(57)【要約】  本発明は、噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の組合せの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法であって、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の存在下でタンパク質を含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含み、該糖は二糖であり、１．０〜２０％ｗ／ｖの量で存在し、該１種又は複数種のアミノ酸は、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭの量で存在する、方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、抗体又はその断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖が、スクロース、トレハロース又はそれらの混合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アミノ酸が、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記糖が、スクロース又はトレハロースであり、前記アミノ酸が、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−リシン塩酸塩又はそれらの混合物である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
界面活性剤を更に含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート２０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法プロセスであって、
ａ．タンパク質、糖及び１種又は複数種のアミノ酸を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製された該タンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された該噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、該再構成時間ＲＴ１は、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短く、該糖は二糖であり、１．０〜２０％ｗ／ｖの量で存在し、該１種又は複数種のアミノ酸は、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭの量で存在する、プロセス。
【請求項９】
前記タンパク質が、抗体又はその断片である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記糖が、スクロース、トレハロース又はそれらの混合物である、請求項８又は９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記アミノ酸が、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物である、請求項８から１０までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記糖が、スクロース又はトレハロースであり、前記アミノ酸が、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−リシン塩酸塩又はそれらの混合物である、請求項８から１１までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
界面活性剤を更に含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む、請求項８から１２までのいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記界面活性剤が、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート２０である、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
請求項８から１４までのいずれか一項に記載のプロセスにより得られるタンパク質製剤。
【請求項１６】
治療又は診断における使用のための、請求項１５に記載のタンパク質製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、噴霧乾燥医薬製剤、及びその製造方法の分野に属する。より詳細には、本発明は、薬学的使用のための噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法、使用及びプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
静脈、筋肉又は皮下注射等のモノクローナル抗体の液体注射は、依然として、治療的用途のモノクローナル抗体の高い全身濃度を提供し得る最も好ましい投与経路である（Ｗａｎら、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ９（２）、ｅ１４１〜ｅ１４６．（２０１２）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｃ．Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０、２１１〜２１７（２０１４）；Ｍｏｒｏｚ，  Ｅ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０１、１０８〜１２１（２０１６））。皮下注射は、患者による自己投与が可能であり、患者の日々の生活に影響し、また全体的な処置費用を制限し得るため、上述の選択肢の好ましい経路である。しかしながら、ヒアルロニダーゼ促進皮下注入システム等の特化されたデバイス又は酵素的方法なしで皮下投与され得る体積は、約１．５〜２ｍｌと非常に限られており、高濃縮モノクローナル抗体製剤を投与する必要がある（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ，  Ｒ．Ｌ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３０（４）、９５１〜９５７（２０１２））。その結果、これらの製剤中の高濃度のモノクローナル抗体が、不可逆的凝集の関連リスクを伴うタンパク質自己相互作用の可能性を高め、これは、生成物の有効性の低下及び免疫原性応答のリスクの増大をもたらす（Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｃ．Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０、２１１〜２１７（２０１４）；Ｂａｒｎｅｔｔら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０７、２１〜２９（２０１５）；Ｍａｈｌｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９８（９）、２９０９〜２９３４（２００９））。
【０００３】
皮下注射用のモノクローナル抗体の製剤は、その液体形態の安定性が不十分である場合にはしばしば乾燥されるが、これは、水の除去がタンパク質立体配座の移動性を劇的に低減して小分子反応物質の輸送を制限し、その後タンパク質自己相互作用及び分解メカニズムの速度を低減し、したがって製剤の（保存）安定性を改善するためである（Ｃｉｃｅｒｏｎｅ，  Ｍ．Ｔ．ら、Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ８、２９８３〜２９９１（２０１２））。乾燥中の液体状態における、及び固体状態におけるタンパク質安定化のための様々なメカニズム及びモデルが、長年にわたり提案されている。
【０００４】
タンパク質製剤の乾燥は、多くの場合凍結乾燥により行われるが、これはタンパク質を高温に曝露するリスクがないためである。しかしながら、凍結乾燥の主な否定的側面は、凍結及び乾燥段階の両方において発生するストレスの量であり、これは活性の部分的又は完全な喪失をもたらす可能性がある。
【０００５】
しかしながら、タンパク質製剤の噴霧乾燥は、所望の形態、密度及び粉体流を有する粉末を生成する、迅速で、１ステップでカスタマイズ可能なプロセスである。噴霧乾燥は比較的高い温度を使用するが、溶媒蒸発中、及び短期間の噴霧乾燥プロセス中に液滴から熱が奪われる結果、タンパク質の熱曝露は最小限である。剪断ストレス、空気／液体界面への曝露、又は水和殻の喪失後の増大した熱ストレス等のストレス因子の影響を低減するために、また固体状態安定性を更に増大させるために、好適な賦形剤が添加される。
【０００６】
しかしながら、噴霧乾燥製剤は、粉末形態の他のタンパク質製剤と同様に、投与直前に通常は水中に再構成されなければならない。噴霧乾燥製剤の再構成は容易に達成され得るにもかかわらず、これが完了するのに要する時間は、噴霧乾燥前にタンパク質製剤に添加される賦形剤に依存して広範囲に変動し得る。
【０００７】
タンパク質安定性に対するこれらの賦形剤の影響を決定するために膨大な研究がなされており、その大多数は、皮下注射用の粉末ではなく吸入のための凍結乾燥又は噴霧乾燥に集中している。更に、噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間に影響し得る好適な賦形剤に関してはほとんど知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、当技術分野において、一度噴霧乾燥された後に許容され得る時間内に再構成される、皮下注射用の更に改善されたタンパク質製剤を提供する技術が、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の組合せにより噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法、プロセス及び使用を提供することにより、上で特定された必要性に対応する。
【００１０】
以下の特定の実施形態が、以降で番号付けされた通りに説明される。
【００１１】
実施形態１：噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法であって、方法は、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の存在下でタンパク質を含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含み、糖は二糖であり、１．０〜２０％ｗ／ｖの量で存在し、１種又は複数種のアミノ酸は、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭの量で存在する、方法。
【００１２】
実施形態２：タンパク質が、抗体又はその断片である、実施形態１に記載の方法。
【００１３】
実施形態３：糖が、スクロース、トレハロース又はそれらの混合物である、実施形態１又は実施形態２に記載の方法。
【００１４】
実施形態４：１種又は複数種のアミノ酸が、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物である、実施形態１から３までのいずれか１つに記載の方法。
【００１５】
実施形態５：糖が、スクロース又はトレハロースであり、アミノ酸が、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−リシン塩酸塩又はそれらの混合物である、実施形態１から４までのいずれか１つに記載の方法。
【００１６】
実施形態６：界面活性剤を更に含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む、実施形態１から５までのいずれか１つに記載の方法。
【００１７】
実施形態７：界面活性剤が、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート２０である、実施形態６に記載の方法。
