(57)【要約】  プライムブースト効果を達成するために、がん抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含有するチンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）およびＭＶＡウイルスベクターが好適なアジュバント中で対象に逐次的に投与される。ポリヌクレオチドは、投与後にｉｎ  ｓｉｔｕで発現されて、ＭＡＧＥＡ３／リンカー／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合タンパク質およびそのバリアントを提供する。また、ｈｌｉ／ＭＡＧＥＡ３／リンカー／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合タンパク質およびそのバリアント。向上したＴ細胞応答が見出される。特定の相乗的な治療アプローチにおいて、化学療法剤およびチェックポイント阻害剤を伴うＣｈＡｄＯｘおよびＭＶＡベクターの三重の組合せは、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の枯渇を結果としてもたらし、がんのマウスモデルにおいて生存時間を劇的に向上させる。
2021532791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子をカプシドで包んだチンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターであって、前記核酸分子が、（ｉ）ＭＡＧＥがん抗原および／もしくはＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原、もしくはその免疫原性断片、または（ｉｉ）ＭＡＧＥがん抗原および／もしくはＬＡＧＥ１がん抗原、もしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、動物細胞において前記がん抗原またはその断片の翻訳、転写および／または発現を指令する発現制御配列に作動可能に連結している、前記ポリヌクレオチド配列、ならびにアデノウイルスパッケージングシグナル配列を含む、ＣｈＡｄベクター。
【請求項２】
（ａ）国際公開第２０１２／１７２２７７号パンフレットに開示されたＣｈＡｄＯｘ１；好ましくは、国際公開第２０１２／１７２２７７号パンフレットに開示された配列番号３８のポリヌクレオチドもしくはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされるＣｈＡｄＯｘ１、または（ｂ）国際公開第２０１７／２２１０３１号パンフレットに開示されたＣｈＡｄＯｘ２；好ましくは、国際公開第２０１７／２２１０３１号パンフレットに開示された配列番号１０のポリヌクレオチドもしくはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされるＣｈＡｄＯｘ２である、請求項１に記載のＣｈＡｄベクター。
【請求項３】
核酸分子をカプシドで包んだ改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターであって、前記核酸分子が、（ｉ）ＭＡＧＥがん抗原および／もしくはＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原、もしくはその免疫原性断片、または（ｉｉ）ＭＡＧＥがん抗原および／もしくはＬＡＧＥ１がん抗原、もしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、動物細胞において前記がん抗原またはその断片の翻訳、転写および／または発現を指令する発現制御配列に作動可能に連結している、前記ポリヌクレオチド配列を含む、ＭＶＡベクター。
【請求項４】
国際公開第２０１１／１２８７０４号パンフレットまたは欧州特許出願公開第２０４４９４７号明細書に開示された通りのものである、請求項３に記載のＭＶＡベクター。
【請求項５】
前記ＭＡＧＥ抗原が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも４６％、好ましくは少なくとも６９％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列、もしくはその任意の免疫原性断片の配列を有するＭＡＧＥ  ３Ａである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣｈＡｄまたはＭＶＡベクター。
【請求項６】
前記ＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原が、配列番号３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６．７％の同一性を有する配列、もしくはその任意の免疫原性断片の配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣｈＡｄまたはＭＶＡベクター。
【請求項７】
前記ＬＡＧＥ１がん抗原が、配列番号５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７８％、好ましくは少なくとも９７％の同一性を有する配列、もしくはその任意の免疫原性断片の配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣｈＡｄまたはＭＶＡベクター。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７９％の同一性を有する配列、もしくはその断片の配列を有するヒトＨＬＡクラスＩＩ組織適合性抗原ガンマ鎖（ｌｉ）をさらにコードし、それにより、前記がん抗原が、ｌｉとの融合物またはその断片として動物細胞中で発現され、
好ましくは、前記断片が膜貫通ドメインであり、より好ましくは、前記膜貫通ドメインが、アミノ酸残基３０〜５５または３０〜６１を含み、よりいっそう好ましくは、前記膜貫通ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣｈＡｄまたはＭＶＡベクター。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８１％の同一性を有する配列、もしくはその断片の配列を有するｔＰＡをさらにコードし、それにより、前記がん抗原が、ｔＰＡとの融合物またはその断片として動物細胞中で発現され、好ましくは、前記断片が、２１アミノ酸のリーダー配列を含み、より好ましくは、前記２１アミノ酸のリーダー配列が配列番号９である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣｈＡｄまたはＭＶＡベクター。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチド配列が、融合タンパク質として動物細胞中で発現される、（ｉ）ＭＡＧＥがん抗原もしくはその免疫原性断片およびＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原もしくはその免疫原性断片、または（ｉｉ）ＭＡＧＥがん抗原もしくはその免疫原性断片およびＬＡＧＥ１がん抗原もしくはその免疫原性断片をコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＣｈＡｄベクター。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチド配列が、融合タンパク質として動物細胞中で発現される、（ｉ）ＭＡＧＥがん抗原もしくはその免疫原性断片および／もしくはＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原もしくはその免疫原性断片、または（ｉｉ）ＭＡＧＥがん抗原もしくはその免疫原性断片および／もしくはＬＡＧＥ１がん抗原もしくはその免疫原性断片をコードし、前記ＭＡＧＥがん抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原またはＬＡＧＥ１がん抗原のうちの少なくとも１つが断片である、請求項１〜９のいずれかに記載のＭＶＡベクター。
【請求項１２】
前記ＭＡＧＥがん抗原およびＮＹ−ＥＳＯ−１またはＭＡＧＥがん抗原およびＬＡＧＥ１が免疫原性断片である、請求項１１に記載のＭＶＡベクター。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチド配列が、発現された場合に、前記ＭＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ−１もしくはＬＡＧＥ１がん抗原またはその断片をいずれかの順序において融合タンパク質として連結する、５〜９アミノ酸のリンカー、好ましくは、アミノ酸配列ＧＧＧＰＧＧＧを有するリンカーをコードする、請求項１０〜１２のいずれかに記載のＣｈＡｄまたはＭＶＡベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＣｈＡｄまたはＭＶＡベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１０もしくは１３のいずれかに記載のＣｈＡｄベクター、または請求項３〜９もしくは１１〜１３のいずれかに記載のＭＶＡベクターをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ヒトコドン用法についてコドン最適化されている、請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチドを含む、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれかに記載のＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項２０】
個体においてがんを予防または治療する方法であって、有効量の請求項１〜１０または１３のいずれかに記載のＣｈＡｄベクターを投与すること、および有効量の請求項３〜９または１１〜１３のいずれかに記載のＭＶＡベクターを投与することを含み、それにより、前記個体の適応免疫系が刺激されて、抗がん免疫応答が提供される、方法。
【請求項２１】
前記ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターの前記投与が、別々に、逐次的にまたは同時に実行される、請求項２０に記載のがんを予防または治療する方法。
【請求項２２】
有効量の１つまたは複数のチェックポイント阻害剤の投与をさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記チェックポイント阻害剤が、前記ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターと同時に、別々にまたは並行して投与される、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記個体が、化学療法および／または放射線療法治療を受けた、受けている、または受ける個体である、請求項２０〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣｈＡｄベクターが最初に投与される、請求項２０〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターが、それぞれ１回より多く投与される、請求項２０〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターが交互に投与される、請求項２０〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
ベクターの各投与の間の期間が、５日〜８週の範囲内、好ましくは１週である、請求項２０〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１を遮断する、請求項２２〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブもしくはアテゾリズマブ、デュルバルマブまたはアベルマブから選択される、請求項２２〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、尿路（尿路上皮）、膀胱、小細胞肺がん、腎臓、頭頸部、肉腫、または乳房のがんである、請求項２２〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
がんの予防または治療において使用するための、請求項１、２、５〜１０または１３のいずれかに記載のＣｈＡｄベクター。
【請求項３３】
がんの予防または治療において使用するための、請求項３〜９または１１〜１３のいずれかに記載のＭＶＡベクター。
【請求項３４】
がんの予防または治療のための患者への別々の、逐次的なまたは同時の投与のための、請求項１、２、５〜１０または１３のいずれかに記載のＣｈＡｄベクター、および請求項３〜９または１１〜１３のいずれかに記載のＭＶＡベクター。
【請求項３５】
がんの治療のためにＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターと共に投与するための１つまたは複数のチェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項３４に記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項３６】
前記チェックポイント阻害剤が、ベクターと同時に、別々にまたは並行して投与される、請求項３５に記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項３７】
患者が、化学療法を受けた、受けているまたは受ける患者である、請求項３１〜３３のいずれかに記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項３８】
前記ＣｈＡｄベクターが最初に投与される、請求項３４〜３６のいずれかに記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項３９】
前記ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターが、それぞれ１回より多く投与される、請求項３４〜３８のいずれかに記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項４０】
前記ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターが交互に投与される、請求項３４〜３９のいずれかに記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項４１】
ベクターの各投与の間の期間が、５日〜８週の範囲内、好ましくは１週である、請求項３４〜４０のいずれかに記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項４２】
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１を遮断する、請求項３５〜４１のいずれかに記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項４３】
前記チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、トレメリムマブもしくはアテゾリズマブ、デュルバルマブまたはアベルマブから選択される、請求項３５〜４１のいずれかに記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項４４】
前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、尿路（尿路上皮）、膀胱、小細胞肺がん、腎臓、頭頸部、肉腫または乳房のがんである、請求項３５〜４１のいずれかに記載のがんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクター。
【請求項４５】
がんの予防または治療のための患者への別々の、逐次的なまたは同時の投与のための、請求項１、２、５〜１０または１３のいずれかに記載のＣｈＡｄベクター、請求項３〜９または１１〜１３のいずれかに記載のＭＶＡベクター、化学療法剤、およびチェックポイント阻害剤。
【請求項４６】
前記化学療法剤が、（ｂ）パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、ゲムシタビン、エトポシドまたはペメトレキセドのうちの１つと組み合わせた（ａ）カルボプラチンまたはシスプラチンから選択される、請求項４５に記載のＣｈＡｄベクター、ＭＶＡベクター、化学療法剤およびチェックポイント阻害剤。
【請求項４７】
前記チェックポイント阻害剤がＰＤ−１である、請求項４５または４６に記載のＣｈＡｄベクター、ＭＶＡベクター、化学療法剤およびチェックポイント阻害剤。
【請求項４８】
前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）もしくは小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、黒色腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、尿路（尿路上皮）、膀胱、小細胞肺がん、腎臓、頭頸部、肉腫または乳がんから選択されるがんである、請求項４５〜４７のいずれかに記載のＣｈＡｄベクター、ＭＶＡベクター、化学療法剤およびチェックポイント阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの予防または治療のためのウイルスベクターベースのワクチン、より特に、目的のがんワクチン抗原を含み、かつ哺乳動物への投与のための、複製欠陥性アデノウイルス（Ａｄ）および改変ワクシニアウイルスアンカラ（Modified Vaccinia Virus Ankara；ＭＶＡ）ベクターに関する。本発明は、したがって、ウイルス粒子、ウイルス粒子を含む免疫原性組成物、およびウイルスベクターを含有する宿主細胞に関する。ウイルスベクターワクチンは、がんを患う対象を治療するためまたは対象ががんに罹ることを予防するために使用される。好ましいレジームでは、本発明は、Ａｄベクターを使用するプライム投与、続いてＭＶＡベクターを使用するブースト投与を伴う。本発明はさらに、本発明の新規の複製欠陥性アデノウイルスベクターを含むワクチン組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
