTTTGGATTCTGAGCAGATTATCTTCGAAGTTACAGATCAAGGTATTGGAATCTCTCCTGAGGATCAAAAGCAGATCTTTGAACCATTCCATAGAGGAAAGAATGTTAGAAACATTACTGGTACAGGACTTGGTTTGATGGTTGCTAAGAAATGTGTTGATCTTCATTCTGGATCTATCCTTTTGAAGTCTGCTGTGGATCAAGGAACAACTGTGACCATCTGTCTCAAAAGGTACAACCATCTCCCAAGGGCT
【０２３６】
CcaRバリアント
【０２３７】
SEQ ID NO: 13: F2A30(aa30):NLS:2xGGS:VP64:4xGGS:CcaR アミノ酸
PGSLQPKKKRKVGGGGSGGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGGSGGSGGSGGSMRILLVEDDLPLAETLAEALSDQLYTVDIATDASLAWDYASRLEYDLVILDVMLPELDGITLCQKWRSHSYLMPILMMTARDTINDKITGLDAGADDYVVKPVDLGELFARVRALLRRGCATCQPVLEWGPIRLDPSTYEVSYDNEVLSLTRKEYSILELLLRNGRRVLSRSMIIDSIWKLESPPEEDTVKVHVRSLRQKLKSAGLSADAIETVHGIGYRLANLTEKSLCQGKN
【０２３８】
SEQ ID NO: 14: F2A30(aa30):NLS:2xGGS:VP64:4xGGS:CcaR 核酸
CCAGGTTCACTCCAGCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTTGGAGGTGGTGGCTCCGGAGGCTCTGATGCCCTCGACGATTTCGACCTCGATATGCTCGGTTCTGATGCTCTCGATGACTTTGACCTTGACATGCTTGGATCAGACGCTTTGGACGACTTCGACTTGGACATGTTGGGATCTGATGCACTTGATGATTTTGACCTTGATATGCTTGGTGGTTCAGGAGGGTCTGGTGGATCAGGAGGATCTATGAGAATACTCCTCGTGGAAGATGATTTGCCATTAGCAGAAACCCTCGCAGAAGCTTTGTCTGATCAACTTTACACTGTTGATATTGCTACAGATGCTTCTTTGGCTTGGGATTATGCTTCTAGACTTGAATACGATTTGGTTATTCTTGATGTTATGTTGCCTGAGCTTGATGGAATTACTCTTTGTCAGAAGTGGAGATCTCATTCTTATTTGATGCCAATCCTTATGATGACTGCTAGAGATACAATTAATGATAAGATCACAGGACTTGATGCTGGTGCTGATGATTACGTTGTTAAACCTGTTGATTTGGGTGAACTTTTTGCTAGAGTTAGAGCTCTTTTGAGAAGAGGATGTGCTACTTGTCAACCAGTTTTGGAGTGGGGTCCTATTAGACTTGATCCATCTACTTATGAAGTTTCTTACGATAATGAGGTTTTGTCTCTTACAAGAAAGGAATACTCTATCTTGGAGCTTTTGCTTAGAAACGGAAGAAGAGTTCTTTCTAGATCTATGATCATCGATTCTATCTGGAAGTTGGAGTCTCCTCCAGAAGAGGATACAGTTAAAGTTCATGTTAGATCTTTGAGACAAAAGCTTAAGTCTGCTGGACTTTCTGCTGATGCTATTGAAACTGTTCATGGAATCGGTTACAGATTGGCTAATCTTACAGAGAAGTCTTTGTGTCAGGGAAAGAAT
【０２３９】
SEQ ID NO: 15: F2A30(aa30):CcaR:4xGSS:VP64:2xGGS:NLS アミノ酸
