(57)【要約】【課題】単離抗体、医薬組成物、単離抗体結合体、ダイマー化阻害方法、シグナル伝達阻害方法、管新生阻害方法、治療方法、および断片検出方法を提供する。【解決手段】本発明は、配列番号１または配列番号３を有する重鎖可変領域配列由来の重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２、および重鎖相補性決定領域３、配列番号２または配列番号４を有する軽鎖可変領域配列由来の軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２、および軽鎖相補性決定領域３を含み、血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）および血管内皮成長因子受容体−３（ＶＥＧＦＲ３）の両方に特異的に結合する単離抗体である。この単離抗体は、腫瘍増殖および腫瘍拡散の抑制をもたらす新たなメカニズムとなり得る。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号３を有する重鎖可変領域配列由来の重鎖相補性決定領域１、重鎖相補性決定領域２、および重鎖相補性決定領域３と、
配列番号２または配列番号４を有する軽鎖可変領域配列由来の軽鎖相補性決定領域１、軽鎖相補性決定領域２、および軽鎖相補性決定領域３とを含み、
血管内皮増殖因子受容体−２および血管内皮増殖因子受容体−３の両方に特異的に結合する、単離抗体。
【請求項２】
前記重鎖相補性決定領域１、前記重鎖相補性決定領域２、および前記重鎖相補性決定領域３が配列番号１由来であり、
前記軽鎖相補性決定領域１、前記軽鎖相補性決定領域２、および前記軽鎖相補性決定領域３が配列番号２由来である、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
前記重鎖相補性決定領域１が配列番号５または配列番号８由来であり、
前記重鎖相補性決定領域２が配列番号６または配列番号９由来であり、
前記重鎖相補性決定領域３が配列番号７由来であり、
前記軽鎖相補性決定領域１、前記軽鎖相補性決定領域２および前記軽鎖相補性決定領域３がそれぞれ配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２由来である、請求項２に記載の単離抗体。
【請求項４】
前記重鎖相補性決定領域１、前記重鎖相補性決定領域２、および前記重鎖相補性決定領域３が配列番号３由来であり、
前記軽鎖相補性決定領域１、前記軽鎖相補性決定領域２、および前記軽鎖相補性決定領域３が配列番号４由来である、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項５】
前記重鎖相補性決定領域１が配列番号１３または配列番号１６由来であり、
前記重鎖相補性決定領域２が配列番号１４または配列番号１７由来であり、
前記重鎖相補性決定領域３が配列番号１５由来であり、
前記軽鎖相補性決定領域１、前記軽鎖相補性決定領域２および前記軽鎖相補性決定領域３がそれぞれ配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０由来である、請求項４に記載の単離抗体。
【請求項６】
Ｆｃ領域、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体、ｓｃＦＶ多量体、一価抗体、多重特異性抗体、またはキメラ抗体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項７】
ヒト化抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の単離抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体および別の分子を含む、単離抗体結合体。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体と細胞を接触させることを含み、
細胞における血管内皮増殖因子受容体−２および／または血管内皮増殖因子受容体−３のホモダイマー化、または、前記血管内皮増殖因子受容体−２および前記血管内皮増殖因子受容体−３のヘテロダイマー化を阻害する、ダイマー化阻害方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体と細胞を接触させることを含み、
細胞における血管内皮増殖因子受容体−２および／または血管内皮増殖因子受容体−３シグナル伝達を阻害する、シグナル伝達阻害方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体の有効量をヒトを除く対象に投与することを含み、
前記投与を必要とする前記ヒトを除く対象における血管新生および／またはリンパ管新生を阻害する、管新生阻害方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体の有効量をヒトを除く対象に投与することを含み、
前記投与を必要とする前記ヒトを除く対象における固形腫瘍を治療する、治療方法。
【請求項１４】
前記固形腫瘍が、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、皮膚がん、中皮腫、肺がん、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、および甲状腺がんからなる群より選択される、請求項１３に記載の治療方法。
【請求項１５】
前記ヒトを除く対象に、別の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１３に記載の治療方法。
【請求項１６】
生物学的試料の中の血管内皮増殖因子受容体−２および／または血管内皮増殖因子受容体−３またはそれらの断片を検出する方法であって、
前記生物学的試料を請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体と接触させ、前記単離抗体と前記血管内皮増殖因子受容体−２および／または血管内皮増殖因子受容体−３またはそれらの断片との間の特異的結合についてアッセイする、断片検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２０１８年３月２０日に出願された米国仮出願第６２／６４５，４３７号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、単離抗体に関し、特に血管内皮増殖因子受容体−２および血管内皮増殖因子受容体−３の両方を標的とする単離抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とリンパ管新生は腫瘍発生に必須であり、疾患悪性度との関連性が高い。生物活性はすべて、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が対応する受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合し、次に受容体の二量体化、自己リン酸化、および下流シグナル伝達の活性化を誘導することに依存する。その結果起こる作用は、細胞増殖、細胞遊走、血管透過性、新生血管の生存につながる。非特許文献１を参照されたい。
ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃは、血管新生とリンパ管形成を担う主要なＶＥＧＦリガンドと考えられている。これまでの前臨床試験において、その受容体であるＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３へのエフェクター結合の遮断は、腫瘍増殖の顕著な阻害につながることが示されている。しかしながら、ＶＥＧＦ−Ａを遮断するためのモノクローナル抗体ベバシズマブ（アバスチン）による治療は、一部のがんにおいて進行を遅延させ、生存期間を延長させたのみであった。非特許文献２および３を参照されたい。
腫瘍悪性腫瘍の臨床的失敗を引き起こす主な要因は、がん細胞がリンパ節や遠隔部位に転移する経路となるリンパ管の増殖（リンパ管新生）を遅らせることができないことである。非特許文献４を参照されたい。
したがって、リンパ管新生の選択的阻害薬は血管新生阻害薬を補完すると考えられるが、臨床使用に利用できるものはまだない。
【０００３】
現在、ＶＥＧＦＲシグナル伝達活性化をブロックするための３つの戦略が開発されている。細胞増殖抑制作用機序による抗血管新生リガンドとしてのベバシズマブの他に、ＶＥＧＦと結合するキメラデコイ受容体であるアフリベルセプトが、進行した臨床試験中である。非特許文献５および６を参照されたい。
第二のクラスの阻害剤は、ＰＴＫ７８７、Ｓｕｔｅｎｔ、ソラフィニブ、Ｚａｃｔｉｍａ、およびＲｅｃｅｎｔｉｎのようなＶＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼ活性を阻害するための低分子に属する。非特許文献７−１１を参照されたい。
ラムシルマブ（登録商標）（Ｃｙｒａｍｚａ）およびＣＤＰ−７９１を含む他の高分子治療薬は、ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦＲ−２との相互作用を遮断するために使用される。非特許文献１２および１３を参照されたい。
これらの薬剤は選択的であり、忍容性が良好であり、一般に、正常臓器におけるＶＥＧＦ阻害の結果に限定した副作用はわずかである。
【０００４】
ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）はＶＥＧＦＲ１、２、および３からなるより広いファミリーの受容体チロシンキナーゼであり、それぞれＦｌｔ−１、ＫＤＲ、およびＦｌｔ−４としても知られる。このファミリーの構造および機能ドメインは非常に類似しており、リガンド結合のための７つの細胞外免疫グロビン様（Ｉｇ）ドメイン、細胞表面ドッキングのための膜貫通ドメイン、および受容体トランス自己リン酸化のための二重チロシンキナーゼドメインを含む。ＶＥＧＦ−Ａおよび胎盤成長因子などのリガンドはＩｇドメイン２および３内のＶＥＧＦＲに結合し、ドメイン２が一次接触し、ドメイン３が結合の特異性を決定する。非特許文献１４および１５を参照されたい。
対照的に、Ｉｇドメイン４−６は受容体複合体の二量体化に関与している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００６．７（５）：ｐ．３５９−７１．
【非特許文献２】Ｍｕｋｈｅｒｊｉ，Ｓ．Ｋ．，ＡＪＮＲ  Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ，２０１０．３１（２）：ｐ．２３５−６．
【非特許文献３】Ｂａｇｒｉ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１０．１６（３）：ｐ．１２２−３２．
【非特許文献４】ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１０．１８（６）：ｐ．５４１−３．
【非特許文献５】Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２００６．３３  （５  Ｓｕｐｐｌ  １０）：ｐ．Ｓ１−７．
【非特許文献６】Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２．９９（１７）：ｐ．１１３９３−８．
【非特許文献７】Ｗｅｄｇｅ，Ｓ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００２．６２（１６）：ｐ．４６４５−５５．
【非特許文献８】Ｗｅｄｇｅ，Ｓ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５．６５（１０）：ｐ．４３８９−４００．
【非特許文献９】Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０００．６０（８）：ｐ．２１７８−８９．
【非特許文献１０】Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００３．９（１）：ｐ．３２７−３７．
【非特許文献１１】Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｓ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００４．６４（１９）：ｐ．７０９９−１０９．
【非特許文献１２】Ｋｒｕｐｉｔｓｋａｙａ，  Ｙａｎｄ  Ｈ．ＡＷａｋｅｌｅｅ，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ，２００９．１０（６）：ｐ．５９７−６０５．
【非特許文献１３】Ｌｕ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００３．２７８（４４）：ｐ．４３４９６−５０７．
【非特許文献１４】Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００４．２７９（１１）：ｐ．１０３８２−８．
【非特許文献１５】Ｆｕｈ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９８．２７３（１８）：ｐ．１１１９７−２０４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
レセプタの二量体化とトランスホスホリル化は理論上、持続的な下流シグナル伝達を生み出すために必要であるので、レセプタが仲介する血管新生またはリンパ管形成活性はリガンド−レセプタ結合を阻害するか、二量体化を遮断することによって阻害することができる。
【０００７】
