(57)【要約】本明細書で提供するのは、２つ以上の腫瘍細胞関連抗原に特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）、１つまたは複数のＴＦＰを発現するように操作されたＴ細胞、及びがんを含めた疾患の治療にそれらを使用する方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする第１の組み換え核酸配列であって、前記第１のＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部分と、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む、ＴＣＲ細胞内ドメインと
を含むＴＣＲサブユニット；及び
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む、マウス、ヒト、またはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗ＭＵＣ１６結合ドメインとが作動可能に連結され、
Ｔ細胞に発現したときに、前記第１のＴＦＰが、ＴＣＲと機能的に相互作用するか、またはＴＣＲに組み込まれている、
前記第１の組み換え核酸配列；ならびに
（ＩＩ）第２のＴＦＰをコードする第２の組み換え核酸配列であって、前記第２のＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部分と、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む、ＴＣＲ細胞内ドメインと
を含むＴＣＲサブユニット；及び
（ｂ）抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメインを含む、マウス、ヒト、またはヒト化抗体ドメイン
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと前記抗ＭＳＬＮ結合ドメインとが作動可能に連結され、
Ｔ細胞に発現したときに、前記第２のＴＦＰが、ＴＣＲと機能的に相互作用するか、またはＴＣＲに組み込まれている、
前記第２の組み換え核酸配列
を含む、組成物。
【請求項２】
（Ｉ）第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする第１の組み換え核酸配列であって、前記第１のＴＦＰが、
（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部分と、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む、ＴＣＲ細胞内ドメインと
を含むＴＣＲサブユニット；及び
（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗ＭＳＬＮ結合ドメインを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインと；
を含み、
前記ＴＣＲサブユニットと、前記第１の抗体ドメインと、前記第２の抗体ドメインとが作動可能に連結され、
Ｔ細胞に発現したときに、前記第１のＴＦＰが、ＴＣＲと機能的に相互作用するか、またはＴＣＲに組み込まれている、
前記第１の組み換え核酸配列
を含む、組成物。
【請求項３】
（ａ）ＴＣＲサブユニット、抗ＭＵＣ１６結合ドメインである第１の抗原結合ドメインを含む第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）；及び
（ｂ）ＴＣＲサブユニット、抗ＭＳＬＮ結合ドメインである第２の抗原結合ドメインを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第２のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）
をコードする組み換え核酸分子を含み、
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットと前記第１の抗体ドメインとが作動可能に連結され、前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットと前記第２の抗体ドメインとが作動可能に連結される、
組成物。
【請求項４】
（ａ）ＴＣＲサブユニットと、抗ＭＵＣ１６結合ドメインである第１の抗原結合ドメインを含む第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗ＭＳＬＮ結合ドメインである第２の抗原結合ドメインを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）
をコードする組み換え核酸分子を含み、
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットと、前記第１の抗体ドメインと、前記第２の抗体ドメインとが作動可能に連結される、
組成物。
【請求項５】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、及びＴＣＲイプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖のみに由来する、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲベータ鎖のみに由来する、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ガンマ鎖のみに由来する、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３デルタ鎖のみに由来する、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３イプシロン鎖のみに由来する、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲアルファ鎖のみに由来する、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲベータ鎖のみに由来する、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ガンマ鎖のみに由来する、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３デルタ鎖のみに由来する、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３イプシロン鎖のみに由来する、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲガンマ鎖のみに由来する、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインが、ＴＣＲデルタ鎖のみに由来する、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第１のＴＦＰ、前記第２のＴＦＰ、または両方が、Ｔ細胞に発現したときに、ＴＣＲに組み込まれているか、またはＴＣＲと機能的に相互作用する、請求項３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第１のＴＦＰ、前記第２のＴＦＰ、または両方が、Ｔ細胞に発現したときに、ＴＣＲに組み込まれているか、またはＴＣＲと機能的に相互作用する、請求項３〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
コードされる第１の抗原結合ドメインが、第１のリンカー配列によって前記第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続され、コードされる第２の抗原結合ドメインが、第２のリンカー配列によって前記第２のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続され、または、前記第１の抗原結合ドメインが、前記第１のリンカー配列によって前記第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続され、かつ前記コードされる第２の抗原結合ドメインが、前記第２のリンカー配列によって前記第２のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第１のリンカー配列及び前記第２のリンカー配列が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方が、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方が、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方が、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方が、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つが、同じＴＣＲサブユニットに由来する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方が、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、前記第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方が、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、前記第２のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方が、抗体断片を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、前記第２のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方が、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
（ｉ）表２の軽鎖配列に対して７０〜１００％の配列同一性を有する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、及びＬＣ  ＣＤＲ３、及び／または（ｉｉ）表２の重鎖配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３をコードする、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
軽鎖可変領域をコードする、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の組成物であって、前記軽鎖可変領域が、表２の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つであるが３０以下の改変を有するアミノ酸配列、または表２の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、前記組成物。
【請求項３３】
重鎖可変領域をコードする、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物であって、前記重鎖可変領域が、表２の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つであるが３０以下の改変を有するアミノ酸配列、または表２の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、前記組成物。
【請求項３４】
コードされる第１のＴＦＰ、コードされる第２のＴＦＰ、または両方が、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記コードされる第１のＴＦＰ及び前記コードされる第２のＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記コードされる第１のＴＦＰ及び前記コードされる第２のＴＦＰが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記共刺激ドメインが、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびにそれらに対する少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
リーダー配列をさらに含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
プロテアーゼ切断部位をさらに含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記それらに対する少なくとも１つであるが２０以下の改変が、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または前記第１のＴＦＰ、前記第２のＴＦＰ、もしくは両方へのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の改変を含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記単離された核酸分子がｍＲＮＡである、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記第１のＴＦＰ、前記第２のＴＦＰ、または両方が、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及びそれらに対する少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部分を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭと置きかわる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭと置きかわる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
リーダー配列をさらに含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項４８】
請求項１〜４７のいずれか１項に記載の組成物の前記核酸分子によってコードされるポリペプチド分子を含む、組成物。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、第１の核酸分子によってコードされる第１のポリペプチドと、第２の核酸分子によってコードされる第２のポリペプチドとを含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
請求項１〜４７のいずれか１項に記載の組成物の核酸分子によってコードされる組み換えＴＦＰ分子を含む、組成物。
【請求項５１】
請求項４８〜５０のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは組み換えＴＦＰ分子をコードする核酸分子を含むベクターを含む、組成物。
【請求項５２】
前記ベクターが、ａ）第１のＴＦＰをコードする第１の核酸分子を含む第１のベクターと、ｂ）第２のＴＦＰをコードする第２の核酸分子を含む第２のベクターとを含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ベクターが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される、請求項５１または５２に記載の組成物。
【請求項５４】
プロモーターをさらに含む、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ベクターが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターである、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ベクター内の前記核酸分子が、ポリ（Ａ）テールをさらにコードする、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ベクター内の前記核酸分子が、３’ＵＴＲをさらにコードする、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ベクター内の前記核酸分子が、プロテアーゼ切断部位をさらにコードする、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
請求項１〜５８のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞を含む、組成物。
【請求項６０】
前記細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第２のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記抑制分子が、ＰＤ１の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組み換え核酸配列を含む、ベクター。
【請求項６５】
請求項１または請求項２に記載の第１の組み換え核酸配列を含む、ベクター。
【請求項６６】
請求項１または請求項２に記載の第２の組み換え核酸配列を含む、ベクター。
【請求項６７】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組成物または請求項６４〜６６のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項６８】
請求項６５に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項６９】
請求項６６に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項７０】
前記細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７１】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項７０に記載の細胞。
【請求項７２】
細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第２のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む、請求項６７〜７１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７３】
前記抑制分子が、ＰＤ１の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む、請求項７２に記載の細胞。
【請求項７４】
少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞であって、前記ＴＦＰ分子が、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、抗ＭＳＬＮ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞内で、前記細胞で、及び／または前記細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項７５】
ｉ）抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む第１のＴＦＰ分子と；
ｉｉ）抗ＭＳＬＮ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む第２のＴＦＰ分子と；
ｉｉｉ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体と
を含む、タンパク質複合体。
【請求項７６】
ｉ）抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と；
ｉｉ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体と
を含む、タンパク質複合体。
【請求項７７】
ｉ）抗ＭＳＬＮ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と；
ｉｉ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体と
を含む、タンパク質複合体。
【請求項７８】
前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項７９】
前記抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、前記抗ＭＳＬＮ結合ドメイン、または両方が、リンカー配列によって前記ＴＣＲ細胞外ドメインに接続される、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項８０】
前記リンカー領域が、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む、請求項７９に記載のタンパク質複合体。
【請求項８１】
請求項７５〜７９のいずれか１項に記載のタンパク質複合体１つ当たりに少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項８２】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の単離された核酸分子によってコードされる少なくとも２つの異なるＴＦＰ分子を含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞。
【請求項８３】
ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団のＴ細胞が、個々にまたは集合的に少なくとも２つのＴＦＰ分子を含み、前記ＴＦＰ分子が、抗ＭＵＣ１６結合ドメインまたは抗ＭＳＬＮ結合ドメインまたは抗ＭＵＣ１６と抗ＭＳＬＮ結合ドメインの両方、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞内で、前記細胞で、及び／または前記細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項８４】
ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団のＴ細胞が、請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組み換え核酸分子によってコードされる少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々にまたは集合的に含む、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項８５】
有効量の請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組成物、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載のベクター、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の細胞、または請求項７５〜８０のいずれか１項に記載のタンパク質複合体と、医薬として許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項８６】
有効量の請求項６８に記載の細胞と、有効量の請求項６９に記載の細胞と、医薬として許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項８７】
ＭＳＬＮまたはＭＵＣ１６の発現に関連する疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項１〜６３のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項８８】
前記ＭＵＣ１６またはＭＳＬＮの発現に関連する疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、前白血病、ＭＵＣ１６の発現に関連する非がん関連適応症、ＭＳＬＮの発現に関連する非がん関連適応症、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、及び再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌からなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記疾患が、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、ＭＵＣ１６またはＭＳＬＮの発現に関連する疾患、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される血液のがんである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、前記第１のＴＦＰ分子及び前記第２のＴＦＰ分子を発現する細胞の効力を増大させる作用物質と組み合わせて投与される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記哺乳動物において、
（ａ）抗ＭＳＬＮキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；
（ｂ）抗ＭＵＣ１６  ＣＡＲ；
（ｃ）抗ＭＳＬＮ  ＣＡＲ及び抗ＭＵＣ１６  ＣＡＲ；または
（ｄ）それらの組み合わせ
を発現する有効量のＴ細胞を投与された哺乳動物と比較して少ないサイトカインが放出される、請求項８７〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、前記第１のＴＦＰ分子及び前記第２のＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に関連する１つまたは複数の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される、請求項８７〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する前記細胞が、ＭＳＬＮまたはＭＵＣ１６に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される、請求項８７〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年８月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／７２５，０９８号の利益を主張するものであり、該仮出願は、参照により全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
血液悪性腫瘍または末期の固形腫瘍を有するほとんどの患者は、標準的治療では治療不能である。加えて、従来の治療の選択肢には重篤な副作用があることが多い。がん細胞を退けるために患者の免疫系を関与させる数多くの試みがなされてきた。これらは総称してがん免疫療法と呼ばれる手法である、しかし、幾つかの障害によって、臨床効果を実現するのはかなり困難である。何百ものいわゆる腫瘍抗原が特定されているが、これらは自己由来であることが多く、そのためにがん免疫療法は健常組織に向けられる可能性があるか、または免疫原性が不十分である。さらに、がん細胞は、複数の機構を使用して自分自身を見えなくしたり、がん免疫療法による免疫攻撃の開始及び伝播に敵対したりする。
【０００３】
遺伝子操作されたＴ細胞をがん細胞上の適切な細胞表面分子に再指向させることに依拠する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変自己Ｔ細胞療法を使用する最近の開発は、がんを治療するために免疫系の力を利用することにおいて有望な結果を示している。例えば、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いる進行中の治験からの臨床結果は、何人かの多発性骨髄腫患者における部分寛解を示している（そのような治験の１つはｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖから識別名ＮＣＴ０２２１５９６７で見出すことができる）。代替的な手法は、腫瘍関連ペプチド抗原に対して選択されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖を自己Ｔ細胞の遺伝子操作に使用することである。これらのＴＣＲ鎖は、完全なＴＣＲ複合体を形成し、所定の第２の特異性のためのＴＣＲを有するＴ細胞をもたらすこととなる。滑膜癌を有する患者では、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲアルファ及びベータ鎖を発現する操作された自己Ｔ細胞で有望な結果が得られた。
【０００４】
遺伝子改変Ｔ細胞が、ＣＡＲまたは第２のＴＣＲを発現してｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏでそれぞれの標的細胞を認識し破壊することができること以外に、操作されたＴ細胞で患者療法を成功させるには、Ｔ細胞が強力な活性化、拡大、経時的な持続性を有することができ、再発性疾患の場合は「メモリー」応答が可能であることが必要とされる。ＣＡＲ  Ｔ細胞の扱いやすく高い臨床的有効性は、現在のところ、メソテリン陽性Ｂ細胞悪性腫瘍及びＨＬＡ−Ａ２を発現するＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド発現滑膜肉腫患者に限られている。様々なヒト悪性腫瘍に対してより広く作用するように、遺伝子操作されたＴ細胞を向上させる必要があることは明らかである。本明細書に記載するのは、既存の手法の制限を克服する可能性を有する、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３デルタを含めたＴＣＲサブユニット、及びＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ鎖と、細胞表面抗原に対して特異的な結合ドメインとの新規融合タンパク質である。本明細書に記載するのは、ＣＡＲより効率的に標的細胞を殺傷するが、同等またはそれ以下のレベルの炎症誘発性サイトカインを放出する新規融合タンパク質である。これらのサイトカインのレベルの上昇が養子ＣＡＲ−Ｔ療法の用量制限毒性に関連することから、これらの融合タンパク質及びそれらを使用する方法は、ＣＡＲに対するＴＦＰの利点を示している。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書で提供するのは、２つ以上の標的に特異性を有する結合タンパク質、ならびにそのような二重特異性結合タンパク質を含む抗体及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）である。加えて、１つまたは複数のＴＦＰを発現するように操作されたＴ細胞、及び疾患の治療にそれらを使用する方法を提供する。ＴＦＰは、単一の分子で二重特異性を有しても、または単一の操作されたＴＣＲで二重特異性を有してもよく、あるいは、二重特異性は、ＴＦＰを含む２つの操作されたＴ細胞集団を混合することから生じることも、または２つの異なるウイルスでＴ細胞の単一の集団に形質導入することから生じることもある。
【０００６】
よって、一態様では、第１のＴ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子であって、該第１のＴＦＰが、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部分と、膜貫通ドメインと、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含むＴＣＲサブユニット；及び抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む、マウス、ヒト、またはヒト化抗体ドメインを含み、ＴＣＲサブユニットと抗ＭＵＣ１６結合ドメインとが作動可能に連結され、Ｔ細胞に発現したときに、第１のＴＦＰが、ＴＣＲと機能的に相互作用するか、またはＴＣＲに組み込まれている、組み換え核酸分子；ならびに第２のＴＦＰをコードする第２の組み換え核酸配列であって、該第２のＴＦＰが、ＴＣＲサブユニット細胞外ドメインの少なくとも一部分と、膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインとを含むＴＣＲサブユニット；及び（ｂ）抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメインを含むマウス、ヒト、またはヒト化抗体ドメインを含み、ＴＣＲサブユニットと抗ＭＳＬＮ結合ドメインとが作動可能に連結され、Ｔ細胞に発現したときに、第２のＴＦＰが、ＴＣＲと機能的に相互作用するか、またはＴＣＲに組み込まれている、第２の組み換え核酸配列を含む、組成物を提供する。
【０００７】
別の態様では、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする第１の組み換え核酸配列であって、該第１のＴＦＰが、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部分と、膜貫通ドメインと、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含む、ＴＣＲ細胞内ドメインとを含むＴＣＲサブユニット；及び抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗ＭＳＬＮ結合ドメインを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含み、ＴＣＲサブユニットと、第１の抗体ドメインと、第２の抗体ドメインとが作動可能に連結され、該第１のＴＦＰが、Ｔ細胞に発現したときに、ＴＣＲと機能的に相互作用するか、またはＴＣＲに組み込まれている、第１の組み換え核酸配列を含む、組成物を提供する。
【０００８】
別の態様では、ＴＣＲサブユニット、抗ＭＵＣ１６結合ドメインである第１の抗原結合ドメインを含む第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）；及びＴＣＲサブユニット、抗ＭＳＬＮ結合ドメインである第２の抗原結合ドメインを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第２のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子を含み、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットと第１の抗体ドメインとが作動可能に連結され、該第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットと該第２の抗体ドメインとが作動可能に連結される、組成物を提供する。
【０００９】
別の態様では、ＴＣＲ複合体サブユニットと、抗ＭＵＣ１６結合ドメインである第１の抗原結合ドメインを含む第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗ＭＳＬＮ結合ドメインである第２の抗原結合ドメインを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離された組み換え核酸分子を含み、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットと、第１の抗体ドメインと、第２の抗体ドメインとが作動可能に連結される、組成物を提供する。
【００１０】
一実施形態では、コードされる第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する。別の実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、及びＴＣＲイプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲベータ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲガンマ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲデルタ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ガンマ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖のみに由来する。
【００１１】
別の実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲベータ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲガンマ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲデルタ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ガンマ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ鎖のみに由来する。別の実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖のみに由来する。
【００１２】
一実施形態では、第１のＴＦＰ、第２のＴＦＰ、または両方は、Ｔ細胞に発現したときに、ＴＣＲに組み込まれているか、またはＴＣＲと機能的に相互作用する。別の実施形態では、第１のＴＦＰ、第２のＴＦＰ、または両方は、Ｔ細胞に発現したときに、ＴＣＲに組み込まれているか、またはＴＣＲと機能的に相互作用する。別の実施形態では、コードされる第１の抗原結合ドメインは、第１のリンカー配列によって第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続され、コードされる第２の抗原結合ドメインは、第２のリンカー配列によって第２のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続され、または第１の抗原結合ドメインは、第１のリンカー配列によって第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続され、かつコードされる第２の抗原結合ドメインは、第２のリンカー配列によって第２のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続される。別の実施形態では、第１のリンカー配列及び第２のリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４である）を含む。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。別の実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
【００１３】
一実施形態では、第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第２のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方は、抗体断片を含む。別の実施形態では、第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第２のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方は、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む。別の実施形態では、組成物は、（ｉ）表２の軽鎖配列に対して７０〜１００％の配列同一性を有する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、及びＬＣ  ＣＤＲ３、及び／または（ｉｉ）表２の重鎖配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３をコードする組み換え核酸分子を含む。一実施形態では、組み換え核酸は軽鎖可変領域をコードし、ここで、軽鎖可変領域は、表２の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つであるが３０以下の改変を有するアミノ酸配列、または表２の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、組成物は、重鎖可変領域をコードする組み換え核酸分子を含み、ここで、重鎖可変領域は、表２の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つであるが３０以下の改変を有するアミノ酸配列、または表２の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、コードされる第１のＴＦＰ、コードされる第２のＴＦＰ、または両方は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。別の実施形態では、コードされる第１のＴＦＰ及びコードされる第２のＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
【００１４】
一実施形態では、コードされる第１のＴＦＰ及びコードされる第２のＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。別の実施形態では、組み換え核酸は、共刺激ドメインをコードする配列を含む。別の実施形態では、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびにそれらに対する少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。別の実施形態では、組み換え核酸は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。別の実施形態では、組み換え核酸は、リーダー配列をコードする配列を含む。別の実施形態では、組み換え核酸は、プロテアーゼ切断部位をコードする配列を含む。一実施形態では、アミノ酸配列に対する少なくとも１つであるが２０以下の改変は、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または第１のＴＦＰ、第２のＴＦＰ、もしくは両方へのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の改変を含む。
【００１５】
一実施形態では、単離された組み換え核酸分子はｍＲＮＡである。
【００１６】
一実施形態では、第１のＴＦＰ、第２のＴＦＰ、または両方は、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及びそれらに対する少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部分を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む。
【００１７】
別の実施形態では、該ＩＴＡＭは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭと置きかわる。別の実施形態では、該ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭと置きかわる。一実施形態では、コードされる組み換え核酸は、リーダー配列をさらに含む。
【００１８】
別の態様では、本明細書に記載する核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチド分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、該ポリペプチドは、第１の核酸分子によってコードされる第１のポリペプチドと、第２の核酸分子によってコードされる第２のポリペプチドとを含む。
【００１９】
別の態様では、本明細書に記載する核酸分子のいずれかによってコードされる組み換えＴＦＰ分子を含む組成物を提供する。
【００２０】
別の態様では、本明細書に記載するポリペプチドまたは組み換えＴＦＰ分子をコードするベクターを含む組成物を提供する。一実施形態では、該ベクターは、ａ）第１のＴＦＰをコードする第１の核酸分子を含む第１のベクターと、ｂ）第２のＴＦＰをコードする第２の核酸分子を含む第２のベクターとを含む。別の実施形態では、該ベクターは、第１のＴＦＰと第２のＴＦＰとを含み、ここで、第１のＴＦＰをコードする配列及び第２のＴＦＰをコードする配列は切断部位によって分離され、該ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。一実施形態では、該ベクターは、プロモーターを含む。一実施形態では、該ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターである。一実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、ポリ（Ａ）テールをさらにコードする。別の実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、３’ＵＴＲをさらにコードする。別の実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、プロテアーゼ切断部位をさらにコードする。
【００２１】
一実施形態では、該組成物は、細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第２のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。別の実施形態では、該抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む。
【００２２】
別の態様では、本明細書に開示する組み換え核酸配列を含むベクターを提供する。一実施形態では、該ベクターは、第１の組み換え核酸配列を含む。別の実施形態では、該ベクターは、第２の組み換え核酸配列を含む。
【００２３】
別の態様では、本明細書に開示する単離された組み換え核酸分子、ベクター、またはポリペプチドのいずれかを含む組成物を含む細胞を提供する。一実施形態では、該細胞は、ヒトＴ細胞である。別の実施形態では、該Ｔ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。一実施形態では、該細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第２のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸を含む。一実施形態では、該抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む。
【００２４】
別の態様では、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞であって、該ＴＦＰ分子が、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、抗ＭＳＬＮ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該ＴＦＰ分子が、該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞内で、該細胞で、及び／または該細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する。別の実施形態では、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む第１のＴＦＰ分子と；抗ＭＳＬＮ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む第２のＴＦＰ分子と；少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体とを含む、タンパク質複合体を提供する。
【００２５】
別の態様では、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と；少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体とを含む、タンパク質複合体を提供する。
【００２６】
別の態様では、抗ＭＳＬＮ結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と；少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体とを含む、タンパク質複合体を提供する。
【００２７】
一実施形態では、タンパク質複合体中のＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む。一実施形態では、抗ＭＵＣ１６結合ドメイン、抗ＭＳＬＮ結合ドメイン、または両方は、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに接続される。一実施形態では、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。
【００２８】
別の態様では、本明細書に記載するタンパク質複合体のいずれかに少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する。別の態様では、本明細書に開示する単離された核酸分子のいずれかによってコードされる少なくとも２つの異なるＴＦＰ分子を含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する。
【００２９】
別の態様では、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、該集団のＴ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々にまたは集合的に含み、該ＴＦＰ分子が、抗ＭＵＣ１６結合ドメインまたは抗ＭＳＬＮ結合ドメインまたは抗ＭＵＣ１６結合ドメインと抗ＭＳＬＮ結合ドメインの両方、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該ＴＦＰ分子が、該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞内で、該細胞で、及び／または該細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を提供する。
【００３０】
別の態様では、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、該集団のＴ細胞が、本明細書に開示する単離された組み換え核酸分子のいずれかによってコードされる少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々にまたは集合的に含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を提供する。別の態様では、本明細書に開示する有効量の組成物、ベクター、細胞、またはタンパク質複合体と、医薬として許容される賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００３１】
