(57)【要約】本発明は、ヒトＣＴＬＡ４分子に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体の組成物、並びにがん免疫療法のための、及び他の免疫療法剤と比較した自己免疫副作用の低減のための、前記組成物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身性Ｔ細胞活性化又は自己反応性Ｔ細胞の優先的増殖をもたらさない、がんの治療に使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項２】
ＣＴＬＡ４が細胞表面に再循環することを可能にする、がんの治療に使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項３】
ｐＨ５．５と比較してｐＨ７でＣＴＬＡ４により高い親和性で結合する、請求項２に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項４】
ｐＨ４．５と比較してｐＨ７でＣＴＬＡ４により高い親和性で結合する、請求項２に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項５】
腫瘍微小環境においてＦｃ受容体（ＦｃＲ）媒介性制御性Ｔ細胞の枯渇を誘導する、請求項２〜請求項４のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項６】
全身性Ｔ細胞活性化又は自己反応性Ｔ細胞の優先的増殖をもたらさない、請求項２〜請求項５のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項７】
ＣＴＬＡ４のＢ７リガンドへの結合を阻害しない、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項８】
細胞表面に位置するＣＴＬＡ４と比較して可溶性ＣＴＬＡ４に対する親和性が低い、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項９】
抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされている、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項１０】
（ａ）細胞表面ＣＴＬＡ４を含む細胞を提供すること、
（ｂ）前記（ｂ）の細胞を抗ＣＴＬＡ４抗体候補と接触させること、
（ｃ）インキュベーションの期間後、細胞表面ＣＴＬＡ４の量を検出すること、及び
（ｄ）工程（ｃ）の細胞表面ＣＴＬＡ４の量を閾値レベルと比較することであって、前記閾値レベルは、コントロール抗ＣＴＬＡ４抗体と接触させた細胞からの細胞表面ＣＴＬＡ４の量である、前記比較すること、を含み、
細胞表面ＣＴＬＡ４の量が前記閾値レベルよりも多い場合に、前記抗ＣＴＬＡ４抗体候補は、誘発する免疫療法関連有害事象のレベルがより低い抗ＣＴＬＡ４抗体であると特定される、
誘発する免疫療法関連有害事象のレベルがより低い抗ＣＴＬＡ４抗体を特定する方法。
【請求項１１】
前記コントロール抗ＣＴＬＡ４抗体がイピリムマブ又はトレメリムマブである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）の細胞がヒトＣＴＬＡ４を発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞表面ＣＴＬＡ４が検出可能に標識されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出可能な標識が蛍光タグである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光タグがオレンジ色の蛍光タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｃ）の検出が、ウエスタンブロット、免疫組織化学、又はフローサイトメトリーを使用して、前記細胞表面ＣＴＬＡ４の検出可能な標識の量を測定することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記（ｃ）のインキュベーションが、
前記抗ＣＴＬＡ４抗体候補を、検出可能に標識された抗ＩｇＧ抗体と接触させること、及び
前記検出可能に標識された抗ＩｇＧ抗体の検出可能な標識の量をウエスタンブロット、免疫組織化学、又はフローサイトメトリーを使用して測定すること、
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能に標識された抗ＩｇＧ抗体の検出可能な標識がＡｌｅｘａ４８８を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、２９３Ｔ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
ｐＨ６以下の低ｐＨでよりもｐＨ６．５〜７．５の高ｐＨでＣＴＬＡ４に対する結合親和性が高い抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項２１】
前記高ｐＨがｐＨ７であり、前記低ｐＨがｐＨ４．５である、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
前記高ｐＨがｐＨ７であり、前記低ｐＨがｐＨ５．５である、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
免疫療法で使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体をスクリーニング又は設計する方法であって、前記抗ＣＴＬＡ４抗体がリソソームでのＣＴＬＡ４分解を引き起こさない、方法。
【請求項２４】
（ａ）ｐＨ６．５〜７．５で前記抗ＣＴＬＡ４抗体をＣＴＬＡ４タンパク質と接触させ、前記ＣＴＬＡ４タンパク質への前記抗ＣＴＬＡ４抗体の結合量を定量すること、
（ｂ）ｐＨ４．５〜５．５で前記抗ＣＴＬＡ４抗体をＣＴＬＡ４タンパク質と接触させ、前記ＣＴＬＡ４タンパク質への前記抗ＣＴＬＡ４抗体の結合量を定量すること、並びに
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）における結合量を比較すること、を含み、
（ｂ）と比較した（ａ）の結合量が閾値レベル以上の場合、前記抗ＣＴＬＡ４抗体はリソソームでのＣＴＬＡ４分解を引き起こさない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記（ａ）のｐＨがｐＨ７．０であり、前記（ｂ）のｐＨがｐＨ５．５であり、前記閾値レベルが３倍である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記（ａ）のｐＨがｐＨ７．０であり、前記（ｂ）のｐＨがｐＨ４．５であり、前記閾値レベルが１０倍である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体の結合量が、前記ＣＴＬＡ４タンパク質への５０％最大結合を達成するのに必要な抗ＣＴＬＡ４抗体の量である、請求項２４〜請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、細胞表面で結合されていたＣＴＬＡ４がエンドサイトーシス後に前記細胞表面に再循環することを可能にする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、エンドソーム及びリソソームにみられるｐＨに対応する酸性ｐＨにおいてＣＴＬＡ４への結合が破壊される抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３０】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、ｐＨ７．０と比較してｐＨ５．５においてＣＴＬＡ４への結合が３分の１以下に減少するものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体は、ｐＨ７．０と比較してｐＨ４．５においてＣＴＬＡ４への結合が１０分の１以下に減少するものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブ又はトレメリムマブと比較して、細胞表面結合ＣＴＬＡ４又は固定化ＣＴＬＡ４への結合よりも可溶性ＣＴＬＡ４への結合がより大きく減少するものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１０〜請求項１９及び請求項２３〜請求項２８のいずれか一項に従って同定、スクリーニング、又は設計された抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項３４】
がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、請求項１〜請求項８、請求項２０〜請求項２２、及び請求項３３のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体が抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象におけるがんの治療に使用するための、請求項１〜請求項８、請求項２０〜請求項２２、及び請求項３３のいずれか一項に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項３７】
抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて投与される、請求項３６に記載の使用のための抗ＣＴＬＡ４抗体。
【請求項３８】
がんを治療するための医薬の製造における、請求項１〜請求項８、請求項２０〜請求項２２、及び請求項３３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３９】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体が抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされている、請求項３８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ＮＩＨ）から授与された助成金番号ＡＩ６４３５０、ＣＡ１７１９７２、及びＡＧ０３６６９０に基づく政府の支援を受けて一部行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体及びその抗原結合性断片に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来のチェックポイント阻害仮説では、がん免疫は２つの異なるチェックポイントによって抑制されるとされている。１つ目は、リンパ器官のナイーブＴ細胞のプライミングを制限するＣＴＬＡ４とＢ７との間の相互作用であり、２つ目は、腫瘍微小環境内でのエフェクターＴ細胞の消耗を引き起こすＰＤ−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １）／Ｂ７Ｈ１（ＰＤＬ１）相互作用である［１］。以来、いくつかの新たな標的が臨床試験で評価中であり［２］、標的化試薬について複数のメカニズムが説明されている［３］。抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、マウス［４〜６］及び患者［７〜８］でがん拒絶を誘発する。
【０００４】
近年、腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇［９〜１１］、及び樹状細胞におけるＢ７のトランスエンドサイトーシス（Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）の阻害［１２〜１３］を含む、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの免疫療法効果を説明するために、多数のさらなるメカニズムが提案されている。しかし、抗ＣＴＬＡ４抗体が、リンパ器官におけるＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用及び機能を阻害し、ナイーブＴ細胞の活性化を促進するという、チェックポイント阻害仮説で前提とされているメカニズムによって腫瘍拒絶を誘発するのかどうかについては今後試験されるべきである［１］。
【０００５】
抗マウスＣＴＬＡ４  ｍＡｂの腫瘍免疫療法効果がＦｃの活性化受容体との相互作用に依存し、治療効果が腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの選択的枯渇と相関することを提案する報告により、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの全身的作用については疑問が投げかけられた［９〜１１］。これらの研究は、抗ＣＴＬＡ４抗体がリンパ器官で治療効果を発揮するという定説に疑問を投げかけているが、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害ががん治療効果に必要である、若しくは寄与するかどうか、又は腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの枯渇に関与どうかに関する中心的な問題には対処されていない。
【０００６】
抗マウスＣＴＬＡ４  ｍＡｂがＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用からの負のシグナル伝達を阻害することにより腫瘍拒絶を誘発するという広く受け入れられている概念にもかかわらず、これらの抗体の阻害活性は決定的には評価されていない［４〜６、９〜１１］。一方、臨床で最初に使用された抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブは、固定化ＣＴＬＡ４と相互作用するために可溶性Ｂ７−１とＢ７−２とが使用される場合、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害できることが報告されている［１４］。しかしながら、Ｂ７−１及びＢ７−２は膜関連の共刺激分子であるため、生理学的条件下で抗体がＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害するかどうかは不明である。
【０００７】
抗ＰＤ−１  ｍＡｂであるニボルマブ及び抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブの併用により、進行性メラノーマ患者の客観的奏効率が大幅に増加した［６、７］。進行性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）においてもこの併用療法から有望な結果が得られた［８］。別の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるトレメリムマブを抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂであるデュルバルマブと併用した場合も同様の臨床的利益が観察された［９］。単独又は併用での抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの幅広い臨床使用には、重篤な有害事象（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔ（ＳＡＥ））が主要な障害となる［６、７］。イピリムマブの治験で観察された重篤な有害事象は、免疫療法関連有害事象（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔ；（ｉｒＡＥ））の概念につながった［１０］。特に、イピリムマブ及びニボルマブ（抗ＰＤ−１）の併用療法では、５０％超の患者でグレード３及びグレード４の重篤な有害事象が生じた。ＮＳＣＬＣでは、イピリムマブ及びニボルマブの併用療法により高い奏効率が得られたが、グレード３及びグレード４の重篤な有害事象も高率で生じた［８］。同様に、デュルバルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）及びトレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）の組み合わせは、ＮＳＣＬＣで臨床活性を示したが［９］、この活性は第ＩＩＩ相臨床試験では立証されなかった。グレード３及びグレード４の重篤な有害事象の発生率が高いことが報告されており、おそらく容認できない毒性のために、患者の脱落率は高かった［９］。高用量の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは単剤療法及び併用療法のいずれでもより良い臨床転帰と関連しているため、免疫療法関連有害事象は多くの患者が免疫療法を継続することを妨げるだけでなく、がん免疫療法効果（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｅｆｆｅｃｔ（ＣＩＴＥ））の有効性も制限する。さらに、両方の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで脱落した患者の数の多さは、いくつかの臨床試験で臨床評価項目を満たせなかったことの一因となっていると考えられる［１１、１２］。
【０００８】
より最近では、切除されたステージＩＩＩ及びステージＩＶのメラノーマに対するアジュバント（術後補助）療法としての、抗ＰＤ−１  ｍＡｂであるニボルマブと抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブとの直接比較により、イピリムマブではがん免疫療法効果は低く免疫療法関連有害事象は多いことが示され［１３］、ＣＴＬＡ４を標的とする免疫療法の見通しにさらなる影を落としている。しかし、３年間生存したイピリムマブ治療患者において、１０年間の生存率はさらに低下しなかった［１４］。この際立って持続的な応答は、特に免疫療法関連有害事象をコントロールできる場合には、免疫療法のためにＣＴＬＡ４を標的とすることの格別の利点を強調している。
【０００９】
安全で効果的な抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの作製に関する基本的な問題は、がん免疫療法効果及び免疫療法関連有害事象が本質的に関連しているかどうかである。マウス及びヒトにおいてＣＴＬＡ４発現の遺伝的不活性化は自己免疫疾患を引き起こすため、免疫療法関連有害事象はがん免疫療法効果に必要な対価であると考えられる。一方、近年の研究では、抗マウスＣＴＬＡ４  ｍＡｂの治療効果には、７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害というよりは、むしろ腫瘍微小環境内での抗体を介したＴｒｅｇの枯渇が必要であることが示されている［１６−１８］。これらの研究は、ＣＴＬＡ４発現の遺伝的不活性化を模することなく局所的なＴｒｅｇの枯渇を達成できれば、免疫療法関連有害事象なしでがん免疫療法効果を達成しうるという興味深い可能性を提起している。この仮説を検証するには、臨床的に観察される免疫療法関連有害事象を忠実に再現するモデルを確立することが不可欠である。
【００１０】
抗ＣＴＬＡ４、又は抗ＣＴＬＡ４と抗ＰＤ−１若しくは抗ＰＤ−Ｌ１剤のいずれかを投与された患者で一般的に報告されている免疫療法関連有害事象には、赤芽球癆などの血液学的異常［１９、２０］、及び大腸炎、皮膚炎、肺炎、肝炎、及び心筋炎などの固形臓器への非感染性の炎症性損傷［２１〜２３］が含まれる。免疫療法関連有害事象という用語は、がん免疫療法効果と自己免疫性有害事象との間の本質的な関係を示唆するが、そのような関係を実証する調査研究はほとんどない。対照的に、ヒトＣｔｌａ４ノックインマウスを用いた本発明者らの以前の研究では、抗ＤＮＡ抗体のレベルとがん拒絶パラメーターとが必ずしも相互に相関しているわけではないことが示された［２４］。特に、試験した抗体の１つであるＬ３Ｄ１０は最大のがん免疫療法効果をもたらしたが、試験したいくつかのｍＡｂの中で、誘導された抗ＤＮＡ抗体のレベルは最も低かったことが判明した。一方、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂによって誘発された有害事象はマウスでは比較的軽度であるため、このモデルでは臨床観察を再現するには至らなかった。したがって、免疫療法関連有害事象の発生機序を理解し、安全で効果的な抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを同定するうえでの価値が限られている。さらに、これらの研究は、臨床的に使用される抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂが利用可能になる前に行われたため、この原理が臨床製品によって誘発された免疫療法関連有害事象に関連していたかどうかは明らかでない。
【発明の概要】
【００１１】
抗ＣＴＬＡ４抗体は、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用からの負のシグナル伝達を阻害することにより腫瘍拒絶を引き起こすと考えられている。本明細書に開示されるように、ヒトＣＴＬＡ４遺伝子ノックインマウス並びにヒト造血幹細胞再構成マウスを使用して、生理学的条件下でのＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害が抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂのがん免疫療法効果に必要であるかどうかを体系的に評価した。驚くべきことに、抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブは、臨床的有効用量により達成される血漿レベルよりかなり高い濃度でも、ＣＴＬＡ４によるＢ７のトランスエンドサイトーシスも固定化又は細胞関連Ｂ７へのＣＴＬＡ４の結合も阻害しない。その結果、イピリムマブは、ＣＴＬＡ４遺伝子ヒト化マウス（Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ）又はヒトＣＤ３４＋幹細胞再構成ＮＳＧ（商標）マウスからの樹状細胞（ＤＣ）のＢ７レベルを増加させない。ヒトＣＴＬＡ４遺伝子及びマウスＣＴＬＡ４遺伝子の両方を発現するＣｔｌａ４ｈ／ｍマウスでは、マウスＣＴＬＡ４に結合せずヒトＣＴＬＡ４に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体が、Ｆｃ受容体依存性Ｔｒｅｇの枯渇と腫瘍拒絶を効率的に誘発する。阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗体であるＬ３Ｄ１０は、腫瘍拒絶を引き起こす点では非阻害的（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）イピリムマブと同等である。特筆すべきことに、ヒト化中に阻害的活性を失ったＬ３Ｄ１０の子孫は、Ｔｒｅｇの枯渇及び腫瘍拒絶においては十分な能力を維持している。リンパ器官におけるＣＤ４  Ｔ細胞の活性化と及び新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）ＣＤ８  Ｔ細胞のプライミングを効果的に阻害した抗Ｂ７抗体は、イピリムマブの免疫療法効果に悪影響を与えない。したがって、臨床的に有効な抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブは、チェックポイント阻害とは無関係な、宿主のＦｃ受容体に依存するメカニズムによって腫瘍拒絶を引き起こす。本明細書に提示されるデータは、ＣＴＬＡ４チェックポイント阻害仮説の再評価を求めており、安全で効果的な次世代の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂのための新しい洞察を提供するものである。
【００１２】
抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、がん免疫療法効果をもたらすことに加えて、重度の免疫療法関連有害事象（ｉｒＡＥ）を引き起こす。ＣＴＬＡ４を標的化することにより、顕著な長期的な利益が示されており、免疫療法関連有害事象をコントロールできれば、これは今後もがん免疫療法にとって貴重なツールとなる。より安全なＣＴＬＡ４標的化試薬を開発するためには、臨床的な免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果を再現する動物モデルが価値を有すると考えられる。免疫療法関連有害事象のマウスモデルを開発する際に、本発明者らは３つの要因を考慮した。第一に、抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ４の併用療法が急速に多数の適応症に拡大しているため、前記併用療法を再現するモデルは、当技術分野で非常に重要と考えられる。第二に、併用療法の結果、対象の５０％超で重篤な有害事象（グレード３及びグレード４の臓器毒性）が発生するという事実は、マウスモデルでの免疫療法関連有害事象の再現をより容易にする。第三に、マウスは一般に免疫療法関連有害事象に対してより耐性があるため、免疫療法関連有害事象を忠実に再現できる条件を探求しなければならない。Ｃｔｌａ４−／−マウスの自己免疫表現型は若年齢で最も強く示され［２５、２６］、成体マウスのＣｔｌａ４遺伝子の標的変異では、自己免疫疾患の重症度が低いので［２７］、本発明者らは、マウスは抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂに対して、若年齢で投与されたときに最も感受性が高い可能性があるという洞察を有していた。これらの要因を考慮して、本発明者らは、併用療法の臨床試験で観察された免疫療法関連有害事象を忠実に再現するモデル系を特定した。
【００１３】
具体的には、ヒト化Ｃｔｌａ４遺伝子を有するマウスを使用して、単独又は併用のいずれかで、抗ＣＴＬＡ４抗体のがん免疫療法効果及び／又は免疫療法関連有害事象を評価するためのモデルが本明細書に記載されている。このモデルでは、臨床薬であるイピリムマブは、特に抗ＰＤ−１抗体と組み合わせた場合、重度の免疫療法関連有害事象を誘発した。同時に、別の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるＬ３Ｄ１０は、同じ条件下で同等のがん免疫療法効果を誘発したが、免疫療法関連有害事象は非常に軽度であった。このことは、免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果は本質的に関連しておらず、これらが異なる遺伝的及び免疫学的基盤を要することを示している。免疫療法関連有害事象は、全身性Ｔ細胞活性化と、自己反応性Ｔ細胞間の制御性Ｔ細胞／エフェクターＴ細胞（Ｔｒｅｇ／Ｔｅｆｆ）比の低下に対応していた。本発明者らは、ヒトのアレルに対してホモ接合性又はヘテロ接合性のマウスを使用し、免疫療法関連有害事象は両アレル性のエンゲージメントを必要とする一方、がん免疫療法効果は片アレル性のエンゲージメントを必要とするにすぎないことを見出した。片アレル性のエンゲージメントと両アレル性のエンゲージメントとの免疫学的区別として、本発明者らは、自己反応性Ｔ細胞のＴｒｅｇへの変換を防ぐためにはＣｔｌａ４遺伝子の両アレル性のエンゲージメントが必要であることを見出した。阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）活性を失わせたＬ３Ｄ１０のヒト化は、治療効果に影響を与えることなく安全性をさらに高めた。総合すると、本明細書に示されているデータは、ＣＴＬＡ４の完全な占有、全身性Ｔ細胞の活性化、及び自己反応性Ｔ細胞の優先的増殖は、腫瘍拒絶には必要ではないが免疫療法関連有害事象と相関しており、一方、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害は抗ＣＴＬＡ４抗体の安全性及び有効性のいずれにも影響を与えないことを示している。これらのデータは、より安全で有効である可能性のあるＣＴＬＡ４標的免疫療法の臨床開発に重要な洞察を提供する。
【００１４】
本明細書では抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂに誘導される免疫療法関連有害事象に関連する重要な原理が記載されている。特に、イピリムマブやトレメリムマブのように、低ｐＨでＣＴＬＡ４の強い結合親和性を持つ抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、表面ＣＴＬＡ４を、その内部移行中にリソソーム分解に向かわせ、これにより表面ＣＴＬＡ４が失われる結果として免疫療法関連有害事象を引き起こす。一方、低ｐＨで結合親和性が弱い抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、抗体誘導性内部移行中にＣＴＬＡ４から解離する。内部移行したＣＴＬＡ４はこれらの抗体から放出され、細胞表面に再循環し、免疫反応の負の調節因子としてのＣＴＬＡ４の機能を維持することになる。ｐＨ感受性抗体は、腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇のためのＡＤＣＣ／ＡＤＣＰの標的である細胞表面ＣＴＬＡ４を維持することで、腫瘍微小環境での選択的Ｔｒｅｇ枯渇、及びこれによる大きな腫瘍の拒絶により効果的なものとなる。これらの知見は、治療薬の開発のためのＣＴＬＡ４標的化において、Ｂ７とＣＴＬＡ４との間の相互作用に対する拮抗作用に基づき抗体を選択するものから、通常のＣＴＬＡ４再循環を維持するものへの重要なパラダイムシフトを示している。これは、抗腫瘍効果が高く毒性が低い新規抗ＣＴＬＡ４抗体の設計及び／又は選択に重要な革新をもたらす。
【００１５】
具体的には、抗腫瘍活性を高めるために、ＣＴＬＡ４標的化剤は腫瘍微小環境でＴｒｅｇを枯渇させる。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、Ｆｃ媒介性Ｔｒｅｇ枯渇活性が増大している。Ｔｒｅｇの枯渇は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）によって発生し得る。ＣＴＬＡ４抗体が腫瘍微小環境内で制御性Ｔ細胞のＣＴＬＡ４をダウンレギュレートしない場合、内部移行したＣＴＬＡ４分子の再循環を維持することにより、優先的にこの活性を高めることもできる。
【００１６】
免疫療法関連有害事象を減少させるため、正常なＣＴＬＡ４再循環を維持し、これにより腫瘍微小環境外の制御性Ｔ細胞の正常な機能を維持するためにＣＴＬＡ４標的化剤が選択又は改変される。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４は、後期エンドソーム又はリソソームｐＨ（ｐＨ４〜６）でＣＴＬＡ４に対して結合親和性が実質的に低下しており、抗体誘発性内部移行中にＣＴＬＡ４から解離し、これにより放出されたＣＴＬＡ４が細胞表面に再循環し、免疫反応の負の調節因子としてのＣＴＬＡ４の機能を維持することが可能になる。
【００１７】
最も好ましい実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、Ｔｒｅｇ枯渇抗腫瘍活性及びＣＴＬＡ４再循環活性の両方を改善するように選択又は改変される。
【００１８】
ＣＴＬＡ４標的化剤の毒性プロファイルをさらに強化するために、前記抗体は可溶性ＣＴＬＡ４（ｓＣＴＬＡ４）への結合が低減しているものであってもよい。ｓＣＴＬＡ４は、ＣＴＬＡ４遺伝子転写産物の選択的スプライシングによって生成される。ＣＴＬＡ４多型と、可溶性ＣＴＬＡ４の産生の欠陥（ｎａｔｕｒｅ  ２００３，  ４２３：  ５０６−５１１）に関する複数の自己免疫疾患との間には関連があり、ｓＣＴＬＡ４アイソフォームの遺伝的サイレンシングはマウスにおけるＩ型糖尿病の発症を増加させた（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１１，  ６０：１９５５−１９６３）。例えば、ハプロタイプＣＴ６０Ｇなどの、ｓＣＴＬＡ４転写産物を生成量がより少ない遺伝的バリアントは、耐性ＣＴ６０Ａハプロタイプなどのより多くのｓＣＴＬＡ４を生成するハプロタイプと比較して自己免疫疾患感受性が高い。したがって、血清中のｓＣＴＬＡ４の存在は、自己免疫疾患の減少に関連している。さらに、可溶性ＣＴＬＡ４（アバタセプト及びベラタセプト）は、免疫抑制に広く使用されている薬物である。したがって、ｓＣＴＬＡ４への結合親和性が低下した抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、免疫応答の負の調節因子としてのｓＣＴＬＡ４の機能を維持している可能性がある。本明細書に記載の発明はまた、本明細書に記載の抗体の機能的特徴又は属性を組み込むことにより、新規抗ＣＴＬＡ４抗体を設計すること又は既存の抗ＣＴＬＡ４抗体の有効性及び／又は毒性プロファイルを増強することを含む。
【００１９】
本明細書では、全身性Ｔ細胞活性化又は自己反応性Ｔ細胞の優先的発現をもたらさない可能性のある、及び／又はＣＴＬＡ４が細胞表面に再循環することを可能にし得る抗ＣＴＬＡ４抗体が提供される。前記抗体は、ｐＨ５．５又は４．５でよりもｐＨ７．０でより高い親和性でＣＴＬＡ４に結合する。前記抗体は、腫瘍微小環境でＦｃ受容体（Ｆｃ−Ｒ）媒介性制御性Ｔ細胞の枯渇を誘導し得る。前記抗体は、全身性Ｔ細胞の活性化又は自己反応性Ｔ細胞の優先的な発現をもたらさなくてもよい。前記抗体は、ＣＴＬＡ４のＢ７リガンドへの結合を阻害しなくてもよい。前記抗体は、細胞表面に位置するＣＴＬＡ４と比較して可溶性ＣＴＬＡ４に対する親和性が低くてもよい。前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わされていてもよい。前記抗ＣＴＬＡ４抗体はがんの治療に使用されていてもよい。
【００２０】
本明細書ではまた、誘発する免疫療法関連有害事象のレベルがより低い抗ＣＴＬＡ４抗体を特定する方法も提供される。前記方法は、細胞表面ＣＴＬＡ４を含む細胞を提供すること、前記細胞を抗ＣＴＬＡ４抗体候補と接触させること、インキュベーションの期間後、細胞表面ＣＴＬＡ４の量を検出すること、及び細胞表面ＣＴＬＡ４の量を閾値レベルと比較すること、を含み得る。前記閾値レベルは、コントロール抗ＣＴＬＡ４抗体と接触させた細胞からの細胞表面ＣＴＬＡ４の量であり得る。細胞表面ＣＴＬＡ４の量が前記閾値レベルよりも多い場合に、前記抗ＣＴＬＡ４抗体候補は、誘発する免疫療法関連有害事象のレベルがより低い抗ＣＴＬＡ４抗体であると特定され得る。前記細胞はヒトＣＴＬＡ４を発現してもよく、前記細胞表面ＣＴＬＡ４は検出可能に標識され得る。検出可能な標識は、オレンジ色の蛍光タンパク質などの蛍光タグであり得る。前記検出は、ウエスタンブロット、免疫組織化学、又はフローサイトメトリーを使用して、前記細胞表面ＣＴＬＡ４の検出可能な標識の量を測定すること、を含み得る。前記インキュベーションは、前記抗ＣＴＬＡ４抗体候補を、検出可能に標識された抗ＩｇＧ抗体と接触させること、及び前記検出可能に標識された抗ＩｇＧ抗体の検出可能な標識の量をウエスタンブロット、免疫組織化学、又はフローサイトメトリーを使用して測定すること、を含み得る。前記検出可能に標識された抗ＩｇＧ抗体は、Ａｌｅｘａ４８８を含み得る。前記細胞は、２９３Ｔ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり得る。
【００２１】
さらに本明細書では、ｐＨ６以下の低ｐＨでよりもｐＨ６．５〜７．５の高ｐＨでＣＴＬＡ４に対する結合親和性が高い抗ＣＴＬＡ４抗体が提供される。前記高ｐＨは７であってもよく、前記低ｐＨは４．５又は５．５であってもよい。
【００２２】
本明細書ではまた、免疫療法で使用するための抗ＣＴＬＡ４抗体をスクリーニング又は設計する方法であって、前記抗ＣＴＬＡ４抗体がリソソームＣＴＬＡ４分解を引き起こさない、方法が提供される。前記方法は、（ａ）ｐＨ６．５〜７．５で前記抗ＣＴＬＡ４抗体をＣＴＬＡ４タンパク質と接触させ、前記ＣＴＬＡ４タンパク質への前記抗ＣＴＬＡ４抗体の結合量を定量すること、（ｂ）ｐＨ４．５〜５．５で前記抗ＣＴＬＡ４抗体をＣＴＬＡ４タンパク質と接触させ、前記ＣＴＬＡ４タンパク質への前記抗ＣＴＬＡ４抗体の結合量を定量すること、並びに（ｃ）（ａ）及び（ｂ）における結合量を比較すること、を含み得る。（ｂ）と比較した（ａ）の結合量が閾値レベル以上の場合、前記抗ＣＴＬＡ４抗体はリソソームＣＴＬＡ４分解を引き起こさない可能性がある。前記（ａ）のｐＨは７．０であってもよく、（ｂ）のｐＨは５．５であってもよく、前記閾値レベルは３倍であってもよい。前記（ａ）のｐＨは７．０であってもよく、（ｂ）のｐＨは４．５であってもよく、前記閾値レベルは１０倍であってもよい。前記抗ＣＴＬＡ４抗体の結合量は、前記ＣＴＬＡ４タンパク質への５０％最大結合を達成するのに必要な抗ＣＴＬＡ４抗体の量であってもよい。前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、細胞表面で結合されていたＣＴＬＡ４がエンドサイトーシス後に細胞表面に再循環することを可能にするものであってもよい。
【００２３】
本明細書ではさらに、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、エンドソーム及びリソソームにみられるｐＨに対応する酸性ｐＨにおいてＣＴＬＡ４への結合が破壊される抗体を前記対象に投与することを含み得る、方法が提供される。前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、ｐＨ７．０と比較してｐＨ５．５においてＣＴＬＡ４への結合が３分の１以下に減少するものであってもよく、ｐｐＨ７．０と比較してｐＨ４．５においてＣＴＬＡ４への結合が１０分の１以下に減少するものであってもよい。前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブ又はトレメリムマブと比較して、細胞表面結合ＣＴＬＡ４又は固定化ＣＴＬＡ４への結合よりも可溶性ＣＴＬＡ４への結合がより大きく減少するものであってもよい。
【００２４】
