(57)【要約】本開示は、腫瘍関連抗原に対する哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されているファーミントンウイルスを提供する。ファーミントンウイルスは、腫瘍関連抗原からのエピトープを含む抗原性タンパク質を発現することができる。ファーミントンウイルスは、ウイルスが腫瘍関連抗原からのエピトープを含む抗原性タンパク質とは別である組成物で製剤化することができる。本開示はまた、哺乳動物の免疫応答を誘導するのに使用するためのプライム：ブースト療法を提供する。ブーストは、ファーミントンウイルス、又はファーミントンウイルスを含む組成物を含む。【選択図】  図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルス。
【請求項２】
前記ファーミントンウイルスのゲノム骨格が、配列番号３〜７のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載のファーミントンウイルス。
【請求項３】
前記ファーミントンウイルスの前記ゲノム骨格が、配列番号３〜７のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする、請求項２に記載のファーミントンウイルス。
【請求項４】
前記腫瘍関連抗原が外来抗原である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のファーミントンウイルス。
【請求項５】
前記外来抗原が、ＨＰＶ由来のＥ６タンパク質又はＨＰＶ由来のＥ７タンパク質を含む、請求項４に記載のファーミントンウイルス。
【請求項６】
前記腫瘍関連抗原が自己抗原である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のファーミントンウイルス。
【請求項７】
前記自己抗原がＭＡＧＥＡ３である、請求項６に記載のファーミントンウイルス。
【請求項８】
前記腫瘍関連抗原がネオエピトープである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のファーミントンウイルス。
【請求項９】
前記ファーミントンウイルスが投与されている哺乳動物において前記腫瘍関連抗原に対して免疫応答を誘導する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のファーミントンウイルス。
【請求項１０】
前記哺乳動物が、前記ファーミントンウイルスとは免疫学的に異なるプライムを以前に投与されている、請求項９に記載のファーミントンウイルス。
【請求項１１】
前記プライムが、
（ａ）前記腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むウイルス、
（ｂ）前記腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞；又は
（ｃ）前記腫瘍関連抗原のペプチド、
である、請求項１０に記載のファーミントンウイルス。
【請求項１２】
細胞死タンパク質をさらにコードする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のファーミントンウイルス。
【請求項１３】
腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含む組成物であって、前記腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されている、組成物。
【請求項１４】
ファーミントンウイルス及び腫瘍関連抗原からのエピトープを含む抗原性タンパク質を含む組成物であって、
前記ファーミントンウイルスが前記抗原性タンパク質とは別である、
前記腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されている、組成物。
【請求項１５】
哺乳動物の免疫応答を誘導するのに使用するための異種組合せプライム：ブースト療法であって、
プライムが、腫瘍関連抗原への哺乳動物の免疫を生成するように製剤化されており、
ブーストが、腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含み、前記腫瘍関連抗原に対して前記哺乳動物の前記免疫応答を誘導するように製剤化されている、
異種組合せプライム：ブースト療法。
【請求項１６】
がんを有する哺乳動物の免疫応答を増強する方法であって、
腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含む組成物を前記哺乳動物に投与するステップ、
を含み、
前記哺乳動物が、前記腫瘍関連抗原又はそのエピトープに向けられているプライムを投与されており、
前記プライムが前記ファーミントンウイルスとは免疫学的に異なる、
方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物が、前記腫瘍関連抗原を発現する腫瘍を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが脳がんである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記脳がんが膠芽腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記がんが結腸がんである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ファーミントンウイルスが前記腫瘍関連抗原のエピトープを発現することができる、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記プライムが前記腫瘍関連抗原のエピトープに向けられている、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プライムが、前記ファーミントンウイルスによってコードされている前記エピトープと同じ前記腫瘍関連抗原のエピトープに向けられている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プライムが、
（ａ）前記腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むウイルス、
（ｂ）前記腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞；又は
（ｃ）前記腫瘍関連抗原のペプチド、
を含む、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記プライムが、前記腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むウイルスを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライムが一本鎖ＲＮＡウイルスを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖ＲＮＡウイルスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プラス鎖ＲＮＡウイルスがレンチウイルスである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記一本鎖ＲＮＡウイルスがマイナス鎖ＲＮＡウイルスである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記プライムが二本鎖ＤＮＡウイルスを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記二本鎖ＤＮＡウイルスがアデノウイルスである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アデノウイルスがＡｄ５ウイルスである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プライムが、前記腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記プライムが前記腫瘍関連抗原のペプチドを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記プライムがアジュバントをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物が前記プライムを投与されて少なくとも９日後に、前記哺乳動物は前記組成物を投与される、請求項１６〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物が前記プライムを投与されて１４日後以内に、前記哺乳動物は前記組成物を投与される、請求項１６〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含む組成物を前記哺乳動物に投与する第２のステップをさらに含む、請求項１６〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の投与するステップが、前記第１の投与するステップの少なくとも５０日、少なくとも７５日、少なくとも１００日、又は少なくとも１２０日後に実施される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含む組成物を前記哺乳動物に投与する第３のステップをさらに含む、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第３の投与するステップが、前記第２の投与するステップの少なくとも５０日、少なくとも７５日、少なくとも１００日、又は少なくとも１２０日後に実施される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つの投与するステップが、全身経路の投与によって実施される、請求項１６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つの投与するステップが非全身経路の投与によって実施される、請求項１６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの投与するステップが、前記哺乳動物の腫瘍に直接注射によって実施される、請求項１６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１つの投与するステップが頭蓋内に実施される、請求項１６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つの投与するステップが静脈内に実施される、請求項１６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１つの投与するステップが静脈内及び頭蓋内の両方に実施される、請求項１６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞の頻度が、前記投与するステップの後に増加する、請求項１６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記Ｔ細胞がＣＤ８  Ｔ細胞を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物を投与されていない対照哺乳動物の生存と比較して、前記哺乳動物の生存が延長している、請求項１６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記対照哺乳動物が、前記腫瘍関連抗原に向けられた前記組成物とは免疫学的に異なるプライムを投与されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ファーミントンウイルスに特異的なＴ細胞の前記頻度が、前記投与するステップ後に３％以下だけ増加する、請求項１６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ファーミントンウイルスに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の前記頻度が、前記投与するステップ後に３％以下だけ増加する、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本開示は、ファーミントン（ＦＭＴ）ウイルス及びがんの処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]病原体及び疾患細胞には、免疫系が検出及び標的化することができる抗原が含まれるので、免疫原性ワクチン及び免疫療法を含めた、免疫ベースの療法の基礎を提供する。例えば、がん処置の文脈では、免疫療法とは、がん細胞が、その細胞表面に認識及び標的化することができる分子を有することが多いという事実に基づいている。
【０００３】
[0003]ウイルスも、疾患細胞を直接死滅させるウイルスの能力を部分的に関連させて、がん治療に用いられてきた。例えば、腫瘍崩壊性ウイルス（ＯＶ）は、悪性細胞に特異的に感染し、悪性細胞の中で複製し、悪性細胞を死滅させ、正常組織を無影響のまま残る。いくつかのＯＶが、種々の新生物の処置に向けての臨床評価に関して進展した段階に到達している。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に加えて、非ＶＳＶマラバウイルスがｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍親和性を示した。「マラバＭＧ１」又は「ＭＧ１」と呼ばれるマラバウイルスは、野生型マラバと比較して、改善された腫瘍選択性及び正常細胞での低減した病原性を有するように、操作された。ＭＧ１は、Ｇタンパク質変異（Ｑ２４２Ｒ）及びＭタンパク質変異（Ｌ１２３Ｗ）の両方を含有する二重変異体株である。ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＧ１はマウスの異種移植腫瘍モデル及び同系腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有し、ＭＧ１に先んじた弱毒化ＶＳＶ、ＶＳＶ△ＡＭ５１腫瘍溶解性ウイルスで観察された治療効力より優れている（国際公開第２０１１／０７０４４０号）。
【０００４】
[0004]ＯＶ誘導性抗腫瘍免疫を改善するために種々の戦略が開発されてきた。この戦略は、ウイルスの固有の腫瘍溶解活性、及び腫瘍関連抗原への免疫を生成する媒体としてウイルスを使用する能力の両方の利点を活かしている。そのような戦略の１つは、「腫瘍溶解性ワクチン」と定義され、ｉｎ  ｖｉｖｏで１つ又は複数の腫瘍抗原（複数可）を発現する核酸配列を含有するような、腫瘍溶解性ウイルスの改変を伴う。ＶＳＶは、がんワクチンベクターとしても使用できることが実証された。ヒトドーパクロームトートメラーゼ（ｈＤＣＴ）は、黒色腫のがんに存在する抗原である。マウス黒色腫モデルで異種プライム：ブースト設定で投与した場合、ｈＤＣＴを発現するＶＳＶは、ＤＣＴへの増大した腫瘍特異的免疫ばかりでなく、抗ウイルス適応免疫の同時の低減も誘導した。結果として、中期及び長期の生存期間の両方の向上がモデル系において見られた。
【０００５】
[0005]ファーミントンウイルスは、一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスのラブドウイルス科のメンバーであり、腫瘍溶解特性を有すると以前に実証されている。ファーミントンウイルスは、流行性の東部ウマ脳炎の発生中に野鳥から最初に分離された。
【０００６】
[0006]がん抗原を標的とするように改善された免疫原性を送達し、一方、処置の全体的な腫瘍溶解効力を保持し又はさらには改善する、改善された腫瘍溶解性ワクチンベクター及び処置レジメンの必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
[0007]以下の開示は、本発明の範囲を例示することを意図するもので、限定することを意図するものではない。
【０００８】
[0008]本発明の目標は、例えば、腫瘍関連抗原を発現しているがんを伴う哺乳動物において、治療的腫瘍溶解性レベルで機能することも、一方、同じ腫瘍関連抗原への治療的免疫応答を誘発することも両方とも機能するように、腫瘍溶解性ワクチンに改変することができる新しい改善された腫瘍溶解性ウイルスを開発することである。本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、異種プライム：ブースト療法のブースト構成要素として使用することができる。例えば、本開示に記載の方法を使用して投与される場合、結果として生じるプライム：ブースト療法は、以前に開示された１つ又は複数のプライム：ブースト組合せ療法の置き換え又は追加の場合に改善された効力をもたらす。例えば、それらのそれぞれの全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる、国際出願の国際公開第２０１０／１０５３４７号、国際公開第２０１４／１２７４７８号、及び国際公開第２０１７／１９５０３２号を参照されたい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
[0009]一態様では、本開示は、腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されているファーミントンウイルスを提供する。一部の実施形態では、ファーミントンウイルスは、腫瘍関連抗原からのエピトープを含む抗原性タンパク質を発現することができる。一部の実施形態では、ファーミントンウイルスは、ウイルスが、腫瘍関連抗原からの少なくとも１つのエピトープを含む抗原性タンパク質とは別である組成物で製剤化されている。
【００１０】
[0010]別の態様では、本開示は、哺乳動物の免疫応答を誘導するのに使用するための異種組合せプライム：ブースト療法を提供する。プライムは、腫瘍関連抗原への哺乳動物の免疫を生成するように製剤化されている。ブーストはファーミントンウイルスを含み、腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されている。腫瘍関連抗原への免疫応答は別として、プライムとブーストは免疫学的に異なる。
【００１１】
[0011]さらに別の態様では、本開示は、腫瘍関連抗原への以前から存在する免疫を有する哺乳動物対象において、上記腫瘍関連抗原への免疫応答を誘導するのに使用するためのブーストを含む組成物を提供する。ブーストはファーミントンウイルスを含み、腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されている。以前から存在する免疫は、組合せプライム：ブースト処置からのプライムによって生成することができる。このような例では、ブーストによって生成される免疫応答は、プライム：ブースト処置で使用されるプライムによって生成される免疫応答と同じ腫瘍関連抗原に基づいている。免疫応答は別として、ブーストはプライムとは免疫学的に異なる。
【００１２】
[0012]さらに別の態様では、本開示は、腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されているファーミントンウイルスを提供する。ファーミントンウイルスは、腫瘍関連抗原への以前から存在する免疫のブーストとして使用するためのものである。以前から存在する免疫は、組合せプライム：ブースト療法のプライムによって生成することができる。組合せプライム：ブースト療法のプライムは、腫瘍関連抗原への哺乳動物の免疫を生成するように製剤化され、腫瘍関連抗原への免疫学的応答は別として、ブーストはプライムとは免疫学的に異なる。
【００１３】
[0013]一態様では、本開示は、腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを提供する。一部の実施形態では、ファーミントンウイルスのゲノム骨格は、配列番号３〜７のうちのいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ファーミントンウイルスのゲノム骨格は、配列番号３〜７のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。
【００１４】
[0014]一部の実施形態では、腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）は、外来抗原である。例えば、外来抗原は、抗原性の部分（単数）、部分（複数）、若しくは派生体、又は腫瘍関連外来抗原全体を含むことができる。本発明の方法で使用される例示的な外来ＴＡＡは、既知のＴＡＡの１つ又は複数の断片であっても１つ又は複数の断片に由来してもよい。外来ＴＡＡは、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）由来のＥ６タンパク質；ＨＰＶ由来のＥ７タンパク質；Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質；ヒトＣＭＶ抗原、ｐｐ６５；マウスＣＭＶ抗原、ｍ３８等、を含む。
【００１５】
[0015]一部の実施形態では、腫瘍関連抗原（「ＴＡＡ」）は、自己抗原である。例えば、自己抗原は、抗原性の部分（単数）、部分（複数）、若しくは派生体、又は腫瘍関連自己抗原全体を含むことができる。本発明の方法で使用される例示的な自己ＴＡＡは、既知のＴＡＡの１つ又は複数の断片であっても１つ又は複数の断片に由来してもよい。自己ＴＡＡは、ヒトドーパクロムトートメラーゼ（ｈＤＣＴ）抗原；黒色腫関連抗原（「ＭＡＧＥＡ３」）；前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原（「ｈｕＳＴＥＡＰ」）；ヒトがん精巣抗原１（「ＮＹＥＳ０１」）他、を含む。
【００１６】
[0016]一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ネオエピトープである。
【００１７】
[0017]一部の実施形態では、ファーミントンウイルスは、ファーミントンウイルスが投与されている哺乳動物において腫瘍関連抗原に対して免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、哺乳動物は、ファーミントンウイルスとは免疫学的に異なるプライムを以前に投与されている。
【００１８】
[0018]一部の実施形態では、プライムは、例えば、
（ａ）腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むウイルス；
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞；又は
（ｃ）腫瘍関連抗原のペプチド、
である。
【００１９】
[0019]一部の実施形態では、ファーミントンウイルスは、細胞死タンパク質をさらにコードする。
【００２０】
[0020]一態様では、本開示は、
腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含む組成物であって、
上記腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されている、組成物を提供する。
【００２１】
[0021]一態様では、本開示は、
ファーミントンウイルス及び腫瘍関連抗原由来のエピトープを含む抗原性タンパク質を含む組成物であって、
上記ファーミントンウイルスが上記抗原性タンパク質とは別である、
上記腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されている、組成物、を提供する。
【００２２】
[0022]一態様では、本開示は、哺乳動物の免疫応答を誘導するのに使用するための異種組合せプライム：ブースト療法であって、
プライムが、腫瘍関連抗原への哺乳動物の免疫を生成するように製剤化されており、
ブーストが、腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含み、上記腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されている、
異種組合せプライム：ブースト療法を提供する。
【００２３】
[0023]一態様では、本開示は、
がんを有する哺乳動物の免疫応答を増強する方法であって、
腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含む組成物を上記哺乳動物に投与するステップを含み、
上記哺乳動物は、上記腫瘍関連抗原又はそのエピトープに向けられているプライムを投与されており、
上記プライムは上記ファーミントンウイルスとは免疫学的に異なる、
方法を、提供する。
【００２４】
[0024]一部の実施形態では、哺乳動物は腫瘍関連抗原を発現する腫瘍を有する。
【００２５】
[0025]一部の実施形態では、がんは脳腫瘍である。例えば、脳がんは膠芽腫とすることができる。
【００２６】
[0026]一部の実施形態では、がんは結腸がんである。
【００２７】
[0027]一部の実施形態では、ファーミントンウイルスは腫瘍関連抗原のエピトープを発現することができる。
【００２８】
[0028]一部の実施形態では、プライムは腫瘍関連抗原のエピトープに向けられている。
【００２９】
[0029]一部の実施形態では、プライムは、ファーミントンウイルスによってコードされているエピトープと腫瘍関連抗原の同じエピトープに向けられている。
【００３０】
[0030]一部の実施形態では、プライムは：
（ａ）腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むウイルス；
（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞；又は
（ｃ）腫瘍関連抗原のペプチド、
を含む。
【００３１】
[0031]一部の実施形態では、プライムは、腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むウイルスを含む。例えば、プライムは、プラス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、レンチウイルス）又はマイナス鎖ＲＮＡウイルスなどの一本鎖ＲＮＡウイルスを含むことができる。一部の実施形態では、プライムは二本鎖ＤＮＡウイルスを含む。例えば、二本鎖ＤＮＡウイルスは、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５ウイルス）とすることができる
【００３２】
[0032]一部の実施形態では、プライムは腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞を含む。
【００３３】
[0033]一部の実施形態では、プライムは腫瘍関連抗原のペプチドを含む。そのような一部の実施形態では、プライムはアジュバントをさらに含む。
【００３４】
[0034]一部の実施形態では、哺乳動物はプライムを投与されて少なくとも９日後に、哺乳動物は組成物を投与される。一部の実施形態では、哺乳動物はプライムを投与されて１４日後以内に、哺乳動物は組成物を投与される。
【００３５】
[0035]一部の実施形態では、提供される方法は、腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含む組成物を哺乳動物に投与する第２のステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の投与するステップは、第１の投与するステップの少なくとも５０日、少なくとも７５日、少なくとも１００日、又は少なくとも１２０日後に実施される。
【００３６】
[0036]一部の実施形態では、提供される方法は、腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含む組成物を哺乳動物に投与する第３のステップをさらに含む。一部の実施形態では、第３の投与するステップは、第２の投与するステップの少なくとも５０日、少なくとも７５日、少なくとも１００日、又は少なくとも１２０日後に実施される。
【００３７】
[0037]一部の実施形態では、少なくとも１つの投与するステップは、全身経路の投与によって実施される。
【００３８】
[0038]一部の実施形態では、少なくとも１つの投与するステップは、非全身経路の投与によって実施される。
【００３９】
[0039]種々の実施形態では、少なくとも１つの投与するステップは、哺乳動物の腫瘍に直接、頭蓋内、静脈内、又は静脈内及び頭蓋内の両方に注射によって実施される。
【００４０】
[0040]一部の実施形態では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞の頻度は、投与するステップの後に増加する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞を含む。
【００４１】
[0041]一部の実施形態では、哺乳動物の生存は、組成物を投与されていない対照哺乳動物の生存と比較して延長している。一部の実施形態では、対照哺乳動物は、腫瘍関連抗原に向けられ、組成物とは免疫学的に異なるプライムを投与されている。
【００４２】
[0042]一部の実施形態では、ファーミントンウイルスに特異的なＴ細胞の頻度は、投与するステップ後に３％以下だけ増加する。一部の実施形態では、ファーミントンウイルスに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の頻度は、投与するステップ後に３％以下だけ増加する。
【００４３】
[0043]本開示の他の態様及び特徴は、添付の図面と併せて、特定の実施形態に関する以下の記載を検討すれば、当業者であれば明らかとなるだろう。
【００４４】
[0044]次に、本開示の実施形態を、単に例示の目的で、添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】操作したファーミントン（ＦＭＴ）ウイルスは、用途が広いがんワクチンプラットフォームであることを示す図である。ｍ３８抗原を発現するように操作したＦＭＴウイルスは、異なる３つのプライム方法：操作したＡｄＶ−ｍ３８、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のＡＣＴ、又はアジュバントを含むｍ３８ペプチド、とペアにした場合、免疫応答をブーストすることができ、ブーストの５〜６日後にワクチン接種マウスから単離したＰＢＭＣのｅｘ−ｖｉｖｏペプチド刺激後のＩＦＮγ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞（図１Ａ）並びにＩＦＮγ及びＴＮＦ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞（図１Ｂ）の頻度と数によって、実証される通りである。
【図１Ｂ】ｍ３８抗原を発現するように操作したＦＭＴウイルスは、異なる３つのプライム方法：操作したＡｄＶ−ｍ３８、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のＡＣＴ、又はアジュバントを含むｍ３８ペプチド、とペアにした場合、免疫応答をブーストすることができ、ブーストの５〜６日後にワクチン接種マウスから単離したＰＢＭＣのｅｘ−ｖｉｖｏペプチド刺激後のＩＦＮγ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞（図１Ａ）並びにＩＦＮγ及びＴＮＦ分泌ＣＤ８  Ｔ細胞（図１Ｂ）の頻度と数によって、実証される通りである。
