(57)【要約】  本発明は、改善されたオメガ-トランスアミナーゼ（ω−ＴＡ）活性を有するタンパク質、改善されたω−ＴＡ活性を有するそれぞれのタンパク質をコードする核酸分子、およびキラルアミンおよびアミノ酸の立体選択的合成またはエナンチオマー混合物中のキラルアミン異性体の増加のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω-トランスアミナーゼ（ω−ＴＡ）の活性を有するタンパク質であって、該タンパク質は、以下からなる群より選択される：
ａ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸がＥとは異なり、１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、１９７位のアミノ酸がＭとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり、３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は、配列番号３に示す１〜４７７位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｂ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸がＥとは異なり、１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、１９７位のアミノ酸がＴとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり、３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は配列番号６に示す１〜４７９位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｃ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸がＥとは異なり、１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、１９７位のアミノ酸がＭとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり、３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は、配列番号９に示す１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｄ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸および１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、Ｅとは異なり、１９７位のアミノ酸がＴとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり、３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は、配列番号１２に示す１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｅ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸および１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、Ｅとは異なり、１９７位のアミノ酸がＭとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり、３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は、配列番号１５に示す１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｆ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）に示すいずれかのアミノ酸配列における、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性のアミノ酸配列を有し、
各場合において、２５位に対応するアミノ酸がＦとは異なり、６４位に対応するアミノ酸がＬとは異なり、８８位に対応するアミノ酸がＴとは異なり、１５７位に対応するアミノ酸がＴとは異なり、１６５位に対応するアミノ酸がＲとは異なり、１６９位に対応するアミノ酸がＶとは異なり、１７４位に対応するアミノ酸がＥとは異なり、１８７位に対応するアミノ酸がＳとは異なり、１９７位に対応するアミノ酸がＴまたはＭとは異なり、２３９位に対応するアミノ酸がＳとは異なり、３２７位に対応するアミノ酸がＳとは異なり、３２８位に対応するアミノ酸がＶとは異なり、３８４位に対応するアミノ酸がＹとは異なり、３８９位に対応するアミノ酸がＩとは異なり、３９１位に対応するアミノ酸がＤとは異なり、３９６位に対応するアミノ酸がＫとは異なり、４１０位に対応するアミノ酸がＨとは異なり、４１４位に対応するアミノ酸がＰとは異なる、タンパク質。
【請求項２】
以下の群から選択される、請求項１に記載のタンパク質：
ａ）  加えて、２位のアミノ酸がＳとは異なり、４８位のアミノ酸がＤとは異なり、１６４位のアミノ酸がＹとは異なり、２０２位のアミノ酸がＤとは異なり、２０５位のアミノ酸がＬとは異なり、２４２位のアミノ酸がＡとは異なり、２４５位のアミノ酸がＡとは異なり、３１１位のアミノ酸がＬとは異なり、３５３位のアミノ酸がＦとは異なり、３５９位のアミノ酸がＤとは異なり、４２４位のアミノ酸がＫとは異なり、４７５位のアミノ酸がＡとは異なり、４７６位のアミノ酸がＬとは異なり、４７７位のアミノ酸が欠失している以外は、請求項１のセクションａ）に規定するアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｂ）  加えて、４６位のアミノ酸がＴとは異なり、６０位のアミノ酸がＣとは異なり、１８５位のアミノ酸がＣとは異なり、１８６位のアミノ酸がＳとは異なり、１９５位のアミノ酸がＳとは異なり、２０５位のアミノ酸がＹとは異なり、２５２位のアミノ酸がＶとは異なり、２６８位のアミノ酸がＳとは異なり、４０９位のアミノ酸がＲとは異なり、４３６位のアミノ酸がＡとは異なり、４７７位、４７８位、４７９位のアミノ酸が欠失している以外は、請求項１のセクションｂ）に規定するアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｃ）  加えて、２位のアミノ酸がＳとは異なり、４８位のアミノ酸がＤとは異なり、６９位のアミノ酸がＰとは異なり、９０位のアミノ酸がＳとは異なり、１６４位のアミノ酸がＹとは異なり、２４２位のアミノ酸がＡとは異なり、２４５位のアミノ酸がＡとは異なり、２６８位のアミノ酸がＴとは異なり、３１１位のアミノ酸がＬとは異なり、３１８位のアミノ酸がＥとは異なり、３２２位のアミノ酸がＲとは異なり、３５３位のアミノ酸がＳとは異なり、４２４位のアミノ酸がＫとは異なり、４５２位のアミノ酸がＥとは異なる、以外は請求項１のセクションｃ）に規定するアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｄ）  加えて、４６位のアミノ酸がＴとは異なり、６０位のアミノ酸がＣとは異なり、１８５位のアミノ酸がＣとは異なり、１８６位のアミノ酸がＣとは異なり、１９５位のアミノ酸がＳとは異なり、２０５位のアミノ酸がＹとは異なり、２５２位のアミノ酸がＶとは異なり、２６８位のアミノ酸がＳとは異なり、４０９位のアミノ酸がＲとは異なり、４３６位のアミノ酸がＡとは異なる以外は、請求項１セクションｄ）に規定するアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｅ）  加えて、４８位のアミノ酸がＤとは異なり、１６４位のアミノ酸がＹとは異なり、２４２位のアミノ酸がＡとは異なり、２４５位のアミノ酸がＡとは異なり、２５５位のアミノ酸がＦとは異なり、４２４位のアミノ酸がＫとは異なる以外は、請求項１セクションｅ）に規定するアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｆ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）の下で規定されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）でそれぞれ規定される各アミノ酸の位置が、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）又はｅ）の各々で規定されるアミノ酸配列と少なくとも６０％同一であるタンパク質配列のアミノ酸配列において対応するアミノ酸の位置にも存在する、タンパク質。
【請求項３】
以下の群から選択される、請求項１又は２のいずれかのタンパク質；
ａ）  配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｂ）  配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号１８における２５、６４、８８、１５７、１６５、１６９、１７４、１８７、１９７、２３９、３２７、３２８、３８４、３８９、３９１、３９６、４１０および４１４位に対応するアミノ酸が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、タンパク質；
ｃ）  配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号１８における２、２５、４６、４８、６０、６４、６９、８８、９０、１５７、１６４、１６５、１６９、１７４、１８７、１９５、１９７、２０２、２０５、２３９、２４２、２４５、２５２、２５５、２６８、３１１、３１８、３２２、３２７、３２８、３５３、３５９、３８４、３８９、３９１、３９６、４０９、４１０、４１４、４２４、４３６、４５２、４７５、４７６および４７７位に対応するアミノ酸が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、タンパク質。
【請求項４】
以下よりなる群より選択される請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ａ）  １６６位のアミノ酸がＧであり、３２７位のアミノ酸がＱであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｂ）  ３２７位のアミノ酸がＱであり、３８４位のアミノ酸がＳであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｃ）  ３２６位のアミノ酸がＱであり、３２７位のアミノ酸がＱであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｄ）  ３２７位のアミノ酸がＱであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｅ）  ３２６位のアミノ酸がＦであり、３２７位のアミノ酸がＱであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｆ）  ３２７位のアミノ酸がＣであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｇ）  ３２７位のアミノ酸がＩであることを定める請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質；
ｈ）  ３２７位のアミノ酸がＭであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｉ）  １６４位のアミノ酸がＹであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｊ）  １６４位のアミノ酸がＳであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｋ）  ３２７位のアミノ酸がＶであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｌ）  ４０９位のアミノ酸がＲであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｍ）  ３２７位のアミノ酸がＳであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｎ）  ２７１位のアミノ酸がＩであることを定める請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質；
ｏ）  ３２９位のアミノ酸がＧであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｐ）  ４０９位のアミノ酸がＰであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｑ）  ４１４位のアミノ酸がＭであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｒ）  １６５位のアミノ酸がＫであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｓ）  ４１４位のアミノ酸がＲであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｔ）  ４１４位のアミノ酸がＨであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｕ）  １６５位のアミノ酸がＣであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｖ）  ３２７位のアミノ酸がＶであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｗ）  １６４位のアミノ酸がＣであることを定める請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質；
ｘ）  ４０９位のアミノ酸がＫであることを定める、請求項１〜３のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項５】
以下からなる群より選択される請求項４に記載のタンパク質：
ａ）  配列番号１８の１６６位のアミノ酸ＳがＧで置換され、配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換されていること以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｂ）配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換され、配列番号１８の３８４位のアミノ酸ＣがＳで置換されていること以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｃ）  配列番号１８の３２６位のアミノ酸ＥがＱで置換され、配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換されている以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｄ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｅ）  配列番号１８の３２６位のアミノ酸ＥがＦで置換され、配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換されている以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｆ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＣで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｇ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＩで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｈ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＭで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｉ）  配列番号１８の１６４位のアミノ酸ＦがＹで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｊ）  配列番号１８の１６４位のアミノ酸ＦがＳで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｋ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＶで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｌ）  配列番号１８の４０９位のアミノ酸ＴがＲで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｍ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＳで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｎ）  配列番号１８の２７１位のアミノ酸ＶがＩで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｏ）  配列番号１８の３２９位のアミノ酸ＳがＧで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｐ）  配列番号１８の４０９位のアミノ酸ＴがＰで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｑ）  配列番号１８の４１４位のアミノ酸ＬがＭで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｒ）  配列番号１８の１６５位のアミノ酸ＱがＫで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｓ）  配列番号１８の４１４位のアミノ酸ＬがＲで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｔ）  配列番号１８の４１４位のアミノ酸ＬがＨで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｕ）  配列番号１８の１６５位のアミノ酸ＱがＣで置換されている以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｖ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＶで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｗ）  配列番号１８の１６４位のアミノ酸ＦがＣで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｘ）  配列番号１８の４０９位のアミノ酸ＴがＫで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｙ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のそれぞれで規定されるアミノ酸配列位置が、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のそれぞれで規定されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも６０％同一性を有するタンパク質配列のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置にも存在する、タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項７】
以下からなる群より選択されるω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする、請求項６に記載の核酸分子：
ａ）   配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）   配列番号１８に示されるアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）   配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する核酸分子であって、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３〜７５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１９０〜１９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６２〜２６４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４６９〜４７１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５に対応するコドンは、配列番号１７のヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５０５〜５０７に対応するコドンは、配列番号１７のヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５２０〜５２２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８９〜５９１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５９〜５６１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７１５〜７１７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９８２〜９８４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１５０〜１１５２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｇｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１６５〜１１６７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１７１〜１１７３に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１８６〜１１８８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２８〜１２３０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有する；
ｄ）  配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する核酸分子であって、
配列番号１７のヌクレオチド位置４〜６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３〜７５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３６〜１３８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｇを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１４２〜１４４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１７８〜１８０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１９０〜１９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２０５〜２０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６２〜２６４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６８〜２７０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４６９〜４７１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｔｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５０５〜５０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５２０〜５２２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５３〜５５５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５６〜５５８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５９〜５６１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８３〜５８５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８９〜５９１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置６０４〜６０６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置６１３〜６１５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｇｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７１５〜７１７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７２４〜７２６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３３〜７３５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７５４〜７５６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７６３〜７６５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置８０２〜８０４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９３１〜９３３に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９５２〜９５４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９６４〜９６６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９８２〜９８４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１０５７〜１０５９に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１０７５〜１０７７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１５０〜１１５２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１６５〜１１６７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１７１〜１１７３に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１８６〜１１８８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２８〜１２３０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２７０〜１２７２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３０６〜１３０８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３５４〜１３５６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有する；
ｅ）  ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義される核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする核酸分子であり、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置７３〜７５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１９０〜１９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置２６２〜２６４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置４６９〜４７１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置４９３〜４９５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置５０５〜５０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置５２０〜５２２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置５５９〜５６１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置７１５〜７１７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置９７９〜９８１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置９８２〜９８４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１１５０〜１１５２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｇｙを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１１６５〜１１６７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１１７１〜１１７３に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１１８６〜１１８８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１２２８〜１２３０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１２４０〜１２４２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有する；
ｆ）  ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義される核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする核酸分子であり、
