(57)【要約】  本発明は、クロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更するための方法に関する。本発明はまた、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物からＲＮＡを精製するための方法に関する。更に、本発明は、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法に関する。特に、本発明は、少なくとも２つのＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法を提供する。本発明はまた、前記方法によって得ることができるＲＮＡ、前記ＲＮＡを含む組成物、又は前記ＲＮＡを含むワクチン、及びそのようなＲＮＡ及び組成物を製造するための方法に関する。更に、本発明は、ＲＮＡ、組成物、又はワクチンを含むキット、特にキットオブパーツに関する。本発明は更に、障害又は疾患を治療又は予防する方法、ＲＮＡ、組成物、及びワクチンの第１及び第２の医学的使用に関する。更に、本発明は、適合されたＲＮＡ配列又は適合されたＲＮＡ混合物を提供するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更する方法であって、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することにより、前記ＲＮＡ配列を適合させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を決定する工程と、前記適合されたＲＮＡ配列を得るために、前記Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数を増加又は減少させる工程とを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記元のＲＮＡ配列中のＧ及び／又はＣヌクレオチドを、Ａ及び／又はＵヌクレオチドで置き換える工程を含む請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドを、Ｇ及び／又はＣヌクレオチドで置き換える工程を含む請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記元のＲＮＡ配列の非コード領域に、更なるヌクレオチド、好ましくはＧ及び／又はＣヌクレオチド、より好ましくはＡ及び／又はＵヌクレオチドを導入する工程を含む請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡがコード領域を含み、前記ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が前記コード領域中で変更される請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記適合されたＲＮＡ配列のコード領域によりコードされるアミノ酸配列が、前記元のＲＮＡ配列のコード領域によりコードされるアミノ酸配列に対して変更されない請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記適合されたＲＮＡの保持時間を、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数を前記元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、更により好ましくは少なくとも５個、最も好ましくは少なくとも１０個、増加させることによって長くする請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記適合されたＲＮＡの保持時間を、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数を前記元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、更により好ましくは少なくとも５個、最も好ましくは少なくとも１０個、減少させることによって短くする請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記クロマトグラフィーカラムが、ＨＰＬＣカラムである請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記クロマトグラフィーカラムが、固定相として逆相を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記クロマトグラフィーカラムが、ポリスチレン、非アルキル化ポリスチレン、アルキル化ポリスチレン、ポリスチレンジビニルベンゼン、非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼン、アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼン、シリカゲル、非極性残基で修飾されたシリカゲル、ブチル、オクチル、及び／又はオクタデシル含有残基から選択されるアルキル含有残基で修飾されたシリカゲル、フェニル残基で修飾されたシリカゲル、又はポリメタクリレートからなる群から選択される材料、好ましくは多孔質材料を含む請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記クロマトグラフィーカラムが、ビーズによって形成されたカラム又はモノリシックカラムである請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法であって、
ａ）元の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対してＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更することにより、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を適合させる工程；及び
ｂ）前記適合されたＲＮＡ種が、少なくとも１つの他のＲＮＡ種から分離されるクロマトグラフィー工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
工程ａ）が、請求項１から１３のいずれかに定義されたクロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更することを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記適合されたＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、前記少なくとも１つの他のＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数と、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個、更により好ましくは少なくとも５個、最も好ましくは少なくとも１０個、異なる請求項１４から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記適合されたＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、前記少なくとも１つの他のＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数と、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、より好ましくは少なくとも４０個、更により好ましくは少なくとも５０個、最も好ましくは少なくとも６０個、異なる請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのＲＮＡ種の同一性及び／又は完全性を決定する工程を更に含む請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法であって、
ａ）元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更することにより、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を適合させる工程；及び
ｂ）適合された配列を有する前記少なくとも１つのＲＮＡ種と、少なくとも１つの更なるＲＮＡ種とが共精製されるクロマトグラフィー工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
工程ａ）が、共精製される少なくとも２つのＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が適合されるＡ及び／又はＵヌクレオチドの目標数を決定することを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記共精製される少なくとも２つのＲＮＡ種のそれぞれの配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、２０個以下、より好ましくは３０個以下、更により好ましくは４０個以下、最も好ましくは５０個以下、異なる請求項１９から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記共精製される少なくとも２つのＲＮＡ種のそれぞれの配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、２個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは４個以下、更により好ましくは５個以下、最も好ましくは１０個以下、異なる請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記共精製される少なくとも２つのＲＮＡ種が、同一画分中に溶出する請求項１８から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法であって、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することにより、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を適合させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１から２３で定義された特徴のいずれかを更に含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記調和された少なくとも２つのＲＮＡ種のそれぞれの配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、２０個以下、より好ましくは３０個以下、更により好ましくは４０個以下、最も好ましくは５０個以下、互いに異なる請求項２４から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記調和された少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、２個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは４個以下、更により好ましくは５個以下、最も好ましくは１０個以下、互いに異なる請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することにより、少なくとも２つのＲＮＡ種の配列を適合させることを含む請求項２４から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を含む混合物の合成のための方法であって、
ａ）少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させることを含む工程であって、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列が、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することにより適合される工程；及び
ｂ）少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種の合成工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３０】
工程ｂ）が、前記少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を別々に合成することを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程ｂ）が、前記少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を混合することを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程ｂ）が、１つのバッチにおける、前記少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種の合成を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
工程ｂ）が、インビトロ転写工程を含む請求項２９から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から２８のいずれかで定義された特徴のいずれかによって更に特徴付けられる請求項２９から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのＲＮＡ又はＲＮＡ種が、少なくとも３０個、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは少なくとも１００個、更により好ましくは少なくとも２００個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも５００個のヌクレオチドを含む請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、又は２９から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのＲＮＡ又はＲＮＡ種が、モノシストロン性、ビシストロン性、又はマルチシストロン性である請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、又は３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つのＲＮＡ又はＲＮＡ種が、コードＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、３５、又は３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのＲＮＡ又はＲＮＡ種が、５’キャップ構造を含む請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、又は３５から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種がコード領域を含むｍＲＮＡであり、元のＲＮＡ配列のコード領域が最適化されたコード配列を含み、
前記最適化されたコード配列が、Ｃ最大化コード配列、Ｇ／Ｃ増加コード配列、Ｇ／Ｃ最適化コード配列、ヒトコドン使用最適化コード配列、ＣＡＩ最大化コード配列、又はそれらの任意の組合せから選択され、
コードされたアミノ酸配列は、好ましくは、対応する野生型ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して変更されない請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、又は３５から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種がコード領域を含むｍＲＮＡであり、
少なくとも１つのコード領域が、Ｇ／Ｃ最適化された核酸配列を含む請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、又は３５から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種が、少なくとも１つのヒストンステムループを含む請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、又は３５から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種が、３’−ＵＴＲを含む請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、又は３５から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記３’−ＵＴＲが、ポリ（Ａ）配列及び／又はポリ（Ｃ）配列を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記３’−ＵＴＲが、少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲエレメントを含む請求項４２から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲエレメントが、アルブミン遺伝子、アルファ−グロビン遺伝子、ベータ−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子、又は前記核酸配列のホモログ、断片、又は変異体からなる群から選択される遺伝子の３’ＵＴＲに由来する核酸配列を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種が、５’−ＵＴＲを含む請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、又は３５から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記５’−ＵＴＲが、少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲエレメントを含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲエレメントが、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは対応するＲＮＡ配列に由来する核酸配列、又は好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠くそのホモログ、断片、若しくは変異体を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲエレメントが、リボソームタンパク質をコードするＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲ、好ましくは対応するＲＮＡ配列に由来する核酸配列、又は好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠く前記核酸配列のホモログ、断片、若しくは変異体を含む請求項４７から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲエレメントが、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードするＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくはＲＰＬ３２又はＲＰＬ３５Ａに由来する、又はＨＳＤ１７Ｂ４、ＡＴＰ５Ａ１、ＡＩＧ１、ＣＯＸＣ６、又はＡＢＣＢ７（ＭＤＲ）からなる群から選択される遺伝子に由来する核酸配列、又は好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠くこれらの遺伝子のいずれかのホモログ、断片、若しくは変異体を含む請求項４７から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種が、好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメントを含む請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、又は２９から５０のいずれかに記載の方法：
ａ）５’キャップ構造；
ｂ）任意に、５’−ＵＴＲエレメント；
ｃ）少なくとも１つのコード領域；
ｄ）３’−ＵＴＲエレメント；
ｅ）任意に、好ましくは１０〜２００個、１０〜１００個、４０〜８０個、又は５０〜７０個のアデニンヌクレオチドを含むポリ（Ａ）配列；
ｆ）任意に、好ましくは１０〜２００個、１０〜１００個、２０〜７０個、２０〜６０個、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドを含むポリ（Ｃ）配列；
ｇ）任意に、ヒストンステムループ；
ｈ）任意に、更なるポリ（Ａ）配列、又はこれらの核酸配列のいずれかの断片若しくは変異体。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種が、少なくとも１つのコード領域を含み、前記コード領域が、好ましくは、配列番号２６〜１４０７９、１４０８０〜１６２６４、１６２６５〜２８６４０、２８６４１〜３０５６８のいずれかに係る核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれかの断片若しくは変異体を含む請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、又は２９から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、又は３５から５２のいずれかに記載の方法によって得ることができることを特徴とするＲＮＡ、好ましくは適合されたＲＮＡ。
【請求項５４】
請求項５３に記載のＲＮＡに対応する又は請求項５３に記載のＲＮＡをコードする核酸配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項５５】
少なくとも２つのＲＮＡ種を含む組成物であって、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することにより、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列が適合されていることを特徴とする組成物。
【請求項５６】
少なくとも１つのＲＮＡ種の配列が、請求項１から１３、１４から１８、１９から２３、２４から２８、２９から３４、又は３５から５２のいずれかに定義された特徴のいずれかを含む方法によって適合されている請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、好ましくは請求項２４から２８のいずれかに記載の方法を使用することによって調和される請求項５５から５６のいずれかに記載の組成物。
【請求項５８】
前記組成物が、インフルエンザウイルスに由来するペプチド又はタンパク質、又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域を含む少なくとも１つのＲＮＡ種を含む請求項５５から５７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５９】
前記少なくとも１つのＲＮＡ種が、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）及び／又はインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）、又はそれらの断片若しくは変異体をコードする請求項５５から５８のいずれかに記載の組成物。
【請求項６０】
前記組成物が、任意に、薬学的に許容される担体を更に含む請求項５５から５９のいずれかに記載の組成物。
【請求項６１】
少なくとも１つのＲＮＡ種のＲＮＡが、好ましくはカチオン性又はポリカチオン性ポリマー、カチオン性又はポリカチオン性多糖、カチオン性又はポリカチオン性脂質、カチオン性又はポリカチオン性タンパク質、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド、又はそれらの任意の組合せから選択される１つ以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物と複合体化又は少なくとも部分的に複合体化又は会合している請求項５５から６０のいずれかに記載の組成物。
【請求項６２】
少なくとも１つのＲＮＡ種のＲＮＡが、脂質、好ましくはカチオン性又は中性脂質と複合体化又は会合し、それにより好ましくはリポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、又はナノリポソームを形成する請求項５５から６１のいずれかに記載の組成物。
【請求項６３】
請求項５３に記載のＲＮＡ又は請求項５５から６２のいずかに記載の組成物を含むことを特徴とするワクチン。
【請求項６４】
多価ワクチンである請求項６３に記載のワクチン。
【請求項６５】
更にアジュバントを含む、請求項５５から６２のいずれかに記載の組成物又は請求項６３から６４のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６６】
インフルエンザウイルスワクチン、好ましくは多価インフルエンザワクチンである請求項６３から６５のいずれかに記載のワクチン。
【請求項６７】
請求項５３に記載のＲＮＡ、請求項５５から６２のいずれかに記載の組成物、又は請求項６３から６６のいずれかに記載のワクチン、任意に、可溶化のための液体ビヒクル、及び任意に、前記成分の用法及び用量に関する情報を提供する技術的指示を含むことを特徴とするキット又はキットオブパーツ。
【請求項６８】
医薬として使用するための、請求項５５から６２のいずれかに記載の組成物、請求項６３から６６のいずれかに記載のワクチン、又は請求項６７に記載のキット又はキットオブパーツ。
【請求項６９】
障害を治療又は予防する方法であって、それを必要とする被験体に、治療有効量の請求項５５から６２のいずれかに記載の組成物、請求項６３から６６のいずれかに記載のワクチン、又は請求項６７に記載のキット又はキットオブパーツを投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項７０】
適合されたＲＮＡを提供するための方法であって、以下の工程：
ａ）任意に、元のＲＮＡ配列中のヌクレオチドの総数を決定する工程；
ｂ）前記元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を決定する工程；
ｃ）コードされたアミノ酸配列を変更せずに、少なくとも１つの代替コドンで置き換えることができる前記元のＲＮＡ配列中のコドンを決定する工程；
ｄ）少なくとも１つの元のコドンを代替コドンで置き換えることにより、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を予め設定した数のＡ及び／又はＵヌクレオチドに調整することであって、前記代替コドンが、前記元のコドンと同一のアミノ酸をコードし、更にＡ及び／又はＵヌクレオチドの含量が高いという特徴を有する工程；及び
ｅ）任意に、好ましくはインビトロ転写を介して、前記ＲＮＡを生成する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序
本発明は、クロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更する方法に関する。本発明はまた、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物からＲＮＡを精製するための方法に関する。更に、本発明は、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製する方法に関する。特に、本発明は、少なくとも２つのＲＮＡ種におけるＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法を提供する。本発明はまた、前記方法によって得られ得るＲＮＡ、前記ＲＮＡを含む組成物、又は前記ＲＮＡを含むワクチン、並びにそのようなＲＮＡ及び組成物を製造するための方法に関する。更に、本発明は、ＲＮＡ、組成物、又はワクチンを含むキット、特にキットオブパーツに関する。本発明は更に、障害又は疾患を治療又は予防する方法、ＲＮＡ、組成物、及びワクチンの第１及び第２の医学的使用に関する。更に、本発明は、適合されたＲＮＡ配列又は適合されたＲＮＡ混合物を提供するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リボ核酸（ＲＮＡ）に基づく治療法は、免疫療法、遺伝子治療、及び遺伝子ワクチンに使用することができる。それらは、多種多様な疾患の治療のための非常に特異的で且つ個別の治療オプションを提供することができる。
【０００３】
特定の医学的治療及び用途では、異なるＲＮＡ分子種を含むＲＮＡ混合物を適用することが望ましい。ＲＮＡ混合物に基づくそのような治療の例としては、病原体のいくつかの血清型（例えば、インフルエンザＡ及びＢウイルスの複数の血清型由来のヘマグルチン（ＨＡ））に対する保護を提供する多価ＲＮＡ混合物の適用；１つの病原体から異なる抗原（例えば、ＨＡ、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）などのインフルエンザ由来の異なる抗原）を提供するＲＮＡ混合物；癌抗原のいくつかのアイソフォーム又はバリアント（例えば、前立腺癌の文脈における前立腺特異抗原（ＰＳＡ））に対する保護を提供するＲＮＡ混合物；抗原の異なるエピトープを提供するＲＮＡ混合物；癌抗原（発現した抗原又は変異した抗原）の癌特異的及び／又は患者特異的混合物を含むＲＮＡ混合物；及び様々な抗体（例えば、１つ以上のタンパク質の異なるエピトープを標的とする抗体）をコードするＲＮＡ混合物、又はその他の治療的に活性なＲＮＡ混合物（例えば、分子治療用の酵素の異なるアイソフォーム、いくつかのタンパク質を補充する必要がある適応症の治療のための異なる治療用タンパク質をコードする）が挙げられる。
【０００４】
特許文献１で詳細に記載されているように、ＤＮＡレベルとＲＮＡレベルで様々な品質管理を実施する規制当局によって承認されたＲＮＡ製造プロセスの確立により、ＲＮＡに基づくの治療の分野で大きな前進が切られた。前記プロセスの重要な要素は、ＲＰ−ＨＰＬＣを介したＲＮＡ産物の分取精製である（特許文献２に記載）。
【０００５】
しかし、これまでのところ、ＲＮＡ製造方法は、１つの特定の治療標的をコードするＲＮＡ分子など、一度に１つの特定のＲＮＡ分子種を生成することにのみ適している。各ＲＮＡ分子種は、別々の生成プロセスで生成される必要がある。異なるＲＮＡ分子種を含むＲＮＡ混合物を生成するためには、別々の生成プロセスを実行する必要があり、別々に生成されたＲＮＡ分子種を混合して、ＲＮＡ混合物を生成する必要がある。したがって、いくつかのＲＮＡ分子種（例えば、インフルエンザウイルス抗原などの異なる抗原をコードするＲＮＡ）を含むＲＮＡ混合物（例えば、多価ワクチン）の従来の製造は、ＤＮＡテンプレートの生成、ＲＮＡ生成、及びＲＮＡ産物のＨＰＬＣ精製のための数回の実行を必要とするため、面倒で、費用がかかり、時間がかかる。経済的理由のほかに、特にパンデミックのシナリオの文脈では、ＲＮＡ混合物（多価ＲＮＡワクチンなど）の生産の促進は非常に有利であり得、公衆衛生にとって非常に重要である。したがって、ＲＮＡ混合物を同時に生産及び精製する、理想的には、１つの生産及び精製プロセスのみで行うことが望ましい。
【０００６】
ＲＮＡ混合物の同時生産、精製、及び分析は、多価／多価ワクチン、特に多価／多価インフルエンザＲＮＡワクチンの製造にとって特に重要である。有利なことに、そのような多価／多価インフルエンザＲＮＡワクチンの製造は、主要な生産プロセス（例えば、精製、分析など）の条件を変更することなく、（例えば、ワクチンの季節的適応；パンデミックシナリオのために）（１つ又は多くの）抗原の迅速な交換を可能にする。
【０００７】
最近、特許文献３に記載されるように、ＲＮＡ混合物に基づく治療薬の生産を経済的にし且つ加速させることを目的として、１つの生産プロセスで異なるＲＮＡ分子種を同時に生産する手順が開発された。
【０００８】
例えば、特許文献３に記載される各種ＲＮＡ分子種の共生産は、ＲＮＡ混合物に基づく治療薬の製造において、時間、人件費、生産コスト、及び生産能力（例えば、スペース、設備）を節約するであろう。しかしながら、得られたＲＮＡ混合物の同時分取精製（本明細書では「共精製」とも呼ばれる）のためのＲＰ−ＨＰＬＣの使用は、深刻な問題を伴う。ＲＮＡ混合物中の異なるＲＮＡ分子種は、一般に、（ＨＰＬＣでの保持時間が異なるため）異なる時点で溶出し、これにより、殆どの場合、ＨＰＬＣによる共精製が技術的に不可能になる（図１Ａと図１Ｂに示す）。例えば、ＨＰＬＣによる共精製は、ＲＮＡ混合物に含まれる異なるＲＮＡ分子種の全てが、本質的に同じ時点で溶出する場合にのみ可能であり、異なるＲＮＡ産物のピークが重なって、清浄な完全長ＲＮＡ産物混合物（ピーク画分）の分離と、不純物からの分離とを容易にする（図１Ｃ及び図１Ｄに示される）。
【０００９】
したがって、複数のＲＮＡ種を含むＲＮＡに基づく治療薬（例えば、多価ＲＮＡワクチン）などのＲＮＡ混合物の精製は、当技術分野で知られた現在の方法論では実行可能ではない。特に、ＲＮＡ混合物中の個々のＲＮＡ種の共精製は実行できない。しかし、そのような共精製は、例えば、抗原組成の季節的変化に適合させることができる多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）／多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）インフルエンザＲＮＡワクチンプラットフォームの開発の状況において、非常に望ましい。そのような状況では、抗原（インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）など）の迅速な交換が求められる。異なる抗原をコードする異なる種のＲＮＡ分子は、通常異なる時点で溶出するので、当該分野で利用可能な方法では、特にＨＰＬＣを介して、ＲＮＡ混合物から異なるＲＮＡ種を共精製することはできない。
【００１０】
同様の理由で、先行技術を使用する場合、ＲＮＡ混合物又は（多価）ワクチンの共ＨＰＬＣベースの品質管理（１つの生産プロセスで生産されるか、個別に生産及び混合）も行うことができない。ＲＮＡの混合物を含む治療薬の分析では、製剤の様々な成分（即ち、各種ＲＮＡ分子種）を、その存在、完全性、比率、及び量（品質管理パラメータ）の観点で特徴付けることができることが求められる。このような品質管理は、ＲＮＡ混合物の製造中又は製造後に、及び／又はバッチ放出品質管理として実施することができる。しかし、前記したように、ＲＮＡ混合物中の異なる種のＲＮＡ分子は、通常、異なる時点で溶出するので、ＨＰＬＣを介した個々のＲＮＡ分子種／又は完全なＲＮＡ混合物の品質／完全性の同時評価（「共分析」）（図１Ａ及び図１Ｂに示す）を強く阻害する。ＨＰＬＣによるＲＮＡ混合物の完全性の信頼できる測定は、各ＲＮＡ分子種のピーク面積の明確な識別が可能な場合（各ＲＮＡ分子種のＲＮＡ品質の同時測定；図１Ｅを参照）及び／又はＲＮＡ混合物中の異なるＲＮＡ種が本質的に同一時点で溶出し、ＨＰＬＣピークの本質的に完全な重なりをもたらす場合（ＲＮＡ混合物全体のＲＮＡ品質の決定；図１Ｃ及び図１Ｄを参照）にのみ可能である。
【００１１】
したがって、複数のＲＮＡ種を含むＲＮＡ治療薬（例えば、多価インフルエンザＲＮＡワクチン）などのＲＮＡ混合物の分析も、当技術分野で提供されている現在の方法論では実行可能ではない。特に、ＲＮＡ混合物中のＲＮＡ種の共分析は、可能ではない。例えば、共分析（例えば、ＨＰＬＣを介する共分析）を、抗原の迅速な交換が求められる多価ＲＮＡワクチンプラットフォームの場合に適用できない（例えば、インフルエンザワクチンなどの季節性ワクチンの場合など）。これは、異なる抗原（例えば、インフルエンザＨＡ及び／又はＮＡなど）をそれぞれコードするＲＮＡ分子の異なる種が、異なる時点で溶出し、通常、ＨＰＬＣピークの部分的な重なりをもたらすからである。
【００１２】
要約すると、前述の技術的な困難は、ＲＮＡ混合物の（共）精製と（共）分析を強力に妨げる。特に、一般的なＲＮＡ、特にＧＭＰグレードのＲＮＡの精製と分析の重要な要素を表す、ＲＰ−ＨＰＬＣは、ＲＮＡ混合物中の個々のＲＮＡ種の（共）精製と（共）分析には使用できない。更に、記載した問題点は、迅速に調整可能なＲＮＡワクチン（例えば、インフルエンザワクチンなど）を製造するための多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）／多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）ＲＮＡ製造プロセスの開発を促進するために解決する必要がある。
【００１３】
前記を要約すると、ＲＮＡ混合物の精製及び／又は分析を可能にするシステムに、充足されていない必要性が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１８０４３０Ａ１号
【特許文献２】国際公開第２００８／０７７５９２Ａ１号
【特許文献３】国際公開第２０１７１０９０１３４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、根底にある発明の目的は、ＲＮＡ、特にＲＮＡ混合物の精製及び／又は分析のためのシステムを提供することである。複数のＲＮＡ種を含むＲＮＡ混合物中の個々のＲＮＡ種の（共）精製及び／又は（共）分析のためのシステムを提供することが、本発明の更なる好ましい目的である。
【００１６】
この目的は、特許請求された主題によって解決される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本願は、本願の記載の一部である、電子形式の配列表と共に提出される。本願と共に提出された電子形式の配列表に含まれる情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。本明細書において「配列番号」に言及する場合、特段の断りがない限り、それぞれの識別子を有する配列表の対応する核酸配列又はアミノ酸配列が参照される。
【００１８】
明確さ及び読み易さのために、以下の定義を提供する。これらの定義について言及された技術的特徴は、本発明の各実施形態で読むことができる。これらの実施形態の文脈において、更なる定義及び説明が具体的に提供されることがある。
【００１９】
定義：
適応免疫応答：本明細書で使用される「適応免疫応答」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、免疫系の抗原特異的応答を意味することが意図される。抗原特異性は、特定の病原体又は病原体に感染した細胞に合わせた応答の生成を可能にする。これらの調整された応答をもたらす機能は、通常、「記憶細胞」（Ｂ細胞）によって体内で維持される。本発明の文脈において、抗原は、少なくとも１つの抗原性ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡコード領域によって提供される。
【００２０】
適応免疫系：適応免疫系は、本質的に、病原体増殖の排除又は予防に主に寄与する。それは、通常、脊椎動物の免疫系に、特定の病原体を認識及び記憶させ（免疫を生成する）、当該病原体に遭遇するたびにより強力な攻撃を行う能力を付与することにより、適応免疫応答を調節する。
【００２１】
アジュバント／アジュバント成分：最も広い意味でのアジュバント又はアジュバント成分は、典型的には、薬剤又はワクチンなどの他の剤の効果を増強し得る薬理学的及び／又は免疫学的な剤である。それは広い意味で解釈されるべきであり、物質の広範な物質を意味する。通常、これらの物質は、抗原の免疫原性を高めることができる。例えば、アジュバントは、自然免疫系によって認識され得、例えば、自然免疫応答を誘発し得る。「アジュバント」は、通常、適応免疫応答を誘発しない。その意味で、「アジュバント」は、抗原ではない。それらの作用機序は、適応免疫応答をもたらす抗原によって引き起こされる作用とは異なる。
【００２２】
抗原：本発明の文脈において、「抗原」は、典型的には、免疫系、好ましくは適応免疫系によって認識され得、抗原特異的免疫応答を、例えば、適応免疫応答の一部としての、抗体及び／又は抗原特異的Ｔ細胞の形成によって誘発することができる物質である。典型的には、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチド又はタンパク質であり得るか又は含み得る。本発明の意味において、抗原は、本明細書で定義される提供されたＲＮＡの翻訳の産物であり得る。この文脈においては、少なくとも１つのエピトープを含むペプチド及びタンパク質の断片、変異体、及び誘導体もまた、抗原として理解される。本発明の文脈では、本明細書で定義される腫瘍抗原及び病原性抗原が特に好ましい。
【００２３】
ビシストロン性ＲＮＡ、マルチシストロン性ＲＮＡ：ビシストロン性又はマルチシストロン性ＲＮＡは、典型的には、２つの（ビシストロン性）又はそれ以上（マルチシストロン性）のコード領域を通常有し得るＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである。この文脈におけるコード領域は、ペプチド又はタンパク質に翻訳可能なコドンの配列である。
【００２４】
担体／ポリマー担体：本発明の文脈において、担体は、典型的には、他の化合物（カーゴ）の輸送及び／又は複合体形成を促進する化合物であることができる。ポリマー担体は、典型的には、ポリマーで形成される担体である。担体は、共有結合又は非共有結合性相互作用によって、そのカーゴに結合させてもよい。担体は、標的細胞に、核酸、例えばＲＮＡ又はＤＮＡを輸送することができる。担体は、いくつかの実施形態では、カチオン性成分である。
【００２５】
カチオン性成分：「カチオン性成分」という用語は、典型的には、通常１〜９のｐＨ値、好ましくは９未満（例えば、５〜９）のｐＨ値、又は８未満（例えば、５〜８）、７未満（例えば、５〜７）、最も好ましくは生理学的ｐＨ、例えば、７．３〜７．４で正に帯電している（カチオン）荷電分子を意味する。したがって、カチオン性成分は、任意の正に帯電した化合物又はポリマー、好ましくは生理学的条件下、特にインビボでの生理学的条件下で正に帯電したカチオン性ペプチド又はタンパク質であり得る。「カチオン性ペプチド又はタンパク質」は、少なくとも１つの正に帯電したアミノ酸、又は１超の正に帯電したアミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＯｒｎから選択される）を含むことができる。したがって、「ポリカチオン性」成分も、所与の条件下で１超の正電荷を示す範囲内にある。
【００２６】
コード領域：本発明の文脈におけるコード領域は、典型的には、ペプチド又はタンパク質に翻訳され得るいくつかのヌクレオチドトリプレットの配列である。コード領域は、好ましくは、その５’末端に、開始コドン、即ち、通常はアミノ酸メチオニン（ＡＴＧ）をコードする３つの連続するヌクレオチドと、通常３ヌクレオチドの倍数の長さを有する後続の領域とを含む。コード領域は、好ましくは、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）で終結する。通常、これはコード領域の唯一の終始コドンである。したがって、本発明の文脈におけるコード領域は、好ましくは、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）で始まり、好ましくは終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧなど）で終わる、３で割ることができるヌクレオチドの数からなるヌクレオチド配列である。コード領域は単離されていてもよいし、又はより長い核酸配列、例えばベクター又はｍＲＮＡに組み込まれていてもよい。本発明の文脈において、コード領域は、「タンパク質コード領域」、「コード配列」、「ＣＤＳ」、「オープンリーディングフレーム」、又は「ＯＲＦ」とも呼ばれることがある。
【００２７】
配列の断片：配列の断片は、典型的には、例えば、核酸分子又はアミノ酸配列の完全長配列のより短い部分であり得る。したがって、断片は、典型的には、全長配列内の対応する一続き（ｓｔｒｅｔｃｈ）と同一である配列を含む又はからなる。本発明の文脈における配列の好ましい断片は、例えば、その断片が由来する分子中のエンティティの連続する一続きに対応するヌクレオチド又はアミノ酸などのエンティティ（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）の連続する一続きを含む又はからなり、これは、その断片が由来する全（即ち、全長）分子の少なくとも５％、１０％、２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。好ましくは、本明細書中で使用される配列の断片は、それが由来する配列と、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である。好ましくは、本明細書で使用される断片は、全長分子と比較して同一の生物学的機能又は特異的活性を有する。
【００２８】
異種配列：２つの配列は、同一遺伝子又は同一アレルに由来しない場合、通常、「異種」であると理解される。即ち、異種配列は、同一生物から誘導可能であり得るが、それらは、天然に（自然界では）同一ｍＲＮＡなどの同一核酸分子に存在しない。
【００２９】
ホモログ（核酸配列／アミノ酸配列の）：用語「ホモログ」は、典型的には、参照配列と関連しているが、好ましくは同一ではない、同一又は別の種の配列を意味する。「ホモログ」という用語は、オルソログ及びパラログを包含する。この文脈では、「オルソログ」は、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した、異なる種の遺伝子によってコードされるタンパク質である。オルソログは、進化の過程で同一機能を保持することが多い。したがって、オルソログのペアを比較すると、機能が失われていたり、取得されていたりすることある。「パラログ」は、ゲノム内での遺伝子重複を介して生成される遺伝子である。パラログはまた、新しい機能を進化させたり、最終的には偽遺伝子になる可能性もある。本発明の文脈において、核酸配列又はアミノ酸配列のホモログは、好ましくは少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％、参照配列と同一である。本明細書で使用される「ホモログ」は、参照分子中のエンティティ（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸残基など）の連続する一続きに対応するエンティティの連続する一続きからなり、これは、全（即ち、全長）参照分子の少なくとも５％、１０％、２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％を表す。
