(57)【要約】本発明は、治療用タンパク質、特に組換え凝固因子の分野に関する。本発明は、規定された位置に特定の点変異を含む組換え第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を提供し、これは前記ＦＶＩＩＩタンパク質の免疫原性を低下させるのに役立ち、第ＶＩＩＩ因子タンパク質はその凝固活性を実質的に保持する。本発明はさらに、前記脱免疫化されたタンパク質をコードする核酸、細胞株および組換えの調製方法、ならびに本発明の組換えＦＶＩＩＩを含む医薬組成物を提供し、これらは血友病Ａの患者（特にＦＶＩＩＩ製品で未だ処置されていない患者）の処置における使用に有利である。さらに、本発明は、以前に処置された患者およびＦＶＩＩＩに対して免疫応答を発現した患者のための（例えば、免疫寛容誘導療法（ＩＴＩ／ＩＴＴ）またはレスキューＩＴＩの）安全な代替物であり得る。本発明はまた、タンパク質の免疫原性を決定するためのアッセイを提供する。
2021520802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｙ７４８、Ｌ１７１、Ｓ５０７、Ｎ７９、Ｉ８０、Ｉ１０５、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｌ２３５、Ｖ２５７、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｙ４３０、Ｌ５０５、Ｆ５５５、Ｉ６１０、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｎ７５４、Ｋ１８３７、Ｒ１９３６、Ｓ２０３０、Ｓ２０３７、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｍ２１２３、Ｓ２１２５、Ｆ２２１５、Ｋ２２２６、Ｋ２２５８、Ｖ２３１３、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３およびＱ２３３５からなる群から選択される位置に少なくとも３個のアミノ酸置換を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質；
ここでＮの置換は、Ｄ、Ｈ、ＳおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｉの置換は、ＴおよびＶからなる群から独立して選択される；Ｓの置換は、Ａ、Ｎ、Ｇ、ＴおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｌの置換は、Ｎ、Ｑ、ＦおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｖの置換は、ＡおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｙの置換は、Ｎ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｆの置換は、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｋの置換は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｒの置換は、Ｑ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｍの置換は、Ｒ、Ｑ、ＫおよびＴからなる群から選択される；および／または、Ｑの置換は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＫからなる群から選択される；
ここで位置は、配列番号１の全長ヒト第ＶＩＩＩ因子分子に関して規定される；および
ここで組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号２からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、発色アッセイにおいて決定される少なくとも５０％の凝固活性を保持している；
または前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の融合タンパク質。
【請求項２】
アミノ酸置換が、Ｙ７４８Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｎ７９Ｓ、Ｉ８０Ｔ、Ｉ１０５Ｖ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｌ２３５Ｆ、Ｖ２５７Ａ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｙ４３０Ｈ、Ｌ５０５Ｎ、Ｆ５５５Ｈ、Ｉ６１０Ｔ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｎ７５４Ｄ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｓ２０３０Ａ、Ｓ２０３７Ｇ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｍ２１２３Ｋ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｖ２３１３Ａ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３ＡおよびＱ２３３５Ｈからなる群から選択される、請求項１記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
【請求項３】
組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が３〜２５個の前記置換を含み、置換が異なる免疫原性クラスター内に位置している、請求項１または２に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
【請求項４】
Ｙ７４８、Ｌ１７１、Ｓ５０７、Ｎ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｋ１８３７、Ｒ１９３６、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｓ２１２５、Ｆ２２１５、Ｋ２２２６、Ｋ２２５８、Ｓ２３１５およびＶ２３３３からなる群から選択される位置に少なくとも３個のアミノ酸置換を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質；
ここで、少なくとも３個のアミノ酸置換は、好ましくはＹ７４８Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａからなる群から選択される。
【請求項５】
少なくとも以下の位置にアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質；
ａ．Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｎ２３３ＤおよびＩ２６５Ｔ；および／または
ｂ．Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３ＤおよびＩ２６５Ｔ；および／または
ｃ．Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、およびＳ５０７Ｅ；および／または
ｄ．Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ；および／または
ｅ．Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６ＮおよびＹ７４８Ｓ；および／または
ｆ．Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｇ．Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｈ．Ｓ２０７７Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｉ．Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｊ．Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｋ．Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｙ７４８ＳおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｌ．Ｌ１７１Ｑ、Ｎ２９９Ｄ、Ｎ６１６ＥおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｍ．Ｓ１１２Ｔ、Ｓ５０７Ｅ、Ｙ７４８Ｓ、Ｋ１８３７ＥおよびＮ２０３８Ｄ；および／または
ｎ．Ｓ１１２Ｔ、Ｙ４２６Ｈ、Ｎ７５４Ｄ、Ｋ１８３７ＥおよびＮ２０３８Ｄ
好ましくは、少なくともｂおよびｃで規定された置換を組み合わせており、任意でｄまたはｅおよび／またはｆ、ｇ、ｈ、Ｉまたはｊおよび／またはＫ１８３７Ｅで規定された置換から選択される置換をさらに含む。
【請求項６】
少なくともＮ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｌ１７１、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｓ５０７、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｌ７０６およびＹ７４８の位置にアミノ酸置換を含む（好ましくは、置換はＮ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｓ５０７Ｅ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６ＮおよびＹ７４８Ｓであり、任意でタンパク質はＫ１８３７Ｅをさらに含み、配列番号７の２０〜１５３３位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含む）、請求項１〜５のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
【請求項７】
少なくともＮ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｌ１７１、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｓ５０７、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｌ７０６、Ｙ７４８、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｓ２３１５およびＶ２３３３の位置にアミノ酸置換を含む（好ましくは、１８個の置換はＮ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｓ５０７Ｅ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａであり、任意でタンパク質は配列番号６の２０〜１５３３位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含む）、請求項１〜６のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
【請求項８】
少なくともＫ１８３７の位置にアミノ酸置換を含む（好ましくは、前記置換はＫ１８３７Ｅであり、任意でタンパク質は配列番号５の２０〜１５３３位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含む）、請求項１〜７のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
【請求項９】
配列番号２からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して（好ましくは配列番号３からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質とも比較して）免疫原性が低下している、請求項１〜８のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質、
ここで、前記免疫原性は任意で、免疫原性スコア、または前記タンパク質とともにインキュベートされた樹状細胞およびドナーの制御性Ｔ細胞枯渇ＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養し、前記Ｔ細胞の活性化を試験することを含むアッセイによって（好ましくは前記アッセイによって）決定される。
【請求項１０】
配列番号５の第ＶＩＩＩ因子タンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項１〜９のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質、ここでＡ１、ａ１、Ａ２、ａ２、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインのみが配列同一性の決定のために考慮される、
または前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の融合タンパク質。
【請求項１１】
一本鎖第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはヘテロ二量体第ＶＩＩＩ因子タンパク質（好ましくは一本鎖Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子タンパク質）である、請求項１〜１０のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
【請求項１２】
融合タンパク質である、請求項１〜１１のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質、ここで融合パートナーは、Ｆｃ領域、アルブミン、アルブミン結合配列、ＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰポリペプチド、絨毛性ゴナドトロピンのベータサブユニットのＣ末端ペプチド、アルブミン結合小分子、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプンおよびそれらの組合せを含む群から選択される。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする核酸、ここで核酸は、好ましくはヒト細胞を含む群から選択される哺乳類細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターである。
【請求項１４】
請求項１３記載の核酸を含む宿主細胞、ここで宿主細胞は、好ましくは前記細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターを含む哺乳類細胞である。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質、請求項１３記載の核酸、または請求項１４記載の宿主細胞を含む医薬組成物、
ここで好ましくは、医薬組成物は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置されていない患者、第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置された患者、第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者、およびＩＴＩで処置されている第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者を含む群から選択される血友病Ａの患者の処置における使用のためのものである、
および／または、任意で、医薬組成物は、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、シクロホスファミド、リツキシマブおよび／またはシクロスポリンを含む群から選択される免疫抑制物質をさらに含む。
【請求項１６】
ＦＶＩＩＩタンパク質を発現する請求項１４記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、前記ＦＶＩＩＩタンパク質を単離することを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製するためのインビトロでの方法。
【請求項１７】
以下を含む、免疫原性が低下している第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製するための請求項１６に記載のインビトロでの方法：
ａ）相当の割合のヒトに関連するＴ細胞エピトープの存在についてＦＶＩＩＩタンパク質を分析する；
ｂ）工程ａで同定されたＴ細胞エピトープの１つを除去する位置に少なくとも１つ（好ましくは１つのみ）のアミノ酸置換を含む複数の前記タンパク質の変異体を調製し、前記変異体の凝固活性を分析する；
ｃ）配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の少なくとも５０％、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の少なくとも５０％を有するタンパク質をもたらすと工程ｂで同定された置換のうち少なくとも３つをそれぞれ含む複数の前記タンパク質の変異体を調製する、ここで置換は異なる免疫原性クラスター内に位置し、前記変異体は前記タンパク質の連続した領域で同定された全ての置換をそれぞれ含む、および前記変異体の凝固活性を分析する；
ｄ）工程ｃの変異体のいずれかが、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の５０％未満の凝固活性、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の５０％未満の凝固活性を有する場合、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の少なくとも５０％、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の少なくとも５０％を有するタンパク質をもたらすと工程ｂで同定された置換のうち少なくとも３つをそれぞれ含む複数の前記タンパク質の変異体を調製することを繰り返す、ここで置換は異なる免疫原性クラスター内に位置し、前記タンパク質の前記連続した領域で同定された置換の異なる組合せが調製される、および前記変異体の凝固活性を分析する；
ｅ）前記タンパク質の凝固活性を配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の５０％未満の凝固活性または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の５０％未満の凝固活性に低下させないことが見出された少なくとも３個（好ましくは少なくとも１０個）の置換を他の含まれている置換と組み合わせて含む第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製する；および、任意で
ｆ）前記タンパク質を医薬組成物として製剤化する、
ここで好ましくは、凝固活性は、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の少なくとも８０％または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の少なくとも８０％である。
【請求項１８】
タンパク質とともにインキュベートされた樹状細胞およびドナーの制御性Ｔ細胞枯渇ＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養し、前記Ｔ細胞の活性化を試験することを含む、前記タンパク質の免疫原性を分析するためのインビトロでの方法、ここでタンパク質は好ましくは請求項１〜１２のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質である。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、治療用タンパク質、特に組換え凝固因子の分野に関する。本発明は、規定された位置に特定の点変異を含む組換え第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質を提供し、これは前記ＦＶＩＩＩタンパク質の免疫原性を低下させるのに役立ち、この第ＶＩＩＩ因子タンパク質はその凝固活性を実質的に保持する。本発明はさらに、前記脱免疫化されたタンパク質をコードする核酸、細胞株および組換えの調製方法、ならびに本発明の組換えＦＶＩＩＩを含む医薬組成物を提供し、これらは血友病Ａの患者（特にＦＶＩＩＩ製品で未だ処置されていない患者）の処置における使用に有利である。さらに、本発明は、以前に処置された患者およびＦＶＩＩＩに対して免疫応答を発現した患者のための（例えば、免疫寛容誘導療法（ＩＴＩ／ＩＴＴ）またはレスキューＩＴＩの）安全な代替物であり得る。本発明はまた、タンパク質の免疫原性を決定するためのアッセイを提供する。
【０００２】
ＦＶＩＩＩは、凝固カスケードにおける重要なコファクターである。野生型ヒトＦＶＩＩＩは２３５１個のアミノ酸からなる一本鎖として合成され、３つのＡドメイン（Ａ１〜Ａ３）、１つのＢドメインおよび２つのＣドメイン（Ｃ１およびＣ２）を含み、これらは短い酸性配列（ａ１〜ａ３）によって中断されている。最初の１９個のアミノ酸はシグナル配列であり、細胞内プロテアーゼによって切断され、２３３２個のアミノ酸のＦＶＩＩＩ分子をもたらす。得られるドメイン構造は、Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２である。翻訳後修飾の間に、ＦＶＩＩＩはグリコシル化され、硫酸化され、タンパク質分解的に処理される。ＦＶＩＩＩタンパク質全体には２５個の潜在的なＮ−グリコシル化部位が含まれる。これらの部位のうち１９個はＢドメインに位置し、さらに６個の部位がタンパク質の残りの部分に広がっている。これらのすべての部位がグリコシル化されるわけではなく、ＦＶＩＩＩは２１個のＮ−グリコシル化を有する。さらに、Ｂドメインは７個のＯ結合型グリコシル化を含んでいる。ＦＶＩＩＩのグリコシル化は、細胞内でのフォールディングおよび輸送において役割を果たしている。硫酸化は、異なるタンパク質（特にトロンビンおよびフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ））との細胞外相互作用に重要である。硫酸化は、酸性領域ａ１、ａ２およびａ３の６つのチロシン上で起こる。セリンプロテアーゼであるフューリンによる細胞内切断により、ＦＶＩＩＩは重鎖（Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ）と軽鎖（ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）に分けられる。この切断の際にＢドメインの一部が失われることがある。したがって、軽鎖は８０ｋＤａの分子量を有するが、重鎖は約２１０ｋＤａの分子量を有し、わずかに不均一となり得る。重鎖と軽鎖の間の結合は共有結合ではなく、Ａ１ドメインとＡ３ドメインの間において２価の金属イオンＣｕ２＋によって媒介されている。
【０００３】
循環中では、ＦＶＩＩＩはａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを介してｖＷＦに結合しており、これはＦＶＩＩＩを早期の活性化および分解から保護する。
【０００４】
活性化の際に、ＦＶＩＩＩはトロンビンによって３つの位置で切断され、これはヘテロ三量体およびＢドメインの欠損（ヘテロ三量体ＦＶＩＩＩａ）をもたらす。ヘテロ三量体は活性化された凝固第ＩＸａ因子および凝固第Ｘ因子と複合体を形成し、軽鎖はリン脂質二重層（例えば（活性化された）血小板の細胞膜）に結合する。
【０００５】
血友病Ａは主にＸ染色体に関連する遺伝性の出血性疾患であり、男性新生児５０００人に１人が発症する。しかし、血友病ＡはＦＶＩＩＩに対する自己免疫反応により自然発症し得る。血友病Ａの患者は、より長い出血の持続時間、自然出血および内出血に苦しみ、これらは日常生活に影響を及ぼす。
【０００６】
血友病Ａの患者は、一般にＦＶＩＩＩの投与によって処置される。疾患の重症度（軽度、中等度または重度）に応じて、処置はオンデマンドまたは予防的である。治療用ＦＶＩＩＩ製品は、ヒト血漿から精製されている（ｐＦＶＩＩＩ）か、または細胞培養で組換えにより産生されている（ｒＦＶＩＩＩ）かのいずれかである。
【０００７】
治療のための組換えＦＶＩＩＩ分子の開発において、Ｂドメインは凝固におけるＦＶＩＩＩの機能性に重要でないため、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ分子が設計されている。これは主にサイズの減少をもたらす。最も一般的なＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ製品の１つは、ファイザーによって製造されているＲｅＦａｃｔｏまたはＲｅＦａｃｔｏ ＡＦである。このＦＶＩＩＩバリアントは、Ｂドメインの８９４アミノ酸を持たない。
【０００８】
