(57)【要約】癌の治療及び／又は予防のための新規の二官能性化合物及びそれらの用途がここに開示される。ここに開示される二官能性化合物は、式（Ｉ）の構造を有する。【選択図】  図１
2021503453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）、その薬学的に許容可能な溶媒和物又は立体異性体の化合物であって、
【化１】
2021503453.tif 000025
Ａは、選択的に置換される６〜１０員環の不飽和炭素環であり、
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである、化合物。
【請求項２】
Ｒ３は、１Ｈ−ピラゾール−３−アミノ、１Ｈ−イミダゾール−２−アミノ又はピリミジン−アミノである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記シクロアルキルアミノ基は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピペラジニル及び４−ピペリドピペリジニルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が、式（Ｉ−Ａ）の構造を有し、
【化２】
2021503453.tif 000026
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はエチルであり、Ｒ３はモルホリンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３は１，４´−ビピペリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
前記化合物が、式（Ｉ−Ｂ）の構造を有し、
【化３】
2021503453.tif 000027
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はジメチルアミンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はジメチルアミンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項９に記載の化合物。
【請求項１３】
被検体における癌を治療するための方法であって、治療上有効量の請求項１に記載の化合物を前記被検体に投与するステップを具備する方法。
【請求項１４】
前記化合物が、式（Ｉ−Ａ）の構造を有し、
【化４】
2021503453.tif 000028
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はエチルであり、Ｒ３はモルホリンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３は１，４´−ビピペリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、式（Ｉ−Ｂ）の構造を有し、
【化５】
2021503453.tif 000029
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はジメチルアミンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はジメチルアミンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の化合物の前記投与の前、前記投与とともに、又は前記投与の後に化学療法剤を前記被検体に投与するステップをさらに具備する請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学療法剤は、ＤＥＴ、ＰＬＸ４０３２、ドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、オキサリプラチン、ベツリン酸、４−Ｓ−システアミニルカテコール、４−Ｓ−システアミニルフェノール、エベロリムス、ボルテゾミブ、カルボプラチン、ダカルバジン、セレコキシブ、テモゾロミド、ソラフェニブ、サリドマイド、レナリドマイド、バルプロ酸、ビンブラスチン、メシル酸イマチニブ、ボセンタン、アポミン、三酸化ヒ素、カルムスチン、ラムブロリズマ、抗ＣＴＬＡ−４剤、抗プログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）剤、イピリムマブ、トレメリムマブ、ドキソルビシン、ＭＥＫ阻害剤、カペシタビン、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤及びタモキシフェンからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌は、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫、ウィルムス腫瘍、骨腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、精巣癌、甲状腺癌、前立腺癌、咽頭癌、子宮頸癌、鼻咽頭癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、食道癌、直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、脳癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌及びＣＮＳ新生物からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１１月１７日出願の米国仮特許出願第６２／５８７４８４号に対して米国特許法第１１９条（ｅ）の下で優先権を主張し、それはその全体においてここに参照によって取り込まれる。
【０００２】
本開示は、概略として癌の治療の分野に関し、より具体的には、抗血管新生及びＤＮＡ架橋活性の双方を示す新規な二官能性化合物並びに癌の治療及び／又は予防におけるそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は、世界中で最も多い死因となっている。癌の治療は、一般に、外科切除及び／又は化学療法剤の投与若しくは放射線療法を伴う。多数の化合物が抗癌剤として開発されており、ほとんどの薬剤開発者は、制御不能な細胞増殖をもたらす１つの特定の細胞メカニズムを標的化することによって抗癌剤を開発する。本開示の発明者らは、１つの特定の代謝経路において酵素を抑制又は阻害することに着目するのではなく、２つの活性部分を１つの分子に結合することによってデュアルモードの活動を有する化合物を創出し、具体的には、一方の部分が抗血管新生活性を担い、他方の部分がＤＮＡ架橋活性を担う。このように、混成分子は、２つの別個の経路から癌細胞を攻撃する２つの官能基を有するので、非常に効力のある抗癌剤となることが期待される。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の発明者らは、ＶＥＧＦ及びオーロラキナーゼ阻害部分とＤＮＡ架橋部分とを結合することによって形成される新たな分類の化合物を設計及び合成した。新たに生成された混成化合物は、種々のヒト癌細胞において大きな抗増殖活性を示すので、癌の治療及び／又は予防に適した医薬品の開発の有望な候補となる。
【０００５】
そこで、本開示の一態様は、式（Ｉ）の構造、その薬学的に許容可能な溶媒和物又は立体異性体を有する新規な化合物を提供することであり、
【化１】
2021503453.tif 000003
Ａは、選択的に置換される６〜１０員環の不飽和炭素環であり、
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである。
【０００６】
本開示のある実施形態によると、式（Ｉ）において、Ｒ３は、１Ｈ−ピラゾール−３−アミノ、１Ｈ−イミダゾール−２−アミノ又はピリミジン−アミノである。
【０００７】
本開示のある実施形態によると、式（Ｉ）において、前記シクロアルキルアミノ基は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピペラジニル及び４−ピペリドピペリジニルからなる群から選択される。
【０００８】
本開示のある実施形態によると、特定の化合物は式（Ｉ−Ａ）のものであり、
【化２】
2021503453.tif 000004
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである。
【０００９】
好適な一実施形態によると、式（Ｉ−Ａ）において、Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はエチルであり、Ｒ３はモルホリンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００１０】
好適な一実施形態によると、式（Ｉ−Ａ）において、Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００１１】
他の好適な実施形態によると、式（Ｉ−Ａ）において、Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３は１，４´−ビピペリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００１２】
更なる実施形態によると、式（Ｉ−Ａ）において、Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００１３】
本開示のある実施形態によると、特定の化合物は式（Ｉ−Ｂ）のものであり、
【化３】
2021503453.tif 000005
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである。
【００１４】
好適な一実施形態によると、式（Ｉ−Ｂ）において、Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はジメチルアミンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００１５】
他の実施形態によると、式（Ｉ−Ｂ）において、Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はジメチルアミンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００１６】
更なる実施形態によると、式（Ｉ−Ｂ）において、Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００１７】
本開示の第２の態様は、癌を有し又は有していると疑われる被検体の治療又は予防のための薬学的組成物を提供するものである。薬学的組成物は、治療上又は予防上の有効量の式（Ｉ）の化合物、及び薬学的に許容可能な担体を具備する。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として約０．１重量％〜９９重量％のレベルで存在する。ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として少なくとも１重量％のレベルで存在する。ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として少なくとも５重量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として少なくとも１０重量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として少なくとも２５重量％のレベルで存在する。
【００１９】
好ましくは、前記化合物は式（Ｉ−Ａ）の構造を有し、
【化４】
2021503453.tif 000006
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである。
【００２０】
選択的に又は追加的に、式（Ｉ−Ａ）の前記化合物は、リポソームに調合される。
【００２１】
好適な一実施形態によると、式（Ｉ−Ａ）において、Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はエチルであり、Ｒ３はモルホリンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００２２】
他の好適な実施形態によると、式（Ｉ−Ａ）において、Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００２３】
更なる実施形態によると、式（Ｉ−Ａ）において、Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３は１，４´−ビピペリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００２４】
更なる実施形態によると、Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００２５】
本開示の他の好適な実施形態によると、前記化合物は式（Ｉ−Ｂ）の構造を有し、
【化５】
2021503453.tif 000007
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである。
【００２６】
好適な一実施形態によると、式（Ｉ−Ｂ）において、Ｒ１は−ＯＨで置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はジメチルアミンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００２７】
他の好適な実施形態によると、式（Ｉ−Ｂ）において、Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はジメチルアミンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００２８】
更なる好適な実施形態によると、式（Ｉ−Ｂ）において、Ｒ１は−ＯＣＯＮＨ（Ｃ２Ｈ５）で置換されたメチルであり、Ｒ２はメチルであり、Ｒ３はピロリジンであり、Ｒ４及びＲ５は独立して水素である。
【００２９】
本開示はまた、癌を有し又は有するものと疑われる被検体の治療又は予防のための方法を包含する。方法は、本薬学的組成物を前記被検体に投与するステップを具備する。
【００３０】
選択的に又は追加的に、方法は、本薬学的組成物の前記投与の前、前記投与とともに、又は前記投与の後に化学療法剤を前記被検体に投与するステップをさらに具備する。
【００３１】
本方法において使用され得る例示の化学療法剤は、これに限定されないが、ＤＥＴ、ＰＬＸ４０３２、ドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、オキサリプラチン、ベツリン酸、４−Ｓ−システアミニルカテコール、４−Ｓ−システアミニルフェノール、エベロリムス、ボルテゾミブ、カルボプラチン、ダカルバジン、セレコキシブ、テモゾロミド、ソラフェニブ、サリドマイド、レナリドマイド、バルプロ酸、ビンブラスチン、メシル酸イマチニブ、ボセンタン、アポミン、三酸化ヒ素、カルムスチン、ラムブロリズマ、抗ＣＴＬＡ−４剤、抗プログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）剤、イピリムマブ、トレメリムマブ、ドキソルビシン、ＭＥＫ阻害剤、カペシタビン、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤及びタモキシフェンを含む。
【００３２】
本方法によって治療され得る例示の癌は、これに限定されないが、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫、ウィルムス腫瘍、骨腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、精巣癌、甲状腺癌、前立腺癌、咽頭癌、子宮頸癌、鼻咽頭癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、食道癌、直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、脳癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌及びＣＮＳ新生物を含む。
【００３３】
本開示はまた、癌を有する被検体の治療又は予防に有用なキットを包含する。キットは、少なくとも、式（Ｉ）の化合物を含有する第１の容器及び化学療法剤を含有する第２の容器を含む。
【００３４】
本開示の１以上の実施形態の詳細を、以下の付随する説明において説明する。発明の他の特徴及び効果が、詳細な説明から、及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【００３５】
以上の概略説明及び以下の詳細な説明の双方は例示としてのものであり、特許請求される発明の更なる説明を与えることが意図されていることが理解されるべきである。
【００３６】
明細書に含まれてその一部を構成する添付図面は、種々の例示のシステム、方法及び発明の種々の態様の他の例示的実施形態を示す。本説明は、添付図面を考慮して読まれる以下の詳細な説明からより深く理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本開示の一実施形態によるＤＮＡ鎖間架橋の形成に対する式（Ｉ）の化合物の効果を示す写真である。
【図２】図２は、本開示の一実施形態によるＨ５２６細胞におけるＤＮＡ鎖間架橋に対するＢＯ−２７６８又はシスプラチンの効果を示し、（Ａ）は変形コメットアッセイによるコメットテールを示す個々の細胞の代表的な画像であり、（Ｂ）はシスプラチン又はＢＯ−２７６８処置細胞においてテールモーメントを表す棒グラフである。テールモーメントが短いほど、ＤＮＡ鎖間架橋が強いことを示す。データは、独立した３回の実験の平均値である。
【図３】図３は、本開示の一実施形態によるＶＥＧＦＲ−２活性に対する（Ａ）ＢＯ−２５９０、（Ｂ）ＢＯ−２５７７又は（Ｃ）バタラニブの阻害効果を示す写真である。
【図４】図４は、本開示の一実施形態による内皮細胞に対するＢＯ−２５９０、ＢＯ−２６９８及びＢＯ−２７６８の抗血管新生効果を示し、（Ａ）はトランスウェルによって測定された内皮細胞転移の阻害であり、（Ｂ）及び（Ｃ）は管形成によって特定された阻害を表す写真であり、（Ｄ）はパネル（Ａ）及び（Ｂ）の定量化された結果を表す折れ線グラフである。
【図５】図５は、本開示の一実施形態によるＨ４６０ヒト肺癌細胞におけるＢＯ−２５９０による細胞周期の干渉を示す。
【図６】図６は、本開示の一実施形態による（Ａ）２４時間、（Ｂ）４８時間又は（Ｃ）７２時間でのＨ４６０ヒト肺癌細胞におけるＢＯ−２５９０によるアポトーシスｓｕｂ−Ｇ１細胞誘導を示す。
【図７】図７は、本開示の一実施形態によるＢＯ−２５９０又はシスプラチンによるアネキシンＶ＋アポトーシス死誘導を示す。
【図８】図８は、本開示の一実施形態によるＢＯ−２７６８によるＨ５２６細胞におけるアポトーシス誘導を示す。
【図９】図９は、本開示の一実施形態によるＨ２１１細胞の増殖抑制に対するＢＯ−２７６８とシスプラチンの（Ａ）１：２、（Ｂ）１：４、（Ｃ）１：８の比率における相乗効果をそれぞれ表す折れ線グラフであり、異なる併用投与間の相乗作用又は拮抗作用は、併用係数（ＣＩ）を用いて計算され、ここで、ＣＩ＝１は二つの薬物が相加効果を有することを示し、ＣＩ＜１は相加効果よりも優れること（「相乗作用」）を示し、ＣＩ＞１は相加効果よりも劣ること（拮抗作用）を示す。
【図１０】図１０は、本開示の一実施形態によるＨ５２６異種移植ヌードマウスにおける（Ａ）腫瘍サイズ及び（Ｂ）体重変化に対するリポソームＢＯ−２５９０Ｌの効果を示す。
【図１１】図１１は、本開示の一実施形態によるＨ５２６異種移植ヌードマウスにおける（Ａ）腫瘍サイズ及び（Ｂ）体重変化に対するリポソームＢＯ−２５９０Ｌ、バタラニブ及びシスプラチンのそれぞれの効果を示す。
【図１２】図１２は、本開示の一実施形態によるＨ５２６異種移植ヌードマウスにおける（Ａ）腫瘍サイズ及び（Ｂ）体重変化に対するミセルＢＯ−２５９０、ＢＯ−２７６８、ＢＯ−２７９２、イリノテカン及びシスプラチンのそれぞれの効果を示す。
【図１３】図１３は、本開示の一実施形態によるＨ５２６ＳＣＬＣ異種移植ヌードマウスにおける（Ａ）腫瘍サイズ及び（Ｂ）体重変化に対するＢＯ−２７６８の投与量依存性阻害効果を表す折れ線グラフである。
【図１４】図１４は、本開示の一実施形態によるＨ２１１ＳＣＬＣ異種移植ヌードマウスにおける（Ａ）腫瘍サイズ及び（Ｂ）体重変化に対するＢＯ−２７６８及びシスプラチンの併用使用の効果を示す。２０ｍｇ／ｋｇのＢＯ−２７６８を投与量で１００μｌで連続５日間投与し、２サイクルに１日休薬した。シスプラチンを４日おきに２又は４ｍｇ／ｋｇの投与量で３回投与した。体重変化を薬物処置後に観察した。
【図１５】図１５は、本開示の一実施形態による腫瘍中のＣＤ３１マーカーのレベルに対するＢＯ−２５９０Ｌ、シスプラチン又はバタラニブの効果を示し、（Ａ）は処置後６日目でのＣＤ３１に対する抗体を使用した代表的なＩＨＣ染色であり、（Ｂ）は腫瘍におけるＣＤ３１の定量的シグナルである。データは、グループあたり１５フィールドの平均値±ＳＤとして表される。
【図１６】図１６は、本開示の一実施形態による腫瘍におけるγ−Ｈ２ＡＸに対するＢＯ−２５９０Ｌ、シスプラチン又はバタラニブの効果を示し、（Ａ）は処置後６日目でのγ−Ｈ２ＡＸに対する抗体を使用した代表的なＩＨＣ染色であり、（Ｂ）は腫瘍におけるγ−Ｈ２ＡＸの定量的シグナルである。データは、グループあたり３匹のマウスの平均値±ＳＤとして表される。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。
【００３９】
１．定義
