(57)【要約】 一様相は、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質（ＲＳ−１）を利用し、体細胞核移植の効率を上昇させる方法、及びそれによって製造された体細胞核置換細胞を提供し、他の様相は、体細胞核置換の効率を上昇させるために、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質をスクリーニングする方法を提供する、Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質を利用すれば、体細胞核置換の効率を上昇させることができる。【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒａｄ５１活性を増大させる物質を含む、胚芽発達の効率または胚芽の形成を増大させるための組成物。
【請求項２】
前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質は、下記化学式１の化合物またはその誘導体である、請求項１に記載の組成物：
【化１】
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【請求項３】
Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化を低下させる製剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化を低下させる製剤は、ヒストン脱メチル化酵素のＫＤＭ４ファミリの構成員の発現を増大させる製剤である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記製剤は、ＫＤＭ４Ａ（ＪＭＪＤ２Ａ）、ＫＤＭ４Ｂ（ＪＭＪＤ２Ｂ）、ＫＤＭ４Ｃ（ＪＭＪＤ２Ｃ）、ＫＤＭ４Ｄ（ＪＭＪＤ２Ｄ）、またはそれらの組み合わせの発現または活性を増大させる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質の濃度は、５μＭないし１５μＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質は、胚芽の４細胞期に存在するものである、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
前記胚芽発達は、胚芽の胚盤胞への発達、または胚盤胞の形成である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記胚芽は、体外で人工受精を介して形成されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記人工受精で卵子に精液を注入させた後、前核形成前、前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質が存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記胚芽は、核が除去された卵子に、体細胞の核を移植して形成されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒａｄ５１活性を増大させる物質が含まれた培地において、卵子を培養する段階を含む、胚芽発達の効率または胚芽の形成を増大させる方法。
【請求項１３】
前記卵子に、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化を低下させる製剤を接触させる段階を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記卵子は、冷凍後に融解されたものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養によって得られた胚芽は、ＤＮＡ複製において損傷が誘発されるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記損傷は、２−細胞期後、４−細胞期前に誘発されるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質は、前記培養によって得られた胚芽の２−細胞期発達停止を低減させるものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
培養する段階で得られた胚芽を個体に発達させる段階をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載の方法によって製造された胚芽。
【請求項２０】
請求項１２に記載の方法によって製造された胚盤胞。
【請求項２１】
請求項１２に記載の方法によって製造された胚芽幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒａｄ５１活性化剤を含む胚芽発達用組成物、及びそれを利用して胚芽発達率を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者免疫適合性幹細胞を作製するための目的には、体細胞核置換を介し、胚芽幹細胞を製造することが最も有利な方法でもある。しかし、体細胞核置換技術は、その製造効率が非常に低く、失敗する原因も、正しく究明されていない。従って、製造効率が低い原因を究明し、作製効率を高めることが体細胞核置換幹細胞の商用化のために解決しなければならない課題として残っている。
【０００３】
遺伝体の恒常性のために、ＤＮＡは、損傷なしに保存されねばならないが、そのうち、最も致命的なＤＮＡ損傷は、ＤＮＡ二重螺旋の切断であり、切断されたＤＮＡ二重鎖の復旧に関与するタンパク質のうち一つとして、Ｒａｄ５１がある。ＤＮＡ二重鎖の切断が発生すると、まず、エキソヌクレアーゼ（exonuclease）により、切断部位に一本鎖ＤＮＡが形成され、該一本鎖は、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ：replication protein Ａ）によってコーティングされながら保護される。その後、組み換えタンパク質Ｒａｄ５１がさらにＲＰＡを代替しながら、フィラメント形態の複合体を形成し、相同染色体などを探索し、相同塩基配列を探した後、ＤＮＡ鎖を交換する過程を経て、相同組み換え修復が完成される。
【０００４】
また、Ｒａｄ５１の酵素活性を増大させる化学物質であるＲＳ−１は、Ｒａｄ５１のＤＮＡ結合活性（binding activity）を増大させることにより、相同組み換え効率を向上させると知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一様相は、Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質を含む胚芽発達用組成物を提供することである。
【０００６】
他の様相は、卵子を、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質が含まれた培地で培養する段階を含む胚芽発達効率を上昇させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一様相はＲａｄ５１活性を増大させる物質を含む、受精卵の胚芽の形成効率または発達効率を上昇させるための組成物を提供する。他の様相は、Ｒａｄ５１活性化剤を含む、胚芽の形成効率または発達効率を上昇させるための組成物を提供する。