配列番号１７のヌクレオチド位置４〜６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３〜７５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３６〜１３８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｇを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１４２〜１４４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１７８〜１８０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１９０〜１９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２０５〜２０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６２〜２６４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６８〜２７０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４６９〜４７１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｔｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５０５〜５０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５２０〜５２２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５３〜５５５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５６〜５５８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５９〜５６１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８３〜５８５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８９〜５９１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置６０４〜６０６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置６１３〜６１５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｇｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７１５〜７１７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７２４〜７２６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３３〜７３５に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７５４〜７５６に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７６３〜７６５に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置８０２〜８０４に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９３１〜９３３に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９５２〜９５４に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９６４〜９６６に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９８２〜９８４に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１０５７〜１０５９に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１０７５〜１０７７に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１５０〜１１５２に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１６５〜１１６７に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１７１〜１１７３に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１８６〜１１８８に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２８〜１２３０に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２７０〜１２７２に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３０６〜１３０８に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３５４〜１３５６に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有する；
ｇ）  遺伝コードの縮重により、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）で定義される核酸分子から逸脱した核酸分子；
ｈ）  配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子であり、配列番号１８の２５、６４、８８、１５７、１６５、１６９、１７４、１８７、２３９、３２７、３２８、３８４、３８９、３９１、３９６、４１０および４１４位に対応するアミノ酸が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、核酸分子；
ｉ）  配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子であり、配列番号１８の２、２５、４６、４８、６０、６４、６９、８８、９０、１５７、１６４、１６５、１６９、１７４、１８５、１８６、１８７、１９５、１９７、２０２、２０５、２３９、２４２、２４５、２５２、２５５、２６８、３１１、３１８、３２２、３２７、３２８、３５３、３５９、３８４、３８９、３９１、３９６、４０９、４１０、４１４、４２４、４３６、４５２、４７５および４７６位に対応するアミノ酸が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、核酸分子；
ｊ）   配列番号１６に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子。
【請求項８】
以下からなる群より選択されるω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする請求項６または７のいずれか一項に記載の核酸分子；
ａ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９６〜４９８のコドンがヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有し、配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１１５０〜１１５２のコドンがヌクレオチド配列ｗｓｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｃ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７６〜９７８のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有し、配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｄ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｅ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７６〜９７８のコドンがヌクレオチド配列ｔｔｙを有し、配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｆ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｇ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ａｔｈを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｈ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ａｔｇを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｉ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２のコドンがヌクレオチド配列ｔａｙを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｊ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２のコドンがヌクレオチド配列ｗｓｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｋ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｇｔｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｌ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７のコドンがヌクレオチド配列ｍｇｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｍ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｗｓｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｎ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置８１１〜８１３のコドンがヌクレオチド配列ａｔｈを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｏ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９８５〜９８７のコドンがヌクレオチド配列ｇｇｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｐ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７のコドンがヌクレオチド配列ｃｃｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｑ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２のコドンがヌクレオチド配列ａｔｇを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｒ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５のコドンがヌクレオチド配列ａａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｓ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２のコドンがヌクレオチド配列ｍｇｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｔ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２のコドンがヌクレオチド配列ｃａｙを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｕ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５のコドンがヌクレオチド配列ｔｇｙを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｖ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｇｔｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｗ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２のコドンがヌクレオチド配列ｔｇｙを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｘ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７のコドンがヌクレオチド配列ａａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｙ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のいずれかの核酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、
ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のそれぞれで規定されるコドン核酸配列が、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）で規定されるいずれかの核酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する核酸配列において、対応するコドン核酸位置に存在する、核酸分子。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
【請求項１０】
組換え核酸分子がベクターまたはプラスミドである、請求項９に記載の組換え核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質を含むか、または請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸分子を含むか、または請求項９または１０のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１２】
ａ）  アミン受容体分子を提供し；
ｂ）  アミン供与体分子を提供し；
ｃ）  工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させる、
段階を含む、アミンの製造方法。
【請求項１３】
ａ）  （Ｒ）−及び（Ｓ）−アミンエナンチオマーを含む組成物を提供し；
ｂ）  アミン受容体分子を提供し；
ｃ）  工程ａ）で提供される組成物および工程ｂ）で提供されるアミン受容体分子を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質と接触させる、
段階を含む、（Ｒ）−及び（Ｓ）−アミンエナンチオマーを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたω−トランスアミナーゼ（ω−ＴＡ）活性を有するタンパク質類、改良されたω−ＴＡ活性を有するそれぞれのタンパク質をコードする核酸分子、およびキラルアミンおよびアミノ酸の立体選択的合成のための方法、またはエナンチオマー混合物中のキラルアミン異性体の増加方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体触媒は、自然界で利用可能な酵素に基づくことができる。より多くの場合、特定の生成物を産生したいという願望が、特定の酵素に対する需要を生み出し、この酵素は、経済的に実行可能な量の目的生成物を大量に産生することに適応している。酵素工学は、所定の生成物の経済的生産に向けて酵素を最適化するための1つの選択肢である。
【０００３】
アミンとアミノ酸は、タンパク質や核酸の一部としてだけでなく、神経伝達物質(例えばアドレナリンやヒスタミン)として、補酵素の前駆体(例えば補酵素Ａのシステアミン)として、あるいは複合脂質(例えば、ホスファチジルエタノールアミンのエタノールアミン)の前駆体としても、自然界に広く存在している。特に、アルカロイドとして医薬的に分類される高置換アミンは、生命の様々な形態で見出される生物学的効果並びに莫大な多様な構造を示す。抗生物質性、鎮痛作用、神経毒性活性のようなアミンの生物活性は、医薬品としての可能性を高め、新薬の探索において非常に有望な候補となる。キラルアミンの立体中心の絶対配置は、生体分子との相互作用、ひいては生体系への影響のタイプにとってきわめて重要である。所望の標的分子の生産のためには、正しいキラリティの生成がしばしば課題となる。（Ｓｃｈａｅｔｚｌｅ，２０１１，Ｉｎａｕｇｕｒａｌ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｅｒｎｓｔ−Ｍｏｒｉｔｚ−Ａｒｎｄｔ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅｉｆｓｗａｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  （Ｒ）−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｍｉｎｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｓ”）。
【０００４】
製薬会社のパイプラインにある活性化合物の多くは、キラルである。光学活性アミンは、多くの活性な医薬および農産物の合成のための重要なクラスの化合物に属する。例えば、Ｌ−フェニルアラニンは動物飼料の重要な添加物である。エナンチオマー的に純粋なアミノ酸の化学合成のための商業的に実行可能なプロセスは利用できない。それにもかかわらず、ラセミ体の混合物を純粋な異性体に分割することは、場合によっては生体触媒プロセスによって可能であるため、ラセミ体アミノ酸の化学合成は依然として重要である。（Ｂｒｅｕｅｒら，２００４、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ４３，７８８−８２４）。
【０００５】
アミントランスアミナーゼまたはω−トランスアミナーゼ（ω−ＴＡ）は、キラルな第一級アミンの産生にとって非常に重要な生体触媒である。ω−ＴＡは、ピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）を補因子として利用し、アミノ供与体からカルボニル部分へのアミノ基の転移を触媒する。それゆえ、反応混合物は２つのアミン（アミノ供与体と生成物）と２つのカルボニル化合物（ケトン基質と副生成物）からなる。これまで、（Ｓ）−選択的および（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼの両方が見出され、よく記述されている。この酵素は、立体選択性が高く、直接的不斉アミノ化の可能性を有し、安価なアミノ供与体を用いてアキラルなケトンから直接的に高いエナンチオマー過剰でキラルなアミンを生成する。（Ｆｅｓｋｏら、２０１３，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ９６，１０３−１１０）。
【０００６】
トランスアミナーゼは、多種多様なキラルアミンおよびアミノ酸の生体触媒合成において注目を集めている。トランスアミナーゼは、ラセミ体アミノ酸の速度論的分割（一つの異性体を混合物として除去する）または対応するプロキラルケト基質から出発する不斉合成のいずれにも適用できる。トランスアミナーゼによって触媒される反応は、受容体の還元アミノ化と同時に供与体の酸化的脱アミノ化を伴う酸化還元反応と見なされることができる。（Ｒｕｄａｔら、２０１２，ＡＭＢ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ２：１１）。
【０００７】
Ｃａｎｎら（２０１２，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１６，１９５３−１９６６）は、片頭痛薬の製造のための前駆体であるα−アミノエステルの立体選択的生産のためのω−トランスアミナーゼの使用の成功を開示している。酵素的対化学的合成の利点と欠点を論じている。
【０００８】
ＵＳ４，９５０，６０６では、光学活性アミンの製造過程について述べている。このプロセスでは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ由来のω−トランスアミナーゼは、アミノ供与体からのアミノ基のエナンチオ選択的転移によって、プロキラルケトンまたはケト酸をアミンに変換する。アミンの（Ｒ）−および（Ｓ）−配置が得られ得る。
【０００９】
Ｐａｒｋら（２０１３，Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１，６９２９−６９３３）は、アミン供与体としてイソプロピルアミンおよびその他の様々な化合物を用いることにより、ケト酸からの非天然アミノ酸のエナンチオ選択的合成における様々なトランスアミナーゼの挙動を開示している。
【００１０】
Ｐａｒｋら（２０１３，ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ  ５，１７３４−１７３８）は、プロキラルアルキルケトンの熱力学的に好ましい不斉アミノ化のために（Ｒ）−または（Ｓ）−選択的ω−トランスアミナーゼを用いることが可能であることを、ワンポット反応にラセミ体アリールアルキルアミンをアミノ供与体として用いることで実証している。この反応では、過剰量のアミノ供与体の添加や共生成物の除去を必要としない。
【００１１】
アミノ供与体として２−プロピルアミン、１−プロピルアミンおよびラセミ−２−ブチルアミンを用いると、アラニンをアミノ供与体として用いる反応と比較して、ω−トランスアミナーゼ触媒反応は、最大３倍高い変換をもたらすことが実証されている。アミノ酸β−アラニンとアスパラギンは、アミノ供与体として乏しかった。芳香族残基を含むいくつかのメチルケトンについて、過剰の２−ブチルアミンまたは１−フェニルエチルアミンをアミノ供与体として用いた場合、光学的に純粋なアミンが高収率で得られた。平衡をシフトさせるためのそれ以上の工程は不要であった。（Ｆｅｓｋｏら、２０１３，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ９６，１０３−１１０）。
【００１２】
Ｓｈｉｎ＆Ｋｉｍ（２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５（８），１７８２−１７８８）は、アミン供与体として、（Ｓ）−α−メチルベンジルアミン（（Ｓ）−α−ＭＢＡ）、１−メチル−３−フェニルプロピルアミン、１−アミノテトラリンまたは１−アミノインダンを含むアリールアミンを用いたω−トランスアミナーゼの単離を開示している。良好なアミノ受容体は、ケト酸であるピルビン酸とグリオキシル酸、あるいはアルデヒドであるプロピオンアルデヒドとブタルアルデヒドであることが分かった。
【００１３】
ＵＳ６，１３３，０１８は、メトキシアセトンとアキラルなアミノ供与体２−アミノプロパンをω−トランスアミナーゼと接触させることによる、（Ｓ）−１−メトキシ−２−アミノプロパンの生成を開示している。
【００１４】
Ｄ−アラニンをアミノ供与体として用いるＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）によって触媒されるケト酸のそれぞれのＤ−アミノ酸への変換によるＤ−アミノ酸の産生のための４つの酵素系は、Ｇａｌｋｉｎら（１９９７，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ  ８３（３），２９９−３００）に以下のように記載する。Ｄ−アミノ酸の方向への反応平衡を駆動するために、さらに反応をＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼと縮合させた。ピルビン酸とアンモニアはアラニンデヒドロゲナーゼによってＬ−アラニンに変換され、同時にＮＡＤＨをＮＡＤに還元する。Ｌ−アラニンは、アラニンラセマーゼによってＤ−アラニンに変換される。ＮＡＤからのＮＡＤＨの再利用は、ギ酸デヒドロゲナーゼによって触媒されるギ酸からの二酸化炭素の生成によって確立される。ピルビン酸は、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ反応によってアラニンから再利用される。グルタミン酸、ロイシン、ノルロイシンおよびメチオニンのＤ−エナンチオマーは高収率で生産できたが、Ｄ−フェニルアラニンおよびＤ−チロシンは低収率で合成され、Ｄ−ノルバリンは３０％の接近でしか生産できず、アミノ酪酸はラセミ混合物としてのみ生産された。
【００１５】
ＷＯ２０１０／０８９１７１Ａ２は、トランスアミナーゼ活性を有する酵素によって触媒される反応において、多環式環系を含む少なくとも１つのケト基中の少なくとも１つのケト基をアミノ基にアンモニア化するための方法を開示する。
【００１６】
ＷＯ２０１５／１９５７０７Ａ１（ＵＳ２０１５３６１４６８Ａ１）は、トランスジェニック細菌による５炭素ポリマー構成単位の生産を開示している。細菌の生合成経路は、ω−トランスアミナーゼを含む複数の酵素の導入によって操作される。ω−トランスアミナーゼは、グルタル酸セミ−アルデヒドの５−アミノペンタノエートへの触媒反応と逆反応、５−アミノペンタノールから５−オキソペンタノール、カダベリンから５−アミノペンタナール、Ｎ５−アセチル−１，５−ジアミノペンタンからＮ５−アセチル−５−アミノペンタナールへの触媒反応を示し、Ｌ−グルタミン酸／２−オキソグルタル酸またはＬ−アラニン／ピルビン酸を、それぞれアミノ供与体／受容体として用いた。
【００１７】
ＫＲ２００３００７２０６７は、Ｌ−選択的芳香族アミノ酸トランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）を含む好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．Ｔ３０株の単離、およびこの株の高反応温度での芳香族Ｌ−アミノ酸の生産のための生体触媒としての使用を開示し、それによりケト酸基質の溶解度を増加させる。
【００１８】
Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら（２０１０，ＣｈｅｍＣａｔ  Ｃｈｅｍ  ２（１），７３−７７、「Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を含む）は、対応するプロキラルアミンからのエナンチオマー的に純粋なアミンの合成およびラセミアミンの分割のための全細胞触媒の使用を開示している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＳＣ６３９４由来の異なるω−トランスアミナーゼ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  Ｙ２ｋ−２、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ＤＳＭ３０１９１、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓのω−トランスアミナーゼのＷ５７Ｇ変異体、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種由来のＣＮＢ０５−０１と呼ばれる変異体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞で発現する。凍結乾燥したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞を、速度論的分割と立体選択的アミノ化反応に用いた。
【００１９】
トランスアミナーゼの使用により到達可能な生成物の範囲は、ケトンに隣接する位置でエチル基よりもかなり大きい基質を受け入れないために、大部分の天然に存在するω−トランスアミナーゼの特性により制限される（Ｓａｖｉｌｅら、２０１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９、３０５−３０９、「Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を含む）。Ｐａｒｋら（２０１４、Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．３５６、２１２−２２０）は、ｎ−ブチル基（例えば、２−オキソヘキサン酸ｎ−ヘキシル）までの置換基を有する基質を受け入れたが、分枝鎖α−ケト酸を受け入れなかったＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ由来の（Ｓ）−選択的ω−トランスアミナーゼを発見した。Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓからの（Ｓ）選択的ωトランスアミナーゼの変異体（Ｖ１５３Ａ）は、直鎖のケト酸（Ｓ）−１−フェニルブチルアミンに対して活性の改善を示したが、分岐ケト酸を受け入れなかった。
【００２０】
それぞれの野生型配列のアミノ酸配列と比較して１７アミノ酸置換を含む中温性Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｒｅｕｓ  ω−トランスアミナーゼの変異体は、アミン供与体としてのイソプロピルアミンの存在下で置換テトラロンから置換（Ｓ）−アミノテトラリンを産生する反応において、熱安定性の改善および比活性の有意な改善を示す。（Ｍａｒｔｉｎら、２００７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３７，２４６−２５５）。
【００２１】
Ｓａｖｉｌｅら（２０１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９、３０５−３０９、「Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を含む）は、ω−トランスアミナーゼを含む生体触媒プロセスによる複雑な抗糖尿病薬シタグリプチンの製造を開示する。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（Ｒ）選択的ω−トランスアミナーゼ（ＡＴＡ−１１７）の種々の変異体を作製した。酵素は広い基質範囲を示し、イソプロピルアミンおよび有機溶媒に対する耐性が増加する。これらの酵素により、種々のトリフルオロメチル置換アミンおよびフェニルアミンを産生することができた。野生型酵素と比較して２７アミノ酸置換を含むＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（Ｒ）−選択的ω−トランスアミナーゼ（ＡＴＡ−１１７）の最適化変異体を用いて、アミン供与体としてイソプロピルアミンの存在下でプロシタグリプチンケトンのアミノ化によりシタグリプチンを生産した。
【００２２】
ＷＯ２００６／０６３３９（ＵＳ７，２４７，４６０）は、それぞれの場合に野生型酵素と比較した場合、熱安定性であり、増加した反応速度および高いアミン供与体濃度に対する耐性を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｔｅｒｕｓ  ω−トランスアミナーゼ変異体を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】ＵＳ４，９５０，６０６
【特許文献２】ＵＳ６，１３３，０１８
【特許文献３】ＷＯ２０１０／０８９１７１
【特許文献４】ＷＯ２０１５／１９５７０７
【特許文献５】ＫＲ２００３００７２０６７
【特許文献６】ＷＯ２００６／０６３３９
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、４３，７８８−８２４，２００４
【非特許文献２】ＡＭＢ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，２：１１、２０１２
【非特許文献３】Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．１６，１９５３−１９６６、２０１２
【非特許文献４】Ｏｒｇａｎｉｃ＆Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１，６９２９−６９３３、２０１３
【非特許文献５】ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ、５，１７３４−１７３８、２０１３
【非特許文献６】Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ、９６，１０３−１１０、２０１３
【非特許文献７】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５（８），１７８２−１７８８、２００１
【非特許文献８】Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ、８３（３），２９９−３００、１９９７
【非特許文献９】ＣｈｅｍＣａｔ  Ｃｈｅｍ、２（１），７３−７７、２０１０
【非特許文献１０】Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２９、３０５−３０９、２０１０
【非特許文献１１】Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．３５６、２１２−２２０、２０１４
【非特許文献１２】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｊｏｕｒｎａｌ、３７，２４６−２５５、２００７
【非特許文献１３】Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２９、３０５−３０９、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
トランスアミナーゼのいくつかの改良がこれまでに達成されているが、不利な平衡、基質および生成物阻害、不十分な熱安定性、不十分な基質特異性およびときにトランスアミナーゼの低いエナンチオ選択性のような、アミンの不斉合成またはラセミアミンの分割の間に生じる制限は、産業スケールでの広範囲のアミンの効率的生産のためにまだ克服しなければならない。
【００２６】
したがって、ω-トランスアミナーゼのさらなる改良が必要である。特に、所望のアミノ化された、エナンチオマー富化された、または純粋な生成物の生産に関して、好ましくは、特定のおよび／または経済的に実行可能な生産プロセスの下で、更なるω-トランスアミナーゼの改良プロセスが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明は、それらのアミノ酸配列における改変を含むω−トランスアミナーゼ（ω−ＴＡｓ）変異体、又は、それらのアミノ酸配列における追加の改変を含むω−ＴＡｓの更なる改変変異体、これらの変異体、及び、各々の野生型ω−ＴＡｓと比較して、改良された反応速度、改良された基質受容性及び改良された比活性を有する、更なるアミノ酸改変を含む更なる改変変異体を提供する。したがって、本発明の改変体およびさらなるアミノ酸改変を含む改変体は、それぞれの野生型ω−ＴＡの使用によって達成できない、新しいアミノ化生成物またはそれぞれの生成物の前駆体の生産方法において、アミノ化生成物の経済的に効率的な生産プロセスの開発を可能にする。
【００２８】
本明細書に記載されているω−ＴＡ変異体またはさらなる改変変異体は、既知の野生型および他の既知のω−ＴＡよりも有利である。特に、本明細書に記載されている改変型または変異型ω−ＴＡは、それぞれの野生型ω−トランスアミナーゼでは産生できない、例えば分枝鎖または芳香族アミノ酸のような、エナンチオマー的に濃縮されたまたはエナンチオマー的にほぼ純粋または純粋な化合物を産生できるという利点を有する。本明細書中に記載されるω−ＴＡのさらなる改変された変異体は、それらが、ホスホ−アミノ酸のエナンチオマー的に富化された、ほぼ純粋な、または純粋な化合物を生成し得るという利点を有する。
