(57)【要約】  本開示は、フルクトースからのアルロースの工業規模生産に有用なエピメラーゼ酵素を提供する。開示される酵素（「エピメラーゼ変異体」）は、親酵素と比較して約１．５〜２倍の向上された触媒活性を有するように操作されたバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＣＧＤ１キシロースイソメラーゼの変異体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードする核酸であって、前記タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１６、１８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８及び１００からなる群から選択される、核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸を含む微生物。
【請求項３】
バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ピキア属（Pichia sp.）、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、大腸菌（E. coli）及びＢ．サブチリス（B. subtilis）からなる群から選択される、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
配列番号１６、１８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８及び１００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質を含む固体マトリックス。
【請求項６】
請求項５に記載の固体マトリックスを含むカラムであって、フルクトースを含むインプット溶液を前記固体マトリックスの上に受け入れ、且つアルロースを含むアウトプット溶液の送出を可能にするように構成されたカラム。
【請求項７】
配列番号１６、１８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８及び１００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を生産する方法であって、
（ａ）請求項２に記載の微生物を培養すること；及び
（ｂ）前記タンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項８】
アルロースを生産する方法であって、フルクトースを含む溶液と請求項４に記載のタンパク質とを、フルクトースの少なくとも一部をアルロースに変換するのに好適な時間と条件のもと接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[1]  本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１８年８月８日に出願された米国特許出願第６２／７１６，２０４号に対する優先権を主張する。本開示に引用される各参考文献、特許及び公開特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
[2]  本出願は、本出願の配列表である、２０１９年８月５日に作成された「00820000058sequencelisting」という名称の１７８ｋｂのテキストファイルを参照により援用する。
【０００３】
技術分野
[03]  本開示は、概して、アルロースの生産に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図の簡単な説明
【図１】[04]野生型エピメラーゼ（２０４０２０、配列番号６）並びにエピメラーゼ変異体２３０３３８（配列番号１６）、２７７２８５（配列番号９０）、２７７２８６（配列番号９２）、２７７２８７（配列番号９４）、２７７２８８（配列番号９６）、２７７２８９（配列番号９８）及び２７７２９０（配列番号１００）により変換されたフルクトースの割合に対するアミノ酸置換の作用を示すグラフである。各対の左側のバーは、２００ｍＭであり；各対の右側のバーは、５０％（ｗ／ｗ）である。
【図２】[05]野生型エピメラーゼ（２０４０２０、配列番号６）並びにエピメラーゼ変異体２３０３３８（配列番号１６）、２７７２８５（配列番号９０）、２７７２８６（配列番号９２）、２７７２８７（配列番号９４）、２７７２８８（配列番号９６）、２７７２８９（配列番号９８）及び２７７２９０（配列番号１００）の発現を示すグラフである。
【図３】[06]野生型エピメラーゼ（２０４０２０、配列番号６）並びにエピメラーゼ変異体２３０３３８（配列番号１６）、２７７２８５（配列番号９０）、２７７２８６（配列番号９２）、２７７２８７（配列番号９４）、２７７２８８（配列番号９６）、２７７２８９（配列番号９８）及び２７７２９０（配列番号１００）の比活性を示すグラフである。各対の左側のバーは、２００ｍＭであり；各対の右側のバーは、５０％ＤＳである。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