【０００８】
本明細書において、用語「胚芽の形成」とは、接合体（zygote）が細胞分裂を介し、いくつかの細胞になり、該細胞が細胞の分裂と分化とを経て、胚芽（embryo）を形成したり、胚芽として発生したりすることを意味する。
【０００９】
本明細書において、用語「効率の上昇」とは、体細胞複製された卵子の胚盤胞発達または胚盤胞発達の増大を意味する。前記胚盤胞とは、受精卵が卵割を繰り返して育つ過程において、緻密化された桑実胚後、胚盤胞腔を形成して胎児に分化する内細胞塊（inner cell mass）と、胎盤に分化する栄養膜細胞（trophectoderm）とに区分されるほどに発育した状態の受精卵を意味する。従って、前記効率の上昇は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化（methylation）を低下させる製剤の不存在下において行われた体細胞核移植と比較し、体細胞核移植の効率が上昇すること、具体的には、体細胞複製された卵子の胚芽発達効率が上昇すること、体細胞核移植胚芽の胚盤胞段階への発達が増大すること、胚盤胞段階への発生が増加すること、胚盤胞の生成効率が上昇すること、胚盤胞を得る効率が上昇すること、または胚盤胞の発達形成率が上昇することを意味する。
【００１０】
本明細書内用語「Ｒａｄ５１」とは、真核生物において発現される遺伝子であって、ＤＮＡ二本鎖切断の修復に関与する、すなわち、ＤＮＡ矯正剤として、Ｒａｄ５１タンパク質ファミリの一種を意味する。前記遺伝子の配列及び位置などは、当該分野に公知されている（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５８８８など）。
【００１１】
前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質は、例えば、ＲＳ−１（ＲＡＤ５１−stimulatory compound−１）という品名で、商業的に購入可能なものであるか、または高速大量スクリーニング（ＨＴＳ：high throughput screening）のような当業界に公知されている方法により、Ｒａｄ５１と結合する物質を選別したもの、または３−［（ベンジルアミノ）スルホニル］−４−ブロモ−Ｎ−（４−ブロモフェニル）ベンズアミド（３−［（benzylamino）sulfonyl］−４−bromo−Ｎ−（４−bromophenyl）benzamide）、４−ブロモ−Ｎ−（４−ブロモフェニル）−３−［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］−ベンツアミド（４−bromo−Ｎ−（４−bromophenyl）−３−［［（phenylmethyl）amino］sulfonyl］−benzamide）、または下記化学式１の化合物またはその誘導体を含んでもよい：
【００１２】
【化１】
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前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質は、損傷されたＤＮＡの矯正機能があるＲａｄ５１タンパク質のｓｓＲＮＡ（single strand ＤＮＡ）またはｄｓＤＮＡ（double strand ＤＮＡ）への結合安全性を維持させることにより、Ｒａｄ５１タンパク質の活性を高めるので、ＤＮＡ矯正効果を持続させる機能を有することができる。
【００１３】
一具体例において、前記培地組成物は、基本培地にＲａｄ５１活性を増大させる物質が、０．１μＭないし５０μＭの濃度で含まれたものでありうる。具体的には、前記基本培地は、哺乳動物卵子の培養に使用される基本培地でありうる。前記基本培地は、哺乳動物の種によって違いがあるが、無機塩類、炭素源、アミノ酸、牛血清アルブミン及び補助因子からなる群のうちから選択されたいずれか一つ以上を含み、当業者に知られた一般的な培地をいずれも含んでもよい。前記無機塩類としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＮａＨＣＯ３などを使用することができ、炭素源としては、グルコース、ナトリウム、ピルベート及び乳酸カルシウム塩などを使用することができ、アミノ酸としては、グルタミンを始めとする必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、補助因子としては、その他微量元素及び緩衝液などを使用することができる。前記培地は、例えば、ＭＥＭ（Minimal Essential Medium）、ＤＭＥＭ（Dulbecco Modified Eagle Medium）、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute Medium）、Ｋ−ＳＦＭ（Keratinocyte Serum Free Medium）、ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、Ｆ１２及びＤＭＥＭ／Ｆ１２によって構成された群のうちから選択されるものでありうる。また、該培地は、等張液中の中性緩衝剤（例えば、リン酸塩及び／または高濃度重炭酸塩）及びタンパク質栄養分（例：血清、例えば、ＦＢＳ、ＦＣＳ（fetal calf serum）、ウマ血清（horse serum）、血清代替物、アルブミン、または必須アミノ酸及び非必須アミノ酸、例えば、グルタミン、Ｌ−グルタミン）を含んでもよい。さらに、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のＨＤＬ抽出物またはＬＤＬ抽出物）、及びその種類のほとんどの保存液培地で発見されるその他成分（例えば、トランスフェリン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、ピルビン酸塩、任意のイオン化形態または塩である糖源、例えば、グルコース、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン及び／または還元剤、例えば、β−メルカプトエタノール）を含んでもよい。また、前記基本培地には、抗生物質をさらに含めてもよい。前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質は、前記基本培地に、０．１μＭないし５０μＭ、０．１μＭないし４０μＭ、０．１μＭないし３０μＭ、１μＭないし５０μＭ、１μＭないし３０μＭ、５μＭないし３０μＭ、または５μＭないし２５μＭで含むことができる。そのとき、前記基本培地に含まれるＲａｄ５１の活性を増大させる物質の濃度が前記範囲未満である場合、活性酸素を効果的に除去することができないので、卵子の胚盤胞発達効率を阻害するので、良好品質の卵子を得ることができないという問題点があり、前記範囲を超える場合、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質が卵子に長時間作用し、卵子の成熟を妨害する問題点がある。
【００１４】