【００２９】
配列番号３の１〜４７７位は、受託番号５Ｇ０９＿ＡのＧｅｎＰｅｐｔ（ＰＤＢ）由来のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型ω−トランスアミナーゼ（ω−ＴＡ）のアミノ酸配列を表す。
【００３０】
配列番号６の１〜４７９位は、受託番号５Ｇ２Ｐ＿ＡのＧｅｎＰｅｐｔ（ＰＤＢ）に由来するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型ω−ＴＡのアミノ酸配列を表す。
【００３１】
配列番号９の１〜４７６位は、受託番号ＫＲＦ５２５２８．１のＧｅｎＰｅｐｔ（ＰＤＢ）に由来するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（土壌７６８０１Ｄ１、由来の野生型ω−ＴＡのアミノ酸配列を表す。
【００３２】
配列番号１２の１〜４７６位は、国際公開第２００６／０６３３６Ａ２号の配列番号１６から誘導できるＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来のω−ＴＡ変異体のアミノ酸配列を表す。
【００３３】
配列番号１５の１〜４７６位は、ＷＯ２００６／０６３３６Ａ２の配列番号２から誘導できるＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型ω−ＴＡのアミノ酸配列を表す。
【００３４】
本明細書中に記載されるのはω−ＴＡ活性を有するタンパク質であり、ここで、これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ω−ＴＡ活性を有する既知のタンパク質の変異体を表す。特に、本明細書に記載されているω−ＴＡ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３の１〜４７７位までのアミノ酸で表される、および／または配列番号６の１〜４７９位までのアミノ酸で表される、および／または配列番号９の１〜４７６位までのアミノ酸で表される、および／または配列番号１２の１〜４７６位までのアミノ酸で表される、および／または配列番号１５の１〜４７６位までのアミノ酸で表される変異体であって、ここで、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２および配列番号１５のそれぞれにおけるアミノ酸配列において、少なくとも２５、６４、８８、１５７、１６５、１６９、１７４、１８７、１９７、２３９、３２７、３２８、３８４、３８９、３９１、３９６、４１０および４１４位のアミノ酸は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１２および配列番号１５に示される配列のそれぞれのアミノ酸位置で与えられるアミノ酸とは異なる。
【００３５】
略称「ω−ＴＡ」が使用され、ここでは「ω−トランスアミナーゼ」を意味する。
【００３６】
本明細書中で使用される用語「変異体」とは、当該技術分野で知られている主題とは異なる主題を意味する。核酸分子およびタンパク質変異体に関しては、それぞれ、既知の配列から逸脱するが、同じ機能を有するタンパク質をコードするか、または同じ反応、例えばω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする機能を有する核酸配列またはアミノ酸配列を含むと理解される。核酸分子配列およびアミノ酸配列が既知の核酸配列およびタンパク質配列から逸脱することは、その配列が、対応して既知の核酸配列またはアミノ酸配列と比較して、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換（置換）および／または欠失および／または挿入をそれぞれ含むことを意味する。
【００３７】
本発明の第１の実施形態はω−ＴＡ活性を有するタンパク質に関し、ここで、タンパク質は、以下よりなる群から選択される：
【００３８】
ａ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸がＥとは異なり、１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、１９７位のアミノ酸がＭとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり、３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は、配列番号３に示す１〜４７７位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００３９】
ｂ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸がＥとは異なり、１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、１９７位のアミノ酸がＴとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり、３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は配列番号６に示す１〜４７９位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００４０】
ｃ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸がＥとは異なり、１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、１９７位のアミノ酸がＭとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり、３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は、配列番号９に示す１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００４１】
ｄ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸及び１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、Ｅとは異なり、１９７位のアミノ酸がＴとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり、３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は配列番号１２に示す１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００４２】
ｅ）  ２５位のアミノ酸がＦとは異なり、６４位のアミノ酸がＬとは異なり、８８位のアミノ酸がＴとは異なり、１５７位のアミノ酸がＴとは異なり、１６５位のアミノ酸がＲとは異なり、１６９位のアミノ酸がＶとは異なり、１７４位のアミノ酸および１８７位のアミノ酸がＳとは異なり、Ｅとは異なり、１９７位のアミノ酸がＭとは異なり、２３９位のアミノ酸がＳとは異なり３２７位のアミノ酸がＳとは異なり、３２８位のアミノ酸がＶとは異なり、３８４位のアミノ酸がＹとは異なり、３８９位のアミノ酸がＩとは異なり、３９１位のアミノ酸がＤとは異なり、３９６位のアミノ酸がＫとは異なり、４１０位のアミノ酸がＨとは異なり、４１４位のアミノ酸がＰとは異なる以外は配列番号１５に示す１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００４３】
ｆ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）またはｆ）に示すいずれかのアミノ酸配列における、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性のアミノ酸配列を有し、
各場合において、２５位に対応するアミノ酸がＦとは異なり、６４位に対応するアミノ酸がＬとは異なり、８８位に対応するアミノ酸がＴとは異なり、１５７位に対応するアミノ酸がＴとは異なり、１６５位に対応するアミノ酸がＲとは異なり、１６９位に対応するアミノ酸がＶとは異なり、１７４位に対応するアミノ酸がＥとは異なり、１８７位に対応するアミノ酸がＳとは異なり、１９７位に対応するアミノ酸がＴまたはＭとは異なり、２３９位に対応するアミノ酸がＳとは異なり、３２７位に対応するアミノ酸がＳとは異なり、３２８位に対応するアミノ酸がＶとは異なり、３８４位に対応するアミノ酸がＹとは異なり、３８９位に対応するアミノ酸がＩとは異なり、３９１位に対応するアミノ酸がＤとは異なり、３９６位に対応するアミノ酸がＫとは異なり、４１０位に対応するアミノ酸がＨとは異なり、４１４位に対応するアミノ酸がＰとは異なる、タンパク質。
【００４４】
アミノ酸略号Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙの意味は、以下の表４の下の段落「配列の記述」の元に導かれる。
【００４５】
第１のアミノ酸配列（例えば、配列番号３の６４位）の「ｘ位に相当するアミノ酸」とは、第１のアミノ酸配列と比較した場合の第２のアミノ酸配列のアミノ酸が、第２のアミノ酸配列のアミノ酸番号が第１のアミノ酸配列のアミノ酸番号と異なる場合の第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列とのペアワイズ配列アラインメントにおいて、第１のアミノ酸配列の位置ｘに現れることを意味する。
【００４６】
本発明の文脈において、配列同一性または配列が同一であるという用語「同一性」は、第１の核酸またはアミノ酸配列が、別の（第２の）核酸またはアミノ酸配列とそれぞれ配列長全体にわたって共有する同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数をパーセントで表したものを意味すると理解される。
【００４７】
「配列同一性」は、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴまたはＥｍｂｏｓｓプログラム「Ｎｅｅｄｌｅ」のような公知のソフトウェアで構成される全体的または局所的アラインメントアルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸または２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。これらのソフトウェアは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、２つのシークエンスを全長にわたってアラインメントし、マッチ数を最大化し、ギャップ数を最小化する。一般に、デフォルトのパラメータが用いられ、ギャップ生成ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチドおよびタンパク質のアラインメントともに）である。ヌクレオチドの場合、使用するデフォルトスコアリングマトリクスは、ＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリクスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９，１０９１５−１０９１９）。シークエンスアラインメントとパーセンテージシークエンス同一性のスコアは、例えば、ＥＢＩの世界中のウェブサイト（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／）でアクセス可能なＥＭＢＯＳＳなどのソフトウェアを用いて決定することができる。あるいは、一般的に知られているアルゴリズムやＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴのような出力フォーマットを用いてデータベース（ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋなど）に対して検索することでシークエンスの類似性や同一性を判定することができるが、好ましくは、ヒットを取得し、ペアワイズにアラインメントして、シークエンスの同一性を最終的に判定することができる。
【００４８】
好ましくは、ω−ＴＡ活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号１８の下で与えられたアミノ酸配列との比較によって決定され、ω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号１６または１７の下で与えられた核酸配列を、コンピュータプログラムの助けを借りて、それぞれ他のタンパク質または核酸分子と比較することによって決定される。互いに比較する配列が異なる長さの場合、同一性は、より短い配列がより長い配列と共有するアミノ酸またはヌクレオチドの数のそれぞれのパーセントにおける同一性を決定することによって決定される。好ましくは、同一性は、公知で公的に利用可能なコンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２（１９９４）、４６７３−４６８０）を用いて決定される。ＣｌｕｓｔａｌＷは、Ｊｕｌｉｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ＠ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ＤＥ）およびＴｏｂｙ（Ｇｉｂｓｏｎ＠ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ＤＥ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍｅｙｅｒｈｏｆｓｔｒａｓｓｅ  １，Ｄ  ６９１１７  ハイデルベルク、ドイツ、により公表されている。ＣｌｕｓｔａｌＷは、特にＩＧＢＭＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  ｅｔ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ，Ｂ．Ｐ．１６３，６７４０４  Ｉｌｌｋｉｒｃｈ  Ｃｅｄｅｘ，  Ｆｒａｎｃｅ；ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／）およびＥＢＩ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ１０  １ＳＤ，ＵＫ）のすべてのミラーリングインターネットページの、様々なインターネットページからダウンロードできる。
【００４９】
好ましくは、バージョン１．８のＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータプログラムを使用して、本発明の文脈で記述されるタンパク質と他のタンパク質との同一性を決定する。ここでパラメータは、以下のように設定しなければならない：ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＴＯＰＤＩＡＧ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＰＡＩＲＧＡＰ＝３、ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰＥＸＴＥＮＤ＝０．０５、ＧＡＰＤＩＳＴ＝８、ＭＡＸＤＩＶ＝４０、ＭＡＴＲＩＸ＝ＧＯＮＮＥＴ、ＥＮＤＧＡＰＳ（オフ）、ＮＯＰＧＡＰ、ＮＯＨＧＡＰ。
【００５０】
好ましくは、バージョン１．８のＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータプログラムを用いて、本発明に関連して記載された核酸分子のヌクレオチド配列と他の核酸分子のヌクレオチド配列との同一性を測定する。ここでは、以下のようにパラメータを設定する必要がある：
ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＴＯＰＤＩＡＧＳ＝４、ＰＡＩＲＧＡＰ＝５、ＤＮＡＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ、ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰＥＸＴ＝５、ＭＡＸＤＩＶ＝４０、ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮｓ：非加重。
【００５１】
さらに、同一性は、問題の核酸分子またはそれらによってコードされるタンパク質間に機能的および／または構造的等価性が存在することを意味する。機能的等価性とは、核酸分子配列またはアミノ酸配列がω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードすることを意味する。上記の分子と相同であり、かつこれらの分子の誘導体を表す核酸分子は、一般的に、これらの分子の改変体であり、これは、同じ生物学的機能を有するかまたは同じ反応を触媒する、すなわちω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする。これらは、天然に存在する変異体、例えば他の種由来の配列、または突然変異のいずれかであってもよく、これらの変異が天然の様式で生じていてもよく、または標的突然変異誘発によって導入されたものであってもよい。さらに、変異体は、合成的に製造される配列であってもよい。対立遺伝子変異体は、自然発生の変異体、または合成的に製造された変異体、または組換えＤＮＡ技術により生成された変異体のいずれかであり得る。しかしながら、本発明に関しては、これらの変異体は、ω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードし、本発明に係るタンパク質に関して本明細書に記載されるアミノ酸置換（置換）、欠失または挿入を含むことが決定的である。
【００５２】
特殊なタイプの誘導体は、例えば、遺伝コードの縮重の結果として本発明に記載されている核酸分子とは異なる核酸分子である。
【００５３】
ＮＣ−ＩＵＢＭＢ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）によると、トランスアミナーゼ（ＴＡｓ）は、トランスフェラーゼ（ＥＣ２）のクラスに属する。トランスフェラーゼは、ある化合物（一般に供与体とみなされる）から別の化合物（一般に受容体とみなされる）に、基、例えばメチル基またはグリコシル基を転移する酵素である。トランスフェラーゼのグループは、窒素性基を転移する酵素（ＥＣ２．６）を含む。ＴＡｓによって触媒される反応は、一般式（Ｉ）に従ってカルボニル基を含む化合物に−ＮＨ２基と−Ｈを転移させることによって、カルボニル受容体の還元的アミノ化と併せて、（アミン）供与体の酸化的脱アミノ化を伴う酸化還元反応と正式にみなすことができる。
【００５４】
【化１】
2021532756.tif 000002
【００５５】
ＴＡｓでも触媒される逆反応は、一般式（Ｉａ）に従って正式に記述できる。
【００５６】
【化２】
2021532756.tif 000003
【００５７】
ＴＡｓは、ピリドキサール５'−リン酸（ＰＬＰ）依存酵素である。ＴＡ触媒反応に特有の特徴は、アミノ基の転移（共有結合性の基質−補酵素中間体を含む十分に確立された機構による）であり、トランスフェラーゼの中から特定のサブクラス、指定されたトランスアミナーゼまたはアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１）へのこれらの酵素の割り当てを正当化する。
【００５８】
ＴＡｓは、α−ＴＡｓおよびω−ＴＡｓとして当該技術分野でさらに一般的に分類される。この命名法は、それぞれのＴＡｓが転移するアミノ酸のアミノ酸基の相対的な位置に基づいている。アミンカルボン酸に関して、α−ＴＡｓはα−炭素のみのアミノ基のアミノ基転移を触媒し、ここでω−ＴＡｓは、非α−アミンにも作用し、それぞれの基質の遠位アミノ基を転移する。（Ｓｈｉｎら、２００３，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６１，４６３−４７１）。しかしながら、いくつかのω−ＴＡｓが、カルボキシル基を持たない（第一級）アミン化合物のアミノ基転移を触媒することができることは、当該技術分野において公知である（Ｒｕｄａｔら、２０１２、ＡＭＢ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ２（１１）；Ｓｈｉｎら、２００３、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６１、４６３−４７１）。
【００５９】
あるタンパク質がＴＡ活性を有する場合、特にω−ＴＡｓは、当該技術分野で既知かつ記述されている方法で検出することができる。ＣｕＳＯ４／ＭｅＯＨによるα−アミノ酸の青染色に基づくタンパク質のω−ＴＡ活性を検出するアッセイは、Ｈｗａｎｇ＆Ｋｉｍ（２００４，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４（５），４２９−４３６）により開発された。Ｔｒｕｐｐｏら（２００９，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．７，３９５−３９８）は、多酵素カスケードｐＨ−指示薬アッセイに基づくω−ＴＡｓの高スループットスクリーニングのためのアッセイについて記載しており、さらに従来のＨＰＬＣ分析アッセイを開示している。
【００６０】
本発明によるタンパク質がω−ＴＡ活性を有するか否かを検出するためにどの方法を用いるかは決定的ではない。好ましくは、本発明に関連して、「一般的方法」の下に記載される方法項目４が、本発明によるタンパク質がω−ＴＡ活性を有するかどうかを検出するために使用され、特に、この方法は、本発明によるω−ＴＡ変異体がω−ＴＡ活性を有するかどうかを検出するために使用される。
【００６１】
さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体、好ましくは「一般的方法」に記載される方法項目７は、本発明によるタンパク質がω−ＴＡ活性を有するか否かを検出するために使用される。
【００６２】
本発明の好ましい実施態様において、本発明によるタンパク質は（Ｓ）−選択的ω−ＴＡである。
【００６３】
用語「（Ｓ）−選択的」とは、本発明に関連して、一般式（Ｉ）による（アミン）受容体の還元的アミノ化により、（Ｒ）−エナンチオマーよりもエナンチオマー過剰で（Ｓ）−エナンチオマーを生成することを意味する。
【００６４】
（Ｓ）−選択的ω−ＴＡｓによって触媒される反応は、一般式（ＩＩ）に従って正式に記述できる。
【００６５】
【化３】
2021532756.tif 000004
【００６６】
本発明によるω−ＴＡ変異体タンパク質は、配列番号３、６、９、１２または１５に示されるアミノ酸配列に関して、本明細書中に上記されたアミノ酸配列と比較して、さらなるアミノ酸改変（アミノ酸置換、欠失または挿入）を示し得る。
【００６７】
上述の項目ａ）またはｃ）のω−ＴＡ変異体に加えて、配列番号３の１〜４７７位までのアミノ酸配列、または配列番号９の１〜４７７位までのアミノ酸配列は、それぞれ、２位および／または４８位および／または１６４位および／または２４２位および／または２４５位および／または３１１位および／または３５３位および／または４２４位に追加のアミノ酸置換を有することができ、
および／または、
配列番号３に示されるアミノ酸配列は、２０２位および／または２０５位および／または３５９位および／または４７５位および／または４７６位に追加のアミノ酸置換、および／または、４７７位にアミノ酸の欠失を有することができ、および／または、配列番号９に示されるアミノ酸配列は、６９位および／または９０位および／または２６８位および／または３１８位および／または３２２位および／または４５２位に追加のアミノ酸置換を有することができる。
【００６８】
上記項目ｂ）およびｄ）に記載のω−ＴＡ変異体に加えて、配列番号６の１〜４７９位までに示されるアミノ酸配列、または配列番号１２の１〜４７６位までに示されるアミノ酸配列は、それぞれ、４６位および／または６０位および／または１８５位および／または１８６位および／または１９５位および／または２０５位および／または２５２位および／または２６８位および／または４０９位および／または４３６位に追加のアミノ酸置換、および／または、配列番号６に示されるアミノ酸配列において、４７７位および／または４７８位および／または４７９位のアミノ酸を欠失させることができる。
【００６９】
上記項目ｅ）のω−ＴＡ変異体に加えて、配列番号１５の１〜４７６位までに示されるアミノ酸配列は、４８位および／または１６４位および／または２４２位および／または２４５位および／または２５５位および／または４２４位に追加のアミノ酸置換を有することができる。
【００７０】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、さらなるアミノ酸改変を含む本発明のタンパク質に関するものであり、好ましくは、それらの実施形態はω−ＴＡ活性を有するタンパク質であり、ここでタンパク質は、以下よりなる群から選択され：
ａ）  ２５位のアミノ酸がＦと異なり、６４位のアミノ酸がＬと異なり、８８位のアミノ酸がＴと異なり、１５７位のアミノ酸がＴと異なり、１６５位のアミノ酸がＲと異なり、１６９位のアミノ酸がＶと異なり、１７４位のアミノ酸がＥと異なり、１８７位のアミノ酸がＳと異なり、１９７位のアミノ酸がＭと異なり、２３９位のアミノ酸がＳと異なり、３２７位のアミノ酸がＳと異なり、３２８位のアミノ酸がＶと異なり、３８４位のアミノ酸がＹと異なり、３８９位のアミノ酸がＩと異なり、３９１位のアミノ酸がＤと異なり、３９６位のアミノ酸がＫと異なり、４１０位のアミノ酸はＨと異なり、４１４位のアミノ酸はＰと異なり、２位のアミノ酸はＳと異なり、４８位のアミノ酸はＤと異なり、１６４位のアミノ酸はＹと異なり、２０２位のアミノ酸はＤと異なり、２０５位のアミノ酸はＬと異なり、２４２位のアミノ酸はＡと異なり、２４５位のアミノ酸はＡと異なり、３１１位のアミノ酸はＬと異なり、３５３位のアミノ酸はＦと異なり、３５９位のアミノ酸はＤと異なり、４２４位のアミノ酸はＫと異なり、４７５位のアミノ酸はＡと異なり、４７６位のアミノ酸はＬと異なり、４７７位のアミノ酸は欠失している以外は、配列番号３に示す１〜４７７位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００７１】
ｂ）  ２５位のアミノ酸がＦと異なり、６４位のアミノ酸がＬと異なり、８８位のアミノ酸がＴと異なり、１５７位のアミノ酸がＴと異なり、１６５位のアミノ酸がＲと異なり、１６９位のアミノ酸がＶと異なり、１７４位のアミノ酸がＥと異なり、１８７位のアミノ酸がＳと異なり、１９７位のアミノ酸がＴと異なり、２３９位のアミノ酸がＳと異なり、３２７位のアミノ酸がＳと異なり、３２８位のアミノ酸がＶと異なり、３８４位のアミノ酸がＹと異なり、３８９位のアミノ酸がＩと異なり、３９１位のアミノ酸がＤと異なり、３９６位のアミノ酸がＫと異なり、４１０位のアミノ酸はＨと異なり、４１４位のアミノ酸はＰと異なり、４６位のアミノ酸はＴと異なり、６０位のアミノ酸はＣと異なり、１８５位のアミノ酸はＣと異なり、１８６位のアミノ酸はＳと異なり、１９５位のアミノ酸はＳと異なり、２０５位のアミノ酸はＹと異なり、２５２位のアミノ酸はＶと異なり、２６８位のアミノ酸はＳと異なり、４０９位のアミノ酸はＲと異なり、４３６位のアミノ酸はＡと異なり、４７７位、４７８位、４７９位のアミノ酸は欠失している以外は、配列番号６に示す１〜４７９位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００７２】
ｃ）２５位のアミノ酸がＦと異なり、６４位のアミノ酸がＬと異なり、８８位のアミノ酸がＴと異なり、１５７位のアミノ酸がＴと異なり、１６５位のアミノ酸がＲと異なり、１６９位のアミノ酸がＶと異なり、１７４位のアミノ酸がＥと異なり、１８７位のアミノ酸がＳと異なり、１９７位のアミノ酸がＭと異なり、２３９位のアミノ酸がＳと異なり、３２７位のアミノ酸がＳと異なり、３２８位のアミノ酸がＶと異なり、３８４位のアミノ酸がＹと異なり、３８９位のアミノ酸がＩと異なり、３９１位のアミノ酸がＤと異なり、３９６位のアミノ酸がＫと異なり、４１０位のアミノ酸はＨと異なり、４１４位のアミノ酸はＰと異なり、２位のアミノ酸はＳと異なり、４８位のアミノ酸はＤと異なり、６９位のアミノ酸はＰと異なり、９０位のアミノ酸はＳと異なり、１６４位のアミノ酸はＹと異なり、２４２位のアミノ酸はＡと異なり、２４５位のアミノ酸はＡと異なり、２６８位のアミノ酸はＴと異なり、３１１位のアミノ酸はＬと異なり、３１８位のアミノ酸はＥと異なり、３２２位のアミノ酸はＲと異なり、３５３位のアミノ酸はＳと異なり、４２４位のアミノ酸はＫと異なり、４５２位のアミノ酸はＥと異なる以外は、配列番号９に示す１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００７３】
ｄ）  ２５位のアミノ酸がＦと異なり、６４位のアミノ酸がＬと異なり、８８位のアミノ酸がＴと異なり、１５７位のアミノ酸がＴと異なり、１６５位のアミノ酸がＲと異なり、１６９位のアミノ酸がＶと異なり、１７４位のアミノ酸がＥと異なり、１８７位のアミノ酸がＳと異なり、１９７位のアミノ酸がＴと異なり、２３９位のアミノ酸がＳと異なり、３２７位のアミノ酸がＳと異なり、３２８位のアミノ酸がＶと異なり、３８４位のアミノ酸がＹと異なり、３８９位のアミノ酸がＩと異なり、３９１位のアミノ酸がＤと異なり、３９６位のアミノ酸がＫと異なり、４１０位のアミノ酸はＨと異なり、４１４位のアミノ酸はＰと異なり、４６位のアミノ酸はＴと異なり、６０位のアミノ酸はＣと異なり、１８５位のアミノ酸はＣと異なり、１８６位のアミノ酸はＣと異なり、１９５位のアミノ酸はＳと異なり、２０５位のアミノ酸はＹと異なり、２５２位のアミノ酸はＶと異なり、２６８位のアミノ酸はＳと異なり、４０９位のアミノ酸はＲと異なり、４３６位のアミノ酸はＡと異なる以外は、配列番号１２に示す１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００７４】
ｅ）  ２５位のアミノ酸がＦと異なり、６４位のアミノ酸がＬと異なり、８８位のアミノ酸がＴと異なり、１５７位のアミノ酸がＴと異なり、１６５位のアミノ酸がＲと異なり、１６９位のアミノ酸がＶと異なり、１７４位のアミノ酸がＥと異なり、１８７位のアミノ酸がＳと異なり、１９７位のアミノ酸がＭと異なり、２３９位のアミノ酸がＳと異なり、３２７位のアミノ酸がＳと異なり、３２８位のアミノ酸がＶと異なり、３８４位のアミノ酸がＹと異なり、３８９位のアミノ酸がＩと異なり、３９１位のアミノ酸がＤと異なり、３９６位のアミノ酸がＫと異なり、４１０位のアミノ酸がＨと異なり、４１４位のアミノ酸がＰと異なり、４８位のアミノ酸がＤと異なり、１６４位のアミノ酸がＹと異なり、２４２位のアミノ酸がＡと異なり、２４５位のアミノ酸がＡと異なり、２５５位のアミノ酸がＦと異なり、４２４位のアミノ酸がＫと異なる以外は、配列番号１５に示す１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質；
【００７５】
ｆ）  ａ）（配列番号３に示す１〜４７７位のアミノ酸配列）における、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
２５位に相当するアミノ酸がＦとは異なり、６４位に相当するアミノ酸がＬと異なり、８８位に相当するアミノ酸がＴとは異なり、１５７位に相当するアミノ酸がＲとは異なり、１６５位に相当するアミノ酸がＲと異なり、１６９位に相当するアミノ酸がＶと異なり、１７４位に相当するアミノ酸がＥとは異なり、１８７位に相当するアミノ酸がＳと異なり、１９７位のアミノ酸がＭと異なり、２３９位に相当するアミノ酸がＭと異なり、３２７位に対応するアミノ酸がＳと異なり、３２８位に対応するアミノ酸はＶと異なり、３８４位に対応するアミノ酸がＹと異なり、３８９位に対応するアミノ酸がＩと異なり、３９１位に対応するアミノ酸がＤと異なり、３９６位に対応するアミノ酸がＫと異なり、４１０位に対応するアミノ酸がＨと異なり、４１４位に対応するアミノ酸がＰと異なり、２位に対応するアミノ酸がＳと異なり、４８位に対応するアミノ酸がＤと異なり、１６４位に対応するアミノ酸がＹと異なり、２０２位に対応するアミノ酸がＤと異なり、２０５位に対応するアミノ酸がＬと異なり、２４２位に対応するアミノ酸がＡと異なり、２４５位に対応するアミノ酸がＡと異なり、３１１位に対応するアミノ酸がＬと異なり、３５３位に対応するアミノ酸がＦと異なり、３５９位に対応するアミノ酸がＤと異なり、４２４位に対応するアミノ酸がＫと異なり、４７５位に対応するアミノ酸がＡと異なり、４７６位に対応するアミノ酸がＬと異なり、４７７位に対応するアミノ酸が欠失している、タンパク質；
【００７６】
ｇ）  ｂ）（配列番号６に示す１〜４７６位のアミノ酸配列）における、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
２５位に相当するアミノ酸はＦと異なり、６４位に相当するアミノ酸はＬと異なり、８８位に相当するアミノ酸はＴと異なり、１５７位に相当するアミノ酸はＴと異なり、１６５位に相当するアミノ酸はＲと異なり、１６９位に相当するアミノ酸はＶと異なり、１７４位に相当するアミノ酸はＥと異なり、１８７位に相当するアミノ酸はＳと異なり、１９７位のアミノ酸はＴと異なり、２３９位に相当するアミノ酸はＳと異なり、３２７位に対応するアミノ酸はＳと異なり、３２８位に対応するアミノ酸はＶと異なり、３８４位に対応するアミノ酸はＹと異なり、３８９位に対応するアミノ酸はＩと異なり、３９１位に対応するアミノ酸はＤと異なり、３９６位に対応するアミノ酸はＫと異なり、４１０位に対応するアミノ酸はＨと異なり、４１４位に対応するアミノ酸はＰと異なり、４６位に対応するアミノ酸はＴと異なり、６０位に対応するアミノ酸はＣと異なり、１８５位に対応するアミノ酸はＣと異なり、１８６位に対応するアミノ酸はＳと異なり、１９５位に対応するアミノ酸はＳと異なり、２０５位に対応するアミノ酸はＹと異なり、２５２位に対応するアミノ酸はＶと異なり、２６８位に対応するアミノ酸はＳと異なり、４０９位に対応するアミノ酸はＳと異なり、４３６位に対応するアミノ酸はＡと異なり、４７７位および４７８位および４７９位に対応するアミノ酸が欠失している、タンパク質；
【００７７】
ｈ）  ｃ）（配列番号９に示す１〜４７９位のアミノ酸配列）における、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％の