本明細書ではまた、本明細書の記載に従って同定、スクリーニング、又は設計された抗ＣＴＬＡ４抗体も本明細書で提供される。前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、がんを治療する方法において、がんの治療を必要としている対象に投与され得、がんを治療するために使用され得、そしてがんを治療するための医薬の製造において使用され得る。前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて使用され得、前記抗体は、同時に又は連続的に投与され得、単一の組成物に組み合わされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＣＴＬＡ４−Ｆｃの変異分析により、イピリムマブとＬ３Ｄ１０は異なるが重複するエピトープに結合することが明らかとなる。  （ａ）〜（ｅ）マウスＣＴＬＡ４配列及びヒトＣＴＬＡ４配列の結晶構造と多様性に基づいて、ｈＣＴＬＡ４−Ｆｃ変異体Ｍ１７（配列番号１）及びＭ１７−４（配列番号２）が生成された。  （ａ）ビオチン化Ｂ７−１に結合する能力によってＣＴＬＡ４分子の完全性が確認された。コントロールｈＩｇＧ−Ｆｃタンパク質、ＷＴ（Ｍ１）ｈＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質、及び変異（Ｍ１７及びＭ１７−４）ｈＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質を９６ウェルプレートに１μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。様々な用量のビオチン化ｈＢ７−１−Ｆｃを添加して、ストレプトアビジン−ＨＲＰで測定される結合能力を試験した。  （ｂ）〜（ｅ）コントロールｈＩｇＧ−Ｆｃタンパク質、ＷＴ（Ｍ１）（配列番号３）ｈＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質、及び変異（Ｍ１７及びＭ１７−４）ｈＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質を９６ウェルプレートに１μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。様々な用量のビオチン化Ｌ３Ｄ１０又はイピリムマブを添加して、ｈＣＴＬＡ４−Ｆｃ分子への結合能力を試験した。これらはＷＴ  ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（ｂ）と結合しｈＩｇＧ−Ｆｃ（ｃ）と結合しなかったことから、結合の特異性が確認された。Ｍ１７の４つの変異はＬ３Ｄ１０及びイピリムマブの両方への結合を完全に不活性化した（ｄ）。一方、Ｍ１７−４の３つの変異はＬ３Ｄ１０への結合を劇的に抑制したが、イピリムマブに対しては抑制しなかった（ｅ）。
【００２６】
【図２】Ｂ７が固定化されている場合、イピリムマブのＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害活性は低い。  （ａ）結合アッセイに可溶性Ｂ７−１を使用する場合、イピリムマブ及びＬ３Ｄ１０はいずれもＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を強力に阻害する。様々な用量の抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂを、０．０２５μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＢ７−１−Ｆｃと共に、１μｇ／ｍＬヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃでコーティングしたプレートに添加した。ＨＲＰ結合アビジンを使用してプレートに結合したＢ７−１−Ｆｃの量を測定した。示されているデータは２連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）の平均であり、２つの独立した実験を代表するものである。  （ｂ）イピリムマブは、Ｌ３Ｄ１０よりビオチン化ヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃによく結合する。様々な用量の抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂ又はコントロールＩｇＧをプレートにコーティングした。ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃを０．２５μｇ／ｍＬで添加した。プレートに結合したＣＴＬＡ４の量は、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを使用して測定した。示されているデータは２連の平均であり、２つの独立した実験を代表するものである。  （ｃ）ＣＨＯ細胞でｍＢ７−１が発現している場合の、イピリムマブによる、マウスＢ７−１−ヒトＣＴＬＡ４相互作用の検出可能であるが程度の低い阻害。様々な用量の抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂを、２００ｎｇのヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃと共に、マウスＢ７−１を発現する１．２×１０５個のＣＨＯ細胞に添加した。対照的に、Ｌ３Ｄ１０は、マウスＢ７−１のヒトＣＴＬＡ４への結合を強力に阻害した。示されているデータは３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）のデータの平均及び標準偏差（ＳＤ）であり、３つの独立した実験を代表するものである。  （ｄ）Ｌ３Ｄ１０は、ポリヒスチンジンタグ付きヒトＣＴＬＡ４とヒトＢ７−１を発現するＣＨＯ細胞との相互作用を阻害するが、イピリムマブはこれを阻害しない。ヒトＢ７−１を発現する１．２×１０５個のＣＨＯ細胞を、２００ｎｇのビオチン化ポリヒスチジンタグ付きＣＴＬＡ４と共に、所定の用量の抗体を併せてインキュベートした。ＣＨＯ細胞に結合したＣＴＬＡ４−Ｆｃの量は、フローサイトメトリーによりＰＥ−ストレプトアビジンで検出した。示されているデータ（平均±ＳＤ）は３連のサンプルの正規化した平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び標準偏差（ＳＤ）であり、２つの独立した実験を代表するものである。  （ｅ）イピリムマブ及びＬ３Ｄ１０は、可溶性ｈＣＴＬＡ４と細胞表面に発現したｈＢ７−１との間の相互作用に対して、示差的な阻害活性を示した。ｈＢ７−１陽性でＦｃＲ陰性のＬ９２９細胞（１×１０５個／試験）を、ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（２００ｎｇ／試験）と共に、所定の用量の抗体を併せてインキュベートした。Ｂ７結合ＣＴＬＡ４−Ｆｃの量をＰＥ−ストレプトアビジンで検出し、ＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。データは２つの独立した実験の結果を表す。
【００２７】
【図３】Ｂ７−１又はＢ７−２が固定化されている場合、イピリムマブのＢ７−１−ＣＴＬＡ４とＢ７−２−ＣＴＬＡ４との間の相互作用の阻害活性は低い。  （ａ）〜（ｃ）Ｂ７−１−ＣＴＬＡ４相互作用における、抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブ及びＬ３Ｄ１０の阻害活性。  （ａ）ｈＢ７−１−Ｆｃを０．５μｇ／ｍＬの濃度で固定化した。ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃを０．２５μｇ／ｍＬで所定の用量の抗体と共に添加した。  （ｂ）飽和用量のイピリムマブ又はＬ３Ｄ１０（１００μｇ／ｍＬ）の存在下でビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃの様々な用量を用いた以外は、（ａ）の場合と同様とした。  （ｃ）プレートをコーティングするために様々な用量のＢ７−１−Ｆｃを使用し、ＣＴＬＡ４−Ｂ７−１相互作用を阻害するために飽和用量のイピリムマブ又はＬ３Ｄ１０（１００μｇ／ｍＬ）を用いた以外は、（ａ）の場合と同様とした。  （ｄ）〜（ｆ）Ｂ７−２−ＣＴＬＡ４相互作用における、抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブ及びＬ３Ｄ１０の阻害活性。  （ｄ）ｈＢ７−２−Ｆｃを固定化した以外は、（ａ）の場合と同様とした。  （ｅ）ｈＢ７−２−Ｆｃを固定化した以外は、（ｂ）の場合と同様とした。  （ｆ）ｈＢ７−２−Ｆｃを固定化した以外は、（ｃ）の場合と同様とした。  （ａ）〜（ｆ）に示されているデータは、４５０ｎｍでの２連又は３連の光学濃度（ＯＤ）の平均である。  （ｇ）細胞表面ｈＢ７−１とＣＴＬＡ４との相互作用の阻害。ｈＢ７−１を発現するＣＨＯ細胞を、ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃと共に、所定の用量の抗体と併せてインキュベートした。Ｂ７結合ＣＴＬＡ４−Ｆｃの量をＰＥ−ストレプトアビジンで検出し、ＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。  （ｈ）ＣＴＬＡ４と細胞表面ｍＢ７−２との相互作用の阻害。ｍＢ７−２を発現するＣＨＯ細胞を使用した以外は、（ｃ）の場合と同様とした。  （ｉ）一晩のＬＰＳ刺激で成熟した脾臓の樹状細胞へのＣＴＬＡ４−Ｆｃの結合の阻害。０．５μｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した２×１０６個の脾臓細胞を各試験に使用し、ＰＥ強度を分析するためにＣＤ１１ｃｈｉｇｈ  ＤＣ（図５、ｂ）をゲーティングした以外は、（ｇ）及び（ｈ）の場合と同様とした。  示されているデータ（平均±ＳＤ）は三連サンプルの正規化したＭＦＩ値である。この図に示すデータは、２〜５回反復されたものである。
【００２８】
【図４】イピリムマブの異なる阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）作用の調整。  （ａ）〜（ｄ）イピリムマブは、既形成のＢ７−ＣＴＬＡ４複合体を分解しない。  （ａ）及び（ｂ）  Ｂ７複合体化ＣＴＬＡ４に対する抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの影響。Ｂ７−ＣＴＬＡ４複合体は、Ｂ７−１（ａ）又はＢ７−２（ｂ）でプレコートしたプレートにビオチン化ＣＴＬＡ４を添加することで形成した。段階的用量の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを、既存のＢ７−１−ＣＴＬＡ４複合体（ａ）又はＢ７−２−ＣＴＬＡ４複合体（ｂ）を含むプレートに添加した。２時間後、未結合のタンパク質を洗い流し、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを使用して、Ｂ７−１又はＢ７−２−複合体化ＣＴＬＡ４の量を検出した。  （ｃ）Ｂ７発現ＣＨＯ細胞を使用したフローサイトメトリーアッセイに基づくＢ７及びＣＴＬＡ４複合体の解離反応速度論。表面ｈＢ７−１又はｍＢ７−２発現ＣＨＯ細胞（１×１０５個／試験）を、可溶性のビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（２００ｎｇ／試験）と共に室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を１００μＬのＤＰＢＳバッファーで図示された時間インキュベートした。Ｂ７結合ＣＴＬＡ４−Ｆｃの量をＰＥ−ストレプトアビジンでフローサイトメトリーにより検出し、３連のサンプルからＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。示されているデータは２つの独立した実験のうち１つの結果を表す。  （ｄ）Ｌ３Ｄ１０は、可溶性ＣＴＬＡ４とＣＨＯ細胞で発現したｈＢ７−１との間の事前に確立された相互作用を顕著に妨害するが、イピリムマブはこれを妨害しない。表面ｈＢ７−１発現ＣＨＯ細胞（１×１０５個／試験）を、可溶性のビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（２００ｎｇ／試験）と共に室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を所定の用量の抗体と共に１００μＬのＤＰＢＳバッファーで１時間インキュベートした。Ｂ７結合ＣＴＬＡ４−Ｆｃの量をＰＥ−ストレプトアビジンで検出し、ＰＥのＭＦＩを計算した。結果は、同様のパターンを持つ３つの独立したアッセイの１つを表している。  （ｅ）イピリムマブは、Ｂ７−１でトランスフェクトしたＪ５５８細胞（Ｊ５５８−Ｂ７）へのＣＤ２８−Ｆｃの結合のＣＴＬＡ４−Ｆｃ媒介性阻害を緩和しない。Ｊ５５８−Ｂ７細胞を、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）及び段階的用量の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ又はコントロールＩｇＧ−Ｆｃの存在下で、ビオチン化ＣＤ２８−Ｆｃ（２０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。示されているデータは３連のサンプルからのＭＦＩの平均値の標準誤差（ＳＥＭ）であり、同様の結果である少なくとも３つの独立した実験を代表するものである。  （ｆ）Ｂ７−１が固定化された場合のＢ７−１−ＣＴＬＡ４相互作用の速度論。  （ｇ）ＣＴＬＡ４が固定化されている場合のＢ７−１−ＣＴＬＡ４相互作用の速度論。この図に示すデータは、２〜５回反復されたものである。
【００２９】
【図５】Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の細胞アッセイの特徴付け。  （ａ）ヒトｈＣＴＬＡ４−ＯＦＰタンパク質の野生型（ＷＴ、上部パネル）及びＹ２０１Ｖ変異体（下部パネル）を安定して発現する２９３Ｔ細胞の共焦点画像。ＷＴ  ｈＣＴＬＡ４は主に細胞内に分布するが、変異型ｈＣＴＬＡ４分子は細胞膜分布の明確なパターンを示すことに注目されたい。  （ｂ）図６で使用される細胞間結合アッセイにおけるＧＦＰ＋ＯＦＰ＋細胞は、前方散乱光及び側方散乱光に基づく細胞−細胞集合である。４℃で２時間共培養したｈＢ７−２−ＧＦＰ−ＣＨＯ及びｈＣＴＬＡ４Ｙ２０１Ｖ−ＯＦＰ−２９３Ｔ細胞の代表的なフロープロファイル。上部パネルはＧＦＰ＋ＯＦＰ＋細胞の前方散乱光と側方散乱光を示し、下部パネルは単一陽性細胞と二重陽性細胞の前方散乱（左）及び側方散乱（右）の比較を示す。  （ｃ）トランスエンドサイトーシスアッセイの特徴付け。上部パネルは、図７に示したデータに使用されるゲーティングを示し、下部パネルは３７℃で４時間の共培養後、ＣＴＬＡ４−ＯＦＰ−ＣＨＯ細胞が、前方散乱及び側方散乱を変化させることなくｈＢ７−２−ＧＦＰ−ＣＨＯ細胞からＧＦＰシグナルを得たことを示す。
【００３０】
【図６】イピリムマブはＢ７／ＣＴＬＡ４に媒介される細胞間相互作用の阻害に効果を有しない。  （ａ）Ｂ７−１−ＧＦＰ又はＢ７−２−ＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、ＣＴＬＡ４Ｙ２０１Ｖでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞、又は共培養なしのＢ７−２とＣＴＬＡ４トランスフェクタントとの混合物のプロファイル。  （ｂ）本試験に使用したＦａｂの純度のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。  （ｃ）及び（ｄ）  代表的なＦＡＣＳプロファイル（ｃ：Ｆａｂは１０μｇ／ｍＬで使用）及び用量反応（ｄ）は、ＣＴＬＡ４−ＯＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対してＬ３Ｄ１０及びイピリムマブＦａｂによる結合が同等であることを示している。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、結合アッセイの二次抗体として使用した。用量反応は、イピリムマブ及びＬ３Ｄ１０  Ｆａｂの同様の結合活性を示している。ＡＦ４８８−ＭＦＩ、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８色素の平均蛍光強度。  （ｅ）抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ  Ｆａｂによる、Ｂ７−１−ＣＴＬＡ４Ｙ２０１Ｖに媒介される細胞間相互作用の阻害。Ｂ７−１−ＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞及びＣＴＬＡ４Ｙ２０１Ｖでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、１０μｇ／ｍＬのＦａｂ又はコントロールタンパク質の存在下、４℃で２時間共培養した。示されるデータは代表的なＦＡＣＳプロファイルである。  （ｆ）対向する細胞上に発現されるＢ７−１及びＣＴＬＡ４によって媒介される細胞間相互作用の阻害についてのＬ３Ｄ１０とイピリムマブとの間の量的比較。段階的用量の抗体を添加した以外は、（ｅ）の場合と同様とした。  （ｇ）抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ  Ｆａｂによる、Ｂ７−２−ＣＴＬＡ４Ｙ２０１Ｖに媒介される細胞間相互作用の阻害。Ｂ７−２−ＧＦＰトランスフェクタントを使用した以外は、（ｅ）の場合と同様とした。  （ｈ）対向する細胞上に発現されるＢ７−２及びＣＴＬＡ４によって媒介される細胞間相互作用の阻害についてのＬ３Ｄ１０とイピリムマブとの間の量的比較。Ｂ７−２−ＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を使用した以外は、（ｆ）の場合と同様とした。  全てのアッセイを少なくとも２回繰り返した。
【００３１】
【図７】イピリムマブはＣＴＬＡ４によるＢ７トランスエンドサイトーシスの阻害に効果を有しない。  （ａ）トランスエンドサイトーシスアッセイに使用されるＢ７−２−ＧＦＰ又はＣＴＬＡ４−ＯＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞系のＦＡＣＳプロファイル。  （ｂ）ＣＴＬＡ４によるＢ７−２の急速なトランスエンドサイトーシス。Ｂ７−２−ＧＦＰトランスフェクタント及びＣＴＬＡ４−ＯＦＰトランスフェクタントを３７℃で０時間、０．５時間、１時間、及び４時間共培養した。  （ｃ）ＣＴＬＡ４によるＢ７−Ｈ２のトランスエンドサイトーシスの欠如。Ｂ７−Ｈ２−ＧＦＰをトランスフェクトしたＰ８１５細胞並びに０時間、１時間、及び４時間の共培養のデータを示した以外は、（ｂ）の場合と同様とした。  （ｄ）コントロールｈＩｇＧ−Ｆｃ、又はイピリムマブ若しくはＬ３Ｄ１０のＦａｂ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下での４時間の共培養中における、ＣＴＬＡ４−ＯＦＰ発現ＣＨＯ細胞によるＢ７−１−ＧＦＰのトランスエンドサイトーシスの示差的な阻害を示す代表的なプロファイル。  （ｅ）Ｌ３Ｄ１０及びイピリムマブのＦａｂによるＢ７−１トランスエンドサイトーシスの阻害を示す用量反応曲線。異なる用量のコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃ又はＦａｂを共培養に添加した以外は、（ｄ）の場合と同様とした。  （ｆ）Ｂ７−２−ＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を使用した以外は、（ｄ）の場合と同様とした。  （ｇ）Ｌ３Ｄ１０及びイピリムマブのＦａｂによるＢ７−２トランスエンドサイトーシスの阻害を示す用量反応曲線。Ｂ７−２−ＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を使用した以外は、（ｅ）の場合と同様とした。  示されているデータ（平均±ＳＤ）は、Ｆａｂの異なる投与量におけるエンドサイトーシスの割合（％）である。全てのアッセイは少なくとも３回繰り返した。
【００３２】
【図８】イピリムマブはｉｎ  ｖｉｖｏでＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害しない。  （ａ）実験デザインの概略。  （ｂ）Ｂ７発現を分析したＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ樹状細胞（ＤＣ）の表現型を示す代表的なデータ。  （ｃ）コントロールｈＩｇＧ−Ｆｃ、Ｌ３Ｄ１０、又はイピリムマブを投与されたマウス由来の樹状細胞におけるｍＢ７−１のレベルを表す代表的なヒストグラム。上部パネルのデータは、ホモ接合型ヒトＣＴＬＡ４ノックインマウス（Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ）での抗体の効果を示し、下部パネルのデータは、ヘテロ接合型マウス（Ｃｔｌａ４ｈ／ｍ）での抗体の効果を示している。  （ｄ）ｍＢ７−２の発現を示した以外は、（ｃ）の場合と同様とした。  （ｃ）及び（ｄ）に示すデータは、各群３個体のマウスのデータを表しており、データは１回反復されたものである。  （ｅ）ヒトＣＴＬＡ４ホモ接合型マウスでは、Ｌ３Ｄ１０はｍＢ７−１（左パネル）及びｍＢ７−２（右パネル）のアップレギュレーションを誘導したが、イピリムマブではこれを誘導しなかった。示されているデータ（平均±ＳＥＭ）は、各群合計６個体のマウスを含む２つの実験から要約したものである。  （ｆ）ヘテロ接合型マウスを使用する以外は、（ｅ）の場合と同様とした。Ｌ３Ｄ１０もイピリムマブも、マウス及びヒトのＣｔｌａ４遺伝子をいずれも優性的に共発現するマウスにおいて、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害しない。  統計的有意性はスチューデントのｔ検定を使用して決定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｎ．ｓ．有意差なし。
【００３３】
【図９】抗ＣＴＬＡ４抗体製剤よりもｈＩｇＧ−Ｆｃコントロール製剤でやや高いレベルのエンドトキシンが検出されたにもかかわらず、ｈＩｇＧ−Ｆｃはマウス脾臓の樹状細胞におけるＢ７−１及びＢ７−２発現をアップレギュレートしなかった。  （ａ）及び（ｂ）  ５００μｇのｈＩｇＧ−Ｆｃ又は等量のＰＢＳを投与したＣｔｌａ４ｈ／ｈマウス由来の、図５（ｂ）に示すようにゲーティングした脾臓の樹状細胞における、Ｂ７−１（ａ）及びＢ７−２（ｂ）発現の代表的なプロファイル。  （ｃ）及び（ｄ）  脾臓の樹状細胞において発現したＢ７−１（ｃ）及びＢ７−２（ｄ）の平均蛍光強度の要約。各群ｎ＝５（Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウス）。したがって、コントロールｈＩｇＧ−Ｆｃ投与マウスのプロファイルは、Ｂ７−１及びＢ７−２の基礎発現レベルを反映している。よって、ｈＩｇＧ−Ｆｃに対するイピリムマブの効果の欠如は、図８に示されるように、イピリムマブがｉｎ  ｖｉｖｏでＢ７−１及びＢ７−２をアップレギュレートできないことを示している。
【００３４】
【図１０】Ｌ３Ｄ１０、ＨＬ１２、ＨＬ３２、及びイピリムマブは、ヒトＣＴＬＡ４に結合するがマウスＣｔｌａ４には結合しない。示されているデータは、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウス（上）又はＣｔｌａ４ｍ／ｍマウス（下）の脾臓細胞を使用した、ゲーティングしたＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞間のＣＴＬＡ４の細胞内染色のドットプロットである。抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂ  ４Ｆ１０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をコントロールとして使用した。
【００３５】
【図１１】イピリムマブはｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＢ７とヒトＣＴＬＡ４との間の相互作用を阻害しない。  （ａ）ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞で再構成されたＮＳＧ（商標）マウスの末梢血白血球（ＰＢＬ）中のヒト白血球の組成を示すＦＡＣＳプロファイル。  （ｂ）（ａ）で分析した個々のマウスの要約データ。  （ｃ）ヒト化ＮＳＧ（商標）マウスの脾臓におけるＴｒｅｇ（中央右パネル）と樹状細胞（右パネル）の正常な組成。  （ｄ）マウス脾臓のヒトＣＤ４  Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３及びＣＴＬＡ４の発現。  （ｅ）及び（ｆ）  Ｌ３Ｄ１０は、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋幹細胞再構成ＮＳＧ（商標）マウスにおいてヒトＢ７−２とヒトＣＴＬＡ４との間の相互作用を阻害するが、イピリムマブはこれを阻害しない。ヒト化マウスに、コントロールＩｇ又は抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（５００μｇ／マウス）を腹腔内投与した。脾臓細胞を注射後２４時間で採取し、樹状細胞でのＢ７−２の発現について分析した。  （ｅ）樹状細胞におけるｈＢ７−２の代表的なプロファイル。  （ｆ）２つの独立した実験からの要約データ（平均±ＳＥＭ）。  コントロールマウスの平均データを人為的に１００と定義し、実験群のデータをコントロールに対して正規化する。統計的有意性はスチューデントのｔ検定を使用して決定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｎ．ｓ．有意差なし。
【００３６】
【図１２】Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害は、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂが誘発するがん免疫療法活性及び腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇には寄与しない。  （ａ）２つの抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、大きく異なる阻害活性を有するにもかかわらず、同等の免疫療法効果を有する。５×１０５個又は１×１０６個のＭＣ３８腫瘍細胞をＣｔｌａ４ｈ／ｈマウスに注入（皮下注射）した（ｎ＝５〜６）。矢印で示すように、７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目に、マウスあたり１００μｇ（左）、３０μｇ（中央）、又は１０μｇ（右）のイピリムマブ、Ｌ３Ｄ１０、又はコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃでマウスを処置（腹腔内投与）した。データは各群マウス５〜６個体の平均値±ＳＥＭを表す。統計分析は、二元配置反復測定分散分析（処置×時間）によって行った。１００μｇ処置の場合、イピリムマブ  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＜０．０００１；Ｌ３Ｄ１０  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＜０．０００１；イピリムマブ  ｖｓ．  Ｌ３Ｄ１０：Ｐ＝０．０６９９。３０μｇ処置の場合、イピリムマブ  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＜０．０００１；Ｌ３Ｄ１０  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＜０．０００１；イピリムマブ  ｖｓ．  Ｌ３Ｄ１０：Ｐ＝０．９９６９。１０μｇ処置の場合、イピリムマブ  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＜０．０００１；Ｌ３Ｄ１０  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＜０．０００１；イピリムマブ  ｖｓ．  Ｌ３Ｄ１０：Ｐ＝０．９９８８。データは独立した３回〜５回の実験を代表するものである。  （ｂ）イピリムマブ及びＬ３Ｄ１０は、Ｂ１６メラノーマの増殖に対して同様の治療効果を有する。１×１０５個のＢ１６腫瘍細胞をＣｔｌａ４ｈ／ｈマウス（ｎ＝４〜５）に注入（皮下注射）した。矢印で示すように、１１日目、１４日目、１７日目（左）又は２日目、５日目、８日目（右）に、１００μｇ（左）又は２５０μｇ（右）のイピリムマブ、Ｌ３Ｄ１０、又はコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃでマウスを処置（腹腔内投与）した。左パネルの場合、イピリムマブ  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．０２６５、Ｌ３Ｄ１０  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．０４８７、イピリムマブ  ｖｓ．  Ｌ３Ｄ１０：Ｐ＝０．３０２。右パネルの場合、イピリムマブ  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．００６１６；Ｌ３Ｄ１０  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．０２６９；イピリムマブ  ｖｓ．  Ｌ３Ｄ１０：Ｐ＝０．３７０。データは各群マウス４〜５個体の平均値±ＳＥＭを表す。  （ｃ）〜（ｆ）Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害は、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスの腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの選択的枯渇に寄与しない。３回目の投与後３日目において、Ｌ３Ｄ１０もイピリムマブも、マウスの脾臓（ｃ）のＴｒｅｇを消失させなかった。示されているデータは、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスのＣＤ４  Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合（％）である。各群ｎ＝マウス６個体。ＣＤ４  Ｔ細胞中のＴｒｅｇの割合（％）（ｄ、上）、Ｔｒｅｇの絶対数（ｄ、下）、及びＣＤ８／Ｔｒｅｇ比（ｅ）で判定されるように、Ｌ３Ｄ１０もイピリムマブも、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスに移植された腫瘍のＴｒｅｇを枯渇させた。各群マウス７個体を含む２つの実験からの要約データを（ｄ）（上部パネル）及び（ｅ）に示す。Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスの腫瘍内のＦｏｘｐ３＋細胞（ｄ、下部パネル）数を、３回目の抗体処置後３日目にフローサイトメトリーでカウントした。各群ｎ＝５。統計分析は、テューキーの多重比較検定を使用した通常の一元配置分散分析によって行った。  （ｆ）Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害は、腫瘍浸潤ＣＤ４（左）又はＣＤ８（右）Ｔ細胞のＩＦＮγ産生細胞の増加には寄与しない。要約データは、各群マウス７個体を含む２回の実験からのものである。１３〜１６日にコラゲナーゼで消化したマウス腫瘍の単一細胞懸濁液を調製し、ゴルジ阻害薬の存在下で４時間培養し、細胞内サイトカインを染色した。  （ｇ）〜（ｊ）どちらの抗体もＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害しないＣｔｌａ４ｈ／ｍマウスでは、Ｌ３Ｄ１０とイピリムマブはいずれも強力な腫瘍拒絶反応及び腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇を引き起こす。マウス及びヒトのＣＴＬＡ４をいずれも発現するヘテロ接合型マウスを使用した以外は、（ａ）の場合と同様とした。  （ｇ）及び（ｈ）  高用量の抗体投与（ｇ、１００μｇ／マウス／注射）及び低用量の抗体投与（ｈ、１０μｇ／マウス／注射）はいずれも効果的な治療効果を示した。  （ｇ）イピリムマブ  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＜０．０００１；Ｌ３Ｄ１０  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＜０．０００１；イピリムマブ  ｖｓ．  Ｌ３Ｄ１０：Ｐ＝０．４９７０。データは独立した５回の実験を代表するものである。Ｔｒｅｇは、Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスの腫瘍（ｉ）では選択的に枯渇したが、脾臓（ｊ）では枯渇せず、どちらの抗体もｉｎ  ｖｉｖｏでＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を有意に阻害しなかった。  （ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、及び（ｉ）に示されているデータ（平均±ＳＥＭ）は、腫瘍細胞チャレンジから１８日後（実験１）又は２０日後（実験２）、及び矢印に示す３回又は４回の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ処置の開始後１１日後又は１３日後におけるＴｒｅｇの割合（％）である。  （ｃ）〜（ｆ）及び（ｉ）〜（ｊ）における統計的有意性はマン・ホイットニー検定を使用して決定した。  （ｋ）抗ＦｃＲ  ｍＡｂの投与は、イピリムマブの治療効果を抑制した。５×１０５個のＭＣ３８腫瘍細胞をＣｔｌａ４ｈ／ｈマウスに注入（皮下注射）した。図に示すように、７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目に、イピリムマブ３０μｇ単独、イピリムマブ３０μｇ＋１ｍｇの２．４Ｇ２（赤い矢印）、又はコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃでマウスを処置（腹腔内投与）した。統計分析は、二元配置反復測定分散分析（処置×時間）によって行った。イピリムマブ  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．０００３；イピリムマブ＋２．４Ｇ２  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．６９６２；イピリムマブ＋２．４Ｇ２  ｖｓ．  イピリムマブ：Ｐ＝０．０２５９。
【００３７】
【図１３】ＣＴＬＡ４は腫瘍浸潤Ｔｒｅｇに発現している。  （ａ）腫瘍由来のＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇでは、Ｆｏｘｐ３陰性ＣＤ４  Ｔ細胞よりもＣＴＬＡ４の発現が高かった。図１２に示すように、ＭＣ３８腫瘍細胞をＣｔｌａ４ｈ／ｈマウス又はＣｔｌａ４ｈ／ｍマウスに注射し、７日目、１０日目、及び１３日目にマウスを１投与あたり１００μｇのコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃ又は抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで処置した。３回目の抗体処置の５日後、マウスを安楽死させ、腫瘍細胞を、腫瘍浸潤ＣＤ４５＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ及びＣＤ４５＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞におけるヒトＣＴＬＡ４又はマウスＣｔｌａ４発現のフローサイトメトリー分析に供した  。データは３つの独立した実験のうちの１つの結果を表す。  （ｂ）及び（ｃ）  腫瘍由来のＴｒｅｇは、脾臓由来のものよりも、表面ＣＴＬＡ４及び総ＣＴＬＡ４の両方の発現が高かった。図１２に示すように、ＭＣ３８腫瘍接種の１４日後、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスを安楽死させ、脾臓及び腫瘍由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇにおける表面ＣＴＬＡ４（ｂ）及び総ＣＴＬＡ４（ｃ）発現のフローサイトメトリー分析に供した。ヒストグラムのプロットの各線は１個体のマウスを示す（ｎ＝６）。示されているデータは少なくとも３つの独立した実験のうちの１つの結果を表す。
【００３８】
【図１４】脾臓及び腫瘍のＴ細胞におけるＩＦＮγ及びＴＮＦα産生に対する抗ｈＣＴＬＡ４  ｍＡｂの効果。  図１２（ａ）に示すように、ＭＣ３８腫瘍細胞をＣｔｌａ４ｈ／ｈマウスに注射し、７日目、１０日目、及び１３日目にマウスを１投与あたり１００μｇのコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃ又は抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで処置した。３回目の抗体処置から３日後、マウスを安楽死させ、処置マウスの腫瘍（ａ、ｂ）及び脾臓（ｃ〜ｆ）内のＣＤ４  Ｔ細胞（ａ、ｃ、ｅ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（ｂ、ｄ、ｆ）におけるＩＦＮγ発現細胞及びＴＮＦα発現細胞の発生頻度を分析した。要約データは、各群マウス７個体を含む２回の実験からのものである。
【００３９】