【図１Ｃ】さらに、ＦＭＴウイルスは、異なる種類の抗原：自己抗原（例えば、ＤＣＴ（図１Ｃ））；外来抗原（例えば、ｍ３８（図１Ｄ））；及びネオエピトープ（例えば、変異させたＡｄｐｇｋ及びＲｅｐｓ１（図１Ｅ））、に向けられた免疫応答をブーストすることができる。
【図１Ｄ】ＦＭＴウイルスは、異なる種類の抗原：自己抗原（例えば、ＤＣＴ（図１Ｃ））；外来抗原（例えば、ｍ３８（図１Ｄ））；及びネオエピトープ（例えば、変異させたＡｄｐｇｋ及びＲｅｐｓ１（図１Ｅ））、に向けられた免疫応答をブーストすることができる。
【図１Ｅ】ＦＭＴウイルスは、異なる種類の抗原：自己抗原（例えば、ＤＣＴ（図１Ｃ））；外来抗原（例えば、ｍ３８（図１Ｄ））；及びネオエピトープ（例えば、変異させたＡｄｐｇｋ及びＲｅｐｓ１（図１Ｅ））、に向けられた免疫応答をブーストすることができる。グラフは平均とＳＥＭを示す。データは一元配置ＡＮＯＶＡダンの多重比較検定（図１Ａ、１Ｂ）、一元配置ＡＮＯＶＡダンの多重比較検定（図１Ｃ）、マンホイットニー検定（図１Ｄ）、及び二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ多重比較検定（図１Ｅ）、で解析した。ＡｄＶ−  アデノウイルス、ＡＣＴ−  養子細胞移植、Ｐ値：＊−  Ｐ＜０．０５、＊＊−  Ｐ＜０．０１、＊＊＊−  Ｐ＜０．００１。
【図２Ａ】ＦＭＴベースのワクチン接種が長期持続性免疫応答を誘導することを示す図である。ＰＢＳ対照と比較してＦＭＴ−ｍ３８による第１のブーストに続いて、並びにＰＢＳ対照及びブースト直前の免疫応答と比較して第１のブーストの１２０日後に適用されたＦＭＴ−ｍ３８による第２のブーストに続いて、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度と数の増加が観察された（図２Ａ）。抗ｍ３８免疫応答は５ヶ月を越えて持続した（図２Ａ）。
【図２Ｂ】同種多回ブーストは、より長い時間間隔で適用された場合（１ヶ月と比較して最低３ヶ月）、より効果的であった（図２Ｂ、２Ｃ）。３つのペプチド全てでプライムしたマウスと比較して、１つのペプチドのみでプライムしたマウスでは、ワクチン接種後に、より高い頻度と数のネオエピトープ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞が検出された（図２Ｂ、２Ｃ）。このような免疫応答は６ヶ月を越えて続いた（図２Ｂ、２Ｃ）。
【図２Ｃ】同種多回ブーストは、より長い時間間隔で適用された場合（１ヶ月と比較して最低３ヶ月）、より効果的であった（図２Ｂ、２Ｃ）。３つのペプチド全てでプライムしたマウスと比較して、１つのペプチドのみでプライムしたマウスでは、ワクチン接種後に、より高い頻度と数のネオエピトープ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞が検出された（図２Ｂ、２Ｃ）。このような免疫応答は６ヶ月を越えて続いた（図２Ｂ、２Ｃ）。
【図２Ｄ】データは、マンホイットニー検定（図２Ｂ、２Ｃ、２Ｅ、及び２Ｈ）及び一元配置ＡＮＯＶＡダンの多重比較検定（図２Ｄ及び２Ｉ）で解析した。ＡＣＴ−  養子細胞移植。
【図２Ｅ】データは、マンホイットニー検定（図２Ｂ、２Ｃ、２Ｅ、及び２Ｈ）及び一元配置ＡＮＯＶＡダンの多重比較検定（図２Ｄ及び２Ｉ）で解析した。ＡＣＴ−  養子細胞移植。
【図２Ｆ】ＦＭＴベースのワクチン接種が長期持続性免疫応答を誘導することを示す図である。
【図２Ｇ】ＦＭＴベースのワクチン接種が長期持続性免疫応答を誘導することを示す図である。
【図２Ｈ】データは、マンホイットニー検定（図２Ｂ、２Ｃ、２Ｅ、及び２Ｈ）及び一元配置ＡＮＯＶＡダンの多重比較検定（図２Ｄ及び２Ｉ）で解析した。ＡＣＴ−  養子細胞移植。
【図２Ｉ】データは、マンホイットニー検定（図２Ｂ、２Ｃ、２Ｅ、及び２Ｈ）及び一元配置ＡＮＯＶＡダンの多重比較検定（図２Ｄ及び２Ｉ）で解析した。ＡＣＴ−  養子細胞移植。
【図３Ａ】ＦＭＴウイルスベースのがんワクチンの抗腫瘍効力を示す図である。プライム＋ブースト設定でのＦＭＴ−ｍ３８ウイルスによる処置は、ＰＢＳ対照及びプライムのみの対照と比較してＣＴ２Ａ−ｍ３８担癌マウスの生存を有意に延長し、担癌マウスにおいて抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した（図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃ）。
【図３Ｂ】プライム＋ブースト設定でのＦＭＴ−ｍ３８ウイルスによる処置は、ＰＢＳ対照及びプライムのみの対照と比較してＣＴ２Ａ−ｍ３８担癌マウスの生存を有意に延長し、担癌マウスにおいて抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した（図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃ）。
【図３Ｃ】プライム＋ブースト設定でのＦＭＴ−ｍ３８ウイルスによる処置は、ＰＢＳ対照及びプライムのみの対照と比較してＣＴ２Ａ−ｍ３８担癌マウスの生存を有意に延長し、担癌マウスにおいて抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導した（図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃ）。
【図３Ｄ】Ａｄｐｇｋ及びＲｅｐｓ１のネオエピトープに対するＦＭＴベースのワクチン接種は、腫瘍の進行を遅延させ、ＭＣ−３８担癌マウスの生存を延長し、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答をブーストした（図３Ｄ）。データを次のように解析した：図３Ａ〜３Ｃの場合：生存分析についてログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定及び一元配置ＡＮＯＶＡダンの多重比較検定；図１Ｄの場合生存分析についてログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定及び二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ多重比較検定。ＡｄＶ−  アデノウイルス、ＡＣＴ−  養子細胞移植、Ｐ値：＊−  Ｐ＜０．０５、＊＊−  Ｐ＜０．０１、＊＊＊−  Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊−  Ｐ＜０．０００１。
【図４Ａ】ＴＡＡ特異的エフェクターＣＤ８  Ｔ細胞を誘導することが、治療効力をもたらすことを示す図である。抗ｍ３８プライム及びブーストによる処置は、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の高い頻度と数を誘導し、ｍ３８発現ＣＴ２Ａ腫瘍を担持するマウスの生存を延長したが、一方、無関係な抗原によるワクチン接種は生存に影響を与えなかった（図４Ａ）。
【図４Ｂ】プライム＋ブースト処置は、ＡＣＴ開始用量１０３細胞で担癌マウスの生存を改善した（図４Ｂ）。ＡＣＴプライム用量を増やすことは、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のより高い頻度と数及び向上した治癒率をもたらした。しかし、さらなる延命効果は、ＡＣＴ用量１０５細胞を超えて観察されなかった（図４Ｂ）。
【図４Ｃ】静脈内（ｉｖ）に投与されたＦＭＴ−ｍ３８処置は、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の最も高い頻度と数を誘導し、頭蓋内（ｉｃ）（腫瘍内）経路及び静脈内（ｉｖ）と頭蓋内（ｉｃ）の経路の組合せと比較して最も良好な治療効力を有した（図４Ｃ）。頭蓋内注射後と比較して、ＦＭＴウイルスの静脈内注射後に脾臓で検出された感染性粒子のより高い量が、この観察を説明している可能性がある（図４Ｃ）。全ての処置戦略は生存を延長したが、頭蓋内注射単独と比較して、静脈内経路単独又は頭蓋内注射との組合せによって投与された群では、より高い治癒率が観察された（図４Ｃ）。
【図５Ａ】以前から存在するＴＡＡ特異的ＣＤ８エフェクターＴ細胞は、腫瘍チャレンジ後の生存を延長することを示す図である（例８を参照されたい）。図５Ａ及び５Ｃは、それぞれ、腫瘍チャレンジの９日前及び６日後のマウスからの血中のＣＤ８＋ＩＦＮγ＋（全ＣＤ８＋細胞のうち）のパーセンテージを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂ及び５Ｄは、それぞれ、腫瘍チャレンジの９日前及び６日後のマウスからの血液１ｍＬ当たりのｍ３８特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の量を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ及び５Ｃは、それぞれ、腫瘍チャレンジの９日前及び６日後のマウスからの血中のＣＤ８＋ＩＦＮγ＋（全ＣＤ８＋細胞のうち）のパーセンテージを示す。
【図５Ｄ】図５Ｂ及び５Ｄは、それぞれ、腫瘍チャレンジの９日前及び６日後のマウスからの血液１ｍＬ当たりのｍ３８特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の量を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、種々のプライム：ブースト処置又はＰＢＳを受けているマウスのカプランマイヤー生存曲線を示す。
【図６Ａ】頭蓋内に投与されたＦＭＴベースのワクチン接種が、脳腫瘍微小環境内の抗腫瘍免疫応答を促進する図である。静脈内（ｉｖ）経路と頭蓋内（ｉｃ）経路の両方によるＦＭＴ−ｍ３８注射は、ＰＢＳ対照と比較して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の頻度と数を増加したが、一方、マクロファージの数は各群で同じままであった（図６Ａ）。ＦＭＴ−ｍ３８静脈内処置群では、マクロファージの異なるＣＤ１１ｂｌｏｗ  ＣＤ４５＋集団が観察された（図６Ａ）。図６Ａの「全マクロファージ」集団は、ＣＤ１１ｂｌｏｗ  ＣＤ４５＋とＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５ｂｒｉｇｈｔのマクロファージ集団両方を含む（ドットプロットの赤いゲート）。
【図６Ｂ】ＦＭＴ−ｍ３８ベースのワクチン接種は、ＣＤ２０６＋マクロファージの頻度と数を減少させたが、一方、ＣＤ８６の発現はＰＢＳ対照と非常に類似していた（図６Ｂ）。
【図６Ｃ】頭蓋内に送達されたＦＭＴ−ｍ３８による処置は、ＣＤ８とＣＤ４  Ｔ細胞の両方の動員を増加したが、一方、対照マウスの腫瘍と比較して、静脈内に投与されたＦＭＴ−ｍ３８により処置されたマウスの腫瘍では、ＣＤ８とＣＤ４  Ｔ細胞の減少した量が見られた（図６Ｃ）。ＣＤ８ｌｏｗ  Ｔ細胞が、ゲーティングされ、ドットプロット上で異なる集団を形成したので、ＣＤ８  Ｔ細胞と思われ（図６Ｃ）、他の実験では活性化時のＣＤ８マーカーのダウンレギュレーションが観察された。ＦＭＴウイルスの頭蓋内注射は、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、及びＴＮＦａの各サイトカイン並びにＧ−ＣＳＦ増殖因子のレベルを高めた（図６Ｄ）。
【図６Ｄ】ＣＤ８ｌｏｗ  Ｔ細胞が、ゲーティングされ、ドットプロット上で異なる集団を形成したので、ＣＤ８  Ｔ細胞と思われ（図６Ｃ）、他の実験では活性化時のＣＤ８マーカーのダウンレギュレーションが観察された。ＦＭＴウイルスの頭蓋内注射は、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、及びＴＮＦａの各サイトカイン並びにＧ−ＣＳＦ増殖因子のレベルを高めた（図６Ｄ）。
【図６Ｅ】ケモカインであるエオタキシン、ＣＸＣＬ５、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸＣＬ１、及びＭＩＰ−２の上昇したレベルが、ＰＢＳ対照又はＦＭＴ静脈内群のマウスの腫瘍で観察されたレベルと比較して、ＦＭＴウイルスを頭蓋内に注射したマウスの腫瘍で観察された。静脈内注射は、ＰＢＳ対照又はＦＭＴ頭蓋内群のレベルと比較して、ＣＸＣＬ５、ＭＩＧ、ＲＡＮＴＥＳ及びＣＸＣＬ１の低下したレベルをもたらした（図６Ｅ）。グラフは、各処置群からの平均とＳＥＭ及び代表的なドットプロットを示す。図６Ａ〜６Ｃの全てのデータを、クラスカル・ウォリス及びダンの多重比較検定で解析したＣＤ２０６＋細胞数を除いて、二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ多重比較検定で解析した。図６Ｄ及び６Ｅの全てのデータを、クラスカル・ウォリス及びダンの多重比較検定で解析した。Ｐ値：＊−  Ｐ＜０．０５、＊＊−  Ｐ＜０．０１、＊＊＊−  Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊−  Ｐ＜０．０００１。
【図７Ａ】抗原特異的セントラルメモリーＣＤ８  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増幅を示す図である。脾細胞を、Ｍａｘｉｍ３８マウスから抽出し、ｍ３８ペプチドの存在下で補充ＲＰＭＩ培地で６日間培養した。回収の日に、細胞をフローサイトメトリーによって表現型を決定した。細胞の大部分はＣＤ８陽性であった（図７Ａ）。
【図７Ｂ】ＣＤ８＋集団内では、細胞のうちの４０〜６０％がメモリーＣＤ１２７＋ＣＤ６２Ｌ＋表現型であった（図７Ｂ）。
【図７Ｃ】メモリーＴ細胞のほとんどがＣＤ２７を発現し、ＫＬＲＧ１を発現したものはなく、ＣＣＲ７の発現は異なる細胞産物間で様々であったが、ほとんどの場合低かった（図７Ｃ）。
【図８】ＦＭＴウイルス骨格へのＣＤ８  Ｔ細胞の応答を示す図である。ＦＭＴウイルスの優性エピトープに対するＣＤ８  Ｔ細胞応答を、ＦＭＴ−ｍ３８ブーストの５〜６日後にペプチド刺激及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイによって評価した。ＦＭＴ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度は０〜３％の範囲であり、ＰＢＳ対照と比較してＡＣＴ−ｍ３８でプライムした群でのみ有意に高かった。一元配置ＡＮＯＶＡダンの多重比較検定。ＡｄＶ−  アデノウイルス、ＡＣＴ−  養子細胞移植、Ｐ値：＊−  Ｐ＜０．０５、＊＊−  Ｐ＜０．０１、＊＊＊−  Ｐ＜０．００１。
【図９Ａ】ＣＴ２Ａ−ｍ３８脳腫瘍モデルの特徴を示す図である。野生型ＣＴ２Ａ細胞を注射したマウス（左パネル）の脳のＭＲＩイメージングに対してＣＴ２Ａ−ｍ３８細胞を注射したマウスの脳のＭＲＩイメージング（図９Ａ）。
【図９Ｂ】ＣＴ２Ａ−ｍ３８細胞の頭蓋内移植の２１日後にマウスから抽出した腫瘍細胞にｍ３８エピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ  Ｉ）対立遺伝子の発現（図９Ｂ）。
【図１０】脳腫瘍採取の日の免疫応答を示す図である。ＦＭＴ−ｍ３８のｉｃ又はｉｖ注射の６日後にＣＴ２Ａ−ｍ３８担癌マウスから血液を採取した。ＦＭＴ−ｍ３８ブーストは、ｍ３８特異的細胞の頻度と数を増幅した。
【図１１Ａ】腫瘍浸潤免疫細胞の表現型を決定するためのゲーティング戦略を示す図である。デブリ及び死細胞を、ＦＳＣ対ＳＳＣプロット上で除外し、次いで、シングレットをＦＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ａプロット上でゲーティングし、残存死細胞を生存性色素染色によって除外した（図１１Ａ）。
【図１１Ｂ】免疫細胞をＣＤ４５の発現に基づいてゲーティングした（図１１Ｂ）。
【図１１Ｃ】次に、ＣＤ４５＋集団内で、ミクログリア（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５ｌｏｗ集団と定義）、全マクロファージ（赤いゲート）（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５ｂｒｉｇｈｔ細胞と定義）、及びリンパ球（ＣＤ１１ｂ−ＣＤ４５＋細胞と定義）を区別した（図１１Ｃ）。全てのＣＤ４５＋細胞内でのＮＫ細胞マーカーＮＫｐ４６の発現も試験したが、この集団は全ての免疫細胞のうちの０．５％未満であった（データ示さず）。「全マクロファージ」集団を、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ４５ｂｒｉｇｈｔ集団とＣＤ１１ｂｌｏｗＣＤ４５＋集団にさらに分けた（図１１Ｃ）。
【図１１Ｄ】マクロファージとミクログリアの両方の集団はまた、樹状細胞と顆粒球も含有する可能性がある。ＣＤ１１ｂ−ＣＤ４５＋リンパ球集団内で、Ｔ細胞をＣＤ３＋細胞としてゲーティングした（図１１Ｄ）。マクロファージ及びＴ細胞を、図５Ａ〜Ｅに示したように他のマーカーの発現についてさらに試験した。ＦＳＣ−Ａ  −  前方散乱−面積、ＦＳＣ−Ｈ  −  前方散乱−高さ、ＳＳＣ  −  側方散乱−面積。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
[0057]一般には、本開示は、ファーミントンウイルス、及び免疫賦活性組成物としての又は免疫賦活性組成物におけるファーミントンウイルスの使用、を提供する。ファーミントンウイルスは、腫瘍関連抗原への以前から存在する免疫のブーストとして使用することができる。ブーストは異種組合せプライム：ブースト処置の構成要素とすることができ、この場合、プライムが以前から存在する免疫を生成している。異種プライム：ブースト処置では、プライムとブーストは免疫学的に異なる。
【００４７】
[0058]本開示の文脈において、「免疫学的に異なる」という表現は、少なくとも２つの薬剤又は組成物（例えば、プライム及びブースト）が、互いに交差反応する抗血清を生じないことを意味すると理解されたい。免疫学的に異なるプライム及びブーストの使用は、プライム及びブーストによって一般的に標的とされる腫瘍関連抗原への効果的なプライム／ブースト応答を可能にする。
【００４８】
[0059]本開示の文脈において、「組合せプライム：ブースト療法」とは、（１）プライム及び（２）ブーストがプライム：ブースト処置として投与される予定の療法を指すものと理解されたい。「療法」とは、物理的構成要素を指すと理解されたく、一方、「処置」とは、療法的構成要素の投与に関連する方法を指すと理解されたい。プライムが最初に投与され、哺乳動物において免疫応答が生じた後のみブーストが投与されることになるので、プライム及びブーストは一緒に物理的に供給又はパッケージされる必要はない。一部の例では、プライムの１つのパッケージ（又は複数のパッケージ）及びブーストの別の１つパッケージ（又は複数のパッケージ）の形態で、病院又は医院などの医療機関に、本発明の組合せを供給することができる。パッケージを、様々な時間で供給することができる。他の例では、プライム及びブーストの両方を含むパッケージの形態で、病院又は医院などの医療機関に本発明の組合せを供給することができる。さらに他の例では、プライムを、養子細胞移植向けに哺乳動物からのＴ細胞の単離によるなど、医療機関によって生成することができ、ブーストを異なる時間で供給することができる。
【００４９】
[0060]本開示の文脈において、「腫瘍関連抗原」、「自己腫瘍関連抗原」という表現は、腫瘍細胞と関連しており、健康な細胞又は相応する健康な細胞においては非存在である又は多くないのいずれかである、任意の免疫原を指すためのものである（用途や要件に応じて）。例を挙げると、腫瘍関連抗原は、生物という面において、腫瘍細胞に独特であるとすることができる。そのような抗原の例は、これらに限定されないが、ヒトドーパクロムトートメラーゼ（ｈＤＣＴ）抗原：黒色腫関連抗原（「ＭＡＧＥＡ３」）；前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原（「ｈｕＳＴＥＡＰ」）；ヒトがん精巣抗原１（「ＮＹＥＳ０１」）等、を含む。
【００５０】
[0061]本開示の文脈において、「外来抗原」又は「非自己抗原」という表現は、生物体の外に源を発する抗原、例えば、ウイルス又は微生物、食品、細胞、及びその他の生物からの物質等由来の抗原、を指す。そのような抗原の例は、これらに限定されないが、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）由来のＥ６タンパク質；ＨＰＶ由来のＥ７タンパク質；Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質；Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質；ヒトＣＭＶ抗原、ｐｐ６５；マウスＣＭＶ抗原、ｍ３８等、を含む。
【００５１】
[0062]本開示の文脈において、「ネオ抗原」という用語は、免疫系によって以前に認識されておらず、腫瘍内の遺伝的異常に起因する、新たに形成した抗原を指す。
【００５２】
[0063]本開示の文脈において、「自己抗原」という表現は、生物体内に源を発する抗原を指す。
【００５３】
[0064]ブーストは、腫瘍関連抗原への哺乳動物の免疫応答を生成するように製剤化されている。ブーストは、例えば：抗原性タンパク質を発現するファーミントンウイルス；ファーミントンウイルス及び別の抗原性タンパク質を含む組成物；又は、抗原性タンパク質を発現するファーミントンウイルスに感染させた細胞、とすることができる。
【００５４】
[0065]野生型ファーミントンウイルスの完全長ゲノム配列が決定されている。ファーミントンウイルスによって産生される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ポリヌクレオチドの配列は、配列番号１（国際公開第２０１２１６７３８２号の配列番号１）に示されている。国際公開第２０１２１６７３８２号の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ファーミントンウイルスのＲＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号２（国際公開第２０１２１６７３８２号の配列番号２）に示されている。５つの推定オープンリーディングフレームがゲノム配列に同定された。まだ同定されていないさらなるＯＲＦがウイルスに存在する可能性がある。対応するタンパク質の配列は、配列番号３、４、５、６、及び７（国際公開第２０１２１６７３８２号の配列番号３、４、５、６及び７）に示されている。
【００５５】
[0066]表１は、配列番号１〜７の説明を提供する。
【００５６】
【表１】
2021520793.tif 000003
【００５７】
[0067]コード化ＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号８、９、１０、１１、及び１２に示されている（国際公開第２０１５１５４１９７号の、それぞれ、配列番号８、９、１０、１１及び１２）。（国際公開第２０１２／１６７３８２及び国際公開第２０１５／１５４１９７号の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。）
【００５８】
[0068]本開示の文脈において、「ファーミントンウイルス」という表現は、そのゲノムバックボーンが以下をコードする任意のウイルスを指すと理解されたい：
配列番号３（国際公開第２０１２１６７３８２号の配列番号３）のタンパク質と少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であるタンパク質；
配列番号４（国際公開第２０１２１６７３８２号の配列番号４）のタンパク質と少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であるタンパク質；
配列番号５（国際公開第２０１２１６７３８２号の配列番号５）のタンパク質と少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であるタンパク質；
配列番号６（ＷＱ２０１２１６７３８２号の配列番号６）のタンパク質と少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であるタンパク質；及び
配列番号７（国際公開第２０１２１６７３８２号の配列番号７）のタンパク質と少なくとも９０％同一であり、より好ましくは少なくとも９５％同一であるタンパク質。
【００５９】
[0069]抗原性タンパク質（例えば、腫瘍関連抗原又はそのエピトープ）を発現する本開示によるファーミントンウイルスは、ウイルス遺伝子産物の産生を妨害しないゲノム骨格のどの場所でも挿入された抗原性タンパク質をコードする核酸配列を有することができる。例えば、抗原性タンパク質をコードする配列は、Ｎ遺伝子とＰ遺伝子の間、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間、又はＧ遺伝子とＬ遺伝子の間、に位置することができる。
【００６０】
[0070]抗原性タンパク質を発現する本開示によるファーミントンウイルスは、細胞死に関与しているタンパク質（「細胞死タンパク質」）又はそのバリアントをコードする核酸配列をさらに含むことができる。細胞死タンパク質の例は、これらに限定されないが、以下を含む：
アポプチン；Ｂｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）；ＢＣＬ２−アンタゴニスト／キラー１（ＢＡＫ１）；ＢＣＬ２関連Ｘ（ＢＡＸ）；ｐ１５  ＢＨ３共役ドメインデスアゴニスト、転写バリアント２（ＢＩＤｖ２）；細胞死のＢ細胞リンパ腫２共役メディエーター；カルバモイルリン酸シンテターゼ２、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、及びジヒドロオロターゼ（ＣＡＤ）；カスパーゼ２（ＣＡＳＰ２）；カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）；カスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）；ＣＣＡＡＴ−エンハンサー結合タンパク質相同タンパク質（ＣＨＯＰ）；ＤＮＡ断片化因子サブユニットアルファ（ＤＦＦＡ）；グランザイムＢ；活性化されたｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）；ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート誘導タンパク質１（ＰＭＡＰＩ  １、ＮＯＸＡとも呼ばれる）；アポトーシスベータのｐ５３アップレギュレートされたモジュレーター（ＰＵＭＡベータ）；アポトーシスガンマのｐ５３アップレギュレートされたモジュレーター（ＰＵＭＡガンマ）；ｐ５３誘導デスドメインタンパク質（ＰＩＤＤ）；組換えＡＤＡＭ１５ディスインテグリンドメイン（ＲＡＩＤＤ）；カスパーゼのユビキチンコンジュゲート第２のミトコンドリア由来活性化因子（ＳＭＡＣ）；オートファジー関連１２（ＡＴＧ１２）；オートファジー関連３（ＡＴＧ３）；ベクリン−１（ＢＥＣＮ１）；溶質輸送体ファミリー２５メンバー４（ＳＬＣ２５Ａ４）；受容体共役セリン／スレオニンプロテインキナーゼ１（ＲＩＰＫ１）；受容体共役セリン／スレオニンプロテインキナーゼ３（ＲＩＰＫ３）；ホスホグリセリン酸ムターゼファミリーメンバー５（ＰＧＡＭ５Ｓ）の短縮型；混合系統キナーゼドメイン様（ＭＬＫＬ）；カテプシンＤ；マラバＭ；並びにそれらの任意のバリアント。
【００６１】
[0071]そのようなさらなるタンパク質の特定の例は、混合系統キナーゼドメイン様（ＭＬＫＬ）、カスパーゼ２（ＣＡＳＰ２）、ｐ１５  ＢＨ３共役ドメインデスアゴニスト、転写バリアント２（ＢＩＤｖ２）、及びＢｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）である。
【００６２】
[0072]細胞死タンパク質又はそのバリアントをコードするファーミントンウイルスは、国際公開第２０１５１５４１９７号で論議されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＭＬＫＬ、ＣＡＳＰ２、ＢＩＤｖ２、及びＢＡＤの各タンパク質の特定の例は、国際公開第２０１５１５４１９７号の、それぞれ、配列番号１３、１５、１７、及び１９に示される配列を有する。
【００６３】
[0073]抗原性タンパク質が同じ腫瘍関連抗原に基づいている限り、プライム及びブーストは、異なる抗原性タンパク質を含むことができる。このことは、プライムの抗原性タンパク質及びブーストの抗原性タンパク質それぞれが、同じ腫瘍関連抗原への免疫反応を誘発する配列を含むように設計又は選択されることを意味すると理解されたい。このことを達成するために、プライムの抗原性タンパク質とブーストの抗原性タンパク質が正確に同じである必要はないことが明らかである。例を挙げると、プライムの抗原性タンパク質とブーストの抗原性タンパク質は、部分的に重複する配列を含むペプチドとすることができ、この場合、重複するセグメントは、腫瘍関連抗原に対応する配列、又は腫瘍関連抗原への免疫反応を誘発するように設計した配列を含み、それにより、同じ抗原への効果的なプライム及びブーストを達成することが可能である。しかし、一部の実施形態では、プライムの抗原性タンパク質とブーストの抗原性タンパク質は同じである。
【００６４】
[0074]腫瘍関連抗原への哺乳動物の免疫を生成するように製剤化されているプライムは、腫瘍関連抗原への免疫応答を強める構成要素の任意の組合せとすることができる、例えば、プライムは、以下のものであってもそれらを含んでもよい：抗原性タンパク質を発現するウイルス；ウイルスと抗原性タンパク質の混合物；薬理的作用剤及び抗原性タンパク質；免疫剤及び抗原性タンパク質（例えば、アジュバント及びペプチド）；養子細胞移植；又はこれらの任意の組合せ。本開示の文脈において、対象は、本発明の療法とは関連のないある特定の抗原への事前曝露を有してもよい。そのような事前曝露へのいずれの免疫応答も、ここに開示された方法及び組成物に関して「プライム」とはされない。
【００６５】
[0075]一部の実施形態では、プライムは、
[0076]（ａ）腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むウイルス；
[0077]（ｂ）腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞；又は
[0078]（ｃ）腫瘍関連抗原のペプチド、
を含む。
【００６６】
[0079]一部の実施形態では、プライムは腫瘍溶解性ウイルスを含む。
【００６７】
[0080]一部の実施形態では、プライムは、腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むウイルスを含む。
【００６８】
[0081]一部の実施形態では、プライムは一本鎖ＲＮＡウイルスを含む。一本鎖ＲＮＡウイルスは、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、レンチウイルス）又は一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスとすることができる。
【００６９】
