(57)【要約】  ＨＡＯ１遺伝子内で編集するための、例えば、二本鎖切断を導入するための組成物および方法が提供される。原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）を有する対象を治療するための組成物および方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡＯ１遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導する方法であって、組成物を細胞に送達することを含み、前記組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む、方法。
【請求項２】
ＨＡＯ１遺伝子の発現を低減する方法であって、組成物を細胞に送達することを含み、前記組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む、方法。
【請求項３】
原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、前記組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによってＰＨ１を治療または予防する、方法。
【請求項４】
ＰＨ１によって引き起こされる末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、前記組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによって、ＰＨ１によって引き起こされる（ＥＳＲＤ）を治療または予防する、方法。
【請求項５】
シュウ酸カルシウム産生および沈着、高シュウ酸尿症、シュウ酸症、ならびに血尿のうちのいずれか１つを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、前記組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによって、シュウ酸カルシウム産生および沈着、高シュウ酸尿症、シュウ酸症、ならびに血尿のうちのいずれか１つを治療または予防する、方法。
【請求項６】
血清グリコレート濃度を高める方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、前記組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによって血清グリコレート濃度を高める、方法。
【請求項７】
対象において尿内のオキシレートを低減する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、前記組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによって対象の尿内のオキサレートを低減する、方法。
【請求項８】
ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組成物であって、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む、組成物。
【請求項１０】
短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）を含む組成物であって、
ａ．ガイド配列であって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列のいずれか１つ、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるか、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つ、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含む、ガイド配列と、
ｂ．ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分であって、前記ヘアピン領域が、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠失しており、任意選択で、前記短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾および３’末端修飾のうちの１つ以上を含む、保存部分と、を含む、組成物。
【請求項１１】
配列番号２０２の配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
５’末端修飾を含む、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記短いｓｇＲＮＡが、３’末端修飾を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾および３’末端修飾を含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記短いｓｇＲＮＡが、３’テールをさらに含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記３’テールが、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０、少なくとも１〜２、少なくとも１〜３、少なくとも１〜４、少なくとも１〜５、少なくとも１〜７、または少なくとも１〜１０個のヌクレオチドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記短いｓｇＲＮＡが、３’テールを含まない、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヘアピン領域内に修飾を含む、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
３’末端修飾と、前記ヘアピン領域内の修飾と、を含む、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
３’末端修飾と、前記ヘアピン領域内の修飾と、５’末端修飾と、を含む、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
５’末端修飾と、前記ヘアピン領域内の修飾と、を含む、請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ヘアピン領域が、少なくとも５個の連続ヌクレオチドを欠失している、請求項１０〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも５〜１０個の欠失しているヌクレオチドが、
ａ．ヘアピン１内にある、
ｂ．ヘアピン１およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」内にある、
ｃ．ヘアピン１およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチド内にある、
ｄ．ヘアピン１の少なくとも一部を含む、
ｅ．ヘアピン２内にある、
ｆ．ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
ｇ．ヘアピン１およびヘアピン２内にある、
ｈ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｉ．ヘアピン２の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｊ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含み、ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
ｋ．ヘアピン１もしくはヘアピン２内にあり、任意選択で、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｌ．連続している、
ｍ．連続しており、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｎ．連続しており、少なくともヘアピン１の一部およびヘアピン２の一部に及ぶ、
ｏ．連続しており、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」に及ぶ、
ｐ．連続しており、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチドに及ぶ、
ｑ．５〜１０個のヌクレオチドからなる、
ｒ．６〜１０個のヌクレオチドからなる、
ｓ．５〜１０個の連続ヌクレオチドからなる、
ｔ．６〜１０個の連続ヌクレオチドからなる、または
ｕ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８からなる、請求項１０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
ネクサス領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含み、前記ネクサス領域が、少なくとも１個のヌクレオチドを欠失している、請求項１０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ネクサス領域内で欠失している前記ヌクレオチドが、
ａ．前記ネクサス領域内の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド、
ｂ．前記ネクサス領域内の少なくともまたは正確に１〜２個のヌクレオチド、１〜３個のヌクレオチド、１〜４個のヌクレオチド、１〜５個のヌクレオチド、１〜６個のヌクレオチド、１〜１０個のヌクレオチド、または１〜１５個のヌクレオチド、および
ｃ．前記ネクサス領域内の各ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
修飾シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む組成物であって、
ａ．ガイド配列であって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列のいずれか１つ、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるか、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つ、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含む、ガイド配列を含み、さらに、
ｂ．以下
１．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
２．１つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
３．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位および１つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
４．ｉ）２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、または
５．ｉ）１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端から８番目のヌクレオチド、またはその後にある、ＹＡ修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに任意選択で、
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、または
６．ｉ）１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位が、前記ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１３個のヌクレオチド内にある、ＹＡ修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、または
７．ｉ）５’末端修飾および３’末端修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、または
８．ｉ）ガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ガイド領域ＹＡ部位の前記修飾が、前記ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、または
９．ｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８におけるＹＡ修飾、または
１０．ｉ）１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、前記ＹＡ部位が、前記５’末端部の８番目のヌクレオチド、またはその後にある、ＹＡ修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）Ｈ１−１およびＨ２−１のうちの１つ以上における修飾、または
１１．ｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ｉｉ）保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、８、および９のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびにｉｉｉ）Ｈ１−１およびＨ２−１のうちの１つ以上における修飾、または
１２．ｉ）ＹＡ修飾などの、前記５’末端部から６番目のヌクレオチド、またはその後に位置する１つ以上のヌクレオチドにおける修飾、
ｉｉ）１つ以上のガイド配列ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｉｉ）Ｂ３、Ｂ４、およびＢ５のうちの１つ以上における修飾であって、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、もしくは２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、修飾、
ｉｖ）ＬＳ１０における修飾であって、ＬＳ１０が、２’−フルオロ以外の修飾を含む、修飾、ならびに／または
ｖ）Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、もしくはＮ１１における修飾、から選択される１つ以上の修飾を含み、
以下
ｉ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｉ．１つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｉｉ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位および１つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｖ．前記５’末端部の前記５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、または１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｖ．前記５’末端部の前記５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート連結を含まない、
ｖｉ．Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、もしくはＢ５のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｖｉｉ．ＬＳ１、ＬＳ８、もしくはＬＳ１０のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｖｉｉｉ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、もしくはＮ１７のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｉｘ．Ｈ１−１が、修飾を含む、
ｘ．Ｈ２−１が、修飾を含む、または
ｘｉ．Ｈ１−２、Ｈ１−３、Ｈ１−４、Ｈ１−５、Ｈ１−６、Ｈ１−７、Ｈ１−８、Ｈ１−９、Ｈ１−１０、Ｈ２−１、Ｈ２−２、Ｈ２−３、Ｈ２−４、Ｈ２−５、Ｈ２−６、Ｈ２−７、Ｈ２−８、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、もしくはＨ２−１５のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート連結を含まない、のうちの少なくとも１つが真である、組成物。
【請求項２８】
配列番号４５０を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
細胞または対象において前記ＨＡＯ１遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断を誘導する際に使用するための、請求項９〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
細胞または対象において前記ＨＡＯ１遺伝子の発現を低減する際に使用するための、請求項９〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
対象においてＰＨ１を治療または予防する際に使用するための、請求項９〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
対象において血清および／または血漿グリコレート濃度を高める際に使用するための、請求項９〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
対象において尿オキサレート濃度を低減する際に使用するための、請求項９〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
オキサレート産生、臓器におけるシュウ酸カルシウム沈着、高シュウ酸尿症、全身性シュウ酸症を含むシュウ酸症、血尿、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を治療もしくは予防する、および／または腎臓もしくは肝臓移植の必要性を遅らせるか、もしくは改善する際に使用するための、請求項９〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
さらに、
ａ．細胞または対象において前記ＨＡＯ１遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導すること、
ｂ．細胞または対象において前記ＨＡＯ１遺伝子の発現を低減すること、
ｃ．対象においてＰＨ１を治療または予防すること、
ｄ．対象において血清および／または血漿グリコレート濃度を高めること、
ｅ．対象において尿オキサレート濃度を低減すること、
ｆ．オキサレート産生を低減すること、
ｇ．臓器におけるシュウ酸カルシウム沈着を低減すること、
ｈ．高シュウ酸尿症を低減すること、
ｉ．全身性シュウ酸症を含むシュウ酸症を治療または予防すること、
ｊ．血尿を治療または予防すること、
ｋ．末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を予防すること、および／または
ｌ．腎臓または肝臓移植の必要性を遅らせるか、または改善すること、を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、血清および／または血漿グリコレートレベルを高める、請求項１〜８または請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法または使用するための組成物。
【請求項３７】
前記組成物が、前記ＨＡＯ１遺伝子の編集を引き起こす、請求項１〜８または請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法または使用するための組成物。
【請求項３８】
前記編集が、編集される集団の割合（編集率）として計算される、請求項３７に記載の方法または使用するための組成物。
【請求項３９】
前記編集率が、前記集団の３０〜９９％である、請求項３８に記載の方法または使用するための組成物。
【請求項４０】
前記編集率が、前記集団の３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、または９５〜９９％である、請求項３８に記載の方法または使用するための組成物。
【請求項４１】
前記組成物が、尿オキサレート濃度を低減する、請求項１〜８または請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法または使用するための組成物。
【請求項４２】
尿オキサレートの減少が、腎臓結石および／または腎臓、肝臓、膀胱、心臓、皮膚、または眼におけるシュウ酸カルシウム沈着を減少させる、請求項４１に記載の方法または使用するための組成物。
【請求項４３】
前記ガイド配列が、
ａ．配列番号１〜１４６、
ｂ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５、および
ｃ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５から選択される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項４４】
前記組成物が、
ａ．配列番号１５１〜１６８のうちのいずれか１つ、または
ｂ．配列番号２５１〜２６８のうちのいずれか１つ、または
ｃ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５から選択されるガイド配列、または
ｄ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５から選択されるガイド配列、を含むｓｇＲＮＡを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項４５】
前記標的配列が、前記ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン１、３、４、５、６、または８の中にある、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項４６】
前記標的配列が、前記ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン１の中にある、請求項４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項４７】
前記標的配列が、前記ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン３の中にある、請求項４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項４８】
前記標的配列が、前記ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン４の中にある、請求項４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項４９】
前記標的配列が、前記ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン６の中にある、請求項４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５０】
前記標的配列が、前記ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン８の中にある、請求項４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５１】
前記ガイド配列が、ＨＡＯ１のプラス鎖内の標的配列に対して相補的である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５２】
前記ガイド配列が、ＨＡＯ１のマイナス鎖内の標的配列に対して相補的である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５３】
前記第１のガイド配列が、前記ＨＡＯ１遺伝子の前記プラス鎖内の第１の標的配列に対して相補的であり、前記組成物が、前記ＨＡＯ１遺伝子の前記マイナス鎖内の第２の標的配列に対して相補的である第２のガイド配列をさらに含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５４】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１〜１４６のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含み、配列番号２００のヌクレオチド配列をさらに含み、前記配列番号２００のヌクレオチドが、その３’末端にある前記ガイド配列の後にある、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５５】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１〜１４６のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含み、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、または配列番号４００〜４５０のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列をさらに含み、前記配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、または配列番号４００〜４５０のうちのいずれか１つのヌクレオチドが、その３’末端にある前記ガイド配列の後にある、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５６】
前記ガイドＲＮＡが、シングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５７】
前記ｓｇＲＮＡが、配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、または１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、請求項５６に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５８】
前記ｓｇＲＮＡが、配列番号１５１〜１６８または２５１〜２６８のうちのいずれか１つを含む、請求項５６に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項５９】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３００のパターンに従って修飾され、前記Ｎが、まとめて、表１のガイド配列（配列番号１〜１４６）のうちのいずれか１つである、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６０】
配列番号３００の各Ｎが、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、前記Ｎが、前記ガイド配列を形成し、前記ガイド配列が、前記ＨＡＯ１遺伝子に対してＣａｓ９を標的とする、請求項５９に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６１】
前記ｓｇＲＮＡが、配列番号１〜１４６の前記ガイド配列、および配列番号２０１、配列番号２０２、もしくは配列番号２０３の前記ヌクレオチドのうちのいずれか１つを含む、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６２】
前記ｓｇＲＮＡが、配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６３】
前記ｓｇＲＮＡが、配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５、１５１〜１６８、および２５１〜２６８から選択される配列を含む、請求項６２に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６４】
前記ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項６４に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６６】
ヌクレオチドの間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６７】
２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６８】
前記ガイドＲＮＡの５’末端での最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾を含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項６９】
前記ガイドＲＮＡの３’末端での最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾を含む、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７０】
前記ガイドＲＮＡの最初の４個のヌクレオチドの間にＰＳ結合を含む、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７１】
前記ガイドＲＮＡの最後の４個のヌクレオチドの間にＰＳ結合を含む、請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７２】
前記ガイドＲＮＡの５’末端での最初の３個のヌクレオチドに２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７３】
前記ガイドＲＮＡの３’末端での最後の３個のヌクレオチドに２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７４】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３００の修飾ヌクレオチドを含む、請求項６３〜７３のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７５】
前記組成物が、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７６】
前記ガイドＲＮＡが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７７】
前記ＬＮＰが、陽イオン性脂質を含む、請求項７６に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７８】
前記陽イオン性脂質が、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであり、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、請求項７７に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項７９】
前記ＬＮＰが、中性脂質を含む、請求項７６〜７８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８０】
前記中性脂質が、ＤＳＰＣである、請求項７９に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８１】
前記ＬＮＰが、ヘルパー脂質を含む、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８２】
前記ヘルパー脂質が、コレステロールである、請求項８１に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８３】
前記ＬＮＰが、ステルス脂質を含む、請求項７６〜８２のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８４】
前記ステルス脂質が、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである、請求項８３に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８５】
前記組成物が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をさらに含む、請求項１〜８４のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８６】
前記組成物が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項１〜８５のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８７】
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９である、請求項８５または８６に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８８】
