(57)【要約】  １つまたはそれ以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドの産生を増加させるための方法、細胞、操作された微生物、およびキットがここで開示される。操作された細胞または半合成生物において非天然アミノ酸をコードする非天然核酸の保持性を高めるための細胞、操作された微生物、およびキットがさらに提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された宿主細胞であって、
ａ．非天然ヌクレオチドを含む第１の核酸分子；および
ｂ．場合により、改変された転移関連タンパク質または転移因子をコードする第２の核酸分子
を含む前記操作された宿主細胞。
【請求項２】
ａ．改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードする第３の核酸分子であって、操作された宿主細胞のゲノム配列に組み込まれているか、または該改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードするプラスミドを含む、第３の核酸分子
をさらに含む、請求項１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項３】
改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、改変された転移関連タンパク質をコードする第２の核酸分子を含まない等価の操作された宿主細胞での発現と比較して、操作された宿主細胞での発現の高い安定性を呈する、請求項１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項４】
改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、ヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードする核酸分子全体の欠失、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または両末端の切断を含む、請求項２に記載の操作された宿主細胞。
【請求項５】
改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、フェオダクチラム・トリコルヌツム由来のヌクレオシド三リン酸トランスポーター（ＰｔＮＴＴ２）を含む、請求項２に記載の操作された宿主細胞。
【請求項６】
ＰｔＮＴＴ２は、ｐＳＣプラスミドから選択されるプロモーターまたはｌａｃオペロン由来のプロモーターの制御下にある、請求項５に記載の操作された宿主細胞。
【請求項７】
ａ．Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント；および
ｂ．ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ足場を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）
をさらに含み、該Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、および該ｓｇＲＮＡの組合せは、非天然ヌクレオチドをコードする第１の核酸分子の複製を調節する、請求項２に記載の操作された宿主細胞。
【請求項８】
第２の核酸分子は、カタラーゼ（ｃａｔ）、ＩＳ１タンパク質ｉｎｓＢ−４（ｉｎｓＢ−４）、ＩＳ１タンパク質ｉｎｓＡ−４（ｉｎｓＡ−４）、またはそれらの組合せを含む遺伝子を含む、請求項１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項９】
改変された転移関連タンパク質は、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＢ、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＡ、またはそれらの組合せを含み；改変された転移因子はＩＳ１を含む、請求項１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項１０】
遺伝子は、１つまたはそれ以上の欠失を含み、該１つまたはそれ以上の欠失は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、内部欠失、および／または遺伝子全体の欠失を含む、請求項８に記載の操作された宿主細胞。
【請求項１１】
改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質をコードする第５の核酸分子をさらに含み、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復、ＳＯＳ応答、ヌクレオチド除去修復、もしくはメチル指向性ミスマッチ修復、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項１２】
改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲｅｃＡ、Ｒａｄ５１、ＲａｄＡ、もしくはＬｅｘＡ、またはそれらの組合せを含む、請求項１１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項１３】
大腸菌細胞、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を含む原核細胞である、請求項１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項１４】
非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチ���アデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む、請求項１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項１５】
非天然塩基は、
【化１】
2021508466.tif 000026
からなる群から選択される、請求項１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項１６】
非天然ヌクレオチドは、非天然糖部分をさらに含む、請求項１に記載の操作された宿主細胞。
【請求項１７】
非天然糖部分は、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の操作された宿主細胞。
【請求項１８】
非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生を増加させる方法であって、
ａ）改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーター、および場合により、改変された転移関連タンパク質または転移因子を含む、操作された宿主細胞を、複数の非天然ヌクレオチドと共にインキュベートすること；ならびに
ｂ）該複数の非天然ヌクレオチドを１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖に組み込み、これにより非天然核酸分子を生成すること
を含み、
該改変された転移関連タンパク質または転移因子、および該改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、該１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖に該非天然ヌクレオチドを含む非天然塩基対の保持性を高める、前記方法。
【請求項１９】
改変された転移関連タンパク質は、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＢ、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＡ、またはそれらの組合せを含み；改変された転移因子はＩＳ１を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、フェオダクチラム・トリコルヌツム由来のコドン最適化ヌクレオシド三リン酸トランスポーター（ＰｔＮＴＴ２）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチ���アデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
非天然塩基は、
【化２】
2021508466.tif 000027
からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
非天然ヌクレオチドは、非天然糖部分をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
非天然糖部分は、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
非天然アミノ酸を含む改変されたポリペプチドを調製する方法であって、
ｃ）改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーター、および場合により、改変された転移関連タンパク質または転移因子を含む、操作された宿主細胞を、複数の非天然ヌクレオチドと共にインキュベートすること；ならびに
ｄ）該複数の非天然ヌクレオチドを１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖に組み込み、これにより非天然核酸分子を生成すること
を含み、
該改変された転移関連タンパク質または転移因子、および該改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、新たに合成されたポリペプチドへの該複数の非天然ヌクレオチドの組込みを促進して改変されたポリペプチドを生成する非天然塩基対の保持性を高める、
前記方法。
【請求項２６】
改変された転移関連タンパク質は、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＢ、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＡ、またはそれらの組合せを含み；改変された転移因子はＩＳ１を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、フェオダクチラム・トリコルヌツム由来のコドン最適化ヌクレオシド三リン酸トランスポーター（ＰｔＮＴＴ２）を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチ���アデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
非天然塩基は、
【化３】
2021508466.tif 000028
からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
非天然ヌクレオチドは、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される非天然糖部分をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／６１２，０６２号の利益を主張し、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【０００２】
連邦政府の資金援助を受けた研究に関する記載
本明細書に開示される発明は、少なくとも部分的に、国立衛生研究所（ＮＩＨ）による助成金番号Ｒ３５  ＧＭ１１８１７８／ＧＭ／ＮＩＧＭＳのもとで米国政府の支援によりなされた。したがって、米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットによって電子的に提出され、その全体を本明細書に参照によって組み入れる、配列表を含有する。２０１８年１２月２０日に作製された上記のＡＳＣＩＩコピーは、４６０８５−７１２＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１１６，２８７バイトである。
【背景技術】
【０００４】
オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をポリメラーゼで配列特異的に合成／増幅する能力の適用は、天然の遺伝アルファベット（ＤＮＡでは４つの天然ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴ、ＲＮＡでは４つの天然ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）に存在する化学的／物理的多様性が限定されていることで制限される。非天然核酸を含む拡張した遺伝アルファベットにより、細胞に保存することができる情報が増加し、遺伝子発現産物の新たな形態を創出するためにこの増加した情報を使用する半合成生物（ＳＳＯ）の創出が促進される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ある特定の実施形態では、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生の増加のための方法、細胞、操作された微生物、プラスミド、およびキットが本明細書で記載される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生の増加のための改変された転移関連タンパク質、改変されたＤＮＡ修復タンパク質、またはそれらの組合せを利用する細胞、操作された微生物、プラスミド、および使用の方法も本明細書に記載される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に開示される態様は、非天然ヌクレオチドを含む第１の核酸分子；および場合により、改変された転移関連タンパク質または転移因子をコードする第２の核酸分子を含む、操作された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードする第３の核酸分子であって、操作された宿主細胞のゲノム配列に組み込まれているか、または改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードするプラスミドを含む、第３の核酸分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、改変された転移関連タンパク質をコードする第２の核酸分子を含まない等価の操作された宿主細胞での発現と比較して、操作された宿主細胞での発現の高い安定性を呈する。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、ヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードする核酸分子全体の欠失、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または両末端の切断を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、フェオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）由来のヌクレオシド三リン酸トランスポーター（ＰｔＮＴＴ２）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、末端欠失または内部欠失である。いくつかの実施形態では、欠失は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または両末端の切断を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、４０、４４、５０、６０、６６、７０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、Ｎ末端での約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、４０、４４、５０、６０、６６、７０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、Ｎ末端での約６６のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＰｔＮＴＴ２は、ｐＳＣプラスミドから選択されるプロモーターまたはｌａｃオペロン由来のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、および、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ足場を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含み、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、非天然ヌクレオチドをコードする第１の核酸分子の複製を調節する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変を認識する標的モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）認識因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ因子は、標的モチーフの３’末端に隣接する。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１５〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバ���アント、およびｓｇＲＮＡとの組合せは、改変を含む核酸分子の複製速度を約８０％、８５％、９５％、９９％またはそれ以上減少させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、第２の核酸分子は、カタラーゼ（ｃａｔ）、ＩＳ１タンパク質ｉｎｓＢ−４（ｉｎｓＢ−４）、ＩＳ１タンパク質ｉｎｓＡ−４（ｉｎｓＡ−４）、またはそれらの組合せを含む遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、改変された転移関連タンパク質は、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＢ、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＡ、またはそれらの組合せを含み；改変された転移因子はＩＳ１を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、１つまたはそれ以上の欠失を含み、１つまたはそれ以上の欠失は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、内部欠失、および／または遺伝子全体の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質をコードする第５の核酸分子をさらに含み、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復、ＳＯＳ応答、ヌクレオチド除去修復、もしくはメチル指向性ミスマッチ修復、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲｅｃＡ、Ｒａｄ５１、ＲａｄＡ、もしくはＬｅｘＡ、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を含む原核細胞である。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−ア���ニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化１】
2021508466.tif 000003
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然糖部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然糖部分は、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、ポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、構成的に発現する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、過剰発現する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｏｌＢ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ｐｏｌＢ遺伝子は、抑制解除される。いくつかの実施形態では、ｐｏｌＢ遺伝子は、オペレーターの半部位にわたる組込みを通して抑制解除される。いくつかの実施形態では、オペレーターは、ｌｅｘＡオペレーターである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｏｌＡ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｄｎａＱ遺伝子によりコードされる。
【０００７】
本明細書に開示される態様は、非天然ヌクレオチドを含む、核酸分子の産生を増加させる方法であって、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーター、および場合により改変された転移関連タンパク質または転移因子を含む、操作された宿主細胞を、複数の非天然ヌクレオチドと共にインキュベートすること；ならびに複数の非天然ヌクレオチドを１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖に組み込み、これにより非天然核酸分子を生成することを含み、改変された転移関連タンパク質または転移因子、および改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖に非天然ヌクレオチドを含む非天然塩基対の保持性を高める、方法を提供する。いくつかの実施形態では、改変された転移関連タンパク質は、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＢ、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＡ、またはそれらの組合せを含み；改変された転移因子はＩＳ１を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、フェオダクチラム・トリコルヌツム由来のコドン最適化ヌクレオシド三リン酸トランスポーター（ＰｔＮＴＴ２）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、末端欠失または内部欠失である。いくつかの実施形態では、欠失は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または両末端の切断である。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、４０、４４、５０、６０、６６、７０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、Ｎ末端での約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、４０、４４、５０、６０、６６、７０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、Ｎ末端での約６６のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、および、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ足場を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含み、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、非天然ヌクレオチドをコードする第１の核酸分子の複製を調節する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変を認識する標的モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）認識因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ因子は、標的モチーフの３’末端に隣接する。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１５〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、改変を含む核酸分子の複製速度を約８０％、８５％、９５％、９９％またはそれ以上減少させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、２−アミノ��デニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化２】
2021508466.tif 000004
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然糖部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然糖部分は、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、ポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、構成的に発現する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、過剰発現する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｏｌＢ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ｐｏｌＢ遺伝子は、抑制解除される。いくつかの実施形態では、ｐｏｌＢ遺伝子は、オペレーターの半部位にわたる組込みを通して抑制解除される。いくつかの実施形態では、オペレーターは、ｌｅｘＡオペレーターである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｏｌＡ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｄｎａＱ遺伝子によりコードされる。
【０００８】
本明細書に開示される態様は、非天然アミノ酸を含む、改変されたポリペプチドを調製する方法であって、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーター、および場合により改変された転移関連タンパク質または転移因子を含む、操作された宿主細胞を、複数の非天然ヌクレオチドと共にインキュベートすること；ならびに、複数の非天然ヌクレオチドを１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖に組み込み、これにより非天然核酸分子を生成することを含み、改変された転移関連タンパク質または転移因子、および改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、新たに合成されたポリペプチドへの複数の非天然ヌクレオチドの組込みを促進して、改変されたポリペプチドを生成する非天然塩基対の保持性を高める、方法を提供する。いくつかの実施形態では、改変された転移関連タンパク質は、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＢ、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＡ、またはそれらの組合せを含み；改変された転移因子はＩＳ１を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、フェオダクチラム・トリコルヌツム由来のコドン最適化ヌクレオシド三リン酸トランスポーター（ＰｔＮＴＴ２）を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、末端欠失または内部欠失である。いくつかの実施形態では、欠失は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または両末端の切断を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、４０、４４、５０、６０、６６、７０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、Ｎ末端での約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、４０、４４、５０、６０、６６、７０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、Ｎ末端での約６６のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、および、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ足場を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含み、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、非天然ヌクレオチドをコードする第１の核酸分子の複製を調節する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変を認識する標的モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）認識因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ因子は、標的モチーフの３’末端に隣接する。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１５〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、改変を含む核酸分子の複製速度を約８０％、８５％、９５％、９９％またはそれ以上減少させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施��態では、非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化３】
2021508466.tif 000005
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される非天然糖部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、ポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、構成的に発現する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、過剰発現する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｏｌＢ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ｐｏｌＢ遺伝子は、抑制解除される。いくつかの実施形態では、ｐｏｌＢ遺伝子は、オペレーターの半部位にわたる組込みを通して抑制解除される。いくつかの実施形態では、オペレーターは、ｌｅｘＡオペレーターである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｏｌＡ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｄｎａＱ遺伝子によりコードされる。
【０００９】
本明細書に開示される態様は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質を含む非天然産物を産生するための操作された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、ＳＯＳ応答を含む。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、または酵母細胞である。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、原核細胞は、大腸菌細胞である。いくつかの実施形態では、大腸菌細胞は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞である。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲｅｃＡである。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、ＲｅｃＡをコードする遺伝子を発現するために操作される。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、Ｒａｄ５１である。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、Ｒａｄ５１をコードする遺伝子を発現するために操作される。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲａｄＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＬｅｘＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質をコードする遺伝子は、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、および／またはｒａｄＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、およびｒａｄＡは、各々独立して、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、残基２〜３４７の内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、アミノ酸位置Ｓ１１９での突然変異、場合によりＳ１１９Ａ突然変異を含む。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、ポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、構成的に発現する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、過剰発現する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｏｌＢ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ｐｏｌＢ遺伝子は、抑制解除される。いくつかの実施形態では、ｐｏｌＢ遺伝子は、オペレーターの半部位にわたる組込みを通して抑制解除される。いくつかの実施形態では、オペレーターは、ｌｅｘＡオペレーターである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｏｌＡ遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｄｎａＱ遺伝子によりコードされる。
【００１０】
本明細書に開示される態様は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質およびポリメラーゼを含む非天然産物を産生するための操作された宿主細胞であって、ポリメラーゼは、基本的な発現レベルの等価のポリメラーゼを含む等価の宿主細胞に対して、発現が上昇する、操作された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、ＳＯＳ応答を含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、構成的に発現する。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩＩである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復、ＳＯＳ応答、ヌクレオチド除去修復、またはメチル指向性ミスマッチ修復を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、ＳＯＳ応答を含む。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、または酵母細胞である。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、原核細胞は、大腸菌細胞である。いくつかの実施形態では、大腸菌細胞は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞である。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲｅｃＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、Ｒａｄ５１である。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲａｄＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＬｅｘＡである。いくつかの実施形態では、欠損タンパク質をコードする遺伝子は、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、および／またはｒａｄＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、およびｒａｄＡは、各々独立して、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、残基２〜３４７の内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、アミノ酸位置Ｓ１１９での突然変異、場合によりＳ１１９Ａ突然変異を含む。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、フェオダクチラム・トリコルヌツム由来のヌクレオシド三リン酸トランスポーター（ＰｔＮＴＴ２）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰｔＮＴＴ２由来のヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、改変される。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、核酸分子によりコードされる。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードする核酸分子は、操作された宿主細胞のゲノム配列に組み込まれる。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードする核酸分子を含むプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、フェオダクチラム・トリコルヌツム由来のコドン最適化ヌクレオシド三リン酸トランスポーターである。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、末端欠失または内部欠失である。いくつかの実施形態では、欠失は、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、または両末端の切断を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、４０、４４、５０、６０、６６、７０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、Ｎ末端での約５、１０、１５、２０、２２、２５、３０、４０、４４、５０、６０、６６、７０またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、Ｎ末端での約６６のアミノ酸残基の欠失を含む。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、ｐＳＣプラスミドから選択されるプロモーターまたはｌａｃオペロン由来のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、ｌａｃオペロンは、大腸菌ｌａｃオペロンである。いくつかの実施形態では、ｌａｃオペロンは、Ｐｂｌａ、Ｐｌａｃ、ＰｌａｃＵＶ５、ＰＨ２０７、Ｐλ、Ｐｔａｃ、またはＰＮ２５から選択される。いくつかの実施形態では、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターは、プロモーターＰｌａｃＵＶ５の制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、および、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ足場を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含み、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の複製を調節する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変を認識する標的モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）認識因子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ因子は、標的モチーフの３’末端に隣接する。いくつかの実施形態では、標的モチーフは、１５〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、改変を含む核酸分子の複製速度を約８０％、８５％、９５％、９９％またはそれ以上減少させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、非天然ヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２���チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５��メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化４】