【００１８】
実施形態８：噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスであって、
ａ．タンパク質、糖及び１種又は複数種のアミノ酸を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で、再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短く、糖は二糖であり、１．０〜２０％ｗ／ｖの量で存在し、１種又は複数種のアミノ酸は、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭの量で存在する、プロセス。
【００１９】
実施形態９：タンパク質が、抗体又はその断片である、実施形態８に記載のプロセス。
【００２０】
実施形態１０：糖が、スクロース、トレハロース又はそれらの混合物である、実施形態８又は９に記載のプロセス。
【００２１】
実施形態１１：アミノ酸が、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物である、実施形態８から１０までのいずれか１つに記載のプロセス。
【００２２】
実施形態１２：糖が、スクロース又はトレハロースであり、前記アミノ酸が、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−リシン塩酸塩又はそれらの混合物である、実施形態８から１１までのいずれか１つに記載のプロセス。
【００２３】
実施形態１３：方法が、界面活性剤を更に含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む、実施形態８から１２までのいずれか１つに記載のプロセス。
【００２４】
実施形態１４：界面活性剤が、ポリソルベート、好ましくはポリソルベート２０である、実施形態１３に記載のプロセス。
【００２５】
実施形態１５：実施形態８から１４までのいずれか１つに記載のプロセスにより得られるタンパク質製剤。
【００２６】
実施形態１６：治療又は診断における使用のための、実施形態１５に記載のタンパク質製剤。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】糖及びアミノ酸の組合せを含む製剤の再構成時間を示す図である。アミノ酸の組合せの効果を、２．５％スクロースのみと比較した。
【図２】ＤｏＥからの噴霧乾燥製剤の拡張パラメータ推定値のプロットを示す図である。５℃で保存された試料に対して測定された値（ｎ＝３）を使用して、モデルを計算した。白いバーは非有意パラメータを示し、０．０５レベルで統計的に有意なパラメータは、影付きのバーで示される。エラーバーは、推定パラメータのそれぞれの推定標準誤差を示す。切片推定値＝１８．６９±０．４５（ＳＥ）分。
【図３】ｍＡｂ１を含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。界面活性剤のみ（白いバー）に対し、選択されたアミノ酸及びスクロース及び界面活性剤（黒いバー）を含む製剤の再構成時間の比較である。
【図４】ｍＡｂ１を含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。スクロース及び単一のアミノ酸又はアミノ酸の組合せに対するスクロースのみの比較である。界面活性剤は存在しない。
【図５】ｍＡｂ１を含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。スクロース、界面活性剤及び単一のアミノ酸又はアミノ酸の組合せに対するスクロース及び界面活性剤のみの比較である。
【図６】ｍＡｂ１を含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。スクロース及び単一のアミノ酸又はアミノ酸の組合せに対するトレハロースのみの比較である。界面活性剤は存在しない。
【図７】ｍＡｂ１を含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。スクロース、界面活性剤及び単一のアミノ酸又はアミノ酸の組合せに対するトレハロース及び界面活性剤のみの比較である。
【図８】Ｆａｂ’−ＰＥＧ抗体を含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。増大濃度のグリシンと組み合わせたスクロースに対し、スクロースのみを有するＦａｂ’−ＰＥＧ抗体製剤の再構成時間に対する効果を示すグラフである。
【図９】Ｆａｂ’−ＰＥＧ抗体を含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。２．５％スクロースと組み合わせた１％の各種アミノ酸を有するＦａｂ’−ＰＥＧ抗体製剤の再構成時間に対する効果を示すグラフである。
【図１０】ｍＡｂ１、二糖及びアルギニンを含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。Ａ）アルギニンの濃度にかかわらないトレハロースの効果を示すグラフである。Ｂ）トレハロースの濃度にかかわらないアルギニンの効果を示すグラフである。Ｃ）アルギニン及びトレハロースの累積量の効果を示すグラフである。
【図１１】ｍＡｂ１、二糖及びグリシンを含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。Ａ）グリシンの濃度にかかわらないトレハロースの効果を示すグラフである。Ｂ）トレハロースの濃度にかかわらないグリシンの効果を示すグラフである。Ｃ）グリシン及びトレハロースの累積量の効果を示すグラフである。
【図１２】ｍＡｂ１、二糖及びリシンを含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。Ａ）リシンの濃度にかかわらないトレハロースの効果を示すグラフである。Ｂ）トレハロースの濃度にかかわらないリシンの効果を示すグラフである。Ｃ）リシン及びトレハロースの累積量の効果を示すグラフである。
【図１３】ｍＡｂ１、二糖及びプロリンを含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。Ａ）プロリンの濃度にかかわらないトレハロースの効果を示すグラフである。Ｂ）トレハロースの濃度にかかわらないプロリンの効果を示すグラフである。Ｃ）プロリン及びトレハロースの累積量の効果を示すグラフである。
【図１４】ｍＡｂ２を含む噴霧乾燥製剤の再構成時間を示す図である。２．５％トレハロースと組み合わせた１００ｍＭの各種アミノ酸を含むｍＡｂ２製剤の再構成時間に対する効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法は、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の存在下でタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む。
【００２９】
二糖及びＬ−アルギニン等のアミノ酸は、凍結乾燥中及び固体状態のタンパク質を安定化することが報告されている（Ｏｈｔａｋｅら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６３（１３）、１０５３〜１０７３（２０１１）；Ｋａｍｅｒｚｅｌｌら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６３（１３）、１１１８〜１１５９（２０１１）、並びにＢａｌｃａｏ及びＶｉｌａ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９３、２５〜４１（２０１５））。しかしながら、本明細書に記載のタンパク質を含む噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮し得る賦形剤及び方法に関する研究はなされていない。
【００３０】
したがって、本発明はまた、噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための、１種又は複数種のアミノ酸と、糖、例えば二糖、好ましくはスクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物との組合せの使用を提供する。
【００３１】
別の態様において、本発明はまた、噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスを提供し、プロセスは、
ａ．タンパク質、糖及び１種又は複数種のアミノ酸を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短い。
【００３２】
「〜の存在下」という用語は、本明細書において使用される場合、糖及び１種又は複数種のアミノ酸が、タンパク質製剤を噴霧乾燥する前からその製剤の一部であることを意味し、噴霧乾燥前のタンパク質製剤がそれらを含む限り、それらが添加される様式及び時期、又は添加の順番に対する制限を暗示するものではない。
【００３３】
許容され得る再構成時間は、３０分以内、好ましくは２５分以内、より好ましくは２０分以内、又はそれより早いと考えられる。「再構成時間」という用語は、本明細書において使用される場合、所望体積の溶媒（例えば水）中で噴霧乾燥タンパク質製剤を再構成するのに要する時間を意味する。本開示の範囲内において、ある特定の賦形剤が予想外に他の賦形剤より優れているか否かを考慮する場合、同一に噴霧乾燥されたタンパク質製剤の再構成時間が、調査される異なる賦形剤に対して、比較される。予想外に優れた賦形剤は、これらの制限内で少なくとも約１０％以上再構成時間を短縮する。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法、使用及びプロセスによるタンパク質製剤中のタンパク質は、抗体又はその抗原結合断片である。
【００３５】
「抗体」（単数又は複数）という用語は、本明細書において使用される場合、モノクローナル又はポリクローナル抗体を指し、当技術分野において知られている組換え技術により生成された組換え抗体に限定されない。
【００３６】
好ましくは、本発明の方法、使用及びプロセスによるタンパク質製剤に含まれる抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３７】
「抗体」（単数又は複数）は、２つの本質的に完全な重鎖及び２つの本質的に完全な軽鎖を有する任意の種、特に哺乳動物種の抗体、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ及びＩｇＭ並びにそれらの改変変異体を含む任意のアイソタイプのヒト抗体、チンパンジー、ヒヒ、アカゲザル若しくはカニクイザル等由来の非ヒト霊長類抗体、マウス、ラットもしくウサギ等由来の齧歯類抗体、ヤギ若しくはウマ抗体、及びそれらの誘導体、又はニワトリ抗体等のトリの種の抗体、又はサメ抗体等の魚の種の抗体を含む。「抗体」（単数又は複数）という用語はまた、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第１の部分が第１の種からのものであり、重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第２の部分が第２の種からのものである「キメラ」抗体も指す。本明細書において対象となるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、例えばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む、「霊長類化」抗体を含む。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体に由来する配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性及び活性を有するマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ又は非ヒト霊長類等の非ヒト種の超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）（ドナー抗体）からの残基で置き換えられたヒト抗体（レシピエント抗体）である。