前記組成物が、薬学的製剤であり、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項８９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項９９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１００】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１０１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１０２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１０３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１０４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１０５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１０６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１０７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１０８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１０９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号２９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１１９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号３９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１２９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号４９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１３９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号５９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１４９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号６９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１５９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号７９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１６９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号８９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１７９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号９９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１００である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１８９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１０９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項１９９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２００】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２０１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２０２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２０３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２０４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２０５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２０６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２０７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１１９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２０８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２０９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１２９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２１９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３７である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２６】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３８である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２７】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１３９である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２８】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１４０である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２２９】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１４１である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３０】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１４２である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３１】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１４３である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３２】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１４４である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３３】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１４５である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３４】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１４６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３５】
配列番号１〜１４６から選択される前記配列が、配列番号１４６である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３６】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５１を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３７】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５２を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３８】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５３を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２３９】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５４を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４０】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５５を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４１】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５６を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４２】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５７を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４３】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５８を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４４】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５９を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４５】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６０を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４６】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６１を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４７】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６２を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４８】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６３を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２４９】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６４を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２５０】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６５を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２５１】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６６を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２５２】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６７を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２５３】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６８を含むｓｇＲＮＡである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
【請求項２５４】
前記組成物が、単回用量として投与される、請求項１〜２５３のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２５５】
前記組成物が、一度投与される、請求項１〜２５４のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２５６】
前記単回用量または一度投与が、
ａ．ＤＳＢを誘導する、および／または
ｂ．ＨＡＯ１遺伝子の発現を低減する、および／または
ｃ．ＰＨ１を治療もしくは予防する、および／または
ｄ．ＰＨ１によって引き起こされるＥＳＲＤを治療もしくは予防する、および／または
ｅ．シュウ酸カルシウム産生および沈着を治療もしくは予防する、および／または
ｆ．高シュウ酸尿症を治療もしくは予防する、および／または
ｇ．シュウ酸症を治療もしくは予防する、および／または
ｈ．血尿を治療もしくは予防する、および／または
ｉ．血清グリコレート濃度を高める、および／または
Ｊ．尿内のオキシレートを低減する、請求項２５４または２５５のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２５７】
前記単回用量または一度投与が、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週間にわたって、ａ）〜ｊ）のうちのいずれか１つ以上を達成する、請求項２５６に記載の方法または組成物。
【請求項２５８】
前記単回用量または一度投与が、永続的な効果を達成する、請求項２５６または２５７に記載の方法または組成物。
【請求項２５９】
永続的な効果を達成することをさらに含む、請求項１〜２５８のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２６０】
前記永続的な効果が、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、または少なくとも５年持続する、請求項２５９に記載の方法または組成物。
【請求項２６１】
前記組成物の投与によって、尿内のオキサレートの治療的に関連する減少がもたらされる、請求項１〜２６０のいずれか一項一項に記載の方法または組成物。
【請求項２６２】
前記組成物の投与によって、治療範囲内の尿オキサレートレベルがもたらされる、請求項１〜２６１のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２６３】
前記組成物の投与によって、正常範囲の１００、１２０、または１５０％以内のオキサレートレベルがもたらされる、請求項１〜２６２のいずれか一項に記載の方法または組成物。
【請求項２６４】
ＰＨ１を有するヒト対象を治療するための医薬の調製のための、請求項９〜２６３のいずれかに記載の組成物または製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／７１２，９０４号、２０１８年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／７３８，９３６号、２０１９年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／８３４，３２８号、および２０１９年５月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８４１，７３４号の利益を主張し、これらは各々、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）は、オキサレートの蓄積を特徴とする遺伝子障害である。ＰＨ１では、ＡＧＸＴ遺伝子によってコードされる酵素アラニングリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴまたはＡＧＴ１）内に突然変異がみられる。通常、ＡＧＴは、肝臓ペルオキシソーム中のグリオキシレートをグリシンに変換する。ＰＨ１を患う患者では、変異体ＡＧＴは、グリオキシレートを分解することができず、グリオキシレートおよびその代謝産物であるオキサレートのレベルが増加する。ヒトは、オキサレートを酸化することができず、ＰＨ１を患う対象における高レベルのオキサレートは、高シュウ酸尿症（尿内の異常に高レベルのオキサレート）を引き起こす。
【０００３】
ＰＨ１では、過剰なオキサレートはまた、カルシウムと組み合わせて、腎臓および他の臓器内でシュウ酸カルシウムを形成し得る。シュウ酸カルシウムの沈着は、シュウ酸カルシウムの広範な沈着（腎石灰化症）または腎臓および膀胱結石の形成（尿路結石症）を生じさせ、腎臓損傷を引き起こすことがある。ＰＨ１における一般的な腎臓合併症としては、尿内の血液（血尿）、尿路感染症、腎臓損傷、および末期腎疾患（ＥＳＲＤ）が挙げられる。時間が経つにつれて、ＰＨ１を患う患者の腎臓は機能しなくなり始め、オキサレートのレベルが血中で上昇する場合がある。全身の組織中のオキサレートの沈着、例えば、全身性シュウ酸症は、高い血中オキサレートレベルに起因して起こる場合があり、骨、皮膚、および眼における合併症につながる場合がある。ＰＨ１を患う患者は、通常、若年齢で腎不全を患い、腎透析または二重腎臓／肝臓臓器移植が唯一の治療選択肢となる。
【０００４】
ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１、グリコレートオキシダーゼ［ＧＯＸまたはＧＯ］としても知られる）は、グリコレートをグリオキシレートに変換する。ＰＨ１を患う個体におけるＨＡＯ１の阻害が、グリオキシレートの形成を遮断し、過剰なグリコレートが尿を介して排泄されることが提案されてきた。この仮説は、例えば、Ｓａｌｉｄｏ  ＥＣ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０３（４８）：１８２４９−１８２５４（２００６）に記載されるようなノックアウト動物モデルを用いて試験されてきた。ＰＨ１の治療のための臨床試験におけるＲＮＡｉ治療薬であるルマシラン（ＡＬＮ−ＧＯ１）は、ＨＡＯ１  ｍＲＮＡを標的とし、初期の臨床試験において、尿オキサレートレベルを下げることが示されている。
【０００５】
ＨＡＯ１の阻害によってＰＨ１を治療するという考え方は、ＨＡＯ１の異常なスプライスバリアントを有するヒト対象が、無症候性グリコール酸尿症を有し、それによって、明らかな腎臓病理を伴わない尿グリコール酸排泄の増加があったことを示すデータによってさらに裏付けられる（Ｆｒｉｓｈｂｅｒｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ５１（８）：５２６−９（２０１４）を参照）。したがって、ＰＨ１は、ＨＡＯ１発現の阻害によって、グリオキシレートの産生を遮断することによって、したがって、その代謝産物であるオキサレートの産生を遮断することによって、治療することができる。
【０００６】
破壊のためにＨＡＯ１を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ノックダウンまたはアンチセンスノックダウンを使用するアプローチも、現在研究されているが、ＨＡＯ１発現の短期間抑制に関する結果は、予備データを奨励することを示しており（Ｌｉｅｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１７  Ｆｅｂ；２８（２）：４９４−５０３を参照）、ＨＡＯ１の長期間続く抑制を生じさせることができる治療の必要性が存在する。本発明は、ＨＡＯ１遺伝子をノックアウトするためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用し、それによってＨＡＯ１タンパク質の産生を低減し、ＰＨ１を患う対象におけるグリオキシレート産生を低減する組成物および方法を提供する。
【０００７】
したがって、以下の実施形態が提供される。いくつかの実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系等のＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と共にガイドＲＮＡを用い、ＨＡＯ１遺伝子の発現を実質的に低減するか、またはノックアウトし、それによって、ＧＯタンパク質の産生を実質的に低減するか、またはなくす組成物および方法を提供する。ＨＡＯ１遺伝子の改変によってＧＯタンパク質の産生を実質的に低減するか、またはなくすことは、長期的または永続的な治療となり得る。
【発明の概要】
【０００８】
以下の実施形態が提供される。
実施形態１  ＨＡＯ１遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導する方法であって、組成物を細胞に送達することを含み、組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む、方法。
実施形態２  ＨＡＯ１遺伝子の発現を低減する方法であって、組成物を細胞に送達することを含み、組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む、方法。
実施形態３  原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによってＰＨ１を治療または予防する、方法。
実施形態４  ＰＨ１によって引き起こされる末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによって、ＰＨ１によって引き起こされる（ＥＳＲＤ）を治療または予防する、方法。
実施形態５  シュウ酸カルシウム産生および沈着、高シュウ酸尿症、シュウ酸症、ならびに血尿のうちのいずれか１つを治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによって、シュウ酸カルシウム産生および沈着、高シュウ酸尿症、シュウ酸症、ならびに血尿のうちのいずれか１つを治療または予防する、方法。
実施形態６  血清グリコレート濃度を高める方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによって血清グリコレート濃度を高める、方法。
実施形態７  対象において尿内のオキシレートを低減する方法であって、それを必要とする対象に組成物を投与することを含み、組成物が、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含み、それによって対象の尿内のオキサレートを低減する、方法。
実施形態８  ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸が投与される、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９  組成物であって、
ａ．ガイドＲＮＡであって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、任意選択で、
ｂ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、を含む、組成物。
実施形態１０  短いシングルガイドＲＮＡ（短いｓｇＲＮＡ）を含む組成物であって、
ａ．ガイド配列であって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列のいずれか１つ、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるか、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のいずれか１つ、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のいずれか１つを含む、ガイド配列と、
ｂ．ヘアピン領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分であって、ヘアピン領域が、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドを欠失しており、任意選択で、短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾および３’末端修飾のうちの１つ以上を含む、保存部分と、を含む、組成物。
実施形態１１  配列番号２０２の配列を含む、実施形態１０に記載の組成物。
実施形態１２  ５’末端修飾を含む、実施形態１０または実施形態１１に記載の組成物。
実施形態１３  短いｓｇＲＮＡが、３’末端修飾を含む、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４  短いｓｇＲＮＡが、５’末端修飾および３’末端修飾を含む、実施形態１０〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５  短いｓｇＲＮＡが、３’テールをさらに含む、実施形態１０〜１４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６  ３’テールが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドを含む、実施形態１５に記載の組成物。
実施形態１７  ３’テールが、約１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜７、１〜１０、少なくとも１〜２、少なくとも１〜３、少なくとも１〜４、少なくとも１〜５、少なくとも１〜７、または少なくとも１〜１０を含む、実施形態１５に記載の組成物。
実施形態１８  短いｓｇＲＮＡが、３’テールを含まない、実施形態１０〜１７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１９  ヘアピン領域内に修飾を含む、実施形態１０〜１８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２０  ３’末端修飾と、ヘアピン領域内の修飾と、を含む、実施形態１０〜１９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２１  ３’末端修飾と、ヘアピン領域内の修飾と、５’末端修飾と、を含む、実施形態１０〜２０のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２２  ５’末端修飾と、ヘアピン領域内の修飾と、を含む、実施形態１０〜２１のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２３  ヘアピン領域が、少なくとも５個の連続ヌクレオチドを欠失している、実施形態１０〜２２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２４  少なくとも５〜１０個の欠失しているヌクレオチドが、
ａ．ヘアピン１内にある、
ｂ．ヘアピン１およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」内にある、
ｃ．ヘアピン１およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチド内にある、
ｄ．ヘアピン１の少なくとも一部を含む、
ｅ．ヘアピン２内にある、
ｆ．ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
ｇ．ヘアピン１およびヘアピン２内にある、
ｈ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｉ．ヘアピン２の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｊ．ヘアピン１の少なくとも一部を含み、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含み、ヘアピン２の少なくとも一部を含む、
ｋ．ヘアピン１もしくはヘアピン２内にあり、任意選択で、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｌ．連続している、
ｍ．連続しており、ヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」を含む、
ｎ．連続しており、少なくともヘアピン１の一部およびヘアピン２の一部に及ぶ、
ｏ．連続しており、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１とヘアピン２との間の「Ｎ」に及ぶ、
ｐ．連続しており、ヘアピン１の少なくとも一部およびヘアピン１の直ぐ３’側の２個のヌクレオチドに及ぶ、
ｑ．５〜１０個のヌクレオチドからなる、
ｒ．６〜１０個のヌクレオチドからなる、
ｓ．５〜１０個の連続ヌクレオチドからなる、
ｔ．６〜１０個の連続ヌクレオチドからなる、または
ｕ．配列番号４００のヌクレオチド５４〜５８からなる、実施形態１０〜２３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２５  ネクサス領域を含むｓｇＲＮＡの保存部分を含み、ネクサス領域が、少なくとも１個のヌクレオチドを欠失している、実施形態１０〜２４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態２６  ネクサス領域内で欠失しているヌクレオチドが、
ａ．ネクサス領域内の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド、
ｂ．ネクサス領域内の少なくともまたは正確に１〜２個のヌクレオチド、１〜３個のヌクレオチド、１〜４個のヌクレオチド、１〜５個のヌクレオチド、１〜６個のヌクレオチド、１〜１０個のヌクレオチド、または１〜１５個のヌクレオチド、および
ｃ．ネクサス領域内の各ヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上を含む、実施形態２５に記載の組成物。
実施形態２７  修飾シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む組成物であって、
ａ．ガイド配列であって、
ｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列のいずれか１つ、または
ｉｉ．配列番号１〜１４６から選択されるガイド配列のいずれか１つの少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチド、または
ｉｉｉ．配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるか、または
ｉｖ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のいずれか１つ、または
ｖ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５のいずれか１つを含む、ガイド配列を含み、さらに、
ｂ．以下
１．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
２．１つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
３．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位および１つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
４．ｉ）２つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、
５．ｉ）１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位が、５’末端部の５’末端から８番目のヌクレオチド、またはその後にある、ＹＡ修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに任意選択で、
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、
６．ｉ）１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位が、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１３個のヌクレオチド内にある、ＹＡ修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、
７．ｉ）５’末端修飾および３’末端修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、
８．ｉ）ガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ガイド領域ＹＡ部位の修飾が、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１個のヌクレオチドが含まない修飾を含む、ＹＡ修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、または
９．ｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位１および８におけるＹＡ修飾、または
１０．ｉ）１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾であって、ＹＡ部位が、５’末端部の８番目のヌクレオチド、またはその後にある、ＹＡ修飾、
ｉｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびに
ｉｉｉ）Ｈ１−１およびＨ２−１のうちの１つ以上における修飾、または
１１．ｉ）保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ｉｉ）保存領域ＹＡ部位１、５、６、７、８、および９のうちの１つ以上におけるＹＡ修飾、ならびにｉｉｉ）Ｈ１−１およびＨ２−１のうちの１つ以上における修飾、または
１２．ｉ）５’末端部から６番目のヌクレオチド、またはその後に位置する１つ以上のヌクレオチドにおける修飾、例えば、ＹＡ修飾、
ｉｉ）１つ以上のガイド配列ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｉｉ）Ｂ３、Ｂ４、およびＢ５のうちの１つ以上における修飾であって、Ｂ６が、２’−ＯＭｅ修飾を含まないか、または２’−ＯＭｅ以外の修飾を含む、修飾、
ｉｖ）ＬＳ１０における修飾であって、ＬＳ１０が、２’−フルオロ以外の修飾を含む、修飾、および／または
ｖ）Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、またはＮ１１における修飾、から選択される１つ以上の修飾を含み、
以下
ｉ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｉ．１つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｉｉ．１つ以上のガイド領域ＹＡ部位および１つ以上の保存領域ＹＡ部位におけるＹＡ修飾、
ｉｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド８〜１１、１３、１４、１７、または１８のうちの少なくとも１つが、２’−フルオロ修飾を含まない、
ｖ．５’末端部の５’末端からのヌクレオチド６〜１０のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート連結を含まない、
ｖｉ．Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、もしくはＢ５のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｖｉｉ．ＬＳ１、ＬＳ８、もしくはＬＳ１０のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｖｉｉｉ．Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ１０、Ｎ１１、Ｎ１６、もしくはＮ１７のうちの少なくとも１つが、２’−ＯＭｅ修飾を含まない、
ｉｘ．Ｈ１−１が、修飾を含む、
ｘ．Ｈ２−１が、修飾を含む、または
ｘｉ．Ｈ１−２、Ｈ１−３、Ｈ１−４、Ｈ１−５、Ｈ１−６、Ｈ１−７、Ｈ１−８、Ｈ１−９、Ｈ１−１０、Ｈ２−１、Ｈ２−２、Ｈ２−３、Ｈ２−４、Ｈ２−５、Ｈ２−６、Ｈ２−７、Ｈ２−８、Ｈ２−９、Ｈ２−１０、Ｈ２−１１、Ｈ２−１２、Ｈ２−１３、Ｈ２−１４、もしくはＨ２−１５のうちの少なくとも１つが、ホスホロチオエート連結を含まない、のうちの少なくとも１つが真である、組成物。
実施形態２８  配列番号４５０を含む、実施形態２７に記載の組成物。
実施形態２９  細胞または対象においてＨＡＯ１遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断を誘導する際に使用するための、実施形態９〜２８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３０  細胞または対象においてＨＡＯ１遺伝子の発現を低減する際に使用するための、実施形態９〜２８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３１  対象においてＰＨ１を治療または予防する際に使用するための、実施形態９〜２８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３２  対象において血清および／または血漿グリコレート濃度を高める際に使用するための、実施形態９〜２８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３３  対象において尿オキサレート濃度を低減する際に使用するための、実施形態９〜２８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３４  オキサレート産生、臓器におけるシュウ酸カルシウム沈着、高シュウ酸尿症、全身性シュウ酸症を含むシュウ酸症、血尿、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を治療もしくは予防する、および／または腎臓もしくは肝臓移植の必要性を遅らせるか、もしくは改善する際に使用するための、実施形態９〜２８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３５  さらに、
ａ．細胞または対象においてＨＡＯ１遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導すること、
ｂ．細胞または対象においてＨＡＯ１遺伝子の発現を低減すること、
ｃ．対象においてＰＨ１を治療または予防すること、
ｄ．対象において血清および／または血漿グリコレート濃度を高めること、
ｅ．対象において尿オキサレート濃度を低減すること、
ｆ．オキサレート産生を低減すること、
ｇ．臓器におけるシュウ酸カルシウム沈着を低減すること、
ｈ．高シュウ酸尿症を低減すること、
ｉ．全身性シュウ酸症を含むシュウ酸症を治療または予防すること、
ｊ．血尿を治療または予防すること、
ｋ．末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を予防すること、および／または
ｌ．腎臓または肝臓移植の必要性を遅らせるか、または改善すること、を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６  組成物が、血清および／または血漿グリコレートレベルを高める、実施形態１〜８または２９〜３５のいずれか１つに記載の方法または使用するための組成物。
実施形態３７  組成物が、ＨＡＯ１遺伝子の編集を引き起こす、実施形態１〜８または２９〜３５のいずれか１つに記載の方法または使用するための組成物。
実施形態３８  編集が、編集される集団の割合（編集率）として計算される、実施形態３７に記載の方法または使用するための組成物。
実施形態３９  編集率が、集団の３０〜９９％である、実施形態３８に記載の方法または使用するための組成物。
