(57)【要約】  本開示は、CAR細胞療法との組合せでの使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤に関し、好ましくは前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は、前記CAR細胞療法の治療可能性を改善する。本開示は、医薬組成物及び、少なくとも1つのグリコシル化阻害剤に接触させたCAR細胞の集団又は亜集団にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの処置及び/又は予防における使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤及び少なくとも1つのCAR細胞療法。
【請求項２】
前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤が、前記CAR細胞療法の治療可能性を改善する、及び/又はCAR細胞活性化を改善する、及び/又は抗原の会合を増加させる、及び/又は腫瘍細胞をCAR細胞療法による認識に感受性にする、及び/又は腫瘍細胞の除去を増加させる、請求項1に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤及び少なくとも1つのCAR細胞療法。
【請求項３】
腫瘍細胞の死滅を増加させることにおける使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤であって、前記腫瘍細胞が、少なくとも1つのCAR細胞療法に曝露される、使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項４】
前記少なくともCAR細胞療法が、CAR-T細胞療法又はCAR-NK細胞療法であり、好ましくは前記T細胞が自己又は同種T細胞である、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項５】
前記グリコシル化阻害剤が、O-グリコシル化阻害剤、N-グリコシル化阻害剤、P-グリコシル化阻害剤、C-グリコシル化阻害剤、S-グリコシル化阻害剤又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項６】
前記グリコシル化阻害剤が、マンノース類似物、2-デオキシグルコース、3-デオキシ-3-フルオログルコサミン、4-デオキシ-4-フルオログルコサミン、2-デオキシ-2-フルオロ-グルコース、2-デオキシ-2-フルオロ-マンノース、6-デオキシ-6-フルオロ-N-アセチルグルコサミン、2-デオキシ-2-フルオロフコース及び3-フルオロシアル酸ツニカマイシン、カスタノスペルミン、オーストラリン、デオキシノジリマイシン、スウェインソニン、デオキシマンノジリマイシン、キフネンシン、マンノスタチン、ノイラミニダーゼ阻害剤、グリコシルトランスフェラーゼの阻害剤からなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項７】
治療剤を更に含み、好ましくは前記治療剤が抗体、好ましくはチェックポイント阻害剤抗体である、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項８】
前記グリコシル化阻害剤が、2-デオキシグルコースである、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項９】
固形又は造血性又はリンパ系腫瘍の処置のための、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項１０】
前記固形腫瘍が、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌、小腸のがん、食道のがん、メラノーマ、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内の悪性メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児期の固形腫瘍、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎盂の癌、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平細胞がん、環境誘発性がん、前記がんの組合せ及び前記がんの転移性病変からなる群から選択される、請求項9に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項１１】
前記造血性又はリンパ系腫瘍が、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性白血病、急性リンパ性白血病(ALL)、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、B細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞若しくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症又は前白血病、前記がんの組合せ及び前記がんの転移性病変からなる群から選択される、請求項9に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項１２】
前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤が前記CAR細胞療法に先行して投与される、請求項1から11のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項１３】
前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤がCAR-T細胞療法と同時に投与される、請求項1から11のいずれか一項に記載の使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤。
【請求項１４】
医学的使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤及びCAR-T細胞療法剤を含む組成物。
【請求項１５】
前記グリコシル化阻害剤が2DGである、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
CAR細胞の単離された集団若しくは亜集団又は単離されたCAR細胞、好ましくは少なくとも1つのグリコシル化阻害剤に接触させたCAR-T細胞の単離された集団若しくは亜集団又は単離されたCAR-T細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法との組合せでの使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤に関し、好ましくは前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は、前記免疫療法の治療可能性を改善する。免疫療法は、細胞に基づく免疫療法、好ましくはCAR細胞療法、好ましくはCAR-T細胞療法であり得る。本発明は、医薬組成物及び、少なくとも1つのグリコシル化阻害剤に接触させた免疫細胞の集団又は亜集団にも関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体(CAR)は、腫瘍反応性モノクローナル抗体由来の抗原結合性成分をTリンパ球由来の細胞内シグナル伝達ドメインと融合することによって一般に構築される合成生物学分子である。最近数年間に、さまざまな施設が、治療抵抗性B細胞悪性病変を有する患者においてCD19 CAR-T細胞を融合することによる優れた持続的な臨床応答を実証し(Lee DW、 Lancet. Feb 7;385(9967):517〜528頁; Turtle CJら、J Clin Invest. 2016年6月1日;126(6):2123〜38頁; Turtle CJら、Science Transl Med. 2016年9月7日;8(355):355ra116; Schuster SJら、N Engl J Med. 2017年12月28日;377(26):2545〜2554頁; Maude SLら、N Engl J Med. 2018年2月1日;378(5):439〜448頁; Park JHら、N Engl J Med. 2018年2月1日;378(5):449〜459頁)、小児及び若年成人再発/治療抵抗性B細胞ALL (Kymriah、Novartis社)並びに成人再発/治療抵抗性大細胞型B細胞リンパ腫(Yescarta、Kite Pharma-Gilead Science社)を処置するための最初の2つのCAR-T細胞療法の承認に至らせた。
【０００３】
広範で正当な興奮にも関わらず、他の血液学的悪性疾患、及び最も重要なことには固形腫瘍へのCAR-T細胞の良好な適用は、いまだ実証されていない。他の疾患徴候にCAR-T細胞の適用を広げるためには、それらの有効性及び毒性プロファイルを決定する要因を精査することが重要になる。CAR-T細胞による死滅への腫瘍細胞の感受性が、標的抗原の発現レベル、アクセサリー分子の利用可能性、CAR親和性及びCAR細胞外スペーサーの設計を含む複数の要因に依存することは十分に認識されている。
【０００４】
グリコシル化は、糖類と他の糖類、タンパク質又は脂質とのグリコシド結合を生じる酵素的プロセスである。特に糖タンパク質は、ポリペプチド骨格に、通常、窒素又は酸素結合を介して共有結合した1つ又は複数のグリカンを有し、この場合それらはそれぞれN-グリカン又はO-グリカンとして公知である。グリコシル化は、タンパク質の最も複雑な翻訳後修飾であり、宿主病原体相互作用、細胞分化及び輸送並びに細胞内及び細胞間シグナル伝達等の多数の生理的事象に関与している。一般に、グリコシル化されたタンパク質は、オリゴ糖エピトープ、糖ペプチドエピトープ及びペプチドエピトープを含むさまざまな種類の抗原エピトープを有する(Lisowska Eら、Cell Mol Life Sci. 2002年3月;59(3):445〜55頁)。興味深いことに、特に豊富にグリコシル化されたタンパク質では、ペプチドエピトープは、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(Munk Kら、Glycobiology. 1992年6月;2(3):233〜40頁)及びヒトMUC1タンパク質(Spencer DIら、Cancer Letters. 1996年2月27日;100(1-2):11〜5頁)について報告された通り、グリカンによってマスクされる場合がある。腫瘍細胞は、それらの非形質転換対応物と比較して広範なグリコシル化変化を示す。これらの変化は、N-グリカンの分枝の増加、高密度のO-グリカン、通常の対応物の切断バージョンの生成並びにシアル酸及びフコースを有する異型の末端構造の生成を含む。糖タンパク質のオリゴ糖構造における変化は、細胞周期の調節解除、細胞増殖(proliferation)の誘導、腫瘍播種及び血管新生の促進並びに免疫回避の亢進を通じてがん進行に関与する(Pinho SSら、Nat Rev Cancer. 2015年9月;15(9):540〜55頁)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lee DW、Lancet. Feb 7;385(9967):517〜528頁
【非特許文献２】Turtle CJら、J Clin Invest. 2016年6月1日;126(6):2123〜38頁
【非特許文献３】Turtle CJら、Science Transl Med. 2016年9月7日;8(355):355ra116
【非特許文献４】Schuster SJら、N Engl J Med. 2017年12月28日;377(26):2545〜2554頁
【非特許文献５】Maude SLら、N Engl J Med. 2018年2月1日;378(5):439〜448頁
【非特許文献６】Park JHら、N Engl J Med. 2018年2月1日;378(5):449〜459頁
【非特許文献７】Lisowska Eら、Cell Mol Life Sci. 2002年3月;59(3):445〜55頁
【非特許文献８】Munk Kら、Glycobiology. 1992年6月;2(3):233〜40頁
【非特許文献９】Spencer DIら、Cancer Letters. 1996年2月27日;100(1-2):11〜5頁
【非特許文献１０】Pinho SSら、Nat Rev Cancer. 2015年9月;15(9):540〜55頁
【非特許文献１１】Zhang D、Cancer Letters 2014年
【非特許文献１２】Xi H、IUBMB Life 2014年
【非特許文献１３】Liら、Cancer Cell 33、187〜201頁、2018年
【非特許文献１４】「Chemical Tools for Inhibiting Glycosylation - Essentials of Glycobiology - NCBI Bookshelf」、Varki A、Cummings RD、Esko JDら編  Essentials of Glycobiology [Internet]. 3rd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2015年〜2017年. doi: 10.1101/glycobiology.3e.055、55章  Chemical Tools for Inhibiting Glycosylation、Jeffrey D. Esko、Carolyn Bertozzi、及びRonald L. Schnaar
【非特許文献１５】Puleら、Mol Ther、2005年11月;12(5):933〜41頁
【非特許文献１６】Brentjensら、CCR、2007年9月15日;13(18 Pt 1):5426〜35頁
【非特許文献１７】Casucciら、Blood、2013年11月14日;122(20):3461〜72頁
【非特許文献１８】Savoldo B、Blood、2009年6月18日;113(25):6392〜402頁
【非特許文献１９】Maherら、Nat Biotechnol、2002年1月;20(1):70〜5頁
【非特許文献２０】Imai C、Leukemia、2004年4月;18(4):676〜84頁
【非特許文献２１】Miloneら、Mol Ther、2009年8月;17(8):1453〜64頁
【非特許文献２２】Casucci Mら、Blood. 2013年11月14日;122(20):3392頁
【非特許文献２３】Amendola Mら、Nat Biotechnol 2005年1月;23(1) :108〜16頁
【非特許文献２４】Norelliら、Nat Med 2018年、24、739〜748頁
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【非特許文献２６】S. Jutzら、Journal of Immunological Methods 430 (2016年)10〜20頁
【非特許文献２７】Ponta Hら、Nat Rev Mol Cell Biol. 2003年1月;4(1):33〜45頁
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【非特許文献３０】Singh Dら、Strahlenther Onkol. 2005年8月;181(8):507〜14頁
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【非特許文献３６】Falcone Lら、Methods Mol Biol. 2016年;1393:105〜11頁
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、キメラ抗原受容体(CAR)分子、例えば腫瘍抗原、例えば固形腫瘍又は腫瘍関連マクロファージに関連する腫瘍の表面に発現される抗原に結合するCAR、を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)を使用してがん(例えば、固形若しくは造血器腫瘍又は腫瘍関連マクロファージに関連する腫瘍)等の障害を処置する組成物及び方法に少なくとも部分的に注目する。組成物は、及び方法は、腫瘍標的化CARを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)を、グリコシル化の阻害剤との組合せで投与することを含む。一部の実施形態では、組合せは、いずれかの治療単独と比較して、例えば、固形若しくは血液腫瘍又は腫瘍関連マクロファージに関連する腫瘍に対する良好な臨床的実効性を維持する又は有する。理論に束縛されることなく、本明細書において、グリコシル化の阻害剤の使用(例えば、本明細書に記載の通り)は、N-グリカン分枝を低減し、腫瘍誘発活性化及びCAR発現細胞、例えばCAR発現T細胞によるサイトカイン放出を増加させ、CAR発現細胞による腫瘍認識及び死滅を増加させ、それにより、CAR発現細胞の機能、例えば、CAR発現細胞の抗腫瘍性又は増殖(proliferative)活性の抑制の原因を除くことが示されている。本発明は、腫瘍抗原、例えば固形腫瘍抗原又は腫瘍関連マクロファージに関連する腫瘍細胞上の抗原に結合するCAR分子を発現する操作された細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞又はNK細胞)の、グリコシル化阻害剤の阻害剤との組合せでの、腫瘍抗原、例えば、固形もしく造血器腫瘍抗原又は腫瘍関連マクロファージに関連する腫瘍(例えば、がん)上の抗原の発現に関連する障害を処置するための使用に更に関する。
【０００７】
CAR-T細胞の養子移入は、B細胞悪性病変に対して優れた結果を実証したが、固形がんに対する有効性はいまだ限られていた。固形腫瘍が、N-グリカンの分枝の増加を含む広範なグリコシル化変化を示すことから、抗原エピトープがCAR-T細胞標的化からマスクされている可能性があると仮定された。それにより本発明者らは、CAR-T細胞がグリコシル化-コンピテント腫瘍細胞よりもグリコシル化インコンピテントを更に効率的に除去したことを観察した。CAR-T細胞の有効性を増加するようにこの機構を活用するために、本発明者らは、グルコース/マンノース類似物2-デオキシ-D-グルコース(2DG)を用いて膵臓腺癌細胞においてグリコシル化、特にN-グリコシル化を遮断することを試み、モデル抗原としてCD44v6に注目した。グリコシル化ノックアウト細胞と同様に、2DGを用いた処置は脱グリコシル化抗原の膜露出を生じ、それにより、腫瘍細胞をCAR細胞による認識に感受性にした。特に、2DG単独では、単独治療としては無効であることが証明されており、CAR-T細胞との相乗効果を示唆している。重要なことに、CAR-T細胞による腫瘍細胞認識を増強できる同じ用量の2DGは、健康な細胞の除去を増加させず、戦略の安全性を支持している。最終的に、膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおいてチャレンジした場合、CAR-T細胞の抗腫瘍性活性は、2DGによって顕著に増加され、この効果は、疲弊(exhaustion)及び老化マーカーの発現における減少を伴った。重要なことに、これらの結果は、CEA-CAR T細胞及びさまざまな腫瘍型を使用した場合に確認され、組合せ戦略がさまざまなCAR特異性を有する複数のがんに良好に適用され得ることを示唆している。
【０００８】
結論として、本結果は、腫瘍グリコシル化がCAR-T細胞有効性を調節し、固形又は造血器腫瘍に対する良好な免疫療法のためにCAR-T細胞と脱グリコシル化剤2DG等のグリコシル化阻害剤との組合せを支持することを示している。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
