(57)【要約】  対応する非修飾のポリメラーゼと比較して、メチル化ｄＮＴＰを組み込む能力が向上したＤＮＡポリメラーゼを開示する。前記ポリメラーゼは、開示の様々なプライマー伸長方法に有用である。組換え核酸、ベクター、および宿主細胞を含む関連の組成物も開示し、これら組成物は、例えば、前記ＤＮＡポリメラーゼの生成に有用である。さらに、前記改良ＤＮＡポリメラーゼを含むキットおよび反応混合物、ならびに前記改良ＤＮＡポリメラーゼを使用するプライマー伸長の方法を開示する。
2021516544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照のＤＮＡポリメラーゼと比較して、メチル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組み込み効率が向上したＤＮＡポリメラーゼであって、
配列番号２の６４０位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩ以外の任意のアミノ酸であり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する前記ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶ以外の任意のアミノ酸であり、
前記対照のＤＮＡポリメラーゼは、前記ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有するが、配列番号２の６４０位に対応する前記対照のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩであり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する前記対照のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶである、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼおよび前記対照のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
配列番号２の６４０位に対応するアミノ酸はＭである、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
配列番号２の７０５位に対応するアミノ酸はＬである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼは配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記ＤＮＡポリメラーゼは配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼは配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の組換え核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１個の容器を含む伸長プライマーを生成するためのキット。
【請求項１１】
（ａ）プライマー伸長条件で、所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能なプライマーを提供する容器、
（ｂ）ｄＮＴＰを提供する容器、および
（ｃ）プライマー伸長に適する緩衝液を提供する容器
からなる群から選択される１個以上の追加の容器をさらに含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記ｄＮＴＰはメチル化ｄＮＴＰである、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、およびｄＮＴＰを含む反応混合物。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチド鋳型はＲＮＡである、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチド鋳型はＤＮＡである、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１６】
Ｍｇ2+をさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１７】
第２の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼを、プライマーの伸長に適する条件で、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型、およびヌクレオシド三リン酸と接触させて、それにより伸長プライマーを生成する、プライマー伸長を実施する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化ヌクレオチド（例えばデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））の効率的かつ効果的な組み込みを含む活性が向上したＤＮＡポリメラーゼ、ならびに核酸ポリヌクレオチドの伸長および増幅を含む様々な用途にこのポリメラーゼを使用する方法を提供する。さらに、メチル化ヌクレオチド（例えばｄＮＴＰ）の効率的かつ効果的な組み込みを含む活性が向上したＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの反応混合物、ならびにＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含むキットも提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、ゲノムの複製および維持という各世代にわたって遺伝子情報を正確に伝達する中心的な役割を果たす。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの合成に関与する酵素として細胞内で機能する。これらは、Ｍｇ2+などの金属活性剤の存在で、複製されるＤＮＡ鋳型またはポリヌクレオチド鋳型により決められた順序に沿って、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を重合させる。生体内では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、組換え、および遺伝子増幅などの様々なＤＮＡ合成工程に関与する。それぞれのＤＮＡ合成工程中に、ＤＮＡ鋳型は１回または多くて数回に亘って複製されて、同一の複製物を生成する。逆に生体外では、ＤＮＡの複製は、例えばポリメラーゼ連鎖反応中には、何度も繰り返すことが可能である（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号を参照）。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の初期の研究段階では、ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ複製の各回毎の開始時に添加していた（前出の米国特許第４，６８３，２０２号を参照）。その後、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを高温で増殖する細菌から採取できること、かつこれらの酵素は一度だけ添加するだけでよいことが判明した（米国特許第４，８８９，８１８号および第４，９６５，１８８号を参照）。ＰＣＲ時の高温では、これら酵素は不可逆的に不活化されることはない。その結果として、それぞれの合成繰返し工程の開始時に新たな酵素を添加することなく、ポリメラーゼ連鎖反応の反復サイクルを実行できるようになった。ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性のポリメラーゼは、組換えＤＮＡの研究や疾患の医学的診断における多くの技術の基本になっている。特に診断用途では、標的の核酸配列は問題となるＤＮＡまたはＲＮＡのごく一部分である可能性があるので、増幅せずに標的核酸配列の存在を検出することは困難な場合がある。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼの全体的な折り畳みパターンは、ヒトの右手に似ていて、手のひら、４つの指、親指、の３つの異なる小領域が含まれている（Beese et al., Science 260:352-355, 1993); Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995を参照）。４つの指と親指の小領域の構造は、サイズや細胞機能が異なるポリメラーゼの間で大きく変化するが、触媒作用を持つ手のひら小領域はすべて重ね合わせが可能である。例えば、入来するｄＮＴＰと相互作用しかつ化学触媒作用中の遷移状態を安定化するモチーフＡは、哺乳類のｐｏｌαおよび原核生物のｐｏｌＩファミリーのＤＮＡポリメラーゼ間では約１Åの平均偏差により重ね合わせが可能である（Wang et al., Cell 89:1087-1099, 1997）。モチーフＡは、構造として、優先的に疎水性残基を含む逆平行のβ鎖で始まり、αヘリックス構造に続く。ＤＮＡポリメラーゼの活性部位の一次アミノ酸配列は、非常に旨く保存されている。例えば、モチーフＡの場合には、配列ＤＹＳＱＩＥＬＲ（配列番号６）は、何百万年もの進化によって分離されてきた、例えば、テルムス・アクウァーティクス（Thermus aquaticus）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、および大腸菌（Escherichia coli）を含む生物由来のポリメラーゼに記憶されている。
【０００５】
旨く保存されていることに加えて、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位は比較的変異しやすく、ＤＮＡポリメラーゼ活性を顕著に低下させることなく特定のアミノ酸置換に対応可能なことが示されている（例えば、米国特許第６，６０２，６９５号を参照）。この変異ＤＮＡポリメラーゼは、例えば核酸合成反応を含む診断用途および研究用途に、様々な選択的な利点を提供できる。
【０００６】
ＤＮＡ重合の酵素法には少なくとも２つの工程があり、それらは（１）入来ヌクレオチドの組み込み工程と、（２）新規に取り込んだヌクレオチドの伸長工程である。ＤＮＡポリメラーゼの全体的な忠実性すなわち「忠実度」は、一般にこれら２つの酵素活性の複合と考えられるが、これら工程は明確に異なる。ＤＮＡポリメラーゼは、入来ヌクレオチドを誤って組み込むこともできるが、それが効率的に伸長されない場合は、伸長率は大きく低下して、全体的な産物の生成量は最小となる。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼに入来ヌクレオチドを誤って組み込ませて、新規に形成した不整合物を容易に誤って伸長させることも可能である。この場合には、全体的な伸長率は高くなるが、全体的な忠実度は低くなる。この種の酵素の一例として、Ｍｎ2+を２価金属イオン活性剤として使用する場合には、ＥＳ１１２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ６８３Ｒ  Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ；米国特許第７，１７９，５９０を参照）が挙げられる。不整合物に遭遇した際に躊躇／停止する傾向がある典型的なＤＮＡポリメラーゼとは異なり、ＥＳ１１２  ＤＮＡポリメラーゼは不整合物を容易に伸長させるので、この酵素は非常に高い効率を有する。ＥＳ１１２に表示される表現型は、おそらくＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖に対するＤＮＡ／ＤＮＡホモ二本鎖の構造的な影響により、ＲＴ工程中にさらに際立つことになる。別の例として、ＤＮＡポリメラーゼが容易に誤って取り込まない（誤って組み込む可能性は一段と低い）が、不整合物を誤って伸長する能力が高い場合がある。この場合には、産物全体の忠実度に顕著な変化はない。一般にこの種の酵素例は、産物の忠実度は高いので、Ｍｎ2+でのＥＳ１１２の特性よりも伸長反応に適している。ただし、この特性を利用すると、単一配列のオリゴヌクレオチドプライマーが配列の不均質性を持つ標的（例えばウイルス標的）にハイブリダイズされる場合などの不整合のあるオリゴヌクレオチドプライマーの誤った伸長が行われるが、誤まった組み込み率は通常より低いことで、元々のオリゴヌクレオチドプライマーを超えるＤＮＡ合成が完了する。この種のＤＮＡポリメラーゼの一例として、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ  ＤＮＡポリメラーゼがある（米国特許公開第２００９／０１４８８９１号を参照）。この種の活性は、オリゴヌクレオチドプライマーの不整合に対してより耐性があるので、「不整合耐性」であると呼ぶ。上記の例ではプライマー伸長型の反応について説明してきたが、ＲＴ−ＰＣＲやＰＣＲなどのプライマー伸長が頻繁に繰返される反応では、活性がより重要になる可能性がある。Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇなどの酵素は不整合に対してより「耐性」があるが、これら酵素はまた、修飾塩基（例えばｔ−ブチルベンジル修飾塩基）を含むことにより、あるいはサイバーグリーンＩ（SYBR Green I、米国特許公開番号２００９／０２８０５３を参照）などのＤＮＡ結合色素の存在で、オリゴヌクレオチドプライマーを伸長する能力が高いことを、データは示唆している。
【０００７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、多くの用途に使用される技術であり、増幅によってＲＮＡ標的を検出および／または定量する。ＰＣＲによってＲＮＡ標的を増幅するためには、最初にＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに逆転写する必要がある。典型的にＲＴ−ＰＣＲ測定は、初期のｃＤＮＡ合成工程（ＲＴ）において、中温性生物に由来する非耐熱性の逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）に基づいている。ＰＣＲでの核酸変性に必要な高温に耐えるように、ｃＤＮＡの増幅には追加の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが必要である。ＲＴ−ＰＣＲ測定でより効率的に逆転写を実施するように設計された熱活性または耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用することには、いくつかの潜在的な利点がある。ＲＮＡ鋳型の二次構造の緩和を可能にするより高い逆転写培養温度を使用する能力とともに逆転写酵素活性を向上することにより、全体としてより高いｃＤＮＡ合成効率と測定感度をもたらすことができる。より高い温度の培養はまた、逆転写工程での誤った初回刺激の低減により、特異性を高めることができる。逆転写効率が改善された酵素は、ＲＴ培養時間および／または酵素濃度の低減を可能にすることで、測定の設計を簡素化できる。ｄＵＴＰとＵＮＧを使用する場合に、厳密でない設定条件で生成されるｄＵＭＰを含む非特異的な伸長産物はＵＮＧによって分解され、プライマーとしても鋳型としても使用できない。中温性生物由来の非耐熱性逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を使用する場合には、ｄＵＴＰおよびＵＮＧの方法を利用することは不可能である（Myers, T.W. et al., ＲＮＡの増幅：ＰＣＲ手法でのテルムス・テルモフィラスのＤＮＡポリメラーゼによる高温逆転写およびＤＮＡ増幅（Amplification of RNA: High Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermus thermophilus DNA Polymerase, in PCR Strategies）、Innis, M.A., Gelfand, D.H., and Sninsky, J.J., Eds., Academic Press, San Diego, CA, 58-68, (1995)）。ただし、逆転写工程のための本発明の熱活性または耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用により、この反応をｄＵＴＰ／ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）の持ち越し汚染防止システムの活用と完全に両立させることが可能である（Longo et al., ポリメラーゼ連鎖反応における持ち越し汚染を制御するためのウラシルＤＮＡグリコシラーゼの使用（Use of Uracil DNA Glycosylase to Control Carry-over Contamination in Polymerase Chain Reactions. Gene 93:125-128, (1990)）。持ち越し汚染制御の提供に加えて、ｄＵＴＰおよびＵＮＧの使用は、「ホットスタート（高温で反応を始めること）」を提供して非特異的な増幅を削減する（Innis and Gelfand, 1999）。
【０００８】