一具体例において、前記組成物は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化を低下させる製剤をさらに含むものでありうる。前記メチル化を低下させる製剤は、ヒストン脱メチル化酵素のＫＤＭ４ファミリの構成員の発現を増大させる製剤でありうる。例えば、前記製剤は、ＫＤＭ４Ａ（ＪＭＪＤ２Ａ）、ＫＤＭ４Ｂ（ＪＭＪＤ２Ｂ）、ＫＤＭ４Ｃ（ＪＭＪＤ２Ｃ）、ＫＤＭ４Ｄ（ＪＭＪＤ２Ｄ）、またはその組み合わせの発現または活性を増大させるものでありうる。
【００１５】
他の様相は、Ｒａｄ５１活性化を増大させる物質が含まれた培地において、卵子を培養する段階を含む、卵子の胚芽発達効率を上昇させる方法を提供する。前記Ｒａｄ５１の活性化を増大させる物質が含まれた培地の具体的な内容は、前述の通りである。
【００１６】
一具体例において、卵子に、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化を低下させる製剤を接触させる段階を含むものでありうる。前記Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化を低下させる製剤の具体的な内容は、前述の通りである。また、前記卵子は、冷凍後、融解されたものでありうる。
【００１７】
前記方法は、Ｒａｄ５１活性化を増大させる物質が含まれた培地において、卵子を１ないし１０日間培養する段階を含んでもよい。具体的には、１ないし１０日、１ないし８日、１ないし７日、２ないし８日、２ないし６日、または３ないし６日間培養するものでありうる。そのとき、培養期間が前記範囲未満である場合、胚芽が胚盤胞に発達するに十分ではないという問題点があり、前記範囲を超える場合、卵子が過度に成熟し、質的に向上した胚盤胞を得難いという問題点がある。
【００１８】
また、前記方法は、前記培養する段階で得られた胚芽を個体に発達させる段階をさらに含んでもよい。前記個体は、桑実胚（morula）、胞胚（blastula）及び／または卵胚（gastrula）でありうる。
【００１９】
他の様相は、前記方法によって製造された胚芽、胚盤胞及び／または胚芽幹細胞を提供する。さらに他の様相は、前記方法によって製造された胚芽及び／または胚盤胞を有効成分として含む移植用組成物を提供する。
【００２０】
他の様相は、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質を利用し、体細胞核移植の効率を上昇させる方法を提供する。前記効率は、体細胞核移植の成功率、前記体細胞核移植によって生成された細胞の胚芽発達率でありうる。前記胚芽発達率は、胚芽の２−細胞期、４−細胞期及び８−細胞期を経て、胚盤胞への発達を意味するものでありうる。
【００２１】
本発明者らは、体細胞核移植によって製造された細胞の複製過程において、体外受精過程に比べ、Ｒａｄ５１の発現度が非常に低いということを確認し、Ｒａｄ５１活性増大物質が、その体細胞複製効率を画期的に向上させる結果を確認した。従って、Ｒａｄ５１活性化剤は、体細胞核移植による細胞製造にも有用に使用され、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質を選別すれば、体細胞核移植の効率を顕著に上昇させることができる。
【００２２】
前記方法は、体細胞の核、及び核が除去された卵子を準備する段階と、前記体細胞の核、及び核が除去された卵子を、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質と共に培養する段階と、体細胞核置換（ＳＣＮＴ：somatic-cell nuclear transfer）細胞を得る段階と、を含んでもよい。
【００２３】
前記方法は、卵母細胞の核を除去する段階、１またはそれ以上の体細胞の核（供与核）を移植する段階、再構築された核移植された卵母細胞（胚芽）を活性化する段階、及び胚盤胞にさらに培養する段階を含んでもよい。そのような体細胞核移植（ＳＣＮＴ）のための段階は、文献（Nature 419, 583-587, 10 October 2002）などに公開された方法により、通常の技術者であるならば、適切に変形して遂行することができる。
【００２４】
前記方法は、供与核を卵母細胞に、直接注入または電気刺激を介し、核と細胞とを融合させることを含む１以上の体細胞、すなわち、供与体細胞の１以上の核を添加する段階を含んでもよい。
【００２５】
「体細胞核置換」または「体細胞核移植」とは、供与細胞から採取した核を、核が除去された受容細胞に移植する技術であって、供与細胞と遺伝的に同一細胞を発生させる技術を意味する。
【００２６】
前記核が除去された卵子は、個体の卵胞から採取した卵丘細胞・卵母細胞複合体（cumulus-oocyte complexs）でもあり、商業的に得たものでありうる。前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でありうる。例えば、前記哺乳動物は、鼠、豚、羊、犬、牛、馬、ヤギなどを含んでもよい。また、前記核が除去された卵子は、凍結され、かつ／または冷凍保存されたものでありうる。前記凍結方法としては、緩慢凍結法（slow-freezing）、または超急速凍結法であるガラス化凍結法（vitrification）が使用されてもよい。
【００２７】
一具体例による方法は、体細胞の核、及び核が除去された卵子を体外（in vitro）で培養し、胚盤胞を形成する段階を含むものでありうる。
【００２８】
前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質は、体細胞の核、及び核が除去された卵子を培養する培地にも添加され、例えば、ＳＣＮＴ細胞の生成前、生成後、２−細胞期、４−細胞期、８−細胞期、または胚盤胞の形成時に、培地に存在するものでありうる。前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質の濃度は、前記物質のＲａｄ５１活性化程度または細胞毒性により、通常の技術者が適切に調節することができ、例えば、前記培地に、０．１μＭないし５０μＭ、０．１μＭないし４０μＭ、０．１μＭないし３０μＭ、１μＭないし５０μＭ、１μＭないし３０μＭ、５μＭないし３０μＭ、または５μＭないし２５μＭの濃度で存在することができる。
【００２９】
一具体例による方法は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化を低下させる製剤と接触させる段階を含むものでありうる。前記Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化を低下させる製剤は、ヒストン脱メチル化酵素のＫＤＭ４ファミリの構成員の発現を増大させる製剤でありうる。前記製剤は、例えば、ＫＤＭ４Ａ（ＪＭＪＤ２Ａ）、ＫＤＭ４Ｂ（ＪＭＪＤ２Ｂ）、ＫＤＭ４Ｃ（ＪＭＪＤ２Ｃ）、ＫＤＭ４Ｄ（ＪＭＪＤ２Ｄ）、またはその組み合わせの発現または活性を増大させるものでありうる。前記接触させる段階は、体細胞の核、及び核が除去された卵子が融合された後、核移植された胚芽に遂行されるものでありうる。具体的には、前記胚芽は、体細胞核移植卵母細胞遺伝子の活性化が始まる前の胚芽でありうる。例えば、前記胚芽を、活性化後の５時間（５ｈｐａ：５hours post activation）または１０〜１２ｈｐａの間（すなわち、１−細胞期）、または約２０ｈｐａ（すなわち、初期２−細胞期）、または２０〜２８ｈｐａの間（すなわち、２−細胞期）、１以上のヒストン脱メチル化酵素ＫＤＭ４ファミリと接触させるものでありうる。
【００３０】