PMRILLVEDDLPLAETLAEALSDQLYTVDIATDASLAWDYASRLEYDLVILDVMLPELDGITLCQKWRSHSYLMPILMMTARDTINDKITGLDAGADDYVVKPVDLGELFARVRALLRRGCATCQPVLEWGPIRLDPSTYEVSYDNEVLSLTRKEYSILELLLRNGRRVLSRSMIIDSIWKLESPPEEDTVKVHVRSLRQKLKSAGLSADAIETVHGIGYRLANLTEKSLCQGKNGGSGGSGGSGGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGGSGGSLQPKKKRKVGG
【０２４０】
SEQ ID NO: 16: F2A30(aa30):CcaR:4xGSS:VP64:2xGGS:NLS 核酸
CCAATGAGAATACTCCTCGTGGAAGATGATTTGCCATTAGCAGAAACCCTCGCAGAAGCTTTGTCTGATCAACTTTACACTGTTGATATTGCTACAGATGCTTCTTTGGCTTGGGATTATGCTTCTAGACTTGAATACGATTTGGTTATTCTTGATGTTATGTTGCCTGAGCTTGATGGAATTACTCTTTGTCAGAAGTGGAGATCTCATTCTTATTTGATGCCAATCCTTATGATGACTGCTAGAGATACAATTAATGATAAGATCACAGGACTTGATGCTGGTGCTGATGATTACGTTGTTAAACCTGTTGATTTGGGTGAACTTTTTGCTAGAGTTAGAGCTCTTTTGAGAAGAGGATGTGCTACTTGTCAACCAGTTTTGGAGTGGGGTCCTATTAGACTTGATCCATCTACTTATGAAGTTTCTTACGATAATGAGGTTTTGTCTCTTACAAGAAAGGAATACTCTATCTTGGAGCTTTTGCTTAGAAACGGAAGAAGAGTTCTTTCTAGATCTATGATCATCGATTCTATCTGGAAGTTGGAGTCTCCTCCAGAAGAGGATACAGTTAAAGTTCATGTTAGATCTTTGAGACAAAAGCTTAAGTCTGCTGGACTTTCTGCTGATGCTATTGAAACTGTTCATGGAATCGGTTACAGATTGGCTAATCTTACAGAGAAGTCTTTGTGTCAGGGAAAGAATGGAGGCTCCGGTGGGTCAGGTGGTTCTGGAGGCTCGGATGCCCTCGACGATTTCGACCTCGATATGCTCGGTTCTGATGCTCTCGATGACTTTGACCTTGACATGCTTGGATCAGACGCTTTGGACGACTTCGACTTGGACATGTTGGGATCTGATGCACTTGATGATTTTGACCTTGATATGCTTGGCGGTTCCGGTGGATCACTCCAGCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTTGGAGGT
【０２４１】
合成植物プロモーターおよび同族転写アクティベーター
【０２４２】
SEQ ID NO: 17: CTTTCCGATTTCTTTACGATTTCCGCTTTCCGATTTCTTTACGATTTGGCTTTCCGATTTCTTTACGATTTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGA
【０２４３】
SEQ ID NO: 40; ccaR CREモチーフ
CTTTCCGATTTCTTTACGATTT
【０２４４】
SEQ ID NO: 41; P35Smin(-51) 
CTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGA) 
【０２４５】
SEQ ID NO: 42: ターミネーター配列 (Trbcs)