ＦＶＩＩＩ置換療法に関する一つの問題は、タンパク質のインビボでの半減期が比較的低いことである。前記半減期を増加させる試みが、例えばＷＯ２０１５／０２３８９４Ａ１においてなされている。この文献は、少なくとも１つの許容ループまたはａ３ドメインの１以上のアミノ酸を置換もしくは欠失、または異種部分で置換しているが、凝結促進ＦＶＩＩＩ活性を保持している組換えＦＶＩＩＩタンパク質を提供する。生成されたＦＶＩＩＩタンパク質は、例えばインビボでの安定性が増加していると考えられる。
【０００９】
重度の血友病Ａ患者の最大で３０％が、治療用ＦＶＩＩＩに対して阻害性抗ＦＶＩＩＩ抗体を発現する。これは、これらの患者が変異または切断されてい得る変化した内因性ＦＶＩＩＩバリアントを生成するか、またはＦＶＩＩＩを全く生成しないため、患者の免疫系が適用された治療用ＦＶＩＩＩを異物として認識するという事実によるものである。ＦＶＩＩＩに対する阻害性抗体は、クラススイッチおよび親和性成熟を受けていることが知られている。これは、抗体を分泌するＢ細胞のＴ細胞依存的な活性化を示唆している。このＢ細胞のＴ細胞依存的な活性化は活性化されたＴヘルパー細胞を必要とし、このＴヘルパー細胞は、ＦＶＩＩＩ抗原および追加の共刺激を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用によりナイーブＴヘルパー細胞から誘導される。
【００１０】
治療物質として投与されるＦＶＩＩＩの完全ヒト配列は、このタンパク質に対する中枢性トレランスが発達していないため、少なくとも一部の血友病患者によって外来タンパク質とみなされ得る。対象のＨＬＡ、投与頻度ならびに各対象のＦＶＩＩＩに存在する変異の位置および性質に応じて、ＦＶＩＩＩに対する免疫応答がＦＶＩＩＩによる処置によって誘導され得る。ＦＶＩＩＩの機能を妨げるＦＶＩＩＩに対するこれらの抗体は、阻害性抗体または阻害剤と呼ばれる。従来、ＦＶＩＩＩ療法を受けている対象におけるＦＶＩＩＩ阻害剤の発現は、より重度の変異またはＦＶＩＩＩの非発現と相関していた。補充療法が「異物」であればあるほど、結果として生じる免疫応答はより頑強なものになると予想されている。実際、血友病患者においては、抗治療物質免疫応答は、治療用ＦＶＩＩＩと健常に機能する免疫系との相互作用の正常でかつ予想される結果であり得る。
【００１１】
阻害剤が形成された場合、患者は主に免疫寛容誘導療法（ＩＴＩ）を受ける。数週間、数ヶ月または数年かかり得るこの治療の間に、免疫系を疲弊させて耐性を誘導するために非常に多量のＦＶＩＩＩが患者に投与される。この治療法は、患者およびその介護者にとって非常に費用がかかり、負担も大きいものである。ＩＴＩの間は、毎日、一部の例では１日２回、ＦＶＩＩＩの適用が行われる。過酷な治療に加えて、阻害剤が存在する場合、出血の回数が増加する。患者を関節出血に起因する身体障害から保護するという目的は、患者および家族全体の社会生活を損なわせる。さらに、かなりの割合の患者では、ＩＴＩは成功しない。
【００１２】
組換えブタＦＶＩＩＩは、ヒトＦＶＩＩＩに対して自己免疫応答を発現した血友病Ａ患者の処置のためにＦＤＡによって承認された。ＷＯ９９／４６２７４Ａ１は、ヒトおよび動物ＦＶＩＩＩ配列またはヒトＦＶＩＩＩおよび非ＦＶＩＩＩ配列を有するハイブリッドＦＶＩＩＩを開示し、これはアミノ酸配列が１つ以上の特定の座位における置換によって変化している改変された第ＶＩＩＩ因子を含み、改変された第ＶＩＩＩ因子はＡ２またはＣ２ドメインエピトープに対する阻害性抗体によって阻害されない。
【００１３】
ＷＯ２０１６／１２３２００Ａ１はまた、組換えまたはキメラＦＶＩＩＩタンパク質を記載しており、ここで１つ以上のタンパク質ドメインは祖先的に再構築されたアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含み、得られたＦＶＩＩＩは阻害剤の結合の減少を示す（すなわちＢ細胞エピトープが欠失している）。
【００１４】
Ｔ細胞がＦＶＩＩＩに対する高親和性抗体の生成に関与していると考えられているため、共通のＴ細胞エピトープを含まず、従って患者において免疫応答を誘導しない組換えＦＶＩＩＩ分子の開発が示唆されている（Scott, 2014, Haemophilia 20 (01):80-86, Tangri et al., 2005, J Immunol.174:3187-3196）。Moise et al. (2012, Clin Immunol 142(3):329-331)により、脱免疫化ＦＶＩＩＩペプチドが発表され、ここでＣ２ドメインＴ細胞エピトープがインシリコでの手法により同定および改変されている。改変されたペプチドはＨＬＡ結合アッセイで評価され、マウスの免疫化に使用された。Schubert et al. (2018, PLoS Comput Biol 14(3):e1005983)により、脱免疫化タンパク質の生物学的治療物質の集団特異的な設計のための類似の手法が発表され、これは薬理活性およびタンパク質の機能を保持しながら免疫原性の低下をもたらすＦＶＩＩＩのＣ２ドメインにおける変異を同定するための計算的手法を記述している。例えば、これらは最大で３つの同時点変異（例えば、Ｖ２３３３Ｅ、Ｌ２３２１Ｆ、Ｑ２３３５ＨまたはＶ２３１３Ｍ／Ｖ２３１３Ｔ）を有する配列についての脱免疫化の結果を教示している。インシリコでの計算の実験的検証として、これらは特定のＨＬＡ対立遺伝子に対する１５アミノ酸長のペプチドの親和性を測定している。
【００１５】
ＷＯ２０１１／０６０３７１Ａ２は、血友病Ａに罹患している患者における第ＶＩＩＩ因子に対する初期免疫応答を予防または低減するために、または第ＶＩＩＩ因子に対する予め形成された阻害剤抗体を有する患者における免疫応答の強度を低減するために、阻害剤についてＢ細胞エピトープを形成すると考えられるＦＶＩＩＩのＣ２ドメインの特定の領域内に少なくとも１つのアミノ酸修飾、および／または関連するＴ細胞エピトープを形成すると考えられるＦＶＩＩＩのＡ２ドメインの特定の領域内に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む改変されたＦＶＩＩＩポリペプチドを開示する。
【００１６】
技術水準を考慮して、本発明者らは、凝固活性を有する脱免疫化組換えＦＶＩＩＩタンパク質（すなわち、ヒトの相当の割合に関連するＴ細胞エピトープの数が減少したタンパク質）を提供するという問題に取り組んだ。有利なことに、血友病Ａ患者の治療のためのこのＦＶＩＩＩタンパク質の使用は、ＦＶＩＩＩ阻害性抗体を含む抗ＦＶＩＩＩ抗体の生成を妨げ、または減少させる。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、第１の実施態様として、Ｙ７４８、Ｌ１７１、Ｓ５０７、Ｎ７９、Ｉ８０、Ｉ１０５、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｌ２３５、Ｖ２５７、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｙ４３０、Ｌ５０５、Ｆ５５５、Ｉ６１０、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｎ７５４、Ｋ１８３７、Ｒ１９３６、Ｓ２０３０、Ｓ２０３７、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｍ２１２３、Ｓ２１２５、Ｆ２２１５、Ｋ２２２６、Ｋ２２５８、Ｖ２３１３、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３およびＱ２３３５からなる群から選択される位置に少なくとも３個のアミノ酸置換を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質；
ここでＮの置換は、Ｄ、Ｈ、ＳおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｉの置換は、ＴおよびＶからなる群から独立して選択される；Ｓの置換は、Ａ、Ｎ、Ｇ、ＴおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｌの置換は、Ｎ、Ｑ、ＦおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｖの置換は、ＡおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｙの置換は、Ｎ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｆの置換は、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｋの置換は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｒの置換は、Ｑ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｍの置換は、Ｒ、Ｑ、ＫおよびＴからなる群から選択される；および／または、Ｑの置換は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＫからなる群から選択される；
ここで位置は、配列番号１の全長ヒト第ＶＩＩＩ因子分子に関して規定される；および
ここで組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号２からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、発色アッセイにおいて決定される少なくとも５０％の凝固活性を保持している；
または前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の融合タンパク質を提供する。
【００１８】
本発明は、第２の実施態様として、Ｙ７４８、Ｌ１７１、Ｓ５０７、Ｎ７９、Ｉ８０、Ｉ１０５、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｌ２３５、Ｖ２５７、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｙ４３０、Ｌ５０５、Ｆ５５５、Ｉ６１０、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｎ７５４、Ｋ１８３７、Ｒ１９３６、Ｓ２０３０、Ｓ２０３７、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｍ２１２３、Ｓ２１２５、Ｆ２２１５、Ｋ２２２６、Ｋ２２５８、Ｖ２３１３、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３およびＱ２３３５からなる群から選択される位置に少なくとも１個のアミノ酸置換を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質；
ここでＮの置換は、Ｄ、Ｈ、ＳおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｉの置換は、ＴおよびＶからなる群から独立して選択される；Ｓの置換は、Ａ、Ｎ、Ｇ、ＴおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｌの置換は、Ｎ、Ｑ、ＦおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｖの置換は、ＡおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｙの置換は、Ｎ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｆの置換は、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｋの置換は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｒの置換は、Ｑ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｍの置換は、Ｒ、Ｑ、ＫおよびＴからなる群から選択される；および／または、Ｑの置換は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＫからなる群から選択される；
ここで変異がＳ５０７の位置である場合、変異はＳ５０７Ｅであり、変異がＮ６１６の位置である場合、変異はＮ６１６Ｅであり、変異がＦ２２１５の位置である場合、変異はＦ２２１５Ｈである；
ここで位置は、配列番号１の全長ヒト第ＶＩＩＩ因子分子に関して規定される；および
ここで組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号２からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、発色アッセイにおいて決定される少なくとも５０％の凝固活性を保持している；
または前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の融合タンパク質を提供する。前記タンパク質は任意で実施態様１のタンパク質である。
【００１９】
第３の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えばＹ７４８Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｎ７９Ｓ、Ｉ８０Ｔ、Ｉ１０５Ｖ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｌ２３５Ｆ、Ｖ２５７Ａ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｙ４３０Ｈ、Ｌ５０５Ｎ、Ｆ５５５Ｈ、Ｉ６１０Ｔ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｎ７５４Ｄ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｓ２０３０Ａ、Ｓ２０３７Ｇ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｍ２１２３Ｋ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｖ２３１３Ａ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３ＡおよびＱ２３３５Ｈからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み得る。
【００２０】
第４の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は例えば３〜２５個の前記置換を含み得、置換は異なる免疫原性クラスター内に位置してい得る。
【００２１】
第５の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えばＹ７４８、Ｌ１７１、Ｓ５０７、Ｎ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｋ１８３７、Ｒ１９３６、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｓ２１２５、Ｆ２２１５、Ｋ２２２６、Ｋ２２５８、Ｓ２３１５およびＶ２３３３からなる群から選択される位置に少なくとも３個のアミノ酸置換を含み得る；
ここで、少なくとも３個のアミノ酸置換は、好ましくはＹ７４８Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａからなる群から選択される。
【００２２】
第６の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば少なくとも以下の位置にアミノ酸置換を含み得る；
ａ．Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｎ２３３ＤおよびＩ２６５Ｔ；および／または
ｂ．Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３ＤおよびＩ２６５Ｔ；および／または
ｃ．Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、およびＳ５０７Ｅ；および／または
ｄ．Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ；および／または
ｅ．Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６ＮおよびＹ７４８Ｓ；および／または
ｆ．Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｇ．Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｈ．Ｓ２０７７Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｉ．Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｊ．Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｋ．Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｙ７４８ＳおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｌ．Ｌ１７１Ｑ、Ｎ２９９Ｄ、Ｎ６１６ＥおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｍ．Ｓ１１２Ｔ、Ｓ５０７Ｅ、Ｙ７４８Ｓ、Ｋ１８３７ＥおよびＮ２０３８Ｄ；および／または
ｎ．Ｓ１１２Ｔ、Ｙ４２６Ｈ、Ｎ７５４Ｄ、Ｋ１８３７ＥおよびＮ２０３８Ｄ
好ましくは、少なくともｂおよびｃで規定された置換を組み合わせており、任意でｄまたはｅおよび／またはｆ、ｇ、ｈ、Ｉまたはｊおよび／またはＫ１８３７Ｅで規定された置換から選択される置換をさらに含む。
【００２３】
第７の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば少なくともＮ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｌ１７１、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｓ５０７、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｌ７０６およびＹ７４８の位置にアミノ酸置換を含み得る（好ましくは、置換はＮ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｓ５０７Ｅ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６ＮおよびＹ７４８Ｓであり、任意でタンパク質はＫ１８３７Ｅをさらに含み、配列番号７の２０〜１５３３位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含む）。
【００２４】
第８の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば少なくともＮ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｌ１７１、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｓ５０７、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｌ７０６、Ｙ７４８、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｓ２３１５およびＶ２３３３の位置にアミノ酸置換を含み得る（好ましくは、１８個の置換はＮ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｓ５０７Ｅ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａであり、任意でタンパク質は配列番号６の２０〜１５３３位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含む）。
【００２５】
第９の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば少なくともＫ１８３７の位置にアミノ酸置換を含み得る（好ましくは、前記置換はＫ１８３７Ｅであり、任意でタンパク質は配列番号５の２０〜１５３３位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含む）。
【００２６】
第１０の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば配列番号２からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して（好ましくは配列番号３からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質とも比較して）免疫原性が低下してい得、前記免疫原性は任意で、免疫原性スコア、または前記タンパク質とともにインキュベートされた樹状細胞およびドナーの制御性Ｔ細胞枯渇ＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養し、前記Ｔ細胞の活性化を試験することを含むアッセイによって（好ましくは前記アッセイによって）決定される。
【００２７】
第１１の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば配列番号５の第ＶＩＩＩ因子タンパク質と少なくとも９０％の配列同一性を有し得、ここでＡ１、ａ１、Ａ２、ａ２、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインのみが配列同一性の決定のために考慮され、または先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の融合タンパク質であり得る。
【００２８】
第１２の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば一本鎖第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはヘテロ二量体第ＶＩＩＩ因子タンパク質（好ましくは一本鎖Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子タンパク質）であり得る。
【００２９】
第１３の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば融合タンパク質であり得、ここで融合パートナーは、Ｆｃ領域、アルブミン、アルブミン結合配列、ＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰポリペプチド、絨毛性ゴナドトロピンのベータサブユニットのＣ末端ペプチド、アルブミン結合小分子、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプンおよびそれらの組合せを含む群から選択される。
【００３０】
第１４の実施態様において、本発明はまた、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする核酸を提供し、核酸は好ましくはヒト細胞を含む群から選択される哺乳類細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターである。
【００３１】
第１５の実施態様において、本発明はまた、第１４の実施態様に記載の前記核酸を含む宿主細胞を提供し、宿主細胞は好ましくは前記細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターを含む哺乳類細胞である。
【００３２】
第１６の実施態様において、本発明はまた、実施態様１〜１３のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質、実施態様１４に記載の核酸、または実施態様１５に記載の宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
第１７の実施態様において、第１６の実施態様に記載の医薬組成物は、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、シクロホスファミド、リツキシマブおよび／またはシクロスポリンを含む群から選択される免疫抑制物質をさらに含む。
【００３４】
第１８の実施態様において、第１６または第１７の実施態様に記載の医薬組成物は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置されていない患者、第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置された患者、第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者、およびＩＴＩで処置されている第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者を含む群から選択される血友病Ａの患者の処置における使用のためのものである。
【００３５】
本発明はまた、有効量の実施態様１６または１７に記載の医薬組成物を用いてそれを必要とする患者（例えば、第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置されていない患者、第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置された患者、第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者、およびＩＴＩで処置されている第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者を含む群から選択される血友病Ａの患者）を処置する方法を提供する。