ＰＣＲなどの核酸増幅法は、典型的には高温で実施される。ＰＣＲにおいて、高温での変性、アニール、および伸長のサイクルの繰り返しは、主に二リン酸、続いて一リン酸へのｄＮＴＰの加水分解を経て、ｄＮＴＰに顕著な分解をもたらすことが知られている。研究によると、γ−リン酸（即ち末端のリン酸）の修飾を持つｄＮＴＰは高温安定性が向上することを示している（米国特許第７，４５２，６９８号）。言い換えると、メチル基付加などの修飾（即ちメチル化ｄＮＴＰ（ｍｅ−ｄＮＴＰ））により、加水分解反応が起こらないようにできる（米国特許第７，４５２，６９８号）。従って室温および高温での安定性の観点から、メチル化ヌクレオチド（即ちメチル化ｄＮＴＰ）の使用は、従来のヌクレオチド（即ちｄＮＴＰ）よりも好ましい。このように安定なｄＮＴＰは、多大な利点をもたらし、当技術分野での改良点になる。しかし通例のＰＣＲ反応では、従来のポリメラーゼは効率的かつ効果的にメチル化ｄＮＴＰを取り込めない。従って、より安定なメチル化ｄＮＴＰを使用する増幅反応を実施するための組成物および方法が、当技術分野では依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書では、対応する非修飾の対照ポリメラーゼ（即ち親ポリメラーゼ）と比較して、メチル化ｄＮＴＰを効率的かつ効果的に組み込む能力を含む活性が改良されたＤＮＡポリメラーゼ、この改良ＤＮＡポリメラーゼを生成する方法、およびこの改良ＤＮＡポリメラーゼを使用する方法を提供する。改良ＤＮＡポリメラーゼは、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、メチル化ｄＮＴＰを効率的かつ効果的に組み込む能力が向上している。ここで、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１〜５に対して実質的に同一（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％で同一）であるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
一側面では、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較してメチル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を組み込む効率が改良されたＤＮＡポリメラーゼが提供され、配列番号２の６４０位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｖ以外の任意のアミノ酸であり、対照ＤＮＡポリメラーゼは、改良ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有するが、配列番号２の６４０位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩであり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶである。一実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より特に少なくとも９８％で同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、改良ＤＮＡポリメラーゼおよび対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％で同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、改良ＤＮＡポリメラーゼおよび対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９５％、特に少なくとも９８％で同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、配列番号２の６４０位に対応するアミノ酸はＭである。別の実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、配列番号２の７０５位に対応するアミノ酸はＬである。別の実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より特に少なくとも９８％で同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２の６４０位に対応するアミノ酸はＭである。別の実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より特に少なくとも９８％で同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２の７０５位に対応するアミノ酸はＬである。別の実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より特に少なくとも９８％で同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２の６４０位に対応するアミノ酸はＭであり、かつ配列番号２の７０５位に対応するアミノ酸はＬである。
【００１１】
別の側面では、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較してメチル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を組み込む効率が向上したＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸が提供され、配列番号２の６４０位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩ以外の任意のアミノ酸であり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶ以外の任意のアミノ酸であり、対照ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有するが、配列番号２の６４０位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩであり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶである。特定の実施形態では、組換え核酸は、上記の改良ＤＮＡポリメラーゼをコードする。
【００１２】
別の関連の側面では、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較してメチル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を組み込む効率が向上したＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸を含む発現ベクターが提供され、配列番号２の６４０位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩ以外の任意のアミノ酸であり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶ以外の任意のアミノ酸であり、対照ＤＮＡポリメラーゼは、改良ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有するが、配列番号２の６４０位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩであり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶである。特定の実施形態では、発現ベクターは、上記の改良ＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸を含む。
【００１３】
さらなる側面では、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較してメチル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を組み込む効率が向上したＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含む伸長プライマーを生成するキットが提供され、配列番号２の６４０位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩ以外の任意のアミノ酸であり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶ以外の任意のアミノ酸であり、対照ＤＮＡポリメラーゼは、改良ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有するが、配列番号２の６４０位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩであり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶである。別の実施形態では、キットはさらに、（ａ）プライマー伸長条件で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能なプライマーを提供する容器、（ｂ）ｄＮＴＰを提供する容器、および（ｃ）プライマー伸長に適する緩衝液を提供する容器からなる群から選択される１個以上の追加容器を含む。別の実施形態では、ｄＮＴＰはメチル化ｄＮＴＰである。特定の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは上記の改良ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１４】
別の側面では、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較してメチル化デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を組み込む効率が向上したＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、およびｄＮＴＰを含む反応混合物が提供され、配列番号２の６４０位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩ以外の任意のアミノ酸であり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶ以外の任意のアミノ酸であり、対照ＤＮＡポリメラーゼは、改良ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有するが、配列番号２の６４０位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩであり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶである。関連の実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型はＲＮＡである。別の実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型はＤＮＡである。別の実施形態では、反応混合物はさらに、Ｍｇ2+を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは上記の改良ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施形態では、反応混合物はさらに、第２の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００１５】
別の側面では、プライマー伸長を実施する方法が提供され、この方法は、プライマーの伸長に適する条件で、ＤＮＡポリメラーゼをプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、およびｄＮＴＰと接触させて、それにより伸長プライマーを生成することを含む。改良ＤＮＡポリメラーゼは、対照ＤＮＡポリメラーゼに比較して、高い効率によりメチル化ｄＮＴＰを組み込み、配列番号２の６４０位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩ以外の任意のアミノ酸であり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する改良ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶ以外の任意のアミノ酸であり、対照ＤＮＡポリメラーゼは、改良ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有するが、配列番号２の６４０位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＩであり、かつ／あるいは配列番号２の７０５位に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＶである。一実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より特に少なくとも９８％で同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、改良ＤＮＡポリメラーゼおよび対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対して少なくとも９０％で同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態によっては、改良ＤＮＡポリメラーゼおよび対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２に対し少なくとも９５％、特に少なくとも９８％で同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、配列番号２の６４０位に対応するアミノ酸はＭである。別の実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、配列番号２の７０５位に対応するアミノ酸はＬである。別の実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、改良ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、上記の改良ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１６】
種々のＤＮＡポリメラーゼが、上記のように変異を受けやすい。特に適しているのは、種々の好熱性細菌種由来の野生型または天然存在の耐熱性ポリメラーゼを含む耐熱性ポリメラーゼ、ならびにアミノ酸の置換、挿入、欠失、またはその他の修飾によるその野生型または天然存在の酵素に由来する合成の耐熱性ポリメラーゼである。従って実施形態によっては、ポリメラーゼは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼの非修飾形態の例として、例えば、ＣＳ５、ＣＳ６、Ｚ０５、またはＺ０５ＤのＤＮＡポリメラーゼ、またはそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％でアミノ酸配列同一性を有する機能性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。他の非修飾ポリメラーゼとして、例えば、以下の好熱性細菌種のいずれか由来のＤＮＡポリメラーゼ（またはそのポリメラーゼに対し、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％でアミノ酸配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられ、それら好熱性細菌種は、テルモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、テルムス・アクアティクス（Thermus aquaticus）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）、テルムス・フラバス（Thermus flavus）、テルムス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、テルムス菌種ｓｐｓ１７（Thermus sp. sps17）、テルムス菌種Ｚ０５（Thermus sp. Z05）、テルモトガ・ネオポリターナ（Thermotoga neopolitana）、テルモシホ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、テルムス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）、バチルス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、またはバチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax）である。適切なポリメラーゼとしてはまた、逆転写酵素（ＲＴ）活性および／またはリボヌクレオチドまたはその他の２’修飾ヌクレオチドなどの従来と異なるヌクレオチドを組み込む能力を有するポリメラーゼが挙げられる。
【００１７】