また、前記接触または注入させる段階は、供与者細胞の核を、核が除去された卵母細胞に注入する前、供与者細胞、例えば、最終分化された体細胞核または細胞質に、１以上のヒストン脱メチル化酵素ＫＤＭ４ファミリが接触または注入されるものでありうる。前記接触または注入は、供与者体細胞と１時間以上、または２時間以上の間接触するものでありうるし、前記接触は、供与者体細胞から核が除去された卵母細胞に対する核除去以前、１日（２４時間）以上、２日以上、３日以上、または３日超過で行われるものでありうる。
【００３１】
従って、前記体細胞の核、及び核が除去された卵子を、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３メチル化を低下させる製剤と接触させることにより、体細胞核移植胚芽において複製を阻害したヒストンメチル酵素の活性を低下させ、胚芽発生関連遺伝子の発現を増進させるので、胚盤胞の発生及び発達効率を増進させることができる。例えば、前記発達効率は、２−細胞、４−細胞及び８−細胞または胚盤胞段階に発達する体細胞核移植胚芽の発達パーセント（％）を上昇させるものでありうる。すなわち、体細胞核移植胚芽の８−細胞または胚盤胞段階への移植前、発達効率を上昇させることができる。一実施例においては、体細胞核移植過程において、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質の有無により、胚芽状態及び胚盤胞数の変化を確認した。その結果、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質の処理により、２−細胞期発達停止（block）の胚芽数が減少し、胚芽発達率が有意に上昇したことを確認した（図３Ａ）。従って、前記Ｒａｄ５１活性を増大させる物質は、２−細胞期発達停止現象を克服し、持続的な胚芽発達を維持することにより、胚盤胞発達効率が上昇するものである。
【００３２】
一具体例において、前記方法は、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質の不在下で行われた体細胞核移植と比較し、核移植の効率が、約５％以上、約１０％以上、約１３％以上、約１５％以上、約３０％以上、約５０％以上、５０ないし８０％、または８０％超過で増加する。すなわち、体細胞核移植胚芽の移植前、発達の効率を上昇させるか、胚芽の胚盤胞段階への発達を増大させるか、あるいは胚芽の拡張された胚盤胞段階への発達を、約５％、約７％、約１０％、約１２以上、または１２％超過で拡張された胚盤胞段階に発達させる。さらに他の具体例において、前記方法は、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質の不在下で行われた体細胞核移植と比較し、胚盤胞段階への成功的な発達は、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上または８倍超過で増加させる。前記体細胞核移植効率の上昇は、胚盤胞の生成または取得の増加を意味する。前記胚盤胞の生成または取得の増加は、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質の不在下で行われた体細胞核移植と比較し、胚盤胞の生成または取得が、約１１０％以上、約１２０％以上、約１３０％以上、約１４０％以上、約１５０％以上または約１５０％超過で増加するものでありうる。
【００３３】
前述のところのように、一様相による方法は、体細胞核移植卵子を、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質が含まれた培地で培養することにより、体細胞核移植卵子の細胞損傷を防止することができるので、卵子の品質を向上させることができる。また、Ｒａｄ５１活性化剤によって凍結及び融解された体細胞核移植卵子の細胞死滅が低減するので、胚盤胞の形成及び生産の効率性を増進させることができる。また、体細胞核移植卵子の着床率が向上することにより、体外受精を介した絶滅危機の動物を生産することができ、胚芽幹細胞誘導が増進されることにより、胚芽幹細胞株を効率的に生産することができる。
【００３４】
他の様相は、前記方法によって製造した、体細胞核移植胚芽、胚盤胞、胚芽幹細胞または複製生殖細胞を提供する。前記胚芽は、遺伝的に変形されたものであり、例えば、体細胞核移植段階以前（すなわち、供与者核を収集し、受容者卵母細胞の細胞質と融合する以前）、供与者核の遺伝物質内１以上の移植遺伝子が変形されたものでありうる。一具体例において、前記胚芽は、供与者体細胞由来核ＤＮＡ、受容者卵母細胞由来細胞質、及び第３供与者個体由来ミトコンドリアＤＮＡを含むものでありうる。前記胚芽幹細胞は、前記方法によって製造された胚盤胞において、内部細胞塊から細胞を分離する段階と、未分化の前記内部細胞塊由来細胞を培養することによって形成されるものでありうる。また、前記胚芽幹細胞は、多能性幹細胞または全能性幹細胞でありうる。
【００３５】
他の様相は、細胞の核、及び核が除去された卵子を準備する段階と、前記体細胞の核、及び核が除去された卵子を、候補物質と共に培養する段階と、および前記培養後に発生した体細胞核置換細胞のＲａｄ５１活性を評価する段階と、を含む、Ｒａｄ５１の活性を増大させ、体細胞複製効率を上昇させる物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００３６】
前記体細胞核移植胚芽または胚盤胞から誘導された細胞、例えば、胚芽幹細胞などは、製剤が、分化または細胞増殖に影響を与えるか否かということを決定するための試験にも使用される。例えば、前記細胞の分化または増殖を行う能力が、製剤の存在または不在から評価されるが、前記体細胞核移植胚芽または胚盤胞から誘導された細胞に影響を与える製剤を選択するためのスクリーニングを行うために使用することができる。試験化合物は、化学的化合物、小分子、ポリペプチド、またはその他生物学的製剤（例えば、抗体またはサイトカインなど）を含む興味のある任意の化合物でありうる。
【００３７】
一具体例による方法で、前記Ｒａｄ５１活性を評価する段階は、Ｒａｄ５１の発現程度を確認するものであり、ＲＴ−ＰＣＲまたは免疫染色法のように、当該分野に周知された技術を利用して遂行することができる。また、前記Ｒａｄ５１活性を評価する段階は、前記体細胞複製効率を評価する段階と共にも遂行されえる。前記候補物質を添加する前と比較し、添加後培養物内のＳＣＮＴ卵母細胞、２−細胞期細胞、４細胞期細胞または胚盤胞段階の細胞数が変化するならば、前記候補物質が、前記Ｒａｄ５１の活性を増大させ、さらには、体細胞核移植による体細胞複製効率を上昇させる物質であると決定することができる。
【００３８】
他の様相は、体細胞の核、及び核が除去された卵子を準備する段階と、前記体細胞の核、及び核が除去された卵子を、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質が含まれた培地で培養し、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）細胞を得る段階と、前記体細胞核移植細胞と液状精液とを体外受精する段階と、を含む、体細胞移植受精卵を製造する方法を提供する。前記体細胞の核、及び核が除去された卵子を、Ｒａｄ５１活性化剤が含まれた培地で培養する方法の具体的な内容は、前述の通りである。前記体細胞核移植細胞は、体細胞核移植卵子、具体的には、２−細胞期、４−細胞期及び８−細胞期の胚芽でもあり、前記胚芽が発達し、胚盤胞段階に逹した細胞でありうる。