【図１５】阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）活性を失ったヒト化Ｌ３Ｄ１０抗体の子孫（ＨＬ１２及びＨＬ３２）は、局所的なＴｒｅｇ枯渇及び腫瘍拒絶に対して有効性を維持している。  （ａ）１μｇ／ｍＬの固定化されたポリヒスチジンタグ付きＣＴＬＡ４に対する、ＨＬ１２、ＨＬ３２、及びＬ３Ｄ１０の結合活性。  （ｂ）ＨＬ１２及びＨＬ３２は、Ｂ７−１−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害できなかった。Ｂ７−１−Ｆｃを０．５μｇ／ｍＬの濃度で固定化した。０．２５μｇ／ｍＬのビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃを段階的濃度の抗−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂと共に添加した。  （ｃ）ＨＬ１２及びＨＬ３２は、Ｂ７−２−ＣＴＬＡ４相互作用をほとんど阻害できなかった。Ｂ７−２−Ｆｃを固定化した以外は、（ｂ）の場合と同様とした。  （ｄ）ＨＬ１２及びＨＬ３２は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢ７−１及びＢ７−２をアップレギュレートできなかった。図８に示すように、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスに、５００μｇ／マウス／注射のコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃ又は抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを投与した。翌日、脾臓細胞を回収して、図８に詳述されるように、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ  ＤＣにおけるＢ７−１及びＢ７−２のレベルを測定した。各群ｎ＝３。  （ｅ）〜（ｇ）Ｌ３Ｄ１０と同様に、ＨＬ１２及びＨＬ３２は、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスの腫瘍微小環境において、Ｔｒｅｇの選択的枯渇を示した。図１２に示すように、Ｌ３Ｄ１０、ＨＬ１２、及びＨＬ３２は、腫瘍（ｅ）で同等の効率的なＴｒｅｇ枯渇を誘発したが、脾臓（ｆ）及び腫瘍流入領域リンパ節（ｇ）ではＴｒｅｇを枯渇させなかった。示されているデータは２回の実験からプールした。各群ｎ＝マウス５個体。示された薬剤１００μｇを１回注射した１日後にマウスを安楽死させた。  （ｈ）イピリムマブ、並びにヒト化Ｌ３Ｄ１０抗体ＨＬ１２及びＨＬ３２によるＭＣ３８腫瘍の効率的な拒絶。ＭＣ３８担持マウスを、腫瘍細胞の接種から７日、１０日、１３日、及び１６日後に、１００μｇのコントロールＩｇＧ−Ｆｃ、イピリムマブ、ＨＬ１２、又はＨＬ３２で処置した。示されているデータは平均値及びＳＥＭである。各群ｎ＝マウス６個体。統計分析は、二元配置反復測定分散分析（処置×時間）によって行った。イピリムマブ  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．０３４；ＨＬ１２  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．０３７；ＨＬ３２  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．０３３６；ＨＬ１２  ｖｓ．  イピリムマブ：Ｐ＝０．９０２１；ＨＬ３２  ｖｓ．  イピリムマブ：Ｐ＝０．９９７２；ＨＬ３２  ｖｓ．  ＨＬ１２：Ｐ＝０．７２５０。  （ｉ）ＨＬ３２及びＬ３Ｄ１０は、最小限の疾患モデルでＢ１６腫瘍細胞の処置に比較的効果的である。１×１０５個のＢ１６腫瘍細胞をＣｔｌａ４ｈ／ｈマウス（ｎ＝４〜５）に注射し（皮下注射）、２日目、５日目、及び８日目にマウスを２５０μｇのイピリムマブ、Ｌ３Ｄ１０、ＨＬ３２、又はコントロールＩｇＧ−Ｆｃで処置した（腹腔内投与）。ＨＬ３２  ｖｓ．  ｈＩｇＧ−Ｆｃ：Ｐ＝０．０００２；Ｌ３Ｄ１０  ｖｓ．  ＨＬ３２：Ｐ＝０．９９９８；イピリムマブ  ｖｓ．  ＨＬ３２：Ｐ＝０．８８９９。データは各群マウス５〜６個体の平均値±ＳＥＭを表す。
【００４０】
【図１６】ＨＬ１２及びＨＬ３２は、ＣＴＬＡ４−Ｂ７相互作用を阻害できないにもかかわらず、末梢リンパ器官及び腫瘍のＴ細胞サブポピュレーションの量に対してＬ３Ｄ１０と同様の効果を示す。  （ａ）固定化ＣＴＬＡ４−Ｆｃへの可溶性Ｂ７の結合を阻害するＨＬ１２及びＨＬ３２の能力は失われていた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、ｈＣＴＬＡ４−Ｉｇを０．２５μｇ／ｍＬの濃度で固定化した。所定の用量の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（Ｌ３Ｄ１０、ＨＬ１２、及びＨＬ３２）又はコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃと共に、ビオチン化ｈＢ７−１−Ｆｃを０．２５μｇ／ｍＬで添加した。洗浄後、プレートに結合したビオチン化ｈＢ７−１−ＦｃをＨＲＰ結合アビジンで検出した。示されているデータは、３連の４５０ｎｍの光学濃度（ＯＤ）の平均である。結果は独立した３回の実験を代表するものである。  （ｂ）及び（ｃ）  Ｌ３Ｄ１０と同様に、ＨＬ１２及びＨＬ３２は優先的に腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを排除する。図１２（ｅ）〜（ｇ）に示すように、腫瘍、脾臓、及び腫瘍流入領域リンパ節（ｄＬＮ）におけるＣＤ８  Ｔ細胞（上段）、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−  Ｔ細胞（中段）、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ（下段）の発生頻度（ｂ）及び数（ｃ）を分析した。まず生存ＣＤ４５＋白血球をゲーティングし、様々な組織におけるＴ細胞サブポピュレーションの発生頻度を定量化し（Ｔサブセット／ＣＤ４５＋細胞×１００％）、腫瘍のＴ細胞サブポピュレーションの数を腫瘍重量（グラム）に対して正規化した。示されている薬剤１００μｇを１回注射した１日後にマウスを安楽死させた。示されているデータは２回の実験からプールした。各群ｎ＝マウス５個体。
【００４１】
【図１７】イピリムマブの治療効果は、ＣＴＬＡ４−Ｂ７の負のシグナル伝達を阻害することによって達成されるのではない。  （ａ）抗Ｂ７  ｍＡｂの阻害活性の確認。マウスＢ７−１又はＢ７−２を発現するＣＨＯ細胞を、抗体（２０μｇ／ｍＬ）とビオチン化ヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ）の混合物と１時間インキュベートした。非結合タンパク質を洗い流した後、ＰＥ結合ストレプトアビジンによって細胞表面ＣＴＬＡ４−Ｆｃを検出し、フローサイトメトリーによって測定した。示されているデータは代表的なＦＡＣＳプロファイルであり、２回反復されたものである。  （ｂ）実験デザインの概略。ＭＣ３８腫瘍担持Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスに、コントロールＩｇ又はイピリムマブのいずれかと組み合わせて抗Ｂ７−１抗体及び抗Ｂ７−２抗体を投与し（３００μｇ／マウス／注射、３日に１回、合計３回の注射）、抗Ｂ７−１及び抗Ｂ７−２なしでイピリムマブを投与したマウスは腫瘍拒絶の陽性コントロールとして使用した。  （ｃ）及び（ｄ）（ｂ）に図示する抗体処置によるＢ７−１及びＢ７−２の飽和。１３日目の最後の抗Ｂ７処置の２４時間後に、ＦＩＴＣ結合抗Ｂ７−１  ｍＡｂ及び抗Ｂ７−２  ｍＡｂでＰＢＬを染色した。Ｃｄ８０−／−Ｃｄ８６−／−マウスのＰＢＬを陰性コントロールとして使用した。  （ｅ）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢ７−２の完全な阻害。ＭＣ３８担持マウスの腫瘍流入領域リンパ節の単一細胞懸濁液からＣＤ４５＋白血球をゲーティングして使用したこと以外は、（ｃ）及び（ｄ）の場合と同様とした。上部パネルはＢ７−２染色のプロファイルを示し、下部パネルは平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。本試験を３回繰り返した。  （ｆ）抗体応答の消失により、抗Ｂ７−１  ｍＡｂ及び抗Ｂ７−２  ｍＡｂによるＢ７の機能的阻害が確認された。腫瘍チャレンジ後２２日目に血清を採取し、抗ヒトＩｇＧ抗体応答を評価した。  （ｇ）抗Ｂ７−１  ｍＡｂ及び抗Ｂ７−２  ｍＡｂによる飽和阻害は、イピリムマブの免疫療法効果に影響しなかった。（ｇ）に示すデータは経時的な腫瘍体積であり、２回の反復により同様の結果が得られた。  （ｄ）〜（ｇ）のデータは平均±ＳＥＭを表し、ｎ．ｓ．は有意差なしを示す。
【００４２】
【図１８】抗Ｂ７  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ処置は、イピリムマブを介したＴ細胞の活性化及びＣＤ８  Ｔ細胞の新規プライミングを防ぐ。  （ａ）抗Ｂ７−１（１Ｇ１０）ｍＡｂ及び抗Ｂ７−２（ＧＬ１）ｍＡｂによるＢ７の機能的阻害により、イピリムマブ誘発性のＣＤ４  Ｔ細胞活性化が妨げられた。ＭＣ３８腫瘍担持Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウス（各群ｎ＝５）に、ｈＩｇＧ−Ｆｃ（１００μｇ／マウス／注射）、イピリムマブ（１００μｇ／マウス／注射）、又はイピリムマブ＋抗ｍＢ７  ｍＡｂ（３００μｇの１Ｇ１０＋３００μｇのＧＬ１／マウス／注射）を７日目、１０日目、及び１３日目に腹腔内投与し、１４日目に安楽死させた。性別及び年齢をマッチさせた無腫瘍Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスを、コントロールのナイーブマウスとして使用した。これらのマウスの脾臓Ｔ細胞をＭＡＣＳ陰性選択により精製し、１０μｇ／ｍＬのｈＩｇＧ−Ｆｃの存在下でナイーブ脾臓樹状細胞と共に４日間共培養した。サイトカインビーズアッセイ（ＣＢＡ）により、上清中のＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０を含む）のレベルを定量化した。  （ｂ）及び（ｃ）  抗Ｂ７  ｍＡｂは、イピリムマブ誘発性の抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞のプライミングを妨げた。全てのマウス（各群ｎ＝４）を、８日目に１００μＬの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した５０μｇのＳＩＹペプチドで皮下的に免疫した以外は、（ａ）の場合と同様とした。１５日目にマウスを安楽死させ、腫瘍流入領域リンパ節を採取して、テトラマー染色によりＳＩＹ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４−細胞でゲーティング）を評価した。コントロール染色にはＯＶＡテトラマーを使用した。代表的なＦＡＣＳプロファイル（ｂ）及び要約データ（ｃ）を示す。データは同様の結果である独立した２回の実験を代表するものである。
【００４３】
【図１９】一般的に使用される抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂである９Ｈ１０及び９Ｄ９の阻害活性の評価。  （ａ）及び（ｂ）  Ｂ７−１（ａ）及びＢ７−２（ｂ）がプレートにコーティングされている場合、９Ｈ１０はＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害しない。所定の濃度のコントロールＩｇＧ又は抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂ  ９Ｄ９及び９Ｈ１０の存在下で、ビオチン化マウスＣｔｌａ４−Ｆｃ融合タンパク質をＢ７コーティングプレートでインキュベートした。示されているデータは２連のウェルの平均であり、２つの独立した実験を代表するものである。  （ｃ）及び（ｄ）  ９Ｄ９及び９Ｈ１０は、可溶性Ｃｔｌａ４−Ｆｃ（ｃ）及びプレート結合Ｃｔｌａ４−Ｆｃ（ｄ）に対して異なる結合能を示す。ＭＰＣ−１１（マウスＩｇＧ２ｂ）及びハムスターＩｇＧ（Ｈａｍ  ＩｇＧ）は、アイソタイプが一致したコントロールＩｇタンパク質である。示されているデータは２連のウェルの平均であり、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。  （ｅ）及び（ｆ）  ＷＴ（Ｃｔｌａ４ｍ／ｍ）マウスの脾臓ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ樹状細胞におけるＢ７−１（ｅ）及びＢ７−２（ｆ）のレベルのアップレギュレーションに対する、抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂである９Ｄ９及び９Ｈ１０の異なる効果。５００μｇの抗体を用いて処置後２４時間で、マウスを安楽死させ、直ちに脾臓細胞を回収してフロー染色を行った。ＩｇＧ群は、５００μｇのＭＰＣ−１１及び５００μｇのＨａｍ  ＩｇＧを投与されたマウスを示す。データ（平均±ＳＥＭ）は、各群マウス３個体を含む２つの独立した実験で、各群６個体の独立したマウスから要約したものである。（ｅ）及び（ｆ）における統計的有意性はスチューデントのｔ検定を使用して決定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｎ．ｓ．有意差なし。
【００４４】
【図２０】抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂである４Ｆ１０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで異なる阻害活性。  （ａ）及び（ｂ）  プレートコーティングされたＢ７−１（ａ）又はＢ７−２（ｂ）へのＣｔｌａ４−Ｆｃの相互作用に対する４Ｆ１０の効果。所定の濃度のコントロールＩｇＧ又は抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂである４Ｆ１０の存在下で、ビオチン化マウスＣｔｌａ４−Ｆｃ融合タンパク質をＢ７コーティングプレートでインキュベートした。ＨＲＰ結合アビジンでＣｔｌａ４−Ｆｃの結合を検出した。示されているデータは２連の平均であり、２つの独立した実験を代表するものである。  （ｃ）及び（ｄ）  ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ樹状細胞上のＢ７−１及びＢ７−２発現に対する４Ｆ１０の影響。５００μｇの４Ｆ１０又はｈＩｇＧ−Ｆｃを腹腔内投与したＷＴ（Ｃｔｌａ４ｍ／ｍ）マウスの脾臓細胞に対して、フローサイトメトリーによりＢ７レベルを分析した。Ｂ７−１（ｃ）及びＢ７−２（ｄ）レベルの要約データ（平均±ＳＥＭ）は、各群マウス６個体からのものである。コントロールＩｇＧ処置群のＢ７レベルは、人為的に１００と定義する。
【００４５】
【図２１】Ｌ３Ｄ１０及びイピリムマブは同等の抗腫瘍活性を示した。ＭＣ３８腫瘍担持Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウス（ｎ＝５）に、７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目にコントロールｈＩｇ、イピリムマブ、又はＬ３Ｄ１０（３０μｇ／注射×４）を投与した。腫瘍増殖を３日ごとに測定した。データは平均±ＳＥＭであり、３回を超えて再現された。統計的有意性は、ボンフェローニの多重比較検定を使用した二元配置反復測定分散分析によって分析した。ｈＩｇ  ｖｓ．  イピリムマブ：Ｐ＝０．０３３５；ｈＩｇ  ｖｓ．  Ｌ３Ｄ１０：Ｐ＝０．０２４８；イピリムマブ  ｖｓ．  Ｌ３Ｄ１０：Ｐ＝０．６９２８。
【００４６】
【図２２】担腫瘍新生仔マウス及び担腫瘍成体マウスのＴｒｅｇは、ナイーブ成体マウスよりも高いレベルのＣＴＬＡ４分子を発現する。  （Ａ）新生仔マウス（１０日齢の雄マウス、灰色の線）と成体マウス（２〜３ヶ月齢の雄のマウス、黒い線）との比較。示されているデータは、雄マウスの脾臓からのＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇのプロファイルである（ｎ＝３）。  （Ｂ）ナイーブ成体雄マウス（黒い線）と担腫瘍成体雄マウス（灰色の線）（３か月齢、ｎ＝６）との比較。示されているデータは、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞での総ＣＴＬＡ４の分布を示すＦＡＣＳプロファイルである。差異は統計的に有意であり、少なくとも５回再現されている。
【００４７】
【図２３】ヒトＣＴＬＡ４遺伝子ノックインマウスでは、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブ及びＬ３Ｄ１０を、単独又は抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせて使用した場合、異なる免疫療法関連有害事象を生じた：成長遅延及び赤芽球癆。  （Ａ）抗体処置及び分析のタイムライン。Ｃ５７ＢＬ／６  Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスを、それぞれ、コントロールヒトＩｇＧ−Ｆｃ、抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブ、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃキメラ  Ｌ３Ｄ１０＋ヒトＩｇＧ−Ｆｃ、抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４）＋ヒトＩｇＧ−Ｆｃ、抗ＰＤ−１＋イピリムマブ、又は抗ＰＤ−１＋Ｌ３Ｄ１０を用いて、１００μｇ／マウス／注射の用量で１０日目、１３日目、１６日目、及び１９日目に処置した。生後４１日目に全血球計算（ＣＢＣ）分析を実施し、生後４２日目に剖検を行った。ケージによる変動を避けるために、同一のケージ内のマウスに個別にタグを付け、異なる抗体で処置した。試験は二重盲検で行った。  （Ｂ）イピリムマブ＋抗ＰＤ−１による雌マウスの主要な成長遅延。イピリムマブ＋抗ＰＤ−１投与群の１匹の雌マウスは、深刻な成長遅延を伴い２２日目に死亡したため、分析から除外した。示されているデータは初回注射後の体重増加（％）の平均値及びＳＥＭである。ｈＩｇ  ｖｓ．  イピリムマブ＋抗ＰＤ−１：Ｐ＜０．０００１、Ｌ３Ｄ１０＋抗ＰＤ−１  ｖｓ．  イピリムマブ＋抗ＰＤ−１：Ｐ＝０．００３。  （Ｃ）イピリムマブ＋抗ＰＤ−１による雄マウスの主要な成長遅延。雄マウスを使用した以外は、（Ｂ）の場合と同様とした。ｈＩｇ  ｖｓ．  イピリムマブ＋抗ＰＤ−１：Ｐ＝０．０１１６、Ｌ３Ｄ１０＋抗ＰＤ−１  ｖｓ．  イピリムマブ＋抗ＰＤ−１：Ｐ＝０．０１５２。使用したマウスの数は、群ラベルの横の括弧内に記載されている。  （Ｄ）〜（Ｇ）マウスモデルで免疫療法関連有害事象の典型的な表現型として再現された赤芽球癆。  （Ｄ）イピリムマブ＋抗ＰＤ−１併用療法は、ヘマクリット（ＨＣＴ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、及び平均赤血球容積（ＭＣＶ）を減少させた。示されているデータは、２つ〜３つの独立した実験の要約であり、各ドットはマウス１個体を表す（雄マウスは青、雌マウスは赤、各群ｎ＝マウス９〜２２個体）。  （Ｅ）骨髄における赤血球の生成障害。写真は、示されている処置を受けたマウスの骨の色の変化（上部パネル）と骨髄の紅潮（下部パネル）を示している。  （Ｆ）フローサイトメトリーによる赤血球発達の分析。示されているデータは、骨髄細胞のＴｅｒ１１９、ＣＤ７１、及び前方散乱光（ＦＳＣ−Ａ）の分布を表す代表的なＦＡＣＳプロファイルである。ステージＩ〜Ｖのゲーティング及び細胞割合（％）を示す。  （Ｇ）各発生段階における赤血球細胞の割合（％）の要約データ。示されているデータは各群３〜４個体の雌マウスでデータの平均値及びＳＥＭであり、雌雄両方のマウスで少なくとも３回反復された。  使用した統計検定：（Ｂ）及び（Ｃ）ボンフェローニの多重比較検定を使用した二元配置反復測定分散分析；（Ｄ）及び（Ｇ）ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析、及びダンの多重比較検定を使用したノンパラメトリック一元配置分散分析（クラスカル・ウォリス検定）。
【００４８】
【図２４】図２３に概説される抗体処置後の正常な血球パラメーター。示されているデータは、２つ〜３つの独立した実験の要約であり、各ドットはマウス１個体を表す（雄マウスは濃い灰色、雌マウスは明るい灰色）。ＣＢＣの結果は、ダンの多重比較検定を使用したノンパラメトリック一元配置分散分析（クラスカル・ウォリス検定）によって分析した。対比較において統計的に有意な差は見つからなかった。ＮＥ：好中球、ＷＢＣ：白血球、ＲＢＣ：赤血球、ＭＯ：単球、ＬＹ：リンパ球、ＥＯ：好酸球、ＲＤＷ：赤血球分布幅、ＰＬＴ：血小板、ＭＰＶ：平均血小板容積。
【００４９】
【図２５】イピリムマブは、抗マウスＰＤ−１と組み合わせて使用すると、心臓に異常を引き起こした。  （Ａ）抗ＰＤ−１＋イピリムマブで処置したマウスでは、身体サイズが小さくなったにもかかわらず、肉眼解剖では心肥大が見られる。左パネルの写真は、示される処置を受けたマウスのホルマリン固定された心臓であり、右パネルのデータは、体重に対して正規化した後のサイズを示している。  （Ｂ）拡大した心房及び心室、並びにこれに対応する心臓壁の薄化を示す肉眼的画像。  （Ｃ）コントロールｈＩｇ、Ｌ３Ｄ１０＋抗ＰＤ−１、又は抗ＰＤ−１＋イピリムマブで処置した心臓の組織像。上部４つのパネルは大動脈基部のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を示し、下部４つのパネルは左心室の心筋の炎症を示す。  （Ｄ）免疫組織化学（上部パネル）、及びＦＩＴＣ標識ＣＤ４又はＣＤ８、ローダミン標識抗ＣＤ３抗体又は抗Ｆｏｘｐ３抗体を使用した３色免疫蛍光染色（下部パネル）による白血球及びＴ細胞の同定。  （Ｅ）異なる処置を受けた雌雄マウス（ｎ＝５〜１２）の複合病理スコア。雄マウスのスコアを青丸で示し、雌マウスのスコアを赤丸で示す。サンプルは６つの独立した実験から採取し、二重盲検でスコア化した。  データは平均±ＳＥＭであり、ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって分析した。
【００５０】
【図２６】肉眼的解剖学及びヘマトキシリン・エオジン染色により、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１処置後の卵巣及び子宮の形成不全が示される。図２３及び図２５と同様に、剖検は生後４２日目に実施した。
【００５１】
【図２７】イピリムマブは血清中のＡＣＴＨレベルを増加させた。Ｃ５７ＢＬ／６  Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスを、それぞれコントロールヒトＩｇＧ−Ｆｃ、抗ＰＤ−１、抗ヒト  ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブ、Ｌ３Ｄ１０、ＨＬ１２、又はＨＬ３２により、１００μｇ／マウス／注射の用量で、１０日目、１３日目、１６日目、及び１９日目に処置した。出生後４２日目又は４３日目に血清を採取した。Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓｅｙ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  Ｈｏｒｍｏｎｅ（Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ社、カタログ番号ＳＥＡ８３６Ｍｕ）を使用して血清ＡＣＴＨレベルを測定した。各群ｎ＝マウス８〜１８個体。統計的有意性は、ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって分析した。
【００５２】
【図２８】イピリムマブは、単剤として又はＰＤ−１と組み合わせて使用した場合に、多臓器炎症を引き起こした。  （Ａ）様々な臓器のＨＥ染色パラフィン切片の代表的な画像。代表的な炎症病巣を矢印で示す。スケールバー：２００μｍ。  （Ｂ）内臓及び腺の毒性スコア。雄マウスのスコアを濃い灰色の丸で示し、雌マウスのスコアを明るい灰色の丸で示す。  （Ｃ）全ての臓器及び腺の複合スコア。  データは各群マウス５〜１２個体（ｎ＝５〜１２）の平均値±ＳＥＭを表す。サンプルは６つの独立した実験から採取し、二重盲検でスコア化した。データは、ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって分析した。
【００５３】
【図２９】１０日目から免疫療法薬投与を開始したマウスの全身性Ｔ細胞活性化の比較。  （Ａ）抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ４によるＣＤ４  Ｔ細胞（上部パネル）及びＣＤ８  Ｔ細胞（下部パネル）の発生頻度への軽微な影響。示されているデータは、抗体処置の開始後３２日目の脾臓のＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の割合（％）である。  （Ｂ）周産期に単剤療法及び抗ＰＤ−１＋イピリムマブの併用療法を受けたマウスのメモリー及びエフェクターＣＤ４  Ｔ細胞（上部パネル）又はＣＤ８  Ｔ細胞（下部パネル）の増加を示す代表的なＦＡＣＳプロファイル。  （Ｃ）及び（Ｄ）  示されている抗ＰＤ−１＋抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂによる併用療法を受けたマウスにおけるＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）及びＣＤ８  Ｔ細胞（Ｄ）の表現型に関する要約データ。示されているデータは、ナイーブ（左）、セントラルメモリー（中央）、エフェクターメモリー（右）の表現型を持つ細胞の割合（％）である。  示されているデータは、各群７〜１１個体の雌マウス及び２〜６個体の雄マウスを含む４つの実験から要約したものである。使用した統計検定：（Ａ）ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析；（Ｃ）及び（Ｄ）ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。
【００５４】
【図３０】イピリムマブはイピリムマブ処置マウスの脾臓におけるＴｒｅｇの発生頻度を増加させた。Ｃ５７ＢＬ／６  Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスを、コントロールヒトＩｇＧ−Ｆｃ、抗ＰＤ−１、又は抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブ若しくはＬ３Ｄ１０をそれぞれ用いて、１００μｇ／マウス／注射の用量で抗ＰＤ−１と組み合わせて１０日目、１３日目、１６日目、及び１９日目に処置した。出生後４２日目に、脾臓を採取し、フローサイトメトリーで脾臓ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇの割合を評価した。統計的有意性は、ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって分析した。
【００５５】
【図３１】抗ＰＤ−１との組み合わせたイピリムマブは自己反応性エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を優先的に増殖させた。  （Ａ）交配スキームの図。マウスは２つの工程で作製した。第一の工程は、示されているように２つの近交系間の異系交配であった。第二の工程は、Ｆ１どうしのインタークロスにより、本試験用に設計された遺伝子型（Ｈ−２ｄ＋Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ又はｈ／ｍＭｍｔｖ８＋９＋）のマウスを得るものであった。  （Ｂ）実験タイムラインの概要。  （Ｃ）抗体療法を受けたマウスからのゲーティングしたＣＤ４  Ｔ細胞間のＶβ１１、Ｖβ８、及びＦｏｘｐ３マーカーの分布を示す代表的なＦＡＣＳプロファイル。  （Ｄ）ウィルススーパー抗原（ＶＳＡｇ）反応性（Ｖβ５＋、Ｖβ１１＋、又はＶβ１２＋、上部パネル）及び非反応性（Ｖβ８＋）ＣＤ４  Ｔ細胞間のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆの組成比。  （Ｅ）胸腺細胞への影響の欠如。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−胸腺細胞を分析した以外は、（Ｄ）の場合と同様である  データは各群マウス６〜７個体（ｎ＝６〜７）の平均値及びＳＤである。
【００５６】
【図３２】イピリムマブはヒトＣＴＬＡ４に結合するがマウスＣＴＬＡ４には結合しない。示されているデータは、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウス（上）又はＣｔｌａ４ｍ／ｍマウス（下）の脾臓細胞を使用した、ゲーティングしたＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞間のＣＴＬＡ４の細胞内染色のドットプロットである。細胞内染色にはビオチン化ｈＩｇ及びイピリムマブを使用した。抗ＣＤ３  ｍＡｂ（クローン１４５−２Ｃ１１）、抗ＣＤ４  ｍＡｂ（クローンＲＭ４−５）、ＦｏｘＰ３  ｍＡｂ（クローンＦＪＫ−１６ｓ）、及びＦｏｘＰ３染色バッファーはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。
【００５７】
【図３３】ヒト化Ｌ３Ｄ１０クローンは、抗ＰＤ−１  ｍＡｂとの併用療法で使用した場合、安全性プロファイルを維持していた。  （Ａ）ヒト化Ｌ３Ｄ１０クローンであるＨＬ１２及びＨＬ３２とイピリムマブとを、周産期に使用した場合の組み合わせ毒性について比較。使用した抗体の変更を除いて、実験レジメンは図２３（Ａ）に示したものと同一であった。  （Ｂ）抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用した場合、イピリムマブは貧血を誘発したが、ヒト化Ｌ３Ｄ１０クローンであるＨＬ１２及びＨＬ３２はこれを誘発しなかった。  （Ｃ）コントロール又は免疫療法薬の所定の組み合わせのいずれかでマウスを処置した後の内臓及び腺の病理スコア。  （Ｄ）複合病理スコア。濃い灰色の円は雄マウスのスコアを表し、明るい灰色の円は使用した雌マウスのスコアを表す。全てのスコア化は二重盲検で行った。データは各群マウス５〜１２個体（ｎ＝５〜１２）の平均値±ＳＥＭを表す。サンプルは５つの独立した実験から採取し、二重盲検でスコア化した。  使用した統計検定は以下である：（Ａ）：ボンフェローニの多重比較検定を使用した反復測定分散分析；（Ｂ）：ダンの多重比較検定を使用したノンパラメトリック一元配置分散分析（クラスカル・ウォリス検定）；（Ｃ）及び（Ｄ）：ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。
【００５８】
【図３４】所定の免疫療法を受けているヒト化マウスの脾臓におけるＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞活性化の表現型。ヒト化Ｌ３Ｄ１０クローン（ＨＬ１２及びＨＬ３２）を使用したこと以外は、マウスを図２３（Ａ）に示すように処置した。示されているデータは、抗体処置開始後３２日目のＣＤ４脾臓Ｔ細胞（上部パネル）及びＣＤ８脾臓Ｔ細胞（下部パネル）の表現型の割合である。データは、各群マウス５〜１１個体（明るい灰色：雌、暗い灰色：雄）を含む３つの実験から要約したものである。統計的有意性は、ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析及びダンの多重比較検定を使用したノンパラメトリック一元配置分散分析（クラスカル・ウォリス検定）によって分析した。
【００５９】
【図３５】ＨＬ１２及びＨＬ３２の免疫療法効果のイピリムマブとの比較。  （Ａ）及び（Ｂ）  ＭＣ３８担持Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウス（ｎ＝５）に、７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目に、３０μｇ（Ａ）又は１０μｇ（Ｂ）のコントロールｈＩｇ、イピリムマブ、ＨＬ１２、又はＨＬ３２のいずれかを腹腔内投与した。  （Ｃ）及び（Ｄ）  ＣＴ２６担持Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウス（ｎ＝６〜１０）に、７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目に１５０μｇ（Ｃ）又は１００μｇ（Ｄ）のコントロールＩｇ、イピリムマブ、ＨＬ１２、又はＨＬ３２のいずれかを腹腔内投与した。  （Ｅ）及び（Ｆ）  Ｂ１６担持Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウス（ｎ＝５〜６）に、２５０μｇのコントロールＩｇ、イピリムマブ、ＨＬ１２（Ｅ）、又はＨＬ３２（Ｆ）を腹腔内投与した。  データは平均±ＳＥＭであり、ボンフェローニの多重比較検定を使用した二元配置分散分析によって分析した。全ての設定において、ＨＬ１２及びＨＬ３２は、コントロールｈＩｇＧと比較して統計的に有意な腫瘍拒絶を誘発した：ＨＬ１２（（Ａ）Ｐ＝０．００２３、（Ｂ）Ｐ＝０．０１０５、（Ｃ）Ｐ＜０．０００１、（Ｄ）Ｐ＝０．０２７２、（Ｅ）Ｐ＜０．０００１）；ＨＬ３２（（Ａ）Ｐ＝０．００４、（Ｂ）Ｐ＝０．００５９、（Ｃ）Ｐ＜０．０００１、（Ｄ）Ｐ＝０．０２５９、（Ｆ）Ｐ＝０．１００３）。イピリムマブによって誘発された腫瘍拒絶も、（Ｃ）の１つの設定を除いて全てで有意であった（（Ａ）Ｐ＝０．００２６、（Ｂ）Ｐ＝０．０２３１、（Ｃ）Ｐ＝０．２、（Ｄ）Ｐ＝０．０００３、（Ｅ）Ｐ＝０．０１４５、（Ｆ）Ｐ＝０．０２３４）。異なる治療用抗体の違いに統計的有意差は見られなかった。
【００６０】
【図３６】Ｃ５７ＢＬ／６．Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスで明らかにされた、免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果の異なる遺伝的要件。  （Ａ）〜（Ｃ）  免疫療法関連有害事象の評価。所定の遺伝子型の雌マウス（ｎ＝５）を、周産期に、コントロールヒトＩｇＧ（ｈＩｇ）又は抗ＰＤ−１＋イピリムマブで処置し、６週齢時点の体重増加、炎症、及び赤血球貧血について評価した。  （Ａ）イピリムマブ＋抗ＰＤ−１の組み合わせはＣｔｌａ４ｈ／ｈで成長遅延を誘発したが、Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスではこれが誘発されなかった。  （Ｂ）イピリムマブ＋抗ＰＤ−１は、一部のマウスの唾液腺における軽度の誘発を除いて、ヘテロ接合型マウスの内臓で炎症を誘発しなかった。  （Ｃ）イピリムマブ＋抗ＰＤ−１は、ヘテロ接合型マウスで赤血球貧血を誘発しなかった。  （Ｄ）イピリムマブによる効果的な腫瘍拒絶。担腫瘍Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ及びＣｔｌａ４ｈ／ｍマウスを、７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目に、コントロールｈＩｇ又はイピリムマブ（１００μｇ／注射×４）のいずれかで処置した。腫瘍増殖を３日ごとに測定した。データは平均±ＳＥＭであり、示された全てのデータは２回再現された。  （Ｅ）イピリムマブ＋抗ＰＤ−１は、Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスで全身性Ｔ細胞活性化を引き起こさなかった。ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの分布を表す代表的なＦＡＣＳプロファイルを左側に示し、要約データを右側に示す。  （Ａ）及び（Ｄ）のデータはボンフェローニの多重比較検定を使用した二元配置反復測定分散分析によって分析した。一方、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）は、対応のない両側スチューデントのｔ検定によって分析した。
【００６１】
【図３７】６〜７週齢の若年成体担腫瘍マウス及び１０日齢の担腫瘍マウスにおける免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果。  （Ａ）〜（Ｃ）ＭＣ３８担持若年雄マウス（７週齢）にＭＣ３８腫瘍細胞を接種し、腫瘍細胞チャレンジ後７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目にコントロールｈＩｇＧ、イピリムマブ、ＨＬ１２、又はＨＬ３２（１００μｇ／注射×４）で処置した。  （Ａ）経時的腫瘍体積。  （Ｂ）腫瘍チャレンジ後２５日目の血清ＴＮＮＩ３レベルをＥＬＩＳＡで測定した。  （Ｃ）ＨＥ染色により、心筋のヒアリン化及び炎症が示される。スケールバー：１００μｍ。  （Ｄ）及び（Ｅ）  ＭＣ３８担持若年雄マウス（６週齢）にＭＣ３８腫瘍細胞を接種し、腫瘍細胞チャレンジ後７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目にコントロールｈＩｇＧ、イピリムマブ、又はイピリムマブ＋抗ＰＤ−１（１００μｇ／注射×４）で処置した。  （Ｄ）経時的腫瘍体積。  （Ｅ）腫瘍チャレンジ後２５日目の血清ＴＮＮＩ３レベルをＥＬＩＳＡで測定した。  （Ｆ）１０日齢のマウスをＭＣ３８腫瘍チャレンジに供し、１４日齢、１７日齢、２０日齢、及び２３日齢で免疫療法を開始し、経時的な腫瘍サイズを示した。データは平均±ＳＥＭであり、ボンフェローニの多重比較検定を使用した二元配置反復測定分散分析によって分析した。ｈＩｇ  ｖｓ．  イピリムマブ又はイピリムマブ＋抗ＰＤ−１：Ｐ＜０．０００１；イピリムマブ  ｖｓ．  イピリムマブ＋抗ＰＤ−１：有意差なし。  （Ｇ）併用療法及び単剤療法は多臓器炎症を誘発した。唾液腺及び肺からの代表的なＨＥ染色切片を示す。スケールバー：１００μｍ。  （Ｂ）及び（Ｅ）データは平均±ＳＥＭである。統計的有意性を分析した。
【００６２】
【図３８】ナイーブＴ細胞の消失及びエフェクターメモリーＴ細胞の増加が多臓器炎症と相関している。示されているデータは、図１６、図２５、図２８、図２９、及び図３３に示したデータの再分析である。ナイーブＴ細胞：ＣＤ４４ＬｏＣＤ６２ＬＨｉ、セントラルメモリーＴ細胞：ＣＤ４４ＨｉＣＤ６２ＬＨｉ、エフェクターメモリーＴ細胞：ＣＤ４４ＨｉＣＤ６２ＬＬｏ。線形回帰の相関係数及びＰ値は、ピアソンの方法で計算した。
【００６３】
