(57)【要約】ヘテロクリティック突然変異を含む腫瘍関連抗原ペプチドおよびそのようなペプチドを含む融合ポリペプチドが本明細書で提供される。そのようなペプチドおよび融合ポリペプチドをコードする核酸、そのようなペプチド、融合ポリペプチドまたは核酸を含む組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、ならびにそのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むセルバンクもまた提供される。そのようなペプチド等を生成する方法もまた本明細書で提供される。そのようなペプチド等を含む免疫原性組成物、医薬組成物およびワクチンもまた提供される。そのようなペプチド等を使用して、対象における抗腫瘍関連抗原免疫応答を誘導する方法、対象における抗腫瘍または抗がん免疫応答を誘導する方法、対象における腫瘍またはがんを処置する方法、対象における腫瘍またはがんを予防する方法、および腫瘍またはがんから対象を保護する方法もまた提供される。
2021502083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん関連タンパク質の免疫原性断片を含む単離されたペプチドであって、前記断片が、ヘテロクリティック突然変異を含む、単離されたペプチド。
【請求項２】
前記ヘテロクリティック突然変異が、アンカー位置における好ましいアミノ酸への突然変異である、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記断片が、長さ約７アミノ酸〜約１１アミノ酸の間、長さ約８アミノ酸〜約１０アミノ酸の間、または長さ約９アミノ酸である、請求項１または２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
前記がん関連タンパク質が、がん精巣抗原または癌胎児性抗原である、前記いずれかの請求項に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
前記がん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＴＥＲＴ、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＮＵＦ２、ＮＹＥＳＯ１、ＰＡＧＥ４、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＳＳＸ２、ＳＴＥＡＰ１およびＳＵＲＶＩＶＩＮのうち１つによってコードされる、前記いずれかの請求項に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
（ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記断片が、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つを含む；
（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１１０および１１２のいずれか１つを含む；
（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記断片が、配列番号１１４を含む；
（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記断片が、配列番号１１６を含む；
（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つを含む；
（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１２６を含む；
（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記断片が、配列番号１２８を含む；
（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１３０および１３２のいずれか１つを含む；
（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１３４および１３６のいずれか１つを含む；
（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１３８を含む；
（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記断片が、配列番号１４０を含む；
（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４２を含む；
（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４４を含む；
（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４６を含む；
（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４８を含む；
（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１５０を含む；
（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１５２および１５４のいずれか１つを含む；または
（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記断片が、配列番号１５６および１５８のいずれか１つを含む、
請求項５に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
（ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記断片が、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つからなる；
（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１１０および１１２のいずれか１つからなる；
（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記断片が、配列番号１１４からなる；
（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記断片が、配列番号１１６からなる；
（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つからなる；
（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１２６からなる；
（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記断片が、配列番号１２８からなる；
（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１３０および１３２のいずれか１つからなる；
（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１３４および１３６のいずれか１つからなる；
（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１３８からなる；
（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記断片が、配列番号１４０からなる；
（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４２からなる；
（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４４からなる；
（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４６からなる；
（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４８からなる；
（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１５０からなる；
（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１５２および１５４のいずれか１つからなる；または
（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記断片が、配列番号１５６および１５８のいずれか１つからなる、
請求項６に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
（ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つからなる；
（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１１０および１１２のいずれか１つからなる；
（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１１４からなる；
（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１１６からなる；
（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つからなる；
（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１２６からなる；
（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１２８からなる；
（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１３０および１３２のいずれか１つからなる；
（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１３４および１３６のいずれか１つからなる；
（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１３８からなる；
（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４０からなる；
（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４２からなる；
（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４４からなる；
（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４６からなる；
（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４８からなる；
（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１５０からなる；
（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１５２および１５４のいずれか１つからなる；または
（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１５６および１５８のいずれか１つからなる、
請求項７に記載の単離されたペプチド。
【請求項９】
前記断片が、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数に結合する、前記いずれかの請求項に記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
前記いずれかの請求項に記載の単離されたペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１３】
ＤＮＡを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１４】
ＲＮＡを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１５】
配列番号２２３〜９７７、および同じアミノ酸配列をコードするそれらの縮重バリアントのいずれか１つから選択される配列を含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１６】
配列番号２２３〜９７７、および同じアミノ酸配列をコードするそれらの縮重バリアントのいずれか１つから選択される配列からなる、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の単離されたペプチドまたは請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の核酸；および
（ｂ）アジュバント
を含む医薬組成物。
【請求項１８】
前記アジュバントが、無毒化リステリオリジンＯ（ｄｔＬＬＯ）、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドまたはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２の各々に結合するペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸を含む、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
（ａ）表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｂ）表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｃ）表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｄ）表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｅ）表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｆ）表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｇ）表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｈ）表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｉ）表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；あるいは
（ｊ）表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸
を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
（ａ）表３に記載のペプチドの全て、もしくは表３に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｂ）表５に記載のペプチドの全て、もしくは表５に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｃ）表７に記載のペプチドの全て、もしくは表７に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｄ）表９に記載のペプチドの全て、もしくは表９に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｅ）表１１に記載のペプチドの全て、もしくは表１１に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｆ）表１３に記載のペプチドの全て、もしくは表１３に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｇ）表１５に記載のペプチドの全て、もしくは表１５に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｈ）表１７に記載のペプチドの全て、もしくは表１７に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｉ）表１９に記載のペプチドの全て、もしくは表１９に記載のペプチドの全てをコードする核酸；または
（ｊ）表２１に記載のペプチドの全て、もしくは表２１に記載のペプチドの全てをコードする核酸
を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜９に記載の単離されたペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む組換え細菌株。
【請求項２３】
請求項１〜９に記載の単離されたペプチドのうち２つまたはそれより多くをコードする１つまたは複数の核酸を含む組換え細菌株。
【請求項２４】
前記２つまたはそれより多くのペプチドが、
（ａ）表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｂ）表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｃ）表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｄ）表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｅ）表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｆ）表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｇ）表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｈ）表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；
（ｉ）表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；あるいは
（ｊ）表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸
を含む、請求項２３に記載の組換え細菌株。
【請求項２５】
前記２つまたはそれより多くのペプチドが、
（ａ）表３に記載のペプチドの全て、もしくは表３に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｂ）表５に記載のペプチドの全て、もしくは表５に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｃ）表７に記載のペプチドの全て、もしくは表７に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｄ）表９に記載のペプチドの全て、もしくは表９に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｅ）表１１に記載のペプチドの全て、もしくは表１１に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｆ）表１３に記載のペプチドの全て、もしくは表１３に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｇ）表１５に記載のペプチドの全て、もしくは表１５に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｈ）表１７に記載のペプチドの全て、もしくは表１７に記載のペプチドの全てをコードする核酸；
（ｉ）表１９に記載のペプチドの全て、もしくは表１９に記載のペプチドの全てをコードする核酸；または
（ｊ）表２１に記載のペプチドの全て、もしくは表２１に記載のペプチドの全てをコードする核酸
を含む、請求項２４に記載の組換え細菌株。
【請求項２６】
２つまたはそれより多くのペプチドの組合せが、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２の各々に結合する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組換え細菌株。
【請求項２７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、ＳｈｉｇｅｌｌａまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組換え細菌株。
【請求項２８】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ株であり、必要に応じて、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、請求項２７に記載の組換え細菌株。
【請求項２９】
融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記融合ポリペプチドが、がん関連タンパク質の免疫原性断片に融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、前記断片が、ヘテロクリティック突然変異を含む、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３０】
前記ヘテロクリティック突然変異が、アンカー位置における好ましいアミノ酸への突然変異である、請求項２９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３１】
前記断片が、長さ約７アミノ酸〜約１１アミノ酸の間、長さ約８アミノ酸〜約１０アミノ酸の間、または長さ約９アミノ酸である、請求項２９または３０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３２】
前記がん関連タンパク質が、がん精巣抗原または癌胎児性抗原である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３３】
前記がん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＴＥＲＴ、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＮＵＦ２、ＮＹＥＳＯ１、ＰＡＧＥ４、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＳＳＸ２、ＳＴＥＡＰ１およびＳＵＲＶＩＶＩＮのうち１つによってコードされる、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３４】
（ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記断片が、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つを含む；
（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１１０および１１２のいずれか１つを含む；
（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記断片が、配列番号１１４を含む；
（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記断片が、配列番号１１６を含む；
（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つを含む；
（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１２６を含む；
（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記断片が、配列番号１２８を含む；
（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１３０および１３２のいずれか１つを含む；
（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１３４および１３６のいずれか１つを含む；
（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１３８を含む；
（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記断片が、配列番号１４０を含む；
（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４２を含む；
（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４４を含む；
（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４６を含む；
（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４８を含む；
（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１５０を含む；
（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１５２および１５４のいずれか１つを含む；または
（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記断片が、配列番号１５６および１５８のいずれか１つを含む、
請求項３３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３５】
（ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記断片が、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つからなる；
（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１１０および１１２のいずれか１つからなる；
（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記断片が、配列番号１１４からなる；
（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記断片が、配列番号１１６からなる；
（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つからなる；
（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１２６からなる；
（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記断片が、配列番号１２８からなる；
（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１３０および１３２のいずれか１つからなる；
（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１３４および１３６のいずれか１つからなる；
（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１３８からなる；
（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記断片が、配列番号１４０からなる；
（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４２からなる；
（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４４からなる；
（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４６からなる；
（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４８からなる；
（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１５０からなる；
（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１５２および１５４のいずれか１つからなる；または
（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記断片が、配列番号１５６および１５８のいずれか１つからなる、
請求項３４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３６】
前記断片が、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数に結合する、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３７】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、細菌分泌シグナル配列を含み、前記融合ポリペプチドが、前記断片に融合されたユビキチンタンパク質をさらに含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチド、前記ユビキチンおよびカルボキシ末端抗原性ペプチドが、前記融合ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へ直列に配列されている、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３８】
前記融合ポリペプチドが、がん関連タンパク質の２つまたはそれより多くの免疫原性断片に融合された前記ＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、前記２つまたはそれより多くの断片の各々が、ヘテロクリティック突然変異を含む、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３９】
前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片が、介在配列なしで互いに直接融合されている、請求項３８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４０】
前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片が、ペプチドリンカーを介して互いに連結されている、請求項３８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４１】
配列番号２０９〜２１７に記載のリンカーのうち１つまたは複数が、前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片を連結させるために使用されている、請求項４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４２】
前記融合ポリペプチド中の２つまたはそれより多くの免疫原性断片の組合せが、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２の各々に結合する、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４３】
前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片が、
（ａ）表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；
（ｂ）表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；
（ｃ）表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；
（ｄ）表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；
（ｅ）表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；
（ｆ）表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；
（ｇ）表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；
（ｈ）表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；
（ｉ）表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；または
（ｊ）表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く
を含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４４】
前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片が、
（ａ）表３に記載のペプチドの全て；
（ｂ）表５に記載のペプチドの全て；
（ｃ）表７に記載のペプチドの全て；
（ｄ）表９に記載のペプチドの全て；
（ｅ）表１１に記載のペプチドの全て；
（ｆ）表１３に記載のペプチドの全て；
（ｇ）表１５に記載のペプチドの全て；
（ｈ）表１７に記載のペプチドの全て；
（ｉ）表１９に記載のペプチドの全て；または
（ｊ）表２１に記載のペプチドの全て
を含む、請求項４３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４５】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、前記融合ポリペプチドのＮ末端にある、請求項２９〜４４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４６】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、請求項４５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４７】
ＬＬＯの前記Ｎ末端断片が、配列番号５９に記載の配列を有する、請求項４６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４８】
前記核酸が、エピソームプラスミドにある、請求項２９〜４７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４９】
前記核酸が、前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に抗生物質耐性を付与しない、請求項２９〜４８のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５０】
弱毒化栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、請求項２９〜４９のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５１】
前記弱毒化栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、１つまたは複数の内在性遺伝子を不活性化する、前記１つまたは複数の内在性遺伝子中の突然変異を含む、請求項５０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５２】
前記１つまたは複数の内在性遺伝子が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔを含む、請求項５１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５３】
前記核酸が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、請求項２９〜５２のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５４】
前記代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素である、請求項５３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５５】
前記融合ポリペプチドが、ｈｌｙプロモーターから発現される、請求項２９〜５４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５６】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、請求項２９〜５５のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５７】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔの欠失またはａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、請求項２９〜５６のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５８】
（ａ）請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の組換え細菌株または請求項２９〜５７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株；および
（ｂ）アジュバント
を含む免疫原性組成物。
【請求項５９】
前記アジュバントが、無毒化リステリオリジンＯ（ｄｔＬＬＯ）、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡまたは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項５８に記載の免疫原性組成物。
【請求項６０】
対象における腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の核酸、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の組換え細菌株、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または請求項５８〜５９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項６１】
対象における腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の核酸、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の組換え細菌株、請求項２９〜５７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または請求項５８〜５９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項６２】
前記がんが、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がんまたは頭頸部がんである、請求項６０または６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年１１月８日に出願された米国出願番号第６２／５８３，２９２号および２０１７年１１月３０日に出願された米国出願番号第６２／５９２，８８４号の利益を主張するものであり、その各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳウェブ経由でテキストファイルとして提出した配列表の参照
ファイル５２２５９８ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載の配列表は、３３３キロバイトであり、２０１８年１１月３日に作成したものであり、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
腫瘍発生には、制御されない成長、死に対する耐性、遊走し遠位部位において成長する可能性、および新たな血管の成長を誘導する能力を含む、重要な能力のセットの獲得が関与する。これらの特徴の根底にあるのは、それらの獲得を加速する遺伝的変異を生じるゲノム不安定性である。がん精巣抗原などの腫瘍関連抗原は、これらの能力のうちいくつかをがん細胞に付与し、このことは、それらが腫瘍発生に直接関連することを示唆し、それらを免疫療法のための潜在的な標的にしている。しかし、Ｔ細胞寛容、ＭＨＣまたはＴＣＲに対する自己抗原の低い親和性、および腫瘍の免疫抑制性環境を含む多くの因子が、がん患者を処置するために使用されるペプチドワクチンに応答した腫瘍特異的Ｔ細胞の拡大がわずかであることに寄与し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
要旨
がん免疫療法のための方法および組成物が提供される。一態様では、がん関連タンパク質の免疫原性断片を含む単離されたペプチドであって、断片が、ヘテロクリティック突然変異を含む、単離されたペプチドが、本明細書で提供される。別の態様では、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、融合ポリペプチドが、がん関連タンパク質の１つまたは複数の免疫原性断片に融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、断片が、ヘテロクリティック突然変異を含む、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が提供される。そのような融合ポリペプチド、ならびにそのような単離されたペプチドおよび融合ポリペプチドをコードする核酸もまた提供される。そのような核酸を含む組換え細菌株もまた提供される。
【０００５】
別の態様では、そのような単離されたペプチド、核酸、融合ポリペプチド、組換え細菌株または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンが、本明細書で提供される。
【０００６】
別の態様では、対象における腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、そのような単離されたペプチド、核酸、融合ポリペプチド、組換え細菌株または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。対象における腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、そのような単離されたペプチド、核酸、融合ポリペプチド、組換え細菌株または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む方法もまた、提供される。
【０００７】
別の態様では、対象における腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、そのような単離されたペプチド、核酸、融合ポリペプチド、組換え細菌株または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。対象における腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、そのような単離されたペプチド、核酸、融合ポリペプチド、組換え細菌株または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む方法もまた、提供される。
【０００８】
別の態様では、そのような組換え細菌または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株のうち１つまたは複数を含むセルバンクが、本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＷＴ１ミニ遺伝子構築物の概略図を示す。図１Ａは、単一のＷＴ１キメラポリペプチド抗原を発現するように設計されたＷＴ１ミニ遺伝子構築物を示す。図１Ｂは、３つの別々のＷＴ１キメラポリペプチド抗原を発現するように設計されたＷＴ１ミニ遺伝子構築物を示す。
【００１０】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニンミニ遺伝子構築物（図２Ａ）およびＬｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物（図２Ｂ）のウエスタンブロットを示す。図２Ａでは、レーン１はラダーであり、レーン２はＬｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物（６８ｋＤａ）であり、レーン３は陰性対照である。図２Ｂでは、レーン１はラダーであり、レーン２は陰性対照であり、レーン３はＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニンミニ遺伝子構築物（構築物番号１）である。
【００１１】
【図３】図３は、ヘテロクリティック突然変異体ＷＴ１ペプチドを発現するいくつかのＬｍ−ミニ遺伝子構築物についてのコロニーＰＣＲ結果を示す。突然変異された残基は、太字かつ下線で示す。
【００１２】
【図４】図４は、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１９７）およびＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１６０）でｅｘ  ｖｉｖｏ刺激した脾細胞におけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。脾細胞は、ＷＴ１−Ｆミニ遺伝子構築物で免疫化したＨＬＡ２トランスジェニックマウス由来である。ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【００１３】
【図５】図５は、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１９７）およびＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１６９）でｅｘ  ｖｉｖｏ刺激した脾細胞におけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示す。脾細胞は、ＷＴ１−ＡＨ１−Ｔｙｒミニ遺伝子構築物で免疫化したＨＬＡ２トランスジェニックマウス由来である。ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【００１４】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１９７；図６Ａ）およびＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１６０；図６Ｂ）でｅｘ  ｖｉｖｏ刺激した脾細胞１００万個当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示す。脾細胞は、ＷＴ１−Ｆミニ遺伝子構築物で免疫化したＨＬＡ２トランスジェニックマウス由来である。ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【００１５】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１９７；図７Ａ）およびＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１６９；図７Ｂ）でｅｘ  ｖｉｖｏ刺激した脾細胞１００万個当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示す。脾細胞は、ＷＴ１−ＡＨ１−Ｔｙｒミニ遺伝子構築物で免疫化したＨＬＡ２トランスジェニックマウス由来である。ＰＢＳおよびＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【００１６】
【図８】図８は、ＰＢＳ対照またはＬｍ  ＡＨ１＿ＨＣで処置したマウスにおけるＣＴ２６腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書において同じ意味で使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、ならびに化学的にまたは生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を指す。これらの用語は、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、修飾されたポリマーを含む。
【００１８】
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われる。用語「Ｎ末端」は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端に有する、タンパク質またはポリペプチドの始点に関する。用語「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を末端に有するアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終点に関する。
【００１９】
用語「融合タンパク質」は、ペプチド結合または他の化学結合により互いに連結されている２つまたはそれより多くのペプチドを含むタンパク質を指す。ペプチドは、ペプチドまたは他の化学結合により互いに直接連結されていることもある。例えば、キメラ分子は、単鎖融合タンパク質として組換え発現され得る。あるいは、ペプチドは、２つまたはそれより多くのペプチド間で「リンカー」例えば、１つもしくは複数のアミノ酸または別の好適なリンカーにより互いに連結されていることもある。
【００２０】
本明細書において同じ意味で使用される用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらのアナログもしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。それらは、一本鎖、二本鎖および多鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
【００２１】
核酸は、モノヌクレオチドが、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸エステルがその隣の３’酸素にホスホジエステル連結によって一方向に結合するような方式で反応してオリゴヌクレオチドを生成するため、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われる。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸エステルがモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸エステルに連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きいオリゴヌクレオチドの内部にあったとしても、５’および３’末端を有すると言われることもある。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のどちらかにおいて、別個のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’にあると言われる。
【００２２】
「コドン最適化」は、特定の宿主細胞における発現増強のために、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつネイティブ配列の少なくとも１つのコドンを宿主細胞の遺伝子においてより使用頻度が高いまたは最も使用頻度が高いコドンで置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。例えば、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、所与のＬｉｓｔｅｒｉａ細胞または任意の他の宿主細胞において天然に存在する核酸配列と比較してより高い使用頻度を有するコドンで置換するように、修飾することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で、容易に入手可能である。各アミノ酸についてのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより利用される最適なコドンは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／０２０７１７０に示されている。これらの表を多数の方法で適応させることができる。その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のために特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも、入手可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
【００２３】
用語「プラスミド」または「ベクター」は、細菌送達ベクター、ウイルスベクター送達ベクター、ペプチド免疫療法用送達ベクター、ＤＮＡ免疫療法用送達ベクター、エピソームプラスミド、組込型プラスミド、またはファージベクターを含む、任意の公知送達ベクターを含む。用語「ベクター」は、１つまたは複数の融合ポリペプチドを、宿主細胞内に送達することおよび必要に応じて宿主細胞に発現させることができる、構築物を意味する。
【００２４】
用語「エピソームプラスミド」または「染色体外プラスミド」は、染色体ＤＮＡから物理的に離れている核酸ベクター（すなわち、エピソームのものであるかまたは染色体外のものであり、宿主細胞のゲノムに組み込まれていない）であって、染色体ＤＮＡから独立して複製する核酸ベクターを指す。プラスミドは、直鎖状であることもあり、または環状であることもあり、一本鎖であることもあり、または二本鎖であることもある。エピソームプラスミドは、必要に応じて、宿主細胞（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の細胞質において複数のコピーで存続することができ、その結果、エピソームプラスミド内で目的の任意の遺伝子の増幅が生じることになる。
【００２５】
用語「ゲノムに組み込まれる」は、細胞内に導入された核酸配列であって、その導入の結果、細胞のゲノムに組み込まれ、その後代に遺伝され得る、核酸配列を指す。任意のプロトコールを細胞のゲノムへの核酸の安定した組込みに使用することができる。
【００２６】
用語「安定的に維持される」は、選択（例えば、抗生物質選択）の非存在下で検出可能な損失なしに少なくとも１０世代にわたって核酸分子またはプラスミドが維持されることを指す。例えば、この期間は、少なくとも１５世代、２０世代、少なくとも２５世代、少なくとも３０世代、少なくとも４０世代、少なくとも５０世代、少なくとも６０世代、少なくとも８０世代、少なくとも１００世代、少なくとも１５０世代、少なくとも２００世代、少なくとも３００世代、または少なくとも５００世代であり得る。「安定的に維持される」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、培養で）細胞内に安定的に維持されている、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定的に維持されている、または両方の、核酸分子またはプラスミドを指すことができる。
【００２７】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、タンパク質をコードする可能性があり得る塩基の配列を含有するＤＮＡの部分である。例えば、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード（ｓｔａｒｔ−ｃｏｄｅ）配列（開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）コドン）と停止コドン配列（終結コドン）の間に位置することができる。