ほとんどの場合において、ＣＤＲ外、すなわちフレームワーク領域（ＦＲ）内のヒト（レシピエント）抗体の残基は、対応する非ヒト残基で追加的に置き換えられている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体中には見られない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体性能を更に高度化するために行われる。ヒト化は、ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性を低減し、したがってヒトの疾患の処置への抗体の適用を促進する。ヒト化抗体、及びそれらを生成するためのいくつかの異なる技術は、当技術分野において周知である。「抗体」（単数又は複数）という用語はまた、ヒト化の代わりとして生成され得るヒト抗体も指す。例えば、免疫化後に、内因性マウス抗体の産生なしにヒト抗体の全レパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えばマウス）を生み出すことが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全阻害をもたらすことが説明されている。そのような生殖系列突然変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物の特定抗原による免疫化後に、前記抗原に対する特異性を有するヒト抗体の産生をもたらす。そのようなトランスジェニック動物を生み出す技術、並びにそのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離及び生成するための技術は、当技術分野において知られている。或いは、トランスジェニック動物、例えばマウスにおいて、マウス抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン遺伝子のみが、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列で置き換えられる。抗体定常領域をコードするマウス生殖系列免疫グロブリン遺伝子は不変のままである。このようにして、抗体エフェクターは、トランスジェニックマウスの免疫系において機能し、結果としてＢ細胞発生は本質的に不変であり、これはｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原負荷後の改善された抗体応答をもたらし得る。対象となる特定抗原をコードする遺伝子がそのようなトランスジェニック動物から単離されたら、定常領域をコードする遺伝子は、完全ヒト抗体を得るためにヒト定常領域遺伝子で置き換えられてもよい。「抗体」（単数又は複数）という用語はまた、本明細書において使用される場合、脱グリコシル化抗体（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）も指す。
【００３８】
「その断片」という用語又はその文法的変化形は、本明細書において使用される場合、抗体断片を指す。抗体の断片は、当技術分野において知られている少なくとも１つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、１つ又は複数の抗原に結合する。本発明による抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、並びにＦｖ及びｓｃＦｖ断片；更にジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えばｓｄＡｂ、ＶＨＨ又はラクダ科抗体（例えばラクダ又はラマからのもの、例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標））及びＶＮＡＲ断片、単鎖抗体、抗体断片又は抗体から形成される二重特異性、三重特異性、四重特異性又は多重特異性抗体を含み、これはＦａｂ−Ｆｖ又はＦａｂ−Ｆｖ−Ｆｖコンストラクトを含むが、それらに限定されない。上で定義された抗体断片は、当技術分野において知られている。
【００３９】
所望により、抗体又は抗原結合断片は、１つ又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートされ得る。エフェクター分子は、本発明の抗体に結合し得る単一部分を形成するように連結した単一エフェクター分子又は２つ以上のそのような分子を含んでもよいことが認識されよう。エフェクター分子に連結した抗体断片を得ることが望ましい場合、これは、抗体断片が直接、又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結する標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順により調製され得る。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、当技術分野において周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９〜５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３、６７〜１２３を参照されたい）。具体的な化学的手順は、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１に記載の手順を含む。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載の組換えＤＮＡ手順を使用して達成され得る。
【００４０】
エフェクター分子という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、抗腫瘍剤、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体断片、抗原結合剤、合成（ＰＥＧを含む）若しくは天然ポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えば蛍光化合物、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法により検出され得る化合物を含む。
【００４１】
エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の半減期を増大させる、及び／又は抗体の免疫原性を低減する、及び／又は上皮バリアを通した免疫系への抗体の送達を高めることができる。この種の好適なエフェクター分子の例は、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物、例えばＷＯ０５／１１７９８４に記載のものを含む。
【００４２】
エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に、合成又は天然ポリマー、例えば任意選択で置換された直鎖若しくは分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分岐若しくは非分岐ポリサッカリド、例えばホモ若しくはヘテロポリサッカリドであってもよい。
【００４３】
上述の合成ポリマーに存在し得る特定の任意選択の置換基は、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基を含む。
【００４４】
合成ポリマーの具体例は、任意選択で置換された直鎖又は分岐鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はそれらの誘導体、特に任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体を含む。
【００４５】
具体的な天然ポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体を含む。
【００４６】
一実施形態において、ポリマーは、アルブミン又はその断片、例えばヒト血清アルブミン又はその断片である。一実施形態において、ポリマーは、ＰＥＧ分子である。
【００４７】
天然又は合成ポリマーのサイズは、所望通りに変更することができるが、一般に、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａの平均分子量範囲内である。特に、ポリマーサイズは、生成物の使用目的、例えば腫瘍等のある特定の組織に局在化する能力、又は循環半減期を延長する能力に基づいて具体的に選択され得る（詳細はＣｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５を参照されたい）。したがって、例えば、生成物が腫瘍の処置における使用等のために循環を脱して組織に侵入することを目的とする場合、例えば約５０００Ｄａの分子量を有する小分子量ポリマーを使用することが有利となり得る。生成物が循環中に留まる用途では、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲内の分子量を有するより高分子量のポリマーを使用することが有利となり得る。
【００４８】
好適なポリマーは、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）、若しくは特にメトキシポリ（エチレングリコール）、又はその誘導体を含み、特に約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲内の分子量を有するものを含む。
【００４９】
一例において、本発明における使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合する。１つの具体例において、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して結合し得る。そのようなアミノ酸は、抗体断片において自然に生じたものであってもよく、又は組換えＤＮＡ方法を使用して断片内に組み込まれたものであってもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例において、本発明の抗体分子は、改変Ｆａｂ断片であり、改変は、エフェクター分子を結合させるための、その重鎖のＣ末端に対する１種又は複数種のアミノ酸の付加である。好適には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が結合し得る１つ又は複数のシステイン残基を含む改変ヒンジ領域を形成する。２つ以上のＰＥＧ分子を結合させるために、複数の部位が使用されてもよい。
【００５０】
好適には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合性に連結する。改変抗体断片に結合した各ポリマー分子は、断片に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合性に連結してもよい。共有結合性の連結は、一般に、ジスルフィド結合、又は特に硫黄−炭素結合である。結合点としてチオール基が使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばチオール選択性誘導体、例えばマレイミド及びシステイン誘導体が使用され得る。活性化ポリマーは、上述のポリマー改変抗体断片の調製における出発材料として使用され得る。
【００５１】
活性化ポリマーは、チオール反応基、例えばα−ハロカルボン酸若しくはエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドを含む任意のポリマーであってもよい。そのような出発材料は、商業的に得られてもよく（例えば、かつてのＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．であるＮｅｋｔａｒ、アラバマ州ハンツビル、米国）、又は、従来の化学的手順を使用して市販の出発材料から調製されてもよい。具体的なＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（かつてのＳｈｅａｒｗａｔｅｒであるＮｅｋｔａｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（かつてのＳｈｅａｒｗａｔｅｒであるＮｅｋｔａｒから入手可能）を含む。