実施形態４０  編集率が、集団の３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、または９５〜９９％である、実施形態３８に記載の方法または使用するための組成物。
実施形態４１  組成物が、尿オキサレート濃度を低減する、実施形態１〜８または実施形態２９〜３５のいずれか１つに記載の方法または使用するための組成物。
実施形態４２  尿オキサレートの減少が、腎臓結石および／または腎臓、肝臓、膀胱、心臓、皮膚、または眼におけるシュウ酸カルシウム沈着を減少させる、実施形態４１に記載の方法または使用するための組成物。
実施形態４３  ガイド配列が、
ａ．配列番号１〜１４６、
ｂ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５、および
ｃ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５から選択される、実施形態１〜４２のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態４４  組成物が、
ａ．配列番号１５１〜１６８のうちのいずれか１つ、または
ｂ．配列番号２５１〜２６８のうちのいずれか１つ、または
ｃ．配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５から選択されるガイド配列、または
ｄ．配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５から選択されるガイド配列、を含むｓｇＲＮＡを含む、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態４５  標的配列が、ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン１、３、４、５、６、または８の中にある、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態４６  標的配列が、ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン１の中にある、実施形態４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態４７  標的配列が、ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン３の中にある、実施形態４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態４８  標的配列が、ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン４の中にある、実施形態４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態４９  標的配列が、ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン６の中にある、実施形態４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５０  標的配列が、ヒトＨＡＯ１遺伝子のエクソン８の中にある、実施形態４５に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５１  ガイド配列が、ＨＡＯ１のプラス鎖内の標的配列に対して相補的である、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５２  ガイド配列が、ＨＡＯ１のマイナス鎖内の標的配列に対して相補的である、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５３  第１のガイド配列が、ＨＡＯ１遺伝子のプラス鎖内の第１の標的配列に対して相補的であり、組成物が、ＨＡＯ１遺伝子のマイナス鎖内の第２の標的配列に対して相補的である第２のガイド配列をさらに含む、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５４  ガイドＲＮＡが、配列番号１〜１４６のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含み、配列番号２００のヌクレオチド配列をさらに含み、配列番号２００のヌクレオチドが、その３’末端にある前記ガイド配列の後にある、実施形態１〜５３のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５５  ガイドＲＮＡが、配列番号１〜１４６のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含み、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、または配列番号４００〜４５０のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列をさらに含み、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、または配列番号４００〜４５０のうちのいずれか１つのヌクレオチドが、その３’末端にあるガイド配列の後にある、実施形態１〜５４のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５６  ガイドＲＮＡが、シングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１〜５５のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５７  ｓｇＲＮＡが、配列番号４、５、６、８、２２、３５、３８、３９、５６、７３、８４、１００、１０５、１１３、１１７、１２９、１４５のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む、実施形態５６に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５８  ｓｇＲＮＡが、配列番号１５１〜１６８または２５１〜２６８のうちのいずれか１つを含む、実施形態５６に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態５９  ガイドＲＮＡが、配列番号３００のパターンに従って修飾され、Ｎが、まとめて、表１のガイド配列（配列番号１〜１４６）のうちのいずれか１つである、実施形態１〜５８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６０  配列番号３００の各Ｎが、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Ｎが、ガイド配列を形成し、ガイド配列が、ＨＡＯ１遺伝子に対してＣａｓ９を標的とする、実施形態５９に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６１  ｓｇＲＮＡが、配列番号１〜１４６のガイド配列のうちのいずれか１つと、配列番号２０１、配列番号２０２、または配列番号２０３のヌクレオチドと、を含み、配列番号２０１、配列番号２０２、または配列番号２０３のヌクレオチドが、その３’末端にあるガイド配列の後にある、実施形態１〜６０のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６２  ｓｇＲＮＡが、配列番号１〜１４６から選択される配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、実施形態１〜６１のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６３  ｓｇＲＮＡが、配列番号８、２２、３５、３９、７３、８４、１００、１０５、１１３、１４５、１５１〜１６８、および２５１〜２６８から選択される配列を含む、実施形態６２に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６４  ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１〜６３のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６５  少なくとも１つの修飾が、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６４に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６６  ヌクレオチドの間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、実施形態６３〜６５のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６７  ２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６３〜６６のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６８  ガイドＲＮＡの５’末端での最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾を含む、実施形態６３〜６７のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態６９  ガイドＲＮＡの３’末端での最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾を含む、実施形態６３〜６８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７０  ガイドＲＮＡの最初の４個のヌクレオチドの間にＰＳ結合を含む、実施形態６３〜６９のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７１  ガイドＲＮＡの最後の４個のヌクレオチドの間にＰＳ結合を含む、実施形態６３〜７０のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７２  ガイドＲＮＡの５’末端での最初の３個のヌクレオチドに２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６３〜７１のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７３  ガイドＲＮＡの３’末端での最後の３個のヌクレオチドに２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６３〜７２のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７４  ガイドＲＮＡが、配列番号３００の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態６３〜７３のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７５  組成物が、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む、実施形態１〜７４のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７６  ガイドＲＮＡが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、実施形態１〜７５のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７７  ＬＮＰが、陽イオン性脂質を含む、実施形態７６に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７８  陽イオン性脂質が、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエートであり、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエートとも呼ばれる、実施形態７７に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態７９  ＬＮＰが、中性脂質を含む、実施形態７６〜７８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８０  中性脂質が、ＤＳＰＣである、実施形態７９に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８１  ＬＮＰが、ヘルパー脂質を含む、実施形態７６〜８０のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８２  ヘルパー脂質が、コレステロールである、実施形態８１に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８３  ＬＮＰが、ステルス脂質を含む、実施形態７６〜８２のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８４  ステルス脂質が、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである、実施形態８３に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８５  組成物が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をさらに含む、実施形態１〜８４のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８６  組成物が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１〜８５のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８７  ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９である、実施形態８５または８６に記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８８  組成物が、薬学的製剤であり、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、実施形態１〜８７のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態８９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態９９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１００  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１０１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１０２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１０３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１０４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１０５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１０６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１０７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１０８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１０９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号２９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１１９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号３９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１２９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号４９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１３９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号５９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１４９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号６９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１５９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号７９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１６９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号８９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１７９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号９９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１００である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１８９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１０９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態１９９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２００  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２０１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２０２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２０３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２０４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２０５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２０６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２０７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１１９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２０８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２０９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１２９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２１９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３７である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２６  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３８である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２７  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１３９である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２８  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１４０である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２２９  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１４１である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３０  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１４２である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３１  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１４３である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３２  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１４４である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３３  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１４５である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３４  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１４６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３５  配列番号１〜１４６から選択される配列が、配列番号１４６である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３６  ガイドＲＮＡが、配列番号２５１を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３７  ガイドＲＮＡが、配列番号２５２を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３８  ガイドＲＮＡが、配列番号２５３を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２３９  ガイドＲＮＡが、配列番号２５４を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２４０  ガイドＲＮＡが、配列番号２５５を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２４１  ガイドＲＮＡが、配列番号２５６を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２４２  ガイドＲＮＡが、配列番号２５７を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２４３  ガイドＲＮＡが、配列番号２５８を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２４４  ガイドＲＮＡが、配列番号２５９を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２４５  ガイドＲＮＡが、配列番号２６０を含むｓｇＲＮＡである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法、使用するための組成物、または組成物。
実施形態２４６  組成物が、単回用量として投与される、実施形態１〜２４５のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２４７  組成物が、一度投与される、実施形態１〜２４６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２４８  単回用量または一度投与が、
ａ．ＤＳＢを誘導する、および／または
ｂ．ＨＡＯ１遺伝子の発現を低減する、および／または
ｃ．ＰＨ１を治療もしくは予防する、および／または
ｄ．ＰＨ１によって引き起こされるＥＳＲＤを治療もしくは予防する、および／または
ｅ．シュウ酸カルシウム産生および沈着を治療もしくは予防する、および／または
ｆ．高シュウ酸尿症を治療もしくは予防する、および／または
ｇ．シュウ酸症を治療もしくは予防する、および／または
ｈ．血尿を治療もしくは予防する、および／または
ｉ．血清グリコレート濃度を高める、および／または
ｊ．尿内のオキシレートを低減する、実施形態２４６または２４７のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２４９  単回用量または一度投与が、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５週間にわたって、ａ）〜ｊ）のうちのいずれか１つ以上を達成する、実施形態２４８に記載の方法または組成物。
実施形態２５０  単回用量または一度投与が、永続的な効果を達成する、実施形態２４８に記載の方法または組成物。
実施形態２５１  永続的な効果を達成することをさらに含む、実施形態１〜２５０のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２５２  永続的な効果が、少なくとも１ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、または少なくとも５年持続する、実施形態２５１に記載の方法または組成物。
実施形態２５３  組成物の投与によって、尿内のオキサレートの治療的に関連する減少がもたらされる、実施形態１〜２５２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２５４  組成物の投与によって、治療範囲内の尿オキサレートレベルがもたらされる、実施形態１〜２５３のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２５５  組成物の投与によって、正常範囲の１００、１２０、または１５０％以内のオキサレートレベルがもたらされる、実施形態１〜２５４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２５６  ＰＨ１を有するヒト対象を治療するための医薬の調製のための、実施形態９〜２５５のいずれかに記載の組成物または製剤の使用。
【０００９】
ＰＨ１を有するヒト対象を治療するための医薬の調製のための、上の実施形態のいずれかに記載の組成物または製剤の使用も開示される。ＰＨ１を治療する際に使用するため、またはＨＡＯ１遺伝子を修飾する（例えば、その中にインデルを形成する、またはその中にフレームシフトまたはナンセンス突然変異を形成する）際に使用するための、上の組成物または製剤のいずれかも開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】ＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９（図１Ａ）、ＨＵＨ７（図１Ｂ）、およびＰＣＨ（図１Ｃ）編集とのＰＨＨにおけるｄｇＲＮＡ編集％の相関を示す。
【図１Ｂ】上記と同様。
【図１Ｃ】上記と同様。
【図２】ＨＡＯ１を標的とする特定のｄｇＲＮＡのオフターゲット分析を示す。
【図３】ＨＡＯ１を標的とする特定のｓｇＲＮＡのオフターゲット分析を示す。
【図４】ＰＨＨにおけるＨＡＯ１を標的とする特定のｓｇＲＮＡの編集％の用量応答曲線を示す。
【図５】ＰＣＨにおけるＨＡＯ１を標的とする特定のｓｇＲＮＡの編集％の用量応答曲線を示す。
【図６】ＰＨＨにおけるＨＡＯ１を標的とする修飾ｓｇＲＮＡ（表２に列挙される）のウェスタンブロット分析を示す。
【図７】ＰＣＨにおけるＨＡＯ１を標的とする修飾ｓｇＲＮＡ（表２に列挙される）のウェスタンブロット分析を示す。
【図８】ＨＡＯ１を標的とする修飾ｓｇＲＮＡ（表２に列挙される）で処理されたＰＨＨ由来のＧＯタンパク質定量値およびインデル頻度を示す。
【図９】ＨＡＯ１を標的とする修飾ｓｇＲＮＡ（表２に列挙される）で処理されたＰＣＨ由来のＧＯタンパク質定量値およびインデル頻度を示す。
【図１０】インビボでのマウスにおける様々な修飾ｓｇＲＮＡ（表１７に列挙される）のＨＡＯ１編集率を示す。
【図１１】５週間の試験において、インビボでのＡＧＴ欠損マウスにおける修飾ｓｇＲＮＡ（表１７に列挙されるＧ７２３）を含むＬＮＰで処理した後の尿オキサレートレベルを示す。
【図１２】１５週間の試験において、インビボでのＡＧＴ欠損マウスにおける修飾ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰで処理した後の尿オキサレートレベルを示す。
【図１３】１５週間の試験において、インビボでのＡＧＴ欠損マウスにおける修飾ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰで処理した後のウェスタンブロット分析を示す。
【図１４】表２０に示される編集レベルとタンパク質レベルとの間の相関を示す。
【図１５】例示的なｓｇＲＮＡ配列（配列番号２０１）における１０個の保存領域ＹＡ部位を１〜１０でラベリングする。数字２５、４５、５０、５６、６４、６７、および８３は、（Ｎ）ｘとして示されるガイド領域を有するｓｇＲＮＡ中のＹＡ部位１、５、６、７、８、９、および１０のピリミジンの位置を示し、例えば、ｘは、任意選択で、２０である。
【図１６】下部ステム、バルジ、上部ステム、ネクサス（そのヌクレオチドは、５’から３’方向で、それぞれＮ１〜Ｎ１８と称することができる）、ヘアピン１およびヘアピン２領域を含む、ｓｇＲＮＡの保存領域の個々のヌクレオチドを示すラベルが付けられた、可能な二次構造における例示的なｓｇＲＮＡ（配列番号４０１、全ての修飾は図示されていない）を示す。ヘアピン１とヘアピン２との間のヌクレオチドは、ｎとラベリングされる。ガイド領域は、ｓｇＲＮＡ上に存在してもよく、この図ではｓｇＲＮＡの保存領域の前に「（Ｎ）ｘ」として示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照し、本発明の実施形態の例は添付の図面で例示される。本発明は例示される実施形態と併せて説明されるが、それらは、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義され、含まれる実施形態によって本発明内に含まれ得る全ての代替物、改変物、および均等物を網羅することが意図される。
【００１２】
本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含めることに留意されたい。したがって、例えば、「コンジュゲート（ａ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」への言及は、複数のコンジュゲートを含み、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞を含む等。
【００１３】
数値範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。測定値および測定可能な値は、有意な桁および測定に関連する誤差を考慮して、おおよその値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。上述の概略的な説明と、以下の詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、その教示を限定するものではないことが理解されるべきである。
【００１４】
本明細書に特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「からなる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれらを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものであると想定される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「または」という用語は、文脈が別途明確に示さない限り、包括的な意味で、すなわち、「および／または」に等しい意味で使用される。
【００１５】
本明細書で使用される章の見出しは、構成的な目的のみのためであり、所望の主題を決して限定するものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる任意の材料が、本明細書で定義される任意の用語または本明細書の任意の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先する。本教示を様々な実施形態と併せて記載するが、本教示をそのような実施形態に限定することを意図するものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替、改変物、および均等物を包含する。
【００１６】
Ｉ．定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語および句は、以下の意味を有することを意図する。
【００１７】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、骨格に沿って一緒に連結された窒素系複素環式塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ（従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、およびそれらのアナログであるポリマーを含む）を含む多量体化合物を指すために本明細書で使用される。核酸「骨格」は、糖ホスホジエステル連結、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換、例えば、２’メトキシまたは２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。窒素系塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、５−メトキシウリジン、プソイドウリジン、もしくはＮ１−メチルプソイドウリジン等の修飾ウリジン）、イノシン、プリンもしくはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−もしくはアザ−プリン、デアザ−もしくはアザ−ピリミジン、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５−メチルシトシン）、２、６、もしくは８位に置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号およびＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であってもよい。一般的な考察については、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．編集、１１ｔｈ  ｅｄ．，１９９２を参照）。核酸は、骨格がポリマーの位置（複数可）に窒素系塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基および連結のみを含んでいてもよく、または従来の構成要素および置換の両方（例えば、２’メトキシ連結を有する従来の塩基、または従来の塩基および１つ以上の塩基アナログの両方を含有するポリマー）を含むことができる。核酸は、ＲＮＡ模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、相補的なＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有するアナログである「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１）。ＲＮＡおよびＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡ内のウラシルもしくはそのアナログおよびＤＮＡ内のチミンもしくはそのアナログの存在によって異なり得る。
【００１８】