2021508466.tif 000006
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然糖部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然糖部分は、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化５】
2021508466.tif 000007
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然主鎖をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然主鎖は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｃ１〜Ｃ１０ホスホネート、３’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、３’−アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ｄＮａＭＴＰおよび／またはｄＴＰＴ３ＴＰである。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、操作された宿主細胞ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ａｒｓＢ遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質の非存在下、または、過剰発現したポリメラーゼと組み合わせた改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質の非存在下での等価の操作された宿主細胞に対して、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の非天然塩基対の保持性を可能にする。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、５０超、１００超、１２０超、１３０超、１５０超、または２００超の継代の後に、少なくとも５０％の非天然塩基対の保持性を可能にする。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、５０超、１００超、１２０超、１３０超、１３７超、１５０超、または２００超の継代の後に、少なくとも５５％の非天然塩基対の保持性を可能にする。いくつかの実施形態では、非天然産物は、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子である。いくつかの実施形態では、非天然産物は、非天然アミノ酸を含むポリペプチドである。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞は、半合成生物である。
【００１１】
本明細書に開示される態様は、本明細書に記載の操作された宿主細胞により産生された非天然ヌクレオチドを含む、核酸分子を提供する。
【００１２】
本明細書に開示される態様は、本明細書に記載の操作された宿主細胞により産生された１つまたはそれ以上の非天然アミノ酸を含む、ポリペプチドを提供する。
【００１３】
本明細書に開示される態様は、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の複製の忠実度を高める方法であって、（ａ）本明細書に記載の操作された宿主細胞を、複数の非天然ヌクレオチドと共にインキュベートすること；および（ｂ）複数の非天然ヌクレオチドを１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖に組み込み、これにより非天然核酸分子を生成することを含み、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質および場合により過剰発現したポリメラーゼは、１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖での非天然ヌクレオチドを含む非天然塩基対の複製の忠実度を高める、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、ＳＯＳ応答を含む。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生の増加は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質、および場合により過剰発現したポリメラーゼの非存在下での等価の宿主細胞における核酸分子の産生に関連する。いくつかの実施形態では、核酸分子の産生の増加は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質、および場合により過剰発現したポリメラーゼの非存在下での等価の宿主細胞における核酸分子の産生より、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％高い。いくつかの実施形態では、核酸分子の産生の増加は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質、および場合により過剰発現したポリメラーゼの非存在下での等価の宿主細胞における核酸分子の産生の１倍超、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、核酸分子の産生の増加は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質、および場合により過剰発現したポリメラーゼの非存在下での等価の宿主細胞における核酸分子の産生より１倍〜５倍、５倍〜１０倍、１０倍〜１５倍、１５倍〜２０倍、２０倍〜２５倍、２５倍〜３０倍、３０倍〜４０倍、４０倍〜５０倍、５０倍〜６０倍、６０倍〜７０倍、７０倍〜８０倍、８０倍〜９０倍、９０倍〜１００倍、または１００倍〜２００倍高い。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形��では、非天然塩基は、
【化６】
2021508466.tif 000008
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然糖部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然糖部分は、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化７】
2021508466.tif 000009
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然主鎖をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然主鎖は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｃ１〜Ｃ１０ホスホネート、３’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、３’−アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ｄＮａＭＴＰおよび／またはｄＴＰＴ３ＴＰである。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、操作された宿主細胞ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ａｒｓＢ遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲｅｃＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、Ｒａｄ５１である。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲａｄＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＬｅｘＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質をコードする遺伝子は、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、および／またはｒａｄＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、およびｒａｄＡは、各々独立して、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、残基２〜３４７の内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、アミノ酸位置Ｓ１１９での突然変異、場合によりＳ１１９Ａ突然変異を含む。
【００１４】
本明細書に開示される態様は、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生を増加させる方法であって、（ａ）本明細書に記載の操作された宿主細胞を、複数の非天然ヌクレオチドと共にインキュベートすること；および（ｂ）複数の非天然ヌクレオチドを１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖に組み込み、これにより非天然核酸分子を生成することを含み、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質および場合により過剰発現したポリメラーゼは、１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖での非天然ヌクレオチドを含む非天然塩基対の保持性を高める、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、ＳＯＳ応答を含む。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生の増加は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質、および場合により過剰発現したポリメラーゼの非存在下での等価の宿主細胞における核酸分子の産生に関連する。いくつかの実施形態では、核酸分子の産生の増加は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質、および場合により過剰発現したポリメラーゼの非存在下での等価の宿主細胞における核酸分子の産生より、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％高い。いくつかの実施形態では、核酸分子の産生の増加は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質、および場合により過剰発現したポリメラーゼの非存在下での等価の宿主細胞における核酸分子の産生の１倍超、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、核酸分子の産生の増加は、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質、および場合により過剰発現したポリメラーゼの非存在下での等価の宿主細胞における核酸分子の産生より１倍〜５倍、５倍〜１０倍、１０倍〜１５倍、１５倍〜２０倍、２０倍〜２５倍、２５倍〜３０倍、３０倍〜４０倍、４０倍〜５０倍、５０倍〜６０倍、６０倍〜７０倍、７０倍〜８０倍、８０倍〜９０倍、９０倍〜１００倍、または１００倍〜２００倍高い。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態では、非��然塩基は、
【化８】
2021508466.tif 000010
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然糖部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然糖部分は、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化９】
2021508466.tif 000011
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然主鎖をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然主鎖は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｃ１〜Ｃ１０ホスホネート、３’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、３’−アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ｄＮａＭＴＰおよび／またはｄＴＰＴ３ＴＰである。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、操作された宿主細胞ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ａｒｓＢ遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲｅｃＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、Ｒａｄ５１である。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲａｄＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＬｅｘＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質をコードする遺伝子は、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、および／またはｒａｄＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、およびｒａｄＡは、各々独立して、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、残基２〜３４７の内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、アミノ酸位置Ｓ１１９での突然変異、場合によりＳ１１９Ａ突然変異を含む。
【００１５】
本明細書に開示される態様は、非天然アミノ酸を含む改変されたポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）本明細書に記載の操作された宿主細胞を、複数の非天然アミノ酸と共にインキュベートすること；および（ｂ）複数の非天然アミノ酸を新たに合成されたポリペプチドに組み込み、これにより改変されたポリペプチドを生成することを含み、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質および場合により過剰発現したポリメラーゼは、新たに合成されたポリペプチドへの複数の非天然アミノ酸の組込みを促進して、改変されたポリペプチドを生成する非天然塩基対の保持性を高める、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、ＳＯＳ応答を含む。いくつかの実施形態では、改変されたポリペプチドは、さらに、共役部分と共役させて、改変されたポリペプチド共役体を生成する。いくつかの実施形態では、共役部分は、タンパク質もしくはその結合断片、ポリマー、治療剤、造影剤、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、改変されたポリペプチドは、治療剤とさらに共役される。いくつかの実施形態では、改変されたポリペプチドは、造影剤である。いくつかの実施形態では、改変されたポリペプチド共役体は、さらに、医薬添加剤と製剤化して、医薬組成物を生成する。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化１０】
2021508466.tif 000012
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然糖部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然糖部分は、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化１１】
2021508466.tif 000013
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然主鎖をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然主鎖は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｃ１〜Ｃ１０ホスホネート、３’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、３’−アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ｄＮａＭＴＰおよび／またはｄＴＰＴ３ＴＰである。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、操作された宿主細胞ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ａｒｓＢ遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲｅｃＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、Ｒａｄ５１である。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＲａｄＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質は、ＬｅｘＡである。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質をコードする遺伝子は、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、および／またはｒａｄＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡ、ｒａｄ５１、およびｒａｄＡは、各々独立して、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、残基２〜３４７の内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ｌｅｘＡは、アミノ酸位置Ｓ１１９での突然変異、場合によりＳ１１９Ａ突然変異を含む。
【００１６】
本明細書に開示される態様は、疾患または症状を処置する方法であって、それを必要としている対象に、本明細書に開示される方法により調製された改変されたポリペプチドを含む医薬組成物を投与し、それにより疾患または症状を処置することを含む、方法を提供する。
【００１７】
本明細書に開示される態様は、本明細書に記載の操作された宿主細胞を含む、キットを提供する。
【００１８】
本明細書に開示される態様は、改変されたＲｅｃＡを含む非天然産物を産生するための操作された宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、改変されたＲｅｃＡをコードする遺伝子は、１つもしくはそれ以上の突然変異、１つもしくはそれ以上の欠失、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、または内部欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｒｅｃＡは、残基２〜３４７の内部欠失を含む。
【００１９】
本明細書に開示される態様は、改変されたＲｅｃＡおよび過剰発現したＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む非天然産物を産生するための操作された宿主細胞であって、過剰発現したＤＮＡポリメラーゼＩＩの発現レベルは、基本的な発現レベルの等価のＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む等価の宿主細胞に関連する、操作された宿主細胞を提供する。
【００２０】
本明細書に開示される態様は、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生を増加させる方法であって、（ａ）改変されたＲｅｃＡおよび場合により過剰発現したＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む、操作された宿主細胞を、複数の非天然ヌクレオチドと共にインキュベートすることであって、過剰発現したＤＮＡポリメラーゼＩＩの発現レベルは、基本的な発現レベルの等価のＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む等価の宿主細胞に関連する、インキュベートすること；ならびに、ｂ）複数の非天然ヌクレオチドを１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖に組み込み、これにより非天然核酸分子を生成することを含み、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質および場合により過剰発現したポリメラーゼは、１つまたはそれ以上の新たに合成されたＤＮＡ鎖での非天然ヌクレオチドを含む非天然塩基対の保持性を高める、方法を提供する。
【００２１】
本明細書に開示される態様は、非天然アミノ酸を含む改変されたポリペプチドを調製する方法であって、（ａ）改変されたＲｅｃＡおよび場合により過剰発現したＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む、操作された宿主細胞を、複数の非天然アミノ酸と共にインキュベートすることであって、過剰発現したＤＮＡポリメラーゼＩＩの発現レベルは、基本的な発現レベルの等価のＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む等価の宿主細胞に関連する、インキュベートすること；ならびに、ｂ）複数の非天然アミノ酸を新たに合成されたＤＮＡ鎖に組み込み、これにより改変されたポリペプチドを生成することを含み、改変されたＤＮＡ修復応答関連タンパク質および場合により過剰発現したポリメラーゼは、新たに合成されたポリペプチドへの複数の非天然アミノ酸の組込みを促進して、改変されたポリペプチドを生成する非天然塩基対の保持性を高める、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、組換え修復を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復応答は、ＳＯＳ応答を含む。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、２−アミノアデニン−９−イル、２−アミノアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−チオウラシル、２−チオ−チミン、２−チオシトシン、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびアルキル誘導体、２−アミノ−アデニン、２−アミノ−プロピル−アデニン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、４−チオ−ウラシル、４−チオ−チミン、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、５−ブロモ、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシン；５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−プロピニルシトシン、５−ウラシル、５−置換、５−ハロ、５−置換ピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、６−アザピリミジン、６−アゾ−ウラシル、６−アゾシトシン、アザシトシン、６−アゾ−チミン、６−チオ−グアニン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、および８−ヒドロキシル置換アデニンおよびグアニン；Ｎ４−エチルシトシン、Ｎ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐｓ、フェノキサジンシチジン（９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ならびにプリンまたはピリミジン基が複素環で置き換えられているものからなる群から選択される非天然塩基を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化１２】
2021508466.tif 000014
からなる群から選択される
【００２３】
いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然糖部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然糖部分は、２’位での修飾：ＯＨ；置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であり、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であり、ｎおよびｍは、１〜約１０である；および／または、５’位での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（ＲもしくはＳ）、４’位での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然塩基は、
【化１３】
2021508466.tif 000015
からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、非天然主鎖をさらに含む。いくつかの実施形態では、非天然主鎖は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｃ１〜Ｃ１０ホスホネート、３’−アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、３’−アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェートからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ｄＮａＭＴＰおよび／またはｄＴＰＴ３ＴＰである。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、操作された宿主細胞ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、ａｒｓＢ遺伝子座に組み込まれる。
【００２４】
本発明の様々な態様を、添付される特許請求の範囲において特に記述する。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態について述べる下記の詳細な記述、および添付図面を参照することによって得られよう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−１】図１Ａ〜図１Ｅは、非天然塩基対（ＵＢＰ）と、その保持率に対するＤＮＡ損傷およびトレランス経路の寄与を示す図である。図１Ａは、ｄＮａＭ−ｄＴＰＴ３  ＵＢＰおよび自然ｄＧ−ｄＣ塩基対を示す。図１Ｂは、ＮＥＲ（ΔｕｖｒＣ）、ＭＭＲ（ΔｍｕｔＨ）、またはＲＥＲ（ΔｒｅｃＡ）が欠失している株を示す。図１Ｃは、ＲＥＲおよびＳＯＳ（ΔｒｅｃＡ）が欠失している株、ならびにＳＯＳ（ｌｅｘＡ（Ｓ１１９Ａ））のみが欠失している株を示す。図１Ｄは、ＳＯＳ調節ポリメラーゼＰｏｌＩＩ（ΔｐｏｌＢ）もしくはＰｏｌＩＶおよびＶ（ΔｄｉｎＢΔｕｍｕＣＤ）またはＲＥＲおよびＳＯＳ（ΔｒｅｃＡ）が欠失している株を示す。図１Ｅは、ＰｏｌＩｅｘｏ−（ｐｏｌＡ（Ｄ４２４Ａ，Ｋ８９０Ｒ））またはＰｏｌＩＩＩｅｘｏ−（ｄｎａＱ（Ｄ１２Ｎ））の野生型、ΔｐｏｌＢ、またはΔｐｏｌＢΔｒｅｃＡバックグラウンドを持つ株を示す。それぞれの場合において、示される株には、示した配列（Ｘ＝ｄＮａＭ）内にＵＢＰが埋め込まれたプラスミドを複製して負荷した。図示される全てのデータに関してｎ≧３であり；点は個々の複製物を表し；バーはサンプル平均を表し；エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。
【図１−２】図１−１の続き。
【図１−３】図１−２の続き。
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｃは、最適化されたＵＢＰ保持率をもたらすレプリソームリプログラミングを示す図である。図２Ａは、固体成長培地の選択後の、ＷＴ−Ｏｐｔ（ミディアムグレー）、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ（ダークグレー）、およびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ（ライトグレー）の個々のクローンにおけるＵＢＰの保持率を示す。各株には、様々な困難を持つ配列構成（ＧＴＡＸＡＧＡ＜ＴＣＣＸＣＧＴ＜ＴＣＣＸＧＧＴ）で複製ｐＩＮＦ由来ＵＢＰを負荷した。各点は個々のクローンを表し、各分布ごとにｎ≧１２である。図２Ｂは、ｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰがある（円形／実線）およびない（四角形／点線）培地での対数期増殖中の、ＷＴ−Ｏｐｔ（ミディアムグレー）、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ（ダークグレー）、およびＰｏｌＩＩ＋Δｒｅｄ−Ｏｐｔ（ライトグレー）細胞の染色体ＵＢＰ組込み体の成長曲線を示す。データは、理論対数成長曲線に当て嵌める。ｎ＝３；小さい点は、個々の複製物を表し；大きい点は、サンプル平均を表し；時間に関するエラーバーおよびＯＤ６００は、Ｓ．Ｄ．を表す。図２Ｃは、ＷＴ−Ｏｐｔ（ミディアムグレー）、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ（ダークグレー）、およびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ（ライトグレー）細胞における染色体ｄＮａＭ−ｄＴＰＴ３  ＵＢＰの保持率は、長期成長にわたって測定されたことを示す。ｎ＝３；小さい点は、個々の複製物を表し；大きい点は、サンプル平均を表し；エラーバーは、ＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔデータ以外の細胞倍加および保持率の両方に関する２つのＳ．Ｄ．を表す。約７０の倍加後、ＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ株の１つの複製物がＷＴ−Ｏｐｔ細胞で汚染された。したがって、黒い矢印の、およびその後のデータは、ＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔに関するただ２つの独立した実験の平均を表す。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３】染色体ｌａｃＺＹＡ座から改変ＰｔＮＴＴ２ヌクレオチドトランスポーター遺伝子を恒常的に発現するよう操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ＹＺ３株と比較した、ＩＳ１のノックアウトを含有する株の、長期成長（１０継代）にわたり増大するｐＴＮＴＴ２活性を示す図である。
【図４Ａ】ＰｔＮＴＴ２発現構成体を具体化する図である。ＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）に関する発現構成体が示されている。図４Ａは、ｐＡＣＳ２を使用して、ＰｏｌＩＩＩＥｘｏ−株を除く図１で提示された全てのデータを作成したことを示す。
【図４Ｂ】ＰｔＮＴＴ２発現構成体を具体化する図である。ＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）に関する発現構成体が示されている。図４Ｂは、ｐＡＣＳ２＋ｄｎａＱ（Ｄ１２Ｎ）を使用して、ＰｏｌＩＩＩｅｘｏ−株のデータを作成したことを示す。
【図４Ｃ】ＰｔＮＴＴ２発現構成体を具体化する図である。ＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）に関する発現構成体が示されている。図４Ｃは、ｌａｃＺＹＡ座からの染色体発現を使用して、図３の全てのデータを作成したことを示す。
【図５】エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼ株に関するＴＣＡＸＡＧＴ  ｐＩＮＦ複製データを複製する、エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼが示されることを示す図である。図１Ｅからの同じ株も、ＴＣＡＸＡＧＴ（Ｘ＝ｄＮａＭ）を複製するそれらの能力に関して試験をした。示される全てのデータに関してＮ＞≧３；エラーバーは、９５％経験的ブートストラップ信頼区間を表す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、ｐｏｌＡ（Ｄ４２４Ａ，Ｋ８９０Ｒ）、Ｐ＿ｐｏｌＢ設計を示す図である。ｐｏｌＡ（Ｄ４２４Ａ，Ｋ８９０Ｒ）の構成戦略、および抑制解除されたＰｐｏｌＢが示される。図６Ａは、ｐｏｌＡが、その５”−  −  −３”エキソヌクレアーゼドメイン（ＰｏｌＡ（１〜３４１）に該当）に切断されたことを示す。次いで所望のＤ４２４Ａ変異を導入した。Ｋ８９０Ｒ変異はＰＣＲで生じ、ＰｏｌＩ機能に限られた影響を有することが予測された。図６Ｂは、プロモーターの−３５配列の上流に存在するｌｅｘＡオペレーター半部位（太字）の１つへの組込みを通して、ＰｐｏｌＢが抑制解除された（ＰＰｏｌＩＩ＋）ことを示す。
【図７−１】図７Ａ〜図７Ｃは、ＵＢＳ染色体組込みを示す図である。図７Ａは、ａｒｓＢ：：ＵＢＰ組込みカセットの構成戦略を示す。組込みカセットは、ＤＮＡを含有する短いＵＢＰのＰＣＲを、ｐＫＤ１３プラスミドのｎｅｏカセットと重ね合わせることにより構成された。図７Ｂは、染色体ＵＢＰの首尾良くなされた組込みが、ＰＣＲおよびビオチンシフトＰＣＲによって確認されたことを示す。ΔｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ  ＳＳＯ組込み体（それぞれＡ２およびＢ３）の確認が示されている。ティールバンドは過剰曝露を示す。図７Ｃは、初期組込み体の再播種および個々のクローンの単離が、ΔｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ（それぞれＡ２．１およびＢ３．１）に関して１００％保持率クローンを素早く同定したことを示す。ＷＴ−Ｏｐｔ組込み体（Ｃ１）に関する同じ手順は、そうではなかった。再播種されたクローンの代表的なサブセットが示されている。赤いバンドは、過剰曝露を示す。パネルＢおよびＣでは、各ゲルを生成するのに使用されるプライマーセットの詳細は、各ゲルの上方に与えられる。分子量は、塩基対の数でサイズ標準の次に提示される。関連あるシフト％値がレーンの下方に提示される場合、ストレプトアビジン−ＤＮＡおよびＤＮＡ種は、それぞれ黒および赤の矢印で示される。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、再プログラムされた株および染色体組込み体の倍加時間特性を示す図である。図８Ａは、染色体ＵＢＰ（ＷＴ−Ｏｐｔ（赤）、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ（青）、およびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ（金））を持たない、再プログラムされた株と、クロラムフェニコール耐性（ｌａｃＺＹＡ：：ｃａｔ（黒））を持つ野生型ＢＬ２１（ＤＥ３）とが示された、成長曲線を示す。円／実線は、ｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰを持つ培地での成長を表す。四角形／点線は、ｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰを持たない培地での成長を表す。図８Ｂは、平均測定倍加時間（ｎ＝３）が、染色体ＵＢＰを持つおよび持たない、ならびにｄＸＴＰが添加されたおよび添加されない、全ての株に関して提示されることを示す。図６Ｂは、出現の順に、配列番号２８および２９をそれぞれ開示する。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、ＷＴ−Ｏｐｔ細胞によるＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ染色体ＵＢＰ組込み体汚染を示す図である。ＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ組込み体の複製物３は、１３継代でＷＴ−Ｏｐｔ細胞により汚染された。図９Ａは、ＰｐｏｌＢ座が、ＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ組込み体に関する複製物３の継代からのｇＤＮＡサンプルのＰＣＲによって、モニタされたことを示す。ＰＰｏｌＩＩ＋変異を持つ株は、ＵＢＰ組込みの前のＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔの分析からわかるように（ｂ）、クロラムフェニコール耐性（ｌａｃＺＹＡ：：ｃａｔ）を持つ野生型ＢＬ２１（ＤＥ３）（ａ）よりも大きいアンプリコンを生成する。図９Ｂは、ｒｅｃＡ座が、ＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ組込み体に関する複製物３の継代からのｇＤＮＡサンプルのＰＣＲによってモニタされたことを示す。ΔｒｅｃＡ変異を持つ株は、ＵＢＰ組込み前のＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔの分析からわかるように（ｂ）、クロラムフェニコール耐性を持つ（ｌａｃＺＹＡ：：ｃａｔ）野生型ＢＬ２１（ＤＥ３）（ａ）よりも小さいアンプリコンを生成する。
