(57)【要約】  タンパク質およびペプチドをパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）ファミリーのメンバーにより産生される内生胞子の表面にターゲティングするために有用なシグナル配列、ならびにこれを用いる方法が提供される。特定のＮ末端ターゲティング配列およびこれの誘導体を用いて、異種分子、例えばペプチド、ポリペプチドおよび他の組換えコンストラクトなどをパエニバチルスファミリーメンバーの胞子表面にディスプレイすることも同じく提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質をコードする核酸分子であって、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、およびこれが作動可能に連結する（ｂ）前記Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含み、ここで、前記第一のポリヌクレオチド配列が、
（ｉ）少なくとも１５、３０、４５、６０、７５もしくは９０個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１９、２３、２５、２７もしくは２９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列；または
（ｉｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１９、２３、２５、２７もしくは２９の少なくとも４５、９０、１３５、１８０、２２５、２７０、３１５もしくは３４５個の連続したヌクレオチドからなる断片を含むポリヌクレオチド配列；
を含み、
前記Ｎ末端シグナルペプチドが、前記融合タンパク質をパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）内生胞子の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記核酸分子。
【請求項２】
前記断片が、配列番号１、３、５、７、９、１９、２３、２５、２７または２９の最初のヌクレオチドから始まる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記第一のポリヌクレオチド配列が、配列番号１、７、１９または２７と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記断片が、配列番号２または配列番号８のアミノ酸１〜１５、または１〜３０、１〜４５、１〜６０、１〜７５、１〜９０、１〜１０５、または１〜１１５をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種である前記ポリペプチドが、
（ａ）植物成長刺激性タンパク質；
（ｂ）酵素；
（ｃ）タンパク質；
（ｄ）パエニバチルスにとって異種であるポリペプチド；
（ｅ）治療タンパク質；または
（ｆ）植物免疫刺激性タンパク質
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
（ａ）１もしくは複数のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド（ここで、前記ポリペプチドは、前記Ｎ末端シグナルペプチドと前記Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種である前記ポリペプチドとの間に位置する）；
（ｂ）選択可能マーカーを含むポリペプチド；
（ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド；
（ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド；または
（ｅ）フレキシブルリンカーエレメントを含むポリペプチド（これは、前記Ｎ末端シグナルペプチドと前記Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種である前記ポリペプチドとを接続する）
をコードする第三のポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記パエニバチルス内生胞子が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバチルス・テラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ）、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）もしくはパエニバチルス・ペオリアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｏｒｉａｅ）を含むパエニバチルス種により形成される内生胞子であるか；または
パエニバチルス種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７、９８もしくは９９％の同一性を共有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を持つ細菌により形成される内生胞子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記第二のポリヌクレオチド配列およびパエニバチルスのうちの少なくとも１つにとって異種であるプロモーターエレメントに作動的に連結されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記第一のポリヌクレオチド配列が、
配列番号１、３、５、７、９、１９、２３、２５、２７または２９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するコドン最適化されたポリヌクレオチド配列またはその断片を含み、
それが、同一条件下で対応する最適化されていない配列と比較して、パエニバチルス内生胞子中でより速い速度でまたはより高レベルで発現される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドに作動可能に連結された前記Ｎ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質であって、前記Ｎ末端シグナルペプチドが、
（ｉ）少なくとも１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５もしくは１１５残基を含むポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１８、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３１もしくは３２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１８、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３１もしくは３２の少なくとも１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５もしくは１１５個の連続したアミノ酸からなる断片を含むポリペプチド；
を含み、
前記Ｎ末端シグナルペプチドが、前記融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記融合タンパク質。
【請求項１１】
前記断片が、配列番号２、４、６、８、１０、１８、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３１または３２の最初のアミノ酸から始まる、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ポリペプチド配列が、配列番号２、８、２０、２１、２２、２８、３１または３２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１０または１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記断片が、配列番号２、８、３１または３２のアミノ酸１〜１５、または１〜３０、１〜４５、１〜６０、１〜７５、１〜９０、１〜１０５、または１〜１１５を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種である前記ポリペプチドが、
（ａ）植物成長刺激性タンパク質；
（ｂ）酵素；
（ｃ）タンパク質；
（ｄ）パエニバチルスにとって異種であるポリペプチド；
（ｅ）治療タンパク質；または
（ｆ）植物免疫刺激性タンパク質
を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が、
（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドとの間に位置する、１もしくは複数のプロテアーゼ切断部位を含有するポリペプチド；
（ｂ）選択可能マーカーを含むポリペプチド；
（ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド；
（ｄ）少なくとも１つのタンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド；または
（ｅ）前記シグナルペプチドと前記Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種である前記ポリペプチドとを接続する、フレキシブルリンカーエレメントを含むポリペプチド
をさらに含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記パエニバチルス内生胞子が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバチルス・テラエ、パエニバチルス・ポリミキサもしくはパエニバチルス・ペオリアエを含むパエニバチルス種により形成される内生胞子であるか；または、パエニバチルス種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７、９８もしくは９９％の同一性を共有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を持つ細菌により形成される内生胞子である、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含む細菌染色体を含む、組換えパエニバチルス細胞。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターであって、前記ベクターが、プラスミド、人工染色体またはウイルスベクターを含む、前記ベクター。
【請求項１９】
（ａ）パエニバチルス細胞における安定な維持を提供する複製開始点；
（ｂ）パエニバチルス細胞における安定でない維持を選択的に提供する複製開始点；
（ｃ）パエニバチルス細胞における安定でない維持を選択的に提供する温度感受性の複製開始点；
（ｄ）発現制御配列に作動可能に連結された、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド；または
（ｅ）発現制御配列に作動可能に連結された、植物成長刺激性タンパク質をコードするポリヌクレオチド
のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターで形質転換された組換えパエニバチルス細胞。
【請求項２１】
前記パエニバチルス細胞が、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバチルス・テラエ、パエニバチルス・ポリミキサもしくはパエニバチルス・ペオリアエを含むパエニバチルス種であるか；または、パエニバチルス種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７、９８もしくは９９％の同一性を共有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を持つ細菌である、請求項２０に記載の組換えパエニバチルス細胞。
【請求項２２】
ａ）胞子形成が可能なパエニバチルス細胞を、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組換えベクターで形質転換すること；および
ｂ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされる融合タンパク質を、胞子形成の結果として融合タンパク質がパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングされるような胞子形成条件下で発現させること
を含む、パエニバチルス内生胞子の胞子表面上に異種の融合タンパク質をディスプレイする方法であって、
ここで、前記Ｎ末端シグナルペプチドが、（ｉ）少なくとも５、１０、１５、２０、２５もしくは３０残基を含むポリペプチド；（ｉｉ）配列番号２、４、６、８もしくは１０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、８もしくは１０の少なくとも５、１０、１５、２０、２５もしくは３０個の連続したアミノ酸からなる断片を含む、前記方法。
【請求項２３】
組成物であって、相乗的に有効な量で
ａ）請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する１または複数の組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞（ここで、前記Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種である前記ポリペプチドが、植物成長または免疫刺激性タンパク質を含む）を含み；および
ｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤を含んでもよい
前記組成物。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２０もしくは２１に記載の組換え細菌細胞、または請求項２３に記載の組成物で処理された種子。
【請求項２５】
植物成長を増進するためおよび／または植物健康を促進するために植物、種子、植物部分または植物周辺の土壌を処理する方法であって、相乗的に有効な量で、同時または逐次的に
ａ）請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス内生胞子（ここで、前記Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種である前記ポリペプチドが、植物成長または免疫刺激性タンパク質を含む）を施用するステップ；および
ｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤を施用してもよいステップ
を含む、前記方法。
【請求項２６】
組換えパエニバチルス内生胞子で処理された宿主植物をスクリーニングする方法であって、
ａ）請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されたパエニバチルス内生胞子を含む組成物を、パエニバチルスが持続的または一過性で定着することが可能な種子、苗または栄養生殖植物に施用し、処理された種子、苗または栄養生殖植物を生産するステップ；
ｂ）処理された種子、苗または栄養生殖植物の形質、構成成分または特質を検出する（さらに測定してもよい）ことにより、処理された種子、苗または栄養生殖植物をスクリーニングするステップ
を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記スクリーニングステップが、
ａ）処理された種子、苗もしくは栄養生殖植物から得られる細胞もしくは組織試料から調製される抽出物中に含有される１もしくは複数の化合物の存在、レベル、レベルの変化、活性もしくは局在を検出する（さらに定量してもよい）ことを含む少なくとも１つのインビトロアッセイ；および／または
ｂ）処理された種子、苗もしくは栄養生殖植物の形質、構成成分もしくは特質を検出する（さらに定量してもよい）ことを含む少なくとも１つのインビボアッセイ
のうちの１または複数を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
パエニバチルス細胞中で発現した異種のタンパク質またはペプチドを農業的に重要な性質についてスクリーニングする方法であって、
ａ）パエニバチルス細胞を、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変し、組換えパエニバチルス細胞を生産すること；および
ｂ）組換えパエニバチルス細胞により産生される化合物のレベルまたは活性を検出する（さらに定量してもよい）ことによりパエニバチルス細胞をスクリーニングすること
を含む、前記方法。
【請求項２９】
植物、種子、ヒトまたは動物を処理する方法であって、
組換えパエニバチルス細胞により産生される内生胞子を含む組成物を植物、種子、ヒトまたは動物に投与することを含み；
ここで、前記組換えパエニバチルス細胞が、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する、前記方法。
【請求項３０】
前記組成物が、生きたパエニバチルス細胞が残らないように熱不活化または滅菌されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
単離および／または精製された、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、組成物。
【請求項３２】
目的タンパク質を植物、種子または圃場に送達する方法であって、
組換えパエニバチルス内生胞子を含む組成物を植物、種子または圃場に施用することを含み；
ここで、前記組換えパエニバチルス内生胞子が、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するように改変されている、前記方法。
【請求項３３】
前記組成物が圃場に、
ａ）定植の前もしくは後に；
ｂ）出芽の前もしくは後に；
ｃ）粉末、懸濁液もしくは溶液として；施用され、および／または
ｄ）ここで、前記組成物が植物成長を刺激するかもしくは有害生物から植物を保護する１もしくは複数の付加的な化合物をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
タンパク質を内生胞子形成性細菌の胞子表面にターゲティングすることが可能であるＮ末端シグナル配列を同定するための方法であって、
内生胞子形成性細菌のゲノムを、配列「ＧＬＹ−Ｘ−Ｘ」（ここで「Ｘ」は任意のアミノ酸を表す）を有する複数のコラーゲン様トリプレットリピートを有するタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームについてスクリーニングすること；および
スクリーニングステップにおいて同定されたタンパク質のうちの少なくとも１つが内生胞子形成性細菌の胞子表面に局在することを、顕微鏡検査により、または実験的に決定すること
を含む、前記方法。
【請求項３５】
前記内生胞子形成性細菌が、タンパク分解抵抗性である毛髪様構造を包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
決定ステップにおいて胞子表面に局在し、内生胞子形成性細菌中で推定Ｎ末端シグナル配列およびレポーター遺伝子を含む融合タンパク質を発現させるものとして同定された少なくとも１つのタンパク質からの推定Ｎ末端シグナル配列を同定することをさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記胞子表面上での前記融合タンパク質の発現に基づいて、前記融合タンパク質を選択することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
選択された融合タンパク質中のレポーター遺伝子を目的のヌクレオチド配列で置き換えることで第二の融合タンパク質を生成させること、および前記第二の融合タンパク質を内生胞子形成性細菌中で発現させることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細菌が、パエニバチルス属、ビリディバチルス（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはリジニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細菌が、パエニバチルス属のメンバーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
局在が、透過電子顕微鏡検査または質量分析を用いて決定される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
Ｎ末端シグナルペプチドをコードする核酸分子であって、前記シグナルペプチドが、
ａ）請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法により内生胞子形成性細菌の胞子表面に局在することが決定されたタンパク質の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０個のＮ末端残基からなる連続的セグメント；
ｂ）請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の方法により内生胞子形成性細菌の胞子表面に局在することが決定されたタンパク質の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０個のＮ末端残基からなる連続的セグメントと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する配列；
を含み、
ここで、前記セグメントまたは配列が、細菌中で発現した場合に、このセグメントまたは配列を含む融合タンパク質を内生胞子形成性細菌の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記核酸分子。
【請求項４３】
融合タンパク質をコードする核酸分子であって、
（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、およびこれが作動可能に連結する（ｂ）前記Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含み、
ここで、前記第一のポリヌクレオチド配列が、請求項４２に記載の配列またはセグメントを含み、前記Ｎ末端シグナルペプチドが、融合タンパク質を細菌内生胞子の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記核酸分子。
【請求項４４】
細菌細胞の胞子形成の際に前記融合タンパク質の転写を引き起こす上流調節配列をさらに含む、請求項４３に記載の核酸分子。
【請求項４５】
前記細菌細胞が、パエニバチルスファミリーのメンバーである、請求項４４に記載の核酸分子。
【請求項４６】
前記上流調節配列が、
（ａ）配列番号１１〜１５のいずれか；
（ｂ）配列番号１１〜１５のいずれかの少なくとも２５、５０、１００、１５０個の連続的ヌクレオチドからなる断片を含む配列；
（ｃ）配列番号１１〜１５のいずれかまたはそれらの２５、５０、１００もしくは１５０個のヌクレオチドの断片と比較して少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列；
を含み、
ここで、前記上流調節配列が、前記細菌細胞の胞子形成の際に転写活性があるプロモーターを含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４７】
上流調節配列および目的タンパク質をコードする核酸分子であって、
（ａ）前記上流調節配列をコードする第一のポリヌクレオチド配列、およびこれが作動可能に連結する（ｂ）前記目的タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチド配列を含み；
ここで、前記目的タンパク質が、前記上流調節配列にとって異種であり、前記上流調節配列が、細菌細胞の胞子形成の際に前記目的タンパク質の転写を引き起こす、前記核酸分子。
【請求項４８】
前記細菌細胞が、パエニバチルスファミリーのメンバーである、請求項４７に記載の核酸分子。
【請求項４９】
前記上流調節配列が、
（ａ）配列番号１１〜１５のいずれか；
（ｂ）配列番号１１〜１５のいずれかの少なくとも２５、５０、１００、１５０個の連続的ヌクレオチドからなる断片を含む配列；
（ｃ）配列番号１１〜１５のいずれかまたはそれらの２５、５０、１００もしくは１５０個のヌクレオチドの断片と比較して少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列；
を含み、
ここで、前記上流調節配列が、前記細菌細胞の胞子形成の際に転写活性があるプロモーターを含む、請求項４７または４８に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８７，３７１号への優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出される配列表の参照
配列表の公式のコピーは、名称「ＢＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１８年１１月１３日、サイズ８０キロバイトのファイルを伴うＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出され、明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩ形式の書類の中に含有される配列表は明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本開示は、内生胞子ディスプレイプラットフォーム、関係するディスプレイ方法、胞子表面ターゲティング配列およびこれを含む融合タンパク質コンストラクト、組換え内生胞子組成物、ならびに様々な用途、例えば目的の異種分子の植物、種子または圃場への送達などのために有用なパエニバチルスおよび他の細菌の属における胞子表面のターゲティング配列を同定するための方法を全般的に対象とする。
【背景技術】
【０００４】
現代の農業技術は、作物の収量および品質を改善するために、植物の健康および成長を促進または増進する組成物に大きく依存している。かかる組成物は、一般に、有機または無機の肥料、栄養素、および植物の適切な成長および発育を促進する他の化合物を包含する。しかしながら、これらの組成物の多くを長期または過剰に用いることは、負の副作用、例えば土壌酸性化または土壌中の栄養バランスの不安定化などをもたらし得ることが十分に確立されている。そのうえ、過剰使用は、人間の消費のために栽培される作物中の有害な最終生成物の濃縮をもたらし得る。
【０００５】
現代の農場はまた、典型的には、有害生物を防除して商業的に栽培される作物の高収量を確保するために、多種多様な化学物質（例として殺虫剤、除草剤、殺菌剤、殺線虫剤および殺真菌剤）の使用に依存している。これらの化合物の多くは広範な活性を呈し、高濃度でヒトおよび動物に潜在的に有害であり得る。加えて、いくつかの化合物は、オフターゲット効果を呈する。そのうえ、これらの合成化合物のうちの少なくともいくつかは、非生分解性である。近年、合成の殺虫剤または殺真菌剤への曝露が低減されているかまたは全くない状態で育てられて収穫された農産物を求める消費者からの圧力が高まっている。合成の殺虫剤または殺真菌剤の使用から生じるさらなる問題は、反復的および／または排他的な使用が、しばしば抵抗性有害生物の選抜につながるということである。通常、抵抗性有害生物は、同じ作用様式を有する他の活性成分に対しても交差抵抗性である。結果として、有害生物防除組成物および化合物は、開発するのが困難でありかつ費用がかかる（例として安全性の懸念および抵抗性の急速な発達のため）。
【０００６】
合成化学物質に依存することなく、植物の成長および／または健康を促進するために、遺伝子工学的方法が用いられる。例えば、作物は、植物の成長および／もしくは健康に関連する遺伝子を導入もしくは改変するように、ならびに／または天然もしくは合成の有害生物防除剤をコードする遺伝子を導入するように改変することができる。導入遺伝子は、ウイルスベクターを用いて標的植物に導入され得る。近年、組換えタンパク質の植物への送達のために細菌を用いたいくつかの成功が報告されている。しかしながら、これまでのところ、かかる成功は、主に、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）のメンバー、より具体的には、最もよく性質決定されているグラム陽性細菌であり、胞子形成研究のための主要な細菌モデルであるバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に限定されている。Ｂ．サチリスが送達および発現のプラットフォームとして注目されているのは、さらには、Ｂ．サチリスのゲノムならびにタンパク質合成および分泌に関連する生物学的経路が十分に理解されているからである。しかしながら、細菌間の遺伝的多様性が高度であるため、Ｂ．サチリスの研究に基づく研究成果は、バチルス科の内外のメンバーに直接翻訳できないことがしばしばある。
【０００７】
したがって、異種の遺伝材料を送達するある種の方法が知られてはいるが、そのような遺伝材料のための新しい送達および発現プラットフォーム開発へのニーズが当該技術分野にある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、なかでも、パエニバチルス属の胞子形成性メンバーを用いて環境（例として植物、圃場）に組換え酵素および他の目的分子（例としてペプチド、タンパク質）を送達するための新たなプラットフォームを提供することにより上で特定したニーズに取り組む方法、組成物および遺伝子コンストラクトを記載する。本開示はまた、パエニバチルスおよび他の細菌の属における胞子表面のターゲティング配列を同定する方法を提供する。
【０００９】
１つの態様において、本開示は、（ｉ）植物の形質もしくは特質を付与もしくは改変する、少なくとも１つの異種のタンパク質もしくはペプチド（例として、植物成長刺激性化合物の産生もしくは活性化に関与する酵素；細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解もしくは改質する酵素；殺微生物もしくは静微生物性の化合物；または病原体もしくは有害生物から植物を保護する酵素、タンパク質もしくはペプチド）；および（ｉｉ）融合タンパク質をパエニバチルス細胞の胞子表面に局在化させるＮ末端ターゲティング配列を含む、融合タンパク質を発現する組換えの内生胞子産生性パエニバチルス細胞を提供する。この一般的組成物は、付加的な構成成分（例として植物の成長および／または健康を促進するもの）をさらに包含し得る。そのうえ、本明細書中に開示される方法の特定の実施形態は、植物の形質または特質を付与する、またはそうでなければ改変する異種のタンパク質およびペプチドの効率的ハイスループットスクリーニングを提供する。
【００１０】
代替的態様において、本開示は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、およびこれが作動可能に連結する（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、ここで第一のポリヌクレオチド配列は、（ｉ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１、３、５、７もしくは９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列；または（ｉｉｉ）配列番号１、３、５、７もしくは９の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５もしくは６０個の連続したヌクレオチドからなる断片を含むポリヌクレオチド配列を含み、Ｎ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記核酸分子を提供する。
【００１１】
別の代替的態様において、本開示は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、およびこれが作動可能に連結する（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、ここで第一のポリヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１、３、５、７もしくは９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１、３、５、７もしくは９の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５もしくは６０個の連続したヌクレオチドからなる断片を含むポリヌクレオチド配列を含み、Ｎ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記核酸分子を提供する。
【００１２】
いくつかの態様において、Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドは、（ａ）植物成長もしくは免疫刺激性タンパク質のうちの少なくとも１つ；（ｂ）酵素；（ｃ）タンパク質；（ｄ）パエニバチルスにとって異種であるポリペプチド；または（ｅ）治療的タンパク質を含む。選択された態様において、核酸分子は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドとの間に位置する、１もしくは複数のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド；（ｂ）選択可能マーカーを含むポリペプチド；（ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド；（ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド；または（ｅ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドとを接続するフレキシブルリンカーエレメントを含むポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１３】
