(57)【要約】  可溶性白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）ポリペプチド、可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む可溶性融合タンパク質および二量体が提供される。可溶性ポリペプチドは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合する。特定の態様では、可溶性ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドと比較して、ＬＩＦに対して増加された結合親和性を示す。そのような可溶性ポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含む発現ベクター、ならびにそのような核酸および／または発現ベクターを含む細胞もまた提供される。必要とする個体（例えば、がんを治療するため）においてＬＩＦ活性を阻害する方法を含む、可溶性ポリペプチドを使用する方法もまた提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）ポリペプチドであって、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性であるアミノ酸配列を含み、前記ＬＩＦＲポリペプチドが、対応する野生型ＬＩＦＲポリペプチドと比較して、白血病抑制因子（ＬＩＦ）に対して増加された結合親和性を示す、可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項２】
Ｌ２１８位のアミノ酸置換、および
Ｎ２７７位のアミノ酸置換
の一方または両方を含み、
ここで位置の識別は、配列番号２に対するものである、
請求項１に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項３】
Ｌ２１８Ｐアミノ酸置換、および
Ｎ２７７Ｄアミノ酸置換
の一方または両方を含む、請求項２に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項４】
Ｉ２５７位のアミノ酸置換、
Ｖ２６２位のアミノ酸置換、および
Ｔ２７３位のアミノ酸置換
のうちの１つ、２つ、または各々を含み、
ここで位置の識別は、配列番号２に対するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項５】
Ｉ２５７Ｖアミノ酸置換、
Ｖ２６２Ａアミノ酸置換、および
Ｔ２７３Ｉアミノ酸置換
のうちの１つ、２つ、または各々を含む、請求項４に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項６】
Ｉ２１７位のアミノ酸置換、
Ｈ２４０位のアミノ酸置換、および
Ｉ２６０位のアミノ酸置換
のうちの１つ、２つ、または各々を含み、
ここで位置の識別は、配列番号２に対するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項７】
Ｉ２１７Ｖアミノ酸置換、
Ｈ２４０Ｒアミノ酸置換、および
Ｉ２６０Ｖアミノ酸置換
のうちの１つ、２つ、または各々を含む、請求項６に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項８】
Ｎ２４２位のアミノ酸置換を含み、前記位置の識別は、配列番号２に対するものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項９】
Ｎ２４２Ｄアミノ酸置換を含む、請求項８に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性であるか、または少なくとも９５％の同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１２】
前記可溶性ＬＩＦＲポリペプチドが、１つ以上の異種ポリペプチドに融合されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１３】
前記１つ以上の異種ポリペプチドが、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモ−アミノ酸ポリマー、プロリン−アラニン−セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される異種ポリペプチドを含む、請求項１２に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１４】
前記１つ以上の異種ポリペプチドが、Ｆｃドメインを含む、請求項１３に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１５】
前記１つ以上の異種ポリペプチドが、請求項２７〜３８のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１６】
前記可溶性ＬＩＦＲポリペプチドおよび可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドが、リンカーを介して融合されている、請求項１５に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１７】
前記リンカーが、ＧｌｙＳｅｒリンカーを含む、請求項１６に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＧｌｙＳｅｒリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーを含む、請求項１７に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドと二量体化されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項２０】
各可溶性ＬＩＦＲポリペプチドがＦｃドメインを含み、二量体化が前記Ｆｃドメインを介している、請求項１９に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、
請求項２１に記載の核酸、
請求項２２に記載の発現ベクター、または
それらの任意の組み合わせ
を含む、細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドを産生する方法であって、
細胞が前記ＬＩＦＲポリペプチドを産生する条件下で、請求項２２に記載の発現ベクターを含む前記細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２５】
前記細胞を培養する前に、前記細胞に前記発現ベクターを導入することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞を培養した後に、前記細胞から前記ＬＩＦＲポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ポリペプチドであって、配列番号４に対して少なくとも７０％の同一性であるアミノ酸配列を含み、前記ｇｐ１３０ポリペプチドが、対応する野生型ｇｐ１３０ポリペプチドと比較して、白血病抑制因子（ＬＩＦ）に対して増加された結合親和性を示す、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項２８】
Ｋ４５位のアミノ酸置換を含み、ここで前記位置の識別は、配列番号４に対するものである、請求項２７に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項２９】
Ｋ４５Ｅアミノ酸置換を含む、請求項２８に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３０】
Ｙ９５位のアミノ酸置換、および
Ｋ１８４位のアミノ酸置換
のうちの一方または両方を含み、
ここで位置の識別は、配列番号４に対するものである、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３１】
Ｙ９５Ｄアミノ酸置換、および
Ｋ１８４Ｅアミノ酸置換
のうちの一方または両方を含む、請求項３０に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３２】
Ｆ４６位のアミノ酸置換、および
Ｉ１３０位のアミノ酸置換、のうちの一方または両方を含み、
ここで位置の識別は、配列番号４に対するものである、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３３】
Ｆ４６Ｌアミノ酸置換、および
Ｉ１３０Ｍアミノ酸置換
のうちの一方または両方を含む、請求項３２に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性であるか、または少なくとも９５％の同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３６】
前記可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドが、１つ以上の異種ポリペプチドに融合されている、請求項２７〜３５のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３７】
前記１つ以上の異種ポリペプチドが、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモ−アミノ酸ポリマー、プロリン−アラニン−セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される異種ポリペプチドを含む、請求項３６に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３８】
前記１つ以上の異種ポリペプチドが、Ｆｃドメインを含む、請求項３７に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項３９】
前記１つ以上の異種ポリペプチドが、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドを含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項４０】
前記可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよび可溶性ＬＩＦＲポリペプチドが、リンカーを介して融合されている、請求項３９に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項４１】
前記リンカーが、ＧｌｙＳｅｒリンカーを含む、請求項４０に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項４２】
前記ＧｌｙＳｅｒリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーを含む、請求項４１に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項４３】
請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドと二量体化されている、請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項４４】
各可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドがＦｃドメインを含み、二量体化が前記Ｆｃドメインを介している、請求項４３に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項４５】
請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４６】
請求項４５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４７】
請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、
請求項４５に記載の核酸、
請求項４６に記載の発現ベクター、または
それらの任意の組み合わせ
を含む、細胞。
【請求項４８】
請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを産生する方法であって、
細胞が前記可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを産生する条件下で、請求項４６に記載の発現ベクターを含む前記細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４９】
前記細胞を培養する前に、前記細胞に前記発現ベクターを導入することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞を培養した後に、前記細胞から前記可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを精製することをさらに含む、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項２７〜３８のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドと二量体化された、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドを含む、ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５２】
前記可溶性ＬＩＦＲポリペプチドおよび前記可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドがそれぞれ二量体化ドメインを含み、前記二量体化ドメインを介して前記可溶性ＬＩＦＲポリペプチドおよび前記可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドが二量体化される、請求項５１に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５３】
前記二量体化ドメインが、Ｆｃドメインを含む、請求項５２に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項５４】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合し、配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性であるアミノ酸配列を含む、可溶性白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項５５】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合し、配列番号４に対して少なくとも７０％の同一性であるアミノ酸配列を含む、可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項５６】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合し配列番号４に対して少なくとも７０％の同一性であるアミノ酸配列を含む可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ポリペプチドと二量体化された、白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合し配列番号２に対して少なくとも７０％の同一性であるアミノ酸配列を含む可溶性白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項５７】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項５８】
請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項５９】
請求項５１〜５３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体タンパク質と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項６０】
治療有効量の請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の医薬組成物を、必要とする個体に投与することを含む、方法。
【請求項６１】
必要とする前記個体が、がんを有する個体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記がんが、膵臓がんである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の医薬組成物と、
必要とする個体に前記医薬組成物を投与するための説明書と
を含む、キット。
【請求項６４】
前記医薬組成物が、１つ以上の単位剤形で存在する、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
前記医薬組成物が、２つ以上の単位剤形で存在する、請求項６３に記載のキット。
【請求項６６】
必要とする前記個体が、がんを有する個体である、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６７】
前記がんが、膵臓がんである、請求項６６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７０１，３９９号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）は、ＩＬ−６スーパーファミリーに属する多機能サイトカインである。Ｉｌ−６スーパーファミリーの他のメンバーとしては、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、およびカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）が挙げられる。ＬＩＦ遺伝子は、ヒトとマウスとの間で高度に保存されている（約７５％）。ＬＩＦタンパク質は、グリコシル化によって修飾されることが多い単量体タンパク質である。グリコシル化されていないＬＩＦタンパク質の分子量は、２０〜２５ｋＤａであり、一方、グリコシル化タンパク質の分子量は、３７〜６３ｋＤａの範囲である。
【０００３】
ＬＩＦは、自己分泌様式および傍分泌様式の両方により機能する。ＬＩＦは、その特異的な受容体（白血病抑制因子受容体−ＬＩＦＲ）に結合し、次いで、糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）を動員して、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を含む下流のシグナル経路の活性化を誘導する高親和性受容体複合体を形成する（図１）。