【００２８】
「プロモーター」は、特定のポリヌクレオチド配列の適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを通常は含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含むこともある。本明細書で開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書で開示される細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯動物細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化した細胞、またはこれらの組合せ）の１つまたは複数において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的活性プロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時期特異的プロモーター（例えば、発生調節プロモーター）、または領域特異的プロモーター（例えば、細胞特異的もしくは組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２において見つけることができる。
【００２９】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結される」は、２つまたはそれより多くの成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）についての、両方の成分が正常に機能するような、およびそれらの成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができる可能性を許容するような、並置を指す。例えば、プロモーターが１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、互いに連続しているまたはトランスで作用するそのような配列を含み得る（例えば、調節配列は、少し離れてコード配列の転写を制御するように作用することができる）。
【００３０】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して「配列同一性」または「同一性」は、指定比較ウインドウにわたって最大に一致するようにアラインメントされたときに同じである、２配列中の残基に言及するものである。配列同一性パーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって、分子の機能特性を変化させない、保存的アミノ酸置換によって異なることが多いと認識される。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを上方修正して置換の保存的性質を補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この修正を行う手段は、当業者に周知である。典型的に、これは、保存的置換を完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとしてスコア化することによって配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の実装に従って、算出される。
【００３１】
「配列同一性パーセンテージ」は、比較ウインドウにわたって最適にアラインメントされた２配列（完全マッチ残基の最大数）を比較することによって決定される値であって、前記比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部分は、前記２配列の最適アラインメントのための参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る値を指す。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を判定してマッチ位置の数を得、このマッチ位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性パーセンテージを得ることによって算出される。別段の明記（例えば、短い方の配列が、連結されている異種配列を含む）がない限り、比較ウインドウは、比較される２配列の短い方の完全長である。
【００３２】
別段の記述がない限り、配列同一性／類似性値は、次のパラメーターを使用してＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用して得られる値を指す：ギャップの重み５０と、長さの重み３と、ｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア行列とを使用する、ヌクレオチド配列についての同一性％および類似性％；ギャップの重み８と、長さの重み２と、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列とを使用する、アミノ酸配列についての同一性％および類似性％；またはこれらと等価の任意のプログラム。「等価のプログラム」は、問題の任意の２配列について、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０により生成される対応するアラインメントと比較したときに同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを含む。
【００３３】
用語「保存的アミノ酸置換」は、類似のサイズ、電荷または極性の別のアミノ酸での配列内に通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例としては、非極性（疎水性）残基、例えばイソロイシン、バリンまたはロイシンでの、別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、ある極性（親水性）残基での別の残基の置換、例えば、アルギニンとリシン間の、グルタミンとアスパラギン間の、またはグリシンとセリン間の置換が挙げられる。加えて、塩基性残基、例えばリシン、アルギニンもしくはヒスチジンでの、別の残基の置換、またはある酸性残基、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の、別の酸性残基での置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニンもしくはメチオニンでの、極性（親水性）残基、例えばシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンの置換、および／または極性残基での非極性残基の置換が挙げられる。典型的なアミノ酸分類が下記に要約される。
【表Ａ】
2021502083.tif 000003
【００３４】
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、それが、例えば、公知参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、公知参照配列と同一であるかまたはかなり類似している配列を指す。
【００３５】
用語「野生型」は、正常な状態または状況（突然変異による、罹患した、変更されたなどの、状態または状況とは対照的に）で見られるような、構造および／または活性を有する実体を指す。野生型遺伝子およびポリペプチドは、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在することが多い。
【００３６】
タンパク質および核酸に関する用語「単離される」は、通常はｉｎ  ｓｉｔｕに存在し得る他の細菌、ウイルスまたは細胞成分に関して比較的精製されているタンパク質および核酸を指し、それらは、タンパク質およびポリヌクレオチドの実質的に純粋な調製物までのものであり、これらを含む。用語「単離される」は、天然に存在しない対応物を有さない、化学合成されたため他のタンパク質もしくは核酸により実質的に夾雑されていない、またはそれらに天然に付随する大部分の他の細胞成分（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチドもしくは細胞成分）から分離もしくは精製されているタンパク質および核酸も含む。
【００３７】
「外来性（の）」または「異種（の）」分子または配列は、細胞に通常は発現されない、または細胞内にその形態で通常は存在しない、分子または配列である。通常の存在は、細胞の特定の発生期および環境条件に関しての存在を含む。例えば、外来性または異種分子または配列は、細胞内の対応する内在性配列の突然変異バージョンを含むこともあり、または細胞内の、しかし異なる形態での（すなわち、染色体内にない）、内在性配列に対応する配列を含むこともある。特定の細胞内の外来性または異種分子または配列は、その細胞の参照種とは異なる種に由来するかまたは同じ種内の異なる生物に由来する分子または配列も含み得る。例えば、異種ポリペプチドを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、異種ポリペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株にとってネイティブでも内在性でもないポリペプチド、すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株により通常は発現されないポリペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株以外の供給源からのポリペプチド、同じ種内の異なる生物に由来するポリペプチドであり得る。
【００３８】
対照的に、「内在性」分子もしくは配列または「ネイティブ」分子もしくは配列は、特定の環境条件下で特定の発達期の特定の細胞にその形態で通常は存在する分子または配列である。
【００３９】
用語「バリアント」は、集団の大部分と異なるが、それでもなお、それらのうちの１つ（例えば、スプライスバリアント）と見なされるのに十分なほど共通様式に類似している、アミノ酸または核酸配列（または生物もしくは組織）を指す。
【００４０】
用語「アイソフォーム」は、別のアイソフォーム、またはバージョン（例えば、同じタンパク質の）と比較してわずかにしか異ならない分子（タンパク質）のバージョンを指す。例えば、タンパク質アイソフォームは、関連しているが異なる遺伝子から産生されることがあり、同じ遺伝子から選択的スプライシングにより生じることがあり、または一塩基多型から生じることがある。
【００４１】
タンパク質に言及するときの用語「断片」は、完全長タンパク質より短いタンパク質、または完全長タンパク質より少数のアミノ酸を有するタンパク質を意味する。核酸に言及するときの用語「断片」は、完全長核酸より短い核酸、または完全長核酸より少数のヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端部分の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端部分の除去）、または内部断片であり得る。断片はまた、例えば、機能性断片または免疫原性断片であり得る。
【００４２】
タンパク質に言及するときの用語「アナログ」は、保存的アミノ酸の相違により、アミノ酸配列に影響を与えない修飾により、または両方により、天然に存在するタンパク質と異なるタンパク質を意味する。
【００４３】
用語「機能性の」は、タンパク質または核酸（またはその断片、アイソフォームもしくはバリアント）の生物活性または生物学的機能を示す生来の能力を指す。そのような生物活性または生物学的機能は、例えば、対象に投与されたときに免疫応答を惹起する能力を含み得る。そのような生物活性または生物学的機能は、例えば、相互作用パートナーとの結合も含み得る。機能性断片、アイソフォームまたはバリアントの場合、これらの生物学的機能は、実際には、基本的な生物学的機能を保持しつつだが変化し得る（例えば、それらの特異性または選択性に関して）。
【００４４】
用語「免疫原性」または「免疫原性の」は、対象に投与されたとき対象において免疫応答を惹起する分子（例えば、タンパク質、核酸、抗原または生物）の生来の能力を指す。免疫原性は、例えば、分子に対する抗体のより多い数、分子に対する抗体のより高い密度、分子に特異的なＴ細胞のより多い数、分子に対するより大きい細胞傷害性またはヘルパーＴ細胞応答などによって、測定され得る。
【００４５】
用語「抗原」は、本明細書では、対象または生物と接触させたとき（例えば、対象もしく生物に存在するとき、または対象もしく生物により検出されたとき）に対象または生物からの検出可能な免疫応答を生じさせる結果となる物質を指すために使用される。抗原は、例えば、脂質、タンパク質、炭水化物、核酸、またはこれらの組合せおよび変形形態であり得る。例えば、「抗原ペプチド」は、対象もしく生物に存在するとき、または対象もしく生物により検出されたとき、対象または生物における免疫応答の増大をもたらすペプチドを指す。例えば、そのような「抗原ペプチド」は、宿主細胞の表面のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上にロードおよび提示され、宿主の免疫細胞により認識または検出され得るタンパク質であって、認識または検出されることによってそのタンパク質に対する免疫応答の増大をもたらすタンパク質を包含し得る。そのような免疫応答は、同じタンパク質を発現する罹患細胞（例えば、腫瘍またはがん細胞）などの、宿主内の他の細胞にまで及ぶこともある。
【００４６】
用語「エピトープ」は、免疫系により認識される抗原上の部位（例えば、抗体が結合する部位）を指す。エピトープは、連続するアミノ酸から形成されることもあり、または１つもしくは複数のタンパク質の三次フォールディングにより並置された非連続アミノ酸から形成されることもある。連続するアミノ酸から形成されるエピトープ（直線状エピトープとしても公知）は、変性溶媒に曝露されても通常は保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープ（立体構造エピトープとしても公知）は、変性溶媒で処置されると通常は失われる。エピトープは、概して少なくとも３個、より通常は少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を特有の空間的立体構造で含む。エピトープの空間的立体構造を判定する方法は、例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴を含む。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。
【００４７】
用語「突然変異」は、遺伝子またはタンパク質の構造のあらゆる変化を指す。例えば、突然変異は、染色体またはタンパク質の欠失、挿入、置換または再配列の結果として生じ得る。「挿入」は、１つまたは複数の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を加えることにより、遺伝子中のヌクレオチドの数またはタンパク質中のアミノ酸の数を変化させる。「欠失」は、１つまたは複数の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を低減させることにより、遺伝子中のヌクレオチドの数またはタンパク質中のアミノ酸の数を変化させる。
【００４８】
ＤＮＡの「フレームシフト」突然変異は、ヌクレオチドの追加または喪失が遺伝子のリーディングフレームを変化させたときに起こる。リーディングフレームは、各塩基がアミノ酸１個をコードする塩基３個の群からなる。フレームシフト突然変異は、これらの塩基の群化をシフトさせ、アミノ酸のコードを変化させる。結果として生じるタンパク質は、通常は非機能性である。挿入および欠失は、各々、フレームシフト突然変異である。
【００４９】
「ミスセンス」突然変異または置換は、コードされているアミノ酸の変化を生じさせる結果となる、タンパク質の１個のアミノ酸の変化または単一ヌクレオチドの点突然変異を指す。１個のアミノ酸の変化を生じさせる結果となる、単一ヌクレオチドの点突然変異は、ＤＮＡ配列における「非同義」置換である。非同義置換は、コドンを未成熟停止コドンに変化させ、その結果、得られるタンパク質が短縮されることになる、「ナンセンス」突然変異を生じさせる結果となることもある。対照的に、ＤＮＡの「同義」突然変異は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない（コドン縮重に起因する）ものである。
【００５０】
用語「体細胞突然変異」は、生殖細胞（例えば、精子または卵子）以外の細胞により獲得される遺伝的変更を含む。そのような突然変異は、遺伝性ではないが、細胞分裂の過程で突然変異した細胞の後代に継代され得る。対照的に、生殖細胞突然変異は、生殖系列で起こり、次世代の子孫に継代され得る。
【００５１】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、人工環境を指し、かつ人工環境（例えば、試験管）で起こるプロセスまたは反応を指す。
【００５２】
用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）を指し、かつ天然環境で起こるプロセスまたは反応を指す。
【００５３】
列挙された１つまたは複数の要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）こともある。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、タンパク質を単独で含有することもあり、または他の成分と組み合わせて含有することもある。
【００５４】
値の範囲の指定は、範囲内のまたは範囲を定義する全ての整数、および範囲内の整数により定義される全ての部分的範囲を含む。
【００５５】
文脈からそうではないことが明らかでない限り、用語「約」は、既定値から述べられている値または変動量±０．５％、１％、５％または１０％である測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
【００５６】
単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」または「少なくとも１つの抗原」は、複数の抗原を、それらの混合物を含めて、含むことができる。
【００５７】
統計的に有意なは、ｐ≦０．０５を意味する。
詳細な説明
Ｉ．大要
【００５８】
がん関連タンパク質の免疫原性断片を含むペプチドであって、断片が、ヘテロクリティック突然変異を含む、ペプチドが、本明細書で提供される。一部のそのようなペプチドは、がん関連タンパク質の１つまたは複数の免疫原性断片を含む組換え融合ポリペプチドであり、各断片は、ヘテロクリティック突然変異を含む（例えば、ＰＥＳＴ含有ペプチドに融合されている）。そのようなペプチドをコードする核酸；そのようなペプチドまたは核酸を含む免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチン；そのようなペプチドまたは核酸を含む組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株；そのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチン；ならびにそのようなペプチド、そのような核酸およびそのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を生成する方法もまた、本明細書で提供される。そのようなペプチド、核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを使用して、対象における抗腫瘍関連抗原免疫応答を誘導する方法、対象における抗腫瘍または抗がん免疫応答を誘導する方法、対象における腫瘍またはがんを処置する方法、対象における腫瘍またはがんを予防する方法、および腫瘍またはがんから対象を保護する方法もまた提供される。
【００５９】
腫瘍関連抗原遺伝子に由来する（例えば、がん精巣抗原（ＣＴＡ）または癌胎児性抗原（ＯＦＡ）由来の）ヘテロクリティック配列（すなわち、配列最適化されたペプチド）の設計および使用は、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子による提示を増加させることができる。ヘテロクリティック配列は、Ｔ細胞応答をプライミングし、中枢性寛容を克服し、野生型ペプチドに対する首尾よい交差反応性免疫応答を惹起するのに十分であることが示されている。ＯＦＡおよびＣＴＡは、がん徴候の範疇内にある患者の最大で１００％において発現されるが、成人の健康な組織では発現されない（例えば、正常では、胚組織のみにおいて発現される）。多くのＯＦＡ／ＣＴＡは、発癌において主な役割を有する。がんにおけるＯＦＡ／ＣＴＡの高度に制限された組織発現に起因して、これらは、免疫療法の魅力的な標的である。
【００６０】
そのようなヘテロクリティック配列は、あるがん型内の総患者カバー範囲が１００％に達することができるように、組み合わされ得る。複数の配列最適化された所有権のある免疫原性ＯＦＡ／ＣＴＡペプチドまたは腫瘍関連抗原ペプチド（すなわち、免疫原性を改善するために配列最適化された）を使用することは、強いＴ細胞応答を生じることができ、処置前に患者に対して配列決定行う必要をなくすことができるさらなる標的を提供できるが、これは、彼らが、最も一般的なＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２およびＨＬＡ−Ｂ０７０２）をカバーするために本発明者らがそれらに対してヘテロクリティックペプチドを設計した腫瘍関連抗原を発現すると考えられるからである。
【００６１】
本明細書に記載の一部の組成物では、ヘテロクリティックペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ベクターにおいて発現される。Ｌｍ技術は、強力な自然免疫刺激、樹状細胞および抗原提示細胞のサイトゾル中への標的ペプチドの直接送達、標的化されたＴ細胞応答の生成、ならびに腫瘍微小環境における調節性Ｔ細胞および骨髄系由来サプレッサー細胞による免疫抑制の低減を取り込む作用機序を有する。複数の処置は、中和抗体なしに与えることができ、および／または中和抗体なしで組み合わせることができる。Ｌｍ技術は、腫瘍細胞を、潜在的に細菌感染した細胞とみなし、それらを排除のために標的化するように免疫系を刺激するために、例えば、生物工学的に操作された生弱毒化Ｌｍ細菌を使用することができる。この技術プロセスは、Ｌｉｓｔｅｒｉａの生弱毒化株で始まり得、例えば、目的の抗原に連結されたＬＬＯ（リステリオリジンＯ）分子の断片を含む融合タンパク質配列をコードするプラスミドを複数コピー追加することができる。この融合タンパク質は、抗原提示細胞の内側のＬｉｓｔｅｒｉａによって分泌される。これは、免疫系の自然アームおよび適応アームの両方の刺激を生じ、そのことが、腫瘍防御機序を低減させ、免疫系ががん細胞を攻撃して破壊するのをより容易にする。
【００６２】
免疫学的には、Ｌｍに基づくベクターは、ペプチドワクチンと比較して、ＣＤ８＋優性Ｔ細胞応答の生成のためのはるかに優れたプラットフォームである。第１に、フィルグラスチム注射のアジュバントを添加する必要がない。これは、生弱毒化細菌ベクターが、いくつかのＴＬＲ、ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰ受容体を含む非常に多くの自然免疫活性化トリガーを本質的に誘発し、抗原提示細胞のサイトゾル内のＳＴＩＮＧ受容体に対してアゴニスト活性を示す強力な能力を有するからである。これは、適応免疫応答のために患者の免疫系をプライミングする免疫微小環境のかなり広い変更である。第２に、Ｌｍベクターは、静脈内注入される。これは、皮下組織の有限な領域に存在し得るものよりも有意に多くの抗原提示細胞にこのベクターが到達することを可能にする。これはまた、皮下注射の必要、フィルグラスチムの使用、および遅延型過敏症のリスクを排除する。これはまた、高いＴ細胞力価をより速く生成する可能性が高いが、それは、最適なＣＤ８＋Ｔ細胞数が、１０回を超えない３回の処置後に典型的にはピークになるからである。第３に、Ｌｍは、Ｔ細胞補助のためにＣＤ４＋交差反応性を有する優勢なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を促進する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、がん細胞を死滅させるのに最も有効である。またＬｍベクターは、ＡＰＣの細胞質中でそれらの抗原を提示するので、それらのペプチドは、プロセシングのためにプロテアソームへと迅速にさし向けられ、ＭＨＣクラス１と複合体化し、優勢にＣＤ８＋のＴ細胞への提示のためにＡＰＣ表面に輸送される。これは、抗原ペプチドの皮下Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ提示よりも多くのＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する利点をもたらすはずである。第４に、Ｌｍベクターは、腫瘍および周囲のリンパ節上のケモカインおよびケモカイン受容体の発現を増加させる。これは、活性化されたＴ細胞の、固形腫瘍の近傍への誘引を促進する。第５に、Ｌｍベクターは、Ｔ細胞の攻撃から腫瘍を保護し得る免疫抑制性細胞の相対数および抑制機能を減少させ、がん細胞のＴ細胞死滅をより可能にする。調節性Ｔ細胞および骨髄系由来サプレッサー細胞の免疫抑制能のこの低減は、これらのペプチドに対して生成されたＴ細胞が固形腫瘍においてより良好な活性を有することをより可能にする。第６に、Ｌｍベクターは、中和抗体を生成しない。これによって、これらのベクターは、中和抗体からの有効性の喪失、およびアナフィラキシーを含み得る遅延型過敏症または急性過敏症の発生なしに、延長された期間にわたって反復して投与することができる。
【００６３】
Ｌｍベクターは、複数の免疫療法機序を介して作用する：インターフェロン遺伝子の刺激物質（ＳＴＩＮＧ）受容体を含むｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）および病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を介した強力な自然免疫刺激、強いＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答、エピトープスプレッディング、ならびに腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇおよび骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を無力化することによる、免疫抑制。加えて、Ｌｉｓｔｅｒｉａの特有の細胞内生活環は、中和抗体を回避し、反復投薬を可能にする。Ｌｍはまた、チェックポイント阻害剤、共刺激アゴニストおよび他の薬剤との相乗作用を有するので、有利である。これはまた、大きなキャパシティーを有し、多くの異なる腫瘍型を標的化するために適応させ得る。例として、Ｌｍの生弱毒化株は、アジュバント特性を有するリステリオリジンＯの短縮型断片（ｔＬＬＯ）、および１つまたは複数の腫瘍関連抗原を含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる抗原−アジュバント融合タンパク質を分泌するように、生物工学的に操作され得る。患者中への注入の際に、生物工学的に操作されたＬｍは、抗原提示細胞によって貪食され得、そこで、融合タンパク質は、Ｌｍによって分泌され、プロセシングされ、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩ分子上に提示される。抗原提示細胞の表面上に提示された標的ペプチドは、腫瘍関連抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する。次いで、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原発現がん細胞を探し出して死滅させ、免疫抑制を克服するために腫瘍微小環境をモジュレートすることができる。
【００６４】
Ｌｍベクターは、いくつかの臨床的利点を有する。処置に関連するいずれの副作用も、患者がまだクリニックにいる注入後直ぐの数時間以内に出現し、ほとんど排他的に軽度〜中程度であり、処置に対して容易に応答し、遅延した開始、累積的毒性または持続する後遺症の証拠なしに、投薬の日に解決する。実務的利点としては、複数の薬剤を投与する必要および引き続く投与のために代替の投薬部位に切り替える必要がないという事実が挙げられる。
【００６５】
製造の見地から、いくつかの利点が存在する。第１に、個々のペプチドを高い濃度および高い程度の純度で製造する必要がない。Ｌｍ細菌は、細菌の内側の複数コピーのＤＮＡプラスミド上のＤＮＡを同時に転写し、これらのペプチドをＡＰＣの細胞質中に直接分泌し、そこで、これらのペプチドは、プロセシングのためにプロテアソームにほとんど直ちに輸送される。本質的に、これらのペプチドは、抗原プロセシングのための使用のまさにその時点で、細菌によって製造される。第２に、Ｌｍベクターは、高度にスケーラブルである。遺伝子操作が完了すると、細菌は、ブロス培養物中で自身を複製する。培養物は、製品原価を大きく低減させるために、スケールアップさせることができる。第３に、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅなどの複雑な担体中で製剤化する必要も、エマルジョンを作出する必要もない。第４に、細菌は、ペプチド製剤の効力の喪失をもたらし得るペプチド分解の心配も分解産物混入の心配もなしに、５年よりもいくらか長い間、非常に安定である。
【００６６】
本明細書で開示される一部のＬｍベクターでは、ミニ遺伝子構築物が、本明細書中の他の箇所により詳細に記載されるように使用される。特異的ＭＨＣクラスＩ結合性抗原決定基の発現のための、本明細書で開示されるミニ遺伝子構築物アプローチの使用は、専門的抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）の抗原提示経路への、短いペプチド配列の高度に効率的な送達を可能にする。ミニ遺伝子技術の具体的な利点は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合され得、その上に提示され得る短いペプチド配列を遊離させるために、より大きいタンパク質がプロテアソーム媒介性分解を受ける必要性を、それが迂回することである。これは、ｐＡＰＣの表面上でのペプチド−ＭＨＣクラスＩ抗原提示のかなり高い効率を生じ、したがって、抗原特異的Ｔ細胞応答のプライミングのためのかなり高いレベルの抗原発現を生じる。
ＩＩ．ヘテロクリティック突然変異を含む腫瘍関連抗原ペプチドおよびそのようなペプチドをコードする核酸
【００６７】
がん関連タンパク質の免疫原性断片を含むペプチドであって、断片が、ヘテロクリティック突然変異を含む、ペプチドが、本明細書で開示される。
【００６８】
用語「ヘテロクリティック」は、ヘテロクリティックペプチドの元になったネイティブペプチド（例えば、アンカー残基突然変異を含有しないペプチド）を認識する免疫応答を生じさせるペプチドを指す。例えば、ＹＬＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号１３０）は、残基２のメチオニンへの突然変異によって、ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号１３１）から生成された。ヘテロクリティックペプチドは、ヘテロクリティックペプチドの元になったネイティブペプチドを認識する免疫応答を生じさせることができる。例えば、ヘテロクリティックペプチドによるワクチン接種によって生成されるネイティブペプチドに対する免疫応答は、ネイティブペプチドによるワクチン接種によって生成される免疫応答と大きさが等しいまたはそれよりも大きい場合がある。免疫応答は、例えば、２倍、３倍、５倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、５００倍、１０００倍、またはそれより多く、増加され得る。
【００６９】
本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドは、１つまたは複数のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子に結合することができる。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子としても公知のＨＬＡ分子は、ペプチドに結合し、それらを免疫細胞に提示する。ペプチドの免疫原性は、ＨＬＡ分子に対するその親和性によって部分的に決定され得る。ＨＬＡクラスＩ分子は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）上に一般に提示されるＣＤ８分子と相互作用する。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴリンパ球上に一般に提示されるＣＤ４分子と相互作用する。例えば、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドは、Ｔ細胞前駆体を活性化するのに十分な親和性で、またはＴ細胞による認識を媒介するのに十分な親和性で、ＨＬＡ分子に結合することができる。
【００７０】
本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドは、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合することができる。例えば、ヘテロクリティックペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子、ＨＬＡ−ＤＲＡ分子、ＨＬＡ−ＤＱＡ１分子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１分子、ＨＬＡ−ＤＰＡ１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１分子、ＨＬＡ−ＤＭＡ分子、ＨＬＡ−ＤＭＢ分子、ＨＬＡ−ＤＯＡ分子またはＨＬＡ−ＤＯＢ分子に結合することができる。
【００７１】
本明細書で開示されるネイティブまたはヘテロクリティックペプチドは、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩ分子に結合することができる。例えば、ヘテロクリティックペプチドは、ＨＬＡ−Ａ分子、ＨＬＡ−Ｂ分子、ＨＬＡ−Ｃ分子、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子、ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ２．１、ＨＬＡ  Ａ３、ＨＬＡ  Ａ３．２、ＨＬＡ  Ａ１１、ＨＬＡ  Ａ２４、ＨＬＡ  Ｂ７、ＨＬＡ  Ｂ２７またはＨＬＡ  Ｂ８に結合することができる。同様に、ヘテロクリティックペプチドは、ＨＬＡクラスＩ分子のスーパーファミリー、例えば、Ａ２スーパーファミリー、Ａ３スーパーファミリー、Ａ２４スーパーファミリー、Ｂ７スーパーファミリー、Ｂ２７スーパーファミリー、Ｂ４４スーパーファミリー、Ｃ１スーパーファミリーまたはＣ４スーパーファミリーに結合することができる。具体的な例では、ヘテロクリティックペプチドまたは断片は、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数に結合する。
【００７２】
ヘテロクリティックペプチドは、対応するネイティブペプチドと比較して、ＨＬＡクラスＩＩ分子へのペプチドの結合を増強する突然変異を含むことができる。あるいはまたは加えて、ヘテロクリティックペプチドは、対応するネイティブペプチドと比較して、ＨＬＡクラスＩ分子へのペプチドの結合を増強する突然変異を含むことができる。例えば、突然変異された残基は、ＨＬＡクラスＩＩモチーフアンカー残基であり得る。「アンカーモチーフ」または「アンカー残基」は、別の実施形態では、ＨＬＡ結合配列（例えば、ＨＬＡクラスＩＩ結合配列またはＨＬＡクラスＩ結合配列）中の特定の位置における好ましい残基の１つまたはセットを指す。
【００７３】
野生型エピトープに対する交差反応性免疫原性応答を惹起する可能性を有する予測されたヘテロクリティックエピトープを生成するための種々の方法が周知である。例えば、野生型エピトープに対する交差反応性免疫原性応答を惹起する可能性を有するヘテロクリティックエピトープを設計するために、野生型エピトープのベースライン予測されたペプチド−ＭＨＣ結合親和性が、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ  ３．０  Ｓｅｒｖｅｒ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）を使用して決定され得る。１．０未満またはそれと等しいペプチド−ＭＨＣ結合親和性パーセントランクは、免疫応答を惹起する可能性が高い強い結合因子とみなされる。潜在的ヘテロクリティックエピトープは、強い結合因子であると予測される野生型エピトープの１位、２位、３位またはＣ末端位置であるがこれらに限定されない１つまたは複数のアミノ酸のランダム置換によって生成される。次いで、潜在的ヘテロクリティックエピトープのペプチド−ＭＨＣ結合親和性が、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ  ３．０  Ｓｅｒｖｅｒを使用して推定される。野生型エピトープと類似のおよび１．０パーセンテージランク未満またはそれと等しいパーセンテージランキング結合親和性を有するヘテロクリティックエピトープは、さらなる検証のための潜在的抗原とみなすことができる。
【００７４】
ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ残基を識別するため、ならびに残基を突然変異させることによってＨＬＡ結合を改善するための他の方法は、周知である。例えば、ＵＳ８，７６５，６８７、ＵＳ７，４８８，７１８、ＵＳ９，２３３，１４９およびＵＳ７，５９８，２２１を参照されたい。その各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを予測するための方法は周知である。一例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＴＥＰＩＴＯＰＥを使用して予測することができる（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＭｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：５８１−５９１）。別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＥｐｉＭａｔｒｉｘを使用して予測することができる（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＤｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３：５２９−５３１）。さらに別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ｍｅｔｈｏｄを使用して予測することができる（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＹｕ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ８：１３７−１４８）。さらに別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩエピトープ予測アルゴリズムを使用して予測することができる。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合することが公知の４５００個よりも多いペプチド配列を含むデータベースである。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、ＭＨＣ結合溝に沿ったある特定の位置におけるある特定のアミノ酸の存在に基づくスコアを提供する。理想的なアミノ酸アンカーは、１０ポイントの値があり、特異なアンカーは、６〜８ポイントの値があり、補助的アンカーは、４〜６ポイントの値があり、好ましい残基は、１〜４ポイントの値がある；結合スコアに対する陰性アミノ酸の影響は−１〜−３の間である。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１についての最大スコアは、３６である。さらに別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、Ｒａｎｋｐｅｐを使用して予測することができる。Ｒａｎｋｐｅｐは、位置特異的スコアリングマトリックス（ＰＳＳＭ）を使用し、またはＭＨＣ−ペプチド結合の予測因子として所与のＭＨＣ分子に結合することが公知のアラインメントされたペプチドのセットからプロファイリングする。Ｒａｎｋｐｅｐは、選択されたプロファイルと共に、ペプチドのスコア、および最大スコアを生じるコンセンサス配列のスコアと比較した、予測されたペプチドの％最適またはパーセンタイルスコアについての情報を含む。Ｒａｎｋｐｅｐは、それぞれＭＨＣ  Ｉ分子およびＭＨＣ  ＩＩ分子へのペプチド結合の予測のための、１０２  ＰＳＳＭおよび８０  ＰＳＳＭの選択を含む。通常、異なるサイズのペプチド結合因子の予測のためのいくつかのＰＳＳＭが、各ＭＨＣ  Ｉ分子について利用可能である。別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＳＶＭＨＣを使用して識別することができる（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＤｏｎｎｅ���  ａｎｄ  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ  （２００２）  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １１；  ３：２５）。
【００７５】
ＭＨＣクラスＩエピトープを識別するための方法もまた周知である。一例として、ＭＨＣクラスＩエピトープは、ＢＩＭＡＳソフトウェアを使用して予測することができる。ＢＩＭＡＳスコアは、ペプチド結合親和性の尺度であるＭＨＣ−Ｉ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体の理論的半減期の計算に基づく。このプログラムは、長さ８〜１０アミノ酸のＨＬＡ−Ｉペプチドについての情報を使用する。ＭＨＣに対するペプチドの結合親和性が高くなるほど、このペプチドがエピトープを示す可能性は高くなる。ＢＩＭＡＳアルゴリズムは、ペプチド中の各アミノ酸がクラスＩ分子への結合に独立して寄与すると想定する。結合にとって重要な支配的なアンカー残基は、１よりも顕著に高い、表中の係数を有する。好ましくないアミノ酸は、１よりも低い正の係数を有する。アミノ酸が結合に対して好ましい寄与をするか好ましくない寄与をするかが知られていない場合、これには値１が割り当てられる。アミノ酸に割り当てられた全ての値は乗算され、得られたランニングスコアには定数が乗算されて、解離の半減時間の推定が得られる。別の例として、ＭＨＣクラスＩエピトープは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを使用して識別することができる。さらに別の例として、ＭＨＣクラスＩエピトープは、ＳＶＭＨＣを使用して識別することができる。さらに別の例として、ＭＨＣクラスＩエピトープは、ＮｅｔＭＨＣ−２．０を使用して識別することができる（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＢｕｕｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ６２：３７８−３８４）。
【００７６】
ＨＬＡ結合モチーフ中の異なる残基が、ＭＨＣ結合を増強するために突然変異され得る。一例では、ＭＨＣ結合を増強する突然変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの１位の残基にある（例えば、チロシン、グリシン、トレオニンまたはフェニルアラニンへの突然変異）。別の例として、突然変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの２位にあり得る（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシンまたはメチオニンへの突然変異）。別の例として、突然変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの６位にあり得る（例えば、バリン、システイン、グルタミンまたはヒスチジンへの）。別の例として、突然変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの９位またはＣ末端位置にあり得る（例えば、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、アラニンまたはシステインへの）。突然変異は、一次アンカー残基または二次アンカー残基にあり得る。例えば、ＨＬＡクラスＩ一次アンカー残基は、２位および９位であり得、二次アンカー残基は、１位および８位、または１位、３位、６位、７位および８位であり得る。別の例では、点突然変異は、４位、５位および８位から選択される位置にあり得る。
【００７７】
同様に、ＨＬＡクラスＩＩ結合部位中の異なる残基が、突然変異され得る。例えば、ＨＬＡクラスＩＩモチーフアンカー残基が改変され得る。例えば、Ｐ１位、Ｐ２位、Ｐ６位またはＰ９位が、突然変異され得る。あるいは、Ｐ４位、Ｐ５位、Ｐ１０位、Ｐ１１位、Ｐ１２位またはＰ１３位が、突然変異され得る。
【００７８】
個々のヘテロクリティック突然変異は、本明細書中の他の箇所でさらに詳細に論じられるように、任意の基準に基づいて選択され得る。例えば、個々のヘテロクリティック突然変異またはヘテロクリティックペプチドは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生じることが公知である場合に選択され得る。
【００７９】
可能なヘテロクリティック突然変異のセットの識別後に、各ヘテロクリティック突然変異を含むヘテロクリティック免疫原性ペプチドの配列が選択され得る。異なるサイズのペプチドが、本明細書中の他の箇所で開示されるように使用され得る。例えば、ヘテロクリティック突然変異またはヘテロクリティック免疫原性ペプチドは、例えば、９アミノ酸からなるＭＨＣクラスＩエピトープに集中され得る。
【００８０】
次いで、ヘテロクリティック免疫原性ペプチドの配列が、ＭＨＣクラスＩ分子への結合を増強するために最適化され得る。各ＨＬＡへの結合を最適化するために、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＭＨＣ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｈａｒｔが、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（例えば：ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ＭＨＣａｌｌｅｌｅｉｄ／１４３）から評定され得る。アンカー位置における好ましいアミノ酸が、ヘテロクリティック抗原性ペプチド配列（例えば、ＮＵＦ２−野生型：ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号１３１）；およびＮＵＦ２−ヘテロクリティック：ＹＬＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号１３０））中に挿入され得る。
【００８１】
次いで、配列最適化されたヘテロクリティック抗原性ペプチドの結合親和性が、例えば、次のアルゴリズムのうち１つを使用して評定され得る：ＮｅｔＭＨＣ４．０  Ｓｅｒｖｅｒ；ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０  Ｓｅｒｖｅｒ；およびｍｈｃｆｌｕｒｒｙ  ｖ０．２．０。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、特異的ＨＬＡへの結合親和性の予測が、対応するネイティブ配列と等価またはそれよりも強いかどうかについて検討され得る。次いで、選択された配列最適化されたヘテロクリティック抗原性ペプチドが、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅのＲＥＶＥＡＬアッセイを使用して、特異的ＨＬＡへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合についてスクリーニングされ得る。例えば、ＲＥＶＥＡＬアッセイの陽性対照ペプチドの＞＝４５％の結合親和性を有するヘテロクリティック抗原性ペプチドが、結合因子とみなされ得る。
【００８２】
配列最適化されたヘテロクリティック抗原性ペプチドに対する結合親和性（例えば、ＩＣ５０）は、例えば、１０００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｎＭ未満であり得る。例えば、結合親和性（例えば、ＩＣ５０）は、約０．５〜５００ｎＭの間、約０．５〜３００ｎＭの間、約０．５〜２００ｎＭの間、約０．５〜１００ｎＭの間、約０．５〜５０ｎＭの間、約０．５〜４０ｎＭの間、約０．５〜３０ｎＭの間、約０．５〜２０ｎＭの間、約０．５〜１０ｎＭの間または約０．５〜５ｎＭの間であり得る。
【００８３】
ヘテロクリティック抗原性ペプチドのＲＮＡ発現レベルもまた、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）ＲＮＡｓｅｑＶ２データセット中の特定の徴候において測定され得る。０よりも大きい標準化されたＲＮＡ発現読み取りを有するＴＣＧＡ試料のパーセンテージが計算され得る。大部分の試料においてＴＣＧＡ発現を有するヘテロクリティック抗原性ペプチドが優先され得る。
【００８４】
具体的な例では、文献の見直しが、潜在的ＴＡＡの一覧表を生成するために徴候特異的腫瘍関連抗原のゲノム的ランドスケープを調査するために実施され得る。第２の文献の見直しが、一覧表のＴＡＡが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生じる公知の免疫原性ペプチドを含むかどうかを決定するために実施され得る。このアプローチは、例えば、ＴＡＡ由来の９アミノ酸（９マー）からなるＭＨＣクラスＩエピトープに主に焦点を当て得る。このステップは、例えば、４つのＨＬＡ型（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２）のうち１つに結合する９マー形式の潜在的標的ペプチドを識別することができる。
【００８５】
次いで、標的ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子への結合を増強するために、配列最適化され得る（ヘテロクリティックペプチドとしても公知）。各ＨＬＡへの結合を最適化するために、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＭＨＣ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｈａｒｔが、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（例えば：ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ＭＨＣａｌｌｅｌｅｉｄ／１４３）から評定され得る。アンカー位置における好ましいアミノ酸が、標的ペプチド配列（例えば、ＮＵＦ２−野生型：ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号１３１）；およびＮＵＦ２−ヘテロクリティック：ＹＬＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号１３０））中に挿入され得る。次いで、配列最適化された標的ペプチドおよび野生型標的ペプチドの結合親和性が、例えば、次のアルゴリズムのうち１つを使用して評定され得る：ＮｅｔＭＨＣ４．０  Ｓｅｒｖｅｒ；ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０  Ｓｅｒｖｅｒ；およびｍｈｃｆｌｕｒｒｙ  ｖ０．２．０。配列最適化された標的ペプチドは、例えば、特異的ＨＬＡへの結合親和性の予測が、野生型標的ペプチド配列と等価またはそれよりも強いかどうかについて検討され得る。次いで、選択された配列最適化された標的ペプチドが、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅのＲＥＶＥＡＬアッセイを使用して、特異的ＨＬＡへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合についてスクリーニングされ得る。例えば、ＲＥＶＥＡＬアッセイの陽性対照ペプチドの＞＝４５％の結合親和性を有する標的ペプチドが、結合因子とみなされ得る。最後に、標的ペプチドのＲＮＡ発現レベルが、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑＶ２データセット中の特定の徴候において測定され得る。例えば、０よりも大きい標準化されたＲＮＡ発現読み取りを有するＴＣＧＡ試料のパーセンテージが計算され得る。例えば、大部分の試料においてＴＣＧＡ発現を有する標的ペプチドが優先され得る。
【００８６】
用語「がん関連タンパク質」は、複数の種類のがんに起こる突然変異を有するタンパク質、特定の種類のがんを有する複数の対象に起こる突然変異を有するタンパク質、または１もしくは複数の種類のがんの発生もしくは進行と相関する突然変異を有するタンパク質を含む。例えば、がん関連タンパク質は、発癌タンパク質（すなわち、がん進行に寄与し得る活性を有するタンパク質、例えば、細胞増殖を調節するタンパク質）であることもあり、または腫瘍抑制タンパク質（すなわち、がん形成の可能性を、例えば、細胞周期の負の調節によって、もしくはアポトーシスを促進することにより、軽減するように概して作用するタンパク質）であることもある。
【００８７】
ヘテロクリティックペプチドに関して、用語「がん関連タンパク質」は、その発現が１つまたは複数の種類のがんの発生または進行と相関するタンパク質を指す。必要に応じて、そのようなタンパク質は、複数の種類のがんに起こる突然変異を有するタンパク質、特定の種類のがんを有する複数の対象に起こる突然変異を有するタンパク質、または１つもしくは複数の種類のがんの発生もしくは進行と相関する突然変異を有するタンパク質を含む。例えば、がん関連タンパク質は、発癌タンパク質（すなわち、がん進行に寄与し得る活性を有するタンパク質、例えば、細胞成長を調節するタンパク質）であることもあり、または腫瘍抑制タンパク質（すなわち、がん形成の可能性を、例えば、細胞周期の負の調節によって、またはアポトーシスを促進することにより、軽減するように概して作用するタンパク質）であることもある。好ましくは、ヘテロクリティックペプチドが由来するがん関連タンパク質は、特定の種類のがんにおいて発現されるが、健康な成人組織では正常では発現されないタンパク質（すなわち、がん特異的発現、がん制限された発現、腫瘍特異的発現または腫瘍制限された発現を有するタンパク質）である。しかし、がん関連タンパク質は、がん特異的発現もがん制限された発現も腫瘍特異的発現も腫瘍制限された発現も有する必要はない。がん特異的またはがん制限されたとみなされるタンパク質の例は、がん精巣抗原または癌胎児性抗原である。がん精巣抗原（ＣＴＡ）は、異なる組織学的起源のヒト腫瘍において発現されるが、雄性生殖細胞を除く正常組織では発現されない腫瘍関連抗原の大きいファミリーである。がんでは、これらの発生的抗原が再発現され得、免疫活性化の場として機能し得る。癌胎児性抗原（ＯＦＡ）は、典型的には胎児発生の間にのみ存在するが、ある特定の種類のがんを有する成人において見出されるタンパク質である。ＣＴＡおよびＯＦＡの発現の腫瘍制限されたパターンにより、これらは、腫瘍特異的免疫療法のための理想的な標的になっている。ほとんどのＯＦＡ／ＣＴＡタンパク質は、発癌において重要な役割を果たす。