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、および単に「ガイド」は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡとしても知られる）、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）のいずれかを指すために、本明細書で互換的に使用される。ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合し得るか、または２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）において会合し得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、各種類を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または天然に存在する配列と比較して修飾もしくは変異を有するｔｒＲＮＡ配列であり得る。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」は、標的配列に対して相補的であり、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、開裂）のための標的配列に対してガイドＲＮＡを指向させるように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」とも称され得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９）および関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長のような、より短い配列またはより長い配列もまたガイドとして使用できる。例えば、いくつかの実施形態では、ガイド配列は、配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、例えば、ガイド配列に対して相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ガイド配列は、配列番号１〜１４６から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、もしくは２０個の連続ヌクレオチドに対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域とは、１００％相補的または同一であってもよい。他の実施形態では、ガイド配列と標的領域とは、少なくとも１個のミスマッチを含有していてもよい。例えば、ガイド配列および標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含有していてもよく、標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態では、ガイド配列および標的領域は、１〜４個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列および標的領域は、１、２、３、または４個のミスマッチを含有していてもよく、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドを含む。
【００２０】
ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の核酸基質は二本鎖核酸であるので、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖（すなわち、与えられる配列と、配列の逆相補体）の両方を含む。したがって、ガイド配列が、「標的配列に対して相補的」であると言われる場合、標的配列の逆相補体に結合するようにガイドＲＮＡを指向させ得ると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が、標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるＵのＴへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド（例えばＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤」は、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は、配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓクリバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）／ニッカーゼおよびその不活性化形態（ｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤」）が含まれる。本明細書で使用される「Ｃａｓタンパク質」とも称される「Ｃａｓヌクレアーゼ」には、Ｃａｓクリバーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、およびｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤が包含される。Ｃａｓクリバーゼ／ニッカーゼおよびｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤には、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはそのＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニットおよびクラス２Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、「クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、ＲＮＡガイドＤＮＡクリバーゼもしくはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２Ｃａｓクリバーゼ／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、ならびに切断／ニッカーゼ活性が不活性化されたクラス２ｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤が含まれる。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ  Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、およびｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、ならびにそれらの修飾が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ、１６３：１−１３（２０１５））は、Ｃａｓ９と相同性であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１およびＳ３を参照。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３（１１）：７２２−３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、６０：３８５−３９７（２０１５）を参照。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリバーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、またはｄＣａｓ  ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）と共に含むガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、Ｃａｓ９等のＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を標的配列へと誘導し、ガイドＲＮＡがこれとハイブリダイズし、この薬剤が標的配列と結合する。この薬剤がクリバーゼまたはニッカーゼである場合、結合の後に切断またはニッキングを行うことができる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、第２の配列に対する第１の配列のアライメントにより、第２の配列の位置の全体でのＸ％以上が第１の配列によって一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列と「少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧと１００％同一性を有する配列を含むが、その理由は、アラインメントは、第２の配列の３つの全ての位置において一致があるという点で１００％同一性を与えるからである。ＲＮＡとＤＮＡとの間の差（一般に、チミジンをウリジンに交換すること、またはその逆）、および修飾ウリジン等のヌクレオシドアナログの存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジン等）が同じ相補体（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てについてのアデノシン；別の例は、シトシンおよび５−メチルシトシンであり、これらの両方が相補体としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の差に寄与しない。したがって、例えば、Ｘがいずれかの修飾ウリジン、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン、または５−メトキシウリジンである配列５’−ＡＸＧは、両方とも同じ配列（５’−ＣＡＵ）に完全に相補的である点において、ＡＵＧと１００％同一であるとみなされる。例示的なアライメントアルゴリズムは、当該技術分野において周知である、Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎおよびＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである。当業者は、アライメントされる配列の所与の対について、どのようなアルゴリズムおよびパラメータ設定の選択が適切であることを理解するであろう。一般的に類似する長さおよび予想される同一性がアミノ酸については５０％超の配列、またはヌクレオチドについては７５％超の配列に関して、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバでＥＢＩによって提供されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定を用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが一般的に適切である。
【００２４】
「ｍＲＮＡ」は、ＤＮＡではなく、ポリペプチドへと翻訳することができる（すなわち、リボソームおよびアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能し得る）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはそのアナログを含むリン酸糖骨格（例えば、２’−メトキシリボース残基）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸糖骨格の糖は、リボース残基、２’−メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。
【００２５】
本明細書に記載のガイドＲＮＡ組成物および方法に有用なガイド配列を、表１および本出願全体に示す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「インデル」は、標的核酸内の二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位において挿入されるか、または欠失するかのいずれかである多数のヌクレオチドからなる挿入／欠失突然変異を指す。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはその両方）の発現の低減を指す。タンパク質のノックダウンは、目的の組織または細胞集団からタンパク質の総細胞量を検出することによって測定することができる。ｍＲＮＡのノックダウンを測定する方法は既知であり、目的の組織または細胞集団から単離されたｍＲＮＡのシークエンシングを含む。いくつかの実施形態では、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物の発現のいくつかの喪失、例えば、転写されるｍＲＮＡの量の低減、または細胞集団（組織に見られるもの等のインビボ集団を含む）によって発現されるタンパク質の量の低減を指し得る。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、細胞における特定のタンパク質の発現の喪失を指す。ノックアウトは、細胞、組織、または細胞集団におけるタンパク質の総細胞量を検出することのいずれかによって測定することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の細胞において（例えば、組織内で見出されるもの等のインビボ集団を含む細胞の集団において）ＨＡＯ１を「ノックアウトする」。いくつかの実施形態では、ノックアウトは、例えば、インデルによって作製される変異体ＨＡＯ１タンパク質の形成ではなく、細胞内のＨＡＯ１タンパク質の発現の完全な喪失である。本明細書で使用される場合、「ＨＡＯ１」は、ＨＡＯ１遺伝子の遺伝子産物であるヒドロキシ酸オキシダーゼ１を指す。ヒト野生型ＨＡＯ１配列は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５４３６３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０１３２３で利用可能である。「ＧＯＸ」および「ＧＯＸ１」は、遺伝子シノニム（ｓｙｎｏｙｍ）である。
【００２９】
「原発性高シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）」は、肝臓ペルオキシソームアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）酵素をコードするＡＧＸＴ遺伝子の突然変異に起因する常染色体劣性障害である。ＡＧＴは、グリオキシレートをグリシンへと代謝する。ＡＧＴ活性の欠如、またはミトコンドリアに対する誤った標的化は、グリオキシレートからオキサレートへの酸化を可能にし、これは尿にのみ排泄することができる。高いオキサレートレベルによって、シュウ酸カルシウムの結石形成および腎実質損傷が起こり、これにより腎機能の進行的な悪化を引き起こし、最終的には、末期腎疾患を引き起こす。したがって、ＰＨ１の特徴は、腎臓および尿路における過剰なオキサレート産生およびシュウ酸カルシウム結晶の沈着である。オキサレートによる腎障害は、細管毒性、腎臓におけるシュウ酸カルシウム沈着、およびシュウ酸カルシウム結石による尿閉塞の組み合わせによって引き起こされる。過剰なオキサレートをもはや効果的に排泄することができないため、腎機能の低下は、疾患を悪化させ、骨、眼、皮膚、および心臓、ならびに重篤な疾病および死を引き起こす他の臓器におけるオキサレートのその後の蓄積および結晶化が起こる。腎不全および末期腎疾患が、特徴である。ＰＨ１のための承認された薬学的療法は存在しない。
【００３０】
グリコレートオキシダーゼ（ＧＯ）は、ＡＧＴの上流にある肝臓ペルオキシソーム酵素であり、ＰＨ１において進行する病変を潜在的に予防するために、疾患肝臓からオキサレート合成のための基質を枯渇させるための１つの可能な機構である。ヒドロキシ酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）遺伝子によってコードされるＧＯは、グリコレートからグリオキシレートへの酸化を触媒する。ＧＯ活性の抑制は、グリコレートの蓄積を引き起こしつつ、オキサレート産生を阻害すべきである。オキサレートとは異なり、グリコレートは可溶性であり、尿内に容易に排泄される。したがって、いくつかの実施形態では、ＧＯ活性を阻害する方法が提供され、阻害されたら、オキサレート産生が阻害され、グリコレート産生が増加する。
【００３１】
グリオキシレートの酸化生成物であるオキサレートは、尿にのみ排泄することができる。尿内の高レベルのオキサレート（「高シュウ酸尿症」）は、ＰＨ１の症状である。したがって、尿内のオキサレートの増加は、ＰＨ１の症状である。オキサレートは、カルシウムと合わさり、腎臓および膀胱結石の主要な構成要素であるシュウ酸カルシウムを形成し得る。腎臓および他の組織中のシュウ酸カルシウムの沈着は、尿中の血液（血尿）、尿路感染症、腎臓損傷、末期腎疾患等を引き起こす場合がある。時間が経つにつれて、血液中のオキサレートレベルが上昇する場合があり、シュウ酸カルシウムが全身の他の臓器に沈着し得る（シュウ酸症または全身性シュウ酸症）。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対して相補性を有する標的遺伝子内の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、標的配列内で結合し、潜在的に（薬剤の活性に応じて）ニックを形成するか、または切断するように指向される。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ＹＡ部位」は、５’−ピリミジン−アデニン−３’ジヌクレオチドを指す。「保存領域ＹＡ部位」は、ｓｇＲＮＡの保存領域内に存在する。「ガイド領域ＹＡ部位」は、ｓｇＲＮＡのガイド領域内に存在する。ｓｇＲＮＡにおける非修飾ＹＡ部位は、ＲＮａｓｅ−Ａ様エンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅ  Ａによる切断を受けやすい場合がある。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、その保存領域内に約１０個のＹＡ部位を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、その保存領域内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位を含む。例示的な保存領域ＹＡ部位を図１５に示す。ガイド領域は、任意の数のＹＡ部位を含む任意の配列であり得るため、例示的なガイド領域ＹＡ部位は図１５に示されていない。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、図１５に示されるＹＡ部位のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、以下の位置またはそのサブセットにおいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＹＡ部位を含む。ＬＳ５−ＬＳ６、ＵＳ３−ＵＳ４、ＵＳ９−ＵＳ１０、ＵＳ１２−Ｂ３、ＬＳ７−ＬＳ８、ＬＳ１２−Ｎ１、Ｎ６−Ｎ７、Ｎ１４−Ｎ１５、Ｎ１７−Ｎ１８、およびＨ２−２〜Ｈ２−３。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位は修飾を含み、これは、ＹＡ部位のうちの少なくとも１個のヌクレオチドが修飾されていることを意味する。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジン（ピリミジン位置とも称される）は、修飾（ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間連結を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のアデニン（アデニン位置とも称される）は、修飾（アデニンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間連結を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジン位置およびアデニン位置は、修飾を含む。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「治療」は、対象における疾患または障害のための投与または治療の任意の適用を指し、その疾患を阻害すること、その進行を止めること、その疾患の１つ以上の症状を緩和すること、その疾患を治癒させること、またはその疾患の１つ以上の症状の再発を予防することを含む。例えば、ＰＨ１の治療は、ＰＨ１の症状を緩和することを含んでいてもよい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「オキサレートの治療的に関連する減少」または「治療範囲内のオキサレートレベル」という用語は、本明細書で使用される場合、ベースラインと比較して、尿オキサレート排泄の３０％を超える減少を意味する。Ｌｅｕｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈｏｐｐｅ（１９９９）Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １４：２５５６−２５５８  ａｔ  ２５５７、ｓｅｃｏｎｄ  ｃｏｌｕｍｎを参照。例えば、治療範囲内のオキサレートレベルを達成することは、ベースラインから３０％を超える尿オキサレートの減少を意味する。いくつかの実施形態では、「正常なオキサレートレベル」または「正常なオキサレート範囲」は、オキサレート約８０〜約１２２μｇ／クレアチニンのｍｇ数である。Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８６２（２）：２３３−２３９を参照。いくつかの実施形態では、オキサレートの治療的に関連する減少は、正常値の２００％、１５０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、または１００％未満または以下のレベルを達成する。
【００３６】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。
【００３７】
ＩＩ．組成物
Ａ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物
例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を有するガイドＲＮＡを使用して、ＨＡＯ１遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するのに有用な組成物が本明細書に提供される。組成物は、ＰＨ１を有するか、またはＰＨ１を有する疑いのある対象に投与され得る。組成物は、尿オキサレート出力が増加しているか、または血清グリコレート出力が減少している対象に投与され得る。ＨＡＯ１遺伝子を標的とするガイド配列を、表１に配列番号１〜１４６で示す。
【００３８】
表１に配列番号１〜１４６で示される各々のガイド配列は、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２００）。ｓｇＲＮＡの場合、上述のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでいてもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号２０１）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０３、４個の末端部のＵを含まない配列番号２０１である）。いくつかの実施形態では、配列番号２０１の４個の末端部のＵは存在しない。いくつかの実施形態では、配列番号２０１の４個の末端部のＵのうちの１、２、または３個のみが存在する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のガイド配列と、ヘアピン領域を含む「ｓｇＲＮＡの保存部分」とを含み、ヘアピン領域が、少なくとも５〜１０個のヌクレオチドまたは６〜１０個のヌクレオチドを欠いている、ＨＡＯ１の短いシングルガイドＲＮＡ（ＨＡＯ１の短いｓｇＲＮＡ）が提供される。特定の実施形態では、ＨＡＯ１の短いシングルガイドＲＮＡのヘアピン領域は、ｓｇＲＮＡの保存部分を参照して、５〜１０個のヌクレオチドを欠いている（例えば、表２ＢのＨ１−１〜Ｈ２−１５）。特定の実施形態では、ＨＡＯ１の短いシングルガイドＲＮＡのヘアピン１領域は、ｓｇＲＮＡの保存部分を参照して、５〜１０個のヌクレオチドを欠いている（例えば、表２ＢのＨ１−１〜Ｈ１−１２）。
【００４０】
例示的な「ｓｇＲＮＡの保存部分」が表２Ａに示されており、表２Ａは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（「ｓｐｙＣａｓ９」（「ｓｐＣａｓ９」とも称される））ｓｇＲＮＡの保存領域を示す。１行目は、ヌクレオチドの番号付けを示し、２行目は、配列（例えば、配列番号４００）を示し、３行目は、「ドメイン」を示す。Ｂｒｉｎｅｒ  ＡＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５６：３３３−３３９（２０１４）は、本明細書で「ドメイン」と呼ばれるｓｇＲＮＡの機能ドメインを記載しており、標的化を担う「スペーサー」ドメイン、「下部ステム」、「バルジ」、「上部ステム」（テトラループを含んでいてもよい）、「ネクサス」、ならびに「ヘアピン１」および「ヘアピン２」ドメインを含む。Ｂｒｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．のページ３３４、図１Ａを参照のこと。
【００４１】
表２Ｂは、本明細書で使用されるｓｇＲＮＡのドメインの概略図を提供する。表２Ｂにおいて、領域間の「ｎ」は、例えば、０〜１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の可変数のヌクレオチドを表す。いくつかの実施形態では、ｎは０に等しい。いくつかの実施形態では、ｎは１に等しい。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１  ｓｇＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（「ｓｐｙＣａｓ９」）またはｓｐｙＣａｓ９等価物由来である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来ではない（「非ｓｐｙＣａｓ９」）。いくつかの実施形態では、５〜１０個のヌクレオチドまたは６〜１０個のヌクレオチドが連続している。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１の短いｓｇＲＮＡは、表２Ａに示されるように、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（「ｓｐｙＣａｓ９」）ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５４〜５８（ＡＡＡＡＡ）を欠失している。いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１の短いｓｇＲＮＡは、例えばペアワイズまたは構造アラインメントによって決定されるように、ｓｐｙＣａｓ９の保存部分のヌクレオチド５４〜５８（ＡＡＡＡＡ）に対応するヌクレオチドを少なくとも欠失している非ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、非ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９（「ｓａＣａｓ９」）ｓｇＲＮＡである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１の短いｓｇＲＮＡは、ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５４〜６１（ＡＡＡＡＡＧＵＧ）を欠失している。いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１の短いｓｇＲＮＡは、ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡの保存部分の少なくともヌクレオチド５３〜６０（ＧＡＡＡＡＡＧＵ）を欠失している。いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１の短いｓｇＲＮＡは、例えば、ペアワイズまたは構造アラインメントによって決定されるように、ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡの保存部分のヌクレオチド５３〜６０（ＧＡＡＡＡＡＧＵ）もしくはヌクレオチド５４〜６１（ＡＡＡＡＡＧＵＧ）の４、５、６、７、もしくは８個のヌクレオチド、または非ｓｐｙＣａｓ９  ｓｇＲＮＡの保存部分の対応するヌクレオチドを欠いている。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、配列番号１〜１４６のガイド配列のうちのいずれか１つと、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドと、を含み、例えば、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０２）。配列番号２０２は、以下の野生型ガイドＲＮＡ保存配列を参照して、８個のヌクレオチドを欠いている。ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０３）。
【００４６】
【表１−１】
2021531804.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【００４７】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【００４８】
【表３】
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【００４９】
【表４】
2021531804.tif 000013
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９等のＣａｓヌクレアーゼ）であってもよいＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を、ＨＡＯ１中の標的ＤＮＡ配列に指向させるガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物を提供する。ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列の１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むｃｒＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドに対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列に対して約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する配列を含むｃｒＲＮＡを含む。ｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含み得る。本明細書に記載される各々の組成物および方法の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、シングルＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合していてもよく、または別個のＲＮＡ上にあってもよい（ｄｇＲＮＡ）。ｓｇＲＮＡの文脈において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。
【００５１】
本明細書に記載される各々の組成物、使用および方法の実施形態では、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、例えば、表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子と、を含む。第１のＲＮＡ分子と第２のＲＮＡ分子は共有結合していなくてもよいが、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対形成によってＲＮＡ二本鎖を形成してもよい。
【００５２】
本明細書に記載される各々の組成物、使用および方法の実施形態では、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」としてシングルＲＮＡ分子を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡに共有結合した表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（またはその一部）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列のも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対形成によって、ステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して共有結合される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のｔｒＲＮＡ配列の全てまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、先端切断または修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に依存する。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００個より多いヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、例えば１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造等の特定の二次構造を含み得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１〜１４６のうちのいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１５１〜１６８または２５１〜２６８のうちのいずれか１つを含む１つ以上のｓｇＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００５６】
一態様では、本発明は、配列番号１〜１４６の核酸のうちのいずれかに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むｇＲＮＡを含む組成物を提供する。
【００５７】
他の実施形態では、組成物は、配列番号１〜１４６のガイド配列のうちのいずれか２つ以上から選択されるガイド配列を含む少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１〜１４６の核酸のうちのいずれかに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を各々含む少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
【００５８】
本発明のガイドＲＮＡ組成物は、ＨＡＯ１遺伝子内の標的配列を認識する（例えばこれに対してハイブリダイズする）ように設計される。例えば、ＨＡＯ１標的配列は、ガイドＲＮＡを含む提供されるＣａｓ開裂によって認識され、切断され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓクリバーゼは、ガイドＲＮＡをＨＡＯ１遺伝子の標的配列に対して指向させてもよく、ガイドＲＮＡのガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓクリバーゼは、標的配列を切断する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ＨＡＯ１遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。
【００６０】