【００３０】
免疫原：本発明の文脈において、免疫原は、典型的には、免疫応答を刺激することができる化合物であると理解され得る。好ましくは、免疫原は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。特に好ましい実施形態では、本発明の意味での免疫原は、提供される核酸分子、好ましくは本明細書で定義されるＲＮＡ分子の翻訳産物である。通常、免疫原は、少なくとも適応免疫応答を誘発する。
【００３１】
免疫応答：免疫応答は、通常、特定の抗原に対する適応免疫系の特異的反応（いわゆる、特異的又は適応免疫応答）若しくは自然免疫系の非特異的反応（いわゆる、非特異的又は自然免疫応答）又はそれらの組合せであり得る。
【００３２】
免疫系：免疫系は、感染から生物を保護することができる。病原体が生物の物理的バリアを通過することに成功し、当該生物に侵入した場合、自然免疫系は、即時ではあるが非特異的な応答を提供する。病原体がこの自然応答を回避すると、脊椎動物は、第２の保護層である適応免疫系を有する。ここでは、免疫系は、感染中にその応答に適応して、病原体に対するその認識を改善する。この改善された応答は、病原体が排除された後も免疫記憶の形で保持され、この病原体に遭遇するたびに適応免疫系がより速く且つより強力な攻撃をもたらすことができるようにする。これによれば、免疫系は、自然免疫系と適応免疫系を含む。これら２つの部分はそれぞれ、通常、いわゆる体液性及び細胞性の成分を含む。
【００３３】
核酸配列／アミノ酸配列：核酸分子の配列は、典型的には、特定の個々の順序、即ちそのヌクレオチドの連続であると理解される。タンパク質又はペプチドの配列は、典型的には、その順序、即ち、そのアミノ酸残基の連続であると理解される。
【００３４】
ペプチド：ペプチド又はポリペプチドは、通常、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸モノマーのポリマーである。ペプチドは通常、５０個未満のモノマー単位を含む。それにもかかわらず、ペプチドという用語は、５０個を超えるモノマー単位を有する分子を除外するものではない。長いペプチドはポリペプチドとも呼ばれ、通常５０個〜６００個のモノマー単位を有する。しかし、本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、典型的には、それが言及する分子の長さによって限定されない。本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」はまた、５０個未満（例えば、１０個）のアミノ酸を含むペプチド又は６００個を超えるアミノ酸を含むペプチドに関してさえも使用され得る。
【００３５】
多価／多価ワクチン：多価ワクチン（「多価ワクチン」とも呼ばれる）は、典型的には、ウイルスの１超の株に由来する抗原（又はその断片若しくは変異体）若しくは同一ウイルスの異なる抗原（又はその断片若しくは変異体）、又はそれらの任意の組合せを含む。「多価ワクチン」という用語は、このワクチンが１超の価を有することを記述する。本発明の文脈において、多価ワクチン（例えば、インフルエンザワクチン、ノロウイルスワクチン）は、好ましくは、いくつかの（遺伝的に）異なるウイルスに由来する抗原ペプチド又はタンパク質をコードする核酸を含むか、又は（遺伝的に）同一のウイルスに由来する異なる抗原をコードする核酸、又はそれらの組合せを含むワクチンを含む。好ましい実施形態では、多価ワクチンは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００又はそれ以上の異なるＲＮＡ又はＲＮＡ種であり、好ましくは本明細書に記載されるものであり、それぞれが少なくとも１つの異なる抗原ペプチド又はタンパク質をコードする。多価ｍＲＮＡワクチンを製造する方法は、ＰＣＴ出願国際公開第２０１７１０９０１３４号に開示されている。
【００３６】
治療有効量：本発明の文脈における治療有効量は、典型的には、例えば病的状況の場合、発現されたペプチド又はタンパク質の病理学的レベルを変化させる、又は欠如する遺伝子産物に置き換わるなどの免疫応答などの医薬効果を誘発するのに十分な量であると理解される。
【００３７】
タンパク質：タンパク質は通常、１つ以上のペプチド又はポリペプチドを含む。タンパク質は通常、その生物学的機能を発揮するために必要になり得る３次元形態に折り畳まれる。
【００３８】
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ：ＲＮＡは、リボ核酸の一般的な略称である。ＲＮＡは、核酸分子、即ち、ヌクレオチドからなるポリマーである。これらヌクレオチドは、通常、所謂骨格に沿って互いに結合しているアデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、グアノシン一リン酸、及びシチジン一リン酸のモノマーである。骨格は、第１のモノマーの糖（即ち、リボース）と第２の隣接するモノマーのリン酸部分との間のホスホジエステル結合によって形成される。特定の連続するモノマーをＲＮＡ配列と呼ぶ。通常、ＲＮＡは、例えば、細胞内部のＤＮＡ配列の転写によって得ることができる。真核細胞では、転写は、通常、核又はミトコンドリア内部で実施される。典型的には、ＤＮＡの転写により、通常、所謂未成熟ＲＮＡが得られ、これは、所謂メッセンジャーＲＮＡ（通常、ｍＲＮＡと略される）にプロセシングされなければならない。例えば、真核生物における未成熟ＲＮＡのプロセシングは、スプライシング、５’−キャッピング、ポリアデニル化、核又はミトコンドリアからのエクスポートなどの様々な異なる転写後修飾を含む。これらプロセス全体をＲＮＡの成熟とも呼ぶ。成熟メッセンジャーＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的に、成熟ｍＲＮＡは、５’−キャップ、５’−ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’−ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。メッセンジャーＲＮＡの他に、転写及び／又は翻訳の調節に関与している可能性があるいくつかの非コードタイプのＲＮＡが存在する。
【００３９】
配列同一性、（配列の）同一性：同じ長さ及び順序のヌクレオチド又はアミノ酸を有する場合、２以上の配列は同一である。同一性の割合は、典型的に、２つの配列が同一である程度について説明する。即ち、典型的に、その配列位置においてレファレンス配列の同一ヌクレオチドと一致するヌクレオチドの割合について説明するものである。同一性の程度を決定するために、比較する配列は、同じ長さ、即ち、比較する配列のうちの最長の配列の長さを有するとみなされる。これは、８ヌクレオチドからなる第１の配列が、前記第１の配列を含む１０ヌクレオチドからなる第２の配列と８０％同一であることを意味する。したがって、本発明の文脈においては、配列の同一性は、好ましくは、同じ長さを有する２つ以上の配列において同じ位置を有する配列のヌクレオチドのパーセンテージに関する。したがって、例えば、第１の配列の位置は、第２の配列の対応する位置と比較することができる。第１の配列の位置が、第２の配列の位置の場合と同じ成分（残基）で占められている場合、２つの配列は、この位置で同一である。そうでない場合、これらの配列は、この位置で異なる。第１の配列と比較して第２の配列に挿入が生じた場合、第１の配列にギャップを挿入して、更なるアラインメントを行うことができる。第１の配列と比較して第２の配列で欠失が生じた場合、第２の配列にギャップを挿入して、更なるアラインメントを行うことができる。次いで、２つの配列が同一であるパーセンテージを、同一の位置の数を、１つの配列にのみ占められる位置を含む位置の総数で除する関数である。２つの配列が同一であるパーセンテージは、数学的アルゴリズムを使用して決定できる。使用できる数学的アルゴリズムの好ましいが限定的ではない例としては、Ｋａｒｌｉｎら（１９９３），ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７又はＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。このプログラムにより、本発明の配列とある程度同一である配列を同定することができる。
【００４０】
トランスフェクション：用語「トランスフェクション」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分子などの核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを意味する。本発明において、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳類細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法を含む。かかる方法は、例えば、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミンなど）に基づくトランスフェクションを含む。好ましくは、非ウイルス的に導入される。
【００４１】
ワクチン：ワクチンは、通常、少なくとも１つの抗原、好ましくは免疫原を提供する予防又は治療物質であると理解される。抗原又は免疫原は、ワクチン接種に適した任意の材料に由来し得る。例えば、抗原又は免疫原は、細菌又はウイルス粒子などのような病原体、又は腫瘍又は癌性組織に由来し得る。抗原又は免疫原は、身体の適応免疫系を刺激して、適応免疫応答をもたらす。
【００４２】
ベクター：用語「ベクター」は、核酸分子、好ましくは人工核酸分子を意味する。本発明におけるベクターは、コード領域を含む核酸配列などの所望の核酸配列を組み込むか又は有するのに好適である。かかるベクターは、ストレージベクター、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクターなどであってよい。ストレージベクターは、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を便利に保管することができるベクターである。したがって、このベクターは、例えば、所望のｍＲＮＡ配列又はその一部に相当する配列（例えば、ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲコード領域に相当する配列）を含んでいてよい。発現ベクターは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質などの発現産物を産生するために用いることができる。例えば、発現ベクターは、プロモータ配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列）などのベクターの一続きの配列の転写に必要な配列を含んでいてよい。クローニングベクターは、典型的に、核酸配列をベクターに組み込むために用いることができるクローニングサイトを含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってよい。トランスファーベクターは、細胞又は生物に核酸分子を移入するのに好適なベクター、例えば、ウイルスベクターであってよい。本発明におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクターであってもＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡ分子である。好ましくは、本願の意味におけるベクターは、クローニングサイト、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性因子）、及びベクターの増殖に好適な配列（例えば、複製起点）を含む。好ましくは、本願の文脈におけるベクターは、プラスミドベクターである。
【００４３】
ビヒクル：ビヒクルは、典型的に、化合物（例えば、薬学的に活性のある化合物）を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な材料であると理解される。例えば、薬学的に活性のある化合物を保管、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容できる液体であってよい。
【００４４】
配列の変異体：核酸配列又はアミノ酸配列の変異体は、通常、元の配列と１つ以上の残基、例えば１つ以上の置換、挿入、及び／又は欠失されたヌクレオチド又はアミノ酸残基が異なる。好ましくは、これらの変異体は、全長分子と比較して同一の生物学的機能又は特異的活性を有する。本発明の文脈において、核酸配列又はアミノ酸配列の変異体は、好ましくは少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％、参照配列と同一である。本明細書で使用される「変異体」は、参照分子中のエンティティ（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸残基など）の連続する一続きに対応するエンティティの連続する一続きを含む又はからなり、これは、全（即ち、全長）参照分子の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％を表す。
【００４５】
クロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更する方法：
本発明の一態様は、クロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更する方法に関する。特に、本発明は、複数のＲＮＡ種の混合物からのＲＮＡのクロマトグラフィー精製などの、ＲＮＡを精製するための方法を提供する。ＲＮＡの保持時間を変更することにより、本発明の方法は、好ましくは前記ＲＮＡの物理的分離を可能にする。
【００４６】
好ましい実施形態によれば、本発明は、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して、ＲＮＡ配列中のアデニン（Ａ）及び／又は（Ｕ）ウラシルヌクレオチドの数を変更することによってＲＮＡ（配列）を適合させる工程を含む、クロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更する方法に関する。
【００４７】
本発明者らは、驚くべきことに、ＲＮＡ中のＡ及びＵヌクレオチドの総数が、高圧（高圧）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、より好ましくは逆相ＨＰＬＣなどの、クロマトグラフィープロセスにおけるクロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間に影響を与えることを見出した。
【００４８】
本明細書で使用される「保持時間」という用語は、典型的には、注入された後、ＲＮＡなどの化合物がクロマトグラフィーカラムで費やす時間を意味する。サンプルに２つの化合物がある場合（例えば、ＲＮＡ混合物中の２つのＲＮＡ種）は、異なる保持時間を有し、各化合物はクロマトグラフィーカラムで異なる時間を費やす。保持時間は、通常、秒又は分単位で示される。
【００４９】
この文脈においては、所定のクロマトグラフィー法の分離係数は、ＲＮＡ配列中のアデニン（Ａ）及び／又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドの数を変更することによって調節できることも発明者らによって見出された。少なくとも２つのＲＮＡ種間のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数の差の増加は、分離係数の増加と相関していることが分かった（図１６を参照）。したがって、本発明の方法は、ＲＮＡ配列中のアデニン（Ａ）及び／又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドの数を変更することにより、クロマトグラフィー法の分離係数を上昇させるために使用され得る。Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数の少なくとも２つのＲＮＡ種間の差の減少は、分離係数の減少と相関している。したがって、本発明の方法は、ＲＮＡ配列中のアデニン（Ａ）及び／又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドの数を変更することにより、クロマトグラフィー法の分離係数を減少させるために使用され得る。
【００５０】
本明細書で使用するとき、「ＲＮＡ種」という用語は、通常、同一のじヌクレオチド配列を有する複数のＲＮＡ分子又は（少なくとも１つのＲＮＡ分子）に関する。
【００５１】
好ましくは、ＲＮＡ種の保持時間は、サンプルが移動相ストリームに注入された瞬間からピークが最大になる時点まで測定される、前記ＲＮＡ種がカラムから移動又は溶出するのに必要な時間である。或いは、サンプルが注入された瞬間から出口での最初の非保持ＲＮＡの出現までの時間を測定することによって、保持時間を決定することもできる。好ましい実施形態では、保持時間の所定の流量への依存性は、対応する保持容量を計算することによって除かれ、これは通常、保持時間に移動相の体積流量を乗じたものとして計算される。したがって、好ましい実施形態では、保持体積は、本発明に係る方法によって変更することができる。
【００５２】
ＲＮＡの保持時間は本発明の方法によって変更され、保持時間は、好ましくは増加又は減少される。特に、元のＲＮＡ（配列）の保持時間は、前記元のＲＮＡ（配列）中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変えることにより変更され、それにより変更された保持時間を有する適合されたＲＮＡ（配列）が得られる。この文脈では、「元のＲＮＡ（配列）」という用語は、任意のＲＮＡ（配列）を意味することがあり、その保持時間は、本明細書に記載の方法によって変更することができる。したがって、「元のＲＮＡ（配列）」は、野生型ＲＮＡ配列であることがある。更に、修飾されたＲＮＡ配列、好ましくは最適化されたＲＮＡ配列、より好ましくは本明細書に記載されている配列（例えば、そのＧ／Ｃ含量に関して修飾された（最適化された）ＲＮＡ配列）も、本発明の意味における「元のＲＮＡ（配列）」として使用できる。本明細書で使用される「適合されたＲＮＡ（配列）」という用語は、元のＲＮＡ（配列）に由来し、それとはＡ及び／又はＵヌクレオチドの総数が異なるＲＮＡ（配列）を意味することが好ましい。言い換えれば、適合されたＲＮＡ（配列）は、本発明方法によって、特に、元のＲＮＡ（配列）中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更すること、したがって、好ましくはＲＮＡの保持時間を変更することによって得ることができる。好ましい実施形態では、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数、又はそれぞれのヌクレオチド位置での対応する配列変化のみが元のＲＮＡ（配列）とは異なる、適合されたＲＮＡ（配列）が本発明の方法によって得られる。
【００５３】
したがって、元のＲＮＡの保持時間は、典型的に、本発明の方法によって変更され、適合されたＲＮＡの保持時間は、元のＲＮＡの保持時間に対して、好ましくは変更されており、より好ましくは増加又は減少される。
【００５４】
本明細書で使用するとき、「ＲＮＡ（配列）」という用語は、個々の化合物としてのＲＮＡ、又は好ましくは本明細書に記載されるようなＲＮＡ種、又は所定のＲＮＡ若しくはＲＮＡ種のヌクレオチド配列を意味し得る。本発明の文脈において、「ＲＮＡ種（ＲＮＡ  ｓｐｅｃｉｅｓ）」という用語は、典型的には、特定のヌクレオチド配列によって定義されるＲＮＡに関する。同一のヌクレオチド配列を有する複数のＲＮＡ分子は、本明細書では「ＲＮＡ種」と呼ばれることもある。
【００５５】
特に、本明細書で使用される「ＲＮＡ種」という用語は、同一のヌクレオチド配列を共有する第１の複数のＲＮＡ分子（又は同一のヌクレオチド配列を共有するＲＮＡ分子の集団）などの第１のＲＮＡ種を意味することがあり、前記ＲＮＡ種は、第１のＲＮＡ種のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を共有する第２の（又は更なる）複数のＲＮＡ分子などの第２の（又は更なる）ＲＮＡ種（又は、第１のＲＮＡ種のヌクレオチド配列と区別されるヌクレオチド配列を共有するＲＮＡ分子の第２（又は更なる）の集団）との混合物中に存在することが好ましい。
【００５６】
本明細書で使用される「ＲＮＡ」という用語は、限定なしに任意のタイプのＲＮＡを意味し得る。好ましくは、ＲＮＡという用語は、長鎖ＲＮＡ、コードＲＮＡ、非コードＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、線状ＲＮＡ（ｌｉｎＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、リボスイッチ、免疫刺激ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）、リボザイム、アプタマー、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、レトロウイルスＲＮＡ又はレプリコンＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、及びＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）からなる群から選択される分子又は分子種を意味する。好ましくは、ＲＮＡはコードＲＮＡである。特に好ましい実施形態によれば、本方法は、コードＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ、より好ましくは本明細書に記載されるものの保持時間を変更するために使用される。好ましい実施形態によれば、コードＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、本明細書に記載されるような長鎖ＲＮＡである。
【００５７】
本発明に係る方法は、好ましくは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、より好ましくはｓｓＲＮＡの保持時間を変更するために使用される。本明細書で使用するとき、「一本鎖ＲＮＡ」又は「ｓｓＲＮＡ」という用語は、通常、任意に（例えば、条件に基づいて）、二次構造要素（例えば、ヘアピン、ステムループなど）を含むことができる一本鎖ＲＮＡからなるＲＮＡ分子を意味する。本発明の文脈において、用語「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」は、典型的には、好ましくは（ヘテロ）二本鎖を形成する２つのＲＮＡ鎖を含むＲＮＡ分子を意味する。
【００５８】
好ましくは、本明細書で使用されるＲＮＡは、３０個超のヌクレオチドを含む。より好ましくは、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、スモールヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又は核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）から選択されない。特に好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、ｓｉＲＮＡではない。
【００５９】
好ましい実施形態によれば、方法は、長鎖ＲＮＡの保持時間を変更するために使用される。本明細書で使用される「長鎖ＲＮＡ」という用語は、典型的には、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドを含む、好ましくは本明細書に記載されるＲＮＡ分子を意味する。或いは、長鎖ＲＮＡは、少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、又は少なくとも８００個のヌクレオチドを含むことができる。長鎖ＲＮＡ分子は、少なくとも１００個のヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも２００個のヌクレオチドを更に含むことができる。本発明の文脈において、長鎖ＲＮＡは、更に好ましくは、３０〜５０．０００個のヌクレオチド、３０〜２００００個のヌクレオチド、１００〜２００００個のヌクレオチド、２００〜２００００個のヌクレオチド、２００〜１５０００個のヌクレオチド、５００〜２００００個のヌクレオチド、８００〜２００００個のヌクレオチド、８００〜５０００個のヌクレオチド、又は８００〜２０００個のヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「長鎖ＲＮＡ」という用語は、特定の種類のＲＮＡに限定されず、単に前記ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの数を意味する。例えば、長鎖ＲＮＡは、より好ましくは本明細書に記載されるように、コードＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡであり得る。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態によれば、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を決定する。本発明の文脈において、「Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数」という表現は、アデニン（Ａ）ヌクレオチドの総数、ウラシル（Ｕ）ヌクレオチドの総数、又はより好ましくは、Ａ及びＵヌクレオチドの総数を意味することができる。Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数は、好ましくは、目標数まで増減され、この目標数は、既知数、又は好ましくは本明細書に記載されるように予め定められた数であることができる。この目標数は、好ましくは、それぞれの目的にしたがって選択される。保持時間の変更は、通常、目標数と、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの元の数との差が大きいほど大きくなる。
【００６１】
したがって、本発明方法は、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を決定する工程と、適合されたＲＮＡ配列を得るためにＡ及び／又はＵヌクレオチドの前記数を増加又は減少させる工程とを含む。
【００６２】
本明細書中で使用するとき、「アデニンヌクレオチド」又は「Ａヌクレオチド」という用語は、典型的には、アデニンヌクレオチド又は好ましくは本明細書に記載される化学的に修飾されたＡヌクレオチドなどのその類似体を意味する。「ウラシルヌクレオチド」又は「Ｕヌクレオチド」という用語は、ウラシルヌクレオチド又は好ましくは本明細書に記載される化学的に修飾されたＵヌクレオチドなどのその類似体を意味する。この文脈において、「Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数」という表現は、アデニン（Ａ）ヌクレオチド及びアデニンヌクレオチド類似体の総数、ウラシル（Ｕ）ヌクレオチド及びウラシルヌクレオチド類似体の総数、又はより好ましくは、Ａヌクレオチド、アデニンヌクレオチド類似体、Ｕヌクレオチド、及びＵヌクレオチド類似体の総数を意味することもある。同様に、「グアニンヌクレオチド」又は「Ｇヌクレオチド」という用語は、グアニンヌクレオチド又は好ましくは本明細書に記載される化学的に修飾されたＧヌクレオチドなどのその類似体を意味し得る。「シトシンヌクレオチド」又は「Ｃヌクレオチド」という用語は、シトシンヌクレオチド又は好ましくは本明細書に記載される化学的に修飾されたＣヌクレオチドなどのその類似体を意味し得る。
【００６３】
本明細書においてＡ、Ｕ、Ｇ、又はＣヌクレオチドに言及する場合は、常に、好ましくは本明細書に記載されるそれぞれのヌクレオチド類似体、より好ましくは化学的に修飾されたヌクレオチドもその用語に含まれる。
【００６４】
本明細書において「ウラシルヌクレオチド」、「Ｕヌクレオチド」、又はウラシルヌクレオチドの類似体に言及する場合、これらの用語はまた、ＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列（例えば、本明細書に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡベクター）中のチミンヌクレオチドに関係することもある。
【００６５】
元のＲＮＡの長さは、元のＲＮＡ及び適合されたＲＮＡ中のヌクレオチドの総数が本質的に同じになるように変更されないことが好ましい。或いは、元のＲＮＡの長さを、ヌクレオチドの付加又は欠失によって増減させることもできる。
【００６６】
好ましい実施形態では、元のＲＮＡ配列中のＧ及び／又はＣヌクレオチドは、Ａ及び／又はＵヌクレオチドで置換され、それにより、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が変化する、特に増加する。
【００６７】
いくつかの実施形態によれば、本発明方法は、元のＲＮＡ配列のＧ及び／又はＣヌクレオチドをＡ及び／又はＵヌクレオチドで置換する工程を含む。
【００６８】
或いは、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドを、Ｇ及び／又はＣヌクレオチドで置換することができ、それにより、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が変化する、特に減少する。
【００６９】
いくつかの実施形態によれば、本発明方法は、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドをＧ及び／又はＣヌクレオチドで置換する工程を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態によれば、方法は、追加のヌクレオチド、好ましくはＧ及び／又はＣヌクレオチド、より好ましくはＡ及び／又はＵヌクレオチドをＲＮＡ配列に導入する工程も含み得る。ここで、ヌクレオチドは、元のＲＮＡ配列の非コード領域に挿入されることが好ましい。
【００７１】
好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１つのコード領域を含むＲＮＡの保持時間を変更する方法に関する。これらの実施形態では、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数は、好ましくは本明細書に記載されるように、好ましくはコード領域内で変更される。例えば、コード領域中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を増加させるために、コード領域中のＧ及び／又はＣヌクレオチドをＡ及び／又はＵヌクレオチドで置き換える。或いは、コード領域中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を減少させるために、コード領域中のＡ及び／又はＵヌクレオチドをＧ及び／又はＣヌクレオチドで置き換えることができる。
【００７２】
特に好ましい実施形態では、ＲＮＡ中の少なくとも１つのコード領域におけるＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、元のＲＮＡ（配列）のコード配列によってコードされるアミノ酸配列を改変することなく変更される。遺伝暗号の縮重により、コード領域のコドンの交換が可能になり、コードされるアミノ酸配列を変更しない。したがって、本発明に係る方法は、好ましくは、ＲＮＡのコード領域内の少なくとも１つのコドンを同じアミノ酸をコードする代替コドンと交換することを含み、代替コドンは、好ましくは、元のコドンのＡ及び／又はＵの数と異なるＡ及び／又はＵヌクレオチドの数によって特徴付けられる。適合されたＲＮＡ配列を提供するための本発明方法の本明細書中の記載に言及し、ここで、適切なコドン交換の選択についてより詳細に説明する。
【００７３】
Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数は、好ましくは、保持時間が所定の目的のために十分に変更される程度まで増加又は減少させる。目的に応じて、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数は、所定の目標数に適合させることができる。例えば、所定の（元の）ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、混合物中に存在し且つ適合させるＲＮＡと共精製される別のＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数又は本質的に同じ数に適合され得る。本質的に同じ数のＡ及び／又はＵヌクレオチドを有するＲＮＡ種は、典型的には、ＨＰＬＣカラムなどのクロマトグラフィーカラムでの本質的に同じ保持時間によって特徴付けられる。したがって、これらのＲＮＡ種は、同一画分（ピーク）でカラムから溶出する。或いは、混合物中の別のＲＮＡ種のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数との差が、適合されたＲＮＡが別の画分（ピーク）で溶出するのに十分であるように、目標数を選択することができる（これは、各ＲＮＡ種の完全性を決定することを可能にする）。
【００７４】
好ましい実施形態において、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、適合されたＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、更により好ましくは少なくとも４個、更により好ましくは少なくとも５個、更により好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは少なくとも１５個、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数から異なるように変更される。或いは、適合されたＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、更により好ましくは少なくとも３０個、更により好ましくは少なくとも４０個、更により好ましくは少なくとも５０個、最も好ましくは少なくとも６０個、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数から異なるように変更される。或いは、適合されたＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、少なくとも６０個、好ましくは少なくとも８０個、より好ましくは少なくとも１００個、更により好ましくは少なくとも１２０個、更により好ましくは少なくとも１４０個、更により好ましくは少なくとも１６０個、最も好ましくは少なくとも２００個、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数から異なるように変更される。
【００７５】
好ましい実施形態によれば、方法は、元のＲＮＡの保持時間に対して適合されたＲＮＡの保持時間を増加させるために使用され、適合されたＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、更により好ましくは少なくとも４個、更により好ましくは少なくとも５個、更により好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは少なくとも１５個、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して増加される。或いは、適合されたＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、更により好ましくは少なくとも３０個、更により好ましくは少なくとも４０個、更により好ましくは少なくとも５０個、最も好ましくは少なくとも６０個、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して増加させることができる。或いは、適合されたＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、少なくとも６０個、好ましくは少なくとも８０個、より好ましくは少なくとも１００個、更により好ましくは少なくとも１２０個、更により好ましくは少なくとも１４０個、更により好ましくは少なくとも１６０個、最も好ましくは少なくとも２００個、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して増加させることができる。
【００７６】
方法は、また、元のＲＮＡの保持時間に対して適合されたＲＮＡの保持時間を減少させるために使用され、適合されたＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、更により好ましくは少なくとも４個、更により好ましくは少なくとも５個、更により好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは少なくとも１５個、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して減少される。或いは、適合されたＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、更により好ましくは少なくとも３０個、更により好ましくは少なくとも４０個、更により好ましくは少なくとも５０個、最も好ましくは少なくとも６０個、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して減少させることができる。或いは、適合されたＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、少なくとも６０個、好ましくは少なくとも８０個、より好ましくは少なくとも１００個、更により好ましくは少なくとも１２０個、更により好ましくは少なくとも１４０個、更により好ましくは少なくとも１６０個、最も好ましくは少なくとも２００個、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して減少させることができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、方法は、Ａヌクレオチドの数とＵヌクレオチドの数との比が０．２〜５、好ましくは０．５〜３、より好ましくは１〜３、更により好ましくは１〜２．５、更により好ましくは１．２〜２、更により好ましくは１．４〜２、更により好ましくは１．５〜２、最も好ましくは１．６〜２となるように、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更することによって元のＲＮＡ配列を適合させる工程を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態によれば、クロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間が変更され、ＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数を変更すると、ＲＮＡ配列のＵヌクレオチド数を変更するよりも、ＲＮＡの保持時間に強い影響を与える。好ましくは、Ａヌクレオチドの数を変更することによって達成される保持時間の変化は、約１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、又は２倍であり、好ましくは１．５倍であり、同じ数のＵヌクレオチドを変更することによって達成される保持時間の変化よりも強い。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数のＵヌクレオチドの数に対する比は、元のＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数のＵヌクレオチドの数に対する比に対して（Ａ及びＵヌクレオチドの総数を変更することなく）増加させ、適合されたＲＮＡの保持時間を長くする。
【００８０】
或いは、ＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数のＵヌクレオチドの数に対する比は、元のＲＮＡ配列のＡヌクレオチドの数のＵヌクレオチドの数に対する比に対して（Ａ及びＵヌクレオチドの総数を変更することなく）減少させ、適合されたＲＮＡの保持時間を短くする。
【００８１】
保持時間の所望の変更（減少又は増加）をもたらす任意の方法でＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更する工程を含む本発明方法の各実施形態は、個々の工程又はそれらの任意の組合せとして使用され得る。
【００８２】
したがって、本明細書に定義されるように、ＲＮＡの保持時間の増加は、好ましくは、元のＲＮＡ配列、好ましくはコード領域のＧ及び／又はＣヌクレオチドを、Ａ及び／又はＵヌクレオチドで置換する、及び／又は追加のＡ及び／又はＵヌクレオチドを元のＲＮＡ配列、好ましくはＵＴＲ領域に導入する、及び／又はＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数のＵヌクレオチドの数に対する比を、元のＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数のＵヌクレオチドの数に対する比に対して（Ａ及びＵヌクレオチドの総数を変更することなく）増加させることにより得ることができ、これらの適合はいずれも、元のＲＮＡ（配列）のコード領域によってコードされるアミノ酸配列を変更せずに好適に適用される。
【００８３】
したがって、本明細書に定義されるように、ＲＮＡの保持時間の減少は、元のＲＮＡ配列、好ましくはコード領域のＡ及び／又はＵヌクレオチドを、Ｇ及び／又はＣヌクレオチドで置換する、及び／又は追加のＧ及び／又はＣヌクレオチドを元のＲＮＡ配列、好ましくはＵＴＲ領域に導入する、及び／又はＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数のＵヌクレオチドの数に対する比を、元のＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数のＵヌクレオチドの数に対する比に対して（Ａ及びＵヌクレオチドの総数を変更することなく）減少させることにより得ることができ、これらの適合はいずれも、元のＲＮＡ（配列）のコード領域によってコードされるアミノ酸配列を変更せずに好適に適用される。
【００８４】
好ましい実施形態では、方法は、混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法に関して本明細書に記載されるように、及び／又は混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製する方法に関して本明細書に記載されるように、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更することによって元のＲＮＡ配列を適合させる工程を含む。
【００８５】
本発明に係る方法は、好ましくは、ＨＰＬＣカラムであるクロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更するための方法として提供される。この文脈において、方法は、好ましくは、ＲＮＡの分析的又は分取的精製に適した条件下でＲＮＡの保持時間を変更するために使用される。特に、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析スケール又は分取スケールでＲＮＡを精製するのに適したクロマトグラフィー手順及び実験条件は、当技術分野で知られており、例えば、その全体を参照により本明細書に援用する国際公開特許第２００８／０７７５９２号に記載されている。
【００８６】
好ましい実施形態では、方法は、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）におけるクロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更するために使用される。好ましくは、ＲＰ−ＨＰＬＣは、国際公開特許第２００８／０７７５９２号に記載されるものである。好ましい実施形態によれば、クロマトグラフィーカラムは、固定相として逆相を含む。逆相クロマトグラフィーでは、非極性化合物を固定相として使用することが好ましく、アセトニトリル及び／又はメタノールなどの水溶液などの極性溶媒を、溶出の移動相として使用することが好ましい。
【００８７】
固定相として使用されるカラムは、ビーズの形態、又は好ましくは重合した「ブロック」、即ちクロマトグラフィーカラムの実質的な部分を満たすブロックであるモノリシックカラムとして提供することができる。その正確な性質に関係なく、特に分取精製に用いられる場合、高分子固定相は、その性質が多孔質であることが好ましく、これは、ビーズ又はブロックが細孔によって特徴付けられることを意味する。他の実施形態では、逆相は、非多孔質逆相である。
【００８８】
好ましい実施形態では、特に分取精製に使用される場合、多孔質逆相材料は、８．０μｍ〜５０μｍ、特に８．０〜３０、更により好ましくは８．０〜２５μｍの粒子サイズで提供される。逆相材料は、小さなビーズの形態で存在してもよい。本発明に係る方法は、この粒子サイズを有する、任意にビーズの形態で多孔質逆相を用いて、特に有利に行うことができ、分取精製の場合に、特に良好な分離結果が得られる。
【００８９】
好ましい実施形態では、逆相は、１０００オングストローム〜５０００オングストロームの細孔サイズ、特に１０００オングストローム〜４０００オングストローム、より好ましくは１５００オングストローム〜４０００オングストローム、２０００オングストローム〜４０００オングストローム又は２５００オングストローム〜４０００オングストロームの細孔サイズを有する。逆相の特に好ましい細孔サイズは、１０００オングストローム〜２０００オングストローム、より好ましくは１０００オングストローム〜１５００オングストローム、最も好ましくは１０００オングストローム〜１２００オングストローム又は３５００〜４５００オングストロームである。他の実施形態では、逆相は、未定義の細孔サイズを有する多孔質逆相である。
