(57)【要約】本明細書において、オリゴヌクレオチド、三量体ペプチド、及びペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を提供する。本明細書ではまた、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、三量体ペプチド、及びペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における筋肉疾患の治療方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体：
【化７７】
2021532784.tif 000083
（Ｉ）
またはその薬学的に許容される塩であって、
式中：
Ａ’が、−Ｎ（Ｈ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化７８】
2021532784.tif 000084
、及び
【化７９】
2021532784.tif 000085
から選択され、式中、
Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、式中、ｘが３〜１０であり、各アルキル基が、それぞれ独立して、出現ごとにＣ２−６−アルキルであり、
またはＲ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１−６−アルキル）−Ｒ６、−（Ｃ１−６−ヘテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、及び
【化８０】
2021532784.tif 000086
から選択され；
式中、Ｒ６が、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２から選択されるか、またはＲ６が、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、これらのそれぞれが、固体支持体に共有結合し；
各Ｒ１が、ＯＨ及び−Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）から独立して選択され、式中、各Ｒ３及びＲ４が、それぞれ独立して、出現ごとに−Ｃ１−６−アルキルであり；
各Ｒ２が、それぞれ独立して、出現ごとに、Ｈ、核酸塩基、及び化学保護基で官能化された核酸塩基から選択され、前記核酸塩基が、それぞれ独立して、出現ごとに、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ３−６−ヘテロ環を含み；
ｚが８〜４０であり；ならびに
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化８１】
2021532784.tif 000087
及び
【化８２】
2021532784.tif 000088
から選択され；
式中、
Ｑが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｒ７が、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、式中、Ｒ８が、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり；
Ｌが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−Ｃ７−１５−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−であり、Ｌが、アミド結合によってＪのアミノ末端に共有結合し；
Ｊが、−Ｐ１−Ｌ１−Ｐ２−Ｌ２−Ｐ３−であり；
Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３が、それぞれ独立して細胞透過性ペプチドであり、式中、Ｐ１及びＰ２が、少なくとも１つの末端または内部システイン残基をそれぞれ含み、Ｐ２が、少なくとも１つの末端または内部リジン残基を含み；
Ｌ１が、
【化８３】
2021532784.tif 000089
であり、
Ｍが、
【化８４】
2021532784.tif 000090
、
【化８５】
2021532784.tif 000091
、または
【化８６】
2021532784.tif 000092
であり、
Ｒ１０が、それぞれ独立して、出現ごとに、Ｈまたはハロゲンであり、
Ｌ１が、Ｐ１及びＰ２の末端または内部システインの側鎖に共有結合的に連結し；
Ｌ２が、−（ＣＨ２）１−６−Ｃ１−６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−であり、Ｌ２が、Ｐ２の末端または内部リジン側鎖に共有結合し、Ｐ３のアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結し；
Ｇが、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、及びステアロイルから選択され、式中、Ｇが、Ｊのカルボキシ末端に共有結合し；及び
以下の条件のうちの少なくとも１つが当てはまる；
１）Ａ’が
【化８７】
2021532784.tif 000093
であるか；または２）Ｅ’が
【化８８】
2021532784.tif 000094
である、前記式Ｉの三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、または前記その薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、及び
【化８９】
2021532784.tif 000095
から選択される、請求項１に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化９０】
2021532784.tif 000096
、
【化９１】
2021532784.tif 000097
、及び
【化９２】
2021532784.tif 000098
から選択される、請求項１に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、４−メトキシトリチル、及び
【化９３】
2021532784.tif 000099
から選択される、請求項１に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化９４】
2021532784.tif 000100
、及び
【化９５】
2021532784.tif 000101
から選択され；ならびに
Ｅ’が
【化９６】
2021532784.tif 000102
である、請求項１に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
Ａ’が、
【化９７】
2021532784.tif 000103
、及び
であり、Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、及びステアロイルから選択される、請求項１に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
前記式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチド複合体が：
【化９８】
2021532784.tif 000104
（Ｉａ）；及び
【化９９】
2021532784.tif 000105
（Ｉｂ）
から選択されるペプチド−オリゴヌクレオチド複合体であり、式中、Ｅ’が、Ｈ、Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、及びステアロイルから選択される、請求項１に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
前記ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体が、式（Ｉａ）の複合体である、請求項１もしくは７の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
前記ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体が、式（Ｉｂ）の複合体である、請求項１もしくは７の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
前記細胞透過性ペプチドの各々が、独立して、両親媒性ペプチド、核標的化ペプチド、エンドソーム破壊ペプチド、キメラペプチド、環状ペプチド、二環式ペプチド、またはオリゴアルギニンペプチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
Ｐ１が両親媒性ペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
Ｐ２が核標的化ペプチドである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１３】
前記両親媒性ペプチドが、疎水性ペプチジルセグメント及び親水性ペプチジルセグメントを含み、前記疎水性ペプチジルセグメントが、独立して、グリシン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンから選択される２〜１０アミノ酸の配列を含み、前記親水性ペプチジルセグメントが、独立して、荷電アミノ酸、非荷電であるが極性のアミノ酸、または疎水性アミノ酸から選択される２〜２０アミノ酸の配列を含み、前記親水性ペプチジルセグメントが、少なくとも１つの非疎水性アミノ酸を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
前記親水性ペプチジルセグメントが、独立して、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、またはグリシンから選ばれる２〜２０アミノ酸の配列を含み、その場合、前記親水性ペプチジルセグメントが、少なくとも１つの非疎水性アミノ酸を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
Ｐ１が、ペネトラチン（配列番号４５）、ｐＶＥＣ（配列番号１７）、ＴＰ１０（配列番号５２）、またはＤＰＶ６（配列番号１）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１６】
Ｐ２がＫＲＶＫ（配列番号５０）、ＳＶ４０（配列番号５３）、またはＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢ（配列番号５４）である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１７】
Ｐ３が、ＤＰＶ６（配列番号１）、ＰＰＣ３（配列番号２）、ＰＰＣ５（配列番号３）、Ｒ１２（配列番号４）、Ｒ１２フルサイクル（配列番号５）、Ｒ１２  Ｎサイクル（配列番号６）、Ｒ１２  Ｃサイクル（配列番号７）、Ｒ１２ベンジルバイサイクル（配列番号８）、Ｒ１２ダブルサイクル（配列番号９）、Ｂｐｅｐ（配列番号１０）、Ｂｐｅｐフルサイクル（配列番号１１）、Ｂｐｅｐ  Ｃサイクル（配列番号１２）、ペネトラチン（ｎｌｅ）（配列番号１３）、エングレイルドＮサイクル（配列番号１４）、エングレイルドＣサイクル（配列番号１５）、エングレイルドフルサイクル（配列番号１６）、ｐＶＥＣ（配列番号１７）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（配列番号１８）、ＡＩＰ６フルサイクル（配列番号１９）、メリチン−Ｂｐｅｐ（配列番号２０）、Ｂｈ３ヘリックス（配列番号２１）、Ｂａｃ７（配列番号２２）、ブフォリン２（配列番号２３）、メリチン（配列番号２４）、ＳｙｎＢ１（配列番号２５）、Ｓ４１３−ＰＶｒｅｖ（配列番号２６）、リボトキシン２Ｌ３（配列番号２７）、ＰｒｅＳ２−ＴＬＭ（配列番号２８）、ＭＡＰ（配列番号２９）、Ｗ／Ｒ（配列番号３０）、ＭＡＰ１２（配列番号３１）、ＳＡＰ（配列番号３２）、ＳＶＭ１（配列番号３３）、ＳＶＭ３（配列番号３４）、ＳＶＭ４（配列番号３５）、ＹＴＡ４（配列番号３６）、４３９ａ（配列番号３７）、ＨｏｘＡ１３セリン２（配列番号３８）、Ｂｉｐ（配列番号３９）、ＰＰＲ３（配列番号４０）、ＰＰＲ４（配列番号４１）、ＡＩＰ６（配列番号４２）、ＤＰＶ１５ｂ（配列番号４３）、ＴＡＴ（配列番号４４）、ペネトラチン（配列番号４５）、Ｒ９（配列番号４６）、ＨｏｘＡ１３セリン１（配列番号４７）、ＫＲＶＫ  ＴＰ１０（配列番号４８）、ＴＰ１０  ＫＲＶＫ（配列番号４９）、またはＳＶ４０  ＴＰ１０（配列番号５１）である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１８】
Ｐ１が、ＤＰＶ６（配列番号１）である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１９】
Ｐ３が、ＤＰＶ６（配列番号１）、Ｂｐｅｐ（配列番号１０）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（配列番号１８）、ブフォリン２（配列番号２３）、ＳｙｎＢ１（配列番号２５）、Ｗ／Ｒ（配列番号３０）、またはＡＩＰ６（配列番号４６）である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２０】
Ｐ１が、ＤＰＶ６（配列番号１）であり、Ｐ２がＳＶ４０（配列番号５３）であり、Ｐ３がＤＰＶ６（配列番号１）、Ｂｐｅｐ（配列番号１０）、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（配列番号１８）、ブフォリン２（配列番号２３）、ＳｙｎＢ１（配列番号２５）、Ｗ／Ｒ（配列番号３０）、またはＡＩＰ６（配列番号４６）である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２１】
Ｐ１が、ＤＰＶ６（配列番号１）であり、Ｐ２がＳＶ４０（配列番号５３）であり、Ｐ３がｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ（配列番号１８）である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２２】
Ｐ１が、ＤＰＶ６（配列番号１）であり、Ｐ２がＳＶ４０（配列番号３０）であり、Ｐ３がＷ／Ｒ（配列番号３０）である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２３】
Ｐ１が、ＤＰＶ６（配列番号１）であり、Ｐ２がＳＶ４０（配列番号３０）であり、Ｐ３がＳｙｎＢ１（配列番号２５）である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２４】
各Ｒ１がＮ（ＣＨ３）２である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２５】
各Ｒ２が、それぞれ独立して、出現ごとに、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンから選択される核酸塩基である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２６】
式中、Ｌが−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−ＤＢＣＯ−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２７】
式中、Ｌが
【化１００】
2021532784.tif 000106
である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２８】
式中、
Ｍが
【化１０１】
2021532784.tif 000107
である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２９】
式中、
Ｍが
【化１０２】
2021532784.tif 000108
である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３０】
式中、Ｌ１が、Ｐ１及びＰ２の末端システインの側鎖に共有結合して、構造体：
【化１０３】
2021532784.tif 000109
を形成する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３１】
式中、Ｌ２が、Ｐ２の末端リジンの側鎖に共有結合し、Ｐ３のアミノ末端にアミド結合によって共有結合して、構造体：
【化１０４】
2021532784.tif 000110
を形成する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３２】
式中、Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、及びステアロイルから選択される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３３】
式中、Ｇが、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３４】
式中、ＧがＨである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３５】
式中、Ｇが−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩、及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３７】
疾患の治療を必要とする対象における前記疾患の治療方法であって、前記方法が、前記対象に、治療有効量の請求項３６に記載の組成物を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項３８】
前記疾患が、神経筋疾患である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記神経筋疾患がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
式（ＩＩ）の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の調製プロセスであって：
2021532784.tif 000111
（ＩＩ）
前記プロセスが：
（ａ）式（ＩＩＩ）の化合物
【化１０５】
2021532784.tif 000112
（ＩＩＩ）
を、式（ＩＶ）の化合物
【化１０６】
2021532784.tif 000113
（ＩＶ）
と、酸の存在下で接触させて、式（Ｖ）の化合物を形成し、