いかなる特定の理論にも拘束されることなく、遺伝子の特定の領域における突然変異（例えば、ヌクレアーゼ媒介性ＤＳＢの結果として生じるインデルに起因するフレームシフト変異）は、遺伝子の他の領域における突然変異よりも許容性が低くてもよく、したがって、ＤＳＢの位置は、もたらされ得るタンパク質ノックダウンの量または種類における重要な因子である。いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１内の標的配列に対して相補的であるか、または相補性を有するｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をＨＡＯ１遺伝子内の特定の位置に指向させるために使用される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＨＡＯ１のエクソン１、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、またはエクソン８内の標的配列に対して相補的であるか、または相補性を有するガイド配列を有するように設計されている。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ヒトＨＡＯ１遺伝子内に存在する標的配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である。いくつかの実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡのガイド配列に対して相補的であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列とは、１００％相補的であるか、または同一であり得る。他の実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、少なくとも１個のミスマッチを含んでいてもよい。例えば、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでいてもよく、ここで、ガイド配列の全長は、約２０である。いくつかの実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１〜４個のミスマッチを含んでいてもよく、ここで、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドである。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物または製剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。
【００６３】
Ｂ．修飾ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾されている。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵ残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される１つ以上の非天然および／または天然に存在する成分または構造の存在を記載するために、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、非標準的なヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、本明細書では「修飾された」と呼ばれる。修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の１つもしくは両方、および／または、架橋リン酸酸素の１つ以上の置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準的な核酸塩基によるものを含め、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置き換え、または部分、キャップ、またはリンカーのコンジュゲーション（そのような３’または５’のキャップ修飾は、糖および／または骨格の修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）の１つ以上を含み得る。
【００６４】
上に列挙されるもの等の化学修飾を組み合わせて、２、３、４、またはそれ以上の修飾を有し得るヌクレオシドおよびヌクレオチド（まとめて「残基」）を含む修飾ｇＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの各々の塩基は修飾され、例えば、全ての塩基がホスホロチオエート基等の修飾リン酸基を有する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１、２、３、またはそれ以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡ内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）が、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
【００６６】
非修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見られるものによる分解を受けやすい場合がある。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、例えば、細胞内または血清に由来するヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡ分子は、インビボとエクスビボの両方において細胞集団に導入されるとき、低減した自然免疫応答を示し得る。「自然免疫応答」という用語は、サイトカイン（特にインターフェロン）発現および放出の誘導ならびに細胞死を含む、一本鎖核酸を含む外来性核酸に対する細胞応答を含む。
【００６７】
骨格修飾のいくつかの実施形態では、修飾残基のリン酸基は、１つ以上の酸素を異なる置換基によって置き換えることによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書において記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置き換えを含み得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の骨格修飾は、帯電していないリンカーまたは非対称な電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
【００６８】
修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルを含む。非修飾リン酸基中のリン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子または原子群のうちの１つによる置き換えは、リン原子をキラルにすることができる。立体リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書においてＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書においてＳｐ）のいずれかを有し得る。骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）による置き換えによってもまた修飾できる。置き換えは、いずれかの架橋酸素または両方の架橋酸素において生じ得る。
【００６９】
リン酸基は、ある骨格修飾において、非リン含有連結基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、帯電したリン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置き換えることのできる部分の例は、非限定的に、例えば、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンオキシメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）を含み得る。
【００７０】
リン酸リンカーとリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドの代替物によって置き換えられている核酸を模倣できるスキャフォールドもまた構築できる。そのような修飾は、骨格および糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、代替骨格によって係留され得る。例は、非限定的に、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）核酸塩基代替物を含み得る。
【００７１】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖基に対する１つ以上の修飾、すなわち糖修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾されていてもよく、例えば、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが２’−アルコキシドイオンを形成するようにさらに脱プロトン化されることがもはや起こり得ないので、核酸の安定性を増強し得る。
【００７２】
２’ヒドロキシル基修飾の例は、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中「Ｒ」がアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲであって式中Ｒが、例えば、Ｈまたは任意選択で置換されたアルキルであり、ｎが０〜２０の整数であり得るもの（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅであり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’−ヒドロキシル基をフッ化物で置き換える２’−フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えばＣ１−６アルキレンまたはＣ１−６ヘテロアルキレン架橋を介して同一のリボース糖の４’炭素へと接続し得る「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよく、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋、Ｏ−アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’−Ｃ３’結合を欠失している「アンロックド（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）」核酸（ＵＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は，メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えばＰＥＧ誘導体）を含み得る。
【００７３】
「デオキシ」２’修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的なｄｓＲＮＡの突出部分）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）、アミノ（ここでアミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（ここでアミノは、例えば、本明細書において記載されるようなものである）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（ここでＲは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、シアノ、メルカプト、アルキル−チオ−アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルを含み得、任意選択で、例えば本明細書において記載されるようなアミノによって置換されていてもよい。
【００７４】
糖修飾は、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を更に含む糖基を含み得る。したがって、修飾核酸は、糖として例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖をも含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成要素の糖原子の１つ以上においてさらに修飾され得る。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖、例えばＬ−ヌクレオシドを含み得る。
【００７５】
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書において記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含むが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾されて、または完全に置き換えられて、修飾核酸に組み込むことのできる修飾残基をもたらすことができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリンアナログ、またはピリミジンアナログから選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、天然に存在する塩基、および塩基の合成誘導体を含み得る。
【００７６】
デュアルガイドＲＮＡを用いる実施形態において、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの各々は、修飾を含み得る。このような修飾は、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡの一方または両方の末端に存在してもよい。ｓｇＲＮＡを含む実施形態では、ｓｇＲＮＡの一方または両方の末端における１つ以上の残基は、化学修飾されていてもよく、および／または内部ヌクレオシドが修飾されていてもよく、および／またはｓｇＲＮＡ全体が化学修飾されていてもよい。特定の実施形態は、５’末端修飾を含む。特定の実施形態は、３’末端修飾を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるガイドＲＮＡは、２０１７年１２月８日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ」という発明の名称のＷＯ２０１８／１０７０２８（Ａ１）に開示された修飾パターンの１つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるガイドＲＮＡは、ＵＳ２０１７０１１４３３４号に開示された構造／修飾パターンの１つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるガイドＲＮＡは、ＷＯ２０１７／１３６７９４号に開示された構造／修飾パターンの１つを含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７８】
Ｃ．ＹＡ修飾
ＹＡ部位における修飾（本明細書でＹＡ修飾とも称される）は、ヌクレオシド間連結の修飾、例えば、化学修飾、置換、または他の方法による、塩基（ピリミジンまたはアデニン）の修飾、および／または糖の修飾（例えば、２位での修飾、例えば、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ｍｏｅ、２’−Ｆアラビノース、２’−Ｈ（デオキシリボース）等）であり得る。いくつかの実施形態では、「ＹＡ修飾」は、例えば、ＲＮａｓｅによるＹＡ部位の認識もしくは切断を妨害することによって、および／またはＲＮａｓｅに対する切断部位の接近性を低減するＲＮＡ構造（例えば、二次構造）を安定化させることによって、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低減するためにジヌクレオチドモチーフの構造を変化させる任意の修飾である。Ｐｅａｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．７６：７２９５−７３００（２０１１）、Ｂｅｈｌｋｅ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：３０５−３２０（２００８）、Ｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０４：１６−２８（２０１６）、Ｇｈｉｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１３、４９、９０３６を参照のこと。Ｐｅａｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｌｈｋｅ，ＫｕおよびＧｈｉｄｉｎｉは、ＹＡ修飾として好適な例示的な修飾を提供する。エンドヌクレオチド分解を低減するための当業者に既知の修飾が包含される。ＲＮａｓｅ切断に関与する２’ヒドロキシル基に影響を与える例示的な２’リボース修飾は、２’−Ｈおよび２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−Ｍｅを含む）である。ＹＡ部位における残基の二環式リボースアナログＵＮＡ、および修飾ヌクレオシド間連結等の修飾は、ＹＡ修飾であり得る。ＲＮＡ構造を安定化させることができる例示的な塩基修飾は、プソイドウリジンおよび５−メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のうちの少なくとも１個のヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジン（「ピリミジン位置」とも称される）は、修飾（ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間連結を変化させる修飾、ピリミジン塩基の修飾、およびリボースの、例えばその２’位での修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のアデニン（「アデニン位置」とも称される）は、修飾（ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間連結を変化させる修飾、ピリミジン塩基の修飾、およびリボースの、例えばその２’位での修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンおよびアデニンは、修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を低減する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、短いｓｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれ以上のＹＡ部位における修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンは、修飾（ピリミジンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間連結を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のアデニンは修飾（アデニンの糖の直ぐ３’側のヌクレオシド間連結を変化させる修飾を含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位のピリミジンおよびアデニンは、糖、塩基、またはヌクレオシド間連結の修飾等の修飾を含む。ＹＡ修飾は、本明細書に記載されるいずれかの種類の修飾であり得る。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅ、または２’−フルオロのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅ、または２’−フルオロのうちの１つ以上を含むピリミジン修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、１つ以上のＹＡ部位を含むＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボースアナログ（例えばＬＮＡ、ＢＮＡ、またはＥＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ＹＡ部位を含むＲＮＡ二本鎖領域内の二環式リボースアナログ（例えば、ＬＮＡ、ＢＮＡ、またはＥＮＡ）を含み、ＹＡ修飾は、ＹＡ部位に対して遠位にある。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ガイド領域のＹＡ部位修飾を含む。いくつかの実施形態では、ガイド領域は、ＹＡ修飾を含み得る、１、２、３、４、５個またはそれ以上のＹＡ部位（「ガイド領域ＹＡ部位」）を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する１つ以上のＹＡ部位（「５末端」等は、ガイド領域の３’末端に対して５位、すなわち、ガイド領域内の最も３’のヌクレオチドを指す）は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する２つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する３つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する４つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、５’末端部の５’末端から５末端、６末端、７末端、８末端、９末端、または１０末端に位置する５つ以上のＹＡ部位が、ＹＡ修飾を含む。修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または９個のヌクレオチド内にある。例えば、修飾ガイド領域ＹＡ部位が、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドの１０個のヌクレオチド内にあり、ガイド領域が、２０個のヌクレオチド長である場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位の修飾ヌクレオチドは、１１〜２０位のいずれかに位置する。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドからＹＡ部位の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチド内に位置する。いくつかの実施形態では、ＹＡ修飾は、ガイド領域の３’末端部ヌクレオチドから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチドに位置する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端部の５’末端からのヌクレオチド４、５、６、７、８、９、１０、または１１番目、またはその後である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、５’末端修飾以外である。例えば、ｓｇＲＮＡは、本明細書に記載の５’末端修飾を含んでいてもよく、修飾ガイド領域ＹＡ部位をさらに含んでいてもよい。あるいは、ｓｇＲＮＡは、非修飾５’末端と、修飾ガイド領域ＹＡ部位と、を含むことができる。あるいは、ｓｇＲＮＡは、修飾５’末端と、非修飾ガイド領域ＹＡ部位と、を含むことができる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１個のヌクレオチドを含まない修飾を含む。例えば、ヌクレオチド１〜３がホスホロチオエートを含み、ヌクレオチド４が２’−ＯＭｅ修飾のみを含み、ヌクレオチド５がＹＡ部位のピリミジンであり、ホスホロチオエートを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１個のヌクレオチド（ヌクレオチド４）を含まない修飾（ホスホロチオエート）を含む。別の例では、ヌクレオチド１〜３がホスホロチオエートを含み、ヌクレオチド４がＹＡ部位のピリミジンであり、２’−ＯＭｅを含む場合、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する少なくとも１個のヌクレオチド（ヌクレオチド１〜３のいずれか）を含まない修飾（２’−ＯＭｅ）を含む。この条件はまた、非修飾ヌクレオチドが修飾ガイド領域ＹＡ部位の５’に位置する場合には、常に満たされる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、修飾ガイド領域ＹＡ部位は、上のＹＡ部位について記載される修飾を含む。
【００８６】
ガイド領域ＹＡ部位修飾の追加の実施形態は、上記の概要に示される。本開示の他の箇所に記載される任意の実施形態は、実現可能な範囲で、先行実施形態のいずれかと組み合わせ得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、保存領域ＹＡ部位修飾を含む。保存領域ＹＡ部位１〜１０を図１５に示す。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存領域ＹＡ部位は、修飾を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、保存領域ＹＡ部位１、８、または１および８は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、保存領域ＹＡ部位１、２、３、４、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位２、３、４、８、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、保存領域ＹＡ部位１、２、３、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位２、３、８、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＹＡ部位１、２、３、４、８、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８つの追加の保存領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、１、２、３、または４つの保存領域ＹＡ部位２、３、４、および１０は、ＹＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、または８つの追加の保存領域ＹＡ部位は、ＹＡ修飾を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、修飾保存領域ＹＡ部位は、上記ＹＡ部位について記載される修飾を含む。
【００９１】
保存領域ＹＡ部位修飾のさらなる実施形態は、上記の概要に示される。本開示の他の箇所に記載される任意の実施形態は、実現可能な範囲で、先行実施形態のいずれかと組み合わせ得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、以下の表３に示される修飾パターンのいずれかを含み、ここで、Ｎは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Ｎの全体は、表１で本明細書に記載されるＨＡＯ１ガイド配列を含む。表３は、ｓｇＲＮＡのガイド配列部分を示していない。修飾は、ガイドのヌクレオチドに対するＮの置換にもかかわらず、表３に示されるように残っている。すなわち、ガイドのヌクレオチドは「Ｎ」を置き換えるが、表３に示されるようにヌクレオチドが修飾される。
【００９３】
【表５−１】
2021531804.tif 000014
【表５−２】
2021531804.tif 000015
【表５−３】
2021531804.tif 000016
【表５−４】
2021531804.tif 000017
【表５−５】
2021531804.tif 000018
【表５−６】
2021531804.tif 000019
【００９４】
いくつかの実施形態では、修飾ｓｇＲＮＡは、以下の配列ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３００）を含み、ここで、「Ｎ」は、任意の天然または非天然ヌクレオチドであってもよく、Ｎの全体は、表１に記載されるＨＡＯ１ガイド配列を含む。例えば、本明細書に包含されるのは、配列番号３００であり、ここで、Ｎは、表１において本明細書で開示されるガイド配列（配列番号１〜１４６）のいずれかに置き換えられる。
【００９５】
以下に記載される修飾（ｍｏｄｉｆｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のいずれも、本明細書に記載されるｇＲＮＡおよびｍＲＮＡ内に存在し得る。
【００９６】
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’−Ｏ−Ｍｅによって修飾されているヌクレオチドを表すために使用され得る。
【００９７】
２’−Ｏ−メチルの修飾は、以下のように描写され得る。
【化１】
2021531804.tif 000020
【００９８】
ヌクレオチド糖環に影響を及ぼすことが示されている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環上の２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増加させることができる。
【００９９】
本出願において、「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」という用語は、２’−Ｆで置換されたヌクレオチドを表すために使用され得る。
【０１００】
２’−Ｆの置換は、以下のように描写され得る。
【化２】
2021531804.tif 000021
【０１０１】
ホスホロチオエート（ＰＳ）連結または結合とは、ホスホジエステル連結、例えばヌクレオチド塩基間の結合での１個の非架橋リン酸酸素を硫黄が置換する結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドはＳ−オリゴとも称され得る。
【０１０２】
ＰＳ修飾を示すために、「＊」を使用し得る。本出願では、用語Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊を使用して、ＰＳ結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを示すことができる。
【０１０３】
本出願では、用語「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」を使用して、２’−Ｏ−Ｍｅで置換され、ＰＳ結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されているヌクレオチドを示すことができる。
【０１０４】
以下の図は、非架橋リン酸酸素へのＳ−の置換を示し、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生じる。
【化３】
2021531804.tif 000022
【０１０５】
脱塩基ヌクレオチドは、窒素系塩基を欠いているものを指す。以下の図は、塩基を欠く脱塩基（脱プリンとしても知られる）部位を有するオリゴヌクレオチドを描写する。
【化４】
2021531804.tif 000023
【０１０６】
反転した塩基は、通常の５’から３’への連結とは反転した連結を有するものを指す（すなわち、５’から５’への連結または３’から３’への連結のいずれか）。例えば、
【化５】
2021531804.tif 000024
【０１０７】
脱塩基ヌクレオチドは、反転した連結と接続することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’−５’連結を介して末端部の５’ヌクレオチドに接続してもよく、または脱塩基ヌクレオチドは、３’−３’連結を介して末端部の３’ヌクレオチドに接続してもよい。末端部の５’または３’ヌクレオチドのいずれかにおける反転した脱塩基ヌクレオチドはまた、反転した脱塩基末端キャップと称され得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上、および３’末端部における最後の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｆ、反転した脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、または安定性および／もしくは性能を増加させることが当該技術分野において周知の他のヌクレオチド修飾である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を用いて連結される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、および３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、反転した脱塩基ヌクレオチドを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、修飾ｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、配列番号２０１、２０２、または２０３に示される修飾パターンを含み、ここで、Ｎは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Ｎの全体は、ＨＡＯ１内の標的配列に対してヌクレアーゼを指向させるガイド配列（例えば、表１に示されるような）を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１５１〜１６８または２５１〜２６８のうちのいずれか１つに示されるｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１〜１４６のガイド配列のうちのいずれか１つと、配列番号２０１、２０２、または２０３のヌクレオチドと、を含むｓｇＲＮＡを含み、配列番号２０１、２０２、または２０３のヌクレオチドは、ガイド配列の３’末端にあり、ｓｇＲＮＡは、表３または配列番号３００に示されるように修飾され得る。
【０１１３】
上述のように、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物または製剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤ＯＲＦ」または単に「修飾ＯＲＦ」であり、ＯＲＦが修飾されていることを示すための略語として使用される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは、少なくとも１つ、複数、または全てのウリジン位置に、修飾ウリジンを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、５位で修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、１位で修飾されたプソイドウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、５−メトキシウリジン、５−ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５−メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１−メチル−プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンとＮ１−メチル−プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５−メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１−メチルプソイドウリジンと５−メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジンとＮ１−メチル−プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５−ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジンと５−メトキシウリジンの組み合わせである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍＲＮＡは、５’キャップ、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２を含む。５’キャップは、一般に、ｍＲＮＡの５’−３’鎖の第１のヌクレオチド（すなわち、第１のキャップ近位のヌクレオチド）の５’位に対して５’−トリホスフェートを介して連結した７−メチルグアニンリボヌクレオチド（例えば、ＡＲＣＡに関して、以下に記載されるようにさらに修飾されてもよい）である。Ｃａｐ０において、ｍＲＮＡの第１および第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’−ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１において、ｍＲＮＡの第１および第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ、２’−メトキシおよび２’−ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２において、ｍＲＮＡの第１および第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’−メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１１（３３）：１２０２５−３０、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１４（１１）：Ｅ２１０６−Ｅ２１１５を参照のこと。ヒトｍＲＮＡ等の哺乳動物ｍＲＮＡを含む、ほとんどの内因性の高級真核生物ｍＲＮＡは、Ｃａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ０、ならびにＣａｐ１およびＣａｐ２とは異なる他のキャップ構造は、ＩＦＩＴ−１およびＩＦＩＴ−５等の自然免疫系の構成要素によって「非自己」として認識されるため、ヒト等の哺乳動物において免疫原性である場合があり、Ｉ型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を引き起こし得る。ＩＦＩＴ−１およびＩＦＩＴ−５等の自然免疫系の構成要素はまた、Ｃａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップとのｍＲＮＡの結合についてｅＩＦ４Ｅと競合する場合があり、ｍＲＮＡの翻訳を潜在的に阻害する。