【００３６】
第１９の実施態様において、本発明はまた、実施態様１〜１３のいずれかに記載の第ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現する実施態様１５に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、前記ＦＶＩＩＩタンパク質を単離することを含む、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製するためのインビトロでの方法を提供する。
【００３７】
第２０の実施態様において、本発明はまた、以下を含む免疫原性が低下している第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製するための実施態様１９に記載のインビトロでの方法を提供する：
ａ）相当の割合のヒトに関連するＴ細胞エピトープの存在についてＦＶＩＩＩタンパク質を分析する；
ｂ）工程ａで同定されたＴ細胞エピトープの１つを除去する位置に少なくとも１つ（好ましくは１つのみ）のアミノ酸置換を含む複数の前記タンパク質の変異体を調製し、前記変異体の凝固活性を分析する；
ｃ）配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の少なくとも５０％、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の少なくとも５０％を有するタンパク質をもたらすと工程ｂで同定された置換のうち少なくとも３つをそれぞれ含む複数の前記タンパク質の変異体を調製する、ここで置換は異なる免疫原性クラスター内に位置し、前記変異体は前記タンパク質の連続した領域で同定された全ての置換をそれぞれ含む、および前記変異体の凝固活性を分析する；
ｄ）工程ｃの変異体のいずれかが、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の５０％未満の凝固活性、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の５０％未満の凝固活性を有する場合、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の少なくとも５０％、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の少なくとも５０％を有するタンパク質をもたらすと工程ｂで同定された置換のうち少なくとも３つをそれぞれ含む複数の前記タンパク質の変異体を調製することを繰り返す、ここで置換は異なる免疫原性クラスター内に位置し、前記タンパク質の前記連続した領域で同定された置換の異なる組合せを調製する、および前記変異体の凝固活性を分析する；
ｅ）前記タンパク質の凝固活性を配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の５０％未満の凝固活性または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の５０％未満の凝固活性に低下させないことが見出された少なくとも３個（好ましくは少なくとも１０個）の置換を他の含まれている置換と組み合わせて含む第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製する；および、任意で
ｆ）前記タンパク質を医薬組成物として製剤化する、
ここで好ましくは、凝固活性は、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の少なくとも８０％または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の少なくとも８０％である。
【００３８】
第２１の実施態様において、本発明はまた、タンパク質とともにインキュベートされた樹状細胞およびドナーの制御性Ｔ細胞枯渇ＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養し、前記Ｔ細胞の活性化を試験することを含む、前記タンパク質の免疫原性を分析するためのインビトロでの方法を提供し、ここでタンパク質は好ましくは実施態様１〜１３のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】（Ａ）ＦＶＩＩＩタンパク質の構造および数回の選択における本発明のＦＶＩＩＩ−１９Ｍタンパク質の生成。（Ｂ）シグナル配列を含むＦＶＩＩＩ−１９Ｍアミノ酸配列。シグナル配列：イタリック体、Ａ１ドメイン：下線、Ａ２ドメイン：二重下線、Ｂドメイン：太い下線、Ａ３ドメイン：点線の下線、Ｃ１ドメイン：破線の下線、Ｃ２ドメイン：波線の下線、中間のドメインａ１、ａ２、ａ３：マークされていない、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓに対する変異はイタリック体の大きな太字で示されている。
【００４０】
【図２】単一の変異を有するＦＶＩＩＩバリアントの相対的な凝固活性。各単一変異バリアントのＦＶＩＩＩ凝固活性を、対照のＦＶＩＩＩ−６ｒｓのＦＶＩＩＩ凝固活性と比較して計算した。括弧内は１つのクラスターに属する変異を示す。（Ａ）Ａ１ドメインにおける変異。（Ｂ）Ａ２ドメインにおける変異。（Ｃ）Ａ３ドメインにおける変異。（Ｄ）Ｃ１ドメインにおける変異。（Ｅ）Ｃ２ドメインにおける変異。
【００４１】
【図３】単一の変異を有するＦＶＩＩＩバリアントの特異的な凝固活性。ＦＶＩＩＩ抗原に対するＦＶＩＩＩ凝固活性の関係を、各単一変異バリアントについて計算した。括弧内は１つのクラスターに属する変異を示す。（Ａ）Ａ１ドメインにおける変異。（Ｂ）Ａ２ドメインにおける変異。（Ｃ）Ａ３ドメインにおける変異。（Ｄ）Ｃ１ドメインにおける変異。（Ｅ）Ｃ２ドメインにおける変異。
【００４２】
【図４】Ａ１、Ａ１Ａ２、Ａ２およびＡ３Ｃ１Ｃ２セクションにおける変異の組合せの結果。（Ａ）ＦＶＩＩＩバリアントの相対的な凝固活性。各バリアントのＦＶＩＩＩ凝固活性を、対照ＦＶＩＩＩ−６ｒｓのＦＶＩＩＩ凝固活性と比較して計算した。（Ｂ）ＦＶＩＩＩバリアントの特異的な凝固活性。各バリアントについて、ＦＶＩＩＩ抗原に対するＦＶＩＩＩ凝固活性の関係を計算した。
【００４３】
【図５】ＤＯＥマトリックスに基づく種々の変異を含むＦＶＩＩＩバリアントの相対的な凝固活性。各バリアントのＦＶＩＩＩ凝固活性を、対照ＦＶＩＩＩ−６ｒｓのＦＶＩＩＩ凝固活性と比較して計算した。（Ａ）Ａ２ドメインにおけるバリアントの結果。（Ｂ）Ａ３Ｃ１Ｃ２ドメインにおけるバリアントの結果。
【００４４】
【図６】ＤＯＥマトリックス後のＡ２およびＡ３Ｃ１Ｃ２セクションにおける変異の組合せを有するＦＶＩＩＩの凝固活性。（Ａ）ＦＶＩＩＩバリアントの相対的な凝固活性。各バリアントのＦＶＩＩＩ凝固活性を、対照ＦＶＩＩＩ−６ｒｓのＦＶＩＩＩ凝固活性と比較して計算した。（Ｂ）ＦＶＩＩＩバリアントの特異的な凝固活性。ＦＶＩＩＩ抗原に対する発色性ＦＶＩＩＩ凝固活性の割合を各バリアントについて計算した。
【００４５】
【図７Ａ】特定の変異を有するＦＶＩＩＩバリアントの相対的および特異的な凝固活性。相対的な凝固活性を、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの凝固活性と比較して規定している。特異的な凝固活性は、抗原に対する発色性凝固活性の割合に関連する。ＦＶＩＩＩの特定のドメインに変異を有する有利なＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性。ＦＶＩＩＩ−ＢＡ３−１Ｍの凝固による凝固活性は決定されなかった。
【図７Ｂ】特定の変異を有するＦＶＩＩＩ変異体の相対的および特異的な凝固活性。相対的な凝固活性を、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの凝固活性と比較して規定している。特異的な凝固活性は、抗原に対する発色性凝固活性の割合に関連する。３つの変異を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性。
【００４６】
【図８】凝固時間を分析するＦＶＩＩＩ−１９Ｍ、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓ、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦおよびＮｕｗｉｑのＲＯＴＥＭ分析。種々のＦＶＩＩＩ濃度を分析した。測定は２通りで実施し、平均値を示した。
【００４７】
【図９】ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ、Ｎｕｗｉｑ、ＦＶＩＩＩ−１９ＭおよびＦＶＩＩＩ−６ｒｓについてのＴＧＡ（トロンビン生成アッセイ）の結果。全ての製品を０．２５Ｕ／ｍｌ、０．０６３Ｕ／ｍｌおよび０．０１６Ｕ／ｍｌのＦＶＩＩＩ凝固活性に希釈した。各点は１回のＴＧＡからの結果を示す。線は、実施した４回のアッセイの中央値を示す。統計解析をフリードマン検定を用いて行った。（Ａ）トロンビン標準物質に基づく所定の濃度の各製品についての生成したトロンビンのピークの量。（Ｂ）所定の濃度の各製品についての曲線下面積。（Ｃ）所定の濃度の各製品についてのトロンビン生成のピークまでの時間。
【００４８】
【図１０】種々のＦＶＩＩＩ製品のｖＷＦとの結合。ｖＷＦに対するＲｅＦａｃｔｏ ＡＦの結合能を１とし、他の製品の基準とした。各点は１回のＥＬＩＳＡからの結果を示す。線は、実施した３回のアッセイの中央値を示す。統計解析をフリードマン検定を用いて行った。
【００４９】
【図１１】精製したタンパク質に基づくＦＶＩＩＩ−６ｒｓおよびＦＶＩＩＩ−１９Ｍの４つの独立した生成物の特異的な凝固活性。（Ａ）発色性ＦＶＩＩＩ凝固活性測定に基づく特異的な凝固活性。線は４回の測定値の中央値を示す。（Ｂ）凝固によるＦＶＩＩＩ凝固活性測定に基づく特異的な凝固活性。線は４回の測定値の中央値を示す。
【００５０】
【図１２】トロンビンにより活性化されたＦＶＩＩＩのウエスタンブロット。各製品をその非活性化型および活性化型において適用した。非活性化型では、一本鎖（約２００ｋＤａ）、重鎖（約９５〜１１０ｋＤａ）および軽鎖（約８０〜９０ｋＤａ）の典型的なバンドが検出可能であった。トロンビン切断後、Ａ１Ａ２（約９０ｋＤａ）、Ａ３Ｃ１Ｃ２（約７５ｋＤａ）、Ａ１（約５０ｋＤａ）、Ａ２（約４０ｋＤａ）およびＢａ３（約２０ｋＤａ）の追加のバンドが検出可能であった。ＦＶＩＩＩを、一次ポリクローナルヒツジ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体および二次ロバ抗ヒツジＩｇＧ ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷを用いて検出した。
【００５１】
【図１３】インビトロでの免疫原性アッセイ。単球をＰＢＭＣから精製し、ｉＤＣに分化させ、最終的にｍＤＣになるように刺激し、抗原（すなわち対象のタンパク質）とともにインキュベートする。また、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製し、再生するために共培養の前に培養する。共培養後、Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより活性化および／または増殖について分析する。任意で、上清をサイトカインについて分析する。
【００５２】
【図１４】インビトロでの免疫原性アッセイの結果。ＩＬ−ＭｉｘプラスＦＶＩＩＩ−１９Ｍで刺激したＤＣに対するＣＤ４＋Ｔ細胞増殖と、ＩＬ−ＭｉｘプラスＦＶＩＩＩ−６ｒｓで刺激したＤＣに対するＣＤ４＋Ｔ細胞増殖との間の差異。０未満のバーはＦＶＩＩＩ−１９Ｍに対して低下したＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。ＦＶＩＩＩ−６ｒｓと比較してより低いＦＶＩＩＩ−１９Ｍに対するＴ細胞応答は、ウィルコクソン検定（ｐ＝０．０３７１）を用いて有意である。
【００５３】
配列表
好ましいシグナル配列を含む以下のＦＶＩＩＩタンパク質の配列が配列表において提供される：
配列番号１  ｗｔヒトＦＶＩＩＩ
配列番号２  ＦＶＩＩＩ−６ｒｓ  
配列番号３  ＲｅＦａｃｔｏ  ＡＦ
配列番号４  Ｂドメイン欠失ｓｃＦＶＩＩＩ
配列番号５  ＦＶＩＩＩ−１９Ｍ
配列番号６  ＦＶＩＩＩ−１８Ｍ
配列番号７  ＦＶＩＩＩ−１５Ｍ
配列番号８  ＦＶＩＩＩ−Ａ１−７Ｍ
配列番号９  ＦＶＩＩＩ−Ａ２−４Ｍ
配列番号１０  ＦＶＩＩＩ−ＢＡ３−１Ｍ
配列番号１１  ＦＶＩＩＩ−Ａ３Ｃ２−４Ｍ
配列番号１２  ＦＶＩＩＩ−ＧＯＦ１
配列番号１３  ＦＶＩＩＩ−ＧＯＦ２
配列番号１４  ＦＶＩＩＩ−ＬＳ１
配列番号１５  ＦＶＩＩＩ−ＬＳ２
配列番号５１  ＦＶＩＩＩ−Ａ１Ａ２−３Ｍ
配列番号５２は、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍをコードする核酸配列を提供する。
配列番号５３は、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓをコードする核酸配列を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明は、Ｙ７４８、Ｌ１７１、Ｓ５０７、Ｎ７９、Ｉ８０、Ｉ１０５、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｌ２３５、Ｖ２５７、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｙ４３０、Ｌ５０５、Ｆ５５５、Ｉ６１０、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｎ７５４、Ｋ１８３７、Ｒ１９３６、Ｓ２０３０、Ｓ２０３７、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｍ２１２３、Ｓ２１２５、Ｆ２２１５、Ｋ２２２６、Ｋ２２５８、Ｖ２３１３、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３およびＱ２３３５からなる群から選択される位置に少なくとも３個のアミノ酸置換を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する；
ここでＮの置換は、Ｄ、Ｈ、ＳおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｉの置換は、ＴおよびＶからなる群から独立して選択される；Ｓの置換は、Ａ、Ｎ、Ｇ、ＴおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｌの置換は、Ｎ、Ｑ、ＦおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｖの置換は、ＡおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｙの置換は、Ｎ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｆの置換は、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｋの置換は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｒの置換は、Ｑ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｍの置換は、Ｒ、Ｑ、ＫおよびＴからなる群から選択される；および／または、Ｑの置換は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＫからなる群から選択される；
ここで位置は、配列番号１の全長ヒト第ＶＩＩＩ因子分子に関して規定され、これはシグナル配列の番号付けを含む；および
ここで組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号２（ＦＶＩＩＩ−６ｒｓ）からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、発色アッセイにおいて決定される少なくとも５０％の凝固活性を保持している；
【００５５】
本発明はまた、前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の融合タンパク質を提供する。
【００５６】
本発明はさらに、Ｙ７４８、Ｌ１７１、Ｓ５０７、Ｎ７９、Ｉ８０、Ｉ１０５、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｌ２３５、Ｖ２５７、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｙ４３０、Ｌ５０５、Ｆ５５５、Ｉ６１０、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｎ７５４、Ｋ１８３７、Ｒ１９３６、Ｓ２０３０、Ｓ２０３７、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｍ２１２３、Ｓ２１２５、Ｆ２２１５、Ｋ２２２６、Ｋ２２５８、Ｖ２３１３、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３およびＱ２３３５からなる群から選択される位置に少なくとも１個のアミノ酸置換を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質；
ここでＮの置換は、Ｄ、Ｈ、ＳおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｉの置換は、ＴおよびＶからなる群から独立して選択される；Ｓの置換は、Ａ、Ｎ、Ｇ、ＴおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｌの置換は、Ｎ、Ｑ、ＦおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｖの置換は、ＡおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｙの置換は、Ｎ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｆの置換は、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｋの置換は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｒの置換は、Ｑ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｍの置換は、Ｒ、Ｑ、ＫおよびＴからなる群から選択される；および／または、Ｑの置換は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＫからなる群から選択される；
ここで置換がＳ５０７の位置である場合、置換はＳ５０７Ｅであり、置換がＮ６１６の位置である場合、置換はＮ６１６Ｅであり、置換がＦ２２１５の位置である場合、置換はＦ２２１５Ｈである；
ここで位置は、配列番号１の全長ヒト第ＶＩＩＩ因子分子に関して規定され、これはシグナル配列の番号付けを含む；および
ここで組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号２（ＦＶＩＩＩ−６ｒｓ）からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、発色アッセイにおいて決定される少なくとも５０％の凝固活性を保持している；
または前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の融合タンパク質を提供する。前記タンパク質は、好ましくは上記で規定される置換のうち少なくとも３個を含むタンパク質である。
【００５７】
好ましくは、置換がＫ２２２６の位置である場合、置換はＫ２２２６Ｑであり、置換がＱ２３３５の位置である場合、置換はＱ２３３５Ｈである。ある実施態様において、Ｑ２３３５は置換されていない。
【００５８】
本発明者らは、本明細書で規定される本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、凝固活性を実質的に維持しつつ、免疫原性を著しく低下させていることを見出した。従って、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は（特に、ＦＶＩＩＩ阻害性抗体を含む抗ＦＶＩＩＩ抗体の生成および／またはさらなる産生を回避するために）血友病Ａの処置に有用である。
【００５９】
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｔ細胞エピトープのレベルで脱免疫化されている。一般に、抗原は、ＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩＩに結合したペプチドとしてＴ細胞に提示される。ヒト集団の大部分に関連するＴ細胞エピトープが本発明のタンパク質において同定および除去されているため、より少ない免疫原性ペプチドが抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状細胞（ＤＣ）またはＢ細胞）によってＴ細胞に提示される。これにより、ナイーブＴ細胞の活性化が妨げられ、または低減される。活性化されたＴヘルパー細胞がなければ、ナイーブＢ細胞は活性化されず、抗ＦＶＩＩＩ抗体を分泌する血漿およびメモリーＢ細胞に分化できない。
【００６０】
したがって、本発明の手法により、抗体形成は、プロセスのごく初期に（すなわち、ＦＶＩＩＩ抗原に応答するナイーブＴヘルパー細胞の刺激を減少させることにより）減少されるか、または最適には妨げられる。ナイーブＴヘルパー細胞の成熟の減少に加えて、潜在的に既に存在するＦＶＩＩＩに対するメモリーＴヘルパー細胞の再刺激もまた、本発明の手法に従って抗原の提示を減少させることにより妨げられ得、または低減され得る。
【００６１】
ペプチド結合に必要なＭＨＣクラスＩＩＩ結合溝内の位置および結合に重要なペプチドのアミノ酸は公知である。最初の段階として、インシリコでの分析法を用いて、どのＦＶＩＩＩペプチドが一般的なＭＨＣクラスＩＩ複合体に最も結合している可能性が高く、これらのうちどのＦＶＩＩＩペプチドがＦＶＩＩＩにのみ存在し、他のヒトタンパク質には存在しないかを予測している。これらのペプチドは免疫原性であると考えられる。さらなるインシリコのツールならびに他の種由来のＦＶＩＩＩおよび関係のないヒトタンパク質との比較を用いて、ＦＶＩＩＩペプチドがＭＨＣクラスＩＩ複合体に結合するのを妨げるアミノ酸変異の推奨を行った。これらの予測および実験的試験に基づいて変異したＦＶＩＩＩバリアントを生成し、これらは凝固において未だ機能的であるが、血友病Ａ患者における阻害性抗体の生成を同程度には誘発しないと考えられる。
【００６２】
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、発色アッセイで決定されるように、配列番号２（ＦＶＩＩＩ−６ｒｓ）からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して少なくとも５０％の凝固活性を有する。ＦＶＩＩＩ−６ｒｓはさらなる変異を含まないＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質であり、野生型ヒトＦＶＩＩＩと実質的に同一の凝固活性を有する。好ましくは、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号２からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の凝固活性を有する。凝固活性はまた、配列番号２からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較してより高くてもよい（例えば、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、または少なくとも４００％の凝固活性）。
【００６３】
本発明全体を通して、特に指定されない場合には、凝固活性は発色アッセイで決定される。発色アッセイは、例えば以下の実施例に詳細に記載されるように、標準的な手順に従って実施される。このアッセイは好ましくは、（例えば実施例に記載されるように）発現ベクターを遺伝子導入した対象のＦＶＩＩＩバリアントを発現するヒト細胞（例えばＨＥＫ２９３−Ｆ細胞）の上清を用いて、同じ条件下でＦＶＩＩＩ−６ｒｓを発現する同じ基本発現ベクターを遺伝子導入した同じ細胞の上清と比較して実施される。従って、相対的な凝固活性を分析することができ、ここで変異体の発色性凝固活性は変異のない分子（すなわちＦＶＩＩＩ−６ｒｓ）の発色性凝固活性に対して標準化される。このアッセイは、変異体タンパク質が合成および細胞によって分泌される能力と分泌されたタンパク質の凝固活性の両方を試験する。
【００６４】
本発明のＦＶＩＩＩは好ましくは、高い特異的な凝固活性をさらに有する。特異的な凝固活性は、（例えば本明細書に記載の）ＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡによって決定される、上記で定義されるＦＶＩＩＩ発色性凝固活性のＦＶＩＩＩ抗原濃度に対する割合を記述する。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の特異的な凝固活性は、例えば少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１５０％、少なくとも１７０％、または少なくとも１９０％であり得る。