【化１０７】
2021532784.tif 000114
（Ｖ）
（ｂ）式（ＶＩ）の化合物
【化１０８】
2021532784.tif 000115
（ＶＩ）
を、式（ＶＩＩ）の化合物
【化１０９】
2021532784.tif 000116
（ＶＩＩ）
と、銅触媒の存在下で接触させて、式（ＶＩＩＩ）の化合物を形成し、
【化１１０】
2021532784.tif 000117
（ＶＩＩＩ）
（ｃ）式（Ｖ）の化合物：
【化１１１】
2021532784.tif 000118
（Ｖ）
を、式（ＶＩＩＩ）の化合物
【化１１２】
2021532784.tif 000119
（ＶＩＩＩ）
と、カップリング剤の存在下で接触させて、式（ＩＩ）の化合物を形成することを含み；
式中、Ｍが
【化１１３】
2021532784.tif 000120
、
【化１１４】
2021532784.tif 000121
、または
【化１１５】
2021532784.tif 000122
であり、
Ｒ１０が、それぞれ独立して、出現ごとに、Ｈまたはハロゲンであり、Ｍが、Ｐ１及びＰ２の末端または内部システインの側鎖に共有結合し；
式中、前記ＰＭＯが、式ＩＸのオリゴヌクレオチド：
【化１１６】
2021532784.tif 000123
（ＩＸ）
またはその薬学的に許容される塩であり、
式中、
Ａが、ＯＨ、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１１７】
2021532784.tif 000124
、及び
【化１１８】
2021532784.tif 000125
からなる群から選択され；
Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘＯＨであり、式中、ｘが３〜１０であり、各アルキル基が、それぞれ独立して、出現ごとに−Ｃ２−６−アルキルであるか、またはＲ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−Ｃ１−６−アルキル−Ｒ６、−Ｃ１−６−ヘテロアルキル−Ｒ６、−アリール−Ｒ６、−ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−６−アルキル−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、及び−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６からなる群から選択されるか、もしくはＲ５が、前記三量体ペプチドの結合点であり；
Ｒ６が、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２からなる群から選択されるか、またはＲ６が、固体支持体に共有結合したＯ、Ｓ、またはＮＨであり；
各Ｒ１が、独立して、ＯＨまたは−ＮＲ３Ｒ４であり；
各Ｒ３及びＲ４が、それぞれ独立して出現ごとに−Ｃ１−６−アルキルであり；
各Ｒ２が、独立して、Ｈ、核酸塩基、及び化学保護基で官能化された核酸塩基からなる群から選択され、その場合、前記核酸塩基が、それぞれ独立して、出現ごとに、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンからなる群から選択されるＣ３−６−ヘテロ環を含み；
ｚが８〜４０であり；
Ｅが、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、及び
【化１１９】
2021532784.tif 000126
からなる群から選択されるか、または
Ｅが、前記三量体ペプチドの結合点であり；
Ｑが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｒ７が、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり；ならびに
Ｒ８が、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である、前記調製プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７１１，８９４号の優先権を主張し、参照することによりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンス技術は、選択的スプライシング産物を含む１つ以上の特異的な遺伝子産物の発現の調節に効果的な手段を提供し、多くの治療的用途、診断的用途、及び研究用途に一意的に有用である。アンチセンス技術の背後にある原理は、標的核酸にハイブリダイズするアンチセンス化合物、例えばオリゴヌクレオチドが、多くのアンチセンスメカニズムのいずれかを介して、転写、スプライシング、または翻訳などの遺伝子発現活性を調節することである。アンチセンス化合物は、その配列特異性ゆえに、標的の検証及び遺伝子の機能化の手段として、ならびに疾患に関与する遺伝子の発現を選択的に調節する治療薬として魅力的である。
【０００３】
アンチセンス技術の分野で重要な進歩がなされたものの、当技術分野において、アンチセンス性能または抗原性能が向上したオリゴヌクレオチド及びペプチド−オリゴヌクレオチド−複合体が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書において、三量体ペプチドに共有結合したオリゴヌクレオチドを含む三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を提供する。本明細書ではまた、本明細書に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患の治療方法も提供する。本明細書において、本明細書に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の調製プロセスも提供する。
【０００５】
したがって、一態様では、本明細書において、式Ｉの三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体：
【化１】
2021532784.tif 000002
（Ｉ）
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
式中：
Ａ’が、−Ｎ（Ｈ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化２】
2021532784.tif 000003
、及び
【化３】
2021532784.tif 000004
から選択され、式中、
Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、式中、ｘが３〜１０であり、各アルキル基が、それぞれ独立して、出現ごとにＣ２−６−アルキルであり、
またはＲ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１−６アルキル）−Ｒ６、−（Ｃ１−６−ヘテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、及び
【化４】
2021532784.tif 000005
から選択され；
式中、Ｒ６が、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２から選択されるか、またはＲ６が、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、これらのそれぞれが、固体支持体に共有結合し；
各Ｒ１が、ＯＨ及び−Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）から独立して選択され、式中、各Ｒ３及びＲ４が、それぞれ独立して、出現ごとに−Ｃ１−６−アルキルであり；
各Ｒ２が、それぞれ独立して、出現ごとに、Ｈ、核酸塩基、及び化学保護基で官能化された核酸塩基から選択され、核酸塩基が、それぞれ独立して、出現ごとに、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ３−６−ヘテロ環を含み；
ｚが８〜４０であり；ならびに
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化５】
2021532784.tif 000006
及び
【化６】
2021532784.tif 000007
から選択され；
式中、
Ｑが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｒ７が、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、式中、Ｒ８が、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり；
Ｌが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−Ｃ７−１５−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−であり、Ｌが、アミド結合によってＪのアミノ末端に共有結合し；
Ｊが、−Ｐ１−Ｌ１−Ｐ２−Ｌ２−Ｐ３−であり；
Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３が、それぞれ独立して細胞透過性ペプチドであり、式中、Ｐ１及びＰ２が、少なくとも１つの末端または内部システイン残基をそれぞれ含み、Ｐ２が、少なくとも１つの末端または内部リジン残基を含み；
Ｌ１が、
【化７】
2021532784.tif 000008
であり、
Ｍが、
【化８】
2021532784.tif 000009
、
【化９】
2021532784.tif 000010
、または
【化１０】
2021532784.tif 000011
であり、
Ｒ１０が、それぞれ独立して、出現ごとに、Ｈまたはハロゲンであり、
Ｌ１が、Ｐ１及びＰ２の末端または内部システインの側鎖に共有結合的に連結し；
Ｌ２が、−（ＣＨ２）１−６−Ｃ１−６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−であり、Ｌ２が、Ｐ２の末端または内部リジン側鎖に共有結合し、Ｐ３のアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結し；
Ｇが、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、及びステアロイルから選択され、式中、Ｇが、Ｊのカルボキシ末端に共有結合し；及び
以下の条件のうちの少なくとも１つが当てはまる；
１）Ａ’が
【化１１】
2021532784.tif 000012
であるか；または２）Ｅ’が
【化１２】
2021532784.tif 000013
である。
【０００６】
一実施形態では、式Ｉのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド複合体は、式Ｉａのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド複合体：
【化１３】
2021532784.tif 000014
（Ｉａ）
またはその薬学的に許容される塩である。
【０００７】
別の実施形態では、式Ｉのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド複合体は、式Ｉｂのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド複合体：
【化１４】
2021532784.tif 000015
（Ｉｂ）
またはその薬学的に許容される塩である。
【０００８】
さらに別の態様では、本明細書において、本開示の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含む、神経筋疾患の治療方法を提供する。
【０００９】
さらに別の態様では、本明細書において、式（ＩＩ）の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の調製プロセスを提供し：
【化１５】
2021532784.tif 000016
（ＩＩ）
プロセスは：
（ａ）式（ＩＩＩ）の化合物
【化１６】
2021532784.tif 000017
（ＩＩＩ）
を、式（ＩＶ）の化合物
【化１７】
2021532784.tif 000018
（ＩＶ）
と、酸の存在下で接触させて、式（Ｖ）の化合物を形成し、
【化１８】
2021532784.tif 000019
（Ｖ）
（ｂ）式（ＶＩ）の化合物：
【化１９】
2021532784.tif 000020
（ＶＩ）
を、式（ＶＩＩ）の化合物
【化２０】
2021532784.tif 000021
（ＶＩＩ）
と、銅触媒の存在下で接触させて、式（ＶＩＩＩ）の化合物を形成し、
【化２１】
2021532784.tif 000022
（ＶＩＩＩ）
（ｃ）式（Ｖ）の化合物：
【化２２】
2021532784.tif 000023
（Ｖ）
を、式（ＶＩＩＩ）の化合物
【化２３】
2021532784.tif 000024
（ＶＩＩＩ）
と、カップリング剤の存在下で接触させて、式（ＩＩ）の化合物を形成することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】４成分のモジュールライブラリの開発及び実装を示す。バイオコンジュゲーションを使用して、ペプチドのすべての組み合わせを１つの構築物にまとめて、個別に試験することができる。
【図２】モジュール構築物を合成するための合成スキームを示す。
【図３】概念実証実験のための特定のペプチド配列及び名称を示す。
【図４Ａ】各モジュール構築物で処理したＨｅＬａ−６５４細胞の平均細胞蛍光を示すヒートマップを示す（ｎ＝３複製ウェル）。
【図４Ｂ】各モジュール構築物で処理した後のＨｅＬａ−６５４細胞の総細胞数を示すヒートマップを示す。各実験は５０００細胞で完了とした。細胞カウント数が少ないことは、細胞毒性の存在を示唆している。
【図４Ｃ】細胞カウント数に平均蛍光を乗じたもの（Ｆ×Ｃ）を示すヒートマップを示し、これにより、モジュール構築物の２つの最も重要なパラメータを取得する単一のメトリックが得られる。
【図５−１】ＨｅＬａ−６５４アッセイで試験した６００個の構築物のＦ×Ｃを示すヒートマップを示す（ｎ＝１複製ウェル）。最も強力な化合物は、ＰＭＯ−ＤＰＶ６−ＳＶ４０−Ｗ／Ｒであったが、これは、試験前は特に注目に値するとは予測されていなかったペプチドの組み合わせである。「Ｘ」でマークした四角は、ゲーティング細胞数がゼロである構築物である。
【図５−２】ＨｅＬａ−６５４アッセイで試験した６００個の構築物のＦ×Ｃを示すヒートマップを示す（ｎ＝１複製ウェル）。最も強力な化合物は、ＰＭＯ−ＤＰＶ６−ＳＶ４０−Ｗ／Ｒであったが、これは、試験前は特に注目に値するとは予測されていなかったペプチドの組み合わせである。「Ｘ」でマークした四角は、ゲーティング細胞数がゼロである構築物である。
【図６−１】ＨｅＬａ−６５４アッセイで試験した６００個の構築物の平均蛍光強度を示すヒートマップを示す（ｎ＝１複製ウェル）。「Ｘ」でマークした四角は、ゲーティング細胞数がゼロである構築物である。
【図６−２】ＨｅＬａ−６５４アッセイで試験した６００個の構築物の平均蛍光強度を示すヒートマップを示す（ｎ＝１複製ウェル）。「Ｘ」でマークした四角は、ゲーティング細胞数がゼロである構築物である。
【図７−１】６００個の構築物で処理した後の総細胞カウント数を示すヒートマップを示す（ｎ＝１複製ウェル）。ゲーティング細胞数は５，０００で完了とした。
【図７−２】６００個の構築物で処理した後の総細胞カウント数を示すヒートマップを示す（ｎ＝１複製ウェル）。ゲーティング細胞数は５，０００で完了とした。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）は、遺伝性疾患の魅力的な治療分子である。ＰＭＯは、ワトソン−クリック塩基対によって標的を認識し、それらの相補的なヌクレオチド配列に対して高レベルの特異性を示すように設計される。標的とする配列のタイプに応じて、ＰＭＯは、タンパク質翻訳の遮断または遺伝子スプライシングの改変を含む、様々な効果を媒介することができる。デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するためにＦＤＡによって承認されたＰＭＯであるエテプリルセンは、ジストロフィンをコードするプレｍＲＮＡ内の変異を含むエキソンを最終的なタンパク質転写産物から除去し、タンパク質の機能を回復させる。
【００１２】
構造に関して、ＰＭＯは、中性オリゴヌクレオチド類似体であり、リボシル環がモルホリノ環に置換され、負に荷電したホスホジエステル骨格が非荷電のホスホジアミデートに置換されている。バックボーン構造の改変により、血清中での分解と細胞内ヌクレアーゼによる分解の両方が予防される。しかしながら、ＰＭＯは、比較的サイズが大きく、電荷が中性であることから、細胞質ゾル及び核への送達は非効率なものとなる。
【００１３】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、核へのＰＭＯの送達を改善するための有望な戦略である。ＣＰＰは、５〜４０アミノ酸の比較的短い配列であり、理想的には細胞質ゾルにアクセスし、カーゴの細胞内送達を促進することができる。ＣＰＰは、その物理化学的特性に基づいて異なる群に分類することができる。１つの一般的なＣＰＰクラスは、Ｒ１２及びＢｐｅｐ（ＲＸＲＲβＲＲＸＲＲβＲ、式中、Ｘはアミノヘキサン酸であり、βはβ−アラニンである）などの反復的なアルギニンベースのペプチドからなる。これらのオリゴアルギニンペプチドは、多くの場合、ランダムコイルである。ＰＭＯと複合体化させる場合、オリゴアルギニンペプチドは、ＰＭＯ送達の促進に最も効果的なペプチドの一つである。ペネトラチン、ｐＶＥＣ、及びメリチンなどの他のＣＰＰは、本質的により両親媒性である。これらの配列には陽イオン性残基が含まれている一方で、荷電残基と疎水性残基の明確な分離により、両親媒性ヘリックスの形成が促進される。しかしながら、両親媒性ＣＰＰがＰＭＯの有効性を有意に向上させることは実証されていない。
【００１４】
ＣＰＰまたはＣＰＰ−ＰＭＯ複合体の普遍的な細胞進入メカニズムは存在しない。このメカニズムは、多くの場合、処理濃度及び結合させるカーゴの種類に大きく依存する。特定の閾値濃度（一般的に低マイクロモル）を超えると、エネルギー非依存的な細胞質ゾルへの取り込みが、エンドサイトーシス及び細胞表面リサイクリングのタイムスケールに比べて、より速く観察される。この取り込み速度の速さは、低分子に対して観察されるメカニズムと同様の直接的な移行メカニズムの存在を裏付けるものである。しかしながら、生理学的に適切な低濃度では、取り込みは、主にエンドサイトーシスである。エンドサイトーシスのカテゴリー内でさえ、ＣＰＰ及びＣＰＰ−ＰＭＯ複合体は、１つまたは複数のエンドサイトーシスメカニズムを使用して細胞に進入することができる。これらのエンドサイトーシスメカニズムには、マイクロピノサイトーシス、クラスリン介在性エンドサイトーシス、カベオラ介在性エンドサイトーシス、及びクラスリン／カベオラ非依存性エンドサイトーシスが含まれる。ＣＰＰ−ＰＭＯ複合体は、主に低濃度でエンドサイトーシスされ、ＰＭＯ送達に不十分なＣＰＰは、エンドソームに捕捉されるか、核コンパートメントから排除される可能性が高い。