【０１１６】
キャップは、共転写的に含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（抗逆キャップアナログ（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結する７−メチルグアニン  ３’−メトキシ−５’−トリホスフェートを含むキャップアナログであり、開始時にインビトロで転写物に組み込むことができる。ＡＲＣＡは、第１のキャップ近位のヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップをもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ７−ｍｅｔｈｙｌ（３’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ  ａｎｄ  ７−ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ」、ＲＮＡ  ７：１４８６−１４９５を参照のこと。ＡＲＣＡの構造を以下に示す。
【化６】
2021531804.tif 000025
【０１１７】
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号Ｎ−７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  カタログ番号Ｎ−７１３３）を使用して、Ｃａｐ１の構造を共転写的に提供することができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧおよびＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’−Ｏ−メチル化変形も、それぞれ、カタログ番号Ｎ−７４１３およびＮ−７４３３としてＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧの構造を以下に示す。
【化７】
2021531804.tif 000026
【０１１８】
あるいは、転写後に、キャップをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａキャッピング酵素は市販されており（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  カタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、そのＤ１サブユニットによって与えられるＲＮＡトリホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性と、そのＤ１２サブユニットによって与えられるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびＧＴＰの存在下で、Ｃａｐ０を与えるように、７−メチルグアニンをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、４０２３−４０２７、Ｍａｏ，Ｘ．  ａｎｄ  Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２４４７２−２４４７９を参照のこと。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化（ポリ−Ａ）テールをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリ−Ａテールは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアデニンを含み、任意選択で、３００個までのアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリ−Ａテールは、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。
【０１２０】
Ｄ．リボ核タンパク質複合体
いくつかの実施形態では、表１からの１つ以上のガイド配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ、または表２からの１つ以上のｓｇＲＮＡ、およびＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含む組成物を包含する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、切断活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、および他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの（例えば、次の段落のリストを参照のこと）、ならびにそれらの修飾（例えば、操作型または変異体）態様が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８（Ａ１）、ＵＳ２０１６／０３１２１９９（Ａ１）を参照のこと。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍもしくはＣｍｒ複合体、またはＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、もしくはそのＣｍｒ２サブユニット、およびＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、またはそのＣａｓ３サブユニットが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型の系に由来していてもよい。様々なＣＲＩＳＰＲ系およびＣａｓヌクレアーゼの考察については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＴ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．９：４６７−４７７（２０１１）、Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＴ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ、１３：７２２−３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＥＬＬ、６０：３８５−３９７（２０１５）を参照のこと。
【０１２１】
Ｃａｓヌクレアーゼの由来となり得る非限定的な例示的な種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇ��ｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６、およびＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａが挙げられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ  ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と共に含むｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼと共に含むｇＲＮＡは、Ｃａｓ  ＲＮＰと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９と共に含むｇＲＮＡは、Ｃａｓ９  ＲＮＰと呼ばれる。
【０１２４】
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメインＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインは、ＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、１個より多いＲｕｖＣドメインおよび／または１個より多いＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９である。組成物、使用および方法の実施形態の各々において、Ｃａｓは、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓヌクレアーゼが使用され、タンパク質の１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の一部によって置き換えられている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１等の異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであってもよい。
【０１２６】
他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、１つのＤＮＡ鎖を切断して一本鎖切断（「ニック」としても知られる）を生成することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡ内でニックを作製する酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断するが、他方の鎖を切断しない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、エンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上述のＣａｓヌクレアーゼ）の一態様である。例えば、Ｃａｓニッカーゼおよび例示的な触媒ドメイン改変の考察については、米国特許第８，８８９，３５６号を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼ等のＣａｓニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインを有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個の機能的ヌクレアーゼドメインのみを含むように修飾される。例えば、薬剤タンパク質は、その核酸切断活性を低下させるために、ヌクレアーゼドメインの１つが突然変異されるか、または完全もしくは部分的に欠失するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、活性が低下したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低下したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、または変化させるように置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  Ｏｃｔ  ２２：１６３（３）：７５９−７７１を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、およびＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）を参照のこと。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、およびＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２  Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１ ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡは、それぞれ、標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖に対して相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列の反対側の鎖にニックを作成することによって（すなわち、二重ニッキング）、ニッカーゼを標的配列に指向させ、ＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態では、二重ニッキングの使用は、特異性を改善し、オフターゲット効果を低減し得る。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ＤＮＡの反対側の鎖を標的とする２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡ内に二重ニックを生成する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ごく接近した位置にあるように選択された２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡ内に二重ニックを生成する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、切断およびニッカーゼ活性を欠いている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ｄＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ｄＣａｓポリペプチドは、触媒（切断／ニッカーゼ）活性を本質的に欠く一方で、ＤＮＡ結合活性を有する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓポリペプチドは、ｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、切断およびニッカーゼ活性を欠くＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、またはｄＣａｓ  ＤＮＡ結合ポリペプチドは、例えば、その触媒ドメイン内の１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、そのエンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上述のＣａｓヌクレアーゼ）の一態様である。例えば、ＵＳ  ２０１４／０１８６９５８（Ａ１）、ＵＳ  ２０１５／０１６６９８０（Ａ１）を参照のこと。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つ以上の異種機能ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む）。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の細胞核への輸送を促進し得る。例えば、異種機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１〜１０個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１〜５個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個のＮＬＳと融合され得る。１個のＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列のＮ末端部またはＣ末端部で連結され得る。これをＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列内に挿入することもできる。他の実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個より多いＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２、３、４、または５個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合され得る。特定の状況では、２個のＮＬＳは、同じ（例えば、２個のＳＶ４０  ＮＬＳ）であってもよく、または異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端部で連結された２個のＳＶ４０  ＮＬＳの配列に融合される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合していてもよく、１つはＮ末端部に連結しており、１つはＣ末端部に連結している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、３個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳなしで融合され得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、単節型配列、例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号６０１）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、双節型配列、例えば、ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０２）であってもよい。特定の実施形態では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のＣ末端部で連結され得る。１つ以上のリンカーは、任意選択で、融合部位に含まれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の細胞内半減期を修飾することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の半減期が増加し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の半減期が低減し得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の安定性を増加させることができる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の安定性を低減させることができる。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、タンパク質分解のシグナルペプチドとして機能し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、またはカルペインプロテアーゼ等のタンパク質分解酵素によって媒介され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＰＥＳＴ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であってもよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、小さなユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、インターフェロン刺激遺伝子−１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子−１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞が発現する発達的に下方制御されたタンパク質−８（ＮＥＤＤ８、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー−８（ＡＴＧ８）および−１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜固定ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチン折りたたみ修飾因子−１（ＵＦＭ１）、およびユビキチン様タンパク質−５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、マーカードメインであってもよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、およびレポーター遺伝子配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であってもよい。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、および橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、または任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグであってもよい。非限定的な例示的なタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ  １、Ｓｏｆｔａｇ  ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ−Ｈｉｓ、およびカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的なレポーター遺伝子としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
【０１３６】
さらなる実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を特異的なオルガネラ、細胞型、組織、または器官に標的化し得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をミトコンドリアに標的化し得る。
【０１３７】
さらなる実施形態では、異種機能ドメインは、エフェクタードメインであってもよい。ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤がその標的配列に指向されるとき、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼが、ｇＲＮＡによって標的配列に指向されるとき、エフェクタードメインは、標的配列を修飾するか、または影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインから選択され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ヌクレアーゼ、例えばＦｏｋＩヌクレアーゼである。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照のこと。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ  １５２：１１７３−８３（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，「ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：９７３−６（２０１３）、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｎａｔ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３−８（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」、Ｃｅｌｌ  １５４：４４２−５１（２０１３）を参照のこと。したがって、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、本質的に、ガイドＲＮＡを使用して所望の標的配列に結合するように指向され得る転写因子になる。
【０１３８】
Ｅ．ｇＲＮＡの有効性の決定
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの有効性は、送達されたとき、またはＲＮＰを形成する他の構成要素と共に発現されたときに決定される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９と共に発現される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼを既に安定に発現する細胞株に送達されるか、またはその細胞株において発現される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＰの一部として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼをコードするｍＲＮＡと共に細胞に送達される。
【０１３９】
本明細書に記載される場合、本明細書に開示されるＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの使用は、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を生じる場合があり、細胞機構による修復時に挿入／欠失（インデル）突然変異の形態でエラーを生じ得る。インデルに起因する多くの突然変異は、リーディングフレームを変化させるか、または未成熟終止コドンを導入し、したがって、非機能性タンパク質を産生する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡの有効性は、インビトロモデルに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、Ｃａｓ９を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞である（ＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、ＨＵＨ７ヒト肝癌細胞である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、ＨｅｐＧ２細胞である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、初代ヒト肝細胞である。いくつかの実施形態では、インビトロモデルは、初代カニクイザル肝細胞である。初代ヒト肝細胞を使用することに関して、市販の初代ヒト肝細胞を使用して、実験間のより高い一貫性を提供することができる。いくつかの実施形態では、インビトロモデルにおいて（例えば、初代ヒト肝細胞において）欠失または挿入が起こるオフターゲット部位の数は、例えば、インビトロでＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡでトランスフェクトされた初代ヒト肝細胞由来のゲノムＤＮＡを分析することによって、決定される。いくつかの実施形態では、そのような決定は、インビトロでＣａｓ９  ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、およびドナーオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされた初代ヒト肝細胞由来のゲノムＤＮＡを分析することを含む。そのような決定のための例示的な手順を以下の作業実施例に提供する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡの有効性は、ｇＲＮＡ選択プロセスのための複数のインビトロ細胞モデルにわたって決定される。いくつかの実施形態では、選択されたｇＲＮＡとのデータの細胞株比較が行われる。いくつかの実施形態では、複数の細胞モデルで交差スクリーニングを実施する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、特定のｇＲＮＡの有効性は、インビボモデルに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、インビボモデルは、げっ歯類モデルである。いくつかの実施形態では、げっ歯類モデルは、Ｈａｏ１遺伝子を発現するマウスである。いくつかの実施形態では、げっ歯類モデルは、ヒトＨＡＯ１遺伝子を発現するマウスである。いくつかの実施形態では、インビボモデルは、非ヒト霊長類、例えばカニクイザルである。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、ＨＡＯ１の編集率によって測定される。いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１の編集率を、例えば、インビトロモデルの場合は全細胞溶解物から、またはインビボモデルの場合は組織内において、ＨＡＯ１タンパク質のノックダウンを達成するために必要な編集率と比較する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、標的細胞型のゲノム内のオフターゲット配列におけるインデルの数および／または頻度によって測定される。いくつかの実施形態では、細胞集団において、および／または標的部位におけるインデル生成の頻度と比較して、非常に低い頻度（例えば、５％未満）で、オフターゲット部位でインデルを生成する有効なガイドＲＮＡが提供される。したがって、本開示は、標的細胞型（例えば、肝細胞）においてオフターゲットインデル形成を示さないか、または細胞集団において、および／もしくは標的部位でのインデル生成の頻度と比較して、オフターゲットインデル形成の頻度が５％未満であるガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、標的細胞型（例えば、肝細胞）において任意のオフターゲットインデル形成を示さないガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によって評価される場合、５個未満のオフターゲット部位においてインデルを生成するガイドＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に記載される１つ以上の方法によって評価される場合、４、３、２、または１個未満または以下のオフターゲット部位においてインデルを生成するガイドＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、オフターゲット部位（複数可）は、標的細胞（例えば、肝細胞）ゲノム内のタンパク質コード領域内では発生しない。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、遺伝子編集事象を検出すること、例えば、挿入／欠失（「インデル」）突然変異の形成、および標的ＤＮＡにおける相同性誘導修復（ＨＤＲ）事象は、タグ化プライマーを用いた線形増幅およびタグ化増幅産物の単離を利用する（本明細書ではこれ以降、「ＬＡＭ−ＰＣＲ」または「線形増幅（ＬＡ）」法と呼ばれる）。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、血清、血漿、血液、または尿等の体液等の試料中のグリコレートのレベルおよび／またはオキサレートのレベルを測定することによって測定される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの有効性は、血清または血漿中のグリコレートのレベルおよび／または尿内のオキサレートのレベルを測定することによって測定される。血清または血漿中のグリコレートのレベルの増加、および／または尿内のオキサレートのレベルの減少は、有効なガイドＲＮＡの指標である。いくつかの実施形態では、尿オキサレートは、０．７ｍｍｏｌ／２４時間／１．７３ｍ２未満まで減少する。いくつかの実施形態では、グリコレートおよびオキサレートのレベルは、細胞培地または血清または血漿を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定される。いくつかの実施形態では、グリコレートおよびオキサレートのレベルは、編集を測定するために使用されるのと同じインビトロまたはインビボ系またはモデルにおいて測定される。いくつかの実施形態では、グリコレートおよびオキサレートのレベルは、細胞、例えば、初代ヒト肝細胞において測定される。いくつかの実施形態では、グリコレートおよびオキサレートのレベルは、ＨＵＨ７細胞において測定される。いくつかの実施形態では、グリコレートおよびオキサレートのレベルは、ＨｅｐＧ２細胞において測定される。
【０１４７】
ＩＩＩ．治療方法
本明細書に開示されるｇＲＮＡならびに関連する方法および組成物は、ＰＨ１を治療および予防し、ＰＨ１の症状を予防するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、シュウ酸カルシウム産生、臓器におけるシュウ酸カルシウム沈着、高シュウ酸尿症、全身性シュウ酸症を含むシュウ酸症、および血尿を治療および予防するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、腎臓または肝臓移植の必要性を遅らせるか、または改善するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡは、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の予防に有用である。本明細書に開示されるｇＲＮＡの投与は、尿内に排泄されるオキサレートが少なくなるように、血清または血漿グリコレートを高め、オキサレートの産生または蓄積を低減する。したがって、一態様では、治療／予防の有効性は、血清または血漿グリコレートを測定することによって評価することができ、グリコレートレベルの増加が有効性を示す。いくつかの実施形態では、治療／予防の有効性は、試料内のオキサレート（例えば、尿オキサレート）を測定することによって評価することができ、尿オキサレートの減少が有効性を示す。
【０１４８】