【００９０】
１０００オングストローム〜５０００オングストロームの細孔サイズ、特に１０００オングストローム〜４０００オングストローム、より好ましくは１５００オングストローム〜４０００オングストローム、２０００オングストローム〜４０００オングストローム又は２５００オングストローム〜４０００オングストロームの細孔サイズは、混合物の他の成分からＲＮＡを分離するのに適していることがあり、このＲＮＡは、好ましくは長鎖ＲＮＡに関して本明細書で記載したサイズを有する、例えば最大約１５０００ヌクレオチド（一本鎖ＲＮＡ分子として）又は塩基対（二本鎖ＲＮＡ分子として）、特に１００〜１００００、より好ましくは５００〜１００００ヌクレオチド又は塩基対、更により好ましくは８００〜５０００ヌクレオチド又は塩基対、更により好ましくは８００〜２０００ヌクレオチド又は塩基対を有する。しかし、逆相の細孔サイズは、分離されるＲＮＡのサイズに応じて選択することもでき、即ち、より大きなＲＮＡ分子を分離しようとする場合、より大きな細孔サイズを選択することができ、より小さなＲＮＡ分子が選択される場合、より小さな細孔サイズを選択することができる。これは、ＲＮＡ分子の保持と分離が（逆）相の相互作用に依存するだけでなく、分子がマトリックスの細孔内に入る可能性にも依存するため、更なる保持効果を提供するという効果によるものである。したがって、限定されるものではないが、例えば、約２０００オングストローム〜約５０００オングストローム、より好ましくは約２５００〜約４０００、最も好ましくは約３５００オングストローム〜約４５００オングストロームの逆相の細孔サイズを使用して、より大きなＲＮＡ分子、例えば、１００〜１００００、より好ましくは５００〜１００００ヌクレオチド又は塩基対、更により好ましくは８００〜５０００ヌクレオチド又は塩基対、更により好ましくは８００〜２０００ヌクレオチド又は塩基対のＲＮＡ分子を分離することができる。或いは、限定されものではないが、約１０００オングストローム〜約２５００オングストローム、より好ましくは約１０００オングストローム〜約２０００オングストローム、最も好ましくは約１０００オングストローム〜１２００オングストロームの逆相の細孔サイズを使用して、より小さなＲＮＡ分子、例えば、約３０〜１０００、５０〜１０００又は１００〜１０００又は２０〜２００、２０〜１００、２０〜５０又は２０〜３０ヌクレオチドのＲＮＡ分子も、このように分離することができる。
【００９１】
一般に、逆相固定相として使用されることが知られている任意の材料、特に任意のポリマー材料を、本発明の文脈におけるクロマトグラフィー法に使用することができる。固定相は、有機及び／又は無機材料から構成することができる。本発明に使用されるポリマーの例としては、（非アルキル化又はアルキル化）ポリスチレン、（非アルキル化又はアルキル化）ポリスチレンジビニルベンゼン、シリカゲル、非極性残基で修飾されたシリカゲル、特にアルキル含有残基で修飾されたシリカゲル、より好ましくは、ブチル、オクチル、及び／又はオクタデシル含有残基で修飾されたシリカゲル、フェニル残基で修飾されたシリカゲル、ポリメタクリレートなど、又は、例えば、前記したゲルクロマトグラフィー又は他のクロマトグラフィー法のためのデキストランなどの他の好適な材料であり、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）材料、アガロース、デキストラン／アガロース混合物、ポリアクリルアミドなどが挙げられる。
【００９２】
好ましくは、クロマトグラフィーカラムは、ポリスチレン、非アルキル化ポリスチレン、アルキル化ポリスチレン、ポリスチレンジビニルベンゼン、非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼン、アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼン、シリカゲル、非極性残基で修飾されたシリカゲル、ブチル、オクチル、及び／又はオクタデシル含有残基から選択されるアルキル含有残基で修飾されたシリカゲル、フェニル残基で修飾されたシリカゲル、又はポリメタクリレートからなる群から選択される材料を含む。
【００９３】
特に好ましい実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、ポリスチレンポリマー、非アルキル化ポリスチレンポリマー、アルキル化ポリスチレンポリマー、非アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼンポリマー、アルキル化ポリスチレンジビニルベンゼン、シリカゲル、非極性残基で修飾されたシリカゲル、特にアルキル含有残基で修飾されたシリカゲル、より好ましくはブチル、オクチル、及び／又はオクタデシル含有残基で修飾されたシリカゲル、フェニル残基で修飾された多孔質シリカゲル、ポリメタクリレートを含む。これらの材料はいずれも、好ましくは本明細書に記載されているように多孔質であるか、又は非多孔質であってもよい。
【００９４】
ポリスチレンジビニルベンゼンの固定相は、それ自体知られている。ＨＰＬＣ法に既に使用されており、商業的に入手可能なそれ自体公知のポリスチレンジビニル−ベンゼンを、本発明の文脈におけるクロマトグラフィー法に使用することができる。
【００９５】
好ましい実施形態では、非アルキル化多孔質ポリスチレンジビニルベンゼンが特に好ましく、これは、限定されるものではないが、特に、８．０±１．５μｍ、特に８．０±０．５μｍの粒子サイズ、及び１０００〜１５００オングストローム、特に１０００〜１２００オングストローム又は３５００〜４５００オングストロームの細孔サイズを有し得る。
【００９６】
更なる実施形態では、アルキル化されたマクロ多孔質モノリシックポリスチレンジビニルベンゼンが特に好ましく、これは、限定されるものではないが、約０．１μｍ〜１０μｍ、特に約１μｍ〜１０μｍ、更に特には、約１μｍ〜６μｍの細孔サイズ分布を有し得る。
【００９７】
更なる実施形態では、多孔質シリカゲルが使用される。多孔質シリカゲルは、４：１のモル比で使用されるテトラエトキシシランとビス（トリエトキシシリル）エタンとから調製することができ、多孔質シリカゲルはオクタデシル炭素鎖で修飾されている。このような多孔質シリカゲルは市販されており、例えば、ＷａｔｅｒｓのＸＢＲＩＤＧＥＴＭ  ＯＳＴ  Ｃ１８又はＷａｔｅｒｓのＡＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＯＳＴ  Ｃ１８が挙げられる。
【００９８】
シリカゲルは、０．５〜５μｍ、好ましくは０．７〜４μｍ、より好ましくは１〜３μｍ、更により好ましくは１．５〜２μｍ、最も好ましくは１．７μｍの粒子サイズを有することができる。多孔質シリカゲルの細孔サイズは、５０〜３００オングストローム、好ましくは７０〜２５０オングストローム、より好ましくは１００〜２００オングストローム、更により好ましくは１２０〜１７０オングストロームであることができ、最も好ましくは１３５オングストロームである。
【００９９】
好ましい実施形態では、水性溶媒と有機溶媒の混合物が、ＲＮＡを溶出させるための移動相としてＨＰＬＣで使用される。特に６．０〜８．０、例えば約７、例えば７．０のｐＨを有する緩衝液を水性溶媒として使用することが好ましい。好ましくは、緩衝液は酢酸トリエチルアンモニウム、より好ましくは０．０２Ｍ〜０．５Ｍ、特に０．０８Ｍ〜０．１２Ｍ、更により好ましくは約０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液である。好ましい実施形態では、移動相で使用される有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、及びアセトン、又はそれらの混合物であり、非常に特に好ましくは、アセトニトリルである。特に好ましい実施形態では、移動相は、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７、及びアセトニトリルの混合物である。
【０１００】
ＲＮＡの保持時間を変更するための方法に関して本明細書に記載された個々の工程又は特徴（又はそのような工程又は特徴の組合せ）のいずれか１つは、本明細書に記載の本発明の他の態様のいずれか１つ、特に、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法、又は本明細書に記載される適合されたＲＮＡを提供するための方法に関しても適用することができる。
【０１０１】
混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法：
更なる態様では、本発明は、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法に関する。この方法は、好ましくは、本発明の他の態様、特にＲＮＡの保持時間を変更するための方法又は少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法に関して、本明細書に記載される方法工程のいずれか１つ又は特徴のいずれか１つ（若しくはそれらの組合せ）によって特徴付けられる。
【０１０２】
好ましい実施形態では、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法は、
ａ）元の配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対してＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更することにより、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を適合させる工程；及び
ｂ）適合されたＲＮＡ種が少なくとも１つの他のＲＮＡ種から分離されるクロマトグラフィー工程を含む。
【０１０３】
本発明の文脈において、「精製する」という用語は、サンプル中の所望のＲＮＡ（種）が、混合物、通常は溶液中に更に存在する別の化合物から分離及び／又は単離されることを意味すると理解される。これらの他の化合物は、例えば、不純物又は他のＲＮＡ種であることがあり、それから所望のＲＮＡ（種）が分離される。したがって、ＨＰＬＣ精製後、ＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製前の最初に導入されたＲＮＡ含有サンプルよりも純粋な形態で存在する。したがって、ＲＮＡ含有サンプル中の分離が必要な望ましくない成分は、特に、インビトロ転写反応に由来する不純物であることがあり、例えば、分解したＲＮＡ断片又は転写の早期終了の結果として生じた断片、更にはプラスミドが完全には線状化されない場合の過度に長い転写産物などが挙げられる。更に、酵素（例えば、ＲＮａｓｅ及びポリメラーゼ）並びにヌクレオチドなどの不純物も分離することができる。
【０１０４】
本発明に係る方法を使用して、出発物質よりも精製後に高い純度を有するＲＮＡが精製される。この点で、純度は可能な限り１００％に近いことが望ましい。このようにして、７０％超、特に８０％、更に特には９０％、最も好ましくは９９％以上の純度を達成することができる。
【０１０５】
好ましい実施形態によれば、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法は、ステップｂ）において、本明細書に記載され、国際公開第２００８／０７７５９２号に更に詳細に記載されるＨＰＬＣプロセス、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣプロセスを含む。
【０１０６】
好ましい実施形態によれば、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法は、分析精製プロセスとして、例えば、ＲＮＡ製造における品質管理において使用される。好ましくは、方法は、少なくとも１つのＲＮＡ種の同一性及び／又は完全性を決定するために使用される。例えば、混合物中の別のＲＮＡ種と同じ又は本質的に同じ保持時間を有し得、したがって、１つの画分（ピーク）に他のＲＮＡ種と共に溶出する１つのＲＮＡの配列を、適合後のＲＮＡ種が異なる保持時間を有するために適合させることができ、その結果、各ＲＮＡ種が溶出する画分（ピーク）の分離をもたらす（図１Ｅも参照）。
【０１０７】
好ましい実施形態によれば、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法は、少なくとも１つのＲＮＡ種の同一性及び／又は完全性を決定する工程を更に含む。
【０１０８】
「完全性」という用語は、本明細書に記載される分析精製プロセスに適用されるサンプル中に完全なＲＮＡ分子が存在するかどうかを記述する。完全なＲＮＡ分子が存在する場合、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物中の少なくとも１つのＲＮＡ種のＲＮＡ分子は、予想される長さを有する。不完全なＲＮＡ分子が存在する場合、ＲＮＡ分子の長さは、予想される長さ又は既知の長さとは異なる。ＲＮＡ分子の長さの低い完全性、即ち差は、特に、分解、切断、不正確な塩基対合、キャッピングの欠如又は不完全なキャッピング、ポリアデニル化の欠如又は不完全なポリアデニル化、又は不完全な転写が原因である可能性がある。これは、本明細書に記載される分析精製プロセス中のＲＮＡのＨＰＬＣピークの広がりにおいて明確である。
【０１０９】
分析精製プロセスでは、通常、より少量のＲＮＡがＨＰＬＣに付される。分析精製プロセスに付される典型的なＲＮＡの量は、約５μｇ未満、例えば、約４μｇ以下、約３μｇ以下、約２μｇ以下、約１μｇ以下、約５００ｎｇ以下、約４００ｎｇ以下、約３００ｎｇ以下、約２００ｎｇ以下、約１００ｎｇ以下、又は約５０ｎｇ以下であり得る。好ましくは、分析精製プロセスに付されるＲＮＡの量は、約１ｎｇ〜約５μｇ、約１０ｎｇ〜約４μｇ、約１０ｎｇ〜約３μｇ、約１０ｎｇ〜約２μｇ、約１０ｎｇ〜約１μｇ、又は約５０ｎｇ〜５μｇから選択される範囲である。より好ましくは、分析的精製プロセスに付されるＲＮＡの量は、少なくとも約１０ｎｇである。
【０１１０】
少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法はまた、分取スケールで使用されてもよい。特に、本発明に係る方法は、少なくとも１つの他の精製工程（例えば、ＨＰＬＣによる）で予め精製された混合物から適合されたＲＮＡ配列を精製するために使用され得る。
【０１１１】
分取精製プロセスでは、通常、より多くの量のＲＮＡがＨＰＬＣに付される。分取精製プロセスに付される典型的なＲＮＡの量は、５μｇ超、例えば、約１０μｇ以上、約１００μｇ以上、約１ｍｇ以上、約１０ｍｇ以上、約１００ｍｇ以上、約１ｇ以上、約１０ｇ以上、約１００ｇ以上、約１ｋｇ以上、約１０ｋｇ以上であり得る。好ましくは、分取精製プロセスに付されるＲＮＡの量は、約５μｇ〜約１０ｋｇ、約５μｇ〜約１ｋｇ、約５μｇ〜約５００ｇ、約５μｇ〜約１００ｇ、約５μｇ〜約５０ｇ、又は約５μｇ〜約１０ｇから選択される範囲である。
【０１１２】
好ましくは、方法の工程ａ）は、本明細書に記載されるように、クロマトグラフィーカラムで少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物からの少なくとも１つのＲＮＡ種の保持時間を変更する工程を含む。
【０１１３】
特定の実施形態において、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種の保持時間（元のＲＮＡ（配列）に対応する、その未変性／非適合状態のもの）は、それが分離されるＲＮＡ種の保持時間と本質的に同じである、又はそれぞれの保持時間が非常に近いので、ＲＮＡ種が同一画分（ピーク）又は重複する画分（ピーク）に溶出し、これらの画分は、ＲＮＡ種を物理的に分離できず、更に、少なくとも１つのＲＮＡ種の完全性を決定することができないものである。
【０１１４】
好ましい実施形態では、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、混合物中の他の成分からの少なくとも１つのＲＮＡ種の物理的分離が、クロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣ、より好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣによって可能になるように、本明細書に記載されるように変更される。少なくとも１つのＲＮＡ種の保持時間は、好ましくは、ＲＮＡ種が少なくとも１つの他の化合物（例えば、別のＲＮＡ種又は不完全配列などの不純物）を含まない別の画分（ピーク）に溶出するように変更され、少なくとも１つのＲＮＡ種がそれらから分離される。少なくとも１つの適合されたＲＮＡ種の変更された保持時間は、混合物中の少なくとも１つの更なるＲＮＡ種の保持時間とは異なり、それから、好ましくは物理的に、より好ましくはＨＰＬＣによって分離されることができる。
【０１１５】
特に好ましい実施形態によれば、方法の工程ａ）は、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を、少なくとも１つのＲＮＡ種の適合された配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、更により好ましくは少なくとも４個、更により好ましくは少なくとも５個、更により好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは少なくとも１５個、混合物中に存在し、それから適合されたＲＮＡ種が分離される少なくとも１つの他のＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数と異なるように適合させることを含む。或いは、少なくとも１つのＲＮＡ種の適合された配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個、更により好ましくは少なくとも３０個、更により好ましくは少なくとも少なくとも４０個、更により好ましくは少なくとも５０個、最も好ましくは少なくとも６０個、混合物中の別のＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数から異なり得る。
【０１１６】
好ましい実施形態、例えば、分析精製プロセスでは、方法の工程ａ）は、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を、少なくとも１つのＲＮＡ種の適合された配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも３０個、更により好ましくは少なくとも４０個、更により好ましくは少なくとも５０個、更により好ましくは少なくとも６０個、最も好ましくは少なくとも７０個、混合物中の別のＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数と異なり得るように適合させることを含む。
【０１１７】
好ましい実施形態、例えば、分取精製プロセスでは、方法の工程ａ）は、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を、少なくとも１つのＲＮＡ種の適合された配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、少なくとも８０個、好ましくは少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１２０個、更により好ましくは少なくとも１４０個、更により好ましくは少なくとも１８０個、更により好ましくは少なくとも２００個、最も好ましくは少なくとも２２０個、混合物中の別のＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数と異なり得るように適合させることを含む。
【０１１８】
好ましい実施形態によれば、例えば、分析精製プロセスでは、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種の配列が、適合されたＲＮＡのＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、それが分離される混合物中の少なくとも１つの他のＲＮＡ種の配列中のそれぞれの数と、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種の配列中のヌクレオチドの総数の少なくとも０．０５倍、少なくとも０．０６倍、少なくとも０．０７倍、少なくとも０．０８倍、少なくとも０．０９倍、少なくとも０．１倍、又は少なくとも０．１５倍に等しい又はそれを超える数が異なるように適合される。好ましい実施形態では、適合されたＲＮＡ中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、それが分離される混合物中の少なくとも１つの他のＲＮＡ種の配列のそれぞれの数と、精製される少なくとも１つのＲＮＡの配列中のヌクレオチドの総数の０．０６５倍に等しい又はそれを超える数が異なる。これらの実施形態では、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種は、それが分離されるＲＮＡ種と同じ長さを有する（即ち、同じ総量のヌクレオチドを含む）ことが好ましい。より好ましくは、ＲＮＡ種の長さは、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下異なる。
【０１１９】
好ましい実施形態によれば、例えば、分析精製プロセスでは、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種の配列が、適合されたＲＮＡ中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、それが分離される混合物中の少なくとも１つの他のＲＮＡ種の配列のそれぞれの数と、精製される少なくとも１つのＲＮＡの配列中のヌクレオチドの総数の少なくとも０．０１倍、少なくとも０．０２倍、少なくとも０．０３倍、少なくとも０．０４倍、又は少なくとも０．０５倍に等しい又はそれを超える数が異なるように適合される。これらの実施形態では、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種は、それが分離されるＲＮＡ種と同じ長さを有する（即ち、同じ総量のヌクレオチドを含む）ことが好ましい。より好ましくは、ＲＮＡ種の長さは、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下異なる。
【０１２０】
好ましい実施形態によれば、例えば、分取精製プロセスでは、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種の配列が、適合されたＲＮＡ中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、それが分離される混合物中の少なくとも１つの他のＲＮＡ種の配列のそれぞれの数と、精製される少なくとも１つのＲＮＡの配列中のヌクレオチドの総数の少なくとも０．２０倍、少なくとも０．２２倍、少なくとも０．２４倍、少なくとも０．２６倍、少なくとも０．２８倍、少なくとも０．３０倍、少なくとも０．３５倍に等しい又はそれを超える数が異なるように適合される。これらの実施形態では、精製される少なくとも１つのＲＮＡ種は、それが分離されるＲＮＡ種と同じ長さを有する（即ち、同じ総量のヌクレオチドを含む）ことが好ましい。より好ましくは、ＲＮＡ種の長さは、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下異なる。
【０１２１】
混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法：
更なる態様によれば、本発明は、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法を提供し、前記方法は、
ａ）元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対してＲＮＡ中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更することにより、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を適合させる工程；及び
ｂ）適合された配列を有する少なくとも１つのＲＮＡ種と、少なくとも１つの更なるＲＮＡ種とが共精製されるクロマトグラフィー工程を含む。
【０１２２】
この方法は、好ましくは、本発明の他の態様、特に、ＲＮＡの保持時間を変更するための方法又は少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製する方法に関して本明細書に記載した方法工程のいずれか１つ又は特徴のいずれか１つ（又はそれらの組合せ）を含む。
【０１２３】
この方法は、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するために使用することが好ましく、少なくとも２つのＲＮＡ種（未変性／非適合状態のもの）が異なる保持時間で特徴付けられ、これにより、少なくとも２つのＲＮＡ種が別々の画分（ピーク）で溶出することとなり、共精製が可能とならない。
【０１２４】
少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法では、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、好ましくは、ＲＮＡの保持時間が、適合されたＲＮＡと混合物中に共存する別の化合物（別のＲＮＡ種など）の保持時間と本質的に同一又は少なくとも十分に近くなるように変更され、適合されたＲＮＡと他の化合物（例えば、別のＲＮＡ種など）が、本明細書に記載されるクロマトグラフィー手順、好ましくはＨＰＬＣ、より好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣにより共精製されるようにする。適合されたＲＮＡと他の化合物（例えば、別のＲＮＡ種など）は、１つの画分で一緒にクロマトグラフィーカラムから溶出する（又はクロマトグラムでそれぞれ１つの単一ピークとして現れる）ことが好ましい。別のＲＮＡ種と本質的に同じ保持時間を有する適合されたＲＮＡを得るために、ＲＮＡ（配列）中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数の適合は、本明細書中において「（ピーク）調和（ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）」又は「保持時間の調和」と呼ぶこともある。より好ましくは、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、好ましくは、ＲＮＡ（種）の保持時間が、約２０％以下、好ましくは約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、０．５％以下、又は０．１％以下、適合されたＲＮＡと混合物中に共存する別の化合物（別のＲＮＡ種など）の保持時間と異なるように変更される。
【０１２５】
したがって、更なる態様では、本発明はまた、少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法を提供し、前記方法は、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を適合させることを含む。前記方法は、好ましくは、少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法に関して本明細書に記載される工程のいずれか１つ又は特徴のいずれか１つ（又はそれらの組合せ）を適用する。
【０１２６】
したがって、本明細書で使用される調和されたＲＮＡ種の保持時間は、好ましくは約２０％以下、より好ましくは約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、０．５％以下、又は０．１％以下だけ異なる。更により好ましくは、調和されたＲＮＡ種は、本質的に同一の保持時間によって特徴付けられる。
【０１２７】
更なる態様では、本発明は、好ましくは本明細書に記載される、少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を含む混合物の合成のための方法を提供し、前記方法は、
ａ）少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させることを含む工程であって、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列が、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対するＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更することにより適合される工程；及び
ｂ）少なくとも２つの調和したＲＮＡ種を合成する工程を含む。
【０１２８】
この方法の工程ａ）は、好ましくは、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することによって、複数のＲＮＡ配列の少なくとも１つのＲＮＡ配列の適合を含む。この点に関して、及び工程ｂ）に関して、クロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更するための本発明方法、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡを精製するための本発明方法、又は少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための本発明の方法の説明が言及される。前記方法の１つ以上に関して本明細書に記載される特徴のいずれか１つは、好ましくは、少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を含む混合物の合成のための本発明方法にも適用される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を含む混合物の合成のための方法の工程ａ）は、
ｉ）任意に、元のＲＮＡ配列のヌクレオチドの総数を決定すること；
ｉｉ）前記元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を決定すること；
ｉｉｉ）コードされたアミノ酸配列を変更せずに、少なくとも１つの代替コドンで置き換えることができる前記元のＲＮＡ配列のコドンを決定すること；
ｉｖ）少なくとも１つの元のコドンを代替コドンで置き換えることにより、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を、予め設定した数のＡ及び／又はＵヌクレオチドに調整することを含みことができ、前記代替コドンが、前記元のコドンと同一のアミノ酸をコードし、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの含量の高さによって更に特徴付けられる。
【０１３０】
少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を含む混合物の合成のための方法の工程ｂ）は、好ましくは、少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種の別々の合成を含む。調和されたＲＮＡ種の混合物を得るために、少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を一緒に混合することが好ましい。或いは、工程ｂ）は、１つのバッチ中における少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種の合成を含む。少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種は、当技術分野で知られた任意の方法、例えば、化学合成によって合成することができる。好ましくは、調和されたＲＮＡ種は、ＲＮＡインビトロ転写により合成される。
【０１３１】
この文脈で使用される「混合物」という用語は、好ましくは、固体、半固体、又は液体混合物を意味する。好ましくは、少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を含む混合物は、液体、より好ましくは水溶液であることができる。更に適切な溶媒、緩衝液、及び賦形剤は、当技術分野で知られており、特に本発明組成物に関して、本明細書中で更に説明する。好ましい実施形態では、少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を含む混合物の合成のための本発明方法によって得られる、少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種を含む混合物は、好ましくは、本明細書に記載の組成物（少なくとも２つのＲＮＡ種を含む）に関して記載された特徴のいずれか１つによって特徴付けられる組成物である。
【０１３２】
好ましい実施形態によれば、少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法（又は少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法又は少なくとも２つの調和されたＲＮＡ種の混合物を合成するための方法）は、共精製される（調和される）少なくとも２つのＲＮＡ種のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が適合されるＡ及び／又はＵヌクレオチドの目標数を決定する工程を含む。例えば、混合物が、本質的に同じ保持時間で特徴付けられる多くのＲＮＡ種を含み、２つ以上のＲＮＡ種を残りのＲＮＡ種から分離しようとする（即ち、共精製しようとする）場合、好ましくは本明細書に記載されるようにＡ及び／又はＵヌクレオチドの目標数を決定するが、この目標数は、本質的に同じ保持時間を有し、同じ画分（ピーク）内でクロマトグラフィーカラムから溶出し、混合物中の望ましくないＲＮＡ種からこれらのＲＮＡ種の（共）分離を可能にする共精製（又は調和）されるＲＮＡ種をもたらす数である。
【０１３３】
（逆相）ＨＰＬＣカラムなどのクロマトグラフィーカラムから同一画分（ピーク）で２つ（又はそれ以上）のＲＮＡ種を溶出するために、したがって、好ましくは分析スケールの精製において２つ（又はそれ以上）のＲＮＡ種の共精製を可能とするために、２つ（又はそれ以上）のＲＮＡ種のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、好ましくは、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、２０個以下、２１個以下、２２個以下、２３個以下、２４個以下、２５個以下、３０個以下、又は３５個以下、互いに異なる。好ましい実施形態では、ＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドは、好ましくは２個以下、より好ましくは３個以下、更により好ましくは４個以下、更により好ましくは５個以下、最も好ましくは６個以下、互いに異なる。更に好ましい実施形態では、ＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、１０個以下、好ましくは１５個以下、より好ましくは２０個以下、更により好ましくは２５個以下、最も好ましくは３０個以下、互いに異なる。２つ以上のＲＮＡ種におけるＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が同一であることが特に好ましい。
【０１３４】
分取スケール精製の場合、（逆相）ＨＰＬＣカラムなどのクロマトグラフィーカラムから同一画分（ピーク）で２つ（又はそれ以上）のＲＮＡ種を溶出するために、したがって、２つ（又はそれ以上）のＲＮＡ種の共精製を可能とするために、２つ（又はそれ以上）のＲＮＡ種のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、好ましくは、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１１個以下、１２個以下、１３個以下、１４個以下、１５個以下、１６個以下、１７個以下、１８個以下、１９個以下、２０個以下、２１個以下、２２個以下、２３個以下、２４個以下、２５個以下、３０個以下、３５個以下、４０個以下、４５個以下、５０個以下、５５個以下、６０個以下、６５個以下、７０個以下、７５個以下、８０個以下、８５個以下、９０個以下、９５個以下、１００個以下、１１０個以下、１２０個以下、１３０個以下、１４０個以下、又は１５０個以下、互いに異なる。好ましい実施形態では、ＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドは、好ましくは２個以下、より好ましくは３個以下、更により好ましくは４個以下、更により好ましくは５個以下、最も好ましくは６個以下、互いに異なる。更に好ましい実施形態では、ＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、１０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは３０個以下、更により好ましくは４０個以下、最も好ましくは５０個以下、互いに異なる。２つ以上のＲＮＡ種におけるＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が同一であることが特に好ましい。
【０１３５】
好ましい実施形態によれば、共精製される、好ましくは同じ長さを有するＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの総数に、０．００８以下、０．００７５以下、０．００７以下、０．００６５以下、０．００６以下、０．００５５以下、０．００５以下、０．００４５以下、０．００４以下、０．００３５以下、又は０．００３以下の数を掛けた数以下だけ異なる。より好ましくは、共精製される、好ましくは同じ長さを有するＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの総数に、０．００６５以下、好ましくは０．００６３以下の数を掛けた数以下だけ異なる。
【０１３６】
好ましい実施形態によれば、共精製される、好ましくは同じ長さを有するＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの総数に、０．０３０以下、０．０２５以下、０．０２０以下、０．０１５以下、０．０１４以下、０．０１３以下、０．０１２以下、０．０１１以下、０．０１０以下、０．００９以下、又は０．００８以下の数を掛けた数以下だけ異なる。
【０１３７】
修飾ＲＮＡ：
本発明の好ましい実施形態によれば、本明細書に記載されるＲＮＡ（種）は、修飾されたＲＮＡの形態であってもよく、本明細書で定義される任意の修飾を、ＲＮＡに導入することができる。本明細書で定義される修飾は、好ましくは、本明細書に記載される人工ＲＮＡをもたらし、それは更に安定化されている。
【０１３８】
したがって、実施形態によれば、ＲＮＡは、「安定化されたＲＮＡ」として、好ましくは「安定化されたｍＲＮＡ」として、即ち、インビボ分解（例えば、エキソ−又はエンドヌクレアーゼによる）に対して本質的に耐性であるＲＮＡとして提供されることができる。そのような安定化は、例えば、人工ＲＮＡの修飾されたリン酸骨格によって行うことができる。本発明に関連する骨格修飾は、前記に含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。これに関連して好ましく使用され得るヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオアート修飾リン酸骨格、好ましくはリン酸骨格に含まれるリン酸酸素の少なくとも１つが硫黄原子で置換されている。安定化されたＲＮＡは、例えば、帯電ホスホナート酸素が、アルキル又はアリール基に置き換わっているアルキル及びアリールホスホナート、又は帯電酸素残基がアルキル化形態で存在するホスホジエステル及びアルキルホスホトリエステルなどの非イオンホスファート類似体を更に含み得る。そのような骨格修飾は、限定することを意図するものではないが、典型的には、メチルホスホナート、ホスホルアミダート、及びホスホロチオアート（例えば、シチジン−５’−Ｏ−（１−チオホスファート）からなる群からの修飾を含む。
【０１３９】
以下に、本明細書に記載されるＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を好ましくは「安定化」させることができる具体的な修飾について記載する。
【０１４０】
化学修飾：
本明細書で使用される用語「核酸修飾」又は「ＲＮＡ修飾」は、骨格修飾並びに糖修飾又は塩基修飾を含む化学修飾を意味し得る。
【０１４１】
この文脈において、本明細書に記載される「修飾された」ＲＮＡはヌクレオチド類似体／修飾、例えば、骨格修飾、糖修飾、又は塩基修飾を含み得る。本発明に関連する骨格修飾は、本明細書に定義されるＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸が化学的に修飾される修飾である。本発明に関連する糖修飾は、本明細書に定義されるＲＮＡのヌクレオチドの糖の化学修飾である。更に、本発明に関連する塩基修飾は、人工ＲＮＡのヌクレオチドの塩基部分の化学修飾である。この文脈において、ヌクレオチド類似体又は修飾は、転写及び／又は翻訳に適用可能なヌクレオチド類似体から選択されることが好ましい。
【０１４２】
糖修飾：
本明細書に記載される修飾されたＲＮＡに含有させることができる、修飾されたヌクレオシド／ヌクレオチドは、糖部分で修飾されることができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を、多数の異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基で修飾又は置換することができる。「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（−ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、又は糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋などによって、同じリボース糖の４’炭素に結合された「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；及びアミノ基（−Ｏ−アミノ、ここでアミノ基（例えば、ＮＲＲ）は、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノであり得る）又はアミノアルコキシを含むがこれらに限定されない。
【０１４３】
「デオキシ」修飾は、水素、アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸）を含み、アミノ基はリンカーを介して糖に結合することができ、リンカーは原子Ｃ、Ｎ、及びＯの１つ以上を含む。
【０１４４】
糖基はまた、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含み得る。したがって、ＲＮＡは、糖として例えばアラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。
【０１４５】
骨格修飾：
リン酸骨格は、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドで更に修飾されてもよく、これらは、本明細書に記載されるように修飾ＲＮＡに含有されることができる。骨格のリン酸基は、酸素原子１つ以上を異なる置換基で置き換えることによって修飾することができる。更に、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、修飾されたリン酸による未修飾リン酸部分の完全置換を含むことができる。修飾されたリン酸基の例としては、ホスホロチオアート、ホスホロセレナート、ボラノホスファート、ボラノホスファートエステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミダート、アルキル又はアリールホスホナート、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオアートは、非結合酸素の両方が硫黄によって置き換わっている。リン酸リンカーは、結合酸素を窒素（架橋されたホスホロアミダート）、硫黄（架橋されたホスホロチオアート）、及び炭素（架橋されたメチレン−ホスホナート）で置き換えることによっても修飾することができる。
【０１４６】
塩基修飾：
本明細書に記載される修飾された核酸、好ましくはｍＲＮＡに含有させることができる、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは、核酸塩基部分で更に修飾されることができる。ＲＮＡなどの核酸中に存在する核酸塩基の例としては、アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本明細書に記載されるヌクレオシド及びヌクレオチドを、主溝面上で化学的に修飾することができる。いくつかの実施形態においては、主溝化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、又はハロ基を含むことができる。
【０１４７】
