(57)【要約】免疫調節成分を含む細胞外小胞が、本明細書に開示される。細胞外小胞を産生するための方法、ならびにがん、ＧｖＨＤ、及び自己免疫疾患を治療するために細胞外小胞を使用するための方法も、提供される。ヒト免疫系を上方調節または下方調節し、がんと戦うために患者の免疫系を増強するか、またはＧｖＨＤ及び自己免疫疾患の症状を緩和させるために患者の免疫系を抑制することができる免疫調節成分を有する、選択、濃縮、または操作された細胞外小胞を含む組成物が、本明細書に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
封入体積を境界する細胞膜を含む細胞外小胞であって、前記細胞膜が内面及び外面を有する前記細胞外小胞と、
前記細胞膜に結合するか、または前記封入体積内に封入された第１の免疫調節成分とを含む、組成物。
【請求項２】
前記第１の免疫調節成分が、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ−３）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ならびにＣＤ７３からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１の免疫調節成分が、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記正の共刺激分子がＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記正の共刺激分子の活性化剤がＴＮＦスーパーファミリーメンバーである、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーが、ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ−２からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがＣＤ４０Ｌである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがＣＤ２７Ｌである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記正の共刺激分子がＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子である、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子が、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である、請求項４に記載の組成物。
【請求項１５】
正の共刺激分子の前記活性化剤がＣＤ８０である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１の免疫調節成分が、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１５からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記サイトカインがＩＬ−７である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記サイトカインがＩＬ−１２である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記サイトカインがＩＬ−１５である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１の免疫調節成分が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞共受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、またはそれらの誘導体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第１の免疫調節成分が、Ｔ細胞受容体または共受容体の活性化剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｔ細胞受容体または共受容体の前記活性化剤が、ＣＤ３の活性化剤、任意選択でＣＤ３のアゴニスト抗体である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第１の免疫調節成分が腫瘍抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記腫瘍抗原が、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ−葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん−精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍抗原が参照ゲノム配列に由来する、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記腫瘍抗原が対象のゲノム配列に由来する、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第１の免疫調節成分が、アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項１〜２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
前記第１の免疫調節成分が、抗体または抗原結合断片である、請求項１〜２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１の免疫調節成分がポリヌクレオチドである、請求項１〜２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｄｓＤＮＡからなる群から選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記第１の免疫調節成分が、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である、請求項１〜２７に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第１の免疫調節成分が、前記細胞外小胞の前記外面に表示される融合タンパク質として発現される、請求項１〜３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
前記融合タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片もしくはバリアントを含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記融合タンパク質の配列が配列番号３である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記細胞外小胞がエクソソームである、請求項１〜３５のいずれかに記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞外小胞がナノベシクルである、請求項１〜３２のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜３７のいずれかに記載の組成物。
【請求項３９】
前記細胞外小胞が第２の免疫調節成分を追加的に含む、請求項１〜３８のいずれかに記載の組成物。
【請求項４０】
前記第２の免疫調節成分が、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記負のチェックポイント調節因子が、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ−３）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ならびにＣＤ７３からなる群から選択される、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第２の免疫調節成分が、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
前記正の共刺激分子がＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーが、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択される、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
正の共刺激分子の前記活性化剤がＴＮＦスーパーファミリーメンバーである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーが、ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ−２からなる群から選択される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがＣＤ４０Ｌである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがＣＤ２７Ｌである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＴＮＦスーパーファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項５０】
前記正の共刺激分子がＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子が、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
正の共刺激分子の前記活性化剤が、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項５３】
正の共刺激分子の前記活性化剤がＣＤ８０である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記第２の免疫調節成分が、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項５５】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１５からなる群から選択される、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記サイトカインがＩＬ−７である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記サイトカインがＩＬ−１２である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５８】
前記サイトカインがＩＬ−１５である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５９】
前記第２の免疫調節成分が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞共受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、またはそれらの誘導体である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項６０】
前記第２の免疫調節成分が、Ｔ細胞受容体または共受容体の活性化剤である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項６１】
Ｔ細胞受容体または共受容体の前記活性化剤が、ＣＤ３の活性化剤、任意選択でＣＤ３のアゴニスト抗体である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記第２の免疫調節成分が腫瘍抗原である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項６３】
前記腫瘍抗原が、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ−葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん−精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記腫瘍抗原が参照ゲノム配列に由来する、請求項６２または６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記腫瘍抗原が対象のゲノム配列に由来する、請求項６２または６３に記載の組成物。
【請求項６６】
前記第２の免疫調節成分が、アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項３９〜６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６７】
前記第２の免疫調節成分が、抗体または抗原結合断片である、請求項３９〜６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６８】
前記第２の免疫調節成分がポリヌクレオチドである、請求項３９〜６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６９】
前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｄｓＤＮＡからなる群から選択される、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記第２の免疫調節成分が、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である、請求項３９〜６５に記載の組成物。
【請求項７１】
前記第２の免疫調節成分が、前記細胞外小胞の外面に表示される融合タンパク質として発現される、請求項３９〜７０のいずれかに記載の組成物。
【請求項７２】
前記融合タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片もしくはバリアントを含む、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記融合タンパク質の配列が配列番号３である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記第２の免疫調節成分が前記第１の免疫調節成分と異なる、請求項３９〜７３のいずれかに記載の組成物。
【請求項７５】
前記細胞外小胞が第３の免疫調節成分を追加的に含む、請求項３９〜７４のいずれかに記載の組成物。
【請求項７６】
前記第３の免疫調節成分が、前記第１及び第２の免疫調節成分と異なる、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記請求項１〜３８のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、
産生細胞を、前記第１、第２、及び／または第３の免疫調節成分で修飾することと、
前記細胞外小胞を前記産生細胞から得ることと、
任意選択で、前記得られた細胞外小胞を単離することと、を含む、前記方法。
【請求項７８】
前記請求項１〜３８のいずれかに記載の組成物を製造する方法であって、
前記細胞外小胞を産生細胞から得ることと、
前記得られた細胞外小胞を単離することと、
前記単離された細胞外小胞を、前記第１、第２、及び／または第３の免疫調節成分で修飾することと、を含む、前記方法。
【請求項７９】
前記単離された細胞外小胞を医薬組成物中に製剤化することをさらに含む、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
対象におけるがんを治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量の前記請求項１〜３８のいずれかに記載の組成物を投与することを含み、前記組成物が前記対象における免疫応答を上方調節し、それによって前記対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる、前記方法。
【請求項８１】
対象における移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量の請求項１〜３８のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が前記対象における免疫応答を下方調節し、それによってＧｖＨＤの症状を軽減することができる、前記方法。
【請求項８２】
対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、
前記対象に、治療有効量の請求項１〜３８のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が前記対象における免疫応答を下方調節し、それによって前記対象の免疫活性を抑制することができる、前記方法。
【請求項８３】
対象におけるがんを治療するまたは予防する方法であって、
前記対象に、治療有効量の請求項２４〜２７のいずれかに記載の前記組成物を投与することを含み、前記組成物が前記腫瘍抗原に対する免疫応答を増強し、それによって、がんに対する前記対象の前記免疫応答を増強することができる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２７日に出願された米国仮出願第６２／７２３，２６７号、及び２０１７年１２月２８日に出願された同第６２／６１１，１４０号の優先権を主張し、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ヒト免疫系を相互作用させ調節するための組成物、組成物を作成する方法、及び組成物を使用してがん、ＧｖＨＤ、及び自己免疫疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫療法とは、免疫応答を誘導、増強、または抑制することによる疾患の治療である。免疫療法は、がん細胞を攻撃するために患者自身の免疫系を刺激することができる。がん免疫療法は、通常、化学療法や放射線療法のような従来のがん療法に比べて少ない副作用を有する。抗炎症免疫療法は、自己免疫疾患及び移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を治療するための患者の免疫系を下方調節することができる。必要なのは、免疫調節分子を体の細胞及び組織に送達するための改善された方法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
薬物送達ビヒクルとして、細胞外小胞は、特に遺伝子治療のために、従来の薬物送達方法よりも多くの利益を提供する。細胞外小胞の全身送達は、様々な組織へのこれらの脂質ナノ粒子の分布を生じさせる。研究は、細胞外小胞がヒト免疫系の調節に関与する様々な細胞と相互作用できることを示している。ヒト免疫系を活性化、抑制、または影響を与えるために治療分子を送達するように選択、濃縮、または操作された細胞外小胞は、がん及び他の免疫系関連疾患に対して強力な治療薬であり得る。
【０００５】
ヒト免疫系を上方調節または下方調節し、がんと戦うために患者の免疫系を増強するか、またはＧｖＨＤ及び自己免疫疾患の症状を緩和させるために患者の免疫系を抑制することができる免疫調節成分を有する、選択、濃縮、または操作された細胞外小胞を含む組成物が、本明細書に提供される。
【０００６】
ヒト免疫系を調節するために細胞外小胞を産生及び利用する方法も、提供される。
【０００７】
したがって、第１の態様では、封入体積を境界する細胞膜を含む細胞外小胞であって、細胞膜が内面及び外面を有している細胞外小胞と、細胞膜に結合するか、または封入体積内に封入された第１の免疫調節成分と、を含む組成物が、本明細書に提供される。
【０００８】
様々な実施形態では、第１の免疫調節成分は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、負のチェックポイント調節因子は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ−３）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ならびにＣＤ７３からなる群から選択される。
【０００９】
様々な実施形態では、第１の免疫調節成分は、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである。これらの実施形態のいくつかでは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーである。これらの実施形態のいくつかでは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ−２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＣＤ４０Ｌである。ある特定の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＣＤ２７Ｌである。ある特定の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＯＸ４０Ｌである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、正の共刺激分子は、ＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子は、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。ある特定の実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、ＣＤ８０である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、第１の免疫調節成分は、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１５からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−７である。ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２である。ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第１の免疫調節成分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞共受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、またはその誘導体である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、第１の免疫調節成分は、Ｔ細胞受容体または共受容体の活性化剤である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体または共受容体の活性化剤は、ＣＤ３の活性化剤、任意選択でＣＤ３のアゴニスト抗体である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１の免疫調節成分は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ−葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん−精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、参照ゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、対象のゲノム配列に由来する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、第１の免疫調節成分は、選択された標的または活性のアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第１の免疫調節成分は、抗体または抗原結合断片である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、第１の免疫調節成分は、ポリヌクレオチドである。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｄｓＤＮＡからなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第１の免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、第１の免疫調節成分は、該細胞外小胞の外側表面に表示される融合タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の配列は、配列番号３である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームである。いくつかの他の実施形態では、細胞外小胞は、ナノベシクルである。
【００２１】
ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、第２の免疫調節成分を追加的に含む。
【００２３】
様々な実施形態では、第２の免疫調節成分は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、負のチェックポイント調節因子は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ−３）、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ならびにＣＤ７３からなる群から選択される。
【００２４】
様々な実施形態では、第２の免疫調節成分は、正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーである。これらの実施形態のいくつかでは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＡＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーである。これらの実施形態のいくつかでは、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ−２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＣＤ４０Ｌである。ある特定の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＣＤ２７Ｌである。ある特定の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＯＸ４０Ｌである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、正の共刺激分子は、ＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子は、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である。いくつかの実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。ある特定の実施形態では、正の共刺激分子の活性化剤は、ＣＤ８０である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、サイトカインまたはサイトカインの結合パートナーである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１５からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−７である。ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２である。ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞共受容体、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、またはそれらの誘導体である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、Ｔ細胞受容体または共受容体の活性化剤である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体または共受容体の活性化剤は、ＣＤ３の活性化剤、任意選択でＣＤ３のアゴニスト抗体である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ−葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん−精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、参照ゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、対象のゲノム配列に由来する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、選択された標的または活性のアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、抗体または抗原結合断片である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、ポリヌクレオチドである。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｄｓＤＮＡからなる群から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、該細胞外小胞の外側表面に表示される融合タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片もしくはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質の配列は、配列番号３である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、第２の免疫調節成分は、該第１の免疫調節成分と異なる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、第３の免疫調節成分を追加的に含む。いくつかの実施形態では、第３の免疫調節成分は、該第１及び第２の免疫調節成分と異なる。
【００３７】
別の態様では、組成物を製造する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、産生細胞を第１、第２、及び／または第３の免疫調節成分で修飾することと、細胞外小胞を産生細胞から得ることと、任意選択で得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの他の実施形態では、方法は、産生細胞から細胞外小胞を得ることと、得られた細胞外小胞を単離することと、単離された細胞外小胞を、第１、第２、及び／または第３の免疫調節成分で修飾することと、を含む。ある特定の実施形態では、方法は、単離された細胞外小胞を医薬組成物中に製剤化することをさらに含む。
【００３８】
別の態様では、対象におけるがんを治療する方法が、本明細書に提供される。方法は、治療有効量の組成物を対象に投与することを含み、組成物は、対象における免疫応答を上方調節し、それによって対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる。
【００３９】
別の態様では、対象における移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を治療する方法が、本明細書に提供される。方法は、治療有効量の組成物を対象に投与することを含み、組成物は、対象における免疫応答を下方調節し、それによってＧｖＨＤの症状を軽減することができる。
【００４０】
別の態様では、対象の自己免疫疾患を治療する方法が、本明細書に提供される。方法は、治療有効量の組成物を対象に投与することを含み、組成物は、対象における免疫応答を下方調節し、それによって対象の免疫活性を抑制することができる。
【００４１】
別の態様では、腫瘍抗原を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療するまたは予防する方法であって、その組成物が、腫瘍抗原に対する免疫応答を増強し、それによって、がんに対する対象の免疫応答を増強することができる方法が、本明細書に提供される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ−葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん−精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。
【００４３】
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、参照ゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、対象のゲノム配列に由来する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】放射標識エクソソームを注射されたマウスの時間経過を示す。図１Ａは、静脈内投与経路を示す。図１Ｂは、腹腔内投与経路を示す。
【図２】放射標識エクソソームの静脈内及び腹腔内投与後の、異なるマウス組織におけるエクソソーム分布の定量である。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ＣＤ４０Ｌ発現エクソソームとインキュベートした後の、２例のヒトドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＢ細胞活性化の効果を示す。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、ＣＤ４０Ｌ発現エクソソームとインキュベートした後の、２人のヒトドナーからの精製されたＢ細胞のＢ細胞活性化の効果を示す。