特に、糖鎖がCAR-T細胞標的化に対して立体的にかさ高くなり得るかどうかを調査するために、本発明者らは、CRISPR-Cas9技術を使用してグリコシルトランスフェラーゼMgat5の発現をノックアウトすることによってN-グリコシル化欠損膵臓腫瘍細胞株を生成した。CAR標的化のためのモデル抗原として、本発明者らは、CD44v6及びCEAに、どちらも膵臓腺癌を含む多種多様な固形腫瘍において過発現される重度にグリコシル化されたタンパク質であることから注目した。際だったことに、N-グリコシル化を妨害することは、CD44v6及びCEA CAR-T細胞の両方による腫瘍標的化の劇的な増加を生じた。この効果は、CAR-T細胞活性化の改善と関連し、更に優れた抗原結合を示唆している。これらの発見は、N-グリコシル化阻害剤ツニカマイシンを使用して更に確認された。固形腫瘍に対するCAR-T細胞の有効性を増加させるようにこの機構を利用するために、本発明者らは腫瘍N-グリコシル化をグルコース/マンノース類似物2-デオキシ-D-グルコース(2DG)を用いて遮断することを試みた。グリコシル化ノックアウト細胞と同様に、2DGを用いた処置も腫瘍細胞をCAR-T細胞による認識に感受性にし、それらの除去を顕著に増加させた。注目すべきことに2DG単独は、無効であることが証明され、CAR-T細胞との相乗効果を更に示唆している。機構的に、Mgat5ノックアウト及び2DGの両方は、膵臓腫瘍細胞でのPHA-Lレシチン染色を減少させ、処置がN-グリカン分枝を効果的に低減することを示している。同様の結果は、2DG処置後の腫瘍細胞表面の脱グリコシル化タンパク質の存在からウエスタンブロットによっても確認された。次いで、本発明者らは、膵臓腺癌異種移植マウスモデルでの組合せアプローチを試みた。in vitroデータにより、高い腫瘍負荷を有し、CAR-T細胞を受けたマウスは、逆にいずれの抗腫瘍性効果単独でも媒介することができなかった高度な利益を2DG投与から受けた(7日目に腫瘍5分の1、p<0.05)。興味深いことに、抗腫瘍性活性の改善は、TIM-3、LAG-3、PD-1及びCD57等の疲弊及び老化マーカーを同時発現するCAR-T細胞の頻度の減少を伴った。代謝調節解除(ワールブルク効果)のおかげで、2DGは、健康な組織と比較してがん細胞において選択的に蓄積することが予測され、組合せアプローチの安全性を支持している。したがって、CAR-T細胞による腫瘍認識を増強できる同じ用量の2DGが、タンパク質脱グリコシル化を誘導できず、ケラチノサイト等の健康な細胞の除去を増加できないことが観察された。最終的に、いくつかの固形及び造血器腫瘍由来のがん細胞株は、高度にN-グリコシル化されていることが見出され、それらの死滅は、CAR-T細胞とグリコシル化阻害剤2DGとを組み合わせることによって顕著に改善された。
【００１０】
この結果は、i)腫瘍細胞のグリコシル化状態がCAR-T細胞の有効性を制御し、ii)CAR-T細胞を、腫瘍腫瘤に優先的に蓄積する脱グリコシル化剤2DG等のグリコシル化阻害剤と組み合わせることが、腫瘍、特に固形腫瘍に対する良好な免疫療法となることを示している。
【００１１】
本発明において、腫瘍のグリコシル化状態が免疫療法、好ましく細胞に基づく免疫療法、より好ましくはCAR-T細胞療法による死滅へのそれらの感受性に影響し得ること、及び2-デオキシ-D-グルコース(2DG)等の脱グリコシル化又はグリコシル化阻害剤が、CAR-T細胞等の前記免疫療法の抗腫瘍性有効性を相乗効果的に改善できることが、驚くべきことに見出された。
【００１２】
キメラ抗原受容体は、腫瘍反応性モノクローナル抗体由来抗原結合性成分をTリンパ球由来細胞内シグナル伝達ドメインと融合することによって一般に構築される合成生物学分子である。固形悪性病変は、広範なグリコシル化変化によって特徴付けられ、ここでグリカンは、免疫系との腫瘍相互作用を調節する可能性を有する。本発明は、脱グリコシル化剤(又はグリコシル化阻害剤)を用いて腫瘍を処置することがCAR-T細胞によるそれらの認識及び死滅を増加させ、それにより最終的な治療結果を改善するという知見に基づいている。2-デオキシ-D-グルコース(2DG)は、解糖の最初の重要なステップを阻害できるグルコース類似物である。更に、それがD-マンノースを構造的に模倣することから、2DGは、N-グリコシル化を阻害できる。腫瘍細胞における代謝調節解除(ワールブルク効果)のおかげで、2DGは、がん細胞において選択的に蓄積することが予測され、抗がん剤治療のための候補として提案されている。近年の臨床試験は、低い抗腫瘍性活性にも関わらず、単独又は、化学療法及び放射線療法等の他の抗がん剤治療との組合せでの2DGの投与が安全で、患者によって十分に忍容されたことを確認した(Zhang D、Cancer Letters 2014年; Xi H、IUBMB Life 2014年)。本発明者らは、2DGがCAR-T細胞による腫瘍細胞認識及び除去を顕著に増加させたことを示している。重要なことに、この効果は、単に相加的ではなく相乗的であり、2DG(最小であった)及びCAR-T細胞単独の個々の活性から予測され得るものを超えていた。同様に2DGは、腫瘍細胞での優先的な蓄積のために、正常な細胞に低い毒性を示す。しかし、2DG以外の脱グリコシル化剤又はグリコシル化阻害剤も実行され得る。更に、前記薬剤又は阻害剤の腫瘍への選択的送達は、例えば特異的細胞標的化のために機能を持たせたナノ粒子の使用によって、達成される。
【００１３】
CAR-T細胞及びモノクローナル抗体が認識成分を共有していることから、グリコシル化阻害は、モノクローナル抗体治療による抗原認識にも良い影響を与えると予測される。更に、PDL1等の腫瘍細胞で発現されるチェックポイント分子のグリコシル化状態が、T細胞の受容体結合を介するそれらの免疫抑制性機能に重要であることが報告された(Liら、Cancer Cell 33、187〜201頁、2018年)。これは、2DGを用いた腫瘍又は感染細胞のグリコシル化の阻害が一般に、T細胞に基づく治療を行うようにできることを示唆している。
【００１４】
次いで、本発明は、がんの処置及び/又は予防における使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤及び少なくとも1つのCAR細胞療法を提供する。
【００１５】
好ましくは前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は、前記CAR細胞療法の治療可能性を改善する、及び/又はCAR細胞活性化を改善する、及び/又は抗原の会合を増加させる、及び/又は腫瘍細胞をCAR細胞療法による認識に感受性にする、及び/又は腫瘍細胞の除去を増加させる。
【００１６】
本発明は、腫瘍細胞の死滅を増加させることにおける使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤であって、前記腫瘍細胞が、少なくとも1つのCAR細胞療法に曝露される、又は前記腫瘍細胞が、少なくとも1つのCAR細胞療法に曝露された、使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤を提供する。
【００１７】
好ましくは少なくともCAR細胞療法はCAR-T細胞療法又はCAR-NK細胞療法であり、好ましくはT細胞は自己又は同種T細胞である。
【００１８】
好ましい実施形態では、前記グリコシル化阻害剤は、O-グリコシル化阻害剤、N-グリコシル化阻害剤、P-グリコシル化阻害剤、C-グリコシル化阻害剤、S-グリコシル化阻害剤又はこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１９】
好ましくは前記グリコシル化阻害剤は、マンノース類似物、2-デオキシグルコース、3-デオキシ-3-フルオログルコサミン、4-デオキシ-4-フルオログルコサミン、2-デオキシ-2-フルオロ-グルコース、2-デオキシ-2-フルオロ-マンノース、6-デオキシ-6-フルオロ-N-アセチルグルコサミン、2-デオキシ-2-フルオロフコース及び3-フルオロシアル酸ツニカマイシン、カスタノスペルミン、オーストラリン(australine)、デオキシノジリマイシン、スウェインソニン、デオキシマンノジリマイシン、キフネンシン(kifunensin)、マンノスタチン、ノイラミニダーゼ阻害剤、グリコシルトランスフェラーゼの阻害剤からなる群から選択される。
【００２０】
好ましくは、上に定義される使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は、治療剤を更に含み、好ましくは前記治療剤は、抗体、好ましくはチェックポイント阻害剤抗体である。好ましい抗体は、下に定義される。
【００２１】
チェックポイント阻害剤治療は、がん免疫療法の1つの形態である。治療は、腫瘍が免疫系による攻撃から自らを保護するために使用できる免疫チェックポイント、免疫系の作用を刺激又は抑制するその重要な制御因子、を標的化する。チェックポイント治療は、抑制性チェックポイントを遮断でき、免疫系機能を回復させる。免疫チェックポイントを標的化した最初の抗がん薬は、2011年に米国において承認されたイピリムマブ、CTLA4遮断薬であった。
【００２２】
現在承認されているチェックポイン阻害剤は、分子CTLA4、PD-1及びPD-L1を標的化する。PD-1は、膜貫通プログラム細胞死1タンパク質(PDCD1及びCD279とも呼ばれる)であり、PD-L1(PD-1リガンド1又はCD274)と相互作用する。細胞表面のPD-L1は、免疫細胞表面のPD1に結合し、免疫細胞活性を抑制する。PD-L1機能の内、T細胞活性についてが重要な制御的役割である。細胞表面のPD-L1の(がん媒介性)上方制御は、そうでなければ攻撃するT細胞を抑制できると考えられている。PD-1又はPD-L1のいずれかに結合し、それにより相互作用を遮断する抗体は、T細胞が腫瘍を攻撃できるようにする。
【００２３】
好ましい実施形態では、グリコシル化阻害剤は、2-デオキシグルコースである。
【００２４】
好ましくは、上に定義された使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は、固形又は造血性又はリンパ系腫瘍の処置のためである。好ましくは、固形腫瘍は、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌、小腸のがん、食道のがん、メラノーマ、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内の悪性メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児期の固形腫瘍、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎盂の癌、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸(spinal axis)腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平細胞がん、環境誘発性がん、前記がんの組合せ及び前記がんの転移性病変からなる群から選択される。
【００２５】
好ましくは、造血性又はリンパ系腫瘍は、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性白血病、急性リンパ性白血病(ALL)、B細胞急性リンパ性白血病(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(T-ALL)、慢性骨髄性白血病(CML)、B細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞若しくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症又は前白血病、前記がんの組合せ及び前記がんの転移性病変からなる群から選択される。
【００２６】
好ましい実施形態では、少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は、CAR細胞療法に先行して投与される、又は少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は、CAR細胞療法と同時に投与される。
【００２７】
本発明は、医学的使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤及びCAR細胞療法剤を含む組成物も提供する。
【００２８】
好ましくは、前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は、前記CAR細胞療法の治療可能性を改善する、及び/又はCAR細胞活性化を改善する、及び/又は抗原結合を増加させる、及び/又は腫瘍細胞をCAR細胞療法による認識に感受性にする、及び/又は腫瘍細胞の除去を増加させる。
【００２９】
本発明は、腫瘍細胞死滅を増加させることにおける使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤を含む組成物を提供し、ここで前記腫瘍細胞は少なくとも1つのCAR細胞療法に曝露される、又は前記腫瘍細胞は少なくとも1つのCAR細胞療法に曝露されたことがある。
【００３０】
好ましくは、グリコシル化阻害剤は2DGであり、CAR細胞療法はCAR-T細胞療法である。
【００３１】
本発明は、少なくとも1つのグリコシル化阻害剤に接触させたCAR-T細胞の単離された集団若しくは亜集団又は単離されたCAR-T細胞も提供する。
【００３２】
好ましくは、前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は、前記CAR細胞療法の治療可能性を改善する、又は対象の前記CAR細胞療法への感受性を増加させる。
【００３３】
本発明は、対象におけるCAR細胞療法との組合せでの使用のための少なくとも1つのグリコシル化阻害剤も提供し、ここで前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は前記CAR細胞療法による腫瘍細胞認識を増加させる、及び/又は前記少なくとも1つのグリコシル化阻害剤は腫瘍細胞の除去を改善する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象(例えば、がん(例えば、固形若しくは造血性(hemtopoietic)若しくは血液の腫瘍又は腫瘍関連マクロファージに関連する腫瘍)を有する対象)を処置することにおいて、グリコシル化の阻害剤との組合せでの使用のためのキメラ抗原受容体(CAR)を含む(例えば、発現する)細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団を含むCAR治療を提供する。CARは、腫瘍抗原結合ドメイン(例えば、CARの腫瘍抗原結合ドメインはCD19又はCD123に結合する)、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００３５】
前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、細胞はT細胞又はNK細胞である。実施形態では、T細胞は自己又は同種T細胞である。
【００３６】
実施形態では、CAR治療及びグリコシル化の阻害剤は連続的に投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、グリコシル化の阻害剤は、CAR治療に先行して投与される。前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、グリコシル化の阻害剤及びCAR治療は、同時に又は同じ時に投与される。
【００３７】
前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、CAR治療は、(a)単回注入、又は(b)複数注入(例えば、複数注入に分割された単一用量)として投与され、グリコシル化の阻害剤は、(a)単一用量、又は(b)複数用量(例えば、第1の及び第2の並びに任意選択で1つ又は複数の続く用量)として投与される。
【００３８】
前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、CAR治療の用量は、グリコシル化の阻害剤の第1の用量の投与後(例えば、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間又はこれを超えた後)、例えば、及び阻害剤の第2の用量の投与前、に投与される。
【００３９】
前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、CAR治療の用量はグリコシル化の阻害剤の第1の用量の投与と同じ時に(例えば、2日以内(例えば、2日、1日、24時間、12時間、6時間、4時間、2時間又はこれ未満以内)に投与される。
【００４０】
前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、グリコシル化の阻害剤の1つ又は複数の続く用量は、グリコシル化の阻害剤の第2の用量後に投与される。
【００４１】
前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、グリコシル化の阻害剤は、1より多い用量で投与され、用量は、1日2回(BID)、1日1回、1週間に1回、14日間ごとに1回又は1カ月ごとに1回投与される。
【００４２】
前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、グリコシル化の阻害剤の投与は、少なくとも7日間、例えば、少なくとも7日間、8日間、9日間、10日間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、8カ月又はこれを超える期間を含む複数用量を含む。
【００４３】
前述の態様及び実施形態のいずれかに含まれる実施形態では、CAR治療は、細胞、例えばCAR陽性細胞を少なくとも約5x106、1x107、1.5x107、2x107、2.5x107、3x107、3.5x107、4x107、5x107、1x108、1.5x108、2x108、2.5x108、3x108、3.5x108、4x108、5x108、1x109、2x109又は5x109個含む用量で投与される。
【００４４】
別の態様では、本発明は、哺乳動物において固形腫瘍細胞へのT細胞媒介免疫応答を刺激するための方法を提供し、方法は、先の態様の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む。
【００４５】
別の態様では、本発明は、組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、抗腫瘍、例えば抗固形又は造血器腫瘍免疫を哺乳動物に与える方法を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、腫瘍抗原、例えば、固形腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する哺乳動物を処置する方法を提供し、前記方法は、先の態様の組成物の有効量を投与することを含む。
【００４７】
上のいずれかの方法の実施形態を含む実施形態では、細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団及びグリコシル化の阻害剤は、別々の投与のため(例えば、2つの別々の組成物中)に準備される。上のいずれかの方法の実施形態を含む他の実施形態では、細胞、例えば免疫エフェクター細胞の集団及びグリコシル化の阻害剤は、同時投与のため(例えば、1つの組成物中)に準備される。
【００４８】
グリコシル化の阻害剤の以下の態様は、前述の態様及び実施形態のいずれかと共に利用され得る。
【００４９】
グリコシル化を阻害するための化学的ツールは、天然産生物、基質ベースのタイトに結合する阻害剤、グリコシドプライマー、化学物質ライブラリーのスクリーニングを通じて見出された阻害剤、及び酵素の三次元構造に基づいて合理的に設計された阻害剤を含む種々の種類の阻害剤を含む。
【００５０】