特に、二量体化の阻害を介したＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達の遮断は、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３のホモ二量体化を妨げるだけでなく、ＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ３のヘテロ二量体化を妨害する。したがって、この戦略はＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３媒介シグナル伝達の同時阻害の可能性があり、腫瘍増殖および腫瘍拡散の抑制をもたらす新たなメカニズムとなり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの局面において、本明細書に記載されるのは配列番号１または３を有する重鎖可変領域配列からの重鎖相補的決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２または４を有する軽鎖可変領域配列からの軽鎖相補的決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む単離された抗体である。ここで、抗体は血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）および血管内皮成長因子受容体−３（ＶＥＧＦＲ３）の両方に特異的に結合する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は配列番号１に由来し、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は配列番号２に由来し、抗体は配列番号１の配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である重鎖可変領域、および配列番号２の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である軽鎖可変領域を含むことができる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は配列番号５または８を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号６または９を有し、重鎖ＣＤＲ３は配列番号７を有し、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１０、１１、および１２を有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は配列番号３に由来し、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は配列番号４に由来する。抗体は配列番号３の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である重鎖可変領域、および配列番号４の配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である軽鎖可変領域を含むことができる。
【００１２】
いくつかの実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は配列番号１３または１６を有し、重鎖ＣＤＲ２は配列番号１４または１７を有し、重鎖ＣＤＲ３は配列番号１５を有し、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１８、１９、および２０を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗体がＦｃ領域、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体、ｓｃＦＶ多量体、一価抗体、多重特異性抗体、またはキメラ抗体を含む抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【００１４】
別の局面において、本明細書に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００１５】
さらに別の局面において、本明細書中に記載の抗体および別の分子（例えば、小分子薬物、細胞標的化部分、細胞傷害剤、ポリペプチド、核酸分子、検出可能な標識、またはポリマー）を含む抗体結合体を記載する。
【００１６】
１つの局面において、細胞におけるＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３のホモダイマー化またはＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３のヘテロダイマー化を阻害する方法を、本明細書中に記載する。この方法は、細胞を本明細書中に記載される抗体と接触させる工程を含む。
【００１７】
１つの局面において、本明細書中で意図するのは、細胞を本明細書中に記載される抗体と接触させることを含む、細胞におけるＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３シグナル伝達を阻害する方法である。
【００１８】
別の局面において、本明細書中で提供するのは、それを必要とする被験体における血管新生および／またはリンパ管新生を阻害する方法であって、本明細書中に記載される抗体の有効量を被験体に投与することを含む方法である。
【００１９】
さらに別の局面において、本明細書に記載するのは、それを必要とする被験体において固形腫瘍を処置する方法である。この方法は、本明細書中に記載される抗体の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、固形腫瘍は、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、皮膚がん、中皮腫、肺がん、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、および甲状腺がんからなる群より選択される。この方法は、被験体に別の治療剤を投与する工程をさらに包含し得る。
【００２０】
１つの局面において、本明細書中で提供するのは、生物学的サンプル中のＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３またはそのフラグメントを検出する方法であって、サンプルを本明細書中に記載される抗体と接触させる工程、ならびに抗体とＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３またはそのフラグメントとの間の特異的結合についてアッセイする工程を含む方法である。
【００２１】
１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の説明に記載する。実施形態の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の両方の認識を示すためのフローサイトメトリ  ヒストグラムのセットである。パネルＡおよびＢは、それぞれ、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒトリンパ管内皮細胞（ＨＬＥＣ）である。無傷の初代培養細胞の第３−第６世代を実験に使用した。パネルＣおよびＤ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、それぞれＶＥＧＦＲ２（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ２）およびＶＥＧＦＲ３（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ３）を過剰に表現している。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は上記の通り、ヒトＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３遺伝子と安定的に接合された。ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３の高発現を有するトランスフェクタントを、ＢＤ  ＦＡＣＳＪａｚｚ（登録商標）セルソーターを用いて、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体（ＡＢＣＡＭ（登録商標）９５３０）またはＶＥＧＦＲ３に対する抗体（Ｒ＆Ｄ５４７０３）によってそれぞれ免疫選択した。無傷の初代細胞またはトランスフェクタント（１×１０5細胞／反応）をＲ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１（１０μｇ／ｍＬ、矢印）で染色し、ＩｇＧ2aアイソタイプ抗体（ＣＴＬ）を陰性対照とした。ラムシルマブ（登録商標）（ＲＡＭ）（１０μｇ／ｍＬ）はＶＥＧＦＲ２陽性対照として作用した。さらに、二次抗体単独で染色された細胞をバックグラウンドとみなし、染色された陽性細胞を全細胞のパーセンテージとして表した（パネルＣおよびＤ、上）。図中、「Ｃｅｌｌｓ」は「細胞」を意味する。
【図２】ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の受容体二量体化の遮断を示す一連のブロットおよびグラフである。パネルＡ、同時免疫沈降、高レベルのＶＥＧＦＲ３および低レベルのＶＥＧＦＲ２（１×１０10／反応）を発現するＨＥＬ９２．１．７赤白血病細胞を、３７℃で２４時間、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１またはラムシルマブ（登録商標）（２０μｇ／ｍＬ、ＲＡＭ）で未処理または処理した。ＩｇＧ2aアイソタイプ抗体は、陰性対照（ＣＴＬ）として役立った。トリシン処理および遠心分離後、細胞を１％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、グリシン溶液で中和し、ＰＢＳで洗浄した。可溶性画分を遠心分離によって得、ＶＥＧＦＲ２に対する抗体（ＡＢＣＡＭ（登録商標）９５３０）２５μｇを添加し、室温で２時間インキュベートした。抗体結合タンパク質複合体をプロテインＡ／Ｇによって免疫沈降させ（ＩＰ）、ＨＥＬ９２．１．７細胞のＶＥＧＦＲ３について免疫ブロットした（ＷＢ）（左）。全可溶性画分を、ＶＥＧＦＲ３およびβ−アクチンに特異的な抗体で免疫プローブし、等しい負荷を示した。同様に、ＶＥＧＦＲ３を引き下げ、ＶＥＧＦＲ２のブロットを行うため、ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ２細胞をＶＥＧＦＲ３の遺伝子エンコーディングによりトランスフェクトした（右）。２４時間のトランスフェクション後、トランスフェクタントを未処理とし、またはＲ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、またはラムシルマブ（登録商標）（２０μｇ／ｍＬ、ＲＡＭ）で処理し、免疫沈降手順を以前に記載したように行った。パネルＢ、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）。ＶＥＧＦＲ２及び／又はＶＥＧＦＲ３の受容体二量体化に対するＲ２Ｃ７−１及びＲ２Ｃ９−１１ｍＡｂ（各１０μｇ／ｍＬ）の阻害作用がＰＬＡにより検討された。細胞を播種し、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１またはラムシルマブ（登録商標）（ＲＡＭ）の存在下、無血清培地中で１６時間培養した。その後、細胞をＶＥＧＦ−Ａ165またはＶＥＧＦ−Ｃで活性化した。それぞれの実験を３連で行い、代表的な画像は蛍光産物の存在によって示されるように、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３のホモ二量体化またはヘテロ二量体化の近接（＜４０ｎｍ）を示した。核をＤＡＰＩで染色した。シグナルを可視化し、４０倍の倍率で、蛍光顕微鏡で画像Ｊ解析によって定量した。結果は抗体処理なしの細胞（ＣＴＬ）の割合の平均±Ｓ．Ｄ．として表される。さらに、アイソタイプ対照（ＩｇＧ2a）で処理した細胞も別の対照として用いた。ＶＥＧＦ−Ａ／−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ａ、またはＶＥＧＦ−Ｃで刺激されていない細胞を、それぞれブランク、二重交差、または灰色の棒で示した。抗体で処理した細胞と未処理の細胞との間の統計的有意性を、ｔ検定によって決定した。「＊」Ｐは＜０．０５を表す。図中、「Ｕｎ−ｔｒｅａｔｅｄ」は「未処理」を意味する。
【図３】ＶＥＧＦＲ２抗体によるヒト臍帯静脈およびリンパ管内皮細胞管形成の遮断を示すグラフのセットである。ＨＵＶＥＣ細胞を、ＶＥＧＦおよび他のサプリメントの非存在下で、ＥＧＭ−２中で８時間飢餓させた。トリシル化後、細胞を１０μｇ／ｍＬのラムシルマブ（登録商標）（ＲＡＭ）、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１または抗体アイソタイプ対照（ＩｇＧ2a）を含む培地に懸濁し、その後マトリゲル（登録商標）プレコートウェル上に播種した。続いて、細胞を２μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａ165で、３７℃までの追加の１０時間の間、反応させた。各実験は３回行った。パネルＢ：リンパ管内皮細胞。同様に、ＨＬＥＣ細胞を飢餓させ、上記抗体で前処理し、３７℃で４時間、２μｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ−Ｃで刺激した。画像を撮影し、形成されたチューブメッシュ、マスタージャンクション、チューブの長さ、およびチューブ領域の総数を、画像Ｊの血管新生アナライザーによって定量した。データは抗体−アイソタイプ対照（ＩｇＧ2a）のパーセンテージ（平均±Ｓ．Ｄ．３連）として表す。＊、「＊＊」、および「＊＊＊」はそれぞれ、Ｐ＜０．０５、＜０．０１、および＜０．００１を示す。