【０００４】
ＬＩＦは、腫瘍の発生および進行において、何らかの役割を果たす。白血球細胞の成長を阻害する際のその役割とは対照的に、ＬＩＦは、多くの種類の固形腫瘍の発生および進行を促進することが多い。ＬＩＦの過剰発現は、培養されたヒトがん細胞の増殖を促進し、様々なヒト腫瘍細胞によって形成される異種移植腫瘍の成長を増加させる。加えて、ＬＩＦは、腫瘍細胞の移動および浸潤性を高め、乳がんおよび横紋筋肉腫の転移を促進する。低酸素症は、固形腫瘍におけるＬＩＦの過剰発現に重要な役割を果たす。ＩＬ−６およびＩＬ−１βなどのサイトカインも、ＬＩＦ発現を誘導することができる。
【０００５】
加えて、ＬＩＦは、膵臓がんにおいて注目され始めている因子である。最近の研究は、遺伝子操作によるまたは抗体阻害を介してかのいずれかで膵臓がんモデルにおけるＬＩＦの阻害が、マウスの寿命を改善し、腫瘍量を減らし、発がんイニシエーションを制限することを示す。最も致命的ながんの１つであるにもかかわらず、膵臓がんの治療選択肢は不足している。ＬＩＦを阻害する現在の方法は、抗ＬＩＦ抗体を採用する。しかしながら、抗体は、ＬＩＦの１つの特異的な面を標的とすることのみができるため、受容体結合と完全には競合することができない。さらに、ＬＩＦとその受容体との間の内因性相互作用の親和性は非常に高く（約５０〜１００ｐＭ）、抗体のみを使用して真に競合するには困難なレベルの親和性である。したがって、ＬＩＦを標的とし、ＬＩＦの活性／シグナル伝達を阻害する改善された方式が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
可溶性白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）ポリペプチド、可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む可溶性融合タンパク質および二量体が提供される。可溶性ポリペプチドは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合する。特定の態様では、可溶性ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドと比較して、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を示す。そのような可溶性ポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含む発現ベクター、ならびにそのような核酸および／または発現ベクターを含む細胞もまた提供される。ＬＩＦ活性の阻害を必要とする個体（例えば、がんを治療するため）においてＬＩＦ活性を阻害する方法を含む、可溶性ポリペプチドを使用する方法もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＬＩＦＲとｇｐ１３０を介したＬＩＦシグナル伝達の概略図。
【図２】本開示の一実施形態による、可溶性ポリペプチドの二量体を使用するＬＩＦ活性の阻害の概略図。
【図３】パネルＡ：複数のソーティングから単離されたＬＩＦＲ  Ｉｇ様ドメインバリアントで観察されたコンセンサス突然変異。パネルＢ：低い（１０ｐＭ、１００ｐＭ）ＬＩＦ濃度での正規化された合計蛍光結合値から計算されるＬＩＦＲバリアントの結合スコア。すべてのスコアは、野生型に対して、酵母表面での差次的発現について正規化された。
【図４】パネルＡ：部位特異的突然変異誘発を使用して生成されたＬＩＦＲバリアントのまとめ。パネルＢ：ＬＩＦＲバリアントの結合スコア。野生型（ＷＴ）に対して正規化された発現も示される。
【図５】ヒトＬＩＦＲ（青色）に結合するヒトＬＩＦ（桃色）のＰｙＭＯＬモデル化構造において示される、図４のパネルＡからのコンセンサス突然変異。突然変異は赤色で示され、ＰｙＭＯＬを使用して導入される。ループ１、２および３における突然変異のクラスターは、挿入図で拡大されている。
【図６】パネルＡ：複数のソーティングから単離されたｇｐ１３０  ＣＢＭドメインバリアントで観察されたコンセンサス突然変異。パネルＢ：部位特異的突然変異誘発を使用して生成された変異体ｇｐ１３０バリアントのまとめ。パネルＣ：ｇｐ１３０バリアントの結合スコア。野生型（ＷＴ）に対して正規化された発現も示される。
【図７】ｇｐ１３０  ＥＬＤＭＥ構造におけるコンセンサス突然変異。ヒトｇｐ１３０（桃色）に結合するヒトＬＩＦ（青色）の解析された構造において示される、図６のパネルＡからのコンセンサス突然変異の選択。ＰｙＭＯＬを使用して挿入された突然変異は、青緑色で示される。ゾーン１および２における突然変異のクラスターは、挿入図で拡大されている。
【図８】ヒトＬＩＦに対する、酵母ディスプレイされたＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤおよびｇｐ１３０  ＥＬＤＭＥの結合。パネルＡ：ヒトＬＩＦに結合する、ＬＩＦＲ野生型（ＷＴ）（丸）、「ＰＤＤ」バリアント（Ｌ２１８Ｐ−Ｎ４２Ｄ−Ｎ２７７Ｄ）（四角）、およびＶＰＲＶＶＡＩＤバリアント（図４のパネルＡの突然変異）（三角）。ＶＰＲＶＶＡＩＤバリアントのＫＤは、３０ｐＭで測定され、これは野生型（ＷＴ）と比較して３２倍高い親和性である。パネルＢ：ヒトＬＩＦに結合する、ｇｐ１３０野生型（ＷＴ）（丸）、「８Ｍ」バリアント（Ｅ４Ｋ−Ｋ５Ｒ−Ｎ１４Ｄ−Ｋ４５Ｅ−Ｆ４６Ｌ−Ｋ８３Ｒ−Ｙ９５Ｄ−Ｎ１００Ｓ）（四角）、およびＥＬＤＭＥバリアント（図４のパネルＡの突然変異）（三角）。ＥＬＤＭＥバリアントのＫＤは、５ｎＭで測定され、これは野生型（ＷＴ）と比較して１２倍高い親和性である。
【図９】本開示のホモ二量体およびヘテロ二量体の可溶性ＬＩＦＲおよび／またはｇｐ１３０融合構築物の例の概略図（パネルＣ〜Ｆ）。パネルＡ：ｇｐ１３０結合面を標的とする抗ＬＩＦモノクローナル抗体「Ｇ１」。パネルＢ：ＬＩＦＲ結合面を標的とする抗ＬＩＦモノクローナル抗体「Ｌ１」。パネルＣ：ｇｐ１３０  ＣＢＭドメイン（ＥＬＤＭＥ）Ｆｃ融合体。パネルＤ：ＬＩＦＲ  ＣＢＭＩ−Ｉｇ様ＣＢＭＩＩドメイン（ＶＰＲＶＶＡＩＤ）Ｆｃ融合体。パネルＥ：ＬＩＦＲ  ＣＢＭＩ−Ｉｇ様ＣＢＭＩＩドメイン（ＶＰＲＶＶＡＩＤ）−ｇｐ１３０  ＣＢＭドメイン（ＥＬＤＭＥ）Ｆｃ融合体。これはホモ二量体であり、５ｘ  Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーを使用して融合されたＬＩＦＲおよびｇｐ１３０を有する。パネルＦ：ＬＩＦＲ  ＣＢＭＩ−Ｉｇ様ＣＢＭＩＩドメイン（ＶＰＲＶＶＡＩＤ）−ｇｐ１３０  ＣＢＭドメイン（ＥＬＤＭＥ）ヘテロ二量体Ｆｃ融合体。このバリアントは、Ｆｃの一方のアームにＬＩＦＲを有し、Ｆｃの他方のアームにｇｐ１３０を有する。すべてのバリアントは、首尾良く発現され、精製された。
【図１０】精製されたＬＩＦ阻害剤の結合。ＫｉｎＥｘＡを使用して測定される、可溶性ヒトＬＩＦに結合するＬＩＦＲ  ＣＢＭＩ−Ｉｇ様ＣＢＭＩＩ野生型Ｆｃ融合体（丸）、ＬＩＦＲ  ＣＢＭＩ−Ｉｇ様ＣＢＭＩＩ（ＶＰＲＶＶＡＩＤ）Ｆｃ融合体（三角）、およびＬＩＦＲ  ＣＢＭＩ−Ｉｇ様ＣＢＭＩＩ（ＶＰＲＶＶＡＩＤ）−ｇｐ１３０  ＣＢＭ（ＥＬＤＭＥ）Ｆｃ融合体（ひし形）。ＫＤ値は、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアによってから計算され、近似曲線が示される。
【図１１】ホモ二量体ＬＩＦ阻害剤は、一度に複数のＬＩＦに結合する。パネルＡ：複数ＬＩＦの結合アッセイの概略図。ＬＩＦが酵母表面上に提示される。阻害剤は、飽和濃度でインキュベートされ、過剰分は洗い流される。次に、ＬＩＦ−Ｈｉｓを、１０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で阻害剤結合酵母と共に培養する。結合は、ＬＩＦのＨｉｓ−タグドメインを介して検出され、これは阻害剤が一度に複数のＬＩＦに結合することができ、「ブリッジ」として作用する場合にのみ存在するはずである。パネルＢ：複数ＬＩＦの結合実験からの結果。ＬＩＦが酵母上に提示され、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０融合体−Ｆｃ、または抗ＬＩＦ  ｍＡｂであるＬ１が、提示されたＬＩＦ−Ｈｉｓと可溶性ＬＩＦ−Ｈｉｓとの間の結合ブリッジとして使用された。各条件での抗Ｈｉｓ蛍光抗体からの蛍光発光が、ＬＩＦ−Ｈｉｓを添加していない対照に対して正規化された。
【図１２】競合体の存在下でＬＩＦに結合するとき、組換え阻害剤は、ＷＴと比較して改善されたオフレートを示す。パネルＡ：競合ＬＩＦ結合アッセイの概略図。ＬＩＦが酵母表面上に提示される。阻害剤は、飽和濃度でインキュベートされ、過剰分は洗い流される。次に、ＬＩＦ−Ｈｉｓを、１０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で阻害剤結合酵母と共に培養する。結合は、阻害剤Ｆｃ融合体のＦｃドメインを介して検出され、これは、高濃度の可溶性ＬＩＦ−Ｈｉｓによって、酵母提示されたＬＩＦから競合的に離される。パネルＢ：競合ＬＩＦ結合実験からの結果。ＬＩＦが酵母上に提示され、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０融合体−Ｆｃ、または抗ＬＩＦ  ｍＡｂであるＬ１が結合パートナーとして添加された。過剰な阻害剤を洗い流し、可溶性ＬＩＦを競合体として２４時間添加した。各条件での抗Ｆｃ蛍光抗体からの蛍光発光は、過剰な阻害剤が除去されず可溶性ＬＩＦが添加されていない対照に対して正規化された。
【図１３】ＬＩＦ阻害剤は、ＬＩＦに同時に結合する。パネルＡ：同時結合アッセイの概略図。ｇｐ１３０（示される）およびＬＩＦＲが酵母表面上に提示される。ＬＩＦは、飽和濃度でインキュベートされ、過剰分は洗い流される。次いで、阻害剤（ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃが示される）を、ＬＩＦ結合酵母と共培養する。結合は、阻害剤のＦｃドメインを介して検出され、これは、ＬＩＦを「ブリッジ」として使用して同時の受容体結合が起こる場合にのみ存在するはずである。パネルＢ：同時結合実験からの結果。ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０のいずれかが酵母上に提示され、ヒトＬＩＦが結合ブリッジとして使用された。蛍光発光は、ＬＩＦを添加していない対照に対して正規化された、抗Ｆｃ蛍光抗体の読み取り値である。ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ、ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロ二量体Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ホモ二量体融合体−Ｆｃ、抗ＬＩＦ  ｍＡｂ  Ｌ１、および抗ＬＩＦ  ｍＡｂ  Ｇ１の同時結合が示される。
【図１４】ＬＩＦ阻害剤は、競合して野生型受容体からＬＩＦを分離させる。パネルＡ：競合結合アッセイの概略図。野生型ｇｐ１３０またはＬＩＦＲ（示される）が酵母表面上に提示される。ヒトＬＩＦ−Ｈｉｓが飽和濃度でインキュベートされる。次いで、阻害剤（ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃが示される）を、過剰量で、ＬＩＦ結合酵母と共培養する。ＬＩＦ結合は、ＬＩＦ上のＨｉｓ６−タグを介して検出される。阻害剤インキュベーション後に結合したままのＬＩＦが少ないほど、阻害剤はよく競合してＷＴ受容体からＬＩＦを分離させることができている。パネルＢ：競合結合実験からの結果。野生型ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０のいずれかが酵母上に提示され、ヒトＬＩＦ−Ｈｉｓで飽和された。結合した比率は、阻害剤無添加に対して正規化された、ＬＩＦ−Ｈｉｓから検出された蛍光発光である。ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃ、ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ−Ｆｃ（組換え）、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ（組換え）、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０融合体−Ｆｃ（組換え）、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロ二量体Ｆｃ（組換え）、抗ＬＩＦ  ｍＡｂ  Ｌ１、および抗ＬＩＦ  ｍＡｂ  Ｇ１の競合結合が示される。
【図１５】組換え阻害剤は、ＨｅＬａルシフェラーゼレポーター細胞における下流ＳＴＡＴ３シグナル伝達をブロックする。パネルＡ：ＨｅＬａレポーター細胞におけるＬＩＦシグナル伝達の概略図。ＬＩＦは、ＬＩＦＲとｇｐ１３０の二量体化を促進し、ＳＴＡＴ３のリン酸化、下流のシグナル伝達の活性化、および最終的なＳＴＡＴ３応答エレメント制御下でのルシフェラーゼの産生を引き起こす。パネルＢ：異なる濃度のＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤ  Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０融合体組換えＦｃ、およびＬＩＦＲ  ＷＴ  Ｆｃによる、ＬＩＦ由来ルシフェラーゼ活性の阻害。パネルＣ：ＬＩＦＲ  Ｆｃまたは融合体Ｆｃの遅延添加時のＬＩＦ由来ルシフェラーゼシグナル。パネルＤ：何桁にもわたる［阻害剤］におけるＬＩＦ由来ルシフェラーゼ活性の阻害。ＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤ  Ｆｃ  ＩＣ５０＝３５ｐＭ、ＬＩＦＲ  ＷＴ  Ｆｃに対して５３倍の改善。パネルＥ：イラスト図−ＩＬ−６ファミリーメンバーのＬＩＦおよびＯＳＭに結合するＬＩＦＲ。グラフ−ＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤ  ＦｃまたはＬＩＦＲ  ＷＴ  Ｆｃと共にインキュベートされた、ＬＩＦまたはＯＳＭに由来するルシフェラーゼシグナルの測定値。
【図１６】ＬＩＦ阻害剤は、膵臓がん細胞におけるＬＩＦシグナル伝達を除去する。パネルＡ：ＬＩＦシグナル伝達の概略図。ＬＩＦは、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０に結合し、受容体のヘテロ二量体化を引き起こす。二量体化によって、ＪＡＫが動員され、チロシン７０５上のＳＴＡＴ３をリン酸化する。これにより、ＳＴＡＴ３の二量体化、核への侵入、および転写プログラミングの活性化が起こる。したがって、ｐＳＴＡＴ３−Ｙ７０５は、ＬＩＦシグナル伝達の読み取り値である。パネルＢ：１３５ｐＭのヒトＬＩＦおよび異なる濃度のＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ（組換え）、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ  Ｆｃ、およびＬ１抗ＬＩＦ  ｍＡｂに曝露された、ＰＡＮＣ１（ヒト膵臓がん細胞株）溶解物のウェスタンブロット。パネルＣ：チューブリンシグナルに対して正規化された、ｐＳＴＡＴ３シグナルの定量化。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
可溶性白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）ポリペプチド、可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドを含む可溶性融合タンパク質および二量体が提供される。可溶性ポリペプチドは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合する。特定の態様では、可溶性ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドと比較して、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を示す。そのような可溶性ポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含む発現ベクター、ならびにそのような核酸および／または発現ベクターを含む細胞もまた提供される。ＬＩＦ活性の阻害を必要とする個体（例えば、がんを治療するため）においてＬＩＦ活性を阻害する方法を含む、可溶性ポリペプチドを使用する方法もまた提供される。
【０００９】
本開示の可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法をより詳細に記載する前に、可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法が、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載するためのものであるにすぎず、可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
【００１０】
ある範囲の値が提供される場合、文脈上明確に指示されていない限り、下限の単位の１０分の１まで、各間に含まれる値は、その範囲の上限と下限との間であり、その記載された範囲内の任意の他の述べられている値またはその間に含まれる値は、可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲内に含まれてもよく、また、記載される範囲内の任意の特定の除外される限界を条件として、可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法内にも包含される。述べられる範囲が限界の一方または両方を備える場合、それらの含まれる限界のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法に含まれる。
【００１１】
特定の範囲は、数値の前に用語「約」が付された状態で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。数が特定の列挙された数に近いかほぼ等しいかを決定するにあたり、近似または近似の列挙されていない数は、それが提示されている文脈において具体的に列挙された数と実質的に等価な数であり得る。
【００１２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法もまた、可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法の実施または試験において使用され得るが、代表的な例示的な可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法をここで記載する。