同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
２５に対応するアミノ酸はＦと異なり、６４位に対応するアミノ酸はＬと異なり、８８位に対応するアミノ酸はＴと異なり、１５７位に対応するアミノ酸はＴと異なり、１６５位に対応するアミノ酸はＲと異なり、１６９位に対応するアミノ酸はＶと異なり、１７４位に対応するアミノ酸はＥと異なり、１８７位に対応するアミノ酸はＳと異なり、１９７位のアミノ酸はＭと異なり、２３９位に対応するアミノ酸はＳと異なり、３２７位に対応するアミノ酸はＳと異なり、３２８位に対応するアミノ酸はＶと異なり、３８４位に対応するアミノ酸はＹと異なり、３８９位に対応するアミノ酸はＩと異なり、３９１位に対応するアミノ酸はＤと異なり、３９６位に対応するアミノ酸はＫと異なり、４１０位に対応するアミノ酸はＨと異なり、４１４位に対応するアミノ酸はＰと異なり、２位に対応するアミノ酸はＳと異なり、４８位に対応するアミノ酸はＤと異なり、６９位に対応するアミノ酸はＰと異なり、９０位に対応するアミノ酸はＳと異なり、１６４位に対応するアミノ酸はＹと異なり、２４２位に対応するアミノ酸はＡと異なり、２４５位に対応するアミノ酸はＡと異なり、２６８位に対応するアミノ酸はＴと異なり、３１１位に対応するアミノ酸はＬと異なり、３１８位に対応するアミノ酸はＥと異なり、３２２位に対応するアミノ酸はＲと異なり、３５３位に対応するアミノ酸はＳと異なり、４２４位に対応するアミノ酸はＫと異なり、４５２位に対応するアミノ酸はＥと異なる、タンパク質；
【００７８】
ｉ）  ｄ）（配列番号１２に示す１〜４７６位のアミノ酸配列）における、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
２５位に対応するアミノ酸はＦと異なり、６４位に対応するアミノ酸はＬと異なり、８８位に対応するアミノ酸はＴと異なり、１５７位に対応するアミノ酸はＴと異なり、１６５位に対応するアミノ酸はＲと異なり、１６９位に対応するアミノ酸はＶと異なり、１７４位に対応するアミノ酸はＥと異なり、１８７位に対応するアミノ酸はＳと異なり、１９７位のアミノ酸はＴと異なり、２３９位に対応するアミノ酸はＳと異なり、３２７位に対応するアミノ酸はＳと異なり、３２８位に対応するアミノ酸はＶと異なり、３８４位に対応するアミノ酸はＹと異なり、３８９位に対応するアミノ酸はＩと異なり、３９１位に対応するアミノ酸はＤと異なり、３９６位に対応するアミノ酸はＫと異なり、４１０位に対応するアミノ酸はＨと異なり、４１４位に対応するアミノ酸はＰと異なり、４６位に対応するアミノ酸はＴと異なり、６０位に対応するアミノ酸はＣと異なり、１８５位に対応するアミノ酸はＣと異なり、１８６位に対応するアミノ酸はＣと異なり、１９５位に対応するアミノ酸はＳと異なり、２０５位に対応するアミノ酸はＹと異なり、２５２位に対応するアミノ酸はＶと異なり、２６８位に対応するアミノ酸はＳと異なり、４０９位に対応するアミノ酸はＲと異なり、４３６位に対応するアミノ酸はＡと異なる、タンパク質；
【００７９】
ｊ）  ｅ）（配列番号１５に示す１〜４７６位のアミノ酸配列）における、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
２５に対応するアミノ酸はＦと異なり、６４に対応するアミノ酸はＬと異なり、８８に対応するアミノ酸はＴと異なり、１５７位に対応するアミノ酸はＴと異なり、１６５位に対応するアミノ酸はＲと異なり、１６９位に対応するアミノ酸はＶと異なり、１７４位に対応するアミノ酸はＥと異なり、１８７位のアミノ酸はＳと異なり、１９７位のアミノ酸はＭと異なり、２３９位に対応するアミノ酸はＳと異なり、３２７位に対応するアミノ酸はＳと異なり、３２８位に対応するアミノ酸はＶと異なり、３８４位に対応するアミノ酸はＹと異なり、３８９位に対応するアミノ酸はＩと異なり、３９１位に対応するアミノ酸はＤと異なり、３９６位に対応するアミノ酸はＫと異なり、４１０位に対応するアミノ酸はＨと異なり、４１４位に対応するアミノ酸はＰと異なり、４８位のアミノ酸はＤと異なり、１６４位のアミノ酸はＹと異なり、２４２位のアミノ酸はＡと異なり、２４５位のアミノ酸はＡと異なり、２５５位のアミノ酸はＦと異なり、４２４位のアミノ酸はＫと異なる、タンパク質。
【００８０】
配列番号１８の１〜４７６位は、配列番号３（１〜４７７位）、配列番号６（１〜４７９位）、配列番号９（１〜４７６位）、配列番号１２（１〜４７６位）および配列番号１５（１〜４７６位）の各アミノ酸配列と比較して、上記のすべてのアミノ酸変異体を含むω−ＴＡ変異体タンパク質のアミノ酸配列を表す。
【００８１】
表１は、野生型ω−ＴＡの各アミノ酸配列（配列番号３の１〜４７７位または配列番号６の１〜４７９位または配列番号９の１〜４７６位または配列番号１５の１〜４７６位）と比較して、ならびにＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の修飾ω−ＴＡ（配列番号１２の１〜４７６位）と比較して、本発明（配列番号１８の１〜４７６位）のω−ＴＡ変異タンパク質のアミノ酸配列に存在する修飾に存在する修飾を、要約する。
【００８２】
【表１】
2021532756.tif 000005
2021532756.tif 000006
【００８３】
表1の「末端」は、それぞれ既知(野生型)配列のアミノ酸配列中に存在する最後のアミノ酸の後の位置を示す。
【００８４】
従って、本発明の好ましい実施形態は、以下からなる群から選択されるω−ＴＡ活性を有する本発明に係るタンパク質に関する：
ａ）  配列番号１８に示される１〜４７６位までのアミノ酸配列を含むタンパク質；
ｂ）  配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号１８における２５、６４、８８、１５７、１６５、１６９、１７４、１８７、１９７、２３９、３２７、３２８、３８４、３８９、３９１、３９６、４１０および４１４位に対応するアミノ酸が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す；
ｃ）  配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、但し、配列番号１８における２、２５、４６、４８、６０、６４、６９、８８、９０、１５７、１６４、１６５、１６９、１７４、１８５、１８６、１８７、１９５、１９７、２０２、２０５、２３９、２４２、２４５、２５２、２５５、２６８、３１１、３１８、３２２、３２７、３２８、３５３、３５９、３８４、３８９、３９１、３９６、４０９、４１０、４１４、４２４、４３６、４５２、４７５および４７６位に対応するアミノ酸が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す。
【００８５】
最も好ましい実施形態において、ω−ＴＡをコードする本発明によるタンパク質は、配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００８６】
本明細書中でこれまでに記載されているタンパク質は、本発明によるω−ＴＡ変異体またはタンパク質変異体として本明細書中で一般的に言及される。
【００８７】
本発明によるタンパク質変異体へのさらなるアミノ酸改変の導入は、ω−ＴＡ変異体の活性を、特にその基質特異性に関してさらに改善することが見出され、これは、これらのさらなる改変ω−ＴＡ変異体が、本明細書中上記のω−ＴＡ変異体と比較して、エナンチオマー的に富化された、またはほぼ純粋な生成物を生成するためにより良好に適合されることを意味する。さらなる修飾を含むω−ＴＡは、本発明によるタンパク質として本明細書中に上記したω−ＴＡ変異体と比較してさらに修飾される。さらなる改変を含むω−ＴＡ変異体は、特に、エナンチオマー的に富化された、またはエナンチオマー的にほぼ純粋なホスホ−アミノ酸を生成するのに適しており、本明細書では、さらなるアミノ酸改変を含む、または、さらなるアミノ酸改変を含む本発明によるタンパク質を含む、ω−ＴＡ変異体と称される。
【００８８】
さらなるアミノ酸改変を有するω−ＴＡ変異体に関して、あるタンパク質がω−ＴＡ活性を有することを示すために好ましい方法は、例えば、ＷＯ２０１７／１５１５７３に記載されており、さらなるアミノ酸改変を有するω−ＴＡ変異体を示すための特定の好ましい方法は、本明細書中で「一般的方法」項目７に記載されている。
【００８９】
「エナンチオマー富化」とは、本明細書において、２つのエナンチオマーの１つが他のエナンチオマーよりも多量に組成中に存在し、好ましくは１つのエナンチオマーの少なくとも６０％が組成中に存在し、より好ましくは１つのエナンチオマーの少なくとも６５％が組成中に存在し、より好ましくは１つのエナンチオマーの少なくとも７０％が組成中に存在し、より好ましくは１つのエナンチオマーの少なくとも７５％が組成中に存在し、さらにより好ましくは１つのエナンチオマーの少なくとも８０％が組成中に存在し、好ましくは１つのエナンチオマーの少なくとも８５％が組成中に存在し、最も好ましくは１つのエナンチオマーの少なくとも９０％が組成中に存在するか、または特に好ましくは１つのエナンチオマーの少なくとも９４％が組成中に存在する。
【００９０】
「エナンチオマーがほぼ純粋である」とは、本明細書では、２つのエナンチオマーのうちの１つが少なくとも９５．０％、好ましくは２つのエナンチオマーのうちの１つが少なくとも９５．５％の量で組成物中に存在し、より好ましくは２つのエナンチオマーのうちの１つが少なくとも９６．０％の量で組成物中に存在し、さらに好ましくは２つのエナンチオマーのうちの１つが少なくとも９６．５％の量で組成物中に存在し、さらにより好ましくは２つのエナンチオマーのうちの１つが少なくとも９７．０％の量で組成物中に存在し、さらにより好ましくは２つのエナンチオマーのうちの１つが少なくとも９８．０％の量で組成物中に存在し、特に好ましくは２つのエナンチオマーのうちの１つが少なくとも９８．５％の量で組成物中に存在し、最も好ましくは２つのエナンチオマーのうちの１つが少なくとも９９．０％の量で組成物中に存在し、または特に好ましくは２つのエナンチオマーのうちの１つが少なくとも９９．５％の量で組成物中に存在する。
【００９１】
したがって、本発明による別の実施形態は、ω−ＴＡ変異体の活性を有する本発明によるタンパク質変異体に関し、ここで、本発明によるアミノ酸配列は、本発明によるタンパク質と比較して、さらなるアミノ酸改変を含む。
【００９２】
好ましくは、さらなるアミノ酸改変を含む本発明のω−ＴＡ活性を有するタンパク質（ω−ＴＡ変異体）のアミノ酸配列に関する本発明の別の実施態様は、それゆえ、以下よりなる群から選択されるω−ＴＡ活性を有する本発明に係るタンパク質である；
ａ）  １６６位のアミノ酸がＧであり、３２７位のアミノ酸がＱであることを定める発明のタンパク質；
ｂ）  ３２７位のアミノ酸がＱであり、３８４位のアミノ酸がＳであることを定める発明のタンパク質；
ｃ）  ３２６位のアミノ酸がＱであり、３２７位のアミノ酸がＱであることを定める発明のタンパク質；
ｄ）  ３２７位のアミノ酸がＱであることを定める発明のタンパク質；
ｅ）  ３２６位のアミノ酸がＦであり、３２７位のアミノ酸がＱであることを定める発明のタンパク質；
ｆ）  ３２７位のアミノ酸がＣであることを定める発明のタンパク質；
ｇ）  ３２７位のアミノ酸がＩであることを定める発明のタンパク質；
ｈ）  ３２７位のアミノ酸がＭであることを定める発明のタンパク質；
ｉ）  １６４位のアミノ酸がＹであることを定める発明のタンパク質；
ｊ）  １６４位のアミノ酸がＳであることを定める発明のタンパク質；
ｋ）  ３２７位のアミノ酸がＶであることを定める発明のタンパク質；
ｌ）  ４０９位のアミノ酸がＲであることを定める発明のタンパク質；
ｍ）  ３２７位のアミノ酸がＳであることを定める発明のタンパク質；
ｎ）  ２７１位のアミノ酸がＩであることを定める発明のタンパク質；
ｏ）  ３２９位のアミノ酸がＧであることを定める発明のタンパク質；
ｐ）  ４０９位のアミノ酸がＰであることを定める発明のタンパク質；
ｑ）  ４１４位のアミノ酸がＭであることを定める発明のタンパク質；
ｒ）  １６５位のアミノ酸がＫであることを定める発明のタンパク質；
ｓ）  ４１４位のアミノ酸がＲであることを定める発明のタンパク質；
ｔ）  ４１４位のアミノ酸がＨであることを定める発明のタンパク質；
ｕ）  １６５位のアミノ酸がＣであることを定める発明のタンパク質；
ｖ）  ３２７位のアミノ酸がＶであることを定める発明のタンパク質；
ｗ）  １６４位のアミノ酸がＣであることを定める発明のタンパク質；
ｘ）  ４０９位のアミノ酸がＫであることを定める発明のタンパク質。
【００９３】
さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列に関して本発明のより好ましい実施形態は、以下からなる群から選択されるω−ＴＡ活性を有するタンパク質に関し；
ａ）  配列番号１８の１６６位のアミノ酸ＳがＧで置換され、配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換されていること以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｂ）配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換され、配列番号１８の３８４位のアミノ酸ＣがＳで置換されていること以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｃ）  配列番号１８の３２６位のアミノ酸ＥがＱで置換され、配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換されている以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｄ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｅ）  配列番号１８の３２６位のアミノ酸ＥがＦで置換され、配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＱで置換されている以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｆ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＣで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｇ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＩで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｈ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＭで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｉ）  配列番号１８の１６４位のアミノ酸ＦがＹで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｊ）  配列番号１８の１６４位のアミノ酸ＦがＳで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｋ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＶで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｌ）  配列番号１８の４０９位のアミノ酸ＴがＲで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｍ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＳで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｎ）  配列番号１８の２７１位のアミノ酸ＶがＩで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｏ）  配列番号１８の３２９位のアミノ酸ＳがＧで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｐ）  配列番号１８の４０９位のアミノ酸ＴがＰで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｑ）  配列番号１８の４１４位のアミノ酸ＬがＭで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｒ）  配列番号１８の１６５位のアミノ酸ＱがＫで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｓ）  配列番号１８の４１４位のアミノ酸ＬがＲで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｔ）  配列番号１８の４１４位のアミノ酸ＬがＨで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｕ）  配列番号１８の１６５位のアミノ酸ＱがＣで置換されている以外は、配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｖ）  配列番号１８の３２７位のアミノ酸ＴがＶで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｗ）  配列番号１８の１６４位のアミノ酸ＦがＣで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｘ）  配列番号１８の４０９位のアミノ酸ＴがＫで置換されている以外は、  配列番号１８に示すアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を有するタンパク質；
ｙ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のそれぞれで規定されるアミノ酸配列位置が、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のそれぞれで規定されるいずれかのアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性を有するタンパク質配列のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸位置にも存在する、タンパク質。
【００９４】
本発明の実施形態として、さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体の活性を有する好ましいタンパク質は、項目ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）およびｐ）に定義されるタンパク質であり、上記に定義されるタンパク質は、より好ましくは、項目ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）およびｈ）に定義されるタンパク質であり、最も好ましいのは、上記に定義される項目ａ）、ｂ）およびｃ）に定義されるタンパク質である。
【００９５】
表２は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列（１〜４７６位まで）と比較して、さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡのアミノ酸配列中に存在するさらなるアミノ酸改変を要約する。
【００９６】
2021532756.tif 000007
【００９７】
本発明の1つのさらなる実施形態は、本発明によるタンパク質をコードする核酸分子に関する。
【００９８】
本発明による核酸分子は、核酸が本発明によるタンパク質をコードする限り、任意の種類の核酸でよい。核酸は、リボ核酸分子（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸分子（イントロンおよびコードＤＮＡを含み得るかもしれないゲノムＤＮＡを含む）であり得る。
【００９９】
本発明にとって特に興味深いのは、配列番号１８の１〜４７６位に示されるアミノ酸配列を含むω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子である。
【０１００】
したがって、本発明はまた、以下からなる群から選択されるω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関し；
ａ）   配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）   配列番号１８に示されるアミノ酸配列の１〜４７６位のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）   配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性を有する核酸分子であって、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３〜７５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１９０〜１９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６２〜２６４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４６９〜４７１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５に対応するコドンは、配列番号１７のヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５０５〜５０７に対応するコドンは、配列番号１７のヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５２０〜５２２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８９〜５９１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５９〜５６１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７１５〜７１７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９８２〜９８４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１５０〜１１５２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｇｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１６５〜１１６７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１７１〜１１７３に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１８６〜１１８８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２８〜１２３０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有する；
【０１０１】
ｄ）  配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性を有する核酸分子であって、
配列番号１７のヌクレオチド位置４〜６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３〜７５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３６〜１３８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｇを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１４２〜１４４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１７８〜１８０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１９０〜１９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２０５〜２０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６２〜２６４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６８〜２７０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４６９〜４７１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｔｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５０５〜５０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５２０〜５２２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５３〜５５５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５６〜５５８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５９〜５６１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８３〜５８５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８９〜５９１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置６０４〜６０６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置６１３〜６１５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｇｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７１５〜７１７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７２４〜７２６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３３〜７３５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７５４〜７５６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７６３〜７６５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置８０２〜８０４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９３１〜９３３に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９５２〜９５４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９６４〜９６６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９８２〜９８４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１０５７〜１０５９に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１０７５〜１０７７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１５０〜１１５２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１６５〜１１６７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１７１〜１１７３に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１８６〜１１８８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２８〜１２３０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２７０〜１２７２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３０６〜１３０８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３５４〜１３５６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有する；
【０１０２】
ｅ）  ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義される核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする核酸分子であり、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置７３〜７５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１９０〜１９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置２６２〜２６４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置４６９〜４７１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置４９３〜４９５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置５０５〜５０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置５２０〜５２２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置５５９〜５６１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置７１５〜７１７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置９７９〜９８１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置９８２〜９８４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１１５０〜１１５２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｇｙを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１１６５〜１１６７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１１７１〜１１７３に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１１８６〜１１８８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１２２８〜１２３０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７におけるヌクレオチド位置１２４０〜１２４２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有する；
【０１０３】
ｆ）  ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）で定義される核酸分子の相補鎖とハイブリダイズする核酸分子であり、