実施形態によっては、ＤＮＡポリメラーゼは熱活性ＤＮＡポリメラーゼである。効率的な逆転写活性を持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＴ−ＰＣＲ、特に単一酵素のＲＴ−ＰＣＲを実施するのに特に適しているが、効率的な逆転写活性を持つ非耐熱性ＤＮＡポリメラーゼもまた、本発明による変異を受けやすい。例えば、効率的かつ効果的に組み込まれたメチル化ｄＮＴＰの特性は、ＲＴ−ＰＣＲでのＲＴ工程に有用であるが、この工程を、熱活性であるが耐熱性でないＤＮＡポリメラーゼが不活化される温度で実施する必要はない。ＲＴ工程に続いて、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを添加するか、または反応混合物中に予め含んでおくかのいずれかで、ＰＣＲ増幅工程を実施できる。例えば、本明細書に記載の改良ＤＮＡポリメラーゼは、実施例に記載されるように、ＲＮＡ鋳型およびＤＮＡ鋳型の伸長および増幅に適した緩衝液中で、ＲＴ工程の前に第２の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせることができる。適切な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの例は、米国特許第４，８８９，８１８号、第５，７７３，２５８号、および第５，６７７，１５２号に記載されている。実施形態によっては、第２の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、AmpliTaq（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（デオキシヌクレオシド三リン酸：ＤＮＡデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、E.C.2.7.7.7）である。実施形態によっては、第２の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、以下の記載のように、可逆的に不活化された耐熱性ポリメラーゼである。一実施形態では、可逆的に不活化された耐熱性ポリメラーゼは、AmpliTaq Gold（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA）である。この第２の技法は、ＲＴ工程中に完全に活性ではないように化学的に修飾された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（または耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを不活化するその他のホットスタート技術）を用いることで、特に恩恵を受ける。効率的な逆転写活性を持つ、熱活性ではあるが耐熱性ではないＤＮＡポリメラーゼの例は、カルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans、Chy）由来のＤＮＡポリメラーゼである。例えば、米国特許第６，４６８，７７５号、第６，３９９，３２０号、第８，９４５，８８２号、第９，４４１，２６９号、および米国特許公開第２０１７／００２９７９２号を参照。
【００１８】
実施形態によっては、ＤＮＡポリメラーゼは、テルムス菌種に由来する。従って、実施形態によっては、ＤＮＡポリメラーゼは、下記の（ａ）〜（ｇ）からなる群から選択されるポリメラーゼに対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％でアミノ酸配列同一性を有する。
（ａ）テルムス菌種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）（配列番号１）、
（ｂ）テルムス・アクアティクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、
（ｃ）テルムス・フィリフォルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）、
（ｄ）テルムス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）、
（ｅ）テルムス菌種ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）、
（ｆ）テルムス・テルモフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）、および
（ｇ）テルムス・カルドフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）。
【００１９】
変異ポリメラーゼすなわち改良ポリメラーゼは、その他の非置換修飾を含むことができる。その修飾の１つは、酵素を不活化するが、ポリヌクレオチドの伸長に典型的に使用される温度などの高温での培養時に酵素を活性化するように転写される熱可逆性の共有結合修飾である。その熱可逆性修飾のための試薬の例は、米国特許第５，７７３，２５８号および第５，６７７，１５２号に説明されている。
【００２０】
実施形態によっては、逆転写酵素の活性は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅およびpSP64 poly(A) (Promega)中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子型Ｉｂ５’ＬＴＲの最初の８００塩基から生成されたＨＣＶ転写産物の検出を実施して決定される。複数の反応混合物は、複数の回数で量調節（titration）したＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）転写産物のコピーを有してもよい（いくつかの反応混合物中に、例えば、１：５の量調節、１：１０の量調節により、例えば１０，０００コピー、１０００コピー、１００コピー、１０コピー、１コピー、０コピー）。本明細書に記載されるように、本発明のポリメラーゼの逆転写酵素能力を、所定の時間単位にわたって、参照ポリメラーゼ（例えば、天然存在の非修飾ポリメラーゼまたは対照ポリメラーゼ）の逆転写酵素能力と比較してもよい。逆転写酵素能力が向上したポリメラーゼは、天然存在または非修飾のポリメラーゼと比較して、より高い効率で転写産物を増幅するか、転写産物を増幅するために必要なＰＣＲのサイクル数が少なくできる（即ち、本明細書で計算されるＣｐ値が低い）。さらに実施形態によっては、ＲＴ機能が向上したポリメラーゼはまた、長いＲＮＡ（例えば、少なくとも５００または１０００または２０００または５０００またはそれ以上のヌクレオチド長）鋳型での複製を改良する。実施形態によっては、逆転写酵素の改善効率には、対照ポリメラーゼに比較してより短い逆転写時間を含む。従って、実施形態によっては、逆転写酵素効率が改善されたポリメラーゼは、対照または参照ポリメラーゼよりも速くＲＮＡ鋳型を逆転写する。
【００２１】
種々のその他の側面では、本発明は、本明細書に記載される変異または改良ＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸、組換え核酸を含むベクター、およびこのベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。この発現ベクターを含む宿主細胞は、組換え核酸の発現に適する条件で宿主細胞を培養することで変異または改良ポリメラーゼを産生する本発明の方法に有用である。本発明のポリメラーゼは、反応混合物および／またはキット内に含まれていてもよい。組換え核酸、宿主細胞、ベクター、発現ベクター、反応混合物、およびキットの実施形態は、上記および本明細書に記載されるとおりである。
【００２２】
さらに別の側面では、ポリヌクレオチドの伸長を実施する方法が提供される。この方法は一般に、メチル化ｄＮＴＰを効率的かつ効果的に組み込む能力が向上したＤＮＡポリメラーゼを、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型、およびヌクレオシド三リン酸（即ちメチル化ｄＮＴＰ）とプライマーの伸長に適する条件で接触させて、それにより伸長したプライマーを生成することを含む。ポリヌクレオチド鋳型は、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型であってもよい。ヌクレオシド三リン酸は、例えばリボヌクレオチドおよび／または標識ヌクレオチドおよび当然ながらメチル化ｄＮＴＰなどの従来とは異なるヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオシド三リン酸塩には、ｄＡＴＰ（２’−デオキシアデノシン５’−三リン酸）、ｄＣＴＰ（２’−デオキシシチジン５’−三リン酸）、ｄＧＴＰ（２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸）、ｄＴＴＰ（２’−デオキシチミジン５’−三リン酸）、ｄＩＴＰ（２’−デオキシイノシン５’−三リン酸）、および／またはｄＵＴＰ（２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）が含まれてもよい。メチル化ｄＮＴＰには、メチル化ｄＡＴＰ、メチル化ｄＣＴＰ、メチル化ｄＧＴＰ、メチル化ＤＴＴＰ、メチル化ＩＴＰ、および／またはメチル化ｄＵＴＰが含まれてもよい。さらに、プライマーおよび／または鋳型は、１つ以上のヌクレオチド類似体を含んでもよい。変形例によっては、ポリヌクレオチドの伸長法は、ポリヌクレオチドの増幅に適する条件で、変異または改良ＤＮＡポリメラーゼを、プライマー対、ポリヌクレオチド鋳型、およびヌクレオシド三リン酸と接触させることを含むポリヌクレオチド増幅の方法である。ポリヌクレオチドの伸長反応は、例えば、ＰＣＲ、等温伸長、または配列制御（例えば４５４配列制御反応（454 sequencing reaction））であってもよい。ポリヌクレオチド鋳型は、任意の種類の生体試料に由来してもよい。
【００２３】
本発明はまた、このポリヌクレオチドの伸長法に有用なキットを提供する。一般に、キットは、本明細書に記載の変異または改良ＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１個の容器を含む。特定の実施形態では、キットはさらに、１つ以上の追加の試薬を提供する１個以上の追加の容器を含む。例えば、特定の変形例では、１個以上の追加の容器は、ヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチド伸長に適する緩衝液、および／またはポリヌクレオチドの伸長条件で所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能な１つ以上のプライマーまたはプローブポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチド鋳型は、任意の種類の生体試料に由来してもよい。
【００２４】
さらに本発明のポリメラーゼを含む反応混合物が提供される。反応混合物はまた、鋳型核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、１つ以上のプライマーまたはプローブポリヌクレオチド、（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、標識ヌクレオシド三リン酸、従来と異なるヌクレオシド三リン酸を含む）ヌクレオシド三リン酸、緩衝液、塩、（例えば蛍光体である）標識物を含んでもよい。実施形態によっては、反応混合物は、鉄キレート剤または紫色染料を含む。特定の実施形態では、反応混合物は、ヘモグロビン、またはヘモグロビンの分解産物を含む。例えば、特定の実施形態では、ヘモグロビンの分解産物は、ヘミン、ヘマチン、ヘマトフォリン、およびビリルビンなどのヘム分解産物を含む。他の実施形態では、反応混合物は、ヘパリンまたはその塩を含む。必要に応じて、反応混合物は、（限定はされないが、上記または本明細書の他の個所に記載されるものを含む）挿入染料を含む。特定の実施形態では、反応混合物は、血液から単離される鋳型核酸を含む。他の実施形態では、鋳型核酸はＲＮＡであり、反応混合物はヘパリンまたはその塩を含む。
【００２５】
実施形態によっては、反応混合物は複数のポリメラーゼを含む。例えば実施形態によっては、反応混合物は、本明細書に記載の逆転写効率が高い（例えば、ＲＮＡ鋳型を伸長する活性が高い）改良ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する別のポリメラーゼを含む。一実施形態では、反応混合物は、本明細書に記載の逆転写効率が向上した改良ＤＮＡポリメラーゼと、第２の耐熱性ＤＮＡ依存性ポリメラーゼとの混合物を含む。第２の耐熱性ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、酵素が逆転写工程に適する温度では不活性であるが、例えば約９０℃〜１００℃の高温かつ約１２分間までの時間の適切な条件で活性化されるような上述の可逆的に修飾されたポリメラーゼであってもよい。可逆的に不活化された耐熱性ポリメラーゼの活性化のための適切な条件は、例えば、実施例に説明されるホットスタートＰＣＲ反応に適用される。適切な第２の耐熱性ＤＮＡ依存性ポリメラーゼの例は、米国特許第５，７７３，２５８号および第５，６７７，１５２号に記載されている。
本明細書では、本発明の実施形態についてさらに説明する。
［定義］
【００２６】
他に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有している。本質的に本明細書に記載のものと類似の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、例示的な方法および材料だけを説明している。本発明の目的のために、次の用語を以下のように定義する。
【００２７】
「a」、「an」、および「the」という用語は、文脈がそうではないと明示していない限り、複数の指示対象も含んでいる。
【００２８】
「アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に組み込まれることが可能な任意のモノマー単位を指す。本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、以下の２０個の天然または遺伝的にコードされたαアミノ酸、すなわちアラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）を含む。「Ｘ」残基が定義されていない場合には、これらは「任意のアミノ酸」として定義されるべきである。これらの２０個の天然アミノ酸の構造は、例えば、Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。セレノシステインやピロリシンなどのさらなるアミノ酸もまた遺伝的にコードが可能である（Stadtman (1996)「セレノシステイン」“Selenocysteine,”Annu Rev Biochem 65:83-100およびIbba et al. (2002)「遺伝的コード：ピロリシンの導入」“Genetic code: introducing pyrrolysine,” Curr Biol. 12(13):R464-R466)）。「アミノ酸」という用語はまた、（例えば、修飾側鎖および／または骨格を有する）非天然アミノ酸、修飾アミノ酸、およびアミノ酸類似体を含む。例えば、Zhang et al. (2004)「哺乳類細胞中のタンパク質への５−ヒドロキシトリプトファンの選択的組み込み」“Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887、Anderson et al. (2004)「機能的４重コドンを持つ伸長された遺伝コード」“An expanded genetic code with a functional quadruplet codon” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571、Ikeda et al. (2003)「新規ヒスチジン類似体の合成および生体内でのタンパク質へのその効率的な組み込み」“Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,” Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706、Chin et al. (2003)「伸長された真核生物の遺伝コード」“An Expanded Eukaryotic Genetic Code,” Science 301(5635):964-967、James et al. (2001)「光異性化可能なフェニルアゾフェニルアラニン残基を含むリボヌクレアーゼＳ変異体の速度論的特性」“Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues,” Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991、Kohrer et al. (2001)「琥珀および黄土色のサプレッサーｔＲＮＡの哺乳類細胞への導入：アミノ酸類似体のタンパク質への部位特異的挿入への一般的手法」“Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315、Bacher et al. (2001)「別の方法による有毒なトリプトファン類似体に成長可能な大腸菌変異体の選択と特徴付け」“Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,” J. Bacteriol. 183(18):5414-5425、Hamano-Takaku et al. (2000)「変異��腸菌チロシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、非天然アミノ酸アザチロシンをチロシンよりも効率的に利用する」“A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine,” J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328、およびBudisa et al. (2001)「｛β｝−（チエノピロリル）アラニンを代替発色団および薬学的に活性なアミノ酸として含むタンパク質」“Proteins with ｛beta｝-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids,” Protein Sci. 10(7):1281-1292を参照。
【００２９】
さらに説明すると、アミノ酸は、典型的には、置換または非置換のアミノ基、置換または非置換のカルボキシ基、および１つ以上の側鎖または側基、またはこれらの基のいずれかの類似体を含む有機酸である。側鎖の例としては、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボラート、ボロナート、ホスファート、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはこれらの基の任意の組み合わせが挙げられる。その他の代表的なアミノ酸として、限定はされないが、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、金属結合アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規の官能基を備えるアミノ酸、その他の分子と共有結合的または非共有結合的に相互作用するアミノ酸、光ケージ化アミノ酸および／または光異性化可能なアミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含むアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、その他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に開裂可能なアミノ酸および／または光開裂可能なアミノ酸、炭素連結糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、および１つ以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