【図４】３Ｄ血管新生モデルにおける種々のＶＥＧＦＲ２抗体の阻害効果を示すグラフのセットである。内皮細胞（ＨＵＶＥＣおよびＨＬＥＣ）をＣＦＳＥで標識し、超低９６ウェルプレート上で、３７℃で４８時間培養して細胞スフェロイドを形成した。続いて、回転楕円体を移し、遠心分離および３７℃で３０分間のインキュベーションによってマトリゲル（登録商標）被覆ウェル上に付着させた。マトリゲル（登録商標）包埋後、付着した細胞スフェロイドを、示されるように、１０μｇ／ｍＬのＲ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、ラムシルマブ（登録商標）（ＲＡＭ）、またはＩｇＧアイソタイプ対照（ＣＴＬ）抗体を含有する培地中で培養した。コア回転楕円体の形状を観察し、光顕及び蛍光顕微鏡下で撮影した。培養７日後からＨＵＶＥＣおよびＨＬＥＣの最終画像を得、ＮＩＳ−ＡＲソフトウェアを用いて蛍光強度を分析した。発芽フィブリンの面積および光度を、総面積および光度からコアスフェロイドを差し引くことによって計算した。データは、発芽領域（パネルＡ）および蛍光強度（パネルＢ）における対照のパーセンテージにおける平均±標準偏差を表す。個々のＶＥＧＦＲ２抗体とＣＴＬ抗体との間の統計的有意性を、ｔ検定によって決定した。「＊＊＊」Ｐは＜０．００１を表す。図中、「Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ａｒｅａ」は「発芽面積の割合」を、「Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎ」は「発芽フィブリン強度」を、それぞれ意味する。
【図５】インビボでの血管新生およびリンパ管新生に対する種々のＶＥＧＦＲ２抗体の阻害効果を示すグラフのセットである。ＨＵＶＥＣ（１×１０6）およびＨＬＥＣ（１×１０6）／ＷＩ３８（２×１０5）細胞混合物を、２００μＬの氷冷マトリゲル（登録商標）に懸濁し、２４Ｇインチニードルを有する氷冷注射器を用いて、３匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの右側腹部および左側腹部にそれぞれ皮下接種した。接種翌日、マウスにＲ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、ラムシルマブ（登録商標）（ＲＡＭ）またはＩｇＧ2a対照抗体（ＣＴＬ）（１０ｍｇ／ｋｇ／マウス）を週２回４週間静脈内注射した。重合したマトリゲル（登録商標）を切除し、１０％ホルマリンで一晩固定し、パラフィンに包埋し、厚さ５μｍの組織切片に切断した。ＨＵＶＥＣおよびＨＬＥＣについてはヒトＣＤ３１と同様にＷＩ３８についてもヒトα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）に特異的な抗体を用いた二重染色法を用いて免疫組織化学的解析を行った。ＡＥＣ陽性チューブの数を分析し、ＮＩＳ−ＡＲソフトウェアを用いて定量した。データは３つの独立した実験の対照の割合で平均±Ｓ．Ｄ．で表し、個々のＶＥＧＦＲ２抗体とＣＴＬ抗体の間の統計的有意性をｔ検定により決定した。「＊」、「＊＊」および「＊＊＊」は、それぞれＰ＜０．０５、＜０．０１および＜０．００１を示す。
【図６】ＶＥＧＦＲ２抗体の処理後の大小血管の比率の決定を示すグラフのセットである。マトリゲル（登録商標）／ＨＵＶＥＣ細胞混合物（１×１０6細胞／５００μＬのマトリゲル（登録商標）栓）を、ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスの腹部正中線に皮下接種した。抗体（ＩｇＧ1  ＣＴＬ、ラムシルマブ（登録商標）（ＲＡＭ）、ＩｇＧ2a  ＣＴＬ、Ｒ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１）を、マトリゲル（登録商標）プラグ移植後７、１４、２１および２８日目にマウスに腹腔内注射した（１０ｍｇ／ｋｇ）。マウスを３５日目に屠殺した。組織ゲルプラグを１０％ホルマリンで２４時間固定し、パラフィンに包埋し、５μｍ厚の切片に切断した。ＨＵＶＥＣ細胞のチューブ形成を、抗ヒトＣＤ３１（ｈＣＤ３１）抗体で免疫組織化学的に染色することによって識別し、インビボでの血管新生に対する抗体の抑制効果を分析した。ｈＣＤ３１陽性血管の直径を顕微鏡で測定し、直径＞または＜５０μｍの２群に分類し、各群の血管数を定量し、各抗体処理における血管数（＞５０μｍ）／全血管数の比を左のパネルに示す。容器の数（＜５０μｍ）／全容器の比を右パネルに示す。データは、２つの独立した実験の平均±標準偏差として表される。個々のＶＥＧＦＲ２とそれに対応するＣＴＬ抗体との間の統計的有意性をｔ検定により判定した。「＊」、「＊＊」はＰ＜０．０５、「Ｐ＜０．０１」を示す。図中、「Ｖｅｓｓｅｌ  ｄｉａｍｅｔｅｒ」は「血管の直径」を意味する。
【図７】種々のＶＥＧＦＲ２抗体の抗体依存性細胞傷害性を示す一連のグラフである。パネルＡは、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の発現プロフィールである。ＨＥＬ９２．１．７細胞を、矢印で示すように、ＶＥＧＦＲ２（ＡＢＣＡＭ（登録商標）９５３０）またはＶＥＧＦＲ３（Ｒ＆Ｄ５４７０３）に対する抗体で染色した。抗体アイソタイプ対照（ＣＴＬ）で染色した細胞と比較した場合、これらの受容体の発現レベルのパーセンテージを決定した。パネルＢは、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）である。ＨＥＬ９２．１．７細胞（５×１０4／ウェル、２５μＬ）を９６ウェルプレートに播種した後、設計濃度のＲ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、またはラムシルマブ（登録商標）（それぞれ２５μＬ／ウェル。ＲＡＭ）を加え、３７℃で１５分間培養した。ＰＢＭＣ隔離キット（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を用いてＮＯＤ−ＳＣＩＤの遺伝子から末端血球単細胞（ＰＢＭＣ）を作製し、４．０×１０6細胞／ｍｌの濃度で、４％のベビーラビット用美容液を含んだＲＰＭＩ１６４０用培地で停止した。５０μＬのＰＢＭＣエフェクターを、ＨＥＬ９２．１．７標的細胞の各ウェルと４対１の比で混合した。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）の添加後、細胞混合物を３７℃で２０時間インキュベートした。細胞生存率は、蛍光強度（５６０ｎｍ／５９０ｎｍ）によって決定した。図中、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ」は「抗体濃度」を意味する。
【図８】個々のＶＥＧＦＲ２抗体による腫瘍増殖の抑制を示すグラフのセットである。ＨＥＬ９２．１．７細胞ソーターフローサイトメトリ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＣｙｔｏＦＬＥＸ  Ｓ）を用いて、ＶＥＧＦＲ３の発現量が高い細胞（集団の９５％以上。パネルＡのＶＥＧＦＲ３−Ｈ）を、発現量が低い細胞（集団の５％未満。パネルＢのＶＥＧＦＲ３−Ｌ）から分離し、細胞拡大を行った。高発現細胞と低発現細胞（１×１０6／マウス）を同一マウスの背側側腹部の左右それぞれに皮下注射した。腫瘍接種７日後、５匹／群に指定の抗体処置（ラムシルマブ（登録商標）（ＲＡＭ）、Ｒ２Ｃ７−１又はＲ２Ｃ９−１１）を５ｍｇ／ｋｇ／マウスの用量で週２回、７日目以降２５日間投与した。ＩｇＧ2a−アイソタイプ対照（ＣＴＬ）を投与したマウスを、同じ様式で処置した。個々のマウスの腫瘍体積を週２回測定した。個々の抗体処理と対照との間の腫瘍サイズの平均値（パネルＡおよびパネルＢの挿入物）の差は、マウスを殺処分した後のｔ検定分析により統計的に決定した。「＊」、「＊＊」はＰ＜０．０５、「Ｐ＜０．０１」を示す。図中、「Ｔｕｍｏｒ  ｓｉｚｅ」は「腫瘍の大きさ」を、「Ｄａｙ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ」は「接種からの日数」を意味する。
【図９】腫瘍増殖に対する複合ＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体の阻害効果を示すグラフである。ＨＥＬ９２．３．１細胞（１×１０6／マウス）をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下接種した。示されるように、マウス１０匹／群および合計６群を、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、またはそれらのラムシルマブ（登録商標）（ＲＡＭ）との組み合わせで処置した。腫瘍接種７日後、マウスにＲ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、ラムシルマブ（登録商標）単独（５ｍｇ／ｋｇ／マウス）又はラムシルマブ（登録商標）（５ｍｇ／ｋｇ）とＲ２Ｃ７−１又はＲ２Ｃ９−１１（５ｍｇ／ｋｇ）の併用を週２回、３５日間静脈内投与した。ＩｇＧ2a−アイソタイプ対照（ＣＴＬ）抗体を用いて、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、またはラムシルマブ（登録商標）単独で処置した各々のマウスにおいて、１０ｍｇ／ｋｇまでの抗体の総量をもたらした。個々のマウスの腫瘍体積を、修正楕円公式［腫瘍体積＝１／２（長さ×幅2）］（Ｔｏｍａｙｋｏ  ＭＭ、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＣＰ．，１９８９）に従って測定した。データは腫瘍サイズの平均値（ｉｎｓｅｔ）の平均値±Ｓ．Ｄ．で表し、ＶＥＧＦＲ２抗体とＣＴＬ抗体との統計学的有意性をｔ検定により判定した。「＊」，「＊＊」および「＊＊＊」は、それぞれ、Ｐ＜０．０５、＜０．０１および＜０．００１を表す。図中、「Ｔｕｍｏｒ  ｓｉｚｅ」は「腫瘍の大きさ」を、「Ｄａｙ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ」は「接種からの日数」を意味する。
【図１０】ＶＥＧＦＲ２上のＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１抗体の結合エピトープの特徴付けを示すグラフのセットである。ＶＥＧＦＲ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ２）を９６ウェルプレート上に５×１０4細胞／１００μＬ／ウェルの濃度で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ２細胞をグルタルアルデヒドで固定し、洗浄した後、細胞に結合するためのＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１抗体の最適濃度を、標準的なＥＬＩＳＡ手順を用いて決定した。Ｒ２Ｃ７−１とＲ２Ｃ９１１  ｍＡｂｓの最適濃度（それぞれ２００μｇ／ｍＬと５０μｇ／ｍＬ）は、ＶＥＧＦＲ２（Ｒ２‐ＩｇＤｓ）抗原の個々の免疫グロビン様ドメインの指定用量で吸収された。その後、固定された２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ２細胞を、吸収された抗体と共に３７℃で３０分間インキュベートした。結合した抗体をＨＲＰと結合したヤギ抗マウスＩｇＧでプローブし、ＡＢＴＳを加えて可視化し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダを用いてＯＤ405で測定した。データは、アイソタイプ対照（ＣＴＬ）のパーセントの手段±Ｓ．Ｄ．として三重反復で表される。ＶＥＧＦＲ２抗原上のＲ２Ｃ７−１（上部）およびＲ２Ｃ９−１１（下部）の潜在的なエピトープ位置は、図式においてＩｇＤ６およびＩｇＤ７にわたる黒線によって示される。図中、「Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」は「抑制率」を意味する。