【図３９】イピリムマブは担腫瘍マウスに軽度の腎機能異常を誘発した。ＭＣ３８担持マウスを、７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目に、１００μｇ／注射／マウスで３回又は４回処置した。腫瘍接種後１８〜２５日目に血清を採取した。  （Ａ）１８〜２０日目のＭＣ３８担持ｈＣＴＬＡ４−ＫＩマウスの血清中のクレアチニン及び尿素窒素（ＢＵＮ）のレベル（赤：雌、青：雄）。  （Ｂ）腫瘍接種後２５日目のＭＣ３８担持ｈＣＴＬＡ４−ＫＩマウス（全て雄）の血清中のクレアチニン及びＢＵＮのレベル。  クレアチニンレベルは、クレアチニン（血清）比色アッセイキット（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  （ｓｅｒｕｍ）  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）又はクレアチニン（ＣＲＥＡ）キット（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  （ＣＲＥＡ）  Ｋｉｔ、ＲＡＮＤＯＸ社、カタログ番号ＣＲ２３３６）を使用して測定した。血清ＢＵＮレベルは、尿素窒素ダイレクトキット（ＵＲＥＡ  ＮＩＴＲＯＧＥＮ  ＤＩＲＥＣＴ  Ｋｉｔ、Ｓｔａｎｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を使用して測定した。統計的有意性はスチューデントのｔ検定によって決定した。
【００６４】
【図４０】複合病理スコアに基づくと、ヒト化はＬ３Ｄ１０の安全性をさらに向上させる。濃い灰色のドットは雄マウスのスコアを表し、明るい灰色のドットは使用した雌マウスのスコアを表す。全てのスコア化は二重盲検で行った。データは各群マウス９個体（ｎ＝９）の平均値±ＳＥＭである。統計的有意性は、ボンフェローニの多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって判定した。
【００６５】
【図４１】免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果の原因となる異なるメカニズム。  （Ａ）免疫療法関連有害事象は、自己反応性Ｔ細胞が自己反応性Ｔｒｅｇへ変換されることを阻害することによって引き起こされ、これは末梢リンパ器官の自己反応性Ｔ細胞のポリクローナル増殖を引き起こす。  （Ｂ）腫瘍拒絶は、腫瘍微小環境におけるＦｃＲ媒介性のＴｒｅｇ枯渇によって達成され、末梢リンパ器官におけるナイーブＴ細胞活性化とは無関係である。免疫療法関連有害事象もがん免疫療法効果も、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害に依存しない。
【００６６】
【図４２Ａ】臨床的抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブは、細胞表面ＣＴＬＡ４のダウンレギュレーションを誘発する。  （Ａ）及び（Ｂ）  オレンジ色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）でタグ付けしたヒトＣＴＬＡ４分子でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、コントロールＩｇＧ又はイピリムマブ（ＩＰ）とともに４時間インキュベートした。  （Ａ）フローサイトメトリーによってＯＦＰの蛍光を検出した。  （Ｂ）シクロヘキシミド（ＣＨＸ）の存在下又は非存在下で、（Ａ）のＣＴＬＡ４のタンパク質レベルをウエスタンブロットで分析した。  （Ｃ）飽和用量のイピリムマブの存在下でも細胞表面ＣＴＬＡ４に強力に結合する市販の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（ＢＮＩ３）で染色することにより、（Ａ）の細胞表面ＣＴＬＡ４を試験した。  （Ｄ）（Ａ）の細胞膜タンパク質を単離し、ウエスタンブロットにより表面ＣＴＬＡ４を検出した。  （Ｅ）ヒトＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ安定発現細胞系を、コントロールＩｇＧ又はイピリムマブ（ＩＰ）のいずれかで４時間処置した。ＣＴＬＡ４のタンパク質レベルをウエスタンブロットで分析した。  （Ｆ）フローサイトメトリーによって（Ｅ）の細胞表面ＣＴＬＡ４を試験した。  （Ｇ）（Ｅ）の細胞膜タンパク質を単離し、ウエスタンブロットにより表面ＣＴＬＡ４を検出した。  （Ｈ）Ｃ５７ＢＬ／６  Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ−ＫＩマウスでＭＣ３８マウス大腸がんモデルを誘発した。腫瘍細胞をコラゲナーゼ消化によって単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでコントロールＩｇＧ又はイピリムマブ（ＩＰ）で４時間処置した。腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの表面及び細胞内ＣＴＬＡ４をフローサイトメトリーで試験した。  （Ｉ）ＭＣ３８担持Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスを、腫瘍接種後１４日目に１６時間、１００μｇのコントロールＩｇＧ又はイピリムマブ（ＩＰ）で腹腔内処置した。腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの表面及び細胞内ＣＴＬＡ４をフローサイトメトリーで試験した。  （Ｃ）及び（Ｈ）の結果は３連である（平均±ＳＥＭ）。（Ｉ）のデータは平均±ＳＥＭ（ｎ＝８）である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。対応のない両側スチューデントのｔ検定。
【図４２Ｂ】同上。
【図４２Ｃ】同上。
【図４２Ｄ】同上。
【図４２Ｅ】同上。
【図４２Ｆ】同上。
【図４２Ｇ】同上。
【図４２Ｈ】同上。
【図４２Ｉ】同上。
【００６７】
【図４３Ａ】免疫療法関連有害作用（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｆｆｅｃｔ；ｉｒＡＥ）モデル及び活性化ヒトＴｒｅｇにおいて、イピリムマブは細胞表面ＣＴＬＡ４のダウンレギュレーションを誘発する。  （Ａ）ＣＴＬＡ４ｈ／ｈ−ＫＩ新生仔マウス（ｎ＝５）を抗ＰＤ−１（１００μｇ）で２４時間又は４８時間腹腔内処置した。その後、マウスを１００μｇのコントロールＩｇＧ又はイピリムマブでさらに４時間腹腔内処置した。肺及び脾臓Ｔｒｅｇの表面及び細胞内ＣＴＬＡ４をフローサイトメトリーで評価した。  （Ｂ）及び（Ｃ）  健康なドナーの血液からのヒトＰＢＭＣを抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で２日間刺激し、コントロールＩｇＧ又はイピリムマブ（ＩＰ）で４時間処置した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３−  非Ｔｒｅｇの表面ＣＴＬＡ４をフローサイトメトリーで測定した（図４３Ｂ）。図４３Ｃに、４人の健康ドナーからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの分析を示す。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．００１。対応のない両側スチューデントのｔ検定。
【図４３Ｂ】同上。
【図４３Ｃ】同上。
【００６８】
【図４４Ａ】抗体誘導性の表面ＣＴＬＡ４のダウンレギュレーションは免疫療法関連有害作用（ｉｒＡＥ）の原因となる。  （Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６  Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ新生仔マウスを、コントロールヒトＩｇＧ＋抗ＰＤ−１、トレメリムマブ（ＩｇＧ１）＋抗ＰＤ−１、又はＨＬ１２＋抗ＰＤ−１をそれぞれ用いて、１００μｇ／マウス／注射の用量で、１０日齢、１３日齢、１６日齢、及び１９日齢で処置した。異なる処置における体重増加を示す。トレメリムマブ（ＩｇＧ１）＋抗ＰＤ１投与群の１匹のマウスは、深刻な成長遅延を伴い１８日齢で死亡したため、分析から除外した。示されているデータは初回注射後の体重増加（％）の平均値及びＳＥＭである。  （Ｂ）出生後４１日目に（Ａ）のマウスからの血液のＣＢＣ分析を行った。血液ヘマトクリット（ＨＣＴ）、総ヘモグロビン（Ｈｂ）、及び平均赤血球容積（ＭＣＶ）のデータを示す。  （Ｃ）ＭＣ３８担持Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウス（ｎ＝５）を、腫瘍接種後７日目、１０日目、１３日目、及び１６日目に、コントロールＩｇ（１００μｇ）又はトレメリムマブ（ＩｇＧ１）（１μｇ、３０μｇ、又は１００μｇ）で腹腔内処置した。示されている腫瘍体積は初回注射後の体重増加（％）の平均値及びＳＥＭである。  （Ｄ）ｈＣＴＬＡ４をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、コントロールＩｇＧ、イピリムマブ、トレメリムマブ（ＩｇＧ１）、ＨＬ１２、又はＨＬ３２のいずれかとともに４時間インキュベートした。ＣＴＬＡ４のタンパク質レベルをウエスタンブロットで分析した。  （Ｅ）ｈＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ安定発現細胞系を、イピリムマブ、トレメリムマブ（ＩｇＧ１）、ＨＬ１２、又はＨＬ３２で４℃／３７℃で２時間処置した。未結合の抗体を洗い流した後、抗ｈＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ４８８により４℃で３０分表面ＣＴＬＡ４を検出し、フローサイトメトリーによって分析した。４℃でＡｌｅｘａ４８８蛍光を差し引いて正規化した後、示されている表面ＣＴＬＡ４の蛍光強度は３連である（平均＋ＳＥＭ）。＊Ｐ＜０．０５、対応のない両側ｔ検定。  （Ｆ）ｈＣＴＬＡ４でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、コントロールＩｇＧ、イピリムマブ、又はＨＬ１２とともに４時間インキュベートした。細胞膜タンパク質を単離し、ウエスタンブロットにより表面ＣＴＬＡ４を検出した。  （Ｇ）Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ−ＫＩ新生仔マウス（ｎ＝６）を抗ＰＤ−１（１００μｇ）で腹腔内処置した。２４時間後、１００μｇのコントロールＩｇＧ、イピリムマブ、又はＨＬ１２でマウスをさらに４時間腹腔内処置した。肺及び脾臓Ｔｒｅｇにおける表面及び細胞内ＣＴＬＡ４をフローサイトメトリーで評価した。ＨＬ１２はＢＩＮ３とＣＴＬＡ４との結合を阻害するため、ＨＬ１２群とコントロール群とを比較する際、ＢＮＩ３クローンによるＣＴＬＡ４染色前に飽和用量のＨＬ１２を追加した。  （Ｈ）ＨＬ１２とＣＴＬＡ４との結合を阻害しない別の市販の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（ｅＢｉｏ２０Ａ）で細胞を染色することにより、（Ｇ）におけるＨＬ１２の処置を評価した。  （Ｉ）健康なドナーの血液からのヒトＰＢＭＣを抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で２日間刺激し、コントロールＩｇＧ、イピリムマブ（ＩＰ）、又はＨＬ１２で４時間処置した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇの表面ＣＴＬＡ４をフローサイトメトリーで測定した。コントロール群とイピリムマブ群との比較には抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（ＢＮＩ３）を用い、ＨＬ１２群には抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（ｅＢｉｏ２０Ａ）を用いた。  （Ｇ）及び（Ｈ）のデータは平均±ＳＥＭである。（Ｉ）の結果は３連である（平均±ＳＥＭ）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＃ｐ＜０．００１。対応のない両側スチューデントのｔ検定。
【図４４Ｂ】同上。
【図４４Ｃ】同上。
【図４４Ｄ】同上。
【図４４Ｅ】同上。
【図４４Ｆ】同上。
【図４４Ｇ】同上。
【図４４Ｈ】同上。
【図４４Ｉ】同上。
【００６９】
【図４５Ａ】抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、リソソームに媒介される分解を通じて表面ＣＴＬＡ４を調節する。  （Ａ）ｈＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ安定発現細胞系における表面ＣＴＬＡ４を、４℃でイピリムマブ−Ａｌｅｘａ４８８又はＨＬ１２−Ａｌｅｘａ４８８で標識し、３０分間、３７℃に移した。抗体で標識された表面ＣＴＬＡ４の代表的な共焦点画像を示す。  （Ｂ）（Ａ）の表面ＣＴＬＡ４をリソソームマーカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標））で染色し、表面ＣＴＬＡ４とリソソームの共局在が共焦点画像で示されている（緑：表面ＣＴＬＡ４、ピンク：リソソーム、白：融合）。  （Ｃ）（Ｂ）におけるイピリムマブ及びＨＬ１２に誘導されるＣＴＬＡ４内部移行後の細胞表面ＣＴＬＡ４局在の期間を、代表的な共焦点画像で示す。  （Ｄ）リソソーム阻害剤であるクロロキン（ＣＱ）による前処置を行い、又は前処置を行わずに、ｈＣＴＬＡ４でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、コントロールＩｇＧ又はイピリムマブとともに４時間インキュベートした。ＣＴＬＡ４のタンパク質レベルをウエスタンブロットで分析した。
【図４５Ｂ】同上。
【図４５Ｃ】同上。
【図４５Ｄ】同上。
【００７０】
【図４６Ａ】エンドソーム−リソソーム輸送中に高い結合親和性を確保する抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、表面ＣＴＬＡ４のリソソーム分解を促進する。  （Ａ）Ｈｉｓ−ｈＣＴＬＡ４（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、様々な抗ＣＴＬＡ４−ｍＡｂを、ｐＨ４．０〜７．０までの様々なｐＨ範囲内のバッファーに１０μｇ／ｍＬで添加した。ＣＴＬＡ４との抗体の結合をＥＬＩＳＡで測定した。  （Ｂ）ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、及びｐＨ７．０での様々な抗ＣＴＬＡ４抗体の制限用量の比較を示す。Ｈｉｓ−ｈＣＴＬＡ４（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、様々な用量の抗ＣＴＬＡ４−ｍＡｂを、ＣＴＬＡ４への結合について測定した。イピリムマブ及びトレメリムマブは、ｐＨ７．０及びｐＨ５．５で本質的に同じ用量反応を示すことに注目されたい。ｐＨ７．０での５０％最大結合を達成するのに必要なｐＨ５．５での抗体量（ＩＣ５０）は、ｐＨ７．０で必要な抗体量と基本的に同じであった。ｐＨ４．５でのＩＣ５０は約５０％〜２５０％増加した。対照的にＨＬ１２及びＨＬ３２では、ｐＨ５．５での結合はｐＨ７．０の結合よりもＩＣ５０の増加ベースで１０倍を超える減少を示す。ｐＨ４．５でのそれらの結合はｐＨ７．０での結合よりもＩＣ５０の増加ベースで１００倍を超えて減少することが観察された。  （Ｃ）Ｈｉｓ−ｈＣＴＬＡ４（０．５μｇ／ｍＬ）をコーティングし、様々な抗ＣＴＬＡ４−ｍＡｂをｐＨ７．０で１０μｇ／ｍＬで加えた。余分な抗体を洗い流した後、ＣＴＬＡ４の結合を検出し、低ｐＨバッファー（ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、及びｐＨ６）で２時間インキュベートした。  （Ａ）〜（Ｃ）に示されているデータは、４５０ｎｍでの２連の光学濃度（ＯＤ）の平均である。  （Ｄ）表面ＣＴＬＡ４を抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで４℃で３０分間標識し、１時間、３７℃へ移した。プロテインＧビーズで抗体に結合したＣＴＬＡ４を捕捉し、ウエスタンブロットで試験した。  （Ｅ）（Ｄ）における表面ＣＴＬＡ４をクロロキン（ＣＱ）で３０分間前処理し、エンドソーム−リソソームｐＨを中和した。プロテインＧビーズで抗体に結合したＣＴＬＡ４を捕捉し、ウエスタンブロットで試験した。
【図４６Ｂ】同上。
【図４６Ｃ】同上。
【図４６Ｄ】同上。
【図４６Ｅ】同上。
【００７１】
【図４７Ａ】ＨＬ１２に誘発された内部移行ＣＴＬＡ４は、細胞表面に再循環し、抗ＣＴＬＡ４誘発性の免疫療法関連有害事象を防ぐ。  （Ａ）ｄｓＲｅｄタグ付きヒトＲａｂ１１でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、イピリムマブ−Ａｌｅｘａ４８８又はＨＬ１２−Ａｌｅｘａ４８８とともに４℃で３０分間インキュベートし、１時間、３７℃へ移した。表面ＣＴＬＡ４及びＲａｂ１１の共局在の代表的な共焦点画像を示す（緑：表面ＣＴＬＡ４、赤：Ｒａｂ１１、青：核、黄色：ＣＴＬＡ４とＲａｂ１１との融合）。  （Ｂ）ｈＣＴＬＡ４−ＧＦＰでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、コントロールＩｇＧ、イピリムマブ、又はＨＬ１２とともに４時間インキュベートした。表面ＣＴＬＡ４の代表的な共焦点画像を示す。  （Ｃ）抗体誘発性の免疫療法関連有害作用（ｉｒＡＥ）の要因となる、各抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの異なる制御を表すモデル。
【図４７Ｂ】同上。
【図４７Ｃ】同上。
【００７２】
【図４８】ｐＨ感受性抗ＣＴＬＡ４抗体は、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの誘導においてより効率的である。ＭＣ３８担腫瘍Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスに、腫瘍接種後１４日目に、コントロールｈＩｇＧ、イピリムマブ、ＨＬ３２、又はＨＬ１２（１００μｇ／マウス）を投与した。腫瘍中のＣＤ４  Ｔ細胞のうちのＴｒｅｇ細胞の割合（％）を、抗体処置の１６時間後に採取された腫瘍の単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーによって決定した。２つのｐＨ感受性抗体であるＨＬ１２及びＨＬ３２は、抗体処置後２４時間でＴｒｅｇの急速な枯渇を引き起こしたことに注目されたい（Ｐ＜０．０００１）。対照的に、イピリムマブは反復投与後にはＴｒｅｇ枯渇を引き起こす可能性があるが（図２１）、単回投与の２４時間後にはほとんど効果がない。
【００７３】
【図４９】ｐＨ感受性の抗ＣＴＬＡ４抗体は、確立された大きな腫瘍の拒絶を誘発するのにより効率的である。ＭＣ３８担腫瘍Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスに、腫瘍接種後１７日目及び２０日目に、コントロールｈＩｇＧ、イピリムマブ、トレメリムマブ（ＩｇＧ１）（ＴｒｅｍｅＩｇＧ１）、ＨＬ３２、又はＨＬ１２（３０μｇ／マウス）を投与した。腫瘍サイズは口径を使用して測定した。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
１．定義
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を保有する免疫グロブリン分子を指す。「可変領域」という用語は、抗体に広く共有されるドメイン（抗体Ｆｃドメインなど）とは異なる免疫グロブリンのドメインを指す。可変領域は、その残基が抗原結合に関与している「超可変領域」を含む。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）」からのアミノ酸残基（すなわち、典型的には軽鎖可変ドメインのおよそ２４〜３４番目（Ｌ１）、５０〜５６番目（Ｌ２）、及び８９〜９７番目（Ｌ３）の残基並びに重鎖可変ドメインのおよそ２７〜３５番目（Ｈ１）、５０〜６５番目（Ｈ２）、及び９５〜１０２番目（Ｈ３）の残基、参考文献４４）を含み、「超可変ループ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの２６〜３２番目（Ｌ１）、５０〜５２番目（Ｌ２）、及び９１〜９６番目（Ｌ３）の残基並びに重鎖可変ドメインの２６〜３２番目（Ｈ１）、５３〜５５番目（Ｈ２）、及び９６〜１０１番目（Ｈ３）の残基、参考文献４５）を含み得る。「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、又は抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ及び抗−抗Ｉｄ抗体を含む）であってもよい。特に、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹなどの免疫グロブリン分子であってもよく、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、若しくはＩｇＡ２などのクラス又はサブクラスのものであってもよい。
【００７５】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合性断片」という用語は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び所望により抗体の「可変領域」抗原認識部位を含むフレームワーク残基を含み、抗原を免疫特異的に結合する能力を示す、抗体の１又は複数の部分を指す。そのような断片には、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、及びそれらの変異体、天然に存在するバリアント、並びに抗体の「可変領域」抗原認識部位及び異種タンパク質（例えば、毒素、異なる抗原の抗原認識部位、酵素、受容体、又は受容体リガンドなど）を含む融合タンパク質が含まれる。本明細書中で使用される場合、「断片」という用語は、少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドをいう。
【００７６】
ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体は、ヒトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に特に好ましいが、マウス抗体又は他の種の抗体は、多くの用途（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｓｉｔｕ検出アッセイ、急性のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用など）に有利に使用され得る。
【００７７】
「キメラ抗体」は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリンの定常領域とを有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、非ヒト種由来の１又は複数のＣＤＲ及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を含むキメラ抗体は、例えばＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００、国際公開第９１／０９９６７号、並びに米国特許第５，２２５，５３９号明細書、米国特許第５，５３０，１０１号明細書、及び米国特許第５，５８５，０８９号明細書）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又はリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；４６〜４８）、及びチェーンシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）などの当技術分野で公知の様々な技法を使用して製造可能であり、これら全ての内容は、参照により本明細書に援用される。
【００７８】
本発明は特に「ヒト化抗体」に関する。本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトフレームワーク領域と非ヒト（通常はマウス又はラット）免疫グロブリンからの１又は複数のＣＤＲとを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５％以上〜９０％以上、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。したがって、おそらくＣＤＲを除いて、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖免疫グロブリン及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、キメラ抗体は可変領域全体が非ヒトである等の理由から、ヒト化抗体は典型的なキメラ抗体を包含しないと考えられる。得られるヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予想されるため、ドナー抗体は、「ヒト化」（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）のプロセスによって「ヒト化」（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）されていると称される。ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、望ましい特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり得る。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＦＲ））残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾により、抗体の性能がさらに向上する場合がある。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み得、超可変領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものであってもよい。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を所望により含み得、これは、１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失、又は付加（すなわち、変異）の導入によって変更された、ＦｃγＲＩＩＢポリペプチドに免疫特異的に結合するヒト免疫グロブリンのものであり得る。
【００７９】
２．抗ＣＴＬＡ４抗体組成物
ヒトＣＴＬＡ４タンパク質に対する抗体であるイピリムマブは、単一の免疫療法薬として、又は抗ＰＤ−１抗体などの別の治療薬と組み合わせて、がん患者の生存期間を延長することが示されている。ただし、がん免疫療法効果は、免疫関連の重大な有害作用（ｉｒＡＥ）に関連している。より優れた治療効果又は自己免疫有害作用の低減を達成するために、新規抗ＣＴＬＡ４抗体を開発する大きな必要性がある。本発明者らは、驚くべきことに、免疫療法に関連する重大な自己免疫有害作用を起こすことなくがん拒絶を誘導するために使用できる抗ＣＴＬＡ４抗体を見出した。
【００８０】
本明細書では、抗体及びその抗原結合性断片、並びにこれらを含む組成物が提供される。前記組成物は医薬組成物であってもよい。前記抗体は抗ＣＴＬＡ４抗体であってもよい。前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体であってもよい。前記抗体はまた、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性であり得る。前記抗体は検出可能に標識されていてもよく、結合した毒素、薬剤、受容体、酵素、又は受容体リガンドを含んでいてもよい。
【００８１】
本明細書ではまた、内因性濃度又はトランスフェクトした濃度で生細胞の表面に発現され得る、ＣＴＬＡ４、特にヒトＣＴＬＡ４に免疫特異的に結合する抗体の抗原結合性断片も提供される。抗原結合性断片はＣＴＬＡ４に結合し得るものであり、生細胞はＴ細胞であり得る。
【００８２】
特定の実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、Ｔｒｅｇ枯渇及びＦｃ受容体依存性腫瘍拒絶を効率的に誘発し得る。好ましい実施形態では、抗腫瘍活性を増大させるために、ＣＴＬＡ４標的化剤は、腫瘍微小環境においてＴｒｅｇを選択的に枯渇させる。特定の実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、Ｆｃ媒介性Ｔｒｅｇ枯渇活性が増大している。Ｔｒｅｇの枯渇は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのＦｃ媒介性エフェクター機能によって発生し得る。Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、当技術分野で公知の任意の方法によって導入又は増強することができる。一例では、前記抗体は、他のアイソタイプと比較してエフェクター機能が高いＩｇＧ１アイソタイプである。前記Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、Ｆｃドメインのアミノ酸配列の変異によってさらに増強することが可能である。例えば、３つの変異（Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、及びＫ３３４Ａ）をＦｃドメインのＣＨ領域に導入して、ＡＤＣＣ活性を高めることができる。ＡＤＣＣ媒介性活性に使用される抗体は、通常、ＡＤＣＣ活性を強化するために何らかの修飾が必要となる。前記抗体のＦｃ領域のオリゴ糖がフコース糖単位を持たないように抗体を改変してＦｃγＩＩＩａ受容体への結合を改善することを通常含む、多くの利用可能な技術がある。抗体がアフコシル化されている場合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増加させる効果がある。例えば、ＢｉｏＷａ社のＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）テクノロジーは、ＦＵＴ８遺伝子ノックアウトＣＨＯ細胞系を使用して、１００％アフコシル化抗体を生成するものである。ＦＵＴ８は、複合型オリゴ糖のα１，６結合においてＧＤＰ−フコースからＧ１ｃＮＡｃへのフコースの転移を触媒するα１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする唯一の遺伝子である。ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ社は、ＦＵＴノックアウトによるものではないが、ＭＡｂ上のフコシル化グリカンの産生が低減されるように改変されたＣＨＯ株を開発した。ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ社のシステムは、ｄｅ  ｎｏｖｏフコース合成経路を、細胞によって代謝され得ない糖ヌクレオチドへとリダイレクトする細菌酵素を導入するものである。代替のアプローチとして、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社は、ＣＨＯ（及びおそらく他の）細胞系で産生されたＭＡｂでフコシル化グリカンの産生を低減する独自のフィードシステムを有する。Ｘｅｎｃｏｒ社は、腫瘍や他の病理細胞の免疫系の排除を改善するように設計したＸｍＡｂ  Ｆｃドメインテクノロジーを開発した。このＦｃドメインには２つのアミノ酸の変化があり、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性が４０倍高くなっている。また、ＦｃγＲＩＩａとの親和性も高まり、異物を貪食して消化することで免疫における役割を果たすマクロファージなどの、他のエフェクター細胞を動員する可能性がある。
【００８３】
別の実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、完全なＣＴＬＡ４占有をもたらさなくてもよく（すなわち、阻害しない、又は完全には阻害していない）、全身性Ｔ細胞活性化又は自己反応性Ｔ細胞の優先的増殖をもたらさなくてもよい。
【００８４】
別の実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、低ｐＨにおいてＣＴＬＡ４に対する結合親和性が弱く、抗体誘発性の内部移行中にＣＴＬＡ４から解離し、これにより放出されたＣＴＬＡ４が細胞表面に再循環して免疫反応の負の調節因子としてのＣＴＬＡ４の機能を維持することが可能になる。このような抗体は、ｐＨ７．０での結合と比較してｐＨ５．５における結合が３分の１未満になる場合がある。これは、後期エンドソームにおけるｐＨ５．５で、ｐＨ７．０における５０％最大結合を達成するために必要な抗体の用量の増加に基づく。リソソームのｐＨ４．５では、そのような減少は１０分の１以下への減少となる。好ましくは、ｐＨ５．５及びｐＨ４．５での減少は、それぞれ１０分の１未満又は１００分の１未満への減少となる。
【００８５】
別の実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、循環におけるｓＣＴＬＡ４が免疫応答の負の調節因子としてのその機能を維持できるように、ｓＣＴＬＡ４に対する結合親和性が低下している。
【００８６】
好ましい実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、これらの特性のうちの２以上を有する。具体的には、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、膜結合性又は可溶性ＣＴＬＡ４の機能に拮抗（すなわち、枯渇又は阻害）することなく、腫瘍微小環境でＴｒｅｇを選択的に枯渇させるため、免疫応答の負の調節因子の機能を維持することができる。
【００８７】
３．抗体の設計及び選択の方法
さらに、本明細書において、本明細書に記載の抗体の機能的特徴又は属性を組み込むことにより、新規抗ＣＴＬＡ４抗体の設計及び／又は選択、並びに既存の抗ＣＴＬＡ４抗体の抗腫瘍効果及び／又は毒性プロファイルを改善するための抗体改変方法が提供される。具体的には、抗ＣＴＬＡ４抗体のＴｒｅｇ枯渇活性を増加させてがん免疫療法効果を増加させ、エンドソーム輸送と抗体結合ＣＴＬＡ４の破壊を減少させ、ＣＴＬＡ４を細胞表面へ再循環可能にすることによって毒性プロファイルを改善する方法が提供される。最も好ましい実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、Ｔｒｅｇ枯渇活性及びＣＴＬＡ４再循環活性の両方を改善するように設計又は改変される。抗ヒトＣＴＬＡ４抗体はマウスなどの他の種のＣＴＬＡ４と交差反応しない傾向があるため、このような試験ではヒト細胞、ヒトＣＴＬＡ４でトランスフェクトした細胞、又は本明細書に記載のヒトＣＴＬＡ４ノックインマウスなどのヒトＣＴＬＡ４を発現するトランスジェニック動物モデルなどのヒトＣＴＬＡ４システムを使用する必要があると理解される。一実施形態では、抗体は、腫瘍環境内のＴｒｅｇの枯渇を増強するように設計される。このような抗体は、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ方法のいずれかを使用して試験又は選択することができる。例えば、ヒトＣＴＬＡ４ノックインマウスに前記抗ＣＴＬＡ４抗体と共に腫瘍細胞株を注射し、その後のタイムポイントで腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを取り出してカウントし、陰性又は陽性コントロールと比較する。
【００８８】
別の実施形態では、抗体は、毒性、特に免疫療法関連有害事象を誘発する能力が低下するように設計される。これは、ヒトＣＴＬＡ４発現動物モデルを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて試験することが最も良い。好ましい実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ４抗体を、単独又は併用のいずれかで、周産期又は新生児期のマウスに投与して、免疫療法関連有害事象を誘導する能力を判定する。毒性又は免疫療法関連有害事象の読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）には、体重増加の減少、血液学（ＣＢＣ）、組織病理、及び生存期間が含まれる。
【００８９】
本明細書に示されるように、免疫療法関連有害事象を減少させる能力の代替として、前記抗ＣＴＬＡ４抗体のエンドソーム（酸性）ｐＨでＣＴＬＡ４を放出する能力をアッセイし得る。これは、一実施形態では、あるｐＨ範囲にわたってＣＴＬＡ４分子に結合する能力をアッセイすることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定することができる。具体的には、前記抗ＣＴＬＡ４抗体を制限用量で添加して、ｐＨ７．０で達成される５０％最大結合を達成するために必要な低ｐＨでの量を決定し得る。別の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を使用してアッセイしてもよく、これにより、抗ＣＴＬＡ４のエンゲージメント後の細胞表面ＣＴＬＡ４の内部移行、細胞内局在化、及び輸送を追跡してもよい。一実施形態では、ＣＴＬＡ４タンパク質の局在化は、エンドソームマーカー（例えば、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）と比較してもよく、この場合、エンドソームマーカーとの共局在は、エンドソーム分解、及び再循環が起こらなかったことを示し、これは、免疫療法関連有害事象を誘発する能力と相関する。別の実施形態では、内部移行したＣＴＬＡ４が細胞表面に再循環する能力は、蛍光ＣＴＬＡ４タンパク質を使用してアッセイすることができ、細胞表面への再循環は、免疫療法関連有害事象を低減する能力と相関する。さらに別の実施形態では、内部移行したＣＴＬＡ４が細胞表面に再循環し、免疫療法関連有害事象を減少させる能力は、Ｒａｂ１１などのエンドソームを再循環させるためのマーカーとの共局在によってアッセイすることができる。
【００９０】
別の実施形態では、抗体は、可溶性ＣＴＬＡ４（ｓＣＴＬＡ４）への結合又は阻害の低減のために設計又は選択される。これは、ＣＴＬＡ４−Ｆｃなどの可溶性ＣＴＬＡ４分子が、その天然リガンド（Ｂ７−１又はＢ７−２）又はプレート若しくは細胞表面に固定化された別の抗ＣＴＬＡ４分子に結合する能力を試験することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験可能である。好ましい実施形態では、前記可溶性ＣＴＬＡ４分子は、結合後のその存在が検出され得るように標識される。