【００３０】
「生体試料」という用語は、生物から採取された種々の種類の試料を含み、診断測定または監視測定に使用できる。この用語は、尿、尿沈渣、血液、唾液、および生体源のその他の液体試料、生検試料などの固形組織試料、あるいはそれらまたはそれらの子孫に由来する組織培養物または細胞を含む。この用語には、特定成分の試薬による処理、溶解、沈殿、または濃縮など、入手後に何らかの方法で操作された試料が含まれる。この用語は臨床試料を含み、また細胞培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、および組織の各試料も含む。
【００３１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの文脈中の「変異体」という用語は、典型的には組換えられ、対応する機能的なＤＮＡポリメラーゼに対して１つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドを意味する。
【００３２】
変異ポリメラーゼの文脈中の「非修飾形態」という用語は、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼを定義する目的のために本明細書で用いられる用語であり、「非修飾形態」または「親形態」という用語は、変異ポリメラーゼを特徴付けるように特定された１つ以上のアミノ酸位置を除いて、変異ポリメラーゼのアミノ酸配列を有する機能的なＤＮＡポリメラーゼを指す。従って、（ａ）その非修飾形態および（ｂ）１つ以上の特定されたアミノ酸置換という語句による変異ＤＮＡポリメラーゼの表現は、特定されたアミノ酸置換を除いて、変異ポリメラーゼのその他の部分は、特定されたモチーフ中で非修飾形態と同一のアミノ酸配列を有することを意味している。「非修飾ポリメラーゼ」は（従って、メチル化ｄＮＴＰを組み込む能力が向上した修飾形態もまた）、さらなる変異を含んで、例えば転写効率、不整合耐性、および伸長率の向上、ＲＴ阻害剤およびポリメラーゼ阻害剤の耐性の向上、および／またはジデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド類似体、色素標識ヌクレオチド、５’−ヌクレアーゼの活性調節、３’−ヌクレアーゼ活性調節（または校正）などの所望の機能を提供してもよい。従って、本明細書に記載の本発明を実施する際には、ＤＮＡポリメラーゼの非修飾形態は予め決定される。非修飾形態のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、野生型および／または天然存在のＤＮＡポリメラーゼ、または意図的に修飾されたＤＮＡポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼの非修飾形態は、好ましくは、様々な好熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼなどの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに野生型または天然存在の耐熱性ポリメラーゼに対して実質的な配列同一性を有するその機能的変異体である。この変異体には、例えば、米国特許第６，２２８，６２８号および第７，１４８，０４９号に記載されるキメラＤＮＡポリメラーゼなどのキメラＤＮＡポリメラーゼが含まれてもよい。特定の実施形態では、ポリメラーゼの非修飾形態は、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する。
【００３３】
「耐熱性ポリメラーゼ」という用語は、熱に対して安定であり、耐熱性があり、その後のポリヌクレオチドの伸長反応を引き起こすのに十分な活性を保持し、かつ二本鎖核酸の変性を引き起こすのに必要な時間で高温に曝されても不可逆的に変性（不活化）しない酵素を指す。核酸変性に必要な加熱条件は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、および第４，９６５，１８８号に例示されている。本明細書で使用される耐熱性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）などの温度サイクル反応での使用に適している。本明細書の目的での不可逆的変性とは、酵素活性の永久的で完全な喪失を指す。耐熱性ポリメラーゼでの酵素活性とは、適切な方法でヌクレオチドを組合わせて、鋳型核酸鎖に相補的であるポリヌクレオチド伸長産物を生成する触媒作用を指す。好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして、テルモトガ・マリチマ、テルムス・アクアティクス、テルムス・テルモフィラス、テルムス・フラバス、テルムス・フィリフォルミス、テルムス菌種ｓｐｓ１７、テルムス菌種Ｚ０５（例えばＺ０５Ｄポリメラーゼ）、テルムス・カルドフィルス、バチルス・カルドテナックス、テルモトガ・ネオポリターナ、およびテルモシホ・アフリカヌスが挙げられる。
【００３４】
「熱活性」という用語は、ＲＴ−ＰＣＲ反応および／またはＰＣＲ反応での逆転写またはアニール／伸長工程に通常使用される温度（即ち４５〜８０℃）で触媒特性を保持する酵素を指す。耐熱性酵素は、核酸の変性に必要な高温に曝された場合に不可逆的に不活化または変性しない酵素である。熱活性酵素には、耐熱性が有っても無くてもよい。熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、限定はされないが、大腸菌、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia viruses）、および鳥類筋芽細胞症ウイルス（Avian myoblastosis virus）を含む好熱性種または中温性種由来のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００３５】
本明細書で使用される「キメラ」タンパク質とは、そのアミノ酸配列が２つ以上の別個のタンパク質由来のアミノ酸配列の部分配列の融合産物を示すタンパク質を指す。キメラタンパク質は、典型的には、アミノ酸配列の直接操作によっては生成されないが、むしろキメラアミノ酸配列をコードする「キメラ」遺伝子から発現される。特定の実施形態では、例えば、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼの非修飾形態は、テルムス種ＤＮＡポリメラーゼ由来のアミノ末端（Ｎ末端）領域、およびＴｍａＤＮＡポリメラーゼ由来のカルボキシ末端（Ｃ末端）領域からなるキメラタンパク質である。Ｎ末端領域とは、Ｎ末端（アミノ酸１位）からアミノ酸内部まで延びる領域を指す。同様にＣ末端領域とは、アミノ酸内部からＣ末端に延びる領域を指す。
【００３６】
「アプタマー」という用語は、米国特許第５，６９３，５０２号に記載されるように、ＤＮＡポリメラーゼを認識してそれに結合し、かつポリメラーゼ活性を効率的に阻害する一本鎖ＤＮＡを指す。ＲＴ−ＰＣＲでのアプタマーとｄＵＴＰ／ＵＮＧの使用はまた、例えば、Smith, E.S. et al（「ＲＮＡの増幅：ＰＣＲプライマーにマグネシウム活性化耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる高温逆転写およびＤＮＡ増幅」Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, in PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219, (2003)）に詳述されている。
【００３７】
変異ＤＮＡポリメラーゼの文脈では、異なる配列（例えば、領域、断片、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置など）への「対応」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の位置番号によって番号付けし、その後に配列同一性の百分率を最大化する方法で配列を整列させる慣例に基づいている。「［特定の配列］の［Ｘ］位に対応する」アミノ酸とは、特定の配列に同等のアミノ酸によって整列させる目的のポリペプチド中のアミノ酸を指す。一般に、本明細書に記載されるように、ポリメラーゼの位置に対応するアミノ酸は、以下に記載のＢＬＡＳＴなどの整列アルゴリズムを使用して決定できる。所定の「対応する領域」内のすべての位置が同一である必要はないので、対応する領域内の一致しない位置を、「対応する位置」と見做してもよい。従って、本明細書で使用する場合に、特定のＤＮＡポリメラーゼの「アミノ酸位置［Ｘ］に対応するアミノ酸位置」は、他のＤＮＡポリラーゼおよび構造相同体およびファミリーでの整列に基づく同等の位置を指している。本発明の実施形態によっては、アミノ酸位置の「対応」は、１つ以上のモチーフを含むポリメラーゼの領域に対して決定される。
【００３８】
本明細書で使用される「組換え体」とは、組換え法によって意図的に修飾されたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。本明細書での「組換え核酸」という用語は、一般に天然では通常見られない形態で、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって独創的に生体内で生成される核酸を意味する。従って、線形の単離された変異型ＤＮＡポリメラーゼ核酸、または通常は結合されないＤＮＡ分子を連結して生体内で生成される発現ベクターは、どちらも本発明の目的では組換え体と見做される。組換え核酸が生成され、宿主細胞内に再導入されると、その組換え核酸は、非組換え的に、すなわち生体内操作ではなく、宿主細胞の生体内細胞機構を使用して複製されることが分かっている。しかしながら、この核酸は、一旦組換えにより生成されると、その後に非組換え的に複製されるにも拘わらず、依然として本発明の目的では組換え体と見做される。「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して、すなわち上記の組換え核酸の発現により生成されたタンパク質である。
【００３９】
核酸は、それが異なる核酸配列と機能的な関係に配置されるなら、「作動可能に連結」されることになる。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合はコード配列に機能的に連結されることになり、あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置される場合はコード配列に作動可能に連結されることになる。
【００４０】
「宿主細胞」という用語は、単細胞の原核生物および真核生物（例えば、細菌、酵母、および放線菌）の両方、ならびに細胞培養で増殖させた場合に高次の植物または動物由来の単一細胞を指す。
【００４１】
「ベクター」という用語は、一片のＤＮＡ、典型的には二本鎖ＤＮＡを指し、その中に一片の外来ＤＮＡを挿入している場合がある。ベクターは、例えば、プラスミド起源であってもよい。ベクターは、宿主細胞中のベクターの自律複製を促進する「レプリコン（複製単位）」ポリヌクレオチド配列を含む。外来ＤＮＡとは、宿主細胞中には天然に見られないＤＮＡであり、例えばベクター分子を複製し、選択可能または選別可能なマーカーをコードし、または導入遺伝子をコードする異種ＤＮＡとして定義される。ベクターは、外来または異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に移送するために使用される。一旦宿主細胞中に入ると、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立してまたは同時に複製でき、ベクターおよびその挿入されたＤＮＡのいくつかのコピーが生成される。さらにベクターは、挿入されたＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にするのに、あるいは挿入されたＤＮＡの複数コピーのＲＮＡへの複製を別の方法で引き起こすのに必要な要素も含むこともできる。いくつかの発現ベクターはさらに、発現されたｍＲＮＡの半減期を長くし、かつ／あるいはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳を可能にする挿入されたＤＮＡに隣接する配列要素を含む。従って、挿入されたＤＮＡがコードするｍＲＮＡおよびポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成できる。
【００４２】
「ヌクレオチド」という用語は、天然存在のリボヌクレオチドモノマーまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー指すことに加えて、本明細書では、ヌクレオチドが使用（例えば、相補性塩基へのハイブリダイズ化など）されている特定の文脈に関連して、文脈内にそうでないことが明示されていない限り、機能的に同等である誘導体および類似体を含むそれらの関連する構造変異体を指すと理解すべきである。
【００４３】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、リボース核酸（ＲＮＡ）ポリマーまたはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー、またはそれらの類似体に対応付けできるポリマーを指す。この用語には、ＲＮＡやＤＮＡなどのヌクレオチドのポリマー、ならびにそれらの合成形態、それらの修飾形態（例えば、化学的または生化学的な修飾形態）、および（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方の小単位を含む）混合ポリマーも含まれる。この修飾の例としては、メチル化、類似体による１つ以上の天然存在のヌクレオチドの置換、および非荷電結合剤（例えば、ホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、ホスホアミダート、カルバマートなど）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および修飾結合剤（例えばαアノマー性核酸など）などによるヌクレオチド間の修飾が挙げられる。また水素結合およびその他の化学的相互作用によって指定配列に結合する能力がポリヌクレオチドに類似する合成分子も挙げられる。典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して連結されるが、核酸の合成形態には他の結合を含むことも可能である（例えば、Nielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記載されるペプチド核酸）。核酸は、例えば、染色体または染色体部分、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡまたはＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物、オリゴヌクレオチド、プローブ、およびプライマーであってもよく、あるいは含んでもよい。核酸は、例えば、一本鎖、二本鎖、または三本鎖であってもよく、いかなる特定の長さにも限定されない。他に示されない限り、特定の核酸配列は、明示された任意の配列に加えて、必要に応じて、相補的配列を含むか、あるいはコードする。
【００４４】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えばヌクレオチド）を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には、約６個〜約１７５個の核酸モノマー単位、より典型的には約８個〜約１００個の核酸モノマー単位、さらにより典型的には約１０個〜約５０個の核酸モノマー単位（例えば、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、またはそれ以上の核酸モノマー単位）を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能や用途などの多くの要因に依存する。オリゴヌクレオチドは、限定はされないが、既存または天然の配列の単離、ＤＮＡの複製または増幅、適切な配列の逆転写、クローニングおよび制限消化、またはNarang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)のリン酸トリエステル法、Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)のリン酸ジエステル法、Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981)のジエチルリン酸アミダイト法、Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)のトリエステル法、自動合成法、米国特許第４，４５８，０６６号の固形支持法などによる直接化学合成、または当業者に既知のその他の方法を含むいずれかの適切な方法によって任意に調製される。