配列番号１７のヌクレオチド位置４〜６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３〜７５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３６〜１３８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｇを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１４２〜１４４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１７８〜１８０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１９０〜１９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２０５〜２０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６２〜２６４に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置２６８〜２７０に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４６９〜４７１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｔｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５０５〜５０７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５２０〜５２２に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５３〜５５５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５６〜５５８に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５５９〜５６１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８３〜５８５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置５８９〜５９１に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置６０４〜６０６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置６１３〜６１５に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｔｇｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７１５〜７１７に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｃｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７２４〜７２６に対応するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７３３〜７３５に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７５４〜７５６に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置７６３〜７６５に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｔｈを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置８０２〜８０４に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９３１〜９３３に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９５２〜９５４に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９６４〜９６６に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置９８２〜９８４に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１０５７〜１０５９に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１０７５〜１０７７に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１５０〜１１５２に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｔａｙを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１６５〜１１６７に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１７１〜１１７３に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１１８６〜１１８８に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７に対するコドンは、ヌクレオチド配列ａｃｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２２８〜１２３０に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｍｇｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｙｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１２７０〜１２７２に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇａｒを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３０６〜１３０８に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｔｎを有し、
配列番号１７のヌクレオチド位置１３５４〜１３５６に対するコドンは、ヌクレオチド配列ｇｇｎを有する；
【０１０４】
ｇ）  遺伝子コードの縮重により、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）又はｆ）で定義される核酸分子から逸脱した核酸分子；
【０１０５】
ｈ）  配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列と少なくとも少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子であり、配列番号１８の２５、６４、８８、１５７、１６５、１６９、１７４、１８７、２３９、３２７、３２８、３８４、３８９、３９１、３９６、４１０および４１４位に対応するアミノ酸が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、核酸分子；
【０１０６】
ｉ）  配列番号１８に示される１〜４７６位のアミノ酸配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子であり、配列番号１８の２、２５、４６、４８、６０、６４、６９、８８、９０、１５７、１６４、１６５、１６９、１７４、１８５、１８６、１８７、１９５、１９７、２０２、２０５、２３９、２４２、２４５、２５２、２５５、２６８、３１１、３１８、３２２、３２７、３２８、３５３、３５９、３８４、３８９、３９１、３９６、４０９、４１０、４１４、４２４、４３６、４５２、４７５および４７６位に対応するアミノ酸が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列のそれぞれの位置に示されるアミノ酸を表す、核酸分子；
【０１０７】
ｊ）   配列番号１６に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子。
【０１０８】
配列番号１６は、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の逆翻訳によって得られたヌクレオチド配列を示し、ここで、遺伝コードの縮重が反映される。
【０１０９】
配列番号１７は、配列番号１６の遺伝コード柔軟性ヌクレオチドの特定のヌクレオチドによる縮重のために、その置換によって得られる合成核酸分子である。
【０１１０】
配列番号１６および配列番号１７はいずれも、配列番号１８に示すアミノ酸配列を有するω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードしている。
【０１１１】
本発明の文脈において、用語「ハイブリダイゼーション」は、好ましくは厳密な条件下で、従来のハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションを意味し、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（分子クローニング、Ａ研究所マニュアル、第３版（２００１）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）またはＡｕｓｕｂｅｌら（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；第５版（２００２）、ＩＳＢＮ：０４７１２５０９２９）において記載されている。特に好ましい場合、「ハイブリダイゼーション」とは、以下の条件下でのハイブリダイゼーションを意味する：
ハイブリダイゼーションバッファー：
１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｆｉｋｏｌｌ  ４００＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ；比１：１：１）；０．１％ＳＤＳ；５ｍＭ  ＥＤＴＡ；５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；２５０μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ；５０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ；
または
２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７％ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度：Ｔ＝６５〜６８℃
洗浄バッファー：０．１ｘＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ
洗浄温度：Ｔ＝６５〜６８℃
【０１１２】
ω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、任意の生物に由来し得る；したがって、それらは、細菌、真菌、動物、ヒト、植物またはウイルスに由来し得る。
【０１１３】
ω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、好ましくは真菌または細菌に由来し、最も好ましくは細菌に由来する。
【０１１４】
前記分子とハイブリダイズする核酸分子は、例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。このような核酸分子は、本明細書に記載されている核酸分子の一部、またはこれらの分子の逆相補体を用いて同定および単離することができ、例えば、標準的な方法によるハイブリダイゼーション（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、Ａ研究室マニュアル、第３版（２００１）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．ＩＳＢＮ：  ０８７９６９５７７３；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；第５版（２００２）、ＩＳＢＮ：０４７１２５０９２９）である。
【０１１５】
ω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を単離するためのハイブリダイゼーション試料として、例えば、配列番号２に記載された１〜１４３１位までの核酸配列、または本質的に配列番号５に記載された１〜１４３７位までの核酸配列、または本質的に配列番号８に記載された核酸配列、または本質的に配列番号１１に記載された核酸配列、または本質的に配列番号１４に記載された核酸配列、または本質的に配列番号１７に記載された核酸配列、またはこれらの核酸配列の断片を用いることができる。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションサンプルとして使用されるフラグメントはまた、慣用の合成技術を使用して調製される合成フラグメントまたはオリゴヌクレオチドであってもよく、その配列は、本発明の文脈において記載される核酸分子と本質的に同一である。本発明の文脈において記載された核酸配列とハイブリダイズする遺伝子が一旦同定され単離されると、その配列を決定し、この配列によってコードされるタンパク質の特性を分析して、ω−ＴＡ活性を有するタンパク質であるかどうかを決定すべきである。あるタンパク質がω−ＴＡ活性を有するタンパク質の活性を有するかどうかを決定する方法は当業者に公知であり、ここで言及した。
【０１１７】
本発明の文脈において記載される核酸分子とハイブリダイズする分子は、特に、言及される核酸分子のフラグメント、誘導体および対立遺伝子変異体を含む。本発明の文脈において、用語「誘導体」は、これらの分子の配列が、上記の核酸分子の配列と１つ以上の位置で異なり、これらの配列と高度に同一であることを意味する。上述の核酸分子に対する相違は、例えば、欠失、付加、置換、挿入または組換えによるものであり得る。
【０１１８】
さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する本発明の別の実施形態は、以下からなる群から選択されるω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする本発明による核酸分子に関し；
ａ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９６〜４９８のコドンがヌクレオチド配列ｇｇｎを有し、配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｂ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有し、配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１１５０〜１１５２のコドンがヌクレオチド配列ｗｓｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｃ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７６〜９７８のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有し、配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｄ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｅ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７６〜９７８のコドンがヌクレオチド配列ｔｔｙを有し、配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｆ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｃａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｇ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ａｔｈを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｈ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ａｔｇを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｉ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２のコドンがヌクレオチド配列ｔａｙを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｊ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２のコドンがヌクレオチド配列ｗｓｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｋ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｇｔｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｌ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７のコドンがヌクレオチド配列ｍｇｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｍ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｗｓｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｎ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置８１１〜８１３のコドンがヌクレオチド配列ａｔｈを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｏ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９８５〜９８７のコドンがヌクレオチド配列ｇｇｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｐ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７のコドンがヌクレオチド配列ｃｃｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｑ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２のコドンがヌクレオチド配列ａｔｇを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｒ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５のコドンがヌクレオチド配列ａａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｓ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２のコドンがヌクレオチド配列ｍｇｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｔ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２４０〜１２４２のコドンがヌクレオチド配列ｃａｙを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｕ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９３〜４９５のコドンがヌクレオチド配列ｔｇｙを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｖ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置９７９〜９８１のコドンがヌクレオチド配列ｇｔｎを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｗ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置４９０〜４９２のコドンがヌクレオチド配列ｔｇｙを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｘ）  配列番号１６または配列番号１７のヌクレオチド位置１２２５〜１２２７のコドンがヌクレオチド配列ａａｒを有すること以外は、配列番号１６または配列番号１７に示される核酸配列の１〜１４２８位の核酸配列を含む核酸分子；
ｙ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のいずれかの核酸配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性を有する核酸配列を有する核酸分子であって、
ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）のそれぞれで規定されるコドン核酸配列が、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）、ｐ）、ｑ）、ｒ）、ｓ）、ｔ）、ｕ）、ｖ）、ｗ）又はｘ）で規定されるいずれかの核酸配列と少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％、よりさらに特に好ましくは９６％、特に好ましくは９７％、最も好ましくは９８％又は特定に好ましくは９９％同一性を有する核酸配列において、対応するコドン核酸位置に存在する、核酸分子。
【０１１９】
本発明に係る好ましい核酸分子は、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、ｉ）、ｊ）、ｋ）、ｌ）、ｍ）、ｎ）、ｏ）およびｐ）で前記に規定される核酸分子であり、より好ましくは、ａ）〜ｋ）の項目で前記に定義される核酸分子であり、さらに好ましいものは、ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）およびｈ）の項目で前記に定義される核酸分子であり、最も好ましいものは、ａ）、ｂ）およびｃ）の項目で前記に定義される核酸分子である。
【０１２０】
ヌクレオチドの略語ａ、ｃ、ｇ、ｔの意味、および縮重ヌクレオチドｒ、ｙ、ｓ、ｗ、ｋ、ｍ、ｂ、ｄ、ｈ、ｖ、ｎの略語の意味は、以下の表３の「シーケンスの説明」というサブタイトルの段落から導き出すことができる。どのアミノ酸が縮重ヌクレオチドを含むコドンによってコードされているかは、以下の表５の「配列の説明」という副題の段落から導き出すことができる。
【０１２１】
さらに、本発明は、本発明による核酸分子を含む組換え核酸分子に関する。
【０１２２】
本発明に関連して、「組換え核酸分子」という用語は、本発明による組換え核酸においてそれらが生じる組み合わせにおいて天然に存在しない、本発明による核酸分子に加えて追加の配列を含有する核酸分子を意味すると理解されるべきである。ここで言及された追加の配列は、好ましくは、任意の機能的又は調節配列（プロモーター、終止シグナル、エンハンサー、リボソーム結合部位（ｒｂ）、転写、翻訳又はＲＮＡ安定性を増強するリーダー配列、細胞内標的配列等）であり、特に微生物中で活性のある機能的又は調節配列であり、特に真菌、特に酵母又は細菌中で活性のある調節配列であることが好ましい。本発明による組換え核酸分子の創製方法は、当業者に公知であり、連結、遺伝子組換え、または核酸分子の新たな合成によって核酸分子を結合させるような遺伝学的方法を含む。これらの方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版（２００１）、コールドスプリングハーバー研究所プレス、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ．ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）、またはＡｕｓｕｂｅｌら（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；第５版（２００２）、ＩＳＢＮ：０４７１２５０９２９）に記載されている。
【０１２３】
さらなる実施態様において、本発明による組換え核酸分子は、調節配列と連結される本発明による核酸分子を含み、それは原核細胞または真核細胞において転写を開始する。
【０１２４】
細胞において転写を開始する調節配列は、プロモーターとしても知られている。
【０１２５】
調節配列およびプラスミドに関する情報は、当業者に周知であり、例えば、国際遺伝子工学機械（ｉＧＥＭ）財団（Ｏｎｅ  Ｋｅｎｄａｌｌ  Ｓｑｕａｒｅ、スーツＢ６１０４、ケンブリッジ、ＭＡ  ０２１３９、米国）によって支援された標準生物学的部分の登録によって、世界中のウェブ（ｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇ／Ｃａｔａｌｏｇ））に記載されている。
【０１２６】
調節配列において記載され、真核生物において、例えば、大腸菌、特に酵母におけるそのような発現については、例えば、文献に十分に記載されており、サッカロミセス  セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。種々の宿主生物におけるタンパク質の発現のための種々の系の概要は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３（１９８７）、３８３−５１６およびＢｉｔｔｅｒら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３（１９８７）、５１６−５４４）またはＧｏｍｅｓら（２０１６，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４（４），３４６）およびＢａｇｈｂａｎら（２０１８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９（６）にある。一般的な酵母プロモーターは、ｐＡＯＸ１、ｐＨＩＳ４、ｐＧＡＬ、ｐＳｃＡＤＨ２である（Ｂａｇｈｂａｎら、２０１８年、前述参照）。一般的な細菌プロモーターは、Ｍａｒｓｃｈａｌｌら（２０１７、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０１、５０１−５１２）およびＴｅｇｅｌら（２０１１、ＦＥＢＳジャーナル２７８、７２９−７３９）によって記載されているように、Ｔ５、Ｔ７、ラムノース誘導性、アラビノース誘導性、ＰｈｏＡ、人工ｔｒｃ（ｔｒｐ−ｌａｃ）プロモーターである。
【０１２７】
本発明の組換え核酸分子のさらなる実施形態は、本発明による核酸分子を含むベクターまたはプラスミドである。
【０１２８】
「ベクター」は、分子生物学の分野において、および本明細書において、遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を標的細胞に移入するために使用される核酸配列または核酸配列を含むビヒクルを表すことが一般的に理解されている。ベクターは、プラスミド、例えば、トランスジェニック植物を作製するためのＴ−ＤＮＡまたはバイナリーベクター、宿主細胞における核酸配列の発現のための発現ベクター、異なる宿主で増殖するのに適格なシャトルベクターであるか、または、ベクターは、宿主に外来性遺伝物質を送達するために改変されたウイルス粒子またはバクテリオファージであり得る。
【０１２９】
「プラスミド」は、分子生物学の分野において一般的に理解され、本明細書中では、染色体ＤＮＡから分離された宿主細胞中に存在する場合にしばしば自律的に自己複製する環状のＤＮＡ分子を表す。
【０１３０】
本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子、本発明によるベクターまたはプラスミドは、例えば本発明による核酸分子を宿主細胞に発現させることにより、本発明によるタンパク質の生産に用いることができる。
【０１３１】
本発明の別の実施形態は、本発明に従う核酸分子を含む、または本発明に従うタンパク質を含む、または本発明に従う組換え核酸分子を含む、または本発明に従うベクターを含む、または本発明に従うプラスミドを含む、宿主または宿主細胞に関する。
【０１３２】
ω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする本発明に従う核酸分子は、例えば、それらの増殖のために、または本発明に従うタンパク質の産生のために、宿主細胞で発現させることができる。宿主細胞内での発現のために、本発明による核酸分子は、ベクターまたはプラスミド上に含まれ得るか、またはそれぞれの宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれ得る。本発明による核酸分子は、宿主細胞への導入を支持するベクターからもなり得る。
【０１３３】
本発明のさらなる実施形態は、本発明による核酸分子を含む、または本発明による組換え核酸分子を含む、または本発明によるベクターを含む、または本発明によるプラスミドを含む、本発明による宿主または宿主細胞に関し、それぞれの場合で本発明のタンパク質を含む。
【０１３４】
本発明の別の実施形態は、本発明による核酸分子を含む、または本発明による組換え核酸分子を含む、または本発明によるベクターを含む、または本発明によるプラスミドを含む本発明による宿主または宿主細胞に関し、それぞれの場合で本発明のタンパク質を発現する。
【０１３５】
本発明の別の実施形態は、本発明に従う核酸分子を含む、または本発明に従う組換え核酸分子を含む、または本発明に従うベクターを含む、または本発明に従うプラスミドを含む本発明による宿主または宿主細胞に関し、各場合において、タンパク質を発現し、タンパク質がω-トランスアミナーゼの活性を有する。
【０１３６】
「核酸分子を発現させること」とは、本明細書において、核酸分子がＲＮＡまたはｍＲＮＡである場合には、核酸分子がタンパク質に翻訳され、好ましくはω−ＴＡ活性を有するタンパク質に翻訳されるか、または核酸分子がＤＮＡまたはｃＤＮＡである場合には、ｍＲＮＡに転写され（およびイントロンを含むゲノムＤＮＡの場合には、プロセシングされる）、好ましくはω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡに転写され、次いで、タンパク質に翻訳され、好ましくはω−ＴＡ活性を有するタンパク質に翻訳されることを意味する。
【０１３７】
宿主における所定の核酸分子の転写は、例えば、ノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによる外来核酸分子の特異的転写物（ｍＲＮＡ）の検出によって、当業者に公知の方法によって実証することができる。
【０１３８】
宿主または宿主細胞が所与のタンパク質を含むか否か、または核酸分子の発現に由来するタンパク質を含むか否かは、例えば、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）のような免疫学的方法によって、当業者に公知の方法によって決定することができる。当業者は、特定のタンパク質と特異的に反応する抗体、すなわち、特定のタンパク質に特異的に結合する抗体を調製するための方法に精通している（例えば、ＬｏｔｔｓｐｅｉｃｈおよびＺｏｒｂａｓ（編集），１９９８，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  ａｋａｄ，Ｖｅｒｌａｇ，ハイデルベルク，Ｂｅｒｌｉｎ，ＩＳＢＮ３−８２７４−００４１−４参照）。一部の企業（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１６８  Ｔｈｉｒｄ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ  ＵＳＡ２４５；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，６０  Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ａｖｅ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ０８８５４，ＵＳＡ）は、オーダーサービスとしてこのような抗体の調製を提供している。
【０１３９】
さらに、当業者は、宿主または宿主細胞がそれぞれの宿主細胞においてω−ＴＡ活性を有するタンパク質の（追加の）活性を検出することによって、本発明によるタンパク質を含むかどうかを試験することができる。好ましくは、それぞれの宿主細胞中でω−ＴＡのさらなる活性を有するタンパク質の活性は、本発明による宿主細胞のω−ＴＡ活性と、本発明によるタンパク質を含まない宿主細胞のそれぞれの活性とを比較することによって検出される。
【０１４０】
あるタンパク質がω−ＴＡ活性を有するか否かの試験は、上述のようにして行うことができる。
【０１４１】
本発明による宿主または宿主細胞は、生物を遺伝的に改変または形質転換するための公知の方法により、当業者によって産生することができる。
【０１４２】
したがって、本発明のさらなる主題は、本発明による宿主または宿主細胞、特に、原核生物または真核生物宿主または宿主細胞であり、これは、本発明による核酸分子、または本発明による組換え核酸分子、または本発明によるベクターまたは本発明によるプラスミドで遺伝子改変(または形質転換)される。本発明による遺伝子組換え(形質転換)宿主または宿主細胞は、ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質を発現し、より好ましくは、本発明による遺伝子組換え(形質転換)宿主または宿主細胞は、本発明によるタンパク質を発現する。
【０１４３】
「核酸分子で遺伝子組換え」または「核酸分子で形質転換」は、本明細書中で、核酸分子が、分子生物学、バイオテクノロジーまたは遺伝子改変の分野における技術的方法によって、技術的および/または非自然発生的な手段によって宿主または宿主細胞に導入されるか、または導入されたことを意味すると理解される。
【０１４４】
本発明による宿主または宿主細胞の子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）、子（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）または子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）もまた、本発明の実施形態であり、好ましくは、これらの子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）、子（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）または子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）は、本発明による核酸分子を含み、または本発明による組換え核酸分子を含み、または本発明によるベクターを含み、または本発明によるプラスミドを含み、または本発明によるタンパク質を含み、より好ましくは、これらの子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）、子（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）または子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）は、本発明による核酸分子を含むか、または本発明による組換え核酸分子を含むか、本発明または本発明によるベクターを含むか、または本発明によるプラスミドを含み、それぞれの場合にタンパク質を発現し、ここで、これらのタンパク質は、ω−ＴＡ活性を有し、さらに好ましくは、これらの子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）、子（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）または子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）は、本発明による核酸分子を含み、本発明による組換え核酸分子を含み、または本発明によるベクターを含み、または本発明によるプラスミドを含み、それぞれの場合にタンパク質を発現し、ここで、これらのタンパク質は、ω−ＴＡ活性を有する。