【００６５】
上清中における低い相対的な凝固活性および高い特異的な凝固活性を有するタンパク質は、合成、フォールディングおよび／または分泌に問題があると想定され得る。これは、（例えばシャペロンの過剰発現を伴う）特定の細胞株における発現によって潜在的に改善され得る。
【００６６】
本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓと比較してそれぞれ少なくとも５０％（好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％）の凝固活性および特異的な凝固活性（いずれも発色法により決定される）を有し得る。
【００６７】
凝固活性は、本明細書の実験部分に記載されているように凝固一段法によって代替的にまたは追加的に評価され得る。特に好ましい実施態様において、発色法によって決定される凝固活性および凝固法によって決定される凝固活性の両方が、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの凝固活性と比較して少なくとも５０％（好ましくは、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも１５０％）である。
【００６８】
本発明者らは、試験した特定の置換が、免疫原性の低下および凝固における機能的活性の維持の両方に関して特に有利であることを見出した。従って、本発明全体を通して、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質におけるアミノ酸置換は、好ましくはＹ７４８Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｎ７９Ｓ、Ｉ８０Ｔ、Ｉ１０５Ｖ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｌ２３５Ｆ、Ｖ２５７Ａ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｙ４３０Ｈ、Ｌ５０５Ｎ、Ｆ５５５Ｈ、Ｉ６１０Ｔ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｎ７５４Ｄ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｓ２０３０Ａ、Ｓ２０３７Ｇ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｍ２１２３Ｋ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｖ２３１３Ａ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３ＡおよびＱ２３３５Ｈからなる群から選択される。
【００６９】
本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば前記置換のうち３〜３８個、３〜２５個、４〜２５個、５〜２４個、６〜２３個、７〜２２個、８〜２１個、９〜２０個、１０〜１９個、１１〜１８個、１２〜１７個、１３〜１６個または１４〜１５個を含み得る。好ましくは、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、前記置換のうち３〜２５個を含み、置換は異なる免疫原性クラスター内に位置する。免疫原性クラスターはタンパク質内において同定されたペプチドであり、複数のＨＬＡ−ＤＲスーパータイプに高い親和性で結合する。言い換えると、免疫原性クラスターは、（例えば、以下の実施例においてより詳細に記述されるように）タンパク質内において同定された種々のＨＬＡスーパータイプに対するＴ細胞エピトープのクラスターである。ＦＶＩＩＩの免疫原性クラスターは、配列番号１６〜５０および５４（表２）に規定されている。任意で、免疫原性クラスターごとに記載された置換のうち１つのみが存在する。最も好ましくは、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、前記置換のうち１５〜１９個を含む。
【００７０】
異なる免疫原性クラスター内に位置する少なくとも３個の置換を含む本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、好ましくはＹ７４８、Ｌ１７１、Ｓ５０７、Ｎ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｋ１８３７、Ｒ１９３６、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｓ２１２５、Ｆ２２１５、Ｋ２２２６、Ｋ２２５８、Ｓ２３１５およびＶ２３３３からなる群から選択される位置に少なくとも３個のアミノ酸置換を含む。少なくとも３個のアミノ酸置換は、好ましくはＹ７４８Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａからなる群から選択される。
【００７１】
好ましいＦＶＩＩＩタンパク質は、例えば以下のリストに従ってＡ１領域の４つの位置および／またはＡ１の７つの位置および／またはＡ１Ａ２の３つの位置および／またはＡ２の５つの位置および／またはＡ３Ｃ１Ｃ２の６つの位置に置換を組み込んでおり、これは１００％を超える特異的な凝固活性を有する：
Ａ１：Ｎ７９、Ｓ１１２、Ｎ２３３、Ｉ２６５；特にＮ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ
Ａ１：Ｎ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｌ１７１、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５；特にＮ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ
Ａ１Ａ２：Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｓ５０７；特にＮ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｓ５０７Ｅ
Ａ２：Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｙ７４８；特にＦ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ
Ａ３Ｃ１Ｃ２：Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｓ２１２５、Ｋ２２５８、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３；特にＮ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３Ａ。
【００７２】
さらに好ましいＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａ２の４つの位置および／またはＡ３Ｃ１Ｃ２の３つの位置および／またはＡ３Ｃ１Ｃ２の４つの位置および／またはＡ３Ｃ１Ｃ２の４つの位置および／またはＡ３Ｃ１Ｃ２の５つの位置に置換を組み込む：
Ａ２：Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｌ７０６、Ｙ７４８；特にＦ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ
Ａ３Ｃ１Ｃ２：Ｓ２０７７、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３；特にＳ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３Ａ
Ａ３Ｃ１Ｃ２：Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３；特にＮ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３Ａ
Ａ３Ｃ１Ｃ２：Ｓ２０７７、Ｋ２２５８、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３；特にＳ２０７７Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３Ａ
Ａ３Ｃ１Ｃ２：Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｋ２２５８、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３；特にＮ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３Ａ。
【００７３】
凝固活性（発色性凝固活性、凝固による凝固活性および特異的な凝固活性）において特に良好な結果を示す好ましい組合せは、以下の位置に置換を組み込んでいる：
ＦＶＩＩＩ−ＧＯＦ１：Ｌ１７１；Ｓ５０７；Ｙ７４８；Ｖ２３３３；特にＬ１７１Ｑ；Ｓ５０７Ｅ；Ｙ７４８Ｓ；Ｖ２３３３Ａ
ＦＶＩＩＩ−ＧＯＦ２：Ｌ１７１；Ｎ２９９；Ｎ６１６；Ｖ２３３３；特にＬ１７１Ｑ；Ｎ２９９Ｄ；Ｎ６１６Ｅ；Ｖ２３３３Ａ。
【００７４】
クラスタースコアの低下において特に良好な結果を有し、したがって免疫原性を強く低下させると計算されるさらに好ましい組合せは、以下である：
ＦＶＩＩＩ−ＬＳ１：Ｓ１１２；Ｓ５０７；Ｙ７４８；Ｋ１８３７；Ｎ２０３８；特にＳ１１２Ｔ；Ｓ５０７Ｅ；Ｙ７４８Ｓ；Ｋ１８３７Ｅ；Ｎ２０３８Ｄ
ＦＶＩＩＩ−ＬＳ２：Ｓ１１２；Ｙ４２６；Ｎ７５４；Ｋ１８３７；Ｎ２０３８；特にＳ１１２Ｔ；Ｙ４２６Ｈ；Ｎ７５４Ｄ；Ｋ１８３７Ｅ；Ｎ２０３８Ｄ。
【００７５】
本発明の好ましい組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、少なくとも以下の位置にアミノ酸置換を含む
ａ．Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｎ２３３ＤおよびＩ２６５Ｔ；および／または
ｂ．Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３ＤおよびＩ２６５Ｔ；および／または
ｃ．Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６ＨおよびＳ５０７Ｅ；および／または
ｄ．Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ；および／または
ｅ．Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６ＮおよびＹ７４８Ｓ；および／または
ｆ．Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｇ．Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｈ．Ｓ２０７７Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｉ．Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｊ．Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｋ．Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｙ７４８ＳおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｌ．Ｌ１７１Ｑ、Ｎ２９９Ｄ、Ｎ６１６ＥおよびＶ２３３３Ａ；および／または
ｍ．Ｓ１１２Ｔ、Ｓ５０７Ｅ、Ｙ７４８Ｓ、Ｋ１８３７ＥおよびＮ２０３８Ｄ；および／または
ｎ．Ｓ１１２Ｔ、Ｙ４２６Ｈ、Ｎ７５４Ｄ、Ｋ１８３７ＥおよびＮ２０３８Ｄ。
【００７６】
本発明の好ましいタンパク質は、本明細書の図７に記載の置換を有する。
【００７７】
特に好ましいタンパク質は、少なくともｂおよびｃで規定された置換を組み合わせている。図７に示されるように、これらの置換を組み合わせることにより、高い発色性凝固活性および凝固による凝固活性ならびに高い特異的な凝固活性がもたらされる。本発明のさらに特に好ましいタンパク質は、少なくともｂおよびｃで規定された置換ならびにｄまたはｅおよび／またはｆ、ｇ、ｈ、ｉまたはｊおよび／またはＫ１８３７Ｅで規定された置換を組み合わせている。本発明のタンパク質は、例えば、ｂ、ｃおよびｄまたはｅで規定された置換を含み得る。本発明の他の有利なタンパク質は、ｂ、ｃおよびｄならびにｆ、ｇ、ｈ、ｉまたはｊで規定された置換を含む。本発明の他の有利なタンパク質は、ｂ、ｃおよびｅならびにｆ、ｇ、ｈ、ｉまたはｊで規定された置換を含む。
【００７８】
任意で、タンパク質はＫ１８３７Ｅをさらに含む。この置換は免疫原性スコアに対して高い効果を有するが、タンパク質の凝固活性に対して負の効果を有するようである。したがって、本発明のタンパク質はＫ１８３７における置換を含まないか、またはＫ１８３７Ｅを含まないことも想定される。
【００７９】
任意で、（例えばＹ７４８Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｆ５５５Ｈ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａの置換を含む）本発明のタンパク質は、Ｎ６１６における置換（Ｎ６１６Ｅなど）を含まない。一方、この置換の包含はタンパク質の免疫原性スコアおよび免疫原性をさらに低下させるため、一般的にはこの置換を含むことが好ましい。
【００８０】
一つの組合せにおいて、本発明のタンパク質は、Ｙ７４８Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｖ１８４Ａ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｆ５５５Ｈ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、および任意でＳ５０７Ｅの置換を含む。
【００８１】
本発明者らは、少なくともＮ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｌ１７１、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｓ５０７、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｌ７０６およびＹ７４８の位置にアミノ酸置換を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパクの置換の有利な組合せを特に示し得、ここで好ましくは、置換は、Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｓ５０７Ｅ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６ＮおよびＹ７４８Ｓである（例えばＦＶＩＩＩ−１４Ｍ）。任意で、タンパク質はＫ１８３７における置換（Ｋ１８３７Ｅなど）をさらに含み、配列番号７（ＦＶＩＩＩ−１５Ｍ）の２０〜１５３３位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含み得る（すなわち、成熟タンパク質は１９アミノ酸のＮ末端シグナル配列を含まない）。
【００８２】
好ましい組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｎ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｌ１７１、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｓ５０７、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｌ７０６、Ｙ７４８、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｓ２３１５およびＶ２３３３の位置に少なくとも１８個のアミノ酸置換を含み、ここで好ましくは、１８個の置換は、Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｓ５０７Ｅ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａである。任意で、タンパク質は配列番号６（ＦＶＩＩＩ−１８Ｍ）の２０〜１５３３位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含む（すなわち、成熟タンパク質は１９アミノ酸のＮ末端シグナル配列を含まない）。
【００８３】
別の好ましい組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｎ７９、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｌ１７１、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｓ５０７、Ｆ５５５、Ｎ６１６、Ｌ７０６、Ｙ７４８、Ｋ１８３７、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｓ２３１５およびＶ２３３３の位置に少なくとも１９個のアミノ酸置換を含み、ここで好ましくは、１９個の置換は、Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｓ５０７Ｅ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２３１５ＴおよびＶ２３３３Ａである。任意で、タンパク質は配列番号５（ＦＶＩＩＩ−１９Ｍ）の２０〜１５３３位のアミノ酸におけるアミノ酸配列を含む（すなわち、成熟タンパク質は１９アミノ酸のＮ末端シグナル配列を含まない）。
【００８４】
本発明のさらなるＦＶＩＩＩタンパク質の配列は配列番号８〜１５または５１として提供され、ここで配列はすべて１９アミノ酸のＮ末端シグナル配列を含むが、本発明の好ましい成熟ＦＶＩＩＩタンパク質はそれ以上のシグナル配列を含まない。したがって、これらは配列番号８〜１５または５１の２０〜１５３３位のアミノ酸にそれぞれ対応する。
【００８５】
好ましくは、指定された位置における置換のために選択されるすべてのアミノ酸は、関連する免疫原性クラスターのクラスタースコアを低下させる。
【００８６】
本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号２（ＦＶＩＩＩ−６ｒｓ）からなる第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して免疫原性が低下している。免疫原性は免疫原性スコアによって決定され得、これは本明細書に記載されているように計算され得る。ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの免疫原性スコアは７．０１であり、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦの免疫原性スコアは１０．０３である。好ましくは、本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、記載されている置換を有しない第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えばＦＶＩＩＩ−６ｒｓ）と比較して、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１３または少なくとも１５低下した免疫原性スコアを有する。例えば、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍは免疫原性スコアが−１０．５５であり、すなわち免疫原性スコアがＦＶＩＩＩ−６ｒｓと比較して１７．５６低下している。
【００８７】
好ましくは、免疫原性は、前記タンパク質とともにインキュベートされた樹状細胞およびドナーの制御性Ｔ細胞枯渇ＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養し、前記Ｔ細胞の活性化を試験することを含むアッセイによって決定され得る。本発明者らによって提供されるそのようなアッセイは、以下にさらに詳細に記載されている。Ｔ細胞は、健常なドナーまたは患者（例えば血友病Ａの患者）に由来し得る。
【００８８】
本発明の全ての組換えＦＶＩＩＩタンパク質において、位置は、配列番号１の全長ヒト第ＶＩＩＩ因子分子に関して規定される。技術水準において、ＦＶＩＩＩ分子におけるアミノ酸のアノテーションは著者間で異なっている。これは主に、アミノ酸の数に含まれ得るか、または省略され得る１９アミノ酸のシグナル配列に起因する。一般に、このプラスまたはマイナス１９アミノ酸の変動が、全長ＦＶＩＩＩ配列の数え方の唯一の差異である。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列の場合、欠失は数え方に変化をもたらし得る。重鎖について、数え方は全長ＦＶＩＩＩの数え方と相関する。Ｂドメイン欠失から軽鎖の数え方は、全長ＦＶＩＩＩ分子の数え方と同じに保たれるか（例えば、欠失の前にあるＱ７６３の後に欠失後のＤ１５８２が続く）、または欠失が生じていないかのように継続され得る（例えば、アミノ酸が欠失しているにもかかわらずＱ７６３の後にＤ７６４が続く）。何個のアミノ酸が欠失したか不明である場合、継続の数え方はアミノ酸配列の比較を複雑にする。継続の数え方は稀であり、ほとんどの著者はＢドメインの欠失にもかかわらず全長ＦＶＩＩＩ分子の数え方を維持している。これに従って、本発明では組換えＦＶＩＩＩタンパク質における置換の位置は、配列番号１の全長ヒトＦＶＩＩＩ分子に関して規定される。それにもかかわらず、分泌された組換えＦＶＩＩＩタンパク質はシグナル配列を含まず、典型的にはＢドメイン欠失バリアントである。
【００８９】
ＢドメインがＦＶＩＩＩの適切な凝固機能に必要でないことは当分野で公知であり、従って様々なＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質が周知である。本発明の文脈において、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｂドメインの完全な欠失または部分的な欠失を含み得る。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質は、（例えば翻訳産物のタンパク質分解的な処理に重要であり得る）Ｂドメインのアミノ末端配列を未だ含み得る。さらに、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質は、１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を保持するためにＢドメインの１つ以上の断片を含み得る。好ましくは、ＦＶＩＩＩタンパク質はフューリン切断部位を含まず、結果としてタンパク質の軽鎖および重鎖が共有結合した一本鎖タンパク質が得られる。
【００９０】
例えば、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｂドメインの０〜２００残基、例えば１〜１００残基、好ましくは８〜９０残基を未だ含み得る。残存しているＢドメインの残基は、ＢドメインのＮ末端および／またはＣ末端および／または内部領域に由来し得る。例えば、ＢドメインのＣ末端由来の残存している残基は、１〜１００残基、好ましくは２０〜９０残基、より好ましくは８６残基を含み得る。他の実施態様において、Ｃ末端由来の残存している残基は、１〜２０残基、例えば４残基を含み得る。例えば、ＢドメインのＮ末端由来の残存している残基は、１〜１００残基、好ましくは２〜２０残基、より好ましくは２〜１０残基、より好ましくは４残基を含み得る。例えば、Ｂドメインの内部領域由来の残存している残基は、２〜２０残基、好ましくは２〜１０残基、より好ましくは４〜８残基を含み得る。好ましい実施態様において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、例えばＦＶＩＩＩ−１９Ｍのように、Ｂドメインの８６個のＣ末端残基およびＢドメインのＮ末端由来の４残基を含む。
【００９１】
本発明全体を通して、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号５の成熟（すなわちシグナル配列を含まない）ＦＶＩＩＩ−１９Ｍタンパク質と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し得、ここでＡ１、ａ１、Ａ２、ａ２、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメイン（残基２０〜７５９および残基１６６８〜２３５１）のみが配列同一性の決定のために考慮される。すなわち、配列同一性の決定のために、Ｂドメイン（全長ヒト配列配列番号１の残基７６０〜１６６７、および部分的なＢドメイン欠失タンパク質におけるそれに対応する残基）およびシグナル配列（残基１〜１９）は考慮されない。
【００９２】
したがって、配列番号１の成熟全長ヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質または（例えば配列番号３の）そのＢドメイン欠失バリアントと、配列番号５のＦＶＩＩＩタンパク質との％配列同一性は同一であり、特に９８．６７％である。本発明の好ましいＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号５との配列同一性が少なくとも９８．７４％である。