いくつかの態様において、パエニバチルス内生胞子は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバチルス・テラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒａｅ）、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）またはパエニバチルス・ペオリアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｏｒｉａｅ）を含むパエニバチルス種により形成される内生胞子である。
【００１４】
他の態様において、パエニバチルス内生胞子は、パエニバチルス・アビシ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、パエニバチルス・アセチ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｅｔｉ）、パエニバチルス・アエスツアリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ）、パエニバチルス・アガレクセデンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒｅｘｅｄｅｎｓ）、パエニバチルス・アガリデボランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒｉｄｅｖｏｒａｎｓ）、パエニバチルス・アルギノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・アルゴリフォンチコラ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｇｏｒｉｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、パエニバチルス・アルカリテラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｉｔｅｒｒａｅ）、パエニバチルス・アルベイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉ）、パエニバチルス・アミロリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・アナエリカヌス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎａｅｒｉｃａｎｕｓ）、パエニバチルス・アンタルクティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・アピアリウス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｐｉａｒｉｕｓ）、パエニバチルス・アラキディス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒａｃｈｉｄｉｓ）、パエニバチルス・アサメンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・アゾレデュセンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、パエニバチルス・アゾトフィクサンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｚｏｔｏｆｉｘａｎｓ）、パエニバチルス・バエクロクダミソリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｅｋｒｏｋｄａｍｉｓｏｌｉ）、パエニバチルス・バルキノネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｒｃｉｎｏｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・バレンゴルジイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂａｒｅｎｇｏｌｔｚｉｉ）、パエニバチルス・ボレアリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）、パエニバチルス・ボビス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、パエニバチルス・ブラジレンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・カメリアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｍｅｌｌｉａｅ）、パエニバチルス・カンピナセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｍｐｉｎａｓｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・カスタネアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｔａｎｅａｅ）、パエニバチルス・カタルパエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｔａｌｐａｅ）、パエニバチルス・カトルミイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｔｈｏｒｍｉｉ）、パエニバチルス・カベルナエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｖｅｒｎａｅ）、パエニバチルス・セルロシリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・セルロシトロフィカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、パエニバチルス・チャルタリウス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈａｒｔａｒｉｕｓ）、パ��ニバチルス・チベンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｂｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・チンジュエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｎｊｕｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・キチノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・コンドロイティヌス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｕｓ）、パエニバチルス・チュンガンゲンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｕｎｇａｎｇｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・シネリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｎｅｒｉｓ）、パエニバチルス・シソロケンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｓｏｌｏｋｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・コンタミナンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ）、パエニバチルス・クッキイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｏｋｉｉ）、パエニバチルス・ククミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｃｕｍｉｓ）、パエニバチルス・カードラノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・デジョネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ダーウィニアヌス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｒｗｉｎｉａｎｕｓ）、パエニバチルス・ダウチ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄａｕｃｉ）、パエニバチルス・デンドリティフォルミス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｆｏｒｍｉｓ）、パエニバチルス・ドングドネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｏｎｇｄｏｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ドオサネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｏｏｓａｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ダラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｕｒｕｓ）、パエニバチルス・エダフィカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｄａｐｈｉｃｕｓ）、パエニバチルス・エヒメンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｈｉｍｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・エルギイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｌｇｉｉ）、パエニバチルス・エンドフィチカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・エテリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｔｈｅｒｉ）、パエニバチルス・ファエシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｅｃｉｓ）、パエニバチルス・ファビスポラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｖｉｓｐｏｒｕｓ）、パエニバチルス・フェラリウス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒａｒｉｕｓ）、パエニバチルス・フィリシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｌｉｃｉｓ）、パエニバチルス・フォンチコラ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、パエニバチルス・フォルシチアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒｓｙｔｈｉａｅ）、パエニバチルス・フリゴリレシステンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｉｇｏｒｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓ）、パエニバチルス・ガンスエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｎｓｕｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ゼラチニリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｌａｔｉｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・ギンセンガルビ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｎｓｅｎｇａｒｖｉ）、パエ��バチルス・ギンセンギフミ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｈｕｍｉ）、パエニバチルス・ギンセンギソリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ）、パエニバチルス・グラシアリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、パエニバチルス・グルカノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・グリカニリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・ゴルドナエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｏｒｄｏｎａｅ）、パエニバチルス・グラミニス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、パエニバチルス・グラニボランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｒａｎｉｖｏｒａｎｓ）、パエニバチルス・グアングゾウエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｕａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｉｓ）、またはパエニバチルス・ハレナエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｒｅｎａｅ）を含むパエニバチルス種により形成される内生胞子である。
【００１５】
いくつかの態様において、パエニバチルス内生胞子は、パエニバチルス・ヘメロカリコラ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｃｏｌａ）、パエニバチルス・ヒスパニカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｓｐａｎｉｃｕｓ）、パエニバチルス・ホドガイエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｏｄｏｇａｙｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ホルデイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｏｒｄｅｉ）、パエニバチルス・フミカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｕｍｉｃｕｓ）、パエニバチルス・フナネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｕｎａｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・イリノイセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｌｌｉｎｏｉｓｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ジャミラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊａｍｉｌａｅ）、パエニバチルス・ジルンリイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｉｌｕｎｌｉｉ）、パエニバチルス・コーベンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｂｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・コレオボランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、パエニバチルス・コンシデンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｎｓｉｄｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・コレエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・クリベンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｒｉｂｂｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・キュングヘエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｙｕｎｇｈｅｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ラクティス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、パエニバチルス・ラルバエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｒｖａｅ）、パエニバチルス・ラルバエ、パエニバチルス・ラルバエ、パエニバチルス・ロータス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、パエニバチルス・レムナエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｍｎａｅ）、パエニバチルス・レンチモルブス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）、パエニバチルス・レンタス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、パエニバチルス・リアオニンゲンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉａｏｎｉｎｇｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ルピニ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｕｐｉｎｉ）、パエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、パエニバチルス・マカリエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｑｕａｒｉｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・マカリエンシス、パエニバチルス・マカリエンシス、パエニバチルス・マーチャンチオフィトラム（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｒｃｈａｎｔｉｏｐｈｙｔｏｒｕｍ）、パエニバチルス・マリニセディミニス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｒｉｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）、パエニバチルス・マシリエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・メディカギニス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ）、パエニバチルス・メンデリイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｎｄｅｌｉｉ）、パエニバチルス・メタノリカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）、パエニバチルス・モンタニテラエ（Ｐａｅ���ｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｔａｎｉｔｅｒｒａｅ）、パエニバチルス・モトブエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｔｏｂｕｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ムシラギノサス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓｕｓ）、パエニバチルス・ナネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ナフタレノボランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｏｖｏｒａｎｓ）、パエニバチルス・ナスチテルミティス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｓｕｔｉｔｅｒｍｉｔｉｓ）、パエニバチルス・ネマトフィルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ）、パエニバチルス・ニコチアナエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、パエニバチルス・オーシャニセディミニス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｃｅａｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）、パエニバチルス・オドリファー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｄｏｒｉｆｅｒ）、パエニバチルス・オエノセラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｅｎｏｔｈｅｒａｅ）、パエニバチルス・オリゼ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、パエニバチルス・パブリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｂｕｌｉ）、パエニバチルス・パナシソリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎａｃｉｓｏｌｉ）、パエニバチルス・パナシテラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｎａｃｉｔｅｒｒａｅ）、パエニバチルス・パサデネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓａｄｅｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ペクチニリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｃｔｉｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・ペリアンドラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｒｉａｎｄｒａｅ）またはパエニバチルス・フェニシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）を含むパエニバチルス種により形成される内生胞子である。
【００１６】
いくつかの態様において、パエニバチルス内生胞子は、パエニバチルス・フィルロスファエラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ）、パエニバチルス・フィスコミトレラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａｅ）、パエニバチルス・ピニ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｉｎｉ）、パエニバチルス・ピニフミ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｉｎｉｈｕｍｉ）、パエニバチルス・ピネソリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｉｎｅｓｏｌｉ）、パエニバチルス・ポチェオネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｃｈｅｏｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ポピリアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）、パエニバチルス・ポプリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｕｌｉ）、パエニバチルス・プロソピディス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｒｏｓｏｐｉｄｉｓ）、パエニバチルス・プロベンセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｒｏｖｅｎｃｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・プエリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｅｒｉ）、パエニバチルス・プルドゥンゲンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｌｄｅｕｎｇｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・プルビファシエンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ）、パエニバチルス・プリスパチイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｒｉｓｐａｔｉｉ）、パエニバチルス・チンシェンギイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ）、パエニバチルス・クエルクス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｑｕｅｒｃｕｓ）、パエニバチルス・ラディシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒａｄｉｃｉｓ）、パエニバチルス・レリクチセサミ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｌｉｃｔｉｓｅｓａｍｉ）、パエニバチルス・レシデュイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｓｉｄｕｉ）、パエニバチルス・リゾリザエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈｉｚｏｒｙｚａｅ）、パエニバチルス・リゾスファエラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ）、パエニバチルス・リグイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｉｇｕｉ）、パエニバチルス・リオグランデンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｉｏｇｒａｎｄｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・リパエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｉｐａｅ）、パエニバチルス・サビナエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｂｉｎａｅ）、パエニバチルス・サチョネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｃｈｅｏｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・サリニカエニ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｎｉｃａｅｎｉ）、パエニバチルス・サングイニス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、パエニバチルス・セディミニス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）、パエニバチルス・セゲティス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｇｅｔｉｓ）、パエニバチルス・セレニイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｉ）、パエニバチルス・セレニチレデュセンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、パエニバチルス・セネガレンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・セプテントリオナリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｐｔｅｎｔｒｉｏｎａｌｉｓ）、パエニバチルス・セプルクリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｐｕｌｃｒｉ）、パエニバチルス・シェンヤンゲンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｈｅｎｙａｎｇｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・シラカミエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒａｋａｍｉｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・シアメンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・シラゲイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｌａｇｅｉ）、パエニバチルス・シノポドフィリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｎｏｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉ）、パエニバチルス・ソラニ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｌａｎｉ）、パエニバチルス・ソリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｌｉ）、パエニバチルス・ソンチ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｎｃｈｉ）、パエニバチルス・ソフォラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｏｐｈｏｒａｅ）、パエニバチルス・スプチ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｕｔｉ）、パエニバチルス・ステリファー（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｌｌｉｆｅｒ）、パエニバチルス・スソンゲンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｓｏｎｇｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・スウェンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｗｕｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・タイチョンゲンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔａｉｃｈｕｎｇｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・タイワネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・タリメンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔａｒｉｍｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・テルリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｌｌｕｒｉｓ）、パエニバチルス・テレウス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、パエニバチルス・テリゲナ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）、パエニバチルス・タイランデンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・サーモフィラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パエニバチルス・チアミノリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・ティエンムエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｉａｎｍｕｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・チベテンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｉｂｅｔｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・チモネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ツンドラエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｕｎｄｒａｅ）、パエニバチルス・ツリセンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・タイファエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｙｐｈａｅ）、パエニバチルス・ウリギニス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｕｌｉｇｉｎｉｓ）、パエニバチルス・ウリナリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｕｒｉｎａｌｉｓ）、パエニバチルス・バリダス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｉｄｕｓ）、パエニバチルス・ビニ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｉ）、パエニバチルス・ブルネリス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉ���ｌｕｓ  ｖｕｌｎｅｒｉｓ）、パエニバチルス・ウェンキシニアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｅｎｘｉｎｉａｅ）、パエニバチルス・ウーポネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｏｏｐｏｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ウソンゲンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｏｏｓｏｎｇｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ウルムキエンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｕｌｕｍｕｑｉｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ウィニイ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｙｎｎｉｉ）、パエニバチルス・キサンチニリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｘａｎｔｈｉｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・シンチャンゲンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｘｉｎｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・キシラネクセデンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｘｙｌａｎｅｘｅｄｅｎｓ）、パエニバチルス・キシラニリティカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｓ）、パエニバチルス・キシラニソルベンス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）、パエニバチルス・ヨンギネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｙｏｎｇｉｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ユンナネンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、パエニバチルス・ザントキシリ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｚａｎｔｈｏｘｙｌｉ）またはパエニバチルス・ゼアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｚｅａｅ）を含むパエニバチルス種により形成される内生胞子である。
【００１７】
いくつかの態様において、核酸分子は、第二のポリヌクレオチド配列およびパエニバチルスのうちの少なくとも１つにとって異種であるプロモーターエレメントに作動的に連結される。
【００１８】
いくつかの態様において、第一のポリヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号１、３、５、７または９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するコドン最適化されたポリヌクレオチド配列であって、同一条件下で元の配列番号１、３、５、７または９のそれぞれと比較して、パエニバチルス内生胞子中でより速い速度でまたはより高レベルで発現する、前記ポリヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
代替的態様において、本開示は、Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドに作動可能に連結されたＮ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質であって、ここでＮ末端シグナルペプチドは、（ａ）配列番号２、４、６、８もしくは１０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％もしくは８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または（ｂ）配列番号２、４、６、８もしくは１０の少なくとも５、１０、１５、２０、２５もしくは３０個の連続したアミノ酸からなる断片を含むポリペプチドを含み、Ｎ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記融合タンパク質を提供する。
【００２０】
いくつかの態様において、Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドは、（ａ）植物成長もしくは免疫刺激性タンパク質のうちの少なくとも１つ；（ｂ）酵素；（ｃ）パエニバチルスにとって異種であるポリペプチド；（ｄ）治療タンパク質（例として抗生物質もしくは抗炎症タンパク質）；または（ｅ）農業的に重要な性質を提供するタンパク質を含み、この農業的に重要な性質としては、限定されるものではないが、殺虫／静虫活性、殺菌／静菌活性、殺真菌／静真菌活性、植物成長、健康もしくは免疫刺激活性および／または改良された非生物的環境抵抗性が挙げられる。他の農業的に重要な性質には改良された作物特性が包含され、これらとしては、出芽、作物収量、タンパク質含量、油含量、デンプン含量、より発達した根系、根成長の改良、根サイズ維持の改良、根有効性の改良、ストレス耐性（例として、干ばつ、熱、塩分、ＵＶ、水、低温に対するもの）の改良、エチレン低減（産生低減および／または受容阻害）、分げつ増加、植物高の上昇、より大きな葉身、より少ない枯れた根出葉、より強い分げつ、より濃い緑色の葉色、色素含量、光合成活性、必要なインプット（例えば肥料または水など）がより少ないこと、必要な種子がより少ないこと、より生産性の高い分げつ、より早期の開花、早期の穀粒成熟、より少ない植物転倒（ｐｌａｎｔ  ｖｅｒｓｅ）（倒伏）、シュート成長の向上、植物成長力の増強、植物株立ち（ｓｔａｎｄ）の向上、ならびにより早期で良好な発芽が挙げられる。
【００２１】
いくつかの態様において、融合タンパク質は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドとの間に位置する、１もしくは複数のプロテアーゼ切断部位を含有するポリペプチド；（ｂ）選択可能マーカー（例として抗生物質への抵抗性を付与するタンパク質）を含むポリペプチド；（ｃ）可視化エレメント（例として蛍光タグ、例えばＧＦＰなど）を含むポリペプチド；（ｄ）少なくとも１つのタンパク質認識／精製ドメイン（例としてＨｉｓタグ）を含むポリペプチド；または（ｅ）シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドとを接続するフレキシブルリンカーエレメントを含むポリペプチドをさらに含む。
【００２２】
代替的態様において、本開示は、先の態様のうちのいずれか１つの核酸分子を含む細菌染色体を含む、組換えパエニバチルス細胞を提供する。
【００２３】
代替的態様において、本開示は、先の態様のうちのいずれか１つの核酸分子を含むベクターであって、プラスミド、人工染色体またはウイルスベクターを含む、前記ベクターを提供する。
【００２４】
いくつかの態様において、ベクターは、（ａ）パエニバチルス細胞における安定な維持を提供する複製開始点；（ｂ）パエニバチルス細胞における選択的な安定でない維持を提供する複製開始点；（ｃ）パエニバチルス細胞における選択的な安定でない維持を提供する温度感受性の複製開始点；（ｄ）発現制御配列に作動可能に連結された、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド；または（ｅ）発現制御配列に作動可能に連結された、植物成長刺激性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００２５】
代替的態様において、本開示は、本明細書中に開示される態様のうちのいずれか１つの核酸分子を含むベクターで形質転換された組換えパエニバチルス細胞を提供する。
【００２６】
いくつかの態様において、パエニバチルス細胞は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバチルス・テラエ、パエニバチルス・ポリミキサまたはパエニバチルス・ペオリアエを含むパエニバチルス種である。他の例示的態様において、パエニバチルス細胞は、本明細書中に記載される例示的なパエニバチルス種のいずれかから選択され得る。
【００２７】
代替的態様において、本開示は、ａ）胞子形成が可能なパエニバチルス細胞を、本明細書中に開示される態様のうちのいずれか１つの核酸分子を含む組換えベクターで形質転換すること；およびｂ）本明細書中に開示される態様のうちのいずれか１つの核酸分子によりコードされる融合タンパク質を、胞子形成の結果として融合タンパク質がパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングされるような胞子形成条件下で発現させることを含む、パエニバチルス内生胞子の胞子表面上に異種の融合タンパク質をディスプレイする方法であって、ここでＮ末端シグナルペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または（ｉｉ）配列番号２からの少なくとも５、１０、１５もしくは２０個の連続したアミノ酸からなる断片を含む、前記方法を提供する。
【００２８】
代替的態様において、本開示は、ａ）本明細書中に開示される態様のうちのいずれか１つの融合タンパク質を発現する１または複数の組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞であって、ここでＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドは、植物成長または免疫刺激性タンパク質を含む、前記細胞；および任意選択でｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤を、相乗的な有効量で含む組成物を提供する。
【００２９】
代替的態様において、本開示は、本明細書中に開示される態様のうちのいずれか１つの核酸、融合タンパク質、細菌細胞または組成物のうちの少なくとも１つで処理された種子を提供する。
【００３０】
代替的態様において、本開示は、ａ）本明細書中に開示される態様のうちのいずれかの融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス内生胞子であって、ここでＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドは、植物成長または免疫刺激性タンパク質を含む、前記内生胞子；および任意選択でｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤を、相乗的な有効量で、同時または逐次的に施用するステップを含む、植物成長を増進するためおよび／または植物健康を促進するために植物、種子、植物部分または植物周辺の土壌を処理する方法を提供する。
【００３１】
代替的態様において、本開示は、ａ）本明細書中に開示される態様のうちのいずれかによる融合タンパク質を発現するように改変されたパエニバチルス内生胞子を含む組成物を、パエニバチルスが持続的または一過性で定着することが可能な種子、苗または栄養生殖植物（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｐｌａｎｔ）に施用することで処理された種子、苗または栄養生殖植物を生産するステップ；ｂ）処理された種子、苗または栄養生殖植物の形質、構成成分または特質を検出し、任意選択で測定することにより、処理された種子、苗または栄養生殖植物をスクリーニングするステップを含む、組換えパエニバチルス内生胞子で処理された宿主植物をスクリーニングする方法を提供する。
【００３２】
いくつかの態様において、スクリーニングステップは、ａ）処理された種子、苗もしくは栄養生殖植物から得られる細胞もしくは組織試料から調製される抽出物中に含有される１もしくは複数の化合物の存在、レベル、レベルの変化、活性もしくは局在を検出し、任意選択で定量することを含む少なくとも１つのインビトロアッセイ；および／またはｂ）処理された種子、苗もしくは栄養生殖植物の形質、構成成分もしくは特質を検出し、任意選択で定量することを含む少なくとも１つのインビボアッセイのうちの１または複数を含む。
【００３３】
代替的態様において、本開示は、ａ）パエニバチルス細胞を、本明細書中に開示される態様による融合タンパク質を発現するように改変することで組換えパエニバチルス細胞を生産すること；およびｂ）組換えパエニバチルス細胞により産生される化合物のレベルまたは活性を検出し、任意選択で定量することによりパエニバチルス細胞をスクリーニングすることを含む、パエニバチルス細胞中で発現した異種のタンパク質またはペプチドを農業的に重要な性質についてスクリーニングする方法を提供する。
【００３４】
代替的態様において、本開示は、対象のパエニバチルスまたは別の内生胞子形成性細菌のゲノムを、複数のコラーゲン様トリプレットリピート「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘ」（「ＧＸＸリピート」、ここで「Ｘ」は任意のアミノ酸を表す）を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームについてスクリーニングすること；および、タンパク質が胞子表面に局在することを、顕微鏡検査により、または実験的に決定することを含む、内生胞子ディスプレイに適したパエニバチルスおよび他の細菌の属における胞子表面ターゲティング配列を同定するための方法を提供する。いくつかの態様において、タンパク質の局在は、透過電子顕微鏡検査または質量分析を用いて決定される。他の態様において、胞子表面に局在するタンパク質からの推定Ｎ末端ターゲティング配列は、レポーター遺伝子と融合され、結果として得られる融合タンパク質は、内生胞子形成性細菌中で発現される。なお他の態様において、結果として得られる融合タンパク質は、かかる内生胞子形成性細菌の表面上での発現が分析される。別の態様において、かかる発現が検出された場合、レポーター遺伝子は目的ヌクレオチド配列で置き換えられ、かかる第二の融合タンパク質は内生胞子形成性細菌中で発現される。
【００３５】
いくつかの態様において、本開示は、前述の方法によって同定されるタンパク質のＮ末端ターゲティング配列を含む、パエニバチルスおよび他の細菌の属からの胞子表面ターゲティングターゲティング配列を提供する。このＮ末端ターゲティング配列は、タンパク質の最初の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０個のアミノ酸、またはその断片もしくはバリアントを含み得る。いくつかの態様において、Ｎ末端ターゲティング配列は、内因性のＮ末端ターゲティング配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％同一なバリアントである。これらの方法を用いて同定されるパエニバチルスおよび他の細菌の属における胞子表面ターゲティング配列は、本明細書中に記載される様々な実施形態のうちのいずれかによる異種の融合タンパク質を作製するために用いられ得る。
【００３６】
選択された態様において、組成物は、生きたパエニバチルス細胞が残らないように熱不活化または滅菌されている。
【００３７】
代替的態様において、本開示は、本明細書中に開示される態様のうちのいずれか１つによる単離および／または精製された融合タンパク質を含む組成物を提供する。
【００３８】
代替的態様において、本開示は、組換えパエニバチルス内生胞子を含む組成物を植物、種子または圃場に施用することを含む、目的タンパク質を植物、種子または圃場に送達する方法であって、ここで組換えパエニバチルス内生胞子は、本明細書中に開示される態様のうちのいずれかによる融合タンパク質を発現するように改変されている、前記方法を提供する。
【００３９】
いくつかの態様において、組成物は、ａ）定植の前もしくは後に；ｂ）出芽の前もしくは後に；ｃ）粉末、懸濁液もしくは溶液として圃場に施用され、またはｄ）組成物は植物成長を刺激する１もしくは複数の付加的な化合物をさらに含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、およびこれが作動可能に連結する（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、ここで第一のポリヌクレオチド配列は、（ｉ）少なくとも１５、３０、４５、６０、７５もしくは９０個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１９、２３、２５、２７もしくは２９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列；または（ｉｉｉ）配列番号１、３、５、７、９、１９、２３、２５、２７もしくは２９の少なくとも４５、９０、１３５、１８０、２２５、２７０、３１５もしくは３４５個の連続したヌクレオチドからなる断片を含むポリヌクレオチド配列を含み、Ｎ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記核酸分子を提供する。
【００４１】
１つの態様において、断片は、配列番号１、３、５、７、９、１９、２３、２５、２７または２９の最初のヌクレオチドから始まる。別の態様において、第一のポリヌクレオチド配列は、配列番号１、７、１９または２７と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。別の態様において、断片は、配列番号２または配列番号８のアミノ酸１〜１５、または１〜３０、１〜４５、１〜６０、１〜７５、１〜９０、１〜１０５、または１〜１１５をコードする。
【００４２】
１つの実施形態において、Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドは、（ａ）植物成長刺激性タンパク質；（ｂ）酵素；（ｃ）タンパク質；（ｄ）パエニバチルスにとって異種であるポリペプチド；（ｅ）治療タンパク質；または（ｆ）植物免疫刺激性タンパク質を含む。
【００４３】
別の実施形態において、核酸は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドとの間に位置する、１もしくは複数のプロテアーゼ切断部位を含むポリペプチド；（ｂ）選択可能マーカーを含むポリペプチド；（ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド；（ｄ）タンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド；または（ｅ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドとを接続するフレキシブルリンカーエレメントを含むポリペプチドをコードする第三のポリヌクレオチド配列をさらに含む。
【００４４】
なお別の実施形態において、パエニバチルス内生胞子は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバチルス・テラエ、パエニバチルス・ポリミキサもしくはパエニバチルス・ペオリアエを含むパエニバチルス種により形成される内生胞子；またはパエニバチルス種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７、９８もしくは９９％の同一性を共有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を持つ細菌により形成される内生胞子である。
【００４５】
１つの態様において、核酸分子は、核酸分子は、第二のポリヌクレオチド配列およびパエニバチルスのうちの少なくとも１つにとって異種であるプロモーターエレメントに作動的に連結される。
【００４６】
別の態様において、第一のポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、５、７、９、１９、２３、２５、２７または２９と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有するコドン最適化されたポリヌクレオチド配列またはその断片であって、同一条件下で対応する最適化されていない配列と比較して、パエニバチルス内生胞子中でより速い速度でまたはより高レベルで発現する、前記ポリヌクレオチド配列またはその断片を含む。
【００４７】
なお別の態様において、本発明は、Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドに作動可能に連結されたＮ末端シグナルペプチドを含む融合タンパク質であって、ここでＮ末端シグナルペプチドは、（ｉ）少なくとも１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５もしくは１１５残基を含むポリペプチド；（ｉｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１８、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３１もしくは３２のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１８、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３１もしくは３２の少なくとも１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５もしくは１１５個の連続したアミノ酸からなる断片を含むポリペプチドを含み、Ｎ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記融合タンパク質に関する。
【００４８】
１つの実施形態において、断片は、配列番号２、４、６、８、１０、１８、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３１または３２の最初のアミノ酸から始まる。別の実施形態において、ポリペプチド配列は、配列番号２、８、２０、２１、２２、２８、３１または３２と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含む。なお別の実施形態において、断片は、配列番号２、８、３１または３２のアミノ酸１〜１５、または１〜３０、１〜４５、１〜６０、１〜７５、１〜９０、１〜１０５、または１〜１１５を含む。
【００４９】
いくつかの態様において、Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドは、（ａ）植物成長刺激性タンパク質；（ｂ）酵素；（ｃ）タンパク質；（ｄ）パエニバチルスにとって異種であるポリペプチド；（ｅ）治療タンパク質；または（ｆ）植物免疫刺激性タンパク質を含む。
【００５０】
他の態様において、融合タンパク質は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドとの間に位置する、１もしくは複数のプロテアーゼ切断部位を含有するポリペプチド；（ｂ）選択可能マーカーを含むポリペプチド；（ｃ）可視化マーカーを含むポリペプチド；（ｄ）少なくとも１つのタンパク質認識／精製ドメインを含むポリペプチド；または（ｅ）シグナルペプチドとＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドとを接続するフレキシブルリンカーエレメントを含むポリペプチドをさらに含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に開示される核酸分子を含む細菌染色体を含む組換えパエニバチルス細胞を提供する。
【００５２】
他の実施形態において、本発明は、本明細書中に開示される核酸分子を含むベクターであって、プラスミド、人工染色体またはウイルスベクターを含む、前記ベクターに関する。１つの態様において、ベクターは、（ａ）パエニバチルス細胞における安定な維持を提供する複製開始点；（ｂ）パエニバチルス細胞における選択的な安定でない維持を提供する複製開始点；（ｃ）パエニバチルス細胞における選択的な安定でない維持を提供する温度感受性の複製開始点；（ｄ）発現制御配列に作動可能に連結された、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド；または（ｅ）発現制御配列に作動可能に連結された、植物成長刺激性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つをさらに含む。
【００５３】
なお他の実施形態において、本発明は、本明細書中に開示される核酸分子を含むベクターで形質転換された組換えパエニバチルス細胞を提供する。１つの態様において、組換えパエニバチルス細胞は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバチルス・テラエ、パエニバチルス・ポリミキサもしくはパエニバチルス・ペオリアエを含むパエニバチルス種；またはパエニバチルス種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７、９８もしくは９９％の同一性を共有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を持つ細菌である。
【００５４】
いくつかの態様において、本発明は、ａ）胞子形成が可能なパエニバチルス細胞を、本明細書中に開示される核酸分子を含む組換えベクターで形質転換すること；およびｂ）本明細書中に開示される核酸分子によりコードされる融合タンパク質を、胞子形成の結果として融合タンパク質がパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングされるような胞子形成条件下で発現させることを含む、パエニバチルス内生胞子の胞子表面上に異種の融合タンパク質をディスプレイする方法であって、ここでＮ末端シグナルペプチドは、（ｉ）少なくとも５、１０、１５、２０、２５もしくは３０残基を含むポリペプチド；（ｉｉ）配列番号２、４、６、８もしくは１０のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％もしくは９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；または（ｉｉｉ）配列番号２、４、６、８もしくは１０の少なくとも５、１０、１５、２０、２５もしくは３０個の連続したアミノ酸からなる断片を含む、前記方法を提供する。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明は、ａ）本明細書中に開示される融合タンパク質を発現する１または複数の組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞であって、ここでＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドは、植物成長または免疫刺激性タンパク質を含む、前記細胞；および任意選択でｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤を、相乗的な有効量で含む組成物に関する。
【００５６】
なお別の実施形態において、本発明は、本明細書中に開示される核酸、本明細書中に開示される融合タンパク質、本明細書中に開示される組換え細菌細胞、または本明細書中に開示される組成物で処理された種子を提供する。
【００５７】
１つの態様において、本発明は、ａ）本明細書中に開示される融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス内生胞子であって、ここでＮ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドは、植物成長または免疫刺激性タンパク質を含む、前記内生胞子；および任意選択でｂ）少なくとも１つの生物学的防除剤を、相乗的な有効量で、同時または逐次的に施用するステップを含む、植物成長を増進するためおよび／または植物健康を促進するために植物、種子、植物部分または植物周辺の土壌を処理する方法を提供する。
【００５８】
別の態様において、本発明は、ａ）本明細書中に開示される融合タンパク質を発現するように改変されたパエニバチルス内生胞子を含む組成物を、パエニバチルスが持続的または一過性で定着することが可能な種子、苗または栄養生殖植物に施用することで処理された種子、苗または栄養生殖植物を生産するステップ；ｂ）処理された種子、苗または栄養生殖植物の形質、構成成分または特質を検出し、任意選択で測定することにより、処理された種子、苗または栄養生殖植物をスクリーニングするステップを含む、組換えパエニバチルス内生胞子で処理された宿主植物をスクリーニングする方法に関する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、スクリーニングステップは、ａ）処理された種子、苗もしくは栄養生殖植物から得られる細胞もしくは組織試料から調製される抽出物中に含有される１もしくは複数の化合物の存在、レベル、レベルの変化、活性もしくは局在を検出し、任意選択で定量することを含む少なくとも１つのインビトロアッセイ；および／またはｂ）処理された種子、苗もしくは栄養生殖植物の形質、構成成分もしくは特質を検出し、任意選択で定量することを含む少なくとも１つのインビボアッセイのうちの１または複数を含む。
【００６０】
１つの態様において、本発明は、ａ）パエニバチルス細胞を、本明細書中に開示される融合タンパク質を発現するように改変することで組換えパエニバチルス細胞を生産すること；およびｂ）組換えパエニバチルス細胞により産生される化合物のレベルまたは活性を検出し、任意選択で定量することによりパエニバチルス細胞をスクリーニングすることを含む、パエニバチルス細胞中で発現した異種のタンパク質またはペプチドを農業的に重要な性質についてスクリーニングする方法に関する。
【００６１】
また提供されるのは、組換えパエニバチルス細胞により産生される内生胞子を含む組成物を植物、種子、ヒトまたは動物に投与することを含む、植物、種子、ヒトまたは動物を処理する方法であって、組換えパエニバチルス細胞は、本明細書中に開示される融合タンパク質を発現する、前記方法である。
【００６２】
いくつかの態様において、組成物は、生きたパエニバチルス細胞が残らないように熱不活化または滅菌されている。
【００６３】
他の態様において、本発明は、本明細書中に開示される単離および／または精製された融合タンパク質を含む組成物に関する。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明は、組換えパエニバチルス内生胞子を含む組成物を植物、種子または圃場に施用することを含む、目的タンパク質を植物、種子または圃場に送達する方法であって、ここで組換えパエニバチルス内生胞子は、本明細書中に開示される融合タンパク質を発現するように改変されている、前記方法を提供する。
【００６５】
ある態様において、組成物は、ａ）定植の前もしくは後に；ｂ）出芽の前もしくは後に；ｃ）粉末、懸濁液もしくは溶液として圃場に施用され、および／またはｄ）組成物は植物成長を刺激するもしくは有害生物から植物を保護する１もしくは複数の付加的な化合物をさらに含む。
【００６６】