【０１４５】
本発明による宿主または宿主細胞は、任意の原核生物または真核生物由来の宿主または宿主細胞であり得る。宿主または宿主細胞は、細菌または細胞（例えば、大腸菌、バシラス属の細菌、特にバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、アグロバクテリウム、特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）、シュードモナス、特にシュードモナス  フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、ストレプトミセス属、ロドコッカス属、特にロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）、ビブリオ・ナトリゲネス（Vibrio natrigens）、コリネバクテリウム、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）または真菌または真菌細胞（例えば、アガリスク、特にアガリクス・ビスポルス（Agaricus bisporus）、アスペルギルス、トリコデルマまたは酵母、特に、Ｓ．セレビジア（S. cerevisiae）、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｓｐ．様Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ならびに、植物若しくは植物細胞であり、または、それらは、動物または動物細胞であり得る。
【０１４６】
本発明による好ましい宿主細胞は、微生物の細胞である。本特許出願の枠組みの中で、これは、例えば、Ｓｃｈｌｅｇｅｌ“Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ  （１９８５）、１−２）に定義されているように、全ての細菌および全ての原生生物（例えば、真菌、特に酵母および藻類）を含むと理解される。
【０１４７】
微生物に関して、本発明による宿主または宿主細胞は、好ましくは細菌／細菌細胞または酵母／酵母細胞であり、最も好ましくは細菌／細菌細胞である。細菌／細菌細胞に関して、本発明による宿主または宿主細胞は、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ種／Ｂａｃｉｌｌｕｓ種細胞または大腸菌（Escherichia coli）／大腸菌細胞であり、最も好ましくは大腸菌／大腸菌細胞である。
【０１４８】
或いは、シュードモナス、特にシュードモナス  フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、ストレプトマイセス属、ロドコッカス属、特にロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）、ビブリオ属、特にビブリオ・ナトリゲネス（Vibrio natrigens）、コリネバクテリウム、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）またはその他は、本発明による宿主または宿主細胞であり得る。
【０１４９】
本発明の好ましい実施形態は、本発明による核酸分子を含む本発明による宿主または宿主細胞に関し、ここで、本発明による核酸分子は、それぞれ宿主または宿主細胞のコドンの使用頻度に適応するように、前記核酸分子のコドンが変化することを特徴とする。
【０１５０】
本発明による宿主細胞は、本発明によるタンパク質の生産に用いることができる。本発明によるタンパク質は、アミン(供与体)の存在下でカルボニル(受容体)からエナンチオマー的に富化されたまたはほぼエナンチオマー的に純粋なアミンを製造するための方法において使用され得る。
【０１５１】
本発明によるタンパク質によるエナンチオマー的に富化されたまたはほぼエナンチオマー的に純粋なアミンの製造方法において触媒される反応は、一般式（Ｉ）によって本明細書において正式に上記に記載され得る。
【発明を実施するための形態】
【０１５２】
したがって本発明の別の実施形態は、以下の工程を含むアミンの製造方法に関する；
ａ）  アミン受容体分子を提供し；
ｂ）  アミン供与体分子を提供し；
ｃ）  工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子を、本発明に記載のタンパク質と接触させ；
ｄ）任意に、アミンを得る。
【０１５３】
アミンの製造のための本発明の好ましい実施形態は、脂肪族アミン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むが、これらに限定されない）の製造方法であるか、またはアリールアミンの製造方法であるか、またはアミノ酸の製造方法であり、より好ましくはα−アミノ酸の製造方法であり、さらに好ましくは、分枝鎖α−アミノ酸、芳香族α−アミノ酸または置換フェニル基を含む芳香族α−アミノ酸の製造方法であり、最も好ましくは、アミノ酸ノルバリン、ロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンの製造方法である。
【０１５４】
更にアミノ酸改変体を含む本発明に係るω−ＴＡ変異体に関して、アミンを製造するための本発明は、好ましくは、脂肪族アミン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むリンを含むが、これらに限定されない）を含むリンを製造する方法であるか、またはアリールアミンを含むリンを製造する方法であるか、または、アミノ酸を含むリンを製造する方法であり、より好ましくは、α−アミノ酸を含むリンを製造する方法、さらにより好ましくは分枝鎖α−アミノ酸を含むリン、芳香族α−アミノ酸を含むリンまたは置換フェニル基を有する芳香族α−アミノ酸を含むリンを製造する方法であり、より好ましくは、α−アミノ酸を含むリンを製造する方法、よりさらに好ましくは、メチル置換リンを含むα−アミノ酸を製造する方法、最もより好ましくは、グルホシネートを製造する方法である。
【０１５５】
アミンの製造のための本発明方法の工程ａ）におけるアミン受容体分子は、アミン供与体分子からアミノ基を受容する分子を含むカルボニル基であり、それによって受容体分子のカルボニル基がアミンになる。
【０１５６】
好ましくは、アミンの製造のための本発明の方法の段階ａ）のアミン受容体分子は、脂肪族ケトン（直鎖、分枝鎖または環状アルカノン、アルケノン、アルキノンを含むが、これらに限定されない）であるか、またはアリールケトンまたはケト酸であり、より好ましくはケト酸であり、よりさらに好ましくはα−ケト酸であり、最も好ましくは、アミン受容体分子は、２−オキソ吉草酸、４−メチル−２−オキソ吉草酸、フェニルピルビン酸または４−ヒドロキシフェニルピルビン酸からなる群から選択される。
【０１５７】
さらなるアミノ酸改変体を含む本発明のタンパク質ω−ＴＡ変異体に関しては、アミンの生産のための本発明の方法の段階ａ）におけるアミン受容体分子は、好ましくは、脂肪族ケトン（直鎖、分枝鎖または環状アルカノン、アルケノン、アルキノン）を含むリンまたはアリールケトンを含むリンまたはケト酸を含むリンを含み、より好ましくは、アミン受容体分子は、ケト酸を含むリンを含み、さらに好ましくは、アミン受容体分子はα−ケト酸を含むリンを含み、よりさらに好ましくはα−ケト酸を含むメチル置換リンを含み、最も好ましくは、段階ａ）におけるアミン受容体分子は、４−［ヒドロキシ（メチル）ホスホリル］−２−オキソブタン酸である。
【０１５８】
好ましくは、アミンの製造のための本発明の方法の工程ａ）におけるアミン受容体分子は、３０ｇ／ｌ（グラム／リットル）〜３００ｇ／ｌ、より好ましくは３０ｇ／ｌ〜２５０ｇ／ｌ、さらにより好ましくは４０ｇ／ｌ〜２５０ｇ／ｌ、さらにより好ましくは５０ｇ／ｌ〜２５０ｇ／ｌの量で提供される。
【０１５９】
アミンの製造方法の本発明の工程ｂ）におけるアミン供与体分子は、アミン基をアミン受容体分子に供与し、それによってアミン供与体分子のアミン基がカルボニル基となる分子を含むアミン基である。
【０１６０】
アミンの製造のための本発明の工程ｂ）におけるアミン供与体分子は、キラルな、プロキラルな、または非キラルなアミンであり得、好ましくは、アミン供与体分子は、キラルな、プロキラルな、または非キラルな、それぞれアルキル−またはアリールまたはアリール−アルキルアミンであり、より好ましくは、アミン供与体分子は、アミノ酸またはアルキル−アミンである。
【０１６１】
アルキル−またはアリールアミンに関して、本発明によるアミンの製造方法の工程ｂ）で使用されるべきアミノ供与体分子は、β−アラニン、１−プロピルアミン、（ラセミ体）２−ブチルアミン、６−アミノヘキサン酸、イソプロピルアミン、ベンジルアミン、メチルベンジルアミン、１−アミノインダン、１−メチル−３−フェニルプロピルアミンである。
【０１６２】
アミノ供与体が非キラルアミノ酸である場合、グリシンは、本発明によるアミンの製造方法の工程ｂ）において提供される好ましいアミノ供与体分子である。本発明に係るアミンの製造方法の工程ｂ）におけるアミノ供与体がキラルなアミノ酸である場合、そのアミノ酸は、その（Ｓ）−エナンチオマーで表されることが好ましい。本発明によるアミンの製造方法の工程ｂ）で提供されるべき好ましい（Ｓ）−配置を有するアミノ酸供与体分子は、（Ｓ）−メチルベンジルアミン、（Ｓ）−１−アミノインダン、（Ｓ）−１−メチル−３−フェニルプロピルアミン、（Ｓ）−アスパラギン酸、（Ｓ）−アスパラギン、（Ｓ）−アラニン、（Ｓ）−グルタミン、（Ｓ）−グルタミン酸、（Ｓ）−オルニチン、（Ｓ）−ホスホセリン、（Ｓ）−フェニルアラニン、（Ｓ）−ロイシン、（Ｓ）−チロシン、（Ｓ）−ノルバリンである。
【０１６３】
本発明によるアミンの製造方法の工程ｂ）において提供される最も好ましいアミノ供与体分子は、イソプロピルアミンである。
【０１６４】
本発明による方法においてアミノ供与体分子として使用される場合、イソプロピルアミンは、ω−ＴＡの作用によってアセトンへ変換される。アセトンは比較的低温で蒸発するという利点をもたらす揮発性化合物である。これは、反応が起こっている間に反応混合物からω−ＴＡによって生成されたアセトンを除去することを可能にし、反応の平衡が、本発明によるアミンの製造方法によって生成されたアミンに向かってシフトされるという有利な効果をもたらす。これにより、ω−ＴＡによって触媒される逆反応が、１つの反応パートナーが欠けているために減少するので、所望のアミンを大量に得ることができる。
【０１６５】
好ましくは、アミンの製造のための本発明による方法の工程ｂ）におけるアミン供与体分子は、１０ｇ／ｌ（グラム／リットル）〜２５０ｇ／ｌ、より好ましくは１５ｇ／ｌ〜２００ｇ／ｌ、さらに好ましくは１７ｇ／ｌ〜１８０ｇ／ｌの量で提供される。
【０１６６】
本発明によるアミンの製造方法の工程ｃ）において、工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子を、好ましくは溶液中で本発明によるタンパク質と接触させる。この溶液は、水のみを含む水溶液であり得るが、水及び有機溶媒を含む溶液でもあり得る。本発明によるアミンの製造方法の工程ｃ）において、有機溶媒を含む水溶液中で、工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子と本発明によるタンパク質を接触させる場合、有機溶媒は、好ましくは、ＤＭＳＯ（ジ−メチルスルホキシド）、ＤＭＡｃ（ジメチルアセトアミド）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、アセトニトリル、トルエン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ヘプタンから選択される。最も好ましいのは、ＤＭＳＯ、ＤＭＡｃおよびトルエンである。
【０１６７】
好ましくは、有機溶媒を含む水溶液は、最大１０％、より好ましくは最大２０％、さらに好ましくは最大３０％、さらにより好ましくは最大４０％、最も好ましくは最大５０％の量の有機溶媒を含む。
【０１６８】
有機溶媒を含む水溶液を使用することは、本発明によるアミンの製造方法の工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および／または工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子が低い溶解度を有し、それらのそれぞれの溶解度が改善され得、ω−ＴＡについて利用可能な基質のより高い量をもたらすので、有機溶媒を含む水溶液を使用することは利点を有する。これはより高い反応速度につながり、目的のアミンをより少ない容量でおよびより短い時間でより多く生産することを意味し、したがって、空間−時間収率を改善する。
【０１６９】
本発明によるタンパク質を本発明によるアミンの製造方法の工程ｃ）において、工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および水溶液中の工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子と接触させる場合、溶液は、好ましくは、ｐＨを調整するための緩衝系を含む。好ましい緩衝系は、トリス−ＨＣｌ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）を含むものである。
【０１７０】
好ましくは、本発明に係るタンパク質を、本発明に係るアミンの製造方法の工程ｃ）において、工程ａ）で提供されるアミン受容体分子と工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子とを接触させる水溶液のｐＨは、ｐＨ４〜ｐＨ１１の間の値、より好ましくはｐＨ５〜ｐＨ１０の間の値、さらに好ましくはｐＨ６〜ｐＨ１０の間の値、さらにより好ましくはｐＨ７〜ｐＨ１０の間の値、さらにより好ましくはｐＨ８〜ｐＨ１０の間の値、最も好ましくはｐＨ８．５〜ｐＨ９．５の間の値に調整する。
【０１７１】
好ましくは、アミンの製造のための本発明の方法の工程ｃ）において、工程ａ）で提供されるアミン受容体分子と工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子と本発明のタンパク質との接触は、１０℃〜６０℃、より好ましくは２０℃〜６０℃、さらに好ましくは２５℃〜５５℃、さらにより好ましくは３０℃〜５０℃、よりさらに好ましくは３０℃〜４５℃、最も好ましくは３４℃〜４２℃の温度で行われる。
【０１７２】
工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子を、本発明によるアミンの製造方法の工程ｃ）において、本発明によるタンパク質と十分な時間接触させて、アミンを製造する。
【０１７３】
工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子は、本発明によるアミンの製造方法の工程ｃ）で本発明のタンパク質と、５時間〜４８時間、より好ましくは５時間〜３６時間、より好ましくは５時間〜３０時間、さらに好ましくは５時間〜２４時間、さらに好ましくは５時間〜１８時間、最も好ましくは５時間〜１４時間、特に好ましくは５時間〜１３時間接触させる。
【０１７４】
工程ｃ）における本発明のタンパク質と、工程ａ）で提供されるアミン受容体分子と、工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子との接触において、該タンパク質は、異なる形態のアミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させることができ、好ましくは、タンパク質を、部分精製された形態でアミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させるか、またはタンパク質を精製された形態でアミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させるか、または、アミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させるとき、該タンパク質は粗細胞抽出物中に存在するか、または生きているまたは生きていない宿主細胞の成分として存在する場合、タンパク質はアミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触させる。
【０１７５】
本発明の方法の工程ｃ）において、アミン受容体分子およびアミン供与体分子を宿主細胞の構成成分としてタンパク質と接触させる場合、宿主細胞は、宿主細胞を培養するために使用された培地を含むものを用いることができ、または宿主細胞は、宿主細胞が培養される培地を含まず、または宿主細胞が（さらなる）処理され、好ましくは宿主細胞が培養される培地がほとんど無くなり、より好ましくは、宿主細胞が（さらなる）処理され、より好ましくは、宿主細胞は（さらなる）処理され、さらに好ましくは、宿主細胞は培養される培地がほぼ無くなり、そして宿主細胞が（さらに）処理されたものである。
【０１７６】
「粗細胞抽出物」とは、本明細書中で、細胞中に存在する全てまたは実質的に全ての無機物質または有機物質（さらなるタンパク質および／または核酸分子を含む）を含む生細胞の破壊によって得られる抽出物を意味する。
【０１７７】
「部分精製」とは、本明細書中で、タンパク質を発現する生細胞中に存在する全無機物質または有機物質（さらなるタンパク質および／または核酸分子を含む）の一部を含む組成物を含むタンパク質を意味する。
【０１７８】
部分的に精製された抽出物は、例えば、遠心分離、濾過、任意の種類のクロマトグラフィー分離、透析のような一般的に公知の手段によって、粗細胞抽出物から有機物または無機物を分画することによって得ることができる。粗細胞抽出物の分画は、同じまたは異なる分画方法を使用して繰り返し行うことができ、沈殿工程を含むことができる。
【０１７９】
「精製された」とは、比活性（乾物量中に存在するタンパク質の活性を材料の総量で除した値、特に乾物量中の他のタンパク質の活性）が、それ以上の分画又は精製工程によって増大することができないタンパク質をいう。
【０１８０】
「精製された」と言う用語について上記に一般に認められている定義から「精製された」は自明であるが、ほとんどの場合、それ以上の無機及び／又は有機化合物がまったく含まれないタンパク質を意味しない。好ましくは「精製された」とは、本明細書において、本発明によるタンパク質が、タンパク質を含む乾燥重量材料の総量の少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％存在することを意味する。
【０１８１】
用語「生きている細胞」とは、本明細書中で増殖および/または増殖可能な細胞を意味する。
【０１８２】
用語「生きていない細胞」とは、ここでは、成長および／または生殖することができない細胞を意味する。しかしながら、生きていない細胞はそれ以上繁殖および／または増殖することはできないが、本発明の用途に関して酵素活性を示し、特にω−ＴＡ活性を有する本発明によるタンパク質の活性を依然として示す。
【０１８３】
本明細書で使用する用語「培地を含まない」（ｆｒｅｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）とは、培養に使用される培地が、例えば遠心分離および／または濾過によって除去されたことを意味する。
【０１８４】
この用語は、「培地を含まない」という用語に関して上記に一般的に認められている理解から自明であるが、ほとんどの場合、培地中に存在した無機および／または有機化合物が必ずしも細胞中にまったく存在しないことを意味するわけではない。好ましくは、本明細書で、精製されたとは、本発明による細胞が、培養培地を含まない細胞を含む乾燥重量材料の総量の少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらに好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％存在することを意味するものとする。
【０１８５】
「宿主細胞が（さらに）処理された」という用語は、本明細書において、本発明に従うタンパク質を含む宿主細胞が、本発明に従うアミンの製造方法の工程ｃ）において、アミン受容体分子およびアミン供与体分子と接触される前に、物理的および／または化学的手段で処理されていることを意味し、好ましくは、それらは物理的手段で処理されていること、より好ましくは、乾燥されていること、さらに好ましくは、凍結乾燥または噴霧乾燥されていること、最も好ましくは、噴霧乾燥されていることを意味する。
【０１８６】
乾燥プロセス、特に細胞の凍結乾燥およびスプレー乾燥プロセスは、当業者にとって公知である。好ましくは、本発明によるタンパク質を含む宿主細胞は、凍結乾燥または噴霧乾燥されており、最も好ましくは、「一般的方法」項目９に記載の方法による本発明によるアミンの製造方法の工程ｃ）で接触させる前に噴霧乾燥されている。
【０１８７】
ω−ＴＡ活性を有するタンパク質は、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）依存性酵素であることが当業者に知られている。好ましい実施形態において、タンパク質は、本発明によるアミンの製造方法の工程ｃ）において、工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子と、ＰＬＰの存在下で接触させられ、より好ましくは、ＰＬＰは、０．０５ｇ／ｌ〜２．０ｇ／ｌの間の量で、さらに好ましくは０．０５ｇ／ｌ〜１．５ｇ／ｌの間の量で、さらにより好ましくは０．０５ｇ／ｌ〜１．０ｇ／ｌの間の量で、さらにより好ましくは０．０７５ｇ／ｌ〜０．７５ｇ／ｌの間の量で、最も好ましくは０．１ｇ／ｌ〜０．５ｇ／ｌの間の量で存在する。
【０１８８】
アミンの取得方法における必須工程ｄ）においてアミンを得ることは、アミンが、生成されたアミンのさらなる精製なしに工程ｄ）の組成物中に存在することを意味することができ、またはそれは生成されたアミンがさらに精製されることを意味することができる。アミンの精製は、当業者に公知の方法により行うことができる。このようなアミンの精製方法には、クロマトグラフィー、蒸留、抽出、吸着またはろ過を含む方法を含むが、これらに限定されない。
【０１８９】
本発明によるアミンの製造方法の好ましい実施形態は、（Ｓ）−アミンを、その（それぞれの）（Ｒ）−アミンよりもエナンチオマー過剰で含む組成物の製造方法であり、該方法は、
ａ）  アミン受容体分子を提供し；
ｂ）  アミン供与体分子を提供し；
ｃ）  工程ａ）で提供されるアミン受容体分子および工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子と本発明のタンパク質とを接触させ；
ｄ）  任意に、（Ｓ）−アミンを、（それぞれの）（Ｒ）−アミンよりもエナンチオマー過剰で含む組成物を得る、工程を含む。
【０１９０】
本明細書中で使用される「エナンチオマー」という用語は、化学の技術分野において一般に理解されているように、重ね合わせできない相互の構造的鏡イメージである２つの立体異性体の１つの分子であるという意味を有し、「エナンチオマー」という用語は、一般に「光学異性体」としても知られている。
【０１９１】
「エナンチオマー過剰（通称、「ｅｅ」と略す）」という用語は、化学の技術分野において一般的に理解され、ここでは、各エナンチオマーのモル分画間の絶対差として定義されるそれぞれのエナンチオマーに対して組成中の一方のエナンチオマーの過剰を明記するために使用される。エナンチオマー過剰率は、当該技術分野では％エナンチオマー過剰率で表されることが多い。例として、（Ｓ）−エナンチオマーの７０％と（Ｒ）−エナンチオマーの３０％を含む組成物は、（Ｓ）−エナンチオマーに関してｅｅ＝４０％（純度（Ｓ）−エナンチオマー４０％＋ラセミ体６０％（＝３０％（Ｓ）＋３０％（Ｒ））である。結論として、ラセミ体エナンチオマー混合物はｅｅ＝０％であり、純粋な（Ｓ）−または（Ｒ）−エナンチオマーは、ｅｅ＝１００％である。
【０１９２】
（Ｓ）−アミンエナンチオマー過剰における組成物の製造のための本発明の方法の好ましい実施形態は、エナンチオマー過剰における脂肪族（Ｓ）−アミン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むがこれらに限定されない）を生成するための方法であるか、またはエナンチオマー過剰におけるアリール（Ｓ）−アミンの生成方法であるか、またはエナンチオマー過剰における（Ｓ）−アミノ酸の生成方法であり、より好ましくは、エナンチオマー過剰における（Ｓ）−α−アミノ酸の生成方法であり、よりさらに好ましくは、エナンチオマー過剰における分枝鎖（Ｓ）−α−アミノ酸または芳香族（Ｓ）−α−アミノ酸または置換フェニル基を含む芳香族（Ｓ）−α−アミノ酸の生成方法であり、最も好ましくは、エナンチオマー過剰におけるアミノ酸（Ｓ）−ノルバリン、（Ｓ）−ロイシン、（Ｓ）−フェニルアラニンまたは（Ｓ）−チロシンの生成方法である。
【０１９３】
更なるアミノ酸改変体を含む本発明のω−ＴＡ変異体に関して、エナンチオマー過剰の（Ｓ）−アミンを含む組成物の製造方法は、好ましくは、エナンチオマー過剰の（Ｓ）−アミン（直鎖、分枝鎖または環状の（Ｓ）−アルカンアミン、アルケン（Ｓ）−アミン、アルキン（Ｓ）−アミンを含むリンを含むがこれに限定されない）を含むリンの製造のための方法であるか、またはエナンチオマー過剰のアリール（Ｓ）−アミンを含むリンの製造のための方法であるか、または、エナンチオマー過剰の（Ｓ）−アミノ酸を含むリンの製造のための方法であり、より好ましくは、エナンチオマー過剰の（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンの製造のための方法であり、さらに好ましくは、エナンチオマー過剰の分枝鎖の（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリン、芳香族（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリン、または置換フェニル基を含む芳香族（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンの製造のための方法であり、さらにより好ましくは、エナンチオマー過剰の（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンの製造方法、さらにより好ましくは、エナンチオマー過剰のメチル置換リンを含む（Ｓ）−α−アミノ酸の製造方法、最も好ましくは、エナンチオマー過剰の（Ｓ）−グルホシネートの製造方法である。
【０１９４】
エナンチオマー過剰の（Ｓ）−アミンを含む組成物の製造のための本発明の別の好ましい実施形態は、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９６％または特に好ましくは少なくとも９８％のエナンチオマー過剰（ｅｅ）の（Ｓ）−アミンを含む組成物の製造方法である。
【０１９５】
提供されるアミン受容体分子の好ましい実施態様、及び、ａ）提供されるアミン供与体分子の好ましい実施態様と、ｂ）アミンの製造のための本発明の工程で提供されるべきアミン供与体分子の好ましい実施態様と、ｂ）で提供されるべき量の好ましい実施態様に関して本明細書で定義されていることは、それぞれ、（Ｓ）−アミンがその（Ｒ）−アミンよりもエナンチオマー過剰で含む組成物の製造方法において、段階ａ）のアミン受容体分子とｂ）のアミン供与体分子に相応に適用可能である。しかしながら、工程ｂ）において、その（それぞれの）（Ｒ）−アミンよりもエナンチオ過剰の（Ｓ）−アミンを含む組成物の製造方法において提供されるアミン供与体分子がキラル分子である場合、少なくとも、アミン供与体の（Ｓ）−立体異性体を含むエナンチオマー混合物が提供され、好ましくは、アミン供与体のラセミ混合物が提供されることは自明である。経済的コストの観点から入手可能かつ実行可能であれば、キラルアミン供与体は、（Ｓ）−立体異性体がエナンチオマー過剰である混合物で提供することができ、より好ましくは、アミン供与体は、高いエナンチオマー過剰で（Ｓ）−立体異性体を含む組成物として提供することができ、その場合、高いエナンチオマー過剰は、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９６％または特に好ましくは少なくとも９８％のエナンチオマー過剰を意味する。
【０１９６】
アミンの生産のための本発明の工程ｃ）に関連する、溶液、水溶液、有機溶媒を含む水溶液、緩衝系、ｐＨ値および／または温度、タンパク質の形態（粗細胞抽出物、部分精製タンパク質、精製タンパク質、生きているまたは生きていない宿主細胞の成分として存在するタンパク質、（さらなる）処理された宿主細胞、宿主細胞のスプレー乾燥）、タンパク質の量およびＰＬＰの存在および量について好ましい実施形態として本明細書で記載されていることは、本発明の工程ｃ）に従って、（Ｓ）−アミンをその（それぞれの）（Ｒ）−アミンよりもエナンチオマー過剰で含む組成物の製造方法に適用可能である。
【０１９７】
アミンの製造のための本発明による方法の工程ｄ）の好ましい実施形態に関して上記で定義されたことは、その（それぞれの）（Ｒ）−アミンよりもエナンチオマー過剰の（Ｓ）−アミンを含む組成物の製造方法の工程ｄ）に適用可能である。
【０１９８】
アミンの製造のための本発明の方法の工程ｄ）に関して定義されたことに加えて、好ましくは、（Ｓ）−アミンを、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％または特に好ましくは少なくとも９９％のエナンチオマー過剰量で含む組成物が、（Ｓ）−アミンをその（Ｒ）−アミンよりもエナンチオマー過剰量で含む組成物の製造方法の工程ｄ）において得られる。
【０１９９】
本発明のタンパク質はまた、（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン立体異性体を含む組成物から立体異性体を減少または除去する方法に用いることができる。（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン異性体を含む組成物から立体異性体を減少または除去するときに、本発明のタンパク質によって触媒される反応は、一般式（Ｉａ）に従う。アミンの合成反応（（式（Ｉ）参照）と比較して、アミノ供与体とアミノ受容体は、（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含む組成物から立体異性体を減少または除去する反応において相互に交換され得ることがわかる（式（Ｉａ）参照）。式（Ｉａ）による反応は、特定の立体異性体が、異なる立体異性体を含む組成物に富み、言い換えれば、特定の立体異性体が組成物から除去され得るという利点を有し、ときにはエナンチオマー混合物を分割するものとしても当技術分野で指摘されている。これらの方法は、化合物がラセミ体の混合物を一般的にもたらす化学合成によって生産される場合に特に重要である。そのような化合物の化学合成は、プロセス経済または他の理由の観点から、望まれる製造工程であり得る。しかし、化学的に生成されたエナンチオマーの分離は、困難であり、高価であり、また不可能でさえあるかもしれない。本発明によるタンパク質は、このような化学的に製造されたラセミ混合物から立体異性体を選択的に除去するために使用することができる。
【０２００】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法を含み、該方法は、以下の工程を含む；
ａ）  （Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンエナンチオマーを含む組成物を提供し；
ｂ）  アミン受容体分子を提供し；
ｃ）  工程ａ）で提供される組成物および工程ｂ）で提供されるアミン受容体と本発明のタンパク質とを接触し；
ｄ）  任意に、工程ａ）で提供される組成物中に存在する量と比較してアミンエナンチオマーの量が減少する組成物を得る。
【０２０１】
（Ｒ）−アミン及び（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法において、少なくとも１つの（Ｓ）−アミン及び１つの（Ｒ）−アミン分子が存在する限り、これらの方法の各々の工程ａ）で提供される組成物中に、構造的に何個の異なる（Ｒ）−アミン及び（Ｓ）−アミン分子が存在するかは決定的ではない。
【０２０２】
（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の段階ａ）で提供される（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含む組成物は、少なくとも１つの（Ｒ）−アミンおよび少なくとも１つの（Ｓ）−アミンを含み、ここで、少なくとも１つの（Ｒ）−アミンおよび少なくとも１つの（Ｓ）−アミンは同じ分子の立体異性体であり得、または、少なくとも１つの（Ｒ）−アミンおよび少なくとも１つの（Ｓ）−アミンは、構造的に異なる分子からの立体異性体であり得る。
【０２０３】
（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法の好ましい実施形態は、脂肪族アミン（直鎖、分枝鎖または環状アルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むがこれらに限定されない）のエナンチオマーの量を減少させる方法であるか、またはアリールアミンのエナンチオマーの量を減少させる方法であるか、またはアミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法であり、より好ましくは、α−アミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法であり、さらにより好ましくは、分岐鎖α−アミノ酸のエナンチオマー、芳香族α−アミノ酸のエナンチオマーまたは置換フェニル基を含む芳香族α−アミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法であり、最も好ましくは、ノルバリン、ロイシン、フェニルアラニンまたはチロシンから選択されるアミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法である。