【００３９】
一具体例による方法は、前記体細胞核移植細胞と液状精液とを体外受精する段階を含む。前記精液は、個体の精管から採取された精液でありうる。前記個体は、ヒトを含む哺乳動物でありうる。例えば、前記哺乳動物は、鼠、豚、羊、犬、牛、馬、ヤギなどを含んでもよい。前記体細胞核移植細胞と液状精液とを、体外受精用培地組成物において、１ないし７日間体外受精させるものでありうる。このとき、体外受精期間が前記範囲未満である場合、受精がなされないという問題点があり、前記範囲を超える場合、胚芽が退化する問題点がある。また、前記段階において、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質と接触または注入させる段階をさらに含んでもよい。前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質に係わる具体的な内容は、前述の通りである。前記Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質は、体細胞核移植細胞に精液を注入させた後、前核（pronucleus）形成前（精液注入後１８時間以内）、具体的には、精液を注入させた後、２−細胞期前、体細胞移植受精卵に接触または注入されるものでありうる。従って、前記体細胞移植受精卵は、体細胞核移植細胞（胚芽）が発達停止なしに効率的に進行し、発達欠陥または生存力損失なしに、２−細胞期、４−細胞期及び８−細胞期を経て、胚盤胞に首尾よく発達するので、生産効率性を上昇させることができる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によれば、Ｒａｄ５１活性化剤を含む、胚芽発達用組成物、及びそれを利用し、胚芽発達率を向上させる方法に係り、前記細胞は、細胞損傷及び／または発達停止なしに、胚盤胞への発達が効率的に進められるが、体外受精手続きを利用し、体細胞複製受精卵を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】ＩＶＦ、新鮮卵子を利用したＳＣＮＴ過程、卵子にＫｄｍ４ａ ｍＲＮＡを注入するＳＣＮＴ過程におけるＲａｄ５１発現程度をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示す。
【図１Ｂ】ＩＶＦ、冷凍卵子を利用したＳＣＮＴ過程、及び新鮮卵子を利用したＳＣＮＴ過程におけるＲａｄ５１発現程度をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果を示す。
【図２】ＩＶＦ、冷凍卵子を利用したＳＣＮＴ過程、及び新鮮卵子を利用したＳＣＮＴ過程におけるＲａｄ５１発現程度を免疫染色法で分析した結果を示す。
【図３Ａ】Ｒａｄ５１活性化剤の有無によるＳＣＮＴ過程における２−細胞期発生停止状態の胚芽及び胚盤胞の数の変化を示す写真である。
【図３Ｂ】ＩＶＦ卵子、ＳＣＮＴ卵子及びＳＣＮＴ＋ＲＳ−１卵子における、オートファジーとミトコンドリアとの相関関係を確認した写真である。
【図４】ＩＶＦ卵子、ＳＣＮＴ卵子及びＳＣＮＴ＋Ｋｄｍ４ａ卵子におけるミトコンドリア活性を確認した写真である。
【図５Ａ】ＩＶＦ卵子、ＳＣＮＴ卵子及びＳＣＮＴ＋ＲＳ−１卵子における細胞損傷を確認した写真である。
【図５Ｂ】ＩＶＦ卵子、ＳＣＮＴ卵子及びＳＣＮＴ＋ＲＳ−１卵子におけるＤＮＡ損傷バイオマーカーの発現を確認した写真である。
【図５Ｃ】ＩＶＦ卵子、ＳＣＮＴ卵子及びＳＣＮＴ＋ＲＳ−１卵子における細胞周期別ＤＮＡ損傷を確認した写真である。
【図６】ＩＶＦ卵子、ＳＣＮＴ卵子及びＳＣＮＴ＋ＲＳ−１卵子におけるＤＮＡ切断いかんを確認したグラフである。
【図７】ＲＳ−１処理がＳＣＮＴ卵子に及ぼす影響を、遺伝子発現の増減いかんを介して確認したグラフである。
【図８】ＲＳ−１処理及びＫｄｍ４ａ ｍＲＮＡ処理によるＳＣＮＴのメカニズムパターンを、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３染色を介して確認した写真である。
【図９Ａ】ＲＳ−１処理いかんによるＳＣＮＴ卵子の複製生成率を確認した表である。
【図９Ｂ】ＲＳ−１処理いかんによるＳＣＮＴ卵子の胚芽幹細胞誘導率を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１．体細胞核移植（ＳＣＮＴ）
８週〜１０週になったメスＢＤＦ／１マウスに、５ＩＵ ＰＭＳＧホルモンと５ＩＵ ｈＣＧホルモンとを投与した。ｈＣＧ投与１４時間後、過剰排卵されたマウスから、ヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）を使用して卵丘細胞を分離し、卵子を収集した。分離された卵丘細胞は、体細胞複製供与細胞として使用するために冷蔵保管し、分離された卵子は、３７℃インキュベーターＫＳＯＭ培養液に、実験開始まで保管した。その後、体細胞複製実験のために、成熟された卵子から核を除去し、事前に分離しておいた卵丘細胞を供与細胞に直接注入した。６時間ＲＳ−１（Ｒａｄ５１−stimulatimulatory compound １）が含まれた培養液において、供与細胞に注入させた卵丘細胞を人為的に活性化させた。その後、２２時間、前記ＲＳ−１試薬が添加された培養液で培養し、２２時間後、ＫＳＯＭ培養液において７２ないし９６時間培養した。
【００４４】
実施例２．Ｋｄｍ４ａ ｍＲＮＡの準備、及び体細胞複製卵子へのＫｄｍ４ａ ｍＲＮＡ注入
２−１．Ｋｄｍ４ａ ｍＲＮＡの準備
全長（full-length）マウスＫｄｍ４ａ／Ｊｈｄｍ３ａ ｃＤＮＡを、In-Fusion Kit（Clonetech ＃６３８９０９）を使用し、クローニング部位の３’末端に、poly（Ａ）８３が含まれたｐｃＤＮＡ３．１プラスミドでクローニングした。インビトロ（in vitro）転写によって線形化されたテンプレートプラスミドから、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｔ７ Ultra Kit（Life Technologies ＃ＡＭ１３４５）を使用し、ｍＲＮＡを合成した。合成されたｍＲＮＡを、nuclease−free waterに溶解させた。ｍＲＮＡの濃度は、NanoDrop ＮＤ−１０００分光光度計（NanoDrop Technologies）を使用して測定した。ｍＲＮＡの分取量を使用するまで−８０℃で保管した。
【００４５】
２−２．体細胞複製卵子へのＫｄｍ４ａ ｍＲＮＡ注入
前記実施例２−１で準備したＫｄｍ４ａ ｍＲＮＡ ２μｇ／μｌを、piezo-driven micromanipulatorを使用し、活性化培養液において、対照群〜１０ｐｌと共に、６時間ＲＳ−１処理した複製卵母細胞と、ＲＳ−１を処理していない複製卵母細胞とにそれぞれ注射した。注射後、ＲＳ−１が添加されたＫＳＯＭ培養液と、ＲＳ−１が添加されていない培養液とにおいて、それぞれ２２時間培養し、その後、ＲＳ−１が添加されていない培養液において、７２〜９６時間培養し、胚盤胞効率を観察した。
【００４６】
実施例３．体外受精（in vitro fertilization）卵子に対する体細胞核移植卵子でのＲａｄ５１発現量の比較分析