【００１５】
本明細書において、ＰＭＯ送達を向上させるための三量体ペプチド−ＰＭＯ複合体を提供する。これらの三量体ペプチド−ＰＭＯ複合体は、互いに共有結合し、ＰＭＯと複合体化した３つ以上のＣＰＰからなる。本明細書において、細胞へのオリゴヌクレオチド取り込みの、特に非複合体化ＰＭＯ及び単一のＣＰＰ−ＰＭＯ複合体と比較した場合の増加について記載する。
【００１６】
定義
本開示を説明するために使用する様々な用語の定義を以下に列挙する。これらの定義は、個別にまたはより大きなグループの一部として特定の場合に限定されない限り、本明細書及び特許請求の範囲の全体において使用する用語に適用される。
【００１７】
用語「約」は、当業者によって理解され、それが用いられる文脈においてある程度異なるであろう。量、時間的な持続期間などの測定可能な値を指す際に本明細書中で使用する場合、用語「約」は、開示する方法を実施するためにそのような変動が適切であるように、明記する値から±２０％または±１０％、例えば、±５％、±１％、及び±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００１８】
用語「アルキル」とは、特定の実施形態では、それぞれ１〜６個、または１〜８個の炭素原子を含む飽和、直鎖または分枝鎖炭化水素部分を指す。Ｃ１−６−アルキル部分の例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル部分が挙げられるが、これらに限定されず；Ｃ１−８−アルキル部分の例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル、及びオクチル部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
アルキル置換基の炭素原子数は、接頭辞「Ｃｘ−ｙ」で示すことができ、式中、ｘは、置換基の最小炭素原子数、ｙは、最大炭素原子数である。同様に、Ｃｘ鎖は、ｘ個の炭素原子を含むアルキル鎖を意味する。
【００２０】
それ自体でまたは別の用語との組み合わせによる用語「ヘテロアルキル」は、別途指示のない限り、指定する数の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される１〜２個のヘテロ原子からなる、安定した直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味し、その場合、窒素及び硫黄原子は、場合により酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、場合により四級化されていてもよい。ヘテロ原子（複数可）は、ヘテロアルキル基の残りの部分とそれが結合している断片の間、及びヘテロアルキル基内の最も遠位の炭素原子に結合している断片の間を含む、ヘテロアルキル基の任意の位置に配置してもよい。例として：−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、または−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３など、最大２個のヘテロ原子が連続してもよい。
【００２１】
単独でまたは他の用語と組み合わせて使用する用語「アリール」とは、別途指示のない限り、１つ以上の環（一般的には１、２、または３個の環）を含有する、炭素環式芳香族系を意味し、そのような環は、ビフェニルなどのようにペンダント様式で一緒に結合していてもよく、またはナフタレンなどのように縮合していてもよい。アリール基の例として、フェニル、アントラシル、及びナフチルが挙げられる。様々な実施形態において、アリール基の例には、フェニル（例えば、Ｃ６−アリール）及びビフェニル（例えば、Ｃ１２−アリール）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、アリール基は、６〜１６個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アリール基は、６〜１２個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ６−１２−アリール）。いくつかの実施形態では、アリール基は、６個の炭素原子（例えば、Ｃ６−アリール）を有する。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、用語「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」とは、芳香族の特徴を有する複素環を指す。ヘテロアリール置換基は、炭素原子の数によって定義してもよく、例えば、Ｃ１−９−ヘテロアリールは、ヘテロ原子の数を含まない、ヘテロアリール基に含まれる炭素原子の数を示す。例えば、Ｃ１−９−ヘテロアリールには、さらに１〜４個のヘテロ原子が含まれる。多環式ヘテロアリールは、部分飽和である１つ以上の環を含んでいてもよい。ヘテロアリールの非限定的な例として、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル（例えば、２−及び４−ピリミジニルを含む）、ピリダジニル、チエニル、フリル、ピロリル（例えば、２−ピロリルを含む）、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル（例えば、３−及び５−ピラゾリルを含む）、イソチアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、テトラゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、及び１，３，４−オキサジアゾリルが挙げられる。
【００２３】
多環式複素環及びヘテロアリールの非限定的な例として、インドリル（例えば、３−、４−、５−、６−、及び７−インドリルを含む）、インドリニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル（例えば、１−及び５−イソキノリルを含む）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キノキサリニル（例えば、２−及び５−キノキサリニルを含む）、キナゾリニル、フタラジニル、１，８−ナフチリジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、クマリン、ジヒドロクマリン、１，５−ナフチリジニル、ベンゾフリル（例えば、３−、４−、５−、６−及び７−ベンゾフリルを含む）、２，３−ジヒドロベンゾフリル、１，２−ベンズイソキサゾリル、ベンゾチエニル（例えば、３−、４−、５−、６−、及び７−ベンゾチエニルを含む）、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル（例えば、２−ベンゾチアゾリル及び５−ベンゾチアゾリルを含む）、プリニル、ベンズイミダゾリル（例えば、２−ベンズイミダゾリルを含む）、ベンゾトリアゾリル、チオキサンチニル、カルバゾリル、カルボリニル、アクリジニル、ピロリジジニル、及びキノリジジニルが挙げられる。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、頭字語ＤＢＣＯは、８，９−ジヒドロ−３Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｄ］アゾシンを指す。
【００２５】
用語「保護基」または「化学保護基」とは、化合物の一部またはすべての反応性部分を遮断し、保護基が除去されるまでそのような部分が化学反応に関与するのを防止する化学部分、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ  ｅｄ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９）に列挙され、記載されている部分を指す。異なる保護基を使用する場合、各（異なる）保護基が異なる手段によって除去可能であることは、有利であり得る。全く異種の反応条件下で保護基が切断される場合、そのような保護基を差次的に除去することが可能になる。例えば、保護基を、酸、塩基、及び水素化分解によって除去することができる。トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、アセタール、及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルなどの基は、酸不安定性であり、水素化分解によって除去可能であるＣｂｚ基、及び塩基不安定性であるＦｍｏｃ基で保護されたアミノ基の存在下で、カルボキシ及びヒドロキシ反応性部分を保護するために使用してもよい。カルボン酸部分は、限定されないが、メチル、またはエチルなどの塩基不安定基でブロックしてもよく、ヒドロキシ反応性部分は、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメートなどの酸不安定基で、または酸と塩基の両方で安定であるが加水分解的に除去可能なカルバメートでブロックされるアミンの存在下で、アセチルなどの塩基不安定基でブロックしてもよい。
【００２６】
カルボン酸及びヒドロキシ反応性部分はまた、ベンジル基などの、水素化分解によって除去可能な保護基によりブロックしてもよく、一方、アミン基は、Ｆｍｏｃなどの塩基不安定基によりブロックしてもよい。式（Ｉ）の化合物の合成のための特に有用なアミン保護基は、トリフルオロアセトアミドである。カルボン酸反応性部分は、２，４−ジメトキシベンジルなどの酸化的に除去可能な保護基でブロックしてもよく、一方、共存するアミノ基は、フッ化物に不安定なシリルカルバメートでブロックしてもよい。
【００２７】
アリルブロッキング基は、酸保護基及び塩基保護基の存在下で有用であるが、それは前者が安定性であり、金属またはπ酸触媒によって後から除去可能なためである。例えば、アリルでブロックされたカルボン酸は、酸不安定性ｔ−ブチルカルバメートまたは塩基不安定性酢酸アミン保護基の存在下で、パラジウム（０）触媒反応により脱保護される。保護基のさらに別の形態は、化合物または中間体が結合し得る樹脂である。残基が樹脂に結合している限り、その官能基はブロックされ、反応することができない。一旦、樹脂から遊離すると、官能基は、反応可能となる。
【００２８】
用語「核酸塩基」、「塩基対形成部分」、「核酸塩基対形成部分」、または「塩基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、及び／またはモルホリノサブユニットの複素環部分を指す。核酸塩基は、天然型、または修飾型またはこれらの天然核酸塩基の類似体であってもよく、例えば、核酸塩基の１つ以上の窒素原子を、それぞれ独立して、出現ごとに炭素に置換してもよい。例示的な類似体として、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基成分）、２，６−ジアミノプリン；５−メチルシトシン；Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン；１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇクランプ）などが挙げられる。
【００２９】
塩基対形成部分のさらなる例として、アシル保護基によって保護されたそれぞれのアミノ基を有するウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニン及びヒポキサンチン、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、シュードイソシトシン及びシュードウラシルなどのピリミジン類似体、ならびに８−置換プリン、キサンチン、またはヒポキサンチンなどの他の修飾核酸塩基（後者の２つは天然分解産物）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾核酸塩基は、Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，ＲＮＡ，２００３，９，１０３４−１０４８，Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌに開示された。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３−２１９６  ａｎｄ  Ｒｅｖａｎｋａｒ  ａｎｄ  Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示されている修飾核酸塩基も企図され、その内容は参照により本明細書に援用される。
【００３０】
塩基対形成部分のさらなる例として、１つ以上のベンゼン環が付加された拡張サイズの核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔａｌｏｇ  （ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＡＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１−１５０；Ｋｏｏｌ，  ＥＴ，  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６−９４３；Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３−５４３；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３−７３３；Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２−６２７に記載されている核酸塩基の置換（その内容は参照により本明細書に援用される）は、本明細書に記載のオリゴマーの合成に有用であると考えられる。拡張サイズの核酸塩基の例を以下に示す：
【化２４】
2021532784.tif 000025
【００３１】
用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」とは、複数の連結されたヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオシドとヌクレオチドの両方の組み合わせを含む化合物を指す。本明細書中に提供する特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドはモルホリノオリゴヌクレオチドである。
【００３２】
語句「モルホリノオリゴヌクレオチド」または「ＰＭＯ」とは、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’−環外炭素に結合する、ホスホルアミデートまたはホスホロジアミデート結合によって一緒に連結されたモルホリノサブユニットを有する修飾オリゴヌクレオチドを指す。各モルホリノサブユニットは、核酸塩基特異的水素結合による標的中の核酸塩基への結合に有効な核酸塩基対形成部分を含む。
【００３３】
用語「アンチセンスオリゴマー」、「アンチセンス化合物」及び「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、同じ意味で使用され、サブユニット間結合によって連結したそれぞれが塩基対形成部分を有する一連のサブユニットを指し、塩基対形成部分は、ワトソン−クリック型塩基対形成によって核酸（通常はＲＮＡ）の標的配列にハイブリダイズして標的配列内に核酸：オリゴマーのヘテロ二本鎖を形成することができる。オリゴマーは、標的配列に対して正確な（完全な）または近しい（十分な）配列相補性を有していてもよく；オリゴマーの末端近くの配列が異なっていることは、内側が異なっているよりも一般的に好ましい。
【００３４】
そのようなアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳を遮断もしくは阻害するか、または天然もしくは異常なプレｍＲＮＡスプライスプロセシングを阻害／変更するように設計することができ、それがハイブリダイズする標的配列に対して「指向する」または「標的とする」と言及され得る。標的配列は、通常、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、またはプロセシング前のｍＲＮＡのスプライス部位、スプライス抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含む領域である。スプライス部位の標的配列は、プロセシング前のｍＲＮＡの通常のスプライスアクセプター接合部から１〜約２５塩基対下流に５’末端を有するｍＲＮＡ配列を含み得る。様々な実施形態において、標的配列は、スプライス部位を含むか、または完全にエキソンコード配列内に含まれるか、またはスプライスアクセプター部位もしくはドナー部位にまたがる、プロセシング前のｍＲＮＡの任意の領域であり得る。オリゴマーは、上記の方法で標的の核酸に対して標的化される場合、タンパク質、ウイルス、または細菌などの生物学的に関連する標的に対して「標的化される」と、より一般的に言及される。
【００３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡは、各分子内の十分な数の対応する位置が互いに水素結合可能なヌクレオチドによって占められ、それによりオリゴヌクレオチドと標的との間で安定かつ特異的な結合が生じる場合、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」とは、オリゴヌクレオチドと標的との間で安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性または正確なペアリングを示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列に対して１００％相補的である必要はないことが当技術分野で理解されている。標的分子へのオリゴヌクレオチドの結合が標的ＲＮＡの正常な機能を妨害し、特異的結合が望まれる条件下で、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合には生理学的条件下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイを実施する条件下で、非標的配列へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。