別の態様では、ＭＳＬＮまたはＭＵＣ１６の発現に関連する疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の本明細書に開示する組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、ＭＵＣ１６またはＭＳＬＮの発現に関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、前白血病、ＭＵＣ１６の発現に関連する非がん関連適応症、ＭＳＬＮの発現に関連する非がん関連適応症、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、及び再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌からなる群から選択される。別の実施形態では、該疾患は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞濾胞性リンパ腫、大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、ＭＵＣ１６またはＭＳＬＮの発現に関連する疾患、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される血液のがんである。別の実施形態では、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する細胞または細胞集団は、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する細胞または細胞集団の効力を増大させる作用物質と組み合わせて投与される。一実施形態では、哺乳動物において、抗ＭＳＬＮキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、抗ＭＵＣ１６  ＣＡＲ、抗ＭＳＬＮ  ＣＡＲ及び抗ＭＵＣ１６  ＣＡＲ；またはそれらの組み合わせを発現する有効量のＴ細胞を投与された哺乳動物と比較して少ないサイトカインが放出される。一実施形態では、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する細胞は、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に関連する１つまたは複数の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。別の実施形態では、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子は、ＭＳＬＮまたはＭＵＣ１６に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。
【００３２】
参照による援用
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、及び特許出願は、１つ１つの出版物、特許、または特許出願が参照により援用されると明確にかつ個別に示される場合と同様に、参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本明細書に開示するがん細胞を二重標的化する方法の一部を示す図である。腫瘍細胞抗原標的であるＭＵＣ１６及びＭＳＬＮは、例示的な抗原である。
【図２】抗ＭＵＣ１６抗体Ｒ３ＭＵ４及びＲ３ＭＵ２９のＭＵＣ１６細胞外ドメイン配列上の結合エピトープを、報告されている別の抗体４Ｈ１１のエピトープと比較して示すタンパク質配列を表す図である。
【図３】非形質導入の（図３Ａ、「ＮＴ」）、抗メソテリンＴＦＰを形質導入した（図３Ｂ、「ＭＳＬＮ  ＴＦＰ」）、抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰを形質導入した（図３Ｃ、「ＭＵＣ１６  ＴＦＰ」）、または二重特異性ＴＦＰの（図３Ｄ）ジャーカット細胞のＦＡＣＳ解析からの一連の画像である。すべてのジャーカット細胞（ＮＴ、ＭＳＬＮ  ＴＦＰ、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ、二重特異性ＴＦＰ）は、最初に標識Ｆｃ＿ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６−ビオチンで同時に染色し、次いでストレプトアビジン＿ＰＥで染色した。
【図４】Ｋ５６２細胞（「ＤＮ」、円）、ＭＳＬＮを発現するＫ５６２細胞（「ＭＳＬＮ＋」、四角）、ＭＵＣ１６を発現するＫ５６２細胞（「ＭＵＣ１６＋」、上向き矢印）、及び両方のタンパク質を発現するＫ５６２（「ＤＰ」、下向き矢印）と共培養した、非形質導入の、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰ、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ、もしくは二重特異性ＴＦＰを形質導入したジャーカット細胞によるＩＬ−２産生の測定値を示すグラフである。
【図５】様々な構築物で形質導入した初代ヒトＴ細胞のＦＡＣＳ解析からの一連の画像である。ＮＴ（非形質導入）、ＭＳＬＮ  ＴＦＰ、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ、及び二重特異性ＴＦＰを形質導入したＴ細胞を、健常なドナーＴ細胞から、単一または二重特異性ＴＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入することによって生成した。細胞を拡大させ、図３に記載するように染色した。ＭＳＬＮ特異性ＴＦＰを発現するが（図５Ｃ）、ＭＵＣ１６  ＴＦＰを発現しない（図５Ｄ）ことがＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞で検出され、加えて、ＭＵＣ１６  ＴＦＰを発現するが（図５Ｆ）、ＭＳＬＮ  ＴＦＰを発現しない（図５Ｅ）ことがＭＵＣ１６  ＴＦＰ  Ｔ細胞で検出された。二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞では、ＭＳＬＮ  ＴＦＰとＭＵＣ１６  ＴＦＰの両方が形質導入した細胞の表面上で検出された（図５Ｇ及び５Ｈ）。ＮＴジャーカット細胞では、ＭＳＬＮ  ＴＦＰまたはＭＵＣ１６  ＴＦＰの検出は観察されなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。
【図６】Ｋ５６２細胞（「ＤＮ」、円）、ＭＳＬＮを発現するＫ５６２細胞（「ＭＳＬＮ＋」、四角）、ＭＵＣ１６を発現するＫ５６２細胞（「ＭＵＣ１６＋」、上向き矢印）、及び両方のタンパク質を発現するＫ５６２（「ＤＰ」、下向き矢印）と共培養した、非形質導入の、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰ、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ、もしくは二重特異性ＴＦＰを形質導入した初代ヒトＴ細胞による細胞傷害性の測定値を（全体の割合（％）として）示すグラフである。
【図７Ａ】Ｋ５６２細胞（「ＤＮ」、円）、ＭＳＬＮを発現するＫ５６２細胞（「ＭＳＬＮ＋」、四角）、ＭＵＣ１６を発現するＫ５６２細胞（「ＭＵＣ１６＋」、上向き矢印）、及び両方のタンパク質を発現するＫ５６２（「ＤＰ」、下向き矢印）と共培養した、非形質導入の、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰ、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ、もしくは二重特異性ＴＦＰを形質導入した初代ヒトＴ細胞による標的特異的サイトカイン産生を示す一連のグラフである。測定したサイトカインは、ＩＦＮ−γであった。
【図７Ｂ】Ｋ５６２細胞（「ＤＮ」、円）、ＭＳＬＮを発現するＫ５６２細胞（「ＭＳＬＮ＋」、四角）、ＭＵＣ１６を発現するＫ５６２細胞（「ＭＵＣ１６＋」、上向き矢印）、及び両方のタンパク質を発現するＫ５６２（「ＤＰ」、下向き矢印）と共培養した、非形質導入の、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰ、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ、もしくは二重特異性ＴＦＰを形質導入した初代ヒトＴ細胞による標的特異的サイトカイン産生を示す一連のグラフである。測定したサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦであった。
【図７Ｃ】Ｋ５６２細胞（「ＤＮ」、円）、ＭＳＬＮを発現するＫ５６２細胞（「ＭＳＬＮ＋」、四角）、ＭＵＣ１６を発現するＫ５６２細胞（「ＭＵＣ１６＋」、上向き矢印）、及び両方のタンパク質を発現するＫ５６２（「ＤＰ」、下向き矢印）と共培養した、非形質導入の、またはＭＳＬＮ  ＴＦＰ、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ、もしくは二重特異性ＴＦＰを形質導入した初代ヒトＴ細胞による標的特異的サイトカイン産生を示す一連のグラフである。測定したサイトカインは、ＴＮＦ−αであった。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書で提供するのは、二重特異性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質または二重特異性Ｔ細胞集団を使用する、がんなどの疾患を治療するための組成物及び使用方法である。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、ＴＣＲを含む様々なポリペプチドに由来する組み換えポリペプチドを含み、該ＴＣＲは、一般に、ｉ）標的細胞上の表面抗原に結合することができ、かつｉｉ）典型的にはＴ細胞内またはＴ細胞の表面上の同じ場所に位置するときに、インタクトなＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。本明細書で提供する場合、ＴＦＰは、キメラ抗原受容体と比較して、相当な利益をもたらす。「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」という用語は、ｓｃＦｖの形態の細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び以下に定義する通りの刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ぶ）を含む、組み換えポリペプチドを指す。一般に、ＣＡＲの中央の細胞内シグナル伝達ドメインは、通常ＴＣＲ複合体と会合して見出されるＣＤ３ゼータ鎖に由来する。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／またはＣＤ２８などの少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つまたは複数の機能的シグナル伝達ドメインと融合することができる。
【００３５】
一態様では、本明細書で提供するのは、（Ｉ）第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする第１の組み換え核酸配列であって、該第１のＴＦＰが、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部分と、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインとを含む、ＴＣＲサブユニット；及び（ｂ）抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、ＴＣＲサブユニットと、抗ＭＵＣ１６結合ドメインとが作動可能に連結され、Ｔ細胞に発現したときに、第１のＴＦＰが、ＴＣＲと機能的に相互作用するか、またはＴＣＲに組み込まれている、第１の組み換え核酸配列；ならびに（ＩＩ）第２のＴＦＰをコードする第２の組み換え核酸配列であって、該第２のＴＦＰが、（ａ）（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部分と、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインとを含む、ＴＣＲサブユニット；及び（ｂ）抗メソテリン（ＭＳＬＮ）結合ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、ＴＣＲサブユニットと抗ＭＳＬＮ結合ドメインとが作動可能に連結され、Ｔ細胞に発現したときに、第２のＴＦＰが、ＴＣＲと機能的に相互作用するか、またはＴＣＲに組み込まれている、第２の組み換え核酸配列を含む、組成物である。
【００３６】
一態様では、本明細書で提供するのは、（Ｉ）第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする第１の組み換え核酸配列であって、該第１のＴＦＰが、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部分と、膜貫通ドメインと、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する細胞内シグナル伝達ドメインからの刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインとを含む、ＴＣＲサブユニット；及び抗ＭＵＣ１６結合ドメインを含む第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗ＭＳＬＮ結合ドメインとを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み；ＴＣＲサブユニットと、第１の抗体ドメインと、第２の抗体ドメインとが作動可能に連結され、Ｔ細胞に発現したときに、第１のＴＦＰが、ＴＣＲと機能的に相互作用するか、またはＴＣＲに組み込まれている、第１の組み換え核酸配列を含む、組成物である。
【００３７】
一態様では、本明細書で提供するのは、ＴＣＲサブユニット、抗ＭＵＣ１６結合ドメインである第１の抗原結合ドメインを含む第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）；及びＴＣＲサブユニット、抗ＭＳＬＮ結合ドメインである第２の抗原結合ドメインを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、第２のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組み換え核酸分子を含み、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットと第１の抗体ドメインとが作動可能に連結され、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットと第２の抗体ドメインとが作動可能に連結される、組成物である。
【００３８】
一態様では、本明細書で提供するのは、ＴＣＲサブユニットと、抗ＭＵＣ１６結合ドメインである第１の抗原結合ドメインを含む第１のヒトまたはヒト化抗体ドメインと、抗ＭＳＬＮ結合ドメインである第２の抗原結合ドメインを含む第２のヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする組み換え核酸分子を含み、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットと、第１の抗体ドメインと、第２の抗体ドメインとが作動可能に連結される、組成物である。
【００３９】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、及びＣＤ３イプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する。
【００４０】
幾つかの実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、及びＴＣＲイプシロン鎖からなる群から選択されるＴＣＲサブユニットのみに由来する。
【００４１】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖のみに由来する。
【００４２】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲベータ鎖のみに由来する。
【００４３】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲガンマ鎖のみに由来する。
【００４４】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲデルタ鎖のみに由来する。
【００４５】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ガンマ鎖のみに由来する。
【００４６】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ鎖のみに由来する。
【００４７】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖のみに由来する。
【００４８】
幾つかの実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲアルファ鎖のみに由来する。
【００４９】
幾つかの実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲベータ鎖のみに由来する。
【００５０】
幾つかの実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲガンマ鎖のみに由来する。
【００５１】
幾つかの実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲデルタ鎖のみに由来する。
【００５２】
幾つかの実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ガンマ鎖のみに由来する。
【００５３】
幾つかの実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３デルタ鎖のみに由来する。
【００５４】
幾つかの実施形態では、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニットの細胞外、膜貫通、及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖のみに由来する。
【００５５】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰ、第２のＴＦＰ、または両方は、Ｔ細胞に発現したときに、ＴＣＲに組み込まれているか、またはＴＣＲと機能的に相互作用する。
【００５６】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰ、第２のＴＦＰ、または両方は、Ｔ細胞に発現したときに、ＴＣＲに組み込まれているか、またはＴＣＲと機能的に相互作用する。
【００５７】
幾つかの実施形態では、コードされる第１の抗原結合ドメインは、第１のリンカー配列によって第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続され、コードされる第２の抗原結合ドメインは第２のリンカー配列によって第２のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続され、または第１の抗原結合ドメインは、第１のリンカー配列によって第１のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続され、かつコードされる第２の抗原結合ドメインは、第２のリンカー配列によって第２のＴＦＰのＴＣＲ細胞外ドメインに接続される。
【００５８】
幾つかの実施形態では、第１のリンカー配列及び第２のリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４である）を含む。
【００５９】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む。
【００６０】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む。
【００６１】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む。
【００６２】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。
【００６３】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。
【００６４】
幾つかの実施形態では，第１のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、第２のＴＦＰのＴＣＲサブユニット、または両方は、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも１つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
【００６５】
幾つかの実施形態では、第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第２のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方は、抗体断片を含む。
【００６６】
幾つかの実施形態では、第１のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、第２のヒトまたはヒト化抗体ドメイン、または両方は、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む。
【００６７】
幾つかの実施形態では、組成物は、（ｉ）表２の軽鎖配列に対して７０〜１００％の配列同一性を有する軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、及びＬＣ  ＣＤＲ３、及び／または（ｉｉ）表２の重鎖配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３をコードする。
【００６８】
幾つかの実施形態では、組成物は軽鎖可変領域をコードし、ここで、軽鎖可変領域は、表２の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つであるが３０以下の改変を有するアミノ酸配列、または表２の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００６９】
幾つかの実施形態では、組成物は重鎖可変領域をコードし、ここで、重鎖可変領域は、表２の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つであるが３０以下の改変を有するアミノ酸配列、または表２の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【００７０】
幾つかの実施形態では、コードされる第１のＴＦＰ、コードされる第２のＴＦＰ、または両方は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。
【００７１】
幾つかの実施形態では、コードされる第１のＴＦＰ及びコードされる第２のＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
【００７２】
幾つかの実施形態では、コードされる第１のＴＦＰ及びコードされる第２のＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
【００７３】
幾つかの実施形態では、組成物は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。
【００７４】
幾つかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ならびにそれらに対する少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。
【００７５】
幾つかの実施形態では、組成物は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。
【００７６】
幾つかの実施形態では、組成物は、リーダー配列をさらに含む。
【００７７】
幾つかの実施形態では、組成物は、プロテアーゼ切断部位をさらに含む。
【００７８】
幾つかの実施形態では、アミノ酸配列に対する少なくとも１つであるが２０以下の改変は、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の改変、または第１のＴＦＰ、第２のＴＦＰ、もしくは両方へのリガンド結合に応答してリン酸化されるアミノ酸の改変を含む。
【００７９】
幾つかの実施形態では、単離された核酸分子はｍＲＮＡである。
【００８０】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰ、第２のＴＦＰ、または両方は、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及びそれらに対する少なくとも１つであるが２０以下の改変を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部分を含む、ＴＣＲサブユニットのＩＴＡＭを含む。
【００８１】
幾つかの実施形態では、該ＩＴＡＭは、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、またはＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭと置きかわる。
【００８２】
幾つかの実施形態では、該ＩＴＡＭは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及びＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭと置きかわる。
【００８３】
幾つかの実施形態では、該組成物は、リーダー配列をさらに含む。
【００８４】
一態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載する組成物の核酸分子によってコードされるポリペプチド分子を含む、組成物である。
【００８５】
幾つかの実施形態では、該ポリペプチドは、第１の核酸分子によってコードされる第１のポリペプチドと、第２の核酸分子によってコードされる第２のポリペプチドとを含む。
【００８６】
一態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載する組成物の核酸分子によってコードされる組み換えＴＦＰ分子を含む、組成物である。
【００８７】
一態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載するポリペプチドまたは組み換えＴＦＰ分子をコードする核酸分子を含むベクターを含む、組成物である。
【００８８】
幾つかの実施形態では、該ベクターは、ａ）第１のＴＦＰをコードする第１の核酸分子を含む第１のベクターと、ｂ）第２のＴＦＰをコードする第２の核酸分子を含む第２のベクターとを含む。
【００８９】
幾つかの実施形態では、該ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。
【００９０】
幾つかの実施形態では、該ベクターは、プロモーターをさらに含む。
【００９１】
幾つかの実施形態では、該ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターである。
【００９２】
幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、ポリ（Ａ）テールをさらにコードする。
【００９３】
幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、３’ＵＴＲをさらにコードする。
【００９４】
幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸分子は、プロテアーゼ切断部位をさらにコードする。
【００９５】
一態様では、本明細書で提供するのは、本明細書に記載する組成物を含む細胞を含む、組成物である。
【００９６】
幾つかの実施形態では、該細胞は、ヒトＴ細胞である。
【００９７】
幾つかの実施形態では、該Ｔ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００９８】
幾つかの実施形態では、該組成物は、細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第２のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。
【００９９】
幾つかの実施形態では、該抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む。
【０１００】
一態様では、本明細書で提供するのは、ＭＳＬＮまたはＭＵＣ１６の発現に関連する疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に有効量の本明細書に記載する組成物を投与することを含む方法である。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、ＭＵＣ１６またはＭＳＬＮの発現に関連する疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、前白血病、ＭＵＣ１６の発現に関連する非がん関連適応症、ＭＳＬＮの発現に関連する非がん関連適応症、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、及び再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌からなる群から選択される。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、該疾患は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫、大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、前白血病、ＭＵＣ１６またはＭＳＬＮの発現に関連する疾患、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される血液のがんである。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する細胞は、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する細胞の効力を増大させる作用物質と組み合わせて投与される。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、哺乳動物において、抗ＭＳＬＮキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、抗ＭＵＣ１６  ＣＡＲ、抗ＭＳＬＮ  ＣＡＲ、及び抗ＭＵＣ１６  ＣＡＲ；またはそれらの組み合わせを発現する有効量のＴ細胞を投与された哺乳動物と比較して少ないサイトカインが放出される。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、一実施形態では、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する細胞は、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に関連する１つまたは複数の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、第１のＴＦＰ分子及び第２のＴＦＰ分子を発現する細胞は、ＭＳＬＮまたはＭＵＣ１６に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。
【０１０７】
一態様では、本明細書に記載するのは、ＴＣＲサブユニットと、抗腫瘍抗原結合ドメイン、例えば、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＭＵＣ１６、抗ＭＳＬＮなどを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする、単離された核酸分子である。幾つかの実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む。さらに他の実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む。さらなる実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、ここで、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つは、同じＴＣＲサブユニットに由来する。なおさらなる実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。なおさらなる実施形態では、ＴＣＲサブユニットは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン及び／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメイン、またはそれらに対する少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの改変を有するアミノ酸配列から選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、抗体断片を含む。幾つかの実施形態では、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、単離された核酸分子は、（ｉ）本明細書で提供する任意の抗腫瘍関連抗原軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、及びＬＣ  ＣＤＲ３、及び／または（ｉｉ）本明細書で提供する任意の抗腫瘍関連抗原重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、軽鎖可変領域は、本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは３つであるが３０、２０、もしくは１０以下の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。他の実施形態では、重鎖可変領域は、本明細書で提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは３つであるが３０、２０、もしくは１０以下の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、ＴＦＰは、Ｔ細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、もしくはＣＤ３ガンマ、またはそれらの機能的断片、またはそれらに対する少なくとも１つ、２つ、もしくは３つであるが２０、１０、もしくは５以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、ＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。他の実施形態では、コードされるＴＦＰは、ＴＣＲもしくはＴＣＲサブユニットのアルファ、ベータ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３デルタ、またはそれらの機能的断片、またはそれらに対するなくとも１つ、２つ、もしくは３つであるが２０、１０、もしくは５以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、コードされるＴＦＰは、ＴＣＲのアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及びＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ならびにＣＤ１５４、あるいはそれらの機能的断片、あるいはそれらに対する少なくとも１つ、２つ、もしくは３つであるが２０、１０、もしくは５以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、膜貫通ドメインを含む。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、コードされる抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに接続される。幾つかの場合では、コードされるリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。幾つかの場合では、コードされるリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。幾つかの場合では、コードされるリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。幾つかの場合では、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはそれらに対しする少なくとも１つ、２つ、もしくは３つであるが２０、１０、もしくは５以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、単離された核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。
【０１１６】
本明細書で提供するのはまた、前述の核酸分子のいずれかによってコードされる、単離されたポリペプチド分子である。
【０１１７】
別の態様で本明細書で提供するのはまた、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、単離されたＴ細胞受容体融合タンパク質（ＴＦＰ）分子である。幾つかの実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメインを含む抗体または抗体断片、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインである。他の実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書で提供するアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖、それらの機能的断片、または本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも１つ、２つ、もしくは３つであるが３０、２０、もしくは１０以下の改変を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、Ｔ細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、もしくはＣＤ３ガンマ、またはそれらに対する少なくとも１つ、２つ、もしくは３つであるが２０、１０、もしくは５以下の改変を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに接続される。幾つかの場合では、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。他の実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。さらに他の実施形態では、単離されたＴＦＰ分子は、リーダー配列をさらに含む。
【０１２１】
本明細書で提供するのはまた、前述のＴＦＰ分子のいずれかをコードする核酸分子を含む、ベクターである。幾つかの実施形態では、該ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、該ベクターは、プロモーターをさらに含む。幾つかの実施形態では、該ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターである。幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸配列は、ポリ（Ａ）テールをさらに含む。幾つかの実施形態では、該ベクター内の核酸配列は、３’ＵＴＲをさらに含む。
【０１２２】
本明細書で提供するのはまた、記載するベクターのいずれかを含む細胞である。幾つかの実施形態では、該細胞は、ヒトＴ細胞である。幾つかの実施形態では、該Ｔ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、該細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインからの正のシグナルを含む第２のポリペプチドと会合した、抑制分子の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドを含む抑制分子をコードする核酸をさらに含む。幾つかの場合では、該抑制分子は、ＰＤ１の少なくとも一部分を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む。
【０１２３】
別の態様では、本明細書で提供するのは、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたＴＦＰ分子であって、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、単離されたＴＦＰ分子である。
【０１２４】
別の態様では、本明細書で提供するのは、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離されたＴＦＰ分子であって、内因性ＴＣＲ複合体に機能的に統合することができる、単離されたＴＦＰ分子である。
【０１２５】
別の態様では、本明細書で提供するのは、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞であって、該ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該ＴＦＰ分子が、該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞内で、該細胞で、及び／または該細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０１２６】
別の態様では、本明細書で提供するのは、ｉ）ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子と；ｉｉ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲ複合体とを含む、タンパク質複合体である。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞受容体のアルファもしくはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、またはＣＤ３ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部分を含む。幾つかの実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、リンカー配列によってＴＣＲ細胞外ドメインに接続される。幾つかの場合では、リンカー領域は、リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０１２８】
本明細書で提供するのはまた、記載するタンパク質複合体のいずれか１つ当たりに少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【０１２９】
別の態様では、本明細書で提供するのは、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、該集団のＴ細胞が、少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々にまたは集合的に含み、該ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含み、該ＴＦＰ分子が、該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞内で、該細胞で、及び／または該細胞の表面上で、内因性ＴＣＲ複合体及び／または少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団である。
【０１３０】
別の態様では、本明細書で提供するのは、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、該集団のＴ細胞が、本明細書で提供する単離された核酸分子によってコードされる少なくとも２つのＴＦＰ分子を個々にまたは集合的に含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団である。
【０１３１】
別の態様では、本明細書で提供するのは、記載するベクターのいずれかでＴ細胞に形質導入することを含む、細胞を作製する方法である。
【０１３２】
別の態様では、本明細書で提供するのは、ＲＮＡが操作された細胞の集団を生成する方法であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、該ＲＮＡが、記載するＴＦＰ分子のいずれかをコードする核酸を含む方法である。
【０１３３】
別の態様では、本明細書で提供するのは、哺乳動物に抗腫瘍免疫をもたらす方法であって、記載するＴＦＰ分子のいずれかを発現する有効量の細胞を該哺乳動物に投与することを含む方法である。幾つかの実施形態では、細胞は、自己Ｔ細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、同種異系Ｔ細胞である。幾つかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【０１３４】
別の態様では、本明細書で提供するのは、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患を有する哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に、記載するＴＦＰ分子のいずれかを含む有効量の細胞を投与することを含む方法である。幾つかの実施形態では、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患は、増殖性疾患、例えば、がんもしくは悪性腫瘍、または前がん状態、例えば、骨髄形成異常、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病、または腫瘍関連抗原の発現に関連する非がん関連適応症からなる群から選択される。幾つかの実施形態では、疾患は、１つまたは複数の急性白血病、例えば、限定するものではないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「Ｂ−ＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「Ｔ−ＡＬＬ」）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；１つまたは複数の慢性白血病、例えば、限定するものではないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；さらなる血液のがんまたは血液状態、例えば、限定するものではないが、Ｂ細胞前リンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ球増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、孤立性形質細胞腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、形質細胞性白血病、骨髄形成異常及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及び骨髄の血液細胞の無効な産生（または異形成）によって総括される血液状態の多様な集まりである「前白血病」、及び腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患、例えば、限定するものではないが、腫瘍関連抗原を発現する非定型及び／または非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態、または増殖性疾患；ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、血液のがんである。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、記載するＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞は、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に関連する１つまたは複数の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与される。幾つかの実施形態では、記載するＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞は、腫瘍関連抗原に関連する疾患を治療する作用物質と組み合わせて投与される。
【０１３６】
本明細書で提供するのはまた、医薬として使用するための、記載する単離された核酸分子のいずれか、記載する単離されたポリペプチド分子のいずれか、記載する単離されたＴＦＰのいずれか、記載するタンパク質複合体のいずれか、記載するベクターのいずれか、または記載する細胞のいずれかである。
【０１３７】
１．定義
別段の定義がない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解される意味と同じ意味を有する。
【０１３８】
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、該冠詞の文法上の目的語が１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）であることを指す。例として、「エレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つのエレメントまたは２つ以上のエレメントを意味する。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「約」は、状況、及び当業者が知っているかまたは知り得ることに応じて、プラスまたはマイナス１パーセント未満、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０パーセント、または３０パーセント超を意味し得る。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」もしくは「対象（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」または「個体」として、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、家畜、農業用動物、もしくは野生動物、ならびに鳥類、及び水生動物が挙げることができるが、これらに限定されない。「患者」とは、疾患、障害、または状態に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクがあるか、さもなければ本明細書で提供する組成物及び方法を必要とする対象である。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」は、疾患または状態の治療または改善における成功を示す任意の徴候を指す。治療は、例えば、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の重症度の低減、遅延、もしくは緩和を含むことができ、または患者が経験する疾患、欠陥、障害、もしくは有害な状態などの症状の頻度の低減を含むことができる。本明細書で使用される場合、「治療または予防する」は、疾患または状態のある程度の治療または改善をもたらす方法を指すために本明細書で使用されることがあり、限定するものではないが、状態の完全な予防を含めた、その目的に向けた様々な結果が企図される。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「予防すること」は、患者における疾患または状態、例えば腫瘍形成を防止することを指す。例えば、腫瘍または他の形態のがんを発症するリスクのある個体が本発明の方法で治療され、その後腫瘍または他の形態のがんを発症しないならば、疾患は、少なくともある期間にわたってその個体において予防されている。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「治療的有効量」は、組成物またはその活性成分の量であって、該組成物を投与される個体に対して、有益効果をもたらすか、さもなければ有害で非有益な事象を低減させるのに十分な量である。本明細書における「治療的有効用量」は、それが投与されたことに対して１つまたは複数の所望のまたは望ましい（例えば有益な）効果を生み出す用量を意味しており、そのような投与は所与の期間にわたって一回または複数回行われる。正確な用量は、治療の目的に応じて異なることとなり、当業者によって公知の技法を使用して確定されることとなる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）；Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）；及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照されたい）。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、ＴＣＲを含む様々なポリペプチドに由来する組み換えポリペプチドを含み、該ＴＣＲは、一般に、ｉ）標的細胞の表面抗原に結合することができ、かつｉｉ）典型的にはＴ細胞内またはＴ細胞の表面上の同じ場所に位置するときに、インタクトなＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。