【図１１】ＶＥＧＦＲ３抗原に対するＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１抗体の結合エピトープの決定を示すグラフのセットである。パネルＡは、細胞ベースの競合ＥＬＩＳＡである。ＶＥＧＦＲ３（２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ３）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートにコーティングした。Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１ｍＡｂの最適濃度を、以前に記載されたように決定した（データはここに示す）。Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１  ｍＡｂの最適濃度は、示されているように、ＶＥＧＦＲ３（Ｒ３−ＩｇＤｓ）抗原の個々の免疫グロブリン様ドメインの設計された用量で吸収された。結合した抗体を、ＨＲＰと結合した二次抗体で免疫プローブし、ＡＢＴＳを加えることによって可視化し、マイクロプレートリーダ（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）を用いてＯＤ405で測定した。データは、アイソタイプ対照（ＣＴＬ）のパーセントの手段±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として三重反復で表される。ＶＥＧＦＲ３抗原上のＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１のエピトープ位置は、概略図においてＩｇＤ６にわたる黒線によって示される。パネルＢは、ネイティブゲル電気泳動である。全細胞外ドメイン（Ｒ３−ＩｇＤ１−７）、ドメイン３−４（Ｒ３−ＩｇＤ３−４）およびドメイン６−７（Ｒ３−ＩｇＤ６−７）を構築し、大腸菌で発現させ、抗Ｍｙｃアフィニティ精製システムを用いて精製した。各組換えタンパク質の純度および分子量を、プローブとして抗Ｍｙｃ抗体を使用する標準的なウェスタンブロットで可視化した（左）。ＶＥＧＦＲ３切断抗原へのＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１の結合を天然ゲル電気泳動で評価し、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１ｍＡｂのエピトープを確認した（それぞれ中央および右）。図中、「Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」は「抑制率」を、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ」は「抗体」を、それぞれ意味する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に記載するのは、血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）および血管内皮増殖因子受容体−３（ＶＥＧＦＲ３）の両方を特異的に標的とする二重機能抗体である。抗体はそれぞれ、リガンド結合に影響を及ぼすことなく、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３のホモ二量体化、ならびに２つのタンパク質のヘテロ二量体化をブロックすることができる。このような抗体はＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３シグナル伝達経路を調節することができ、血管新生およびリンパ管新生の両方を阻害する。
【００２４】
いくつかの実施形態では抗体の重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は配列番号１または３を有する重鎖可変領域配列に由来し、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は配列番号２または４を有する軽鎖可変領域配列に由来する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号５、８、１３、または１６であり得る。重鎖ＣＤＲ２は、配列番号６、９、１４、または１７であり得る。重鎖ＣＤＲ３は、配列番号７または１５であり得る。軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１０または１８であり得る。軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１１または１９であり得る。軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１２または２０であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、抗体がＶＥＧＦＲ２のドメインＩｇＤ６およびＩｇＤ７内、ならびにＶＥＧＦＲ３のドメインＩｇＤ６内のエピトープに結合する。エピトープは構造的であってもよい。
【００２７】
本明細書で使用する「抗体」という語はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、全長抗体またはその断片、Ｆｃ領域を含む抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、一本鎖抗体、ｓｃＦＶ多量体、一価抗体、多価抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含むが、これらに限定されず、抗原結合活性を有する様々な抗体構造を含む。
【００２８】
抗体はまた、別の分子（例えば、小分子薬物、別のタンパク質またはペプチド、検出標識、ポリマー、または炭水化物）に結合体化され得る。
【００２９】
本明細書中に開示する抗体配列およびそれらのＣＤＲに基づいて、当業者は本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知の方法（例えば、組換え方法）を使用して、種々の形態の抗ＶＥＧＦＲ２／抗ＶＥＧＦＲ３抗体を産生し得る。
【００３０】
本明細書中に記載する抗体またはその成分をコードする単離された核酸分子（例えば、発現ベクター）もまた、本明細書中に意図される。例えば、核酸分子は、配列番号１〜２０のいずれかをコードすることができる。核酸を含む宿主細胞もまた、本明細書中に提供される。核酸分子および宿主細胞は、抗体を生成するために使用され得る。
【００３１】
本明細書中に記載する抗体はＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３のホモ二量体化またはＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３のヘテロ二量体化をブロックするため、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３シグナル伝達をブロックするため、または血管新生および／またはリンパ管新生をブロックするために使用され得る。抗体はまた、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）において、サンプル中のＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３またはそのフラグメントを検出するために使用され得る。抗体はドメインＩｇＤ６〜ＩｇＤ７を含むＶＥＦＧＲ２またはＶＥＦＧＲ３の断片に結合し、それを検出することができる。
【００３２】
さらに、抗体を用いて、固形腫瘍、例えば、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、皮膚がん、中皮腫、肺がん、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、肉腫、および甲状腺がんを治療することができる。
【００３３】
用語「サンプル」は任意の生物学的サンプル（例えば、体液サンプル、血液サンプル、細胞サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、または組織サンプル）であり得る。
【００３４】
本明細書に記載する抗体はいずれも、様々な投与経路、例えば、静脈内、関節内、結膜内、頭蓋内、腹腔内、胸膜内、筋肉内、くも膜下、または皮下投与経路に適した医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、水溶液または凍結乾燥製剤であり得る。それは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤）を含み得る。医薬組成物は抗体と一緒に作用する他の活性成分、例えば、別の治療剤またはアジュバントを含むことができる。
【００３５】
以下の特定の実施例は単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法においても本開示の残りの部分を限定するものではない。さらに詳述することなく、当業者は本明細書の説明に基づいて本開示を最大限に利用することができると考えられる。本明細書に引用する全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
ＶＥＧＦＲ−２の免疫グロビン様ドメイン４〜７ドメインを標的とする治療抗体はリガンド濃度とは無関係に治療上の利益をもたらすことができ、ＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達を標的とするための分化された作用様式を表すと仮定した。以下に記載するのは、ＶＥＧＦＲ−２を標的とする治療用抗体、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１の作製、ならびにインビトロおよびインビボでの血管新生およびリンパ管新生を模倣するモデル系におけるそれらの阻害作用である。
【００３７】
（ＶＥＧＦ−Ｒ２／−Ｒ３二量体化を遮断する二重機能抗体の開発）
ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３の受容体二量体化はそれらの特異的リガンドの生物学的活性を実行するため、それらの下流シグナル伝達の活性化に必要なシナリオである。ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−ＣがＶＥＧＦＲ３によるＶＥＧＦＲ２のホモ二量体化またはヘテロ二量体化を引き起こす可能性がこれまでの報告で示されていることから、ＶＥＧＦＲ２の二量体化領域を標的とすることで、ＶＥＧＦＲ２および／またはＶＥＧＦＲ３受容体を介したシグナル伝達活性化が重篤に障害され、関節リウマチにおける血管新生、リンパ管新生、腫瘍転移、糖尿病関連網膜症、血管炎などのＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ誘発病因の遮断をもたらす可能性があると仮定した。
【００３８】
仮説を検証するため、ＶＥＧＦＲ２の二量体化領域、免疫グロビン様ドメイン４〜７（ＩｇＤ４〜７）をコードするプラスミドを構築し、大腸菌発現系で発現させ、Ｈｉｓ−タグアフィニティカラムにより精製した。その組換えタンパク質で免疫した後、マウス脾細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマライブラリーを作製した。２つのハイブリドーマ  クローン（Ｒ２Ｃ７およびＲ２Ｃ９）を、ＨＵＶＥＣ細胞に対するそれらの高い結合親和性およびチューブ形成を阻害する顕著な能力に基づいて、さらなる研究のため最初に選択した。両方のクローンの単一集団を確実にするため、２つのハイブリドーマ細胞クローンを、限界希釈プロセスによってさらに選択した。得られたクローンをＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１と再命名した。両方の抗体の機能をさらに調べ、それらの物理的性質も詳細に特徴づけた。
【００３９】
（ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の二重標的化）
新規に開発されたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の結合特殊性を調べるため、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１、ヒト静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）細胞およびＶＥＧＦＲ２（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ）を表現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をモデルとして用いた。両抗体は、ＨＵＶＥＣ細胞においてＶＥＧＦＲ２に対して同等の親和性を有した（図１Ａおよび１Ｃ）。Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１の結合特殊性をさらに確認するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はヒトＶＥＧＦＲ２またはその空ベクトル（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＣ）をエンジェイした遺伝子と安定的にトランスフェクトした。ＶＥＧＦＲ２の発現量は、まず臨床使用ＶＥＧＦＲ２抗体であるラムシルマブ（登録商標）により測定した。フローサイトメトリ解析から得られた結果から、新たに開発された抗体のＶＥＧＦＲ２結合はラムシルマブ（登録商標）と同等であることが示された。Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１  ｍＡｂｓの結合特殊性は、ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＣトランスフェクタンズにおいても実証され、ＶＥＧＦＲ２、ＡＢＣＡＭ（登録商標）９５３０に対する市販の抗体によって確認された微量汚れを示した（データは示していない）。
【００４０】
Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１  ｍＡｂｓの結合活性は、ヒトの内節細胞（ＨＬＥＣ）およびＶＥＧＦＲ３を表現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞においても見出された。フローサイトメトリ分析は、新しく開発されたｍＡｂがまた、異なる親和性でＨＬＥＣに結合することができることを明らかにした（図１Ｂ）。ＨＬＥＣ細胞におけるＶＥＧＦＲ２の一定量の表現が報告されていることから（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１３．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（９）：ｅ７４６８６．参照）、ＶＥＧＦＲ３（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ３）を表現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１のＶＥＧＦＲ３への結合特殊性を定義するために生成した。発現量は市販のＶＥＧＦＲ３抗体、Ｒ＆Ｄ５４７０３で染色することによって確認した（データは示さず）。フローサイトメトリ分析を用いた実験はラムシルマブ（登録商標）とは異なり、両方の抗体がＶＥＧＦＲ３に結合することができることを明らかに実証した（図１Ｄ）。なぜか、Ｒ２Ｃ９−１１は、Ｒ２Ｃ７−１  ｍＡｂと比較した場合、より高いＶＥＧＦＲ３結合を示した。まとめると、データは新しく開発された抗体がＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３に対する二重結合能力を有し、それらが血管新生およびリンパ管形成を阻害する二重機能を有する可能性を示唆した。
【００４１】
（リガンド誘発性受容体二量体化の阻害）
Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１  ｍＡｂｓの前処理がＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３ヘテロ二量化を防止できるかどうかを調べるため、高レベルＶＥＧＦＲ３および低レベルＶＥＧＦＲ２を発現するＨＥＬ９２．１．７、ならびにＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＥＧＦ−Ｒ２／−Ｒ３）細胞を共発現するＨＥＫ２９３Ｔを細胞モデルとして用いた。共免疫（ＩＰ）アッセイを用いて、ＨＥＬ９２．１．７でＶＥＧＦＲ２を引き下げ、またはＶＥＧＦＲ３を引き下げ、ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＥＧＦ−Ｒ２／−Ｒ３トランスフェクタにおけるＶＥＧＦＲ２のブロットを行ったところ、特にＲ２Ｃ９−１１において、その受容不均化に対する阻害能力がラムシルマブ（登録商標）よりも優れていることが明らかになった。図２Ａを参照されたい。
【００４２】
新たに開発されたｍＡｂがＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ誘導受容体ホモおよび／またはヘテロ二量体化に対して阻害作用を有するかどうかをさらに調べるため、近接連結アッセイ（ＰＬＡ）でＨＬＥＣ細胞を用いた。細胞を血清飢餓状態にし、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、ラムシルマブ（登録商標）、またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ2a）で前処理し、続いてＶＥＧＦ−Ａ新たに開発されたｍＡｂがＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ誘導受容体ホモおよび／またはヘテロ二量体化に対して阻害作用を有するかどうかをさらに調べるため、近接連結アッセイ（ＰＬＡ）でＨＬＥＣ細胞を用いた。細胞を血清飢餓状態にし、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、ラムシルマブ（登録商標）、またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ2a）で前処理し、続いてＶＥＧＦ−Ａ１６５またはＶＥＧＦ−Ｃを刺激した。ＶＥＧＦＲ２とＶＥＧＦＲ３の同質化および／または不均化の形成は、受容体間の近接性が４０ｎｍより小さいときに検出された。未刺激細胞（ＣＴＬ）またはＩｇＧ2a処理対照と比較して、結果は、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１ｍＡｂの両方がラムシルマブ（登録商標）のそれと比較して、ＶＥＧＦ−Ａ１６５およびＶＥＧＦ−Ｃ誘導受容体二量体化に対して同等の阻害作用を有することを示した。図２Ｂを参照されたい。要約すると、新たに開発された抗体は、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃ誘発受容体二量体化の遮断に対してラムシルマブ（登録商標）と同等の効果を示したもの、ヘテロ二量体化に対してはラムシルマブ（登録商標）よりも優れた阻害効果を示した。
【００４３】
（ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の下流シグナル伝達の減弱）
リガンドが誘導する受容体二量体化の後、受容体自己リン酸化の開始とその下流のシグナル伝達活性化は必須の事象であり、結果として生じるリガンドの生物学的活性を説明する。受容体二量体化の遮断がそのダウンストリームシグナル伝達を減弱させるのに充分であるかどうかを調べるため、ＨＵＶＥＣ細胞を飢餓状態にし、Ｒ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１  ｍＡｂまたはその抗体アイソタイプ対照（ＩｇＧ2a）で前処理した。ラムシルマブ（登録商標）で同時に前処理した細胞を対照とした。その後、細胞は、ＶＥＧＦ−Ａ165の処置、血清刺激、または処置なしを受けた。
【００４４】
ＦＡＫ  ｐ３８ＭＡＰＫなどのＶＥＧＦＲ２の自己リン酸化およびその下流シグナル伝達分子のウェスタンブロット解析により、新たに開発されたｍＡｂまたはラムシルマブ（登録商標）のいずれかによる受容体の二量体化の阻害は、Ｒ２Ｃ７−１の阻害作用がラムシルマブ（登録商標）の阻害作用よりも弱いにもかかわらず、特にＹ１０５４残基上のチロシンリン酸化に対するＶＥＧＦＲ２の活性化を有意に減弱させることができることが実証された（データは示していない）。
【００４５】
興味深いことに、ラムシルマブ（登録商標）誘発性ｐ３８ＭＡＲＫ脱リン酸化とは異なり、Ｒ２Ｃ７−１  ｍＡｂはｐ３８ＭＡＲＫ活性化に何ら影響を及ぼさなかった。その代わりに、それはＦＡＫ活性を著しく不活性化した。ラムシルマブ（登録商標）と比較して、Ｒ２Ｃ９−１１はｐ３８ＭＡＰＫ活性の減弱に対して同じ作用を共有していた（データは示さず）。ＨＬＥＣ細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ誘導性シグナル伝達については、両ｍＡｂはＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の自己リン酸化の減弱に対して同様の効果を有することが示された（データは示していない）。対照的に、ＶＥＧＦ−Ｃ誘導性シグナル伝達においてＶＥＧＦＲ３活性を有意に低下させたのはＲ２Ｃ９−１１のみであった（データは示さず）。
【００４６】
まとめると、Ｒ２Ｃ７−１  ｍＡｂによるＶＥＧＦＲ２媒介シグナル伝達の遮断の根底にある機序はＲ２Ｃ９−１１のそれとは異なっている可能性があるが、両者はＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３受容体媒介シグナル伝達活性化の二重遮断を示す。
【００４７】
（二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）管形成の遮断）
新規開発抗体によるＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ誘導シグナル伝達活性化の弱毒化がＨＵＶＥＣおよびＨＬＥＣ細胞の生物学的挙動を調節できるかどうかを調べるため、２Ｄチューブ形成アッセイを行った。ＨＵＶＥＣおよびＨＬＥＣ細胞を、ＶＥＧＦおよび他のサプリメントの非存在下で、マトリゲル（登録商標）被覆ウェル上に播種した。細胞をラムシルマブ（登録商標）、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１または抗体アイソタイプ対照（ＩｇＧ2a）で前処理し、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃでさらに１０時間刺激した。写真撮影後、チューブメッシュとマスターセグメントの総数を画像Ｊの血管新生アナライザーで定量した結果、Ｒ２Ｃ９−１１は、ラムシルマブ（登録商標）と比較して、ＶＥＧＦ−Ａ−またはＶＥＧＦ−Ｃ誘発性血管チューブ形成に対して優れたまたは匹敵する抑制効果を有することが示された。図３を参照されたい。しかしながら、Ｒ２Ｃ７−１  ｍＡｂは、その対応物より明らかに弱かった。
【００４８】
異なる系に対するそれらの抑制機能をさらに調べるため、３次元（３Ｄ）発芽フィブリン形成を、ＣＦＳＥ蛍光トラッカーの存在下で、超低プレート上でＨＵＶＥＣおよびＨＬＥＣ細胞を培養して細胞スフェロイドを形成することによって確立した。プレコートマトリゲル（登録商標）ェルに移した後、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、ラムシルマブ（登録商標）、またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ2a）を含む培地中で細胞を７日間培養した。発芽領域および蛍光強度をＮＩＳ−ＡＲソフトウェアを用いて分析した。対照細胞の発芽領域および蛍光と比較して、試験した全ての抗体は、発芽フィブリン形成を抑制する劇的な能力を示した（Ｐ＜０．００１）。図４Ａおよび４Ｂを参照されたい。特に、新しく開発された抗体は両方とも、ラムシルマブ（登録商標）と比較した場合、優れた抑制効果を示した。まとめると、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１  ｍＡｂは、選択したモデルに依存して、血管およびリンパ管形成の阻害に対して異なる能力を示した。
【００４９】
（インビボでの周皮細胞駆動リンパ管形成の確立）
いくつかの報告は、血管新生およびリンパ管新生における周皮細胞の中心的役割を実証している。Ｏｚｅｒｄｅｍ  Ｕ，２００６，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓ，２００６．３８（５）：２５１−４を参照されたい。周皮細胞として働くＷＩ３８線維芽細胞がインビボでリンパ管形成を促進できるかどうかを調べるため、ＨＬＥＣ細胞をモデルとしてマトリゲル（登録商標）プラグアッセイを行った。ＨＬＥＣ／ＷＩ３８混合物を氷−寒冷マトリゲル（登録商標）に埋め込み、ＮＯＤ−ＳＣＩＤの各マイナーに皮下注射した。重合したマトリゲル（登録商標）を切除し、固定し、２または４週間パラフィンに包埋した。組織マトリゲル（登録商標）中のヒトＷＩ３８およびＨＬＥＣ細胞の免疫組織化学分析を、それぞれ３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で染色したヒトα−小筋アクチン（ＳＭＡ）および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）で染色したＣＤ３１に特異的な抗体で二重染色することにより行った。ＷＩ３８細胞はヒトＳＭＡに特異的な抗体で検出され、２週間以内に新たなヒトリンパ管の形成が見出される前に、ヒトＣＤ３１に対する抗体でプローブされた（データは示していない）、マウス組織中の新たな血管に合流したことが実証された。４週間後、ＨＬＥＣ細胞は右下から左上に移動し、より大きなリンパ管を形成した（データは示さず）。このデータは、リンパ管形成における周皮細胞の重要な役割を強く支持する。
【００５０】
（インビボでの血管新生とリンパ管新生の減弱）
上記と同じモデルを用いて、ＨＵＶＥＣまたはＨＬＥＣ細胞をＷＩ３８と予め混合し、マトリゲル（登録商標）に包埋し、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下接種した。マウスにラムシルマブ（登録商標）、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、または対照抗体を週２回、４週間投与した。ＡＥＣによって部分的または完全に汚れたチューブをＮＩＳ−ＡＲソフトウェアを用いて定量化した。Ｒ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１で処理したマウスは対照マウスと比較した場合、血管形成の劇的な減少を示し、特にリンパ管形成に関してラムシルマブ（登録商標）よりも優れた機能を示した。図５を参照されたい。
【００５１】
さらに、サイズにおける血管の比も決定した。マウスにＲ２Ｃ７−１，Ｒ２Ｃ９−１１，ラムシルマブ（登録商標）を投与した場合、直径５０μｍより大きい血管の比率は有意に減少したが、直径５０μｍより小さい血管の比率は著しく増加した。図６を参照されたい。この現象はＨＬＥＣをモデルとしたリンパ管形成においても認められ、Ｒ２Ｃ７−１及びＲ２Ｃ９−１１はラムシルマブ（登録商標）と比較して、リンパ管形成の抑制に優れた効果を有することが一貫して示された（データは示していない）。このように、データから、新たに開発された抗体によるＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の二重標的化は、ラムシルマブ（登録商標）よりも血管新生およびリンパ管新生に対してより良好な阻害効果をもたらす可能性があることが示された。
【００５２】
（インビトロおよびインビボでの抗体依存性腫瘍細胞毒性）
新しく開発した抗体はＶＥＧＦＲ３を特異的に標的とすることができたので、ＶＥＧＦＲ３を発現する細胞においてそれらの細胞毒性能力を綿密に調べた。ＨＥＬ９２．１．７細胞を用い、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の発現状態を最初に特徴付けた。ＨＥＬ９２．１．７のフローサイトメトリ分析はＶＥＧＦＲ３の高い発現（〜９５％）を明確に明らかにしたが、ＶＥＧＦＲ２の低い発現（〜５％）を明らかにした。図７Ａを参照されたい。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスから分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を行った実験では、ラムシルマブ（登録商標）を含むすべての検査抗体が０．１２５μｇ／ｍＬの低濃度の抗体でも、ＰＢＭＣおよび２％児血清の存在下でＨＥＬ９２．１．７腫瘍細胞を殺傷する顕著な能力を示すことが示された。図７Ｂを参照されたい。