特定の実施形態において、本発明は、内生胞子形成性細菌のゲノムを、配列「ＧＬＹ−Ｘ−Ｘ」（ここで「Ｘ」は任意のアミノ酸を表す）を有する複数のコラーゲン様トリプレットリピートを有するタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームについてスクリーニングすること；および、スクリーニングステップにおいて同定されたタンパク質のうちの少なくとも１つが内生胞子形成性細菌の胞子表面に局在することを、顕微鏡検査により、または実験的に決定することを含む、タンパク質を内生胞子形成性細菌の胞子表面にターゲティングすることが可能であるＮ末端シグナル配列を同定するための方法に関する。
【００６７】
１つの態様において、内生胞子形成性細菌は、タンパク分解抵抗性である毛髪様構造を包含する。別の態様において、方法は、決定ステップにおいて胞子表面に局在し、内生胞子形成性細菌中で推定Ｎ末端シグナル配列およびレポーター遺伝子を含む融合タンパク質を発現させるものとして同定された少なくとも１つのタンパク質からの推定Ｎ末端シグナル配列を同定することをさらに含む。
【００６８】
別の態様において、方法は、胞子表面上での融合タンパク質の発現に基づいて融合タンパク質を選択することをさらに含む。なお別の態様において、方法は、選択された融合タンパク質中のレポーター遺伝子を目的のヌクレオチド配列で置き換えることで第二の融合タンパク質を生成させること、および第二の融合タンパク質を内生胞子形成性細菌中で発現させることをさらに含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、細菌は、パエニバチルス属、ビリディバチルス（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属またはリジニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバーである。１つの実施形態において、細菌は、パエニバチルス属のメンバーである。
【００７０】
いくつかの態様において、局在は、透過電子顕微鏡検査または質量分析を用いて決定される。
【００７１】
他の態様において、本発明は、Ｎ末端シグナルペプチドをコードする核酸分子に関し、ここでシグナルペプチドは、ａ）本明細書中に開示される方法により内生胞子形成性細菌の胞子表面に局在することが決定されたタンパク質の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０個のＮ末端残基からなる連続的セグメント；ｂ）本明細書中に開示される方法により内生胞子形成性細菌の胞子表面に局在することが決定されたタンパク質の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０個のＮ末端残基からなる連続的セグメントと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含み、ここでセグメントまたは配列は、細菌中で発現した場合にこのセグメントまたは配列を含む融合タンパク質を内生胞子形成性細菌の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記核酸分子を含む。
【００７２】
なお他の態様において、本発明は、（ａ）Ｎ末端シグナルペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、およびこれが作動可能に連結する（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチドにとって異種であるポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、ここで第一のポリヌクレオチド配列は、本明細書中に開示される配列またはセグメントを含み、Ｎ末端シグナルペプチドは、融合タンパク質を細菌内生胞子の胞子表面にターゲティングすることが可能である、前記核酸分子を提供する。
【００７３】
１つの態様において、核酸分子は、細菌細胞の胞子形成の際に融合タンパク質の転写を引き起こす上流調節配列をさらに含む。１つの実施形態において、細菌細胞は、パエニバチルスファミリーのメンバーである。
【００７４】
いくつかの実施形態において、上流調節配列は、（ａ）配列番号１１〜１５のいずれか；（ｂ）配列番号１１〜１５のいずれかの少なくとも２５、５０、１００、１５０個の連続的ヌクレオチドからなる断片を含む配列；（ｃ）配列番号１１〜１５のいずれかまたはそれらの２５、５０、１００もしくは１５０個のヌクレオチドの断片と比較して少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含み、ここで上流調節配列は、細菌細胞の胞子形成の際に転写活性があるプロモーターを含む。
【００７５】
なお他の実施形態において、本発明は、（ａ）上流調節配列をコードする第一のポリヌクレオチド配列、およびこれが作動可能に連結する（ｂ）目的タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチド配列を含む、上流調節配列および目的タンパク質をコードする核酸分子であって、ここで目的タンパク質は、上流調節配列にとって異種であり、上流調節配列は、細菌細胞の胞子形成の際に目的タンパク質の転写を引き起こす、前記核酸分子を提供する。１つの態様において、細菌細胞は、パエニバチルスファミリーのメンバーである。
【００７６】
別の態様において、上流調節配列は、（ａ）配列番号１１〜１５のいずれか；（ｂ）配列番号１１〜１５のいずれかの少なくとも２５、５０、１００、１５０個の連続的ヌクレオチドからなる断片を含む配列；（ｃ）配列番号１１〜１５のいずれかまたはそれらの２５、５０、１００もしくは１５０個のヌクレオチドの断片と比較して少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含み、ここで上流調節配列は、細菌細胞の胞子形成の際に転写活性があるプロモーターを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の内生胞子の透過電子顕微鏡写真を描写する。コラーゲン様タンパク質から構成される毛髪様構造が内生胞子表面から伸びている様子が示され、１つのかかる構造が矢印により表示される。
【図２Ａ】図２Ａは、本開示による例示的Ｎ末端ターゲティング配列、具体的にはこの図により示されるように内生胞子表面に局在する（配列番号２）−ＧＦＰ融合タンパク質コンストラクトを発現するパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２内生胞子の位相差顕微鏡写真（左側）および落射蛍光顕微鏡写真（右側）（倍率１０００倍）を描写する。右側パネル中のＧＦＰタンパク質により産生される蛍光は、左側パネル中の位相差顕微鏡検査（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｏｙ）で観察された細胞イメージと対応しており、内生胞子表面へのＧＦＰの正しい局在を指し示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本開示による例示的Ｎ末端ターゲティング配列、具体的には内生胞子表面（影付きの領域）に局在する（配列番号２）−ＧＦＰ融合タンパク質コンストラクトを発現するパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２内生胞子のフローサイトメトリーヒストグラムを描写する。観察可能なＧＦＰ蛍光がない野生型のパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２内生胞子が比較のために示される（白色、点線の領域）。この図上では各胞子集団について１０，０００イベントが示される。
【図３】図３は、本開示による例示的な胞子表面ターゲティング配列である配列番号２および配列番号８のＮ末端部の局所的な配列アラインメントを描写する。コンセンサス配列（配列番号３２）がアラインメントの下に示される。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本開示は、融合タンパク質をパエニバチルスの胞子表面にターゲティングすることが可能な遺伝子コンストラクト、同様に、目的の異種分子（例としてペプチド、タンパク質）を様々な環境、例えば植物などに送達するためにこれらのコンストラクトを用いた組成物および方法を提供する。例えば、組換えパエニバチルス内生胞子での処理後、処理された植物は、パエニバチルス内生胞子によって送達された異種タンパク質に起因し得る変化を検出するためにスクリーニングされ得る。かかる変化としては、宿主植物の成長速度または収量が変わること；植物健康（例として環境ストレス、病害または有害生物への抵抗性）の増進；および組換えパエニバチルス内生胞子で処理されずに同条件下で成長した宿主植物と比較して、増強された、改変された、またはそうでなければ新たな特質の呈示が挙げられ得る。異種タンパク質を胞子表面に効率的にターゲティングするターゲティング配列の使用はまた、例えば、植物の形質または特質を増強する、改変するおよび／または新たに付与することが可能である有用な異種タンパク質のハイスループットスクリーニングのためのプラットフォームを提供する。
【００７９】
古典的な胞子形成プロセス（Ｂ．サチリスを用いた研究に基づいて解明されたもの）は、栄養細胞が非対称的に細胞分裂することで母細胞および前胞子が形成されることを伴い、これらは介在する隔壁により分離された２つの異なる区画として発達する。最終的に、隔壁中のペプチドグリカンが分解され、前胞子が母細胞に飲み込まれ、細胞内細胞を形成する。母細胞と前胞子との間の細胞内コミュニケーションが各細胞における細胞特異的な遺伝子発現を調整し、その結果、内生胞子特異的な化合物の産生、前胞子周囲の皮質層の形成およびコートの沈着がもたらされる。
【００８０】
いくつかのバチルスの種、例としてＢ．サチリス、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）において、このコートは、内生胞子の最外層になっていく。前胞子は、最後の脱水および成熟を経て、完全な内生胞子となる。母細胞は続いてプログラム細胞死によって分解され、その結果、内生胞子は環境中に放出される。内生胞子は次いで典型的には、より好都合な条件または特定の刺激が発芽および栄養生殖状態（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｓｔａｔｅ）への回帰を誘発するまで、休眠状態にとどまる。
【００８１】
胞子と環境との間の最も外側の表面として、コート層は多くの決定的な機能を担っている。詳細には、この層は、環境の侵襲に対する半透性のバリアとして作用し、周辺環境との相互作用を仲介し、それゆえに胞子生存率の維持において、および内生胞子の発芽を誘発する条件の感知において重要な役割を果たす。コート層は、宿主免疫細胞の認識に寄与する病原性細菌株の細胞表面分子を含有することから、臨床研究のターゲットでもある。Ｂ．サチリスの胞子コート上に異種タンパク質をディスプレイする方法は、Ｂ．サチリスの胞子コートタンパク質を含有する融合タンパク質コンストラクト、例えば目的タンパク質と融合させたＣｏｔＣなどを用いて開発された。しかしながら、パエニバチルスの胞子表面タンパク質は未知であり、それゆえにＢ．サチリスを用いた研究は、どのようにして融合タンパク質が他の細菌の属、例えばパエニバチルスなどの胞子表面にターゲティングされ得るかについてのガイダンスを提供することはできない。
【００８２】
対照的に、本開示は、融合タンパク質コンストラクトをパエニバチルス細胞の胞子表面にターゲティングすることが可能なＮ末端コンストラクトおよびこれを含む融合タンパク質を提供する。融合タンパク質を胞子表面にターゲティングするために用いられるＮ末端シグナル配列は、配列番号２、４、６、８または１０により表される配列を有するポリペプチドを含み得る。あるいは、選択実施形態において、このＮ末端シグナル配列は、胞子表面ターゲティング機能を保持するのに十分な配列番号２、４、６、８または１０の断片またはバリアントを含み得る。例えば、断片は、配列番号２、４、６、８または１０の最初の１０、１５、２０、２５または３０アミノ酸を含み得る。さらなる代替的態様は、配列番号１、３、５、７もしくは９のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるＮ末端シグナル配列、またはその断片もしくはバリアントを包含する。これらおよび他の実施形態は、本明細書中に記載される。
【００８３】
本開示の全体を通じて、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその任意の派生物（例として含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ））は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」または適用可能な対応するその派生物で置き換えられ得る。
【００８４】
本明細書中で用いられるとき、「パエニバチルス」とは、パエニバチルス属に分類される内生胞子産生性細菌をいう。この用語は、限定されることなく、様々なパエニバチルスファミリーのメンバーを包含し、これらとしては、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバチルス・アビシ、パエニバチルス・アセチ、パエニバチルス・アエスツアリ、パエニバチルス・アガレクセデンス、パエニバチルス・アガリデボランス、パエニバチルス・アルギノリティカス、パエニバチルス・アルゴリフォンチコラ、パエニバチルス・アルカリテラエ、パエニバチルス・アルベイ、パエニバチルス・アミロリティカス、パエニバチルス・アナエリカヌス、パエニバチルス・アンタルクティカス、パエニバチルス・アピアリウス、パエニバチルス・アラキディス、パエニバチルス・アサメンシス、パエニバチルス・アゾレデュセンス、パエニバチルス・アゾトフィクサンス、パエニバチルス・バエクロクダミソリ、パエニバチルス・バルキノネンシス、パエニバチルス・バレンゴルジイ、パエニバチルス・ボレアリス、パエニバチルス・ボビス、パエニバチルス・ブラジレンシス、パエニバチルス・カメリアエ、パエニバチルス・カンピナセンシス、パエニバチルス・カスタネアエ、パエニバチルス・カタルパエ、パエニバチルス・カトルミイ、パエニバチルス・カベルナエ、パエニバチルス・セルロシリティカス、パエニバチルス・セルロシトロフィカス、パエニバチルス・チャルタリウス、パエニバチルス・チベンシス、パエニバチルス・チンジュエンシス、パエニバチルス・キチノリティカス、パエニバチルス・コンドロイティヌス、パエニバチルス・チュンガンゲンシス、パエニバチルス・シネリス、パエニバチルス・シソロケンシス、パエニバチルス・コンタミナンス、パエニバチルス・クッキイ、パエニバチルス・ククミス、パエニバチルス・カードラノリティカス、パエニバチルス・デジョネンシス、パエニバチルス・ダーウィニアヌス、パエニバチルス・ダウチ、パエニバチルス・デンドリティフォルミス、パエニバチルス・ドングドネンシス、パエニバチルス・ドオサネンシス、パエニバチルス・ダラス、パエニバチルス・エダフィカス、パエニバチルス・エヒメンシス、パエニバチルス・エルギイ、パエニバチルス・エンドフィチカス、パエニバチルス・エテリ、パエニバチルス・ファエシス、パエニバチルス・ファビスポラス、パエニバチルス・フェラリウス、パエニバチルス・フィリシス、パエニバチルス・フォンチコラ、パエニバチルス・フォルシチアエ、パエニバチルス・フリゴリレシステンス、パエニバチルス・ガンスエンシス、パエニバチルス・ゼラチニリティカス、パエニバチルス・ギンセンガルビ、パエニバチルス・ギンセンギフミ、パエニバチルス・ギンセンギソリ、パエニバチルス・グラシアリス、パエニバチルス・グルカノリティカス、パエニバチルス・グリカニリティカス、パエニバチルス・ゴルドナエ、パエニバチルス・グラミニス、パエニバチルス・グラニボランス、パエニバチルス・グアングゾウエンシス、パエニバチルス・ハレナエ、パエニバチルス・ヘメロカリコラ、パエニバチルス・ヒスパニカス、パエニバチルス・ホドガイエンシス、パエニバチルス・ホルデイ、パエニ���チルス・フミカス、パエニバチルス・フナネンシス、パエニバチルス・イリノイセンシス、パエニバチルス・ジャミラエ、パエニバチルス・ジルンリイ、パエニバチルス・コーベンシス、パエニバチルス・コレオボランス、パエニバチルス・コンシデンシス、パエニバチルス・コレエンシス、パエニバチルス・クリベンシス、パエニバチルス・キョンヒエンシス、パエニバチルス・ラクティス、パエニバチルス・ラルバエ、パエニバチルス・ラルバエ、パエニバチルス・ラルバエ、パエニバチルス・ロータス、パエニバチルス・レムナエ、パエニバチルス・レンチモルブス、パエニバチルス・レンタス、パエニバチルス・リアオニンゲンシス、パエニバチルス・ルピニ、パエニバチルス・マセランス、パエニバチルス・マカリエンシス、パエニバチルス・マカリエンシス、パエニバチルス・マカリエンシス、パエニバチルス・マーチャンチオフィトラム、パエニバチルス・マリニセディミニス、パエニバチルス・マシリエンシス、パエニバチルス・メディカギニス、パエニバチルス・メンデリイ、パエニバチルス・メタノリカス、パエニバチルス・モンタニテラエ、パエニバチルス・モトブエンシス、パエニバチルス・ムシラギノサス、パエニバチルス・ナネンシス、パエニバチルス・ナフタレノボランス、パエニバチルス・ナスチテルミティス、パエニバチルス・ネマトフィルス、パエニバチルス・ニコチアナエ、パエニバチルス・オーシャニセディミニス、パエニバチルス・オドリファー、パエニバチルス・オエノセラエ、パエニバチルス・オリゼ、パエニバチルス・パブリ、パエニバチルス・パナシソリ、パエニバチルス・パナシテラエ、パエニバチルス・パサデネンシス、パエニバチルス・ペクチニリティカス、パエニバチルス・ペオリアエ、パエニバチルス・ペリアンドラエ、パエニバチルス・フェニシス、パエニバチルス・フィルロスファエラエ、パエニバチルス・フィスコミトレラエ、パエニバチルス・ピニ、パエニバチルス・ピニフミ、パエニバチルス・ピネソリ、パエニバチルス・ポチェオネンシス、パエニバチルス・ポリミキサ、パエニバチルス・ポピリアエ、パエニバチルス・ポプリ、パエニバチルス・プロソピディス、パエニバチルス・プロベンセンシス、パエニバチルス・プエリ、パエニバチルス・プルドゥンゲンシス、パエニバチルス・プルビファシエンス、パエニバチルス・プリスパチイ、パエニバチルス・チンシェンギイ、パエニバチルス・クエルクス、パエニバチルス・ラディシス、パエニバチルス・レリクチセサミ、パエニバチルス・レシデュイ、パエニバチルス・リゾリザエ、パエニバチルス・リゾスファエラエ、パエニバチルス・リグイ、パエニバチルス・リオグランデンシス、パエニバチルス・リパエ、パエニバチルス・サビナエ、パエニバチルス・サチョネンシス、パエニバチルス・サリニカエニ、パエニバチルス・サングイニス、パエニバチルス・セディミニス、パエニバチルス・セゲティス、パエニバチルス・セレニイ、パエニバチルス・セレニチレデュセンス、パエニバチルス・セネガレンシス、パエニバチルス・セプテントリオナリス、パエニバチルス・セプルクリ、パエニバチルス・シェンヤンゲンシス、パエニバチルス・シラカミエンシス、パエニバチルス・シアメンシ���、パエニバチルス・シラゲイ、パエニバチルス・シノポドフィリ、パエニバチルス・ソラニ、パエニバチルス・ソリ、パエニバチルス・ソンチ、パエニバチルス・ソフォラエ、パエニバチルス・スプチ、パエニバチルス・ステリファー、パエニバチルス・スソンゲンシス、パエニバチルス・スウェンシス、パエニバチルス・タイチョンゲンシス、パエニバチルス・タイワネンシス、パエニバチルス・タリメンシス、パエニバチルス・テルリス、パエニバチルス・テラエ、パエニバチルス・テレウス、パエニバチルス・テリゲナ、パエニバチルス・タイランデンシス、パエニバチルス・サーモフィラス、パエニバチルス・チアミノリティカス、パエニバチルス・ティエンムエンシス、パエニバチルス・チベテンシス、パエニバチルス・チモネンシス、パエニバチルス・ツンドラエ、パエニバチルス・ツリセンシス、パエニバチルス・タイファエ、パエニバチルス・ウリギニス、パエニバチルス・ウリナリス、パエニバチルス・バリダス、パエニバチルス・ビニ、パエニバチルス・ブルネリス、パエニバチルス・ウェンキシニアエ、パエニバチルス・ウーポネンシス、パエニバチルス・ウソンゲンシス、パエニバチルス・ウルムキエンシス、パエニバチルス・ウィニイ、パエニバチルス・キサンチニリティカス、パエニバチルス・シンチャンゲンシス、パエニバチルス・キシラネクセデンス、パエニバチルス・キシラニリティカス、パエニバチルス・キシラニソルベンス、パエニバチルス・ヨンギネンシス、パエニバチルス・ユンナネンシス、パエニバチルス・ザントキシリおよびパエニバチルス・ゼアエが挙げられる。
【００８５】
ある態様において、融合タンパク質を発現させるために用いられるパエニバチルスのメンバーは、土壌から単離されたグラム陽性、好気性の芽胞形成性の細菌であるパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２である。パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の試料は、２０１４年８月２８日に、ブダペスト条約の下、米国農務省の国立農業利用研究センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）農業研究局（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）、１８１５  Ｎｏｒｔｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ６１６０４，Ｕ．Ｓ．Ａ．にある農業研究局カルチャーコレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＮＲＲＬ）に寄託されている。パエニバチルス胞子の基本的な組成または構造に関する知識が全般的に足りないことを考えると、この層の形成の際にタンパク質が胞子表面にターゲティングされるプロセスに関してはほとんど知られていない。
【００８６】
ある態様において、融合タンパク質を発現させるために用いられるパエニバチルスのメンバーは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２または本明細書中に開示される他の例示的なパエニバチルスファミリーメンバーのうちのいずれかの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と少なくとも９７、９８または９９パーセントの同一性を共有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を持つ細菌である。あるいは、融合タンパク質を発現させるために用いられるパエニバチルスのメンバーは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２または本明細書中に開示される他の例示的なパエニバチルスファミリーメンバーのうちのいずれかのそれと少なくとも７０パーセントのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション値を持つ細菌である。別の例において、融合タンパク質を発現させるために用いられるパエニバチルスのメンバーは、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２または本明細書中に開示される他の例示的なパエニバチルスファミリーメンバーのうちのいずれかのそれと９５、９６、９７、９８または９９パーセントの平均ヌクレオチド同一性を持つ細菌である。
【００８７】
用語「Ｎ末端シグナル配列」とは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはその近位にあるポリペプチド配列をいい、これは、ポリペプチドの細胞内区画への、または分泌のための局在化を導く。この用語は、文脈に応じて、用語「Ｎ末端ターゲティング配列」、「ターゲティング配列」、「シグナル配列」および「シグナルペプチド」と交換可能に用いられ得ることが認識され、理解される。Ｎ末端シグナル配列は、成熟タンパク質のポリペプチド配列の一部として保持され得て、あるいは局在化プロセスの際またはその後に切断されてもよい。この用語は、ポリペプチドのアミノ末端またはその近位にあるポリペプチド配列を具体的に指すために用いられ得て、これは、パエニバチルス内生胞子の胞子表面へのポリペプチドの局在化を導く。この関連で、Ｎ末端シグナル配列に必要とされる唯一の機能は、それがその一部であるポリペプチドをパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングする能力である。
【００８８】
「植物」または「宿主植物」は、パエニバチルスが定着することができる根圏または葉圏を持つ任意の植物、同様にパエニバチルス菌にとって一過性の宿主として働く植物を包含する。定着は、本開示のある態様において好ましいこともあるが、本明細書に記載される方法および組成物が機能するための要件ではない。
【００８９】
本明細書中で用いられるとき、「生物学的防除」は、第二の生物または生物学的分子の使用による、病原体および／または昆虫および／またはダニ類（ａｃａｒｉｄ）および／または線虫の防除として定義される。生物学的防除の公知のメカニズムは、根の表面上の空間または栄養分について真菌と競合して打ち負かすことにより根腐れを防除する細菌を包含する。細菌毒素、例えば抗生物質などは、病原体を防除するために用いられてきた。毒素は、単離して植物に直接施用することができ、または細菌種は、その場で毒素を産生するように投与され得る。生物学的防除を発揮させる他の手段としては、標的の植物病原体、昆虫、ダニ（ｍｉｔｅ）もしくは線虫に対して活性を持つ、または標的の有害生物／病原体を攻撃するある種の真菌産生成分の施用が挙げられる。「生物学的防除」はまた、植物健康、成長、成長力、ストレス応答または収量に対して有益な効果を有する微生物を包含し得る。施用経路としては、噴霧施用、土壌施用および種子処理が挙げられる。
【００９０】
「ハイブリダイゼーション」とは、１または複数のポリヌクレオチドが反応することでヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応をいう。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対、フーグスティン結合または任意の他の配列特異的方法で起こり得る。複合体は、二重構造を形成する２本のストランド、多重鎖複合体を形成する３本以上のストランド、セルフハイブリダイズする１本のストランド、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」条件下で実施することができる。一般的に、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、約４０℃で、１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液中で行われる。中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、典型的に約５０℃、６×ＳＳＣ中で実施され、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、一般に約６０℃、１×ＳＳＣ中で実施される。
【００９１】
本明細書中で用いられるとき、用語「配列同一性」とは２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が比較ウインドウにわたって同一である（すなわち、それぞれヌクレオチド−ヌクレオチド間または残基−残基間を基準として同一である）程度をいう。配列同一性のパーセンテージは、最適にアラインメントされた２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較し、両配列において同一の核酸塩基（例としてポリヌクレオチド配列の場合はＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）が生じる位置の数を決定することで一致する位置の数を得て、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数（すなわちウィンドウサイズ）で除算し、その結果に１００を乗じることで配列同一性のパーセンテージを得ることにより、計算される。同等の計算は、アラインメントされた２つのアミノ酸配列を比較することにより、実施することができる。
【００９２】
アミノ酸配列の比較に関して、比較は、配列同一性の測定に加えて、残基の変化が「保存的」な置換を構成するかどうかも考慮し得る。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の交換可能性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリンおよびアスパラギン−グルタミンである。
【００９３】
Ｎ末端ターゲティング配列
本開示は、パエニバチルス菌からのＮ末端ターゲティング配列を提供する。ストレスの多い環境条件下で、パエニバチルスファミリーの細菌は、胞子形成を経て、より長い期間、休眠状態のままでいることができる内生胞子を形成する。本明細書中に詳細に記載されるように、パエニバチルス内生胞子の最外層は胞子表面として知られ、タンパク質層を含む。バチルスの胞子表面ターゲティング配列に関する利用可能な文献が増えているにもかかわらず、パエニバチルスにおける相同のＮ末端ターゲティング配列を同定する研究は報告されていない。胞子表面をターゲットとする公知のタンパク質であるＣｏｔＣ、ＢｃｌＡ、ＢｃｌＢまたはＢｅｔＡのバイオインフォマティクス解析は、パエニバチルスにおける相同のＮ末端ターゲティング配列を何ら明らかにすることができず、このことは、これらのタンパク質の胞子表面ターゲティング配列はパエニバチルス属において保存されていないことを示唆する。パエニバチルスの胞子表面を形成してこれに局在するタンパク質の性質決定が限られていることを考えると、パエニバチルスにおいて全般的に、またはこの属内の特定の種（例としてパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２）において、タンパク質を胞子表面にターゲティングするために必要なＮ末端シグナル配列を容易に推論することはできない。
【００９４】
利用可能な文献中のガイダンスがこのように不足しているにもかかわらず、本発明者らは、内因性タンパク質および融合タンパク質をパエニバチルス細胞の胞子表面に導くことが可能なＮ末端ターゲティング配列を同定した。
【００９５】
参照を容易にするため、本明細書中で言及されるヌクレオチドおよびポリペプチド配列の配列番号を下の表１中に収載する。
【００９６】
表１：例示的なパエニバチルスＮ末端ターゲティング配列（すなわち配列番号１〜１０および１８）ならびに上流調節配列（すなわち配列番号１１〜１５）
【表１】
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【００９７】
表２：付加的な例示的パエニバチルスＮ末端ターゲティング配列
【表２】
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【００９８】
表１上に収載される例示的なＮ末端ターゲティング配列（すなわち配列番号１〜１０および１８）および表２中に収載される例示的なＮ末端ターゲティング配列（すなわち配列番号１９〜３０）に加えて、さらなる実施形態において、前述の配列のいずれかと少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有するバリアント配列も、その配列が融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングする能力を保持するかぎり、用いられ得る。いくつかの実施形態において、表１中に収載されるポリペプチド配列のいずれかから選択される少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の連続的アミノ酸からなる断片が用いられ得る。いくつかの態様において、必要とされる唯一の機能は、その配列が融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングする能力を維持することである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、このＮ末端シグナル配列またはそのバリアントもしくは断片は、連結されるＮ末端シグナル配列にとって異種である目的のペプチドまたはポリペプチド配列を含む融合タンパク質を、パエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングするために用いられ得る。いくつかの実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、表１上に収載される個々の配列のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸からなる、表１上に収載される個々のポリペプチド配列のいずれかのうちの同数のアミノ酸からなる連続的配列と同一である、少なくとも１つの連続的配列を含む。
【０１００】