【図１０Ａ】継代中の、ＷＴ−Ｏｐｔ染色体ＵＢＰ組込み体ＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）変異を示す図である。ＷＴ−Ｏｐｔの継代中のＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）変異の図およびその特徴付け。図１０Ａは、ｃａｔとＩＳ１（上部パネル）との間の領域がＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）のＣ末端とＩＳ１（中間パネル）とに切断された場所で、継代中にＷＴ−Ｏｐｔ変異が生じることを示す。配列決定は、この転位を確認した（下部パネル）。図１０Ａは、出現順に、配列番号３０〜３２をそれぞれ開示する。
【図１０Ｂ】継代中の、ＷＴ−Ｏｐｔ染色体ＵＢＰ組込み体ＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）変異を示す図である。ＷＴ−Ｏｐｔの継代中のＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）変異の図およびその特徴付け。図１０Ｂは、ＩＳ１トランスポゾンによるＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）の不活性化が、ＷＴ−Ｏｐｔの継代からのｇＤＮＡのＰＣＲによってモニタされたことを示す（プライマーに関する表Ｓ１参照）。転位事象は、ＰｔＮＴＴ２（６６〜５７５）を不活性化し、そのサイズは約３０００〜４０００ｂｐに及ぶ。不活性化は、ＵＢＰ損失の急速相中に生じる。追加のアンプリコン（サイズが約１５００ｂｐ）も、クロラムフェニコール耐性を持つ野生型ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｌａｃＺＹＡ：：ｃａｔ）（ａ）、ＵＢＰ組込み前のＷＴ−Ｏｐｔ（ｂ）、および野生型ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｃ）のこれらのプライマーによって生成される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
細胞が増加した情報を保存し回収することを可能にする非天然塩基対（ＵＢＰ）の開発は、治療物質として開発するための非天然アミノ酸を含有するタンパク質の産生を促進することにより、ヒトの健康への適用を含む、実際の適用に重大な影響を与える。しかし、細胞の集団内でのＵＢＰの保持性は、配列に依存し、いくつかの配列では、ＵＢＰは、実際の適用（例えばタンパク質発現）に対して十分に維持されないか、または低いレベルで維持され、これにより、使用できるコドンの数を制限する。
【００２７】
延長された増殖の間のＵＢＰの喪失が、三リン酸の取り込みに対する選択圧、およびＵＢＰを喪失したＤＮＡ配列を切断し、ゆえに分解することを対象とするＣａｓ９の発現を介するＵＢＰ保持性を適用することにより緩和され得るが、保持性は、いくつかの配列の状況において困難な課題のままである。さらに、この手法は、保持される各配列に対して異なるガイドＲＮＡを最適化することを必要とし、これは、多くの用途、例えばランダムＤＮＡ配列の増殖に関与するものにおいて困難な課題である。加えて、プラスミドと対照的に、染色体においてＵＢＰの情報をコードすることは、ＵＢＰ含有配列の望まれない切断のため、および／または、プラスミドの多くのコピーの１つで重大な消去が少ないこととは対照的に、切断により染色体が破壊されるために、この選択圧を適用することに不適合であると予想された。
【００２８】
いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復関連タンパク質、例えば、組換え修復、ＳＯＳ応答、ヌクレオチド除去修復、もしくはメチル指向性ミスマッチ修復に関与するタンパク質、および／または、改変された転移関連タンパク質、例えば、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＢ、挿入因子ＩＳ１  ４タンパク質ＩｎｓＡを利用するＵＢＰの保持性を増すための、方法、組成物、細胞、操作された微生物、プラスミド、およびキットが、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復関連タンパク質の構成型発現または過剰発現、および／または、転移関連タンパク質の欠失もしくは発現低下は、ＵＢＰ染色体保持性が高いことを特徴とするＳＳＯの創出をもたらすヌクレオシド三リン酸トランスポーターの高い安定性を促進する。
【００２９】
ある特定の実施形態では、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生の増加のための方法、組成物、細胞、操作された微生物、プラスミド、およびキットが、本明細書に開示される。いくつかの例では、（ａ）非天然ヌクレオチドを含む第１の核酸分子；および、（ｂ）改変された転移関連タンパク質をコードする第２の核酸分子を含む、操作された細胞が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードする第３の核酸分子であって、操作された宿主細胞のゲノム配列に組み込まれているか、または改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードするプラスミドを含む、第３の核酸分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、および、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ足場を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含み、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、非天然ヌクレオチドをコードする第１の核酸分子の複製を調節する。ある特定の実施形態では、操作された細胞は、（ａ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアントをコードする第４の核酸分子；および、（ｂ）ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ足場を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする第５の核酸分子をさらに含む。いくつかの例では、第１、第２、第３、第４、および第５の核酸分子は、１つまたはそれ以上のプラスミドでコードされ、第５の核酸分子によりコードされるｓｇＲＮＡは、第１の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変を認識する標的モチーフを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書でさらに提供されるものとして、操作された細胞を以下と共にインキュベートすることを含む方法により産生される非天然ヌクレオチドを含有する核酸分子が挙げられる：（ａ）非天然ヌクレオチドを含む第１の核酸分子；（ｂ）改変された転移関連タンパク質をコードする第２の核酸分子；（ｃ）改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードする第３の核酸分子；（ｄ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアントをコードする第４の核酸分子；および、（ｅ）ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ足場を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする第５の核酸分子。いくつかの例では、第１の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変は、改変された第１の核酸分子を生成し、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、非天然ヌクレオチドを含有する核酸分子の産生を導く改変された第１の核酸分子の複製を調節する。いくつかの例では、操作された細胞での改変された転移関連タンパク質の発現により、三リン酸トランスポーターの安定性は高まる。いくつかの実施形態では、三リン酸トランスポーターの高い安定性は、（ｉ）非天然ヌクレオチドによりコードされる非天然アミノ酸を含む改変されたポリペプチドの産生の増加、および／または、（ｉｉ）操作された細胞のゲノムにおける非天然ヌクレオチドの高い保持性に寄与する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本明細書で追加で提供されるものとして、生物を以下と共にインキュベートすることを含む方法により産生される半合成生物（ＳＳＯ）が挙げられる：（ａ）非天然ヌクレオチドを含む第１の核酸分子；（ｂ）改変された転移関連タンパク質をコードする第２の核酸分子；（ｃ）改変されたヌクレオシド三リン酸トランスポーターをコードする第３の核酸分子；（ｄ）Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアントをコードする第４の核酸分子；および、（ｅ）ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ足場を含むシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする第５の核酸分子。いくつかの例では、第１の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変は、改変された第１の核酸分子を生成し、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアント、およびｓｇＲＮＡの組合せは、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子を含有する半合成生物の産生を導く改変された第１の核酸分子の複製を調節する。いくつかの例では、操作された細胞での改変された転移関連タンパク質の発現により、三リン酸トランスポーターの安定性は高まる。いくつかの実施形態では、三リン酸トランスポーターの高い安定性は、（ｉ）非天然ヌクレオチドによりコードされる非天然アミノ酸を含む改変されたポリペプチドの産生の増加、および／または、（ｉｉ）ＳＳＯのゲノムにおける非天然ヌクレオチドの高い保持性に寄与する。
【００３２】
ＤＮＡ修復機構
ＤＮＡ修復機構として、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、リボヌクレオチド除去修復（ＲＥＲ）、ＳＯＳ応答、メチル指向性ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、および組換え修復が挙げられる。ＮＥＲ、ＭＭＲ、ＲＥＲ、およびＳＯＳ応答は、シグナルにより誘発されるが、これは、宿主ゲノムへのＵＢＰの導入により模倣することができる。組換え修復および／またはＳＯＳ応答に関与する原核細胞でのＤＮＡ修復関連タンパク質の非限定例として、ＲｅｃＡ、Ｒａｄ５１、ＲａｄＡ、およびＬｅｘＡが挙げられる。組換え修復に関与する原核細胞でのＤＮＡ修復関連タンパク質の非限定例として、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＮ、およびＲｕｖＡＢＣが挙げられる。ＮＥＲに関与する原核細胞でのＤＮＡ修復関連タンパク質の非限定例として、ＵｖｒＡおよびＵｖｒＢが挙げられる。ＭＭＲに関与する原核細胞でのＤＮＡ修復関連タンパク質の非限定例として、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、およびＭｕｔＬが挙げられる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復関連タンパク質は、染色体ＵＢＰ保持性を高めるために、本明細書に記載の操作された細胞またはＳＳＯに導入される。いくつかの実施形態では、改変されたＤＮＡ修復関連タンパク質は、ＲｅｃＡ、Ｒａｄ５１、ＲａｄＡ、ＬｅｘＡ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＮ、ＲｕｖＡＢＣ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＵｖｒＡ、および／またはＵｖｒＢの欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、内部欠失、および／または遺伝子全体の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復関連タンパク質をコードする核酸分子での欠失または突然変異は、改変されて欠失に達する。
【００３４】
転移関連タンパク質
大腸菌では、核酸配列からなる転移因子（例えばＩＳＩ）の転移の複製および保存（非複製）作用様式が存在する。複製経路では、転移因子の新たなコピーが、転移事象において生成される。転移の結果、１つのコピーが新たな部位に現れ、１つのコピーが古い部位に留まる。保存経路では、複製は起こらない。その代わりに、因子は、染色体またはプラスミドから切り離され、新たな部位に組み込まれる。これらの場合、因子のＤＮＡ複製は起こらず、因子は本来の染色体の部位で喪失する。転移因子の欠失は、その近傍における欠失（例えば、隣接または周りのＤＮＡに加えて、転移因子の欠失）の高い出現率の原因となる。
【００３５】
ｉｎｓＢ−４およびｉｎｓＡ−４遺伝子は、ＩＳ１トランスポゾン、ＩｎｓＢ、およびＩｎｓＡの転移に必要な２つのタンパク質をコードする。ＩＳ１転移により、９〜８個の塩基対の標的複製が生じる。ｉｎｓＢ−４の欠失により、ＩｎｓＢにより媒介される異常な転移事象の抑制が生じる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法、操作された細胞、および半合成生物は、転移関連タンパク質をコードする改変された核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、転移関連タンパク質は、ｉｎｓＢおよび／またはｉｎｓＡを含む。いくつかの実施形態では、転移関連タンパク質をコードする改変された核酸分子は、欠失または突然変異を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、両末端での切断、内部欠失、および／または遺伝子全体の欠失を含む。いくつかの実施形態では、突然変異により、ｉｎｓＢおよび／またはＩｎｓＡの発現の低下が生じる。いくつかの実施形態では、転移関連タンパク質をコードする改変された核酸分子の欠失または突然変異は、三リン酸ヌクレオシドトランスポーターの発現および／または活性の安定化に効果的であり、それによりＵＢＰの保持性が高まる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法、操作された細胞、および半合成生物は、ＩＳ１転移因子をコードする改変された核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ＩＳ１転移因子をコードする改変された核酸分子は、欠失または突然変異を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、ＩＳ１トランスポゾンをコードする核酸分子の全てまたは一部のノックアウトまたはノックダウンを含む。いくつかの実施形態では、突然変異により、ＩＳ１トランスポゾンの発現の低下が生じる。いくつかの実施形態では、ＩＳ１トランスポゾンをコードする改変された核酸分子の欠失または突然変異は、三リン酸ヌクレオシドトランスポーターの発現および／または活性の安定化に効果的であり、それによりＵＢＰの保持性が高まる。いくつかの例では、ＩＳ１転移因子をコードする改変された核酸分子は、配列番号４を含む。
【００３８】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）の編集システム
いくつかの実施形態では、本明細書に開示された方法、細胞、および操作された微生物は、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の改変に対する、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムを利用する。いくつかの例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、その非天然ヌクレオチド位置での改変を含む改変された核酸分子の保持性を調節する。いくつかの例では、保持性は、改変された核酸分子の複製が低下することである。いくつかの例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＲｅｃＢＣＤおよびその関連するヌクレアーゼのようなＤＮＡ修復タンパク質に関与する分解へ導く改変された核酸分子内の二本鎖切断を生成する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、（１）宿主ゲノム中のクラスター化アレイでの、「スペーサー」と呼ばれる非天然ヌクレオチドを含む目的の核酸分子に相同である遺伝物質の短い領域の組込み、（２）スペーサーからのショートガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、（３）プロトスペーサーと称する目的の核酸分子の特定部分へのｃｒＲＮＡの結合、および（４）ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）によるプロトスペーサーの分解を含む。いくつかの場合、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌である化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）において記載されており、この中で、Ｃａｓ９および２つの非コード小型ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ））は、配列特異的な手法で、共同して作用して、目的の核酸分子を標的化し、分解する（Ｊｉｎｅｋら、「Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｄｕａｌ−ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６〜８２１頁（２０１２年８月、電子公開２０１２年６月２８日））。
【００４０】
いくつかの例では、２つの非コードＲＮＡは、１つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）にさらに融合される。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡは、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変を認識する標的モチーフを含む。いくつかの実施形態では、改変は、置換、挿入、または欠失である。いくつかの場合、ｓｇＲＮＡは、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での置換を認識する標的モチーフを含む。いくつかの場合、ｓｇＲＮＡは、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での欠失を認識する標的モチーフを含む。いくつかの場合、ｓｇＲＮＡは、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での挿入を認識する標的モチーフを含む。
【００４１】
いくつかの場合、標的モチーフは、１０〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの例では、標的モチーフは、１５〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの場合、標的モチーフは、約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。いくつかの場合、標的モチーフは、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長である。
【００４２】
いくつかの場合、ｓｇＲＮＡは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）認識因子をさらに含む。いくつかの例では、ＰＡＭは、標的モチーフの３’末端に隣接して位置する。いくつかの場合、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変でＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する標的モチーフ内のヌクレオチドは、ＰＡＭの５’末端から３〜２２、５〜２０、５〜１８、５〜１５、５〜１２、または５〜１０ヌクレオチドに位置する。いくつかの場合、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変でＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する標的モチーフ内のヌクレオチドは、ＰＡＭの５’末端から約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドに位置する。
【００４３】
いくつかの例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアントを利用する。Ｃａｓ９は、二重らせんの各鎖に対して１つである、２つの活性切断部位を有する二本鎖ヌクレアーゼである。いくつかの例では、Ｃａｓ９ポリペプチドまたはそのバリアントは、二本鎖切断を生成する。いくつかの場合、Ｃａｓ９ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９である。いくつかの例では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、本明細書に記載の細胞および／または操作された微生物での発現に対して最適化されたＣａｓ９である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体は、例えばＰＡＭのｓｇＲＮＡ上流の１７〜２０ヌクレオチドと適合する配列を含有する、目的の核酸分子（例えばＤＮＡ）の一部に結合する。一旦結合すると、次いでＣａｓ９中の２つの独立したヌクレアーゼドメインは、それぞれ、ＰＡＭの３塩基上流のＤＮＡ鎖の１つを切断し、平滑末端のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）は残る。次いで、ＤＳＢの存在により、いくつかの例では、ＲｅｃＢＣＤおよびその関連するヌクレアーゼにより目的のＤＮＡの分解が生じる。
【００４５】
いくつかの例では、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体は、その非天然ヌクレオチド位置での改変を含む改変された核酸分子の保持性を調節する。いくつかの実施形態では、保持性とは、改変された核酸分子の複製が低下することである。いくつかの場合、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡは、改変された核酸分子の複製速度を約８０％、８５％、９５％、９９％またはそれ以上減少させる。
【００４６】
いくつかの例では、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生は、約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上高まる。いくつかの例では、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の産生は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上高まる。
【００４７】
いくつかの場合、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の保持性は、約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上高まる。いくつかの例では、非天然ヌクレオチドを含む核酸分子の保持性は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上高まる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、２つまたはそれ以上のｓｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、２つまたはそれ以上のｓｇＲＮＡの各々は、独立して、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での改変を認識する標的モチーフを含む。いくつかの実施形態では、改変は、置換、挿入、または欠失である。いくつかの場合、２つまたはそれ以上のｓｇＲＮＡの各々は、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での置換を認識する標的モチーフを含む。いくつかの場合、２つまたはそれ以上のｓｇＲＮＡの各々は、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での欠失を認識する標的モチーフを含む。いくつかの場合、２つまたはそれ以上のｓｇＲＮＡの各々は、目的の核酸分子内の非天然ヌクレオチド位置での挿入を認識する標的モチーフを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、目的の核酸分子へのＣＲＩＳＰＲ成分の結合の特異性は、ｓｇＲＮＡのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ部分での非反復スペーサー因子により制御され、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分に沿って転写が起こると、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをプロトスペーサー：ｃｒＲＮＡヘテロ二本鎖に向け、二本鎖切断（ＤＳＢ）形成を誘発する。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡの特異性は、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。いくつかの例では、ｓｇＲＮＡの標的外結合速度は、約２０％、１５％、１０％、５％、３％、１％またはそれ以下未満である。
【００５０】
核酸分子
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、本明細書で目的の核酸分子とも称する）は、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（短い阻害型ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）のような任意の供給源または組成物由来であり、任意の形態（例えば、線状、環状、スーパーコイル状、一本鎖、二本鎖など）である。いくつかの実施形態では、核酸は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはポリヌクレオチドを含む。いくつかの場合、核酸は、天然および非天然核酸を含む。いくつかの場合、核酸はまた、ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体、および／または非ネイティブ主鎖などを含有）のような非天然核酸を含む。用語「核酸」は、特定の長さのポリヌクレオチド鎖を指さない、または推定せず、ゆえにポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドもまた、定義に含まれることは理解される。例示的な天然ヌクレオチドとして、限定されないが、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、およびｄＧＭＰが挙げられる。例示的な天然デオキシリボヌクレオチドとして、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰ、およびｄＧＭＰが挙げられる。例示的な天然リボヌクレオチドとして、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＧＤＰ、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、およびＧＭＰが挙げられる。ＲＮＡについて、ウラシル塩基は、ウリジンである。核酸は、ときに、ベクター、プラスミド、ファージミド、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、酵母人工染色体（例えばＹＡＣ）、または宿主細胞内で複製できるか、もしくは複製される他の核酸である。いくつかの場合、非天然核酸は、核酸類似体である。追加の場合、非天然核酸は、細胞外供給源由来である。他の場合、非天然核酸は、本明細書で提供される生物、例えば遺伝子操作された生物の細胞内空間で利用可能である。
【００５１】
非天然核酸
ヌクレオチド類似体、または非天然ヌクレオチドは、塩基、糖、またはリン酸部分に対するいくつかの種類の改変を含有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、改変は、化学修飾を含む。いくつかの場合、改変は、３’ＯΗもしくは５’ＯΗ基、主鎖、糖成分、またはヌクレオチド塩基で起こる。改変は、いくつかの例では、場合により、天然に存在しないリンカー分子、および／または鎖間もしくは鎖内架橋を含む。一態様では、改変された核酸は、３’ＯΗもしくは５’ＯΗ基、主鎖、糖成分、もしくはヌクレオチド塩基の１つまたはそれ以上の改変、および／または、天然に存在しないリンカー分子の付加を含む。一態様では、改変された主鎖は、ホスホジエステル主鎖以外の主鎖を含む。一態様では、改変された糖は、デオキシリボース（改変されたＤＮＡ中）以外、またはリボース（改変されたＲＮＡ）以外の糖を含む。一態様では、改変された塩基は、アデニン、グアニン、シトシンもしくはチミン（改変されたＤＮＡ中）以外の塩基、または、アデニン、グアニン、シトシンもしくはウラシル（改変されたＲＮＡ中）以外の塩基を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも１つの改変された塩基を含む。いくつかの例では、核酸は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上の改変された塩基を含む。いくつかの場合、塩基部分に対する改変は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ／Ｕ、ならびに、異なるプリンまたはピリミジン塩基の天然および合成改変を含む。いくつかの実施形態では、改変は、アデニン、グアニン、シトシンもしくはチミン（改変されたＤＮＡ中）の改変された形態、または、アデニン、グアニン、シトシンもしくはウラシル（改変されたＲＮＡ）の改変された形態である。
【００５３】
非天然核酸の改変された塩基として、限定されないが、ウラシル−５−イル、ヒポキサンチン−９−イル（Ｉ）、２−アミノアデニン−９−イル、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（疑似ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ））、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリン、Ｏ−６置換プリン、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−メチルシトシン、二重鎖形成の安定性を高めるもの、ユニバーサル核酸、疎水性核酸、プロミスキャスな核酸、サイズ拡大した核酸、フッ素化核酸、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６および０−６置換プリンのような、ある特定の非天然核酸。５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、アデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＩ１／４）ウラシル、５−プロピニルシトシン、ピリミジン核酸の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（疑似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、３−デアザアデニン、三環式ピリミジン、フェノキサジンシチジン（［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、プリンまたはピリミジン基が他の複素環で置き換えられているもの、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、２−ピリドン、アザシトシン、５−ブロモシトシン、ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、および５−ヨードウラシル、２−アミノ−アデニン、６−チオ−グアニン、２−チオ−チミン、４−チオ−チミン、５−プロピニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、Ｎ４−エチルシトシン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、５−ヒドロキシシトシン、２’−デオキシウリジン、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン、ならびに、米国特許第３，６８７，８０８号；米国特許第４，８４５，２０５号；米国特許第４，９１０，３００号；米国特許第４，９４８，８８２号；米国特許第５，０９３，２３２号；米国特許第５，１３０，３０２号；米国特許第５，１３４，０６６号；米国特許第５，１７５，２７３号；米国特許第５，３６７，０６６号；米国特許第５，４３２，２７２号；米国特許第５，４５７，１８７号；米国特許第５，４５９，２５５号；米国特許第５，４８４，９０８号；米国特許第５，５０２，１７７号；米国特許第５，５２５，７１１号；米国特許第５，５５２，５４０号；米国特許第５，５８７，４６９号；米国特許第５，５９４，１２１号；米国特許第５，５９６，０９１号；米国特許第５，６１４，６１７号；米国特許第５，６４５，９８５号；米国特許第５，６８１，９４１号；米国特許第５，７５０，６９２号；米国特許第５，７６３，５８８号；米国特許第５，８３０，６５３号；および米国特許第６，００５，０９６号；ＷＯ９９／６２９２３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、（２００１）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：８０７〜８１３頁；Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０年、８５８〜８５９頁；Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、国際版、１９９１年、３０、６１３；およびＳａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｒｏｏｋｅａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年、２７３〜２８８頁に記載されたもの。追加の塩基改変は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、国際版、１９９１年、３０、６１３；およびＳａｎｇｈｖｉ、第１５章、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年で見出すことができる。
【００５４】
様々な複素環塩基および様々な糖部分（および糖類似体）を含む非天然核酸は、当該技術分野で利用可能であり、核酸は、いくつかの場合、天然に存在する核酸の主要な５個の基本塩基成分以外の１つまたは複数の複素環塩基を含む。例えば、複素環塩基として、いくつかの場合、ウラシル−５−イル、シトシン−５−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−３−イル基が挙げられ、ここで、プリンは９位を介して、ピリミジンは１位を介して、ピロロピリミジンは７位を介して、およびピラゾロピリミジンは１位を介して核酸の糖部分に結合される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、非天然核酸の改変された塩基は、以下に示し、ここで、波線は、（デオキシ）リボースまたはリボースへの結合の点を示す。
【００５６】