本発明の特に好ましい実施形態では、ヌクレオチド類似体／ヌクレオシド類似体が塩基修飾から選択され、これらは、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスファート、２−アミノプリン−リボシド−５’−トリホスファート；２−アミノアデノシン−５’−トリホスファート、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−トリホスファート、２−チオシチジン−５’−トリホスファート、２−チオウリジン−５’−トリホスファート、２’−フルオロチミジン−５’−トリホスファート、２’−Ｏ−メチル−イノシン−５’−トリホスファート  ４−チオウリジン−５’−トリホスファート、５−アミノアリルシチジン−５’−トリホスファート、５−アミノアリルウリジン−５’−トリホスファート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスファート、５−ブロモウリジン−５’−トリホスファート、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、５−ヨードシチジン−５’−トリホスファート、５−ヨード−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−ヨードウリジン−５’−トリホスファート、５−ヨード−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、５−メチルシチジン−５’−トリホスファート、５−メチルウリジン−５’−トリホスファート、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−トリホスファート、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−トリホスファート、６−アザシチジン−５’−トリホスファート、６−アザウリジン−５’−トリホスファート、６−クロロプリンリボシド−５’−トリホスファート、７−デアザアデノシン−５’−トリホスファート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスファート、８−アザアデノシン−５’−トリホスファート、８−アジドアデノシン−５’−トリホスファート、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−トリホスファート、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−トリホスファート、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−トリホスファート、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−トリホスファート、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−トリホスファート、シュードウリジン−５’−トリホスファート、又はピューロマイシン−５’−トリホスファート、キサントシン−５’−トリホスファートから選択される。５−メチルシチジン−５’−トリホスファート、７−デアザグアノシン−５’−トリホスファート、５−ブロモシチジン−５’−トリホスファート、及びシュードウリジン−５’−トリホスファートからなる群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが特に好ましい。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、及び４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジンを含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、及び４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジンを含む。
【０１５０】
他の実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、及び２−メトキシ−アデニンを含む。
【０１５１】
他の実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、イノシン、１−メチル−イノシン、ウィオシン（ｗｙｏｓｉｎｅ）、ウィブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオグアノシンを含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドを主溝面上で修飾させることができ、ウラシルのＣ−５上の水素をメチル基又はハロ基で置き換えることを含むことができる。
【０１５３】
具体的な実施形態では、修飾されたヌクレオシドは、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−シチジン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−ウリジン、又は５’−Ｏ−（１−チオホスファート）−シュードウリジンである。
【０１５４】
更に具体的な実施形態では、修飾されたＲＮＡは、６−アザ−シチジン、２−チオ−シチジン、アルファ−チオ−シチジン、シュード−イソ−シチジン、５−アミノアリル−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、Ｎ１−メチル−シュードウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、アルファ−チオ−ウリジン、４−チオ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン、デオキシ−チミジン、５−メチル−ウリジン、ピロロ−シチジン、イノシン、アルファ−チオ−グアノシン、６−メチル−グアノシン、５−メチル−シチジン、８−オキソ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、２−アミノ−６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン、シュード−イソ−シチジン、６−クロロ−プリン、Ｎ６−メチル−アデノシン、アルファ−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデノシンから選択されるヌクレオシド修飾を含むことができる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、本明細書で定義される少なくとも１つのコード領域を含み、前記コード領域は、好ましくはＮ（１）−メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）、シュードウリジン（Ψ）、５−メトキシウリジンから選択される少なくとも１つの修飾されたウリジンヌクレオシドを含む。或いは又は更に、本明細書で使用されるＲＮＡは、本明細書で定義される少なくとも１つのコード領域を含み、コード領域は、少なくとも１つの修飾されたシトシンヌクレオシド、好ましくは５−メチルシトシンを含む。
【０１５６】
脂質修飾：
更なる実施形態によれば、本明細書で定義される修飾されたＲＮＡは、脂質修飾を含むことができる。本明細書で定義されるそのような脂質修飾されたＲＮＡは、典型的には、そのＲＮＡと共有結合した少なくとも１つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合した少なくとも１つの脂質とを更に含む。或いは、脂質修飾されたＲＮＡは、本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡと、そのＲＮＡと（リンカーなしで）共有結合された少なくとも１つの（二機能性）脂質を含む。第３の選択肢によれば、脂質修飾されたＲＮＡは、本明細書で定義されるＲＮＡ分子と、そのＲＮＡと共有結合した少なくとも１つのリンカーと、それぞれのリンカーと共有結合した少なくとも１つの脂質と、更には、そのＲＮＡと（リンカーなしで）共有結合された少なくとも１つの（二機能性）脂質とを含む。この文脈では、脂質修飾が、線状ＲＮＡの末端に存在することが特に好ましい。
【０１５７】
元のＲＮＡの最適化されたコード配列：
「最適化されたコード配列」という用語は、対応する野生型コード配列と比較して少なくとも１つのコドン（１つのアミノ酸をコードするヌクレオチドのトリプレット）が異なるコード配列に関する。好ましくは、本発明の文脈における「最適化されたコード配列」のコドンは、インビボ分解に対する耐性の改善、及び／又はインビボでの安定性の改善、及び／又はインビボでの翻訳可能性の改善を示し得る。最も広い意味でのコドン最適化は、遺伝暗号の縮重を利用しており、複数のコドンが同じアミノ酸をコードし、互換的に使用されて、インビボ用途（例えば、ワクチン接種）のコード配列を最適化／変更することができる。
【０１５８】
特に好ましい実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種は、コード領域を含むｍＲＮＡであり、元のＲＮＡ配列のコード領域は、最適化されたコード配列を含み、最適化されたコード配列は、Ｃ最大化コード配列、Ｇ／Ｃ増加コード配列、Ｇ／Ｃ最適化コード配列、ヒトのコドン使用最適化コード配列、ＣＡＩ最大化コード配列、又はそれらの任意の組合せから選択される。
【０１５９】
特定の実施形態によれば、ＲＮＡ、特に元のＲＮＡのコード配列を最適化することができ、少なくとも１つのコード配列のＣ含量は、対応する野生型コード配列のＣ含量と比較して、増加させる、好ましくは最大化させることができる（本明細書では、「Ｃ最大化コード配列」と呼ぶ）。核酸配列のＣ最大化コード配列によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれの野生型核酸コード配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して、変わらないことが好ましい。前記したシトシン最適化ＲＮＡの生成は、国際公開第２０１５／０６２７３８号によるＣ最大化法を使用して好適に行うことができる。この文脈において、国際公開第２０１５／０６２７３８号の開示は、参照により本明細書に援用される。
【０１６０】
いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡ、特に元のＲＮＡのコード配列を最適化することができ、コード配列のＧ／Ｃ含量を、対応する野生型コード配列と比較して増加させることができる（本明細書では、「Ｇ／Ｃ増加コード配列」と呼ぶ）。「Ｇ／Ｃ増加コード配列」という用語は、対応する野生型核酸配列と比較して増加した数のグアノシン及び／又はシトシンヌクレオチドを含む、本発明のＲＮＡ、好ましくは元のＲＮＡのコード配列に関する。そのような増加した数は、アデノシン又はチミジンヌクレオチドを含むコドンを、グアノシン又はシトシンヌクレオチドを含むコドンで置換することによって生成することができる。濃縮されたＧ／Ｃ含量をＤＮＡ又はＲＮＡのコード配列で生じさせる場合、遺伝暗号の縮重を利用する。特に、ＲＮＡの場合、Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量が増加した配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含量が増加した配列よりも安定している。核酸配列のＧ／Ｃ含量修飾コード配列によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれの野生型核酸コード配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して変わらないことが好ましい。好ましくは、本発明の元のＲＮＡコード配列のＧ／Ｃ含量は、対応する野生型核酸コード配列のコード配列のＧ／Ｃ含量と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％増加する。
【０１６１】
好ましい実施形態によれば、ＲＮＡ、特に元のＲＮＡのコード配列を最適化することができ、コード配列のＧ／Ｃ含量を、対応する野生型コード配列のＧ／Ｃ含量と比較して最適化させることができる（本明細書では、「Ｇ／Ｃ最適化コード配列」と呼ぶ）。その文脈における「最適化された」とは、Ｇ／Ｃ含量が、好ましくは本質的に可能な限り最大のＧ／Ｃ含量にまで増加されたコード配列を意味する。核酸配列のＧ／Ｃ含量最適化コード配列によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれの野生型核酸コード配列によりコードされるアミノ酸配列と比較して変わらないことが好ましい。前記したＧ／Ｃ最適化ＲＮＡ配列の生成は、国際公開第２００２／０９８４４３号に説明されるＧ／Ｃ最適化方法を使用して好適に行うことができる。この文脈において、国際公開第２００２／０９８４４３号の開示の全範囲が、本発明に含まれる。
【０１６２】
特に好ましい実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種は、コード領域を含むｍＲＮＡであり、元のＲＮＡ配列の少なくとも１つのコード領域は、Ｇ／Ｃ最適化された核酸配列を含む。
【０１６３】
好ましい実施形態によれば、ＲＮＡ、特に元のＲＮＡのコード配列を最適化することができ、コドンコード配列は、ヒトのコドン使用に最適化することができる（本明細書では、「ヒトコドン使用最適化コード配列」と呼ぶ）。同じアミノ酸をコードするコドンは、被験体、例えば、ヒトで異なる頻度で生じる。したがって、本明細書で定義されるＲＮＡのコード配列は、同じアミノ酸をコードするコドンの頻度が、ヒトのコドン使用に係るそのコドンの自然発生頻度に対応するように最適化されることが好ましい。例えば、アミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、野生型コード配列は、コドン「ＧＣＣ」が０．４０の頻度で使用され、コドン「ＧＣＴ」が０．２８の頻度で使用され、コドン「ＧＣＡ」が０．２２の頻度で使用され、コドン「ＧＣＧ」が０．１０の頻度で使用されるなどのように適合されることが好ましい。したがって、（Ａｌａで例示される）このような手順は、ＲＮＡ、好ましくは元のＲＮＡのコード配列によってコードされる各アミノ酸に適用される。
【０１６４】
好ましい実施形態によれば、ＲＮＡ、特に元のＲＮＡのコード配列を最適化することができ、コドン適応指数（ＣＡＩ）を増加させる又は好ましくは最大化することができる（本明細書では「ＣＡＩ最大化コード配列」と呼ぶ）。したがって、細胞（例えば、ヒト）において比較的稀な野生型配列のコドンを全て、細胞において高頻繁であるそれぞれのコドンに交換されることが好ましく、ここで高頻繁コドンは、比較的稀なコドンと同じアミノ酸をコードする。適切には、最も頻度の高いコドンが、コードされた各アミノ酸に使用される。適切には、本発明のＲＮＡ、好ましくは元のＲＮＡは、少なくとも１つのコード配列を含み、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指数（ＣＡＩ）は、少なくとも０．５、少なくとも０．８、少なくとも０．９、又は少なくとも０．９５である。最も好ましくは、少なくとも１つのコード配列のコドン適応指数（ＣＡＩ）は、１である。例えば、本発明に係る核酸配列の少なくとも１つのコード配列によってコードされるアミノ酸配列中に存在するアミノ酸アラニン（Ａｌａ）の場合、野生型コード配列は、最も高頻度のヒトコドン「ＧＣＣ」が常に前記アミノ酸に使用されるように適合される。したがって、（Ａｌａで例示される）そのような手順は、ＲＮＡのコード配列、好ましくは元のＲＮＡによってコードされる各アミノ酸に適用され、ＣＡＩ最大化コード配列を得る。
【０１６５】
５’キャップ構造
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＲＮＡは、好ましくは本明細書に記載されるＲＮＡを安定化させる５’キャップ構造の付加によって修飾することができる。
【０１６６】
本明細書で使用される「５’−キャップ構造」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、修飾されたヌクレオチド（キャップ類似体）、特にグアニンヌクレオチドを意味することが意図され、ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ分子の５’末端に付加される。好ましくは、５’−キャップは、５’−５’−三リン酸結合を使用して付加される（ｍ７ＧｐｐｐＮとも呼ばれる）。５’−キャップ構造の更なる例としては、グリセリル、反転デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’−セコヌクレオチド、非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環状３，５ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分、３’−３’−反転脱塩基部分、３’−２’−反転ヌクレオチド部分、３’−２’−反転脱塩基部分、１，４−ブタンジオールリン酸、３’−ホスホルアミダート、ヘキシルリン酸、リン酸アミノヘキシル、３’−リン酸、３’−ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、又は架橋又は非架橋メチルホスホナート部分が挙げられる。本発明の文脈において使用され得る更に修飾された５’−キャップ構造は、ｃａｐ１（ｍ７ＧｐｐｐＮの隣接ヌクレオチドのリボースの更なるメチル化）、ｃａｐ２（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の２番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ｃａｐ３（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の３番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ｃａｐ４（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の４番目のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ）、修飾されたＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオアート修飾ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンである。
【０１６７】
５’キャップ（ｃａｐ０又はｃａｐ１）構造は、化学的ＲＮＡ合成又はキャップアナログを使用したＲＮＡインビトロ転写（共転写キャッピング）においても形成され得る。
【０１６８】
本明細書で使用される「キャップ類似体」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、核酸分子の５’末端に組み込まれたときに、翻訳又は局在化を促進する及び／又は核酸分子、特に、ＲＮＡ分子の分解を防止するというキャップ機能性を有する非重合性ジヌクレオチドを意味することが意図される。非重合性とは、キャップアナログが５’末端にのみ組み込まれることを意味する。これは、５’三リン酸を有さず、テンプレート依存性ポリメラーゼ、特にテンプレート依存性ＲＮＡポリメラーゼによって３’方向に伸長できないからである。キャップ類似体の例としては、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、又はアンチ反転キャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、７，２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの四リン酸誘導体）からなる群から選択される化学構造が挙げられるが、これらに限定されない。更なるキャップ類似体は、これまでに記載されている（国際公開第２００８／０１６４７３号、国際公開第２００８／１５７６８８号、国際公開第２００９／１４９２５３号、国際公開第２０１１／０１５３４７号、及び国際公開第２０１３／０５９４７５号）。その文脈における更なる適切なキャップ類似体は、国際公開第２０１７／０６６７９３号、国際公開第２０１７／０６６７８１号、国際公開第２０１７／０６６７９１号、国際公開第２０１７／０６６７８９号、国際公開第２０１７／０６６７８２号、国際公開第２０１７／０６６７９７号に記載されており、これらのキャップ類似体に関する開示を、参照により本明細書に援用する。
【０１６９】
好ましい実施形態では、５’−キャップ構造は、本明細書に記載されるＲＮＡインビトロ転写反応において、好ましくは本明細書に定義されるキャップアナログを使用して共転写により付加される。本発明の文脈における好ましいキャップアナログは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７Ｇ）又は３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。本発明の文脈における更に好ましいキャップアナログは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧであり、共転写によりｃａｐ１構造を生成する。
【０１７０】
別の実施形態では、５’−キャップ構造は、キャッピング酵素（例えば、ワクシニアウイルスキャッピング酵素、市販のキャッピングキット）を使用する酵素キャッピングを介して付加され、ｃａｐ０又はｃａｐ１又はｃａｐ２構造を生成する。他の実施形態では、５’−キャップ構造（ｃａｐ０、ｃａｐ１）は、例えば、キャッピングリアクタ内（国際公開第２０１６／１９３２２６号）で、固定化されたキャッピング酵素を使用する酵素キャッピングを介して付加される。
【０１７１】
ｍ７ＧｐｐｐＮ（ｃａｐ０）、ｃａｐ１、及びｃａｐ２は、ポリメラーゼＩＩによって転写されたＲＮＡに天然に存在する５’−キャップ構造であるので、この文脈では修飾されたＲＮＡに含まれる修飾とはみなされない。したがって、本発明の修飾されたＲＮＡ配列は、ｃａｐ０、ｃａｐ１、又はｃａｐ２を含み得るが、更に、修飾されたＲＮＡ配列は、本明細書で定義された少なくとも１つの更なる修飾を含み得る。
【０１７２】
ポリ（Ａ）配列
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＲＮＡは、ポリ（Ａ）配列又はポリ（Ａ）テールを含むことができる。
【０１７３】
「ポリ（Ａ）配列」、「ポリ（Ａ）テール」、又は「３’−ポリ（Ａ）テール」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、典型的にはＲＮＡの３’末端に位置する、最大約４００個のアデノシンヌクレオチドのアデノシンヌクレオチドの配列を意味する。本発明の文脈において、ポリ（Ａ）配列は、例えば、ベクターの転写などによるＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの生成のためのテンプレートとして機能するベクター内などにおけるｍＲＮＡ又は任意の他の核酸分子内に位置し得る。
【０１７４】
好ましい実施形態では、３’末端に好適に位置するポリ（Ａ）配列は、典型的には、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、好ましくは約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチド、より好ましくは約４０〜８０個のアデノシンヌクレオチド、又は更により好ましくは約５０〜７０個のアデノシンヌクレオチドである。好ましくは、本明細書で使用されるＲＮＡ中のポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡインビトロ転写によりＤＮＡテンプレートから誘導される。
【０１７５】
他の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＤＮＡテンプレートから必ずしも転写されるのではなく、化学合成の一般的な方法によってインビトロで得られる。
【０１７６】
更なる実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、市販のポリアデニル化キット及び当技術分野で公知の対応するプロトコルを使用する（ＲＮＡインビトロ転写後の）ＲＮＡの酵素的ポリアデニル化によって、又はそれに代えて、例えば、ポリアデニル化反応器（国際公開第２０１６１７４２７１号に記載）内での固定化ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用することによって生成される。
【０１７７】
或いは、本明細書で使用されるＲＮＡは、ポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルは、典型的には、アデニン及びウラシル／チミンヌクレオチドからなる六量体、好ましくは六量体配列ＡＡＵＡＡＡを含む。他の配列、好ましくは六量体配列も考えられる。ポリアデニル化は、通常、プレｍＲＮＡ（未成熟ｍＲＮＡとも呼ぶ）のプロセシング中に生じる。この文脈において、ＮＮ（Ｕ／Ｔ）ＡＮＡコンセンサス配列を含むコンセンサスポリアデニル化シグナルが好ましい。特に好ましい実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、以下の配列の１つを含む：ＡＡ（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ又はＡ（Ｕ／Ｔ）（Ｕ／Ｔ）ＡＡＡ（ここで、ウリジンは、通常、ＲＮＡ中に存在し、チミジンは、通常、ＤＮＡ中に存在する）。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、ベクターに由来するポリ（Ａ）配列、及び酵素的ポリアデニル化によって生成された少なくとも１つの追加のポリ（Ａ）配列（例えば、国際公開第２０１６／０９１３９１号に記載）を含み得る。
【０１７９】
ポリ（Ｃ）配列
更に好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＲＮＡは、ポリ（Ｃ）配列を含み得る。「ポリ（Ｃ）配列」という用語は、シトシンヌクレオチドの長い配列、典型的には、約１０〜約２００個のシトシンヌクレオチド、好ましくは約１０〜約１００個のシトシンヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約７０個のシトシンヌクレオチド又は更により好ましくは約２０〜約５０個、又は更には約２０〜約３０個のシトシンヌクレオチドの配列として理解されるべきである。ポリ（Ｃ）配列は、好ましくは、核酸に含まれるコード配列の３’に位置され得る。好ましくは、本明細書で使用されるＲＮＡ中のポリ（Ｃ）配列は、ＲＮＡインビトロ転写によりＤＮＡテンプレートから誘導される。
【０１８０】
ＵＴＲ
好ましい実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡ又は少なくとも１つのＲＮＡ種は、３’−ＵＴＲ及び／又は５’−ＵＴＲを含む。好ましくは、本明細書で使用される３’−ＵＴＲ又は５’−ＵＴＲは、１つ以上の３’−ＵＴＲエレメント又は５’−ＵＴＲエレメントをそれぞれ含む。したがって、本明細書で使用されるＲＮＡは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント及び／又は少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントを含み得る。この文脈において、ＵＴＲエレメントは、任意の天然に存在する遺伝子の５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲに由来する、遺伝子の５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲの断片、ホモログ、又は変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。好ましくは、本発明の文脈で使用される５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲエレメントは、本明細書で使用されるＲＮＡの少なくとも１つのコード配列に対して異種である。５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲエレメントは、天然に存在する遺伝子に由来することが好ましい。他の実施形態では、合成的に設計された５’−ＵＴＲ又は３’−ＵＴＲエレメントが、本発明の文脈で使用することができる。
【０１８１】
「３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、コード配列の３’（即ち「下流」）に位置し、通常、タンパク質に翻訳されない核酸分子の一部を意味することが意図される。通常、３’−ＵＴＲは、ｍＲＮＡのコード配列（ｃｄｓ）とポリ（Ａ）配列との間にあるｍＲＮＡの一部である。本発明の文脈において、３’−ＵＴＲという用語は、ＤＮＡテンプレートにコードされていないエレメントであって、そこからＲＮＡが転写されるが、成熟中の転写後に付加されるエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列など）を含むこともできる。
【０１８２】
「５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、コード配列の５’（即ち「上流」）に位置し、タンパク質に翻訳されない核酸分子の一部を意味することが意図される。５’−ＵＴＲは、通常、ｍＲＮＡのコード配列の５’に位置するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定の部分であると理解される。通常、５’−ＵＴＲは転写開始部位で始まり、コード配列の開始コドンの１ヌクレオチド前で終了する。好ましくは、５’−ＵＴＲは、２０個、３０個、４０個、又は５０個のヌクレオチドを超える長さを有する。５’−ＵＴＲは、遺伝子発現を制御するためのエレメント（調節エレメントとも呼ばれる）を含むことができる。そのような調節エレメントは、例えば、リボソーム結合部位であり得る。５’−ＵＴＲは、転写後に修飾されることがあり、例えば、５’キャップが付加されることがある。
【０１８３】
３’−ＵＴＲエレメント
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、本明細書に記載されるＲＮＡの３’−ＵＴＲ内に通常配置される少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントを含むことができる。
【０１８４】
好ましくは、本発明の文脈における３’−ＵＴＲは、コード配列に対して異種である。より好ましくは、本明細書で使用されるＲＮＡ、好ましくは本明細書で使用されるＲＮＡの３’ＵＴＲは、少なくとも１つの異種３’−ＵＴＲエレメントを含む。
【０１８５】
好ましくは、少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’−ＵＴＲ又は脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【０１８６】
好ましくは、本明細書で使用されるＲＮＡは、好ましくは本明細書に記載される３’−ＵＴＲエレメントを含み、（安定したＲＮＡを提供する）半減期が延長されたＲＮＡに関連する遺伝子に由来し得る。好ましくは、３’ＵＴＲエレメントは、好ましくは安定なＲＮＡをコードする遺伝子の３’ＵＴＲに由来する、又は前記遺伝子のホモログ、断片、若しくは変異体に由来する核酸配列である。
【０１８７】
特に好ましい実施形態では、３’−ＵＴＲエレメントは、アルブミン遺伝子、アルファ−グロビン遺伝子、ベータ−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子、例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲに由来する、又はアルブミン遺伝子、アルファ−グロビン遺伝子、ベータ−グロビン遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子、リポキシゲナーゼ遺伝子、及びコラーゲンアルファ遺伝子、例えば、コラーゲンアルファ１（Ｉ）遺伝子（国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６９〜１３９３で表される）からなる群から選択される遺伝子の３’−ＵＴＲの変異体に由来する、又はそれらのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。特に好ましいのは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６９（ヒトアルブミン３’−ＵＴＲ）及び配列番号１３７６（アルブミン７  ３’−ＵＴＲ）に係る３’−ＵＴＲ配列である。この文脈において、国際公開第２０１３／１４３７００号の開示を、参照により本明細書に援用する。或いは、本明細書で使用されるＲＮＡは、好ましくは、配列番号３０５７２、３０５７４、３０５７６、３０５７８、３０５８０、３０５８２、又は３０５８４から選択される核酸配列又はその断片若しくは変異体を含む又はからなる３’−ＵＴＲエレメントを含む。
【０１８８】
他の実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、国際公開第２０１５／１０１４１４号の配列番号１０〜２０５及び国際公開第２０１５／１０１４１５号の配列番号１及び２のいずれかで表される３’−ＵＴＲエレメントを含む。この文脈において、国際公開第２０１５／１０１４１４号及び国際公開第２０１５／１０１４１５号の開示を、参照により本明細書に援用する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、国際公開第２０１６／１０７８７７号に記載される任意の３’−ＵＴＲエレメントであり得る３’−ＵＴＲエレメントを含む。この文脈において、３’−ＵＴＲエレメント／配列に関する国際公開第２０１６／１０７８７７号の開示を、参照により本明細書に援用する。特に好ましい３’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１６／１０７８７７の配列番号１〜２４及び配列番号４９〜３１８、又はこれらの配列の断片若しくは変異体である。この文脈において、本発明に係るＲＮＡ配列の３’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１６／１０７８７７号の配列番号１〜２４及び配列番号４９〜３１８に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることが特に好ましい。
【０１９０】
特定の実施形態では、本明細書で定義されるＲＮＡは、国際公開第２０１７／０３６５８０に記載される任意の３’−ＵＴＲエレメントであり得る３’−ＵＴＲエレメントを含む。この文脈において、３’−ＵＴＲエレメント／配列に関する国際公開第２０１７／  ０３６５８０号の開示を、参照により本明細書に援用する。特に好ましい３’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１７／０３６５８０号の配列番号１５２〜２０４に係る核酸配列、又はこれらの配列の断片若しくは変異体である。この文脈において、本発明に係るＲＮＡ配列の３’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１７／０３６５８０号の配列番号１５２〜２０４に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることが特に好ましい。
【０１９１】
更に、特に好適な３’−ＵＴＲは、国際公開第２０１８１７２５５６号に開示されている。特にＧＮＡＳ、ＣＡＳＰ１、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ、ＣＯＸ６Ｂ１、ＮＤＵＦＡ１、及びＲＰＳ９に関する国際公開第２０１８１７２５５６号の開示は、参照により本明細書に含まれる。好ましい３’−ＵＴＲエレメントは、ＧＮＡＳ、ＣＡＳＰ１、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ、ＣＯＸ６Ｂ１、ＮＤＵＦＡ１、又はＲＰＳ９に由来する。特に好ましい３’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１８１７２５５６号に開示される配列番号２３〜３６に係る核酸配列、又はこれらの配列の断片若しくは変異体である。
【０１９２】
５’−ＵＴＲエレメント
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、本明細書に記載されるＲＮＡの５’−ＵＴＲ内に通常位置する少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを含むことができる。
【０１９３】
好ましくは、本発明の文脈における５’−ＵＴＲは、コード配列に対して異種である。より好ましくは、本明細書で使用されるＲＮＡ、好ましくは本明細書で使用されるＲＮＡの５’ＵＴＲは、少なくとも１つの異種の５’−ＵＴＲエレメントを含む。
【０１９４】
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを含む。好ましくは、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又は脊索動物遺伝子、好ましくは脊椎動物遺伝子、より好ましくは哺乳動物遺伝子、最も好ましくはヒト遺伝子の５’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【０１９５】
特定の実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、国際公開第２０１３／１４３７００号に記載される任意の５’−ＵＴＲエレメントであり得る少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントを含む。好適には、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１〜１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２からなる群から選択される核酸配列に由来する。この文脈において、国際公開第２０１３／１４３７００号の開示を、参照により本明細書に援用する。
【０１９６】
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、ＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは対応するＲＮＡ配列、又は、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠くそのホモログ、断片、若しくは変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる少なくとも１つの異種の５’−ＵＴＲエレメントを含む。より好ましくは、少なくとも１つの異種５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードするＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくは対応するＲＮＡ配列、又は、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠く前記核酸配列のホモログ、断片、若しくは変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【０１９７】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームタンパク質をコードするＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はリボソームタンパク質をコードするＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲの変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。例えば、５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号６７、１７０、１９３、２４４、２５９、５５４、６５０、６７５、７００、７２１、９１３、１０１６、１０６３、１１２０、１１３８、及び１２８４〜１３６０のいずれかに係る核酸配列の５’−ＵＴＲ、対応するＲＮＡ配列、又は、好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠くそれらのホモログ若しくはそれらの変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント、好ましくは異種の５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードするＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ、好ましくはＲＰＬ３２又はＲＰＬ３５Ａに由来する、又は、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＡＴＰ５Ａ１、ＡＩＧ１、ＣＯＸＣ６、又はＡＢＣＢ７（ＭＤＲ）からなる群から選択される遺伝子に由来する、又は好ましくは５’ＴＯＰモチーフを欠くこれらの遺伝子のいずれか１つのホモログ、断片、又は変異体に由来する、核酸配列を含む又はからなる。
【０１９９】
好ましくは、５’−ＵＴＲエレメントは、リボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードするＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する、又はリボソームラージタンパク質（ＲＰＬ）をコードするＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲのホモログ又は変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。例えば、５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号６７、２５９、１２８４〜１３１８、１３４４、１３４６、１３４８〜１３５４、１３５７、１３５８、１４２１、及び１４２２のいずれかに係る核酸配列の５’−ＵＴＲ、対応するＲＮＡ配列、好ましくは５’−ＴＯＰモチーフを欠く本明細書に記載のそれらのホモログ又はそれらの変異体に由来する核酸配列を含む又はからなる。
【０２００】
好ましい実施形態では、５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１３６８に係る核酸配列、好ましくは対応するＲＮＡ配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなる。別の好ましい実施形態では、５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１３／１４３７００号の配列番号１４１２〜１４２０に係る核酸配列、又は対応するＲＮＡ配列、又はそれらの断片若しくは変異体を含む又はからなる。
【０２０１】
或いは、５’−ＵＴＲエレメントは、好ましくは、本明細書に開示される配列番号３０５７０に係る核酸配列、又はその断片若しくは変異体を含む又はからなる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、国際公開第２０１６／１０７８７７号に記載される任意の５’−ＵＴＲエレメントであり得る５’−ＵＴＲエレメントを含む。この文脈において、３’−ＵＴＲエレメント／配列に関する国際公開第２０１６／１０７８７７号の開示を、参照により本明細書に援用する。特に好ましい５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１６／１０７８７７号の配列番号２５〜３０及び配列番号３１９〜３８２に係る核酸配列、又はこれらの配列の断片若しくは変異体である。この文脈において、本発明に係るＲＮＡ配列の５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１６／１０７８７７号の配列番号２５〜３０及び配列番号３１９〜３８２に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることが特に好ましい。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、国際公開第２０１７／０３６５８０号に記載される任意の５’−ＵＴＲエレメントであり得る５’−ＵＴＲエレメントを含む。この文脈において、３’−ＵＴＲエレメント／配列に関する国際公開第２０１７／０３６５８０号の開示を、参照により本明細書に援用する。特に好ましい５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１７／０３６５８０号の配列番号１〜１５１に係る核酸配列、又はこれらの配列の断片若しくは変異体である。この文脈において、本発明に係るＲＮＡ配列の５’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１７／０３６５８０号の配列番号１〜１５１に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列を含む又はからなることが特に好ましい。
【０２０４】
更に、特に好適な５’−ＵＴＲは、国際公開第２０１８１７２５５６号に開示される。特に、ＳＬＣ７Ａ３、ＡＴＰ５Ａ１、ＲＰＬ３２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＮＯＳＩＰ、ＡＳＡＨ１、ＲＰＬ３１、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＵＢＱＬＮ２、ＭＰ６８、及びＮＤＵＦＡ４に関する国際公開第２０１８１７２５５６号の開示は、参照により本明細書に含まれる。好ましい３’−ＵＴＲエレメントは、ＳＬＣ７Ａ３、ＡＴＰ５Ａ１、ＲＰＬ３２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＮＯＳＩＰ、ＡＳＡＨ１、ＲＰＬ３１、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＵＢＱＬＮ２、ＭＰ６８、又はＮＤＵＦＡ４に由来する。特に好ましい３’−ＵＴＲエレメントは、国際公開第２０１８１７２５５６号に開示される配列番号１〜２２に係る核酸配列、又はこれらの配列の断片若しくは変異体である。
【０２０５】
好ましくは、本明細書で定義される少なくとも１つの５’−ＵＴＲエレメント及び本明細書で定義される少なくとも１つの３’−ＵＴＲエレメントは、相乗的に作用して、前記した少なくとも１つのＲＮＡ配列からのタンパク質産生を増大させる。
【０２０６】
ヒストンステムループ