【００８８】
例えば、がん関連タンパク質は、本明細書中の他の箇所に列挙されたがん関連タンパク質のいずれか１つであり得る。例えば、がん関連タンパク質は、次の遺伝子のうち１つによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ｈＴＥＲＴ、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＮＵＦ２、ＮＹＥＳＯ１、ＰＡＧＥ４、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＳＳＸ２、ＳＴＥＡＰ１およびＳＵＲＶＩＶＩＮ。
【表Ｂ】
2021502083.tif 000004
【００８９】
各ヘテロクリティック免疫原性ペプチドは、ヘテロクリティック突然変異を含むがん関連タンパク質の断片（すなわち、がん関連タンパク質由来のアミノ酸の連続した配列）であり得る。各ヘテロクリティック免疫原性ペプチドは、免疫応答を誘導するのに十分な任意の長さのものであり得る。例えば、本明細書に開示されるヘテロクリティック免疫原性ペプチドは、長さ５〜１００、１５〜５０、または２１〜２７アミノ酸、または長さ１５〜１００、１５〜９５、１５〜９０、１５〜８５、１５〜８０、１５〜７５、１５〜７０、１５〜６５、１５〜６０、１５〜５５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、２０〜１００、２０〜９５、２０〜９０、２０〜８５、２０〜８０、２０〜７５、２０〜７０、２０〜６５、２０〜６０、２０〜５５、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、１１〜２１、１５〜２１、２１〜３１、３１〜４１、４１〜５１、５１〜６１、６１〜７１、７１〜８１、８１〜９１、９１〜１０１、１０１〜１２１、１２１〜１４１、１４１〜１６１、１６１〜１８１、１８１〜２０１、８〜２７、１０〜３０、１０〜４０、１５〜３０、１５〜４０、１５〜２５、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、１〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、８〜１１、または１１〜１６アミノ酸であり得る。例えば、ヘテロクリティック免疫原性ペプチドは、長さ１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸であり得る。例えば、ヘテロクリティック免疫原性ペプチドは、長さ８〜１００、８〜５０、８〜３０、８〜２５、８〜２２、８〜２０、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、７〜１１、または８〜１０アミノ酸であり得る。一例では、ヘテロクリティック免疫原性ペプチドは、長さ９アミノ酸であり得る。
【００９０】
一部の場合には、ヘテロクリティック免疫原性ペプチドは、親水性であることがあり、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもしくは目的の別の細菌における分泌可能性を予示し得る、最大で、ある特定のハイドロパシー閾値またはそれ未満のスコアを有することがある。例えば、ヘテロクリティック免疫原性ペプチドをＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数２１アミノ酸ウインドウによってスコア化することができ、カットオフ（およそ１．６）より上のスコアを有する全てを除外することができる。それらは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより分泌される可能性が低いからである。
【００９１】
ヘテロクリティック免疫原性ペプチドは、単一のヘテロクリティック突然変異を含み得、または２つもしくはそれより多くのヘテロクリティック突然変異（例えば、２つのヘテロクリティック突然変異）を含み得る。例示的なヘテロクリティック突然変異体ペプチドは、対応する野生型（ネイティブ）ペプチドもまた提供する次の表中のヘテロクリティックペプチド配列からなる、それから本質的になる、またはそれを含む。対応するヘテロクリティックペプチドにおいて改変された野生型ペプチド中の残基は、太字かつ下線で示される。
【表Ｃ】
2021502083.tif 000005
【００９２】
そのようなヘテロクリティックペプチドをコードする核酸も開示される。核酸は、任意の形態のものであり得る。核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含むこともあり、またはＤＮＡもしくはＲＮＡからなることもあり、一本鎖であることもあり、または二本鎖であることもある。核酸は、エピソームプラスミド、多コピーエピソームプラスミド、または組込型プラスミドなどの、プラスミドの形態であることもある。あるいは、核酸は、ウイルスベクターの形態であることもあり、ファージベクターの形態であることもあり、または細菌人工染色体内にあることもある。そのような核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有することもあり、または２つもしくはそれより多くのオープンリーディングフレームを有することもある。一例では、そのような核酸は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれより多くのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間に含むことができる。例えば、核酸は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間に含むことができる。各オープンリーディングフレームは、異なるペプチドをコードすることができる。一部の核酸では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にするための２つの停止コドンが続く。
【００９３】
核酸は、コドン最適化され得る。核酸は、核酸中の少なくとも１つのコドンが、元の配列中のコドンよりもそのアミノ酸のために特定の生物によってより頻繁に使用されるコドン（例えば、ヒトまたはＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のために最適化されたコドン）で置き換えられている場合、コドン最適化されている。本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドをコードする核酸の例は、配列番号２２３〜９７７に提供される。
ＩＩＩ．組換え融合ポリペプチド
【００９４】
本明細書中の他の箇所で開示されるような、ヘテロクリティック突然変異を含む１つまたは複数の腫瘍関連抗原ペプチドに融合された（すなわち、がん関連タンパク質の１つまたは複数の免疫原性断片に融合された、ここで、各断片は、ヘテロクリティック突然変異を含む）ＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換え融合ポリペプチドが、本明細書で開示される。
【００９５】
本明細書中の他の箇所で開示されるような、ヘテロクリティック突然変異を含む１つまたは複数の腫瘍関連抗原ペプチド（すなわち、がん関連タンパク質の１つまたは複数の免疫原性断片に融合され、ここで、各断片は、ヘテロクリティック突然変異を含む）を含む組換え融合ポリペプチドであって、融合ポリペプチドがＰＥＳＴ含有ペプチドを含まない、組換え融合ポリペプチドもまた本明細書で開示される。
【００９６】
Ｎ末端からＣ末端へ、細菌分泌配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、および本明細書中の他の箇所で開示されるような、ヘテロクリティック突然変異を含む１つまたは複数の腫瘍関連抗原ペプチド（すなわち、がん関連タンパク質の１つまたは複数の免疫原性断片に融合され、ここで、各断片は、ヘテロクリティック突然変異を含む）を（すなわち、直列に、例えば、Ｕｂ−ペプチド１−ペプチド２で）含む組換え融合ポリペプチドもまた本明細書で提供される。あるいは、各抗原性ペプチドがその独自の分泌配列およびＵｂタンパク質と融合されている（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１；Ｕｂ２−ペプチド２）、別々の融合ポリペプチドの組合せが使用されることもある。
【００９７】
そのような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸（ミニ遺伝子構築物と称される）も開示される。そのようなミニ遺伝子核酸構築物は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれより多くのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間にさらに含むことができる。例えば、ミニ遺伝子核酸構築物は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間にさらに含むことができる。各オープンリーディングフレームは、異なるペプチドをコードすることができる。一部の核酸構築物では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にするための２つの停止コドンが続くことがある。
【００９８】
細菌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａのシグナル配列、例えば、ＨｌｙもしくはＡｃｔＡシグナル配列、または任意の他の公知シグナル配列であり得る。他の場合には、シグナル配列は、ＬＬＯシグナル配列であり得る。例示的なＬＬＯシグナル配列は、配列番号９７に記載される。シグナル配列は、細菌のものであることもあり、宿主細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、例えばｓｅｃＡ１シグナルペプチド）に特有のものであることもあり、または宿主細菌にとって異質のものであることもある。シグナルペプチドの特定の例としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチド；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドなどのｓｅｃＡ２シグナルペプチド；およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）などのＴａｔシグナルペプチドが挙げられる。特定の例では、分泌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質から、例えば、ＡｃｔＡ３００分泌シグナル、またはＡｃｔＡ１００分泌シグナルである。例示的なＡｃｔＡシグナル配列は、配列番号９８に記載される。
【００９９】
ユビキチンは、例えば、完全長タンパク質であり得る。例示的なユビキチン配列は、配列番号１８８に示される。本明細書で提供される核酸構築物から発現されたユビキチンは、宿主細胞サイトゾルに侵入すると、核酸構築物から発現された組換え融合ポリペプチドの残部からカルボキシ末端で加水分解作用によって切断され得る。この切断が融合ポリペプチドのアミノ末端を遊離させ、その結果、宿主細胞サイトゾル中でペプチドが産生される。
【０１００】
融合ポリペプチド中の抗原ペプチドの選択、可変性および構成は、本明細書中の他の箇所で詳細に論じられ、ヘテロクリティック変異を含む腫瘍関連抗原ペプチドは、本明細書中の他の箇所でより詳細に論じられる。
【０１０１】
組換え融合ポリペプチドは、１つまたは複数のタグを含むことができる。例えば、組換え融合ポリペプチドは、１つもしくは複数の抗原ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端側に１つまたは複数のペプチドタグを含むことができる。タグを抗原ペプチドに直接融合させることができ、またはリンカー（その例は、本明細書中の他の箇所で開示される）を介して抗原ペプチドに連結させることができる。タグの例としては、次のものを挙げられる：ＦＬＡＧタグ、２×ＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、６×Ｈｉｓタグ、およびＳＩＩＮＦＥＫＬタグ。例示的なＳＩＩＮＦＥＫＬタグは、配列番号１６に記載される（配列番号１〜１５に記載の核酸のいずれか１つによりコードされる）。例示的な３×ＦＬＡＧタグは、配列番号３２に記載される（配列番号１７〜３１に記載の核酸のいずれか１つによりコードされる）。例示的なバリアント３×ＦＬＡＧタグは、配列番号９９に記載される。２つまたはそれより多くのタグ、例えば、２×ＦＬＡＧタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、３×ＦＬＡＧタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、または６×ＨｉｓタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグを、一緒に使用することができる。２つまたはそれより多くのタグを使用する場合、それらは、組換え融合ポリペプチド内のいずれの箇所にいずれの順序で位置してもよい。例えば、２つのタグが、組換え融合ポリペプチドのＣ末端にあってもよく、２つのタグが、組換え融合ポリペプチドのＮ末端にあってもよく、２つのタグが、組換え融合ポリペプチドの内部に位置してもよく、組換え融合ポリペプチドのＣ末端に１つのタグがあってＮ末端に１つのタグがあってもよく、組換え融合ポリペプチドのＣ末端に１つのタグがあって内部に１つのタグがあってもよく、または組換え融合ポリペプチドのＮ末端に１つのタグがあって内部に１つのタグがあってもよい。他のタグには、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、およびポリ（ＮＡＮＰ）が含まれる。特定の組換え融合ポリペプチドは、Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグを含む。そのようなタグによって、これらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することにより、組換え融合タンパク質の容易な検出、組換え融合タンパク質の分泌の確認、または分泌された融合ポリペプチドの免疫原性の追跡が可能になり得る。そのような免疫応答を、例えば、これらのタグに特異的なモノクローナル抗体およびＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含む、多数の試薬を使用してモニターすることができる。
【０１０２】
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株により発現されることもあり、またはタンパク質発現および単離に使用される他のベクターおよび細胞系から発現され、単離されることもある。そのような抗原ペプチドの発現を有する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物に、および組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株とアジュバントとを含むワクチンに使用することができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の宿主細胞系における、およびＬｉｓｔｅｒｉａ以外の宿主細胞系における、非溶血性短縮型のＬＬＯ、ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ様配列を有する融合ポリペプチドとしての１つまたは複数の抗原ペプチドの発現は、抗原ペプチドの免疫原性を増強する結果となり得る。
【０１０３】
そのような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸も開示される。核酸は、任意の形態のものであり得る。核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含むこともあり、またはＤＮＡもしくはＲＮＡからなることもあり、一本鎖であることもあり、または二本鎖であることもある。核酸は、エピソームプラスミド、多コピーエピソームプラスミド、または組込型プラスミドなどの、プラスミドの形態であることもある。あるいは、核酸は、ウイルスベクターの形態であることもあり、ファージベクターの形態であることもあり、または細菌人工染色体内にあることもある。そのような核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有することもあり、または２つもしくはそれより多くのオープンリーディングフレーム（例えば、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、および代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレーム）を有することもある。一例では、そのような核酸は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれより多くのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間に含むことができる。例えば、核酸は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間に含むことができる。各オープンリーディングフレームは、異なるポリペプチドをコードすることができる。一部の核酸では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にするための２つの停止コドンが続く。
Ａ．抗原ペプチド
【０１０４】
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドは、本明細書中の他の箇所で開示されるような、ヘテロクリティック突然変異を含む１つまたは複数の腫瘍関連抗原性ペプチド（すなわち、がん関連タンパク質の免疫原性断片、ここで、各断片は、ヘテロクリティック突然変異を含む）を含む。融合ポリペプチドは、単一の抗原ペプチドを含むこともあり、または２つもしくはそれより多くの抗原ペプチドを含むこともある。各抗原ペプチドは、免疫応答を誘導するのに十分な任意の長さであり得、各抗原ペプチドが同じ長さであることもあり、または抗原ペプチドが異なる長さを有することもある。ヘテロクリティック抗原性ペプチドの適切な長さの例は、本明細書中の他の箇所で開示される。
【０１０５】
各抗原ペプチドはまた、親水性であることがあり、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもしくは目的の別の細菌における分泌可能性を予示し得る、最大で、ある特定のハイドロパシー閾値またはそれ未満のスコアを有することがある。例えば、抗原ペプチドをＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数２１アミノ酸ウインドウによってスコア化することができ、カットオフ（およそ１．６）より上のスコアを有する全てを除外することができる。それらは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより分泌される可能性が低いからである。同様に、抗原ペプチドまたは融合ポリペプチドの組合せは、親水性であることがあり、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもしくは目的の別の細菌における分泌可能性を予示し得る、最大で、ある特定のハイドロパシー閾値またはそれ未満のスコアを有することがある。
【０１０６】
抗原ペプチドを任意の方法で互いに連結させることができる。例えば、抗原ペプチドを介在配列なしで互いに直接融合させることができる。あるいは、抗原ペプチドを、ペプチドリンカーなどの１つまたは複数のリンカーを介して、互いに間接的に連結させることができる。一部の場合には、隣接する抗原ペプチドの一部のペアを互いに直接融合させることができ、抗原ペプチドの他のペアを１つまたは複数のリンカーを介して互いに間接的に連結させることができる。同じリンカーを、隣接する抗原ペプチドの各ペア間に使用することができ、または任意の数の異なるリンカーを、隣接する抗原ペプチドの異なるペア間に使用することができる。加えて、１つのリンカーを、隣接する抗原ペプチドのペア間に使用することができ、または複数のリンカーを、隣接する抗原ペプチドのペア間に使用することができる。
【０１０７】
任意の好適な配列をペプチドリンカーに使用することができる。一例として、リンカー配列は、例えば、長さ１〜約５０アミノ酸であり得る。一部のリンカーは、親水性であり得る。リンカーは、様々な目的に役立つことができる。例えば、リンカーは、細菌分泌を増加させること、抗原プロセシングを助長すること、融合ポリペプチドの柔軟性を増大させること、融合ポリペプチドの剛直性を増大させること、または任意の他の目的に役立つことができる。具体的な例として、柔軟性リンカー、剛直性リンカーおよびイムノプロテアソーム（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）プロセシングリンカーのうち１つまたは複数または全てを使用することができる。そのようなリンカーの例は、以下に提供される。一部の場合には、反復を最小にするために、異なるアミノ酸リンカー配列が抗原ペプチド間に分布しており、または同じアミノ酸リンカー配列をコードする異なる核酸が抗原ペプチド間に分布している（例えば、配列番号８４〜９４）。これは、二次構造を低減させることによって、Ｌｍ組換えベクター株集団内の融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、プラスミド）の十分な転写、翻訳、分泌、維持または安定化を可能にすることにも役立ち得る。他の好適なペプチドリンカー配列は、例えば、次の要因の１つまたは複数に基づいて選択することができる：（１）柔軟な伸長立体構造を採ることができること、（２）抗原ペプチド上の機能性エピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと、および（３）機能性エピトープと反応する可能性がある疎水性または荷電残基を欠いていること。例えば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有し得る。他のほぼ中性のアミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａも、リンカー配列に使用され得る。リンカーとして役立つように用いることができるアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２；ＵＳ４，９３５，２３３；およびＵＳ４，７５１，１８０において開示されているものを含み、前記参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。リンカーの特定の例は、以下の表におけるもの（これらの各々は、単独でリンカーとして使用されることもあり、配列の反復を含むリンカーの状態で使用されることもあり、または表中の他の配列の１つもしくは複数をさらに含むリンカーで使用されることもある）を含むが、他のものも想定され得る（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｄｄｙ  Ｃｈｉｃｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：１５３−１６７を参照されたい）。指定されていない限り、「ｎ」は、列挙されているリンカー内の反復の未確定数を表す。
【表Ｄ】
2021502083.tif 000006
【０１０８】
ＶＧＫＧＧＳＧＧリンカー（配列番号３７）は、例えば、融合タンパク質に柔軟性および電荷平衡を提供するために使用され得る。ＥＡＡＡＫリンカー（配列番号３９）は、例えば、融合タンパク質がさもなければ自分自身にフォールディングする場合に、発現および分泌を促進するために使用され得る剛直な／堅いリンカーである。ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３６）は、例えば、発現および分泌の促進を助けるために、増加した柔軟性を融合タンパク質に与えるために使用され得る柔軟なリンカーである。「ｉ２０」リンカー（例えば、配列番号２０９〜２１７）は、例えば、イムノプロテアソームによる融合タンパク質の切断を促進し、本明細書で設計および開示されるヘテロクリティック９マーと同様に、所望される正確な最小の結合断片を得る頻度を増加させることを助けるように設計されたイムノプロテアソームリンカーである。ＧＧＧＧＳリンカーおよびＥＡＡＡＫリンカー（それぞれ配列番号３６および３９）の組合せは、例えば、改善された発現および分泌のために構築物の平衡を保つことを助け、そこから選択するためのより多くの特有のコドンを提供することによってＤＮＡ合成を促進することを助けるために、柔軟性および剛直性を交代させるために使用され得る。
【０１０９】
融合ポリペプチドは、任意の数のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含み得る。一部の場合には、融合ポリペプチドが組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株から産生および分泌されることができるように、融合ポリペプチドは、任意の数のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含む。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のヘテロクリティック抗原性ペプチド、または２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０のヘテロクリティック抗原性ポリペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、単一のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、約１〜１００、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０，４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、５〜１５、５〜２０、５〜２５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、２０〜２５、２０〜３５、２０〜４５、３０〜４５、３０〜５５，４０〜５５、４０〜６５、５０〜６５、５０〜７５、６０〜７５、６０〜８５、７０〜８５、７０〜９５、８０〜９５、８０〜１０５、９５〜１０５、５０〜１００、１〜１００、５〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、または１〜１０のヘテロクリティック抗原性ペプチドの範囲の数のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、最大約１００、１０、２０、３０、４０、または５０のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含み得る。別の例では、融合ポリペプチドは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含み得る。
【０１１０】
加えて、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質由来の任意の数のヘテロクリティック抗原性ペプチド（すなわち、同じがん関連タンパク質由来の任意の数の非連続断片）を含み得る。あるいは、融合ポリペプチドは、２つまたはそれより多くの異なるがん関連タンパク質、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のがん関連タンパク質由来の任意の数のヘテロクリティック抗原性ペプチドを含み得る。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のがん関連タンパク質、または２〜５、５〜１０、１０〜１５もしくは１５〜２０個のがん関連タンパク質由来のヘテロクリティック突然変異を含み得る。例えば、２つまたはそれより多くのがん関連タンパク質は、約２〜３０、約２〜２５、約２〜２０、約２〜１５または約２〜１０個のがん関連タンパク質であり得る。例えば、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質由来の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個のヘテロクリティック抗原性ペプチド、または同じがん関連タンパク質由来の２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５もしくは４５〜５０個のヘテロクリティック抗原性ポリペプチドを含み得る。同様に、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質由来の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個のヘテロクリティック抗原性ペプチド、または２つもしくはそれより多くの異なるがん関連タンパク質由来の２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５もしくは４５〜５０個のヘテロクリティック抗原性ポリペプチドを含み得る。加えて、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質由来の任意の数の非連続ヘテロクリティック抗原性ペプチド（すなわち、同じがん関連タンパク質由来の任意の数の非連続断片）を含み得る。例えば、融合ポリペプチドは、同じがん関連タンパク質由来の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個の非連続ヘテロクリティック抗原性ペプチド、または同じがん関連タンパク質由来の２〜５０、２〜４５、２〜４０、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５もしくは４５〜５０個の非連続ヘテロクリティック抗原性ポリペプチドを含み得る。一部の場合には、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは全てが、同じがん関連タンパク質由来の非連続ヘテロクリティック抗原性ペプチドであり、または単一のがん関連タンパク質由来のヘテロクリティック抗原性ペプチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは全てが、そのがん関連タンパク質由来の非連続ヘテロクリティック抗原性ペプチドである。
【０１１１】
各ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、異なる（すなわち、特有の）ヘテロクリティック突然変異を含み得る。あるいは、融合ポリペプチド中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち２つまたはそれより多くが、同じヘテロクリティック突然変異を含み得る。例えば、同じヘテロクリティック抗原性ポリペプチドの２つまたはそれより多くのコピーが、融合ポリペプチド中に含まれ得る（すなわち、融合ポリペプチドは、同じヘテロクリティック抗原性ペプチドの２つまたはそれより多くのコピーを含む）。一部の融合ポリペプチドでは、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、他のヘテロクリティック抗原性ペプチドのいずれにも存在しない異なる（すなわち、特有の）ヘテロクリティック突然変異を含む。
【０１１２】
一部の場合には、ヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち少なくとも２つは、同じがん関連タンパク質の重複する断片を含み得る。例えば、ヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち２つまたはそれより多くは、がん関連タンパク質の同じアミノ酸残基において異なるヘテロクリティック突然変異を含み得る。
【０１１３】
一部のヘテロクリティック抗原性ペプチドは、少なくとも２つの異なるヘテロクリティック突然変異、少なくとも３つの異なるヘテロクリティック突然変異、または少なくとも４つの異なるヘテロクリティック突然変異を含み得る。
【０１１４】
ヘテロクリティック突然変異の任意の組合せが、融合ポリペプチド中に含まれ得る。例えば、１つまたは複数の異なるＨＬＡ型に結合するヘテロクリティック抗原性ペプチドが含まれ得る。例えば、次のＨＬＡ型のうち１つまたは複数または全てに結合するヘテロクリティック抗原性ペプチドが識別され得る：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２。
【０１１５】
融合ポリペプチド中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの各々は、同じがん関連タンパク質由来のヘテロクリティック突然変異を含み得、または融合ポリペプチド中のヘテロクリティック抗原性ペプチドの組合せは、２つもしくはそれより多くのがん関連タンパク質由来のヘテロクリティック突然変異を含み得る。例えば、融合ポリペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のがん関連タンパク質、または２〜５、５〜１０、１０〜１５もしくは１５〜２０個のがん関連タンパク質由来のヘテロクリティック突然変異を含み得る。例えば、２つまたはそれより多くのがん関連タンパク質は、約２〜３０、約２〜２５、約２〜２０、約２〜１５または約２〜１０個のがん関連タンパク質であり得る。一例では、ヘテロクリティック抗原性ペプチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、同じがん関連タンパク質由来のヘテロクリティック突然変異を含む。別の例では、ヘテロクリティック抗原性ペプチドのいずれも、同じがん関連タンパク質由来のヘテロクリティック突然変異を含まない。
【０１１６】
ヘテロクリティック抗原性ペプチドの例示的な配列は、本明細書中の他の箇所で開示される。例として、ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、本明細書で開示される抗原性ペプチド配列のいずれかに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な配列を含み得る、それから本質的になり得る、またはそれからなり得る。
【０１１７】
一例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１およびＲＮＦ４３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、ヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全て、あるいは、例えば、表３中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全てを含むペプチドを含み得る。
【０１１８】
別の例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡおよびＰＳＡ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、前立腺がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表５中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表５中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０１１９】
別の例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴおよびＳＵＲＶＩＶＩＮ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、すい臓がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表７中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、または１２個全て、あるいは、例えば、表７中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、または１２個全てを含むペプチドを含み得る。
【０１２０】
別の例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３およびＰＲＡＭＥ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、膀胱がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全て、あるいは、例えば、表９中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、または１３個全てを含むペプチドを含み得る。
【０１２１】
別の例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１１中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全て、あるいは、例えば、表１１中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全てを含むペプチドを含み得る。
【０１２２】
別の例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴ、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびＳＡＲＴ３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、子宮がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全て、あるいは、例えば、表１３中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全てを含むペプチドを含み得る。
【０１２３】
別の例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、卵巣がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１５中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全て、あるいは、例えば、表１５中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全てを含むペプチドを含み得る。
【０１２４】
別の例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、低悪性度神経膠腫に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１７中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表１７中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０１２５】
別の例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３およびＭＡＧＥＡ３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表１９中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０１２６】
別の例として、組換え融合ポリペプチドは、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチドを含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＮＹＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、頭頸部がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表２１中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表２１中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
Ｂ．ＰＥＳＴ含有ペプチド
【０１２７】
本明細書で開示される組換え融合タンパク質は、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含む。ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）（すなわち、抗原ペプチドのＮ末端）にあることもあり、融合ポリペプチドのカルボキシ末端（Ｃ末端）（すなわち、抗原ペプチドのＣ末端）にあることもあり、または抗原ペプチド中に埋め込まれていることもある。一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株および方法では、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドの一部ではなく、融合ポリペプチドとは別である。ＬＬＯペプチドなどの抗原ペプチドのＰＥＳＴ様配列への融合は、抗原ペプチドの免疫原性を増強することができ、細胞により媒介される抗腫瘍免疫応答を増大させる（すなわち、細胞により媒介される抗腫瘍免疫を増大させる）ことができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５（６）：３６６３−３６７３を参照されたい。
【０１２８】
ＰＥＳＴ含有ペプチドは、ＰＥＳＴ配列またはＰＥＳＴ様配列を含むものである。真核生物タンパク質中のＰＥＳＴ配列は、かなり前に同定されている。例えば、いくつかの正荷電アミノ酸を含有するクラスターに常にではないが一般に隣接している、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）（ＰＥＳＴ）を多く含むアミノ酸配列を含有するタンパク質は、急速な細胞内半減期を有する（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：３６４−３６９）。さらに、これらの配列は、タンパク質を、分解のためにユビキチン−プロテオソーム経路の標的にすることが報告されている（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２１：２６７−２７１）。この経路は、ＭＨＣクラスＩと結合する免疫原性ペプチドを生成するために真核細胞によっても使用され、ＰＥＳＴ配列が免疫原性ペプチドを生じさせる真核生物タンパク質において大量に存在するという仮説が立てられている（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４８：１０９−１１３）。原核生物タンパク質は、ＰＥＳＴ配列を通常は含有しない。なぜなら、これらのタンパク質は、この酵素経路を有さないからである。しかし、アミノ酸プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）を多く含むＰＥＳＴ様配列が、ＬＬＯのアミノ末端で報告されており、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ病原性に不可欠であると報告されている（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｃａｔｕｒ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ  （２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９９２−９９５）。ＬＬＯにおけるこのＰＥＳＴ様配列の存在によって、タンパク質は、宿主細胞のタンパク質分解機構による分解の標的にされ、その結果、ＬＬＯが、その機能を果たし、ファゴソームまたはファゴリソソームの空胞からのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの逃避を助長したら後、そのタンパク質は、細胞を損傷させ得る前に破壊される。
【０１２９】
ＰＥＳＴおよびＰＥＳＴ様配列の同定は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４（４７７４）：３６４−３７８に、およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。ＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様配列は、ＰＥＳＴ発見プログラムを使用して同定することができる。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）残基を多く含む領域であり得る。必要に応じて、ＰＥＳＴ様配列に、いくつかの正荷電アミノ酸を含有する１つまたは複数のクラスターを隣接させることができる。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、アスパルテート（Ｄ）、グルタメート（Ｅ）、セリン（Ｓ）および／またはトレオニン（Ｔ）残基の高い局所的濃度を有する長さ少なくとも１２アミノ酸の親水性ストレッチと定義され得る。一部の場合には、ＰＥＳＴ様配列は、正荷電アミノ酸、すなわち、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリシン（Ｋ）を含有しない。一部のＰＥＳＴ様配列は、１つまたは複数の内部リン酸化部位を含有することがあり、これらの部位でのリン酸化がタンパク質分解に先行する。
【０１３０】
一例では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．において開示されているアルゴリズムに適合する。別の例では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓにおいて開示されているアルゴリズムに適合する。ＰＥＳＴ様配列を、指定タンパク質配列内の正荷電アミノ酸Ｒ、ＨおよびＫについて最初にスキャンすることにより同定することもできる。両脇が正電荷を有する全てのアミノ酸が計数され、ウインドウサイズパラメーターと等しいまたはそれより多い数のアミノ酸を含有するモチーフのみがさらに考慮される。必要に応じて、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１つのＰ、少なくとも１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含有しなければならない。
【０１３１】
ＰＥＳＴモチーフの質を、重要なアミノ酸の局所的濃縮とモチーフの疎水性とに基づくスコアリングパラメーターによって、改善することができる。Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＴの濃縮は、質量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、１個相当のＤまたはＥ、１個相当のＰ、および１個相当のＳまたはＴについて補正される。疎水性の計算はまた、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  （１９８２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５の方法に、原則的に従うこともある。簡易計算のために、元々はアルギニンについての−４．５からイソロイシンについての＋４．５までの範囲であるＫｙｔｅ・Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数が、次の線形変換を使用して正の整数に変換され、この変換によってアルギニンについての０からイソロイシンについての９０までの値が得られた：ハイドロパシー指数＝１０×Ｋｙｔｅ・Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数＋４５。
【０１３２】
可能性のあるＰＥＳＴモチーフの疎水性を、各アミノ酸種についての（モルパーセントと疎水性指数の積の和として計算することもできる。所望のＰＥＳＴスコアは、次の方程式によって表されるような、局所的濃縮の項と疎水性の項の組合せとして得られる：ＰＥＳＴスコア＝０．５５×ＤＥＰＳＴ−０．５×疎水性指数。
【０１３３】
したがって、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、上記アルゴリズムを使用して少なくとも＋５のスコアを有するペプチドを指すことができる。あるいは、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３２、少なくとも３５、少なくとも３８、少なくとも４０、または少なくとも４５のスコアを有するペプチドを指すことができる。
【０１３４】
当該技術分野で公知の任意の他の利用可能な方法またはアルゴリズムを使用してＰＥＳＴ様配列を同定することもできる。例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を参照されたい。使用することができる別の方法は、次のものである：アミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｎに１の値を割り当てることにより、適切な長さの各ストレッチ（例えば、３０〜３５アミノ酸ストレッチ）についてＰＥＳＴ指数が算出される。ＰＥＳＴ残基の各々についての係数値（ＣＶ）は１であり、他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）の各々についてのＣＶはゼロである。
【０１３５】
ＰＥＳＴ様アミノ酸配列の例は、配列番号４３〜５１に記載される。ＰＥＳＴ様配列の一例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号４３）である。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号４４）である。しかし、任意のＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様アミノ酸配列を使用することができる。ＰＥＳＴ配列ペプチドは公知であり、例えば、ＵＳ７，６３５，４７９、ＵＳ７，６６５，２３８、およびＵＳ２０１４／０１８６３８７に記載されており、これらの参考特許文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
ＰＥＳＴ様配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種から、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからであり得る。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも４つのそのような配列（配列番号４５〜４８）を含有し、これらのいずれの配列も、本明細書で開示される組成物および方法での使用に好適である。他の類似のＰＥＳＴ様配列としては、配列番号５２〜５４が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．からのストレプトリジンＯタンパク質も、ＰＥＳＴ配列を含有する。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓストレプトリジンＯは、ＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号４９）をアミノ酸３５〜５１に含み、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓストレプトリジンＯは、ＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号５０）をアミノ酸３８〜５４に含む。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、ｌｓｏ遺伝子によってコードされる、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ細胞溶解素から：ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（例えば、配列番号５１）である。
【０１３７】
あるいは、ＰＥＳＴ様配列は、他の原核生物に由来することもある。ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が予想される他の原核生物は、例えば、他のＬｉｓｔｅｒｉａ種を含む。
（１）リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）
【０１３８】
本明細書で開示される組成物および方法において利用することができるＰＥＳＴ含有ペプチドの一例は、リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）ペプチドである。ＬＬＯタンパク質の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１３１２８（配列番号５５；核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１５１２７に記載されている）で指定されるタンパク質である。配列番号５５は、シグナル配列を含むプロタンパク質である。このプロタンパク質の最初の２５アミノ酸は、シグナル配列であり、それが細菌により分泌されるときにＬＬＯから切断されることによって、シグナル配列のない５０４アミノ酸の完全長活性ＬＬＯタンパク質が生じる結果となる。本明細書で開示されるＬＬＯペプチドは、シグナル配列を含むこともあり、またはシグナル配列を含まないペプチドを含むこともある。使用することができる例示的なＬＬＯタンパク質は、配列番号５５に記載の配列、もしくは配列番号５５のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片を含むか、そのようなものから本質的になるか、またはそのようなものからなる。ＬＬＯタンパク質の断片、またはＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、ホモログの断片、バリアントの断片もしくはアナログの断片をコードする、任意の配列を使用することができる。相同ＬＬＯタンパク質は、参照ＬＬＯタンパク質との配列同一性、例えば、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い配列同一性を有することができる。
【０１３９】
ＬＬＯタンパク質の別の例は、配列番号５６に記載される。使用することができるＬＬＯタンパク質は、配列番号５６に記載の配列、もしくは配列番号５６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片を含み得るか、そのようなものから本質的になり得るか、またはそのようなものからなり得る。
【０１４０】