【図５】図５Ａは、ＣＤ４０レポーター細胞株の概略図である。図５Ｂは、抗ＣＤ４０アゴニスト抗体または組換えヒトＣＤ４０Ｌで処理されたＣＤ４０レポーター細胞株の濃度依存的活性化を示す。図５Ｃは、ＣＤ４０レポーター細胞株に対するＣＤ４０Ｌ発現エクソソームの効果を示す。
【図６】ＣＤ８０発現エクソソームを有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＴ細胞活性化の効果を示す。図６Ａは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数に対するＣＤ８０発現エクソソームの効果を示す。図６Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数に対するＣＤ８０発現エクソソームの効果を示す。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ発現に対するＣＤ８０発現エクソソームの効果を示す。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、２例のドナーからのヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ発現に対するＣＤ２７Ｌ発現エクソソームの効果を示す。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、２例のドナーからのヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−２発現に対するＣＤ２７Ｌ発現エクソソームの効果を示す。
【図１０】図１０Ａ及び図１０Ｂは、２例のドナーからのヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ発現に対するＯＸ４０Ｌ発現エクソソームの効果を示す。
【図１１】図１１Ａ及び図１１Ｂは、２例のドナーからのヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ−２発現に対するＯＸ４０Ｌ発現エクソソームの効果を示す。
【図１２】図１２Ａは、ＯＸ４０レポーター細胞株の概略図である。図１２Ｂは、抗ＯＸ４０アゴニスト抗体または組換えヒトＯＸ４０Ｌで処理されたＯＸ４０レポーター細胞株の濃度依存的活性化を示す。図１２Ｃは、ＯＸ４０レポーター細胞株に対するＯＸ４０Ｌ発現エクソソームの効果を示す。
【図１３】図１３Ａ及び図１３Ｂは、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ発現に対する抗ＣＤ３抗体と組み合わせたＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。
【図１４】図１４Ａは、ＩＬ−７受容体レポーター細胞株の概略図である。図１４Ｂは、組換えヒトＩＬ−７で処理されたＩＬ−７受容体レポーター細胞株の濃度依存的活性化を示す。図１４Ｃは、ＩＬ−７受容体レポーター細胞株に対するＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。
【図１５】ＥｄＵ組み込みによって測定された、インビボでのマウスにおけるＴ細胞増殖に対するＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。図１５Ａは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。図１５Ｂは、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。
【図１６】ＣＤ７１陽性によって測定された、インビボでのマウスにおけるＴ細胞増殖に対するＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。図１６Ａは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。図１６Ｂは、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。
【図１７】図１７Ａは、エクソソームの表面上に高密度で発現された、ＰＴＧＦＲＮ／ＩＬ−７融合タンパク質、及び融合タンパク質のバリアントの概略図を示す。図１７Ｂは、最適化されたＰＴＧＦＲＮ／ＩＬ−７融合タンパク質の配列である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、精製されたエクソソームの表面上の異なるＩＬ−７融合タンパク質の相対発現を示すウエスタンブロットである。図１８Ｂは、ＩＬ−７媒介性Ｔ細胞活性化のモデルとしての、ＩＬ−７受容体下方調節に対するＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａは、精製されたエクソソームの表面上の異なるＩＬ−７融合タンパク質の相対発現を示すウエスタンブロットである。図１８Ｂは、ＩＬ−７媒介性Ｔ細胞活性化のモデルとしての、ＩＬ−７受容体下方調節に対するＩＬ−７発現エクソソームの効果を示す。
【図１９】図１９Ａは、ＰＢＭＣにおけるＴ細胞活性化に対する抗ＣＤ３ｓｃＦｖエクソソームの効果を示す。図１９Ｂは、ＰＢＭＣにおけるＢ細胞活性化に対する抗ＣＤ３ｓｃＦｖエクソソームの効果を示す。
【図２０】図２０Ａは、ＰＢＭＣにおけるＴ細胞活性化に対する抗ＣＤ３ｓｃＦａｂエクソソームの効果を示す。図２０Ｂは、ＰＢＭＣにおけるＢ細胞活性化に対する抗ＣＤ３ｓｃＦａｂエクソソームの効果を示す。
【図２１】図２１Ａは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖエクソソームで処理した後の、Ｔ細胞活性化の程度を示すヒストグラムである。図２１Ｂは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖエクソソームで処理した後の、Ｂ細胞活性化の程度を示すヒストグラムである。
【図２２】図２２Ａは、可溶性抗ＣＤ３抗体またはプレートコーティング抗ＣＤ３抗体と比較した、プレートコーティング活性化アッセイにおけるＴ細胞活性化に対する抗ＣＤ３ｓｃＦａｂエクソソームの効果を示す。図２２Ｂは、図２２Ａに示すように行われた別個の実験の結果を定量化する棒グラフである。
【図２３】図２３Ａは、全長ＰＴＧＦＲＮ／ＩＬ−１２融合タンパク質の概略図を示す。図２３Ｂは、短縮ＰＴＧＦＲＮ／ＩＬ−１２融合タンパク質の概略図を示す。
【図２４】図２４Ａは、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγを誘導する、短いもしくは全長のいずれかのＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２を過剰発現する組換えヒトＩＬ−１２またはエクソソームの効果を示す。図２４Ｂは、組換えＩＬ−１２及びＩＬ−１２含有エクソソームの効力を要約する表である。
【図２５】組換えＩＬ−１２及びＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームが、メラノーマのマウスモデルにおいて腫瘍成長を低減させる効果を示す。
【図２６】図２６Ａは、ＰＢＳで処理された図２５に示される腫瘍担持マウスの各々の腫瘍成長曲線を示す。図２６Ｂは、組換えＩＬ−１２で処理された図２５に示される腫瘍担持マウスの各々の腫瘍成長曲線を示す。図２６Ｃは、ＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームで処理された図２５に示される腫瘍担持マウスの各々の腫瘍成長曲線を示す。
【図２７】図２５に示される有効性試験における全てのＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの画像を示す。
【図２８】図２５に示されるＢ１６Ｆ１０腫瘍担持マウスの生存曲線を示す。
【図２９】図２９Ａは、ＰＢＳ、ｒＩＬ−１２またはＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームで処理されたマウスの腫瘍におけるＩＦＮγ遺伝子発現のレベルを示す。図２９Ｂは、ＰＢＳ、ｒＩＬ−１２またはＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームで処理されたマウスの腫瘍におけるＣＸＣＬ９遺伝子発現のレベルを示す。図２９Ｃは、ＰＢＳ、ｒＩＬ−１２またはＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームで処理されたマウスの腫瘍におけるＣＸＣＬ１０遺伝子発現のレベルを示す。図２９Ｄは、ＰＢＳ、ｒＩＬ−１２またはＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームで処理されたマウスの腫瘍におけるＴＧＦβ遺伝子発現のレベルを示す。
【図３０】ＰＢＳ、ｒＩＬ−１２、またはＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームで処理された腫瘍担持マウスにおけるＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋脾臓Ｔ細胞のパーセントを示す。
【図３１】図３１Ａは、ＩＦＮγ単量体に融合した全長ＰＴＧＦＲＮの概略図を示す。図３１Ｂは、ＩＦＮγタンデム二量体に融合した全長ＰＴＧＦＲＮの概略図を示す。
【図３２】精製されたヒト及びマウスの単量体（ｍ）及びタンデム二量体（ｔｄ）ＰＴＧＦＲＮ  ＩＦＮγエクソソームのＰＡＧＥ解析結果を示す。
【図３３】それぞれ、天然エクソソーム（ＷＴ）、単量体ＩＦＮγ  ＰＴＧＦＲＮエクソソーム（ｍ−ＩＦＮγ−ＰＴＧＦＲＮ）、及びタンデム二量体ＩＦＮγ  ＰＴＧＦＲＮエクソソーム（ｔｄ−ＩＦＮγ−ＰＴＧＦＲＮ）を添加した後の単球ＰＤ−Ｌ１発現を示す。ＬＰＳ誘導ＰＤ−Ｌ１活性化を陽性対照として使用した。
【図３４】ＰＤＧＦＲの膜貫通ドメインに融合した１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質の概略図を示す。
【図３５】ｐＤｉｓｐｌａｙ  ＩＬ−１５エクソソームを添加した後のＣＤ６９陽性ＮＫ細胞の百分率によって測定されたＮＫ細胞活性化を示す。
【図３６】図３６Ａは、全長ＰＴＧＦＲＮに融合したＩＬ−１５及び全長ＰＴＧＦＲＮに融合したＩＬ−１５  Ｎ７２Ｄの概略図を示す。図３６Ｂは、全長ＰＴＧＦＲＮに融合したＩＬ−１５及び全長ＰＴＧＦＲＮに融合したＩＬ−１５  Ｎ７２Ｄのウエスタンブロッティングを示す。
【図３７】全長ＰＴＧＦＲＮに融合したＩＬ−１５及び全長ＰＴＧＦＲＮに融合したＩＬ−１５  Ｎ７２Ｄを添加した後の、ＣＤ６９陽性ＮＫ細胞の百分率によって測定されたＮＫ細胞活性化を示す。
【図３８】それぞれ、ＰＤＧＦＲ膜貫通領域（ｅｘｏＣＤ３−ＰＤ）、全長ＰＴＧＦＲＮ（ｅｘｏＣＤ３−長）、及びＰＴＧＦＲＮ断片（ｅｘｏＣＤ３−短）に融合した抗ＣＤ３抗体断片の概略図を示す。
【図３９】それぞれ、天然エクソソーム（ＷＴ）、ＰＤＧＦＲ膜貫通領域（ｐＤｉｓｐｌａｙ）に融合した抗ＣＤ−３抗体断片を有するエクソソーム、全長ＰＴＧＦＲＮ（ＦＬ  ＰＴＧＦＲＮ）に融合した抗ＣＤ−３抗体断片を有するエクソソーム、及びＰＴＧＦＲＮ断片（短いＰＴＧＦＲＮ）に融合した抗ＣＤ−３抗体断片を有するエクソソームを添加した後の、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）の結果を示す。
【図４０】図４０Ａは、抗ＣＤ３抗体断片を添加した後の、ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率によって測定されたＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を示す。図４０Ｂは、それぞれ、天然エクソソーム（ｅｘｏＮａｔｉｖｅ）及びＰＴＧＦＲＮ断片（ｅｘｏＣＤ３−短）に融合した抗ＣＤ３抗体断片を有するエクソソームを添加した後の、ＣＤ６９陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率によって測定されたＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を示す。
【図４１】ＣＤ４０Ｌ−ＧＦＰ  ＰＴＧＦＲＮ融合タンパク質、及びＢ細胞に対するＣＤ６９陽性によって測定されたＢ細胞活性化アッセイにおける各構築物のＥＣ５０の概略図を示す。
【図４２】図４２Ａは、それぞれ、天然エクソソーム、三量体ＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ構築物ｐＣＢ−５２７を有するエクソソーム、及び三量体ＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ構築物ｐＣＢ−７６６を有するエクソソームを添加した後の、ＣＤ６９陽性Ｂ細胞の百分率によって測定されたＢ細胞活性化を示す。図４２Ｂは、それぞれ濃度一致ＣＤ４０Ｌと比較した、三量体ＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ構築物ｐＣＢ−５２７及びｐＣＢ−７６６を有するエクソソームを添加した後の、ＣＤ６９陽性Ｂ細胞の百分率によって測定されたＢ細胞活性化を示す。
【図４３】図４３Ａは、三量体ＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ構築物ｐＣＢ−５２７を有するエクソソームを添加した後の、ＣＤ６９陽性Ｂ細胞の百分率によって測定されたドナー１におけるＢ細胞活性化を示す。図４３Ｂは、三量体ＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ構築物ｐＣＢ−５２７を有するエクソソームを添加した後の、ＣＤ６９陽性Ｂ細胞の百分率によって測定されたドナー２におけるＢ細胞活性化を示す。
【図４４】図４４Ａは、抗ＣＤ４０Ｌ装飾ビーズで単離され、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌに対する蛍光抗体で標識された天然エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。図４４Ｂは、抗ＣＤ４０Ｌ装飾ビーズ及びＣＤ８１及びＣＤ４０Ｌに対する標識蛍光抗体で単離された天然エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。
【図４５】図４５Ａは、抗ＣＤ４０Ｌ装飾ビーズで単離され、ＣＤ８１に対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２二重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。図４５Ｂは、抗ＣＤ４０Ｌ装飾ビーズで単離され、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌに対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２二重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。
【図４６】図４６Ａは、抗ＩＬ−１２装飾ビーズで単離され、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌに対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２二重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。図４６Ｂは、抗ＩＬ−１２装飾ビーズで単離され、ＣＤ８１に対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２二重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。
【図４７】図４７Ａは、それぞれ、組換えＩＬ−１２、組換えＣＤ４０Ｌと混合された組換えＩＬ−１２、ＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム、二重陽性ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２エクソソーム、ならびにＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム及びＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソームの混合物を添加した後の、ドナー１ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ応答を示す。図４７Ｂは、それぞれ、組換えＩＬ−１２、組換えＣＤ４０Ｌと混合された組換えＩＬ−１２、ＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム、二重陽性ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２エクソソーム、ならびにＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム及びＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソームの混合物を添加した後の、ドナー２ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ応答を示す。
【図４８】それぞれ、組換えＩＬ−１２、組換えＣＤ４０Ｌと混合された組換えＩＬ−１２、ＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム、二重陽性ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２エクソソーム、ならびにＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム及びＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソームの混合物を添加した後のドナー１及びドナー２ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ応答のＥＣ５０を示す。
【図４９】図４９Ａは、それぞれ、組換えＣＤ４０Ｌ、組換えＣＤ４０Ｌと混合された組換えＩＬ−１２、ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソーム、二重陽性ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２エクソソーム、ならびにＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム及びＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソームの混合物を添加した後の、ドナー１ヒトＰＢＭＣにおけるＢ細胞活性化を示す。図４９Ｂは、それぞれ、組換えＣＤ４０Ｌ、組換えＣＤ４０Ｌと混合された組換えＩＬ−１２、ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソーム、二重陽性ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２エクソソーム、ならびにＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム及びＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソームの混合物を添加した後の、ドナー２ヒトＰＢＭＣにおけるＢ細胞活性化を示す。
【図５０】それぞれ、組換えＣＤ４０Ｌ、組換えＣＤ４０Ｌと混合された組換えＩＬ−１２、ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソーム、二重陽性ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２エクソソーム、ならびにＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム及びＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソームの混合物を添加した後の、ドナー１及びドナー２ヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ応答のＥＣ５０を示す。
【図５１】図５１Ａは、抗ＩＬ−１２装飾ビーズで単離され、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌに対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２／ＦＬＴ３Ｌ三重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。図５１Ｂは、抗ＩＬ−１２装飾ビーズで単離され、ＩＬ−１２及びＦＬＴ３Ｌに対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２／ＦＬＴ３Ｌ三重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。図５１Ｃは、抗ＩＬ−１２装飾ビーズで単離され、ＣＤ４０Ｌ及びＦＬＴ３Ｌに対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２／ＦＬＴ３Ｌ三重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。
【図５２】図５２Ａは、抗ＣＤ４０Ｌ装飾ビーズで単離され、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌに対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２／ＦＬＴ３Ｌ三重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。図５２Ｂは、抗ＣＤ４０Ｌ装飾ビーズで単離され、ＩＬ−１２及びＦＬＴ３Ｌに対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２／ＦＬＴ３Ｌ三重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。図５２Ｃは、抗ＣＤ４０Ｌ装飾ビーズで単離され、ＣＤ４０Ｌ及びＦＬＴ３Ｌに対する蛍光抗体で標識されたＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２／ＦＬＴ３Ｌ三重操作エクソソームのＦＡＣＳ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
ヒト免疫系を調節することができる細胞外小胞が、本明細書に開示される。細胞外小胞を産生する方法ならびにこれらの細胞外小胞を用いてがん及び他の免疫系関連疾患を治療する方法も、提供される。
【００４６】
本発明がより詳細に説明される前に、本発明は、説明される具体的な実施形態に限定されないことを理解されるべきであり、そのような実施形態は、もちろん変化することができる。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態のみを説明する目的であり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することが意図されるものではないことも、理解されたい。
【００４７】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り下限の単位の１０分の１までの各介在値は、その範囲の上限値と下限値と、その記載範囲内の任意の他の記載値または介在値との間で、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲に独立して含まれることができ、また、記載範囲における任意の具体的に除外された限界値を条件として、本発明内に包含される。記載範囲が限界値の１つまたは両方を含む場合、それらの含まれた限界値のいずれかまたは両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
【００４８】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価の任意の方法及び材料は、本発明の実施または試験に使用されることができるが、代表的な例示的な方法及び材料が、説明される。
【００４９】
本明細書中で引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、任意の任意選択的要素を除外するように起草されることができることを、さらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲要素の列挙に関連した「単なる」、「のみ」などのような排他的用語の使用、または負の限定の使用の先行基準として機能することが意図される。
【００５１】
本開示を読むと当業者に明らかになるように、本明細書に説明及び例示される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかから容易に分離され得るか、またはそれらと組み合わされ得る別個の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、または論理的に可能な任意の他の順序で行われることができる。
【００５２】
主題発明をさらに説明するにあたって、主題方法を実践する際の使用のための主題システムは、より詳細に議論され、続いて関連する方法の見直しが行われる。
【００５３】
本明細書で使用される際、用語「細胞外小胞」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞よりも小さい直径を有する全ての膜結合小胞を含む。一般に、細胞外小胞は、直径２０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲であり、内側空間内に、細胞外小胞の外側表面に表示された、及び／または膜にまたがるいずれかの様々な巨大分子輸送物を含むことができる。輸送物は、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び／またはそれらの組み合わせを含むことができる。例として、限定されないが、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接または間接操作（例えば、連続押出またはアルカリ溶液による処理による）によって細胞に由来する小胞、小胞化オルガネラ、及び生体細胞によって産生される小胞（例えば、原形質膜の直接発芽または後期エンドソームと原形質膜との融合によって）が含まれる。細胞外小胞は、生体または死体、外植された組織もしくは臓器、及び／または培養細胞に由来することができる。
【００５４】
本明細書で使用される際、用語「エクソソーム」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小さい（直径２０〜３００ｎｍ、より好ましくは直径４０〜２００ｎｍ）小胞を指し、直接原形質膜発芽によって、または後期エンドソームと原形質膜との融合によって生成される。エクソソームは、細胞外小胞の一種である。エクソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療剤）、レシーバー（例えば、標的部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）、糖（例えば、単純糖、多糖類、もしくはグリカン）、または他の分子を含む。エクソソームは、産生細胞に由来し、そのサイズ、密度、生化学パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。
【００５５】
本明細書で使用される際、用語「ナノベシクル」は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小さい（直径２０〜２５０ｎｍ、より好ましくは直径３０〜１５０ｎｍ）小胞を指し、ナノベシクルが操作なしに産生細胞によって産生されないように、直接または間接操作によって細胞から生成される。産生細胞の適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ナノベシクルの産生は、いくつかの事例では、産生細胞の破壊を生じ得る。好ましくは、ナノベシクルの集団は、原形質膜から直接発芽するか、または後期エンドソームと原形質膜との融合による産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノベシクルは、細胞外小胞の一種である。ナノベシクルは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意選択で、ペイロード（例えば、治療剤）、レシーバー（例えば、標的部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）、糖（例えば、単純糖、多糖類、もしくはグリカン）、または他の分子を含む。ナノベシクルは、操作に従って産生細胞に由来すると、そのサイズ、密度、生化学パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離され得る。
【００５６】
用語「細胞外小胞送達」または「細胞外小胞の送達」は、対象の標的組織、細胞、及び／または臓器への細胞外小胞の投与及び局在化を指す。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、標的細胞の細胞質に送達されることができる。他の実施形態では、免疫調節成分は、標的細胞の膜に送達される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞の膜は、標的細胞の膜と融合する。
【００５７】
本明細書で使用される際、用語「産生細胞」は、細胞外小胞が単離され得る任意の細胞を指す。産生細胞は、細胞外小胞の供給源として機能する細胞である。産生細胞は、タンパク質、脂質、糖、または核酸成分を細胞外小胞と共有することができる。いくつかの実施形態では、産生細胞は、修飾細胞または合成細胞である。いくつかの実施形態では、産生細胞は、培養細胞または単離された細胞である。ある特定の実施形態では、産生細胞は、細胞株である。ある特定の他の実施形態では、産生細胞は、一次細胞である。いくつかの具体的な実施形態では、産生細胞は、免疫細胞である。
【００５８】
本明細書で使用される「膜」は、内部空間を外部空間から分離する境界層であり、１つ以上の生物学的化合物、典型的には脂質、及び任意選択でポリペプチド及び／または炭水化物を含む。いくつかの実施形態では、膜は、脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。これらの実施形態のいくつかでは、膜は、グリカンのような１つ以上のポリペプチド及び／または１つ以上の多糖類をさらに含む。細胞外小胞は、本明細書に定義される膜を含む。
【００５９】
本明細書で使用される際、用語「免疫調節成分」は、細胞外小胞と接触した標的（例えば、標的細胞）に作用し、免疫系を調節する治療剤を指す。細胞外小胞及び／または産生細胞へと導入されることができる免疫調節成分は、チェックポイント阻害剤の調節剤もしくはチェックポイント阻害剤のリガンド、表面抗原及びその誘導体、サイトカイン及びその誘導体のような治療剤を含む。免疫調節成分は、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、ならびに抗原結合断片、またはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びＤＮＡのようなポリヌクレオチドも含むことができる。
【００６０】
用語「レシーバー」は、細胞外小胞を標的に誘導する、及び／または対象における細胞外小胞と標的との相互作用を促進する分子を指す。いくつかの実施形態では、レシーバーは、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、レシーバーは、対象の組織中の免疫調節成分の濃度を増加させることができる。レシーバーの例は、表３に列挙される例を含むが、これらに限定されない。
【００６１】
用語「標的」は、細胞、病原体、代謝産物、ポリペプチド複合体、または免疫細胞もしくはがん細胞のような、対象の組織中に存在するか循環系もしくはリンパ系中を循環する任意の分子もしくは構造を指す。標的の例は、表４に列挙される例を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
「治療剤」または「治療分子」は、有効量で存在する場合、それを必要とする対象に対して所望の治療効果、薬理学的及び／または生理学的効果を生み出す化合物または分子を含む。「治療剤」または「治療分子」は、対象に投与されると、対象に対して測定可能または伝達可能な効果を有し、例えば、疾患、障害または状態の症状を緩和または減少させる任意の化合物、例えば、低分子薬物、または生物製剤（例えば、ポリペプチド薬物もしくは核酸薬物）を含む。
【００６３】
本明細書で使用される際、用語「抗体」は、天然または部分的もしくは完全に合成的に産生される免疫グロブリン、及びその断片を包含する。本用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインと相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。「抗体」は、抗原に特異的に結合し認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドをさらに含む。抗体という用語の使用は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル及び組換え抗体、その断片を含むこと、かつ、一本鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片のような抗体断片、ダイアボディ、ならびに抗体関連ポリペプチドをさらに含むことを意味する。抗体は、所望の生物学的活性または機能を示す限り、二重特異性抗体及び多重特異性抗体を含む。