【００３６】
オリゴヌクレオチドはまた、核酸塩基（当技術分野では多くの場合、単に「塩基」と呼ばれる）の改変または置換を含み得る。修飾または置換された塩基を含むオリゴヌクレオチドとして、核酸において最も一般的に認められる１つ以上のプリンまたはピリミジン塩基を、あまり一般的ではない、すなわち非天然の塩基に置換したオリゴヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、プリン塩基のＮ９原子、またはピリミジン塩基のＮ１原子において、ヌクレオチドまたはヌクレオシドのモルホリン環に共有結合している。
【００３７】
プリン塩基は、以下の一般式で記載されるように、イミダゾール環に融合したピリミジン環を含む：
【化２５】
2021532784.tif 000026
プリン
【００３８】
アデニンとグアニンは、核酸において最も一般的に認められる２つのプリン核酸塩基である。これらは、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニン、ヒポキサンチン、及び７−メチルグアニンを含むがこれらに限定されない他の天然プリンで置換してもよい。
【００３９】
ピリミジン塩基は、以下の一般式で記載されるように、６員のピリミジン環を含む：
【化２６】
2021532784.tif 000027
ピリミジン
【００４０】
シトシン、ウラシル、及びチミンは、核酸において最も一般的に認められるピリミジン塩基である。これらは、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、シュードウラシル、及び４−チオウラシルを含むがこれらに限定されない他の天然ピリミジンで置換してもよい。一実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ウラシルの代わりにチミン塩基を含む。
【００４１】
他の修飾塩基または置換塩基として、２，６−ジアミノプリン、オロト酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇクランプ及びその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、スーパーＴ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、スーパーＧ、スーパーＡ、ならびにＮ４−エチルシトシン、またはそれらの誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）、及びＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、シュードウラシルまたはそれらの誘導体；ならびに２，６−ジフルオロトルエンのような縮重塩基もしくはユニバーサル塩基、または脱塩基部位のような存在しない塩基（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、ｌ−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；または環の酸素を窒素に置換したピロリジン誘導体（アザリボース））が挙げられるが、これらに限定されない。シュードウラシルは、ウリジンのように通常のＮ−グリコシドではなくＣ−グリコシドを含む、天然の異性化バージョンのウラシルである。
【００４２】
特定の修飾核酸塩基または置換核酸塩基は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるために、特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、及び０−６置換プリンが含まれる。様々な実施形態において、核酸塩基は、５−メチルシトシン置換を含んでいてもよく、この置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されている。
【００４３】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基または置換核酸塩基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製を容易にするために有用である。例えば、特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、３つ以上（例えば、３、４、５、６またはそれ以上）の連続したグアニン塩基を含む場合がある。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、３つ以上の連続したグアニン塩基のストリングがオリゴヌクレオチドの凝集を引き起こし、精製が複雑になり得る。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、連続するグアニンの１つ以上をヒポキサンチンに置換することができる。３つ以上の連続するグアニン塩基のストリング中の１つ以上のグアニンをヒポキサンチンに置換することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドの凝集を低減し、それによって精製を容易にすることができる。
【００４４】
本明細書中で提供するオリゴヌクレオチドは、合成され、生物学的起源のアンチセンス組成物を含まない。本開示の分子はまた、取り込み、分布、もしくは吸収、またはそれらの組み合わせを支援するために、他の分子、分子構造、または化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤に、混合し、カプセル化し、複合体化し、さもなければ会合させてもよい。
【００４５】
用語「相補的な」及び「相補性」とは、塩基対合規則によって会合したオリゴヌクレオチド（すなわち、一連のヌクレオチド）を指す。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’−３’）」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ（５’−３’）」に相補的である。相補性は、塩基対合規則に従って核酸の塩基のうちのいくつかのみがマッチする「部分的」なものであってもよい。あるいは、核酸間の「完全な」、「全体的な」、または「完璧な」相補性があってもよい。核酸の鎖間の相補性の程度は、核酸の鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意な影響をもたらす。多くの場合、完全な相補性が望ましいが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに関して、１つ以上、ただし好ましくは６、５、４、３、２、または１つのミスマッチを含み得る。そのようなハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーの標的配列に対する「ほぼ」または「実質的な」相補性、及び正確な相補性で起こり得る。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の相補性で標的配列にハイブリダイズし得る。オリゴマー内の任意の位置でのバリエーションが含まれる。特定の実施形態では、オリゴマーの末端近くの配列のバリエーションは、内部におけるバリエーションよりも一般的に好ましく、存在する場合、通常、５’末端、３’末端、または両末端の約６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド内に存在する。
【００４６】
用語「ペプチド」とは、複数の連結されたアミノ酸を含む化合物を指す。本明細書中で提供するペプチドは、細胞透過性ペプチドであるとみなすことができる。
【００４７】
用語「細胞透過性ペプチド」及び「ＣＰＰ」とは、交換可能に使用され、輸送ペプチド、担体ペプチド、またはペプチド形質導入ドメインとも呼ばれる陽イオン性細胞透過性ペプチドを指す。本明細書中で提供するペプチドは、所与の細胞培養集団の１００％の細胞内で細胞透過を誘導する能力を有し、全身投与時に、ｉｎ  ｖｉｖｏで、複数の組織内で高分子の移行を可能にする。様々な実施形態において、本開示のＣＰＰ実施形態は、以下にさらに記載するように、アルギニンリッチなペプチドを含み得る。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、用語「キメラペプチド」とは、第１のペプチドまたはその断片である第１の部分を、異なるペプチドまたはその断片である第２の部分に融合したものを含むポリペプチドを指す。キメラペプチドは、２つ以上の共有結合したペプチドを含み得る。ペプチドを、アミノ酸側鎖、Ｎ末端、Ｃ末端、またはそれらの任意の組み合わせを介して共有結合させてもよい。特定の実施形態では、ペプチドを、一方のペプチドのＮ末端を介して他方のＣ末端に共有結合させる。特定の実施形態では、共有結合リンカーは、アミド結合である。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、用語「三量体ペプチド」とは、第１のペプチドまたはその断片である第１の部分を、異なるペプチドまたはその断片である第２の部分に融合し、それを異なるペプチドまたはその断片である第３の部分に融合したものを含むポリペプチドを指す。三量体ペプチドは、３つ以上の共有結合したペプチドを含み得る。ペプチドを、アミノ酸側鎖、Ｎ末端、Ｃ末端、またはそれらの任意の組み合わせを介して共有結合させてもよい。特定の実施形態では、ペプチドを、一方のペプチドのＮ末端を介して他方のＣ末端に共有結合させる。特定の実施形態では、共有結合リンカーは、アミド結合である。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、用語「両親媒性ペプチド」とは、本質的に荷電したアミノ酸と本質的に非荷電のアミノ酸が分離された領域を有するペプチドを指す。これらの領域は、それぞれ、親水性ペプチジルセグメント及び疎水性ペプチジルセグメントとして知られる。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、用語「オリゴアルギニンペプチド」とは、ペプチドが、すべてアルギニンからなるか、またはほとんどアルギニンアミノ酸残基からなるペプチドを指す。特定の実施形態では、ペプチドは、完全にアルギニンアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、ペプチドは、アミノヘキサン酸またはβアラニンなどであるがこれらに限定されないアミノ酸リンカーにより間隔を置いて配置された５０〜９９％のアルギニンアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、ペプチドは、アミノヘキサン酸またはβアラニンなどであるがこれらに限定されないアミノ酸リンカーにより間隔を置いて配置された７５％のアルギニンアミノ酸残基からなる。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、用語「核標的化ペプチド」とは、核輸送によってタンパク質を細胞核に輸送可能にする核局在化配列をペプチドが含むペプチドを指す。特定の実施形態では、この配列は、タンパク質表面に露出した１つ以上の正に荷電したアミノ酸からなる。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、用語「エンドソーム破壊ペプチド」とは、ペプチドが細胞の細胞質への薬剤の放出を支援し得るペプチドを指す。特定の実施形態では、この配列は、１つ以上の正に荷電したアミノ酸からなる。
【００５４】
用語「処置」とは、疾患を改善するために用いる１つ以上の特定の手順の適用を指す。特定の実施形態では、特定の手順は、１つ以上の医薬品の投与である。個体（例えば、ヒトなどの哺乳類）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然な経過を改変する試みにおいて使用する任意のタイプの介入である。処置には、医薬組成物の投与が含まれるが、これに限定されず、予防的に、または病理学的事象の開始後に、もしくは病因物質との接触後に実施してもよい。処置には、疾患または病態の症状または病状に対する任意の所望の効果が含まれ、例えば、処置しようとしている疾患または病態の１つ以上の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善が含まれ得る。処置には「予防的」処置も含まれ、処置しようとしている疾患もしくは病態の進行速度を低下させるか、その疾患もしくは病態の発症を遅延させるか、またはその発症の重症度を低下させることを目的とすることができる。
【００５５】
「有効量」または「治療有効量」とは、所望の治療効果を生成するのに有効な、哺乳類対象に単回投与または一連の投与の一部として投与するアンチセンスオリゴマーなどの治療化合物の量を指す。
【００５６】
用語「改善」とは、病態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度の低下を意味する。特定の実施形態では、改善は、病態または疾患の１つ以上の指標の進行の遅延または鈍化を含む。指標の重症度は、当業者に公知の主観的または客観的尺度によって判定してもよい。
【００５７】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される塩」とは、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって親オリゴヌクレオチドを修飾する、開示するオリゴヌクレオチドの誘導体を指す。適切な塩のリストは、その全体が参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８  ａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２（１９７７）に認められる。
【００５８】
三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体
本明細書において、三量体細胞透過性ペプチドに化学的に連結されたオリゴヌクレオチドを提供する。三量体細胞透過性ペプチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する。特に、三量体細胞透過性ペプチドには、両親媒性ペプチド、核標的化ペプチド、エンドソーム破壊ペプチド、キメラペプチド、環状ペプチド、二環式ペプチド、オリゴアルギニンペプチド、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００５９】
オリゴヌクレオチドはさらに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みをさらに増強する１つ以上のヘテロアルキル部分（例えば、ポリエチレングリコール）に化学的に結合することができる。例示的な一実施形態では、三量体細胞透過性ペプチドを、そのＮ末端またはＣ末端残基において、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両端に共有結合させる。
【００６０】
したがって、一態様では、本明細書において、式Ｉの三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体：
【化２７】
2021532784.tif 000028
（Ｉ）
またはその薬学的に許容される塩を提供し、
式中：
Ａ’が、−Ｎ（Ｈ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化２８】
2021532784.tif 000029
、及び
【化２９】
2021532784.tif 000030
から選択され、式中、
Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、式中、ｘが３〜１０であり、各アルキル基が、それぞれ独立して、出現ごとにＣ２−６−アルキルであり、
またはＲ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１−６−アルキル）−Ｒ６、−（Ｃ１−６−ヘテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−６−アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、及び
【化３０】
2021532784.tif 000031
であり、
式中、Ｒ６が、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２から選択されるか、またはＲ６が、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり、これらのそれぞれが、固体支持体に共有結合し；
各Ｒ１が、ＯＨ及び−Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）から独立して選択され、式中、各Ｒ３及びＲ４が、それぞれ独立して、出現ごとに−Ｃ１−６−アルキルであり；
各Ｒ２が、それぞれ独立して、出現ごとに、Ｈ、核酸塩基、及び化学保護基で官能化された核酸塩基から選択され、核酸塩基が、それぞれ独立して、出現ごとに、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ３−６−ヘテロ環を含み；
ｚが８〜４０であり；ならびに
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化３１】
2021532784.tif 000032
及び
【化３２】
2021532784.tif 000033
から選択され；
式中、
Ｑが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｒ７が、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、式中、Ｒ８が、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり；
Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３が、それぞれ独立して細胞透過性ペプチドであり、前記Ｐ１及びＰ２が、それぞれ少なくとも１つのシステインアミノ酸残基を含み、Ｐ２が、少なくとも１つのリジンを含み；
Ｊが、−Ｐ１−Ｌ１−Ｐ２−Ｌ２−Ｐ３−であり；
Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３が、それぞれ独立して細胞透過性ペプチドであり、式中、Ｐ１及びＰ２が、少なくとも１つの末端または内部システイン残基をそれぞれ含み、Ｐ２が、少なくとも１つの末端または内部リジン残基を含み；
Ｌ１が、
【化３３】
2021532784.tif 000034
であり、
Ｍが、
【化３４】
2021532784.tif 000035
、
【化３５】
2021532784.tif 000036
、または
【化３６】
2021532784.tif 000037
であり、
Ｒ１０が、それぞれ独立して、出現ごとに、Ｈまたはハロゲンであり、
Ｌ１が、Ｐ１及びＰ２の末端または内部システインの側鎖に共有結合的に連結し；
Ｌ２が、−（ＣＨ２）１−６−Ｃ１−６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−であり、Ｌ２が、Ｐ２の末端または内部リジン側鎖に共有結合し、Ｐ３のアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結し；
Ｇが、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、及びステアロイルから選択され、式中、Ｇが、Ｊのカルボキシ末端に共有結合し；及び
以下の条件のうちの少なくとも１つが当てはまる；
１）Ａ’が
【化３７】
2021532784.tif 000038
であるか；または２）Ｅ’が
【化３８】
2021532784.tif 000039
である。
【００６１】
一実施形態では、Ｐ１及びＰ２は、それぞれ少なくとも１つのシステインアミノ酸残基を含み、その場合、元のアミノ酸残基の１つをシステインアミノ酸残基で置換した。
【００６２】
別の実施形態では、Ｐ１及びＰ２は、それぞれ少なくとも１つのシステインアミノ酸残基を含み、その場合、システインアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基への追加的な残基である。
【００６３】
一実施形態では、Ｐ２は、少なくとも１つのリジンアミノ酸残基を含み、その場合、元のアミノ酸残基の１つをリジンアミノ酸残基で置換した。
【００６４】
別の実施形態では、Ｐ２は、少なくとも１つのリジンアミノ酸残基を含み、その場合、リジンアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基への追加的な残基である。
【００６５】
一実施形態では、ｚは８〜３０である。別の実施形態では、ｚは１０〜３０である。さらなる実施形態では、ｚは１５〜２５である。別の実施形態では、ｚは２０〜２５である。一実施形態では、ｚは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０である。
【００６６】
さらに別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、及び
【化３９】
2021532784.tif 000040
から選択される。
【００６７】
別の実施形態では、Ａ’は、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化４０】
2021532784.tif 000041
、
【化４１】
2021532784.tif 000042
、及び
【化４２】
2021532784.tif 000043
から選択される。
【００６８】
さらに別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、４−メトキシトリチル、及び
【化４３】
2021532784.tif 000044
から選択される。
【００６９】
さらに別の実施形態では、Ａ’は、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化４４】
2021532784.tif 000045
、及び
【化４５】
2021532784.tif 000046
から選択され；ならびに
Ｅ’は
【化４６】
2021532784.tif 000047
である。
【００７０】
別の実施形態では、Ａ’は、
【化４７】
2021532784.tif 000048
であり、
Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイル、及びステアロイルから選択される。
【００７１】
一実施形態では、式Ｉの三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体は、式Ｉａのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド複合体である：
【化４８】
2021532784.tif 000049
（Ｉａ）。
【００７２】
一実施形態では、式Ｉのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド複合体は、式Ｉｂのキメラペプチド−オリゴヌクレオチド複合体であり：
【化４９】
2021532784.tif 000050
（Ｉｂ）
式中、Ｅ’が、Ｈ、Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、及びステアロイルから選択される。
【００７３】
一実施形態では、細胞透過性ペプチドのそれぞれは、独立して、両親媒性ペプチド、核標的化ペプチド、エンドソーム破壊ペプチド、キメラペプチド、環状ペプチド、二環式ペプチド、またはオリゴアルギニンペプチドである。
【００７４】
別の実施形態では、Ｐ１は両親媒性ペプチドである。
【００７５】
さらに別の実施形態では、Ｐ２は核標的化ペプチドである。
【００７６】
さらに別の実施形態では、両親媒性ペプチドは、疎水性ペプチジルセグメント及び親水性ペプチジルセグメントを含み、疎水性ペプチジルセグメントは、独立して、グリシン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンから選択される２〜１０アミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントは、独立して、荷電アミノ酸、非荷電であるが極性のアミノ酸、または疎水性アミノ酸から選択される２〜２０アミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントは、少なくとも１つの非疎水性アミノ酸を含む。
【００７７】
一実施形態では、親水性ペプチジルセグメントは、独立して、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、またはグリシンから選ばれる２〜２０アミノ酸の配列を含み、その場合、親水性ペプチジルセグメントは、少なくとも１つの非疎水性アミノ酸を含む。
【００７８】
別の実施形態では、Ｐ１は、ペネトラチン、ｐＶＥＣ、ＴＰ１０、またはＤＰＶ６である。
【００７９】
さらに別の実施形態では、Ｐ２は、ＫＲＶＫ、ＳＶ４０、またはＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢである。
【００８０】
さらなる実施形態では、Ｐ３は、ＤＰＶ６、ＰＰＣ３、ＰＰＣ５、Ｒ１２、Ｒ１２フルサイクル、Ｒ１２  Ｎサイクル、Ｒ１２  Ｃサイクル、Ｒ１２ベンジルバイサイクル、Ｒ１２ダブルサイクル、Ｂｐｅｐ、Ｂｐｅｐフルサイクル、Ｂｐｅｐ  Ｃサイクル、ペネトラチン（ｎｌｅ）、エングレイルドＮサイクル、エングレイルドＣサイクル、エングレイルドフルサイクル、ｐＶＥＣ、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ、ＡＩＰ６フルサイクル、メリチン−Ｂｐｅｐ、Ｂｈ３ヘリックス、Ｂａｃ７、ブフォリン２、メリチン、ＳｙｎＢ１、Ｓ４１３−ＰＶｒｅｖ、リボトキシン２Ｌ３、ＰｒｅＳ２−ＴＬＭ、ＭＡＰ、Ｗ／Ｒ、ＭＡＰ１２、ＳＡＰ、ＳＶＭ１、ＳＶＭ３、ＳＶＭ４、ＹＴＡ４、４３９ａ、ＨｏｘＡ１３セリン２、Ｂｉｐ、ＰＰＲ３、ＰＰＲ４、ＡＩＰ６、ＤＰＶ１５ｂ、ＴＡＴ、ペネトラチン、Ｒ９、ＨｏｘＡ１３セリン１、ＫＲＶＫ  ＴＰ１０、ＴＰ１０  ＫＲＶＫ、またはＳＶ４０  ＴＰ１０である。
【００８１】
一実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６である。
【００８２】
別の実施形態では、Ｐ３は、ＤＰＶ６、Ｂｐｅｐ、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ、ブフォリン２、ＳｙｎＢ１、Ｗ／Ｒ、またはＡＩＰ６である。
【００８３】
さらに別の実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６であり、Ｐ２はＳＶ４０であり、及びＰ３は、ＤＰＶ６、Ｂｐｅｐ、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ、ブフォリン２、ＳｙｎＢ１、Ｗ／Ｒ、またはＡＩＰ６である。
【００８４】
さらなる実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６であり、Ｐ２はＳＶ４０であり、及びＰ３はｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐである。
【００８５】
一実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６であり、Ｐ２はＳＶ４０であり、及びＰ３はＷ／Ｒである。
【００８６】
別の実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６であり、Ｐ２はＳＶ４０であり、及びＰ３はＳｙｎＢ１である。
【００８７】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの実施形態において、各Ｒ１は、Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００８８】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ２は核酸塩基であり、核酸塩基は、それぞれ独立して、出現ごとに、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ４−６−ヘテロ環の環を含む。
【００８９】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、各Ｒ２は核酸塩基であり、核酸塩基は、それぞれ独立して、出現ごとに、ピリミジン、プリン、及びデアザ−プリンから選択されるＣ４−６−ヘテロ環の環を含む。
【００９０】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ２は、それぞれ独立して、出現ごとに、アデニン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンから選択される核酸塩基である。
【００９１】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ２は、それぞれ独立して、出現ごとに、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンから選択される核酸塩基である。
【００９２】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−ＤＢＣＯ−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−である。
【００９３】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｌは
【化５０】
2021532784.tif 000051
である。
【００９４】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｍは
【化５１】
2021532784.tif 000052
である。
【００９５】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、Ｍは
【化５２】
2021532784.tif 000053
である。
【００９６】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｌ１は、Ｐ１及びＰ２の末端システインの側鎖に共有結合して構造：
【化５３】
2021532784.tif 000054
を形成する。
【００９７】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｌ２は、Ｐ２の末端リジンの側鎖に共有結合し、Ｐ３のアミノ末端にアミド結合によって共有結合して構造：
【化５４】
2021532784.tif 000055
を形成する。
【００９８】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、及びステアロイルから選択される。
【００９９】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、Ｇは、Ｈ、または−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１００】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、ＧはＨである。
【０１０１】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの別の実施形態では、Ｇは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１０２】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのさらに別の実施形態では、三量体オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体は、非複合体化オリゴヌクレオチドと比較して、取り込みにおいて少なくとも２０倍の向上を示す。
【０１０３】
一実施形態では、三量体オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体は、非三量体型オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体と比較して、取り込みにおいて少なくとも３倍の向上を示す。
【０１０４】
別の実施形態では、三量体オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体は、対応する非三量体型ペネトラチン−ペプチド複合体と比較して、取り込みの向上を示す。
【０１０５】
本開示の代表的なペプチド−オリゴヌクレオチド複合体には、とりわけ、以下の構造の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体：
【化５５】
2021532784.tif 000056
（ＩＶ）
またはその薬学的に許容される塩が含まれ、式中、
Ｇが、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり；
Ｒ２が、それぞれ独立して、出現ごとに、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンから選択される核酸塩基であり；
Ｋが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１−６−Ｃ７−１５−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１−６Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｍが、
【化５６】
2021532784.tif 000057
、
【化５７】
2021532784.tif 000058
、または
【化５８】
2021532784.tif 000059
であり、
Ｒ１０が、それぞれ独立して、出現ごとに、Ｈまたはハロゲンであり、Ｌ１が、Ｐ１及びＰ２の末端または内部システインの側鎖に共有結合し；
ｚが８〜４０であり；ならびに
Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３が、それぞれ独立して細胞透過性ペプチドであり、Ｐ１及びＰ２が、それぞれ少なくとも１つのシステインアミノ酸残基を含み、細胞透過性ペプチドの各々が、独立して、両親媒性ペプチド、核標的化ペプチド、エンドソーム破壊ペプチド、キメラペプチド、環状ペプチド、二環式ペプチド、またはオリゴアルギニンペプチドである。
【０１０６】
一実施形態では、式（ＩＶ）の構造は式（ＩＶａ）である：
【化５９】
2021532784.tif 000060
（ＩＶａ）
【０１０７】
本開示の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の一実施形態では、ＧはＨである。
【０１０８】
本開示の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の別の実施形態では、Ｇは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体は、溶媒和されていない。他の実施形態では、１つ以上の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体は、溶媒和形態である。当技術分野で公知のように、溶媒和物は、水、エタノールなどのような薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。
【０１１０】
式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩａ及びＩＶの三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体をそれらの中性形態で示すが、いくつかの実施形態では、これらのペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を、薬学的に許容される塩の形態で使用する。
【０１１１】
オリゴヌクレオチド
モルホリノベースのサブユニットの重要な特性には：１）安定した、非荷電の、または正に荷電したバックボーン結合によってオリゴマー形態で連結する能力；２）形成されるポリマーが、標的ＲＮＡを含む標的核酸の相補的塩基とハイブリダイズできるようにヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、５−メチル−シトシン及びヒポキサンチン）をサポートする能力、比較的短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜１５塩基）で約４５℃を超えるＴＭ値；３）オリゴヌクレオチドを哺乳類細胞に能動的または受動的に輸送する能力；ならびに４）オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二本鎖が、それぞれＲＮＡｓｅ及びＲＮａｓｅ  Ｈ分解に抵抗する能力が含まれる。