【００１３】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示のためのものであり、提供される刊行日は、個別に確認を必要とし得る実際の刊行日とは異なる場合があるので、本発明の可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法が、その刊行物よりも先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲はいかなる任意選択的な要素も排除するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。このように、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」などのような排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を果たすことを意図する。
【００１５】
明瞭さのために別の実施形態の文脈中で記載された、可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法の特定の特徴はまた、単一の実施形態と組み合わせて提供され得ることが認識される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される、可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法の様々な特徴は、別々にまたは任意の好適なサブコンビネーションで提供されてもよい。実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、本明細書において、このような組み合わせが実施可能なプロセスおよび／または組成物を内包する程度まで、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように開示される。加えて、そのような変数を記載している実施形態に列挙されるすべてのサブコンビネーションも、本発明の可溶性ポリペプチド、核酸、発現ベクター、細胞および方法によって具体的に包含され、そのようなありとあらゆるサブコンビネーションが、個別にかつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。
【００１６】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証された個々の実施形態の各々は、本開示の方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。いかなる列挙された方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能なあらゆる他の順序で実行され得る。
【００１７】
可溶性ポリペプチド
上にまとめたように、本開示の態様は、可溶性ポリペプチドを含む。可溶性ポリペプチドは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１５０１８（ヒト）およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０９０５６（マウス））に結合し、ＬＩＦ活性を阻害する。ＬＩＦは、多機能サイトカインであり、その受容体としては、白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４２７０２（ヒト）およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４２７０３（マウス））、ならびに糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４０１８９（ヒト）およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ００５６０（マウス））が挙げられる。
【００１８】
図１、図１５のパネルＡ、および図１６のパネルＡに概略的に示されるように、ＬＩＦは、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０に結合し、受容体のヘテロ二量体化を引き起こす。二量体化によって、ＪＡＫが動員され、チロシン７０５上のＳＴＡＴ３をリン酸化する。これにより、ＳＴＡＴ３の二量体化、核への侵入、および転写プログラミングの活性化が起こる。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、ＬＩＦＲおよび／またはｇｐ１３０の細胞外（したがって可溶性）部分に基づき、様々な状況での使用が見出される。例えば、可溶性ポリペプチドは、ＬＩＦ活性の阻害を必要とする個体、例えば、ＬＩＦ活性の阻害が有益であるがんまたは他の医学的状態を有する個体に投与される場合、治療薬としての使用が見出される。可溶性ポリペプチドは、ＬＩＦリガンドの「トラップ」として作用する「デコイ」受容体として使用され得るため、細胞（例えば、がん細胞）の表面上のその天然受容体に結合するためのＬＩＦの利用可能性が、実質的に減少するか、またはなくなり、それによって、ＬＩＦ活性／シグナル伝達が減少するか、またはなくなる。一実施形態に係るそのようなＬＩＦリガンドトラップの概略図は、図２に概略的に示される。この例では、可溶性ポリペプチドは二量体化されており、この二量体の各単量体は、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）ドメイン２０８（例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインなど）に（直接的または間接的に）融合されたＬＩＦＲ部分２０２（ここでは、ヒトＬＩＦＲの最初の３つのドメインを含む部分（サイトカイン結合モチーフＩ−Ｉｇ様−サイトカイン結合モチーフＩＩ））を含む。図２に示されるように、二量体は、細胞２１０の表面上のその天然ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０受容体からＬＩＦを隔離するＬＩＦリガンドトラップとして作用し、それにより、ＬＩＦシグナル伝達／活性を阻害する。本開示の可溶性ポリペプチドはまた、例えば、がん（例えば、膵臓がん）検出のバイオマーカーとしてのＬＩＦを検出するための診断用途において、また、例えば、ＬＩＦの生物学的効果を決定するためにＬＩＦシグナル伝達／活性を阻害するための研究用途において、使用が見出される。次に、本開示の可溶性ポリペプチドについてさらに詳細に説明する。
【００２０】
可溶性ＬＩＦＲポリペプチド
本開示は、可溶性ＬＩＦＲポリペプチドを提供する。「可溶性ＬＩＦＲポリペプチド」とは、例えば、可溶性ＬＩＦＲポリペプチドがＬＩＦＲの細胞外部分またはそのフラグメントのみを含むために、細胞膜に組み込まれないＬＩＦＲポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、ＬＩＦＲの最初の３つのドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、それはＮ末端からＣ末端に向かう順序で、（１）サイトカイン結合モチーフＩ（ＣＢＭＩ）ドメイン、（２）Ｉｇ様ドメイン、および（３）サイトカイン結合モチーフＩＩ（ＣＢＭＩＩ）ドメインである。以下の表１に、野生型ヒトＬＩＦＲのアミノ酸配列（シグナル配列を除く）が示される。下線が引かれているアミノ酸は、ＣＢＭＩ、Ｉｇ様、およびＣＢＭＩＩドメインを構成する。
【表１】
2021531002.tif 000003
【００２１】
特定の態様では、本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列、または配列番号２に記載されるアミノ酸配列の４００〜４８９、４２０〜４８９、４４０〜４８９、４６０〜４８９、４７０〜４８９、４７５〜４８９、４８０〜４８９、または４８５〜４８９の連続アミノ酸を含むそのＬＩＦ結合フラグメントを含む。
【００２２】
可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、野生型ＬＩＦＲアミノ酸配列を有してもよい。他の態様では、可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、１つ以上の保存的アミノ酸置換、対応する野生型ＬＩＦＲポリペプチドと比較して、ＬＩＦに対する結合親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換（例えば、ＬＩＦに対するＬＩＦＲの結合親和性を増加させる本明細書に記載されるいずれかのアミノ酸置換の１つ以上）、またはそれらの組み合わせを含む「バリアント」である。本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、アミノ酸が、同様の特性を有する別のアミノ酸で置換されたものであり、その結果、ペプチド化学の当業者が、ポリペプチドの二次構造および疎水性親水性の性質が実質的に変わらないと予想するところのものである。特定の実施形態で想定されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において、改変がなされてもよく、ポリペプチドは、所望な特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子を少なくともほぼ有し、それを依然として得るポリペプチドを含む。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更して、同等の、またはさらに改良されたバリアントポリペプチドを作成することが望ましい場合、当業者は、例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンの１つ以上を変更することができる。
【００２３】
上にまとめたように、本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、配列番号２と少なくとも７０％の同一性であるアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、ＬＩＦＲポリペプチドは、対応する野生型ＬＩＦＲポリペプチドと比較して、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を示す。本明細書で使用される場合、「対応する」野生型ポリペプチドは、１つ以上の親和性を増加させるアミノ酸置換を含むように組換えされた、親の野生型ポリペプチド（ヒト、マウスなどに由来する）である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「増加した結合親和性」とは、可溶性ＬＩＦＲポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドが、対応する野生型ポリペプチドと比較して、ＬＩＦに対して、より強い結合を示す（より低いＫＤ値によって示される）ことを意味する。ＬＩＦに対する可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドの結合親和性を測定するための方法が利用可能である。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００装置を使用する）、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）結合平衡除外アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）技術（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ（登録商標））、または他の同様のアッセイ／技術を用いて、可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドが所望な結合親和性を示すかどうかを決定してもよい。本開示の文脈において結合親和性を測定するための好適な手法は、例えば、Ｈｕｎｔｅｒ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ  Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｊ．Ｒ．（２０１６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８０：２１−４４に記載されるものを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、直接結合アッセイにおいて、平衡結合定数（ＫＤ）は、フルオロフォアまたは放射性同位体に接合した可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチド、または標識された抗体による検出のためのＮ末端またはＣ末端エピトープタグを含む可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドを使用して測定されてもよい。標識またはタグが実行可能ではないか、または望ましくない場合、競合結合アッセイを使用して、標識された競合体の最大シグナルの５０％が検出可能である標識されていない可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドの量である、最大半値阻害濃度（ＩＣ５０）を決定することができる。次いで、測定されたＩＣ５０値からＫＤ値を計算することができる。
【００２６】
特定の態様では、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を有する可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、Ｌ２１８位のアミノ酸置換、およびＮ２７７位のアミノ酸置換の一方または両方を含み、ここで、位置の識別は、配列番号２に対するものである。Ｌ２１８位およびＮ２７７位のアミノ酸置換の非限定的な例としては、Ｌ２１８Ｐアミノ酸置換、およびＮ２７７Ｄアミノ酸置換の一方または両方を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を有する可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、Ｉ２５７位のアミノ酸置換、Ｖ２６２位のアミノ酸置換、およびＴ２７３位のアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、または各々を含み、ここで、位置の識別は、配列番号２に対するものである。Ｉ２５７位、Ｖ２６２位、およびＴ２７３位のアミノ酸置換の例としては、限定されないが、Ｉ２５７Ｖアミノ酸置換、Ｖ２６２Ａアミノ酸置換、およびＴ２７３Ｉアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、または各々を含む。
【００２８】
特定の態様では、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を有する可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、Ｉ２１７位のアミノ酸置換、Ｈ２４０位のアミノ酸置換、およびＩ２６０位のアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、または各々を含み、ここで、位置の識別は、配列番号２に対するものである。Ｉ２１７位、Ｈ２４０位およびＩ２６０位のアミノ酸置換の非限定的な例としては、Ｉ２１７Ｖアミノ酸置換、Ｈ２４０Ｒアミノ酸置換、およびＩ２６０Ｖアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、または各々を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を有する可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、Ｎ２４２位のアミノ酸置換を含み、ここで、位置の識別は、配列番号２に対するものである。Ｎ２４２アミノ酸置換の非限定的な例は、Ｎ２４２Ｄアミノ酸置換である。
【００３０】
特定の態様では、本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性であるアミノ酸配列、または配列番号２に記載されるアミノ酸配列の４００〜４８９、４２０〜４８９、４４０〜４８９、４６０〜４８９、４７０〜４８９、４７５〜４８９、４８０〜４８９、または４８５〜４８９の連続アミノ酸を含むそのＬＩＦ結合フラグメントを含み、可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、Ｉ２１７位、Ｌ２１８位、Ｈ２４０位、Ｉ２５７位、Ｉ２０６位、Ｖ２６２位、Ｔ２７１位、およびＮ２７７位のいずれかに、任意の組み合わせで１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、配列番号２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性であるアミノ酸配列、または配列番号２に記載されるアミノ酸配列の４００〜４８９、４２０〜４８９、４４０〜４８９、４６０〜４８９、４７０〜４８９、４７５〜４８９、４８０〜４８９、または４８５〜４８９の連続アミノ酸を含むそのＬＩＦ結合フラグメントを含み、可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、ＬＩＦに対してＬＩＦＲの結合親和性を増加させる本明細書に記載のいずれかのアミノ酸置換のうちの１つ以上、例えば、本明細書の他の箇所で記載されるように、任意の組み合わせで、アミノ酸置換Ｉ２１７Ｖ、Ｌ２１８Ｐ、Ｈ２４０Ｒ、Ｉ２５７Ｖ、Ｉ２０６Ｖ、Ｖ２６２Ａ、Ｔ２７１Ｉ、およびＮ２７７Ｄの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または各々を含む。
【００３２】
可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド
可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドもまた、本開示によって提供される。「可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド」とは、例えば、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドがｇｐ１３０の細胞外部分またはそのフラグメントのみを含むために、細胞膜に組み込まれないｇｐ１３０ポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、ｇｐ１３０のサイトカイン結合モチーフ（ＣＢＭ）ドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。以下の表２に、野生型ヒトｇｐ１３０のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）が示される。下線が引かれているアミノ酸は、ＣＢＭドメインを構成する。