【００４５】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、ポリヌクレオチド伸長が開始される条件、例えば、（コピーされた鋳型によって指示される）必須のヌクレオシド三リン酸および適切な緩衝液中のポリメラーゼの存在、および（例えばポリメラーゼ連鎖反応中などの）適切な温度または温度サイクルを含む条件に置かれた場合に、鋳型誘導の核酸合成の開始点として作用可能なポリヌクレオチドを指す。さらに説明すると、プライマーはまた、新規ＲＮＡ合成や生体内転写関連工程（例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）など）を含む種々のオリゴヌクレオチド媒介合成工程での開始剤として使用できる。プライマーは、典型的には、一本鎖オリゴヌクレオチド（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド）である。プライマーの適切な長さは、プライマーの使用目的によって異なるが、典型的には６〜４０ヌクレオチド、より典型的には１５〜３５ヌクレオチドである。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定したハイブリッド複合体を形成するようにより低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、プライマー伸長が起こるためには、鋳型とハイブリダイズするように十分に相補的である必要がある。特定の実施形態では、「プライマー対」という用語は、（例えば、標的配列がＲＮＡとして発現している場合に、またはＲＮＡである場合に）増幅される核酸配列の５’末端の相補体にハイブリダイズする５’センスプライマー（「順方向プライマー」と呼ぶこともある）、および増幅される配列の３’末端にハイブリダイズする３’アンチセンスプライマー（「逆方向プライマー」と呼ぶこともある）を含む１組のプライマーを意味する。プライマーは、必要に応じて、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段により検出可能な標識を組み込むことによって標識化できる。例えば有用な標識には、32Ｐ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、（ＥＬＩＳＡ測定で一般的に使用される）酵素、ビオチン、または抗血清抗体またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質が含まれる。
【００４６】
核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸、またはヌクレオチドに関連する場合の「従来の」または「天然の」という用語は、記載されているポリヌクレオチド中に天然に存在するものを指す（即ち、ＤＮＡではこれらはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰである）。さらに、配列制御などの生体内のＤＮＡ合成反応では、ｄＩＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰはｄＧＴＰの代わりに頻繁に利用され、７−デアザ−ｄＡＴＰは、ｄＡＴＰの代わりに利用できる。総称して、これらはｄＮＴＰと呼ばれる場合がある。
【００４７】
核酸塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドに関連する場合の「従来と異なる」または「修飾された」という用語は、特定のポリヌクレオチドに天然に存在する従来の塩基、ヌクレオシド、またはヌクレオチドの修飾体、誘導体、または類似体を含む。従来と異なるまたは修飾された核酸塩基の一例として、メチル基がｄＮＴＰに付加しているメチル化ｄＮＴＰが挙げられる。α−、β−、またはγ−リン酸基のいずれか１つ以上を、１つ以上のメチル基で修飾できる。好ましい実施形態では、メチル化ｄＮＴＰは、γ−リン酸基に付加された１つのメチル基を有する。従来のｄＮＴＰと比較して、特定の従来と異なるヌクレオチドは、リボース糖の２’位置で修飾されている。従ってＲＮＡの場合には、天然存在のヌクレオチドはリボヌクレオチド（即ち、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、総称してｒＮＴＰ）であるが、これらのヌクレオチドは、本明細書で使用される場合に、比較すると糖の２’位置にｄＮＴＰには存在しない水酸基を有するので、リボヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの基質として従来と異なるヌクレオチドとなる。本明細書で使用される従来と異なるヌクレオチドには、限定はされないが、核酸配列を制御するためのターミネーターとして使用される化合物が含まれる。ターミネーター化合物の例として、限定はされないが、２’，３’ジデオキシ構造を有する化合物が挙げられ、これら化合物は、ジデオキシヌクレオシド三リン酸と呼ばれる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸であるｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、およびｄｄＧＴＰは、総称してｄｄＮＴＰと呼ばれる。ターミネーター化合物のさらなる例として、リボヌクレオチドの２’−ＰＯ4類似体が挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７９９１号および第２００５／００３７３９８号を参照）。その他の従来とは異なるヌクレオチドとして、ホスホロチオアートｄＮＴＰ（［α−Ｓ］ｄＮＴＰ）、５’−［α−ボラノ］−ｄＮＴＰ、［α］−メチルホスホナートｄＮＴＰ、およびリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）が挙げられる。従来と異なる塩基は、32Ｐ、33Ｐ、または35Ｓなどの放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、ビオチンなどのハプテン標識、またはストレプトアビジンまたはアビジンなどの酵素標識により標識されてもよい。蛍光標識には、フルオレセイン系統の色素などの負に帯電した色素、またはローダミン系統の色素などの電荷が中性の色素、またはシアニン系統の色素などの正に帯電した色素を含んでもよい。フルオレセイン系統の色素として、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、およびＺＯＥが挙げられる。ローダミン系統の色素として、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、およびＴＡＭＲＡが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、テキサスレッド、およびＴＡＭＲＡで標識された種々の色素またはヌクレオチドは、Perkin-Elmer (Boston, MA)、Applied Biosystems (Foster City, CA)、またはInvitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)から市販されている。シアニン系統の色素には、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＣｙ７が含まれ、GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)から市販され���いる。
【００４８】
本明細書で使用される「配列同一性の百分率」とは、比較窓領域全体で２つの最適に整列させた配列を比較して決定され、この比較窓領域内の配列の一部分は、２つの配列の最適な整列において、（付加または欠失を含まない）参照配列に対比して付加または欠失（すなわち切れ目）を含んでいてもよい。この百分率は、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が発生する位置の数を測定して一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較窓領域内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて算出されて、配列同一性の百分率が求められる。
【００４９】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈での「同一の」または百分率の「同一性」という用語は、同一である２つ以上の配列または部分配列を指している。後述の配列比較のアルゴリズムのうちの１つを使用し、または手動での位置合わせと目視検査によって測定して、比較窓領域または指定領域にわたって最大の対応となるように比較して整列させた場合に、配列が、特定の百分率で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有するなら（例えば、特定の領域全体で、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するなら）、その配列は互いに「実質的に同一」であると言える。これらの定義はまた、試験配列の相補体にも適用される。任意ではあるが、この同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチドである領域にわたって、またはより典型的には、長さが１００〜５００、または１，０００以上のヌクレオチドである領域にわたって存在する。
【００５０】
２つ以上のポリペプチド配列の文脈での「類似性」または「百分率類似性」という用語は、後述の配列比較のアルゴリズムのうちの１つを使用し、または手動での位置合わせおよび目視検査によって測定して、比較窓領域または特定領域にわたって最大の対応となるように比較し整列させた場合に、保存アミノ酸置換によって定義される同一あるいは類似のいずれかである特定の百分率（例えば、特定領域で６０％の類似性、任意に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の類似性）のアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指している。配列が互いに、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％で類似しているなら、これらの配列はまた、互いに「実質的に類似」であると言える。任意ではあるが、この類似性は、長さが少なくとも約５０アミノ酸である領域にわたって、またはより典型的には、長さが１００〜５００、または１，０００以上のアミノ酸である領域にわたって存在する。
【００５１】
配列比較では、典型的には１つの配列を参照配列として機能させて、試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合に、試験配列と参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。既定のプログラムパラメータが通常使用されるが、代替パラメータを指定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列での配列同一性または配列類似性の百分率を計算する。
【００５２】
本明細書で使用される「比較窓領域」とは、２０〜６００、一般的には約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置の番号のうちのいずれかの区画を指し、1つの配列は、参照配列とともに２つの配列を最適に整列させた後に、同一の連続位置の番号の参照配列と比較される。比較のために配列を整列させる方法は、当技術分野でよく知られている。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970) の局地的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970)の相同性整列アルゴリズム、Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実行（例えば、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis. のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または手動の位置合わせおよび目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)を参照）により実施できる。
【００５３】
百分率の配列同一性および配列類似性を決定するのに適するアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)およびAltschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)にそれぞれ説明されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公開されている。このアルゴリズムでは、最初にクエリ配列で長さＷの短いワードを特定して、高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを含み、これは、データベース配列内の同一の長さのワードと整列させると、正の値の閾値スコアＴに一致するか、またはそれを満たす。Ｔは近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（前出のAltschul et al.）。これらの初期の近傍ワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するシードとして機能する。ワードのヒットは、累積的な整列スコアを増大できる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。ヌクレオチド配列の累積スコアは、パラメーターＭ（一致する残基対の報酬スコア、常に＞０）およびＮ（不一致の残基の罰則スコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合に、スコアマトリックスを使用して累積スコアが計算される。各方向へのワードヒットの拡張は、累積整列スコアが到達した最大値から量Ｘだけ落下した場合に、１つ以上の負のスコアの残基整列の累積により累積スコアが０以下になった場合に、またはいずれかの配列の終端に到達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。（ヌクレオチド配列の場合の）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、既定値としてワード長（Ｗ）に１１、期待値（Ｅ）に１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較値を使用する。アミノ酸配列の場合のＢＬＡＳＴＰプログラムは、既定値としてワード長に３、期待値（Ｅ）に１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照）の整列値（Ｂ）に５０、期待値（Ｅ）に１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較値を使用する。
【００５４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較での最小合計確率が約０．２未満、典型的には約０．０１未満、より典型的には約０．００１未満である場合に、この核酸は参照配列に類似であると見做される。
【００５５】
「Ｃｐ値」または「交差点」値という用語は、投入された標的核酸の定量を可能にする値を指す。Ｃｐ値は、二次微分最大法（Van Luu-The, et al.,「二次微分計算および二重補正を使用した高速処理測定のためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法の改善」“Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction,” BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287-293）によって測定できる。二次微分法では、Ｃｐは二次微分曲線の最初のピークに対応する。このピークは、対数線形段階の開始点に対応する。この二次微分法では、即時蛍光強度曲線の二次微分値を計算して、１個の値だけを取得する。元々のＣｐ法は、局所的に定義された、例えば多項式関数による強度値の微分可能な近似に基づいている。次に三次導関数が計算される。Ｃｐ値は、三次導関数の最小の根である。Ｃｐはまた、フィットポイント法を使用して決定することもでき、この場合には、Ｃｐは、対数線形領域での閾値に平行な線の交差によって求められる（Van Luu-The, et al., BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287-293）。Rocheが提案するLightCycler装置を用いて、二次導関数最大法による計算によって、Ｃｐ値は提供される。
【００５６】
「ＰＣＲ効率」という用語は、サイクル毎の増幅効率の指標を指す。ＰＣＲ効率は、各条件で、式：％ＰＣＲ効率＝（１０(-slope)−１）×１００を用いて計算され、式中の勾配（slope）は、ｙ軸に対数のコピー回数およびｘ軸にＣｐをプロットして直線回帰によって計算される。ＰＣＲ効率は、完全一致の、または完全不一致のプライマー鋳型を用いて測定できる。
【００５７】
「核酸伸長速度」という用語は、生体触媒（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼなどの酵素）が、１つ以上のヌクレオチドを核酸に（例えば共有結合的に）付加させて、核酸（例えば、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド）を鋳型依存的または鋳型非依存的な方法で伸長する速度を指す。例示すると、本明細書に記載の特定の変異ＤＮＡポリメラーゼは、これらのＤＮＡポリメラーゼの非修飾形態に比べて核酸伸長速度が向上して、所定の一連の反応条件でこれらの非修飾形態のＤＮＡポリメラーゼよりも速い速度でプライマーを伸長できる。
【００５８】
「ＲＴおよびポリメラーゼ阻害剤の許容量」という用語は、対照ポリメラーゼのポリメラーゼ活性または逆転写活性を阻害すると思われる量の阻害剤の存在で、活性（ポリメラーゼ活性または逆転写活性）を維持するポリメラーゼの能力を指す。実施形態によっては、改良ポリメラーゼは、対照ポリメラーゼの活性を本質的に排除すると思われる量の阻害剤の存在で、ポリメラーゼ活性または逆転写活性の発揮を可能にする。
【００５９】