【０１１２】
オリゴマーと標的配列との間に形成される二本鎖の安定性は、結合ＴＭ及び細胞内での酵素的切断に対する二本鎖の感受性の関数である。相補配列ＲＮＡに対するオリゴマーのＴＭは、Ｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５，ｐｐ．１０７−１０８に記載されているように、またはＭｉｙａｄａ  Ｃ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒ．Ｂ．，１９８７，Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４  ｐｐ．９４−１０７に記載されているように、従来の方法により測定してもよい。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、相補配列ＲＮＡに関して、体温よりも高く、いくつかの実施形態では、約４５℃または５０℃よりも高い結合ＴＭを有し得る。６０〜８０℃以上の範囲のＴＭもまた、含まれる。周知の原理によれば、相補性に基づくＲＮＡハイブリッドに関するオリゴマーのＴＭは、二本鎖のＣ：Ｇ塩基対の塩基の比率を増やすか、もしくはヘテロ二本鎖の長さ（塩基対）を増加するか、またはその両方によって高めることができる。同時に、細胞への取り込みを最適化する目的で、オリゴマーのサイズを制限することが有効な場合がある。このため、本開示の化合物には、２５塩基以下の長さで高いＴＭ（４５〜５０℃以上）を示す化合物が含まれる。
【０１１３】
オリゴヌクレオチドの長さは、それがプレｍＲＮＡ分子内の意図された位置に選択的に結合可能である限り、様々に異なっていてもよい。そのような配列の長さは、本明細書に記載の選択手順に従って決定することができる。一般的に、オリゴヌクレオチドは、長さが約８ヌクレオチド〜最大約５０ヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドの長さ（ｚ）は、８〜３８、８〜２５、１５〜２５、１７〜２１、または約１８であり得る。しかしながら、この範囲内の任意の長さのヌクレオチドを、本明細書に記載の方法で使用し得ることが理解されるであろう。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基修飾または置換を含む。例えば、特定の核酸塩基を選択して、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させてもよい。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン及び２，６−ジアミノプリンを含むＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込んでもよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのピリミジン塩基は、５−置換ピリミジン塩基を含み、ピリミジン塩基は、シトシン、チミン及びウラシルからなる群から選択される。一実施形態では、５−置換ピリミジン塩基は、５−メチルシトシンである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのプリン塩基には、Ｎ−２，Ｎ−６置換プリン塩基が含まれる。一実施形態では、Ｎ−２，Ｎ−６置換プリン塩基は、２，６−ジアミノプリンである。
【０１１５】
モルホリノベースのオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，６９８，６８５号；第５，２１７，８６６号；第５，１４２，０４７号；第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，５２１，０６３号；第５，５０６，３３７号及び係属中の米国特許出願第１２／２７１，０３６号；第１２／２７１，０４０号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ／２００９／０６４４７１号及びＷＯ／２０１２／０４３７３０号ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，１８７−１９５に詳述されている。
【０１１６】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂの実施形態では、Ｒ２は、それぞれ独立して、出現ごとに、アデニン、２，６−ジアミノプリン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシル、及びヒポキサンチンであり；及び
各Ｒ１は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０１１７】
本明細書に記載のヌクレオチド部分の様々な実施形態を表１に提供する。
【表１】
2021532784.tif 000061
【０１１８】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列リストは、ＧＣＴＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧ（配列番号５６）である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、溶媒和されていない。他の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、溶媒和形態である。当技術分野で公知のように、溶媒和物は、水、エタノールなどのような薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。
【０１２０】
式Ｉ、Ｉａ、及びＩｂのオリゴヌクレオチドを、それらの中性形態で示すが、いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容される塩の形態で使用する。
【０１２１】
三量体ペプチド
本明細書中で提供するオリゴヌクレオチドは、三量体ペプチドに複合体化したオリゴヌクレオチド部分を含む。特に、三量体ペプチドは、３つの共有結合した細胞浸透性ペプチドを含み、３つの細胞浸透性ペプチドは、独立して、両親媒性ペプチド、核標的化ペプチド、エンドソーム破壊ペプチド、キメラペプチド、環状ペプチド、二環式ペプチド、またはオリゴアルギニンペプチドである。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、３つの細胞透過性ペプチドは、１つの両親媒性ペプチド、１つの核標的化ペプチド、及び１つの追加の細胞透過性ペプチドを含み、両親媒性ペプチドは三量体ペプチドのＮ末端にあり、核標的化ペプチドは中間ペプチドであり、追加の細胞透過性ペプチドは、三量体ペプチドのＣ末端にある。
【０１２３】
そのような三量体ペプチドの代表を以下に示し：
【化６０】
2021532784.tif 000062
式中、Ｎ末端はオリゴヌクレオチドに共有結合している。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、三量体ペプチドは、細胞への化合物の輸送を増強するのに効果的であり得る。輸送部分は、いくつかの実施形態では、オリゴマーの末端に結合させる。ペプチドは、所与の細胞培養集団の、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％（中間のすべての数値を含む）の細胞内で細胞透過を誘導する能力を有し、全身投与時に、ｉｎ  ｖｉｖｏで、複数の組織内で高分子の移行を可能にする。
【０１２５】
上記の輸送部分は、結合させた輸送部分の非存在下でのオリゴマーの取り込みと比較して、結合させたオリゴマーの細胞への進入を大幅に増強することが示されている。取り込みは、非複合体化化合物と比較して、少なくとも３倍、及びいくつかの実施形態では５０倍増強され得る。いくつかの実施形態では、取り込みは、非三量体型オリゴヌクレオチド−ペプチド複合体と比較して、増強され得、いくつかの実施形態では、３倍に増強され得る。
【０１２６】
本開示の実施において、三量体ペプチドの使用は特に有用である。特定の三量体ペプチドトランスポーターは、筋肉細胞を含む一次細胞へのアンチセンス化合物の送達に非常に効果的であることが示されている。さらに、本明細書に記載の三量体ペプチドトランスポーターは、アンチセンスＰＭＯに複合体化した場合、いくつかの遺伝子転写産物のスプライシングを変化させる能力が増強されることを示す。
【０１２７】
したがって、一態様では、本明細書において、３つの共有結合した細胞透過性ペプチドである三量体ペプチド、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０１２８】
一実施形態では、各三量体ペプチドは、３つの共有結合した細胞透過性ペプチドであり、細胞透過性ペプチドは、独立して、両親媒性ペプチド、核標的化ペプチド、エンドソーム破壊ペプチド、キメラペプチド、環状ペプチド、二環式ペプチド、またはオリゴアルギニンペプチドである。
【０１２９】
別の実施形態では、各三量体ペプチドは、３つの共有結合した細胞透過性ペプチドであり、細胞透過性ペプチドの１つは両親媒性ペプチドであり、細胞透過性ペプチドの１つは核標的化ペプチドであり、ペプチドの１つは追加の細胞透過性ペプチドである。
【０１３０】
さらに別の実施形態では、各三量体ペプチドは、３つの共有結合した細胞透過性ペプチドであり、３つの細胞透過性ペプチドは、１つの両親媒性ペプチド、１つの核標的化ペプチド、及び１つの追加の細胞透過性ペプチドを含み、その場合、両親媒性ペプチドが三量体ペプチドのＮ末端、核標的化ペプチドが中間ペプチド、そして追加の細胞透過性ペプチドが三量体ペプチドのＣ末端である。
【０１３１】
さらに別の実施形態では、両親媒性ペプチドは、疎水性ペプチジルセグメント及び親水性ペプチジルセグメントを含み、疎水性ペプチジルセグメントは、独立して、グリシン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンから選択される２〜１０アミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントは、独立して、荷電アミノ酸、非荷電であるが極性のアミノ酸、または疎水性アミノ酸から選択される２〜２０アミノ酸の配列を含み、親水性ペプチジルセグメントは、少なくとも１つの非疎水性アミノ酸を含む。
【０１３２】
一実施形態では、親水性ペプチジルセグメントは、独立して、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、またはグリシンから選ばれる２〜２０アミノ酸の配列を含み、その場合、親水性ペプチジルセグメントは、少なくとも１つの非疎水性アミノ酸を含む。
【０１３３】
別の実施形態では、Ｐ１は、ペネトラチン、ｐＶＥＣ、ＴＰ１０、またはＤＰＶ６である。
【０１３４】
さらに別の実施形態では、Ｐ２は、ＫＲＶＫ、ＳＶ４０、またはＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢである。
【０１３５】
さらなる実施形態では、Ｐ３は、ＤＰＶ６、ＰＰＣ３、ＰＰＣ５、Ｒ１２、Ｒ１２フルサイクル、Ｒ１２  Ｎサイクル、Ｒ１２  Ｃサイクル、Ｒ１２ベンジルバイサイクル、Ｒ１２ダブルサイクル、Ｂｐｅｐ、Ｂｐｅｐフルサイクル、Ｂｐｅｐ  Ｃサイクル、ペネトラチン（ｎｌｅ）、エングレイルドＮサイクル、エングレイルドＣサイクル、エングレイルドフルサイクル、ｐＶＥＣ、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ、ＡＩＰ６フルサイクル、メリチン−Ｂｐｅｐ、Ｂｈ３ヘリックス、Ｂａｃ７、ブフォリン２、メリチン、ＳｙｎＢ１、Ｓ４１３−ＰＶｒｅｖ、リボトキシン２Ｌ３、ＰｒｅＳ２−ＴＬＭ、ＭＡＰ、Ｗ／Ｒ、ＭＡＰ１２、ＳＡＰ、ＳＶＭ１、ＳＶＭ３、ＳＶＭ４、ＹＴＡ４、４３９ａ、ＨｏｘＡ１３セリン２、Ｂｉｐ、ＰＰＲ３、ＰＰＲ４、ＡＩＰ６、ＤＰＶ１５ｂ、ＴＡＴ、ペネトラチン、Ｒ９、ＨｏｘＡ１３セリン１、ＫＲＶＫ  ＴＰ１０、ＴＰ１０  ＫＲＶＫ、またはＳＶ４０  ＴＰ１０である。
【０１３６】
一実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６である。
【０１３７】
別の実施形態では、Ｐ３は、ＤＰＶ６、Ｂｐｅｐ、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ、ブフォリン２、ＳｙｎＢ１、Ｗ／Ｒ、またはＡＩＰ６である。
【０１３８】
さらに別の実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６であり、Ｐ２はＳＶ４０であり、及びＰ３は、ＤＰＶ６、Ｂｐｅｐ、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐ、ブフォリン２、ＳｙｎＢ１、Ｗ／Ｒ、またはＡＩＰ６である。
【０１３９】
さらなる実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６であり、Ｐ２はＳＶ４０であり、及びＰ３はｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐである。
【０１４０】
一実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６であり、Ｐ２はＳＶ４０であり、及びＰ３はＷ／Ｒである。
【０１４１】
別の実施形態では、Ｐ１はＤＰＶ６であり、Ｐ２はＳＶ４０であり、及びＰ３はＳｙｎＢ１である。
【０１４２】
変数Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３のための様々な実施形態を、表２に提供する：
【表２−１】
2021532784.tif 000063
【表２−２】
2021532784.tif 000064
【表２−３】
2021532784.tif 000065
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の三量体ペプチドは、溶媒和されていない。他の実施形態では、１つ以上のキメラペプチドは溶媒和形態である。当技術分野で公知のように、溶媒和物は、水、エタノールなどのような薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。
【０１４４】
三量体ペプチドを、それらの中性形態で示すが、いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容される塩の形態で使用する。
【０１４５】
方法
本明細書において、対象に式Ｉ、Ｉａ、またはＩｂのペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を投与することを含む、それを必要とする対象における神経筋疾患、筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染の治療方法を提供する。
【０１４６】
したがって、一態様では、本明細書において、対象に本開示のキメラペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を投与し、それを必要とする対象における筋肉疾患、ウイルス感染症、神経筋疾患、または細菌感染症の治療方法を提供する。
【０１４７】
一実施形態では、神経筋疾患はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。
【０１４８】
別の実施形態では、ウイルス感染は、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、及びデングウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。
【０１４９】
別の実施形態では、細菌感染はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる。
【０１５０】
本明細書中で考慮される「対象」は、通常、ヒトである。しかしながら、対象は、治療が望まれる任意の哺乳類であり得る。したがって、本明細書に記載の方法は、ヒト及び獣医学の両方の用途に適用することができる。
【０１５１】
投与／用量
治療用組成物の製剤化及びそれらのその後の投与（投薬）は、当業者の技術の範囲内である。投薬は、処置する疾患状態の重症度及び応答性に依存し、一連の処置を、数日〜数か月間、または疾患状態の減少が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定値から計算することができる。
【０１５２】
当業者であれば、最適な用量、投与方法、及び繰返し数を容易に決定することができる。最適用量は、個々のオリゴマーの相対的効力に応じて様々に異なる場合があり、一般的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であることが認められているＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般的に、用量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年１回以上、または２〜２０年に１回投与してもよい。当業者であれば、体液または組織中の薬物の測定した滞留時間及び濃度に基づいて、投薬の繰返し数を容易に推定することができる。処置が成功した後、疾患状態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが望ましく、その場合、オリゴマーを、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの維持用量の範囲で１日１回以上〜２０年に１回、投与する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、式Ｉ、Ｉａ、またはＩｂの三量体複合体を、単独で投与する。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、式Ｉ、Ｉａ、またはＩｂの三量体複合体を、治療有効量または治療有効用量で投与する。「治療有効量」は、それ自体で患者に投与する場合に、筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染を効果的に治療する、式Ｉ、Ｉａ、またはＩｂの三量体複合体の量である。特定の対象について、所与の場合に「治療有効量」であることが証明される量は、そのような用量が担当医によって「治療有効量」とみなされても、検討中の疾患または病態に対して同様に処置される対象の１００％に対して有効ではない可能性がある。治療有効量に対応するオリゴヌクレオチドの量は、疾患の種類、疾患の病期、治療を受けている患者の年齢、及びその他の事実に強く依存する。