【表２】
2021531002.tif 000004
【００３３】
特定の態様では、本開示の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列、または配列番号４に記載されるアミノ酸配列の１５０〜２００、１６０〜２００、１７０〜２００、１８０〜２００、１８５〜２００、１９０〜２００、または１９５〜２００の連続アミノ酸を含むそのＬＩＦ結合フラグメントを含む。
【００３４】
可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、野生型ｇｐ１３０アミノ酸配列を有してもよい。他の態様では、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、１つ以上の保存的アミノ酸置換、対応する野生型ｇｐ１３０ポリペプチドと比較して、ＬＩＦに対する結合親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換（例えば、ＬＩＦに対するｇｐ１３０の結合親和性を増加させる本明細書に記載されるいずれかのアミノ酸置換の１つ以上）、またはそれらの組み合わせを含む「バリアント」である。
【００３５】
上にまとめたように、本開示の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも７０％の同一性であるアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、ｇｐ１３０ポリペプチドは、対応する野生型ｇｐ１３０ポリペプチドと比較して、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を示す。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を有する可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、Ｋ４５位のアミノ酸置換を含み、ここで、位置の識別は、配列番号４に対するものである。Ｋ４５位のアミノ酸置換の非限定的な例は、Ｋ４５Ｅアミノ酸置換である。
【００３７】
特定の態様では、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を有する可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、Ｙ９５位のアミノ酸置換、およびＫ１８４位のアミノ酸置換の一方または両方を含み、ここで、位置の識別は、配列番号４に対するものである。Ｙ９５位およびＫ１８４位のアミノ酸置換の非限定的な例としては、Ｙ９５Ｄアミノ酸置換、およびＫ１８４Ｅアミノ酸置換の一方または両方を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を有する可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、Ｆ４６位のアミノ酸置換、およびＩ１３０位のアミノ酸置換の一方または両方を含み、ここで、位置の識別は、配列番号４に対するものである。Ｆ４６位およびＩ１３０位のアミノ酸置換の例としては、限定されないが、Ｆ４６Ｌアミノ酸置換、およびＩ１３０Ｍアミノ酸置換の一方または両方を含む。
【００３９】
特定の態様では、本開示の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性であるアミノ酸配列、または配列番号４に記載されるアミノ酸配列の１５０〜２００、１６０〜２００、１７０〜２００、１８０〜２００、１８５〜２００、１９０〜２００、または１９５〜２００の連続アミノ酸を含むそのＬＩＦ結合フラグメントを含み、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、Ｋ４５位、Ｆ４６位、Ｙ９５位、Ｉ１３０位、およびＫ１８４位のいずれかに、任意の組み合わせで１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本開示の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性であるアミノ酸配列、または配列番号４に記載されるアミノ酸配列の１５０〜２００、１６０〜２００、１７０〜２００、１８０〜２００、１８５〜２００、１９０〜２００、または１９５〜２００の連続アミノ酸を含むそのＬＩＦ結合フラグメントを含み、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、ＬＩＦに対してｇｐ１３０の結合親和性を増加させる本明細書に記載のいずれかのアミノ酸置換のうちの１つ以上、例えば、本明細書の他の箇所で記載されるように、任意の組み合わせで、アミノ酸置換Ｋ４５Ｅ、Ｆ４６Ｌ、Ｙ９５Ｄ、Ｉ１３０Ｍ、およびＫ１８４Ｅの１つ、２つ、３つ、４つ、または各々を含む。
【００４１】
融合および二量体タンパク質
本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドのいずれかを含む融合タンパク質も提供される。「融合タンパク質」とは、アミノ酸の単一の連続鎖の一部として、１つ以上の異種ポリペプチドに融合した可溶性ＬＩＦＲポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを含む融合体を意味し、この鎖は、天然には存在しない。特定の態様では、１つ以上の異種ポリペプチドは、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモ−アミノ酸ポリマー、プロリン−アラニン−セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の態様では、融合タンパク質は、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドに融合した可溶性ＬＩＦＲポリペプチドを含む。
【００４２】
本開示の融合タンパク質の２つ以上のドメインは、直接的または間接的に融合されてもよい。例えば、可溶性ＬＩＦＲポリペプチドは、リンカーを介して間接的に可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドに融合されてもよい。また、例として、可溶性ＬＩＦＲポリペプチドまたは可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドは、リンカーを介して異種ポリペプチド（例えば、Ｆｃドメイン）に融合されてもよい。好適なリンカーとしては、限定されないが、ペプチドリンカーが挙げられる。特定の態様では、ペプチドリンカーは、グリシンおよびセリンを含むリンカー、例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーである。目的のＧｌｙＳｅｒリンカーとしては、限定されないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーが挙げられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の異種ポリペプチドは、Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＦｃドメインまたはマウスＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインは、全長Ｆｃドメインまたはそのフラグメントであってもよい。本開示の可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドのいずれかに融合し得るヒトＦｃドメインの非限定的な例は、以下の表３に記載の配列（配列番号５）を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、またはそのフラグメントである。
【表３】
2021531002.tif 000005
【００４４】
本開示の融合タンパク質の例のアミノ酸配列（シグナル配列を除く）は、表４に提供される。リンカー（ここでは、３ｘ  グリシン−セリン（ＧＳ）リンカー、波線の下線部））を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（イタリック体）に融合したｇｐ１３０ドメイン（下線部）を含む融合タンパク質（「ｇｐ１３０  ＥＬＤＭＥ  ｈＩｇＧ１」）のアミノ酸配列が提供される（配列番号６）。ｇｐ１３０ドメインは、本明細書の他の箇所で記載されるように、アミノ酸置換Ｋ４５Ｅ、Ｆ４６Ｌ、Ｙ９５Ｄ、Ｉ１３０Ｍ、およびＫ１８４Ｅ（「ＥＬＤＭＥ」）を含む。この融合タンパク質は、図９のパネルＣに概略的に示される二量体タンパク質の単量体に対応する。リンカー（ここでは、３ｘ  グリシン−セリン（ＧＳ）リンカー、波線の下線部））を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（イタリック体）に融合したＬＩＦＲサイトカイン結合モチーフＩ（ＣＢＭＩ）−サイトカイン結合モチーフＩＩ（ＣＢＭＩＩ）ドメイン（下線部）を含む融合タンパク質（「ＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤ  ｈＩｇＧ１」）のアミノ酸配列も表４に提供される（配列番号７）。ＬＩＦＲサイトカイン結合モチーフＩ（ＣＢＭＩ）−サイトカイン結合モチーフＩＩ（ＣＢＭＩＩ）ドメインは、本明細書の他の箇所で記載されるように、アミノ酸置換Ｉ２１７Ｖ、Ｌ２１８Ｐ、Ｈ２４０Ｒ、Ｉ２５７Ｖ、Ｉ２０６Ｖ、Ｖ２６２Ａ、Ｔ２７１Ｉ、およびＮ２７７Ｄ（「ＶＰＲＶＶＡＩＤ」）を含む。この融合タンパク質は、図９のパネルＤに概略的に示される二量体タンパク質の単量体に対応する。表４は、リンカー（ここでは、５ｘ  グリシン４−セリン１（Ｇ４Ｓ）リンカー、波線の下線部）を介して「ｇｐ１３０  ＥＬＤＭＥ  ｈＩｇＧ１」融合タンパク質のＥＬＤＭＥ  ｇｐ１３０ドメイン（二重下線部）に融合した「ＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤ  ｈＩｇＧ１」融合タンパク質のＶＰＲＶＶＡＩＤ  ＬＩＦＲドメイン（下線部）を含む融合タンパク質（「ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０  ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ＥＬＤＭＥ  ｈＩｇＧ１」）のアミノ酸配列であって、ここで、ＥＬＤＭＥ  ｇｐ１３０ドメインは、リンカー（ここでは、３ｘ  グリシン−セリン（ＧＳ）リンカー、波線の下線部）を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（イタリック体）に融合した、アミノ酸配列も提供する（配列番号８）。この融合タンパク質は、図９のパネルＥに概略的に示される二量体タンパク質の単量体に対応する。表４は、さらに、図９のパネルＦに概略的に示される二量体タンパク質の融合タンパク質単量体のアミノ酸配列を提供する。第１のモノマーは、リンカー（ここでは、３ｘ  グリシン−セリン（ＧＳ）リンカー、波線の下線部）を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃノブ−イン−ホール（ＫｉＨ）ＣＨ３Ａドメイン（イタリック体）に融合した「ＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤ  ｈＩｇＧ１」融合タンパク質のＶＰＲＶＶＡＩＤ  ＬＩＦＲドメイン（下線部）を含む（配列番号９）。第２のモノマーは、リンカー（ここでは、３ｘ  グリシン−セリン（ＧＳ）リンカー、波線の下線部）を介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃノブ−イン−ホール（ＫｉＨ）ＣＨ３Ｂドメイン（イタリック体）に融合した「ｇｐ１３０  ＥＬＤＭＥ  ｈＩｇＧ１」融合タンパク質のＥＬＤＭＥ  ｇｐ１３０ドメイン（下線部）を含む（配列番号１０）。
【表４−１】
2021531002.tif 000006
【表４−２】
2021531002.tif 000007
【表４−３】
2021531002.tif 000008
【００４５】
可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、またはこれらを含む融合タンパク質のいずれかと二量体化された、可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、またはこれらを含む融合タンパク質（例えば、表４の融合タンパク質のいずれか、またはそのＬＩＦ結合性バリアント）のいずれかを含む二量体タンパク質も提供される。いくつかの実施形態では、各単量体は、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質であり、単量体の二量体化は、Ｆｃドメインを介して行われる。本開示の例示的な二量体タンパク質としては、以下の実験の章に記載されるもの、および図９に概略的に示されるものが挙げられる。
【００４６】
可溶性ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０ポリペプチドの組換え／開発および産生
１つ以上の所望な機能性を有するさらなる可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドを組換え／開発する方法も、本開示によって提供される。可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドが開発される様式は、様々であってもよい。合理的かつ組み合わせのアプローチを使用して、新規な特性、例えば、ＬＩＦに対して増加した結合親和性および／または特異性を有する可溶性ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０ポリペプチドを組換えすることができる。例えば、可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドを開発するために、可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドのライブラリーを作成し、例えば、細菌ディスプレイ、ファージディスプレイ、酵母表面ディスプレイ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、および／または任意の他の好適なスクリーニング方法によってスクリーニングしてもよい。
【００４７】
酵母表面ディスプレイは、新規の分子認識特性、増加した標的結合親和性、適切な折り畳み、および改善された安定性を有するタンパク質を設計するために使用されてきた強力なコンビナトリアル技術である。このプラットフォームでは、所望の生化学的および生物物理学的特性を有する変異体を単離するために、タンパク質変異体のライブラリーがハイスループット様式で生成およびスクリーニングされる。以下の実験の章に示されるように、本願発明者らは、ＬＩＦに対して増加した結合親和性を有する可溶性ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０ポリペプチドを組換えするための酵母表面ディスプレイを首尾良く用いてきた。酵母表面ディスプレイは、真核生物分泌経路、シャペロンの補助による折り畳み、および効率的なジスルフィド結合形成の品質管理機構から利益を得る。
【００４８】
目的の望ましい特性を有する可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドを開発するための１つの例示的な方法は、酵母接合アグルチニンタンパク質Ａｇａ２ｐに可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドを遺伝子的に融合することを含み、このタンパク質は、酵母細胞壁タンパク質Ａｇａ１ｐに対して２つのジスルフィド結合によって接続する。このＡｇａ２ｐ融合構築物、および染色体に組み込まれたＡｇａ１ｐ発現カセットは、ガラクトース誘導性プロモーター等の好適なプロモーターの制御下で発現させることができる。蛍光標識された一次または二次抗体を使用するフローサイトメトリーによって細胞表面発現レベルを測定するために、Ｎ末端またはＣ末端のエピトープタグを含めることができる。この構築物は、最も広く使用されるディスプレイフォーマットを表し、ここで、可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドのＮ末端は、Ａｇａ２ｐに融合されてもよいが、酵母表面ディスプレイプラスミドのいくつかの代替変形例が記載されており、本開示の可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドを開発するために使用されてもよい。ファージディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイで使用されるパニングに基づく方法に勝る、このスクリーニングプラットフォームの利点の１つは、２色ＦＡＣＳを使用して、特定の標的に対する結合親和性がわずか２倍程異なるクローンを定量的に識別することができることである。
【００４９】
ＤＮＡレベルでＬＩＦＲまたはｇｐ１３０を選択的に突然変異させるために、アプローチの一例は、エラープローンＰＣＲであり、これを使用して、プルーフリーディング（すなわち、エキソヌクレアーゼ）活性を有しないポリメラーゼを使用すること、ヌクレオシドアナログのトリホスフェート誘導体の混合物を使用すること、変化させた比率のｄＮＴＰを使用すること、マグネシウムまたはマンガンの濃度を変えることなどを含め、任意の数の変化させた反応条件によって突然変異を導入することができる。代替的に、例えば、オーバーラップエクステンションＰＣＲを使用してオリゴヌクレオチドアセンブリによって、縮重コドンを導入することができる。次いで、酵母における相同組換えのために酵母ディスプレイベクターと十分に重複する隣接プライマーを使用して遺伝物質が増幅され得る。これらの方法により、比較的低コストおよび少ない労力で、ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ライブラリーを作成することが可能になる。ライブラリー組成に対する規定された制御を可能にする合成ライブラリーおよび最新の方法が開発されている。
【００５０】