毎年１６０万人より多くの米国人ががんと診断され、約６００，０００人が２０１８年に米国単独でこの疾患で死亡したと予測される。過去数１０年の間に、がんの検出、診断、および治療において著しい進歩が達成された。しかしながら、依然として６７％の人々が治療の開始の５年後に生存しているに過ぎない。（Siegel, R. L. et al. (2017) Cancer J. Clin. 67(1): 7 - 30を参照）
【０００３】
現行の治療オプションとしては、外科的処置、放射線、高周波、化学療法薬、モノクローナル抗体などが挙げられる。これらのアプローチのほとんどは、重篤なリスク、毒性の副作用、高いコスト、および疑わしい有効性と関連付けられる。
【０００４】
だが、がん免疫療法は、近年ある程度の著しい進歩を実証しており、関心を引く進展中の分野であり続けている。健常な正常ヒト免疫系は、腫瘍関連抗原（ＴＡ）を認識する細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の能力に基づいて腫瘍細胞を同定および拒絶する先天的な能力を有する。がん細胞は、通常、細胞性および液性の両方の、統合された免疫応答を活性化させるはずである。細胞応答は、免疫応答に参加するＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞を伴う。しかしながら、がんおよび悪性がんの発生において、腫瘍細胞に対する正常なＣＴＬ活性は弱体化または喪失される。がん免疫療法は、したがって、腫瘍細胞に対するヒト免疫系のＣＴＬ活性を回復または再燃させるための様々なアプローチを採る。ヒトがん患者の免疫系は、腫瘍関連抗原（ＴＡ）を発現する悪性細胞を根絶するという目標と共に利用され得る。
【０００５】
細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ８を発現し、がん性細胞を特異的に殺傷することができる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞は、細胞傷害性応答の発生をサポートし、サイトカインを産生し、そしてまたＢ細胞の成熟および増殖を補助する。液性応答の間に、Ｂ細胞は、活性化され、複製され、分化し、ＴＡ特異的な抗体を産生する。さらなる情報のために、Murphy, K. & Weaver, C. "Janeway's Immunobiology" 9th Edition (2016): Garland Science/Taylor & Francis: New York, NYを参照されたい。
【０００６】
養子Ｔ細胞療法および免疫チェックポイントモジュレーターは、腫瘍を拒絶するヒト免疫系の能力をブーストすることを目的とした臨床アプローチである。しかしながら、両方のアプローチは制限を有する。養子Ｔ細胞療法は、要求される特異性のエフェクターＴ細胞の拡大増殖および形質導入を要求する（Baruch E. N. et al. (2017) Cancer 123(S11): 2154 - 62）を参照。この複雑性は現在、このアプローチの応用性を制限している。免疫チェックポイントモジュレーターのセグメントであるチェックポイント阻害剤治療は、エフェクター機能を向上させるためにＴ細胞へのブレーキを解放するモノクローナル抗体に基づく。チェックポイント阻害剤は進行性がん患者のある比率において長期間の臨床応答を誘導することがあるが、全てのＴ細胞のこの刺激により引き起こされる自己免疫毒性の副作用が依然として問題である。また、既存のチェックポイント阻害剤治療は、Ｔ細胞により浸潤されていない「冷」腫瘍に関して有効性の欠如を抱えている。
【０００７】
上記に対する有望な代替を表す別のアプローチは、がんワクチンまたはより詳細には治療用がんワクチンであり、これは腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するために使用される。これは、腫瘍細胞は本来的に免疫原性に乏しく、ワクチンはこの欠乏を克服するために役立つことを助けるべきであるという概念に基づく。多くの異なる種類のがんワクチンが研究されており、一部は有望な結果を示している。Sahin U. et al. (2017) Nature 547(7662): 222 - 226は、がんに対する多重特異性治療免疫を動員する個別化ＲＮＡミュータノーム（mutanome）ワクチンを試みた。また、Ott P. A. et al. (2017) Nature 547(7662): 217 - 221は、黒色腫を有する患者のための個別化免疫原性ネオ抗原ワクチンを試みた。
【０００８】
しかしながら、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ＧＳＫ）による２つの大きい第ＩＩＩ相試験を含むいくつかの大スケール臨床試験の失敗後に、がんワクチンの可能性は疑問のあるものとなった。これらの試験では、アジュバントと組み合わせた組換え腫瘍関連タンパク質に基づくワクチン接種アプローチが使用された。このワクチンプラットフォームは、多くの他のもののように、良好な抗体およびＣＤ４＋  Ｔヘルパー応答を誘導できることを証明したが、一貫したＣＴＬ応答を開始させることはできなかった。ＣＴＬは抗腫瘍免疫応答の鍵となるエフェクターであることを考慮すると、これはそれらのワクチンの臨床的失敗を説明する可能性がある。技術的課題は、したがって、ヒトにおいて良好なＣＤ８応答を誘導する新たながんワクチンプラットフォームを提供することである。
【０００９】
何らかの有効性を達成するために、がんワクチンは、ｉ）がん細胞上で潜在的に発現されるか、またはがん細胞上にのみ発現され、かつ統合された免疫応答を誘発できる抗原を標的化する能力、ならびにｉｉ）抗原特異的Ｔ細胞の堅牢なクローン性拡大増殖およびエフェクターおよびメモリー分化を誘導する能力を有するべきであると考えられる（Coulie, P. G. (2014) Nat. Rev. Cancer, 14(2): 135 - 146）を参照。
【００１０】
伝統的に、治療用がんワクチンは、腫瘍抗原（ＴＡ）タンパク質およびアジュバントを含んでいた。例えば、スティムバックス（Stimuvax）（かつてはＢＬＰ２５リポソームワクチン（Ｌ−ＢＬＰ２５）として公知）と呼ばれるワクチンは、ムチン１（ＭＵＣ１）抗原およびアジュバントＭＰＬ４に由来する合成ペプチドを被包するリポソームであり、米国特許第６，６００，０１２号明細書、ＢＩＯＭＩＲＡ  ＩＮＣ．がこれに関する。また、切除されたＭＡＧＥ−Ａ３陽性非小細胞肺がんを有する患者における第３相試験において査定されたマグリット（MAGRIT）ワクチン（Vansteenkiste, J. F. et al Lancet Oncol. 17(6): 822 - 835を参照）は、組換え黒色腫関連抗原ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質と組み合わせたＡＳ１５アジュバントを含有していた。しかしながら、上記に一般に指し示されるように、これらのスティムバックスおよびマグリットワクチンは、大きい第ＩＩＩ相試験において有効性を示さなかった。
【００１１】
米国および欧州において承認された最初の「がんワクチン」はプロベンジ（PROVENGE）であり、これは患者の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原とインキュベートされた自己細胞ワクチンである。適切なＴ細胞応答を活性化させる有効性および能力にもかかわらず、このワクチンは各患者のために個々に作られることを要求し、それにより、複雑かつ高価な生産プロセスを伴う。結果として、ワクチンの実用性は限定されている（米国特許出願公開第２００４／１４１９９１号明細書、ＬＡＵＳ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。
【００１２】
ベクターベースのがんワクチンは、大きな有望性を示して強い治療的関心を生じさせており、いくつかのベクター技術、アジュバントおよび組合せが診療所において試験されている。この戦略の基礎は、腫瘍抗原を送達するために組換えウイルスベクターを使用することである。ウイルスベクター自体は複製欠陥性となるように改変されているため、もはや患者に対して有害ではない。ベクターは、ＴＡの他に、アジュバントとして作用して免疫応答の誘導を増強する他のウイルス抗原の両方を発現する。理想的なウイルスベクターは、いくつかの特性：ｉ）安全であること、ｉｉ）効率的な抗原提示を可能にすること、ｉｉｉ）統合された免疫応答を誘発すること、およびｉｖ）大スケールで製造できることを有するべきである（Melief, C. J. M. et al. (2015) J. Clin. Invest. 125(9): 3401 - 3412）を参照。
【００１３】
いくつかのウイルスベクターが臨床使用のために提唱されてきた。例えば、複製欠陥性アデノウイルス（Ａｄ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１について欧州特許第２，１３０，９２１号明細書、ＧＬＡＸＯＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ  ＢＩＯＬＯＧＡＬＳ  ＳＡ、またはマラリアについて米国特許出願公開第２０１２／０８２６９４号明細書、ＣＲＵＣＥＬＬにおいて開示されるものなど、感染性疾患のためのワクチンベクターとして研究されてきた。
【００１４】
ワクチン接種の分野において、ワクチン投与には、典型的には、１回目の注射と同じ方式であるが、後の１つまたは複数の時点において投与される１つまたは複数のブースティング注射が後続する。１回目（プライミング）の投与および以後（ブースティング）の投与の間隔の間に、免疫系は、細胞性および液性の両方の応答を誘発することにより応答する（Woodland, D. L. (2004) Trends Immunol. 25(2): 98 - 104を参照）。
【００１５】
しかしながら、同じベクターを用いる繰返しの投与（同種ブースティング）は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答をブーストせず、その理由は、競合する免疫原性がウイルス抗原に対して生成され、ウイルスカプシドの表面抗原を認識し、組換えベクターによる抗原提示細胞のさらなる感染を予防する抗体の産生が結果としてもたらされるからである。特に、同種ブースティングは、挿入された腫瘍抗原に対してＣＤ８  Ｔ細胞を誘導しない。この問題を回避するための潜在的なアプローチは、２つの異なるウイルスベクターなどの異なる抗原送達システムを使用するワクチンの逐次的な投与（異種ブースティング）を伴う。欧州特許出願公開第２，６３１，２９０号明細書、ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮは、ワクシニアウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターを含むプライム／ブーストワクチン用のウイルスベクターを開示する。Chen, J.-L. et al. (2015) Int. J. Cancer 136(6): E590 - 601は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的抗体、ならびにイスコマトリックス（ISCOMATRIX）中のＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を用いてプライミングされ、組換えＮＹ−ＥＳＯ−１鶏痘ウイルスを用いてブーストされた黒色腫患者における細胞応答を記載する。
【００１６】
多くのプライム／ブーストワクチンはＤＮＡワクチンから構成され、様々なウイルスベクターが試みられてきた。例えば、国際公開第２００６／０５７４５４号パンフレット、ＪＡＰＡＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＧＥＮＣＹは、プライミングのためにバチルス・カルメット−ゲラン（Bacillus Calmette-Guerin）（ＢＣＧ）ベクターおよびブースティングのために弱毒化ワクシニアウイルス株ＤＩｓを使用することによるＨＩＶ−１  ｇａｇ  Ｅ抗原に対して開発された異種プライム／ブーストＨＩＶワクチンを開示する。Odunsi, K. et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109(15): 5797 - 5802は、２つの異なるオルソポックスベクター（ワクシニアおよび鶏痘）ならびに抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１を用いるプライム−ブーストアプローチを使用した限定されたサイズの第Ｉ相研究を記載し、黒色腫および卵巣がん患者の中でのあり得る臨床的利益を示した。
【００１７】
ヒトアデノウイルスは、それらの特性（例えば、複製欠損、安定性、高い免疫原性、多数の細胞種に形質導入する能力など）のため、がんワクチンの開発のために科学者により広く使用されている。天然のアデノウイルス感染症はヒト集団において風土性であり、ヒトの大部分は人生の最初の５年以内に血清転換する。そのため、ヒトアデノウイルスに由来するがんワクチンは、既存の液性および細胞性免疫に遭遇し、それがその有効性を制限する（Coughlan, L. (2015) et al.  J. Pharm. Pharmacol. 67(3): 382 - 399、および米国特許第６，１４０，０８７号明細書、ＡＤＶＥＣ  ＩＮＣ、名称「Adenovirus Vectors for Gene Therapy」を参照）。
【００１８】
米国特許第９，７１４，４３５号明細書、ＩＳＩＳ  ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ、名称「Simian Adenovirus and hybrid Adenoviral vectors」および欧州特許出願公開第２，１６３，２６０号明細書、ＩＳＴＩＴＵＴＯ  ＲＩＣＨＥＲＣＨＥ  ＤＩ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＥ、名称「Chimpanzee Adenovirus Vaccine Carriers」は、ヒトにおいていかなる既存の免疫も逃れる非ヒト霊長動物に由来する複製欠陥性アデノウイルスを科学者がどのように開発したのかを説明する。チンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）は、いくつかのクオリティ：ｉ）堅牢な免疫原性、ｉｉ）ヒトにおける低い血清有病率、ｉｉｉ）標準化された生産的製造を示す。
【００１９】
弱毒化非複製性ワクシニアウイルスアンカラ株（ＭＶＡ）もまた公知である。このウイルスベクターは、優れた安全性プロファイルと共に免疫応答を誘発することが示されている。ＭＶＡは、結果としてそのゲノムの約１５％の喪失を伴うニワトリ胚線維芽細胞における５７０回より多くの継代により弱毒化されている。そのため、ＭＶＡは、多くの哺乳動物細胞においてビリオンを成熟させる能力を欠如しており、強い免疫原性および増幅の低減したリスクと関連付けられる。ＩＳＩＳ  ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ  Ｌｉｍｉｔｅｄの国際公開第２０１１／１２８７０４号パンフレットは、導入遺伝子がポックスウイルスゲノムに挿入される、ＭＶＡを含むポックスウイルス発現系を記載し、したがって、感染症に対するワクチン、がん治療および遺伝子療法の目的のためのポックスウイルスベクターならびに目的の遺伝子を標的細胞に移入するためのその使用を提供する。Ｉｓｉｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄの欧州特許出願公開第２０４４９４７号明細書もあり、これは、免疫応答、特に、インフルエンザウイルスに対するＴ細胞免疫応答を誘導するために使用されるＭＶＡウイルスベクターを記載する。
【００２０】
感染性疾患の治癒を目的として、異種プライム−ブーストレジームにおけるウイルスベクターベースのワクチンが開発され、強いＣＴＬ応答を誘導するために最適化されている。このワクチン戦略は、同じ免疫原を持つ改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）を用いるプライムおよびブーストのためにチンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）を用いた。Coughlan L. et al. (2015) J. Pharm. Pharmacol. 67(3): 382 - 99およびHui E. P. et al. (2013) Cancer Res. 73(6): 1676 - 88は、前臨床研究および感染性疾患状況における臨床研究における両方のウイルスベクターの個々の試験、ならびにそれらがどのように非常に高い安全性プロファイルを有するのかを報告する。
【００２１】
欧州特許出願公開第２，０４４，９４７号明細書、ＩＳＩＳ  ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮは、インフルエンザの予防におけるプライミング用のアデノウイルスベクターおよび次にブースティング用のＭＶＡを有するワクチンを開示する。
【００２２】