値の範囲が列挙される場合、その範囲内には各値及び部分的範囲を包含することが意図される。例えば、「Ｃ１−１０」はＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１−１０、Ｃ１−９、Ｃ１−８、Ｃ１−７、Ｃ１−６、Ｃ１−５、Ｃ１−４、Ｃ１−３、Ｃ１−２、Ｃ２−１０、Ｃ２−９、Ｃ２−８、Ｃ２−７、Ｃ２−６、Ｃ２−５、Ｃ２−４、Ｃ２−３、Ｃ３−１０、Ｃ３−９、Ｃ３−８、Ｃ３−７、Ｃ３−６、Ｃ３−５、Ｃ３−４、Ｃ４−１０、Ｃ４−９、Ｃ４−８、Ｃ４−７、Ｃ４−６、Ｃ４−５、Ｃ５−１０、Ｃ５−９、Ｃ５−８、Ｃ５−７、Ｃ５−６、Ｃ６−１０、Ｃ６−９、Ｃ６−８、Ｃ６−７、Ｃ７−１０、Ｃ７−９、Ｃ７−８、Ｃ８−１０、Ｃ８−９及びＣ９−１０を包含することが意図される。
【００４０】
特に断りがない限り、用語「アルキル」は、１〜２０個（例えば、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個）の炭素原子を有する直鎖、分岐及び／又は環状（「シクロアルキル」）炭化水素を意味する。１〜４個の炭素を有するアルキル部分（Ｃ１−４アルキル）を「低級アルキル」という。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、２−イソプロピル−３−メチルブチル、ペンチル、ペンタン−２−イル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、ヘプタン−２−イル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル及びドデシルを含む。シクロアルキル部分は単環式又は多環式であってもよく、例としてシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルを含む。特に断りがない限り、アルキル基の各例は、１以上の置換基で独立して選択的に置換され、すなわち、非置換（「非置換アルキル」）又は置換（「置換アルキル」）される。ある実施形態では、アルキル基は、置換Ｃ２−１０アルキルである。ある実施形態では、シクロアルキルは、３〜６個の炭素原子の環を有する単環式飽和カルボキシクリル基（「Ｃ３−６シクロアルキル」）である。ある実施形態では、シクロアルキル基は、５〜６個の炭素原子の環を有する（「Ｃ５−６シクロアルキル」）。Ｃ５−６シクロアルキル基の例は、シクロペンチル（Ｃ５）及びシクロヘキシル（Ｃ６）を含む。特に断りがない限り、シクロアルキル基の各例は、１以上の置換基で独立して非置換（「非置換シクロアルキル」）又は置換（「置換シクロアルキル」）される。ある実施形態では、シクロアルキル基は、非置換Ｃ３−１０シクロアルキルである。ある実施形態では、シクロアルキル基は、置換Ｃ３−１０シクロアルキルである。
【００４１】
「ヘテロシクロアルキル」は、炭素原子環及び１〜４個のヘテロ原子の環を有する３−〜１０−員環の非芳香族環系のラジカルのことをいい、各ヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄、リン及びケイ素から独立して選択される（「３〜１０員環ヘテロシクロアルキル」）。１以上の窒素原子を含むヘテロシクリル基においては、付着点は、原子価が許す限り、炭素又は窒素原子であり得る。特に断りがない限り、ヘテロシクロアルキルの各例は、１以上の置換基で独立して選択的に置換され、すなわち、非置換（「非置換ヘテロシクロアルキル」）又は置換（「置換ヘテロシクロアルキル」）される。ある実施形態では、ヘテロシクリル基は、炭素原子環及び１〜４個のヘテロ原子の環を有する５〜８員環の非芳香族環系であり、各ヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される。ある実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、炭素原子環及び１〜４個のヘテロ原子の環を有する５〜６員環の非芳香族環系であり、各ヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される。ある実施形態では、５〜６員環のヘテロシクリルは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜３個のヘテロ原子の環を有する。ある実施形態では、５〜６員環のヘテロシクリルは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子の環を有する。ある実施形態では、５〜６員環のヘテロシクロアルキルは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１個のヘテロ原子の環を有する。１個のヘテロ原子を含む例示の５員環ヘテロシクリル基は、限定することなく、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ジヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ジヒドロピロリル及びピロリル−２，５−ジオンを含む。２個のヘテロ原子を含む例示の５員環ヘテロシクリル基は、限定することなく、ジオキソラニル、オキサスルフラニル、ジスルフラニル及びオキサゾリジン−２−オンを含む。３個のヘテロ原子を含む例示の５員環ヘテロシクリル基は、限定することなく、トリアゾリニル、オキサジアゾリニル及びチアジアゾリニルを含む。１個のヘテロ原子を含む例示の６員環ヘテロシクリル基は、限定することなく、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピリジニル及びチアニルを含む。２個のヘテロ原子を含む例示の６員環ヘテロシクリル基は、限定することなく、ピペラジニル、モルホリニル、ジチアニル及びジオキサニルを含む。２個のヘテロ原子を含む例示の６員環ヘテロシクリル基は、限定することなく、トリアジナニルを含む。１個のヘテロ原子を含む例示の７員環ヘテロシクリル基は、限定することなく、アゼパニル、オキセパニル及びチエパニルを含む。１個のヘテロ原子を含む例示の８員環ヘテロシクリル基は、限定することなく、アゾカニル、オキセカニル及びチオカニルを含む。
【００４２】
特に断りがない限り、用語「アリール」は、炭素及び水素原子から構成される芳香族環又は部分的芳香族環系を意味する。アリール部分は、ともに結合又は融合した複数の環を具備し得る。アリール部分の例は、フェニル、ナフチル、ピレニル、アントリル及びフェナントリルを含む。特に断りがない限り、アリール基の各例は、１以上の置換基で独立して選択的に置換され、すなわち、非置換（「非置換アリール」）又は置換（「置換アリール」）される。ある実施形態では、アリール基は、置換フェニル（例えばベンジル）である。
【００４３】
特に断りがない限り、用語「ヘテロアリール」はアリール部分を意味し、その炭素原子の少なくとも１つがヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ又はＳ）で置換されている。ある実施形態では、ヘテロアリール基は、芳香族環系に供給された炭素原子環及び１〜４個のヘテロ原子の環を有する５〜１０員環の芳香族環系であり、各ヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される（「５〜１０員環ヘテロアリール」）。ある実施形態では、ヘテロアリール基は、芳香族環系に供給された炭素原子環及び１〜４個のヘテロ原子の環を有する５〜８員環の芳香族環系であり、各ヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される（「５〜８員環ヘテロアリール」）。ある実施形態では、ヘテロアリール基は、芳香族環系に供給された炭素原子環及び１〜４個のヘテロ原子の環を有する５〜６員環の芳香族環系であり、各ヘテロ原子は、窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される（「５〜６員環ヘテロアリール」）。ある実施形態では、５〜６員環のヘテロアリールは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜３個のヘテロ原子の環を有する。ある実施形態では、５〜６員環のヘテロアリールは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜２個のヘテロ原子の環を有する。ある実施形態では、５〜６員環ヘテロアリールは、窒素、酸素及び硫黄から選択される１個のヘテロ原子の環を有する。特に断りがない限り、ヘテロアリール基の各例は、１以上の置換基で独立して選択的に置換され、すなわち、非置換（「非置換ヘテロアリール」）又は置換（「置換ヘテロアリール」）される。ある実施形態では、ヘテロアリール基は、非置換５〜１４員環ヘテロアリールである。ある実施形態では、ヘテロアリール基は、置換５〜１４員環ヘテロアリールである。１個のヘテロ原子を含む例示の５員環ヘテロアリール基は、限定することなく、ピロリル、フラニル及びチオフェニルを含む。２個のヘテロ原子を含む例示の５員環ヘテロアリール基は、限定することなく、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル及びイソチアゾリルを含む。３個のヘテロ原子を含む例示の５員環ヘテロアリール基は、限定することなく、トリアゾリル、オキサジアゾリル及びチアジアゾリルを含む。４個のヘテロ原子を含む例示の５員環ヘテロアリール基は、限定することなく、テトラゾリルを含む。１個のヘテロ原子を含む例示の６員環ヘテロアリール基は、限定することなく、ピリジニルを含む。２個のヘテロ原子を含む例示の６員環ヘテロアリール基は、限定することなく、ピリダジニル、ピリミジニル及びピラジニルを含む。３個又は４個のヘテロ原子を含む例示の６員環ヘテロアリール基は、限定することなく、それぞれトリアジニル及びテトラジニルを含む。１個のヘテロ原子を含む例示の７員環ヘテロアリール基は、限定することなく、アゼピニル、オキセピニル及びチエピニルを含む。２個のヘテロ原子を含む例示の１０員環ヘテロアリール基は、限定することなく、キナゾリニルを含む。
【００４４】
特に断りがない限り、用語「アルキルアリール」又は「アルキル−アリール」は、アリール部分に結合したアルキル部分を意味する。
【００４５】
特に断りがない限り、用語「ハロゲン」及び「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを包含する。
【００４６】
用語「アミノ」は、式：−Ｎ（Ｒｃ）２の部分のことをいい、ここでＲｃの各例は独立してここに記載された置換基であり、又はＲｃの２つの例が接続され、置換若しくは非置換ヘテロシクリルを形成する。ある実施形態では、アミノは、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）である。ある実施形態では、アミノは置換アミノ基であり、Ｒｃの少なくとも一例は水素ではない。
【００４７】
用語「サッカライド基」は、糖部分の任意の原子を介して、例えばアグリコン炭素原子を介して、別の化合物又は原子に共有的に付着した糖類モノラジカルのことをいう。代表的な糖類は、例示として、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、バンコサミン、３−デスメチル−バンコサミン、３−エピ−バンコサミン、４−エピ−バンコサミン、アコサミン、アクチノサミン、ダウノサミン、３−エピ−ダウノサミン、リストサミン、Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、シアル酸、イズロン酸及びＬ−フコースなどのヘキソース、Ｄ−リボース又はＤ−アラビノースなどのペントース、Ｄ−リブロース又はＤ−フルクトースなどのケトース、スクロース、ラクトース、マルトース、２−Ｏ−（α−Ｌ−バンコサミニル）−β−Ｄ−グルコピラノース又は２−Ｏ−（３−デスメチル−α−Ｌ−バンコサミニル）−β−Ｄ−グルコピラノースなどのビスサッカライド、アセタール、アミン、アシル化、硫酸化及びリン酸化糖などの誘導体を含む。この定義を目的として、これらの糖類は従来の三文字命名法を用いて参照され、糖類はそれらの開環した形態又は好ましくはそれらのピラノース形態のいずれかであり得る。
【００４８】
用語「アミノ酸基」は、アミノ酸部分の任意の原子を介して、例えばアミノ若しくはカルボキシル官能基又はリジンの側鎖アミノ基などの側鎖上の任意の官能基を介して、別の化合物又は原子に付着したアミノ酸モノラジカルのことをいう。
【００４９】
特に断りがない限り、化学構造又は部分を説明するように使用される場合、用語「置換された」はその構造又は部分の誘導体のことをいい、その水素原子の１以上が、原子、化学部分又は、これに限定されないが、−ＯＨ、−ＣＨＯ、アルコキシ、アルカノイルオキシ（例えば−ＯＡｃ）、アルケニル、アルキル（例えばメチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル）、アリール、アリールオキシ、ハロ、若しくはハロアルキル（例えば−ＣＣｌ３、−ＣＦ３、−Ｃ（ＣＦ３）３）などの官能基で置換されている。特に断りがない限り、用語「アルコキシ」は−Ｏ−アルキル基を意味する。アルコキシ基の例は、これに限定されないが、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）４ＣＨ３及び−Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３を含む。用語「低級アルコキシ」は、−ＯＣＨ３及び−ＯＣＨ２ＣＨ３などの−Ｏ−（低級アルキル）のことをいう。
【００５０】
特に断りがない限り、一連の名詞の直前にある１以上の形容詞は、名詞の各々に当てはまると解釈されるべきである。例えば、「選択的に置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール又はヘテロアリール」という文言は、「選択的に置換されたアルキル、選択的に置換されたシクロアルキル、選択的に置換されたヘテロシクロアルキル、選択的に置換されたアリール又は選択的に置換されたヘテロアリール」と同じ意味を有する。
【００５１】
本開示は、置換基の上記の例示的な列挙によって限定されることをいかなる態様においても意図しない。
【００５２】
用語「溶媒和物」は、通常は加溶媒分解反応によって溶媒を伴う化合物の形態をいう。この物理的会合は、水素結合を含み得る。従来の溶媒は、水、メタノール、エタノール、酢酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びジエチルエーテルなどを含む。ここに記載される化合物は、例えば、結晶形態で調製されてもよく、溶媒和されてもよい。適切な溶媒和物は、薬学的に許容可能な溶媒和物を含み、さらに化学量論的溶媒和物及び非化学量論的溶媒和物の両方を含む。ある例では、例えば１以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み込まれる場合、溶媒和物は単離が可能となる。「溶媒和物」は、溶液相及び単離可能な溶媒和物の両方を包含する。
【００５３】
同じ分子式を有するがそれらの原子の結合の性質若しくは順序又はそれらの原子の空間配置が異なる化合物は、「異性体」と呼ばれることも理解されるべきである。それらの原子の空間配置が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。
【００５４】
互いに鏡像ではない「立体異性体」は「ジアステレオマー」と呼ばれ、互いに重ね合わせのできない鏡像であるものは「エナンチオマー」と呼ばれる。化合物が不斉中心を有する場合、例えば、４つの異なる基に結合する場合、１対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置によって特徴付けられることができ、カーン及びプレログのＲ−及びＳ−順位則によって又は分子が偏光面を回転する態様によって記述され、又は右旋性若しくは左旋性として（すなわち、それぞれ（＋）若しくは（−）−異性体として）指定される。キラル化合物は、個々のエナンチオマーのどちらかとして、又はそれらの混合物として存在し得る。等割合のエナンチオマーを含む混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００５５】
構造又は構造の一部の立体化学が例えば太線又は破線で示されない場合は、構造又は構造の一部はその全ての立体異性体を包含すると解釈されるべきであることにも留意されたい。同様に、それらの中心の立体化学を特定しない１以上のキラル中心を有する化合物の名称は、純粋な立体異性体及びそれらの混合物を含有する。さらに、未充足な原子価で図面に示されるいずれの原子も、原子価を満たすのに充分な水素原子に付着されているとされる。
【００５６】
本発明の目的のため、窒素などのヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満たして安定部分の形成をもたらすここに記載の水素置換基及び／又は任意の適切な置換基を有し得る。
【００５７】
特に断りがない限り、化合物の「治療上有効量」は、疾患若しくは状態の治療若しくは管理において治療効果を提供し、又は疾患若しくは状態に関連する１以上の症状を遅延若しくは最小化するのに充分な量である。化合物の治療上有効量は、単独又は他の療法との併用で、疾患又は状態の治療又は管理において治療効果を提供する治療剤の量である。用語「治療上有効量」は、療法全体を改善し、疾患若しくは状態の症状若しくは原因を低減若しくは回避し、又は他の治療剤の治療有効性を増強する量を包含し得る。
【００５８】
特に断りがない限り、化合物の「予防上の有効量」は、疾患若しくは状態、又は疾患若しくは状態に関連する１以上の症状を防止し、又はその再発を防止するのに充分な量である。化合物の予防上の有効量は、単独又は他剤との併用で、疾患の予防において予防効果を提供する治療剤の量であることを意味する。用語「予防上の有効量」は、全体的な予防を改善し、又は他の予防剤の予防有効性を増強する量を包含し得る。
【００５９】
特に断りがない限り、用語「治療する／処置する／処理する（ｔｒｅａｔ）」、「治療している／処置している／処理している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療／処置／処理（ｔｒｅａｍｅｎｔ）」は、患者が特定の疾患又は障害を患う間に生じる作用であって、疾患若しくは障害の重症度又はその症状の１以上を軽減し、又は疾患若しくは障害の進行を阻止又は減速する作用を考慮する。
【００６０】
構造又は構造の一部の立体化学が例えば太線又は破線で示されない場合は、構造又は構造の一部はその全ての立体異性体を包含すると解釈されるべきであることにも留意されたい。同様に、それらの中心の立体化学を特定しない１以上のキラル中心を有する化合物の名称は、純粋な立体異性体及びそれらの混合物を含有する。さらに、未充足の原子価で図面に示されるいずれの原子も、原子価を満たすのに充分な水素原子に付着しているとされる。
【００６１】
発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるものの、特定の実施例で説明される数値は可能な限り厳密に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本質的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって検討される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。有効な／効果的な実施例以外においても、明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、いずれの場合においても用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変化し得る近似値である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効数字の数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。
【００６２】
単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」は、そうでないことを文脈が明示しない限り、複数の参照を含むものとしてここに使用される。
【００６３】
２．式（Ｉ）の新規な化合物
本発明は、式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容可能な溶媒和物又は立体異性体を包含する。
【化６】
2021503453.tif 000008
Ａは、選択的に置換される６〜１０員環の不飽和炭素環であり、
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである。
【００６４】
本開示のある実施形態によると、式（Ｉ）において、Ｒ３は、１Ｈ−ピラゾール−３−アミノ、１Ｈ−イミダゾール−２−アミノ又はピリミジン−アミノである。
【００６５】
本開示の更なる実施形態によると、式（Ｉ）において、シクロアルキルアミノ基は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピペラジニル及び４−ピペリドピペリジニルからなる群から選択される。
【００６６】
本開示のある実施形態によると、特定の化合物は式（Ｉ−Ａ）のものであり、
【化７】
2021503453.tif 000009
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである。
【００６７】
式（Ｉ−Ａ）の例示の化合物は、これに限定されないが、以下を含む。
【化８】
2021503453.tif 000010
【表１】
2021503453.tif 000011
【００６８】