特定の態様では、ディスプレイライブラリー（例えば、酵母ディスプレイライブラリー）は、ＦＡＣＳによって目的の標的（例えば、ＬＩＦ）に対する結合についてスクリーニングされる。ライブラリースクリーニングのために２色ＦＡＣＳを使用してもよく、ここで、１つの蛍光標識を使用してｃ−ｍｙｃエピトープタグを検出することができ、他方を使用して、目的の結合標識に対する可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドの相互作用を測定することができる。単一細胞分解能で２つの蛍光体の励起および発光特性を測定するために、異なる機器レーザーおよび／またはフィルターセットを使用することができる。これにより、結合と共に酵母の発現レベルを正規化することが可能になる。すなわち、低い酵母発現を示すが大量の標的に結合する可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドを、高レベルで発現されるが標的に対して弱く結合する可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドと区別することができる。したがって、結合対発現の二次元フローサイトメトリープロットでは、対角線上に、標的抗原に結合する酵母細胞の集団が現れる。高親和性結合剤は、ライブラリー選別ゲートを使用して単離することができる。代替的に、初期のソーティングラウンドにおいて、所望な長さのポリペプチドを発現しない望ましくないクローンのライブラリーを除去することが有用であり得る。
【００５１】
目的の可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドをコードするクローンについての可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドライブラリーの富化後、酵母プラスミドが回収され、配列決定される。高い選別ストリンジェンシー下で、さらなるラウンドのＦＡＣＳを実施することができる。次いで、酵母に提示されたＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドクローンの結合親和性または動的オフレートを測定してもよい。
【００５２】
目的のＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドが、表面ディスプレイ（例えば、酵母表面ディスプレイ）によって同定されたら、組換え可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチド、またはこれを含む任意の融合タンパク質が、好適な方法を使用して産生されてもよい。特定の態様では、可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチド、またはこれを含む任意の融合タンパク質は、組換えＤＮＡアプローチを使用して産生される。様々な宿主細胞型において、組換え方法を使用してポリペプチドを生成するための戦略が開発されてきた。例えば、機能的な可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズム空間における折り畳みを促進し有用な精製ハンドルとして機能するバルナーゼを遺伝子融合パートナーとして用いて産生されてもよい。特定の実施形態によれば、組換え可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドは、酵母（例えば、酵母株Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）または哺乳動物細胞（例えば、ヒト胎児由来腎臓細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞）において発現される。発現構築物は、１つ以上のタグ（例えば、金属キレートクロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ）による精製のためのＣ末端ヘキサヒスタジンタグ）をコードしてもよい。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、凝集物、誤って折り畳まれた多量体等を除去することができる。
【００５３】
本開示の態様は、本開示の可溶性ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０ポリペプチド（およびこれを含む任意の融合タンパク質）をコードする核酸を含む。すなわち、本明細書に記載の可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドのいずれかを含む、本開示の可溶性ＬＩＦＲもしくはｇｐ１３０ポリペプチドまたは融合タンパク質のいずれかをコードする核酸が提供される。ある特定の態様において、そのような核酸は発現ベクター中に存在する。発現ベクターは、薬剤（例えば、可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチド）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、プロモーターは、この薬剤を発現するために選択された宿主細胞の種類に基づいて選択される。好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡに統合された部分として宿主生物内で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするために選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、ネオマイシン耐性等）を含む。
【００５４】
本明細書に記載の可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドのいずれかを含み、本開示の可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含む宿主細胞、ならびにこれを含む任意の発現ベクターも提供される。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は、本開示の可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドをコードする核酸をクローニングするために使用することができる原核生物宿主細胞の一例である。使用に好適な他の微生物宿主には、枯草菌等の桿菌、およびサルモネラ菌、セラチア、および様々なシュードモナス種等の他の腸内細菌科が含まれる。これらの原核生物宿主において、発現ベクターを作製することもでき、それは典型的には、宿主細胞と適合性のある発現制御配列（例えば複製起点）を含有するであろう。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはλファージ由来のプロモーター系等の、任意の数の様々な周知のプロモーターが存在するであろう。プロモーターは、典型的には、任意選択的にオペレーター配列を用いて発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了するためのリボソーム結合部位配列等を有するであろう。
【００５５】
酵母等の他の微生物もまた、発現に有用である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）は、必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終結配列等を有する好適なベクターを含む好適な酵母宿主細胞の例である。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖系酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームＣ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素からのプロモーターが含まれる。
【００５６】
微生物に加えて、哺乳動物細胞（例えば、インビトロ細胞培養で成長させた哺乳動物細胞）を使用して、本開示の可溶性ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０ポリペプチドを発現し、産生することもできる。好適な哺乳動物宿主細胞には、ヒト細胞系、非ヒト霊長類細胞系、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞系等が含まれる。好適な哺乳動物細胞系として、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサー等の発現制御配列、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列等の必要なプロセシング情報部位を含み得る。好適な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。
【００５７】
（例えば、組換えによって）合成されると、可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、ゲル電気泳動等を含む、当該技術分野で既知の標準的な手順に従って精製され得る。主題の可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチドは、実質的に純粋、例えば、少なくとも約８０％〜８５％純粋、少なくとも約８５％〜９０％純粋、少なくとも約９０％〜９５％純粋、または９８％〜９９％以上純粋であってもよく、例えば、細胞片、可溶性ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０ポリペプチド以外の高分子などの混入物質を含まない。
【００５８】
組成物
本開示の可溶性ＬＩＦＲおよび／または可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド（これらを含む任意の融合および／または二量体タンパク質を含む）を含む組成物も提供される。
【００５９】
特定の態様では、組成物は、液体媒体中に存在する本開示の可溶性ＬＩＦＲおよび／または可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを含む。液体媒体は、水、緩衝溶液等の水性液体媒体であってもよい。１つ以上の添加剤、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）等）、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール等が、そのような組成物中に存在してもよい。
【００６０】
医薬組成物もまた提供される。医薬組成物は、本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、融合タンパク質、および／または二量体化タンパク質（これらはいずれも、本明細書で「ＬＩＦ結合剤」と呼ばれ得る）と、薬学的に許容される担体と、を含む。医薬組成物は、一般に、治療有効量のＬＩＦ結合剤を含む。「治療有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な投薬量、例えば、ＬＩＦシグナル伝達に関連する細胞増殖性障害（例えば、がん、例えば膵臓がん）を有する個体における細胞増殖の減少など、有益または所望な治療（予防を含む）効果をもたらすのに十分な量を意味する。
【００６１】
本開示のＬＩＦ結合剤は、治療的投与のために様々な製剤に組み込まれ得る。より具体的には、ＬＩＦ結合剤は、適切な薬学的に許容される賦形剤または希釈剤と組み合わせることによって、医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾル剤等の固体、半固体、液体、または気体形態の製剤に製剤化することができる。
【００６２】
個体への投与に好適な（例えば、ヒト投与に好適な）本開示のＬＩＦ結合剤の製剤は、一般に滅菌であり、選択される投与経路に従って個体に投与するには禁忌である検出可能な発熱物質または他の混入物質をさらに含まない状態であり得る。
【００６３】
医薬剤形において、ＬＩＦ結合剤は、単独で、または他の薬学的に活性な化合物との適切な会合において、および組み合わせて、投与することができる。以下の方法および賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
【００６４】
経口製剤の場合、ＬＩＦ結合剤は、単独で、または適切な添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプン等の従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン等のバインダー；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム等の崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；および所望な場合、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤および香味剤と組み合わせて使用され、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を作製してもよい。
【００６５】
ＬＩＦ結合剤は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高次脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール等の水性溶媒もしくは非水性溶媒にＬＩＦ結合剤を溶解、懸濁または乳化することによって、また、所望な場合、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および防腐剤等の従来の添加剤を用いて、注射用製剤に製剤化することができる。
【００６６】
医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体形態であってもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌溶液で再構成されるべきである。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、一定量の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と当量である）を加え戻すことであるが、非経口投与用の医薬組成物の産生に抗菌剤を含む溶液が使用されてもよい。
【００６７】
ＬＩＦ結合剤の水性製剤は、例えば、約４．０〜約７．０、または約５．０〜約６．０の範囲のｐＨ、または代替的に約５．５のｐＨ緩衝液中で調製することができる。この範囲内のｐＨに好適である緩衝液の例には、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液および他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の張性に応じて、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５ｍＭ〜約５０ｍＭであり得る。
【００６８】
使用方法
本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、融合タンパク質、および／または二量体化タンパク質（これらはいずれも、本明細書で「ＬＩＦ結合剤」と呼ばれ得る）を使用する方法も提供される。特定の実施形態によれば、ＬＩＦ活性の阻害を必要とする個体に、治療有効量の本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、融合タンパク質、および／または二量体化タンパク質、または任意のこのようなＬＩＦ結合剤を含む医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。特定の態様では、ＬＩＦ活性の阻害を必要とする個体は、ＬＩＦシグナル伝達に関連する細胞増殖性障害を有し、投与は、細胞増殖性障害を治療するのに有効である。ある特定の態様において、細胞増殖性疾患はがんである。目的のがんとしては、限定されないが、膵臓がんが挙げられる。
【００６９】
例えば、いくつかの実施形態では、本開示のＬＩＦ結合剤または医薬組成物は、ＬＩＦ結合剤または医薬組成物が有効量で投与される場合に、宿主におけるがん細胞の成長、転移および／または浸潤を阻害する。「がん細胞」とは、例えば、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、密度依存的増殖阻害の損失、足場非依存性の増殖能力、免疫無防備状態の非ヒト動物モデルにおける腫瘍の増殖および／もしくは発生を促進させる能力、ならびに／または細胞形質転換の任意の適切な指標のうちの１つ以上によって特徴付けることができる、新生物細胞表現型を示す細胞を意味する。本明細書において「がん細胞」は、「腫瘍細胞」、「悪性細胞」または「がん性細胞」と互換的に使用され得、固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移性腫瘍などのがん細胞を包含する。
【００７０】
本開示の方法を使用して治療可能ながんとしては、限定されないが、固形腫瘍、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、大腸がん、腎細胞がん、および本開示のＬＩＦ結合剤または医薬組成物を使用して治療され得る任意の他の種類のがんが挙げられる。
【００７１】
ＬＩＦ結合剤は、単独で（例えば、単剤療法において）、または１つ以上のさらなる治療薬剤と組み合わせて（例えば、併用療法において）、投与され得る。
【００７２】
いくつかの実施形態では、有効量のＬＩＦ結合剤（またはこれを含む医薬組成物）は、単独で（例えば、単剤療法において）、または１つ以上のさらなる治療薬剤と組み合わせて（例えば、併用療法において）、１回以上の用量で投与されたときに、ＬＩＦ結合剤または医薬組成物を用いる治療が存在しない状態での個体における症状と比較して、個体における細胞増殖性障害（例えば、がん）の症状を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上減少するのに有効な量である。
【００７３】
特定の態様では、本開示の方法は、ＬＩＦ結合剤または医薬組成物が有効量で投与される場合、個体におけるがん細胞の成長、転移および／または浸潤を阻害する。
【００７４】
ＬＩＦ結合剤または医薬組成物は、インビボおよびエクスビボでの方法、および全身および局所的な投与経路を含め、薬物送達に好適な任意の利用可能な方法および経路を使用して、個体に投与されてもよい。従来のおよび医薬的に許容される投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経鼻、経口、および他の経腸および非経口投与経路が含まれる。投与経路は、所望な場合、組み合わされてもよく、またはＬＩＦ結合剤および／または所望な効果に応じて調節されてもよい。ＬＩＦ結合剤または医薬組成物は、単回投与または複数回投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ結合剤または医薬組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ結合剤または医薬組成物は、例えば、全身送達（例えば、静脈内注入）のために、または局所部位に、注射によって投与される。
【００７５】