【００６４】
本明細書で使用される用語「抗原結合断片」は、無傷の免疫グロブリンの断片、及び抗原に特異的に結合する能力を有する抗原結合領域を含むポリペプチドの任意の部分を指す。例えば、抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片であり得るが、これらに限定されない。Ｆａｂ断片は、１つの抗原結合部位を有し、かつ軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖の第１の定常領域ＣＨ１を含有する。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ’断片が重鎖ＣＨ１領域のＣ末端に少なくとも１つのシステイン残基を含む重鎖のヒンジ領域を追加的に含む点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２断片が生成され、それにより、Ｆａｂ’断片のシステイン残基がヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合される。Ｆｖ断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有する最小抗体断片であり、Ｆｖ断片を産生するための組換え技術は、当該技術分野において周知である。二本鎖Ｆｖ断片は、重鎖可変領域が非共有結合によって軽鎖可変領域に連結された構造を有することができる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片は、重鎖可変領域がペプチドリンカーを介して軽鎖可変領域に共有結合されるか、または重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がそのＣ末端で互いに直接連結された、二本鎖Ｆｖ断片中のような二量体構造を一般に有することができる。抗原結合断片は、プロテアーゼを使用して得られ（例えば、抗体全体をパパインで消化してＦａｂ断片を得、ペプシンで消化してＦ（ａｂ’）２断片を得る）かつ、遺伝子組換え技術によって調製され得る。ｄＡｂ断片は、ＶＨドメインからなる。一本鎖抗体分子は、いくつかの個々の分子、例えば、二量体、三量体、または他のポリマーを有するポリマーを含むことができる。
【００６５】
語句「核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。「核酸分子」は、染色体ＤＮＡ及び自己複製プラスミド、ベクター、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、などを含む。核酸分子は組換え可能であり、核酸が細胞へと導入される際に外因性ポリペプチドが発現され得る。
【００６６】
用語「アゴニスト」は、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を生み出す分子を指す。受容体は、内因性アゴニストまたは外因性アゴニストいずれかによって活性化されることができる。内因性アゴニストの非限定的な例は、ホルモン及び神経伝達物質を含む。外因性アゴニストの非限定的な例は、薬物を含む。アゴニストは、完全アゴニスト、部分アゴニスト、または逆アゴニストであり得る。
【００６７】
用語「アンタゴニスト」は、受容体に結合すると生物学的応答そのものを誘発するよりもむしろ、アゴニスト媒介性応答を遮断または減衰させる分子を指す。多くのアンタゴニストは、受容体上の構造的に定義された結合部位で内因性リガンドまたは基質と競合することによってその効力を達成する。アンタゴニストの非限定的な例は、アルファブロッカー、ベータブロッカー、及びカルシウムチャネルブロッカーを含む。アンタゴニストは、競合的、非競合的（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）、または競合的でない（ｕｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）アンタゴニストであり得る。
【００６８】
本明細書で使用される際、タンパク質の「断片」という用語は、天然に存在するタンパク質と比較してＮ末端及び／またはＣ末端が欠失したタンパク質を指す。好ましくは、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、またはＡＴＰトランスポーターの断片は、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持する。このような断片は、「機能的断片」としても呼ばれる。断片がその意味で機能的断片であるかどうかは、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及び例えばＧＦＰのような自己蛍光タンパク質との断片の融合物を含む、エクソソームのタンパク質含有量を決定する任意の技術分野で既知の方法によって評価されることができる。具体的な実施形態では、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーターの断片は、エクソソームを特異的に標的とする天然に存在するＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、またはＡＴＰトランスポーターの能力の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を保持する。
【００６９】
本明細書で使用される際、タンパク質の「バリアント」という用語は、当該技術分野で既知の方法によるアラインメント時に、ある特定のアミノ酸配列同一性を別のタンパク質と共有するタンパク質を指す。タンパク質のバリアントは、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再配列を含むことができる。具体的な実施形態では、バリアントは、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、またはＡＴＰトランスポーターの断片と少なくとも７０％の同一性を有するバリアントである。いくつかの実施形態では、ＰＴＧＦＲＮのバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号１に従うＰＴＧＦＲＮまたはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＢＳＧのバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号９に従うＢＳＧまたはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ２のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３４に従うＩＧＳＦ２またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ３のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２０に従うＩＧＳＦ３またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＧＳＦ８のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号１４に従うＩＧＳＦ８またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＢ１のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２１に従うＩＴＧＢ１またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＧＡ４のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２２に従うＩＴＧＡ４またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＳＬＣ３Ａ２のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２３に従うＳＬＣ３Ａ２またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ１のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２４に従うＡＴＰ１Ａ１またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ２のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２５に従うＡＴＰ１Ａ２またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ３のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２６に従うＡＴＰ１Ａ３またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ａ４のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２７に従うＡＴＰ１Ａ４またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ１Ｂ３のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２８に従うＡＴＰ１Ｂ３またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ１のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号２９に従うＡＴＰ２Ｂ１またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ２のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３０に従うＡＴＰ２Ｂ２またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ３のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３１に従うＡＴＰ２Ｂ３またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰ２Ｂ４のバリアントまたは断片のバリアントは、配列番号３２に従うＡＴＰ２Ｂ４またはその機能的断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を共有する。上記の場合の各々では、バリアントまたは断片のバリアントは、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持することが好ましい。
【００７０】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：１５  ２３７−４４（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５−６５（１９９２）、及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９９４）において説明される。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）［Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ２０  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）Ｊは、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、国立生物情報センター（ＮＢＣＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）及びインターネット上を含むいくつかの供給源から入手可能である。ＢＬＡＳＴ、及びプログラムを使用して配列識別を決定する方法の説明は、ＮＩＨ（国立衛生研究所）のＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）の公式ウェブサイトでアクセスすることができる。
【００７１】
本明細書に提供される任意のタンパク質の列挙は、タンパク質の機能的バリアントを包含する。タンパク質の「機能的バリアント」という用語は、エクソソームを特異的に標的とする能力を保持するタンパク質のバリアントを指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、例えば、薬学的に許容される担体及び賦形剤などの１つ以上の他の化学成分と混合もしくは混ぜ合わされ、または懸濁された細胞外小胞のような、本明細書に記載の化合物のうちの１つ以上を指す。医薬組成物の１つの目的は、対象への細胞外小胞の調製物の投与を容易にすることである。用語「薬学的に許容される」及びその文法的変形は、組成物の投与を禁止する程度の望ましくない生理的効果の産生なしに対象に投与することができる組成物、担体、希釈剤及び試薬を指す。用語「賦形剤」または「担体」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加された不活性物質を指す。用語「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、米国連邦政府の規制機関によって承認されたか、もしくはヒトを含む動物に使用するために米国薬局方に列挙された薬剤のいずれか、同様に対象に著しい刺激を与えず、かつ投与される化合物の生物学的活性及び特性を抑制しない任意の担体もしくは希釈剤を包含する。医薬組成物を調製する際に有用であり、かつ一般に安全であり、無毒であり、及び望ましい賦形剤ならびに担体が含まれる。
【００７３】
本明細書で使用される際、用語「単離する」、「単離された」、及び「単離すること」、または「精製する」、「精製された」、及び「精製すること」、同様に「抽出された」及び「抽出すること」は互換的に使用され、１つ以上の精製のプロセス、例えば所望の細胞外小胞調製物の選択もしくは濃縮を経た、所望の細胞外小胞の調製物の状態（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される単離することまたは精製することは、産生細胞を含有する試料から細胞外小胞を除去する、部分的に除去する（例えば、画分）プロセスである。いくつかの実施形態では、単離された細胞外小胞組成物は検出可能な望ましくない活性を有しないか、または代替的に、望ましくない活性のレベルもしくは量は許容可能なレベルもしくは量以下である。他の実施形態では、単離された細胞外小胞組成物は、許容される量及び／または濃度以上の所望の細胞外小胞の量及び／または濃度を有する。他の実施形態では、単離された細胞外小胞組成物は、組成物が得られる出発物質（例えば、産生細胞調製物）と比較して濃縮される。この濃縮は、出発物質と比較して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超であり得る。いくつかの実施形態では、単離された細胞外小胞調製物は、残留生物学的製剤を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、単離された細胞外小胞調製物は、任意の汚染生体物質を含まない１００％遊離、９９％遊離、９８％遊離、９７％遊離、９６％または９５％である。残留生物学的製剤は、非生物材料（化学物質を含む）、または不要な核酸、タンパク質、脂質、もしくは代謝産物を含むことができる。残留生物学的製剤を実質的に含まないことは、細胞外小胞組成物が検出可能な産生細胞を含有しないこと、及び細胞外小胞のみが検出可能であることも意味し得る。
【００７４】
用語「投与」、「投与すること」ならびにそれらの変異形は、細胞外小胞または薬剤のような組成物を対象へと導入することを指し、かつ組成物または薬剤の同時及び順次導入を含む。組成物または薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは皮下）、直腸、リンパ内、髄腔内、腫瘍内、眼周または局所を含む任意の好適な経路による。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図された機能を実行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈へと導入することによって投与される。
【００７５】
本明細書で使用される際、用語「調節する」、「調節すること」、「修飾する」、及び／または「調節因子」は、増加または減少、例えば直接または間接的に、促進する／刺激する／上方調節すること、もしくは干渉する／阻害する／下方調節することによって、例えばアンタゴニストもしくはアゴニストとして作用するような特定の濃度、レベル、発現、機能または行動を変化させる能力を一般に指す。いくつかの事例では、調節剤は、対照と比較して、または一般に期待されるであろう活性の平均レベルと比較して、または活性の対照レベルと比較して、ある特定の濃度、レベル、活性もしくは機能を増加及び／または減少させることができる。
【００７６】
用語「十分な量」は、所望の効果を生み出すのに十分な量、例えば、対象における状態を調節するのに十分な量を意味する。
【００７７】
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。治療有効量は、予防が治療であると考えられ得るため、「予防有効量」であり得る。
【００７８】
本明細書で使用される際、用語「実質的に」または「実質的な」は、例えば、具体的な空間における実体の存在、レベル、もしくは濃度、ある実体の別の実体に対する効果、または治療の効果を指す。例えば、実体の活性、レベルまたは濃度は、増加がベースラインと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１０００倍である場合、実質的に増加する。実体の活性、レベルまたは濃度は、増加がベースラインと比較して５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、または５００％である場合も実質的に増加する。
【００７９】
用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、生体内で生じるプロセスを指す。
【００８０】
本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を含む。
【００８１】
本出願で使用される省略形は以下を含む。「ｍＲＮＡ」はメッセンジャーＲＮＡを指し、「ｍｉＲＮＡ」はマイクロＲＮＡを指し、「ｓｉＲＮＡ」は低分子干渉ＲＮＡを指し、「アンチセンスＲＮＡ」はｍＲＮＡに相補的な一本鎖ＲＮＡを指し、「ｓｈＲＮＡ」は小または短ヘアピンＲＮＡを指し、「ｌｎｃＲＮＡ」は長鎖非コードＲＮＡを指し、「ｄｓＤＮＡ」は二本鎖ＤＮＡを指す。
【００８２】
組成物
本開示の態様は、免疫系を調節することができる組成物を含む。組成物は、細胞膜を含む細胞外小胞と、細胞膜に結合するか、または膜結合封入体積内に封入された免疫調節成分とを含む。
【００８３】
細胞外小胞
様々な実施形態では、組成物は、細胞外小胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、内部空間を封入する膜を含む細胞由来小胞である。
【００８４】
様々な実施形態では、細胞外小胞は、それが由来する細胞よりも小さい直径を有する膜結合小胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、約２０〜１００ｎｍ、２０〜２００ｎｍ、２０〜３００ｎｍ、２０〜４００ｎｍ、２０〜５００ｎｍ、２０〜６００ｎｍ、２０〜７００ｎｍ、２０〜８００ｎｍ、２０〜９００ｎｍ、３０〜１００ｎｍ、３０〜２００ｎｍ、３０〜３００ｎｍ、３０〜４００ｎｍ、３０〜５００ｎｍ、３０〜６００ｎｍ、３０〜７００ｎｍ、３０〜８００ｎｍ、３０〜９００ｎｍ、４０〜１００ｎｍ、４０〜２００ｎｍ、４０〜３００ｎｍ、４０〜４００ｎｍ、４０〜５００ｎｍ、４０〜６００ｎｍ、４０〜７００ｎｍ、４０〜８００ｎｍ、４０〜９００ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、５０〜５００ｎｍ、５０〜７５０ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、１００〜５００ｎｍ、または５００〜１０００ｎｍのような、約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。
【００８５】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームである。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、ナノベシクルである。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、アポトーシス小体である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、細胞の断片である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、直接または間接操作によって細胞に由来する小胞である。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、小胞化オルガネラである。様々な実施形態では、細胞外小胞は、生体細胞によって産生される小胞である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、生体に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、死体に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、外植された組織に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、外植された臓器に由来する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、培養細胞に由来する。これらの実施形態のいくつかでは、細胞外小胞が細胞培養系で生成される際、細胞外小胞はさらに単離される（例えば、細胞外小胞を培養細胞から分離することによって）。分離は、沈降によって達成されることができる。例えば、細胞外小胞は、０．５〜２．０、０．６〜１．０、０．７〜１．０、０．８〜１．０、０．９〜１．０、１．０〜１．１、１．１〜１．２、１．２〜１．３、１．４〜１．５、１．０〜１．５、１．５〜２．０、及び１．０〜２．０ｋｇ／ｍ３の比密度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を有することができる。分離は、アフィニティ精製によって達成されることもできる。例えば、細胞外小胞は、細胞外小胞を含む集団を樹脂に結合することによって精製されることができ、該樹脂は細胞外小胞の表面上の１つ以上の標的タンパク質に対して特異的親和性を有する複数のリガンドを含む。標的タンパク質は、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）、ＥＷＩタンパク質／免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８、ＩＧＳＦ３）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４）、ＡＴＰトランスポータータンパク質（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）、ＳＬＣ３Ａ２、ＢＳＧ、またはＣＤ９８ｈｃであり得る。標的タンパク質は追加的に、エクソソームの表面上に表示される免疫調節成分であってもよい。
【００８７】
様々な実施形態では、細胞外小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、糖をさらに含む。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、ポリヌクレオチドをさらに含む。
【００８８】
様々な実施形態では、細胞外小胞膜は、内面及び外面を含み、かつ内部空間を封入する。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、ペイロードをさらに含む。ある特定の実施形態では、ペイロードは、内部空間内に封入される。ある特定の実施形態では、ペイロードは、細胞外小胞の外側表面上に表示される。ある特定の実施形態では、ペイロードは、細胞外小胞の膜にまたがっている。様々な実施形態では、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び／またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、レシーバーをさらに含む。
【００８９】
エクソソーム
様々な実施形態では、細胞外小胞は、エクソソームである。ある特定の実施形態では、エクソソームは、産生細胞によって分泌される小さい膜結合小胞である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、産生細胞由来のエクソソームは、約２０〜２９０ｎｍ、２０〜２８０ｎｍ、２０〜２７０ｎｍ、２０〜２６０ｎｍ、２０〜２５０ｎｍ、２０〜２４０ｎｍ、２０〜２３０ｎｍ、２０〜２２０ｎｍ、２０〜２１０ｎｍ、２０〜２００ｎｍ、２０〜１９０ｎｍ、２０〜１８０ｎｍ、２０〜１７０ｎｍ、２０〜１６０ｎｍ、２０〜１５０ｎｍ、２０〜１４０ｎｍ、２０〜１３０ｎｍ、２０〜１２０ｎｍ、２０〜１１０ｎｍ、２０〜１００ｎｍ、２０〜９０ｎｍ、２０〜８０ｎｍ、２０〜７０ｎｍ、２０〜６０ｎｍ、２０〜５０ｎｍ、２０〜４０ｎｍ、２０〜３０ｎｍ、３０〜３００ｎｍ、３０〜２９０ｎｍ、３０〜２８０ｎｍ、３０〜２７０ｎｍ、３０〜２６０ｎｍ、３０〜２５０ｎｍ、３０〜２４０ｎｍ、３０〜２３０ｎｍ、３０〜２２０ｎｍ、３０〜２１０ｎｍ、３０〜２００ｎｍ、３０〜１９０ｎｍ、３０〜１８０ｎｍ、３０〜１７０ｎｍ、３０〜１６０ｎｍ、３０〜１５０ｎｍ、３０〜１４０ｎｍ、３０〜１３０ｎｍ、３０〜１２０ｎｍ、３０〜１１０ｎｍ、３０〜１００ｎｍ、３０〜９０ｎｍ、３０〜８０ｎｍ、３０〜７０ｎｍ、３０〜６０ｎｍ、３０〜５０ｎｍ、３０〜４０ｎｍ、４０〜３００ｎｍ、４０〜２９０ｎｍ、４０〜２８０ｎｍ、４０〜２７０ｎｍ、４０〜２６０ｎｍ、４０〜２５０ｎｍ、４０〜２４０ｎｍ、４０〜２３０ｎｍ、４０〜２２０ｎｍ、４０〜２１０ｎｍ、４０〜２００ｎｍ、４０〜１９０ｎｍ、４０〜１８０ｎｍ、４０〜１７０ｎｍ、４０〜１６０ｎｍ、４０〜１５０ｎｍ、４０〜１４０ｎｍ、４０〜１３０ｎｍ、４０〜１２０ｎｍ、４０〜１１０ｎｍ、４０〜１００ｎｍ、４０〜９０ｎｍ、４０〜８０ｎｍ、４０〜７０ｎｍ、４０〜６０ｎｍ、４０〜５０ｎｍ、５０〜３００ｎｍ、５０〜２９０ｎｍ、５０〜２８０ｎｍ、５０〜２７０ｎｍ、５０〜２６０ｎｍ、５０〜２５０ｎｍ、５０〜２４０ｎｍ、５０〜２３０ｎｍ、５０〜２２０ｎｍ、５０〜２１０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、５０〜１９０ｎｍ、５０〜１８０ｎｍ、５０〜１７０ｎｍ、５０〜１６０ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、５０〜１４０ｎｍ、５０〜１３０ｎｍ、５０〜１２０ｎｍ、５０〜１１０ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、５０〜９０ｎｍ、５０〜８０ｎｍ、５０〜７０ｎｍ、５０〜６０ｎｍ、６０〜３００ｎｍ、６０〜２９０ｎｍ、６０〜２８０ｎｍ、６０〜２７０ｎｍ、６０〜２６０ｎｍ、６０〜２５０ｎｍ、６０〜２４０ｎｍ、６０〜２３０ｎｍ、６０〜２２０ｎｍ、６０〜２１０ｎｍ、６０〜２００ｎｍ、６０〜１９０ｎｍ、６０〜１８０ｎｍ、６０〜１７０ｎｍ、６０〜１６０ｎｍ、６０〜１５０ｎｍ、６０〜１４０ｎｍ、６０〜１３０ｎｍ、６０〜１２０ｎｍ、６０〜１１０ｎｍ、６０〜１００ｎｍ、６０〜９０ｎｍ、６０〜８０ｎｍ、６０〜７０ｎｍ、７０〜３００ｎｍ、７０〜２９０ｎｍ、７０〜２８０ｎｍ、７０〜２７０ｎｍ、７０〜２６０ｎｍ、７０〜２５０ｎｍ、７０〜２４０ｎｍ、７０〜２３０ｎｍ、７０〜２２０ｎｍ、７０〜２１０ｎｍ、７０〜２００ｎｍ、７０〜１９０ｎｍ、７０〜１８０ｎｍ、７０〜１７０ｎｍ、７０〜１６０ｎｍ、７０〜１５０ｎｍ、７０〜１４０ｎｍ、７０〜１３０ｎｍ、７０〜１２０ｎｍ、７０〜１１０ｎｍ、７０〜１００ｎｍ、７０〜９０ｎｍ、７０〜８０ｎｍ、８０〜３００ｎｍ、８０〜２９０ｎｍ、８０〜２８０ｎｍ、８０〜２７０ｎｍ、８０〜２６０ｎｍ、８０〜２５０ｎｍ、８０〜２４０ｎｍ、８０〜２３０ｎｍ、８０〜２２０ｎｍ、８０〜２１０ｎｍ、８０〜２００ｎｍ、８０〜１９０ｎｍ、８０〜１８０ｎｍ、８０〜１７０ｎｍ、８０〜１６０ｎｍ、８０〜１５０ｎｍ、８０〜１４０ｎｍ、８０〜１３０ｎｍ、８０〜１２０ｎｍ、８０〜１１０ｎｍ、８０〜１００ｎｍ、８０〜９０ｎｍ、９０〜３００ｎｍ、９０〜２９０ｎｍ、９０〜２８０ｎｍ、９０〜２７０ｎｍ、９０〜２６０ｎｍ、９０〜２５０ｎｍ、９０〜２４０ｎｍ、９０〜２３０ｎｍ、９０〜２２０ｎｍ、９０〜２１０ｎｍ、９０〜２００ｎｍ、９０〜１９０ｎｍ、９０〜１８０ｎｍ、９０〜１７０ｎｍ、９０〜１６０ｎｍ、９０〜１５０ｎｍ、９０〜１４０ｎｍ、９０〜１３０ｎｍ、９０〜１２０ｎｍ、９０〜１１０ｎｍ、９０〜１００ｎｍ、１００〜３００ｎｍ、１１０〜２９０ｎｍ、１２０〜２８０ｎｍ、１３０〜２７０ｎｍ、１４０〜２６０ｎｍ、１５０〜２５０ｎｍ、１６０〜２４０ｎｍ、１７０〜２３０ｎｍ、１８０〜２２０ｎｍ、または１９０〜２１０ｎｍのような、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。
【００９１】
特に好ましい実施形態では、本明細書に記載の産生細胞由来のエクソソームは、約３０〜１００ｎｍの最長寸法を有する。別の好ましい実施形態では、産生細胞由来のエクソソームは、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。別の好ましい実施形態では、産生細胞由来のエクソソームは、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、９０％のエクソソームが最長寸法２０〜３００ｎｍを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、９５％のエクソソームが最長寸法２０〜３００ｎｍを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、９９％のエクソソームが最長寸法２０〜３００ｎｍを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、９０％のエクソソームが最長寸法４０〜２００ｎｍを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、９５％のエクソソームが最長寸法４０〜２００ｎｍを有する集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームの集団は、９９％のエクソソームが最長寸法４０〜２００ｎｍを有する集団を含む。他の好ましい実施形態では、本明細書に記載のエクソソームまたはエクソソーム集団のサイズは、以下に記載される方法に従って測定される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、エクソソームは、産生細胞によって生成される。いくつかの実施形態では、エクソソームの膜は、産生細胞に由来する１つ以上の分子を含む。いくつかの実施形態では、エクソソームは、細胞培養系で生成され、単離される（例えば、エクソソームを産生細胞から分離することによって）。分離は、沈降によって達成されることができる。例えば、エクソソームは、０．５〜２．０、０．６〜１．０、０．７〜１．０、０．８〜１．０、０．９〜１．０、１．０〜１．１、１．１〜１．２、１．２〜１．３、１．４〜１．５、１．０〜１．５、１．５〜２．０、及び１．０〜２．０ｋｇ／ｍ３の比密度を有することができる。分離は、アフィニティ精製によって達成されることもできる。例えば、細胞外小胞は、細胞外小胞を含む集団を樹脂に結合することによって精製されることができ、該樹脂は細胞外小胞の表面上の１つ以上の標的タンパク質に対して特異的親和性を有する複数のリガンドを含む。１つ以上の標的タンパク質は、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１及び／またはＣＤ９）、ＥＷＩタンパク質／免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８及び／またはＩＧＳＦ３）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＢ１及び／またはＩＴＧＡ４）、ＡＴＰトランスポータータンパク質（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３及び／またはＡＴＰ２Ｂ４）、ＳＬＣ３Ａ２、ＢＳＧ、またはＣＤ９８ｈｃであり得る。標的タンパク質は追加的に、エクソソームの表面上に表示される免疫調節成分であってもよい。
【００９３】
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、内面及び外面を含む。ある特定の実施形態では、内面は、エクソソームの内側コアに面する。ある特定の実施形態では、外面は、エンドソーム、多胞体、または産生細胞もしくは標的細胞の膜／細胞質と接触し得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、脂質及び脂肪酸を含む。いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、リン脂質、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、ステロール、コレステロール、及びホスファチジルセリンを含む。いくつかの実施形態では、脂質及び脂肪酸は、表１に列挙されるもののうちの１つ以上であり得る。