詳細な説明
[07]  本開示は、フルクトースからのアルロースの工業規模生産に有用なエピメラーゼ酵素を提供する。開示される酵素（「エピメラーゼ変異体」）は、親酵素と比較して約１．５〜２倍の向上された触媒活性を有するように操作されたバークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ＣＧＤ１キシロースイソメラーゼ（配列番号６）の変異体である。下記の表１は、添付の配列表における各エピメラーゼ変異体のアミノ酸配列を識別し、変異体をコードする核酸配列の例を提供する。各エピメラーゼ変異体と親酵素（配列番号６）との間のアミノ酸の相違を表２にまとめてあり、アミノ酸番号は、配列番号６のそれを指す。
【０００６】
【表１】
2021532809.tif 000002
【０００７】
【表２】
2021532809.tif 000003
【０００８】
核酸、ベクター及び宿主微生物
[08]  本開示は、上述の開示されるエピメラーゼ変異体をコードする核酸を提供する。配列表は、これらの変異体をコードするヌクレオチド配列の例を提供するものであるが、エピメラーゼ変異体をコードするいずれのヌクレオチド配列も使用され得る。
【０００９】
[09]  ヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の様々な微生物の種又は株における発現に最適化され得る。好適な微生物として、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ピキア属（Pichia sp.）、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、大腸菌（E. coli）及びＢ．サブチリス（B. subtilis）があるが、これらに限定されるものではない。これらの生物で任意のタンパク質を発現させるためのプロモーター及び他の必要な調節配列を含むベクターが知られており、当業者に容易に入手可能である。
【００１０】
[10]  上述のエピメラーゼ変異体をコードする核酸は、コード配列が所望の宿主微生物での発現に好適な調節配列に作動可能に連結されたベクターに含まれ得る。調節配列は、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位並びに転写及び翻訳の終結を調節するための配列を含み、プロモーター又はオペレーターなどの他のエレメントを含み得る。宿主微生物に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムとは独立して複製若しくは機能し得るか、又はゲノム自体に組み込まれ得る。使用されるベクターは、宿主で複製できる限り、特に限定されるものではなく、当技術分野において公知のいずれのベクターでもあり得る。
【００１１】
[11]  ベクターは、抗生物質耐性遺伝子などの少なくとも１つの選択可能なマーカーを含み得る。好適な抗生物質として、例えばアミカシン、アンピシリン、オーグメンチン（アモキシシリン＋クラブロン酸）、セファゾリン、セフォキシチン、セフタジジム、セフチオフル、セファロチン、クロラムフェニコール、エンロフロキサシン、フロルフェニコール、ゲンタマイシン、イミペネム、カナマイシン、ペニシリン、サラフロキシチン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン及びチルミコシンがある。
【００１２】
[12]  上述の１つ又は複数のエピメラーゼ変異体を生産するため、ベクターを使用して微生物を操作し得る。ベクターを微生物に送達する方法は、周知であり、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、マイクロインジェクション、脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、コンジュゲーション及び感染がある。
【００１３】
アルロースを生産する方法
[13]  本明細書に開示されるエピメラーゼ変異体は、当技術分野において周知の方法を用いて、フルクトースからのアルロースの工業規模生産に使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１７／０１０１６３７号、米国特許出願公開第２０１７／０２９８４００号、米国特許出願公開第２０１６／０３０４８５３号及び米国特許出願公開第２０１６／０２８１０７６号を参照されたい。
【００１４】
[14]  いくつかの実施形態では、エピメラーゼ変異体又はエピメラーゼ変異体を含む微生物由来の抽出物が固体マトリックスに結合され、及びフルクトースを含むインプット溶液がマトリックスの上を通されて、フルクトースの少なくとも一部を、アウトプット流から回収できるアルロースに変換する。任意選択的に、アルロースは、アウトプット流中の他の成分から分離及び濃縮され得る。
【００１５】