次いで、本発明のグリコシル化阻害剤は、さまざまなクラスの阻害剤(下の表を参照されたい)を含む:代謝阻害剤、ドリコール-PP-GlcNAcアセンブリの阻害剤、グリコシダーゼの天然阻害剤としての植物アルカロイド、ムチン型グリカンのO-GalNac開始の阻害剤、O-GlcNAc修飾の阻害剤、基質類似物、グリコシドプライマー、糖脂質及びGPIアンカーの阻害剤、ノイラミニダーゼ(シアリダーゼ)阻害剤、スルホトランスフェラーゼ阻害剤。これらの阻害剤は、その全体が参照により組み込まれる、「Chemical Tools for Inhibiting Glycosylation - Essentials of Glycobiology - NCBI Bookshelf」、Varki A、Cummings RD、Esko JDら編 Essentials of Glycobiology [Internet]. 3rd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2015年〜2017年. doi: 10.1101/glycobiology.3e.055、特に55章 Chemical Tools for Inhibiting Glycosylation、Jeffrey D. Esko、Carolyn Bertozzi、及びRonald L. Schnaarに記載されている。
【００５１】
【表１】
2021532125.tif 000002
【００５２】
共通前駆体の代謝又は細胞内輸送活性を妨害することによってグリコシル化を遮断する多数の阻害剤が記載されている。これらの化合物の一部は、小胞体(ER)、ゴルジ及びトランスゴルジネットワークの間のタンパク質の移行を妨害することによって間接的に作用する。例えば、真菌代謝物ブレフェルジンAは、トランスゴルジネットワークの近位に位置するゴルジ構成成分がERへ戻る逆行輸送を生じる。これにより、ブレフェルジンAを用いて細胞を処置することは、トランスゴルジネットワークに位置する酵素をER及びゴルジにおいて見出されるものから分離し、シアル酸付加又は硫酸化等の後の反応から一部のグリカンのコア構造のアセンブリをアンカップルさせる。薬物は、2つの経路が同じコンパートメントに属しているのか、又は同じ酵素を共有しているのかを検討するために使用され得る。酵素の局在化及びアレイが、異なる細胞型において相当変動することから、ある系から別の系へのブレフェルジンAの効果を推定することはしばしば困難である。
【００５３】
一部の阻害剤は、グリコシル化に関与する前駆体が形成される中間代謝における重要なステップで作用する。例えば、グルタミン類似物、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン(DON)は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ、フルクトース及びグルタミンからグルコサミンを形成するヘキソサミン生合成経路の酵素を遮断する。このようにグルコサミン産生を抑制することは、すべての主なファミリーがN-アセチルグルコサミン又はN-アセチルガラクトサミンを含有することから、グリカンアセンブリに多面的影響を有する。DONは、他のグルタミン使用酵素にも影響し、したがって非特異的副作用を限定するために注意が必要である。塩素酸塩は、硫酸化を遮断する別の種類の一般的阻害剤である。塩素酸塩アニオン(ClO)は、硫酸塩(SO)の類似物であり、ホスホアデノシン-5′-ホスホ硫酸(PAPS)、すべての公知の硫酸化反応のための活性硫酸ドナー、の形成に関与するスルフリラーゼと不完全な複合体を形成する。これにより、塩素酸塩(通常10〜30mM)を用いて細胞を処置することは、>90%まで硫酸化を阻害するが、効果は、グリカン又は硫酸化反応のいずれの特定のクラスに対しても特異的ではない(例えば、チロシン硫酸化も影響を受ける)。
【００５４】
グリコシル化の選択的阻害を示す多数の糖類似物が作製されている:
2-デオキシグルコース及び糖のフッ素化類似物(3-デオキシ-3-フルオログルコサミン、4-デオキシ-4-フルオログルコサミン、6-デオキシ-6-フルオロ-N-アセチルグルコサミン、2-デオキシ-2-フルオログルコース、2-デオキシ-2-フルオロマンノース、2-デオキシ-2-フルオロフコース及び3-フルオロシアル酸)は、糖タンパク質生合成を阻害する。2-デオキシグルコースの初期の研究は、類似物がUDP-2-デオキシグルコースに並びにGDP-2-デオキシグルコース及びドリコール-P-2-デオキシグルコースに転換されたことを示した。糖タンパク質形成の阻害は、通常糖タンパク質に延長又は移行され得ない2-デオキシグルコースを含有する種々のドリコールオリゴ糖の蓄積の結果として明らかに生じる。同様に、4-デオキシ-N-アセチルグルコサミンは、UDP-4-デオキシ-N-アセチルグルコサミンに転換され、類似物の組み込みを生じずにヘパラン硫酸形成の阻害を生じる。4-デオキシ-キシロースもおそらく天然に存在するキシロシル化基質と競合することによって、グルコサミノグリカンアセンブリを阻害する。
【００５５】
更に、本発明のグリコシル化阻害剤は、
【００５６】
【化１】
2021532125.tif 000003
【００５７】
ツニカマイシン
【００５８】
【化２】
2021532125.tif 000004
【００５９】
O-GlcNAc-特異的β-ヘキソサミニダーゼ(OGA)及びO-GlcNAcトランスフェラーゼ(OGT)の阻害剤
【００６０】
【化３】
2021532125.tif 000005
【００６１】
スフィンゴ糖脂質形成の阻害剤を含む。これらの類似物は、スフィンゴ糖脂形成を開始するグルコーストランスフェラーゼの強力な阻害剤である。
【００６２】
【化４】
2021532125.tif 000006
【００６３】
インフルエンザノイラミニダーゼ阻害剤の構造。Neu5Ac、NANA; 2-デオキシ-2,3-デヒドロ-Nアセチルノイラミン酸、DANA; 4-アミノ-DANA; 4-グアニジノ-DANA(Relenza、ザナミビル); (3R、4R、5S)-4-アセトアミド-5-アミノ-3-(1-エチルプロポキシル)-1-シクロヘキサン-1-カルボン酸エチルエステル(GS4104、Tamiflu、オセルタミビル)の化学構造。DANAは、加水分解中の遷移状態に類似していると考えられており、Relenzaでのグアニジニウム基の付加は活性部位への高い親和性結合を提供する。Tamiflu中のエチルエステルは、経口利用能を増強し、次いで非特異的エステラーゼによって身体中で急速に除かれる。
【００６４】
N結合グリカン生合成に関与するグリコシダーゼを阻害するアルカロイドの例:
【００６５】
【表２】
2021532125.tif 000007
【００６６】
グリコシルトランスフェラーゼの合成基質ベースの阻害剤
【００６７】
【表３】
2021532125.tif 000008
【００６８】
本発明では、がん免疫療法(イムノオンコロジー(immuno-oncology)と呼ばれる場合もある、IOと省略される)は、がんを処置するための免疫系の使用である。免疫療法は、能動的、受動的又はハイブリッド(能動的及び受動的)として分類され得る。これらのアプローチは、がん細胞が、腫瘍関連抗原(TAA)として公知の、免疫系によって検出され得る分子をそれらの表面にしばしば有し;それらがしばしばタンパク質又は他の高分子(例えば、炭水化物)であるという事実を利用する。能動的免疫療法は、TAAを標的化することによって腫瘍細胞を攻撃するように免疫系を方向付ける。受動的免疫療法は、既存の抗腫瘍応答を増強し、モノクローナル抗体、リンパ球及びサイトカインの使用を含む。
【００６９】
これらの内、複数の抗体治療は、広範ながんを処置するために種々の管轄において承認されている。抗体は、免疫系によって産生されるタンパク質であり、細胞表面の標的抗原に結合する。通常、免疫系は、それらを病原体と闘うために使用する。各抗体は、1つ又は少数のタンパク質に特異的である。腫瘍抗原に結合するものはがんを処置する。細胞表面受容体は、抗体療法のための共通標的であり、CD20、CD274及びCD279を含む。がん抗原に結合すると、抗体は、抗体依存性細胞傷害を誘導できる、補体系を活性化できる又はそのリガンドとの相互作用について受容体を妨げることができ、そのすべてが細胞死をもたらすことができる。承認された抗体として、アレムツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ及びリツキシマブが挙げられる。
【００７０】
能動的細胞療法は、血液から、又は腫瘍からの免疫細胞の除去を通常含む。腫瘍に特異的なものは培養され、それらが腫瘍を攻撃する患者に戻される;代替的に、免疫細胞は腫瘍特異的受容体を発現するように遺伝的に操作され、培養され、患者に戻される場合がある。この方法において使用され得る細胞型は、ナチュラルキラー細胞、リンホカイン活性化キラー細胞、細胞傷害性T細胞及び樹状細胞である。
【００７１】
インターロイキン-2及びインターフェロン-αは、サイトカイン、免疫系の挙動を制御し、調和させるタンパク質である。それらは、抗腫瘍活性を増強する能力を有し、それにより受動的がん処置として使用され得る。インターフェロン-αは、ヘアリー細胞白血病(leukaemia)、AIDS関連カポジ肉腫、濾胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病(leukaemia)及び悪性メラノーマにおいて使用される。インターロイキン-2は、悪性メラノーマ及び腎細胞癌の処置において使用される。
【００７２】
養子T細胞療法
がん特異的T細胞は、腫瘍浸潤リンパ球の断片化及び単離によって、又は末梢血由来の細胞を遺伝的に操作することによって得ることができる。細胞は、レシピエント(腫瘍保有者)への輸注に先立って活性化及び増殖される。
【００７３】
養子T細胞療法は、T細胞の輸注(養子細胞移行)による受動的免疫処置の1つの形態である。それらは、血液及び組織において見出され、外来病原体を見つけた場合に通常活性化する。詳細にはそれらは、外来タンパク質の一部をその表面抗原に提示する細胞にT細胞の表面受容体が遭遇した場合に活性化する。これらは、感染細胞又は抗原提示細胞(APC)のいずれかであり得る。それらは、正常な組織において及び腫瘍組織において見出され、ここでそれらは腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)として公知である。それらは、腫瘍抗原を示す樹状細胞等のAPCの存在によって活性化される。これらの細胞は、腫瘍を攻撃できるが、腫瘍内の環境は、高度に免疫抑制性であり、免疫媒介腫瘍死を妨げている。
【００７４】
腫瘍標的化T細胞を産生し、得るための複数の方法が開発されている。腫瘍抗原に特異的なT細胞は、腫瘍試料(TIL)から除去され得る、又は血液から濾過され得る。続く活性化及び培養は、ex vivoで実施され、生じたものは再注入される。活性化は、遺伝子治療を通じて、又はT細胞を腫瘍抗原に曝露することによって生じる。
【００７５】
2014年時点で、複数のACT臨床試験が進行中であった。重要なことに、2018年からの一研究は、複数の先行する免疫療法に抵抗性の転移性メラノーマを有する患者において臨床応答が得られることを示した。
【００７６】
最初の2つの養子T細胞療法、チサゲンレクルユーセル及びアキシカブタゲンシロロイセルは、2017年にFDAによって承認された。
【００７７】
別のアプローチは、健康なドナー由来のハプロタイプ一致のγδT細胞又はNK細胞の養子移行である。このアプローチの主な有利点は、これらの細胞がGVHDを引き起こさないことである。不利な点は、移行された細胞の機能がしばしば損なわれることである。
【００７８】
CAR-T細胞療法
キメラ抗原受容体
「キメラ抗原受容体」又は「CAR」又は「CARs」は、細胞(例えば、T細胞)に抗原特異性を付与できる操作された受容体を指す。CARは、人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体又はキメラ免疫受容体としても公知である。好ましくは本発明のCARは、抗原特異的標的化領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択で1つ又は複数の同時刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００７９】
抗原特異的標的化ドメイン
抗原特異的標的化ドメインは、目的の標的抗原に結合する能力を有するCARを提供する。抗原特異的標的化ドメインは、腫瘍死滅を生じる、エフェクター免疫応答をそれに対して引き起こすことが望ましい、臨床的に関心がある抗原を好ましくは標的化する。
【００８０】
抗原特異的標的化ドメインは、生物学的分子(例えば、細胞表面受容体若しくは腫瘍タンパク質又はこれらの構成成分)を特異的に認識し、結合する能力を有する任意のタンパク質又はペプチドであり得る。抗原特異的標的化ドメインは、目的の生物学的分子に対する、任意の天然に存在する、合成、半合成又は組換えで産生された結合パートナーを含む。
【００８１】
例示的な抗原特異的標的化ドメインは、抗体若しくは抗体断片若しくは誘導体、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子/受容体に対するリガンド又はこれらの受容体結合ドメイン及び腫瘍結合タンパク質を含む。
【００８２】
好ましい実施形態では、抗原特異的標的化ドメインは抗体である、又はそれ由来である。抗体由来標的化ドメインは、抗体の断片又は抗体の1つ若しくは複数の断片の遺伝的に操作された産生物であってよく、その断片は抗原との結合に関与する。例として、可変領域(Fv)、相補性決定領域(CDR)、Fab、1本鎖抗体(scFv)、重鎖可変領域(VH)、軽鎖可変領域(VL)及びラクダ抗体(VHH)が挙げられる。
【００８３】
好ましい実施形態では、結合ドメインは1本鎖抗体(scFv)である。scFvは、マウス、ヒト又はヒト化scFvであってよい。
【００８４】
抗体又はその抗原結合性断片に関して「相補性決定領域」又は「CDR」は、抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域中の高度に可変性のループを指す。CDRは、抗原コンホメーションと相互作用し、(一部のフレームワーク領域が結合に関与することが公知であるが)抗原への結合を大きく決定し得る。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、それぞれ3個のCDRを含有する。
【００８５】
「重鎖可変領域」又は「VH」は、CDRよりも高度に保存され、CDRを支持するスキャホールドを形成するフレームワーク領域として公知の隣接するストレッチの間に挿入された3つのCDRを含有する抗体の重鎖の断片を指す。
【００８６】
「軽鎖可変領域」又は「VL」は、フレームワーク領域間に挿入された3つのCDRを含有する抗体の軽鎖の断片を指す。
【００８７】
「Fv」は、完全な抗原結合部位を保有する抗体の最も小さな断片を指す。Fv断片は、単一の重鎖の可変領域に結合した単一の軽鎖の可変領域からなる。
【００８８】
「1本鎖Fv抗体」又は「scFv」は、直接又はペプチドリンカー配列を介して互いにつながれている軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる操作された抗体を指す。
【００８９】
腫瘍細胞表面分子に特異的に結合する抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して調製され得る。そのような方法として、ファージディスプレイ、ヒト若しくはヒト化抗体を生成する方法又はヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物若しくは植物を使用する方法が挙げられる。部分的又は完全な合成抗体のファージディスプレイライブラリーは、利用可能であり、標的分子に結合できる抗体又はその断片についてスクリーニングされ得る。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも利用可能である。同定されると、抗体をコードするアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、単離、及び/又は決定され得る。
【００９０】
本発明のCARによって標的化され得る抗原の例として、これだけに限らないが、がん細胞で発現される抗原及び種々の血液学的疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患及び感染性疾患に関連する細胞で発現される抗原が挙げられる。
【００９１】
がん抗原を標的化する標的化ドメインに関して、標的化ドメインの選択は、処置されるがんの種類に依存し、腫瘍抗原を標的化できる。対象由来の腫瘍試料は、ある特定のバイオマーカー又は細胞表面マーカーの存在について特徴付けられ得る。例えば、対象由来の乳がん細胞は、Her2Neu、エストロゲン受容体及び/又はプロゲステロン受容体のそれぞれについて陽性又は陰性である場合がある。腫瘍抗原又は細胞表面分子は、個々の対象の腫瘍細胞において見出されるものが選択される。好ましくは抗原特異的標的化ドメインは、腫瘍細胞に見出され、正常な組織には実質的に見出されない又はその発現が非生体(non-vital)正常組織に限定されている細胞表面分子を標的化する。
【００９２】
CARによって標的化され得るがんに特異的な更なる抗原として、これだけに限らないが、メソテリン、EGFRvIII、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、インターロイキン-11受容体a(IL-l lRa)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板由来増殖因子受容体-ベータ(PDGFR-ベータ)、SSEA-4、CD20、葉酸受容体アルファ(FRa)、ERBB2 (Her2/neu)、MUCl、上皮増殖因子受容体(EGFR)、NCAM、プロスターゼ(Prostase)、PAP、ELF2M、エフリンB2、IGF-I受容体、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、チロシナーゼ、EphA2、フコシルGM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-アセチル-GD2、葉酸受容体ベータ、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD 179a、ALK、ポリシアル酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、レグマイン(legumain)、HPV E6、E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子タンパク質17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos関連抗原1、p53、p53変異体、プロステイン(prostein)、サバイビン及びテロメラーゼ、PCTA-l/ガレクチン8、メランA/MARTl、Ras変異体、hTERT、肉腫移行ブレイクポイント、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、アンドロゲン受容体、サイクリンB l、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B 1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES 1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2、腸カルボキシルエステラーゼ(intestinal carboxyl esterase)、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5及びIGLL1の任意の1つ又は複数が挙げられる。
【００９３】