AGCTTTCGTTCGTATCATCGGTTTCGACAACGTTCGTCAAGTTCAATGCATCAGTTTCATTGCGCACACACCAGAATCCTACTGAGTTtGAGTATTATGGCATTGGGAAAacTGTTTTTCTTGTACCATTTGTTGTGCTTGTAATTTACTGTGTTTTTTATTCGGTTTTCGCTATCGAACTGTGAAATGGAAATGGATGGAGAAGAGTTAATGAATGATATGGTCCTTTTGTTCATTCTCAAATTAATATTATTTGTTTTTTCTCTTATTTGTTGTGTGTTGAATTTGAAAtTATAAGAGATATGCAAACATTTTGTTTTGAGTAAAAATGTGTCAAATCGTGGCCTCTAATGACCGAAGTTAATATGAGGAGTAAAACACTTGTAGTTGTACCATTATGCTTATTCACTAGGCAACAAATATATTTTCAGACCTAGAAAAGCTGCAAATGTTACTGAATACAAGTATGTCCTCTTGTGTTTTAGACATTTATGAACTTTCCTTTATGTAATTTTCCAGAATCCTTGTCAGATTCTAATCATTGCTTTATAATTATAGTTATACTCATGGATTTGTAGTTGAGTATGAAAATATTTTTTAATGCATTTTATGACTTGCCAATTGATTGACAACATGCATCAaTCG
【０２４６】
SEQ ID NO: 43: ターミネーター配列 (NOSターミネーター):
TAGAGTAGATGCCGACCGAACAAGAGCTGATTTCGAGAACGCCTCAGCCAGCAACTCGCGCGAGCCTAGCAAGGCAAATGCGAGAGAACGGCCTTACGCTTGGTGGCACAGTTCTCGTCCACAGTTCGCTAAGCTCGCTCGGCTGGGTCGCGGGAGGGCCGGTCGCAGTGATTCAGGAATTAATTCCCTAGAGTCAAGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGACCGGCATGCAAGCTGAT
【０２４７】
SEQ ID NO: 44 UBQ10プロモーター
ACCCGACGAGtCAGTAATAAACGGCGTCAAAGTGGTTGCAGCCGGCACACACGAGTCGTGTTTATCAACTCAAAGCACAAATACTTTTCCTCAACCTAAAAATAAGGCAATTAGCCAAAAACAACTTTGCGTGTAAACAACGCTCAATACACGTGTCATTTTATTATTAGCTATTGCTTCACCGCCTTAGCTTTCTCGTGACCTAGTCGTCCTCGTCTTTTCTTCTTCTTCTTCTATAAAACAATACCCAAAGAGCTCTTCTTCTTCACAATTCAGATTTCAATTTCTCAAAATCTTAAAAACTTTCTCTCAATTCTCTCTACCGTGATCAAGGTAAATTTCTGTGTTCCTTATTCTCTCAAAATCTTCGATTTTGTTTTCGTTCGATCCCAATTTCGTATATGTTCTTTGGTTTAGATTCTGTTAATCTTAGATCGAAGACGATTTTCTGGGTTTGATCGTTAGATATCATCTTAATTCTCGATTAGGGTTTCATAGATATCATCCGATTTGTTCAAATAATTTGAGTTTTGTCGAATAATTACTCTTCGATTTGTGATTTCTATCTAGATCTGGTGTTAGTTTCTAGTTTGTGCGATCGAATTTGTAGATTAATCTGAGTTTTTCTGATTAACAGCTCGAGTGCGGGATC
【０２４８】
SEQ ID NO: 47 LRHK1-01核酸配列
ATGATGTTACAACCAAAGAAGAAAAGGAAGGTGGGTGGAAGACAAAACCAAGAACGCCGCAGGATTGAAATTAGCATCAAGCAACAAACCCAACGGGAACGATTTATTAACCAAATTACCCAACATATCCGCCAATCTTTAAACTTGGAAACGGTTTTAAATACCACCGTCGCTGAAGTTAAAACCCTGTTGCAAGTTGATCGAGTTGCCGTGTACCGTTTTAACCCGGATTGGAGCGGCGAGTTTGTGGCCGAAAGCGTGGGTAGCGGTTGGGTGAAACTGGTGGGCCCGGATATCAAAACCGTGTGGGAAGACACACATCTGCAAGAAACCCAAGGTGGTCGCTATCGCCATCAAGAAAGCTTCGTGGTGAACGACATTTATGAGGCCGGCCATTTCAGCTGCCATCTGGAGATTTTAGAACAGTTTGAAATTAAAGCCTACATTATCGTGCCGGTTTTTGCCGCCGAAAAACTGTGGGGTTTACTGGCCGCCTATCAGAACAGTGGTACCCGCGAATGGGTGGAATGGGAAAGCAGCTTTCTGACCCAAGTTGGTCTGCAGTTCGGCATCGCCATCCAACAATCGGAATTATATGAGCAATTACAGCAACTCAATAAAGATTTGGAAAACCGAGTCGAAAAACGCACCCAGCAACTTGCCGCCACCAATCAATCCCTAAGAATGGAAATCAGTGAGCGACAAAAAACGGAAGCCGCTCTCCGCCACACTAACCATACTCTGCAATCCCTGATTGCGGCCTCCCCCAGGGGTATTTTTACCCTTAATTTAGCAGACCAAATTCAGATTTGGAATCCTACAGCAGAACGTATTTTTGGTTGGACAGAAACAGAAATTATTGCCCATCCAGAATTATTAACATCCAACATTTTGCTGGAAGATTATCAGCAATTTAAACAGAAAGTTTTATCAGGCATGGTTTCCCCTAGCCTAGAATTAAAATGTCAAAAAAAAGATGGTAGTTGGATTGAAATTGTCCTTTCCGCTGCTCCCCTATTGGATAGTGAAGAAAATATTGCCGGATTGGTGGCGGTTGTCGCCGATATTACCGAGCAAAAGCGGCAGGCAGAACAAATTCGTTTGCTACAATCCGTTGTGGTTAATACTAATGATGCGGTGGTGATTACGGAAGCGGAGCCCATTGATGATCCCGGGCCGAGAATTCTCTATGTCAATGAAGCATTTACTAAAATCACCGGTTATACTGCTGAAGAAATGCTAGGCAAAACCCCCCGAGTTTTACAGGGACCAAAAACTAGTCGCACTGAATTAGATAGGGTGCGGCAAGCCATTAGTCAATGGCAATCAGTTACCGTTGAAGTGATTAATTATCGTAAGGATGGCAGTGAGTTTTGGGTGGAATTTAGTCTGGTGCCCGTTGCCAATAAAACAGGTTTTTACACCCATTGGATTGCTGTGCAAAGGGATGTCACTGAGCGCCGACGCACGGAGGAAGTCCGCCTAGCTTTAGAACGGGAAAAAGAATTAAGCCGCCTAAAAACTCGTTTTTTCTCCATGGCTTCCCATGAATTTCGTACTCCCCTCAGTACGGCCTTAGCTGCTGCCCAATTACTGGAAAATTCTGAAGTGGCCTGGCTTGATCCCGATAAGCGTAGCCGGAACTTACACCGTATTCAAAATTCCGTGAAAAATATGGTACAGCTCCTGGATGATATTTTAATCATTAACCGTGCCGAAGCGGGCAAATTGGAATTTAATCCTAATTGGTTAGATTTGAAATTATTGTTCCAGCAATTTATCGAAGAAATTCAATTAAGTGTCAGTGACCAATATTATTTTGACTTTATTTGTAGCGCTCAAGATACGAAGGCATTGGTGGATGAAAGGTTAGTGCGGTCTATTTTATCTAATCTGTTATCTAATGCGATTAAATACTCTCCCGGGGGAGGGCAGATTAAAATTGCCCTAAGCCTAGATTCGGAACAGATTATTTTTGAAGTCACCGACCAGGGCATTGGCATTTCGCCAGAGGACCAAAAGCAAATTTTTGAACCCTTTCATCGGGGCAAAAATGTCAGAAATATTACGGGAACAGGACTCGGTTTAATGGTTGCCAAGAAATGTGTTGACTTACACAGTGGCAGTATCTTGCTAAAAAGTGCAGTTGACCAGGGAACAACAGTTACTATCTGTTTAAAACGCTATAACCATTTGCCTCGAGCTCACAAACAGAAAATTGTGGCACCGGTGAAGCAGACTCTCAACTTTGACTTGCTAAAGTTAGCTGGTGATGTTGAATCTAATCCTGGA