ＬＬＯタンパク質の別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＺＰ＿０１９４２３３０もしくはＥＢＡ２１８３３に記載されているような、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＲＺ０１００００１５またはＡＡＲＺ０１００００１５．１に記載の核酸配列によってコードされるような、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株からのＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ４ｂ  Ｆ２３６５株からのＬＬＯタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０１２８２３を参照されたい）、ＥＧＤ−ｅ株からのＬＬＯタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４６３７３３を参照されたい）、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの任意の他の株からのＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質のさらに別の例は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ細菌ＨＴＣＣ２１７０からのＬＬＯタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＺＰ＿０１１０６７４７もしくはＥＡＲ０１４３３を参照されたく、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＯＣ０１０００００３によってコードされる）である。使用することができるＬＬＯタンパク質は、上記ＬＬＯタンパク質、もしくは上記ＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片のいずれかを含み得るか、そのようなものから本質的になり得るか、またはそのようなものからなり得る。
【０１４１】
ＬＬＯの相同なタンパク質、またはそれらのホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片も、使用することができる。１つのそのような例は、例えばＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉにおいて見つけることができる、アルベオリジンである（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２３５６４もしくはＡＡＡ２２２２４を参照されたく、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６２７０９によりコードされる）。他のそのような相同タンパク質は公知である。
【０１４２】
ＬＬＯペプチドは、完全長ＬＬＯタンパク質、短縮型ＬＬＯタンパク質、またはＬＬＯ断片であり得る。同様に、ＬＬＯペプチドは、ネイティブＬＬＯタンパク質の１つもしくは複数の機能性を保持するものであることもあり、またはネイティブＬＬＯタンパク質の１つもしくは複数の機能性を欠いているものであることもある。例えば、保持されるＬＬＯ機能性は、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）によるファゴソームもしくはファゴリソソームからの逃避を可能にすること、またはそれと融合されているペプチドの免疫原性を増強することであり得る。保持される機能性は、溶血機能または抗原機能でもあり得る。あるいは、ＬＬＯペプチドは、非溶血性ＬＬＯであり得る。ＬＬＯの他の機能は公知であり、ＬＬＯ機能性を評価するための方法およびアッセイも公知である。
【０１４３】
ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ様配列であることもあり、またはＰＥＳＴ様配列を含むこともある。ＬＬＯ断片は、内部欠失、Ｃ末端からの短縮化およびＮ末端からの短縮化の１つまたは複数を含み得る。一部の場合には、ＬＬＯ断片は、１つより多くの内部欠失を含み得る。他のＬＬＯペプチドは、１つまたは複数の突然変異を有する完全長ＬＬＯタンパク質であり得る。
【０１４４】
一部のＬＬＯタンパク質または断片は、野生型ＬＬＯと比較して低下した溶血活性を有するか、または非溶血性断片である。例えば、ＬＬＯタンパク質を、カルボキシ末端における活性化ドメインの欠失もしくは突然変異によって、システイン４８４の欠失もしくは突然変異によって、または別の位置における欠失もしくは突然変異によって非溶血性にすることができる。
【０１４５】
他のＬＬＯタンパク質は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，７７１，７０２において詳述されているようなコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。突然変異は、例えば、置換または欠失を含み得る。ＣＢＤ全体を突然変異させることができ、ＣＢＤの部分を突然変異させることができ、またはＣＢＤ内の特定の残基を突然変異させることができる。例えば、ＬＬＯタンパク質は、配列番号５５の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１およびＷ４９２の１つもしくは複数（例えば、Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、Ｃ４８４およびＷ４９１、Ｃ４８４およびＷ４９２、Ｗ４９１およびＷ４９２、もしくは３つの残基全て）の突然変異、または配列番号５５と最適にアラインメントされたときに一致する残基（例えば、一致するシステインもしくはトリプトファン残基）の突然変異を含み得る。例として、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１およびＷ４９２がアラニン残基で置換されている突然変異ＬＬＯタンパク質を作出することができ、この置換によって、溶血活性が野生型ＬＬＯと比較して実質的に低下されることになる。Ｃ４８４Ａ、Ｗ４９１ＡおよびＷ４９２Ａ突然変異を有する突然変異ＬＬＯタンパク質は、「ｍｕｔＬＬＯ」と称される。
【０１４６】
別の例として、コレステロール結合ドメインを含む内部欠失を有する突然変異ＬＬＯタンパク質を作出することができる。配列番号７４に記載される、配列番号５５のコレステロール結合ドメインの配列。例えば、内部欠失は、１〜１１アミノ酸欠失であることもあり、１１〜５０アミノ酸欠失であることもあり、またはそれより長いこともある。同様に、突然変異した領域は、１〜１１アミノ酸であることもあり、１１〜５０アミノ酸であることもあり、またはそれより長いこともある（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００、もしくは３０〜１５０アミノ酸）。例えば、配列番号５５の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００からなる突然変異した領域は、ＣＢＤを含む欠失した配列（配列番号５５の残基４８３〜４９３）をもたらすことになる。しかし、突然変異した領域は、ＣＢＤの断片であることもあり、またはＣＢＤの一部分と重複することもある。例えば、突然変異した領域は、配列番号５５の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４８５〜４９０、４８６〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０からなり得る。例えば、ＣＢＤの断片（残基４８４〜４９２）を異種配列で置き換えることができ、これによって溶血活性が野生型ＬＬＯと比較して実質的に低下されることになる。例えば、ＣＢＤ（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ；配列番号７４）を、ＮＹ−ＥＯＳ−１からのＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ１５７〜１６５を含有する、抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１からのＣＴＬエピトープ（ＥＳＬＬＭＷＩＴＱＣＲ；配列番号７５）で、置き換えることができる。結果として生じるＬＬＯは、「ｃｔＬＬＯ」と称される。
【０１４７】
一部の突然変異したＬＬＯタンパク質では、突然変異した領域は、異種配列によって置き換えられていることがある。例えば、突然変異した領域は、等数の異種アミノ酸、より少数の異種アミノ酸、またはより多数のアミノ酸（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００、もしくは３０〜１５０アミノ酸）によって置き換えられていることがある。他の突然変異したＬＬＯタンパク質は、１つまたは複数の点突然変異（例えば、１残基、２残基、３残基、またはそれより多くの残基の点突然変異）を有する。突然変異した残基は、連続していることもあり、または連続していないこともある。
【０１４８】
１つの例の実施形態では、ＬＬＯペプチドは、シグナル配列に欠失を、およびＣＢＤに突然変異または置換を有し得る。
【０１４９】
一部のＬＬＯペプチドは、Ｎ末端ＬＬＯ断片（すなわち、Ｃ末端欠失を有するＬＬＯタンパク質）である。一部のＬＬＯペプチドは、長さ少なくとも４９４、４８９、４９２、４９３、５００、５０５、５１０、５１５、５２０もしくは５２５アミノ酸であるか、または長さ４９２〜５２８アミノ酸である。例えば、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の約４４０または４４１アミノ酸（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４４１アミノ酸、または別のＬＬＯタンパク質の配列番号５５もしくは５６と最適にアラインメントされたときに一致する断片）からなり得る。他のＮ末端ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４２０アミノ酸（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４２０アミノ酸、または別のＬＬＯタンパク質の配列番号５５もしくは５６と最適にアラインメントされたときに一致する断片）からなり得る。他のＮ末端断片は、ＬＬＯタンパク質の約アミノ酸２０〜４４２（例えば、配列番号５５もしくは５６のアミノ酸２０〜４４２、または別のＬＬＯタンパク質の配列番号５５もしくは５６と最適にアラインメントされたときに一致する断片）からなり得る。他のＮ末端ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含む活性化ドメインのない、特に、システイン４８４のない、任意のΔＬＬＯを含む。例えば、Ｎ末端ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０または２５アミノ酸（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０もしくは２５アミノ酸、または別のＬＬＯタンパク質の配列番号５５もしくは５６と最適にアラインメントされたときに一致する断片）に相当し得る。好ましくは、断片は、１つまたは複数のＰＥＳＴ様配列を含む。ＬＬＯ断片および短縮型ＬＬＯタンパク質は、上記の特定のアミノ酸範囲のいずれか１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有し得る。残基数は、上に列挙した残基数と正確に一致する必要はない（例えば、相同ＬＬＯタンパク質が、本明細書で開示される特定のＬＬＯタンパク質と比較して挿入または欠失を有する場合）。Ｎ末端ＬＬＯ断片の例としては、配列番号５７、５８および５９が挙げられる。使用することができるＬＬＯタンパク質は、配列番号５７、５８もしくは５９に記載の配列、または配列番号５７、５８もしくは５９のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片を含むか、そのようなものから本質的になるか、あるいはそのようなものからなる。一部の組成物および方法では、配列番号５９に記載のＮ末端ＬＬＯ断片が使用される。配列番号５９に記載のＮ末端ＬＬＯ断片をコードする核酸配列の例は、配列番号６０である。
（２）ＡｃｔＡ
【０１５０】
本明細書で開示される組成物および方法に利用することができるＰＥＳＴ含有ペプチドの別の例は、ＡｃｔＡペプチドである。ＡｃｔＡは、表面結合タンパク質であり、感染した宿主細胞において細胞質を通ってＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを前進させるための宿主アクチンポリマーの重合、集合および活性化を助長するために足場として作用する。哺乳動物細胞サイトゾルへの侵入の直後に、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、宿主アクチンフィラメントの重合を誘導し、アクチン重合によって生じた力を使用して先ずは細胞内に移動し、次いで細胞から細胞へと移動する。ＡｃｔＡは、アクチン核形成およびアクチンに基づく運動性の媒介に関与している。ＡｃｔＡタンパク質は、宿主細胞骨格成分のための複数の結合部位を提供することによって、細胞のアクチン重合機構を集合させるための足場として作用する。ＡｃｔＡのＮ末端は、モノマーアクチンと結合し、内因性アクチン核形成活性を刺激することにより構成的に活性な核形成促進因子として作用する。ａｃｔＡおよびｈｌｙ遺伝子は両方とも、転写活性化因子ＰｒｆＡにより調節される１０ｋｂ遺伝子クラスターのメンバーであり、ａｃｔＡは、哺乳動物サイトゾルにおいておおよそ２２６倍上方調節される。ＡｃｔＡタンパク質、またはＡｃｔＡタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、ホモログの断片、バリアントの断片もしくはアナログの断片をコードする、任意の配列を、使用することができる。相同ＡｃｔＡタンパク質は、参照ＡｃｔＡタンパク質との配列同一性、例えば、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い配列同一性を有することができる。
【０１５１】
ＡｃｔＡタンパク質の一例は、配列番号６１に記載の配列を含むか、この配列から本質的になるか、この配列からなる。ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、配列番号６２に記載の配列を含むか、この配列から本質的になるか、またはこの配列からなる。これらの配列のどちらかに対応するプロタンパク質の最初の２９アミノ酸は、シグナル配列であり、そのプロタンパク質が細菌により分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から切断される。ＡｃｔＡペプチドは、シグナル配列（例えば、配列番号６１もしくは６２のアミノ酸１〜２９）を含むこともあり、またはシグナル配列を含まないペプチドを含むこともある。ＡｃｔＡタンパク質の他の例は、配列番号６１または６２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、アイソフォームの断片またはアナログの断片を含むか、そのようなものから本質的になるか、またはそのようなものからなる。
【０１５２】
ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００２株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ  ５３４８株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００６株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６４）、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの任意の他の株からのＡｃｔＡタンパク質である。使用することができるＬＬＯタンパク質は、上記ＬＬＯタンパク質、または上記ＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片のいずれかを含み得るか、そのようなものから本質的になり得るか、またはそのようなものからなり得る。
【０１５３】
ＡｃｔＡペプチドは、完全長ＡｃｔＡタンパク質、または短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＡｃｔＡ断片（例えば、Ｃ末端部分が除去されたＮ末端ＡｃｔＡ断片）であり得る。好ましくは、短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも１つのＰＥＳＴ配列（例えば、１つより多くのＰＥＳＴ配列）を含む。加えて、短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、必要に応じて、ＡｃｔＡシグナルペプチドを含み得る。短縮型ＡｃｔＡタンパク質に含有されるＰＥＳＴ様配列の例としては、配列番号４５〜４８が挙げられる。一部のそのような短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号４５〜４８に記載のＰＥＳＴ様配列のうちの少なくとも２つもしくはそれらのホモログ、配列番号４５〜４８に記載のＰＥＳＴ様配列のうちの少なくとも３つもしくはそれらのホモログ、または配列番号４５〜４８に記載のＰＥＳＴ様配列の４つ全てもしくはそれらのホモログを含む。短縮型ＡｃｔＡタンパク質の例としては、完全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）の約残基３０〜１２２、約残基３０〜２２９、約残基３０〜３３２、約残基３０〜２００、もしくは約残基３０〜３９９を含むもの、そのような残基から本質的になるもの、またはそのような残基からなるものが挙げられる。短縮型ＡｃｔＡタンパク質の他の例としては、完全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）の最初の約５０、１００、１５０、２００、２３３、２５０、３００、３９０、４００もしくは４１８残基を含むもの、そのような残基から本質的になるもの、またはそのような残基からなるものが挙げられる。短縮型ＡｃｔＡタンパク質の他の例としては、完全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）の約残基２００〜３００もしくは残基３００〜４００を含むもの、そのような残基から本質的になるもの、またはそのような残基からなるものが挙げられる。例えば、短縮型ＡｃｔＡは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，６５５，２３８に記載されているような野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０アミノ酸からなる。別の例として、短縮型ＡｃｔＡは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０１８６３８７に記載されているような、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修飾バージョン（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と呼ばれる）であり得、前記修飾バージョンは、ＰＥＳＴモチーフが欠失されており、非保存的ＱＤＮＫＲ（配列番号７３）置換を含有する。あるいは、短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、上記アミノ酸範囲または本明細書で開示されるＡｃｔＡペプチドのいずれかについてのアミノ酸範囲のうちの１つに対応する、相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有し得る。残基数は、本明細書に列挙される残基数と正確に一致する必要はない（例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が、本明細書で用いられるＡｃｔＡタンパク質と比較して挿入または欠失を有する場合には、それに応じて残基数を調整することができる）。
【０１５４】
短縮型ＡｃｔＡタンパク質の例としては、例えば、配列番号６３、６４、６５もしくは６６に記載の配列、または配列番号６３、６４、６５もしくは６６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、バリアントの断片、アイソフォームの断片もしくはアナログの断片を含むタンパク質、そのようなものから本質的になるタンパク質、あるいはそのようなものからなるタンパク質が挙げられる。配列番号６３は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれ、配列番号６２に記載の完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜１２２からなる。配列番号６４は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２またはＬＡ２２９と呼ばれ、配列番号６２に記載の完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜２２９からなる。配列番号６５は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と呼ばれ、配列番号６２に記載の完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３３２からなる。配列番号６６は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と呼ばれ、配列番号６２に記載の完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３９９からなる。特定の例として、配列番号６４に記載の配列からなる短縮型ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。
【０１５５】
短縮型ＡｃｔＡタンパク質の例としては、例えば、配列番号６７、６９、７０もしくは７２に記載の配列、または配列番号６７、６９、７０もしくは７２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、バリアントの断片、アイソフォームの断片もしくはアナログの断片を含むタンパク質、そのようなものから本質的になるタンパク質、あるいはそのようなものからなるタンパク質が挙げられる。特定の例として、配列番号６７に記載の配列（配列番号６８に記載の核酸によってコードされる）からなる短縮型ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。別の特定の例として、配列番号７０に記載の配列（配列番号７１に記載の核酸によってコードされる）からなる短縮型ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。配列番号７１は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株におけるＡｃｔＡをコードする最初の１１７０ヌクレオチドである。一部の場合には、ＡｃｔＡ断片を異種シグナルペプチドに融合させることができる。例えば、配列番号７２は、Ｈｌｙシグナルペプチドに融合されているＡｃｔＡ断片を示す。
Ｃ．組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物の生成
【０１５６】
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物または前記組換え融合ポリペプチドを含む組成物を生成する方法も、本明細書で提供される。例えば、そのような方法は、免疫療法構築物に含めるための抗原ペプチドを選択するおよび設計する（および、例えば、各抗原ペプチドのハイドロパシーを試験し、抗原ペプチドを、それが選択されたハイドロパシー指数閾値より上のスコアを有する場合、修飾するまたは選択から外す）ステップと、選択された抗原ペプチドの各々を含む１つまたは複数の融合ポリペプチドを設計するステップと、融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップとを含むことができる。
【０１５７】
抗原ペプチドを疎水性または親水性についてスクリーニングすることができる。抗原ペプチドを、例えば、それらが親水性である場合、またはそれらが、目的の特定の細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）における分泌可能性を予示し得る、最大で、ある特定のハイドロパシー閾値もしくはそれ未満のスコアを有する場合、選択することができる。例えば、抗原ペプチドをＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によって２１アミノ酸ウインドウでスコア化することができ、カットオフ（およそ１．６）より上のスコアを有する全てが除外される。それらは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより分泌される可能性が低いからである。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  （１９８２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５７（１）：１０５−１３２を参照されたい。あるいは、約選択カットオフのスコアを有する抗原ペプチドを変更することができる（例えば、抗原ペプチドの長さを変えること）。使用することができる他のスライディングウインドウサイズとしては、例えば、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７アミノ酸またはそれより多いアミノ酸数が挙げられる。例えば、スライディングウインドウサイズは、９〜１１アミノ酸、１１〜１３アミノ酸、１３〜１５アミノ酸、１５〜１７アミノ酸、１７〜１９アミノ酸、１９〜２１アミノ酸、２１〜２３アミノ酸、２３〜２５アミノ酸、または２５〜２７アミノ酸であり得る。使用することができる他のカットオフとしては、例えば、次の範囲１．２〜１．４、１．４〜１．６、１．６〜１．８、１．８〜２．０、２．０〜２．２、２．２〜２．５、２．５〜３．０、３．０〜３．５、３．５〜４．０、もしくは４．０〜４．５が挙げられ、またはカットオフは、１．４、１．５、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．３、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、もしくは４．５であり得る。カットオフは、例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用される細菌の属または種によって変わり得る。
【０１５８】
他の好適なハイドロパシープロットまたは他の適切な尺度は、例えば、Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ２２：３８１−４１５；Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １０００：６３７−６５５；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  （１９８４）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５３：５９５−６２３；Ａｂｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｌｅｏ  （１９８７）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１３０−１５２；Ｓｗｅｅｔ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  （１９８３）  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７１：４７９−４８８；Ｂｕｌｌ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｓｅ  （１９７４）  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １６１：６６５−６７０；Ｇｕｙ  （１９８５）  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ４７：６１−７０；Ｍｉｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １８：５３４−５５２；Ｒｏｓｅｍａｎ  （１９８８）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００：５１３−５２２；Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：８４９−８５５；Ｗｉｌｓｏｎ  （１９８１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９：３１−４１；Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  （１９９０）  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０；Ａｂｏｄｅｒｉｎ  （１９７１）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２：５３７−５４４；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７９：１２５−１４２；Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  （１９８１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；Ｍａｎａｖａｌａｎ  ａｎｄ  Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  （１９７８）  Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６７３−６７４；Ｂｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｍｏｕｌｄ  （１９９１）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９３：７２−８２；Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ａｎｄ  Ｐｌｉｓｋａ  （１９８３）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １８：３６９−３７５；Ｊａｎｉｎ  （１９７９）  Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２；Ｒａｏ  ａｎｄ  Ａｒｇｏｓ  （１９８６）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８６９：１９７−２１４；Ｔａｎｆｏｒｄ  （１９６２）  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８４：４２４０−４２７４；Ｗｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １８８：２１５−２１８；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５４２５−５４３１；およびＣｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  （１９９０）  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０において報告されているものを含み、前記参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
必要に応じて、抗原ペプチドを、対象ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型と結合するそれらの能力について（例えば、ｎｅｔＭＨＣｐａｎ、ＡＮＮ、ＳＭＭＰＭＢＥＣ．ＳＭＭ、ＣｏｍｂＬｉｂ＿Ｓｉｄｎｅｙ２００８、ＰｉｃｋＰｏｃｋｅｔ、およびｎｅｔＭＨＣｃｏｎｓを含む、ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇで入手可能なＩｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤ）を使用することによって）スコア化し、各抗原ペプチドからの最高ＭＨＣ結合スコアによって順位付けすることができる。他の情報源は、ＴＥｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｐｒｅｄｉｃｔ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）または他の入手可能なＭＨＣ結合測定尺度を含む。異なる発現ベクター、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａについては、カットオフが異なり得る。
【０１６０】
必要に応じて、抗原ペプチドを免疫抑制性エピトープ（例えば、Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導ヘルパーＴエピトープなど）についてスクリーニングして、抗原ペプチドを選択から外すこと、または免疫抑制の影響を回避することができる。
【０１６１】
必要に応じて、エピトープの免疫原性についての予測アルゴリズム使用して抗原ペプチドをスクリーニングすることができる。しかし、これらのアルゴリズムは、どのペプチドがＴ細胞応答を生じさせるかを予測する点での正確度が最高２０％である。あるいは、いかなるスクリーニング／予測アルゴリズムも使用されない。あるいは、抗原ペプチドを免疫原性についてスクリーニングすることができる。例えば、このスクリーニングは、１つまたは複数のＴ細胞を抗原ペプチドと接触させるステップと、免疫原性Ｔ細胞応答について分析するステップとを含むことができ、前記分析において免疫原性Ｔ細胞応答によりペプチドは免疫原性ペプチドとして同定される。このスクリーニングは、免疫原性アッセイを使用して、１つもしくは複数のＴ細胞をペプチドと接触させることによって、ＣＤ２５、ＣＤ４４もしくはＣＤ６９のうちの少なくとも１つの分泌を測定する、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−２を含む群から選択されるサイトカインの分泌を測定するステップも含むことができ、前記測定において分泌の増加により前記ペプチドは１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含むと同定される。
【０１６２】
選択された抗原ペプチドを、可能性のある融合ポリペプチドの１つまたは複数の候補順序に配列することができる。抗原ペプチドが、単一のプラスミドに適合し得るばかりでなくそれ以外に使用可能である場合、異なる抗原ペプチドに必要／所望に応じて優先順位を指定することができ、および／または異なる抗原ペプチドを異なる融合ポリペプチドに（例えば、異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株への組み入れのために）分配することができる。優先順位は、翻訳されたポリペプチドの相対サイズ、転写の優先度、および／または全体の疎水性などの要因によって決定することができる。抗原ペプチドを、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示されるように、それらが、リンカーもリンカーのいずれの組合せも伴わずに任意の数の抗原ペプチドペア間で直接連結されるように配列することができる。含めることになる直鎖状抗原ペプチドの数は、突然変異量に対する必要とされる構築物の数、単一のプラスミドからの複数のエピトープの翻訳および分泌効率、ならびにプラスミドを含む各細菌またはＬｍに必要とされるＭＯＩについての考慮に基づいて、決定することができる。
【０１６３】
疎水性について同じくスコア化される、抗原ペプチドの組合せ、または全融合ポリペプチド（すなわち、抗原ペプチドとＰＥＳＴ含有ペプチドと任意のタグとを含む）。例えば、融合した抗原ペプチドの全体、または全融合ポリペプチドを、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によりスライディング２１アミノ酸ウインドウでハイドロパシーについてスコア化することができる。いずれかの領域が、カットオフ（例えば、およそ１．６）より上のスコアを有する場合、抗原ペプチドを、融合ポリペプチド内で、抗原ペプチドの許容される順序（すなわち、いずれの領域もカットオフより上のスコアを有さないもの）が見出されるまで、並べ替えるまたはシャッフルすることができる。あるいは、任意の問題のある抗原ペプチドを除去することができ、または異なるサイズのものになるように再設計することができる。あるいはまたは加えて、本明細書中の他の箇所で開示されるような抗原ペプチド間の１つまたは複数のリンカーを付加または修飾して疎水性を変化させることができる。個々の抗原ペプチドについてのハイドロパシー試験と同様に、他のウインドウサイズを使用することができ、または他のカットオフを使用することができる（例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用される細菌の属または種に依存して）。加えて、他の好適なハイドロパシープロットまたは他の適切な尺度を使用することができよう。
【０１６４】
必要に応じて、抗原ペプチドの組合せまたは全融合ポリペプチドを、免疫抑制性エピトープ（例えば、Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導ヘルパーＴエピトープなど）についてさらにスクリーニングして、抗原ペプチドを選択から外すこと、または免疫抑制の影響を回避することができる。
【０１６５】
次いで、抗原ペプチドの組合せ候補または融合ポリペプチドをコードする核酸を設計および最適化することができる。例えば、配列を、翻訳レベル、発現期間、分泌レベル、転写レベルおよびこれらの任意の組合せの増加のために、最適化することができる。例えば、増加は、対照、非最適化配列と比較して、２倍〜１０００倍、２倍〜５００倍、２倍〜１００倍、２倍〜５０倍、２倍〜２０倍、２倍〜１０倍、または３倍〜５倍であり得る。
【０１６６】
例えば、融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸を、オリゴヌクレオチド配列において形成される可能性のある二次構造のレベルの低下のために最適化することができ、または代替的に、配列を修飾し得る任意の酵素の結合を防止するために最適化することができる。細菌細胞における発現は、例えば、転写サイレンシング、短いｍＲＮＡ半減期、二次構造形成、リプレッサーおよび阻害剤などのオリゴヌクレオチド結合分子の結合部位、ならびに希少ｔＲＮＡプールの利用可能性によって妨げられることがある。細菌発現に関する多くの問題の原因は、元の配列内に見られる。ＲＮＡの最適化は、シス作用性エレメントの修飾、そのＧＣ含量の適応、細菌細胞の非限定的ｔＲＮＡプールに対するコドンバイアスの修正、および内部相同領域の回避を含み得る。したがって、配列を最適化することは、例えば、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域を調整することを、必然的に伴い得る。配列を最適化することは、例えば、次のシス作用性モチーフのうちの１つまたは複数を回避することも、必然的に伴い得る：内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位およびリボソーム侵入部位；ＡＴリッチもしくはＧＣリッチ配列ストレッチ；反復配列およびＲＮＡ二次構造；（隠れた）スプライスドナーおよびアクセプター部位；分岐点；またはこれらの組合せ。発現を最適化することは、プラスミド内の遺伝子の隣接領域および／または他の場所に配列エレメントを付加させることも、必然的に伴う。
【０１６７】
配列を最適化することは、例えば、宿主遺伝子（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子）のコドンバイアスにコドン使用頻度を適応させることも、必然的に伴い得る。例えば、以下のコドンがＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに使用され得る。
【表Ｅ】
2021502083.tif 000007
【０１６８】
融合ポリペプチドをコードする核酸を生成し、送達ビヒクル、例えば、細菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に導入することができる。ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子などの、他の送達ビヒクルは、ＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法に好適であり得る。融合ポリペプチドをコードするプラスミドを生成し、細菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に導入すると、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を培養し、特徴付けて、抗原ペプチドを含む融合ポリペプチドの発現および分泌を確認することができる。
ＩＶ．組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株
【０１６９】
本明細書中の他の箇所で開示されるような、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドまたはヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組換え細菌株、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ株もまた本明細書で提供される。好ましくは、細菌株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）株である。しかし、他の細菌株、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、ＳｈｉｇｅｌｌａまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株もまた使用され得る。Ｌｍは、ワクチンベクターとしてのいくつかの固有の利点を有する。この細菌は、特別な要件なしにｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に効率的に増殖し、この細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなどのグラム陰性菌における主要毒性因子であるＬＰＳを欠いている。遺伝的に弱毒化されたＬｍベクターは、重篤な有害効果が起こった場合に抗生物質でそれらを容易に除去することができ、一部のウイルスベクターとは異なり宿主ゲノムへの遺伝物質の組込みが起こらないので、さらなる安全性ももたらす。
【０１７０】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、任意のＬｉｓｔｅｒｉａ株であり得る。好適なＬｉｓｔｅｒｉａ株の例としては、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｕｒｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）、または当該技術分野において公知の任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ種が挙げられる。好ましくは、組換えｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種の株である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の例としては、次のものが挙げられる：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ野生型（例えば、Ｂｉｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｈｉｎｒｉｃｈｓ  （１９８７）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３９：２００５−２００９；Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６を参照されたい）；ファージキュアリングされているＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０５６（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６を参照されたい）；ファージキュアリングされており、ｈｌｙ遺伝子欠失を有する、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２７（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−  ４１８６；Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ  （１９９４）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：５６０８−５６１３を参照されたい）；ファージキュアリングされており、ａｃｔＡ遺伝子欠失を有する、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６；Ｓｋｏｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：５２７−  ５３８を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０４２（デルタＰＥＳＴ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０９７（ＬＬＯ−Ｓ４４Ａ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４３６４（デルタｌｐｌＡ；リポ酸タンパク質リガーゼ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４４０５（デルタｉｎｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４４０６（デルタｉｎｌＢ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−ＬＯＯＯｌ（デルタａｃｔＡ；デルタｉｎｌＢ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−Ｌ０００２（デルタａｃｔＡ；デルタｌｐｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−Ｌ０００３（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ；デルタｌｐｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０３８（デルタａｃｔＡ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４３８４（ＬＬＯ  Ｓ４４Ａ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；ｌｐｌＡ１の欠失を有するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株（リポ酸タンパク質リガーゼＬｐｌＡ１をコードする）（例えば、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：４６２−４６４を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０１７（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔを有する１０４０３Ｓ）（例えば、ＵＳ７，６９１，３９３を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ５９１８２４を参照されたい）。別の実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ−ｅ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３２１０；ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ−６７９を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ欠失、必要に応じてｕｖｒＡＢ欠失を兼備）（ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ）（例えば、ＵＳ７，６９１，３９３を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｉｎｌＢ−二重突然変異体（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６２を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｌｐｌＡ突然変異体またはｈｌｙ突然変異体（例えばＵＳ２００４／００１３６９０を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｄａｌ／ｄａｔ二重突然変異体（例えば、ＵＳ２００５／００４８０８１を参照されたい）である。他のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株は、次の遺伝子：ｈｌｙ（ＬＬＯ；リステリオリジン）、ｉａｐ（ｐ６０）、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｄａｌ（アラニンラセマーゼ）、ｄａｔ（Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢ、ａｃｔＡの１��もしくは任意の組合せをコードする核酸；または単層小胞の成長、拡散、分解、二層小胞の分解、宿主細胞への結合もしくは宿主細胞による取込みを媒介する任意の核酸を含有するように（例えば、プラスミドにより、および／またはゲノム組込みにより）修飾されているものを含む。上記参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、野生型ビルレンスを有することもあり、弱毒化されたビルレンスを有することもあり、またはビルレンスがないこともある。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａには、ファゴソームまたはファゴリソソームから逃れてサイトゾルに侵入するのに十分なビルレンスがあり得る。そのようなＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書中の他の箇所で開示される少なくとも１つの弱毒化突然変異、欠失または不活性化を含む生弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株であることもある。好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、弱毒化栄養要求性株である。栄養要求性株は、その増殖に必要な特定の有機化合物を合成することができないものである。そのような株の例は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，１１４，４１４に記載されている。
【０１７２】
好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。例えば、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子をコードしないプラスミドを含むこともある。しかし、本明細書で提供される一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製に一般に利用される従来の選択およびクローニングプロセスに使用され得る。例示的な抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物が挙げられる。
Ａ．ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドを含む、またはヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株
【０１７３】
本明細書で開示される組換え細菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）は、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドを含むか、または本明細書中の他の箇所で開示されるようなヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
【０１７４】
ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合タンパク質をコードする核酸を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株では、核酸は、コドン最適化され得る。各アミノ酸についてのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより利用される最適なコドンの例は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／０２０７１７０に示されている。核酸は、その核酸中の少なくとも１つのコドンが、元の配列でのそのコドンと比べてそのアミノ酸についてのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる使用頻度が高いコドンで置き換えられている場合、コドン最適化されている。
【０１７５】
核酸は、細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株中のエピソームプラスミドに存在することもあり、および／または核酸は、細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムに組み込まれていることもある。一部の組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書で開示の２種のヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする２種の別個の核酸：核酸はエピソームプラスミド中にあるもの、および細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムに組み込まれているものを含む。
【０１７６】
エピソームプラスミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（細胞培養で）、ｉｎ  ｖｉｖｏで（宿主内で）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、安定して維持されるものであり得る。エピソームプラスミドにおける場合、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、プラスミド中のプロモーター／調節配列に作動可能に連結されていることがある。細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムに組み込まれている場合、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、外来性プロモーター／調節配列に作動可能に連結されていることもあり、または内在性プロモーター／調節配列に作動可能に連結されていることもある。遺伝子の構成的発現の駆動に有用なプロモーター／調節配列の例は周知であり、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａのｈｌｙ、ｈｌｙＡ、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡおよびｐ６０プロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｇｉＡプロモーター、ならびにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｐｈａＺプロモーターを含む。一部の場合には、目的の挿入された遺伝子は、分断されも、ゲノムＤＮＡへの組込みから生じることが多い調節的制約を受けもせず、一部の場合には、挿入された異種遺伝子の存在は、細胞自体の重要な領域の再配列も分断ももたらさない。
【０１７７】
そのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むプラスミドまたはベクターで、細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株または本明細書中の他の箇所に記載の弱毒化細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を形質転換することにより、作製することができる。前記プラスミドは、宿主染色体に組み込まれないエピソームプラスミドであることがある。あるいは、プラスミドは、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の染色体に組み込まれる組込型プラスミドであることもある。本明細書で使用されるプラスミドはまた、多コピープラスミドであることもある。細菌を形質転換する方法は周知であり、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、電子穿孔法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的形質転換技術、および物理的形質転換技術を含む。例えば、ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：１９０−１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．；およびＭｉｌｌｅｒ，  １９９２，  Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
異種核酸がゲノムに組み込まれている細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、部位特異的組込ベクターを使用することによって作製することができ、それによって、組み込まれた遺伝子を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａが、相同組換えを使用して作出される。組込ベクターは、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を感染させることができる、任意の部位特異的組込ベクターであり得る。そのような組込ベクターは、例えば、ＰＳＡ  ａｔｔＰＰ’部位、ＰＳＡインテグラーゼをコードする遺伝子、Ｕ１５３  ａｔｔＰＰ’部位、Ｕ１５３インテグラーゼをコードする遺伝子、Ａ１１８  ａｔｔＰＰ’部位、Ａ１１８インテグラーゼをコードする遺伝子、または任意の他の公知ａｔｔＰＰ’部位、または任意の他のファージインテグラーゼを含むことができる。
【０１７９】
組み込まれた遺伝子を含むそのような細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、異種核酸を細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ染色体に組み込むための任意の他の公知の方法を使用して作出することもできる。相同組換えの技術は周知であり、例えば、Ｂａｌｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０９（１−２）：１１−１７）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ３７（１）：１９−２４）、およびＵＳ６，８５５，３２０に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの染色体への組込みを、トランスポゾン挿入を使用して達成することもできる。トランスポゾン挿入の技術は周知であり、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５８：  ３７７０−３７７８によりＤＰ−Ｌ９６７の構築について記載されている。トランスポゾン突然変異誘発は、安定したゲノム挿入を達成することができるが、異種核酸が挿入されたゲノム内の位置が分からない。
【０１８１】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの染色体への組込みを、ファージ組込み部位を使用して達成することもできる（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４（１５）：４１７７−４１８６を参照されたい）。例えば、インテグラーゼ遺伝子、およびバクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）の結合部位を使用して、対応する結合部位に異種遺伝子を挿入することができ、前記対応する結合部位は、ゲノム内の任意の適切な部位（例えば、ｃｏｍＫ、またはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端）であり得る。利用する結合部位から内在性プロファージを異種核酸の組込みの前にキュアリングすることができる。そのような方法によって、例えば、単一コピー組込み体を得ることができる。「ファージキュアリングステップ」を回避するために、ＰＳＡファージに基づくファージ組込み系を使用することができる（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４：４１７７−４１８６を参照されたい）。組み込まれた遺伝子の維持は、例えば、抗生物質による連続選択を必要とし得る。あるいは、抗生物質での選択を必要としない、ファージに基づく染色体組込み系を確立することができる。その代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。例えば、臨床応用のためのファージに基づく染色体組込み系を使用することができ、その場合、例えばＤ−アラニンラセマーゼをはじめとする必須酵素に対する栄養要求性がある宿主株（例えば、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−））が使用される。
【０１８２】
コンジュゲーションを使用して、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌に導入することもできる。コンジュゲーションの方法は周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｐｌａｓｍｉｄ  ５６（３）：２２３−２２７およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２（３５）：１２５５４−１２５５９に記載されており、これらの参照文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
特定の例では、組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ａｃｔＡ配列（ＡｃｔＡタンパク質をコードする）または内在性ｈｌｙ配列（ＬＬＯタンパク質をコードする）を有するオープンリーディングフレームとしてその細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれているヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。例えば、ヘテロクリティックペプチドもしくは融合ポリペプチドの発現および分泌は、内在性ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の制御下にあることもあり、または内在性ｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあることもある。別の例では、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸は、ＡｃｔＡタンパク質をコードするａｃｔＡ配列、またはＬＬＯタンパク質をコードするｈｌｙ配列を代替することができる。
【０１８４】
組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の選択を、任意の手段により達成することができる。例えば、抗生物質選択を使用することができる。抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製に一般に利用される従来の選択およびクローニングプロセスに使用され得る。例示的な抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物が挙げられる。あるいは、栄養要求性株を使用することができ、外来性代謝関連遺伝子を、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、または抗生物質耐性遺伝子に加えて、選択に使用することができる。一例として、本明細書で提供される代謝酵素または相補遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌について選択するために、代謝酵素をコードする遺伝子（例えば、アミノ酸代謝関連遺伝子）または相補遺伝子の発現について選択することになる培地において、形質転換された栄養要求性細菌を増殖させることができる。あるいは、温度感受性プラスミドを、組換え体を選択するために使用することができ、または任意の他の公知手段を、組換え体を選択するために使用することができる。
Ｂ．細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化
【０１８５】
本明細書で開示される組換え細菌株（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株）を弱毒化することができる。用語「弱毒化」は、宿主動物において疾患を引き起こす細菌の能力の低下を包含する。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａは培養での増殖および維持が可能であるが、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の病原特性は、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａと比較して低下され得る。ＢＡＬＢ／ｃマウスへの弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａの静脈内接種を一例として使用すると、接種された動物の５０％が生き残る致死量（ＬＤ５０）は、好ましくは、野生型ＬｉｓｔｅｒｉａのＬＤ５０より少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１，０００倍、さらにより好ましくは少なくとも約１０，０００倍、および最も好ましくは約１００，０００倍に増加される。したがって、Ｌｉｓｔｅｒｉａの弱毒化株は、それが投与された動物を死滅させないものであるか、または投与された細菌数が、同じ動物を死滅させるために必要となる野生型非弱毒化細菌の数より非常に多い場合にのみ、動物を死滅させるものである。弱毒化細菌はまた、一般的な環境では、その増殖に必要な栄養素がそこに存在しないため、複製することができないものを意味すると解釈すべきである。したがって、細菌は、必要な栄養素が提供される制御された環境での複製に限定される。弱毒化株は、無制御複製ができないことから環境上安全である。
（１）細菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を弱毒化する方法
【０１８６】
弱毒化を任意の公知手段により遂行することができる。例えば、そのような弱毒化株は、１つもしくは複数の内在性ビルレンス遺伝子が欠損していることもあり、または１つもしくは複数の内在性代謝関連遺伝子が欠損していることもある。そのような遺伝子の例は、本明細書で開示され、弱毒化は、本明細書で開示される遺伝子のいずれか１つまたは任意の組合せの不活性化により達成することができる。不活性化を、例えば、欠失によって、または突然変異（例えば、不活性化突然変異）によって、達成することができる。用語「突然変異」は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意のタイプの突然変異または修飾を含み、欠失、短縮化、挿入、置換、破壊または転座を包含し得る。例えば、突然変異は、フレームシフト突然変異、タンパク質の未成熟終結を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節配列の突然変異を含むことができる。突然変異誘発は、組換えＤＮＡ技術を使用して達成することができ、または突然変異原性化学物質もしくは放射線を使用する旧来の突然変異誘発技術およびその後の突然変異体の選択を使用して達成することができる。復帰が付随して起こる確率が低いため、欠失突然変異体が好まれ得る。用語「代謝関連遺伝子」は、宿主細菌によって利用または必要とされる栄養素の合成に関与するまたは必要とされる酵素をコードする遺伝子を指す。例えば、この酵素は、宿主細菌の持続的増殖に必要な栄養素の合成に、関与し得る、または必要とされ得る。用語「ビルレンス」遺伝子は、生物のゲノムにおけるその存在または活性がその生物の病原性に寄与する（例えば、生物による宿主におけるニッチへの定着（細胞への接着を含む）、免疫回避（宿主の免疫応答の回避）、免疫抑制（宿主の免疫応答の阻害）、細胞への侵入および細胞からの退出、または宿主からの栄養の獲得を可能にする）遺伝子を含む。
【０１８７】
そのような弱毒化株の特定の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。そのような弱毒化株の別の例は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０１４２７９１を参照されたい。ＬｍｄｄＡは、内在性ビルレンス遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化されているＬｉｓｔｅｒｉａ株に基づく。そのような株は、ｄａｌ遺伝子の相補性によりｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原発現のためのプラスミドを保持することができる。あるいは、ＬｍｄｄＡは、内在性ｄａｌ、ｄａｔおよびａｃｔＡ遺伝子の突然変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ  Ｌｉｓｔｅｒｉａであることもある。そのような突然変異は、例えば、欠失または他の不活性化突然変異であり得る。
【０１８８】
弱毒化株の別の特定の例は、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−）、またはｐｒｆＡ遺伝子の部分的欠失もしくは不活性化突然変異を有する株である。ＰｒｆＡタンパク質は、Ｌｍがその脊椎動物宿主に定着するために必要とする必須ビルレンス遺伝子を含むレギュロンの発現を制御する。したがって、ｐｒｆＡ突然変異は、ＰｒｆＡ依存性ビルレンス遺伝子の発現を活性化するＰｒｆＡの能力を強く損なわせる。
【０１８９】
弱毒化株のさらに別の特定の例は、細菌の自然ビルレンスに重要な２つの遺伝子−インターナリンＢおよびａｃｔＡ−が欠失しているＬｍ  ｉｎｌＢ（−）ａｃｔＡ（−）である。
【０１９０】
弱毒化細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の他の例としては、１つまたは複数の内在性ビルレンス遺伝子が欠損している、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が挙げられる。そのような遺伝子の例としては、ＬｉｓｔｅｒｉａにおけるａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＢ、ｐｌｃＡ、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｉｎｌＪおよびｂｓｈが挙げられる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、上述の株のいずれかの二重突然変異体または三重突然変異体であることもある。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書で提供される（例えば、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む）遺伝子のうちの各遺伝子についての突然変異もしくは欠失を含むことがあり、または例えば、前記遺伝子のうちのいずれかの１０以下についての、突然変異もしくは欠失を含むこともある。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性インターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異もしくは欠失、および／または内在性ａｃｔＡ遺伝子の突然変異もしくは欠失を含むことがある。あるいは、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性インターナリンＢ（ｉｎｌＢ）遺伝子の突然変異もしくは欠失、および／または内在性ａｃｔＡ遺伝子の突然変異もしくは欠失を含むことがある。あるいは、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣおよびａｃｔＡ遺伝子の突然変異または欠失を含むことがある。隣接細胞へのＬｉｓｔｅｒｉａの移行は、そのプロセスに関与する内在性ａｃｔＡ遺伝子および／または内在性ｉｎｌＣ遺伝子または内在性ｉｎｌＢ遺伝子の欠失により阻害され、それによって、高レベルの弱毒化とともに、免疫原性の増大および株骨格としての有用性が生じる結果となる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｐｌｃＡとｐｌｃＢ両方の突然変異または欠失を含む、二重突然変異体であることもある。一部の場合には、株は、ＥＧＤ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ骨格から構築され得る。
【０１９１】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝関連遺伝子の突然変異を有する栄養要求性株であることもある。一例として、株は、１つまたは複数の内在性アミノ酸代謝関連遺伝子が欠損していることがある。例えば、Ｄ−アラニンが欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａの栄養要求性株の生成は、多数の方法で達成することができ、これらの方法は周知であり、例えば、欠失突然変異、挿入突然変異、フレームシフト突然変異、タンパク質の未成熟終結を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節配列の突然変異を含む。栄養要求性表現型の復帰が付随して起こる確率が低いため、欠失突然変異体が好まれ得る。一例として、本明細書で提示されるプロトコールに従って生成されるＤ−アラニンの突然変異体を、Ｄ−アラニンの非存在下で増殖する能力について単純な実験室培養アッセイで試験することができる。この化合物の非存在下で増殖することができない突然変異体を選択することができる。
【０１９２】
内在性アミノ酸代謝関連遺伝子の例としては、ビタミン合成遺伝子、パントテン酸シンターゼをコードする遺伝子、Ｄ−グルタミン酸シンターゼ遺伝子、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子、Ｄ−アラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子、ｄｇａ、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与する遺伝子、システインシンターゼＡの合成に関与する遺伝子（ｃｙｓＫ）、ビタミンＢ１２依存性メチオニンシンターゼ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＥ、ａｓｎＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｔＢ、ｌｅｕＡ、ａｒｇＧおよびｔｈｒＣが挙げられる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、２つまたはそれより多くのそのような遺伝子（例えば、ｄａｔおよびｄａｌ）が欠損していることもある。Ｄ−グルタミン酸合成は、Ｄ−ｇｌｕ＋ｐｙｒのアルファ−ケトグルタル酸塩＋Ｄ−ａｌａへの変換および逆反応に関与するｄａｌ遺伝子によって、一部は制御される。
【０１９３】
別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、アミノ酸合成遺伝子などの内在性シンターゼ遺伝子が欠損していることもある。そのような遺伝子の例としては、ｆｏｌＰ、ジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質をコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子、ｈｉｓＦ、ｈｉｓＨ、ｆｌｉＩ、リボソーム大サブユニットプソイドウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、二官能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＢ、ｃｂｉＤ、ウロポルフィリン−ＩＩＩ  Ｃ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼをコードする遺伝子、ｃｏｂＱ、ｕｐｐＳ、ｔｒｕＢ、ｄｘｓ、ｍｖａＳ、ｄａｐＡ、ｉｓｐＧ、ｆｏｌＣ、クエン酸シンターゼをコードする遺伝子、ａｒｇＪ、３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子、インドール−３−グリセロールリン酸シンターゼをコードする遺伝子、アントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ成分をコードする遺伝子、ｍｅｎＢ、メナキノン特異的イソコリスミン酸シンターゼをコードする遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩをコードする遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼをコードする遺伝子、ｃａｒＢ、ｃａｒＡ、ｔｈｙＡ、ｍｇｓＡ、ａｒｏＢ、ｈｅｐＢ、ｒｌｕＢ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ａｌｓＳ、ｆａｂＦ、ｆａｂＨ、プソイドウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｐｙｒＧ、ｔｒｕＡ、ｐａｂＢ、およびａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２など）が挙げられる。
【０１９４】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ｐｈｏＰ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤまたはｐｌｃＢが欠損していることもある。さらに別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ペプチド輸送体が欠損していることもある。例としては、ＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質、亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質、糖ＡＢＣ輸送体、リン酸輸送体、ＺＩＰ亜鉛輸送体、ＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬物耐性輸送体、硫酸輸送体、プロトン依存性オリゴペプチド輸送体、マグネシウム輸送体、葉酸／硝酸輸送体、スペルミジン／プトレシンＡＢＣ輸送体、Ｎａ／Ｐｉ共輸送体、糖リン酸輸送体、グルタミンＡＢＣ輸送体、主要促進剤ファミリー輸送体、グリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体、モリブデンＡＢＣ輸送体、タイコ酸（ｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）ＡＢＣ輸送体、コバルトＡＢＣ輸送体、アンモニウム輸送体、アミノ酸ＡＢＣ輸送体、細胞分裂ＡＢＣ輸送体、マンガンＡＢＣ輸送体、鉄化合物ＡＢＣ輸送体、マルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体、Ｂｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬物耐性輸送体、および上記タンパク質のうちの１つについてのサブユニットをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１９５】
他の弱毒化細菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株は、細菌増殖プロセス、複製プロセス、細胞壁合成、タンパク質合成、脂肪酸の代謝に、または任意の他の増殖もしくは複製プロセスに使用されるアミノ酸を代謝する内因性代謝酵素が欠損していることがある。同様に、弱毒化株は、細胞壁合成に使用されるアミノ酸の形成を触媒することができる内在性代謝酵素、細胞壁合成に使用されるアミノ酸の合成を触媒することができる内在性代謝酵素、または細胞壁合成に使用されるアミノ酸の合成に関与することができる内在性代謝酵素が欠損していることがある。あるいは、アミノ酸が細胞壁生合成に使用されることもある。あるいは、代謝酵素は、細胞壁成分であるＤ−グルタミン酸の合成酵素である。
【０１９６】
他の弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｄ−グルタミン酸合成遺伝子、ｄｇａ、ａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によってコードされる代謝酵素、またはアラニン合成に関与する任意の他の酵素が、欠損していることもある。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に欠損していることがある代謝酵素のさらに他の例としては、ｓｅｒＣによってコードされる酵素（ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ）、ａｓｄによってコードされる酵素（アスパラギン酸ベータセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；細胞壁構成要素ジアミノピメリン酸の合成に関与する）、ｇｓａＢ−グルタミン酸−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子によってコードされる酵素（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒する）、ｈｅｍＬによってコードされる酵素（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒する）、ａｓｐＢによってコードされる酵素（Ｌ−アスパルテートおよび２−オキソグルタレートからのオキサロアセテート（ｏｘａｌｏｚｃｅｔａｔｅ）およびＬ−グルタメートの形成を触媒するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ａｒｇＦ−１によってコードされる酵素（アルギニン生合成に関与する）、ａｒｏＥによってコードされる酵素（アミノ酸生合成に関与する）、ａｒｏＢによってコードされる酵素（３−デヒドロキネート生合成に関与する）、ａｒｏＤによってコードされる酵素（アミノ酸生合成に関与する）、ａｒｏＣによってコードされる酵素（アミノ酸生合成に関与する）、ｈｉｓＢによってコードされる酵素（ヒスチジン生合成に関与する）、ｈｉｓＤによってコードされる酵素（ヒスチジン生合成に関与する）、ｈｉｓＧによってコードされる酵素（ヒスチジン生合成に関与する）、ｍｅｔＸによってコードされる酵素（メチオニン生合成に関与する）、ｐｒｏＢによってコードされる酵素（プロリン生合成に関与する）、ａｒｇＲによってコードされる酵素（アルギニン生合成に関与する）、ａｒｇＪによってコードされる酵素（アルギニン生合成に関与する）、ｔｈｉｌ（チアミン生合成に関与する）、ＬＭＯｆ２３６５＿１６５２によってコードされる酵素（トリプトファン生合成に関与する）、ａｒｏＡによってコードされる酵素（トリプトファン生合成に関与する）、ｉｌｖＤによってコードされる酵素（バリンおよびイソロイシン生合成に関与する）、ｉｌｖＣによってコードされる酵素（バリンおよびイソロイシン生合成に関与する）、ｌｅｕＡによってコードされる酵素（ロイシン生合成に関与する）、ｄａｐＦによってコードされる酵素（リシン生合成に関与する）、およびｔｈｒＢによってコードされる酵素（トレオニン生合成に関与する）（全てＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２９７３）が挙げられる。
【０１９７】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｔＲＮＡシンテターゼなどの他の代謝酵素の突然変異により生成されることもある。例えば、代謝酵素は、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼをコードするｔｒｐＳ遺伝子によってコードされることがある。例えば、宿主株細菌は、Δ（ｔｒｐＳ  ａｒｏＡ）であることがあり、両方のマーカーが組込ベクターに含有されていることもある。
【０１９８】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するように突然変異させることができる代謝酵素の他の例としては、ｍｕｒＥによってコードされる酵素（ジアミノピメリン酸の合成に関与する；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３４８５）、ＬＭＯｆ２３６５＿２４９４によってコードされる酵素（タイコ酸生合成に関与する）、ＷｅｃＥによってコードされる酵素（リポ多糖生合成タンパク質ｒｆｆＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１４０７５．１）、またはａｍｉＡによってコードされる酵素（Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）が挙げられる。代謝酵素のさらに他の例としては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４６６３４７）、または細胞壁タイコ酸グリコシル化タンパク質ＧｔｃＡが挙げられる。
【０１９９】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するように突然変異させることができる代謝酵素の他の例としては、ペプチドグリカン成分または前駆体の合成酵素が挙げられる。この成分は、例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリル−ウンデカプレノール、ＧｌｃＮＡｃ−ｐ−（１，４）−ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリルウンデカプレノール、または任意の他のペプチドグリカン成分もしくは前駆体であり得る。
【０２００】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するように突然変異させることができる代謝酵素のさらに他の例としては、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＡ−１またはｍｕｒＡ−２によってコードされる代謝酵素（全てＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２９７３に記載されている）が挙げられる。あるいは、代謝酵素は、ペプチドグリカン成分または前駆体の任意の他の合成酵素であり得る。代謝酵素は、トランス−グリコシラーゼ、トランス−ペプチダーゼ、カルボキシ−ペプチダーゼ、任意の他のクラスの代謝酵素、または任意の他の代謝酵素であることもある。例えば、代謝酵素は、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ代謝酵素であり得、または任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ代謝酵素であり得る。
【０２０１】
他の細菌株中の対応するオルソロガス遺伝子を突然変異させることにより、Ｌｉｓｔｅｒｉａについて上で説明したように他の細菌株を弱毒化することができる。
（２）弱毒化細菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を相補する方法
【０２０２】
本明細書で開示される弱毒化細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、相補遺伝子を含む核酸、または弱毒化突然変異を相補する（例えば、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の栄養要求性を相補する）代謝酵素をコードする核酸をさらに含むことができる。例えば、本明細書で開示されるような融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを有する核酸は、相補遺伝子を含むかまたは相補代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを、さらに含むことができる。あるいは、第１の核酸は、融合ポリペプチドをコードすることができ、別の第２の核酸は、相補遺伝子を含むことができ、または相補代謝酵素をコードすることができる。
【０２０３】
相補遺伝子は、染色体外のものであることもあり、または細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれていることもある。例えば、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含むエピソームプラスミドを含むことができる。そのようなプラスミドは、エピソームまたは染色体外様式でＬｉｓｔｅｒｉａに含有されることになる。あるいは、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含む組込型プラスミド（すなわち、組込ベクター）を含むことができる。そのような組込型プラスミドをＬｉｓｔｅｒｉａ染色体への組込みに使用することができる。好ましくは、エピソームプラスミドまたは組込型プラスミドは、抗生物質耐性マーカーを欠いている。
【０２０４】
抗生物質耐性遺伝子の代わりに、または抗生物質耐性遺伝子に加えて、代謝関連遺伝子を選択に使用することができる。一例として、本明細書で提供される代謝酵素または相補遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌について選択するために、代謝酵素をコードする遺伝子（例えば、アミノ酸代謝関連遺伝子）または相補遺伝子の発現について選択することになる培地において、形質転換された栄養要求性細菌を増殖させることができる。例えば、Ｄ−グルタミン酸合成に対する栄養要求性がある細菌を、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドで形質転換することができ、その栄養要求性細菌は、Ｄ−グルタミン酸の非存在下で増殖するであろうが、前記プラスミドで形質転換されていない栄養要求性細菌も、Ｄ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現しない栄養要求性細菌も、増殖しないであろう。同様に、Ｄ−アラニン合成に対する栄養要求性がある細菌は、形質転換され、Ｄ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする核酸を含むプラスミドを発現する場合、Ｄ−アラニンの非存在下で増殖するであろう。必要な増殖因子、栄養補助剤、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含むまたは欠いている適切な培地を作製するためのそのような方法は周知であり、そのような方法を商業的に入手することができる。
【０２０５】
本明細書で提供される代謝酵素または相補遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を適切な培地で選択してしまえば、それらの細菌を選択圧の存在下で繁殖させることができる。そのような繁殖は、栄養要求性因子を含有しない培地における細菌の増殖を含み得る。栄養要求性細菌における代謝酵素または相補遺伝子を発現するプラスミドの存在により、確実に、プラスミドは細菌とともに複製することになり、したがって、プラスミドを保有する細菌は連続的に選択されることになる。細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の生産は、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖している培地の体積を調整することによって容易に規模拡大することができる。
【０２０６】
１つの特定の例では、弱毒化株は、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を有する株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）もしくはＬｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ））であり、相補遺伝子は、アラニンラセマーゼ酵素（例えば、ｄａｌ遺伝子によってコードされる）、またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素（例えば、ｄａｔ遺伝子によってコードされる）をコードする。例示的なアラニンラセマーゼタンパク質は、配列番号７６に記載の配列（配列番号７８によってコードされる；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３８４３８）を有することがあり、または配列番号７６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、もしくはアイソフォームの断片であることもある。アラニンラセマーゼタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａアラニンラセマーゼタンパク質であり得る。あるいは、アラニンラセマーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性アラニンラセマーゼタンパク質、または任意の他のアラニンラセマーゼタンパク質であり得る。例示的なＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号７７に記載の配列（配列番号７９によってコードされる；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３８４３９）を有することがあり、または配列番号７７のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、もしくはアイソフォームの断片であることもある。Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であり得る。あるいは、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質、または任意の他のＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であり得る。
【０２０７】
別の特定の例では、弱毒化株は、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を有する株（例えば、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−））であり、相補遺伝子は、ＰｒｆＡタンパク質をコードする。例えば、相補遺伝子は、一部のＰｒｆＡ機能を回復させる突然変異ＰｒｆＡ（Ｄ１３３Ｖ）タンパク質をコードし得る。野生型ＰｒｆＡタンパク質の例は、配列番号８０に記載され（配列番号８１に記載の核酸配列によってコードされ）、Ｄ１３３Ｖ突然変異ＰｒｆＡタンパク質の一例は、配列番号８２に記載される（配列番号８３に記載の核酸によってコードされる）。相補ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号８０または８２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、またはアイソフォームの断片であることもある。ＰｒｆＡタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ＰｒｆＡタンパク質であり得る。あるいは、ＰｒｆＡタンパク質は、任意の他のグラム陽性ＰｒｆＡタンパク質、または任意の他のＰｒｆＡタンパク質であり得る。
【０２０８】
別の例では、菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ａｃｔＡ遺伝子の欠失または不活性化突然変異を含むことがあり、相補遺伝子は、その突然変異を相補してＬｉｓｔｅｒｉａ株の機能を回復するためのａｃｔＡ遺伝子を含むことがある。
【０２０９】
他の栄養要求株および相補系を、本明細書で提供される方法および組成物に伴う使用に採用することもできる。
Ｃ．  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の調製および保管
【０２１０】
組換え細菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）を、必要に応じて、動物宿主によって継代させた。このような継代は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のワクチンベクターとしての有効性を最大化することができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を安定させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のビルレンスを安定させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を増大させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のビルレンスを増大させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜株を除去することができ、またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜株が広がることを抑えることができる。動物宿主によって組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を継代させる方法は当該技術分野において周知であり、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００６／０２３３８３５に記載されている。
【０２１１】
組換え細菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）は、凍結されたセルバンク中で保管することができる、または凍結乾燥されたセルバンク中で保管することができる。そのようなセルバンクは、例えば、マスターセルバンク、ワーキングセルバンクまたは適正製造基準（ＧＭＰ）セルバンクであり得る。「適正製造基準」の例としては、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓの２１  ＣＦＲ  ２１０−２１１によって定義されるものが挙げられる。しかし、「適正製造基準」は、臨床グレード材料の産生のためまたはヒト摂取のための他の基準、例えば、米国以外の国の基準によっても定義され得る。そのようなセルバンクは、臨床グレード材料の産生用に意図され得、またはヒト使用のための規制実施に従い得る。
【０２１２】
組換え細菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）はまた、ワクチン用量のバッチから、凍結されたストックから、または凍結乾燥されたストックからであり得る。
【０２１３】
そのようなセルバンク、凍結されたストック、またはワクチン用量のバッチは、例えば、解凍の際に、９０％よりも高い生存率を示すことができる。解凍は、例えば、２４時間にわたる、凍結保存のための保管または凍結された保管の後に行うことができる。あるいは、保管は、例えば、２日間、３日間、４日間、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、５カ月間、６カ月間、９カ月間または１年間にわたって持続し得る。
【０２１４】
セルバンク、凍結されたストック、またはワクチン用量のバッチは、例えば、栄養培地中で細菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）の培養物を成長させるステップ、グリセロールを含む溶液中で培養物を凍結させるステップ、および−２０℃未満でＬｉｓｔｅｒｉａ株を保管するステップを含む方法によって、凍結保存することができる。温度は、例えば、約−７０℃、または約−７０〜約−８０℃の間であり得る。あるいは、セルバンク、凍結されたストック、またはワクチン用量のバッチは、限定培地中でＬｉｓｔｅｒｉａ株の培養物を成長させるステップ、グリセロールを含む溶液中で培養物を凍結させるステップ、および−２０℃未満でＬｉｓｔｅｒｉａ株を保管するステップを含む方法によって、凍結保存することができる。温度は、例えば、約−７０℃、または約−７０〜約−８０℃の間であり得る。任意の規定された微生物学的培地がこの方法で使用され得る。
【０２１５】
例えば、セルバンクから、凍結されたストックから、スタータ培養物から、またはコロニーからの培養物（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａワクチン用量のバッチを産生するために使用されるＬｉｓｔｅｒｉａワクチン株の培養物）が、接種され得る。培養物は、例えば、対数増殖期中期、ほぼ対数増殖期中期、または別の増殖期で接種され得る。
【０２１６】
凍結させるために使用される溶液は、必要に応じて、グリセロールの代わりにまたはグリセロールに加えて、別の束一的添加剤または抗凍結特性を有する添加剤を含有する。そのような添加剤の例としては、例えば、マンニトール、ＤＭＳＯ、スクロース、または任意の他の束一的添加剤もしくは抗凍結特性を有する添加剤が挙げられる。
【０２１７】
細菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）の培養物を増殖させるために利用される栄養培地は、任意の好適な栄養培地であり得る。好適な培地の例としては、例えば、ＬＢ；ＴＢ；動物質を含まない変性テリフィックブロス；または限定培地が挙げられる。
【０２１８】
増殖させるステップは、細胞を増殖させる任意の公知手段によって実施することができる。例えば、増殖ステップは、振盪フラスコ（例えば、バッフル付き振盪フラスコ）、回分式発酵槽、撹拌タンクもしくはフラスコ、エアリフト型発酵槽、フェッドバッチ、連続セル反応器、セル固定化反応器、または任意の他の細菌増殖手段を用いて行うことができる。
【０２１９】
必要に応じて、一定したｐＨが、培養物の（例えば、回分式発酵槽内での）増殖中に維持される。例えば、ｐＨを約６．０に、約６．５に、約７．０に、約７．５に、または約８．０に維持することができる。同様に、ｐＨは、例えば、約６．５〜約７．５、約６．０〜約８．０、約６．０〜約７．０、約６．０〜約７．０、または約６．５〜約７．５であり得る。
【０２２０】
必要に応じて、一定した温度を、培養物の増殖中に維持することができる。例えば、温度を約３７℃でまたは３７℃で維持することができる。あるいは、温度を、２５℃、２７℃、２８℃、３０℃、３２℃、３４℃、３５℃、３６℃、３８℃、または３９℃で維持することができる。
【０２２１】
必要に応じて、一定した溶存酸素濃度を、培養物の増殖中に維持することができる。例えば、溶存酸素濃度を、飽和度２０％、飽和度１５％、飽和度１６％、飽和度１８％、飽和度２２％、飽和度２５％、飽和度３０％、飽和度３５％、飽和度４０％、飽和度４５％、飽和度５０％、飽和度５５％、飽和度６０％、飽和度６５％、飽和度７０％、飽和度７５％、飽和度８０％、飽和度８５％、飽和度９０％、飽和度９５％、飽和度１００％、または飽和度ほぼ１００％で維持することができる。
【０２２２】
組換え細菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）の凍結乾燥および凍結保存のための方法は公知である。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ培養物は、液体窒素中で急速凍結させ、その後、最終凍結温度で保管することができる。あるいは、培養物は、より漸進的な様式で（例えば、最終保管温度で培養物のバイアル中に置くことによって）凍結させることができる。培養物は、細菌培養物を凍結させるための任意の他の公知の方法によっても凍結させることができる。
【０２２３】
培養物の保管温度は、例えば、−２０℃〜−８０℃の間であり得る。例えば、温度は、−２０℃を大きく下回るか、または−７０℃以下であり得る。あるいは、温度は、約−７０℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−８０℃、−３０〜−７０℃、−４０〜−７０℃、−５０〜−７０℃、−６０〜−７０℃、−３０〜−８０℃、−４０〜−８０℃、−５０〜−８０℃、−６０〜−８０℃または−７０〜−８０℃であり得る。あるいは、温度は、７０℃よりも低い、または−８０℃よりも低い温度であり得る。
Ｖ．免疫原性組成物、医薬組成物およびワクチン
【０２２４】
本明細書で開示されるようなヘテロクリティックペプチド、本明細書で開示されるような組換え融合ポリペプチド、本明細書で開示されるようなヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、あるいは本明細書で開示されるような細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンも、提供される。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物は、それがＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むという理由で本質的に免疫原性であり得、および／または前記組成物は、アジュバントもさらに含み得る。他の免疫原性組成物は、ＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法組成物を含む。
【０２２５】
用語「免疫原性組成物」は、抗原を含有する組成物であって、前記抗原が、その組成物への曝露時に対象における前記抗原に対する免疫応答を惹起する、任意の組成物を指す。免疫原性組成物により惹起される免疫応答は、特定の抗原に対するものであることもあり、または抗原上の特定のエピトープに対するものであることもある。
【０２２６】
免疫原性組成物は、単一の本明細書で開示されるようなヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチド、本明細書で開示されるようなヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、あるいは本明細書で開示されるような組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むこともあり、または複数の異なる本明細書で開示されるようなヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチド、本明細書で開示されるようなヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、あるいは本明細書で開示されるような組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むこともある。第１の組換え融合ポリペプチドは、例えば、それが、第２の組換え融合ポリペプチドが含まない１つの抗原ペプチドを含む場合、第２の組換え融合ポリペプチドと異なる。２つの組換え融合ポリペプチドが、同じ抗原ペプチドのいくつかを含み、それにもかかわらず異なると見なされることもある。そのような異なるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、同時に対象に投与することができ、または逐次的に対象に投与することができる。逐次投与は、本明細書で開示される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株（またはヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチドまたは核酸）を含む原薬が、異なる剤形（例えば、１つの薬剤は錠剤またはカプセル剤であり、別の薬剤は滅菌液である）である、および／または異なる投薬スケジュールで投与される（例えば、混合物からの１つの組成物が少なくとも１日１回投与され、別のものが、より低い頻度で、例えば、週１回、２週間に１回、もしくは３週間に１回投与される）場合、特に有用である。複数のヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が、各々、抗原ペプチドの異なるセットを含むこともある。あるいは、２つまたはそれより多くのヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、または組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が、抗原ペプチドの同じセット（例えば、異なる順序で抗原ペプチドの同じセット）を含むこともある。
【０２２７】
複数のヘテロクリティックペプチドまたは断片または組換え融合ポリペプチドは、複数の異なるＨＬＡタイプに結合できる。例えば、それらは、以下のＨＬＡタイプ：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうちの１つまたはそれより多くまたは全てに結合できる。