本明細書中で論じられるように、本開示のいくつかの態様による融合タンパク質コンストラクトは、融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングするＮ末端シグナル配列またはそのバリアントもしくは断片、およびＮ末端シグナル配列にとって異種であるポリペプチド配列を含む。しかしながら、さらなる態様において、開示される配列、同様に開示される態様のいずれかによるその配列バリアントおよび断片のいずれも、他の目的のために用いられ得る。本開示はこれらの配列がＮ末端胞子表面ターゲティング配列として機能する態様に注目しているが、このことは、他の機能の否認として解釈されるものではない。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号２、４、６、８または１０により表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。代替的実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号２、４、６、８または１０の断片を含む（例として配列番号２、４、６、８または１０のいずれかにおいて見出される少なくとも１つの連続的な部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド）。代替的実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号２、４、６、８または１０のバリアントを含む（例として配列番号２、４、６、８または１０により表される配列と最小のまたは全く同じ程度のパーセンテージ同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチド）。選択実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、上で定義されるように、断片およびバリアントのいずれとしても適格であり得る（例として、配列番号２、４、６、８または１０中に見出される連続的部分配列に続いて、開示される配列同一性の範囲内に入る異なる配列を含むＮ末端シグナル配列）。
【０１０２】
選択実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号２、４、６、８または１０により表されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
選択実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号２、４、６、８または１０により表されるアミノ酸配列の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸からなる連続的配列と同一である、少なくとも５、１０、１５、２０または２５アミノ酸からなる連続的配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号１、３、５、７または９により表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。代替的実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号１、３、５、７または９により表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片を含む（例として、配列番号１、３、５、７または９により表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド中に見出される少なくとも１つの連続的部分配列を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド）。代替的実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号１、３、５、７または９により表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドのバリアントを含む（例として、配列番号１、３、５、７または９により表される配列のいずれかにより表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと最小のまたは全く同じ程度のパーセンテージ同一性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチド）。選択実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、上で定義されるように、断片およびバリアントのいずれとしても適格であり得る（例として、配列番号１、３、５、７または９により表されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド中に見出される連続的部分配列に続いて、最小の配列同一性の範囲内に入る異なる配列を含むＮ末端シグナル配列）。
【０１０５】
選択実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号１、３、５、７または９により表されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１０６】
選択実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、中等度または高いストリンジェンシー下で配列番号１、３、５、７または９と相補的な核酸プローブにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【０１０７】
選択実施形態において、Ｎ末端シグナル配列は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドからなる、配列番号１、３、５、７または９により表されるヌクレオチド配列中の同数のヌクレオチドからなる連続的配列と同一である連続的配列を含む。
【０１０８】
本開示、例えば前述の実施形態などにより考えられる代替的Ｎ末端ターゲティング配列のいずれに関しても、選択された態様における、かかる配列の最小限の必要とされる機能は、融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングする能力である。
【０１０９】
胞子形成に関連する調節配列
本開示は、胞子形成の際に本開示による融合タンパク質および他のコンストラクトを発現させるために用いられ得る複数の上流調節配列（例として、配列番号１１〜１５）を提供する。本明細書中に詳細に記載されるように、これらの上流調節配列は、目的タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面に導くＮ末端ターゲティング配列を有する融合タンパク質を発現させるために用いられ得る。いくつかの態様において、これらの上流調節配列（またはその断片もしくはバリアント）はまた、胞子形成の際に任意の目的異種タンパク質を、目的タンパク質がＮ末端ターゲティング配列を包含するか否かにかかわらず発現させるために用いられ得る。
【０１１０】
いくつかの態様において、目的タンパク質の転写は、本明細書中に記載される上流調節配列のうちのいずれかの中に存在するプロモーター（例として、配列番号１１〜１５のいずれか、または胞子形成の際の転写活性を保ったその断片もしくはバリアント）により制御される。いくつかの態様において、ＤＮＡコンストラクトは、目的タンパク質をコードする配列を、本明細書中に記載される調節配列のいずれか（例として、配列番号１１〜１５のいずれか）または胞子形成の際の転写活性を保ったその断片もしくはバリアントの下流に含み得る。かかる断片は、配列番号１１〜１５の任意の連続的な２５、５０、１００、１５０または２００ヌクレオチドを含み得て、これは、胞子形成の際の転写活性を保っている。同様に、バリアントは、配列番号１１〜１５のいずれか（またはその断片）と比較して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含み得て、これは、胞子形成の際の転写活性を保っている。目的タンパク質をコードするＤＮＡおよび任意の上流調節配列（複数可）は、パエニバチルスまたは他の細胞の染色体ＤＮＡの中に組み込まれ得る。
【０１１１】
融合タンパク質
本開示は、少なくとも１つの目的分子（例として、目的のタンパク質またはペプチド、例えば少なくとも１つの植物成長刺激性タンパク質またはペプチドなどのポリペプチド配列）に直接的または間接的に連結されるＮ末端ターゲティング配列を含む融合タンパク質を提供する。選択された実施形態において、間接的な連結は、介在性スペーサー、リンカーまたは調節配列であり得る。タンパク質またはペプチドは、限定されるものではないが、ペプチドホルモン、非ホルモンペプチド、植物成長刺激性化合物の産生もしくは活性化に関与する酵素、または細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解もしくは改質する酵素を含み得る。一般的に、パエニバチルス内生胞子中で発現可能であって、選択されるＮ末端ターゲティング配列にとって異種である任意の目的タンパク質が用いられ得る。いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、パエニバチルス属の細菌において発現するタンパク質である。他の実施形態において、目的タンパク質は、融合タンパク質が発現するパエニバチルス内生胞子と同種の細菌から単離される。なおさら他の実施形態において、目的タンパク質は、融合タンパク質が内生胞子上に発現するパエニバチルス株から単離される。ターゲティング配列は、上記のターゲティング配列のいずれかであることができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ターゲティング配列、および植物を病原体から保護する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを含み得る。ターゲティング配列は、上記のターゲティング配列のいずれかであることができる。
【０１１３】
融合タンパク質は、当該技術分野で公知の標準的なクローニングおよび分子生物学的方法を用いて作ることができる。例えば、タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（例として、植物成長刺激性タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、上記のターゲティング配列のいずれかをコードするＤＮＡにライゲーションすることで、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を形成させることができる。融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子は、任意の好適なベクター、例えばプラスミドベクターにクローニングすることができる。ベクターは、好適には、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を容易に挿入することができるマルチクローニングサイトを含む。ベクターはまた、好適には、そのベクターで形質転換、トランスフェクト、または交配された細菌を容易に同定して単離することができるような、選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子などを含有する。ベクターがプラスミドである場合、プラスミドは、好適には、複製開始点も含む。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、好適には、パエニバチルス内生胞子の胞子表面上で融合タンパク質の発現を引き起こす胞子形成プロモーター（例として、パエニバチルスファミリーメンバーからのネイティブプロモーター）の制御下にある。いくつかの態様において、融合タンパク質の転写は、本明細書中に記載される上流調節配列のうちのいずれかの中に存在するプロモーター（例として、配列番号１１〜１５のいずれか、または胞子形成の際の転写活性を保ったその断片もしくはバリアント）により制御される。いくつかの態様において、ＤＮＡコンストラクトは、本開示による融合タンパク質をコードする配列を、本明細書中に記載される調節配列のいずれか（例として、配列番号１１〜１５のいずれか）または胞子形成の際の転写活性を保ったその断片もしくはバリアントの下流に含み得る。かかる断片は、配列番号１１〜１５の任意の連続的な５０、１００、１５０または２００ヌクレオチドを含み得て、これは、胞子形成の際の転写活性を保っている。同様に、バリアントは、配列番号１１〜１５のいずれか（またはその断片）と比較して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の配列同一性を有する配列を含み得て、これは、胞子形成の際の転写活性を保っている。融合タンパク質をコードするＤＮＡ（例として、配列番号１、３、５、７、９のいずれかの配列またはそのバリアントもしくは断片）は、１または複数の上流調節配列（複数可）と共に、パエニバチルスまたは他の細胞の染色体ＤＮＡの中に組み込まれ得る。
【０１１４】
融合タンパク質はまた、ターゲティング配列の一部ではない付加的なポリペプチド配列、または連結される目的タンパク質（例として、植物成長刺激性タンパク質もしくはペプチド、植物を病原体から保護するタンパク質もしくはペプチド、植物においてストレス抵抗性を増強するタンパク質もしくはペプチド、または植物結合性のタンパク質もしくはペプチド）を含むことができる。例えば、融合タンパク質は、融合タンパク質自体または融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞の胞子の精製（例としてポリヒスチジンタグ）または可視化（例として蛍光タンパク質、例えばＧＦＰまたはＹＦＰなど）を容易にするためのタグまたはマーカーを包含することができる。
【０１１５】
本明細書中に記載されるターゲティング配列を用いた胞子表面上での融合タンパク質の発現は、これらの配列のアミノ末端における二次構造の欠如のために増強され、このことは融合タンパク質のネイティブフォールディングおよび活性の保持を可能にする。適切なフォールディングは、ターゲティング配列と融合パートナータンパク質との間に短いアミノ酸リンカーを包含することにより、さらに増強することができる。
【０１１６】
それゆえに、本明細書中に記載される融合タンパク質のいずれも、ターゲティング配列と連結される目的タンパク質（例として、植物成長刺激性タンパク質もしくはペプチド、植物を病原体から保護するタンパク質もしくはペプチド、植物においてストレス抵抗性を増強するタンパク質もしくはペプチド、または植物結合性のタンパク質もしくはペプチド）との間にアミノ酸リンカーを含むことができる。
【０１１７】
リンカーは、ポリアラニンリンカーまたはポリグリシンリンカーを含むことができる。アラニン残基およびグリシン残基の両方の混合物を含むリンカーを用いることもできる。例えば、ターゲティング配列が配列番号２を含む場合、融合タンパク質は、次の構造のうちの１つを有することができる。
【０１１８】
リンカーなし：配列番号２−融合パートナータンパク質
アラニンリンカー：配列番号２−Ａｎ−融合パートナータンパク質
グリシンリンカー：配列番号２−Ｇｎ−融合パートナータンパク質
アラニンおよびグリシンの混合リンカー：配列番号２−（Ａ／Ｇ）ｎ−融合パートナータンパク質
ここでＡｎ、Ｇｎおよび（Ａ／Ｇ）ｎは、それぞれ、任意の数のアラニン、任意の数のグリシンまたは任意の数のアラニンおよびグリシンの混合物である。
【０１１９】
例えば、ｎは、１から２５の間の任意の整数、例えば６から１０の間の整数などであることができる。リンカーがアラニン残基およびグリシン残基の混合物を含む場合、アラニン残基およびグリシン残基の任意の組み合わせを用いることができる。上で示されるような、配列番号２により表されるＮ末端ターゲティング配列。しかしながら、本明細書中に開示される他のＮ末端ターゲティング配列のいずれも、上の例示的配置において、配列番号２に代えて置き換えられ得る（例として、配列番号４、６、８もしくは１０またはその断片もしくはバリアント）。上に示される構造において、「融合パートナータンパク質」は、連結される目的タンパク質（例として、植物成長刺激性タンパク質もしくはペプチド、植物を病原体から保護するタンパク質もしくはペプチド、植物においてストレス抵抗性を増強するタンパク質もしくはペプチド、または植物結合性のタンパク質もしくはペプチド）を表す。
【０１２０】
代わりにまたは加えて、リンカーは、プロテアーゼ認識部位を含むことができる。プロテアーゼ認識部位を包含することは、プロテアーゼ認識部位を認識するプロテアーゼに曝露されたときの目的タンパク質（例として、植物成長刺激性タンパク質もしくはペプチド、植物を病原体から保護するタンパク質もしくはペプチド、植物においてストレス抵抗性を増強するタンパク質もしくはペプチド、または植物結合性のタンパク質もしくはペプチド）を標的とした除去を可能にする。
【０１２１】
ある態様において、融合タンパク質は、植物成長刺激性化合物の産生または活性化に関与する酵素、例えばアセトインレダクターゼ、インドール−３−アセトアミドヒドロラーゼ、トリプトファンモノオキシゲナーゼ、アセトラクテートシンセターゼ、α−アセトラクテートデカルボキシラーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ジアセチルレダクターゼ、ブタンジオールデヒドロゲナーゼ、アミノトランスフェラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ、アミンオキシダーゼ、インドール−３−ピルビン酸デカルボキシラーゼ、インドール−３−アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、トリプトファン側鎖オキシダーゼ、ニトリルヒドロラーゼ、ニトリラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、アデノシンリン酸イソペンテニルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、アデノシンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＣＹＰ７３５Ａ、５’−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、ゼアチンシス−トランスイソメラーゼ、ゼアチン  Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ、β−グルコシダーゼ、シス−ヒドロキシラーゼ、ＣＫ  シス−ヒドロキシラーゼ、ＣＫ  Ｎ−グルコシルトランスフェラーゼ、２，５−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、アデノシンヌクレオシダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ゼアチンレダクターゼ、ヒドロキシルアミンレダクターゼ、２−オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ、ジベレリン酸  ２Ｂ／３Ｂヒドロラーゼ、ジベレリン  ３−オキシダーゼ、ジベレリン  ２０−オキシダーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、β−１，６−グルカナーゼ、アミノシクロプロパン−１−カルボン酸デアミナーゼ、ノッド因子の産生に関与する酵素、または上のものの任意の組み合わせなどを含む。
【０１２２】
他の態様において、融合タンパク質は、細菌、真菌または植物の栄養源を分解または改質する酵素、例えばセルラーゼ、リパーゼ、リグニンオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、ホスファターゼ、ニトロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、硝酸レダクターゼ、亜硝酸レダクターゼ、アミラーゼ、アンモニアオキシダーゼ、リグニナーゼ、グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルカナーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、キシラナーゼ、シデロフォア、または上のものの任意の組み合わせなどを含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質のターゲティング配列、胞子表面タンパク質、または胞子表面タンパク質断片にとってネイティブな胞子形成プロモーターの制御下で発現する。融合タンパク質は、高発現の胞子形成プロモーターの制御下で発現させ得る。ある態様において、高発現の胞子形成プロモーターは、シグマ−Ｋ胞子形成特異的ポリメラーゼプロモーター配列を含む。選択された態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質のターゲティング配列にとってネイティブであるプロモーターの制御下で発現させ得る。いくつかの場合において、ターゲティング配列にとってネイティブであるプロモーターは、高発現の胞子形成プロモーターである。他の場合において、ターゲティング配列にとってネイティブであるプロモーターは、高発現胞子形成プロモーターではない。後者の場合、ネイティブプロモーターを高発現胞子形成プロモーターで置き換えることが有利であり得る。高発現胞子形成プロモーターの制御下での融合タンパク質の発現は、パエニバチルス内生胞子の胞子表面上での融合タンパク質の発現の増加を提供する。高発現胞子形成プロモーターは、１または複数のシグマ−Ｋ胞子形成特異的プロモーター配列を含むことができる。
【０１２４】
上記のように、融合タンパク質は、ターゲティング配列、および成長刺激性タンパク質またはペプチドを含み得る少なくとも１つの異種タンパク質を含み得る。植物成長刺激性タンパク質またはペプチドは、中でも、ペプチドホルモン、非ホルモンペプチド、植物成長刺激性化合物の産生もしくは活性化に関与する酵素、または細菌、真菌もしくは植物の栄養源を分解もしくは改質する酵素を含むことができる。植物成長刺激性タンパク質またはペプチドは、植物成長刺激性化合物の産生または活性化に関与する酵素を含むことができる。植物成長刺激性化合物の産生または活性化に関与する酵素は、植物成長を刺激するもしくは植物構造を変える化合物についての生物学的合成経路中の任意のステップを触媒する任意の酵素、または植物成長を刺激するもしくは植物構造を変える化合物の不活性もしくは低活性誘導体を、その化合物の活性型もしくは高活性型の化合物に変換することを触媒する任意の酵素であることができる。あるいは、植物成長刺激性化合物は、植物成長ホルモン、例として、サイトカイニンもしくはサイトカイニン誘導体、エチレン、オーキシンもしくはオーキシン誘導体、ジベレリン酸もしくはジベレリン酸誘導体、アブシジン酸もしくはアブシジン酸誘導体、またはジャスモン酸もしくはジャスモン酸誘導体を含むことができる。
【０１２５】
酵素がプロテアーゼまたはペプチダーゼを含む場合、プロテアーゼまたはペプチダーゼは、タンパク質、ペプチド、プロタンパク質またはプレプロタンパク質を切断することで生理活性ペプチドを生成させるプロテアーゼまたはペプチダーゼであることができる。生理活性ペプチドは、生物学的活性を発揮する任意のペプチドであることができる。タンパク質、ペプチド、プロタンパク質またはプレプロタンパク質を切断することで生理活性ペプチドを生成させるプロテアーゼまたはペプチダーゼは、サブチリシン、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、プロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、サーモリシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼ、カルボキシラーゼ、セリンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼを含むことができる。
【０１２６】
植物成長刺激性タンパク質はまた、細菌、真菌または植物の栄養源を分解または改質する酵素を含むことができる。かかる酵素としては、セルラーゼ、リパーゼ、リグニンオキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、ホスファターゼ、ニトロゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミダーゼ、硝酸レダクターゼ、亜硝酸レダクターゼ、アミラーゼ、アンモニアオキシダーゼ、リグニナーゼ、グルコシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルカナーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、キシラナーゼおよびシデロフォアが挙げられる。植物生育培地に導入された場合、または植物、種子もしくは植物周辺の領域もしくは植物種子に施用された場合、細菌、真菌または植物の栄養源を分解または改質する酵素を含む融合タンパク質は、植物の近くに栄養分を処理することを助け、植物による、または植物の近くの有益な細菌もしくは真菌による栄養分取り込みの増大をもたらすことができる。融合タンパク質は、ターゲティング配列、および植物を病原体から保護する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを含むことができる。タンパク質またはペプチドは、植物免疫応答を刺激するタンパク質またはペプチドを含むことができる。例えば、植物免疫応答を刺激するタンパク質またはペプチドは、植物免疫系エンハンサータンパク質またはペプチドを含むことができる。植物免疫系エンハンサータンパク質またはペプチドは、植物の免疫系に対して有益な効果を有する任意のタンパク質またはペプチドであることができる。あるいは、植物を病原体から保護するタンパク質またはペプチドは、抗菌活性、抗真菌活性、または抗菌活性と抗真菌活性の両方を有するタンパク質またはペプチドであることができる。植物を病原体から保護するタンパク質またはペプチドはまた、殺虫活性、殺蠕虫活性を有する、昆虫もしくは虫（ｗｏｒｍ）の捕食を抑制するタンパク質もしくはペプチド、またはそれらの組み合わせであることもできる。植物を病原体から保護するタンパク質は、酵素を含むことができる。好適な酵素としては、プロテアーゼおよびラクトナーゼが挙げられる。プロテアーゼおよびラクトナーゼは、細菌のシグナル伝達分子（例として、細菌のラクトンホモセリンシグナル伝達分子）に特異的であることができる。酵素はまた、細菌または真菌の細胞構成成分に特異的な酵素であることもできる。
【０１２７】
融合タンパク質は、ターゲティング配列、および植物においてストレス抵抗性を増強する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを含むことができる。例えば、植物においてストレス抵抗性を増強するタンパク質またはペプチドは、ストレス関係化合物を分解する酵素を含む。ストレス関係化合物としては、限定されるものではないが、アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）、活性酸素種、一酸化窒素、オキシリピンおよびフェノールが挙げられる。具体的な活性酸素種としては、ヒドロキシル、過酸化水素、酸素およびスーパーオキシドが挙げられる。ストレス関係化合物を分解する酵素は、スーパーオキシドジスムターゼ、オキシダーゼ、カタラーゼ、アミノシクロプロパン−１−カルボン酸デアミナーゼ、ペルオキシダーゼ、抗酸化酵素または抗酸化ペプチドを含むことができる。
【０１２８】
植物においてストレス抵抗性を増強するタンパク質またはペプチドはまた、植物を環境ストレスから保護するタンパク質またはペプチドを含むことができる。環境ストレスは、例えば、干ばつ、洪水、熱、凍結、塩分、重金属、低ｐＨ、高ｐＨまたはそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、植物を環境ストレスから保護するタンパク質またはペプチドは、氷核形成タンパク質、プロリナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、イソコリスミ酸シンターゼ、イソコリスミ酸ピルベートリアーゼ、またはコリンデヒドロゲナーゼを含むことができる。
【０１２９】
融合タンパク質は、ターゲティング配列、および少なくとも植物結合性のタンパク質またはペプチドを含むことができる。植物結合性のタンパク質またはペプチドは、植物の任意の部分（例として、植物の根または植物の空中部分、例えば葉、茎、花または果実など）に、または植物体に、特異的または非特異的に結合することが可能な任意のタンパク質またはペプチドであることができる。それゆえに、例えば、植物結合性のタンパク質またはペプチドは、根結合性のタンパク質もしくはペプチド、または葉結合性のタンパク質もしくはペプチドであることができる。
【０１３０】
融合タンパク質を発現する組換えパエニバチルス内生胞子および細胞
本明細書中に記載される融合タンパク質は、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞（例として、Ｐ．テラエ）に発現させることができる。融合タンパク質は、上で論じられる融合タンパク質のいずれかであることができる。組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞は、上で論じられる融合タンパク質のいずれかのうちの２つ以上を共発現することができる。例えば、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞は、植物結合性のタンパク質またはペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質を、植物成長刺激性タンパク質もしくはペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質、植物を病原体から保護するタンパク質もしくはペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質、または植物においてストレス抵抗性を増強する少なくとも１つのタンパク質もしくはペプチドと一緒に共発現することができる。
【０１３１】
組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞は、パエニバチルス細胞、例えばパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２、パエニバチルス・テラエ、パエニバチルス・ポリミキサまたはパエニバチルス・ペオリアエ細胞などを含み得る。他の態様において、内生胞子産生性パエニバチルス細胞は、本明細書中に記載される例示的なパエニバチルス種のいずれかから選択され得る。
【０１３２】
融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞を作製するため、任意のパエニバチルス菌が、当該技術分野で公知の標準的な方法を用いて（例として、融合タンパク質をコードするベクターでのエレクトロポレーションにより）形質転換され得る。次いで、細菌を当該技術分野で公知の任意の方法によりスクリーニングすることで形質転換体を同定することができる。例えば、ベクターが抗生物質耐性遺伝子を包含する場合、細菌を抗生物質耐性についてスクリーニングすることができる。あるいは、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、パエニバチルス細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込むことができる。組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞は、次いで、胞子形成を誘導する条件に曝露することができる。胞子形成を誘導するために適した条件は、当該技術分野で公知である。例えば、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞は、寒天プレート上に播いて、約３０℃の温度で数日間（例として３日間）インキュベートすることができ、あるいはＳｃｈａｅｆｆｅｒの胞子形成培地中で培養することができる。
【０１３３】
上の種のいずれかの不活性化株、非毒性株、または遺伝的に操作された株も好適に用いることができる。代わりにまたは加えて、融合タンパク質を発現する組換えパエニバチルスファミリーの胞子が作製されたら、使用中のさらなる発芽を防ぐためにそれらを不活性化することができる。当該技術分野で公知である、細菌胞子を不活性化するための任意の方法を用いることができる。好適な方法としては、限定されるものではないが、熱処理、ガンマ線照射、Ｘ線照射、ＵＶ−Ａ照射、ＵＶ−Ｂ照射、化学処理（例として、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、過酸化水素、酢酸、漂白剤、またはそれらの任意の組み合わせでの処理）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。あるいは、非毒性株または遺伝的もしくは物理的に不活性化された株に由来する胞子を用いることができる。
【０１３４】
本開示による融合タンパク質コンストラクトは、融合タンパク質をパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングするＮ末端シグナル配列またはそのバリアントもしくは断片、およびＮ末端シグナル配列にとって異種であるポリペプチド配列を含む。選択実施形態において、Ｎ末端シグナル配列およびＮ末端シグナル配列にとって異種であるポリペプチド配列は、直接的に連結される。他の態様において、介在性のリンカーまたはスペーサー配列が存在し得る。さらなる態様において、切断配列または他の調節配列が２つの領域の間に位置し得る。Ｎ末端シグナル配列にとって異種であるポリペプチド配列は、１または複数の機能的タンパク質を含み得る。複数の機能的タンパク質がＮ末端シグナル配列にとって異種であるポリペプチド配列中に含有される態様において、少なくとも１つのスペーサー、切断配列または他の制御性エレメントが２つ以上の機能的タンパク質の間に置かれ得る。
【０１３５】
Ｎ末端シグナル配列にとって異種であるポリペプチド配列は、例えば、（ａ）植物成長刺激性タンパク質もしくはペプチド；（ｂ）植物を病原体から保護するタンパク質もしくはペプチド；（ｃ）植物においてストレス抵抗性を増強するタンパク質もしくはペプチド；（ｄ）植物結合性のタンパク質もしくはペプチド；（ｅ）植物免疫系エンハンサータンパク質もしくはペプチド；または（ｆ）栄養分取り込みを増大させるタンパク質もしくはペプチドであり得る。パエニバチルス中で発現した場合、これらの融合タンパク質はパエニバチルス内生胞子の胞子表面にターゲティングされ、タンパク質またはペプチドが胞子の外側上にディスプレイされるように物理的に配向される。
【０１３６】