[15]  酵素の結合に好適な多くの固体マトリックスは、当技術分野において周知であり、アルギネート（例えば、アルギン酸ナトリウム）、AMBERLITE（商標）樹脂（例えば、XAD（登録商標）2樹脂、XAD（登録商標）4樹脂、XAD（登録商標）8樹脂、XAD（登録商標）16樹脂（Sigma Aldrich）、SEPHADEX（登録商標）樹脂又はDUOLITE（商標）樹脂（例えば、A568；Dow Chemical）；並びにPurolite CR8415及びECR 8314（Purolite）がある。さらに、国際公開第２０１６／１６０５７３号及び国際公開第２０１６／１９１２６７号を参照されたい。エピメラーゼを担体に固定化するための方法は、当業者によく知られている。例えば、米国特許第８，３７５，１０６号を参照されたい。
【００１６】
[16]  他の実施形態では、エピメラーゼ変異体を発現する微生物を透過処理し、米国特許第８，７３５，１０６号に記載されているようにアルギネートビーズ又は粘土、カーボン、珪藻土若しくはポリアクリルアミドなどのヒドロゲルに固定化し得る。
【００１７】
[17]  当業者は、添付の特許請求の範囲の範囲に包含される上述の実施形態に対する多くの変形形態及び変更形態があることを理解するであろう。
【実施例】
【００１８】
実施例１．アルロースエピメラーゼの工業生産のためのマーカーフリーバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）株の作製
[18]  本例は、アルロースエピメラーゼを発現するマーカーフリーＢ．サブチリス（B. subtilis）株の作製について記載する。簡単に説明すると、第１のステップでは、ＢＭＣＧＤ１エピメラーゼをコードし、抗生物質耐性マーカーを含むカセットでＢ．サブチリス（B. subtilis）株を形質転換した。このカセットは、バチルス（Bacillus）染色体に組み換わり、大きい胞子形成遺伝子クラスター及びリジン生合成遺伝子ｌｙｓＡを含む８ｋｂのＤＮＡをノックアウトした。第２のステップでは、第２のカセットをＢ．サブチリス（B. subtilis）染色体に組み換え、ｌｙｓＡ遺伝子を回復させ、抗生物質耐性をコードするＤＮＡを除去した。Ｂ．サブチリス（B. subtilis）の形質転換前に、Keioコレクションの大腸菌（E. coli）株３９  Ａ１０を使用してプラスミドＤＮＡの継代を行った。関連する表現型は、大腸菌（E. coli）の他の点では野生型であるＫ−１２株のＤＮＡメチラーゼＨｓｄＭにおける欠損である。
【００１９】
[19]  詳細には、５１２０ｂｐのカセット（配列番号１；IDT, Coralville, IAの合成ＤＮＡ）を合成し、標準的なアンピシリン耐性ｐＩＤＴベクターにクローニングした。合成断片は、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）染色体上のｌｙｓＡの上流７００ｂｐ、抗生物質マーカーｃａｔ（６５１ｂｐ）、ＤＮＡ結合タンパク質ｌａｃＩ（１０８３ｂｐ）及びアルロースエピメラーゼ（８９４ｂｐ）をコードし、ｄａｃＦに相同の７００ｂｐを含んでいた。このベクターを大腸菌（E. coli）株３９  Ａ１０（Baba et al., 2006）に形質転換し、プラスミドＤＮＡを調製してＢ．サブチリス（B. subtilis）株１Ａ７５１及び１Ａ９７６に形質転換した。
【００２０】
[20]  形質転換体を、クロラムフェニコールを補充したＬＢで選択した。ｐＩＤＴのレプリコンは、大腸菌（E. coli）では機能するが、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）などのグラム陽性菌では機能しない。したがって、発生したコロニーは、染色体への組み込み現象を意味した。株１Ａ７５１では、プレート上のコロニー形態を用いて、単一組み換え現象と二重組み換え現象とを区別した。二重組み換え現象では、胞子形成に必要な遺伝子をノックアウトする一方、単一組み換えではノックアウトしないであろう。ＬＢプレート上で３日後、胞子形成の能力があるコロニーは、褐色で不透明であったが、胞子形成のないコロニーは、より半透明であった。
【００２１】
[21]  アルロースエピメラーゼカセットを有するＢ．サブチリス（B. subtilis）株１Ａ９７６は、ヒスチジン及びリジン栄養要求性であり、キシロース誘導時に非常に高い形質転換効率を達成することができる。１９２５ｂｐの合成ＤＮＡ（配列番号２）をプライマー（配列番号３、配列番号４）及びＴａｑポリメラーゼ（Promega）により増幅した。このＰＣＲ産物は、エピメラーゼカセットのドロッピングにより欠失したｌｙｓＡ遺伝子及びｌａｃＩに相同の５００ｂｐをコードしていた。このＤＮＡの二重組み換え現象が成功すると、リジン原栄養性でクロラムフェニコールに感受性であるコロニーが得られるはずである。すなわち、全ｃａｔ遺伝子が消失するはずである。
【００２２】
[22]  ヒスチジンを補充したDavisの最小培地で形質転換体を選択した。発生したコロニーは、ＰＣＲによりキャラクタリゼーションを行い、クロラムフェニコールを含む及び含まないＬＢに画線した。導入したＤＮＡを増幅し、クロラムフェニコール感受性であった株のキャラクタリゼーションをさらに行い、それらの染色体ＤＮＡを抽出した。