【０２２８】
一例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１およびＲＮＦ４３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、ヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全て、あるいは、例えば、表３中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２２９】
別の例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡおよびＰＳＡ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、前立腺がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表５中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表５中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２３０】
別の例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴおよびＳＵＲＶＩＶＩＮ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、すい臓がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表７中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、または１２個全て、あるいは、例えば、表７中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、または１２個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２３１】
別の例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３およびＰＲＡＭＥ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、膀胱がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全て、あるいは、例えば、表９中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、または１３個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２３２】
別の例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１１中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全て、あるいは、例えば、表１１中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２３３】
別の例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴ、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびＳＡＲＴ３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、子宮がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全て、あるいは、例えば、表１３中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２３４】
別の例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、卵巣がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１５中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全て、あるいは、例えば、表１５中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２３５】
別の例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、低悪性度神経膠腫に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１７中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表１７中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２３６】
別の例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３およびＭＡＧＥＡ３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表１９中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２３７】
別の例として、免疫原性組成物は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または全てによってコードされるヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態で）を含み得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＮＹＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、頭頸部がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表２１中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表２１中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２３８】
免疫原性組成物は、アジュバント（例えば、２つもしくはそれより多くのアジュバント）、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組合せをさらに含み得る。必要に応じて、免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含むこともあり、前記ＡＰＣは、対象にとって自己のものであってもよく、または同種異系のものであってもよい。
【０２３９】
用語アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を含む。例えば、アジュバントは、本明細書で開示される免疫原性組成物と組み合わせられたとき、よりいっそう増強されたおよび／または長期の免疫応答をもたらす、免疫応答の非特異的刺激物質、または対象においてデポーの生成を可能にする物質であり得る。アジュバントは、例えば、Ｔｈ１により主として媒介される免疫応答、Ｔｈ１型免疫応答、またはＴｈ１媒介免疫応答に有利に働くことができる。同様に、アジュバントは、抗体媒介応答より細胞媒介免疫応答に有利に働くことができる。あるいは、アジュバントは、抗体媒介応答に有利に働くことができる。一部のアジュバントは、抗原を緩徐に放出することにより免疫応答を増強することができ、その一方で他のアジュバントは、それらの効果を次の機序のいずれかにより媒介することができる：細胞の浸潤、炎症および注射部位への輸送を、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）について、増加させる機序、共刺激性シグナルもしくは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）発現を上方調節することによりＡＰＣの活性状態を促進する機序、抗原提示を増強させる機序、または間接的効果のためにサイトカイン放出を誘導する機序。
【０２４０】
アジュバントの例としては、サポニンＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＭＰＬ、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）、イミキモド、サイトカインまたはそれをコードする核酸、ケモカインまたはそれをコードする核酸、ＩＬ−１２またはそれをコードする核酸、ＩＬ−６またはそれをコードする核酸、およびリポ多糖が挙げられる。好適なアジュバントの別の例は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１である。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１は、天然の代謝可能な油、または精製された乳化剤を含有する。好適なアジュバントの他の例としては、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはそれをコードする核酸、およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質またはそれをコードする核酸が挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦは、例えば、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ベクター内で成長したヒトタンパク質であることもある。ＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞およびＴ細胞のクローン拡大および分化を促進する。
【０２４１】
好適なアジュバントのさらに別の例は、無毒化リステリオリジンＯ（ｄｔＬＬＯ）タンパク質である。無毒化は、コレステロールへのＬＬＯの結合におよび最終的な膜細孔形成に重要な３つの選択されたアミノ酸に点突然変異を導入することによって達成することができる。標的となる３つのアミノ酸は、ＬＬＯのコレステロール結合ドメイン（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ；配列番号７４）に存在し、ＰＣＲによりＤＮＡ配列に導入された点突然変異によって配列内で修飾され得る（ＥＡＴＧＬＡＷＥＡＡＲ；配列番号９６）。アジュバントとしての使用に好適なｄｔＬＬＯの一例は、配列番号９５によってコードされる。ＬＬＯの無毒化された非溶血性形態（ｄｔＬＬＯ）は、腫瘍免疫療法における有効なアジュバントであり、ＰＡＭＰとして作用することにより自然免疫応答および細胞免疫応答を活性化することができる。配列番号９５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列によってコードされるｄｔＬＬＯも、アジュバントとしての使用に好適である。
【０２４２】
アジュバントのさらに他の例としては、増殖因子もしくはそれをコードする核酸、細胞集団、フロント不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）、ミョウバン、インターロイキンもしくはそれをコードする核酸、クイルグリコシド、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、細菌マイトジェン、細菌毒素、または任意の他のタイプの公知アジュバント（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  ｅｄ．  （Ａｕｇｕｓｔ  ２００３）：  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．  Ｐａｕｌ  （Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ４３：  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ＧＪＶ  Ｎｏｓｓａｌを参照されたい）が挙げられる。
【０２４３】
免疫原性組成物は、１つまたは複数の免疫調節分子をさらに含み得る。例としては、インターフェロンガンマ、サイトカイン、ケモカイン、およびＴ細胞刺激物質が挙げられる。
【０２４４】
免疫原性組成物は、ワクチンまたは医薬組成物の形態であることもある。用語「ワクチン」および「医薬組成物」は、同じ意味であり、これらの用語は、対象へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための薬学的に許容される担体中の免疫原性組成物を指す。ワクチンは、例えば、ペプチドワクチン（例えば、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドまたは組換え融合ポリペプチドを含む）、ＤＮＡワクチン（例えば、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドまたは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む）、または細胞内に含有され細胞によって送達されるワクチン（例えば、本明細書で開示される組換えＬｉｓｔｅｒｉａ）であり得る。ワクチンは、疾患もしくは状態に罹患しないようにもしくはそれを発症しないように対象を予防し得、および／またはワクチンは、疾患もしくは状態を有する対象にとって治療的であり得る。ペプチドワクチンを調製するための方法は周知であり、例えば、ＥＰ１４０８０４８、ＵＳ２００７／０１５４９５３、およびＯｇａｓａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：８９９５−８９９９に記載され、その各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。必要に応じて、ペプチド進化技術が、より高い免疫原性を有する抗原を作出するために使用され得る。ペプチド進化のための技術は周知であり、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６，７７３，９００に記載されている。
【０２４５】
「薬学的に許容される担体」は、有意な有害効果なく対象に導入することができる免疫原性組成物を収容するビヒクルであって、免疫原性組成物に対して有害な効果をもたらさないビヒクルを指す。すなわち、「薬学的に許容される」は、安全であり、かつ本明細書で開示される方法における使用のための少なくとも１つの免疫原性組成物の有効量の所望の投与経路に適した送達をもたらす、任意の製剤を指す。薬学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、周知である。好適な薬学的に許容される担体、およびそれらの選択に関与する要因についての記載は、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，  １９９０などの、様々な容易に入手できる情報源で見つけられる。そのような担体は、任意の投与経路（例えば、非経口、経腸（例えば、経口）または局所的適用）に好適であり得る。そのような医薬組成物を緩衝することができ、例えば、その場合、ｐＨは、免疫原性組成物の安定性および投与経路に従ってｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲の特定の所望の値で維持される。
【０２４６】
好適な薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、塩類溶液、例えば食塩水、グルコース、緩衝溶液、例えばリン酸緩衝溶液または重炭酸緩衝溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、白色パラフィン、グリセロール、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、コラーゲン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。医薬組成物またはワクチンは、例えば、免疫原性組成物と有害に反応しない、希釈剤、安定剤（例えば、糖およびアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝液、増粘用添加剤、滑沢剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、ビタミン、着色、着香、芳香物質などを含む、助剤も含み得る。
【０２４７】
液体製剤について、例えば、薬学的に許容される担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、エマルジョン、または油であり得る。非水性溶媒には、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。水性担体には、例えば、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。油の例としては、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油、および魚肝油が挙げられる。固体担体／希釈剤には、例えば、ゴム、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロースもしくはデキストロース）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはこれらの混合物が含まれる。
【０２４８】
必要に応じて、持続放出性または誘導放出性医薬組成物またはワクチンを製剤化することができる。この製剤化は、例えば、活性化合物が段階的分解性のコーティングで（例えば、マイクロカプセル化、複数のコーティングなどにより）保護されるリポソームまたは組成物の使用によって、達成することができる。そのような組成物を即時放出用に製剤化することができ、または徐放用に製剤化することもできる。組成物をフリーズドライし、得られた凍結乾燥物を（例えば、注射用製品の調製に）使用することも可能である。
【０２４９】
本明細書で開示される免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、がんの予防または処置に有効な１つまたは複数のさらなる化合物を含むことができる。例えば、さらなる化合物は、化学療法に有用な化合物、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、グリアデルインプラント（ｇｌｉａｄｅｌｉｍｐｌａｎｔ）、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール・ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組合せを含み得る。さらなる化合物は、他の生物製剤も含むことがあり、そのような生物製剤としては、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対する抗体、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）が挙げられる。さらなる化合物は、例えば、さらなる免疫療法薬も含むことができる。
【０２５０】
さらなる化合物は、免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ−８０／８６およびＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害剤、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤、または任意の他の抗原提示細胞／Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害剤も含み得る。免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストの例としては、抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片が挙げられる。さらなる化合物は、Ｔ細胞刺激物質、例えば、Ｔ細胞受容体共刺激分子と結合する抗体もしくはその機能性断片、共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーも含み得る。Ｔ細胞受容体共刺激分子は、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含み得る。共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体は、例えば、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含み得る。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５を含み得る。例えば、ＷＯ２０１６１００９２９、ＷＯ２０１６０１１３６２、およびＷＯ２０１６０１１３５７を参照されたく、これらの特許文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＩ．治療方法
【０２５１】
本明細書で開示される、ヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドをコードする核酸、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸
組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物およびワクチンを、様々な方法に使用することができる。例えば、それらを、対象における抗がん関連タンパクもしくは抗腫瘍関連抗原免疫応答を誘導もしくは増強する方法に、対象における抗腫瘍もしくは抗がん免疫応答を誘導もしくは増強する方法に、対象における腫瘍もしくはがんを処置する方法に、対象における腫瘍もしくはがんを予防する方法に、または腫瘍もしくはがんから対象を保護する方法に使用することができる。それらを、対象の脾臓および腫瘍におけるエフェクターＴ細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を上昇させる方法であって、前記エフェクターＴ細胞が腫瘍関連抗原へと標的化される方法に使用することもできる。それらを、対象における腫瘍関連抗原Ｔ細胞を増加させる方法、腫瘍またはがんを有する対象の生存期間を延長する方法、対象におけるがんの開始を遅延させる方法、または対象における腫瘍または転移サイズを低減する方法に、使用することもできる。
【０２５２】
対象における抗腫瘍関連抗原免疫応答を誘導または増強する方法は、例えば、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチン（例えば、ヘテロクリティックペプチド、またはヘテロクリティックペプチドを含む組換え融合ポリペプチド、あるいはヘテロクリティックペプチドまたは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む）を対象に投与するステップを含むことができる。それによって、抗腫瘍関連抗原免疫応答を対象において誘導または増強することができる。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、融合ポリペプチドを発現することができ、それによって対象において免疫応答が惹起される。免疫応答は、例えば、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含み得る。そのような方法は、対象の脾臓および腫瘍微小環境におけるエフェクターＴ細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を上昇させることもでき、その結果、対象におけるより顕著な抗腫瘍応答が可能になる。
【０２５３】
対象における抗腫瘍または抗がん免疫応答を誘導または増強する方法は、例えば、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含むことができる。それによって、抗腫瘍または抗がん免疫応答を対象において誘導または増強することができる。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、融合ポリペプチドを発現することができ、それによって対象において抗腫瘍または抗がん関連応答が惹起される。
【０２５４】
対象における腫瘍またはがん（例えば、ここで、腫瘍またはがんは、本明細書の他の箇所に開示される特定の腫瘍関連抗原またはがん関連抗原タンパク質を発現する）を処置する方法は、例えば、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含むことができる。その結果、対象は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍またはがんに対する免疫応答を開始することができ、それによって対象における腫瘍またはがんが処置される。
【０２５５】
対象における腫瘍またはがん（例えば、ここで、腫瘍またはがんは、本明細書の他の箇所に開示される特定の腫瘍関連抗原またはがん関連抗原タンパク質の発現に関連する）を予防する方法、または疾患を発症しないように対象を保護する方法は、例えば、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含むことができる。その結果、対象は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を開始することができ、それによって腫瘍またはがんが予防されるか、または対象が腫瘍またはがんを発症しないように保護される。
【０２５６】
上記方法の一部では、２つまたはそれより多くのヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンが投与される。複数のヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを、任意の順序もしくは組合せで逐次的に投与することができ、または任意の組合せで同時に投与することができる。例として、４つの異なるＬｉｓｔｅｒｉａ株が、投与されることになる場合、それらを逐次的に投与することができ、それらを同時に投与することができ、またはそれらを任意の組合せで投与すること（例えば、第１の株と第２の株を同時に投与し、その後、第３の株と第４の株を同時に投与すること）ができる。必要に応じて、逐次投与の場合、組成物を同じ免疫応答の間に、好ましくは互いに０〜１０または３〜７日以内に投与することができる。複数のヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、各々が抗原ペプチドの異なるセットを含むことがある。あるいは、２つまたはそれより多くが、抗原ペプチドの同じセット（例えば、異なる順序での抗原ペプチドの同じセット）を含むこともある。
【０２５７】
複数のヘテロクリティックペプチドもしくは断片または組換え融合ポリペプチドは、複数の異なるＨＬＡ型に結合できる。例えば、これらは、次のＨＬＡ型のうち１つまたは複数または全てに結合できる：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２。
【０２５８】
一例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１およびＲＮＦ４３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、ヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのような抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全て、あるいは、例えば、表３中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２５９】
別の例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＳＸ２、ＳＡＲＴ３、ＰＡＧＥ４、ＰＳＭＡおよびＰＳＡ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、前立腺がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表５中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表５中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２６０】
別の例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴおよびＳＵＲＶＩＶＩＮ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、すい臓がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表７中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、または１２個全て、あるいは、例えば、表７中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、または１２個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２６１】
別の例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３およびＰＲＡＭＥ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、膀胱がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全て、あるいは、例えば、表９中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、または１３個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２６２】
別の例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＭＡＧＥＡ３、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１１中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全て、あるいは、例えば、表１１中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、または１１個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２６３】
別の例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＲＡＭＥ、ｈＴＥＲＴ、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびＳＡＲＴ３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、子宮がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１３中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全て、あるいは、例えば、表１３中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２６４】
別の例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、卵巣がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１５中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全て、あるいは、例えば、表１５中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、１０個もしくはそれより多く、１１個もしくはそれより多く、１２個もしくはそれより多く、１３個もしくはそれより多く、または１４個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２６５】
別の例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＮＵＦ２、ＫＬＨＬ７およびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、低悪性度神経膠腫に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１７中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表１７中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２６６】
別の例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡ４、ＧＡＧＥ１、ＮＹＥＳＯ１、ＳＴＥＡＰ１、ＲＮＦ４３およびＭＡＧＥＡ３。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）に関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表１９中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表１９中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２６７】
別の例として、複数のヘテロクリティックペプチド（例えば、ペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、または細菌ベクターの形態）は、次の遺伝子のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、または全てによってコードされ得る：ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＡＧＥＡ４、ＳＴＥＡＰ１、ＮＹＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数または全てに結合できる。そのようながん関連タンパク質は、例えば、頭頸部がんに関連する。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、任意の順序であり得る。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、一緒に直接融合させることができ、またはリンカーによって一緒に連結させることができ、その例は、本明細書中の他の箇所で開示される。具体的な例では、抗原性ペプチドのうち１つまたは複数または全てが、９マー（例えば、リンカーによって一緒に連結された９マー）であり得る。そのようなヘテロクリティック抗原性ペプチドの例は、実施例２に提供される。ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、例えば、表２１中のヘテロクリティック抗原性ペプチドのうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全て、あるいは、例えば、表２１中の配列のうち１つもしくは複数、２つもしくはそれより多く、３つもしくはそれより多く、４つもしくはそれより多く、５つもしくはそれより多く、６つもしくはそれより多く、７つもしくはそれより多く、８つもしくはそれより多く、９つもしくはそれより多く、または１０個全てを含むペプチドを含み得る。
【０２６８】
一部の実施方法では、疾患はがんまたは腫瘍である。がんは、非調節細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理状態である。がんは、造血器悪性腫瘍または固形腫瘍（すなわち、前がん病変を含む、過度の細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の結果として生じる細胞塊）であることもある。転移性がんは、最初に開始した場所から体内の別の場所に拡散したがんを指す。転移性がん細胞により形成される腫瘍は、転移性腫瘍または転移と呼ばれ、転移は、がん細胞が身体の他の部分に拡散するプロセスを指すためにも使用される用語である。一般に、転移性がんは、元の、または原発性の、がんと同じ名称および同じ種類のがん細胞を有する。固形腫瘍の例としては、黒色腫、癌腫、芽腫および肉腫が挙げられる。血液学的悪性腫瘍は、例えば、白血病またはリンパ系悪性腫瘍、例えばリンパ腫を含む。がんの例示的なカテゴリーは、脳がん、乳がん、消化器がん、泌尿生殖器がん、婦人科がん、頭頸部がん、ヘムがん、皮膚がんおよび胸部がんカテゴリーを含む。脳悪性腫瘍は、例えば、神経膠芽腫、高悪性度橋神経膠腫、低悪性度神経膠腫、髄芽腫、神経芽腫、および毛様細胞性星細胞腫を含む。消化器がんは、例えば、結腸直腸がん、胆嚢がん、肝細胞がん、膵臓がん、ＰＮＥＴ、胃がんおよび食道がんを含む。泌尿生殖器がんは、例えば、副腎皮質がん、膀胱がん、嫌色素性腎臓がん、腎（明細胞）がん、腎（乳頭）がん、ラブドイドがん、および前立腺がんを含む。婦人科がんは、例えば、子宮癌肉腫、子宮内膜がん、漿液性卵巣がん、および子宮頸がんを含む。頭頸部がんは、例えば、甲状腺がん、上咽頭がん、頭頸部がん、および腺様嚢胞がんを含む。ヘムがんは、例えば、多発性骨髄腫、脊髄形成異常、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む。皮膚がんは、例えば、皮膚黒色腫および扁平上皮癌を含む。胸部がんは、例えば、扁平上皮肺がん、小細胞肺がん、および肺腺癌を含む。
【０２６９】
そのようながんのより詳細な例としては、扁平上皮がんまたは癌（例えば、口腔扁平上皮癌）、骨髄腫、口腔がん、若年性鼻咽喉血管線維腫、神経内分泌腫瘍、肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がんを含む胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、グリア系腫瘍、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、肝細胞癌、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がんもしくは癌、唾液腺癌、腎臓または腎がん（例えば、腎細胞癌）、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、線維肉腫、胆嚢がん、骨肉腫、中皮腫、および頭頸部がんが挙げられる。がんは、脳がんまたは別の種類のＣＮＳもしくは頭蓋内腫瘍であることもある。例えば、対象は、星細胞系腫瘍（例えば、星細胞腫、未分化星細胞腫、神経膠芽腫、毛様細胞性星細胞腫、上衣下巨細胞性星細胞腫、多形黄色星細胞腫）、乏突起膠細胞系腫瘍（例えば、乏突起神経膠腫、退形成性乏突起神経膠腫）、上衣細胞腫瘍（例えば、上衣腫、退形成性上衣腫、粘液乳頭状上衣腫、上衣下腫）、混合型神経膠腫（例えば、混合型乏突起星細胞腫、退形成性乏突起星細胞腫）、原因不明の神経上皮腫瘍（例えば、極性海綿芽腫、星状芽細胞腫、大脳神経膠腫症）、脈絡叢の腫瘍（例えば、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌）、神経細胞性もしくは混合型神経細胞膠細胞性腫瘍（例えば、神経節細胞腫、小脳異形成性神経節細胞腫、神経節膠腫、退形成性神経節膠腫、線維形成性乳児神経節腫、中枢性神経細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、嗅神経芽腫）、松果体実質腫瘍（例えば、松果体細胞腫、松果体芽腫、松果体細胞腫／松果体芽腫混合型）、または混合型神経細胞性もしくは神経芽細胞性要素を有する腫瘍（例えば、髄上皮腫、膠芽腫、神経芽腫、網膜芽腫、上衣芽腫）を有することができる。がんの他の例としては、低悪性度神経膠腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳がん、およびＤＮＡミスマッチ修復欠損がんまたは腫瘍が挙げられる。がんは、エストロゲンに対する受容体を有する場合、エストロゲン受容体陽性と呼ばれる。がんの別の例は、マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）結腸直腸がんである。
【０２７０】
具体的な例では、がんは、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がんまたは頭頸部がんである。
【０２７１】
用語「処置する」または「処置すること」は、目的が標的腫瘍またはがんを予防または緩和することである、治療的処置と発症予防対策または予防対策との両方を指す。処置することは、疾患に直接影響を及ぼすこと、もしくは疾患を直接治癒させること、抑制すること、阻害すること、予防すること、疾患の重症度を低下させること、疾患の開始を遅延させること、疾患の進行を緩徐化すること、疾患の進行を安定させること、疾患の寛解を誘導すること、疾患の転移を予防するもしくは遅延させること、腫瘍またはがんに関連する症状を軽減／改善することのうちの１つもしくは複数、またはこれらの組合せを含み得る。例えば、処置することは、予想生存期間を延長することまたは腫瘍または転移サイズを減少させることを含み得る。効果（例えば、抑制すること、阻害すること、予防すること、〜の重症度を低下させること、〜の開始を遅らせること、〜の進行を緩徐化すること、〜の進行を安定させること、〜の寛解を誘導すること、〜の転移を予防するまたは遅延させること、〜の症状を軽減／改善することなど）は、処置を受けていないまたはプラセボ処置を受けている対照対象と比較しての効果であり得る。用語「処置する」または「処置すること」は、腫瘍またはがんを有する対象について（例えば、処置を受けていないまたはプラセボ処置を受けている対照対象と比較して）生存の可能性のパーセントを上昇させることまたは予想生存期間を延長することを指すこともある。一例では、「処置すること」は、（例えば、処置を受けていないまたはプラセボ処置を受けている対照対象と比較して）進行を遅延させること、寛解を促進すること、寛解を誘導すること、寛解を増加させること、回復を加速させること、代替療法の有効性を増大させること、代替療法に対する抵抗性を低下させること、またはこれらの組合せを指す。用語「予防すること」または「妨げること」は、例えば、症状の開始を遅延させること、腫瘍またはがんの再発を予防すること、再発エピソードの数もしくは頻度を減少させること、症候性エピソード間の潜伏期間を延長すること、腫瘍またはがんの転移を予防することまたはこれらの組合せを指すことができる。用語「抑制すること」または「阻害すること」は、例えば、症状の重症度を低下させること、急性エピソードの重症度を低下させること、症状の数を低減させること、疾患関連症状の発生率を低下させること、症状の潜伏期間を短縮すること、症状を改善すること、二次症状を軽減すること、二次感染を低減させること、患者生存期間を延長すること、またはこれらの組合せを指すことができる。
【０２７２】
用語「対象」は、腫瘍またはがんの治療を必要する、または疾患を発症しやすい、哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。用語対象は、発病予防的処置または治療的処理のいずれかを受ける哺乳動物（例えば、ヒト）も指す。対象は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、マウス、非ヒト哺乳動物、およびヒトを含み得る。用語「対象」は、あらゆる点で健康であり、腫瘍またはがんを有さないか疾患の徴候を示さない個体を、必ずしも除外するとは限らない。
【０２７３】
個体は、リスク因子（例えば、遺伝的、生化学的、家族歴、および状況的曝露）であって、そのリスク因子を有する個体が腫瘍またはがんを発症するリスクを、そのリスク因子を有さない個体より統計学的に有意に高くすることが公知の少なくとも１つのリスク因子を対象が有する場合、腫瘍またはがんを発症するリスクが高い。
【０２７４】
「症状」または「徴候」は、医師によって観察される疾患の客観的証拠、または対象によって知覚される疾患の主観的証拠、例えば歩行の変化を指す。症状または徴候は、疾患のあらゆる顕現であり得る。症状は、一次のものであることもあり、二次的なものであることもある。用語「一次（の）」は、特定の疾患または障害（例えば、腫瘍またはがん）の直接的結果である症状を指し、その一方で用語「二次（的）」は、一次原因に由来するまたはその結果として生じる症状を指す。本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、一次もしくは二次症状または二次的合併症を処置することができる。
【０２７５】
ヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、有効なレジメンで投与され、この有効なレジメンは、腫瘍またはがんの少なくとも１つの徴候もしくは症状の開始を遅延させる、重症度を低下させる、さらなる悪化を阻害する、および／または改善する、投薬量、投与経路および投与頻度を意味する。あるいは、ヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、有効なレジメンで投与され、この有効なレジメンは、ヘテロクリティックペプチドまたは組換え融合ポリペプチド（あるいは核酸にコードされる）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチン中の異種性抗原に対する免疫応答を誘導する、あるいは組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、前記細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株自体に対する免疫応答を誘導する投薬量、投与経路および投与頻度を意味する。対象が既に腫瘍またはがんに罹患している場合、そのレジメンを治療有効レジメンと呼ぶことができる。対象が、一般集団と比較して腫瘍またはがんを発症するリスクが高いが、まだ症状を経験していない場合、そのレジメンを発病予防有効レジメンと呼ぶことができる。一部の事例では、治療有効性または発病予防的有効性は、個々の患者において歴史的対照と比較してまたは同じ患者における過去の経験と比較して観察され得る。他の事例では、治療有効性または発病予防的有効性は、前臨床または臨床試験で処置を受けた患者の集団において未処置の患者の対照集団と比較して実証され得る。例えば、本明細書に記載される方法による処置を受けた個々の患者が、処置を受けていない比較対象患者の対照集団における平均成績より好ましい成績を達成した場合、あるいはより好ましい成績が、処置を受けた患者において、対照臨床試験（例えば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相試験）で対照患者に対してｐ＜０．０５もしくは０．０１またはさらには０．００１レベルで実証された場合、レジメンを治療的にまたは発病予防的に有効と見なすことができる。
【０２７６】
ペプチドについての例示的投薬量は、例えば、１日当たり１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、１０〜２０、２０〜４０、３０〜６０、４０〜６０、４０〜８０、５０〜１００、５０〜１５０、６０〜８０、８０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜６００、５００〜８００、６００〜８００、８００〜１０００、１０００〜１５００、または１５００〜１２００μｇペプチドである。ペプチドについての例示的投薬量は、例えば、１日当たり１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、１０〜２０、２０〜４０、３０〜６０、４０〜６０、４０〜８０、５０〜１００、５０〜１５０、６０〜８０、８０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜６００、５００〜８００、６００〜８００、８００〜１０００、１０００〜１５００、または１５００〜１２００ｍｇペプチドである。
【０２７７】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株についての例示的投薬量は、例えば、１×１０６〜１×１０７ＣＦＵ、１×１０７〜１×１０８ＣＦＵ、１×１０８〜３．３１×１０１０ＣＦＵ、１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵ、５〜５００×１０８ＣＦＵ、７〜５００×１０８ＣＦＵ、１０〜５００×１０８ＣＦＵ、２０〜５００×１０８ＣＦＵ、３０〜５００×１０８ＣＦＵ、５０〜５００×１０８ＣＦＵ、７０〜５００×１０８ＣＦＵ、１００〜５００×１０８ＣＦＵ、１５０〜５００×１０８ＣＦＵ、５〜３００×１０８ＣＦＵ、５〜２００×１０８ＣＦＵ、５〜１５×１０８ＣＦＵ、５〜１００×１０８ＣＦＵ、５〜７０×１０８ＣＦＵ、５〜５０×１０８ＣＦＵ、５〜３０×１０８ＣＦＵ、５〜２０×１０８ＣＦＵ、１〜３０×１０９ＣＦＵ、１〜２０×１０９ＣＦＵ、２〜３０×１０９ＣＦＵ、１〜１０×１０９ＣＦＵ、２〜１０×１０９ＣＦＵ、３〜１０×１０９ＣＦＵ、２〜７×１０９ＣＦＵ、２〜５×１０９ＣＦＵ、および３〜５×１０９ＣＦＵである。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株についての他の例示的投薬量は、例えば、１×１０７生物、１．５×１０７生物、２×１０８生物、３×１０７生物、４×１０７生物、５×１０７生物、６×１０７生物、７×１０７生物、８×１０７生物、１０×１０７生物、１．５×１０８生物、２×１０８生物、２．５×１０８生物、３×１０８生物、３．３×１０８生物、４×１０８生物、５×１０８生物、１×１０９生物、１．５×１０９生物、２×１０９生物、３×１０９生物、４×１０９生物、５×１０９生物、６×１０９生物、７×１０９生物、８×１０９生物、１０×１０９生物、１．５×１０１０生物、２×１０１０生物、２．５×１０１０生物、３×１０１０生物、３．３×１０１０生物、４×１０１０生物、および５×１０１０生物である。投薬量は、患者の状態に依存することもあり、もしあれば、以前の処置に対する応答に、その処置が発病予防的であったにせよ治療的であったにせよ、依存することもあり、他の要因に依存することもある。
【０２７８】
投与は、任意の好適な手段により得る。例えば、投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、腹腔内、局所、鼻腔内、筋肉内、眼内、直腸内、結膜、経皮、皮内、経膣、直腸、腫瘍内、傍がん（ｐａｒｃａｎｃｅｒａｌ）、経粘膜、血管内、心室内、吸入（エアロゾル）、鼻吸引（スプレー）、舌下、エアロゾル、坐剤、またはこれらの組合せであり得る。吸入による鼻腔内投与または適用には、適切な担体の存在下で混合され、エアロゾル化または霧化される、ヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの、溶液または懸濁液が、好適である。そのようなエアロゾルは、本明細書に記載される任意のヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを含み得る。投与は、坐剤（例えば、肛門坐剤もしくは尿道坐剤）の形態、皮下移植用の（例えば、ある期間にわたって制御放出をもたらす）ペレットの形態、またはカプセルの形態であることもある。投与はまた、腫瘍部位へのまたは腫瘍内への注射によるものであることもある。投与レジメンは、処置されることになるの正確な性質および種類、腫瘍またはがんの重症度、対象の年齢および全身健康状態、対象の体重、個々の対象の応答などのような要因に基づいて、容易に決定することができる。
【０２７９】
投与頻度は、数ある要因の中でも特に、対象におけるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの半減期、対象の状態、および投与経路に依存し得る。頻度は、例えば、対象の状態の変化、または処置下の腫瘍もしくはがんの進行に応じて、１日１回、週１回、月１回、年４回、または不定期間隔であり得る。処置コースは、対象の状態および他の要因に依存し得る。例えば、処置コースは、数週間、数ヶ月、または数年（例えば、最大２年）であり得る。例えば、腫瘍の退行または腫瘍成長の抑制を達成するために、初回処置コースの直後に、または数日、数週間もしくは数ヶ月おいて、反復投与（用量）を始めることができる。診断方法、例えば、イメージング技術、血清腫瘍マーカー、生検、または腫瘍関連症状の存在、非存在もしくは改善の分析を含む、任意の公知の技術によって、評定を決定することができる。特定の例として、ヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを、最大２年の間、３週間に１回投与することができる。一例では、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、エフェクターＴ細胞対調節性Ｔ細胞比を上昇させ、より強力な抗腫瘍免疫応答を生じさせるために、漸増用量で投与される。例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および細胞免疫応答を増強することが公知の他のサイトカインを含む、サイトカインを対象に提供することによって、抗腫瘍応答をさらに強化することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，９９１，７８５を参照されたい。
【０２８０】
一部の方法は、追加のヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンで対象に「追加免疫すること」、あるいはヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを複数回投与することをさらに含み得る。「追加免疫すること」は、対象に追加の用量を投与することを指す。例えば、一部の方法では、２回の追加免疫（または合計３回の接種）が投与され、３回の追加免疫が投与され、４回の追加免疫が投与され、５回の追加免疫が投与され、または６回もしくはそれより多くの追加免疫が投与される。投与される投薬数は、例えば、腫瘍またはがんに対する疾患の応答に依存し得る。
【０２８１】
必要に応じて、追加免疫接種に使用されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、最初の「初回抗原刺激」接種で使用されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンと同じである。あるいは、追加免疫ヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、初回抗原刺激のヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンと異なる。必要に応じて、同じ投薬量が、初回抗原刺激接種および追加免疫接種において使用される。あるいは、より多い投薬量が、追加免疫剤に使用され、またはより少ない投薬量が追加免疫剤に使用される。初回抗原刺激接種と追加免疫接種の間の期間は、実験に基づいて決定することができる。例えば、初回抗原刺激接種と追加免疫接種の間の期間は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６〜８週間、または８〜１０週間であり得る。
【０２８２】