特に好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、ヒストンステムループ配列／構造を含む。本明細書で使用される「ヒストンステムループ」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、主にヒストンヒストンｍＲＮＡに見られる核酸配列を意味することが意図される。例示的なヒストンステムループ配列は、ロペスら（Ｄａｖｉｌａ  Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，＆Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ，Ｔ．（２００８），ＲＮＡ，１４（１））に記載されている。ヒストンプレｍＲＮＡのステムループには、通常、ヒストンダウンストリームエレメント（ＨＤＥ）として知られるプリンリッチ配列が続く。これらのプレｍＲＮＡは、Ｕ７  ｓｎＲＮＡとＨＤＥとの塩基対合を介してＵ７  ｓｎＲＮＰによって触媒される、ステムループの約５ヌクレオチド下流の単一のエンドヌクレアーゼ開裂によって核内でプロセシングされる。
【０２０７】
そのようなヒストンステムループ配列は、国際公開第２０１２／０１９７８０号に開示されるヒストンステムループ配列から選択されることが好ましく、ヒストンステムループ配列／構造に関する開示を、参照により本明細書に援用する。
【０２０８】
本発明における使用に適したヒストンステムループ配列は、好ましくは、国際公開第２０１２／０１９７８０号の式（Ｉ）又は（ＩＩ）に由来する。更に好ましい実施形態によれば、本明細書で定義されるＲＮＡは、国際公開第２０１２／０１９７８０号の特定の式（Ｉａ）又は（ＩＩａ）の少なくともいずれかに由来する少なくとも１つのヒストンステムループ配列を含み得る。
【０２０９】
特に好ましいヒストンステムループ配列は、本明細書に開示される配列番号３０５８６に係る核酸配列、又は配列ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（国際公開第２０１５０２４６６７の配列番号４３）、又はより好ましくは対応するＲＮＡ配列ＣＡＡＡＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（国際公開第２０１５０２４６６７号の配列番号４４）である。
【０２１０】
前記修飾のいずれも、本発明の文脈においてＲＮＡ（又はＲＮＡ種）に適用することができ、適切又は必要な場合には、それぞれの核酸配列においてこれらの修飾の組合せが互いに干渉しない限り、任意の組合せで互いに組み合わせてもよい。当業者であれば、適宜、選択することができよう。
【０２１１】
したがって、本明細書で使用されるＲＮＡは、好ましくは少なくとも１つのヒストンステムループを含む５’−ＵＴＲ及び／又は３’−ＵＴＲを含み得る。本明細書で使用されるＲＮＡの３’−ＵＴＲは、好ましくは本明細書で定義される、好ましくはポリ（Ａ）及び／又はポリ（Ｃ）配列も含む。３’ＵＴＲの単一の要素は、本発明のＲＮＡ配列の配列に沿って５’から３’までの任意の順で存在し得る。更に、本明細書に記載の更なるエレメント、例えば、本明細書に定義される安定化配列（例えば、グロビン遺伝子のＵＴＲに由来する）、ＩＲＥＳ配列、ｍｉＲＮＡ結合部位なども含まれ得る。各エレメントは、本明細書で使用されるＲＮＡ中において、少なくとも１回（特に、ジシストロン性又はマルチシストロン性構築物において）、好ましくは２回以上繰り返されてもよい。
【０２１２】
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡ（ＲＮＡ種）は、モノシストロン性、ビシストロン性又はマルチシストロン性である。好ましくは、ＲＮＡは、少なくとも２つのコード領域と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列とを含む。
【０２１３】
したがって、好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡは、好ましくは５’から３’方向に、
ａ）５’キャップ構造（ｃａｐ０、ｃａｐ１、ｃａｐ２）、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＮ（ｃａｐ０）；
ｂ）任意に、本明細書中に定義される５’−ＵＴＲエレメント；
ｃ）少なくとも１つのコード配列；
ｄ）本明細書中に定義される３’−ＵＴＲエレメント；
ｅ）任意に、好ましくは１０〜２００個、１０〜１００個、４０〜８０個、又は５０〜７０個のアデニンヌクレオチド、より好ましくは６４個のアデニンヌクレオチドを含むポリ（Ａ）配列；
ｆ）任意に、好ましくは１０〜２００個、１０〜１００個、２０〜７０個、２０〜６０個、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドからなり、より好ましくは３０個のシトシンヌクレオチドを含むポリ（Ｃ）配列；
ｇ）任意に、ヒストンステムループ；
ｈ）任意に、更なるポリ（Ａ）配列；
又はこれらの核酸配列のいずれかの断片若しくは変異体を含む。
【０２１４】
特定の実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡ（又はＲＮＡ種）は、好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメントを含む：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＮ、
ｂ）少なくとも１つのコード領域；
ｃ）アルファ−グロビン遺伝子に由来する核酸配列、好ましくは配列番号３０５７８に係る核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つのホモログ、断片、若しくは変異体を含む３’−ＵＴＲエレメント、
ｄ）好ましくは１０〜２００個、１０〜１００個、４０〜８０個、又は５０〜７０個アデニンヌクレオチドを含み、より好ましくは６４個のアデニンヌクレオチドを含むポリ（Ａ）配列、
ｅ）好ましくは１０〜２００個、１０〜１００個、２０〜７０個、２０〜６０個、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドからなり、より好ましくは３０個のシトシンヌクレオチドを含むポリ（Ｃ）配列、及び
ｆ）好ましくは配列番号３０５８６に係る核酸配列を含むヒストンステムループ、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む。
【０２１５】
いくつかの好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＲＮＡ（又はＲＮＡ種）は、好ましくは５’から３’方向に、以下のエレメント：
ａ）５’−キャップ構造、好ましくはｍ７ＧｐｐｐＮ、
ｂ）ＴＯＰ遺伝子の５’−ＵＴＲに由来する核酸配列、好ましくは配列番号３０５７０に係る核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれかのホモログ、断片、若しくは変異体を含む５’−ＵＴＲエレメント、
ｃ）少なくとも１つのコード領域、
ｄ）アルブミン遺伝子に由来する核酸配列、好ましくは配列番号３０５８２又は３０５８４に係る核酸配列の対応するＲＮＡ配列、又はこれらの核酸配列のいずれかのホモログ、断片、若しくは変異体を含む３’−ＵＴＲエレメント、
ｅ）好ましくは１０〜２００個、１０〜１００個、４０〜８０個、又は５０〜７０個のアデニンヌクレオチドを含み、より好ましくは６４個のアデニンヌクレオチドを含むポリ（Ａ）配列、
ｆ）好ましくは１０〜２００個、１０〜１００個、２０〜７０個、２０〜６０個、又は１０〜４０個のシトシンヌクレオチドからなり、より好ましくは３０個のシトシンヌクレオチドを含むポリ（Ｃ）配列、及び
ｇ）好ましくは配列番号３０５８６に係る核酸配列を含むヒストンステムループ、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む。
【０２１６】
本明細書に開示される方法にしたがって適合されるＲＮＡ（又はＲＮＡ種）の少なくとも１つのコード領域（又はコード配列）は、好ましくはペプチド又はタンパク質をコードする。
【０２１７】
好ましい実施形態では、少なくとも１つのコード領域は、感染症を引き起こす病原体に由来する抗原、又はそのような抗原の断片若しくは変異体をコードする。より好ましくは、少なくとも１つのコード領域は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、又は原生動物抗原、又はこれらの抗原のいずれか１つの断片若しくは変異体をコードする。
【０２１８】
この文脈においては、更に好ましくは、以下からなる群から選択される病原体に由来する抗原が更に好ましい：アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、アストロウイルス（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）科、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、ヘンセラ菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス・ホミニス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属の種、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）科、セパシア菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）及び他のバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属の種、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の種、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ＣＪＤプリオン、肝臓ジストマ（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属の種、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属の種、コロナウイルス、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏ−ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、及びＤＥＮ−４）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギイ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属、エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルス及びエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）属の種、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１、及びＯ１０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）及び巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ＦＦＩプリオン、フィラリア（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａ）上科、フラビウイルス、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ）属の種、ＧＳＳプリオン、グアナリトウイルス、デュクレー菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ヘニパウイルス（ヘンドラウイルス、ニパーウイルス）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１及び２（ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２））、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ホルタエ・ウェルネッキー（Ｈｏｒｔａｅａ  ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）及びヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラヌロマチス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、クーループリオン、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マラセジア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）属の種、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ  ｙｏｋａｇａｗａｉ）、微胞子虫（Ｍ��ｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）門、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、流行性耳下腺炎ウイルス、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）及びマイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎マイコプラスマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ）、アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔ又はａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノロウイルス、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属の種、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オリエンティア・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科（インフルエンザ）、ブラジルパラコクシジオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）属の種、ヴェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パルボウイルスＢ１９、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属、ニューモシスチス肺炎菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、鼻炎ウイルス、ライノウイルス、痘瘡リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｋａｒｉ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、斑点熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス（Ｓａｂｉａ  ｖｉｒｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ヒゼンダニ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属、シンノンブルウイルス、ハンタウイルス、スポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、テニア（Ｔａｅｎｉａ）属、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｎｉｓ）又はネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｔｉ）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポ���ーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属の種、ヒト鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡又は小痘瘡、ｖＣＪＤプリオン、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、及び偽結核エルジニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。好ましくは、病原体は、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、プラスモディウム、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、デングウイルス、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、結核菌、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、黄熱病ウイルス、及びジカウイルスから選択される。
【０２１９】
特に好ましい実施形態によれば、少なくとも１つのコード領域は、インフルエンザウイルス、より好ましくはインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、若しくはインフルエンザＣウイルス（株）又はこれらのいずれかの変異体に由来する抗原、又はその断片若しくは変異体をコードする。
【０２２０】
この文脈において、本明細書で使用されるＲＮＡの少なくとも１つのコード領域は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質１（Ｍ１）、マトリックスタンパク質２（Ｍ２）、非構造タンパク質１（ＮＳ１）、非構造タンパク質２（ＮＳ２）、核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、ポリメラーゼ塩基性タンパク質ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、又はポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）、又はそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも１つの抗原又はその断片若しくは変異体をコードすることが特に好ましい。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡの少なくとも１つのコード領域は、本明細書で述べるインフルエンザウイルスタンパク質のいずれか１つに由来する少なくとも１つの抗原ペプチド若しくはタンパク質又はその断片若しくは変異体をコードする。
【０２２１】
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡの少なくとも１つのコード領域は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）から選択される少なくとも１つの抗原、又はその断片若しくは変異体をコードする。より好ましくは、本明細書で使用されるＲＮＡの少なくとも１つのコード領域は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原ペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくは変異体をコードする。この文脈において、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、同じインフルエンザウイルス、又は異なるインフルエンザウイルス（又はそれぞれ異なるインフルエンザウイルス株）から選択され得る。
【０２２２】
インフルエンザ抗原及びインフルエンザウイルスに由来する抗原ペプチド又はタンパク質は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５８６２号及び国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６６３号に記載されており、それらの全体を参照により本明細書に援用する。
【０２２３】
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは、本明細書に開示される方法にしたがって適合される元のＲＮＡ（種）又は適合されたＲＮＡ（種）は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６６３に記載される配列番号１〜３０５０４、２１３７１３、２１３７３８、２１３７３９、２１３７８７、２１３７９２、２１３７９７、２１３８０２、２１３９９６〜２１４０２３、２１４１００〜２１４１２７、２１４２１２〜２１４２３９、２１４３１６〜２１４３４３、２１４４２０〜２１４４４７、２１４５２４〜２１４５５１、２１４６２８〜２１４６５５、２１４７３２〜２１４７５９、２１４８３６〜２１４８６３、２１４９４０〜２１４９６７、２１５０４４、２１５０４９〜２１５０７６、２１５１６１、２１５１６６〜２１５１９３、２１５２７８、２１５２８３〜２１５３１０、２１５３９５、２１５４００〜２１５４２７、２１５５１２、２１５５１７〜２１５５４４のいずれか１つに係るアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなるペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６６３に記載される配列番号３０５０５〜２１３５２８、２１３５２９〜２１３５５７、２１３７４０〜２１３７４６、２１３７８８、２１３７８９、２１３７９３、２１３７９４、２１３７９８、２１３７９９、２１３８０３、２１３８０４、２１４０２４〜２１４０５１、２１４１２８〜２１４１５５、２１４２４０〜２１４２６７、２１４３４４〜２１４３７１、２１４４４８〜２１４４７５、２１４５５２〜２１４５７９、２１４６５６〜２１４６８３、２１４７６０〜２１４７８７、２１４８６４〜２１４８９１、２１４９６８〜２１４９９５、２１５０４５、２１５０４６、２１５０７７〜２１５１０４、２１５１６２、２１５１６３、２１５１９４〜２１５２２１、２１５２７９、２１５２８０、２１５３１１〜２１５３３８、２１５３９６、２１５３９７、２１５４２８〜２１５４５５、２１５５１３、２１５５１４、２１５５４５〜２１５５７２、２１５６２９、２１５６３２、２１５６３８〜２１５８３５、２１５８９２、２１５８３６〜２１５８８９のいずれか１つに係る核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む。
【０２２５】
更に好ましい実施形態によれば、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）は、好ましくはＧＩ．１〜ＧＩ．１７のノロウイルス、ＧＩＩ．１〜ＧＩＩ．２４のノロウイルス、ＧＩＩＩ．１〜ＧＩＩＩ．４のノロウイルス、ＧＩＶ．１〜ＧＩＶ．４のノロウイルス、及びＧＶ．１〜ＧＶ．４のノロウイルスから選択されるノロウイルス、より好ましくは、ＧＩ．１ノロウイルス及びＧＩＩ．４ノロウイルス、又はこれらのいずれかの変異体からなる群から選択されるノロウイルスに由来する抗原又はその断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。
【０２２６】
この文脈において、本明細書で使用されるＲＮＡの少なくとも１つのコード領域は、ノロウイルスの非構造タンパク質ＮＳ１／ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、ＮＳ６、ＮＳ７、ノロウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１、及びノロウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ２、又はそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも１つの抗原、又はその断片若しくは変異体をコードすることが特に好ましい。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡの少なくとも１つのコード領域は、本明細書で述べられるノロウイルスタンパク質のいずれか１つに由来する少なくとも１つの抗原ペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくは変異体をコードする。
【０２２７】
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡの少なくとも１つのコード領域は、ノロウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１若しくはノロウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ２又はそれらの断片若しくは変異体から選択される少なくとも１つの抗原をコードする。この文脈において、ノロウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ１及び／又はノロウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ２は、同じノロウイルスから、又は異なるノロウイルス（又はそれぞれ異なるノロウイルス株）から選択され得る。ノロウイルス抗原及びノロウイルスに由来する抗原ペプチド又はタンパク質はまた、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６７３号にも記載されており、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０２２８】
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは本明細書に開示される方法にしたがって適合される元のＲＮＡ（種）又は適合されたＲＮＡ（種）は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６７３に記載される配列番号１〜４４１０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなる（ノロウイルスに由来する）ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。
【０２２９】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６７３に記載される配列番号４４１１〜３９６９０、３９７１３〜３９７４６のいずれか１に係る核酸配列又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）又は適合されたＲＮＡ（種）は、腫瘍抗原をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。好適には、腫瘍抗原は、以下からなるリストから選択される：５Ｔ４、７０７−ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ、ＡｌｂＺＩＰ  ＨＰＧ１、アルファ−５−ベータ−１−インテグリン、アルファ−５−ベータ−６−インテグリン、アルファ−アクチニン−４／ｍ、アルファ−メチルアシル補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ−４、ＡＲＴＣ１／ｍ、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ−１、ＢＣＬ−２、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ−カテニン／ｍ、ＢＩＮＧ−４、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡ１５−３／ＣＡ２７−２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＳＰ−８／ｍ、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤＥ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＥＡ、ＣＬＣＡ２、ＣＭＬ２８、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ−１／ｍ、コアクトシン様タンパク質、ｃｏｌｌａｇｅ  ＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ−２、ＣＴ−９／ＢＲＤ６、Ｃｔｅｎ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ−Ｂ、ＣＹＰＢ１、ＤＡＭ−１０、ＤＡＭ−６、ＤＥＫ−ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＧＦＲ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、ＥＺＨ２、ＦＧＦ−５、ＦＮ、Ｆｒａｕ−１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ７ｂ、ＧＡＧＥ−８、ＧＤＥＰ、ＧｎＴ−Ｖ、ｇｐｌ  ＯＯ、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＡＧＥ、ＨＡＳＴ−２、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１  ７Ｉ、ＨＬＡ−Ａ１  １／ｍ、ＨＬＡ−Ａ２／ｍ、ＨＮＥ、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１４／ＳＣＰ−１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン−２、カリクレイン−４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、ＫＫ−ＬＣ−１、Ｋ−Ｒａｓ／ｍ、ＬＡＧＥ−Ａ１、ＬＤＬＲ−ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ３、ＭＡＧＥ−Ｂ４、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｂ１０、ＭＡＧＥ−Ｂ１６、ＭＡＧＥ−Ｂ１７、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｄ１、ＭＡＧＥ−Ｄ２、ＭＡＧＥ−Ｄ４、ＭＡＧＥ−Ｅｌ、ＭＡＧＥ−Ｅ２、ＭＡＧＥ−Ｆ１、ＭＡＧＥ−Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２、マンマグロビンＡ、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２、ＭＡＲＴ−２／ｍ、基質タンパク質２２、ＭＣ１  Ｒ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＥＩ／ｍ、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ、ＭＭＰ１  １、ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ−抗原、ＭＲＰ−３、ＭＵＣ−��、ＭＵＣ−２、ＭＵＭ−１／ｍ、ＭＵＭ−２／ｍ、ＭＵＭ−３／ｍ、ミオシンクラスｌ／ｍ、ＮＡ８８−Ａ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、Ｎｅｏ−ＰＡＰ、Ｎｅｏ−ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、ＮＧＥＰ、ＮＭＰ２２、ＮＰＭ／ＡＬＫ、Ｎ−Ｒａｓ／ｍ、ＮＳＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｂ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＯＡ１、ＯＦＡ−ｉＬＲＰ、ＯＧＴ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ−９、ＯＳ−９／ｍ、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐｉ  ５、ｐ１９０マイナー  ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐ５３、ｐ５３／ｍ、ＰＡＧＥ−４、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、ＰＡＰ、ＰＡＲＴ−１、ＰＡＴＥ、ＰＤＥＦ、Ｐｉｍ−１−キナーゼ、Ｐｉｎ−１、Ｐｍｌ／Ｐａｒアルファ、ＰＯＴＥ、ＰＲＡＭＥ、ＰＲＤＸ５／ｍ、プロステイン、プロテイナーゼ−３、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＧＲ、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＰＴＰＲＫ  ｍ、ＲＡＧＥ−１、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１  ６８、ＲＵ１、ＲＵ２、Ｓ−１００、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＳＣＣ、ＳＩＲＴ２／ｍ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２／ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０、ＳＳＸ−４、ＳＴＡＭＰ−１、ＳＴＥＡＰ−１、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、ＳＹＴ−ＳＳＸ−１、ＳＹＴ−ＳＳＸ−２、ＴＡ−９０、ＴＡＧ−７２、ＴＡＲＰ、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＴＧＦベータ、ＴＧＦベータＲＩＩ、ＴＧＭ−４、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＧ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２／６ｂ、ＴＲＰ／ＩＮＴ２、ＴＲＰ−ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１、及びＷＴ１。
【０２３１】
別の特に好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）又は適合されたＲＮＡ（種）は、例えば、代謝障害又は内分泌障害などの治療に特に使用することができる少なくとも１つの治療用ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む。これら及び他のタンパク質は、機能性タンパク質の欠陥のある内因性産生を十分な量で置き換えることによって、被験体を治療することを意図しているので、治療的であると理解される。したがって、そのような治療用タンパク質は、典型的には、哺乳動物、特にヒトのタンパク質である。
【０２３２】
好ましくは、治療用ペプチド又はタンパク質は、医学的治療（例えば、タンパク質置換）、抗体、Ｔ細胞受容体、遺伝子編集タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に使用される又は使用できる任意の治療用ペプチド又はタンパク質から選択される又はそれに由来する。
【０２３３】
別の特に好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）又は適合されたＲＮＡ（種）は、癌又は腫瘍疾患、免疫障害、感染症、アルツハイマー病、喘息、及び多様な障害（例えば、骨粗しょう症、虫歯、特発性肺線維症、巣状分節性糸球体硬化症、疼痛、筋ジストロフィー、及び新血管性加齢性黄斑変性症など）の治療に特に使用される抗体からなる群から選択される少なくとも１つの治療用抗体をコードする。
【０２３４】
別の特に好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）又は適合されたＲＮＡ（種）は、アレルギー又はアレルギー性疾患に関連する少なくとも１つのアレルゲン（アレルゲン又はアレルゲン抗原）及び／又は少なくとも１つの自己免疫自己抗原（自己抗原）をコードする核酸配列を含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む。
【０２３５】
適合されたＲＮＡ及びベクター：
更なる態様では、本発明は、本発明に係る方法によって得ることができるＲＮＡに関する。より具体的には、本発明は、クロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更するための方法によって、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物からの１つのＲＮＡ種を精製すつための方法によって、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法によって、少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法によって、又は本明細書に記載される適合されたＲＮＡを提供するための方法によって得られる適合されたＲＮＡ（又は適合された配列をそれぞれ有するＲＮＡ（種））を提供する。
【０２３６】
本発明に係る（適合された）ＲＮＡは、好ましくは、その配列が、元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対してＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更することによって適合されたことを特徴とする。元のＲＮＡ配列は、好ましくは本明細書に記載のＲＮＡ配列、好ましくは対応する野生型ＲＮＡ配列、より好ましくは本明細書に記載のように修飾された（例えば、Ｇ／Ｃ含量が変更された又はコドンが最適化された）対応するＲＮＡ配列である。
【０２３７】
好ましい実施形態では、本発明に係る適合されたＲＮＡは、特に本発明の方法に関して、本明細書に記載される特徴のいずれか１つによって特徴付けられる。
【０２３８】
特定の実施形態では、本発明に係る適合されたＲＮＡは、ＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数のＵヌクレオチドの数に対する比によって特徴付けられ、この比は、０．２〜５、好ましくは０．５〜３、より好ましくは１〜３、更により好ましくは１〜２．５、更により好ましくは１．２〜２、更により好ましくは１．４〜２、更により好ましくは１．５〜２、最も好ましくは１．６〜２の範囲である。
【０２３９】
特に好ましい実施形態によれば、本発明に係るＲＮＡは、配列番号２６〜１４０７９、１４０８０〜１６２６４、１６２６５〜２８６４０、２８６４１〜３０５６８のいずれか１つに係る核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む。
【０２４０】
更なる態様では、本発明は、本発明に係る合されたＲＮＡ配列を含むベクターに関する。好ましい実施形態では、本発明に係るベクターは、本発明に係る適合されたＲＮＡ配列に対応する核酸配列、又はその断片若しくは変異体を含むＤＮＡベクターである。或いは、本発明に係るベクターは、本発明に係る適合されたＲＮＡ配列をコードする核酸配列、又はその断片若しくは変異体を含むＤＮＡベクターである。好ましくは、本発明に係るベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターである
【０２４１】
ＲＮＡの生産
本発明に係るＲＮＡは、当技術分野で知られている任意の方法を使用して調製することができ、例えば、固相ＲＮＡ合成などの合成法、及びＲＮＡインビトロ転写反応などのインビトロ法が挙げられる。特に好ましいのは、ＲＮＡインビトロ転写である。
【０２４２】
「ＲＮＡインビトロ転写」又は「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡが無細胞系（インビトロ）で合成されるプロセスに関する。ＤＮＡ、特にプラスミドＤＮＡ（又はＰＣＲ産物）は、通常、ＲＮＡ転写産物を生成するためのテンプレートとして使用される。ＲＮＡは、本発明によれば、好ましくは線状化プラスミドＤＮＡテンプレートである適切なＤＮＡテンプレートのＤＮＡ依存性インビトロ転写により得ることができる。インビトロ転写を制御するためのプロモータは、任意のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの具体的な例としては、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。インビトロＲＮＡ転写用のＤＮＡテンプレートは、核酸、特にインビトロ転写されるそれぞれのＲＮＡに対応するｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写用の適切なベクター、例えばプラスミドＤＮＡに導入することにより得ることができる。本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、それがインビトロで転写される前に、適切な制限酵素で線状化される。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの逆転写又は化学合成によって得ることができる。更に、インビトロＲＮＡ合成のためのＤＮＡテンプレートはまた、遺伝子合成によって得ることができる。
【０２４３】
ＲＮＡインビトロ転写で使用される試薬としては、典型的には、バクテリオファージがコードされたＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、又はＳｙｎ５）などのそのそれぞれのＲＮＡポリメラーゼに対して高い結合親和性を有するプロモータ配列を有するＤＮＡテンプレート（線状化プラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）；４種の塩基（アデニン、シトシン、グアニン、及びウラシル）のリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）；任意に、本明細書に定義されるキャップアナログ（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７Ｇ）など）；任意に、本明細書に定義される更に修飾されたヌクレオチド；ＤＮＡテンプレート内のプロモータ配列に結合できるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、又はＳｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼなど）；任意に、混入ＲＮａｓｅを不活性化するリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）阻害剤；任意に、転写を阻害し得るピロリン酸を分解するピロホスファターゼ；ポリメラーゼの補因子としてＭｇ２＋イオンを供給するＭｇＣｌ２；抗酸化剤（例えば、ＤＴＴなど）も含有し得る適切なｐＨ値を維持するバッファー（Ｔｒｉｓ又はＨＥＰＥＳ）、及び／又は最適濃度のスペルミジンなどのポリアミン、又は国際公開第２０１７／１０９１６１号に開示されるバッファー系が挙げられる。
【０２４４】
実施形態では、ＲＮＡのインビトロ転写で使用されるヌクレオチド混合物は、本明細書で定義される修飾されたヌクレオチドを更に含むことができる。実施形態では、ヌクレオチド混合物（即ち、混合物中の各ヌクレオチドの画分）は、好ましくは、国際公開第２０１５／１８８９３３号に記載される、所定のＲＮＡ配列に対して最適化され得る。
【０２４５】
本明細書で定義される１個超の異なるＲＮＡを生成する必要がある実施形態、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の異なるＲＮＡ分子を生成する必要がある場合、国際公開第２０１７／１０９１３４号に記載の手順を好適に使用することができる。
【０２４６】
好ましい実施形態では、国際公開第２０１６／１８０４３０号によれば、ＲＮＡ生産は、ＤＮＡ及びＲＮＡレベルで様々な品質管理工程を実施する現在の適正製造基準（ＧＭＰ）の下で行われる。得られたＲＮＡ産物は、好ましくはＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＣｕｒｅＶａｃ、テュービンゲン、ドイツ；国際公開第２００８／０７７５９２号によるＲＰ−ＨＰＬＣ）及び／又は接線フロー濾過（国際公開第２０１６／１９３２０６号に記載）を使用して精製される。好ましい実施形態では、ＲＮＡ、特に精製されたＲＮＡは、国際公開第２０１６／１６５８３１号又は国際公開第２０１１／０６９５８６号にしたがって凍結乾燥され、本明細書で定義される温度安定性ＲＮＡを生じる。本発明のＲＮＡ、特に精製されたＲＮＡは、国際公開第２０１６／１８４５７５号又は国際公開第２０１６１８４５７６号にしたがって噴霧乾燥又は噴霧凍結乾燥を使用して凍結乾燥させて、本明細書で定義される温度安定性ＲＮＡを生成することもできる。
【０２４７】
適合したＲＮＡ配列を提供するための方法
更なる態様によれば、本発明は、適合されたＲＮＡ配列を提供するための方法も提供し、前記方法は、好ましくは、以下の工程を含む：
ａ）任意に、元のＲＮＡ配列のヌクレオチドの総数を決定する工程；
ｂ）前記元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を決定する工程；
ｃ）コードされたアミノ酸配列を変更せずに、少なくとも１つの代替コドンで置き換えることができる元のＲＮＡ配列中のコドンを決定する工程；及び
ｄ）少なくとも１つの元のコドンを代替コドンで置き換えることにより、ＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を予め設定した数のＡ及び／又はＵヌクレオチドに調整する工程であって、前記代替コドンは、前記元のコドンと同じアミノ酸をコードし、更にＡ及び／又はＵヌクレオチドの含量が高いことを特徴とする工程。
【０２４８】
好ましい実施形態では、方法の工程ｂ）は、元のＲＮＡ配列中のＧ及び／又はＣヌクレオチドの数を決定することを更に含む。
【０２４９】
好ましくは、本発明に係る適合されたＲＮＡを提供するための方法は、ＲＮＡを製造することを含む工程ｅ）を更に含む。好ましくは、ＲＮＡは、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって、又は本明細書における「ＲＮＡの産生」のセクションに記載される方法によって製造される。より好ましくは、方法は、好ましくは本明細書に記載される、インビトロ転写の工程を含む。特に好ましい実施形態では、方法は、インビトロ転写と、得られたＲＮＡを、好ましくは本明細書に記載されるクロマトグラフィープロセス、好ましくはＨＰＬＣプロセス、より好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣプロセスで精製する工程とを含む。