[0082]一部の実施形態では、プライムは二本鎖ＤＮＡウイルスを含む。例えば、ウイルスは、アデノウイルス、例えば、Ａｄ５ウイルスとすることができる。
【００７０】
[0083]一部の実施形態では、プライムは腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞を含む。例えば、プライムは、メモリー表現型のＴ細胞、例えば、ＣＤ８＋メモリー細胞（例えば、ＣＤ８＋ＣＤ１２７＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）を含むことができる。
【００７１】
[0084]一部の実施形態では、プライムは、ペプチド、例えば、腫瘍関連抗原のエピトープを含む。そのような一部の実施形態では、プライムはアジュバントをさらに含む。
【００７２】
[0085]著者らによって企図されたプライムのより特定な例は、以下を含む：
抗原性タンパク質を発現するアデノウイルス；抗原性タンパク質を発現するレンチウイルス；抗原性タンパク質を発現するリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＬＭ）；抗原性タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルス；アデノウイルス及び抗原性タンパク質、この場合、当該抗原性タンパク質は当該アデノウイルスによってコードされていない；腫瘍溶解性ウイルス及び抗原性タンパク質、この場合、当該抗原性タンパク質は当該腫瘍溶解性ウイルスによってコードされていない；ポリｌ：Ｃと抗原性タンパク質の混合物；抗原性タンパク質に特異的なＣＤ８メモリーＴ細胞；ポリｌ：Ｃと、抗ＣＤ４０抗体と、抗原性タンパク質との混合物；並びに免疫賦活性ＲＮＡ若しくはＤＮＡを含む、又は抗原性タンパク質を含む、ナノ粒子アジュバント。
【００７３】
[0086]腫瘍関連抗原は、例えば、以下の抗原とすることができる：
黒色腫抗原，ファミリーＡ，３（ＭＡＧＥＡ３）；ヒトパピローマウイルスＥ６タンパク質（ＨＰＶ  Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７タンパク質（ＨＰＶ  Ｅ７）；前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原（ｈｕＳＴＥＡＰ）；がん精巣抗原１（ＮＹＥＳ０１）；ブラキウリタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；メソテリン；ＣＭＶ  ｐｐ６５；ＣＭＶ  ＩＥ１；ＥＧＦＲｖｌｌｌ；ＩＬ１３Ｒ  ａｌｐｈａ２；Ｈｅｒ２／ｎｅｕ；ＣＤ７０；ＣＤ１３３；ＢＣＡ；ＦＡＰ；メソテリン；ＫＲＡＳ；ｐ５３；ＣＨＩ；ＣＳＰ；ＦＡＢＰ７；ＮＬＧＮ４Ｘ；ＰＴＰ；Ｈ３Ｆ３Ａ  Ｋ２７Ｍ；Ｇ３４Ｒ／Ｖ；又はそれらの任意の組合せ。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は外来抗原である。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は自己抗原である。一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、野生型自己タンパク質の腫瘍特異的変異からもたらされるネオ抗原である。
【００７４】
[0087]全長、野生型、ヒトＭＡＧＥＡ３のタンパク質配列は、配列番号１３（国際公開第２０１４／１２７４７８号の配列番号１）に示されている。全長、野生型、ヒトＭＡＧＥＡ３のバリアントのタンパク質配列は、配列番号１４（国際公開第２０１４／１２７４７８号の配列番号４）に示されている。ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の各タンパク質配列は、配列番号１５〜１８（国際公開第２０１７／１９５０３２号の配列番号９〜１２）に示されている。ｈｕＳＴＥＡＰタンパク質のタンパク質配列は、配列番号１９（国際公開第２０１７／１９５０３２号の配列番号１３）に示されている。ＮＹＥＳ０１のタンパク質配列は、配列番号２０（国際公開第２０１４／１２７４７８号の配列番号１３）に示されている。ヒトブラキウリタンパク質のタンパク質配列は、識別子０１５１７８−１（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／０１５１７８）（配列番号２１）でＵｎｉｐｒｏｔデータベースに開示されている。分泌されたヒト前立腺酸性ホスファターゼのタンパク質配列は、識別子Ｐ１５３０９−１（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｑ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ１５３０９）（配列番号２２）でＵｎｉｐｒｏｔデータベースに開示されている。その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの特定の配列のバリアントは、バリアントタンパク質は、リファレンスタンパク質の少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含み、バリアントタンパク質のアミノ酸配列がリファレンスタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一である限り、本開示のプライム及び／又はブースト向けの抗原性タンパク質として使用することができる。
【００７５】
[0088]一態様では、本開示は、哺乳動物の免疫応答を誘導するのに使用するための異種組合せプライム：ブースト療法を提供する。プライムは、腫瘍関連抗原への哺乳動物の免疫を生成するように製剤化されている。ブーストは、ファーミントンウイルスを含み、腫瘍関連抗原に対して哺乳動物の免疫応答を誘導するように製剤化されている。腫瘍関連抗原への免疫応答は別として、プライムとブーストは免疫学的に異なる。
【００７６】
[0089]一部の実施形態では、プライム：ブースト療法は、複数の抗原に対して免疫応答を生成するように製剤化されている。ＭＡＧＥＡ３、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ｈｕＳＴＥＡＰ、がん精巣抗原１；ブラキウリ；前立腺酸性ホスファターゼ；ＦＡＰ；ＨＥＲ２；及びメソテリンなどの抗原性タンパク質が、２つ以上の抗原性エピトープを有することを、理解されたい。複数の抗原性エピトープを有する抗原性タンパク質を含む又は発現するようにプライム及びファーミントンウイルスを製剤化することは、哺乳動物が２つ以上の抗原性エピトープに対する免疫応答を生成する、という結果をもたらすことができる。
【００７７】
[0090]特定の一例では、プライムとファーミントンウイルスは両方とも、ＨＰＶ１６血清型並びにＨＰＶ１８血清型のＥ６及びＥ７の形質転換タンパク質における少なくとも１つの抗原に対して免疫応答を誘導するように製剤化されている。このことは、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の各タンパク質ドメインを含む融合タンパク質をファーミントンウイルスに発現させることによって達成することができる。４つのタンパク質ドメインはプロテアソーム分解性リンカーによってリンクされているが、このリンカーは、融合タンパク質がプロテアソームの中にあると、切り離されたＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、及びＨＰＶ１８  Ｅ７の各タンパク質がもたらされる。例示的な融合タンパク質が、国際公開第２０１４／１２７４７８号及び国際公開第２０１７／１９５０３２号で論議されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。プライムは、ファーミントンウイルスによって発現される抗原性タンパク質とは別である抗原性タンパク質に対する免疫応答を誘導するように製剤化することができる。例えば、プライムは、４つのタンパク質ドメインが異なる順序でリンクされているＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスとすることができる。
【００７８】
[0091]特定の別の例では、プライムとファーミントンウイルスは両方とも、ＭＡＧＥＡ３の少なくとも１つの抗原に対して免疫応答を誘導するように製剤化されている。
【００７９】
このことは、
アミノ酸配列であって、
（ａ）ＥＶＤＰＩＧＨＬＹ（配列番号２３）、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号２４）、ＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（配列番号２５）、ＴＦＰＤＬＥＳＥＦ（配列番号２６）、ＶＡＥＬＶＨＦＬＬ（配列番号２７）、ＲＥＰＶＴＫＡＥＭＬ（配列番号２８）、ＡＥＬＶＨＦＬＬＬ（配列番号２９）、ＷＱＹＦＦＰＶＩＦ（配列番号３０）、ＥＧＤＣＡＰＥＥＫ（配列番号３１）、ＫＫＬＬＴＱＨＦＶＱＥＮＹＬＥＹ（配列番号３２）、ＶＩＦＳＫＡＳＳＳＬＱＬ（配列番号３３）、ＶＦＧＩＥＬＭＥＶＤＰＩＧＨＬ（配列番号３４）、ＧＤＮＱＩＭＰＫＡＧＬＬＩＩＶ（配列番号３５）、ＴＳＹＶＫＶＬＨＨＭＶＫＩＳＧ（配列番号３６）、及びＦＬＬＬＫＹＲＡＲＥＰＶＴＫＡＥ（配列番号３７）、からなる群から選択される少なくとも１つの腫瘍関連エピトープを含む、アミノ酸配列、並びに、
（ｂ）配列番号１３（）のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一である、アミノ酸配列、
を含む抗原性タンパク質をファーミントンウイルスに発現させることによって達成することができる。
【００８０】
プライムは、ファーミントンウイルスによって発現される抗原性タンパク質とは別である抗原性タンパク質に対する免疫応答を誘導するように製剤化することができる。例えば、プライムは、ポリＩ：Ｃと、ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号２４）を含む合成ロングペプチドとの混合物とすることができる
【００８１】
[0092]さらに特定の別の例では、プライムとファーミントンウイルスは両方とも、ネオ抗原に対して免疫応答を誘導するように製剤化されている。このことは、ネオ抗原を含む抗原性タンパク質へのアジュバントとしてファーミントンウイルスを製剤化することによって達成することができるが、この場合、ファーミントンウイルスは抗原性タンパク質をコードしない。プライムは、ネオ抗原の免疫原性配列が保存されている限り、同じ抗原性タンパク質に対して又は異なる抗原性タンパク質に対して、製剤化することができる。
１．本開示によるプライム：ブースト療法は、がんの処置に使用することができる。例えば、一態様では、がんを有する哺乳動物の免疫応答を増強する方法であって、
腫瘍関連抗原又はそのエピトープを発現することができる核酸を含むファーミントンウイルスを含む組成物を上記哺乳動物に投与するステップ、
を含み、
上記哺乳動物が、上記腫瘍関連抗原又はそのエピトープに向けられているプライムを投与されており、
上記プライムが上記ファーミントンウイルスとは免疫学的に異なる、
方法が提供される。
【００８２】
[0093]一部の実施形態では、哺乳動物は、膠芽腫などの、脳がんを有する。一部の実施形態では、プライムは結腸がんを有する。
【００８３】
[0094]プライム及びファーミントンウイルスを含む組成物は、種々の投与経路のいずれかによって投与することができるが、この経路は、プライム及びファーミントンウイルスを含む組成物に同じであっても異なっていてもよい。本明細書を読む当業者であれば、投与の適切な経路が、例えば、哺乳動物が有するがんのタイプによることを含めて、１つ又は複数の要因によって、変化し得ることを理解するであろう。一部の実施形態では、プライム及びファーミントンウイルスを含む組成物のうちの少なくとも１つは、全身経路の投与によって投与される。一部の実施形態では、プライム及びファーミントンウイルスを含む組成物のうちの少なくとも１つは、非全身経路の投与によって投与される。
【００８４】
[0095]投与経路の非限定的な例は、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、頭蓋内の各注射、及び腫瘍への直接注射を含む。例えば、脳がんの場合、頭蓋内投与を適切とすることができる。一部の実施形態では、プライム及び／又はファーミントンウイルスを含む組成物は、２つ以上の方法によって、例えば、頭蓋内及び静脈内の両方に投与される。
【００８５】
[0096]一部の実施形態では、提供される方法は、ファーミントンウイルスによる２回以上の「ブースト」を含み、例えば、方法は、本明細書に開示のファーミントンウイルスを含む組成物を哺乳動物に投与する第２のステップ（及び任意選択で第３のステップ）をさらに含むことができる。２回以上の「ブースト」を含む実施形態では、後続のブーストは、時間間隔によって、例えば、投与する前回のステップから５０日、少なくとも７５日、少なくとも１００日、又は少なくとも１２０日で隔てることができる。少なくとも３回のブーストを含む実施形態では、ブースト間の時間間隔はほぼ同じであってもよく、その時間間隔は異なっていてもよい。
【００８６】
[0097]一部の実施形態では、免疫応答は、ファーミントンウイルスを含む組成物を投与するステップの後（又は組成物を投与する各ステップの後）に哺乳動物において生成する。例えば、免疫応答は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な免疫応答、例えば、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞（例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞）の頻度の増加（例えば、哺乳動物からの血液又は血清試料などの試料中で決定して）を含むことができる。
【００８７】
[0098]一部の実施形態では、ファーミントンウイルスを含む組成物を投与するステップの後（又は組成物を投与する各ステップの後）、ファーミントンウイルスに特異的であるが、限定された免疫応答又は免疫無応答が哺乳動物において生じる。例えば、一部の実施形態では、ファーミントンウイルスを含む組成物を投与するステップの後（又は組成物を投与する各ステップの後）、ファーミントンウイルスに特異的なＴ細胞（例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞）の頻度は、３％以下である（例えば、哺乳動物からの血液又は血清試料などの試料中で決定して）。
【００８８】
[0099]提供されるプライム：ブースト療法は、提供される方法に従って製剤化することができ、例えば、プライム及び／又はブーストは、本明細書で論議される特定の経路の投与向けに製剤化することができる。
【００８９】
[00100]配列
[00101]配列番号１（ファーミントンラブドウイルスｃＤＮＡ）
ttacgacgca taagctgaga aacataagag actatgttcatagtcaccct gtattcatta       60
ttgactttta tgacctatta ttcgtgaggt catatgtgaggtaatgtcat ctgcttatgc      120
gtttgcttat aagataaaac gatagaccct tcacgggtaaatccttctcc ttgcagttct      180
cgccaagtac ctccaaagtc agacgatggc tcgtccgctagctgctgcgc aacatctcat      240
aaccgagcgt cattcccttc aggcgactct gtcgcgggcgtccaagacca gagccgagga      300
attcgtcaaa gatttctacc ttcaagagca gtattctgtcccgaccatcc cgacggacga      360
cattgcccag tctgggccca tgctgcttca ggccatcctgagcgaggaat acacaaaggc      420
cactgacata gcccaatcca tcctctggaa cactcccacacccaacgggc tcctcagaga      480
gcatctagat gccgatgggg gaggctcatt cacagcgctgcccgcgtctg caatcagacc      540
cagcgacgag gcgaatgcat gggccgctcg catctccgactcagggttgg ggcctgtctt      600
ctatgcagcc ctcgctgctt acatcatcgg ctggtcaggaagaggagaga ctagccgcgt      660
gcagcagaac ataggtcaga aatggctgat gaacctgaacgcaatcttcg gcaccacgat      720
cacccatcca acaaccgtgc gtctgccaat caacgtcgtcaacaacagcc tcgcagtgag      780
gaacggactt gctgccacac tctggctata ctaccgttcatcacctcaga gtcaggacgc      840
gttcttctat gggctcatcc gtccctgttg cagtggatatctcggcctgc tacatcgggt      900
gcaggagatt gatgagatgg agccggactt cctcagtgacccccggatca tccaggtgaa      960
tgaggtctac agtgcactca gagccctggt tcaactgggaaacgacttca agaccgccga     1020
tgatgagccc atgcaggtct gggcgtgcag gggaatcaacaacggatatc tgacatatct     1080
ctcagaaact cctgcgaaga aaggagctgt tgtgcttatgtttgcccaat gcatgctgaa     1140
gggcgactct gaggcctgga acagctaccg cactgcaacctgggtgatgc cctattgcga     1200
caatgtggcc ctaggagcga tggcaggcta catccaagcccgccagaaca ccagggcata     1260
tgaggtctca gcccagacag gtctcgacgt caacatggccgcggtcaagg actttgaggc     1320
cagttcaaaa cccaaggctg ctccaatctc gctgatcccacgccccgctg atgtcgcatc     1380
ccgcacctct gagcgcccat ctattcctga ggttgacagcgacgaagagc tcggaggaat     1440
gtaaaccaat aagcttcact gccggtagtt taggcatacacacgcagttc cgttatccat     1500
cacacccgtc ccttctttta tgctgctatt atttcagttgctaagcttcc tgatttgatt     1560
aacaaaaaac cgtagacctc ctacgtgagg tatagctagaaattggttct atcggttgag     1620
agtctttgta ctattagcca tggaggacta tttgtctagcttagaggccg cgagagagct     1680
cgtccggacg gagctggagc ccaagcgtaa cctcatagccagcttagagt ccgacgatcc     1740
cgatccggta atagcgccag cggtaaaacc aaaacatcccaagccatgcc tgagcactaa     1800
agaagaggat catctcccct ctcttcgcct actattcggcgcaaaacgag acacctcggt     1860
gggcgtagag cagactctcc acaagcgtct ctgcgcttgtctcgacggtt acctgaccat     1920
gacgaagaaa gaggccaatg cctttaaggc cgcggctgaagcagcagcat tagcagtcat     1980
ggacattaag atggagcatc agcgccagga tctagaggatctgaccgctg ctatccctag     2040
gatagaattc aaactcaatg ccatcctgga aaacaacaaggagatagcca aggctgtaac     2100
tgctgctaag gagatggagc gggagatgtc gtggggggaaagcgccgcca gctcgctcaa     2160
gtctgtcacc ctagatgagt cgtttagggg ccctgaagagctttcagagt catttggcat     2220
ccgatataag gtcagaacct ggaatgagtt caagaaggcgctggaaacca gcattgtgga     2280
cctgaggcct agccctgttt catttaggga attacggactatgtggctgt ctcttgacac     2340
ctcctttagg ctcattgggt ttgccttcat tcccacatgcgagcgcctgg agaccaaagc     2400
caaatgcaag gagacaagga ctctactccc ccttgcagagtcgatcatgc gaagatggga     2460
cctgcgggat ccaaccatct tggagaaagc ctgcgtagtaatgatgatcc gtgggaatga     2520
gattgcatcg ctgaatcagg taaaagatgt tctcccgaccacaattcgtg ggtggaagat     2580
cgcttattag tcactgctcc cattagtccc actagacggcatacttccat tccgcccttt     2640
aattcccctg tcagacactc atgctccgaa atcactaaccatccttgtcc accaagcaat     2700
acgcatattc agtagcactg catctcgccc tccccctatcaagccccagc gctgcagatc     2760
ttcaccacat atatacatgc atcaactaca tgtgatttagaaaaaaccag acccttcacg     2820
ggtaatagcc taactcacga acgttcctct cgtttcgtatgataaggcct taagcattgt     2880
cgatacggtc gttatgcgtc ggttcttttt aggagagagcagtgcccctg cgagggactg     2940
ggagtccgag cgacctcccc cctatgctgt tgaggtccctcaaagtcacg ggataagagt     3000
caccgggtac ttccagtgca acgagcgtcc gaaatccaagaagaccctcc acagcttcgc     3060
cgtaaaactc tgcgacgcaa ttaagccggt tcgagcggatgctcccagct tgaagatagc     3120
aatatggacg gctctagatc tggccttcgt gaaacctcccaatggaactg taacaataga     3180
tgcggcggtg aaagctacac cgctaatcgg gaacacccagtacaccgtag gcgatgaaat     3240
cttccagatg ctagggagaa ggggtggcct gatcgtcatcaggaacttac cccatgatta     3300
tcctcgaacg ttgattgagt tcgcctctcc cgagccttgagcaccagggc atcggtccgc     3360
ccgccctgtg atctcccgta gccgggctca gcgatcaagccggcccgggt cgggggggac     3420
tggtgcaaca caaggggcgg cagtggacgc tgattaacaaaaaaccacct atatagaccc     3480
ctcacggtct tagactctgt tgccagctga caaccaacacacaagacatc tctctgattc     3540
agccgacccg atcgattcct ccccacccaa ttcctaccaacgcactcctc acaagctcca     3600
ccatgctcag gatccagatc cctccgattg ctatcattctggtaagtctc ctcacactcg     3660
acctgtccgg tgcaaggagg acaaccacac aaagaatccctctccttaat gattcgtggg     3720
atttgttctc gagctatggc gacattcccg aagaacttgtcgtataccag aactacagcc     3780
acaattcctc cgagttaccc cctcctggct tcgagagatggtacataaac cgaagagtgg     3840
cagacacttc cataccgtgc aggggcccct gtctagtgccctacatcctt catggcctca     3900
atgacacaac tgtctctcga cggggaggag gatggcgaaggtccggaatg aagtacccaa     3960
cccacgctgt caggctaggc ccttcaacag acgacgagagagttgaggaa gacatcggct     4020
acgtcaatgt ctccgcacta tcctgcacag ggtcgcccgttgagatggcg ataccaacaa     4080
tccccgactg caccagtgct atccatccac gatccgaggttactgtgccc gtcaagctcg     4140
atgtcatgag acgaaatccc aactaccctc ccattagagcgtggtcgtgc atcggacaga     4200
aaatcaccaa ccgatgtgat tgggcactct tcggcgagaacctcatatat actcaagttg     4260
aagctagctc tctagcattc aagcacacaa gagcctctcttttgaacgaa tccaacggga     4320
tagacgctga aggacgtgca gttccctata tcctcggggatatcgaaccc gggtactgcc     4380
gaaccctatt caacacatgg gtctctagtg agatcgtgtcatgcacgccc atcgaacttg     4440
tcctagttga cctgaaccct ttgtccccgg gacatggcggatatgctgta ttgctgccaa     4500
acggagacaa agtggatgta cacgacaagc atgcatgggatggggacaac aaaatgtgga     4560
gatgggtgta cgagaagaaa gatccctgtg cgttcgagctggtatccagg gaagtgtgtc     4620
ttttctcact gagtaggggt agtagactga gaggagcaacccctccccaa ggagagctcc     4680
tcacctgccc gcattcggga aaggcatttg acctgaagggggcccgaagg attacaccca     4740
tttcatgcaa aatcgacatg gaatatgact tgctgtcactaccaaccgga gtcatcctag     4800
gcctccacct atcagaactc gggacctcct ttggcaacctctcaatgagt cttgaaatgt     4860
atgaacctgc cacaactctg acccctgagc aaatcaacttctcgcttaaa gagctgggaa     4920
gctggaccga ggctcaactg aagagcctgt ctcactcaatctgcctctcc acattctcca     4980
tatgggaact atcggttggg atgatcgatc taaaccctaccagggcagca agggccttgc     5040
tccatgatga taacatactg gcaacattcg agaacggtcacttttccatc gtcagatgtc     5100
gtccggaaat agttcaagtc ccttcgcatc ctcgagcatgtcacatggat ctccgccctt     5160
atgacaagca atcacgggca tcaaccctgg tggttccccttgacaacagc actgccctcc     5220
tggtccccga caacatcgtg gttgaaggag tagaggccagtctatgcaac cactccgttg     5280
ccatcacgct gtcgaagaac agaactcact catacagcctctatccccag ggtcgtcctg     5340
tgcttcgaca gaaaggtgcc gtggagctcc cgacgatagggcccctccag ttacatcctg     5400
ccactcgagt ggacctttat acactgaaag agttccaggaggaccgaata gcgcgcagtc     5460
gagtcacaga catcaaggct gccgttgacg atctgcgtgcgaagtggcgt aaaggcaaat     5520
ttgaggcgga caccacggga gggggacttt ggtcggcgattgtgggagtc ttcagttctc     5580
tcggggggtt cttcatgagg cccttgattg ctctcgcggcgatagtgacc tcaatcatca     5640
tcctgtatat ccttctgcgt gtactgtgtg ctgcctcatgttcgacacac cgaagagtaa     5700
ggcaggactc ttggtaaaga ggactgcgat tgttgagtggacaaacccta ggcctattcc     5760
gatttagaaa aaaccagacc tctcacgagg tcttttctactagctgggtt ttcctcattc     5820
tatccagagc catggccttc gacccgaact ggcagagagaaggttatgaa tgggatccgt     5880
caagtgaggg cagaccgacc gatgagaacg aagacgacagaggtcatcgg ccaaaaacga     5940
gacttcgtac attccttgcc cgcacgttaa atagccctatccgagcccta ttctacacaa     6000