本開示のある実施形態によると、特定の化合物は、式（Ｉ−Ｂ）のものである。
【化９】
2021503453.tif 000012
Ｒ１は、ハロ、−ＯＲ、−ＯＡｃ、−ＯＳＯ２Ｒ又は−ＯＣＯＮＨＲで選択的に置換されたアルキルであり、Ｒは水素、アルキル、シクロアルキル又はアリールであり、
Ｒ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ３は、−ＮＲＡＲＢ、−ＮＨＰｈＲＣ、モノ−若しくはビス−サッカライド基又はアミノ酸基であり、又は−ＮＲＡＲＢが統合されて、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、１−置換ピペラジン、１，４´−ビピペリジン、４´−置換４，４´−ビピペリジンからなる群から選択された選択的に置換されるアニリン又はシクロアルキルアミンを形成し、ピペラジン及び４，４´−ビピペリジンにおける置換基がアルキル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｍＮＲＡＲＢであり、
ｎ及びｍは独立して１から５の間の整数であり、
ＲＡ及びＲＢは独立してＨ又はＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲＣは水素、ハロ、アルコキシ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨＣＯＲａ、−ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲａ、又は選択的に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル若しくはアリールであり、ＲａはＣ１−６アルキル又はアリールであり、
Ｒ４及びＲ５は、独立して水素、−ＯＨ、アルコキシ又は−Ｏ（ＣＨ２）ｘＮ（Ｒｂ）２であり、
ｘは１から５の間の整数であり、
ＲｂはＣ１−１０アルキル又はシクロアルキルアミノ基であり、
前記アリール又はヘテロアリールは、Ｃ１−６アルキル、アルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、−ＮＨ２、−ＮＨＲｃ、−Ｎ（Ｒｃ）２、シクロアルキルアミノ、メチレンジオキシ又はエチレンジオキシ基からなる群から選択された少なくとも１つの置換基で選択的に置換され、Ｒｃは独立して水素又はＣ１−１０アルキルである。
【００６９】
式（Ｉ−Ｂ）の例示の化合物は、これに限定されないが、以下を含む。
【化１０】
2021503453.tif 000013
【表２】
2021503453.tif 000014
【００７０】
発明の化合物は、１以上の立体中心を含有するので、エナンチオマーのラセミ混合物又はジアステレオマーの混合物として存在し得る。したがって、本発明は、そのような化合物の立体的に純粋な形態、その他これらの形態の混合物を包含する。立体異性体は、結晶化、クロマトグラフィー、及び分割剤の使用など、標準的な技術を用いて非対称に合成又は分解され得る。ラセミ混合物からエナンチオマーを分離する１つの好適な方法は、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の使用によるものである。あるいは、ラセミのものは、溶媒の存在下で光学的に活性な形態の分割剤と反応することによってそのエナンチオマーに分離され得る。分割剤の光学形態に応じて、２つのエナンチオマーのうちの１つが、高い収率でかつ高い光学的純度で不溶性塩として分離され、他方のエナンチオマーが溶液に残る。
【００７１】
したがって、本発明は、ここに開示される化合物の立体異性体混合物をさらに包含する。それは、ここに開示される化合物の立体配置異性体（例えば、二重結合を伴うか否かにかかわらず、シス異性体及びトランス異性体）も、混合形態又は純粋若しくは実質的に純粋な形態のいずれかにおいて、包含する。
【００７２】
３．使用方法
本発明は、癌を有する被検体の治療又は予防のための方法を包含する。方法は、癌の増殖を抑制するように、治療上又は予防上の有効量の本開示の式（Ｉ）の化合物を被検体に投与するステップを具備する。
【００７３】
ある実施形態では、方法は、被検体に式（Ｉ）の化合物の投与前、投与時又は投与後に化学療法剤を投与するステップをさらに含む。化学療法剤は、ＤＥＴ、ＰＬＸ４０３２、ドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、オキサリプラチン、ベツリン酸、４−Ｓ−システアミニルカテコール、４−Ｓ−システアミニルフェノール、エベロリムス、ボルテゾミブ、カルボプラチン、ダカルバジン、セレコキシブ、テモゾロミド、ソラフェニブ、サリドマイド、レナリドマイド、バルプロ酸、ビンブラスチン、メシル酸イマチニブ、ボセンタン、アポミン、三酸化ヒ素、カルムスチン、ラムブロリズマ、抗ＣＴＬＡ−４剤、抗プログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）剤、イピリムマブ、トレメリムマブ、ドキソルビシン、ＭＥＫ阻害剤、カペシタビン、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤及びタモキシフェンからなる群から選択され得る。
【００７４】
本開示では、癌は、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、多発性骨髄腫、ウィルムス腫瘍、骨腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、精巣癌、甲状腺癌、前立腺癌、咽頭癌、子宮頸癌、鼻咽頭癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、食道癌、直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、脳癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌又はＣＮＳ新生物のいずれかであり得る。好ましい一実施形態によれば、式（Ｉ）の本化合物によって治療可能な癌は、小細胞肺癌である。他の好ましい実施形態によれば、式（Ｉ）の本化合物によって治療可能な癌は、急性リンパ芽球性白血病である。
【００７５】
式（Ｉ）の化合物の量、投与経路及び投薬スケジュールは、治療、予防又は管理される具体的な適応症並びに患者の年齢、性別及び状態などの要因に依存することになる。そのような要因が担う役割は、当技術分野において周知であり、日常的な実験によって対応され得る。
【００７６】
４．薬学的製剤
本発明は、癌の治療又は予防のための薬学的組成物を包含する。薬学的組成物は、本発明の式（Ｉ）の化合物の治療上又は予防上の有効量を具備する。
【００７７】
式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として、およそ０．１重量％から９９重量％のレベルで存在する。ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として、少なくとも１重量％のレベルで存在する。ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として、少なくとも５重量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として、少なくとも１０重量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、薬学的組成物の総重量を基準として、少なくとも２５重量％のレベルで存在する。
【００７８】
ある好ましい実施形態では、薬学的組成物は、化学療法剤をさらに具備する。化学療法剤は、ＤＥＴ、ＰＬＸ４０３２、ドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、オキサリプラチン、ベツリン酸、４−Ｓ−システアミニルカテコール、４−Ｓ−システアミニルフェノール、エベロリムス、ボルテゾミブ、カルボプラチン、ダカルバジン、セレコキシブ、テモゾロミド、ソラフェニブ、サリドマイド、レナリドマイド、バルプロ酸、ビンブラスチン、メシル酸イマチニブ、ボセンタン、アポミン、三酸化ヒ素、カルムスチン、ラムブロリズマ、抗ＣＴＬＡ−４剤、抗プログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）剤、イピリムマブ、トレメリムマブ、ドキソルビシン、ＭＥＫ阻害剤、カペシタビン、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤及びタモキシフェンからなる群から選択され得る。
【００７９】
ある薬学的組成物は、患者への、経口、粘膜（例えば、経鼻、舌下、経膣、口腔又は直腸）、非経口（例えば、皮下、静脈内、ボーラス注入、筋肉内又は動脈内）又は経皮投与に適した１回分の単位投与形態である。投与形態の例は、これに限定されないが、錠剤、カプレット、軟質ゼラチンカプセルなどのカプセル、サシェ、トローチ、甘味入りの錠剤、ディスパージョン、座剤、軟膏、パップ剤（湿布）、ペースト、粉末、包帯、クリーム、石膏、溶液、パッチ、エアロゾル（例えば、点鼻薬又は吸入器）、ゲル、患者への経口又は粘膜投与に適した懸濁液（例えば、水性若しくは非水性液体懸濁液、水中油型乳濁液又は油中水型乳濁液）、溶液及びエリキシル剤を含む液体投与形態、患者への非経口投与に適した液体投与形態並びに患者への非経口投与に適した液体投与形態を提供するように再構成することができる滅菌固体（例えば、結晶性又はアモルファス固体）を含む。
【００８０】
製剤は、投与の様式に適合するべきである。例えば、経口投与は、本発明の化合物を胃腸管内での分解から保護するために腸溶コーティングを必要とする。同様に、製剤は、作用部位への活性成分の送達を容易にする成分を含み得る。例えば、化合物は、分解酵素から保護し、循環系における輸送を促進し、細胞膜を介した細胞内部位への送達を果たすために、リポソーム製剤で投与され得る。
【００８１】
同様に、難溶性化合物は、これに限定されないが、シクロデキストリン（例えば、α−シクロデキストリン又はβ−シクロデキストリン）並びに、これに限定されないが、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、生体適合性油（例えば、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びごま油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステルなどの非水性溶媒及びそれらの混合物（例えば、ＤＭＳＯ：コーン油）、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）及びＰＥＧ−２０００などの脂質などの可溶化剤、乳化剤及び界面活性剤の助力を得て、液体投与形態（及び再構成に適した投与形態）に組み込まれ得る。好ましい一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物（すなわち、ＢＯ−２５９０）は、脂質に組み込まれて経口又は非経口投与に適したリポソームを形成する。
【００８２】
投与形態の組成、形状及びタイプは、その用途に応じて変化する。例えば、疾患の急性治療に用いられる投与形態は、それが具備する活性成分の１以上を、同じ疾患の慢性治療に用いられる投与形態よりも大量に含み得る。同様に、非経口投与形態は、それが具備する活性成分の１以上を、同じ疾患を治療するのに用いられる経口投与形態よりも少量に含み得る。本発明に包含される具体的な投与形態が互いに異なるこれら及び他の方法は、当業者には容易に明らかとなる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９９０）を参照。
【００８３】
４．１  経口投与形態
経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、これに限定されないが、錠剤（例えば、チュアブルタブレット）、カプレット、カプセル及び液体（例えば、フレーバードシロップ）などの個別投与形態として提示することができる。そのような投与形態は、所定量の活性成分を含み、当業者に周知の調剤方法により調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９９０）を参照。
【００８４】
標準的な経口投与形態は、従来の薬学的配合技術に従って、活性成分を少なくとも１つの賦形剤との密な混合物で混合することにより調製される。賦形剤は、投与に望ましい調製の形態に応じて、様々な形態をとることができる。
【００８５】
それらの投与の容易さのため、錠剤及びカプセルは、最も有利な経口投与単位形態を代表する。所望であれば、錠剤は、標準的な水性又は非水性技術によってコーティングすることができる。そのような投与形態は、従来の調剤方法によって調製することができる。一般に、薬学的組成物及び投与形態は、活性成分を液体担体、微粉固体担体又はその両方と均一かつ密接に混合し、その後必要に応じて製品を所望の形態に成形することによって調製される。崩壊剤は、迅速な溶解を容易にするように固体投与形態に組み込まれ得る。潤滑剤も、投与形態（例えば、錠剤）の製造を容易にするように組み込まれ得る。
【００８６】
４．２  非経口投与形態
非経口投与形態は、これに限定されないが、皮下、静脈内（ボーラス注入を含む）、筋肉内及び動脈内を含む様々な経路によって患者に投与され得る。それらの投与は通常、汚染物質に対する患者の自然防御を迂回するため、非経口投与形態は、明確に無菌であり、又は患者への投与前に滅菌することが可能である。非経口投与形態の例は、これに限定されないが、注入ために準備された溶液、薬学的に許容可能な注入用ビヒクルに溶解又は懸濁されるように準備された乾燥製品、注入のため準備された懸濁液及び乳濁液を含む。
【００８７】
本発明の非経口投与形態を提供するのに使用され得る適切なビヒクルは、当業者に周知である。例は、これに限定されないが、水、これに限定されないが、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液及びデキストロースなどの水性ビヒクル、これに限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールなどの水混和性ビヒクル並びに、これに限定されないが、脂質、コーン油、綿実油、落花生油、ごま油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び安息香酸ベンジルなどの非水性ビヒクルを含む。
【００８８】
４．３  経皮、局所及び粘膜投与形態
経皮、局所及び粘膜投与形態は、これに限定されないが、点眼液、スプレー、エアロゾル、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、溶液、乳濁液、懸濁液又は当業者に公知の他の形態を含む。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄｓ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９９０）参照。経皮投与形態は、所望量の活性成分の浸透を可能にするように皮膚に貼附して具体的な期間着用することができる「リザーバ型」又は「マトリックス型」パッチを含む。
【００８９】
経皮、局所及び粘膜投与形態を提供するために使用できる適切な賦形剤（例えば、担体及び希釈剤）及び他の材料は、製薬業界の当業者に周知であり、所与の薬学的組成物又は投与形態が適用される特有の組織に依存する。
【００９０】
治療される具体的な組織に応じて、本発明の活性成分での治療に先行して、それと併せて、又はその後に続けて、追加の成分を使用し得る。例えば、活性成分を組織に送達するのを介助するように浸透促進剤を使用し得る。
【００９１】
薬学的組成物若しくは投与形態のｐＨ又は薬学的組成物若しくは投与形態が適用される組織のｐＨもまた、１以上の活性成分の送達を改善するように調整され得る。同様に、溶媒担体の極性、そのイオン強度又は張性は、送達を改善するように調整され得る。ステアリン酸塩などの化合物もまた、１以上の活性成分の親水性又は親油性を有利に変更して送達を改善するように薬学的組成物又は投与形態に添加され得る。これに関して、ステアリン酸塩は、製剤の脂質ビヒクルとして、乳化剤又は界面活性剤として及び送達増強又は浸透増強剤として役立ち得る。活性成分の異なる塩、水和物又は溶媒和物は、結果として生じる組成物の特性をさらに調整するのに使用され得る。
【００９２】
５．  キット
被検体における癌の治療又は予防に有用なキットもまた、本開示に包含される。
【００９３】
本開示によるキットは、式（Ｉ）の本化合物を格納する第１の容器、上記の化学療法剤を格納する第２の容器及びキットの使用方法をユーザに説明するキットに関連する説明文を少なくとも含む。説明文は、パンフレット、テープ、ＣＤ、ＶＣＤ又はＤＶＤの形態であり得る。容器の例は、これに限定されないが、バイアル及びチューブなどを含む。
【００９４】
ここで、限定ではなく例証を目的として提供される以下の実施形態を参照して、本発明をより具体的に説明する。それらは標準的に使用され得るものであるが、当業者に公知の他の手順、方法論又は技術が代替的に使用されてもよい。
【実施例】
【００９５】
材料及び方法
細胞培養
本検討において使用される各種の細胞を、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充された製造者推奨培地において、加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で成長させた。
【００９６】
動物
動物実験が、Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインに従って許可され、取り扱われた。
【００９７】
ｎｕ／ｎｕ遺伝子を保持する無胸腺ヌードマウスを国家実験動物センター（台湾、台北）から取得した。雄のヌードマウス（６週齢以上で体重２０〜２４ｇ以上）を全てのヒト腫瘍異種移植に使用した。試験化合物を、尾静脈を介して静脈内投与した。腫瘍体積をキャリパーで長さ×幅×高さ（又は幅）を計測することによって測定した。試験化合物に使用されたビヒクルは、通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ等張液）であった。実験の過程における腫瘍付与ヌードマウスについて、％体重変化とは、（読取り日における総体重／処置開始日における総体重）×１００をいう。
【実施例１】
【００９８】
実施例１  １，２−ビス（ヒドロキシメチル）ピロロ［２，１−ａ］−フタラジン−フタラジン誘導体（式（Ｉ−Ａ））の化学合成（手法１）
式（Ｉ−Ａ）の化合物を手法１に記載される手順によって合成した。商業的に入手可能な１−フタラジノン１９をオキシ塩化リンで処理して化合物２０を与え、それをさらにエタノールにおいて各種ω−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアルキルアミン、環状アミン、アニリン、１−メチルピペラジン、１−エチルピペラジン、１−メチル−４，４´−ビピペリジン、又は１−エチル−４，４´−ビピペリジンで処理して化合物２１を得た。そして、化合物２１をジクロロメタンにおいてトリメチル−シリルシアニド（ＴＭＳＣＮ）及びアルキル又はアリールクロライドと反応させて化合物２２を得て、それをエーテル中でテトラフルオロホウ酸（ＨＢＦ４）と、その後にアセチレンジカルボン酸ジメチル（ＤＭＡＤ）によって処理してヒドロフルオロホウ酸塩に変換し、ジエステル誘導体２３を与えた。２３のジエステル官能基を、氷槽内でエーテル／ＣＨ２Ｃｌ２の混合物においてＬｉＡｌＨ４と反応させることによって対応のビス（ヒドロキシメチル）誘導体２４に還元した。同様に、ビス（ヒドロキシメチル）誘導体２４を、各種イソシアネートと反応させて化合物２５（Ｒ１は−ＣＨ２ＯＣＯＮＨＲであり、Ｒはアルキル又はアリールである）を与え、若しくはピリジンにおいて酸無水物で処理して化合物２５（Ｒ１は−ＣＨ２ＯＣＯＲである）を与えることによって、又はトルエン若しくはメタンスルホニルクロライド／Ｅｔ３Ｎと反応させて化合物２５（Ｒ１は−ＣＨ２ＯＳＯ２Ｒであり、ＲはＭｅ又は４−ＭｅＰｈである）を与えることによって、それらの対応のビス（アルキルカルバメート）同族体及び他の良好な脱離基に変換した。
【００９９】
手法１
【化１１】
2021503453.tif 000015
【０１００】
それにより得られた式（Ｉ−Ａ）の例示の化合物は、以下を含む。
【化１２】
2021503453.tif 000016
【表３】
2021503453.tif 000017
【０１０１】
１．１  （３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）−ジメタノール（ＢＯ−２５７１）及び（３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２５７３）
（１）１−クロロフタラジン
商業的に入手可能なフタラジン−１（２Ｈ）−オン（５．０ｇ、３４．０ｍｍｏｌ）及びオキシ塩化リン（ＰＯＣｌ３）（２５ｍＬ）の混合物を１００℃で２時間撹拌しながら加熱した。室温に冷却した後、過剰なＰＯＣｌ３を減圧下で完全に蒸留除去した。残留物をトルエン（２×２５ｍＬ）及びその後にＴＨＦ（１００ｍＬ）で練和し、固体生成物を濾過によって収集してＴＨＦで洗浄した。そして、生成物をＤＣＭに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムを介して乾燥し、減圧下で蒸発させて１−クロロフタラジンを与えた。収量４．６ｇ（８２％）、融点１１９〜１２１℃（ｌｉｔ．３３融点１３２〜１３４℃）。
【０１０２】
1H NMR (DMSO-d6) δ 8.20 (2H, t, J = 7.2 Hz, ArH), 8.33 (2H, t, J = 7.6 Hz, ArH), 9.73 (1H, s, ArH).