このパエニバチルス胞子表面ディスプレイシステムは、ペプチド、酵素および他のタンパク質を、植物に（例として、植物の葉、果実、花、茎または根に）、または植物生育媒体、例えば土壌などに送達するために用いることができる。このようにして土壌または別の植物生育媒体に送達されるペプチド、酵素およびタンパク質は、より長い期間、土壌中で存続して活性を呈する。本明細書中に記載される融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞を土壌または植物の根圏中に導入することで、多くの異なる土壌条件において植物成長の有益な増進につながり得る。これらの酵素を生成させるためにパエニバチルス胞子表面ディスプレイシステムを用いることは、植物の一生の最初の数ヶ月にわたって、いくつかの態様においては植物の寿命に至るまでのより長い期間にわたって、植物および根圏に対するそれらの有益な効果を発揮し続けることを可能にする。
【０１３７】
いくつかの態様において、本明細書中に記載されるいずれかの態様による組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞またはかかる細胞により産生される内生胞子を含む組成物は、植物に直接的に施用され得る（例として、粉末、懸濁液または溶液として、種子に、または圃場に）。いくつかの態様において、かかる組成物は、圃場に、播種の前または後に、あるいは新芽形成の前または後に（例として、定植の前もしくは後に、または出芽の前もしくは後に）施用され得る。
【０１３８】
代替的態様において、本明細書中に開示される融合タンパク質および／または組成物は、組換えパエニバチルス細胞または胞子を植物、種子または圃場に施用することにより、植物、種子、および／または圃場に間接的に送達され得る。これらの態様において、融合タンパク質は、組換えパエニバチルス細胞により発現または作製され得て（例として圃場において）、このことは、融合タンパク質の植物、種子または圃場への送達をもたらす。
【０１３９】
植物成長促進効果および／または他の有益な特質を有する組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞
いくつかのパエニバチルス菌は、固有の有益な特質を有することが知られている。例えば、いくつかの株は、植物成長促進効果または殺虫（例として殺蚊）効果を有する。本明細書中に記載される融合タンパク質のいずれも、かかる株において発現させることができる。
【０１４０】
例えば、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞は、植物成長促進性のパエニバチルス株を含み得る。植物成長促進性の菌株は、殺虫性毒素（例としてＢｉｎ毒素）を産生する菌株、殺真菌性化合物（例として、β−１，３−グルカナーゼ、キトシナーゼ（ｃｈｉｔｏｓｉｎａｓｅ）、リチカーゼ、またはそれらの組み合わせ）を産生する菌株、殺線虫性化合物（例としてＣｒｙ毒素）を産生する菌株、殺菌性化合物を産生する菌株、１または複数の抗生物質に抵抗性である菌株、１または複数の自由に複製するプラスミドを含む菌株、植物の根に結合する菌株、植物の根に定着する菌株、バイオフィルムを形成する菌株、栄養分を可溶化する菌株、有機酸を分泌する菌株、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１４１】
生物学的防除剤
本開示により提供される組成物は、生物学的防除剤をさらに包含し得る。生物学的防除剤としては、とりわけ、細菌、真菌もしくは酵母、原生動物、ウイルス、昆虫病原性線虫、接種材料および植物成分および／もしくはそれぞれの株の全ての識別特性を有するそれらの変異体、ならびに／または昆虫、ダニ、線虫および／もしくは植物病原体に対する活性を呈するそれぞれの株により産生される少なくとも１つの代謝物を挙げることができる。本開示は、上記の組換えパエニバチルス内生胞子と、本明細書中に記載される特定の生物学的防除剤との、ならびに／または本明細書中に記載される微生物の特定株の変異体であって、それぞれの株の全ての識別特性を有する前記変異体との、ならびに／または昆虫、ダニ、線虫および／もしくは植物病原体に対する活性を呈する、もしくは植物成長を促進するならびに／もしくは植物健康を増進するそれぞれの株により産生される少なくとも１つの代謝物との組み合わせを提供する。本開示によると、本明細書中に記載される生物学的防除剤は、任意の生理学的状態、例えば活性状態または休眠状態などにおいて使われ得て、または用いられ得る。
【０１４２】
例示的組成物
選択された態様において、本開示は、ａ）目的の異種タンパク質を含む融合タンパク質をパエニバチルスファミリーメンバーの胞子表面に局在させるターゲティング配列を含む融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞；およびｂ）本明細書中に開示される、少なくとも１つのさらなる異なる特定の生物学的防除剤、ならびに／または本明細書中に開示される微生物の特定株の、それぞれの株の全ての識別特性を有する変異体、ならびに／または昆虫、ダニ、線虫および／もしくは植物病原体に対する活性を呈するそれぞれの株により産生される少なくとも１つの代謝物を、相乗的な有効量で含む組成物を提供する。代替的態様において、組成物は、少なくとも１つの付加的な殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤を含むが、ただし組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞、殺虫剤および殺真菌剤は同一ではない。別の態様において、組成物は、植物および植物部分の全体的な損傷を、同様に、昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体により引き起こされる、収穫された果実または野菜の損失を低減させるために用いられる。別の態様において、組成物は、全体的な植物健康を向上させる。
【０１４３】
用語「植物健康」は、一般に、有害生物の防除と関係しない植物の様々な種類の改良を含む。例えば、言及され得る有利な性質は、改良された作物特性であり、これらとしては、出芽、作物収量、タンパク質含量、油含量、デンプン含量、より発達した根系、根成長の改良、根サイズ維持の改良、根有効性の改良、ストレス耐性（例として、干ばつ、熱、塩分、ＵＶ、水、低温に対するもの）の改良、エチレン低減（産生低減および／または受容阻害）、分げつ増加、植物高の上昇、より大きな葉身、より少ない枯れた根出葉、より強い分げつ、より濃い緑色の葉色、色素含量、光合成活性、必要なインプット（例えば肥料または水など）がより少ないこと、必要な種子がより少ないこと、より生産性の高い分げつ、より早期の開花、早期の穀粒成熟、より少ない植物転倒（ｐｌａｎｔ  ｖｅｒｓｅ）（倒伏）、シュート成長の向上、植物成長力の増強、植物株立ち（ｓｔａｎｄ）の向上、ならびにより早期で良好な発芽が挙げられる。
【０１４４】
本開示により提供される組成物は、同じ環境条件下で栽培された植物であって、その一部が本開示による組成物で処理され、別の一部が本開示による組成物で処理されない前記植物を比較することにより、植物成長、健康または他の肯定的な特質に対する潜在的な利点を識別するためにスクリーニングされ得る。代わりに、前記の他の一部は、全く処理されていないか、または好適な対照（すなわち、本開示による組成物を含まない施用物、例えば全ての活性成分を含まない施用物など）、本明細書に記載される組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞を含まない施用物、もしくは本明細書に開示されるさらなる特定の生物学的防除剤を含まない施用物で処理される。
【０１４５】
本開示による組成物は、任意の所望の方法で、例えば種子コーティング、土壌灌注および／もしくは直接的に畝間の形態で、ならびに／または葉面噴霧として施用され得て、出芽前、出芽後またはその両方に施用され得る。言い換えれば、組成物は、種子、植物に、または収穫された果実および野菜に、または植物が生育中のもしくは生育が望まれる土壌（植物の生育場所）に施用することができる。
【０１４６】
植物および植物部分の全体的な損傷を低減することは、しばしば、より健康な植物ならびに／または植物成長力および収量の増加をもたらす。好ましくは、本開示による組成物は、慣用的植物もしくは遺伝子導入植物またはそれらの種子を処理するために用いられる。
【０１４７】
別の態様において、本開示により提供される組成物は、動物の健康またはかかる動物の全身の全体的体調を改善する。健康増進の指標としては、次のうちの１つまたは複数が挙げられる：動物における疾患状態の寛解もしくは回復；動物の特定部分の重量増加もしくは全体的な重量増加を包含し得る重量増加の向上；腸内細菌叢の維持；飼料利用効率の向上；死亡リスクの低減；疾患抵抗性の向上；罹患率の低減；免疫応答の向上；下痢発生の減少、生産性の向上；および／または病原体排出の低減。本開示はまた、動物に、融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞を含む上記の組成物のいずれかの治療量または有効量を投与することによる、動物の健康を改善するための方法に関する。いくつかの態様において、かかる融合タンパク質としては、飼料の消化を助ける酵素、例えばアミラーゼ、グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼおよびペクチナーゼなど、または免疫調節因子、例えば抗体などが挙げられる。組成物の有効量は、本発明の組成物を投与していないがそれ以外は本発明の組成物を受けている動物と同じ食餌（飼料および他の化合物を包含する）を投与している動物と比較して、動物の健康を増進させるのに有効な量である。用語「治療量」とは、動物における疾患状態を寛解または回復させるのに十分な量をいう。
【０１４８】
別の態様において、本開示により提供される組成物は、汚染または混入物質を媒体、例えば土壌、地下水、堆積物または表面水などから除去する。本開示はまた、融合タンパク質を胞子表面上に発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞を含む上記の組成物のいずれかの有効量を媒体、例えば土壌、地下水、堆積物または表面水などに施用することにより、汚染または混入物質をかかる媒体から除去するための方法に関する。
【０１４９】
組換えパエニバチルスコンストラクトおよび組成物を用いる方法
本開示はまた、融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に記載されるさらなる特定の生物学的防除剤のうちの少なくとも１つを含む上記の組成物のうちのいずれかを用いた、植物成長を刺激するための方法に関する。植物成長を刺激するための方法は、植物、種子、植物部分に、植物周辺の場所に、または植物が植えられる所（例として、土壌または他の生育媒体）に、（ｉ）異種のタンパク質（例として、少なくとも１つの植物成長刺激性タンパク質）；および（ｉｉ）ターゲティング配列を含む融合タンパク質を発現する組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞；ならびに本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、ならびに／または本明細書中に開示される微生物の特定株の、それぞれの株の全ての識別特性を有する変異体、ならびに／または昆虫、ダニ、線虫および／もしくは植物病原体に対する活性を呈するそれぞれの株により産生される少なくとも１つの代謝物を相乗的な有効量で含む組成物を施用することを含む。
【０１５０】
本開示の別の態様において、植物および植物部分の全体的な損傷を、同様に、昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体により引き起こされる、収穫された果実または野菜の損失を低減させるための方法が、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に記載される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤を、相乗的な有効量で、同時または逐次的に施用するステップを含んで提供される。
【０１５１】
本方法の１つの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの殺真菌剤をさらに含む。１つの態様において、少なくとも１つの殺真菌剤は、合成の殺真菌剤である。別の実施形態において、組成物は、殺真菌剤に加えてまたは殺真菌剤に代えて、少なくとも１つの殺虫剤を含むが、ただし殺虫剤、殺真菌剤、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される特定の生物学的防除剤は同一ではない。
【０１５２】
本開示の方法は、次の施用方法、すなわち組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤の両方が、農業的に許容される貯蔵寿命を有する単一の安定な組成物（いわゆる「単一製剤」）に製剤化され得るもの、または使用前または使用時に組み合わされるもの（いわゆる「組み合わせ製剤」）を包含する。
【０１５３】
特に言及されない場合、表現「組み合わせ」は、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤の、ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤の様々な組み合わせであって、単一製剤中のもの、単一の「レディーミックス」形態のもの、単一製剤から構成される組み合わせの噴霧混合物、例えば「タンクミックス」などの中のもの、および特に、逐次的に、すなわち合理的に短い時間内で、例えば数時間または数日など、例として２時間から７日間のうちに続けて施用される場合の単独活性成分の組み合わせ使用におけるものを表す。本開示による組成物を適用する順序は、本開示を実施する上で必須ではない。したがって、用語「組み合わせ」はまた、例として、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤を、植物またはその周辺、生息場所もしくは保存空間に同時または連続的に施用した後の、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または殺虫剤の、処理される植物またはその周辺、生息場所もしくは保存空間の上またはその中における存在を包含する。
【０１５４】
組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に記載される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤が逐次的に使われ、または用いられる場合、次の方法に従って、植物または植物部分（種子および種子から出芽する植物を包含する）、収穫された果実および野菜を処理することが好ましい：最初に、少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤を植物または植物部分上に施用し、２回目で、本明細書中に記載されるさらなる特定の生物学的防除剤および組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞を同じ植物または植物部分に施用する。この施用方法により、収穫時の植物上の殺虫剤／殺真菌剤の残留量は可能なかぎり低くなる。（作物）栽培サイクル内での１回目の施用と２回目の施用の間の期間は変わり得て、達成される効果に依存する。例えば、１回目の施用は、植物または植物部分への昆虫、ダニ、線虫および／もしくは植物病原体の感染を防ぐために（これはとりわけ種子を処理する場合のことである）、または昆虫、ダニ、線虫および／もしくは植物病原体の感染を駆除するために（これはとりわけ植物および植物部分を処理する場合のことである）行われ、２回目の適用は、昆虫、ダニ、線虫および／もしくは植物病原体の感染を防ぐもしくは防除するため、ならびに／または植物成長を促進するために行われる。この関連での防除は、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される特定の生物学的防除剤を含む組成物は、有害生物または植物病原性真菌を完全に根絶させることはできないが、感染を許容されるレベルで維持することは可能であることを意味する。
【０１５５】
本開示はまた、複数回の施用により、本開示の組成物の殺傷、阻害、予防および／または忌避活性を増強する方法を提供する。いくつかの他の実施形態において、本開示の組成物は、任意の所望の発達ステージの間または任意の所与の有害生物圧力下で、約１時間、約５時間、約１０時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約１週間、約１０日間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間またはそれより長い間隔で２回、植物および／または植物部分に施用される。いくつかの実施形態においてなお、本開示の組成物は、任意の所望の発達ステージの間または任意の所与の有害生物圧力下で、約１時間、約５時間、約１０時間、約２４時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約１週間、約１０日間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間またはそれより長い間隔で、２回より多く、例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれより多く、植物および／または植物部分に施用される。各施用間の間隔は、所望の場合は変えることができる。当業者は、施用回数および間隔の長さを、植物種、植物有害生物種および他の要因に応じて決定することが可能である。
【０１５６】
前述のステップに従うことにより、少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤の、処理された植物、植物部分ならびに収穫された果実および野菜上での非常に低レベルの残留を達成することができる。
【０１５７】
特に言及されない場合、本開示による組成物での植物または植物部分（種子および種子から出芽する植物を包含する）、収穫された果実および野菜の処理は、慣例的な処理方法、例えば浸漬、噴霧、霧化、灌注、蒸発、散粉、霧状散布（ｆｏｇｇｉｎｇ）、全面散布（ｂｒｏａｄｃａｓｔｉｎｇ）、発泡（ｆｏａｍｉｎｇ）、塗布、展着（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ−ｏｎ）、灌水（灌注）、滴下灌漑を用いて、直接的に、またはそれらの周辺、生息場所もしくは保存空間に対する作用により行われる。さらには、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞、本明細書中に記載される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤を単一製剤または組み合わせ製剤として超低容量法により施用すること、または本開示による組成物を組成物もしくは単独製剤として土壌（畝間）中に注入することが可能である。
【０１５８】
用語「処理される植物」は、その根系を包含する植物のあらゆる部分、および、それぞれ処理される植物の茎もしくは幹の、半径が少なくとも１０ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍの周囲内にある、または前記の処理される植物の根系の少なくとも１０ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍ周囲である材料、例として土壌または栄養媒体を包含する。
【０１５９】
本明細書中に記載される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤と組み合わせて、任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤の存在下で用いられまたは使われる組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞の量は、最終的な製剤、同様に処理される植物、植物部分、種子、収穫された果実および野菜の大きさまたはタイプに依存する。通常、本開示によって使われるまたは用いられる組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞は、その単一製剤、または本明細書中に記載される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤ならびに任意選択で殺真菌剤および／もしくは少なくとも１つの殺虫剤との組み合わせ製剤の約１％から約８０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％から約６０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約１０％から約５０％（ｗ／ｗ）の量で存在する。
【０１６０】
また、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞と組み合わせて、任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤の存在下で用いられまたは使われる本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤の量は、最終的な製剤、同様に処理される植物、植物部分、種子、収穫された果実または野菜の大きさまたはタイプに依存する。通常、本開示によって使われるまたは用いられる本明細書中に記載されるさらなる特定の生物学的防除剤は、その単一製剤、または組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／もしくは少なくとも１つの殺虫剤との組み合わせ製剤の約０．１％から約８０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１％から約６０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは約１０％から約５０％（ｗ／ｗ）の量で存在する。
【０１６１】
組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞の施用は、葉面噴霧として、土壌処理として、および／または種子処理／ドレッシングとして実行され得る。葉面処理として用いられる場合、１つの実施形態において、１エーカーあたり約１／１６から約５ガロンの全培養液が施用される。土壌処理として用いられる場合、１つの実施形態において、１エーカーあたり約１から約５ガロンの全培養液が施用される。種子処理のために用いられる場合、１エーカーあたり約１／３２から約１／４ガロンの全培養液が施用される。種子処理の場合、最終使用製剤は、１グラムあたり少なくとも１×１０４、少なくとも１×１０５、少なくとも１×１０６、１×１０７、少なくとも１×ｘ１０８、少なくとも１×１０９、少なくとも１×１０１０コロニー形成単位を含有する。
【０１６２】
比率は、本開示による組み合わせの前記構成成分を植物または植物部分に施用する時点での本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤の量、および本開示による組み合わせの前記構成成分を植物もしくは植物部分に施用する少し前（例として４８時間、２４時間、１２時間、６時間、２時間、１時間）または施用する時点での組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞の量に基づいて、計算することができる。
【０１６３】
組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤の植物または植物部分への施用は、両構成成分が施用（複数可）の後に植物上または植物中に存在するかぎり、同時または異なる時に行うことができる。組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示されるさらなる特定の生物学的防除剤が異なる時に施用され、本明細書中に開示されるさらなる特定の生物学的防除剤が組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞の前に施用される場合、当業者は、当該技術分野で公知の化学的分析により、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞を施用する時点または施用する時点の少し前に、植物上／中の本明細書中に開示されるさらなる特定の生物学的防除剤の濃度を決定することができる。逆もまた同様であって、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞が最初に植物に施用される場合、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞の濃度は、また当該技術分野で公知である試験を用いて、本明細書中に開示されるさらなる特定の生物学的防除剤を施用する時点または施用する時点の少し前に決定することができる。
【０１６４】
本開示の別の態様において、上記の組成物で処理された種子が提供される。植物の種子を処理することによる昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体の防除は、長期間にわたって知られており、継続的な改良の対象である。それにもかかわらず、種子の処理は、常に満足のいく方法で解決することができない一連の問題を伴う。それゆえに、植物の貯蔵の過程で、播種後または出芽後に作物保護組成物を付加的に送達する必要性を取り除くまたは少なくとも顕著に低減させる、種子および発芽中の植物を保護するための方法を開発することが望ましい。さらには、使われる活性成分による植物自体への損傷を引き起こすことなく、種子および発芽中の植物に昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体による攻撃からの最良の可能な保護を提供するように、使われる活性成分の量を最適化することが望ましい。とりわけ、種子を処理するための方法は、最小限の作物保護組成物の使用で種子および発芽中の植物の最適の保護を達成するため、有害生物抵抗性または有害生物耐性の遺伝子導入植物が持つ固有の殺虫性および／または殺線虫性の性質も考慮すべきである。
【０１６５】
それゆえ、本開示はまた、とりわけ、上で定義される組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および少なくとも１つのさらなる生物学的防除剤で種子を処理することにより、種子および発芽中の植物を有害生物による攻撃から保護するための方法に関し、ここで生物学的防除剤は、本明細書中に開示される特定の微生物、ならびに／または本明細書中に開示される微生物の特定株の、それぞれの株の全ての識別特性を有する変異体、ならびに／または昆虫、ダニ、線虫および／もしくは植物病原体に対する活性を呈するそれぞれの株により産生される少なくとも１つの代謝物、ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または任意選択で本開示の少なくとも１つの殺虫剤から選択される。種子および発芽中の植物を有害生物による攻撃から保護するための本開示の方法は、種子を、１回の操作で同時に、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に記載される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤で処理する方法を包含する。これはまた、種子を、異なる時に、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤で処理する方法も包含する。
【０１６６】
本開示はさらに、種子および結果として生じる植物を昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体から保護する目的のために種子を処理する方法を提供する。本開示はまた、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に記載される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤で同時に処理された種子に関する。本開示はさらに、組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤で異なる時に処理された種子に関する。組換え内生胞子産生性パエニバチルス細胞および本明細書中に開示される少なくとも１つのさらなる特定の生物学的防除剤、ならびに任意選択で少なくとも１つの殺真菌剤および／または少なくとも１つの殺虫剤で異なる時に処理された種子の場合、本開示の組成物中の個々の活性成分は、種子上の異なる層中に存在し得る。
【０１６７】
さらには、本開示は、種子の粉の摩耗を防ぐため、本開示の組成物での処理後にフィルムコーティングプロセスに供される種子に関する。
【０１６８】
本開示の利点の１つは、本開示の組成物の特定の全身性性質のために、これらの組成物での種子の処理は、種子自体だけでなく、それらが出芽した後の種子から生じる植物に対しても、昆虫、ダニ、線虫および／または植物病原体からの保護を提供することである。このように、作物を播種時またはその少し後に直接的に処理する必要がないこともある。さらなる利点は、本開示の組成物での種子の処理を通じて、処理された種子の発芽および出芽が促進され得るという事実に見られる。
【０１６９】
本開示の組成物は、農業、温室、林業または園芸において用いられる任意の品種の植物の種子を保護するために適している。より詳細には、当該種子は、穀類（例として、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギおよびキビ）、トウモロコシ、ワタ、ダイズ、イネ、ジャガイモ、ヒマワリ、コーヒー、タバコ、キャノーラ、アブラナ、ビート（例として、テンサイおよび飼料ビート）、ピーナッツ、野菜（例として、トマト、キュウリ、マメ、アブラナ属植物（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、タマネギおよびレタス）、果樹植物、芝生および観賞植物の種子である。とりわけ重要なのは、穀類（例えばコムギ、オオムギ、ライムギおよびカラスムギなど）、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、キャノーラ、アブラナおよびイネの種子の処理である。
【０１７０】
本開示の目的のため、本開示の組成物は、単独で、または好適な製剤で種子に施用される。種子は、好ましくは、処理の過程で損傷が生じないような安定性を有する条件中で処理される。一般的には、種子は、収穫から播種の間の任意の時点で処理され得る。典型的に、種子は、植物から分離され、穂軸、外皮、茎、殻、毛またはパルプが除去されて用いられる。それゆえに、例えば、収穫され、洗浄され、乾燥されることで水分含量が１５重量％未満になった種子が用いられ得る。あるいは、乾燥後、例えば水で処理され、次いで再度乾燥された種子を用いることもできる。
【０１７１】
種子を処理する場合、一般的には、種子に施用される本開示の組成物の量および／または他の添加物の量を、種子の発芽が悪影響を受けないようにおよび／または種子から出芽する植物が損傷を受けないように選択することを確実にすることが必要である。これは、とりわけ、ある施用量で植物毒性効果を呈し得る活性成分を使用する場合のことである。
【０１７２】
本開示の組成物は、直接的に、言い換えればさらなる構成成分を含むことなく、かつ希釈されることなく、施用することができる。原則として、組成物を好適な製剤の形態で種子に施用することが好ましい。種子処理のための好適な製剤および方法は、当業者に公知であって、例えば次の書類：米国特許第４，２７２，４１７号Ａ；第４，２４５，４３２号Ａ；第４，８０８，４３０号Ａ；第５，８７６，７３９号Ａ；米国特許公開第２００３／０１７６４２８号Ａ１；ＷＯ２００２／０８０６７５Ａ１；ＷＯ２００２／０２８１８６Ａ２中に記載されており、これらの各々の内容は参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１７３】
本開示に従って用いることができる組み合わせは、慣用的な種子ドレッシング製剤、例えば溶液剤、エマルション剤、懸濁剤、散剤、フォーム剤、スラリー剤または種子用の他のコーティング組成物などに、およびまたＵＬＶ製剤に変換され得る。これらの製剤は、公知の方法で、組成物を慣例的アジュバント、例えば慣例的増量剤およびまた溶媒または希釈剤、着色料、ウェッター、分散剤、乳化剤、泡止め剤、保存料、二次増粘剤、展着剤、ジベレリン、およびまた水などと混合することにより、調製される。本発明に従って用いることができる種子ドレッシング製剤中に存在し得る着色料は、かかる目的のために慣例的である全ての着色料を包含する。この関連では、水への溶解性が低い顔料だけでなく、水溶性の染料を用いることも可能である。例としては、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｒｅｄ  １１２およびＣ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｒｅｄ  １の名称の下で知られる着色料が挙げられる。
【０１７４】
植物種または植物栽培品種、それらの場所および生育条件（土壌、気候、植生期間、食べ物（ｄｉｅｔ））に応じて、本開示による組成物、本開示による処理を用いることまたは使うことはまた、超相加的な（「相乗的な」）効果をもたらし得る。それゆえに、例えば、本開示による処理において本発明の組成物を用いることまたは使うことにより、施用量低減および／または活性スペクトルの広範化および／または活性の向上  より良好な植物成長、高温または低温への耐性の向上、干ばつへの、または水もしくは土壌の塩分含量への耐性の向上、開花性能の向上、より容易な収穫、成熟促進、より高い収量、より大きい果実、より大きい植物高、より濃い緑色の葉色、より早期の開花、収穫生産物のより高い品質および／またはより高い栄養価、より高い果実内糖度、収穫生産物のより良好な保存安定性および／または加工性が可能であり、これらは実際に予想されていた効果を上回るものである。