【００２３】
[23]  この染色体ＤＮＡでクロラムフェニコール耐性アルロースを含む株１Ａ７５１を形質転換し、ヒスチジンを補充したDavisの最小培地で選択した。クロラムフェニコールを含む及び含まないＬＢに形質転換体を画線し、下記のように酵素学的キャラクタリゼーションを行った。
【００２４】
実施例２．エピメラーゼタンパク質レベルの解析
[24]  粗ライセート及び可溶性ライセート中のエピメラーゼタンパク質レベルを、４〜１２％ビス−トリスNuPAGE（NUPAGE（登録商標））ゲル（Invitrogen）上のポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。タンパク質レベルは、タンパク質定量用標準物質を用いてSimplyBlue（SIMPLYBLUE（商標））Safe Stain（Invitrogen）で染色したゲルのデンシトメトリーにより決定した。
【００２５】
実施例３．Ｂ．サブチリス（B. subtilis）におけるＢＭＣＧＤ１エピメラーゼの発現
[25]  ＢＭＣＧＤ１エピメラーゼ遺伝子を保有するｐＨＴ２５４コンストラクトを、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）における発現のためにコドン最適化を行い（配列番号５）、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）株ＤＰ１０７７を形質転換するのに使用した。株ＤＰ１０７７は、バチルス（Bacillus）Genetic Stock Center株１Ａ９７６（Ｅｍ  ｈｉｓ  ｎｐｒＥ１８  ａｐｒＥ３  ｅｇｌＳ（Δ）１０２  ｂｇｌＴ／ｂｇｌＳ（Δ）ＥＶ  ｌａｃＡ：：ＰｘｙｌＡ−ｃｏｍＫ）の胞子形成欠陥（ΔｓｐｏＩＩＧ：：ＺｅｏＲ）誘導体である。胞子形成欠陥であることに加えて、この株は、ｎｐｒＥ遺伝子及びａｐｒＥ遺伝子の突然変異の結果、それぞれ中性プロテアーゼ及びサブチリシンを分泌する能力に欠陥がある。この株は、コンピテント細胞の単純生産のため、コンピテンス因子ｃｏｍＫをキシロース誘導性プロモーターの制御下に置いた発現カセットをさらに有する。
【００２６】
[26]  形質転換体は、１％グルコース及び５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した、Ｍｎ２＋及びＣｏ２＋を欠いたカスタムAzure培地（Teknova）又は２ｇ／Ｌの合成完全アミノ酸混合物（MP Biomedicals）、１％グルコース及び５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充したDavisの最小培地（HiMedia）のいずれかで選択及び培養した。培養物を３７℃で１６時間増殖させた。この培養物４０μＬを使用して２ｍｌの新鮮培地に接種し、得られた培養物を対数増殖中期（６００ｎｍでＯＤが約０．７）まで３７℃でインキュベートした。次いで、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、インキュベーションを３７℃で４時間又は２４℃で２０時間継続した。
【００２７】
[27]  細胞を遠心分離により収集し、２回凍結及び融解し、PeriPreps（PERIPREPS（商標））完全溶解プロトコル（Epicentre）を用いて溶解した。粗ライセートの遠心分離後、上清画分を集めてライセート中の可溶性タンパク質を調製した。
【００２８】
[28]  粗及び可溶性ライセート中のエピメラーゼタンパク質レベルを、実施例２で上記したようなポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。
【００２９】
実施例４．エピメラーゼ変異体の作製
[29]  米国特許第８，６３５，０２９号に記載された方法に基づき、アミノ酸変異をコードするヌクレオチド変化をＢＭＣＧＤ１最適化コード配列に導入し、エピメラーゼ変異体のためのコード配列を作製するのに使用した。これらのコード配列をｐＨＴ２５４（MoBiTech, Inc.）に組み入れた。このベクターは、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のｇｒｏＥＳＬオペロンの上流にあるプロモーターに由来する強力なＰｇｒａｃ１００プロモーターから目的遺伝子を発現する。このプロモーターは、ＩＰＴＧによる誘導を可能にするｌａｃオペレーターに融合した改良型調節エレメント及び強力なリボソーム結合部位を含む。ヌクレオチドは、ＵＰエレメント、−３５領域及び−１５領域を含むｇｒｏＥＳＬプロモーターの保存領域で最適化した（Phan et el., 2012）。各コード配列をＢａｍＨＩ制限部位及びＸｍａＩ制限部位で発現ベクターｐＨＴ２５４にクローニングした。
【００３０】
[30]  次いで、ベクターを上記のようにバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＤＢ１０７７株に形質転換した。形質転換体を、５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地で選択した。