【０１０３】
13C NMR (DMSO-d6) δ 126.1, 128.4, 128.7, 155.3. HRMS [ESI+]: calculated for C8H5ClN2, 165.0220 [M+H]+, found 165.0212.
【０１０４】
（２）４−（フタラジン−１−イル）モルホリン
トリエチルアミン（６．９６ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（１２０ｍＬ）における１−クロロフタラジン（３．６４ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、モルホリン（１．８９ｍＬ、２２．０ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。反応混合物を１８時間還流で加熱し、溶媒を減圧下で乾燥するまで除去した。反応物を室温まで冷却し、溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物を水で希釈して、ＤＣＭで２回抽出した。分離された有機層を硫酸ナトリウムを介して乾燥させ、真空下で蒸発させて４−（フタラジン−１−イル）モルホリンを与えた。褐色の固体、収量３．８ｇ（８０％）、融点１２５〜１２７℃（ｌｉｔ．４３融点８２℃）。
【０１０５】
1H NMR (DMSO-d6) δ 3.40 (4H, t, J = 4.8 Hz, 2 × CH2), 3.88 (4H, t, J = 4.4 Hz, 2 × CH2), 7.94-7.97 (2H, m, ArH), 8.09-8.14 (2H, m, ArH), 9.31 (1H, s, ArH).
【０１０６】
13C NMR (DMSO-d6) δ 51.4, 51.7, 66.5, 120.7, 124.4, 124.5, 127.5, 128.5, 132.4, 132.5, 148.4, 159.7. HRMS [ESI+]: calculated for C12H13N3O, 216.1137 [M+H]+, found 216.1094.
【０１０７】
（３）２−アセチル−４−モルホリノ−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリル
触媒量のＡｌＣｌ３を含有するＤＣＭ（３０ｍＬ）における４−（フタラジン−１−イル）モルホリン（２．０ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｍｅ３ＳｉＣＮ（２．３２ｍＬ、１８．６ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。そして、アセチルクロライド（１．０ｍＬ、１４．０ｍｍｏｌ）を上記混合物に滴下して添加し、室温で４時間撹拌した。反応混合物を氷水に注ぎ、有機層を水、５％ＮａＯＨ溶液、そして水で上手く洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムを介して乾燥し、真空中で濃縮して２−アセチル−４−モルホリノ−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリルを与えた。収量２．３６ｇ（８９％）、融点１４０〜１４２℃。
【０１０８】
1H NMR (CDCl3) δ 2.32 (3H, s, CH3), 3.13-3.18 (2H, m, CH2), 3.44-3.49 (2H, m, CH2), 3.81-3.86 (2H, m, CH2), 3.94-3.99 (2H, m, CH2), 6.70 (1H, s, CH), 7.43 (1H, d, J = 7.6 Hz, ArH), 7.51-7.59 (3H, m, ArH).
【０１０９】
13C NMR (CDCl3) δ 16.9, 49.8, 55.8, 66.7, 116.4, 121.5, 124.0, 123.7, 129.2, 130.3, 132.8,155.5, 169.6. HRMS [ESI+]: calculated for C15H16N4O2, 285.1352 [M+H]+, found 285.1341.
【０１１０】
（４）ジメチル−３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート
温酢酸（５０ｍＬ）における２−アセチル−４−モルホリノ−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリル（２．０ｇ、７．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＦ４（１．５５ｍＬ）を滴下して添加した。混合物を５０〜６０℃で３０分間撹拌させた。室温に冷却後、濾過によって黄色固体の塩を収集し、濾過ケークを乾燥エーテルで洗浄した。固体塩をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＤ（１．６ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）をこの溶液に徐々に添加した。反応混合物を９０〜１００℃で１６時間加熱した。溶媒を真空中で蒸発によって除去した。残留物をＭｅＯＨから結晶化してジメチル−３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレートを与えた。収量１．５ｇ（５６％）、融点１８２〜１８３℃。
【０１１１】
1H NMR (DMSO-d6) δ 2.64 (3H, s, CH3), 3.30-3.31 (4H, m, 2 × CH2), 3.80 (3H, s, COOCH3), 3.87 (3H, s, COOCH3), 3.87-3.88 (4H, m, 2 × CH2), 7.64 (1H, t, J = 8.0 Hz, ArH), 7.81 (1H, t, J = 7.5 Hz, ArH), 8.06 (1H, d, J = 8.0 Hz, ArH), 8.25 (1H, d, J = 8.5 Hz, ArH).
【０１１２】
13C NMR (DMSO-d6) δ 13.9, 52.4, 52.7, 55.6, 66.2, 106.7, 115.8, 117.7, 121.0, 124.6, 126.7, 128.9, 130.3, 133.0, 156.2, 159.7, 165.6, 165.9; HRMS [ESI+]: calculated for C20H21N3O5, 406.1379 [M+Na]+, found 406.1385.
【０１１３】
（５）ジメチル−３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート
温酢酸（５０ｍＬ）におけるジメチル−３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート（２．０ｇ、７．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＦ４（１．５５ｍＬ）を滴下して添加した。混合物を５０〜６０℃で３０分間撹拌させた。室温に冷却後、濾過によって黄色固体の塩を収集し、濾過ケークを乾燥エーテルで洗浄した。固体塩をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＤ（１．６ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）をこの溶液に徐々に添加した。反応混合物を９０〜１００℃で１６時間加熱した。溶媒を真空中で蒸発によって除去した。残留物をＭｅＯＨから結晶化してジメチル−３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレートを与えた。収量１．５ｇ（５６％）、融点１８２〜１８３℃。
【０１１４】
1H NMR (DMSO-d6) δ 2.64 (3H, s, CH3), 3.30-3.31 (4H, m, 2 × CH2), 3.80 (3H, s, COOCH3), 3.87 (3H, s, COOCH3), 3.87-3.88 (4H, m, 2 × CH2), 7.64 (1H, t, J = 8.0 Hz, ArH), 7.81 (1H, t, J = 7.5 Hz, ArH), 8.06 (1H, d, J = 8.0 Hz, ArH), 8.25 (1H, d, J = 8.5 Hz, ArH).
【０１１５】
13C NMR (DMSO-d6) δ 13.9, 52.4, 52.7, 55.6, 66.2, 106.7, 115.8, 117.7, 121.0, 124.6, 126.7, 128.9, 130.3, 133.0, 156.2, 159.7, 165.6, 165.9; HRMS [ESI+]: calculated for C20H21N3O5, 406.1379 [M+Na]+, found 406.1385.
【０１１６】
（６）（３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２５７１）
ＤＣＭ（５０ｍＬ）におけるジメチル−３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート（１．５ｇ、３．９ｍｍｏｌ）の溶液を、０〜５℃のジエチルエーテル（２０ｍＬ）におけるＬＡＨ（０．３７ｇ、９．７ｍｍｏｌ）の撹拌された懸濁液に滴下して添加した。２時間後の反応の完了後に、過剰なＬＡＨを水（２ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（２ｍＬ）の添加によって分解した。反応混合物をセライトのパッドを介して濾過し、ＤＣＭで充分に洗浄した。混合された濾液及び洗浄物を乾燥するまで真空中で蒸発させた。残留物をエタノールから再結晶化して（３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２５７１）を与えた。収量１．０ｇ（８０％）、融点１８４〜１８６℃。
【０１１７】
1H NMR (DMSO-d6) δ 2.46 (3H, s, CH3), 3.23 (4H, s, 2 × CH2), 3.87 (4H, s, 2 × CH2), 4.58 (3H, s, 1 × OCH2 and 1 × OH), 4.78-4.83 (3H, m, 1 × OCH2 and 1 × OH), 7.45 (1H, t, J = 7.5 Hz, ArH), 7.73 (1H, t, J = 7.5 Hz, ArH), 7.97 (1H, d, J = 8.0 Hz, ArH), 8.29 (1H, d, J = 7.5 Hz, ArH).
【０１１８】
13C NMR (DMSO-d6) δ 9.3, 51.9, 53.8, 54.4, 66.5, 114.4, 115.7, 118.3, 121.6, 123.2, 123.6, 125.3, 126.0, 130.2, 132.3, 154.1. HRMS [ESI+]: calculated for C18H21N3O3, 310.1556 [M+H-H2O]+, found 310.1569.
【０１１９】
（７）（３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２５７３）
乾燥ＤＭＦにおける（３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（０．１５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．２５ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）及びエチルイソシアネート（０．１５ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン下の室温で２４〜４８時間撹拌した。反応の完了後、反応混合物を真空中で乾燥するまで蒸発させた。残留物をエーテルで練和し、所望の生成物を濾過によって収集して（３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２５７３）を与えた。収量０．１６ｇ（７５％）、融点１７１〜１７３℃。
【０１２０】
1H NMR (DMSO-d6) δ 0.97 (6H, t, J = 6.5 Hz, 2 × CH3), 2.46 (3H, s, CH3), 2.97-2.98 (4H, m, 2 × CH2), 3.22 (4H, s, 2 × CH2), 3.85 (4H, s, 2 × CH2), 5.17 (2H, s, OCH2), 5.38 (2H, s, OCH2), 7.01 (2H, brs, 2 × NH), 7.49 (1H, t, J = 7.5 Hz, ArH), 7.76 (1H, t, J = 7.0 Hz, ArH), 7.99 (1H, d, J = 8.0 Hz, ArH), 8.10 (1H, d, J = 7.0 Hz, ArH).
【０１２１】
13C NMR (DMSO-d6) δ 9.35, 15.5, 35.4, 51.9, 56.5, 57.3, 66.4, 109.5, 116.1, 117.6, 119.2, 122.9, 125.2, 126.2, 129.6, 132.7, 154.6, 156.5, 156.6. HRMS [ESI+]: calculated for C24H31N5O5, 294.1606 [M+H-2(OCONHC2H5)]+, found 294.1602.
【０１２２】
１．２  （３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２６８６）及び（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２７１６）
（１）１−（ピロリジン−１−イル）フタラジン
ピロリジン（２０．０ｍＬ、２４０．０ｍｍｏｌ）を、ＴＥＡ（３０．０ｍＬ、２００．０ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（２００ｍＬ）において１−クロロフタラジン（１０．０ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）の溶液に徐々に添加した。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。反応の完了後、溶媒を蒸発させ、残留物を水で希釈してからＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムを介して乾燥し、真空中で蒸発させて所望の生成物１−（ピロリジン−１−イル）フタラジンを与えた。収量１０．０ｇ（８３％）、融点９０〜９１℃。
【０１２３】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1H NMR (DMSO-d6) δ 1.95-1.98 (4H, m, 2 × CH2), 3.82 (4H, t, J = 6.5 Hz, 2 × CH2), 7.80-7.88 (2H, m, ArH), 7.94-7.95 (1H, m, ArH), 8.28 (1H, d, J = 8.5 Hz, ArH), 8.97 (1H, s, ArH).
【０１２４】
13C NMR (DMSO-d6) δ 25.8, 51.1, 119.2, 125.2, 126.5, 128.7,  130.9, 131.6, 144.1, 155.7. HRMS [ESI+]: calculated for C12H13N3, 200.1188 [M+H]+, found 200.1209.
【０１２５】
（２）２−アセチル−４−（ピロリジン−１−イル）−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリル
触媒量のＡｌＣｌ３を含有するＤＣＭ（３０ｍＬ）における１−（ピロリジン−１−イル）フタラジン（５．０ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｍｅ３ＳｉＣＮ（６．３ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。そして、アセチルクロライド（２．７ｍＬ、３７．５ｍｍｏｌ）を上記混合物に滴下して添加し、室温で４時間撹拌した。反応混合物を氷水に注ぎ、有機層を水、５％ＮａＯＨ溶液、そして水で上手く洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムを介して乾燥し、真空中で濃縮して２−アセチル−４−（ピロリジン−１−イル）−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリルを与えた。収量５．７ｇ（８５％）、融点１２３〜１２５℃。
【０１２６】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.83 (2H, t, J = 6.8 Hz, CH2) 2.00 (2H, s, CH2), 2.21 (3H, s, CH3), 3.28-3.34 (2H, m, CH2), 3.70-3.75 (2H, m, CH2), 7.06 (1H, s, CH), 7.59-7.66 ( 2H, m, ArH), 7.81 (2H, d, J = 7.4 Hz, ArH).
【０１２７】
13C NMR (DMSO-d6) δ 20.8, 25.3,49.8, 116.9, 122.7, 126.7, 127.3, 129.7, 130.4, 132.3, 153.5, 170.8. HRMS [ESI+]: calculated for C15H16N4O, 269.1402 [M+H]+, found 269.1416.
【０１２８】
（３）ジメチル−３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート
温酢酸（５０ｍＬ）における２−アセチル−４−（ピロリジン−１−イル）−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリル（５．０ｇ、１８．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＦ４（３．６ｍＬ）を滴下して添加した。混合物を５０〜６０℃で３０分間撹拌させた。室温に冷却後、濾過によって黄色固体の塩を収集し、濾過ケークを乾燥エーテルで洗浄した。固体塩をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＤ（４．５ｍＬ、３７．０ｍｍｏｌ）をこの溶液に徐々に添加した。反応混合物を９０〜１００℃で１６時間加熱した。溶媒を真空中で蒸発によって除去した。残留物をＭｅＯＨから結晶化してジメチル−３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレートを与えた。収量２．５ｇ（４８％）、融点１７６〜１７８℃。
【０１２９】
1H NMR (DMSO-d6) 1.92 (4H, s, 2 × CH2), 2.57 (3H, s, CH3), 3.65 (4H, s, 2 × CH2), 3.78 (3H, s, COOCH3), 3.86 (3H, s, COOCH3), 7.55 (1H, t, J = 7.7 Hz, ArH), 7.73 (1H, t, J = 7.7 Hz, ArH), 8.14 (1H, d, J = 8.2 Hz, ArH), 8.20 (1H d, J = 8.1 Hz, ArH).
【０１３０】
13C NMR (DMSO-d6) δ 10.5,  25.7, 51.3, 51.9, 52.7, 106.7, 111.7, 117.8, 120.1, 123.0, 127.4, 127.7, 128.1, 129.4, 132.4, 153.7, 165.0, 167.3. HRMS [ESI+]: calculated for C20H21N3O4, 368.1610 [M+H]+, found 368.1581.
【０１３１】
（４）（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２６８６）
ＤＣＭ（５０ｍＬ）におけるジメチル−３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート（２．２ｇ、６．２３ｍｍｏｌ）の溶液を、０〜５℃のジエチルエーテル（５０ｍＬ）におけるＬＡＨ（０．６ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）の撹拌された懸濁液に滴下して添加した。２時間後の反応の完了後に、過剰なＬＡＨを水（２ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（２ｍＬ）の添加によって分解した。反応混合物をセライトのパッドを介して濾過し、ＤＣＭで充分に洗浄した。混合された濾液及び洗浄物を乾燥するまで真空中で蒸発させた。残留物をエタノールから再結晶化して（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２６８６）を与えた。収量１．６ｇ（８３％）、融点１６０〜１６２℃。
【０１３２】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.94 (4H t, J = 6.5 Hz, 2 × CH2), 2.42 (3H,  s, CH3), 3.58 (4H , t, J = 6.4 Hz, 2 × CH2), 4.51-4.56 (3H, m, 1 × OH and 1 × OCH2), 4.72 (1H, t, J = 5.2 Hz, OH), 4.80 (2H, d, J = 5.1 Hz, OCH2), 7.38-7.41 (1H,  m, ArH), 7.68-7.71 (1H, m, ArH), 8.05 (1H, d, J = 8.1 Hz, ArH), 8.26 (1H, d, J = 8.0 Hz, ArH).
【０１３３】
13C NMR (DMSO-d6) δ 9.3, 25.3, 51.3, 53.8, 54.5, 113.8, 116.6, 117.9, 120.8, 122.4, 123.3, 124.7, 126.7, 130.3, 131.8, 152.5. HRMS [ESI+]: calculated for C18H21N3O2 294.1606 [M+H-H2O]+, found 294.1627.
【０１３４】
（５）（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２７１６）
乾燥ＤＭＦにおける（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（０．１５ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、（０．１６ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、エチルイソシアネート（０．２ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（３．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン下の室温で２４〜４８時間撹拌した。反応の完了後、反応混合物を真空中で乾燥するまで蒸発させた。残留物をエーテルで練和し、所望の生成物を濾過によって収集して（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２７１６）を与えた。収量０．１３ｇ（７０％）、融点１４０〜１４２℃。
【０１３５】
1H NMR (DMSO-d6) δ 0.96-0.99 (6H, m, 2 × CH3), 1.93 (4H, t, J = 6.5 Hz, 2 × CH2), 2.43 (3H, s, CH3), 2.96-3.00 (4H, m, 2 × CH2), 3.60 (4H, s, 2 × CH2), 5.15 (2H, s, OCH2), 5.36 (2H, s, OCH2), 6.98-7.03 (2H, m, 2 × NH), 7.46 (1H, t, J = 7.3 Hz, ArH), 7.72 (1H, t, J = 7.3 Hz, ArH), 8.06 (1H, d, J = 8.4 Hz, ArH), 8.10 (1H, d, J = 8.2 Hz, ArH).
【０１３６】
13C NMR (DMSO-d6) δ 9.3, 15.5, 25.4, 35.5, 51.3, 56.6, 57.5, 108.8, 116.8, 117.0, 118.8, 122.6, 125.6, 127.1, 129.7, 132.2, 152.9, 156.6, 156.7. HRMS [ESI+]: calculated for C24H31N5O4, 278.1657 [M+H-2(OCONHC2H5)]+, found 278.1660.