【０１７５】
本開示による処理における本発明の組成物のある施用量では、植物における強化効果も有し得る。望まれない植物病原性の真菌および／または微生物および／またはウイルスによる攻撃に対する植物の防御システムが動員される。植物強化性（抵抗性誘導性）物質は、この関連では、その後に望まれない植物病原性の真菌および／または微生物および／またはウイルスを接種した場合に、処理された植物がこれらの植物病原性の真菌および／または微生物および／またはウイルスへの実質的な程度の抵抗性を示すように、植物の防御システムを刺激することが可能な物質または物質の組み合わせを意味するものと理解される。それゆえに、本開示による処理において本開示による組成物を用いることまたは使うことにより、植物を、処理後の一定の期間内、上述の病原体による攻撃から保護することができる。保護が効果を発揮する期間は、一般に、活性化合物での植物の処理後１から１０日、好ましくは１から７日に及ぶ。
【０１７６】
本明細書中に開示される組成物のいずれも、１または複数の農薬を包含し得る。同様に、本開示による組成物を施用する方法は、少なくとも１つの農薬を植物生育媒体に導入すること、または少なくとも１つの農薬を植物もしくは種子に施用することをさらに含み得る。
【０１７７】
農薬は、肥料（例として液体肥料）、微量栄養肥料材料（例として、ホウ酸、ボレート、ホウ素フリット、硫酸銅、銅フリット、銅キレート、四ホウ酸ナトリウム十水和物、硫酸鉄、酸化鉄、硫酸アンモニウム鉄、鉄フリット、鉄キレート、硫酸マンガン、酸化マンガン、マンガンキレート、塩化マンガン、マンガンフリット、モリブデン酸ナトリウム、モリブデン酸、硫酸亜鉛、酸化亜鉛、炭酸亜鉛、亜鉛フリット、リン酸亜鉛、亜鉛キレートもしくはそれらの組み合わせ）、殺虫剤（例として、有機リン酸エステル、カルバメート、ピレスロイド、殺ダニ剤、アルキルフタレート、ホウ酸、ボレート、フッ化物、硫黄、ハロ芳香族置換型尿素、炭化水素エステル、生物学べースの殺虫剤もしくはそれらの組み合わせ）、除草剤（例として、クロロフェノキシ化合物、ニトロフェノール化合物、ニトロクレゾール化合物、ジピリジル化合物、アセトアミド、脂肪族酸、アニリド、ベンズアミド、安息香酸、安息香酸誘導体、アニス酸、アニス酸誘導体、ベンゾニトリル、ベンゾチアジアジノンジオキシド、チオカルバメート、カルバメート、カルバニレート、クロロピリジニル、シクロヘキセノン誘導体、ジニトロアミノベンゼン誘導体、フルオロジニトロトルイジン化合物、イソキサゾリジノン、ニコチン酸、イソプロピルアミン、イソプロピルアミン誘導体、オキサジアゾリノン、ホスフェート、フタレート、ピコリン酸化合物、トリアジン、トリアゾール、ウラシル、尿素誘導体、エンドタール、塩素酸ナトリウムもしくはそれらの組み合わせ）、殺真菌剤（例として、置換型ベンゼン、チオカルバメート、エチレンビスジチオカルバメート、チオフタリダミド、銅化合物、有機水銀化合物、有機スズ化合物、カドミウム化合物、アニラジン、ベノミル、シクロヘキサミド、ドジン、エトリジアゾール、イプロジオン、メトラキシル（ｍｅｔｌａｘｙｌ）、チアミメホン（ｔｈｉａｍｉｍｅｆｏｎ）、トリホリンもしくはそれらの組み合わせ）、殺軟体動物剤、殺藻剤、植物成長矯正剤（ｐｌａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｍｅｎｄｍｅｎｔ）、細菌接種材料（例として、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種材料、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種材料、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種材料、アゾリゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種材料、アロリゾビウム（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種材料、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の細菌接種材料、クライベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属の細菌接種材料、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌接種材料、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌接種材料、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ）属の細菌接種材料、バチルス属の細菌接種材料、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の細菌接種材料、パエニバチルス属の細菌接種材料、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属の細菌接種材料、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌接種材料、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属の細菌接種材料、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌接種材料、��リコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の細菌接種材料、グリオクラジウム（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）属の細菌接種材料、グロムス（Ｇｌｏｍｕｓ）属の細菌接種材料、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の細菌接種材料もしくはそれらの組み合わせ）、真菌接種材料（例として、グロムス（Ｇｌｏｍｅｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、クラロイドグロムス（Ｃｌａｒｏｉｄｏｇｌｏｍｅｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、ギガスポラ（Ｇｉｇａｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、アカウロスポラ（Ａｃａｕｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、サックロスポラ（Ｓａｃｃｕｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、エントロホスポラ（Ｅｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、パシドスポラ（Ｐａｃｉｄｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、ディバーシスポラ（Ｄｉｖｅｒｓｉｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、パラグロムス（Ｐａｒａｇｌｏｍｅｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、アーケオスポラ（Ａｒｃｈａｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、ゲオシフォン（Ｇｅｏｓｉｐｈｏｎａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、アンビスポラ（Ａｍｂｉｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、スクテロスポラ（Ｓｃｕｔｅｌｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、デンティスクルタタ（Ｄｅｎｔｉｓｃｕｌｔａｔａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、ラコセトラ（Ｒａｃｏｃｅｔｒａｃｅａｅ）科の真菌接種材料、担子菌門の真菌接種材料、子嚢菌門の真菌接種材料、接合菌門の真菌接種材料もしくはそれらの組み合わせ）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０１７８】
肥料は、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、重硫酸アンモニウム、多硫化アンモニウム、チオ硫酸アンモニウム、水性アンモニア、無水アンモニア、ポリリン酸アンモニウム、硫酸アルミニウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモニウムカルシウム、硫酸カルシウム、焼成マグネサイト、方解石型石灰石、酸化カルシウム、硝酸カルシウム、ドロマイト石灰石、水和石灰、炭酸カルシウム、リン酸ジアンモニウム、リン酸一アンモニウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウムカリウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム、マグネシア石灰石、マグネシア、尿素、尿素−ホルムアルデヒド、尿素硝酸アンモニウム、硫黄被覆尿素、ポリマー被覆尿素、イソブチリデン二尿素、Ｋ２ＳＯ４−（ＭｇＳＯ４）２、カイナイト、シルビナイト、キーゼリット、エプソム塩、元素状硫黄、マール、粉砕された牡蠣殻、魚粉、油粕、魚肥、血粉、リン鉱石、過リン酸、スラグ、骨粉、木灰、堆肥、バットグアノ、ピートモス、コンポスト、生砂、綿実粕、羽毛粉、蟹粉、フィッシュエマルジョン、フミン酸またはそれらの組み合わせを含むことができる。農薬は、本明細書中に記載される任意の殺真菌剤、細菌接種材料または除草剤を含むことができる。単独の、または殺虫剤と組み合わせた胞子形成細菌は、有効量の少なくとも１つの殺真菌剤をさらに含むことができる。
【０１７９】
一般的に、「殺真菌剤」は、真菌の死亡率を上昇させるまたは成長速度を抑える物質である。用語「真菌（ｆｕｎｇｕｓ）」または「真菌（ｆｕｎｇｉ）」は、クロロフィルを欠いた多種多様な有核の胞子を持つ生物を包含する。真菌の例としては、酵母、カビ（ｍｏｌｄ）、カビ（ｍｉｌｄｅｗ）、サビ菌、およびキノコが挙げられる。典型的な殺真菌性成分としてはまた、カプタン、フルジオキソニル、イプロジオン、テブコナゾール、チアベンダゾール、アゾキシストロビン、プロクロラズおよびオキサジキシルが挙げられる。本開示による選ばれた組成物、植物種子または接種物は、任意の天然または合成の殺真菌剤、例えばアルジモルフ、アンプロピルホス、アンプロピルホス  カリウム、アンドプリム、アニラジン、アザコナゾール、アゾキシストロビン、ベナラキシル、ベノダニル、ベノミル、ベンザマクリル、ベンザマクリル−イソブチル、ビアラホス、ビナパクリル、ビフェニル、ビテルタノール、ブラスチシジン−Ｓ、ボスカリド、ブロムコナゾール、ブピリメート、ブチオベート、多硫化カルシウム、カプシマイシン、カプタホール、カプタン、カルベンダジム、カルボン、キノメチオネート、クロベンチアゾン、クロルフェナゾール、クロロネブ、クロロピクリン、クロロタロニル、クロゾリネート、クロジラコン、クフラネブ、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、シプロフラム、デバカルブ、ジクロロフェン、ジクロブトラゾール、ジクロフルアニド、ジクロメジン、ジクロラン、ジエトフェンカルブ、ジメチリモール、ジメトモルフ、ジモキシストロビン、ジニコナゾール、ジニコナゾール−Ｍ、ジノカップ、ジフェニルアミン、ジピリチオン、ジタリムホス、ジチアノン、ドデモルフ、ドジン、ドラゾキソロン、エジフェンホス、エポキシコナゾール、エタコナゾール、エチリモール、エトリジアゾール、ファモキサドン、フェナパニル、フェナリモル、フェンブコナゾール、フェンフラム、フェニトロパン、フェンピクロニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、酢酸フェンチン、フェンチンヒドロキシド、フェルバム、フェリムゾン、フルアジナム、フルメトベル、フルオピラム、フルオロミド、フルキンコナゾール、フルルプリミドール、フルシラゾール、フルスルファミド、フルトラニル、フルトリアホル、ホルペット、ホセチル−アルミニウム、ホセチル−ナトリウム、フサライド、フベリダゾール、フララキシル、フラメトピル、フルカルボニル（ｆｕｒｃａｒｂｏｎｉｌ）、フルコナゾール、フルコナゾール−シス、フルメシクロックス、グアザチン、ヘキサクロロベンゼン、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、イマザリル、イミベンコナゾール、イミノクタジン、イミノクタジン  アルベシレート、イミノクタジントリアセテート、ヨードカルブ、イプロベンホス（ＩＢＰ）、イプロジオン、イルママイシン、イソプロチオラン、イソバレジオン、カスガマイシン、クレソキシム−メチル、銅調製物、例えば水酸化銅、ナフテン酸銅、塩基性塩化銅、硫酸銅、酸化銅、オキシン−銅およびボルドー液など、マンカッパー、マンコゼブ、マンネブ、メフェリムゾン、メパニピリム、メプロニル、メタラキシル、メトコナゾール、メタスルホカルブ、メトフロキサ��、メチラム、メトメクラム（ｍｅｔｏｍｅｃｌａｍ）、メトスルホバックス、ミルジオマイシン、ミクロブタニル、ミクロゾリン、ジメチルジチオカルバミン酸ニッケル、ニトロタル−イソプロピル、ヌアリモール、オフラセ、オキサジキシル、オキサモカルブ、オキソリン酸、オキシカルボキシム（ｏｘｙｃａｒｂｏｘｉｍ）、オキシフェンチイン、パクロブトラゾール、ペフラゾエート、ペンコナゾール、ペンシクロン、ホスジフェン（ｐｈｏｓｄｉｐｈｅｎ）、ピマリシン、ピペラリン、ポリオキシン、ポリオキソリム、プロベナゾール、プロクロラズ、プロシミドン、プロパモカルブ、プロパノシン−ナトリウム、プロピコナゾール、プロピネブ、プロチオシナゾール（ｐｒｏｔｈｉｏｃｉｎａｚｏｌｅ）、ピラゾホス、ピリフェノクス、ピリメタニル、ピロキロン、ピロキシフル、キンコナゾール、キントゼン（ＰＣＮＢ）、硫黄および硫黄調製物、テブコナゾール、テクロフタラム、テクナゼン、テトシクラシス（ｔｅｔｃｙｃｌａｓｉｓ）、テトラコナゾール、チアベンダゾール、チシオフェン、チフルザミド、チオファネート−メチル、チオキシミド、トルクロホス−メチル、トリルフルアニド、トリアジメホン、トリアジメノール、トリアズブチル、トリアゾキシド、トリクラミド、トリシクラゾール、トリデモルフ、トリフロキシストロビン、トリフルミゾール、トリホリン、ウニコナゾール、バリダマイシンＡ、ビンクロゾリン、ビニコナゾール、ザリラミド、ジネブ、ジラモール（ｚｉｒａｍｏｒ）またはそれらの組み合わせなどを含み得る。殺真菌剤はまた、置換型ベンゼン、チオカルバメート、エチレンビスジチオカルバメート、チオフタリダミド、銅化合物、有機水銀化合物、有機スズ化合物、カドミウム化合物、アニラジン、ベノミル、シクロヘキサミド、ドジン、エトリジアゾール、イプロジオン、メトラキシル、チアミメホン、トリホリンまたはそれらの組み合わせを含むことができる。当業者は、農業目的のために用いられる他の公知の合成または天然起源の殺真菌剤はまた、本開示による組成物、植物種子または接種物中に包含させるために選択され得ることを、容易に理解する。
【０１８０】
組成物、植物種子または接種物が殺真菌剤を含む場合、殺真菌剤は、葉の殺真菌剤であることができる。葉の殺真菌剤としては、銅、マンコゼブ、ペンチオピラド、トリアゾール、シプロコナゾール、メトコナゾール、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、テブコナゾール、アゾキシストロビン、ピラクラストビン（ｐｙｒａｃｌａｓｔｏｂｉｎ）、フルオキサストロビン、ピコキシストロビン、トリフロキシストロビン、硫黄、ボスカリド、チオファネート  メチル、クロロタノニル（ｃｈｌｏｒｏｔｈａｎｏｎｉｌ）、ペンチオピラド、ジフェンコナゾール（ｄｉｆｅｎｃｏｎａｚｏｌｅ）、フルトリアホル、シプロジニル、フルジナム（ｆｌｕｚｉｎａｍ）、イプロジオン、ペンフルフェン、シアゾファミド、フルトラニル、シモキサニル、ジメトモルフ、ピリメタニル、ゾキサミド、マンジプロパミド、メトリナム（ｍｅｔｒｉｎａｍ）、プロパモカルブ、フェンアミドン、テトラコナゾール、クロロナブ（ｃｈｌｏｒｏｎａｂ）、ヒメキサゾール、トルクロホスおよびフェンブコナゾールが挙げられる。当業者は、農業目的のために用いられる他の公知の合成または天然起源の葉の殺真菌剤はまた、本開示による組成物、植物種子または接種物中に包含させるために選択され得ることを、容易に理解する。
【０１８１】
殺虫剤を含む本開示による組成物、種子および接種材料は、昆虫の死亡率を上昇させるまたは成長速度を抑える能力を持つ。本明細書中で用いられるとき、用語「昆虫」は、「昆虫綱」の中の全ての生物を包含する。用語「成虫前」昆虫とは、例えば、卵、幼虫および若虫を包含する成虫期の前の生物の任意の形態をいう。本明細書中で用いられるとき、用語「殺虫剤」および「殺虫性の」はまた、「殺線虫剤」および「殺線虫性の」ならびに「殺ダニ剤」および「殺ダニ性の」を包含する。「殺線虫剤」および「殺線虫性の」とは、線虫の死亡率を上昇させるまたは成長速度を抑える物質の能力をいう。一般的に、用語「線虫」は、前記生物の卵、幼虫、若年形態および成熟形態を含む。「殺ダニ剤」および「殺ダニ性の」とは、クモ（Ａｒａｃｈｎｉｄａ）綱ダニ（Ａｃａｒｉ）亜綱に属する外部寄生生物の死亡率を上昇させるまたは成長速度を抑える物質の能力をいう。
【０１８２】
本開示の１つの態様によると、少なくとも１つの殺虫剤は、以下を含む。
【０１８３】
（１）アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤、例えば、カルバメート、例えばアラニカルブ、ベンジオカルブ、ベンフラカルブ、ブトカルボキシム、ブトキシカルボキシム、カルボフラン、カルボスルファン、エチオフェンカルブ、フラチオカルブ、イソプロカルブ、メトルカルブ、オキサミル、ピリミカルブ、プロポキスル、チオファノクス、トリアザメート、トリメタカルブ、ＸＭＣおよびキシリルカルブ；もしくは有機リン酸エステル、例えばアセフェート、アザメチホス、アジンホス−エチル、アジンホス−メチル、カズサホス、クロルエトキシホス、クロルフェンビンホス、クロルメホス、クロルピリホス−メチル、クマホス、シアノホス、デメトン−Ｓ−メチル、ダイアジノン、ジクロルボス／ＤＤＶＰ、ジクロトホス、ジメトエート、ジメチルビンホス、ジスルホトン、ＥＰＮ、エチオン、ファムフール、フェニトロチオン、ホスチアゼート、ヘプテノホス、イミシアホス、イソフェンホス、イソプロピル  Ｏ−（メトキシアミノチオホスホリル）サリチレート、イソオキサチオン、マラチオン、メカルバム、メチダチオン、メビンホス、モノクロトホス、ナレド、オメトエート、パラチオン−メチル、フェントエート、ホレート、ホスメット、ホスファミドン、ホキシム、ピリミホス−メチル、プロフェノホス、プロペタムホス、プロチオホス、ピラクロホス、ピリダフェンチオン、キナルホス、スルホテップ、テブピリムホス、テメホス、テルブホス、テトラクロルビンホス、チオメトンおよびトリクロルホン（ｔｒｉｃｌｏｒｆｏｎ）など。（２）ＧＡＢＡ作動性塩化物チャネルアンタゴニスト、例えば、シクロジエン−有機塩素、例えばクロルデンおよび／もしくはフェニルピラゾールなど。（３）ナトリウムチャネルモジュレーター／電位作動型ナトリウムチャネルブロッカー、例えば、ピレスロイド、例として、アクリナトリン、アレトリン、ｄ−シス−トランスアレトリン、ｄ−トランスアレトリン、ビフェントリン、ビオアレトリン、ビオアレトリン  ｓ−シクロペンテニル異性体、ビオレスメトリン、シクロプロトリン、シハロトリン、ラムダ−シハロトリン、ガンマ−シハロトリン、エムペントリン［（ＥＺ）−（ＩＲ）−異性体］、エスフェンバレレート、エトフェンプロックス、フェンプロパトリン、フェンバレレート、フルシトリネート、フルメトリン、タウ−フルバリネート、ハルフェンプロックス、イミプロトリン、カデトリン、ペルメトリン、フェノトリン［（ｌＲ）−トランス−異性体］、プラレトリン、ピレトリン（除虫菊）、レスメトリン、テフルトリン、テトラメトリン、テトラメトリン［（１Ｒ）−異性体）］、およびトランスフルトリンもしくはＤＤＴもしくはメトキシクロルなど。（４）ニコチン作動性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）アゴニスト、例えば、ネオニコチノイド、例として、ジノテフラン、ニテンピラム、およびチアメトキサムもしくはニコチンもしくはスルホキサフロルなど。（５）ニコチン作動性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のアロステリック活性化剤、例えば、スピノシン、例として、スピネトラムおよびスピノサドなど。（６）塩化物チャネル活性化剤、例えば、アベルメクチン／ミルベマイシン、例えばアバメクチン��エマメクチンベンゾエート、レピメクチンおよびミルベメクチンなど。（７）幼若ホルモン模倣物、例えば、幼若ホルモンアナログ、例として、ヒドロプレン、キノプレンおよびメトプレンもしくはフェノキシカルブもしくはピリプロキシフェンなど。（８）未知もしくは非特異的なメカニズムを有する活性化合物、例えば、アルキルハライド、例として、メチルブロミドおよび他のアルキルハライド；もしくはクロロピクリンもしくはフッ化スルフリルもしくはホウ砂もしくは吐酒石など。（９）選択的摂食抑制物質、例えばピメトロジンもしくはフロニカミド。（１０）ダニ増殖阻害剤、例えばクロフェンテジン、ヘキシチアゾクスおよびジフロビダジンもしくはエトキサゾール。（１１）昆虫腸膜の微生物撹乱物質、例えばバチルス・チューリンゲンシス亜種イスラエレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）、リジニバチルス・スフェリクス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス・チューリンゲンシス亜種アイザワイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ａｉｚａｗａｉ）、バチルス・チューリンゲンシス亜種クルスタキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｋｕｒｓｔａｋｉ）、バチルス・チューリンゲンシス亜種テネブリオニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）、およびＢｔ植物タンパク質：ＣｒｙｌＡｂ、ＣｒｙｌＡｃ、ＣｒｙｌＦａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ａｂ、Ｃｒｙ３Ｂｂ、Ｃｒｙ３４／３５Ａｂｌ。（１２）酸化的リン酸化阻害剤、ＡＴＰ撹乱物質、例えば、ジアフェンチウロンもしくは有機スズ化合物、例えばアゾシクロチン、シヘキサチンおよび酸化フェンブタチンもしくはプロパルギットもしくはテトラジホンなど。（１３）Ｈプロトン勾配を遮ることにより作用する酸化的リン酸化の脱共役剤、例えば、クロルフェナピル、ＤＮＯＣおよびスルフルラミドなど。（１４）ニコチン作動性アセチルコリン受容体アンタゴニスト、例えば、ベンスルタップ、カルタップ塩酸塩、チオシラム（ｔｈｉｏｃｙｌａｍ）およびチオスルタップ−ナトリウムなど。（１５）キチン生合成阻害剤、タイプ０、例えば、ビストリフルロン、クロルフルアズロン、ジフルベンズロン、フルシクロクスロン、フルフェノクスロン、ヘキサフルムロン、ルフェヌロン、ノバルロン、ノビフルムロンおよびテフルベンズロンなど。（１６）キチン生合成阻害剤、タイプ１、例えばブプロフェジン。（１７）脱皮阻害剤（とりわけハエ目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、すなわち双翅類に対するもの）、例えば、シロマジンなど。（１８）エクジソン受容体アゴニスト、例えば、クロマフェノジド、ハロフェノジド、メトキシフェノジドおよびテブフェノジドなど。（１９）オクトパミンアゴニスト。（２０）複合体Ｉｌｌ電子伝達阻害剤、例えば、ヒドラメチルノンもしくはアセキノシルもしくはフルアクリピリムなど。（２１）複合体Ｉ電子伝達阻害剤、例えばＭＥＴＩ殺ダニ剤の群からのもの、例として、フェナザキン、フェンピロキシメート、ピリミジフェン、ピリダベン、テブフェンピラドおよびトルフェンピラドもしくはロテノン（Ｄｅｒｒｉｓ）。（２２）電位作動型ナトリウムチャネルブロッカー、例えばインドキサカルブもしくはメタフルミゾン。（２３）アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤。（２４）複合体ＩＶ電子伝達阻害剤、例えば、ホスフィン、例として、リン化アルミニウム、リン化カルシウム、ホスフィンおよびリン化亜鉛もしくはシアニドなど。（２５）複合体ＩＩ電子伝達阻害剤、例えば、シエノピラフェンおよびシフルメトフェンなど。（２６）リアノジン受容体エフェクター、例えば、ジアミド、例として、商品名リナキシピル（商標）によっても知られているクロラントラニリプロール、およびシアントラニリプロールなど、または上で確認される化合物もしくは化合物分類の１もしくは複数の任意の組み合わせ。
【０１８４】
当業者は、農業目的のために用いられる他の公知の合成または天然起源の殺虫剤はまた、本開示による組成物、植物種子または接種物中に包含させるために選択され得ることを、容易に理解する。
【０１８５】
本明細書中に記載される内生胞子ディスプレイプラットフォームを用いたスクリーニング方法
本明細書中に開示される融合タンパク質コンストラクトおよび組換えパエニバチルス細胞は、本開示の全体を通じて論じられるように、新たなおよび／または改変された植物の特質を生じさせる異種タンパク質のハイスループットスクリーニングのためのプラットフォームとして用いられ得る。かかる特質としては、植物収量および他の植物特性における商業的に重要な改良、例えば、植物のタンパク質または油含量／組成の変化、植物の炭水化物含量／組成の変化；種子の炭水化物含量／組成の変化、種子の油またはタンパク質組成の変化；環境または化学的なストレスへの耐性（例として、寒冷または熱、干ばつ、殺虫剤または除草剤への抵抗性）の向上；老化の遅延または病害抵抗性；成長改善、健康増進；草食動物抵抗性；窒素固定または窒素利用の改善；根の構造または長さの改良；水使用効率の改善；バイオマスの増加；種子重量の増加；シュートの長さの増加；収量の増加；穀粒質量または水分含量の改変；金属耐性；病原体または有害生物への抵抗性；光合成能力改善；塩分耐性；成長力改善；成熟種子の乾燥重量および／または新鮮重量の増加、植物あたりの成熟種子数の増加；クロロフィル含量の増加；参照植物／種子に対する代謝物レベルまたはメタボロームにおける検出可能な変調；参照植物／種子に対する転写産物レベルまたはトランスクリプトームにおける検出可能な変調；参照植物に対するタンパク質レベルまたはプロテオームにおける検出可能な変調；ならびに上の形質または特質のいずれかの組み合わせなどが挙げられ得る。そのうえ、前のリストは、限定されない例のセットとして意図される。当業者は、本明細書中に開示されるハイスループット送達プラットフォームが、本開示中の他の場所で論じられる、またはそうでなければ当該技術分野で公知である様々な他の植物の形質および特質のスクリーニングに適していることを理解する。
【０１８６】
本開示による融合タンパク質を発現するように改変された組換えパエニバチルス細胞により産生される内生胞子は、インビトロで成長させた植物細胞、宿主植物種子、苗に、または栄養生殖植物、またはそうでなければ成熟植物に施用され得る。異種タンパク質は、結果として、インビトロで成長させた植物細胞、宿主植物種子、苗に、または成熟植物に、形質または特質を改変または付与し得る。選択実施形態において、パエニバチルス内生胞子は、種子に接種するために用いられ得て、結果として得られる新たなまたは改変された形質または特質は、直ちに明らかになり得るが、一方で他の実施形態では宿主植物のより後の発達ステージまで明らかにならないこともある。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質を送達するために用いられるパエニバチルス菌は、宿主植物種にとって外来である。他のものにおいて、選択されるパエニバチルス菌は、宿主植物種に定着することが知られている内在性のエンドファイトである。宿主植物は、本明細書に開示される任意の好適な植物（単子葉植物、双子葉植物、球果植物など）であり得る。
【０１８８】
融合タンパク質を送達するために用いられる組換えパエニバチルス菌は、コーティングもしくは噴霧によって、または当該技術分野で公知の宿主植物の内生胞子を施用する任意の他の方法によって、宿主植物種子、苗、栄養生殖植物、またはそうでなければ成熟植物検体に接種するために用いられ得る。液体として、例えば溶液または懸濁液として施用される場合、パエニバチルス内生胞子は、水溶液中に混合または懸濁され得る。好適な液体希釈剤または担体としては、水溶液、石油蒸留物または他の液体担体が挙げられる。固体組成物は、パエニバチルス内生胞子を、適切に分けられた固体担体、例えば泥炭、小麦、ふすま、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、ケイソウ土、フラー土、低温殺菌土壌などの中または上に分散させることにより調製することができる。かかる製剤が水和剤を含む場合、分散剤、例えば非イオン性、アニオン性、両性またはカチオン性の分散・乳化剤などを用いることができる。
【０１８９】
パエニバチルス内生胞子は、宿主植物種子の表面に直接的に、または栄養生殖植物の葉および茎に直接的に、または付加的な構成成分を含む組成物の一部として、施用され得る。付加的な構成成分としては、１または複数の、定着率を増大させる化合物、植物成長もしくは健康を増進する化合物、駆除剤もしくは除草剤、または植物の栽培および成長を促進するために適したものとして本明細書中に開示される任意の他の化合物が挙げられ得る。そのうえ、組成物は、異なるアミノ酸配列を含む融合タンパク質を発現するように改変されている付加的なパエニバチルス内生胞子を包含し得る。例えば、組成物は、植物成長促進因子を含む融合タンパク質を発現する第一のパエニバチルス内生胞子、同様に駆除剤抵抗性を増強するタンパク質を含む融合タンパク質を発現する第二のパエニバチルス内生胞子を含み得る。
【０１９０】
選択実施形態において、宿主植物の種子上にコーティングされた組換えパエニバチルス内生胞子は、種子が発芽して栄養生殖状態になると、植物の異なる組織に局在化することが可能である。例えば、組換えパエニバチルス細胞は、植物中の組織のうちのいずれか１つに局在化することが可能で、これら組織としては、根、不定根、種子根、根毛、シュート、葉、花、芽、房、成長点、花粉、雌ずい、子房、雄ずい、果実、走根、根茎、小結節、塊茎、毛状突起、孔辺細胞、排水組織、花弁、萼片、苞穎、花軸、維管束形成層、師部および木部が挙げられる。他の実施形態において、組換えパエニバチルス細胞は、植物の根および／または根毛に局在化することが可能であり得る。代替的実施形態において、組換えパエニバチルス細胞は、植物の光合成組織、例えば、植物の葉およびシュートに；または植物の維管束組織、例えば、木部および師部の中に局在化することが可能であり得る。
【０１９１】
他の実施形態において、組換えパエニバチルス細胞は、植物の生殖組織（花、花粉、雌ずい、子房、雄ずい、果実）に局在化することが可能である。なおさら別の実施形態において、組換えパエニバチルス細胞は、植物の果実または種子組織に定着する。なおさら別の実施形態において、組換えパエニバチルス細胞は、植物の表面（例として、植物の外側または植物の葉圏）に存在するように植物に定着することができる。なおさら他の実施形態において、組換えパエニバチルス細胞は、植物の実質的に全て、または全ての組織に局在化することが可能である。
【０１９２】
宿主植物への施用が予定される組換えパエニバチルス内生胞子を含む組成物は、種子コーティング組成物、根処理物、または葉面施用組成物を含み得る。種子コーティング組成物、または根処理物、または葉面施用組成物は、殺真菌剤、抗菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節物質、栄養分またはそれらの組み合わせを含み得る。種子コーティング組成物、または根処理物、または葉面施用組成物は、農業的に許容される担体、粘着付与剤、微生物安定剤またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。選択実施形態において、種子コーティング組成物、または根処理物、または葉面施用組成物は、第二の細菌を含有することができ、これとしては、限定されるものではないが根粒菌の細菌調製物が挙げられる。組成物はまた、界面活性剤を含有し得る。１つの実施形態において、界面活性剤は、０．０１％  ｖ／ｖから１０％  ｖ／ｖの間の濃度で存在する。別の実施形態において、界面活性剤は、０．１％  ｖ／ｖから１％  ｖ／ｖの間の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、組成物は、微生物安定剤（例として安定剤）を包含し得る。
【０１９３】
接種されたら、処理された宿主植物（例として、処理された種子、苗、栄養生殖植物、またはそうでなければ成熟植物）は、新たなまたは改変された特質または形質の存在についてスクリーニングされ得る。スクリーニングは、処理後の任意の時点で行うことができる。選択実施形態において、種子が処理され得て、種子が芽を出すまで、またはより先の発達ステージに達するまで、スクリーニングが行われないことがあり得る。他の実施形態において、種子、苗または栄養生殖植物が処理され得て、新たなまたは改変された形質または特質についてスクリーニングされる試料を含み得る収穫最終生産物を処理された植物が産生するまで、スクリーニングが行われないことがあり得る。
【０１９４】