様々な個体が本方法に従って治療可能である。一般に、そのような対象は「哺乳動物」または「哺乳類」であり、これらの用語は、肉食目（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯目（例えば、マウス、モルモットおよびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む哺乳類綱内の生物を説明するために広く使用される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
【００７６】
「治療すること」または「治療」とは、個体の細胞増殖性疾患（例えば、がん）に関連する症状の少なくとも改善を意味し、改善は、あるパラメータ、例えば、治療される細胞増殖性疾患に関連する症状の程度における少なくとも軽減を指すために広義で使用される。したがって、治療はまた、個体が細胞増殖性疾患、または少なくとも細胞増殖性疾患を特徴付ける症状にそれ以上苦しむことがないように、病的状態または少なくともそれに関連する症状が完全に抑制された、例えば、発生するのを防止された、または停止された、例えば、中止された状況も含む。
【００７７】
投薬は、治療される疾患状態の重症度および応答性に依存する。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定値から計算することができる。投与する医師は、最適な投薬量、投薬方法および反復率を決定することができる。最適な投薬量は、個々のＬＩＦ結合剤の相対的な効力に応じて変わってもよく、一般に、インビトロおよびインビボでの動物モデルなどにおいて有効であることがわかっているＥＣ５０に基づいて推定され得る。一般に、投薬量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日、１週間、１ヶ月、または１年に１回以上投与され得る。治療する医師は、測定された滞留時間、および体液または組織中の薬物の濃度に基づいて、投与の繰り返し率を推定することができる。治療が成功した後、疾患状態の再発を防止するために、維持療法を対象に受けさせることが望ましい場合があり、ＬＩＦ結合剤または医薬組成物は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で、１日に１回以上、数ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回、毎年１回、または任意の他の好適な頻度で投与される。
【００７８】
本開示の治療方法は、対象に１種類のＬＩＦ結合剤を投与することを含んでもよく、または異なるＬＩＦ結合剤のカクテルの投与によって、２種類以上のＬＩＦ結合剤を対象に投与することを含んでもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＬＩＦシグナル伝達に関連する細胞増殖性障害を有するものとして個体を同定することを含む方法が提供される。ＬＩＦシグナル伝達に関連する細胞増殖性障害を有するものとして個体を同定することは、種々のアプローチおよびそれらの組み合わせを使用して実施され得る。特定の態様では、同定することは、個体から得られた試料（例えば、体液試料、腫瘍生検等）におけるＬＩＦ存在量に基づく。いくつかの実施形態では、ＬＩＦ存在量は、本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、融合タンパク質、および／または二量体化タンパク質をＬＩＦ捕捉剤として使用して定量化される。
【００８０】
特定の態様では、同定することは、個体から得られる試料中のＬＩＦシグナル伝達のレベルに基づく。ＬＩＦシグナル伝達のレベルは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路における分子を含む、１つ以上のＬＩＦシグナル伝達経路分子のリン酸化状態に基づいてもよく、その非限定的な例は、ｐＳＴＡＴ３（例えば、ｐＳＴＡＴ３−Ｙ７０５）である。ある特定の実施形態によれば、同定することはイムノアッセイに基づく。ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーアッセイ、組織切片試料に対する免疫組織化学、組織切片試料に対する免疫蛍光、ウエスタン分析等を含む様々な好適なイムノアッセイフォーマットが利用可能である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、同定することは核酸配列決定に基づく。例えば、対象とするタンパク質をコードするｍＲＮＡに対応する配列決定リードの数が、そのタンパク質の発現レベルを決定するために使用され得る。特定の態様では、配列決定は、次世代配列決定システムを使用して、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）および／またはＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）配列決定システム）；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、ＭｉｎＩＯＮ（商標）、ＧｒｉｄＩＯＮｘ５（商標）、ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ（商標）、またはＳｍｉｄｇＩＯＮ（商標）ナノポア配列決定デバイス）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）（例えば、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）および／またはＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）配列決定システム）；Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、ＰＡＣＢＩＯ  ＲＳ  ＩＩ配列決定システム）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（例えば、ＳＯＬｉＤ配列決定システム）；Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４  ＧＳ  ＦＬＸ＋および／またはＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ配列決定システム）；または目的の任意の他の配列決定プラットフォームによって提供される配列決定プラットフォームで行われる。組織または体液試料から核酸を単離するためのプロトコル、および所望の配列決定プラットフォームに適した配列決定アダプターを有する配列決定ライブラリーを調製するためのプロトコルが容易に利用可能である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＬＩＦシグナル伝達に関連する細胞増殖性障害を有するものとして個体を同定することを含む方法は、個体から試料を得ることをさらに含む。
【００８３】
個体から得られる試料は、個体がＬＩＦシグナル伝達に関連する細胞増殖性障害を有するかどうかを決定するのに好適な任意の試料であってもよい。ある特定の態様において、試料は、全血、血清、血漿等の体液試料である。いくつかの実施形態において、試料は組織試料である。対象とする組織試料として腫瘍生検試料等が挙げられるが、これに限定されない。
【００８４】
キット
キットもまた、本開示によって提供される。いくつかの実施形態では、本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、融合タンパク質、および／または二量体化タンパク質のいずれかを含む医薬組成物を含むキットが提供される。キットは、ＬＩＦ活性の阻害を必要とする個体、例えば、細胞増殖性障害（例えば、がん、例えば膵臓がん）、またはＬＩＦ活性の阻害が有益である他の医学的状態を有する個体に医薬組成物を投与するための説明書をさらに含んでもよい。特定の態様では、キットは、１つ以上（例えば、２つ以上）の単位剤形で存在する医薬組成物を含む。
【００８５】
特定の態様では、本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、融合タンパク質、および／または二量体化タンパク質のいずれかを含むキットが提供され、このようなキットは、試料（例えば、体液試料、組織試料など）中のＬＩＦを検出するためにこれらを使用するための説明書をさらに含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本開示の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、融合タンパク質、および／または二量体化タンパク質のいずれかを含むキットが提供され、このようなキットは、例えば、研究目的のために、インビトロまたはインビボでＬＩＦシグナル伝達／活性を抑制するためのこれらを使用するための説明書をさらに含む。
【００８７】
キットの成分は、別々の容器内に存在してもよく、または複数の成分が単一の容器内に存在してもよい。好適な容器は、単一チューブ（例えば、バイアル）、１つ以上のウェルのプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）などを含む。
【００８８】
キットの説明書は、好適な記録媒体に記録することができる。例えば、説明書は、紙またはプラスチック等の基材上に印刷することができる。そのため、説明書は、添付文書としてキット内に、キットまたはその成分の容器のラベル内（すなわち、包装または副次的な包装と関連して）等に存在していてもよい。他の実施形態では、説明書は、ポータブルフラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどの好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書は、キット内には存在しないが、例えばインターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができ、かつ／または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段は、好適な基材上に記録される。
【００８９】
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の条項によっても定義される。
１．可溶性白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）ポリペプチドであって、配列番号２と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＬＩＦＲポリペプチドが、対応する野生型ＬＩＦＲポリペプチドと比較して、白血病抑制因子（ＬＩＦ）に対して増加した結合親和性を示す、可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９０】
２．
Ｌ２１８位のアミノ酸置換、および
Ｎ２７７位のアミノ酸置換、の一方または両方を含み、
位置の識別は、配列番号２に対するものである、第１の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９１】
３．
Ｌ２１８Ｐアミノ酸置換、および
Ｎ２７７Ｄアミノ酸置換、の一方または両方を含む、第２の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９２】
４．
Ｉ２５７位のアミノ酸置換、
Ｖ２６２位のアミノ酸置換、および
Ｔ２７３位のアミノ酸置換、のうちの１つ、２つ、または各々を含み、
位置の識別は、配列番号２に対するものである、第１〜３の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９３】
５．
Ｉ２５７Ｖアミノ酸置換、
Ｖ２６２Ａアミノ酸置換、および
Ｔ２７３Ｉアミノ酸置換、のうちの１つ、２つ、または各々を含む、第４の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９４】
６．
Ｉ２１７位のアミノ酸置換、
Ｈ２４０位のアミノ酸置換、および
Ｉ２６０位のアミノ酸置換、のうちの１つ、２つ、または各々を含み、
位置の識別は、配列番号２に対するものである、第１〜５の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９５】
７．
Ｉ２１７Ｖアミノ酸置換、
Ｈ２４０Ｒアミノ酸置換、および
Ｉ２６０Ｖアミノ酸置換、のうちの１つ、２つ、または各々を含む、第６の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９６】
８．Ｎ２４２位のアミノ酸置換を含み、位置の識別は、配列番号２に対するものである、第１〜７の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９７】
９．Ｎ２４２Ｄアミノ酸置換を含む、第８の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９８】
１０．配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、第１〜９の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【００９９】
１１．配列番号２と少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第１〜９の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１００】
１２．可溶性ＬＩＦＲポリペプチドが、１つ以上の異種ポリペプチドに融合している、第１〜１１の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１０１】
１３．１つ以上の異種ポリペプチドが、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモ−アミノ酸ポリマー、プロリン−アラニン−セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される異種ポリペプチドを含む、第１２の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１０２】
１４．１つ以上の異種ポリペプチドが、Ｆｃドメインを含む、第１３の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１０３】
１５．１つ以上の異種ポリペプチドが、第２７〜３８の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを含む、第１２〜１４の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１０４】
１６．可溶性ＬＩＦＲポリペプチドおよび可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドが、リンカーを介して融合されている、第１５の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１０５】
１７．リンカーが、ＧｌｙＳｅｒリンカーを含む、第１６の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１０６】
１８．ＧｌｙＳｅｒリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーを含む、第１７節に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１０７】
１９．第１〜１８の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドと二量体化されている、第１〜１８の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１０８】
２０．各可溶性ＬＩＦＲポリペプチドがＦｃドメインを含み、二量体化がＦｃドメインを介している、第１９の条項に記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド。
【０１０９】
２１．第１〜１８の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドをコードする核酸。
【０１１０】
２２．第２１の条項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【０１１１】
２３．細胞であって、
第１〜１８の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチド、
第２１の条項に記載の核酸、
第２２の条項に記載の発現ベクター、または
それらの任意の組み合わせを含む、細胞。
【０１１２】
２４．第１〜１８節のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドを製造する方法であって、
細胞が可溶性ＬＩＦＲポリペプチドを産生する条件下で、第２２の条項に記載の発現ベクターを含む細胞を培養することを含む、方法。
【０１１３】
２５．細胞を培養する前に、細胞に発現ベクターを導入することをさらに含む、第２４の条項に記載の方法。
【０１１４】
２６．細胞を培養した後に、細胞からＬＩＦＲポリペプチドを精製することをさらに含む、第２４の条項または第２５の条項に記載の方法。
【０１１５】
２７．可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ポリペプチドであって、配列番号４と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、ｇｐ１３０ポリペプチドが、対応する野生型ｇｐ１３０ポリペプチドと比較して、白血病抑制因子（ＬＩＦ）に対して増加した結合親和性を示す、可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１１６】
２８．Ｋ４５位にアミノ酸置換を含み、位置の識別は、配列番号４に対するものである、第２７の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１１７】
２９．Ｋ４５Ｅアミノ酸置換を含む、第２８の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１１８】
３０．
Ｙ９５位のアミノ酸置換、および
Ｋ１８４位のアミノ酸置換、の一方または両方を含み、
位置の識別は、配列番号４に対するものである、第２７〜２９の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１１９】
３１．
Ｙ９５Ｄアミノ酸置換、および
Ｋ１８４Ｅアミノ酸置換、の一方または両方を含む、第３０の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２０】
３２．
Ｆ４６位のアミノ酸置換、および
Ｉ１３０位のアミノ酸置換、の一方または両方を含み、