Ewer K. J. et al. (2013) Nat. Commun. 4: 2836およびOgwang, C. et al. (2015) Sci. Transl. Med. 7(286): 286re5は、マラリア用のプライミングとしてのＣｈＡｄおよびブースティングとしてのＭＶＡを有するワクチンを開示する。
【００２３】
同じプライム−ブーストアプローチは、５Ｔ４抗原を発現するがんマウスモデルにおいてCappuccini, F. et al. (2017) Oncotarget 8(29): 47474 - 47489、がんマウスモデルが前立腺がん抗原であるＳＴＥＡＰ１を発現するCappuccini, F. et al. (2016) Cancer Immunol. Immunother. CII 65(6): 701 - 713において記載されている。全てのこれらの研究において、異種プライム−ブーストワクチンは、ＴＡに対する強い免疫応答および抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化を誘導した。
【００２４】
国際公開第２０１７／１２０６７０号パンフレット（Ｌｉｃｈｔｙ、Ｂ．  ＆  Ｂｅｌｌ，  Ｊ．）もあり、これは、抗原特異的Ｔリンパ球の刺激および有意な生存を結果としてもたらす、臨床的に関連するがんモデルの結果における複製性腫瘍溶解性ラブドウイルスおよび免疫チェックポイント阻害剤の併用投与を記載する。腫瘍溶解性ラブドウイルスは、悪性細胞に特異的に感染し、それにおいて複製され、それを殺傷し、正常組織は影響されないままとする。腫瘍溶解性ラブドウイルス（例えば、ＶＳＶｄｅｌｔａ５  ｌまたはＭａｍｂａ  ＭＧ  １）は、ＭＡＧＥＡ３、ヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７融合タンパク質、前立腺タンパク質のヒト６回膜貫通上皮抗原、またはがん精巣抗原から選択される、試験動物が既存の免疫を有する腫瘍抗原を発現する。
【００２５】
治療用がんワクチンの成功は、腫瘍上に発現されるが正常組織上には発現されない腫瘍抗原を標的化することを必要とする。がん生殖細胞系列抗原は、いくつかの種類のがんにおいて生理学的に発現されるが、ＭＨＣ  Ｉ分子の欠如に起因して免疫系に抗原を提示できない生殖細胞系列細胞を除いて、分化した正常組織において発現されないタンパク質の異種群である。これらの抗原は、がん生殖細胞系列遺伝子によりコードされる。Gnjatic, S. et al. (2006) Cancer Res. 95: 1 - 30に記載されるように、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３は、原型的なＭＡＧＥ型抗原であり、群の最も代表的なもののうちの２つである。また、Coulie P. G. et al. (2014)、上掲は、多数の患者において起こることが示された応答を記載する。
【発明の概要】
【００２６】
本発明によれば、核酸分子をカプシドで包んだチンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターであって、核酸分子が、（ｉ）ＭＡＧＥがん抗原および／もしくはＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原、もしくはその免疫原性断片、または（ｉｉ）ＭＡＧＥがん抗原および／もしくはＬＡＧＥ１がん抗原、もしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、動物細胞においてがん抗原またはその断片の翻訳、転写および／または発現を指令する発現制御配列に作動可能に連結している、前記ポリヌクレオチド配列、ならびにアデノウイルスパッケージングシグナル配列を含む、ＣｈＡｄベクターが提供される。有利には、そのようなＣｈＡｄウイルスベクターは、安定かつ十分に研究されており、ヒトアデノウイルスに対する抗体により中和されず、かつ複製欠損性となるように操作されている。それらは、挿入される目的の抗原のために高容量を有し、アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するＨＥＫ２９３細胞中で製造することができる。
【００２７】
ＭＡＧＥ型抗原は、がん患者においてＣＤ８  Ｔ細胞を誘導することが公知である腫瘍特異的な共有されるヒト腫瘍抗原である。それらは、多くのがん種において発現され、ＭＨＣ−１分子を有しない男性生殖細胞系列細胞を除いて、正常組織中で発現されない。
【００２８】
ＮＹ−ＥＳＯ−１（遺伝子名ＣＴＡＧ１）は多くのがん患者において強いＣＤ８応答を誘導し、複数のＨＬＡクラスＩ特異性により表されるように、多数のＣＤ８エピトープが同定され得る。
【００２９】
特定の形態では、ＣｈＡｄベクターは、（ａ）国際公開第２０１２／１７２２７７号パンフレットに開示されたＣｈＡｄＯｘ１；好ましくは、国際公開第２０１２／１７２２７７号パンフレットに開示された配列番号３８のポリヌクレオチドもしくはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされるＣｈＡｄＯｘ１、または（ｂ）国際公開第２０１７／２２１０３１号パンフレットに開示されたＣｈＡｄＯｘ２；好ましくは、国際公開第２０１７／２２１０３１号パンフレットに開示された配列番号１０のポリヌクレオチドもしくはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされるＣｈＡｄＯｘ２であってもよい。
【００３０】
核酸分子をカプシドで包んだ（encapdisating）改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクターであって、核酸分子が、（ｉ）ＭＡＧＥがん抗原および／もしくはＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原、もしくはその免疫原性断片、または（ｉｉ）ＭＡＧＥがん抗原および／もしくはＬＡＧＥ１がん抗原、もしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、動物細胞においてがん抗原またはその断片の翻訳、転写および／または発現を指令する発現制御配列に作動可能に連結している、前記ポリヌクレオチド配列を含む、ＭＶＡベクターもまた本発明により提供される。有利には、そのようなＭＶＡベクターは、ヒトにおいて複製ができず、天然痘ワクチンとしての長い安全性追跡記録を有する。ＭＶＡは、ＣｈＡｄを用いるプライミング後に優れたブースティングを提供する。ＭＶＡは、病原性および免疫系逃避因子を有さず、高度に免疫原性であり、かつニワトリ胚性線維芽細胞または不死化アヒル胚性細胞系において容易に製造される。
【００３１】
ＭＶＡベクターは、より特定の形態では、国際公開第２０１１／１２８７０４号パンフレットまたは欧州特許出願公開第２０４４９４７号明細書に開示された通りであってもよい。
【００３２】
本明細書に記載されるような本発明のＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターについて、ＭＡＧＥ抗原は、好ましくは、ＭＡＧＥ３Ａであり、そのため、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも４６％、好ましくは少なくとも６９％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列、もしくはその任意の免疫原性断片の配列を有する。
【００３３】
本明細書に記載されるような本発明のＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターについて、ＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原は、配列番号３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６．７％の同一性を有する配列、もしくはその任意の免疫原性断片の配列を有する。
【００３４】
本明細書に記載されるような本発明のＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターについて、ＬＡＧＥ１抗原は、配列番号５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７８％、好ましくは少なくとも９７％の同一性を有する配列、もしくはその任意の免疫原性断片の配列を有する。
【００３５】
本発明の好ましいＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡクラスＩＩ組織適合性抗原ガンマ鎖（ｈｌｉまたはｌｉ）をさらにコードしてもよく、かつｌｉは、配列番号６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７９％の同一性を有する配列、もしくはその断片の配列を有してもよく、それにより、がん抗原は、ｌｉとの融合物またはその断片として動物細胞中で発現され、より好ましくは、断片は膜貫通ドメインであり、よりいっそう好ましくは、膜貫通ドメインは、アミノ酸残基３０〜５５または３０〜６１を含む。特に好ましい実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を有する。
【００３６】
本発明の代替的に好ましいＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は、配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８１％の同一性を有する配列、もしくはその断片の配列を有するｔＰＡをさらにコードしてもよく、それにより、がん抗原は、ｔＰＡとの融合物またはその断片として動物細胞中で発現され、より好ましくは、断片は、２１アミノ酸のリーダー配列を含み、よりいっそう好ましくは、２１アミノ酸のリーダー配列は配列番号９である。
【００３７】
有利には、ｌｉまたはｔＰＡを含めることは、ウイルスベクターで製造される抗原の免疫原性を増加させる。これは、抗原特異的Ｔ細胞応答の大きさ、広さおよび持続期間を増加させる。
【００３８】
本発明のＣｈＡｄベクターは、融合タンパク質として動物細胞中で発現される、（ｉ）本明細書においてそれぞれ定義されるような、ＭＡＧＥがん抗原もしくはその免疫原性断片およびＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原もしくはその免疫原性断片、または（ｉｉ）本明細書においてそれぞれ定義されるような、ＭＡＧＥがん抗原もしくはその免疫原性断片およびＬＡＧＥ１がん抗原もしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチド配列を有するように構築されてもよい。
【００３９】
本発明のＭＶＡベクターは、融合タンパク質として動物細胞中で発現される、（ｉ）本明細書においてそれぞれ定義されるような、ＭＡＧＥがん抗原もしくはその免疫原性断片および／もしくはＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原もしくはその免疫原性断片、または（ｉｉ）本明細書においてそれぞれ定義されるような、ＭＡＧＥがん抗原もしくはその免疫原性断片および／もしくはＬＡＧＥ１がん抗原もしくはその免疫原性断片をコードするポリヌクレオチド配列であって、ＭＡＧＥがん抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原またはＬＡＧＥ１がん抗原のうちの少なくとも１つが断片である、ポリヌクレオチド配列を有するように構築されてもよい。
【００４０】
本発明者らは、ＮＹＥＳＯ−１は、ヒトにおいてＭＡＧＥＡ３よりも免疫原性であり得ると考える。また、がん患者において、患者のある特定の群において、腫瘍は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ではなくＭＡＧＥＡ３を発現することがより頻繁に見出される。したがって、あり得る懸念は、ＭＡＧＥＡ３抗原およびＮＹ−ＥＳＯ−１抗原の両方を含む、本発明のプライム−ブーストレジメンにおけるＭＶＡブーストベクターを有することで、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対して免疫優性の免疫応答およびＭＡＧＥＡ３に対して有効でない免疫化に繋がる可能性があるということである。したがって、少なくともそのような特定の患者群、またはＮＹ−ＥＳＯ−１と比較してＭＡＧＥＡ３のより高い発現を有する群について、ＭＡＧＥＡ３がん抗原またはその免疫原性断片のみを含むＭＶＡベクターがプライム−ブーストレジメンにおいて好ましい。すなわち、ある特定の実施形態では、本発明は、何らかのＮＹ−ＥＳＯ−１がん抗原またはその免疫原性断片を含むＭＶＡベクターを含まない。同様に、ある特定の実施形態では、本発明は、何らかのＬＡＧＥ１がん抗原またはその免疫原性断片を含むＭＶＡベクターを含まない。
【００４１】
好ましい実施形態では、ＭＶＡベクターのそれぞれ、ＭＡＧＥがん抗原およびＮＹ−ＥＳＯ−１、またはＭＡＧＥがん抗原およびＬＡＧＥ１のそれぞれは、免疫原性断片である。
【００４２】
本発明のＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターが、発現時に抗原の融合物をもたらすように構築される場合、ポリヌクレオチド配列はまた、好ましくは、発現された場合に、ＭＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ−１もしくはＬＡＧＥ１がん抗原またはその断片をいずれかの順序において融合タンパク質として連結する、５〜９アミノ酸の好適なポリペプチドリンカー、より好ましくは、アミノ酸配列ＧＧＧＰＧＧＧを有するポリペプチドリンカーをコードする。
【００４３】
本発明はまた、したがって、上述のようなおよび本明細書に記載されるようなＣｈＡｄまたはＭＶＡベクターを含む免疫原性組成物を提供する。そのような組成物は、好適なアジュバントをさらに含んでもよい。
【００４４】
本発明はさらに、本明細書に記載されるようなＣｈＡｄベクターまたはＭＶＡベクター中に含有される、融合タンパク質をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００４５】
好ましいポリヌクレオチドは、ＭＡＧＥＡ３／リンカー／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合タンパク質をコードする配列番号１０の核酸配列を含む。配列番号１０と少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドもまた可能である。５０１アミノ酸の翻訳されたタンパク質配列は、配列番号１１またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列に示される通りである。
【００４６】
別の好ましいポリヌクレオチドは、ｈｌｉ／ＭＡＧＥＡ３／リンカー／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合タンパク質をコードする配列番号１２の核酸配列を有する。配列番号１２と少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドもまた可能である。翻訳されたタンパク質配列は、配列番号１３またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列に示される。
【００４７】
さらに別の好ましいポリヌクレオチドは、ｔＰＡ／ＭＡＧＥＡ３／リンカー／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合タンパク質をコードする配列番号１４の核酸配列を有する。配列番号１２と少なくとも７０％の同一性を有する配列を有するポリヌクレオチドもまた可能である。翻訳されたタンパク質配列は、配列番号１５またはそれと少なくとも７０％の同一性を有する配列に示される。
【００４８】
特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、上述の配列またはそのバリアントのいずれかからなる。
【００４９】
本発明の全ての態様において、抗原をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。当業者は、例えば、米国特許第８，３２６，５４７号明細書、またはPuigbo, P. et al. (2007) OPTIMIZER: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences: Nucleic Acids Research, 35:W126-W131に記載のものを含む、多数の利用可能なソフトウェアパッケージに精通している。また、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより提供されるものなどの商業的に利用可能なサービスおよびソフトウェアもある。
【００５０】
本発明はまた、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを含む。ウイルスゲノムのＢＡＣクローンのウイルスへの変換（「レスキュー」）は、ＩＳＩＳ  ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ  Ｌｉｍｉｔｅｄの国際公開第２０１２／１７２２７７号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような周知の方法により実行することができる。
【００５１】
本発明は、本明細書に記載されるようなＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターを含む単離された宿主細胞をさらに含む。
【００５２】
また、本発明は、個体においてがんを予防または治療する方法であって、有効量の本明細書に記載されるようなＣｈＡｄベクターを投与すること、および有効量の本明細書に記載されるようなＭＶＡベクターを投与することを含み、それにより、個体の適応免疫系が刺激されて、抗がん免疫応答が提供される、方法を提供する。有利には、本発明の方法は、強いＴ細胞免疫応答、特に、長く持続する保護免疫に繋がる強いＣＤ８＋免疫応答を生成する。