【０２０４】
本発明によるさらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体に関して、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための本発明による方法は、好ましくは、脂肪族アミン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカンアミン、アルケンアミン、アルキンアミンを含むリンを含むがこれらに限定されない）を含むリンのエナンチオマーの量を減少させるための方法であるか、または、アリールアミンを含むリンのエナンチオマーの量を減少させるための方法であるか、または、アミノ酸を含むリンのエナンチオマーの量を減少させるための方法であり、より好ましくは、α−アミノ酸を含むリンのエナンチオマーの量を減少させるための方法であり、さらに好ましくは、分枝鎖α−アミノ酸を含むリンのエナンチオマー、芳香族α−アミノ酸を含むリンのエナンチオマーまたは置換フェニル基を含む芳香族α−アミノ酸を含むリンのエナンチオマー量を減少させるための方法であり、よりさらに好ましくは、α−アミノ酸を含むリンのエナンチオマーの量を減少させる方法であり、よりさらにもっと好ましくは、メチル置換リンを含むα−アミノ酸のエナンチオマーの量を減少させる方法であり、最も好ましくはグルホシネートのエナンチオマーの量を減少させる方法である。
【０２０５】
アミンの生産のための本発明の工程ｃ）に関連する、溶液、水溶液、有機溶媒を含む水溶液、緩衝系、ｐＨ値および／または温度、タンパク質の形態（粗細胞抽出物、部分精製タンパク質、精製タンパク質、生きているまたは生きていない宿主細胞の成分として存在するタンパク質、（さらなる）処理された宿主細胞、宿主細胞のスプレー乾燥）、タンパク質の量およびＰＬＰの存在および量について好ましい実施形態として本明細書で定義されていることは、本方法の工程ｃ）に従って、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法に適用できる。
【０２０６】
アミンの製造のための本発明による方法の工程ｄ）の好ましい実施形態に関して本明細書中で上記に定義されていることは、工程ｄ）にしたがって、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法に適用可能である。
【０２０７】
本発明によるタンパク質は、特に、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミン立体異性体を含む組成物から（Ｓ）−エナンチオマーの量を、減少、または実質的またはほぼ完全に除去する方法に使用することができ、それにより、（Ｒ）−アミンがエナンチオマー過剰に存在する組成物を生成する。（Ｓ）−選択的ω−ＴＡによるエナンチオマー的に富化された又はほぼエナンチオマー的に純粋なアミンの製造のための方法において触媒されるそれぞれの反応は、一般式（ＩＩ）によって説明することができる。
【０２０８】
【化４】
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【０２０９】
生物活性を有する多くの化合物は、医薬のように、農業に使用される活性化合物、補助食品添加物、飼料添加物などがエナンチオマーとして存在する。大多数の場合、一方のエナンチオマーのみが所望の生物学的活性を示し、他方のエナンチオマーは不活性であるか、しばしば望ましくない副作用さえ示す。現在、生物学的活性を有し、医薬として使用されている多くの化合物、農業分野において補助的な食品または飼料添加物（例えば、アミノ酸）は、ラセミ体の混合物としてのみ入手可能であるという欠点を有する化学合成によってのみ、生産され得るか経済的に実行可能な条件下でのみ生産され得る。本発明によるタンパク質は、そのようなラセミ混合物から（Ｓ）−アミンの量を、部分的に、有意に、またはほぼ完全に除去することができるという利点を提供し、組成物が、生物学的活性エナンチオマーを含むか、または生物学的活性エナンチオマーの製造プロセスにおいて使用するための前駆体を含むか、または組成物中にその生物学的活性エナンチオマーまたは前駆体を含むが、不活性エナンチオマーをほとんど含まず得られるという利点を有する。これにより、医薬品、農業に使用される製品、または補助食品もしくは飼料添加物を含む製品における副作用が軽減される。
【０２１０】
好ましい実施形態において、（Ｒ）−アミン及び（Ｓ）−アミンエナンチオマーを含む組成中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法は、（Ｒ）−アミン及び（Ｓ）−アミンを含む組成中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させる方法であり、該方法は；
ａ）  （Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物を提供し；
ｂ）  アミン受容体分子を提供し；
ｃ）  工程ａ）で提供される組成物および工程ｂ）で提供されるアミン受容体分子と本発明によるタンパク質とを接触させ；
ｄ）  任意に、（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量が、工程ａ）で提供される組成物中に存在する量と比較して減少した組成物を得る、工程を含む。
【０２１１】
（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンエナンチオマーを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させる方法の好ましい実施形態は、脂肪族（Ｓ）−アミン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカン（Ｓ）−アミン、アルケン（Ｓ）−アミン、アルキン（Ｓ）−アミン）の量を減少させる方法であるか、またはアリール（Ｓ）−アミンの量を減少させる方法であるかまたは（Ｓ）アミノ酸の量を減少させる方法であり、（Ｓ）−α−アミノ酸の量を減少させる方法がより好ましく、よりさらに好ましくは、分枝鎖（Ｓ）−α−アミノ酸、芳香族（Ｓ）−α−アミノ酸または置換フェニル基を含む芳香族（Ｓ）−α−アミノ酸の量を減少させる方法であり、最も好ましくは、（Ｓ）−ノルバリン、（Ｓ）−ロイシン、（Ｓ）−フェニルアラニン又は（Ｓ）−チロシンから選択されるアミノ酸の量を減少させる方法である。
【０２１２】
本発明のさらなるアミノ酸改変体を含むω−ＴＡ変異体に関して、（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させるための本発明の方法は、好ましくは、脂肪族（Ｓ）−アミン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカン（Ｓ）−アミン、アルケン（Ｓ）−アミン、アルキン（Ｓ）−アミンを含むリンを含むがこれらに限定されない）を含むリンの量を減少させるための方法であり、または、アリール（Ｓ）−アミンを含むリンの量を減少させるための方法であるか、または、（Ｓ）−アミノ酸を含むリンの量を減少させるための方法であり、より好ましくは、（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンの量を減少させるための方法であり、さらに好ましくは、分枝鎖（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリン、芳香族（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンまたは置換フェニル基を含む芳香族（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンのエナンチオマー量を減少させるための方法であり、
よりさらに好ましくは、（Ｓ）−α−アミノ酸を含む置換リンの量を減少させるための方法であり、よりさらにもっと好ましくはメチル置換リンを含む（Ｓ）−α−アミノ酸の量を減少させる方法であり、最も好ましくは（Ｓ）−グルホシネートの量を減少させる方法である。
【０２１３】
好ましくは、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法、または（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の各段階ａ）で提供される（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物は、脂肪族（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、アルケン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、アルキン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含むがこれらに限定されない）、または、アリール（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、または（Ｒ）−および（Ｓ）−アミノ酸からなる群から選択される（Ｒ）−アミンおよび／または（Ｓ）−アミンを含み、より好ましくは、（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸であり、さらにより好ましくは、分枝鎖（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸、芳香族（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸または置換フェニル基を含む芳香族（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸であり、最も好ましくは、アミノ酸である（Ｒ）−および（Ｓ）−ノルバリン、（Ｒ）−および（Ｓ）−ロイシン、（Ｒ）−および（Ｓ）−フェニルアラニンまたは（Ｒ）−および（Ｓ）−チロシンである。
【０２１４】
さらなるアミノ酸変異を含む本発明のω−ＴＡ変異体に関して、好ましくは（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法、または（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法のそれぞれ工程ａ）で提供される（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物は、脂肪族（Ｒ）および（Ｓ）−アミン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、アルケン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、アルキン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含むリンを含むがこれらに限定されない）を含むリン、または、アリール（Ｒ）および（Ｓ）−アミンを含むリン、または（Ｒ）−および（Ｓ）−アミノ酸を含むリンからなる群から選択される（Ｒ）−アミンおよび／または（Ｓ）−アミンを含み、より好ましくは、（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンであり、さらにより好ましくは、分枝鎖（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリン、芳香族（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンまたは置換フェニル基を含む芳香族（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンであり、よりさらに好ましくは、（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含む置換リンであり、よりさらにもっと好ましくは、メチル置換リンを含む（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸であり、最も好ましくは（Ｒ）−および（Ｓ）−グルホシネートである。
【０２１５】
より好ましくは、（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法、または（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の各工程ａ）で提供される組成物は、
同じ分子の（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含み、
より好ましくは、脂肪族（Ｒ）および（Ｓ）−アミン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、アルケン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、アルキン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含むがこれらに限定されない）、または、アリール（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、または（Ｒ）−および（Ｓ）−アミノ酸からなる群から選択される単一の化合物のエナンチオマーを表す（Ｒ）および（Ｓ）−アミンを含み、
より好ましくは、（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸、さらにより好ましくは分枝鎖（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸、芳香族（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸または置換フェニルを含む芳香族（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸であり、最も好ましくは、アミノ酸である（Ｒ）−および（Ｓ）−ノルバリン、（Ｒ）−および（Ｓ）−ロイシン、（Ｒ）−および（Ｓ）−フェニルアラニンまたは（Ｒ）−および（Ｓ）−チロシンである。
【０２１６】
さらにアミノ酸変異を含む本発明のω−ＴＡ変異体に関して、好ましくは、（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための方法、または（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の各工程ａ）において提供される（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含む組成物は、同じ分子の（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含み、
より好ましくは、脂肪族（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含むリン（直鎖、分枝鎖または環状のアルカン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、アルケン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミン、アルキン（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含むリンを含むがこれらに限定されない）、または、アリール（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含むリン、または（Ｒ）−および（Ｓ）−アミノ酸を含むリンからなる群から選択される単一の化合物のエナンチオマーを表す（Ｒ）−および（Ｓ）−アミンを含み、より好ましくは、（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリン、さらにより好ましくは分枝鎖（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリン、芳香族（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンまたは置換フェニル基を含む（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含むリンであり、よりさらに好ましくは、（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸を含む置換リンであり、よりさらにもっと好ましくはメチル置換リンを含む（Ｒ）−および（Ｓ）−α−アミノ酸、最も好ましくは（Ｒ）−および（Ｓ）−グルホシネートである。
【０２１７】
好ましくは、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させるための各方法、または（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法の工程ｂ）で提供されるアミン受容体分子は、アミン供与体としてのアミンの製造方法の上記各工程ｂ）で提供されるアミン供与体分子として記載されている構造に対応する構造であり、但し、アミンの製造方法の工程ｂ）で上記に提供されるアミノ供与体分子として記載される分子のようなアミノ基は、カルボニル基に置き換えられる。一例として、工程（ｂ）で提供されるアミン供与体分子として記載されているイソプロピルアミンのアミノ基をカルボニル基に置き換えることは、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法、または（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させるそれぞれの方法の、工程ｂ）で使用される対応するアミン受容体分子アセトンに導かれる。
【０２１８】
（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中のアミンエナンチオマーの量を減少させる方法、または（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させる方法の各々の工程ｂ）で提供される最も好ましいアミン受容体分子は、アセトンである。
【０２１９】
アミンの生産のための本発明の工程ｃ）に関連して、溶液、水溶液、有機溶媒を含む水溶液、緩衝系、ｐＨ値および／または温度、タンパク質の形態（粗細胞抽出物、部分精製タンパク質、精製タンパク質、生きているまたは生きていない宿主細胞の成分として存在するタンパク質、（さらなる）処理された宿主細胞、宿主細胞のスプレー乾燥）、タンパク質の量およびＰＬＰの存在および量について好ましい実施形態として本明細書で定義されていることは、本方法の工程ｃ）に応じて、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させる方法に適用できる。
【０２２０】
アミンの製造のための本発明による方法の工程ｄ）の好ましい実施形態に関して本明細書中で上記に定義されたことは、本方法の工程ｄ）に応じて、（Ｒ）−アミンおよび（Ｓ）−アミンを含む組成物中の（Ｓ）−アミンエナンチオマーの量を減少させるための方法に適用可能である。
【０２２１】
本発明のさらなる実施態様は、アミンの製造、好ましくは（Ｓ）−アミンの製造のための本発明によるタンパク質の使用である。
【０２２２】
アミンの量、好ましくはエナンチオマー混合物中の（Ｓ）−アミンの量を減少させるための本発明によるタンパク質の使用もまた、本発明の実施形態である。
【０２２３】
本発明による宿主細胞において本発明によるタンパク質を発現させるための本発明による核酸分子の使用もまた、本発明の実施形態である。
【０２２４】
本発明の別の実施形態は、本発明による核酸分子、本発明による組換え核酸分子、本発明によるプラスミド、または本発明によるベクターの使用、本発明による宿主細胞の形質転換もしくは遺伝的改変、または本発明によるタンパク質の生産に関する。
【０２２５】
アミンの製造のため、またはアミンの量、好ましくはエナンチオマー混合物中の（Ｓ）−アミンの量を減少させるための本発明による宿主細胞の使用もまた、本発明の実施形態である。
【０２２６】
配列の説明
本出願を通じて、以下のＩＵＰＡＣコードに従って、ヌクレオチド及びアミノ酸の略号を使用する：
【０２２７】
2021532756.tif 000009
【０２２８】
アミノ酸とヌクレオチドの識別のために、上表に示した大文字のヌクレオチドコード略号を、ここでは小文字で記す。
【０２２９】
2021532756.tif 000010
【０２３０】
コドンの使用は、以下の表に従って、いわゆる「一般的遺伝コード」に従う。ここで、「ｔ」はリボ核酸（ＲＮＡ）配列中の「ｕ」によって置換されるべきである。「ＴＬＣ」はアミノ酸の３文字コードおよび「ＳＬＣ」はアミノ酸の単一文字コードのための「ＳＬＣ」を表す。
【０２３１】
2021532756.tif 000011
2021532756.tif 000012
【０２３２】
配列番号１：配列番号３に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のω−トランスアミナーゼ（ω−ＴＡ）をコードする核酸配列であって、逆翻訳は一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。６個のＨｉｓアミノ酸をコードする１４３２〜１４４９位のヌクレオチドを、１４５０〜１４５２位に位置する終止コドンの前のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の配列に挿入した。
【０２３３】
配列番号２：配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のω−ＴＡをコードする核酸配列。６個のＨｉｓアミノ酸をコードする１４３２位から１４４９位のヌクレオチドを、１４５０〜１４５２位に位置する停止コドンの前のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の配列に挿入した。
【０２３４】
配列番号３：受託番号５Ｇ０９＿Ａの下のＧｅｎＰｅｐｔ（ＰＤＢ）に由来するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来ω−ＴＡのアミノ酸配列。示されるアミノ酸は、配列番号１および２に示されている核酸配列によってコードされている。４７８〜４８３位の６個のＨｉｓアミノ酸を、配列修飾によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の配列に挿入した。
【０２３５】
配列番号４：配列番号６に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られるＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来のω−ＴＡをコードする核酸配列であって、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
【０２３６】
配列番号５：配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来のω−ＴＡをコードする核酸配列。６個のＨｉｓアミノ酸をコードする１４３８〜１４５５位のヌクレオチドを、１４５６〜１４５８位に位置する終止コドンの前のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の配列に挿入した。
【０２３７】
配列番号６：受託番号５Ｇ２Ｐ＿Ａの下のＧｅｎＰｅｐｔ（ＰＤＢ）に由来するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来ω−ＴＡのアミノ酸配列。示されているアミノ酸は、配列番号４および５に示されているように、核酸配列によってコードされている。４８０〜４８５位の６個のＨｉｓアミノ酸を、配列改変によりＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の配列に挿入した。
【０２３８】
配列番号７：配列番号９に示されるアミノ酸配列の逆翻訳により得られるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（土壌７６８０１Ｄ１）由来のω−ＴＡをコードする核酸配列であり、ここで、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
【０２３９】
配列番号８：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＬＭＴＡ０１００００７９．１から派生可能な土壌７６８０１Ｄ１）由来のω−ＴＡをコードする核酸配列。
【０２４０】
配列番号９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｎｏ．ＫＲＦ５２５２８．１のもとでＧｅｎＰｅｐｔ（ＰＤＢ）から派生した土壌７６８０１Ｄ１から導出される）からのω−ＴＡのアミノ酸配列。示されるアミノ酸は、上述の配列番号７および８に示される核酸配列によってコードされている。
【０２４１】
配列番号１０：配列番号１２に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られる、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の変異ω−ＴＡをコードする核酸配列であって、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
【０２４２】
配列番号１１：配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の変異ω−ＴＡ変異体をコードする核酸配列。配列は、ＷＯ２００６／０６３３３６Ａ２の配列番号１５から導き出される。
【０２４３】
配列番号１２：ＷＯ２００６／０６３３６Ａ２の配列番号１６に由来するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の変異ω−ＴＡのアミノ酸配列。示されるアミノ酸は、上述の配列番号１１および１２に示される核酸配列によってコードされている。
【０２４４】
配列番号１３：配列番号１５に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られる、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型ω−ＴＡをコードする核酸配列であり、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
【０２４５】
配列番号１４：配列番号１５に示すアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型ω−ＴＡをコードする核酸配列。配列は、ＷＯ２００６／０６３３３６Ａ２の配列番号１から導き出される。
【０２４６】
配列番号１５：ＷＯ２００６／０６３３６Ａ２の配列番号２に由来するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型ω−ＴＡのアミノ酸配列。示されるアミノ酸は、上述の配列番号１３および１４に示される核酸配列によってコードされている。
【０２４７】
配列番号１６：配列番号１８に示されるアミノ酸配列の逆翻訳によって得られる改良されたω−ＴＡをコードする核酸配列であり、逆翻訳は、一般的な遺伝コードの縮重による翻訳の原理に従う。
【０２４８】
配列番号１７：配列番号１８に示すアミノ酸配列を有する改良されたω−ＴＡをコードする核酸配列。
【０２４９】
配列番号１８：改良されたω−ＴＡのアミノ酸配列であり、改良は、配列番号３および９に示されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のアミノ酸配列と比較して、および配列番号６、１２および１５に示されるＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換により得られる。
【０２５０】
配列番号１９：Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（同義語：Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ１）遺伝子の核酸コード配列。
【０２５１】
配列番号２０：配列番号１９に示されるコード配列から得られるＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ１）の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。
【０２５２】
配列番号２１：Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来の核酸配列と比較して、１６０−１６２位のヌクレオチドにより同定されたコドン、および１７２−１７４位のヌクレオチドにより同定されたコドン、および６３７−６３９位のヌクレオチドにより同定されたコドンについて、ヌクレオチド置換（置換）を含む、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＯ１）遺伝子の変異体の核酸コード配列。
【０２５３】
配列番号２２：配列番号２１に示されるコード配列から得られるＤ−アミノ酸オキシダーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。アミノ酸配列は、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来の核酸配列と比較して、５４位、５８位および２１３位にアミノ酸置換（置換）を含み、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と比較して、したがって、ＤＡＡＯ変異体（突然変異体）のアミノ酸配列である。
【０２５４】
配列番号２３：Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ由来のカタラーゼ遺伝子の核酸コード配列。
【０２５５】
配列番号２４：配列番号２３に示すコード配列から得られるカタラーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。
【０２５６】
配列番号２５：カタラーゼの活性を有する配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸配列。
【０２５７】
配列番号２６：図１の「ｌａｃオペレーター」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
【０２５８】
配列番号２７：図１の「Ｔｒｃプロモーター」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
【０２５９】
配列番号２８：図１の「ｒｒｎＢ」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
【０２６０】
配列番号２９：図１の「シストロン」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
【０２６１】
配列番号３０：図１の「ｒｒｎＢターミネーター」と名づけられた遺伝子要素の核酸配列。
【図面の簡単な説明】
【０２６２】
【図１】１つのオペロンからＤＡＡＯ、ω−ＴＡ、カタラーゼの活性をもつタンパク質をトリシストロン性ＲＮＡとして発現させるのに用いられる遺伝子要素を示すプラスミド地図。
【０２６３】
トリ−シストロン性ＲＮＡの転写と翻訳に関与する調節性遺伝子要素の略語への説明：
ｌａｃオペレーター：Ｕｌｌｍａｎｎ，２００１，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ，ＩＳＢＮ：９７８０４７００１５９０２；Ｕｌｌｍａｎｎ，２００９，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＥＬＳ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ：Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ．ＤＯＩ：１０．１００２／９７８０４７００１５９０２．ａ００００８４９．ｐｕｂ２；配列番号２６に示される核酸配列からなる。
Ｔｒｃプロモーター：Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｐおよびｌａｃＵＶ５プロモーターに由来する合成プロモーター（Ｂｒｏｓｉｕｓら、１９８５、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６０、３５３９−３５４１）；配列番号２７に示される核酸配列からなる。
ｒｒｎＢ：ＲｈｏＩ非依存性転写終結シグナル（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ＆Ｈａｒｔｍａｎｎ，１９９７，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２６５（４）３８５−３９３；Ｏｒｏｓｚら、１９９１，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（３），６５３−６５９）；配列番号２８に示される核酸配列からなる。
ｔ７エンハンサー：ｔ７遺伝子からの転写増強配列。（使用した配列：ｔｔａａｃｔｔｔａ）。
ＲＢＳ１：リボソーム結合部位（配列：ｇａｇｇｔ）。
シストロン：転写終結配列；配列番号２９に示される核酸配列からなる。
ＲＢＳ２：リボソーム結合部位（使用配列：ａａｇｇａｇ）。
ｂｏｘＡ：転写抗転写終結配列（使用配列：ｔｇｃｔｃｔｔｔａａｃａａ）。
シストロン：配列番号２９に示される核酸配列からなる合成シストロン。
ｒｒｎＢターミネーター：転写終結シグナル；配列番号３０に示される核酸配列からなる。
Ｔ２ターミネーター：翻訳終結シグナル（Ｏｒｏｓｚら、１９９１、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１（３）、６５３−６５９）。
【０２６４】