【０１５５】
異なる実施形態において、式Ｉ、Ｉａ、またはＩｂの三量体複合体及び使用する有効量に応じて、オリゴヌクレオチドは、筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染に関与する遺伝子の発現を調節することができる。
【０１５６】
式Ｉ、Ｉａ、またはＩｂの三量体複合体の量は、筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染の効果的な治療をもたらすはずであるが、その量は、好ましくは、患者に対して過度に毒性ではない（すなわち、その量は、医療ガイドラインによって確立された毒性限界内であることが好ましい）。いくつかの実施形態では、筋肉疾患、ウイルス感染、または細菌感染の過剰な毒性を予防するか、より効果的な治療を提供するか、またはその両方を提供するために、総投与量に制限を設ける。通常、本明細書中で考慮する量は１日あたりであり；しかしながら、本明細書中では、半日及び２日または３日サイクルも考慮する。
【０１５７】
筋肉疾患、ウイルス感染症、または細菌感染症を治療するために、異なる投与レジメンを使用してもよい。いくつかの実施形態では、日用量、例えば、上記の例示的な用量のいずれかを、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間にわたって、１日１回、２回、３回、３回、または４回投与する。治療する疾患の病期及び重症度に応じて、高用量でより短い治療時間（例えば、最大５日）、または低用量でより長い治療時間（例えば、１０日以上、または数週間、または１か月、またはそれ以上）を採用してもよい。いくつかの実施形態では、１日１回または２回の用量を、１日おきに投与する。
【０１５８】
式Ｉ、Ｉａ、もしくはＩｂの三量体複合体、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の形態は、純粋な形態または適切な医薬組成物で、当技術分野で公知の許容される投与様式または薬剤のいずれかを介して投与することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、経口、経鼻、非経口（静脈内、筋肉内、または皮下）、局所、経皮、膣内、膀胱内、槽内、または直腸に投与することができる。剤形は、例えば、正確な用量の単純投与に適した単位剤形での、例えば、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体剤形、例えば、錠剤、丸薬、軟質弾性カプセルまたは硬質ゼラチンカプセル、散剤、溶液、懸濁液、坐剤、エアロゾルなどであり得る。特定の投与経路の１つは、経口投与であり、特に、治療する疾患の重症度によって好都合な日用量レジメンを調節することができる経口投与である。
【０１５９】
助剤及びアジュバント剤には、保存剤、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、乳化剤、及び分散剤が含まれ得る。微生物の作用の予防は、一般的に、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって提供される。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤も組成物中に含ませてよい。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。助剤にはまた、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び抗酸化剤、例えば、クエン酸、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、ブチル化ヒドロキシトルエンなどが含まれ得る。
【０１６０】
上述の固体剤形は、コーティング及びシェル、例えば、腸溶コーティングならびに当技術分野で周知の他のものを用いて調製することができる。これらには、鎮静剤を含有させることができ、また、これらは、腸管の特定の部分において、活性オリゴヌクレオチドを遅延様式で放出するような組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質及びワックスである。活性オリゴヌクレオチドはまた、適切な場合、上述の賦形剤のうちの１つ以上を含むマイクロカプセル化形態であり得る。
【０１６１】
経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ剤、及びエリキシル剤が含まれる。そのような剤形は、例えば、本明細書に記載の複合体、またはその薬学的に許容される塩、及び場合により薬学的アジュバントを、担体、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど；可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；油、特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ならびにソルビタンの脂肪酸エステル；またはこれらの物質の混合物などに対して、溶解、分散などを行い、それによって溶液または懸濁液を形成することによって調製される。
【０１６２】
一般的に、意図する投与様式に応じて、薬学的に許容される組成物は、約１重量％〜約９９重量％の本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容される塩、及び９９重量％〜１重量％の薬学的に許容される賦形剤を含む。一例では、組成物は、約５重量％〜約７５重量％の本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容される塩と、その残りが適切な薬学的賦形剤である。
【０１６３】
そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者には公知であるかまたは明らかであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）を参照のこと。
【０１６４】
キット
他の実施形態では、キットを提供する。本開示によるキットは、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、または本開示の組成物を含むパッケージ（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、式Ｉ、Ｉａ、またはＩｂによるペプチド−オリゴヌクレオチド複合体、またはその薬学的に許容される塩を含む。
【０１６５】
語句「パッケージ」とは、本明細書に提示のオリゴヌクレオチドまたは組成物を含む任意の容器を意味する。いくつかの実施形態では、パッケージは、箱または包装であり得る。医薬品のパッケージに使用する包装材料は当業者に周知である。医薬品包装材料の例として、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、袋、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、ならびに選択した製剤及び意図する投与様式及び処置様式に好適な任意の包装材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６６】
キットには、パッケージ内に含めないが、パッケージの外側に取り付けるアイテム、例えば、ピペットを含ませることもできる。
【０１６７】
キットは、本開示のオリゴヌクレオチドまたは組成物を患者に投与するための説明書をさらに含み得る。キットにはまた、米国食品医薬品局などの規制当局による本明細書のオリゴヌクレオチドの承認された使用に関する説明書を含ませることができる。キットにはまた、オリゴヌクレオチドのラベルまたは製品インサートを含ませることができる。パッケージ（複数可）もしくは製品インサート（複数可）、またはその両方は、それ自体が規制当局によって承認され得る。キットには、パッケージ内の固相または液相（例えば、提供する緩衝液）中のオリゴヌクレオチドを含ませることができる。キットには、方法を実行するための溶液を調製するための緩衝液、及びある容器から別の容器に液体を移すためのピペットを含ませることができる。
【０１６８】
三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の調製プロセス
別の態様では、本明細書において、本出願に記載の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の調製プロセスを提供する。特に、本明細書において、式（ＩＩ）の三量体ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の調製プロセスを提供し：
【化６１】
2021532784.tif 000066
（ＩＩ）
プロセスは：
（ａ）式（ＩＩＩ）の化合物
【化６２】
2021532784.tif 000067
（ＩＩＩ）
を、式（ＩＶ）の化合物
【化６３】
2021532784.tif 000068
（ＩＶ）
と、酸の存在下で接触させて、式（Ｖ）の化合物を形成し、
【化６４】
2021532784.tif 000069
（Ｖ）
（ｂ）式（ＶＩ）の化合物：
【化６５】
2021532784.tif 000070
（ＶＩ）
を、式（ＶＩＩ）の化合物
【化６６】
2021532784.tif 000071
（ＶＩＩ）
と、銅触媒の存在下で接触させて、式（ＶＩＩＩ）の化合物を形成し、
【化６７】
2021532784.tif 000072
（ＶＩＩＩ）
（ｃ）式（Ｖ）の化合物：
【化６８】
2021532784.tif 000073
（Ｖ）
を、式（ＶＩＩＩ）の化合物
【化６９】
2021532784.tif 000074
（ＶＩＩＩ）
と、カップリング剤の存在下で接触させて、式（ＩＩ）の化合物を形成することを含み；
式中、Ｍが、
【化７０】
2021532784.tif 000075
、
【化７１】
2021532784.tif 000076
、または
【化７２】
2021532784.tif 000077
であり、
Ｒ１０が、それぞれ独立して、出現ごとに、Ｈまたはハロゲンであり、Ｍが、Ｐ１及びＰ２の末端または内部システインの側鎖に共有結合し；
ＰＭＯが、式ＩＸのオリゴヌクレオチド：
【化７３】
2021532784.tif 000078
（ＩＸ）
またはその薬学的に許容される塩であり；
式中、
Ａが、ＯＨ、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化７４】
2021532784.tif 000079
、及び
【化７５】
2021532784.tif 000080
からなる群から選択され；
Ｒ５が、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘＯＨであり、式中、ｘが３〜１０であり、各アルキル基が、それぞれ独立して、出現ごとに−Ｃ２−６−アルキルであるか、またはＲ５が、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−Ｃ１−６−アルキル−Ｒ６、−Ｃ１−６−ヘテロアルキル−Ｒ６、−アリール−Ｒ６、−ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−６−アルキル−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、及び−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６からなる群から選択されるか、もしくはＲ５が、三量体ペプチドの結合点であり；
Ｒ６が、ＯＨ、ＳＨ、及びＮＨ２からなる群から選択されるか、またはＲ６が、固体支持体に共有結合したＯ、Ｓ、またはＮＨであり；
各Ｒ１が、独立して、ＯＨまたは−ＮＲ３Ｒ４であり；
各Ｒ３及びＲ４が、それぞれ独立して出現ごとに−Ｃ１−６−アルキルであり；
各Ｒ２が、独立して、Ｈ、核酸塩基、及び化学保護基で官能化された核酸塩基からなる群から選択され、その場合、核酸塩基が、それぞれ独立して、出現ごとに、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリン、及びデアザ−プリンからなる群から選択されるＣ３−６−ヘテロ環を含み；
ｚが８〜４０であり；
Ｅが、Ｈ、−Ｃ１−６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、及び
【化７６】
2021532784.tif 000081
からなる群から選択されるか、または
Ｅが、三量体ペプチドの結合点であり；
Ｑが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｒ７が、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり；ならびに
Ｒ８が、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である。
【０１６９】
一実施形態では、工程（ａ）の酸はトリフルオロ酢酸である。
【０１７０】
別の実施形態では、工程（ｂ）の銅触媒は、銅（Ｉ）ブロミドである。
【０１７１】
さらに別の実施形態では、工程（ｃ）のカップリング試薬は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）である。
【０１７２】
さらなる実施形態では、工程（ａ）の溶媒は水であり、工程（ｂ）の溶媒は水／ＤＭＳＯであり、工程（ｃ）の溶媒は水／ＤＭＳＯである。
【０１７３】
別の実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物は、工程（ｃ）の反応条件に対して不活性である。
【０１７４】
別の実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）の生成物は、精製せずに工程（ｃ）で使用することができる。
【実施例】
【０１７５】
説明することを目的として、及び本開示の特定の具体的な実施形態を記載するために、実施例を以下に示す。しかしながら、特許請求の範囲は、本明細書に記載の実施例によって決して制限されるべきではない。開示する実施形態に対する様々な変更及び修正は当業者には明らかであり、本開示の化学構造、置換基、誘導体、製剤または方法に関連するものを含むがこれらに限定されないそのような変更及び修正は、開示の精神及び添付の特許請求の範囲を逸脱することなく行われ得る。本明細書のスキーム中の構造における変数の定義は、本明細書に示す式中の対応する位置の変数の定義に対応する。
【０１７６】
４つのモジュールを含む構築物に注目し；１つはオリゴヌクレオチド用、３つは別個のペプチド配列用である。モジュールには、核標的化ペプチドまたはエンドソーム破壊ペプチドなどの様々な機能性ペプチドが含まれている必要があるだろうと考えた。構築物を合成するために、簡便なアプローチを選択し、モジュール１をモジュール２に連結し、これとは別に、モジュール３をモジュール４に連結した。次いで、２つの二量体を複合体化して４モジュール構築物を提供することができた（図２）。
【０１７７】
特定の官能基に耐性があり、一般的な溶媒や条件に適合し、ペプチド基質に適しているように各反応を最適化する必要があるため、バイオコンジュゲーション反応の選択は重要であった。ペプチド複合体化に関していくつかの反応を調べたところ、特定の反応に対する様々な制約が生じた。
【表３】
2021532784.tif 000082
【０１７８】
例えば、テトラジンは樹脂上のペプチドに組み込むことができるが、ペプチドの切断及び側鎖の脱保護中に還元されることが明らかとなった。同様に、市販のＤＢＣＯ試薬に存在する第三級アミドはトリフルオロ酢酸で切断されるため、基質オフのレジンにＤＢＣＯを組み込む必要がある。さらに、マレイミドとアジドは同じペプチド上に存在する場合に反応する。
【０１７９】
いくつかの潜在的な反応を調べた後、最終的な合成スキームは、２つのアジド−アルキン付加環化と１つのＳＮＡｒ反応を組み合わせる（図２）。反応１では、ＰＭＯ−ＤＢＣＯがアジドペプチドと結合してモジュール１と２を連結する。アジドペプチドには遊離チオールも含まれ、中性条件下ではＤＢＣＯと反応しない。これとは別に、反応２の場合、銅触媒によるアジド−アルキン付加環化により、モジュール３と４を連結する。モジュール３には、デカフルオロビフェニルに結合したＮ末端システイン残基とＣ末端アジドリジンが含まれる。パーフルオロアレーンは反応３を可能にし、遊離チオールがアジド／アルキン付加環化を妨害するのを防ぐ作用もある。モジュール４には、ペプチド大環状化などのほとんどの反応に対して安定しているアルキンのみが含まれる。最後に、反応３において、モジュール１−２及び３−４を、チオール−パーフルオロアレーン  ＳＮＡｒ反応により複合体化することができる。アジドはすでにアルキンと反応しているため、ＴＣＥＰを使用して、意図しないアジドの還元を心配することなく、ジスルフィドの形成を防ぐことができる。
【０１８０】
選択した合成スキームには、コンビナトリアルライブラリーの合成についての多くの利点がある。第一に、安定した不可逆的な結合を生成するために、すべての反応が、以前より生物学的アッセイにおいて使用されてきた。第二に、反応は副産物を生成せず、理論的に定量的であるため、精製の必要性が低くなる。第三に、すべての試薬は比較的良性であり、細胞培養実験に影響を与えない。銅は存在するが、低マイクロモル濃度の銅は、このスクリーニングの目的に対して細胞の生存率に影響を与えなかったことが明らかとなった。最後に、反応はすべて非常に小スケールで実施することができる（例えば、５μＬ未満の容量）。特に、高収率と少容量の組み合わせは、各反応を個別に精製することを必要とせずに、反応を高濃度で実行し、細胞培養処置用の培地に直ちに希釈することができることを示唆している。
【０１８１】
個々の反応条件を最適化した後、３６個の概念実証用構築物のセットを合成した。オリゴヌクレオチドについては、モジュール１、ＰＭＯ  ＩＶＳ２−６５４（配列番号５６）を使用したが、これは、改変型ＨｅＬａ細胞株の核にこれを送達することに成功するとｅＧＦＰ蛍光が誘導される。モジュール２には、４つの異なるＣＰＰのセット：ペネトラチン、ｐＶＥＣ、ＴＰ１０、及びＤＰＶ６が含まれていた。モジュール３には、ＫＲＶＫ及びＳＶ４０核局在化配列（ＮＬＳ）ならびに脳へのウイルス送達を向上させることが最近報告された配列であるペプチドＰＨＰ．ｅＢが含まれていた。モジュール４には、３つのＣＰＰ：Ｂｐｅｐ、ＤＰＶ６、及びＰＰＣ３が含まれていた（図３）。