【０１３７】
１．３  （６−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）−３−メチルピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２５９０）
（１）１−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）フタラジン
１，４´−ビピペリジン（２０．０ｇ、１２０．０ｍｍｏｌ）を、ＴＥＡ（３４ｍＬ、２４０．０ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（２００ｍＬ）において１−クロロフタラジン（１０．０ｇ、６０．０ｍｍｏｌ）の溶液に徐々に添加した。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。反応の完了後、溶媒を蒸発させ、残留物を水で希釈してからＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウムを介して乾燥し、真空中で蒸発させて所望の生成物１−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）フタラジンを与えた。収量１０．２ｇ（５７％）、融点１４０〜１４２℃。
【０１３８】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.37-1.42 (2H, m, CH2), 1.48-1.53 (4H, m, CH2), 1.75-1.81 (2H, m, CH2), 1.88-1.91 (2H, m, CH2), 2.43 (1H, s, CH), 2.57 (4H, s, 2 × CH2), 2.94-3.00 (2H, m, CH2), 3.87-3.90 (2H, m, CH2), 7.92-7.94 (2H, m, ArH), 8.04-8.06 (2H, m, ArH), 9.25 (1H, s, ArH). HRMS [ESI+]: calculated for C18H24N4, 297.2079 [M+H]+, found 297.2092.
【０１３９】
（２）４−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）−２−アセチル−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリル
触媒量のＡｌＣｌ３を含有するＤＣＭ（３０ｍＬ）における１−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）フタラジン（２．０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｍｅ３ＳｉＣＮ（１．６９ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。そして、アセチルクロライド（０．８８ｍＬ、１０．０ｍｍｏｌ）を上記混合物に滴下して添加し、室温で４時間撹拌した。反応混合物を氷水に注ぎ、有機層を水、５％ＮａＯＨ溶液、そして水で上手く洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムを介して乾燥し、真空中で濃縮して４−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）−２−アセチル−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリルを与えた。収量１．４５ｇ（６０％）、融点１６０〜１６２℃。
【０１４０】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.42-1.45 (1H, m, CH2), 1.70-1.82 (6H, m, 3 × CH2), 2.10-2.26 (6H, m, 3 × CH2), 2.65 (3H, s, CH3), 2.66-2.73 (1H, m, CH), 2.95-3.00 (3H, m, CH2), 3.76 (1H, d, J = 7.0 Hz, CH2), 3.88 (1H, d, J = 4.5 Hz, CH2), 7.00 (1H, s, CH), 7.61-7.69 (3H, m, ArH ), 7.82 (1H, d, J = 7.2 Hz, ArH). HRMS [ESI+]: calculated for C21H27N5O, 366.2294 [M+H]+, found 366.2308.
【０１４１】
（３）ジメチル−６−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）−３−メチルピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート
温酢酸（５０ｍＬ）における４−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）−２−アセチル−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリル（１．３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＦ４（０．７ｍＬ）を滴下して添加した。混合物を５０〜６０℃で３０分間撹拌させた。室温に冷却後、濾過によって黄色固体の塩を収集し、濾過ケークを乾燥エーテルで洗浄した。固体塩をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＤ（０．８ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）をこの溶液に徐々に添加した。反応混合物を９０〜１００℃で１６時間加熱した。溶媒を真空中で蒸発によって除去した。残留物をＭｅＯＨから結晶化してジメチル−６−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）−３−メチルピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレートを与えた。収量１．０ｇ（７０％）、融点１８９〜１９１℃。
【０１４２】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.43-1.46 (3H, m, CH2), 1.68-1.72 (2H, m, CH2), 1.88 (2H, s, CH2), 2.02-2.04 (2H, m, CH2), 2.14-2.16 (2H, m, CH2), 2.65 (3H, s, CH3), 3.01 (4H, m, 2 × CH2), 3.17 (1H, s, CH), 3. 49-3.51 (3H, m, CH2), 3.81 (3H, s, COOCH3), 3.86-3.88 (2H, m, CH2), 3.89 (3H, s, COOCH3), 7.66 (1H, t, J = 8.0 Hz,  ArH), 7.83 (1H, t, J = 7.2 Hz, ArH ), 8.00 (1H, d, J = 8.4 Hz, ArH), 8.27 (1H, d, J = 8.4 Hz, ArH).
【０１４３】
13C NMR (DMSO-d6) δ 12.6, 24.5, 26.2, 28.1, 50.4, 51.5, 58.2, 58.9, 67.5, 70.4, 111.6, 118.1, 123.4, 127.6, 128.5, 129.8, 132.8, 133.5, 147.4, 165.9, 175.7. HRMS [ESI+]: calculated for C26H32N4O4, 465.2502 [M+H]+, found 465.2501.
【０１４４】
（４）（６−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）−３−メチルピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２５９０）
ＤＣＭ（５０ｍＬ）におけるジメチル−６−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）−３−メチルピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート（０．６５ｇ、１．３１ｍｍｏｌ）の溶液を、０〜５℃のジエチルエーテル（５０ｍＬ）におけるＬＡＨ（０．１０ｇ、４．５ｍｍｏｌ）の撹拌された懸濁液に滴下して添加した。２時間後の反応の完了後に、過剰なＬＡＨを水（２ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（２ｍＬ）の添加によって分解した。反応混合物をセライトのパッドを介して濾過し、ＤＣＭで充分に洗浄した。混合された濾液及び洗浄物を乾燥するまで真空中で蒸発させた。残留物をエタノールから再結晶化して（６−（［１，４´−ビピペリジン］−１´−イル）−３−メチルピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノールを与えた。収量０．４２ｇ（７８％）、融点１８３〜１８５℃。
【０１４５】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.41 (2H, s, CH2), 1.52 (4H, s, 2 × CH2), 1.76-1.88 (4H, m, 2 × CH2), 2.43 (3H, s, CH3), 2.50-2.53 (4H, m, 2 × CH2), 2.83 (2H, t, J = 12.0 Hz, CH2), 3.33 (1H, m, CH), 3.63 (2H, d, J = 15.0 Hz, CH2), 4.55 (3H, s, 1 × OH and 1 × OCH2), 4.74 (1H, s, OH), 4.80 (2H, s, OCH2), 7.43 (1H, t, J = 7.2 Hz,  ArH), 7.71 (1H, t, J = 7.2 Hz, ArH ), 7.89 (1H, d, J = 8.4 Hz, ArH), 8.26 (1H, d, J = 8.4 Hz, ArH).
【０１４６】
13C NMR (DMSO-d6) δ 13.5, 16.5, 24.4, 25.9, 27.2, 49.6, 50.8, 53.0, 53.8, 61.7, 66.8, 113.6, 115.6, 117.5, 120.2, 123.0, 124.7, 125.4, 128.1, 129.6, 131.5, 153.8. HRMS [ESI+]: calculated for C24H32N4O2, 409.2604 [M+H]+, found 409.2638.
【０１４７】
１．４  （３−エチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）−ジメタノール（ＢＯ−２５７７）
（１）４−（フタラジン−１−イル）モルホリン
トリエチルアミン（６．９６ｍＬ、５０．０ｍｍｏｌ）を含有するエタノール（１２０ｍＬ）における溶液１１（３．６４ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）に、モルホリン（１．８９ｍＬ、２２．０ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。反応混合物を１８時間還流で加熱し、溶媒を減圧下で乾燥するまで除去した。反応物を室温まで冷却し、溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物を水で希釈して、ＤＣＭで２回抽出した。分離された有機層を硫酸ナトリウムを介して乾燥させ、真空下で蒸発させて４−（フタラジン−１−イル）モルホリンを与えた。褐色の固体、収量３．８ｇ（８０％）、融点１２５〜１２７℃（ｌｉｔ．４３融点８２℃）。
【０１４８】
1H NMR (DMSO-d6) δ 3.40 (4H, t, J = 4.8 Hz, 2 × CH2), 3.88 (4H, t, J = 4.4 Hz, 2 × CH2), 7.94-7.97 (2H, m, ArH), 8.09-8.14 (2H, m, ArH), 9.31 (1H, s, ArH).
【０１４９】
13C NMR (DMSO-d6) δ 51.4, 51.7, 66.5, 120.7, 124.4, 124.5, 127.5, 128.5, 132.4, 132.5, 148.4, 159.7. HRMS [ESI+]: calculated for C12H13N3O, 216.1137 [M+H]+, found 216.1094.
【０１５０】
（２）４−モルホリノ−２−プロピオニル−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリル
触媒量のＡｌＣｌ３を含有するＤＣＭ（３０ｍＬ）における４−（フタラジン−１−イル）モルホリン（２．０ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｍｅ３ＳｉＣＮ（２．３２ｍＬ、１８．６ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。そして、プロピオニルクロライド（１．２ｍＬ、１４．０ｍｍｏｌ）を上記混合物に滴下して添加し、室温で４時間撹拌した。反応混合物を氷水に注ぎ、有機層を水、５％ＮａＯＨ溶液、そして水で上手く洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムを介して乾燥し、真空中で濃縮して４−モルホリノ−２−プロピオニル−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリルを与えた。収量２．４６ｇ（８９％）、融点１４６〜１４８℃。
【０１５１】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.05 (3H, t, J = 5.6 Hz, CH3), 2.53-2.58 (1H, m, CH2), 2.71-2.75 (1H, m, CH2), 3.03 (2H, s, CH2), 3.35 (2H, s, CH2), 3.70 (2H, s, CH2), 3.87 (2H, s, CH2), 7.04 (1H, s, CH), 7.64 (3H, s, CH), 7.80 (1H, s, ArH).
【０１５２】
13C NMR (DMSO-d6) δ 49.8, 51.8, 65.7, 116.4, 121.5, 124.0, 123.7, 129.2, 130.3, 132.8,155.5, 169.6. HRMS [ESI+]: calculated for C16H18N4O2, 299.1508 [M+H]+, found 299.1519.
【０１５３】
（３）ジメチル−３−エチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート
温酢酸（５０ｍＬ）における４−モルホリノ−２−プロピオニル−１，２−ジヒドロフタラジン−１−カルボニトリル（２．０ｇ、７．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＦ４（１．３０ｍＬ）を滴下して添加した。混合物を５０〜６０℃で３０分間撹拌させた。室温に冷却後、濾過によって黄色固体の塩を収集し、濾過ケークを乾燥エーテルで洗浄した。固体塩をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＤ（１．５ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）をこの溶液に徐々に添加した。反応混合物を９０〜１００℃で１６時間加熱した。溶媒を真空中で蒸発によって除去した。残留物をＭｅＯＨから結晶化してジメチル−３−メチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレートを与えた。収量１．６ｇ（６０％）、融点１８２〜１８３℃。
【０１５４】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.21 (3H, s, CH3), 3.15 (2H, d, J = 6.0 Hz, CH2), 3.30 (4H, s, 2 × CH2), 3.80 (3H, s, COOCH3), 3.89 (7H, s, 2 × CH2 and 1 × COOCH3), 7.63 (1H, s, ArH), 7.80 (1H, s, ArH), 8.06 (1H, d, J = 7.0 Hz, ArH), 8.26 (1H, d, J = 7.0 Hz, ArH ).
【０１５５】
13C NMR (DMSO-d6) δ 13.9, 23.0, 52.4, 52.7, 55.6, 66.2, 106.7, 115.8, 117.7, 121.0, 124.6, 126.7, 128.9, 130.3, 133.0, 156.2, 159.7, 165.6, 165.9. HRMS [ESI+]: calculated for C21H23N3O5, 420.1535 [M+Na]+, found 420.1552.
【０１５６】
（４）（３−エチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２５７７）
ＤＣＭ（５０ｍＬ）におけるジメチル−３−エチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート（１．４ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の溶液を、０〜５℃のジエチルエーテル（２０ｍＬ）におけるＬＡＨ（０．４３ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の撹拌された懸濁液に滴下して添加した。２時間後の反応の完了後に、過剰なＬＡＨを水（２ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（２ｍＬ）の添加によって分解した。反応混合物をセライトのパッドを介して濾過し、ＤＣＭで充分に洗浄した。混合された濾液及び洗浄物を乾燥するまで真空中で蒸発させた。残留物をエタノールから再結晶化して（３−エチル−６−モルホリノピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２５７７）を与えた。収量１．２ｇ（９０％）、融点１８０〜１８２℃。
【０１５７】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.21 (3H, t, J = 7.5 Hz, CH3), 2.93-2.98 (2H, m, CH2), 3.21 (4H, t, J = 4.5 Hz, 2 × CH2), 3.86 (4H, t, J = 4.5 Hz, 2 × CH2), 4.57 (3H, s, 1 × OCH2 and 1 × OH), 4.76 (1H, t, J = 5.5 Hz, OH), 4.82 (2H, d, J = 5.0 Hz, OCH2), 7.43 (1H, t, J = 8.5 Hz, ArH), 7.72 (1H, t, J = 8.0 Hz, ArH), 7.95 (1H, d, J = 7.5 Hz, ArH), 8.29 (1H, d, J = 8.0 Hz, ArH).
【０１５８】
13C NMR (DMSO-d6) δ 13.5, 16.5, 51.3, 53.1, 53.8, 65.8, 113.7, 115.2, 117.5, 120.4, 123.0, 124.7, 125.4, 128.3, 129.7, 131.7, 153.4. HRMS [ESI+]: calculated for C19H23N3O3, 364.1637 [M+Na]+, found 364.1638.
【実施例２】
【０１５９】
実施例２  ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン誘導体（式（Ｉ−Ｂ））の化学合成（手法２）
式（Ｉ−Ｂ）の化合物を、手法２に示すように合成した。商業的に入手可能な２，３−ナフタレン−ジカルボン酸無水物２６を酢酸においてヒドラジン水和物で処理して化合物２７を得て、それをオキシ塩化リンと反応させて化合物２８を得た。アセトニトリルにおける各種ω−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアルキルアミン、環状アミン、アニリン、１−メチルピペラジン、１−エチルピペラジン、１−メチル−４，４´−ビピペリジン、又は１−エチル−４，４´−ビピペリジン及び炭酸カリウムとの２８の処理によって化合物２９を得て、それをＨ２雰囲気下でメタノールにおいて１０％Ｐｄ／Ｃと反応させて３０を与えた。化合物３０を、さらにジクロロメタンにおいてトリメチル−シリルシアニド及びアルキル又はアリールクロライドと反応させて化合物３１を得た。同様に、化合物３１を、前述したように、テトラフルオロホウ酸／アセチレンジカルボン酸ジメチル（ＤＭＡＤ）によって処理することによってジエステル誘導体３２に変換した。３２のジエステルを、氷槽内でエーテル／ＣＨ２Ｃｌ２の混合物においてＬｉＡｌＨ４と反応させることによって対応のビス（ヒドロキシメチル）誘導体３３（式（Ｉ−Ｂ））に還元した。そして、ビス（ヒドロキシメチル）誘導体３３を各種イソシアネートによって処理して化合物３４（Ｒ１は−ＣＨ２ＯＣＯＮＨＲであり、Ｒはアルキル又はアリールである）を与え、若しくはピリジンにおいて酸無水物で処理して化合物３４（Ｒ１は−ＣＨ２ＯＣＯＲである）を与え、又はトルエン若しくはメタンスルホニルクロライド／Ｅｔ３Ｎと反応させて化合物３４（Ｒ１は−ＣＨ２ＯＳＯ２Ｒであり、ＲはＭｅ又は４−ＭｅＰｈである）を与えることによって、それらの対応のビス（アルキルカルバメート）同族体及び他の良好な脱離基に変換した。
【０１６０】
手法２
【化１３】
2021503453.tif 000018
【０１６１】
これにより得られる式（Ｉ−Ｂ）の例示の化合物は、以下を含んでいた。
【化１４】
2021503453.tif 000019
【表４】
2021503453.tif 000020
【０１６２】
２．１  （６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２７６８）及び（６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）−ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２７７２）
（１）２，３−ジヒドロベンゾ［ｇ］フタラジノン−１，４−ジオン
ヒドラジン水和物（８０％溶液、６３ｍＬ）を、氷酢酸（６００ｍＬ）におけるナフタレン−２，３−ジカルボン酸無水物（３９．７ｇ、２００．０ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に添加した。混合物を、撹拌しつつ６時間還流で加熱した。冷却後、固体生成物を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥して２，３−ジヒドロベンゾ［ｇ］フタラジノン−１，４−ジオンを与えた。収量４０．２ｇ（９４％）、融点３４４〜３４６（ｌｉｔ．４０融点３４４℃）。
【０１６３】
1H NMR (DMSO-d6): δ 7.75-7.78 (2H, m, ArH), 8.29-8.31 (2H, m, ArH), 8.76 (2H, s, ArH), 11.52 (2H, s, 2 × NH).
【０１６４】
13C NMR (DMSO-d6): δ 123.8, 126.2, 128.5, 129.1, 134.1. HRMS [ESI+]: calcd for C12H8N2O2, 213.0664 [M+H]+, found 213.0681.