本発明のCARによって標的化され得る炎症性疾患に特異的な抗原として、これだけに限らないがAOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(エオタキシン-1)、CD125、CD147(ベイシジン)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受容体)、CD25(IL-2受容体のa鎖)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc領域、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、ラマグラマ(Lama glama)、LFA-1(CD11a)、MEDI-528、ミオスタチン、OX-40、rhuMAb β7、スクレロスシン(scleroscin)、SOST、TGF β1、TNF-a又はVEGF-Aの任意の1つ又は複数が挙げられる。
【００９４】
本発明のCARによって標的化され得る神経細胞障害に特異的な抗原として、これだけに限らないがベータアミロイド又はMABT5102Aの任意の1つ又は複数が挙げられる。
【００９５】
本発明のCARによって標的化され得る糖尿病に特異的な抗原として、これだけに限らないがL-1β又はCD3の任意の1つ又は複数が挙げられる。糖尿病又は他の代謝障害に特異的な他の抗原は、当業者に明らかである。
【００９６】
本発明のCARによって標的化され得る心血管疾患に特異的な抗原として、これだけに限らないがC5、心筋ミオシン、CD41(インテグリンアルファ-IIb)、フィブリンII、ベータ鎖、ITGB2(CD18)及びスフィンゴシン-1-リン酸の任意の1つ又は複数が挙げられる。
【００９７】
好ましくは、抗原特異的結合ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。具体的な実施形態では、ポリヌクレオチドは、CD44v6又はCEAに特異的に結合する1本鎖Fvをコードしている。
【００９８】
同時刺激ドメイン
CARは、1つ又は複数の同時刺激ドメインも含む。このドメインは、細胞増殖(proliferation)、細胞生存及びメモリー細胞の発達を増強し得る。
【００９９】
各同時刺激ドメインは、例えば、MHCクラスI分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CDl la/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD 19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL2Rベータ、IL2Rガンマ、IL7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB 1、CD29、ITGB2、CD 18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96(タクチル(Tactile))、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD 19a及びCD83に特異的に結合するリガンド、の任意の1つ又は複数の同時刺激ドメインを含む。追加的同時刺激ドメインは、当業者に明らかである。
【０１００】
細胞内シグナル伝達ドメイン
CARは、細胞内シグナル伝達ドメインも含む。このドメインは、細胞質性である場合があり、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞がその専門化された機能を実施するように方向付ける。細胞内シグナル伝達ドメインの例として、これだけに限らないが、T細胞受容体のζ鎖若しくはその任意のホモログ(例えば、η鎖、FcεR1γ及びβ鎖、MB1(Igα)鎖、B29(Igβ)鎖等)、CD3ポリペプチド(Δ、δ及びε)、sykファミリーチロシンキナーゼ(Syk、ZAP 70等)、srcファミリーチロシンキナーゼ(Lck、Fyn、Lyn等)並びにCD2、CD5及びCD28等のT細胞形質導入に関与する他の分子が挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖、FcyRIII、FcsRI、Fc受容体の細胞質側末端、細胞質受容体を有する免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)又はこれらの組合せである場合がある。
【０１０１】
好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１０２】
膜貫通ドメイン
CARは、膜貫通ドメインも含む。膜貫通ドメインは、I型、II型又はIII型膜貫通タンパク質のいずれかを含む膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質由来の膜貫通配列を含み得る。本発明のCARの膜貫通ドメインは、人工疎水性配列も含む場合がある。本発明のCARの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択され得る。追加的膜貫通ドメインは、当業者に明らかである。CAR構築物において使用される膜貫通(TM)領域の例は、1)CD28 TM領域(Puleら、Mol Ther、2005年11月;12(5):933〜41頁; Brentjensら、CCR、2007年9月15日;13(18 Pt 1):5426〜35頁; Casucciら、Blood、2013年11月14日;122(20):3461〜72頁); 2) OX40 TM領域(Puleら、Mol Ther、2005年11月;12(5):933〜41頁); 3) 41BB TM領域(Brentjensら、CCR、2007年9月15日;13(18 Pt 1):5426〜35頁);4)CD3ゼータTM領域(Puleら、Mol Ther、2005年11月;12(5):933-41頁; Savoldo B、Blood、2009年6月18日;113(25):6392〜402頁); 5)CD8a TM領域(Maherら、Nat Biotechnol、2002年1月;20(1):70〜5頁; Imai C、Leukemia、2004年4月;18(4):676〜84頁; Brentjensら、CCR、2007年9月15日;13(18 Pt 1):5426〜35頁; Miloneら、Mol Ther、2009年8月;17(8):1453〜64頁)である。
【０１０３】
承認された薬物
チサゲンレクルユーセル(Kymriah)、キメラ抗原受容体(CAR-T)治療は、急性リンパ芽球性白血病を処置するために2017年にFDAによって承認された。この処置は、CD19陽性細胞(B細胞)(罹患した細胞だけでなく正常な抗体産生細胞も含む)を身体から除去する。アキシカブタゲンシロロイセル(Yescarta)は、別のCAR-T治療であり、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の処置のために2017年に承認された。
【０１０４】
抗体治療
抗体は適応免疫応答の重要な構成成分であり、外来抗原の認識及び免疫応答の刺激の両方において中心的役割を演じている。抗体は、一部のB細胞によって産生されるY形のタンパク質であり、2つの領域:抗原に結合する抗原結合性断片(Fab)、並びにマクロファージ、好中球及びNK細胞を含むさまざまな免疫細胞型の表面で発現されるいわゆるFc受容体と相互作用する断片結晶性(Fc)領域からなる。多数の免疫療法レジメンは、抗体を含む。モノクローナル抗体技術は、腫瘍表面に存在するもの等の特定の抗原に対する抗体を操作し、生成する。
【０１０５】
抗体の種類
コンジュゲーション
2種類ががん処置において使用される:
ネイキッドモノクローナル抗体は、エレメントが付加されていない抗体である。大部分の抗体治療は、この種類の抗体を使用する。
【０１０６】
コンジュゲートされたモノクローナル抗体は、細胞傷害性又は放射性のいずれかの別の分子に連結されている。毒性化学物質は、典型的には化学療法薬として使用されているものであるが、他の毒素も使用され得る。抗体は、がん細胞表面の特定の抗原に結合し、治療を腫瘍に方向付ける。放射性化合物連結抗体は、放射線標識されたと称される。化学標識された(Chemolabelled)又は免疫毒素抗体は、化学治療的分子又は毒素をそれぞれ用いてタグ化されている。
【０１０７】
Fc領域
Fc受容体に結合するFcの能力は、抗体が免疫系を活性化できるようにすることから重要である。Fc領域は、変動し:それらは、多数のサブタイプで存在し、例えば、グリコシル化と呼ばれるプロセスでの糖の付加を用いて更に、修飾され得る。Fc領域における変化は、Fc受容体と結合する抗体の能力を変更させることができ、更に、抗体が引き起こす免疫応答の種類を決定する。PD-1及びPD-L1阻害剤を含む多数のがん免疫療法薬は、抗体である。例えば、PD-1を標的化する免疫チェックポイント遮断剤は、T細胞によって発現されるPD-1に結合するように設計された抗体であり、腫瘍を排除するようにこれらの細胞を再活性化する。抗PD-1薬は、PD-1に結合するFab領域だけでなく、Fc領域も含有する。実験研究は、がん免疫療法薬のFc部分が処置の結果に影響を与え得ることを示している。例えば、抑制性Fc受容体に結合するFc領域を有する抗PD-1薬は、治療有効性を減少した可能性がある。画像研究は、抗PD-1薬のFc領域が腫瘍関連マクロファージによって発現されるFc受容体に結合できることを更に示した。このプロセスは、それらの目的とする標的(すなわち、T細胞の表面に発現されるPD-1分子)から薬物を除去し、治療有効性を制限する。更に、同時刺激タンパク質CD40を標的化する抗体は、最適な治療有効性のために選択的Fc受容体との結合を必要とする。併せて、これらの研究は、抗体に基づく免疫チェックポイント標的化戦略におけるFc状態の重要性を強調している。
【０１０８】
ヒト/非ヒトバランス
抗体はマウス、キメラ、ヒト化及びヒトとも称される。マウス抗体は、異なる種由来であり、免疫反応の危険性を有する。キメラ抗体は、定常領域として公知である対応するヒト対応物を用いて抗体の一部を置き換えることによってマウス抗体の免疫原性を低減することを試みている。ヒト化抗体は、ほとんど完全にヒトであり;可変領域の相補性決定領域だけがマウス供給源由来である。ヒト抗体は、未改変ヒトDNAを使用して産生される。
【０１０９】
抗体依存性細胞傷害。ナチュラルキラー(NK)細胞のFc受容体が、がん細胞に結合した抗体のFc領域と相互作用する場合、NK細胞は、パーフォリン及びグランザイムを放出し、がん細胞のアポトーシスを導く。
【０１１０】
細胞死機構
抗体依存性細胞傷害(ADCC)
抗体依存性細胞傷害(ADCC)は、標的細胞表面に結合するために抗体を必要とする。抗体は、結合領域(Fab)及び、Fc表面受容体を介して免疫系細胞によって検出され得るFc領域から形成される。Fc受容体は、ナチュラルキラー細胞を含む多くの免疫系細胞で見出される。ナチュラルキラー細胞が抗体でコートされた細胞に遭遇すると、後者のFc領域は、それらのFc受容体と相互作用し、パーフォリン及びグランザイムBを放出し、腫瘍細胞を死滅させる。例として、リツキシマブ、オファツムマブ及びアレムツズマブが挙げられる。開発中の抗体は、特定の種類のFc受容体、FcγRIIIAに高い親和性を有する変更されたFc領域を有し、有効性を劇的に増加させることができる。
【０１１１】
補体
補体系は、抗体が細胞表面に結合した後に細胞死を生じ得る血液タンパク質を含む(古典的補体経路、補体活性化の方法)。一般に系は、外来病原体を扱うが、がんにおいて治療用抗体を用いて活性化され得る。系は、IgG1 Fc領域を含有する限り、抗体がキメラ、ヒト化又はヒトであれば始動され得る。補体は、補体依存性細胞傷害として公知の膜侵襲複合体の活性化;抗体依存性細胞傷害の増強;及びCR3依存性細胞傷害によって細胞死を導くことができる。補体依存性細胞傷害は、抗体ががん細胞表面に結合し、C1複合体がこれらの抗体に結合し、続いてタンパク質ポアががん細胞膜において形成された場合に生じる。
【０１１２】
FDA承認抗体
がん免疫療法:モノクローナル抗体
【０１１３】
【表４】
2021532125.tif 000009
【０１１４】
アレムツズマブ(Campeth-1H)は、フルダラビン抵抗性慢性リンパ球性白血病(CLL)、皮膚T細胞リンパ腫、末梢性T細胞リンパ腫及びT細胞前リンパ球性白血病の処置のために示される抗CD52ヒト化IgG1モノクローナル抗体である。CD52は、>95%の末梢血リンパ球(T細胞及びB細胞の両方)並びに単球において見出されるが、リンパ球でのその機能は不明である。それは、CD52に結合し、補体結合及びADCC機構によってその細胞傷害性効果を開始する。抗体標的(免疫系の細胞)のために、アレムツズマブ治療の一般的な合併症は、感染、毒性及び骨髄抑制である。
【０１１５】
アテゾリズマブ
デュルバルマブ
デュルバルマブ(Imfinzi)は、プログラム細胞死リガンド1(PD-L1)とPD-1及びCD80(B7.1)分子との相互作用を遮断するヒト免疫グロブリンG1カッパ(IgG1κ)モノクローナル抗体である。デュルバルマブは、白金含有化学療法の際に若しくはその後に疾患進行を有した、及び/又は白金含有化学療法を用いたネオアジュバント若しくはアジュバント処置の12か月以内に疾患進行を有した、局所的に進行した又は転移性の尿路上皮性癌を有する患者の処置のために承認されている。
【０１１６】
イピリムマブ
イピリムマブ(Yervoy)は、表面タンパク質CTLA4に結合するヒトIgG1抗体である。通常の生理機能では、T細胞は、2つのシグナル:抗原-MHC複合体へのT細胞受容体の結合、及びCD80又はCD86タンパク質へのT細胞表面受容体CD28の結合、によって活性化される。CTLA4は、CD80又はCD86に結合し、CD28のこれらの表面タンパク質への結合を妨げ、それによりT細胞の活性化を負に制御する。
【０１１７】
活性細胞傷害性T細胞は、メラノーマ細胞を攻撃するための免疫系に必要である。通常阻害される活性メラノーマ特異的細胞傷害性T細胞は、有効な抗腫瘍応答を生じることができる。イピリムマブ(Ipilumumab)は、抗腫瘍応答を増加させるように、制御性T細胞の細胞傷害性T細胞に対する比にシフトをもたらすことができる。制御性T細胞は、他のT細胞を抑制し、腫瘍の利益になる場合がある。
【０１１８】
ニボルマブ
オファツムマブ
オファツムマブは、CD20に結合する第2世代ヒトIgG1抗体である。慢性リンパ球性白血病(CLL)のがん性細胞が通常CD20発現B細胞であることから、CLLの処置において使用される。CD20タンパク質の大きなループに結合するリツキシマブとは異なり、オファツムマブは、別の小さなループに結合する。このことは、それらの異なる特徴を説明できる。リツキシマブと比較してオファツムマブは免疫原性をあまり有さない低い用量で補体依存性細胞傷害を誘導する。
【０１１９】
ペンブロリズマブ
ペンブロリズマブは、腫瘍がFDA承認検査によって判定される高いPD-L1発現を有する転移性非小細胞肺がんを有する患者の第一選択処置のために承認されている。
【０１２０】
リツキシマブ
リツキシマブは、親抗体イブリツモマブから開発された、CD20に対して特異的なキメラモノクローナルIgG1抗体である。イブリツモマブと同様に、リツキシマブはCD20を標的化し、ある特定のB細胞悪性病変の処置において有効になっている。これらは、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫及び濾胞リンパ腫等の高悪性度及び低悪性度リンパ腫並びにB細胞慢性リンパ球性白血病(leukaemia)等の白血病(leukaemia)を含む。CD20の機能はあまり知られていないが、CD20は、B細胞活性化に関与するカルシウムチャネルである可能性がある。抗体の作用の様式は、主にADCCの誘導及び補体媒介性細胞傷害を通じてである。他の機構として、アポトーシス及び細胞増殖停止が挙げられる。リツキシマブも化学療法へのがん性B細胞の感受性を増加させる。
【０１２１】
サイトカイン治療
サイトカインは、腫瘍内に存在する多くの種類の細胞によって産生されるタンパク質である。それらは、免疫応答を調節できる。腫瘍は、それらが増殖でき、免疫応答を低減できるようにするためにしばしばそれらを使用する。これらの免疫調節効果は、免疫応答を誘発するための薬物としてそれらを使用できるようにする。2つの一般的に使用されるサイトカインは、インターフェロン及びインターロイキンである。
【０１２２】
インターフェロン
インターフェロンは、免疫系によって産生される。それらは、通常抗ウイルス応答に関与するが、がんに対する使用も有する。それらは、3つの群:I型(IFNα及びIFNβ)、II型(IFNγ)及びIII型(IFNλ)に分けられる。IFNαは、ヘアリー細胞白血病(leukaemia)、AIDS関連カポジ肉腫、濾胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病(leukaemia)及びメラノーマにおける使用のために承認されている。I及びII型IFNは広範に研究され、両方の型が抗腫瘍免疫系効果を促進するが、I型IFNだけが臨床的に有効であると示されている。IFNλは、動物モデルにおいてその抗腫瘍効果についての有望さを示している。
【０１２３】
I型IFNとは異なり、インターフェロンガンマは、いかなるがんの処置のためにもまだ承認されていない。しかし、生存率の改善は、インターフェロンガンマが膀胱癌及びメラノーマがんを有する患者に投与された場合に観察された。最も有望な結果は、ステージ2及び3の卵巣癌を有する患者において達成された。がん細胞におけるIFN-ガンマのin vitro研究は、更に広範であり、結果は、一般にアポトーシスによって誘導されるが、オートファジーによる場合もある増殖阻害又は細胞死をもたらすIFN-ガンマの抗増殖(proliferative)活性を示している。
【０１２４】
インターロイキン
インターロイキンは、数々の免疫系効果を有する。インターロイキン-2は悪性メラノーマ及び腎細胞癌の処置において使用される。通常の生理機能ではそれは、エフェクターT細胞及び制御性T細胞の両方を促進するが、その作用の正確な機構は不明である。
【０１２５】
組合せ免疫療法
PD1等の種々の免疫療法をCTLA4阻害剤と組み合わせることは、抗腫瘍応答を増強でき持続的な応答をもたらす。
【０１２６】
腫瘍のアブレーション治療を免疫療法と組み合わせることは、免疫刺激応答を増強し、治癒的転移性がん処置に相乗効果を有する。
【０１２７】
チェックポイント免疫療法を医薬品と組み合わせることは、応答を改善する可能性を有し、かかる組合せ療法は、臨床的調査の非常に調査されている領域である。CSF-1R阻害剤及びTLRアゴニスト等の免疫刺激薬は、この状況において特に有効であった。
【０１２８】
多糖類-K
日本の厚生労働省は、キノコ、コリオルス・ベルシコル(Coriolus versicolor)から抽出された多糖類-Kの、化学療法を受けている患者の免疫系を刺激するための使用を1980年代に承認した。それは米国及び他の管轄区域では、栄養補助食品である。
【０１２９】
抗CD47治療
多数の腫瘍細胞は宿主免疫系の免疫監視(immunosurveilance)を回避するためにCD47を過発現する。CD47は、その受容体シグナル制御タンパク質アルファ(SIRPα)に結合し、腫瘍細胞のファゴサイトーシスを下方制御する。したがって、抗CD47治療は、腫瘍細胞のクリアランスを回復させることを目的にする。加えて、増加している証拠は、抗CD47治療への応答における腫瘍抗原特異的T細胞応答の使用を支持している。抗CD47抗体、操作されたデコイ受容体、抗SIRPα抗体及び二特異性薬剤を含む多数の治療法が開発されている。2017年現在、広範な固形及び血液悪性疾患が臨床的に検査されている。
【０１３０】
抗GD2抗体
GD2ガングリオシド
細胞の表面の炭水化物抗原は、免疫療法のための標的として使用され得る。GD2は、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、メラノーマ、小細胞肺がん、脳腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫及び他の軟部組織肉腫を含む、多くの種類のがん細胞の表面に見出されるガングリオシドである。それは、正常組織の表面に通常発現されず、それを免疫療法のための良い標的にしている。2014年時点で、臨床試験は進行中であった。