【００９１】
４．治療方法
本発明はさらに、免疫応答のアップレギュレーションのための、本明細書に記載される抗体組成物の使用に関する。免疫系の上方調節は、がん及び慢性感染症の治療において特に望ましく、したがって、本発明は、そのような障害の治療において有用性を有する。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、細胞の異常な制御不能な増殖から生じる新生物又は腫瘍を指す。「がん」には、白血病及びリンパ腫が明示的に含まれる。「がん」という用語は、遠隔部位に転移する可能性がある細胞が関与する疾患も指す。
【００９２】
したがって、本発明の方法及び組成物はまた、以下を含むがこれらに限定されない、様々ながん又は他の異常な増殖性疾患の治療又は予防において有用であり得る：膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、及び皮膚の癌を含む癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；扁平上皮がんを含む；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病並びに前骨髄球性白血病を含む、骨髄系の造血性腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；メラノーマ（黒色腫）、セミノーマ（精上皮腫）、テラトカルシノーマ（胚性奇型腫）、神経芽細胞腫、神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫を含む間葉系腫瘍；及びメラノーマ（黒色腫）、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ（角化棘細胞腫）、セミノーマ（精上皮腫）、甲状腺濾胞がん、及びテラトカルシノーマ（胚性奇型腫）を含む他の腫瘍。アポトーシスの異常によって引き起こされるがんもまた、本発明の方法及び組成物によって治療されると考えられる。そのようながんには、濾胞性リンパ腫；ｐ５３変異を伴う癌腫；乳房、前立腺、及び卵巣のホルモン依存性腫瘍；家族性腺腫性ポリポーシスなどの前がん性病変；並びに骨髄異形成症候群が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、悪性腫瘍又は増殖異常性変化（化生及び異形成など）、又は過剰増殖性障害は、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓、又は子宮において、本発明の方法及び組成物によって治療又は予防される。他の特定の実施形態では、肉腫、メラノーマ、又は白血病は、本発明の方法及び組成物によって治療又は予防される。
【００９３】
本発明の別の実施形態では、前記抗体組成物及びその抗原結合性断片は、現在の標準的及び実験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、又は手術から選択され得るがこれらに限定されない別の抗腫瘍療法と共に使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、がん、自己免疫疾患、感染症、又は中毒の治療又は予防のために当業者に公知の治療的又は予防的有効量の１又は複数の薬剤、治療用抗体、又は他の薬剤と組み合わせて投与され得る。そのような薬剤には、例えば、上記の生物学的応答修飾因子、細胞毒素、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、有糸分裂阻害剤、又は免疫療法剤のいずれかが含まれる。
【００９４】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗体組成物及びその抗原結合性断片は、別の抗腫瘍免疫療法と共に使用され得る。そのような実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、免疫調節効果を増強するために、代替免疫調節経路（ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、４−１−ＢＢ、Ｂ７−Ｈ１、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、又はＬＡＧ３など）を妨害又は増強するか、又はサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＧＦ−β、ＩＦＮｇ、Ｆｌｔ３、ＢＬｙｓ）及びケモカイン（例えば、ＣＣＬ２１）などのエフェクター分子の活性を調節する分子と組み合わせて投与される。特定の実施形態は、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合性断片を、抗ＰＤ−１（ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）又はニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ））、抗Ｂ７−Ｈ１（アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）又はデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ））、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＴＩＭ４、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳ、又は抗４−１ＢＢとともに含む、二重特異性抗体を含む。さらに別の実施形態では、より広い免疫応答を達成するために、本発明の抗体又はその抗原結合性断片は、ＩＤＯ阻害剤などの、免疫応答の異なる段階又は側面を活性化する分子と組み合わせて投与される。より好ましい実施形態では、前記抗体組成物及びその抗原結合性断片は、自己免疫副作用を悪化させることなく、抗ＰＤ−１又は抗４−１ＢＢ抗体と組み合わされる。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、別の免疫刺激分子に結合する抗体に架橋された、ＣＴＬＡ４に結合する抗体、を含む二重特異性抗体を含む。特定の実施形態は、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体組成物と、抗ＰＤ−１、抗Ｂ７−Ｈ１、抗Ｂ７−Ｈ３、抗Ｂ７−Ｈ４、抗ＬＩＧＨＴ、抗ＬＡＧ３、抗ＴＩＭ３、抗ＴＩＭ４、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＢＴＬＡ、抗ＣＤ２７、抗ＩＣＯＳ又は抗４−１ＢＢと、を含む二重特異性抗体を含む。本発明はさらに、がんの治療のためのそのような抗体の使用に関する。
【００９６】
５．産生
本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体及びその抗原結合性断片は、真核生物発現系を使用して調製され得る。発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるベクターからの発現を伴い得る。前記発現系はまた、真核細胞を感染させるために使用され得る、複製欠損レトロウイルスベクターなどの、ウイルスベクターであってもよい。前記抗体はまた、細胞ゲノムに組み込まれているベクター又はベクターの一部から抗体を発現する安定発現細胞株から産生されてもよい。前記安定発現細胞株は、組み込まれた複製欠陥レトロウイルスベクターから抗体を発現し得る。前記発現系はＧＰＥｘ（商標）であってもよい。
【００９７】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体及びその抗原結合性断片は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を使用して精製できる。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリペプチドが親和性マトリックス上に捕獲されることを可能にするアミノ酸配列を含む追加のドメインを含むように改変され得る。例えば、免疫グロブリンドメインのＦｃ領域を含む本明細書に記載される抗体は、プロテインＡ又はプロテインＧカラムを使用して、細胞培養上清又は細胞質抽出物から単離され得る。さらに、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、又はＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ社）などのタグを使用して、抗体の精製を補助できる。そのようなタグは、カルボキシル基又はアミノ末端のいずれかなどにおいて、ポリペプチド配列内の任意の位置に挿入可能である。有用であり得る他の融合としては、アルカリホスファターゼなどの、ポリペプチドの検出を補助する酵素が挙げられる。ポリペプチドの精製には免疫親和性クロマトグラフィーも使用され得る。
【００９８】
６．医薬組成物
本発明はさらに、治療的有効量の任意の上記抗ＣＴＬＡ４抗体組成物又はその抗原結合性断片、及び生理学的に許容される担体又は賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含む医薬組成物に関する。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的に有効な量の抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合性断片及び薬学的に許容される担体を含む。
【００９９】
特定の実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府若しくは州政府の規制当局に承認されていること、又は動物、より具体的にはヒトでの使用のために米国薬局方若しくは他の一般に認められている薬局方に収録されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は媒体を指す。そのような医薬担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む、水及び油などの無菌の液体であってもよい。前記医薬組成物が静脈内投与される場合、水は好ましい担体である。生理食塩水、デキストロース水溶液、及びグリセロール溶液も、特に注射剤のための液体担体として使用することができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、トレハロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。前記組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤又は乳化剤、例えばポロキサマー又はポリソルベート、又はｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。
【０１００】
一般に、本発明の組成物の成分は、別々に又は混合して単位剤形で、例えば、有効製剤の量を表示するアンプル又は分包などの密閉容器に入れた乾燥凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、供給することができる。前記組成物が注入によって投与される場合、滅菌の医薬品グレードの水又は生理食塩水を含む注入ボトルでそれを分注することができる。前記組成物が注射により投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１０１】
本発明の組成物は、中性又は塩の形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンで形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンで形成されたもの含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体組成物又はその抗原結合性断片は、特に室温での長期保存を可能にするために、凍結乾燥のために製剤化することも可能である。凍結乾燥製剤は、皮下投与に特に有用である。
【０１０３】
７．投与方法
本明細書に記載の組成物を投与する方法は、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下）、硬膜外、及び粘膜（例えば、鼻腔内及び経口経路）を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の抗体は、筋肉内、静脈内、又は皮下に投与される。前記組成物は、例えば、注入又はボーラス注射、上皮又は粘膜皮膚ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって、任意の簡便な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は全身的又は局所的であり得る。
【実施例】
【０１０４】
<実施例1>
抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂはチェックポイント阻害とは無関係に宿主のＦｃ受容体に依存したメカニズムにより腫瘍拒絶を引き起こす
〔材料と方法〕
（動物）
内因性マウスＣｔｌａ４遺伝子座の制御下でヒトＣＴＬＡ４タンパク質と１００％の同一性を有するＣＴＬＡ４タンパク質を発現するＣＴＬＡ４ヒト化マウスは既に説明されている［３８］。このホモ接合型ノックインマウス（Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ）をＣ５７ＢＬ／６背景に１０世代以上戻し交配した。Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスと野生型（ＷＴ）ＢＡＬＢ／ｃ又は野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスとを交配させてヘテロ接合型マウス（Ｃｔｌａ４ｈ／ｍ）を作製した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ヒト臍帯血ＣＤ３４＋幹細胞再構成ＮＳＧ（商標）マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バーハーバー）から購入した。全動物（雄及び雌、６〜１６週齢、各実験で週齢をマッチさせた）を分析に使用し、マウスを無作為に各群に割付けたことを除き盲検又は無作為化は行われなかった。全動物はChildren's National Medical Center内Children’s Research Instituteの研究動物施設に保管した。マウスを用いる全ての試験は動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ；Institutional Animal Care and Use Committee）の承認を受けた。
【０１０５】
（細胞培養）
本研究で用いられた細胞系で国際細胞株検証委員会（ICLAC；International Cell Line Authentication Committee）に提案されるクロスコンタミネーション又は誤認証の細胞株データベースには記載されているものはなかった。マウス又はヒトのＢ７−１又はＢ７−２でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞及びＬ９２９細胞は以前説明されている［２０、２９］。また、Ｂ７−１トランスフェクトＪ５５８細胞［２２］、Ｂ７−Ｈ２−ＧＦＰ［５０］トランスフェクトＰ８１５細胞は以前説明されている。マウス結腸腫瘍細胞系ＭＣ３８は以前説明されている［５］。メラノーマ細胞系Ｂ１６−Ｆ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６４７５（商標））及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１２６８（商標））は最初にＡＴＣＣ（米国バージニア州マナサス）から購入した。販売者より受領後、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験まで細胞継代は最小限にとどめた。全ての細胞系は３７℃でインキュベートし、５％ＣＯ２を含む雰囲気下で維持した。細胞は１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００単位／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。
【０１０６】
（抗体）
マウス抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるＬ３Ｄ１０は既に説明されている［１５］。本研究で用いられた抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ  Ｌ３Ｄ１０はヒトＩｇＧ１  Ｆｃ及びＬ３Ｄ１０の可変領域からなるキメラ抗体である。組換えＷＴ（Ｍ１）ｈＣＴＬＡ４タンパク質及び変異（Ｍ１７、Ｍ１７−４）ｈＣＴＬＡ４タンパク質、並びに親Ｌ３Ｄ１０及び完全ヒト化Ｌ３Ｄ１０（クローンＨＬ１２及びクローンＨＬ３２）を含む組換え抗体はＬａｋｅｐｈａｒｍａ社（米国カリフォルニア州ベルモント）で作製された。ＷＣ５００１０９３０２及びhttp://www.drugbank.ca/drugs/DB06186に開示されるアミノ酸配列を有する組換えイピリムマブは、Ａｌｐｈａｍａｂ社（中国、江蘇省蘇州市）又はＬａｋｅｐｈａｒｍａ社（米国カリフォルニア州サンフランシスコ）から臨床サンプルの残りを提供された。ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（アジドなし）はＡｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国ジョージア州アテネ）に一括注文した。抗マウスＣＤ１６／３２  ｍＡｂ  ２．４Ｇ２、抗マウスＢ７−１ｍＡｂ  １Ｇ１０、抗マウスＢ７−２  ｍＡｂ  ＧＬ１、抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂｓ  ９Ｄ９及び９Ｈ１０、コントロールハムスターＩｇＧ、コントロールマウスＩｇＧ２ｂ  ＭＰＣ−１１、並びにヒトＣＴＬＡ４−ＦｃはＢｉｏ−Ｘ−Ｃｅｌｌ社（米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）から購入した。精製ハムスター抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂ  ４Ｆ１０はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国カリフォルニア州サンノゼ）から購入した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏブロッキングアッセイに用いる精製ビオチン化ハムスターＩｇＧアイソタイプコントロール抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ヒトＢ７−１−Ｆｃ、Ｂ７−２−Ｆｃ、及びポリヒスチジンタグ化ヒトＣＴＬＡ４の融合タンパク質はＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（中国、北京）から購入した。組換えマウスＣｔｌａ４−Ｆｃタンパク質はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。ビオチン化は製造者の説明書に従いＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を所望のタンパク質に結合させることにより行った。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）吸収処理済み（ｃｒｏｓｓ−ａｂｓｏｒｂｅｄ）二次抗体はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国）から購入した。サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−６及びＩＬ−１０のレベルはサイトメトリックビーズアレイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６０４８５）により製造者のプロトコルに従って評価した。ＳＩＹペプチドはMBL International Corporation（米国マサチューセッツ州ウォバーン）から購入し、ＳＩＹ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞はＨ−２ＫｂテトラマーＳＩＹＲＹＹＧＬ−ＰＥ（ＭＢＬコード番号：ＴＳ−Ｍ００８−１）により検出した。ＮＩＨより提供されたＨ−２ＫｂテトラマーＯＶＡ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）−ＰＥ（番号３１０７４）はフロー染色のネガティブコントロールに用いた。
【０１０７】
（Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ阻害アッセイ）
３種のアッセイにより抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの阻害活性を評価した。１つ目に、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ又はそのリガンドであるＢ７−１でプレートをコートした。結合アッセイの可溶相にビオチン化融合タンパク質を用い、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horse Radish Peroxidase；ＨＲＰ）結合アビジン（Pierce High Sensitivity NeutrAvidin-HRP、Thermo Scientific社）によりタンパク質結合量を測定した。重炭酸塩バッファー（０．１Ｍ）中、タンパク質を４℃でコートし、室温で結合アッセイを行った。
【０１０８】
２つ目に、フローサイトメトリーを用いて、細胞表面にマウス又はヒトのＢ７−１又はＢ７−２を発現するようにトランスフェクトされたＣＨＯ細胞へのビオチン化融合タンパク質の結合を検出した。１０５μＬのＰＢＳ溶液からなる各アッセイでは、２００ｎｇのビオチン化ヒト又はマウスＣＴＬＡ４タンパク質と、様々な用量の抗ヒト若しくは抗マウスＣＴＬＡ４  ｍＡｂ又はコントロールＩｇＧと、の存在下、１．２×１０５個のＣＨＯ細胞を３０分間室温でインキュベートした。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入したフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｔｈｒｙｔｈｏｒｉｎ、ＰＥ）結合ストレプトアビジンを用いて、結合した受容体の量を測定した。ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーを実施し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社）を用いてデータを分析した。
【０１０９】
３つ目に、Ｂ７−１−ＣＴＬＡ４及びＢ７−２−ＣＴＬＡ４の相互作用阻害の読み出しとして、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂによるＢ７−１とＢ７−２のアップレギュレーションを使用した。概要としては、週齢及び性別をマッチさせたマウスに５００μｇの抗体又はそのコントロールを腹腔内投与した。投与２４時間後、マウスを安楽死させ、その脾臓細胞を、抗ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）抗体、抗ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）抗体、抗Ｂ７−１（クローン１６−１０−Ａ１）抗体、及び抗Ｂ７−２（クローンＰＯ３．１）抗体、並びに、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（米国カリフォルニア州サンノゼ）から購入したアイソタイプコントロール抗体により染色した。ヒトＣＤ３４＋臍帯血細胞で再構成されたＮＳＧ（商標）マウスに同用量の抗体を投与した。２つのフロスト顕微鏡スライド中で脾臓をつぶし（ｍｅｓｈ）、１００μｇ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ及び５Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ  Ｉを含む５ｍＬバッファー中で３７℃、２０分間インキュベートした。消化された節（ｎｏｄｅ）をセルストレーナーを通して穏やかに押し込んで、細胞懸濁液を作製し、これを以下のマーカーに特異的な抗体で染色した：ｈＢ７−１、クローン２Ｄ１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０５２０８）；ｈＢ７−２：クローンＩＴ２．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０５４３８）；ｈＣＤ１１ｃ、クローン３．９；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１６１４）；ＨＬＡ−ＤＲ、クローンＬ２４３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０７６１６）；ｈＣＤ４５、クローンＨＩ３０  （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０４０２９）。
【０１１０】
（トランスエンドサイトーシスアッセイ及び細胞間相互作用アッセイ）
ＧＦＰ（Ｃ−ＧＦＰＳｐａｒｋタグ）タグ付きヒトＢ７−２／Ｂ７−１、及びＯＦＰ（Ｃ−ＯＦＰＳｐａｒｋタグ）タグ付きヒトＣＴＬＡ４  ｃＤＮＡを有するプラスミドをＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（中国、北京）から購入し、これを用いていずれかの分子を発現するＣＨＯ安定発現細胞系を確立した。抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂによるトランスエンドサイトーシスの阻害を測定するために、製造業者の説明書に従って、Pierce（商標）Fab Preparation Kit（Thermo Scientific、米国）でＦａｂ断片を作成した。所定用量のＦａｂタンパク質又はコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃタンパク質を、ＧＦＰタグ付きＢ７−２発現ＣＨＯ細胞に添加し、その直後にＯＦＰタグ付きＣＴＬＡ４発現ＣＨＯ細胞とともに３７℃で４時間培養した。
【０１１１】
ＯＦＰタグ付きヒトＣＴＬＡ４又はヒトＣＴＬＡ４Ｙ２０１ＶｃＤＮＡをコードするプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ安定発現細胞系を樹立した。Ｂ７−ＧＦＰタグ付きＣＨＯ細胞及びＣＴＬＡ４Ｙ２０１Ｖ−ＯＦＰタグ付きＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１５ｍＬ遠心チューブで一晩懸濁培養した後、約２：１の比率で、４℃で２時間共培養した。共培養の直前に、所定用量のＦａｂ又はコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃタンパク質を添加した。トランスエンドサイトーシスアッセイ及び細胞間相互作用アッセイのいずれにおいても、それぞれの単一の試験で１×１０５個のＢ７−ＧＦＰタグ付きＣＨＯ細胞を使用した。トランスエンドサイトーシスと細胞間相互作用の量は、フローサイトメトリーにより、ＣＴＬＡ４−ＯＦＰトランスフェクトＣＨＯ細胞又はＣＴＬＡ４Ｙ２０１Ｖ−ＯＦＰトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞による、Ｂ７−ＧＦＰトランスフェクトＣＨＯ細胞からのＧＦＰシグナルの獲得に基づいて決定した。
【０１１２】
両アッセイの計算には以下の式を用いる。
【０１１３】
トランスエンドサイトーシス又は細胞間相互作用（％）＝｛ＧＦＰ＋ＯＦＰ＋（％）｝／（ＧＦＰ＋ＯＦＰ＋（％）＋ＧＦＰ−ＯＦＰ＋（％））
【０１１４】
（Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の速度論）
Ｌａｋｅｐｈａｒｍａ社にて、２５℃でＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６で結合実験が行われた。ビオチン化Ｂ７−１−Ｆｃ又はＣＴＬＡ４−Ｆｃをストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーで捕捉した。次に、ロードされたバイオセンサーを、様々な濃度のＢ７−１−Ｆｃ又はＣＴＬＡ４−Ｆｃの希釈液に浸した（開始３００ｎＭ、１：３希釈、７点）。
【０１１５】
結合速度定数ｋａは、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ又はＢ７−１−Ｆｃの１Ｍ溶液内で１秒あたりに形成されるＢ７−１−ＣＴＬＡ４複合体の数を表す。
【０１１６】
（既形成のＢ７−ＣＴＬＡ４複合体に対するＣＴＬＡ４  ｍＡｂの影響）
ＥＬＩＳＡ実験のため、ｈＢ７−１−Ｆｃ又はｈＢ７−２−Ｆｃを、９６ウェル高結合ポリスチレンプレートにて所定濃度で一晩コーティングバッファー中でプレコートした。未結合タンパク質を洗い流した後、プレートをＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡでブロックし、０．２５μｇ／ｍＬのビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質と共に２時間インキュベートした。未結合タンパク質を洗い流した後、所定量のｈＩｇＧ−Ｆｃ／イピリムマブ／Ｌ３Ｄ１０を添加して２時間インキュベートした。プレートに結合したビオチン化ＣＴＬＡ４−ＦｃをＨＲＰ結合ストレプトアビジンで検出した。フローサイトメトリーアッセイでは、表面ｈＢ７−１又はｍＢ７−２発現ＣＨＯ細胞（１×１０５個／試験）を室温で３０分間、可溶性ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（２００ｎｇ／試験）と共にインキュベートした。洗浄後、所定量のコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃ又は抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂと共に、細胞を１００μＬのＤＰＢＳバッファー中で所定時間（分）インキュベートした。フローサイトメトリーによりＰＥ−ストレプトアビジンを用いてＢ７に結合したＣＴＬＡ４−Ｆｃ量を検出し、３連のサンプルからＰＥの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。
【０１１７】
（腫瘍の増殖及び退縮アッセイ）
ヒトＣＴＬＡ４遺伝子のヘテロ接合性又はホモ接合性ノックインを有するマウスに、所定数の結腸直腸がん細胞ＭＣ３８又はメラノーマ細胞系Ｂ１６−Ｆ１０を接種した。腫瘍細胞の注射後２日目、７日目、又は１１日目に、所定用量で免疫療法を開始した。腫瘍体積を読み出しとして腫瘍の増殖及び退縮を決定した。腫瘍体積（Ｖ）は下記式から求めた。
【０１１８】
Ｖ＝ａｂ２／２
ここで、ａは長径、ｂは短径を表す。
【０１１９】
（生物学的統計）
各実験の分析に用いられた具体的試験は図の説明に示されている。Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定により、データが正規分布に従うか否かに基づいて、各統計分析で適切な検定を選択した。２群比較には対応のない両側スチューデントのｔ検定又はマンホイットニー検定、複数比較には一元配置又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びＳｉｄａｋ修正、行動試験には二元配置反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりデータを分析した。サンプルサイズは、文献及び過去の経験に基づき適切な統計的検出力で選択した。分析から除外されたサンプルはなく、特記されたものを除き無作為化は行われなかった。動物群の割付けにおいて盲検化は行われなかったが、本試験におけるいくつかの測定（すなわち、腫瘍サイズ測定、Ｂ７発現のフローサイトメトリーアッセイ）においては行われた。グラフのｙ軸のエラーバーは、図示されるように標準誤差（ＳＥＭ）又は標準偏差（ＳＤ）を表す。統計的計算はエクセル（マイクロソフト社）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ）又はＲソフトウェア（https://www.r-project.org/)により行った。
【０１２０】
〔結果〕
Ｂ７が細胞膜に提示されている場合、イピリムマブはＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害しない
よりよい比較のために、マウス抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（Ｌ３Ｄ１０）の可変領域を使用して、イピリムマブ（ヒトＩｇＧ１）と同じアイソタイプを有するキメラ抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂ［１４］を作製した［１５］。キメラ抗体の見かけの親和性は２．３ｎＭであり、これはイピリムマブ（１．８〜４ｎＭ）と同程度である［１４、１６］。変異ＣＴＬＡ４分子への結合に基づいて、これらの２つの抗体は、ヒトＣＴＬＡ４の重複するエピトープに異なる方式で結合する（図１）。以前の報告［１４］と一致して、固定化ＣＴＬＡ４を使用して可溶性Ｂ７−１と相互作用させると、イピリムマブはＢ７−１−ＣＴＬＡ４相互作用を強力に阻害した。これはＬ３Ｄ１０と同程度である（図２Ａ）。Ｂ７−１及びＢ７−２は細胞表面共刺激分子として機能することから、固定化されたヒトＢ７−１とＢ７−２を使用して抗ＣＴＬＡ４抗体の阻害を評価した。図３Ａに示されるように、イピリムマブは、非常に高濃度（８００μｇ／ｍＬ）で使用した場合でも、プレートに固定化されたｈＢ７−１へのＣＴＬＡ４−Ｆｃの結合を阻害しなかった。３つの異なる供給源（クリニックで使用される薬を含む）からの市販のイピリムマブを使用して同じ結果が得られたため、この阻害の欠如は、組換えイピリムマブのバッチの違いによるものではない。一方、Ｌ３Ｄ１０は０．２μｇ／ｍＬの低濃度でもプレートに固定化されたｈＢ７−１の結合を有意に阻害し、約３μｇ／ｍＬの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を達成した。したがって、Ｂ７−１がプレートに固定化されている場合、Ｂ７−１−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害において、Ｌ３Ｄ１０はイピリムマブよりも１，０００倍以上効率的である。イピリムマブの阻害活性の欠如は、広範囲のリガンド濃度及び受容体濃度にわたって明らかであった（図３Ｂ及び図３Ｃ）。プレートに固定化されたＢ７−２のＣＴＬＡ４−Ｆｃへの結合は、約２００μｇ／ｍＬという高いＩＣ５０ではあったが、イピリムマブによる阻害の影響を若干受けやすかった（図３Ｄ）。このＩＣ５０は、３ｍｇ／ｋｇという有効用量［７］（１９．４μｇ／ｍＬ、会社の製品添付文書に基づく）によって達成される安定した血漿レベルよりも１０倍高いため、臨床用量においてＢ７−２−ＣＴＬＡ４の相互作用の有意な阻害が起こる可能性は低い。イピリムマブの低い阻害活性は、広範囲のＢ７−２及びＣＴＬＡ４タンパク質濃度で観察された（図３Ｅ及び３Ｆ）。ここでも、Ｂ７−２−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害において、Ｌ３Ｄ１０は０．１μｇ／ｍＬというＩＣ５０を有し、イピリムマブよりも約２，０００倍効率的である。Ｂ７−１−ＣＴＬＡ４複合体とＢ７−２−ＣＴＬＡ４複合体の構造分析では非常に類似した相互作用が観察されることから［１８−１９］、Ｂ７−１とＢ７−２の微妙な差異はおそらく結合部位の構造的差異によるものではなく、Ｂ７−２−ＣＴＬＡ４相互作用のほうがオフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）が高い［１７］ことに起因すると考えられる。
【０１２１】
この驚くべき観察を実証するために、ＦｃＲと併せてＢ７を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を使用した［２０］。ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃを使用して、２つの抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂの阻害活性を評価した。ここでも、Ｌ３Ｄ１０はＣＴＬＡ４−ＦｃのＢ７−１トランスフェクトＣＨＯ細胞への結合を効果的に阻害したが、イピリムマブは、５１２μｇ／ｍＬの量で使用しても阻害を起こさなかった（図３Ｇ）。Ｌ３Ｄ１０よりもはるかに効力は低いものの、高用量のイピリムマブは、ヒトＣＴＬＡ４とマウスＢ７−１（ｍＢ７−１）との間の相互作用を約２５％阻害した（図２Ｃ）。イピリムマブは、Ｂ７−２とＦｃＲでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞へのＣＴＬＡ４−Ｆｃ結合を多少阻害したが、イピリムマブを５１２μｇ／ｍＬで使用した場合でも、５０％未満の阻害しか観察されなかった（図３Ｈ）。ただし、ビオチン化がイピリムマブのＣＴＬＡ４−Ｆｃの結合に影響を与えた可能性がある。この懸念に対処するため、阻害試験で使用されたビオチン化ＣＴＬＡ４−ＦｃへのＬ３Ｄ１０とイピリムマブの結合を比較した。図２Ｂに示されるように、イピリムマブはビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃへの結合においてＬ３Ｄ１０よりも効果的である。したがって、イピリムマブにより阻害が起こらなかったことは、ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃへの結合が不十分であったことに起因するものではない。ポリヒスチジンタグ付きＣＴＬＡ４を使用してＢ７−１トランスフェクトＣＨＯ細胞と相互作用させたときにも同様のパターンが観察された（図２Ｄ）。細胞表面におけるＦｃＲの役割の可能性を除外するため、ｈＢ７−１を発現しＦｃＲ陰性であるＬ９２９細胞を使用した。図２Ｅに示されるように、Ｌ３Ｄ１０は細胞表面Ｂ７−１へのＣＴＬＡ４の結合を阻害したが、イピリムマブはこれを阻害しなかった。さらに、ＬＰＳ成熟脾臓樹状細胞をＢ７の供給源として使用した場合にも、イピリムマブによる阻害は起こらなかった（図３Ｉ）。これらのデータを総合すると、イピリムマブのＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害能力は使用するアッセイの様式に大きく左右され、Ｂ７−１及びＢ７−２が固定化されている場合には阻害活性はほぼ又は全く検出されない一方、Ｌ３Ｄ１０は、Ｂ７タンパク質が固定化されているか否かにかかわらずＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用の強力な阻害剤であることがわかる。