【００５３】
本発明によるがんを予防または治療する好ましい方法において、ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターの投与は、別々に、逐次的にまたは同時に実行される。
【００５４】
本発明によるがんを予防または治療する特定の方法において、有効量の１つまたは複数の免疫チェックポイントモジュレーターがさらに投与される。そのようなチェックポイントモジュレーターは、ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターと同時に、別々にまたは並行して投与されてもよい。
【００５５】
本発明のがんを予防または治療する方法の態様では、治療されている個体は、化学療法および／または放射線療法治療を受けた、受けている、または受ける個体であってもよい。
【００５６】
本発明によるがんを予防または治療する方法において、ＣｈＡｄベクターは、好ましくは、最初に投与される。
【００５７】
本発明のがんの予防または治療方法において、ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターは、それぞれ１回より多く投与されてもよい。好ましい態様では、ＣｈＡｄがプライミング免疫化として使用される場合、これらは１回のみ行われ、続いて２回のＭＶＡブースター免疫化が行われる。ＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターが交互に投与されるがんの治療または予防方法もまた可能である。
【００５８】
本発明のベクターの各投与の間の期間は、５日〜８週の範囲内であってもよいが、好ましくは、約１週の期間が、プライムおよびその後の１回または複数回のブーストの間に使用される。
【００５９】
チェックポイントモジュレーターが投与され、そしてまた治療レジメンの部分を形成する、本発明のがんの予防または治療方法において、チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−Ｌ１を遮断する阻害剤であってもよい。有利には、１つまたは複数のチェックポイントモジュレーターと共に本発明のベクターおよび免疫原性組成物を使用することは、同等の効果（すなわち、単独で使用される場合の同等の効果）のために必要とされるチェックポイントモジュレーターの投薬量を低減するために役立ち得る。効果は、本発明のウイルスベクター治療レジメンおよびチェックポイントモジュレーターの間で単に付加的なものではなく、相乗的なものである。
【００６０】
特に好ましいチェックポイントモジュレーターは、ニボルマブ（オプジーボ（Opdivo）（登録商標））、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（Keytruda）（登録商標））、イピリムマブ（ヤーボイ（Yervoy）（登録商標））、トレメリムマブもしくはアテゾリズマブ（テセントリク（Tecentriq）（登録商標））、デュルバルマブ（durvaliumab）（イミフィンジ（Imfinzi）（登録商標））またはアベルマブ（バベンチオ（Bavencio）（登録商標））から選択されてもよい。
【００６１】
本発明によるがんを予防または治療する方法は、がん生殖細胞系列遺伝子、好ましくは、ＭＡＧＥ型、ＮＹＥＳＯ、およびＬＡＧＥ抗原をコードする遺伝子を発現するがんを対象とし、好ましくは、例えば、がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、尿路（尿路上皮）、食道、膀胱、小細胞肺がん、腎臓、頭頸部、肉腫、または乳房のがんである、特定のがん種を対象とする。
【００６２】
よって、本発明は、がんの予防または治療において使用するための本発明のＣｈＡｄベクターを含む。また、がんの予防または治療において使用するための本発明のＭＶＡベクター。そのような使用に関して、本発明の方法の様々な態様のそれぞれが等しく適用される。
【００６３】
さらに、本発明は、がんの予防または治療のための患者への別々の、逐次的なまたは同時の投与のための、本明細書において定義されるような本発明のＣｈＡｄベクター、および本明細書において定義されるような本発明のＭＶＡベクターを含む。
【００６４】
本明細書において定義されるようながんの予防または治療において使用するためのＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターは、Chen, D.S. and Mellman, I. (2013) Immunity 39(1):1-10、およびChen, D.S. and Mellman, I. (2017) Nature 541(7637):321-330に記載されるような、がん免疫サイクルまたはがん免疫セットポイントの１つまたは複数のモジュレーター、好ましくは、がんの治療のためにＣｈＡｄおよびＭＶＡベクターと共に投与するためのチェックポイント阻害剤をさらに含んでもよい。
【００６５】
進行性がんを有する患者の大部分は、現在、チェックポイントモジュレーターに基づく免疫療法に応答しない。例えば、抗ＰＤ１阻害剤が、黒色腫、腎細胞癌、頭頸部癌および肺癌において使用される。一態様では、本発明は、抗ＰＤ１および化学療法と組み合わせてＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＣＤ８  Ｔ細胞を誘導するためにＣｈＡｄ／ＭＶＡワクチンを使用する。いかなる特定の理論によっても縛られることを望まないが、本発明者らは、そうでなければ「冷」腫瘍であるものが、抗ＰＤ１によりブーストされる腫瘍特異的ＣＤ８  Ｔ細胞により浸潤されることを予期する。
【００６６】
本発明者らはまた、本発明によるワクチン＋化学療法剤＋チェックポイント阻害剤の三重の組合せは、ワクチン単独またはワクチン＋化学療法剤またはワクチン＋チェックポイント阻害剤と比較した場合に、マウスモデルにおいて有意に向上した抗腫瘍効果、およびマウスの有意な生存時間を提供することを見出した。実際、三重の組合せの効果は、相乗的であるようなものである。三重の組合せを用いて骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の有意な枯渇が達成される。本発明はまた、したがって、そのような三重の組合せの治療方法および対応する医療用途を提供する。本発明はまた、がんの予防または治療のための患者への別々の、逐次的なまたは同時の投与のための、上記に定義されるようなＣｈＡｄベクター、上記に定義されるようなＭＶＡベクター、化学療法剤、およびチェックポイント阻害剤を提供する。
【００６７】
化学療法剤は、（ｂ）パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、ゲムシタビン、エトポシドまたはペメトレキセドのうちの１つと組み合わせた（ａ）カルボプラチンまたはシスプラチンから選択されてもよい（但し、それに限定されない）。チェックポイント阻害剤について、これはＰＤ−１であってもよい。そのような特定の三重の組合せは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）もしくは小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、黒色腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、尿路（尿路上皮）、膀胱、腎臓、頭頸部、肉腫または乳がんに対する有用な治療を提供し得る。
【００６８】
がんの予防または治療のための本明細書に記載されるようなＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターを含むキットもまた、本発明の部分として提供される。そのようなキットは、本発明のＣｈＡｄおよび／またはＭＶＡベクターのうちの１つを保持する少なくとも１つの容器を含む。キットは、異なる本発明のウイルスベクターをそれぞれ有する、２つまたはより多く、すなわち、複数の容器を含んでもよい。キットは、使用されるワクチンレジメンに関する必須の情報、例えば、プライム−ブースト、および投与の間の期間を含む、ワクチンとしてのベクターの使用における説明書のセットを含んでもよい。より複合的な実施形態では、キットは、本明細書に記載の発明による、さらなる治療エレメント、例えば、チェックポイントモジュレーターのいずれかを含んでもよい。
【００６９】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して以下においてさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１−１】図１Ａは、調製したマウスＰ１Ａ抗原をコードするＣｈＡｄＯｘ１ベクターを図式的に示す。
【図１−２】図１Ｂは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が採取され、免疫応答について試験されるマウスのＣｈＡｄＯｘ１−Ｐ１Ａ／ＭＶＡ−Ｐ１Ａプライム−ブースト免疫化の図式的な概要を示す。
【図２】図２は、図１に示されるように、Ｐ１ＡをコードするＣｈＡｄＯｘ１／ＭＶＡウイルスベクターを用いて免疫化されたマウスにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の結果を示す。
【図３】図３は、同系Ｐ１Ａ発現がん細胞系、Ｐ８１５および１５Ｖ４Ｔ３を用いた負荷に対するマウスＤＢＡ／２マウスのＣｈＡｄＯｘ１−Ｐ１Ａ／ＭＶＡ−Ｐ１Ａプライム−ブースト予防ワクチン接種の図式的な概要を示す。
【図４】図４は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）対照に対して３つのＰ１Ａ抗原についての図３に示されるようなマウスのプライム−ブーストワクチン接種後の経時的な平均Ｐ８１５腫瘍成長を示す。
【図５】図５は、図４に示されるワクチン接種マウスについてのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。
【図６】［図６Ａ］図６Ａは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）対照に対して図３に示されるようなマウスのＣｈＡｄＯｘ１−ＩｉＰ１Ａ／ＭＶＡ−Ｐ１Ａのプライム−ブーストワクチン接種、または細胞系Ｌ１２１０．Ｐ１Ａ．Ｂ７．１を用いた免疫化後の経時的な平均１５Ｖ４Ｔ３腫瘍成長を示す。    ［図６Ｂ］図６Ｂは、図６Ａに示されるワクチン接種マウスについてのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。
【図７】図７は、確立された腫瘍の拒絶を伴う、治療的状況においてマウスにおけるプライム−ブーストＰＩＡワクチンを試験するためのワクチン接種スキームを図式的に示す。
【図８−１】［図８Ａ］図８Ａは、Ｐ１Ａ発現同系がん株１５Ｖ４Ｔ３を用いた負荷に対して治療的状況においてＤＢＡ／２マウスにおける異なるＣｈＡｄＯｘ１−Ｐ１Ａ／ＭＶＡ−Ｐ１Ａプライム−ブーストワクチン接種レジームを用いたワクチン接種後の経時的な腫瘍体積成長を示す。    ［図８Ｂ］図８Ｂは、プライムブーストワクチン接種スキーム（単一のプライム−ブースト、高用量（１０８  ＣｈａｄＯｘ／１０７ＭＶＡ）後２５日目までの平均腫瘍成長を示す。
【図８−２】［図８Ｃ］図８Ｃは、図８に示されるワクチン接種マウスについてのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。
【図９】図９は、マウスにおける治療的状況において抗ＰＤ１チェックポイント阻害剤治療とＣｈＡｄＯｘ１−ＩｉＰ１Ａ／ＭＶＡ−Ｐ１Ａのプライム−ブーストワクチン接種を組み合わせた効果を示すための実験において使用されたワクチン接種スキームを示す。
【図１０】図１０は、Ｐ１Ａ発現同系がん株１５Ｖ４Ｔ３を用いた負荷に対してＤＢＡ／２マウスにおいて、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたＣｈＡｄＯｘ１−ＩｉＰ１Ａ／ＭＶＡ−Ｐ１Ａプライム−ブーストワクチン接種レジームについての経時的な腫瘍体積成長を示す。
【図１１】図１１は、図１０におけるワクチン接種マウスについてのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。
【図１２】図１２は、ＭＡＧＥ−Ａ３（Ｍ）およびＮＹ−ＥＳＯ−１（ＮＹ）タンパク質をコードするウイルスベクターを非近交系ＣＤ１マウスにワクチン接種し、次にＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を決定する実験についての図式的な概要を示す。
【図１３】図１３は、インバリアント鎖ｌｉまたはｔＰＡありおよびなしでの、ＣｈＡｄＯｘ−ＭＡＧＥＡ３／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合物を用いた非近交系ＣＤ１マウスの免疫化の結果としての（ＩＦＮγ産生により測定された場合の）ＣＤ８  Ｔ細胞の誘導を示す。免疫化後に単離されたＰＢＭＣをｅｘ  ｖｉｖｏでオーバーラップするＭＡＧＥＡ３またはオーバーラップするＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを用いて刺激した。
【図１４】図１４は、図１３と同じものを、ｔＰＡありまたはなしでのＭＶＡ−ＭＡＧＥＡ３のブーストを用いた免疫化の結果と共に示す。
【図１５】図１５は、図１３と同じものを、ｔＰＡありまたはなしでのＭＶＡ−ＮＹ−ＥＳＯ−１のブーストを用いた免疫化の結果と共に示す。
【図１６】図１６Ａは、ＣｈＡｄＯｘ−Ｍ−ＮＹ、ＣｈＡｄＯｘ−ｔＰＡ−Ｍ−ＮＹまたはＣｈＡｄＯｘ−Ｉｉ−Ｍ−ＮＹを用いたプライム、およびＭＶＡ−Ｍ、ＭＶＡ−ＮＹ、ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｍ、またはＭＶＡ−ｔＰＡ−ＮＹベクターを用いたブースト後のＰＢＭＣにおけるＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹＥＳＯ特異的応答を示す。図１６Ｂは、ＭＶＡ−Ｍ、ＭＶＡ−ＮＹ、ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｍ、またはＭＶＡ−ｔＰＡ−ＮＹベクターのいずれかを用いた２回目のブースト後のＰＢＭＣにおけるＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹＥＳＯ特異的応答を示す。
【図１７】［図１７Ａ］図１７Ａは、ＣｈＡｄＯｘ−Ｉｉ−ＭＡＧＥＡ３／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合物を用いた免疫化、およびＭＶＡ−Ｍ、ＭＶＡ−ＮＹ、ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｍ、またはＭＶＡ−ｔＰＡ−ＮＹベクターを用いたブースト後の非近交系ＣＤ１マウスにおけるＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹＥＳＯに対するＣＤ８  Ｔ細胞応答の誘導を示す。    ［図１７Ｂ］図１７Ｂは、ＭＶＡ−Ｍ、ＭＶＡ−ＮＹ、ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｍ、またはＭＶＡ−ｔＰＡ−ＮＹベクターを用いた２回目のブースト後のＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹＥＳＯ特異的応答を示す。
【図１８】図１８は、マウスの８つの実験群のそれぞれにおけるマウスへの１５Ｖ４Ｔ３細胞注射およびその後の治療ポイントの時間表を示す。
【図１９】図１９は、図１８に示される実験の平均腫瘍成長結果のグラフを示す。結果は、二元配置分散分析により分析している。＊＝ｐ＜０．０５。＊＊＝ｐ＜０．０１。＊＊＊＝ｐ＜０．００１。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図２０−１】図２０は、マウスの８つの実験群のそれぞれについての、移植後の腫瘍の経時的な腫瘍体積のグラフを示す。
【図２０−２】図２０は、マウスの８つの実験群のそれぞれについての、移植後の腫瘍の経時的な腫瘍体積のグラフを示す。
【図２１】図２１は、マウスの８つの実験群のそれぞれについてのカプランマイヤー生存プロットを示す。データは、ログランク（マンテル・コックス）検定により分析した。＊＝ｐ＜０．０５。＊＊＝ｐ＜０．０１。
【図２２】図２２は、マウスの８つの実験群の２７日目における出血でのＣＤ８細胞のＩＦＮγ応答を示すチャートである。
【図２３】図２３は、マウスの８つの実験群のそれぞれにおけるマウスへの１５Ｖ４Ｔ３細胞注射およびその後の治療ポイントの繰返しの実験の時間表を示す。
【図２４】図２４は、ある特定の実験的治療および対照についての、（ａ）ＣＤ１１ｂ、（ｂ）ＣＤ１１ｂ＋かつＧＲ１ｈｉ＋、または（ｃ）ＣＤ１１ｂかつＧＲ１ｉｎｔ＋であるＣＤ４５＋細胞の割合のグラフを示す。
【図２５】図２５は、ある特定の実験的治療および対照についての、（ａ）ＣＤ１１ｃ、および（ｂ）ＣＤ１１ｂ＋かつＣＤ１１ｃ＋であるＣＤ４５＋細胞の割合のグラフを示す。
【図２６】図２６は、マウスのＰＢＳ対照、αＰＤ１のみ、ならびに２つの試験群（１）低用量１週間隔プライムブースト（ＣｈＡｄＯｘ１−Ｉｉ−Ｐ１Ａ＋ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｐ１Ａ）および（２）低用量１週間隔プライムブースト（ＣｈＡｄＯｘ１−Ｉｉ−Ｐ１Ａ＋ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｐ１Ａ）＋αＰＤ１についてのワクチン接種の時間表を示す。
【図２７】図２７は、図２６に示される実験マウスおよび対照のそれぞれについての経時的な平均腫瘍体積を示す。
【図２８】図２８は、図２６に示される実験マウスおよび対照のそれぞれについての腫瘍量を示すチャートである。