位置の識別は、配列番号４に対するものである、第２７〜３１の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２１】
３３．
Ｆ４６Ｌアミノ酸置換、および
Ｉ１３０Ｍアミノ酸置換、のうちの一方または両方を含む、第３２の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２２】
３４．配列番号４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、第２７〜３３の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２３】
３５．配列番号４と少なくとも９０％同一であるか、または少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第２７〜３３の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２４】
３６．可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドが、１つ以上の異種ポリペプチドに融合している、第２７〜３５の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２５】
３７．１つ以上の異種ポリペプチドが、Ｆｃドメイン、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ、ホモ−アミノ酸ポリマー、プロリン−アラニン−セリンポリマー、エラスチン様ペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される異種ポリペプチドを含む、第３６の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２６】
３８．１つ以上の異種ポリペプチドが、Ｆｃドメインを含む、第３７の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２７】
３９．１つ以上の異種ポリペプチドが、第１〜１４の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドを含む、第３６〜３８の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２８】
４０．可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドおよび可溶性ＬＩＦＲポリペプチドが、リンカーを介して融合されている、第３９の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１２９】
４１．リンカーが、ＧｌｙＳｅｒリンカーを含む、第４０の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１３０】
４２．ＧｌｙＳｅｒリンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリンカーを含む、第４１の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１３１】
４３．第２７〜４２の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドと二量体化されている、第２７〜４２の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１３２】
４４．各可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドがＦｃドメインを含み、二量体化がＦｃドメインを介している、第４３の条項に記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド。
【０１３３】
４５．第２７〜４２の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドをコードする核酸。
【０１３４】
４６．第４５の条項に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【０１３５】
４７．細胞であって、
第２７〜４２の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド、
第４５の条項に記載の核酸、
第４６の条項に記載の発現ベクター、または
それらの任意の組み合わせを含む、細胞。
【０１３６】
４８．第２７〜４２節のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを製造する方法であって、
細胞が可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを産生する条件下で、第４６の条項に記載の発現ベクターを含む細胞を培養することを含む、方法。
【０１３７】
４９．細胞を培養する前に、細胞に発現ベクターを導入することをさらに含む、第４８の条項に記載の方法。
【０１３８】
５０．細胞を培養した後に、細胞から可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドを精製することをさらに含む、第４８の条項または第４９の条項に記載の方法。
【０１３９】
５１．ヘテロ二量体タンパク質であって、
第２７〜３８の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドと二量体化された、第１〜１４の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドを含む、ヘテロ二量体タンパク質。
【０１４０】
５２．可溶性ＬＩＦＲポリペプチドおよび可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドがそれぞれ二量体化ドメインを含み、前記二量体化ドメインを介して前記可溶性ＬＩＦＲポリペプチドおよび可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドが二量体化される、第５１の条項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【０１４１】
５３．二量体化ドメインが、Ｆｃドメインを含む、第５２の条項に記載のヘテロ二量体タンパク質。
【０１４２】
５４．医薬組成物であって、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合し、配列番号２と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、可溶性白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【０１４３】
５５．医薬組成物であって、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合し、配列番号４と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【０１４４】
５６．医薬組成物であって、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合し、配列番号４と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、可溶性糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ポリペプチドと二量体化された、白血病抑制因子（ＬＩＦ）に結合し、配列番号２と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、可溶性白血病抑制因子受容体（ＬＩＦＲ）ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【０１４５】
５７．医薬組成物であって、
第１〜１８の条項のいずれか１つに記載の可溶性ＬＩＦＲポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【０１４６】
５８．医薬組成物であって、
第２７〜４２の条項のいずれか１つに記載の可溶性ｇｐ１３０ポリペプチドと、
薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【０１４７】
５９．医薬組成物であって、
第５１〜５３の条項のいずれか１つに記載のヘテロ二量体タンパク質と、
薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【０１４８】
６０．治療有効量の第５４〜５９の条項のいずれか１つに記載の医薬組成物を、必要とする個体に投与することを含む、方法。
【０１４９】
６１．必要とする個体が、がんを有する個体である、第６０の条項に記載の方法。
【０１５０】
６２．がんが、膵臓がんである、第６１の条項に記載の方法。
【０１５１】
６３．キットであって、
第５４〜５９の条項のいずれか１つに記載の医薬組成物と、
必要とする個体に前記医薬組成物を投与するための説明書と、を含む、キット。
【０１５２】
６４．医薬組成物が、１つ以上の単位剤形で存在する、第６３の条項に記載のキット。
【０１５３】
６５．医薬組成物が、２つ以上の単位剤形で存在する、第６３の条項に記載のキット。
【０１５４】
６６．必要とする個体が、がんを有する個体である、第６３〜６５の条項のいずれか１つに記載のキット。
【０１５５】
６７．がんが、膵臓がんである、第６６の条項に記載のキット。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
【０１５７】
実験
実施例１−組換え可溶性ＬＩＦＲポリペプチド
この実施例では、ＬＩＦＲバリアントが、酵母表面上に提示されたヒトＬＩＦＲのＩｇ様ドメインのライブラリーから同定され、ＦＡＣＳを使用して、ヒトＬＩＦに対して最適な結合体についてソーティングされた。複数回のソーティング後、バリアントが選択され、配列決定され、特性決定された。ソーティングから単離されたＬＩＦＲバリアントは、図３にまとめられる。
【０１５８】
図３のパネルＡは、複数のソーティングから単離されたＬＩＦＲ  Ｉｇ様ドメインバリアントで観察されたコンセンサス突然変異を示す。番号付けは、ＬＩＦＲサイトカイン結合モチーフＩ（ＣＢＭＩ）ドメインの先頭から始まる。図３のパネルＢは、低い（１０ｐＭ、１００ｐＭ）ＬＩＦ濃度での正規化された合計蛍光結合値から計算されるＬＩＦＲバリアントの結合スコアを示す。すべてのスコアは、野生型に対して、酵母表面での差次的発現について正規化された。
【０１５９】
同定されたＬＩＦＲ突然変異（図３のパネルＡに示される）に基づき、いずれのソーティングでも観察されなかった、可能な変異体ＬＩＦＲバリアントの複数の組み合わせを、部位特異的突然変異誘発を使用して作成した。図４のパネルＡは、部位特異的突然変異誘発を使用して生成されたバリアントをまとめたものである。図４のパネルＢは、図３のパネルＢについて上に記載されるように計算された、このようなバリアントの結合スコアを示す。野生型（ＷＴ）に対して正規化された発現も示される。この分析から、ＶＰＲＶＶＡＩＤ（Ｉ２１７Ｖ−Ｌ２１８Ｐ−Ｈ２４０Ｒ−Ｉ２５７Ｖ−Ｉ２０６Ｖ−Ｖ２６２Ａ−Ｔ２７１Ｉ−Ｎ２７７Ｄ）が、最適なＬＩＦＲバリアントとして同定された。
【０１６０】
図５では、図４のパネルＡからのコンセンサス突然変異が、ヒトＬＩＦＲ（青色）に結合するヒトＬＩＦ（桃色）のＰｙＭＯＬモデル化構造において示される。突然変異は赤色で示され、ＰｙＭＯＬを使用して導入されている。ループ１、２および３における突然変異のクラスターは、挿入図で拡大されている。
【０１６１】
実施例２−組換え可溶性ｇｐ１３０ポリペプチド
この実施例では、ｇｐ１３０バリアントが、酵母表面上に提示されたヒトｇｐ１３０のＣＢＭドメインのライブラリーから同定され、ＦＡＣＳを使用して、ヒトＬＩＦに対して最適な結合体についてソーティングされた。複数回のソーティング後、バリアントが選択され、配列決定され、特性決定された。ソーティングから単離されたｇｐ１３０バリアントは、図６にまとめられる。
【０１６２】
図６のパネルＡは、複数のソーティングから単離されたｇｐ１３０  ＣＢＭドメインバリアントで観察されたコンセンサス突然変異を示す。番号付けは、ｇｐ１３０サイトカイン結合モチーフＩ（ＣＢＭ）ドメインの先頭から始まる。図６のパネルＢは、部位特異的突然変異誘発を使用して生成された変異体ｇｐ１３０バリアントのまとめを示す。図６のパネルＣは、低ＬＩＦ濃度として１００ｐＭおよび１ｎＭを使用して、図３のパネルＢに記載されているように計算されたｇｐ１３０バリアントの結合スコアを示す。野生型（ＷＴ）に対して正規化された発現も示される。この分析から、ＥＬＤＭＥ（Ｋ４５Ｅ−Ｆ４６Ｌ−Ｙ９５Ｄ−Ｉ１３０Ｍ−Ｋ１８４Ｅ）が、最適なｇｐ１３０バリアントとして同定された。
【０１６３】
図７では、図６のパネルＡから選択されたコンセンサス突然変異が、ヒトｇｐ１３０（桃色）に結合するヒトＬＩＦ（青色）の解析された構造において示される。ＰｙＭＯＬを使用して挿入された突然変異は、青緑色で示される。ゾーン１および２における突然変異のクラスターは、挿入図で拡大されている。
【０１６４】
実施例３−ヒトＬＩＦに対するＬＩＦＲおよびｇｐ１３０バリアントの結合
この実施例では、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０のバリアントが、酵母表面上に提示された。ヒトＬＩＦに対する結合は、フローサイトメトリーを使用して蛍光抗体検出によって測定された。
【０１６５】
図８のパネルＡは、ヒトＬＩＦに対する、酵母に提示された野生型ＬＩＦＲおよびＬＩＦＲバリアントの結合結果を示す。ＬＩＦＲ野生型（ＷＴ）（丸）、「ＰＤＤ」バリアント（Ｌ２１８Ｐ−Ｎ４２Ｄ−Ｎ２７７Ｄ）（四角）、およびＶＰＲＶＶＡＩＤバリアント（図４のパネルＡの突然変異）（三角）の結果が示される。ＶＰＲＶＶＡＩＤバリアントのＫＤは、３０ｐＭで測定され、これは野生型（ＷＴ）と比較して３２倍高い親和性である。
【０１６６】
図８のパネルＢは、ヒトＬＩＦに対する、酵母に提示された野生型ｇｐ１３０およびｇｐ１３０バリアントの結合結果を示す。ｇｐ１３０野生型（ＷＴ）（丸）、「８Ｍ」バリアント（Ｅ４Ｋ−Ｋ５Ｒ−Ｎ１４Ｄ−Ｋ４５Ｅ−Ｆ４６Ｌ−Ｋ８３Ｒ−Ｙ９５Ｄ−Ｎ１００Ｓ）（四角）、およびＥＬＤＭＥバリアント（図４のパネルＡの突然変異）（三角）の結果が示される。ＥＬＤＭＥバリアントのＫＤは、５ｎＭで測定され、これは野生型（ＷＴ）と比較して１２倍高い親和性である。
【０１６７】
実施例４−ホモ二量体とヘテロ二量体の可溶性ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０融合ポリペプチド
この実施例では、ホモ二量体およびヘテロ二量体の、可溶性ＬＩＦＲおよび／またはｇｐ１３０  Ｆｃ融合構築物を生成した。図９のパネルＡおよびＢは、それぞれ、ＬＩＦのｇｐ１３０結合面およびＬＩＦＲ結合面を標的とする、抗ＬＩＦモノクローナル抗体Ｇ１およびＬ１を概略的に示す。これらの抗体は、有効性のベンチマークとして機能する。
【０１６８】
図９のパネルＣに概略的に示されるのは、ｇｐ１３０サイトカイン結合モチーフ（ＣＢＭ）バリアント（ＥＬＤＭＥ）Ｆｃ融合ホモ二量体であり、二量体化は、Ｆｃドメインを介して行われる。この構築物は、「ｇｐ１３０  ＥＬＤＭＥ  Ｆｃ」と呼ばれる場合がある。
【０１６９】
図９のパネルＤは、ＬＩＦＲサイトカイン結合モチーフ１−Ｉｇ様−サイトカイン結合モチーフ２（ＣＢＭＩ−Ｉｇ様−ＣＢＭＩＩ）バリアント（ＶＰＲＶＶＡＩＤ）Ｆｃ融合ホモ二量体を概略的に示し、ここで、二量体化は、Ｆｃドメインを介して行われる。この構築物は、「ＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤ  Ｆｃ」と呼ばれる場合がある。
【０１７０】
図９のパネルＥに概略的に示されるのは、５ｘ  Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーを介してｇｐ１３０  ＣＢＭ  ＥＬＤＭＥバリアントに融合したＬＩＦＲ  ＣＢＭＩ−Ｉｇ様−ＣＢＭＩＩ  ＶＰＲＶＶＡＩＤバリアントを各単量体が含む、ホモ二量体である。Ｆｃドメインは、ｇｐ１３０部分に対してＣ末端にあり、二量体化は、Ｆｃドメインを介して行われる。この構築物は、「ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０  Ｖ−Ｅ融合対Ｆｃ」と呼ばれる場合がある。
【０１７１】
図９のパネルＦは、Ｆｃドメインを介して二量体化された、パネルＣに示されるｇｐ１３０  ＥＬＤＭＥ  Ｆｃ単量体とパネルＤに示されるＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤ  Ｆｃ単量体とを含むヘテロ二量体を概略的に示す。
【０１７２】
図９のパネルＣ〜Ｆに概略的に示される構築物の各々は、首尾よく発現され、精製された。
【０１７３】
可溶性ＬＩＦに対する、精製されたＬＩＦ阻害剤の結合を、ＫｉｎＥｘＡを使用して試験した。図１０には、（１）各単量体としてＷＴ  ＬＩＦＲ  ＣＢＭＩ−Ｉｇ様−ＣＢＭＩＩ  Ｆｃ融合体を有するホモ二量体、（２）各単量体としてＬＩＦＲ  ＶＰＲＶＶＡＩＤ  Ｆｃを有するホモ二量体、および（３）各単量体としてＬＩＦＲ−ｇｐ１３０  Ｖ−Ｅ融合体Ｆｃを有するホモ二量体に対する結合結果が示される。ＫＤ値は、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアから計算され、近似曲線が示される。ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃは、ヒトＬＩＦに対して２３ｐＭの親和性、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃと比較して４３倍の改善を有する。
【０１７４】
実施例５−複数ＬＩＦの結合アッセイ
結合アッセイを図１１のパネルＡに概略的に示されるように実施し、ＬＩＦに結合した受容体デコイがもう１つのＬＩＦ分子にも係合することができるかどうかを決定した。目標は、Ｆｃ融合体としてホモ二量体である阻害剤が、二量体の各アームで同時にＬＩＦに結合することができるかどうかを示すことであった。このアッセイによって、ＬＩＦが、酵母表面上に提示される。Ｆｃ融合体阻害剤（ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃが示されている）を飽和濃度で導入し、提示されたリガンドに結合させ、過剰分は洗い流される。次に、可溶性ＬＩＦ−Ｈｉｓを、Ｆｃ融合体結合酵母と共培養する。ＬＩＦ結合は、ＬＩＦ−ＨｉｓのＨｉｓ−タグドメインを介して検出され、これは、「ブリッジ」として作用するホモ二量体を用い、Ｆｃ融合体に対する複数のＬＩＦ結合が起こる場合にのみ存在するはずである。
【０１７５】