【０１６５】
（２）１，４−ジクロロベンゾ［ｇ］フタラジン
ピリジン（２４．０ｍＬ）を含有するオキシ塩化リン（４００ｍＬ）における２，３−ジヒドロベンゾ［ｇ］フタラジン−１，４−ジオン（４０．０ｇ、１８８．０ｍｍｏｌ）の懸濁液を１００℃で５時間加熱した。反応混合物を４０℃まで冷却させてから、減圧下で乾燥するまで濃縮した。固体残留物をエーテルで練和し、濾過し、エーテルで洗浄した。固体生成物を練和して氷水とともに３０分間撹拌し、固体生成物を濾過によって収集し、水で洗浄し、乾燥して１，４−ジクロロベンゾ［ｇ］フタラジンを与えた。収量４０．８ｇ（８５％）、融点２１７〜２１９℃（ｌｉｔ．４０融点２１７〜２２０℃）。
【０１６６】
1H NMR (DMSO-d6): δ 7.91-7.93 (2H, m, ArH), 8.50-8.52 (2H, m, ArH), 9.09 (2H, s, ArH).
【０１６７】
13C NMR (DMSO-d6) δ 124.3, 124.6, 126.2, 126.9, 128.0, 130.1, 137.4, 155.5. HRMS [ESI+]: calcd for C12H6Cl2N2, 248.9986 [M+H]+, found 249.0000.
【０１６８】
（３）４−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゾ［ｇ］フタラジン−１−アミン
ジメチルアミン（３０ｍＬ、６０．０ｍｍｏｌ）を、室温で無水アセトニトリル（４００ｍＬ）において１，４−ジクロロベンゾ［ｇ］フタラジン（１０ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）及び無水炭酸カリウム（５５ｇ、４００．０ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に徐々に加えた。反応混合物を室温で７２時間撹拌させてから濾過して炭酸カリウムを除去した。濾液を減圧下で蒸発させ、固体残留物をエーテルから再結晶化して４−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゾ［ｇ］フタラジン−１−アミンを与えた。収量９．３ｇ（９０％）、融点９０〜９２℃。
【０１６９】
1H NMR (DMSO-d6) δ 3.25 (6H, s, 2 × NCH3), 7.79-7.83 (2H, m, ArH), 8.37-8.40 (2H, m, ArH), 8.84 (1H, s, ArH), 8.93 (1H, s, ArH).
【０１７０】
13C NMR (DMSO-d6) δ 42.5, 118.9, 123.2, 125.0, 126.6, 128.6, 128.9, 129.0, 129.3, 133.9, 134.0, 147.8, 159.8. HRMS [ESI+]: calcd for C14H12ClN3, 258.0798 [M+H]+, found 258.0791.
【０１７１】
（４）Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゾ［ｇ］フタラジン−１−アミン
ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）における４−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルベンゾ［ｇ］フタラジン−１−アミン（５．１５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）の溶液に１０％Ｐｄ／Ｃ（１．０３ｇ）を添加した。反応混合物を室温で４時間にわたって３５ｐｓｉで水素化してから、セライトのパッドを介して濾過した。濾過ケークをＭｅＯＨで充分に洗浄した。混合された濾液及び洗浄物を減圧下で濃縮し、残留物をＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥するまで真空で蒸発させた。生成物を、クロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサンにおける勾配溶出０〜４０％の酢酸エチル）によって精製してＮ，Ｎ−ジメチルベンゾ［ｇ］フタラジン−１−アミンを与えた。収量２．８ｇ（６４％）、融点１１５〜１１７℃。
【０１７２】
1H NMR (DMSO-d6) δ 3.23 (6H, s, 2 × NCH3), 7.72-7.76 (2H, m, ArH), 8.24 (1H, dd, J = 6.8 and  2.2 Hz, ArH), 8.35 (1H, dd, J = 6.8 and 2.2 Hz, ArH), 8.69 (1H, s, ArH), 8.85 (1H, s, ArH), 9.26 (1H, s, ArH).
【０１７３】
13C NMR (DMSO-d6) δ 42.4, 117.4, 125.1, 125.2, 126.3, 127.7, 128.2, 128.4, 129.4, 133.7, 133.8, 146.8, 159.0. HRMS [ESI+]: calcd for C14H13N3, 224.1188 [M+H]+, found 224.1198.
【０１７４】
（５）２−アセチル−４−（ジメチルアミノ）−１，２−ジヒドロベンゾ［ｇ］フタラジン−１−カルボニトリル
触媒量のＡｌＣｌ３を含有するＤＣＭ（３０ｍＬ）におけるＮ，Ｎ−ジメチルベンゾ［ｇ］フタラジン−１−アミン（２．２２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｍｅ３ＳｉＣＮ（２．５ｍＬ、２０．０ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。そして、アセチルクロライド（１．１ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を上記混合物に滴下して添加し、室温で４時間撹拌した。反応混合物を氷水に注ぎ、有機層を水、５％ＮａＯＨ溶液、そして水で上手く洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムを介して乾燥し、真空中で濃縮して２−アセチル−４−（ジメチルアミノ）−１，２−ジヒドロベンゾ［ｇ］フタラジン−１−カルボニトリルを与えた。収量２．７ｇ（９２％）、融点１２５〜１２７℃。
【０１７５】
1H NMR (DMSO-d6) δ 2.29 (3H, s, COCH3), 2.99 (6H, s, 2 × NCH3), 7.23 (1H, s, CH), 7.67-7.73 (2H, m, ArH), 8.01 (1H, d, J = 7.7 Hz, ArH), 8.20 (1H, d, J = 7.6 Hz, ArH), 8.34 (1H, s, ArH), 8.35 (1H, s, ArH).
【０１７６】
13C NMR (DMSO-d6) δ 20.6, 40.9, 116.4, 118.2, 125.8, 126.3, 127.3, 127.7, 127.8, 128.8, 129.4, 132.8, 133.7, 155.7, 170.9. HRMS [ESI+]: calcd for C17H16N4O, 293.1402 [M+H]+, found 293.1407.
【０１７７】
（６）ジメチル−６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート
温酢酸（８０ｍＬ）における２−アセチル−４−（ジメチルアミノ）−１，２−ジヒドロベンゾ［ｇ］フタラジン−１−カルボニトリル（２．９５ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＦ４（２．２ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。混合物を５０〜６０℃で３０分間撹拌させた。室温に冷却後、濾過によって黄色固体の塩を収集し、濾過ケークを乾燥エーテルで洗浄した。固体塩をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＤ（３．１ｍＬ、２５．０ｍｍｏｌ）をこの溶液に徐々に添加した。反応混合物を９０〜１００℃で１６時間加熱した。溶媒を真空中で蒸発によって除去した。残留物をＭｅＯＨから結晶化してジメチル−６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレートを与えた。収量１．７ｇ（４３％）、融点１８０〜１８２℃。
【０１７８】
1H NMR (DMSO-d6) δ 2.66 (3H, s, CH3), 3.08 (6H, s, 2 × NCH3), 3.81 (3H, s, COOCH3), 3.97 (3H, s, COOCH3), 7.64 (1H, t, J = 7.8 Hz, ArH), 7.71 (1H, t, J = 7.2 Hz, ArH), 8.06 (1H, d, J = 8.2 Hz, ArH), 8.24 (1H, d, J = 8.3 Hz, ArH), 8.65 (1H, s, ArH), 8.73 (1H, s, ArH).
【０１７９】
13C NMR (DMSO-d6) δ 10.2, 42.6, 51.6, 52.5, 107.9, 111.2, 115.6, 119.9, 121.0, 123.9, 127.0, 127.9, 128.0, 129.0, 129.4, 130.9, 131.3, 134.0, 156.8, 164.4, 166.9. HRMS [ESI+]: calcd for C22H21N3O4, 392.1610 [M+H]+, found 392.1590.
【０１８０】
（８）（６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２７６８）
ＤＣＭ（５０ｍＬ）におけるジメチル−６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート（１．６ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の溶液を、０〜５℃のジエチルエーテル（１００ｍＬ）におけるＬＡＨ（０．３９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の撹拌された懸濁液に滴下して添加した。２時間後の反応の完了後に、過剰なＬＡＨを水（２ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（２ｍＬ）の添加によって分解した。反応混合物をセライトのパッドを介して濾過し、ＤＣＭで充分に洗浄した。混合された濾液及び洗浄物を乾燥するまで真空中で蒸発させた。残留物をエタノールから再結晶化して（６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２７６８）を与えた。収量１．１ｇ（８０％）、融点１５６〜１５８℃。
【０１８１】
1H NMR (DMSO-d6) δ 2.46 (3H, s, CH3), 2.99 (6H, s, 2 × NCH3), 4.56 (2H, d, J = 5.1 Hz, OCH2), 4.62 (1H, t, J = 5.4 Hz, OH), 4.90-4.91 (3H, m, OCH2 and OH), 7.52 (1H, t, J = 7.5 Hz, ArH), 7.63 (1H, t, J = 7.3 Hz, ArH), 8.00 (1H, d, J = 8.3 Hz, ArH), 8.14 (1H, d, J = 8.2 Hz, ArH), 8.58 (1H, s, ArH), 8.66 (1H, s, ArH).
【０１８２】
13C NMR (DMSO-d6) δ 8.9, 42.8, 53.4, 54.2, 115.6, 115.7, 117.5, 120.4, 120.4, 123.6, 125.5, 126.3, 126.6, 127.5, 128.1, 129.3, 130.1, 134.6, 154.7. HRMS [ESI+]: calcd for C20H21N3O2, 318.1606 [M+H-H2O]+, found 318.1620.
【０１８３】
（８）（６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）−ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２７７２）
乾燥ＤＭＦにおける（６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（０．２ｇ、０．６ｍｍｏｌ）、（０．１６ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、エチルイソシアネート（０．２ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．５５ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン下の室温で２４〜４８時間撹拌した。反応の完了後、反応混合物を真空中で乾燥するまで蒸発させた。残留物をエーテルで練和し、所望の生成物を濾過によって収集して（６−（ジメチルアミノ）−３−メチルベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）−ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２７７２）を与えた。収量０．１５ｇ（５３％）、融点１３２〜１３４℃。
【０１８４】
1H NMR (DMSO-d6) δ 0.98-1.01 (6H, m, 2 × CH3), 2.48 (3H, s, CH3),  2.98-3.04 (10H, m, 2 × CH2 and 2 × NCH3), 5.18 (2H, s, OCH2), 5.49 (2H, s, OCH2), 7.06 (1H, t, J = 5.2 Hz, NH), 7.10 (1H, t, J = 5.5 Hz, NH), 7.56 (1H, t, J = 7.9 Hz, ArH), 7.66 (1H, t, J = 7.4 Hz, ArH), 7.97 (1H, d, J = 8.3 Hz, ArH), 8.17 (1H, d, J = 8.3 Hz, ArH), 8.51 (1H, s, ArH), 8.64 (1H, s, ArH).
【０１８５】
13C NMR (DMSO-d6). δ 8.9, 15.1, 15.2, 35.0, 35.1, 42.8, 56.2, 57.0, 110.6, 115.5, 116.2, 118.5, 120.3, 125.5, 125.6, 126.0, 127.0, 127.6, 128.4, 129.3, 130.3, 134.5, 155.3, 156.1, 156.3. HRMS [ESI+]: calcd for C26H31N5O4, 302.1657 [M+H-2(OCONHC2H5)]+, found 302.1667.
【０１８６】
２．２  （３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２７６２）及び（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２７６３）
（１）１−クロロ−４−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］フタラジン
ピロリジン（３．５ｍＬ、４２．０ｍｍｏｌ）を、無水アセトニトリル（４００ｍＬ）において１，４−ジクロロベンゾ［ｇ］フタラジン（７．０ｇ、２８．０ｍｍｏｌ）及び無水炭酸カリウム（５５ｇ、４００．０ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に徐々に加えた。反応混合物を室温で７２時間撹拌させてから濾過して炭酸カリウムを除去した。濾液を減圧下で蒸発させ、固体残留物をエーテルから再結晶化して１−クロロ−４−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］フタラジンを与えた。収量６．８ｇ（８５％）、融点１１２〜１１４℃。
【０１８７】
1H NMR (DMSO-d6) δ 2.02 (4H, brs, 2 × CH2), 3.96 (4H, brs, 2 × CH2), 7.76-7.79 (2H, m, ArH), 8.33-8.38 (2H, m, ArH), 8.75 (1H, s, ArH), 9.06 (1H, s, ArH).
【０１８８】
13C NMR (DMSO-d6) δ 25.4, 51.1, 118.7, 123.1, 124.0, 126.8, 128.1, 128.6, 128.9, 129.5, 133.7, 144.6, 155.5. HRMS [ESI+]: calcd for C16H14ClN3, 284.0955 [M+H]+, found 284.0948.
【０１８９】
（２）１−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］フタラジン
ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）における１−クロロ−４−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］フタラジン（５．１ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）の溶液に１０％Ｐｄ／Ｃ（１．０３ｇ）を添加した。反応混合物を室温で４時間にわたって３５ｐｓｉで水素化してから、セライトのパッドを介して濾過した。濾過ケークをＭｅＯＨで充分に洗浄した。混合された濾液及び洗浄物を減圧下で濃縮し、残留物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥するまで真空で蒸発させた。生成物を、クロマトグラフィー（ＳｉＯ２、ヘキサンにおける勾配溶出０〜４０％の酢酸エチル）によって精製して１−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］フタラジンを与えた。収量３．３ｇ（７３％）、融点１５０〜１５２℃。
【０１９０】
1H NMR (DMSO-d6) δ 2.00-2.03 (4H, m, 2 × CH2), 3.94-3.97 (4H, m, 2 × CH2), 7.66-7.73 (2H, m, ArH), 8.18 (1H, d, J = 8.2 Hz, ArH), 8.31 (1H, d, J = 8.3 Hz, ArH), 8.55 (1H, s, ArH), 8.97 (1H, s, ArH), 9.04 (1H, s, ArH).
【０１９１】
13C NMR (DMSO-d6) δ 25.5, 50.8, 117.2, 125.3, 125.4, 127.2, 128.0, 128.1, 129.6, 133.5, 144.1, 154.8. HRMS [ESI+]: calcd for C16H15N3, 250.1344 [M+H]+, found 250.1362.
【０１９２】
（３）２−アセチル−４−（ピロリジン−１−イル）−１，２−ジヒドロベンゾ［ｇ］フタラジン−１−カルボニトリル
触媒量のＡｌＣｌ３を含有するＤＣＭ（５０ｍＬ）における１−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］フタラジン（３．２５ｇ、１３．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｍｅ３ＳｉＣＮ（３．２６ｍＬ、２６．０ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。そして、アセチルクロライド（１．４ｍＬ、１９．６ｍｍｏｌ）を上記混合物に滴下して添加し、室温で４時間撹拌した。反応混合物を氷水に注ぎ、有機層を水、５％ＮａＯＨ溶液、そして水で上手く洗浄した。溶液を硫酸ナトリウムを介して乾燥し、真空中で濃縮して２−アセチル−４−（ピロリジン−１−イル）−１，２−ジヒドロベンゾ［ｇ］フタラジン−１−カルボニトリル（３３ｂ）（ＢＯ−２７６０）を与えた。収量３．２ｇ（７７％）、融点１６２〜１６４℃。
【０１９３】
1H NMR (CDCl3) δ 1.92-2.00 (2H, m, CH2), 2.08-2.10 (2H, m, CH2), 2.31 (3H, s, COCH3), 3.44-3.47 (2H, m, CH2), 3.83-3.89 (2H, m, CH2), 6.90 (1H, s, CH), 7.58-7.64 (2H, m, ArH), 7.85 (1H, s, ArH), 7.90 (1H, d, J = 7.9 Hz, ArH), 7.93 (1H, d, J = 7.9 Hz, ArH), 8.17 (1H, s, ArH).
【０１９４】
13C NMR (CDCl3) δ 20.7, 15.4, 41.5, 50.1, 115.8, 120.1, 125.7, 126.3, 127.0, 127.7, 127.9, 128.5, 129.0, 133.1, 133.8, 154.1. 171.1. HRMS [ESI+]: calcd for C19H18N4O, 319.1559 [M+H]+, found 319.1557.
【０１９５】
（４）ジメチル−３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート
温酢酸（９０ｍＬ）における２−アセチル−４−（ピロリジン−１−イル）−１，２−ジヒドロベンゾ［ｇ］フタラジン−１−カルボニトリル（３．２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＦ４（２．２ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。混合物を５０〜６０℃で３０分間撹拌させた。室温に冷却後、濾過によって黄色固体の塩を収集し、濾過ケークを乾燥エーテルで洗浄した。固体塩をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＤ（３．１ｍＬ、２５．０ｍｍｏｌ）をこの溶液に徐々に添加した。反応混合物を９０〜１００℃で１６時間加熱した。溶媒を真空中で蒸発によって除去した。残留物をＭｅＯＨから結晶化してジメチル−３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレートを与えた。収量２．０ｇ（４８％）、融点１９０〜１９２℃。
【０１９６】
1H NMR (CDCl3) δ 2.02-2.05 (4H, m, 2 × CH2), 2.68 (3H, s, CH3), 3.76-3.78 (4H, m, 2 × CH2), 3.89 (3H, s, COOCH3), 4.04 (3H, s, COOCH3), 7.49 (1H, t, J = 7.1 Hz, ArH), 7.57 (1H, t, J = 6.9 Hz, ArH), 7.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, ArH), 7.92 (1H, d, J = 8.4 Hz, ArH), 8.52 (1H, s, ArH), 8.77 (1H, s, ArH).