【０１４５】
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリンまたはそれらの断片であってもよく、天然源由来であっても組み換え源由来であってもよい。
【０１４６】
「抗体断片」または「抗体結合ドメイン」という用語は、抗体の少なくとも一部分またはその組み換え変異体であって、抗原及びその所定のエピトープなどの標的に対する認識及び特異的結合を抗体断片に付与するのに十分な、インタクトな抗体の抗原結合ドメイン、すなわち抗原を決定する可変領域を含有するものを指す。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、線状抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と略される）（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質であって、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とが短いフレキシブルなポリペプチドリンカーによって隣接して連結され、単一のポリペプチド鎖として発現することが可能であり、該ｓｃＦｖが、その由来であるインタクトな抗体の特異性を保持しているものを指す。
【０１４８】
抗体に関する「重鎖可変領域」または「ＶＨ」（または、単一ドメイン抗体、例えばナノボディの場合、「ＶＨＨ」）は、フレームワーク領域として公知の隣接するストレッチ間に介在する３つのＣＤＲを含有する重鎖の断片を指し、これらのフレームワーク領域は一般に、ＣＤＲより高度に保存され、ＣＤＲを支持する足場を形成する。
【０１４９】
指定されない限り、本明細書で使用される場合、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に対して、ＶＬ及びＶＨ領域をいずれの順序で有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでも、ＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
【０１５０】
抗体またはその抗体断片を含む本発明のＴＦＰ組成物の一部分は、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）または重鎖抗体ＨＣＡｂ２４２：４２３−４２６を含めた、抗原結合ドメインが連続するポリペプチド鎖の一部として発現される種々の形態で存在してもよい。一態様では、本発明のＴＦＰ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、ＴＦＰは、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む抗体断片を含む。
【０１５１】
「抗体重鎖」という用語は、天然に存在する立体配座の抗体分子に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、それは通常、その抗体が属するクラスを決定する。
【０１５２】
「抗体軽鎖」という用語は、天然に存在する立体配座の抗体分子に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０１５３】
「組み換え抗体」という用語は、組み換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系によって発現される抗体などを指す。この用語はまた、抗体をコードし、抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子、または抗体を特定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体を意味すると解釈されるものとし、ここで、該ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野で利用可能であり、周知されている組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
【０１５４】
「抗原」または「Ａｇ」という用語は、抗体が特異的に結合することができる分子、さもなければ免疫応答を誘発する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特定の免疫適格細胞の活性化、または両方を含み得る。
【０１５５】
当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含めた任意の巨大分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう、さらに、抗原は、組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。したがって、当業者であれば、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、本明細書で使用される用語としての「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明には、限定するものではないが、２つ以上の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用が含まれること、そしてこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配置されることは容易に認められる。さらに、当業者であれば、抗原は、「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するであろう。抗原は、合成で生成されてもよく、または生体試料に由来してもよく、またはポリペプチド以外の巨大分子であってもよいことは容易に認められる。そのような生体試料として、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生体内成分を有する液体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１５６】
「抗腫瘍効果」という用語は、様々な手段によって明らかにすることができる生物学的効果を指し、それらとして、例えば、腫瘍量の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増大、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、またはがん性状態に関連する様々な生理的症状の改善が挙げられるが、これらに限定されない。「抗腫瘍効果」は、まず第一に、腫瘍の発生の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体の能力によって明らかにすることができる。
【０１５７】
「自己」という用語は、任意の物質であって、それを後で再導入しようとする個体と同じ個体に由来する物質を指す。
【０１５８】
「同種異系」という用語は、任意の物質であって、その物質が導入される個体と同じ種の異なる動物または異なる患者に由来する物質を指す。２つ以上の個体は、１つまたは複数の遺伝子座における遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系と言われる。幾つかの態様では、同じ種の個体に由来する同種異系物質は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝学的に異なり得る。
【０１５９】
「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【０１６０】
「がん」という用語は、急速で無制御な異常細胞の増殖によって特徴付けられる疾患を指す。がん細胞は、局所的に、または血流及びリンパ系を通して体の他の部分に広がり得る。様々ながんの例は、本明細書に記載されており、それらとして、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合特性に有意な影響を与えないか、またはそれを変更しないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変には、アミノ酸の置換、付加、及び欠失が含まれる。改変は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野で公知の標準的技法によって、本発明の抗体または抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定められている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。よって、本発明のＴＦＰ中の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基で置きかえることができ、変更されたＴＦＰは、本明細書に記載する機能アッセイを使用して試験することができる。
【０１６２】
「刺激」という用語は、刺激ドメインまたは刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がその同族リガンドと結合し、それによってシグナル伝達事象、例えば、限定するものではないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介するシグナル伝達を媒介することによって誘導される一次応答を指す。刺激は、ある種の分子の発現の変更、及び／または細胞骨格構造の再構築などを媒介し得る。
【０１６３】
「刺激分子」または「刺激ドメイン」という用語は、Ｔ細胞によって発現される分子またはその一部分であって、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくともある側面に対して刺激を与えるようにＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナル伝達配列（複数可）を提供するものを指す。一態様では、一次シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体がペプチドを担持するＭＨＣ分子と結合することによって開始され、これによって、限定するものではないが、増殖、活性化、分化などのＴ細胞応答が媒介される。刺激を与えるように作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたは「ＩＴＡＭ」として公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。本発明に特に有用な一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても公知である）及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、アクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）などの免疫系細胞であって、その表面上で主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を表示するものを指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して、これらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原を処理し、それらをＴ細胞に提示する。
【０１６５】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書で使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＦＰ含有細胞、例えば、ＴＦＰ発現Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＴＦＰ発現Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の例として、細胞溶解活性、及びサイトカインの分泌を含めたヘルパーＴ細胞活性が挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとして、一次刺激、または抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。ある実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含み得る。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとして、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものが挙げられる。
【０１６６】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（「免疫受容活性化チロシンモチーフ」）を含み得る。ＩＴＡＭを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例として、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ  ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それによって、限定するものではないが、増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子として、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられるが、これらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、次のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び活性化ＮＫ細胞受容体に代表され得る。そのような分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、もしくは本来の細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはそれらの機能的断片を含み得る。「４−１ＢＢ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供されるアミノ酸配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等な残基を有する、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーを指し、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基として定義される。
【０１６８】
「コードする」という用語は、定義されたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸配列のいずれか、及びそれに起因する生物学的特性を有する生物学的プロセスにおいて、他のポリマー及び巨大分子を合成するための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有特性を指す。よって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞または他の生体系内でタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡの配列と同一であり、通常配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡを転写するための鋳型として使用される非コード鎖は、両方とも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするとみなすことができる。
【０１６９】
別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であって、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列が幾つかの型において１つまたは複数のイントロンを含有することがあるという範囲でイントロンが含まれてもよい。
【０１７０】
「有効量」または「治療的有効量」という用語は、本明細書では相互に交換可能に使用され、本明細書に記載する通りの化合物、製剤、物質、または組成物の特定の生物学的または治療的結果を実現するのに有効な量を指す。
【０１７１】
「内因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の内部に由来するか、またはそれらの内部で生成される任意の物質を指す。
【０１７２】
「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で生成される任意の物質を指す。
【０１７３】
「発現」という用語は、プロモーターによって駆動される、特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳を指す。
【０１７４】
「移入ベクター」という用語は、単離された核酸を含む組成物であって、単離された核酸を細胞の内側に送達するために使用することができるものを指す。多数のベクターが当技術分野で公知であり、それらとして、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。よって、「移入ベクター」という用語には、自己複製プラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語にはまた、核酸の細胞への移入を促進する非プラスミドまたは非ウイルス性化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどがさらに含まれると解釈されるものとする。ウイルス性移入ベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
「発現ベクター」という用語は、発現させようとするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現調節配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現系において供給され得る。発現ベクターとして、当技術分野で公知のすべてのものが挙げられ、それらとして、組み換えポリヌクレオチドを組み込んだ、コスミド、プラスミド（例えば、裸のものまたはリポソーム中に含有されたもの）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
【０１７６】
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点で、レトロウイルスの中でも独特である。それらは、宿主細胞のＤＮＡに相当量の遺伝情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法のうちの一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは、すべてレンチウイルスの例である。
【０１７７】
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターを指し、それとして、とりわけ、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）に示されるような自己不活性化レンチウイルスベクターが挙げられる。臨床で使用することができるレンチウイルスベクターの他の例として、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが挙げられるが、これらに限定されない。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者には公知であろう。
【０１７８】
「相同」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子間、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。２つの分子の両方におけるあるサブユニット位置が同じ単量体のサブユニットで占められているとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンで占められているならば、それらは、その位置で相同または同一である。２つの配列間の相同性は、一致するまたは相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、長さ１０のサブユニットのポリマー中で５つの位置）が相同であるならば、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０のうち９）が一致するまたは相同であるならば、２つの配列は９０％相同である。
【０１７９】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。ほとんどの部分で、ヒト化抗体及びその抗体断片はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体または抗体断片）であり、それにおいて該レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基は、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって置きかえられている。幾つかの場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置きかえられている。さらに、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。これらの改変によって、抗体または抗体断片の性能をさらに洗練し、最適化することができる。一般に、ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むものであり、それにおいてＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは相当な部分がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体断片は、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分も含むことができる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６，１９９２を参照されたい。
【０１８０】
「ヒト」または「完全ヒト」は、抗体または抗体断片などの免疫グロブリンであって、分子全体がヒト起源のものであるか、またはヒト型の抗体もしくは免疫グロブリンと同一のアミノ酸配列からなるものを指す。
【０１８１】
「単離された」という用語は、天然の状態から変更されたか、または取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ものではないが、同じ核酸またはペプチドであって、その天然の状態の共存する物質から部分的にまたは完全に分離されたものは、「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞などの非天然環境で存在することができる。
【０１８２】
本発明との関係において、通常存在する核酸塩基について、次の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【０１８３】
「作動可能に連結された」または「転写調節」という用語は、異種核酸配列の発現をもたらす、制御配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与えるならば、該プロモーターは該コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いに隣接していてもよく、例えば、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合、同じリーディングフレーム内にある。
【０１８４】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、もしくは胸骨内注射、腫瘍内または注入技法が含まれる。
【０１８５】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明確に示された配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、相同分子種、ＳＮＰ、及び相補的配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１８６】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、相互に交換可能に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチド配列を構成することができるアミノ酸の最大数については制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、通常、当技術分野でペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、一般に当技術分野でタンパク質と呼ばれ、多くのタイプが存在する長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然のペプチド、組み換えペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１８７】
「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要とされる、細胞の転写機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【０１８８】
「プロモーター／制御配列」という用語は、プロモーター／制御配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を指す。幾つかの場合では、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、他の場合では、この配列は、エンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に必要とされる他の制御エレメントも含んでもよい。プロモーター／制御配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであってもよい。
【０１８９】
「構成的」プロモーターという用語は、ヌクレオチド配列であって、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんどまたはすべての生理的条件下で該細胞内に該遺伝子産物を産生させるものを指す。
【０１９０】
「誘導性プロモーター」という用語は、ヌクレオチド配列であって、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在するときのみ、該細胞内に該遺伝子産物を産生させるものを指す。
【０１９１】
「組織特異的」プロモーターという用語は、ヌクレオチド配列であって、遺伝子をコードするまたは遺伝子によって特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞が該プロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ、該細胞内に該遺伝子産物を産生させるものを指す。
【０１９２】
「リンカー」及び「フレキシブルポリペプチドリンカー」という用語は、ｓｃＦｖとの関係において使用される場合、グリシン及び／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーであって、可変重鎖及び可変軽鎖領域を一緒に連結するために単独でまたは組み合わせて使用されるものを指す。一実施形態では、フレキシブルポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎを含み、式中、ｎは、１以上の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、及びｎ＝１０である。一実施形態では、フレキシブルポリペプチドリンカーには、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、リンカーには、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）、または（Ｇｌｙ３／Ｓｅｒ）の複数の繰返しが含まれる。本発明の範囲内に含まれるのはまた、ＷＯ２０１２／１３８４７５（参照により本明細書に援用される）に記載されるリンカーである。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４である）を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３である）を含む。
【０１９３】
本明細書で使用される場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写の開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「フロント」または５’末端に付加される改変されたグアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されたヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識及びリボヌクレアーゼからの保護に不可欠である。キャップ付加は転写と対であり、転写と同時に起こるため、互いに影響を与え合う。転写の開始直後に、合成中のｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼに会合しているキャップ合成複合体と結合する。この酵素複合体は、ｍＲＮＡのキャッピングに必要とされる化学反応に触媒作用を及ぼす。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡの機能性、例えば、その安定性または翻訳の効率を調節するために改変することができる。
【０１９４】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターから生成される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを生成するために使用される鋳型を含む。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに結合される一連のアデノシンである。一過性発現用の構築物の好ましい実施形態では、ポリＡは、５０〜５０００の間、好ましくは６４超、より好ましくは１００超、最も好ましくは３００または４００超である。ポリ（Ａ）配列は、局在性、安定性、または翻訳の効率などのｍＲＮＡの機能性を改変するために、化学的または酵素的に改変することができる。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化」は、ポリアデニリル部分、またはその改変された変異体のメッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、ポリアデニル酸ポリメラーゼという酵素の作用を通してＲＮＡ前駆体に付加された、アデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合、数百）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特定配列、ポリアデニル化シグナルを含有する転写物に付加される。ポリ（Ａ）テール及びそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのを助ける。ポリアデニル化は、転写終結、核からのｍＲＮＡの輸送、及び翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡをＲＮＡに転写した直後に核内で生じるが、それに加えて後で細胞質内で生じることもある。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼに会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を通して切断される。切断部位は、通常、切断部位の近くに塩基配列ＡＡＵＡＡＡ（配列番号９８）が存在することによって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が切断部位の遊離３’末端に付加される。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、「一過性」は、非統合導入遺伝子の数時間、数日、または数週間にわたる発現を指し、ここで、この発現期間は、ゲノムに統合された場合または宿主細胞内の安定したプラスミドレプリコン内に含有される場合の該遺伝子の発現期間より短い。
【０１９８】
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の一方の部分から細胞の他方の部分へのシグナル伝達に役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句には、シグナルを受け取り、細胞膜を越えてシグナルを伝達することができる分子及び分子の複合体が含まれる。
【０１９９】
「対象」という用語には、免疫応答が誘発され得る生体（例えば、哺乳動物、ヒト）が含まれることが意図される。
【０２００】
「実質的に精製された」細胞という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、それが天然に存在する状態で通常会合する他の細胞型から分離されている細胞を指す。幾つかの場合では、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。他の場合では、この用語は、単に、その天然の状態で天然に会合している細胞から分離されている細胞を指す。幾つかの態様では、該細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される。他の態様では、該細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されない。
【０２０１】
「治療（の）（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」という用語は、本明細書で使用される場合、治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を意味する。治療効果は、病態の低減、阻害、寛解、または根絶によって得られる。
【０２０２】
「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）という用語は、本明細書で使用される場合、疾患または病態の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）または保護的治療を意味する。
【０２０３】
本発明との関係において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある種の態様では、本発明の過剰増殖性障害抗原は、限定するものではないが、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、ＮＨＬ、白血病、子宮癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎臓癌、及び腺癌、例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌、食道癌、胃癌、再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌を含めた、がんに由来する。
【０２０４】
「形質移入された」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外来核酸が宿主細胞内に移入されるまたは導入されるプロセスを指す。「形質移入された」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外来核酸によって形質移入された、形質転換された、または形質導入されたものである。該細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
【０２０５】
「特異的に結合する」という用語は、試料中に存在する同族結合パートナー（例えば、ＢＣＭＡ）を認識し、結合するが、試料中の他の分子を必然的に及び実質的に認識または結合しない、抗体、抗体断片、または特異的リガンドを指す。
【０２０６】
範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様は、範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での説明は単に便宜上及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する確固たる限定と解釈されるべきではないことが理解されるものとする。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示しているとみなされるものとする。例えば、１〜６などの範囲の説明は、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６だけでなく、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲を具体的に開示しているとみなされるものとする。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するものを含み、かつ９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％、及び９８〜９９％の同一性などの部分範囲を含む。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【０２０７】
２．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）
本発明は、ＴＦＰをコードする組み換えＤＮＡ構築物であって、該ＴＦＰが、特異的にＢＣＭＡ、例えば、ヒトＢＣＭＡに結合する抗体断片を含み、該抗体断片の配列が、ＴＣＲサブユニットまたはその一部分をコードする核酸配列に隣接し、同じリーディングフレーム内にある、ＤＮＡ構築物を包含する。本明細書で提供するＴＦＰは、機能的ＴＣＲ複合体を形成するために、１つまたは複数の内因性の（または代替的に、１つもしくは複数の外因性、または内因性と外因性との組み合わせの）ＴＣＲサブユニットと会合することができる。
【０２０８】
一態様では、本発明のＴＦＰは、別名では抗原結合ドメインと呼ばれる、標的特異的結合エレメントを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を定める標的抗原のタイプと数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する標的抗原を認識するように選択することができる。よって、本発明のＴＦＰ内の抗原結合ドメインの標的抗原として作用することができる細胞表面マーカーの例として、ウイルス感染症、細菌感染症、及び寄生虫感染症；自己免疫疾患；ならびにがん性疾患（例えば、悪性疾患）に関連するものが挙げられる。
【０２０９】
一態様では、ＴＦＰ媒介性Ｔ細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを操作してＴＦＰに入れることによって、関心対象の抗原に指向させることができる。
【０２１０】
一態様では、抗原結合ドメインを含むＴＦＰの一部分は、ＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインを含む。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡを標的とする。
【０２１１】
抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインであってもよく、それらとして、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及びそれらの機能的断片、例えば、限定するものではないが、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及びラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、ならびに抗原結合ドメインとして機能することが当技術分野で公知の代替の足場、例えば、組み換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン、ＤＡＲＰＩＮなどが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、標的抗原を特異的に認識し、結合する天然または合成リガンドを、ＴＦＰの抗原結合ドメインとして使用することができる。幾つかの場合では、抗原結合ドメインは、ＴＦＰが最終的に使用されることとなる種と同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトで使用する場合、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインにヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０２１２】
よって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化もしくはヒト抗体もしくは抗体断片、またはマウス抗体もしくは抗体断片を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載するヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの１つまたは複数（例えば、３つすべて）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、及び／または本明細書に記載するヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの１つまたは複数（例えば、３つすべて）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含み、例えば、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、１つまたは複数の、例えば３つすべてのＬＣ  ＣＤＲ、及び１つまたは複数の、例えば３つすべてのＨＣ  ＣＤＲを含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書に記載するヒト化またはヒト抗ＢＣＭＡ結合ドメインの１つまたは複数（例えば、３つすべて）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含み、例えば、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、２つの可変重鎖領域を有し、各々が、本明細書に記載するＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、及びＨＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書に記載するヒト化もしくはヒト軽鎖可変領域、及び／または本明細書に記載するヒト化もしくはヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書に記載するヒト化重鎖可変領域、例えば、少なくとも２つの本明細書に記載するヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。一実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、本明細書で提供するアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含む、ｓｃＦｖである。ある実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ  ｎｂ）は、本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０、もしくは１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；及び／または本明細書で提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの改変（例えば、置換）であるが、３０、２０、もしくは１０以下の改変（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗腫瘍関連抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、本明細書に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、本明細書に記載するリンカーを介して結合される。一実施形態では、ヒト化抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカー（式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６であり、好ましくは、３または４である）を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、次の配向：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれかであり得る。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０２１３】
幾つかの態様では、非ヒト抗体はヒト化されており、この場合、抗体の特定の配列または領域が、ヒトにおいて天然に産生される抗体またはそれらの断片に対する類似性を増大させるように改変されている。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化されている。
【０２１４】
ヒト化抗体は、当技術分野で公知の種々の技法を使用して生成することができ、それらとして、ＣＤＲ移植（例えば、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号；国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号；ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、及び第５，５８５，０８９号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたい）、ベニアリングまたはリサーフェシング（例えば、欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号及び第ＥＰ５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４；ならびにＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたい）、鎖シャッフリング（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたい）、ならびに、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第ＷＯ９３１７１０５号、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９−２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３−６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７−７９（２０００）、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５−９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７−２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ  Ｓ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９−１０（１９９４）、及びＰｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９−７３（１９９４）（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）に開示される技法が挙げられるが、これらに限定されない。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、例えば、抗原結合を変更する、例えば向上させるために、ＣＤＲドナー抗体に由来する対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって特定され、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデル化して抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定し、配列を比較して、特定の位置にある他とは異なるフレームワーク残基を特定することによって行われる（例えば、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３（これらは参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）を参照されたい）。
【０２１５】
ヒト化抗体または抗体断片は、その中に残留する非ヒト源に由来する１つまたは複数のアミノ酸残基を含む。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と呼ばれることが多く、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。本明細書で提供する場合、ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子に由来する１つまたは複数のＣＤＲ、及びフレームワーク領域を含み、ここで、フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にまたはほとんどヒト生殖細胞系列に由来する。抗体または抗体断片をヒト化する複数の技法が当技術分野で周知であり、本質的にはＷｉｎｔｅｒ及び共同研究者による方法に従って（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、対応するヒト抗体の配列の代わりに置換することによって、すなわちＣＤＲ移植によって実施することができる（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号；及び米国特許第４，８１６，５６７号；第６，３３１，４１５号；第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第６，５４８，６４０号（それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。そのようなヒト化抗体及び抗体断片では、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に小さい部分が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。ヒト化抗体は、幾つかのＣＤＲ残基及び場合により幾つかのフレームワーク（ＦＲ）残基がげっ歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体であることが多い。抗体及び抗体断片のヒト化は、ベニアリングもしくはリサーフェシング（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４（１９９４）；及びＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（１９９４））、または鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）によっても実現することができる（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【０２１６】