体外受精（ＩＶＦ：in vitro fertilization）卵子、前記実施例１における体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ、Ｆ／Ｔ ＳＣＮＴ）、及び前記実施例２において、体細胞核移植過程において、Ｋｄｍ４ａ ｍＲＮＡが注入された複製卵子（ＳＣＮＴ＋Ｋｄｍ４ａ）における相同組み換えメカニズムを調節するＲａｄ５１の発現程度を、ｑＲＴ−ＰＣＲで比較分析した。具体的には、胚芽のｍＲＮＡは、Dynabeads ｍＲＮＡ DIRECT kit（Dynal Asa、オスロ、ノルウェー）を利用して分離した。前核期（ＰＮ：pronuclear stage）、２−細胞期、４−細胞期の胚芽２０個あまりを溶解／結合バッファで洗浄した後、Dynabeads oligo ｄＴ２５と混ぜて室温で結合させた。ｍＲＮＡをビードに結合させた後、Buffer−Ａで２回洗浄し、Buffer−Ｂでさらに洗浄した。その後、Tris−ＨＣｌ溶液を添加し、７３℃で、ビードからｍＲＮＡを分離した。分離されたｍＲＮＡから、オリゴｄＴプライマーを利用してｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをテンプレートにし、マウスＲａｄ５１の発現をｑＲＴ−ＰＣＲで分析した。そのときに使用されたプライマー塩基配列は、下記の通りである：
正方向プライマー：５’−ＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＡＴ−３’
逆方向プライマー：５’−ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡ−３’
前核期と、２−細胞期、４−細胞期との胚芽におけるＲａｄ５１発現を比較分析した結果、ＩＶＦの１−細胞期においては、Ｒａｄ５１が非常に豊かに発現されていて、２−細胞期においては、有意に低減する傾向を示し、４−細胞期においては、１−細胞期に類似して、Ｒａｄ５１発現が増大する勢いを示した。一方、ＳＣＮＴにおいては、１−細胞期、２−細胞期までは、ＩＶＦに類似した発現様相を示したが、４−細胞期においては、ＩＶＦと比較し、ＳＣＮＴの１−細胞期と類似した発現増大を確認することができなかった。しかし、ＳＣＮＴ＋Ｋｄｍ４ａにおいては、ＩＶＦに類似した発現パターンを確認することができた（図１Ａ）。
【００４７】
新鮮卵子及び冷凍卵子を利用したＳＣＮＴで形成された４−細胞期におけるＲａｄ５１発現が、ＩＶＦによって形成された４−細胞期に比べ、顕著に低いということを確認した（図１Ｂ）。
【００４８】
次に、体細胞核置換（ＳＣＮＴ）によって形成された４−細胞期において、ＩＶＦによって形成された４−細胞期に比べ、Ｒａｄ５１のＲＮＡ発現が顕著に低い結果を免疫染色法で再分析した。具体的には、体細胞複製卵子を活性化させた後、３０時間、２−細胞段階において、０．１％ ＢＳＡが添加されたＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で３０分間処理した。Triton Ｘが０．１％添加されたＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで２４時間処理後、Ｒａｄ５１、γＨ２ＡＸ、Mitotracker、ＬＣ３Ｂの抗体を室温で２時間処理した。その後、０．１％ ＢＳＡが添加されたＰＢＳで１０分間３回洗浄し、ヤギ抗マウス（goat anti-mouse）抗体、ロバ抗ウサギ（donkey anti-rabbit）抗体でそれぞれ１時間処理した。その後、ＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで１０分間３回洗浄し、核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：４’，６−diamidino−２−phenylindole）で染色した。染色された卵子は、スライドガラスに固定し、共焦点蛍光顕微鏡で観察して分析した。
【００４９】
その結果、２−細胞期状態までは、Ｒａｄ５１蛋白質量が、ＩＶＦ、ＳＣＮＴ、冷凍卵子を利用したＳＣＮＴにおいて違いがなかったが、体細胞核置換によって形成された４−細胞期においては、Ｒａｄ５１蛋白質量が有意に低いということを確認した（図２）。
【００５０】
実施例４．Ｒａｄ５１活性増大化合物処理による体細胞複製効率向上の確認及びバイオマーカー確認
４−１．体細胞複製効率向上の確認
前記実施例３の結果に基づき、Ｒａｄ５１活性を増大させる物質であるＲＳ−１を、体細胞複製過程において処理した後、体細胞複製効率が向上するか否かということを分析した。まず、ＲＳ−１が卵子発生に、毒性を誘発するか否かということを確認するために、ＲＳ−１ ０，１，５，１０μＭを、前記体外受精（ＩＶＦ）卵子、及び実施例１における体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ、Ｆ／Ｔ ＳＣＮＴ）に処理し、適正濃度を選別した。
【００５１】
その結果、１０μＭの濃度において、胚芽の発達率が有意に上昇したということを確認した（表１）（対照群：３１％、ＲＳ−１：７６％）。また、予想されたように、ＲＳ−１処理により、２−細胞期発達停止（block）状態の胚芽数も減少し（対照群：３９％、ＲＳ−１５％）、胚芽発達率も有意に上昇したことを確認した（対照群：１７％、ＲＳ−１５９％）（図３Ａ）。
【００５２】
【表１】
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４−２．バイオマーカーの発現及び相関関係の確認
体外受精（ＩＶＦ）卵子、前記実施例１における体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ、Ｆ／Ｔ ＳＣＮＴ）、及び前記実施例４−１において、 ＲＳ−１を処理した体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１）のそれぞれ１−細胞期、２−細胞期及び４−細胞期において、オートファジーマーカーであるＬＣ３Ｂと、ミトコンドリアマーカーであるMito Trackerとの染色を介し、オートファジーとミトコンドリアとの相関関係を確認した。具体的には、ＳＣＮＴ由来の１−細胞期、２−細胞期及び４−細胞期の体細胞複製卵子を、ミトコンドリア分布を評価するために、Mito Tracker Orange ＣＭＴＭＲｏｓ（Molecular Probes）を使用して染色した。Mito Trackerは、０．３％ ＢＳＡが添加されたＭ１６培養液において、３００ｎＭ濃度で３７℃で３０分間、暗い条件で使用された。洗浄後、卵母細胞を固定させ、ＬＣ３Ｂ抗体で免疫蛍光染色した後、ＤＡＰＩで核を染色した。
【００５３】
その結果、１−細胞期においては、ＳＣＮＴグループでのみ、細胞質に、オートファジーとミトコンドリアとの分布が凝縮し、小点（dot）に発現される特異点を見出し、ＲＳ−１を処理したＳＣＮＴグループにおいては、ＩＶＦグループと類似した発現パターンを確認することができた。また、２−細胞期において、ＩＶＦグループは、核及び細胞質において、オートファジーとミトコンドリアとの発現が押しなべて分布したが、ＳＣＮＴグループ及びＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループにおいては、核に、オートファジー及びミトコンドリアが集中して発現するということを確認することができた。特に、２−細胞期において、発達中止をなしたＳＣＮＴグループにおいては、核において発現が示されず、細胞質でのみ発現するる特異点を確認することができた。４−細胞期においては、発現パターンが全てのグループで類似した様相を示した（図３Ｂ）。