健康な対象の尿における正常な１日のオキサレート排泄は、２４時間あたり１０〜４０ｍｇの範囲であり、一方、２４時間あたり４０〜４５ｍｇを超える濃度は、臨床的な高シュウ酸尿症であるとみなされる（例えば、Ｂｈａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２０１５  Ｍａｙ  ６；４（２）：２３５−２４４を参照）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび組成物の投与は、臨床的な高シュウ酸尿症に関連する尿オキサレートのレベルを対象がもはや示さないように、オキサレートのレベルを減少させるのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび組成物の投与は、２４時間以内に対象の尿オキサレートを４０ｍｇ未満に減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよび組成物の投与は、２４時間以内に対象の尿オキサレートを３５ｍｇ未満、３０ｍｇ未満、２５ｍｇ未満、２０ｍｇ未満、１５ｍｇ未満、または１０ｍｇ未満に減少させる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、組成物、または薬学的製剤のうちのいずれか１つ以上は、対象において疾患または障害を治療または予防するための医薬を調製する際に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、治療および／または予防は、医薬／組成物の単回用量、例えば、一度治療によって達成される。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、ＰＨ１である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、組成物、または薬学的製剤のうちのいずれか１つ以上を投与することを含む、対象において疾患または障害を治療または予防する方法を含む。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、ＰＨ１である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、組成物、または薬学的製剤は、例えば、一度に単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、単回用量は、永続的な治療および／または予防を達成する。いくつかの実施形態では、本方法は、永続的な治療および／または予防を達成する。永続的な治療および／または予防は、本明細書で使用される場合、少なくともｉ）３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５週間、ｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３０、もしくは３６ヶ月間、またはｉｉｉ）１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０年間続く治療および／または予防を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、組成物、または薬学的製剤の単回用量は、対象の生存期間にわたって本明細書に記載される適応症のいずれかを治療および／または予防するのに十分である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、組成物、または薬学的製剤のうちのいずれか１つ以上を投与または送達することを含む、標的ＤＮＡを修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ＨＡＯ１遺伝子である。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン内にある。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ＨＡＯ１遺伝子のエクソン１、２、３、４、５、６、７、または８の中にある。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、組成物、または薬学的製剤のうちのいずれか１つ以上を投与または送達することを含む、標的遺伝子の調節のための方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、調節は、ＨＡＯ１標的遺伝子の編集である。いくつかの実施形態では、調節は、ＨＡＯ１標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、方法または使用は、遺伝子編集をもたらす。いくつかの実施形態では、方法または使用は、標的ＨＡＯ１遺伝子内の二本鎖切断をもたらす。いくつかの実施形態では、方法または使用は、ＤＳＢの非相同性末端結合中にインデル変異の形成をもたらす。いくつかの実施形態では、方法または使用は、標的ＨＡＯ１遺伝子におけるヌクレオチドの挿入または欠失をもたらす。いくつかの実施形態では、標的ＨＡＯ１遺伝子におけるヌクレオチドの挿入または欠失は、非機能性タンパク質をもたらすフレームシフト突然変異または未成熟終止コドンをもたらす。いくつかの実施形態では、標的ＨＡＯ１遺伝子におけるヌクレオチドの挿入または欠失は、標的遺伝子発現のノックダウンまたは除去をもたらす。いくつかの実施形態では、方法または使用は、ＤＳＢの相同性誘導修復を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、方法または使用は、ＨＡＯ１遺伝子調節をもたらす。いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子調節は、遺伝子発現の低減である。いくつかの実施形態では、方法または使用は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の低減をもたらす。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子内で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する方法であって、配列番号１〜１４６のいずれか１つ以上のガイド配列、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４６のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡは、ＨＡＯ１遺伝子においてＤＳＢを誘導するために投与される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはｍＲＮＡ、またはＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするベクターと共に投与され得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子を修飾する方法であって、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが、ＨＡＯ１遺伝子を修飾するために投与される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはｍＲＮＡ、またはＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするベクターと共に投与され得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＰＨ１を治療または予防する方法であって、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが、ＰＨ１を治療または予防するために投与される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはｍＲＮＡ、またはＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするベクターと共に投与され得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、シュウ酸カルシウム産生および／または沈着を低減するか、またはなくす方法であって、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、方法が提供される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはｍＲＮＡ、またはＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするベクターと共に投与され得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、高シュウ酸尿症を治療または予防する方法であって、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、方法が提供される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはｍＲＮＡ、またはＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするベクターと共に投与され得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、全身性シュウ酸症を含むシュウ酸症を治療または予防する方法であって、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、方法が提供される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはｍＲＮＡ、またはＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするベクターと共に投与され得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、血尿を治療または予防する方法であって、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡを投与することを含む、方法が提供される。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはｍＲＮＡ、またはＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするベクターと共に投与され得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが、尿内のオキサレートレベルを低減するために投与される。ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはｍＲＮＡ、またはＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするベクターと共に投与され得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜１４６のガイド配列のいずれか１つ以上、または配列番号１５１〜１６８もしくは２５１〜２６８のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが、血清または血漿において血清グリコレートを増加させるために投与される。ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）もしくはｍＲＮＡ、またはＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするベクターと共に投与され得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、表１のガイド配列を、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼと一緒に含むｇＲＮＡは、ＤＳＢを誘導し、修復中の非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）が、ＨＡＯ１遺伝子内の突然変異をもたらす。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪは、ヌクレオチドの欠失または挿入を引き起こし、ＨＡＯ１遺伝子におけるフレームシフトまたはナンセンス突然変異を誘導する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明のガイドＲＮＡ（例えば、本明細書で提供される組成物で）を投与することは、対象におけるグリコレートのレベル（例えば、血清または血漿レベル）を増加させ、したがって、オキサレート蓄積を防ぐ。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、血清グリコレートの増加は、尿オキサレートの減少を引き起こす。いくつかの実施形態では、尿オキサレートの減少は、臓器におけるシュウ酸カルシウム形成および沈着を低減するか、またはなくす。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚、または家禽である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、表１のガイド配列のうちのいずれか１つ以上、または表２からの１つ以上のｓｇＲＮＡを含むガイドＲＮＡ（例えば、本明細書で提供される組成物で）の使用は、ＰＨ１を有するヒト対象を治療するための医薬の調製のために提供される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ、組成物、および製剤は、静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ、組成物、および製剤は、肝循環に投与される。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるガイドＲＮＡを含む組成物の単回投与は、変異体タンパク質の発現をノックダウンするのに十分である。他の実施形態では、本明細書で提供されるガイドＲＮＡを含む組成物の１回を超える投与は、治療効果を最大化するのに有益であり得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、治療は、ＰＨ１疾患の進行を遅らせるか、または止める。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、治療は、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の進行を遅らせるか、または止める。いくつかの実施形態では、治療は、腎臓および／または肝臓移植の必要性を遅らせるか、または止める。いくつかの実施形態では、治療は、ＰＨ１の症状の改善、安定化、または変化を遅らせる。
【０１７３】
Ａ．併用療法
いくつかの実施形態では、本発明は、上述のように、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つ（例えば、本明細書で提供される組成物で）を、ＰＨ１およびその症状を緩和するのに適した追加の療法と併せて含む、併用療法を含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ＰＨ１のための追加の療法は、ビタミンＢ６、ハイドレーション、腎透析、または肝臓もしくは腎臓移植である。いくつかの実施形態では、追加の療法は、ルマシラン（ＡＬＮ−ＧＯ１、Ａｌｎｙｌａｍ）である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、併用療法は、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つを、ＨＡＯ１を標的とするｓｉＲＮＡと共に含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、野生型または変異体ＨＡＯ１の発現をさらに低減するか、またはなくすことができる任意のｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、薬物ルマシラン（ＡＬＮ−ＧＯ１、Ａｌｎｙｌａｍ）である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つ（例えば、本明細書で提供される組成物で）の後に投与される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、本明細書で提供されるｇＲＮＡ組成物のいずれかで治療した後に、定期的に投与される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、併用療法は、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つ（例えば、本明細書で提供される組成物で）を、ＨＡＯ１を標的とするアンチセンスヌクレオチドと共に含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスヌクレオチドは、ＨＡＯ１の発現をさらに低減するか、またはなくすことができる任意のアンチセンスヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンスヌクレオチドは、表１に開示されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのいずれか１つ（例えば、本明細書で提供される組成物で）の後に投与される。いくつかの実施形態では、アンチセンスヌクレオチドは、本明細書で提供されるｇＲＮＡ組成物のいずれかで治療した後に、定期的に投与される。
【０１７７】
Ｂ．ｇＲＮＡ組成物の送達
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ヌクレオチドおよびタンパク質カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、組成物、または薬学的製剤の送達に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、核酸、タンパク質、または核酸をタンパク質と共に送達する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのいずれか１つを対象に送達する方法を含み、ｇＲＮＡは、ＬＮＰと会合する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰはまた、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと会合する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本発明は、開示されるｇＲＮＡおよびＬＮＰのうちのいずれか１つを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをさらに含む。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、陽イオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）とも称される、（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート、または別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、ＷＯ／２０１７／１７３０５４号の脂質およびその中に記載される参照文献を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４．５、５．０、５．５、６．０、または６．５のＲＮＡホスフェートに対する陽イオン性脂質アミンのモル比（Ｎ：Ｐ）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ脂質の文脈において、陽イオン性およびイオン化可能との用語は、互換可能であり、例えば、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じて陽イオン性である。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｇＲＮＡと会合するＬＮＰは、疾患または障害を治療するための医薬の調製において使用するためのものである。
【０１８２】
エレクトロポレーションは、カーゴの送達のための周知の手段であり、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つの送達のために、任意のエレクトロポレーション方法論が使用され得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、本明細書に開示されるｇＲＮＡおよびＣａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡのうちのいずれか１つを送達するために使用され得る。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つをエクスビボで細胞に送達する方法を含み、ｇＲＮＡは、ＬＮＰと会合するか、またはＬＮＰと会合しない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰまたはｇＲＮＡはまた、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡと会合する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ組成物は、単独で、または１つ以上のベクターにコードされて、脂質ナノ粒子に製剤化され、または脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、その内容が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年３月３０日に出願され、２０１７年５月１０日に公開される、「ＬＩＰＩＤ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」という発明の名称のＷＯ／２０１７／１７３０５４号を参照。
【０１８５】
特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ベクターは、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸としては、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列、およびＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９等のヌクレアーゼであってもよい）をコードする核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、を含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、を含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９であってもよい。一実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（すなわち、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであってもよい）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列の全てまたは一部が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸は、さらにベクター配列を含んでいてもよく、ここで、ベクター配列は、自然状態ではｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡと共に見出されない核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【０１８６】
この説明および例示的な実施形態は、限定として解釈されるべきではない。本明細書および添付の特許請求の範囲において、特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される量、パーセンテージ、または割合、および他の数値を表すすべての数字は、どの場合においても用語「約」によって、まだそれほど非修飾である範囲により修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。非常に少なくとも、および均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
【０１８７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」、および任意の単語の単数形の使用は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含めることに留意されたい。本明細書で使用される「含める（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびその文法上の変形は、リスト内のアイテムの列挙が、リストされたアイテムに置換または追加できる他の同様のアイテムを除外しないように、非限定的であることを意図している。
【実施例】
【０１８８】
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１８９】
実施例１−材料および方法
ヌクレアーゼｍＲＮＡのインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１−メチルプソイド−Ｕを含有するキャップされたポリアデニル化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを、線状プラスミドＤＮＡテンプレートおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって生成した。Ｔ７プロモーターおよび１００ｎｔポリ（Ａ／Ｔ）領域を含有するプラスミドＤＮＡを、２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、および１ｘ反応緩衝液の条件で、３７℃で２時間インキュベートすることによって線状化した。ＸｂａＩを、反応物を６５℃で２０分間加熱することによって不活性化した。線状プラスミドを、シリカマキシスピンカラム（Ｅｐｏｃｈ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、酵素および緩衝塩から精製され、アガロースゲルによって分析し、線状化を確認した。５０ｎｇ／μＬの線状プラスミド、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、およびＮ１−メチルプソイド−ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）の各々２ｍＭ、１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのＭｕｒｉｎｅ  ＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬのＩｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、および１ｘ反応緩衝液の条件で、Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応物を３７℃で４時間インキュベートした。４時間のインキュベーション後、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、最終濃度が０．０１Ｕ／μＬになるように添加し、反応物をさらに３０分間インキュベートして、ＤＮＡテンプレートを除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキットを使用し、製造者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡを酵素およびヌクレオチドから精製した。あるいは、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿法で精製し、いくつかの場合では、これに続いてタンジェンシャルフロー濾過によりさらなる精製を行った。転写物濃度を、２６０ｎｍでの光吸光度を測定することによって決定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
【０１９０】
実施例で使用されるＣａｓ９  ｍＲＮＡの転写のための配列は、配列番号５００または配列番号５０１のいずれかを含んでいた。
配列番号５００
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配列番号５０１
ＧＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＣＴＴＧＴＴＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣＧＴＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＧＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＣＧＴＣＧＧＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＡＣＡＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＧＡＧＣＡＣＴＧＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧＡＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＡＡＧＡＣＡＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＧＧＡＡＡＣＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＡＧＴＣＧＣＡＴＡＣＣＡＣＧＡＡＡＡＧＴＡＣＣＣＧＡＣＡＡＴＣＴＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＧＡＣＣＴＧＡＧＡＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＡＣＡＣＡＴＧＡＴＣＡＡＧＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＧＡＴＣＡＡＣＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＡＡＡＧＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＣＴＧＴＴＣＧＧＡＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＣＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＣＡＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＣＧＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＣＧＣＡＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＴＡＣＧＡＣＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＡＧＴＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＡＴＡＣＧＣＡＧＧＡＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＡＡＡＧＣＡＧＡＧＡＡＣＡＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＡＡＧＣＡＴＣＣＣＧＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣＣＧＴＡＣＴＡＣＧＴＣＧＧＡＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＡＣＴＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＣＧＡＡＡＧＡＡＴＧＡＣＡＡＡＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＡＡＴＡＣＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＡＡＧＴＡＣＧＴＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＡＴＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＧＧＡＧＴＣＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＡＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡＣＡＴＡＣＣＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＣＡＴＡＣＧＣＡＣＡＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＴＴＣＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＴＣＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＡＣＡＣＡＴＣＧＣＡＡＡＣＣＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧＴＣＡＡＧＧＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＡＡＡＴＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＧＴＣＧＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＴＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＴＣＣＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＡＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＡＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＡＡＣＡＡＧＡＣＡＧＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＧＴＣＧＣＡＣＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＧＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＡＣＧＣＡＴＡＣＣＴＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＡＴＣＡＡＧＡＡＧＴＡＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＴＡＣＧＧＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＴＣＴＡＣＧＡＣＧＴＣＡＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＣＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＣＡＧＴＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＡＡＣＡＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＣＣＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＴＣＧＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＣＴＧＧＧＡＣＣＣＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＧＧＡＧＧＡＴＴＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＣＡＧＴＣＧＣＡＴＡＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧＧＴＣＧＴＣＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＣＡＡＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＴＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＧＡＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＴＴＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＣＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＴＡＣＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＡＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＴＴＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡＴＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＣＧＣＡＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＧＧＡＣＴＧＴＡＣＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＡＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＴＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＴＣＧＡＧ
【０１９１】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤
一般に、脂質ナノ粒子の構成要素を、種々のモル比で、１００％エタノールに溶解した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ）を２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解して、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得た。実施例２−４で使用されるＬＮＰは、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノエート）とも称される、イオン化可能な脂質（（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノエート、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧをそれぞれ５０：３８：９：３のモル比で含んでいた。ＬＮＰを、約６のＲＮＡホスフェートに対する脂質アミンの（Ｎ：Ｐ）モル比、ｇＲＮＡとｍＲＮＡの重量比１：１で製剤化した。実施例２〜４で使用したＬＮＰは、配列番号５０１に由来するＣａｓ９  ｍＲＮＡを含有していた。