【００５２】
一実施形態において、抗体は、例えばＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示されている方法に従ってＰＥＧ化された、すなわち共有結合したＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する改変Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はｄｉＦａｂである［Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ並びにＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９８、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，  Ａ．  ２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２、５４：５３１〜５４５も参照されたい］。一例において、ＰＥＧは、ヒンジ領域内のシステインに結合する。一例において、ＰＥＧ改変Ｆａｂ断片は、改変ヒンジ領域内の単一チオール基に共有結合性に連結したマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合性に連結してもよく、リシン残基上のアミン基のそれぞれには、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合してもよい。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの総分子量は、約４０，０００Ｄａである場合がある。
【００５３】
具体的なＰＥＧ分子は、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（かつてのＳｈｅａｒｗａｔｅｒであるＮｅｋｔａｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２０，０００）改変リシンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドを含む。
【００５４】
ＰＥＧリンカーの代替の源は、ＧＬ２−４００ＭＡ３（以下の構造中のｍは５である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ｍは２である）を供給するＮＯＦを含み、ｎは約４５０である。
【化１】
2021502990.tif 000002
【００５５】
すなわち、各ＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。
【００５６】
したがって、一実施形態において、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ３として知られる、２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−｛［３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分岐ＰＥＧ、−ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５−ＭＡＬ、Ｍｗ４０，０００である。
【００５７】
以下の種類のさらなる選択肢であるＰＥＧエフェクター分子が、Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である。
【化２】
2021502990.tif 000003
【００５８】
一実施形態において、鎖内のアミノ酸２２６、例えば重鎖のアミノ酸２２６（連続番号による）又はその付近のシステインアミノ酸残基を介して結合した、（例えば本明細書に記載のＰＥＧを用いて）ＰＥＧ化された本発明の抗体が提供される。
【００５９】
一実施形態において、本開示は、１つ又は複数のＰＥＧポリマー、例えば１つ又は２つのポリマー、例えば４０ｋＤａポリマー（単数又は複数）を含むＦａｂ’ＰＥＧ分子を提供する。本開示によるＦａｂ’−ＰＥＧ分子は、Ｆｃ断片とは無関係な半減期を有することから特に有利となり得る。一例において、本発明は、噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法を提供し、方法は、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の存在下でタンパク質を含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含み、タンパク質は、ＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートしたＦａｂ’断片である。本発明の別の実施形態において、噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスが提供され、プロセスは、
ａ．タンパク質、糖及び１種又は複数種のアミノ酸を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短く、タンパク質は、ＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートしたＦａｂ’断片であり、糖は二糖であり、１．０〜２０％ｗ／ｖの量で存在し、１種又は複数種のアミノ酸は、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭの量で存在する。
【００６０】
本発明の方法、使用及びプロセスによるタンパク質製剤に含まれる抗体又はその断片は、好ましくは、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体、好ましくはヒト化モノクローナル全長抗体である。
【００６１】
抗体分子は、典型的には、抗体配列をコードするベクターを含む宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現をもたらすのに好適な条件下で培養し、抗体分子を単離することにより生成され得る。
【００６２】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含んでもよく、この場合、重鎖又は軽鎖ポリペプチドをコードする配列のみが、宿主細胞のトランスフェクトに使用される必要がある。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の生成には、細胞系は２つのベクターでトランスフェクトされてもよく、第１のベクターは軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターは重鎖ポリペプチドをコードする。或いは、単一のベクターが使用されてもよく、ベクターは、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
【００６３】
工業規模に従って製造され得る抗体又はその抗原結合断片は、組換え抗体断片をコードする１つ又は複数の発現ベクターでトランスフェクトされた真核宿主細胞を培養することにより生成され得る。真核宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００６４】
哺乳動物細胞は、その増殖及び組換えタンパク質の発現を補助する任意の培地で培養され得、好ましくは、培地は、動物血清及びペプトン等の動物由来生成物を含まない既知組成培地である。細胞増殖及びタンパク質生成を可能にする適切な濃度で存在する、ビタミン、アミノ酸、ホルモン、増殖因子、イオン、緩衝剤、ヌクレオシド、グルコース又は同等のエネルギー源の様々な組合せを含む、当業者に利用可能な様々な細胞培養培地が存在する。当業者に知られている細胞培養周期の間の異なる時点で、適切な濃度の追加の細胞培養培地成分が細胞培養培地に含まれてもよい。
【００６５】
哺乳動物細胞培養は、必要な生成規模に依存してフェッドバッチ形式で動作していても、又はしていなくてもよい振盪フラスコ又はバイオリアクタ等の任意の好適な容器で行うことができる。これらのバイオリアクタは、撹拌槽又はエアリフト反応器であってもよい。１，０００Ｌ超〜５０，０００Ｌ、好ましくは５，０００Ｌ〜２０，０００Ｌの間、又は１０，０００Ｌまでの容量を有する様々な大規模バイオリアクタが利用可能である。或いは、例えば２Ｌ〜１００Ｌの間の、より小規模のバイオリアクタもまた、抗体又は抗体断片の製造に使用され得る。
【００６６】
抗体又はその抗原結合断片は、典型的には、哺乳動物宿主細胞培養物、典型的にはＣＨＯ細胞培養物の上清中に見られる。抗体又はその抗原結合断片等の対象となるタンパク質が上清中に分泌されるＣＨＯ培養プロセスにおいて、前記上清は、当技術分野において知られている方法により、典型的には遠心分離により回収される。
【００６７】
或いは、宿主細胞は、原核細胞、好ましくはグラム陰性菌である。より好ましくは、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。タンパク質発現のための原核宿主細胞は、当技術分野において周知である（Ｔｅｒｐｅ，  Ｋ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７２、２１１〜２２２（２００６））。宿主細胞は、抗体の抗原結合断片等の対象となるタンパク質を生成するように遺伝子操作された組換え細胞である。組換え大腸菌宿主細胞は、ＭＣ４１００、ＴＧ１、ＴＧ２、ＤＨＢ４、ＤＨ５α、ＤＨ１、ＢＬ２１、Ｋ１２、ＸＬ１Ｂｌｕｅ及びＪＭ１０９を含む任意の好適な大腸菌株に由来し得る。一例は、組換えタンパク質発酵に一般的に使用される宿主株、大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）である。抗体断片はまた、改変大腸菌株、例えば代謝突然変異又はプロテアーゼ欠失大腸菌株を培養することにより生成され得る。
【００６８】
抗体断片は、典型的には、タンパク質の性質、生成規模、及び使用される大腸菌株に依存して、大腸菌宿主細胞のペリプラズム中、又は宿主細胞培養上清中に見られる。タンパク質をこれらの区画に標的化するための方法は、当技術分野において周知である（Ｍａｋｒｉｄｅｓ，  Ｓ．Ｃ．；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６０、５１２〜５３８（１９９６））。タンパク質を大腸菌のペリプラズムに方向付けるための好適なシグナル配列の例は、大腸菌ＰｈｏＡ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、ＬａｍＢ及びＯｍｐＦシグナル配列を含む。タンパク質は、自然の分泌経路に依存することにより、又はタンパク質分泌をもたらす外膜の制限された漏出の誘導により上清に標的化され得、後者の例は、ｐｅｌＢリーダー、タンパク質Ａリーダー、バクテリオシン放出タンパク質の同時発現、マイトマイシン誘導バクテリオシン放出タンパク質及び培養培地へのグリシン添加、並びに膜透過化のためのｋｉｌ遺伝子の同時発現の使用である。最も好ましくは、組換えタンパク質は、宿主大腸菌のペリプラズム中に発現する。
【００６９】
大腸菌宿主細胞における組換えタンパク質の発現はまた、誘導系の制御下にあってもよく、それにより、大腸菌における組換え抗体の発現は、誘導プロモーターの制御下にある。大腸菌における使用に好適な多くの誘導プロモーターは、当技術分野において周知であり、プロモーターに依存して、組換えタンパク質の発現は、増殖培地の特定の物質の温度又は濃度等の様々な因子により誘導され得る。誘導プロモーターの例は、ラクトース又は非加水分解性ラクトース類似体、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導可能な大腸菌ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｃプロモーター、並びにそれぞれホスファート、トリプトファン及びＬ−アラビノースにより誘導されるｐｈｏＡ、ｔｒｐ及びａｒａＢＡＤプロモーターを含む。発現は、例えば、誘導因子の添加、又は誘導が温度依存性である場合には温度の変化により誘導され得る。組換えタンパク質発現の誘導が培養物への誘導因子の添加により達成される場合、誘導因子は、発酵系及び誘導因子に依存して任意の好適な方法により、例えば単一若しくは複数の注入添加により、又は供給物を介した誘導因子の段階的添加により添加され得る。誘導因子の添加と実際のタンパク質発現の誘導との間に遅延が生じ得ること、例えば誘導因子がラクトースである場合、ラクトースの前に任意の既存の炭素源が利用される間、タンパク質発現の誘導が生じるまでに遅延が生じ得ることが認識されよう。