【０１２２】
ＣＴＬＡ４及びＢ７はｉｎ  ｖｉｖｏで共存し、動的に相互作用するため、効率的な阻害が起こるためには既存のＢ７−ＣＴＬＡ４複合体の分解が必要であろう。この問題に対処するため、まずＢ７とビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃとの間で複合体を形成させた。未結合のＣＴＬＡ４を洗い流した後、段階的な用量のイピリムマブ又はＬ３Ｄ１０を添加した。さらに２時間インキュベーションした後、抗体及び未結合のタンパク質を洗い流し、残存した結合ＣＴＬＡ４分子をＨＲＰ結合ストレプトアビジンで検出した。図４Ａに示されるように、Ｌ３Ｄ１０は既存のＢ７−１−ＣＴＬＡ４複合体を強力に破壊したが、イピリムマブはこれを破壊しなかった。同様に、高用量のイピリムマブはＢ７−２−ＣＴＬＡ４複合体を部分的に破壊したものの、Ｌ３Ｄ１０に対して効果は２５０分の１であった（図４Ｂ）。
【０１２３】
細胞表面上の既形成Ｂ７−ＣＴＬＡ４複合体に対する抗ＣＴＬＡ４抗体の影響を評価するための最初のステップとして、Ｂ７発現ＣＨＯ細胞を、ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃタンパク質と共に４０℃で０〜１２０分間インキュベートすることにより、フローサイトメトリーによって複合体の安定性を評価した。解離したＣＴＬＡ４−Ｆｃを洗い流した後、ＰＥ結合ストレプトアビジンを用いて細胞に結合したＣＴＬＡ４−Ｆｃを測定した。図４Ｃに示されるように、Ｂ７−１を発現するＣＨＯ細胞上のＣＴＬＡ４−Ｆｃの量は１２０分の試験期間を通して変化しなかったため、既形成Ｂ７−１−ＣＴＬＡ４複合体の破壊に対する抗ＣＴＬＡ４抗体の影響を試験することができた。一方、Ｂ７−２−ＣＴＬＡ４−Ｆｃ複合体は１５分以内に急速に解離し、複合体の大部分は３０分以内に崩壊した（図４Ｃ）。この急速な解離により、これらのアッセイにおいて、既形成Ｂ７−２−ＣＴＬＡ４複合体に対する抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの影響を評価することはできなかった。図４Ｄに示されるように、イピリムマブは、細胞表面の既形成Ｂ７−１−ＣＴＬＡ４複合体の破壊にほとんど影響しなかった。
【０１２４】
ＣＴＬＡ４はＣＤ２８−ＦｃよりもＢ７に対する親和性が高いため［１７、２１］、ＣＴＬＡ４を阻害すると、ＣＴＬＡ４によるＣＤ２８−Ｂ７の相互作用の阻害が緩和される可能性がある。Ｌ３Ｄ１０とイピリムマブがこの阻害を元に戻すことができるかどうかを試験するために、ビオチン化ＣＤ２８−Ｆｃ及び非標識ＣＴＬＡ４−Ｆｃと共に、段階的用量の各抗体又はコントロールＩｇＧ−Ｆｃを添加し、Ｂ７−１トランスフェクトＪ５５８細胞に対するＣＤ２８−Ｆｃの結合を測定した［２２］。図４Ｅに示されるように、Ｌ３Ｄ１０はＢ７−ＣＤ２８の相互作用を有意にレスキューしたが、イピリムマブはこれを有意にレスキューしなかった。イピリムマブが既形成の複合体を破壊できないことは、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の動態がイピリムマブの阻害活性の主要な決定要因になることを示唆している。そのため、固定化Ｂ７−１又はＣＴＬＡ４のいずれかを使用してＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用の速度論を評価した。図４Ｆに示されるように、Ｂ７−１が固定化されている場合、２価のＢ７−１−ＦｃとＣＴＬＡ４−Ｆｃの見かけの親和性は９．９×１０−１０Ｍであり、これはＣＴＬＡ４−Ｆｃが固定化されている場合よりもやや高い（１．５×１０−９Ｍ）（図４Ｇ）。注目すべきことに、固定化されたＢ７−１に対するＣＴＬＡ４のオンレート（ｏｎ  ｒａｔｅ）であるＫｏｎ＝５．９×１０６（１／Ｍｓ）（図４Ｆ）は、固定化されたＣＴＬＡ４に対するＢ７−１のＫｏｎである１．４×１０６（１／Ｍｓ）の４倍である（図４Ｇ）（Ｐ＝０．００１５）。Ｂ７が溶液中に存在する場合は、Ｂ７−ＣＴＬＡ４複合体の形成が遅いことで、イピリムマブによる分解に耐性があるＢ７−ＣＴＬＡ４複合体の形成前にイピリムマブがＣＴＬＡ４を占有することが可能となる可能性があり、これによりイピリムマブのアッセイ依存性阻害活性を調整するメカニズムが提供される。一方、Ｌ３Ｄ１０は既形成の複合体を破壊できるため、本明細書で使用されている条件に関係なく、ＣＴＬＡ４−Ｂ７の相互作用を阻害することができる。
【０１２５】
イピリムマブはＢ７−ＣＴＬＡ４を介した細胞間相互作用、並びにＣＴＬＡ４によるＢ７−１及びＢ７−２のトランスエンドサイトーシスを効果的に阻害しない
ほとんどのＣＴＬＡ４分子は、ＡＰ−２に媒介されるメカニズム［２３−２４］を介して細胞内に存在する。Ｂ７及びＣＴＬＡ４が両方とも細胞表面で安定して発現している場合に抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂがＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害できるかどうかを測定するため、ＣＴＬＡ４にＹ２０１Ｖ変異を導入し、ＣＴＬＡ４の元来のエンドサイトーシスを阻止し、細胞表面に安定的に発現するようにした［２５］（図５Ａ）。図６Ａに示されるように、Ｂ７−１−ＧＦＰ又はＢ７−２−ＧＦＰのいずれかを発現するＣＨＯ細胞とＣＴＬＡ４Ｙ２０１−ＯＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、フローサイトメトリーによって明確に区別可能である。これらをＦＡＣＳ分析の直前に混合すると、ＧＦＰ＋ＯＦＰ＋細胞はほとんど観察されなかった。イピリムマブとＬ３Ｄ１０の細胞間相互作用の阻害能を比較するため、ＣＴＬＡ４分子のクロスリンクによる間接的な影響を回避するために、双方の抗体からＦａｂ断片を調製した（図６Ｂ）。これらの抗体のＦａｂは、ＯＦＰタグ付きＣＴＬＡ４で安定的にトランスフェクトされた細胞に対して同程度の結合を示した（図６Ｃ及び３Ｄ）。抗体をブロックせずに４℃で２時間共培養すると、ほとんどのＯＦＰ＋細胞はＢ７−ＧＦＰ発現細胞と同程度の強度でＧＦＰを獲得した（図６Ｅ及び３Ｇ）。特に、ＧＦＰ＋ＯＦＰ＋細胞には、細胞クラスターと一致する前方散乱光及び側方散乱光が観察された（図５Ｂ）。図６Ｅ及び図６Ｆに示されるように、Ｌ３Ｄ１０  ＦａｂはＢ７−１−ＧＦＰ−ＣＴＬＡ４Ｙ２０１Ｖ相互作用を効果的に阻害したが、イピリムマブＦａｂはこれを効果的に阻害しなかった。同様に、１０μｇ／ｍＬのイピリムマブＦａｂは細胞のＢ７−２とＣＴＬＡ４の相互作用を１５％しか阻害しなかったが、同用量のＬ３Ｄ１０  Ｆａｂは８０％の阻害を引き起こした（図６Ｇ及び図６Ｈ）。
【０１２６】
ＣＴＬＡ４は細胞表面Ｂ７−２のトランスエンドサイトーシスを媒介することが報告されている［１２］。これらの発見は、より生理学的に適切な条件下で抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの阻害活性を測定するための新たなアッセイを我々に提供する。ＧＦＰタグ付きＢ７又はＯＦＰタグ付きＣＴＬＡ４でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いた（図７Ａ）。蛍光タンパク質タグ付き受容体とリガンドを使用することにより、生細胞でのＢ７とＣＴＬＡ４の相互作用を定量化することができた。ＣＴＬＡ４−ＯＦＰ＋細胞がＢ７−２−ＧＦＰ＋細胞に確実に取り囲まれるように、過剰量のＢ７−２−ＧＦＰ＋細胞を追加した。図７Ｂに示されるように、３７℃での共培養により、ＣＴＬＡ４とＢ７−２の両方を発現する新たな細胞集団が時間依存的に蓄積された。この蓄積は、共培養の４時間後にピークに達した。ＧＦＰ＋ＯＦＰ−細胞割合は共培養を通して変化しないまま、実質的に全てのＯＦＰ＋細胞が経時的にＯＦＰ＋ＧＦＰ＋となったことから、予想通り、二重陽性細胞の出現はＣＴＬＡ４−ＯＦＰトランスフェクトＣＨＯ細胞によるＢ７−２−ＧＦＰの取り込みが原因であった。この解釈と一致して、ＯＦＰ＋ＧＦＰ＋の散乱光は単一細胞のものであった（図１０Ｃ）。コントロールとして、ＣＴＬＡ４−ＯＦＰトランスフェクタントをＢ７−Ｈ２−ＧＦＰトランスフェクタントと共培養した。図７Ｃに示されるように、ＣＴＬＡ４−ＯＦＰトランスフェクタントへのＧＦＰシグナルの伝達は４時間にわたって検出されなかったことから、アッセイの特異性を確認することができた。モデルの確立後、Ｌ３Ｄ１０  Ｆａｂ及びイピリムマブ  Ｆａｂのトランスエンドサイトーシスへの影響を比較した。図７Ｄ及び図４Ｅに示されるように、Ｌ３Ｄ１０  Ｆａｂは、Ｂ７−１のトランスエンドサイトーシスの阻害において、イピリムマブＦａｂよりも約１０倍効率が高い。同様に、Ｌ３Ｄ１０  Ｆａｂは、Ｂ７−２のトランスエンドサイトーシスの阻害において約３０倍効果が高い（図７Ｆ及び図７Ｇ）。Ｌ３Ｄ１０  ＦａｂはＢ７−２のトランスエンドサイトーシスを効果的に阻害したが（ＩＣ５０＝１μｇ／ｍＬ）、イピリムマブＦａｂは、１０μｇ／ｍＬで使用した場合でもＢ７−１のトランスエンドサイトーシスを２０％未満しか阻害せず（図７Ｅ）、Ｂ７−２のトランスエンドサイトーシスを３０％しか阻害しなかった（図７Ｇ）ことに留意すべきである。１０μｇ／ｍＬの用量はモル比では３０μｇ／ｍＬのインタクトなイピリムマブに等しく、これはクリニックで有効用量のイピリムマブ（３ｍｇ／ｋｇ）を使用した場合の定常状態の血漿薬物濃度よりも約５０％高い［７］。
【０１２７】
イピリムマブは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＴＬＡ４によるＢ７−１又はＢ７−２のダウンレギュレーションを阻害しない
ＣＴＬＡ４は主にＴｒｅｇで発現し、可能性のあるメカニズムの１つとして、樹状細胞（ＤＣ）上のＢ７−１及びＢ７−２の発現をダウンレギュレートすることにより自己免疫疾患を抑制する［２６］。Ｃｔｌａ４の標的変異［２６］と阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ［１２］による処置はいずれも樹状細胞上のＢ７−１及びＢ７−２の発現を増加させることから、Ｔｒｅｇ上のＣＴＬＡ４の生理的機能は、樹状細胞上のＢ７をトランスエンドサイトーシスを介してダウンレギュレートすることであることが示唆されている［１２、２７］。したがって、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害は、樹状細胞上のＢ７のアップレギュレーションに直結する。ｉｎ  ｖｉｖｏで抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの阻害活性を評価するため、非常に高用量の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ（５００μｇ／マウス；約２５ｍｇ／ｋｇ、つまりクリニックで使用されるイピリムマブの最大用量である３ｍｇ／ｋｇの８倍超に相当）を、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ又はＣｔｌａ４ｈ／ｍマウスに注射し、注射２４時間後に脾臓細胞を採取してＣＤ１１ｃｈｉｇｈＤＣ（樹状細胞）上のＢ７−１レベル及びＢ７−２レベルを測定した（図８Ａ及び５Ｂ）。図８Ｃ、８Ｄ、８Ｅに示されるように、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃを投与したＣｔｌａ４ｈ／ｈマウスと比較して、Ｌ３Ｄ１０で処置したマウスの樹状細胞では、穏やかではあるが統計的に有意なＢ７−１の上昇、及び強力なＢ７−２のアップレギュレーションがみられた。Ｂ７−２のアップレギュレーションの程度は、ヒトＴｒｅｇと樹状細胞の共培養において阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを使用した場合と同様である［１２、２７］。一方、イピリムマブはｉｎ  ｖｉｖｏでＢ７−１及びＢ７−２をアップレギュレートしなかった。混入したＬＰＳの影響の可能性を排除するために、抗体調製物中のエンドトキシンレベルのレベルを測定したところ、０．０００２５〜０．００２５ｎｇ／μｇであり、ＩｇＧ  Ｆｃコントロールの２〜１０分の１であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢ７−１及びＢ７−２のアップレギュレーションの原因とはなっていなかった（図９）。
【０１２８】
Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスにおけるＣＴＬＡ４タンパク質の５０％以上はマウス起源であり、抗ヒトＣＴＬＡ４抗体に結合しないものの（図１０）、マウスＢ７−１及びＢ７−２と機能的に交差反応する［２８−３０］。また、トランスエンドサイトーシスにはＴｒｅｇ上のいくつかの阻害されていない（ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ）ＣＴＬＡ４分子があればよいため、阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂの存在下であっても、結合していないＣＴＬＡ４は樹状細胞上のＢ７をダウンレギュレートするはずである。実際、どちらの抗体もＣｔｌａ４ｈ／ｍマウスの樹状細胞上のＢ７−１とＢ７−２のアップレギュレーションを引き起こさなかった（図８Ｃ、８Ｄ、８Ｆ）。Ｌ３Ｄ１０によるＢ７のアップレギュレーションは、Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスでは起こらずＣｔｌａ４ｈ／ｈマウスで特異的に起こる。これはＢ７のアップレギュレーションがＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用の完全な阻害に依存するという考えを支持し、またＬ３Ｄ１０によるＢ７のアップレギュレーションがＬＰＳの混入に起因する可能性を否定するものである。
【０１２９】
Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスで観察されたイピリムマブによる阻害の欠如がヒトＴ細胞とヒト樹状細胞の間でも観察されるかどうかを決定するために、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋幹細胞再構成ＮＳＧ（商標）マウスを使用した。図１１Ａ及び１１Ｂに示されるように、ここで使用したマウスの末梢血は、７０〜９０％がＴリンパ球、Ｂリンパ球、及び樹状細胞を含むヒト白血球で構成されていた。脾臓では、ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ及びＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＤＣが高頻度で観察された（図１１Ｃ）。樹状細胞では、ｈＢ７−２の顕著な発現（図１１Ｅ）が観察されたが、ｈＢ７−１（データ未掲載）の顕著な発現は観察されなかった。ヒトＣＴＬＡ４がＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇで高レベルで発現したため（図１１Ｄ）、このモデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏの設定におけるヒト樹状細胞とＴｒｅｇとの間のＢ７−２−ＣＴＬＡ４の相互作用を研究した。図１１Ｅと１１Ｆに示されるように、イピリムマブは樹状細胞のＢ７−２発現を有意にアップレギュレートしなかったが（Ｐ＝０．２２）、Ｌ３Ｄ１０で処理したマウスの樹状細胞では、Ｂ７−２レベルが２．５倍近く上昇した（Ｐ＜０．００１）。これはヒトＣＴＬＡ４遺伝子ノックインマウスのデータと一致する。したがって、Ｌ３Ｄ１０は、ヒト化マウスのヒト造血系におけるｈＣＴＬＡ４によるＢ７−２のダウンレギュレーションを阻害する一方、イピリムマブはこれを阻害しない。
【０１３０】
Ｔｒｅｇの枯渇にも腫瘍拒絶にもＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用の阻害は不要である
免疫療法効果にＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害が必要かどうかを試験するため、まずＬ３Ｄ１０とイピリムマブの腫瘍拒絶反応を誘発する能力について比較した。Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスに結腸がん細胞系ＭＣ３８を接種した。腫瘍が直径約５ｍｍのサイズに達したところで、当該マウスを、コントロールのヒトＩｇＧ−Ｆｃ、Ｌ３Ｄ１０、又はイピリムマブで、１０、３０、及び１００μｇ／マウス／注射の用量で４回処置し、４〜６週間の間腫瘍サイズを観察した。図１２Ａに示されるように、コントロールＩｇＧ  Ｆｃ処置マウスでは腫瘍が徐々に成長したが、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは両方とも１０μｇ／マウスという低用量においても完全な拒絶が達成された。複数の実験において、これらの２つの抗体は腫瘍拒絶を引き起こす能力において同等であった。別の腫瘍モデルであるＢ１６メラノーマでは、これらの抗体はいずれも、腫瘍形成前に投与した場合であっても腫瘍形成後に投与した場合であっても、腫瘍増殖を同様に遅延させた（図１２Ｂ）。一方、公表されている研究［１０］から予測されたように、抗体単独療法では完全な拒絶は達成されなかった。
【０１３１】
最近の研究では、抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂの治療効果はＦｃサブクラス及び宿主Ｆｃ受容体によって影響を受け、これが腫瘍微小環境内で選択的に抗体依存的なＴｒｅｇの枯渇に影響を与えることが報告されている［９−１１］。しかし、このような枯渇にＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用の阻害が必要であるかどうかは試験されていない。かかる阻害はＢ７をアップレギュレートすることができ（図８及び図１１）、これがＣＤ２８の超刺激を引き起こし、Ｔ細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があるため、上記の可能性は残る［３１−３２］。この問題に対処するために、担腫瘍マウスを拒絶反応が完了する前に安楽死させ、コントロールＩｇ、イピリムマブ、又はＬ３Ｄ１０を投与したマウスにおけるＴｒｅｇの頻度を分析した。いずれの抗ＣＴＬＡ４抗体も脾臓のＴｒｅｇは減少させなかったが（図１２Ｃ）、いずれも腫瘍微小環境のＴｒｅｇの割合（％）（図１２Ｄ、上部パネル）及び絶対数（図１２Ｄ、下部パネル）を減少させた。興味深いことに、腫瘍浸潤性Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞は低レベルではあるもののＣＴＬＡ４を発現したが、これらは抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂによって枯渇しなかった（図１３Ａ）。腫瘍ではＴｒｅｇが効率的に枯渇したが脾臓やリンパ節ではＴｒｅｇの枯渇がおこらなかったことは、腫瘍浸潤ＴｒｅｇでＣＴＬＡ４がはるかに高い発現を示したことにより説明される（図１３Ｂ及び１３Ｃ）。これは以前の研究でも報告されている［９〜１１］。Ｔｒｅｇ枯渇の結果として、Ｔｒｅｇに対するＣＤ８  Ｔ細胞の比率は腫瘍で選択的に増加した（図１２Ｅ）。さらに、腫瘍微小環境においてインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生細胞（図１２Ｆ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）産生Ｔ細胞が増加しており（図１４Ａ及び１４Ｂ）、脾臓では増加していなかったこと（図１４Ｃ〜１４Ｆ）から示唆されるように、Ｔｒｅｇの枯渇は、ＣＤ８  Ｔ細胞及びＣＤ４  Ｔ細胞の機能的成熟に関連していた。
【０１３２】
Ｌ３Ｄ１０とイピリムマブは、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの枯渇において同等であるため、Ｂ７−ＣＴＬＡ４の相互作用の阻害がＴｒｅｇの枯渇に寄与している可能性は低い。さらに、イピリムマブはｉｎ  ｖｉｖｏでＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用を阻害しないと考えられるもののＣｔｌａ４ｈ／ｈマウス及びメラノーマ患者に治療効果をもたらすため、この相互作用の阻害は治療効果を得るためには必要ではないと考えられる。さらに、２つのｍＡｂは、大幅に異なる阻害活性を有するにもかかわらず、同等の治療効果を有し、腫瘍微小環境での選択的Ｔｒｅｇ枯渇において同様の効力を示すことから、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害は抗体の治療効果を高めない。この観察を実証するため、２つの抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの治療反応をＣｔｌａ４ｈ／ｍマウスで試験した。このＣｔｌａ４ｈ／ｍマウスでは、これらの抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂが最大５０％のＣＴＬＡ４分子に結合することができ、どちらの抗体もＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用を阻害して樹状細胞上のＢ７をアップレギュレートすることはできない（図８Ｆ）。この場合も、高用量（図１２Ｇ）及び低用量（図１２Ｈ）の抗体を使用した場合において、どちらの抗体もＭＣ３８腫瘍の急速な拒絶を引き起こした。これと対応して、２つの抗体はいずれも腫瘍微小環境のＴｒｅｇを選択的に枯渇させ（図１２Ｉ）、脾臓のＴｒｅｇは枯渇させなかった（図１２Ｊ）。これらの遺伝的データは、腫瘍拒絶及び局所Ｔｒｅｇ枯渇に対するＣＴＬＡ４阻害の関連性に疑問を投げかけ、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂがＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用の阻害を通じてがん免疫を誘導するという一般的な仮説と対立する［４］。治療用抗体は全てＴｒｅｇの枯渇に効果的であったがＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用の阻害能は異なっていたため、これらの抗体は抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cellular cytotoxicity；ＡＤＣＣ）を介してＴｒｅｇの枯渇を誘発することにより腫瘍拒絶を引き起こしたと仮定した。ＡＤＣＣは宿主エフェクター細胞のＦｃＲに依存しているため、抗ＦｃＲ抗体が腫瘍拒絶反応を抑制できるかどうかを試験した。図１２Ｋに示されるように、抗ＦｃＲ処理の併用によってイピリムマブの腫瘍免疫療法効果は完全に消失した。
【０１３３】
Ｌ３Ｄ１０  ｍＡｂのヒト化に際し、ＨＬ１２及びＨＬ３２とよばれる２つのクローンを得た。これらのクローンは、ＣＴＬＡ４に対する強力な結合能を維持するが（図１５Ａ）、プレートに結合したＢ７−１（図１５Ｂ）及びＢ７−２（図１５Ｃ）に対するＣＴＬＡ４の結合を阻害する能力を失っている。これはおそらくオフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）の約４倍の増加及び対応する二価の親和性によるものであると考えられる（図１）。
【０１３４】
Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６システム（フォルテバイオ社（ForteBio））を用いて多濃度速度実験を行った。抗ｈＩｇＧ−Ｆｃバイオセンサー（フォルテバイオ社、番号１８−５０６４）をサンプル希釈液（ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で水和し、ｐＨ１．７グリシンで調整した。抗原をサンプル希釈液で６００ｎＭから開始して７点の２倍連続希釈により希釈した。全ての抗体をサンプル希釈液で１０μｇ／ｍＬに希釈し、抗ｈＩｇＧ−Ｆｃバイオセンサーに１２０秒間固定化した。サンプル希釈液でベースラインを６０秒間確立した後、バイオセンサーを一連の濃度の抗原を含むウェルに移動して、会合を測定した。サンプル希釈液中の目的の各タンパク質について、会合を１２０秒間観察し、解離を１８０秒間観察した。Ｋｏｎ：オンレート（ｏｎ  ｒａｔｅ）；Ｋｄｉｓ：オフレート（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）；ＫＤ：平衡解離定数。
【０１３５】
【表１】
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【０１３６】
対応して、これらの抗体では宿主ＡＰＣ上のＢ７−１及びＢ７−２のアップレギュレーションを誘発する能力も失われていた（図１５Ｄ）。これらの抗体では、固定化されたＣＴＬＡ４−Ｆｃへの可溶性Ｂ７の結合を阻害する能力も失われていた（図１６Ａ）。これらのヒト化抗体がＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用を阻害する能力を失っていたため、我々はさらに、阻害活性が腫瘍拒絶及びＴｒｅｇ枯渇に必須であるかどうかを試験することとした。図１５Ｅに示されるように、これらのヒト化抗体は阻害活性を失っているにもかかわらず腫瘍微小環境で急速にＴｒｅｇ枯渇を誘発し、一方、脾臓（図１５Ｆ）又は流入領域リンパ節（draining lymph node)（図１５Ｇ）では誘発しなかった。さらに、末梢リンパ器官と腫瘍におけるＴ細胞サブポピュレーションの量に対して、ＨＬ１２とＨＬ３２はＬ３Ｄ１０と同様の効果を示した（図１６Ｂ及び１６Ｃ）。さらに重要なことに、いずれの抗体も、ＭＣ３８腫瘍（図１５Ｈ）及びＢ１６腫瘍（図１５Ｉ）の拒絶の誘発に関してイピリムマブ及び親Ｌ３Ｄ１０と同程度の効率を有した。
【０１３７】
Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用はイピリムマブの免疫治療活性に必須ではない
ＣＴＬＡ４チェックポイント阻害仮説の重要な予測として、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、負のシグナルを送達するためにＢ７が存在しない限り、免疫療法の効果を生まないであろうと考えられている。Ｃｄ８０（Ｂ７−１をコード）及びＣｄ８６（Ｂ７−２をコード）の標的変異を有するマウスはＴｒｅｇを有さないため［３３］Ｃｔｌａ４をほとんど発現しないことから、抗Ｂ７−１（１Ｇ１０）ｍＡｂ及び抗Ｂ７−２（ＧＬ１）ｍＡｂの飽和用量を用いて上記予測を試験した。上記抗Ｂ７−１（１Ｇ１０）ｍＡｂ及び抗Ｂ７−２（ＧＬ１）ｍＡｂはそれぞれヒトＣＴＬＡ４のｍＢ７−１、ｍＢ７−２への結合をそれぞれ阻害する（図１７Ａ）。図１７Ｂに図示されるように、コントロールＩｇ、又は抗ｍＢ７−１  ｍＡｂと抗ｍＢ７−２  ｍＡｂとの組み合わせと共に、イピリムマブでＭＣ３８担腫瘍マウスを処置した。新たな抗ｍＢ７  ｍＡｂへのＢ７−１及びＢ７−２の結合は、Ｃｄ８０及びＣｄ８６（ｄＫＯ）の両方の標的変異を持つマウスで観察されたものと同程度にまで減少していたことから（図１７Ｃ及び１７Ｄ）、使用した抗ｍＢ７  ｍＡｂは、末梢血白血球の全てのＢ７−１及びＢ７−２を完全にマスキングした。腫瘍流入領域リンパ節からの樹状細胞においてもＢ７−２の同様の阻害が観察された（図１７Ｅ）。一方、抗体処置にかかわらず、１Ｇ１０  ｍＡｂではＢ７−１レベルはほとんど検出できなかったため（データ未掲載）、内因性Ｂ７−１のマスキングの程度は評価できなかった。Ｂ７−１とＢ７−２はいずれも抗原に対する抗体反応に必要であり［３４］、抗ＣＴＬＡ４抗体は抗薬物抗体（anti drug antibody：ＡＤＡ）の強力な誘導因子であるため［５］、ＡＤＡはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＢ７−１とＢ７−２の機能の優れた指標である。イピリムマブに対する抗体反応が完全に消失したことから、機能的阻害も確認された（図１７Ｆ）。重要なことに、抗ｍＢ７で処置されたマウスもコントロールＩｇで処置されたマウスもイピリムマブ療法に同様に反応したことから（図１７Ｇ）、Ｂ７の飽和的阻害はイピリムマブに誘発される腫瘍拒絶に影響しなかった。したがって、イピリムマブの免疫療法効果はＢ７による負のシグナル伝達の無効化によっては説明できない。
チェックポイント阻害仮説における別の重要な予測として、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂがナイーブＴ細胞のブレーキを放出してがん免疫療法効果を達成すると考えられている。抗Ｂ７  ｍＡｂによってＴ細胞依存性抗体応答が完全に消失したことから、抗Ｂ７  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ処理によってイピリムマブに誘導されるＴｈ２細胞活性化が阻止されるかどうか試験した。図１８Ａに示されるように、イピリムマブ処置によってＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０等のＴｈ２型サイトカインのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生が有意に増加した。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗Ｂ７  ｍＡｂｓ処理によって相殺された。末梢リンパ器官のＣＤ８  Ｔ細胞の新規プライミングに対する抗Ｂ７  ｍＡｂの影響を試験するため、担腫瘍マウスをＳＩＹペプチドで免疫化し、抗Ｂ７  ｍＡｂの存在下又は非存在下、イピリムマブでマウスを処置した。ＳＩＹ−Ｈ−２Ｋｂ特異的Ｔ細胞の代表的プロファイルを図１８Ｂに示し、代表的な試験の要約データを図１８Ｃに示す。図１８Ｂ及び１８Ｃに示されるように、抗Ｂ７  ｍＡｂの非存在下では、ＳＩＹペプチドによる免疫化によって、ＳＩＹ特異的Ｔ細胞が有意に増加した。これはイピリムマブによって若干増加するようである。一方、抗Ｂ７  ｍＡｂの存在下では、ＳＩＹ特異的Ｔ細胞の新規プライミングは観察されなかった。図１７のデータにより、抗Ｂ７  ｍＡｂがイピリムマブの免疫療法効果に干渉しないことが示されていることから、図１８のデータは、イピリムマブによる免疫療法効果を達成するためにイピリムマブ処置後の新規Ｔ細胞プライミングは必要ないことを示唆している。
【０１３８】
Ｂ７−Ｃｔｌａ４相互作用の阻害は、抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂの免疫療法効果と関連しない
２つの抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂｓである４Ｆ１０及び９Ｈ１０のインタクト抗体及びＦａｂの刺激効果［３５〜３６］に基づき、ＣＴＬＡ４はＴ細胞制御のための細胞固有の負の制御因子であるという概念が提案された。ただし、これらの抗体がＢ７−Ｃｔｌａ４相互作用を阻害することを示すデータは提示されていない。より最近では、３つ目の抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂである９Ｄ９が、担腫瘍マウスに対して治療効果を有し、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの局所的な枯渇をもたらすことが報告されている［１０］。そのため、腫瘍拒絶を誘発することが示されているこれら３つの市販の抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂ全てについて、生理学的条件下でＢ７−Ｃｔｌａ４相互作用を阻害する能力を試験した。第１の試験として、漸増量（モル基準でＣｔｌａ４−Ｆｃの２０００倍量まで）の抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂを使用して、ビオチン化Ｃｔｌａ４−Ｆｃのプレート被覆ｍＢ７−１及びｍＢ７−２への結合阻害を行った。図１９Ａに示されるように、抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂ  ９Ｄ９を非常に高濃度で使用した場合には多少の阻害が観察されたものの、抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂ  ９Ｈ１０は試験された最高濃度でもｍＢ７−１−Ｃｔｌａ４相互作用を阻害しなかった。また、ｍＡｂ  ９Ｄ９はｍＢ７−２−Ｃｔｌａ４相互作用を効果的に阻害したが、９Ｈ１０はこれを阻害しなかった（図１９Ｂ）。興味深いことに、９Ｄ９は可溶性Ｃｔｌａ４−Ｆｃへの強い結合を示したが、９Ｈ１０は結合が弱く（図１９Ｃ）、その一方、固定化マウスＣｔｌａ４−Ｆｃへの結合に関しては９Ｈ１０は９Ｄ９よりも強力であった（図１９Ｄ）。このアッセイにおける９Ｈ１０による阻害活性の欠如は、単に９Ｈ１０が可溶性Ｃｔｌａ４−Ｆｃに対して結合力が不十分であることを反映している可能性があるため、野生型（ＷＴ）マウス（Ｃｔｌａ４ｍ／ｍ）の樹状細胞上のＢ７−１及びＢ７−２のアップレギュレーションを用いてｉｎ  ｖｉｖｏでのＢ７−Ｃｔｌａ４の相互作用の阻害を測定した。図１９Ｅ及び図１９Ｆに示されるように、９Ｈ１０は樹状細胞上のＢ７−１発現をアップレギュレートしなかったが、９Ｄ９はｍＢ７−１レベルを１５％増加させた（Ｐ＜０．０５）。興味深いことに、９Ｄ９は樹状細胞で明らかにｍＢ７−２をアップレギュレートしたが、９Ｈ１０ではｍＢ７−２はアップレギュレートされなかった。したがって、９Ｈ１０は、最初にかつ最も詳細に研究されてきた腫瘍免疫療法用抗Ｃｔｌａ４  ｍＡｂであるが、Ｂ７−Ｃｔｌａ４の相互作用を阻害しない。これらのデータは、抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂによる抗腫瘍免疫の誘導におけるＢ７−Ｃｔｌａ４相互作用阻害の役割に反するものである。いずれのｍＡｂも同等の免疫療法効果及び同等の腫瘍微小環境内Ｔｒｅｇ枯渇を示したため［１０］、抗マウスＣＴＬＡ４  ｍＡｂの治療効果は、ｍＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用の阻害というよりは、Ｔｒｅｇの局所的枯渇により統一的に説明される。興味深いことに、４Ｆ１０はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢ７−Ｃｔｌａ４相互作用を阻害したが、ｉｎ  ｖｉｖｏで樹状細胞上のＢ７のアップレギュレーションを誘導しなかった（図２０）。
【０１３９】
〔考察〕
イピリムマブはＢ７が可溶型で添加された場合にＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害（ｂｌｏｃｋ）することに基づき、阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）ｍＡｂと呼ばれたが、上記データは、生理学的条件下、例えばＢ７−１及びＢ７−２が固相に固定化されている場合や細胞膜上に発現している場合、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂに晒される前にＢ７−ＣＴＬＡ４複合体が形成されている場合、Ｂ７及びＣＴＬＡ４がいずれも細胞表面分子として発現している場合、そして特にＢ７とＣＴＬＡ４がそれぞれ樹状細胞上、Ｔ細胞上に天然に発現したものとして提示されている場合や、動物がｉｎ  ｖｉｖｏで抗体治療を受ける場合には、イピリムマブはＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用をほとんど阻害しないことを示唆している。さらに重要なことには、イピリムマブは、Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスにおいて５０％以上のＣＴＬＡ４が当該抗体に結合していない場合や宿主Ｂ７が抗Ｂ７  ｍＡｂでマスキングされている場合にも有効性を維持していることから、イピリムマブはＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を阻害しなくてもその免疫療法効果を有する。
【０１４０】
本開示に記載される研究における驚くべき発見として、Ｂ７タンパク質又はＣＴＬＡ４タンパク質が可溶性相に存在するかどうかに依存してイピリムマブの阻害活性が大きく異なることが挙げられる。これは２つのデータによって説明することができる。第一に、イピリムマブは既存のＢ７−ＣＴＬＡ４複合体を破壊しない。第二に、プレートに結合したＢ７に結合する可溶性ＣＴＬＡ４のオンレート（ｏｎ−ｒａｔｅ）は、プレートに結合したＣＴＬＡ４に結合する可溶性Ｂ７のオンレートの３倍以上である。これらのデータを合わせると、Ｂ７が固定化されている場合よりも、Ｂ７が溶液で追加された場合、イピリムマブはフリーのＣＴＬＡ４に結合する可能性が高く、ＣＴＬＡ４−Ｂ７複合体が形成される前にＣＴＬＡ４−Ｂ７の相互作用を阻害する可能性が高いことが示唆される。ＣＴＬＡ４抗体の相互作用は動的であるため、抗体から分離したＣＴＬＡ４分子は、固定化Ｂ７に結合してイピリムマブによる阻害に対して「免疫」を獲得する可能性がある。したがって、最近報告されたような［３７］、ＣＴＬＡ４上におけるＢ７結合部位とイピリムマブ結合部位の部分的重複は、生理学的条件下でのＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害を必ずしも可能とするわけではない。
【０１４１】