【００９５】
ある特定の実施形態では、エクソソームは、内側リーフレット及び外側リーフレットからなる脂質二重層を含む。内側リーフレット及び外側リーフレットの組成物は、当該技術分野で既知の二重層間分布アッセイによって決定されることができ、例えば、Ｋｕｙｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９８５  ８１９：１７０を参照されたい。いくつかの実施形態では、外側リーフレットの組成物は、約７０〜９０％のコリンリン脂質、約０〜１５％の酸性リン脂質、及び約５〜３０％のホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの実施形態では、内側リーフレットの組成物は、約１５〜４０％のコリンリン脂質、約１０〜５０％の酸性リン脂質、及び約３０〜６０％のホスファチジルエタノールアミンである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、１つ以上のポリペプチドをさらに含む。ある特定の実施形態では、エクソソームは、以下、スペクトリン、ミオシン様ポリペプチド、バンド３、ＳＬＣ４Ａ１、アクチン、アクチン様ポリペプチド、グリセルアルデヒド３−Ｐ脱水素酵素（Ｇ３ＰＤ）、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１及び／またはＣＤ９）、Ａｌｉｘ及びＴＳＧ１０１、インテグリン（例えば、ＩＴＧＢ１及び／またはＩＴＧＡ４）、セレクチン、ＣＲ１、ＴＮＦＲＩ、タンパク質分解酵素、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型タンパク質もしくはヒストン、ＥＷＩタンパク質／免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８及び／またはＩＧＳＦ３）、ＡＴＰトランスポータータンパク質（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３及び／またはＡＴＰ２Ｂ４）、ＳＬＣ３Ａ２、ＢＳＧ、またはＣｄ９８ｈｃを含むがこれらに限定されないリストから選択される１つ以上のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、エクソソームは、表２から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、エクソソームは、その表面にポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、エクソソームは、１つ以上のポリペプチドを含有するために修飾される。いくつかの実施形態では、産生細胞は、１つ以上のポリペプチドを含有するために修飾される。いくつかの実施形態では、産生細胞は１つ以上のポリペプチドを天然に含有し、そこに由来するエクソソームもポリペプチドを含有する。任意の所望の表面マーカーのレベルは、エクソソーム上で直接修飾されることができる（例えば、複合体を組み換えて産生されたポリペプチドと接触させて、複合体の膜に挿入またはコンジュゲーションをもたらすことによって）。あるいは、または加えて、任意の所望の表面マーカーのレベルは、産生細胞上で直接修飾されることができる（例えば、複合体を組み換えて産生されたポリペプチドと接触させて、細胞の膜に挿入またはコンジュゲーションをもたらすことによって）。あるいは、産生細胞は、外因性核酸を産生細胞内へと形質導入して所望の表面マーカーを発現させることによって修飾されることができる。表面マーカーは既に産生細胞上に天然に存在することができ、この場合、外因性構築物は産生細胞内または産生細胞上のマーカーの過剰発現及びマーカーの濃度の増加をもたらし得る。あるいは、天然に発現された表面マーカーは、産生細胞から除去されることができる（例えば、産生細胞内で遺伝子サイレンシングを誘導することによって）。ポリペプチドは、異なる機能性をエクソソームに付与することができる（例えば、特異的標的化能力、送達機能（例えば、融合分子）、酵素機能、インビボでの半減期の増加または減少など）。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ４９、ＣＤ４０、ＣＤ１３３、ＣＤ５９、グリピカン−１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、インテグリン、セレクチン、レクチン、及びカドヘリンを含むが、これらに限定されない。
【００９８】
特定の実施形態では、エクソソームは、その表面上に１つ以上のポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、最近エクソソームの表面上で濃縮されることが特定されたタンパク質の群から選択される（その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／５５０，５４３号で詳細に説明される）。このポリペプチドの群は、プロスタグランジンＦ２受容体陰性調節因子（ＰＴＧＦＲＮ）、バシギン（ＢＳＧ）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３（ＩＧＳＦ３）、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー８（ＩＧＳＦ８）、インテグリンベータ−１（ＩＴＧＢ１）、インテグリンアルファ−４（ＩＴＧＡ４）、４Ｆ２細胞表面抗原重鎖（ＳＬＣ３Ａ２）、及びＡＴＰトランスポータータンパク質のクラス（ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、エクソソーム膜は、グリカンのような１つ以上の多糖類をさらに含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、エクソソームは、ペイロード（治療剤）を標的に送達する。ペイロードは、エクソソームと接触した標的（例えば、標的細胞）に作用する治療剤である。接触は、インビトロまたは対象において生じ得る。エクソソーム及び／または産生細胞へと導入されることができるペイロードは、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含むか、または転写を中断させるヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素のようなポリペプチドをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡのような調節機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分を含むアミノ酸または翻訳を中断させる毒素）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、ならびに低分子（例えば、低分子薬物及び毒素）のような治療剤を含む。
【０１０１】
エクソソームは、膜融合を介して標的細胞と相互作用し、エクソソーム組成物中のペイロード（例えば、治療剤）を標的細胞の表面または細胞質に送達することができる。いくつかの実施形態では、膜融合は、エクソソームと標的細胞の原形質膜との間で生じる。他の実施形態では、膜融合は、エクソソームと標的細胞のエンドソーム膜との間で生じる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、エクソソームは、レシーバーポリペプチドを含む。レシーバーポリペプチドは、合成されることができる。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチドは、産生細胞（例えば、レシーバーポリペプチドをコードする外因性核酸が、産生細胞内へと導入される）内、または産生細胞外で作成された組換えレシーバーポリペプチド（例えば、タンパク質発現系によって合成される）内へと導入される。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチド（例えば、組換え産生ポリペプチド）は、直接（例えば、エクソソームが産生細胞から単離された後）エクソソームへと導入される。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチドは、エクソソームの表面上にあり得る。いくつかの実施形態では、レシーバーポリペプチドは、血液のような対象の循環系内で循環する特定の標的（例えば、病原体、代謝産物、ポリペプチド複合体、または非機能的細胞もしくはがん細胞のような細胞のような標的）、または（疾患組織のような）組織内に存在する標的にエクソソームを標的化することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、エクソソームは、合成される。例えば、エクソソームは、例えば、治療用ポリペプチドのようなペイロード、（ＤＮＡもしくはＲＮＡのような）核酸または他のポリヌクレオチド、多糖類またはグリカン、脂質または脂肪酸、大きな生物製剤、エクソソームが天然に存在しないような低分子または毒素を含むことができる。いくつかの実施形態では、エクソソームは、修飾される（例えば、ペイロードを導入するか、または膜のタンパク質、脂質もしくはグリカン含有量を変更させることによるように、それ以外の方法で複合体の含有量を修飾することによって）。例えば、エクソソームは、最初に産生細胞から単離され、次いで所望に応じて修飾され、それによって合成エクソソームを生成する。いくつかの実施形態では、産生細胞は、修飾される。例えば、外因性核酸、外因性ポリペプチドまたは低分子または毒素は、産生細胞へと導入されることができる。あるいは、または加えて、産生細胞は、それ以外の方法で（例えば、細胞膜の脂質またはグリカン含有量を変更することによるように、細胞または膜含有量を修飾することによって）修飾されることができる。修飾産生細胞から生成されたエクソソームは、産生細胞の修飾のうちの１つ以上を含む。プロセスは、合成エクソソームを産生する。いくつかの実施形態では、産生細胞及び産生細胞から単離されたエクソソームの両方は、本明細書に記載のように修飾される。
【０１０４】
ナノベシクル
様々な実施形態では、細胞外小胞は、ナノベシクルである。ある特定の実施形態では、ナノベシクルは、内部空間を封入する膜を含む細胞由来の小さな小胞であり、ナノベシクルが操作なしで細胞によって産生されないように、直接または間接操作によって細胞から生成される。細胞の適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されず、いくつかの事例では、産生細胞の破壊を生じ得る。
【０１０５】
様々な実施形態では、ナノベシクルは、約２０〜１００ｎｍ、２０〜１５０ｎｍ、２０〜２００ｎｍ、３０〜１００ｎｍ、３０〜１５０ｎｍ、３０〜２００ｎｍ、３０〜２５０ｎｍ、４０〜１００ｎｍ、４０〜１５０ｎｍ、４０〜２００ｎｍ、４０〜２５０ｎｍ、５０〜１００ｎｍ、５０〜１５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、５０〜２５０ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、または１５０〜２５０ｎｍのような、約２０〜２５０ｎｍの最長寸法を有する。
【０１０６】
様々な実施形態では、ナノベシクルは、産生細胞に由来する。ある特定の実施形態では、ナノベシクルは、直接または間接操作によって産生細胞から生成される。適切な操作は、連続押出、アルカリ溶液による処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。これらの実施形態のいくつかでは、操作は、産生細胞の破壊を生じ得る。いくつかの好ましい実施形態では、ナノベシクルの集団は、原形質膜から直接発芽するか、または後期エンドソームと原形質膜との融合による産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ナノベシクルは、そのサイズ、密度、生化学パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づいて産生細胞から単離される。ある特定の実施形態では、単離は、沈降によって達成されることができる。例えば、ナノベシクルは、０．５〜２．０、０．６〜１．０、０．７〜１．０、０．８〜１．０、０．９〜１．０、１．０〜１．１、１．１〜１．２、１．２〜１．３、１．４〜１．５、１．０〜１．５、１．５〜２．０、及び１．０〜２．０ｋｇ／ｍ３の比密度を有することができる。
【０１０８】
様々な実施形態では、ナノベシクルは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ナノベシクルは、糖をさらに含む。ある特定の実施形態では、ナノベシクルは、ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノベシクルは、レシーバーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ナノベシクルは、ペイロードをさらに含む。これらの実施形態のいくつかでは、ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、低分子、及び／またはそれらの組み合わせを含む。
【０１０９】
免疫調節成分
様々な実施形態では、組成物は、免疫調節成分をさらに含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、免疫調節化合物は、該タンパク質がエクソソームの表面上に保持されるように、エクソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現されるタンパク質である。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、膜タンパク質である。ある特定の実施形態では、免疫調節化合物は、可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、エクソソーム表面タンパク質は、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）、ＥＷＩタンパク質／免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８、ＩＧＳＦ３）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４）、ＡＴＰトランスポータータンパク質（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）、ＳＬＣ３Ａ２、ＢＳＧ、またはＣＤ９８ｈｃまたはその断片もしくはバリアントである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、免疫調節化合物は、該可溶性タンパク質がエクソソームの表面上に保持されるように、エクソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現される可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、エクソソーム表面タンパク質は、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）、ＥＷＩタンパク質／免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８、ＩＧＳＦ３）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４）、ＡＴＰトランスポータータンパク質（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）、ＳＬＣ３Ａ２、ＢＳＧ、またはＣＤ９８ｈｃまたはその断片もしくはバリアントである。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、抗腫瘍活性を有する。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、先天性免疫応答を調節する。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、ナチュラルキラー細胞を標的とする。いくつかの他の実施形態では、免疫調節成分は、適応性免疫応答を調節する。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、細胞傷害性Ｔ細胞を標的とする。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、その全長形態で産生細胞内で発現される。他の実施形態では、免疫調節成分は、エクソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現され、エクソソームの表面上の免疫調節化合物の生体活性部分のより高いレベルの発現を生じる。いくつかの実施形態では、免疫調節化合物は、該可溶性タンパク質がエクソソームの表面上に保持されるように、エクソソーム表面タンパク質への翻訳融合タンパク質として発現される可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、エクソソーム表面タンパク質は、テトラスパニン（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）、ＥＷＩタンパク質／免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（例えば、ＰＴＧＦＲＮ、ＩＧＳＦ８、ＩＧＳＦ３）、インテグリン（例えば、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４）、ＡＴＰトランスポータータンパク質（例えば、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ１Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ１Ａ４、ＡＴＰ１Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ１、ＡＴＰ２Ｂ２、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＰ２Ｂ４）、ＳＬＣ３Ａ２、ＢＳＧ、またはＣＤ９８ｈｃまたはその断片もしくはバリアントである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤である。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）の阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、ＣＴＬＡ−４のモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ−４のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、ＣＴＬＡ−４のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＣＴＬＡ−４に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、イピリムマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、トレメリムマブである。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２のモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ニボルマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ペンブロリズマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ピジリズマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、アテゾリズマブである。いくつかの特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、アベルマブである。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）の阻害剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＬＡＧ３の阻害剤は、ＬＡＧ３のモノクローナル抗体である。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質３（ＴＩＭ−３）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）を有するＴ細胞免疫受容体の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＣＤ２０、ＣＤ３９、またはＣＤ７３の阻害剤である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、正の共刺激分子の活性化剤である。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性化剤である。ある特定の実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１８、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、Ｍ６８、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＲＡＮＫ、ＯＣＩＦ、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７１、ＣＤ２６９、ＧＩＴＲ、ＴＲＯＹ、ＣＤ３５８、ＴＲＡＭＰ、及びＸＥＤＡＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーである。ある特定の実施形態では、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｃ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ２７Ｌ、Ｓｉｖａ、ＣＤ１５３、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＡＭＬＧ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＧＩＴＲリガンド、及びＥＤＡ−２からなる群から選択される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性化剤は、単量体タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーの活性化剤は、三量体タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、単量体タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、三量体タンパク質として発現される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＯＸ４０）の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＯＸ４０の活性化剤は、ＯＸ４０のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ＯＸ４０の活性化剤は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）である。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＣＤ２７の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤ２７の活性化剤は、ＣＤ２７のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ＣＤ２７の活性化剤は、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）である。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＣＤ４０の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤ４０の活性化剤は、ＣＤ４０のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ＣＤ４０の活性化剤は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、単量体ＣＤ４０Ｌである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、三量体ＣＤ４０Ｌである。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、三量体ＣＤ４０Ｌは、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、三量体ＣＤ４０Ｌは、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、三量体ＣＤ４０Ｌは、ＰＴＧＦＲＮへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号１９または配列番号２０の配列を有する。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＧＩＴＲの活性化剤は、ＧＩＴＲのアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ＧＩＴＲの活性化剤は、ＧＩＴＲの天然リガンドである。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、４−１ＢＢの活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、４−１ＢＢの活性化剤は、４−１ＢＢのアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、４−１ＢＢの活性化剤は、４−１ＢＢの天然リガンドである。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、Ｆａｓ受容体（Ｆａｓ）である。これらの実施形態のいくつかでは、Ｆａｓ受容体は、細胞外小胞の表面上に表示される。いくつかの他の実施形態では、免疫調節成分は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）である。これらの実施形態のいくつかでは、Ｆａｓリガンドは、細胞外小胞の表面上に表示される。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、Ｆａｓ受容体の抗体である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、Ｆａｓリガンドの抗体である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、ＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子の活性化剤である。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８−スーパーファミリー共刺激分子は、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、誘導性Ｔ細胞共刺激剤（ＩＣＯＳ）の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＩＣＯＳの活性化剤は、ＩＣＯＳのアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ＩＣＯＳの活性化剤は、ＩＣＯＳリガンド（ＩＣＯＳＬ）である。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＣＤ２８の活性化剤である。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤ２８の活性化剤は、ＣＤ２８のアゴニスト抗体である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ＣＤ２８の活性化剤は、ＣＤ２８の天然リガンドである。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８のリガンドは、ＣＤ８０である。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、組成物は、負のチェックポイント調節因子の阻害剤または負のチェックポイント調節因子の結合パートナーの阻害剤、及び正の共刺激分子の活性化剤または正の共刺激分子の結合パートナーの活性化剤を含む。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、エクソソーム表面タンパク質またはその断片に翻訳融合された可溶性サイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキン２（ＩＬ−２）である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキン７（ＩＬ−７）である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）である。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−７は、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−７は、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端またはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−７は、ＰＴＧＦＲＮへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２の配列を有する。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２は、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２は、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端またはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１２は、ＰＴＧＦＲＮへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の配列を有する。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、サイトカインは、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５は、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５は、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端またはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５は、ＰＴＧＦＲＮへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号１５または配列番号１６の配列を有する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、サイトカインは、インターフェロン（ＩＦＮ）である。ある特定の実施形態では、インターフェロンは、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。ある特定の実施形態では、インターフェロンは、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）である。いくつかの実施形態では、ＩＦＮγは、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮγは、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端またはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮγは、ＰＴＧＦＲＮへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号７または配列番号８の配列を有する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＴＣＲα鎖またはその誘導体である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＴＣＲβ鎖またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、Ｔ細胞の共受容体またはその誘導体である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ−葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん−精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドからなる群から選択される。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）である。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ムチンである。これらの実施形態のいくつかでは、ムチンは、分泌ムチンである。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ムチンは、膜貫通ムチンである。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ムチン１（ＭＵＣ１）である。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、Ｔｎ−ＭＵＣ１である。特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ムチン１６（ＭＵＣ１６）である。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）である。これらの実施形態のいくつかでは、ＭＡＧＥは、Ｉ型ＭＡＧＥである。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、ＭＡＧＥは、ＩＩ型ＭＡＧＥである。特定の実施形態では、Ｉ型ＭＡＧＥは、ＭＡＧＥーＡ２である。特定の実施形態では、Ｉ型ＭＡＧＥは、ＭＡＧＥ−Ａ４である。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、チロシナーゼである。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）である。様々な実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、及びＣＤ８６からなる群から選択される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはその誘導体である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ−葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん−精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドのうちの１つ以上に結合する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、Ｔ細胞受容体または共受容体の活性化剤である。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＣＤ３の活性化剤である。ある特定の実施形態では、活性化剤は、ＣＤ３のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、ＣＤ３に対するモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の実施形態では、活性化剤は、ＣＤ３に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体断片は、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体断片は、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端またはその断片に融合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体断片は、ＰＴＧＦＲＮへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、配列番号１８または配列番号２１の配列を有する。ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ＣＤ２８の活性化剤である。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＣＤ２８のモノクローナル抗体の断片である。ある特定の実施形態では、抗体断片は、ＣＤ２８のモノクローナル抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、またはＦｄである。ある特定の実施形態では、阻害剤は、ＣＤ２８に対するナノボディ、二重特異性抗体、または多重特異性抗体である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、ＭＨＣクラスＩまたはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、ＭＨＣクラスＩＩまたはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、ＭＨＣクラスＩＩＩまたはその誘導体である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、またはその誘導体である。これらの実施形態のいくつかでは、免疫調節成分は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、またはその誘導体である。