異種初回抗原刺激追加免疫戦略は、非常に多くの病原体に対する免疫応答および保護の増強に効果をあげている。例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １７０：２９−３８；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  （２００２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：２３９−２５０；Ｇｏｎｚａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１２２６−１２３１；およびＴａｎｇｈｅ  （２００１）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６９：３０４１−３０４７を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。初回抗原刺激注射および追加免疫注射において異なる形態の抗原を提供することで、抗原に対する免疫応答を最大化することができる。ＤＮＡワクチンでの初回抗原刺激、その後のアジュバント中のタンパク質での追加免疫または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達は、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を改善する１つの有効な方法である。例えば、Ｓｈｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：  ３３１−３３５；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１０３９−１０４５；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：９５−１０２；およびＳｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−７７９を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。一例として、対象が、ＤＮＡ初回抗原刺激、その後の抗原を発現するアデノウイルスベクターでの追加免疫によるワクチン接種を受ける場合、抗原をコードするＤＮＡにＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）を加えることで、Ｔ細胞応答を増強することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−３３５を参照されたい。別の例として、抗原の免疫原性部分をコードするベクター構築物、および抗原の免疫原性部分を含むタンパク質を、投与することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００２／０１６５１７２を参照されたい。同様に、核酸ワクチン接種に対する免疫応答を、目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの（例えば、同じ免疫応答の間の、好ましくは、互いに０〜１０または３〜７日以内の）同時投与によって増強することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，５００，４３２を参照されたい。
【０２８３】
本明細書で開示される治療方法は、がんの予防または処置に有効な１つまたは複数のさらなる化合物を投与するステップも含むことができる。例えば、さらなる化合物は、化学療法に有用な化合物、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール・ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組合せを含み得る。あるいは、さらなる化合物は、他の生物製剤も含むことができ、そのような生物製剤としては、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対する抗体、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）が挙げられる。あるいは、さらなる化合物は、他の免疫療法薬を含むことができる。あるいは、さらなる化合物は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤、例えば、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキシアルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害剤であり得る。ＩＤＯ阻害は、化学療法剤の有効性を増強することができる。本明細書で開示される治療方法を、放射線、幹細胞処置、外科手術または任意の他の処置と組み合わせることもできる。
【０２８４】
そのようなさらなる化合物または処置は、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの投与に先行することもあり、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの投与の後に続くこともあり、あるいは本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの投与と同時であることもある。
【０２８５】
標的免疫調節療法は、例えば、４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体関連）を含む腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーを標的とするアゴニスト抗体を使用することによる、共刺激受容体の活性化に主な重点を置いている。ＧＩＴＲのモジュレーションは、抗腫瘍設定でもワクチン設定でも可能性を実証してきた。アゴニスト抗体の別の標的は、Ｔ細胞活性化のための共刺激シグナル分子である。共刺激シグナル分子の標的化は、Ｔ細胞の活性化増強およびより強力な免疫応答の助長をもたらすことができる。共刺激は、チェックポイント阻害からの阻害の影響を防止することおよび抗原特異的Ｔ細胞増殖を増加させることにも役立ち得る。
【０２８６】
Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づく免疫療法は、腫瘍に浸潤して破壊する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の新規生成を誘導することにより、ならびに腫瘍微小環境における免疫抑制性調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数および活性を低下させることにより作用する。Ｔ細胞共阻害または共刺激受容体（例えば、チェックポイント阻害剤ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３ならびに共刺激物質ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲおよびＣＤ４０）に対する抗体（またはその機能性断片）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づく免疫療法との相乗効果を有することができる。
【０２８７】
したがって、一部の方法は、さらに、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ−８０／８６およびＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害剤、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤または任意の他の抗原提示細胞／Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害剤などの、免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含むことができる。免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストの例としては、抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片が挙げられる。例えば、抗ＰＤ−１抗体を、対象に、２週間に１回５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間に１回５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間に１回１〜２ｍｇ／ｋｇ、１週間に１回１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２週間に１回１〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間に１回１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または４週間に１回１〜１０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【０２８８】
同様に、一部の方法は、Ｔ細胞刺激物質、例えば、Ｔ細胞受容体共刺激分子と結合する抗体もしくはその機能性断片、共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーを投与するステップをさらに含むことができる。Ｔ細胞受容体共刺激分子は、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含み得る。共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体は、例えば、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含み得る。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５を含み得る。
【０２８９】
例えば、一部の方法は、Ｔ細胞受容体共刺激分子と結合する抗体もしくはその機能性断片または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体と結合する抗体もしくはその機能性断片を含む組成物の有効量を投与するステップをさらに含むことができる。抗体は、例えば、抗ＴＮＦ受容体抗体もしくはその抗原結合性断片（例えば、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、もしくはＴＮＦＲ２５）、抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。あるいは、他のアゴニスト性分子（例えば、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性断片を含有する融合タンパク質、抗原提示細胞（ＡＰＣ）／Ｔ細胞アゴニスト、ＣＤ１３４またはそのリガンドもしくは断片、ＣＤ１３７またはそのリガンドもしくは断片、あるいは誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）（ＩＣＯＳ）またはそのリガンドもしくは断片、あるいはアゴニスト性小分子）を投与することができる。
【０２９０】
特定の例では、一部の方法は、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能性断片および／または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能性断片を投与するステップをさらに含むことができる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能性断片または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能性断片を、ヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの初回用量の約７２時間後に投与することができ、あるいはヘテロクリティックペプチド、組換え融合ポリペプチド、ヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの初回用量の約４８時間後に投与することができる。抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能性断片または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能性断片を、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇおよび約５ｍｇ／ｋｇの用量で、投与することができる。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を、例えば、約１×１０９ＣＦＵの用量で投与することができる。一部のそのような方法は、抗ＰＤ−１抗体またはその機能性断片の有効量を投与するステップをさらに含むことができる。
【０２９１】
がん免疫療法の有効性を評定する方法は周知であり、例えば、Ｄｚｏｊｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６６（８）：８３１−８３８；Ｎａｒｕｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １３（７）：６５８−６６３、Ｓｅｈｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．  ６：２１）、およびＨｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５６（５）：７２５−７３０に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。一例として、前立腺がんについては、前立腺がんモデル、例えば、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２マウスモデル、１７８−２  ＢＭＡ細胞モデル、ＰＡＩＩＩ腺癌細胞モデル、ＰＣ−３Ｍモデル、または任意の他の前立腺がんモデルを使用して、本明細書で開示される方法および組成物を試験することができる。
【０２９２】
あるいは、または加えて、免疫療法をヒト対象において試験することができ、公知の＿＿＿を使用して有効性をモニターすることができる。そのような方法は、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を直接測定するステップ、または疾患進行を（例えば、腫瘍転移の数もしくはサイズを判定すること、または疾患症状、例えば咳、胸痛、体重減少などをモニターすることにより）測定するステップを含むことができる。ヒト対象におけるがん免疫療法の有効性を評定する方法は周知であり、例えば、Ｕｅｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．  ７：９およびＴｈｏｍａｓ−Ｋａｓｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１９（１０）：２４２８−２４３４に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＩＩ．キット
【０２９３】
本明細書で開示される方法を行う際に利用される試薬を含むキット、または本明細書で開示される組成物、ツールまたは器具を含むキットも、提供される。
【０２９４】
例えば、そのようなキットは、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドまたは組換え融合ポリペプチド、本明細書で開示されるヘテロクリティックペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、本明細書で開示される組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、本明細書で開示される免疫原性組成物、本明細書で開示される医薬組成物、または本明細書で開示されるワクチンを含み得る。そのようなキットは、本明細書で開示される方法を行うためのペプチドもしくは組換え融合ポリペプチド、ペプチドもしくは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの使用を説明する説明資料をさらに含み得る。そのようなキットは、必要に応じてアプリケーターをさらに含み得る。モデルキットが下で説明されるが、他の有用なキットの内容は、本開示に照らせば明白であろう。
【０２９５】
上記または下記の全ての特許出願、ウェブサイト、他の公表文献、受託番号などは、それら全体があらゆる目的で参照により組み込まれ、この組込みは、各々の個々の事柄が参照によりそのように組み込まれると具体的にかつ個々に示されている場合と同程度のものである。異なるバージョンの配列が、異なる時点で、ある受託番号に結び付けられたとしても、本出願の有効出願日の時点でその受託番号に結び付けられるバージョンを意図している。この有効出願日は、該当する場合、受託番号を参照して実際の出願日または優先権出願の出願日のどちらか早いほうの日を意味する。同様に、異なるバージョンの公表文献、ウェブサイトなどが、異なる時点で公表されていたとしても、別段の指示がない限り、本出願の有効出願日の最も近日に公表されたバージョンを意図している。別段の具体的な指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。明確化および理解を目的として例証および例によってある程度詳細に本発明を説明したが、ある特定の変更および修飾を添付の特許請求の範囲に記載の範囲内で行うことができることは明らかであろう。
実施形態の列挙
【０２９６】
本明細書で開示される主題は、以下の実施形態を含むが、これらに限定されない。
【０２９７】
１．  がん関連タンパク質の免疫原性断片を含む単離されたペプチドであって、前記断片が、ヘテロクリティック突然変異を含む、単離されたペプチド。
【０２９８】
２．  前記ヘテロクリティック突然変異が、アンカー位置における好ましいアミノ酸への突然変異である、実施形態１に記載の単離されたペプチド。
【０２９９】
３．  前記断片が、長さ約７アミノ酸〜約１１アミノ酸の間、長さ約８アミノ酸〜約１０アミノ酸の間、または長さ約９アミノ酸である、実施形態１または２に記載の単離されたペプチド。
【０３００】
４．  前記がん関連タンパク質が、がん精巣抗原または癌胎児性抗原である、前記いずれかの実施形態に記載の単離されたペプチド。
【０３０１】
５．  前記がん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＴＥＲＴ、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＮＵＦ２、ＮＹＥＳＯ１、ＰＡＧＥ４、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＳＳＸ２、ＳＴＥＡＰ１およびＳＵＲＶＩＶＩＮのうち１つによってコードされる、前記いずれかの実施形態に記載の単離されたペプチド。
【０３０２】
６．  （ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記断片が、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つを含む；（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１１０および１１２のいずれか１つを含む；（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記断片が、配列番号１１４を含む；（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記断片が、配列番号１１６を含む；（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つを含む；（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１２６を含む；（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記断片が、配列番号１２８を含む；（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１３０および１３２のいずれか１つを含む；（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１３４および１３６のいずれか１つを含む；（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１３８を含む；（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記断片が、配列番号１４０を含む；（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４２を含む；（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４４を含む；（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４６を含む；（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４８を含む；（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１５０を含む；（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１５２および１５４のいずれか１つを含む；または（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記断片が、配列番号１５６および１５８のいずれか１つを含む、実施形態５に記載の単離されたペプチド。
【０３０３】
７．  （ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記断片が、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つからなる；（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１１０および１１２のいずれか１つからなる；（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記断片が、配列番号１１４からなる；（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記断片が、配列番号１１６からなる；（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つからなる；（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１２６からなる；（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記断片が、配列番号１２８からなる；（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１３０および１３２のいずれか１つからなる；（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１３４および１３６のいずれか１つからなる；（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１３８からなる；（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記断片が、配列番号１４０からなる；（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４２からなる；（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４４からなる；（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４６からなる；（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４８からなる；（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１５０からなる；（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１５２および１５４のいずれか１つからなる；または（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記断片が、配列番号１５６および１５８のいずれか１つからなる、実施形態６に記載の単離されたペプチド。
【０３０４】
８．  （ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つからなる；（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１１０および１１２のいずれか１つからなる；（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１１４からなる；（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１１６からなる；（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つからなる；（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１２６からなる；（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１２８からなる；（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１３０および１３２のいずれか１つからなる；（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１３４および１３６のいずれか１つからなる；（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１３８からなる；（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４０からなる；（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４２からなる；（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４４からなる；（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４６からなる；（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１４８からなる；（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１５０からなる；（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１５２および１５４のいずれか１つからなる；または（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記単離されたペプチドが、配列番号１５６および１５８のいずれか１つからなる、実施形態７に記載の単離されたペプチド。
【０３０５】
９．  前記断片が、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数に結合する、前記いずれかの実施形態に記載の単離されたペプチド。
【０３０６】
１０．  前記いずれかの実施形態に記載の単離されたペプチドをコードする核酸。
【０３０７】
１１．  ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている、実施形態１０に記載の核酸。
【０３０８】
１２．  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおける発現のためにコドン最適化されている、実施形態１０に記載の核酸。
【０３０９】
１３．  ＤＮＡを含む、実施形態１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸。
【０３１０】
１４．  ＲＮＡを含む、実施形態１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸。
【０３１１】
１５．  配列番号２２３〜９７７、および同じアミノ酸配列をコードするそれらの縮重バリアントのいずれか１つから選択される配列を含む、実施形態１０〜１４のいずれか一項に記載の核酸。
【０３１２】
１６．  配列番号２２３〜９７７、および同じアミノ酸配列をコードするそれらの縮重バリアントのいずれか１つから選択される配列からなる、実施形態１５に記載の核酸。
【０３１３】
１７．  （ａ）実施形態１〜９のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の単離されたペプチドまたは実施形態１０〜１６のいずれか一項に記載の１つもしくは複数の核酸；および（ｂ）アジュバント
を含む医薬組成物。
【０３１４】
１８．  前記アジュバントが、無毒化リステリオリジンＯ（ｄｔＬＬＯ）、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドまたはＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１を含む、実施形態１７に記載の医薬組成物。
【０３１５】
１９．  次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２の各々に結合するペプチドまたは前記ペプチドをコードする核酸を含む、実施形態１７または１８に記載の医薬組成物。
【０３１６】
２０．  （ａ）表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｂ）表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｃ）表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｄ）表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｅ）表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｆ）表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｇ）表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｈ）表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｉ）表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；あるいは（ｊ）表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸を含む、実施形態１７〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【０３１７】
２１．  （ａ）表３に記載のペプチドの全て、もしくは表３に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｂ）表５に記載のペプチドの全て、もしくは表５に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｃ）表７に記載のペプチドの全て、もしくは表７に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｄ）表９に記載のペプチドの全て、もしくは表９に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｅ）表１１に記載のペプチドの全て、もしくは表１１に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｆ）表１３に記載のペプチドの全て、もしくは表１３に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｇ）表１５に記載のペプチドの全て、もしくは表１５に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｈ）表１７に記載のペプチドの全て、もしくは表１７に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｉ）表１９に記載のペプチドの全て、もしくは表１９に記載のペプチドの全てをコードする核酸；または（ｊ）表２１に記載のペプチドの全て、もしくは表２１に記載のペプチドの全てをコードする核酸を含む、実施形態２０に記載の医薬組成物。
【０３１８】
２２．  実施形態１〜９に記載の単離されたペプチドのいずれか１つをコードする核酸を含む組換え細菌株。
【０３１９】
２３．  実施形態１〜９に記載の単離されたペプチドのうち２つまたはそれより多くをコードする１つまたは複数の核酸を含む組換え細菌株。
【０３２０】
２４．  前記２つまたはそれより多くのペプチドが、（ａ）表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｂ）表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｃ）表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｄ）表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｅ）表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｆ）表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｇ）表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｈ）表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；（ｉ）表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸；あるいは（ｊ）表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く、または表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くをコードする核酸を含む、実施形態２３に記載の組換え細菌株。
【０３２１】
２５．  前記２つまたはそれより多くのペプチドが、（ａ）表３に記載のペプチドの全て、もしくは表３に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｂ）表５に記載のペプチドの全て、もしくは表５に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｃ）表７に記載のペプチドの全て、もしくは表７に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｄ）表９に記載のペプチドの全て、もしくは表９に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｅ）表１１に記載のペプチドの全て、もしくは表１１に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｆ）表１３に記載のペプチドの全て、もしくは表１３に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｇ）表１５に記載のペプチドの全て、もしくは表１５に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｈ）表１７に記載のペプチドの全て、もしくは表１７に記載のペプチドの全てをコードする核酸；（ｉ）表１９に記載のペプチドの全て、もしくは表１９に記載のペプチドの全てをコードする核酸；または（ｊ）表２１に記載のペプチドの全て、もしくは表２１に記載のペプチドの全てをコードする核酸を含む、実施形態２４に記載の組換え細菌株。
【０３２２】
２６．  ２つまたはそれより多くのペプチドの組合せが、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２の各々に結合する、実施形態２３〜２５のいずれか一項に記載の組換え細菌株。
【０３２３】
２７．  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、ＳｈｉｇｅｌｌａまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株である、実施形態２２〜２６のいずれか一項に記載の組換え細菌株。
【０３２４】
２８．  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株であり、必要に応じて、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態２７に記載の組換え細菌株。
【０３２５】
２９．  融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記融合ポリペプチドが、がん関連タンパク質の免疫原性断片に融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、前記断片が、ヘテロクリティック突然変異を含む、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３２６】
３０．  前記ヘテロクリティック突然変異が、アンカー位置における好ましいアミノ酸への突然変異である、実施形態２９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３２７】
３１．  前記断片が、長さ約７アミノ酸〜約１１アミノ酸の間、長さ約８アミノ酸〜約１０アミノ酸の間、または長さ約９アミノ酸である、実施形態２９または３０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３２８】
３２．  前記がん関連タンパク質が、がん精巣抗原または癌胎児性抗原である、実施形態２９〜３１のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３２９】
３３．  前記がん関連タンパク質が、次のヒト遺伝子：ＣＥＡＣＡＭ５、ＧＡＧＥ１、ＴＥＲＴ、ＫＬＨＬ７、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、ＭＡＧＥＡ６、ＮＵＦ２、ＮＹＥＳＯ１、ＰＡＧＥ４、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＲＮＦ４３、ＳＡＲＴ３、ＳＳＸ２、ＳＴＥＡＰ１およびＳＵＲＶＩＶＩＮのうち１つによってコードされる、実施形態２９〜３２のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３０】
３４．  （ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記断片が、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つを含む；（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１１０および１１２のいずれか１つを含む；（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記断片が、配列番号１１４を含む；（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記断片が、配列番号１１６を含む；（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つを含む；（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１２６を含む；（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記断片が、配列番号１２８を含む；（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１３０および１３２のいずれか１つを含む；（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１３４および１３６のいずれか１つを含む；（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１３８を含む；（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記断片が、配列番号１４０を含む；（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４２を含む；（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４４を含む；（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４６を含む；（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４８を含む；（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１５０を含む；（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１５２および１５４のいずれか１つを含む；または（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記断片が、配列番号１５６および１５８のいずれか１つを含む、実施形態３３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３１】
３５．  （ａ）前記がん関連タンパク質が、ＣＥＡＣＡＭ５によってコードされ、前記断片が、配列番号１００、１０２、１０４、１０６および１０８のいずれか１つからなる；（ｂ）前記がん関連タンパク質が、ＧＡＧＥ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１１０および１１２のいずれか１つからなる；（ｃ）前記がん関連タンパク質が、ＴＥＲＴによってコードされ、前記断片が、配列番号１１４からなる；（ｄ）前記がん関連タンパク質が、ＫＬＨＬ７によってコードされ、前記断片が、配列番号１１６からなる；（ｅ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１１８、１２０、１２２および１２４のいずれか１つからなる；（ｆ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１２６からなる；（ｇ）前記がん関連タンパク質が、ＭＡＧＥＡ６によってコードされ、前記断片が、配列番号１２８からなる；（ｈ）前記がん関連タンパク質が、ＮＵＦ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１３０および１３２のいずれか１つからなる；（ｉ）前記がん関連タンパク質が、ＮＹＥＳＯ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１３４および１３６のいずれか１つからなる；（ｊ）前記がん関連タンパク質が、ＰＡＧＥ４によってコードされ、前記断片が、配列番号１３８からなる；（ｋ）前記がん関連タンパク質が、ＰＲＡＭＥによってコードされ、前記断片が、配列番号１４０からなる；（ｌ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４２からなる；（ｍ）前記がん関連タンパク質が、ＰＳＭＡによってコードされ、前記断片が、配列番号１４４からなる；（ｎ）前記がん関連タンパク質が、ＲＮＦ４３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４６からなる；（ｏ）前記がん関連タンパク質が、ＳＡＲＴ３によってコードされ、前記断片が、配列番号１４８からなる；（ｐ）前記がん関連タンパク質が、ＳＳＸ２によってコードされ、前記断片が、配列番号１５０からなる；（ｑ）前記がん関連タンパク質が、ＳＴＥＡＰ１によってコードされ、前記断片が、配列番号１５２および１５４のいずれか１つからなる；または（ｒ）前記がん関連タンパク質が、ＳＵＲＶＩＶＩＮによってコードされ、前記断片が、配列番号１５６および１５８のいずれか１つからなる、実施形態３４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３２】
３６．  前記断片が、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２のうち１つまたは複数に結合する、実施形態２９〜３５のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３３】
３７．  前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、細菌分泌シグナル配列を含み、前記融合ポリペプチドが、前記断片に融合されたユビキチンタンパク質をさらに含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチド、前記ユビキチンおよびカルボキシ末端抗原性ペプチドが、前記融合ポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へ直列に配列されている、実施形態２９〜３６のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３４】
３８．  前記融合ポリペプチドが、がん関連タンパク質の２つまたはそれより多くの免疫原性断片に融合された前記ＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、前記２つまたはそれより多くの断片の各々が、ヘテロクリティック突然変異を含む、実施形態２９〜３７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３５】
３９．  前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片が、介在配列なしで互いに直接融合されている、実施形態３８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３６】
４０．  前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片が、ペプチドリンカーを介して互いに連結されている、実施形態３８に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３７】
４１．  配列番号２０９〜２１７に記載のリンカーのうち１つまたは複数が、前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片を連結させるために使用されている、実施形態４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３８】
４２．  前記融合ポリペプチド中の２つまたはそれより多くの免疫原性断片の組合せが、次のＨＬＡ型：ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２の各々に結合する、実施形態３８〜４１のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３３９】
４３．  前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片が、（ａ）表３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；（ｂ）表５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；（ｃ）表７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；（ｄ）表９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；（ｅ）表１１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；（ｆ）表１３に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；（ｇ）表１５に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；（ｈ）表１７に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；（ｉ）表１９に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多く；または（ｊ）表２１に記載のペプチドのうち２つもしくはそれより多くを含む、実施形態３８〜４２のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４０】
４４．  前記２つまたはそれより多くの免疫原性断片が、（ａ）表３に記載のペプチドの全て；（ｂ）表５に記載のペプチドの全て；（ｃ）表７に記載のペプチドの全て；（ｄ）表９に記載のペプチドの全て；（ｅ）表１１に記載のペプチドの全て；（ｆ）表１３に記載のペプチドの全て；（ｇ）表１５に記載のペプチドの全て；（ｈ）表１７に記載のペプチドの全て；（ｉ）表１９に記載のペプチドの全て；または（ｊ）表２１に記載のペプチドの全てを含む、実施形態４３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４１】
４５．  前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、前記融合ポリペプチドのＮ末端にある、実施形態２９〜４４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４２】
４６．  前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態４５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４３】
４７．  ＬＬＯの前記Ｎ末端断片が、配列番号５９に記載の配列を有する、実施形態４６に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４４】
４８．  前記核酸が、エピソームプラスミドにある、実施形態２９〜４７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４５】
４９．  前記核酸が、前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に抗生物質耐性を付与しない、実施形態２９〜４８のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４６】
５０．  弱毒化栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、実施形態２９〜４９のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４７】
５１．  前記弱毒化栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、１つまたは複数の内在性遺伝子を不活性化する、前記１つまたは複数の内在性遺伝子中の突然変異を含む、実施形態５０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４８】
５２．  前記１つまたは複数の内在性遺伝子が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔを含む、実施形態５１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３４９】
５３．  前記核酸が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態２９〜５２のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３５０】
５４．  前記代謝酵素が、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素である、実施形態５３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３５１】
５５．  前記融合ポリペプチドが、ｈｌｙプロモーターから発現される、実施形態２９〜５４のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３５２】
５６．  組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態２９〜５５のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３５３】
５７．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔの欠失またはａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態２９〜５６のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３５４】
５８．  （ａ）実施形態２２〜２８のいずれか一項に記載の組換え細菌株または実施形態２９〜５７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株；および（ｂ）アジュバントを含む免疫原性組成物。
【０３５５】
５９．  前記アジュバントが、無毒化リステリオリジンＯ（ｄｔＬＬＯ）、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡまたは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態５８に記載の免疫原性組成物。
【０３５６】
６０．  対象における腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、実施形態１０〜１６のいずれか一項に記載の核酸、実施形態１７〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物、実施形態２２〜２８のいずれか一項に記載の組換え細菌株、実施形態２９〜５７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または実施形態５８〜５９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【０３５７】
６１．  対象における腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド、実施形態１０〜１６のいずれか一項に記載の核酸、実施形態１７〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物、実施形態２２〜２８のいずれか一項に記載の組換え細菌株、実施形態２９〜５７のいずれか一項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または実施形態５８〜５９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【０３５８】