【０１９７】
13C NMR (CDCl3) δ 10.4, 25.6, 51.4, 51.5, 52.4, 107.6, 111.2, 117.1, 120.7, 121.9, 124.8, 126.3, 127.1, 128.1, 128.1, 128.8, 131.2, 131.4, 134.3, 153.8, 165.6, 168.1. HRMS [ESI+]: calcd for C24H23N3O4, 440.1586 [M+Na]+, found 440.1569.
【０１９８】
（５）（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２７６２）
ＤＣＭ（５０ｍＬ）におけるジメチル−３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジカルボキシレート（１．７ｇ、４．０ｍｍｏｌ）の溶液を、０〜５℃のジエチルエーテル（１００ｍＬ）におけるＬＡＨ（０．３９ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の撹拌された懸濁液に滴下して添加した。２時間後の反応の完了後に、過剰なＬＡＨを水（２ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（２ｍＬ）の添加によって分解した。反応混合物をセライトのパッドを介して濾過し、ＤＣＭで充分に洗浄した。混合された濾液及び洗浄物を乾燥するまで真空中で蒸発させた。残留物をエタノールから再結晶化して（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（ＢＯ−２７６２）を与えた。収量１．１ｇ（８２％）、融点１６０〜１６２℃。
【０１９９】
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.98-1.99 (4H, m, 2 × CH2), 2.43 (3H, s, CH3), 3.68-3.70 (4H, m, 2 × CH2), 4.52-4.55 (3H, m, OCH2 and OH), 4.82 (1H, t, J = 5.0 Hz, OH), 4.90 (2H, d, J = 5.1 Hz, OCH2), 7.50 (1H, t, J = 7.4 Hz, ArH), 7.61 (1H, t, J = 7.3 Hz, ArH), 7.98 (1H, d, J = 8.3 Hz, ArH), 8.14 (1H, d, J = 8.3 Hz, ArH), 8.64 (1H, s, ArH), 8.67 (1H, s, ArH).
【０２００】
13C NMR (DMSO-d6) δ 8.9, 25.0, 50.9, 53.4, 54.2, 115.2, 116.4, 117.2, 119.9, 120.0, 123.0, 125.3, 126.4, 126.7, 127.3, 128.1, 129.3, 129.9, 134.3, 152.2. HRMS [ESI+]: calcd for C22H23N3O2, 344.1763 [M+H-H2O]+, found 344.1754.
【０２０１】
（６）（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２７６３）
乾燥ＤＭＦにおける（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ジメタノール（０．３６ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、エチルイソシアネート（０．３２ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．５５ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン下の室温で２４〜４８時間撹拌した。反応の完了後、反応混合物を真空中で乾燥するまで蒸発させた。残留物をエーテルで練和し、所望の生成物を濾過によって収集して（３−メチル−６−（ピロリジン−１−イル）ベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン−１，２−ジイル）ビス（メチレン）ビス（エチルカルバメート）（ＢＯ−２７６３）を与えた。収量０．２８ｇ（５６％）、融点１４２〜１４４℃。
【０２０２】
1H NMR (DMSO-d6) δ 0.95-1.02 (6H, m, 2 × CH3), 1.98 (4H, brs, 2 × CH2), 2.45 (3H, s, CH3), 2.97-3.05 (4H, m, 2 × CH2), 3.72 (4H, brs, 2 × CH2), 5.16 (2H, s, OCH2), 5.48 (2H, s, OCH2), 7.02 (1H, t, J = 5.7 Hz, NH), 7.07 (1H, t, J = 5.2 Hz, NH), 7.54 (1H, t, J = 7.7 Hz, ArH), 7.65 (1H, t, J = 7.4 Hz, ArH), 7.94 (1H, d, J = 8.1 Hz, ArH), 8.17 (1H, d, J = 8.3 Hz, ArH), 8.47 (1H, s, ArH), 8.72 (1H, s, ArH).
【０２０３】
13C NMR (DMSO-d6) δ 8.9, 15.1, 15.2, 25.1, 35.0, 35.1, 51.0, 56.2, 57.1, 110.0, 115.7, 116.3, 118.2, 119.8, 124.8, 125.7, 127.1, 127.3, 128.3, 129.3, 130.1, 134.2, 152.6, 156.1, 156.3. HRMS [ESI+]: calcd for C28H33N5O4, 328.1814 [M+H-2(OCONHC2H5)]+, found 328.1816.
【実施例３】
【０２０４】
実施例３  式（Ｉ）の化合物のリポソームカプセル化の調製
式（Ｉ）の化合物は、一般に疎水性である。高い薬剤濃度で特異的な腫瘍細胞又は臓器の標的に活性化合物を送達するために、式（Ｉ）の化合物、特に、ＢＯ−２５９０を変性脱水−再水和法及び下記の手順による繰返しの押出し形成よってリポソームにカプセル化してリポソーム薬剤を生成した。
【０２０５】
（１）リポソームカプセル化
ＢＯ−２５９０のリポソームカプセル化を、ＣＨＣｌ３において大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ-3-ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯ）及びＰＥＧ−２０００（モル比５０：４５：４：１）を混合することによって調製した。混合物を丸底フラスコに入れてから、ＢＯ−２５９０を反応混合物（４ｍｇ／ｍＬ）に添加した。有機溶媒を、減圧下で回転蒸発によって除去した。結果として得られる乾燥脂質膜をリン酸緩衝生理食塩水（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４及び１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）において脱水し、ハンドシェーキングすることによって拡散させた。懸濁液を複数回凍結及び解凍させ、その後に６０℃で高圧押出し器（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、バンクーバー、カナダ）を用いて０．８、０．６、０．４、０．２μｍ孔径のポリカーボネートメンブレンフィルター（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を介して繰返し押出し形成を行った。生成物溶液を４℃で保存した。
【０２０６】
（２）ＨＰＬＣ分析
リポソームＢＯ−２５９０（ＢＯ−２５９０Ｌ）を、移動相条件下［アセトニトリル／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（０．５％ＴＦＡ）（４５／５０／５）、（保持時間４．６分、流速０．５ｍＬ／分）］でＲＰ−１８カラムを用いて高圧液体クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって定量化した。リポソームＢＯ−２５９０（１００μｌ）を移動相（１００μｌ）に添加し、ボルテックスで完全に混合し、１０分間インキュベートした。結果として得られる乳状サンプルを遠心分離し、透明な上清をＨＰＬＣ定量分析に取り入れた。我々の調製（ｎ＞５）では、ＢＯ−２５９０リポソームは、３．１２〜２．９４ｍｇ／ｍＬを含有していた（４ｍｇ／ｍＬの濃度における開始材料でカプセル化７６〜７０％）。
【０２０７】
（３）安定性分析
リポソームカプセル化ＢＯ−２５９０Ｌを４℃で３週間保存した。それは、ＨＰＬＣ分析によってカプセル化７６％〜６６．３％から約１０％の崩壊を示した。
【実施例４】
【０２０８】
実施例４  式（Ｉ）の化合物のインビトロ特性化
４．１  式（Ｉ）の化合物は癌細胞に対する細胞毒性を有した
式（Ｉ−Ａ）及び（Ｉ−Ｂ）の全ての代表的化合物を、まず、ヒトリンパ性白血病細胞株（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）及びそのビンブラスチン耐性細胞サブライン（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＶＢＬ）に対するそれらのインビトロ細胞毒性について評価した（表１参照）。高い細胞毒性を有する選択化合物を、固形腫瘍細胞株のパネル、すなわち、結腸癌ＨＣＴ−１１６、非小細胞肺癌Ｈ４６０、小細胞肺癌Ｈ５２６及び膵臓癌ＰａｃａＳ１に対してさらに評価した（表２）。
【０２０９】
簡単に説明すると、試験細胞を、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）及び５％の加熱不活性化ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地１６４０（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、において、３７℃で５％のＣＯ２加湿雰囲気において３×１０３個／ミリリットルの初期細胞密度で培養した。新たに合成された化合物の種々の濃度における７２時間のインキュベーションの後に、全ての細胞株に対するそれらの細胞毒性効果を、マイクロプレート分光光度計を用いてＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）アッセイによって測定した。簡単に説明すると、処置の終了時にＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）溶液のアリコートを添加した後に、細胞を３７℃で１〜２時間インキュベートした。５７０ｎｍ及び６００ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで計測した。各化合物の６又は７種数の濃度における用量−効果の関係を、Ｃｈｏｕ及びＭａｒｔｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ２００６、５８：６２１−６８１）によって開発された半数影響原理（ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェア、バージョン１．０．１、ＣｏｍｐｕＳｙｎ、Ｉｎｃ．，Ｐａｒａｍｕｓ、ＮＪ）の補助によってＩＣ５０値を計算するのに用いた。ＩＣ５０は、腫瘍細胞の成長を５０％阻害するのに必要な濃度で定義される。データは、各化合物について３〜６回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＴＤＥＶ）を表す。
【０２１０】
表１は、ヒトリンパ性白血病ＣＣＲＦ−ＣＥＭ及びそのビンブラスチン耐性細胞サブライン（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＶＢＬ）に対する１，２−ビス（ヒドロキシメチル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン誘導体（式Ｉ−Ａ）及びベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン誘導体（式Ｉ−Ｂ）のインビトロ細胞毒性をまとめた。データは、これらの化合物はＣＣＲＦ−ＣＥＭに対して大きな細胞毒性を示し、ビンブラスチンに対して交差耐性を示さなかったことを明らかにした。選択化合物を、各種固形腫瘍（すなわち、結腸癌ＨＣＴ−１１６、非小細胞肺癌Ｈ４６０、小細胞肺癌Ｈ５２６、膵臓癌ＰａｃａＳ１）に対するそれらの細胞毒性について評価した。注目すべきことに、試験化合物は、全ての固形腫瘍細胞株の細胞成長を概ね活性的に阻害した（表２）。これらの中で、小細胞肺癌Ｈ５２６細胞は、試験化合物に対して最も影響されやすかった。
【０２１１】
また、ヒト小細胞肺癌細胞（ＳＣＬＣ）における式（Ｉ−Ｂ）の化合物の細胞毒性と既知の抗増殖剤のもの（例えば、イリノテカン、エトポシド、シスプラチン及びカルボプラチン）とを比較し、結果を表３にまとめた。表３のデータが示すように、本開示の式（Ｉ−Ｂ）の化合物は、一般に、イリノテカン、エトポシド、シスプラチン及びカルボプラチンのものよりも効力があった。
【０２１２】
表１．ヒトリンパ性白血病（ＣＣＲＦ）及びそのビンブラスチン耐性細胞サブラインＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＶＢＬに対する式（Ｉ−Ａ）及び（Ｉ−Ｂ）の化合物の細胞毒性
【化１５】
2021503453.tif 000021
【表５】
2021503453.tif 000022
ａデータは、各化合物についての３〜６回の独立した実験の平均±標準偏差（ＳＴＤＥＶ）を表す。ｂＣＣＲＦ−ＣＥＭ／ＶＢＬは、ＣＣＲＦ−ＣＥＭの細胞サブラインである。括弧内のｃ番号は、親細胞株の対応のＩＣ５０との比較によって測定される耐性係数である。ｄＩＣ５０値の単位はｎＭである。
【０２１３】
表２．ヒト固形腫瘍細胞株に対する１，２−ビス（ヒドロキシメチル）ピロロ［２，１−ａ］フタラジン誘導体（式（Ｉ−Ａ））及びベンゾ［ｇ］ピロロ［２，１−ａ］フタラジン誘導体（式（Ｉ−Ｂ））のインビトロ細胞毒性
【表６】
2021503453.tif 000023
【０２１４】
表３．ヒト小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞のバッチに対する式Ｉ−Ｂの化合物と治療剤の細胞毒性の比較
【表７】
2021503453.tif 000024
【０２１５】
４．２  式（Ｉ）の化合物がＤＮＡ鎖間架橋を誘発した
本実施例では、ＢＯ−２５９０、ＢＯ−２５７７（式Ｉ−Ａ）並びにＢＯ−２６９８、ＢＯ−２７５５、ＢＯ−２７６２及びＢＯ−２７６８（式Ｉ−Ｂ）をそれらのＤＮＡ架橋活性について試験し、それにおいてアルカリアガロースゲル電気泳動によって架橋を分析した。簡単に説明すると、精製されたｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドＤＮＡ（１５００ｎｇ）を、４０μＬの結合緩衝液（３ｍＭの塩化ナトリウム／１ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、及び１ｍＭのＥＤＴＡ）において種々の濃度（１〜２０μＭ）の試験化合物に混合した。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。反応の終了時に、プラスミドＤＮＡを、ＢａｍＨＩによる消化によって、及びその後に続くエタノール沈殿によって線状化した。ＤＮＡペレットをアルカリ緩衝液（０．５ＮのＮａＯＨ−１０ｍＭのＥＤＴＡ）において溶解及び変性した。２０μＬのＤＮＡ溶液（１０００ｎｇ）のアリコートを、４μＬの６×アルカリローディングダイと混合してから、ＮａＯＨ−ＥＤＴＡ緩衝液とともに０．８％アルカリアガロースゲルにおいて４℃で電気泳動で分解した。電気泳動を１８Ｖで２２時間実行した。臭化エチジウム溶液でゲルを染色した後、ＤＮＡをＵＶ光下で可視化した。結果を図１に示す。
【０２１６】
図１における写真に示すように、ＢＯ−２５９０、ＢＯ−２５７７、ＢＯ−２６９８、ＢＯ−２７５５、ＢＯ−２７６２及びＢＯ−２７６８はそれぞれＤＮＡ鎖間架橋を誘発し、効果は用量に依存して現れた。また、試験された化合物間で、ＢＯ−２５９０は、メルファランのものよりも比較的強い架橋剤であることが分かった。
【０２１７】
また、細胞におけるＤＮＡ鎖切断を計測するための簡単な方法である単細胞電気泳動アッセイ（ＳＣＧＥ、「コメットアッセイ」としても知られる）を、ＢＯ−２７６８によって誘発されるＤＮＡ損傷を評価するために実行した。この目的のため、細胞を、顕微鏡スライド上で低融点アガロース懸濁液においてカプセル化してから、中性又はアルカリ性（ｐＨ＞１３）条件で、懸濁溶解細胞の電気泳動において溶解した。用語「コメット」とは、電気泳動ゲルを介したＤＮＡマイグレーションのパターンをいい、それは流星に似ていることが多く、流星の先端に対する尾の強度がＤＮＡ切断数を反映する。結果を図２に示し、それは、ＢＯ−２７６８はシスプラチンとして用量に依存してＤＮＡ切断を誘発する能力があることを確証している。
【０２１８】
４．３  ＢＯ−２５９０及びＢＯ−２５７７は血管新生を阻害した
本実施例では、ＢＯ−２５９０及びＢＯ−２５７７は、ウェスタンブロット解析によってＶＥＧＦＲ−２を抑制する際のそれらの活性の試験を受けた。簡単に説明すると、内皮性ＥＡ．ｈｙ９２６細胞を、種々の濃度で１２時間ＢＯ−２５９０又はＢＯ−２５７７とともにインキュベートした。一次抗体、抗ＶＥＧＦＲ−２及び抗ｐ−ＶＥＧＦＲ−２を用いて、それぞれ合計ＶＥＧＦＲ−２及びｐ−ＶＥＧＦＲ−２のタンパク質をブロットした。結果を図３に示す。
【０２１９】
図３に示すように、ＢＯ−２５９０及びＢＯ−２５７７での処理は、ｐ−ＶＥＧＦＲ−２タンパク質レベルでの著しい抑制となり、ｐ−ＶＥＧＦＲ−２の減少においてはＢＯ−２５９０がＢＯ−２５７７よりも強力であった。また、ＢＯ−２５９０又はＢＯ−２５７７はＶＥＧＦＲ−２の総タンパク質レベルを大きくは変化させないので、我々はＢＯ−２５９０又はＢＯ−２５７７がＶＥＧＦＲの活性化の阻害剤として機能し得るものと推定した。したがって、バタラニブ（Ｖａｌａｔａｎｉｂ）が、対照物として含まれた。驚くことに、ｐ−ＶＥＧＦＲ−２の抑制に有効なＢＯ−２５９０の用量は、バタラニブのものよりも約１０倍低かった。これにより、ＢＯ−２５９０がＶＥＧＦＲ−２の強力な阻害剤であることが明らかとなった。