既形成の複合体を破壊するためのＬ３Ｄ１０とイピリムマブとの間の異なる活性は、未だ解明されていない。イピリムマブのＫｏｎ（２．６×１０５／Ｍｓ又は３．８３×１０５／Ｍｓ）［１４、１６］は、可溶性Ｂ７のＫｏｎ（１〜４×１０６／Ｍｓ、本研究）よりも低いが、Ｌ３Ｄ１０のＫｏｎ（２．０７×１０５／Ｍｓ）はイピリムマブのＫｏｎより速くはない［１５］。したがって、Ｋｏｎ又はＫｏｆｆは、Ｂ７の固定化されたＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用の阻害能がこれらの２つの抗体で異なることの説明とはならない。より可能性の高い説明としては、いったん複合体が形成されるとＣＴＬＡ４の構造がイピリムマブの結合を妨げるように変化することが考えられる。イピリムマブ−ＣＴＬＡ４複合体に関する公表されたデータによると、ＣＴＬＡ４上のイピリムマブのエピトープとＢ７結合部位とが一部重複することが示されており［３７］、上記説明と整合する。
【０１４２】
Ｂ７及びＣＴＬＡ４のいずれも細胞表面に存在する生理学的条件をモデル化するため、ＧＦＰタグ付きＢ７−１若しくはＧＦＰタグ付きＢ７−２、又はＯＦＰタグ付きＣＴＬＡ４のいずれかをそれぞれ発現するＣＨＯ細胞を使用してトランスエンドサイトーシスアッセイを行った。ＣＴＬＡ４のクロスリンクによる複雑なシグナリングの問題を解消するため、二価抗体ではなくＦａｂを使用することが重要である。このデータは、細胞表面ＣＴＬＡ４への強力な結合にもかかわらず、飽和的結合に必要な濃度の１０倍の濃度（１０μｇ／ｍＬ）でも、イピリムマブＦａｂはＢ７−１の及びＢ７−２のトランスエンドサイトーシスを１５〜３０％しか阻害しなかったことを明らかに示している。より重要なことには、この濃度は、モル比に換算すると、臨床的有効用量の投与により得られる定常状態の血漿中濃度よりも約５０％高い。同様に、細胞表面のＣＴＬＡ４がＹ２０１Ｖ変異によって安定化され、安定的なＢ７−ＣＴＬＡ４を介した細胞間相互作用が可能になると、高用量のイピリムマブＦａｂによっても、２０％未満の阻害しか起こらない。臨床的有効用量の投与では、Ｂ７のトランスエンドサイトーシスもＢ７とＣＴＬＡ４を介する細胞表面の相互作用も有効に阻害するためには不十分なため、このｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞ベースのアッセイは、この臨床的に有効な薬剤の作用機序がＣＴＬＡ４阻害であることに大きな疑問を投げかけている。
【０１４３】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験により得られた推測を、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験によって検証した。我々のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、ＣＴＬＡ４がトランスエンドサイトーシスにより樹状細胞中のＢ７のダウンレギュレーションを引き起こすことによって機能するという最近の発見に基づいている［１２、２７］。この特有の性質のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定的な樹状細胞−Ｔｒｅｇ間の結合が起こることは予想しがたいであろう。むしろ、ＣＴＬＡ４を介したトランスエンドサイトーシスを阻害することによって樹状細胞上のＢ７の発現が直接的に高まる［１２、２７］。Ｂ７のアップレギュレーションが抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂのシグナル伝達によるものであるという説明の可能性を除外するため、マウスとヒトの両方のＣＴＬＡ４アレルからなるヘテロ接合型マウスを使用した［３８］。本モデルにおいて、抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂは有効なアゴニストになる可能性はあるが、抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂはＣＴＬＡ４分子の５０％に結合できないため、有効なアンタゴニストにはならない。阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるＬ３Ｄ１０はホモ接合性マウスではＢ７のアップレギュレーションを誘発するがヘテロ接合性マウスでは誘発しないという事実は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイの特異性を裏付け、機能的阻害にはＣＴＬＡ４の５０％を超える阻害が必要であろうことを示した。これはおそらく非占有ＣＴＬＡ４が５０％以下であるとトランスエンドサイトーシスが起こるためであると考えられる。このように、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害には、樹状細胞上のＢ７のアップレギュレーションが最も生理学的に関連しており直接的な読み出しとなるものと考えられる。
【０１４４】
Ｂ７−ＣＴＬＡ４阻害が寄与していないことは、阻害と治療効果との間の相関の欠如によっても説明される。Ｂ７−ＣＴＬＡ４の相互作用の阻害には１０００倍以上の開きがあるにもかかわらず、Ｌ３Ｄ１０とイピリムマブは腫瘍拒絶の誘発においては同等である。したがって、上記阻害は、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの有効性に大きく寄与するものではない。興味深いことに、Ｌ３Ｄ１０は全てのＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用を機能的に阻害することができないヘテロ接合型マウスでも腫瘍拒絶を効率的に誘発するので、阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗体であっても上記阻害は腫瘍拒絶に必要ない。特筆すべきことに、阻害活性を失ったヒト化Ｌ３Ｄ１０の子孫は、免疫療法における活性を完全に維持している。これらのデータは、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂが主にチェックポイント阻害によって機能するという仮説を否定する［１］。この有力な仮説を否定することにより、これらのデータは、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの阻害活性の改善は抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの治療効果を高める正しいアプローチではなさそうであることを示唆する。我々の関連論文では、この概念がさらに検証されている。
【０１４５】
ごく一部のヒト対象が、可溶性Ｂ７−１を発現することが知られている［３９］。イピリムマブは可溶性ＣＤ８０とＣＴＬＡ４の間の相互作用を阻害するため、可溶性ＣＤ８０の阻害が腫瘍拒絶の原因であるかどうかを検討することは興味深い。２つの理由により、この可能性は低い。第一に、可溶性ＣＤ８０はＴ細胞の共刺激を起こして腫瘍拒絶反応を促進することが知られているため［４０］、この相互作用を阻害すると、腫瘍拒絶反応を促進するのではなくむしろ抑制するはずである。第二に、ＣＤ８０が固定化されているか可溶型であるかに関わらずＢ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害能を失ったヒト化Ｌ３Ｄ１０クローンであるＨＬ１２及びＨＬ３２は、腫瘍拒絶の強力な誘導因子である。
【０１４６】
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究によると、本開示で用いられるすべての治療上有効な抗ＣＴＬＡ４抗体は局所的なＴｒｅｇ枯渇を引き起こすのに非常に有効であることが示されている。我々のデータは、抗マウスＣｔｌａ４  ｍＡｂと同様に、臨床的に有効なイピリムマブを含む抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂはＡＤＣＣを通して治療効果を奏した可能性があることの明確なエビデンスの１つを提供している。この仮説は、イピリムマブに誘発される腫瘍拒絶における宿主ＦｃＲの重要な役割によって裏付けられている。我々の研究は、腫瘍環境内でのＴｒｅｇの局所的な枯渇が臨床的に有効な抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂの主要なメカニズムであるという仮説を支持しており、阻害活性に関わらず、選択的に局所的Ｔｒｅｇ枯渇を増強することによって次世代の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを開発するための新たなアプローチを提案する。
【０１４７】
治療効果を達成するために腫瘍微小環境内の局所的Ｔｒｅｇ枯渇を誘導する必要があることは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体とは異なり抗ＣＴＬＡ４抗体は末梢リンパ器官の負のシグナル伝達を妨げることによって腫瘍拒絶を促進する、というもう１つのチェックポイント阻害仮説［１］の前提と一致しない。この仮説は、Ｂ７阻害が、イピリムマブの治療効果に影響を与えることなく、新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）Ｔ細胞活性化を妨げたことを示すデータによって否定された。重要なことに、全身性Ｔ細胞活性化は、腫瘍拒絶に寄与する代わりに、免疫療法関連有害作用と強く相関することが示されている。
【０１４８】
最後に、マウスでの遺伝データの蓄積は、ＣＴＬＡ４がＴ細胞活性化に対して負の制御をもたらし、かかる制御はＳｈｐ−２［４１〜４２］によって達成される、という当初の概念［３５〜３６］は再検討の余地があることを示唆している。したがって、ＣＴＬＡ４は細胞固有のＴ細胞活性化に対する負の制御因子である［４４〜４５］という概念を支持するものとしてＣｔｌａ４−／−マウスにおける重度の自己免疫疾患が使用されているものの、この見解と整合しない少なくとも３つの遺伝的データの系統が出現している。第一に、致死性の開始は生殖系又は汎Ｔ細胞の遺伝子欠損を有するマウスと比べて遅いものの［４４−４６］、ＴｒｅｇにおけるＣｔｌａ４遺伝子の系統特異的な欠損は、Ｃｔｌａ４遺伝子の生殖系欠損を有するマウスで観察される自己免疫の表現型を十分再現することができるが、エフェクターＴ細胞におけるＣｔｌａ４遺伝子の系統特異的な欠損ではこれが再現されない［２６］。Ｆｏｘｐ３−細胞におけるＣｔｌａ４の機能はまだ調査されていないが、これらのデータは、Ｃｔｌａ４−／−マウスにおける致命的な自己免疫の発生にはエフェクターＴ細胞におけるＣｔｌａ４の欠損は必要ないことを示唆している。第二に、野生型（ＷＴ）及びＣｔｌａ４−／−Ｔ細胞の両方からなるキメラマウスでは、野生型Ｔ細胞の共存によって自己免疫の表現型は妨げられた［４７］。これらのデータも、自己免疫疾患が細胞固有の負の制御因子の欠如によって引き起こされたのではないことを強く示唆している。細胞固有の負の制御因子による影響がないことは、上記キメラマウスではウイルス感染中にＣｔｌａ４−／−Ｔ細胞の優先的な増加が観察されないことによっても示される［４８］。第三に、ＣＴＬＡ４の負の制御を媒介していることが知られるＳｈｐ２のＴ細胞特異的欠損は［４１−４２］、Ｔ細胞活性化を増強するのではなくむしろ減少させることがわかった［４９］。Ｔ細胞活性化の負の調節因子としてのＣＴＬＡ４の提案以来報告されてきたこれらの遺伝的データの背景のもと、本開示で報告されるデータは、がん免疫療法におけるＣＴＬＡ４チェックポイント阻害仮説に対して再評価の必要性を提示している。
【０１４９】
＜実施例２＞
ＣＴＬＡ４の完全な占有、全身性Ｔ細胞の活性化、及び自己反応性Ｔ細胞の優先的増殖は腫瘍拒絶には不要であるが免疫療法関連有害事象と相関し、一方Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用の阻害は抗ＣＴＬＡ４抗体の安全性や有効性に影響しない
〔方法〕
（動物）
内因性マウスＣｔｌａ４遺伝子座の制御下でヒトＣＴＬＡ４タンパク質と１００％の同一性を有するＣＴＬＡ４タンパク質を発現するＣＴＬＡ４ヒト化マウスは既に説明されている［２４］。このホモ接合型ノックインマウス（Ｃｌｔａ４ｈ／ｈ）をＣ５７ＢＬ／６背景に１０世代以上戻し交配した。Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスと野生型（ＷＴ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（腫瘍増殖研究用）又は野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（免疫療法関連有害事象研究用）とを交配させてヘテロ接合型マウス（Ｃｔｌａ４ｈ／ｍ）を作製した。野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＮＣＩ契約を通じてCharles River Laboratoriesから購入した。全動物はChildren’s National Medical Center内Children’s Research Instituteの研究動物施設に保管された。マウスを用いる全ての試験は動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ；Institutional Animal Care and Use Committee）の承認を受けた。
【０１５０】
（細胞培養）
マウス結腸腫瘍細胞系ＭＣ３８は以前説明されており［２］、ＣＴ−２６細胞系及びＢ１６−Ｆ１０細胞系はＡＴＣＣ（米国バージニア州マナサス）から購入した。販売者より受領後、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験まで細胞継代は最小限にとどめた。細胞系は認証を受けておらず、マイコプラズマ汚染についての定期的試験も行われていない。ＭＣ３８細胞系、ＣＴ２６細胞系、及びＢ１６−Ｆ１０細胞系は５％ＣＯ２内、３７℃でインキュベートした。ＭＣ３８細胞及びＢ１６細胞は１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium、Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。ＣＴ２６細胞は完全ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。
【０１５１】
（抗体）
マウス抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるＬ３Ｄ１０は既に説明されている［２８］。本試験で用いられた抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ  Ｌ３Ｄ１０はヒトＩｇＧ１  Ｆｃ及びＬ３Ｄ１０の可変領域からなるキメラ抗体である。組換え抗体は請負契約を通じてＬａｋｅｐｈａｒｍａ社（米国カリフォルニア州ベルモント）で作製された。ＷＣ５００１０９３０２及びhttp://www.drugbank.ca/drugs/DB06186に開示されるアミノ酸配列を有する組換えイピリムマブは、Ａｌｐｈａｍａｂ社（中国、江蘇省蘇州市）及びＬａｋｅｐｈａｒｍａ社（米国カリフォルニア州サンフランシスコ）から提供された。主要な結果を検証するため、臨床的に使用されている薬剤も用いた。ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（アジドなし）はＡｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国ジョージア州アテネ）に一括注文した。抗マウスＰＤ−１  ｍＡＢ  ＲＭＰ１−１４はＢｉｏ−Ｘ  Ｃｅｌｌ社（米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン）から購入した。全てのｍＡｂのエンドトキシンレベルをＬＡＬアッセイ（Ｓｉｇｍａ）で決定したところ、０．０２ＥＵ／ｍｇより低かった。
【０１５２】
（腫瘍の増殖及び退縮アッセイ）
ヒトＣＴＬＡ４遺伝子のヘテロ接合性又はホモ接合性ノックインを有するマウスに、所定数の結腸直腸がん細胞ＭＣ３８、ＣＴ２６、又はメラノーマ細胞系Ｂ１６−Ｆ１０を接種した。腫瘍細胞の注射後２日目、７日目、又は１１日目に、所定用量で免疫療法を開始した。腫瘍体積を読み出しとして腫瘍の増殖及び退縮を決定した。腫瘍体積（Ｖ）は下記式から求めた。
【０１５３】
Ｖ＝ａｂ２／２
ここで、ａは長径、ｂは短径を表す。
【０１５４】
（Ｌ３Ｄ１０のヒト化）
Ｌ３Ｄ１０は請負契約を通じてＬａｋｅｐｈａｒｍａ社でヒト化された。それぞれの第１のヒト化鎖は第１のフレームワークを用い、最も多いヒト配列と最小限の親抗体のフレームワーク配列を含む（ヒト化ＨＣ１及びＬＣ１）。それぞれの第２のヒト化鎖は、ＨＣ１及びＬＣ１と同じフレームワークを用いたものだが、追加で親Ｌ３Ｄ１０抗体配列を含む（ヒト化ＨＣ２及びＬＣ２）。それぞれの第３のヒト化鎖は、第２のフレームワークを用い、ＨＣ２／ＣＬ２と同様に、ヒトフレームワークに融合された追加の親配列を含む（ヒト化ＨＣ３及びＬＣ３）。３つのヒト化軽鎖及び３つのヒト化重鎖を可能な全組み合わせで組み合わせ、その発現レベル及び抗原結合親和性を試験し、親Ｌ３Ｄ１０抗体と同様の作用を有する抗体を特定した。
【０１５５】
（全血球計算）
Ｋ２ＥＤＴＡ（ＢＤ）を備えたチューブを使用して血液サンプル（５０μＬ）を４１日齢で収集し、製造業者のマニュアルに従ってＨＥＭＡＶＥＴ  ＨＶ９５０（Drew Scientific Group、米国フロリダ州マイアミレイクス）で分析した。
【０１５６】
（内部臓器の組織病理学的分析）
治療用抗体又はコントロール抗体を投与したマウスから収集したホルマリン固定臓器からＨ＆Ｅ切片を作製し、二重盲検でスコア化した。
スコア基準：
心臓：心膜、右心房又は左心房、大動脈基部、及び左心室又は右心室への浸潤をそれぞれ１ポイントとしてカウントする。
肺スコアリングは、細気管支を取り囲むリンパ球凝集体に基づく：１は部位毎のリンパ球凝集体の１〜３個の小さな病巣；２は４〜１０個の小さな病巣又は１〜３個の中間的な病巣；３は４個以上の中間的な病巣、又は大きな病巣の存在；４は実質における顕著な間質性線維症及びリンパ球凝集体の大きな病巣を表す。
肝スコアリングは、門脈三管を取り巻くリンパ球浸潤凝集体に基づく：１は部位毎の１〜３個のリンパ球凝集体の小さな病巣；２は４〜１０個の小さな病巣又は１〜３個の中間的な病巣；３は４個以上の中間的な病巣、又は大きな病巣の存在；４は実質における顕著な間質性線維症及びリンパ球凝集体の大きな病巣を表す。
腎臓スコアリング：１．糸球体細胞質の穏やかな増加；２．糸球体細胞質の増加、及び遠位尿細管又は近位尿細管におけるリンパ球浸潤；３．集合管内の大きなリンパ球の凝集；４．腎臓の皮質及び髄質内における顕著なリンパ球凝集体。
唾液腺スコアリングは、顎下腺におけるリンパ球浸潤に基づく：１は部位毎の１〜３個のリンパ球凝集体の小さな病巣；２は４〜１０個の小さな病巣、又は１〜３個の中間的な病巣；３は４個以上の中間的な病巣、又は大きな病巣の存在；４は、実質における顕著な間質性線維症及び組織破壊、及びリンパ球凝集体の大きな病巣を表す。
示されているデータは、調査した全ての臓器のスコアの合計である。
【０１５７】
（Ｆ１異系交配による自己反応性Ｔ細胞の分析）
図３１Ａに図示されるように、Ｃ５７ＢＬ／６．Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスを野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスと異系交配させた。Ｆ１マウスを相互交配させて、Ｃｔｌａ４ｈとＨ−２アレルの両方がランダムに分離されているＦ２を生成させた。公表されている報告［２４、３０］に従い、尾ＤＮＡを用いてＣｔｌａ４アレルと内因性ウィルススーパー抗原（ＶＳＡｇ）Ｍｍｔｖ８、９の遺伝子型を特定し、末梢血白血球を用いてフローサイトメトリーによってＨ−２ｄハプロタイプの存在を決定した。
【０１５８】
（薬物毒性のための臨床化学）
血清心筋トロポニンＩ  タイプ３（ＴＮＮＩ３）を測定するためのキットはＣｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ社から購入し（カタログ番号ＳＥＡ４７８Ｍｕ）、製造業者のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡを使用してＴＮＮＩ３レベルを測定した。クレアチニンレベルは、クレアチニン（血清）比色アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）又はクレアチニン（ＣＲＥＡ）キット（ＲＡＮＤＯＸ、カタログ番号ＣＲ２３３６）を使用して測定した。血清ＢＵＮレベルは、ＵＲＥＡ  ＮＩＴＲＯＧＥＮ  ＤＩＲＥＣＴキット（Ｓｔａｎｂｉｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用し、製造元のマニュアルに従って測定した。
【０１５９】
（生物学的統計）
各実験の分析に用いられた具体的試験は図の説明に示されている。ダゴスティーノ・ピアソンの正規性検定により、外れ値を削除したデータが正規分布に従うか否かに基づいて、各統計分析で適切な検定を選択した。２群比較には対応のない両側スチューデントのｔ検定又はマンホイットニー検定、複数比較には一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）又はクラスカル・ウォリス試験、行動試験には二元配置反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりデータを分析した。線形回帰の相関係数及びＰ値はピアソン法を用いて算出した。サンプルサイズは、文献及び過去の経験に基づき適切な統計的検出力で選択した。分析から除外されたサンプルはなく、特記されたものを除き無作為化は行われなかった。動物群の割付けにおいて盲検化は行われなかったが、本試験におけるいくつかの測定（すなわち、腫瘍サイズ測定、組織学的検査のスコアリング）においては行われた。グラフのｙ軸のエラーバーは、図示されるように標準誤差（ＳＥＭ）又は標準偏差（ＳＤ）を表す。統計的計算はエクセル（マイクロソフト社）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）又はＲソフトウェア（https://www.r-project.org/)により行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１６０】
〔結果〕
ヒトＣＴＬＡ４ノックインマウスモデルは併用療法の免疫療法関連有害事象を忠実に再現する
併用療法における免疫療法関連有害事象のメカニズム及び予防的戦略を研究する際の主な課題は、マウスが顕著な有害事象を起こすことなく抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの高用量に耐えることである。本研究では、臨床で使用されるイピリムマブと、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂのパネルの中で最も強力なＬ３Ｄ１０と、の２つのヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂを選択した［２４、２８］。同じモデルで比較すると、２つのｍＡｂは腫瘍拒絶を引き起こす点で同等であった（図２１）。若いマウスは成体担腫瘍マウスの特徴を再現しつつ、より高レベルのＣＴＬＡ４を発現したため（図２２）、ヒトＣＴＬＡ４ノックイン（Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ）マウスを、周産期に、それぞれコントロール用のヒトＩｇＧ−Ｆｃ、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるイピリムマブ、Ｌ３Ｄ１０、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−１＋イピリムマブ、又は抗ＰＤ−１＋Ｌ３Ｄ１０で処置した。マウスを生後１０日目、１３日目、１６日目、及び１９日目に１００μｇ／マウス／注射の用量で処置し、経時的な体重増加率、及び６週齢における血液学的及び組織病理学的変化を評価した（図２３Ａ）。図２３Ｂに示すように、イピリムマブと抗ＰＤ−１の組み合わせは雌マウスの成長を大幅に遅らせたが、いずれの抗体も単独では体重増加に大きな影響を与えなかった。雄マウスでも抗ＰＤ−１＋イピリムマブに対して実質的かつ統計的に有意な成長の遅延がみられた（図２３Ｃ）。注目すべきことに、抗ＰＤ−１＋Ｌ３Ｄ１０を使用した場合には成長遅延は観察されなかった（図２３Ｂ及び図１Ｃ）。併用療法の造血に対する影響を研究するため、併用療法の開始後１か月後に全血球計算（ＣＢＣ）を実施した（図２４）。イピリムマブ＋抗ＰＤ−１で処置された大多数のマウスで血中ヘマトクリット（ＨＣＴ）、総ヘモグロビン（Ｈｂ）及び平均赤血球容積（ＭＣＶ）レベルの有意な低下が観察されたが、Ｌ３Ｄ１０＋抗ＰＤ−１を投与されたマウスは影響を受けなかった（図２３Ｄ）。白血球の存在は概ね正常であった（図２４）。これらのデータは、抗ＰＤ−１とイピリムマブの組み合わせは貧血を引き起こすが、抗ＰＤ−１とＬ３Ｄ１０の組み合わせは貧血を引き起こさないことを示している。単剤では、イピリムマブは、平均減少量は統計的に有意ではなかったものの、若いマウスの高割合で貧血を誘発したが、Ｌ３Ｄ１０では貧血は誘発されなかった。剖検後、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１投与マウスから得られた骨及び骨髄は青白く、骨髄での赤血球生成は非常に制限されていたことが明らかである。一方、Ｌ３Ｄ１０＋抗ＰＤ−１投与の骨及び骨髄はコントロールＩｇで処置されたマウスと同様であった（図２３Ｅ）。骨髄の赤血球系統の欠陥を定量化するため、骨髄細胞間のＣＤ７１及びＴｅｒ１１９マーカーの分布と細胞サイズを分析した。これらのマーカーは、赤血球発生の５つの段階をＩからＶの順で示すために用いられた：ステージＩ、ＣＤ７１＋Ｔｅｒ１１９−；ステージＩＩ、ＦＳＣ−ＡｈｉＣＤ７１＋Ｔｅｒ１１９＋；ステージＩＩＩ、ＦＳＣ−ＡｍｉＣＤ７１＋Ｔｅｒ１１９＋；ステージＩＶ、ＦＳＣ−ＡｌｏＣＤ７１＋Ｔｅｒ１１９＋；ステージＶ、ＣＤ７１−Ｔｅｒ１１９＋。図２３Ｆと図２３Ｇに示すように、抗ＰＤ−１＋イピリムマブ処置マウスは、��駆細胞の有意な増加（ステージＩ）と成熟赤血球の頻度の減少（ステージＶ）を示し、明らかに重度の貧血を示した。一方、Ｌ３Ｄ１０と抗ＰＤ−１で処置されたマウスは、骨髄において赤血球の正常な分布と成熟を示した。
【０１６１】
Ｌ３Ｄ１０と併せて抗ＰＤ−１を受けたＣＴＬＡ４ｈ／ｈマウスと、イピリムマブと併せて抗ＰＤ−１を受けたＣＴＬＡ４ｈ／ｈマウスとの間の成長速度の劇的な違いは、これらの２つの抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂが非常に異なる有害事象を誘発し得ることを示唆している。この可能性をテストするため、マウスを生後４２日齢に達した時点で安楽死させ剖検を行った。抗ＰＤ−１＋イピリムマブで治療されたマウスでは顕著な心臓肥大が観察されたが、抗ＰＤ−１＋Ｌ３Ｄ１０で治療されたマウスでは観察されなかった（図２５Ａ）。肥大した心臓は、右心室と左心室の両方の心室の拡張を示し、左心室でより顕著であった。これは重度の拡張型心筋症を示している。左心室と心室中隔心筋壁の厚さは、ｈＩｇＧ処置群の心臓と比較して５０％以上減少した（図２５Ｂ）。組織学的検査では、心内膜及び心筋に広範かつ大量のリンパ球浸潤を伴う心筋炎、心筋細胞の変性、並びに炎症病巣における構造的破壊がみられた（図２５Ｃ）。免疫組織化学検査では、抗ＰＤ−１＋イピリムマブ処置マウスの心臓において、大量のＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が観察され（図２５Ｄ、上部パネル）、これはＴ細胞媒介性の病理と一致する。これらの細胞には、ＣＤ４とＣＤ８のいずれのＴ細胞サブセットも含まれていた（図２５Ｄ、下部パネル）。抗ＰＤ−１＋イピリムマブ処置マウスの炎症部位にはＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が存在した。これは、Ｔｒｅｇの存在にもかかわらず組織破壊が起こったことを示唆している（図２５Ｄ）。Ｌ３Ｄ１０＋抗ＰＤ−１併用療法又はイピリムマブ単独療法を受けたマウスでは軽度から中程度の炎症が観察された。一方、Ｌ３Ｄ１０単独療法も抗ＰＤ−１単独療法も検出可能な炎症を引き起こさなかった（図２５Ｅ）。Ｃ５７ＢＬ／６背景のマウスはＢＡＬＢ／ｃ背景を持つマウスとは異なりＰｄ１遺伝子を欠損させた場合であっても心疾患を発症しなかったため［２９］、抗ＰＤ−１処置が心臓の炎症を誘発しなかったのはＣ５７ＢＬ／６背景のマウスを使用したことに起因する可能性がある。心臓の他、イピリムマブと抗ＰＤ−１  ｍＡｂの組み合わせは雌の尿生殖器に重度の欠陥を引き起こし、卵巣と子宮の形成不全の組織学的所見が認められた（図２６）。副腎機能の欠陥と一致して、副腎皮質刺激ホルモンの有意な上昇が観察された。これは副腎によるコルチゾールの不完全な産生に対する反応である可能性が高い（図２７）。
【０１６２】
組織破壊に対する抗ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４及びこれらの組み合わせの影響を定量的に分析するため、コントロールＩｇ又は免疫療法抗体の投与を受けたマウスからの内臓及び腺の組織学的分析を行った。臓器と腺を１０％ホルマリンで固定し、切片にしてヘマトキシリンとエオシン（ＨＥ）で染色し、二重盲検的にスコアを付けた。代表的なスライドを図２８Ａに示し、各グループの個々のマウスのスコアを図２８Ｂに示す。全ての臓器の複合スコアを図２８Ｃに示す。Ｌ３Ｄ１０単独療法は検査したどの臓器にも重度の炎症を誘発せず、安全性が確認された。一方、イピリムマブ単独療法によって全てのマウスで中等度から重度の炎症が誘発され、これはコントロールＩｇ、抗ＰＤ−１、及びＬ３Ｄ１０単独療法群において時折起こるベースラインの炎症よりも有意に強い。イピリムマブは抗ＰＤ−１と組み合わせると全てのマウスに炎症を引き起こし、全ての主要臓器に重度の炎症が見られた。特筆すべきことに、抗ＰＤ−１及びイピリムマブ処置マウスでは、結腸の組織学的所見の最も重篤な形態でありクローン病の特有の病理学的特徴である貫壁性炎症が観察されたが、他のグループではこれは観察されなかった。全ての臓器のスコアを組み合わせると、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１はＬ３Ｄ１０＋抗ＰＤ−１治療よりも劇的に強い炎症を誘発したことが明らかである（図２８Ｃ）。さらに、イピリムマブ単独でも、抗ＰＤ−１単独又はＬ３Ｄ１０単独と比べて単剤として有意に強い有害事象を誘発した（図２８Ｃ）。
【０１６３】
イピリムマブ＋抗ＰＤ１は全身性Ｔ細胞活性化と自己反応性エフェクターＴ細胞の増殖を誘導するが、Ｌ３Ｄ１０＋抗ＰＤ−１はこれらを誘導しない
イピリムマブ＋抗ＰＤ−１併用療法により誘発された重篤な有害事象のメカニズムを理解するために、コントロールＩｇＧ、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１、及びＬ３Ｄ１０＋抗ＰＤ−１をそれぞれ投与されたマウスの３群におけるＴ細胞の頻度及び機能的サブセットを分析した。図２９Ａに示されるように、３群のＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の頻度は実質的に同じであった。ＣＤ４４マーカー及びＣＤ６２Ｌマーカーを使用すると、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１グループでエフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏ）の大幅な増加が観察されたが、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｈｉ）の頻度は影響を受けていなかった（図２９Ｂ及び４Ｄ）。これと対応して、抗ＰＤ−１及びイピリムマブ治療群ではナイーブＴ細胞の頻度は大幅に減少していた（図２９Ｂ及び４Ｄ）。Ｔｒｅｇの頻度は脾臓で有意に上昇していたため、異常なＴ細胞の活性化はＴｒｅｇの枯渇によるものではない（図３０）。
【０１６４】
免疫療法関連有害事象の病因を理解するため、自己反応性Ｔ細胞に対する免疫療法の影響を理解することは非常に重要である。この問題に対処するために、内因性の自己抗原がいくつかの選択的Ｖβによって認識されるという事実を利用した［３０］。Ｃ５７ＢＬ／６マウスには内因性スーパー抗原を提示するＩＥがないため、（Ｂ６．Ｃｔｌａ４ｈ／ｈ×ＢＡＬＢ／ｃ野生型）Ｆ１×Ｆ１交配によりＦ２マウスを作製し、この子孫をＨ−２ｄハプロタイプ（ＢＡＬＢ／ｃ背景の場合）とＨ−２ｂハプロタイプ（Ｃ５７ＢＬ／６背景の場合）を区別するｍＡｂを使用して分類した。尾ＤＮＡのＰＣＲを使用して、マウスＣｔｌａ４アレルとヒトＣＴＬＡ４アレル、及び内因性ウィルススーパー抗原（ＶＳＡｇ）８、９の状態を決定した（図３１Ａ）。
【０１６５】
山口らは、Ｃｔｌａ４の標的突然変異を有するマウスを用いて、ＣＴＬＡ４の標的変異がエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の割合を増加させたことから、ＣＴＬＡ４はＶβ５、Ｖβ１１、及びＶβ１２を発現するＴ細胞をＴｒｅｇに変換するのに役立つことを示した［３１］。そのため、Ｈ−２ｄ＋ＣＴＬＡ４ｈ／ｈマウスのウィルススーパー抗原（ＶＳＡｇ）反応性Ｔｅｆｆ及びＴｒｅｇに対する抗ＰＤ−１＋イピリムマブ又は抗ＰＤ−１＋Ｌ３Ｄ１０の影響を分析した（図３１Ｂ）。ウィルススーパー抗原（ＶＳＡｇ）８、９と反応するＶβ１１を使用した代表的なデータを図３１Ｃに示し、ＶＳＡｇ反応性Ｔ細胞のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比の要約を図３１Ｄに示す。具体的なＶβのデータは補足表２に提供されている。
【０１６６】
【表２】
2021511812.tif 000003
【０１６７】
図３１Ｃに示されるように、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１はＦｏｘｐ３−Ｖβ１１＋ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を倍増させたが、Ｆｏｘｐ３＋Ｖβ１１＋ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度は３０％しか増加させなかった。したがって、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１は自己反応性Ｔ細胞の頻度を増加させるだけでなく、自己反応性Ｔ細胞中のＴｒｅｇの頻度を減少させた。非ウィルススーパー抗原（ＶＳＡｇ）反応性Ｔ細胞（Ｖβ８＋）の頻度は、Ｆｏｘｐ３の発現に関わらず影響を受けなかった。一方、抗ＰＤ−１＋Ｌ３Ｄ１０はＣＤ４  Ｔ細胞の頻度に影響を与えなかった。Ｖβ５＋及びＶβ１２＋ＣＤ４  Ｔ細胞の間でもＶＳＡｇ反応性エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の選択的増加が観察された（表２）。結果として、抗ＰＤ−１＋イピリムマブを投与された研究された全てのマウスにおいて、ＶＳＡｇ反応性ＣＤ４  Ｔ細胞のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比は有意に減少した（Ｐ＝０．００２６）。Ｖβ８間のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比は影響を受けなかったため、この減少はＶＳＡｇ反応性Ｔ細胞に選択的であった。これらのデータは、自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的抑制が抗ＰＤ−１＋イピリムマブ処置によって弱められることを示している。さらに、処置がＴ細胞増殖中にＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比に影響するかどうかを調べるため、ＶＳＡｇ反応性胸腺細胞におけるＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比も分析した。図３１Ｅに示されるように、抗ＰＤ−１＋イピリムマブは胸腺細胞間のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比に影響を与えなかった。
本研究で使用された抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂはヒトＣＴＬＡ４と反応するがマウスＣＴＬＡ４とは反応しないため（図３２）、マウスＣｔｌａ４アレルとヒトＣＴＬＡ４アレルを有するヘテロ接合性マウス（Ｃｔｌａ４ｈ／ｍ）では全てのＣＴＬＡ４分子の機能を阻害することができない。最大５０％のＣＴＬＡ４のエンゲージメントでも、ウィルススーパー抗原（ＶＳＡｇ）反応性Ｔ細胞のＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比の低下を引き起こすのに十分であるかどうかを試験した。図３１Ｄに要約されているように、ＣＴＬＡ４ｈ／ｍマウスでは、抗体処置に関係なく、Ｔｒｅｇに対する従来型Ｔ細胞の比率の変化は観察されなかった。
【０１６８】
ヒト化Ｌ３Ｄ１０クローンは強力ながん免疫療法効果を示すが免疫療法関連有害事象は最小限である
Ｌ３Ｄ１０抗体を臨床試験にトランスレーションする第１のステップとして、Ｌ３Ｄ１０をヒト化し、同様のＣＴＬＡ４に対する結合を有する２つのクローンを作製し、これらを免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果についてイピリムマブと比較した。図３３Ａに示されるように、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスにおいてイピリムマブは抗ＰＤ−１と組み合わせると成長遅延を引き起こしたが、ＨＬ１２及びＨＬ３２では抗ＰＤ−１と組み合わせても成長遅延は引き起こされなかった。イピリムマブとは対照的に、ＨＬ１２もＨＬ３２もＨＣＴとＨｂで測定される貧血を誘発しなかった（図３３Ｂ）。組織病理学的分析により、ＨＬ１２及びＨＬ３２を抗ＰＤ−１と組み合わせると、ごく一部のマウスでは肺及び唾液腺に中程度の炎症が観察されたものの、心臓、肝臓、結腸、又は腎臓では炎症が引き起こされないことが確認された（図３３Ｃ）。複合病理スコアによると、ＨＬ１２とＨＬ３２は併用療法においてＬ３Ｄ１０よりも炎症の誘発がさらに軽度であることが明らかになった（図３３Ｄと図２８Ｃを比較）。さらに、これらのヒト化クローンを抗ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用した場合、Ｔ細胞の全身性活性化は誘導されなかった（図３４）。したがって、Ｌ３Ｄ１０の安全性プロファイルは、ヒト化によって損なわれていなかった。