【０１４８】
様々な実施形態では、免疫調節成分は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質、低分子、または毒素であり得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質であり得る。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、アゴニストである。これらの実施形態のいくつかでは、アゴニストは、ホルモンのような内因性アゴニスト、または神経伝達物質である。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、アゴニストは、薬物のような外因性アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、受容体に結合することなくアゴニスト応答を作製することができる物理的アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、内因性アゴニストよりも大きな最大応答を生み出すことができるスーパーアゴニストである。ある特定の実施形態では、アゴニストは、受容体で完全な有効性を有する完全アゴニストである。ある特定の他の実施形態では、アゴニストは、完全アゴニストと比較して受容体において部分的な有効性のみを有する部分アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、受容体の構成活性を阻害することができる逆アゴニストである。いくつかの実施形態では、アゴニストは、他のコアゴニストと連携して受容体に対する効果を生み出すコアゴニストである。ある特定の実施形態では、アゴニストは、共有結合の形成を通じて受容体に永続的に結合する不可逆性アゴニストである。ある特定の実施形態では、アゴニストは、特定の型の受容体に対する選択的アゴニストである。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、アンタゴニストである。これらの実施形態のいくつかでは、アンタゴニストは、受容体を活性化することなく、内因性リガンドまたはアゴニストと同じ結合部位で受容体に可逆的に結合する競合的アンタゴニストである。競合的アンタゴニストは、最大応答を達成するために必要なアゴニストの量に影響することができる。これらの実施形態のいくつかの他の実施形態では、アンタゴニストは、受容体の活性部位または受容体のアロステリック部位に結合する非競合的アンタゴニストである。非競合的アンタゴニストは、任意の量のアゴニストによって得られる最大応答の大きさを低減させることができる。いくつかの他の実施形態では、アンタゴニストは、別個のアロステリック結合部位への結合前にアゴニストによる受容体活性化を必要とする、競合的でないアンタゴニストである。
【０１５２】
様々な実施形態では、免疫調節成分は、抗体または抗原結合断片を含む。免疫調節成分は、全長タンパク質またはその断片であり得る。抗体または抗原結合断片は、天然源に由来し得るか、部分的または完全に合成的に産生され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。これらの実施形態のいくつかでは、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体である。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。いくつかの他の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、ならびにＦｄ断片から選択される。ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、ｓｃＦｖまたは（ｓｃＦｖ）２断片である。ある特定の他の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ナノボディ（登録商標）（単一ドメイン抗体）である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、二重特異性または多重特異性抗体である。
【０１５３】
様々な実施形態では、抗体または抗原結合断片は、完全にヒトである。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ヒト化される。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、キメラである。これらの実施形態のいくつかでは、キメラ抗体は、非ヒトＶ領域ドメイン及びヒトＣ領域ドメインを有する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、マウスまたは獣医学のような非ヒトである。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ポリヌクレオチドである。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｄｓＤＮＡを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｌｎｃＲＮＡ）である。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであるとき、ポリヌクレオチドは所望のポリペプチドへと翻訳されることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはプレｍｉＲＮＡ分子である。これらの実施形態のいくつかでは、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ分子が標的細胞内の天然ｍＲＮＡを沈黙させる（ｓｉｌｅｎｃｅ）ことができるように、標的細胞の細胞質に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、がん遺伝子または他の調節不全ポリペプチドの発現に干渉することができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。これらの実施形態のいくつかでは、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ分子が標的細胞内の天然ｍＲＮＡを沈黙させることができるように、標的細胞の細胞質に送達される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡに相補的であるアンチセンスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を調節し、疾患を調節することができる長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡへと転写されることができるＤＮＡである。これらの実施形態のいくつかでは、転写ＲＮＡは、所望のポリペプチドへと翻訳されることができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、タンパク質、ペプチド、糖脂質、または糖タンパク質である。
【０１５６】
様々な実施形態では、組成物は、原子、分子などの混合物、融合物、組み合わせ及びコンジュゲートを含む、２つ以上の上記の免疫調節成分を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、膜に結合するか、または該細胞外小胞の封入体積内に封入された１、２、３，４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の異なる免疫調節成分を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、ポリペプチドと組み合わされた核酸を含む。ある特定の実施形態では、組成物は、互いにコンジュゲートされた２つ以上のポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、生体活性分子にコンジュゲートされたタンパク質を含む。これらの実施形態のいくつかでは、生体活性分子は、プロドラッグである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、組成物は、膜に結合するか、または該細胞外小胞の封入体積内に封入された２つの異なる免疫調節成分を含む。ある特定の実施形態では、２つの異なる免疫調節成分は、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ−１２は、それぞれＰＴＧＦＲＮまたはその断片に融合される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ−１２は、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端またはその断片にそれぞれ融合される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ−１２は、ＰＴＧＦＲＮへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、それぞれ配列番号２０及び配列番号３の配列を有する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、組成物は、膜に結合するか、または該細胞外小胞の封入体積内に封入された３つの異なる免疫調節成分を含む。ある特定の実施形態では、２つの異なる免疫調節成分は、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１２、及びＦＬＴ３Ｌは、ＰＴＧＦＲＮまたはその断片にそれぞれ融合される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１２、及びＦＬＴ３Ｌは、ＰＴＧＦＲＮのＮ末端またはその断片にそれぞれ融合される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１２、及びＦＬＴ３Ｌは、ＰＴＧＦＲＮへの融合タンパク質として発現され、ポリペプチドは、それぞれ配列番号２０、配列番号３、及び配列番号２２の配列を有する。
【０１５９】
医薬組成物
医薬組成物は、対象への投与に適した形態で、複数の細胞外小胞及び薬学的に許容される賦形剤または担体を一般に含む。薬学的に許容される賦形剤または担体は、投与される特定の組成物、同様に組成物を投与するために使用される具体的な方法によって部分的に決定される。したがって、複数の細胞外小胞を含む医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．２１ｓｔ  ｅｄ．（２００５）を参照されたい）。医薬組成物は、一般に滅菌されて製剤化され、かつ米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の１つ以上の治療剤及び細胞外小胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、１つ以上の別個の治療剤と共投与され、共投与は、細胞外小胞の投与の前、後、またはそれと同時の別個の治療剤の投与を含む。
【０１６１】
薬学的に許容される賦形剤は、ヒトの薬学的使用と同様の獣医学的使用に許容される賦形剤を含む、一般に安全であり、無毒であり、及び望ましい賦形剤を含む。
【０１６２】
担体または希釈剤の例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。かかる媒質及び化合物の薬学的活性物質への使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒質または化合物が本明細書に記載の細胞外小胞と互換性がない場合を除き、その組成物中における使用が企図される。補体治療剤は、組成物中へと組み込まれることもできる。典型的には、医薬組成物は、その意図された投与経路と適合性があるように製剤化される。細胞外小胞は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮膚内、経皮、直腸、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、腫瘍内、筋肉内経路、または吸入剤として投与されることができる。ある特定の実施形態では、細胞外小胞を含む医薬組成物は、例えば、注射によって静脈内投与される。細胞外小胞は、任意選択で、細胞外小胞が意図された疾患、障害または状態を治療することに少なくとも部分的に有効である他の治療剤と組み合わせて投与されることができる。
【０１６３】
溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる。水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌化合物；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート化合物；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張度調整用化合物。ＰＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整されることができる。調製物は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数の用量バイアルに封入することができる。
【０１６４】
注射可能な使用に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液及び滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。組成物は、一般に滅菌され、容易な注射可能性が存在する程度の流体である。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなどのような）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成されることができる。所望の場合、等張化合物、例えば、糖、マニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールのようなポリアルコール、及び塩化ナトリウムは、組成物に添加されることができる。注射可能組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含ませることによってもたらされ得る。
【０１６５】
滅菌注射可能溶液は、所望に応じて、適切な溶媒中に、本明細書に列挙された成分の１つまたは組み合わせと有効量の細胞外小胞を組み込むことによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒及び任意の所望の他の成分を含む滅菌ビヒクルへと細胞外小胞を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分と、前もって滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥である。細胞外小胞は、細胞外小胞の持続的もしくは拍動的放出を可能にするような様式で製剤化され、デポ注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。
【０１６６】
細胞外小胞を含む組成物の全身投与は、経粘膜手段によっても行われることができる。経粘膜投与のために、浸透するバリアに適した浸透剤が、製剤に使用される。かかる浸透剤は、当該技術分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与用の、界面活性剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、例えば、鼻腔スプレーの使用を通じて達成されることができる。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞を含む医薬組成物は、医薬組成物から利益を得るであろう対象へと静脈内投与される。特定の他の実施形態では、組成物は、例えば、リンパ内注射もしくはリンパ節内注射（例えば、Ｓｅｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０５（４６）：１７９０８（２００８）を参照されたい）、または筋肉内注射、皮下注射、腫瘍内注射、胸腺もしくは肝臓への直接注射によってリンパ系に投与される。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞を含む医薬組成物は、液体懸濁液として投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、投与後にデポを形成することができる製剤として投与される。ある特定の好ましい実施形態では、デポは、細胞外小胞を徐々に循環へと放出するか、またはデポ形態であり続ける。
【０１６９】
典型的には、薬学的に許容される組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、生体適合性があり毒性がなく、かつ対象への投与に適している。水が担体の構成成分である場合、水は、汚染物質、例えば、エンドトキシンを含まないように高度に精製及び処理される。
【０１７０】
薬学的に許容される担体は、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び／または鉱物油であり得るが、これらに限定されない。医薬組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香料増強剤、乳化剤、懸濁剤、及び／または防腐剤をさらに含むことができる。
【０１７１】
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載の細胞外小胞、及び任意選択で薬学的活性薬剤または治療剤を含む。治療剤は、生物剤、低分子剤、または核酸剤であり得る。
【０１７２】
本明細書に記載の細胞外小胞を含む医薬組成物を含む剤形が、提供される。いくつかの実施形態では、剤形は、静脈内注射用の液体懸濁液として製剤化される。いくつかの実施形態では、剤形は、腫瘍内注射用の液体懸濁液として製剤化される。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の調製は、残留複製能力のある核酸を破壊するために、例えば、Ｘ線、ガンマ線、ベータ粒子、アルファ粒子、中性子、陽子、元素核、ＵＶ線のような放射線を受ける。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の調製物は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００ｋＧｙ超の照射線量を使用してガンマ照射を受ける。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の調製物は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、または１００００ｍＳｖ超の照射線量を使用してＸ線照射を受ける。
【０１７６】
方法
本開示の態様は、細胞外小胞及び免疫調節成分を含む組成物を製造する方法も含む。いくつかの実施形態では、方法は、産生細胞から細胞外小胞を得ることであって、産生細胞が免疫調節成分を天然に含有する、得ることと、任意選択で、得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、産生細胞を免疫調節成分で修飾することと、細胞外小胞を修飾産生細胞から得ることと、任意選択で、得られた細胞外小胞を単離することと、を含む。いくつかの他の実施形態では、方法は、産生細胞から細胞外小胞を得ることと、得られた細胞外小胞を単離することと、単離された細胞外小胞を免疫調節成分で修飾することと、を含む。ある特定の実施形態では、方法は、単離された細胞外小胞を医薬組成物中に製剤化することをさらに含む。
【０１７７】
細胞外小胞を産生する方法
産生細胞を免疫調節成分で修飾する方法
様々な実施形態では、方法は、免疫調節成分で産生細胞を修飾することを含む。
【０１７８】
産生細胞は、哺乳動物細胞株、植物細胞株、昆虫細胞株、真菌細胞株、または原核細胞株であり得る。ある特定の実施形態では、産生細胞は、哺乳動物細胞株である。哺乳動物細胞株は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ−１０８０細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＰＥＲＣ−６細胞株、ＣＥＶＥＣ細胞株、線維芽細胞株、羊水細胞株、上皮細胞株、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）細胞株を含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、哺乳動物細胞株は、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＪヒト包皮線維芽細胞、ｆＨＤＦ線維芽細胞、ＡＧＥ．ＨＮ（登録商標）ニューロン前駆細胞、ＣＡＰ（登録商標）羊水細胞、脂肪間葉系幹細胞、またはＲＰＴＥＣ／ＴＥＲＴ１細胞であり得る。産生細胞は、一次細胞でもあり得る。様々な実施形態では、一次細胞は、一次哺乳動物細胞、一次植物細胞、一次昆虫細胞、一次真菌細胞、または一次原核細胞であり得る。
【０１７９】
ある特定の好ましい実施形態では、産生細胞は、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、抗原提示細胞、マクロファージ、Ｔヘルパー細胞、または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）のような免疫細胞である。
【０１８０】
様々な実施形態では、免疫調節成分は、トランスフェクション、ウイルス導入、電気穿孔、押出、超音波処理、細胞融合、もしくは当業者に既知の他の方法によって、産生細胞へと導入された導入遺伝子またはｍＲＮＡからの産生細胞内で発現させることができる。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、トランスフェクションによって産生細胞に導入される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、カチオン性脂質及びポリマーのような合成高分子を使用して好適な産生細胞に導入され得る（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：Ｓ１１８−Ｓ１３０（２００５））。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、電荷相互作用を通じて免疫調節成分と複合体を形成する。これらの実施形態のいくつかでは、正荷電複合体は負荷電細胞表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞によって取り込まれる。いくつかの他の実施形態では、カチオン性ポリマーは、産生細胞をトランスフェクトするために使用することができる。これらの実施形態のいくつかでは、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質は、免疫調節成分を産生細胞に導入するために使用することができる。免疫調節成分は、粒子媒介性トランスフェクション、「遺伝子銃」、バイオリスティック、または粒子撃ち込み技術のような物理的方法を使用して産生細胞に導入することもできる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：Ｓ１１８−Ｓ１３０（２００５））。例えば、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子は、産生細胞のトランスフェクション効率を評価するために使用することができる。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、ウイルス導入によって産生細胞に導入される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、及びスプマウイルスを含む、いくつかのウイルスは、遺伝子導入ビヒクルとして使用されることができる。ウイルス媒介性遺伝子導入ビヒクルは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びヘルペスウイルスのようなＤＮＡウイルスに基づくベクター、同様にレトロウイルスに基づくベクターを含む。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、電気穿孔によって産生細胞に導入される。電気穿孔は細胞膜に一過性の細孔を作製し、細胞へと様々な分子を導入することを可能にする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ及びＲＮＡ、同様にポリペプチド及び非ポリペプチド治療剤を、電気穿孔によって産生細胞へと導入することができる。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、マイクロ注射によって産生細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ガラスマイクロピペットを、免疫調節成分を顕微鏡レベルで産生細胞へと注入するために使用することができる。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、押出によって産生細胞に導入される。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、超音波処理によって産生細胞に導入される。いくつかの実施形態では、産生細胞は、高強度の音波に曝露され、免疫調節成分の付加を可能にする細胞膜の一過性破壊を引き起こす。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、細胞融合によって産生細胞に導入される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、電気細胞融合によって導入される。いくつかの他の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、産生細胞を融合させるために使用される。いくつかの他の実施形態では、センダイウイルスは、産生細胞を融合させるために使用される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、低張溶解によって産生細胞に導入される。これらの実施形態のいくつかでは、産生細胞は、免疫調節成分の付加を可能にする破裂をそれらに引き起こす低イオン強度緩衝液に曝露される。いくつかの代替実施形態では、低張液に対する制御透析は、産生細胞を膨らませ、産生細胞膜内に細孔を作製するために使用される。産生細胞は、その後、膜の再密封を可能にする条件に曝露される。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、界面活性剤処理によって産生細胞に導入される。ある特定の実施形態では、産生細胞は、免疫調節成分の付加を可能にする細孔を作製することによって産生細胞膜を一時的に損なうように軽度の界面活性剤で処理される。産生細胞が付加された後、界面活性剤は洗い流され、それによって膜を再密封する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによって産生細胞に導入される。ある特定の実施形態では、産生細胞は、免疫調節成分の結合時に受容体及び結合した免疫調節成分の内在化を誘導する表面受容体を有する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、濾過によって産生細胞に導入される。ある特定の実施形態では、産生細胞及び免疫調節成分を産生細胞よりも小さい孔径のフィルタに強制的に通し、産生細胞膜の一過性破壊を引き起こすことによって、免疫調節成分が産生細胞に入ることを可能にすることができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、産生細胞はいくつかの凍結解凍サイクルに曝され、免疫調節成分の付加を可能にする細胞膜破壊を生じる。
【０１９３】
細胞外小胞を免疫調節成分で修飾する方法