tattcctagg aattcgagcg gtttgggacg ggttcaaaagactcctacct gtgaggaccg     6060
aaaagggtta tgcgaggttt tctgagtgcg tcacatatggaatgatcgga tgtgatgagt     6120
gtgtaataga cccggtgagg gttgtcattg agctgaccgagatgcagtta ccgattaaag     6180
gcaaaggctc tacgaggttg agagcaatga taactgaagaccttctcacg gggatgcgca     6240
cagccgtgcc tcagatcaga gtgagatcga agatcctagcagagcggtta gggagagcaa     6300
tcggccgaga gaccttgccg gcaatgatcc atcatgagtgggcatttgtg atggggaaga     6360
ttctcacttt catggcagac aatgtgggta tgaacgctgacacggtcgag ggcgttctat     6420
cactatcaga ggtcacacgg cgatgggata tcggcaactctgtgtccgca gtgttcaatc     6480
ctgatggcct tactatcaga gtagaaaaca cgggttacatcatgaccaga gagactgcct     6540
gcatgatcgg agacattcat gctcaatttg caatccaatacctagctgca tacctagacg     6600
aggtgatcgg cacaaggacg tctctctcac ccgccgaactgacctctctc aaactatggg     6660
gacttaacgt cctgaaactc ctaggacgga acggttatgaggtgatcgcc tgcatggagc     6720
ccatagggta cgctgtcctg atgatgggaa gagacaggagtcctgatccc tatgtcaatg     6780
acacctattt aaacagcatc ctctcagaat tccctgtcgactctgacgct cgagcctgcg     6840
ttgaagccct cttaactatc tatatgagct tcggcacaccccataaagtc tcggacgcat     6900
tcggcctctt cagaatgttg ggacatccga tggttgatggagctgacggg attgaaaaga     6960
tgcgaaggtt aagcaagaag gtcaagatcc cagaccagtctacagcgatc gacctcgggg     7020
ctatcatggc cgaactgttt gtgcggagtt tcgtaaagaagcacaaaagg tggcccaact     7080
gctccatcaa tctcccgcca cgacacccct tccaccacgcccgcctatgt gggtatgtcc     7140
cggctgaaac ccatccccta aacaacactg catcctgggcggctgtggag ttcaaccagg     7200
aattcgagcc gccgagacag tacaaccttg cagacatcattgatgacaag tcgtgctctc     7260
ccaacaagca tgagctatat ggtgcttgga tgaagtcaaaaacagctggg tggcaggaac     7320
aaaagaagct catactccga tggttcactg agaccatggttaaaccttcg gagctcctgg     7380
aagagattga tgcacacggc ttccgagaag aggataagttgattggatta acaccaaagg     7440
agagagagct gaaattaaca ccaagaatgt tctccttgatgacattcaag ttcagaacct     7500
accaagtcct cactgagagt atggtcgccg atgagatcctcccgcacttc ccccagatca     7560
ccatgaccat gtccaaccac gaactcacaa agaggttgattagcagaacg agacctcaat     7620
ctggaggagg gcgtgatgtt cacatcaccg tgaacatagatttccagaaa tggaacacaa     7680
acatgagaca cggactggtc aaacatgtct tcgagcgactggacaacctc tttggcttca     7740
ccaacttaat cagacgaact catgaatact tccaggaggcgaaatactat ctggctgaag     7800
atggaactaa tctgtcgttc gacaggaacg gggagttaatagatggccca tacgtttaca     7860
ccggatcata cggggggaac gaggggttac gacagaagccctggacaata gttaccgtgt     7920
gtggaatata caaggtagct agagacctga aaatcaaacatcagatcacc ggtcagggag     7980
ataatcaggt ggtcacccta atatttccgg atcgagagttgccttcagat ccggtggaga     8040
ggagcaagta ctgtagagac aagagcagtc agttcctgacacgtctcagt caatatttcg     8100
ctgaggttgg tttgcccgtc aagactgaag agacatggatgtcatcacgt ctctatgctt     8160
acggtaagcg catgttctta gagggagttc cacttaagatgtttctcaag aagataggca     8220
gagctttcgc cctctcgaat gagtttgtcc cgtccctcgaggaagatctg gccagagtct     8280
ggagtgccac cagcgcagcg gtagagcttg acctaactccctacgtagga tatgtcctcg     8340
ggtgctgctt gtctgcgcag gcgatcagaa atcacctcatctactcccct gttctggagg     8400
gccctctgct ggttaaggcc tacgagcgta agttcattaactacgacgga ggaacaaagc     8460
ggggggcgat gcccggccta cgtccaacct ttgagagcctagtcaaaagt atctgctgga     8520
agccaaaggc catcggaggg tggccggtat tgatgttagaagatctcatc atcaaagggt     8580
tccctgatcc ggcgactagc gccctggctc aattgaagtcaatggtgcca tatacctctg     8640
gtatcgaccg ggagatcata ctttcctgtc tcaaccttcccttatcgtcg gtggtatctc     8700
cgtcaatgtt gttaaaggac ccggcggcca tcaacaccatcacaaccccg tccgcgggcg     8760
acatcctgca agaggtcgcc agagactatg ttaccgattacccactccaa aacccgcagc     8820
tcagagcagt ggtcaagaac gtgaagaccg agctagacacattggccagt gacttattca     8880
aatgtgaacc tttctttcct cctttaatga gcgatatcttctcggcatct ctcccggcat     8940
atcaagacag gattgttcgc aagtgctcca cgacttctacaatcaggaga aaagctgccg     9000
agaggggctc cgactctctc ctcaaccgga tgaaaaggaatgagatcaat aagatgatgt     9060
tacatctttg ggctacctgg ggaaggagcc ctctggccagattagacacc agatgtctca     9120
caacctgcac caagcaatta gcccaacagt atcggaaccagtcttgggga aagcagatcc     9180
atggagtctc agtcggccac cccttagaac tgttcggtcgaataacaccc agccatagat     9240
gcctacatga ggaggaccac ggagatttcc tgcaaaccttcgccagcgag catgtgaacc     9300
aagtggacac cgacatcacc acaactctgg ggccgttctacccttacata ggctcggaga     9360
cgcgagaacg ggcagtcaag gttcgaaaag gagtgaattacgtagttgag ccgcttctga     9420
aacccgcagt tcgactacta agagccatta attggttcattcccgaggag tcagatgcgt     9480
cccatttgct gagcaatcta ttagcgtctg ttaccgacatcaatcctcaa gaccactact     9540
catctaccga agtagggggg ggcaacgccg tccatcgctacagctgccga ctatccgaca     9600
aattgagcag agtcaacaac ttatatcagt tgcatacttatttatctgtc acaacagagc     9660
ggttgaccaa gtacagtcga ggatcaaaaa acactgacgcacacttccag agcatgatga     9720
tttatgcaca aagccgtcat atagacctca tcttggagtctctgcacacc ggagagatgg     9780
taccgttgga gtgtcatcat cacattgagt gcaatcactgtatagaggat atacccgacg     9840
agccaatcac gggggacccg gcttggactg aagtcaagtttccttcaagt cctcaggagc     9900
cctttcttta catcaggcaa caagatctgc cggtcaaagacaaactcgag cctgtgcctc     9960
gcatgaacat cgtccgtctt gccggattgg gtccggaggcgattagtgag ctagcgcact    10020
actttgttgc attccgagtt atccgggcgt cagagacggatgtcgaccct aacgatgttc    10080
tctcgtggac ctggctgagc cgaattgatc ctgacaaattggttgagtat atcgtgcatg    10140
tgttcgcttc actggaatgg catcatgtat taatgtcaggcgtgagtgtg agcgtcagag    10200
atgcattctt taagatgcta gtgtctaaaa gaatctcagagactccgcta agttcattct    10260
attatctggc caacctgttc gttgaccctc agactcgcgaagcactaatg agctctaaat    10320
acgggttcag cccccccgcc gagacagtcc ccaacgcaaatgccgccgca gccgaaataa    10380
gaagatgctg tgcgaacagt gcgccgtcga tcttagaatcagcccttcac agccgtgagg    10440
ttgtttggat gccaggaacg aacaattatg gagacgttgtcatctggtct cattacatta    10500
gattacggtt cagcgaagtt aaactagttg acattacacgatatcagcag tggtggagac    10560
agtctgagcg agacccctac gatttggtcc cggacatgcaggttcttgag agcgacctag    10620
atacgctgat gaaacggata ccgaggctca tgcgcaaggcgagacgtccc cctcttcagg    10680
taattcgaga ggacctggat gtcgcagtca tcaatgctgatcatcccgct cactctgtgc    10740
ttcagaacaa atacaggaaa ttgattttca gagagccgaagattatcacg ggagctgtgt    10800
acaagtacct ctccctaaaa tcagagttga cagagttcacctcagcaatg gtgatcggag    10860
acggaactgg aggtatcacc gccgccatga tggccgatgggatagatgtg tggtatcaga    10920
cgctcgtcaa ctatgaccac gtgacacaac agggattatccgtacaagcc ccggcagcat    10980
tggatcttct gcgcggggca ccctctggta ggctcttgaatccgggaaga ttcgcatcat    11040
ttgggtctga cctaactgac cctcgattta cagcctactttgatcaatat cccccgttca    11100
aggtggacac tctatggtct gacgcagagg gcgacttttgggacaagcct tccaagttga    11160
atcaatactt tgagaacatc attgctttga gacatcggttcgtgaagaca aatggacagc    11220
ttgtcgtgaa ggtgtatctg actcaagaca ctgctaccacaattgaagca ttcagaaaga    11280
agctgtcccc atgcgccatc atcgtgtctc tcttctcgacggaaggctcc acagaatgct    11340
tcgtcctaag caatctcatc gcaccagaca cccctgtcgaccttgagatg gtggagaata    11400
tccctaaact aacatccctt gttccccaga ggacgacagtgaaatgctat tcccgacgag    11460
tagcgtgcat cagtaaaagg tggggacttt tcagatctccgagcatagcc cttgaagtcc    11520
aaccgttcct tcactacatc acaaaggtca tctcagacaaaggaacacaa ctgagtctca    11580
tggcggtagc tgacacaatg atcaacagtt acaagaaggctatctcaccc cgagtgttcg    11640
atctacaccg gcatagggcc gcactgggtt tcgggaggagatccttgcat ctcatctggg    11700
ggatgatcat ctcaccaatc gcttaccagc attttgagaatccggccaag ttgatggatg    11760
tcctggacat gttgaccaat aacatctcag ctttcttatcgatatcgtcg tcaggatttg    11820
acctgtcatt tagtgtcagt gcagaccgag atgtccggattgacagcaaa cttgtcagac    11880
tcccgctatt cgaaggatca gacctaaaat tcatgaaaaccatcatgtct accctcggat    11940
ctgtgttcaa ccaggtcgag ccttttaagg ggatcgccataaacccttct aaactaatga    12000
ctgtcaagag gacacaggag ttacgttaca acaacctaatttacactaag gatgccatcc    12060
tattccccaa tgaagcggca aaaaacactg ccccgcttcgagccaacatg gtataccccg    12120
tccggggaga tctattcgcc cctaccgatc gcataccaatcatgactcta gtcagcgatg    12180
agacaacacc tcagcactct cctccagagg atgaggcataactgaatcct ccctgaaggc    12240
tcacatgtcc cacgcgacgc aagatataac gacaagcaactcgccctatt aactgtgatt    12300
aataaaaaac cgattattca gttgcttgag ggagtttcaatccgttcagt gtatgatagg    12360
aagtttctga gatggtgggg attagggggc acctagagtatgtttgttcg ttttatgcgt    12420
cgt                                                               12423
【００９０】
[00102]配列番号２（ファーミントンＲＮＡ）
uuacgacgca uaagcugaga aacauaagag acuauguucauagucacccu guauucauua       60
uugacuuuua ugaccuauua uucgugaggu cauaugugagguaaugucau cugcuuaugc      120
guuugcuuau aagauaaaac gauagacccu ucacggguaaauccuucucc uugcaguucu      180
cgccaaguac cuccaaaguc agacgauggc ucguccgcuagcugcugcgc aacaucucau      240
aaccgagcgu cauucccuuc aggcgacucu gucgcgggcguccaagacca gagccgagga      300
auucgucaaa gauuucuacc uucaagagca guauucugucccgaccaucc cgacggacga      360
cauugcccag ucugggccca ugcugcuuca ggccauccugagcgaggaau acacaaaggc      420
cacugacaua gcccaaucca uccucuggaa cacucccacacccaacgggc uccucagaga      480
gcaucuagau gccgaugggg gaggcucauu cacagcgcugcccgcgucug caaucagacc      540
cagcgacgag gcgaaugcau gggccgcucg caucuccgacucaggguugg ggccugucuu      600
cuaugcagcc cucgcugcuu acaucaucgg cuggucaggaagaggagaga cuagccgcgu      660
gcagcagaac auaggucaga aauggcugau gaaccugaacgcaaucuucg gcaccacgau      720
cacccaucca acaaccgugc gucugccaau caacgucgucaacaacagcc ucgcagugag      780
gaacggacuu gcugccacac ucuggcuaua cuaccguucaucaccucaga gucaggacgc      840
guucuucuau gggcucaucc gucccuguug caguggauaucucggccugc uacaucgggu      900
gcaggagauu gaugagaugg agccggacuu ccucagugacccccggauca uccaggugaa      960
ugaggucuac agugcacuca gagcccuggu ucaacugggaaacgacuuca agaccgccga     1020
ugaugagccc augcaggucu gggcgugcag gggaaucaacaacggauauc ugacauaucu     1080
cucagaaacu ccugcgaaga aaggagcugu ugugcuuauguuugcccaau gcaugcugaa     1140
gggcgacucu gaggccugga acagcuaccg cacugcaaccugggugaugc ccuauugcga     1200
caauguggcc cuaggagcga uggcaggcua cauccaagcccgccagaaca ccagggcaua     1260
ugaggucuca gcccagacag gucucgacgu caacauggccgcggucaagg acuuugaggc     1320
caguucaaaa cccaaggcug cuccaaucuc gcugaucccacgccccgcug augucgcauc     1380
ccgcaccucu gagcgcccau cuauuccuga gguugacagcgacgaagagc ucggaggaau     1440
guaaaccaau aagcuucacu gccgguaguu uaggcauacacacgcaguuc cguuauccau     1500
cacacccguc ccuucuuuua ugcugcuauu auuucaguugcuaagcuucc ugauuugauu     1560
aacaaaaaac cguagaccuc cuacgugagg uauagcuagaaauugguucu aucgguugag     1620
agucuuugua cuauuagcca uggaggacua uuugucuagcuuagaggccg cgagagagcu     1680
cguccggacg gagcuggagc ccaagcguaa ccucauagccagcuuagagu ccgacgaucc     1740
cgauccggua auagcgccag cgguaaaacc aaaacaucccaagccaugcc ugagcacuaa     1800
agaagaggau caucuccccu cucuucgccu acuauucggcgcaaaacgag acaccucggu     1860
gggcguagag cagacucucc acaagcgucu cugcgcuugucucgacgguu accugaccau     1920
gacgaagaaa gaggccaaug ccuuuaaggc cgcggcugaagcagcagcau uagcagucau     1980
ggacauuaag auggagcauc agcgccagga ucuagaggaucugaccgcug cuaucccuag     2040
gauagaauuc aaacucaaug ccauccugga aaacaacaaggagauagcca aggcuguaac     2100
ugcugcuaag gagauggagc gggagauguc guggggggaaagcgccgcca gcucgcucaa     2160
gucugucacc cuagaugagu cguuuagggg cccugaagagcuuucagagu cauuuggcau     2220
ccgauauaag gucagaaccu ggaaugaguu caagaaggcgcuggaaacca gcauugugga     2280
ccugaggccu agcccuguuu cauuuaggga auuacggacuauguggcugu cucuugacac     2340
cuccuuuagg cucauugggu uugccuucau ucccacaugcgagcgccugg agaccaaagc     2400
caaaugcaag gagacaagga cucuacuccc ccuugcagagucgaucaugc gaagauggga     2460
ccugcgggau ccaaccaucu uggagaaagc cugcguaguaaugaugaucc gugggaauga     2520
gauugcaucg cugaaucagg uaaaagaugu ucucccgaccacaauucgug gguggaagau     2580
cgcuuauuag ucacugcucc cauuaguccc acuagacggcauacuuccau uccgcccuuu     2640
aauuccccug ucagacacuc augcuccgaa aucacuaaccauccuugucc accaagcaau     2700
acgcauauuc aguagcacug caucucgccc ucccccuaucaagccccagc gcugcagauc     2760
uucaccacau auauacaugc aucaacuaca ugugauuuagaaaaaaccag acccuucacg     2820
gguaauagcc uaacucacga acguuccucu cguuucguaugauaaggccu uaagcauugu     2880
cgauacgguc guuaugcguc gguucuuuuu aggagagagcagugccccug cgagggacug     2940
ggaguccgag cgaccucccc ccuaugcugu ugaggucccucaaagucacg ggauaagagu     3000
caccggguac uuccagugca acgagcgucc gaaauccaagaagacccucc acagcuucgc     3060
cguaaaacuc ugcgacgcaa uuaagccggu ucgagcggaugcucccagcu ugaagauagc     3120
aauauggacg gcucuagauc uggccuucgu gaaaccucccaauggaacug uaacaauaga     3180
ugcggcggug aaagcuacac cgcuaaucgg gaacacccaguacaccguag gcgaugaaau     3240
cuuccagaug cuagggagaa gggguggccu gaucgucaucaggaacuuac cccaugauua     3300
uccucgaacg uugauugagu ucgccucucc cgagccuugagcaccagggc aucgguccgc     3360
ccgcccugug aucucccgua gccgggcuca gcgaucaagccggcccgggu cgggggggac     3420
uggugcaaca caaggggcgg caguggacgc ugauuaacaaaaaaccaccu auauagaccc     3480
cucacggucu uagacucugu ugccagcuga caaccaacacacaagacauc ucucugauuc     3540
agccgacccg aucgauuccu ccccacccaa uuccuaccaacgcacuccuc acaagcucca     3600
ccaugcucag gauccagauc ccuccgauug cuaucauucugguaagucuc cucacacucg     3660
accuguccgg ugcaaggagg acaaccacac aaagaaucccucuccuuaau gauucguggg     3720
auuuguucuc gagcuauggc gacauucccg aagaacuugucguauaccag aacuacagcc     3780
acaauuccuc cgaguuaccc ccuccuggcu ucgagagaugguacauaaac cgaagagugg     3840
cagacacuuc cauaccgugc aggggccccu gucuagugcccuacauccuu cauggccuca     3900
augacacaac ugucucucga cggggaggag gauggcgaagguccggaaug aaguacccaa     3960
cccacgcugu caggcuaggc ccuucaacag acgacgagagaguugaggaa gacaucggcu     4020
acgucaaugu cuccgcacua uccugcacag ggucgcccguugagauggcg auaccaacaa     4080
uccccgacug caccagugcu auccauccac gauccgagguuacugugccc gucaagcucg     4140
augucaugag acgaaauccc aacuacccuc ccauuagagcguggucgugc aucggacaga     4200
aaaucaccaa ccgaugugau ugggcacucu ucggcgagaaccucauauau acucaaguug     4260
aagcuagcuc ucuagcauuc aagcacacaa gagccucucuuuugaacgaa uccaacggga     4320
uagacgcuga aggacgugca guucccuaua uccucggggauaucgaaccc ggguacugcc     4380
gaacccuauu caacacaugg gucucuagug agaucgugucaugcacgccc aucgaacuug     4440
uccuaguuga ccugaacccu uuguccccgg gacauggcggauaugcugua uugcugccaa     4500
acggagacaa aguggaugua cacgacaagc augcaugggauggggacaac aaaaugugga     4560
gaugggugua cgagaagaaa gaucccugug cguucgagcugguauccagg gaaguguguc     4620
uuuucucacu gaguaggggu aguagacuga gaggagcaaccccuccccaa ggagagcucc     4680
ucaccugccc gcauucggga aaggcauuug accugaagggggcccgaagg auuacaccca     4740
uuucaugcaa aaucgacaug gaauaugacu ugcugucacuaccaaccgga gucauccuag     4800
gccuccaccu aucagaacuc gggaccuccu uuggcaaccucucaaugagu cuugaaaugu     4860