【００５３】
これらの抗体がん抑制効果は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤの遺伝子移植がんにおいてさらに調査した。高レベル（〜９５％）または低レベル（〜５％）のＶＥＧＦＲ３を発現する細胞を選別し、増殖させた。高レベルまたは低レベルのＶＥＧＦＲ３を有する細胞をマウスの右側または左側の側腹部に接種した。腫瘍接種７日後、マウスにＲ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、ラムシルマブ（登録商標）またはＩｇＧ対照抗体を週２回、２５日間投与した。新しく開発された抗体は、高レベルまたは低レベルのＶＥＧＦＲ３を発現する腫瘍に対して、ラムシルマブ（登録商標）と同等の治療効果を有することが実証された。図８を参照されたい。要約すると、血液およびリンパ管形成の阻害に対する二重機能の他に、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１はＡＤＣＣ殺傷効果を誘発し、ＶＥＧＦＲ３を発現する腫瘍細胞の増殖を抑制することができた。抑制効力は２５日間の投与でラムシルマブ（登録商標）と同程度であった。
【００５４】
（新たに開発された抗体とラムシルマブ（登録商標）との併用療法）
新たに開発された抗体とラムシルマブ（登録商標）との併用により、より良好な腫瘍抑制効果が得られるかどうかを検討するため、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１又はラムシルマブ（登録商標）を単独又は併用投与されたマウス（１０例／群）を用い、ＨＥＬ９２．１．７をモデルとして検討された。接種７日後に抗体（計１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与を行い、週２回３５日間投与した。興味深いことに、Ｒ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１とラムシルマブ（登録商標）との併用は、Ｒ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１単独治療と比較した場合、腫瘍抑制に対してより優れた治療法を与えなかった。しかしながらＲ２Ｃ９−１１治療単独は、他の抗体または併用よりも有意に優れた治療効果を提供することができた。図９を参照されたい。したがって、これらのデータは、ＨＥＬ９２．１．７のようなＶＥＧＦＲ３発現腫瘍細胞を標的とすることはそれらの細胞生存を減弱させるだけでなく、ベビー血清中の活性化補体の存在下で試験した抗体を標的とすることによって腫瘍細胞毒性を誘導する可能性を強く示唆する。
【００５５】
（新しく開発された抗体の認識エピトープ）
Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１抗体の認識エピトープを明らかにするため、細胞ベースの競合酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ２トランスフェクタント（５×１０4／ウェル）をコーティングし、９６ウェルプレート上に固定した。細胞に結合するためのＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１抗体の最適濃度、対数期の最高濃度を、標準的なＥＬＩＳＡ手順を用いて決定した（データは示さず）。続いて最適濃度を有する抗体を、結合エピトープを競合させるため、ＶＥＧＦＲ２（Ｒ２−ＩｇＤ）の個々の組換え細胞外ドメインの設計用量で吸収した。Ｒ２Ｃ７−１とＲ２Ｃ９−１１の主要認識エピトープはＩｇＤ６とＩｇＤ７の間に位置したが、わずかな差異を示した。Ｒ２Ｃ７−１はＲ２Ｃ９−１１と比較した場合、ＩｇＤ６に対してより強い結合を示した。図１０を参照されたい。新しく開発された抗体のエピトープをさらに定義するため、アラニンスキャニング突然変異誘発を行った。ＶＥＧＦＲ２のＩｇＤ６とＩｇＤ７との間の任意のアミノ酸変化は両方の抗体の結合能力の劇的な損失を引き起こし（データは示さず）、このことは新しく開発された抗体の認識エピトープが構造エピトープであり得ることを示す。
【００５６】
同じ方法を採用して、ＶＥＧＦＲ３上の抗体のエピトープを定義した。ＶＥＧＦＲ３用抗体の最適濃度を決定するため、ＨＥＫ２９３Ｔ／ＶＥＧＦＲ３トランスフェクタをターゲットとして使用した（データは示されていない）。続いて、結合エピトープを競合させるため、最適濃度の抗体をＶＥＧＦＲ３（Ｒ３−ＩｇＤ）の個々の組換え細胞外ドメインに吸収させた。同様に、それらの主要なエピトープは両方ともＶＥＧＦＲ３のＩｇＤ６に位置したが、ＩｇＤ７には位置しなかった。図１１Ａを参照されたい。この知見に適合させるため、種々の組換えＩｇＤタンパク質のウェスタンブロット分析を、天然ゲル電気泳動を用いて行った。ＩｇＤ５はＶＥＧＦＲ３受容体生合成後に蛋白分解的切断を受けることが報告されていることから（Ｐａｊｕｓｏｌａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．９（１２）：３５４５−５５参照）、細胞ベースのＥＬＩＳＡ（図１１Ａ参照）においても競合的能力を示さなかったことから、ＩｇＤ１−７、ＩｇＤ３−４、ＩｇＤ６−７断片が大腸菌系で発現され生成された。非還元ゲル電気泳動後、精製タンパク質をＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１抗体で免疫プローブしたところ、ＩｇＤ３−４ではなくＩｇＤ６−７に著しく高い結合能を示した（図１１Ｂ）。まとめると、データはＶＥＧＦＲ２とＶＥＧＦＲ３に対するＲ２Ｃ７−１とＲ２Ｃ９−１１のエピトープは両方ともＩｇＤ６−７に位置し、ＶＥＧＦＲ３蛋白質上の認識部位はＩｇＤ６に特異的に位置することを強く示した。
【００５７】
（相補性決定領域（ＣＤＲ）および結合親和性）
抗体のＣＤＲを定義するため、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ系を適用して、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１抗体の可変領域を定義した。両方の抗体分泌ハイブリドーマが単一クローンであることを確認するため、細胞を２つの連続した連続希釈によって選択した。抗体をコードする遺伝子は、５’−ＲＡＣＥまたは５’−／３’−変性ＩｇＧ特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによりクローン化した。表１を参照されたい。新しく開発された抗体からクローニングされたＣＤＲを表２に示す。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ系によって定義された重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｈ１）およびＣＤＲ２（ＣＤＲ−Ｈ２）のアミノ酸配列はＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１で大きく異なることが示されたが、重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｈ３）では区別がなかった。軽鎖のＣＤＲ領域を定義するため、２つの系は差異を示さなかった。これらのデータを総合すると、Ｒ２Ｃ７−１とＲ２Ｃ９−１１の間のＣＤＲのアミノ酸配列の変動のため、これらの２つの抗体は両方ともＩｇＤ６−７ドメインに潜在的な結合を示したが、ＶＥＧＦＲ２とＶＥＧＦＲ３上に明確な結合エピトープを有する可能性がある。
【００５８】
【表１】
2021531264.tif 000003
【００５９】
【表２】
2021531264.tif 000004
【００６０】
【表３】
2021531264.tif 000005
【００６１】
Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１の結合親和性を決定するため、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）およびＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ−４）の組換えＩｇＤ４−７およびＩｇＤ６−７を標的抗原として使用し、結合親和性をＢｉａｃｏｒｅシステムにより測定した。表３の結果は、Ｒ２Ｃ９−１１がＲ２Ｃ７−１よりもＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３のＩｇＤ４−７およびＩｇＤ６−７抗原に対して高い親和性を有することを一貫して示した。いずれかの抗体によるＶＥＧＦＲ２への結合は、ＶＥＧＦＲ３への結合よりも強かった。また、新しく開発された両抗体によるＶＥＧＦＲ２又はＶＥＧＦＲ３のＩｇＤ４−７への結合は、ＩｇＤ６−７への結合よりもわずかに高かった。これらのデータはまた、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１の認識エピトープがＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の細胞外ドメインの３次元構造に依存することを示唆した。
【００６２】
（材料及び方法）
（１．細胞培養）
ＮＨＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳと１Ｘ抗生物質−抗真菌物質（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で補ったＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ2インキュベータ中、３７℃で培養した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）細胞を、内皮基礎培地−２（ＥＧＭ−２）および種々の増殖因子、サイトカインおよび他のサプリメント中、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔキット（Ｌｏｎｚａ（登録商標）、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中、３７℃で、５％ＣＯ2インキュベータ中で維持した。実験で使用した初代培養細胞は第３−第６世代であった。ヒトリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）をＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（登録商標）（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、製造者の指示に従って内皮細胞培地ＭＶ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（登録商標））で培養した。
【００６３】
（２．ハイブリドーマの生成）
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）のヒト組換え免疫グロビン（Ｉｇ）ドメイン４〜７で、２週間隔で３回、腹腔内（ＩＰ）免疫した。ＶＥＧＦＲ２の細胞外ドメイン４〜７をコードする遺伝子を、遺伝子特異的プライマーおよびＨＵＶＥＣの第１株ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲにより作製し、その後ｐＧＥＸ−ＫＧベクターにクローニングした。得られたプラスミド、ｐＧＥＸ−ＶＥＧＦＲ２−ＥＤ  Ｉｇ  Ｄ４−７を直接配列決定により検証した。コードされたタンパク質を大腸菌発現系で発現させ、以下の「遺伝子構築物および発現」の節に記載されるように、グルタチオン結合セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて精製した。血清を採取し、間接酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗ＶＥＧＦＲ２抗体の有無を検査した。高レベルの抗体力価（＞１：３０００希釈）が検出された後、マウスは、フロイントアジュバントの非存在下で、２５μｇの組換え抗原による最終ＩＰ追加免疫を受けた。最後の追加免疫の５日後、マウスを屠殺した。その脾臓細胞を回収し、改変ハイブリドーマ技術によって骨髄腫細胞と融合させた（Ａｐｉｒａｔｍａｔｅｅｋｕｌ，Ｎ．，ＰＰｈｕｎｐａｅ  ａｎｄ  ＷＫａｓｉｎｒｅｒｋ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９．６０（１−３）：ｐ．５参照）。簡単に述べると、脾細胞（７×１０7細胞）を、５０％ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ  ４０００。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、２×１０7のＳｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５８１）細胞と、スタンダードハイブリドーマ技術によって融合させた。ＨＡＴ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））選択後、ハイブリドーマ含有ウェルから得られた培養上清を、標準的な間接ＥＬＩＳＡ手順を用いて抗体−抗原反応性について分析した。４５０ｎｍ（ＯＤ450ｎｍ）≧０．６０での光学濃度の値を有するハイブリドーマを陽性とみなし、陽性ウェルの単細胞クローニングを、限界希釈法を用いて行った。分泌マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のアイソタイプを、マウスｍＡｂアイソタイピングキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定した。