【０１６９】
ＨＬ１２及びＨＬ３２の向上した安全性が治療効果と引き換えに達成されたものであるかどうかを決定するために、これらの治療効果についてまずイピリムマブをＨＬ１２及びＨＬ３２と比較した。以前の研究によると、抗マウスＣＴＬＡ４  ｍＡｂ単独療法は、Ｃ５７ＢＬ／６起源の結腸がん細胞系ＭＣ３８及びＢＡＬＢ／ｃ起源のＣＴ２６の拒絶を誘発できることが明らかとなっている。そのため、ＢＡＬＢ／ｃ．Ｃｔｌａ４ｍ／ｍマウスとＣ５７ＢＬ／６．Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスを交配させてＦ１マウス（Ｃｔｌａ４ｈ／ｍ）を作製した。図３５に示されるように、ＭＣ３８腫瘍はコントロールＩｇ処置マウスでは妨げられずに増殖するが、低用量の抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂを追加すると腫瘍の増殖が妨げられた。３０μｇ／注射、４回の用量で、全ての抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは同等に強力であった（図３５Ａ）。１０μｇ／注射、４回の低用量では、ＨＬ３２はイピリムマブやＨＬ１２よりも若干強力のようであったが、その差は統計的に有意ではなかった（図３５Ｂ）。ＣＴ２６は、抗ＣＴＬＡ４免疫療法に対してＭＣ３８よりも若干耐性があるため、より高用量を必要とする。高用量の抗体を使用した場合、３つのｍＡｂは全て統計的に有意な成長阻害を引き起こした（図３５Ｃ）。より低用量では、イピリムマブは腫瘍増殖を若干減少させたものの、減少は統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．２９）。一方、ＨＬ１２とＨＬ３２は両方とも明らかな増殖阻害を誘発した（Ｐ＜０．００１）（図３５Ｄ）。Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍モデルを使用した場合、両方の抗体とも有意な阻害を達成した（図３５Ｅ及び３５Ｆ）。総合すると、ヒト化Ｌ３Ｄ１０クローンであるＨＬ１２及びＨＬ３２は、腫瘍拒絶の誘発において少なくともイピリムマブと同程度に強力である。したがって、ヒト化マウスモデルにより、非常に安全であり、少なくとも同程度に強力な抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを特定することができた。
【０１７０】
Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスでは、ヒトＣＴＬＡ４のエンゲージメントは腫瘍拒絶反応の誘発には十分であるが、自己免疫疾患には不十分である
イピリムマブがＣＴＬＡ４ｈ／ｍマウスにおいて腫瘍拒絶を誘発できるという上記のデータは、このｍＡｂが細胞表面ＣＴＬＡ４の一部のみエンゲージした場合に免疫療法関連有害事象を誘発しうるかどうかに関しての興味深い問題を提起した。本研究で使用された抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂはマウスＣＴＬＡ４分子と反応しないため（図３２）、Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスで免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果を比較することにより、免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果が同様のレベルの受容体エンゲージメントを必要とするかどうかを評価した。驚くべきことに、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスで成長遅延を誘発した場合と同じ用量のイピリムマブ＋抗ＰＤ−１（図２３Ａ）は、Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスでは成長遅延を誘発しなかった（図３６Ａ）。免疫療法関連有害事象がみられないことと一致して、組織病理学的分析により、唾液腺の中程度の炎症を除いて、抗ＰＤ−１＋イピリムマブは分析した他の臓器に炎症を引き起こさないことが明らかになった（図３６Ｂ）。一方ホモ接合型マウスでは、上記で使用された用量と同じ用量で実質的に全ての分析された臓器で重度の炎症が引き起こされている（図２５及び図２８）。同様に、抗ＰＤ−１＋イピリムマブで処置したＣｔｌａ４ｈ／ｍマウスでは貧血は観察されなかった（図３６Ｃ）。しかしながら、イピリムマブによる免疫療法に関してはヘテロ接合型マウスはホモ接合型マウスとほとんど同様の反応性を示した（図３６Ｄ）。したがって、免疫療法関連有害事象とがん免疫は遺伝的に連動していない可能性がある。ヒトＣＴＬＡ４遺伝子は優性的様式でイピリムマブに対するがん免疫療法効果反応を起こさせるが、ヒトＣＴＬＡ４遺伝子の免疫療法関連有害事象に対する役割は劣性である。これらのデータは、免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果の原因となるメカニズムは異なることを示唆している。
【０１７１】
ホモ接合型マウスでの観察とは対照的に（図２９）、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１の組み合わせは、Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスではＴ細胞の全身活性化を誘導しなかった（図３６Ｅ）。この異なる自己免疫有害作用を理解するために、ヒトＣＴＬＡ４ホモ接合及びヘテロ接合型マウスにおける抗ＰＤ−１＋イピリムマブのＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比に対する影響を分析した。図３１Ｃ及び図３１Ｄに示されるように、ホモ接合型マウスでＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比を低下させる処置と同一の処置は、ヘテロ接合型マウスでは効果がない。この異なる遺伝的要件は、自己免疫有害作用ががん免疫とは連動しない可能性があるという知見をより強固なものとする。全身性Ｔ細胞活性化が起こらないこと、及び自己反応性Ｔｅｆｆの選択的増加がみられないことは、Ｃｔｌａ４ｈ／ｍマウスにおいて免疫療法関連有害事象が起こらないことの説明となる。
【０１７２】
同一の設定での免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果の観察
これまで、免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果のより頑健な評価を可能にするために、それぞれ別個の設定を使用してきたが、同じ設定下でも免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果が観察されうることを示すことは興味深い。この目標を達成するために２つのアプローチをとった。まず、抗ＣＴＬＡ４抗体処置を受けている若い成体マウスの心臓の有害作用を、血清マーカーとしての心筋トロポニンＩ（ＴＮＮＩ３、様々な心疾患の一般的な診断マーカー）と組織学分析の両方に基づいて評価した。図３７Ａに示されるように、６〜７週齢の若い成体マウスにおいて、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは同様に頑健な腫瘍拒絶を誘発した。腫瘍拒絶は同様であったにもかかわらず、３つのｍＡｂはそれぞれ異なる有害な心臓欠陥を誘発した。特に、イピリムマブは高レベルのＴＮＮＩ３を誘導した（図３７Ｂ）。これに対応して、組織学的分析により、広範囲の心膜炎症（図３７Ｃ、下部パネル）を伴う筋細胞内外の広範なヒアリン沈着が明らかになった（図３７Ｃ、上部パネル）。ＨＬ１２で処置されたマウス血清でも、より低いレベルではあるが顕著なＴＮＮＩ３が観察され、これと対応する程度低いレベルの心臓のヒアリン化及び炎症も観察された。一方、ＨＬ３２処置マウスでは、血清ＴＮＮＩ３の上昇はなく、またこれと対応するように、ヒアリン化や炎症の組織学的所見も観察されなかった。イピリムマブの治療効果は、抗ＰＤ−１と組み合わせると、単独療法と併用療法との間で同等であった（図３７Ｄ）。心毒性は増加したが、毒性研究における典型的な高い固体差のため、イピリムマブ単独群とイピリムマブ＋抗ＰＤ−１群の間に統計的有意性はなかった（図３７Ｅ）。
【０１７３】
逆に、がん免疫療法効果は、免疫療法関連有害事象の評価において頑健な１０日齢のマウスを使用して試験した。図３７Ｆに示されるように、ＭＣ３８腫瘍は１０日齢のマウスに移植された後、次第に成長した。特筆すべきことに、この若いマウスは、急速な腫瘍の退縮（図３７Ｆ）及び広範なサーバー（ｓｅｒｖｅｒ）臓器の炎症（図３７Ｇ）に示されるように、腫瘍拒絶及び免疫療法関連有害事象の誘発のいずれにおいてもイピリムマブに高い反応性を示した。
【０１７４】
全身性Ｔ細胞活性化は免疫療法関連有害事象と強く相関している
本研究で用いた様々な抗体は免疫療法関連有害事象及び末梢Ｔ細胞活性化についてそれぞれ異なるプロファイルを示すため、末梢Ｔ細胞活性化が免疫療法関連有害事象と関係するかどうかを決定することは興味深い。図３８Ａ及び３８Ｄに示されるように、コントロール又は５つの異なる抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂｓ投与のいずれかを受けたマウスの個別の免疫療法関連有害事象スコアは、脾臓のナイーブＣＤ４及びナイーブＣＤ８  Ｔ細胞の割合と負に相関している。セントラルメモリーＴ細胞の割合は、そのような相関関係を示さない（図３８Ｃ及び図１０Ｆ）。一方、エフェクターメモリーＴ細胞の割合は、免疫療法関連有害事象と正に相関する（図３８Ｂ及び図３８Ｅ）。強い相関関係は、末梢における広範なＴ細胞活性化が免疫療法関連有害事象の根本的な原因である可能性があることを示唆している。
【０１７５】
〔考察〕
免疫療法関連有害事象が新たな臨床的事項であることが記載されて以来［１０］、がん免疫療法の進歩におけるこの大きな障壁を克服するために、マウスモデルにおける状態のモデル化への関心が高まっている。しかしながら、免疫系ががん組織と慢性的に相互作用しているヒトのがん患者とマウスの腫瘍モデルとは異なることにおそらく起因して、その進展は遅い。さらに、免疫療法関連有害事象は薬物特異的である可能性が高いため、１つの抗マウスＣＴＬＡ４  ｍＡｂを用いて特定の抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂの免疫療法関連有害事象をモデル化することは困難である。本開示における我々の研究では、ヒトＣＴＬＡ４ノックインマウスを使用して、臨床で使用されている抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの免疫療法関連有害事象を評価した。このモデルは、単独での又は抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせたイピリムマブに関連するほとんどの病理学的観察（心臓、肺、肝臓、腎臓、腸等の臓器への重度の炎症を含む）をうまく再現できたことが示された。このモデルでは、赤芽球癆等、イピリムマブに関連する希少な疾患［１９、２０］も観察された。
【０１７６】
これらのモデルはイピリムマブと抗ＰＤ−１の組み合わせを模倣するために使用することはできるが、抗ＰＤ−１単独では本モデルでは免疫療法関連有害事象を誘導しなかったことに注意が必要である。臨床的観察と一致して、イピリムマブは単独でも複数の臓器の炎症に基づく顕著な有害作用を誘発するものの、その重症度は併用療法よりもかなり低い。また、重度の免疫療法関連有害事象を観察するためには、非常に若いマウスを使用する必要があった。しかし、有害作用の重症度はやや下がるが、心臓病（図３７）と腎臓破壊（図３９）の検体検査所見と病理学的所見が観察された。２つのヒト化Ｌ３Ｄ１０クローンのうち、心臓の病変の原因となる点において、一方は他方のクローンよりも安全と考えられる点は興味深い。全体として、ヒト化後に、有効性を損なうことなく安全性の向上が観察された（図４０）。したがって、Ｃｔｌａ４ｈ／ｈマウスを用いて、類似性の高い抗体を識別し、それによりさらなる臨床開発のためのサブクローンを選択することができる。関連研究では、ヒト化によって、治療効果又は安全性は損なわれることなくＬ３Ｄ１０の阻害的（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）活性が大幅に低減されたことが示されており、これはがん免疫療法効果も免疫療法関連有害事象もＣＴＬＡ４−Ｂ７相互作用の阻害に関連しないことをさらに示唆している。
【０１７７】
抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの免疫療法関連有害事象を評価するためには非常に若いマウスが最適であるが、これらはまた、イピリムマブ処置後に強いがん免疫療法効果も示す。若いマウスにおいて、成長遅延、生殖器系の発達障害等の免疫療法関連有害事象の多くが観察されたため、本開示に説明されるモデルは、小児がん患者にとって特に重要な潜在的な免疫療法関連有害事象の予測に役立つ可能性がある。
【０１７８】
若いマウスにおいて、リンパ球減少症によってＴ細胞の広範な恒常性増殖がみられることが確立されている［３２、３３］。がん患者や若いマウスではリンパ球減少がみられることが多く、リンパ球減少症は恒常的増殖及び自己免疫疾患と関連していることから［３４、３５］、リンパ球減少症が免疫療法関連有害事象の補助的因子であるかどうかを検討することは非常に興味深い。この場合、リンパ球減少症を免疫療法関連有害事象の潜在的なバイオマーカーとして使用できる可能性がある。さらに、上記データは担腫瘍マウスがより高レベルのＣｔｌａ４を発現する点において若いマウスと類似することを示しており、若いマウスのデータは、腫瘍を有する宿主のデータの参考となる可能性がある。若いマウスにおける心筋炎、再生不良性貧血、及び内分泌障害を含む臓器炎症のスペクトルは、臨床所見を再現しており、本論文の強力な裏付けとなる。
【０１７９】
Ｌｉｕらは、最近、部分的なＴｒｅｇ枯渇を使用して、マウスの免疫療法関連有害事象への感受性を高めた［３６］。このモデルは免疫療法関連有害事象のいくつかの病理学的特徴を再現したが、ヒトＣＴＬＡ４ノックインマウスにイピリムマブを用いたときに観察された特徴のように（データ未掲載）、イピリムマブはヒトがん患者においてＴｒｅｇを枯渇させるのではなく、むしろ全身的に増加させる［３７］。そのため、Ｔｒｅｇ枯渇ベースのモデルががん患者の免疫療法関連有害事象の原因を反映する可能性は低い。一方、併用療法によりＴｒｅｇ／Ｔｅｆｆ比が低下することが判明したため、Ｔｒｅｇの全体的な欠陥が免疫療法関連有害事象のいくつかの病理学的特徴を再現している可能性はある。
【０１８０】
ヒトＣＴＬＡ４アレルについてホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかであるマウスを使用した場合、免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果は遺伝的に連動していない可能性がある。そのため、免疫療法関連有害事象はホモ接合型マウスでしか観察されないが、がん免疫療法効果はヘテロ接合型マウスとホモ接合型マウスのいずれでも観察される。この遺伝的要件の顕著な違いは、免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果の異なるメカニズムを示唆している。すなわち、免疫療法関連有害事象はイピリムマブにより引き起こされたＣＴＬＡ４機能の喪失を表すが、がん免疫療法効果はヒトＣＴＬＡ４遺伝子の機能の獲得を表す。
【０１８１】
免疫学的な根拠として、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１はホモ接合型マウスでは広範なＴ細胞活性化を誘発したが、ヘテロ接合型マウスではこれを誘発しなかったことから、上記の異なる遺伝的要件は全身的Ｔ細胞活性化に反映される。内因性スーパー抗原反応性を自己反応性のマーカーとして使用して、イピリムマブ＋抗ＰＤ−１は自己反応性Ｔ細胞のＴｒｅｇへの変換を妨げ、この結果、自己反応性Ｔｒｅｇに対して自己反応性エフェクター細胞の比率が増加することが見出された。我々の以前の研究では、ＴｒｅｇがエフェクターＴ細胞と共通の抗原特異性を有している場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化の抑制にはＴｒｅｇが最も効果的であることが示されている［３８］。したがって、図４１Ａで提案されているように、自己反応性Ｔｒｅｇに対する自己反応性エフェクターＴ細胞の比率が大きくなることにより、自己反応性Ｔ細胞の活性化が可能になり、これが自己免疫疾患につながった。
【０１８２】
ＣＴＬＡ４遺伝子の両アレル欠失により、自己反応性Ｔ細胞のＴｒｅｇへの変換が減少することが示されている［３１］。自己免疫性エフェクターＴ細胞／制御性Ｔ細胞の比率の増加は自己免疫疾患につながる可能性があるため、免疫療法関連有害事象に抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂによる両アレル性のエンゲージメントが必要であることは、上記変換にＣＴＬＡ４の両アレルのエンゲージメントが必要であることによって少なくとも一部説明される。Ｃｔｌａ４遺伝子座の遺伝的不活性化と、両アレル性の抗体のエンゲージメントとの間の一致は、イピリムマブがいくらかＣＴＬＡ４分子を不活性化したという興味深い可能性を示唆している。関連する研究においてイピリムマブが生理的条件下でＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用を阻害しないことが示されているため、イピリムマブがＣＴＬＡ４分子を不活性化するメカニズムは今後解明の余地がある。
【０１８３】
がん免疫療法効果におけるヒトＣＴＬＡ４の優性的な機能と一致して、本発明者らによるものを含むいくつかの最近の研究では、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇの局所的枯渇の重要な役割が示されている。そのため、Ｓｅｌｂｙらは、同一のＦｖ及び異なるＦｃアイソタイプを有する抗マウスＣＴＬＡ４  ｍＡｂを用いて、抗マウスＣＴＬＡ４  ｍＡｂの腫瘍拒絶を誘発する能力はＦｃ部分により決定されることを示している［１６］。具体的には、ＩｇＧ２ａやＩｇＧ２ｂ等の、ＦｃｇＲを活性化する親和性が強いものは、腫瘍微小環境で腫瘍拒絶反応及びＴｒｅｇ枯渇を効果的に誘発することができる。一方、親和性が弱いものは、これを効果的に誘発することはできなかった。この概念と一致して、Ｂｕｌｌｉａｒｄら［１８］は、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂ誘発性の腫瘍拒絶には活性化シグナル伝達受容体サブユニットをコードするＦｃｅｒ１遺伝子が必須であることを示している。さらに、Ｓｉｍｐｓｏｎらは、Ｆｃｅｒ１でコードされたサブユニットを組み込んだＦｃγＲの活性化の中で、腫瘍拒絶とＴｒｅｇの枯渇には活性化ＦｃγＲＩＶのエンゲージメントが必要であることを示した［１７］。これは、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂのＦｃ部分と好中球又はマクロファージのＦｃＲの相互作用が必要であることを示唆している。関連論文における我々のデータはさらに抗ＣＴＬＡ４誘発性の腫瘍拒絶にはＴｒｅｇ枯渇が必要であるがＢ７−ＣＴＬＡ４の相互作用は必要ないことを示している（図４１Ｂ）。複数のＣＴＬＡ４  ｍＡｂは腫瘍拒絶反応では同等であったが、末梢Ｔ細胞活性化の誘導には大きなばらつきがあるため、これらのデータは、抗ＣＴＬＡ４抗体が末梢のナイーブＴ細胞活性化を刺激することにより腫瘍拒絶反応を促進するという知見と一致しない。免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果に関連する異なるメカニズムと局所性は、末梢リンパ器官における全身性のＴ細胞の活性化を回避しながら優先的に腫瘍微小環境内のＴｒｅｇ枯渇を引き起こしうるより効果的で安全なＣＴＬＡ４標的化試薬の製造における新しい知見を提供する。
【０１８４】
標準的なチェックポイント阻害仮説は、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂがリンパ器官のナイーブＴ細胞の活性化を誘導することにより腫瘍拒絶を誘導することを示唆してきた。一方、上述のデータは、実際には、ｍＡｂがリンパ器官のＴ細胞の全身的な活性化を引き起こす能力が、がん免疫療法効果よりもむしろ免疫療法関連有害事象と関連していることを示している。このことは、併用療法により引き起こされる免疫療法関連有害事象スコアと全身性Ｔ細胞活性化の間の驚くべき相関関係により強調されている。一方、関連研究によると、イピリムマブが抗原特異的Ｔ細胞の新規プライミングなしに腫瘍拒絶を誘発しうることが示されている。これは、イピリムマブ処置時にはＴ細胞のプライミングが既に達成されているためである。この時点では、リンパ系器官におけるＴ細胞のプライミングではなく、Ｔｒｅｇによる局所抑制の解除が、がん免疫が開始されるポイントとなる。
【０１８５】
総合すると、本研究は、安全でより効果的な免疫療法抗体の開発のために、免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果を切り離せるかどうかという根本的問題に対処することを目的としている。本開示では、免疫療法関連有害事象を忠実に再現する新たなモデルが説明されており、このモデルを使用することにより、免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果が本質的に連結していないことが示された。この概念は、イピリムマブと少なくとも同等の効果を有し、かつ毒性が大幅に低い治療用抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂを特定するための基盤を提供する。このデータは、ヒト化Ｌ３Ｄ１０クローンがヒトのがん治療の治療法開発の潜在的な候補であることを示している。腫瘍微小環境でのＴ細胞活性化はがん免疫を伴うが、末梢リンパ器官での全身的Ｔ細胞活性化は自己免疫のリスクを伴うという知見（図４１）は、標的の選択や標的治療薬候補に幅広い示唆を与えるであろう。
【０１８６】
本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物及び特許出願がその全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、本開示に参照により組み込まれる。本発明をその具体的実施形態について説明してきたが、さらなる変形が可能であり、本出願は、概して本発明の原理に従って、本発明の分野の慣例の範囲内であり前述の本質的特徴に適用することができる本開示からの逸脱も含め、いかなる変形例、用途、又は適応をも包含することを意図していることが理解されよう。
【０１８７】
＜実施例３＞
抗体に誘導されるリソソーム分解は抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体の免疫療法関連有害作用の根底にある
マウスでもヒトでも、ＣＴＬＡ４の標的変異によって強力な自己免疫の表現型が与えられた場合、免疫療法関連有害事象が、抗体に誘発される受容体のダウンレギュレーションに関連する可能性があることが提案されている。この仮説を試験するため、外因性のヒトＣＴＬＡ４分子を発現する複数の細胞系を作製し、臨床薬であるイピリムマブのＣＴＬＡ４発現に対する影響を試験した。イピリムマブは、ｈＣＴＬＡ４トランスフェクト２９３Ｔ細胞（図４２Ａ〜Ｄ）でもヒトＣＴＬＡ４を発現するＣＨＯ安定発現細胞系（図４２Ｅ〜Ｇ）でもＣＴＬＡ４、特に細胞表面ＣＴＬＡ４のダウンレギュレーションを誘導することがわかった。ＣＴＬＡ４はもともと細胞内に存在し、活性化に伴い細胞表面に再循環するため、ＣＴＬＡ４の細胞表面への発現はイピリムマブのＣＴＬＡ４のダウンレギュレーション誘発能をつかさどる主要因子である可能性がある。未処置の成体マウスでは、制御性Ｔ細胞上に検出される細胞表面ＣＴＬＡ４はごくわずかである（データ未掲載）。これと対応して、イピリムマブはナイーブマウスでＣＴＬＡ４の有意なダウンレギュレーションを引き起こさなかった。一方、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞は非常に高いレベルの細胞表面ＣＴＬＡ４を発現し、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもイピリムマブによって大幅にダウンレギュレートされる（図４２Ｈ〜Ｉ）。
【０１８８】
細胞表面ＣＴＬＡ４の抗体誘発性ダウンレギュレーションが免疫療法関連有害事象への感受性に寄与するかどうかを試験するために、イピリムマブで処置されたｉｒＡＥ  ＣＴＬＡ４ｈ／ｈ−ノックイン（ＫＩ）新生仔マウスモデルで、Ｔｒｅｇ間の細胞表面ＣＴＬＡ４レベルを分析した。本モデルでは、成体マウスと比較してＴｒｅｇは非常に高レベルの表面ＣＴＬＡ４を発現し、イピリムマブと抗ＰＤ−１の併用治療により重度の免疫療法関連有害事象が引き起こされることが示されている（１８）。興味深いことに、抗ＰＤ−１治療と組み合わせると、肺及び脾臓のＴｒｅｇでＣＴＬＡ４の発現が顕著に増加することがわかった（図４３Ａ）。イピリムマブと抗ＰＤ−１の併用治療により、表面ＣＴＬＡ４及び細胞内ＣＴＬＡ４のいずれも、抗ＰＤ−１処置なしのＴｒｅｇと同レベルにまで有意なダウンレギュレーションが引き起こされることが分かった（図４３Ａ）。さらに、健康なドナーの血液からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を刺激することにより、ヒト系におけるイピリムマブによるＣＴＬＡ４のダウンレギュレーションを試験した。活性化されていないヒト血液Ｔｒｅｇでは、細胞表面のＣＴＬＡ４レベルが非常に低かった（データ未掲載）。抗ＣＤ３による活性化及び抗ＣＤ２８による刺激の後、細胞表面ＣＴＬＡ４は劇的に増加し、これはイピリムマブによって有意にダウンレギュ―レートされた（図４３Ｂ〜Ｃ）。
【０１８９】
同様のがん免疫治療効果を有する異なる抗ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡＢが様々な免疫療法関連有害事象を引き起こすことが示されている（１８）。臨床薬であるイピリムマブは、抗ＰＤ−１との併用治療において重度の免疫療法関連有害事象を誘発したが、ヒトＣＴＬＡ４  ｍＡｂであるＨＬ１２及びＨＬ３２は抗ＰＤ−１との併用治療において重度の免疫療法関連有害事象を誘発しなかった。トレメリムマブと同じ配列で作製された抗ＣＴＬＡ４モノクローナルＩｇＧ１抗体も、ＣＴＬＡ４ｈ／ｈ−ＫＩ新生仔マウスモデルにおいて、がん免疫療法効果の可能性を有しながら、免疫療法関連有害事象を引き起こした（図４４Ａ〜Ｃ）。そこで、これらの抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂによるＣＴＬＡ４ダウンレギュレーションの効果を比較した。図４４Ｄ〜Ｆに示されるように、イピリムマブとトレメリムマブ（ＩｇＧ１）は外因性ＣＴＬＡ４を発現するヒト細胞系において表面ＣＴＬＡ４及び細胞内ＣＴＬＡ４を選択的にダウンレギュレーションするが、ＨＬ１２とＨＬ３２ではダウンレギュレーションはおこらない。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、強い有害作用を引き起こすイピリムマブはｉｒＡＥ  ＣＴＬＡ４ｈ／ｈ−ＫＩ新生仔マウスモデルの肺及び脾臓のＴｒｅｇの表面ＣＴＬＡ４レベル及び細胞内ＣＴＬＡ４レベルをダウンレギュレートするが、免疫療法関連有害事象を引き起こさないＨＬ１２ではダウンレギュレーションが起こらないことが分かった（図４４Ｇ〜Ｈ）。イピリムマブ処置及びＨＬ１２処置されたヒト活性化Ｔｒｅｇ細胞で似たような結果が示された（図４４Ｉ）。これらのデータは、抗体に誘発される表面ＣＴＬＡ４のダウンレギュレーションが免疫療法関連有害作用の原因となるという重要な証拠を提供する。
【０１９０】
ＣＴＬＡ４は構成的に細胞膜から内部移行し、再循環及び分解のいずれも受けるため（１９）、表面ＣＴＬＡ４の抗体誘発性ダウンレギュレーションは内部移行した表面ＣＴＬＡ４のリソソーム分解が原因である可能性があると仮定した。イピリムマブとＨＬ１２をＡｌｅｘ４８８で標識し、表面ＣＴＬＡ４トラフィッキングを追跡することでこれを試験した（図４５Ａ〜Ｃ）。概要としては、ＣＴＬＡ４発現ＣＨＯ細胞をイピリムマブ−Ａｌｅｘ４８８又はＨＬ１２−Ａｌｅｘ４８８と共に４℃でインキュベートし、表面ＣＴＬＡ４が抗体に結合することが示された（図４５Ａ）。これらの細胞を３７℃に戻した後、イピリムマブ標識表面ＣＴＬＡ４及びＨＬ１２標識表面ＣＴＬＡ４はいずれも内部移行した。しかしながら、内部移行したＣＴＬＡ４局在のパターンは、イピリムマブ処理とＨＬ１２処理との間で明らかに異なっていた（図４５Ａ）。リソソームトラッカーで細胞を染色することにより、ＣＴＬＡ４の有意なダウンレギュレーションを引き起こしたイピリムマブは細胞表面ＣＴＬＡ４をリソソームに移動させて分解するが（図４５Ｂ−Ｃ）、ＣＴＬＡ４レベルに影響を与えなかったＨＬ１２ではこれが起こらないことが分かった。これと一致して、イピリムマブ処理細胞において、ＣＴＬＡ４のダウンレギュレーションはリソソームを阻害することによって阻害され、イピリムマブはリソソームによる表面ＣＴＬＡ４分解を促進するがＨＬ１２ではこれが起こらないという考えが確認された（図４５Ｄ）。
【０１９１】
細胞表面タンパク質は、内部移行した後、初期エンドソームに向かう。エンドソームでは、低いｐＨのためにリガンドが同族の受容体から解離することがあるが、後期リソソーム分解にはエンドソーム酸性化中のリガンドと受容体との持続的な結合が必要である（２０〜２２）。これに基づき、表面ＣＴＬＡ４の、リソソーム分解や再循環といった運命は、エンドソーム酸性化中の表面ＣＴＬＡ４の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂとの結合親和性と関わっている可能性がある。これを試験するため、エンドソーム酸性化プロセスにおいて起こる様々なｐＨ条件でＣＴＬＡ４の抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂへの結合を比較した。図４６Ａのデータは、イピリムマブとトレメリムマブ（ＩｇＧ１）が１０μｇ／ｍＬでｐＨ７．０からｐＨ４．０まで似たような飽和結合を示すことを表している。このことから、細胞表面（ｐＨ７．０）、エンドソーム内（ｐＨ５．０〜６．５）、又はリソソーム内（ｐＨ４．５）ｐＨにおいてこれらの複合体は維持されうると予測される（図４６Ａ〜Ｂ）。一方、ＨＬ１２及びＨＬ３２は、ｐＨがエンドソームのレベル（ｐＨ６．０以下）に達すると、ＣＴＬＡ４との結合親和性を失い始めた。図４６Ｂに示されるように、イピリムマブとトレメリムマブは、ｐＨ７．０とｐＨ５．５で本質的に同じ用量反応を示す。ｐＨ７．０での５０％最大結合量を達成するために必要なｐＨ５．５での抗体量（ＩＣ５０）は、ｐＨ７．０のＩＣ５０と本質的に同じであった。ｐＨ４．５でのＩＣ５０は約５０〜２５０％増加した。一方、ＨＬ１２及びＨＬ３２では、ｐＨ５．５における結合は、ｐＨ７．０における結合と比較すると、ＩＣ５０の上昇基準で１０倍以上に結合が低下していた。ｐＨ４．５における結合をｐＨ７．０における結合と比較すると、こちらもｐＨ４．５でのＩＣの低下がＩＣ５０の上昇基準で１００倍以上に結合が低下していた。ＣＴＬＡ４がすでに抗体に結合した後でｐＨを低下させた場合でも、ｐＨ依存性結合の同様の結果が示された（図４６Ｃ）。低ｐＨでの結合親和性の喪失が内部移行中の抗体とＣＴＬＡ４の解離に関連しているのかどうかを確認するため、表面ＣＴＬＡ４を４℃で抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂで標識し、続いて細胞を３７℃に移動して、ＣＴＬＡ４の内部移行及び引き続く分解又は細胞膜への再循環を起こさせた（図４６Ｄ〜Ｅ）。３７℃でのインキュベーション後、抗体に結合したＣＴＬＡ４をプロテインＧビーズで補足し、ウエスタンブロットで試験した（図４６Ｄ〜Ｅ）。データから、抗体に誘発されるＣＴＬＡ４の内部移行中にＨＬ１２とＨＬ３２はＣＴＬＡ４から解離したが、イピリムマブとトレメリムマブ（ＩｇＧ１）は解離しなかったことが明らかに示された（図４６Ｄ）。これはエンドソーム−リソソーム輸送中にｐＨを中和させることによってレスキューされた（図４６Ｅ）。
【０１９２】
ＨＬ１２及びＨＬ３２によって内部移行したＣＴＬＡ４は抗体から解放されてリソソーム分解から逃れたので、実験によりこれが細胞膜に再循環できるかどうかを試験した。再循環エンドソームマーカーであるＲａｂ１１を確認すると、ＨＬ１２に誘導された内部ＣＴＬＡ４は、イピリムマブ処理のものよりも多くＲａｂ１１と共存して局在していることがわかり（図４７Ａ）、ＨＬ１２に誘導された内部ＣＴＬＡ４は細胞表面に再循環するが、イピリムマブでは再循環しないことが示された。これを確認するため、ＧＦＰ−ＣＴＬＡ４トランスフェクト２９３Ｔ細胞をコントロールＩｇＧ、イピリムマブ、又はＨＬ１２とインキュベートし、細胞表面ＣＴＬＡ４を共焦点顕微鏡で試験した（図４７Ｂ）。予想された通り、インタクトな表面ＣＴＬＡ４を有するコントロールｈＩｇＧ−Ｆｃ処理細胞と比較して、イピリムマブ処理細胞は細胞表面ＣＴＬＡ４のほとんどを失っていた（図６Ｂ）。細胞間で表面ＣＴＬＡ４にはいくらかばらつきがあったものの、ＨＬ１２処理細胞のほとんどに表面ＣＴＬＡ４が観察された。上記ばらつきは、再循環プロセスが終了していなかったことに起因する可能性がある（図４７Ｂ）。
【０１９３】
データは、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂに誘導される免疫療法関連有害事象に関する重要な原理を実証している。図４７Ｃに示されるように、イピリムマブやトレメリムマブのように低ｐＨでＣＴＬＡ４の強い結合親和性を有する抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、表面ＣＴＬＡ４を内部移行中にリソソーム分解に誘導し、表面ＣＴＬＡ４の喪失による免疫療法関連有害事象を引き起こす。一方、ＨＬ１２やＨＬ３２のように低ｐＨでの結合親和性が弱い抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂは、抗体誘導性の内部移行中にＣＴＬＡ４から解離する。これらの抗体から解放された表面ＣＴＬＡ４は表面に再循環して、免疫応答の負の制御因子としての機能を維持する。これらの発見は、新規抗ＣＴＬＡ４の設計や、既存の抗ＣＴＬＡ４抗体の抗腫瘍効果の改善及び毒性の低減のために重要な新知見を提供する。
【０１９４】
＜実施例４＞
ｐＨ感受性抗ＣＴＬＡ４抗体は、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ枯渇及び確立された大きな腫瘍の拒絶反応の誘発においてより効果的である
（免疫療法関連有害事象の傾向の低い）ｐＨ感受性抗ＣＴＬＡ４抗体のポイントは、ＣＴＬＡ４から解離して、ＣＴＬＡ４をリソソーム分解から逃れさせ、細胞表面に再循環させることである。ＣＴＬＡ４レベルは（ＡＤＣＣ）／ＡＤＣＰのターゲットの感受性を決定するため、本発明者らは、上記性質がＴｒｅｇ枯渇に役立ちうることに着眼した。がん免疫療法効果に対する腫瘍微小環境のＴｒｅｇ枯渇の重要な役割を考慮すると、免疫療法関連有害事象を低減するｐＨ感受性がどのようにがん免疫療法効果に影響するかを検討することは非常に興味深い。腫瘍微小環境において、及び大きな腫瘍の拒絶反応において、Ｔｒｅｇ枯渇についてｐＨ感受性抗体とｐＨ非感受性抗体とを比較した。腫瘍微小環境でのＴｒｅｇ枯渇における抗体の機能を試験するため、１４日前にＭＣ３８腫瘍を投与したマウスにこれらの抗体を注射した。１６時間後、腫瘍を採取し、フローサイトメトリーでＣＤ４  Ｔ細胞中のＴｒｅｇの割合（％）を評価した。図４８に示されるように、ＨＬ１２とＨＬ３２は１６時間以内にＴｒｅｇを有意に減少させたが、イピリムマブはこの時点でＴｒｅｇを枯渇させなかった。
【０１９５】
本発明者らは以前に、４つの処理を施した様々な小さい腫瘍において、腫瘍拒絶の誘発効果はイピリムマブ、ＨＬ１２、ＨＬ３２で同等であることを示した（図３５）。ＨＬ１２とＨＬ３２によるＴｒｅｇ枯渇の有効性が高いこと、及び抗腫瘍Ｔ細胞応答の抑制におけるＴｒｅｇの重要な役割を考慮し、異なる抗ＣＴＡＬ−４抗体の有効性を、より厳しい条件で、すなわち、大きな腫瘍を有し、確立された腫瘍微小環境を有するマウスで再評価した。１７日前にＭＣ３８腫瘍（平均直径１０ｍｍ）を投与されたマウスを、１．５ｍｇ／ｋｇ／用量のイピリムマブ、又はＨＬ１２及びＨＬ３２で２回処理した。図４９に示されるように、この比較的低用量では、ＨＬ３２はイピリムマブよりも有意に効果が高かった（Ｐ＜０．０００１）。ＨＬ１２も、統計的有意性は達成しなかったものの、高い効果を有する傾向がみられた。
【０１９６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４２Ｅ】
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【図４２Ｆ】
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【図４２Ｇ】
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【図４２Ｈ】
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【図４２Ｉ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４４Ｅ】
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【図４４Ｆ】
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【図４４Ｇ】
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【図４４Ｈ】
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【図４４Ｉ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021511812.tif 000081
2021511812.tif 000082
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