augaaccugc cacaacucug accccugagc aaaucaacuucucgcuuaaa gagcugggaa     4920
gcuggaccga ggcucaacug aagagccugu cucacucaaucugccucucc acauucucca     4980
uaugggaacu aucgguuggg augaucgauc uaaacccuaccagggcagca agggccuugc     5040
uccaugauga uaacauacug gcaacauucg agaacggucacuuuuccauc gucagauguc     5100
guccggaaau aguucaaguc ccuucgcauc cucgagcaugucacauggau cuccgcccuu     5160
augacaagca aucacgggca ucaacccugg ugguuccccuugacaacagc acugcccucc     5220
ugguccccga caacaucgug guugaaggag uagaggccagucuaugcaac cacuccguug     5280
ccaucacgcu gucgaagaac agaacucacu cauacagccucuauccccag ggucguccug     5340
ugcuucgaca gaaaggugcc guggagcucc cgacgauagggccccuccag uuacauccug     5400
ccacucgagu ggaccuuuau acacugaaag aguuccaggaggaccgaaua gcgcgcaguc     5460
gagucacaga caucaaggcu gccguugacg aucugcgugcgaaguggcgu aaaggcaaau     5520
uugaggcgga caccacggga gggggacuuu ggucggcgauugugggaguc uucaguucuc     5580
ucgggggguu cuucaugagg cccuugauug cucucgcggcgauagugacc ucaaucauca     5640
uccuguauau ccuucugcgu guacugugug cugccucauguucgacacac cgaagaguaa     5700
ggcaggacuc uugguaaaga ggacugcgau uguugaguggacaaacccua ggccuauucc     5760
gauuuagaaa aaaccagacc ucucacgagg ucuuuucuacuagcuggguu uuccucauuc     5820
uauccagagc cauggccuuc gacccgaacu ggcagagagaagguuaugaa ugggauccgu     5880
caagugaggg cagaccgacc gaugagaacg aagacgacagaggucaucgg ccaaaaacga     5940
gacuucguac auuccuugcc cgcacguuaa auagcccuauccgagcccua uucuacacaa     6000
uauuccuagg aauucgagcg guuugggacg gguucaaaagacuccuaccu gugaggaccg     6060
aaaaggguua ugcgagguuu ucugagugcg ucacauauggaaugaucgga ugugaugagu     6120
guguaauaga cccggugagg guugucauug agcugaccgagaugcaguua ccgauuaaag     6180
gcaaaggcuc uacgagguug agagcaauga uaacugaagaccuucucacg gggaugcgca     6240
cagccgugcc ucagaucaga gugagaucga agauccuagcagagcgguua gggagagcaa     6300
ucggccgaga gaccuugccg gcaaugaucc aucaugagugggcauuugug auggggaaga     6360
uucucacuuu cauggcagac aaugugggua ugaacgcugacacggucgag ggcguucuau     6420
cacuaucaga ggucacacgg cgaugggaua ucggcaacucuguguccgca guguucaauc     6480
cugauggccu uacuaucaga guagaaaaca cggguuacaucaugaccaga gagacugccu     6540
gcaugaucgg agacauucau gcucaauuug caauccaauaccuagcugca uaccuagacg     6600
aggugaucgg cacaaggacg ucucucucac ccgccgaacugaccucucuc aaacuauggg     6660
gacuuaacgu ccugaaacuc cuaggacgga acgguuaugaggugaucgcc ugcauggagc     6720
ccauagggua cgcuguccug augaugggaa gagacaggaguccugauccc uaugucaaug     6780
acaccuauuu aaacagcauc cucucagaau ucccugucgacucugacgcu cgagccugcg     6840
uugaagcccu cuuaacuauc uauaugagcu ucggcacaccccauaaaguc ucggacgcau     6900
ucggccucuu cagaauguug ggacauccga ugguugauggagcugacggg auugaaaaga     6960
ugcgaagguu aagcaagaag gucaagaucc cagaccagucuacagcgauc gaccucgggg     7020
cuaucauggc cgaacuguuu gugcggaguu ucguaaagaagcacaaaagg uggcccaacu     7080
gcuccaucaa ucucccgcca cgacaccccu uccaccacgcccgccuaugu ggguaugucc     7140
cggcugaaac ccauccccua aacaacacug cauccugggcggcuguggag uucaaccagg     7200
aauucgagcc gccgagacag uacaaccuug cagacaucauugaugacaag ucgugcucuc     7260
ccaacaagca ugagcuauau ggugcuugga ugaagucaaaaacagcuggg uggcaggaac     7320
aaaagaagcu cauacuccga ugguucacug agaccaugguuaaaccuucg gagcuccugg     7380
aagagauuga ugcacacggc uuccgagaag aggauaaguugauuggauua acaccaaagg     7440
agagagagcu gaaauuaaca ccaagaaugu ucuccuugaugacauucaag uucagaaccu     7500
accaaguccu cacugagagu auggucgccg augagauccucccgcacuuc ccccagauca     7560
ccaugaccau guccaaccac gaacucacaa agagguugauuagcagaacg agaccucaau     7620
cuggaggagg gcgugauguu cacaucaccg ugaacauagauuuccagaaa uggaacacaa     7680
acaugagaca cggacugguc aaacaugucu ucgagcgacuggacaaccuc uuuggcuuca     7740
ccaacuuaau cagacgaacu caugaauacu uccaggaggcgaaauacuau cuggcugaag     7800
auggaacuaa ucugucguuc gacaggaacg gggaguuaauagauggccca uacguuuaca     7860
ccggaucaua cggggggaac gagggguuac gacagaagcccuggacaaua guuaccgugu     7920
guggaauaua caagguagcu agagaccuga aaaucaaacaucagaucacc ggucagggag     7980
auaaucaggu ggucacccua auauuuccgg aucgagaguugccuucagau ccgguggaga     8040
ggagcaagua cuguagagac aagagcaguc aguuccugacacgucucagu caauauuucg     8100
cugagguugg uuugcccguc aagacugaag agacauggaugucaucacgu cucuaugcuu     8160
acgguaagcg cauguucuua gagggaguuc cacuuaagauguuucucaag aagauaggca     8220
gagcuuucgc ccucucgaau gaguuugucc cgucccucgaggaagaucug gccagagucu     8280
ggagugccac cagcgcagcg guagagcuug accuaacucccuacguagga uauguccucg     8340
ggugcugcuu gucugcgcag gcgaucagaa aucaccucaucuacuccccu guucuggagg     8400
gcccucugcu gguuaaggcc uacgagcgua aguucauuaacuacgacgga ggaacaaagc     8460
ggggggcgau gcccggccua cguccaaccu uugagagccuagucaaaagu aucugcugga     8520
agccaaaggc caucggaggg uggccgguau ugauguuagaagaucucauc aucaaagggu     8580
ucccugaucc ggcgacuagc gcccuggcuc aauugaagucaauggugcca uauaccucug     8640
guaucgaccg ggagaucaua cuuuccuguc ucaaccuucccuuaucgucg gugguaucuc     8700
cgucaauguu guuaaaggac ccggcggcca ucaacaccaucacaaccccg uccgcgggcg     8760
acauccugca agaggucgcc agagacuaug uuaccgauuacccacuccaa aacccgcagc     8820
ucagagcagu ggucaagaac gugaagaccg agcuagacacauuggccagu gacuuauuca     8880
aaugugaacc uuucuuuccu ccuuuaauga gcgauaucuucucggcaucu cucccggcau     8940
aucaagacag gauuguucgc aagugcucca cgacuucuacaaucaggaga aaagcugccg     9000
agaggggcuc cgacucucuc cucaaccgga ugaaaaggaaugagaucaau aagaugaugu     9060
uacaucuuug ggcuaccugg ggaaggagcc cucuggccagauuagacacc agaugucuca     9120
caaccugcac caagcaauua gcccaacagu aucggaaccagucuugggga aagcagaucc     9180
auggagucuc agucggccac cccuuagaac uguucggucgaauaacaccc agccauagau     9240
gccuacauga ggaggaccac ggagauuucc ugcaaaccuucgccagcgag caugugaacc     9300
aaguggacac cgacaucacc acaacucugg ggccguucuacccuuacaua ggcucggaga     9360
cgcgagaacg ggcagucaag guucgaaaag gagugaauuacguaguugag ccgcuucuga     9420
aacccgcagu ucgacuacua agagccauua auugguucauucccgaggag ucagaugcgu     9480
cccauuugcu gagcaaucua uuagcgucug uuaccgacaucaauccucaa gaccacuacu     9540
caucuaccga aguagggggg ggcaacgccg uccaucgcuacagcugccga cuauccgaca     9600
aauugagcag agucaacaac uuauaucagu ugcauacuuauuuaucuguc acaacagagc     9660
gguugaccaa guacagucga ggaucaaaaa acacugacgcacacuuccag agcaugauga     9720
uuuaugcaca aagccgucau auagaccuca ucuuggagucucugcacacc ggagagaugg     9780
uaccguugga gugucaucau cacauugagu gcaaucacuguauagaggau auacccgacg     9840
agccaaucac gggggacccg gcuuggacug aagucaaguuuccuucaagu ccucaggagc     9900
ccuuucuuua caucaggcaa caagaucugc cggucaaagacaaacucgag ccugugccuc     9960
gcaugaacau cguccgucuu gccggauugg guccggaggcgauuagugag cuagcgcacu    10020
acuuuguugc auuccgaguu auccgggcgu cagagacggaugucgacccu aacgauguuc    10080
ucucguggac cuggcugagc cgaauugauc cugacaaauugguugaguau aucgugcaug    10140
uguucgcuuc acuggaaugg caucauguau uaaugucaggcgugagugug agcgucagag    10200
augcauucuu uaagaugcua gugucuaaaa gaaucucagagacuccgcua aguucauucu    10260
auuaucuggc caaccuguuc guugacccuc agacucgcgaagcacuaaug agcucuaaau    10320
acggguucag cccccccgcc gagacagucc ccaacgcaaaugccgccgca gccgaaauaa    10380
gaagaugcug ugcgaacagu gcgccgucga ucuuagaaucagcccuucac agccgugagg    10440
uuguuuggau gccaggaacg aacaauuaug gagacguugucaucuggucu cauuacauua    10500
gauuacgguu cagcgaaguu aaacuaguug acauuacacgauaucagcag ugguggagac    10560
agucugagcg agaccccuac gauuuggucc cggacaugcagguucuugag agcgaccuag    10620
auacgcugau gaaacggaua ccgaggcuca ugcgcaaggcgagacguccc ccucuucagg    10680
uaauucgaga ggaccuggau gucgcaguca ucaaugcugaucaucccgcu cacucugugc    10740
uucagaacaa auacaggaaa uugauuuuca gagagccgaagauuaucacg ggagcugugu    10800
acaaguaccu cucccuaaaa ucagaguuga cagaguucaccucagcaaug gugaucggag    10860
acggaacugg agguaucacc gccgccauga uggccgaugggauagaugug ugguaucaga    10920
cgcucgucaa cuaugaccac gugacacaac agggauuauccguacaagcc ccggcagcau    10980
uggaucuucu gcgcggggca cccucuggua ggcucuugaauccgggaaga uucgcaucau    11040
uugggucuga ccuaacugac ccucgauuua cagccuacuuugaucaauau cccccguuca    11100
agguggacac ucuauggucu gacgcagagg gcgacuuuugggacaagccu uccaaguuga    11160
aucaauacuu ugagaacauc auugcuuuga gacaucgguucgugaagaca aauggacagc    11220
uugucgugaa gguguaucug acucaagaca cugcuaccacaauugaagca uucagaaaga    11280
agcugucccc augcgccauc aucgugucuc ucuucucgacggaaggcucc acagaaugcu    11340
ucguccuaag caaucucauc gcaccagaca ccccugucgaccuugagaug guggagaaua    11400
ucccuaaacu aacaucccuu guuccccaga ggacgacagugaaaugcuau ucccgacgag    11460
uagcgugcau caguaaaagg uggggacuuu ucagaucuccgagcauagcc cuugaagucc    11520
aaccguuccu ucacuacauc acaaagguca ucucagacaaaggaacacaa cugagucuca    11580
uggcgguagc ugacacaaug aucaacaguu acaagaaggcuaucucaccc cgaguguucg    11640
aucuacaccg gcauagggcc gcacuggguu ucgggaggagauccuugcau cucaucuggg    11700
ggaugaucau cucaccaauc gcuuaccagc auuuugagaauccggccaag uugauggaug    11760
uccuggacau guugaccaau aacaucucag cuuucuuaucgauaucgucg ucaggauuug    11820
accugucauu uagugucagu gcagaccgag auguccggauugacagcaaa cuugucagac    11880
ucccgcuauu cgaaggauca gaccuaaaau ucaugaaaaccaucaugucu acccucggau    11940
cuguguucaa ccaggucgag ccuuuuaagg ggaucgccauaaacccuucu aaacuaauga    12000
cugucaagag gacacaggag uuacguuaca acaaccuaauuuacacuaag gaugccaucc    12060
uauuccccaa ugaagcggca aaaaacacug ccccgcuucgagccaacaug guauaccccg    12120
uccggggaga ucuauucgcc ccuaccgauc gcauaccaaucaugacucua gucagcgaug    12180
agacaacacc ucagcacucu ccuccagagg augaggcauaacugaauccu cccugaaggc    12240
ucacaugucc cacgcgacgc aagauauaac gacaagcaacucgcccuauu aacugugauu    12300
aauaaaaaac cgauuauuca guugcuugag ggaguuucaauccguucagu guaugauagg    12360
aaguuucuga gauggugggg auuagggggc accuagaguauguuuguucg uuuuaugcgu    12420
cgu                                                               12423
【００９１】
[00103]配列番号３（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ１タンパク質）
MARPLAAAQHLITERHSLQATLSRASKTRAEEFVKDFYLQEQYSVPTIPTDDIAQSGPML
LQAILSEEYTKATDIAQSILWNTPTPNGLLREHLDADGGGSFTALPASAIRPSDEANAWA
ARISDSGLGPVFYAALAAYIIGWSGRGETSRVQQNIGQKWLMNLNAIFGTTITHPTTVRL
PINVVNNSLAVRNGLAATLWLYYRSSPQSQDAFFYGLIRPCCSGYLGLLHRVQEIDEMEP
DFLSDPRIIQVNEVYSALRALVQLGNDFKTADDEPMQVWACRGINNGYLTYLSETPAKKG
AVVLMFAQCMLKGDSEAWNSYRTATWVMPYCDNVALGAMAGYIQARQNTRAYEVSAQTGL
DVNMAAVKDFEASSKPKAAPISLIPRPADVASRTSERPSIPEVDSDEELGGM
【００９２】
[00104]配列番号４（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ２タンパク質）
MEDYLSSLEAARELVRTELEPKRNLIASLESDDPDPVIAPAVKPKHPKPCLSTKEEDHLP
SLRLLFGAKRDTSVGVEQTLHKRLCACLDGYLTMTKKEANAFKAAAEAAALAVMDIKMEH
QRQDLEDLTAAIPRIEFKLNAILENNKEIAKAVTAAKEMEREMSWGESAASSLKSVTLDE
SFRGPEELSESFGIRYKVRTWNEFKKALETSIVDLRPSPVSFRELRTMWLSLDTSFRLIG
FAFIPTCERLETKAKCKETRTLLPLAESIMRRWDLRDPTILEKACVVMMIRGNEIASLNQ
VKDVLPTTIRGWKIAY
【００９３】
[00105]配列番号５（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ３タンパク質）
MRRFFLGESSAPARDWESERPPPYAVEVPQSHGIRVTGYFQCNERPKSKKTLHSFAVKLC
DAIKPVRADAPSLKIAIWTALDLAFVKPPNGTVTIDAAVKATPLIGNTQYTVGDEIFQML
GRRGGLIVIRNLPHDYPRTLIEFASPEP
【００９４】
[00106]配列番号６（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ４タンパク質）
MLRIQIPPIAIILVSLLTLDLSGARRTTTQRIPLLNDSWDLFSSYGDIPEELVVYQNYSH
NSSELPPPGFERWYINRRVADTSIPCRGPCLVPYILHGLNDTTVSRRGGGWRRSGMKYPT
HAVRLGPSTDDERVEEDIGYVNVSALSCTGSPVEMAIPTIPDCTSAIHPRSEVTVPVKLD
VMRRNPNYPPIRAWSCIGQKITNRCDWALFGENLIYTQVEASSLAFKHTRASLLNESNGI
DAEGRAVPYILGDIEPGYCRTLFNTWVSSEIVSCTPIELVLVDLNPLSPGHGGYAVLLPN
GDKVDVHDKHAWDGDNKMWRWVYEKKDPCAFELVSREVCLFSLSRGSRLRGATPPQGELL
TCPHSGKAFDLKGARRITPISCKIDMEYDLLSLPTGVILGLHLSELGTSFGNLSMSLEMY
EPATTLTPEQINFSLKELGSWTEAQLKSLSHSICLSTFSIWELSVGMIDLNPTRAARALL
HDDNILATFENGHFSIVRCRPEIVQVPSHPRACHMDLRPYDKQSRASTLVVPLDNSTALL
VPDNIVVEGVEASLCNHSVAITLSKNRTHSYSLYPQGRPVLRQKGAVELPTIGPLQLHPA
TRVDLYTLKEFQEDRIARSRVTDIKAAVDDLRAKWRKGKFEADTTGGGLWSAIVGVFSSL
GGFFMRPLIALAAIVTSIIILYILLRVLCAASCSTHRRVRQDSW
【００９５】
[00107]配列番号７（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ５タンパク質）
MAFDPNWQREGYEWDPSSEGRPTDENEDDRGHRPKTRLRTFLARTLNSPIRALFYTIFLG
IRAVWDGFKRLLPVRTEKGYARFSECVTYGMIGCDECVIDPVRVVIELTEMQLPIKGKGS
TRLRAMITEDLLTGMRTAVPQIRVRSKILAERLGRAIGRETLPAMIHHEWAFVMGKILTF
MADNVGMNADTVEGVLSLSEVTRRWDIGNSVSAVFNPDGLTIRVENTGYIMTRETACMIG
DIHAQFAIQYLAAYLDEVIGTRTSLSPAELTSLKLWGLNVLKLLGRNGYEVIACMEPIGY
AVLMMGRDRSPDPYVNDTYLNSILSEFPVDSDARACVEALLTIYMSFGTPHKVSDAFGLF
RMLGHPMVDGADGIEKMRRLSKKVKIPDQSTAIDLGAIMAELFVRSFVKKHKRWPNCSIN
LPPRHPFHHARLCGYVPAETHPLNNTASWAAVEFNQEFEPPRQYNLADIIDDKSCSPNKH
ELYGAWMKSKTAGWQEQKKLILRWFTETMVKPSELLEEIDAHGFREEDKLIGLTPKEREL
KLTPRMFSLMTFKFRTYQVLTESMVADEILPHFPQITMTMSNHELTKRLISRTRPQSGGG
RDVHITVNIDFQKWNTNMRHGLVKHVFERLDNLFGFTNLIRRTHEYFQEAKYYLAEDGTN
LSFDRNGELIDGPYVYTGSYGGNEGLRQKPWTIVTVCGIYKVARDLKIKHQITGQGDNQV
VTLIFPDRELPSDPVERSKYCRDKSSQFLTRLSQYFAEVGLPVKTEETWMSSRLYAYGKR
MFLEGVPLKMFLKKIGRAFALSNEFVPSLEEDLARVWSATSAAVELDLTPYVGYVLGCCL
SAQAIRNHLIYSPVLEGPLLVKAYERKFINYDGGTKRGAMPGLRPTFESLVKSICWKPKA
IGGWPVLMLEDLIIKGFPDPATSALAQLKSMVPYTSGIDREIILSCLNLPLSSVVSPSML
LKDPAAINTITTPSAGDILQEVARDYVTDYPLQNPQLRAVVKNVKTELDTLASDLFKCEP
FFPPLMSDIFSASLPAYQDRIVRKCSTTSTIRRKAAERGSDSLLNRMKRNEINKMMLHLW
ATWGRSPLARLDTRCLTTCTKQLAQQYRNQSWGKQIHGVSVGHPLELFGRITPSHRCLHE
EDHGDFLQTFASEHVNQVDTDITTTLGPFYPYIGSETRERAVKVRKGVNYVVEPLLKPAV
RLLRAINWFIPEESDASHLLSNLLASVTDINPQDHYSSTEVGGGNAVHRYSCRLSDKLSR
VNNLYQLHTYLSVTTERLTKYSRGSKNTDAHFQSMMIYAQSRHIDLILESLHTGEMVPLE
CHHHIECNHCIEDIPDEPITGDPAWTEVKFPSSPQEPFLYIRQQDLPVKDKLEPVPRMNI
VRLAGLGPEAISELAHYFVAFRVIRASETDVDPNDVLSWTWLSRIDPDKLVEYIVHVFAS
LEWHHVLMSGVSVSVRDAFFKMLVSKRISETPLSSFYYLANLFVDPQTREALMSSKYGFS
PPAETVPNANAAAAEIRRCCANSAPSILESALHSREVVWMPGTNNYGDVVIWSHYIRLRF
SEVKLVDITRYQQWWRQSERDPYDLVPDMQVLESDLDTLMKRIPRLMRKARRPPLQVIRE
DLDVAVINADHPAHSVLQNKYRKLIFREPKIITGAVYKYLSLKSELTEFTSAMVIGDGTG
GITAAMMADGIDVWYQTLVNYDHVTQQGLSVQAPAALDLLRGAPSGRLLNPGRFASFGSD
LTDPRFTAYFDQYPPFKVDTLWSDAEGDFWDKPSKLNQYFENIIALRHRFVKTNGQLVVK
VYLTQDTATTIEAFRKKLSPCAIIVSLFSTEGSTECFVLSNLIAPDTPVDLEMVENIPKL
TSLVPQRTTVKCYSRRVACISKRWGLFRSPSIALEVQPFLHYITKVISDKGTQLSLMAVA
DTMINSYKKAISPRVFDLHRHRAALGFGRRSLHLIWGMIISPIAYQHFENPAKLMDVLDM
LTNNISAFLSISSSGFDLSFSVSADRDVRIDSKLVRLPLFEGSDLKFMKTIMSTLGSVFN
QVEPFKGIAINPSKLMTVKRTQELRYNNLIYTKDAILFPNEAAKNTAPLRANMVYPVRGD
LFAPTDRIPIMTLVSDETTPQHSPPEDEA
【００９６】
[00108]配列番号８（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ１）
atggctcgtc cgctagctgc tgcgcaacat ctcataaccgagcgtcattc ccttcaggcg       60
actctgtcgc gggcgtccaa gaccagagcc gaggaattcgtcaaagattt ctaccttcaa      120
gagcagtatt ctgtcccgac catcccgacg gacgacattgcccagtctgg gcccatgctg      180
cttcaggcca tcctgagcga ggaatacaca aaggccactgacatagccca atccatcctc      240
tggaacactc ccacacccaa cgggctcctc agagagcatctagatgccga tgggggaggc      300