【図２】配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の、または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型ω−ＴＡタンパク質により触媒される、２−オキソ吉草酸のアミノ化による（Ｓ）−ノルバリンの産生を、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体と比較して提示する。
【０２６５】
【図３】配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体と比較した、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来のまたは配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型ω−ＴＡタンパク質により触媒される、４−メチル−２−オキソ−吉草酸のアミノ化による（Ｓ）−ロイシンの産生を提示する。
【０２６６】
【図４】配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体と比較した、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の、または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型ω−ＴＡタンパク質により触媒される、フェニルピルビン酸のアミノ化による（Ｓ）−フェニルアルニンの産生を提示する。
【０２６７】
【図５】配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体と比較した、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の、または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型ω−ＴＡタンパク質により触媒される、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸のアミノ化による（Ｓ）−チロシンの産生を提示する。
【０２６８】
一般的方法
１．  ω−ＴＡ変異体および更なるアミノ酸変異を有するω−ＴＡ変異体の産生
本明細書に記載されているω−ＴＡ活性を有するタンパク質をコードする本明細書に記載されている既知のヌクレオチド配列は、ユーロフィンゲノミクスＧｍｂＨ（ユーロフィンゲノミクスＧｍｂＨ、Ａｎｚｉｎｇｅｒ  Ｓｔｒ．７ａ、８５５６０エベルスベルグ、ドイツ）によるサービス提供者によって合成された。
【０２６９】
配列番号２、５、８、１１、１４の核酸配列に、核酸置換（置換）を導入した。置換は、核酸配列中のヌクレオチドを置換するのに適切な任意の手段によって、参照ポリペプチドをコードする核酸配列中で行うことができる。これらの方法は文献に広く記載されており、それぞれの配列において熟練者によく知られている。いくつかの分子生物学的方法を用いて、それぞれの核酸置換を達成することができる。本発明による変異核酸配列および対応するタンパク質を調製するための有用な方法は、予め選択された１つ以上のアミノ酸をコードするコドン上で部位特異的変異誘発を行うことを含み、それにより、異なるアミノ酸をコードする方法において選択されたコドンを変更する。これらの部位特異的変異を得る方法は、熟練者に周知であり、文献に広く記載されているか（特に：指向性突然変異誘発：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９９１，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．Ｊ．ＭｃＰＨＥＲＳＯＮ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ）、または市販キット（例えば、ＱｉａｇｅｎまたはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ由来のＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥTM照明突然変異誘発キット）を使用することが可能である。部位特異的変異誘発後、核酸をＭＧ１６５５において大腸菌スターチンに形質転換した。有利な生体内変換収量を有する変異ポリペプチドを含む細胞を、適切なスクリーニング法を用いて選択した。適切なスクリーニング方法は、ここでは「一般的方法」項目４および７に記載する。改良ポリペプチドをコードする変異核酸配列を配列検証した。配列検証の方法は熟練者によく知られており、文献に広く記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２０１２）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ））。
【０２７０】
２．  ω−ＴＡ変異体の発現ベクター／宿主細胞
野生型ω−ＴＡ（配列番号２、５、８、１４）または突然変異を含む既知ω−ＴＡ（配列番号１１）または本明細書に記載のω−ＴＡ変異体をコードする核酸配列を、市販のｐＥＴ２２Ｂベクター（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ  Ｓｔｒ  ２５０、６４２９３  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）にクローニングし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ＤＥ３細胞で発現させた。
【０２７１】
３．  ω−ＴＡ変異体の発現
ω−ＴＡ変異体をコードするそれぞれの核酸配列を導入したｐＥＴ２２Ｂベクターを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ＤＥ３の前培養を、カルベニシリンを添加した２０ｍｌのＬＢ−Ｍｅｄｉｕｍを含むフラスコで一夜１８０ｒｐｍの回転振盪機上３７℃で増殖させた。ωＴＡタンパク質の発現は、カルベニシリンを添加した２５０ｍｌのＬＢ−Ｍｅｄｉｕｍを含むフラスコに前培養を移して行った。１８０ｒｐｍの回転振盪器上で３７℃での増殖により０．６〜０．８のＯＤ（光学密度）に達した後、ω−ＴＡタンパク質の発現を０．５ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の添加により誘導した。誘導細胞培養を、１８０ｒｐｍ振盪で２０時間２０℃でインキュベートした。酵素の精製は、製造業者のプロトコールに従い、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔ  ｏｆ  Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｔｒａｓｓｅ  １、４０７２４  Ｈｉｌｄｅｎ）を用いて実施した。
【０２７２】
４．  アミン受容体およびアミン供与体存在下におけるωＴＡ変異体の活性試験
４０μｌのトリエタノールアミン緩衝液（脱イオン水中の２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝９，０）に、１０μｌのピリドキサールリン酸塩（脱イオン水中の１０ｍＭ溶液）および１０μｌのアミノ供与体（脱イオン水中の２Ｍ溶液、ＨＣｌ水溶液の添加によってｐＨ＝９，０に調整）を室温で添加した。続いてアミノ受容体（脱イオン水中の１００ｍＭ溶液）２０μｌを加えた（アミノ受容体が水に溶けない場合は、比例ＤＭＳＯを加える）。最後に、２０μｌのトランスアミナーゼ酵素（１、５ｍｇ／ｍｌ）を室温で加え、混合物を回転振盪器上で４０℃で８００ｒｐｍで６〜７時間インキュベートした。アミノ基転移反応は、反応中に種々の時間間隔で採取したアリコートのＨＰＬＣ分析によりモニターした。
【０２７３】
５．  さらなるアミノ酸改変を有するω−ＴＡ変異体に使用される発現ベクター／宿主細胞
さらなるアミノ酸改変を有するω−ＴＡ変異体についての活性試験は、２つの反応工程を含む方法を使用することによって行った。
【０２７４】
最初の反応段階（段階１）は、ω−ＴＡｓのアミン受容体を作成する。この段階は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯまたはＤＡＯ、ＥＣ  １．４．３．３）によって触媒される。ＤＡＡＯはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を含むフラボタンパク質であり、次の一般式（ＩＩＩ）に従い、Ｄ−アミノ酸の酸素による酸化的脱アミノ化を触媒して、過酸化水素およびアンモニアとともに対応する２−オキソ酸を生成する：
【０２７５】
【化５】
2021532756.tif 000013
【０２７６】
最初の反応段階においてα−２−オキソカルボン酸の生産に用いたＤＡＡＯの活性を有するタンパク質は、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来のＤＡＯ１タンパク質のＤＡＡＯ変異体であった。Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来の野生型ＤＡＯ１タンパク質のコード核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃ  Ｕ６００６．１号（配列番号１９に示される）に由来し、そして、配列番号１９に示される核酸配列によってコードされる対応するアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ  ａｃｃ  Ｎｏ．Ｐ８０３２４（配列番号２０に示す）に由来する。本明細書中で使用されるＤＡＡＯ変異体は、ＷＯ２０１７／１５１５７３において、Ｍｕｔａｎｔ  Ａｃ３０５として開示されている（３６ページ、表１）。配列番号２０と比較して、変異体Ａｃ３０５は、５４位および５８位および２１３位にアミノ酸置換（置換体）を含む。変異体Ａｃ３０５において、配列番号２０の５４位のアミノ酸ＮはＣで置換（置換）され、配列番号２０の５８位のアミノ酸ＦはＨで置換（置換）され、配列番号２０の２１３位のアミノ酸ＭはＳで置換（置換）される。変異体Ａｃ３０５のアミノ酸配列は、配列番号２２に示される。配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするそれぞれの核酸配列は、配列番号２１に示される。工程１の反応は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するＤＡＡＯの活性を有するタンパク質によって触媒された。
【０２７７】
第２の反応工程（工程２）では、工程１のＤＡＡＯの活性を有するタンパク質によって産生されたα−２−オキソカルボン酸は、アミン供与体の存在下、一般式（Ｉ）に従ってω−ＴＡ活性を有するタンパク質によってアミノ酸に変換される。
【０２７８】
一般式（ＩＩＩ）による工程１の記述から明らかなように、ＤＡＡＯの活性を有するタンパク質によって触媒されるＤ−アミノ酸のケト酸への転換は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する。Ｈ２Ｏ２の除去が望まれるかもしれないが、すべての状況で必ずしも必要ではない。Ｈ２Ｏ２の除去は、本発明に関連して、カタラーゼの活動を有するタンパクを追加することによって達成された。
【０２７９】
カタラーゼの活性を有するタンパク質（ＥＣ  １．１１．１．６；過酸化水素：過酸化水素−酸化物還元酵素）は当該技術分野において公知であり、次の一般式（ＩＶ）に従って、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の水（Ｈ２Ｏ）および酸素（Ｏ２）への変換を触媒する：
【０２８０】
【化６】
2021532756.tif 000014
【０２８１】
Ｈ２Ｏ２の除去に使用されるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ由来のカタラーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２４の下で示し、かつ、ＧｅｎｅＰｅｐｔ受託番号ＷＰ＿０１２９８６６００．１．の下で利用可能である。配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１３８９１．１に由来）は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するカタラーゼタンパク質のためのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ由来の核酸コード配列を示す。配列番号２５は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するカタラーゼタンパク質もコードする核酸配列である。配列番号２３に示される核酸配列と比較して、配列番号２５に示される核酸配列のコドンは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのコドン使用に適応されている。
【０２８２】
ＤＡＡＯの活性を有するタンパク質、ω−ＴＡ活性を有するタンパク質およびカタラーゼの活性を有するタンパク質を産生するために、それぞれの３つのタンパク質をコードする核酸配列を、すべての３つのタンパク質がｔｒｃ−プロモーター（ｔｒｐ−およびｌａｃＵＶ５−プロモーター由来の配列から構成されるハイブリッドプロモーター）からのトリシストロンＲＮＡとして単一オペロンから転写されるように、大腸菌発現ベクターにクローニングした。プロモーターからの転写に関する遺伝子の順番は、ＤＡＡＯ（配列番号２１）−＞さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体をコードする核酸分子（上述の通り）−＞カタラーゼ（配列番号２５）であった。配列番号２１は、その５’末端において、アミノ酸配列ＭＡＲＩＲＬをコードする核酸配列と翻訳的に融合された。
【０２８３】
使用される発現ベクターは、ｐＳＥ４２０（Ａｄｄｇｅｎｅ，７５  Ｓｉｄｎｅｙ  Ｓｔ，Ｓｕｉｔｅ５５０Ａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ０２１３９； https://www.addgene.org/vector-database/4064/、または、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．１６８  Ｔｈｉｒｄ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ０２４５１ＵＳＡ，https://www.thermofisher.com/search/results?query=pSE420&focusarea).)に基づいている。一般に知られている方法により、改変ｐＳＥ４２０ベクターに遺伝的エレメントを導入した。使用した発現ベクター中に存在する関連する遺伝子要素を図１に示す。３つの酵素の発現のために、発現ベクターを大腸菌ＭＧ１６５５株細胞に移入した。
【０２８４】
６．  さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体の発現
さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体を、「一般的方法」の項目５に記載されたトリ−シストロン性発現ベクター中にクローン化し、大腸菌ＭＧ１６５５株細胞中で発現させた。このために、カナマイシンを添加したＬＢ−Ｍｅｄｉｕｍ中の２０ｍｌの前培養液を、１８０ｒｐｍの回転振盪器上で３７℃の振盪フラスコ中で一夜増殖させた。ωＴＡタンパク質の発現は、前培養物を、カナマイシンを補充した２００ｍｌのＬＢ−培地を含有するフラスコに移すことによって行った。ωＴＡタンパク質の発現は、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の添加により０．６〜０．８のＯＤに達した後に誘導された。誘導細胞培養を１８０ｒｐｍ振盪で２０時間２０℃でインキュベートした。採取のために、細胞培養物を８０００ｇで４℃で１５分間遠心分離し、得られた細胞ペレットを凍結乾燥または噴霧乾燥するまで−８０℃で保存した。
【０２８５】
７．  さらなるアミノ酸改変を有するω−ＴＡ変異体の活性試験
機械的撹拌器、Ｏ２ガス注入管およびｐＨ制御投与ユニットを備えた１リットルの温度調節可能なガラスダブルジャケット付き反応器において、５０ｗ％ラセミ（Ｒ，Ｓ）−グルホシネートアンモニウム水溶液（ラセミ体グルホシネートアンモニウム１６０，８ｇに相当）２６８ｍｌを添加した。ｐＨ制御された供給ユニットを介して、２Ｍイソプロピルアミン水溶液を、機械的撹拌下（２５０ｒｐｍ）、ｐＨ＝９，０に達するまで添加した。２Ｍイソプロピルアミン水溶液の制御添加により、全反応時間中、ｐＨを一定に保つ。反応器を内温３５℃に加熱する。
【０２８６】
ビーカー中で、野生型ω−ＴＡタンパク質およびさらなるアミノ酸改変を有するω−ＴＡ変異体を発現する図１に記載された発現ベクターを含む噴霧乾燥大腸菌ＭＧ１６５５株細胞８ｇを、２００ｍｇピリドキサールリン酸、２ｍｌポリプロピレングリコール（Ｐ２０００）および１３８ｍｌの脱イオン水と混合した。この混合物を、撹拌下（２５０ｒｐｍ）、３５℃でガラス反応器に添加した。Ｏ２ガス注入管を介して、０，１ｌ／分の流速で酸素ガスを気泡化した。混合物を２４時間撹拌し、反応中に種々の時間間隔で採取したアリコートのＨＰＬＣ分析を介して反応進行をモニターした。その後、酸素ガス供給ならびにイソプロピルアミン供給を停止し、反応混合物を、撹拌下（２５０ｒｐｍ）、９０℃で３０分間変性した。残査混合物を室温まで冷却した。
【０２８７】
８．  ω−ＴＡｓにより産生されるアミンの検出
Ａ）  アミノ基転移生成物（Ｓ）−ノルバリン、（Ｓ）−ロイシン、（Ｓ）−チロシンおよび（Ｓ）−グルホシネートアンモニウムの分析
アミノ基転移反応の経過を、ＨＰＬＣ分析によりモニターした。本研究で使用したＨＰＬＣ法は、Ｄａｖａｎｋｏｖら（１９８０，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  １３（１１），６７７−６８５）の発表に基づいている。
【０２８８】
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃｈｉｒｅｘ  ３１２６（Ｄ）−ペニシラミン１５０＊４，６ｍｍ（Ｃａｔ．：００Ｆ−３１２６−Ｅ０）
流速： １ｍｌ／分
溶出液：  Ａ）脱イオン水＋０，５ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４（ｖ／ｖ）
Ｂ）メタノール
Ａ：Ｂ＝９０：１０（アイソクラティック）
検出器：  ＤＡＤ  ２３０ｎｍ
オーブン：  ３０℃
ランタイム：  １５分
【０２８９】
Ｂ）  アミノ基転移生成物Ｌ−フェニルアラニンの分析：
アミノ基転移反応の経過をＨＰＬＣ分析によりモニターした。具体的には、以下のＨＰＬＣパラメータを用いた：
【０２９０】
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｐｒｏｄｉｇｙ  ３μｍＯＤＳ−３  １００Ａ  １００＊４ｍｍ（Ｃａｔ．：００Ｄ−４２２２−Ｄ０）
流速：  ２ｍｌ／分
溶出液：    Ａ）アセトニトリル
Ｂ）脱イオン水
７分以内のＡ：Ｂ＝５：９５からＡ：Ｂ＝９５：５
検出器：  ＶＷＤＶ１  Ａ、２１０ｎｍ
オーブン：  ４０℃
ランタイム：  ９分
【０２９１】
９．  細胞の噴霧乾燥
噴霧乾燥実験は、実験室（ラボスケール）の噴霧乾燥機で行われ、最高温度入力は２２０℃であった。乾燥機は圧縮空気または窒素を５〜８バール下で２００〜８００ｌ／時（リットル／時）使用する。最大風量は、３５ｍ３／ｈ（メートル３／時）で到達できる。
【０２９２】
フラスコ培養または発酵材料（すなわち、総容量１リットル）のいずれかから細菌細胞塊を乾燥させるために、遠心分離によって培地を１０倍（１０倍）濃縮し、遠心分離後に得られた培養上清中で最終容量１００ｍｌになるまで再懸濁した。得られた濃縮液はポンピングに適している必要があり、磁気撹拌器により常時混合されるべきである。この液体は、吸引器を１００％に設定した５００ｌ／ｈの気流を用いて０．７ｍｍのノズルに適用した。典型的な生成物流量は１０ｍｌ／分であり、適用温度は、平均して注入口−１４５℃、排出口８５℃であった。その後乾燥バイオマスの重量を測定し、ｇ／ｌスケールで生物変換実験に用いた。
【実施例】
【０２９３】
実施例
１．  ２−オキソ吉草酸の（Ｓ）−ノルバリンへの変換
配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型ω−ＴＡタンパク質、または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型ω−ＴＡタンパク質、または配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体を、「一般的方法」項目３に記載されるように発現させ、精製した。
【０２９４】
脱イオン水中の２５μｌのトリエタノールアミン緩衝液（脱イオン水中の２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝９．０）に、脱イオン水中の１０μｌのピリドキサールリン酸塩（ＰＬＰ）（脱イオン水中の１０ｍＭ溶液）および脱イオン水中の１０μｌのイソプロピルアミン（脱イオン水中の２Ｍ溶液、ＨＣｌ水溶液の添加によってｐＨ＝９．０に調整）を室温で添加した。続いて、２０μｌの２−オキソ吉草酸（脱イオン水中の１００ｍＭ溶液）を加えた。最後に、１．５ｍｇ／ｍｌのそれぞれのω−ＴＡタンパク質を含む溶液３５μｌを室温で添加し、混合物を回転振盪機上で８００ｒｐｍで６時間４０℃でインキュベートした。アミノ基転移反応は、「一般的方法」項目８に記載されているように、反応中に異なる時間間隔で採取したアリコートのＨＰＬＣ分析によってモニターした。
【０２９５】
表６は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型タンパク質および配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型タンパク質のものと比較して、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体について得られた結果を示す。その結果を図２にも示した。
【０２９６】
2021532756.tif 000015
【０２９７】
表６の説明：
時間（ｈ）で測定される「時間」は、反応が開始されてからの経過時間を示す。
ｍＡＵ＊ｓは、ミリ（ｍ）吸光度（Ａ）単位（Ｕ）に、秒（ｓ）を乗じた値の略であり、ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるピークの下の面積を表す標準単位である。ピークの下の面積が大きいほど、それぞれの生成物の量は高くなる。
【０２９８】
表６と図２から導かれるのは、ω−ＴＡ変異体が触媒する反応では、２−オキソ吉草酸からの（Ｓ）−ノルバリンの生産は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからの野生型タンパク質が触媒する反応よりも速く進むということである。さらに、ω−ＴＡ変異体によって触媒される反応中に生産される（Ｓ）−ノルバリンの最大量には、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからの野生型タンパク質によって触媒される反応に比べて、より早い段階で到着する。
【０２９９】
２．  ４−メチル−２−オキソ吉草酸の（Ｓ）−ロイシンへの変換
配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型ω−ＴＡタンパク質、または配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型ω−ＴＡタンパク質、または配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体を、「一般的方法」項目３に記載されるように発現させ、精製した。
【０３００】
４０μｌのトリエタノールアミン緩衝液（脱イオン水中の２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝９，０）に、１０μｌのピリドキサールリン酸塩（脱イオン水中の１０ｍＭ溶液）および１０μｌのイソプロピルアミン（脱イオン水中の２Ｍ溶液、ＨＣｌ水溶液の添加によってｐＨ＝９．０に調整）を室温で添加した。続いて、４−メチル−２−オキソ−吉草酸（脱イオン水中１００ｍＭ溶液）２０μｌを加えた。最後に、１．５ｍｇ／ｍｌのそれぞれのω−ＴＡタンパク質を含む溶液２０μｌを室温で添加し、混合物を回転振盪機上で８００ｒｐｍで６時間４０℃でインキュベートした。アミノ基転移反応は、「一般的方法」項目８に記載されているように、反応中に異なる時間間隔で採取したアリコートのＨＰＬＣ分析によってモニターした。
【０３０１】
表７は、配列番号３に示されているアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型タンパク質および配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型タンパク質のものと比較して、配列番号１８に示されているアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体について得られた結果を示す。その結果を図３にも示した。
【０３０２】
2021532756.tif 000016
【０３０３】
表７の説明：表６の説明を参照
【０３０４】
表７および図３から、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型酵素は、４−メチル−２−オキソ−吉草酸のアミノ化によって（Ｓ）−ロイシンを産生しないが、ω−ＴＡ変異体は（Ｓ）−ロイシンをかなり効率的に産生することがわかる。
【０３０５】
３．  フェニルピルビン酸の（Ｓ）−フェニルアラニンへの変換
配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型ω−ＴＡタンパク質、または配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型ω−ＴＡタンパク質、または配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体を、「一般的方法」項目３に記載されるように発現させ、精製した。
【０３０６】
４０μｌのトリエタノールアミン緩衝液（脱イオン水中の２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝９．０）に、１０μｌのピリドキサールリン酸塩（脱イオン水中の１０ｍＭ溶液）および１０μｌのイソプロピルアミン（脱イオン水中の２Ｍ溶液、ＨＣｌ水溶液の添加によってｐＨ＝９．０に調整）を室温で添加した。続いて、比１：１のＤＭＳＯ／脱イオン水中のフェニルピルビン酸（１００ｍＭフェニルピルビン酸溶液）２０μｌを加えた。最後に、１．５ｍｇ／ｍｌのそれぞれのω−ＴＡタンパク質を含む溶液２０μｌを室温で添加し、混合物を回転振盪機上で８００ｒｐｍで６時間４０℃でインキュベートした。アミノ基転移反応は、「一般的方法」項目８に記載されているように、反応中に異なる時間間隔で採取したアリコートのＨＰＬＣ分析によってモニターした。
【０３０７】
表８は、配列番号１８に示されているアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体について得られた結果を、配列番号３に示されているアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．および配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型タンパク質の結果と比較したものである。その結果を図４にも示した。
【０３０８】
2021532756.tif 000017
【０３０９】
表8の説明:表6の説明を参照
【０３１０】
表８および図４から、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型酵素は、フェニルピルビン酸から（Ｓ）−フェニルアラニンを産生せず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型酵素は、ω−ＴＡ変異体によって産生される（Ｓ）−フェニルアラニンの量と比較して（Ｓ）−フェニルアラニンを非常にゆっくりとそして少量産生することがわかる。
【０３１１】
４．  ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸の（Ｓ）−チロシンへの変換：
配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型ω−ＴＡタンパク質、または配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型ω−ＴＡタンパク質、または配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体を、「一般的方法」項目３に記載されるように発現させ、精製した。
【０３１２】
４０μｌのトリエタノールアミン緩衝液（脱イオン水中の２００ｍＭ溶液、ｐＨ＝９，０）に、１０μｌのピリドキサールリン酸塩（脱イオン水中の１０ｍＭ溶液）および１０μｌのイソプロピルアミン（脱イオン水中の２Ｍ溶液、ＨＣｌ水溶液の添加によってｐＨ＝９．０に調整）を室温で添加した。続いて、比１：１のＤＭＳＯ／脱イオン水中の２０μｌのｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（１００ｍＭのｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸溶液）を加えた。最後に、１．５ｍｇ／ｍｌのそれぞれのω−ＴＡタンパク質を含む溶液２０μｌを室温で添加し、混合物を回転振盪機上で８００ｒｐｍで６時間４０℃でインキュベートした。アミノ基転移反応は、「一般的方法」項目８に記載されているように、反応中に異なる時間間隔で採取したアリコートのＨＰＬＣ分析によってモニターした。
【０３１３】
表９は、配列番号３に示されているアミノ酸配列を有するＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．由来の野生型タンパク質および配列番号６に示されているアミノ酸配列を有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型タンパク質のものと比較して、配列番号１８に示されているアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体について得られた結果を示す。その結果を図５にも示した。
【０３１４】
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【０３１５】
表９の説明：表６の説明を参照
【０３１６】
表９および図５から、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来の野生型酵素は、アミノ化ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸によって（Ｓ）−チロシンを産生しないが、ω−ＴＡ変異体は、（Ｓ）−チロシンを非常に効率的に産生することがわかる。
【０３１７】
５．  さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体による４−［ヒドロキシ（メチル）ホスホリル］−２−オキソブタン酸から（Ｓ）−グルホシネートの製造
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体及び表２に記載された更なるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体を、「一般的方法」の第６項に記載されているように、ＤＡＡＯの活性を有し、かつ、カタラーゼ活性を有するタンパク質（「一般的方法」の第５項を参照）とともに発現し、続いて「一般的方法」の第９項に記載されているスプレー乾燥を行った。ＤＡＡＯは、（Ｒ）−グルホシネートの脱アミノ化により４−［ヒドロキシ（メチル）ホスホリル］−２−オキソブタン酸を生成する。４−［ヒドロキシ（メチル）ホスホリル］−２−オキソブタン酸は、その後、さらなるアミノ酸改変を有するω−ＴＡ変異体によってアミノ酸受容体として使用され、アミノ化反応において（Ｓ）−グルホシネートに変換される。配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体、及び本明細書中表２に記載されるさらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体の活性試験を、「一般的方法、項目７」に記載の試験に従って行った。アミノ基転移反応は、「一般的方法」の項目８に記載されているようにＨＰＬＣ分析によってモニターし、反応開始５時間後に各反応で生成される（Ｓ）−グルホシネートの量を測定した。
【０３１８】
表１０は、さらなるアミノ酸改変を含むω−ＴＡ変異体の各々によって産生される（Ｓ）−グルホシネート（Ｓ−ＧＡ）の量、および、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体によって産生される量を示す。
【０３１９】
2021532756.tif 000019
【０３２０】
表１０の説明：
アミノ酸変化の同定のために、カラム１の番号は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列中のアミノ酸位置を特定する。番号の前に現れる文字は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列中のそれぞれの位置に存在するアミノ酸を特定する。番号の後に現れる文字は、さらなるアミノ酸変異を含むω−ＴＡ変異体のアミノ酸配列中のそれぞれの位置に存在するアミノ酸を特定する。カラムの同列に与えられた２つの番号は、それぞれ、番号の前後に出現する文字であり、配列番号１８に示されているアミノ酸配列と比較して、２つの同時のアミノ酸置換（置換）を特定する。
【０３２１】
表１０から、さらなるアミノ酸変異を含むω−ＴＡ変異体は、配列番号１８に示されているアミノ酸配列を有するω−ＴＡ変異体と比較してより多くの（Ｓ）−グルホシネートを産生することが導き出される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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