【００９３】
例えば、記載されている置換のうち１つのみを有する成熟Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質について、配列番号５の成熟ＦＶＩＩＩ−１９Ｍタンパク質との％配列同一性はＡ１、ａ１、Ａ２、ａ２、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインに対して決定され、すなわち１４２４アミノ酸のうち１８個が置換されており、従ってタンパク質は配列番号５の成熟ＦＶＩＩＩ−１９Ｍタンパク質と少なくとも９８．７４％の配列同一性を有する。ＦＶＩＩＩ−１９Ｍにも存在する記載されている置換のうち３つを有する成熟Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質について、配列番号５の成熟ＦＶＩＩＩ−１９Ｍタンパク質との％配列同一性はＡ１、ａ１、Ａ２、ａ２、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインに対して決定され、すなわち１４２４アミノ酸のうち１６個が置換されており、従ってタンパク質は配列番号５のＦＶＩＩＩ−１９Ｍタンパク質と９８．８８％の配列同一性を有する。ＦＶＩＩＩ−１９Ｍにも存在する記載されている置換のうち４つを有する本発明の成熟Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質は、１４２４アミノ酸のうち１５個が置換されており、従って９８．９５％の配列同一性を有する。３８個の記載されている置換すべてを組み込んだ成熟Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍと比較して１９個のさらなる置換を有し、したがってＦＶＩＩＩ−１９Ｍと９８．６７％の配列同一性を有する。
【００９４】
配列同一性はさらに、分子の第ＶＩＩＩ因子部分について（規定されるように、Ａ１、ａ１、Ａ２、ａ２、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインに基づいて）のみ決定される（すなわち、タンパク質が（例えば任意のサイズの挿入物を含む）融合タンパク質である場合、（例えば、本明細書にさらに記載されるように）融合部分または挿入部分、タンパク質ドメインまたは領域は考慮されない）。したがって、配列同一性の決定のために、存在する場合には融合パートナーは無視され、Ａ１、ａ１、Ａ２、ａ２、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインに対する％配列同一性が計算される。配列同一性は、当分野で知られているように（例えば、ニードルマン−ウンシュアルゴリズムまたは好ましくはスミス−ウォーターマンアルゴリズムを用いて）計算され得る（Smith et al., 1981. Identification of Common Molecular Subseqences, J Mol Biol. 147: 195-197）。
【００９５】
ある実施態様において、本明細書で規定されている置換を除くＦＶＩＩＩタンパク質のすべての残基（特に、Ａ１、ａ１、Ａ２、ａ２、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインに関して）は、配列番号１のヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質の残基に対応している（すなわち同一である）。任意で、これはまた、Ｂドメインまたは存在しているＢドメインの部分にも適用され得る。
【００９６】
別の実施態様において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質はさらなる変異（例えば、さらなるＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープに関して免疫原性を低下させることが当分野で公知である変異、および／またはタンパク質の血清半減期を改善することが当分野で公知である変異、および／またはタンパク質の精製を容易にする（例えば、一本鎖タンパク質をもたらす）変異）を組み込んでいる。
【００９７】
好ましくは、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は融合タンパク質（例えば、配列番号５に規定されるＦＶＩＩＩ−１９Ｍと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の融合タンパク質）であり、ここでＡ１、ａ１、Ａ２、ａ２、ａ３、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインのみが配列同一性の計算のために考慮される。
【００９８】
好ましくは、融合パートナーは、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質のインビボでの血清半減期を延長する。融合パートナーは、Ｆｃ領域、アルブミン、アルブミン結合配列、ＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰポリペプチド、絨毛性ゴナドトロピンのベータサブユニットのＣ末端ペプチド、アルブミン結合小分子、およびそれらの組合せを含む群から選択され得る。ＦＶＩＩＩタンパク質は、非タンパク質融合パートナー（ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）および／またはＨＥＳ（ヒドロキシエチルデンプン）など）と代替的または追加的に共有結合してい得る。ＰＡＳポリペプチドまたはＰＡＳ配列は、主にアラニンおよびセリン残基を含むか、または主にアラニン、プロリンおよびセリン残基を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＰＡＳ配列はＷＯ２０１５／０２３８９４で明らかにされているように生理条件下でランダムコイル構造を形成する。ＨＡＰポリペプチドまたは配列は、ＷＯ２０１５／０２３８９４に規定されるように、例えばグリシンまたはグリシンおよびセリンの反復配列を含むホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。潜在的な融合物、融合パートナーおよびそれらの組合せは、例えばＷＯ２０１５／０２３８９４にさらに詳細に記載されている。
【００９９】
好ましくは、治療応用のために、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は少なくともＦｃ領域と融合している。ＦＶＩＩＩとＦｃ領域との融合タンパク質が免疫原性を低下させることは技術水準において公知である（Krishnamoorthy et al., Recombinant factor VIII Fc (rFVIIIFc) fusion protein reduces immunogenicity and induces tolerance in hemophilia A mice, Cell. Immunol. 2016, http://dx.doi.org/10.1016/j.cellimm.2015.12.2008; Carcao et al., Recombinant factor VIII Fc fusion protein for immune tolerance induction in patients with severe haemophilia A with inhibitors - A retrospective analysis. Haemophilia 2018:1-8)。
【０１００】
融合パートナーは、例えば本発明のＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端またはＣ末端に結合され得るが、ＦＶＩＩＩタンパク質が本明細書で規定されるように機能的なままである限り、ＦＶＩＩＩ配列内に挿入され得る。上述したように、配列同一性の決定のために、本明細書で規定される例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の融合パートナーの挿入は、配列同一性を低下させるように考慮されない。
【０１０１】
本発明者らは、高い割合の本発明のＦＶＩＩＩタンパク質が、産生のために選択された細胞株において一本鎖タンパク質として産生されたことを見出した。一本鎖タンパク質としてのＦＶＩＩＩの産生は、凝固活性を低下させるとは考えられないが、精製に有益であり得る。精製を単純化するために、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は一本鎖タンパク質であり得、または少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の割合で一本鎖タンパク質を有し得る。あるいは、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩタンパク質として産生され得る。好ましくは、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、一本鎖Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子タンパク質である。
【０１０２】
組換え一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質は当分野で公知であり、ここで例えばＢドメインの少なくとも一部および隣接する酸性ａ３ドメインの４アミノ酸（例えば全長ＦＶＩＩＩの残基７８４〜１６７１）が除去され、特にフューリン切断部位が除去される（ＥＭＡ／ＣＨＭＰ／６９９３９０／２０１６−評価報告書ＡＦＳＴＹＬＡ）。例示的な一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号４として提供される。本明細書に規定される１９個の変異（例えばＦＶＩＩＩ−１９Ｍに組み込まれた同一の１９個の変異）を組み込む配列番号４に基づく例示的なＦＶＩＩＩ一本鎖タンパク質は、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍのａ３ドメインの４つのアミノ酸を有しておらず、すなわち配列番号５と９９．７２％（少なくとも９９％）の配列同一性を有する。前記タンパク質はＢドメインが欠失していてもよく、（例えば上述のように）融合タンパク質であってもよい。
【０１０３】
タンパク質は、さらにグリコシル化および／または硫酸化されてい得る。好ましくは翻訳後修飾（タンパク質のグリコシル化および／または硫酸化など）はヒト細胞中で起こる。
【０１０４】
本発明のある実施態様において、タンパク質はｖＷＦと結合できる。例えば、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質のｖＷＦへの結合能は、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦのｖＷＦへの結合能の０〜１００％、１０〜９０％、２０〜８０％、３０〜７０％、４０〜６０％または５０〜６０％であり、これは（例えば本明細書に記載されている）ＥＬＩＳＡに基づく方法によって決定され得る。本明細書に示されるように、記載されている変異のうちいくつかを含む本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の結合能は、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦと比較して（例えば６０％未満に）低下し得る。
【０１０５】
本発明のタンパク質は好ましくは、薬学的に使用され得るようにインビトロおよびインビボでのヒト血漿中で安定である。本発明者らは、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍの約８３％の発色性凝固活性が、ヒト血漿中における３７℃で２４時間のインビトロでのインキュベーションの後に維持されたことを示し得る。ＦＶＩＩＩ−６ｒｓでは同一の条件下において約９１％の凝固活性が維持され、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦおよびＮｕｗｉｑでは９７％であった。
【０１０６】
好ましくは、インビボにおいて（阻害剤を含まない患者の）ヒト血清中の本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約６時間、好ましくは少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間である。本明細書で規定されるように、ＦＶＩＩＩタンパク質は、融合パートナーを伴わないＦＶＩＩＩタンパク質であってもよく、または本明細書で規定される融合タンパク質であってもよい。任意で、所定の半減期は融合パートナーを伴わずに既に得られている。さらなるパートナーが存在する場合、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は同じであり得、またはさらに長くなり得る。
【０１０７】
本発明はまた、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする核酸を提供する。核酸は好ましくは、Ｎ末端シグナル配列（例えば、配列番号１の１９アミノ酸のシグナル配列）を有するＦＶＩＩＩをコードする。したがって、本発明の好ましい核酸は、配列番号５〜１５または５１をコードする。本発明の核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。核酸は、宿主細胞（例えばヒト細胞）における発現のために最適化され得る。ＦＶＩＩＩ−１９Ｍをコードする核酸は、配列番号５２として提供される。比較のために、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの核酸配列が配列番号５３として提供される。
【０１０８】
核酸は好ましくは、（例えば、細菌、酵母、植物または動物細胞（例えば、好ましくは哺乳類細胞、または特にヒト細胞もしくは治療用ＦＶＩＩＩタンパク質の産生に適した別の細胞株（例えばＣＨＯ細胞））における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した）発現ベクターである。発現ベクターは、構成的または誘導性プロモーターであり得る適切なプロモーターの機能的制御下においてＦＶＩＩＩタンパク質を（好ましくはコドン最適化された形態で）コードする配列を含む。プロモーターは、天然においてＦＶＩＩＩの発現に関連しないプロモーター（例えばＥＦ−１α）または異種プロモーター（例えばＣＭＶまたはＳＶ４０）であり得る。
【０１０９】
あるいは、核酸は、遺伝子治療（例えばヒト患者の遺伝子治療）に適したベクターであり得る。遺伝子治療に適したベクターは当分野で公知であり、例えば、（例えばアデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスに基づく）ウイルスベースのベクター（レンチウイルスベクターなど）または非ウイルスベースのベクター（限定されないが、小型プラスミドおよびミニサークルまたはトランスポゾンベースのベクターなど）である。本発明のＡＡＶベースのベクターは、例えば血友病Ａ患者の遺伝子治療のためにＡＡＶ粒子にパッケージングされてい得る。
【０１１０】
本発明はさらに、本発明の核酸を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は細菌細胞または酵母細胞であり得るが、典型的には哺乳類細胞であり、好ましくはヒト細胞である。好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターを含むヒト細胞である。細胞は、本発明の核酸を一過性または安定に遺伝子導入されてい得る。細胞は、細胞株、初代細胞または幹細胞であり得る。タンパク質の産生のために、細胞は通常、細胞株（ＨＥＫ−２９３細胞などのＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｃｒｕｃｅｌｌ’ｓ Ｐｅｒ．Ｃ６などのヒト胚性網膜細胞、またはＣＡＰなどのヒト羊膜細胞など）である。
【０１１１】
細胞は、患者の体内への遺伝子導入および再導入後に、患者においてＦＶＩＩＩを産生させるのに適した血友病Ａ患者の自己細胞であり得る。細胞は幹細胞（例えば造血幹細胞）であり得るが、好ましくは（特に患者がヒトである場合）胚性幹細胞ではない。細胞はまた、肝細胞、肝類洞壁内皮細胞または血小板であり得る。
【０１１２】
本発明のタンパク質を発現する細胞株はまた、例えば本明細書に記載されているように、例えば複数の方法を用いて、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現に適した条件下で前記細胞を培養し、前記タンパク質を精製することを含む、本発明のタンパク質を調製する方法に使用され得る。
【０１１３】
したがって、本発明は、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質、本発明の核酸、または本発明の宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、適切な賦形剤（例えば、緩衝剤、安定化剤、増量剤、保存剤、別の（例えば組換え）タンパク質、またはそれらの組合せ）を含み得る。製剤化に適した緩衝剤は、例えば、２０５ｍＭ ＮａＣｌ、５．３ｍＭ ＣａＣｌ２、６．７ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、１．３％スクロースおよび０．０１３％ Ｔｗｅｅｎ２０を蒸留水中に含み得、ｐＨは７．０であり得る。本発明の文脈において、特に明示的に記載されていない場合、「ａ」は１つ以上を意味すると理解される。
【０１１４】
医薬組成物は、例えば静脈内投与または皮下投与のために製剤化され得る。一般に、これは緩徐な静脈内プッシュボーラス注入としての投与のためのものである。持続注入は、例えば重度の出血または外科手術のために入院を必要とする患者に指示される。（例えば植物で発現した後に）耐性誘導に寄与し得る経口投与も可能である。
【０１１５】
ＦＶＩＩＩを含む医薬組成物は凍結乾燥され得る。投与量および処置スキームは（例えば、出血の予防のために、または出血性イベントのための間欠的なオンデマンドの治療を伴って）適宜選択され得る。
【０１１６】
本発明はまた、免疫抑制物質（例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、シクロホスファミド、リツキシマブ、および／またはシクロスポリン）と組み合わせた本発明のＦＶＩＩＩタンパク質を含む医薬組成物を提供し、かつ／またはこれはそのような物質と実質的に同時に（例えば、数分〜１２時間以内に）投与するためのものであり得る。
【０１１７】
（例えば本発明のタンパク質を含む）医薬組成物は、それを必要とする患者（特に血友病Ａ患者、例えばＦＶＩＩＩに対する自己免疫応答を伴う後天性血友病患者または先天性血友病Ａ患者）の処置における使用のためのものであり得る。哺乳類（マウスなど）は本発明の医薬組成物を用いて処置され得るが、患者は典型的にはヒト患者である。
【０１１８】
医薬組成物は、免疫原性の低下が所望される状況において（例えば、任意の組換えまたは血漿第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置されていない血友病Ａ患者の処置における使用のために）特に有利である。したがって、本発明によれば、患者における阻害性抗体を含む抗体の生成の発生率および／または程度は、従来のＦＶＩＩＩによる処置と比較して低下し、または好ましくは阻害性抗体を含む抗体の生成は妨げられる。本発明の医薬組成物はまた、組換えおよび／または血漿第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置された患者の処置に使用され得る。組換えおよび／または血漿第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体を有する患者では、低い免疫原性または免疫寛容原性の特性を有するＦＶＩＩＩタンパク質を用いることが所望されるため、医薬組成物は、例えば免疫寛容誘導（ＩＴＩ）の処置のために使用され得る（Carcao et al., Recombinant factor VIII Fc fusion protein for immune tolerance induction in patients with severe haemophilia A with inhibitors - A retrospective analysis. Haemophilia 2018:1-8）。したがって、本発明の組成物はまた、レスキューＩＴＩのために使用され得る。医薬組成物はまた、ＩＴＩによって処置されている組換えおよび／または血漿第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者において有利に使用され得る。さらに、本発明の医薬組成物は、阻害性抗体を有する患者においてバイパス物質として使用され得る。
【０１１９】
本明細書に記載の置換の組合せは、分析されたＨＬＡ−ＤＲスーパータイプ対立遺伝子（ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１５０１）のうち少なくとも１つを有するすべての対象の免疫原性スコアを低下させる。これらのサブタイプは、集団において９０％を超えて存在する（Southwood et al., J. Immunol. 1998;160;3363-3373参照）。したがって、本発明のＦＶＩＩＩは、それを必要とするすべての患者（特にＨＬＡ−ＤＲスーパータイプ対立遺伝子の１つを有する患者）の処置のために有利に使用され得る。表１は、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍの実施例について、免疫原性が種々の対立遺伝子を有する患者に対して異なるように低下していることを示す。
【０１２０】
表１Ａ〜Ｃ：種々のＨＬＡ−ＤＲスーパータイプについてのＦＶＩＩＩ−６ｒｓ（Ａ）およびＦＶＩＩＩ−１９Ｍ（Ｂ）の免疫原性、ならびに種々のＨＬＡ−ＤＲスーパータイプについてのＦＶＩＩＩ−６ｒｓと比較したＦＶＩＩＩ−１９Ｍの免疫原性の絶対的な低下（Ｃ）を示す個々のＴ細胞エピトープ測定（ＩＴＥＭ）スコア。ＩＴＥＭスコアは、タンパク質の長さで正規化された対立遺伝子のペアについてのＥｐｉＭａｔｒｉｘ Ｈｉｔｓ（下記参照の方法）の数および強度に基づいている。表１ＡまたはＢの低いＩＴＥＭスコアは、低い免疫原性を反映している。表１ＣのＩＴＥＭスコアにおける大きな低下（すなわち、前記表の高い正の値）は、導入された置換からの高い効果を反映している。
【表１】
2021520802.tif 000003
【０１２１】
分析されたすべての対立遺伝子について、免疫原性スコアの低下があり、特に免疫原性スコアの低下は１３を上回っている。１７を超える免疫原性スコアの特に大きな低下は、以下のＨＬＡ型の組合せの１つを有する患者が、本発明の医薬組成物による処置から特に利益を得ることができることを示している：
・  ＤＲＢ１＊０７０１と、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１またはＤＲＢ１＊１５０１との組合せ；
・  ＤＲＢ１＊０８０１と、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１またはＤＲＢ１＊１５０１との組合せ；
・  ＤＲＢ１＊１１０１と、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１またはＤＲＢ１＊１５０１との組合せ；
・  ＤＲＢ１＊１３０１とＤＲＢ１＊１１０１との組合せ；
・  ＤＲＢ１＊１５０１と、ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１５０１との組合せ；
【０１２２】
２０を超える免疫原性スコアのさらに大きな低下は、以下のＨＬＡ型の組合せの１つを有する患者が、本発明の医薬組成物による処置からさらに特に利益を得ることができることを示している：ＤＲＢ１＊１１０１と、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１またはＤＲＢ１＊１５０１との組合せ。免疫原性スコアの特に大きな低下を有する患者の処置が好ましい。
【０１２３】
本発明は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質を発現する本発明の宿主細胞を適切な条件下で培養し、前記ＦＶＩＩＩタンパク質を単離することを含む、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質を調製するためのインビトロでの方法を提供し、ここでタンパク質は任意で医薬組成物として製剤化される。本明細書に記載されるように、宿主細胞は好ましくはヒト細胞である。
【０１２４】
ある実施態様において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質を調製するためのインビトロでの方法は、Ｔ細胞エピトープの存在についてＦＶＩＩＩタンパク質を分析する工程、Ｔ細胞エピトープの１つ以上を除去する位置におけるアミノ酸置換を同定する工程、および得られた本発明のＦＶＩＩＩタンパク質を発現する宿主細胞を培養する前に対応する変異体の凝固活性についてアミノ酸置換を試験する工程をさらに含む。したがって、本発明はまた、以下を含む、免疫原性が低下しているタンパク質（例えば本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質）を調製するためのインビトロでの方法を提供する：