ヒト化抗体の作製に使用される軽鎖及び重鎖両方のヒト可変ドメインを選択するのは、抗原性を低減させるためである。いわゆる「ベストフィット」法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列が、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類のものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体用のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークが、幾つかの異なるヒト化抗体に使用されてもよい（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６−１７）：１１５７−１１６５（１９９７）；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）（これらの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。幾つかの実施形態では、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、４つすべてのフレームワーク領域は、ＶＨ４−４−５９生殖細胞系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、対応するマウス配列のアミノ酸に由来する１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの改変、例えば置換を含むことができる。一実施形態では、軽鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば４つすべてのフレームワーク領域は、ＶＫ３−１．２５生殖細胞系列配列に由来する。一実施形態では、フレームワーク領域は、対応するマウス配列のアミノ酸に由来する１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの改変、例えば置換を含むことができる。
【０２１７】
幾つかの態様では、抗体断片を含む本発明のＴＦＰ組成物の一部分は、標的抗原に対する高親和性及び他の好適な生物学的特性を保持したままヒト化される。本発明の一態様によれば、ヒト化抗体及び抗体断片は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物を解析するプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を詳細に調べることによって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の解析、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響を与える残基の解析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基は、標的抗原に対する親和性の増大などの所望の抗体または抗体断片の特性が実現されるように、レシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与している。
【０２１８】
一態様では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、断片、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）またはラクダ科重鎖（ＶＨＨ）である。一態様では、抗腫瘍関連抗原結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二機能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体である（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））。一態様では、本発明の抗体及びその断片は、野生型または親和性が強化された腫瘍関連抗原タンパク質と結合する。
【０２１９】
本明細書で提供するのはまた、標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ、または融合部分結合ドメインの標的に関して本明細書に別途記載する任意の標的抗原）に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法であり、該方法は、本明細書に述べるＶＨ（またはＶＨＨ）ドメインのアミノ酸配列内の１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって、ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを用意すること、任意選択によりこのようにして用意したＶＨドメインを１つまたは複数のＶＬドメインと組み合わせること、及びＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組み合わせ（１つまたは複数）を試験して、関心対象の標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的であり、任意選択により１つまたは複数の所望の特性を有する、特異的結合メンバーまたは抗体抗原結合ドメインを特定することを含む。
【０２２０】
幾つかの場合、ＶＨドメイン及びｓｃＦｖは、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。ｓｃＦｖ分子は、フレキシブルポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ及びＶＬ領域を一緒に連結することによって生成することができる。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ及び／またはアミノ酸組成のリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折り畳まれ、相互作用するかに大きく影響を与え得る。実際、短いポリペプチドリンカーが用いられるならば（例えば、５〜１０のアミノ酸）、鎖内の折り畳みは妨げられる。鎖間の折り畳みも、２つの可変領域を一緒にして機能的エピトープ結合部位を形成するために必要とされる。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。リンカーの配向及びサイズの例については、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、第２００５／０１７５６０６号、第２００７／００１４７９４号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０２０２５８号及び第ＷＯ２００７／０２４７１５号（これらは、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０２２１】
ｓｃＦｖは、そのＶＬ領域とＶＨ領域との間に、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１５個超の残基のリンカーを含むことができる。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。幾つかの実施形態では、リンカー配列は、アミノ酸のグリシン及びセリンを含む。別の実施形態では、リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｎは、１以上の正の整数である）などのグリシンとセリンとの組の繰返しを含む。一実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３であり得る。リンカーの長さを変動させると、活性を保持または強化することができ、それによって活性試験において優れた効力が生じる。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝２〜４）を含む。幾つかの場合では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜３）を含む。
【０２２２】
３．安定性及び変異
抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ分子（例えば、可溶性ｓｃＦｖ）の安定性は、従来の対照ｓｃＦｖ分子または完全長抗体の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）を基準にして評価することができる。一実施形態では、ヒト化またはヒトｓｃＦｖは、記載するアッセイにおいて、親のｓｃＦｖより約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、または約１５℃高い熱安定性を有する。
【０２２３】
抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性の向上は、次に腫瘍関連抗原−ＴＦＰ構築物全体にもたらされ、抗腫瘍関連抗原ＴＦＰ構築物の治療特性の向上につながる。抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定は、従来の抗体と比較したときに少なくとも約２℃または３℃向上し得る。一実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較したときに１℃向上した熱安定性を有する。別の実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較したときに２℃向上した熱安定性を有する。別の実施形態では、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較したときに４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、または１５℃向上した熱安定性を有する。比較は、例えば、本明細書に開示するｓｃＦｖ分子と、該ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬが由来する抗体のｓｃＦｖ分子またはＦａｂ断片との間で行うことができる。熱安定性は、当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。例えば、一実施形態では、ＴＭを測定することができる。ＴＭを測定する方法及びタンパク質の安定性を決定する他の方法は、後述する。
【０２２４】
ｓｃＦｖの変異（可溶性ｓｃＦｖのヒト化または変異誘発を通して生じる）によって、ｓｃＦｖの安定性が変更され、ｓｃＦｖ及び抗腫瘍関連抗原ＴＦＰ構築物の全体的な安定性が向上する。ヒト化ｓｃＦｖの安定性は、ＴＭ、温度変性、及び温度凝集などの測定値を使用してマウスｓｃＦｖと比較される。一実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ヒト化プロセスから生じる少なくとも１つの変異を含み、それによって、変異したｓｃＦｖが抗腫瘍関連抗原ＴＦＰ構築物に安定性の向上をもたらすようになる。別の実施形態では、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、ヒト化プロセスから生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の変異を含み、それによって、変異したｓｃＦｖが抗腫瘍関連抗原ＴＦＰ−構築物に安定性の向上をもたらすようになる。
【０２２５】
一態様では、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、本明細書に記載する抗原結合ドメインのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を含み、該抗原結合ドメインは、本明細書に記載する抗腫瘍関連抗原抗体断片の所望の機能特性を保持する。特定の一態様では、本発明のＴＦＰ組成物は、抗体断片を含む。さらなる態様では、その抗体断片は、ｓｃＦｖを含む。
【０２２６】
様々な態様では、ＴＦＰの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域（例えば、ＶＨ及び／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内及び／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つもしくは複数のアミノ酸を改変することによって操作される。特定の一態様では、本発明のＴＦＰ組成物は、抗体断片を含む。さらなる態様では、その抗体断片は、ｓｃＦｖを含む。
【０２２７】
当業者であれば、本発明の抗体または抗体断片をさらに改変して、アミノ酸配列が（例えば、野生型から）変動しているが、所望の活性が変動していないようにすることができることを理解するであろう。例えば、「可欠」アミノ酸残基でアミノ酸置換を生じる追加のヌクレオチド置換が、タンパク質に施されてもよい。例えば、分子中の可欠アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置きかえられてもよい。別の実施形態では、アミノ酸の鎖を、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成が異なる構造的に類似した鎖で置きかえることができ、例えば、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえられる保存的置換がなされてもよい。
【０２２８】
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、それらには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【０２２９】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の関係における同一性の割合（％）は、同じである２つ以上の配列を指す。２つの配列は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手動アラインメント及び目視検査によって、比較域または指定領域にわたって最大の一致が得られるように比較し、整列させたときに、２つの配列が特定の割合（％）の同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有するならば（例えば、特定の領域にわたって、または特定されていないときは配列全体にわたって、６０％の同一性、任意選択により７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性）、「実質的に同一」である。任意選択により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長（または１０アミノ酸長）の領域にわたって、またはより好ましくは１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチド長（または２０、５０、２００以上のアミノ酸長）の領域にわたって存在する。
【０２３０】
配列比較については、典型的には１つの配列が参照配列として機能し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよいし、または代替のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の割合（％）を算出する。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための最適な配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索法、コンピュータによるこれらのアルゴリズムの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、または手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって実施することができる。配列同一性の割合（％）及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に利用可能である。
【０２３１】
一態様では、本発明は、機能的に同等な分子を生成する、出発抗体または断片（例えば、ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列の改変を企図する。例えば、ＴＦＰに含まれる抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬは、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保持するように改変することができる。本発明は、機能的に同等な分子を生成するための、ＴＦＰ構築物全体の改変、例えば、ＴＦＰ構築物の様々なドメインの１つまたは複数のアミノ酸配列における改変を企図する。ＴＦＰ構築物は、出発ＴＦＰ構築物の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を保持するように改変することができる。
【０２３２】
４．細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然源由来または組み換え源由来のいずれであってもよい。その源が天然である場合、該ドメインはいずれのタンパク質に由来してもよいが、特に、膜結合または膜貫通タンパク質に由来してもよい。一態様では、細胞外ドメインは、膜貫通ドメインと会合することができる。本発明に特に有用な細胞外ドメインは、少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタ、あるいは、代替実施形態では、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の細胞外領域（複数可）を含んでもよい。
【０２３３】
５．膜貫通ドメイン
一般に、ＴＦＰ配列は、単一のゲノム配列によってコードされる細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含有する。代替実施形態では、ＴＦＰは、ＴＦＰの細胞外ドメインとは異種の膜貫通ドメインを含むように設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接した１つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来するタンパク質の細胞外領域に会合した１つまたは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸）、及び／または膜貫通タンパク質が由来したタンパク質の細胞内領域に会合する１つまたは複数の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸）を含むことができる。ある場合には、膜貫通ドメインは、細胞外領域の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。ある場合には、膜貫通ドメインは、細胞内領域の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。一態様では、膜貫通ドメインは、使用されるＴＦＰの他のドメインのうちの１つに会合しているものである。幾つかの場合では、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合しないように、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最低限に抑えるように選択したり、またはアミノ酸置換によって改変したりすることができる。一態様では、膜貫通ドメインを、ＴＦＰ  Ｔ細胞表面上の別のＴＦＰとホモ二量体化することができる。異なる態様では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＴＦＰに存在する本来の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最低限に抑えるように改変または置換されてもよい。
【０２３４】
膜貫通ドメインは、天然源由来または組み換え源由来のいずれであってもよい。その源が天然である場合、該ドメインは、いずれの膜結合または膜貫通タンパク質に由来してもよい。一態様では、膜貫通ドメインは、ＴＦＰが標的に結合したときは必ず細胞内ドメイン（複数可）にシグナル伝達することができる。本発明に特に有用な膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、またはＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域（複数可）を含んでもよい。
【０２３５】
幾つかの場合では、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質に由来するヒンジを介して、ＴＦＰの細胞外領域、例えば、ＴＦＰの抗原結合ドメインに結合することができる。例えば、一実施形態では、ヒンジは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のヒンジ、例えば、ＩｇＧ４のヒンジ、またはＣＤ８ａのヒンジであり得る。
【０２３６】
６．リンカー
任意選択により、２〜１０のアミノ酸長の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーが、ＴＦＰの膜貫通ドメインと細胞質領域の間の連結を形成してもよい。グリシン−セリンのダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。例えば、一態様では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣのヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２３７】
７．細胞質ドメイン
ＴＦＰの細胞質ドメインは、ＴＦＰがＣＤ３ガンマ、デルタ、またはイプシロンポリペプチドを含有するならば、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータサブユニットは、一般に、シグナル伝達ドメインを欠いている。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、ＴＦＰが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。よって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能を果たすように指示する、タンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される限りにおいて、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、そのような切断部分がインタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。よって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語には、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分が含まれることを意味する。
【０２３８】
本発明のＴＦＰに使用される細胞内シグナル伝達ドメインの例として、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗原受容体の関与に続いてシグナル伝達を開始するように協調して作用する共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体、及び同じ機能的能力を有する任意の組み換え配列が挙げられる。
【０２３９】
ＴＣＲのみを通して生成されるシグナルはナイーブＴ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次及び／または共刺激シグナルが必要とされることが公知である。よって、ナイーブＴ細胞の活性化は、２つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、ＴＣＲを通して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）、及び抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらすもの（二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン）によって媒介されると言うことができる。
【０２４０】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激的または抑制的のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激的に作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）として公知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０２４１】
本発明に特に有用な、ＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインの例として、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄのものが挙げられる。一実施形態では、本発明のＴＦＰは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３イプシロンの一次シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えば、本来のＩＴＡＭドメインと比較して変更された（例えば、増大されたまたは減少された）活性を有する変異ＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化された及び／または切断されたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４、またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【０２４２】
ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをそれ自体で含むことができ、またはそれを、本発明のＴＦＰとの関係において有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）を組み合わせることができる。例えば、ＴＦＰの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖部分と共刺激シグナル伝達ドメインとを含むことができる。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＴＦＰの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。例えば、ＣＤ２７の共刺激は、ヒトＴＦＰ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拡大、エフェクター機能、及び生存を強化することが実証されており、ヒトＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性及び抗腫瘍活性を増強する（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（３）：６９６−７０６）。
【０２４３】
本発明のＴＦＰの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムなまたは特定の順序で互いに連結されてもよい。任意選択により、例えば、２〜１０アミノ酸長（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長）の、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーによって、細胞内シグナル伝達配列間の連結が形成されてもよい。
【０２４４】
一実施形態では、グリシン−セリンのダブレットを、適切なリンカーとして使用することができる。一実施形態では、単一のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを、適切なリンカーとして使用することができる。
【０２４５】
一態様では、本明細書に記載するＴＦＰ発現細胞は、第２のＴＦＰ、例えば、異なる抗原結合ドメイン、例えば、同じ標的（例えば、ＭＵＣ１６またはＭＳＬＮ）または異なる標的（例えば、ＭＵＣ１６またはＭＳＬＮ）に対するものを含む第２のＴＦＰをさらに含むことができる。一実施形態では、ＴＦＰ発現細胞が２つ以上の異なるＴＦＰを含むとき、異なるＴＦＰの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第１及び第２のＴＦＰを発現する細胞は、第１のＴＦＰの抗原結合ドメインを、例えば、断片、例えば、ｓｃＦｖとして含むことができ、これは、第２のＴＦＰの抗原結合ドメインと会合しないものであり、例えば、第２のＴＦＰの抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
【０２４６】
別の態様では、本明細書に記載するＴＦＰ発現細胞は、別の作用物質、例えば、ＴＦＰ発現細胞の活性を強化する作用物質をさらに発現することができる。例えば、一実施形態では、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子、例えば、ＰＤ１は、幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の免疫エフェクター応答開始能力を減少させることがある。抑制分子の例として、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、抑制分子を含み、それは、細胞に正のシグナルをもたらす第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載する細胞内シグナル伝達ドメインに会合している。一実施形態では、作用物質は、例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、及びＴＩＧＩＴなどの抑制分子またはこれらのいずれかの断片（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部分）の第１のポリペプチドと、本明細書に記載する細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインを含むもの（例えば、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８、例えば、本明細書に記載するようなもの）及び／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）である第２のポリペプチドとを含む。一実施形態では、作用物質は、ＰＤ１またはその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部分）の第１のポリペプチドと、本明細書に記載する細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び／または本明細書に記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の第２のポリペプチドとを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬＡも含むＣＤ２８受容体ファミリーの抑制性メンバーである。ＰＤ−１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞、及び骨髄細胞上に発現される（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７５）。ＰＤ１に対する２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ１に結合するとＴ細胞の活性化を下方制御することが示されている（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１０２７−３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：６３４−４３）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒトのがんに豊富に存在する（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５４：３０７−３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０：５０９４）。免疫抑制は、ＰＤ１のＰＤ−Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって、逆転させることができる。
【０２４７】
一実施形態では、作用物質は、抑制分子の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、例えば、プログラム死１（ＰＤ１）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を、膜貫通ドメイン、及び任意選択により、４１ＢＢ及びＣＤ３ゼータなどの細胞内シグナル伝達ドメインに融合させることができる（本明細書ではＰＤ１  ＴＦＰとも呼ばれる）。一実施形態では、ＰＤ１  ＴＦＰは、本明細書に記載する抗腫瘍抗原ＴＦＰと組み合わせて使用すると、Ｔ細胞の持続性を向上させる。一実施形態では、ＴＦＰは、ＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＴＦＰである。あるいは、提供するのは、プログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）またはプログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）に特異的に結合するｓｃＦｖなどの抗体または抗体断片を含有するＴＦＰである。
【０２４８】
別の態様では、本発明は、ＴＦＰ発現Ｔ細胞、例えば、ＴＦＰ−Ｔ細胞の集団を提供する。幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現Ｔ細胞の集団は、異なるＴＦＰを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態では、ＴＦＰ−Ｔ細胞の集団は、本明細書に記載する抗腫瘍関連抗原結合ドメインを有するＴＦＰを発現する第１の細胞と、異なる抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば、第１の細胞によって発現されるＴＦＰ内の抗腫瘍関連抗原結合ドメインとは異なる本明細書に記載される抗腫瘍関連抗原結合ドメインを有するＴＦＰを発現する第２の細胞とを含むことができる。別の例として、ＴＦＰ発現細胞の集団は、抗腫瘍関連抗原結合ドメイン、例えば本明細書に記載するようなものを含むＴＦＰを発現する第１の細胞と、腫瘍関連抗原以外（例えば、別の腫瘍関連抗原）の標的に対する抗原結合ドメインを含むＴＦＰを発現する第２の細胞とを含むことができる。
【０２４９】
別の態様では、本発明は、細胞集団であって、該集団内の少なくとも１つの細胞が、本明細書に記載する抗腫瘍関連抗原ドメインを有するＴＦＰを発現し、第２の細胞が、別の作用物質、例えば、ＴＦＰ発現細胞の活性を強化する作用物質を発現する、細胞集団を提供する。例えば、一実施形態では、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子は、例えば、幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を減少させ得る。抑制分子の例として、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態では、抑制分子を阻害する作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、抑制分子を含み、それは、細胞に正のシグナルをもたらす第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載する細胞内シグナル伝達ドメインに会合している。
【０２５０】
本明細書に開示するのは、ＴＦＰをコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを生成するための方法である。本発明はまた、細胞内に直接形質移入することができる、ＴＦＰをコードするＲＮＡ構築物を含む。形質移入に使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、特別に設計されたプライマーを用いた鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）、それに続くポリＡの付加によって、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ及び／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現しようとする核酸、ならびに典型的には５０〜２０００塩基長であるポリＡテールを含有する構築物を生成することを含み得る。そのように生成されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的に形質移入させることができる。一態様では、鋳型は、ＴＦＰの配列を含む。
【０２５１】
一態様では、抗腫瘍関連抗原ＴＦＰは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。一態様では、抗腫瘍関連抗原ＴＦＰをコードするｍＲＮＡは、ＴＦＰ−Ｔ細胞を産生するためにＴ細胞に導入される。一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ  ＴＦＰは、一過性形質移入の形態で細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成された鋳型を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成される。任意の源に由来する関心対象のＤＮＡは、ＰＣＲによって、適正なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍＲＮＡ合成用の鋳型に直接変換することができる。ＤＮＡ源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または任意の他の適正なＤＮＡ源であり得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に望ましい鋳型は、本発明のＴＦＰである。一実施形態では、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含有する。ＤＮＡは、生物のゲノムに由来する天然に存在するＤＮＡ配列に由来するものであり得る。一実施形態では、核酸は、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全部を含むことができる。核酸は、エキソン及びイントロンを含むことができる。一実施形態では、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態では、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは、天然に存在する生物には通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するように一緒に連結された遺伝子部分を含有するものである。一緒に連結されたＤＮＡ部分は、単一の生物に由来しても、２種以上の生物に由来してもよい。
【０２５２】
形質移入に使用されるｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型を生成するのに、ＰＣＲが使用される。ＰＣＲの実施方法は、当技術分野で周知である。ＰＣＲに使用するためのプライマーは、ＰＣＲ用の鋳型として使用しようとするＤＮＡの領域に実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、プライマー配列内の塩基の大部分またはすべてが相補的であるか、または１つまたは複数の塩基が非相補的もしくは不一致である、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下で、アニーリングまたは意図されるＤＮＡ標的とのハイブリッド形成が可能である。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分と実質的に相補的になるように設計することができる。例えば、プライマーは、細胞内で通常転写される核酸の部分（オープンリーディングフレーム）を、５’及び３’ＵＴＲを含めて増幅するように設計することができる。プライマーは、関心対象の特定のドメインをコードする核酸の一部分を増幅するように設計することもできる。一実施形態では、プライマーは、ヒトｃＤＮＡのコード領域を、５’及び３’ＵＴＲのすべてまたは部分を含めて増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当技術分野で周知の合成方法によって生成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅しようとするＤＮＡ配列の上流にある、ＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドと実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「上流」は、増幅しようとするＤＮＡ配列に対して、コーディング鎖の５側の位置を指すために使用される。「リバースプライマー」は、増幅しようとするＤＮＡ配列の下流にある、二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「下流」は、増幅しようとするＤＮＡ配列に対して、コーディング鎖の３’側の位置を指すために本明細書において使用される。
【０２５３】
ＰＣＲに有用な任意のＤＮＡポリメラーゼを、本明細書に開示する方法に使用することができる。試薬及びポリメラーゼは、幾つもの供給業者から市販されている。
【０２５４】
安定性及び／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用されてもよい。ＲＮＡは、好ましくは、５’及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態では、５’ＵＴＲは、１〜３，０００ヌクレオチド長である。コーディング領域に付加しようとする５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、様々な方法によって変更することができ、それらとして、ＵＴＲの異なる領域にアニーリングするＰＣＲのためのプライマーを設計することが挙げられるが、これに限定されない。この手法を使用すれば、当業者であれば、転写されたＲＮＡの形質移入後に最適な翻訳効率を実現するのに必要とされる５’及び３’ＵＴＲの長さを改変することができる。
【０２５５】
５’及び３’ＵＴＲは、天然に存在する、関心対象の核酸に内因性の５’及び３’ＵＴＲであり得る。あるいは、ＵＴＲ配列をフォワードまたはリバースプライマーに組み込むことによって、または鋳型の任意の他の改変によって、関心対象の核酸に内因性でないＵＴＲ配列を付加することができる。関心対象の核酸に内因性ではないＵＴＲ配列を使用することは、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率を改変するのに有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列にＡＵリッチなエレメントがあると、ｍＲＮＡの安定性が減少することが公知である。したがって、３’ＵＴＲは、当技術分野で周知のＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を増大させるように選択または設計することができる。
【０２５６】
一実施形態では、５’ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含有することができる。あるいは、関心対象の核酸に内因性ではない５’ＵＴＲが上記のようにＰＣＲによって付加されているとき、この５’ＵＴＲ配列を付加することによって、コンセンサスコザック配列を再設計することができる。コザック配列は、幾つかのＲＮＡ転写物の翻訳の効率を増大させることができるが、効率的な翻訳を可能にするためにすべてのＲＮＡに必要とされるわけではないと思われる。多くのｍＲＮＡのためのコザック配列の要件は、当技術分野で公知である。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであり得る。他の実施形態では、３’または５’ＵＴＲに様々なヌクレオチド類似体を使用して、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害させることができる。
【０２５７】
遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成できるようにするには、転写しようとするＤＮＡ鋳型の配列の上流に、転写のプロモーターが結合されていなければならない。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加されると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ＰＣＲ産物中に、転写しようとするオープンリーディングフレームの上流に組み込まれることとなる。好ましい一態様では、プロモーターは、本明細書に別途記載するようなＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとして、Ｔ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。
【０２５８】
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端のキャップと３’ポリ（Ａ）テールの両方を有し、これらは、細胞内のｍＲＮＡのリボソーム結合、翻訳の開始、及び安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長いコンカテマー産物を生成する。３’ＵＴＲの末端で線状化されたプラスミドＤＮＡを転写すると、通常のサイズのｍＲＮＡが生じるが、これは転写後にポリアデニル化されても、真核生物の形質移入に有効ではない。
【０２５９】
線状ＤＮＡ鋳型において、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、転写物の３’末端を、鋳型の最後の塩基を越えて伸長させることができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：６２２３−３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５−６５（２００３）。
【０２６０】
ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡ鋳型に組み込む従来の方法は、分子クローニングである。しかし、プラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドの不安定性を引き起こすことがあり、これが、細菌細胞から得られたプラスミドＤＮＡ鋳型に欠失及び他の異常が高度に混入していることが多い理由である。これによって、クローニング手順は、労力と時間を要するだけでなく、信用できないものとなる。これが、ポリＡ／Ｔ  ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型をクローニングを用いずに構築することができる方法が非常に望ましい理由である。
【０２６１】
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ＰＣＲ中に１００Ｔテール（サイズが５０〜５０００Ｔであり得る）などのポリＴテールを含有するリバースプライマーを使用することによって、またはＰＣＲ後に、限定するものではないが、ＤＮＡライゲーションまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ組み換えを含めた任意の他の方法によって、生成することができる。ポリ（Ａ）テールはまた、ＲＮＡに安定性をもたらし、その分解を低減させる。一般に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、１００〜５０００アデノシンである。
【０２６２】
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写後に、Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してさらに伸長させることができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さを、１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチドに増加させると、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍増大する。加えて、異なる化学基を３’末端に結合させると、ｍＲＮＡの安定性が増大し得る。そのような結合は、改変／人工ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含有し得る。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してＡＴＰ類似体をポリ（Ａ）テールに組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに増大させることができる。
【０２６３】
５’キャップを付けることによっても、ＲＮＡ分子の安定性をもたらすことができる。好ましい実施形態では、本明細書に開示する方法によって生成されるＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、当技術分野で公知の、本明細書に記載する技法を使用して提供される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６−４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８−９５（２００１）、Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８−９６６（２００５））。
【０２６４】
本明細書に開示する方法によって生成されるＲＮＡは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含有することができる。ＩＲＥＳ配列は、任意のウイルス、染色体、または人工設計配列であってもよく、ｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する。細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質であって、糖、ペプチド、脂質、タンパク質、酸化防止剤、及び界面活性剤などの、細胞の透過性及び生存能を促進する因子を含有することができるものが含まれ得る。
【０２６５】