【０２５０】
以下において、適合されたＲＮＡを提供するための本発明方法の概念が、好ましい実施形態について説明することによって更に説明される（本明細書の実施例６も参照）。また、コドン使用を変更することによる配列適合の基本原理、特にＡＵ適合の基本原理を、図２に例示する。
【０２５１】
自動化インシリコ法（アルゴリズム）を、アミノ酸配列を変更せずに、ＲＮＡ配列中の任意のヌクレオチドの数を定義された値に設定するために使用することができる（方法の（工程ｄ））。本発明の文脈において、ＨＰＬＣ共分析及び／又はＨＰＬＣ共精製のためのＲＮＡ混合物の調和を可能にするために、自動化されたインシリコ法を、配列適合、特にＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数（ＡＵ数）の適合に使用することができる。
【０２５２】
以下の表１は、コードされたアミノ酸配列を変更せずに、ＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を増加させるために適用できるコード配列中の（遺伝的にコードされたアミノ酸ごとの）コドン変更をまとめたものである。表２は、コードされたアミノ酸配列を変更せずに、ＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を減少させるために適用できるコード配列中の（遺伝的にコードされたアミノ酸ごとの）コドン変更をまとめたものである。
【０２５３】
【表１−１】
2021502079.tif 000002
【０２５４】
【表１−２】
2021502079.tif 000003
【０２５５】
【表２−１】
2021502079.tif 000004
【０２５６】
【表２−２】
2021502079.tif 000005
【０２５７】
方法の初期段階では、好ましくは、適合されるＲＮＡ配列に含まれる各コドンのマトリックスが作成され、これは、コードされるアミノ酸の変更を引き起こさない、可能なコドン交換を特定するものである（本明細書では「交換マトリックス」と呼ぶ）。例示的な「交換マトリックス」を式（Ｉ）に示す。
2021502079.tif 000006
【０２５８】
式（Ｉ）は、コドン「ＣＧＡ」について、代替コドンへの変更が、Ａヌクレオチドの数を１個増加させるオプションを提供し（例えば、ＣＧＡ−＞ＡＧＡ）、Ｃヌクレオチドの数を１個増加させるオプションを提供し（例えば、ＣＧＡ−＞ＣＧＣ）、Ｇヌクレオチドの数を１個増加させるオプションを提供し（例えば、ＣＧＡ−＞ＣＧＧなど）、Ｔヌクレオチドの数を１個増加させるオプション（ＣＧＡ−＞ＣＧＴなど）を提供する。
【０２５９】
交換マトリックスは、好ましくは、適合されるＲＮＡ配列中の個々のコドンごとに生成される。前記交換マトリクスを使用して、各コドンにおけるそれぞれのヌクレオチド（それぞれ、Ａ及びＴ（Ｕ）数）の潜在的な最大数を（アミノ酸配列を変えることなく）決定することができる。したがって、適合される配列の全てのコドンは、段階的な反復によって潜在的なコドン交換に関して分析され、各反復工程では、対応するコドンは、潜在的なヌクレオチド変化のための（上で記載した）各交換マトリクスを使用して分析される。例えば、それぞれのコドンで理論的に可能な変更がない場合（例えば、「ＡＴＧ」又は「ＴＧＧ」の場合など）、式（ＩＩ）に例示的に示す対応する交換マトリックスを使用した（交換マトリックスの＊＝０）。
2021502079.tif 000007
【０２６０】
式（ＩＩ）は、コドン「ＡＴＧ」の場合、代替コドンへの変更が、Ａヌクレオチド、Ｃヌクレオチド、Ｇヌクレオチド、又はＴヌクレオチドの数を増加させるオプションがないことを示している（ＡＴＧ（Ｍｅｔ）には代替コドンがないため）。
【０２６１】
それぞれの交換マトリックス（＊＞０）にしたがう交換が理論的に可能である場合、コドンは、例えば、Ａ及び／又はＴ（Ｕ）ヌクレオチド数を増加させるオプションを提供するコドンのみが適合されるという前提で変更を行うことができるかどうかについて更に分析される。したがって、標的ヌクレオチド（例えば、Ａ及び／又はＴ（Ｕ））と、現在の交換マトリックスにおいてポジティブな結果を生成する可能性のあるヌクレオチド（即ち、Ａ及び／又はＴ（Ｕ）の変更；例えば、式（Ｉ）を参照）との間のインターセクションが構築される。その結果、各コドンは分類され、３つのカテゴリの１つにグループ化される。
【０２６２】
カテゴリ１（「好ましい」カテゴリ）：
１つの標的ヌクレオチドのみ（本例では、Ａ又はＴ（Ｕ））の増加を可能にする潜在的なコドン交換。例えば、コドン「ＧＡＣ」（Ａｓｐ）は、Ａ及びＴ（Ｕ）ヌクレオチド数を増加させるために「ＧＡＵ」（Ａｓｐ）に変更することができる。その変更は、Ａ及びＴ（Ｕ）ヌクレオチドの数に（前記のもの以外に）更なる影響を与えないので、更なる分析を必要としない。
【０２６３】
カテゴリ２（「可能」カテゴリ）：
両方の標的ヌクレオチド（本例では、Ａ及びＴ（Ｕ））の増加を可能にする潜在的なコドン交換。例えば、コドン「ＧＣＡ」は「ＧＣＵ」に変更でき、これにより、Ｔ（Ｕ）数は増加するが、同時にＡ数は減少する。したがって、この例における２種の標的ヌクレオチドのうちの１つ（Ｔ（Ｕ））の数が、他の標的ヌクレオチドの数（Ａ）の減少と引き換えに増加するかどうかを決定するために、このカテゴリに属するコドンに関して更なる分析が必要である。
【０２６４】
カテゴリ３（「不可能」カテゴリ）：
代替コドンが存在しない（＊＝０）ＲＮＡ配列中のコドン。このカテゴリ３の例は、ＡＴＧ（Ｍｅｔ；開始コドン）又は「ＵＧＧ」（Ｔｒｐ）である。
【０２６５】
元の配列の全てのコドンは、好ましくはそのように分類される。次いで、好ましくは、全ての標的ヌクレオチド（Ａ、Ｔ（Ｕ））について、何個の潜在的なヌクレオチド交換が同定されたかを計算することができる。
【０２６６】
好ましい実施形態では、方法は、本明細書で定義されるカテゴリ１のコドンのみを使用してＲＮＡ配列を適合させることを含む。いくつかの実施形態では、カテゴリ２のコドンも使用し（例えば、カテゴリ１の全てのコドンを使用次第）、Ａ及びＴ（Ｕ）数の更なる適合の可能性を提供する。所望のヌクレオチド数を達成するためにカテゴリ２を要する場合、交換ヌクレオチド（ヌクレオチドＡ又はＴ（Ｕ））を同定するために以下の比の計算を使用することができる。
2021502079.tif 000008
式中、ｉは、対応する標的を表し、ｃｉは、カテゴリ２のｉの可能な適合位置の数、ｘｉ、はｉの望ましい閾値、ｐｉは、既に変更された同定された適合位置の数を表す。好ましくは、計算された全ての比を最低から始まり最高の比までランク付けし、所望の閾値に達するまで又はカテゴリ２の可能な全ての交換が行われるまで、カテゴリ２の変更を適用する。この手順は、目標ヌクレオチド数、例えば、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの目標数が、カテゴリ１の交換のみの使用で達成することができない場合に、好ましくは、任意のＲＮＡ配列について繰り返し行われる。
【０２６７】
所望の目標ヌクレオチド数を達成できない場合（カテゴリ１及び２の全ての代替コドンが使用されている、即ち、これ以上の変更は不可能である）、好ましくは、目標ヌクレオチド数にできる限り近くマッチングしている配列が生成される。
【０２６８】
方法のいくつかの実施形態によれば、以下の改良のうちの１つがその際に行われてもよい。
１．前記した実施形態で使用され、交換の可能性に基づく基本的な等分布に加えて、正規分布、最初の出現分布、最後の出現分布、又はランダムベースの分布など、他の分布モデルも想定され得る。或いは、可能な変更の平均又は可能な変更の中央値を決定し、全ての交換をこれらの値の周りに配置してもよい。
２．交換マトリックスは、標的配列のコドンに関する追加情報（例えば、コドン使用など）を更に含み得る。これは、コドン交換が望ましいかどうかという問題の更なる基準を作り、特定のコドン使用又は標的配列における異なるヌクレオチド比への適合を容易にする。
３．第３のカテゴリは、交換によって回避すべき配列又はモチーフ（例えば、制限酵素の認識モチーフ、プロモータ配列、又は望ましくない二次構造を構築する配列、など）によって更に行われ得る。
４．Ａ及び／又はＵ適合のための最適なヌクレオチド数を同定するために、それらの長さ及び所望の標的ヌクレオチドの出現に基づいて、入力配列の自動化ビニングが行われ得る。
【０２６９】
本発明に係る適合ＲＮＡを提供するための方法に関して記載された工程のいずれか１つ又は工程の組合せは、好ましくは、本明細書に記載される他の方法、特にクロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法、又は少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法に適用され得る。
【０２７０】
組成物及びワクチン
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載される少なくとも１つの適合されたＲＮＡ配列と、任意に、薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。本明細書に記載される少なくとも１つの適合されたＲＮＡを含む本発明組成物は、好ましくは、本明細書に記載される医薬組成物又はワクチンである。好ましい実施形態によれば、本発明組成物は、好ましくは本明細書に記載される多価ワクチンである。
【０２７１】
好ましい実施形態では、本発明に係る組成物は、本明細書に記載の方法、特にクロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法、又は本明細書に記載される適合されたＲＮＡを提供するための方法によって得られるＲＮＡを含む。
【０２７２】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る組成物は、少なくとも２つのＲＮＡ種を含み、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列が、前記少なくとも１つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を元のＲＮＡ配列のＡヌクレオチド及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することによって適合される。より好ましくは、組成物は、少なくとも２つのＲＮＡ種を含み、少なくとも１つのＲＮＡ種は、本発明に係る方法のいずれか１つ、好ましくはクロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つのＲＮＡ種を精製するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を調和させるための方法、又は本明細書に記載される適合されたＲＮＡを提供するための方法によって得られる適合されたＲＮＡである。より好ましくは、本発明組成物に含まれる少なくとも２つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、本明細書に記載されるように調和される。
【０２７３】
好ましい実施形態では、本発明に係る組成物は、少なくとも２種のＲＮＡ種、例えば、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、又は少なくとも１０種のＲＮＡ種を含み、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列が、前記少なくとも１つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を元のＲＮＡ配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することにより適合され、好ましくは、２種（又はそれ以上）のＲＮＡ種におけるＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が、互いに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０個以下異なる。好ましい態様においては、ＲＮＡ種におけるＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、好ましくは２個以下、より好ましくは３個以下、更により好ましくは４個以下、更により好ましい５個以下、最も好ましくは６個以下、互いに異なる。更に好ましい態様において、ＲＮＡ種中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数は、１０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは３０個以下、更により好ましくは４０個以下、最も好ましくは５０個以下、互いに異なる。２種以上のＲＮＡ種におけるＡ及び／又はＵヌクレオチドの数が同一であることが特に好ましい。
【０２７４】
好ましくは、本発明組成物は、本明細書に記載される少なくとも１つの適合されたＲＮＡ（種）と、薬学的に許容される担体とを含む又はからなる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、好ましくは医薬組成物又はワクチンである本発明組成物の液体又は非液体ベースを含むことが好ましい。本発明組成物が液体形態で提供される場合、担体は、好ましくは水、典型的にはパイロジェンフリー水；等張生理食塩水又は緩衝（水）溶液、例えば、リン酸、クエン酸などの緩衝溶液である。水又は好ましくは緩衝液、より好ましくは水性緩衝液を用いることができ、これらは、ナトリウム塩、好ましくは少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩、カルシウム塩、好ましくは少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩、任意にカリウム塩、好ましくは少なくとも３ｍＭのカリウム塩を含有する。好ましい実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び任意に、カリウム塩は、それらのハロゲン化物（例えば、塩化物、ヨウ化物、又は臭化物）、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、又は硫酸塩などの形態で存在してもよい。限定されるものではないが、ナトリウム塩の例としては、例えば、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４が挙げられ、任意のカリウム塩の例としては、例えば、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４が挙げられ、カルシウム塩の例としては、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２が挙げられる。更に、前記カチオンの有機アニオンが緩衝液に含有されていてもよい。
【０２７５】
更に、ヒトへの投与に適した、１以上の相溶性のある固体又は液体の充填剤又は希釈剤又は封入化合物を使用することもできる。本明細書で使用される「相溶性」という用語は、本発明組成物の構成成分が、通常の使用条件下で本発明組成物の生物活性又は薬学的有効性を大幅に低減させる相互作用が生じないように組成物の少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）と混合することができることを意味する。薬学的に許容される担体、充填剤、及び希釈剤は、もちろん、治療対象となる患者への投与に適するように十分に高い純度と十分に低い毒性とを有していなければならない。薬学的に許容される担体、充填剤、又はそれらの構成成分として使用できる化合物のいくつかの例としては、例えば、ラクトース、グルコース、トレハロース、及びスクロースなどの糖；コーンスターチ又はポテトスターチなどのデンプン；デキストロース；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなど；粉末状トラガカント；麦芽；ゼラチン；獣脂；ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムなどの固体流動剤；硫酸カルシウム；例えば、落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びテオブロマ由来の油などの植物油；ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール；アルギン酸が挙げられる。
【０２７６】
組成物に含まれ得る更なる添加剤は、Ｔｗｅｅｎなどの乳化剤；ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤；着色剤；味覚付与剤、医薬担体；錠剤形成剤；安定化剤；抗酸化剤；保存料などである。
【０２７７】
好ましい実施形態では、本明細書で定義される組成物、医薬組成物、ワクチンに含まれる、本明細書で定義される（適合）ＲＮＡは、１つ以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはカチオン性又はポリカチオン性ポリマー、カチオン性又はポリカチオン性多糖、カチオン性又はポリカチオン性脂質、カチオン性又はポリカチオン性タンパク質、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド、又はそれらの任意の組合せと複合体化若しくは少なくとも部分的に複合体化又は会合される。
【０２７８】
本明細書で使用される「カチオン性又はポリカチオン性化合物」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、約１〜９のｐＨ値、約３〜８のｐＨ値、約４〜８のｐＨ値、約５〜８のｐＨ値、より好ましくは約６〜８のｐＨ値、より好ましくは約７〜８のｐＨ値、最も好ましくは生理学的ｐＨ、例えば、約７．２〜約７．５の範囲で正に帯電された帯電分子を意味することが意図される。したがって、カチオン性成分、例えば、カチオン性ペプチド、カチオン性タンパク質、カチオン性ポリマー、カチオン性多糖、カチオン性脂質は、生理学的条件下で正に帯電する任意の正に荷電した化合物又はポリマーであり得る。「カチオン性又はポリカチオン性のペプチド又はタンパク質」は、少なくとも１つの正に帯電したアミノ酸、又は１超の正に帯電したアミノ酸、例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、又はＯｒｎから選択されるアミノ酸を含み得る。したがって、「ポリカチオン性」成分も、所定条件下で１超の正電荷を示す範囲内にある。
【０２７９】
この文脈において特に好ましいカチオン性又はポリカチオン性化合物は、カチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はその断片のタンパク質の以下のリストから選択することができる：プロタミン、ヌクレオリン、スペルミン、若しくはスペルミジン、又は他のカチオン性ペプチド又はタンパク質、例えば、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、例えば、ＨＩＶ結合ペプチド、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ペプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来又はアナログペプチド、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡ、又はタンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）、ＰｐＴ６２０、プロリンリッチペプチド、アルギニンリッチペプチド、リジンリッチペプチド、ＭＰＧペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド、ｐＡｎｔｐ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブフォリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、又はヒストンを含む。より好ましくは、本明細書で定義される核酸、好ましくは本明細書で定義されるｍＲＮＡは、１以上のポリカチオン、好ましくはプロタミン又はオリゴフェクタミン、最も好ましくはプロタミンと複合体化される。この文脈においては、プロタミンが特に好ましい。
【０２８０】
トランスフェクション又は錯化剤として使用することができる更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性化合物は、カチオン性多糖、例えば、キトサン、ポリブレンなど；カチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ジ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ、ＤＩＭＲＩ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−６−１４、ＣＬＩＰ１、ＣＬＩＰ６、ＣＬＩＰ９、オリゴフェクタミンなど；又はカチオン性又はポリカチオン性ポリマー、例えば、ベータ−アミノ酸ポリマー又は逆ポリアミドなどの修飾ポリアミノ酸、ＰＶＰなどの修飾ポリエチレン、ｐＤＭＡＥＭＡなどの修飾アクリレート、ｐＡＭＡＭなどの修飾アミドアミン、ジアミン末端修飾１，４ブタンジオールジアクリレート−コ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーなどの修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）、ポリプロピレンアミンデンドリマー又はｐＡＭＡＭベースのデンドリマーなどのデンドリマー、ＰＥＩ、ポリ（プロピレンイミン）などのポリイミン、ポリアリルアミン、シクロデキストリンベースのポリマー、デキストランベースのポリマーなどの糖骨格ベースのポリマー、ＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳコポリマーなどのシラン骨格ベースのポリマー、１以上のカチオンブロックの組合せからなるブロックポリマー（例えば、前記カチオン性ポリマーから選択される）及び１以上の親水性又は疎水性ブロック（例えば、ポリエチレングリコールなど）の組合せからなるブロックポリマー；などを含む。
【０２８１】
実施形態では、組成物又はワクチンは、１以上のポリカチオン化合物及び／又はポリマー担体と複合体化された、本明細書に記載の少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡと、少なくとも１つの遊離ＲＮＡとを含み、前記少なくとも１つの複合体化されたＲＮＡは、好ましくは、本発明に係る少なくとも１つのＲＮＡと同一である。
【０２８２】
本明細書で使用される「ポリマー担体」という用語は、当業者によって認識及び理解され、例えば、別の化合物（カーゴ）の輸送及び／又は錯化を促進する化合物を意味することが意図される。ポリマー担体は、典型的には、ポリマーから形成される担体である。ポリマー担体は、共有的又は非共有的相互作用によって、そのカーゴ（核酸、ＲＮＡ）と会合し得る。
【０２８３】
この文脈において、本発明組成物の少なくとも１つのＲＮＡが、カチオン性又はポリカチオン性化合物及び／又はポリマー担体、好ましくはカチオン性タンパク質又はペプチドと少なくとも部分的に複合体化されることが特に好ましい。この文脈において、国際公開第２０１０／０３７５３９号及び国際公開第２０１２／１１３５１３号の開示を、参照により本明細書に援用する。部分的には、人工核酸の一部のみがカチオン性化合物と複合体化し、人工核酸の残りの部分が（本発明医薬組成物、免疫原性組成物に含まれ）非複合型（「遊離」）であることを意味する。
【０２８４】
更に好ましいカチオン性又はポリカチオン性のタンパク質又はペプチドは、国際公開第２００９／０３０４８１号の式（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘに由来することができ、それに関する国際公開第２００９／０３０４８１号の開示を、参照により本明細書に援用する。
【０２８５】
好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、本明細書で定義されるＲＮＡと、ポリマー担体とを含む。本発明にしたがって使用されるポリマー担体は、ジスルフィド架橋されたカチオン性成分によって形成されるポリマー担体であり得る。ジスルフィド架橋されたカチオン性成分は、互いに同一であっても異なっていてもよい。ポリマー担体はまた、更なる成分も含み得る。本発明にしたがって使用されるポリマー担体が、本明細書に記載のジスルフィド結合によって架橋される、本明細書に定義のカチオン性ペプチド、タンパク質、又はポリマー、及び任意に更なる成分の混合物を含むことも特に好ましい。
【０２８６】
この文脈において、国際公開第２０１２／０１３３２６の式｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ’）ｘ（Ｃｙｓ）ｙ｝及び式Ｃｙｓ，｛（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ｝Ｃｙｓ２に係るポリマー担体が好ましく、それに関する国際公開第２０１２／０１３３２６号の開示を、参照により本明細書に援用する。
【０２８７】
更なる特定の実施形態では、本明細書で定義されるＲＮＡ又は本発明に係る（医薬）組成物又はワクチンに含有される任意の更なる核酸を複合体化するために使用できるポリマー担体は、国際公開第２０１１／０２６６４１号の式（Ｌ−Ｐ１−Ｓ−［Ｓ−Ｐ２−Ｓ］ｎ−Ｓ−Ｐ３−Ｌ）に係るポリマー担体に由来することができ、それに関する国際公開第２０１１／０２６６４１号の開示を、参照により本明細書に援用する。
【０２８８】
他の実施形態では、好ましくは組成物、医薬組成物、又はワクチンである組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つの人工核酸を含み、前記少なくとも１つの人工核酸は、ポリマー担体と複合体化又は会合し、任意に、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２２、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２２７、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２２９、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２２６に記載される少なくとも１つの脂質成分と複合体化又は会合する。この文脈において、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２２、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２２７、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２２９、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６３２２６の開示を、参照により本明細書に援用する。
【０２８９】
好ましい実施形態では、ポリマー担体化合物は、ペプチドエレメントＣｙｓＡｒｇ１２Ｃｙｓ又はＣｙｓＡｒｇ１２又はＴｒｐＡｒｇ１２Ｃｙｓによって形成される又は含む又はからなる。特に好ましい実施形態では、ポリマー担体化合物は、（Ｒ１２Ｃ）−（Ｒ１２Ｃ）二量体、（ＷＲ１２Ｃ）−（ＷＲ１２Ｃ）二量体、又は（ＣＲ１２）−（ＣＲ１２Ｃ）−（ＣＲ１２）三量体からなり、二量体（例えば、（ＷＲ１２Ｃ））又は三量体（例えば、（ＣＲ１２））中の個々のペプチドエレメントは、−ＳＨ基を介して結合される。
【０２９０】
実施形態では、複合体化された（適合された）ＲＮＡが、担体化合物としてのカチオン性又はポリカチオン性ペプチド又はタンパク質と複合体化される実施形態では、複合体化ＲＮＡの窒素／リン酸比は、約０．１〜約２０、又は約０．２〜約１５、又は約２〜約１５、又は約２〜約１２であり、Ｎ／Ｐ比は、カチオン性ペプチド又はポリマーの塩基性基の窒素原子の、核酸、好ましくはＲＮＡのリン酸基に対するモル比として定義される。
【０２９１】
したがって、本明細書で定義される組成物は、本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡを含み、少なくとも１つの人工核酸、好ましくは本明細書で定義されるＲＮＡの、本明細書で定義される１以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物、好ましくはプロタミンに対するＮ／Ｐ比が、約０．３〜４、約０．５〜２、約０．７〜２、及び約０．７〜１．５の範囲を含む約０．１〜２０の範囲である。
【０２９２】
好適には、本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡは、１以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物及び／又はポリマー担体と複合体化され、ここで、核酸の、カチオン性又はポリカチオン性化合物に対する比は、約６：１（ｗ／ｗ）〜約０．２５：１（ｗ／ｗ）、より好ましくは約５：１（ｗ／ｗ）〜約０．５：１（ｗ／ｗ）、更により好ましくは約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）、又は約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：１（ｗ／ｗ）、最も好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約２：１（ｗ／ｗ）の範囲から選択される重量比であり；又は任意に、核酸の、カチオン性又はポリカチオン性成分及び／又はポリマー担体に対する窒素／リン酸比は、約０．１〜１０の範囲、好ましくは約０．３〜４又は０．３〜１の範囲、最も好ましくは約０．５〜１又は０．７〜１の範囲、更に最も好ましくは約０．３〜０．９又は０．５〜０．９の範囲である。
【０２９３】
この文脈において、本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡが、プロタミンと複合体化していることが特に好ましい。
【０２９４】
好適には、複合体化されたＲＮＡは、プロタミン−トレハロース溶液を、２：１のＲＮＡ対プロタミンの重量対重量比（ｗ／ｗ）で、ＲＮＡサンプルに添加することによってプロタミンと複合体化される。
【０２９５】
好ましい実施形態では、本明細書で定義される組成物、医薬組成物、ワクチンは、１以上のカチオン性又はポリカチオン性化合物（例えば、プロタミン）と複合体化される本明細書で定義される少なくとも１つのＲＮＡと、少なくとも１つの遊離ＲＮＡとを含む。
【０２９６】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの複合体化ＲＮＡ（例えば、プロタミン複合体化ＲＮＡ）は、少なくとも１つの遊離ＲＮＡと同一である。
【０２９７】
好ましくは、アジュバント成分のＲＮＡ（例えば、プロタミン複合体化ＲＮＡ）の、遊離核酸、特に遊離ＲＮＡに対するモル比は、約１：１の比を含む約０．００１：１〜約１：０．００１のモル比から選択することができる。
【０２９８】
好ましくは、アジュバント成分の複合体化されたＲＮＡ（例えば、プロタミン複合体化ＲＮＡ）の、遊離核酸、特に遊離ＲＮＡに対する比は、約５：１（ｗ／ｗ）〜約１：１０（ｗ／ｗ）の範囲、より好ましくは約４：１（ｗ／ｗ）〜約１：８（ｗ／ｗ）の範囲、更により好ましくは約３：１（ｗ／ｗ）〜約１：５（ｗ／ｗ）又は１：３（ｗ／ｗ）の範囲であり、この比は、約１：１（ｗ／ｗ）が最も好ましい。
【０２９９】
本明細書で定義されるアジュバント成分（例えば、プロタミン複合体化ＲＮＡ）と、遊離ＲＮＡ成分とを含む組成物に関して、国際公開第２００９／１４４２３０号の開示を、参照により本明細書に援用する。本明細書で定義されるアジュバント成分（例えば、プロタミン複合体化ＲＮＡ）と、本明細書で定義される遊離ＲＮＡ成分とを含むそのような組成物は、国際公開第２０１６／１６５８２５号に開示される手段及び方法を使用して生成することができる。
【０３００】
好ましい実施形態では、好ましくは医薬組成物、ワクチンである組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡを含み、少なくとも１つのＲＮＡは、１以上の脂質（例えば、カチオン性脂質及び／又は中性脂質）と複合体化又は会合して、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポプレックス、及び／又はナノリポソームを形成する。
【０３０１】
本発明の文脈において、「脂質ナノ粒子」という用語（「ＬＮＰ」とも呼ぶ）は、特定の形態に限定されず、例えば、水性環境及び／又はＲＮＡの存在下で、カチオン性脂質と任意に１以上の更なる脂質とが組み合わされたときに生成される形態を含む。例えば、リポソーム、脂質複合体、リポプレックスなどは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の範囲内である。
【０３０２】
ＬＮＰは通常、カチオン性脂質と、中性脂質、荷電脂質、ステロイド、及びポリマーコンジュゲート脂質（例えば、ＰＥＧ化脂質）から選択される１以上の賦形剤とを含む。ＲＮＡは、ＬＮＰの脂質部分内、又はＬＮＰの一部又は全体の脂質部分によって包囲される水性空間に封入され得る。ＲＮＡ又はその一部はまた、ＬＮＰと会合及び複合体化され得る。ＬＮＰは、核酸が結合する粒子、又は１以上の核酸が封入される粒子を形成することができる任意の脂質を含むことができる。好ましくは、ＬＮＰを含む核酸は、１以上のカチオン性脂質、及び１以上の安定化脂質を含む。安定化脂質には、中性脂質及びＰＥＧ化脂質が含まれる。
【０３０３】
一実施形態では、ＬＮＰは、本質的に（ｉ）少なくとも１つのカチオン性脂質；（ｉｉ）中性脂質；（ｉｉｉ）ステロール、例えば、コレステロール；及び（ｉｖ）ＰＥＧ−脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−ｃＤＭＡから本質的になり、モル比は、約２０〜６０％カチオン性脂質：５〜２５％中性脂質：２５〜５５％ステロール；０．５〜１５％ＰＥＧ−脂質である。
【０３０４】
その文脈において、好ましいステロールはコレステロールである。ステロールは、脂質粒子の約１０モル％〜約６０モル％又は約２５モル％〜約４０モル％であり得る。一実施形態では、ステロールは、脂質粒子中に存在する総脂質の約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は約６０モル％である。別の実施形態では、ＬＮＰは、ステロールのモル基準で約５％〜約５０％、例えば、モル基準で約１５％〜約４５％、約２０％〜約４０％、約４８％、約４０％、約３８．５％、約３５％、約３４．４％、約３１．５％、又は約３１％（脂質ナノ粒子の脂質の総モル１００％に基づく）を含む。
【０３０５】
ＬＮＰのカチオン性脂質はカチオン化可能であることがある。即ち、ｐＨが、脂質のイオン化可能基のｐＫ未満に低下するとプロトン化するが、ｐＨ値がより高くなると次第に中性になる。ｐＫ未満のｐＨ値では、脂質は、負に帯電した核酸と会合することができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、ｐＨ低下時に正電荷を帯びる両性イオン性脂質を含む。
【０３０６】
ＬＮＰは、任意の更なるカチオン性又はカチオン化可能な脂質、即ち、生理学的ｐＨなどの選択的ｐＨで正味の正電荷を有する多くの脂質種のいずれかを含み得る。
【０３０７】
そのような脂質としては、限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びＮ−（１，２ジミリスチルオキシプロパン−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられる。
【０３０８】
更に、本発明で使用できるカチオン性脂質の多くの市販の調製物が入手可能である。これらは、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの市販されている、ＤＯＴＭＡ及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されている、Ｎ−（１−（２，３ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）及び（ＤＯＰＥ）を含むカチオン性リポソーム）；及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から市販されている、エタノール中にジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む市販のカチオン性脂質）が挙げられる。以下の脂質は、カチオン性であり、生理学的ｐＨ未満で正の電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。
【０３０９】
更なるカチオン性脂質は、アミノ脂質であってもよい。代表的なアミノ脂質としては、限定されるものではないが、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、及び２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［ｌ，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）；ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）；ＭＣ３（米国特許出願公開第２０１００３２４１２０号明細書）が挙げられる。
【０３１０】
他の好適な（カチオン性）脂質は、国際公開第２００９／０８６５５８号、国際公開第２００９／１２７０６０号、国際公開第２０１０／０４８５３６号、国際公開第２０１０／０５４４０６号、国際公開第２０１０／０８８５３７号、国際公開第２０１０／１２９７０９号、国際公開第２０１１／１５３４９３号、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６０号明細書、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書、及び米国特許第８１５８６０１号明細書に開示されている。その文脈において、国際公開第２００９／０８６５５８号、国際公開第２００９／１２７０６０号、国際公開第２０１０／０４８５３６号、国際公開第２０１０／０５４４０６号、国際公開第２０１０／０８８５３７号、国際公開第２０１０／１２９７０９号、国際公開第２０１１／１５３４９３号、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６０号明細書、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書、及び米国特許第８１５８６０１号明細書の開示を、参照により本明細書に援用する。
【０３１１】
特に好ましい実施形態では、ＬＮＰは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５９２９に係る式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質を含む。この文脈において、カチオン性脂質に関するＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５９２９の開示を、参照により本明細書に援用する。
【０３１２】
恒久的にカチオン性の脂質又はリピドイドの量は、核酸カーゴの量を考慮して選択することができる。一実施形態では、これらの量は、ナノ粒子又は組成物のＮ／Ｐ比が約０．１〜約２０の範囲となるように選択される。この文脈において、Ｎ／Ｐ比は、脂質又はリピドイドの塩基性窒素含有基の窒素原子（「Ｎ」）の、カーゴとして使用されるＲＮＡのリン酸基（「Ｐ」）に対するモル比として定義される。Ｎ／Ｐ比は、ＲＮＡが塩基の統計的分布を示すという条件で、例えば、１μｇのＲＮＡが典型的に約３ｎｍｏｌのリン酸残基を含有することに基づいて計算することができる。脂質又はリピドイドの「Ｎ」値は、その分子量と、恒久的にカチオン性の及び存在する場合にはカチオン化可能な基の相対含量に基づいて計算できる。
【０３１３】
特定の実施形態では、ＬＮＰは、粒子の形成の間、粒子形成を安定化させる１以上の更なる脂質を含む。
【０３１４】
好適な安定化脂質は、中性脂質及びアニオン性脂質を含む。「中性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで非荷電又は中性両性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれか１つを意味する。代表的な中性脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが挙げられる。
【０３１５】
中性脂質の例としては、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチル  ＰＥ、１６−Ｏ−ジメチル  ＰＥ、１８−１−トランス  ＰＥ、１−ステアリオイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、及び１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）が挙げられる。一実施形態では、中性脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭから選択される中性脂質を含む。各種実施形態では、カチオン性脂質の中性脂質に対するモル比は、約２：１〜約８：１の範囲である。
【０３１７】
ＬＮＰのインビボ特性と挙動は、親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をＬＮＰ表面に添加して、立体的安定性を付与することにより変更することができる。更に、ＬＮＰは、リガンド（例えば、抗体、ペプチド、及び炭水化物）をその表面又はＰＥＧ鎖の末端（例えば、ＰＥＧ化脂質を介して）に結合させることにより、特異的なターゲティングに使用することができる。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ポリマーコンジュゲート脂質を含む。「ポリマーコンジュゲート脂質」という用語は、脂質部分とポリマー部分の両方を含む分子を意味する。ポリマーコンジュゲート脂質の例は、ＰＥＧ化脂質である。「ＰＥＧ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を意味する。ＰＥＧ化脂質は、当技術分野で知られており、１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ｓ−ＤＭＧ）などが挙げられる。
【０３１９】
特定の実施形態では、ＬＮＰは、ポリエチレングリコール脂質（ＰＥＧ化脂質）である更なる安定化脂質を含む。好適なポリエチレングリコール脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられる。代表的なポリエチレングリコール脂質としては、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、及びＰＥＧ−ｓ−ＤＭＧが挙げられる。一実施形態では、ポリエチレングリコール脂質は、Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）である。一実施形態では、ポリエチレングリコール脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧである。他の実施形態では、ＬＮＰは、ＰＥＧ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、例えば、１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＡＧ）、例えば、４−Ｏ−（２’，３’−ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル−１−Ｏ−（ω−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオアート（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、ＰＥＧ化セラミド（ＰＥＧ−ｃｅｒ）、又はＰＥＧジアルコキシプロピルカルバマート、例えば、ω−メトキシ（ポリエトキシ）エチル−Ｎ−（２，３ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバマート又は２，３−ジ（テトラデカノキシ）プロピル−Ｎ−（ω−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバマートを含む。各種実施形態では、カチオン性脂質のＰＥＧ化脂質に対するモル比は、約１００：１〜約２５：１の範囲である。
【０３２０】
脂質ナノ粒子中の核酸、特にＲＮＡの総量は変化し、例えば、ＲＮＡの総脂質量に対するｗ／ｗ比に応じて決めることができる。本発明の一実施形態では、ＲＮＡの総脂質量に対する比は、０．０６ｗ／ｗ未満、好ましくは０．０３ｗ／ｗ〜０．０４ｗ／ｗである。
【０３２１】
本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡを含む組成物、医薬組成物、又はワクチンは、液体及び／又は乾燥（例えば、凍結乾燥）形態で提供されてもよい。好ましい実施形態では、本発明に係るＲＮＡ又は組成物は、凍結乾燥形態で提供される。したがって、ＲＮＡ及び組成物は、例えば、インフルエンザウイルス又はノロウイルスによる感染などの感染症に対するワクチン接種に適したＲＮＡ及び組成物を（周囲温度に関係なく、且つ冷却することなく）保存する可能性を提供する。好ましくは、少なくとも１つの凍結乾燥ＲＮＡ又は組成物は、被験体への投与などの使用前に、有利には水性担体に基づく好適な緩衝液、例えば、Ｒｉｎｇｅｒ−Ｌａｃｔａｔｅ溶液中で再構成される。
【０３２２】