【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【００５７】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体はまた、リン酸部分で改変される。改変されたリン酸部分は、限定されないが、２つのヌクレオチド間の結合での改変をもつものを含み、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェートを含有する。２つのヌクレオチド間のこれらのホスフェートまたは改変ホスフェート結合は、３’−５’結合または２’−５’結合を通してであり、結合は、３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’のような反転した極性を含有することは理解される。様々な塩、混合した塩、および遊離酸形態もまた含まれる。多くの米国特許により、改変したホスフェートを含有するヌクレオチドをどのように作製し使用するかは教示されており、限定されないが、３，６８７，８０８号；４，４６９，８６３号；４，４７６，３０１号；５，０２３，２４３号；５，１７７，１９６号；５，１８８，８９７号；５，２６４，４２３号；５，２７６，０１９号；５，２７８，３０２号；５，２８６，７１７号；５，３２１，１３１号；５，３９９，６７６号；５，４０５，９３９号；５，４５３，４９６号；５，４５５，２３３号；５，４６６，６７７号；５，４７６，９２５号；５，５１９，１２６号；５，５３６，８２１号；５，５４１，３０６号；５，５５０，１１１号；５，５６３，２５３号；５，５７１，７９９号；５，５８７，３６１号；および、５，６２５，０５０号が挙げられる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、非天然核酸は、２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロ−ヌクレオシド（ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００６４６０）、５’−置換ＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体（ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３３９６１；Ｓａｈａら、Ｊ．  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．、１９９５年、６０、７８８〜７８９頁；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９９年、９、８８５〜８９０頁；およびＭｉｋｈａｉｌｏｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９１年、１０（１−３）、３３９〜３４３頁；Ｌｅｏｎｉｄら、１９９５年、１４（３−５）、９０１〜９０５頁；およびＥｐｐａｃｈｅｒら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２００４年、８７、３００４〜３０２０頁；ＰＣＴ／ＪＰ２０００／００４７２０；ＰＣＴ／ＪＰ２００３／００２３４２；ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１３２１６；ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０２０４３５；ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１５４７９；ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２４４８４；ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５６７１８；ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０６７５６０）、または、改変された塩基と共にモノホスフェートとして作製された５’−置換モノマー（Ｗａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、２００４年、２３（１＆２）、３１７〜３３７頁）を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、非天然核酸は、糖環の５’位および２’位での修飾（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２９９３）、例えば５’−ＣＨ２−置換２’−Ｏ−保護ヌクレオシド（Ｗｕら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２０００年、８３、１１２７〜１１４３頁、およびＷｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９９年、１０、９２１〜９２４頁）を含む。いくつかの場合、非天然核酸は、オリゴヌクレオチドへの組込みのために調製されたアミド結合型ヌクレオシドダイマーを含み、ここで、ダイマー（５’から３’）での３’結合したヌクレオシドは、２’−ＯＣＨ３および５’−（Ｓ）−ＣＨ３を含む（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１９９７年、１２８７〜１２９０頁）。非天然核酸は、２’−置換５’−ＣＨ２（またはＯ）改変されたヌクレオシドを含むことができる（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０１０２０）。非天然核酸は、５’−メチレンホスホネートＤＮＡおよびＲＮＡモノマー、ならびにダイマーを含むことができる（Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．、１９９３年、３４、２７２３〜２７２６頁；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、１９９５年、７、７０３〜７０５頁；および、Ｈｕｔｔｅｒら、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２００２年、８５、２７７７〜２８０６頁）。非天然核酸は、２’置換を有する５’−ホスホネートモノマー（ＵＳ２００６／００７４０３５）、および他の改変された５’−ホスホネートモノマー（ＷＯ１９９７／３５８６９）を含むことができる。非天然核酸は、５’−改変されたメチレンホスホネートモノマー（ＥＰ６１４９０７およびＥＰ６２９６３３）を含むことができる。非天然核酸は、５’および／または６’位でのヒドロキシル基を含む５’または６’−ホスホネートリボヌクレオシドの類似体を含むことができる（Ｃｈｅｎら、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，Ｓｕｌｆｕｒ  ａｎｄ  Ｓｉｌｉｃｏｎ、２００２年、７７７、１７８３〜１７８６頁；Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０００年、８、２５０１〜２５０９頁；Ｇａｌｌｉｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００７年、９２５〜９３３頁；および、Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９７６年、１９（８）、１０２９〜１０３３頁）。非天然核酸は、５’−ホスフェート基を有する５’−ホスホネートデオキシリボヌクレオシドモノマーおよびダイマーを含むことができる（Ｎａｗｒｏｔら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００６年、１６（１）、６８〜８２頁）。非天然核酸は、６’−ホスホネート基を有するヌクレオシドを含むことができ、ここで、５’および／または６’位は、チオ−ｔｅｒｔ−ブチル基（ＳＣ（ＣＨ３）３）（およびその類似体）；メチレンアミノ基（ＣＨ２ＮＨ２）（およびその類似体）またはシアノ基（ＣＮ）（およびその類似体）で置換されないか、または置換される（Ｆａｉｒｈｕｒｓｔら、Ｓｙｎｌｅｔｔ、２００１年、４、４６７〜４７２頁；Ｋａｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８６年、２９、１０３０〜１０３８頁；Ｋａｐｐｌｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８２年、２５、１１７９〜１１８４頁；Ｖｒｕｄｈｕｌａら、Ｊ���Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９８７年、３０、８８８〜８９４頁；Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９７６年、１９、１３７１〜１３７７頁；Ｇｅｚｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１９８３年、１０５（２６）、７６３８〜７６４０頁；および、Ｈａｍｐｔｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ、１９７３年、９５（１３）、４４０４〜４４１４頁）。
【００６０】
いくつかの実施形態では、非天然核酸はまた、糖部分の改変を含む。いくつかの場合、核酸は、１つまたはそれ以上のヌクレオシドを含有し、糖部分は改変される。このような糖の改変されたヌクレオシドは、高いヌクレアーゼ安定性、高い結合親和性、またはいくつかの他の有益な生物学的特性を付与することができる。ある特定の実施形態では、核酸は、化学修飾されたリボフラノース環部分を含む。化学修飾されたリボフラノース環の例として、限定されないが、置換基の付加（５’および／または２’置換基を含む）；２つの環原子を架橋して二環式核酸（ＢＮＡ）の形成；Ｓ、Ｎ（Ｒ）またはＣ（Ｒｉ）（Ｒ２）（Ｒ＝Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたは保護基）でのリボシル環酸素原子の置換；ならびに、それらの組合せが挙げられる。化学修飾された糖の例は、ＷＯ２００８／１０１１５７、ＵＳ２００５／０１３０９２３、およびＷＯ２００７／１３４１８１で見出すことができる。
【００６１】
いくつかの例では、改変された核酸は、改変された糖または糖類似体を含む。ゆえに、リボースおよびデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、または糖「類似体」シクロペンチル基であり得る。糖は、ピラノシルまたはフラノシル形態であり得る。糖部分は、リボース、デオキシリボース、アラビノース、または２’−Ｏ−アルキルリボースのフラノシドであり、糖は、［アルファ］または［ベータ］アノマー立体配置のいずれかで、それぞれの複素環塩基に結合することができる。糖改変は、限定されないが、２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体、２’−フルオロ−ＤＮＡ、および２’−アルコキシ−またはアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含む。例えば、糖改変は、２’−Ｏ−メチル−ウリジンまたは２’−Ｏ−メチル−シチジンを含み得る。糖改変は、２’−Ｏ−アルキル置換デオキシリボヌクレオシドおよび２’−Ｏ−エチレングリコール様リボヌクレオシドを含む。これらの糖または糖類似体、およびそれぞれの「ヌクレオシド」の調製は知られており、このような糖または類似体は、複素環塩基（核酸塩基）に結合する。糖改変はまた、他の改変と共に作製され、組み合わせることができる。
【００６２】
糖部分に対する改変は、リボースおよびデオキシリボースの天然改変、ならびに非天然改変を含む。糖改変は、限定されないが、２’位での以下の修飾を含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。２’糖修飾はまた、限定されないが、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、および−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、ｎおよびｍは、１〜約１０である。
【００６３】
２’位での他の修飾は、限定されないが、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリール、Ｏ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基、および類似の特性を有する他の置換基を含む。類似の修飾はまた、糖の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上のまたは２’−５’結合したオリゴヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で作製することができる。改変された糖はまた、ＣＨ２およびＳのような架橋環酸素での修飾を含有するものを含む。ヌクレオチド糖類似体はまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分のような糖模倣体も有し得る。このような改変された糖構造の調製を教示し、塩基改変の範囲を詳細に記載する多くの米国特許が存在し、例えば、米国特許第４，９８１，９５７号；米国特許第５，１１８，８００号；米国特許第５，３１９，０８０号；米国特許第５，３５９，０４４号；米国特許第５，３９３，８７８号；米国特許第５，４４６，１３７号；米国特許第５，４６６，７８６号；米国特許第５，５１４，７８５号；米国特許第５，５１９，１３４号；米国特許第５，５６７，８１１号；米国特許第５，５７６，４２７号；米国特許第５，５９１，７２２号；米国特許第５，５９７，９０９号；米国特許第５，６１０，３００号；米国特許第５，６２７，０５３号；米国特許第５，６３９，８７３号；米国特許第５，６４６，２６５号；米国特許第５，６５８，８７３号；米国特許第５，６７０，６３３号；米国特許第４，８４５，２０５号；米国特許第５，１３０，３０２号；米国特許第５，１３４，０６６号；米国特許第５，１７５，２７３号；米国特許第５，３６７，０６６号；米国特許第５，４３２，２７２号；米国特許第５，４５７，１８７号；米国特許第５，４５９，２５５号；米国特許第５，４８４，９０８号；米国特許第５，５０２，１７７号；米国特許第５，５２５，７１１号；米国特許第５，５５２，５４０号；米国特許第５，５８７，４６９号；米国特許第５，５９４，１２１号、５，５９６，０９１号；米国特許第５，６１４，６１７号；米国特許第５，６８１，９４１号；および、米国特許第５，７００，９２０号であり、これらの各々は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【００６４】
改変された糖部分を有する核酸の例として、限定されないが、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、および２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を有する核酸が挙げられる。２’位での置換基はまた、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、およびＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択されることができ、ここで、各ＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
【００６５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、１つまたはそれ以上の二環式核酸を含む。ある特定のいくつかの実施形態では、二環式核酸は、４’および２’リボシル環原子間の架橋を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される核酸は、１つまたはそれ以上の二環式核酸を含み、ここで、架橋は、４’から２’の二環式核酸を含む。このような４’から２’の二環式核酸の例として、限定されないが、式：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’および４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’ならびにそれらの類似体の１つ（米国特許第７，３９９，８４５号を参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’およびその類似体（ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２００８／１５０７２９、ＵＳ２００４／０１７１５７０、米国特許第７，４２７，６７２号、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００９年、７４、１１８〜１３４頁、およびＷＯ２００８／１５４４０１を参照）が挙げられる。また、例えば、Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８年、４、４５５〜４５６頁；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８年、５４、３６０７〜３６３０頁；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００年、９７、５６３３〜５６３８頁；Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８年、８、２２１９〜２２２２頁；Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、６３、１００３５〜１００３９頁；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００７年、１２９（２６）、８３６２〜８３７９頁；Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ、２００１年、２、５５８〜５６１頁；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ、２００１年、８、１〜７頁；Ｏｒａｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００１年、３、２３９〜２４３頁；米国特許第４，８４９，５１３号；米国特許第５，０１５，７３３号；米国特許第５，１１８，８００号；米国特許第５，１１８，８０２号；米国特許第７，０５３，２０７号；米国特許第６，２６８，４９０号；米国特許第６，７７０，７４８号；米国特許第６，７９４，４９９号；米国特許第７，０３４，１３３号；米国特許第６，５２５，１９１号；米国特許第６，６７０，４６１号；および米国特許第７，３９９，８４５号；国際公開番号ＷＯ２００４／１０６３５６、ＷＯ１９９４／１４２２６、ＷＯ２００５／０２１５７０、ＷＯ２００７／０９００７１、およびＷＯ２００７／１３４１８１；米国特許公開番号ＵＳ２００４／０１７１５７０、ＵＳ２００７／０２８７８３１、およびＵＳ２００８／００３９６１８；米国仮出願第６０／９８９，５７４号、米国仮出願第６１／０２６，９９５号、米国仮出願第６１／０２６，９９８号、米国仮出願第６１／０５６，５６４号、米国仮出願第６１／０８６，２３１号、米国仮出願第６１／０９７，７８７号、および米国仮出願第６１／０９９，８４４号；ならびに、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ��００８／０６４５９１、ＰＣＴＵＳ２００８／０６６１５４、ＰＣＴＵＳ２００８／０６８９２２、およびＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３を参照。
【００６６】
ある特定の実施形態では、核酸は、結合した核酸を含む。核酸は、任意の核酸間結合を使用して共に結合することができる。核酸間の連結基の２つのメインクラスは、リン原子の有無により定義される。核酸間結合を含有する代表的なリンとして、限定されないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、およびホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）が挙げられる。核酸間結合を含有する代表的な非リンとして、限定されないが、メチレンメチルイミノ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−）、チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）、チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ）−Ｓ−）；シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｈ）２−Ｏ−）；およびＮ，Ｎ＊−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３））が挙げられる。ある特定の実施形態では、キメラ原子を有する核酸間結合は、ラセミ混合物として、別々のエナンチオマー、例えばアルキルホスホネートおよびホスホロチオエートとして調製することができる。非天然核酸は、単一の改変を含有することができる。非天然核酸は、部分の１つの中または異なる部分の間の複数の改変を含有することができる。
【００６７】
核酸に対する主鎖ホスフェート改変は、限定されないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（架橋または非架橋）、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、ホスホジチオエート、および、ボラノホスフェートを含み、任意の組合せで使用することができる。他の非ホスフェート結合もまた使用することができる。
【００６８】
いくつかの実施形態では、主鎖改変（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合）は、改変された核酸に免疫調節活性を付与することができる、および／または、インビボでそれらの安定性を高めることができる。
【００６９】
いくつかの例では、リン誘導体（または改変されたホスフェート基）は、糖または糖類似体部分に結合し、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなどであり得る。改変されたホスフェート結合または非ホスフェート結合を含有する例示的なポリヌクレオチドは、Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら、１９９６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８４１〜１８４８頁；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら、１９９６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２３１８〜２３２３頁；および、Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２９６６〜２９７３頁；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、１９９７年、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ：  ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ”  ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ、（ＣｈａｄｗｉｃｋおよびＣａｒｄｅｗ編）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｚｏｎ、１９９３年、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ”  ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１６５〜１９０頁；Ｍｉｌｌｅｒら、１９７１年、ＪＡＣＳ  ９３：６６５７〜６６６５頁；Ｊａｇｅｒら、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：７２４７〜７２４６頁；Ｎｅｌｓｏｎら、１９９７年、ＪＯＣ  ６２：７２７８〜７２８７頁；米国特許第５，４５３，４９６号；ならびに、Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、２００１年、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８：１１５７〜１１７９頁で見出すことができる。
【００７０】
いくつかの場合、主鎖改変は、ホスホジエステル結合を、アニオン性、中性またはカチオン性基のような代替部分に置き換えることを含む。このような改変の例として、アニオン性ヌクレオシド間結合；Ｎ３’からＰ５’のホスホロアミデート改変；ボラノホスフェートＤＮＡ；プロオリゴヌクレオチド；メチルホスホネートのような中性ヌクレオシド間結合；アミド結合型ＤＮＡ；メチレン（メチルイミノ）結合；ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合；スルホニル基を含有する主鎖；モルホリノオリゴ；ペプチド核酸（ＰＮＡ）；ならびに、正帯電されたデオキシリボ核酸グアニジン（ＤＮＧ）オリゴが挙げられる（Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ、２００１年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：１１５７〜１１７９頁）。改変された核酸は、１つまたはそれ以上の改変を含むキメラまたは混合主鎖、例えば、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合の組合せのようなホスフェート結合の組合せを含むことができる。
【００７１】
ホスフェートに対する置換基として、例えば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または、１つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合が挙げられる。これらは、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに、混合したＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有する他のものを含む。多くの米国特許により、このような種類のホスフェート置換をどのように作製し使用するかは開示されており、限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；米国特許第５，１６６，３１５号；米国特許第５，１８５，４４４号；米国特許第５，２１４，１３４号；米国特許第５，２１６，１４１号；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，２６４，５６２号；米国特許第５，２６４，５６４号；米国特許第５，４０５，９３８号；米国特許第５，４３４，２５７号；米国特許第５，４６６，６７７号；米国特許第５，４７０，９６７号；米国特許第５，４８９，６７７号；米国特許第５，５４１，３０７号；米国特許第５，５６１，２２５号；米国特許第５，５９６，０８６号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６０２，２４０号；米国特許第５，６０８，０４６号；米国特許第５，６１０，２８９号；米国特許第５，６１８，７０４号；米国特許第５，６２３，０７０号；米国特許第５，６６３，３１２号；米国特許第５，６３３，３６０号；米国特許第５，６７７，４３７号；および、米国特許第５，６７７，４３９号が挙げられる。また、ヌクレオチドの糖およびホスフェート部分の両方が、例えばアミド型結合（アミノエチルグリシン）（ＰＮＡ）により置き換えることができることは、ヌクレオチド置換基において理解される。米国特許第５，５３９，０８２号；米国特許第５，７１４，３３１号；および、米国特許第５，７１９，２６２号により、ＰＮＡ分子をどのように作製し使用するかは教示されており、これらの各々は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。また、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５４、１４９７〜１５００頁も参照。他の種類の分子（共役体）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に結合して、例えば細胞取り込みを高めることも可能である。共役体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と化学的に結合することができる。このような共役体は、限定されないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９年、８６、６５５３〜６５５６頁）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４年、４、１０５３〜１０６０頁）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２年、６６０、３０６〜３０９頁；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３年、３、２７６５〜２７７０頁）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９２年、２０、５３３〜５３８頁）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭ５ＯＪ、１９９１年、１０、１１１１〜１１１８頁；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０年、２５９、３２７〜３３０頁；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３年、７５、４９〜５４頁）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−Ｓ−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６、３６５１〜３６５４頁；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９０年、１８、３７７７〜３７８３頁）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５年、１４、９６９〜９７３頁）、もしくはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５年、３６、３６５１〜３６５４頁）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５年、１２６４、２２９〜２３７頁）、または、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６年、２７７、９２３〜９３７頁）のような脂質部分を含む。多くの米国特許により、このような共役体の製造が教示されており、限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号；米国特許第４，９４８，８８２号；米国特許第５，２１８，１０５号；米国特許第５，５２５，４６５号；米国特許第５，５４１，３１３号；米国特許第５，５４５，７３０号；米国特許第５，５５２，５３８号；米国特許第５，５７８，７１７号、米国特許第５，５８０，７３１号；米国特許第５，５８０，７３１号；米国特許第５，５９１，５８４号；米国特許第５，１０９，１２４号；米国特許第５，１１８，８０２号；米国特許第５，１３８，０４５号；米国特許第５，４１４，０７７号；米国特許第５，４８６，６０３号；米国特許第５，５１２，４３９号；米国特許第５，５７８，７１８号；米国特許第５，６０８，０４６号；米国特許第４，５８７，０４４号；米国特許第４，６０５，７３５号；米国特許第４，６６７，０２５号；米国特許第４，７６２，７７９号；米国特許第４，７８９，７３７号；米国特許第４，８２４，９４１号；米国特許第４，８３５，２６３号；米国特許第４，８７６，３３５号；米国特許第４，９０４，５８２号；米国特許第４，９５８，０１３号；米国特許第５，０８２，８３０号；米国特許第５，１１２，９６３号；米国特許第５，２１４，１３６号；米国特許第５，０８２，８３０号；米国特許第５，１１２，９６３号；米国特許第５，２１４，１３６��；米国特許第５，２４５，０２２号；米国特許第５，２５４，４６９号；米国特許第５，２５８，５０６号；米国特許第５，２６２，５３６号；米国特許第５，２７２，２５０号；米国特許第５，２９２，８７３号；米国特許第５，３１７，０９８号；米国特許第５，３７１，２４１号、米国特許第５，３９１，７２３号；米国特許第５，４１６，２０３号、米国特許第５，４５１，４６３号；米国特許第５，５１０，４７５号；米国特許第５，５１２，６６７号；米国特許第５，５１４，７８５号；米国特許第５，５６５，５５２号；米国特許第５，５６７，８１０号；米国特許第５，５７４，１４２号；米国特許第５，５８５，４８１号；米国特許第５，５８７，３７１号；米国特許第５，５９５，７２６号；米国特許第５，５９７，６９６号；米国特許第５，５９９，９２３号；米国特許第５，５９９，９２８号、および米国特許第５，６８８，９４１号が挙げられる。
【００７２】
核酸塩基対合特性
いくつかの実施形態では、非天然核酸は、別の核酸と塩基対を形成する。いくつかの実施形態では、安定して組み込まれる非天然核酸は、別の核酸、例えば天然または非天然核酸と塩基対を形成することができる非天然核酸である。いくつかの実施形態では、安定して組み込まれる非天然核酸は、別の非天然核酸（非天然核酸塩基対（ＵＢＰ））と塩基対を形成することができる非天然核酸である。例えば、第１の非天然核酸は、第２の非天然核酸と塩基対を形成することができる。例えば、核酸に組み込まれる場合に塩基対形成することができる非天然ヌクレオチド三リン酸の１対は、ｄ５ＳＩＣＳのトリホスフェート（ｄ５ＳＩＣＳＴＰ）およびｄＮａＭのトリホスフェート（ｄＮａＭＴＰ）を含む。このような非天然ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖部分を有することができる。いくつかの実施形態では、実質的に、非天然核酸は、天然核酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）と塩基対を形成しない。いくつかの実施形態では、安定して組み込まれる非天然核酸は、天然核酸と塩基対を形成することができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、安定して組み込まれる非天然核酸は、ＵＢＰを形成することができる非天然核酸であるが、実質的には、４つの天然核酸の各々と塩基対を形成しない。いくつかの実施形態では、安定して組み込まれる非天然核酸は、ＵＢＰを形成することができる非天然核酸であるが、実質的には、１つまたはそれ以上の天然核酸と塩基対を形成しない。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、Ａ、ＴおよびＣと塩基対を形成しないが、Ｇと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、Ａ、ＴおよびＧと塩基対を形成しないが、Ｃと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、Ｃ、ＧおよびＡと塩基対を形成しないが、Ｔと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、Ｃ、ＧおよびＴと塩基対を形成しないが、Ａと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、ＡおよびＴと塩基対を形成しないが、ＣおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、ＡおよびＣと塩基対を形成しないが、ＴおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、ＡおよびＧと塩基対を形成しないが、ＣおよびＴと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、ＣおよびＴと塩基対を形成しないが、ＡおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、ＣおよびＧと塩基対を形成しないが、ＴおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、ＴおよびＧと塩基対を形成しないが、ＡおよびＧと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、Ｇと塩基対を形成しないが、Ａ、ＴおよびＣと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、Ａと塩基対を形成しないが、Ｇ、ＴおよびＣと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、Ｔと塩基対を形成しないが、Ｇ、ＡおよびＣと塩基対を形成することができる。例えば、安定して組み込まれる非天然核酸は、実質的に、Ｃと塩基対を形成しないが、Ｇ、ＴおよびＡと塩基対を形成することができる。
【００７４】
例示的に、インビボ条件下で非天然ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基対（ＵＢＰ）を形成することが可能な非天然ヌクレオチドとして、限定されないが、５ＳＩＣＳ、ｄ５ＳＩＣＳ、ＮＡＭ、ｄＮａＭ、ｄＴＰＴ３、およびこれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、非天然ヌクレオチドは、
【化２０】
2021508466.tif 000022
を含む。
【００７５】
操作された生物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法およびプラスミドは、操作された生物、例えば、ＵＢＰ保持性が向上した非天然ヌクレオチドまたは非天然核酸塩基対（ＵＢＰ）を組み込み、複製し、さらに、非天然ヌクレオチドまたは非天然核酸塩基対を含有する核酸を、非天然アミノ酸残基を含有するタンパク質に転写し、翻訳する、生物を生成するためにさらに使用される。いくつかの例では、生物は、半合成生物（ＳＳＯ）である。いくつかの例では、ＳＳＯは、細胞である。
【００７６】
いくつかの例では、利用される細胞は、異種タンパク質、例えば非天然ヌクレオチド三リン酸を細胞に輸送することが可能なヌクレオシド三リン酸トランスポーター、ヌクレオチド三リン酸トランスポーターの安定性を高める改変された転移関連タンパク質、非天然ヌクレオチド三リン酸位置での改変を取り除くＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、および／または、非天然核酸に対して高い忠実度を有するポリメラーゼをコードする発現カセットで遺伝的に形質転換させ、その結果、非天然ヌクレオチドは、細胞核酸に組み込まれ、例えば、インビボ条件下で非天然塩基対を形成する。いくつかの例では、細胞は、非天然核酸の取り込みに対して高い活性をさらに含む。いくつかの場合、細胞は、非天然核酸の移入に対して高い活性をさらに含む。いくつかの場合、細胞は、非天然核酸に対して高いポリメラーゼ活性をさらに含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡは、別々のプラスミドでコードされる。いくつかの例では、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡは、同じプラスミドでコードされる。いくつかの場合、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、または非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードする核酸分子は、１つまたはそれ以上のプラスミドに位置する。いくつかの例では、Ｃａｓ９は、第１のプラスミドでコードされ、ｓｇＲＮＡおよび非天然ヌクレオチドを含む核酸分子を含む核酸分子は、第２のプラスミドでコードされる。いくつかの例では、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子は、同じプラスミドでコードされる。いくつかの例では、核酸分子は、２つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含む。
【００７８】
いくつかの例では、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡをコードする第１のプラスミド、ならびに非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードする第２のプラスミドは、操作された微生物に導入される。いくつかの例では、Ｃａｓ９をコードする第１のプラスミド、ならびにｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードする第２のプラスミドは、操作された微生物に導入される。いくつかの例では、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、および非天然ヌクレオチドを含む核酸分子をコードするプラスミドは、操作された微生物に導入される。いくつかの例では、核酸分子は、２つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非天然ヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）でその核酸内に組み込まれる生細胞を生成する。いくつかの例では、非天然相互塩基対合ヌクレオチドが、それぞれのトリホスフェートとして、ヌクレオチド三リン酸トランスポーターの作用により細胞に取り込まれる場合、非天然塩基対は、インビボ条件下で非天然塩基対を形成することが可能な非天然相互塩基対合ヌクレオチドの対を含む。細胞は、ヌクレオチド三リン酸トランスポーターをコードする発現カセットで遺伝的に形質転換させることができ、その結果、ヌクレオチド三リン酸トランスポーターは発現し、非天然ヌクレオチドを細胞に輸送するために利用可能である。細胞は、ポリメラーゼをコードする発現カセットで遺伝的に形質転換させることができ、その結果、ポリメラーゼは発現し、非天然ヌクレオチドを細胞の核酸に組み込むために利用可能である。細胞は、原核または真核細胞であり得、非天然相互塩基対合ヌクレオチドの対は、それぞれのトリホスフェートとして、ｄ５ＳＩＣＳのトリホスフェート（ｄ５ＳＩＣＳＴＰ）およびｄＮａＭのトリホスフェート（ｄＮａＭＴＰ）であり得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、細胞は、核酸で、例えば、このような非天然ヌクレオチドを細胞に輸送することが可能なヌクレオチド三リン酸トランスポーターをコードする発現カセットで遺伝的に形質転換させた細胞である。細胞は、異種ヌクレオチド三リン酸トランスポーターを含むことができ、異種ヌクレオチド三リン酸トランスポーターは、天然または非天然ヌクレオチド三リン酸を細胞に輸送することができる。細胞は、異種ポリメラーゼを含み、異種ポリメラーゼは、非天然核酸に対して活性を有する。
【００８１】
いくつかの場合、本明細書に記載の方法はまた、リン酸カリウムおよび／またはホスファターゼもしくはヌクレオチダーゼの阻害剤の存在下で、遺伝的に形質転換させた細胞と、それぞれのトリホスフェート形態の非天然ヌクレオチドとを接触することを含む。このような接触の間または接触の後、細胞は、細胞の増殖および複製に好適な生命維持培地内に置くことができる。非天然ヌクレオチドのそれぞれのトリホスフェート形態は、細胞の少なくとも１つの複製サイクルを通して細胞内の核酸に組み込まれるために、細胞は、生命維持培地に維持することができる。非天然相互塩基対合ヌクレオチドの対は、それぞれのトリホスフェートとして、ｄ５ＳＩＣＳのトリホスフェート（ｄ５ＳＩＣＳＴＰ）およびｄＮａＭのトリホスフェート（ｄＮａＭＴＰ）を含むことができ、細胞は大腸菌であり得、ｄ５ＳＩＣＳＴＰおよびｄＮａＭＴＰは、トランスポーターＰｔＮＴＴ２により大腸菌に効果的に移入することができ、ＰｏｌＩのような大腸菌ポリメラーゼは、非天然トリホスフェートを効果的に使用して、ＤＮＡを複製し、それにより非天然ヌクレオチドおよび／または非天然塩基対を細胞環境内の細胞核酸に組み込むことができる。