【００７０】
大腸菌宿主細胞培養物（発酵物）は、大腸菌の増殖及び組換えタンパク質の発現を補助する任意の培地で培養され得る。培地は、例えばＤｕｒａｎｙ  Ｏら（２００４）（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３９、１６７７〜１６８４）に記載のような任意の既知組成培地であってもよい。
【００７１】
大腸菌宿主細胞の培養は、必要な生成規模に依存して、振盪フラスコ又は発酵槽等の任意の好適な容器で行うことができる。１，０００リットル超〜約１００，０００リットルの容量を有する様々な大規模発酵槽が利用可能である。好ましくは、１，０００〜５０，０００リットル、より好ましくは１，０００〜２５，０００、２０，０００、１５，０００、１２，０００又は１０，０００リットルの発酵槽が使用される。０．５〜１，０００リットルの間の容量を有する、より小規模な発酵槽もまた使用され得る。
【００７２】
大腸菌の発酵は、必要なタンパク質及び収量に依存して、任意の好適なシステム、例えば連続、回分又はフェッドバッチ形式で行うことができる。回分形式は、必要な場合には栄養物又は誘導因子の注入添加と共に使用され得る。或いは、フェッドバッチ培養が使用されてもよく、培養物は、回分形式の予備誘導において、発酵槽内に最初に存在していた栄養物、及び発酵が完了するまで増殖速度を制御するために使用された１つ又は複数の栄養物供給計画を使用して、維持され得る最大比増殖速度で増殖され得る。フェッドバッチ形式はまた、大腸菌宿主細胞の代謝を制御し、より高い細胞密度を達成させるために予備誘導に使用され得る。
【００７３】
所望に応じて、宿主細胞は、発酵培地からの回収に供されてもよく、例えば、宿主細胞は、遠心分離、濾過又は濃縮により試料から回収されてもよい。この場合、プロセスは、典型的には、タンパク質の抽出前に遠心分離及び細胞回収のステップを含む。
【００７４】
抗体又は抗体の抗原結合断片等の対象となるタンパク質が宿主細胞のペリプラズム空間内に見られる大腸菌発酵プロセスでは、宿主細胞からタンパク質を放出させることが必要である。放出は、機械的若しくは圧力処理による細胞溶解、凍結−融解処理、浸透圧ショック、抽出剤又は熱処理等の任意の好適な方法により達成され得る。タンパク質放出のためのそのような抽出方法は、当技術分野において周知である。したがって、特定の実施形態において、生成プロセスは、タンパク質精製前に追加のタンパク質抽出ステップを含む。
【００７５】
ヒト抗体の抗原結合断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで得るための他の方法は、ファージディスプレイ又はリボソームディスプレイ技術等のディスプレイ技術に基づくものであり、少なくとも部分的に人工的に、又はドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから生成された組換えＤＮＡライブラリが使用される。ヒト抗体を生成するためのファージ及びリボソームディスプレイ技術は、当技術分野において周知である。ヒト抗体はまた、対象となる抗原でｅｘ  ｖｉｖｏ免疫化され、その後融合されてハイブリドーマを生成する、単離ヒトＢ細胞から生成されてもよく、これは次いで最適なヒト抗体に関してスクリーニングされ得る。
【００７６】
噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法、使用及びプロセス。
【００７７】
噴霧乾燥のプロセスは、液体供給物の微細液滴への微粒化後に水分を蒸発させ、乾燥粉末を得ることを含む。３つの基本ステップからなる噴霧乾燥は、二流体ノズル（ｔｗｏ−ｆｌｕｉｄ  ｎｏｚｚｌｅ）による液体供給物の噴霧ガス（圧縮空気又はＮ２、５〜８バール）への分散から開始する。ノズルを介して微小液滴が噴霧される（微粒化）。次いで、液滴は、通常は液体を蒸発及び移動させる加熱並流空気ストリーム（ｈｅａｔｅｄ  ｃｏ−ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｉｒ  ｓｔｒｅａｍ）からなる乾燥媒体中に懸濁される。最終ステップにおいて、乾燥した固体は、サイクロン内で空気ストリームから分離される。乾燥粉末は回収され、空気は大気中に排出される。
【００７８】
タンパク質製剤の噴霧乾燥の例は、以降で実施例において説明される。
【００７９】
全体として、本発明によるタンパク質製剤に含まれる抗体又はその断片は、任意の濃度で、例えば１〜２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２０〜１５０ｍｇ／ｍＬ、更に好ましくは３０〜１００ｍｇ／ｍＬ、例えば３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。或いは、１種又は複数種のアミノ酸は、噴霧乾燥されるタンパク質製剤中に、１００ｍＬ当たりの重量（％ｗ／ｖ）で表現される量で好ましくは存在する。そのような場合、全体として、本発明によるタンパク質製剤に含まれる抗体又はその断片は、０．１〜２０％ｗ／ｖ、好ましくは２．０〜１５％ｗ／ｖ、又は更に好ましくは３．０〜１０％ｗ／ｖ、例えば３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５又は１０％ｗ／ｖの量で存在し得る。
【００８０】
噴霧乾燥されたタンパク質製剤の再構成時間の短縮は、噴霧乾燥前に糖及び１種又は複数種のアミノ酸を組み込むことにより達成される。
【００８１】
全体として、本発明に関し、糖は、好ましくは二糖、より好ましくはスクロース、トレハロース又はそれらの混合物から選択される。糖は、好ましくは、噴霧乾燥されるタンパク質製剤中に、１．０％〜２０％ｗ／ｖ又は１．５％〜１５％ｗ／ｖ又は１．５％〜１０％ｗ／ｖ又は１．５％〜４．５％ｗ／ｖ、例えば１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．５、４．０、４．１、４．２又は４．５％ｗ／ｖ、又は更に好ましくは２．５％〜４．２％ｗ／ｖ、例えば２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１又は４．２％ｗ／ｖの量で存在する。或いは、糖は、好ましくは、噴霧乾燥されるタンパク質製剤中に、モル濃度で表現される量で存在する。そのような場合、糖は、好ましくは、噴霧乾燥されるタンパク質製剤中に、３０〜６００ｍＭ、又は４５〜１３５ｍＭ、例えば４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０又は１３５ｍＭ、又は更に好ましくは７０ｍＭ〜１２５ｍＭ、例えば７０、７３、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０又は１２５ｍＭの量で存在する。スクロース又はトレハロースは、本発明の技術的効果を達成するための同等の性能を示す糖であり、混合物におけるそれらの個々の存在が好ましい。
【００８２】
全体として、本発明に関し、１種又は複数種のアミノ酸は、そのＤ型及び／又はＬ型で存在し得るが、Ｌ型が典型的である。１種又は複数種のアミノ酸は、好ましくは、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物である。限定されないが、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リシン及び／若しくはヒスチジン、又はそれらの混合物の含有が好ましい。アミノ酸は、任意の好適な塩、例えば塩酸塩、例えばアルギニン−ＨＣｌ、リシン−ＨＣｌ又はヒスチジン−ＨＣｌとして存在してもよい。１種又は複数種のアミノ酸は、好ましくは、噴霧乾燥されるタンパク質製剤中に、１０ｍＭ以上若しくは１０ｍＭ超〜２５０ｍＭ、好ましくは５０ｍＭ以上若しくは５０ｍＭ超〜２００ｍＭ、又は５０ｍＭ以上若しくは５０ｍＭ超〜１５０ｍＭ、例えば５０、５１、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ｍＭの量で存在する。或いは、１種又は複数種のアミノ酸は、好ましくは、噴霧乾燥されるタンパク質製剤中に、１００ｍＬ当たりの重量（％ｗ／ｖ）で表現される量で存在する。例えば、少なくとも１種のアミノ酸がアルギニン−ＨＣｌ（２１０．６６ＤａのＭＷを有する）である場合、前記アルギニン−ＨＣｌは、０．２以上若しくは０．２超〜５．２５％ｗ／ｖの重量、又は１．０６以上若しくは１．０６超〜４．２％ｗ／ｖ、好ましくは１．０６以上若しくは１．０６超〜３．２％ｗ／ｖ、例えば１．１、１．１５、１．２、１．５、２．０、２．２、２．５、３．０又は３．２％ｗ／ｖの量で存在するであろう。別の例において、少なくとも１種のアミノ酸がリシン−ＨＣｌ（１８２．６５ＤａのＭＷを有する）である場合、前記リシン−ＨＣｌは、０．１以上若しくは０．１超〜４．５％ｗ／ｖの重量、又は０．９以上若しくは０．９超〜３．６％ｗ／ｖ、好ましくは０．９以上若しくは０．９超〜２．７％ｗ／ｖ、例えば０．９、０．９５、１．０、１．５、１．８、２．０、２．５又は２．７％ｗ／ｖの量で存在するであろう。任意のアミノ酸に対し対象のモル濃度を％ｗ／ｖに変換することは、十分当業者の技術の範囲内であろう。
【００８３】
全体として、本発明に関し、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の１つのモル濃度は、累積され得る。そのような場合、糖及び１種又は複数種のアミノ酸は、好ましくは、噴霧乾燥されるタンパク質製剤中に、６０ｍＭ以上若しくは６０ｍＭ超〜４００ｍＭ、好ましくは７０ｍＭ以上若しくは７０ｍＭ超〜３００ｍＭ、又は７０ｍＭ以上若しくは７０ｍＭ超〜２６０ｍＭ、例えば７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０又は２６０ｍＭの累積モル濃度（或いは累積量とも呼ばれる）で存在する。
【００８４】
一実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法は、スクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、及びグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸の存在下でタンパク質を含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む。好ましくは、タンパク質は、抗体又はその断片である。前記抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。
【００８５】
別の実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスは、
ａ．タンパク質、スクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、及びグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、スクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、及びグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短く、糖は二糖であり、１．０〜２０％ｗ／ｖの量で存在し、１種又は複数種のアミノ酸は、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭの量で存在する。好ましくは、タンパク質は、抗体又はその断片である。前記抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。
【００８６】
別の実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスは、