【０１３１】
免疫チェックポイント
免疫チェックポイントは、免疫系機能に影響を与える。免疫チェックポイントは、刺激性又は抑制性である場合がある。腫瘍は、免疫系の攻撃からそれら自身を保護するためにこれらのチェックポイントを使用する場合がある。現在承認されているチェックポイント治療は、抑制性チェックポイント受容体を遮断する。したがって、免疫細胞へのネガティブフィードバックシグナル伝達の遮断は、腫瘍に対する免疫応答の増強を生じる。
【０１３２】
調査中の1つのリガンド-受容体相互作用は、膜貫通プログラム細胞死1タンパク質(PDCD1、PD-1; CD279としても公知)とそのリガンド、PD-1リガンド1(PD-L1、CD274)との間の相互作用である。細胞表面のPD-L1は、免疫細胞表面のPD1に結合し、免疫細胞活性を抑制する。PD-L1機能は、T細胞活性での重要な制御的役割である。細胞表面のPD-L1の(がん媒介性)上方制御は、そうでなければ攻撃するT細胞を抑制できると考えられる。がん細胞のPD-L1もFAS-及びインターフェロン依存性アポトーシスを阻害し、T細胞によって産生される細胞傷害分子から細胞を保護する。PD-1又はPD-L1のいずれかに結合し、それにより相互作用を遮断する抗体は、T細胞が腫瘍を攻撃できるようにする。
【０１３３】
CTLA-4遮断
FDAによって承認された最初のチェックポイント抗体は、イピリムマブであり、メラノーマの処置のために2011年に承認された。それは、免疫チェックポイント分子CTLA-4を遮断する。臨床試験は、特に他の薬物との組合せで、肺がん又は膵臓がんでの抗CTLA-4治療のいくつかの利益も示した。進行中の治験では、CTLA-4遮断とPD-1又はPD-L1阻害剤との組合せが、さまざまな種類のがんについて検査されている。
【０１３４】
しかし、チェックポイント遮断(詳細には、CTLA-4遮断抗体)を用いて又はチェックポイント遮断抗体の組合せを用いて処置された患者は、皮膚科学的、胃腸管、内分泌又は肝臓の自己免疫性反応等の免疫関連の有害事象を罹患する高い危険がある。これらは、大部分は抗CTLA-4抗体が血流への注射によって投与される場合に誘導されるT細胞活性化の広さによる。
【０１３５】
膀胱がんのマウスモデルを使用して研究者らは、腫瘍領域での低用量抗CTLA-4の局所注射が、抗体が血液に送達された場合と同様の腫瘍抑制能力を有することを見出した。同時に、循環抗体のレベルは低く、抗CTLA-4治療の局所投与が有害事象をわずかしか生じない可能性があることを示唆している。
【０１３６】
PD-1阻害剤
IgG4 PD1抗体ニボルマブを用いた最初の臨床試験結果は、2010年に公開された。それは、2014年に承認された。ニボルマブは、メラノーマ、肺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん及びホジキンリンパ腫を処置するために承認されている。非小細胞肺がんについての2016年の臨床試験は、第一選択の最設定における処置のためには、主なエンドポイントに合致しなかったが、FDAは、治療の続く選択で承認した。ペンブロリズマブは、2014年にFDAによって承認された別のPD1阻害剤である。Keytruda(ペンブロリズマブ)は、メラノーマ及び肺がんを処置するために承認されている。
【０１３７】
抗体BGB-A317は、早期臨床試験中のPD-1阻害剤である(Fcガンマ受容体Iに結合しないように設計された)。
【０１３８】
PD-L1阻害剤
2016年5月に、PD-L1阻害剤アテゾリズマブは、膀胱がんの処置のために承認された。
【０１３９】
現在開発されている抗PD-L1抗体として、アフィマー(affimer)生物治療法に加えて、アベルマブ及びデュルバルマブが挙げられる。
【０１４０】
その他
免疫療法を増強するための他の様式として、標的化、いわゆる内在性チェックポイント遮断、例えばCISHが挙げられる。
【０１４１】
腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に優先的に感染し、死滅させるウイルスである。感染されたがん細胞は、腫瘍退縮によって破壊されることから、それらは、新たな感染性ウイルス粒子又はビリオンを放出し、残りの腫瘍を破壊することを助ける。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の直接の破壊を生じるだけでなく、長期間の免疫療法のために宿主抗腫瘍免疫応答も刺激すると考えられている。
【０１４２】
抗がん剤としてのウイルスの可能性は、協調的な研究努力は1960年代まで始まらなかったが、20世紀初期に最初に認識された。アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、単純ヘルペス、ニューカッスル病ウイルス及びワクシニアを含む多数のウイルスは、腫瘍溶解性薬剤として現在臨床的に検査されている。T-Vecは、メラノーマの処置のために最初にFDAで承認された腫瘍溶解性ウイルスである。多数の他の腫瘍溶解性ウイルスは、フェーズII〜III開発にある。
【０１４３】
多糖
キノコにおいて見出されるある特定の化合物、主に多糖は、免疫系を上方制御でき、抗がん特性を有する場合がある。例えば、レンチナン等の、ベータグルカンは、マクロファージ、NK細胞、T細胞及び免疫系サイトカインを刺激することが臨床検査において示されており、免疫アジュバントとして臨床試験において調査されている。
【０１４４】
ネオ抗原
多数の腫瘍が変異を発現する。これらの変異は、T細胞免疫療法における使用のための新たな標的化可能な抗原(ネオ抗原)を創出する可能性がある。がん病変におけるCD8+ T細胞の存在は、RNA配列決定データを使用して同定される通り、高い変異負荷を有する腫瘍において高い。ナチュラルキラー細胞及びT細胞の細胞溶解活性に関連する転写物のレベルは、多数のヒト腫瘍において変異負荷と正に相関する。ランブロリズマブを用いて処置された非小細胞肺がん患者では、変異負荷は、臨床応答と強い相関を示す。イピリムマブを用いて処置されたメラノーマ患者では、長期間の効果も、顕著ではないが高い変異負荷と関連している。長期間の臨床的利益を有する患者において予測されるMHC結合ネオ抗原は、臨床的利益を有さない又は臨床的利益が最小である患者の腫瘍では見出されない一連のテトラペプチドモチーフが濃縮されている。しかし、他の研究において同定されたヒトネオ抗原は、テトラペプチドシグネチャーへの偏向を示さない。
【０１４５】
本明細書において使用される場合、用語「Tリンパ球」及び「T細胞」は、互換的に用いられ、胸腺において成熟を完了し、身体での特定の外来抗原の同定及び他の免疫細胞の活性化及び非活性化を含む免疫系における種々の役割を有する白血球の主な種類を指す。T細胞は、培養されたT細胞、例えば、初代T細胞若しくは培養されたT細胞株由来のT細胞、例えばジャーカット、SupTl等、又は哺乳動物由来のT細胞等の任意のT細胞であってよい。T細胞は、CD3+細胞であってよい。T細胞は、任意の種類のT細胞であってよく、これだけに限らないが、CD4+/CD8+二重陽性T細胞、CD4+ヘルパーT細胞(例えば、Thl及びTh2細胞)、CD8+ T細胞(例えば、細胞傷害性T細胞)、末梢血単核細胞(PBMC)、末梢血白血球(PBL)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、メモリーT細胞、ナイーブT細胞、制御性T細胞、ガンマデルタT細胞(γδT細胞)等が挙げられる任意の発達ステージであってよい。ヘルパーT細胞の追加的な種類は、Th3、Thl 7、Th9又はTfh細胞等の細胞を含む。メモリーT細胞の追加的な種類は、セントラルメモリーT細胞(Tcm細胞)、エフェクターメモリーT細胞(Tern細胞及びTEMRA細胞)等の細胞を含む。T細胞は、T細胞受容体(TCR)又はキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように改変されたT細胞等の遺伝的に操作されたT細胞も指す場合がある。T細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化する場合もある。
【０１４６】
本明細書において使用される場合、用語「ナイーブT細胞」又はTnは、活性化又はメモリーT細胞とは異なり、末梢でそれらの同族抗原と遭遇していない成熟T細胞を指す。ナイーブT細胞は、L-セレクチン(CD62L)の表面発現;活性化マーカーCD25、CD44又はCD69の非存在;及びメモリーCD45ROアイソフォームの非存在によって一般に特徴付けられる。それらは、サブユニットIL-7受容体-a、CD 127及び共通-γ鎖、CD 132からなる機能性IL-7受容体も発現する。ナイーブ状態では、T細胞は、静止状態及び非分裂性で、ホメオスタシス生存機構のために共通ガンマ鎖サイトカインIL-7及びIL-15を必要とすると考えられている。
【０１４７】
本明細書において使用される場合、用語「NK細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」は、CD56又はCD16の発現及びT細胞受容体(CD3)の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。
【０１４８】
本明細書において使用される場合、用語「セントラルメモリーT細胞」又はTcmは、エフェクターメモリーT細胞又はTernと比較して、低い発現又はアポトーシス促進性シグナル伝達遺伝子、例えば、Bid、Bnip3及びBadを有し、二次リンパ系器官への輸送に関連する遺伝子、CD62L、CXCR3、CCR7を含む、の高い発現を有する、T細胞のサブグループ又は亜集団を指す。
【０１４９】
本明細書において使用される場合、用語「ステムメモリーT細胞(stem memory T cell)」又は「幹細胞メモリーT細胞」又はTscmは自己再生でき、Tcm、Tern及びTeff(エフェクターT細胞)を生成でき、長期間の免疫を調節するために重要な特性であるCD27並びにCCR7及びCD62L等のリンパ系ホーミング分子を発現する、T細胞のサブグループ又は亜集団を指す。本明細書において使用される場合、用語「NK細胞」又は「ナチュラルキラー細胞」は、CD56又はCD16の発現及びT細胞受容体(CD3)の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書において使用される場合、用語「適応NK細胞」及び「メモリーNK細胞」は、互換的であり、表現型的にCD3-及びCD56+であり、CD57+、NKG2C及びCD57の少なくとも1つ並びに任意選択でCD16を発現し、有するが、次の: +、低PLZF、低SYK、FceRy及び低FcsRy、低EAT-2、低TIGIT、低PD1、低CD7、低CD161、高LILRB1、高CD45RO及び低CD45RAの1つ又は複数の発現を欠いているNK細胞のサブセットを指す。一部の実施形態では、CD56+ NK細胞の単離された亜集団は、NKG2C及びCD57の発現を有する。一部の他の実施形態では、CD56+ NK細胞の単離された亜集団は、CD57、CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCRリガンド、NKp30、NKp40、NKp46、活性化及び抑制性KIR、NKG2A並びに/又はDNAM-1の発現を含む。CD56+は、かすかな又は鮮やかな発現である場合がある。
【０１５０】
本明細書において使用される場合、用語「NKT細胞」又は「ナチュラルキラーT細胞」は、T細胞受容体(TCR)を発現するCD ld拘束性(CD ld-restricted)T細胞を指す。従来の主要組織適合性(MHC)分子によって示されるペプチド抗原を検出する従来のT細胞とは異なり、NKT細胞は、CD ld、非古典的MHC分子によって示される脂質抗原を認識する。2種類のNKT細胞が現在認識されている。インバリアントな、又はI型NKT細胞は、非常に限定されたTCRレパートリー-古典的a-鎖(Va24- Jal 8、ヒトにおいて)を限定されたスペクトラムのβ鎖(ΛiβI 1、ヒトにおいて)と共に発現する。非古典的又は非インバリアントII型NKT細胞と呼ばれるNKT細胞の第2の集団は、更に不均一なTCR αβ使用を示す。I型NKT細胞は、免疫療法のために好適と現在考えられている。適応又はインバリアント(I型)NKT細胞は、次のマーカー、TCR Va24-Jal 8、Vbl l、CDl d、CD3、CD4、CD8、aGalCer、CD 161及びCD56の少なくとも1つ又は複数の発現を用いて同定され得る。
【０１５１】
本明細書において使用される場合、用語「単離された」等は、元の環境からから分離された細胞又は細胞の集団を指す、すなわち、単離された細胞の環境は、「単離されていない」参照細胞が存在する環境において見出される少なくとも1つの構成成分を実質的に含まない。用語は、天然環境、例えば、組織、生検において見出される一部の又はすべての構成成分から除外されている細胞を含む。用語は、細胞が天然に存在しない環境、例えば培養物、細胞懸濁物において見出される場合、少なくとも1つ、一部又はすべての構成成分から除外されている細胞も含む。したがって、単離された細胞は、それが天然において見出された場合の、又は天然に存在しない環境において増殖、保存又は存在した場合の、他の物質、細胞又は細胞集団を含む少なくとも1つの構成成分から部分的に又は完全に分離されている。単離された細胞の具体的な例として、部分的に純粋な細胞、実質的に純粋な細胞及び天然に存在しない培地において培養された細胞が挙げられる。単離された細胞は、所望の細胞若しくはその集団を環境中の他の物質若しくは細胞から分離することによって、又は環境由来の1つ若しくは複数の他の細胞集団若しくは亜集団から除外することによって得ることができる。本明細書において使用される場合、用語「精製」等は、純度を増加させることを指す。例えば、純度は、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%又は100%に増加され得る。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、用語「集団」は、T、NK又はNKT細胞を参照して使用される場合、T、NK又はNKT細胞の2つ以上をそれぞれ含む細胞の群を指す。例としてT細胞を使用すると、単離された又は濃縮されたT細胞の集団は1種類だけのT細胞を含む場合がある、又は2種類以上のT細胞の混合物で含む場合がある。T細胞の単離された集団は、1種類のT細胞の均一な集団、又は2種類以上のT細胞の不均一な集団である場合がある。T細胞の単離された集団は、T細胞及び少なくともT細胞以外の細胞、例えばB細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等を有する不均一な集団である場合もある。不均一な集団は、.01%から約100%T細胞を有する場合がある。したがって、T細胞の単離された集団は、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%又は99%T細胞を有し得る。T細胞の単離された集団は、これだけに限らないが本明細書において開示されている1つ若しくは複数又はすべての異なる種類のT細胞を含み得る。1つより多い種類のT細胞を含むT細胞の単離された集団では、各種類のT細胞の割合は、0.01%から99.99%の範囲であり得る。単離された集団は、集団のすべてのT細胞が単一のT細胞のクローンであるT細胞のクローン集団である場合もある。
【０１５３】
T、NK又はNKT細胞の単離された集団は、ヒト末梢血又は臍帯血等の天然の供給源から得ることができる。種々の細胞型を分離するために組織又は細胞混合物から細胞を分離するための種々の方法は、当技術分野において開発されている。一部の場合では、これらの操作は、細胞の比較的均一な集団をもたらす。T細胞は、本明細書に記載される選別若しくは選択プロセスによって、又は当技術分野において公知の他の方法によって単離され得る。単離された集団中のT細胞の割合は、天然供給源中のT細胞の割合よりも少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%又は約95%高い場合がある。T細胞の単離された集団は、T細胞全般又は1つ若しくは複数の特定の種類のT細胞についてである場合がある。
【０１５４】
本明細書において使用される場合、用語「亜集団」は、T、NK又はNKT細胞を参照して使用される場合、それぞれ天然で見出されるT、NK又はNKT細胞のすべての種類は含まないT、NK又はNKT細胞の集団を指す。
【０１５５】
細胞ベースの養子免疫療法の有効性を改善するための薬剤
本発明は、養子細胞ベースの治療のために好適な免疫細胞の治療可能性を改善するために十分な量の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤を含む組成物を提供する。治療可能性の改善を有する免疫細胞は、増殖(proliferation)、残留性、細胞傷害性及び/又は細胞リコール/メモリーの改善を示した。免疫細胞は、in vivo増殖(proliferation)、in vivo残留性、in vivo細胞傷害性、及び/又はin vivo細胞リコール/メモリーが明確に改善され得る。免疫細胞療法可能性を改善するためには、免疫細胞の良好な品質が一般に必要であり、T細胞集団中では、例えば、その維持、拡大(expansion)、分化、及び/又は脱分化を通じたナイーブT細胞、幹細胞メモリーT細胞及び/又はセントラルメモリーT細胞の数又は割合の増加がin vivo養子治療可能性の改善のためのT細胞の良好な品質の指標である。NK細胞集団では、例えば、その維持、サブタイプスキューイング(skewing)、拡大、分化及び/又は脱分化を通じた適応NK細胞の数又は割合の増加はin vivo養子治療可能性の改善のためのNK細胞の良好な品質の指標である。NKT細胞集団に関して、例えば、その維持、サブタイプスイッチング、拡大、分化及び/又は脱分化を通じたI型NKT細胞の数又は割合の増加は、in vivo養子治療可能性の改善のためのNKT細胞の良好な品質の指標である。
【０１５６】
養子細胞ベースの治療のために好適な免疫細胞は、上に定義される1つ又は複数のグリコシル化阻害剤を用いて接触、処置又は調節される。薬剤を用いた処置は、細胞拡大、維持、分化、脱分化及び/若しくは生存率を調節することによって、並びに/又は増殖(proliferation)、細胞傷害性、残留性及び/若しくは細胞リコール/メモリーを増加させることによって、細胞又は細胞の亜集団の生物学的特性を及びそれにより処置される細胞の治療可能性を変更できる。例えば、処置は、治療用免疫細胞生存率をin vitro及びin vivoの両方で改善できる。更に処置は、処置された細胞集団のさまざまな亜集団の比を変更できる。例えば、一実施形態では、ナイーブT細胞、幹細胞メモリーT細胞及び/又はセントラルメモリーT細胞の数及び割合は、上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤並びにその誘導体及び類似物の1つ又は複数を使用する処置で、単離されたT細胞集団において増加している。別の実施形態では、上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤の1つ又は複数並びにその誘導体及び類似物を使用するNK細胞集団の処置で、適応NK細胞の数及び百分率は、集団において増加している。
【０１５７】
理論に束縛されることなく、上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤は、細胞代謝、栄養素センシング(nutrient sensing)、増殖(proliferation)、アポトーシス、シグナル伝達、感染プロセスに関する特性、及び/又は細機能の他の態様を制御することを介して細胞拡大、代謝及び/又は細胞分化を調節することによって、養子治療のための免疫細胞の治療可能性を改善する。当業者によって理解される通り、本発明の範囲は、これだけに限らないが、上に定義される本発明の列挙されたグリコシル化阻害剤の塩、エステル、エーテル、溶媒和物、水和物、立体異性体又はプロドラッグを含む類似物又は誘導体を含む。