好ましい実施形態では、組成物は、医薬組成物又はワクチンであり、典型的には、本明細書で定義される少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡの安全且つ有効な量を含む。本明細書で使用されるとき、「安全且つ有効な量」とは、例えば、インフルエンザウイルスによる感染などの、例えば、本明細書に記載される感染症などに対する免疫応答を有意に誘導するのに十分である、上で定義した組成物又はワクチンのＲＮＡの量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、重篤な副作用を避けるのに十分に少ない量であり、即ち、利益とリスクの賢明な関係を可能にする量である。これらの上下限値の決定は、通常、賢明な医学的判断の範疇にある。ワクチン又は組成物に関して、「安全且つ有効な量」という表現は、達成される免疫反応が過剰又は有害ではないが、好ましくは、係る免疫反応が測定可能なレベルを下回ることがないように適応免疫系を刺激するのに適したＲＮＡの量を意味する。上で定義した組成物又はワクチンのＲＮＡのそのような「安全且つ有効な量」は、更に、例えば、ＲＮＡのタイプ、例えば、モノシストロン性、ビ−又は更にはマルチシストロン性ｍＲＮＡであることなどに応じて選択することができる。これは、ビ−又は更にはマルチシストロン性ｍＲＮＡが、等量のモノシストロン性ｍＲＮＡの使用よりもコードされたポリペプチドの有意に高い発現をもたらす可能性があるためである。担当医師の知識と経験の範囲内で、上で定義した組成物又はワクチンのＲＮＡの「安全且つ有効な量」は、治療の特定の目的、治療される患者の年齢及び身体的状態、並びにそれに類する要因に関連して更に変化し得る。本発明に係るワクチン又は組成物は、医薬組成物又はワクチンとして、ヒト及び獣医学の目的のために本発明にしたがって使用することができる。
【０３２３】
好ましい実施形態では、本発明に係る組成物、ワクチン、又はキットオブパーツのＲＮＡは、凍結乾燥形態で提供される。好ましくは、凍結乾燥されたＲＮＡは、投与前に、有利には水性担体に基づく好適な緩衝液、例えば、Ｒｉｎｇｅｒ−Ｌａｃｔａｔｅ溶液、好ましくはＲｉｎｇｅｒ溶液、リン酸緩衝液中で再構成される。
【０３２４】
好ましい実施形態によれば、注射に適した緩衝液は、本発明ワクチン又は組成物における担体として、又は本発明ワクチン又は本発明組成物を再懸濁するために使用され得る。注射に適したそのような緩衝液は、例えば、本明細書に記載される液体又は非液体の基剤／担体であり得る。Ｒｉｎｇｅｒ−Ｌａｃｔａｔｅ溶液が、液体基剤として特に好ましい。
【０３２５】
薬学的に許容される担体の選択は、原則として、ワクチン又は組成物が投与される方法によって決定される。ワクチン又は組成物は、例えば、全身的又は局所的に投与することができる。全身投与の経路には、一般に、例えば、経皮、経口、非経口経路を含み、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、及び腹腔内注射、及び／又は鼻腔内投与経路を含む。一般的な局所投与経路は、例えば、局所投与経路だけでなく、皮内、経皮、皮下、又は筋肉内注射、又は病変内、頭蓋内、肺内、心臓内、及び舌下注射も含む。より好ましくは、ワクチン又は組成物は、皮内、皮下、又は筋肉内経路によって、好ましくは注射によって投与でき、これは無針及び／又は針注射であり得る。したがって、組成物／ワクチンは、好ましくは液体又は固体の形態に処方される。投与されるワクチン又は組成物の好適な量は、動物モデルを用いた通常の実験によって決定することができる。そのようなモデルとしては、限定することを意図するものではないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ラット、イヌ、及び非ヒト霊長類モデルが挙げられる。注射用の好ましい単位剤形は、水、生理食塩水、又はそれらの混合物の滅菌溶液を含む。そのような溶液のｐＨは、約７．４に調整する必要がある。注射に適した担体は、ヒドロゲル、制御放出又は遅延放出のためのデバイス、ポリ乳酸、及びコラーゲンマトリックスを含む。局所適用に適した薬学的に許容される担体には、ローション、クリーム、ゲルなどでの使用に適したものが含まれる。ワクチンが経口投与される場合、錠剤、カプセルなどが好ましい単位剤形である。経口投与に使用することができる単位剤形を調製するための薬学的に許容される担体は、先行技術でよく知られている。それらの選択は、本発明の目的にとって重要ではないが、味、コスト、及び保存性などの副次的な事項に依存し、当業者であれば何らの困難性なく選択することができる。
【０３２６】
別の実施形態によれば、（医薬）組成物又はワクチンは、アジュバントを含み得る。アジュバントは、例えば、ワクチン又は組成物の免疫刺激特性を増強するために使用され得る。この文脈において、アジュバントは、本発明に係るワクチン又は組成物の投与及び送達を支援するのに適した任意の化合物として理解され得る。更に、そのようなアジュバントは、それに結合することなく、自然免疫系の免疫応答、即ち非特異的免疫応答を開始又は増強させることができる。換言すれば、投与されたときに、本発明に係るワクチン又は組成物は、典型的には、ワクチン又は組成物に含まれる少なくとも１つの抗原ペプチド又はタンパク質により、適応免疫応答を開始する。更に、本発明に係るワクチン又は組成物は、本明細書で定義されるアジュバントを本発明に係るワクチン又は組成物に添加することにより、（支援的な）先天性免疫応答を生じさせることができる。
【０３２７】
そのようなアジュバントは、当業者に公知であり、本発明の場合に好適な、即ち、哺乳動物における免疫応答の誘導を支援するアジュバントから選択することができる。好ましくは、アジュバントは、限定されるものではないが、ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミルジペプチド、プルロニック（登録商標）、ミョウバン溶液、水酸化アルミニウム、ＡＤＪＵＭＥＲ（商標）（ポリホスファゼン）、リン酸アルミニウムゲル、藻類由来のグルカン、アルガミュリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）、高タンパク質吸着性水酸化アルミニウムゲル、低粘度水酸化アルミニウムゲル、ＡＦ又はＳＰＴ（スクアレン（５％）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１（１．２５％）、及びｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水のエマルジョン）、ＡＶＲＩＤＩＮＥ（商標）（プロパンジアミン）、ＢＡＹ  Ｒ１００５（商標）（（Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセタート）、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（商標）（１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）、リン酸カルシウムゲル、ＣＡＰ（商標）（リン酸カルシウムナノ粒子）、コレラホロトキシン、コレラ毒素Ａ１−プロテインＡ−Ｄ断片融合タンパク質、コレラ毒素のＢサブユニット、ＣＲＬ  １００５（ブロックコポリマーＰ１２０５）、サイトカイン含有リポソーム、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＯＣ／ミョウバン複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ガンマイヌリン、Ｇｅｒｂｕアジュバント（以下の混合物：ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐｌ−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、ｉｉ）ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド（ＤＤＡ）、ｉｉｉ）亜鉛Ｌ−プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（１−（２−メチプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）、ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミタート）、ＤＲＶ類（脱水−再水和小胞から調製した免疫リポソーム）、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−１ベータ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、ＩＳＣＯＭＳ（商標）、ＩＳＣＯＰＲＥＰ  ７．０．３．（商標）、リポソーム、ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥ（商標）（７−アリル−８−オキソグアノシン）、ＬＴ  経口アジュバント（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）不安定内毒素プロトキシン）、任意の組成物の微小球体及び微小粒子、ＭＦ５９（商標）、（スクアレン水エマルジョン）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１（商標）（精製不完全フロイントアジ��バント）、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０（商標）（代謝可能油アジュバント）、ＭＰＬ（商標）（３−Ｑ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ）、ＭＴＰ−ＰＥ及びＭＴＰ−ＰＥリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ））−エチルアミド、一ナトリウム塩）、ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３）、ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）及びＤ−ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−イソＧｌｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）、ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼ−ガラクトースオキシダーゼ）、任意の組成物のナノスフェア又はナノ粒子、ＮＩＳＶ類（非イオン性界面活性剤小胞）、ＰＬＥＵＲＡＮ（商標）（ベータ−グルカン）、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ及びＰＬＡ（乳酸及びグリコール酸のホモポリマー及びコポリマー、ミクロスフェア／ナノスフェア）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）  Ｌ１２１（商標）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリラート）、ＰＯＤＤＳ（商標）（プロテイノイドミクロスフェア）、ポリエチレンカルバマート誘導体、ポリｒＡ：ポリｒＵ（ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、渦巻き型タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ｉｎｃ．、アラバマ州アラバスター）、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（ＱＳ−２１）、Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａ  サポニン）、Ｓ−２８４６３（４−アミノ−オテック−ジメチル−２−エトキシメチル−ｌＨ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）、ＳＡＦ−１（商標）（Ｓｙｎｔｅｘ  アジュバント配合物）、センダイプロテオリポソーム及びセンダイ含有脂質マトリックス、Ｓｐａｎ−８５（トリオレイン酸ソルビタン）、Ｓｐｅｃｏｌ（Ｍａｒｃｏｌ  ５２、Ｓｐａｎ  ８５及びＴｗｅｅｎ  ８５のエマルジョン）、スクアレン又はＲｏｂａｎｅ（登録商標）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサン及び２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２テトラコサヘキサン）、ステアリルチロシン（オクタデシルチロシンヒドロクロリド）、Ｔｈｅｒａｍｉｄ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド）、スレオニル−ＭＤＰ（Ｔｅｒｍｕｒｔｉｄｅ（商標）又は［ｔｈｒ１］−ＭＤＰ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン）、Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰ又はウイルス様粒子）、Ｐａｍ３Ｃｙｓを含むＷａｌｔｅｒ−Ｒｅｅｄリポソーム（水酸化アルミニウムに吸着させた脂質Ａを含有するリポソーム）、特に、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ及びＲｅｈｙｄｒａｇｅｌ等のアルミニウム塩、ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＩＦＡ、ＭＦ５９、Ｐｒｏｖａｘ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ及びＶａｘｆｅｃｔｉｎを含むエマルジョン、Ｏｐｔｉｖａｘ（ＣＲＬ１００５）、Ｌ１２１及びＰｏｌｏａｘｍｅｒ４０１０を含むコポリマー、Ｓｔｅａｌｔｈを含むリポソーム、ＢＩＯＲＡＬを含む渦巻き型のもの、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ及びＩＳＣＯＭを含む植物由来のアジュバント、Ｔｏｍａｔｉｎｅを含む同時刺激に好適なアジュバント、ＰＬＧ、ＰＭＭ及びＩｎｕｌｉｎを含むバイオポリマー、Ｒｏｍｕｒｔｉｄｅ、ＤＥＴＯＸ、ＭＰＬ、ＣＷＳ、マンノース、ＣｐＧ核酸配列、ＣｐＧ７９０９、ヒトＴＬＲ１−１０のリガンド、マウスＴＬＲ１−１３のリガンド、ＩＳＳ−１０１８、ＩＣ３１、イミダゾキノリン類、Ａｍｐｌｉｇｅｎ、Ｒｉｂｉ５２９、ＩＭＯｘｉｎｅ、ＩＲＩＶ類、ＶＬＰ類、コレラ毒素、易熱性毒素、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ、ＧＰＩアンカー、ＬＮＦＰＩＩＩ／Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、抗菌ペプチド、ＵＣ−１Ｖ１５０、ＲＳＶ融合タンパク質及びｃｄｉＧＭＰを含む微生物由来のペプチド、並びにＣＧＲＰ神経ペプチド含むアンタゴニストとして好適なアジュバントからなる群から選択することができる。
【０３２８】
好適に使用することができる更なるアジュバントは、国際公開第２０１６／２０３０２５号にも提供されている。本発明に係る組成物の免疫刺激特性を増強するために含有され得る好適なアジュバントに関して、国際公開第２０１６／２０３０２５号の請求項７及び／又は請求項１７に係るアジュバント、並びにそれらに関する開示は、参照により本明細書に含まれる。
【０３２９】
特定の実施形態では、本明細書で定義される組成物、医薬組成物、免疫原性組成物は、少なくとも１つのアジュバントを含むことができ、前記少なくとも１つのアジュバントは、国際公開第２００８０１４９７９号及び国際公開第２００９０９５２２６号にそれぞれ開示される式ＧｌＸｍＧｎを有する核酸アジュバント又は式ＣｌＸｍＣｎを有する核酸アジュバントであることができ、それらに関する開示を、参照により本明細書に援用する。
【０３３０】
ワクチン又は組成物は、その免疫原性を更に高めるために、１以上の補助物質を更に含むことができる。本明細書で定義される組成物又はワクチンのＲＮＡと、任意に本明細書で定義される組成物又はワクチンと共に処方（又は別々に処方）され得る補助物質との相乗作用が、好ましくはそれにより達成される。この点において、様々な種類の補助物質に応じて、様々なメカニズムを考慮することができる。例えば、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を可能にする化合物、例えば、リポ多糖、ＴＮＦ−アルファ、又はＣＤ４０リガンドは、好適な補助物質の第１のクラスを形成する。一般に、「危険信号」（ＬＰＳ、ＧＰ９６など）又はＧＭ−ＣＦＳなどのサイトカインによって免疫系に影響を与える任意の剤を補助物質として使用することができ、本発明に係る免疫刺激アジュバントにより生成される免疫応答を、標的化された方法で増強する及び／又はそれに影響を与えることができる。特に好ましい補助物質は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ｈＧＨなどの成長因子などの、コードされた少なくとも１つの抗原による適応免疫応答の誘導に加えて、自然免疫応答を促進するモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、又はケモカインなどのサイトカインである。好ましくは、そのような免疫原性増強剤又は化合物は、別々に提供され（本発明ワクチン又は組成物と共にに処方されず）、個別に投与される。
【０３３１】
ワクチン又は組成物は、更に、ヒトＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対するその（リガンドとしての）結合親和性のために、又はマウスＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、又はＴＬＲ１３に対するその（リガンドとしての）結合親和性のために免疫刺激性であることが知られている任意の更なる化合物を更に含むことができる。
【０３３２】
この文脈でワクチン又は組成物に添加することができる別のクラスの化合物は、ＣｐＧ核酸、特にＣｐＧ−ＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡであることができる。ＣｐＧ−ＲＮＡ又はＣｐＧ−ＤＮＡは、一本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＤＮＡ）、二本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）、又は二本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｄｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）であることができる。ＣｐＧ核酸は、好ましくはＣｐＧ−ＲＮＡの形態であり、より好ましくは一本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）の形態である。ＣｐＧ核酸は、好ましくは、少なくとも１つ以上の（分裂促進的な）シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフ）を含む。第１の好ましい代替によれば、これらの配列に含まれる少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、即ち、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）は、メチル化されていない。これらの配列に任意に含まれる全ての更なるシトシン又はグアニンは、メチル化することもメチル化しないこともできる。しかし、更に好ましい代替によれば、ＣｐＧモチーフのＣ（シトシン）及びＧ（グアニン）は、メチル化された形態で存在することもできる。
【０３３３】
好ましくは、前記化合物は、本発明に係るＲＮＡを含有する（本発明の）前記組成物又はワクチンとは別に処方及び投与される。
【０３３４】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る組成物は、少なくとも２つのＲＮＡ種を含み、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列を、前記少なくとも１つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することによって適合され、少なくとも１つのＲＮＡ種は、ノロウイルスに由来する少なくとも１つのペプチド又はタンパク質又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。好ましくは、本発明組成物中の少なくとも１つの適合されたＲＮＡは、ノロウイルスに由来するペプチド又はタンパク質又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。より好ましくは、少なくとも１つのコード領域は、本明細書に記載されるノロウイルスに由来するペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくは変異体をコードする。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、ノロウイルスワクチン、より好ましくは多価ノロウイルスワクチンである。
【０３３５】
ノロウイルスに由来する好適なノロウイルス抗原及び抗原ペプチド又はタンパク質は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６７３号に記載されており、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０３３６】
好ましい実施形態では、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）又は適合されたＲＮＡ（種）は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６７３に記載されている配列番号１〜４４１０のいずれか１つに係るアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなる（ノロウイルスに由来する）ペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。
【０３３７】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で使用されるＲＮＡ（種）、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６７３に記載される配列番号４４１１〜３９６９０、３９７１３〜３９７４６のいずれか１つに係る核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はそれからなる少なくとも１つのコード領域を含む。
【０３３８】
更に好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む多価ノロウイルスワクチンであり、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列は、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して少なくとも１つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を変更することにより適合され、少なくとも１つのＲＮＡ種は、ノロウイルスに由来する少なくとも１つのペプチド又はタンパク質、又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域含み、少なくとも１つのＲＮＡ種は、ノロウイルスに由来する異なるペプチド又はタンパク質、又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。
【０３３９】
特に好ましい実施形態では、本発明に係る組成物は、以下を含む多価ノロウイルスワクチンである。
ａ）ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６７３に記載される配列番号４４１１〜３９６９０、３９７１３〜３９７４６のいずれか１つに係る少なくとも１つの核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む少なくとも１つの、又は複数の、又は少なくとも１超のＲＮＡ種、及び
ｂ）ノロウイルスに由来する少なくとも１つのペプチド又はタンパク質、又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域であって、好ましくは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６７３に係る配列番号１〜４４１０のいずれか１つに係るアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの適合された核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を好ましくは含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む少なくとも１つの、又は複数の、又は少なくとも１超の適合されたＲＮＡ種。
【０３４０】
特に好ましい実施形態によれば、本発明に係る組成物は、少なくとも２つのＲＮＡ種を含み、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列は、前記少なくとも１つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数を、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチドの数に対して変更することにより適合され、少なくとも１つのＲＮＡ種が、インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１つのペプチド又はタンパク質、又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。好ましくは、本発明組成物における少なくとも１つの適合されたＲＮＡは、インフルエンザウイルスに由来するペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域、又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体を含む。より好ましくは、少なくとも１つのコード領域は、本明細書に記載のインフルエンザウイルスに由来するペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくは変異体をコードする。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、インフルエンザワクチン、より好ましくは多価インフルエンザワクチンである。
【０３４１】
好ましい実施形態では、組成物は、本明細書に記載の少なくとも２つのＲＮＡ種を含み、少なくとも１つのＲＮＡ種は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）から選択される少なくとも１つの抗原、又はその断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。より好ましくは、ＲＮＡの少なくとも１つのコード領域は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及び／又はノイラミニダーゼ（ＮＡ）に由来する少なくとも１つの抗原ペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくは変異体をコードする。この文脈において、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、同じインフルエンザウイルス又は異なるインフルエンザウイルス（又はそれぞれに異なるインフルエンザウイルス株）から選択され得る。
【０３４２】
好適なインフルエンザ抗原及びインフルエンザウイルスに由来する抗原ペプチド又はタンパク質は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７５８６２号及び国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６６３号に記載されており、それらの全体を、参照により本明細書に援用する。
【０３４３】
好ましくは、本発明組成物中の少なくとも１つのＲＮＡ（種）、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）又は適合されたＲＮＡ（種）は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６６３に記載される配列番号１〜３０５０４、２１３７１３、２１３７３８、２１３７３９、２１３７８７、２１３７９２、２１３７９７、２１３８０２、２１３９９６〜２１４０２３、２１４１００〜２１４１２７、２１４２１２〜２１４２３９、２１４３１６〜２１４３４３、２１４４２０〜２１４４４７、２１４５２４〜２１４５５１、２１４６２８〜２１４６５５、２１４７３２〜２１４７５９、２１４８３６〜２１４８６３、２１４９４０〜２１４９６７、２１５０４４、２１５０４９〜２１５０７６、２１５１６１、２１５１６６〜２１５１９３、２１５２７８、２１５２８３〜２１５３１０、２１５３９５、２１５４００〜２１５４２７、２１５５１２、２１５５１７〜２１５５４４のいずれか１つに係るアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなるペプチド又はタンパク質をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。
【０３４４】
いくつかの実施形態によれば、本発明組成物中の少なくとも１つのＲＮＡ種、好ましくは適合される元のＲＮＡ（種）は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６６３に記載される配列番号３０５０５〜２１３５２８、２１３５２９〜２１３５５７、２１３７４０〜２１３７４６、２１３７８８、２１３７８９、２１３７９３、２１３７９４、２１３７９８、２１３７９９、２１３８０３、２１３８０４、２１４０２４〜２１４０５１、２１４１２８〜２１４１５５、２１４２４０〜２１４２６７、２１４３４４〜２１４３７１、２１４４４８〜２１４４７５、２１４５５２〜２１４５７９、２１４６５６〜２１４６８３、２１４７６０〜２１４７８７、２１４８６４〜２１４８９１、２１４９６８〜２１４９９５、２１５０４５、２１５０４６、２１５０７７〜２１５１０４、２１５１６２、２１５１６３、２１５１９４〜２１５２２１、２１５２７９、２１５２８０、２１５３１１〜２１５３３８、２１５３９６、２１５３９７、２１５４２８〜２１５４５５、２１５５１３、２１５５１４、２１５５４５〜２１５５７２、２１５６２９、２１５６３２、２１５６３８〜２１５８３５、２１５８９２、２１５８３６〜２１５８８９のいずれか１つに係る核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む。
【０３４５】
特に好ましい実施形態によれば、本発明組成物中の少なくとも１つのＲＮＡ種、好ましくは適合されたＲＮＡ種は、本明細書に記載される配列番号２６〜１４０７９、１４０８０〜１６２６４、１６２６５〜２８６４０、２８６４１〜３０５６８のいずれか１つに係る核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む。
【０３４６】
更に好ましい実施形態では、本発明に係る組成物は、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む多価インフルエンザワクチンであり、少なくとも１つのＲＮＡ種の配列は、前記少なくとも１つのＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチド数を、元のＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチド数に対して変更することによって適合され、少なくとも１つのＲＮＡ種は、インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１つのペプチド又はタンパク質、又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域を含み、少なくとも１つのＲＮＡ種は、インフルエンザウイルスに由来する異なるペプチド若しくはタンパク質、又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。より好ましくは、組成物は、インフルエンザＨＡに由来するペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのＲＮＡ種と、インフルエンザＮＡに由来するペプチド又はタンパク質、又はその断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つの他のＲＮＡ種とを含み、前記ＲＮＡ種の少なくとも１つは、本明細書に記載される適合されたＲＮＡである。
【０３４７】
特に好ましい実施形態では、本発明に係る組成物は、以下を含む多価インフルエンザワクチンである。
ａ）ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６０６６３に記載される配列番号３０５０５〜２１３５２８、２１３５２９〜２１３５５７、２１３７４０〜２１３７４６、２１３７８８、２１３７８９、２１３７９３、２１３７９４、２１３７９８、２１３７９９、２１３８０３、２１３８０４、２１４０２４〜２１４０５１、２１４１２８〜２１４１５５、２１４２４０〜２１４２６７、２１４３４４〜２１４３７１、２１４４４８〜２１４４７５、２１４５５２〜２１４５７９、２１４６５６〜２１４６８３、２１４７６０〜２１４７８７、２１４８６４〜２１４８９１、２１４９６８〜２１４９９５、２１５０４５、２１５０４６、２１５０７７〜２１５１０４、２１５１６２、２１５１６３、２１５１９４〜２１５２２１、２１５２７９、２１５２８０、２１５３１１〜２１５３３８、２１５３９６、２１５３９７、２１５４２８〜２１５４５５、２１５５１３、２１５５１４、２１５５４５〜２１５５７２、２１５６２９、２１５６３２、２１５６３８〜２１５８３５、２１５８９２、２１５８３６〜２１５８８９のいずれか１つに係る少なくとも１つの核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む少なくとも１つの、又は複数の、又は少なくとも１超のＲＮＡ種、及び
ｂ）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１つのペプチド又はタンパク質、又は前記ペプチド又はタンパク質の断片若しくは変異体をコードする少なくとも１つのコード領域であって、本明細書に記載される配列番号２６〜１４０７９、１４０８０〜１６２６４、１６２６５〜２８６４０、２８６４１〜３０５６８のいずれか１つに係る核酸配列、又はこれらの核酸配列のいずれか１つの断片若しくは変異体を好ましくは含む又はからなる少なくとも１つのコード領域を含む少なくとも１つの、又は複数の、又は少なくとも１超の適合されたＲＮＡ種。
【０３４８】
ＲＮＡ組成物を製造するための方法
本発明の更なる態様は、本明細書に記載されるＲＮＡ組成物を製造するための方法に関する。この方法は、好ましくは、少なくとも２つのＲＮＡ種を含むＲＮＡ組成物、好ましくは（多価）ワクチンを製造するためのものであり、好ましくは本明細書に記載される、より好ましくはクロマトグラフィーカラムでのＲＮＡの保持時間を変更するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種の混合物から少なくとも１つＲＮＡ種を精製するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ種を含む混合物から少なくとも２つのＲＮＡ種を共精製するための方法、少なくとも２つのＲＮＡ配列のＡ及び／又はＵヌクレオチド数を調和させるための方法、適合されたＲＮＡを提供するための方法、又は本明細書に記載の組成物又はワクチンに関して本明細書に記載される少なくとも１つの適合されたＲＮＡ種の配列中のＡ及び／又はＵヌクレオチド数を変更することによって、少なくとも１つＲＮＡ種の配列が適合されている。
【０３４９】
好ましい実施形態では、方法は、ＲＮＡ種のプールから選択される少なくとも２つのＲＮＡ種を含む組成物の迅速且つ効率的な製造を可能にするシステムを提供する。ＲＮＡ種／配列のプールから出発して、組成物の少なくとも２つのＲＮＡ種は、本明細書に提示された方法によって迅速に交換することができる。この概念はまた、図３及び実施例７に示される。例えば、多価インフルエンザワクチンの場合、季節性インフルエンザワクチンの製造（図３参照；Ａ：季節Ａ；Ｂ：季節Ｂ；Ｃ：季節Ｃ）などのために、ＡＵ適合されたＲＮＡ配列プールから、抗原、例えば、ＨＡ及び／又はＮＡ抗原をコードするＲＮＡ種を容易に交換することができる（「＋」：ＲＮＡ混合物への新たなＲＮＡ種の追加；「−」：混合物からのＲＮＡ種の除去）。そのようにして、方法は、インフルエンザワクチンの迅速な季節的適合を可能にする。概説した概念は、ノロウイルスなどの他の迅速に適合する病原体にも適しており、ＲＮＡベースのノロウイルスワクチンを迅速に適合させるために使用できる。したがって、方法は、好ましくは、組成物に含まれる少なくとも１つのＲＮＡ配列の配列を適合させる工程を含み得る。ＲＮＡを製造するための方法は、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
【０３５０】
したがって、方法は、好ましくは、組成物に含まれる少なくとも１つのＲＮＡ配列の配列を適合させる工程を含み得る。ＲＮＡを製造するための方法は、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
【０３５１】
キット
別の態様によれば、本発明はまた、本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）、本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含む組成物、任意に可溶化のための液体ビヒクル、及び任意に本明細書に記載される（適合された）ＲＮＡ（種）の用法及び用量に関する情報を伴う技術的指示を含むキット、特にキットオブパーツを提供する。好ましくは、本明細書に記載される（適合された）ＲＮＡ（種）又は本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含む組成物は、キットの別々部分で提供され、本明細書に記載される（適合された）ＲＮＡ（種）又は本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含む組成物は、好ましくは凍結乾燥されている。より好ましくは、キットは、本明細書に記載のＲＮＡ、組成物は、本発明に係る少なくとも１つのＲＮＡ（種）を含む組成物を可溶化するためのビヒクルをその一部として更に含み、ビヒクルは、好ましくはＲｉｎｇｅｒ−ｌａｃｔａｔｅ溶液である。前記キットはいずれも、本明細書で定義される治療又は予防に使用することができる。より好ましくは、前記キットのいずれかは、ワクチン、好ましくはインフルエンザウイルス感染又はノロウイルス感染などの感染症による感染に対するワクチンとして使用され得る。
【０３５２】
（医学的）使用及び用途：
本発明は更に、本発明に係る（適合された）ＲＮＡ（種）、本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含む組成物／ワクチンは、又はそれを含むキットのいくつかの用途及び使用を提供する。特に、（医薬）組成物又はワクチンは、一般的には医薬組成物として、又はワクチンとして、ヒト及び獣医学の目的、好ましくはヒトの医療目的に使用することができる。
【０３５３】
したがって、更なる態様では、本発明は、本発明に係る（適合された）ＲＮＡ（種）、本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含む組成物／ワクチン、又は本明細書で定義されるキット又はキットオブパーツの、医薬としての第１の医学的使用に関する。特に、本発明は、医薬の調製のための、本明細書で定義される少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）又は本明細書に記載されるその断片若しくは変異体の使用を提供する。
【０３５４】
別の態様によれば、本発明は、本発明に係る（適合された）ＲＮＡ（種）、本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含む組成物、又は本明細書に記載にキット又はキットオブパーツの、インフルエンザウイルスによる感染症の治療のための第２のの医学的使用に関する。特に、本発明は、医薬の調製に使用される、本明細書に記載される少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を提供し、本明細書に記載される（適合された）ＲＮＡ（種）は、好ましくは、薬学的に許容されるビヒクル及び任意に更なるアジュバント並びに本明細書で定義される任意の更なる成分と共に処方される。
【０３５５】
更に、本発明は、本発明に係る（適合された）ＲＮＡ（種）、本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含む組成物、又は本明細書に記載されるキット若しくはキットオブパーツの、ノロウイルスによる感染の治療のための第２の医学的使用に関する。特に、本発明は、医薬の調製に使用される、本明細書に記載される少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を提供し、本明細書に記載される（適合された）ＲＮＡ（種）は、好ましくは、薬学的に許容されるビヒクル及び任意に更なるアジュバント並びに本明細書で定義される任意の更なる成分と共に処方される。
【０３５６】
本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含む組成物又はワクチンは、例えば、全身的又は局所的に投与することができる。全身投与のための経路としては、一般に、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内及び腹腔内注射、及び／又は鼻腔内投与経路を含む経皮、経口、非経口経路が挙げられる。一般に、局所投与のための経路としては、例えば、局所投与経路だけでなく、皮内、経皮、皮下、又は筋肉内注射、又は病変内、頭蓋内、肺内、心臓内、及び舌下注射も含む。より好ましくは、ワクチンは、皮内、皮下、又は筋肉内経路により投与することができる。
【０３５７】
更なる態様において、本発明は、障害を治療又は予防する方法を提供し、障害は、好ましくは、インフルエンザウイルス又はノロウイルスによる感染、又はインフルエンザウイルス又はノロウイルスによる感染に関連する障害であり、方法は、それを必要とする被験体に、本発明に係る（適合された）ＲＮＡ（種）、本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含む本発明組成物、又は本発明キット又はキットオブパーツを投与することを含む。
【０３５８】
特に、そのような方法は、好ましくは以下の工程を含むことができる：
ａ）本発明に係る（適合された）ＲＮＡ（種）、本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含むワクチン／組成物、又は本明細書に記載の本発明キット又はキットオブパーツを提供すること；及び
ｂ）本発明に係る（適合された）ＲＮＡ（種）、本発明に係る少なくとも１つの（適合された）ＲＮＡ（種）を含むワクチン／組成物、又は本明細書に記載のキット又はキットオブパーツを、組織又は生物に適用又は投与すること。
【図面の簡単な説明】
【０３５９】
【図１】図１は、ＲＮＡ混合物のＨＰＬＣ共精製及び／又は共分析に関連する技術的問題を示す。ＨＰＬＣヒストグラム（異なるＲＮＡ分子種を含むＲＮＡ混合物）の模式図を示す。  図１Ａ及び１Ｂ：ＲＮＡ混合物のＲＮＡ分子種の保持時間が異なる。不完全（ａｂｏｒｔｉｖｅ）配列などの不純物は互いに分離できない。更に、ヒストグラムが部分的に重なっているので、個々の種の完全性などの品質属性を決定できない。図１Ａは、混合物中の各ＲＮＡ種の別々のヒストグラムを示す。図１Ｃ及び１Ｄ：まれなケースとして、ＲＮＡ混合物の３つのＲＮＡ種の保持時間が類似しており、不完全配列などの不純物を互いに分離することができた。更に、ピークが全体的に重なっているので、ＲＮＡ混合物全体の完全性などの品質属性を決定できた。図１Ｃは、混合物中の各ＲＮＡ種の別々のヒストグラムを示す。図１Ｅ：ＲＮＡ種は、異なる保持時間を有している。ヒストグラムは完全に互いに分離されているので、ＲＮＡ混合物の個々のＲＮＡ種の完全性などの品質属性を決定できる。
【図２】図２は、ＡＵ数を増加させる又は減少させるために、短いタンパク質（アミノ酸配列：ＡＷＨＰＶＡＣ）をコードする所定の核酸配列を適合させる基本原理を示す。図２Ａ：適合方法／アルゴリズムの最初の工程として、核酸配列の全てのコドンを分類し、代替コドンとの潜在的な交換を各個々のコドンに割り当てる（ＡＵ数の増減を可能にするコドン変更を、表１及び表２に示す）。図２Ａでは、アスタリスク（＊）でラベルされたコドンは、そのそれぞれのコドンが変更されたときに、ＡＵ数の増加を可能にすることができ、ハッシュ（＃）でラベルされたコドンは、そのそれぞれのコドンが変更されたときに、ＡＵ数の減少を可能にすることができ、クロス（「ｘ」）でラベルされたコドンは、ＡＵ数に変化をもたらさない。図２Ｂは、ＡＵ数が増加した標的配列への入力核酸配列の適合を示す。代替コドンに置き換えられ得る可能性のある４種のコドンはいずれも、ＡＵ数のより多いコドンに変更される（該当コドンをハイライトする）。図２Ｃは、ＡＵが減少した標的配列への入力核酸配列の適合を示す。代替コドンに置き換えられ得る可能性のある３種のコドンはいずれも、ＡＵ数がより少ないコドンに変更される（該当コドンをハイライトする）。
【図３】図３は、本発明の多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）／多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）ｍＲＮＡワクチンプラットフォーム（例えば、インフルエンザ）のモジュール設計原理を示し、ＲＮＡ種を、製造条件（ＨＰＬＣ精製及び／又はＨＰＬＣ分析）を変更せずに迅速に交換できる。ＡＵ適合されたＲＮＡ配列プールから、例えば、季節性インフルエンザワクチンの製造（Ａ：季節Ａ；Ｂ：季節Ｂ；Ｃ：季節Ｃ）などのために、抗原、例えば、ＨＡ及び／又はＮＡ抗原をコードするＲＮＡ種を容易に交換できる（「＋」：ＲＮＡ混合物への新たなＲＮＡ種の追加；「−」：混合物からのＲＮＡ種の除去）。一般的概念は、ノロウイルス抗原などにも使用することができる。