【図２９】図２９は、図２５〜２８に示されるような対照および実験群のそれぞれについての各個々の動物についての腫瘍成長速度データのグラフである。
【図３０】図３０は、マウスの各実験群および対照群における腫瘍中の総細胞の割合としての腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の割合を示すチャートである。
【図３１】図３１は、マウスの実験群および対照群のそれぞれにおけるＣＤ４：ＣＤ８  Ｔ細胞の比を示すチャートである。
【図３２】図３２は、マウスの実験群および対照群のそれぞれにおける腫瘍中のＣＤ４＋：ＣＤ８＋  ＴＩＬの比の比（左手チャート）、ならびにＣＤ８＋細胞であるＴ細胞のパーセンテージ（右手チャート）のチャートを示す。
【図３３】図３３は、対照および実験マウス群のそれぞれにおけるＣＤ３＋  ＣＤ８＋  ＴＩＬカウントの絶対数を示すチャートである。
【図３４】図３４は、対照および実験マウス群のそれぞれにおける絶対的なＰ１Ａ３５〜４３四量体＋  Ｈ−２Ｌｄ  ＣＤ８＋  ＴＩＬカウントを示すチャートである。
【図３５】図３５は、Ｐ１Ａ特異的ＣＤ８＋  ＴＩＬ浸潤物と回収時の腫瘍量との相関を示す図表である。
【図３６】図３６は、マウスの血液におけるＣＤ８応答を示すチャートである。
【図３７】図３７は、マウスの血液におけるＣＤ８応答を示すチャートである。
【図３８】図３８〜４０は、マウスの脾臓におけるＣＤ８応答を示すデータのチャートである。
【図３９】図３８〜４０は、マウスの脾臓におけるＣＤ８応答を示すデータのチャートである。
【図４０】図３８〜４０は、マウスの脾臓におけるＣＤ８応答を示すデータのチャートである。
【図４１】図４１〜４３は、Ｔ細胞サブセット解析を示すデータの棒グラフである。図４３に対するレジェンドは、図４１および図４２に適用される。
【図４２】図４１〜４３は、Ｔ細胞サブセット解析を示すデータの棒グラフである。図４３に対するレジェンドは、図４１および図４２に適用される。
【図４３】図４１〜４３は、Ｔ細胞サブセット解析を示すデータの棒グラフである。図４３に対するレジェンドは、図４１および図４２に適用される。
【図４４】図４４および図４５は、さらなるＴ細胞サブセット解析を示すデータの棒グラフである。図４５に対するレジェンドは、図４４に適用される。
【図４５】図４４および図４５は、さらなるＴ細胞サブセット解析を示すデータの棒グラフである。図４５に対するレジェンドは、図４４に適用される。
【図４６】図４６は、Ｔ細胞サブセット解析のさらなるデータを示す。
【図４７】図４７は、Ｔ細胞上のＰＤ１発現についてのデータのチャートを示す。
【図４８】図４８は、Ｔ細胞上のＰＤ１発現についてのさらなるデータを示す。
【図４９】図４９は、Ｔ細胞上のＰＤ１発現についてのさらなるデータを示す。
【図５０】図５０は、Ｐ１Ａ特異的Ｔ細胞上のＰＤ１発現についてのデータのチャートを示す。
【図５１】図５１〜５３は、Ｐ１Ａ特異的Ｔ細胞上のＰＤ１発現についてのさらなるデータのチャートを示す。
【図５２】図５１〜５３は、Ｐ１Ａ特異的Ｔ細胞上のＰＤ１発現についてのさらなるデータのチャートを示す。
【図５３】図５１〜５３は、Ｐ１Ａ特異的Ｔ細胞上のＰＤ１発現についてのさらなるデータのチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
詳細な説明
本発明に従って使用するための好適なチンパンジーアデノウイルスベクターは、国際公開第２０１２／１７２７７号パンフレット、Ｉｓｉｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、または国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｉ  Ｒｉｃｅｒｃｈｅ  ｄｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｍｏｌｅｃｏｌａｒｅ  Ｐ．  Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ  Ｓ．  ｐ．  Ａ、またはＯｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄの国際公開第２０１７／２２１０３１号パンフレット（これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【００７２】
特に好ましいアデノウイルスベクターは、Ｖａｃｃｉｔｅｃｈ  Ｌｔｄ、ＯｘｆｏｒｄのチンパンジーアデノウイルスＯｘｆｏｒｄ  １および２（ＣｈＡｄＯｘ１およびＣｈＡｄＯｘ２）である。ＣｈＡｄＯｘ１は、野生型分離株Ｙ２５（種ヒトアデノウイルスＥ）からの複製欠陥性Ｅ１／Ｅ３欠失チンパンジーアデノウイルスベクターであり、Dicks M.D. et al. (2012) PLoS ONE 7: e40385に記載されている。ＣｈＡｄＯｘ２は、ＨＥＫ２９３細胞中でのウイルス収率を増加させるために改変されたＥ４領域を有するＣｈＡｄ６８に由来するＥ１／Ｅ３欠失ワクチンベクターである。
【００７３】
本発明のＣｈＡｄベクターは、（ａ）国際公開第２０１２／１７２２７７号パンフレットに開示されたＣｈＡｄＯｘ１；好ましくは、国際公開第２０１２／１７２２７７号パンフレットに開示された配列番号３８のポリヌクレオチドもしくはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされるＣｈＡｄＯｘ１、または（ｂ）国際公開第２０１７／２２１０３１号パンフレットに開示されたＣｈＡｄＯｘ２；好ましくは、国際公開第２０１７／２２１０３１号パンフレットに開示された配列番号１０のポリヌクレオチドもしくはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列によりコードされるＣｈＡｄＯｘ２であってもよい。本発明において使用されるＣｈＡｄベクターは、本明細書にさらに記載されるように、核酸配列の全てのホモログ、均等物および誘導体を含んでもよいことを当業者は理解する。
【００７４】
本発明に従って使用するための好適な改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターは、国際公開第２０１１／１２８７０４号パンフレットまたは欧州特許出願公開第２０４４９４７号明細書（これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【００７５】
本発明のウイルスベクターのいずれかによりコードおよび発現されるような、がん抗原は、別々であれ、互いおよび任意選択的に他のポリペプチドとの融合物の形態であれ、好ましくは、本明細書において定義されるように免疫原性であり、これは、がん抗原の断片ならびに互いおよび他のポリペプチドとのそれらの融合物を含む。
【００７６】
本明細書において使用される場合、「抗原」は、一般に、タンパク質またはポリペプチドの１つまたは複数のエピトープと等しく、これには、その融合物および断片およびバリアントが含まれる。そのような断片およびバリアントは、親抗原と本質的に同じ生物学的活性または機能を保持してもよい。「抗原性の」（antigenic）は、通常、タンパク質またはポリペプチドまたは断片が、抗体またはＴ細胞を産生するために使用されることができ、そのため対象において抗体またはＴ細胞応答を誘導できることが意味される。「免疫原性の」（immunogenic）は、タンパク質またはポリペプチドまたは断片が、対象において強力かつ好ましくは保護的な免疫応答を誘発できることが意味される。そのため、後者の場合、タンパク質またはポリペプチドまたは断片は、抗体応答および非抗体ベースの免疫応答を生成することが可能であり得る。
【００７７】
本明細書において使用される場合、参照配列に対して同一性を有する核酸配列が言及される場合は常に、同一性の程度は、以下の任意のものから選択されてもよく、「少なくとも」がここに列記される各パーセンテージの数値に適用される：少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％。相同性または同一性の程度を決定する目的のために核酸配列を比較する場合、ＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰ（両方ともＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウェアパッケージから）などのプログラムを使用することができる。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列を比較し、最も類似したセグメントの最適なアライメントを生成する。ＧＡＰは、全長に沿って配列をアライメントすることを可能にし、適宜いずれかの配列にスペースを挿入することにより最適なアライメントを見出す。好適には、本発明の文脈において、核酸配列の同一性を議論する場合、比較はそれらの全長に沿った配列のアライメントにより為される。上記は、適宜変更の上で、本出願に開示される全ての核酸配列に適用される。
【００７８】
追加的に、本明細書に例示される特定の核酸分子からのバリエーションが、遺伝コードの縮重を考慮して可能であることもまた当業者は認める。好ましくは、そのようなバリアントは、全長にわたり本明細書に記載の核酸配列に対して実質的な同一性を有する。
【００７９】
本発明との繋がりにおいて記載される任意のアミノ酸配列に関して、これは、これらのアミノ酸配列のバリアントを含む。当業者に周知のように、本明細書に開示される所与の開始または参照配列について、１つまたは複数のアミノ酸残基が、任意の組合せで置換、欠失または付加されてもよい。本発明のタンパク質の特性および活性を変更しないサイレント置換、付加および欠失は、変化として好ましい。様々なアミノ酸は類似した特性を有し、１つまたは複数のそのようなアミノ酸は、その物質の所望の免疫原性も他の活性も排除することなく１つまたは複数の他のそのようなアミノ酸により置換され得る。そのため、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、多くの場合に互いに置換され得る。これらのうち、グリシンおよびアラニンは、互いを置換するために好ましく使用される。また、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、疎水性であるより大きい脂肪族側鎖を有し、互いを置換するために使用されてもよい。フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは、芳香族側鎖を有するアミノ酸であり、互いを置換してもよい。リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、塩基性側鎖を有するアミノ酸であり、互いを置換してもよい。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性側鎖を有し、互いを置換してもよい。アスパラギンおよびグルタミンは、アミド側鎖を有し、互いを置換してもよい。システインおよびメチオニンは、硫黄含有側鎖を有し、互いを置換してもよい。
【００８０】
「バリアント」は、本明細書において記載される場合、天然に存在するまたは人工的なバリアントを含む。人工的なバリアントは、核酸分子、細胞または生物に応用されるものを含む、突然変異誘発または遺伝子操作または遺伝子編集技術を使用して生成されてもよい。本明細書において使用される場合、参照配列に対して同一性を有するアミノ酸配列が言及される場合は常に、同一性の程度は、以下の任意のものから選択されてもよく、「少なくとも」がここに列記される各パーセンテージの数値に適用される：少なくとも４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％。当業者は、アミノ酸配列を比較するためにＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを使用してもよい。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、適宜いずれかの配列にスペースを挿入することにより最適なアライメントを見出す。最適なアライメントのためにアミノ酸の同一性または類似性（同一性プラスアミノ酸種の保存）を算出することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似した配列の最も長いストレッチをアライメントし、フィットに対して値を割り当てる。そのため、それぞれが異なるスコアを有する、類似性のいくつかの領域が見出される比較を得ることが可能である。上記は、適宜変更の上で、本出願に開示される全てのアミノ酸配列に適用される。
【００８１】
特に好ましいＭＶＡベクターは、当該技術分野において最も一般的に使用されるように、ＣＥＦ中での５７０回の継代後のＡｎｔｏｎ  Ｍａｙｒにより製造される標準的なＭＶＡである。これは、天然痘根絶との繋がりで開発されたワクシニアウイルスの高度に弱毒化された株である。ＭＶＡは、ワクシニアゲノムの約１０％を喪失しており、それと共に霊長動物細胞中で効率的に複製する能力を喪失している。
【００８２】
ＭＡＧＥヒトがん抗原に関して、ＭＡＧＥファミリーは約４０のメンバーからなる。ＭＡＧＥ−Ａタンパク質は、少なくとも４６％の配列同一性、定義された生化学構造および特性を共有する。ＭＡＧＥ−Ａ３は、がんの主要な形態において著しく発現され、その発現は、負のアウトカムと関連付けられる。他のＭＡＧＥ−ＡファミリーメンバーとのＭＡＧＥ−Ａ３アミノ酸配列のアライメントは、以下の同一性％値を与える：
【００８３】
【表１】
2021532791.tif 000003
【００８４】
上記に示されるＭＡＧＥ抗原のそれぞれは、配列番号１のＭＡＧＥＡ３参照配列との任意の同一性パーセンテージの点で定義され得るように、本発明の遂行において使用されてもよい。
【００８５】
ＮＹ−ＥＳＯ−１に関して、これは、１８０アミノ酸の公知のがん抗原である。配列は、ＬＡＧＥ−１に対して７６．６％の同一性を有する。いくつかの研究は、配列の免疫原性を定義することを試みてきた。主な領域は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のａａ  ７９〜１７３にわたる。Gnjatic S, et al. (2006) Adv. Cancer Res. vol 95:1-30; Sabbatini P, et al. (2012) Clin. Cancer Res. Vol 18(23): 6497-508;およびBaumgaertner P, et al. (2016) Oncoimmunology vol 9:5(10)は、黒色腫または卵巣がんがどのように特定の目的の断片を強調してきたのかを報告する。これらは、本発明の任意の態様において使用するための各オプションである：
・ＮＹ−ＥＳＯ−１  ７９〜１７３
・ＮＹ−ＥＳＯ−１  ７９〜１０８
・ＮＹ−ＥＳＯ−１  １００〜１２９
・ＮＹ−ＥＳＯ−１  １２１〜１５０
・ＮＹ−ＥＳＯ−１  ４２〜１７３
【００８６】
ＬＡＧＥ１もまた公知のがん抗原であり、それまたはその断片もまた、本発明のウイルスベクターおよび方法および使用においてＭＡＧＥＡ３と共に使用されてもよい。
【００８７】
アジュバントは、本明細書に記載の発明のＡｄＣｈおよび／またはＭＶＡベクターの送達用の組成物において使用されてもよい。有利には、これらのウイルスベクターは、がん抗原または断片およびＣＤ７４、ＭＨＣクラスＩＩインバリアント鎖（ｌｉ）の間の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を含むように操作されてもよい。これは、増進したＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫原性に繋がることが予期される。そのようなタンパク質融合物および好ましいｌｉ配列を作る方法についてのより詳細な情報は、Ｉｓｉｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄの国際公開第２０１５／０８２９２２号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に提供される。
【００８８】
本発明のウイルスベクターは、エピトープストリングとして１つまたは複数の抗原遺伝子を発現するように設計されてもよい。好ましくは、複数のエピトープのストリング中のエピトープは、不必要な核酸および／またはアミノ酸材料が回避されるように、介在配列なしで連結されて一緒になっている。エピトープストリングの作出は、好ましくは、同じリーディングフレームにおいて１つまたは複数のエピトープをコードするＤＮＡと共に、エピトープストリングのアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ構築物を使用して達成される。代替的に、抗原は、別々のポリペプチドとして発現されてもよい。
【００８９】
抗原の任意の断片は、別々であれ、記載されるようなエピトープストリング中であれ、好ましくは、親抗原の配列からの少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含み、ｎは、好ましくは、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５７、５８、５９、６０、７０、８０、９０もしくは１００アミノ酸、または７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５７、５８、５９、６０、７０、８０、９０もしくは１００アミノ酸より多い。断片は、好ましくは、親抗原の１つまたは複数のエピトープを含む。断片は、一部の状況では、親抗原の単一のエピトープのみを含むまたはからなるものであってもよい。通常、断片は、抗原性／免疫原性の特性が維持されるように、親領域またはエピトープと十分に類似している。
【００９０】