ａ．タンパク質、１％〜２０％のスクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、及び５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２５０ｍＭのグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、スクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、及びグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短い。好ましくは、タンパク質は、抗体又はその断片である。前記抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。
【００８７】
別の実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスは、
ａ．タンパク質、１．５％〜４．５％ｗ／ｖ又は２．５％〜４．２％ｗ／ｖのスクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、及び５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭのグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、スクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、及びグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短い。好ましくは、タンパク質は、抗体又はその断片である。前記抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。本発明はまた、糖、１種又は複数種のアミノ酸及び界面活性剤の存在下でタンパク質を含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む、噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法を提供する。
【００８８】
更に、本発明は、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスを提供し、プロセスは、
ａ．タンパク質、糖、１種又は複数種のアミノ酸及び界面活性剤を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、糖及び１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短い。好ましくは、タンパク質は、抗体又はその断片であり、糖は二糖であり、１．０〜２０％ｗ／ｖの量で存在し、１種又は複数種のアミノ酸は、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭの量で存在する。
【００８９】
本発明による方法における使用に利用可能な界面活性剤は、これらに限定されないが、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤及び双性イオン性界面活性剤を含む。本発明による使用のための典型的な界面活性剤は、これらに限定されないが、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノカプリル酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン）、トリオレイン酸ソルビタン、グリセリン脂肪酸エステル（例えば、モノカプリル酸グリセリン、モノミリスチン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン）、ポリグリセリン脂肪酸エステル（例えば、モノステアリン酸デカグリセリル、ジステアリン酸デカグリセリル、モノリノール酸デカグリセリル）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル（例えば、テトラステアリン酸ポリオキシエチレンソルビトール、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール）、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ジステアリン酸ポリエチレングリコール）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油（例えば、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油）、ポリオキシエチレンミツロウ誘導体（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールミツロウ）、ポリオキシエチレンラノリン誘導体（例えば、ポリオキシエチレンラノリン）、及びポリオキシエチレン脂肪酸アミド（例えば、ポリオキシエチレンステアリン酸アミド）；Ｃ１０〜Ｃ１８アルキルサルファート（例えば、セチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム）、平均２〜４モルのエチレンオキシド単位が付加されたポリオキシエチレンＣ１０〜Ｃ１８アルキルエーテルサルファート（例えば、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム）、及びＣ１〜Ｃ１８アルキルスルホコハク酸エステル塩（例えば、ナトリウムラウリルスルホコハク酸エステル）；並びに天然界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質（例えば、スフィンゴミエリン）、及びＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸のスクロースエステルを含む。好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばポリソルベート２０、４０、６０又は８０、より好ましくはポリソルベート２０又はポリソルベート８０である。
【００９０】
界面活性剤は、一般に、０．０１％ｗ／ｖ〜１．０％ｗ／ｖ、好ましくは０．０２％ｗ／ｖ〜０．１％ｗ／ｖ、又は更に好ましくは０．０２％ｗ／ｖ〜０．０５％ｗ／ｖの量で存在する。好ましくは、界面活性剤は、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０であり、０．０２％ｗ／ｖ〜０．０５％ｗ／ｖ、例えば０．０２、０．０３、０．０４又は０．０５％ｗ／ｖの量で存在する。
【００９１】
一実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法は、スクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸、及びポリソルベートから選択される界面活性剤の存在下でタンパク質を含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む。好ましくは、タンパク質は、抗体若しくはその断片であり、及び／又は、ポリソルベートは、ポリソルベート２０である。抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。
【００９２】
別の実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスは、
ａ．タンパク質、スクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、グリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸、及びポリソルベート界面活性剤を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、スクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、及びグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短く、糖は二糖であり、１．０〜２０％ｗ／ｖの量で存在し、１種又は複数種のアミノ酸は、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭの量で存在する。好ましくは、タンパク質は、抗体若しくはその断片であり、及び／又は、ポリソルベート界面活性剤は、ポリソルベート２０である。抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。
【００９３】
別の実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法は、１％〜２０％ｗ／ｖのスクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、５０ｍＭ〜２５０ｍＭのグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸、及び０．０１％ｗ／ｖ〜１．０％ｗ／ｖのポリソルベート２０の存在下でタンパク質を含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む。好ましくは、タンパク質は、抗体又はその断片である。抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。
【００９４】
別の実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスは、
ａ．タンパク質、１％〜２０％のスクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、１０ｍＭ〜２５０ｍＭのグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸、及び０．０１％ｗ／ｖ〜１．０％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、スクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、及びグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短い。好ましくは、タンパク質は、抗体又はその断片である。抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。
【００９５】
更に別の実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するための方法は、１．５％〜４．５％ｗ／ｖ又は２．５％〜４．２％ｗ／ｖのスクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭのグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸の存在下でタンパク質を含むタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップを含む。好ましくは、タンパク質は、抗体又はその断片であり、０．０２％ｗ／ｖ〜０．１％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含む。抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。
【００９６】
別の実施形態において、本発明による噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成時間を短縮するためのプロセスは、
ａ．タンパク質、１．５％〜４．５％ｗ／ｖ又は２．５％〜４．２％ｗ／ｖのスクロース若しくはトレハロース又はそれらの混合物、５０ｍＭ以上又は５０ｍＭ超〜２００ｍＭのグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸、及び０．０２％ｗ／ｖ〜０．１％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含むタンパク質製剤を調製するステップと；