ＲＮＡは、幾つもの異なる方法、例えば、商業的に入手可能な方法のいずれかを使用して標的細胞に導入することができ、それらの方法として、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ−ＩＩ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、（ＥＣＭ  ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、もしくはＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム媒介形質移入、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介形質移入、または「遺伝子銃」などのパーティクルガン送達系（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１−７０（２００１）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６６】
８．ＴＦＰをコードする核酸構築物
本発明はまた、本明細書に記載する１つまたは複数のＴＦＰ構築物をコードする核酸分子を提供する。一態様では、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供する。一態様では、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供する。
【０２６７】
所望の分子をコードする核酸配列は、当技術分野で公知の組み換え方法を使用して、例えば、該遺伝子を発現する細胞に由来するライブラリーをスクリーニングすること、該遺伝子を含むことが公知のベクターからそれを抽出すること、または該遺伝子を含有する細胞及び組織から直接それを単離することなどによって、標準的技法を使用して得ることができる。あるいは、関心対象の遺伝子は、クローニングではなく、合成的に生成することができる。
【０２６８】
本発明はまた、本発明のＤＮＡが挿入されるベクターを提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、導入遺伝子の長期の安定な統合及び娘細胞におけるその伝播を可能にするために、長期の遺伝子移入を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターに優るさらなる利点を有する。それは、低免疫原性というさらなる利点も有する。
【０２６９】
別の実施形態では、本発明の所望のＴＦＰをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＴＦＰをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、ｃｒｉｓｐｒ、ＣＡＳ９、及びジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して遂行することができる（Ｊｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９．１０：７０４−７１６（参照により本明細書に援用される）を参照されたい）。
【０２７０】
本発明の発現構築物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化及び遺伝子療法に使用されてもよい。遺伝子送達のための方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている）を参照されたい）。別の実施形態では、本発明は、遺伝子療法用ベクターを提供する。
【０２７１】
核酸は、幾つものタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含めたベクターにクローニングすることができる。特に関心対象のベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。
【０２７２】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学の手引き書に記載されている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１種の生物で機能する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つまたは複数の選択マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０２７３】
幾つものウイルスベースの系が、哺乳類細胞への遺伝子移入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に便利なプラットフォームを提供する。当技術分野で公知の技法を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで組み換えウイルスを単離し、対象の細胞にｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで送達することができる。幾つものレトロウイルス系が、当技術分野で公知である。幾つかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。幾つものアデノウイルスベクターが、当技術分野で公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【０２７４】
追加的なプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を制御する。典型的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置しているが、幾つものプロモーターが、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は、多くの場合フレキシブルなので、エレメントが互いに逆転または移動してもプロモーター機能は保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は５０ｂｐ離れるまで増加させることができ、その後活性は低下し始める。個々のエレメントは、プロモーターに応じて協同的または独立に機能して転写を活性化することができると思われる。
【０２７５】
哺乳動物のＴ細胞でＴＦＰ導入遺伝子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。本来のＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的送達に関与する、伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドに広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からのＴＦＰ発現を駆動するのに有効であることが示されている（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、これに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。しかし、他の構成的プロモーター配列も使用されてもよく、それらとして、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定するものではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるものではない。誘導性プロモーターも、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターを使用すると、それに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの発現を、そのような発現が所望されるときにオンにしたり、発現が所望されないときにオフにしたりすることができる分子スイッチが得られる。誘導性プロモーターの例として、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンにより制御されるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７６】
ＴＦＰポリペプチドまたはその一部分の発現を査定するために、細胞に導入しようとする発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含有して、ウイルスベクターを通して形質移入または感染させようとする細胞集団からの発現細胞の特定または選択を容易にすることができる。他の態様では、選択マーカーを別々のＤＮＡ断片上に担持させて、同時形質移入手順に使用してもよい。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方を適正な制御配列に隣接させて、宿主細胞内で発現できるようにしてもよい。有用な選択マーカーとして、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。
【０２７７】
レポーター遺伝子は、形質移入された可能性がある細胞の特定、及び制御配列の機能性の評価に使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物もしくは組織に存在しないか、またはそれらによって発現されない遺伝子であり、容易に検出可能な何らかの特性、例えば酵素活性によって発現が顕在化するポリペプチドをコードする。レポーター遺伝子の発現は、該ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：７９−８２）。適切な発現系は周知であり、公知の技法を使用して調製しても、商業的に得てもよい。一般に、レポーター遺伝子の最も高い発現レベルを示す最小限の５’隣接領域を有する構築物が、プロモーターとして特定される。そのようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結し、これを使用して、プロモーター駆動転写を調節する能力について作用物質を評価してもよい。
【０２７８】
遺伝子を細胞に導入し、発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターとの関係において、該ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫の細胞に、当技術分野における任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
【０２７９】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を生成するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照されたい）。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための一方法は、リン酸カルシウム形質移入である。
【０２８０】
関心対象のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法として、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、とりわけレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えばヒトの細胞に挿入するための最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び第５，５８５，３６２号を参照されたい）。
【０２８１】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段として、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズなどのコロイド分散系、及び脂質ベースの系、例えば、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。核酸を標的化送達する現状技術の他の方法、例えば、標的化ナノ粒子または他の適切なサブミクロンサイズの送達系でのポリヌクレオチドの送達が利用可能である。
【０２８２】
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。脂質配合物の使用は、宿主細胞に核酸を導入するために企図される（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ）。別の態様では、核酸は、脂質と会合されてもよい。脂質と会合された核酸は、リポソームの水性内部に封入されてもよく、リポソームの脂質二重層内に散在してもよく、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合する連結分子を介してリポソームに結合されてもよく、リポソーム内に捕捉されてもよく、リポソームと複合体を形成してもよく、脂質を含有する溶液中に分散されてもよく、脂質と混合されてもよく、脂質と組み合わされてもよく、脂質中の懸濁液として含有されてもよく、ミセルに含有されてもミセルと複合体を形成してもよく、または脂質と別様に会合されてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中のいずれの特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、二重層構造内に存在しても、ミセルとして存在しても、「崩壊した」構造で存在してもよい。それらはまた、場合によりサイズまたは形状が均一でない凝集粒子を形成して、溶液中に単に散在しているだけでもよい。脂質は、天然に存在する脂質でも合成脂質でもよい脂肪性物質である。例えば、脂質として、細胞質内に天然に存在する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素を含有する化合物及びそれらの誘導体の部類、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドが挙げられる。
【０２８３】
使用に適した脂質は、商業的供給元から得ることができる。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．から得ることができ；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から得ることができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ；ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から得てもよい。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するので、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、閉鎖された脂質二重層または凝集粒子の生成によって形成される、種々の一重膜及び多重膜の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質の二重膜と内部の水性媒体とを有する小胞構造を有することを特徴とし得る。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。それは、リン脂質を過剰な水溶液に懸濁させると自然に形成する。脂質成分は、自己再編成を経た後で、閉鎖構造を形成し、水及び溶解した溶質を脂質二重層の間に捕捉する（Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５０５−１０）。しかし、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造であると想定されてもよいし、単に脂質分子の不均一な凝集粒子として存在すると想定されてもよい。リポフェクタミン−核酸複合体もまた企図される。
【０２８４】
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法であるか、または別様に細胞を本発明の阻害剤に曝露するために使用される方法であるかにかかわらず、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、種々のアッセイが実施されてもよい。そのようなアッセイとして、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザン及びノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ；「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの存在または非存在を、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）または本発明の範囲内の作用物質を特定するための本明細書に記載するアッセイによって検出することを挙げることができる。
【０２８５】
本発明は、ＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一態様では、ＴＦＰベクターは、細胞、例えばＴ細胞に直接形質導入することができる。一態様では、ベクターは、クローニングまたは発現ベクターであり、例えば、限定するものではないが、１種または複数のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルス及びレンチウイルスベクター構築物を含めたベクターである。一態様では、ベクターは、哺乳動物のＴ細胞においてＴＦＰ構築物を発現することができる。一態様では、哺乳動物のＴ細胞は、ヒトＴ細胞である。
【０２８６】
９．Ｔ細胞源
拡大及び遺伝子改変の前に、Ｔ細胞源を対象から得る。「対象」という用語には、免疫応答を誘発することができる生体（例えば、哺乳動物）が含まれることが意図される。対象の例として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染症の部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含めた、幾つもの源から得ることができる。本発明のある種の態様では、当技術分野で入手可能な幾つものＴ細胞株が使用されてもよい。本発明のある種の態様では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの、当業者に公知の幾つもの技法を使用して、対象から収集した血液単位から得ることができる。好ましい一態様では、個体の循環血に由来する細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞を含めたリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して、血漿分画を除去し、後続の処理工程のために適正な緩衝液または培地中に入れてもよい。本発明の一態様では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の態様では、洗浄溶液は、カルシウムを含まず、かつマグネシウムを含まなくてもよく、または全部とまでいかなくても多くの二価カチオンを含まなくてもよい。カルシウムの非存在下での初期活性化工程は、活性化の拡大につながり得る。当業者であれば容易に理解するように、洗浄工程は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えば、ＣＯＢＥ（登録商標）２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ（登録商標）、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ（登録商標）５）を製造業者の使用説明書に従って使用することによって遂行することができる。洗浄後に、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ非含有、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ（登録商標）Ａ、または緩衝液を含むもしくは含まない他の生理食塩水などに再懸濁させてもよい。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。
【０２８７】
一態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を除去することによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって、または対向流遠心溶出法によって、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特定の亜集団を、ポジティブまたはネガティブ選択技法によってさらに単離することができる。例えば、一態様では、Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）結合ビーズと、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間インキュベートすることによって単離される。一態様では、その時間は、約３０分である。さらなる態様では、その時間は、３０分〜３６時間の範囲またはそれ以上、及びその間のすべての整数値である。さらなる態様では、その時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の好ましい態様では、その時間は、１０〜２４時間である。一態様では、インキュベーション時間は、２４時間である。腫瘍組織からまたは免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する際など、他の細胞型と比較してＴ細胞があまりないような状況では、より長いインキュベーション時間を使用してＴ細胞を単離してもよい。さらに、より長いインキュベーション時間を使用すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞を捕捉する効率を上げることができる。よって、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合することができる時間を単に短くするもしくは長くすることによって、及び／またはビーズのＴ細胞に対する比率を増加させるまたは減少させることによって（本明細書でさらに記載するように）、培養開始時またはプロセス中の他の時点で、Ｔ細胞の亜集団を優先的に選択するまたは反選択することができる。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加させるまたは減少させることによって、培養開始時または他の所望の時点で、Ｔ細胞の亜集団を優先的に選択するまたは反選択することができる。当業者であれば、本発明との関係において複数回の選択も使用できることを認識するであろう。ある種の態様では、選択手順を実施し、「選択されていない」細胞を活性化及び拡大プロセスに使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞は、さらなる回の選択に供することもできる。
【０２８８】
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃厚化は、ネガティブ選択された細胞に特有の表面マーカーに指向する抗体を組み合わせて遂行することができる。一方法は、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁性免疫接着またはフローサイトメトリーを介した細胞選別及び／または選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃厚化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある種の態様では、典型的には、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を濃厚化するまたはポジティブ選択することが望ましい場合がある。あるいは、ある種の態様では、制御性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５結合ビーズまたは他の同様の選択方法によって除去される。
【０２８９】
一実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、及びパーフォリン、または他の適正な分子、例えば他のサイトカインの１つまたは複数を発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現をスクリーニングするための方法は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載される方法によって決定することができる。
【０２９０】
所望の細胞集団をポジティブまたはネガティブ選択によって単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変動させることができる。ある種の態様では、細胞とビーズの最大限の接触を確実にするために、ビーズと細胞とが一緒に混合される体積を相当減少させる（例えば、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様では、２０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。一態様では、１０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。さらなる態様では、１億細胞／ｍＬ超が使用される。さらなる態様では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍＬの濃度が使用される。さらなる一態様では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍＬからの濃度が使用される。さらなる態様では、１億２５００または１億５０００万細胞／ｍＬの濃度を使用することができる。高い濃度を使用すると、細胞収率、細胞活性化、及び細胞拡大を増大させることができる。さらに、高い細胞濃度を使用すると、ＣＤ２８−ネガティブＴ細胞などの、関心対象の標的抗原を弱く発現し得る細胞をより効率的に捕捉することができ、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病血液、腫瘍組織など）から、より効率的に捕捉することができる。そのような細胞集団は、治療的価値を有することがあり、得ることが望ましいと思われる。例えば、高濃度の細胞を使用すると、通常、より弱いＣＤ２８の発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を、より効率的に選択することができる。
【０２９１】
関連する態様では、低い方の細胞濃度を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）との混合物を相当希釈することによって、粒子と細胞の間の相互作用が最小限に抑えられる。これは、粒子に結合する所望の抗原を豊富に発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一態様では、使用される細胞濃度は、５×１０６／ｍＬである。他の態様では、使用される濃度は、約１×ｌ０５／ｍＬ〜１×ｌ０６／ｍＬ、及びその間の任意の整数値であり得る。他の態様では、細胞は、ローテーター上で、様々な長さの時間、様々な速度で、２〜１０℃または室温のいずれかでインキュベートされてもよい。
【０２９２】
刺激のためのＴ細胞は、洗浄工程後に凍結することもできる。理論に束縛されることを望むものではないが、凍結及び後続の解凍工程によって、細胞集団中の顆粒球及びある程度の単球が除去されることによって、より均一な産物が得られる。血漿及び血小板を除去する洗浄工程後に、細胞は、凍結溶液中に懸濁されてもよい。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で公知であり、これとの関係で有用であるが、一方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、もしくは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、ならびに７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、あるいは、例えば、Ｈｅｓｐａｎ（登録商標）及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ（登録商標）Ａを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用することを含み、次いで、細胞は、−８０℃まで１／分の速度で凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相で保存される。その他の制御凍結法だけでなく、即時に−２０℃にする、または液体窒素中での非制御凍結も使用されてもよい。ある種の態様では、凍結保存された細胞は、本明細書に記載するように解凍及び洗浄され、室温で１時間静置され、その後本発明の方法を使用して活性化される。
【０２９３】
本発明との関係において企図するのはまた、本明細書に記載するように拡大させた細胞が必要になると思われる時期より前の時期に、対象から血液試料またはアフェレーシス産物を収集することである。そのため、拡大させようとする細胞の源は、任意の必要な時点で収集することができ、Ｔ細胞などの所望の細胞を単離及び凍結して、Ｔ細胞療法から利益を得ると思われる本明細書に記載するものなどの幾つもの疾患または状態のために、後でＴ細胞療法に使用することができる。一態様では、血液試料またはアフェレーシスは、全般的に健常な対象から採取される。ある種の態様では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるが疾患をまだ発症していない、全般的に健常な対象から採取され、関心対象の細胞が、後で使用するために単離及び凍結される。ある種の態様では、Ｔ細胞は、拡大され、凍結され、後で使用されてもよい。ある種の態様では、試料は、本明細書に記載するような特定の疾患の診断の直後に、任意の治療の前に患者から収集される。さらなる態様では、細胞は、幾つもの関連する治療法、例えば、限定するものではないが、作用物質、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びタクロリムス（ＦＫ５０６）、抗体、または他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シクロホスファミド、フルダラビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシン（以前のＦＲ９０１２２８）、ならびに放射線照射での治療の前に、対象からの血液試料またはアフェレーシスから単離される。
【０２９４】
本発明のさらなる態様では、Ｔ細胞は、対象に機能性Ｔ細胞を残す治療に続いて、患者から直接得られる。これに関して、ある種のがん治療、特に免疫系を損傷する薬物での治療に続く、治療の直後で患者が通常治療から回復しようとする期間中に得られたＴ細胞の質は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大能力に関して最適であり得るか、または向上したものであり得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載する方法を使用するｅｘ  ｖｉｖｏでの操作後に、これらの細胞は、生着及びｉｎ  ｖｉｖｏでの拡大の強化に好ましい状態にあり得る。よって、本発明との関係において、Ｔ細胞、樹状細胞、または他の造血系細胞を含む血液細胞をこの回復期の間に収集することが企図される。さらに、ある種の態様では、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの動員）及び移植前処置を使用して、とりわけ、療法後の所定の時間枠の間に、対象に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または拡大が好ましい状態を作り出すことができる。実例となる細胞型として、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
【０２９５】
１０．Ｔ細胞の活性化及び拡大
Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載される方法を使用して、活性化及び拡大させてもよい。
【０２９６】
一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体に関連するシグナルを刺激する作用物質が結合された表面と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとの接触によって拡大し得る。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載するように、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと併せたプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激することができる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激については、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体である。抗ＣＤ２８抗体の例として、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当技術分野で一般に公知の他の方法を使用することができる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０２９７】
異なる刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得られた末梢血の単核細胞産物は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多いヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによってＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させると、約８〜９日目前では主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団が産生されるが、約８〜９日目から後では、Ｔ細胞集団は、次第に大きくなるＴＣ細胞集団を含む。したがって、治療目的に応じて、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットを単離したならば、このサブセットをより大きく拡大させることが有益であり得る。
【０２９８】
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーが相当に変動するが、大部分は、細胞拡大プロセスの過程において再現性が良い。よって、そのような再現性によって活性化Ｔ細胞産物を特定の目的に合わせる能力が可能になる。
【０２９９】
抗腫瘍関連抗原ＴＦＰが構築されたら、様々なアッセイを使用して、限定するものではないが、抗原刺激に続いてＴ細胞を拡大させる能力、再刺激の非存在下でＴ細胞の拡大を持続する能力、及び適正なｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び動物モデルでの抗がん活性などの、分子の活性を評価することができる。抗腫瘍関連抗原ＴＦＰの効果を評価するアッセイについては、以下でさらに詳述する。
【０３００】
一次Ｔ細胞でのＴＦＰ発現のウエスタンブロット解析を使用して、単量体及び二量体の存在を検出することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。極めて簡潔に述べると、ＴＦＰを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との１：１混合物）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで１０日間より長く拡大させ、続いて溶解させ、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。ＴＦＰを、ＴＣＲ鎖に対する抗体を使用するウエスタンブロット法によって検出する。同じＴ細胞サブセットを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に使用すれば、共有結合二量体の形成を評価することができる。
【０３０１】
抗原刺激に続くＴＦＰ＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの拡大は、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合物をアルファＣＤ３／アルファＣＤ２８及びＡＰＣで刺激し、続いて、解析されるＧＦＰをプロモーターの制御下で発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。例示的なプロモーターとして、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１アルファ、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。ＧＦＰの蛍光は、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットでの培養の６日目に、フローサイトメトリーによって評価する（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。あるいは、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合物をアルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズで０日目に刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用してＴＦＰと共にｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＴＦＰを形質導入する。
【０３０２】
再刺激の非存在下でのＴＦＰ＋Ｔ細胞の拡大の持続も測定することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。簡潔に述べると、０日目にアルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、１日目に指定のＴＦＰを形質導入した後、培養８日目にＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ粒子計数器を使用して平均Ｔ細胞容積（ｆｌ）を測定する。
【０３０３】
動物モデルを使用してＴＦＰ−Ｔ活性を測定することもできる。例えば、がんを治療するためのヒトＢＣＭＡ特異的ＴＦＰ＋Ｔ細胞を使用する、免疫不全マウスにおける異種移植モデルである（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。極めて簡潔に述べると、がんの確立後、マウスを処置群に従って無作為化する。様々な数の操作したＴ細胞を、１：１の比率で、がんを有するＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−マウスに同時注射する。マウス由来の脾臓ＤＮＡ中の各ベクターのコピー数を、Ｔ細胞注射後の様々な時点で評価する。動物は、１週間間隔でがんについて査定する。アルファ腫瘍関連抗原−ゼータＴＦＰ＋Ｔ細胞または偽の形質導入されたＴ細胞を注射されたマウスにおける末梢血腫瘍関連抗原＋がん細胞数を測定する。これらの群についての生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。加えて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−マウスにＴ細胞を注射してから４週間後の末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数も解析することができる。マウスにがん細胞を注射し、３週間後に、ｅＧＦＰに連結されたＴＦＰをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによってＴＦＰを発現するように操作したＴ細胞を注射する。Ｔ細胞は、注射前に偽の形質導入細胞と混合することによって４５〜５０％入力ＧＦＰ＋Ｔ細胞に正規化し、フローサイトメトリーによって確認する。動物は、１週間間隔でがんについて査定する。ＴＦＰ＋Ｔ細胞群についての生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。
【０３０４】
用量依存的なＴＦＰ処置応答を評価することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。例えば、ＴＦＰ  Ｔ細胞、同等数の偽の形質導入Ｔ細胞を２１日目に注射したマウス、またはＴ細胞を注射しなかったマウスにおける末梢血を、がんの確立から３５〜７０日後に得る。末梢血＋がん細胞数を決定するために各群からのマウスを無作為に採血し、３５日目及び４９日目に屠殺する。残りの動物は、５７日目及び７０日目に評価する。
【０３０５】
細胞増殖及びサイトカイン産生の査定については、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）で前に記載されている。簡潔に述べると、ＴＦＰ媒介増殖の査定は、マイクロタイタープレート内で、洗浄したＴ細胞を、ＢＣＭＡまたはＣＤ３２及びＣＤ１３７（ＫＴ３２−ＢＢＬ）を発現する細胞と、最終Ｔ細胞：ＢＣＭＡ発現細胞の比率が２：１になるように混合することによって実施する。ＢＣＭＡ細胞を発現する細胞には、使用前にガンマ放射線を照射する。抗ＣＤ３モノクローナル抗体（クローンＯＫＴ３）及び抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（クローン９．３）をＫＴ３２−ＢＢＬ細胞を有する培養物に添加して、Ｔ細胞増殖刺激の陽性対照とする。何故なら、これらのシグナルは、ｅｘ  ｖｉｖｏでの長期のＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を支援するからである。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びフローサイトメトリーを製造業者によって記載されるように使用して、Ｔ細胞を培養物中で計数する。ＴＦＰ＋Ｔ細胞は、ｅＧＦＰ−２Ａを連結したＴＦＰを発現するレンチウイルスベクターで操作したＴ細胞を使用して、ＧＦＰ発現によって特定する。ＧＦＰを発現しないＴＦＰ＋Ｔ細胞の場合、ＴＦＰ＋Ｔ細胞は、ビオチン化組み換えＢＣＭＡタンパク質及び二次アビジン−ＰＥ結合体を用いて検出する。Ｔ細胞上のＣＤ４＋及びＣＤ８＋の発現も、特異的モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて同時に検出する。サイトカインの測定は、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、再刺激から２４時間後に収集した上清で実施する。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターを使用して蛍光を査定し、製造業者の使用説明書に従ってデータを解析する。
【０３０６】
細胞傷害性は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって査定することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：１４５３−１４６４（２００９）を参照されたい）。簡潔に述べると、標的細胞に、３７℃で２時間頻繁に撹拌しながら５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４として、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を加え、完全ＲＰＭＩ中で２回洗浄し、マイクロタイタープレート内に播種する。エフェクターＴ細胞を、ウェル内の完全ＲＰＭＩ中で、様々なエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞と混合する。培地のみ（自然放出、ＳＲ）またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００界面活性剤の１％溶液（全放出、ＴＲ）を含有するさらなるウェルも調製する。３７℃で４時間のインキュベーション後に、各ウェルからの上清を採集する。次いで、ガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ）を使用して、放出される５１Ｃｒを測定する。各条件を少なくとも３連で実施し、次式を使用して溶解率（％）を算出する：溶解（％）＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＴＲ−ＳＲ）（式中、ＥＲは、各実験条件で放出された平均５１Ｃｒを表す）。
【０３０７】
画像技術を使用して、腫瘍を有する動物モデルにおけるＴＦＰの特異的輸送及び増殖を評価することができる。そのようなアッセイは、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１５７５−１５８６（２０１１）に記載されている。簡潔に述べると、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスにがん細胞をＩＶ注射し、その７日後に、ＴＦＰ構築物でのエレクトロポレーションから４時間後のＴ細胞を注射する。そのＴ細胞に、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定的に形質移入し、マウスを生物発光について撮像する。あるいは、がん異種移植モデルにおける単回注射のＴＦＰ＋Ｔ細胞の治療効力及び特異性を、次のように測定することができる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入したがん細胞を注射し、続いて７日後に、ＢＣＭＡ  ＴＦＰをエレクトロポレーションしたＴ細胞を単回尾静脈注射する。注射後の様々な時点で、動物を撮像する。例えば、代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性がんの光子密度ヒートマップを、５日目（処置の２日前）及び８日目（ＴＦＰ＋  ＰＢＬの２４時間後）に生成することができる。
【０３０８】
本明細書の実施例の項に記載するものだけでなく、当技術分野で公知のものを含めた他のアッセイも、本発明の抗ＢＣＭＡ  ＴＦＰ構築物を評価するために使用することができる。
【０３０９】
１１．治療用途
腫瘍抗原関連疾患または障害
腫瘍細胞上の１つの標的、例えば、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＭＵＣ１６、ＭＳＬＮなどに指向するがん療法で治療された多くの患者は、時間の経過と共に、代替のシグナル伝達経路及びフィードバックループなどの回避機構が活性化されるにつれて抵抗性になる。二重特異性療法は、回避経路として互いに代用されることの多い標的を組み合わせることによって、これに対処しようとするものである。２つ以上の腫瘍関連抗原に特異的なＴＣＲを有する治療用Ｔ細胞集団は、有望な併用療法である。幾つかの実施形態では、二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞は、追加的な抗がん剤と投与される。幾つかの実施形態では、該抗がん剤は、抗体もしくはその断片、別のＴＦＰ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  Ｔ細胞、または小分子である。例示的な腫瘍関連抗原として、腫瘍胎児抗原（例えば、胎児組織及びがん性体細胞に発現されるもの）、腫瘍ウイルス抗原（例えば、腫瘍化ウイルスによってコードされるもの）、過剰発現／蓄積抗原（例えば、正常組織と新生物組織の両方によって発現され、新生物において発現レベルが非常に高いもの）、がん−精巣抗原（例えば、がん細胞及び精巣及び胎盤などの成人生殖組織によってのみ発現されるもの）、系統限定抗原（例えば、単一のがん組織型によって大部分発現されるもの）、変異抗原（例えば、遺伝子変異または転写の変更の結果としてがんによって発現されるもの）、翻訳後に変更された抗原（例えば、グリコシル化における腫瘍関連の変更などがあるもの）、及びイディオタイプ抗原（例えば、腫瘍細胞が特定のクローン型を発現する、高度に多型の遺伝子に由来するもの、例えば、クローン異常に起因するＢ細胞、Ｔ細胞リンパ腫／白血病におけるものなど）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な腫瘍関連抗原として、アルファ−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ベータ−カテニン、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫ１２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＬＰＰ、ＣＯＡ−１、ＣＳＮＫ１Ａ１、ＣＤ７９、ＣＤ７９Ｂ、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮＤＣ３Ｂ、ＦＮ１、ＧＡＳ７、ＧＰＮＭＢ、ＨＡＵＳ３、ＨＳＤＬ１、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２ｄ、ＨＬＡ−Ａ１１ｄ、ｈｓｐ７０−２、ＭＡＲＴ２、ＭＡＴＮ、ＭＥＩ、ＭＵＭ−１ｆ、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、Ｉ型ミオシン、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ５３、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＰＰ１Ｒ３Ｂ、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１または−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ−１、Ｄ３９３−ＣＤ２０ｎ、サイクリン−Ａ１、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧｎＴＶｆ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＬＡＧＥ−１、ＬＹ６Ｋ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２ｍ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ｍｕｃｉｎｋ、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２ｇ、ＸＡＧＥ−１ｂ／ＧＡＧＥＤ２ａ、遺伝子／タンパク質、ＣＥＡ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、マンマグロビン−Ａ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＯＡ１、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、アディポフィリン、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＩＮＧ−４、ＣＡＬＣＡ、ＣＤ４５、ＣＤ２７４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、グリピカン−３、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ヘプシン、ＩＤＯ１、ＩＧＦ２Ｂ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸カルボキシエステラーゼ、アルファ−フェトプロテイン、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、Ｌｅｎｇｓｉｎ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ｐ５３、ＰＡＸ５、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、セセルニン１、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、テロメラーゼ、ＴＰＢＧ、ＶＥＧＦ、及びＷＴ１の抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１０】