６２．  前記がんが、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がんまたは頭頸部がんである、実施形態６０または６１に記載の方法。
配列の簡単な説明
【０３５９】
添付の配列表に列挙されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準文字略語、およびアミノ酸の３文字コードを使用して示される。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端で始まり、フォワード方向に（すなわち、各列の左から右に）３’末端へと進む、標準的慣行に従う。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されるが、表示される鎖へのいずれの言及も相補鎖を含むように解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端で始まり、フォワード方向に（すなわち、各列の左から右に）カルボキシ末端へと進む、標準的慣行に従う。
【表Ｆ−１】
2021502083.tif 000008
【表Ｆ−２】
2021502083.tif 000009
【表Ｆ−３】
2021502083.tif 000010
【表Ｆ−４】
2021502083.tif 000011
【実施例】
【０３６０】
（実施例１）
ヘテロクリティックペプチドの設計のためのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ方法論
がん関連タンパク質に由来するヘテロクリティックペプチド（すなわち、配列最適化されたペプチド）を、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子による提示を増加させるように設計した。腫瘍関連抗原遺伝子は、腫瘍組織において発現されるが、正常な健康組織において非常に低い発現を有する遺伝子を代表するので、ヘテロクリティックペプチドを、これらの腫瘍関連抗原遺伝子によって発現されるペプチドを変更することによって誘導した。特に、ヘテロクリティックペプチドを、がん関連タンパク質、例えば、がん精巣抗原または癌胎児性抗原から設計した（すなわち、腫瘍関連抗原から設計した）。がん精巣抗原（ＣＴＡ）は、異なる組織学的起源のヒト腫瘍において発現されるが、雄性生殖細胞を除く正常組織では発現されない腫瘍関連抗原の大きいファミリーである。がんでは、これらの発生的抗原が再発現され得、免疫活性化の遺伝子座として機能し得る。癌胎児性抗原（ＯＦＡ）は、典型的には胎児発生の間にのみ存在するが、ある特定の種類のがんを有する成人において見出されるタンパク質である。ＣＴＡおよびＯＦＡの発現の腫瘍制限されたパターンにより、これらは、腫瘍特異的免疫療法のための理想的な標的になっている。複数のＯＦＡ／ＣＴＡの組合せは、患者カバー範囲を最大化することができる。ほとんどのＯＦＡ／ＣＴＡタンパク質は、発癌において重要な役割を果たすので、それらを標的化することは、がん増殖を顕著に損なうことができる。複数のＯＦＡ／ＣＴＡペプチドを組み合わせることは、標的疾患を有する潜在的に全ての患者において発現される、１つの処置における複数の高結合力標的を示す。
【０３６１】
ヘテロクリティックを、あるがん型において最大で１００％の発現を有する遺伝子から、北アメリカで最も一般的な４つのＨＬＡに対して設計した。選択したＨＬＡ型としては、Ａ０２０１、Ａ０３０１、Ａ２４０２およびＢ０７０２が挙げられ、これらは、北アメリカの白人においてそれぞれ４７．８％、２０．６％、２０．６％および２８．７％の頻度を有し、北アメリカのアフリカ系アメリカ人において１６．８％、２３．８％、８．９％および１６．０％の頻度を有する。これは、患者１人当たり少なくとも１つのペプチド−ＭＨＣ組合せの可能性を増加させる。ヘテロクリティック配列は、Ｔ細胞応答をプライミングし、中枢性寛容を克服し、野生型ペプチドに対する首尾よい交差反応性免疫応答を惹起するのに十分であることが示されている。ヘテロクリティックエピトープの組合せは、あるがん型内の総患者カバー範囲を、１００％に近づくレベルにすることができる。したがって、本発明者らは、処置前に患者に対して配列決定を行う必要がないが、これは、彼らが、最も一般的なＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０３０１、ＨＬＡ−Ａ２４０２およびＨＬＡ−Ｂ０７０２）をカバーするために本発明者らがそれらに対してヘテロクリティックペプチドを設計した腫瘍関連抗原を発現すると考えられるからである。
【０３６２】
文献の見直しを実施して、潜在的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の一覧表を生成するために徴候特異的腫瘍関連抗原のゲノム的ランドスケープを調査した。文献からの免疫原性情報を有するＨＬＡ−Ａ０２０１に対するヘテロクリティックペプチドを選択した。ＨＬＡ−Ａ２４０２に対するヘテロクリティックペプチドもまた選択した。
【０３６３】
第２の文献の見直しを実施して、一覧表のＴＡＡが、ＣＤ８＋Ｔリンパ球応答を生じる公知の免疫原性ペプチドを含むかどうかを決定した。このアプローチは、ＴＡＡ由来の９アミノ酸（９マー）からなるＭＨＣクラスＩエピトープに主に焦点を当てた。このステップにより、４つのＨＬＡ型（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２およびＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２）のうち１つに結合する９マー形式の潜在的腫瘍関連抗原ペプチド（ＴＡＡＰ）が識別された。
【０３６４】
ＴＡＡＰを配列最適化して、ＭＨＣクラスＩ分子への結合を増強した（ヘテロクリティックペプチドとしても公知）。各ＨＬＡへの結合を最適化するために、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＭＨＣ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃｈａｒｔを、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（例：ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ＭＨＣａｌｌｅｌｅｉｄ／１４３）から評定した。アンカー位置における好ましいアミノ酸を、ＴＡＡＰ配列（例えば、ＮＵＦ２−野生型：ＹＭＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号１３１）；およびＮＵＦ２−ヘテロクリティック：ＹＬＭＰＶＮＳＥＶ（配列番号１３０））中に挿入した。
【０３６５】
次いで、配列最適化されたＴＡＡＰおよび野生型ＴＡＡＰ配列の結合親和性を、次のアルゴリズムのうち１つを使用して評定した：ＮｅｔＭＨＣ４．０  Ｓｅｒｖｅｒ；ＮｅｔＭＨＣｐａｎ４．０  Ｓｅｒｖｅｒ；およびｍｈｃｆｌｕｒｒｙ  ｖ０．２．０。
【０３６６】
配列最適化されたＴＡＡＰを、特異的ＨＬＡへの結合親和性の予測が、野生型ＴＡＡＰ配列と等価またはそれよりも強いかどうかについて検討した。
【０３６７】
次いで、選択された配列最適化されたＴＡＡＰを、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅのＲＥＶＥＡＬアッセイを使用して、特異的ＨＬＡへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合についてスクリーニングした。ＲＥＶＥＡＬアッセイの陽性対照ペプチドの＞＝４５％の結合親和性を有するＴＡＡＰを、結合因子とみなした。
【０３６８】
最後に、ＴＡＡＰのＲＮＡ発現レベルを、ＴＣＧＡ  ＲＮＡｓｅｑＶ２データセット中の特定の徴候において測定した。０よりも大きい標準化されたＲＮＡ発現読み取りを有するＴＣＧＡ試料のパーセンテージを計算した。大部分の試料においてＴＣＧＡ発現を有するＴＡＡＰを優先した。
【０３６９】
各ヘテロクリティック抗原性ペプチドは、単一のヘテロクリティック突然変異を含み得、または２つもしくはそれより多くのヘテロクリティック突然変異（例えば、２つのヘテロクリティック突然変異）を含み得る。例示的なヘテロクリティック突然変異体ペプチドは、対応する野生型（ネイティブ）ペプチドと共に、次の表中に提供される。対応するヘテロクリティックペプチドにおいて改変された野生型ペプチド中の残基は、太字かつ下線で示す。
【０３７０】
【表１】
2021502083.tif 000012
（実施例２）
ヘテロクリティックペプチドの設計および結合親和性
【０３７１】
いくつかのがん型を、それに対するヘテロクリティック免疫原性ペプチド（配列最適化された腫瘍関連抗原ペプチド）を開発するために選択した。これらとしては、非小細胞肺がん、前立腺がん、膵臓がん、膀胱がん、乳がん（例えば、ＥＲ＋乳がん）、子宮がん、卵巣がん、低悪性度神経膠腫、結腸直腸がん（例えば、ＭＳＳ結腸直腸がん）および頭頸部がんが挙げられた。表２は、がんの各型についてペプチドが由来する腫瘍関連遺伝子の要約を提供する。最後の列は、その徴候についてＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）患者の少なくとも９０％において発現された、先行する列の腫瘍関連抗原（例えば、ＣＴＡ／ＯＦＡ）遺伝子の数を示す。例えば、３つのＴＡＡ遺伝子が、ＮＳＣＬＣ患者の９０％よりも多くにおいて発現された。残りのＴＡＡ遺伝子は、ＴＣＧＡ  ＮＳＣＬＣ患者の集団の＜９０％において発現された。
【０３７２】
【表２】
2021502083.tif 000013
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）ヘテロクリティックペプチド
【０３７３】
７つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１１個のペプチドを、ＮＳＣＬＣヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表３に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表１に記載の通りである。
【０３７４】
【表３】
2021502083.tif 000014
【０３７５】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表４に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。ＮＳＣＬＣ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表４に提供される。表４中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有するＮＳＣＬＣ患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有するＮＳＣＬＣ患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有するＮＳＣＬＣ患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有するＮＳＣＬＣ患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０３７６】
【表４】
2021502083.tif 000015
【０３７７】
構築物を、ユビキチンペプチドの後にＣ末端ヘテロクリティックペプチドを有する（すなわち、ヘテロクリティックペプチドおよび「ミニ遺伝子」）、１つまたは複数のヘテロクリティックペプチドに融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードするように設計した。融合ポリペプチドのｔＬＬＯ、ヘテロクリティックペプチドおよびユビキチン／ヘテロクリティックペプチド成分を、本明細書中の他の箇所で開示されるリンカーから選択される種々のリンカーによって連結した。例示的な融合ポリペプチド挿入物配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、ＮＳＣＬＣ  ＨＣ＋ＭＧ（配列番号２１８）である。ＮＳＣＬＣ  ＨＣ＋ＭＧをコードする例示的な核酸は、配列番号２２０に記載される。
【０３７８】
いずれのユビキチンペプチドもなしに１つまたは複数のヘテロクリティックペプチド（すなわち、「ミニ遺伝子」なしのヘテロクリティックペプチド）に融合されたｔＬＬＯを含む融合ポリペプチドをコードする構築物もまた設計した。融合ポリペプチドのｔＬＬＯおよびヘテロクリティックペプチド成分を、本明細書中の他の箇所で開示されるリンカーから選択される種々のリンカーによって連結した。例示的な融合ポリペプチド挿入物配列（すなわち、ｔＬＬＯの下流のペプチド配列）は、ＮＳＣＬＣ  ＨＣのみ（配列番号２１９）である。ＮＳＣＬＣ  ＨＣのみをコードする例示的な核酸は、配列番号２２１および２２２に記載される。
【０３７９】
各構築物中の個々の成分のアミノ酸位置の内訳は、以下に提供される。
【０３８０】
【表４Ａ】
2021502083.tif 000016
【０３８１】
【表４Ｂ】
2021502083.tif 000017
前立腺がんヘテロクリティックペプチド
【０３８２】
９つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１０個のペプチドを、前立腺がんヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表５に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表１に記載の通りである。
【０３８３】
【表５】
2021502083.tif 000018
【０３８４】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表６に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。前立腺がん（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表６に提供される。表６中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する前立腺がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する前立腺がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する前立腺がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する前立腺がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０３８５】
【表６】
2021502083.tif 000019
膵臓がんヘテロクリティックペプチド
【０３８６】
６つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１２個のペプチドを、膵臓がんヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表７に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表１に記載の通りである。
【０３８７】
【表７】
2021502083.tif 000020
【０３８８】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表８に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。膵臓がん（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表８に提供される。表８中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する膵臓がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する膵臓がん患者の９８％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する膵臓がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する膵臓がん患者の９８％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０３８９】
【表８】
2021502083.tif 000021
膀胱がんヘテロクリティックペプチド
【０３９０】
８つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１４個のペプチドを、膀胱がんヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表９に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表１に記載の通りである。
【０３９１】
【表９】
2021502083.tif 000022
【０３９２】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表１０に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。膀胱がん（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表１０に提供される。表１０中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する膀胱がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する膀胱がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する膀胱がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する膀胱がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０３９３】
【表１０】
2021502083.tif 000023
乳がんヘテロクリティックペプチド
【０３９４】
６つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１１個のペプチドを、乳がんヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表１１に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表１に記載の通りである。
【０３９５】
【表１１】
2021502083.tif 000024
【０３９６】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表１２に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。乳がん（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表１２に提供される。表１２中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する乳がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する乳がん患者の９５％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する乳がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する乳がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０３９７】
【表１２】
2021502083.tif 000025
子宮がんヘテロクリティックペプチド
【０３９８】
８つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１４個のペプチドを、子宮がんヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表１３に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表１に記載の通りである。
【０３９９】
【表１３】
2021502083.tif 000026
【０４００】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表１４に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。子宮がん（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表１４に提供される。表１４中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する子宮がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する子宮がん患者の８３％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する子宮がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する子宮がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０４０１】
【表１４】
2021502083.tif 000027
卵巣がんヘテロクリティックペプチド
【０４０２】
８つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１４個のペプチドを、卵巣がんヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表１５に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表１に記載の通りである。
【０４０３】
【表１５】
2021502083.tif 000028
【０４０４】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表１６に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。卵巣がん（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表１６に提供される。表１６中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する卵巣がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する卵巣がん患者の８３％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する卵巣がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する卵巣がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０４０５】
【表１６】
2021502083.tif 000029
低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）ヘテロクリティックペプチド
【０４０６】
８つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１０個のペプチドを、ＬＧＧヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表１７に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表１に記載の通りである。
【０４０７】
【表１７】
2021502083.tif 000030
【０４０８】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表１８に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表１８に提供される。表１８中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有するＬＧＧ患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有するＬＧＧ患者の４３％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有するＬＧＧ患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有するＬＧＧ患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０４０９】
【表１８】
2021502083.tif 000031
結腸直腸がん（ＣＲＣ）ヘテロクリティックペプチド
【０４１０】
８つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１０個のペプチドを、ＣＲＣヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表１９に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表２２に記載の通りである。
【０４１１】
【表１９】
2021502083.tif 000032
【０４１２】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表２０に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。結腸直腸がん（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表２０に提供される。表２０中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する結腸直腸がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する結腸直腸がん患者の９８％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する結腸直腸がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する結腸直腸がん患者の９８％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０４１３】
【表２０】
2021502083.tif 000033
頭頸部がんヘテロクリティックペプチド
【０４１４】
６つの遺伝子を横断するヘテロクリティック突然変異を有する合計で１０個のペプチドを、頭頸部がんヘテロクリティックペプチドとして選択した。各ヘテロクリティック突然変異について、長さ９アミノ酸のペプチドを、実施例１および本明細書中の他の箇所に記載されるように設計した。これらのペプチドは、表２１に示される。各々中のヘテロクリティック突然変異は、表１に記載の通りである。
【０４１５】
【表２１】
2021502083.tif 000034
【０４１６】
ヘテロクリティック９マーペプチドのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性は、表２２に提供される。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測された結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムに基づき、このＮｅｔＭＨＣ４．０アルゴリズムは、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値（ｎＭ）を単位としてＭＨＣクラスＩ分子へのペプチド結合を予測する；より低い数は、より強い予測された結合親和性を反映する。その結合を高親和性Ｔ細胞エピトープの結合に対して比較することによって、各候補ペプチドが示されたＭＨＣクラスＩ対立遺伝子に結合しＭＨＣ−ペプチド複合体を安定化する能力を決定する結合アッセイを介して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を決定した。簡潔に述べると、各ペプチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてその特異的ＨＬＡ分子と共にインキュベートする。結合強度を、陽性対照結合スコアを１００％に設定して、陽性対照と同じＨＬＡ分子に対する公知の免疫原性ペプチドに対して比較する。配列最適化された結合スコアを、対照ペプチドに対して標準化する。すなわち、各ペプチドに、非常に強い結合特性を有する公知のＴ細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。ヘテロクリティック試験ペプチドのスコアを、陽性対照ペプチドによって生じるシグナルのパーセンテージとして定量的に報告する。陽性対照の４５％よりも大きいまたはそれと等しいスコアを有するペプチドを、結合因子とみなす。頭頸部がん（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータベース）を有する患者における各遺伝子のパーセント発現、試験されているＨＬＡ対立遺伝子、および各ヘテロクリティックペプチドに対応する野生型ペプチドが免疫原性であることが既知であるかどうかもまた、表２２に提供される。表２２中のヘテロクリティックペプチドの各々を含む構築物について、ＨＬＡ型Ａ＊０２：０１を有する頭頸部がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊０３：０１を有する頭頸部がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ａ＊２４：０２を有する頭頸部がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現し、ＨＬＡ型Ｂ＊０７：０２を有する頭頸部がん患者の１００％が、少なくとも１つのＴＡＡ遺伝子を発現する。
【０４１７】
【表２２】
2021502083.tif 000035
（実施例３）
概念実証：ＬｍヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子融合タンパク質構築物の有効性。
【０４１８】
ペプチドミニ遺伝子発現系を使用して、ウィルムス腫瘍タンパク質を標的化する特有のヘテロクリティックミニ遺伝子を評定した。この発現系は、カルボキシ末端に別個のペプチド部分を含有する組換えタンパク質のパネルのクローニングを促進するように設計した。これは、シグナル配列（ＳＳ）−ユビキチン（Ｕｂ）−抗原性ペプチド構築物のうち１つをコードする配列を鋳型として利用する単純なＰＣＲ反応によって達成される。Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域に及ぶプライマーを使用し、プライマーの３’末端に所望のペプチド配列のためのコドンを導入することによって、新たなＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を、単一のＰＣＲ反応で生成することができる。細菌プロモーターおよびシグナル配列（例えば、ＬＬＯまたはＡｃｔＡ１−１００分泌シグナル）の最初の数ヌクレオチドをコードする５’プライマーは、全ての構築物について同じとすることができる。この戦略を使用して生成した構築物は、図１Ａおよび１Ｂに概略図で示される。
【０４１９】
ミニ遺伝子システムの利点の１つは、単一のＬｉｓｔｅｒｉａベクター構築物を使用して、複数のペプチドを細胞にローディングすることが可能なことである。上記単一のペプチド発現系の改変を使用して、複数のペプチドを、組換え弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｍｄｄａ）中に導入することができる。逐次的なＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列由来の複数の別個のペプチドをコードするキメラタンパク質を、１つの挿入物中にコードすることができる。例えば、図１Ｂを参照されたい。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位を、ペプチド構築物の各々の別々の翻訳を可能にするために、各ＳＳ−Ｕｂ−ペプチドコード配列の前に導入することができる。図１Ｂは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａの１つの株から３つの別々のペプチド抗原を発現するように設計された構築物の概略図表示を示す。
【０４２０】
ＡＤＸＳ  Ｌｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ構築物によるｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティック融合タンパク質の発現を評定するために、ウィルムス腫瘍１タンパク質を標的化する特有のヘテロクリティックミニ遺伝子を、ｐＡｄｖ１３４プラスミド中に生成し、Ｌｍｄｄａ中に形質転換した。ｐＡｄｖ１３４  ｔＬＬＯプラスミドは、配列番号５９に記載のＮ末端ＬＬＯ断片をコードする。ｔＬＬＯ−ＷＴ１ヘテロクリティック融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ次を含む：配列番号５９に記載のＮ末端ＬＬＯ断片、次に、配列番号９９に記載のＦＬＡＧタグ、次に、配列番号１８８に記載のユビキチン配列、次に、以下の表２３に列挙されるヘテロクリティックＷＴ１  ９マー。
【０４２１】
【表２３】
2021502083.tif 000036
【０４２２】
組み合わせたＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニン構築物（構築物番号１）は、配列番号１８９に記載される（ｔＬＬＯ＝１〜４４１；ＦＬＡＧ＝４４２〜４６２；ユビキチン＝４６３〜５３７；ヘテロクリティックフェニルアラニンペプチド＝５３８〜５４６）。３つのＷＴ１ペプチド（Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３；それぞれ、配列番号１９０（ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ）、１９１（ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ）および１９２（ＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ））を標的化する１つのさらなる構築物（Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物）を生成した。各「Ｐ」ペプチドは、さらなるＣＤ４  Ｔヘルパーエピトープを提供するのに十分な長さである１９〜２２アミノ酸から構成される。これら３つのペプチドは、リンカーによって分離される。Ｐ３ペプチドは、ＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号１９３）をＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号１９２）に変換するヘテロクリティック突然変異を含有する。ヘテロクリティックＰ３ペプチドに加えて、Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物は、Ｃ末端にユビキチン−ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１６９）部分を含有する。組み合わせたＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物は、配列番号１９４に記載される（ｔＬＬＯ＝１〜４４１；野生型ＷＴ１ペプチドｖ１４  −  ＷＴ１−４２７長＝４４２〜４６０；野生型ＷＴ１ペプチドｖ１５  −  ＷＴ１−３３１長＝４６６〜４８７；ヘテロクリティックＷＴ１ペプチドｖ１Ｂ  −  ＷＴ１−１２２Ａ１−長＝４９３〜５１１；ＦＬＡＧ＝５１２〜５３２；ユビキチン＝５３３〜６０７；ヘテロクリティックチロシンペプチド＝６０８〜６１６）。各個々のＬｍｄｄａ構築物を、特有のヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子産物のｔＬＬＯ−融合タンパク質発現について、ウエスタンブロットによってアッセイした。
【０４２３】
構築物番号１（Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニンミニ遺伝子構築物）およびＬｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物を、特有のヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子産物のｔＬＬＯ−融合タンパク質発現について、ウエスタンブロットによってアッセイした。Ｌｍ  ＷＴ１ミニ遺伝子構築物を含有するプレートからの単一のコロニーを使用して、乾燥振盪インキュベーター中３７℃で６ｍＬのＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）ブロス中の一晩培養物に接種した。次の日、元の一晩培養物の１：１０希釈物を、９ｍＬの新鮮なＢＨＩ中に再懸濁し、ＯＤ６００＝０．６に達するまで、乾燥振盪インキュベーター中３７℃で成長させた。細胞を、１３０００ＲＰＭで２分間の遠心分離によってペレット化した。試料上清を捕集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動した。試料を、７５μＬの試料を２５μＬの４×ＬＤＳ試料緩衝液（カタログ番号１６１−０７４７）で希釈することによって調製し、９８℃で１０分間煮沸し、氷上に置き、次いで、４℃で１０分間最大速度で遠心分離した。１３μＬの試料を、４〜１５％のプレキャストタンパク質ゲル（ＢｉｏＲａｄカタログ番号４５６１０８６）上で泳動した。タンパク質ゲルを、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ移動装置（カタログ番号１７０−４１５５）およびＰＶＤＦ  Ｍｉｄｉ移動パック（Ｂｉｏ−Ｒａｄ番号１７０−４１５７）を使用して移動させた。ブロットを、一次抗体としての抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）または抗ＬＬＯ（Ａｂｃａｍ  ａｂ２００５３８）および二次抗体としてのヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ｓｃ２００５）と共にインキュベートした。次いで、これらのブロットを、ｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１７７２８６６）上でインキュベートし、洗浄し、次いで、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号３４０７６）によって発色させた；画像を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ  ６００（ＧＥ）上で現像した。
【０４２４】
特有のｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティックミニ遺伝子融合タンパク質の発現および分泌を確認した。構築物番号１およびＬｍｄｄａ−ＷＴ１−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１６９）ヘテロクリティックチロシン＋ミニ遺伝子構築物からの培養物上清の抗Ｆｌａｇタグ抗体ウエスタンブロットは、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに示される。本発明者らは、各個々のｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティックミニ遺伝子融合タンパク質についての正確なサイズおよび正体に対応するタンパク質バンドを検出することができた。これらのデータは、ＷＴ１タンパク質内の複数のペプチド断片を標的化するヘテロクリティックペプチドについて、ｐＡｄｖ１３４プラスミドおよびＬｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を使用して生成される能力を実証している。
【０４２５】
表２３中の構築物番号２〜９について、各個々のＬｍｄｄａ構築物を、ヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子を含有する各特有のｔＬＬＯ−融合タンパク質からプラスミドＤＮＡを検出するために、コロニーＰＣＲによってアッセイした。
【０４２６】
【表２４】
2021502083.tif 000037
手順
【０４２７】
使用した一般的なコロニーＰＣＲ手順は、次の通りである。大きいコロニーを有するプレートを得た（一般に、３７℃で２４時間成長させたプレートが、この手順についてうまくいく）。次の通りのＰＣＲ用マスターミックスを作出した。
【表Ｇ】
2021502083.tif 000038
【０４２８】
２０μＬのマスターミックスを、各ＰＣＲ管中にアリコート分配した。ピペットチップ（１０〜２０μＬ体積が一番うまくいく）を使用して、１つのコロニーから十分な体積を掻き取った。ピペットチップをＰＣＲ管中に入れて数回タップし、旋回させて細菌を除去した。次のＰＣＲプログラムを使用して、サーモサイクラー中でＰＣＲ反応（複数可）を実行した。
【表Ｈ】
2021502083.tif 000039
【０４２９】
ＰＣＲ管をサーモサイクラーから取り出し、４μＬの６×ローディング色素を添加した。１０μＬの各ＰＣＲ反応を、１０μＬの１ｋｂ＋ＤＮＡラダーと共に、１％アガロースゲル上で泳動した。プライマーは、産物にさらなる１６３塩基対を追加した。フォワードプライマーは、ｔＬＬＯの３’末端の上流７０塩基対（ＸｈｏＩ部位を含む）に結合した。リバースプライマーは、停止部位の下流９３塩基対（ＸｍａＩ部位を含む）に結合した。
【０４３０】
表２３からのｐＡｄｖ１３４  ＷＴ１−ヘテロクリティックプラスミド番号２〜９を含有するＬｍｄｄａ株を示す代表的なコロニーＰＣＲ結果は、図３に示される。本発明者らは、各個々のｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティックミニ遺伝子プラスミドについての正確なサイズおよび正体に対応するＤＮＡバンドを検出することができた。これらのデータは、ＷＴ１タンパク質内の複数のペプチド断片を標的化するヘテロクリティックペプチドについて、ｐＡｄｖ１３４プラスミドおよびＬｍｄｄａ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を使用して生成される能力を実証しており、これは、そのような構築物が、ＷＴ１ならびにＷＴ１発現がんおよび腫瘍に対する免疫応答を作出または増強するために、ＷＴ１を標的化するための治療組成物として使用することができることを示している。
【０４３１】
２つの異なるＷＴ１構築物を使用してＡＡＤマウスにおけるＷＴ１特異的Ｔ細胞応答の生成を評定するために、ＥＬＩＳｐｏｔを実施して、所望のワクチン誘導性Ａｇ特異的応答を決定した。ＡＡＤマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ／Ｈ２−Ｄ）２Ｅｎｇｅ／Ｊ；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ストック番号：００４１９１）は、種間ハイブリッドクラスＩ  ＭＨＣ遺伝子であるＡＡＤを発現するトランスジェニックマウスであり、ＡＡＤは、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１プロモーターの指示の下に、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子のアルファ−１およびアルファ−２ドメインならびにマウスＨ−２Ｄｄ遺伝子のアルファ−３膜貫通および細胞質ドメインを含有する。このトランスジェニック株は、ＨＬＡ−Ａ２提示された抗原に対するヒトＴ細胞免疫応答のモデル化を可能にし、感染性疾患に対するワクチンまたはがん治療の試験において有用であり得る。免疫化スケジュールは、表２５に提供される。使用したマウスは、８〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスであった。
【０４３２】
【表２５】
2021502083.tif 000040
【０４３３】
ワクチン調製。簡潔に述べると、各グリセロールストックを、必要な栄養素プレート上にストリークし、一晩成長させた。単一のコロニーを、抗生物質選択下でＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）ブロスの一晩培養物中での成長に使用した。一晩培養物を１：１０（体積／体積）希釈で使用して、新鮮なＢＨＩブロスに接種した。細菌を、オービタルシェーカー中で３７℃で１〜３時間、対数増殖期中期、約０．６〜０．７のＯＤになるまでインキュベートした。マウスに、ＰＢＳ中でのｉ．ｐ．接種によって１×１０９ＣＦＵのＬｍを感染させた。
【０４３４】
ＥＬＩＳＰＯＴ。１８日目に、マウスを、ＩＡＣＵＣプロトコールに従いＣＯ２窒息によって屠殺し、脾臓を収集し、脾細胞の単一細胞懸濁液を、９６ウェルプレート上にプレートし、野生型またはヘテロクリティックペプチド（表２６）のいずれかで刺激した。同様の実験を、他の野生型およびヘテロクリティックペプチド対（表２７）で実施する。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、野生型またはヘテロクリティックペプチドのいずれかに応答する抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を列挙した。完全なＥＬＩＳＰＯＴプロトコールは、ＣＴＬ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ＥＬＩＳＰＯＴ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ）に従った。
【０４３５】
【表２６】
2021502083.tif 000041
【０４３６】
【表２７】
2021502083.tif 000042
【０４３７】
一般的なＥＬＩＳＰＯＴプロトコールは以下に提供される。
【０４３８】
０日目（滅菌条件）。特定のプロトコールに従って捕捉抗体を希釈することによって、捕捉溶液を調製した。多くのサイトカインは、ＰＶＤＦメンブレンを７０％エタノールで３０秒間事前に濡らし、１５０μＬのＰＢＳで３回洗浄し、その後各ウェルに８０μＬの捕捉溶液を添加することから恩恵を受ける。プレートを、加湿チャンバー中で４℃で一晩インキュベートした。
【０４３９】
１日目（滅菌条件）。１％の新鮮なＬ−グルタミンを添加することによって、ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地を調製した。ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地中に２×最終濃度で抗原／マイトジェン溶液を調製した。０日目からのコーティング抗体を有するプレートをデカントし、１５０μＬのＰＢＳで１回洗浄した。抗原／マイトジェン溶液を１００μＬ／ウェルでプレートした。ＰＢＭＣを解凍した後または密度勾配で白血球を単離した後、ＰＢＭＣを、ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地中で所望の濃度、例えば、３００，０００細胞／ウェルに対応する３百万／ｍＬに調整した（しかし、１００，０００〜８００，０００細胞／ウェルは、線形の結果を提供するので、細胞数は、予想されたスポット計数に従って調整することができる）。ＰＢＭＣを処理する間、およびプレートするまで、細胞を加湿インキュベーター中３７℃で５〜９％ＣＯ２で維持した。大きいオリフィスチップを使用して、ＰＢＭＣを１００μＬ／ウェルでプレートした。完了したら、プレートの側面を穏やかにタップし、３７℃の加湿インキュベーター、５〜９％ＣＯ２中に直ちに置いた。使用するサイトカインに依存して、２４〜７２時間インキュベートした。プレートは積み重ねなかった。インキュベーターのドアを注意深く開け閉めすることによって、プレートの振動を回避した。インキュベーションの間、プレートには触らなかった。
【０４４０】
２日目。２日目のための洗浄溶液：ＰＢＳ、蒸留水およびＴｗｅｅｎ−ＰＢＳを調製した。検出抗体を特定のプロトコールに従って希釈することによって、検出溶液を調製した。プレートを、各回に２００μＬ／ウェルで、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、０．０５％のＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで２回洗浄した。８０μＬ／ウェルの検出溶液を添加した。ＲＴで２時間インキュベートした。三次抗体を特定のプロトコールに従って希釈することによって、三次溶液を調製した。プレートを、２００μＬ／ウェルで、０．０５％のＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで３回洗浄した。８０μＬ／ウェルのＳｔｒｅｐ−ＡＰ溶液を添加した。ＲＴで３０分間インキュベートした。顕色剤溶液を、使用する特定のプロトコールに従って調製した。プレートを、各回に２００μＬ／ウェルで、０．０５％のＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、蒸留水で２回洗浄した。顕色剤溶液を８０μＬ／ウェルで添加した。ＲＴで１０〜２０分間インキュベートした。メンブレンを水道水で穏やかにリンスすることによって反応を停止させ、デカントし、３回繰り返した。プレートの保護的アンダードレーンを除去し、プレートの背部を水道水でリンスした。プレートを、ランニングフード中で裏向きにして２時間、またはベンチトップでペーパータオル上で２４時間、風乾した。プレートをスキャンし、計数した。
【０４４１】
ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＢ６マウスを記載されるようにワクチン接種し、脾細胞を、特異的ＷＴ１ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１９７）、ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１６０））でｅｘ  ｖｉｖｏ刺激し、ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって分析した。ヘテロクリティックワクチン接種（ＷＴ１−Ｆミニ遺伝子：ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１６０）は、免疫化したＨＬＡ２トランスジェニックマウスにおいてＡｇ特異的Ｔ細胞応答を誘導した。図４および図６Ｂを参照されたい。加えて、ヘテロクリティックワクチン接種は、ネイティブＷＴ１腫瘍抗原（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１９７）と交差反応するＴ細胞応答を惹起した。図４および図６Ａを参照されたい。このデータは、ＷＴ１−Ｆヘテロクリティックミニ遺伝子ワクチンによるワクチン接種が、ＷＴ１−ネイティブ腫瘍抗原（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１９７）と交差反応性であるＴ細胞を惹起することができることを実証した。全体として、このデータは、ヘテロクリティックミニ遺伝子ワクチンが、ネイティブ腫瘍抗原と交差反応するＴ細胞を惹起することができることを実証した。
【０４４２】
ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＢ６マウスを記載されるようにワクチン接種し、脾細胞を収集した。Ｔ細胞がワクチン特異的ＹＭＦＰＮＡＰＹＬペプチド（配列番号１６９）またはネイティブＷＴ１ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１９７）に応答してＩＦＮｇを産生する能力を、ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。ヘテロクリティックワクチン接種（ＷＴ１−ＡＨ１−Ｔｙｒミニ遺伝子：ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１６９）は、免疫化したＨＬＡ２トランスジェニックマウスにおいてＡｇ特異的Ｔ細胞応答を誘導した。図５および図７Ｂを参照されたい。加えて、ヘテロクリティックワクチン接種は、ネイティブＷＴ１腫瘍抗原（ＲＭＦＰＡＰＹＬ；配列番号１９７）と交差反応するＴ細胞応答を惹起した。図５および図７Ａを参照されたい。
（実施例４）
概念実証：ＣＴ２６チャレンジ研究におけるヘテロクリティックＬｍ−ＡＨ１構築物の治療有効性。
【０４４３】
この研究は、Ｌｍ  ＡＨ１−ＨＣヘテロクリティックミニ遺伝子ワクチンがＣＴ２６腫瘍成長を制御または抑制できるかどうかを試験した。
処置スケジュール
【０４４４】
ヘテロクリティックＡＨ１−ＨＣワクチン接種は、表２８に記載のように開始し、続いて、推奨されるワクチンによる１週間間隔の２回の追加免疫を行った。
【０４４５】
【表２８】
2021502083.tif 000043
実験の詳細
【０４４６】
ワクチン投薬の詳細。ＡＨ１−ＨＣは、ヘテロクリティックＡＨ１−ＨＣワクチンでプライミングおよび追加免疫したマウスを指す。
【０４４７】
腫瘍細胞系拡大。ＣＴ２６細胞系を、１０％のＦＢＳを有するＲＰＭＩ中で培養した。
【０４４８】
腫瘍接種。０日目に、（１４ＪＵＮ１７）ＣＴ２６細胞を、０．２５％のトリプシン（１×）でトリプシン処理し、ＰＢＳ中適切な濃度（３×１０５細胞／マウス）で、培地で２回洗浄する。ＣＴ２６細胞を、各マウスの右側腹部に皮下移植した。
【０４４９】
処置。ワクチン調製は次の通りであった：（ａ）−８０℃から、１つのバイアルを３７℃の水浴中で解凍した；（ｂ）１４，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を廃棄した；（ｃ）１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを廃棄した；および（ｄ）５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度になるように再懸濁した。ワクチン投薬は、腫瘍移植の３〜４日後に開始した。
【０４５０】
【表２９】
2021502083.tif 000044
結果および結論
【０４５１】
Ｌｍ−ＡＨ１  ＨＣ構築物は、マウスＣＴ２６結腸直腸がんモデルにおいて腫瘍成長を有意に制御することができた。図８を参照されたい。
【図１】
2021502083.tif 000045
【図２】
2021502083.tif 000046
【図３】
2021502083.tif 000047
【図４】
2021502083.tif 000048
【図５】
2021502083.tif 000049
【図６】
2021502083.tif 000050
【図７】
2021502083.tif 000051
【図８】
2021502083.tif 000052
【配列表】
2021502083000001.app
【国際調査報告】
2021502083.tif 000053
2021502083.tif 000054
2021502083.tif 000055
2021502083.tif 000056
2021502083.tif 000057
2021502083.tif 000058