本発明において使用される抗原または抗原遺伝子の１つまたは複数は、Ｃ末端および／またはＮ末端において切断されていてもよい。これは、クローニングおよびベクター化ワクチンの構築を促し得、かつ／または抗原の免疫原性もしくは抗原性を増進し得る。切断の方法は当業者に公知である。例えば、遺伝子操作の様々な周知の技術を使用して、抗原遺伝子のいずれかの末端においてコーディング核酸配列を選択的に欠失させ、次に所望のコーディング配列をウイルスベクターに挿入することができる。例えば、候補タンパク質の切断は、コーディング核酸のそれぞれ３’および／または５’末端を選択的に侵食する３’および／または５’エキソヌクレアーゼ戦略を使用して作出される。野生型遺伝子配列は、発現される抗原が、親抗原と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはより多くのアミノ酸だけ切断され得るように切断されてもよい。一部の事例では、抗原遺伝子は、野生型抗原と比較してＣ末端において（発現された場合に）１０〜２０アミノ酸だけ切断されている。他の事例では、抗原遺伝子は、野生型抗原と比較してＣ末端において（発現された場合に）１３〜１８アミノ酸、好ましくは、（発現された場合に）１５アミノ酸だけ切断されている。
【００９１】
一部の状況では、抗原遺伝子はリーダー配列を含んでもよく、これは、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、翻訳効率、ｍＲＮＡ安定性に影響してもよく、かつ抗原の発現および／または免疫原性を増進してもよい。本発明との繋がりにおいて、アジュバント能力にも役立ち得る一部の好ましいリーダー配列は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）またはＭＨＣ  ＩＩシャペロンタンパク質インバリアント鎖（Ｉｉ）である。好ましくは、リーダー配列は、１つまたは複数の抗原に対してＮ末端に配置される。
【００９２】
本発明は、任意選択的に１つまたは複数の追加の活性原料成分、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントと組み合わせて、本発明の１つまたは複数のウイルスベクターを含む、薬学的または免疫原性組成物を含む。好ましくは、組成物は、免疫原性および／または抗原性組成物である。
【００９３】
好適なアジュバントは当該技術分野において周知であり、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）を含むフロイントアジュバント、ミョウバン（水酸化アルミニウム）、ミョウバン＋百日咳菌（Bordatella pertussis）および免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ、典型的には、ウイルスタンパク質を含有するＱｕｉｌ  Ａのマトリックス）が挙げられる。
【００９４】
本発明の免疫原性および／または抗原性組成物は、予防的（がんの形成を予防する免疫応答を誘導する）または治療的（抗がん活性を有する免疫応答を誘導する）であってもよい。
【００９５】
本発明のベクターまたは組成物は、単回の免疫化または複数回の免疫化のいずれかとして個々の対象に投与される。好ましくは、ウイルスベクターまたはその免疫原性組成物は、単一、二重または三重の免疫化レジームの部分として投与される。それらはまた、同種または異種プライム−ブースト免疫化レジームの部分として投与されてもよい。
【００９６】
免疫化レジームは、本発明のウイルスベクターまたは免疫原性組成物の２回目またはその後の投与を含んでもよい。２回目の投与は、短い期間でまたは長い期間で投与され得る。用量は、時間、日、週、月または年の期間で、例えば、１回目の投与から１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０もしくはより多くの週もしくは０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０もしくはより多くの年の後までに、または１回目の投与から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０もしくはより多くの週もしくは０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５もしくは４０もしくはより多くの年の後に投与されてもよい。好ましくは、２回目の投与は、１回目の投与から少なくとも２か月後に行われる。好ましくは、２回目の投与は、１回目の投与から１０年後までに行われる。これらの時間間隔は、好ましくは、適宜変更の上で、任意のその後の用量の間の期間に適用される。
【００９７】
投与に関して、本発明のウイルスベクターは、１０、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４またはより多くのウイルス粒子（ｖｐ）の１つまたは複数の用量の量において投与されてもよい。
【００９８】
投与は、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、または鼻腔内投与により為されてもよい。好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、全身的に、特に、注射および灌流などを含む、血管内投与により投与される。
【００９９】
免疫チェックポイントモジュレーター（アゴニストまたは阻害剤）は、がんの治療において使用される免疫療法である。それらは、がん細胞を攻撃するＴ細胞をチューニングすることが公知のタンパク質であるチェックポイントタンパク質を調節する。本発明に従って使用するためのチェックポイントモジュレーターのセグメント、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）またはＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）を含む、異なるチェックポイントタンパク質を遮断する。ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１はＴ細胞上に見出される一方、ＰＤ−Ｌ１はがん細胞上に見出される。ＰＤ−１を遮断するための好適なチェックポイント阻害剤としては、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））が挙げられ、黒色腫、ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、尿路（尿路上皮）、膀胱などのがんを患う患者を治療するために本発明のワクチン接種アプローチと共に使用されてもよい。ＣＴＬＡ−４を遮断するための好適なチェックポイント阻害剤としてはイピリムマブ（ヤーボイ（登録商標））が挙げられ、黒色腫の治療のために本発明と共に使用されてもよい。ＰＤ−Ｌ１を遮断するための好適なチェックポイント阻害剤としてはアテゾリズマブ（テセントリク（登録商標））が挙げられ、肺、乳房および尿路上皮を含むがんの治療のために本発明と共に使用されてもよい。
【０１００】
本発明の方法および使用の施行において有用な免疫チェックポイントモジュレーターの他の好適な標的としては、例えば、ＡＭＨＲＩＩ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＢＴＮＬ２、ブチロフィリンファミリー、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５５、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＤＮ６、ＣＣＲ２、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＧＤ２、ＧＧＧ（グアニリルシクラーゼＧ）、ＧＩＲＴ、ＧＩＲＴリガンド、ＨＨＬＡ２、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳリガンド、ＩＦＮ、ＩＬ１、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１２、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１５Ｒ、ＬＡＧ３、ＬＩＧＨＴ、ＬＩＦ、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ａファミリー、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、Ｒｅｓｏｋｉｎｅ、ＳＥＭＡ４Ｄ、Ｓｉｇｌｅｃファミリー、ＳＩＲＰアルファ、ＳＴＩＮＧ、ＴＧＦベータファミリー、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＴＬ１Ａ、ＴＭＩＧＤ２、ＴＮＦＲＳＦ、ＶＩＳＴＡ、４−１ＢＢおよび４−１ＢＢリガンドから選択される任意のものが挙げられる。
【０１０１】
チェックポイントモジュレーターのより完全な総説は、Mahoney, A. M. et al., (2015) Nature Reviews Drug Discovery vol 14: 561 - 584（特に図１を参照）により提供される。
【０１０２】
チェックポイントモジュレーターの投与は、本発明のプライムまたは１回もしくは複数回のブースト免疫化のいずれかと同時に為されてもよい。これは、したがって、予防または治療目的のための組合せ治療を提供する。同時投与の改変として、チェックポイントモジュレーターは、プライムおよび／またはブースト投与の実質的に後に、実際上同時に、投与されてもよい。あるいは、プライムおよび／またはブースト投与から時間的に遅延した逐次投与が為されてもよい。遅延は、プライムおよびブースト投与と比較して異なってもよく、チェックポイントモジュレーターがワクチン投与の間に時間的に別々に投与されるように十分に長くてもよい。本発明の免疫原性組成物とは別々のチェックポイントモジュレーターの投与は、各投与の間の等しい期間を結果としてもたらしてもよい。一部の事例では、チェックポイントモジュレーターは、本発明のＣｈＡｄベースの免疫原性組成物を使用するプライムワクチン接種の前に投与されてもよい。
【０１０３】
１つまたは複数のチェックポイントモジュレーターの文脈における「組合せ治療」は、組合せの成分の同時の、逐次的なまたは別々の投与を想定する。例えば、本発明のウイルスベクターおよびチェックポイント阻害剤の同時の投与である。例えば、本発明のウイルスベクターおよび１つまたは複数のチェックポイント阻害剤の逐次的な投与もまた可能である。さらに、本発明のウイルスベクターおよび１つまたは複数のチェックポイント阻害剤の別々の投与の例がある。ウイルスベクターおよびチェックポイント阻害剤の投与が逐次的または別々である場合、ウイルスおよびチェックポイント阻害剤は、治療剤が協同的な、例えば、相乗的な、効果を示すことを可能とする時間間隔内に投与されてもよい。好ましい実施形態では、本発明のウイルスベクターおよび１つまたは複数のチェックポイント阻害剤は、互いの１、２、３、６、１２、２４、４８、７２時間以内、または４、５、６もしくは７日以内または８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０もしくは３１日以内に投与される。一部の実施形態では、本発明のウイルスベクターの第１の用量は、チェックポイント阻害剤の第１の用量の前に投与され、またはその逆であり、ウイルスベクターおよびチェックポイント阻害剤を用いる治療がオーバーラップする時期を含んでもよい。他の実施形態では、本発明のウイルスベクターの第１の用量は、チェックポイント阻害剤の第１の用量と同じ時点またはおおよそ同じ時点に投与されてもよい。他の実施形態では、本発明のウイルスベクターの第１の用量は、チェックポイント阻害剤の第１の用量（または第２、第３もしくはその後の用量）の後に投与され、ウイルスベクターおよびチェックポイント阻害剤を用いる治療がオーバーラップする時期を含んでもよい。
【実施例】
【０１０４】
材料および方法
ウイルスベクターの構築
翻訳効率のためにコドン最適化された、ウイルスベクターへの挿入用の遺伝子配列は、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＤＮＡストリングまたはプラスミドとして合成された。チンパンジーアデノウイルスベクター（ＣｈＡｄＯｘ）の構築のために、ＤＮＡストリング挿入物およびｐ１９９０骨格（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクター）を制限酵素ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩを用いて消化し、次に終夜のインキュベーションを介してライゲートした。目的の遺伝子配列をコードするプラスミドｐ１９９０でＤＨ５α（商標）コンピテント大腸菌（E. coli）を形質転換し、次にＰＣＲ法を介して陽性クローンについてスクリーニングした。陽性のクローニングされたＤＮＡをｍｉｄｉｐｒｅｐを介して増幅し、次にＬＲクロナーゼを使用して、遺伝子挿入物を含有するｐ１９９０およびｐ２５６３［配列番号２４］、ＣｈＡｄＯｘデスティネーションベクターの間でＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を実行した。ｐ２５６３デスティネーションベクターＤＮＡを細菌形質転換、ｍａｘｉｐｒｅｐおよび重力カラム精製を介して増幅した。ｐ２５６３デスティネーションベクターをＰｍｅ１を用いて消化してＤＮＡを線状化した後に、ウイルス製造用とした。
【０１０５】
ＣｈＡｄＯｘ１ベクターを生成するための寄託された生物学的材料の核酸配列および供給源を含む、より包括的な技術情報は、Ｉｓｉｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄの国際公開第２０１２／１７２２７７号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＣｈＡｄＯｘ２ベクターを生成するための生物学的材料の核酸配列および供給源を含む、より包括的な技術情報は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄの国際公開第２０１７／２２１０３１号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１０６】
本発明のＣｈＡｄＯｘウイルスベクターの製造のためのさらなる材料および方法の情報を提供する、参照により本明細書に組み込まれる他の関連する開示は、Dicks, M. D. J., et al. (2012) "A Novel Chimpanzee Adenovirus Vector with Low Human Seroprevalence: Improved Systems for Vector Derivation and Comparative Immunogenicity" PlosOne e40385である。
【０１０７】
改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを生成するために、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＤＮＡストリングまたはプラスミドをＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＰＣＲを介して増幅し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ反応のための正しいオーバーハングを確実にした。遺伝子挿入物およびｐ４７１９［配列番号２５］、ＭＶＡデスティネーションベクターを次に制限酵素Ａｌｅ  Ｉを用いて消化した。増幅された挿入物およびｐ４７１９を次にＩｎＦｕｓｉｏｎ法を使用してライゲートした。ライゲートされたプラスミドでＤＨ５α（商標）コンピテント大腸菌（E. coli）を形質転換した。陽性クローンをスクリーニングし、ＤＮＡをｍｉｄｉｐｒｅｐを介して増幅した。ＤＮＡを線状化させるためのＸｈｏ１＋Ａｃｃ６５１を用いる最終の消化をウイルス製造の前に行った。
【０１０８】
本発明のために必要なＭＶＡベクターを生成および再製造するための寄託された生物学的材料の核酸配列および供給源を含む、より包括的な技術情報は、Ｉｓｉｓ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄの国際公開第２０１１／１２８７０４号パンフレットおよび欧州特許出願公開第２０４４９４７号明細書（これらのそれぞれは参照により全体が組み込まれる）に開示されている。本発明のＭＶＡウイルスベクターの製造のためのさらなる材料および方法の情報を提供する、参照により本明細書に組み込まれる他の関連する開示は、Pavot V., Sebastian S., Turner A. V., Matthews J., Gilbert S.C. (2017) "Generation and Production of Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) as a Vaccine Vector" In: Ferran M., Skuse G. (eds) Recombinant Virus Vaccines, Methods in Molecular Biology, vol 1581 Humana Press, New York, NYである。
【０１０９】
ペプチドの製造
Ｐ１Ａ、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の全体をカバーする１５アミノ酸の長さの短いペプチドのオーバーラップするプールをＭｉｍｏｔｏｐｅｓ、Ｍｕｌｇｒａｖｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａに注文して製造した。
【０１１０】
マウス
６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ／２およびＣＤ１マウスをＥｎｖｉｇｏ、ＵＫから購入し、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫにおいて飼育した。マウスの世話および実験の手順は、ＵＫ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ａｃｔ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  ３０／２９４７の条項に従って実行した。