【００８２】
本発明の方法により、当業者は、個別の細胞の少なくともいくつかの中で維持される少なくとも１つの核酸内に、少なくとも１つの非天然ヌクレオチドおよび／または少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を有する、生きて増殖する細胞の集団を得ることができ、少なくとも１つの核酸は、細胞内で安定して増殖し、細胞は、生物の増殖および複製に好適な生命維持培地内で非天然ヌクレオチドと（例えば、その存在下で増殖させて）接触させた場合、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドのトリホスフェート形態の細胞取り込みをもたらすのに好適なヌクレオチド三リン酸トランスポーターを発現する。
【００８３】
ヌクレオチド三リン酸トランスポーターによる細胞への輸送の後、非天然塩基対合ヌクレオチドは、細胞機構、例えば、細胞自身のＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡポリメラーゼ、異種ポリメラーゼ、または定方向進化を使用して進化しているポリメラーゼにより細胞内の核酸に組み込まれる（Ｃｈｅｎ  Ｔ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ  ＦＥ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２０１４年１月２１日；５８８（２）：２１９〜２９頁；Ｂｅｔｚ  Ｋら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１３年１２月１１日；１３５（４９）：１８６３７〜４３頁）。非天然ヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、構造ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および自律複製核酸（例えば、プラスミド、ウイルス、またはベクター）のような細胞核酸に組み込むことができる。
【００８４】
いくつかの場合、遺伝子操作された細胞は、細胞への核酸、例えば異種核酸の導入により生成される。本明細書に記載の任意の細胞は、宿主細胞であり得、発現ベクターを含むことができる。一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌である。いくつかの実施形態では、細胞は、１つまたはそれ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。核酸試薬は、様々な技術を使用して微生物に導入することができる。様々な生物に異種核酸を導入するのに使用される方法の非限定的な例として、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、超音波を介した形質転換、粒子衝撃などが挙げられる。いくつかの例では、担体分子の付加（例えばビス−ベンゾイミダゾール化合物、例えば、米国特許第５，５９５，８９９号を参照）は、典型的には、従来の方法により形質転換することは難しいと考えられる細胞へのＤＮＡの取り込みを高めることができる。形質転換の従来の方法は、当業者にとって容易に利用可能であり、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．において見出すことができる。
【００８５】
いくつかの例では、遺伝的形質転換は、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドおよび人工染色体での発現カセットの直接導入を使用して、または、細胞内の遺伝物質もしくはカチオン性リポソームのような担体の導入を介して得られる。このような方法は、当該技術分野で利用可能であり、本明細書に記載の方法での使用に容易に適応可能である。導入ベクターは、遺伝子を細胞内に送達するのに使用される任意のヌクレオチド構築物（例えばプラスミド）であり得、遺伝子を送達する一般的戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルスもしくはアデノウイルスの一部としてあり得る（Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３〜８８頁、（１９９３））。ウイルスベクター、化学的形質移入体、または物理機械的方法を含む、トランスフェクションのための適切な手段、例えば電気穿孔およびＤＮＡの直接拡散は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、１４６５〜１４６８頁、（１９９０）；および、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、８１５〜８１８頁、（１９９１）に記載される。
【００８６】
例えば、ヌクレオチド三リン酸トランスポーターもしくはポリメラーゼ核酸分子、発現カセット、および／またはベクターは、限定されないが、カルシウム媒介性トランスフェクション、電気穿孔、顕微注射、リポフェクション、粒子衝撃などを含む、任意の方法で細胞に導入することができる。
【００８７】
いくつかの場合、細胞は、細胞内の１つまたはそれ以上の核酸に組み込まれた非天然ヌクレオチド三リン酸を含む。例えば、細胞は、細胞内に維持されたＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを組み込むことが可能な生細胞であり得る。細胞はまた、非天然相互塩基対合ヌクレオチドの対を含む少なくとも１つの非天然塩基対（ＵＢＰ）を、細胞内の核酸にインビボ条件下で組み込むことができ、非天然相互塩基対合ヌクレオチド、例えばそれぞれのトリホスフェートは、ヌクレオチド三リン酸トランスポーターの作用により細胞に取り込まれ、遺伝子は、遺伝的形質転換により細胞内に存在する（例えば導入した）。例えば、ｓ細胞内に維持された核酸への組込みが起こると、ｄ５ＳＩＣＳおよびｄＮａＭは、例えばｄ５ＳＩＣＳおよびｄＮａＭを含む生命維持培地内で増殖する場合、生物のＤＮＡ複製機構により安定して増殖することができる安定した非天然塩基対を形成することができる。
【００８８】
いくつかの場合、細胞は、非天然核酸の複製が可能である。このような方法は、それぞれのトリホスフェートとして、１つまたはそれ以上の非天然ヌクレオチドを細胞にインビボ条件下で輸送することが可能なヌクレオチド三リン酸トランスポーターをコードする発現カセットで細胞を遺伝的に形質転換することを含むことができる。あるいは、コードされたヌクレオチド三リン酸トランスポーターを発現することができる発現カセットで、以前、遺伝的に形質転換させた細胞を利用することができる。方法はまた、細胞の増殖および複製に好適な生命維持培地内で、遺伝的に形質転換させた細胞を、リン酸カリウムおよび少なくとも１つの非天然ヌクレオチド（例えば、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成することが可能な２つの相互塩基対合ヌクレオチド）のそれぞれのトリホスフェート形態に接触または曝露することを含むこと、ならびに、インビボ条件下で、細胞の少なくとも１つの複製サイクルを通して、少なくとも１つの非天然ヌクレオチド（例えば、非天然塩基対（ＵＢＰ）を形成することが可能な２つの相互塩基対合ヌクレオチド）のそれぞれのトリホスフェート形態の存在下で、生命維持培地内に形質転換させた細胞を維持することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、細胞は、安定して組み込まれた非天然核酸を含む。いくつかの実施形態は、細胞内に維持された核酸でのＡ、Ｇ、Ｔ、およびＣ以外のヌクレオチドを安定して組み込む細胞（例えば大腸菌として）を含む。例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、およびＣ以外のヌクレオチドは、ｄ５ＳＩＣＳ、ｄＮａＭ、およびｄＴＰＴ３であり得、細胞の核酸への組込みが起こると、核酸内に安定した非天然塩基対を形成することができる。一態様では、非天然ヌクレオチドおよび非天然塩基対は、三リン酸トランスポーターに対して遺伝子で形質転換された生物が、リン酸カリウムおよびｄ５ＳＩＣＳ、ｄＮａＭ、およびｄＴＰＴ３のトリホスフェート形態を含む、生命維持培地内で成長する場合、生物の複製装置により安定して増殖することができる。
【００９０】
いくつかの場合、細胞は、拡張した遺伝アルファベットを含む。細胞は、安定して組み込まれた非天然核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、拡張した遺伝アルファベットを有する細胞は、別の核酸、例えば天然または非天然核酸と塩基対（ｂｐ）を形成することができる非天然核酸を含む。いくつかの実施形態では、拡張した遺伝アルファベットを有する細胞は、別の核酸に水素結合している非天然核酸を含む。いくつかの実施形態では、拡張した遺伝アルファベットを有する細胞は、塩基対形成された別の核酸に水素結合していない非天然核酸を含む。いくつかの実施形態では、拡張した遺伝アルファベットを有する細胞は、疎水性相互作用を介して別の核酸に塩基対形成する非天然核酸を含む。いくつかの実施形態では、拡張した遺伝アルファベットを有する細胞は、非水素結合性相互作用を介して別の核酸に塩基対形成する非天然核酸を含む。拡張した遺伝アルファベットを有する細胞は、異種核酸をコピーして、非天然核酸を含む核酸を形成することができる細胞であり得る。拡張した遺伝アルファベットを有する細胞は、別の非天然核酸（非天然核酸塩基対（ＵＢＰ））と塩基対形成された非天然核酸を含む細胞であり得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、非天然ＤＮＡ由来の細胞は、インビボ条件下で、移入された非天然ヌクレオチドから塩基対形成（ＵＢＰ）する。いくつかの実施形態では、リン酸カリウムおよび／またはホスファターゼの阻害剤および／またはヌクレオチダーゼ活性は、非天然核酸の輸送を促進することができる。方法は、異種ヌクレオチド三リン酸トランスポーターを発現する細胞の使用を含む。このような細胞が１つまたはそれ以上のヌクレオチド三リン酸と接触する場合、ヌクレオチド三リン酸は、細胞内に輸送される。細胞は、リン酸カリウムならびに／またはホスファターゼおよびヌクレオチダーゼの阻害剤の存在下であり得る。非天然ヌクレオチド三リン酸は、細胞の自然機構により細胞内の核酸に組み込むことができ、例えば、相互塩基対形成して細胞の核酸内の非天然塩基対を形成することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＵＢＰは、非天然トリホスフェートに曝露する場合、細胞または細胞の集団に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ＵＢＰは、実質的に一貫して、非天然トリホスフェートに曝露する場合、細胞または細胞の集団に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、ＵＢＰの複製により、実質的な成長速度の低下をもたらさない。いくつかの実施形態では、異種タンパク質の複製発現、例えばヌクレオチド三リン酸の輸送により、実質的な成長速度の低下をもたらさない。
【００９３】
いくつかの実施形態では、細胞内の異種遺伝子、例えばＮＴＴの発現の誘導により、異種遺伝子の発現の誘導を伴わない細胞の増殖および取り込みと比較して、より遅い細胞増殖、および非天然核酸の高い取り込みをもたらすことができる。いくつかの実施形態では、細胞内の異種遺伝子、例えばＮＴＴの発現の誘導により、異種遺伝子の発現の誘導を伴わない細胞の増殖および取り込みと比較して、増大した細胞増殖、および非天然核酸の高い取り込みをもたらすことができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＵＢＰは、対数増殖期の間に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＵＢＰは、非対数増殖期の間に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＵＢＰは、実質的に線形増殖期の間に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＵＢＰは、期間にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定して組み込まれる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、もしくは５０、またはそれ以上の複製にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定して組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間の増殖後、細胞または細胞の集団に安定して組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定して組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２か月の増殖後、細胞または細胞の集団に安定して組み込むことができる。例えば、ＵＢＰは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０年の増殖にわたって増殖した後、細胞または細胞の集団に安定して組み込むことができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載のポリメラーゼをさらに利用して、１つまたはそれ以上の非天然核酸塩基を含む変異コドンを含有する変異ｍＲＮＡを生成する。いくつかの例では、細胞は、本明細書に開示されるポリメラーゼをさらに利用して、１つまたはそれ以上の非天然核酸塩基を含む変異アンチコドンを含有する変異ｔＲＮＡを生成する。いくつかの例では、変異アンチコドンは、非天然核酸を表す。いくつかの例では、変異ｔＲＮＡのアンチコドンは、合成への翻訳の間に変異ｍＲＮＡのコドンと、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を対形成する。
【００９６】
本明細書で使用される場合、アミノ酸残基とは、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子を指すことができる。好適なアミノ酸として、限定されないが、天然に存在するアミノ酸のＤ−およびＬ−異性体の両方、ならびに有機合成または他の代謝経路により調製される天然に存在しないアミノ酸が挙げられる。用語アミノ酸は、本明細書で使用される場合、限定されないが、α−アミノ酸、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体を含む。
【００９７】
用語「α−アミノ酸」とは、α−炭素を示す炭素と結合したアミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子を指すことができる。
【００９８】
用語「β−アミノ酸」とは、β立体配置におけるアミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子を指すことができる。
【００９９】
「天然に存在するアミノ酸」とは、天然で合成されるペプチド中で通常見出される１２個のアミノ酸のいずれか１つを指すことができ、１文字略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶで知られている。
【０１００】
以下の表は、天然アミノ酸の特性の概要を示す。
【０１０１】
【表１】
2021508466.tif 000023
【０１０２】
「疎水性アミノ酸」は、小型疎水性アミノ酸および大型疎水性アミノ酸を含む。「小型疎水性アミノ酸」は、グリシン、アラニン、プロリン、およびそれらの類似体であり得る。「大型疎水性アミノ酸」は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびそれらの類似体であり得る。「極性アミノ酸」は、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、およびそれらの類似体であり得る。「荷電アミノ酸」は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパルテート、グルタメート、およびそれらの類似体であり得る。
【０１０３】
「アミノ酸類似体」は、構造的にアミノ酸と類似し、ペプチド模倣大環状分子の形成においてアミノ酸と置換される分子であり得る。アミノ酸類似体は、限定されないが、β−アミノ酸およびアミノ酸を含み、アミノまたはカルボキシ基は、類似の反応性基により置換される（例えば、第二級もしくは第三級アミンによる第一級アミンの置換、またはエステルによるカルボキシ基の置換）。
【０１０４】
「非天然アミノ酸」とは、天然で合成されるペプチド中で通常見出される２０個のアミノ酸の１つではないアミノ酸であり得、１文字略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶで知られている。
【０１０５】
アミノ酸類似体は、β−アミノ酸類似体を含むことができる。β−アミノ酸類似体の例として、限定されないが、環式β−アミノ酸類似体；β−アラニン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；（Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フリル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｒ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フリル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフェニ��）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｓ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−カルボン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−カルボン酸；３−アミノ−３−（２−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（２−チエニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（３−ブロモフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−メトキシフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−アミノアジピン酸；Ｄ−β−フェニルアラニン；β−ロイシン；Ｌ−β−ホモアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモイソロイシン；Ｌ−β−ホモロイシン；Ｌ−β−ホモメチオニン；Ｌ−β−ホモフェニルアラニン；Ｌ−β−ホモプロリン；Ｌ−β−ホモトリプトファン；Ｌ−β−ホモバリン；Ｌ−Ｎω−ベンジルオキシカルボニル−β−ホモリシン；Ｎω−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモヒドロキシプロリン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモスレオニン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモチロシン；γ−トリチル−Ｌ−β−ホモアスパラギン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−Ｎω−β−ホモリジン；Ｎδ−トリチル−Ｌ−β−ホモグルタミン；Ｎω−２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモヒドロキシ−プロリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモスレオニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモチロシン；２−アミノシクロペンタンカルボン酸；および２−アミノシクロヘキサンカルボン酸が挙げられる。
【０１０６】
アミノ酸類似体は、アラニン、バリン、グリシン、またはロイシンの類似体を含むことができる。アラニン、バリン、グリシン、およびロイシンのアミノ酸類似体の例として、限定されないが、α−メトキシグリシン；α−アリル−Ｌ−アラニン；α−アミノイソ酪酸；α−メチル−ロイシン；β−（１−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｄ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−クロロ−Ｌ−アラニン；β−シアノ−Ｌ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｄ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｌ−アラニン；β−シクロペンテン−１−イル−アラニン；β−シクロペンチル−アラニン；β−シクロプロピル−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；β−ｔ−ブチル−Ｄ−アラニン；β−ｔ−ブチル−Ｌ−アラニン；γ−アミノ酪酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジニトロ−フェニルグリシン；２，５−ジヒドロ−Ｄ−フェニルグリシン；２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸；２−フルオロ−フェニルグリシン；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−フルオロ−バリン；４，４，４−トリフルオロ−バリン；４，５−デヒドロ−Ｌ−ｌｅｕ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；４−フルオロ−Ｄ−フェニルグリシン；４−フルオロ−Ｌ−フェニルグリシン；４−ヒドロキシ−Ｄ−フェニルグリシン；５，５，５−トリフルオロ−ロイシン；６−アミノヘキサン酸；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｄ−α−アミノ酪酸；Ｄ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｄ−（２−チエニル）グリシン；Ｄ−（３−チエニル）グリシン；Ｄ−２−アミノカプロン酸；Ｄ−２−インダニルグリシン；Ｄ−アリルグリシン−ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−シクロヘキシルグリシン；Ｄ−ノルバリン；Ｄ−フェニルグリシン；β−アミノ酪酸；β−アミノイソ酪酸；（２−ブロモフェニル）グリシン；（２−メトキシフェニル）グリシン；（２−メチルフェニル）グリシン；（２−チアゾイル）グリシン；（２−チエニル）グリシン；２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｌ−α−アミノ酪酸；Ｌ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｌ−（３−チエニル）グリシン；Ｌ−２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−２−アミノカプロン酸ジシクロヘキシル−アンモニウム塩；Ｌ−２−インダニルグリシン；Ｌ−アリルグリシン．ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｌ−シクロヘキシルグリシン；Ｌ−フェニルグリシン；Ｌ−プロパルギルグリシン；Ｌ−ノルバリン；Ｎ−α−アミノメチル−Ｌ−アラニン；Ｄ−α，γ���ジアミノ酪酸；Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；β−シクロプロピル−Ｌ−アラニン；（Ｎ−β−（２，４−ジニトロフェニル））−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−メチルトリチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；４，５−デヒドロ−Ｌ−ロイシン；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｄ−アリルグリシン；Ｄ−ホモシクロヘキシルアラニン；Ｌ−１−ピレニルアラニン；Ｌ−２−アミノカプロン酸；Ｌ−アリルグリシン；Ｌ−ホモシクロヘキシルアラニン；およびＮ−（２−ヒドロキシ−４−メトキシ−Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ−ＯＨが挙げられる。
【０１０７】
アミノ酸類似体は、アルギニンまたはリジンの類似体を含むことができる。アルギニンおよびリジンのアミノ酸類似体の例として、限定されないが、シトルリン；Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸；Ｌ−２−アミノ−３−ウレイドプロピオン酸；Ｌ−シトルリン；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＯＨ；Ｎδ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−オルニチン；Ｎω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン；α−メチル−オルニチン；２，６−ジアミノヘプタン二酸；Ｌ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキセ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキセ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−オルニチン；（Ｎδ−４−メチルトリチル）−Ｄ−オルニチン；（Ｎδ−４−メチルトリチル）−Ｌ−オルニチン；Ｄ−オルニチン；Ｌ−オルニチン；Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（非対称的）；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（対称的）；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ．ＨＣｌ；Ｌｙｓ（Ｍｅ３）−ＯＨクロリド；Ｎω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；およびＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンが挙げられる。
【０１０８】
アミノ酸類似体は、アスパラギン酸またはグルタミン酸の類似体を含むことができる。アスパラギン酸およびグルタミン酸のアミノ酸類似体の例として、限定されないが、α−メチル−Ｄ−アスパラギン酸；α−メチル−グルタミン酸；α−メチル−Ｌ−アスパラギン酸；γ−メチレン−グルタミン酸；（Ｎ−γ−エチル）−Ｌ−グルタミン；［Ｎ−α−（４−アミノベンゾイル）］−Ｌ−グルタミン酸；２，６−ジアミノピメリン酸；Ｌ−α−アミノスベリン酸；Ｄ−２−アミノアジピン酸；Ｄ−α−アミノスベリン酸；α−アミノピメリン酸；イミノ二酢酸；Ｌ−２−アミノアジピン酸；スレオ−β−メチル−アスパラギン酸；γ−カルボキシ−Ｄ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；γ−カルボキシ−Ｌ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ；Ｌ−Ａｓｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；およびピログルタミン酸が挙げられる。
【０１０９】
アミノ酸類似体は、システインおよびメチオニンの類似体を含むことができる。システインおよびメチオニンのアミノ酸類似体の例として、限定されないが、Ｃｙｓ（ファルネシル）−ＯＨ、Ｃｙｓ（ファルネシル）−ＯＭｅ、α−メチル−メチオニン、Ｃｙｓ（２−ヒドロキシエチル）−ＯＨ、Ｃｙｓ（３−アミノプロピル）−ＯＨ、２−アミノ−４−（エチルチオ）酪酸、ブチオニン、ブチオニンスルホキシミン、エチオニン、メチオニンメチルスルホニウムクロリド、セレノメチオニン、システイン酸、［２−（４−ピリジル）エチル］−ＤＬ−ペニシラミン、［２−（４−ピリジル）エチル］−Ｌ−システイン、４−メトキシベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メトキシベンジル−Ｌ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｌ−ペニシラミン、ベンジル−Ｄ−システイン、ベンジル−Ｌ−システイン、ベンジル−ＤＬ−ホモシステイン、カルバモイル−Ｌ−システイン、カルボキシエチル−Ｌ−システイン、カルボキシメチル−Ｌ−システイン、ジフェニルメチル−Ｌ−システイン、エチル−Ｌ−システイン、メチル−Ｌ−システイン、ｔ−ブチル−Ｄ−システイン、トリチル−Ｌ−ホモシステイン、トリチル−Ｄ−ペニシラミン、シスタチオニン、ホモシスチン、Ｌ−ホモシスチン、（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、セレノ−Ｌ−シスチン、シスタチオニン、Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ、およびアセトアミドメチル−Ｄ−ペニシラミンが挙げられる。
【０１１０】
アミノ酸類似体は、フェニルアラニンおよびチロシンの類似体を含むことができる。フェニルアラニンおよびチロシンのアミノ酸類似体の例として、β−メチル−フェニルアラニン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、α−メチル−３−メトキシ−ＤＬ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、２，４−ジクロロ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、２−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、２−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、２；４；５−トリヒドロキシ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジメトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン、３，５−ジヨード−Ｄ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−チロシン、３−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−フルオロ−チロシン、３−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−メトキシ−Ｌ−チロシン、３−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、４−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、４−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｄ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ビス（２−クロロエチル）アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、４−フ��オロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、チロキシン、３，３−ジフェニルアラニン、チロニン、エチル−チロシン、およびメチル−チロシンが挙げられる。
【０１１１】
アミノ酸類似体は、プロリンの類似体を含むことができる。プロリンのアミノ酸類似体の例として、限定されないが、３，４−デヒドロ−プロリン、４−フルオロ−プロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシ−プロリン、チアゾリジン−２−カルボン酸、およびｔｒａｎｓ−４−フルオロ−プロリンが挙げられる。
【０１１２】
アミノ酸類似体は、セリンおよびスレオニンの類似体を含むことができる。セリンおよびスレオニンのアミノ酸類似体の例として、限定されないが、３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸、２−アミノ−３−エトキシブタン酸、２−アミノ−３−メトキシブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−エトキシプロピオン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、およびα−メチルセリンが挙げられる。
【０１１３】
アミノ酸類似体は、トリプトファンの類似体を含むことができる。トリプトファンのアミノ酸類似体の例として、限定されないが、α−メチル−トリプトファン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；１−メチル−トリプトファン；４−メチル−トリプトファン；５−ベンジルオキシ−トリプトファン；５−ブロモ−トリプトファン；５−クロロ−トリプトファン；５−フルオロ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メトキシ−トリプトファン；５−メトキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メチル−トリプトファン；６−ブロモ−トリプトファン；６−クロロ−Ｄ−トリプトファン；６−クロロ−トリプトファン；６−フルオロ−トリプトファン；６−メチル−トリプトファン；７−ベンジルオキシ−トリプトファン；７−ブロモ−トリプトファン；７−メチル−トリプトファン；Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−１−カルボン酸；７−アザトリプトファン；Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；５−メトキシ−２−メチル−トリプトファン；および６−クロロ−Ｌ−トリプトファンが挙げられる。
【０１１４】
アミノ酸類似体は、ラセミ体であり得る。いくつかの例では、アミノ酸類似体のＤ異性体を使用する。いくつかの場合、アミノ酸類似体のＬ異性体を使用する。いくつかの例では、アミノ酸類似体は、ＲまたはＳ立体配置にあるキラル中心を含む。ときに、β−アミノ酸類似体のアミノ基は、保護基、例えばｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トシルなどで置換される。ときに、β−アミノ酸類似体のカルボン酸官能基は、例えばそのエステル誘導体として保護される。いくつかの場合、アミノ酸類似体の塩を使用する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｌｉｕ  Ｃ．Ｃ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０年、７９、４１３頁に記載の非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｎ６（２−アジドエトキシ）−カルボニル−Ｌ−リジンを含む。
【０１１６】
細胞型
一部の実施形態では、多くのタイプの細胞／微生物が、例えば形質転換または遺伝子操作するために使用される。一部の実施形態では、細胞は、原核または真核細胞である。ある場合には、細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母、または単細胞原虫などの微生物である。その他の場合には、細胞が、培養動物、植物、またはヒト細胞などの真核細胞である。さらなる場合には、細胞は、植物または動物などの生物中に存在する。
【０１１７】
一部の実施形態では、操作された微生物は、分裂し増殖することがしばしば可能な単細胞生物である。微生物には、下記の形体：好気性菌、嫌気性菌、糸状菌、非糸状菌、一倍体、二倍体、栄養要求体、および／または非栄養要求体の１種またはそれ以上を含めることができる。ある特定の実施形態では、操作された微生物が原核微生物（例えば、細菌）であり、ある特定の実施形態では、操作された微生物が非原核微生物である。一部の実施形態では、操作された微生物が真核微生物（例えば、酵母、真菌、アメーバ）である。一部の実施形態では、操作された微生物が真菌である。一部の実施形態では、操作された生物が酵母である。
【０１１８】