ａ）相当の割合のヒトに関連するＴ細胞エピトープの存在について第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば野生型第ＶＩＩＩ因子タンパク質）を分析する；
ｂ）工程ａで同定されたＴ細胞エピトープの１つを除去する位置に少なくとも１つ（好ましくは１つのみ）のアミノ酸置換を含む複数の前記タンパク質の変異体を調製し、前記変異体の凝固活性を分析する；
ｃ）配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の少なくとも５０％、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の少なくとも５０％を有するタンパク質をもたらすと工程ｂで同定された置換のうち少なくとも３つをそれぞれ含む複数の前記タンパク質の変異体を調製する、ここで置換は異なる免疫原性クラスター内に位置し、前記変異体は前記タンパク質の連続した領域のすべての免疫原性クラスターにおいて同定された置換をそれぞれ含む、および前記変異体の凝固活性を分析する；
ｄ）工程ｃの変異体のいずれかが、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の５０％未満の凝固活性、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の５０％未満の凝固活性を有する場合、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の少なくとも５０％、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の凝固活性の少なくとも５０％を有するタンパク質をもたらすと工程ｂで同定された置換のうち少なくとも３つをそれぞれ含む複数の前記タンパク質の変異体を調製することを繰り返す、ここで置換は異なる免疫原性クラスター内に位置し、前記タンパク質の前記連続した領域で同定された置換の異なる組合せが調製される、および前記変異体の凝固活性を分析する；
ｅ）前記タンパク質の凝固活性を配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の５０％未満の凝固活性または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の５０％未満の凝固活性に低下させないことが見出された少なくとも３個（好ましくは少なくとも１０個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも１９個）の置換を他の含まれている置換と組み合わせて含む第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製する；および、任意で
ｆ）前記タンパク質を医薬組成物として製剤化する。
【０１２５】
工程ａの分析は、好ましくは（例えば、本明細書に記載されている免疫原性クラスターの存在についてタンパク質を分析することによって）インシリコで行われる。したがって、工程ｂは次に、同定された免疫原性クラスターの１つを除去する。あるいは、Ｔ細胞エピトープの分析は、（例えば、ヒトのＭＨＣクラスＩＩからのペプチドを溶出することによって）インビトロで実施され得る。
【０１２６】
好ましくは、工程ｃ、ｄおよびｅにおける凝固活性は、配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の凝固活性の少なくとも８０％または少なくとも１００％であるか、または配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質の少なくとも８０％または少なくとも１００％である。配列番号２の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の８０〜１２０％（好ましくは９０〜１１０％）の凝固活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質は、例えばｗｔヒトＦＶＩＩＩまたはそのＢドメイン欠失バリアント（ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦなど）であり得る。
【０１２７】
任意で、工程ｅのタンパク質はさらなる変異を含むように改変されてい得、特に（例えば、本明細書に開示されている融合パートナーのうち１つまたは２つ以上を含む）融合タンパク質として（好ましくはＦｃ領域を含む融合タンパク質として）発現され得る。
【０１２８】
免疫原性が低下している第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製する方法において、インシリコでの分析後に同定されたアミノ酸置換の位置は、Ｙ７４８、Ｌ１７１、Ｓ５０７、Ｎ７９、Ｉ８０、Ｉ１０５、Ｓ１１２、Ｌ１６０、Ｖ１８４、Ｎ２３３、Ｌ２３５、Ｖ２５７、Ｉ２６５、Ｎ２９９、Ｙ４２６、Ｙ４３０、Ｌ５０５、Ｆ５５５、Ｉ６１０、Ｎ６１６、Ｉ６３２、Ｌ７０６、Ｎ７５４、Ｋ１８３７、Ｒ１９３６、Ｓ２０３０、Ｓ２０３７、Ｎ２０３８、Ｓ２０７７、Ｍ２１２３、Ｓ２１２５、Ｆ２２１５、Ｋ２２２６、Ｋ２２５８、Ｖ２３１３、Ｓ２３１５、Ｖ２３３３およびＱ２３３５である。好ましくは、Ｎの置換は、Ｄ、Ｈ、ＳおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｉの置換は、ＴおよびＶからなる群から独立して選択される；Ｓの置換は、Ａ、Ｎ、Ｇ、ＴおよびＥからなる群から独立して選択される；Ｌの置換は、Ｎ、Ｑ、ＦおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｖの置換は、ＡおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｙの置換は、Ｎ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｆの置換は、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｋの置換は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｒの置換は、Ｑ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｍの置換は、Ｒ、Ｑ、ＫおよびＴからなる群から選択される；および／または、Ｑの置換は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＫからなる群から選択される；
【０１２９】
本発明はさらに、タンパク質（例えば本発明のＦＶＩＩＩタンパク質）とともにインキュベートされた樹状細胞およびドナー（例えば、健常なヒトまたは例えば血友病Ａの患者）の制御性Ｔ細胞枯渇ＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養し、前記Ｔ細胞の活性化を試験することを含む、前記タンパク質の免疫原性を決定するためのアッセイを提供する。このようなアッセイのために、単球が（例えばＰＢＭＣから）精製され得、（例えばＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下で）未熟ＤＣ（ｉＤＣ）に分化され得、（例えば、ＬＰＳ、またはＩＬ−１ベータ、ＩＬ−６およびＴＮＦ−アルファなどのサイトカインの混合物を用いて）最終的に成熟ＤＣ（ｍＤＣ）になるように刺激され得、同時に抗原（すなわち対象のタンパク質）とともにインキュベートされ得る。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、（好ましくはＰＢＭＣの同一のバッチからの）同一のドナーのＰＢＭＣから精製され、その後の増殖の検出のためにＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル）で標識され、（例えば、細胞の回復および安定に結合していないＣＦＳＥの除去のための時間を提供するために）共培養の前に培養される。好ましくは少なくとも１：１０のＤＣ：Ｔ細胞の比率で（例えば約１２時間から約２週間、１日から９日、または２日から７日）ＤＣとの共培養を行った後、Ｔ細胞をフローサイトメトリーで活性化および／または増殖について分析する。代替的または追加的に、上清をサイトカインについて分析してもよい。アッセイのための好ましい条件は以下の実施例に記載されている。このアッセイは、制御性ＣＤ２５＋Ｔ細胞の非存在下において一次および二次のＴ細胞媒介性免疫応答の両方の評価を可能にするという利点を有し、これは免疫応答の検出を容易にする。結果はインビボでのタンパク質の免疫原性と相関することが予想される。
【０１３０】
脱免疫化ＦＶＩＩＩタンパク質ＦＶＩＩＩ−１９Ｍについて、アッセイにより、分析した対象の多数においてＦＶＩＩＩ−１９Ｍに応答したＴ細胞の増殖が低下していたことが確認された。低い免疫原性スコアはインビトロアッセイにおけるタンパク質の低い免疫原性と相関していた（すなわち、インシリコで同定されたエピトープにおける置換は免疫原性を低下させる）と結論付けられ得る。
【０１３１】
本明細書で引用されているすべての刊行物は、本明細書に完全に組み込まれる。本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは本発明の範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【実施例】
【０１３２】
ヒトＦＶＩＩＩのＭＨＣクラスＩＩ（Ｔ細胞エピトープ）への結合におけるペプチドの初期のインシリコ解析を、ヒト集団の大部分（＞９０％）を包含する８つの一般的なクラスＩＩスーパータイプ対立遺伝子（ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１１０、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１５０１）のパネルに関して結合の可能性を予測するＥｐｉＭａｔｒｉｘツール（Epivax, Providence, RI, USA）、および推定Ｔ細胞エピトープクラスター（指定された免疫原性クラスター）を同定するためのＣｌｕｓｔｉＭｅｒアルゴリズムを用いて行った。配列番号２（ＦＶＩＩＩ−６ｒｓ）のＦＶＩＩＩ配列について解析を実行し、これは１９アミノ酸のシグナル配列および８１８アミノ酸のＢドメインを除いた１５１４アミノ酸を含んでいた。除外されたＢドメインのアミノ酸は、フューリンおよびトロンビン切断部位のいずれにも干渉しなかった。インシリコのツールは合計５２個の免疫原性ペプチドクラスターを明らかにし、クラスタースコアは４〜３４の範囲であり、高い値では非常に高い結合親和性を示し、低い値では低い親和性を示した。クラスターは１４〜２２個のアミノ酸を含み、いくつかのクラスターは数個のアミノ酸について重複していた。
【０１３３】
５２個のクラスターのうち１２個については、活性、結合もしくは安定性に重要な領域との干渉のために、または交換の可能性がないために、アミノ酸変異が除外された。残りの４０個のクラスターを脱免疫化するために、７４個の変異を選択した。交換されたアミノ酸は、好ましくは他の種において天然に存在する変化に基づいていた。利用可能な天然の変化が存在しなかった場合、アミノ酸交換は自然選択によって生じた変異を含む許容点変異（point accepted mutation；ＰＡＭ）マトリックスから選択された。特に、ＰＡＭマトリックスに基づいて、Ｎの置換は、Ｄ、Ｈ、Ｓからなる群から独立して選択される；Ｉの置換はＴである；Ｓの置換は、Ａ、Ｎ、Ｇ、Ｔからなる群から独立して選択される；Ｌの置換は、ＮおよびＱからなる群から独立して選択される；Ｖの置換は、ＡおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｙの置換は、ＮおよびＨからなる群から独立して選択される；Ｆの置換は、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｋの置換は、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から独立して選択される；Ｒの置換は、Ｑ、ＨおよびＳからなる群から独立して選択される；Ｍの置換は、Ｒ、Ｑ、ＫおよびＴからなる群から選択される；および／または、Ｑの置換は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、ＨおよびＫからなる群から選択される。
【０１３４】
いくつかのクラスターについて最大で３つの変異が示され、すべてがクラスタースコアの強い低下をもたらした。これらの場合では、すべての変異が組込みのために選択された。追加の変異がスコアの低い低下のみをもたらした場合、この変異を除外した。さらに、５つのクラスターにおける変異は、そのクラスターの合計スコアがすでに低く、変異による予測される改善はわずかであったため完全に除外された。これらの除外基準は、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）−ＦＶＩＩＩへの組込みについて変異を７４個から５７個に減少させた：Ｎ７９Ｓ、Ｉ８０Ｔ、Ｉ１０５Ｖ、Ｌ１０７Ｎ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｆ２１４Ｈ、Ｎ２３３Ｄ、Ｌ２３５Ｆ、Ｖ２５７Ａ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｉ３１０Ｔ、Ｆ３１２Ｓ、Ｙ４２６Ｈ、Ｙ４３０Ｈ、Ｌ４８１Ｎ、Ｆ４８４Ｓ、Ｌ５０５Ｎ、Ｓ５０７Ｅ、Ｌ５４８Ｎ、Ｆ５５５Ｈ、Ｉ６１０Ｔ、Ｎ６１６Ｅ、Ｆ６２７Ｈ、Ｉ６３２Ｔ、Ｙ６５７Ｄ、Ｍ７０１Ｋ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ、Ｎ７５４Ｄ、Ｆ１７１０Ｈ、Ｆ１７９４Ｈ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｆ１９３７Ｈ、Ｌ１９６３Ｑ、Ｓ２０３０Ａ、Ｓ２０３７Ｇ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｍ２１２３Ｋ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｙ２１３４Ｈ、Ｙ２１６７Ｎ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｆ２２５３Ｈ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｖ２２７６Ａ、Ｆ２２７９Ｈ、Ｖ２３１３Ａ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３Ａ、Ｑ２３３５Ｈ。
表２：ＦＶＩＩＩにおいて同定された免疫原性クラスター
【表２−１】
2021520802.tif 000004
【表２−２】
2021520802.tif 000005
【０１３５】
変異の組込みを３回行った。１回目は単一の変異のみを組み込んだが、２回目および３回目は１回目で組込みに成功した変異の組合せを含んでいた。各回において、最も重要な読み取りは、変異していない対照ＦＶＩＩＩと比較した変異ＦＶＩＩＩバリアントの凝固活性であった。この手法を図１に示す。
【０１３６】
すべてのＦＶＩＩＩバリアントのＤＮＡ配列を合成し、ＥＦ−１αプロモーターの制御下でベクターバックボーンにクローニングした。合成した断片のサイズを小さくするために、３つの追加の制限部位をサイレント変異によってＦＶＩＩＩ配列に組み込んだ。この配列は、バックボーンへのクローニングのためにＦＶＩＩＩ配列の先頭（ＨｉｎｄＩＩＩ）および末尾（ＸｂａＩ）に制限部位を既に有していた。一つの追加の制限部位（ＢａｍＨＩ）がＢドメイン配列の除去の後に自然に生じた。これにより、追加で組み込まれた３つの制限部位（ＫｐｎＩ、ＸｍａＩ、およびＥｃｏＲＩ）と組み合わせて６つの特有の制限部位を持つＦＶＩＩＩ分子がもたらされた。結果として、合成される配列が短縮されただけでなく、変異の組合せを容易にするモジュラーシステムが利用可能となった。この６つの制限部位を有する配列に由来するＦＶＩＩＩ分子を、実施した全ての実験の参照分子とし、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓと呼んだ。アミノ酸配列を配列番号２に示す。新規アミノ酸のための塩基のトリプレットの選択は、ヒトのコドン使用頻度表に基づいていた。アミノ酸に対してヒトゲノムで最も頻繁に使用される塩基のトリプレットを選択した。
【０１３７】
単一の置換が未だ機能的なＦＶＩＩＩ分子をもたらすか否かを調べるために、すべての変異を試験した。単一の変異を含むＦＶＩＩＩバリアントを小規模なＨＥＫ２９３−Ｆ培養において産生させた。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を、Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ中で各ＦＶＩＩＩコンストラクトについて二通りで遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を４日間培養した。培養後、ＦＶＩＩＩを含む上清を遠心分離により回収した。上清中のＦＶＩＩＩ凝固活性を、本明細書に記載されているように発色法を用いて二通りで分析した。ＦＶＩＩＩ抗原ＥＬＩＳＡを実施するまで残りの上清を凍結させた。異なる遺伝子導入の日からの異なるコンストラクトの凝固活性の結果を比較するために、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞にＦＶＩＩＩ−６ｒｓをコードする参照ベクターをさらに遺伝子導入した。したがって、各バリアントのＦＶＩＩＩ凝固活性はＵ／ｍｌでは示されず、相対的な凝固活性が計算され、これは同じ遺伝子導入の日のＦＶＩＩＩ−６ｒｓに対するバリアントの凝固活性を示した。
【０１３８】
図２に、ＦＶＩＩＩのドメインに割り当てられた単一変異のバリアントの相対的な凝固活性を示す。分析により、８つの変異のみが細胞培養上清中のＦＶＩＩＩの凝固活性の完全な喪失をもたらしたことが明らかになった。そのうちの１つであるＬ１９６３Ｑは、重度の血友病Ａをもたらすことが知られている対照の変異であった。１１個の変異は、対照の凝固活性の５０％未満の上清中のＦＶＩＩＩ凝固活性をもたらした。したがって、ＦＶＩＩＩ凝固活性が低いか、または存在しないため、合計１９個の変異がさらなる実験から除外された。除外された１９個の変異は１６個の免疫原性クラスターに広がっていたが、６つのクラスターにおいてさらなる変異がうまく組み込まれていたため、１０個の免疫原性クラスターのみを除外しなければならなかった。残りの３８個の変異は、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの凝固活性の少なくとも半分に相当する凝固活性を有するＦＶＩＩＩバリアントをもたらした。凝固活性に加えて、ＦＶＩＩＩバリアントの抗原価（antigen value）および得られた特異的な凝固活性を決定した（図３）。特異的な凝固活性はＦＶＩＩＩ抗原に対するＦＶＩＩＩ発色性凝固活性の割合であるため、１００％はＦＶＩＩＩ凝固活性の量がＦＶＩＩＩ抗原の量と同等であることを示した。しかし、ほとんどの値が１００％を超えていた。より高い値は、バリアントの凝固活性の改善を示し得る。３８個の活性なＦＶＩＩＩバリアントのうち、３５個は少なくとも１００％の特異的な凝固活性を有していた。残りの３つのバリアントは、１００％未満であったが７０％を超える特異的な凝固活性を有しており、これは生成したＦＶＩＩＩの一部が不活性であったことを示している。除外されたＦＶＩＩＩバリアントのうち５つは７０％未満の特異的な凝固活性を示し、そのうち３つは２５％未満の値を有しており、これは分泌されたＦＶＩＩＩのほとんどが不活性であったことを示している。対照的に、除外されたバリアントのうち６つは１００％を超える高い特異的な凝固活性を有しており、これは活性なＦＶＩＩＩであるが分泌が減少していたことを示唆している。特異的な凝固活性が０％であったＦＶＩＩＩの凝固活性を持たない８つのバリアントはすべて、ＦＶＩＩＩ抗原を示さなかった。これは、組み込まれた変異がＦＶＩＩＩバリアントの非産生または非分泌のいずれかをもたらしたことを示していた。
【０１３９】
この１回目のスクリーニングでは、３８個の単一の置換（Ｎ７９Ｓ、Ｉ８０Ｔ、Ｉ１０５Ｖ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｌ２３５Ｆ、Ｖ２５７Ａ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｙ４３０Ｈ、Ｌ５０５Ｎ、Ｓ５０７Ｅ、Ｆ５５５Ｈ、Ｉ６１０Ｔ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ、Ｎ７５４Ｄ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｓ２０３０Ａ、Ｓ２０３７Ｇ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｍ２１２３Ｋ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｖ２３１３Ａ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３Ａ、Ｑ２３３５Ｈ）が、（ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの凝固活性の少なくとも半分に相当する）実質的な凝固活性を有する機能性ＦＶＩＩＩ分子をもたらした。
【０１４０】
５つのさらなる単一の変異を試験した（Ｓ６６０Ｇ、Ｉ６５８Ｔ、Ｎ１７９６Ｄ、Ｎ２１３７Ｈ、Ｉ２１６８Ｔ）。これらの変異は、非機能的な変異バリアントのために１回目のスクリーニングにおいて除外されなければならなかった免疫原性クラスターのうち４つについて提案された。これら５つの変異は免疫原性の低下に対する影響がより低いと計算されたため、当初は試験されなかった。しかしながら、これらのバリアントの分析は、３つのバリアントでは特異的な凝固活性が約１００％であったが、上清中のＦＶＩＩＩ凝固活性は低いか、または全くないことを明らかにした。Ｉ６５８ＴおよびＮ２１３７Ｈについては凝固活性が非常に低く、５０％の制限を約１０％超えただけであったため、変異は２回目のスクリーニングに移行されなかった。
【０１４１】
組込みに成功した３８個の単一の変異はすべて２回目のスクリーニングに移行されるための特性を有していたが、単一の変異の組合せを可能にするために、各免疫原性クラスターに対して１つの変異のみが選択された。したがって、より低いＦＶＩＩＩ凝固活性をもたらす変異は除外された。さらに、変異Ｓ２０３０Ａは、Ｓ２０３７ＧおよびＮ２０３８Ｄを含むクラスターの一部ではなく、先行のクラスターの一部であることが見出された。このクラスターの計算されたスコアは変異を伴わずに既に非常に低かったため、Ｓ２０３０Ａもまた除外された。これにより２５個の変異がもたらされ、これらを２回目のスクリーニングに移行した。
【０１４２】
２回目のスクリーニングでは、３８個の変異のうち２５個が選択された（Ｎ７９Ｓ、Ｓ１１２Ｔ、Ｌ１６０Ｓ、Ｌ１７１Ｑ、Ｖ１８４Ａ、Ｎ２３３Ｄ、Ｉ２６５Ｔ、Ｎ２９９Ｄ、Ｙ４２６Ｈ、Ｓ５０７Ｅ、Ｆ５５５Ｈ、Ｎ６１６Ｅ、Ｉ６３２Ｔ、Ｌ７０６Ｎ、Ｙ７４８Ｓ、Ｋ１８３７Ｅ、Ｒ１９３６Ｑ、Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２０７７Ｇ、Ｓ２１２５Ｇ、Ｆ２２１５Ｈ、Ｋ２２２６Ｑ、Ｋ２２５８Ｑ、Ｓ２３１５Ｔ、Ｖ２３３３Ａ）。
【０１４３】
変異を組み込んだＦＶＩＩＩバリアントのインシリコでのモデル化を試みたが、十分に高い分解能を有するＦＶＩＩＩの完全な結晶構造の欠如のために成功しなかった。本発明者らは機能的な単一の変異を小さな群において組み合わせることを選択し、他の変異と組み合わせて不活性なタンパク質をもたらす変異を同定し続けた。（制限部位によって規定される）すべてのセクションについて、５０％を超える相対的な凝固活性を有するＦＶＩＩＩバリアントをもたらしたすべての変異を含む１つのベクターを設計した。さらに、８０％を超える相対的な凝固活性をもたらし、クラスターの免疫原性スコアを少なくとも１５ポイント低下させた変異のみを含む１つのベクターを設計した。セクションＡ１Ａ２およびＡ２については、すべての変異が８０％を超える相対的な凝固活性を有し、スコアを１５ポイントを超えて低下させたため、１つのベクターのみを設計した。これに基づいて、表３に示されるように、以下の位置に置換を含むＦＶＩＩＩバリアントを作製した。
【表３】
2021520802.tif 000006
【０１４４】
ＦＶＩＩＩバリアントの産生を、１回目について記載されているように生じさせた。産生の４日後、細胞培養上清中のＦＶＩＩＩ凝固活性を決定した。セクションＡ１およびＡ１Ａ２において、対照のＦＶＩＩＩ−６ｒｓと同等であるか、またはより良い凝固活性が達成された（図４Ａ）。特に、セクションＡ１Ａ２における３つの変異の組合せはＦＶＩＩＩバリアントの産生および／または分泌に正の効果を与えていると見られ、分泌された活性ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの２倍を超える量をもたらした。優れた凝固活性のために、Ａ１の７つの変異およびＡ１Ａ２の３つの変異を３回目に移行した。セクションＡ２では、ＦＶＩＩＩバリアントの凝固活性は８０％未満であり、Ａ３Ｃ１Ｃ２セクションの２つのバリアントは４０％未満の凝固活性を明らかにした。これらの結果のため、Ａ２およびＡ３Ｃ１Ｃ２において組み合わされた変異をさらに分析しなければならなかった。Ａ３Ｃ１Ｃ２セクションに９つの変異を有するバリアントを除くすべての組合せについて特異的な凝固活性は１００％を超えており、これは生成されたＦＶＩＩＩバリアントが機能的であることを示していた（図４Ｂ）。このバリアントの低い特異的な凝固活性は、主に不活性なＦＶＩＩＩが分泌されたことを示していた。