【０１９２】
クロスフロー技術を使用し、エタノール中の脂質を２体積のＲＮＡ溶液および１体積の水と衝突噴流混合することによって、ＬＮＰを調製した。エタノール中の脂質を、混合交差部（ｍｉｘｉｎｇ  ｃｒｏｓｓ）により、２体積のＲＮＡ溶液と混合した。第４の水の流れを、ライン内のティーを通る交差部の出口流と混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０号の図２を参照）。ＬＮＰを室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（約１：１ｖ／ｖ）。希釈したＬＮＰを、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ  ＭＷＣＯ）でタンジェンシャルフロー濾過を用いて濃縮し、次いで、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ）を用い、緩衝液を５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）に交換した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで４℃または−８０℃で保存した。
【０１９３】
ヒトＨＡＯ１ガイド設計およびカニクイザル相同性ガイド設計を有するヒトＨＡＯ１
目的の領域においてＰＡＭを同定するために、ヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）および目的のユーザが規定したゲノム領域（例えば、ＨＡＯ１タンパク質コードエクソン）を用い、初期のガイド選択をインシリコで行った。同定された各ＰＡＭについて、分析を行い、統計を報告した。ｇＲＮＡ分子をさらに選択し、当該技術分野において公知のいくつかの基準（例えば、ＧＣ含有量、予測されるオンターゲット活性、および潜在的オフターゲット活性）に基づいてランク付けした。
【０１９４】
合計１４６個のガイドＲＮＡを、エクソン１、２、３、４、５、６、７、および８内のタンパク質コード領域を標的とするＨＡＯ１（ＥＮＳＧ０００００１０１３２３）に対して設計した。ガイドおよび対応するゲノム座標を上に提供する（表１）。ガイドＲＮＡのうち７２個は、カニクイザルＨＡＯ１と１００％の相同性を有する。
【０１９５】
Ｃａｓ９（ｍＲＮＡ／タンパク質）およびインビトロでのガイドＲＮＡ送達
Ｓｐｙ  Ｃａｓ９を構成的に発現するヒト胚性腎臓腺癌細胞株ＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９」）を、１０％のウシ胎児血清および５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を追加したＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクションの２０時間前に、細胞を９６ウェルプレート中で、１０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした（トランスフェクション時に約７０％のコンフルエント）。製造者のプロトコルに従って、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１３７７８１５０）でトランスフェクトした。細胞を、個々のガイド（２５ｎＭ）、ｔｒＲＮＡ（２５ｎＭ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（０．３μＬ／ウェル）、およびＯｐｔｉＭｅｍを含むリポプレックスによってトランスフェクトした。
【０１９６】
ヒト肝細胞癌細胞株ＨＵＨ７（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ、カタログ番号ＪＣＲＢ０４０３）を、１０％のウシ胎児血清を追加したＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクションの２０時間前に、細胞を９６ウェルプレート中で、１５，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした（トランスフェクション時に約７０％のコンフルエント）。製造者のプロトコルに従って、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＬＭＲＮＡ００３）でトランスフェクトした。細胞を、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡ（１００ｎｇ、配列番号５００）、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（０．３μＬ／ウェル）およびＯｐｔｉＭｅｍを含有するリポプレックス、次いで、個々のガイド（２５ｎＭ）、トレーサーＲＮＡ（２５ｎＭ）、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（０．３μＬ／ウェル）およびＯｐｔｉＭｅｍを含有する別個のリポプレックスを用い、順次トランスフェクトした。
【０１９７】
初代ヒト肝臓肝細胞（ＰＨＨ）（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号Ｈｕ８２４９およびＨｕ８２９８）ならびに初代カニクイザル肝臓肝細胞（ＰＣＨ）（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号Ｃｙ３６７）を解凍し、追加物質（Ｇｉｂｃｏ、カタログＣＭ７５００）を含む肝細胞解凍培地に再懸濁させ、次いで、遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化した細胞を、肝細胞プレーティング培地および追加物質パック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１２１７６０１およびＣＭ３０００）に再懸濁させた。細胞を計数し、ＰＨＨについては３３，０００細胞／ウェル、ＰＣＨについては５０，０００細胞／ウェルの密度でＢｉｏ−ｃｏａｔ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉでコーティングした９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８７７２７２）上にプレーティングした。プレーティングした細胞を、３７℃および５％ＣＯ２雰囲気での組織培養インキュベーター中で５時間放置し、接着させた。インキュベーション後、細胞を単層形成について調べ、肝細胞培養培地（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号Ｙ２００２０および／またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１２１７６０１およびＣＭ４０００）で１回洗浄した。
【０１９８】
ｄｇＲＮＡを利用した試験のために、個々のｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを、等量の試薬を混合し、９５℃で２分間インキュベートし、室温まで冷却することによって、予めアニーリングしておいた。予めアニーリングしたｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡからなるデュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）を、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９タンパク質と共にインキュベートし、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。製造者のプロトコルに従って、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１３７７８１５０）でトランスフェクトした。Ｓｐｙ  Ｃａｓ９（１０ｎＭ）、個々のガイド（１０ｎＭ）、トレーサーＲＮＡ（１０ｎＭ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（１．０μＬ／ウェル）およびＯｐｔｉＭｅｍを含むＲＮＰによって、細胞をトランスフェクトした。
【０１９９】
初代ヒトおよびカニクイザル肝細胞を、以下にさらに記載されるように、ＬＮＰでも処理した。ＬＮＰで処理する前に、細胞株を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＬＮＰを、６％カニクイザル血清を含む培地中、３７℃で１０分間インキュベートし、本明細書でさらに提供される量で細胞に投与した。
【０２００】
ゲノムＤＮＡ単離
ＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９、ＨＵＨ７、ＰＨＨ、およびＰＣＨでトランスフェクトした細胞を、トランスフェクション後、２４、４８、７２、または９６時間で回収した。ｇＤＮＡを、製造者のプロトコルに従って、９６ウェルプレートの各々のウェルから５０μＬ／ウェルのＢｕｃｃａｌＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）を用いて抽出した。全てのＤＮＡ試料に対し、本明細書に記載されるように、ＰＣＲおよびその後のＮＧＳ分析を行った。
【０２０１】
次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）およびオンターゲット切断効率の分析
ゲノム中の標的位置における編集効率を定量的に決定するために、ディープシーケンシングを使用して、遺伝子編集によって導入された挿入および欠失（「インデル」）の存在を同定した。目的の遺伝子（例えば、ＨＡＯ１）内の標的部位周辺でＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅させた。プライマー配列設計は、現場で標準として行われた。
【０２０２】
シークエンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ装置でシークエンシングした。低品質スコアを有する読み取りを除去した後に、読み取りをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）とアラインメントした。読み取り値を含む得られたファイルを、参照ゲノム（ＢＡＭファイル）に対してマッピングし、目的の標的領域と重なり合った読み取り値を選択し、野生型の読み取り値の数と、挿入または欠失（「インデル」）を含む読み取り値の数を計算した。
【０２０３】
編集割合（例えば、「編集効率」または「編集率」）は、野生型を含む配列読み取りの総数に対する、挿入または欠失（「インデル」）を含む配列読み取りの総数であると定義される。
【０２０４】
定量ＰＣＲによるＨＡＯ１転写物分析
実施例３にさらに記載されるように、初代ヒト肝細胞および初代カニクイザル肝細胞を、表２から選択された修飾ガイドを用いて製剤化されたＬＮＰで処理した。ＬＮＰを、３％カニクイザル血清を含む培地（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号Ｙ２００２０）中、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＮＰを、ヒトまたはカニクイザル肝細胞に添加した。処理から２１日後、培地を除去し、５０μＬ／ウェルのＴｒｉｐｌｅＥ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２５６３−０２９）を細胞に添加し、次いで３７℃で１０分間インキュベートした。５０μＬ／ウェルの培地を細胞に添加して、ＴｒｉｐｌｅＥをクエンチし、細胞をプレートから解離させた。次いで、細胞を２，０００ｒｐｍでペレットになるまで遠心分離し、上清を試料から吸引した。ｍＲＮＡを単離するために、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０６）を使用した。製造者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔの手順を完了した。ＲＮＡを、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ８０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＤ−８０００−ＧＬ）を使用して定量化した。製造者のプロトコルに従って、ＲＮＡ定量化の手順を完了した。使用前に、ＲＮＡ試料を−２０℃で保存した。
【０２０５】
ＨＡＯ１転写物レベルを評価するために定量ＰＣＲを行った。Ｔａｑｍａｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ  １−Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３９２９３８）を使用してＰＣＲ反応物を作製した。製造者のプロトコルに従って、反応の設定を完了した。ＨＡＯ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３５１３７２、転写物のＵｎｉＧｅｎｅ  ＩＤ  Ｈｓ０１０２３３２４ ｇ１）および１８Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３１９４１３Ｅ）を標的とする定量ＰＣＲプローブをＰＣＲ反応で使用した。製造者のプロトコルに従って、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４３７６６００）を使用して、リアルタイムＰＣＲ反応および転写物の定量化を実行した。
【０２０６】
ウェスタンブロットによるグリコレートオキシダーゼ（ＧＯ）タンパク質分析
実施例３にさらに記載されるように、初代ヒト肝細胞および初代カニクイザル肝細胞を、表２から選択された修飾ガイドを用いて製剤化されたＬＮＰで処理した。ＬＮＰを、３％カニクイザル血清を含む培地（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号Ｙ２００２０）中、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＮＰを、ヒトまたはカニクイザル肝細胞に添加した。トランスフェクションから２１日後、培地を除去し、細胞を、５０μＬ／ウェルのＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＰ−１１５）と、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１１６９７４９８００１）、１ｍＭのＤＴＴ、および２５０Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号７１２０６−３）からなる新しく添加したプロテアーゼ阻害剤混合物で溶解させた。細胞を氷上で３０分間維持し、そのときに、ＮａＣｌ（１Ｍ最終濃度）を添加した。細胞溶解物を完全に混合し、氷上で３０分間保持した。全細胞抽出物（「ＷＣＥ」）をＰＣＲプレートに移し、遠心分離してペレットデブリにした。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号５００−０００１）を使用して、溶解物のタンパク質含有量を評価した。製造者のプロトコルに従って、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイの手順を完了した。使用前に、抽出物を−２０℃で保存した。
【０２０７】
ＡＧＴ欠損マウスを、実施例４にさらに記載されるように、選択ガイドを用いて製剤化されたＬＮＰで処理した。処理後のマウスから肝臓を採取し、タンパク質抽出のために６０ｍｇ分を使用した。試料をビーズチューブ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、カタログ番号６９２５−５００）に入れ、６００μＬ／試料のＲＩＰＡ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＢＰ−１１５）と、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテルル（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１１６９７４５００）からなる新しく添加したプロテアーゼ阻害剤混合物で溶解させ、５．０ｍ／秒で均質化した。次いで、試料を１４，０００ＲＰＭ、４℃で１０分間遠心分離し、液体を新しい管に移した。最終的な遠心分離を１４，０００ＲＰＭで１０分間実施し、試料を上述のＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して定量化した。
【０２０８】
ウェスタンブロットを実施して、ＧＯタンパク質レベルを評価した。溶解物をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合し、９５℃で１０分間かけて変性させた。製造者のプロトコルに従って、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＮＰ０３２３ＢＯＸ）上でＮｕＰａｇｅ系を使用してウェスタンブロットを実行し、続いて０．４５μｍのニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１６２０１１５）上に濡れた状態で移した。移した後、膜を水で完全にすすぎ、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ溶液（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号ＳＴ−１８０）で染色し、完全で均一な移動を確認した。ブロットを、室温で、ラボロッカー上で３０分間、ＴＢＳ中の５％の粉乳を使用してブロックした。ブロットをＴＢＳＴですすぎ、ＴＢＳＴ中１：１０００でウサギα−ＧＯポリクローナル抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ、カタログ番号ＧＴＸ８１１４４）でプローブした。インビトロ細胞溶解物を用いたブロットについては、ＴＢＳＴ中で１：１０００でビンキュリンをローディング対照（Ａｂｃａｍ、ａｂ１３０００７）として使用し、ＧＯ一次抗体と同時にインキュベートした。インビボマウス肝臓抽出物を用いたブロットについては、ＴＢＳＴ中で１：１０００でα−チューブリンをローディング対照（Ａｂｃａｍ、ａｂ７２９１）として使用し、ＧＯ一次抗体と同時にインキュベートした。ブロットを袋に密封し、ラボロッカー上で、４℃で一晩保持した。インキュベーション後、ブロットを、ＴＢＳＴ中でそれぞれ５分間かけて３回すすぎ、ＴＢＳＴ中でそれぞれ１：１２，５００でマウスおよびウサギに対する二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＩ３５５１８およびＰＩＳＡ５３５５７１）を用い、室温で３０分間プローブした。インキュベーション後、ブロットをＴＢＳＴ中で各５分間かけて３回、およびＰＢＳで２回すすいだ。ブロットを可視化し、Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを使用して分析した。
【０２０９】
実施例２−スクリーニングおよびガイド定量化
複数の細胞型におけるＨＡＯ１ガイドの交差スクリーニング
ヒトＨＡＯ１を標的とするガイド、およびカニクイザルにおける相同性を有するものを、ＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９およびＨＵＨ７細胞株、および実施例１に記載したように初代ヒトおよびカニクイザル肝細胞にトランスフェクトした。各細胞型にわたって、各ガイド配列を含むｃｒＲＮＡについて編集率を決定した。４種類全ての細胞株において、表１のガイド配列のスクリーニングデータを以下に列挙する（表７Ｂ〜１０）。
【０２１０】
表７Ｂは、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９タンパク質を構成的に過剰発現するヒト腎臓腺癌細胞株ＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９において、ＨＡＯ１および対照ｄｇＲＮＡ（表７Ａ）についての編集％、挿入（Ｉｎｓ）％、および欠失（Ｄｅｌ）％についての３重試料の平均および標準偏差を示す。
【０２１１】
【表６】
2021531804.tif 000027
【０２１２】
【表７−１】
2021531804.tif 000028
【表７−２】
2021531804.tif 000029
【表７−３】
2021531804.tif 000030
【０２１３】
表８は、ヒト肝細胞癌細胞株ＨＵＨ７において、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡと共トランスフェクトされた試験ＨＡＯ１および対照ｄｇＲＮＡ（表７Ａ）についての編集％、挿入（Ｉｎｓ）％、および欠失（Ｄｅｌ）％を示す。Ｎ＝１。
【０２１４】
【表８−１】
2021531804.tif 000031
【表８−２】
2021531804.tif 000032
【表８−３】
2021531804.tif 000033
【表８−４】
2021531804.tif 000034
【０２１５】
表９は、初代ヒト肝細胞において、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９タンパク質と共トランスフェクトされた試験ＨＡＯ１および対照ｄｇＲＮＡ（表７Ａ）についての編集％、挿入（Ｉｎｓ）％、および欠失（Ｄｅｌ）％についての平均および標準偏差を示す。Ｎ＝３。
【０２１６】
【表９−１】
2021531804.tif 000035
【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
2021531804.tif 000038
【表９−５】
2021531804.tif 000039
【０２１７】
表１０は、初代カニクイザル肝細胞において、Ｓｐｙ  Ｃａｓ９タンパク質と共トランスフェクトされた試験ＨＡＯ１  ｄｇＲＮＡについての編集％、挿入（Ｉｎｓ）％、および欠失（Ｄｅｌ）％についての平均および標準偏差を示す。Ｎ＝３。
【０２１８】
【表１０−１】
2021531804.tif 000040
【表１０−２】
2021531804.tif 000041
【表１０−３】
2021531804.tif 000042
【０２１９】
ＰＨＨと各々の細胞型との間の各ガイドについての編集効率を比較することによって相関を計算した（図１）。
【０２２０】
初代ヒト肝細胞の編集データに基づいて、ガイド配列のサブセットをさらに評価した。このサブセットを表１１に提供し、初代ヒト肝細胞スクリーニングからの対応する編集データを再現する。
【０２２１】
【表１１】
2021531804.tif 000043
【０２２２】
ＨＡＯ１ガイドのオフターゲット分析
オリゴ挿入に基づくアッセイ（例えば、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３３、１８７−１９７；２０１５を参照）を使用して、ＨＡＯ１を標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位を決定した。表１１の１７種類のｄｇＲＮＡ（および既知のオフターゲットプロファイルを有する３種類の対照ガイド）を、上述のＨＥＫ２９３−Ｃａｓ９細胞においてスクリーニングし、オフターゲットの結果を図２にプロットした。このアッセイは、いくつかのｄｇＲＮＡについての潜在的なオフターゲット部位を特定し、検出可能なオフターゲットを有しない他の部位を特定した。特定された潜在的なオフターゲット部位がないか、またはほとんどなかった修飾ガイドを、さらなる分析のためにｓｇＲＮＡとして合成した（表２）。
【０２２３】
加えて、生化学的方法（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６、６００−６０６；２０１７）を使用して、ＨＡＯ１を標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位を決定した。表２の１０種類の修飾ｓｇＲＮＡ（および既知のオフターゲットプロファイルを有する３種類の対照ガイド）を、上述のＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡを使用してスクリーニングし、潜在的なオフターゲットの結果を図３にプロットした。このアッセイは、いくつかのｓｇＲＮＡについての潜在的なオフターゲット部位を特定した。
【０２２４】
潜在的なオフターゲット部位を検証するための標的シークエンシング
潜在的なオフターゲットを検出するために使用されるＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９細胞は、Ｃａｓ９を構成的に過剰発現し、様々な細胞型における一過性送達パラダイムと比較して、より多くの潜在的なオフターゲット「ヒット」をもたらす。さらに、この生化学アッセイは、典型的には、細胞環境を含まない精製された高分子量ゲノムＤＮＡを利用し、使用されるＣａｓ９  ＲＮＰの用量に依存するため、潜在的なオフターゲット部位の数を過剰に表す。したがって、これらの方法によって特定された潜在的なオフターゲット部位は、特定された潜在的なオフターゲット部位の標的シークエンシングを使用して検証され得る。
【０２２５】
１つのアプローチでは、初代肝細胞を、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび目的のｓｇＲＮＡ（例えば、評価のための潜在的なオフターゲット部位を有するｓｇＲＮＡ）を含むＬＮＰで処理する。次いで、初代肝細胞を溶解し、潜在的なオフターゲット部位（複数可）に隣接するプライマーを使用してＮＧＳ分析のためのアンプリコンを生成する。特定のレベルでのインデルの同定は、潜在的なオフターゲット部位を検証し得るが、潜在的なオフターゲット部位で見出されるインデルの欠如は、ＨＥＫ２９３ Ｃａｓ９細胞アッセイまたは生化学アッセイにおいて偽陽性を示す場合がある。
【０２２６】
初代ヒトおよびカニクイザル肝細胞におけるＳｐｙ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の交差スクリーニング
用量応答アッセイにおいて、初代ヒト肝細胞および初代カニクイザル肝細胞に対して、ヒトＨＡＯ１を標的とする修飾ｓｇＲＮＡおよびカニクイザル適合ｓｇＲＮＡ配列の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を試験した。ＬＮＰを実施例１に記載のように製剤化した。初代ヒトおよびカニクイザル肝細胞を、実施例１に記載されるようにプレーティングした。ＬＮＰで処理する前に、両方の細胞株を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。ＬＮＰを、６％カニクイザル血清を含む培地中、３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＮＰを、３００ｎｇ  Ｃａｓ９  ｍＲＮＡで始まる８点の３倍用量応答曲線において、ヒトまたはカニクイザル肝細胞に添加した。細胞を、実施例１に記載されるようにＮＧＳ分析のために処理後９６時間かけて溶解させた。両方の細胞株におけるガイド配列の用量応答曲線データを図４および５に示す。１４．７ｎＭ濃度での編集％を以下の表１２および１３に列挙する。
【０２２７】
表１２は、初代ヒト肝細胞において、ＬＮＰを介してＳｐｙ  Ｃａｓ９と共に送達される１４．７ｎＭの試験ＨＡＯ１  ｓｇＲＮＡについての編集％、挿入（Ｉｎｓ）％、および欠失（Ｄｅｌ）％についての平均および標準偏差を示す。これらの試料を３重で生成した。
【０２２８】
【表１２】
2021531804.tif 000044
【０２２９】
表１３は、初代カニクイザル肝細胞において、ＬＮＰを介してＳｐｙ  Ｃａｓ９と共に送達される１４．７ｎＭの試験ＨＡＯ１  ｓｇＲＮＡについての編集％、挿入（Ｉｎｓ）％、および欠失（Ｄｅｌ）％についての平均および標準偏差を示す。これらの試料を３重で生成した。
【０２３０】
【表１３】
2021531804.tif 000045
【０２３１】
実施例３．表現型分析
ＨＡＯ１転写物の定量ＰＣＲ分析
初代ヒト肝細胞を、表２からの修飾ｓｇＲＮＡを用いて製剤化されたＬＮＰ（実施例１に記載されるような）で処理した。ＬＮＰを実施例１に記載のように製剤化した。トランスフェクションから２１日後、細胞を収穫し、ＲＮＡを単離し、実施例１に記載の定量ＰＣＲによる分析を行った。
【０２３２】
ＲＮＡを、ＨＡＯ１  ｍＲＮＡの減少について３重で分析し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍから決定されたＣｔ値を用いて計算した。各試料内の１８Ｓに対するＣｔ値をＨＡＯ１の値と比較して、比率を計算した。この比率を陰性対照に対して正規化した後、ＨＡＯ１  ｍＲＮＡの減少率を決定した。ＨＡＯ１  ｍＲＮＡの減少％のデータを表１４に提供する。
【０２３３】
【表１４】
2021531804.tif 000046
【０２３４】
細胞内グリコレートオキシダーゼのウェスタンブロット分析
ＨＡＯ１の定量ＰＣＲ分析からの細胞の一部を、トランスフェクションの２１日後にも収穫し、全細胞抽出物（ＷＣＥ）を調製し、実施例１に記載したようにウェスタンブロットによる分析を行った。
【０２３５】
細胞の一部もまた、本明細書に記載されるように収集し、ＮＧＳシークエンシングのために処理した。これらの細胞についての編集データを表１５に提供する。
【０２３６】
【表１５】
2021531804.tif 000047
【０２３７】
ＷＣＥを、ＧＯタンパク質の減少についてウェスタンブロットによって分析した。全長ＧＯタンパク質は、３７０個のアミノ酸を有し、予測分子量は４１ｋＤであった。この分子量でのバンドは、ウェスタンブロットにおいて、対照レーン（未処理細胞）において観察された（図６および７）。
【０２３８】
ＧＯタンパク質の減少率は、Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｖｅｒ  ５．２ソフトウェアを使用して計算した。ローディング対照としてビンキュリンを使用し、ＧＯと同時にプローブした。ＧＯのバンドを包含する全領域と比較して、各試料内のビンキュリンの密度測定値について比率を計算した。この比率を陰性対照レーンに対して正規化した後、ＧＯタンパク質の減少率を決定した。結果を表１６に示し、図８および９に示す。
【０２３９】
【表１６】
2021531804.tif 000048
【０２４０】
実施例４．ＰＨ１のマウスモデルにおけるＨａｏ１のインビボでの編集
本試験では、野生型およびＡＧＴ欠損マウス（Ａｇｘｔ１−／−）、例えば、肝臓ＡＧＸＴ  ｍＲＮＡおよびタンパク質を欠いたヌル変異体マウスの両方を使用した。ＡＧＴ欠損マウスは、以前にＳａｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００６  Ｎｏｖ  ２８；１０３（４８）：１８２４９−５４に記載されているように、高シュウ酸尿症および結晶尿を示し、したがって、ＰＨ１の表現型モデルを代表するものである。野生型マウスを使用して、ＡＧＴ欠損マウスにおいてどの製剤を試験するかを決定した。
【０２４１】
ＬＮＰを製剤化する前に、マウスＨａｏ１を標的とするｄｇＲＮＡを、ヒトおよびカニクイザルＨＡＯ１を標的とするｇＲＮＡについて実施例２に記載したのと同様に、編集効率についてスクリーニングした。活性なｄｇＲＮＡを同定したら、修飾ｓｇＲＮＡのさらに小さなセットを、インビボでのさらなる評価のために合成した。
【０２４２】
動物を体重測定し、体重に従ってグループ化し、グループ平均体重に基づいて投与溶液を調製した。マウスＨａｏ１を標的とする修飾ｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ（以下の表１７を参照）を、動物あたり０．２ｍＬの体積（体重１キログラムあたり約１０ｍＬ）で、側方尾静脈を介して投与した。ＬＮＰを実施例１に記載のように製剤化した。治療から１週間後、野生型マウスを安楽死させ、ＤＮＡ抽出およびマウスＨａｏ１の編集の分析のために、肝臓組織を収集した。図１０および以下の表１７に示すように、治療したマウスにおいて、編集の用量依存的なレベルを観察した。
【０２４３】
ＬＮＰがインビボでマウスＨａｏ１遺伝子を編集することができることを確立した後、Ｇ７２３を含有するＬＮＰを、２ｍｐｋの用量でＡＧＴ欠損マウスに投与した（ｎ＝４）。例えば、Ｌｉｅｂｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１７  Ｆｅｂ；２８（２）：４９４−５０３に記載されるように、これらのマウスを代謝ケージに収容し、オキサレートレベルについて種々の時間点で尿を集めた。表１８は、ＡＧＴ欠損マウスの編集結果を示す。達成された平均編集％（ｎ＝４）は、７９．８５であり、標準偏差は５．９１であった。図１１に示されるように、尿オキサレートレベルは、治療の１週間後に減少し、この減少レベルは、投与から少なくとも５週間まで維持され、この時点で、試験を終了した。図１１に示すデータを表１９に示す。対照（ＰＢＳ注射した）動物（ｎ＝３）における減少は観察されなかった（データは示されていない）。
【０２４４】
【表１７】
2021531804.tif 000049
【０２４５】
【表１８】
2021531804.tif 000050
【０２４６】
【表１９】
2021531804.tif 000051
【０２４７】
ＬＮＰ処置から５週間後まで、ＡＧＴ欠損マウスにおける持続的な尿オキサレートの減少を実証した後、投与から１５週間後まで、尿オキサレートを追跡するために追加の実験を実施した。Ｇ７２３を含有するＬＮＰを、０．３ｍｐｋ（ｎ＝４）および１ｍｐｋ（ｎ＝４）の用量でＡＧＴ欠損マウスに投与した。これらのマウスを代謝ケージに収容し、上述のように、オキサレートレベルについて種々の時間点で尿を集めた。表２０は、１５週間の試験におけるＡＧＴ欠損マウスの編集結果を示す。０．３ｍｐｋ用量で達成された平均編集％は、７５．８であり、標準偏差は２．６であった。１ｍｐｋ用量で達成した平均編集％は、７２．７５であり、標準偏差は１２．５０であった。図１２に示されるように、尿オキサレートレベルは、治療後に減少し、この減少レベルは、投与から少なくとも１５週間まで維持され、この時点で、試験を終了した。図１２に示すデータを表２１に示す。対照（ＰＢＳ注射した）動物（ｎ＝３）における減少は観察されなかった（データは示されていない）。処理したマウス由来の肝臓試料を処理し、実施例１に記載のようにウェスタンブロット上で実行した。ＧＯタンパク質の減少率は、上述のようにＬｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｖｅｒ  ５．２ソフトウェアを使用して計算し、表２０に示す。ウェスタンブロット画像を図１３に示す。図１４は、表２０に示される編集レベルとタンパク質レベルとの間のＲ２値０．９９での相関を示す。
【０２４８】
【表２０】
2021531804.tif 000052
【０２４９】
【表２１】
2021531804.tif 000053
【図１Ａ】
2021531804.tif 000054
【図１Ｂ】
2021531804.tif 000055
【図１Ｃ】
2021531804.tif 000056
【図２】
2021531804.tif 000057
【図３】
2021531804.tif 000058
【図４】
2021531804.tif 000059
【図５】
2021531804.tif 000060
【図６】
2021531804.tif 000061
【図７】
2021531804.tif 000062
【図８】
2021531804.tif 000063
【図９】
2021531804.tif 000064
【図１０】
2021531804.tif 000065
【図１１】
2021531804.tif 000066
【図１２】
2021531804.tif 000067
【図１３】
2021531804.tif 000068
【図１４】
2021531804.tif 000069
【図１５】
2021531804.tif 000070
【図１６】
2021531804.tif 000071
【配列表】
2021531804000001.app
【国際調査報告】
2021531804.tif 000072
2021531804.tif 000073
2021531804.tif 000074
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2021531804.tif 000076
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