「デオキシリボヌクレオシド三リン酸」または「ｄＮＴＰ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、および／またはｄＵＴＰを指す総称である。デオキシリボースを含むヌクレオシド三リン酸はｄＮＴＰと呼ばれ、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）、およびデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）のように、その名称にはデオキシ−という接頭語を付け、その略称には小文字のｄ−を付ける。ｄＮＴＰは、ＤＮＡ複製の構成基本単位である（組み込みの過程で２つのリン酸基は消失する）。各ｄＮＴＰは、リン酸基、デオキシリボース糖、および窒素含有塩基で構成されている。ＤＮＡの二重らせん構造は、ポリマー中のモノマー単位によく似たｄＮＴＰから構成されている。
【００６０】
「アルキル化プライマー」という用語は、１つ以上の塩基がアルキル基の付加によって修飾されているオリゴヌクレオチドを指す。本発明の修飾プライマーを使用すると、非特異的増幅、特にプライマー二量体の生成の減少、および／または非修飾プライマーを用いて実施された増幅に対比して目標とする標的の収量の随伴的な増加が起こる（米国特許第６，００１，６１１号を参照）。
【００６１】
「メチル化したｄＮＴＰ」、「メチル化ｄＮＴＰ」、または「ｍｅ−ｄＮＴＰ」という用語は、１つ以上のメチル基が付加されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはｄＮＴＰを指す。その例として、メチル化ｄＡＴＰ、メチル化ｄＣＴＰ、メチル化ｄＧＴＰ、およびメチル化ｄＴＴＰが挙げられる。１つ以上のメチル基は、ｄＮＴＰ中に見られるα−、β−、またはγ−リン酸基のいずれかの１つ以上に付加されてもよい。特定の例として、メチル化ｄＮＴＰでは、各ｄＮＴＰの末端γ−リン酸基がメチル基で修飾されていて、これによりＰＣＲなどの増幅反応での使用では、通常の非メチル化ｄＮＴＰに比較してより安定したｄＮＴＰ成分を生成する。γ−リン酸基に１つのメチル基を持つメチル化ｄＮＴＰを使用するような場合には、メチル基はγ−リン酸基の上に存在するために、リン酸基はピロリン酸として切断されるので、ＰＣＲの伸長段階中にメチル基はアンプリコン中に組み込まれない。このように、より安定した成分が使用されているが、ＰＣＲ反応を妨害しない。
【００６２】
「フッ素化ｄＮＴＰ」、「フッ化ｄＮＴＰ」、「Ｆ−ｄＮＴＰ」、または「ｆ−ｄＮＴＰ」という用語は、１つのリン酸基がフッ素化された任意のデオキシリボヌクレオシド三リン酸またはｄＮＴＰを指す。その例として、フッ化ｄＡＴＰ、フッ化ｄＣＴＰ、フッ化ｄＧＴＰ、フッ化ｄＴＴＰ、およびフッ化ｄＵＴＰが挙げられる。フッ素原子は、ｄＮＴＰに見られるα−、β−、またはγ−リン酸基のいずれか１つにある１つの酸素を置換してもよい。特定の例として、フッ化ｄＮＴＰでは、各ｄＮＴＰの末端γ−リン酸基がフッ素化され、これによりＰＣＲなどの増幅反応での使用では、通常の非修飾ｄＮＴＰに比較してより安定なｄＮＴＰ成分を生成する。
【００６３】
「５’−ヌクレアーゼプローブ」という用語は、少なくとも１つの発光標識部分を含み、かつ５’−ヌクレアーゼ反応で使用されて標的核酸の検出を行うオリゴヌクレオチドを指す。実施形態によっては、例えば、５’−ヌクレアーゼプローブは、単一の発光部分（例えば蛍光色素など）のみを含む。特定の実施形態では、５’−ヌクレアーゼプローブは、プローブが選択された条件でヘアピン構造を生成できるように自己相補性の領域を含む。さらに説明すると、実施形態によっては、５’−ヌクレアーゼプローブは、少なくとも２つの標識部分を含み、２つの標識のうちの１つがオリゴヌクレオチドから切断されまたは別の方法で分離された後に、高い強度の放射線を放出する。特定の実施形態では、５’−ヌクレアーゼプローブは、２つの異なる蛍光色素、例えば５’末端レポーター色素および３’末端クエンチャー色素または部分により標識される。実施形態によっては、５’−ヌクレアーゼプローブは、末端位置以外の、または末端位置に加えて、１つ以上の位置で標識される。プローブが未処理の場合に、レポーター色素からの蛍光発光が少なくとも部分的に消光されるように、典型的には、２つの蛍光体の間でエネルギー移動が発生する。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中に、例えば鋳型核酸に結合した５’ヌクレアーゼプローブは、レポーター色素の蛍光発光が消光されないように、例えばこの活性を有するＴａｑポリメラーゼまたは別のポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。５’−ヌクレアーゼプローブの例はまた、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，９９４，０５６号、および第６，１７１，７８５号に記載されている。その他の実施形態によっては、５’ヌクレアーゼプローブは、２つ以上の異なるレポーター色素および３’末端クエンチャー色素または部分により標識されてもよい。
【００６４】
「ＦＲＥＴ」または「蛍光共鳴エネルギー移動」または「フェルスター共鳴エネルギー移動」という用語は、少なくとも２つの発色団、すなわちドナー発色団およびアクセプター発色団（クエンチャ―と呼ばれる）間でのエネルギーの移動を指す。ドナーは、典型的には、ドナーが適切な波長での光放射によって励起されると、エネルギーをアクセプターに移動させる。アクセプターは、典型的には、移動されたエネルギーを、異なる波長をもつ光放射の形態で再放出する。アクセプターが「ダーク」クエンチャ―（暗消光剤）である場合に、このクエンチャ―は、光以外の形態で移動されたエネルギーを消散させる。特定の蛍光体がドナーまたはアクセプターとして機能するかどうかは、ＦＲＥＴ対の他方の部材の特性に依存する。通常使用されるドナー−アクセプター対には、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対が挙げられる。通常使用されるクエンチャ―は、ＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。通常使用されるダーククエンチャ―には、BlackHole QuenchersTM (BHQ) (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.)、Iowa BlackTM (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa)、およびBlackBerryTM Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.)が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】メチル化ｄＮＴＰまたはフッ素化ｄＮＴＰを用いるＺ０５Ｄ−Ｆ２の特性の向上を示すリアルタイムＰＣＲデータを示す。
【００６６】
【図２】異なる濃度でのメチル化ｄＮＴＰの組み込みを比較するリアルタイムＰＣＲデータを示す。親Ｚ０５Ｄによる１ｍＭの標準ｄＮＴＰの組み込みが基準として示され、比較の基本となる。
【００６７】
【図３】鋳型およびｄｄＣＴＰ（ＰＤＢ受託コード４Ｎ５Ｓ）との三成分系複合体中のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片の結晶構造を示す。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５Ｄでの原型として用いられる。対応する残基Ｉ６３８およびＶ７０３（Ｉ６４０およびＶ７０５）は標識されている。
【００６８】
【図４Ａ】親Ｚ０５Ｄ（配列番号２）、Ｚ０５Ｄ−Ｆ２（配列番号３）、および単一変異体であるＺ０５Ｄ−Ｉ６４０Ｍ（配列番号４）およびＺ０５Ｄ−Ｖ７０５Ｌ（配列番号５）による通常の非修飾のｄＮＴＰまたはメチル化ｄＮＴＰの組み込みを比較するリアルタイムＰＣＲデータを示す。
【図４Ｂ】図４Ａの説明に同じ。
【００６９】
【図５】親Ｚ０５Ｄ（配列番号２）、Ｚ０５Ｄ−Ｆ２（配列番号３）、および単一変異体であるＺ０５Ｄ−Ｉ６４０Ｍ（配列番号４）およびＺ０５Ｄ−Ｖ７０５Ｌ（配列番号５）によるメチル化ｄＮＴＰの組み込みを比較するＲＴ−ＰＣＲデータを示す。β−カテニン転写産物を、アルキル化プライマーおよびメチル化ｄＮＴＰを（１ｍＭまたは２ｍＭで）有するＲＮＡ鋳型として使用した。通常の（非修飾の）ｄＮＴＰを用いるＺ０５Ｄのデータが、基準として示されている。［発明の詳細な説明］
【００７０】
本発明は、ポリメラーゼ領域内の１つ以上のアミノ酸が非修飾ＤＮＡポリメラーゼに対比して変異している改良ＤＮＡポリメラーゼを提供する。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、非修飾形態のポリメラーゼと比較して、メチル化ｄＮＴＰを効率的かつ効果的に組み込む能力が向上した活性酵素である。
【００７１】
メチル化ｄＮＴＰをより効率的かつ効果的に組み込むＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡ標的を検出および／または定量する検定を含む様々な用途に有用である。従って、ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、組換えＤＮＡ研究および疾患の医学的診断の用途を含むポリヌクレオチド伸長ならびにポリヌクレオチド鋳型の逆転写または増幅を含む種々の用途に有用である。
【００７２】
実施形態によっては、本発明のポリメラーゼは、キメラポリメラーゼであり、すなわち複数の酵素からのポリペプチド領域を含む。このキメラＤＮＡポリメラーゼは、例えば、米国特許第６，２２８，６２８号に記載されている。キメラＣＳ系統ＤＮＡポリメラーゼが特に適切であるが、このポリメラーゼは、実質的なアミノ酸配列同一性または類似性（典型的には、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性）を有するＣＳ５およびＣＳ６ポリメラーゼおよびそれらの変異体を含む。ＣＳ５およびＣＳ６ＤＮＡポリメラーゼは、テルムス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼおよびテルモトガ・マリチマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ由来のキメラ酵素である。これらは、テルムス酵素のＮ末端の５’−ヌクレアーゼドメイン、Ｔｍａ酵素のＣ末端の３’−５’エキソヌクレアーゼ、およびポリメラーゼドメインを含む。これらの酵素は、効率的な逆転写酵素活性を有し、ヌクレオチド類似体含有プライマーを伸長させ、α−チオリン酸ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰを組み込むことができ、またフルオレセイン色素系統およびシアニン色素系統で標識したｄＮＴＰも組み込むことができる。ＣＳ５およびＣＳ６ポリメラーゼは、効率的なＭｇ2+活性化ＰＣＲ酵素でもある。ＣＳ５およびＣＳ６キメラポリメラーゼは、例えば、米国特許第７，１４８，０４９号にさらに記載されている。
【００７３】
実施形態によっては、アミノ酸置換は単一のアミノ酸置換である。本明細書で提供されるＤＮＡポリメラーゼは、非修飾のポリメラーゼに対比して、活性部位に１つ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。これらの位置でのアミノ酸置換により、メチル化ｄＮＴＰを組み込む能力が向上し、非修飾のポリメラーゼに対比してメチル化ｄＮＴＰを組み込む能力が向上した変異ＤＮＡポリメラーゼが生成される。実施形態によっては、Ｚ０５Ｄの６４０位かつ／あるいは７０５位のアミノ酸は、Ｚ０５Ｄの天然配列に対応しないアミノ酸により置換されている。特定の実施形態では、Ｚ０５Ｄの６４０位のアミノ酸はメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）により置換され、かつ／あるいはＺ０５Ｄの７０５位のアミノ酸はロイシン（ＬｅｕまたはＬ）により置換されている。１つ以上の特定部位でのその他の適切なアミノ酸置換は、例えば、部位特異的な変異誘発の既知の方法、および本明細書にさらに記載される測定でのポリヌクレオチド伸長性能の決定方法、または当業者に既知の別の方法を用いて決定できる。
【００７４】
実施形態によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号３を含み、さらに天然のポリメラーゼと比較して（例えば、アミノ酸置換、付加、または欠失による）１つ以上のさらなるアミノ酸の変更を含む。
【００７５】
実施形態によっては、この機能的な変異ポリメラーゼは、典型的には、野生型または天然存在のポリメラーゼに対して実質的な配列同一性または類似性を有し、典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００７６】
１つ以上の特定部位での他の適切なアミノ酸置換は、例えば、部位特異的な変異誘発の既知の方法、および本明細書にさらに記載される測定でのポリヌクレオチド伸長性能の決定方法、または当業者に既知の別の方法を用いて決定でき、例えば、このアミノ酸置換は、米国特許公開第２００９／０１４８８９１号および第２００９／０２８０５３９号に記載されている。
【００７７】
実施形態によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、テルムス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）またはその変異体（例えば、Ｄ５８０Ｇ変異を保持するＺ０５Ｄ（配列番号２）などの変異体）に由来する。従って、本発明の特定の変形例によっては、変異ポリメラーゼは、テルムス種Ｚ０５Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（または、配列番号２に対し実質的に同一、例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％で同一のＤＮＡポリメラーゼ）に対比して、６４０位および／または７０５位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、配列番号２の６４０位のアミノ酸は、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）（即ち配列番号３または４）である。特定の実施形態では、配列番号２の７０５位のアミノ酸残基は、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）（即ち配列番号３または５）である。
【００７８】
テルムス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の例として、アミノ酸置換Ｄ５８０Ｇ（即ちＺ０５Ｄ（配列番号２））を含む変異体が挙げられる。実施形態によっては、変異テルムス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アミノ酸残基置換Ｄ５８０ＧおよびＩ６４０Ｍ（配列番号４）を含む。実施形態によっては、変異テルムス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アミノ酸残基置換Ｄ５８０ＧおよびＶ７０５Ｌ（配列番号５）を含む。実施形態によっては、変異テルムス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、アミノ酸残基置換Ｄ５８０Ｇ、Ｉ６４０Ｍ、およびＶ７０５Ｌ（配列番号３）を含む。特定の実施形態では、変異テルムス種Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｄ５８０Ｇ、Ｉ６４０Ｍ、および／またはＶ７０５Ｌ（配列番号３〜５）から独立して選択される１つ以上のアミノ酸残基置換を含む。
【００７９】
配列番号１（Ｚ０５）の５８０位に対応するアミノ酸での置換により、それはＺ０５Ｄ（配列番号２）として既知であるが、例えば、伸長率、逆転写効率、および／または増幅能力の向上を含むポリメラーゼ活性が向上したＤＮＡポリメラーゼを生成できることは上記に示した通りである（米国特許第８，９６２，２９３号および第９，１０２，９２４号、および米国特許公開第２０１６−００２４５４８号を参照）。従って、本明細書に記載される配列番号１（Ｚ０５）の５８０位に対応するアミノ酸での置換を含む改良ポリメラーゼでもまた、上記の特性が改善されることが予測される。
【００８０】
本明細書に記載される変異および置換に加えて、本発明のＤＮＡポリメラーゼはまた、その他の非置換修飾を含んでもよい。この修飾は、ポリヌクレオチド伸長を含む用途でさらなる利点を付与するために、例えば当該分野で既知の共有結合修飾を含んでもよい。例えば、この修飾の１つは、酵素を不活性化するが、ポリヌクレオチド伸長に典型的に用いられる温度など、高温での培養時に酵素を活性化するように逆転される熱可逆性の共有結合修飾である。この熱可逆性修飾のための反応剤は、例えば、米国特許第５，７７３，２５８号および第５，６７７，１５２号に記載されている。
【００８１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、対応する非修飾ポリメラーゼ（例えば、本発明のポリメラーゼが由来する野生型ポリメラーゼまたは対応する変異体）をコードするＤＮＡ配列を、例えば通常部位特異的な変異誘発と呼ばれる技術を使用して、変異することで構築できる。非修飾形態のポリメラーゼをコードする核酸分子を、当業者に周知の様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって変異させることができる。（例えば、「ＰＣＲ手順書第１４章のＰＣＲ手法」PCR Strategies at Chapter 14; PCR Protocols (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA)、「方法および応用への手引き」A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990)を参照。） 
【００８２】