【０１８２】
合成は、アジド歪みアルキン付加環化を使用したモジュール１と２の複合体化から開始した。水中で、５ｍＭ  ＰＭＯ−ＤＢＣＯを５ｍＭアジド−モジュール２ペプチド−ｃｙｓと共にインキュベートした。１時間後、反応物を液体窒素で瞬間冷凍し、凍結乾燥により溶媒を除去した。各反応について、生成物へのほぼ完全な変換をＬＣ−ＭＳ分析で示し、精製を必要とせずに反応がきれいに進行したことを示した。
【０１８３】
モジュール３と４を、銅触媒によるアジド−アルキン付加環化を使用して複合体化した。デカフルオロビフェニル−モジュール３ペプチド−アジドとアルキン−モジュール４ペプチドを水に溶解して、各モジュールの１０ｍＭストック溶液を作成した。これとは別に、臭化銅（Ｉ）を不活性雰囲気下でＤＭＳＯに溶解した。ペプチドを合わせ（各最終濃度３．３ｍＭ）、臭化銅溶液を添加して（最終濃度６．７ｍＭ）反応を開始した。２時間後、水中の１００ｍＭリン酸二ナトリウムを加えることにより反応をクエンチした。反応３の準備において、溶媒を真空下で除去した。
【０１８４】
最後に、モジュール１−２と３−４を組み合わせた。５ｍＭ  ＴＣＥＰを含有するＤＭＳＯ中で、モジュール１−２（最終濃度０．６３ｍＭ）をモジュール３−４（最終濃度１．２５ｍＭ、２当量）と混合した。モジュール１は細胞アッセイの活性成分であるため、限定試薬として使用した。２時間後、反応液を瞬間冷凍し、希釈して細胞処理するまで−８０℃で保存した。反応成分を個別に試験すると、銅の存在が反応を妨げることが示唆され、最適化を実質的に試みたにもかかわらず、反応変換率がおよそ７０％を超えることはなかった。
【０１８５】
合成した３６個の構築物を使用して、改変型ＨｅＬａ細胞アッセイを使用してＰＭＯ活性を調節する能力を試験した。ＨｅＬａ−６５４細胞に対し、非蛍光ｅＧＦＰタンパク質を発現するように安定的に形質移入した。ｅＧＦＰ遺伝子は、ヒトβ−グロビン遺伝子（ＩＶＳ２−６５４）由来の変異型イントロンによって中断されている。挿入によりプレｍＲＮＡスプライシングが変化し、成熟ｍＲＮＡにおいて断片が保持され、非蛍光タンパク質が生成される。ＰＭＯ  ＩＶＳ２−６５４は、β−グロビン挿入と塩基対を形成し、ｍＲＮＡスプライシングを修飾し、それによって蛍光ｅＧＦＰの発現をもたらす。
【０１８６】
処置のために、粗反応混合物を培地中で５μＭに希釈した。モジュラー構築物の濃度は、反応で混合したモジュール１−２複合体の元の濃度に基づいて計算した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する培地を使用して、細胞を各構築物で２２時間処置した後、フローサイトメトリーで細胞の蛍光を測定した。
【０１８７】
異なるモジュールは、細胞の蛍光レベルにいくつかの顕著な傾向をもたらした（図４）。モジュール２がＤＰＶ６の場合、モジュール３及び４にどのペプチドを配置したかに関係なく、構築物全体が一貫して高い蛍光を発した。しかしながら、モジュール２にｐＶＥＣまたはＴＰ１０を配置した場合、わずかな細胞蛍光が観察された。化合物の毒性を制御するための間接的な読み取り値として、フローサイトメトリー中のゲート細胞カウント数を使用した。毒性の高い化合物は全体的な細胞カウント数の減少をもたらし、生存不能な細胞はヨウ化プロピジウム染色に基づいてゲートアウトした。この実験では、モジュール３ペプチドが核局在化配列ＫＲＶＫである場合、より低い細胞カウント数が一貫して観測されたことが観察された。非常に活性が高く無毒な化合物が好ましいため、細胞の蛍光と細胞カウント数の読み取り値を掛け合わせて、全体的な化合物の効力（Ｆ×Ｃ）の測定値を取得した。
【０１８８】
概念実証実験の成功を受けて、ＨｅＬａ−６５４細胞において試験するための６００個の複合体のライブラリを合成した。モジュール４のペプチド数を３から５０に増やすためにライブラリを選択した。ライブラリ内のペプチドの種類の多様性を高め、改変型ペプチドと特有の官能基を組み込むことの実現可能性を強調するために、キメラペプチド、環状ペプチド、及び二環式ペプチドの混合物を含ませた。環状ペプチドには、２つのシステイン残基が結合してモジュラー反応と互換性のある安定したペプチド大環状化合物を形成するＲ１２、Ｂｐｅｐ、及びエングレイルドバリアントが含まれていた。二環式バリアントには、二重大環状Ｒ１２と、３つの側鎖が１，３，５−トリスブロモメチルベンゼンと結合した別のＲ１２配列が含まれていた。他のペプチドには、以前に報告されたいくつかのＣＰＰ、有効なＰＭＯ担体であるとコンピュータ予測されたペプチド（ＰＰＣ）、及びＮＬＳ配列が付加されたペプチドが含まれていた（表２を参照のこと）。
【０１８９】
追加の化合物を使用して、反応２が１５０の異なる生成物を含むことを除いて、反応１及び２を前述のように実施した。反応３では、多数の化合物を扱うために、前述の条件を使用して、３８４ウェルプレートで２日間にわたって合成を実施した。合成後、化合物をＰＢＳで１００μＭに希釈し、次いで１０％ＦＢＳを含有する培地で５μＭに希釈した。この場合も、ＨｅＬａ−６５４細胞を構築物で２２時間処置し、細胞の蛍光をフローサイトメトリーで分析した（図５）。
【０１９０】
異なるペプチドの組み合わせにより、ペプチドの効力における特定の傾向が浮き彫りになった。第一に、概念実証実験で認められるように、モジュール２としてのＤＰＶ６は最も高いＦ×Ｃをもたらす。モジュール４の場合、ｐＶＥＣ−Ｂｐｅｐキメラは一貫して高いパフォーマンスをもたらす。モジュール４の位置にメリチンやメリチン−Ｂｐｅｐなどのペプチドが含まれている場合、特定の複合体は毒性が高かった。予測どおり、Ｒ１２またはＢｐｅｐバリアントなどの陽イオン性の高いペプチドは比較的活性が高く、ヒートマップの上部に集合している。最後に、個々のモジュールの役割は重要であり、モジュール２ペプチドで示すように、モジュール３及び４の特定のペプチドが蛍光を上下に調整することができる場合でも、ｐＶＥＣまたはＴＰ１０が存在すると蛍光は劇的に減少し、支配的な効果がもたらされる。
【０１９１】
ＰＭＯ−ＤＰＶ６−ＳＶ４０−Ｗ／Ｒは、トップヒットであり、全体的なＦ×Ｃが最も高かった。ゲート細胞カウント数は最大５０００細胞に達し、平均蛍光強度は非複合体化ＰＭＯのおよそ２０倍であった。Ｗ／Ｒは、それ自体でＰＭＯに複合体化した場合（それ自体でＰＭＯの約３倍の活性）、特に強力なペプチドではなかったことから、この結果は、複数のペプチドを組み合わせることが有効であるという概念をさらに支持するものである。興味深い傾向の１つは、最初の３つのモジュールにＰＭＯ−ＤＰＶ６−ＳＶ４０が含まれている場合、ペプチドブフォリン２とｓｙｎＢ１に加えて、Ｗ／Ｒが非常に良好に機能することを示している。モジュール３にペプチドＫＲＶＫまたはＰＨＰ．ｅＢが含まれている場合、これら３つのペプチドの効力は低くなる。特定の理論に拘束されるものではないが、これはＳＶ４０によって提供されるより大きな正味電荷に起因する可能性があり、多くの構築物（例えば、ＰＭＯ−ＤＰＶ６−ＳＶ４０−Ｒ１２）はより高い正味の正電荷を有するが、活性は低い。
【０１９２】
実施例１：ペプチド調製及び精製のための一般的方法
Ｆａｓｔ−ｆｌｏｗペプチド合成
ペプチドは、自動フローペプチドシンセサイザーを使用して０．１ｍｍｏｌスケールで合成した。ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ  Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＨＹＲ樹脂の２００ｍｇ部分を、９０℃に維持した反応器にロードした。反応器に導入する前に、すべての試薬を、ＨＰＬＣポンプを使用して９０℃に維持したステンレス鋼ループに８０ｍＬ／分で流した。カップリングごとに、ＤＭＦ中に０．２Ｍアミノ酸と０．１７Ｍ  ＨＡＴＵを含有する溶液１０ｍＬを２００μＬのジイソプロピルエチルアミンと混合し、反応器に送液した。Ｆｍｏｃ除去は、１０．４ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを使用して達成した。各工程の間に、ＤＭＦ（１５ｍＬ）を使用して反応器を洗い流した。アルギニンには特別なカップリング条件を使用し、流速を４０ｍＬ／分に減らし、ＤＭＦ中に０．２Ｍ  Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨと０．１７Ｍ  ＰｙＡＯＰを含有する溶液１０ｍＬを２００μＬのジイソプロピルエチルアミンと混合し、反応器に送液した。非天然アミノ酸をカップリングするために、またはペプチドをキャップするために（例えば、４−ペンチン酸で）、樹脂を、ＤＭＦ中の２．５ｍＬの０．４Ｍ  ＨＡＴＵに溶解した４−ペンチン酸（１ｍｍｏｌ）ならびに５００μＬのジイソプロピルエチルアミンとともに室温で３０分間インキュベートした。合成終了後、樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、真空乾燥した。
【０１９３】
ペプチドの切断及び脱保護
５ｍＬの９４％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％の１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）、２．５％の水、及び１％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（ｖ／ｖ）で６０℃、７分間処理することにより、各ペプチドを、樹脂からのグローバルな側鎖の脱保護と切断に同時に供した。アルギニンリッチな配列の場合、樹脂を、８２．５％ＴＦＡ、５％フェノール、５％チオアニソール、５％水、及び２．５％ＥＤＴ（ｖ／ｖ）からなる切断カクテルで室温、１４時間処置した。混合物にＮ２をバブリングすることによりＴＦＡを蒸発させた。次に、約４０ｍＬの冷エーテル（−８０℃で冷却）を加えて沈殿させ、ペプチドを洗浄した。粗生成物を４，０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によりペレット化し、エーテルをデカントした。エーテル沈殿と遠心分離をさらに２回繰り返した。３回目の洗浄後、０．１％ＴＦＡを含有する５０％水及び５０％アセトニトリルにペレットを再溶解し、フリットシリンジで濾過して樹脂を除去し、凍結乾燥した。
【０１９４】
ペプチド精製
０．１％ＴＦＡを含有する水及びアセトニトリルにペプチドを再溶解し、０．２２μｍナイロンフィルターで濾過し、質量分析半分取逆相ＨＰＬＣで精製した。溶媒Ａは０．１％ＴＦＡ添加剤を含む水であり、溶媒Ｂは０．１％ＴＦＡ添加剤を含むアセトニトリルでしあった。０．５％／分の速度で変化する線形グラジエントを使用した。ほとんどのペプチドは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：９．４×２５０ｍｍ、５μｍで精製した。アルギニンリッチ配列などの非常に親水性の高いペプチドは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ１８カラム：９．４×２５０ｍｍ、５μｍで精製した。機器からの各フラクションに関する質量データを使用して、純粋なフラクションのみをプールして凍結乾燥した。フラクションプールの純度はＬＣ−ＭＳで確認した。
【０１９５】
実施例１のプロトコールを使用して、表２のペプチドを合成した。
【０１９６】
実施例２：ＰＭＯ−ＤＢＣＯ合成
ＰＭＯ  ＩＶＳ−６５４（５０ｍｇ、８μｍｏｌ）を１５０μＬのＤＭＳＯに溶解した。この溶液に、ＨＢＴＵ（ＤＭＦ中の０．４Ｍ  ＨＢＴＵ  ３７．５μＬ、１５μｍｏｌ）及び４０μＬ  ＤＭＦ中のＤＩＥＡ（２．８μＬ、１６μｍｏｌ）で活性化した２当量のジベンゾシクロオクチン酸（５．３ｍｇ、１６μｍｏｌ）を含有する溶液を添加した（最終反応容量＝０．２３ｍＬ）。反応を２５分間進行させた後、１ｍＬの水と２ｍＬの水酸化アンモニウムでクエンチした。水酸化アンモニウムは、反応の過程で形成されたエステルを加水分解する。１時間後、溶液を４０ｍＬに希釈し、逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：２１．２×１００ｍｍ、５μｍ）及び５８分にわたる２〜６０％Ｂの線形勾配（溶媒Ａ：水；溶媒Ｂ：アセトニトリル）（１％Ｂ／分）を用いて精製した。機器からの各フラクションに関する質量データを使用して、純粋なフラクションのみをプールして凍結乾燥した。フラクションプールの純度はＬＣ−ＭＳで確認した。
【０１９７】
実施例３：ライブラリ合成条件
反応１
ＰＭＯ−ＤＢＣＯを１０ｍＭの濃度（重量分析で測定）で水に溶解した。モジュール２ペプチドを、１０ｍＭ濃度（重量分析で測定；分子量は、リジン、アルギニン、及びヒスチジン１残基あたり０．５のトリフルオロ酢酸対イオンを含むように計算した）の０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水に溶解した。マイクロ遠心チューブ内で、５０μＬのＰＭＯ−ＤＢＣＯ溶液を５０μＬのモジュール２ペプチドと混合した。溶液を混合し、反応を１時間進行させた。次いで、生成物をＬＣ−ＭＳによって分析し、溶媒を凍結乾燥によって除去した。最後に、生成物を１００μＬのＤＭＳＯに再懸濁して５ｍＭ溶液を提供し、−２０℃で保存した。
【０１９８】
反応２
モジュール３ペプチドとモジュール４ペプチドを１０ｍＭ濃度（重量分析で測定）で水に溶解してストック溶液を調製した。各反応について、ＰＣＲチューブ内で４μＬのモジュール３ペプチドを４μＬのモジュール４ペプチドと混合した。これとは別に、１ｍＬの脱気ＤＭＳＯと２．８ｍｇの臭化銅（Ｉ）をＮ２下で混合して２０ｍＭの溶液を得ることによって、臭化銅溶液を調製した。周囲条件下で、４μＬのＣｕＢｒ溶液をモジュールペプチド３と４の混合物に添加した。反応物にキャップを付け、反応を２時間進行させたが；反応のセットアップ中に存在する少量のＯ２は、反応の進行を実質的に妨げることはない。２時間後、Ｎａ２ＨＰＯ４の１００ｍＭ溶液を２μｌ添加した。次いで、ＰＣＲチューブを超音波処理し、ボルテックスし、遠心分離した。溶媒を除去するために、３５℃に設定したＳａｖａｎｔ  ＳＰＤ１２１Ｐ  Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃを使用してＰＣＲチューブを真空下で２時間遠心分離した。最後に、生成物を１６μＬのＤＭＳＯに再懸濁して５ｍＭ溶液を提供し、−８０℃で保存した。生成物をＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１９９】
反応３
モジュール１−２とモジュール３−４を組み合わせることによって、最終的なモジュラー構築物を合成した。まず、１．６μＬの反応物２を３８４ウェルプレートに加えた。これとは別に、３０μＬの反応物１を１５μＬのＴＣＥＰ溶液（４００ｍＭ  ＮａＯＨを含有する５０／５０  水／ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ  ＴＣＥＰ−ＨＣｌ）及び７５μＬのＤＭＳＯと混合した。次いで、１．６μＬの反応物１の溶液を３８４ウェルプレートの反応物２に添加した。個々の反応物には、最終的に０．４μＬの反応物１（ＤＭＳＯ中５ｍＭ）、１．６μＬの反応物２（ＤＭＳＯ中５ｍＭ）、０．２μＬのＴＣＥＰ溶液（水／ＤＭＳＯ中１００ｍＭ）、及び１μＬのＤＭＳＯが含まれていた。過剰量の反応物２を使用して、反応を強制的に完了させたが；銅の存在は、この複合体化の効率を妨げる。反応物１を限定試薬として使用して、細胞培養アッセイの活性成分であるＰＭＯが過剰になることを回避した。反応を２時間進行させた後、プレートを−８０℃で保存した。反応物をＬＣ−ＭＳで分析した。
【０２００】
実施例４：ＨｅＬａ−６５４  ｅＧＦＰアッセイ
１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＭＥＭ中でＨｅＬａ  ６５４細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。処置の１８時間前に、細胞を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＭＥＭ中の９６ウェルプレートにウェルあたり５，０００細胞の密度でプレーティングした。実験当日、ＤＭＳＯ中の粗反応混合物を含有する３８４ウェルプレートを、３．２μＬの反応混合物に１６．８μＬのＰＢＳを添加することにより１００μＭに希釈した。次いで、各構築物を１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＭＥＭで５μＭに希釈した。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２において２２時間、濃度５μＭの各複合体と共にインキュベートした。次に、処置用培地を吸引し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で１５分間、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡと共にインキュベートし、１×ＰＢＳで洗浄し、２％ＦＢＳ及び２μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳに再懸濁した。フローサイトメトリー分析を、ＢＤＬＳＲＩＩフローサイトメーターで実施した。データにゲートを適用して、ヨウ化プロピジウムに対して高度に陽性であるか、または主要な細胞集団とは十分に異なる前方／側方散乱の読み取り値を有する細胞が除外されたことを確認した。各試料を、５，０００のゲートイベントで制限した。
【０２０１】
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を使用して分析を実施した。各試料について、平均蛍光強度及びゲート細胞数を測定し（図６及び７）、強度に細胞数を掛けて計算した（図５）。
【０２０２】
参照による援用
本出願全体で引用するすべての参考文献（参考文献、発行済特許、公開済特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む）の内容は、その全体が参照により本明細書に明示的に援用される。別途定義されない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【０２０３】
均等物
当業者であれば、通例の実験方法に過ぎないものを使用して、本明細書に記載される本開示の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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