一態様では、本発明は、少なくとも１つの腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、本発明は、腫瘍の一部が腫瘍関連抗原に対して陰性であり、腫瘍の一部が腫瘍関連抗原に対して陽性である疾患を治療するための方法を提供する。例えば、本発明の抗体またはＴＦＰは、該腫瘍抗原の発現の上昇に関連する疾患について治療を受けてきた対象を治療するのに有用であり、ここで、腫瘍関連抗原のレベルの上昇について治療を受けてきた対象は、腫瘍関連抗原のレベルの上昇に関連する疾患を呈する。
【０３１１】
一態様では、本発明は、哺乳動物のＴ細胞で発現させるためのプロモーターに作動可能に連結された抗腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰを含むベクターに関する。一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍の治療に使用される、腫瘍関連抗原ＴＦＰを発現する組み換えＴ細胞を提供し、ここで、腫瘍関連抗原ＴＦＰを発現する組み換えＴ細胞は、腫瘍関連抗原ＴＦＰ−Ｔと呼ばれる。一態様では、本発明の腫瘍関連抗原ＴＦＰ−Ｔは、ＴＦＰ−Ｔが腫瘍細胞を標的化し、腫瘍の増殖が阻害されるように、その表面上に発現した本発明の少なくとも１つの腫瘍関連抗原ＴＦＰに腫瘍細胞を接触させることができる。
【０３１２】
一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、ＴＦＰ−Ｔが抗原に応答して活性化され、がん細胞を標的化するように、腫瘍細胞を本発明の腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰ  Ｔ細胞と接触させることを含み、腫瘍の増殖が阻害される方法に関する。
【０３１３】
一態様では、本発明は、対象におけるがんを治療する方法に関する。該方法は、対象におけるがんが治療されるように、対象に本発明の腫瘍関連抗原抗体、二重特異性抗体、またはＴＦＰ  Ｔ細胞を投与することを含む。本発明の腫瘍関連抗原ＴＦＰ  Ｔ細胞によって治療可能ながんの例は、腫瘍関連抗原の発現に関連するがんである。一態様では、がんは骨髄腫である。一態様では、がんはリンパ腫である。一態様では、がんは結腸癌である。
【０３１４】
幾つかの実施形態では、腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰ療法は、１つまたは複数の追加療法と組み合わせて使用することができる。幾つかの場合では、そのような追加療法は、化学療法薬、例えば、シクロホスファミドを含む。幾つかの場合では、そのような追加療法は、外科的切除または放射線治療を含む。
【０３１５】
一態様では、本明細書に開示するのは、細胞療法の方法であって、Ｔ細胞が、ＴＦＰを発現するように遺伝子改変され、ＴＦＰ発現Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される方法である。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの複製が可能であり、それによって長期の持続性がもたらされることから、持続的に腫瘍を制御することができる。様々な態様では、患者に投与されたＴ細胞またはその子孫は、患者へのＴ細胞の投与後、少なくとも４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２年、３年、４年、または５年、患者内で存続する。
【０３１６】
幾つかの場合では、本明細に開示するのは、細胞療法の一種であって、Ｔ細胞が、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡによって、ＴＦＰを一過性に発現するように改変され、ＴＦＰ発現Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される療法である。注入された細胞は、レシピエントにおいて腫瘍細胞を殺傷することができる。よって、様々な態様において、患者に投与されたＴ細胞は、患者へのＴ細胞の投与後、１か月未満、例えば、３週間、２週間、または１週間存在する。
【０３１７】
いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動免疫応答でも受動免疫応答でもよく、あるいは、直接対間接免疫応答によるものであってもよい。一態様では、ＴＦＰが形質導入されたＴ細胞は、腫瘍関連抗原を発現するヒトがん細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカインの分泌及び強力な細胞溶解活性を呈し、可溶性腫瘍関連抗原抑制に抵抗し、バイスタンダー殺傷を媒介し、及び／または確立されたヒト腫瘍の退行を媒介する。例えば、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍の不均一な領域内の無抗原腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性がん細胞に対して先に応答している腫瘍関連抗原再指向性Ｔ細胞による間接的な破壊を受けやすい可能性がある。
【０３１８】
一態様では、本発明のヒトＴＦＰ改変Ｔ細胞は、哺乳動物におけるｅｘ  ｖｉｖｏでの免疫化及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ療法のためのワクチンの一種である。一態様では、哺乳動物はヒトである。
【０３１９】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの免疫化に関して、細胞を哺乳動物に投与する前に、次のうちの少なくとも１つがｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる：ｉ）細胞の拡大、ｉｉ）ＴＦＰをコードする核酸の細胞への導入、またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。
【０３２０】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの手順は、当技術分野で周知であり、以下でより詳細に考察する。簡潔に述べると、細胞を哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、本明細書に開示するＴＦＰを発現するベクターで遺伝子改変する（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入または形質移入する）。ＴＦＰ改変細胞は、哺乳動物のレシピエントに投与して、治療上の利益をもたらすことができる。哺乳動物のレシピエントは、ヒトであってもよく、ＴＦＰ改変細胞は、レシピエントに対して自己由来であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種異系、同系、または異種であり得る。
【０３２１】
造血幹細胞及び前駆細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させる手順については、例えば、米国特許第５，１９９，９４２号（参照により本明細書に援用される）に記載されており、本発明の細胞に適用することができる。他の適切な方法が当技術分野で公知であり、したがって、本発明は、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させるいかなる特定の方法にも限定されない。簡潔に述べると、Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの培養及び拡大は、（１）哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を末梢血採集物または骨髄外植体から収集すること；ならびに（２）そのような細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させることを含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載される細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、及びｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子を細胞の培養及び拡大に使用することができる。
【０３２２】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの免疫化に関する細胞ベースのワクチンに加えて、本発明はまた、患者において抗原に対する免疫応答を誘発するｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫化のための組成物及び方法を提供する。
【０３２３】
一般に、本明細書に記載するように活性化及び拡大させた細胞は、免疫不全の個体に生じる疾患の治療及び予防に利用することができる。特に、本発明のＴＦＰ改変Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患、障害、及び状態の治療に使用される。ある種の態様では、本発明の細胞は、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患、障害、及び状態を発症するリスクのある患者の治療に使用される。よって、本発明は、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患、障害、及び状態の治療または予防するための方法であって、それを必要とする対象に治療的有効量の本発明のＴＦＰ改変Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。
【０３２４】
一態様では、本発明の抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または前がん状態を治療するために使用することができる。一態様では、がんは骨髄腫である。一態様では、がんはリンパ腫である。一態様では、がんは結腸癌である。さらに、腫瘍関連抗原の発現に関連する疾患として、例えば、腫瘍関連抗原を発現する、非定型及び／または非古典的がん、悪性腫瘍、前がん状態、または増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍関連抗原の発現に関連する非がん関連適応症は、抗原によって異なり、例えば、感染性疾患、自己免疫疾患（例えば、ループス）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、及び移植であるが、これらに限定されない。
【０３２５】
本発明の抗体またはＴＦＰ改変Ｔ細胞は、単独で投与されても、あるいは希釈剤及び／または他の成分、例えば、ＩＬ−２もしくはＩＬ−１２、または他のサイトカインもしくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与されてもよい。
【０３２６】
本発明はまた、腫瘍関連抗原を発現する細胞集団の増殖を阻害するまたは該細胞集団を低減させるための方法であって、腫瘍関連抗原を発現する細胞を含む細胞集団を、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原ＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む方法を提供する。特定の態様では、本発明は、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団の増殖を阻害するまたは該細胞集団を低減させるための方法であって、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団を、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む方法を提供する。一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団の増殖を阻害するまたは該細胞集団を低減させるための方法であって、腫瘍関連抗原を発現するがん細胞集団を、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞と接触させることを含む方法を提供する。ある種の態様では、本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞は、多発性骨髄腫または腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連する別のがんを有する対象またはそれらの動物モデルにおいて、細胞及び／またはがん細胞の分量、数、量、または割合（％）を、陰性対照に対して少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低減させる。一態様では、対象はヒトである。
【０３２７】
本発明はまた、腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連する疾患（例えば、腫瘍関連抗原を発現するがん）を予防する、治療する、及び／または管理するための方法であって、必要とする対象に、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様では、対象はヒトである。腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連する障害の非限定的な例として、自己免疫性障害（ループスなど）、炎症性障害（アレルギー及び喘息など）、及びがん（血液のがん、または腫瘍関連抗原を発現する非定型がんなど）が挙げられる。
【０３２８】
本発明はまた、腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連する疾患を予防する、治療する、及び／または管理するための方法であって、必要とする対象に、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様では、対象はヒトである。
【０３２９】
本発明は、腫瘍関連抗原を発現する細胞に関連するがんの再発を予防するための方法であって、それを必要とする対象に、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本発明の抗腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞を投与することを含む方法を提供する。一態様では、該方法は、それを必要とする対象に、該腫瘍関連抗原を発現する細胞に結合する本明細書に記載する有効量の抗腫瘍関連抗原抗体またはＴＦＰ−Ｔ細胞を、有効量の別の療法と組み合わせて投与することを含む。
【０３３０】
１２．併用療法
本明細書に記載する抗体またはＴＦＰ発現細胞は、他の公知の作用物質及び療法と組み合わせて使用されてもよい。「組み合わせて」投与されるとは、本明細書で使用される場合、対象が障害に罹患する間に２つ（またはそれ以上）の異なる治療が対象に送達されること、例えば、対象が障害と診断された後、かつ障害が治癒もしくは排除されるかまたは他の理由で治療が中止される前に、２つ以上の治療が送達されることを意味する。幾つかの実施形態では、一方の治療の送達が、第２の治療の送達の開始時に依然として行われており、そのために投与に関して重複がある。これは、本明細書において「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」また「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、他方の治療の開始前に終了する。いずれかの場合の幾つかの実施形態では、治療は、併用投与であるために、より有効である。例えば、第２の治療は、より有効であり、例えば、第１の治療の非存在下で第２の治療を投与した場合に見られるよりも、少ない第２の治療で同等な効果が見られるか、もしくは第２の治療が症状を大幅に低減させるか、または同等な状況が第１の治療で見られる。幾つかの実施形態では、送達は、症状、または障害に関係する他のパラメータの低減が、一方の治療が他方の非存在下で送達されるときに観察されるものよりも大きくなるようなものである。２つの治療の効果は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、または相加的以上であり得る。送達は、送達される第１の治療の効果が、第２の治療が送達されても検出可能であるようなものであり得る。
【０３３１】
幾つかの実施形態では、「少なくとも１つの追加治療剤」には、ＴＦＰ発現細胞が含まれる。提供するのはまた、同じもしくは異なる標的抗原、または同じ標的抗原上の同じもしくは異なるエピトープに結合する、複数のＴＦＰを発現するＴ細胞である。提供するのはまた、第１のサブセットのＴ細胞が第１のＴＦＰを発現し、第２のサブセットのＴ細胞が第２のＴＦＰを発現する、Ｔ細胞の集団である。
【０３３２】
本明細書に記載するＴＦＰ発現細胞及び少なくとも１つの追加治療剤は、同じもしくは別々の組成物で同時に投与することも、または逐次投与することもできる。逐次投与の場合、本明細書に記載するＴＦＰ発現細胞を１番目に、追加作用物質を２番目に投与することができ、または投与の順序を逆にすることができる。
【０３３３】
さらなる態様では、本明細書に記載するＴＦＰ発現細胞は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びタクロリムス、抗体または他の免疫除去剤、例えば、アレムツズマブ、抗ＣＤ３抗体、もしくは他の抗体療法、シクロホスファミド、フルダラビン、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ロミデプシン、サイトカイン、及び放射線照射、ペプチドワクチン、例えば、Ｉｚｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０８：９６３−９７１に記載されるものと組み合わせた治療レジメンに使用されてもよい。
【０３３４】
一実施形態では、対象に、ＴＦＰ発現細胞の投与に関連する副作用を低減または改善する作用物質を投与することができる。ＴＦＰ発現細胞の投与に関連する副作用として、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及びマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）とも呼ばれる血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状として、高熱、嘔気、一過性低血圧、低酸素症などが挙げられる。したがって、本明細書に記載する方法は、本明細書に記載するＴＦＰ発現細胞を対象に投与すること、及びＴＦＰ発現細胞での治療に起因する可溶性因子のレベルの上昇を管理する作用物質をさらに投与することを含むことができる。一実施形態では、対象において上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、及びＩＬ−６のうちの１つまたは複数である。したがって、この副作用を治療するために投与される作用物質は、これらの可溶性因子のうちの１つまたは複数を中和する作用物質であり得る。そのような作用物質として、ステロイド、ＴＮＦαの阻害剤、及びＩＬ−６の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＮＦαの阻害剤の例は、エタネルセプトである（エンブレル（登録商標）という名称で市販されている）。ＩＬ−６の阻害剤の例は、トシリズマブである（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標）という名称で市販されている）。
【０３３５】
一実施形態では、対象に、ＴＦＰ発現細胞の活性を強化する作用物質を投与することができる。例えば、一実施形態では、作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質であり得る。抑制分子、例えば、プログラム死１（ＰＤ１）は、幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の免疫エフェクター応答開始能力を減少させることがある。抑制分子の例として、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲベータが挙げられる。抑制分子の阻害は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質レベルでの阻害によるものは、ＴＦＰ発現細胞の性能を最適化することができる。実施形態では、抑制核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して、ＴＦＰ発現細胞内の抑制分子の発現を阻害することができる。ある実施形態では、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある実施形態では、抑制分子は、ＴＦＰ発現細胞内で阻害される。これらの実施形態では、抑制分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＴＦＰの構成要素、例えば、構成要素のすべてをコードする核酸に連結される。一実施形態では、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体断片であり得る。例えば、該作用物質は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはＣＴＬＡ４に結合する抗体（例えば、イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０及びＭＤＸ−１０１とも呼ばれ、ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）として市販されている）；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ；トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブとして公知であったもの、ＣＰ−６７５，２０６））または抗体断片であり得る。ある実施形態では、該作用物質は、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子−３（ＴＩＭ３）に結合する抗体または抗体断片である。ある実施形態では、該作用物質は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に結合する抗体または抗体断片である。
【０３３６】
幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の活性を強化する作用物質は、例えば、第１のドメインと第２のドメインを含む融合タンパク質であって、第１のドメインが、抑制分子、またはその断片であり、第２のドメインが、正のシグナルに関連するポリペプチド、例えば、本明細書に記載するような細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである、融合タンパク質である。幾つかの実施形態では、正のシグナルに関連するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７、及び／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの、例えば、本明細書に記載するものを含むことができる。一実施形態では、融合タンパク質は、ＴＦＰを発現する細胞と同じ細胞によって発現される。別の実施形態では、融合タンパク質は、抗腫瘍関連抗原ＴＦＰを発現しない細胞、例えばＴ細胞によって発現される。
【０３３７】
１３．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載する通りのＴＦＰ発現細胞、例えば、複数のＴＦＰ発現細胞を、１つまたは複数の医薬としてまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含んでもよい。そのような組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、またはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含んでもよい。本発明の組成物は、一態様では、静脈内投与用に製剤化される。
【０３３８】
本発明の医薬組成物は、治療しようとする（または予防しようとする）疾患に適した方式で投与されてもよい。適正な投与量は、臨床試験によって決定されてもよいが、投与の分量及び頻度は、患者の状態、及び患者の疾患のタイプ及び重症度などの因子によって決定されることとなる。
【０３３９】
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、プールヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌、及び真菌からなる群から選択される混入物質を実質的に含まない、例えば、検出可能レベルのこれらの混入物質が存在しない。一実施形態では、細菌は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ａ群からなる群から選択される少なくとも１種である。
【０３４０】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示されるとき、投与しようとする本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度、及び状態の個体差を考慮して、医師によって決定され得る。一般論として述べると、本明細書に記載するＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、幾つかの場合では、１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内のすべての整数値を含む）の投与量で投与されてもよい。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されてもよい。細胞は、免疫療法で一般に公知の注入技法を使用することによって投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
【０３４１】
ある種の態様では、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、その後続いて再採血し（またはアフェレーシスを行い）、そこからのＴ細胞を本発明に従って活性化し、活性化及び拡大させたＴ細胞を患者に再注入することが所望されることがある。このプロセスは、数週間毎に複数回実施することができる。ある種の態様では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採取血液から活性化することができる。ある種の態様では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採取血液から活性化される。
【０３４２】
主題組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、埋め込み、または移植による方式を含めた、任意の便利な方式で行われてもよい。本明細書に記載する組成物は、患者に、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に投与されてもよい。一態様では、本発明のＴ細胞組成物は、患者に、皮内または皮下注射によって投与される。一態様では、本発明のＴ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染症の部位に直接注射されてもよい。
【０３４３】
特定の例示的な態様では、対象は、白血球搬出法を受けてもよく、この方法では、白血球が、ｅｘ  ｖｉｖｏで収集、濃厚化、または除去されて、関心対象の細胞、例えば、Ｔ細胞が選択及び／または単離される。これらのＴ細胞単離物は、当技術分野で公知の方法によって拡大されてもよく、本発明の１つまたは複数のＴＦＰ構築物が導入され、それによって本発明のＴＦＰ発現Ｔ細胞を作出することができるように処理されてもよい。それを必要とする対象は、その後、高用量の化学療法での標準的治療に続いて末梢血幹細胞移植を受けてもよい。ある種の態様では、移植に続いて、または移植と同時に、対象は、本発明の拡大されたＴＦＰ  Ｔ細胞の注入を受ける。追加的な態様において、拡大された細胞は、手術の前または手術に続いて投与される。
【０３４４】
患者に投与しようとする上記治療の投与量は、治療されている状態の正確な性質及び治療のレシピエントに応じて異なることとなる。ヒトに投与する場合の投与量の調整は、当技術分野に受け入れられている慣例に従って実施することができる。例えば、アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））の用量は、一般に、成人患者には１〜約１００ｍｇの範囲内であり、通常、１〜３０日間の期間にわたって毎日投与される。好ましい日用量は、１日当たり１〜１０ｍｇであるが、幾つかの場合では、１日当たり４０ｍｇまでの、より多い用量が使用されてもよい（米国特許第６，１２０，７６６号に記載されている）。
【０３４５】
一実施形態では、ＴＦＰは、Ｔ細胞に、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を使用して導入され、対象（例えば、ヒト）は、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞の初回投与、及び本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞の１回またな複数回の後続投与を受け、ここで、１回または複数回の後続投与は、前の投与後１５日未満、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日未満に施される。一実施形態では、１週間当たり２回以上の本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与が、対象（例えば、ヒト）に施され、例えば、１週間当たり、２、３、または４回の本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与が施される。一実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）は、１週間当たり２回以上のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与を受け（例えば、１週間当たり２、３、または４回の投与）（本明細書ではサイクルとも呼ばれる）、続いて１週間はＴＦＰ  Ｔ細胞の投与を受けず、次いで１回または複数回のＴＦＰ  Ｔ細胞の追加投与（例えば、１週間当たり２回以上のＴＦＰ  Ｔ細胞の投与）が対象に施される。別の実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）は、２回以上のサイクルのＴＦＰ  Ｔ細胞を受け、各サイクルの間の時間は、１０、９、８、７、６、５、４、または３日未満である。一実施形態では、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、１日おきに投与されて、１週間当たり３回投与される。一実施形態では、本発明のＴＦＰ  Ｔ細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間またはそれ以上にわたって投与される。
【０３４６】
一態様では、腫瘍関連抗原ＴＦＰ  Ｔ細胞は、レンチウイルスなどのレンチウイルスベクターを使用して生成される。そのように生成されたＴＦＰ−Ｔ細胞は、安定なＴＦＰ発現を有する。
【０３４７】
一態様では、ＴＦＰ  Ｔ細胞は、形質導入後、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間、ＴＦＰベクターを一過性に発現する。ＴＦＰの一過性発現は、ＲＮＡ  ＴＦＰベクター送達によってもたらすことができる。一態様では、ＴＦＰ  ＲＮＡは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に形質導入される。
【０３４８】
一過性に発現するＴＦＰ  Ｔ細胞（特に、マウスｓｃＦｖを有するＴＦＰ  Ｔ細胞）を使用して治療されている患者に生じるおそれがある潜在的な問題は、複数回の治療後のアナフィラキシーである。
【０３４９】
この理論に束縛されるものではないが、そのようなアナフィラキシー反応は、患者において体液性抗ＴＦＰ応答、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＴＦＰ抗体が発生していることによって引き起こされる可能性があると考えられる。患者の抗体産生細胞は、抗原への曝露が１０〜１４日間中断されると、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシーを引き起こさない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けると思われる。
【０３５０】
患者が一過性ＴＦＰ療法の過程で抗ＴＦＰ抗体応答（ＲＮＡ形質導入によって生成されるものなど）を生じるリスクが高いならば、ＴＦＰ  Ｔ細胞注入の中断は、１０日〜１４日より長く続けるべきではない。
【実施例】
【０３５１】
以下の実験例を参照することによって、本発明をさらに詳述する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、別段の指定がない限り、限定は意図されていない。よって、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるものではなく、本明細書で提供する教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形を包含すると解釈されるものとする。さらなる説明はなくとも、当業者であれば、前述の説明及び以下の実例を使用して、本発明の化合物を作製及び利用することができ、特許請求する方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に指摘するものであり、決して本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０３５２】
以下の実施例は、がん細胞上の２つ以上の標的抗原に特異性を有する、操作されたＴ細胞受容体について記載する。加えて、同じ細胞または細胞の組み合わせのいずれかで、２つ以上の抗原に特異的なＴＣＲを有するＴ細胞の集団を作出する方法について記載する。一実施形態では、単一のＴＣＲサブユニットに両方の結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂなど）をタンデムに有するＴＦＰ構築物が作製される。一実施形態では、単一のＴＣＲに両方の結合ドメインを有し、１つの結合ドメインが２つのＴＣＲサブユニット（例えば、両方ともイプシロンサブユニット、イプシロンサブユニット及びガンマサブユニットなど）の各々にある、ＴＦＰ構築物が作製される。別の実施形態では、ＴＦＰ構築物は、別々のレンチウイルスベクターで個々に作製され、標的Ｔ細胞集団は、両方のウイルスで形質導入される。実施例は、抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰと抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰとの組み合わせ、及び／または抗ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６の両方に特異性を有するＴＦＰ、及び／またはＴ細胞が、抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰを形質導入されたＴ細胞と抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰを形質導入されたＴ細胞との混合物である、混合Ｔ細胞集団を開示する。本明細書に開示する抗ＭＳＬＮ及び抗ＭＵＣ１６構築物は例示に過ぎず、上述のように限定と解釈すべきではないことを意味している。本発明の方法には抗腫瘍抗原抗体の種々の組み合わせを有する構築物が企図される。
【０３５３】
実施例１：ＴＦＰ構築物
抗メソテリンＴＦＰ構築物は、配列（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を有するリンカーをコードするＤＮＡ配列によってＣＤ３またはＴＣＲ  ＤＮＡ断片に連結された抗メソテリン結合ドメイン（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、またはそれらの断片）ＤＮＡ断片を、例えば、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクター（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ））にクローニングすることによって操作する。他の適切なベクターを使用してもよい。
【０３５４】
生成した抗メソテリンＴＦＰ構築物は、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＴＣＲα（抗メソテリン−リンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体α鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＴＣＲαＣ（抗メソテリン  リンカー−ヒトＴ細胞受容体α定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＴＣＲβ（抗メソテリン−リンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体β鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＴＣＲβＣ（抗メソテリン−リンカー−ヒトＴ細胞受容体β定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＴＣＲγ（抗メソテリン−リンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体γ鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＴＣＲγＣ（抗メソテリン  リンカー−ヒトＴ細胞受容体γ定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＴＣＲδ（抗メソテリン−リンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体δ鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＴＣＲδＣ（抗メソテリン−リンカー−ヒトＴ細胞受容体δ定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＣＤ３γ（抗メソテリン−リンカー−ヒトＣＤ３γ鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＣＤ３δ（抗メソテリン−リンカー−ヒトＣＤ３δ鎖）、及びｐ５１０＿抗メソテリン＿ＣＤ３ε（抗メソテリン−リンカー−ヒトＣＤ３ε鎖）である。
【０３５５】
幾つかの実施形態では、抗メソテリンＣＡＲ構築物であるｐ５１０＿抗メソテリン＿２８ζは、抗メソテリン、部分的なＣＤ２８細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、及びＣＤ３ゼータをコードする合成ＤＮＡをＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクターにクローニングすることによって生成する。他の実施形態では、抗メソテリンＣＡＲ構築物は、４−１ＢＢゼータドメインを使用して生成する。
【０３５６】
抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰ構築物は、配列（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎ＝１〜４）を有するリンカーをコードするＤＮＡ配列によってＣＤ３またはＴＣＲ  ＤＮＡ断片に連結された  抗ＭＵＣ１６結合ドメイン（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、またはそれらの断片）ＤＮＡ断片を、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクター（（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）（ＳＢＩ））にクローニングすることによって操作することができる。他のベクター、例えば、ｐＬＲＰＯベクターも使用してもよい。
【０３５７】
抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰ構築物の実施例には、ｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＴＣＲα（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体α鎖）、ｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＴＣＲ  αＣ（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒトＴ細胞受容体α定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＴＣＲβ（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体β鎖）、ｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＴＣＲβＣ（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒトＴ細胞受容体β定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＴＣＲγ（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体γ鎖）、ｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＴＣＲγＣ（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒトＴ細胞受容体γ定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＴＣＲδ（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒト完全長Ｔ細胞受容体δ鎖）、ｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＴＣＲδＣ（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒトＴ細胞受容体δ定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗ｍｕｃ１６＿ＣＤ３γ（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒトＣＤ３γ鎖）、ｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＣＤ３δ（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒトＣＤ３δ鎖）、及びｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿ＣＤ３ε（抗ＭＵＣ１６−リンカー−ヒトＣＤ３ε鎖）が含まれる。本明細書に使用する抗ＭＵＣ１６は、ヒトＭＵＣ１６特異的ｓｃＦｖ、例えば、４Ｈ１１であってもよい。
【０３５８】
抗ＭＵＣ１６  ＣＡＲ構築物であるｐ５１０＿抗ＭＵＣ１６＿２８ζの実施例は、抗ＭＵＣ１６、部分的なＣＤ２８細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、及びＣＤ３ゼータをコードする合成ＤＮＡをＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクターにクローニングすることによって生成することができる。他の実施形態では、抗ＭＵＣ１６  ＣＡＲ構築物は、４−１ＢＢゼータドメインを使用して生成する。
【０３５９】
ＴＣＲドメイン及び結合ドメインからのＴＦＰの生成
【０３６０】
ＭＵＣ１６結合ドメイン（例えば、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、またはそれらの断片）は、Ｇ４Ｓ、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、または（Ｇ４Ｓ）４などのリンカー配列を使用して、組み換えによってＣＤ３−イプシロンまたは他のＴＣＲサブユニットに連結することができる。ｓｃＦｖを使用するならば、様々なリンカー及びｓｃＦｖ構造を使用することができる。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲガンマ鎖及びＴＣＲデルタ鎖は、完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして、ＴＦＰの生成に使用することができる。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖／ＴＣＲガンマ鎖及びＴＣＲデルタ鎖のいずれの可変配列もＴＦＰの作製に適している。
【０３６１】
ＴＦＰ発現ベクター
【０３６２】
プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を可能にするシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、及び転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソーム複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起点及びＣｏｌＥ１または当技術分野で公知の他のもの）、ならびに選択を可能にするエレメント（アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー）を含む、発現ベクターを用意する。
【０３６３】
好ましくは、ＴＦＰをコードする核酸構築物を、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、発現を、ＭＵＣ１６＋標的細胞に応答する抗ＭＵＣ１６−ＴＦＰ形質導入Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞応答の分量及び質に基づいて検証する。エフェクターＴ細胞応答として、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性（すなわち、脱顆粒）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６４】
ＴＦＰ．ＭＵＣ１６レンチウイルス移入ベクターを使用して、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を生成することができる。レンチウイルス移入ベクターＤＮＡを、リポフェクタミン（登録商標）試薬と合わせた３つのパッケージング成分、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ、及びｒｅｖと混合して、それらを一緒にＨＥＫ−２９３（胚性腎、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞に形質移入する。２４時間後及び４８時間後に、培地を収集し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を−８０℃で保存する。形質導入単位の数は、Ｓｕｐ−Ｔ１（Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１９４２（商標））細胞での滴定によって決定することができる。再指向性ＴＦＰ．ＭＵＣ１６  Ｔ細胞は、新たなナイーブＴ細胞を、例えば、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化し、次いで適正な数の形質導入単位を添加して所望の割合（％）の形質導入Ｔ細胞を得ることによって生成する。これらの改変Ｔ細胞を拡大させ、それらが休止し、サイズが小さくなるまで行い、その時点で、後日の解析のためにそれらを凍結保存する。細胞の数及びサイズは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）ＩＩＩを使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞（ＴＦＰ．ＭＵＣ１６を細胞表面上に発現するもの）の割合（％）及びその発現の相対蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって決定する。ヒストグラムプロットから、形質導入された割合（％）とその相対蛍光強度とを比較することによって、ＴＦＰの相対的発現レベルを調べることができる。
【０３６５】
幾つかの実施形態では、複数のウイルスベクターでのＴ細胞形質導入によって、複数のＴＦＰを導入する。
【０３６６】
ヒト化ＴＦＰ再指向性Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
【０３６７】
ＴＦＰ．ＭＵＣ１６  Ｔ細胞が、細胞表面に発現されるＴＦＰを産生する、標的腫瘍細胞を殺傷する、増殖する、及びサイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定することができる。
【０３６８】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ、例えば、正常なアフェレーシスドナー由来の血液であり、そのナイーブＴ細胞は、Ｔ細胞、すなわちＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球に対するネガティブ選択によって得ることができる）をヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）で処理し、次いで抗ＣＤ３×抗ＣＤ２８ビーズで、例えば、１０％ＲＰＭＩ中３７℃、５％ＣＯ２で活性化し、その後ＴＦＰをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを使用して、例えば、抗ＦＬＡＧ抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、細胞表面のＴＦＰの存在を確認することができる。サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）産生は、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイを使用して測定することができる。
【０３６９】
ＴＣＲサブユニット源
【０３７０】
ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のサブユニットはすべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含有する。ヒトＴＣＲ複合体は、ＣＤ３−イプシロンポリペプチド、ＣＤ３−ガンマポリペプチド、ＣＤ３−デルタポリペプチド、ＣＤ３−ゼータポリペプチド、ＴＣＲアルファ鎖ポリペプチド、及びＴＣＲベータ鎖ポリペプチドを含有する。ヒトＣＤ３−イプシロンポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７７６６である。ヒトＣＤ３−ガンマポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０９６９３である。ヒトＣＤ３−デルタポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４３２３４である。ヒトＣＤ３−ゼータポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０９６３である。ヒトＴＣＲアルファ鎖の規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＩＳＵ１である。ヒトＴＣＲベータ鎖Ｃ領域の規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１８５０であり、ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域の配列はＰ０４４３５である。