【０１１１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
ワクチンの免疫原性を査定するために、全身麻酔下での５０μｌの総容量の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射を介して図中に指し示される用量において製造されたＣｈＡｄＯｘ１およびＭＶＡウイルスベクターをマウスに投与した。各実験について詳述するスキームに従ってワクチン接種を時点において投与した。生Ｌ１２１０．Ｐ１Ａ．Ｂ７−１細胞を用いる免疫化は、腹腔内注射を介して行った。ｅｘ  ｖｉｖｏアッセイ用のＰＢＭＣを得るために、尾静脈出血を介して血液を採取し、ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて赤血球細胞を除去するための処理を行った。
【０１１２】
１０の異なる組換えウイルスワクチン（以下の表１を参照）を生成し、抗原発現を感染細胞において確認した。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
Ｐ１Ａ抗原を発現するこれらのウイルスベクター化ワクチンの免疫原性を、ＤＢＡ／２、Ｃ５７ＢＬ／６およびＣＤ１非近交系マウスを含むマウスの３つの異なる系統において試験した。
【０１１５】
ｅｘ  ｖｉｖｏペプチド刺激
単離されたマウスＰＢＭＣまたは脾臓細胞を、１０％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁し、Ｖ底９６ウェルプレートに加えた。抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）と共にＰ１Ａ、ＭＡＧＥ−Ａ３もしくはＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドまたはＤＭＳＯ対照を４ｍｇ／ｍｌの作用濃度において培養培地に加えることにより細胞を刺激した。細胞内サイトカイン蓄積を促進するために１時間後にＢｒｅｆａｌｄｉｎ  Ａを添加すると共に、ペプチド刺激細胞を５％のＣＯ２中３７℃で５時間インキュベートした。
【０１１６】
フローサイトメトリー  −  細胞内サイトカイン染色
ペプチド刺激後、ＰＢＭＣをＰＢＳを用いて洗浄し、ＰＢＳ中のＡｑｕａ  ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗ＣＤ８／抗ＣＤ４抗体と４℃で２０分間インキュベートすることにより表面マーカー／生存能のための染色を行った。サイトカインを産生する活性化細胞のパーセンテージを査定するために、細胞を次にＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定および透過処理し（permeabalised）、１ｘのｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の抗ＩＦＮ−γ、抗ＴＮＦ−αおよび抗ＩＬ−２抗体と４℃で２０分間インキュベートした。試料をＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，  Ｉｎｃ．）を使用して解析を行った。
【０１１７】
統計解析
全ての統計的検定および解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して行った。複数の群間の差異は、クラスカル・ウォリスノンパラメトリック分散分析を用い、個々の群間の差異は、マン−ホイットニーノンパラメトリックｔ検定を用いて決定した。
【０１１８】
[実施例１]
ＣｈＡｄＯｘ／ＭＶＡを用いる免疫化によるＰ１Ａに対するＣＤ８  Ｔ細胞の誘導
Ｐ１Ａは、同系宿主における非突然変異ＭＡＧＥ型抗原に対するＣＤ８応答の誘導を確認するためおよびＰ１Ａ発現腫瘍Ｐ８１５に対する保護を誘導するために使用できるマウスＭＡＧＥ型抗原である。それはＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１のサロゲートである。
【０１１９】
図１Ｂは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が採取され、ワクチン接種応答について試験されるマウスのプライム−ブースト免疫化の図式的な概要を示す。図２は、Ｐ１ＡをコードするＣｈＡｄＯｘ１／ＭＶＡウイルスベクターを用いてワクチン接種されたマウスにおけるＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示す。ワクチン接種スキームの時間表（図１）に従って、ＢＬ／６、ＤＢＡ／２およびＣＤ１マウスにＣｈＡｄＯｘ１．Ｐ１ＡまたはＣｈＡｄＯｘ１．Ｐ１Ａ−Ｉｉのいずれか（プライム）、続いて４週後にＭＶＡ．Ｐ１Ａ（ブースト）をワクチン接種した。Ｐ１Ａ特異的Ｔ細胞応答を試験するために、Ｐ１Ａペプチドプールを用いてＰＭＢＣをｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、Ｉ型サイトカインを産生する細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより解析した。サイトカインＩＦＮ−γ（Ａ）およびＴＮＦ−α（Ｂ）を産生するＣＤ８＋細胞のパーセンテージ（ｎ＝６／群）を測定した。異種プライム−ブーストワクチン接種は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内染色により示されるように、マウスの３つ全ての系統においてＰ１Ａに対する強いＣＤ８応答を誘導した（図２）。Ｐ１ＡをＭＨＣ  ＩＩシャペロンタンパク質インバリアント鎖（Ｉｉ）に融合させた場合に応答はさらに増進された。これらの結果は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびＤＢＡ／２マウスにおけるＰ１Ａ特異的四量体染色により確認された（結果は示さない）。
【０１２０】
全体として、観察されたものは、ＤＢＡ／２、Ｂ６および非近交系ＣＤ１マウスにおける非常に強いＣＤ８応答であった。ＣＤ８応答は、ＣｈＡｄＯｘベクターにＩｉを加えることにより増加した。見出されたものは、ＣＤ８  Ｔ細胞がオーバーラップペプチドにより誘導された場合に、それらはＩＦＮγ、ＩＬ２、およびＴＮＦαを分泌したことであった。Ｐ１Ａに対するＣＤ４応答はほとんどなかった（ＣＤ４エピトープは公知ではない）。
【０１２１】
[実施例２]
腫瘍発生に対するＰ１Ａを持つＣｈＡｄＯｘ１およびＭＶＡウイルスベクターの保護有効性の査定
腫瘍負荷に対するワクチン保護有効性の査定の部分として、マウスの１つの脇腹の皮下（ｓ．ｃ．）に無血清細胞培養培地中の腫瘍細胞を注射した。触知可能な腫瘍が発生したら、成長を記録し、腫瘍サイズがいずれかの方向において１０ｍｍに達したらマウスを安楽死させた。腫瘍体積は、式：長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ）×０．５を使用して測定した。生存曲線をカプラン−マイヤー法に従って作成し、生存における差異をログランク検定を使用して試験した。０．０５より低いＰ値を有意と考えた。
【０１２２】
より詳細には、ＤＢＡ／２マウスを４週間隔で与えたＰＢＳ、生Ｌ１２１０．Ｐ１Ａ．Ｂ７−１細胞またはＣｈＡｄＯｘ１−Ｐ１Ａ（±Ｉｉ）／ＭＶＡ−Ｐ１Ａプライム−ブーストのいずれかを用いて免疫化し、次に脇腹における皮下注射を介して１．５×１０６個のＰ８１５細胞または１×１０６個の１５Ｖ４Ｔ３細胞を用いた負荷を行った。Ｐ８１５および１５Ｖ４Ｔ３は、同系Ｐ１Ａ陽性肥満症細胞腫細胞系である。１５Ｖ４Ｔ３細胞は、Boon T, Van den Eynde B, Hirsch H, Moroni C, De Plaen E, van der Bruggen P, De Smet C, Lurquin C, Szikora JP, De Backer O. (1994) "Genes coding for tumor-specific rejection antigens" Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 59: 617 - 22に記載されている。
【０１２３】
Ｐ８１５負荷（図４）および１５Ｖ４Ｔ３（図７Ａ）後の各治療群についての平均腫瘍成長。カプラン−マイヤー生存曲線をＰ８１５（図５）、１５Ｖ４Ｔ３（図７Ｂ）について示す（ｎ＝１０／群）。
【０１２４】
図４および図５に示されるように、Ｐ１Ａを伴うアデノウイルスプライムおよびＭＶＡブーストワクチン接種は、ＰＢＳ対照群と比較してワクチン接種マウスにおいて、有意に腫瘍成長を低減し、生存を向上させた。興味深いことに、Ｉｉ＿Ｐ１Ａを用いてワクチン接種された群は、Ｌ１２１０．Ｐ１Ａ  Ｂ７．１細胞を用いて免疫化された陽性対照群と比較してより小さい腫瘍体積およびより良好な生存を有した。この細胞系は、非常に強いＰ１Ａ特異的細胞傷害活性およびＰ１Ａ陽性腫瘍負荷に対する保護を誘導することが以前に示されている（Brandle D. et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28(12): 4010 - 4019およびNaslund T. I. et al. (2007) J. Immunol. 178(11): 6761 - 6769）を参照。これは、ワクチン接種からの刺激された免疫応答は、Ｐ８１５腫瘍からのマウスの保護において効率的であることを指し示した。図６Ａおよび図６Ｂは、他のＰ１Ａ陽性腫瘍細胞系１５Ｖ４Ｔ３を使用して観察された同じ結果を示す。
【０１２５】
全体として、観察されたものは、異なるＰ１Ａ発現腫瘍モデルＰ８１５および１５Ｖ４Ｔ３（およびＶ４Ｄ６；データは示さない）における腫瘍負荷に対する保護および生存の増加と関連付けられるＣＤ８応答であった。プライム−ブーストレジメンは、陽性対照細胞ワクチンを用いるよりも良好な保護を与えた。インバリアント鎖（Ｉｉ）−Ｐ１Ａ融合物がベクターにおいてＰ１Ａ単独よりもどのように良好であるらしいのかも観察される。任意の腫瘍が、長期間後に治療を用いた成長効果の低減から逃れている場合、これらはＰ１Ａ発現を喪失していた（データは示さない）。
【０１２６】
[実施例３]
Ｐ１Ａを持つＣｈＡｄＯｘ１およびＭＶＡウイルスベクターのワクチン治療有効性の査定
ワクチン治療有効性を査定するための実験を行った。１５Ｖ４Ｔ３腫瘍が確立されたら、マウスを５日後からＣｈＡｄＯｘベクターを用いてプライミングし、次に２６日目にＭＶＡベクターを用いてブーストした。ワクチン接種スキームを図７に示す。３つの異なるワクチン接種スキームを試験した。ＤＢＡ／２マウスを脇腹における皮下注射を介して１×１０６個の１５Ｖ４Ｔ３細胞を用いて負荷し、次に負荷の５日後に３週間隔の単一の標準用量ＣｈＡｄＯｘ−Ｐ１Ａ（１０８ＩＵ）／ＭＶＡ−Ｐ１Ａ（１０７ＰＦＵ）プライム−ブーストワクチン接種、３週間隔の単一の低用量プライム−ブーストワクチン接種（ＣｈＡｄＯｘ  −  １０７ＩＵ、ＭＶＡ  −  １０６ＰＦＵ）、週毎の交互の低用量ＣｈＡｄＯｘ−Ｐ１Ａ／ＭＶＡ−Ｐ１Ａワクチン接種または週毎の対照抗原、ＤＰＹをコードするＣｈＡｄＯｘ／ＭＶＡワクチン接種のいずれかを与えた。各治療群における１５Ｖ４Ｔ３腫瘍成長および生存を次にモニターした。
【０１２７】
図８に示されるように、腫瘍成長は、関連しないタンパク質ＤＰＹを発現するウイルスベクターを用いてワクチン接種された対照群と比較してワクチン接種マウスにおいて顕著に遅延された。さらに、単一の標準用量プライム−ブーストは、腫瘍負荷に対する最良の保護および生存を実証した。しかしながら、ワクチン接種マウスは、後のステージ（６週目）において腫瘍成長を制御する能力を喪失し始めた。
【０１２８】
治療有効性は、したがって、１５Ｖ４Ｔ３モデルにおいて観察された。
【０１２９】
[実施例４]
免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたＣｈＡｄＯｘ１−Ｐ１Ａ／ＭＶＡ−Ｐ１Ａプライム−ブーストワクチン接種レジームの治療有効性の査定
より良好な腫瘍保護を達成し、ワクチン有効性を増加させるために、ワクチンをチェックポイント阻害剤での遮断と組合せ、同じ１５Ｖ４Ｔ３腫瘍モデルを使用して、ＤＢＡ／２マウスにＰ１Ａ発現同系１５Ｖ４Ｔ３腫瘍細胞を接種した。ＤＢＡ／２マウスを脇腹における皮下注射を介して１×１０６個の１５Ｖ４Ｔ３細胞を用いて負荷し、次に腫瘍サイズに基づいて負荷後８日目に異なる治療群に無作為化した。マウスにＰＢＳ（シャム）ワクチン接種、単独のもしくは抗ＰＤ１もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれか（３日間隔の３用量）と組み合わせた週毎のＣｈＡｄＯｘ／ＭＶＡワクチン接種、または単独の抗ＰＤ１もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体のいずれかを与えた。各治療群における１５Ｖ４Ｔ３腫瘍成長（図１０）および生存（図１１）をモニターし、継続期間の全体を通じて記録した。触知可能な腫瘍の確立後、腫瘍サイズを測定し、マウスを異なる群に無作為化した。図１０（左手グラフ）に示されるように、組合せ療法を与えたマウスの腫瘍成長は、対照および単一療法群におけるマウスと比較してはるかに遅延した。また、抗ＰＤ１およびワクチンの組合せ療法を与えたマウスの１００％は、腫瘍負荷後３６日目まで生存し、抗ＣＴＬＡ４およびワクチン治療の群においてマウスの５０％が生存したが、他のマウスは全て生存が不良であった。
【０１３０】
ワクチン＋抗ＰＤ１の相乗効果が１５Ｖ４Ｔ３モデルの治療的状況において観察された。
【０１３１】
[実施例５]
ＣＤ１非近交系マウスにおけるＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１の免疫原性の査定
マウスＰ１Ａ遺伝子をコードするベクターからの応答が確立されたので、ヒトＭＡＧＥ型抗原をコードするベクター構築物を製造し、試験した。異なる形態のヒトＭＡＧＥ型抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１の免疫原性をＣＤ１非近交系マウスにおいて調べた。ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１を融合タンパク質としてチンパンジーアデノウイルスベクターにクローニングすると共に、それらをＭＶＡに個々にクローニングした。これは２つの主な理由に起因する。第１に、アデノウイルスベクター化ワクチンの製造はＭＶＡより高価である。臨床的状況用の調製のために試みたことは、コストを最小化して、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１の融合物を発現する１つの単一のアデノウイルスベクター化ワクチンのみを含ませることであった。第２に、一部のヒト腫瘍はＭＡＧＥ−Ａ３またはＮＹ−ＥＳＯ−１のいずれかを発現する。腫瘍に対するより特異的な応答を誘導するために、腫瘍により発現される特定の抗原がブースティングのために標的化される。より詳細には、マウスを時間表（図１２）に従ってワクチン接種し、ＭＡＧＥ−Ａ３−ＮＹ−ＥＳＯ−１±ＩｉまたはｔＰＡをコードするＣｈＡｄＯｘ１を用いるプライム、続いてＭＡＧＥ−Ａ３またはＮＹ−ＥＳＯ−１のいずれか、±ｔＰＡをコードするＭＶＡを用いる２回のブーストを行った（２回目のＭＶＡブーストは１回目のＭＶＡブーストに対して交替の抗原を含有する）。指し示される時点において各ワクチン接種後に抗原特異的Ｔ細胞応答を査定した。ＰＢＭＣを回収し、ＭＡＧＥ−Ａ３（青丸）またはＮＹ−ＥＳＯ−１（赤四角）ペプチドを用いてｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、ＩＦＮ−γ＋応答細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより解析した。
【０１３２】
図１３は、ＣｈＡｄＯｘ１−ＭＡＧＥ−Ａ３／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合物（Ｍ−ＮＹ）、ｔＰＡを有するＣｈＡｄＯｘ１−ＭＡＧＥ−Ａ３／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合物（ｔＰＡ−Ｍ−ＮＹ）およびインバリアント鎖を有するＣｈＡｄＯｘ１−ＭＡＧＥ−Ａ３／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合物（ｌｉ−Ｍ−ＮＹ）を用いた非近交系ＣＤ１マウスのプライミング注射後のＭＡＧＥ−Ａ３／ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＣＤ８  Ｔ細胞の誘導を示す。２週後、ＰＢＭＣを単離し、ＭＡＧＥ−Ａ３オーバーラップペプチド（赤丸）およびＮＹ−ＥＳＯ−１オーバーラップペプチド（青四角）に対する応答をｅｘ  ｖｉｖｏの細胞内サイトカイン染色により試験した。プライム後のＣＤ８  ＩＦＮγ応答は、融合タンパク質を含有するＣｈＡｄＯｘプライムは両方の抗原に対して特異的なＣＤ８  Ｔ細胞を誘発できることを示す。
【０１３３】
次に、ＣｈＡｄＯｘプライムしたマウスに（ｉ）ｔＰＡへの融合ありまたはなしのＭＡＧＥＡ３を含有するＭＶＡ、および（ｉｉ）ｔＰＡへの融合ありまたはなしのＮＹ−ＥＳＯ−１を含有するＭＶＡを用いるブースター注射を与えた。ＰＢＭＣを次に再びこれらのマウスから単離し、オーバーラップペプチドを用いた刺激後にｅｘ  ｖｉｖｏの細胞内サイトカイン染色を使用してＭＡＧＥＡ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１応答について試験した。図１４はＭＶＡ−ＭＡＧＥＡ３±ｔＰＡブーストの効果を示し、図１５はＭＶＡ−ＮＹ−ＥＳＯ−１±ｔＰＡブーストの効果を示す。図１４および図１５のそれぞれにおいて、プライムのみの結果とのブーストの結果の簡便な比較のために左手部分として図１３を含めている。見ることができるように、初期のプライム応答は、ＭＶＡを使用する選択された抗原のいずれかに対してはるかにより高い大きさまでブーストされる。