【０１５８】
本明細書において使用される場合、組合せでの2つ以上の実体が互いの効果を相殺する又は中和する場合に使用される「アンタゴニスト的」と比較して;及び組合せでの2つ以上の実体がそれらの個々の効果の合計とほとんど等しい効果を生じる場合に使用される「相加的」と比較して、用語「相乗作用」又は「相乗的」は、2つ以上の実体が一緒に作用して、それらの個々の効果の合計よりも大きな効果を生じるような増強された効果についての2つ以上の実態の組合せを指す。
【０１５９】
本発明は、上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤に接触させた免疫細胞の単離された集団又は亜集団を含む組成物を提供する。一実施形態では、免疫細胞の単離された集団又は亜集団は、免疫細胞の治療可能性を改善するために十分な量の上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤に接触させた。一部の実施形態では、処置された免疫細胞は、細胞ベースの養子治療において使用される。本発明は、免疫細胞の集団又は亜集団及び上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤から選択される1つ又は複数のグリコシル化阻害剤を更に提供し、ここで、上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤から選択される1つ又は複数のグリコシル化阻害剤を使用する免疫細胞の集団又は亜集団の処置は、養子治療のための免疫細胞の治療可能性を改善する。処置は、細胞増殖(proliferation)、細胞傷害性及び残留性を改善する、並びに/又は細胞療法の再発率を低減するように免疫細胞の生物学的特性を変更できる。
【０１６０】
一部の実施形態では、免疫細胞の集団はT細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、NK細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、NKT細胞を含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤に接触させたT細胞の集団又は亜集団は、同じ処置を受けていないT細胞と比較して、ナイーブT細胞(Tn)、幹細胞メモリーT細胞(Tscm)及び/若しくはセントラルメモリーT細胞(Tcm)の数若しくは割合が増加、並びに/又は細胞増殖(proliferation)、細胞傷害性、細胞リコール及び/若しくは残留性が改善している。一部の実施形態では、上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤を用いた同じ処置を受けていない細胞集団中のTn、Tscm、及び/又はTcmの数と比較して、Tn、Tscm、及び/若しくはTcmの数は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%増加している、又は少なくとも5、10、15若しくは20倍増加している。
【０１６２】
一部の実施形態では、上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤に接触させたNK細胞の集団又は亜集団は、同じ処置を受けていないNK細胞と比較して、適応(若しくはメモリー)NK細胞の数若しくは割合の増加並びに/又は、細胞増殖(proliferation)、細胞傷害性、細胞リコール及び/若しくは残留性が改善している。一部の実施形態では、上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤を用いた同じ処置を受けていない細胞集団中の適応NK細胞の数と比較して、適応NK細胞の数は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%増加している、又は少なくとも5、10、15若しくは20倍増加している。
【０１６３】
一部の実施形態では、T、NK又はNKT細胞の集団又は亜集団は、挿入、欠失又は核酸置換を含んで遺伝的に操作される。改変された免疫細胞はサイトカイン導入遺伝子を発現する、抑制性受容体が発現抑制される;又は免疫細胞を再標的化するために活性化受容体若しくはCARを過発現し得る。一部の実施形態では、対象若しくはドナーから調節のために単離された、又は対象/ドナーの末梢血、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍から単離された若しくはそれに含まれた免疫細胞の集団は、遺伝的に改変され得る。一部の実施形態では、免疫細胞の単離された集団は、遺伝的に操作され、挿入、欠失及び/又は核酸置換を含む。一部の具体的な実施形態では、免疫細胞は、T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、をコードする外来性核酸及び/又はCD 16若しくはその変種の過発現を含む。
【０１６４】
本発明は、養子細胞ベースの治療のために好適な免疫細胞の集団又は亜集団を調節する方法を提供し、方法は、上に定義される本発明の少なくとも1つの薬剤を含む組成物に免疫細胞を接触させることを含む。
【０１６５】
一実施形態では、養子細胞ベースの治療のために好適な免疫細胞の集団又は亜集団を調節する方法は、上に定義される本発明の少なくとも1つのグリコシル化阻害剤を含む組成物に免疫細胞を接触させることを含み、ここで、接触させた免疫細胞は、上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤に接触させていない免疫細胞と比較して、細胞拡大が増加、1つ若しくは複数の所望の細胞亜集団の数若しくは割合が増加、並びに/又は増殖(proliferation)、細胞傷害性、細胞リコール及び/若しくは残留性が改善されている。
【０１６６】
一部の実施形態では、養子細胞ベースの治療のために好適な免疫細胞の集団又は亜集団を調節する方法は、上に定義される本発明の少なくとも1つのグリコシル化阻害剤を含む組成物を免疫細胞に接触させることを含み、ここで、細胞の1つ又は複数の所望の亜集団の維持及び拡大は、上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤に接触させていない免疫細胞と比較して、改善されている。
【０１６７】
一部の実施形態では、養子細胞ベースの治療のために好適な免疫細胞の集団又は亜集団を調節する方法は、上に定義される本発明の少なくとも1つの薬剤を含む組成物を免疫細胞に接触させることを含み、ここで、分化の望ましい状態に初期化された集団中の免疫細胞の数又は割合は、上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤に接触させていない免疫細胞と比較して、増加している。
【０１６８】
一部の実施形態では、養子細胞ベースの治療のために好適な免疫細胞の集団又は亜集団を調節する方法は、上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤に接触させていない免疫細胞と比較して、細胞拡大を増加させる、1つ又は複数の所望の免疫細胞亜集団の数若しくは割合を増加させる、並びに/又は免疫細胞の増殖(proliferation)、細胞傷害性、細胞リコール及び/若しくは残留性を改善するために十分な量で、上に定義される本発明の少なくとも1つのグリコシル化阻害剤を含む組成物に免疫細胞を接触させることを含む。一実施形態では、免疫細胞処置のための薬剤は、約0.1nMから約50μΜの間である。一実施形態では、免疫細胞処置のための薬剤は、約0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、500nM、1μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ若しくは25μΜ又はその間の任意の濃度である。一実施形態では、免疫細胞処置のための薬剤は、約0.1nMから約5nMの間である、約1nMから約100nMの間である、約50nMから約250nMの間、約100nMから約500nMの間、約250nMから約1μΜの間、約500nMから約5μΜの間、約3μΜから約10μΜの間、約5μΜから約15μΜの間、約12μΜから約20μΜの間又は約18μΜから約25μΜの間である。
【０１６９】
一部の実施形態では、養子細胞ベースの治療のために好適な免疫細胞の集団又は亜集団を調節する方法は、上に定義される本発明のグリコシル化阻害剤に接触させていない免疫細胞と比較して、細胞拡大を増加させる、1つ又は複数の所望の免疫細胞亜集団の数若しくは割合を増加させる、並びに/又は免疫細胞の増殖(proliferation)、細胞傷害性、細胞リコール及び/若しくは残留性を改善するために十分な期間で、上に定義される本発明の少なくとも1つのグリコシル化阻害剤を含む組成物に免疫細胞を接触させることを含む。一実施形態では、免疫細胞は、上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤に、少なくとも10分間、30分間、1時間、2時間、5時間、12時間、16時間、18時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、15日、20日、25日、30日又はその間の任意の期間接触させる。一実施形態では、免疫細胞は上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤に約0.5時間から約2時間の間、約1時間から約12時間の間、約10時間から約2日の間、約1日から約3日の間、約2日から約5日の間、約3日から約6日の間、約5日から約8日の間、約7日から約14日の間、約12日から約22日の間、約14日から25日の間、約20日から約30日の間、接触させる。一部の実施形態では、免疫細胞は、上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤に16時間、14時間、12時間、10時間、8時間、6時間、4時間、2時間未満又はその間の任意の期間接触させる。このように、前記十分な期間は、例えば、15、13、11、9、7、5、3又は1時間未満である。方法の一部の他の実施形態では、前記十分な期間は、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間未満又はその間の任意の期間である。このように前記十分な期間は、例えば、30、42、54、66、78、90時間未満である。
【０１７０】
免疫細胞を上に定義される本発明の少なくとも1つのグリコシル化阻害剤を含む組成物に接触させることを含む、養子細胞ベースの治療のために好適な免疫細胞の集団又は亜集団を調節する方法は、接触後に免疫細胞から1つ又は複数の所望の亜集団を濃縮又は単離することを更に含む場合があり、ここで1つ又は複数の所望の亜集団は、ナイーブT細胞、幹細胞メモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞、適応NK細胞及びI型NKT細胞からなる群から選択される。
【０１７１】
一部の他の実施形態では、調節のための単離された免疫細胞は、遺伝的に改変されている(遺伝的に操作される、又は再構成、変異、遺伝的インプリンティング及び/若しくはエピジェネティック修飾から天然に由来する)。一部の実施形態では、調節のための単離された免疫細胞は、少なくとも1つの遺伝的に改変された様相(modality)を有する。一部の実施形態では、免疫細胞の単離された集団は、ゲノム的に操作されており、挿入、欠失、及び/又は核酸置換を含む。一部の具体的な実施形態では、免疫細胞は、T細胞受容体(TCR)、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする外来性核酸、及び/又はCD 16若しくはその変種の過発現を含む。このように遺伝的に改変された免疫細胞は、開示される本組成物及び方法を使用するex vivo調節のために単離される。一部の実施形態では、調節後、対象から単離された遺伝的に改変された免疫細胞は、同じドナー又は異なる患者に投与されてよい。一部の実施形態では、調節のためのドナー由来免疫細胞は、T細胞受容体(TCR)及び/又はキメラ抗原受容体(CAR)をコードする外来性核酸を含む。
【０１７２】
本発明は、細胞ベースの養子治療において使用される場合に免疫細胞の治療可能性を改善するために十分な量の、上に定義される本発明の1つ又は複数のグリコシル化阻害剤に接触させた、免疫細胞の単離された集団又は亜集団を含む組成物を提供する。
【０１７３】
種々の疾患は、本発明の細胞を養子細胞療法に好適な対象に導入することによって回復され得る。疾患の例は、これだけに限らないが、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病(1型)、若年性特発性関節炎の一部の形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎の一部の形態、多発性硬化症、天疱瘡/類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症/全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性ループス、エリテマトーデス、甲状腺炎の一部の形態、ぶどう膜炎の一部の形態、白斑、多発血管炎性肉芽腫症(ウェゲナー)を含む種々の自己免疫性障害;これだけに限らないが、急性及び慢性白血病(leukaemia)、リンパ腫、多発性骨髄腫並びに骨髄異形成症候群を含む血液学的悪性疾患;これだけに限らないが、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭部、頸部、胃、子宮頸部、直腸、喉頭又は食道の腫瘍を含む固形腫瘍;並びにこれだけに限らないが、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)、RSV(呼吸器多核体ウイルス)、EBV(エプスタイン・バーウイルス)、CMV(サイトメガロウイルス)、HBV、HCV、アデノウイルス及びBKポリオーマウイルス関連障害を含む感染症、を含む。
【０１７４】
本明細書に記載の任意の方法及び組成物の実施形態では、がんは、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌、小腸のがん、食道のがん、メラノーマ、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内の悪性メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児の固形腫瘍、膀胱のがん、腎臓若しくは尿管のがん、腎盂の癌、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮細胞がん、T細胞リンパ腫、環境誘発性がん、前記がんの組合せ及び前記がんの転移性病変、からなる群から選択される固形がんである。
【０１７５】
本明細書に記載される任意の方法及び組成物の実施形態では、がんは、慢性リンパ球性白血病(leukaemia)(CLL)、急性白血病(leukaemia)、急性リンパ性白血病(leukaemia)(ALL)、B細胞急性リンパ性白血病(leukaemia)(B-ALL)、T細胞急性リンパ性白血病(leukaemia)(T-ALL)、慢性骨髄性白血病(leukaemia) (CML)、B細胞前リンパ球性白血病(leukaemia)、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病(leukaemia)、小細胞又は大細胞型濾胞リンパ腫、悪性リンパ球増殖性状態、MALTリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質細胞様リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症又は前白血病の1つ又は複数から選択される血液学的がんである。
【０１７６】
本発明は、以下の図を参照して非限定的例によって示される。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】腫瘍細胞でのO-グリコシル化は、CD44v6 CAR-T細胞による認識を妨害することを示す図である。a、K562対照と比較した変異Jurkat試料由来Cosmc増副産物のDNA配列決定。b、左:生成されたJurkatモデル細胞株の模式図。c、CD44v6 CAR-T細胞(44v6.28z)又は対照CD19 CAR-T細胞(19.28z)は、グリコシル化コンピテント(44v6+/Cosmc+)又はインコンピテント(44v6+/Cosmc-)Jurkat細胞を用いて、1:5、1:10、1:25のエフェクター対標的比(E:T)で培養された。4日後、標的細胞死滅は、FACSによって分析され、除去指数(elimination index)[1-(44v6.28z CAR-T細胞を用いた残存腫瘍細胞の数/19.28z CAR-T細胞を用いた残存腫瘍細胞の数)]として表された。左:代表的なドナー由来のFACSプロット。右:n=3ドナーから得られたデータ(平均±  SEM)。二元配置ANOVAからの結果は、統計的に有意な場合に示されている(***P <0.001; ****P<0.0001)。
【図２】腫瘍細胞でのN-グリコシル化は、CD44v6 CAR-T細胞による認識を妨害することを示す図である。N-グリコシル化は、グリコシルトランスフェラーゼMgat5の発現をノックアウトすることによってT3M4膵臓腺癌細胞株において妨害され、グリコ表現型は、PHA-L染色によって評価された。a、生成されたモデルT3M4膵臓腺癌細胞株の模式図(PDAC)。b、c、複合N-グリカンに結合するPHA-Lを用いた、及びCARの標的抗原CD44v6を用いたwt(N-グリコシル化コンピテント)又はMgat5 ko(N-グリコシル化欠損)T3M4腫瘍の染色、d、e、CD44v6 CAR-T細胞(44v6.28z)は、wt若しくはMgat5 koを用いて、又はツニカマイシン処置(100ng/ml、48時間)T3M4腫瘍を用いてチャレンジされた。4日後、死滅は除去指数(d)及びCD69上方制御としてのT細胞活性化(e)として表された。一元配置ANOVAは、統計解析(*P<0.05; **P<0.01)のために使用された。f、CD44v6 CAR T細胞(44v6.28z)によるIFNγ及びTNFαの産生は、wt又はMgat5 ko膵臓腫瘍細胞のいずれかを用いた刺激の24時間後に測定された。二元配置ANOVAを統計解析のために使用した(*P<0.05; **P<0.01; ****P<0.0001)。
【図３】Mgat5 ko腫瘍は、エフェクター細胞において強いNFAT及びNF-kB活性化を誘導することを示す図である。Jurkat三重レポーター細胞は、CAR T構築物を用いて形質導入され、wt(N-グリコシル化構成成分)又はMgat5 ko(N-グリコシル化欠損(N-glycosylation deficient))T3M4膵臓腫瘍細胞株を用いて刺激された。a、生成されたJurkat-CAR+三重レポーター(TPR)細胞株の模式図。b、Jurkat-CAR+レポーター細胞の経時的活性化。NFAT及びNF-kB活性化は、eGFP及びCFPシグナルそれぞれの百分率を測定することによって評価された。二元配置ANOVAは、統計解析のために使用された(*P<0.05; **P<0.01; ****P<0.0001)。