非限定的な例として、ClontechからのTransformer Site-Directed Mutagenesis kit（形質転換部位特異的変異誘発キット）で利用される２つのプライマーシステムは、非修飾形態のポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドに部位特異的変異を導入するために使用されてもよい。このシステムで、標的プラスミドの変性に続いて、２つのプライマーは、同時にプラスミドに結合され、これらのプライマーの一方には目的とする部位特異的変異を含み、他方にはプラスミドの別の点に変異を含み、制限部位が排除される。次に第２の鎖の合成が実施され、これら２つの変異を緊密に結合し、得られたプラスミドは大腸菌のｍｕｔＳ株に形質転換される。プラスミドＤＮＡは、形質転換された細菌から単離され、関連する制限酵素により制限され（それにより非変異のプラスミドを線形化し）、次に大腸菌内に再形質転換される。このシステムでは、サブクローニングや一本鎖ファージミドの生成を必要とせずに、発現プラスミド中に直接に変異を生成できる。２つの変異の緊密な結合およびその後の非変異プラスミドの線形化により、高い変異効率が得られ、最小限の選別が可能となる。初期の制限部位プライマーの合成後に、この方法では、変異部位ごとに新規のプライマー型を１つだけ使用する必要がある。各位置で変異体を別々に調製するのではなく、１組の「変性を組み込んだ」オリゴヌクレオチドプライマーを合成して、所定の部位に全ての所望の変異を同時に導入できる。形質転換体は、変異した領域を通してプラスミドＤＮＡを配列決定して変異クローンを特定かつ分類することにより選別できる。次に変異ＤＮＡをそれぞれ制限し、例えばMutation Detection Enhancement gel（変異検出強化ゲル）（Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ）などでの電気泳動によって分析して、（非変異誘発対照に対するバンドシフトの比較によって）配列に他の変化が発生していないことを確認する。あるいは、ＤＮＡ領域全体を配列決定して、標的領域の外側でさらなる変異事象が発生していなかったことを確認できる。
【００８３】
２つ以上のアミノ酸が置換されたＤＮＡポリメラーゼを、種々の方法で生成できる。ポリペプチド鎖中に互いに近接して位置するアミノ酸の場合に、それらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを使用して同時に変異させてもよい。しかしながら、アミノ酸が互いにある距離離れている（例えば１０個を超えるアミノ酸によって隔てられている）場合に、所望の全ての変更をコードする単一のオリゴヌクレオチドを生成することは、より困難なことになる。代わりに、２つの代替方法のうちのいずれかを使用できる。第１の方法では、置換されるアミノ酸ごとに個々のオリゴヌクレオチドを生成する。次にこのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニールし、鋳型から合成されるＤＮＡの第２の鎖は、全ての所望のアミノ酸置換をコードすることになる。もう一方の方法は、２回以上の変異誘発のサイクルを含んで所望の変異体を生成する。1回目のサイクルは、単一変異体について説明した通りであり、すなわち非修飾のポリメラーゼをコードするＤＮＡが鋳型に使用され、第１の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールして、その後にヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子が生成される。２回目の変異誘発サイクルでは、１回目の変異誘発サイクルで生成された変異ＤＮＡを鋳型として利用する。従って、この鋳型にはすでに１つ以上の変異が含まれている。次に、さらなる所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールし、結果としてＤＮＡ鎖はここで、１回目と２回目の変異誘発の両方からの変異をコードする。得られたＤＮＡは、３回目の変異誘発サイクルなどの鋳型として使用できる。あるいは、Seyfang & Jin (Anal. Biochem. 324:285-291. 2004)の多重部位変異誘発法を利用してもよい。
【００８４】
これにより、本発明のＤＮＡポリメラーゼのいずれかをコードする組換え核酸も提供される。ＤＮＡポリメラーゼをコードする本発明の核酸を使用して、様々なベクターを生成できる。宿主細胞に適合性のある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有する任意のベクターを、本発明の実施に使用できる。一般に発現ベクターは、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された転写調節核酸領域および翻訳調節核酸領域を含む。「制御配列」という用語は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適する制御配列には、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。さらに、ベクターは、転写されたｍＲＮＡの半減期を延ばすために正の逆調節要素（ＰＲＥ）を含んでもよい（Gelfand et al.の米国特許第４，６６６，８４８号を参照）。転写および翻訳調節核酸領域は、通常は、ポリメラーゼを発現するのに使用される宿主細胞に適している。種々の宿主細胞に対して、多数の適切な発現ベクターの形態および適切な調節配列が当技術分野では知られている。概して、転写調節配列および翻訳調節配列は、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサー配列またはアクチベーター配列を含んでもよい。典型的な実施形態では、調節配列は、プロモーターならびに転写開始および停止配列を含む。ベクターはまた、典型的には、外来ＤＮＡの挿入のためのいくつかの制限部位を含むポリリンカー領域を含む。特定の実施形態では、「融合フラグ」は、精製を容易に、および必要に応じてタグ／フラグ配列、例えば「Ｈｉｓタグ」のその後の除去を容易にするように使用される。しかしながら、これらは、「熱工程」が使用されてもよい中温性宿主（例えば大腸菌）から熱活性および／または耐熱性タンパク質を精製する場合には、一般的に不必要である。複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子、および目的のポリメラーゼをコードするＤＮＡを含む適切なベクターの構築は、標準的な組換えＤＮＡ手法を使用して調製される。当技術分野では周知なように、単離されたプラスミド、ウイルスベクター、およびＤＮＡ断片を特定の順序で切断し、適合させ、および連結して、所望のベクターを生成する（例えば、Sambrook et al.「分子クローニング：実験室マニュアル」Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 2nd ed. 1989)を参照）。
【００８５】
特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は、当技術分野では周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。適切な選択遺伝子は、例えば、アンピシリン耐性および／またはテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を含み、これらのベクターにより形質転換された細胞がこれらの抗生物質の存在で増殖することを可能にする。
【００８６】
本発明の一側面では、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、単独で、またはベクターとの組合せのいずれかで、細胞に導入される。本明細書における「〜に導入された」または文法上の同等語は、核酸がその後の核酸の組み込み、増幅、および／または発現に適する方法で細胞に入ることを意味している。この導入の方法は、標的となる細胞の種類によって大きく支配される。この方法の例としては、ＣａＰＯ4沈殿、リポソーム融合、LIPOFECTIN（登録商標）、電気穿孔、ウイルス感染などが挙げられる。
【００８７】
実施形態によっては、原核生物は、本発明の初期のクローニング工程用の宿主細胞として典型的に使用される。これらは、大量のＤＮＡの迅速な生産に、部位特異的変異誘発に使用される一本鎖ＤＮＡ鋳型の生産に、多くの変異体の同時選択に、および生成された変異体のＤＮＡ配列決定に特に有用である。適切な原核生物宿主細胞には、大腸菌Ｋ１２株９４（ＡＴＣＣ番号３１，４４６）、大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７，３２５）、大腸菌Ｋ１２株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ番号５３，６０６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５３７）、および大腸菌Ｂが挙げられるが、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９などの他の多くの大腸菌株、およびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などの桿菌、サルモネラ・チフィリウム（Salmonella typhimurium）またはセラチア・マルセセンス（Serratia marcesans）などの他の腸内細菌科、および種々のシュードモナス種などを含む原核生物の多くの他の種および属の全てを宿主として使用できる。原核宿主細胞または強固な細胞壁を有する他の宿主細胞は、典型的には、前出のSambrook et al.の１．８２節に記載されるように、塩化カルシウム法を使用して形質転換される。あるいは、これらの細胞の形質転換に電気穿孔法を使用できる。原核生物の形質転換技術は、例えば、Dowerの「遺伝子工学、原理と方法」Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990)およびHanahan et al., Meth. Enzymol., 204:63, 1991に記載されている。大腸菌の形質転換に典型的に使用されるプラスミドとして、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、およびBluescriptＭ１３が挙げられ、これらは全て、前出のSambrook et alの１．１２〜１．２０節に記載されている。但し、多くのその他の適切なベクターも利用可能である。
【００８８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、典型的には、ＤＮＡポリメラーゼの発現を誘導または引き起こすのに適切な条件で、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養して生成される。タンパク質発現に適する条件で形質転換された宿主細胞を培養する方法は、当技術分野で周知である（例えば、前出のSambrook et al.を参照）。λｐＬプロモーター含有プラスミドベクターからのポリメラーゼの産生に適する宿主細胞には、大腸菌株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ番号５３６０６）（米国特許第５，０７９，３５２号、およびF.C. et al., PCR Methods and Applications 2:275-87, 1993を参照）が含まれる。発現に続いて、ポリメラーゼを回収および単離できる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを精製する方法は、例えば、前出のLawyer et al.に記載されている。精製してしまえば、ＤＮＡポリメラーゼによるＲＴ効率、不整合耐性、伸長率、および／またはＲＴおよびポリメラーゼ阻害剤の耐性を向上させる能力を、（例えば、実施例に記載されているように）試験できる。
【００８９】
本発明の改良ＤＮＡポリメラーゼは、この酵素活性が必要とされまたは所望される任意の目的に使用できる。従って、本発明の別の側面では、ポリメラーゼを使用するポリヌクレオチド伸長（例えばＰＣＲ）の方法が提供される。ポリヌクレオチド伸長に適する条件は、当技術分野で知られている。（例えば、前出のSambrook et al.を参照、またAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed., John Wiley & Sons 1999)も参照。）一般に、プライマーは標的核酸にアニールすなわちハイブリダイズされて、プライマー−鋳型複合体を生成する。このプライマー−鋳型複合体を、適切な環境でＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸と接触させて、プライマーの３’末端への１つ以上のヌクレオチドの付加を可能として、それにより伸長した標的核酸に相補的なプライマーを生成する。このプライマーは、例えば、１つ以上のヌクレオチド類似体を含んでもよい。さらに、ヌクレオシド三リン酸は、従来のヌクレオチド、従来と異なるヌクレオチド（例えばリボヌクレオチドまたは標識ヌクレオチド）、またはそれらの混合物であってもよい。いくつかの変形例では、ポリヌクレオチド伸長反応は、標的核酸の増幅を含む。ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー対を用いる核酸増幅に適切な条件もまた、当該分野で既知である（例えばＰＣＲ増幅手法）。（例えば、前出のSambrook et al.、前出のAusubel et al.、および「ＰＣＲ応用：機能ゲノミクスのための手順」PCR Applications: Protocols for Functional Genomics (Innis et al. eds., Academic Press 1999)を参照。）他の特定の限定的な実施形態では、ポリヌクレオチド伸長反応は、ＲＮＡ鋳型の逆転写（例えばＲＴ−ＰＣＲ）を含む。実施形態によっては、改良ポリメラーゼは、４５４配列決定（454 sequencing）に使用可能である（Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380）。
【００９０】
必要に応じて、プライマー伸長反応では、参照または非修飾ポリメラーゼの現実的または潜在的な阻害剤を含む。阻害剤は、例えば、参照または非修飾（対照）ポリメラーゼの核酸伸長速度および／または逆転写効率を阻害できる。実施形態によっては、阻害剤はヘモグロビンまたはその分解産物である。例えば、実施形態によっては、ヘモグロビン分解産物は、ヘミン、ヘマトポルフィリン、またはビリルビンなどのヘム分解産物である。実施形態によっては、阻害剤は鉄キレート剤または紫色顔料である。他の実施形態では、阻害剤はヘパリンである。特定の実施形態では、阻害剤は挿入色素である。特定の実施形態では、阻害剤は、ポリメラーゼ阻害剤として記載されているメラニンである。例えば、Ekhardt, et al., Biochem Biophys Res Commun. 271(3):726-30 (2000)を参照。
【００９１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば血液などのポリメラーゼ阻害剤を含む試料から単離されたポリヌクレオチド鋳型の存在で鋳型を伸長するために使用できる。例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、血液の主要成分であるヘモグロビンの存在で、またはヘモグロビン分解産物の存在で鋳型を伸長するために使用できる。ヘモグロビンは、ヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、およびビリルビンなどの種々のヘム分解産物に分解される可能性がある。従って、特定の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、限定はされないが、ヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、およびビリルビンを含むヘモグロビン分解産物の存在で鋳型を伸長するために使用できる。特定の実施形態では、ヘモグロビン分解産物はヘミンである。実施形態によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用して、約０．５〜２０．０μＭ、約０．５〜１０．０μＭ、約０．５〜５．０μＭ、約１．０〜１０．０μＭ、約１．０〜５．０μＭ、約２．０〜５．０μＭ、または約２．０〜３．０μＭのヘミンの存在で鋳型を伸長できる。他の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用して、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、２０．０μＭのヘミン、または２０μＭを超えるヘミンの存在で鋳型を伸長できる。ヘモグロビンの分解産物には、鉄キレート剤と紫色顔料が含まれる。従って、実施形態によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用して、鉄キレート剤および／または紫色顔料の存在で鋳型を伸長できる。他の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用して、参照または対照ＤＮＡポリメラーゼによって同一の鋳型の伸長を阻害すると思われるヘモグロビン分解産物の量の存在で鋳型を伸長できる。
【００９２】
本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用して、ヘパリンの存在で鋳型を伸長できる。ヘパリンは、通常、血液から分離された試料中に抗凝固剤として存在する。実施形態によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用して、約１．０〜４００ｎｇ／μＬ、１．０〜３００ｎｇ／μＬ、１．０〜２００ｎｇ／μＬ、５．０〜４００ｎｇ／μＬ、５．０〜３００ｎｇ／μＬ、５．０〜２００ｎｇ／μＬ、１０．０〜４００ｎｇ／μＬ、１０．０〜３００ｎｇ／μＬ、または１０．０〜２００ｎｇ／μＬのヘパリンの存在で鋳型を伸長できる。実施形態によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用して、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｎｇ／μＬのヘパリン、または４００ｎｇ／μＬを超えるヘパリンの存在で鋳型を伸長できる。他の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用して、参照または対照ＤＮＡポリメラーゼによって同一の鋳型の伸長を阻害すると思われるヘパリンの量の存在で鋳型を伸長できる。