tcattcacag cgctgcccgc gtctgcaatc agacccagcgacgaggcgaa tgcatgggcc      360
gctcgcatct ccgactcagg gttggggcct gtcttctatgcagccctcgc tgcttacatc      420
atcggctggt caggaagagg agagactagc cgcgtgcagcagaacatagg tcagaaatgg      480
ctgatgaacc tgaacgcaat cttcggcacc acgatcacccatccaacaac cgtgcgtctg      540
ccaatcaacg tcgtcaacaa cagcctcgca gtgaggaacggacttgctgc cacactctgg      600
ctatactacc gttcatcacc tcagagtcag gacgcgttcttctatgggct catccgtccc      660
tgttgcagtg gatatctcgg cctgctacat cgggtgcaggagattgatga gatggagccg      720
gacttcctca gtgacccccg gatcatccag gtgaatgaggtctacagtgc actcagagcc      780
ctggttcaac tgggaaacga cttcaagacc gccgatgatgagcccatgca ggtctgggcg      840
tgcaggggaa tcaacaacgg atatctgaca tatctctcagaaactcctgc gaagaaagga      900
gctgttgtgc ttatgtttgc ccaatgcatg ctgaagggcgactctgaggc ctggaacagc      960
taccgcactg caacctgggt gatgccctat tgcgacaatgtggccctagg agcgatggca     1020
ggctacatcc aagcccgcca gaacaccagg gcatatgaggtctcagccca gacaggtctc     1080
gacgtcaaca tggccgcggt caaggacttt gaggccagttcaaaacccaa ggctgctcca     1140
atctcgctga tcccacgccc cgctgatgtc gcatcccgcacctctgagcg cccatctatt     1200
cctgaggttg acagcgacga agagctcggaggaatg                             1236
【００９７】
[00109]配列番号９（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ２）
atggaggact atttgtctag cttagaggcc gcgagagagctcgtccggac ggagctggag       60
cccaagcgta acctcatagc cagcttagag tccgacgatcccgatccggt aatagcgcca      120
gcggtaaaac caaaacatcc caagccatgc ctgagcactaaagaagagga tcatctcccc      180
tctcttcgcc tactattcgg cgcaaaacga gacacctcggtgggcgtaga gcagactctc      240
cacaagcgtc tctgcgcttg tctcgacggt tacctgaccatgacgaagaa agaggccaat      300
gcctttaagg ccgcggctga agcagcagca ttagcagtcatggacattaa gatggagcat      360
cagcgccagg atctagagga tctgaccgct gctatccctaggatagaatt caaactcaat      420
gccatcctgg aaaacaacaa ggagatagcc aaggctgtaactgctgctaa ggagatggag      480
cgggagatgt cgtgggggga aagcgccgcc agctcgctcaagtctgtcac cctagatgag      540
tcgtttaggg gccctgaaga gctttcagag tcatttggcatccgatataa ggtcagaacc      600
tggaatgagt tcaagaaggc gctggaaacc agcattgtggacctgaggcc tagccctgtt      660
tcatttaggg aattacggac tatgtggctg tctcttgacacctcctttag gctcattggg      720
tttgccttca ttcccacatg cgagcgcctg gagaccaaagccaaatgcaa ggagacaagg      780
actctactcc cccttgcaga gtcgatcatg cgaagatgggacctgcggga tccaaccatc      840
ttggagaaag cctgcgtagt aatgatgatc cgtgggaatgagattgcatc gctgaatcag      900
gtaaaagatg ttctcccgac cacaattcgt gggtggaagatcgcttat                  948
【００９８】
[00110]配列番号１０（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ３）
atgcgtcggt tctttttagg agagagcagt gcccctgcgagggactggga gtccgagcga       60
cctcccccct atgctgttga ggtccctcaa agtcacgggataagagtcac cgggtacttc      120
cagtgcaacg agcgtccgaa atccaagaag accctccacagcttcgccgt aaaactctgc      180
gacgcaatta agccggttcg agcggatgct cccagcttgaagatagcaat atggacggct      240
ctagatctgg ccttcgtgaa acctcccaat ggaactgtaacaatagatgc ggcggtgaaa      300
gctacaccgc taatcgggaa cacccagtac accgtaggcgatgaaatctt ccagatgcta      360
gggagaaggg gtggcctgat cgtcatcagg aacttaccccatgattatcc tcgaacgttg      420
attgagttcg cctctcccgagcct                                           444
【００９９】
[00111]配列番号１１（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ４）
atgctcagga tccagatccc tccgattgct atcattctggtaagtctcct cacactcgac       60
ctgtccggtg caaggaggac aaccacacaa agaatccctctccttaatga ttcgtgggat      120
ttgttctcga gctatggcga cattcccgaa gaacttgtcgtataccagaa ctacagccac      180
aattcctccg agttaccccc tcctggcttc gagagatggtacataaaccg aagagtggca      240
gacacttcca taccgtgcag gggcccctgt ctagtgccctacatccttca tggcctcaat      300
gacacaactg tctctcgacg gggaggagga tggcgaaggtccggaatgaa gtacccaacc      360
cacgctgtca ggctaggccc ttcaacagac gacgagagagttgaggaaga catcggctac      420
gtcaatgtct ccgcactatc ctgcacaggg tcgcccgttgagatggcgat accaacaatc      480
cccgactgca ccagtgctat ccatccacga tccgaggttactgtgcccgt caagctcgat      540
gtcatgagac gaaatcccaa ctaccctccc attagagcgtggtcgtgcat cggacagaaa      600
atcaccaacc gatgtgattg ggcactcttc ggcgagaacctcatatatac tcaagttgaa      660
gctagctctc tagcattcaa gcacacaaga gcctctcttttgaacgaatc caacgggata      720
gacgctgaag gacgtgcagt tccctatatc ctcggggatatcgaacccgg gtactgccga      780
accctattca acacatgggt ctctagtgag atcgtgtcatgcacgcccat cgaacttgtc      840
ctagttgacc tgaacccttt gtccccggga catggcggatatgctgtatt gctgccaaac      900
ggagacaaag tggatgtaca cgacaagcat gcatgggatggggacaacaa aatgtggaga      960
tgggtgtacg agaagaaaga tccctgtgcg ttcgagctggtatccaggga agtgtgtctt     1020
ttctcactga gtaggggtag tagactgaga ggagcaacccctccccaagg agagctcctc     1080
acctgcccgc attcgggaaa ggcatttgac ctgaagggggcccgaaggat tacacccatt     1140
tcatgcaaaa tcgacatgga atatgacttg ctgtcactaccaaccggagt catcctaggc     1200
ctccacctat cagaactcgg gacctccttt ggcaacctctcaatgagtct tgaaatgtat     1260
gaacctgcca caactctgac ccctgagcaa atcaacttctcgcttaaaga gctgggaagc     1320
tggaccgagg ctcaactgaa gagcctgtct cactcaatctgcctctccac attctccata     1380
tgggaactat cggttgggat gatcgatcta aaccctaccagggcagcaag ggccttgctc     1440
catgatgata acatactggc aacattcgag aacggtcacttttccatcgt cagatgtcgt     1500
ccggaaatag ttcaagtccc ttcgcatcct cgagcatgtcacatggatct ccgcccttat     1560
gacaagcaat cacgggcatc aaccctggtg gttccccttgacaacagcac tgccctcctg     1620
gtccccgaca acatcgtggt tgaaggagta gaggccagtctatgcaacca ctccgttgcc     1680
atcacgctgt cgaagaacag aactcactca tacagcctctatccccaggg tcgtcctgtg     1740
cttcgacaga aaggtgccgt ggagctcccg acgatagggcccctccagtt acatcctgcc     1800
actcgagtgg acctttatac actgaaagag ttccaggaggaccgaatagc gcgcagtcga     1860
gtcacagaca tcaaggctgc cgttgacgat ctgcgtgcgaagtggcgtaa aggcaaattt     1920
gaggcggaca ccacgggagg gggactttgg tcggcgattgtgggagtctt cagttctctc     1980
ggggggttct tcatgaggcc cttgattgct ctcgcggcgatagtgacctc aatcatcatc     2040
ctgtatatcc ttctgcgtgt actgtgtgct gcctcatgttcgacacaccg aagagtaagg     2100
caggactcttgg                                                      2112
【０１００】
[00112]配列番号１２（ファーミントンラブドウイルスＯＲＦ５）
atggccttcg acccgaactg gcagagagaa ggttatgaatgggatccgtc aagtgagggc       60
agaccgaccg atgagaacga agacgacaga ggtcatcggccaaaaacgag acttcgtaca      120
ttccttgccc gcacgttaaa tagccctatc cgagccctattctacacaat attcctagga      180
attcgagcgg tttgggacgg gttcaaaaga ctcctacctgtgaggaccga aaagggttat      240
gcgaggtttt ctgagtgcgt cacatatgga atgatcggatgtgatgagtg tgtaatagac      300
ccggtgaggg ttgtcattga gctgaccgag atgcagttaccgattaaagg caaaggctct      360
acgaggttga gagcaatgat aactgaagac cttctcacggggatgcgcac agccgtgcct      420
cagatcagag tgagatcgaa gatcctagca gagcggttagggagagcaat cggccgagag      480
accttgccgg caatgatcca tcatgagtgg gcatttgtgatggggaagat tctcactttc      540
atggcagaca atgtgggtat gaacgctgac acggtcgagggcgttctatc actatcagag      600
gtcacacggc gatgggatat cggcaactct gtgtccgcagtgttcaatcc tgatggcctt      660
actatcagag tagaaaacac gggttacatc atgaccagagagactgcctg catgatcgga      720
gacattcatg ctcaatttgc aatccaatac ctagctgcatacctagacga ggtgatcggc      780
acaaggacgt ctctctcacc cgccgaactg acctctctcaaactatgggg acttaacgtc      840
ctgaaactcc taggacggaa cggttatgag gtgatcgcctgcatggagcc catagggtac      900
gctgtcctga tgatgggaag agacaggagt cctgatccctatgtcaatga cacctattta      960
aacagcatcc tctcagaatt ccctgtcgac tctgacgctcgagcctgcgt tgaagccctc     1020
ttaactatct atatgagctt cggcacaccc cataaagtctcggacgcatt cggcctcttc     1080
agaatgttgg gacatccgat ggttgatgga gctgacgggattgaaaagat gcgaaggtta     1140
agcaagaagg tcaagatccc agaccagtct acagcgatcgacctcggggc tatcatggcc     1200
gaactgtttg tgcggagttt cgtaaagaag cacaaaaggtggcccaactg ctccatcaat     1260
ctcccgccac gacacccctt ccaccacgcc cgcctatgtgggtatgtccc ggctgaaacc     1320
catcccctaa acaacactgc atcctgggcg gctgtggagttcaaccagga attcgagccg     1380
ccgagacagt acaaccttgc agacatcatt gatgacaagtcgtgctctcc caacaagcat     1440
gagctatatg gtgcttggat gaagtcaaaa acagctgggtggcaggaaca aaagaagctc     1500
atactccgat ggttcactga gaccatggtt aaaccttcggagctcctgga agagattgat     1560
gcacacggct tccgagaaga ggataagttg attggattaacaccaaagga gagagagctg     1620
aaattaacac caagaatgtt ctccttgatg acattcaagttcagaaccta ccaagtcctc     1680
actgagagta tggtcgccga tgagatcctc ccgcacttcccccagatcac catgaccatg     1740
tccaaccacg aactcacaaa gaggttgatt agcagaacgagacctcaatc tggaggaggg     1800
cgtgatgttc acatcaccgt gaacatagat ttccagaaatggaacacaaa catgagacac     1860
ggactggtca aacatgtctt cgagcgactg gacaacctctttggcttcac caacttaatc     1920
agacgaactc atgaatactt ccaggaggcg aaatactatctggctgaaga tggaactaat     1980
ctgtcgttcg acaggaacgg ggagttaata gatggcccatacgtttacac cggatcatac     2040
ggggggaacg aggggttacg acagaagccc tggacaatagttaccgtgtg tggaatatac     2100
aaggtagcta gagacctgaa aatcaaacat cagatcaccggtcagggaga taatcaggtg     2160
gtcaccctaa tatttccgga tcgagagttg ccttcagatccggtggagag gagcaagtac     2220
tgtagagaca agagcagtca gttcctgaca cgtctcagtcaatatttcgc tgaggttggt     2280
ttgcccgtca agactgaaga gacatggatg tcatcacgtctctatgctta cggtaagcgc     2340
atgttcttag agggagttcc acttaagatg tttctcaagaagataggcag agctttcgcc     2400
ctctcgaatg agtttgtccc gtccctcgag gaagatctggccagagtctg gagtgccacc     2460
agcgcagcgg tagagcttga cctaactccc tacgtaggatatgtcctcgg gtgctgcttg     2520
tctgcgcagg cgatcagaaa tcacctcatc tactcccctgttctggaggg ccctctgctg     2580
gttaaggcct acgagcgtaa gttcattaac tacgacggaggaacaaagcg gggggcgatg     2640
cccggcctac gtccaacctt tgagagccta gtcaaaagtatctgctggaa gccaaaggcc     2700
atcggagggt ggccggtatt gatgttagaa gatctcatcatcaaagggtt ccctgatccg     2760
gcgactagcg ccctggctca attgaagtca atggtgccatatacctctgg tatcgaccgg     2820
gagatcatac tttcctgtct caaccttccc ttatcgtcggtggtatctcc gtcaatgttg     2880
ttaaaggacc cggcggccat caacaccatc acaaccccgtccgcgggcga catcctgcaa     2940
gaggtcgcca gagactatgt taccgattac ccactccaaaacccgcagct cagagcagtg     3000
gtcaagaacg tgaagaccga gctagacaca ttggccagtgacttattcaa atgtgaacct     3060
ttctttcctc ctttaatgag cgatatcttc tcggcatctctcccggcata tcaagacagg     3120
attgttcgca agtgctccac gacttctaca atcaggagaaaagctgccga gaggggctcc     3180
gactctctcc tcaaccggat gaaaaggaat gagatcaataagatgatgtt acatctttgg     3240
gctacctggg gaaggagccc tctggccaga ttagacaccagatgtctcac aacctgcacc     3300
aagcaattag cccaacagta tcggaaccag tcttggggaaagcagatcca tggagtctca     3360
gtcggccacc ccttagaact gttcggtcga ataacacccagccatagatg cctacatgag     3420
gaggaccacg gagatttcct gcaaaccttc gccagcgagcatgtgaacca agtggacacc     3480
gacatcacca caactctggg gccgttctac ccttacataggctcggagac gcgagaacgg     3540
gcagtcaagg ttcgaaaagg agtgaattac gtagttgagccgcttctgaa acccgcagtt     3600
cgactactaa gagccattaa ttggttcatt cccgaggagtcagatgcgtc ccatttgctg     3660
agcaatctat tagcgtctgt taccgacatc aatcctcaagaccactactc atctaccgaa     3720
gtaggggggg gcaacgccgt ccatcgctac agctgccgactatccgacaa attgagcaga     3780
gtcaacaact tatatcagtt gcatacttat ttatctgtcacaacagagcg gttgaccaag     3840
tacagtcgag gatcaaaaaa cactgacgca cacttccagagcatgatgat ttatgcacaa     3900
agccgtcata tagacctcat cttggagtct ctgcacaccggagagatggt accgttggag     3960
tgtcatcatc acattgagtg caatcactgt atagaggatatacccgacga gccaatcacg     4020
ggggacccgg cttggactga agtcaagttt ccttcaagtcctcaggagcc ctttctttac     4080
atcaggcaac aagatctgcc ggtcaaagac aaactcgagcctgtgcctcg catgaacatc     4140
gtccgtcttg ccggattggg tccggaggcg attagtgagctagcgcacta ctttgttgca     4200
ttccgagtta tccgggcgtc agagacggat gtcgaccctaacgatgttct ctcgtggacc     4260
tggctgagcc gaattgatcc tgacaaattg gttgagtatatcgtgcatgt gttcgcttca     4320
ctggaatggc atcatgtatt aatgtcaggc gtgagtgtgagcgtcagaga tgcattcttt     4380
aagatgctag tgtctaaaag aatctcagag actccgctaagttcattcta ttatctggcc     4440
aacctgttcg ttgaccctca gactcgcgaa gcactaatgagctctaaata cgggttcagc     4500
ccccccgccg agacagtccc caacgcaaat gccgccgcagccgaaataag aagatgctgt     4560
gcgaacagtg cgccgtcgat cttagaatca gcccttcacagccgtgaggt tgtttggatg     4620
ccaggaacga acaattatgg agacgttgtc atctggtctcattacattag attacggttc     4680
agcgaagtta aactagttga cattacacga tatcagcagtggtggagaca gtctgagcga     4740
gacccctacg atttggtccc ggacatgcag gttcttgagagcgacctaga tacgctgatg     4800
aaacggatac cgaggctcat gcgcaaggcg agacgtccccctcttcaggt aattcgagag     4860
gacctggatg tcgcagtcat caatgctgat catcccgctcactctgtgct tcagaacaaa     4920
tacaggaaat tgattttcag agagccgaag attatcacgggagctgtgta caagtacctc     4980
tccctaaaat cagagttgac agagttcacc tcagcaatggtgatcggaga cggaactgga     5040
ggtatcaccg ccgccatgat ggccgatggg atagatgtgtggtatcagac gctcgtcaac     5100
tatgaccacg tgacacaaca gggattatcc gtacaagccccggcagcatt ggatcttctg     5160
cgcggggcac cctctggtag gctcttgaat ccgggaagattcgcatcatt tgggtctgac     5220
ctaactgacc ctcgatttac agcctacttt gatcaatatcccccgttcaa ggtggacact     5280
ctatggtctg acgcagaggg cgacttttgg gacaagccttccaagttgaa tcaatacttt     5340
gagaacatca ttgctttgag acatcggttc gtgaagacaaatggacagct tgtcgtgaag     5400
gtgtatctga ctcaagacac tgctaccaca attgaagcattcagaaagaa gctgtcccca     5460
tgcgccatca tcgtgtctct cttctcgacg gaaggctccacagaatgctt cgtcctaagc     5520
aatctcatcg caccagacac ccctgtcgac cttgagatggtggagaatat ccctaaacta     5580
acatcccttg ttccccagag gacgacagtg aaatgctattcccgacgagt agcgtgcatc     5640
agtaaaaggt ggggactttt cagatctccg agcatagcccttgaagtcca accgttcctt     5700
cactacatca caaaggtcat ctcagacaaa ggaacacaactgagtctcat ggcggtagct     5760
gacacaatga tcaacagtta caagaaggct atctcaccccgagtgttcga tctacaccgg     5820
catagggccg cactgggttt cgggaggaga tccttgcatctcatctgggg gatgatcatc     5880
tcaccaatcg cttaccagca ttttgagaat ccggccaagttgatggatgt cctggacatg     5940
ttgaccaata acatctcagc tttcttatcg atatcgtcgtcaggatttga cctgtcattt     6000
agtgtcagtg cagaccgaga tgtccggatt gacagcaaacttgtcagact cccgctattc     6060
gaaggatcag acctaaaatt catgaaaacc atcatgtctaccctcggatc tgtgttcaac     6120
caggtcgagc cttttaaggg gatcgccata aacccttctaaactaatgac tgtcaagagg     6180
acacaggagt tacgttacaa caacctaatt tacactaaggatgccatcct attccccaat     6240
gaagcggcaa aaaacactgc cccgcttcga gccaacatggtataccccgt ccggggagat     6300
ctattcgccc ctaccgatcg cataccaatc atgactctagtcagcgatga gacaacacct     6360
cagcactctc ctccagagga tgaggca                                       6387
【０１０１】
[00113]配列番号１３（全長、野生型、ヒトＭＡＧＥ３のタンパク質配列）
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSWGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGEE
【０１０２】
[00114]配列番号１４（全長、野生型、ヒトＭＡＧＥ３のバリアントのタンパク質配列）
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSWGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGEEDYKDDDDK*