【図４】図４は、ＲＮＡ配列中のアデニンヌクレオチドの数が、ＨＰＬＣの保持時間と相関することを示す。様々なポリＡサイズのホタルルシフェラーゼをコードするＲＮＡ種（１〜４）を生成し、ＨＰＬＣで個々に分析した。ＨＰＬＣクロマトグラムを重ね合わせた。１＝Ａ２５；２＝Ａ３５；３＝Ａ５０；４＝Ａ６４。実験の詳細な説明は、実施例１に記載する。
【図５Ａ】図５は、ＲＮＡ配列中のアデニンヌクレオチドの数を適合させることで、ＨＰＬＣの保持時間の調和が可能になることを示す。図５Ａ：ＨＡ−Ｂブリスベンをコードするアデニン適合されたＲＮＡ配列を示す（重ねて表示）。（１）非適合配列；（２）ｃｄｓに導入された９個のアデニン；（３）ＵＴＲに追加された９個のアデニンの一続き、又は（４）ポリＡに追加された９個のアデニン。実験の詳細な説明は、実施例２に記載する。
【図５Ｂ】図５は、ＲＮＡ配列中のアデニンヌクレオチドの数を適合させることで、ＨＰＬＣの保持時間の調和が可能になることを示す。図５Ｂ：ＨＡ−Ｂプーケットをコードするアデニン適合されたＲＮＡ配列を示す（重ねて表示）。（１）非適合配列；（２）ｃｄｓに導入された９個のアデニン；（３）ＵＴＲに追加された９個のアデニンの一続き、又は（４）ポリＡに追加された９個のアデニン。実験の詳細な説明は、実施例２に記載する。
【図６】図６は、アデニン数の適合により、ＨＡ−ＡをコードするＲＮＡ配列とＨＡ−ＢをコードするＲＮＡ配列のＨＰＬＣ保持時間の調和が可能になることを示す。ＨＡ−ＢをコードするＲＮＡ配列は、Ａの数を増加させることにより、ＨＡ−Ａ  ＲＮＡ配列のＡの数に一致するように適合させた。アスタリスクは、ＨＰＬＣピークが完全に重なることを示す（ピークの傾斜の減少が保持時間を決定する）。注：図６の目的においては、個々のクロマトグラムを識別する必要はない。実験の詳細な説明は、実施例２に記載する。
【図７Ａ】図７は、ＨＰＬＣが、ＲＮＡ混合物の共分析に特に適した方法であることを示す。様々な比におけるインタクトなＲＮＡ及び分解されたＲＮＡのＲＮＡ混合物を、ＨＰＬＣで分析した。図７Ａ：インタクトなＲＮＡの量を示す、様々なＲＮＡ混合物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせ。注：図７の目的においては、個々のクロマトグラムを識別する必要はない。実験の詳細な説明は、実施例３に記載する。
【図７Ｂ】図７は、ＨＰＬＣが、ＲＮＡ混合物の共分析に特に適した方法であることを示す。様々な比におけるインタクトなＲＮＡ及び分解されたＲＮＡのＲＮＡ混合物を、ＨＰＬＣで分析した。図７Ｂ：分解されたＲＮＡの量を示す、様々なＲＮＡ混合物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせ。注：図７の目的においては、個々のクロマトグラムを識別する必要はない。実験の詳細な説明は、実施例３に記載する。
【図８Ａ】図８は、アデニン適合されＲＮＡ混合物（３つの異なるＮＡ抗原をコードする）が、共分析と共精製に適した１つの個別のＨＰＬＣピークを生成することを示す。図８Ａ：個々の非適合ＲＮＡ配列（１〜３）、結果として得られた非適合ＲＮＡ混合物（４）のＨＰＬＣヒストグラムを示す。実験の詳細な説明は、実施例４に記載する。
【図８Ｂ】図８は、アデニン適合されＲＮＡ混合物（３つの異なるＮＡ抗原をコードする）が、共分析と共精製に適した１つの個別のＨＰＬＣピークを生成することを示す。図８Ｂ：個々の配列適合されたＲＮＡ配列のＨＰＬＣヒストグラム（１〜３）と、結果として得られる調和されたＲＮＡ混合物（４）を示す。実験の詳細な説明は、実施例４に記載する。
【図９】図９は、技術的な問題の詳細な説明を示す。インフルエンザウイルスＡ及びＢのＨＡ及びＮＡをコードするＲＮＡ種は、ＡＵの数が異なるために部分的に重なるＨＰＬＣクロマトグラムを有し、このようなＲＮＡ混合物（７種のＲＮＡ種全てを含む）の共精製及び／又は共分析は、技術的に不可能であろうことを示す。１＝インフルエンザウイルスＢのノイラミニダーゼをコードするＲＮＡ種（ＮＡ−Ｂ、ブリスベン）；２＝インフルエンザウイルスＡのノイラミニダーゼをコードする２つのＲＮＡ種（ＮＡ−Ａ、香港、カリフォルニア）；３＝インフルエンザウイルスＢのヘマグルチニンをコードする２つのＲＮＡ種（ＨＡ−Ｂ、ブリスベン、プーケット）；インフルエンザウイルスＡのヘマグルチニンをコードする２つのＲＮＡ分子種（ＨＡ−Ａ、香港、カリフォルニア）。実験の詳細な説明は、実施例５に記載する。
【図１０Ａ】図１０は、アデニン及び／又はウラシルの数が、ＨＰＬＣ保持時間と相関することを示す。図１０Ａ：Ａ及び／又はＵの総数／数、及びＨＰＬＣでのＲＮＡ保持時間に対してプロットした異なるＨＡ及びＮＡのＲＮＡ種のＡＵ含量（％）を示す。Ａ及び／又はＵの総数／数は、ＨＰＬＣ保持時間と相関するが、ＡＵの含量は、ＨＰＬＣ保持時間と相関しない。実験の詳細な説明は、実施例５に記載する。
【図１０Ｂ】図１０は、アデニン及び／又はウラシルの数が、ＨＰＬＣ保持時間と相関することを示す。図１０Ｂ：Ｇ及び／又はＣの総数／数、及びＨＰＬＣでのＲＮＡ保持時間に対してプロットした異なるＨＡ及びＮＡのＲＮＡ種のＧＣの含量（％）を示す。グアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）の数と含量（％）の両方は、ＨＰＬＣの保持時間と相関していない。実験の詳細な説明は、実施例５に記載する。
【図１１】図１１は、３つの異なるＲＮＡ分子種を含むＲＮＡ混合物の配列適合ストラテジを示す。配列適合されたＲＮＡ混合物を得るためには、２つの生成物ピークを１７個のＡＵ又は４０個のＡＵだけシフトさせる必要があり（シフトされたピーク：破線）、３つの成分のそれぞれをＨＰＬＣで共分析することができる（適合された配列のＡＵ数の違い：７０ＡＵ）。実験の詳細な説明は、実施例６に記載する。
【図１２Ａ】図１２は、モノリシックエチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンコポリマーでのＡＵ数が異なる構築物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。流量及び勾配プロファイルが示される。第１のピークは、ＡＵ数８２４の構築物に対応し、第２のピークは、ＡＵ数８９４の構築物に対応し、第３のピークは、ＡＵ数１１３７の構築物に対応し、第４のピークは、ＡＵ数１１３９の構築物に対応し、最後のピークは、ＡＵ数１４２４の構築物に対応する。実験の詳細な説明は、実施例８に記載する。
【図１２Ｂ】図１２は、モノリシックエチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンコポリマー上のＡＵ数が異なる構築物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。流量及び勾配プロファイルが示される。第１のピークは、ＡＵ数８２４の構築物に対応し、第２のピークは、ＡＵ数８９４の構築物に対応し、第３のピークは、ＡＵ数１１３７の構築物に対応し、第４のピークは、ＡＵ数１１３９の構築物に対応し、最後のピークは、ＡＵ数１４２４の構築物に対応する。実験の詳細な説明は、実施例８に記載する。
【図１３Ａ】図１３は、粒子状のポリ（スチレン）−ジビニルベンゼン（ＰＶＤ）カラムでのＡＵ数が異なる構築物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。第１のピークは、ＡＵ数８２４の構築物に対応し、第２のピークは、ＡＵ数８９４の構築物に対応し、第３のピークは、ＡＵ数１１３７の構築物に対応し、第４のピークは、ＡＵ数１１３９の構築物に対応し、最後のピークは、ＡＵ数１４２４の構築物に対応する。実験の詳細な説明は、実施例８に記載する。
【図１３Ｂ】図１３は、粒子状のポリ（スチレン）−ジビニルベンゼン（ＰＶＤ）カラムでのＡＵ数が異なる構築物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。第１のピークは、ＡＵ数８２４の構築物に対応し、第２のピークは、ＡＵ数８９４の構築物に対応し、第３のピークは、ＡＵ数１１３７の構築物に対応し、第４のピークは、ＡＵ数１１３９の構築物に対応し、最後のピークは、ＡＵ数１４２４の構築物に対応する。実験の詳細な説明は、実施例８に記載する。
【図１４Ａ】図１４は、シリカベースのＣ４カラムでのＡＵ数が異なる構築物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。第１のピークは、ＡＵ数８２４の構築物に対応し、第２のピークは、ＡＵ数８９４の構築物に対応し、第３のピークは、ＡＵ数１１３７の構築物に対応し、第４のピークは、ＡＵ数１１３９の構築物に対応し、最後のピークは、ＡＵ数１４２４の構築物に対応する。実験の詳細な説明は、実施例８に記載する。
【図１４Ｂ】図１４は、シリカベースのＣ４カラムでのＡＵ数が異なる構築物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。第１のピークは、ＡＵ数８２４の構築物に対応し、第２のピークは、ＡＵ数８９４の構築物に対応し、第３のピークは、ＡＵ数１１３７の構築物に対応し、第４のピークは、ＡＵ数１１３９の構築物に対応し、最後のピークは、ＡＵ数１４２４の構築物に対応する。実験の詳細な説明は、実施例８に記載する。
【図１５Ａ】図１５は、ＰＬＰＲ−ＳカラムでのＡＵ数が異なる構築物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。第１のピークは、ＡＵ数８２４の構築物に対応し、第２のピークは、ＡＵ数８９４の構築物に対応し、第３のピークは、ＡＵ数１１３７の構築物に対応し、第４のピークは、ＡＵ数１１３９の構築物に対応し、最後のピークは、ＡＵ数１４２４の構築物に対応する。実験の詳細な説明は、実施例８に記載する。
【図１５Ｂ】図１５は、ＰＬＰＲ−ＳカラムでのＡＵ数が異なる構築物のＨＰＬＣクロマトグラムの重ね合わせを示す。第１のピークは、ＡＵ数８２４の構築物に対応し、第２のピークは、ＡＵ数８９４の構築物に対応し、第３のピークは、ＡＵ数１１３７の構築物に対応し、第４のピークは、ＡＵ数１１３９の構築物に対応し、最後のピークは、ＡＵ数１４２４の構築物に対応する。実験の詳細な説明は、実施例８に記載する。
【図１６】図１６は、実施例８の代表的なＨＰＬＣランのＡＵ数の差に対する分離因子アルファのプロットを示す。モノリシック：流量０．５（図１２参照）のモノリシックエチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンコポリマーの値とそれぞれの傾向線；ＰＶＤ：流量０．３（図１３参照）の粒子状ポリ（スチレン）−ジビニルベンゼン（ＰＶＤ）カラムの値とそれぞれの傾向線；Ｃ４−Ｆ１：流量１．０（図１４参照）のシリカベースのＣ４カラムの値とそれぞれの傾向線；ＰＬＰＲ−Ｓ：流量１．０（図１５参照）のＰＬＰＲ−Ｓカラムの値とそれぞれの傾向線。実験の詳細な説明は、実施例８に記載する。
【実施例】
【０３６０】
以下に示す実施例は、単なる例示であり、本発明を更に説明するものである。これらの実施例は、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０３６１】
【表３】
2021502079.tif 000009
【０３６２】
実施例１：ＨＰＬＣ保持時間に対する、一続きのヌクレオチドホモポリマーの相関の検証
本発明者らは、驚くべきことに、ＲＮＡのサイズではなく、ＲＮＡのアデニンヌクレオチド（Ａヌクレオチド）及び／又はウラシルヌクレオチド（Ｕヌクレオチド）の総数が、ＨＰＬＣ保持時間に影響を及ぼしていることを見出した。更なる詳細については、以下に記載する。
【０３６３】
１．１．様々な一続きのアデニンのを含むホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡの調製：
ホタルルシフェラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、３２Ｌ４リボソームタンパク質（３２Ｌ４  ＴＯＰ  ５’−ＵＴＲ）に由来する５’−ＵＴＲと、３’末端にアルブミンに由来する３’−ＵＴＲと、ヒストン−ステムループ構造と、様々な数のアデニンヌクレオチドの一続き（以下では「ポリＡストレッチ」又は「Ａホモポリマー」とも呼ぶ）とを含むように改変されたｐＵＣ１９由来のベクター骨格に導入した。完全なＲＮＡ配列は、配列表に記載される（以下の表４を参照）。
【０３６４】
【表４】
2021502079.tif 000010
【０３６５】
ＤＮＡプラスミドを、ＥｃｏＲＩを使用して線状化し、適切な緩衝条件下でヌクレオチド混合物及びキャップアナログの存在下にて、ＤＮＡ依存性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで転写した。得られた個々のＲＮＡ産物を、国際公開第２００８／０７７５９２  Ａ１号に記載されるＰｕｒｅＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）を使用して精製し、続いてＨＰＬＣを使用して分析した。
【０３６６】
１．２  ＨＰＬＣ保持時間の決定：
注射用水（ＷＦＩ）を使用して、個々のＲＮＡサンプルを０．１ｇ／Ｌに希釈した。１０μｌの希釈ＲＮＡサンプルをＨＰＬＣカラム（モノリシックポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）マトリックス）に注入した。ＲＰ  ＨＰＬＣ分析は、以下の条件を使用して行った。
勾配１：緩衝液Ａ（０．１Ｍ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０））；緩衝液Ｂ（２５％アセトニトリルを含む０．１Ｍ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０））。３０％緩衝液Ｂから開始して、勾配は２分間で３２％緩衝液Ｂにまで拡張し、その後、１ｍｌ／ｍｉｎの流量で１５分間かけて５５％緩衝液Ｂに拡張した（国際公開第２００８／０７７５９２号から適応させた）。クロマトグラムは、２６０ｎｍの波長で記録した。
【０３６７】
一方でヌクレオチドホモポリマーストレッチの存在及び程度と、他方でＨＰＬＣ保持時間との間の最終的な相関関係を調べるために、各ＨＰＬＣ分析ランのクロマトグラムを重ね合わせた。図４は、アデニンヌクレオチドの一続きが異なるＲＮＡのＨＰＬＣランの重ね合わせを示す。
【０３６８】
結果
図４に示されるように、Ａヌクレオチドホモポリマーストレッチの長さ（Ａヌクレオチドの総数）のみが異なる様々なＲＮＡ分子種のＨＰＬＣ保持時間の分析は、ＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの総数とＨＰＬＣ保持時間とに明確な相関関係を示す。より長いＡホモポリマーは保持時間の増加をもたらし、ＨＰＬＣ保持時間に対する観察された効果は、Ａヌクレオチドの数の増加（＋２５アデニンヌクレオチド；＋３５アデニンヌクレオチド；＋５０アデニンヌクレオチド；＋６４アデニンヌクレオチド）によるものであることを示唆する。
【０３６９】
なお、シトシンヌクレオチド（Ｃヌクレオチド）の総数の変化は、ＨＰＬＣ保持時間に影響を与えなかった（図示せず）。Ｃヌクレオチドの数ではなくＡヌクレオチドの数のみがＨＰＬＣの保持時間に影響を与えるので、ＲＮＡ分子種の伸長のみによってもたらされる影響を排除できる。
【０３７０】
実施例２：アデニン数の適合による共精製及び／又は共分析のための異なるＨＡ  ＲＮＡ配列のＨＰＬＣ保持時間の調和
本発明者らは、驚くべきことに、２つ以上の異なるＲＮＡ種（例えば、インフルエンザＨＡ−Ｂをコードする異なる配列を含むＲＮＡ分子）におけるＡヌクレオチドの総数の適合が、ＨＰＬＣ保持時間を調和させるのに適しており、その結果、共精製及び／又は共分析が可能になることを見出した。更なる詳細については、以下に記載する。
【０３７１】
２．１．  Ａヌクレオチドの総数の適合：
これまでの実施例は、ＲＮＡ配列中のＡヌクレオチド数とそれぞれのＨＰＬＣ保持時間との間の相関関係を示すので、ＨＡ抗原をコードするＲＮＡ配列（インフルエンザＨＡをコードする４つの異なるＲＮＡ配列）は、それらが（本質的に）同数のＡヌクレオチドを含むように適合させた。配列適合は、コードされたアミノ酸配列が変化しないように、遺伝子コードの縮重を利用する（表１及び表２を比較）又はアデニンストレッチをＲＮＡ分子種のポリＡテール又はＵＴＲに導入することにより行った。
【０３７２】
目的は、ＨＰＬＣで４つのクロマトグラムの完全な重ね合わせ（調和）を得ることによって、異なるＨＡ  ＲＮＡ分子種を含むＲＮＡ混合物の共精製及び／又は共分析を容易にする方法で配列を適合させることとした。これは、ｍＲＮＡ混合物に基づくインフルエンザワクチンの費用対効果と迅速な生産のための前提条件である（例えば、多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）／多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）インフルエンザＲＮＡワクチンプラットフォームの開発用、図３を参照）。
【０３７３】
様々なＨＡ抗原（ＨＡ−Ａ及びＨＡ−Ｂ）をコードする全てのＲＮＡ分子種の保持時間を調和させるために、インフルエンザＢの様々なＨＡタンパク質をコードするＧＣ最適化ＤＮＡ配列を、Ａヌクレオチドの数を増加させる、コード配列（コドン交換によって）を適合させる、ポリＡ配列を伸長させる、又はＵＴＲ領域に更なるＡヌクレオチドを導入することによって適合させた（以下の表５を参照）。適合は、ＨＡ−Ｂ配列中のＡヌクレオチドの総数をＨＡ−Ａ配列中のＡヌクレオチドの数に対してより近くにシフトさせるために、ＨＡ−Ｂ配列中のＡヌクレオチドの総数を９個増加させることによって行った。ＤＮＡ構築物とＲＮＡは、実施例１に記載したように調製した。
【０３７４】
【表５】
2021502079.tif 000011
【０３７５】
２．２．  Ａヌクレオチドの総数の、ＨＰＬＣ保持時間に及ぼす影響：
ＨＰＬＣサンプル調製及びＨＰＬＣ分析を、実施例１に記載されるように行った。ＨＰＬＣ保持時間に対するＡヌクレオチドの数の影響を調べるために、各ＲＮＡ種のクロマトグラムを重ね合わせて分析した。
【０３７６】
図５Ａは、ＨＡ−Ｂ／ブリスベンをコードするＲＮＡ分子種の４つの重ね合わせたクロマトグラムを示す（１つの非適合配列（１）と３つの適合された配列（それぞれ２、３、及び４））。図５Ｂは、ＨＡ−Ｂ／プーケットをコードするＲＮＡ分子種の４つの重ね合わせたクロマトグラムを示す（１つの非適合配列（１）と３つの適合された配列（それぞれ２、３、及び及び４））。図６は、ＨＡ−Ｂ／ブリスベンをコードする適合されたＲＮＡ分子種（９個のアデニンがコドン交換によってｃｄｓに導入されている）、ＨＡ−Ｂ／プーケットをコードする適合されたＲＮＡ分子種、及びＨＡ−Ａをコードする２つの非適合ＲＮＡ分子種（ＨＡ−Ａカリフォルニア；ＨＡ−Ａ香港）の重ね合わせたクロマトグラムを示す。
【０３７７】
結果：
結果は、９個のアデニンの追加によるＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数の適合（図５Ａ及び図５Ｂ参照）が、ＨＰＬＣ保持時間のシフトをもたらしたことを示す。図５Ａ及び図５Ｂに示すように、ＵＴＲに導入された又はポリＡテールに導入されたＡストレッチの効果は、保持時間に僅かに高い影響を与えた。
【０３７８】
図６は、ＨＡ−Ｂ配列が成功裏に適合され、ＨＡ−ＡピークとＨＡ−Ｂピークが調和されていることを示す。完全に重なり合うＨＰＬＣピークをもたらす、この配列適合により、混合物中の個々のＲＮＡ種の共分析、及び混合物中のＲＮＡの完全性の同時測定が可能になる。更に、ＨＰＬＣ保持時間の調和により、同時ＲＮＡ精製（共精製）が可能になる。
【０３７９】
注目すべきことに、実施例５で更に詳細に分析及び記載されるように、図６で観察されたＨＡ−Ａ配列と適合されたＨＡ−Ｂ配列の驚くほど正確な重ね合わせは、それぞれのＲＮＡ配列（ＨＡ−Ｂブリスベン：ＡＵ数７３２；ＨＡ−Ｂプーケット：ＡＵ数７２６；ＨＡ−Ａカリフォルニア：ＡＵ数７３７；ＨＡ−Ａ香港：ＡＵ数：７２９；表４参照）のＡヌクレオチドとＵヌクレオチドの数（ＡＵ数）が厳密に一致することによっても説明できる。
【０３８０】
実施例３：ＲＮＡ混合物の共分析のためのＨＰＬＣの好適性の評価
本発明者らは、ＨＰＬＣがＲＮＡ混合物の共分析に特に適した方法であることを示した。更なる詳細については、以下に記載する。
【０３８１】
３．１．  試験ＲＮＡの準備：
ＨＰＬＣシステムを試験するためのＲＮＡを、実施例１にしたがって生成した。
【０３８２】
３．２．  ＲＮＡの定方向分解（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）及び完全性が異なるＲＮＡ混合物の調製：
ＲＮＡサンプルを９０℃で１４０分間分解した。続いて、インタクトなＲＮＡと分解されたＲＮＡを、インタクトなＲＮＡ：分解されたＲＮＡの様々な比（９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、及び１０：９０）で混合し、様々な完全性のそれぞれのＲＮＡ混合物を分析ＨＰＬＣに適用した。分析ＨＰＬＣを実施例１に記載されるように行った。分析のために、異なるＲＮＡ混合物のＨＰＬＣランを重ね合わせた。結果を図７に示す。
【０３８３】
結果：
図７が示すように、ＲＮＡ混合物のＲＮＡ完全性は、ＲＮＡ混合物が同じ保持時間（調和されたＲＮＡピーク；個々のＲＮＡ成分のピーク、この場合、インタクトな（ｉｎｔｅｇｅｒ）ＲＮＡと分解されたＲＮＡが完全に重なり合っている）を有するシナリオで決定することができる。したがって、分析システムは、本発明に係る（多価）ＲＮＡ混合物の分析に適している。
【０３８４】
実施例４：Ａヌクレオチドの数の適合による共精製及び／又は共分析のためのＮＡのＲＮＡ配列のＨＰＬＣ保持時間の調和
本発明者らは、驚くべきことに、適合された数のＡヌクレオチドを有するＲＮＡ種を含む（３つの異なるＮＡ抗原をコードする）ＲＮＡ混合物が、共分析及び共精製に適した１つの調和されたＨＰＬＣピークを生成することを見出した。更なる詳細については、以下に記載する。
【０３８５】
４．１．  数種のインフルエンザ株のＮＡタンパク質をコードするＤＮＡにおけるＡヌクレオチドの数の適合：
目的は、３つのクロマトグラムの完全な重ね合わせを得ることによって、異なるＨＡ  ＲＮＡ分子種のＲＮＡ混合物の共精製及び／又は共分析を容易にする方法でＮＡ  ＲＮＡ配列を適合させることとした。これは、ＲＮＡ混合物に基づくインフルエンザワクチンの費用対効果と迅速な生産のための前提条件である（例えば、多価インフルエンザＲＮＡワクチンの開発用、図３を参照）。
【０３８６】
様々なＮＡ抗原をコードする全てのＲＮＡ分子種の保持時間を調和させるために、インフルエンザの様々なＮＡタンパク質をコードするＧＣ最適化ＤＮＡ配列を、コード配列を変更（コドン交換、以下の表６を参照）することによってＡヌクレオチド数を減少させることによって適合させた。ＮＡ  Ｈ３Ｎ２をコードするＲＮＡ及びＮＡ  Ｈ１Ｎ１をコードするｍＲＮＡのＡヌクレオチドの数を減少させ、ＮＡインフルエンザＢをコードするＲＮＡ中のＡヌクレオチドの数と本質的に一致するように適合を行った。
【０３８７】
ＤＮＡ構築物及びＲＮＡは、実施例１に記載されるように調製した。
【０３８８】
【表６】
2021502079.tif 000012
【０３８９】
４．２．  Ａヌクレオチドの数のＨＰＬＣ保持時間に対する影響：
ＨＰＬＣサンプル調製及びＨＰＬＣ分析は、実施例１に記載されるように行った。
【０３９０】
Ａヌクレオチドの数のＨＰＬＣ保持時間に対する影響を調べるために、非適合ＲＮＡ種のクロマトグラムを重ね合わせて分析した。更に、非適合ＲＮＡ分子種を混合し（各１００ｎｇ）、混合物として適用し、ＨＰＬＣで分析した（図８Ａを参照）。更に、適合されたＮＡ  Ｈ３Ｎ２（香港）ＲＮＡ、適合されたＮＡ  Ｈ３Ｎ２（カリフォルニア）ＲＮＡ、及びＮＡインフルエンザＢ（ブリスベン）ＲＮＡを混合し（各１００ｎｇ）、混合物として適用し、ＨＰＬＣで分析した（図８Ｂを参照）。図８Ａは、対応するＲＮＡ混合物のクロマトグラム（４）の隣に、ＮＡをコードする非適合ＲＮＡ分子種の重ね合わせたクロマトグラム（１、２、３）を示す。図８Ｂは、調和されたＮＡ  ＲＮＡ混合物のクロマトグラム（４）を示す。
【０３９１】
結果
結果は、ＲＮＡ混合物の個々のＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数の適合が、ＲＮＡ混合物の保持時間の適合と分離したＨＰＬＣピークをもたらすことを示す（図８Ｂを参照）。これは、共精製と共分析（個々のＨＰＬＣピークが僅かな変動を示す場合でも）を可能にする。対照的に、非適合ＲＮＡ混合物は、共分析と共精製に適さない幅広い非分離ＨＰＬＣピーク（図８Ｂを参照）を生成する。
【０３９２】
なお、配列番号１７及び１９におけるＡヌクレオチドの数の適合（減少）は、セリンコドンＡＧＣをコドンＵＣＣに変更することにより行った。これにより、Ａ数の減少とＵ数の増加をもたらす（したがって、ＡＵ数は安定；Ａ：Ｕ比は減少）。このことは、個別に分析した適合配列のＨＰＬＣクロマトグラムで観察された僅かな変動が、Ａ：Ｕ比のシフトによって引き起こされたことを示唆している。したがって、Ａ：Ｕ比の適合は、本発明に係る配列適合にも使用することができる。
【０３９３】
実施例５：ＨＰＬＣの保持時間に対するヌクレオチドの影響
これまでの実施例で示したように、ＲＮＡ配列中のＡヌクレオチドの数を適合させることで、ＨＰＬＣクロマトグラムの調和が可能となる。これは、共分析及び／又は共精製の要件である。本発明者らは更に、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数がＨＰＬＣ保持時間と相関することを見出した。この知見は、ＲＮＡ配列を適合させ、ＲＮＡ混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを調和させるためのより多くのオプションを提供する。更なる詳細については、以下に記載する。
【０３９４】
５．１．  数種のインフルエンザ株のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡの調製：
インフルエンザウイルス（インフルエンザＡとインフルエンザＢ）の表面にある２つの糖タンパク質である異なるヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質をコードするＤＮＡ配列を生成し、実施例１に記載したようにＲＮＡを生成した。
【０３９５】
【表７】
2021502079.tif 000013
【０３９６】
５．２．  ヌクレオチドの総数及び／又はヌクレオチドの相対含量とＨＰＬＣ保持時間との間の相関：
ＨＰＬＣサンプル調製及びＨＰＬＣ分析は、実施例１に記載されるように行った。
【０３９７】
第１の工程では、ＨＡ及びＮＡ抗原をコードする個別に生成されたＲＮＡ構築物（ＲＮＡ種）をＨＰＬＣで別々に分析した。重ね合わせたＨＰＬＣクロマトグラムを図９に示す。７つの異なるＲＮＡ種のクロマトグラムを重ね合わせたところ、全てのクロマトグラムが部分的に重なり合い、ＨＰＬＣによる共精製と共分析のいずれをも技術的に不可能にする（当技術分野における課題の図である図１と比較されたい）。
【０３９８】
ＨＰＬＣの保持時間に対するヌクレオチド配列の影響をよりよく理解するために、各ＲＮＡ分子種のヌクレオチド数（Ａ、Ｕ、Ｇ、及びＣ）及びヌクレオチド含量と、ＨＰＬＣ保持時間との間の相関を調べた。
【０３９９】
図１０Ａは、異なるＨＡとＮＡ  ＲＮＡ種のＡとＵヌクレオチドの数及び含量（ＡＵ％）と、それぞれのＨＰＬＣ保持時間との間の相関を示す。図１０Ｂは、異なるＨＡとＮＡ  ＲＮＡ種のグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの数及び含量（ＧＣ％）と、それぞれのＨＰＬＣ保持時間との間の相関を示す。
【０４００】
結果：
図１０Ａは、Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数の、それぞれの保持時間に対する明確な相関関係を示す。このような相関は、Ａ及びＵヌクレオチドの含量（ＡＵ％）では見られなかった。図１０Ｂは、ＨＰＬＣの保持時間が、Ｇ及び／又はＣヌクレオチドの数によっても、Ｇ及び／又はＣヌクレオチドの含量（ＧＣ％）によっても影響されないことを示す。
【０４０１】
なお、Ａヌクレオチドの数と保持時間との間の相関は、Ｕヌクレオチドの数と保持時間との間の相関よりも強い。それと一致して、実施例４の結果はまた、保持時間に対するＡヌクレオチドの影響が、保持時間に対するＵヌクレオチドの影響よりも強いことを示唆した。
【０４０２】
全体として、Ａ及びＵヌクレオチドの数は最良の相関関係を示し、ＲＮＡ配列を適合させて、共分析と共精製のためにＲＮＡ混合物を調和させる最も精確な方法を可能にする。
【０４０３】
実施例６：自動化ヌクレオチド適合法（アルゴリズム）の開発
本発明者らは、アミノ酸配列を変えることなくＲＮＡ配列中の任意のヌクレオチドの数をある決まった値に設定する自動化されたインシリコ法（アルゴリズム）を開発した。本発明の文脈において、自動化されたインシリコ法は、ＲＮＡ配列の配列適合（Ａ及び／又はＵヌクレオチドの数（ＡＵ数）の適合）のために使用し、ＨＰＬＣ共分析及び／又はＨＰＬＣ共精製のためのＲＮＡ混合物の調和を可能にした。更なる詳細については、以下に記載する。
【０４０４】
６．１  配列分析及び目標ＡＵ数の定義：
実験の目的は、ＨＰＬＣを使用した共分析に適した、適応されたＲＮＡ混合物（抗体をコードする３つの異なるＲＮＡ分子種を含む）のＲＮＡ配列を生成することとした。それぞれのＨＰＬＣクロマトグラムが完全に分離されるようにし（少なくとも７０個のＡＵ数の差）、完全性の共分析が可能になるように、全てのＲＮＡ分子においてＡＵ数を適合する必要がある。
【０４０５】
３つの抗体配列（配列番号２０〜２２）を選択し、ＧＣ最適化ＤＮＡ（配列番号２３〜２５）配列を生成した（本質的に実施例１にしたがって）。ＨＰＬＣ共分析のためのＡ及びＵ（Ｔ）ヌクレオチドのに最適な数を定義できるように、それぞれのＧＣ最適化配列（生成物１、生成物２、生成物３；以下の表８を参照）について、ヌクレオチド数を決定した。
【０４０６】
【表８】
2021502079.tif 000014
【０４０７】
ＲＮＡ混合物に含まれるＲＮＡ分子種をＨＰＬＣ共分析に適合させるために、生成物２及び生成物３の目標ＡＵ数を以下の値に設定し、ＲＮＡ混合物として分析したときにＨＰＬＣで完全性分析を行えるようにした。
【０４０８】
【表９】
2021502079.tif 000015
【０４０９】
表９に示すように、３つのＲＮＡ配列のＡＵ数が少なくとも７０個のヌクレオチド異なるように、各生成物ＲＮＡの目標ＡＵ数を設定した（図１１に示すストラテジ）。
【０４１０】
６．２  ＡＵ配列適合方法：
以下では、生成物２（＋１７ＡＵ）（配列番号２４）の配列適合方法を例示的に説明する。配列中のＡヌクレオチドの数がＴ（Ｕ）ヌクレオチドの数よりも多かったので、得られたＡＵ適合された配列中のＡとＵヌクレオチドの分布を維持するために、適合値を＋８Ａと＋９Ｔ（Ｕ）に設定した。
【０４１１】
方法（アルゴリズム）の初期段階では、配列に含まれる各コドンのマトリックスを作成し、可能な変更（本明細書では、「交換マトリックス」と呼ぶ）を特定した。例示的な「交換マトリックス」を式（Ｉ）に示す。
2021502079.tif 000016
【０４１２】
式（Ｉ）は、コドン「ＣＧＡ」について、代替コドンへの変更がＡヌクレオチドの数を１個増加させるオプション（例えば、ＣＧＡ−＞ＡＧＡ）を提供する、Ｃヌクレオチドの数を１個増加させるオプション（例えば、ＣＧＡ−＞ＣＧＣ）を提供する、Ｇヌクレオチドの数を１個増加させるオプション（例えば、ＣＧＡ−＞ＣＧＧ）、及びＴヌクレオチドの数を１個増加させるオプション（例えば、ＣＧＡ−＞ＣＧＴ）を提供することを示す。
【０４１３】
交換マトリックスは、配列中の個々のコドンごとに生成した。前記交換マトリックスを使用して、各コドンにおけるそれぞれのヌクレオチド（それぞれ、Ａ及びＴ（Ｕ）数）の（アミノ酸配列を変化させることがない）潜在的な最大数を決定した。したがって、配列の６３個のコドン全てを分析し、潜在的な代替コドンを、例えば、表１０に示すような表形式に組み立てた。
【０４１４】
【表１０】
2021502079.tif 000017
【０４１５】
次に、配列番号２４に係る配列を、別々のコドンに繰り返し分割し、表形式で保存した。これにより、表１１に例示されるリスト（配列中の位置１、２、３、４、…、８６、及び８７が示されている）を得た。
【０４１６】
【表１１】
2021502079.tif 000018
【０４１７】
次に、コドンのリスト（表１１を参照）を、可能なコドン変化について段階的な反復によって分析したた。各反復工程では、対応するコドンを、潜在的なヌクレオチド変化のための（上で記載した）各交換マトリクスを使用して分析した。例えば、それぞれのコドンで理論的に可能な変更がなかった場合（例えば、「ＡＴＧ」又は「ＴＧＧ」の場合など）、式（ＩＩ）に例示的に示す対応する交換マトリックスを使用した（交換マトリックスの＊＝０）。
2021502079.tif 000019
【０４１８】
式（ＩＩ）は、コドン「ＡＴＧ」の場合、代替コドンへの変更により、Ａヌクレオチド、Ｃヌクレオチド、Ｇヌクレオチド、又はＴヌクレオチドの数を増加させるオプションがないことを示す（ＡＴＧ（Ｍｅｔ）には代替コドンがないため）。
【０４１９】
それぞれの交換マトリックス（＊＞０）にしたがう変更が理論的に可能であった場合、コドンは、例えば、Ａ及び／又はＴ（Ｕ）ヌクレオチド数を増加させるオプションを提供するコドンのみが適合されるという前提で変更を行うことができるかどうかについて更に分析した。したがって、標的ヌクレオチド（例えば、Ａ及び／又はＴ（Ｕ））と、現在の交換マトリックスにおいてポジティブな結果を生成する可能性のあるヌクレオチド（即ち、Ａ及び／又はＴ（Ｕ）の変更；例えば、式（Ｉ）を参照）との間のインターセクションを構築した。その結果、各コドンは分類され、３つのカテゴリの１つにグループ化された。
【０４２０】
カテゴリ１（「好ましい」カテゴリ）：
１つの標的ヌクレオチドのみ（本例では、Ａ又はＴ（Ｕ））の増加を可能にする潜在的なコドン交換。例えば、コドン「ＧＡＣ」（Ａｓｐ）は、Ａ及びＴ（Ｕ）ヌクレオチド数を増加させるために「ＧＡＵ」（Ａｓｐ）に変更することができる。その変更は、Ａ及びＴ（Ｕ）ヌクレオチドの数に（前記のもの以外に）更なる影響を与えないので、更なる分析を必要としない。
【０４２１】
カテゴリ２（「可能」カテゴリ）：
両方の標的ヌクレオチド（本例では、Ａ及びＴ（Ｕ））の増加を可能にする潜在的なコドン交換。例えば、コドン「ＧＣＡ」は「ＧＣＵ」に変更でき、これにより、Ｔ（Ｕ）数は増加するが、同時にＡ数は減少する。したがって、この例における２種の標的ヌクレオチドのうちの１つ（Ｔ（Ｕ））の数が、他の標的ヌクレオチドの数（Ａ）の減少と引き換えに増加するかどうかを決定するために、このカテゴリに属するコドンに関して更なる分析が必要である。
【０４２２】
カテゴリ３（「不可能」カテゴリ）：
代替コドンが存在しない（＊＝０）ＲＮＡ配列中のコドン。このカテゴリ３の例は、ＡＴＧ（Ｍｅｔ；開始コドン）又は「ＵＧＧ」（Ｔｒｐ）である。
【０４２３】
元の配列の全てのコドンは、そのように分類した。この工程の後、合計８７のエントリを有する３つのカテゴリが存在した（配列番号２４に存在する８７個のコドンの場合）。次の工程では、カテゴリ３を考慮しなかった。これは、コドン変更が目標ヌクレオチド数（Ａ、Ｔ（Ｕ））に影響しないからである。
【０４２４】
次に、全ての標的ヌクレオチド（Ａ、Ｔ（Ｕ））に対して特定された潜在的なヌクレオチド変化の数が計算した。配列番号２４の場合の、可能なヌクレオチド変更をリストする（カテゴリ１、カテゴリ２；表１２を参照）。
【０４２５】
【表１２】
2021502079.tif 000020
【０４２６】
したがって、Ａには、２２個の好ましい変更（前記したカテゴリ１／「好ましい」を参照）が特定され、Ｔ（Ｕ）には、１５個の好ましい変更が特定された。適合値を＋８Ａ及び＋９Ｔ（Ｕ）に設定したので、コドン位置での適合はいずれも、カテゴリ１から得られた。表１３は、配列全体に均等に分布させた導入コドン交換をまとめたものである。
【０４２７】
【表１３】
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【０４２８】
これらの交換により、配列番号２５に係る以下の適合された配列が得られた。
【０４２９】
前記した例では、カテゴリ２の潜在的なヌクレオチド交換は行われなかった。しかし、例えば、１５より大きいＴ（Ｕ）数が必要とされるシナリオにおいては、カテゴリ１のコドンを全て使用した後、カテゴリ２のコドンを使用し、Ａ及びＴ（Ｕ）数の更なる適合可能性を得る。所望のヌクレオチド数を達成するためにカテゴリ２を要する場合、以下の比の計算することにより、交換ヌクレオチド（ヌクレオチドＡ又はＴ（Ｕ））を同定する。
2021502079.tif 000022
式中、ｉは、対応する標的を表し、ｃｉは、カテゴリ２のｉの可能な適合位置の数、ｘｉ、はｉの望ましい閾値、ｐｉは、既に変更された同定された適合位置の数を表す。計算された全ての比を最低から始まり最高の比までランク付けし、所望の閾値に達するまで又はカテゴリ２の可能な全ての交換が行われるまで、カテゴリ２の変更を適用する。この手順は、カテゴリ１の交換のみの使用では、所望の数を達成できない場合に、全ての標的について繰り返し行われる。
【０４３０】
例えば、カテゴリ２は、４７個のコドンを含み（表１２を参照）、Ａ又はＴ数を増加させるために交換され得る可能性がある。したがって、所望の閾値に達するまで、又はカテゴリ２のコドンも全て使用するまで、カテゴリ２から更なる変更を行う。配列番号２４の場合、Ｔ（Ｕ）数の、例えば２０個への変更は、カテゴリ２の以下の代替コドンを使用することにより、更なる適合をもたらす（カテゴリ１からの更なるコドン交換は示さず）：６＝ＡＴＴ、９＝ＡＴＴ、２１＝ＣＴＴ、１４４＝ＣＣＴ、１８３＝ＴＣＴ。
【０４３１】
所望の目標ヌクレオチド数を達成できない場合（カテゴリ１及び２の全ての代替コドンが使用されている、即ち、これ以上の変更は不可能である）、目標ヌクレオチド数にできる限り近くマッチングしている配列が生成される。
【０４３２】
前記した方法（アルゴリズム）を更に最適化するために、以下の改良を行うことができる。
１．前記した実験で使用した基本的な等分布は、交換の可能性に基づく。正規分布、最初の出現分布、最後の出現分布、又はランダムベースの分布など、他の分布モデルも想定され得る。或いは、可能な変更の平均又は、可能な変更の中央値を決定し、全ての交換をこれらの値の周りに配置することができる。
２．交換マトリックスは、標的配列のコドンに関する追加情報（例えば、コドン使用など）を含む。これは、コドン交換が望ましいかどうかという問題の更なる基準を作り、特定のコドン使用又は標的配列における異なるヌクレオチド比への適合を容易にする。
３．第３のカテゴリを、交換によって回避すべき配列又はモチーフ（例えば、制限酵素の認識モチーフ、プロモータ配列、又は望ましくない二次構造を構築する配列、など）によって行う。
４．Ａ及び／又はＵ適合のための最適なヌクレオチド数を同定するために、それらの長さ及び所望の標的ヌクレオチドの出現に基づいて、入力配列の自動化ビニングを行う。
【０４３３】
実施例７：迅速に調整可能なインフルエンザワクチン製造のための多価インフルエンザウイルスＲＮＡプラットフォームの生成及び使用
ＨＡ抗原をコードするＧＣ最適化コード配列のプールを、６１２ＡＵ（３６０Ａ及び２５２Ｔ）の数にＡＵ適合し、ＡＵ適合されたＨＡ配列プール（配列番号２６から１６２６３）を得た。ＮＡ抗原をコードするＧＣ最適化コード配列のプールを、４８８ＡＵ（２７１Ａ及び２１７Ｕ）の数にＡＵ数に適合し、ＡＵ適合されたＮＡ配列プール（配列番号１６２６４〜３０５６７）を得た。ＡＵ適合は、本質的に実施例６に記載されるように、本発明にしたがって行った。適合により、適合されたＨＡ  ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ混合物の共精製及び適合されたＮＡ配列を含むＲＮＡ混合物の共精製が可能となる。更に、適合により、ＨＡをコードするＲＮＡ配列（ＡＵ数６１２）及びＮＡをコードするＲＮＡ配列（ＡＵ数４８８）が分離したピーク（ＡＵ数の差：１２４）を生成する（ＨＰＬＣを使用した完全性の分析に適している）ので、適合されたＨＡ及びＮＡ  ＲＮＡ種を含むＲＮＡ混合物の共分析が可能となる。
【０４３４】
ＨＡ  ＲＮＡ混合物は、ＧＣ最適化されたＡＴ適合されたＤＮＡテンプレート（実施例１に記載されるように生成される）を使用して国際公開第２０１７／１０９１３４号に開示される手順にしたがって生成される。端的に言えば、ＤＮＡ構築物混合物（それぞれが異なるＨＡコード配列及びＴ７プロモータを含む）は、ＨＡ  ｍＲＮＡ構築物の混合物を生成するための同時ＲＮＡインビトロ転写のためのテンプレートとして使用される。続いて、得られた調和されたＲＮＡ混合物は、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用する共精製に使用される。
【０４３５】
並行反応において、ＮＡ  ＲＮＡ混合物は、ＧＣ最適化されたＡＴ適合されたＤＮＡテンプレートを使用して国際公開第２０１７／１０９１３４号に開示される手順にしたがって生成される。端的に言えば、ＤＮＡ構築物混合物（それぞれが異なるＮＡコード配列及びＴ７プロモータを含む）は、ＨＡ  ｍＲＮＡ構築物の混合物を生成するための同時ＲＮＡインビトロ転写のためのテンプレートとして使用される。続いて、得られた調和されたＲＮＡ混合物は、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用する共精製に使用される。
【０４３６】
ＨＡ抗原をコードする精製済みｍＲＮＡ混合物とＮＡ抗原をコードする精製済みｍＲＮＡ混合物を混合して、ＨＡ／ＮＡ  ＲＮＡ混合物を生成する。混合物の完全性（即ち、ＮＡピークとＨＡピーク）は、本明細書に記載されるようにＨＰＬＣを介して共分析される。
【０４３７】
有利なことに、本発明に係るＨＰＬＣベースの共精製及び共分析のためのクロマトグラフィーピークを調和させるために、ＨＡ配列及びＮＡ配列のＡＵ適合は、要求、例えば、季節性インフルエンザワクチンの設計又はパンデミックシナリオ（図３と比較）に迅速に適合され得るｍＲＮＡベースの多価インフルエンザワクチンの製造を容易にする。
【０４３８】
実施例８：様々な逆相ＨＰＬＣマトリックスに対する方法の好適性
本発明者らは、Ａ及び／又はＵ数の適合を介したＲＮＡの保持時間の変更は、特定の逆相カラム化学に限定されないことを見出した。
【０４３９】
Ａ及び／又はＵ数の適合による保持時間の変更が他の逆相カラムでも観察できるかどうかを試験するために（実施例１〜７では、モノリシックポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）マトリックスを使用）、以下のカラムを試験した。
−モノリシックエチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼンコポリマー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（図１３を参照）
−粒子状ポリ（スチレン）−ジビニルベンゼンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（図１４を参照）
−シリカベースのＣ４カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（図１５を参照）
−ＰＬＲＰＳ、非アルキル化多孔質ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）マトリックス（図１６を参照）
【０４４０】
黄熱ウイルス抗原をコードするＲＮＡを生成した。各構築物は、同一抗原（ＹＦＶ（１７Ｄ）−ｐｒＭＥ）をコードし、同一のＵＴＲエレメントを含み、同一サイズを有する。各構築物のＡＵ数は、コード配列適合によって変更した。構築物を表１４に示す。
【０４４１】
【表１４】
2021502079.tif 000023
【０４４２】
保持時間に対するＡＵ適合の影響を評価するために、５００ｕｇの各構築物を個別にそれぞれのカラムに供した。更に、各カラムについて、２種の異なる流量を試験した。結果を、図１２〜図１５に示す。
【０４４３】
更に、分離因子アルファは、試験された各カラムの各構築物について決定した。クロマトグラフィーでは、分離因子アルファは、２つの化合物の保持時間の比を表す。したがって、１．０より大きい値の分離因子は、２つの化合物の分離が発生したことを意味する。本分析では、配列番号３０５９２（ＡＵ１４２４を含む）を、分離因子計算のレファレンスとして使用した。計算した分離因子を表１５に示す。得られた分離因子の値を、各構築物のＡＵ数の差に対してプロットした（ＡＵ１４２４を含む配列番号３０５９２をレファレンスとした）。この図を図１６に示す。
【０４４４】
【表１５】
2021502079.tif 000024
【０４４５】
結論：
図１３に示すように、保持時間の調整は、モノリシックエチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン−コポリマーで機能する。４種全ての構築物が、異なる保持時間で溶出し、明確に分離できた。本ケースでは、ＡＵ８９４を有する構築物からのＡＵ８２４を有する構築物の分離は、各ピークを更に分析できるほどに強かった。
【０４４６】
図１４に示すように、保持時間の調整は、粒子状ポリ（スチレン）−ジビニルベンゼンカラムで機能する。４種全ての構築物が、異なる保持時間で溶出し、明確に分離できた。本ケースでは、ＡＵ８９４を有する構築物からのＡＵ８２４を有する構築物の分離は、各ピークを更に分析できるほどに強かった。
【０４４７】
図１５に示すように、保持時間の調整は、シリカベースのＣ４カラムで機能する。４種全ての構築物が、異なる保持時間で溶出し、明確に分離できた。本ケースでは、ＡＵ１１３９を有する構築物からのＡＵ８２４を有する構築物の分離は、各ピークを更に分析できるほどに強かった。
【０４４８】
図１６は、本発明の発明概念をまとめている。様々なＲＮＡ構築物のＡＵ数の適合（即ち、構築物間のＡＵ数の差を大きくする）により、保持時間の変更がもたらされ、ＨＰＬＣでの分離が可能になる。なお、その影響は、使用されるカラムマトリックスに関係なく観察された。
【０４４９】
言うまでもなく、ＡＵ数の調和（即ち、構築物間のＡＵ数の差を小さくする）も保持時間の変更をもたらし、ＨＰＬＣでの共精製が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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