様々な代替実施形態では、免疫調節成分は、細胞外小胞の単離後に細胞外小胞に直接導入される。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、トランスフェクションによって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、カチオン性脂質及びポリマーのような合成高分子を使用して細胞外小胞に導入することができる（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：Ｓ１１８−Ｓ１３０（２００５））。ある特定の実施形態では、リン酸カルシウム、シクロデキストリン、またはポリブレンのような化学物質を、免疫調節成分を細胞外小胞に導入するために使用することができる。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、電気穿孔によって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、細胞外小胞膜に一過性の孔を引き起こす電界に曝露され、免疫調節成分の付加を可能にする。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、マイクロ注射によって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、ガラスマイクロピペットは、免疫調節成分を顕微鏡レベルで細胞外小胞へと直接注入するために使用されることができる。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、押出によって細胞外小胞に導入される。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、免疫調節成分は、超音波処理によって細胞外小胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、高強度の音波に曝露され、免疫調節成分の付加を可能にする細胞外小胞膜の一過性破壊を引き起こす。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、細胞外小胞の表面にコンジュゲートされることができる。コンジュゲーションは、当該技術分野で既知の方法によって化学的または酵素的に達成されることができる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、化学的にコンジュゲートされた免疫調節成分を含む。化学的コンジュゲーションは、リンカーの使用の有無にかかわらず、免疫調節成分の別の分子への共有結合によって達成することができる。かかるコンジュゲートの形成は当業者の技術範囲内であり、様々な技術はコンジュゲートを達成するために既知であり、具体的な技術の選択は、コンジュゲートされる材料によって誘導される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、細胞外小胞にコンジュゲートされる。ある特定の他の実施形態では、脂質、炭水化物、核酸、及び低分子のような非ポリペプチドは、細胞外小胞にコンジュゲートされる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、低張溶解によって細胞外小胞に導入される。これらの実施形態のいくつかでは、細胞外小胞は、免疫調節成分の付加を可能にする破裂をそれらに引き起こす低イオン強度緩衝液に曝露される。いくつかの代替実施形態では、低張液に対する制御透析は、細胞外小胞を膨らませ、細胞外小胞膜内に細孔を作製するために使用される。細胞外小胞は、その後、膜の再密封を可能にする条件に曝露される。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、界面活性剤処理によって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、免疫調節成分の付加を可能にするため、細孔を作製することによって細胞外小胞膜を一時的に損なうように軽度の界面活性剤で処理される。細胞外小胞が付加された後、界面活性剤は洗い流され、それによって膜を再密封する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、免疫調節成分の結合時に受容体及び結合した免疫調節成分の内在化を誘導する表面受容体を有する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、機械的発射によって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、金マイクロキャリアのような重粒子または荷電粒子に結合された免疫調節成分を撃ち込むことができる。これらの実施形態のいくつかでは、粒子を、細胞外小胞膜を横断するように機械的または電気的に加速されることができる。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、濾過によって細胞外小胞に導入される。ある特定の実施形態では、細胞外小胞及び免疫調節成分は、細胞外小胞よりも小さい孔径のフィルタに強制的に通し、細胞外小胞膜の一過性破壊を引き起こすことによって、免疫調節成分が細胞外小胞に入ることを可能にする。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、いくつかの凍結解凍サイクルに曝され、免疫調節成分の付加を可能にする細胞外小胞膜破壊を生じる。
【０２０７】
細胞外小胞を単離する方法
細胞外小胞は、産生細胞から単離することができる。ある特定の実施形態では、細胞外小胞は、産生細胞によって細胞培養培地へと放出される。細胞外小胞の単離の全ての既知の様式は、本明細書での使用に好適であると見なされることが、企図される。例えば、細胞外小胞の物理的特性は、それらを培地または他の供給源材料から分離するために採用されることができ、電荷（例えば、電気泳動分離）、サイズ（例えば、濾過、分子篩など）、密度（例えば、規則的または勾配遠心分離）、スベドベリ定数（例えば、外力の有無を伴う沈降など）に基づく分離を含む。あるいは、または加えて、単離は、１つ以上の生物学的特性に基づくことができ、表面マーカー（例えば、沈殿、固相への可逆結合、ＦＡＣＳ分離、特異的リガンド結合、非特異的リガンド結合、アフィニティ精製など）を採用することができる方法を含む。
【０２０８】
単離及び濃縮は、典型的には連続遠心分離を含む一般的かつ非選択的な様式で行われることができる。あるいは、単離及び濃縮は、細胞外小胞または産生細胞特異的表面マーカーを使用するような、より特異的かつ選択的な様式で行われることができる。例えば、特定の表面マーカーは、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、アフィニティ精製、及びビーズ結合リガンドを用いた磁気分離に使用されることができる。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、細胞外小胞を単離するために使用することができる。サイズ排除クロマトグラフィー技術は、当該技術分野で既知である。例示的な非限定的技術が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ボイド体積画分は、単離されて対象の細胞外小胞を含む。さらに、いくつかの実施形態では、細胞外小胞は、当該技術分野で一般に知られているように、（１つ以上のクロマトグラフィー画分の）遠心分離技術によってクロマトグラフィー分離後にさらに単離されることができる。いくつかの実施形態では、例えば、密度勾配遠心分離を利用は、細胞外小胞をさらに単離するために使用されることができる。ある特定の実施形態では、産生細胞由来の細胞外小胞を他の起源の細胞外小胞からさらに分離することが望ましい場合がある。例えば、産生細胞由来の細胞外小胞は、産生細胞に特異的な抗原抗体を使用する免疫吸着捕捉によって、非産生細胞由来の細胞外小胞から分離されることができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞の単離は、分画遠心分離、サイズベースの膜濾過、免疫沈降、ＦＡＣＳ選別、及び磁気分離を含むがこれらに限定されない方法の組み合わせを含むことができる。
【０２１１】
細胞外小胞のサイズを測定する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞外小胞のサイズ及び／または細胞外小胞の集団を測定することを含む。一般に、細胞外小胞サイズは、最長測定可能寸法として測定される。一般に、細胞外小胞の最長測定可能寸法は、その直径としても呼ばれる。
【０２１２】
細胞外小胞サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）及び／または多角度光散乱（ＭＡＬＳ）を使用して測定することができる。細胞外小胞のサイズを測定するためにＤＬＳ及び／またはＭＡＬＳを使用する方法は、当業者に既知であり、ナノ粒子追跡アッセイ（ＮＴＡ、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００ナノ粒子追跡デバイスを使用する）を含む。特定の実施形態では、細胞外小胞サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、ＮＴＡによって測定された場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、ＮＴＡによって測定された場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、ＮＴＡによって測定された場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、ＮＴＡによって測定された場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、ＮＴＡによって測定された場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、ＮＴＡによって測定された場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、ＮＴＡによって測定された場合、（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、ＮＴＡによって測定された場合（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。
【０２１３】
細胞外小胞サイズは、調節可能な抵抗パルス検知（ＴＲＰＳ）を使用して測定されることができる。特定の実施形態では、ＴＲＰＳによって測定された細胞外小胞サイズは、ｉＺＯＮ  ｑＮＡＮＯ  Ｇｏｌｄを使用して決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、ＴＲＰＳによって測定された場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用して）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄ）によって測定された場合、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、ＴＲＰＳによって測定された場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用して）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、ＴＲＰＳによって測定された場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用して）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、ＴＲＰＳによって測定された場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用して）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、ＴＲＰＳによって測定された場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用して）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、ＴＲＰＳによって測定された場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用して）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞集団は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、ＴＲＰＳによって測定された場合（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用して）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。
【０２１４】
細胞外小胞サイズは、電子顕微鏡法を用いて測定されることができる。いくつかの実施形態では、細胞外小胞サイズを測定するために使用される電子顕微鏡法は、透過型電子顕微鏡法である。特定の実施形態では、細胞外小胞サイズを測定するために使用される透過型電子顕微鏡は、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮである。電子顕微鏡を使用して細胞外小胞サイズを測定する方法は当業者に周知であり、任意のかかる方法は細胞外小胞サイズを測定するのに適切であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、走査型電子顕微鏡で測定された場合（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、走査型電子顕微鏡で測定された場合（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、走査型電子顕微鏡で測定された場合（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、走査型電子顕微鏡で測定された場合（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、走査型電子顕微鏡で測定された場合（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）、約２０〜３００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の９０％は、走査型電子顕微鏡で測定された場合（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の９５％は、走査型電子顕微鏡で測定された場合（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、集団を含み、細胞外小胞の９９％は、走査型電子顕微鏡で測定された場合（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査型電子顕微鏡）、約４０〜２００ｎｍの最長寸法を有する。
【０２１５】
がん、ＧｖＨＤ、及び自己免疫疾患を治療する方法
また、対象におけるがん、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）及び自己免疫疾患を治療する方法が、本明細書に提供される。
【０２１６】
様々な実施形態では、組成物は、がんを有する対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、免疫応答を上方調節し、対象の免疫系の腫瘍標的化を増強することができる。いくつかの実施形態では、治療されるがんは、腫瘍微小環境、またはいわゆる「熱い腫瘍」もしくは「炎症性腫瘍」への白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球）の浸潤により特徴付けられる。いくつかの実施形態では、治療されるがんは、腫瘍微小環境、またはいわゆる「冷たい腫瘍」もしくは「非炎症性腫瘍」への低レベルまたは検出不可能なレベルの白血球浸潤により特徴付けられる。いくつかの実施形態では、組成物は、「冷たい腫瘍」を「熱い腫瘍」へと変換するのに十分な量及び時間投与され、すなわち、該投与は腫瘍微小環境への白血球（例えばＴ細胞）の浸潤を生じる。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、細胞外小胞及び免疫調節成分を含む組成物は、がんワクチンとして対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、個別化がんワクチンとして対象に投与される。いくつかの実施形態では、免疫調節成分は、腫瘍抗原または腫瘍抗原に由来するペプチドである。好適な腫瘍抗原の例は、アルファ−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、Ｔｎ−ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＶＥＧＦＲ、アルファ−葉酸受容体、ＣＥ７Ｒ、ＩＬ−３、がん−精巣抗原、ＭＡＲＴ−１  ｇｐ１００、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、参照ゲノム配列に由来する。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、組成物を受容する対象のゲノム配列に由来する。
【０２１８】
組成物で治療されることができるがんは、表５に列挙されるがんを含むが、これらに限定されない。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、組成物は、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を有する対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、免疫応答を下方調節し、ＧｖＨＤの症状を緩和させることができる。いくつかの特定の実施形態では、組成物は、アポトーシスシグナル伝達の活性化を通じてＧｖＨＤの症状を緩和させる。ある特定の実施形態では、ＧｖＨＤを治療するための組成物は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ＦａｓＬは、細胞外小胞の表面上に発現される。
【０２２０】
様々な実施形態では、組成物は、自己免疫疾患を有する対象に投与される。これらの実施形態のいくつかでは、組成物は、免疫応答を下方調節し、対象の免疫活性を抑制することができる。
【０２２１】
自己免疫疾患は、多発性硬化症、末梢神経炎、シェーグレン症候群、関節リウマチ、脱毛症、自己免疫性膵炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、デビック病（視神経脊髄炎）、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、各種血管炎、強皮症、糖尿病、動脈炎、白斑、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、乾癬、ぶどう膜炎、及び全身性エリテマトーデスを含むが、これらに限定されない。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の循環系に静脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、好適な液体中に注入され、対象の静脈へと投与される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の循環系に動脈内投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、好適な液体中に注入され、対象の動脈へと投与される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、組成物は、髄腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物が脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊柱管またはくも膜下腔への注射を介して投与される。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、組成物は、対象の１つ以上の腫瘍へと腫瘍内投与される。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、組成物は、鼻腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、局所投与または全身投与のいずれかの形態で鼻を通して吸送されることができる。ある特定の実施形態では、組成物は、鼻腔スプレーとして投与される。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、組成物は、腹腔内投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、好適な液体中に注入され、対象の腹膜へと注射される。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）のリンパ管への分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）の胸腺、脾臓、及び／または骨髄への分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）の１つ以上のリンパ節への分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）の、頸部リンパ節、鼠径部リンパ節、縦隔リンパ節、または胸骨リンパ節のうちの１つ以上への分布を生じる。いくつかの実施形態では、該腹腔内投与は、組成物（例えば、組成物中の細胞外小胞）の、膵臓への分布を生じる。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、組成物は、眼周投与によって対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、眼周組織へと注射される。眼周薬物投与は、結膜下投与、前側テノン嚢下投与、後側テノン嚢下投与、及び球後投与の経路が含まれる。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、組成物は、複数の投与経路によって同じ対象へと投与される。いくつかの実施形態では、該複数の投与経路は、静脈内投与、動脈内投与、髄腔内投与、鼻腔内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、及び／または眼周投与を含む。好ましい実施形態では、該複数の投与経路は、静脈内投与及び腹腔内投与を含む。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の用量は、１ｎｇ〜１０ｎｇ、１０ｎｇ〜１００ｎｇ、１００ｎｇ〜１μｇ、１μｇ〜５μｇ、５μｇ〜１０μｇ、１０μｇ〜５０μｇ、５０μｇ〜７５μｇ、７５μｇ〜１００μｇ、１００μｇ〜１５０μｇ、１５０μｇ〜２００μｇ、２００μｇ〜３００μｇ、３００μｇ〜５００μｇ、５００μｇ〜１ｍｇ、または１ｍｇ〜１０ｍｇである。
【０２３１】
組成物は、対象に１回投与されることができる。あるいは、複数の投与は、一定期間にわたって実行されることができる。例えば、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の投与は、対象に行われることができる。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、疾患、障害または状態に関連する症状が持続する限り、必要に応じて行われることができる。いくつかの実施形態では、反復投与は、対象の寿命の残りの期間で示され得る。治療期間は様々であり得、例えば、１年、６ヶ月、３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、２週間、１週間、３日、２日、または１日以下であり得る。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、細胞外小胞の用量は、１日１回、隔日１回、週１回、週２回、月１回または月２回のような間隔で投与される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、標的細胞または組織中の免疫調節成分の濃度を疾患、障害または状態の症状に関連するレベルよりも高く効果的に増加させるのに十分な頻度で投与される。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、組成物は、疾患、障害または状態が治療されるか、またはその症状が改善されるように、治療期間にわたって少なくとも２回投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、疾患、障害または状態が治療されるか、またはその症状が予防されるように、治療期間にわたって少なくとも２回投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療期間中に十分な量の免疫調節成分が標的細胞または組織に送達されるように、治療期間にわたって十分な回数投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、疾患、障害または状態の１つ以上の症状が予防、減少、改善もしくは遅延されるように、治療期間中に十分な量の免疫調節成分が標的細胞もしくは組織に送達されるように、治療期間にわたって十分な回数投与される。いくつかの実施形態では、標的細胞または組織中の免疫調節成分濃度を増加させることは、ピーク濃度を増加させることを含むが、他の実施形態では、平均濃度を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、治療期間中の実質的な増加は、対象における治療前もしくは治療後の期間を比較することによって、または治療を受ける集団で行われた測定値を、一致した未治療の対照集団と比較することによって決定されることができる。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、標的細胞または組織中の免疫調節成分の濃度が、少なくとも約１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月もしくは６ヶ月以上増加するように、治療期間当たり十分な回数投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、標的細胞または組織中の免疫調節成分の濃度が、少なくとも治療期間と同じくらいの期間増加するように、治療期間当たり十分な回数投与される。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、治療期間内の反復投与間の時間間隔は、循環中の細胞外小胞の数が、投与された薬学的組成物中に存在する細胞外小胞の数の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％未満に低減する期間以下である。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、方法は、治療剤を保有する細胞外小胞の適切な治療用量の注射の前に、１つ以上の非治療用細胞外小胞の用量をさらに含む。ある特定の実施形態では、非治療用細胞外小胞は、治療用細胞外小胞に別々に投与され、かつ治療用細胞外小胞とは異なる用量で投与される。ある特定の実施形態では、非治療用細胞外小胞の用量は、治療用細胞外小胞の用量よりも多い。ある特定の他の実施形態では、非治療用細胞外小胞の用量は、治療用細胞外小胞の用量よりも少ない。ある特定の実施形態では、非治療用細胞外小胞の用量は、治療用細胞外小胞と同じである。様々な実施形態では、適切な用量の治療用細胞外小胞の注射前の非治療用細胞外小胞の方法は、肝臓、肺、及び／または脾臓における治療用細胞外小胞の更新を低減させる。
【０２３８】
有効量の組成物は、標的組織、標的細胞型、投与手段、細胞外小胞の物理的特徴（例えば、サイズ、及びいくつかの場合では、送達される分子の程度）ならびに他の決定要因に少なくとも部分的に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、標的細胞の効率的な細胞応答を提供する。増加した効率は、宿主対象の細胞トランスフェクション（すなわち、細胞外小胞成分でトランスフェクトされた細胞の百分率）の増加、細胞応答の増加、または先天性免疫応答の低減によって実証されることができる。
【０２３９】
細胞外小胞及びその医薬組成物の投与量ならびに投与頻度は、例えば、疾患の重症度、患者の年齢、性別及び食事、任意の炎症の重症度、投与時間、及び他の臨床的要因のような様々な要因に基づいて主治医によって決定され得る。一例では、静脈内投与は最小限で有効な用量で開始され、用量は予め選択された時間経過にわたって正の効果が観察されるまで増加する。その後、用量の増分的増加は、現れ得る任意の悪影響を考慮しながら、対応する効果の増加を生み出すレベルに限定される。
【実施例】
【０２４０】
以下の実施例は、当業者に本発明を作成する及び使用する方法の完全な開示ならびに説明を提供するように提案され、かつ発明者がその発明と見なす範囲を限定することが意図されるものではなく、または、以下の実験が実行された全てもしくは唯一の実験であることを表すことが意図されるものではない。努力は使用された数（例えば、量、温度など）についての正確性を確実にするためになされてきたが、いくつかの実験誤差や偏差は説明されるべきである。別途示されない限り、部品は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気中または大気近傍である。標準的な略称は、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロ塩基（複数可）；ｐｌ、ピコリッター（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）などが使用されることができる。
【０２４１】
本発明の実施は、別途示されない限り、当技術分野の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を採用する。かかる技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００５）、Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照されたい。
【０２４２】
方法
エクソソーム精製
調整培養培地を回収し、室温で５分間３００〜８００×ｇで遠心分離して、細胞及び大きな破片を除去した。次いで、培地上清を１０００Ｕ／Ｌベンゾナーゼ（登録商標）で補充し、水浴中で１時間３７℃でインキュベートした。上清を回収し、４℃で３０分間１６，０００×ｇで遠心分離して、残留細胞破片及び他の大きな汚染物質を除去した。次いで、上清を４℃で３時間１３３，９００×ｇで超遠心分離して、エクソソームをペレット化した。上清を廃棄し、残留培地をチューブの底部から吸引した。ペレットを２００〜１０００μＬのＰＢＳ（−Ｃａ−Ｍｇ）中に再懸濁した。
【０２４３】
エクソソーム集団をさらに濃縮するために、密度勾配精製（ショ糖またはＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標））を介してペレットを処理した。ショ糖勾配精製のために、以下の表６に定義されるように、エクソソームペレットをショ糖勾配の上部に重ねた。
【表６】
2021508691.tif 000002
【０２４４】
勾配を、ＳＷ４１  Ｔｉ回転子に配置された１２ｍＬの超クリア（３４４０５９）チューブ中で４℃で１６時間２００，０００×ｇで回して、エクソソーム画分を分離した。
【０２４５】
エクソソーム層を上層から穏やかに除去し、３８．５ｍＬの超クリア（３４４０５８）チューブ中の約３２．５ｍＬのＰＢＳ中で希釈し、再び４℃で３時間１３３，９００×ｇで超遠心分離して、精製されたエクソソームをペレット化した。生じたペレットを最小体積のＰＢＳ（約２００μＬ）中に再懸濁し、４℃で保存した。
【０２４６】
Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配のために、ＳＷ  ４１  Ｔｉ回転子用１２ｍＬのＵｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ内で、等体積の１０％、３０％、及び４５％のＯｐｔｉｐｒｅｐにより３層滅菌勾配を調製した。ペレットをＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配に添加し、４℃で１６時間２００，０００×ｇで超遠心分離して、エクソソーム画分を分離した。次いで、エクソソーム層を、チューブの上部約３ｍＬから穏やかに回収した。
【０２４７】
エクソソーム画分を、３８．５ｍＬの超クリア（３４４０５８）チューブ中の約３２ｍＬのＰＢＳ中で希釈し、４℃で３時間１３３，９００×ｇで超遠心分離して、精製されたエクソソームをペレット化した。次いで、ペレット化されたエクソソームを最小体積のＰＢＳ（約２００μＬ）中に再懸濁し、４℃で保存した。
【０２４８】
実施例１：エクソソームを操作して、免疫チェックポイント調節因子抗体を表示する
ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞株は高密度に増殖され、生じたエクソソームは当業者に既知の方法（例えば、本明細書に記載の方法）に従って培養培地から単離される。細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）抗体で操作されたエクソソームは、当該技術分野で既知の技術に従って化学的コンジュゲーションによって調製される。ＣＴＬＡ４抗体で修飾されたエクソソームは、フローサイトメトリーによって選択される。同時に、未修飾エクソソームは、同じ標準的な方法に従って単離される。
【０２４９】
２つのエクソソーム集団は放射性トレーサーで標識され、各調製物の１５０μｇは生きたマウス（例えば、メラノーマのマウスモデル）へと注射される。ＣＴＬＡ−４抗体を示すエクソソームまたは未修飾エクソソームのいずれかを受容するマウスは３０分間連続で監視され、全動物ＰＥＴ／ＣＴによって４時間間隔で再び監視される。全動物撮像は、標識されたエクソソームを様々な組織にリアルタイムで高解像度で追跡することを可能にする。
【０２５０】
各エクソソーム集団の１５０μｇは、放射性トレーサーで最初に標識することなく２つのマウスコホートへと静脈内注射される。マウスは、投与後５週間で安楽死させられる。腫瘍試料は、回収され、免疫組織化学及びリアルタイムＰＣＲによって分析される。
【０２５１】
実施例２：エクソソームを操作してＦａｓリガンドを表示する
ヒト抗原提示細胞は、ピューロマイシン耐性選択マーカー及びＦａｓリガンドをコードするプラスミドでトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞はピューロマイシンで処理され、耐性コロニーは選択され、フローサイトメトリーによってＦａｓリガンドの表面発現についてアッセイされる。安定したＦａｓリガンド発現細胞は高濃度に成長させられ、生じたエクソソームは当業者に既知の方法（例えば、本明細書に記載の方法）に従って培養培地から単離される。同時に、トランスフェクトされていない産生細胞は培養され、生じたエクソソームは同じ標準的な方法に従って単離される。