任意の適切な酵母は、宿主微生物、操作された微生物、遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ）された生物、または異種もしくは改変ポリヌクレオチドの供給源として選択される。酵母には、限定するものではないが、ヤロウイア酵母（例えば、Ｙ．リポリチカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダリポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類された））、カンジダ酵母（例えば、Ｃ．レブカウフィ（Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．ヴィスワナティイ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、Ｃ．プルチェリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ））、ロドトルラ酵母（例えば、Ｒ．グルティヌス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ））、ロドスポリジウム酵母（例えば、Ｒ．トルロイデス（Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ））、サッカロマイセス酵母（例えば、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．バイアナス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、Ｓ．パストリアナス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、Ｓ．カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ））、クリプトコッカス酵母、トリコスポロン酵母（例えば、Ｔ．プランス（Ｔ．ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．キュタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ピチア酵母（例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））、およびリポマイセス酵母（例えば、Ｌ．スタルケイイ（Ｌ．ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェルス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ））が含まれる。一部の実施形態では、適切な酵母は、アラキニオタス（Ａｒａｃｈｎｉｏｔｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、アウキサウトロン（Ａｕｘａｒｔｈｒｏｎ）、ブラストマイセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｉｍ）、クリソスポリウム・デバリオマイセス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｉｍ  Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、コッキジオーデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジムノアスカス（Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、イッサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、リポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）、ルッサチェンキア（Ｌｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、ミクロスポルム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、ミクソトリクム（Ｍｙｘｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ミクソザイマ（Ｍｙｘｏｚｙｍａ）、オイジオデンドロン（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ）、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スキゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スコプラリオプシス（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ）、セペドニウム（Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属のものである。一部の実施形態では、適切な酵母は、アラキニオタス・フラボルテウス（Ａｒａｃｈｎｉｏｔｕｓ  ｆｌａｖｏｌｕｔｅｕｓ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、アルキサルスロン・タクステリ（Ａｕｘａｒｔｈｒｏｎ  ｔｈａｘｔｅｒｉ）、ブラストマイセス・デルマティティジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・ファマタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンジイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ラムビカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌａｍｂｉｃａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・ルスチタニアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｔｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・ビスワナティイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、カンジダ・キセストビイイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｘｅｓｔｏｂｉｉ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｉｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、コッキジオーデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、クリプトコッカス・アルビダス・ヴァー．ジフルエンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｉｄｕｓ  ｖａｒ．ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、クリプトコッカス・ラウレンティイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｍａｎｓ）、デバリオマイセス・ハンセニイイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ギムノアスカス・ダグワイエンシス（Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓ  ｄｕｇｗａｙｅｎｓｉｓ）、ハンセヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ）、ヒストプラズマ・カプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、イッサチェンキア・オクチデンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、イスタチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓｔａｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒ���ｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クルイベロマイセス・ワルティイ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗａｌｔｉｉ）、リポマイセス・リポフェルス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、リポマイセス・スタルケイイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、ミクロスポラム・ジプセウム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、ミクソトリクム・デフレキサム（Ｍｙｘｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｄｅｆｌｅｘｕｍ）、オイジオデンドロン・エキヌラタム（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ）、パキソレン・タンノフィリス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ  ｔａｎｎｏｐｈｉｌｉｓ）、ペニシリウム・ノタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）、ピチア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、スキゾサッカロマイセス・ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、スコプラリオプシス・アクレモニウム（Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ  ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、セプドニウム・クリソスペルマム（Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｍ）、トリコスポロン・キュタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、またはヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリチカとして分類された）種のものである。一部の実施形態では、酵母は、ＡＴＣＣ２０３６２、ＡＴＣＣ８８６２、ＡＴＣＣ１８９４４、ＡＴＣＣ２０２２８、ＡＴＣＣ７６９８２、およびＬＧＡＭ  Ｓ（７）１株を含むがこれらに限定されないＹ．リポリチカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．およびＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９（２００２））。ある特定の実施形態では、酵母がカンジダ種（即ち、カンジダｓｐｐ．）酵母である。任意の適切なカンジダ種は、脂肪ジカルボン酸（例えば、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、エイコサン二酸）を生成するために、使用しおよび／または遺伝子改変することができる。一部の実施形態では、適切なカンジダ種には、限定するものではないが本明細書に記述されるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉ���ａｎｓ）、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・ファマタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｆａｍａｔａ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ギリエルモンディイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ラムビカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌａｍｂｉｃａ）、カンジダ・リポリチカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・ルスチタニアエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｔｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・プルチェリマ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、カンジダ・ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・ビスワナティイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、カンジダ・キセストビイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｘｅｓｔｏｂｉｉ）、および任意のその他のカンジダ種酵母が含まれる。カンジダ種株の非限定的な例には、限定するものではないがｓＡＡ００１（ＡＴＣＣ２０３３６）、ｓＡＡ００２（ＡＴＣＣ２０９１３）、ｓＡＡ００３（ＡＴＣＣ２０９６２）、ｓＡＡ４９６（ＵＳ２０１２／００７７２５２）、ｓＡＡ１０６（ＵＳ２０１２／００７７２５２）、ＳＵ−２（ｕｒａ３−／ｕｒａ３−）、Ｈ５３４３（ベータ酸化遮断；米国特許第５６４８２４７号）株が含まれる。カンジダ種酵母からの任意の適切な株が、遺伝子改変のための親株として利用される。
【０１１９】
酵母属、種、および株は、区別し、分類し、かつ／または名付けることが難しくなる可能性がある遺伝物質に、しばしば非常に密接に関係している。ある場合には、Ｃ．リポリチカ（Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびＹ．リポリチカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株は、区別し、分類し、かつ／または名付けるのが難しくなる可能性があり、場合によっては、同じ生物と見なされる可能性がある。ある場合には、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびＣ．ビスワナティイ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）の様々な株を区別し、分類し、かつ／または名付けることが難しくなる可能性がある（例えば、Ａｒｉｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４６、２５７〜２６２（２０００）参照）。ＡＴＣＣからならびにその他の商用のまたはアカデミックな供給元から得られたいくつかのＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびＣ．ビスワナティイ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）株は、均等であり、かつ本明細書に記述される実施形態に等しく適切であると見なすことができる。一部の実施形態では、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびＣ．ビスワナティイ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）のいくつかの親株は、名称のみが異なると見なされる。
【０１２０】
任意の適切な真菌は、宿主微生物、操作された微生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として選択される。真菌の非限定的な例には、限定するものではないがアスペルキルス真菌（例えば、Ａ．パラシティカス（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、Ａ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））、トラウストキトリウム真菌、スキゾキトリウム真菌、およびリゾプス真菌（例えば、Ｒ．アリザス（Ｒ．ａｒｒｈｉｚｕｓ）、Ｒ．オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｒ．ニグリカンス（Ｒ．ｎｉｇｒｉｃａｎｓ））が含まれる。一部の実施形態では、真菌は、株ＡＴＣＣ２４６９０を含むがこれに限定されないＡ．パラシティカス（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）株であり、ある特定の実施形態では、真菌は、株ＡＴＣＣ３８１６３を含むがこれに限定されないＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）株である。
【０１２１】
任意の適切な原核生物は、宿主微生物、操作された微生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として選択される。グラム陰性またはグラム陽性菌が選択される。細菌の例には、限定するものではないがバシラス細菌（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ））、アシネトバクター細菌、ノルカルディア細菌、キサントバクター細菌、セスケリキア細菌（例えば、大腸菌（例えば、株ＤＨ１０Ｂ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５−アルファ、ＤＢ３、ＤＢ３．１）、ＤＢ４、ＤＢ５、ＪＤＰ６８２、およびｃｃｄＡ−ｏｖｅｒ（例えば、米国出願第０９／５１８，１８８号）））、ストレプトマイセス細菌、エルウィニア細菌、クレブシエラ細菌、セラチア細菌（例えば、Ｓ．マルセッサンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ））、シュードモナス細菌（例えば、Ｐ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、サルモネラ細菌（例えば、Ｓ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓ．ティフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ））、メガスファエラ細菌（例えば、メガスファエラ・エルスデニイイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ））が含まれる。細菌には、限定するものではないが光合成細菌（例えば、緑色非硫黄細菌（例えば、クロロフレキサス細菌（例えば、Ｃ．アウランティアカス（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ））、クロロネマ細菌（例えば、Ｃ．ギガテウム（Ｃ．ｇｉｇａｔｅｕｍ））、緑色硫黄細菌（例えば、クロロビウム細菌（例えば、Ｃ．リミコラ（Ｃ．ｌｉｍｉｃｏｌａ））、ペロディクチオン細菌（例えば、Ｐ．ルテオラム（Ｐ．ｌｕｔｅｏｌｕｍ））、紫硫黄細菌（例えば、クロマチウム細菌（例えば、Ｃ．オケニイ（Ｃ．ｏｋｅｎｉｉ）））、および紫非硫黄細菌（例えば、ロドスピリラム細菌（例えば、Ｒ．ルブラム（Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ））、ロドバクター細菌（例えば、Ｒ．スファエロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｒ．カプシュラタス（Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ））、およびロドミクロビウム細菌（例えば、Ｒ．バネリイ（Ｒ．ｖａｎｅｌｌｉｉ））も含まれる。
【０１２２】
非微生物からの細胞は、宿主微生物、操作された微生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として利用することができる。そのような細胞の例には、限定するものではないが昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（例えば、Ｄ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、スポドプテラ（例えば、Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）、およびトリコプルサ（例えば、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）；線虫細胞（例えば、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）細胞）；トリ細胞；両生類細胞（例えば、キセノパス・ラエビス細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ細胞））；爬虫類細胞；哺乳類細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、Ｃ１２７、ＢＨＫ、Ｐｅｒ−Ｃ６、Ｂｏｗｅｓメラノーマ、およびＨｅＬａ細胞）；および植物細胞（例えば、シロイヌナズナ、タバコ、クフェア・アシニフォリア（Ｃｕｐｈｅａ  ａｃｉｎｉｆｏｌｉａ）、クフェア・アエキペタラ（Ｃｕｐｈｅａ  ａｅｑｕｉｐｅｔａｌａ）、クフェア・アングスチフォリア（Ｃｕｐｈｅａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、クフェア・アペンディキュラタ（Ｃｕｐｈｅａ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔａ）、クフェア・アビゲラ（Ｃｕｐｈｅａ  ａｖｉｇｅｒａ）、クフェア・アビゲラ・バー．プルチェリマ（Ｃｕｐｈｅａ  ａｖｉｇｅｒａ  ｖａｒ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、クフェア・アキシリフロラ（Ｃｕｐｈｅａ  ａｘｉｌｌｉｆｌｏｒａ）、クフェア・バヒエンシス（Ｃｕｐｈｅａ  ｂａｈｉｅｎｓｉｓ）、クフェア・バイロニス（Ｃｕｐｈｅａ  ｂａｉｌｌｏｎｉｓ）、クフェア・ブラキポダ（Ｃｕｐｈｅａ  ｂｒａｃｈｙｐｏｄａ）、クフェア・ブスタマンタ（Ｃｕｐｈｅａ  ｂｕｓｔａｍａｎｔａ）、クフェア・カルカラタ（Ｃｕｐｈｅａ  ｃａｌｃａｒａｔａ）、クフェア・カロフィラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ）、クフェア・カロフィラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ）ｓｕｂｓｐ．メソステモン（ｍｅｓｏｓｔｅｍｏｎ）、クフェア・カルサゲネシス（Ｃｕｐｈｅａ  ｃａｒｔｈａｇｅｎｅｎｓｉｓ）、クフェア・サーカエオイデス（Ｃｕｐｈｅａ  ｃｉｒｃａｅｏｉｄｅｓ）、クフェア・コンフェルチフローラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｃｏｎｆｅｒｔｉｆｌｏｒａ）、クフェア・コルダタ（Ｃｕｐｈｅａ  ｃｏｒｄａｔａ）、クフェア・クラシフローラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｃｒａｓｓｉｆｌｏｒａ）、クフェア・シアネア（Ｃｕｐｈｅａ  ｃｙａｎｅａ）、クフェア・デカンドラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｄｅｃａｎｄｒａ）、クフェア・デンティキュラタ（Ｃｕｐｈｅａ  ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔａ）、クフェア・ジスペルマ（Ｃｕｐｈｅａ  ｄｉｓｐｅｒｍａ）、クフェア・エピロビイフォリア（Ｃｕｐｈｅａ  ｅｐｉｌｏｂｉｉｆｏｌｉａ）、クフェア・エリコイデス（Ｃｕｐｈｅａ  ｅｒｉｃｏｉｄｅｓ）、クフェア・フラヴァ（Ｃｕｐｈｅａ  ｆｌａｖａ）、クフェア・フラビセツラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｆｌａｖｉｓｅｔｕｌａ）、クフェア・フクシイフォリア（Ｃｕｐｈｅａ  ｆｕｃｈｓｉｉｆｏｌｉａ）、クフェア・ガウメリ（Ｃｕｐｈｅａ  ｇａｕｍｅｒｉ）、クフェア・グルチノサ（Ｃｕｐｈｅａ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）、クフェア・ヘテロフィラ（Ｃｕｐｈｅ��  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、クフェア・フーケリアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ）、クフェア・ヒッソピフォリア（Ｃｕｐｈｅａ  ｈｙｓｓｏｐｉｆｏｌｉａ）（メキシコハナヤナギ）、クフェア・ヒッソポイデス、クフェア・イグネア（Ｃｕｐｈｅａ  ｉｇｎｅａ）、クフェア・イングラタ（Ｃｕｐｈｅａ  ｉｎｇｒａｔａ）、クフェア・ジョルレンシス（Ｃｕｐｈｅａ  ｊｏｒｕｌｌｅｎｓｉｓ）、クフェア・ランセオラタ（Ｃｕｐｈｅａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）、クフェア・リナリオイデス（Ｃｕｐｈｅａ  ｌｉｎａｒｉｏｉｄｅｓ）、クフェア・ラベア（Ｃｕｐｈｅａ  ｌｌａｖｅａ）、クフェア・ロフォストマ（Ｃｕｐｈｅａ  ｌｏｐｈｏｓｔｏｍａ）、クフェア・ルテア（Ｃｕｐｈｅａ  ｌｕｔｅａ）、クフェア・ルテセンス（Ｃｕｐｈｅａ  ｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）、クフェア・メラニウム（Ｃｕｐｈｅａ  ｍｅｌａｎｉｕｍ）、クフェア・メルビラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｍｅｌｖｉｌｌａ）、クフェア・ミクランタ（Ｃｕｐｈｅａ  ｍｉｃｒａｎｔｈａ）、クフェア・ミクロペタラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｍｉｃｒｏｐｅｔａｌａ）、クフェア・ミムロイデス（Ｃｕｐｈｅａ  ｍｉｍｕｌｏｉｄｅｓ）、クフェア・ニチデュラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｎｉｔｉｄｕｌａ）、クフェア・パルストリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、クフェア・パルソンシア（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｒｓｏｎｓｉａ）、クフェア・パスキュオルム（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｓｃｕｏｒｕｍ）、クフェア・パウシペタラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｐａｕｃｉｐｅｔａｌａ）、クフェア・プロキュムベンス（Ｃｕｐｈｅａ  ｐｒｏｃｕｍｂｅｎｓ）、クフェア・シュードシレン（Ｃｕｐｈｅａ  ｐｓｅｕｄｏｓｉｌｅｎｅ）、クフェア・シュードヴァシニウム（Ｃｕｐｈｅａ  ｐｓｅｕｄｏｖａｃｃｉｎｉｕｍ）、クフェア・プルクラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｐｕｌｃｈｒａ）、クフェア・ラセモサ（Ｃｕｐｈｅａ  ｒａｃｅｍｏｓａ）、クフェア・レペンス（Ｃｕｐｈｅａ  ｒｅｐｅｎｓ）、クフェア・サリシフォリア（Ｃｕｐｈｅａ  ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉａ）、クフェア・サルバドレンシス（Ｃｕｐｈｅａ  ｓａｌｖａｄｏｒｅｎｓｉｓ）、クフェア・シュマンニイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｃｈｕｍａｎｎｉｉ）、クフェア・セッシリフローラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｅｓｓｉｌｉｆｌｏｒａ）、クフェア・セッシリフォリア（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉａ）、クフェア・セトサ（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｅｔｏｓａ）、クフェア・スペクタビリス（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ）、クフェア・スペルマコス（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｐｅｒｍａｃｏｃｅ）、クフェア・スプレンディダ（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｐｌｅｎｄｉｄａ）、クフェア・スプレンディダ・バー．ビリディフラバ（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｐｌｅｎｄｉｄａ  ｖａｒ．ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）、クフェア・ストリグロサ（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｔｒｉｇｕｌｏｓａ）、クフェア・スブリゲラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｓｕｂｕｌｉｇｅｒａ）、クフェア・テレアンドラ（Ｃｕｐｈｅａ  ｔｅｌｅａｎｄｒａ）、クフェア・サイモイデス（Ｃｕｐｈｅａ  ｔｈｙｍｏｉｄｅｓ）、クフェア・トルカナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｔｏｌｕｃａｎａ）、クフェア・ウレンス（Ｃｕｐｈｅａ  ｕｒｅｎｓ）、クフェア・ウトリキュロサ（Ｃｕｐｈ��ａ  ｕｔｒｉｃｕｌｏｓａ）、クフェア・ビスコシッシマ（Ｃｕｐｈｅａ  ｖｉｓｃｏｓｉｓｓｉｍａ）、クフェア・ワトソニアナ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗａｔｓｏｎｉａｎａ）、クフェア・ウライティイ（Ｃｕｐｈｅａ  ｗｒｉｇｈｔｉｉ）、クフェア・ランセオラタ（Ｃｕｐｈｅａ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ））が含まれる。
【０１２３】
宿主生物、または異種ポリヌクレオチドの供給源として使用される、微生物または細胞は、市販されている。本明細書に記述される微生物および細胞と、その他の適切な微生物および細胞は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ；Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）から入手可能である。宿主微生物および操作された微生物は、任意の適切な形態で提供される。例えばそのような微生物は、初代培養物とされまたは１回もしくはそれ以上の回数で継代されている（例えば、希釈されたおよび培養された）、液体培養物または固体培養物（例えば、寒天をベースにした培地）で提供される。微生物は、凍結形態または乾燥形態（例えば、凍結乾燥された）でも提供される。微生物は、任意の適切な濃度で提供される。
【０１２４】
ポリメラーゼ
ポリメラーゼの特に有用な機能は、鋳型として既存の核酸を使用して、核酸鎖の重合を触媒することである。有用なその他の機能は、本明細書のその他の箇所に記述される。有用なポリメラーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼが含まれる。
【０１２５】
ポリメラーゼの非天然核酸の特異性、加工性、またはその他の特徴を改善する能力は、例えば、増幅、配列決定、標識、検出、クローニング、および多くのその他のものを含む、非天然核酸の組込みが望まれる様々な文脈で、非常に望ましいと考えられる。本発明は、非天然核酸に関して性質が改変されたポリメラーゼ、そのようなポリメラーゼを作製する方法、そのようなポリメラーゼを使用する方法、および下記の完全に検討することで明らかにされる多くのその他の特徴を提供する。
【０１２６】
ある場合には、本明細書に開示されるものには、例えばＤＮＡ増幅中、非天然核酸を成長鋳型コピーに組み込むポリメラーゼが含まれる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ポリメラーゼの活性部位が改変されてその活性部位への非天然核酸の立体進入阻害が低減されるように、改変することができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、非天然核酸の１つまたはそれ以上の非天然の特徴に対する相補性を提供するように、改変することができる。そのようなポリメラーゼは、細胞にＵＢＰを安全に組み込むために、細胞内で発現させまたは操作させることができる。したがって本発明は、異種または組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ポリメラーゼを含む組成物、およびその使用方法を含む。
【０１２７】
ポリメラーゼは、タンパク質工学に関する方法を使用して、改変することができる。例えば分子モデリングは、目標の活性を改変するように変異を作製することができるポリメラーゼの場所を特定するために、結晶構造に基づいて実施することができる。置換のための標的として特定される基は、エネルギー最小化モデリング、ホモロジーモデリング、および／または保存アミノ酸置換、例えばＢｏｒｄｏら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１７：７２１〜７２９（１９９１）およびＨａｙｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ９９：１５９２６〜１５９３１（２００２）に記載されるものを使用して選択される基と置き換えることができる。
【０１２８】
様々なポリメラーゼのいずれかを、本明細書で述べる方法または組成物、例えば生体系から単離されたタンパク質をベースにした酵素およびその機能的バリアントを含むもので、使用することができる。以下に具体化されるものなどの、特定のポリメラーゼの言及は、他に指示しない限り、その機能的バリアントを含むことが理解されよう。一部の実施形態において、ポリメラーゼは野生型ポリメラーゼである。一部の実施形態では、ポリメラーゼは改変されたまたは変異したポリメラーゼである。
【０１２９】
活性部位領域への非天然核酸の進入を改善するための、および活性部位領域で非天然ヌクレオチドと配位するための特徴を持つポリメラーゼを、使用することもできる。一部の実施形態では、改変ポリメラーゼは改変されたヌクレオチド結合部位を有する。
【０１３０】
一部の実施形態では、改変ポリメラーゼは非天然核酸に対して特異性を有し、それは非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、改変された糖を含む非天然核酸に対して特異性を有し、それは天然核酸および／または改変された糖を含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、改変塩基を含む非天然核酸に対して特異性を有し、それは天然核酸および／または改変塩基を含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、トリホスフェートを含む非天然核酸に対して特異性を有し、それはトリホスフェートを含む核酸および／またはトリホスフェートを含まない非天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である。例えば、改変されたまたは野生型ポリメラーゼは、トリホスフェートを含む非天然核酸に対して特異性を有することができ、それはジホスフェートもしくはモノホスフェートを含むまたはホスフェートを含まない非天然核酸、またはこれらの組合せに対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である。
【０１３１】
一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、非天然核酸に対して緩和特異性（ｒｅｌａｘｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有する。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、非天然核酸に対する特異性および天然核酸に対する特異性を有し、それは天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、改変された糖を含む非天然核酸に対する特異性および天然核酸に対する特異性を有し、それは天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、改変塩基を含む非天然核酸に対する特異性および天然核酸に対する特異性を有し、それは天然核酸に対する野生型ポリメラーゼの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である。
【０１３２】
エキソヌクレアーゼ活性が存在しないことは、野生型の特徴とすることができ、またはバリアントもしくは操作されたポリメラーゼによって与えられた特徴とすることができる。例えばｅｘｏマイナスＫｌｅｎｏｗ断片は、３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性に欠けた、Ｋｌｅｎｏｗ断片の変異した形である。
【０１３３】
本発明の方法は、例えば変異を通して、内在性３から５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性に欠けたまたは３から５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性が無効になった、任意のＤＮＡポリメラーゼの基質範囲を拡げるために使用される。ＤＮＡポリメラーゼの例には、ｐｏｌＡ、ｐｏｌＢ（例えば、Ｐａｒｒｅｌ  ＆  Ｌｏｅｂ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ  Ｂｉｏｌ  ２００１参照）、ｐｏｌＣ、ｐｏｌＤ、ｐｏｌＹ、ｐｏｌＸ、および逆転写酵素（ＲＴ）が含まれるが、好ましくは前進的な高忠実度ポリメラーゼ（ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００４６４３）である。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、実質的に３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性に欠ける。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは実質的に、非天然核酸に関して３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性に欠ける。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、天然核酸に関して３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有し、実質的に、非天然核酸に関して３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性に欠ける。
【０１３４】
一部の実施形態では、改変ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。一部の実施形態では、改変ポリメラーゼは、天然核酸に対する野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、非天然核酸に関する３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。一部の実施形態では、改変ポリメラーゼは、天然核酸に対する野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、非天然核酸に対する３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性および天然核酸に関する３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。一部の実施形態では、改変ポリメラーゼは、天然核酸に対する野生型ポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、天然核酸に関する３’から５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。
【０１３５】
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、その核酸からの解離速度によって特徴付けられる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、１種またはそれ以上の天然および非天然核酸に関して比較的低い解離速度を有する。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、１種またはそれ以上の天然および非天然核酸に関して比較的高い解離速度を有する。解離速度は、本明細書で述べられる方法で反応速度を調整するように調整することができる、ポリメラーゼの活性である。
【０１３６】
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、特定の天然および／または非天然核酸あるいは天然および／または非天然核酸の収集物と共に使用される場合、その忠実度によって特徴付けられる。忠実度は一般に、核酸鋳型のコピーを作製するときにポリメラーゼが正しい核酸を成長核酸鎖に組み込む精度を指す。ＤＮＡポリメラーゼ忠実度は、ポリメラーゼ−鎖−鋳型核酸二成分複合体の同じ部位で鎖合成を争うため、天然および非天然核酸が例えば等しい濃度で存在する場合、天然および非天然核酸の正しい組込みと正しくない組込みとの比として測定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ忠実度は、天然および非天然核酸に関する（ｋｃａｔ／Ｋｍ）と、不正確な天然および非天然核酸に関する（ｋｃａｔ／Ｋｍ）との比として計算することができ；式中、ｋｃａｔおよびＫｍは、定常状態酵素動態でのＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎパラメーターである（参照によって組み入れるＦｅｒｓｈｔ，Ａ．Ｒ．（１９８５）  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ、第２版、ｐ．３５０、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性がある、またはない状態で、少なくとも約１００、１０００、１０，０００、１００，０００、または１×１０６の忠実度値を有する。
【０１３７】