【００９３】
実施形態によっては、本発明の改良ポリメラーゼは、逆転写反応に用いられる。実施形態によっては、逆転写反応は、ＲＮＡ鋳型、１つ以上のプライマー、および本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む混合物中で実施される。反応混合物は、典型的には、４つの全ての標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）（またはｄＮＴＰのメチル化版）、および２価の陽イオンと１価の陽イオンを含む緩衝液を含む。陽イオンとしては、例えば、Ｍｇ2+が挙げられるが、Ｍｎ2+またはＣｏ2+などの他の陽イオンでも、ＤＮＡポリメラーゼを活性化できる。他の実施形態では、逆転写反応は、本発明の熱活性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施される。特定の実施形態では、本発明の改良ポリメラーゼは、実施例に説明されるように、Ｍｎ2+またはＭｇ2+の存在でＤＮＡ鋳型の効率的な増幅を損なうことなく、ＲＮＡ鋳型のより効率的な増幅を可能にする。
【００９４】
実施形態によっては、改良ポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと比較して、より安定なメチル化ｄＮＴＰを組み込む能力が向上している。Ｚ０５Ｄ（配列番号２）の６４０位および／または７０５位に対応するアミノ酸での置換がメチル化ｄＮＴＰを組み込む能力をもたらすことは、過去には分かっていなかった。そこで、実施形態によっては、配列番号２の６４０位に対応するアミノ酸にＩｌｅ（Ｉ）からＭｅｔ（Ｍ）への置換、および／または配列番号２の７０５位に対応するアミノ酸にＶａｌ（Ｖ）からロイシン（Ｌ）への置換を有するＤＮＡポリメラーゼは、メチル化ｄＮＴＰを組み込む能力の向上をもたらすことができた。実施形態によっては、対照ポリメラーゼと比較して、より安定なメチル化ｄＮＴＰを組み込む能力が向上したＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２の６４０位に対応するアミノ酸にＩｌｅ（Ｉ）からＭｅｔ（Ｍ）への置換、および／または配列番号２の７０５位に対応するアミノ酸にＶａｌ（Ｖ）からＬｅｕ（Ｌ）への置換を含み、かつ配列番号１〜５に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００９５】
標的核酸は、供給を生体源または合成源に由来してもよい。標的は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。一般にアンプリコンが生成される場合に、アンプリコンはＤＮＡから構成されるが、リボヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドもまた、アンプリコンに組み込むことができる。ＲＮＡが検出対象である場合に、増幅工程は、典型的には、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む逆転写の使用を含むことになる。
【００９６】
特定の標的配列には、例えば、ウイルス核酸（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パルボＢ１９ウイルス、エプスタインバーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、マレー渓谷脳炎ウイルス、およびクンジンウイルス）、細菌核酸（例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、クラミジア・ムリダルム（Chlamydia muridarum）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis））、マイコバクテリア、真菌核酸、または動物や植物由来の核酸を含むことができる。実施形態によっては、標的核酸は、動物（例えばヒト）の核酸であるか、または動物（例えばヒト）試料に由来する（即ち、ウイルスまたは他の病原性生物の核酸は、動物の生検からの試料、血液試料、尿試料、糞便試料、唾液などに存在してもよい）。実施形態によっては、標的核酸は、例えば、疾患（例えば癌、糖尿病など）に関連する変異体を含んでもよいヒトの遺伝子領域である。実施形態によっては、本発明のポリメラーゼは不整合に対する耐性を持っているので、この酵素は、例えば、関連する配列の多様性が標的配列内にあると思われる場合に特に有用である。一例として、本発明は、ウイルス病原体がそれらのゲノム内に相当な変異を有していて、殆どのまたは全ての可能性のあるウイルスゲノムを増幅する単一のプライマーまたは小単位のプライマーを設計することが困難または不可能な場合に、あるいは配列の変異が発生すると知られているか、またはその発生の可能性が高い癌またはその他の疾患の遺伝子マーカーにおいて、ウイルス病原体を検出するために用いることができる。
【００９７】
本明細書に記載の改良ポリメラーゼを使用して伸長産物または増幅産物を検出するその他の方法には、蛍光二本鎖ヌクレオチド結合色素、または蛍光二本鎖ヌクレオチド挿入色素の使用が含まれる。蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素の例として、サイバーグリーン（分子プローブ）が挙げられる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を、融解曲線分析との組み合わせにより使用して、プライマー伸長産物および／または増幅産物を測定できる。融解曲線分析は、搭載ソフトウェア（ＳＤＳ２．１）を備えたＡＢＩ５７００／７０００（９６ウェル方式）装置またはＡＢＩ７９００（３８４ウェル方式）装置などのリアルタイムＰＣＲ装置で実施できる。あるいは、融解曲線分析を終点分析として実施できる。融点分析方法は、例えば米国特許公開第２００６／０１７２３２４号に記載されている。
【００９８】
本発明の別の側面では、本明細書に記載のプライマー伸長法で使用するキットが提供される。実施形態によっては、キットは、使い易いように区画化されており、本発明による改良ＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１個の容器を含む。追加の試薬を提供する１個以上の追加の容器をまた含んでもよい。実施形態によっては、キットはまた、ヘパリンまたはその塩を含む、またはヘパリンを溶液中に放出する採血管、容器、または装置を含んでもよい。採血装置は、ヘパリン処理された管であってもよい。これら追加の容器は、例えば、核酸増幅手法（例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡ配列決定手法、またはＤＮＡ標識処理手法で使用する試薬を含み、上記の方法によるプライマー伸長手法での使用のための当業者に既知の任意の試薬または他の成分を含んでもよい。例えば、特定の実施形態では、キットはさらに、プライマー伸長条件で、所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能な５’センスプライマー、または５’センスプライマーおよび対応する３’アンチセンスプライマーを含むプライマー対を提供する容器を含む。他の特定の限定的な変形例では、キットは、（従来の、かつ／あるいは従来と異なる）ヌクレオシド三リン酸を提供する１個以上の容器を含む。特定の実施形態では、キットは、α−チオリン酸ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、および／または、例えばフルオレセイン色素もしくはシアニン色素系統のｄＮＴＰ、またはメチル化ｄＮＴＰなどの標識ｄＮＴＰを含む。さらに他の特定の限定的な実施形態では、キットは、プライマー伸長反応に適する緩衝液を提供する１個以上の容器を含む。
【００９９】
本発明の別の側面では、本明細書に記載されるように、メチル化ｄＮＴＰを組み込む能力が向上したポリメラーゼを含む反応混合物が提供される。反応混合物は、例えば、核酸増幅手法（例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡ配列決定手法、またはＤＮＡ標識処理手法で使用する試薬をさらに含んでもよい。例えば、特定の実施形態では、反応混合物は、プライマー伸長反応に適する緩衝液を含む。反応混合物はまた、鋳型核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、１つ以上のプライマーまたはプローブポリヌクレオチド、（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識ヌクレオチド、従来と異なるヌクレオチド、メチル化ｄＮＴＰを含む）ヌクレオシド三リン酸、塩（例えばＭｎ2+、Ｍｇ2+）、標識（例えば蛍光体）を含んでもよい。実施形態によっては、反応混合物は、プライマー伸長条件で、所定のポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能な５’センスプライマー、または５’センスプライマーおよび対応する３’アンチセンスプライマーを含むプライマー対を含む。実施形態によっては、反応混合物は、α−チオリン酸ｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、および／または、例えばフルオレセイン色素またはシアニン色素系統のｄＮＴＰおよび／またはメチル化ｄＮＴＰなどの標識ｄＮＴＰを含む。実施形態によっては、反応混合物は、鉄キレート剤または紫色色素を含む。特定の実施形態では、反応混合物は、ヘモグロビン、またはヘモグロビンの分解産物を含む。例えば、特定の実施形態では、ヘモグロビンの分解産物は、ヘミン、ヘマチン、ヘマトフォリン、およびビリルビンなどのヘム分解産物を含む。他の実施形態では、反応混合物は、ヘパリンまたはその塩を含む。特定の実施形態では、反応混合物は、血液から単離される鋳型核酸を含む。他の実施形態では、鋳型核酸はＲＮＡであり、反応混合物はヘパリンまたはその塩を含む。
【０１００】
実施形態によっては、反応混合物は、２つ以上のポリメラーゼを含む。例えば、実施形態によっては、反応混合物は、対照ポリメラーゼと比較して、逆転写酵素効率が向上した第１のＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有する第２のＤＮＡポリメラーゼを含む。第２のＤＮＡポリメラーゼは、野生型または非修飾のポリメラーゼであってもよく、またはＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性が向上した改良ポリメラーゼであってもよい。この反応混合物は、逆転写酵素活性が向上したポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼの両方を提供して、ＲＮＡ鋳型の増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）に有用になる。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は、請求される発明を説明するために提示されるが、この発明を限定するものではない。
実施例１：修飾ポリメラーゼの特定
【０１０２】
修飾されたポリメラーゼは、Ｚ０５Ｄ（配列番号２、米国特許第８，９６２，２９３号に記載）として知られる野生型Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１）の既知の変異体に基づいている。Ｚ０５Ｄ変異体では、５８０位のアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）がアミノ酸グリシン（Ｇ）によって置換されている（即ち、Ｚ０５ＤはＤ５８０Ｇ変異を有するＺ０５Ｄポリメラーゼである）（配列番号２）。本発明の修飾されたポリメラーゼは、「Ｚ０５変異体Ｆ２」または（「Ｚ０５Ｄ−Ｆ２」）（配列番号３）として知られている。Ｚ０５Ｄ変異体Ｆ２は、メチル化ｄＮＴＰおよびアルキル化プライマーを用いてＰＣＲベースの検定を使用して、誤りがちなＰＣＲによって生成されたライブラリ中に見出された。Ｚ０５Ｄ−Ｆ２は、より大規模（５００ｍＬ）で発現・精製され、図１に示すように、ＰＣＲ測定中のＺ０５Ｄ−Ｆ２によるメチル化ｄＮＴＰの組み込みが確認された。使用した種々のポリメラーゼの配列を、以下の表１に示す。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【０１０３】
これらの実施例に説明されるすべてのＰＣＲ実験において、以下の表２に示すように、使用されたプライマーは配列番号７および８の核酸配列を持ち、使用されたプローブは配列番号９の核酸配列を持ち、使用された鋳型は配列番号１０の核酸配列を持っていた。
【表２】
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【０１０４】
親Ｚ０５Ｄ（配列番号２）にはメチル化ｄＮＴＰが組み込まれていないが、Ｚ０５Ｄ−Ｆ２（配列番号３）は、標準のコバス（cobas）６８００／８８００条件で、１ｍＭのｄＮＴＰを用いてＰＣＲを正常に実行できた。これら条件を以下の表３に示す。
【表３】
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【０１０５】
しかし、Ｚ０５Ｄ−Ｆ２およびメチル化ｄＮＴＰを使用すると、親Ｚ０５Ｄおよび通常のｄＮＴＰ（即ち非メチル化ｄＮＴＰ）と比較して、ほぼ６サイクルの遅延が観察された。メチル化ｄＮＴＰに加えて、フッ素化ｄＮＴＰ（Ｆ−ｄＮＴＰ）をまた、ヌクレオチドの加水分解を回避する可能性があると思われる別の安定した代替候補として試験した。しかし、Ｆ−ｄＮＴＰは、Ｚ０５Ｄ−Ｆ２によって非常に低い効率で組み込まれた（Ｃｐ＞４０）。Ｆ−ｄＮＴＰの濃度を増大させても、ＰＣＲ性能の大幅な向上は見られなかった。対照的に、図２に示すように、マスターミックス試薬中のメチル化ｄＮＴＰの濃度を２ｍＭに増量すると、ＰＣＲ効率が向上し、測定されたＣｐ値は、標準条件での親Ｚ０５Ｄおよび非修飾ヌクレオチドのＣｐ値と同一になった。
実施例２：修飾ｄＮＴＰを組み込む修飾ポリメラーゼ
【０１０６】
Ｚ０５Ｄ−Ｆ２変異体は、図３に示すように、２つのアミノ酸置換：Ｉ６４０ＭおよびＶ７０５Ｌ（配列番号３）を有する。２つのアミノ酸置換のらせん形態を解いて、単一アミノ酸変異体を、メチル化ｄＮＴＰの組み込みに関して評価した。従って、単一アミノ酸変異体Ｚ０５Ｄ−Ｉ６４０Ｍ（配列番号４）およびＺ０５Ｄ−Ｖ７０５Ｌ（配列番号５）は、部位特異的な変異誘発によって生成され、発現・精製された。単一アミノ酸変異体、二重変異体Ｆ２（配列番号３）および親Ｚ０５Ｄタンパク質（配列番号２）は、図４Ａと４Ｂに示すように、通常の非修飾ｄＮＴＰ、メチル化ｄＮＴＰ、およびＦ−ｄＮＴＰを用いてＰＣＲ性能について評価した。等濃度のＺ０５Ｄ変異体を、（上記の表３に示す）マスターミックス試薬中にアルキル化プライマーを含むＤＮＡ鋳型を使用して試験した。通常のｄＮＴＰでは、単一変異体Ｚ０５Ｄ−Ｖ７０５Ｌ（配列番号５）は、親Ｚ０５Ｄ（配列番号２）と同じ性能を示すが、二重変異体Ｚ０５Ｄ−Ｆ２（配列番号３）および単一変異体Ｚ０５Ｄ−Ｉ６４０Ｍ（配列番号４）は、遅延したＣｐ値およびより低い蛍光信号を示している。一方で、Ｚ０５Ｄ−Ｆ２（配列番号３）およびＺ０５Ｄ−Ｉ６４０Ｍ（配列番号４）だけが、メチル化ｄＮＴＰを用いるＰＣＲを促進する変異体である。纏めると、これらのデータは、Ｉ６４０Ｍはメチル化ｄＮＴＰの組み込みにとって重要なアミノ酸置換であることを示唆している。興味深いことに、Ｚ０５Ｄ−Ｉ６４０Ｍ（配列番号４）は、二重変異体Ｚ０５Ｄ（Ｚ０５Ｄ−Ｆ２、配列番号３）と比較して、５サイクルの遅延を示している。この結果は、アミノ酸置換Ｖ７０５Ｌそれ自体では、メチル化ｄＮＴＰを用いるＰＣＲは促進されていないが、アミノ酸置換Ｖ７０５Ｌは、Ｚ０５Ｄ−Ｆ２の二重変異体（配列番号３）中の修飾ヌクレオチドとともにＰＣＲ効率を向上させることを示唆している。フッ素化ｄＮＴＰ（Ｆ−ｄＮＴＰ）は、全く組み込まれないか、種々のタンパク質によって非常に僅かな効率でのみ組み込まれる（データは示さず）。
実施例３：ＨＩＶアッセイでの修飾ポリメラーゼによるメチル化ｄ−ＮＴＰの組み込み
【０１０７】
コバスリアットシステム（cobas（登録商標） Liat（登録商標） System）でのＨＩＶアッセイなどの測定法で、安定したヌクレオチド代替物としてメチル化ｄＮＴＰを使用するためには、メチル化ｄＮＴＰおよびＺ０５Ｄ−Ｆ２（配列番号３）により、ＲＴ−ＰＣＲを促進する必要がある。そこでこれを試験するために、β−カテニン転写産物をＲＮＡ鋳型として使用して、アルキル化プライマーおよび１ｍＭまたは２ｍＭのメチル化ｄＮＴＰを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。比較として、親Ｚ０５Ｄ（配列番号２）および非修飾ヌクレオチドを使用する反応を並行して実施した。結果を図５に示す。予想通り、単一変異体Ｚ０５Ｄ−Ｖ７０５Ｌ（配列番号５）は、いかなる成長曲線も示さず、単一変異体Ｚ０５Ｄ−Ｉ６４０Ｍ（配列番号４）だけは、メチル化ｄＮＴＰ濃度を増大させるとＲＴ−ＰＣＲを促進した。二重変異体Ｚ０５Ｄ−Ｆ２（配列番号３）は、１ｍＭおよび２ｍＭのメチル化ｄＮＴＰの濃度で正常にＲＴ−ＰＣＲを作動させたが、これらのマスターミックス試薬条件で、Ｃｐ値はそれぞれ約９サイクルおよび約４サイクル遅延した。ＲＴ−ＰＣＲの特性を最適化するためには、マスターミックス試薬の他の成分（金属イオン、塩濃度など）の調節が必要になる場合がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021516544.tif 000015
2021516544.tif 000016