【０３７１】
ＴＣＲドメイン及びｓｃＦｖからのＴＦＰの生成
【０３７２】
メソテリンｓｃＦｖは、Ｇ４Ｓ、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、または（Ｇ４Ｓ）４などのリンカー配列を使用して、組み換えによってＣＤ３−イプシロンまたは他のＴＣＲサブユニット（１Ｃ参照）に連結される。様々なリンカー及びｓｃＦｖ構造が利用される。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖は、完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして、ＴＦＰの生成に使用した。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖のいずれの可変配列もＴＦＰの作製に許容される。
【０３７３】
ＴＦＰ発現ベクター
【０３７４】
プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を可能にするシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、及び転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソーム複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起点及びＣｏｌＥ１または当技術分野で公知の他のもの）、ならびに選択を可能にするエレメント（アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー）を含む、発現ベクターを用意する。
【０３７５】
好ましくは、ＴＦＰをコードする核酸構築物を、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、発現を、メソテリン＋標的細胞に応答する抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞応答の分量及び質に基づいて検証する。エフェクターＴ細胞応答として、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性（すなわち、脱顆粒）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７６】
ＴＦＰ．メソテリンレンチウイルス移入ベクターを使用して、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を生成する。レンチウイルス移入ベクターＤＮＡを、リポフェクタミン（登録商標）試薬と合わせた３つのパッケージング成分、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ、及びｒｅｖと混合して、それらを一緒にＨＥＫ−２９３（胚性腎、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞に形質移入する。２４時間後及び４８時間後に、培地を収集し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を−８０℃で保存する。形質導入単位の数は、Ｓｕｐ−Ｔ１（Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１９４２（商標））細胞での滴定によって決定する。再指向性ＴＦＰ．メソテリンＴ細胞は、新たなナイーブＴ細胞を、例えば、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化し、次いで適正な数の形質導入単位を添加して所望の割合（％）の形質導入Ｔ細胞を得ることによって生成する。これらの改変Ｔ細胞を拡大させ、それらが休止し、サイズが小さくなるまで行い、その時点で、後日の解析のためにそれらを凍結保存する。細胞の数及びサイズは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）ＩＩＩを使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞（ＴＦＰ．メソテリンを細胞表面上に発現するもの）の割合（％）及びその発現の相対蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって決定する。ヒストグラムプロットから、形質導入された割合（％）とその相対蛍光強度とを比較することによって、ＴＦＰの相対的発現レベルを調べる。
【０３７７】
幾つかの実施形態では、複数のウイルスベクターでのＴ細胞形質導入によって、複数のＴＦＰを導入する。
【０３７８】
ＴＦＰ再指向性Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
【０３７９】
抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞が、細胞表面に発現されるＴＦＰを産生する、標的腫瘍細胞を殺傷する、増殖する、及びサイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定する。
【０３８０】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ、例えば、正常なアフェレーシスドナー由来の血液であり、そのナイーブＴ細胞は、Ｔ細胞、すなわちＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球に対するネガティブ選択によって得ることができる）をヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）で処理し、次いで抗ＣＤ３×抗ＣＤ２８ビーズで、例えば、１０％ＲＰＭＩ中３７℃、５％ＣＯ２で活性化し、その後ＴＦＰをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを使用して、例えば、抗ＦＬＡＧ抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、細胞表面のＴＦＰの存在を確認する。サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）産生は、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイを使用して測定する。
【０３８１】
実施例２：抗体配列
【０３８２】
抗体配列の生成
【０３８３】
ヒトメソテリンポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ１３４２１（またはＱ１３４２１−１）である。用意するのは、ヒトメソテリンポリペプチド及びその断片またはドメインに特異的に結合することができる抗体ポリペプチドである。抗メソテリン抗体は、様々な技術を使用して生成することができる（例えば、（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７を参照されたい）。マウス、ラクダ、または他の種で作製された抗メソテリン抗体が出発物質として使用される場合、ヒト化が実施される。例えば、マウス抗メソテリン抗体のヒト化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）治療、すなわち、抗ＭＳＬＮ／抗ＭＵＣ１６ＴＦＰ構築物を形質導入したＴ細胞での治療を受けた対象においてマウス特異的残基がヒト抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘導し得る臨床状況に所望される。ヒト化は、非ヒト抗メソテリン抗体由来のＣＤＲ領域を適正なヒト生殖細胞系列のアクセプターフレームワークに移植することによって遂行され、それには任意選択によりＣＤＲ及び／またはフレームワーク領域に他の改変を施すことが含まれる。本明細書で示す場合、抗体及び抗体断片残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，１９９１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，１９８７）。
【０３８４】
ｓｃＦｖの生成
ヒトまたはヒト化抗メソテリンＩｇＧを使用して、ＴＦＰ構築物のｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得、任意選択により、構築物のコドンをヒト由来の細胞での発現に最適化する。ｓｃＦｖに出現するＶＬ及びＶＨドメインの順序は様々であり（すなわち、ＶＬ−ＶＨ、またはＶＨ−ＶＬの配向）、「Ｇ４Ｓ」または「Ｇ４Ｓ」サブユニットの３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３が、可変ドメインを接続してｓｃＦｖドメインを作出する。抗メソテリンまたは抗ＭＵＣ１６  ｓｃＦｖプラスミド構築物は、最適なＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他の親和性タグを有することができ、これをＨＥＫ２９３または他の適切なヒトもしくは哺乳類細胞株にエレクトロポレーションし、精製する。検証アッセイには、ＦＡＣＳによる結合解析、Ｐｒｏｔｅｏｎ（登録商標）を使用する動態解析、及びメソテリン発現細胞の染色が含まれる。
【０３８５】
例示的な抗メソテリンＶＬ及びＶＨドメイン、ＣＤＲ、及びそれらをコードするヌクレオチド配列は、米国特許第９，２７２，００２号；第８，２０６，７１０号；第９，０２３，３５１号；第７，０８１，５１８号；第８，９１１，７３２号；第９，１１５，１９７号、及び第９，４１６，１９０号；ならびに米国特許出願公開第２００９００４７２１１号に記載されるものであり得る。他の例示的な抗メソテリンＶＬ及びＶＨドメイン、ＣＤＲ、及びそれらをそれぞれコードするヌクレオチド配列は、次のモノクローナル抗体：ラット抗メソテリン抗体４２０４１１、ラット抗メソテリン抗体４２０４０４、マウス抗メソテリン抗体ＭＮ−１、マウス抗メソテリン抗体ＭＢ−Ｇ１０、マウス抗メソテリン抗体ＡＢＩＮ２３３７５３、ウサギ抗メソテリン抗体ＦＱＳ３７９６（３）、ウサギ抗メソテリン抗体ＴＱ８５、マウス抗メソテリン抗体ＴＡ３０７７９９、ラット抗メソテリン抗体２９５Ｄ、ラット抗メソテリン抗体Ｂ３５、マウス抗メソテリン抗体５Ｇ１５７、マウス抗メソテリン抗体１２９５８８、ウサギ抗メソテリン抗体１１Ｃ１８７、マウス抗メソテリン抗体５Ｂ２、ウサギ抗メソテリン抗体ＳＰ７４、ウサギ抗メソテリン抗体Ｄ４Ｘ７Ｍ、マウス抗メソテリン抗体Ｃ−２、マウス抗メソテリン抗体Ｃ−３、マウス抗メソテリン抗体Ｇ−１、マウス抗メソテリン抗体Ｇ−４、マウス抗メソテリン抗体Ｋ１、マウス抗メソテリン抗体Ｂ−３、マウス抗メソテリン抗体２００−３０１−Ａ８７、マウス抗メソテリン抗体２００−３０１−Ａ８８、ウサギ抗メソテリン抗体ＥＰＲ２６８５（２）、ウサギ抗メソテリン抗体ＥＰＲ４５０９、またはウサギ抗メソテリン抗体ＰＰＩ−２ｅ（ＩＨＣ）のものであり得る。
【０３８６】
幾つかの実施形態では、配列番号５２〜５４（それぞれ、ＳＤ１、ＳＤ４、及びＳＤ６）に定められるものなどの、単一ドメイン（ＶＨＨ）バインダーを使用する。
【０３８７】
ヒトまたはヒト化抗ＭＵＣ１６  ＩｇＧを使用して、ＴＦＰ構築物のｓｃＦｖ配列を生成することができる。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得、任意選択により、構築物のコドンをヒト由来の細胞での発現に最適化する。ｓｃＦｖに出現するＶＬ及びＶＨドメインの順序は様々であり（すなわち、ＶＬ−ＶＨ、またはＶＨ−ＶＬの配向）、「Ｇ４Ｓ」または「Ｇ４Ｓ」サブユニットの３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３が、可変ドメインを接続してｓｃＦｖドメインを作出する。抗ＭＵＣ１６  ｓｃＦｖプラスミド構築物は、最適なＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または他の親和性タグを有することができ、これをＨＥＫ２９３または他の適切なヒトもしくは哺乳類細胞株にエレクトロポレーションし、精製する。検証アッセイには、ＦＡＣＳによる結合解析、Ｐｒｏｔｅｏｎを使用する動態解析、及びＭＵＣ１６発現細胞の染色が含まれる。
【０３８８】
本明細書に記載する組成物及び方法で使用することができる、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、及びＣＤＲを含めた抗ＭＵＣ１６結合ドメインの例は、幾つかの出版物及び／または商業的供給元に存在し得る。例えば、３Ａ５及び１１Ｄ１０を含めた、ある種の抗ＭＵＣ１６抗体は、ＷＯ２００７／００１８５１に開示されている（その内容は参照により援用される）。３Ａ５モノクローナル抗体は、ＯＶＣＡＲ−３スキャチャード解析による４３３ｐＭの親和性でＭＵＣ１６ポリペプチドの複数の部位に結合する。抗ＭＵＣ１６  ＶＬ及びＶＨドメイン、ＣＤＲ、及びそれらをそれぞれコードするヌクレオチド配列の他の例は、次のモノクローナル抗体：ＧＴＸ１００２９、ＧＴＸ２１１０７、ＭＡ５−１２４５２５、ＭＡ５−１１５７９、２５４５０００２、ＡＢＩＮ１５８４１２７、ＡＢＩＮ９３６５５、１１２８８９、１２０２０４、ＬＳ−Ｃ３５６１９５、ＬＳ−Ｂ６７５６、ＴＡ８０１２４１、ＴＡ８０１２７９、Ｖ３４９４、Ｖ３６４８、６６６９０２、６６６９０４、ＨＰＡ０６５６００、ＡＭＡｂ９１０５６のものであり得る。
【０３８９】
ヒトＭＵＣ１６ポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ８ＷＸＩ７に相当する。用意するのは、ヒトＭＵＣ１６ポリペプチド及びその断片またはドメインに特異的に結合することができる抗体ポリペプチドである。抗ＭＵＣ１６抗体は、様々な技術を使用して生成することができる（例えば、（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７を参照されたい）。抗ＭＵＣ１６抗体が出発物質として使用される場合、マウス抗ＭＵＣ１６抗体のヒト化が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）治療、すなわち、ＴＦＰ．ＭＵＣ１６構築物を形質導入したＴ細胞での治療を受けた対象においてマウス特異的残基がヒト抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘導し得る臨床状況に所望される。ヒト化は、マウス抗ＭＵＣ１６抗体由来のＣＤＲ領域を適正なヒト生殖細胞系列のアクセプターフレームワークに移植することによって遂行され、それには任意選択によりＣＤＲ及び／またはフレームワーク領域に他の改変を施すことが含まれる。本明細書で示す場合、抗体及び抗体断片残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，１９９１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，１９８７）。
【０３９０】
単一ドメインバインダー
【０３９１】
ラクダ科または他の単一ドメイン抗体を使用して抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰ構築物を生成することもできる。そのＶＨＨドメインを使用して、様々なＴＣＲサブユニットと融合させることができる。幾つかの実施形態では、単一ドメイン（例えば、ＶＨＨ）バインダー、例えば、表２（配列番号：１４、配列番号：１９、配列番号：２４、配列番号：２９、配列番号：３４、配列番号：３９、配列番号：４３、及び配列番号：４７）に定められるものを使用する。抗ｈＭＵＣ１６ラクダ科抗体の調製は、実施例３にさらに記載する。
【０３９２】
ＴＣＲドメイン及びｓｃＦｖからのＴＦＰの生成
【０３９３】
ＭＵＣ１６  ｓｃＦｖは、Ｇ４Ｓ、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、または（Ｇ４Ｓ）４などのリンカー配列を使用して、組み換えによってＣＤ３−イプシロンまたは他のＴＣＲサブユニットに連結することができる。様々なリンカー及びｓｃＦｖ構造を使用することができる。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖は、完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして、ＴＦＰの生成に使用することができる。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖のいずれの可変配列もＴＦＰの作製に許容される。
【０３９４】
ＴＦＰ発現ベクター
【０３９５】
プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を可能にするシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、及び転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソーム複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起点及びＣｏｌＥ１または当技術分野で公知の他のもの）、ならびに選択を可能にするエレメント（アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー）を含む、発現ベクターを用意する。
【０３９６】
好ましくは、ＴＦＰをコードする核酸構築物を、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、発現を、ＭＵＣ１６＋標的細胞に応答するＴＦＰ．ＭＵＣ１６形質導入Ｔ細胞（「ＭＵＣ１６．ＴＦＰ」または「ＭＵＣ１６．ＴＦＰ  Ｔ細胞」または「ＴＦＰ．ＭＵＣ１６」または「ＴＦＰ．ＭＵＣ１６  Ｔ細胞」）のエフェクターＴ細胞応答の分量及び質に基づいて検証する。エフェクターＴ細胞応答として、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性（すなわち、脱顆粒）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９７】
ＴＦＰ．ＭＵＣ１６レンチウイルス移入ベクターを使用して、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を生成することができる。レンチウイルス移入ベクターＤＮＡを、リポフェクタミン（登録商標）試薬と合わせた３つのパッケージング成分、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ、及びｒｅｖと混合して、それらを一緒にＨＥＫ−２９３（胚性腎、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞に形質移入する。２４時間後及び４８時間後に、培地を収集し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を−８０℃で保存する。形質導入単位の数は、Ｓｕｐ−Ｔ１（Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１９４２（商標））細胞での滴定によって決定することができる。再指向性ＴＦＰ．ＭＵＣ１６  Ｔ細胞は、新たなナイーブＴ細胞を、例えば、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化し、次いで適正な数の形質導入単位を添加して所望の割合（％）の形質導入Ｔ細胞を得ることによって生成する。これらの改変Ｔ細胞を拡大させ、それらが休止し、サイズが小さくなるまで行い、その時点で、後日の解析のためにそれらを凍結保存する。細胞の数及びサイズは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）ＩＩＩを使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞（ＴＦＰ．ＭＵＣ１６を細胞表面上に発現するもの）の割合（％）及びその発現の相対蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって決定する。ヒストグラムプロットから、形質導入された割合（％）とその相対蛍光強度とを比較することによって、ＴＦＰの相対的発現レベルを調べることができる。
【０３９８】
幾つかの実施形態では、複数のウイルスベクターでのＴ細胞形質導入によって、複数のＴＦＰを導入する。
【０３９９】
ヒト化ＴＦＰ再指向性Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
【０４００】
ＴＦＰ．ＭＵＣ１６  Ｔ細胞が、細胞表面に発現されるＴＦＰを産生する、標的腫瘍細胞を殺傷する、増殖する、及びサイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定することができる。
【０４０１】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ、例えば、正常なアフェレーシスドナー由来の血液であり、そのナイーブＴ細胞は、Ｔ細胞、すなわちＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球に対するネガティブ選択によって得ることができる）をヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）で処理し、次いで抗ＣＤ３×抗ＣＤ２８ビーズで、例えば、１０％ＲＰＭＩ中３７℃、５％ＣＯ２で活性化し、その後ＴＦＰをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを使用して、例えば、抗ＦＬＡＧ抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、細胞表面のＴＦＰの存在を確認することができる。サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）産生は、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイを使用して測定することができる。
【０４０２】
ＴＣＲサブユニット源
【０４０３】
ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のサブユニットはすべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含有する。ヒトＴＣＲ複合体は、ＣＤ３−イプシロンポリペプチド、ＣＤ３−ガンマポリペプチド、ＣＤ３−デルタポリペプチド、ＣＤ３−ゼータポリペプチド、ＴＣＲアルファ鎖ポリペプチド、及びＴＣＲベータ鎖ポリペプチドを含有する。ヒトＣＤ３−イプシロンポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０７７６６である。ヒトＣＤ３−ガンマポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０９６９３である。ヒトＣＤ３−デルタポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４３２３４である。ヒトＣＤ３−ゼータポリペプチドの規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２０９６３である。ヒトＴＣＲアルファ鎖の規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６ＩＳＵ１である。ヒトＴＣＲベータ鎖Ｃ領域の規範配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１８５０であり、ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域の配列は、Ｐ０４４３５である。
【０４０４】
ＴＣＲドメイン及びｓｃＦｖからのＴＦＰの生成
【０４０５】
メソテリンｓｃＦｖは、Ｇ４Ｓ、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、または（Ｇ４Ｓ）４などのリンカー配列を使用して、組み換えによってＣＤ３−イプシロンまたは他のＴＣＲサブユニット（１Ｃ参照）に連結される。様々なリンカー及びｓｃＦｖ構造が利用される。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖は、完全長ポリペプチドまたはそれらの定常ドメインのみのいずれかとして、ＴＦＰの生成に使用した。ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖のいずれの可変配列もＴＦＰの作製に許容される。
【０４０６】
ＴＦＰ発現ベクター
【０４０７】
プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター）、分泌を可能にするシグナル配列、ポリアデニル化シグナル、及び転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソーム複製及び原核生物での複製を可能にするエレメント（例えば、ＳＶ４０起点及びＣｏｌＥ１または当技術分野で公知の他のもの）、ならびに選択を可能にするエレメント（アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー）を含む、発現ベクターを用意する。
【０４０８】
好ましくは、ＴＦＰをコードする核酸構築物を、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、発現を、メソテリン＋標的細胞に応答する抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞のエフェクターＴ細胞応答の分量及び質に基づいて検証する。エフェクターＴ細胞応答として、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び標的細胞溶解または細胞溶解活性（すなわち、脱顆粒）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０９】
ＴＦＰ．メソテリンレンチウイルス移入ベクターを使用して、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム材料を生成する。レンチウイルス移入ベクターＤＮＡを、リポフェクタミン（登録商標）試薬と合わせた３つのパッケージング成分、ＶＳＶ−Ｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ、及びｒｅｖと混合して、それらを一緒にＨＥＫ−２９３（胚性腎、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３（商標））細胞に形質移入する。２４時間後及び４８時間後に、培地を収集し、ろ過し、超遠心分離によって濃縮する。得られたウイルス調製物を−８０℃で保存する。形質導入単位の数は、Ｓｕｐ−Ｔ１（Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１９４２（商標））細胞での滴定によって決定する。再指向性ＴＦＰ．メソテリンＴ細胞は、新たなナイーブＴ細胞を、例えば、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化し、次いで適正な数の形質導入単位を添加して所望の割合（％）の形質導入Ｔ細胞を得ることによって生成する。これらの改変Ｔ細胞を拡大させ、それらが休止し、サイズが小さくなるまで行い、その時点で、後日の解析のためにそれらを凍結保存する。細胞の数及びサイズは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）ＩＩＩを使用して測定する。凍結保存の前に、形質導入された細胞（ＴＦＰ．メソテリンを細胞表面上に発現するもの）の割合（％）及びその発現の相対蛍光強度をフローサイトメトリー解析によって決定する。ヒストグラムプロットから、形質導入された割合（％）とその相対蛍光強度とを比較することによって、ＴＦＰの相対的発現レベルを調べる。
【０４１０】
幾つかの実施形態では、複数のウイルスベクターでのＴ細胞形質導入によって、複数のＴＦＰを導入する。
【０４１１】
ＴＦＰ再指向性Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及びサイトカイン分泌の評価
【０４１２】
抗ＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞が、細胞表面に発現されるＴＦＰを産生する、標的腫瘍細胞を殺傷する、増殖する、及びサイトカインを分泌する機能的能力は、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定する。
【０４１３】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ、例えば、正常なアフェレーシスドナー由来の血液であり、そのナイーブＴ細胞は、Ｔ細胞、すなわちＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球に対するネガティブ選択によって得ることができる）をヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）で処理し、次いで抗ＣＤ３×抗ＣＤ２８ビーズで、例えば、１０％ＲＰＭＩ中３７℃、５％ＣＯ２で活性化し、その後ＴＦＰをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを使用して、例えば、抗ＦＬＡＧ抗体または抗マウス可変ドメイン抗体によって、細胞表面のＴＦＰの存在を確認する。サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）産生は、ＥＬＩＳＡまたは他のアッセイを使用して測定する。
【０４１４】
実施例３：多重化されたＴＦＰポリペプチドの実証、及び多重化されたヒト化ＴＦＰ再指向性Ｔ細胞の使用
本明細書で提供するＴＦＰポリペプチドは、内因性ＴＣＲサブユニットポリペプチドと機能的に会合して、機能的ＴＣＲ複合体を形成することができる。ここでは、機能的な、多重化された組み換えＴＣＲ複合体を作出するために、レンチウイルスベクター内の複数のＴＦＰを使用してＴ細胞に形質導入する。例えば、用意するのは、ｉ）例えば、ＣＤ３−イプシロンポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、ならびにメソテリン特異的ｓｃＦｖ抗体断片を有する第１のＴＦＰと、ｉｉ）ＣＤ３−ガンマポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメイン、ならびにメソテリン特異的抗体断片を有する第２のＴＦＰとを含有するＴ細胞である。第１のＴＦＰ及び第２のＴＦＰは、互いに、及び内因性ＴＣＲサブユニットポリペプチドと相互作用することができ、それによって機能的ＴＣＲ複合体を形成することができる。
【０４１５】
これらの多重化されたヒト化抗ＭＳＬＮ、抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰ  Ｔ細胞の使用は、固形腫瘍で実証することができる。
【０４１６】
実施例４：ＴＦＰを形質導入したＴ細胞の調製
レンチウイルスの生成
【０４１７】
適正な構築物をコードするレンチウイルスは、次のように調製する。５×１０６個のＨＥＫ−２９３ＦＴ細胞を１００ｍｍの皿に播種し、一晩置いて７０〜９０％の培養密度に到達させる。指定のＤＮＡプラスミド２．５μｇ及び２０μＬのＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＶＰ１００）を、血清を含まない０．５ｍＬのＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地中で希釈し、穏やかに混合する。別のチューブで、３０μＬのＮａｎｏＦｅｃｔ（登録商標）形質移入試薬（ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＮＦ１００）を、血清を含まない０．５ｍＬのＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地中で希釈し、穏やかに混合する。次いでＮａｎｏＦｅｃｔ／ＤＭＥＭ及びＤＮＡ／ＤＭＥＭ溶液を一緒に混合し、１０〜１５秒間ボルテックスし、その後ＤＭＥＭ−プラスミド−ＮａｎｏＦｅｃｔ混合物を室温で１５分間インキュベートする。前の工程からの完全な形質移入複合体を細胞のプレートに滴加し、揺動して形質移入複合体をプレート内で均等に分散させる。次いで、プレートを、加湿した５％ＣＯ２のインキュベーター内で一晩３７℃でインキュベートする。翌日、上清を１０ｍＬの新たな培地に置きかえ、２０μＬのＶｉｒａｌＢｏｏｓｔ（５００×、ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＶＢ１００）を補給する。次いで、プレートを３７℃でさらに２４時間インキュベートする。次いで、レンチウイルスを含有する上清を、５０ｍＬの滅菌した蓋付きの円錐状遠心分離管内に収集し、氷上に置く。３０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心分離した後、透明な上清を低タンパク質結合０．４５μｍ滅菌フィルターでろ過し、続いてウイルスを２５，０００ｒｐｍで１．５時間４℃での超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎｎ、Ｌ８−７０Ｍ）によって単離する。ペレットを取り出し、ＤＭＥＭ培地中に再懸濁させ、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）；カタログ番号６３１２３５）を使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、レンチウイルス濃度／力価を確定する。あらゆる残留プラスミドＤＮＡをＤＮアーゼＩでの処理によって除去する。このウイルスストック調製物は、直ちに感染に使用するか、または小分けにし、さらなる使用のために−８０℃で保存する。
【０４１８】
ＰＢＭＣの単離
【０４１９】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、全血またはバフィーコートのいずれかから調製する。全血を１０ｍＬのＨｅｐａｒｉｎバキュテナー内に収集し、直ちに処理するか、または４℃で一晩保存する。抗凝固処理したおよそ１０ｍＬの全血を、５０ｍＬの円錐状遠心分離管内で、滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液と混合して総体積を２０ｍＬとする（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない）。次いで、この血液／ＰＢＳ混合物２０ｍＬを、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標）、１７−１４４０−０３）の表面上にそっと重ね、その後、ブレーキをかけずに４００ｇで３０〜４０分間室温で遠心分離する。
【０４２０】
バフィーコートは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入する。ＬｅｕｃｏＳｅｐ（登録商標）チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）は、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ）を添加することによって調製し、１０００ｇで１分間遠心分離する。バフィーコートをＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋を含まない）中で１：３に希釈する。希釈したバフィーコートをＬｅｕｃｏｓｅｐチューブに移し、ブレーキをかけずに１０００ｇで１５分間遠心分離する。希釈した血漿／Ｆｉｃｏｌｌの界面に見られる、ＰＢＭＣを含有する細胞の層を、Ｆｉｃｏｌｌの混入が最小限になるように注意深く取り出す。次いで、ＰＢＭＣを４０ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、２００ｇで１０分間室温で遠心分離することによって、残留するＦｉｃｏｌｌ、血小板、及び血漿タンパク質を除去する。次いで、細胞を血球計数器で計数する。この洗浄したＰＢＭＣを、５％ＡＢ血清及び１．２５μｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを有する）ＣＡＲ−Ｔ培地（ＡＩＭ  Ｖ−ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）（ＢＳＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で一度洗浄する。あるいは、この洗浄したＰＢＭＣを断熱容器に移し、−８０℃で２４時間凍結させた後、後日の使用のために液体窒素中で保存する。
【０４２１】
Ｔ細胞の活性化
【０４２２】
全血またはバフィーコートのいずれかから調製したＰＢＭＣを抗ヒトＣＤ２８及びＣＤ３抗体結合磁気ビーズで２４時間刺激し、その後ウイルス形質導入を行う。新たに単離したＰＢＭＣを、ＣＡＲ−Ｔ培地（ＡＩＭ  Ｖ−ＡｌｂｕＭＡＸ（ＢＳＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５％ＡＢ血清及び１．２５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを有する）中でｈｕＩＬ−２を用いずに１回洗浄し、その後、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２（１０００×ストックからのもの；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＣＡＲ−Ｔ培地中に、１×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁させる。もしＰＢＭＣを予め凍結していたなら、それを解凍し、１×１０７細胞／ｍＬの最終濃度で、９ｍＬの予め温めておいた（３７℃）ｃＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンの存在下で１×１０６細胞／ｍＬの濃度とし、その後ＣＡＲ−Ｔ培地中で１回洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬでＣＡＲ−Ｔ培地中に再懸濁させ、上記のようにＩＬ−２を添加する。
【０４２３】
活性化の前に、抗ヒトＣＤ２８及びＣＤ３抗体結合磁気ビーズ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）を、１ｍＬの滅菌１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し（ビーズを溶液から単離するのに磁気ラックを使用する）、その後、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２を有するＣＡＲ−Ｔ培地中に再懸濁させ、４×ｌ０７ビーズ／ｍＬの最終濃度にする。次いで、２５μＬ（１×１０６個のビーズ）を１ｍＬのＰＢＭＣに移すことによって、ＰＢＭＣとビーズとを１：１のビーズ対細胞比で混合する。次いで、所望の数のアリコートを、１２ウェルの低付着性または非処理細胞培養プレートの単一ウェルに分注し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし、その後ウイルス形質導入を行う。
【０４２４】
Ｔ細胞の形質導入／形質移入及び拡大
【０４２５】
ＰＢＭＣの活性化に続き、細胞を４８時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。レンチウイルスを氷上で解凍し、５×１０６個のレンチウイルスを、培地１ｍＬ当たり２μＬのＴｒａｎｓＰｌｕｓ（商標）（Ａｌｓｔｅｍ）（１：５００の最終希釈）と共に、細胞１×１０６個の各ウェルに添加する。細胞をさらに２４時間インキュベートし、その後ウイルスの添加を繰り返す。あるいは、レンチウイルスを氷上で解凍し、それぞれのウイルスを、５μｇ／ｍＬポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、５または５０ＭＯＩで添加する。細胞を１００ｇで１００分間室温でスピノキュレーションする。次いで、細胞を、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２の継続的な存在下で６〜１４日間増殖させる（総インキュベーション時間は、必要とされる最終的なＣＡＲ−Ｔ細胞数に依存する）。細胞濃度を２〜３日毎に解析し、その時点で培地を添加して、細胞懸濁液を１×１０６細胞／ｍＬに維持する。
【０４２６】
幾つかの場合では、活性化したＰＢＭＣを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡでエレクトロポレーションする。一実施形態では、ヒトＰＢＭＣを、１対１の比率のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））で、３００ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（Ｍｉｌｙｅｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製のＴｒａｎｓＡｃｔ（登録商標）Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔなどの他の刺激試薬を使用してもよい）の存在下で３日間刺激する。これらのビーズは、エレクトロポレーションの前に除去する。細胞を洗浄し、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に２．５×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させる。２００μＬの細胞懸濁液（５×１０６細胞）を２ｍｍのギャップのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃｕｖｅｔｔｅｓ  Ｐｌｕｓ（商標）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ（登録商標）ＢＴＸ）に移し、氷上で予冷する。この細胞懸濁液に１０μｇのＩＶＴ  ＴＦＰ  ｍＲＮＡを添加する。次いで、ＥＣＭ（登録商標）８３０  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＢＴＸ）を使用して、ｍＲＮＡ／細胞混合物を２００Ｖで２０ミリ秒間エレクトロポレーションする。エレクトロポレーションの直後に、細胞を新たな細胞培養培地（ＡＩＭ  Ｖ  ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）（ＢＳＡ）無血清培地＋５％ヒトＡＢ血清＋３００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２）に移し、３７℃でインキュベートする。
【０４２７】
細胞染色によるＴＦＰ発現の確認
【０４２８】
レンチウイルスの形質導入またはｍＲＮＡのエレクトロポレーションに続いて、抗メソテリンまたはＭＵＣ１６  ＴＦＰの発現を、マウス抗メソテリンまたはＭＵＣ１６を検出する抗マウスＦａｂ抗体を使用するフローサイトメトリーによって確認する。Ｔ細胞を３ｍＬの染色用緩衝液（ＰＢＳ、４％ＢＳＡ）中で３回洗浄し、ウェル当たり細胞１×１０６個でＰＢＳ中に再懸濁させる。死細胞を排除するために、細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に氷上で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬの染色用緩衝液中に再懸濁させる。Ｆｃ受容体をブロッキングするために、１μＬの１：１００希釈正常ヤギＩｇＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を各チューブに添加し、氷上で１０分間インキュベートする。１．０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を各チューブに添加し、よく混合し、細胞を３００ｇで５分間遠心分離することによってペレットにする。ｓｃＦｖ  ＴＦＰの表面発現は、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識ヒトＭＳＬＮ  ＩｇＧ１  ＦｃまたはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照によって検出する。１μｇの抗体をそれぞれの試料に添加し、氷上で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を２回洗浄し、ＢＤ（登録商標）ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＡｎｔｉ−ＣＤ３  ＡＰＣ（クローン、ＵＣＨＴ１）、ａｎｔｉ−ＣＤ４−Ｐａｃｉｆｌｃ  ｂｌｕｅ（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ｎｔｉ−ＣＤ８  ＡＰＣＣｙ７（クローンＳＫ１）を使用して、表面マーカーを染色する。フローサイトメトリーは、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ  Ｘ２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施し、データは、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを使用して取得し、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で解析する。
【０４２９】
実施例５：フローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ
メソテリンまたはＭＵＣ１６について陽性または陰性のいずれかである標的細胞を、蛍光染料であるカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。これらの標的細胞を、非形質導入、対照ＣＡＲ−Ｔ構築物形質導入、またはＴＦＰ形質導入のいずれかを行ったエフェクターＴ細胞と混合する。指定のインキュベーション時間後、フローサイトメトリーによって、各々のエフェクター／標的細胞培養物について、ＣＦＳＥ標識標的細胞及び陰性対照標的細胞の生細胞に対する死細胞の割合（％）を決定する。各々のＴ細胞陽性標的細胞培養物における標的細胞の生存率（％）を標的細胞のみを含有するウェルに対して算出する。
【０４３０】
エフェクターＴ細胞の細胞障害活性は、エフェクター細胞と標的細胞との共インキュベーション後に、フローサイトメトリーを使用して、エフェクターＴ細胞がある場合またはない場合での標的細胞内の生存標的細胞数を比較することによって測定する。メソテリン．ＭＵＣ１６  ＴＦＰまたはＣＡＲ−Ｔ細胞での実験では、標的細胞はメソテリンまたはＭＵＣ１６陽性細胞であり、それに対して陰性対照として使用する細胞はメソテリンまたはＭＵＣ１６陰性細胞である。
【０４３１】
標的細胞を１回洗浄し、ＰＢＳ中に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させる。蛍光染料であるカルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を０．０３μＭの濃度で細胞懸濁液に添加し、細胞を室温で２０分間インキュベートする。完全細胞培養培地（ＲＰＭＩ（登録商標）−１６４０＋１０％ＨＩ−ＦＢＳ）を反応体積の５倍の体積で細胞懸濁液に添加することによって標識反応を停止し、細胞をさらに２分間室温でインキュベートする。細胞を遠心分離によってペレットにし、細胞傷害性培地（フェノールレッド不含ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））プラス５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中に２×ｌ０５細胞／ｍＬで再懸濁させる。５０マイクロリットルのＣＦＳＥ標識−標的細胞懸濁液（１０，０００個の細胞と同等である）を９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の各ウェルに添加する。
【０４３２】
ＴＦＰ構築物を形質導入したエフェクターＴ細胞を、陰性対照としての非形質導入Ｔ細胞と共に洗浄し、細胞傷害性培地中に２×１０６細胞／ｍＬ、または１×１０６細胞／ｍＬで懸濁させる。５０μＬのエフェクターＴ細胞懸濁液（１００，０００または５０，０００個の細胞と同等である）をプレーティングした標的細胞に添加して、１００μＬの総体積中でエフェクター対標的の比率が、それぞれ１０対１または５対１になるようにする。次いで培養物を混合し、遠沈させ、４時間３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートする。このインキュベーションの直後に、培養細胞に７ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシンＤ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標））を製造業者によって推奨される通りに添加し、フローサイトメトリーをＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）Ｘ−２０（ＢＤ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施する。フローサイトメトリーのデータの解析は、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して実施する。
【０４３３】
標的細胞の生存率（％）は、エフェクターＴ細胞及び標的細胞を有する試料中の生存標的細胞（ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ−）の数を、標的細胞のみを有する試料中の生存細胞（ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ−）の数で除することによって算出する。エフェクター細胞の細胞傷害性は、標的細胞の殺傷率（％）＝１００％−細胞の生存率（％）として算出する。
【０４３４】
抗ＭＳＬＮ．ＭＵＣ１６  ２８ζ  ＣＡＲ構築物または抗ＭＳＬＮ抗ＭＵＣ１６  ＢＢζ  ＣＡＲ構築物を形質導入したＴ細胞は、非形質導入Ｔ細胞または非メソテリンもしくはＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ対照を形質導入したＴ細胞のいずれかと比較したときに、メソテリンまたはＭＵＣ１６発現細胞に対して細胞傷害性を実証することができる。しかし、抗メソテリン−ＣＤ３ε及び抗ＭＵＣｌ６−ＣＤ３εを形質導入したＴ細胞は、抗メソテリンＣＡＲ対照よりも標的に対して効率的に細胞傷害性を誘導することができる。抗メソテリン−ＣＤ３γ及び抗ＭＵＣ１６−ＣＤ３γ  ＴＦＰも、５〜１０：１のエフェクター標的比で抗メソテリン及び抗ＭＵＣ１６−ＣＡＲで観察されるものよりも大きい確固たる細胞傷害性を媒介することができる。代替ヒンジ領域を有するＴＦＰ構築物でも同様の結果を得ることができる。この場合でも、メソテリンまたはＭＵＣ１６発現標的細胞に対する細胞傷害性は、抗メソテリン−ＣＤ３ε及び抗ＭＵＣ１６−ＣＤ３εまたは抗メソテリン−ＣＤ３γ及び抗ＭＵＣ１６−ＣＤ３γＴＦＰを形質導入したＴ細胞での細胞傷害性の方が、抗メソテリン及び抗ＭＵＣ１６−ＣＡＲを形質導入したＴ細胞での細胞傷害性より大きくなり得る。
【０４３５】
メソテリン及びＭＵＣ１６に特異的なＴＦＰをコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションしたＴ細胞も、メソテリン発現細胞に対して確固たる細胞傷害性を実証する。メソテリン−ネガティブ細胞の有意な殺傷は、対照または抗メソテリン及び抗ＭＵＣ１６  ＴＦＰ構築物のいずれでも見られなかったが、メソテリンまたはＭＵＣ１６発現細胞のメソテリンまたはＭＵＣ１６特異的殺傷を、抗メソテリン及び抗ＭＵＣ１６−ＣＤ３ε、または抗メソテリン及び抗ＭＵＣ１６  ＣＤ３γ  ＴＦＰを形質導入したＴ細胞で観察することができる。