【０２２０】
４．４  ＢＯ−２５９０は内皮細胞のマイグレーションを減少させた
本実施例では、我々は、トランスウェルマイグレーションアッセイを用いて化合物ＢＯ−２５９０が細胞マイグレーションを抑制することができるかを調査した。
【０２２１】
簡単に説明すると、内皮細胞を細胞透過膜の上層に入れ、ＢＯ−２５９０を含有する溶液を細胞透過膜の下層に入れた。インキュベーション期間（８時間）に続いて、膜を介して泳動した細胞を染色し、蛍光顕微鏡下で計数した。明らかに、化合物ＢＯ−２５９０によるＶＥＧＦＲ経路の阻害が、細胞マイグレーションにおける障害をもたらした（図４、パネルＡ）。
【０２２２】
４．５  ＢＯ−２５９０は血管新生を中断させた
血管新生は、既存の脈管構造からの伸張として派生した新たな結果を生成する過程である。血管挙動の実行又は管形成を監視することによって、化合物が血管新生を中断させることができるかを判定することができる。この実施例では、式（Ｉ）の化合物が血管新生を中断したかを、管形成アッセイを用いて調査した。
【０２２３】
簡単に説明すると、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞を、種々の濃度のＢＯ−２５９０で２４時間処理した。その後、細胞（５×１０５個の細胞／ウェル）を１％ＦＣＳを含有する１００μｌの培地において懸濁し、続いてマトリゲルで３７℃で１時間プレコーティングした９６ウェルのプレート上に播種した。４８時間のインキュベーションの後、管形成能力を位相差顕微鏡下で検査した。
【０２２４】
図４（パネルＢ）における写真が示すように、ＢＯ−２５９０の不在時にロバストな管構造が形成されたが、ｎＭ範囲のＢＯ−２５９０でのプレインキュベーションは管構造の管形成を著しくかつ用量依存的に消滅させた。バタラニブも、管形成を抑制したが、大幅に高い濃度であった。結果は、ＢＯ−２５９０による管形成の阻害はＢＯ−２５９０誘発のＶＥＧＦＲ−２阻害に密接に相関することを示した。したがって、ＢＯ−２５９０がｐ−ＶＥＧＦＲ−２の発現の阻害を介して抗血管新生活性をトリガしたと結論付けるのが合理的である。ＢＯ−２７６８及びＢＯ−２６９８も、用量に依存して管形成に対する同様の阻害効果を示した（図４、パネルＣ及びＤ）。
【０２２５】
４．６  ＢＯ−２５９０は細胞周期を干渉した
我々は、Ｈ４６０肺癌細胞における細胞周期進行に対するＢＯ−２５９０の効果を濃度０、０．１２５、０．２５、０．５、１及び２μＭにおいて２４、４８及び７２時間さらに調査した。細胞周期分布をフローサイトメトリーによって分析した。図５に示すように、ＢＯ−２５９０は、細胞周期進行と用量依存的に干渉した。ＢＯ−２５９０の濃度を増加させることによって、Ｇ２期における著しい抑止が最初に観察され、Ｓ期の進行の抑止が続き、最後にＧ１の抑止が２４時間で現れた。ただし、４８又は７２時間のインキュベーションに続き、細胞周期は徐々に進み、大量のｓｕｂ−Ｇ１細胞が現れ始めた（図６）。ｓｕｂ−Ｇ１細胞も、アポトーシス細胞であった。したがって、ＢＯ−２５９０が用量依存的にｓｕｂ−Ｇ１細胞を誘発したという所見は、ＢＯ−２５９０がＤＮＡ損傷を介したアポトーシス細胞死をトリガし得ることを示す。
【０２２６】
４．７  ＢＯ−２５９０はアポトーシス細胞死を誘発した
この実施例では、アネキシンＶ染色アッセイを用いて、Ｈ４６０細胞株におけるＢＯ−２５９０によって誘発されるアポトーシス細胞死を評価した。簡単に説明すると、Ｈ４６０細胞を、ＢＯ−２５９０で濃度０．５、１及び２μＭで４８時間処理してから、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色した。染色した細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。４８時間の処理後、ＢＯ−２５９０は用量に依存してアネキシンＶ＋細胞の比率を大幅に増加させたことが分かった（図７）。
【０２２７】
４．８  ＢＯ−２７６８はアポトーシス細胞死を誘発した
この実施例では、ＢＯ−２７６８の効果を、アポトーシス細胞死がＨ５２６細胞株において測定されたことを除いて、実施例４．７の手順に従って評価した。簡単に説明すると、Ｈ５２６細胞を濃度０．０１、０．０２、０．０４及び０．０８μＭのＢＯ−２７６８又は濃度２、４、８及び１６μＭのシスプラチンで２４、４８又は７２時間処理してから、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色した。染色した細胞をフローサイトメトリーによって分析した。７２時間の処理後、ＢＯ−２７６８は用量に依存してアネキシンＶ＋細胞の比率を大幅に増加させたことが分かった（図８）。
【０２２８】
４．９  ＢＯ−２７６８及びシスプラチンは細胞増殖を相乗的に抑制した
この実施例では、細胞増殖の抑制に対する相乗効果がＢＯ−２７６８とシスプラチンの間に存在するかを調査した。この目的のため、Ｈ２１１細胞をＢＯ−２７６８又はシスプラチンで単独で又は組合せて処理し、Ｈ２１１細胞の増殖率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイによって分析した。結果を図９に示す。
【０２２９】
図９におけるデータが示すように、１：２、１：４及び１：８の比におけるＢＯ−２７６８及びシスプラチンの共投与は、それぞれ、増殖Ｈ２１１細胞数の相乗的な低減をもたらした。
【実施例５】
【０２３０】
実施例５  式（Ｉ）の化合物のインビトロ特性化
実施例４において前述したように、式（Ｉ）の化合物は、一般的に、試験される腫瘍細胞株に対して細胞毒性を有した。本実施例では、ヒトＳＣＬＣを保持するヌードマウスにおける式（Ｉ）の選択された化合物の治療有効性を調査した。
【０２３１】
５．１  実施例３のリポソームＢＯ−２５９０（ＢＯ−２５９０Ｌ）はＳＣＬＣ  Ｈ５２６異種移植片を効果的に抑制した
ＢＯ−２５９０は溶解性に乏しいので、本実施例では実施例３のリポソームＢＯ−２５９０（ＢＯ−２５９０Ｌ）を用いて、ヒトＳＣＬＣ  Ｈ５２６異種移植片を保持するヌードマウスに対するその治療有効性を調査した。
【０２３２】
全ての実験において、腫瘍細胞をヌードマウスに皮下移植し、腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達するとＢＯ−２５９０Ｌを尾静脈を介して投与した。Ｈ５２６異種移植片保持ヌードマウスを、まずＢＯ−２５９０Ｌで１日おきに６回（Ｑ２Ｄ×６）にわたって２．５、５及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で処置した。図１０（パネルＡ）に示すように、１０ｍｇ／ｋｇでのＢＯ−２５９０Ｌは、３０日目（Ｄ３０）にＨ５２６腫瘍体積を５５％抑制した。試験された全用量において、ＢＯ−２５９０Ｌは体重の減量をもたらすことはなく、これはＢＯ−２５９０Ｌの低い毒性を示している（図１０、パネルＢ）。
【０２３３】
ＢＯ−２５９０Ｌの治療活性を確認するために、バタラニブ及びシスプラチンのような既知の化学療法剤によって実行される比較実験も行った。簡単に説明すると、Ｈ５２６異種移植片保持マウスを、ビヒクル、ＢＯ−２５９０Ｌ（１０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×９）、バタラニブ（１００ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×９）及びシスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ、Ｑ２Ｄ×３）でそれぞれ処置される４つの群に分けた。結果を図１１に示す。
【０２３４】
ＢＯ−２５９０Ｌはバタラニブよりもはるかに強力であり、Ｈ５２６異種移植片の成長を抑制する際に３３日目（Ｄ３３）においてシスプラチンとほぼ同程度に有効であることが分かり、約６０％の腫瘍抑制がＢＯ−２５９０Ｌによって観察された（図１１、パネルＡ）。注目すべきこととして、９日連続で１０ｍｇ／ｋｇで与えられたＢＯ−２５９０Ｌは体重の減量をもたらさず（図１１、パネルＢ）、ＢＯ−２５９０Ｌは低い毒性を有したという前述の所見を支持している。これに対して、４ｍｇ／Ｋｇの用量で使用されたシスプラチンは、試験動物における深刻な体重の減量をもたらした。
【０２３５】
５．２  ミセルＢＯ−２５９０、ＢＯ−２７６８、ＢＯ−２７９２はＳＣＬＣ  Ｈ５２６異種移植片を効果的に抑制した
ヒトＳＣＬＣ  Ｈ５２６異種移植片を保持するヌードマウスに対するＢＯ−２５９０、ＢＯ−２７６８、ＢＯ−２７９２、イリノテカン及びシスプラチンの治療有効性を、実施例５．１と同様の手順に従って調査した。ＢＯ−２５９０、ＢＯ−２７６８、ＢＯ−２７９２、イリノテカン及びシスプラチンを、２０％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ１５（登録商標）、１０％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、１０％のＰＥＧ４００、３０％のエタノール及び４０％のＤ５Ｗの溶液においてそれぞれ調合した。結果を図１２及び１３に示す。
【０２３６】
ＢＯ−２５９０及びＢＯ−２７９２は腫瘍サイズを減少させる際にイリノテカン及びシスプラチンと同程度に有効であることが分かった（図１２、パネルＡ）。一方、２０ｍｇ／ｋｇ（毎日２回）の用量でのＢＯ−２７６８は、ＢＯ−２５９０、ＢＯ−２７９２、イリノテカン及びシスプラチンのいずれよりも驚くほどに強力であり、この検討の時間全体を通じて腫瘍の成長は完全に抑制された（すなわち、成長がなかった）が、他の群（すなわち、ＢＯ−２５９０、ＢＯ−２７９２、イリノテカン又はシスプラチンで試験された群）の腫瘍は時間の増加とともにサイズが徐々に増加した。また、試験化合物（すなわち、ＢＯ−２５９０、ＢＯ−２７６８、ＢＯ−２７９２、イリノテカン及びシスプラチン）のいずれも、試験動物の体重に対して有害な効果を示さなかった（図１２、パネルＢ）。
【０２３７】
５．３  ＢＯ−２７６８は用量に依存してＳＣＬＣ  Ｈ５２６異種移植片を抑制した
実施例５．２における所見の観点から、ＢＯ−２７６８の抗腫瘍有効性をさらに詳細に調査したところ、予想通り、ＢＯ−２７６８は用量に依存して腫瘍の成長を抑制し、２０ｍｇ／ｋｇの用量（１日あたり２回）は、試験動物の体重におけるいずれの有害な効果もなく（図１３、パネルＢ）、検討の時間全体を通じて腫瘍の成長を完全に抑制し得る（図１３、パネルＡ）。
【０２３８】
５．４  ＢＯ−２７６８及びシスプラチンは、試験被検体の体重に悪影響を及ぼすことなくＳＣＬＣ  Ｈ２１１異種移植片のサイズを相乗的に減少させた
この実施例では、腫瘍サイズの抑制及び試験被検体の体重変化に対するＢＯ−２７６８及びシスプラチンの相乗効果を調査した。この目的のため、Ｈ２１１細胞のアリコート（５×１０６、５０μｌ）をヌードマウスに皮下移植した。そして、試験動物をＢＯ−２７６８又はシスプラチンで、単独で又は組合せて処置した。（２０％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ１５、１０％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、１０％のＰＥＧ４００、３０％のエタノール及び４０％の蒸留水に溶解された）ＢＩ−２７６８を、１００μｌにおける２０ｍｇ／ｋｇの用量で５連続日にわたって投与してから、１日休止し、このサイクルを１回反復した（すなわち、合計で２サイクル）。シスプラチンを２又は４ｍｇ／ｋｇの用量で４日毎に１回、これを３回にわたって与えた。結果を図１４に示す。
【０２３９】
図１４におけるデータが示すように、ＢＯ−２７６８及びシスプラチンの共投与は、試験動物の体重に悪影響を与えることなく（図１４、パネルＢ）、腫瘍サイズにおける相乗効果をもたらした（図１４、パネルＡ）。
【０２４０】
５．５  免疫組織化学染色によって実証されたＳＣＬＣ  Ｈ５２６の組織部位におけるＢＯ−２５９０Ｌ（式ＩＡ）抗血管新生及びＤＮＡ損傷活性
スライド上の腫瘍異種移植組織部位をキシレンに毎回７分間にわたって２回脱パラフィン処理した。そして、スライドを、１００％〜７０％の順に段階的エタノールにおいて再水和し、その後に続いてｄＨ２Ｏにおいて洗い流した。抗原賦活化を、クッカーにおける５０分間インキュベーション、その後に続く３０分間の大気温冷却とともにクエン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ６．０）を用いて行ってから、ｄＨ２Ｏで洗い流した。後のスライドに、製造者の指示（Ｎｏｖｏｌｉｎｋポリマー検出システム、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ヴェッツラー、ドイツ）１１に従ってＡｂｃａｍ（登録商標）から得られた一次抗体（抗ウサギＣＤ３１抗体及び抗マウスγ−Ｈ２ＡＸ抗体）で免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を行った。ＩＨＣ処理の後、Ｐａｎｏｒａｍｉｃ２５０ＦｌａｓｈＩＩホールスライドスキャナーを用いてスライドをデジタル的にスキャンし、３ＤＨＩＳＴＥＣＨ  Ｐａｎｏｒａｍｉｃビューワソフトウェア（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ  Ｌｔｄ．，ブタペスト、ハンガリー）によって分析した。
【０２４１】
腫瘍内の血管の密度を、抗ＣＤ３１（内皮細胞のマーカー）を用いて免疫蛍光染色によって評価した（図１５、パネルＡ）。ビヒクル対照物と比較して、全体として、大幅に減少した血管が、ＢＯ−２５９０Ｌ、バタラニブ又はシスプラチンで処置された腫瘍において観察された（図９、パネルＡ）。ＩＨＣの後に、スライドをＰａｎｏｒａｍｉｃ２５０ＦｌａｓｈＩＩホールスライドスキャナーによってスキャンした。組織部位におけるＣＤ３１の発現を、３個の腫瘍部位のうちの１５個の異なる領域から測定し、計数値を３ＤＨＩＳＴＥＣＨ  Ｐａｎｏｒａｍｉｃビューワソフトウェア（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ  Ｌｔｄ．，ブタペスト、ハンガリー）を用いて平均化した。図１５（Ｂ）に示すように、ＣＤ３１マーカーは、処置なしの腫瘍においては時間に依存して増加した。一方、９日目に、ＣＤ３１マーカーの強度は、対照物と比較して、ＢＯ−２５９０Ｌ又はバタラニブで処置した腫瘍において４％まで減少した（図１５、パネルＢ）。使用された用量でのシスプラチンは腫瘍成長を大幅に抑制したので、シスプラチン処置による腫瘍における減少したＣＤ３１マーカーも観察された。９日目に、シスプラチン処置による腫瘍におけるＣＤ３１マーカーの強度は対照物の１９％であり、それはＢＯ−２５９０Ｌ又はバタラニブよりも少ない程度であった。これらの結果は、ＢＯ−２５９０Ｌはインビボシステムにおいて血管新生の阻害についてバタラニブとほぼ同等に効力があることを示した。
【０２４２】
ＢＯ−２５９０ＬはＤＮＡ損傷剤であるので、我々は、免疫組織化学染色の使用を介してＤＮＡ損傷マーカーγ−Ｈ２ＡＸのレベルにおけるＢＯ−２５９０Ｌの効果を調査した。
【０２４３】
予想通り、シスプラチン又はＢＯ−２５９０Ｌで処置された腫瘍では著しく増加したγ−Ｈ２ＡＸが観察されたが、バタラニブで処置された腫瘍ではより少ないレベルしか観察されなかった（図１６、パネルＡ）。定量分析によって、γ−Ｈ２ＡＸシグナルは対照物の腫瘍ではほとんど見られないことが明らかとなった。一方、シスプラチン又はＢＯ−２５９０で処置された腫瘍では、γ−Ｈ２ＡＸシグナルにおける時間依存での増加が見られた。バタラニブで処置された腫瘍では、適度なレベルのγ−Ｈ２ＡＸが観察された（図１６、パネルＢ）。
【０２４４】
まとめると、ＢＯ−２５９０Ｌは、ＤＮＡ損傷及び血管の抑制を介して癌細胞を死滅させることができる。
【０２４５】
実施形態の上記説明は例示のみのために与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、本開示の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。
【図１】
2021503453.tif 000030
【図２（Ａ）】
2021503453.tif 000031
【図２（Ｂ）】
2021503453.tif 000032
【図３（Ａ）】
2021503453.tif 000033
【図３（Ｂ）】
2021503453.tif 000034
【図３（Ｃ）】
2021503453.tif 000035
【図４（Ａ）】
2021503453.tif 000036
【図４（Ｂ）】
2021503453.tif 000037
【図４（Ｃ）】
2021503453.tif 000038
【図４（Ｄ）】
2021503453.tif 000039
【図５】
2021503453.tif 000040
【図６（Ａ）】
2021503453.tif 000041
【図６（Ｂ）】
2021503453.tif 000042
【図６（Ｃ）】
2021503453.tif 000043
【図７】
2021503453.tif 000044
【図８】
2021503453.tif 000045
【図９（Ａ）】
2021503453.tif 000046
【図９（Ｂ）】
2021503453.tif 000047
【図９（Ｃ）】
2021503453.tif 000048
【図１０（Ａ）】
2021503453.tif 000049
【図１０（Ｂ）】
2021503453.tif 000050
【図１１（Ａ）】
2021503453.tif 000051
【図１１（Ｂ）】
2021503453.tif 000052
【図１２（Ａ）】
2021503453.tif 000053
【図１２（Ｂ）】
2021503453.tif 000054
【図１３（Ａ）】
2021503453.tif 000055
【図１３（Ｂ）】
2021503453.tif 000056
【図１４（Ａ）】
2021503453.tif 000057
【図１４（Ｂ）】
2021503453.tif 000058
【図１５（Ａ）】
2021503453.tif 000059
【図１５（Ｂ）】
2021503453.tif 000060
【図１６（Ａ）】
2021503453.tif 000061
【図１６（Ｂ）】
2021503453.tif 000062
【国際調査報告】
2021503453.tif 000063
2021503453.tif 000064
2021503453.tif 000065