【０１３４】
プライムとしてのＣｈＡｄＯｘ−インバリアント鎖（ｌｉ）およびＭＶＡ−ｔＰＡは、試料サイズおよび何らかの程度の変動性を有する非近交系マウスの使用であるとしても、最も免疫原性のレジームであるようである。
【０１３５】
二重ブーストにおいて、初期のプライム応答は、より高い大きさまで同時に増加した（データは示さない）。観察された応答は、他のＩ型サイトカインに概ねマッチする（データは示さない）。
【０１３６】
どれほどの頻度の抗原特異的Ｔ細胞がはるかにより高いレベルにブーストされるようであるのか、および選択された抗原を標的とする応答を考慮すれば、本発明は、問題とされる個々の腫瘍の特定の発現パターンに従って予防または治療に対するより個別化されたアプローチを可能とし得る。
【０１３７】
図１６Ａは、ＭＶＡ−Ｍ、ＭＶＡ−ＮＹ、ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｍ、またはＭＶＡ−ｔＰＡ−ＮＹベクターを用いたブースト後のＣＤ８＋細胞中のＩＦＮ−γ＋細胞のパーセンテージを示す。図１６Ｂは、ＭＶＡ−Ｍ、ＭＶＡ−ＮＹ、ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｍ、またはＭＶＡ−ｔＰＡ−ＮＹベクターのいずれかを用いた２回目のブースト後のＣＤ８＋細胞中のＩＦＮ−γ＋細胞のパーセンテージを示す。
【０１３８】
マウスを融合物ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するアデノウイルスを用いてプライムし、ＭＡＧＥ−Ａ３またはＮＹ−ＥＳＯ−１のいずれかを発現するＭＶＡを用いてブーストした場合、増加したＣＤ８応答は、ＭＶＡにより発現される抗原を標的とした（図１４および図１５）。また、両方のＭＶＡ（ＭＶＡ＿ＭＡＧＥＡ３およびＭＶＡ＿ＮＹＥＳＯ）を用いてマウスをブーストすることは、これらの２つの抗原に対する類似したレベルのＣＤ８応答を誘導した。
【０１３９】
Bolhassani A. et al. (2011) Mol. Cancer. 10:3に記載されるように、抗原の免疫原性は、遺伝子を一部の分子アジュバントに融合させることにより増進され得る。これらの中で、ヒト組織プラスミノーゲン（plasmogen）活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド（Delogu G. et al. (2002) Infect. Immun.70(1): 292 - 302を参照）は、感染細胞内のタンパク質発現を増加させ、そのためＴ細胞応答を増進することがある（例えば、Biswas S. et al. (2011) PLoS One 6(6): e20977）。また、抗原をＭＨＣ  ＩＩ関連Ｉｉに融合させることは、ＣＤ８応答を強化し得る（Mikkelsen M. et al. (2011) Journal of Immunology 186(4): 2355 -2364;およびSorensen M. R. et al. (2009) European Journal of Immunology 39(10): 2725 - 2736）。
【０１４０】
上記の様々な実施例から要約すると、Ｐ１Ａに対するＣＤ８応答は、抗原をＩｉに融合させた場合に増進される（図２）。より良好な刺激されたＣＤ８応答がどのようにマウスにおけるより良好な腫瘍保護に変換されたのかもまた示される（図４および図５）。ｔＰＡ融合物の効果は、ウイルスベクター化ワクチンにおいて今までに研究されていない。実施例は、Ｉｉとは異なり、ＭＡＧＥ抗原へのｔＰＡ融合物は、アデノウイルスを用いる単一のワクチン接種においてＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を増進できなかったことを示す。また、単一のプライムブーストワクチン接種において、マウスをＩｉに融合した抗原を発現するアデノウイルスを用いてプライムし、ｔＰＡに融合した抗原をコードするＭＶＡを用いてブーストした場合に、ＣＤ８応答における増加が観察された（図１６Ａおよび図１６Ｂを参照）。しかしながら、さらなる解析は、ＭＶＡブーストにおけるＭＡＧＥ抗原へのｔＰＡ融合物はＣＤ８応答を増進できなかったことを示す。
【０１４１】
[実施例６]
ＤＢＡ／２マウスにおける１５Ｖ４Ｔ３腫瘍に対する効果におけるワクチン、チェックポイント阻害剤および化学療法の三重の組合せ
図１８は、化学療法およびチェックポイント阻害剤治療を伴う試験マウスのワクチン接種の他に、関連付けられる対照治療についての実験クロノロジーを示す。簡潔に述べれば、１００万個の１５Ｖ４Ｔ３細胞をＤＢＡ／２マウスのそれぞれの皮下に注射した。６日目に腫瘍サイズに基づいてマウスを群に無作為に分割した。マウスの任意のワクチン接種を含む治療を腫瘍移植後８日目に開始した。投与される場合、２０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルおよび４０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンを８日目にＩ．Ｐによりマウスに与え、２０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを９日目にＩ．Ｐにより与えた。投与される場合、３用量の１００μｇのａＰＤ１を１８、２１および２４日目にＩ．Ｐにより与えた。群当たりのマウスの数は６または７または８であった。
【０１４２】
図１９は、実験および対照治療のそれぞれについてのマウスにおける平均腫瘍体積の時間経過を示す。
【０１４３】
図２０は、各実験群または対照群における個々のマウスの腫瘍体積についての時間経過を示す。ワクチン接種および／または化学療法および／またはチェックポイント阻害剤のいずれであれ、治療の時間を示す。４８日のエンドポイントでの腫瘍なしであることが見出される各群中のマウスの数もまた指し示す。ワクチン接種、化学療法およびチェックポイント阻害剤の三重の組合せは明確に、様々な治療の中で最も有効に腫瘍の形成を阻害する。
【０１４４】
図２１は、各実験群および対照群における経時的なマウスの生存を示す。ワクチン接種、化学療法およびチェックポイント阻害剤の三重の組合せは明確に、他の治療および対照と比較してマウスの最良の生存を提供する。
【０１４５】
ａＰＤ１および化学療法とのワクチンの三重の組合せは、他の群と比較して腫瘍成長を有意に阻害した。腫瘍注射後２３日目に８匹のうち６匹が腫瘍なしマウスであり、これらのマウスは４８日目まで腫瘍なしのままであった。また、図２２に示されるように、三重の組合せの群はまた、腫瘍注射後２７日目に最も高い末梢Ｐ１Ａ特異的ＣＤ８応答を有する。
【０１４６】
[実施例７]
ＤＢＡ／２マウスにおける１５Ｖ４Ｔ３腫瘍に対する効果におけるワクチン、チェックポイント阻害剤および化学療法の三重の組合せ
図２３は、マウスの各実験群および対照についての時間表を示す。１００万個の１５Ｖ４Ｔ３細胞（早期継代）をＤＢＡ／２マウスに同時に注射した。１１日目に腫瘍サイズに基づいてマウスを群に無作為に分割し、マウスのワクチン接種を腫瘍移植後１１日目に開始した。投与される場合、２０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルおよび４０ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンを１１日目にＩ．Ｐにより与え、２０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを１２日目にＩ．Ｐ．により与えた。投与される場合、３用量の１００μｇのａＰＤ１を２１、２４および２７日目にＩ．Ｐ．により与えた。群当たりｎ＝６または７。腫瘍負荷を伴わないナイーブ群もまたこの実験に含めた。出血を１４日目に実行し、試料を使用して骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）枯渇を調べた。
【０１４７】
図２４および図２５は、化学療法のみまたは化学療法＋ワクチンを用いて治療されたマウスがどのようにＭＤＳＣ頻度を低下させたのかを示す。
【０１４８】
[実施例８]
ＤＢＡ／２マウスにおける１５Ｖ４Ｔ３腫瘍  −  ＣＰＩを用いるワクチン接種は腫瘍Ｔ細胞浸潤を増加させる
１００万個の１５Ｖ４Ｔ３細胞をＤＢＡ／２マウスの皮下に注射した。ワクチン接種スケジュールをＰＢＳ対照、ａＰＤ１のみ、ならびにマウスの２つの試験群：（１）低用量１週間隔プライムブースト（ＣｈＡｄＯｘ１−Ｉｉ−Ｐ１Ａ＋ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｐ１Ａ）および（２）低用量１週間隔プライムブースト（ＣｈＡｄＯｘ１−Ｉｉ−Ｐ１Ａ＋ＭＶＡ−ｔＰＡ−Ｐ１Ａ）＋ａＰＤ１について図２６に示す。マウスのワクチン接種を腫瘍移植後１０日目に開始した。ＣＰＩ（αＰＤ１）をプライムの３日後に与え、腫瘍注射後１３、１６および１９日目に３用量の１００μｇを用いた。全てのマウスを２０日目に出血させ、２１日目に屠殺した。腫瘍微環境の免疫プロファイルをＦＡＣＳにより研究した。結果を図２７〜５３に示す。
【０１４９】
より詳細には、図２７は、屠殺時のマウスの全ての群における腫瘍サイズの均一な広がりを示す。図２８は、ワクチン＋抗ＰＤ−１組合せ群におけるマウスのサブセットにおける腫瘍量の低減を示し、これらのマウスにおける腫瘍クリアランスの開始を指し示す。
【０１５０】
図２９は、各群におけるマウスのそれぞれについての個々の腫瘍成長曲線を示す。
【０１５１】
図３０は、マウスのワクチンおよび対照群の腫瘍中のＣＤ８＋腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）のパーセンテージを示す。ワクチン接種は、腫瘍中の総細胞の割合としてＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＴＩＬを増加させる。
【０１５２】
図３３および図３４は、算出され、細胞数および腫瘍重量に対して正規化された絶対的なＴＩＬ数を示す。
【０１５３】
図３６および図３７は、ＣｈＡｄＯｘプライム後１１日目の早期の時点において評価された場合に、αＰＤ−１治療の追加がどのようにＣｈＡｄＯｘ／ＭＶＡワクチン接種によりプライムされたＰ１Ａ特異的応答をブーストするようであるのかを示す。
【０１５４】
図４６は、腫瘍におけるＰ１Ａ特異的ＴＥＭ  ＣＤ８＋の浸潤はどのようにＰ１Ａ特異的ＣＤ８と同じパターンに従うのかを示す。
【０１５５】
全体として、図２７〜５３の結果は、対照と比較してマウスのワクチン群におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＴＩＬの増加およびＰ１Ａ特異的ＴＩＬの増加と共に、ワクチンがどのように腫瘍のＴ細胞浸潤を増加させるのかを示す。
【０１５６】
また、ＣＤ３＋ＣＤ８＋  ＴＩＬは主に、エフェクターメモリー細胞ＴＥＭ（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋）およびＴＣＭ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋）である。
【０１５７】
さらに、Ｐ１Ａ特異的ＴＩＬはワクチン群においてＰＤ−１を発現するが、発現はαＰＤ１遮断と共に減少する。
【０１５８】
本明細書において参照されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列
ある特定のタンパク質またはポリペプチドが本明細書において参照され、これらについての参照ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、本明細書の部分として提出される添付の配列表において提供される。配列の一部をアノテーション付けして、以下のようにさらなる情報を提供する：
ヒトＨＬＡクラスＩＩ組織適合性抗原ガンマ鎖（ｌｉ）ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０４２３３．３。下線を引いた配列部分はベクターにおいて使用される膜貫通ドメインを表す：
【０１５９】
【化１】
2021532791.tif 000005
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）。示される下線を引いた配列部分はベクターにおいて使用されるリーダー配列である。
【０１６０】
【化２】
2021532791.tif 000006
ベクターＣｈＡｄＯｘ１＿ＭＡＧＥ＿ＮＹＥＳＯのポリヌクレオチド構築物。ＭＡＧＥＡ３に下線を引いている。リンカーを太字としている。ＮＹ−ＥＳＯ−１を斜体としている。
【０１６１】
【化３】
2021532791.tif 000007
ＣｈＡｄＯｘ１＿ＭＡＧＥ＿ＮＹＥＳＯの翻訳されたタンパク質。ＭＡＧＥＡ３に下線を引いている。リンカーを太字としている。ＮＹ−ＥＳＯ−１を斜体としている：
【０１６２】
【化４】
2021532791.tif 000008
ベクターＣｈＡｄＯｘ１＿ｈＩｉ＿ＭＡＧＥ＿ＮＹ−ＥＳＯ−１のポリヌクレオチド構築物。ｌｉ配列を太字とし、斜体文字としている。ＭＡＧＥＡ３に下線を引いている。配列リンカーを太字としている。ＮＹ−ＥＳＯ−１を斜体としている：
【０１６３】
【化５】
2021532791.tif 000009
ＣｈＡｄＯｘ１＿ｈＩｉ＿ＭＡＧＥ＿ＮＹ−ＥＳＯ−１の翻訳されたタンパク質配列。ｌｉ配列を太字とし、斜体文字としている。ＭＡＧＥＡ３に下線を引いている。リンカーを太字としている。ＮＹ−ＥＳＯ−１を斜体としている：
【０１６４】
【化６】
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ベクターＣｈＡｄＯｘ１＿ｔＰＡ＿ＭＡＧＥ＿ＮＹ−ＥＳＯ−１のポリヌクレオチド構築物。ｔＰＡ配列を太字とし、斜体文字としている。ＭＡＧＥＡ３に下線を引いている。リンカーを太字としている。ＮＹ−ＥＳＯ−１を斜体としている：
【０１６５】
【化７】
2021532791.tif 000011
ＣｈＡｄＯｘ１＿ｔＰＡ＿ＭＡＧＥ＿ＮＹ−ＥＳＯ−１の翻訳されたタンパク質。ｔＰＡ配列を太字とし、斜体文字としている。ＭＡＧＥＡ３に下線を引いている。リンカーを太字としている。ＮＹ−ＥＳＯ−１を斜体としている：
【０１６６】
【化８】
2021532791.tif 000012
ベクターＭＶＡ＿ｔＰＡ＿ＭＡＧＥＡ３のポリヌクレオチド構築物。ｔＰＡに下線を引いている：
【０１６７】
【化９】
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ＭＶＡ＿ｔＰＡ＿ＭＡＧＥＡ３の翻訳されたタンパク質。ｔＰＡに下線を引いている：
【０１６８】
【化１０】
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ベクターＭＶＡ＿ｔＰＡ＿ＮＹＥＳＯのポリヌクレオチド構築物。ｔＰＡに下線を引いている：
【０１６９】
【化１１】
2021532791.tif 000015
ＭＶＡ＿ｔＰＡ＿ＮＹＥＳＯの翻訳されたタンパク質。ｔＰＡに下線を引いている：
【０１７０】
【化１２】
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ベクターＣｈＡｄＯｘ１＿ｍＩｉ＿Ｐ１Ａのポリヌクレオチド構築物。Ｉｉ配列に下線を引いている：
【０１７１】
【化１３】
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ＣｈＡｄＯｘ１＿ｍＩｉ＿Ｐ１Ａの翻訳されたタンパク質。Ｉｉ配列に下線を引いている：
【０１７２】
【化１４】
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【０１７３】
本明細書の記載および特許請求の範囲の全体を通じて、「含む」および「含有する」という語ならびにそれらのバリエーションは、「含むがそれに限定されない」を意味し、それらは、他の部分、添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図しない（および除外しない）。本明細書の記載および特許請求の範囲の全体を通じて、文脈が他に要求しなければ、単数は複数を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈が他に要求しなければ、本明細書は、複数の他に単数を想定するものと理解されるべきである。
【０１７４】
本発明の特定の態様、実施形態または例と組み合わせて記載される特色、整数、特徴、化合物、化学的部分または基は、それと不適合でなければ、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であることが理解されるべきである。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示される特色の全て、ならびに／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの全ては、そのような特色および／またはステップの少なくとも一部が互いに排他的である組合せを除いて、任意の組合せで組み合わせられてもよい。本発明は、いかなる以上の実施形態の詳細にも制限されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示される特色の任意の新規の１つ、もしくは任意の新規の組合せ、またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップの任意の新規の１つ、もしくは任意の新規の組合せに拡張される。
【０１７５】
本出願との繋がりで本明細書と同時にまたはそれに先行して提出され、本明細書と共に公衆に閲覧される全ての書類および文書に対して読者の注意が向けられ、全てのそのような書類および文書の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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