【０１０３】
[00115]配列番号１５（人工ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質配列）
[00116]各Ｘは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合、Ｘは任意の天然アミノ酸とすることができる。全てのＸがシステインである場合、その配列は野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質配列に対応する。
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILEXVYXKQQLLRREVYDFAFRDLCIV
YRDGNPYAVXDKXLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRXINXQKPLCPE
EKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRXMSXCRSSRTRRETQL
【０１０４】
[00117]配列番号１６（人工ＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質配列）
[00118]各Ｘは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合、Ｘは任意の天然アミノ酸とすることができる。全てのＸがシステインである場合、その配列は野生型ＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質配列に対応する。
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITXVYXKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSI
PHAAXHKXIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRXLRXQKPLNPAEKLRH
LNEKRRFHNIAGHYRGQXHSXCNRARQERLQRRRETQV
【０１０５】
[00119]配列番号１７（人工ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質配列）
[00120]各Ｘは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合、Ｘは任意の天然アミノ酸とすることができる。ＸＸＸがＣＹＥであり、９１位と９４位のＸがシステインである場合、その配列は野生型ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質配列に対応する。
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYXXXQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCK
CDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVXPIXSQKP
【０１０６】
[00121]配列番号１８（人工ＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質配列）
[00122]各Ｘは、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合、Ｘは任意の天然アミノ酸とすることができる。ＸＸＸがＣＨＥであり、９８位と１０１位のＸがシステインである場合、その配列は野生型ＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質配列に対応する。
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLXXXQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHT
MLCMCCKCEARIKLVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVXPWXASQQ
【０１０７】
[00123]配列番号１９（コドン最適化ヒトＳＴＥＡＰタンパク質）
MESRKDITNQEELWKMKPRRNLEEDDYLHKDTGETSMLKRPVLLHLHQTAHADEFDCPSE
LQHTQELFPQWHLPIKIAAIIASLTFLYTLLREVIHPLATSHQQYFYKIPILVINKVLPM
VSITLLALVYLPGVIAAIVQLHNGTKYKKFPHWLDKWMLTRKQFGLLSFFFAVLHAIYSL
SYPMRRSYRYKLLNWAYQQVQQNKEDAWIEHDVWRMEIYVSLGIVGLAILALLAVTSIPS
VSDSLTWREFHYIQSKLGIVSLLLGTIHALIFAWNKWIDIKQFVWYTPPTFMIAVFLPIV
VLIFKSILFLPCLRKKILKIRHGWEDVTKINKTEICSQLKL
【０１０８】
[00124]配列番号２０（ＮＹＥＳＱ１  ＭＡＲタンパク質のタンパク質配列）
MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR*
【０１０９】
[00125]配列番号２１（ヒトブラキウリタンパク質のアイソフォーム１；識別子Ｏ１５１７８−１でＵｎｉｐｒｏｔデータベース）
MSSPGTESAGKSLQYRVDHLLSAVENELQAGSEKGDPTERELRVGLEESE
LWLRFKELTNEMIVTKNGRRMFPVLKVNVSGLDPNAMYSFLLDFVAADNH
RWKYVNGEWVPGGKPEPQAPSCVYIHPDSPNFGAHWMKAPVSFSKVKLTN
KLNGGGQIMLNSLHKYEPRIHIVRVGGPQRMITSHCFPETQFIAVTAYQN
EEITALKIKYNPFAKAFLDAKERSDHKEMMEEPGDSQQPGYSQWGWLLPG
TSTLCPPANPHPQFGGALSLPSTHSCDRYPTLRSHRSSPYPSPYAHRNNS
PTYSDNSPACLSMLQSHDNWSSLGMPAHPSMLPVSHNASPPTSSSQYPSL
WSVSNGAVTPGSQAAAVSNGLGAQFFRGSPAHYTPLTHPVSAPSSSGSPL
YEGAAAATDIVDSQYDAAAQGRLIASWTPVSPPSM
【０１１０】
[00126]配列番号２２（ヒト前立腺酸性ホスファターゼのアイソフォーム１；識別子Ｐ１５３０９−１でＵｎｉｐｒｏｔデータベース）
MRAAPLLLARAASLSLGFLFLLFFWLDRSVLAKELKFVTLVFRHGDRSPI
DTFPTDPIKESSWPQGFGQLTQLGMEQHYELGEYIRKRYRKFLNESYKHE
QVYIRSTDVDRTLMSAMTNLAALFPPEGVSIWNPILLWQPIPVHTVPLSE
DQLLYLPFRNCPRFQELESETLKSEEFQKRLHPYKDFIATLGKLSGLHGQ
DLFGIWSKVYDPLYCESVHNFTLPSWATEDTMTKLRELSELSLLSLYGIH
KQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMYSAHDTTVSGLQMAL
DVYNGLLPPYASCHLTELYFEKGEYFVEMYYRNETQHEPYPLMLPGCSPS
CPLERFAELVGPVIPQDWSTECMTTNSHQGTEDSTD
【０１１１】
[00127]配列番号２３（腫瘍関連エピトープ）
EVDPIGHLY
[00128]配列番号２４（腫瘍関連エピトープ）
FLWGPRALV
[00129]配列番号２５（腫瘍関連エピトープ）
KVAELVHFL
[00130]配列番号２６（腫瘍関連エピトープ）
TFPDLESEF
[00131]配列番号２７（腫瘍関連エピトープ）
VAELVHFLL
[00132]配列番号２８（腫瘍関連エピトープ）
REPVTKAEML
[00133]配列番号２９（腫瘍関連エピトープ）
AELVHFLLL
[00134]配列番号３０（腫瘍関連エピトープ）
WQYFFPVIF
[00135]配列番号３１（腫瘍関連エピトープ）
EGDCAPEEK
[00136]配列番号３２（腫瘍関連エピトープ）
KKLLTQHFVQENYLEY
[00137]配列番号３３（腫瘍関連エピトープ）
VIFSKASSSLQL
[00138]配列番号３４（腫瘍関連エピトープ）
VFGIELMEVDPIGHL
[00139]配列番号３５（腫瘍関連エピトープ）
GDNQIMPKAGLLIIV
[00140]配列番号３６（腫瘍関連エピトープ）
TSYVKVLHHMVKISG
[00141]配列番号３７（腫瘍関連エピトープ）
FLLLKYRAREPVTKAE
【実施例】
【０１１２】
[00142]実験
[00143]以下の実施例では、試験したプライム及び試験した抗原性タンパク質は、異なるプライムを用いる及び異なる種類の抗原性ペプチドを用いるプライム：ブースト組合せ処置において免疫応答を生成するのにファーミントン（ＦＭＴ）ウイルスを使用することができる、という概念に関する証拠を提供することを理解されたい。本明細書で実証の通り、ＦＭＴウイルスは、種々のタイプのプライム及び抗原性ペプチドに対する免疫応答のブーストを実現することができる。
【０１１３】
[00144]実験１．抗原性タンパク質を発現するように操作したＦＭＴウイルスは、異なる３つのプライム戦略において抗原特異的免疫応答をブーストする
[00145]組合せプライム：ブースト療法におけるブースト構成要素としてＦＭＴウイルスを特徴づけるために、本開示の著者らは、ｍＣＭＶ由来抗原ｍ３８を発現するように操作したＦＭＴウイルス（ＦＭＴ−ｍ３８）は、
異なる３つのプライム：
１）ｍ３８を発現するように操作したアデノウイルス（ＡｄＶ）（ＡｄＶ−ｍ３８）、
２）ｍ３８特異的ＣＤ８メモリーＴ細胞の養子細胞移植（ＡＣＴ）（ＡＣＴ−ｍ３８）及び
３）アジュバントを含むｍ３８ペプチド（ペプチドｍ３８）
と組み合わせた場合の、ｉｎ  ｖｉｖｏでｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を増幅する能力について調査した。
【０１１４】
[00146]これらプライムとの組合せのそれぞれにおいて、ＦＭＴ−ｍ３８は、頻度（ＰＢＳ対照の０．２％と比較して、それぞれ、ＡｄＶ−ｍ３８、ＡＣＴ−ｍ３８、及びｍ３８ペプチドの各プライムについて、全ＣＤ８  Ｔ細胞のうち平均８．４％、３８．３％、及び５５．７％、Ｐ＜０．０００１；図１Ａを参照されたい）の増加、及び、ｍ３８抗原の優性エピトープによるｅｘｖｉｖｏ刺激時にＩＦＮγを発現するＣＤ８  Ｔ細胞として定義したｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の数（ＰＢＳ対照の１細胞と比較して、それぞれ、ＡｄＶ−ｍ３８、ＡＣＴ−ｍ３８、及びｍ３８ペプチドの各プライムについて、平均８．２×１０４、１６．８×１０４及び１２５．７×１０４の細胞、Ｐ＜０．０００１；図１Ａを参照されたい）の増加、を誘導した。
【０１１５】
[00147]ペプチド刺激時にＩＦＮγとＴＮＦαの両方を発現する多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞について同じ結果が観察されたが、全てのＣＤ８＋ＩＦＮ＋Ｔ細胞がＴＮＦαを分泌したわけではない（図１Ｂ）。さらに、同じアッセイ中に、しかし別々のウェルで、本開示の著者らは、ＦＭＴウイルスの優性エピトープに対するＣＤ８免疫応答について評価した。ＡＣＴ−ｍ３８  −  プライム群のＦＭＴ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度は、ＰＢＳと比較して有意により高かった（平均１．１％対０．０２％、Ｐ＜０．００１）が、全ＣＤ８  Ｔ細胞のうちの３％を超えず、一方、ＡｄＶ−ｍ３８及びｍ３８ペプチドでプライムした群は、ＰＢＳ対照と違いはなかった（それぞれ平均０．０６％及び０．１３％、図８）。ＦＭＴ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のこういったレベルは、ＦＭＴ−ｍ３８ウイルスを受けている未処理のマウス及び担癌マウスでのさらなる全実験中で一貫していた。要約すると、本開示の著者らが見いだしたことは、ＦＭＴウイルスを、ＦＭＴ特異的細胞性免疫応答の小さいレベル又はさらにほとんど検出不能のレベルの状態で、多様なプライム：ブースト処置戦略においてブーストとして首尾よく使用できることである。
【０１１６】
[00148]実験２．ＦＭＴウイルスベースのプライム：ブースト処置は、異なる種類の抗原に対して強力な免疫応答を誘導する
[00149]一部のタイプのがんが外来抗原を発現するが（例えば、ＣＭＶ陽性患者においてＣＭＶタンパク質を発現する神経膠芽腫）、ほとんどの場合、がんワクチンは、ＭＨＣ  Ｉにより提示されたネオエピトープによって現れる異常に発現された自己抗原又はがん特異的変異を標的とする必要がある。
【０１１７】
[00150]本開示の著者らは、異なる３つの種類の抗原：
１）腫瘍関連自己抗原、
２）外来抗原及び
３）腫瘍由来のネオエピトープ
に対するブーストとして作用するＦＭＴウイルスの能力に関してＦＭＴウイルスを試験した。
【０１１８】
[00151]それぞれ、プライム及びブーストとして、ＤＣＴ（ＡｄＶ−ＤＣＴ及びＦＭＴ−ＤＣＴ）を発現するＡｄＶウイルス及びＦＭＴウイルスを用いた、黒色腫関連自己抗原であるＤＣＴに対して向けられたプライム：ブースト処置は、ＡｄＶ−ＤＣＴでプライムし、ＤＣＴの代わりにＧＦＰがコードされたＦＭＴウイルス（ＦＭＴ−ＧＦＰ）でブーストした群及びＰＢＳ対照と比較して、ＤＣＴ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増幅をもたらした（全ＣＤ８  Ｔ細胞のうち平均頻度９．４％に対して対照群について０．９％及び０．６％、Ｐ＝０．００７０、平均数２．８×１０４細胞に対して対照群について０．１×１０４細胞及び０．０５×１０４細胞、Ｐ＝０．００７６；図１Ｃを参照されたい）。それぞれ、プライム及びブーストとしてＡＣＴ−ｍ３８及びＦＭＴ−ｍ３８を用いた、ｍＣＭＶ由来（外来）抗原であるｍ３８に対する免疫は、プライムのみを受けた群と比較して、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度（平均４０．３％に対して０．１％、Ｐ＝０．０１１９；図１Ｄを参照されたい）及び数（平均３．６×１０５細胞に対して０．００２×１０５細胞、Ｐ＝０．０１１９；図１Ｄを参照されたい）の大規模の増加を誘導した。
【０１１９】
[00152]次に、本開示の著者らは、腫瘍由来のネオエピトープに対する免疫応答をブーストするＦＭＴウイルスの能力について評価した。本開示の著者らは、ＭＣ−３８マウス大結腸がん細胞株に由来する、Ａｄｐｇｋ、Ｄｐａｇｔ１及びＲｅｐｓ１−ネオエピトープを発現するＦＭＴウイルス（ＦＭＴ−ＭＣ−３８）を作出し、これをペプチドベースのプライムと組み合わせて使用した。重要なことに、このＦＭＴ−ＭＣ−３８ウイルスは、ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープを構成するペプチド断片のみを発現し、ＦＭＴ−ＤＣＴ及びＦＭＴ−ｍ３８のような抗原全体を発現しなかった。プライムのみを受けた対照群と比較して、ＦＭＴ−ＭＣ−３８ブーストと組み合わせたプライムは、各ペプチドに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の頻度と数を高めた（図１Ｅ）：Ａｄｐｇｋ（平均頻度５．１％に対して０．０６％、平均数３．１×１０４細胞に対して０．０２×１０４細胞、Ｐ＞０．０５）、Ｄｐａｇｔ１（平均頻度１．６％に対して０．０９％、平均数１×１０４細胞に対して０．０４×１０４細胞、Ｐ＞０．０５）及びＲｅｐｓ１（平均頻度１１．１％に対して０．０６％、平均数６．５×１０４細胞に対して０．０３×１０４細胞、Ｐ＜０．００１）。
【０１２０】
[00153]このことが実証することは、ＦＭＴウイルスが異なる種類の抗原に対する免疫に適用できることである。さらに、抗原全体（複数可）を発現させる必要なしに、目的の１つ又は複数のエピトープに対する免疫刺激向けに操作したＦＭＴウイルスを使用することが実現可能である。
【０１２１】
[00154]実験３．ＦＭＴウイルスブーストによって誘導される免疫応答は、長期間にわたって持続することができる
[00155]抗原特異的エフェクターＴ細胞の数は、抗原刺激に続いて数日以内に縮小し、同じ抗原による再刺激時に数が増幅し、分化してエフェクター機能を実施するメモリーＴ細胞に関して小さなプールの状態のままである。したがって、本開示の著者らは、本開示によるブーストするファーミントンウイルスによって誘導される免疫応答を、縮小期に続いて、同じブーストを使用して、再び再刺激できるかどうかを調べた。
【０１２２】
[00156]このことに対処するために、本開示の著者らは、ＡＣＴ−ｍ３８又はｍ３８ペプチドプライムと組み合わせたＦＭＴ−ｍ３８ウイルスを使用してｍ３８抗原に対してマウスを免疫し、ＦＭＴ−ｍ３８でマウスを再びブーストする前に１２０日待って、任意の効果を誘導する前に抗体を中和することによってウイルスがクリアされるリスクを最小限に抑えた。先の実験で観察したように、ＦＭＴ−ｍ３８による第１のブーストは高いｍ３８特異的免疫応答を誘導した（図２Ａ、時点５日を参照されたい）。頻度と数は、ＡＣＴ−ｍ３８プライム群とｍ３８ペプチド−プライム群の両方で９５％を超えて、１１２日以内に縮小した（ＡＣＴ−ｍ３８でプライムしたマウスで１．７×１０５細胞から０．０１２×１０５細胞、Ｐ＜０．０００１及びｍ３８ペプチドでプライムしたマウスで１．２５７×１０６細胞から０．０２７×１０６細胞、Ｐ＜０．０００１；図２Ａ、２Ｂを参照されたい）。
【０１２３】
[00157]次いで、各処置群を、第２回にあたってＦＭＴ−ｍ３８を受けるマウスと代わりにＰＢＳを受けるマウスとに分けた。ＦＭＴ−ｍ３８による第２のブーストは、第２のブースト前の残留のプールと比較して、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度と数の増幅をもたらしたが、ＰＢＳはもたらさなかった（ｍ３８でプライムしたマウスにおいて：１．９×１０５に対して０．２×１０５細胞、ＦＭＴ−ｍ３８の第２のブーストに対してＰ＝０．００７９及び７．４×１０４に対して３．６×１０４細胞、ＰＢＳの第２のブースト対照に対してＰ＝０．４９；ＡＣＴ−ｍ３８でプライムしたマウスにおいて１．８×１０４に対して０．１×１０４細胞、ＦＭＴ−ｍ３８で第２のブーストに対してＰ＝０．０５６及び１２３８に対して１０６６細胞、ＰＢＳの第２のブースト対照に対してＰ＝０．６０、図２Ｃ）。
【０１２４】
[00158]驚くべきことに、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答が緩慢な縮小を経たとしても（ＣＤ８＋ＩＦＮ＋細胞の数によって明白なように（図２Ａ））、第２のブースト後の早期時点と後期時点の間の差（５日に対して１５２日）は統計的に有意ではなく、ｍ３８ペプチドでプライムしたマウスにおけるｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度と量の両方は、ＰＢＳ対照におけるよりも、さらにはブーストを１回だけ受けた群におけるよりも、なおも有意に高く（図２Ａ、Ｄ）、ｍ３８−ペプチドでプライムし、ＦＭＴ−ｍ３８で２回ブーストしたマウスの場合の第２のブースト前と比較してより高かった（図２Ｅ）。
【０１２５】
[00159]上に記載の観察をさらに確認するために、本開示の著者らは、３つのＭＣ−３８由来のネオエピトープ：Ａｄｐｇｋ、Ｄｐａｇｔ１及びＲｅｐｓ１に対してマウスを免疫刺激した。マウスを、全ての３つのロング変異体ペプチドで又は別々に各ペプチドでプライムし、全てのマウスをＭＴ−ＭＣ−３８ウイルスでブーストした。対照の場合、マウスを全ての３つのペプチドでプライムし、ＰＢＳでブーストした（プライムのみの対照）。各免疫刺激は、プライムのみの群と比較して、各エピトープへ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の頻度と数を増幅した（図２Ｆ、２Ｇ、時点５日）。本開示の著者らは最初に、ブーストどうしの間の時間間隔を短縮しようと試み、したがって、免疫応答が依然として縮小を経ている間に、第１のブーストの３５日後に第２のＦＭＴ−ＭＣ−３８ブーストを適用した（図２Ｆ、２Ｇ）。しかし、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増幅は検出されなかった（図２Ｆ、２Ｇ）。したがって、本開示の著者らは、１２４日後にブーストを繰り返して、抗ｍ３８免疫刺激実験で先に適用した時間間隔を真似た。ＦＭＴ−ＭＣ−３８による第３のブーストは、第３のブーストの１週間前に行った測定と比較して、Ｄｐａｇｔ１プライム群を除いて、各処置群の各エピトープに特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の増加した頻度と数をまねいたが、その差は、Ｒｅｐｓ１プライム群（Ｐ＝０．０１５９）及びＤｐａｇｔ１特異的ＣＤ８  Ｔ細胞についての３つのペプチドプライム群（Ｐ＝０．００７９）でのみにおいて統計的に有意であった（単一ペプチドでプライムしたマウスにおいてブースト後に対するブースト前の平均細胞数：それぞれ、Ａｄｐｇｋ−、Ｄｐａｇｔ１−及びＲｅｐｓ１−の各特異的ＣＤ８  Ｔ細胞に関して、１．６×１０４に対して０．７×１０４、４１４に対して５００、及び２．０×１０４に対して０．６×１０４；並びに、全ての３つのペプチドでプライムしたマウスにおいて：それぞれ、Ａｄｐｇｋ−、Ｄｐａｇｔ１−及びＲｅｐｓ１−の各特異的ＣＤ８  Ｔ細胞に関して、４６２１に対して１５２４、７２６８に対して３７４、及び７１２６に対して１７８５（図２Ｈ））。先の実験のように、免疫応答は、プライムのみの対照と比較して、第３のブーストの１９０日後での抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞数によって例示されるように長期間にわたって持続した（図２Ｉ）が、この時点で並びに第３のブーストの９８日後で、第３のブースト前と同じレベルであった。
【０１２６】
[00160]したがって、本開示の著者らは、ＦＭＴベースのブーストが、長期持続性の抗原特異的免疫応答を誘導する能力を有すると結論する。ブーストどうしの間に長い時間間隔（マウスで最低１２０日）が適用されることを条件として、同種設定でＣＤ８  Ｔ細胞を再刺激することも実現可能である。重要なことに、このことは、外来抗原とネオエピトープの両方について、抗原全体又は１つ若しくは複数のエピトープに対してブーストした場合に、達成できる。
【０１２７】
[00161]実験４．本開示による例示的なプライム：ブースト療法による処置は、動物の生存を改善する
[00162]ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＭＴベースのプライム：ブースト処置の抗腫瘍効力を決定するために、本開示の著者らは、担癌の免疫適格性マウスをプライム：ブースト療法で処置した。ＦＭＴウイルスの安全性プロファイルによりＣＭＶ抗原が脳腫瘍を標的とするための特に有望なツールとなるので、最初に著者らは神経膠腫マウスモデルでＣＭＶ抗原を標的とすることに注目した。この目的のために、著者らはマウス神経膠腫ＣＴ２Ａ細胞を操作してｍ３８抗原を発現させ、安定したＣＴ２Ａ−ｍ３８細胞株を生成した。ＣＴ２Ａ−ｍ３８細胞の頭蓋内移植の２１日後にマウスから抽出した腫瘍細胞は、ｍ３８エピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ  Ｉ）対立遺伝子を発現した（図９Ｂ）。
【０１２８】
[00163]興味深いことに、著者らは、ＭＲＩ画像法によって例示のように、これらの腫瘍細胞が野生型ＣＴ２Ａ細胞よりもｉｎ  ｖｉｖｏでより攻撃的であることを観察した（図９Ａ）。ＡｄＶ−ｍ３８及びＦＭＴ−ｍ３８によるプライム：ブースト処置（最初に静脈内投与し、２日後に頭蓋内投与した）は、プライムのみ及びＰＢＳ対照と比較して、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度（それぞれ、プライム：ブースト、プライムのみ、及びＰＢＳについて、５．２％に対して２．３５％及び０．０１％、Ｐ＜０．０００１（図３Ａ））及び数（それぞれ、プライム：ブースト、プライムのみ、及びＰＢＳについて、４．２×１０４細胞に対して０．６×１０４細胞及び０．０４×１０４細胞、Ｐ＜０．０００１）を有意に増加し、ＣＴ２Ａ−ｍ３８細胞を同所移植したマウスの生存（４０日に対して２５日及び２４日、Ｐ＜０．０００１、６匹／３０匹（２０％）のマウスが処置群において治癒した）を延長した。
【０１２９】
[00164]次の実験では、著者らは、ＡＣＴ−ｍ３８でＡＤＶ−ｍ３８を置き換え、ＣＴ２Ａ−ｍ３８の細胞数を１×１０４〜３×１０３細胞に減少させた。より大きな免疫賦活有効性（ｍ３８特異的Ｔ細胞の頻度：２５．３％に対してそれぞれプライムのみ及びＰＢＳ対照について０．４１％及び０．０７８％、Ｐ＝０．０００３、ｍ３８−特異的Ｔ細胞の数：１．３×１０５細胞に対してそれぞれプライムのみ及びＰＢＳ対照について８２０及び２８細胞、Ｐ＝０．０００３（図３Ｂ））にもかかわらず、同様の抗腫瘍効力が達成された（生存期間中央値：４７日に対してそれぞれプライムのみ及びＰＢＳ対照について２５日及び２２日、Ｐ＝０．０００８、１匹／１０匹（１０％）のマウスが処置群において治癒した（図３Ｂ））。
【０１３０】
[00165]さらに、著者らは、３×１０３ＣＴ２Ａ−ｍ３８細胞を移植したマウスにおいて、ｍ３８ペプチドプライムとＦＭＴ−ｍ３８（静脈内のみで投与した）との組合せの効力について試験した。この処置レジメンは、ＰＢＳ対照と比較して、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度（４３．０％に対して０．０９％、Ｐ＝０．００７９）及び数（８．１×１０５に対して２５８細胞、Ｐ＝０．００７９）の高い増加、並びに中度の延命効果（３２日に対して２１日、Ｐ＝０．００２７）をもたらした（図３Ｃ）。このことは、腫瘍へのＦＭＴウイルスの直接注射が、多数の腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することとは別であるメカニズムによって抗腫瘍効力に寄与し得ることを示唆するが、選択したプライム方法の生存に及ぼす影響を排除することはできない。
【０１３１】
[00166]さらに、本開示の著者らは、ＭＣ−３８皮下マウス腫瘍モデルにおいてＦＭＴ−ＭＣ−３８ウイルスの有効性について調査した。担癌マウスを、アジュバントを含むＡｄｐｇｋ及びＲｅｐｓ１のロング変異体ペプチドで、アジュバントのみで、又はＰＢＳでプライムし、ＦＭＴ−ＭＣ−３８又はＰＢＳでブーストした。ＦＭＴ−ＭＣ−３８ウイルスのみ（プライムの代わりにＰＢＳを使用）での処置は、Ａｄｐｇｋ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の最も高い増幅（４２．９％に対してそれぞれアジュバント＋ブースト、プライム＋ブースト、プライムのみ及びＰＢＳの各群で１７．１％、１５．６％、０．１１％及び０．１３％）、及び遅延した腫瘍進行をもたらした（図３Ｄ）。ＦＭＴ−ＭＣ−３８は、プライムなしでＡｄｐｇｋ特異的応答をブーストすることができた。他方、Ｒｅｐｓ１特異的Ｔ細胞のブーストは、Ｒｅｐｓ１ペプチドプライムを使用した場合にのみ観察されたが、腫瘍の進行や動物の生存には影響しなかったが（図３Ｄ）、このことは、Ｒｅｐｓ１は腫瘍拒絶抗原ではない可能性があることを示唆する。
【０１３２】
[00167]要約すると、著者らが、異なる２つのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて実証したことは、本開示によるＦＭＴウイルスベースのブーストが、担癌マウスにおいて腫瘍特異的抗原に対して免疫応答を生成し、そのマウスの生存を延長することである。
【０１３３】
[00168]実験５．ＴＳＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＦＭＴウイルスベースの抗腫瘍処置の効力を大幅に増強する。
【０１３４】
[00169]本開示の著者らは、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）特異的エフェクターＴ細胞の増幅が、本開示によるプライム：ブースト療法の抗腫瘍効力に大幅に寄与すると仮説を立てた。この仮説を検証するために、著者らは実験を計画したが、この場合、ＣＴ２Ａ−ｍ３８担癌マウスは、（ｉ）ｍ３８に対する若しくはニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）  −無関係な抗原−  に対するプライム：ブースト処置を受けた、又は（ｉｉ）ｍ３８特異的メモリーＴ細胞で養子移植されたが、ｍ３８の代わりにＧＦＰを発現するＦＭＴウイルス（ＦＭＴ−ＧＦＰ）でブーストされた。
【０１３５】
[00170]先の実験におけるように、共通抗原性ペプチドとしてｍ３８を使用するプライム：ブースト処置は、高い頻度及び多数のｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を誘導し、動物の生存を有意に延長した（図４Ａ）。対照的に、共通抗原性ペプチドとしてＯＶＡを使用するプライム：ブースト処置は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を大量に増幅させたにもかかわらず延命効果をもたらさず（図４Ａ）、その結果、ＴＳＡ特異的Ｔ細胞は抗腫瘍効力を媒介することができるが、その他のＴ細胞はできないことを確認した。ｍ３８特異的メモリーＴ細胞を養子移植したマウスは、関連する抗原を有さないウイルスがメモリー細胞からエフェクター細胞へのＴ細胞の分化を誘発することができなかったので、ＦＭＴ−ＧＦＰ処置から利益を得なかった（図４Ａ）。これらの結果は、ＴＳＡ特異的エフェクターＴ細胞による腫瘍細胞の死滅が、本開示によるプライム：ブースト療法の効力の一因となる主要なメカニズムであることを示す。
【０１３６】
[00171]実験６．ＴＳＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の数を増加することは、治療効力を改善する
[00172]本開示の著者らは、本開示によるプライム：ブースト療法のＴ細胞依存性が用量依存的であるかどうかを判定することを目的とした。この目的のために、著者らは、１０３〜１０６細胞の範囲の様々な用量のＡＣＴ−ｍ３８でＣＴ２Ａ−ｍ３８担癌マウスをプライムし、ＦＭＴ−ｍ３８ウイルスでブーストした。全ての処置が、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度と数を用量依存的様式で増幅した（図４Ｂ）。１０３細胞の最も低い用量でのＡＣＴ−ｍ３８は、ＰＢＳ対照と比較して、最小の延命効果をもたらした（２８日に対して２１日、Ｐ＝０．００３５；図４Ｂ）。より高いプライム用量でｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の量を増加することは、ＰＢＳ対照及び最低プライム用量群と比較して、動物の生存をさらに延長した（生存期間中央値：それぞれ、１０４、１０５及び１０６細胞用量群で、４４日、１匹／５匹（２０％）のマウスが治癒した、４７日、２匹／５匹（４０％）のマウスが治癒した及び４５日、それぞれ、ＰＢＳ及び１０３細胞用量群と比較した場合、Ｐ＝０．００３５及びＰ＝０．００１６；図４Ｂ）。したがって、抗原特異的エフェクターＴ細胞の数は、抗腫瘍効力と直接相関していた。しかし、これらのデータはまた、それ以上の治癒については１０６細胞のプライム用量では観察されなかったので、マウスでは飽和処置用量に到達していた可能性があることを示す。