【００６４】
（３．抗体精製）
抗ＶＥＧＦＲ２  ｍＡｂを産生するハイブリドーマを、ハイブリドーマ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて無血清条件下で培養した。ｍＡｂを、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するアフィニティクロマトグラフィーによって培養上清から精製した。氷冷ＰＢＳ（１０×床容量）で洗浄した後、プロテインＡビーズによって捕捉された抗体を、溶出緩衝液（Ｒ２Ｃ７−１については５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ３．０、またはＲ２Ｃ９−１１については５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ３．０）で溶出した。溶出した画分を、１００μＬの中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０／１．５Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ。１ｍＬ／チューブ）を含むチューブに集めた。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および間接ＥＬＩＳＡによる純度および活性。ｍＡｂの濃度はＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ（登録商標）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて決定し、４℃で一晩ＰＢＳに対して透析した。その後、抗ＶＥＧＦＲ２  Ａｂを、さらなる使用のため８０℃で保存した。
【００６５】
（４．チューブ形成アッセイ）
培養ウェルを氷冷マトリゲル（登録商標）（８０μＬ／ウェル、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でコーティングし、続いて３７o℃で３０分間インキュベートしてゲル化させた。ＬＥＣおよびＨＵＶＥＣを、ＶＥＧＦおよび他のサプリメントの非存在下で、ＥＧＭ−２中で８時間飢餓させた。トリプシン処理後、細胞を、示されるように、２μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａ165またはＶＥＧＦ−Ｃ（Ｃｙｓ１５６Ｓｅｒ）（Ｒ＆Ｄ、ＭｃＫｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ、ＮＥ）の存在下で、ラムシルマブ（登録商標）（５μｇ／ｍＬ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（登録商標）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、抗ＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体（２０μｇ／ｍＬ、Ｒ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１）を含む培地（Ｒ＆Ｄ、ＭｃＫｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ、ＮＥ）に再懸濁し、続いて、それぞれ、ＬＥＣまたはＨＵＶＥＣについて３７℃で、４時間または１０時間、プレコートされたウェルに播種した。ＮＩＫＯＮ（登録商標）Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｌｉｇｈｔ  ＤＳ−Ｕ３  ｓｙｓｔｅｍ（東京、日本）を用いて、それぞれのウェルの全体画像を撮影し、形成された分岐節、メッシュ、およびチューブの長さの総数を、画像Ｊの血管新生分析器によって定量した。データは、手段±Ｓ．Ｅ．として三連で表した。
【００６６】
（５．フローサイトメトリ分析）
細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｍＭ  ＰＢＳベースのＥＤＴＡで解離させ、遠心分離によって収集した。非特異的結合を遮断するため、細胞を４℃で１時間、１％ウシセラミアルブミン（ＢＳＡ）で潜伏させた。ＰＢＳ洗浄後、ＶＥＧＦＲ２（１×１０5／反応）を発現するＨＵＶＥＣまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２μＧ／ｍＬ抗ＶＥＧＦＲ２  ｍＡｂｓ（Ｒ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１）、ラムシルマブ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（登録商標）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）またはそれらのイソタイプ制御免疫グロビンＧ（ＩｇＧ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、４Ｃでさらに１時間処理した。ＶＥＧＦＲ３発現のため、ＶＥＧＦＲ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）またはウサギＩｇＧ対照（ＡＢＣＡＭ（登録商標）、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）に対して１ｈ免疫プローブした。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで広範囲に洗浄した後、細胞を、それらの対応する二次免疫、４μＧ／ｍＬゴート抗ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ（ＡＢＣＡＭ（登録商標））と共役したドンキー抗ウサギＩｇＧ、またはマウス抗ヒトで染色した。ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共役したＩｇＧを４℃で１ｈ洗浄し、その後、細胞をＰＢＳ＋１％パラホルムアルデヒド及び１％ＢＳＡ中で再浮遊させた。ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の細胞表面発現を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて分析した。
【００６７】
（６．インサイチュ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ））
抗ＶＥＧＦＲ２（Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１）ｍＡｂによるＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３ホモ−／ヘテロ−二量体化の遮断を、製造者の指示に従ってＤｕｏｌｉｎｋインサイチュＰＬＡキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて調査した。簡単に述べると、ＬＥＣを８ウェルチャンバースライドに播種し、Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、またはラムシルマブ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（登録商標））の存在下で無血清培地と共に１６時間培養した。その後、細胞をＶＥＧＦ−Ｃ（５００ｎｇ／ｍＬで１５分間）、ＶＥＧＦ−Ｃ（Ｃｙｓ１５６Ｓｅｒ）（２μｇ／ｍＬで１０分間）またはＶＥＧＦ−Ａ165（５０ｎｇ／ｍＬで５分間）で刺激した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ブロッキング緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で３０分間、ＲＴでブロックした。２μｇ／ｍＬのＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）に対する市販の抗体で染色した細胞を対照とした。特異的オリゴヌクレオチド（ＰＬＡプローブ）に連結した対応する種特異的二次抗体、抗ウサギＰＬＵＳまたは抗マウスＭＩＮＵＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を添加した。リガーゼ（最終濃度１単位／μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含む液を３７℃で３０分間添加することにより、ＰＬＡプローブ反応のライゲーションを行った。シグナル増幅は連結したＰＬＡプローブを３７℃で１００分間ローリングサークル増幅することにより、ポリメラーゼ含有溶液（１０単位／μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））中で行った。緩衝液Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で洗浄した後、スライドをＤＡＰＩで染色して細胞核を可視化し、Ｄｕｏｌｉｎｋインサイチュ  マウント培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））でマウントした。さらに、アイソタイプ対照ＩｇＧを対照として使用した。蛍光シグナル（またはドット）を画像化し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  Ｏｆｆｌｉｎｅソフトウェアによって分析した。
【００６８】
（７．共免疫沈降分析）
抗ＶＥＧＦＲ２抗体によるＶＥＧＦ−Ｃ誘導受容体二量体化に対する阻害効果を決定するため、ＬＥＣ細胞を、それらが７０〜８０％コンフルエンシーに達するまで、直径６ｃｍの皿に播種した。細胞を洗浄し、２０μｇ／ｍＬの抗体（Ｒ２Ｃ７−１、Ｒ２Ｃ９−１１、またはアイソタイプ対照抗体）を含有する無血清培地で１６時間飢餓させた。続いて、細胞を、ＶＥＧＦ−Ｃ（５００ｎｇ／ｍＬ）を用いてまたは用いずに１５分間刺激し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  Ｎａ2  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１％  ＮＰ−４０／１％デオキシコール酸ナトリウム／２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム／１ｍＭ  β−グリセロリン酸／１ｍＭ  Ｎａ3  ＶＯ4／１μｇ／ｍＬロイペプチン）によって回収した。免疫沈降のため、溶解物（１ｍｇ／サンプル）をプロテイン−Ａ／Ｇ−アガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で２時間前洗浄し、非特異的結合を最小限に抑え、次いで抗ＶＥＧＦＲ３抗体（１μｇ／サンプル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）と４℃で一晩インキュベートし、免疫沈降したタンパク質を天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、市販のＶＥＧＦＲ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で免疫ブロットし、以下に記載するように、ＥＣＬウェスタンブロットシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を用いて可視化した。
【００６９】
（８．天然ゲル電気泳動）
ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の受容体二量体化状態もまた、ネイティブゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって測定した。細胞を、２０μｇ／ｍＬのＲ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１を含有する無血清培地で１６時間飢餓状態にした。ラムシルマブ（登録商標）およびアイソタイプ対照抗体を、それぞれ陽性および陰性対照として使用した。細胞をＶＥＧＦ−Ｃ（５００ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激し、低張溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ）によって回収した。等量のサンプルたんぱく質を４×ネイティブサンプルバッファー（４００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４０％グリセロールと０．０２％ブロモフェノールブルー）で混合し、事前鋳造されたネイティブＰＡＧＥゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ（登録商標））を用いてネイティブＰＡＧＥにより解消した。ＶＥＧＦＲの二量体化およびリン酸化状態を、抗ＶＥＧＦＲ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＶＥＧＦＲ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）または抗ｐ−ＶＥＧＦＲ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって検出した。