一部の実施形態では、自然源からのポリメラーゼまたはそのバリアントを、特定の構造を有する非天然核酸の組込みを検出するアッセイを使用してスクリーニングする。一実施例では、ポリメラーゼは、非天然核酸またはＵＢＰ；例えばｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、またはｄ５ＳＩＣＳＴＰ−ｄＮａＭＴＰ  ＵＢＰを組み込む能力に関してスクリーニングすることができる。ポリメラーゼ、例えば異種ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼと比較して、非天然核酸に関して改質した性質を示すものを、使用することができる。例えば、改質された性質は、例えば、Ｋｍ、ｋｃａｔ、Ｖｍａｘ、非天然核酸（または天然のヌクレオチド）の存在下でのポリメラーゼ加工性、非天然核酸の存在下でのポリメラーゼによる平均鋳型リード長、非天然核酸のポリメラーゼの特異性、非天然核酸の結合速度、生成物（ピロリン酸、三リン酸など）の生成放出速度、分枝速度、またはこれらの任意の組合せとすることができる。一実施形態では、改質された性質は、非天然核酸に関して低減したＫｍおよび／または非天然核酸に関して増大したｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍである。同様に、ポリメラーゼは場合により、野生型ポリメラーゼと比較して、非天然核酸の増大した結合速度、増大した生成物放出速度、および／または低下した分枝速度を有する。
【０１３８】
同時に、ポリメラーゼは、天然核酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴを、成長する核酸コピーに組み込むことができる。例えば、ポリメラーゼは場合により、対応する野生型ポリメラーゼの少なくとも約５％程に高い（例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、またはそれよりも高い）、天然核酸に関する特異的活性と、天然核酸の存在下で野生型ポリメラーゼの少なくとも５％程に高い（例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、またはそれよりも高い）、鋳型の存在下での天然核酸での加工性とを示す。場合により、ポリメラーゼは、野生型のポリメラーゼの少なくとも約５％程に高い（例えば、約５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％、またはそれよりも高い）、天然のヌクレオチドに関するｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍを示す。
【０１３９】
特定の構造の非天然核酸を組み込む能力を有することができる、本明細書で使用されるポリメラーゼは、指向性進化法を使用して生成することもできる。核酸合成アッセイは、様々な非天然核酸のいずれかに関して特異性を有するポリメラーゼバリアントをスクリーニングするのに使用することができる。例えば、ポリメラーゼバリアントは、非天然核酸、またはＵＢＰ；例えばｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、またはｄ５ＳＩＣＳＴＰ−ｄＮａＭＴＰ  ＵＢＰを核酸に組み込む能力に関してスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、そのようなアッセイは、例えば組換えポリメラーゼバリアントを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。一部の実施形態では、そのようなアッセイは、例えば細胞内でポリメラーゼバリアントを発現するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイである。そのような指向性進化法は、本明細書で述べる非天然核酸のいずれかに対する活性に関して、任意の適切なポリメラーゼのバリアントをスクリーニングするのに使用することができる。
【０１４０】
記述される組成物の改変ポリメラーゼは、場合により、改変および／または組換えΦ２９−型ＤＮＡポリメラーゼとすることができる。場合により、ポリメラーゼは、改変および／または組換えΦ２９、Ｂ１０３、ＧＡ−１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、またはＬ１７ポリメラーゼとすることができる。
【０１４１】
記述される組成物の改変ポリメラーゼは、場合により、改変および／または組換え原核ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）、ＤＮＡポリメラーゼＩＶ（ＰｏｌＩＶ）、ＤＮＡポリメラーゼＶ（ＰｏｌＶ）とすることができる。一部の実施形態では、改変ポリメラーゼは、非命令的損傷ヌクレオチド上でＤＮＡ合成を媒介するポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、ＰｏｌＩ、ＰｏｌＩＩ（ｐｏｌＢ）、ＰｏｌｌＩＶ（ｄｉｎＢ）、および／またはＰｏｌＶ（ｕｍｕＣＤ）をコードする遺伝子が、操作された細胞またはＳＳＯで恒常的に発現しまたは過発現する。一部の実施形態では、ＰｏｌＩＩの発現または過発現の増加は、操作された細胞またはＳＳＯにおける非天然塩基対（ＵＢＰ）の増大する保持率に寄与する。
【０１４２】
本発明で一般に有用な核酸ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびそれらの変異体または変化形態を含む。ＤＮＡポリメラーゼおよびその性質は、とりわけＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  第２版、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１）に詳細に記載されている。本発明で有用な公知の従来のＤＮＡポリメラーゼには、限定するものではないがピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、１９９１、Ｇｅｎｅ、１０８：１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ピュロコックス・ウォエセイ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｈｉｎｎｉｓｄａｅｌｓら、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０：１８６〜８、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ  １９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、バシルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｔｅｎｅｓｈおよびＭｃＧｏｗａｎ、１９７７、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（ＴＩｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる。Ｃａｒｉｅｌｌｏら、１９９１、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ、１９：４１９３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、テルモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｓａｂｉｎｏ、１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９）、テルムス・アクアティクス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎら、１９７６、Ｊ．Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ、１２７：１５５０）ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス・コダカラエンシスＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉら、１９９７、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（テルモコックス種から、ＪＤＦ−３、親出願ＷＯ  ０１３２８８７）、ピロコッカスＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼとも呼ばれる。Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａら、１９９４、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８２０、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（好熱菌テルモトガ・マリティマから；ＤｉａｚおよびＳａｂｉｎｏ、１９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ、３１：１２３９；ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（テルモコックス・ゴルロナリウス（ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）から、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＬｅｃｏｍｔｅおよびＤｏｕｂｌｅｄａｙ、１９８３、Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍら、１９８１、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１１２）、および古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｃａｎｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１４２５０）が含まれる。中温性ポリメラーゼおよび好熱性ポリメラーゼが共に企図される。好熱性ＤＮＡポリメラーゼには、限定するものではないがＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＴｆＩ、Ｔｔｈ、ＴＩｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、Ｖｅｎｔ（商標）およびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ−３、ならびにこれらの変異体、バリアント、および誘導体が含まれる。３’エキソヌクレアーゼ欠損変異体であるポリメラーゼも企図される。本発明で有用な逆転写酵素には、限定するものではないが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ、およびその他のレトロウイルスからの逆転写酵素（Ｌｅｖｉｎ、Ｃｅｌｌ  ８８：５〜８（１９９７）；Ｖｅｒｍａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．４７３：１〜３８（１９７７）；Ｗｕら、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：２８９〜３４７（１９７５）参照）が含まれる。ポリメラーゼの他の例には、限定するものではないが９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ  Ｇａｒｄｎｅｒら（２００４）「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７９（１２）、１１８３４〜１１８４２；ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｇａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｒｃｈａｅｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（１２）２５４５〜２５５３．）が含まれる。非好熱性生物から単離されたポリメラーゼは、熱不活性化可能とすることができる。その例は、ファージからのＤＮＡポリメラーゼである。様々な供給源のいずれかからのポリメラーゼは、高温条件に対するそれらの耐性を増大させまたは減少させるように改変できることが理解されよう。一部の実施形態では、ポリメラーゼを好熱性とすることができる。一部の実施形態では、好熱性ポリメラーゼを熱不活性化可能にすることができる。好熱性ポリメラーゼは、高温条件にまたは熱サイクリング条件、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法に用いられる場合に、典型的には有用である。
【０１４３】
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、Φ２９、Ｂ１０３、ＧＡ−１、ＰＺＡ、Φ１５、ＢＳ３２、Ｍ２Ｙ、Ｎｆ、Ｇ１、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、ＰＺＥ、ＳＦ５、Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、Ｌ１７、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）、９°Ｎｍ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、ＴｆＩ、Ｔｔｈ、ＴＩｉ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、Ｖｅｎｔ（商標）およびＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ−３、Ｐｆｕ、Ｔａｑ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＧＢ−Ｄ、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、古細菌ＤＰ１Ｉ／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素を含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ１−Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＯＬＢポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素である。
【０１４５】
さらにそのようなポリメラーゼは、例えばポリメラーゼによるＤＮＡへの非天然核酸残基の組込みを含む増幅または配列決定の文脈において、実時間的用例を含むＤＮＡ増幅および／または配列決定の適用例のために使用することができる。他の実施形態では、組み込まれる非天然核酸を天然残基と同じにすることができ、例えばこの場合、非天然核酸の標識またはその他の部分が、組込み中のポリメラーゼの作用によって除去され、または非天然核酸は、天然核酸と区別される１つまたはそれ以上の特徴を有することができるものである。
【０１４６】
ヌクレオチドトランスポーター
ヌクレオチドトランスポーター（ＮＴ）は、細胞膜および小胞上でのヌクレオシド基質を容易にする一群の膜輸送タンパク質である。一部の実施形態では、２つのタイプのヌクレオシドトランスポーター、集中型ヌクレオシドトランスポータオおよび平衡型ヌクレオシドトランスポーターがある。ある場合には、ＮＴは、有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）および有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）も包含する。ある場合には、ヌクレオチドトランスポーターがヌクレオシド三リン酸トランスポーターである。
【０１４７】
一部の実施形態では、ヌクレオチド三リン酸トランスポーター（ＮＴＴ）が、細菌、植物、または藻類由来である。一部の実施形態では、ヌクレオチドヌクレオシド三リン酸トランスポーターが、ＴｐＮＴＴ１、ＴｐＮＴＴ２、ＴｐＮＴＴ３、ＴｐＮＴＴ４、ＴｐＮＴＴ５、ＴｐＮＴＴ６、ＴｐＮＴＴ７、ＴｐＮＴＴ８（Ｔ．シュードナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ））、ＰｔＮＴＴ１、ＰｔＮＴＴ２、ＰｔＮＴＴ３、ＰｔＮＴＴ４、ＰｔＮＴＴ５、ＰｔＮＴＴ６（Ｐ．トリコルヌツム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））、ＧｓＮＴＴ（ガルディエリア・スルフラリア（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ  ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ））、ＡｔＮＴＴ１、ＡｔＮＴＴ２（アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ＣｔＮＴＴ１、ＣｔＮＴＴ２（クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、ＰａｍＮＴＴ１、ＰａｍＮＴＴ２（プロトクラミジア・アメーボフィア（Ｐｒｏｔｏｃｈｌａｍｙｄｉａ  ａｍｏｅｂｏｐｈｉｌａ）、ＣｃＮＴＴ（カエジバクター・カリオフィルス（Ｃａｅｄｉｂａｃｔｅｒ  ｃａｒｙｏｐｈｉｌｕｓ））、ＲｐＮＴＴ１（リッケッツイア・プロワゼキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ））である。
【０１４８】
一部の実施形態では、ＮＴＴが、ＣＮＴ１、ＣＮＴ２、ＣＮＴ３、ＥＮＴ１、ＥＮＴ２、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３、またはＯＣＴ１である。
【０１４９】
一部の実施形態では、ＮＴＴが非天然核酸を生物に、例えば細胞に移入する。一部の実施形態では、ヌクレオチド結合部位への非天然核酸の立体進入阻害を低減させるためにＮＴＴのヌクレオチド結合部位が改変されるように、ＮＴＴを改変することができる。一部の実施形態では、ＮＴＴは、非天然核酸の１つまたはそれ以上の特徴との相互作用が増大するように、改変することができる。そのようなＮＴＴは、細胞内にＵＢＰを安定して移入させるため、細胞内で発現させまたは操作することができる。したがって本発明は、異種または組換えＮＴＴを含む組成物と、その使用方法とを含む。
【０１５０】
ＮＴＴは、タンパク質工学に関する方法を使用して改変することができる。例えば分子モデリングは、標的の活性または結合部位を改変するように変異を行うことができるＮＴＴの場所を特定するために、結晶構造に基づいて実施することができる。置換のための標的として特定される残基は、Ｂｏｒｄｏら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１７：７２１〜７２９（１９９１）、およびＨａｙｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、ＵＳＡ  ９９：１５９２６〜１５９３１（２００２）に記載されるような、エネルギー最小化モデリング、ホモロジーモデリング、および／または保存アミノ酸置換を使用して、選択される残基と置き換えることができる。
【０１５１】
様々なＮＴＴのいずれかは、例えば、生体系から単離されたタンパク質をベースにした酵素およびその機能的バリアントを含む、本明細書で述べる方法または組成物で使用することができる。以下に具体化されるものなどの特定のＮＴＴへの言及は、他に指示しない限り、それらの機能的バリアントを含むと理解されよう。一部の実施形態では、ＮＴＴが野生型ＮＴＴである。一部の実施形態では、ＮＴＴが、改変されたまたは変異体のＮＴＴである。
【０１５２】
細胞内への非天然核酸の進入を改善するための、およびヌクレオチド結合領域で非天然ヌクレオチドと配位するための特徴を持つＮＴＴを、使用することもできる。一部の実施形態では、改変ＮＴＴは、改変ヌクレオチド結合部位を有する。一部の実施形態では、改変または野生型ＮＴＴは、非天然核酸に対して緩和特異性を有する。
【０１５３】
一部の実施形態では、改変ＮＴＴは、非天然核酸に対する野生型ＮＴＴの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、非天然核酸に対する特異性を有する。一部の実施形態では、改変または野生型ＮＴＴは、天然核酸および／または非天然核酸であって改変された糖を持たないものに対する野生型ＮＴＴの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、改変された糖を含む非天然核酸に対する特異性を有する。一部の実施形態では、改変または野生型ＮＴＴは、天然核酸および／または非天然核酸であって改変塩基を持たないものに対する野生型ＮＴＴの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、改変塩基を含む非天然核酸に対する特異性を有する。一部の実施形態では、改変または野生型ポリメラーゼは、トリホスフェートを含む核酸および／または三リン酸を含まない非天然核酸に対する野生型ＮＴＴの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、トリホスフェートを含む非天然核酸に対する特異性を有する。例えば、改変または野生型ＮＴＴは、ジホスフェートもしくはモノホスフェートを含むまたはホスフェートを含まないまたはこれらの組合せである非天然核酸に対する野生型ＮＴＴの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、トリホスフェートを含む非天然核酸に対する特異性を有することができる。
【０１５４】
一部の実施形態では、改変または野生型ＮＴＴは、天然核酸に対する野生型ＮＴＴの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、非天然核酸に対する特異性および天然核酸に対する特異性を有する。一部の実施形態では、改変または野生型ＮＴＴは、天然核酸二対する野生型ＮＴＴの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、改変された糖を含む非天然核酸に対する特異性および天然核酸に対する特異性を有する。一部の実施形態では、改変または野生型ＮＴＴは、天然核酸に対する野生型ＮＴＴの特異性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９９％である、改変塩基を含む非天然核酸に対する特異性および天然核酸に対する特異性を有する。
【０１５５】
ＮＴＴは、核酸からのそれらの解離速度によって特徴付けることができる。一部の実施形態では、ＮＴＴは、１種またはそれ以上の天然および非天然核酸に関して比較的低い解離速度を有する。一部の実施形態では、ＮＴＴは、１種またはそれ以上の天然および非天然核酸に関して比較的高い解離速度を有する。解離速度は、本明細書で述べる方法において反応速度を調整するよう調整することができるＮＴＴの活性である。
【０１５６】
自然供給源からのＮＴＴまたはそのバリアントは、特定の構造を有する非天然核酸の移入を検出するアッセイを使用して、スクリーニングすることができる。一実施例では、ＮＴＴは、非天然核酸またはＵＢＰ、例えばｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、またはｄ５ＳＩＣＳＴＰ−ｄＮａＭＴＰ  ＵＢＰを移入する能力に関してスクリーニングすることができる。ＮＴＴ、例えば異種ＮＴＴは、野生型ＮＴＴと比較して、非天然核酸に関して改質された性質を示すものを使用することができる。例えば、改質された性質は、例えばＫｍ、ｋｃａｔ、Ｖｍａｘ、非天然核酸（または天然ヌクレオチド）の存在下でのＮＴＴ移入、非天然核酸の存在下でＮＴＴを持つ細胞による平均鋳型リード長、非天然核酸に対するＮＴＴの特異性、非天然核酸の結合速度、または生成物放出速度、またはこれらの任意の組合せとすることができる。一実施形態では、改質された性質は、非天然核酸に対する低減されたＫｍおよび／または非天然核酸に対する増大したｋｃａｔ／ＫｍもしくはＶｍａｘ／Ｋｍである。同様にＮＴＴは、場合により、野生型ＮＴＴと比較して、非天然核酸の増大した結合速度、増大した生成物放出速度、および／または増大した細胞移入速度を有する。
【０１５７】
同時に、ＮＴＴは、天然核酸、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴを細胞に移入することができる。例えば、ＮＴＴは場合により、対応する野生型ＮＴＴの場合に関して少なくとも約５％程に高い（例えば５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれよりも高い）、天然核酸に関する特異的移入活性を示す。場合によりＮＴＴは、野生型ＮＴＴの場合の少なくとも約５％程に高い（例えば５％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％またはそれよりも高い）、天然ヌクレオチドに関するｋｃａｔ／ＫｍまたはＶｍａｘ／Ｋｍを示す。
【０１５８】
特定の構造の非天然核酸を移入する能力を有することができる、本明細書で使用されるＮＴＴは、指向性進化法を使用して生成することもできる。核酸合成アッセイは、様々な非天然核酸のいずれかに関して特異性を有するＮＴＴバリアントをスクリーニングするのに使用することができる。例えば、ＮＴＴバリアントは、非天然核酸またはＵＢＰ、例えばｄ５ＳＩＣＳＴＰ、ｄＮａＭＴＰ、またはｄ５ＳＩＣＳＴＰ−ｄＮａＭＴＰ  ＵＢＰを核酸に移入する能力についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、そのようなアッセイは、例えば組換えＮＴＴバリアントを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。一部の実施形態では、そのようなアッセイは、例えばＮＴＴバリアントを細胞内で発現するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイである。そのような指向性進化法は、本明細書で述べる非天然核酸のいずれかに対する活性に関して、任意の適切なＮＴＴのバリアントをスクリーニングするのに使用することができる。
【０１５９】
核酸試薬およびツール
本明細書に記述される方法、細胞、または操作された微生物で使用される核酸試薬は、１種またはそれ以上のＯＲＦを含む。ＯＲＦは、任意の適切な供給源からのものとされ、時々、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、逆転写ＲＮＡ、もしくは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または前述の１つもしくはそれ以上を含む核酸ライブラリーからのものとされ、目的の核酸配列、目的のタンパク質、または目的の活性を含有する任意の生物種からのものである。そこからＯＲＦを得ることができる生物の、非限定的な例には、例えば細菌、酵母、真菌、ヒト、昆虫、線虫、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、またはマウスが含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記述される核酸試薬またはその他の試薬が単離されまたは精製される。
【０１６０】
核酸試薬は時々、ＯＲＦと併せて翻訳されかつアミノ酸タグをコードする、ＯＲＦに隣接するヌクレオチド配列を含む。タグコード化ヌクレオチド配列は、核酸試薬のＯＲＦの３’および／または５’に位置付けられ、それによってタグを、ＯＲＦによりコードされたタンパク質またはペプチドのＣ末端またはＮ末端でコードする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および／または翻訳を抑止しない任意のタグが利用され、当業者によって適切に選択される。タグは、培養物または発酵培地からの所望のＯＲＦ生成物の単離および／または精製を容易にすることができる。
【０１６１】
核酸または核酸試薬は、核酸の意図される用途によりしばしば選択される、ある特定のエレメント、例えば調節エレメントを含むことができる。下記のエレメントのいずれかを、核酸試薬に含めることができまたは核酸試薬から排除することができる。核酸試薬は例えば、下記のヌクレオチドエレメント：１つまたはそれ以上のプロモーターエレメント、１つまたはそれ以上の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、標的ヌクレオチド配列が挿入される１つまたはそれ以上の領域（「挿入エレメント」）、１つまたはそれ以上の標的ヌクレオチド配列、１つまたはそれ以上の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、および１つまたはそれ以上の選択エレメントの１つまたはそれ以上または全てを含むことができる。核酸試薬には、そのようなエレメントの１つまたはそれ以上を提供することができ、核酸が所望の生物に導入される前にその他のエレメントが核酸に挿入される。一部の実施形態では、提供された核酸試薬は、プロモーター、５’ＵＴＲ、場合による３’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列がヌクレオチド酸試薬に挿入される（即ち、クローニングされる）挿入エレメント（複数可）を含む。ある特定の実施形態では、提供される核酸試薬は、プロモーター、挿入エレメント（複数可）、および場合による３’ＵＴＲを含み、５’ＵＴＲ／標的ヌクレオチド配列が、場合による３’ＵＴＲと共に挿入される。エレメントは、選択された発現系での発現（例えば、選択された生物での発現、または例えば無細胞系での発現）に適した任意の順序で配置構成することができ、一部の実施形態では、核酸試薬が、５’から３’方向に下記のエレメント：（１）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、および挿入エレメント（複数可）；（２）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、および標的ヌクレオチド配列；（３）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、挿入エレメント（複数可）、および３’ＵＴＲ；および（４）プロモーターエレメント、５’ＵＴＲ、標的ヌクレオチド配列、および３’ＵＴＲを含む。
【０１６２】
核酸試薬、例えば発現カセットおよび／または発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始配列、転写終結配列、およびその他のエレメントを含む様々な調節エレメントを含むことができる。「プロモーター」は一般に、転写開始部位に関して比較的固定された場所にあるときに機能する、ＤＮＡの１つまたは複数の配列である。例えばプロモーターは、ヌクレオチド酸リン酸トランスポーター核酸セグメントの上流にすることができる。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含有し、上流エレメントおよび応答エレメントを含有することができる。「エンハンサー」は一般に、転写開始部位から固定されていない距離で機能するＤＮＡの配列を指し、転写単位から５’または３”のいずれかにすることができる。さらに、エンハンサーは、イントロン内ならびにコード配列そのものの内部にすることができる。それらは通常、長さが１０から３００の間であり、ｃｉｓで機能する。エンハンサーは、プロモーター付近からの転写を増大させるように機能する。エンハンサーは、プロモーターのように、転写の調節を媒介する応答エレメントもしばしば含有する。エンハンサーはしばしば、発現の調節を決定する。
【０１６３】
上述のように、核酸試薬は、１つまたはそれ以上の５’ＵＴＲおよび１つまたはそれ以上の３’ＵＴＲを含んでいてもよい。例えば、真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）および原核宿主細胞（例えば、ウイルス、細菌）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼす可能性のある転写の終結をシグナル伝達する配列を、含有することができる。これらの試薬は、ｍＲＮＡコード化組織因子タンパク質の非翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写することができる。３”非翻訳領域は、転写終結部位も含む。一部の好ましい実施形態では、転写単位はポリアデニル化領域を含む。この領域の１つの利益は、転写された単位がｍＲＮＡのように処理され輸送される可能性が増大することである。発現構成体におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。一部の好ましい実施形態では、同種ポリアデニル化シグナルを、導入遺伝子構成体で使用することができる。
【０１６４】
５’ＵＴＲは、そこから由来するヌクレオチド配列に対して内在する１つまたはそれ以上のエレメントを含むことができ、場合によっては１つまたはそれ以上の外在エレメントを含む。５’ＵＴＲは、任意の適切な核酸、例えばゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡに、例えば任意の適切な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳類）に由来することができる。当業者なら、選択された発現系（例えば、選択された生物での発現、または例えば無細胞系での発現）に基づいて、５’ＵＴＲに適切なエレメントを選択できる。５’ＵＴＲは時々、当業者に公知の下記のエレメント：エンハンサー配列（例えば、転写または翻訳）、転写開始部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、アクセサリータンパク質結合部位、フィードバック調節剤結合部位、Ｐｒｉｂｎｏｗボックス、ＴＡＴＡボックス、−３５エレメント、Ｅ−ボックス（ヘリックス−ループ−ヘリックス結合エレメント）、リボソーム結合部位、レプリコン、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、サイレンサーエレメントなどの、１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは、適正な状態調節に必要な全ての５’ＵＴＲエレメントがプロモーターエレメント断片にまたはプロモーターエレメント断片の機能的部分配列内に含有されるように、単離される。
【０１６５】
核酸配列試薬中の５’ＵＴＲは、翻訳エンハンサーヌクレオチド配列を含むことができる。翻訳エンハンサーヌクレオチド配列はしばしば、プロモーターと核酸試薬中の標的ヌクレオチド配列との間に位置付けられる。翻訳エンハンサー配列は、しばしばリボソームと結合し、１８Ｓ  ｒＲＮＡ−結合リボヌクレオチド配列（即ち、４０Ｓリボソーム結合配列）であることもあり、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であることもある。ＩＲＥＳは一般に、いくつかの特異的分子間相互作用を介して４０Ｓリボソームサブユニットと接触する、精密に配置されたＲＮＡ三次構造を持つＲＮＡ足場を形成する。リボソームエンハンサー配列の例は公知であり、当業者が特定することができる（例えば、Ｍｉｇｎｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：Ｄ１４１−Ｄ１４６（２００５）；Ｐａｕｌｏｕｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：７２２〜７３３（２００３）；Ａｋｂｅｒｇｅｎｏｖら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：２３９〜２４７（２００４）；Ｍｉｇｎｏｎｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（３）：ｒｅｖｉｅｗｓ０００４．１−０００１．１０（２００２）；Ｇａｌｌｉｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：３４０１〜３４１１（２００２）；Ｓｈａｌｏｉｋｏら、ＤＯＩ：１０．１００２／ｂｉｔ．２０２６７；およびＧａｌｌｉｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：３２５７〜３２７３（１９８７））。
【０１６６】
翻訳エンハンサー配列は、時々、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列またはその他の配列（例えば、ヒドロポリプ配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０７１２８）などの、真核配列である。翻訳エンハンサー配列は、時々、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏコンセンサス配列などの原核配列である。ある特定の実施形態では、翻訳エンハンサー配列が、ウイルス性ヌクレオチド配列である。翻訳エンハンサー配列は時々、例えばタバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）（ＴＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（Ａｌｆａｌｆａ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）；タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ）（ＥＴＶ）；ポテトウイルスＹ（Ｐｏｔａｔｏ  Ｖｉｒｕｓ  Ｙ）（ＰＶＹ）；カブモザイク（Ｔｕｒｎｉｐ  Ｍｏｓａｉｃ）（ｐｏｔｙ）ウイルス、およびエンドウ種子由来モザイクウイルス（Ｐｅａ  Ｓｅｅｄ  Ｂｏｒｎｅ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）などの、植物ウイルスの５’ＵＴＲからのものである。ある特定の実施形態では、ＴＭＶからの長さ約６７塩基のオメガ配列が、翻訳エンハンサー配列として核酸試薬に含まれる（例えば、グアノシンヌクレオチドに欠けており、２５ヌクレオチド長のポリ（ＣＡＡ）中央領域を含む）。
【０１６７】
３’ＵＴＲは、そこから生じるヌクレオチド配列に対して内在する１つまたはそれ以上のエレメントを含むことができ、場合によっては１つまたはそれ以上の外在性エレメントを含む。３’ＵＴＲは、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡなどの任意の適切な核酸に、例えば任意の適切な生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、または哺乳類）に由来する。当業者は、選択された発現系（例えば、選択された生物での発現）に基づいて、３’ＵＴＲに適切なエレメントを選択することができる。３’ＵＴＲは、場合によっては、当業者に公知の下記のエレメント：転写調節部位、転写開始部位、転写終結部位、転写因子結合部位、翻訳調節部位、翻訳終結部位、翻訳開始部位、翻訳因子結合部位、リボソーム結合部位、レプリコン、エンハンサーエレメント、サイレンサーエレメント、およびポリアデノシン尾部の１つまたはそれ以上を含む。３’ＵＴＲは、しばしばポリアデノシン尾部を含み、場合によっては含まず、ポリアデノシン尾部が存在する場合には、１つまたはそれ以上のアデノシン部分が付加されまたはそこから失われる（例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０アデノシン部分が付加されまたは排除される）。
【０１６８】
一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの改変は、プロモーターの活性を変化させる（例えば、増加させ、付加し、減少させ、または実質的になくす）のに使用される。次にプロモーター活性の変化は、改変された５’または３’ＵＴＲを含む作動可能に連結されたプロモーターエレメントから目的のヌクレオチド配列（複数可）の転写を変化させることによって、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の活性（例えば、酵素活性）を変化させることができる。例えば微生物は、ある特定の実施形態において、新規な活性（例えば、宿主生物において通常は見られない活性）を付加することができるまたは目的のヌクレオチド配列（例えば、目的の同種または異種ヌクレオチド配列）に作動可能に連結された同種もしくは異種プロモーターからの転写を増大させることによって既存の活性の発現を増大させることができる、改変された５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現させるための、遺伝子改変によって操作することができる。一部の実施形態では、微生物は、ある特定の実施形態において、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された同種または異種プロモーターからの転写を減少させまたは実質的になくすことによって活性の発現を減少させることができる改変された５’または３’ＵＴＲを含む核酸試薬を発現させる、遺伝子改変によって操作することができる。