【０４３６】
実施例６：リアルタイム細胞傷害性アッセイによる細胞傷害性の決定
ＴＦＰは、リアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）形式でもＣＡＲより優れた細胞傷害性を実証することができる。ＲＴＣＡアッセイは、専用９６ウェルプレートの各ウェルで接着性標的細胞単層の電気インピーダンスをリアルタイムで測定し、最終的な読み出しを細胞指数と呼ばれる値として提示する。細胞指数の変動は、共インキュベートしたＴ細胞エフェクターによる標的細胞殺傷の結果として標的細胞単層が破壊されることを示す。よって、エフェクターＴ細胞の細胞傷害性は、標的細胞及びエフェクターＴ細胞を両方有するウェルの細胞指数の、標的細胞のみを有するウェルのものと比較した変動として評価することができる。
【０４３７】
接着性標的細胞は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養する。ＲＴＣＡの調製のために、５０μＬの、例えばＤＭＥＭ培地を、Ｅ−プレート（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標），Ｉｎｃ、カタログ番号：ＪＬ−１０−１５６０１０−１Ａ）の適正なウェルに添加する。次いで、このプレートをＲＴＣＡ  ＭＰ機器（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に入れ、適正なプレートレイアウト及びアッセイスケジュールを製造業者のマニュアルに記載される通りにＲＴＣＡ２．０ソフトウェアに入力する。ベースライン測定は、１００回の測定を１５分毎に実施する。１００μＬの体積中１×１０４個の標的細胞を各アッセイウェルに添加し、細胞を１５分間静置する。プレートを読み取り装置に戻し、読み取りを再開する。
【０４３８】
翌日、エフェクターＴ細胞を洗浄し、細胞傷害性培地（フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））プラス５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００−３１８））中に再懸濁させる。次いで、プレートを機器から取り出し、細胞傷害性培地（フェノールレッド不含ＲＰＭＩ（登録商標）−１６４０＋５％ＡＢ血清）中に懸濁させたエフェクターＴ細胞を、１００，０００個の細胞または５０，０００個の細胞で各ウェルに添加して、エフェクター対標的比がそれぞれ１０対１または５対１になるようにする。次いで、プレートを機器に戻す。測定は、１００回の測定を２分毎に、次いで１，０００回の測定を１５分毎に行う。
【０４３９】
ＲＴＣＡアッセイでは、抗メソテリン−２８ζ及び抗ＭＵＣ１６−２８ζ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞、または抗メソテリン−ＢＢζ及び抗ＭＵＣ１６  ＢＢζ  ＣＡＲ形質導入構築物を形質導入したＴ細胞で、ＴＦＰ形質導入細胞の殺傷を観察することができる。これは、細胞単独または対照ＣＡＲ構築物を形質導入したＴ細胞と共インキュベートした細胞と比較して、エフェクター細胞添加後に細胞指数が時間依存的に減少することによって実証される。しかし、ＴＦＰ発現Ｔ細胞による標的細胞の殺傷の方が、ＣＡＲで観察されるものよりも深く、迅速であり得る。例えば、ＴＦＰを形質導入したＴ細胞の添加から４時間以内に、メソテリンまたはＭＵＣ１６発現標的細胞の殺傷が本質的に完了し得る。他のＣＤ３及びＴＣＲ構築物含む幾つものＴＦＰ構築物を形質導入したＴ細胞では、殺傷はほとんどまたは全く観察できない。代替ヒンジ領域を有するＴＦＰ構築物で同様の結果を得ることができる。メソテリンを形質導入した標的細胞に対する細胞傷害性は、ＴＦＰを形質導入したＴ細胞での細胞傷害性の方が、ＣＡＲを形質導入したＴ細胞での細胞傷害性より大きくなり得る。
【０４４０】
ＴＦＰを形質導入したＴ細胞の細胞傷害活性は、形質導入に使用したウイルス量（ＭＯＩ）に関して用量依存的であり得る。ＴＦＰレンチウイルスのＭＯＩが増加するとメソテリン陽性細胞の殺傷が増加することを観察することができ、それによってＴＦＰ形質導入と細胞障害活性との間の関係性がさらに強化される。
【０４４１】
実施例７：高または低標的密度を有する細胞におけるルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイ
ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイは、共培養後に残留する生存標的細胞におけるルシフェラーゼ酵素活性を間接的に測定することによって、ＴＦＰ  Ｔ細胞の細胞傷害性を査定するものである。
【０４４２】
ヒト腫瘍細胞株、Ｋ５６２を共培養する標的細胞株として使用する。標的を発現しない（「ＤＮ」）、ＭＳＬＮを発現する（「ＭＳＬＮ＋」）、ＭＵＣ１６を発現する（「ＭＵＣ１６＋」）、またはＭＳＬＮとＭＵＣ１６を両方発現する（「ＤＰ」）Ｋ５６２細胞を、ヒトＭＳＬＮ、ヒトＭＵＣ１６細胞外ドメインをコードするレンチウイルスで形質導入することによって、または両方のウイルスで逐次形質導入することによって生成した。レンチウイルスによってコードされる耐性遺伝子に一致する抗生物質を適用することによって、所望の標的抗原を安定的に発現する標的細胞を選択した。標的細胞は、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスでの形質導入、続いて安定な細胞株を生成するための抗生物質の選択を介して、ホタルルシフェラーゼを過剰発現するようにさらに改変した。
【０４４３】
典型的な細胞傷害性アッセイでは、標的細胞をウェル当たり５０００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングする。ＴＦＰ  Ｔまたは対照細胞を標的細胞に様々なエフェクター対標的比で添加した。次いで、細胞の混合物を２４時間または４８時間、３７℃、５％ＣＯ２で培養し、その後、生存標的細胞におけるルシフェラーゼ酵素活性を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、カタログ番号Ｅ２６１０）によって測定した。細胞は遠心してペレットにし、ルシフェラーゼ基質を含有する培地中に再懸濁させた。次いで、腫瘍細胞の殺傷率（％）を次式で算出した：細胞傷害性（％）＝１００％×［１−ＲＬＵ（腫瘍細胞＋Ｔ細胞）／ＲＬＵ（腫瘍細胞）］。
【０４４４】
実施例８：Ｔ細胞でのＣＤ６９またはＣＤ２５の上方制御によって測定される活性化
ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞の活性化は、ＭＳＬＮ＋またはＭＵＣ１６＋、及びＭＳＬＮ−またはＭＵＣ１６−細胞を使用して実施する。上記のように、活性化したＰＢＭＣに５０ＭＯＩのＬＶで２日間連続して形質導入し、それを拡大する。形質導入後８日目に、ＰＢＭＣの共培養物を、細胞傷害性培地（フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））プラス５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００−３１８）中で標的細胞とＥ：Ｔ比１：１で合わせる（各細胞型０．２×１０６）。ＢＣＭＡを過剰発現する細胞は、陰性対照として使用することができる。共培養の開始から２４時間後に、細胞を採集し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ａｑｕａで３０分間氷上で染色する。Ｆｃ受容体をブロッキングするために、ヒトＦｃ  ｂｌｏｃｋ（ＢＤ）を添加し、１０分間室温でインキュベートする。続いて細胞を、抗ＣＤ３  ＡＰＣ（クローン、ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ８  ＡＰＣｃｙ７（クローンＳＫＩ）、抗ＣＤ６９−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００（クローンＦＮ５０）（ＢＤ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）、及び抗ＣＤ２５−ＰＥ（クローンＢＣ９６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））で染色する。細胞を２回洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）によって解析する。データは、上記のようにＦｌｏｗＪｏ（登録商標）解析ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  ｓｔａｒ，Ｉｎｃ）を使用して解析する。
【０４４５】
同様の実験を、非形質導入Ｔ細胞または陽性対照バインダーを形質導入したＴ細胞のいずれかで、ＭＳＬＮ−またはＭＵＣ１６−細胞、及びＭＳＬＮ＋またはＭＵＣ１６＋細胞を使用して行うことができる。
【０４４６】
Ｔ細胞の活性化は、グランザイムＢ産生の解析によっても同様に査定することができる。Ｔ細胞は、上記のように培養及び拡大し、グランザイムＢの細胞内染色を製造業者のキット使用説明書に従って行う（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００−３１８）。細胞を採集し、ＰＢＳで３回洗浄し、ヒトＦｃ  ｂｌｏｃｋで１０分間ブロッキングする。細胞は、表面抗原を抗ＣＤ３  ＡＰＣ（クローン、ＵＣＨＴ１）及び抗ＣＤ８  ＡＰＣｃｙ７（クローンＳＫＩ）で３０分間４℃で染色する。次いで、細胞を固定／透過処理溶液（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（登録商標）Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｌｂｉｌｚａｔｉｏｎキット  カタログ番号５５４７１４）で２０分間４℃で固定し、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（登録商標）緩衝液で洗浄することによって流す。続いて細胞を抗グランザイムＢ  Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ７００（登録商標）（クローンＧＢ１１）で染色し、ＢＤ  Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させる。データをＢＤ  ＬＳＲＩＩ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）（Ｔｒｅｅ  ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を使用して解析する。
【０４４７】
実施例９：ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分泌の比較定量化
同種抗原を有する細胞の認識に関連するエフェクターＴ細胞の活性化及び増殖の別の尺度は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）などのエフェクターサイトカインの産生である。
【０４４８】
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）。
【０４４９】
単一特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞及び二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞による、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−αを含めた標的特異的サイトカインの産生を、Ｔ細胞と様々なＫ５６２ベースの標的細胞との共培養の４８時間後に採集した上清から、Ｕ−ＰＬＥＸ（登録商標）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉ（ｈｕ）Ａｓｓａｙｓ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）、ＬＬＣ、カタログ番号：Ｋ１５０６７Ｌ−４）を使用して測定した。
【０４５０】
非形質導入Ｔ細胞または対照であるＣＡＲを形質導入したＴ細胞と比較して、ＴＦＰを形質導入したＴ細胞は、メソテリンもしくはＭＵＣ１６を内因的に発現する細胞またはメソテリンもしくはＭＵＣ１６を形質導入した細胞のいずれかと共培養したときに、より高いレベルのＩＬ−２及びＩＦＮ−γを両方とも産生し得る。対照的に、メソテリンもしくはＭＵＣ１６陰性細胞または非形質導入細胞と共培養すると、ＴＦＰを形質導入したＴ細胞からのサイトカインの放出をほとんどまたは全くもたらすことができない。前述の細胞傷害性のデータと一致して、代替ヒンジ領域で構築したＴＦＰは、メソテリンまたはＭＵＣ１６を有する標的細胞と共培養したときに同様の結果を生じ得る。
【０４５１】
実施例１０：ヒトＭＵＣ１６ペプチドに特異的なナノボディの生成及び同定
材料及び方法
ヒトＭＵＣ１６ペプチドを使用するＶＨＨの形質転換、再クローニング、及び発現
ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰ（配列番号９２）
【０４５２】
組み換えｐＭＥＣＳ  ＧＧでの非サプレッサー株（例えば、ＷＫ６）の形質転換
ｐＭＥＣＳ  ＧＧベクターにクローニングするナノボディ遺伝子は、ＰｅｌＢシグナル配列をＮ末端に、ＨＡタグ及びＨｉｓ６タグをＣ末端に含有する（ＰｅｌＢリーダー−ナノボディ−ＨＡ−Ｈｉｓ６）。ＰｅｌＢリーダー配列は、ナノボディをＥ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に指向させ、ＨＡ及びＨｉｓ６タグは、ナノボディの精製及び検出（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどでの）に使用することができる。
【０４５３】
ｐＭＥＣＳ  ＧＧベクターでは、Ｈｉｓ６タグの後にアンバー終止コドン（ＴＡＧ）が続き、このアンバー終止コドンの後にＭ１３ファージの遺伝子ＩＩＩが続く。サプレッサーＥ．ｃｏｌｌ株（例えば、ＴＧ１）では、アンバー終止コドンはグルタミンとして読み取られ、したがってナノボディはファージのタンパク質ＩＩＩとの融合タンパク質として発現し、それによってパニングのためにナノボディをファージコート上にディスプレイすることが可能になる。非サプレッサーＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、ＷＫ６）では、アンバー終止コドンは終止コドンとして読み取られ、したがって得られるナノボディはタンパク質ＩＩＩに融合しない。
【０４５４】
ｐＭＥＣＳ  ＧＧベクターにクローニングされたナノボディを発現し、精製するために、関心対象のナノボディの遺伝子を含有するｐＭＥＣＳ  ＧＧベクターを調製し、非サプレッサー株（例えば、ＷＫ６）をこのプラスミドで形質転換するために使用する。得られたクローンのナノボディは、ＭＰ０５７プライマー（５’−ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ−３’（配列番号９９））を使用して配列決定して、クローンの同一性を確認する。抗原結合能力は、ＥＬＩＳＡまたは任意の他の適正なアッセイによって再試験する。ナノボディ遺伝子を有する組み換えｐＭＥＣＳ  ＧＧベクターを含有する非サプレッサー株（例えば、ＷＫ６）を使用して、ナノボディを発現させ、精製することができる。
【０４５５】
ナノボディ遺伝子のｐＭＥＣＳ  ＧＧからｐＨＥＮ６ｃベクターへの再クローニング
プライマー配列：
−  プライマーＡ６Ｅ（５’  ＧＡＴ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＲ  ＧＧＡ  ＧＧ３’）（配列番号：９４）。
【０４５６】
−  プライマーＰＭＣＦ（５’  ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  Ｔ  ３’）（配列番号：９５）。
【０４５７】
−  ユニバーサルリバースプライマー（５’  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＴＡ  ＴＧＡ  Ｃ  ３’）（配列番号：９６）。
【０４５８】
−  ユニバーサルフォワードプライマー（５  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ３’）（配列番号：９７）。
【０４５９】
ナノボディ遺伝子は、鋳型としてのナノボディ遺伝子ならびにプライマーＡ６Ｅ及びＰＭＣＦを有する組み換えｐＭＥＣＳ  ＧＧを含有するＥ．ｃｏｌｉを使用するＰＣＲによって増幅する（約３０サイクルのＰＣＲ、各サイクルは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で４５秒からなり、続いてＰＣＲの最後に７２℃で１０分の伸長）。約４００ｂｐの断片を増幅する。次いでＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）製のＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットによる）、ＰｓｔＩで一晩消化する。
【０４６０】
ＰＣＲ産物を精製し、ＢｓｔＥＩＩで一晩消化する（またはＦｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）製のＥｃｏ９１Ｉ）。ＰＣＲ産物を上記のように精製し、ｐＨＥＮ６ｃベクターをＰｓｔＩで３時間消化する。消化したベクターを上記のように精製し、次いでＢｓｔＥＩＩで２〜３時間消化する。消化したベクターを１％アガロースゲルで泳動し、ベクターバンドをゲルから切り出し、精製する（例えば、Ｑｉａｇｅｎ製のＱＩＡＱｕｉｃｋゲル抽出キットによる）。ＰＣＲ産物とベクターとをライゲーションする。エレクトロコンピテントＷＫ６細胞をライゲーション反応で形質転換する。形質転換体を、ＬＢ／寒天／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／グルコース（１〜２％）プレートを使用して選択する。
【０４６１】
ナノボディの発現及び精製：
新たに形質転換したＷＫ６コロニーを使用して、１０〜２０ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）＋グルコース（１％）に接種し、２００〜２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートする。この前培養物１ｍｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．１％グルコースを補給したＴＢ培地３３０ｍｌに添加し、振盪（２００〜２５０ｒｐｍ）しながら３７℃で増殖させ、ＯＤ６００が０．６〜０．９になるまで行う。１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによってナノボディの発現を誘導し、培養物を２８℃で一晩振盪しながらインキュベートする（約１６〜１８時間；一晩の誘導後のＯＤ６００は、理想的には２５〜３０の間になるはずである）。
【０４６２】
培養物を８分間８０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを１リットルの培養物から１２ｍｌのＴＥＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））に再懸濁させ、氷上で１時間振盪する。使用したＴＥＳ１２ｍｌ毎に、１８ｍｌのＴＥＳ／４を添加し、氷上でさらに１時間（振盪しながら）さらにインキュベートし、次いで８０００ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離する。その上清は、細胞膜周辺腔から抽出されたタンパク質を含有する。
【０４６３】
ＩＭＡＣによる精製
Ｈｉｓ−ｓｅｌｅｃｔをＰＢＳで平衡化する：１リットルの培養物に由来する周辺質抽出物当たり１ｍｌの樹脂（約２ｍｌのＨｉｓ−ｓｅｌｅｃｔ溶液）を５０ｍｌのファルコンチューブに添加し、ＰＢＳを添加して最終体積を５０ｍｌにし、混合し、次いで、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を捨てる。この樹脂をＰＢＳで２回洗浄し、次いで周辺質抽出物を添加し、穏やかに振盪しながら３０分間〜１時間室温でインキュベートする（インキュベーション時間をそれより長くすると非特異的結合が生じることがある）。
【０４６４】
試料を、底部にフィルターを有するＰＤ−１０カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−０４３５−０１）にかけ、５０〜１００ｍｌのＰＢＳ（使用する樹脂１ｍｌ当たり５０〜１００ｍｌのＰＢＳ）で洗浄する。溶出を３回実施し、毎回、使用する樹脂１ｍｌ当たり１ｍｌのＰＢＳ／０．５Ｍイミダゾールを用い、合わせた溶出液をＰＢＳに対して一晩４℃で透析して（カットオフ３５００ダルトン）、イミダゾールを除去する。
【０４６５】
タンパク質の量は、溶出した試料のＯＤ２８０測定によって、この時点で推定することができる。各クローンの吸光係数は、Ｅｘｐａｓｙプロテオミクスサーバーでの一次構造解析の下でＰｒｏｔＰａｒａｍツールによって決定することができる。ナノボディのさらなる精製は、様々な方法によって実現することができる。例えば、試料は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５  １６／６０にかけるのに適した体積が得られるまで（最大４ｍｌ）２０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離することによって、濃縮されてもよい（Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）５０００ＭＷカットオフ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））。次いで、濃縮した試料を、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０カラムにかける。ピーク画分をプールし、試料をＯＤ２８０で測定し、定量化する。アリコートは、約１ｍｇ／ｍｌの濃度で、−２０℃で保存する。
【０４６６】
免疫化
ラマに、ＫＬＨに結合したヒトＭＵＣ１６ペプチド（ｈＭＵＣ１６）（ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰ−Ｃ−ＫＬＨ）（配列番号９３）、及び／またはＣ末端でビオチン化したヒトＭＵＣ１６ペプチド（ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰ−Ｃ−ビオチン）、及び／またはＮ末端でビオチン化したヒトＭＵＣ１６ペプチド（ビオチン−ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰ）を、０、７、１４、２１、２８、及び３５日目に皮下注射した。ビオチン化ペプチドは、注射前に中性アビジンと混合した。使用したアジュバントは、ＧＥＲＢＵアジュバントＰ（ＧＥＲＢＵ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ）であった。４０日目に、リンパ球調製物のために、ラマから約１００ｍｌの抗凝固処理血液を収集した。
【０４６７】
ＶＨＨライブラリーの構築
抗原特異的ナノボディの存在をスクリーニングするために、ラマのリンパ球からＶＨＨライブラリーを構築した。この目的のために、末梢血リンパ球からの全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いる第１鎖ｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した。このｃＤＮＡを使用して、ＶＨＨコード配列をＰＣＲによって増幅し、ＳＡＰＩで消化し、ファージミドベクターｐＭＥＣＳ−ＧＧのＳＡＰＩ部位にクローニングした。このように得られたＶＨＨライブラリーをＣｏｒｅ  ９３ＧＧと呼んだ。このライブラリーは、約１０８個の独立した形質転換体から構成され、約８７％の形質転換体が、正しい挿入物サイズを有するベクターを有していた。
【０４６８】
ヒトＭＵＣ１６ペプチド特異的ナノボディの単離
Ｃｏｒｅ  ９３ＧＧライブラリーを、ＣまたはＮ末端のいずれかをビオチン化したｈＭＵＣ１６（ｂｉｏ−ｈＭＵＣ１６）ペプチド
ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬＰ（配列番号９２）に対して４回パニングした。ｂｉｏ−ｈＭＵＣ１６ペプチドをストレプトアビジン被覆プレートと相互作用させ、その後ライブラリー由来のファージをプレートに添加した。抗原特異的ファージの濃厚化は、各回のパニング後に、抗原被覆ウェルから溶出したファージミド粒子の数を、陰性対照ウェル（ストレプトアビジンで被覆され、ブロッキングされているが、ペプチドを含有しない）から溶出したファージミド粒子の数と比較することによって査定した。これらの実験から、ファージ集団が、２回目の後に抗原特異的ファージについて約２倍に濃厚化されたことが示唆された。１回目、３回目、及び４回目の後に濃厚化は観察されなかった。合計して３８０個のコロニー（３回目から１９０個、４回目から１９０個）を無作為に選択し、それらの周辺質抽出物中の抗原特異的ナノボディの存在についてＥＬＩＳＡによって解析した（ＥＬＩＳＡは可溶性ナノボディを含む粗周辺質抽出物を使用する）。ＥＬＩＳＡスクリーニングに使用したペプチドは、パニングに使用したものと同じであり、ブロッキングしたストレプトアビジン被覆ウェルにペプチドを含まないものを陰性対照として使用した。これらの３８０個のコロニーのうち、３４個のコロニーがこのアッセイで陽性と評価された。陽性コロニーの配列データに基づいて、２つの異なるＣＤＲ３グループ（Ｂ細胞系統）に属する、６つの異なる完全長ナノボディが区別された（Ｅｘｃｅｌファイルを参照されたい）。同じＣＤＲ３グループ（同じＢ細胞系統）に属するナノボディは、非常に類似しており、それらのアミノ酸配列から、それらは、体細胞超突然変異に起因するクローン的に関連したＢ細胞に由来するか、または同じＢ細胞に由来するが、ライブラリー構築中のＲＴ及び／またはＰＣＲエラーによって多様化したことが示唆される。同じＣＤＲ３グループに属するナノボディは、同じエピトープを認識するが、それらの他の特徴（例えば、親和性、効力、安定性、発現収率など）が異なり得る。これらのパニングからのクローンは、次の名称のコード：ＭＵを有する。
【０４６９】
ｈＭＵＣ１６ペプチド特異的ナノボディのフローサイトメトリー解析
ナノボディ及び細胞
各々の抗ｈＭＵＣ１６−ペプチドＮｂについて、上記の最初のＥＬＩＳＡスクリーニングで行ったのと同じように周辺質抽出物を生成した。各細胞株からの細胞（ＳＫＯＶ３  Ｍｕｃ１６  Ｌｕｃ、ＯＶＣＡＲ  ３  Ｍｕｃ１６  Ｌｕｃ、Ｅｘｐｉ−２９３、及びジャーカット）を解凍し、洗浄し、計数した。各Ｎｂクローンからの周辺質抽出物を、約２×１０５個の細胞でインキュベートした。洗浄後、細胞を、マウス抗ＨＡタグ抗体と抗マウスＰＥとの混合物とインキュベートした。さらに洗浄した後、Ｔｏ−ｐｒｏ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））を生／死染色として各試料に添加し、細胞をフローサイトメトリーで解析した。陽性対照Ｍａｂとして、ヒト抗Ｍｕｃ１６−４ｈ１１（＋抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ＋Ｔｏ−ｐｒｏ）を、ＳＫＯＶ３  Ｍｕｃ１６  Ｌｕｃ及びＯＶＣＡＲ  ３  Ｍｕｃ１６  Ｌｕｃ細胞に対して使用した。陰性対照として、各細胞株に、無関係のＮｂを有する試料（ＢＣＩＩ１０−細菌βラクタマーゼ特異的）、すべての検出Ｍａｂを有する試料、二次抗マウスＰＥ  Ｍａｂだけを有する試料、及び細胞だけを有する試料（Ｔｏ−ｐｒｏを含む及び含まないもの）を使用した。
【０４７０】
実施例１１：ジャーカットヒトＴ細胞株におけるフローサイトメトリーベースのＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６特異的ＴＦＰの検出
ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６二重特異性ＴＦＰの発現を、フローサイトメトリーを使用して、最初にジャーカットヒトＴ細胞株で評価した。ＭＳＬＮ特異的ＴＦＰ、ＭＵＣ１６特異的ＴＦＰ、または二重特異性ＴＦＰ（ＭＳＬＮ  ＴＦＰ及びＭＵＣ１６  ＴＦＰが単一のレンチウイルスベクター内でＴ２Ａ配列によって連結されたもの）をコードするレンチウイルス調製物を使用して、ジャーカット細胞に形質導入した。
【０４７１】
レンチウイルスによる形質導入から４８時間後に、形質導入されたジャーカット細胞及び非形質導入（ＮＴ）対照細胞を採集し、ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６特異的ＴＦＰの表面発現について解析した。ＭＳＬＮ特異的ＴＦＰは、Ｆｃ  ＭＳＬＮ、Ｆｃタグを有するヒトメソテリン／ＭＳＬＮ（２９６−５８０）タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＭＳＮ−Ｈ５２６ｘ）によって検出した。このタンパク質は、Ｚｅｎｏｎ（商標）Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｚ２５４５１）で標識し、１μｇ／試料で染色に使用した。
【０４７２】
ＭＵＣ１６特異的ＴＦＰは、ＭＵＣ１６−ビオチンペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＷＸＩ７、ａａ  １４３１９−１４４３８、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅで合成されたもの）、続いてストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：５５４０６１）によって検出した。ＭＵＣ１６ペプチドは、試料当たり４０ピコモルで使用した。すべてのジャーカット細胞（ＮＴ、ＭＳＬＮ  ＴＦＰ、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ、二重特異性ＴＦＰ）は、最初に標識Ｆｃ＿ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６−ビオチンで同時に染色し、次いでストレプトアビジン−ＰＥで染色した。
【０４７３】
ＭＳＬＮ特異的ＴＦＰを発現するが、ＭＵＣ１６  ＴＦＰを発現しないことが、ＭＳＬＮ  ＴＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入したジャーカット細胞で検出された（図３Ｂ）。加えて、ＭＵＣ１６  ＴＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入したジャーカット細胞で、ＭＵＣ１６  ＴＦＰは検出されたが、ＭＳＬＮ  ＴＦＰは検出されなかった（図３Ｃ）。二重特異性ＴＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入したジャーカット細胞では、両方のＭＳＬＮ  ＴＦＰとＭＵＣ１６  ＴＦＰが、形質導入したジャーカット細胞の同じ集団の表面に検出された（図３Ｄ）。ＮＴジャーカット細胞では、ＭＳＬＮ  ＴＦＰまたはＭＵＣ１６  ＴＦＰの検出は観察されなかった（図３Ａ）。
【０４７４】
実施例１３：二重特異性ＴＦＰジャーカット細胞による標的特異的サイトカイン産生
標的を発現しない（「ＤＮ」）、ＭＳＬＮを発現する（「ＭＳＬＮ＋」）、ＭＵＣ１６を発現する（「ＭＵＣ１６＋」）、またはＭＳＬＮとＭＵＣ１６を両方発現する（「ＤＰ」）、単一特異性ＴＦＰジャーカット細胞及び二重特異性ＴＦＰジャーカット細胞による標的特異的サイトカイン産生を、ジャーカット細胞と様々なＫ５６２ベースの標的細胞との共培養から２４時間後に採集された上清で測定した。上清中のヒトＩＬ−２のレベルは、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，ＬＬＣ）を使用して、Ｕ−ＰＬＥＸ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉ（ｈｕ）  Ａｓｓａｙｓ（カタログ番号：Ｋ１５０６７Ｌ−４）で解析した。
【０４７５】
ＮＴジャーカット細胞は、標的の発現にかかわらず、いずれの標的腫瘍細胞との共培養でも検出可能なＩＬ−２を産生しなかった（図４）。単一特異性ＴＦＰジャーカット細胞は、マッチした標的を発現する標的細胞との共培養でのみ（すなわち、ＭＳＬＮ発現細胞またはＫ５６２過剰発現細胞と共培養したＭＳＬＮ  ＴＦＰジャーカット細胞、及びＭＵＣ１６発現細胞またはＫ５６２過剰発現細胞と共培養したＭＵＣ１６  ＴＦＰジャーカット細胞）ＩＬ−２を産生した。ＭＳＬＮ  ＴＦＰジャーカット細胞は、ＭＳＬＮ＋標的細胞またはＤＰ標的細胞との共培養でＩＬ−２を産生したが、ＤＮまたはＭＵＣ１６＋標的細胞との共培養では産生しなかった。ＭＵＣ１６  ＴＦＰジャーカット細胞は、ＭＵＣ１６＋標的細胞またはＤＰ標的細胞との共培養でＩＬ−２を産生したが、ＤＮまたはＭＳＬＮ＋標的細胞との共培養では産生しなかった。二重特異性ＴＦＰジャーカット細胞は、標的、ＭＳＬＮのみ（ＭＳＬＮ＋）、ＭＵＣ１６のみ（ＭＵＣ１６＋）、または両方の標的（ＤＰ）のうちのいずれかを発現する標的細胞に応答してＩＬ−２を産生し、両方の単一特異性ＴＦＰジャーカット細胞より広い反応性を実証した（図４）。標的を発現しない標的細胞（ＤＮ）との共培養ではＩＬ−２が産生されなかったことから、二重特異性ＴＦＰの特異性が確認された。
【０４７６】
実施例１４：初代ヒトＴ細胞におけるフローサイトメトリーベースのＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６の二重特異性ＴＦＰの検出
ＮＴ、ＭＳＬＮ  ＴＦＰ、ＭＵＣ１６  ＴＦＰ、及び二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞は、健常なドナーのヒト初代Ｔ細胞から、単一または二重特異性ＴＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入することによって生成した。これらのＴ細胞は、健常なドナーのＰＢＭＣから精製し、０日目に、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  ＴｒａｎｓＡｃｔ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号：１３０−０１９−０１１）によって活性化し、ヒトＩＬ−７が存在するときは、プレミアムグレード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号：１３０−０９５−３６４）、及びヒトＩＬ−１５が存在するときは、プレミアムグレード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号：１３０−０９５−７６６）によって行った。１日目に、活性化Ｔ細胞にレンチウイルスで形質導入し、新たな培地を２日毎に補給することによって、細胞を１０日間拡大させた。
【０４７７】
１０日目に、Ｔ細胞を採集し、上記のようにフローサイトメトリーによってＦｃ  ＭＳＬＮ及びＭＵＣ１６−ビオチンペプチドで染色して、単一または二重特異性ＴＦＰの表面発現を決定した。このリガンドに加えて、ＭｏｎｏＲａｂ（登録商標）Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｃａｍｅｌｉｄ  ＶＨＨ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ［ｉＦｌｕｏｒ４８８］（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、カタログ番号：Ａ０１８６２）を使用してＴＦＰを検出した。
【０４７８】
ジャーカット細胞を使用するアッセイに見られる結果と同様に、ＭＳＬＮ特異的ＴＦＰを発現するが（図５Ｃ）、ＭＵＣ１６  ＴＦＰを発現しないことが（図５Ｄ）ＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞で検出され、加えて、ＭＵＣ１６  ＴＦＰを発現するが（図５Ｆ）、ＭＳＬＮ  ＴＦＰを発現しないことが（図５Ｅ）ＭＵＣ１６  ＴＦＰ  Ｔ細胞で検出された。二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞では、両方のＭＳＬＮ  ＴＦＰ及びＭＵＣ１６  ＴＦＰが形質導入した細胞の表面上で検出された（図５Ｇ及び５Ｈ）。ＮＴ  Ｔ細胞では、ＭＳＬＮ  ＴＦＰまたはＭＵＣ１６  ＴＦＰの検出は観察されなかった（図５Ａ及び５Ｂ）。
【０４７９】
実施例１５：二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞による標的特異的な腫瘍細胞殺傷
単一特異性及び二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞による標的特異的な腫瘍細胞殺傷を、実施例１４に従って調製した初代ヒトＴ細胞を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性アッセイを使用して評価した。標的を発現しない（ＤＮ）、ＭＳＬＮを発現する（ＭＳＬＮ＋）、ＭＵＣ１６を発現する（ＭＵＣ１６＋）、またはＭＳＬＮとＭＵＣ１６を両方発現する（ＤＰ）腫瘍細胞株（実施例１３に記載する通り）を、レポーターとしてホタルルシフェラーゼを発現するように安定的に形質導入した。ＮＴまたはＴＦＰ  Ｔ細胞との４８時間の共培養後に、共培養細胞のルシフェラーゼ活性を、生腫瘍細胞のマーカーとしてＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、カタログ番号Ｅ２６１０）を用いて決定した。次いで、腫瘍細胞の殺傷率（％）を次式で算出した：細胞傷害性（％）＝１００％×［１−ＲＬＵ（腫瘍細胞＋Ｔ細胞）／ＲＬＵ（腫瘍細胞）］。
【０４８０】
予想した通りに、ＮＴ  Ｔ細胞は、標的細胞のいずれに対しても検出可能な殺傷を示さなかった（図６）。単一特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞は、マッチした標的を発現する標的細胞のみを殺傷した。ＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＭＳＬＮ＋標的細胞またはＤＰ標的細胞を劇的に殺傷したが、ＤＮまたはＭＵＣ１６＋標的細胞を殺傷しなかった。ＭＵＣ１６  ＴＦＰ  Ｔ細胞は、ＭＵＣ１６＋標的細胞またはＤＰ標的細胞を完全に殺傷したが、ＤＮまたはＭＳＬＮ＋標的細胞を殺傷しなかった。二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞は、標的、ＭＳＬＮのみ（ＭＳＬＮ＋）、ＭＵＣ１６のみ（ＭＵＣ１６＋）、または両方の標的（ＤＰ）のいずれかを発現する標的細胞を有意に殺傷し、両方の単一特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞より広い範囲の反応性を実証した（図６）。標的を発現しない標的細胞（ＤＮ）に対して殺傷しないことから、二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞の特異性が確認される。
【０４８１】
実施例１７：二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞による標的特異的なサイトカイン産生
前述の実施例に記載する方法によって、初代ヒトＴ細胞を調製し、形質導入した。単一特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞及び二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞による、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−αを含めた標的特異的なサイトカイン産生を、Ｔ細胞と様々なＫ５６２ベースの標的細胞との共培養から４８時間後に採集した上清から、Ｕ−ＰＬＥＸ（登録商標）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉ（ｈｕ）Ａｓｓａｙｓ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標），ＬＬＣ、カタログ番号：Ｋ１５０６７Ｌ−４）を使用して測定した。
【０４８２】
すべてのＴＦＰ  Ｔ細胞は、マッチする標的を発現する腫瘍細胞と共培養したときに、有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図７Ａ）。ＭＵＣ１６＋標的細胞と培養したＭＳＬＮ  ＴＦＰ  Ｔ細胞、またはＭＳＬＮ＋標的細胞と培養したＭＵＣ１６  ＴＦＰ  Ｔ細胞では、マッチしない標的発現を有する腫瘍細胞に対する殺傷及びそれらの特異性の欠如と一致して、サイトカイン産生は観察されなかった。二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞では、それとは逆に、ＭＳＬＮ＋、ＭＵＣ１６＋、またはＤＰ標的細胞との共培養後に有意なＩＦＮ−γの産生が観察された単一特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞のいずれかよりも、広い反応性が観察された（図７Ａ）。
【０４８３】
ＧＭ−ＣＳＦ（図７Ｂ）及びＴＮＦ−α（図７Ｃ）の顕著な産生が、単一特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞及び二重特異性  ＴＦＰ  Ｔ細胞で観察され、腫瘍細胞に対して同様の反応性パターンを有していた。ＭＳＬＮ  ＴＦＰ及びＭＵＣ１６  ＴＦＰ  Ｔ細胞は、マッチした標的腫瘍細胞と共培養したときのみサイトカインを産生したが、マッチしない標的細胞と共培養したときは産生しなかった。二重特異性ＴＦＰ  Ｔ細胞は、一方または両方の標的を発現する標的細胞に応答した。
【０４８４】
実施例１８：臨床試験
再発性または難治性疾患を有する切除不能な卵巣癌を有する患者を、ＭＳＬＮ−ＭＵＣ１６−ＴＦＰを発現するＴ細胞の臨床試験に登録する。初期試験では、ＭＳＬＮ−ＭＵＣ１６−ＴＦＰを発現するＴ細胞の安全性プロファイルを調査し、また細胞動力学及び薬力学の成果を調査する。これらの結果から、さらなる試験のための投与量の選択に関する情報を入手し、さらなる試験では、次に、切除不能な卵巣癌を有する患者のより大きいコホートに投与して、ＭＳＬＮ−ＭＵＣ１６−ＴＦＰを発現するＴ細胞の効力プロファイルを定める。
【０４８５】
実施例１９：フローサイトメトリーによるＣＤ１０７ａの露出
Ｔ細胞活性化に関するさらなるアッセイは、休止細胞内の細胞質細胞溶解性顆粒の膜に位置するリソソーム膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）である、ＣＤ１０７ａの表面発現である。細胞溶解活性の前提条件であるエフェクターＴ細胞の脱顆粒は、活性化により誘導される顆粒エキソサイトーシスに続いて、ＣＤ１０７ａの細胞表面への動員をもたらす。よって、ＣＤ１０７ａの露出は、サイトカイン産生に加えて、細胞傷害性と密接に相関するＴ細胞活性化のさらなる尺度となる。
【０４８６】
標的及びエフェクター細胞を別々に洗浄し、細胞傷害性培地（ＲＰＭＩ＋５％ヒトＡＢ血清＋１％抗生物質抗真菌剤）中に再懸濁させる。このアッセイは、Ｕ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内の１００μＬの最終体積中、０．５μＬ／ウェルのＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）抗体（Ｃｌｏｎｅ−Ｈ４Ａ３、ＢＤ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、２×１０５個のエフェクター細胞を２×１０５個の標的細胞と合わせることによって実施する。次いで、培養物を１時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。このインキュベーションの直後に、１０μＬの１：１０希釈の分泌阻害剤モネンシン（１０００×溶液、ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標））を、細胞を乱さないように各ウェルに注意深く添加する。次いで、プレートをさらに２．５時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。このインキュベーションに続いて、細胞をＡＰＣ抗ヒトＣＤ３抗体（Ｃｌｏｎｅ−ＵＣＨＴ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ８抗体（Ｃｌｏｎｅ−ＳＫ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ抗ヒトＣＤ４抗体（Ｃｌｏｎｅ−ＲＰＡ−Ｔ４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、次いで３０分間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液及び１００μＬのＩＣ固定緩衝液中に再懸濁させ、その後解析する。
【０４８７】
Ｔ細胞の表面上のＣＤ１０７ａの露出をフローサイトメトリーによって検出する。フローサイトメトリーは、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（登録商標）Ｘ２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、フローサイトメトリーのデータの解析は、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して実施する。ＣＤ１０７＋ｖｅであるＣＤ３ゲート内のＣＤ８＋エフェクター細胞の割合（％）を、各エフェクター／標的細胞培養物について決定する。
【０４８８】
前述の細胞傷害性及びサイトカインデータと一致して、腫瘍関連抗原を発現する標的細胞と、抗腫瘍関連抗原−２８ζ  ＣＡＲを形質導入したエフェクターＴ細胞とを共培養すると、腫瘍関連抗原陰性標的細胞とインキュベートしたエフェクターと比較して、ＣＤ１０７ａ表面発現の増加を誘導し得る。同じ条件下で比較すると、抗腫瘍関連抗原−ＣＤ３ε  ＬＬまたは抗腫瘍関連抗原−ＣＤ３γ  ＬＬ  ＴＦＰを発現するエフェクターは、５〜７倍のＣＤ１０７ａ発現の誘導を提示し得る。代替ヒンジ領域で構築された抗腫瘍関連抗原ＴＦＰは、腫瘍関連抗原を有する標的細胞と共培養したときに、同様の結果を生み出し得る。
【０４８９】
実施例２０：ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスの効力試験
抗腫瘍関連抗原ＴＦＰを形質導入したエフェクターＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍応答を実現する能力を査定するために、抗腫瘍関連抗原−２８ζ  ＣＡＲ、抗腫瘍関連抗原−ＣＤ３ε  ＴＦＰ、または抗腫瘍関連抗原−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかを形質導入したエフェクターＴ細胞を、腫瘍関連抗原＋ヒトがん細胞株を予め接種したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγ−／−（ＮＳＧ−ＪＡＸ）マウスに養子移入する。
【０４９０】
試験の開始前に少なくとも６週齢である雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγ−／−（ＮＳＧ−ＪＡＸ）マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ストック番号００５５５７）から入手し、実験で使用する前に３日間順化させる。接種用のヒト腫瘍関連抗原発現細胞株は、対数期培養に維持し、その後採集し、トリパンブルーで計数して生細胞数を決定する。腫瘍接種の当日に、細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、予め温めておいた滅菌ＰＢＳ中に、０．５〜１×１０６細胞／１００μＬのいずれかで再懸濁させる。非形質導入、または抗腫瘍関連抗原−２８ζ  ＣＡＲ、抗腫瘍関連抗原−ＣＤ３ε  ＴＦＰ、もしくは抗ＣＤ３γ  ＴＦＰ構築物を形質導入した、いずれかのＴ細胞を、養子移入用に調製する。試験の０日目に、実験群当たり１０匹の動物に、０．５〜１×１０６個の腫瘍関連抗原発現細胞を静脈内接種する。３日後に、１００μＬの滅菌ＰＢＳ中の５×１０６個のエフェクターＴ細胞集団を各動物に静脈内移入する。動物についての詳細な臨床所見を安楽死まで毎日記録する。すべての動物について死亡または安楽死まで体重測定を毎週行う。試験及び対照物質の養子移入から３５日後にすべての動物を安楽死させる。試験中に瀕死状態を呈するすべての動物は、獣医師と相談した上で、試験責任者の判断で安楽死させる。
【０４９１】
非形質導入Ｔ細胞と比較して、抗腫瘍関連抗原−２８ζ  ＣＡＲ、抗腫瘍関連抗原−ＣＤ３ε  ＴＦＰ、または抗腫瘍関連抗原−ＣＤ３γ  ＴＦＰのいずれかを形質導入したＴ細胞の養子移入は、メソテリン発現細胞株腫瘍を有するマウスの生存を延ばすことができ、また、抗腫瘍関連抗原ＣＡＲ及びＴＦＰを形質導入したＴ細胞が両方とも、これらのマウスモデルで標的細胞の殺傷を媒介することができ、それに伴って生存を延ばすことができることを示すことができる。総括すると、これらのデータから、ＴＦＰが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で第一世代のＣＡＲに優る抗原特異的殺傷を実証する、キメラ受容体操作に取って代わるプラットフォームになることを示すことができる。
【０４９２】
【表１−１】
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【０４９３】
【表１−２】
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【０４９４】
【表１−３】
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【０４９５】
【表１−４】
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【０４９６】
【表１−５】
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【０４９７】
【表１−６】
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【０４９８】
【表１−７】
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【０４９９】
【表１−８】
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【０５００】
【表１−９】
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【０５０１】
【表１−１０】
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【０５０２】
【表１−１１】
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【０５０３】
【表１−１２】
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【０５０４】
【表１−１３】
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【０５０５】
文末脚注
本明細書で本発明の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、そのような実施形態が単なる例として提供されているに過ぎないことが当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく多数の変形、変更、及び置換をここから想起するであろう。本発明を実施する際に、本明細書に記載する本発明の実施形態の様々な代替形態を用いることができることが理解されるべきである。添付する特許請求の範囲が本発明の範囲を規定するものであり、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物が本発明の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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