【００５４】
実施例５．体外受精卵子に対する体細胞核移植卵子でのミトコンドリア活性分析
体外受精（ＩＶＦ）卵子、前記実施例１における体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ、Ｆ／Ｔ ＳＣＮＴ）、及び前記実施例２において、体細胞核移植過程において、Ｋｄｍ４ａ ｍＲＮＡが注入された複製卵子（ＳＣＮＴ＋Ｋｄｍ４ａ）におけるミトコンドリア活性及び潜在力を分析するために、それぞれの卵子をＪＣ−１で染色した。具体的には、ＳＣＮＴ由来の１−細胞期、２−細胞期及び４−細胞期の体細胞複製卵子を、ミトコンドリア活性を測定するために、ＪＣ−１（Thermo Fisher Scientific、Waltham、ＭＡ、米国）を使用し、１μｇ／ｍｌの濃度で培養液に添加し、２０分間暗い条件で培養した。その後、Hoechst（Sigma）で核を染色した。
【００５５】
その結果、ＩＶＦグループにおいては、２−細胞期において、ミトコンドリアが細胞質と核周囲とに豊かに発現することを確認することができた。一方、ＳＣＮＴグループとＳＣＮＴ＋Ｋｄｍ４ａグループとにおいては、ミトコンドリアが細胞質に部分的に凝縮し、不安定に発現することを確認することができた。また、ＳＣＮＴグループ及びＳＣＮＴ＋Ｋｄｍ４ａグループの４−細胞期においては、相対的に細胞質表面でのみ発現することを確認することができた。従って、ＩＶＦグループとＳＣＮＴグループとにおけるミトコンドリア発現様相は、全く異なるということが分かる（図４）。
【００５６】
実施例６．ＲＳ−１処理いかんによる細胞損傷及びＤＮＡ損傷の確認
６−１．細胞損傷の確認
ＲＳ−１処理いかんによる体細胞複製卵子の細胞損傷いかんを確認するために、体外受精（ＩＶＦ）卵子、前記実施例１における体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ、Ｆ／Ｔ ＳＣＮＴ）、及び前記実施例４−１において、ＲＳ−１を処理した体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１）の２−細胞期における活性酸素発生いかんを確認した。具体的には、ＩＶＦグループ、２−細胞期のＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループ及びＳＣＮＴグループを３０分間、ＣｅｌｌＲＯＸ酸化ストレス製剤（oxidative stress reagenent）５μＭを添加した培養液において、３７℃、３０分間暗い条件で培養した。その後、ＰＶＡ ０．１％を添加したＤ−ＰＢＳで洗浄し、核をHoechst（Sigma）で染色した。
【００５７】
その結果、ＩＶＦグループにおいては、全体的に活性酸素が減少する傾向を示すことを確認することができた。一方、ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループ及びＳＣＮＴグループの核において、活性酸素が増加することを確認することができた。（図５Ａ）。
【００５８】
６−２．ＤＮＡ損傷の確認
ＲＳ−１処理いかんによる体細胞複製卵子のＤＮＡ損傷いかんを確認するために、体外受精（ＩＶＦ）卵子、前記実施例１における体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ、Ｆ／Ｔ ＳＣＮＴ）、及び前記実施例４−１において、ＲＳ−１を処理した体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１）のＤＮＡ損傷バイオマーカー（ｒＨ２ＡＸ）の発現いかんを確認した。具体的には、４％パラホルムアルデヒドによって固定されたＩＶＦグループ、ＳＣＮＴグループ及びＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループを、１−細胞期、２−細胞期及び４−細胞期において固定させた後、ｒＨ２ＡＸ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２２５５１）とＲａｄ５１（Ａｂｃａｍ、ａｂ６３８０１）とで２時間培養し、１：２００でＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡに希釈されたヤギ抗マウス抗体のような濃度に希釈されたヤギ抗ウサギ抗体で１時間培養した。その後、ＤＡＰＩで核を染色した。
【００５９】
その結果、ＩＶＦグループの１−細胞期においては、ｒＨ２ＡＸとＲａｄ５１との発現が非常に微々たることを確認することができた。一方、ＳＣＮＴグループにおいては、Ｒａｄ５１とｒＨ２ＡＸとが核で強く発現し、ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループにおいては、ＤＮＡ損傷が有意に低減することを確認することができた。また、ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１の２−細胞期発達停止グループにおいては、他のグループに比べ、核において、ＤＮＡの損傷が非常に強く発現されることを確認することができた。特異的なこととしては、ＩＶＦグループの４−細胞期核においては、Ｒａｄ５１及びｒＨ２ＡＸが非常に強く発現され、ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループの４−細胞期核において、Ｒａｄ５１及びｒＨ２ＡＸＩＶＦの発現も、それと類似していることを確認することができた。一方、ＳＣＮＴグループの４−細胞期核においては、Ｒａｄ５１及びｒＨ２ＡＸが非常に微々たることを確認することができた。すなわち、体細胞核移植過程においてＲＳ−１を処理する場合、２−細胞期から４−細胞期に複製される過程において、ＤＮＡの損傷が有意に増大することが分かる（図５Ｂ及び図５Ｃ）。
【００６０】
実施例７．ＤＮＡ切断（break）の確認
体外受精（ＩＶＦ）卵子、前記実施例１における体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ、Ｆ／Ｔ ＳＣＮＴ）、及びＲＳ−１が処理されたＳＣＮＴ卵子でのＤＮＡの切断を確認するために、単細胞電気泳動法（comet assay）を遂行した。具体的には、ＤＮＡ損傷を確認するために、各サンプルを、培養液から除去された１ｍｌチューブに入れた状態で、１％アガロース３７℃に懸濁させた後、事前にコーティングされたスライド（Trevigen）に固定した。該スライドは、４℃で４時間恒温培養した後、４時間、Trevigenの４℃溶液に浸した。該スライドを溶解溶液から除去し、３０分間４℃ １Ｘ ＴＡＥ緩衝液に浸し、３０分〜４０分間電気泳動した。該スライドを、３０分間１Ｍ酢酸アンモニウムに室温で浸漬させた後、７５℃に固定した。室温において３０分間固定した後、アガロースが完全に乾燥するまで、４２℃で２０分間培養した。その後、５分間１Ｘ ＳＹＢＲ greenＩ染色溶液で染色した。
【００６１】