【図４】2DGは、膵臓腫瘍細胞においてそれらの生存及び増殖(proliferation)に直接影響することなくN-グリコシル化を阻害することを示す図である。a、b、T3M4膵臓腫瘍細胞は、Mgat5 ko(N-グリコシル化欠損(N-glycosylation deficient))細胞と比較してグリコシル化状態を分析される前に4mMの2DGで48時間処置された。a、対照Mgat5 ko細胞と比較した2DG処置細胞の糖表現型を示すPHA-L染色。一元配置ANOVAは、統計解析(****P<0.0001)のために使用された。b、未処置(無(nihil))或いは2DGの増加性の用量(4mM若しくは16mM)又は対照ツニカマイシン(Tunica、100ng/ml)を用いて48時間処置した後、のいずれかの腫瘍の全細胞可溶化物中のβ1インテグリン及びCD44v6グリコシル化の分析。c、d、腫瘍細胞は、処置の洗浄除去前に、4mM 2DGを用いて48時間まで処置された。腫瘍脱グリコシル化(c)及びグリコシル化(d)の動態は、PHA-L染色によって評価された。一元配置ANOVAは、統計解析(****P<0.0001)のために使用された。e、f、2DGの増加性の濃度を用いて48時間処置された腫瘍細胞の用量応答。N-グリコシル化機能障害は、PHA-L染色(e)及び乳酸産生による解糖検査(f)によって決定された。二元配置ANOVAは、統計解析(*P<0.05; **P<0.01; ****P<0.0001)のために使用された。腫瘍生存率(g)及び増殖(proliferation)(h)は、4mM 2DG、48時間を用いた処置の後に分析され、それぞれ7AADpos細胞の百分率及びCFSE希釈の百分率として表された。
【図５】低用量の2DGを用いてグリコシル化を遮断することは、表面抗原発現を障害しないことを示す図である。T3M4膵臓腫瘍細胞は、抗原発現及び細胞適応度を分析する前に4mMの2DGを用いて48時間処置された。a、2DGを用いた、又はN-グリカンを切断する対照PNGaseを用いた処置後の細胞外脱グリコシルβ1インテグリン及びCD44v6のビオチン濃縮アッセイ。未処置腫瘍細胞(無)は、対照として示されている。b、未処置又は4mM 2DGを用いて48時間処置された腫瘍におけるβ1インテグリン及びCD44v6の細胞外発現。
【図６】2DGは、CD44v6 CAR-T細胞による腫瘍認識及び死滅を増加させることを示す図である。(a、b)CD44v6pos T3M4(a)及びPT45膵臓腫瘍細胞(b)は、CD44v6 CAR-T細胞(44v6.28z)又は対照CD19 CAR-T細胞(19.28z)のいずれかと同時培養される前に4mM 2DGに48時間曝露された。翌日、腫瘍細胞死滅はFACSによって分析され、除去指数として表された。左:代表的なドナー由来のFACSプロット。中央:1:10のエフェクター対標的の比(E:T比)での除去指数。右:n=3のドナーから得られたデータ(平均±SEM)。一元配置ANOVAからの結果は統計的に有意(*、P≦0.05; ***、P≦0.001)な場合に示されている。c、未処置(無)又は4mM 2DG、48時間を用いて処置されたT3M4腫瘍のいずれかを用いて刺激されたJurkat-CAR+レポーター細胞の経時的活性化。NFAT及びNF-kB活性化は、eGFP及びCFPシグナルの百分率をそれぞれ測定することによって評価された。二元配置ANOVAは、統計解析(****P<0.0001)のために使用された。
【図７】2DGは、健康な細胞を脱グリコシル化せず、死滅も増加させなかったことを示す図である。a、b、新鮮バフィーコート細胞は、PHA-L染色による細胞グリコシル化(a)及び7aad-アネキシンV染色による生存率(b)の分析の前に培地単独(無)又は4mM 2DGに18時間のいずれかに曝露された。c、d、初代ケラチノサイトは、ウエスタンブロットによって分析される又はCD44v6 CAR-T細胞(44v6.28z)と同時培養される前に2DGに48時間曝露された。c、未処置(無)又は2DGを用いて、若しくはN-グリコシル化部位を切断する対照PNGaseを用いて処置された初代ケラチノサイトにおける、細胞外β1インテグリン及びCD44v6のビオチン濃縮アッセイ。d、未処置又は2DGを用いて処置された、初代ケラチノサイトのCD44v6 CAR T細胞(44v6.28z)によるin vitro死滅。死滅は、対照CD19 CAR-T細胞(19.28z)と比較された除去指数として表された。
【図８】2DGがin vivoでCD44v6 CAR-T細胞による膵臓腫瘍の認識及び死滅を増加させることを示す図である。NSGマウスは、分泌ルシフェラーゼを発現するT3M4腺癌細胞0.1x106個を膵臓内に注射された。a、c、腫瘍負荷が低かった場合、腫瘍移植から2及び3日目に、マウスは、500mg/kg 2DGを腹腔内(i.p.)に注射された。3日目に、マウスは、CD44v6(44v6.28z)又は対照としてCD19(19.28z)CAR T細胞のいずれか5x105個を静脈内(i.v.)に注入された。腫瘍負荷は、分泌ルシフェラーゼを測定することによってモニターされ、二元配置ANOVAは、統計解析のために使用された(**P<0.01; ***P<0.001)。b、d、腫瘍負荷が高かった場合、腫瘍移植から6及び7日目に、マウスは、500mg/kg 2DGを腹腔内(i.p.)に注射された。7日目にマウスは、CD44v6(44v6.28z)又は対象としてCD19(19.28z)CAR T細胞のいずれか5x105個を静脈内(i.v.)に注入された。腫瘍負荷は、分泌ルシフェラーゼを測定することによってモニターされ、二元配置ANOVAは統計解析(**P<0.01)のために使用された。
【図９】2DGがCEA CAR-T細胞による腫瘍認識及び死滅を増加させることを示す図である。a、b、CEA CAR-T細胞(CEA.28z)又は対照CD19 CAR T細胞(19.28z)は、wt(N-グリコシル化コンピテント)又はMgat5 ko(N-グリコシル化欠損(N-glycosylation deficient))T3M4膵臓腫瘍細胞のいずれかを用いてチャレンジされた。4日後、腫瘍死滅は、FACSによって分析され、除去指数(a)及びCD69上方制御としてのT細胞活性化(b)として表された。t検定は、統計解析(*P<0.05)のために使用された。c、未処置(無)又は2DG-処置T3M4膵臓腫瘍のいずれかを用いて刺激されたJurkat-CAR+レポーター細胞の経時的活性化。NFAT及びNF-kB活性化は、eGFP及びCFPシグナルの百分率をそれぞれ測定することによって評価された。二元配置ANOVAは、統計解析のために使用された(**P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001)。d〜f、CEA- PT45(d)、CEA+ BxPc3(e)及びT3M4(f)細胞は、CEA CAR-T細胞(CEA.28z)と又は対照CD19 CAR-T細胞(19.28z)と同時培養される前に4mM 2DGに48時間曝露された。4日後、腫瘍死滅はFACSによって分析され、除去指数として表された。左:1:10のE:T比での除去指数。右:n=3ドナーから得られたデータ(平均±SEM)。一元配置ANOVAからの結果は、統計的に有意(*、P≦0.05; **、P≦0.01; ***、P≦0.001)な場合に示されている。g、未処置(無)又は4mM 2DGを用いて処置のいずれかのT3M4膵臓腫瘍と同時培養されたCEA CAR T細胞(CEA.28z)の活性化は、96時間でCD69上方制御によって測定された。t検定は、統計解析のために使用された(**、P≦0.01)。h、未処置(無)又は4mM 2DG、48時間処置のいずれかのT3M4膵臓腫瘍細胞を用いて刺激されたJurkat-CAR+レポーター細胞の経時的活性化。i、CEA CART細胞(CEA.28z)によるIFNγ産生は、未処置(無)又は2DG処置膵臓腫瘍細胞のいずれかを用いた刺激の24時間後に測定された。二元配置ANOVAは、統計解析のために使用された(*P<0.05)。
【図１０】複合N-グリカンがいくつかの上皮癌によって発現されることを示す図である。a、膵臓、肺、乳房及び膀胱の腫瘍由来の細胞株でのPHA-L、CD44v6及びCEA発現のヒートマップ。b、PHA-L(左)又はCD44v6(右)の発現と44v6.28z CAR T細胞による1:10 E:Tでのin vitro腫瘍死滅との相関分析。c、CD44v6+ 5637、H1975及びPC9細胞はCD44v6.28z CAR-T細胞又は対照19.28z CAR-T細胞との同時培養の前に4mM 2DGに48時間曝露された。腫瘍死滅は、FACSによって分析され、除去指数として表された。二元配置ANOVAからの結果は、統計的に有意(*P<0.05)な場合に示されている。
【図１１】複合N-グリカンがいくつかの血液学的腫瘍によって発現されることを示す図である。a、急性骨髄性白血病(leukaemia)(AML)、多発性骨髄腫(MM)、慢性骨髄性白血病(leukaemia)(CML)、急性リンパ芽球性白血病(leukaemia)(ALL)及びリンパ腫由来の細胞株でのPHA-L、CD44v6及びCD19発現のヒートマップ。
【発明を実施するための形態】
【０１７８】
材料及び方法
形質導入及び培養条件
健常ドナー由来T細胞の活性化は、抗CD3/CD28イムノコンジュゲート磁気ビーズ(bCD3/CD28)(ClinExvivo CD3/CD28; Invitrogen社)を用いて製造者の説明書に従って実施された。T細胞は、2ラウンドのスピノキュレーション(spinoculation)によってRV-形質導入された、又は一晩のインキュベーションによってLV-形質導入され、IL-7及びIL-15(5ng/mL; Peprotech社)を含むRPMI 1640(Gibco-Brl社)、ウシ胎児血清(10%、BioWhittaker)中で培養された。CAR形質導入効率及び選別は、プロテイン質-L(Thermo Scientific社)染色によって製造者の説明書に従って実施された。表現型分析及び機能検査は、刺激後21日目に実施された。腫瘍細胞は、一晩インキュベーションによってLV-形質導入され、マーカー遺伝子を用いてFACS-選別された。血液学的腫瘍、膀胱がん及び肺がん細胞は、RPMI 1640(Gibco-Brl社)中で培養され、一方、膵臓腫瘍細胞は、IMDM(Gibco-Brl社)中で培養された。T細胞及び腫瘍細胞の増殖のためのすべての培地は、ペニシリン(100UI/ml; Pharmacia社)、ストレプトマイシン(100UI/ml; Bristol-Meyers Squibb社)、グルタミン(2mM; Gibco)及びウシ胎児血清(10%、BioWhittaker)が補充された。XG-6及びXG-7細胞は、IL-6(2ng/ml、Peprotech社)が添加されて培養された。初代ケラチノサイトは、Lonza社(LO192627)から購入され、Epi-Life(Invitrogen社、M-EPI-500-CA)中でヒトケラチノサイト増殖補助剤(Invitrogen社、S-001-5)を用いて製造者の説明書に従って培養された。
【０１７９】
Cosmc PCR及び配列決定
Jurkat及びK562細胞からの全ゲノムDNAは、QIAamp DNA mini kit(Qiagen社)を使用して単離された。Cosmc遺伝子PCRについて、フォワードプライマーは、5'-CTCCATAGAGGAGTTGTTGC-3'(配列番号1)であり、リバースプライマーは、5'-TCACGCTTTTCTACCACTTC-3'(配列番号2)であった。予測される1,218-bp PCRバンド産物は、アガロースゲルで分析、抽出及び配列決定された。
【０１８０】
レトロウイルス及びレンチウイルス構築物
Cosmcレンチウイルス(LV)発現ベクターを生成するために、DNA配列は、GeneArt(ThermoFisher社)によって合成され、自己不活性化LVベクターに、CD44v6又はCosmc分子及びマーカー遺伝子NGFR又はeGFPの共発現をそれぞれ駆動するPGK双方向性プロモーターを用いてクローニングされた。本発明者らは、CD44v6、CEA、CD19 CAR構築物を特異的scFvs CD44v6、BIWA8 mAb; CEA、BW431-26 mAb; CD19、FMC63 mAb)をIgG1-由来ヒンジスペーサー、CD28共刺激エンドドメイン及びTCRゼータ鎖を保有するCAR骨格にクローニングすることによって生成した。すべてのCAR構築物は、ウイルスベクター及び293T細胞において産生された上清に発現された。レトロウイルスベクターは、Casucci Mら、Blood. 2013年11月14日;122(20):3392頁に記載の通り使用され、一方レンチウイルスベクターは、Amendola Mら、Nat Biotechnol 2005年1月;23(1) :108〜16頁に記載の通り使用された。CD44v6レンチウイルス発現ベクター及び分泌ルシフェラーゼ発現ベクターの両方は、以前記載の通り使用された(Norelliら、Nat Med 2018年、24、739〜748頁; Bondanza及びCasucci、Methods in molecular biology 1393、Tumor immunology methods and protocols、10章)。
【０１８１】
生成され、ウイルスベクター骨格にクローニングされたすべての配列は、下に列挙されている。
【０１８２】
COSMC配列(配列番号3):MLSESSSFLKGVMLGSIFCALITMLGHIRIGHGNRMHHHEHHHLQAPNKEDILKISEDERMELSKSFRVYCIILVKPKDVSLWAAVKETWTKHCDKAEFFSSENVKVFESINMDTNDMWLMMRKAYKYAFDKYRDQYNWFFLARPTTFAIIENLKYFLLKKDPSQPFYLGHTIKSGDLEYVGMEGGIVLSVESMKRLNSLLNIPEKCPEQGGMIWKISEDKQLAVCLKYAGVFAENAEDADGKDVFNTKSVGLSIKEAMTYHPNQVVEGCCSDMAVTFNGLTPNQMHVMMYGVYRLRAFGHIFNDALVFLPPNGSDND
【０１８３】
CD19-scFv(FMC63)配列(配列番号4):
【０１８４】
【化５】
2021532125.tif 000010
【０１８５】
CD44v6-scFv(Biwa-8)配列(配列番号5):MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSINYIYWLQQKPGQAPRILIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQWSSNPLTFGGGTKVEIKRGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYLDSIKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQGLDYWGRGTLVTVSS
【０１８６】
CEA-scFv(BW431-26)配列(配列番号6):MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGVHSQVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTISSGYSWHWVRQPPGRGLEWIGYIQYSGITNYNPSLKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCAREDYDYHWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSTSSSVSYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQWSSYPTFGQGTKVEIKV
【０１８７】
ヒンジ配列(配列番号7):EPKSCDKTHTCPPCP
【０１８８】
CD28配列(配列番号8):FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
【０１８９】
CD3ζ鎖配列(配列番号9):RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR*
【０１９０】
2DG処置
用量評価のために、腫瘍細胞は、2、4、8、16又は64mM 2DG(D8375、Sigma-Aldrich社)に曝露され、48時間後、壊死性及び増殖性(proliferating)細胞の絶対細胞数及び百分率をFlow-Count Fluorospheres(BeckmanCoulter社)、7-AAD及びCFSEをそれぞれ使用してFACSによって決定した。薬物動態研究のために、腫瘍細胞は、4mM 2DGを用いて処置され、表面N-グリコシル化は、脱グリコシル化及びグリコシル化の動態をそれぞれ評価するために、処置から又は洗浄除去からのさまざまな時点でPHA-L染色によって評価された。安全性研究のために、バフィーコート細胞は、PHA-L染色による糖表現型及び7aad/アネキシンV染色による細胞生存率の評価の前に、IL-2(100IU/mL; Chiron社)、IL-21(10ng/ml; Peprotech社)及びIL-15(5ng/mL; Peprotech社)の存在下で4mM 2DGを用いて18時間処置された。
【０１９１】
in vitro同時培養アッセイ
健常ドナー由来のCEA又はCD44v6 CAR-T細胞は、IL-7及びIL-15の非存在下で1:5、1:10、1:25のE:T比で標的細胞と同時培養された。無関係なCAR (CD19 CAR T)を用いて形質導入されたT細胞は、対照として使用された。24時間又は96時間後、同時培養物は、Flow-Count Fluorospheres (BeckmanCoulter社)を使用してFACSによって分析され、除去指数として表された標的細胞死滅は、次の通り算出された:1-(実験用CAR-T細胞を用いた残存標的細胞の数/無関係のCAR-T細胞を用いた残存標的の数)。CAR-T細胞と2DGとを組み合わせた同時培養アッセイでは、標的細胞は、洗浄される前に4mM 2DGに48時間曝露され、実験用又は無関係のCAR-T細胞と共に同時培養され、上記の通り分析された。これらの実験では、2DG単独の除去指数は、次の通り算出された:1-(2DGを補充された培地で培養された標的細胞の数/培地のみで培養された標的細胞の数)。Jurkat CAR-TPRと腫瘍細胞との同時培養は、1:1のE:T比で実施された。対照として、Jurkat CAR-TPR細胞は50ng/mLのホルボールミリステートアセテート(PMA)若しくは1μg/mLのイオノマイシン又は2つの組合せのいずれかを用いて処置された。蛍光の上方制御は、24時間後に評価された。
【０１９２】
フローサイトメトリー
本発明者らは、ヒトCD44v6(e-Bioscience社)、CD3、CD45、NGFR、LAG3(BD Bioscience社)、HLA-DR、PD1、TIM3、(Biolegend社)、CD57 (Miltenyi Biotec社)に特異的なmAbを使用した。細胞の活力(vitality)を決定するために、7-アミノアクチノミシンD(7-AAD)、アネキシンV又はDAPI試薬が使用された。LV形質導入腫瘍細胞について、GFP発現は、直接蛍光によって分析された。試料は、蛍光標示式細胞分取器(FACS)Canto flow cytometer(BD Biosciences社)を通され、データは、FlowJo software(Tree Star社)を用いて分析された。分枝状N-グリカン発現分析のために、細胞は、ビオチン化インゲンマメ白血球凝集素(PHA-L; Caderlane社)と共に1時間、製造者の説明書に従ってインキュベートされ、洗浄され、PE-コンジュゲートストレプトアビジンと共にインキュベートされ、フローサイトメトリーによって分析された。
【０１９３】
CAR+ Jurkat三重レポーター細胞の生成
三重レポーターJurkat T細胞株(Jurkat TPR)は、Steinbergerのグループから親切にも提供された(S. Jutzら、Journal of Immunological Methods 430 (2016年)10〜20頁)。最初に細胞は、CD44v6(44v6.28z)又はCD19(19.28z)のいずれかに特異的なCAR構築物を発現するレンチウイルスベクターを用いた一晩のインキュベーションによって形質導入された。次に、形質導入効率は、1週間後にマーカー遺伝子NGFRに陽性の細胞の百分率から判断してフローサイトメトリーによって確認された。最後に、CAR+ Jurkat TPR細胞は、エフェクター対標的(E:T)の比、1:1で標的細胞と同時培養され、レポーター遺伝子活性化は、CytoFLEX(Beckman Coulter社)を使用してフローサイトメトリーによって4、6、24又は48時間で評価された。