【０２５２】
２つのエクソソーム集団は放射性トレーサーで標識され、各調製物の１５０μｇは生きたマウス（例えば、ＧｖＨＤのマウスモデル）へと注射される。未修飾細胞に由来するエクソソームまたはＦａｓリガンド発現細胞に由来するエクソソームのいずれかを受容するマウスは、３０分間連続で監視され、全動物ＰＥＴ／ＣＴによって４時間間隔で再び監視される。全動物撮像は、標識されたエクソソームを様々な組織にリアルタイムで高解像度で追跡することを可能にする。
【０２５３】
未修飾産生細胞及びＦａｓリガンドを発現するように操作された産生細胞からの精製されたエクソソーム集団は、本明細書に記載の方法に従って精製される。各エクソソーム集団の１５０μｇは、放射性トレーサーで最初に標識することなく２つのマウスコホートへと注射される。両方のコホートの動物は、免疫組織化学分析及びリアルタイムＰＣＲのために投与後３〜５週間安楽死させられる。
【０２５４】
実施例３：腹腔内投与後のエクソソームのリンパ取り込み
精製されたエクソソームのインビボでの生体内分布を決定するために、以下の実験を実行した。
【０２５５】
２９３Ｔ細胞から調整培養培地を回収し、室温で５分間３００〜８００×ｇで遠心分離して、細胞及び大きな破片を除去した。次いで、培地上清を１０００Ｕ／Ｌベンゾナーゼ（登録商標）で補充し、水浴中で１時間３７℃でインキュベートした。上清を回収し、４℃で３０分間１６，０００×ｇで遠心分離して、残留細胞破片及び他の大きな汚染物質を除去した。次いで、上清を４℃で３時間１３３，９００×ｇで超遠心分離して、エクソソームをペレット化した。上清を廃棄し、チューブの底から残留培地を吸引した。次いで、ペレットを２００〜１０００μＬのＰＢＳ（−Ｃａ−Ｍｇ）中に再懸濁した。
【０２５６】
エクソソーム集団をさらに濃縮するために、表６に定義されるようにショ糖密度勾配精製を介してペレットを処理した。
【０２５７】
勾配を、ＳＷ４１  Ｔｉ回転子に配置された１２ｍＬの超クリア（３４４０５９）チューブ中で４℃で１６時間２００，０００×ｇで回して、エクソソーム画分を分離した。
【０２５８】
エクソソーム層を上層から穏やかに除去し、３８．５ｍＬの超クリア（３４４０５８）チューブ中の約３２．５ｍＬのＰＢＳ中で希釈し、再び４℃で３時間１３３，９００×ｇで超遠心分離して、精製されたエクソソームをペレット化した。生じたペレットを最小体積のＰＢＳ（約２００μＬ）中に再懸濁し、４℃で保存した。
【０２５９】
インビボ撮像用の精製されたエクソソームを放射標識するために、１００μＬ中の１×１０１１個の精製されたエクソソームをＨＥＰＥＳ（２００μＬ、０．１Ｍ、ｐＨ８．５）で希釈し、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯ（５μｇ）に３７℃で１時間コンジュゲートし、続いて４℃で単独で一晩インキュベートした。ＤＦＯ−エクソソームを、ＨＥＰＥＳ（１００μＬ、１Ｍ、ｐＨ７．３）中で希釈した８９Ｚｒ（７．５ｍＣｉ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、ｑＥｖカラム上で精製した。このことは、１００μＣｉ／１×１０１０エクソソームでの総収率（最大０．８ｍＬのＰＢＳ中で０．４ｍＣｉの８９Ｚｒ−ＤＦＯ−エクソソーム）を生じた。放出前に品質管理（ＨＰＬＣ）を実行し、９５％超のＲＣＰを確実にした。
【０２６０】
インビトロ安定性
エクソソーム（２０μＣｉ／２×１０１０）を、室温で以下の中でインキュベートした。
ａ．製剤緩衝液
ｂ．マウス血清（できれば血清中１０％  ｖ／ｖのエクソソーム溶液）
【０２６１】
インキュベーション開始２時間後に溶液をＨＰＬＣへと注入し、トレーサーの安定性を決定した。
【０２６２】
インビボ撮像
マウス（ＳＫＨ−１、ｎ＝８、５〜８週齢）を２つの群にランダムに分け、体重を測定し、１×１０１０／ｇのエクソソームで注射して（第１の群の動的スキャンが終了した直後に第２の群を注射して）、１００μＣｉ／マウスの最小放射線量を得た。群１を静脈内注射（ＩＶ）し、群２を腹腔内注射（ＩＰ）した。
【０２６３】
マウスは、以下のスケジュールを使用して、４匹のマウスのホテルで全身ＰＥＴ／ＣＴスキャンを受ける。１時間の動的（５×６０、５×１８０、８ｘ３００秒）ならびに４時間（２０分）、２４時間（木曜、２０分）、及び４８時間（金曜、３０分）の静的撮像。各撮像時点に続いて、解剖学的参照のためにＣＴを行った。
【０２６４】
最後の撮像時点の後、マウスを安楽死させ、以下の臓器を回収、計量し、ガンマカウンタ内で計数した。血液、肺（１つ）、肝臓（葉）、脾臓、膵臓、腎臓（１つ）、肝臓、結腸、及び高取り込みの追加の臓器。
【０２６５】
計数が極端に高かった場合、臓器を２〜３日間崩壊させ、再び計数した。
【表７】
2021508691.tif 000003
【０２６６】
結果
処理されたマウスの２つのコホートを、処理の４時間後、２４時間後、及び４８時間後に撮像した。全身ＰＥＴ／ＣＴ撮像は、ＩＶ処理された群１における全てのマウスの肝臓への頑強な送達（図１Ａ）、及びＩＰ処理された群２におけるマウスの異なる非重複分布を明らかにした（図１Ｂ）。臓器を解剖し、放射線撮影ガンマカウンタによって分析したところ、ＩＶ処理したマウスにおける有意な肝臓及び脾臓の取り込みが明らかになった（図２）。対照的に、ＩＰ処理されたマウスについて、取り込みは、主に脾臓、膵臓、胸腺、及びリンパ節において観察され、肝臓及び卵巣において追加の取り込みが観察された。これらの結果は、異なる投与経路が実質的に異なる生体内分布プロファイルを生じることを実証する。重要なことに、ＩＰ投与は、リンパ系の著しい取り込みをもたらし、ＩＰ投与が免疫細胞に到達するための好適な投与経路であり得ることを示唆した。
【０２６７】
実施例４：操作されたＣＤ４０ＬエクソソームによるＢ細胞活性化
ＣＤ４０Ｌは、主にＴ細胞上で発現される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４０Ｌ受容体ＣＤ４０は、マクロファージ、樹状細胞、及びＢ細胞を含む抗原提示細胞上で発現される。ＣＤ４０を通じたシグナル伝達は、Ｂ細胞を活性化し、抗原特異的応答を誘導する。したがって、ＣＤ４０経路を活性化することは、広範囲の腫瘍型における抗腫瘍免疫の発達に影響を及ぼす。操作されたエクソソームが特定の免疫学的効果を誘導するために生成されることができるかどうかを決定するために、エクソソームを、全長ヒトＣＤ４０Ｌを含有するプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞から生成した。トランスフェクトされた細胞をピューロマイシン選択下に置き、耐性細胞集団を高密度に増殖させた。生じたエクソソームを調整培養培地から回収し、上述のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配上で精製した。未修飾ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞由来からのエクソソームも単離して、対照として使用した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、９６ウェルプレートのウェル当たり１５０，０００細胞で蒔き、精製されたＣＤ４０Ｌエクソソームまたは天然エクソソームと共に３７℃で一晩インキュベートした。ＰＢＭＣの１つの試料を、陽性対照として１μｇ／ｍＬの可溶性組換えＣＤ４０Ｌ−Ｆｃと共にインキュベートした。図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、ＣＤ４０Ｌエクソソームは、２人の異なるドナー試料におけるＣＤ６９発現によって測定されたように、用量依存的様式でＢ細胞を活性化した。天然エクソソームは、Ｂ細胞活性化を誘導することができなかった。重要なことに、ＣＤ４０ＬエクソソームによるＢ細胞活性化のレベルは、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃによって引き起こされた活性化に匹敵した。
【０２６８】
観察されたエクソソーム媒介性Ｂ細胞活性化が、Ｂ細胞の直接活性化に起因するのか、またはトランス作用性免疫細胞を通じたものかどうかを決定するために、精製されたヒトＢ細胞を使用して同様の実験を行った。５０，０００個の精製されたヒトＢ細胞を、９６ウェルプレートに蒔き、ＣＤ４０Ｌエクソソーム、天然エクソソーム、またはＣＤ４０Ｌ−Ｆｃのいずれかと共にインキュベートした。高濃度ＣＤ４０Ｌエクソソームの１つの試料を凍結解凍サイクル（ＣＤ４０Ｌ−ＥＶ［Ｆ／Ｔ］）に通し、Ｂ細胞活性化についても試験した。図４Ａ及び４Ｂに示されるように、ＣＤ４０Ｌエクソソームは、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃと同様の程度で、２人のドナーからの精製されたＢ細胞を活性化した。天然エクソソームはＢ細胞を活性化することができなかったが、ＣＤ４０Ｌエクソソーム凍結解凍試料はＢ細胞を活性化することに成功し、ＣＤ４０Ｌエクソソームの効果がＢ細胞を通じて直接媒介されることと、ＣＤ４０Ｌの存在がＢ細胞活性化に十分であることとを示した。加えて、操作されたエクソソームは、少なくとも１つの凍結解凍サイクルの間安定し活性であり続ける。
【０２６９】
ＣＤ４０Ｌエクソソームをさらに検証するために、レポーター系を使用して、操作されたエクソソームの活性を測定した。ＣＤ４０経路の活性化は、ＮＦ−κＢの活性化を生じる。その表面上でＣＤ４０を過剰発現させ、ＮＦ−κＢプロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の下流にルシフェラーゼレポーターを含有するように操作された修飾Ｕ２ＯＳ細胞株を使用して、抗Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）と架橋されたアゴニスト抗ＣＤ４０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．）または抗ＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）と架橋された組換えヒトＣＤ４０Ｌ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で細胞をインキュベートすることによってＣＤ４０活性化を確認した（図５Ａ及び５Ｂ）。ＣＤ４０Ｌ操作エクソソームを操作された細胞と共にインキュベートし、抗ＣＤ４０＋抗Ｆｃの効果に匹敵するルシフェラーゼ活性の頑強な増加を生じた。重要なことに、操作されたエクソソームは、架橋抗体を必要とせず、エクソソームの表面上のＣＤ４０ＬがＣＤ４０を活性化するのに十分な機能的ＣＤ４０Ｌ三量体を形成できることを実証した。
【０２７０】
実施例５：操作されたＣＤ８０エクソソームによるＴ細胞活性化
ＣＤ８０は、抗原提示細胞上で発現され、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４に結合する。ＣＤ８０（ならびにＣＤ８６）によるＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４を通じた刺激は、免疫応答の開始中にＴ細胞を活性化する。エクソソームを操作してＴ細胞を活性化することができるかどうかを決定するために、実施例４に記載のＨＥＫ２９３ＳＦ細胞のトランスフェクション及び選択によって、ＣＤ８０含有エクソソームを生成した。ＣＤ８０エクソソームの活性を検証するために、ヒトＰＢＭＣを、９６ウェルプレートのウェル当たり１５０，０００個の細胞で蒔き、（ｉ）精製されたＣＤ８０エクソソーム及び抗ＣＤ３抗体、（ｉｉ）天然エクソソーム及び抗ＣＤ３抗体、（ｉｉｉ）抗ＣＤ３抗体単独、または（ｉｖ）抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３抗体の組み合わせ、と共にインキュベートした。試料を、３７℃で３日間インキュベートし、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図６Ａ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ｂ）の両方についてＴ細胞計数についてアッセイした。ＣＤ８０エクソソームは、用量依存的様式で、かつＣＤ３及びＣＤ２８抗体の陽性対照に匹敵する程度でＴ細胞を活性化した。対照的に、天然エクソソームは、Ｔ細胞増殖に効果がなかった。
【０２７１】
ＣＤ８０エクソソームがＴ細胞の機能的活性化を誘導することを確認するために、天然エクソソームと追加の抗ＣＤ３抗体、及びＣＤ８０エクソソームと追加の抗ＣＤ３抗体と共にインキュベートしたＰＢＭＣにおいて、ＩＦＮγレベルをＡｌｐｈａＬＩＳＡによって測定した。図７Ａに示されるように、ＩＦＮγレベルの用量依存的な増加は、ＣＤ８０エクソソームについてはあったが、天然エクソソームについてはなかった。図７Ｂに示されるように、最高濃度のＣＤ８０エクソソームは、陽性対照（抗ＣＤ２８／抗ＣＤ３）を含む任意の他の条件よりも大きなＩＦＮγレベルを生じた。これらの結果は、エクソソームが免疫細胞活性化を生じる特異的活性で操作されることができることを実証する。
【０２７２】
実施例６：操作されたＣＤ２７Ｌ及びＯＸ４０Ｌエクソソームによる炎症性サイトカイン産生
ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）及びＯＸ４０Ｌは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、かつＴ細胞上の同族受容体（それぞれ、ＣＤ２７及びＯＸ４０）に結合する。ＣＤ２７ＬはＴ細胞及びＢ細胞のある特定の集団によって発現されるが、ＯＸ４０Ｌは抗原提示細胞のある特定の集団によって発現される。したがって、ＣＤ２７またはＯＸ４０を通じたシグナル伝達は、具体的にアネルギーＴ細胞を活性化する方法として、免疫腫瘍学に影響を及ぼす。エクソソームを操作してＰＢＭＣにおける炎症性サイトカイン産生を誘導することができるかどうかを決定するために、実施例４に記載のＨＥＫ２９３ＳＦ細胞のトランスフェクション及び選択によって、ＣＤ２７ＬならびにＯＸ４０Ｌ含有エクソソームを生成した。ＣＤ２７Ｌエクソソームの活性を検証するために、ヒトＰＢＭＣを、９６ウェルプレートに蒔き、精製されたＣＤ２７Ｌエクソソーム及び抗ＣＤ３抗体、天然エクソソーム及び抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体単独、または抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３抗体の組み合わせ、と共にインキュベートした。試料を、３７℃で２日間インキュベートし、２人の異なるドナーにおけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生（図８Ａ及び８Ｂ）及びＩＬ−２産生（図９Ａ及び９Ｂ）についてアッセイした。ＣＤ２７Ｌエクソソームは、用量依存的様式で、かつＣＤ３及びＣＤ２８抗体の陽性対照に匹敵する（ドナー１）または有意に超える（ドナー２）程度で、ＩＦＮγ及びＩＬ−２産生を誘導した。対照的に、天然エクソソームは、ＩＦＮγまたはＩＬ−２産生に効果がなかった。同様に、ＯＸ４０Ｌエクソソームは、２人の異なるドナーにおけるＩＦＮγ及びＩＬ−２産生を同様またはそれ以上の程度で誘導するのに十分であった（図１０Ａ及び１０Ｂならびに図１１Ａ及び１１Ｂ）。
【０２７３】
ＯＸ４０Ｌエクソソームをさらに検証するために、レポート系を使用して、操作されたエクソソームの活性を測定した。ＯＸ４０経路の活性化は、ＮＦ−κＢの活性化を生じる。その表面上でＯＸ４０を過剰発現させ、ＮＦ−κＢプロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の下流にルシフェラーゼレポーターを含有するように操作された修飾ＪｕｒｋａｔＴ細胞株を使用して、抗Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）と架橋されたアゴニスト抗ＯＸ４０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または抗ＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と架橋された組換えヒトＯＸ４０Ｌ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で細胞をインキュベートすることによってＯＸ４０活性化を確認した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。抗ＩｇＧと架橋した抗ＯＸ４０Ｌ抗体はレポーター細胞を活性化することができなかったが、抗Ｆｃと架橋した組換えＯＸ４０Ｌはレポーター遺伝子の頑強な活性化をもたらした（図１２Ｂ）。際立ったことに、操作されたＯＸ４０Ｌエクソソームは、抗ＯＸ４０抗体または組換えＯＸ４０Ｌのいずれかよりも大きな程度でレポーター遺伝子発現を誘導した（図１２Ｃ）。重要なことに、操作されたエクソソームは、架橋抗体を必要とせず、エクソソームの表面上のＯＸ４０ＬがＯＸ４０を活性化するのに十分な機能的ＯＸ４０Ｌ三量体を形成できることを実証した。
【０２７４】
実施例７：ＩＬ−７操作エクソソームによるＴ細胞活性化
ＩＬ−７は、Ｂ細胞及びＴ細胞増殖に関与するサイトカインであり、免疫療法に影響を及ぼす。具体的には、ＩＬ−７は、白血球により不十分に浸潤される腫瘍またはＴ細胞アネルギーを誘導した腫瘍微小環境において、Ｔ細胞を活性化し、腫瘍抗原応答を誘導することができる。ヘテロ二量体ＩＬ−７受容体を通じたＩＬ−７シグナル伝達は、Ｔ細胞による腫瘍特異的抗原応答を増強することができるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）シグナル伝達を誘導する。エクソソームを操作してＴ細胞活性化を誘導することができるかどうかを決定するために、ＩＬ−７含有エクソソームを、ＩＬ−７とＰＤＧＦ受容体との融合物をコードするｐＤｉｓｐｌａｙ（商標）プラスミド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でのＨＥＫ２９３ＳＦ細胞のトランスフェクション及び選択によって生成した。操作されたエクソソームを、方法に記載されているように精製した。ＩＬ−７エクソソームの活性を検証するために、ヒトＰＢＭＣを、９６ウェルプレートに蒔き、精製されたＩＬ−７エクソソーム及び抗ＣＤ３抗体、天然エクソソーム及び抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体単独、または抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３抗体の組み合わせ、と共にインキュベートした。試料を、３７℃で２日間インキュベートし、ＩＦＮγについてアッセイした（図１３Ａ及び１３Ｂ）。抗ＣＤ３抗体と組み合わせたＩＬ−７エクソソームは、抗ＣＤ３単独よりも大きな程度でピークＩＦＮγ産生を誘導した（図１３Ａ）。加えて、ＩＬ−７エクソソームは、用量依存的様式で、かつＣＤ３及びＣＤ２８抗体の陽性対照に匹敵する程度で、ＩＦＮγを誘導した。対照的に、天然エクソソームは、ＩＦＮγ産生に効果がなかった（図１３Ｂ）。
【０２７５】
ＩＬ−７受容体は、ＩＬ−７Ｒ及びＩＬ−２ＲＧからなるヘテロ二量体複合体であり、ＩＬ−７の存在下で三元複合体を形成し、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を通じた下流シグナル伝達を誘導し、細胞増殖を生じる。合成細胞ベースのアッセイを使用して、ＩＬ−７受容体を通じたＩＬ−７シグナル伝達を測定して、操作されたＩＬ−７エクソソームの機能的活性を評価した（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（図１４Ａ）。組換えヒトＩＬ−７（ｒｈＩＬ−７）はＩＬ−７受容体を通じたシグナル伝達を増加させるのに十分であり（図１４Ｂ）、操作されたＩＬ−７エクソソームはＩＬ−７受容体を通じたシグナル伝達を誘導することができたが天然エクソソームはできなかった（図１４Ｃ）。これらのデータは、ＩＬ−７発現エクソソームがインビトロでＩＬ−７受容体を通じたシグナル伝達を誘導するのに十分であることを実証する。
【０２７６】
インビトロで観察されたＩＬ−７エクソソームの効果がインビボモデルで再現されることができるかどうかを決定するために、ＩＬ−７エクソソームをＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した。２０匹のマウスのコホートを、以下の群に分離した。（１）ＰＢＳ、（２）組換えヒトＩＬ−７（ｒｈＩＬ−７）、（３）ＩＬ−７操作エクソソーム、及び（４）未修飾天然エクソソーム。各群の５匹のマウスに、１ｍｇのＥｄＵ及びＰＢＳ、１×１０１１天然もしくはＩＬ−７エクソソーム、または１０μｇのｒｈＩＬ−７のいずれかを腹腔内（ＩＰ）に１日１回３日間注射した。マウスを犠牲にし、脾臓を単離し、フローサイトメトリーによって脾臓細胞内でＥｄＵレベルを測定した。図１５Ａに示されるように、パーセント陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照コホートと比較して、ＩＬ−７エクソソームマウス及びｒｈＩＬ−７マウスにおいて有意に増加した。ＩＬ−７エクソソームマウスにおけるＴ細胞計数はｒｈＩＬ−７コホートよりも低かったが、ＩＬ−７エクソソームコホートに投与されたＩＬ−７分子は５倍少なかったと推定される（データは示さず）。同様の傾向は、メモリマーカーＣＤ４５ＲＯのレベルを測定することによって、メモリＣＤ８＋Ｔ細胞について観察された（図１５ｂ）。
【０２７７】
直交アプローチとして、エクソソーム処理マウスから単離された脾臓細胞においてＣＤ７１（トランスフェリン受容体）のレベルを測定した。ＣＤ７１は、増殖のために必要であり、ＣＤ７１レベルはＴ細胞数と相関する。図１５Ａ及び１５Ｂに示されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びメモリＣＤ−８＋Ｔ細胞数は、図１６Ａ及び１６Ｂで観察されるのと同じ傾向に従った。合わせて、これらのデータは、操作されたエクソソームがインビボで特異的免疫細胞効果を誘導することができ、この活性化が組換えアゴニストと比較して分子当たりに基づきより強力であり得ることを実証する。
【０２７８】
実施例８：ＩＬ−７専有の足場への融合は特定の活性を増強する
ＩＬ−７操作エクソソームの活性を増強するために、ＩＬ−７配列を、ＨＥＫ２９３ＳＦエクソソームの表面上で高度に発現される新規のエクソソーム膜貫通タンパク質であるＰＴＧＦＲＮの切断部分に融合した。ＩＬ−７を、最Ｃ末端側のＩｇＶドメイン、膜貫通ドメイン、及びＰＴＧＦＲＮの細胞内ドメイン、同様にＦＬＡＧタグの前の領域を包含するＰＴＧＦＲＮの短い断片の上流の翻訳融合として発現させた。一連の発現構築物を、ＩＬ−７とＰＴＧＦＲＮとの間に一連の４つのアミノ酸欠失を導入することによって生成した（図１７ａ）。生じた構築物を、ｐＸ−１〜ｐＸ−４（図１７Ｂに示されるｐＸ−４完全配列）に番号付けした。抗ＩＬ−７抗体を用いたウエスタンブロット分析によって示されるように、構築物ｐＸ−３及びｐＸ−４は、最高レベルの発現を示した。ＰＴＧＦＲＮ骨格におけるＩＬ−７発現のレベルは、実施例７（図１８Ａ）で使用されたｐＤｉｓｐｌａｙ−ＩＬ−７よりも劇的に高かった。ＩＬ−７の増加した発現は、これらの新規融合タンパク質がはるかに高いレベルのＩＬ−７媒介性Ｔ細胞活性化を誘導できることを示唆した。ＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−７融合物の効力を決定するために、Ｔ細胞活性化のインビトロモデルを行った。Ｔ細胞のＩＬ−７媒介性活性化時に、ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）レベルは、２４時間以内に用量依存的に減少する（Ｇｈａｗａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｆｅｂ；９１（２）：１４９−５８）。したがって、様々なＩＬ−７操作エクソソームでＰＢＭＣをインキュベートした後、ＩＬ−７Ｒレベルをモニタリングした。図１８Ｂに示されるように、天然エクソソームはＩＬ−７Ｒレベルを低減させることができなかったが、ｐＤｉｓｐｌａｙ−ＩＬ−７エクソソーム（ＩＬ−７−ｐＤ）は、高用量でのみＩＬ−７Ｒレベルを低減させた。対照的に、ＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−７エクソソーム（ＩＬ−７−ｐＸ３〜ｐＸ４）は、はるかに低い用量でＩＬ−７Ｒレベルを完全に低減させ、これらの操作されたエクソソームの効力の増加を実証した。ＩＣ５０の尺度として、ＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−７エクソソームは、ＩＬ−７−ｐＤエクソソームよりも２０〜７６倍強力であり（表２）、増加したリガンド密度が生物学的効力を増加させるのに十分であることを実証した。さらに、これらの結果は、ＰＴＧＦＲＮの特異的切断が、エンジニアリング治療用エクソソームでの使用のための理想的な足場であり得ることを実証する。
【表８】
2021508691.tif 000004
【０２７９】
実施例９：抗ＣＤ３抗体断片で操作されたエクソソーム
前述の実施例に示されるように、エクソソームは、免疫調節タンパク質の機能的内因性配列を過剰発現するように操作されることができる。合成アゴニストをエクソソームの表面上で操作することができるかどうかを決定するために、抗ＣＤ−３抗体を、実施例４に記載のｐＤｉｓｐｌａｙ、またはＣＤ８０の膜貫通ドメインいずれかへの融合物として発現した。ヒトＰＢＭＣをウェル当たり１００，０００個の細胞で９６ウェルプレートに蒔き、抗ＣＤ３一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（図１９Ａ及び１９Ｂ）または一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）（図２０Ａ及び２０Ｂ）を発現するように操作されたエクソソームと共に一晩インキュベートした。陽性対照として、ＰＢＭＣを、製造業者のプロトコルに従ってＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）ＣＤ３／ＣＤ２８  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にインキュベートした。抗ＣＤ２８共刺激の存在下で、全ての操作されたエクソソームは陽性対照に匹敵するＴ細胞（図１９Ａ及び２０Ａ）及びＢ細胞（図１９Ｂ及び２０Ｂ）の活性化を誘導したが、操作されていないエクソソーム対照は誘導しなかった。抗ＣＤ３エクソソームの免疫細胞集団への効果を測定するために、フローサイトメトリーによってＣＤ６９陽性についてＴ細胞及びＢ細胞をアッセイした。図２１Ａに示されるように、ＣＤ８０膜貫通ドメインに融合した抗ＣＤ３ｓｃＦｖを発現するエクソソームと共にインキュベートしたＰＢＭＣは、Ｔ細胞の約４０％の活性化をもたらした。Ｂ細胞の活性化について同様の効果を観察した（図２１Ｂ）。
【０２８０】
抗ＣＤ−３エクソソーム媒介性Ｔ細胞活性化が直接Ｔ細胞活性化に起因するのか、またはトランス作用性免疫細胞を通じたものかどうかを決定するために、精製されたＴ細胞の活性化を測定した。１００，０００個の精製されたヒトＴ細胞を、抗ＣＤ２８抗体の存在下または非存在下で非標的抗体もしくは抗ＣＤ３エクソソームでプレコーティングしたウェル、または抗ＣＤ２８抗体の存在下もしくは非存在下で可溶性抗ＣＤ３エクソソームと共にインキュベートしたウェルに、９６ウェル形式で蒔いた。図２２Ａに示されるように、可溶性及びプレートコーティングされた抗ＣＤ３ｓｃＦｖエクソソームの両方は、ＣＤ６９発現によって測定された抗ＣＤ２８抗体の存在下でＴ細胞を活性化した。図２２Ｂに示されるように、抗ＣＤ２８抗体の存在下でのプレートコーティング抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ２８抗体の存在下でのプレートコーティング抗ＣＤ３ｓｃＦｖと同じ程度に活性化Ｔ細胞を活性化した。際立ったことに、抗ＣＤ２８抗体の存在下で可溶性抗ＣＤ３抗体はＴ細胞の約３０％を活性化するのに十分であったが、抗ＣＤ２８抗体の存在下で可溶性抗ＣＤ３ｓｃＦｖエクソソームはＴ細胞の有意により高い割合を活性化し、抗体断片を過剰発現するように操作されたエクソソームが可溶性抗体と比較してより高いレベルのＴ細胞活性化を誘導できることを実証した。合わせて、これらの結果は、エクソソームが特定の細胞型に対して機能的活性を有する抗体断片を過剰発現するよう操作されることができることを実証する。
【０２８１】
実施例１０：ＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームはインビトロ及びインビボで強力な免疫調節活性を有する。
ＩＬ−１２は、感染及び他の抗原刺激に応答して抗原提示細胞によって産生される強力な免疫刺激サイトカインである。活性化された樹状細胞、マクロファージ、及び好中球によるＩＬ−１２産生は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方によるＩＦＮγ産生を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞障害性効果を誘導する。腫瘍微小環境におけるＩＬ−１２分泌の複合的な影響は、ＩＦＮγを含むＴｈ１サイトカインの分泌を生じ、腫瘍細胞殺傷、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）のリプログラミング及び抗血管新生効果をもたらす。ＩＬ−１２媒介性抗腫瘍効果は、多数の動物モデルにおいて耐久性Ｔ細胞応答及び抗腫瘍免疫を生じる。ＩＬ−１２は、以前にヒトにおいて免疫療法剤として試験されたが、頑強なＩＦＮγ応答の検出可能な誘導にもかかわらず、腎細胞癌患者において有意な毒性を生じた（Ｌｅｏｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９７  Ｏｃｔ  １；９０（７）：２５４１−８）。したがって、エクソソームは、サイトカインの高い局所濃度及び推定された腫瘍保持薬理学に起因して、ＩＬ−１２にとって理想的な送達モダリティを表すことができる。
【０２８２】
ＩＬ−１２は、ｐ３５及びｐ４０の２つのドメインからなる。ヒトＩＬ−１２二量体を、全長ＰＴＧＦＲＮ（図２３Ａ、構築物８７１、配列番号３）または高密度表面表示を可能にするＰＴＧＦＲＮの短縮断片（図２３Ｂ、構築物８７３、配列番号５）いずれかへの融合タンパク質としてコードさせ、構築物をＨＥＫ２９３ＳＦ細胞内で安定して発現させた。安定した細胞株を化学的に定義された培地で成長させ、培養上清からのエクソソームを方法に記載されているようなＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配上で精製した。エクソソームの表面上のＩＬ−１２タンパク質の量を、ＥＬＩＳＡによって測定し、全ての機能的研究のためにｒＩＬ−１２に濃度一致させた。精製された全長及び短いｈＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームまたは組換えｈＩＬ−１２（ｒｈＩＬ−１２；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，カタログ番号５７３００４）を、ＩＦＮγ発現を誘導するために準最適濃度抗ＣＤ３抗体の存在下でヒトＰＢＭＣ中で滴定した。ｒｈＩＬ−１２は、全長ＩＬ１２−ＰＴＧＦＲＮに匹敵する０．０２９ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０で頑強なＩＦＮγ発現を生じ、いずれもＩＬ１２−短−ＰＴＧＦＲＮよりも約１０倍強力であった（図２４Ａ〜Ｂ）。これらの結果は、全長ＰＴＧＦＲＮ骨格上に表示されたＩＬ−１２が短いＰＴＧＦＲＮ構築物よりも強力な免疫調節試薬であり得ることを示唆する。
【０２８３】
マウス及びヒトＩＬ−１２タンパク質は交差反応せず、図２４に示されるインビトロデータは、全長ＰＴＧＦＲＮに融合したｍＩＬ−１２がＰＴＧＦＲＮの短い足場を使用するよりもより強力であることを示唆する。がんのインビボモデルにおけるｍＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮエクソソームの効力を決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞（群当たりｎ＝５マウス）を皮下移植した。腫瘍接種後５日目、６日目、及び７日目に、ＰＢＳ、０．２μｇの組換えマウスＩＬ−１２（ｍＩＬ１２；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，カタログ番号５７７００４）、または全長ＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮを表示する１×１０１１のエクソソーム（ｍＩＬ１２−エクソソーム、配列番号４）を動物に腫瘍内注射した。腫瘍体積が２，０００ｍｍ３に達すると、動物を犠牲にした。図２５〜２７に示されるように、ＰＢＳ群の腫瘍は急速に成長したが、ｒｍＩＬ１２及びｍＩＬ１２−Ｅｘｏ群の腫瘍は激減した（体積の約６５〜８０％低減）。重要なことに、１６日目までに、ｍＩＬ１２−Ｅｘｏ群の腫瘍はｒｍＩＬ１２群の腫瘍よりも小さく、可溶性サイトカインと比較してエクソソームの表面上に表示される際のＩＬ−１２の優れた有効性を実証した。ＰＢＳ処理群と比較して、ＩＬ−１２処理群にとっても生存利益があった（図２８）。
【０２８４】