【０１４５】
ＦＶＩＩＩバリアントの凝固活性を妨げるＡ２およびＡ３Ｃ１Ｃ２セクションにおける変異を検出するために、２つの実験計画法（ＤＯＥ）のマトリックスを作成した。変異のあらゆる可能な組合せを有するベクターの合成を避けるために、Ａ２セクションの５つの変異を１／２一部実施要因計画(half factorial design)でモデル化し、Ａ３Ｃ１Ｃ２セクションの６つの変異を１／８一部実施要因計画(8th fraction fractional design)で分析した。既に試験したバリアント（単一の変異体、完全変異体、ナイーブバリアント）を除いて、Ａ２セクションのために１０個のベクターを設計し、Ａ３Ｃ１Ｃ２セクションのために１４個のベクターを設計した。前述のように、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞においてバリアントを産生させ、上清中のＦＶＩＩＩ凝固活性を決定した。分析により、Ａ２セクションにおける変異Ｉ６３２Ｔは１００％未満の凝固活性を有するすべてのバリアントに組み込まれていたため、おそらく凝固活性の低下の原因であることが明らかになった（図５Ａ）。前記変異体は、好ましくは本発明のタンパク質に含まれない。Ａ３Ｃ１Ｃ２セクションにおいて、３つの変異Ｎ２０３８Ｄ、Ｓ２１２５ＧおよびＫ２２５８ＱがＦＶＩＩＩ凝固活性を低下させたようであった（図５Ｂ）。しかしながら、低下した凝固活性に対する明らかな影響は変異Ｓ２１２５Ｇについてのみ検出され、これは好ましくは本発明のタンパク質に含まれない。Ｎ２０３８ＤおよびＫ２２５８Ｑについては、それらの影響が互いの組合せにおいてのみ生じ得るのか、またはＳ２１２５Ｇとの組合せにおいてのみ生じ得るのかを明確に特定することはできなかった。
【０１４６】
Ａ２およびＡ３Ｃ１Ｃ２セクションにおけるすべてのバリアントの特異的な凝固活性は、少なくとも約１００％であった（データ示さず）。これにより、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓと比較して低下したＦＶＩＩＩ凝固活性は、おそらく産生または分泌の問題に起因するものであり、不活性なＦＶＩＩＩに起因するものではないことが明らかになった。
【０１４７】
ＤＯＥマトリックスの結果に基づいて、Ａ２セクションのための１つのベクターおよびＡ３Ｃ１Ｃ２セクションのための４つのベクターを設計した。４つのＡ３Ｃ１Ｃ２ベクターは、変異Ｓ２１２５Ｇのみ、または変異Ｓ２１２５ＧとＫ２２５８ＱもしくはＮ２０３８Ｄとの組合せ、または３つのすべての変異を除外した。５つのベクターに組み込まれた変異を以下の表４に示す。
【表４】
2021520802.tif 000007
【０１４８】
種々のベクターを遺伝子導入したＨＥＫ２９３−Ｆ細胞の上清中のＦＶＩＩＩ凝固活性の測定により、Ａ２セクションに４つの変異を有するバリアントの凝固活性は、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの凝固活性と同等であったことが明らかになった（図６Ａ）。対照的に、Ａ３Ｃ１Ｃ２の４つのバリアントはすべて活性であったが、５つの変異および変異Ｎ２０３８Ｄを含まない４つの変異を含むバリアントの凝固活性は、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓと比較して低下していたことが明らかとなった。これは、変異Ｎ２０３８Ｄの除外のみでは凝固活性が低いままであり、ＦＶＩＩＩの産生または分泌に影響を与えなかったことを示している。対照的に、Ｋ２２５８Ｑの除外はＦＶＩＩＩ凝固活性の上昇をもたらした。しかし、単一の欠失としては効果がなかったが、Ｋ２２５８Ｑと組み合わせたＮ２０３８Ｄの除外は相加的な効果を有し、バリアントのＦＶＩＩＩ凝固活性をさらに改善した。それにもかかわらず、Ｎ２０３８Ｄを未だ含む４つの変異の組合せを３回目に移行した。これは、多くの変異を組み込み、可能な限り免疫原性を低下させることを目的としたためである。さらに、このバリアントの凝固活性の結果は約１００％であり、他のセクションにおける組合せの結果と類似していた。すべてのバリアントの特異的な凝固活性は少なくとも１００％であり、これは活性なＦＶＩＩＩのみが存在していたことを示していた。
【０１４９】
最後に、２回目のスクリーニングは１９個の変異をもたらし、これは５つのセクションにおいて組み合わされ得る。セクションＡ１およびＡ１Ａ２については、１回目からのすべての変異の組合せを含めることができた。これはセクションＡ２およびＡ３Ｃ１Ｃ２では不可能であった。ＤＯＥマトリックスに基づいて、Ａ２セクションでは１つの変異を除外しなければならず、Ａ３Ｃ１Ｃ２セクションでは５つの変異を除外しなければならなかった。
【０１５０】
したがって、２回目では６つの追加の変異を除外した。最後の回のスクリーニングは、１回目および２回目のスクリーニングから残っている１９個の変異（Ｎ７９Ｓ；Ｓ１１２Ｔ；Ｌ１６０Ｓ；Ｌ１７１Ｑ；Ｖ１８４Ａ；Ｎ２３３Ｄ；Ｉ２６５Ｔ；Ｎ２９９Ｄ；Ｙ４２６Ｈ；Ｓ５０７Ｅ；Ｆ５５５Ｈ；Ｎ６１６Ｅ；Ｌ７０６Ｎ；Ｙ７４８Ｓ；Ｋ１８３７Ｅ；Ｎ２０３８Ｄ；Ｓ２０７７Ｇ；Ｓ２３１５Ｔ；Ｖ２３３３Ａ）をすべて含む単一のＦＶＩＩＩ分子を含んでいた。この変異ＦＶＩＩＩバリアントは凝固について機能的であることが示され、この分子の免疫原性を低下させる多数の単一置換を含んでいた。
【０１５１】
１９個の変異をＦＶＩＩＩ配列に組み込んだことにより、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの初期の免疫原性スコアである７．０１が、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍでは−１０．５５まで低下した。免疫原性スコアは、ランダム配列を有するタンパク質に対する対象のタンパク質の免疫原性を示す。ランダムなタンパク質の免疫原性スコアを０に設定する。異なる長さの異なるタンパク質のスコアを比較できるように、インシリコ解析のために分割されたタンパク質の９アミノ酸の１０００個あたりのスコアを与える。他のタンパク質の例示的な免疫原性スコアは、破傷風毒素では約２３、Ｒｅｆａｃｔｏ ＡＦでは１０．０３、アルブミンでは約−１０、またはＩｇＧ Ｆｃ領域では約−４２である。
【０１５２】
Ａ３Ｃ１Ｃ２セクションは大部分が変異の組み込みによって影響されることが明らかになったため、凝固活性を比較するために、Ａ３Ｃ１Ｃ２セクションに変異を持たない追加のベクター（ＦＶＩＩＩ−１５Ｍ）を設計した。これは、合計１５個（ＦＶＩＩＩ−１５Ｍ、配列番号７）および１９個（ＦＶＩＩＩ−１９Ｍ、配列番号５）の変異を含む２つのタンパク質をもたらした。両方のベクターについて、上清中のＦＶＩＩＩ凝固活性の分析は、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓと少なくとも同等の凝固活性を明らかにした。１５個の変異を有するバリアントは、１９個の変異を有するバリアントと比較してより高濃度の活性なＦＶＩＩＩとして分泌された。特異的な凝固活性は、ＦＶＩＩＩ−１５Ｍではおよそ１００％であり、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍでは１００％を超えていた。
【０１５３】
さらなるバリアントは、凝固活性を低下させるようであるＫ１８３７の位置における置換（Ｋ１８３７Ｅなど）を含まないが、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍの他の置換を含んでいる。このバリアントは、ＦＶＩＩＩ−１８Ｍと名付けられている。これはＦＶＩＩＩ−１９Ｍとほぼ同じ特異的な凝固活性を有するが、上清において測定した場合により高い発色性凝固活性を有する。Ｋ１８３７Ｅ置換は、ＦＶＩＩＩの産生、フォールディングまたは分泌をある程度低下させ得ると結論づけることができる。しかしながら、凝固アッセイに関してＦＶＩＩＩ−１８Ｍの凝固活性は改善されるため、この置換は凝固活性も低下させ得る。それにもかかわらず、以下に記載されるさらなるアッセイは、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍが治療的に使用され得ることを示す。
【０１５４】
さらなる有利なバリアント（例えば、置換Ｌ１７１Ｑ、Ｓ５０７Ｅ、Ｙ７４８ＳおよびＶ２３３３Ａを有するＦＶＩＩＩタンパク質ＦＶＩＩＩ−ＧＯＦ１；および置換Ｌ１７１Ｑ、Ｎ２９９Ｄ、Ｎ６１６ＥおよびＶ２３３３Ａを有するＦＶＩＩＩ−ＧＯＦ２）を産生させた。これらのバリアントは、凝固活性および特異的な凝固活性に関して最も良い結果を示す種々の領域に置換を組み込んでいる。以下のバリアントは、免疫原性スコアの低下に関して最も良い結果を有する置換を組み込んでいる：置換Ｓ１１２Ｔ、Ｓ５０７Ｅ、Ｙ７４８Ｓ、Ｋ１８３７ＥおよびＮ２０３８Ｄを有するＦＶＩＩＩ−ＬＳ１；および置換Ｓ１１２Ｔ、Ｙ４２６Ｈ、Ｎ７５４Ｄ、Ｋ１８３７ＥおよびＮ２０３８Ｄを有するＦＶＩＩＩ−ＬＳ２。注目すべきことに、置換Ｓ５０７ＥおよびＹ７４８Ｓは両方の側面に関して非常に有利である。したがって、本発明の好ましいタンパク質は前記置換を少なくとも含み、任意でＬ１７１ＱおよびＶ２３３３Ａを含む。Ａ１領域に７つの好ましい置換をすべて組み込むことは、免疫原性を低下させるためにさらに最適である。
【０１５５】
図７は、本発明における種々の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発色性凝固活性、凝固による凝固活性、および特異的な凝固活性を要約しており、すべてのコンストラクトはＨＥＫ２９３−Ｆ細胞中で産生され、分析は細胞の上清において実施した。測定した相対的な凝固活性は、常に並行して産生および試験したＦＶＩＩＩ−６ｒｓの凝固活性に基づいて百分率で与えられる。特異的な凝固活性は、以下に記述されるＥＬＩＳＡにより上清中において検出された抗原に対する検出された発色性凝固活性の割合に基づいている。
【０１５６】
さらなる実験のために、より大きな質量のタンパク質をもたらすＣＡＰ−Ｔ細胞においてコンストラクトＦＶＩＩＩ−１９ＭおよびＦＶＩＩＩ−６ｒｓを産生させた。さらに、細胞培養上清からＦＶＩＩＩ−１９ＭおよびＦＶＩＩＩ−６ｒｓを精製した。
【０１５７】
ＦＶＩＩＩ−６ｒｓ、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦおよびＮｕｗｉｑと比較したＦＶＩＩＩ−１９Ｍの種々の分析を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを用いて行った。ブロットにより、主に二本鎖ＦＶＩＩＩである２つの市販品と比較して、ＦＶＩＩＩ−１９ＭおよびＦＶＩＩＩ−６ｒｓは主に一本鎖タンパク質として産生されていたことが明らかとなった。この差異は、産生に用いた種々の細胞株に起因してい得る。２つのさらなるウエスタンブロットにより、ＦＶＩＩＩ−１９ＭおよびＦＶＩＩＩ−６ｒｓはグリコシル化および硫酸化されていることが明らかとなり、ＣＡＰ−Ｔ細胞において翻訳後修飾が行われたことが確認された。しかしながら、６つのチロシンすべてが硫酸化されていたか否か、およびどのグリコシル化パターンが付加されていたかについて詳細な結論は得られなかった。
【０１５８】
種々のＦＶＩＩＩ産物の凝固時間を、ＲＯＴＥＭ法を用いて決定した。この分析において、血漿の凝固時間を適用したＦＶＩＩＩの量および機能性に応じて分析する。ＦＶＩＩＩ産物をＦＶＩＩＩ欠損血漿に添加し、内在性経路を介して凝固を開始した。血餅が形成し始めるまでの時間を測定した。種々の濃度のＦＶＩＩＩを添加することによって、ＦＶＩＩＩの濃度の低下に相関する凝固時間の増加を検出した。種々の産物を比較すると、共にＢドメインが欠失しているＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（Pfizer Inc.、ＣＨＯ細胞において産生）およびＮｕｗｉｑ（Octapharma AG、ＨＥＫ細胞において産生）は非常に類似した凝固時間を示したが、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓでは凝固時間はわずかに延長され、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍではさらに延長されていた（図８）。しかしながら、すべての凝固時間は１Ｕ／ｍｌのＦＶＩＩＩにおいて１２０秒〜１６０秒の間でのみ変動しており、これは健常な人の正常な凝固時間である１００〜２４０秒の範囲内であった。
【０１５９】
トロンビン生成アッセイ（図９）において、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓは、生成したトロンビンのピークの量およびトロンビン生成のピークまでの時間に関してＲｅＦａｃｔｏ ＡＦおよびＮｕｗｉｑに類似していたが、わずかに低下した曲線下面積を示した。ＦＶＩＩＩ−１９Ｍは、生成したトロンビンのピーク、曲線下面積およびトロンビン生成のピークに達するまでに必要な時間について、特にＲｅＦａｃｔｏ ＡＦおよびＮｕｗｉｑと比較して有意に低い結果を示した。しかしながら、これらの結果はＲＯＴＥＭの結果と同等であり、これはＦＶＩＩＩ−１９Ｍのわずかに延長された凝固時間を示していた。
【０１６０】
ＦＶＩＩＩ−１９ＭおよびＦＶＩＩＩ−６ｒｓのｖＷＦへの結合力をＥＬＩＳＡに基づく手法で決定した。ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦを参照として用い、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦのｖＷＦへの結合力を１とした。他のすべての効力をＲｅＦａｃｔｏ ＡＦと比較して計算した。データは、ｖＷＦの結合はＲｅＦａｃｔｏ ＡＦおよびＮｕｗｉｑについて類似していたが、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓおよびＦＶＩＩＩ−１９Ｍでは損なわれていたことを明らかにした（図１０）。しかしながら、ＮｕｗｉｑとＦＶＩＩＩ−１９Ｍの間についてのみ有意な差が検出され得た。ＦＶＩＩＩ−６ｒｓの結合の低下は、ＣＡＰ−Ｔ細胞によりなされた異なる翻訳後修飾によるものであり得る。これは、ウエスタンブロットで検出された重鎖および軽鎖における硫酸化の減少と相関し得る。特にＹ１６８３の硫酸化はｖＷＦの結合に重要であるため、硫酸化の欠損はｖＷＦの結合に影響を与え得る。しかしながら、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦはウエスタンブロットにおいてほとんど硫酸化を有しないことを示したが、良好なｖＷＦ結合を示したため、硫酸化の減少はｖＷＦ結合の低下の唯一の理由にはなり得ない。したがって、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓと比較したＦＶＩＩＩ−１９Ｍの効力の低下は、組み込まれた変異に由来する追加的な構造変化がｖＷＦ結合に影響を与えているためであり得る。
【０１６１】
発色アッセイはＦＶＩＩＩ−１９Ｍの凝固活性を特に過大評価し得るため、凝固時間、トロンビン生成およびｖＷＦへの結合に関して実施された実験におけるＦＶＩＩＩ−１９Ｍのわずかに低い凝固活性は、発色アッセイと比較して凝固アッセイで測定されたより低い凝固活性によって少なくとも部分的に説明され得る（図１１）。
【０１６２】
本発明のタンパク質の免疫原性を２つの異なる手法で分析した：
免疫原性スコア
１９個の単一の点変異を有するＦＶＩＩＩ分子の免疫原性の低下をインシリコでの計算法により評価した。変異を持たない分子の初期の免疫原性スコアは約７であったが、１９個の単一の点変異を有するＦＶＩＩＩ分子では約−１１まで低下した。免疫原性スコアは、分析したＦＶＩＩＩと同じ長さのランダム配列を有するタンパク質と比較して計算された。
【０１６３】
タンパク質の免疫原性の可能性を示す免疫原性スコアを、ＥｐｉＶａｘのＥｐｉＭａｔｒｉｘシステムを用いて計算した。対象のタンパク質の免疫原性スコアを他のタンパク質のスコアと比較できるように、ランダムなアミノ酸配列を有するタンパク質のスコアと相関させている。この「平均的な」タンパク質の免疫原性スコアをゼロに設定する。さらに、免疫原性スコアを１０００ペプチドあたりで示し、各ペプチドは９個のアミノ酸を含む。これにより、様々な長さのタンパク質を比較できる。０を超える免疫原性スコアは過剰なＭＨＣクラスＩＩリガンドの存在を示し、免疫原性の可能性がより高いことを示し、０未満のスコアはランダムなタンパク質よりも少ない潜在的なＭＨＣクラスＩＩリガンドの存在を示し、免疫原性の可能性がより低いことを示す。＋２０を超えるスコアを有するタンパク質は、著しく免疫原性の可能性があるとみなされる。
【０１６４】
インビトロでの免疫原性アッセイ
対象のタンパク質（ＦＶＩＩＩなど）の免疫原性を分析するためのインビトロでのＴ細胞アッセイを確立し、これは健常なドナーの樹状細胞（ＤＣ）および制御性Ｔ細胞枯渇ＣＤ４＋Ｔ細胞ならびに対象のタンパク質での刺激に基づく。
【０１６５】
本発明における組換え分子ＦＶＩＩＩ−１９Ｍは、インビトロでの免疫原性Ｔ細胞アッセイにより、変異を持たないＦＶＩＩＩ分子と比較して免疫原性が低いことが示された。
【０１６６】
インビトロアッセイは、ＤＣの表面上のＦＶＩＩＩ−１９Ｍペプチドの提示の減少に起因して、より少ないＴ細胞が活性化されるか否かを決定できる。アッセイには、単球由来のＤＣおよびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞が含まれる。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のサブ集団は主に制御性Ｔ細胞を含むため、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を共培養の前に枯渇させた。これは、健常なドナーおよび耐性のある血友病Ａ患者に由来するＴ細胞集団には発生期に枯渇しなかったＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞を抑制する制御性Ｔ細胞が含まれていると予想されたため、重要であった（Kamate, C., Lenting, P. J., van den Berg, H. M. & Mutis, T. Depletion of CD4+/CD25high regulatory T cells may enhance or uncover factor VIII-specific T-cell responses in healthy individuals. Journal of Thrombosis and Haemostasis 5, 611-613 (2007)）。アッセイの目的はＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞を刺激することであったため、制御性Ｔ細胞を枯渇させた。ＤＣをＡＰＣとして用いる手法を２つの理由のために選択した。一方では、提示されたＦＶＩＩＩエピトープとの相互作用に基づくＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化に焦点を当てていた。他の免疫細胞との相互作用による影響は結果を歪め得た。一方で、このアッセイは、血友病Ａ患者に由来する細胞を用いて実施され得る。これらの患者（特に以前に処置されていない血友病Ａ患者）はナイーブＴ細胞を未だ有し得、ナイーブＴ細胞の活性化は主にＤＣによって生じる。
【０１６７】
図１３に示されるように、単球を解凍したＰＢＭＣから精製し、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを用いて（例えば５日間で）未熟ＤＣ（ｉＤＣ）に分化させた。この細胞を、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）を得るためにサイトカイン（例えば、以下に規定されるＩＬ−Ｍｉｘ）および抗原（例えば、対象のＦＶＩＩＩ）で例えば１日間刺激した。ｍＤＣとの共培養の２日前に、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製した。精製後、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞をＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル）で標識し、精製および標識のプロセスから回復させるためにＩＬ−２の存在下で２日間培養した。ｍＤＣおよび標識されたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、例えば９日間共培養した。Ｔ細胞を回収し、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１６８】
ＤＣ−Ｔ細胞アッセイを、ＦＶＩＩＩ−１９ＭおよびＦＶＩＩＩ−６ｒｓを用いて行った。細胞を健常なドナーのＰＢＭＣから精製した。ＤＣを、以前に決定したＩＬ−Ｍｉｘ単独またはＩＬ−Ｍｉｘおよび追加のタンパク質のいずれかで分化後に刺激した。追加のタンパク質は、ＦＶＩＩＩ特異的Ｔ細胞増殖の正の対照としてＲｅＦａｃｔｏ ＡＦであり、対象のタンパク質としてＦＶＩＩＩ−６ｒｓおよびＦＶＩＩＩ−１９Ｍであった。十分なＦＶＩＩＩが存在することを保証するために、ＦＶＩＩＩ産物の濃度は１５Ｕ／ｍｌであった。共培養を４８ウェルプレート中で行い、少なくとも１：１０のＤＣ：Ｔ細胞比をもたらした。すべての細胞を、純度を確保するために精製した後にフローサイトメトリーで分析し、Ｔ細胞を、事前の活性化を除外するために共培養の前に、および９日間の共培養後に分析した。９日間の共培養後のＴ細胞のフローサイトメトリー分析の結果をさらに解析した。すべての手法について、すべてのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を決定した。
【０１６９】
合計で２３の異なる健常なドナーを分析した。最終的な分析のために、ＩＬ−ＭｉｘおよびＦＶＩＩＩよりもＩＬ−Ｍｉｘのみで処理したＤＣに対して高いＴ細胞応答を示したドナー、および異なるＦＶＩＩＩタンパク質で刺激した場合にＴ細胞の生存率の著しい変動を示したドナーを除外した。すべての健常な人がＦＶＩＩＩに対するＴ細胞を有しているわけではないため、すべての健康なドナーがＦＶＩＩＩに反応するわけではないことが予想された。この選択に基づいて、１０人の健康なドナーの結果を分析した。
【０１７０】
図１４は、ＩＬ−ＭｉｘプラスＦＶＩＩＩ−１９Ｍで刺激したＤＣに対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖と、ＩＬ−ＭｉｘプラスＦＶＩＩＩ−６ｒｓで刺激したＤＣに対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖との間の差異を示す。０未満の結果は、ＦＶＩＩＩ−６ｒｓと比較してＦＶＩＩＩ−１９Ｍに対するＴ細胞応答の低下を示す。この低下した応答は、ほとんどのドナーで検出された。しかし、０を超える結果が少数のドナーで検出された。これらのドナーでは増殖の差異は１０％未満であったが、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍに対して低下した応答を示したドナーの群ではより大きな差異が検出された。全体として、ＦＶＩＩＩ−１９Ｍに対して低下した応答を示すドナーの量が多く、ＩＬ−ＭｉｘおよびＦＶＩＩＩ−１９Ｍで刺激したＤＣに対するＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖において著しい低下をもたらした。インビトロでのＤＣ−Ｔ細胞アッセイからのこれらの結果により、１９個のアミノ酸変異を含む脱免疫化ＦＶＩＩＩバリアントへの応答におけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の低下が確認された。
【０１７１】
インビトロでの安定性
本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質をＦＶＩＩＩ欠損血漿中において３７℃でインキュベートし、凝固活性をＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ、ＮｕｗｉｑおよびＦＶＩＩＩ−６ｒｓと比較して、種々の期間経過後に分析した。表５に示されるように、凝固活性の減少は分析したすべてのタンパク質について許容できるものであった。
表５：ＦＶＩＩＩ欠損血漿中において３７℃でインキュベートしたＦＶＩＩＩタンパク質の発色性凝固活性。
【表５】
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【０１７２】
方法
インシリコでの分析
ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを同定し、結果をクラスター化し、クラスターを他のタンパク質と比較し、アミノ酸交換を予測するために、インシリコでのＴ細胞エピトープモデリング（ＥｐｉＭａｔｒｉｘツール）を適用した。
【０１７３】
インシリコでの分析に用いたモデル化のツールは、ＥｐｉＶａｘ（Providence, RI, USA）から市販されている。このツールは、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを見出すためにタンパク質配列を分析する。これらのペプチドを、この結合を減少させるために潜在的なアミノ酸交換についてさらに分析する。