スクリーニングの際、もしあるならばどのような利点が処理された宿主植物に付与されたかを決定するために、様々な試験がインビトロおよびインビボの両方で実施され得る。インビボのスクリーニングアッセイとしては、植物または種子の表現型形質または特質を測定する試験（例として、植物成長速度または高さ；作物収量；環境ストレス、例えば熱、寒冷または塩分などへの抵抗性；生物学的病原体または有害昆虫への抵抗性；化学処理、例えば殺虫剤または除草剤などへの抵抗性を測定するアッセイ）が挙げられる。インビトロのスクリーニングアッセイとしては、限定されるものではないが、植物抽出物、組織試料、細胞試料の組成または性質を測定する試験などが挙げられる。いくつかの実施形態において、インビトロスクリーニングは、処理された宿主植物の細胞または組織中で見出される所与のタンパク質、酵素、遺伝子転写産物、代謝物または他の化合物を精製してその量または活性を測定することを含み得る。他の実施形態において、スクリーニングは、処理された宿主植物の細胞または組織の構造を、肉眼によるものであろうと顕微鏡検査によったものであろうと、目視検査することを含み得る。
【０１９５】
代替的実施形態において、スクリーニングは、処理された宿主植物を対象とするアッセイと対照的に、本開示による融合タンパク質を発現するように改変された組換えパエニバチルス内生胞子または栄養細胞のアッセイを含み得る。これらの実施形態において、パエニバチルスファミリーメンバーの細胞または内生胞子は、１または複数の活性、例えば、限定されるものではないが、錯化したリン酸または錯化した鉄を遊離させる能力（例としてシデロフォアの分泌を通じて）；植物ホルモンの産生；抗菌性の、抗真菌性の、または殺虫性の、または殺線虫性の化合物の産生；ＡＣＣデアミナーゼ、アセトイン、ペクチナーゼ、セルラーゼまたはＲＮａｓｅの産生および／または分泌などのインビトロアッセイに供され得る。パエニバチルスファミリーメンバーの、栄養生殖植物よりもむしろ細胞または内生胞子を対象とするスクリーニング方法は、処理された宿主細胞を対象とする方法よりも早期に有用な異種タンパク質の検出を可能にし得る点で、とりわけ有利である。
【０１９６】
胞子表面ターゲティング配列を同定する方法
本開示は、本明細書中に記載される異種タンパク質のための胞子表面ディスプレイプラットフォームの一部として有用である、パエニバチルスにおいて同定されたいくつかのＮ末端胞子表面ターゲティング配列を開示する。しかしながら、本開示は、これらの特定の配列、その断片およびバリアントに限定されるものではない。本開示によるスクリーニング方法は、パエニバチルスおよび他の内生胞子形成性細菌の属において、内生胞子ディスプレイプラットフォームの一部として、または他の目的のために同様に有用であり得る付加的なＮ末端胞子表面ターゲティング配列を同定するために広く用いられ得る。１つの実施形態において、本発明のために有用な内生胞子形成性細菌は、図１中に示されるように、タンパク分解抵抗性である毛髪様構造を有する。例えば、本明細書中に開示されるスクリーニング方法は、リジニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビリディバチルス（Ｖｉｒｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ）およびブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）の内生胞子形成性メンバーにおいてＮ末端胞子表面ターゲティング配列を同定するために用いられ得る。
【０１９７】
いくつかの例示的な態様において、かかる配列は、対象のパエニバチルスまたは別の内生胞子形成性細菌のゲノムを、複数のコラーゲン様トリプレットアミノ酸リピート「グリシン−−任意の残基−−任意の残基」（「ＧＸＸリピート」）を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）についてスクリーニングすること、および、タンパク質が胞子表面に局在することを、顕微鏡検査により、または実験的に決定することによって同定され得る。これらのＧＸＸリピートは、ポリペプチド配列の隣接するまたは別の領域にあり得る。いくつかの態様において、ポリペプチド配列は、特定数の隣接するまたは総ＧＸＸリピートのうちの特定数（例として、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０個のＧＸＸリピート）についてスクリーニングされ得る。いくつかの態様において、タンパク質の局在は、視覚的に（例として透過電子顕微鏡検査を用いて）または実験的に（例として質量分析を用いて）決定される。いくつかの態様において、Ｎ末端ターゲティング配列を同定する方法は、推定Ｎ末端ターゲティング配列およびレポーター（例としてＧＦＰ）を含む融合タンパク質をパエニバチルスまたは他の細菌細胞中で発現させることにより、推定Ｎ末端ターゲティング配列を試験するステップをさらに含み得る。
【０１９８】
いくつかの態様において、本開示は、前述のスクリーニングプロセスによって同定されるタンパク質のＮ末端部を含む、パエニバチルスおよび他の細菌の属（例として、リジニバチルス、ビリディバチルスおよびブレビバチルス）からの胞子表面ターゲティング配列を提供する。かかるターゲティング配列のこのＮ末端ターゲティング配列は、内因性配列の最初の５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０もしくは５０個のアミノ酸、またはその断片もしくはバリアントを含み得る。いくつかの態様において、Ｎ末端ターゲティング配列は、内因性配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％同一なバリアント、またはその断片である。これらの方法によって同定されるパエニバチルスおよび他の細菌の属における胞子表面ターゲティング配列は、本明細書中に記載される様々な実施形態のうちのいずれかによる異種の融合タンパク質を作製するために用いられ得る。
【０１９９】
次の限定されない例は、本開示をさらに説明するために提供される。
【０２００】
［実施例］
実施例１：内生胞子ディスプレイに適したコラーゲン様胞子表面タンパク質を同定するための一般的なプロトコール
パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の全ゲノムについて、コラーゲン様ＧＸＸリピートを含有するＯＲＦを検索した。コラーゲン様胞子表面タンパク質を、次いで、透過電子顕微鏡検査により可視化した（図１）。コラーゲン様胞子表面タンパク質の存在はまた、質量分析により実験的に確認した。簡潔には、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の胞子をトリプシンで消化することで表面タンパク質を除去した。胞子を遠心分離により除去し、上清を質量分析により分析することで、コラーゲン様胞子表面タンパク質の存在を検証した。この一般的プロトコールを用いて、配列番号１〜１０により識別されるＮ末端ターゲティング配列を有する内因性のパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２タンパク質を同定した。同じ方法を用いることで、ビリディバチルス、リジニバチルスまたはブレビバチルスからの胞子表面タンパク質および対応するＮ末端ターゲティング配列を同定し得る。
【０２０１】
実施例２：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をディスプレイする組換えパエニバチルス内生胞子を調製するための一般的なプロトコール
融合コンストラクトを作製するため、遺伝子合成により、ＧＦＰをコードする遺伝子を、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の開示されたＮ末端ターゲティング配列（配列番号１）のアミノ酸をコードするＤＮＡセグメントであって、開示されたＮ末端ターゲティング配列のネイティブプロモーターの制御下にある前記セグメントに融合させ、Ｅ．コリ／パエニバチルスシャトルベクター、ｐＡＰ１３にクローニングした。結果として得られたベクターコンストラクトをパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２に導入した。次いで、正しい形質転換体を、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒの胞子形成液体培地中、３０℃で、胞子形成がされるまで増殖させた。融合コンストラクトを発現するパエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の胞子を、次いで、落射蛍光顕微鏡検査により調べた。ＧＦＰは、融合コンストラクトを発現する胞子上で視認できる（図２Ａ）。パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の胞子を、フローサイトメトリーによっても調べた。融合コンストラクトを発現する胞子は、野生型胞子よりも顕著に多くの蛍光がある（図２Ｂ）。
【０２０２】
実施例３．目的の任意タンパク質をディスプレイする組換えパエニバチルス内生胞子を調製するための一般的なプロトコール
パエニバチルス細胞（例として、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２）を、上の実施例２中に記載されるように培養し、形質転換し、スクリーニングすることで、本開示によるＮ末端胞子表面ターゲティング配列を有する融合コンストラクトを生産し得る。スクリーニングは、質量分析により、または当該技術分野で公知の任意の他の生化学的または視覚的手段（例として、目的タンパク質はＧＦＰまたは別の選択／スクリーニングタグでタグ付けされ得る）により進行させ得る。融合コンストラクトを作製するために用いられるＮ末端ターゲティング配列は、配列番号２、４、６、８もしくは１０、１８、２０、２１、２２、２４、２６、２８、３０のうちのいずれかのポリペプチド、またはその断片もしくはバリアントを含み得る。いくつかの態様において、Ｎ末端ターゲティング配列は、配列番号２および８のペアワイズアライメント（図３）中の同一残基に対応する１または複数の残基を有する配列を含み得て、これは、ポリペプチドを胞子表面にターゲティングすることが可能である。同様に、図３として提供される配列番号２および８のペアワイズアライメントの中の同一／保存残基に対応する１または複数の残基を有する配列を含むＮ末端ターゲティング配列が用いられ得る。
【０２０３】
例えば、Ｎ末端ターゲティング配列は、Ｍ−Ｘ−Ｖ−Ｘ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ｘ−Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｒ−Ｐ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｋ−Ｉ−Ｄ−Ｎ−Ｒ−Ｄ−Ｘ−Ｖ−Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｘ−Ｇ−Ｆ−Ｘ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｘ−Ｒ−Ｔ−Ｌ−Ｙ−Ｖ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｘ（配列番号３１）（ここで「Ｘ」は任意のアミノ酸を表す）を含み得て、または任意の連続的な５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５もしくは６０残基のそのセグメントを含む。別の例において、Ｎ末端ターゲティング配列は、Ｍ−Ｘ−Ｖ−Ｘ−Ｓ−Ｔ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ｘ−Ｎ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｒ−Ｐ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｋ−Ｉ−Ｄ−Ｎ−Ｒ−Ｄ−Ｘ−Ｖ−Ｎ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｖ−Ｌ−Ｉ−Ｘ−Ｇ−Ｆ−Ｘ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｘ−Ｒ−Ｔ−Ｌ−Ｙ−Ｖ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｖ−Ｘ−Ｘ−Ｎ−Ｘ−Ｖ−Ｉ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ａ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｆ−Ｅ−Ｆ−Ｖ−Ｆ−Ｔ−Ｔ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｅ−Ｎ−Ｅ−Ｘ−Ｑ−Ｘ−Ｓ−Ｖ−Ｗ−Ｇ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｘ−Ａ−Ｈ−Ｒ−Ｘ−Ｖ−Ｓ−Ｘ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ（配列番号３２）（ここで「Ｘ」は任意のアミノ酸を表す）を含み得て、または任意の連続的な５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５もしくは１２０残基のそのセグメントを含む。
【０２０４】
いくつかの態様において、選択されたＮ末端ターゲティング配列は、これらの配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を共有し得て、融合コンストラクトを胞子表面にターゲティングすることが可能なままであり得る。
【０２０５】
実施例４：組換えパエニバチルス内生胞子を用いた、植物成長促進性化合物の産生に関与する融合タンパク質を種子、苗、植物または植物部分に送達する方法
植物成長促進性化合物の産生を担う酵素は、本明細書中に開示されるパエニバチルス内生胞子送達システムを用いて植物に送達することができる。例えば、ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、アセトインを２，３−ブタンジオールに変換する。２，３−ブタンジオールは、植物成長促進性化合物である。この酵素を発現するパエニバチルス内生胞子は、種子処理もしくは種子コーティングとして施用することができ、または滴下もしくは噴霧により種子、苗、植物もしくは植物部分の周辺領域に送達することができる。
【０２０６】
実施例５：組換えパエニバチルス内生胞子を用いた、単一のパエニバチルス内生胞子上の複数の融合タンパク質を種子、苗、植物または植物部分に送達する方法
単一の組換えパエニバチルス内生胞子は、１つより多くの異種の融合タンパク質をディスプレイするために用いることができる。これは、２つ（またはそれより多く）の別の融合タンパク質を構築することにより達成される。パエニバチルス内生胞子表面上にディスプレイさせる各々の異種タンパク質のコーディング配列を、そのネイティブプロモーターの制御下にあるＮ末端ターゲティング配列に別々に融合させる。融合タンパク質コンストラクトは、同じプラスミドベクターまたは異なるプラスミドベクターにクローニングし、エレクトロポレーションによりパエニバチルスのメンバーに導入することができる。結果として得られるパエニバチルス内生胞子は、その後、胞子表面上に両方の異種タンパク質の混合物を発現する。これは、有害生物抵抗性を緩和するために複数のタンパク質性無脊椎動物毒素をスタックするために、とりわけ有用である。
【０２０７】
実施例６：各々が１または複数の異なる融合タンパク質をディスプレイする複数の組換えパエニバチルス内生胞子の組み合わせを用いた、１または複数の異なる融合タンパク質を種子、苗、植物または植物部分に供給する方法
ある場合において、各々が１または複数の異なる異種タンパク質を発現する１つより多くのパエニバチルス内生胞子の組み合わせでの送達が提供される（上記のように）。例えば、植物の根の周辺領域への窒素固定酵素の送達は、化学窒素肥料の必要性を低減させる。細菌における窒素固定は、最少でも８個または９個の異なる酵素を、および種に応じて潜在的には２０個までの異なる酵素を必要とし得る。ここで、各々が窒素固定経路の異なる酵素構成成分を発現するパエニバチルス内生胞子の組み合わせの送達が有用であり得る。例えば、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫを異種性にディスプレイするパエニバチルス内生胞子は、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮおよびＮｉｆＤを異種性にディスプレイするパエニバチルス内生胞子との混合物に組み合わされ、根の周辺領域に送達され得る。
【０２０８】
実施例７：組換えパエニバチルス内生胞子を用いた、無脊椎動物の植物有害生物を殺傷する無脊椎動物毒素を種子、苗、植物もしくは植物部分の周辺領域に、または種子処理として送達する方法
限定されるものではないが昆虫または線虫といった無脊椎動物に対して拮抗的であるタンパク質性毒素は、パエニバチルス内生胞子システムを用いて送達することができる。例えば、限定されるものではないが殺虫性でも殺線虫性でもあるＣｒｙ５ＢおよびＣｒｙ２１ＡといったＣｒｙ毒素は、パエニバチルス内生胞子における発現のためにＮ末端ターゲティング配列に融合させ得る。Ｃｒｙ毒素または他のタンパク質性無脊椎動物毒素を発現するパエニバチルス内生胞子は、無脊椎動物の植物病原体からの保護のために、種子処理もしくは種子コーティングとして施用することができ、または滴下もしくは噴霧により種子、苗、植物もしくは植物部分の周辺領域に送達することができる。
【０２０９】
実施例８：パエニバチルス内生胞子を用いた、細菌の植物有害生物に対して拮抗的であるペプチド、タンパク質または酵素を種子、苗、植物もしくは植物部分の周辺領域に、または種子処理として送達する方法
バクテリオシンは、他の細菌に対する拮抗活性を有する細菌により産生される小さなペプチドである。大きな非リボソームペプチド合成酵素により合成される他の抗微生物分子（例えばバシトラシン）とは対照的に、バクテリオシンはリボソーム的に合成されるという事実のため、バクテリオシンは、パエニバチルス内生胞子システムを用いた送達に特によく適している。１または複数のバクテリオシンのコーディング配列は、パエニバチルス内生胞子における発現のためにＮ末端ターゲティング配列に融合させ得る。バクテリオシンを発現するパエニバチルス内生胞子は、細菌の植物病原体からの保護のために、種子処理もしくは種子コーティングとして施用することができ、または滴下もしくは噴霧により種子、苗、植物もしくは植物部分の周辺領域に送達することができる。
【０２１０】
実施例９：パエニバチルス内生胞子を用いた、真菌の植物有害生物に対して拮抗的であるペプチド、タンパク質または酵素を種子、苗、植物もしくは植物部分の周辺領域に、または種子処理として送達するための方法
真菌の主要な細胞壁構成成分はキチンである。キチナーゼはキチンを分解する酵素であり、それらの細胞壁を破壊することにより真菌植物病原体から保護するためにパエニバチルス内生胞子の表面上に発現させることができる。キチナーゼを発現するパエニバチルス内生胞子は、種子処理もしくは種子コーティングとして施用することができ、または滴下もしくは噴霧により種子、苗、植物もしくは植物部分の周辺領域に送達することができる。
【０２１１】
実施例１０：パエニバチルス内生胞子を用いた、細菌、真菌または植物の栄養源を分解または改質する酵素を種子、苗、植物もしくは植物部分の周辺領域に、または種子処理として送達するための方法
細菌、真菌または植物の栄養源の分解または改質を担う酵素は、組換えパエニバチルス内生胞子を用いて植物に送達することができる。例えば、複雑な多糖を壊すグリコシドヒドロラーゼは、この目的酵素（または別の酵素）を発現する組換えパエニバチルス内生胞子で植物または種子を処理することにより、単純な糖を有益な根圏細菌に利用可能にするために用いることができる。
【０２１２】
実施例１１：パエニバチルス内生胞子を用いた植物成長促進性の生物防除剤に由来するゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングによる、植物成長促進性の生物防除剤への応答を評価するための方法
今日用いられている生物防除株の多くは外因性のＤＮＡ取り込みが困難であり、このことは研究者が前記株の標的化遺伝子改変体を作製することを不可能にしている。この課題のため、これらの生物防除株が持つ植物成長促進効果の作用メカニズムを解明することは、信じられないほどに困難である。パエニバチルス内生胞子は、生物防除株の潜在的な植物成長促進効果を担う特異的遺伝子を同定するための新規のアプローチを提示する。まず、Ｎ末端ターゲティング配列およびネイティブプロモーターを好適なＥ．コリ／バチルスシャトルベクター（例としてｐＨＰ１３）にクローニングし、その結果、パエニバチルス内生胞子上での異種タンパク質発現に適したベクターを得る。全てのクローニングステップおよびプラスミドの増殖は、Ｅ．コリにおいて実施される。次に、総ｇＤＮＡを標的の植物成長促進性の生物防除株から抽出する。ｇＤＮＡを剪断して断片にし（酵素的にまたは超音波的に）、パエニバチルス内生胞子上での異種タンパク質発現のための上記ベクターにライゲーションすることで、対象の生物防除株に由来する全ての遺伝材料から構成されるｇＤＮＡライブラリーを作製する。結果として得られたベクターライブラリーをエレクトロポレーションによりパエニバチルスのメンバーに導入し、細菌を適切な抗生物質選択剤を含有する寒天プレート上に播くことで、パエニバチルス内生胞子の形質転換体を選択する。各々が標的生物防除株のｇＤＮＡの異なる断片を発現する個々のパエニバチルス内生胞子形質転換体を、植物成長促進効果について評価する。これらの効果としては、限定されるものではないが、緑色化の増大、発芽の改善、植物成長力の向上、根長の増加、根質量の増加、植物高の上昇、葉面積の増加または有害生物への抵抗性を挙げることができる。上述の植物健康パラメーターを調節することが見出されたパエニバチルス内生胞子形質転換体中のベクターは、観察された植物成長促進効果を担う生物防除株に由来する遺伝的決定因子を同定するために配列決定することができる。
【０２１３】
実施例１２：パエニバチルス内生胞子を用いた、植物無脊椎動物、細菌および真菌の植物病原体に対して拮抗的である新規または性質不明の毒素を同定するための方法
今日使用中である生物防除株の多くは外因性のＤＮＡ取り込みが困難であり、このことは研究者が前記株の標的化遺伝子改変体を作製することを不可能にしている。この課題のため、生物防除株が無脊椎動物、細菌および真菌の植物病原体に対して毒性となる作用メカニズムを解明することは、信じられないほどに困難である。パエニバチルス内生胞子は、生物防除株の潜在的な植物保護効果を担う特異的遺伝子を同定するための新規のアプローチを提示する。まず、Ｎ末端ターゲティング配列およびネイティブプロモーターを好適なＥ．コリ／バチルスシャトルベクター（例としてｐＨＰ１３）にクローニングし、その結果、パエニバチルス内生胞子上での異種タンパク質発現に適したベクターを得る。全てのクローニングステップおよびプラスミドの増殖は、Ｅ．コリにおいて実施される。次に、総ｇＤＮＡを標的の植物成長促進性の生物防除株から抽出する。ｇＤＮＡを剪断して断片にし（酵素的にまたは超音波的に）、パエニバチルス内生胞子上での異種タンパク質発現のための上記ベクターにライゲーションすることで、対象の生物防除株に由来する全ての遺伝材料から構成されるｇＤＮＡライブラリーを作製する。結果として得られたベクターライブラリーをエレクトロポレーションによりパエニバチルスのメンバーに導入し、細菌を適切な抗生物質選択剤を含有する寒天プレート上に播くことで、パエニバチルス内生胞子の形質転換体を選択する。各々が標的生物防除株のｇＤＮＡの異なる断片を発現する個々のパエニバチルス内生胞子形質転換体を、無脊椎動物、細菌および真菌の植物病原体に対するアンタゴニスト活性について評価する。上の植物病原体に対して拮抗的であることが見出されたパエニバチルス内生胞子形質転換体中のベクターは、観察された植物保護効果を担う生物防除株に由来する遺伝的決定因子を同定するために配列決定することができる。
【０２１４】
実施例１３：非生存パエニバチルス内生胞子を用いた、病原体からの植物の保護または植物健康の改善の目的のために種子、苗、植物または植物部分を処理するための方法
非生存の（死んだ）パエニバチルス内生胞子を有するパエニバチルス内生胞子送達システムを用いて植物健康促進性タンパク質／酵素または植物保護タンパク質／酵素を送達するニーズがあり得る。パエニバチルス内生胞子は、十分な熱処理、ＵＶ光、ガンマ線照射または高圧処理によって不活化して非生存にすることができる。結果として得られた非生存のパエニバチルス内生胞子は、種子処理もしくは種子コーティングとして施用することができ、または滴下もしくは噴霧により種子、苗、植物もしくは植物部分の周辺領域に送達することができる。
【０２１５】
実施例１４．エシェリキア・コリからのベータ−ガラクトシダーゼ（Β−Ｇａｌ）をディスプレイする組換えパエニバチルス内生胞子を調製するための一般的なプロトコール
融合コンストラクトを作製するため、遺伝子合成により、β−ｇａｌをコードする遺伝子を、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の開示されたＮ末端ターゲティング配列（配列番号１）のアミノ酸をコードするＤＮＡセグメントであって、開示されたＮ末端ターゲティング配列のネイティブプロモーターの制御下にある前記セグメントに融合させ、Ｐａｔｒｉｃｋ，ＪＥ  ａｎｄ  Ｋｅａｒｎｓ，ＤＢ．  ２００８．  ＭｉｎＪ  （ＹｖｊＤ）  ｉｓ  ａ  Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．７０：１１６６−１１７９中に記載されるｐＭｉｎｉＭａｄベクターに由来するＥ．コリ／パエニバチルスシャトルベクターにクローニングした。結果として得られたベクターコンストラクトを、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｔｉｍｍｕｓｋ（２０１３），”Ａ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ａｎｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｌｏｎｅｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ，”  ＰＬｏＳＯＮＥ，８（６）：ｅ６８０９２，ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６８０９２により記載されているものと同様に、エレクトロポレーションによりパエニバチルス・ポリミキサ株（Ｓｔｒａｉｎ  １）に導入した。ターゲティング配列を含まないシャトルベクターを含有する対照も調製した。次いで、正しい形質転換体を、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒの胞子形成液体培地中、３０℃で、胞子形成がされるまで増殖させた。結果として得られた培養液を遠心分離することで上清を胞子から分けた。融合コンストラクトを発現するまたは空のシャトルベクターのみを含有するパエニバチルス・ポリミキサの胞子、および対応する上清を、その後、インビトロアッセイにより調べた。β−ｇａｌは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）の加水分解に基づいて、融合コンストラクトを発現する胞子上で機能する。結果を下の表３中に示す。
【０２１６】
表３．上清および胞子のベータガラクトシダーゼ活性
【表３】
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【０２１７】
実施例１５．バチルス・チューリンゲンシスからの栄養成長期殺虫性タンパク質３（Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ３、Ｖｉｐ３）（配列番号１７）をディスプレイする組換えパエニバチルス内生胞子を調製するための一般的なプロトコール
融合コンストラクトを作製するため、ｖｉｐ３をコードする遺伝子（配列番号１６）を、実施例１４中に記載されるＥ．コリ／パエニバチルスシャトルベクターへのＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙにより、パエニバチルス種ＮＲＲＬ  Ｂ−５０９７２の開示されたＮ末端ターゲティング配列（配列番号１）のアミノ酸をコードするＤＮＡセグメントに融合させた。融合物の発現は、開示されたＮ末端ターゲティング配列のネイティブプロモーターの制御下にある。結果として得られたベクターコンストラクトを、上記のように、エレクトロポレーションによりパエニバチルス・ポリミキサ株（Ｓｔｒａｉｎ  １）に導入した。次いで、正しい形質転換体を、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒの胞子形成液体培地中、３０℃で、胞子形成がされるまで増殖させた。
【０２１８】
実施例１６．スポドプテラ・エキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）に対するＶｉｐ３を発現するパエニバチルス・ポリミキサ株の活性
実施例１５からのＶｉｐ３を発現するパエニバチルス・ポリミキサ株のスポドプテラ・エキシグア（ビートヨトウムシ（ｂｅｅｔ  ａｒｍｙｗｏｒｍ））に対する殺虫活性を評価した。９６ウェルプレートアッセイを実施することで、空ベクター対照および活性カーゴ（配列番号２−Ｖｉｐ３）を包含する各パエニバチルス・ポリミキサ株の殺虫活性を試験した。菌株をＳｃｈａｅｆｆｅｒの胞子形成液体培地中で胞子形成がされるまで増殖させることにより菌株の胞子を産生させ、結果として得られた全液体培地を遠心分離することで胞子を上清から分離した。菌株からの胞子試料を次いで、Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５），”Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｅａｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃｏｒｎ  Ｒｏｏｔｗｏｒｍ，  Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａ  ｈｏｗａｒｄｉ  Ｂａｒｂｅｒ（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ：  Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ），ｏｎ  ａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎ，”  Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．，７８：２９０−２９３中に記載されているものと同様に寒天基材を含有する９６ウェルマイクロプレートにアプライした。胞子試料を次いで水中に希釈し、１００％、３３％、１１％、３．７％および１．２％の濃度でプレートにアプライした。
【０２１９】
処理物を乾燥させた後、スポドプテラ・エキシグア（ビートヨトウムシ）からの卵  約２０個を各ウェルに加えた。数日後、処理された幼虫の発育阻害スコアおよび死亡率スコアを評価することにより、殺虫活性を決定した。昆虫の発育阻害スコアは、次のスケールに従って評点した：１＝重度の発育阻害、２＝高度の発育阻害、最小限の成長、３＝未処理の対照よりわずかに小さい、４＝未処理の対照と同じ大きさ。昆虫死亡率スコアは、次のスケールに基づく：４＝０〜２５％の死亡率、３＝２６〜５０％の死亡率、２＝５１〜７９％の死亡率、１＝８０〜１００％の死亡率。
【０２２０】
ターゲティングされたＶｉｐ３（すなわち、配列番号２−Ｖｉｐ３）を発現する１１％のパエニバチルス胞子で処理されたスポドプテラ・エキシグアの幼虫は、空ベクターを発現する同濃度のパエニバチルス胞子で処理されたものよりも２倍強い発育阻害を経験した（表４を参照されたい）。同様に、ターゲティングされたＶｉｐ３を発現する１１％のパエニバチルス胞子で処理された幼虫は、空ベクターを発現する同濃度のパエニバチルス胞子で処理されたものよりも１．５倍高い死亡率を経験した（表５を参照されたい）。
【０２２１】
表４．スポドプテラ・エキシグア（ビートヨトウムシ）の発育阻害評点
【表４】
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【０２２２】
表５．スポドプテラ・エキシグア（ビートヨトウムシ）の死亡率評点
【表５】
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【０２２３】
特に定義されないかぎり、本明細書中の全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。引用される全ての刊行物、特許および特許公開は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【０２２４】
開示される発明は、これらが変わることができることから、記載される特定の方法、プロトコールおよび材料に限定されないことが理解される。
【０２２５】
また、本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためのものであり、添付の特許請求の範囲のみにより限定される本発明の範囲を限定することを意図していないことが理解される。
【０２２６】
当業者は、本明細書中に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識する、または通例に過ぎない実験法を用いて確認することができる。かかる等価物は、次の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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