【０１９４】
Mgat5ノックアウト膵臓腫瘍細胞の生成
Mgat5特異的gRNA及びCas9タンパク質をコードするレンチウイルスベクタープラスミドは、ABM good社(K1298706)から購入した。レンチウイルスベクター産生後、T3M4膵臓腫瘍細胞株は、形質導入され、製造の説明書(Thermo Fisher社、A1113803)に従ってポジティブ選択のためにピューロマイシンを補充した培地中で培養された。
【０１９５】
ウエスタンブロットアッセイ
腫瘍細胞又は健康な初代ケラチノサイトは、培地のみ又は4mM 2DGを補充してのいずれかで48時間処置され、溶解され、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(electrophoresys)に供された。脱グリコシル化は、分子量シフトとして評価された。選択的細胞膜タンパク質分析のために、ビオチン化アッセイは、製造者の説明書(Thermo Scientific社)に従って実施された。PNGase F(NEB、P0704)を用いた細胞可溶化物の処置は、製造者の説明書によって推奨される通り実施された。
【０１９６】
in vivo有効性実験
すべての実験は、Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC) of San Raffaele University Hospital and Scientific Institute及びItalian Governmental Health Institute(Rome、Italy)によって承認された。NSGマウス(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl)は、Jackson Laboratoriesから得られ、個々に換気されたケージ内で特定病原体除去(SPF)の施設で飼育された。9週齢NSGマウスは、分泌ルシフェラーゼを発現するT3M4腫瘍細胞0.1x106個を膵臓内に注射された(Bondanza及びCasucci、Methods in molecular biology 1393、Tumor immunology methods and protocols、10章)。腫瘍負荷が高かった場合は、腫瘍移植から6及び7日目にマウスは、500mg/kg 2DGを腹腔内(i.p.)に注射された。7日目にマウスは、CD44v6又は対照としてCD19 CAR T細胞のいずれか5x105個を静脈内(i.v.)に注入された。別の一連の実験では、マウスは、腫瘍負荷が低かった場合は、500mg/kg 2DGを用いて2及び3日目に処置され、3日目にCD44v6又はCD19 CAR T細胞のいずれか10x105個を受けた。腫瘍増殖は、QUANTI-Luc検出試薬(InvivoGen社)を使用して生物発光アッセイによってモニターされ、製造者の説明書に従って相対発光量(relative light units)(RLU)として表された。マウスは、RLUが>106であったときに屠殺された。屠殺時に、腫瘍塊は回収され、製造者の説明書に従ってgentle MACS(Miltenyi Biotec社)及び腫瘍分散試薬(Miltenyi Biotec社、130-095-929)を使用して分散され、FACSによって分析された。
【０１９７】
乳酸産生アッセイ
乳酸産生は、Lactate-Glo assay(Promega社)を製造者の説明書に従って使用して2、4、8、16又は64mM 2DGの用量での2DG処置の48時間後に評価された。
【０１９８】
統計解析
統計解析は、Graphpad Prism 5.0aソフトウェアバージョンを使用して実施された。すべてのデータは、平均+/-SEMとして表わされている。t検定、一元配置又は二元配置ANOVAは、試料間の差異の統計的有意性を決定するために使用された。P値<0.05を有する差異は統計的に有意と見なされた。
【実施例】
【０１９９】
(実施例1)
グリコシル化は、CD44v6+腫瘍細胞をCD44v6 CAR-T細胞による死滅から保護する
近年、本発明者らは、急性骨髄性白血病(leukaemia)、多発性骨髄腫及びいくつかの上皮癌を含む複数の腫瘍型に対処できるCD44v6 CARを開発し、最適化した(Casucci Mら、Blood. 2013 11月14日;122(20):3392〜4頁)。CD44v6が広範にグリコシル化されており(Ponta Hら、Nat Rev Mol Cell Biol. 2003年1月;4(1):33〜45頁)、糖鎖が立体的にかさ高い場合があることから、本発明者らは、O-又はN-連結のいずれかのグリコシル化が、CD44v6 CAR-T細胞による標的化に影響を与え得るかどうかを調査した。この課題に答えるための最初のステップとして、本発明者らは、O-グリコシル化欠損を生じるTシンターゼシャペロンタンパク質Cosmcの機能喪失型変異によって天然で特徴付けられているJurkat T細胞白血病(leukaemia)細胞株を利用した(Ju Tら、Proc Natl Acad Sci USA. 2002年12月24日;99(26):16613〜8頁;図1a)。O-グリコシル化を回復させ、CAR-T細胞に対する抗原を提供するために、Jurkat細胞をCosmc及びCD44v6を選択マーカーと共に保有するレンチウイルスベクターを用いて形質導入した(図1b)。際だったことに、CD44v6 CAR-T細胞はO-グリコシル化コンピテントJurkat細胞(44v6pos/Cosmcpos)よりもO-グリコシル化インコンピテントJurkat細胞(44v6pos/Cosmcneg)を更に効率的に認識し、死滅させた(図1c)。したがって、CD44v6遺伝子を用いて形質導入すると、天然のO-グリコシル化コンピテントK562細胞は、操作されたグリコシル化コンピテントJurkat細胞と同様に溶解された。これらの結果は、O-グリコシル化がCAR-T細胞による標的細胞死滅を妨害する可能性があることを示している。
【０２００】
N-グリコシル化の影響を検証するために、本発明者らは、CRISPR-Cas9技術を使用してグリコシルトランスフェラーゼMgat5の発現をノックアウトすることによって、N-グリコシル化欠損膵臓腫瘍細胞、例えばT3M4を生成した(図2a)。N-グリコシル化の阻害は、PHA-L(図2b)、Mgat5-改変分枝状N-グリカンに特異的に結合するレクチン、への結合の減少によって確認した。重要なことに、グリコシル化阻害は、CAR標的化のための必要条件である細胞膜でCD44v6曝露を顕著に妨げなかった(図2c)。際だったことに、T3M4細胞でのN-グリコシル化を妨害することは、CD44v6 CAR-T細胞によるそれらの除去を劇的に改善した(図2d)。この効果は、CAR-T細胞活性化(図2e)及びサイトカイン放出の改善と関連しており(図2f)、更に優れた抗原結合を示唆している。これらの発見は、N-グリコシル化阻害剤ツニカマイシンを使用して確認された。抗腫瘍性活性の改善が異なるCAR誘導細胞内シグナル伝達事象から生じたかどうかを確認するために、本発明者らは、さまざまな蛍光タンパク質がT細胞活性化の際に活性化される転写因子(TF)、例えばNFAT、NF-kB及びAP-1の特異的調節下に位置付けられている、「三重パラメーターレポーター」(TPR) Jurkat T細胞を利用した(Jutz Sら、J Immunol Methods. 2016年3月;430:10〜20頁及び図3a)。これらの細胞をCD44v6 CARを用いて形質導入し、さまざまな標的細胞を用いて刺激した。TF上昇は、N-グリコシル化欠損T3M4細胞の場合に強かった(図3b、左)。予測された通り、CD19 CARを用いて形質導入し、CD19陰性標的細胞を用いて刺激したTPR Jurkat細胞の場合は、活性化は観察されなかった(図3b、右)。
【０２０１】
併せて、これらの結果は、グリコシル化が、おそらく抗原認識を立体的に妨害することによってCAR-T細胞による標的細胞除去を阻害することを示している。固形腫瘍が、特に、N-グリカンの分枝の増加を含むいくつかのグリコシル化変化によって特徴付けられることを考慮して(Pinho SSら、Nat Rev Cancer. 2015年9月;15(9):540〜55頁)、かかる厄介な糖構造の生成での薬理学的妨害を、それがCAR-T細胞による腫瘍細胞認識及び死滅を増加させるかどうかを検証するために評価した。
【０２０２】
(実施例2)
2DGは、膵臓がん細胞においてN-グリコシル化を遮断する
CAR-T細胞との組合せでの安全な使用のためのグリコシル化阻害剤を探索して、本発明者らは、2-デオキシ-D-グルコース(2DG)に注目した。2DGは、解糖及びN-連結グリコシル化の両方の強力な阻害剤であり、ワールブルク効果の結果として健康な細胞と比較して、おそらく腫瘍細胞における優先的蓄積のおかげで、ヒトにおいて良好な忍容性を示した(Singh Dら、Strahlenther Onkol. 2005年8月;181(8):507〜14頁; Stein Mら、Prostate. 2010年9月15日;70(13):1388〜94頁; Raez LEら、Cancer Chemother Pharmacol. 2013年2月;71(2):523〜30頁; Magistroni Rら、J Nephrol. 2017年8月;30(4):511〜519頁; Xi Hら、IUBMB Life. 2014年2月;66(2):110〜21頁)。これらの理由から、本発明者らは、2DGが固形腫瘍に対するCAR-T細胞の抗腫瘍活性を増加させるかどうかの調査を開始した。最初の腫瘍モデルとして、本発明者らは、膵臓腺癌、新規治療選択肢の開発が特に緊急であるがん(診断の5年後に5%の人々だけが生存している、World Cancer Report 2014年WHO)を使用した。
【０２０３】
Mgat5遺伝子をノックアウトした後に生じたことと同様に、2DGは、PHA-Lへの結合の低減(図4a)及びベータ-1インテグリン、ウエスタンブロット分析のために使用されるモデルタンパク質の分子量シフト(図4b)によって示された通り、N-グリコシル化を強力に阻害できた。この効果は、5時間後には既に検出可能であり(図4c)、2DGを洗浄除去後24時間持続した(図4d)。更に、解糖を阻害できなかった低用量の2DGを使用した場合(図4f)に既に示された通り(図4e)、2DGを用いたN-グリコシル化の選択的遮断が実現可能であることを示唆している。低用量の2DGが腫瘍細胞生存率(図4g)及び増殖(proliferation) (図4h)に影響を有さなかったことに注目して、単剤療法としての2DGの有効性の乏しさを示唆している。
【０２０４】
細胞表面での発現が、CAR標的化のための必要条件であることから、本発明者らは、2DGを用いた処置で生成された脱グリコシル化抗原が細胞膜に達することができるかどうかを検討することを試みた。この目的のために、本発明者らは、ビオチン濃縮ウエスタンブロット分析(方法を参照されたい)を実施した。重要なことに、ベータ-1インテグリン及びCD44v6の脱グリコシル化形態は、2DGを用いた処置で表面タンパク質内に明確に検出された(図5a)。成熟タンパク質のグリカンを切断できるPNGase酵素を用いた処置を対照として使用し、同様の結果が生じた。FACSによって測定されたベータ-1インテグリン及びCD44v6の表面発現レベルは、同様に維持された(図5b)。
【０２０５】
併せて、これらの結果は、低用量の2DGは、それ自体が腫瘍細胞に細胞傷害性ではないが、細胞表面でのタンパク質曝露を妨害することなくN-グリコシル化を阻害できることを示している。
【０２０６】
(実施例3)
2DGは、CD44v6 CAR-T細胞による膵臓がん細胞の死滅を増加させる
2DGが脱グリコシル化抗原の曝露を誘導することを証明した後に、本発明者らは、CAR-T細胞に加えて2DGに基づく組合せアプローチの抗腫瘍性活性を調査した。
【０２０７】
T細胞への2DGの活性を混乱させる可能性を回避するために、腫瘍細胞を、2DGの非存在下でCAR-T細胞と同時培養する前に、2DGを用いて前処置した。CD44v6を発現するが、PT45及びT3M4の両方はCD44v6 CAR-T細胞単独によってあまり標的化されなかった(図6a〜図6b、赤いバー及び線)。際だったことに、しかし、2DGを用いた前処置は、腫瘍細胞をCD44v6 CAR-T細胞による認識に感受性にさせ、それらの除去を顕著に増加させている(図6a〜図6b、青いバー及び線)。注目すべきことにこの効果は、それが、2DG(欠いていた)及びCAR-T細胞単独(最小であった)の個々の抗腫瘍性活性から予測され得るものを超えていたことから、単に相加的ではなく相乗的であった。
【０２０８】
CAR-形質導入Jurkat TPR細胞を利用することによって、本発明者らは、Mgat5ノックアウト細胞の場合(実施例1を参照されたい)と同様に、腫瘍細胞死滅の改善もT細胞活性化の改善と関連した(図6c)ことを実証した。
【０２０９】
(実施例4)
2DGは、CD44v6 CAR T細胞による健康なケラチノサイトの死滅を増加させない
アプローチの安全性プロファイルに光をあてるために、本発明者らは、健康な末梢血単核細胞(PBMC)への2DG単独の効果を評価することにから開始した。腫瘍グリコシル化を阻害できる同じ用量の2DGは、PBMCグリコシル化を妨害できず(図7a)、CD3+T細胞、CD19+B細胞、CD14+単球及びCD15+顆粒球の生存率に影響を与えなかった(図7b)。
【０２１０】
次に本発明者らは、CAR-T細胞によって潜在的に標的化され得る健康な細胞への組合せアプローチの効果を調査した。本発明者らは、ヒトケラチノサイトは、CD44v6を発現するがCD44v6 CAR-T細胞によって標的化されないことをin vitro(Casucci Mら、Blood. 2013 11月14日;122(20):3392〜4頁)及びin vivoの両方で以前報告した。2DGがそれらの死滅を増加させるかどうかを検証するために、ヒト初代ケラチノサイトをCD44v6 CAR-T細胞との同時培養の前に2DGに曝露した。重要なことに、腫瘍細胞認識を増強できる同じ用量の2DGは、ケラチノサイトグリコシル化を阻害できず(図7c)、CD44v6 CAR-T細胞によるケラチノサイト除去を増加できなかった(図7d)。これらのデータは、グリコシル化阻害剤がCAR-T細胞療法の有効性を改善することを支持している。特に、ワールブルク効果のおかげで、2DGは、健康な組織に対する毒性を増加させることなくCD44v6 CAR-T細胞療法の有効性を改善する。
【０２１１】
(実施例5)
2DGを用いた処置は、膵臓腫瘍細胞をin vivoでCD44v6 CAR-T細胞療法に感受性にする
次に本発明者らは、2DG等のグリコシル化阻害剤が腫瘍細胞をCAR-T細胞による死滅に感受性にできるかどうかを膵臓腺癌異種移植マウスモデルにおいて評価することを試みた。この目的のために、本発明者らは、2つの異なる設定、すなわち、それぞれ更に許容的な設定及び更に困難な設定の両方でコンビナトリアル処置様式を検査するために、高CAR-T細胞用量を用いた微小残存病変(MRD)(図8a)及び低CAR-T細胞用量を用いた高腫瘍負荷(HTB)(図8b)を使用した。簡潔には、単純に血液試料を分析することによって腫瘍増殖を容易にモニタリングできるようにする分泌ルシフェラーゼを発現している44v6pos/19neg T3M4細胞をNSGマウスに注射した(Falcone Lら、Methods Mol Biol. 2016年;1393:105〜11頁)。2又は7日後(それぞれ、MRD及びHTB設定)、マウスは2DGを受け、さまざまな用量のCD44v6又はCD19 CAR-T細胞を用いて処置された(方法を参照されたい)。腫瘍増殖は、血液試料の生物発光分析を通じて毎週モニターした。MRD設定では、CD44v6 CAR-T細胞は、単独で膵臓腫瘍細胞を排除できた(図8c)一方で、HTB設定では、CD44v6 CAR-T細胞を受けたマウスは、2DG投与から顕著な利益を得た(図8d)。興味深いことに、屠殺時に、2DGを受けたマウス由来の腫瘍浸潤性CD44v6 CAR-T細胞は、2DGを受けていないマウスと比較して、顕著に低い頻度の疲弊及び老化マーカーを発現する細胞を含み、長期間の良好な抗腫瘍活性を示唆している(図8e)。併せて、これらの結果は、CAR-T細胞単独ではいかなる抗腫瘍性活性も媒介できなかった設定においてさえ、非常に攻撃的な膵臓がん細胞株に対する組合せ処置の有効性を示した。
【０２１２】
(実施例6)
組合せアプローチは、さまざまなCAR特異性を用いて実現可能である
2DGとCAR-T細胞との間の相乗効果が他のCAR特異性に共通であるかどうかを検証するために、本発明者らは、CEA CAR-T細胞を利用した。本発明者らは、多種多様な固形腫瘍において過発現されている高度にグリコシル化されたタンパク質(その質量の60%が炭水化物由来である)であることから、CEAを選択した。近年、CEA CAR-T細胞は、膵臓がん又は結腸直腸癌の肝転移を有する患者での顕著な毒性の無い有効性を示唆し(Katz SCら、Clin Cancer Res. 2015年7月15日;21(14):3149〜59頁; Zhang Cら、Mol Ther. 5月3日;25(5):1248〜1258頁)、CEA CAR-T細胞の抗腫瘍有効性を増加させるための戦略が当分野にいて大きな関心事であることを示している。
【０２１３】
本発明ではCD44v6 CAR-T細胞(実施例1)を用いて観察されたものと同様に、CEA CAR-T細胞がN-グリコシル化コンピテント細胞よりN-グリコシル化欠損T3M4細胞を更に効率的に死滅させることを実証している(図9a)。この場合でも、腫瘍死滅の増加は、CD69上方制御を分析することによって(図9b)及び実施例1に記載される通りJurkat TPR細胞を利用することによって示される通り(図9c)、T細胞活性化の増加が伴っていた。
【０２１４】
最も重要なことに、2DGを用いた前処置は、CEA CAR-T細胞によるCEAneg PT45腫瘍細胞の認識を増加させなかった(図9d)一方で、CEApos BxPC3及びT3M4腫瘍細胞の除去を顕著に改善した(図9e〜図9f)。再び、かかる改善は、CAR-T細胞活性化の増加(図9g〜図9h)及びサイトカイン放出(図9i)と関連していた。
【０２１５】
併せて、これらの結果は、さまざまなCAR特異性を含むこの組合せ戦略の適用を支持している。
【０２１６】
(実施例7)
相乗効果は、さまざまな腫瘍型に適用可能である
グリコシル化阻害剤(2DG等)とCAR-T細胞との間の相乗効果がさまざまな腫瘍型で利用できるかどうかを検証するために、本発明者らは、さまざまな固形(図10a)及び血液学的(図11a)腫瘍細胞株をPHA-L染色を利用してそれらのグリコシル化状態についてスクリーニングした。多様性が予測されるにもかかわらず、固形及び血液学的型由来のいくつかの細胞がん株は、高度にN-グリコシル化されていることが見出され、膵臓、肺及び膀胱固形腫瘍並びにAML、ALL及びMMを含むさまざまながんの種類が、グリコシル化阻害剤とCAR T細胞処置とを組み合わせるアプローチを用いて標的化され得ることを示している。
【０２１７】
これを機能的に証明するために、本発明者らは、分析した一部の細胞株を用いて同時培養アッセイを実施した。際だったことに、負の相関が、N-グリコシル化レベルとCD44v6 CAR-T細胞による死滅との間に観察され(図10b)、グリコシル化がCAR-T細胞認識に悪影響を与えていることを更に支持している。更に、本発明者らは、阻害剤、特に2DGを用いてグリコシル化、特にN-グリコシル化を阻害することが、CAR-T細胞単独ではほとんど標的化されない高度にグリコシル化された腫瘍の除去を劇的に増加させることを証明した(図10c)。
【０２１８】
併せてこれらの結果は、複数の腫瘍の種類の処置へのこの組合せ戦略の適用を支持する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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