ｂ．ステップａ）において調製されたタンパク質製剤を噴霧乾燥するステップと；
ｃ．ステップｂ）の噴霧乾燥タンパク質製剤を回収するステップと；
ｄ．回収された噴霧乾燥タンパク質製剤を、好ましくは水で再構成時間ＲＴ１以内に再構成するステップと
を含み、再構成時間ＲＴ１は、スクロース又はトレハロース、及びグリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタマート、Ｌ−アスパルタート、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン又はそれらの混合物の群から選択される１種又は複数種のアミノ酸の非存在下で調製された同じタンパク質製剤の再構成時間より短い。好ましくは、タンパク質は、抗体又はその断片である。抗体又はその断片は、任意選択でＰＥＧ等のポリマーにコンジュゲートされる。
【００９７】
噴霧乾燥されるタンパク質製剤は、４．０〜７．５、好ましくは４．０〜６．０、より好ましくは５．０〜６．０、例えば５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９又は６．０のｐＨを有する。ｐＨを一定に維持するために、噴霧乾燥されるタンパク質製剤は、緩衝剤を含む。タンパク質製剤の製薬分野において使用される緩衝剤は数多くあり、例えば、これらに限定されないが、シトラート、ホスファート、ラクタート、ヒスチジン、グルタマート、マレアート、タルトラート、又はスクシナート等がある。好ましい緩衝剤種は、典型的には、高い緩衝能力を維持するために、最適なタンパク質安定性のための好ましいｐＨに近く（＋／−１ｐＨ単位）、また一連の異なる緩衝剤種の中に入れられた場合に特定のタンパク質に対して観察される実証された最大の安定性に関連するｐＫａを有する緩衝剤種から選択される。製剤の適切なｐＨ範囲は、一般に、一連の様々なｐＨの製剤中に入れられた場合に特定のタンパク質に対して観察される実証された最大の安定性に関連する範囲から選択される。緩衝剤はまた、好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭ、１０ｍＭ〜８０ｍＭ、１０ｍＭ〜６０ｍＭ、１５ｍＭ〜６０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭ、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ｍＭの濃度のアミノ酸又はアミノ酸の混合物であり得る。限定されない例として、緩衝剤は、１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝剤であってもよい。
【００９８】
本発明による方法及びプロセスにおいて、追加の賦形剤が使用されてもよい。これらの賦形剤は、これらに限定されないが、粘度向上剤、増量剤、可溶化剤、例えば単糖、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボース等；多糖、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等；及びポリオール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）等；ポリ−エチレングリコール（例えば、ＰＥＧ１００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００若しくはＰＥＧ２００００）、ポリビニルピロリドン、トリメチルアミンＮ−オキシド、トリメチルグリシン又はそれらの組合せを含む。
【００９９】
噴霧乾燥タンパク質製剤組成物が患者に投与され得る前に、それを溶媒で再構成する必要がある。本発明の範囲内において、好ましい溶媒は水性溶媒であり、より好ましくは水性溶媒は水であり、更により好ましくは滅菌水である。
【０１００】
噴霧乾燥タンパク質製剤の再構成は、本発明による前記噴霧乾燥タンパク質製剤が回収されてから数日、数週間又は数か月後に行うことができることが、当業者に理解されよう。
【０１０１】
再構成に使用される溶媒の体積は、得られる再構成された噴霧乾燥タンパク質製剤中の抗体又はその断片等のタンパク質の濃度を決定付ける。噴霧乾燥する前の体積より少ない体積の溶媒で再構成すると、噴霧乾燥前より濃縮された製剤が得られ、その逆も成り立つ。
【０１０２】
再構成比率（噴霧乾燥されたタンパク質製剤を再構成するために使用された溶媒に対する噴霧乾燥前のタンパク質製剤の体積）は、１：０．１〜１０：１で変動し得る。好ましい実施形態において、再構成された噴霧乾燥タンパク質製剤中のタンパク質の得られる濃度が、噴霧乾燥前のタンパク質製剤の濃度の２倍となるように、約１：０．５の比率が適用される。
【０１０３】
本発明はまた、本発明によるプロセスによって得られた噴霧乾燥タンパク質製剤を提供する。好ましくは、そのような噴霧乾燥タンパク質製剤は、抗体製剤又は抗体断片の製剤である。
【０１０４】
そのような噴霧乾燥タンパク質製剤は、再構成が必要となるまで、バイアル、アンプル、管、瓶又はシリンジ（例えばプレフィルドシリンジ）等の好適な容器内で保存され得る。容器は、本発明のプロセスによって得られた噴霧乾燥タンパク質製剤、噴霧乾燥タンパク質製剤を再構成するための好適な溶媒、シリンジ、プレフィルドシリンジ、オートインジェクタ、無針デバイス、インプラント若しくはパッチ、又は他の非経口投与用デバイス等の送達デバイス、及び取扱説明書を含む１つ又は複数の容器を備える部品のキットの一部であってもよい。
【０１０５】
本発明によるプロセスによって得られるタンパク質製剤又は噴霧乾燥タンパク質製剤（或いは、一度再構成されたら、再構成されたタンパク質製剤と呼ばれる）は、治療又は診断における使用のためのものである。
【０１０６】
本発明によるプロセスによって得られた再構成されたタンパク質製剤は、治療有効量で投与される。「治療有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、標的疾患、障害又は状態を処置、改善若しくは予防するために、又は検出可能な治療効果、薬理効果又は予防効果を示すために必要なタンパク質（すなわち抗体）の量を指す。任意の抗体又はその抗原結合断片に関して、治療有効量は、まず細胞培養アッセイ又は動物モデルにおいて、通常は齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類において推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用され得る。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定することができる。
【０１０７】
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の全体的健康、対象の年齢、体重及び性別、食生活、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ（単数又は複数）、反応感度、並びに治療に対する耐性／応答性に依存する。この量は、慣例的な実験により決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、抗体の治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０１０８】
適切な用量は、例えば、使用される特定の抗体、処置される対象、投与形態、並びに処置されている状態の性質及び重症度に依存して変動する。特定の実施形態において、本発明によるプロセスによって得られる再構成された噴霧乾燥タンパク質製剤は、皮下経路で、又は筋肉注射として投与される。
【０１０９】
ここで、添付の図面に示される実施形態を参照しながら、本発明を例示的に更に説明する。
【実施例】
【０１１０】
（例１）
約６．１の等電点（ｐＩ）を有するヒト化ＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ１）を、３０ｍＭヒスチジン、２００ｍＭソルビトールを含むｐＨ５．６、１６０ｍｇ／ｍｌの濃度の水溶液として用意した。全ての賦形剤は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ（商標）、ドイツ）。
【０１１１】
１５ｍｌまでの体積用のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ３０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））遠心分離フィルタを使用して、緩衝液交換を行った。２０℃で２時間の遠心分離の反復を含む、４サイクルの２〜３倍希釈を行った（相対遠心力＝４０００・ｇ）。１５ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．６）を含む原液を調製した。全ての製剤が、２．５％スクロース（７３ｍＭスクロースと同等）を含んでいた。この試験において使用されたアミノ酸の濃度を、表１に示す。
【表１】
2021502990.tif 000004
【０１１２】
緩衝液交換後、噴霧乾燥の前に、製剤を対応する原液で５０ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ１濃度まで希釈した。
【０１１３】
噴霧乾燥は、Ｂｕｃｈｉ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  ｄｒｙｅｒ  Ｂ−２９０を用い、出口空気を除湿機に通過させて行った（Ｂｕｃｈｉ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、フラヴィル、スイス）。入口温度は１２０℃に設定し、出口温度は５５〜６０℃の間であった。吸引器は、３５ｍ３／時の空気流速に対応する１００％に設定した。液体供給流に対する速度設定は、１０％のポンプ速度に従い３ｍｌ／分であり、霧化Ｎ２流に対しては６００ｌ／時であった。製剤（９〜１５ｍｌ）を、二流体ノズル（０．７ｍｍの液体オリフィス内径）で霧化した。噴霧乾燥後、サイクロンにより粉末をガラス容器に回収し、プラスチックバイアルに移し、冷蔵庫内で２〜８℃で保存した。各製剤に対して、約１００ｍｇのｍＡｂ１を含む噴霧乾燥粉末を４つのバイアルに充填した。再構成時間の評価には、３つのバイアルを使用した。
【０１１４】
噴霧乾燥製剤を０．９ｍｌのＭｉｌｌｉＱ−水で約１００ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成した。粉末が完全に溶解する時間を視覚的に観察し、記録した。所与の製剤に対して再構成時間の変動を調査するために３つの試料を再構成した。再構成後、Ｃａｒｙ５０Ｂｉｏ  ＵＶ−可視分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）に接続されたＳｏｌｏＶＰＥ（ＣＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて希釈せずに、吸光係数ε＝１．３３（ｍｇ／ｍｌ）−１ｃｍ−１で、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によりｍＡｂ１の濃度を決定した。
【０１１５】
異なる噴霧乾燥ｍＡｂ１製剤に対して、噴霧乾燥製剤を３回再構成し、平均及び標準偏差を計算した。ロイシン及びフェニルアラニンを含む製剤を除く全ての製剤が、２．５％スクロースと比較してより速い再構成時間を示した（図１）。ロイシンを含む製剤は、非常に乳様の外観及び多量の凝集体の存在を示し（データは示さず）、これが再構成時間に影響した。一方フェニルアラニンを含む製剤は透明で、（肉眼で）観察不可能な粒子のわずかな形成を示した（データは示さず）が、それでもスクロースのみより長い再構成時間をもたらした。これらの実験は、グリシン、セリン、システイン、イソロイシン、グルタミン、アラニン、アルギニン、プロリン、リシン及びトリプトファン等のアミノ酸と組み合わせたスクロース等の糖の組合せが、スクロースのみと比較して噴霧乾燥抗体製剤の再構成時間を短縮することを示している。
【０１１６】
（例２）