【０２４９】
SEQ ID NO: 48 LRHK1-05核酸配列
ATGATGTTACAACCAAAGAAGAAAAGGAAGGTGGGTGGAAGACAAAACCAAGAACGCCGCAGGATTGAAATTAGCATCAAGCAACAAACCCAACGGGAACGATTTATTAACCAAATTACCCAACATATCCGCCAATCTTTAAACTTGGAAACGGTTTTAAATACCACCGTCGCTGAAGTTAAAACCCTGTTGCAAGTTGATCGAGTTCTGGTGTATCGCTTTAACCCGGATTGGAGCGGCGAGTTTATCCATGAAAGCGTGGCCCAGATGTGGGAACCGCTGAAGGATCTGCAGAACAACTTTCCGCTGTGGCAAGATACCTATTTACAAGAAAATGAGGGTGGCCGCTACCGCAATCATGAAAGTCTGGCCGTGGGCGATGTGGAAACCGCCGGTTTCACCGATTGCCATTTAGATAATCTGCGTCGCTTCGAAATTCGCGCCTTTCTGACCGTGCCGGTTTTTGTTGGTGAACAGCTGTGGGGTCTGCTGGGCGCCTATCAGAATGGTGCACCGCGCCATTGGCAAGCTCGCGAAATTCATCTGCTGCACCAGATCGCCAACCAGCTGGGTATCGCCATCCAACAATCGGAATTATATGAGCAATTACAGCAACTCAATAAAGATTTGGAAAACCGAGTCGAAAAACGCACCCAGCAACTTGCCGCCACCAATCAATCCCTAAGAATGGAAATCAGTGAGCGACAAAAAACGGAAGCCGCTCTCCGCCACACTAACCATACTCTGCAATCCCTGATTGCGGCCTCCCCCAGGGGTATTTTTACCCTTAATTTAGCAGACCAAATTCAGATTTGGAATCCTACAGCAGAACGTATTTTTGGTTGGACAGAAACAGAAATTATTGCCCATCCAGAATTATTAACATCCAACATTTTGCTGGAAGATTATCAGCAATTTAAACAGAAAGTTTTATCAGGCATGGTTTCCCCTAGCCTAGAATTAAAATGTCAAAAAAAAGATGGTAGTTGGATTGAAATTGTCCTTTCCGCTGCTCCCCTATTGGATAGTGAAGAAAATATTGCCGGATTGGTGGCGGTTGTCGCCGATATTACCGAGCAAAAGCGGCAGGCAGAACAAATTCGTTTGCTACAATCCGTTGTGGTTAATACTAATGATGCGGTGGTGATTACGGAAGCGGAGCCCATTGATGATCCCGGGCCGAGAATTCTCTATGTCAATGAAGCATTTACTAAAATCACCGGTTATACTGCTGAAGAAATGCTAGGCAAAACCCCCCGAGTTTTACAGGGACCAAAAACTAGTCGCACTGAATTAGATAGGGTGCGGCAAGCCATTAGTCAATGGCAATCAGTTACCGTTGAAGTGATTAATTATCGTAAGGATGGCAGTGAGTTTTGGGTGGAATTTAGTCTGGTGCCCGTTGCCAATAAAACAGGTTTTTACACCCATTGGATTGCTGTGCAAAGGGATGTCACTGAGCGCCGACGCACGGAGGAAGTCCGCCTAGCTTTAGAACGGGAAAAAGAATTAAGCCGCCTAAAAACTCGTTTTTTCTCCATGGCTTCCCATGAATTTCGTACTCCCCTCAGTACGGCCTTAGCTGCTGCCCAATTACTGGAAAATTCTGAAGTGGCCTGGCTTGATCCCGATAAGCGTAGCCGGAACTTACACCGTATTCAAAATTCCGTGAAAAATATGGTACAGCTCCTGGATGATATTTTAATCATTAACCGTGCCGAAGCGGGCAAATTGGAATTTAATCCTAATTGGTTAGATTTGAAATTATTGTTCCAGCAATTTATCGAAGAAATTCAATTAAGTGTCAGTGACCAATATTATTTTGACTTTATTTGTAGCGCTCAAGATACGAAGGCATTGGTGGATGAAAGGTTAGTGCGGTCTATTTTATCTAATCTGTTATCTAATGCGATTAAATACTCTCCCGGGGGAGGGCAGATTAAAATTGCCCTAAGCCTAGATTCGGAACAGATTATTTTTGAAGTCACCGACCAGGGCATTGGCATTTCGCCAGAGGACCAAAAGCAAATTTTTGAACCCTTTCATCGGGGCAAAAATGTCAGAAATATTACGGGAACAGGACTCGGTTTAATGGTTGCCAAGAAATGTGTTGACTTACACAGTGGCAGTATCTTGCTAAAAAGTGCAGTTGACCAGGGAACAACAGTTACTATCTGTTTAAAACGCTATAACCATTTGCCTCGAGCTCACAAACAGAAAATTGTGGCACCGGTGAAGCAGACTCTCAACTTTGACTTGCTAAAGTTAGCTGGTGATGTTGAATCTAATCCTGGA
【０２５０】
SEQ ID NO: 49 LRHK1-10核酸配列
ATGATGTTACAACCAAAGAAGAAAAGGAAGGTGGGTGGAAGACAAAACCAAGAACGCCGCAGGATTGAAATTAGCATCAAGCAACAAACCCAACGGGAACGATTTATTAACCAAATTACCCAACATATCCGCCAATCTTTAAACTTGGAAACGGTTTTAAATACCACCGTCGCTGAAGTTAAAACCCTGTTGCAAGTTGATCGAGTTACCATTTATCGTTTTCGCGCCGATTGGAGCGGTGAATTTGTGGCCGAATCTTTAGCCCAAGGTTGGACACCGGTGCGTGAAATTGTGCCGGTGGTTGCCGATGACTATCTGCAAGAAACCCAAGGTCGCAACTTTGCCAATGGCAAAAGCATCGTGATTAAAGATATTTACAGCGCCAACTACAGCATCTGCCACATTGCACTGCTGGAACTGATGCAAGCTCGCGCCTATATGATCGTGCCGATCTTCCAAGGTGAAAAGCTGTGGGGTCTGCTGGCCGCCTATCAGAACATCAAGCCTCGCGATTGGCAAGAAGATGAGGTGGATCTGGTGATGCAGATCGGTACCCAGCTGGGCATCGCCATCCAACAATCGGAATTATATGAGCAATTACAGCAACTCAATAAAGATTTGGAAAACCGAGTCGAAAAACGCACCCAGCAACTTGCCGCCACCAATCAATCCCTAAGAATGGAAATCAGTGAGCGACAAAAAACGGAAGCCGCTCTCCGCCACACTAACCATACTCTGCAATCCCTGATTGCGGCCTCCCCCAGGGGTATTTTTACCCTTAATTTAGCAGACCAAATTCAGATTTGGAATCCTACAGCAGAACGTATTTTTGGTTGGACAGAAACAGAAATTATTGCCCATCCAGAATTATTAACATCCAACATTTTGCTGGAAGATTATCAGCAATTTAAACAGAAAGTTTTATCAGGCATGGTTTCCCCTAGCCTAGAATTAAAATGTCAAAAAAAAGATGGTAGTTGGATTGAAATTGTCCTTTCCGCTGCTCCCCTATTGGATAGTGAAGAAAATATTGCCGGATTGGTGGCGGTTGTCGCCGATATTACCGAGCAAAAGCGGCAGGCAGAACAAATTCGTTTGCTACAATCCGTTGTGGTTAATACTAATGATGCGGTGGTGATTACGGAAGCGGAGCCCATTGATGATCCCGGGCCGAGAATTCTCTATGTCAATGAAGCATTTACTAAAATCACCGGTTATACTGCTGAAGAAATGCTAGGCAAAACCCCCCGAGTTTTACAGGGACCAAAAACTAGTCGCACTGAATTAGATAGGGTGCGGCAAGCCATTAGTCAATGGCAATCAGTTACCGTTGAAGTGATTAATTATCGTAAGGATGGCAGTGAGTTTTGGGTGGAATTTAGTCTGGTGCCCGTTGCCAATAAAACAGGTTTTTACACCCATTGGATTGCTGTGCAAAGGGATGTCACTGAGCGCCGACGCACGGAGGAAGTCCGCCTAGCTTTAGAACGGGAAAAAGAATTAAGCCGCCTAAAAACTCGTTTTTTCTCCATGGCTTCCCATGAATTTCGTACTCCCCTCAGTACGGCCTTAGCTGCTGCCCAATTACTGGAAAATTCTGAAGTGGCCTGGCTTGATCCCGATAAGCGTAGCCGGAACTTACACCGTATTCAAAATTCCGTGAAAAATATGGTACAGCTCCTGGATGATATTTTAATCATTAACCGTGCCGAAGCGGGCAAATTGGAATTTAATCCTAATTGGTTAGATTTGAAATTATTGTTCCAGCAATTTATCGAAGAAATTCAATTAAGTGTCAGTGACCAATATTATTTTGACTTTATTTGTAGCGCTCAAGATACGAAGGCATTGGTGGATGAAAGGTTAGTGCGGTCTATTTTATCTAATCTGTTATCTAATGCGATTAAATACTCTCCCGGGGGAGGGCAGATTAAAATTGCCCTAAGCCTAGATTCGGAACAGATTATTTTTGAAGTCACCGACCAGGGCATTGGCATTTCGCCAGAGGACCAAAAGCAAATTTTTGAACCCTTTCATCGGGGCAAAAATGTCAGAAATATTACGGGAACAGGACTCGGTTTAATGGTTGCCAAGAAATGTGTTGACTTACACAGTGGCAGTATCTTGCTAAAAAGTGCAGTTGACCAGGGAACAACAGTTACTATCTGTTTAAAACGCTATAACCATTTGCCTCGAGCTCACAAACAGAAAATTGTGGCACCGGTGAAGCAGACTCTCAACTTTGACTTGCTAAAGTTAGCTGGTGATGTTGAATCTAATCCTGGA
【０２５１】
SEQ ID NO: 50 LRHK1-12核酸配列
ATGATGTTACAACCAAAGAAGAAAAGGAAGGTGGGTGGAAGACAAAACCAAGAACGCCGCAGGATTGAAATTAGCATCAAGCAACAAACCCAACGGGAACGATTTATTAACCAAATTACCCAACATATCCGCCAATCTTTAAACTTGGAAACGGTTTTAAATACCACCGTCGCTGAAGTTAAAACCCTGTTGCAAGTTGATCGAGTTGTTATTTTTCAGTTTTCACCCGACTCTGACTTTTCCGTTGGTAATATTGTGGCAGAGTCGGTATTGGCTCCATTTAAGCCAATCATTAATAGTGCAATTGAAGAAACTTGTTTTAGTAATAACTATGCCCAAAGGTATCAGCAGGGCAGAATTCAGGTCATTGAGGATATTCACCAGTCCCATCTTAGGCAATGCCACATTGACTTTCTTGCCAGGCTACAGGTCAGGGCAAACCTAGTGCTACCACTAATTAATGATGCCATTTTGTGGGGCTTATTGTGTATTCATCAATGTGACAGTTCTAGAGTTTGGGAACAAACAGAAATTGATCTGCTCAAGCAGATCACTAATCAGTTTGAAATCGCCATCCAACAATCGGAATTATATGAGCAATTACAGCAACTCAATAAAGATTTGGAAAACCGAGTCGAAAAACGCACCCAGCAACTTGCCGCCACCAATCAATCCCTAAGAATGGAAATCAGTGAGCGACAAAAAACGGAAGCCGCTCTCCGCCACACTAACCATACTCTGCAATCCCTGATTGCGGCCTCCCCCAGGGGTATTTTTACCCTTAATTTAGCAGACCAAATTCAGATTTGGAATCCTACAGCAGAACGTATTTTTGGTTGGACAGAAACAGAAATTATTGCCCATCCAGAATTATTAACATCCAACATTTTGCTGGAAGATTATCAGCAATTTAAACAGAAAGTTTTATCAGGCATGGTTTCCCCTAGCCTAGAATTAAAATGTCAAAAAAAAGATGGTAGTTGGATTGAAATTGTCCTTTCCGCTGCTCCCCTATTGGATAGTGAAGAAAATATTGCCGGATTGGTGGCGGTTGTCGCCGATATTACCGAGCAAAAGCGGCAGGCAGAACAAATTCGTTTGCTACAATCCGTTGTGGTTAATACTAATGATGCGGTGGTGATTACGGAAGCGGAGCCCATTGATGATCCCGGGCCGAGAATTCTCTATGTCAATGAAGCATTTACTAAAATCACCGGTTATACTGCTGAAGAAATGCTAGGCAAAACCCCCCGAGTTTTACAGGGACCAAAAACTAGTCGCACTGAATTAGATAGGGTGCGGCAAGCCATTAGTCAATGGCAATCAGTTACCGTTGAAGTGATTAATTATCGTAAGGATGGCAGTGAGTTTTGGGTGGAATTTAGTCTGGTGCCCGTTGCCAATAAAACAGGTTTTTACACCCATTGGATTGCTGTGCAAAGGGATGTCACTGAGCGCCGACGCACGGAGGAAGTCCGCCTAGCTTTAGAACGGGAAAAAGAATTAAGCCGCCTAAAAACTCGTTTTTTCTCCATGGCTTCCCATGAATTTCGTACTCCCCTCAGTACGGCCTTAGCTGCTGCCCAATTACTGGAAAATTCTGAAGTGGCCTGGCTTGATCCCGATAAGCGTAGCCGGAACTTACACCGTATTCAAAATTCCGTGAAAAATATGGTACAGCTCCTGGATGATATTTTAATCATTAACCGTGCCGAAGCGGGCAAATTGGAATTTAATCCTAATTGGTTAGATTTGAAATTATTGTTCCAGCAATTTATCGAAGAAATTCAATTAAGTGTCAGTGACCAATATTATTTTGACTTTATTTGTAGCGCTCAAGATACGAAGGCATTGGTGGATGAAAGGTTAGTGCGGTCTATTTTATCTAATCTGTTATCTAATGCGATTAAATACTCTCCCGGGGGAGGGCAGATTAAAATTGCCCTAAGCCTAGATTCGGAACAGATTATTTTTGAAGTCACCGACCAGGGCATTGGCATTTCGCCAGAGGACCAAAAGCAAATTTTTGAACCCTTTCATCGGGGCAAAAATGTCAGAAATATTACGGGAACAGGACTCGGTTTAATGGTTGCCAAGAAATGTGTTGACTTACACAGTGGCAGTATCTTGCTAAAAAGTGCAGTTGACCAGGGAACAACAGTTACTATCTGTTTAAAACGCTATAACCATTTGCCTCGAGCTCACAAACAGAAAATTGTGGCACCGGTGAAGCAGACTCTCAACTTTGACTTGCTAAAGTTAGCTGGTGATGTTGAATCTAATCCTGGA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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