その結果、ＩＶＦ(in vitro fertilization)グループと比較し、ＳＣＮＴグループにおいて、３’末端が有意に長くなりながら、ＤＮＡ切断が多く起こることを確認することができた。しかし、ＲＳ−１を処理したＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループにおいては、３’末端が有意に短くなりながら、ＤＮＡ切断が低減することを確認することができた。また、ＳＣＮＴグループにおいて、非正常的な３’末端が生成されることを確認することができたが、ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループにおいては、非正常的な３’末端の生成が有意に低減することを確認することができた（図６）。
【００６２】
実施例８．ＲＳ−１処理が体細胞核移植卵子に及ぼす影響の確認
ＲＳ−１処理が体細胞核移植卵子に及ぼす影響を確認するために、前記実施例１の体細胞複製過程において、２−細胞期段階の複製卵子にＲＳ−１を処理し、ＲＮＡシーケンシングを施した。そのとき、陰性対照群として、体外受精（ＩＶＦ）卵子を使用した。具体的には、相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＳＭＡＲＴｅｒ超低入力ＲＮＡ ｃＤＮＡ準備キット（Takara、６３４８９０）を使用し、製造メーカーの指示によって増幅させた。Ｍ２２０ソニケータ（Covaris）を使用し、ｃＤＮＡを約２００ｂｐ断片に断片化した。断片化されたｃＤＮＡｓは、末端修復されてアダプタ連結されたた。シーケンシングライブラリは、製造社の指示により、ＳｃｒｉｐｔＳｅｑ ｖ２キット（Illumina）を使用して準備した。ＨｉＳｅｑ２５００（Illumina）において、単一縦断シーケンシングを行い、ＳＴＡＲ（ｖ２．５．２ｂ、https://github.com/alexdobin/STAR）を使用し、ｍｍ９マウスゲノムにマッピング（mapping）した。その後、ＦＰＫＭ（kilobase per million read）当たりの切片を、基本オプションを使用し、カフスリンク（ｖ２．２．１）によって計算した。
【００６３】
その結果、翻訳、免疫反応、代謝過程、ミトコンドリア翻訳関連の遺伝子発現が増大し、ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループにおいて、ＩＶＦグループと類似した発現様相を示すと確認することができた。また、細胞増殖関連遺伝子が増加し、細胞分化関連遺伝子が減少することを確認することができた（図７）。
【００６４】
実施例９．ＲＳ−１処理及びｍＲＮＡ ｍＲＮＡ注入による体細胞核移植効率の確認
前記実施例３におけるＲＳ−１処理体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１）、及び前記実施例２における体細胞核の移植過程において、Ｋｄｍ４ａ ｍＲＮＡが注入された複製卵子（ＳＣＮＴ＋Ｋｄｍ４ａ）の複製メカニズムを確認するために、それぞれの卵子におけて発現する遺伝子を、前記実施例８と同一方法で確認した。
【００６５】
その結果、ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループにおいて、有意に増加する遺伝子は、１９０個であり、ＳＣＮＴ＋Ｋｄｍ４ａグループにおいて、有意に増加する遺伝子は、４５個（１，３１４個中）であることを確認することができた。また、ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループにおいて、有意に減少する遺伝子は、４１４個であり、ＳＣＮＴ＋Ｋｄｍ４ａグループにおいて、有意に増加する遺伝子は、３個（４７８個中）であることを確認することができた。
【００６６】
また、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３染色を介し、ＲＳ−１処理とＫｄｍ４ａ ｍＲＮＡ処理とによる体細胞核移植は、別個のメカニズムを介して行われることを立証した。具体的には、パラホルムアルデハイドによって固定されたＩＶＦグループ、ＳＣＮＴグループ、ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループを、１−細胞期に固定させた後、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体（Millipore、０７−４４２）で２時間培養し、１：２００でＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡに希釈されたヤギ抗ウサギ抗体で１時間培養した。その後、ＤＡＰＩで核を染色した。
【００６７】
すなわち、ＲＳ−１処理とＫｄｍ４ａ ｍＲＮＡ処理とによる体細胞核移植は、全く別個のメカニズムによるものであることが分かる（図８）。
【００６８】
実施例１０．ＲＳ−１処理いかんによる複製生成率及び幹細胞誘導率の確認
１０−１．複製マウス生産を介した複製生成率の確認
一般的には、複製マウスの生産率は、正常な体細胞複製後、１％前後であると報告されている。従って、体細胞核移植卵子のＲＳ−１処理いかんによるマウスへの着床及び複製の生成率を確認した。具体的には、ＳＣＮＴ及びＳＣＮＴ＋ＲＳ−１の卵母細胞の２−細胞期を仮妊娠させた後で０．５日になる代理母メスＩＣＲマウスの子宮に胚芽を移植した。移植後１９．５日になる日、体細胞複製マウスを代理母の子宮から取り出した後、複製鼠を養育するＩＣＲマウスの同日に生まれた一般ＩＣＲマウスと共に、代理母の体臭を染み込ませて養育した。
【００６９】
その結果、ＲＳ−１を処理したＳＣＮＴ＋ＲＳ−１グループにおける複製マウス生成率が５％まで上昇することを確認することができた。また、発生過程において、毒性問題が全くなかった。従って、体細胞核移植卵子の製造時、ＲＳ−１を処理すれば、毒性問題なしに、複製マウスを効率的に生産することができるという利点がある（図９Ａ）。
【００７０】
１０−２．幹細胞樹立効率の確認
ＲＳ−１処理いかんによる幹細胞樹立効率を確認するために、前記実施例１において製造した体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ）、及び前記実施例３におけるＲＳ−１処理体細胞核移植卵子（ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１）の胚盤胞から胚芽幹細胞を誘導した。具体的には、各グループの胚盤胞を、マウス胚芽幹細胞培養培地が入っているマウス胚芽線維芽細胞（ＭＥＦ cells）フィーダ細胞上で培養した。２０％ ＫＳＲ、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸、１００units／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全ての製品は、GIBCO）、１．５Ｘ１０３units／ｍｌ 組み換えｍＬｉｆ（Chemicon）を培養液として使用した。トリプシン−ＥＤＴＡを使用して継代させ、確立された体細胞複製マウス胚芽幹細胞に、アルカリホスファターゼを処理し、組織化学染色で樹立された幹細胞を評価した。
【００７１】
その結果、ＲＳ−１非処理グループ（ＳＣＮＴ）に比べ、ＲＳ−１処理グループ（ＳＣＮＴ＋ＲＳ−１）において、胚芽幹細胞の誘導率が有意に高いことを確認することができた（１７％対４５％）（図９Ｂ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際調査報告】
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