【０１３７】
[00173]実験７．神経膠腫に対する抗腫瘍効力は、静脈内ＦＭＴウイルスの投与で達成することができる
[00174]さらに、本開示の著者らは、ＦＭＴウイルスの投与の異なる経路及び抗腫瘍効力に対する異なる経路の影響について調査した。著者らは、脳は免疫特権のある器官と考えられるので、静脈内注射が、とりわけ頭蓋内注射より、末梢血のＴＳＡ特異的エフェクターＴ細胞の増幅に優れているであろうと仮説を立てた。しかし、腫瘍に注射されたウイルスは、腫瘍溶解性ウイルス媒介の腫瘍細胞溶解によって直接的に、又は局所炎症を誘導、腫瘍微小環境を改変、及び細胞傷害性Ｔ細胞の腫瘍への動員を増加することによって間接的に、腫瘍根絶に寄与する可能性がある。
【０１３８】
[00175]著者らは最初に、静脈内（ｉｖ）又は頭蓋内（ｉｃ）に注射した未処理のマウスにおいて脳及び脾臓のＦＭＴウイルスの分布を調べた。予想通り、ｉｖ群（平均１×１０４ｐｆｕ、注射用量の０．００３％）と比較して、ｉｃ注射（平均１．４×１０７ｐｆｕ、注射用量の４０％超）の後の脳でより多くのウイルスが見られ、ｉｖ注射のマウスの脾臓は、ｉｃ経路によるウイルスを受けているマウス（平均４．９５×１０４ｐｆｕ、注射用量の０．５％）よりも多くのウイルス（平均１．５×１０７ｐｆｕ、注射用量の５％）を含有していた（図４Ｃ）。
【０１３９】
[00176]次に、著者らは、ＦＭＴ−ｍ３８投与の異なる経路：１）ｉｃ、２）ｉｖ及び３）ｉｖ、これに続くｉｃ（ｉｖ＋ｉｃ）の、ＡＣＴ−ｍ３８でプライムしたＣＴ２Ａ−ｍ３８担癌マウスの生存に及ぼす影響について研究した。各処置は、ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増幅を誘導し（それぞれ、ｉｃ、ｉｖ、及びｉｖ＋ｉｃの各群で３．７％、３０．０％、及び３４．１％の頻度であるのに対して、ＰＢＳ対照で０．０２％、それぞれ、Ｐ＞０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０１（図４Ｃ））、動物の生存を延長した（それぞれ、ｉｃ、ｉｖ、及びｉｖ＋ｉｃの各群で３４日、８３日及び４９日の生存期間中央値あるのに対して、ＰＢＳ対照で２２日、それぞれ、Ｐ＝０．００２１、Ｐ＝０．００１９及びＰ＝０．００１９（図４Ｃ））。注目すべきは、ｉｖ及びｉｖ＋ｉｃブーストレジメンはｉｃ注射よりも優れており（それぞれ、Ｐ＝０．００７３及びＰ＝０．００１５）、２０％の治癒率をもたらした（マウス２匹／５匹）。ｉｖ群とｉｖ＋ｉｃ群の間に有意差は観察されなかった。要約すると、静脈内投与された本開示によるＦＭＴベースのブーストは、頭蓋内注射と比較して、より大規模の抗原特異的応答を誘導し、長期生存をもたらすが、このことは、主として脾臓に移動するより大量の感染性ウイルス粒子が、メモリーＴ細胞への増強されたＴＳＡ提示をもたらすことに起因する。しかし、これらのデータは、静脈内プライム：ブースト処置に加えて、ＦＭＴ−ｍ３８ウイルスを腫瘍に直接注射することの考えられる効果を排除するものではない。
【０１４０】
[00177]実験８．ＴＳＡに対する以前から存在する免疫は、腫瘍でチャレンジされたマウスの生存を延長するが、完全な腫瘍拒絶にとって十分ではない
[00178]ＴＳＡ特異的ＣＤ８エフェクターＴ細胞の以前から存在するプールが腫瘍細胞移植に続いて腫瘍の進行を防ぐことになるかどうかを評価するために、本開示の著者らは、「ＦＭＴウイルスブーストによって誘導される免疫応答は、長期間にわたって持続することができる」と題する、上で論議した実験で、第１／第２のブーストの２８１日／１６１日後で、プライム：ブースト療法で以前に処置したマウス（図２Ａ〜２Ｅに提示）に頭蓋内にＣＴ２Ａ−ｍ３８を注射した。
【０１４１】
[00179]ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の量は、腫瘍チャレンジの前後で類似していたが、異なる処置レジームによる群間で様々であった（図５Ａ〜５Ｄ）。全てのプライム：ブースト処置マウスは、ＰＢＳ対照群よりも有意に長く生存した（生存期間中央値：それぞれ、２つのＦＭＴ−ｍ３８ブーストを伴うｍ３８ペプチドプライム、１つのＦＭＴ−ｍ３８ブーストを伴うｍ３８ペプチドプライム、２つのＦＭＴ−ｍ３８ブーストを伴うＡＣＴ−ｍ３８プライム、１つのＦＭＴ−ｍ３８ブーストを伴うＡＣＴ−ｍ３８プライム、を受けているマウスについて３２日、３４．５日、３５日、３５日に対して、ＰＢＳ対照群について２１日、Ｐ＜０．０５（図５Ｅ））。しかし、以前から存在するｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の量を問わず、全てのマウスは最終的に腫瘍に屈服し、プライム：ブースト処置マウスの生存期間中央値は、著者らが行った治療実験ほとんどにおいてＦＭＴ−ｍ３８で処置したマウスの結果と非常に類似していた。これらの結果は、エフェクターＴ細胞の腫瘍への非効率的な動員、エフェクターＴ細胞の低下した機能（疲弊）、又はアジュバント療法がないことの無効性、のいずれかを示唆する。
【０１４２】
[00180]実験９．ＦＭＴ−ｍ３８ウイルスの頭蓋内注射は、脳腫瘍微小環境内の抗腫瘍免疫応答を促進する
[00181]腫瘍微小環境に対する本開示による例示的なブーストの影響について調べるために、著者らは、ｍ３８ペプチドでプライムし、頭蓋内又は静脈内にＦＭＴ−ｍ３８ウイルスでブーストしたＣＴ２Ａ−ｍ３８腫瘍担持マウスから腫瘍組織を回収した。
【０１４３】
[00182]末梢ｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の増幅を確認するために、ブーストの６日後、腫瘍組織回収の直前に血液試料を採取した（図１０）。対照のＰＢＳ群と比較して、ＦＭＴ−ｍ３８ウイルスのｉｃ注射は、Ｔ細胞を含めて、リンパ球の腫瘍への動員を増加したが、一方、マクロファージ及びミクログリアの量は未変化のままであった（図６Ａ）。意外にも、著者らは、ｉｖ注射群で減少したＴ細胞浸潤を検出した（図６Ａ）。興味深いことに、著者らは、ｉｃ注射群とＰＢＳ対照の両方と比較して、ｉｖ注射群においてマクロファージ集団のＣＤ１１ｂの低下した発現を観察した（図６Ａ中にＣＤ１１ｂｌｏｗマクロファージ集団として例示）。両方の処置レジメンは、Ｍ２分極化のマーカーのうちの１つであるＣＤ２０６を発現するマクロファージの数を減少させたが、一方、ＣＤ８６共刺激分子の発現レベルは対照群におけるのと同じままであった（図６Ｂ）。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のうちで、著者らは、対照及びｉｖ注射群と比較して、ｉｃ注射群でＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞（図６ＣではＣＤ８ｌｏｗと定義）の両方の増加した量を観察した（図６Ｃ）。対照を含めて、各群では、ＣＤ８  Ｔ細胞のうち９０％超がＣＤ１３７、  −  ＴＣＲ刺激によって誘導される活性化のマーカーであることを発現した。
【０１４４】
[00183]さらに、別の実験では、著者らは、野生型ＦＭＴウイルスのｉｃ又はｉｖの注射に続いて、腫瘍微小環境のサイトカインプロファイル及びケモカインプロファイルを比較した。ｉｃ経路にてＦＭＴウイルスを注射したマウスから回収した腫瘍は、ｉｖ注射したマウスからの腫瘍と比較して、メモリーＴ細胞プールの維持に重要なＩＬ−７サイトカイン（Ｐ＜０．０５）並びに炎症性サイトカインＩＬ−６及びＴＮＦα（統計的に有意ではない）の増加した濃度を有した（図６Ｄ）。他方、著者らは、ＰＢＳ対照と比較して、ｉｃとｉｖ（Ｐ＜０．０５）の注射群の両方で、Ｔｈ１型Ｔ細胞応答を阻害するより高レベルのＩＬ−１３サイトカインも観察した（図６Ｄ）。ＰＢＳ対照と比較して、両方の注射群はまた、好中球の増殖及び分化を支える顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の上昇した発現をはっきりと示した（図６Ｄ）。さらに、ＦＭＴウイルスのｉｃ注射は、エオタキシン（ＰＢＳ対照と比較してＰ＜０．０５）、ＣＸＣＬ５（ｉｖ群と比較してＰ＜０．０１）、ＣＸＣＬ１（ＰＢＳ対照と比較してＰ＜０．０５）及びＭＩＰ−２（ＰＢＳ対照と比較してＰ＜０．０１）の増加した濃度によって例示のように、顆粒球誘因性ケモカイン環境（図６Ｅ）を誘導する。興味深いことに、ｉｖウイルス注射は、ＭＩＧ−  Ｔｈ１細胞を誘引する分子、及びＲＡＮＴＥＳ−  免疫細胞の全スペクトル：ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＤＣ、好塩基球、好酸球、及び単球を動員するケモカイン  −の低下したレベルをもたらした（図６Ｅ）。
【０１４５】
[00184]まとめると、これらの結果が強調することは、静脈内免疫に加えてＦＭＴベースのブーストを腫瘍に直接注射することが、活性化ＣＤ８  Ｔ細胞の増加した浸潤、ＣＤ２０６＋マクロファージの減少した数及び炎症性サイトカインの分泌によって実証されるように、抗腫瘍免疫応答に好ましい腫瘍微小環境内の変化を誘導することである。
【０１４６】
[00185]動物の研究
[00186]全てのＣ５７ＢＩ／６及びＣ５７ＢＩ／６−Ｌｙ５．１マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
【０１４７】
[00187]養子細胞移植（ＡＣＴ）のための細胞産物の生成
[00188]雄性トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６Ｎ−Ｔｇ（Ｔｃｒａ、Ｔｃｒｂ）３２９Ｂｉａｔ（Ｍａｘｉ−ｍ３８）マウスを、Ａｎｅｔｔｅ  Ｏｘｅｎｉｕｓ博士（ＥＴＨ  Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）から厚意で提供されたものである、Ｃ５７ＢＩ／６−Ｌｙ５．１雌性マウスとつがわせてコロニーを確立した。雌性ＯＴ−１マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
【０１４８】
[00189]養子細胞移植（ＡＣＴ）のための細胞産物を生成するために、雌性Ｍａｘｉ−ｍ３８又はＯＴ−１マウスから脾臓を抽出し、脾臓細胞を単離し、１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、５５ｍＭ  ２β−メルカプトエタノール、ＨＥＰＥＳバッファー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）、ペニシリン−ストレプトマイシン、及びＹｏｎｇｈｏｎｇ  Ｗａｎ博士（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、カナダ）から厚意で提供されたセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）濃縮カクテル、を補充したＲＰＭＩ培地で、６〜７日間培養した。
【０１４９】
[00190]ペプチド：ｍ３８又はニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）の免疫優性エピトープを、１μｇ／ｍｌで培養の開始時のみに添加した。密度に応じて、細胞を１回又は２回継代した。ＡＣＴの場合、細胞をピペッティングによって回収し、ＤＰＢＳで２×洗浄し、トリパンブルー染色で血球計算盤を使用してカウントし、ＤＰＢＳに再懸濁した。細胞産物の一部を、ＡＣＴの同じ日又は翌日にフローサイトメトリーによる表現型決定のために確保しておいた。メモリー表現型を、蛍光色素コンジュゲート抗体：ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ１２７−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ２７−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＫＬＲＧ１−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ６０５、ＣＤ６２Ｌ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００及びＣＣＲ７（ＣＤ１９７）−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７８６で染色することにより確認した。Ｆｉｘａｂｌｅ  ｅＦｌｕｏｒ４５０  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、死細胞を除外した。細胞のうち９５％超がＣＤ８＋  Ｔ細胞であり、ＣＤ１２７＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞として定義したＴｃｍ細胞の頻度は４０〜６０％の範囲であった（図７）。
【０１５０】
[00191]未処理のマウスにおけるワクチン接種研究
[00192]７〜１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＩ／６マウスを：
１）両側筋肉内注射によるＤＣＴ（ＡｄＶ−ＤＣＴ）又はｍ３８（ＡｄＶ−ｍ３８）を発現するアデノウイルス（ＡｄＶ）の１×１０８プラーク形成単位（ｐｆｕ）、
２）静脈内（ｉｖ）に用量１×１０５細胞でのｍ３８特異的又はＯＶＡ特異的ＣＤ８メモリーＴ細胞（ＡＣＴ−ｍ３８又はＡＣＴ−ＯＶＡ）の養子細胞移植（ＡＣＴ）或いは
３）アジュバント：抗ＣＤ４０抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）３０〜５０μｇ及びポリｌ：Ｃ  １０〜１００μｇ、を含む１つ又は複数のペプチド（ＢｉｏｍｅｒＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５０μｇによる腹腔内（ｉｐ）、
で０日目にプライムした。
【０１５１】
ｍ３８（ＦＭＴ−ｍ３８）、ＤＣＴ（ＦＭＴ−ＤＣＴ）、ＧＦＰ（ＦＭＴ−ＧＦＰ）、又はＭＣ−３８由来のネオエピトープＡｄｐｇｋ、Ｄｐａｇｋ１、及びＲｅｐｓ１（ＦＭＴ−ＭＣ−３８）を発現するＦＭＴウイルス３×１０８ｐｆｕで、マウスを静脈内に９〜１４日後にブーストした。ｅｘ  ｖｉｖｏペプチド刺激及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイによる抗原特異的Ｔ細胞の定量化のために、ブーストの５〜７日後、場合によってはより後の時点で血液を採取した。一実験では、マウスに、第１のブーストの１２０日後に第２回目にあたってＦＭＴ−ｍ３８ウイルス３×１０８ｐｆｕを与えた。別の実験では、マウスは、第１のブーストの３５日後に第２回目にあたって及び第２のブーストの１２４日後に第３回目にあたって、ＦＭＴ−ＭＣ−３８ウイルス３×１０８ｐｆｕを受けた。
【０１５２】
[00193]脳担癌マウスにおける効力実験
[00194]脳腫瘍の効力研究のために、ハミルトン注射器と定位固定フレームに取り付けられた輸液ポンプを使用して、７〜１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、ブレグマの右側２．５ｍｍ及び前方０．５ｍｍ、深さ３．５ｍｍの位置で、ＣＴ２Ａ−ｍ３８細胞を用いて０日目に頭蓋内（ｉｃ）注射し、無血清ＤＭＥＭ培地で再懸濁した。上で、図３Ａに提示し、実験４に関して論議した実験では、本開示の著者らは、１×１０４細胞を注射し、他の全ての実験では、３×１０３細胞を注射した。マウスを、ＡＤＶ−ｍ３８  １×１０９ｐｆｕで、又はアジュバント：抗ＣＤ４０抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）３０μｇ及びポリＩ：Ｃ  １０μｇを含むｍ３８ペプチド５０μＧで、３日目にプライムした。或いは、マウスを、ＡＣＴ−ＯＶＡ  １×１０６細胞、又はＡＣＴ−ｍ３８を用量：図４Ａに提示の実験で１×１０６細胞（実験５、上で論議）、若しくは用量応答研究を除く他の実験では１×１０５細胞（図４Ｂ；実験６）、を用いて１１日目にプライムした。ＦＭＴ−ｍ３８、ＦＭＴ−ＯＶＡ又はＦＭＴ−ＧＦＰを、深さ２．５ｍｍであるが同じ位置に用量１×１０７ｐｆｕで１２日目にｉｃ若しくは３×１０８ｐｆｕの用量で１４日目にｉｖ、のいずれかに、又は両方に投与した。
【０１５３】
[00195]抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の定量化のために、ｉｃブーストの５日後又はｉｖブーストの７日後（腫瘍移植の１９日後）に血液を採取した。マウスは、立毛、顔面のゆがみ、猫背、呼吸困難又は神経学的症状（頭部後屈、旋回運動、発作）などの症状の発症について毎日モニタリングし、エンドポイントに達した場合、安楽死させた。可視的頭部腫瘍が頻繁に発生したが、死後の解剖に基づいて十分明白なように頭蓋内腫瘍も常に存在した。エンドポイントの原因が疑わしい場合はいつでも、マウスを死後に解剖して、頭蓋内腫瘍の存在について確認した。ｉｖ又はｉｃいずれかのＦＭＴ−ｍ３８注射後、ウイルス関連の急性毒性は観察されなかった。ＦＭＴウイルスによる免疫後、マウスは、頻繁に体重を減少することとなったが、決して１５％を超えず、１週間以内にベースラインの体重に回復したと思われる。
【０１５４】
[00196]ＭＣ−３８担癌マウスにおける効力実験
[00197]８週齢の雌性Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、無血清ＤＭＥＭ培地に再懸濁した１×１０５ＭＣ−３８細胞を０日目に皮下注射した。翌日（１日目）、マウスを、アジュバント：抗ＣＤ４０抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）３０μｇ及びポリＩ：Ｃ１０μｇ、を含むＡｄｐｇｋ及びＲｅｐｓ１ロング変異体ペプチド５０μｇで、アジュバントのみで又はＰＢＳで、プライムした。９日目に腫瘍を測定し、腫瘍サイズが８０〜１３０ｍｍ３のマウスのみを研究に含めた。１０日目に、マウスに、ＦＭＴ−ＭＣ−３８ウイルス３×１０８ｐｆｕ（１ペプチド−プライム群、アジュバント−プライム群及び１ＰＢＳ−プライム群）又はＰＢＳ（１ペプチドプライム群及び１ＰＢＳプライム群）を注射した。マウスがエンドポイント：腫瘍サイズ１０００ｍｍ３超又は出血性潰瘍、に達するまで、腫瘍を翌日及び週に２回測定した。腫瘍体積は式：（長さ×幅×深さ）／２で計算した。ＦＭＴ−ＭＣ−３８注射に続いて、ウイルス関連の急性毒性は観察されなかった。
【０１５５】
[00198]ＰＢＭＣ単離、刺激、及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）アッセイ
[00199]伏在静脈を穿刺することにより、マウスからヘパリン処理採血チューブに血液を採取した。血液量を測定し、ＡＣＫ溶解バッファーでの赤血球溶解のために血液を１５ｍｌコニカルチューブに移した。１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、５５ｍＭ  ２β−メルカプトエタノール、ＨＥＰＥＳバッファー（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）、及びペニシリン−ストレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ培地にＰＢＭＣを再懸濁し、９６ウェル丸底プレートに移した。各試料を、３つのウェル（抗原刺激、ＦＭＴ由来のエピトープ刺激及び非刺激対照）又はＭＣ−３８由来のエピトープでの実験では４つのウェル（各エピトープについて別々に１つ及び非刺激対照）のいずれかに分けた。非刺激対照では、ペプチドストック溶液をＤＭＳＯで作製したので、ＲＰＭＩ中の０．１〜０．４％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を添加した。未処理のマウスからの血液試料を、ペプチド刺激の追加の対照に、染色陰性対照に、並びにＰＭＡ及びイオノマイシン刺激（それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌ）陽性対照に、使用した。ペプチドを、それぞれ、ＯＶＡ、ｍ３８、ＦＭＴ、又はＭＣ−３８のペプチドについて、濃度０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、又は５μｇ／ｍｌで添加した。３７℃、５％ＣＯ２で１時間のインキュベーションに続いて、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を０．２μｌ毎ウェルで各ウェルに添加し、さらに４時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、９６ウェルＶ底プレート（ＥｖｅｒＧｒｅｅｎ）に移し、４℃で一晩保存した。翌日、ＩＣＳアッセイを実施した。簡潔にいえば、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ）で洗浄し、ＣＤ８−ＰＥ、ＴＣＲ−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７１１及びＣＤ４５．１−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５の抗体並びにＦｉｘａｂｌｅ  ｅＦｌｕｏｒ４５０  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ）で固定及び透過処置し、ＩＦＮγ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＴＮＦα−ＰＥ−Ｃｙ７及びＩＬ−２−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ６０５の抗体で染色し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。データを、ＨＴＳユニットを備えたＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、データをＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｉＳｔａｒ）ソフトウェアを使用して解析した。デブリ及びダブレットを、それぞれ、ＦＳＣ対ＳＳＣ、及びＦＳＣ−Ａ対ＦＳＣ−Ｈでゲーティングすることによって除外した。生存細胞は、生存性色素染色に基づいてゲーティングした。次に、ＣＤ８陽性細胞及びＴＣＲ陽性細胞をゲーティングし、この集団内でＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＩＬ−２の発現について調べた。細胞数を以下の式で計算した：
[00200]
【０１５６】
【数１】
2021520793.tif 000004
【０１５７】
[00201]式中、Ｎ−  血液１ｍｌあたりの結果として生じる陽性細胞数、Ｎｓ−  ペプチド含有ウェル中の陽性細胞の数、Ｎｕ−  非刺激対照における陽性細胞の数、Ｖｍ−  動物から採取した総血液量、Ｗ−  数血液試料が分配されたウェルの数、Ｖｆ−  フローサイトメトリーによるデータ取得に使用した試料量のフラクション、すなわち１３０μｌのうち８０μｌ。
【０１５８】
[00202]腫瘍微小環境の特徴づけ
[00203]腫瘍浸潤免疫細胞の表現型決定
[00204]ハミルトン注射器と定位固定フレームに取り付けられた輸液ポンプを使用して、７週齢の雌性Ｃ５７ＢＩ／６マウスを、ブレグマの右側２．５ｍｍ及び前方０．５ｍｍ、深さ３．５ｍｍの位置で、ＣＴ２Ａ−ｍ３８細胞３×１０３を用いて０日目に頭蓋内（ｉｃ）注射し、無血清ＤＭＥＭ培地で再懸濁した。３日目に、マウスを、アジュバント：抗ＣＤ４０抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）３０μｇ及びポリＩ：Ｃ  １０μｇを含むｍ３８ペプチド５０μＧで、又はＰＢＳで、プライムした。９日後、マウスを、深さ２．５ｍｍであるが同じ位置でｉｃに注射したＦＭＴ−ｍ３８  １×１０７ｐｆｕで、ｉｖにＦＭＴ−ｍ３８  ３×１０８ｐｆｕ、又はｉｃにＰＢＳで、のいずれかでブーストした。ブーストの６日後に、血液を採取して、末梢血中のｍ３８特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の存在について確認し、その後、マウスを安楽死させ、腫瘍組織を採取した。腫瘍組織をＮｅｕｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で解離し、細胞をパーコール勾配法で精製した。次いで細胞を４℃で一晩保持した。翌日、細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、蛍光色素コンジュゲート抗体：ＣＤ１１ｂ−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ４２１、ＣＤ４−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ５１０、ＣＤ８６−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ６０５、ＣＤ３−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ６５０、Ｆ４／８０−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７１１、ＣＤ１３７−ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ７８５、ＣＤ８−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＮＫｐ４６−ＰＥ、ＣＤ２０６−ＰＥ−Ｃｙ７で及びｍ３８−ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＡＰＣで、染色した。Ｆｉｘａｂｌｅ  ｎｅａｒ−ＩＲ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、死細胞を除外した。ＢＳ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｉＳｔａｒ）ソフトウェアで解析した。
【０１５９】
[00205]統計学
[00206]カプランマイヤー生存曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄバージョン５．０ｆ（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアで作成し、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用して比較した。０．０５未満のＰ値を有意とした。免疫細胞の頻度と数、サイトカインとケモカインの濃度は、図の説明文に示した統計的検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄバージョン５．０ｆ（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアで処置群にわたって比較した。０．０５未満のＰ値を有意とした。
【０１６０】
[00207]先行の記載では、説明の目的のために、多数の詳細が、本例の完全な理解を可能とするべく記載されている。しかし、これらの特定の詳細が必要とされないことは当業者であれば明らかであろう。したがって記載してきた事項は、記載した例の適用に関する単なる例示であり、上記の教示に照らして、多数の改変及び変形が可能である。
【０１６１】
[00208]上の記載は例を提供しているため、当業者であれば、特定の例に対して改変及び変形をなし得ることが理解されよう。したがって、特許請求の範囲は、本明細書に記載の特定の例によって限定されるべきではなく、全体として明細書と矛盾しない様式で解釈されるべきである。
【図１Ａ】
2021520793.tif 000005
【図１Ｂ】
2021520793.tif 000006
【図１Ｃ】
2021520793.tif 000007
【図１Ｄ】
2021520793.tif 000008
【図１Ｅ】
2021520793.tif 000009
【図２Ａ】
2021520793.tif 000010
【図２Ｂ】
2021520793.tif 000011
【図２Ｃ】
2021520793.tif 000012
【図２Ｄ】
2021520793.tif 000013
【図２Ｅ】
2021520793.tif 000014
【図２Ｆ】
2021520793.tif 000015
【図２Ｇ】
2021520793.tif 000016
【図２Ｈ】
2021520793.tif 000017
【図２Ｉ】
2021520793.tif 000018
【図３Ａ】
2021520793.tif 000019
【図３Ｂ】
2021520793.tif 000020
【図３Ｃ】
2021520793.tif 000021
【図３Ｄ】
2021520793.tif 000022
【図４Ａ】
2021520793.tif 000023
【図４Ｂ】
2021520793.tif 000024
【図４Ｃ】
2021520793.tif 000025
【図５Ａ】
2021520793.tif 000026
【図５Ｂ】
2021520793.tif 000027
【図５Ｃ】
2021520793.tif 000028
【図５Ｄ】
2021520793.tif 000029
【図５Ｅ】
2021520793.tif 000030
【図６Ａ】
2021520793.tif 000031
【図６Ｂ】
2021520793.tif 000032
【図６Ｃ】
2021520793.tif 000033
【図６Ｄ】
2021520793.tif 000034
【図６Ｅ】
2021520793.tif 000035
【図７Ａ】
2021520793.tif 000036
【図７Ｂ】
2021520793.tif 000037
【図７Ｃ】
2021520793.tif 000038
【図８】
2021520793.tif 000039
【図９Ａ】
2021520793.tif 000040
【図９Ｂ】
2021520793.tif 000041
【図１０】
2021520793.tif 000042
【図１１Ａ】
2021520793.tif 000043
【図１１Ｂ】
2021520793.tif 000044
【図１１Ｃ】
2021520793.tif 000045
【図１１Ｄ】
2021520793.tif 000046
【配列表】
2021520793000001.app
【国際調査報告】
2021520793.tif 000047
2021520793.tif 000048
2021520793.tif 000049
2021520793.tif 000050
2021520793.tif 000051