【００７０】
（９．ウエスタンブロッティング分析）
プロテイン溶解物は、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））またはＲＩＰＡ緩衝液を添加した溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０／２ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  Ｎａ3  ＶＯ4／１０％グリセロール／１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／プロテアーゼ）を用いて得られた。ＨＵＶＥＣおよびＬＥＣ細胞を、処置の１日前に播種した。抗ＶＥＧＦＲ２抗体、Ｒ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１（示されるように、５、１０、２０μｇ／ｍＬ）を培地に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした後、ＨＵＶＥＣのため２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ−Ａ165（Ｒ＆Ｄ）を刺激した。ＬＥＣ細胞をＲ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１抗体（２０μｇ／ｍＬ）とプレインキュベートし、ＶＥＧＦ−Ｃ（５００ｎｇ／ｍＬ、１５分間）、ＶＥＧＦ−Ｃ（Ｃｙｓ１５６Ｓｅｒ）（２μｇ／ｍＬ、１０分間）またはＶＥＧＦ−Ａ165（５０ｎｇ／ｍＬ、５分間）（Ｒ＆Ｄ）で刺激し、次いでＲＩＰＡ緩衝液によって回収した。ラムシルマブ（登録商標）（５μｇ／ｍＬ。Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（登録商標））および２０μｇ／ｍＬの適切なアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのＲ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１に対するマウスＩｇＧ。ＡＢＣＡＭ（登録商標）からのＶＥＧＦＲ３抗体に対するウサギＩｇＧ）を、それぞれ陽性対照または陰性対照として用いた。抽出たんぱく質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄたんぱく質アッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ（登録商標））で測定した。１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ（登録商標））で、等量の総タンパク質（５０μｇ／サンプル）を分離した。タンパク質をニトロセルロース膜（ＨＹＢＯＮＤ（登録商標）−Ｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に移した。ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ中３％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で、室温で２時間ブロッキングした後、膜を、抗ＶＥＧＦＲ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、−ＶＥＧＦＲ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐ−ＶＥＧＦＲ３（Ｔｙｒ１２３０／１２３１）（細胞適用）、ｐ−ＦＡＫ、ｐ−ｐ３８ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）およびβ−アクチン（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）またはチューブリンに対する抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼに連結した適切な二次抗体とインキュベートした。ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を用いて免疫反応性タンパク質を可視化し、シグナルをＸ線フィルム（ＦＵＪＩ（登録商標）、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）上で検出した。
【００７１】
（１０．細胞ベースの競合ＥＬＩＳＡ）
Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１抗ＶＥＧＦＲ２抗体のエピトープを、細胞ベースの競合ＥＬＩＳＡによって決定した。ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５００００細胞／１００μＬ／ウェルの密度で９６ウェルプレート上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。広範な洗浄後、細胞をＰＢＳ中の１％グルタルアルデヒドで固定し、次いでＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。非特異的結合を減少させるため、細胞を３％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、３７℃で３０分間ブロックし、一方、Ｒ２Ｃ７−１およびＲ２Ｃ９−１１抗体（８μｇ／ウェル）を、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３組換えタンパク質の個々の免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＤ４、Ｄ５、Ｄ６およびＤ７）の指示用量（０．２、１．０、または５．０μｇ／ウェル）で、３７℃で３０分間吸収させた。続いて、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３を発現する細胞を、予め吸収されたＲ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１抗体と共に３７℃で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳＴで３回広範に洗浄した。結合した抗体をＨＲＰと結合したヤギ抗マウスＩｇＧを用いて３７℃で１時間プローブし、ＡＢＴＳ（３７℃で３０分間）を加えることによって可視化し、ＯＤ405でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（登録商標）、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって測定した。
【００７２】
（１１．遺伝子構築と発現）
ＶＥＧＦＲ２の細胞外免疫グロビン（Ｉｇ）ドメインをｐＧＥＸ−４Ｔ−１プラスミド（ＧＥ（登録商標）Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）に構築し、組換え蛋白質をコンピテントＥｃｏｌｉ細胞系で発現させた。ＶＥＧＦＲ２遺伝子（ＮＭ＿００２２５３．２）の細胞外Ｉｇドメインおよびそのサブドメイン６および７を、プラスミドＥＸ−Ｉ０１１４−Ｌｖ２０５（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を鋳型として使用し、ＢａｍＨ１およびＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で制限的に消化し、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（ＧＥ（登録商標）Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）にクローニングし、それぞれＶＥＧＦＲ２−ＥＤ  Ｉｇ  Ｄ１−７およびＤ６−７と命名した遺伝子特異的ＰＣＲプライマーによって作製した。この遺伝子構築物を、４２℃で４０秒間の熱ショックによってＪＭ１０９細胞（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に形質転換し、そしてＬＢ寒天上のアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）によって選択した。抗生物質耐性細胞における遺伝子挿入は、標準的なコロニーＰＣＲおよび遺伝子配列決定により確認した。陽性細胞をアンピシリン含有ＬＢブロス中で増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））により３７℃で３時間タンパク質発現を誘導した。細胞をペレット化し、氷冷溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０／０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で、１００μｇ／ｍＬリゾチーム、１０ｍＭ  ＰＭＳＦおよび５単位のベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を添加して疑った。超音波処理後１０，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって可溶性画分を得た。ＧＳＴタグ化組換えタンパク質をグルタチオン結合セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で捕捉し、１０ｍＭ還元型グルタチオンで溶出し、ＰＢＳに対して一晩透析した。組換えタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた。
【００７３】
真核細胞においてＶＥＧＦＲ３遺伝子の細胞外ドメインを発現するため、遺伝子挿入物をｐＣＭＶ６−ＸＬ６−ｍｙｃベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）にクローニングし、タンパク質発現を行った。簡単に述べると、ＶＥＧＦＲ３遺伝子（ＮＭ＿００２０２０．４）の細胞外Ｉｇドメインとそのサブドメインを、遺伝子特異的プライマーとｐＣＭＶ６−ＸＬ６−ＶＥＧＦＲ３（Ｄｒ．Ｊ．Ｌ  Ｓｕ提供）を鋳型としてＰＣＲ法により作製した。制限消化後、挿入物をｐＣＭＶ６−ＸＬ６（ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位にクローニングし、遺伝子増幅のためＤＨ５α細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））に形質転換した。得られたＶＥＧＦＲ３−ＥＤ  Ｉｇ  Ｄ１−７−、Ｄ３−４−、およびＤ６−７−ｍｙｃプラスミドの遺伝子配列を直接配列決定により検証した。
【００７４】
言及されたプラスミドによってコードされる組換えタンパク質を発現および精製するため、ＨＥＫ２９３細胞を、製造業者の説明書に記載されるように、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））でトランスフェクトした。コードされたタンパク質を抗Ｍｙｃ抗体動員カラムで精製し、ネイティブＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いてネイティブＰＡＧＥゲル中で分離し、続いてニトロセルロース膜上でイムノブロッティングした。ＶＥＧＦＲ２抗体の交差反応性を調べるため、ブロットをＲ２Ｃ７−１またはＲ２Ｃ９−１１抗体でプローブし、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）によって検出した。シグナルは、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を用いて可視化した。
【００７５】
（他の実施形態）
本明細書に開示された特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示された各特徴は、同一の、同等の、または同様の目的を果たす代替特徴によって置換可能である。よって特に断らない限り、開示される各特徴は同等または類似の特徴の、一般的系列の一例にすぎない。
【００７６】
上記の説明から、当業者は説明された実施形態の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、実施形態の様々な変更および修正を行って、それを様々な用途および条件に適応させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【図１】
2021531264.tif 000006
【図２】
2021531264.tif 000007
【図３】
2021531264.tif 000008
【図４】
2021531264.tif 000009
【図５】
2021531264.tif 000010
【図６】
2021531264.tif 000011
【図７】
2021531264.tif 000012
【図８】
2021531264.tif 000013
【図９】
2021531264.tif 000014
【図１０】
2021531264.tif 000015
【図１１】
2021531264.tif 000016
【配列表】
2021531264000001.app
【国際調査報告】
2021531264.tif 000017
2021531264.tif 000018
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