ｒｍＩＬ１２よりもＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮ−エクソソームの機構的効果を理解するために、対照群及び処理群の腫瘍においてＴｈ１遺伝子発現をプロファイリングした。ＩＦＮγ（図２９Ａ）、Ｔ細胞化学誘引剤ＣＸＣＬ９（図２９Ｂ）及びＣＸＣＬ１０（図２９Ｃ）、ならびにＴＧＦβ（図２９Ｄ）は、対照群と比較してＩＬ−１２処理群において全て増加した。ほとんどの場合において、サイトカインシグナルは、ｒｍＩＬ−１２と比較してｍＩＬ１２−Ｅｘｏで処理された動物において高かった。脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγレベルをフローサイトメトリーによって測定し、Ｅｘｏ−ｍＩＬ−１２処理マウスは、ＰＢＳ群またはｒｍＩＬ−１２群のいずれかよりも有意に大きなシグナルを示した（図３０）。合わせて、これらのデータは、エクソソームの表面上に表示されるＩＬ−１２が、インビトロで頑強なＴ細胞活性化を促進する新規かつ強力な免疫調節戦略を表し、インビボでマウスメラノーマの侵襲的モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を誘発するために使用されることができることを実証する。機構的には、ＩＬ−１２エクソソームは、ｒＩＬ−１２よりも優位性を示し、したがって、がん免疫療法における新規の差別化された治療モダリティを表す。
【０２８５】
実施例１１：インターフェロンガンマ表示エクソソームは有力な免疫細胞活性化剤である
インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）は、先天性及び適応性免疫応答のプライミングに関与するサイトカインである。インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）は、ＩＬ−１２を含む多数のシグナルに応答して多様な細胞型から発現され、かつＮＫ細胞を活性化し、抗原提示細胞における抗原提示を促進し、白血球活性化及び浸潤を促進するのに十分である。ＩＦＮγは、ホモ二量体として天然に発現され、可溶性因子として分泌される。ＩＦＮγ発現エクソソームを、単量体または二量体のヒト及びマウスＩＦＮγに融合した全長ＰＴＧＦＲＮでＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を安定してトランスフェクトすることによって生成した（それぞれ、図３１Ａ及び３１Ｂ）。上述のように懸濁細胞培養物由来のエクソソームを精製し、ＰＡＧＥによって分析した。単量体（ｍ）及びタンデム二量体（ｔｄ）ＰＴＧＦＲＮ  ＩＦＮγエクソソームを、同等レベルで予測分子量（矢印）で発現させた（図３２）。精製されたエクソソームをＥＬＩＳＡによって分析し、組換えＩＦＮγ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号５７０２０６）を使用する標準曲線と比較して、エクソソーム当たりのＩＦＮγ分子の数を計算した。表９の結果は、精製されたエクソソームの４つの型の各々におけるＩＦＮγ分子の数を示す。特に、タンデム二量体ＩＦＮγ  ＰＴＧＦＲＮエクソソームは、単量体ＩＦＮγ  ＰＴＧＦＲＮエクソソームの少なくとも２倍のＩＦＮγ分子を含有し、タンデム二量体エクソソームが二量体ＩＦＮγ構築物を適切に発現していることを示唆する。
【表９】
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【０２８６】
ヒト単量体及びタンデム二量体ＰＴＧＦＲＮ−ＩＦＮγエクソソームを、増加する濃度でヒトＰＢＭＣと共に２４時間インキュベートした。ＩＦＮγシグナル伝達によって誘導された下流表面タンパク質であるＰＤ−Ｌ１発現によって単球活性化を測定した。図３３に示されるように、天然ＨＥＫ２９３ＳＦエクソソーム（ＷＴ）は、ＰＤ−Ｌ１発現を誘導することができなかったが、単量体及びタンデム二量体の両方のＩＦＮγ  ＰＴＧＦＲＮエクソソームは、タンデム二量体ＩＦＮγ  ＰＴＧＦＲＮエクソソームによるより大きな活性化と共に、用量依存的様式でＰＤ−Ｌ１を誘導した。エクソソーム媒介性ＰＤ−Ｌ１活性化は、ＬＰＳ誘導活性化に匹敵した（図３３）。これらのデータは、単量体または二量体形式のいずれかの可溶性サイトカインが、エクソソームの表面上で機能的に発現され、免疫細胞活性化を誘導することができることを実証する。免疫腫瘍学におけるＩＦＮγ発現エクソソームの使用は、腫瘍細胞に対するＮＫ及びＴ細胞応答の誘導に有用であり得る。
【０２８７】
実施例１２：ＩＬ−１５発現エクソソームはＮＫ細胞活性化を誘導する
インターロイキン１５（ＩＬ−１５）は、病原性感染後に単核細胞によって産生されるサイトカインである。ＩＬ−１５は、可溶性タンパク質として分泌されることができるか、またはＩＬ−１５Ｒαに結合した二量体膜固定タンパク質として提示されることができる。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞及びＴ細胞を活性化し、免疫腫瘍学及び他の免疫介入療法において潜在的な治療分子として関与する。ＩＬ−１５発現エクソソームを、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質に融合したＰＤＧＦＲ（ｐＤｉｓｐｌａｙ）の膜貫通ドメインをコードする発現プラスミドでＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を安定してトランスフェクトすることによって産生した（図３４）。上記の方法に記載されているように、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配超遠心分離によってエクソソームを精製した。精製されたエクソソームをヒトＰＢＭＣと共に２４時間インキュベートし、フローサイトメトリーによってＣＤ６９に対する陽性パーセントとしてＮＫ細胞活性化を測定した。ｐＤｉｓｐｌａｙ  ＩＬ−１５エクソソームのいずれも、ＰＢＭＣ培養物の細胞当たり最大１０５個のエクソソームの用量でＮＫ細胞活性化を誘導しなかった（図３５、エクソソーム構築物番号は図３４通り）。より高密度のＩＬ−１５表示がＮＫ細胞活性化を誘導するために必要であったかどうかを調査するために、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を全長ＰＴＧＦＲＮに融合したＩＬ−１５をコードする発現プラスミドで安定してトランスフェクトした。加えて、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を、全長ＰＴＧＦＲＮに融合したより強力なＩＬ−１５をコードする発現プラスミドで安定してトランスフェクトした（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９  Ｓｅｐ  １５；１８３（６）：３５９８−６０７に記載されるようなＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ、図３６Ａ）。抗ＰＴＧＦＲＮウエスタンブロッティングによって発現を確認した（図３６Ｂ）。組換えＩＬ−１５に正規化して（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号５７０３０２）、ＩＬ−１５レベルをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号Ｄ１５００）によって数量化した。ＩＬ−１５ＰＴＧＦＧＮエクソソームを２つの独立したＰＢＭＣ培養物に一晩添加し、濃度一致組換えＩＬ−１５と比較した。３つ全てのＩＬ−１５供給源は、ＣＤ６９に対して陽性であるＮＫ細胞の百分率によって測定されたように、用量依存的様式でＰＢＭＣにおけるＮＫ細胞活性化を誘導した。さらに、全ての構築物は、意味のある比較有効性を実証する両方のドナーにわたって互いに比較可能であった（図３７、エクソソーム構築物番号は図３６通り）。これらのデータは、ＩＬ−１５がエクソソームの表面上に能動的かつ強力に表示されることができることを実証するが、このことは、ＰＴＧＦＲＮによって与えられるもののような高い発現レベルを必要とする。
【０２８８】
実施例１３：ＰＴＧＦＲＮ足場上に抗ＣＤ−３抗体断片を表示するエクソソームはＴ細胞を活性化する
実施例９における結果は、抗ＣＤ３抗体断片を表示するエクソソームがＴ細胞を活性化できることを実証する。ＰＴＧＦＲＮ足場がこの活性を支持するかどうかを決定するために、抗ＣＤ３抗体断片（ＯＫＴ３バリアント）をＰＤＧＦＲ膜貫通領域（ｅｘｏＣＤ３−ＰＤ）、全長ＰＴＧＦＲＮ（ｅｘｏＣＤ３−長）、またはＰＴＧＦＲＮ断片（ｅｘｏＣＤ３−短）に融合し、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞内で安定して発現させた（図３８）。Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６（Ｐａｌｌ）を使用して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によってエクソソーム結合を確認した。ＣＤ３断片をＢＬＩプローブに結合させ（図３９、ｉｉ）、洗浄し（図３９、ｉｉｉ）、エクソソーム構築物を添加した（図３９、ｉｖ）。ＷＴ  ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞からのエクソソームはＢＬＩプローブに結合しなかったが、全ての操作された構築物は結合した。両方のＰＴＧＦＲＮ断片は、より大きな親和性でプローブに結合し、安定して結合し続けた（図３９、ｖ）。抗ＣＤ３表示エクソソームをインビトロ活性について試験した。フローサイトメトリーによって測定されたように、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９陽性によってＴ細胞活性化を測定した。未修飾天然エクソソーム（ｅｘｏＮａｔｉｖｅ）とは対照的に、ＰＴＧＦＲＮ断片に融合した抗ＣＤ３を有するエクソソーム（ｅｘｏＣＤ３−短）は、インビトロでＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するのに有効であった（図４０）。
【０２８９】
実施例１４：ＣＤ４０Ｌを表示するエクソソームはＢ細胞の強力な活性化剤である
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は、Ｂ細胞及び他の抗原提示細胞上で高度に発現される共刺激受容体ＣＤ４０に結合する腫瘍壊死スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）のリガンドである。ＴＮＦＳＦリガンド媒介性細胞活性化は、細胞表面上に形成し、同族受容体に結合する三量体リガンド複合体の形成を必要とする。ＣＤ４０Ｌの異なる立体構造をそれらの表面に表示するエクソソームがＢ細胞を活性化するのに十分であったかどうかを調査するために、４０超の異なるＣＤ４０Ｌ発現構築物を設計し、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞において個別にトランスフェクトした。ＰＤＧＦＲの膜貫通ドメイン、全長ＰＴＧＦＲＮ、及びＰＴＧＦＲＮの短い単一ドメイン断片との融合物として、ＣＤ４０Ｌを発現させた（図４１Ａ、下）。単量体（ｐＣＢ−５１８〜ｐＣＢ−５２６）または強制三量体（ｐＣＢ−６０７及びｐＣＢ−５２７）としてＣＤ４０Ｌ−ＧＦＰ  ＰＴＧＦＲＮ融合物を発現させた（図４１Ａ、下）。単量体ＣＤ４０Ｌの三量体形成を促進するために、ＴＲＡＦ２（ｐＣＢ−５２１〜ｐＣＢ−５２３）またはコラーゲンＸＶ（ｐＣＢ−５２４〜ｐＣＢ−５２６）からの多量体化ドメインへの融合物を発現する構築物を設計した。単量体ＣＤ４０Ｌ構築物のうち、ｐＣＢ−５１８／５２１／５２４は内因性ＣＤ４０Ｌからの全長Ｎ末端幹配列を含有し、ｐＣＢ−５１９／５２２／５２５は内因性ＣＤ４０Ｌからの切断Ｎ末端幹配列を含有し、ｐＣＢ−５２０／５２３／５２６はＣＤ４０Ｌの可溶性部分のみを含有した。操作されたエクソソーム集団の各々を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＢ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１５０６４）を使用してヒト末梢血から単離した精製されたＢ細胞と共にインキュベートし、Ｂ細胞活性化をフローサイトメトリーによってＢ細胞に対するＣＤ６９陽性によって測定した。構築物の各々のＥＣ５０は、細胞培養物の粒子濃度の関数として計算され、図４１（上）に示されるグラフにプロットされる。興味深いことに、単量体ＣＤ４０Ｌ構築物の全ては適度な効力を有したが、三量体構築物は単量体より少なくとも１０倍強力であった（図４１、上）。これらの結果は、単量体ＣＤ４０Ｌがエクソソーム表面上に提示された際にＢ細胞の不十分な活性化剤であることと、しかし強制三量体ＣＤ４０Ｌが頑強なＢ細胞活性化を誘導できることとを実証する。さらに、ＰＴＧＦＲＮは二量体構造を形成することが示されており（ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４８０２６）、標的結合及び免疫細胞活性化をさらに促進するために高次多量体構造がエクソソーム表面上に形成されることができることを示唆している。
【０２９０】
図４１に示される結果は、ＰＴＧＦＲＮのＣ末端に融合した管腔ＧＦＰを含有するエクソソームを全て採用した。タグなしＣＤ４０Ｌエクソソームを生成することを目標に、リード構築物ｐＣＢ−５２７と同じ三量体ＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ構築物を、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞（ｐＣＢ−７６６）において安定して発現させたが、Ｃ末端ＧＦＰを欠いた。ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号，ＤＣＤＬ４０）を使用して、以下の表１０に示されるように、操作されたエクソソームの表面上のＣＤ４０Ｌの絶対濃度を数量化した。
【表１０】
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【０２９１】
精製されたＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮエクソソームを、濃度一致組換えヒトＣＤ４０Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号５９１７０２）と比較して、上述のＢ細胞活性化アッセイにおいて試験した。ＧＦＰ含有及びタグなしＣＤ４０Ｌエクソソームは、粒子数またはＣＤ４０Ｌ濃度の関数として測定された場合、同等のＢ細胞活性化剤であり（図４２Ａ）、両方のエクソソーム調製物は濃度一致ＣＤ４０Ｌよりも強力であった（図４２Ｂ）。ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞からの天然の操作されていないエクソソームはＢ細胞を活性化することができず、エクソソーム表面上の操作されたＣＤ４０Ｌ三量体構築物がＢ細胞を強力に活性化するのに十分であったことを実証した。
【０２９２】
ＣＤ４０を作動させ、かつＢ細胞を活性化する代替的なモダリティは、二次抗体と架橋したアゴニスト抗体を使用することである。三量体ＣＤ４０Ｌ発現エクソソームの効力をアゴニストＣＤ４０Ｌ抗体と比較するために、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０Ｌ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（登録商標）；Ｃｌｏｎｅ  ５Ｃ３）と二次架橋抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，カタログ番号１１５−００６−０７１）と共にＰＢＭＣ培養物をインキュベートした。最大Ｂ細胞活性化は、図４３Ａ及び４３Ｂにおいて点線として示される。ｐＣＢ−５２７エクソソーム（ＰＴＧＦＲＮ三量体ＣＤ４０Ｌ−ＧＦＰ）は、２人の独立したドナーのＰＢＭＣプールにおいて架橋アゴニスト抗体よりも大きな最大Ｂ細胞活性化を誘導し（図４３Ａ及び４３Ｂ）、免疫細胞を活性化させることにおける三量体ＣＤ４０Ｌエクソソームの優位性を実証した。
【０２９３】
実施例１５：個々のエクソソーム上の複数の免疫腫瘍学分子の同時表示
前述の実施例は、個々の免疫調節タンパク質がエクソソームの表面上に表示されることができ、１つ以上の免疫細胞型における機能的変化を誘導することを実証する。ある特定の用途において、組み合わせて操作されたエクソソーム、すなわち、エクソソーム表面上に２つ以上の分子を含有するエクソソームの使用が必要とされることができ、各々は異なる免疫細胞経路をシグナル伝達することが可能である。ＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２及びＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ融合タンパク質の両方を発現するプラスミドでＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を安定してトランスフェクトした。エクソソームを単離し、上述のように精製した。未修飾ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞由来のエクソソームを、陰性対照として使用した。
【０２９４】
異なるリガンドの同時付加を実証するために、プルダウン共染色アッセイを開発した：
試薬：
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ，カタログ番号１０６０８Ｄ）：１ｘ１０７ビーズ／ｍＬ、５０％スラリー
単離緩衝液：０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ（２％ＢＳＡから１：４）
ブロック緩衝液：２％ＢＳＡ／ＰＢＳ（１ｇｒ／５０ｍＬ、濾過）
●０．５ｍｌのビーズを０．５ｍｌの単離緩衝液で洗浄し、０．５ｍＬ単離緩衝液に再懸濁させる
●１μｇのビオチン化捕捉抗体（０．５ｕｇ／ｕｌ原液の２．２ｕｌ）を添加する
●１時間回転、室温
●５００μｌ分離緩衝液で洗浄する
●５００μＬブロック緩衝液に再懸濁させる、１０分間の回転、室温
●５００μｌ単離緩衝液（１×１０７ビーズ／ｍＬ、５０％スラリー）中でインキュベートする
●４℃で保管する
Ａ．エクソソーム捕捉及びフロー
試料当たり１×１０５（１０μｌビーズ、２０μｌスラリー）
ビーズ当たり５０，０００個のエクソソーム、試料当たり５×１０９個のエクソソーム（１．２×１０９エクソソーム／μＬ原液）
フローのための５μＬの各蛍光標識検出抗体
５×１０９エクソソーム＋２０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓスラリー＋０．７ｍｌの０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを混合する
手順：
１．１２０μＬスラリービーズ、上清（ｓｕｐ）を取り除き、０．７ｍｌのブロック緩衝液を添加し、混合し、１０分間室温で回転させ、上清を除去する
２．０．７ｍｌ単離緩衝液＋２５．２μｌエクソソーム中にビーズを懸濁させ、４℃でＯＮを回転させる
３．翌日：エクソソーム及びビーズを素早く回す、５秒
４．マグネットにチューブを配置し、上清を除去する
５．７００μｌでブロックし、室温で１０分間回転させる
６．マグネットにチューブを配置し、上清を除去する
７．６００μｌ単離緩衝液に再懸濁させる：チューブ当たり６×１００μｌ
８．１μｌ標識検出抗体を添加し、混合し、３０分間４℃で暗所でインキュベートする
９．２分間５００ｇで回し、上清を除去する
１０．単離緩衝液で２回洗浄する
１１．２００μｌ単離緩衝液に再懸濁し、フローを実行。
【０２９５】
天然エクソソームを、抗ＣＤ４０Ｌ装飾ビーズで単離し、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌ（図４４Ａ）、または天然及び操作されたエクソソーム上に存在するエクソソームマーカーであるＣＤ８１及びＣＤ４０Ｌ（図４４Ｂ）に対する蛍光抗体で標識した。ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ８１について蛍光シグナルが検出されなかったため、ＣＤ４０Ｌビーズは、天然エクソソームのいずれもプルダウンしなかった。対照的に、ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２二重操作エクソソームを、抗ＣＤ４０Ｌビーズと共にインキュベートし、上記のように単離した。ＣＤ８１（図４５Ａ）、ＩＬ−１２またはＣＤ４０Ｌ（図４５Ｂ）についての染色は全て、操作されたエクソソーム（計数されたビーズの９７％超）で検出され、ＣＤ４０Ｌ媒介性単離がＩＬ−１２エクソソームを単離できることも示した。同様に、抗ＩＬ−１２装飾ビーズをＩＬ−１２／ＣＤ４０Ｌ操作エクソソームと共にインキュベートし、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、及びＣＤ８１について染色した。全てのビーズの９８％超は、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ−１２、またはＣＤ８１の両方について陽性であり（図４６Ａ及び４６Ｂ）、エクソソームがそれらの表面上にＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌの両方を含有することを実証した。
【０２９６】
インビトロでの効力について操作されたエクソソームを試験するために、ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ１１９５１７）によってＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌ濃度を数量化した。等濃度の組換えＩＬ−１２、組換えＣＤ４０Ｌと混合した組換えＩＬ−１２、ＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソーム、二重陽性ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ／ＩＬ−１２エクソソーム、またはＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２エクソソームとＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌエクソソームとの混合物を、増加濃度でヒトＰＢＭＣに添加した（ｒｈＩＬ−１２−ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，カタログ番号５７３００４、ｒｈＣＤ４０Ｌ−Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，カタログ番号５９１７０２）。細胞を抗ＣＤ３抗体で共刺激し、ＩＦＮγ産生を（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，カタログ番号ＡＬ２１７Ｃ）によって測定した。図４７Ａ及び４７Ｂに示されるように、全てのＩＬ−１２含有エクソソーム調製物は、組換えサイトカインに匹敵するＩＦＮγ応答を誘発した。様々な条件のＥＣ５０の計算は、エクソソーム関連ＩＬ−１２が、エクソソーム表面上で単独で発現されても組み合わせて発現されても、濃度一致ＩＬ−１２よりも強力であることが明らかにした（図４８）。Ｂ細胞活性化の文脈において、組換えＣＤ４０Ｌ及び単一または二重操作ＣＤ４０Ｌエクソソームで同様の結果を達成した（図４９Ａ及びＢ）。再び、ＣＤ４０Ｌ操作エクソソームは可溶性組換えサイトカインよりも強力であり、この場合、二重操作エクソソームはアッセイで試験された最も強力な構築物であった（図５０）。
【０２９７】
組み合わせ表面表示エクソソームの可能性をさらに探索するために、ＰＴＧＦＲＮ−ＩＬ−１２、ＰＴＧＦＲＮ−ＣＤ４０Ｌ、またはＰＴＧＦＲＮ−ＦＬＴ３Ｌ融合タンパク質のいずれかを発現する３つの独立した構築物でＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を安定してトランスフェクトした。エクソソームを、精製し、上述のアフィニティビーズ法により単離したが、抗ＦＬＴ３Ｌ−ＰＥ共役抗体を用いて表面ＦＬＴ３Ｌの存在についても調べた。抗ＩＬ−１２ビーズで単離されたエクソソームは、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌ（図５１Ａ）、ＩＬ−１２及びＦＬＴ３Ｌ（図５１Ｂ）、ならびにＣＤ４０Ｌ及びＦＬＴ３Ｌ（図５１Ｃ）に対して二重陽性であった。抗ＣＤ４０Ｌビーズで単離されたエクソソームは、ＩＬ−１２及びＣＤ４０Ｌ（図５２Ａ）、ＩＬ−１２及びＦＬＴ３Ｌ（図５２Ｂ）、ならびにＣＤ４０Ｌ及びＦＬＴ３Ｌ（図５２Ｃ）に対して二重陽性であり、個々のエクソソームが３つの免疫調節リガンドの各々を発現することを確認した。これらの結果は、多重操作された免疫調節エクソソームが実現可能な治療モダリティであることと、それらが免疫細胞活性化において可溶性サイトカインよりも同等またはより強力であることとを実証する。
＊＊＊
【０２９８】
前述の発明は、明確な理解のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されてきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更及び修正がそこになされ得ることは、本開示の教示に照らして当業者には容易に明らかである。
【０２９９】
したがって、前述は、本発明の原理を例示するにすぎない。当業者は、本明細書に明示的に説明されるかまたは示されることはないが、本発明の原理を具現化し、その精神及び範囲内に含まれる様々な配置を考案できることが理解されるであろう。さらに、本明細書に列挙される全ての実施例及び条件付き言語は、本発明の原理がかかる具体的に列挙される実施例及び条件に限定されないことを、読者が理解するのを支援するように、主に意図する。さらに、本発明の原理、態様、ならびに実施形態、同様にその具体例を列挙する本明細書の全ての記述は、その構造的及び機能的均等物の両方を包含することが意図される。加えて、かかる均等物は、構造に関係なく、現在既知の均等物及び将来開発される均等物、すなわち、同じ機能を実行するように開発された任意の要素の両方を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示されかつ記載される例示的な実施形態に限定されることが意図されない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化されている。
配列リスト
＞配列番号１
【化１】
2021508691.tif 000007
＞配列番号２
【化２】
2021508691.tif 000008
＞ｈＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮ、８７１（配列番号３）
【化３】
2021508691.tif 000009
＞ｍＩＬ−１２−ＰＴＧＦＲＮ、８７２（配列番号４）
【化４】
2021508691.tif 000010
＞ｈＩＬ−１２−短ＰＴＧＦＲＮ、８７３（配列番号５）
【化５】
2021508691.tif 000011
＞ｍＩＬ−１２−短ＰＴＧＦＲＮ、８７４（配列番号６）
【化６】
2021508691.tif 000012
配列番号７  ＰＴＧＦＲＮ＿ＩＦＮ＿ガンマ単量体
【化７】
2021508691.tif 000013
配列番号８  ＰＴＧＦＲＮ＿ＩＦＮ＿ガンマ二量体
【化８】
2021508691.tif 000014
配列番号９  ＰＴＧＦＲＮ＿ＩＦＮ＿ガンママウス単量体
【化９】
2021508691.tif 000015
配列番号１０  ＰＴＧＦＲＮ＿ＩＦＮ＿ガンママウス二量体
【化１０】
2021508691.tif 000016
配列番号１１  ＩＬ−１５  ４４１
【化１１】
2021508691.tif 000017
配列番号１２  ＩＬ−１５  ４４２
【化１２】
2021508691.tif 000018
配列番号１３  ＩＬ−１５  ４４３
【化１３】
2021508691.tif 000019
配列番号１４  ＩＬ−１５  ４４４
【化１４】
2021508691.tif 000020
配列番号１５  ＩＬ−１５  １００９
【化１５】
2021508691.tif 000021
配列番号１６  ＩＬ−１５  １０１０
【化１６】
2021508691.tif 000022
配列番号１７  ｐＤｉｓｐｌａｙ−抗ＣＤ３
【化１７】
2021508691.tif 000023
配列番号１８  ＰＴＧＦＲＮ−抗ＣＤ３
【化１８】
2021508691.tif 000024
配列番号１９  ＰＴＧＦＲＮ＿ＣＤ４０Ｌ三量体マウス
【化１９】
2021508691.tif 000025
配列番号２０  ＰＴＧＦＲＮ＿ＣＤ４０Ｌ三量体ヒト
【化２０】
2021508691.tif 000026
配列番号２１  ＰＴＧＦＲＮ＿短−抗ＣＤ３
【化２１】
2021508691.tif 000027
配列番号２２  ＦＬＴ３Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ
【化２２】
2021508691.tif 000028
表
【表１】
2021508691.tif 000029
【表２−１】
2021508691.tif 000030
【表２−２】
2021508691.tif 000031
【表２−３】
2021508691.tif 000032
【表２−４】
2021508691.tif 000033
【表２−５】
2021508691.tif 000034
【表２−６】
2021508691.tif 000035
【表２−７】
2021508691.tif 000036
【表２−８】
2021508691.tif 000037
【表２−９】
2021508691.tif 000038
【表２−１０】
2021508691.tif 000039
【表２−１１】
2021508691.tif 000040
【表２−１２】
2021508691.tif 000041
【表２−１３】
2021508691.tif 000042
【表２−１４】
2021508691.tif 000043
【表２−１５】
2021508691.tif 000044
【表２−１６】
2021508691.tif 000045
【表２−１７】
2021508691.tif 000046
【表２−１８】
2021508691.tif 000047
【表２−１９】
2021508691.tif 000048
【表３−１】
2021508691.tif 000049
【表３−２】
2021508691.tif 000050
【表３−３】
2021508691.tif 000051
【表３−４】
2021508691.tif 000052
【表３−５】
2021508691.tif 000053
【表３−６】
2021508691.tif 000054
【表３−７】
2021508691.tif 000055
【表４−１】
2021508691.tif 000056
【表４−２】
2021508691.tif 000057
【表５−１】
2021508691.tif 000058
【表５−２】
2021508691.tif 000059
【表５−３】
2021508691.tif 000060
【図１】
2021508691.tif 000061
【図２】
2021508691.tif 000062
【図３】
2021508691.tif 000063
【図４】
2021508691.tif 000064
【図５】
2021508691.tif 000065
【図６】
2021508691.tif 000066
【図７】
2021508691.tif 000067
【図８】
2021508691.tif 000068
【図９】
2021508691.tif 000069
【図１０】
2021508691.tif 000070
【図１１】
2021508691.tif 000071
【図１２】
2021508691.tif 000072
【図１３】
2021508691.tif 000073
【図１４】
2021508691.tif 000074
【図１５】
2021508691.tif 000075
【図１６】
2021508691.tif 000076
【図１７】
2021508691.tif 000077
【図１８Ａ】
2021508691.tif 000078
【図１８Ｂ】
2021508691.tif 000079
【図１９】
2021508691.tif 000080
【図２０】
2021508691.tif 000081
【図２１】
2021508691.tif 000082
【図２２】
2021508691.tif 000083
【図２３】
2021508691.tif 000084
【図２４】
2021508691.tif 000085
【図２５】
2021508691.tif 000086
【図２６】
2021508691.tif 000087
【図２７】
2021508691.tif 000088
【図２８】
2021508691.tif 000089
【図２９】
2021508691.tif 000090
【図３０】
2021508691.tif 000091
【図３１】
2021508691.tif 000092
【図３２】
2021508691.tif 000093
【図３３】
2021508691.tif 000094
【図３４】
2021508691.tif 000095
【図３５】
2021508691.tif 000096
【図３６】
2021508691.tif 000097
【図３７】
2021508691.tif 000098
【図３８】
2021508691.tif 000099
【図３９】
2021508691.tif 000100
【図４０】
2021508691.tif 000101
【図４１】
2021508691.tif 000102
【図４２】
2021508691.tif 000103
【図４３】
2021508691.tif 000104
【図４４】
2021508691.tif 000105
【図４５】
2021508691.tif 000106
【図４６】
2021508691.tif 000107
【図４７】
2021508691.tif 000108
【図４８】
2021508691.tif 000109
【図４９】
2021508691.tif 000110
【図５０】
2021508691.tif 000111
【図５１】
2021508691.tif 000112
【図５２】
2021508691.tif 000113
【配列表】
2021508691000001.app
【国際調査報告】
2021508691.tif 000114
2021508691.tif 000115
2021508691.tif 000116