再構成時間の短縮に対する界面活性剤の効果を分析した。接線流ダイアフィルトレーションを使用して、ｍＡｂ１保存緩衝液を、糖（０．１Ｍ）及びラクタート（０．０５Ｍ）、又はＬ−アルギニンＨＣｌ（０．２４Ｍ）、トレハロース（０．１Ｍ）及びＬ−ヒスチジン（０．０５Ｍ）を含む水性原液（ｐＨ５．０）と交換した。ダイアフィルトレーションステップ後、溶液を更に濃縮し、濾過した（ポリエーテルスルホン、０．２２ｕｍ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ベドフォード、米国）。吸光係数１．３３（ｍｇ／ｍｌ）−１ｃｍ−１で２８０ｎｍのＵＶ吸光度を使用して、ｍＡｂ１製剤の濃度を測定し、１００ｍｇ／ｍｌに調節した。製剤スクリーニングに使用された供給溶液は、残りの賦形剤の濾過（０．２２ｕｍ）溶液を添加することにより調製した。ＳＤプロセスパラメータスクリーニングの実験中に使用された溶液（表２）にはポリソルベート２０を注入し、その最終濃度まで超純水（Ｔｙｐｅ  １（２５℃でρ≧１８．２ＭΩｃｍ）、且つ濾過（０．２２ｕｍ）したもの）で希釈した。水酸化ナトリウム原液、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物及びポリソルベート２０は、Ｍｅｒｃｋ（ダルムシュタット、ドイツ）から入手した。Ｌ−アルギニン一塩酸塩、Ｌ−リシン一塩酸塩及びＤ（＋）−トレハロース二水和物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス、米国）から入手した。Ｄ（＋）−スクロースは、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ（ダルムシュタット、ドイツ）から購入した。Ｌ−ヒスチジンは、製剤用及び噴霧乾燥（ＳＤ）プロセスパラメータスクリーニング製剤用のそれぞれについて、Ｍｅｒｃｋ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。乳酸及び塩酸原液は、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ペンシルバニア州ピッツバーグ、米国）により提供された。
【０１１７】
製剤スクリーニングの実験用の供給溶液は、０．７ｍｍ二流体ノズル、高性能サイクロン、小型収集容器及びＢ−２９６  Ｄｅｈｕｍｉｄｉｆｉｅｒ（Ｂｕｃｈｉ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ、フラヴィル、スイス）を備えたＢｕｃｈｉ  Ｂ−２９０  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒを使用して、５０ｍｇ／ｍｌのｍＡｂ１濃度及び１５ｍｌの全供給体積で噴霧乾燥した。設定は独自の手順に基づき、また全ての製剤スクリーニングの実験に対して一定を維持した。入口空気温度は１２０℃に設定し（出口温度は監視され、５５〜６０℃の範囲であった）、入口空気流速は５８０ｌ／分に設定し、ノズルＮ２流速は１０ｌ／分に設定し、溶液供給速度は３ｍｌ／分に設定した。
【０１１８】
次いで、収集容器（収集器）からの粉末を、サイクロンから回収された粉末とプールし、ＦｌｕｒｏＴｅｃゴム注入栓（Ｗｅｓｔ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ペンシルバニア州ウェストホワイトランドタウンシップ、米国）及びアルミニウムクリンプシール（Ａｄｅｌｐｈｉ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ、ウェストサセックス、英国）で閉じられた２ｍｌのＴｙｐｅ  Ｉ透明管状ガラス注入バイアル（Ｓｃｈｏｔｔ  ＡＧ、マインツ、ドイツ）内に分配した。最後に、試料を５℃又は４０℃で４週間保存し、続いて再構成の前に５℃で保存した。
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１１９】
製剤スクリーニング設計の異なる因子レベルに対して得られたデータを使用して、応答のそれぞれに対し名義因子を含む回帰モデルをフィッティングした。ＪＭＰソフトウェアは、パラメータ推定値が全てのレベルにわたり平均ゼロとなる項によって名義変数を表すため、ｎレベル名義因子は、処理のためにｎ−１の標識変数によって表されることになる。したがって、パラメータ推定値はある特定のレベルに対応する平均応答と、全てのレベルにわたる平均応答との間の差をとることにより計算されたため、製剤スクリーニングにはｎ−１のパラメータ推定値のみを直接得ることができた。次いで、名義変数の全てのレベルにわたるパラメータ推定値の和がゼロに制約される、すなわち、最後の項が、他のｎ−１レベルにわたる推定値の和の負数として計算されるという知識に基づき、最終因子レベルのパラメータ推定値が別個に計算された。これは、拡張されたパラメータ推定値の間の依存性を暗示している（ＪＭＰ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８  マニュアル）。
【０１２０】
噴霧乾燥製剤を、供給溶液のｍＡｂ１噴霧乾燥前濃度の２倍である１００ｍｇ／ｍｌで３回再構成し、得られたモデルに対する拡張されたパラメータ推定値を図２に示す。パラメータ推定値は、界面活性剤因子に対して、並びにＬ−アルギニンＨＣｌ及びＬ−ヒスチジンＨＣｌの単一アミノ酸塩レベルに対して、０．０５レベルで有意であった。
【０１２１】
糖の代わりにポリソルベート２０を添加すると、再構成時間の短縮は得られなかった。図３は、スクロースの代わりにポリソルベート２０を含む噴霧乾燥製剤に対する、例１のスクロース及びグリシン、スクロース及びアラニン、スクロース及びアルギニン、並びにスクロース及びプロリンを含むｍＡｂ１の噴霧乾燥製剤に対して得られた再構成時間の比較を示す。図３に示されるように、再構成時間は、いずれの場合もスクロースの非存在下で界面活性剤と組み合わせたアミノ酸のほうが悪かった。
【０１２２】
同様に、図４、図５、図６及び図７に示されるように、再構成時間は界面活性剤（ポリソルベート２０）並びに糖（スクロースとして図４及び図５に示され、又はトレハロースとして図６及び図７に示される）の存在下、１種又は複数種のアミノ酸、例えばＬ−アルギニンＨＣｌ、Ｌ−リシンＨＣｌ、Ｌ−ヒスチジンＨＣＬ又はそれらの組合せの非存在下で噴霧乾燥された製剤においては短縮されなかった。
【０１２３】
（例３）
約７．０のｐＩを有する２００ｍｇ／ｍｌのＦａｂ’−ＰＥＧ抗体を含む製剤を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔａ−１５−３０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）遠心分離フィルタを使用して、１０ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．５）中のアミノ酸（グリシン、アラニン、プロリン、リシン、セリン、グルタミン及びアルギニン）並びにスクロースの様々な製剤と緩衝液交換した。
【０１２４】
調製された製剤は、表３に示される通りであった。
【表３】
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【０１２５】
製剤の噴霧乾燥は、噴霧乾燥前に乾燥空気を事前に除湿するために使用される除湿機Ｂ−２９６（設定の必要なし）に連結されたＢｕｃｈｉ  Ｂ２９０  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｅｒを用いて行った。５０ｍｇ／ｍＬのＦａｂ’−ＰＥＧ抗体を含む製剤を、表４に示されるプロセスパラメータを使用して噴霧乾燥した。
【表４】
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【０１２６】
噴霧乾燥された生成物を、９００μＬのＭｉｌｌｉＱ水で再構成して、１００ｍｇ／ｍＬの濃度を得た。粉末が完全に溶解して透明溶液となる時間を測定した。ｔ０の時点で、所与の製剤に対して再構成時間の変動を評価するために３つの試料を再構成した。Ｃａｒｙ５０Ｂｉｏ  ＵＶ−可視分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）に接続されたＳｏｌｏＶＰＥ（ＣＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて希釈せずに、又はＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて約１ｍｇ／ｍＬに希釈後に、ε＝０．８６（ｍｇ／ｍｌ）−１ｃｍ−１で、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によりＦａｂ’−ＰＥＧ濃度を決定した。
【０１２７】
図８に示されるように、２．５％スクロース及び増大濃度のグリシンの存在下での１００ｍｇ／ｍｌのＦａｂ’−ＰＥＧ抗体の噴霧乾燥製剤の再構成時間は、グリシンを含まない同じ製剤（約２５分）と比較して短縮されている。
【０１２８】
試験された他のアミノ酸もまた、２．５％スクロースのみでのＦａｂ’−ＰＥＧ抗体を含む製剤の再構成時間に対して優れた効果を示した。図９に示されるように、選択されたアミノ酸の含有は、スクロースのみに対して再構成時間の短縮をもたらす（Ｇｌｎ＞Ａｌａ＞Ｓｅｒ＞Ｇｌｙ＞Ｌｙｓ＞Ａｒｇ＞Ｐｒｏ）。
【０１２９】
（例４）
再構成時間に対するアミノ酸及び／又は糖の添加の効果を更に分析した。ｍＡｂ１を、１５ｍＭヒスチジンを含むｐＨ５．６の５０ｍｇ／ｍｌの濃度の水溶液として用意した。様々なアミノ酸（Ａｒｇ−ＨＣｌ；Ｇｌｙ−ＨＣｌ、Ｌｙｓ−ＨＣｌ及びＰｒｏ−ＨＣｌ）並びに１種の糖（トレハロース）を、それぞれ異なるモル濃度（アミノ酸に対しては０、５０、１００及び１５０ｍＭ、並びに糖に対しては３０、７５、１２０ｍＭ）で試験した。
【０１３０】
調製された製剤は、表５に示される通りであった。
【表５】
2021502990.tif 000009
【０１３１】
製剤の噴霧乾燥、再構成及び再構成時間の評価は、例３に従って行った。
【０１３２】
図１０Ｂに示されるように、糖（本明細書では二糖トレハロース、そのモル濃度にかかわらない）及び増大濃度のアルギニンの存在下での５０ｍｇ／ｍｌ（再構成後は１００ｍｇ／ｍＬ）のｍＡｂ１の噴霧乾燥製剤の再構成時間は、アルギニンを含まない同じ製剤（約２２分）と比較して短縮される。図１０Ｃは、この効果が、糖及びアミノ酸のモル濃度の両方が組み合わされた場合（累積モル濃度）、プラトーに達するまで（ここでは約２００ｍＭの累積モル濃度）更に増大することを明確に示している。
【０１３３】
それと比較して、グリシンの存在は、そのモル濃度又は糖のモル濃度にかかわらずｍＡｂ１の再構成時間を改善しない。
【０１３４】
他の試験されたアミノ酸（プロリン及びリシン）もまた、アルギニンよりは顕著でないものの、累積モル濃度を考慮すると（図１２Ｃ及び図１３Ｃを参照されたい）再構成時間の短縮の傾向を示した。
【０１３５】
（例５）
再構成時間に対するアミノ酸及び糖の添加の効果を、５０ｍｇ／ｍＬ（再構成後は１００ｍｇ／ｍＬ）のｍＡｂ２（約７．６のｐＩを有するヒト化ＩｇＧモノクローナル抗体）を用いて更に分析した。様々なアミノ酸（Ａｒｇ−ＨＣｌ；Ｇｌｙ−ＨＣｌ、Ｌｙｓ−ＨＣｌ及びＰｒｏ−ＨＣｌ）並びに１種の糖（トレハロース）を、０．０１％ｗ／ｖのＰＳ２０（再構成後は０．０２％ｗ／ｖ）の存在下、１５ｍＭヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．６）中の１つのモル濃度のみ（アミノ酸に対しては１００ｍＭ、及び糖に対しては７５ｍＭ）で試験した。対照製剤は、アミノ酸を含んでいなかった。
【０１３６】
製剤の噴霧乾燥、再構成及び再構成時間の評価は、例３に従って行った。
【０１３７】
図１４は、試験されたアミノ酸は全て７５ｍＭの糖のみを含む製剤と比較して再構成時間を低減することができるが、アルギニンで最善の結果が得られ、続いてプロリン及びリシンで次善の結果が得られることを明確に示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021502990.tif 000014
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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