【０１７４】
モデル化のプロセスに用いたＦＶＩＩＩ分子は、８１８アミノ酸のＢドメインが欠失したＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子（ＢＤＤ ＦＶＩＩＩ）（ＦＶＩＩＩ−６ｒｓ、配列番号２）であった。モデル化のプロセスは４つの工程を含んでいた。最初の工程では、ＥｐｉＭａｔｒｉｘツールがタンパク質を９個のアミノ酸（いわゆる９アミノ酸）からなるペプチドに分割した。これは、ＭＨＣクラスＩＩのコア結合領域が９個のアミノ酸を含むという事実に起因する。９アミノ酸の配列およびそれに続く９アミノ酸の配列は、８つのアミノ酸が重複している。これらの高度に重複している９アミノ酸を構築することで、潜在的な結合ペプチドは失われなかった。すべての９アミノ酸の結合能を、ヒト集団の９０％を超えて包含する８つの一般的なＨＬＡクラスＩＩスーパータイプ対立遺伝子（ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊０８０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１５０１）に対して試験した（De Groot, A S, MCMURRY, J. & MOISE, L. Prediction of immunogenicity: in silico paradigms, ex vivo and in vivo correlates. Current Opinion in Pharmacology 8, 620-626 (2008); Moise, L. et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clinical Immunology 142, 320-331 (2012)）。各９アミノ酸がＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性を「Ｚスコア」によって示した。このスコアは、集団における所定の対立遺伝子の頻度に対して正規化した結合の強さを示した（De Groot, Anne S. & Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clinical Immunology 131, 189-201 (2009)）。少なくとも４つのＨＬＡ対立遺伝子について高いＺスコアを有する９アミノ酸を高度に免疫原性があるとみなし、ＥｐｉＢａｒと名付けた（Weber, C. A. et al. T cell epitope: Friend or Foe? Immunogenicity of biologics in context. Advanced Drug Delivery Reviews 61, 965-976 (2009)）。
【０１７５】
次の工程では、重複するＥｐｉＢａｒをプログラムＣｌｕｓｔｉＭｅｒを用いてクラスター化した（Moise, L. et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clinical Immunology 142, 320-331 (2012)）。この分析は、複数のＨＬＡ対立遺伝子に由来するクラスＩＩのＭＨＣに結合する最大で２５アミノ酸のＥｐｉＢａｒクラスターをもたらした。これらのクラスターを最適化する前に、他の内在性タンパク質との類似性に関する分析をプログラムＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘを用いて行った。少なくとも２つの他の内在性タンパク質との配列の重複は、中枢性トレランスが共通の内在性ペプチドに対して確立されている可能性が非常に高いため、クラスターのさらなる改変からの除外をもたらした。さらに、切断部位、活性化部位またはＦＶＩＩＩの活性に重要な他の部位を含むクラスターを除外し、変化させなかった。最後の工程では、アミノ酸交換をＯｐｔｉＭａｔｒｉｘを用いて計算した。このツールは、ＭＨＣクラスＩＩへの結合に対する同定されたクラスターの各アミノ酸の寄与を評価した（Moise, L. et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clinical Immunology 142, 320-331 (2012)）。その後、ＯｐｔｉＭａｔｒｉｘは、どのアミノ酸置換がＭＨＣクラスＩＩへの結合親和性を低下させたかを計算した（De Groot, Anne S. & Moise, L. Prediction of immunognicity for therapeutic proteins: State of the art. Current Opinion in Drug Discovery & Development 10, 1-9 (2007)）。これらの最適化は、アミノ酸交換が保存的でなければならず、好ましくは他の種において生じており、血友病Ａをもたらすすべての公知のＦＶＩＩＩ変異を含むデータベースに登録されていないという原則に基づいていた（Kemball-Cook, G., Tuddenham, Edward G. D. & Wacey, A. I. The Factor VIII Structure and Mutation Resource Site: HAMSTeRS Version 4. Nucleic Acids Research 26, 216-219 (1998)）。
【０１７６】
変異の分析
インシリコでの結果によって推奨されたアミノ酸交換をＦＶＩＩＩ配列に組み込んだ。第ＶＩＩＩ因子分子の各変異をＦＶＩＩＩ凝固活性についてスクリーニングした。１回目では、単一の変異を組み込んだ。２回目および３回目は、１回目でうまく組み込まれた単一の変異の組合せを含んでいた。参照分子は、６つの特有の制限部位を持つＦＶＩＩＩ−６ｒｓであった。単一の変異（１回目）および変異の組合せ（２および３回目）をヒト細胞株（ＨＥＫ２９３−Ｆ）での産生（一過性の遺伝子導入）後に分析し、ここで産生および分泌されたタンパク質を細胞培養上清中で分析した。ＦＶＩＩＩ凝固活性を発色法および凝固法により分析した。抗原価をＦＶＩＩＩ抗原ＥＬＩＳＡにより分析した。特異的な凝固活性を抗原に対する凝固活性の関係として計算した。
【０１７７】
１回目では、推奨された５７個の変異から、ＦＶＩＩＩ凝固活性が低いか、または存在しないため、１９個の変異を除外した。残りの３８個の変異は、参照分子の凝固活性の少なくとも半分に相当する凝固活性を有するＦＶＩＩＩバリアントをもたらした。２回目では、２５個の変異が選択され、これは各免疫原性クラスターに対して１つの変異のみであった。（制限部位によって規定される）セクションにおいて組み合わされた変異の組合せを分析した（相対的および特異的な凝固活性）。さらなる分析をＤＯＥマトリックスに基づいて行った。
【０１７８】
組換えタンパク質の大規模な産生を、一過性の遺伝子導入およびその後の精製（ＳＡＥｘ−強力な陰イオン交換クロマトグラフィー−あるいはＴＦＦ−タンジェンシャルフローろ過、ＡＣ−ＦＶＩＩＩアフィニティークロマトグラフィー、ＳＥＣ−サイズ排除クロマトグラフィーを介した緩衝液交換）によってＣＡＰ−Ｔ細胞において行った。
【０１７９】
翻訳後修飾および機能性（ＦＶＩＩＩ重鎖および軽鎖を検出するウエスタンブロット、トロンビン切断、グリコシル化および硫酸化、２Ｄ−ＤＩＧＥ、ならびに機能性アッセイＲＯＴＥＭ、ＴＧＡおよびｖＷＦ−ＦＶＩＩＩ ＥＬＩＳＡ）についてさらなる分析を行った。
【０１８０】
本発明における組換えタンパク質の免疫原性の低下をインシリコおよびインビトロ（ＤＣ−Ｔ細胞アッセイ）において確認した。
【０１８１】
遺伝子導入
一過性の遺伝子導入のために真核細胞系（すなわち、ＣＡＰ−Ｔ細胞およびＨＥＫ細胞）を用いた。ＣＡＰ細胞はヒト初代羊膜細胞に基づく不死化細胞株であり、懸濁液中で増殖する。ＣＡＰ−Ｔ細胞は元のＣＡＰ細胞に基づいており、サルウイルス４０の大型Ｔ抗原を追加的に発現する。ＣＡＰ−Ｔ細胞は一過性の遺伝子導入に特に有用である。さらに、ＨＥＫ ２９３−Ｆ細胞株を一過性の遺伝子導入に用いた。ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞株は元のＨＥＫ２９３細胞株に由来し、無血清培地中での懸濁増殖に適応している。ＨＥＫ細胞を、様々な変異ＦＶＩＩＩバリアントの小規模の産生のために使用した。
【０１８２】
一過性の遺伝子導入を、市販の４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Lonza Group Ltd., Basel）を用いてエレクトロポレーションにより行った。エレクトロポレーションを、７・１０６個のＨＥＫ２９３−Ｆ細胞および７μｇのＦＶＩＩＩプラスミドを用いて１００μｌの容積で行った。１・１０７個のＣＡＰ−Ｔ細胞を、１００μｌの容積での５μｇのＦＶＩＩＩプラスミドの遺伝子導入のために用いた。遺伝子導入後、細胞を４日間インキュベートした。細胞および上清をさらなる分析のために用いた。
【０１８３】
タンパク質精製
ＦＶＩＩＩ−６ｒｓおよびＦＶＩＩＩ−１９Ｍを、最大で８００ｍｌのスケールでＣＡＰ−Ｔ細胞において産生させた。精製をＦＰＬＣによって細胞培養上清から直接行った。最初の工程は、タンジェンシャルフローろ過または強力な陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ Ｑ（GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg）を用いたイオン交換クロマトグラフィーのいずれかであった。この工程において、試料を濃縮し、宿主細胞タンパク質を除去し、緩衝液を交換した。溶出したタンパク質を含む画分をクロマトグラムに従って決定した。第二の工程は、市販のＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂（GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg）を充填したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーであった。溶出したＦＶＩＩＩを含む画分をクロマトグラムに従って決定した。最後の工程は、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによるＦＶＩＩＩ製剤緩衝液への緩衝液交換であった。ＦＶＩＩＩを含む画分をクロマトグラムにおける高いＵＶピークおよび安定な導電率のピークに従って決定した。精製後、ＦＶＩＩＩ産物を１０ｋＤａの分子量カットオフを有するスピンカラム（Merck Millipore, Darmstadt）を介して濃縮した。すべてのカラムを製造者によって指定された条件下で行った。
【０１８４】
分析
発色アッセイおよび凝固アッセイ
ＦＶＩＩＩ凝固活性を発色法または凝固法のいずれかで決定した。発色アッセイでは、ＦＶＩＩＩ試料をＦＶＩＩＩ欠損血漿に添加する。さらに、調製物は、ＦＩＸａ、ＦＸ、リン脂質および塩化カルシウムを含む。ＦＶＩＩＩａ、ＦＩＸａおよびＦＸはテナーゼ複合体を形成し、ＦＸはＦＸａに活性化される。ＦＸの活性化の割合は活性なＦＶＩＩＩの量に依存する。その後、ＦＸａによって加水分解される基質を添加する。加水分解された基質は発色性であり、４０５ｎｍでの吸光度が測定される。標準曲線に基づいて、活性なＦＶＩＩＩの量を決定できる。凝固カスケードの一部のみが起こる発色法とは対照的に、凝固法ではＦＸＩの活性化から血餅の生成までの凝固カスケード全体が起こる。調製物は、ＦＶＩＩＩ欠損血漿中のＦＶＩＩＩ試料、塩化カルシウムおよび活性化因子を含む。血餅を形成するのに必要な時間を測定する。標準曲線に基づいて、活性なＦＶＩＩＩの量を決定できる。
【０１８５】
両方の試験を、製造者の指示に従ってＢＣＳ ＸＰ（Siemens Healthineers, Erlangen）によって完全に自動的に行った。発色法のための試薬をCoatest SP FVIII Kit（Chromgenix, Haemochrom Diagnotica GmbH, Essen）から得た。さらに、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＴｒｉｓ−ＢＳＡ（ＴＢＳＡ）緩衝液ならびに水を希釈のために必要とした。すべての試薬および試料をＢＣＳ ＸＰに入れた。凝固アッセイの開始のための活性化因子アクチンＦＳＬは、Ｓｉｅｍｅｎｓ（Siemens Healthineers, Erlangen）から市販されている。さらに、この試験は塩化カルシウム（Siemens Healthineers, Erlangen）およびＴＢＳＡ緩衝液を必要とする。発色アッセイについては、すべての試薬および試料をＢＣＳ ＸＰ（Siemens Healthineers, Erlangen）に入れた。両方のアッセイについて、必要なすべてのピペッティング、希釈、インキュベーションおよび測定の工程を、ＢＣＳ ＸＰによって行った。両方のアッセイの試料を、ＦＶＩＩＩ欠損血漿（Siemens Healthineers, Erlangen）で少なくとも１：２に希釈した。試験の標準曲線を、生物学的基準調製物（biological reference preparation、ＢＲＰ）（ｅｄｑｍ．Ｓｔｒａｓｓｂｏｕｒｇ）を用いて生成した。ＢＲＰの活性をＩＵ／ｍｌで示す。しかしながら、１Ｕ／ｍｌは１ＩＵ／ｍｌに相当すると仮定され得る。
【０１８６】
ＥＬＩＳＡ
ＦＶＩＩＩ抗原の量を、市販のＡｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＶＩＩＩ：Ａｇ ＥＬＩＳＡキット（Stago, Dusseldorf）を用いて決定した。このキットでは、抗ＦＶＩＩＩ Ｆ（ａｂ’）をウェルにコーティングする。試料をウェルに添加し、ペルオキシダーゼと結合した抗ＦＶＩＩＩ ＩｇＧによる結合の後に検出する。ＴＭＢおよび硫酸を用いて、ペルオキシダーゼとＴＭＢとの反応による呈色反応を起こす。４５０ｎｍでの吸光度が測定され得る。ＦＶＩＩＩ試料を、凝固活性に基づいて検量線に適合する濃度に希釈した。ＥＬＩＳＡを製造者のプロトコルに従って行い、吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。
【０１８７】
ＦＶＩＩＩコンストラクトのｖＷＦへの結合を検出するために、別のＥＬＩＳＡを行った。この場合、ｖＷＦを９６ウェルプレートのウェルに０．１Ｕ／ｍｌの濃度でコーティングした。その後、ＦＶＩＩＩバリアントを０．２５Ｕ／ｍｌの濃度で適用した。ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦを参照として用いた。各試料を緩衝液でさらに１：２に希釈した。合計７回の段階希釈を行った。結合したＦＶＩＩＩを検出するために、発色性凝固剤活性測定にも用いたＣｏａｔｅｓｔ ＳＰ ＦＶＩＩＩキット（Chromgenix, Haemochrom Diagnotica GmbH, Essen）からの試薬を用いた。最初に、ＦＩＸａ、ＦＸおよびリン脂質をウェルに添加した。５分間インキュベートした後、塩化カルシウムを添加した。これを再度５分間インキュベートした。最後の工程において、発色性基質を添加した。基質を添加した後、プレートを直ちにプレートリーダーに入れ、発色基質の展開を４０５ｎｍで４９０秒間測定した。生成された曲線をＰＬＡ３．０ソフトウェアを用いて解析した。種々のＦＶＩＩＩ産物のｖＷＦ結合能を、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦと比較して計算した。
【０１８８】
ウエスタンブロット
ウエスタンブロッティングのために、タンパク質試料を、ＭＯＰＳ緩衝液システムにおけるＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いた還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。適用したＦＶＩＩＩ溶液は、ＦＶＩＩＩ凝固活性に基づいて最大濃度１０Ｕ／ｍｌであった。ゲルからのタンパク質をニトロセルロース膜上にブロッティングした。膜を４℃で一晩ブロッキングした。ＦＶＩＩＩの検出のための一次抗体は、重鎖および軽鎖を検出するポリクローナルヒツジ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体（Cedarlane, Burlington）、または重鎖のみを検出するモノクローナルウサギ抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体（Sino Biological Inc., Wayne）および軽鎖を検出するモノクローナルマウス抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体（Merck Millipore, Darmstadt）のいずれかであった。二次抗体は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ（LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg）、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤ（LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg）またはＣＦ６８０（Biotium Inc., Fremont）のいずれかと結合しており、これらはＯｄｙｓｓｅｙスキャナーにより検出可能な蛍光シグナルをもたらした。一次抗体および二次抗体を、室温において振盪台（shaking platform）上でそれぞれ１時間インキュベートした。
【０１８９】
スルホチロシンの検出のために、マウス抗ヒトスルホチロシン抗体（Merck Millipore, Darmstadt）を用いた。二次抗体は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷと結合したロバ抗マウス抗体であった。調製を上述のように行った。
【０１９０】
ＦＶＩＩＩバリアントがトロンビンによって活性化され得るか否かを決定するために、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットの前に、１０Ｕ／ｍｌトロンビンとともに３７℃で８分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを上述のように行った。ウエスタンブロットにおけるＦＶＩＩＩの検出のための一次抗体は、重鎖および軽鎖ならびにＩＲＤｙｅ ８００ＣＷと結合した二次ロバ抗ヒツジ抗体（LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg）を検出するポリクローナルヒツジ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体（Cedarlane, Burlington）であった。
【０１９１】
機能性アッセイ
トロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）では、生成したトロンビンの量を測定する。組織因子による外因性経路を介して凝固カスケードが起こる。最終的に生成したトロンビンは、４６０ｎｍで測定できる蛍光発生基質を切断する。ＦＶＩＩＩ欠損血漿中に希釈したＦＶＩＩＩを用いてアッセイを行った。最大で０．２５Ｕ／ｍｌのＦＶＩＩＩ濃度を分析した。ＴＧＡ試薬Ｃ ｌｏｗおよびＴＧＡ基質（いずれもTechnoclone (Vienna)から市販されている）を、製造者のプロトコルを参照して各試料ウェルに添加した。ＴＧＡ試薬ｌｏｗは、凝固カスケードを開始するために組換えヒト組織因子を含む低濃度のリン脂質ミセルからなる。基質は、生成したトロンビンによって最終的に切断される蛍光発生基質である。反応をプレートリーダー中において３７℃で行い、蛍光発生基質の展開を２時間測定した。試料に加えて、検量線をTechnoclone (Vienna)から入手できるＴＧＡ Ｃａｌ Ｓｅｔを用いて測定した。検量線に基づいて生成したトロンビンの量を算出した。さらに、生成された曲線の最初の偏差に基づいて、曲線下面積およびトロンビンの最大生成までの時間を算出した。
【０１９２】
また、ＲＯＴＥＭシステム（Tem International GmbH, Munich）を用いたトロンボエラストメトリー（ＴＥＭ）を、ＦＶＩＩＩバリアントの機能性を決定するために使用した。この方法では、試料をカップに入れ、ピンをカップの中央にセットする。試料はカップとピンの間の空間にある。ピンを回転させ、その回転をピンから検出器に反射される光線によってモニターする。凝固が始まると、生成した血餅がピンの動きを（最終的な血餅が形成された場合に最大まで）制限する。ＴＧＡとは対照的に、凝固を、Tem International GmbH (Munich)から市販されているｉｎ−ｔｅｍ試薬を用いてＲＯＴＥＭシステムにおいて内因性経路を介して開始した。発色性凝固活性に基づいて、１Ｕ／ｍｌ〜０．０１Ｕ／ｍｌの間のＦＶＩＩＩ濃度を分析した。試薬を製造者のプロトコルに記載されているように使用した。測定および計算を、ＲＯＴＥＭシステムにより完全に自動的に行った。最後に、凝固時間を決定した。
【０１９３】
インビトロでのＤＣ−Ｔ細胞アッセイ
インビトロアッセイのためのＤＣおよびＴ細胞を、健常なドナーのＰＢＭＣから得た。ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｆｌｏｔ（Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen）を用いた密度勾配を介して健常なドナーの白血球除去産物または献血の全血のいずれかから精製した。ＰＢＭＣを、アッセイに使用するまで−１５０℃で凍結保存した。単球およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、Miltenyi Biotec（Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach）から市販されているＭＡＣＳ技術を用いて精製した。単球の精製のためにＣＤ１４マイクロビーズを用い、Ｔ細胞の精製のためにＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach）を用いた。単球について、製造者のプロトコルに従って精製を行った。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の精製について、製造者のプロトコルにおいて推奨されている２つの工程の精製プロセスを、ＣＤ４＋Ｔ細胞の陰性選択およびＣＤ２５＋細胞の陽性選択を並行して行い、１つの精製カラムのみを用いる１つの工程に統合した。使用した抗体の量はプロトコルに従っており、インキュベーションの時間は陰性選択の工程に従った。単球は、アッセイ中に精製される最初の細胞であった。精製後、単球をＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Lonza Group Ltd., Basel）中に１・１０６細胞／ｍｌで播種した。単球をＤＣに分化させるために、終濃度４０００Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および１２５０Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（PeproTech, Hamburg）を各ウェルに添加した。単球を３７℃で５日間培養した。４日後、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の精製を行った。精製後、Quah et al., Nature Protocols, 2007に従ってＴ細胞をＣＦＳＥ（BioLegend, Koblenz）で標識した。その後、精製したＴ細胞を、終濃度２・１０６細胞／ｍｌでＸ−ＶＩＶＯ−１５中に播種した。ＩＬ−２（PeproTech, Hamburg）を終濃度２０Ｕ／ｍｌで細胞懸濁液に添加した。Ｔ細胞を３７℃で２日間培養した。ＤＣおよびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の共培養を開始する２４時間前に、ＤＣを、１５Ｕ／ｍｌ ＦＶＩＩＩを伴って、または伴わずに、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−１β、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−６および１０ｎｇ／ｍｌ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αからなるＩＬ−Ｍｉｘ（Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach）で刺激した。翌日、Ｔ細胞を回収し、細胞数を決定した。Ｔ細胞の濃度を新鮮なＸ−ＶＩＶＯ１５中において２・１０６細胞／ｍｌとした。ＤＣを含むウェル中の上清を、ＤＣを乱さないように慎重に除去した。Ｔ細胞懸濁液を、少なくとも１：１０のＤＣ：Ｔ細胞比になるようにＤＣのウェルに適用した。追加したＴ細胞懸濁液の量は、最初にＤＣを播種したウェルのサイズに依存していた。追加のサイトカインは培地に添加しなかった。細胞を３７℃で９日間共培養した。その後、Ｔ細胞を回収し、増殖に関してフローサイトメトリーで分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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