【００３１】
[31]  ９６個のＢ．サブチリス（B. subtilis）形質転換体をDavisの最小培地に植えた。Davisの最小培地は、１Ｌの最終容量における試薬グレードの水、１０．６ｇのデキストロースを含まない最小ブロスDavis（HIMEDIA、カタログ番号Ｍ３９０−５００Ｇ）と共に２ｇの合成完全アミノ酸混合物（MP Biomedicals、カタログ番号Ｍ４４００−０２２）を使用して作り、１２１℃で１５分間オートクレーブした。使用前に、グルコースを１％になるように加え、クロラムフェニコールを５μｇ／ｍｌなるように加えた。
【００３２】
実施例５．形質転換体におけるエピメラーゼ活性のスクリーニング
[32]  Ｄ−フルクトースからＤ−アルロースへのエピメラーゼスクリーニングのため、形質転換体を、２ｇ／Ｌの合成完全アミノ酸（MP Biomedicals）、１％グルコース及び５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを補充した６００μＬのDavisの最小培地（HiMedia）に植えた。細胞を３７℃で対数増殖中期まで増殖させ、次いで２４℃で２０時間、ＩＰＴＧにおいて誘導した。細胞を遠心分離により収集し、最終容量７５μＬとしてPeriPreps溶解プロトコル（Epicentre）を用いて溶解した。可溶性タンパク質の発現を４〜１２％ビス−トリスNuPAGEゲル（Invitrogen）上のポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析し、タンパク質レベルは、定量標準物質に対するデンシトメトリーにより決定した。回収された可溶性エピメラーゼは、培養物の１〜１０μｇ／ｍＬの範囲であった。
【００３３】
[33]  Ｂ．サブチリス（B. subtilis）由来のライセートのエピメラーゼ活性について、容量１００μＬ：１０％ｖ／ｖの清澄化したライセート、低（２００ｍＭ）又は高（５０％ｗｔ／ｗｔ）フルクトース及び５ｍＭのＭｇＣｌ２での反応をアッセイした。反応を７０℃で２時間インキュベートし、１０％容量の２％ＨＣｌの添加により止め、４℃に冷却した。ＨＰＬＣ解析前に分子量カットオフ１０ｋＤａのＰＥＳ膜（Pall）で反応を濾過した。
【００３４】
[34]  結果を表３に示す。
【００３５】
【表３】
2021532809.tif 000004
【００３６】
実施例６．野生型エピメラーゼと、１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を有するエピメラーゼ変異体との比較分析
[35]  変異体２３０３３８において１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換（Ｄ８９Ｋ、Ｓ１５４Ｔ及びＣ１６７Ｉ）を有するエピメラーゼ変異体によりアルロースに変換されたフルクトースの割合を２つの条件下（１０％ｖ／ｖの清澄化したライセート、低（２００ｍＭ）又は高（５０％ｗｔ／ｗｔ）フルクトース、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．０及び５ｍＭのＭｇＣｌ２）で試験し、野生型エピメラーゼと比較した。結果を図１に示す（バーの各対の左側のバーは、２００ｍＭのフルクトースから始めて１時間後のフルクトースからアルロースへの変換の割合を表し、バーの各対の右側のバーは、５０％ｗｔ／ｗｔのフルクトースから始めて２時間後のフルクトースからアルロースへの変換の割合を表す）。各変異体に存在するアミノ酸置換を棒グラフの上の格子に示し、変異体のアミノ酸配列を配列番号１６（変異体２３０３３８）、配列番号９０（変異体２７７２８５）、配列番号９２（変異体２７７２８６）、配列番号９４（変異体２７７２８７）、配列番号９６（変異体２７７２８８）、配列番号９８（変異体２７２８９）及び配列番号１００（変異体２７２９０）に示す。「２０４０２０」は、野生型エピメラーゼ（配列番号６）である。エピメラーゼ発現（μｇ／ｍｌ）を図２に示す。比活性（エピメラーゼ１μｇ／ｍｌで変換されたフルクトース）を図３に示す。
【００３７】
[36]  本例から、酵素を評価した条件下で三重変異体の触媒活性が最も高かったことが証明される。２００ｍＭのフルクトース及び５０％（ｗ／ｗ）のフルクトースの両方において、３つの置換（Ｄ８９Ｋ、Ｓ１５４Ｔ及びＣ１６７Ｉ）をすべて有する変異体が最も高い発現を有し、活性が最も高い酵素であった。
【００３８】
参考文献
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【図１】
2021532809.tif 000005
【図２】
2021532809.tif 000006
【図３】
2021532809.tif 000007
【配列表】
2021532809000001.app
【国際調査報告】
2021532809.tif 000008
2021532809.tif 000009
2021532809.tif 000010