複数ＬＩＦの結合アッセイの結果を図１１のパネルＢに示す。ＬＩＦが酵母上に提示され、Ｆｃ融合体阻害剤が、提示されたＬＩＦと可溶性ＬＩＦとの間の結合ブリッジとして使用された。各条件での抗Ｈｉｓ６タグ蛍光抗体からの蛍光発光は、ＬＩＦ−Ｈｉｓを添加していない対照に対して正規化された。提示されたＬＩＦに対するＦｃ融合体結合も、抗Ｆｃタグ蛍光抗体を使用して確認された（図１２のパネルＢに示されるデータ）。ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０融合体−Ｆｃ、および抗ＬＩＦ  ｍＡｂ  Ｌ１についての複数ＬＩＦの結合結果を示す。
【０１７６】
これらの結果から、試験した４種類すべてのホモ二量体が、複数のＬＩＦ分子に結合することができることが決定される。組換えＬＩＦＲ−Ｆｃは、おそらくＬＩＦに対する改善された親和性および遅いオフレート（実施例６で説明される）に起因して、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃと比較して改善された複数ＬＩＦ結合を示す。ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０融合体−Ｆｃは、おそらく４つのＬＩＦ結合ドメインが存在することに起因して、最大の複数ＬＩＦ結合能を示す。両方の組換えＦｃ融合体は、抗ＬＩＦ  ｍＡｂ、Ｌ１と比較した場合、潜在的に高い親和性に起因して、より大きな複数ＬＩＦ結合を示す。全体として、これらの結果は、Ｆｃ融合体として、阻害剤が、２：１のＬＩＦ：阻害剤の化学量論でＬＩＦに結合することができることを暗示しており、複数ＬＩＦの結合および隔離を介するさらに大きな治療利益の可能性を与える。
【０１７７】
実施例６−競合ＬＩＦ結合アッセイ
結合アッセイを図１２のパネルＡに概略的に示されるように実施し、ＬＩＦに結合した受容体デコイが、過剰な可溶性ＬＩＦ競合剤の存在下でどの程度ＬＩＦに結合したままであるかを決定した。目標は、組換え受容体が、過剰な競合剤による競合に対する改善された耐性によって示されるように、より遅いオフレート（off-rate）を引き起こすかどうかを決定することであった。このアッセイによって、ＬＩＦが、酵母表面上に提示される。Ｆｃ融合体阻害剤（ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃが示されている）を飽和濃度で導入し、提示されたリガンドに結合させ、過剰分は洗い流される。次に、可溶性ＬＩＦ−Ｈｉｓを、Ｆｃ融合体結合酵母と共培養する。Ｆｃ融合体結合は、阻害剤のＦｃドメインを介して検出され、これは、高濃度の可溶性ＬＩＦ−Ｈｉｓによって競合され、酵母提示されたＬＩＦから分離され得る。
【０１７８】
競合ＬＩＦ結合アッセイの結果を図１２のパネルＢに示す。ＬＩＦが酵母上に提示され、結合パートナーとしてＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０融合体−Ｆｃ、または抗ＬＩＦ  ｍＡｂであるＬ１が添加された。過剰な阻害剤を洗い流し、可溶性ＬＩＦを競合体として２４時間添加した。各条件での抗Ｆｃ蛍光抗体からの蛍光発光は、過剰な阻害剤が除去されず可溶性ＬＩＦが添加されていない対照に対して正規化された。
【０１７９】
これらの結果から、組換えＬＩＦＲ−ＦｃおよびＬＩＦＲ−ｇｐ１３０融合体−Ｆｃが、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃと比較したときに、劇的に改善されたオフレートを有すると決定される。このことは、高レベル（１００ｎＭ）のＬＩＦ−Ｈｉｓ競合剤存在下で最も顕著であり、組換え受容体は、５０％より多くが結合したままであり、一方、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃは、酵母提示されたＬＩＦからほぼ完全に競合で分離している。結合したままのＦｃ融合体の相対量は、抗ＬＩＦ  ｍＡｂ、Ｌ１に匹敵する。組換えＦｃ融合体によって示される改善されたオフレートは、おそらく改善された親和性を部分的に説明し、より大きな治療有効性につながるはずである。
【０１８０】
実施例７−同時受容体結合アッセイ
結合アッセイを図１３のパネルＡに概略的に示されるように実施し、ＬＩＦに結合した受容体デコイがｇｐ１３０またはＬＩＦＲとも同時に係合することができるかどうかを決定した。目標は、阻害剤が、ＬＩＦに結合することにおいて、ＬＩＦＲ、ｇｐ１３０、またはその両方と競合するかどうかを示すことであった。このアッセイによって、ｇｐ１３０（示されている）またはＬＩＦＲが、酵母表面上に提示される。ＬＩＦを飽和濃度で導入し、提示された受容体に結合させ、過剰分は洗い流される。次いで、阻害剤（ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃが示される）を、ＬＩＦ結合酵母と共培養する。結合は、阻害剤のＦｃドメインを介して検出され、これは、「ブリッジ」としてＬＩＦを使用して同時受容体結合が起こる場合にのみ存在するはずである。阻害剤の結合が検出されない場合は、提示された受容体が共にインキュベートされた阻害剤と競合関係にあり、したがってＬＩＦに対する阻害剤の結合を妨げていると決定される。
【０１８１】
同時結合アッセイの結果を図１３のパネルＢに示す。ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０のいずれかが酵母上に提示され、ヒトＬＩＦが結合ブリッジとして使用された。蛍光発光は、ＬＩＦを添加していない対照に対して正規化された、抗Ｆｃ蛍光抗体の読み取り値である。提示された受容体に対するＬＩＦ結合も、抗Ｈｉｓ６タグ蛍光抗体を使用して確認された（データは示されず）。ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ、ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロ二量体Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ホモ二量体融合体−Ｆｃ、抗ＬＩＦ  ｍＡｂ  Ｌ１、および抗ＬＩＦ  ｍＡｂ  Ｇ１の同時結合の結果が示される。
【０１８２】
これらの結果から、ＬＩＦＲ−ＦｃがＬＩＦ−ｇｐ１３０複合体に結合することができ（およびはるかに少ない程度で、そしていくぶん驚くべきことに、ＬＩＦ−ＬＩＦＲ複合体とも）、一方、ｇｐ１３０−Ｆｃは、ＬＩＦ−ＬＩＦＲ複合体にのみ結合することができると決定される。このことは、ＬＩＦＲ−Ｆｃが、ＬＩＦＲがＬＩＦに結合することを効果的にブロックし、一方、ｇｐ１３０−Ｆｃは、ｇｐ１３０がＬＩＦに結合することをブロックすることを意味する。両方の受容体（ヘテロ二量体Ｆｃおよび融合体Ｆｃ）を有するポリペプチドは、両方の提示された受容体に対する同時結合を比較的等しい程度で示す。抗ＬＩＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｌ１およびＧ１は、各１つの提示された受容体ＬＩＦ複合体−すなわちそれぞれｇｐ１３０−ＬＩＦまたはＬＩＦＲ−ＬＩＦとしか同時に結合することができない。このことは、Ｌ１が、ＬＩＦＲと競合し（ＬＩＦＲが提示されるときに阻害剤の結合が観察されない）、一方、Ｇ１は、ｇｐ１３０と競合する（ｇｐ１３０が提示されるときに阻害剤の結合が観察されない）ことを意味する。したがって、阻害機構の観点から、Ｌ１はＬＩＦＲ−Ｆｃに匹敵し、一方、Ｇ１はｇｐ１３０−Ｆｃに匹敵する。すべての場合において、ＬＩＦが存在しない状態では結合が観察されず、このことは、同時結合にＬＩＦが必要であることを示す。
【０１８３】
実施例８−競合結合アッセイ
競合結合アッセイを図１４のパネルＡに概略的に示されるように実施した。このアッセイによれば、野生型ｇｐ１３０またはＬＩＦＲ（示される）が酵母表面上に提示される。ヒトＬＩＦ−Ｈｉｓが飽和濃度で導入される。次いで、阻害剤（ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃが示される）を、過剰量で、ＬＩＦ結合酵母と共培養する。ＬＩＦ結合は、ＬＩＦ上のＨｉｓ６−タグを介して検出される。阻害剤インキュベーション後に結合したままのＬＩＦが少ないほど、阻害剤は、よりよく競合してＷＴ受容体からＬＩＦを離すことができている。
【０１８４】
競合結合アッセイの結果を図１４のパネルＢに示す。野生型ＬＩＦＲまたはｇｐ１３０のいずれかが酵母上に提示され、ヒトＬＩＦ−Ｈｉｓで飽和された。結合した比率は、阻害剤無添加に対して正規化された、ＬＩＦ−Ｈｉｓから検出された蛍光発光である。ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃ、ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ−Ｆｃ（組換え）、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ（組換え）、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０融合体−Ｆｃ（組換え）、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロ二量体Ｆｃ（組換え）、抗ＬＩＦ  ｍＡｂ  Ｌ１、および抗ＬＩＦ  ｍＡｂ  Ｇ１の競合結合が示される。
【０１８５】
これらの結果から、野生型ＬＩＦＲ−Ｆｃは競合して野生型ＬＩＦＲから、そして予想外にｇｐ１３０からも、ＬＩＦを分離させると決定される。組換えＬＩＦＲ−Ｆｃは、この観点で野生型ＬＩＦＲ−Ｆｃよりも改善されており、強力に競合してＬＩＦをＬＩＦＲおよびｇｐ１３０の両方から分離させることができる。組換えｇｐ１３０−Ｆｃは、ｇｐ１３０とはよく競合してＬＩＦを分離させるが、予想されるように、ＬＩＦＲがＬＩＦに結合する能力には影響を有さない。ホモ二量体およびヘテロ二量体の両方としてのＬＩＦＲおよびｇｐ１３０の融合体は、同じ阻害剤中に両方の組換え受容体を有することによって予想されるように、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０の両方と競合してＬＩＦを分離させる強い能力を示す。抗ＬＩＦモノクローナル抗体Ｌ１およびＧ１は、各１つの受容体、すなわちそれぞれＬＩＦＲおよびｇｐ１３０のみと効果的に競合してＬＩＦを分離させるが、実際のところ、逆の受容体すなわちそれぞれｇｐ１３０およびＬＩＦＲに対するＬＩＦ結合は強化させている。
【０１８６】
実施例９−ＨｅＬａルシフェラーゼレポーター細胞における下流ＬＩＦシグナル伝達の遮断
ＬＩＦは、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０に結合し、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０のヘテロ二量体化を引き起こす。二量体化によって、ＪＡＫが動員され、ＳＴＡＴ３をリン酸化する。これにより、ＳＴＡＴ３の二量体化、核への侵入、およびＳＴＡＴ３応答エレメントを介した転写プログラミングの活性化が起こる。ＳＴＡＴ３応答エレメントによって先行されるルシフェラーゼの遺伝子を含むように細胞株を改変して、ｐＳＴＡＴ３の活性化によってルシフェラーゼが産生するようにすることができる。この状況では、ルシフェリンを用いる標準的なルシフェラーゼアッセイを使用して決定されるルシフェラーゼ活性は、細胞内のＬＩＦシグナル伝達と直接的に相関し得る。図１５のパネルＡは、ＨｅＬａ細胞におけるこのＬＩＦレポーター細胞系を概略的に示す。
【０１８７】
図１５のパネルＢに示されるのは、ルシフェラーゼアッセイからの結果であり、ＨｅＬａレポーター細胞は、０．５ｎＭのＬＩＦおよび異なる濃度のＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ  Ｆｃ、およびＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃに曝露された。細胞を５時間インキュベートした後、溶解させ、ルシフェラーゼアッセイを行った。結果は、阻害剤無添加に対して正規化される。図１５のパネルＣは、遅延阻害剤添加アッセイからの結果を示す。このアッセイによれば、０．５ｎＭのＬＩＦがＨｅＬａレポーター細胞に１．５時間添加され、次いで、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃ、またはＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ  Ｆｃのいずれかを５ｎＭ、２５ｎＭ、または５０ｎＭでウェルに直接添加する。ルシフェラーゼレベルは、ＬＩＦ添加から２０時間後に測定される。結果は、ベースラインを差し引き、阻害剤無添加に対して正規化される。図１５のパネルＤは、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ＦｃについてのＩＣ５０を、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃと比べて決定するための広範囲の阻害剤濃度にわたるＬＩＦ由来ルシフェラーゼ阻害を示す。組換え後、改善された阻害の５３倍のシフトが観察される。図１５のパネルＥは、ＨｅＬａレポーター細胞が、ＬＩＦの近縁種であるオンコスタチン−Ｍ（ＯＳＭ）を含め複数のＩＬ−６ファミリーメンバーサイトカインに応答する能力を利用する。細胞を、０．５ｎＭのＬＩＦまたはＯＳＭおよび１μＭのＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ＦｃまたはＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃのいずれかと共に５時間インキュベートし、ルシフェラーゼレベルを測定した。
【０１８８】
まとめると、これらの結果は、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ＦｃおよびＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ  Ｆｃが、低い濃度であっても、ＬＩＦが媒介する下流のシグナル伝達を強力に低減させ、ＬＩＦが媒地中に既に存在した後に添加される場合に、ＬＩＦシグナル伝達を大幅にブロックすることができることを示し、これは治療薬のための有望な兆候である。ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃと比較した場合、両方の組換え阻害剤がはるかに優れた阻害を示し、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃと比べてＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ＦｃによるＩＣ５０に５３倍の改善があったほどである。ＷＴおよび組換えＬＩＦＲ−Ｆｃの両方が、ＬＩＦに対して高度な特異性を示し、ＯＳＭはＬＩＦＲに結合することができるという事実にもかかわらず、高い受容体濃度であっても、ＯＳＭ由来ルシフェラーゼシグナルの低減は示さない。組換え阻害剤が、その高い親和性に起因して、ＷＴよりも、ＬＩＦに対してさらに選択的であるという事実は、治療薬としてのこの組換えトラップに付随するオフターゲット毒性がない可能性が高いことを示す。
【０１８９】
実施例１０−膵臓がん細胞におけるＬＩＦシグナル伝達の除去
ＬＩＦは、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０に結合し、ＬＩＦＲおよびｇｐ１３０のヘテロ二量体化を引き起こす。二量体化によって、ＪＡＫが動員され、チロシン７０５上のＳＴＡＴ３をリン酸化する。これにより、ＳＴＡＴ３の二量体化、核への侵入、および転写プログラミングの活性化が起こる。したがって、ｐＳＴＡＴ３−Ｙ７０５は、ＬＩＦシグナル伝達の読み取り値である。図１６のパネルＡは、ＬＩＦシグナル伝達を概略的に示す。
【０１９０】
図１６のパネルＢに示されるのは、１３５ｐＭのヒトＬＩＦおよび異なる濃度のＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−Ｆｃ（「ＬＩＦＲ  Ｆｃ組換え」）、ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃ（「ＬＩＦＲ  Ｆｃ  ＷＴ」）、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ  Ｆｃ（「融合体Ｆｃ組換え」）、およびＬ１抗ＬＩＦ  ｍＡｂ（「抗ＬＩＦ  ｍＡｂ」）に曝露されたＰＡＮＣ１（ヒト膵臓がん細胞株）由来の溶解物のウェスタンブロットの結果である。細胞を３７℃で２０分間インキュベートした後、プロテアーゼおよびホスファターゼの阻害剤の存在下で溶解した。タンパク質濃度を正規化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ゲル上に流した。ウェスタンブロットでホスホ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）、ＳＴＡＴ３（全体）、およびβ−チューブリンの染色が行われた。図１６のパネルＣは、チューブリンシグナルに対して正規化された、ｐＳＴＡＴ３シグナルの定量化を示す。
【０１９１】
これらの結果は、わずか約３倍過剰量でインキュベートされた場合であっても、ＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ＦｃおよびＬＩＦＲ−ＶＰＲＶＶＡＩＤ−ｇｐ１３０−ＥＬＤＭＥ  Ｆｃが、がん細胞においてＬＩＦが媒介するｐＳＴＡＴ３レベルを減少させることができ、治療に関連するようにより過剰量でインキュベートされる場合には、ＬＩＦシグナル伝達を完全に除去することができることを示す。阻害の程度は、定量化（パネルＣ）に示されるように、抗ＬＩＦ  ｍＡｂ、Ｌ１よりも改善されている。ＬＩＦＲ−ＷＴ−Ｆｃは、ＬＩＦ由来のシグナル伝達をブロックする効果がはるかに低く、このことは、親和性操作によって得られる利点を示している。強力なシグナル阻害は、ＫＰ４ヒト膵臓がん細胞（図示せず）でも観察された。
【０１９２】
このように、上述の内容は、単に本開示の原理を説明しているにすぎない。本明細書に明示的に記載または図示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を当業者であれば工夫することができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術分野の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図する。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすあらゆる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載の例示的な実施形態に限定されることを意図しない。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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