【０１６９】
発現カセットまたは発現ベクターからのヌクレオチド三リン酸トランスポーターの発現は、原核細胞または真核細胞で発現することが可能な任意のプロモーターによって制御することができる。プロモーターエレメントは、典型的には、ＤＮＡ合成および／またはＲＮＡ合成に必要とされる。プロモーターエレメントはしばしば、遺伝子に対応したＲＮＡの合成のための開始部位を提供することによって、特定の遺伝子の転写を容易にすることができるＤＮＡの領域を含む。プロモーターは一般に、それが調節する遺伝子付近に位置付けられ、遺伝子（例えば、遺伝子の５’）の上流に位置付けられ、一部の実施形態では遺伝子のセンス鎖と同じＤＮＡ鎖上にある。一部の実施形態では、プロモーターエレメントは、遺伝子または生物から単離することができ、ポリヌクレオチド配列との機能的接続に挿入することができ、その結果、変化したかつ／または調節された発現が可能になる。核酸の発現に使用される非天然プロモーター（例えば、所与の核酸配列に通常は関連付けられていないプロモーター）は、しばしば、異種プロモーターと呼ばれる。ある特定の実施形態では、異種プロモーターおよび／または５’ＵＴＲを、本明細書に記述される所望の活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの機能的接続に挿入することができる。プロモーターに関して本明細書で使用される「作動可能に連結された」および「〜との機能的接続」という用語は、コード配列とプロモーターエレメントとの間の関係を指す。プロモーターは、転写を介したコード配列からの発現がプロモーターエレメントによって調節されまたは制御される場合、コード配列に作動可能に連結されまたは機能的に接続される。「作動可能に連結された」および「〜との機能的接続」という用語は、プロモーターエレメントに関して本明細書では同義で利用される。
【０１７０】
プロモーターはしばしば、ＲＮＡポリメラーゼと相互に作用する。ポリメラーゼは、既存の核酸試薬を使用して核酸の合成を触媒する酵素である。鋳型がＤＮＡ鋳型である場合、ＲＮＡ分子は、タンパク質が合成される前に転写される。本発明の方法で使用するのに適したポリメラーゼ活性を有する酵素は、タンパク質を合成するのに選択された鋳型を持つ選択された系において活性な、任意のポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、本明細書ではプロモーターエレメントとも呼ばれるプロモーター（例えば、異種プロモーター）は、ヌクレオチド配列またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結させることができる。プロモーターエレメントからの転写は、プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列またはＯＲＦ配列に対応するＲＮＡの合成を触媒することができ、したがって所望のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の合成をもたらす。
【０１７１】
プロモーターエレメントは、場合によっては、調節制御に対して応答性を示す。プロモーターエレメントは、場合によっては、選択剤によって調節することもできる。即ち、プロモーターエレメントからの転写は、場合によっては、環境、栄養、または内部状態、またはシグナルの変化に応答して、開始させ、停止させ、上方調節し、または下方調節することができる（例えば、熱誘導性プロモーター、光調節プロモーター、フィードバック調節プロモーター、ホルモンの影響を受けるプロモーター、組織特異的プロモーター、酸素およびｐＨの影響を受けるプロモーター、選択剤（例えば、カナマイシン）に応答性のあるプロモーターなど）。環境、栄養、または内部シグナルによって頻繁に影響を受けるプロモーターは、プロモーターでまたはプロモーター付近で結合しかつある特定の条件下で標的配列の発現を増加させまたは減少させるするシグナルによって（直接または間接的に）影響を受ける。
【０１７２】
本明細書に記述される実施形態で使用されるプロモーターエレメントからの転写に影響を及ぼす選択または調節剤の非限定的な例には、限定するものではないが（１）その他の点では毒性の化合物に対する耐性を提供する生成物（例えば、抗生剤）をコードする核酸セグメント；（２）その他の点では受容細胞が欠けている生成物（例えば、必須の生成物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養用急性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードする核酸セグメント；（４）容易に特定することができる生成物（例えば表現型マーカー、例えば抗生剤（例えば、β−ラクタマーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質）をコードする核酸セグメント；（５）その他の点では細胞生存および／または機能に有害な生成物を結合する核酸セグメント；（６）その他の点では上記Ｎｏ．１〜５に記述される核酸セグメントのいずれかの活性を阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する生成物を結合する核酸セグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）所望の分子を単離しまたは同定するのに使用することができる核酸セグメント（例えば、特異的タンパク質結合部位）；（９）その他の点では非機能的とすることができる特異的ヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の下位集団のＰＣＲ増幅用）；（１０）非存在である場合に、特定の化合物に耐性または感受性を直接または間接的に与える核酸セグメント；（１１）毒性であるまたは受容細胞内で比較的無毒性の化合物を毒性化合物に変換する生成物（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）を、コードする核酸セグメント；（１２）それらを含有する核酸分子の複製、分配、または遺伝性を阻害する核酸セグメント；および／または（１３）条件複製機能、例えばある特定の宿主もしくは宿主細胞株でのまたはある特定の環境条件下（例えば、温度および栄養状態など）での複製をコードする核酸セグメントが含まれる。一部の実施形態では、調節または選択剤は、生物が供される既存の成長条件（例えば、液体培養物中での成長、発酵槽内での成長、固体栄養プレート上での成長など）を変化させるために添加することができる。
【０１７３】
一部の実施形態では、プロモーターエレメントの調節は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の活性（例えば、酵素活性など）を変化させる（例えば、増大させ、付加し、減少させ、または実質的になくす）のに使用することができる。例えば微生物は、ある特定の実施形態において、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された同種または異種プロモーター（例えば、目的の同種または異種ヌクレオチド配列）からの転写を増大させることによって、新規な活性（例えば、宿主生物において通常は見られない活性）を付加することができるまたは既存の活性の発現を増大させることができる核酸試薬を発現させるため、遺伝子改変によって操作することができる。一部の実施形態では、微生物は、ある特定の実施形態において目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された同種または異種プロモーターからの転写を減少させまたは実質的になくすことによって、活性の発現を減少させることができる核酸試薬を発現させるため、遺伝子改変によって操作することができる。
【０１７４】
異種タンパク質をコードする核酸、例えばヌクレオチド三リン酸トランスポーターは、任意の適切な発現系に挿入しまたはそのような発現系と共に用いることができる。一部の実施形態では、核酸試薬は時々、宿主生物の染色体に安定して一体化され、またはある特定の実施形態において、核酸試薬は、宿主染色体の一部の欠失とすることができる（例えば、遺伝子改変された生物であり、宿主ゲノムの変化が、遺伝子改変を保持する所望の生物を選択的にまたは優先的に維持する能力を与える）。そのような核酸試薬（例えば、核酸または遺伝子改変された生物であってその変化したゲノムが選択可能な特性を生物に与えるもの）は、所望のタンパク質または核酸分子の生成を導くそれらの能力に合わせて選択することができる。望む場合には、核酸試薬は、コドンが（ｉ）自然配列で指定されたものとは異なるｔＲＮＡを使用して、同じアミノ酸を、または（ｉｉ）非従来的なもしくは非天然アミノ酸（検出可能に標識されたアミノ酸を含む）を含む通常のものとは異なるアミノ酸をコードするように、変化させることができる。
【０１７５】
組換え発現は、プラスミドなど、ベクターの部分とすることができる発現カセットを使用して、役立つように実現される。ベクターは、ヌクレオチド三リン酸トランスポーターをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ベクターは、本明細書に記述される転写および翻訳に必要とされるその他のエレメントを含むこともできる。発現カセット、発現ベクター、およびカセットまたはベクター内の配列は、非天然ヌクレオチドが接触する細胞とは異種であるとすることができる。例えば、ヌクレオチド三リン酸トランスポーター配列は、細胞に対して異種とすることができる。
【０１７６】
ヌクレオチド三リン酸トランスポーターを保持し、コード化し、かつ／または発現するのに適した様々な原核および真核発現ベクターを、生成することができる。そのような発現ベクターは、例えばｐＥＴ、ｐＥＴ３ｄ、ｐＣＲ２．１、ｐＢＡＤ、ｐＵＣ、および酵母ベクターを含む。ベクターは、例えば、様々なｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況で使用することができる。使用することができる原核プロモーターの非限定的な例には、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ、またはマルトースプロモーターが含まれる。使用することができる真核プロモーターの非限定的な例には、構成的プロモーター、例えばウイルス性プロモーター、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０、およびＲＳＶプロモーター、ならびに調節可能なプロモーター、例えば誘発性または抑制的プロモーター、例えばｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター、およびＣＲＥによって調節される合成プロモーターが含まれる。細菌発現のためのベクターはｐＧＥＸ−５Ｘ−３を含み、真核発現用にはｐＣＩｎｅｏ−ＣＭＶを含む。用いることができるウイルス性ベクターには、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロナルトロフィックウイルス、シンドビスおよびその他のウイルスに関するものが含まれる。ベクターとして使用するのに適したものにする、これらのウイルスの性質を共有する、任意のウイルスファミリーも有用である。用いることができるレトロウイルスベクターは、Ｖｅｒｍａ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２２９〜２３２頁、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９８５）に記述されるものを含む。例えば、そのようなレトロウイルスベクターは、所望の性質を発現する、マウスマロニー白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、およびその他のレトロウイルスを含むことができる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造的初期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびカプシド形成に必要な逆位末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含有する。ベクターとして操作された場合、ウイルスは典型的には、除去された初期遺伝子の１つまたはそれ以上を有し、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットは、除去されたウイルス性核酸の代わりにウイルスゲノムに挿入される。
【０１７７】
クローニング
当技術分野で公知の任意の都合の良いクローニング戦略は、ＯＲＦなどのエレメントを核酸試薬に組み込むのに利用される。公知の方法は、（１）鋳型を１つまたはそれ以上の既存の制限酵素部位で切断し、目的のエレメントをライゲーションし、（２）１つまたはそれ以上の適切な制限酵素部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズすることによって制限酵素部位を鋳型に付加し、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する（本明細書で、より詳細に記述される）など、挿入エレメントとは無関係に、エレメントを鋳型に挿入するのに利用することができる。その他のクローニング戦略は、例えばＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーハイブリダイゼーション部位および本明細書に記述されるその他のものなど、核酸試薬に存在するまたは挿入される１つまたはそれ以上の挿入部位を利用する。一部の実施形態では、クローニング戦略を、組換えなどの遺伝子操作と組み合わせることができる（例えば、本明細書にさらに記述されるように、改変される生物のゲノムへの、目的の核酸配列による核酸試薬の組換え）。一部の実施形態では、クローン化ＯＲＦ（複数可）は、目的の１つまたはそれ以上のＯＲＦで、ヌクレオチド三リン酸トランスポーター活性またはポリメラーゼ活性の変化した活性を含む微生物を操作することによって、改変されたまたは野生型ヌクレオチド三リン酸トランスポーターおよび／またはポリメラーゼを生成することができる（直接または間接的に）。
【０１７８】
核酸は、核酸と１種またはそれ以上の特異的切断剤とを接触させることによって、特異的に切断される。特定の切断剤はしばしば、特定の部位で特定のヌクレオチド配列により、特異的に切断することになる。酵素特異的切断剤の例には、限定するものではないがエンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＩＩ）；ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｐ）；Ｃｌｅａｖａｓｅ（商標）酵素；Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、および真核構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ；Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えばＡｃｃ  Ｉ、Ａｆｌ  ＩＩＩ、Ａｌｕ  Ｉ、Ａｌｗ４４  Ｉ、Ａｐａ  Ｉ、Ａｓｎ  Ｉ、Ａｖａ  Ｉ、Ａｖａ  ＩＩ、ＢａｍＨ  Ｉ、Ｂａｎ  ＩＩ、Ｂｃｌ  Ｉ、Ｂｇｌ  Ｉ．Ｂｇｌ  ＩＩ、Ｂｌｎ  Ｉ、ＢｓａＩ、Ｂｓｍ  Ｉ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｓＨ  ＩＩ、ＢｓｔＥ  ＩＩ、Ｃｆｏ  Ｉ、ＣＩａ  Ｉ、Ｄｄｅ  Ｉ、Ｄｐｎ  Ｉ、Ｄｒａ  Ｉ、ＥｃＩＸ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  ＩＩ、ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｈａｅ  ＩＩ、Ｈａｅ  ＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｈｐａ  Ｉ、Ｈｐａ  ＩＩ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｋｓｐ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、ＭＩｕＮ  Ｉ、Ｍｓｐ  Ｉ、Ｎｃｉ  Ｉ、Ｎｃｏ  Ｉ、Ｎｄｅ  Ｉ、Ｎｄｅ  ＩＩ、Ｎｈｅ  Ｉ、Ｎｏｔ  Ｉ、Ｎｒｕ  Ｉ、Ｎｓｉ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｐｖｕ  Ｉ、Ｐｖｕ  ＩＩ、Ｒｓａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｓａｕ３Ａ  Ｉ、Ｓｃａ  Ｉ、ＳｃｒＦ  Ｉ、Ｓｆｉ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、Ｓｐｅ  Ｉ、Ｓｐｈ  Ｉ、Ｓｓｐ  Ｉ、Ｓｔｕ  Ｉ、Ｓｔｙ  Ｉ、Ｓｗａ  Ｉ、Ｔａｑ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ）；グリコシラーゼ（例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジン水和物−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ−ＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼ、５−ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５−ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６−エテノ−アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）；リボザイム、およびＤＮＡザイムが含まれる。サンプル核酸は、化学剤で処理され、または改変ヌクレオチドを使用して合成され、改変核酸は切断される。非限定的な例では、サンプル核酸は、（ｉ）アルキルプリンＤＮＡ−グリコシラーゼによって認識され切断される、Ｎ３−メチルアデニンおよびＮ３−メチルグアニンを含む、いくつかのアルキル化塩基を発生させるメチルニトロソ尿素などのアルキル化剤；（ｉｉ）ウラシルＮ−グリコシラーゼによって切断することができるウラシル残基を形成するために、ＤＮＡのシトシン残基の脱アミノ化を引き起こす、重硫酸ナトリウムで；および（ｉｉｉ）グアニンを、その酸化形態、８−ヒドロキシグアニンであって、ホルムアミドピリミジンＤＮＡ  Ｎ−グリコシラーゼによって切断することができるものに変換する化学剤で、処理される。化学切断プロセスの例には、限定するものではないがアルキル化（例えば、ホスホロチオ���ート改変核酸のアルキル化）；Ｐ３’−Ｎ５’−ホスホロアミデート含有核酸の酸不安定性の切断；ならびに核酸の四酸化オスミウムおよびピペリジン処理が含まれる。
【０１７９】
一部の実施形態では、核酸試薬は、１つまたはそれ以上のレコンビナーゼ挿入部位を含む。レコンビナーゼ挿入部位は、組換えタンパク質による一体化／組換え反応に関与する核酸分子上の認識配列である。例えば、Ｃｒｅレコンビナーゼに関する組換え部位はｌｏｘＰであり、これは８塩基対コア配列を挟む２つの１３塩基対逆位反復（レコンビナーゼ結合部位として働く）で構成される、３４塩基対配列である（例えば、Ｓａｕｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１〜５２７（１９９４））。組換え部位のその他の例には、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列、ならびにこれらの変異体、断片、バリアント、および誘導体が含まれ、組換えタンパク質λ  Ｉｎｔによって、ならびに補助タンパク質組込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳ、およびエクシシオナーゼ（Ｘｉｓ）によって認識されるものである（例えば、米国特許第５，８８８，７３２号；第６，１４３，５５７号；第６，１７１，８６１号；第６，２７０，９６９号；第６，２７７，６０８号；および第６，７２０，１４０号；米国特許出願第０９／５１７，４６６号、および第０９／７３２，９１４号；米国特許公開第２００２／０００７０５１号；およびＬａｎｄｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９〜７０７（１９９３））。
【０１８０】
レコンビナーゼクローニング核酸の例は、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にあり、ｉｎ  ｖｉｖｏでまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の核酸分子をクローニングするための少なくとも１つの組換え部位が含まれる。一部の実施形態では、系は、バクテリオファージラムダ系（例えば、ａｔｔ１およびａｔｔ２）をしばしばベースにする少なくとも２つの異なる部位特異的組換え部位を含有しかつ野生型（ａｔｔ０）部位から変異する、ベクターを利用する。各変異部位は、同じタイプ（例えばａｔｔＰ１ではａｔｔＢ１、ａｔｔＲ１ではａｔｔＬ１）のその同族パートナーａｔｔ部位（即ち、その結合パートナ組換え部位）に関して固有の特異性を有し、他の変異型の組換え部位とまたは野生型ａｔｔ０部位と交差反応しなくなる。異なる部位特異性は、所望の分子の指向的クローニングまたは連結を可能にし、したがってクローン化分子の所望の配向が提供される。組換え部位によって挟まれた核酸断片は、デスティネーションベクターと呼ばれることもある、受容体プラスミド分子上のａｔｔ部位によって挟まれた選択可能なマーカー（例えば、ｃｃｄＢ）を置き換えることにより、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）系を使用して、クローニングされサブクローニングされる。次いで所望のクローンは、ｃｃｄＢ感受性宿主株の形質変換および受容体分子上でのマーカーの正の選択によって、選択される。負の選択に関する類似の戦略（例えば、毒性遺伝子の使用）は、哺乳類および昆虫におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）などのその他の生物で使用することができる。
【０１８１】
核酸試薬は時々、１つまたはそれ以上の複製起点（ＯＲＩ）エレメントを含有する。一部の実施形態では、鋳型は２つまたはそれ以上のＯＲＩを含み、１つは、１つの生物（例えば、細菌）において効率的に機能し、別のものは別の生物（例えば、真核生物、例えば酵母など）で効率的に機能する。一部の実施形態では、ＯＲＩは、１つの種（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）で効率的に機能することができ、別のＯＲＩは、異なる種（例えば、Ｓ．ポムベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）など）で効率的に機能することができる。核酸試薬は時々、１つまたはそれ以上の転写調節部位も含む。
【０１８２】
核酸試薬、例えば発現カセットまたはベクターは、マーカー生成物をコードする核酸配列を含むことができる。マーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達されか否かかつ送達されたら発現するか否かを決定するのに使用される。実施例のマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含む。一部の実施形態では、マーカーは、選択可能なマーカーにすることができる。そのような選択可能なマーカーが首尾良く宿主細胞に移行すると、形質変換された宿主細胞は、選択的圧力下に置かれた場合に生存することができる。選択的レジームの、２つの広く使用される全く異なるカテゴリーがある。第１のカテゴリーは、細胞の代謝と、補われた培地とは無関係に成長する能力に欠けている変異細胞系の使用とに基づく。第２のカテゴリーは、任意の細胞型で使用される選択スキームを指しかつ変異細胞系の使用を必要としない、優性選択である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を停止させる薬物を使用する。新規な遺伝子を有することになるそれらの細胞は、薬物耐性を伝えるタンパク質を発現する可能性があり、選択を生き抜く可能性がある。そのような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．  １：３２７（１９８２））、ミコフェニコール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２（１９８０））、またはヒグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０〜４１３（１９８５））を使用する。
【０１８３】
核酸試薬は、１つまたはそれ以上の選択エレメントを含むことができる（例えば、核酸試薬の存在を選択するための、および選択的に調節することができるプロモーターエレメントの活性化のためではない、エレメント）。選択エレメントはしばしば、核酸試薬が細胞に含まれるか否かを決定するための公知のプロセスを使用するものが、利用される。一部の実施形態では、核酸試薬は、２つまたはそれ以上の選択エレメント、この場合１つが１種の生物において効率的に機能しかつ別のエレメントは別の生物において効率的に機能する選択エレメントを含む。選択エレメントの例には、限定するものではないが、（１）その他の点では毒性の化合物に対して耐性を提供する生成物（例えば、抗生剤）をコードする核酸セグメント；（２）その他の点では受容細胞が欠けている生成物（例えば、必須の生成物、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養用急性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードする核酸セグメント；（４）容易に特定することができる生成物（例えば表現型マーカー、例えば抗生剤（例えば、β−ラクタマーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および細胞表面タンパク質）をコードする核酸セグメント；（５）その他の点では細胞生存および／または機能に有害な生成物を結合する核酸セグメント；（６）その他の点では上記Ｎｏ．１〜５に記述される核酸セグメントのいずれかの活性を阻害する核酸セグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を改変する生成物を結合する核酸セグメント（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）；（８）所望の分子を単離しまたは同定するのに使用することができる核酸セグメント（例えば、特異的タンパク質結合部位）；（９）その他の点では非機能的とすることができる特異的ヌクレオチド配列をコードする核酸セグメント（例えば、分子の下位集団のＰＣＲ増幅用）；（１０）非存在である場合に、特定の化合物に耐性または感受性を直接または間接的に与える核酸セグメント；（１１）毒性であるまたは受容細胞内で比較的無毒性の化合物を毒性化合物に変換する生成物（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）を、コードする核酸セグメント；（１２）それらを含有する核酸分子の複製、分配、または遺伝性を阻害する核酸セグメント；および／または（１３）条件複製機能、例えばある特定の宿主もしくは宿主細胞株でのまたはある特定の環境条件下（例えば、温度および栄養状態など）での複製をコードする核酸セグメントが含まれる。
【０１８４】
核酸試薬は、ｉｎ  ｖｉｖｏ転写および／または翻訳に有用な、任意の形態のものにすることができる。核酸は、超螺旋プラスミドなどのプラスミドである場合があり、酵母人工染色体（例えば、ＹＡＣ）である場合があり、直鎖状核酸（例えば、ＰＣＲによってまたは制限消化によって生成された直鎖状核酸）である場合があり、一本鎖である場合があり、二本鎖である場合がある。核酸試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスまたは転写媒介型増幅プロセス（ＴＭＡ）などの増幅プロセスによって製造される場合がある。ＴＭＡでは、発光によって検出される増幅生成物を生成するために、２種の酵素が等温反応で使用される（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６  Ｊｕｎ  ２５；３５（２５）：８４２９〜３８）。標準ＰＣＲプロセスは公知であり（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；第４，６８３，１９５号；第４，９６５，１８８号；および第５，６５６，４９３号）、一般に、複数サイクル内で行われる。各サイクルは、混成核酸が解離する熱変性；プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする冷却；およびポリメラーゼ（即ち、Ｔａｑポリメラーゼ）によるオリゴヌクレオチドの伸長を含む。ＰＣＲサイクルプロセスの例は、サンプルを９５℃で５分間処理し；９５℃で１分間、５９℃で１分、１０秒、および７２℃で１分３０秒を４５サイクル繰り返し；次いでサンプルを７２℃で５分間処理することである。多数回のサイクルは、市販の熱サイクラーを使用して頻繁に行われる。ＰＣＲ増幅生成物は、ある時間にわたり、より低い温度で（例えば、４℃で）貯蔵される場合もあり、場合によっては分析前に凍結（例えば、−２０℃で）される。
【０１８５】
製造のキット／物品
本明細書には、ある特定の実施形態において、本明細書に記述される１つまたはそれ以上の方法と共に使用される、製造のキットおよび物品が開示される。そのようなキットは、バイアルおよびチューブなどの１つまたはそれ以上の容器を受容するように区画化されたキャリア、パッケージ、または容器を含み、これら容器（複数可）のそれぞれは、本明細書に記述される方法で使用される個別の要素の１つを含むものである。適切な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
【０１８６】
一部の実施形態では、キットは、キットの内容物を収容するのに適切な包装材料を含む。ある場合には、包装材料は、好ましくは滅菌された、汚染物質のない環境を提供するために、周知の方法によって構成される。本明細書で用いられる包装材料は、例えば、核酸配列決定システムと共に使用するために販売される商用キットで、慣習的に利用されるものを含むことができる。例示的な包装材料には、限定するものではないが、本明細書で述べる構成要素を固定限度内で保持することが可能なガラス、プラスチック、紙、および箔などが含まれる。
【０１８７】
包装材料は、構成要素に関する特定の用途を示す標識を含むことができる。標識によって示される、キットに関する使用は、キット内に存在する構成要素の特定の組合せに適宜合わせた、本明細書で述べる方法の１つまたはそれ以上とすることができる。例えば標識は、キットが、ポリヌクレオチドを合成する方法にまたは核酸の配列を決定する方法に有用であることを示すことができる。
【０１８８】
包装された試薬または構成要素を使用するための取扱い説明書も、キットに含めることができる。取扱い説明書は、典型的には、キットの構成要素および混合されるサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物の維持期間、温度、および緩衝条件などの、反応パラメーターについて記述する具体的表現（ｔａｎｇｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を含むことになる。
【０１８９】
特定の反応に必要な全ての構成要素が、特定のキット内に存在する必要があるわけはないことが、理解されよう。むしろ１つまたはそれ以上の追加の構成要素を、その他の供給源から提供することができる。キットと共に提供される取扱い説明書は、提供されることになる追加の構成要素（複数可）およびそれらを得ることができる場所を、特定することができる。
【０１９０】
一部の実施形態では、例えば、遺伝子操作された細胞を製造するための本発明により提供される方法を使用して、非天然核酸を細胞核酸に安定して組み込むのに有用なキットが提供される。一部の実施形態では、本明細書に記述されるキットは、遺伝子操作された細胞と、１つまたはそれ以上の非天然核酸とを含む。別の実施形態では、本明細書に記述されるキットは、配列番号１〜３２から選択される配列を含む、単離され精製されたプラスミドを含む。
【０１９１】
追加の実施形態では、本明細書に記述されるキットは、細胞と、細胞内に導入しそれによって遺伝子操作された細胞を提供するための異種遺伝子を含有する核酸分子、例えばこのパラグラフで上に記述される実施形態のいずれかの核酸を含む発現ベクターとを提供する。
【０１９２】
ある特定の用語
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および化学的用語は、特許請求の範囲に記載される対象が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。前述の概略的記述および以下の詳細な記述は例示的で説明的なものにすぎず、特許請求の範囲に記載される任意の対象を制限するものではないことが理解されよう。本出願では、単数形の使用は、他に特に指示しない限り複数形を含む。本明細書および添付される特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。本出願において、「または」の使用は、他に指示しない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびにその他の形、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」という用語の使用は、限定ではない。
【０１９３】
本明細書で使用される範囲および量は、「約」特定の値または範囲と表すことができる。約は、正確な量も含む。したがって「約５μＬ」は、「約５μＬ」および「５μＬ」も意味する。一般に、「約」という用語は、実験誤差内であると予測できる量を含む。
【０１９４】
本明細書で使用されるセクションの表題は、単なる組織上の目的であり、記述される対象を限定すると解釈するものではない。
【０１９５】
実施例
これらの実施例は、単なる例示を目的に提供され、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１９６】
細胞が大腸菌内でＵＢＰをどのように保持するかまたは失うかの決定
定常状態の条件下、ｄＮＡＭ−ｄＴＰＴ３  ＵＢＰを含有するＤＮＡを、完全天然対応物の場合に近付く効率で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製する。しかし、これらの速度は、生成物解離によって制限される可能性が高い。ｉｎ  ｖｉｖｏ複製は、より加工性があり、それに相応して、生成物の解離によってそれほど制限されないようである。したがって、ＳＳＯ内にＵＢＰを含有するＤＮＡの複製は、完全天然ＤＮＡの場合よりも効率的ではないようであり、したがって複製フォークを止める（ｓｔａｌｌ）可能性がある。さらに構造研究は、ＵＢＰが、三リン酸挿入中にＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様構造を採用することを示したが、いったん挿入されるとＵＢＰは、局所螺旋歪みを誘発させる交差鎖インターカレート構造を採用する。８，９細胞は、止めた複製フォークと螺旋歪みとの両方を、ＤＮＡ損傷のサインと解釈し、障害を起こすヌクレオチドであって本発明者らがＵＢＰ損失に関与する可能性があると疑うものを、修復しまたはそれに耐えるようなプログラムを開始する。
【０１９７】
細胞がＵＢＰをどのように保持するかまたは失うかを決定するために、これらの経路が機能不全になる影響について研究した。結果は、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）もＳＯＳ応答も、ＵＢＰ保持率または損失に著しく関与しないことを示す。逆に、正常なレプリソームポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）、ＰｏｌＩＩ、およびメチル指向型ミスマッチ修復（ＭＭＲ）は全て、ＵＢＰ保持率に関与し；一方、止めた複製フォークの組換え修復（ＲＥＲ）は、ＵＢＰ損失に対して主要な経路を提供する。次に、ＳＯＯのレプリソームは、より良好にＵＢＰをプラスミド上に保持するだけではなく、ＵＢＰをその染色体内に安定して留める能力も与えるように、再プログラムされた。
【０１９８】
ヌクレオチド除去修復はＹＢＰ保持または損失に関与しない
一般に大腸菌は、直接損傷反転、塩基除去重複、ＮＥＲ、ＭＭＲ、ＲＥＲ、およびＳＯＳ応答を介して、ＤＮＡ損傷に応答する。これらの経路は、ＵＢＰによって模倣されないようなＤＮＡ損傷の特定の形態を認識する酵素に依拠するので、直接損傷反転も塩基除去修復も、ＵＢＰ保持率または損失に関与しないようである。対照的に、ＮＥＲ、ＭＭＲ、ＲＥＲ、およびＳＯＳ応答は、少ない構造特異的シグナルによって誘発される。細胞がＵＢＰをそれらのＤＮＡ内で保持するのをどのように管理するかの調査を開始するために、ＵＢＰによって模倣されるバルク状病変から得られる歪みに関してＤＮＡを走査するタンパク質の複合体による複製独立型手法で媒介される、ＮＥＲについて研究した。ＵＢＰ保持率または損失にするＮＥＲの関与を、親ＳＳＯからの、ＮＥＲの必須成分をコードするｕｖｒＣを欠失させることによって、調査した（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）＋ｐＡＣＳ２（図４））。プラスミドｐＩＮＦ１およびｐＩＮＦ２における２つの異なる配列構成で位置決めされたｄＮａＭ−ｄＴＰＴ３  ＵＢＰを含有するＤＮＡの複製は、ｕｖｒＣの欠失によって影響を受けず、これはＮＥＲがＵＢＰ保持率または損失に関与しないことを示した（図１Ｂ）。
【０１９９】
メチル指向型ミスマッチ修復はＵＢＰ保持率を増大させる
次にＭＭＲを調査したが、これは複製中のＤＮＡポリメラーゼから出現するときに新しく合成されたＤＮＡの決定的な第１のチェックが行われ、かつミスマッチ天然ヌクレオチドにより引き起こされた螺旋歪みを認識するタンパク質の複合体によって媒介される。ミスマッチの検出により、ＭＭＲ複合体は、新しく合成された非メチル化鎖に切れ目を入れ、それがギャップの形成をもたらしかつその後のＤＮＡ再合成をもたらす。ＮＥＲとは対照的に、ｍｕｔＨの欠失を介した  ＭＭＲの不活性化は、ｐＩＮＦ１およびｐＩＮＦ２の両方によるＵＢＰ保持率の低減をもたらした（図１Ｂ）。これらの結果は、ＵＢＰに関連した螺旋歪みが、ＭＭＲを活性化するのに十分深刻なものではないこと、または非天然ヌクレオチドを切除できないこと、しかし、非天然および天然ヌクレオチドの対合によって引き起こされた歪みはＭＭＲによって認識され加工されることを示す。このようにＭＭＲは、天然状態としてＵＢＰを効果的に認識しかつミス対合天然ヌクレオチドを選択的に除去するようであり、それによって、遺伝子アルファベットの安定な拡張が支持される。
【０２００】
組換え修復はＵＢＰ損失に対する主要な経路を提供する
ＲＥＲはＲｅｃＡによって媒介され、止めた複製フォークよりも先に一本鎖ＤＮＡ上にフィラメントを形成し、それが組換え中間体の形成を容易にし、継続するＤＮＡ複製のための同種鋳型に切り換わる。ＳＯＳ応答は、同じＲｅｃＡフィラメントがＳＯＳレプレッサーＬｅｘＡの切断を促進させるときに誘発され、それがフォークを止めた損傷ＤＮＡの耐容および／または修復に関わる様々な遺伝子の抑制解除をもたらす。本発明者らは、ｒｅｃＡの欠失を通してＲＥＲおよびＳＯＳ応答を組み合わせた関与を調査し、ｐＩＮＦ１によるＵＢＰ保持率の著しい増加を観察した（図１Ｂ）。ＲｅｃＡの関与をさらに調査するために、ｐＩＮＦ３、ｐＩＮＦ４、およびｐＩＮＦ５によって提供されたより困難な配列でのＵＢＰの保持率を、ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯで測定した（図１Ｃ）。これらの配列構成において、ｒｅｃＡの非存在は、ＵＢＰ保持率のより劇的な増大をもたらした。
【０２０１】
ｒｅｃＡの欠失が、ＲＥＲを除去することによってまたはＳＯＳ応答の誘発を防止することによって、ＵＢＰ保持率を容易にするか否かを見定めるため、ＳＯＳ応答を誘発させることができないがＲＥＲに適したＳＳＯ（ＳＳＯ  ｌｅｘＡ（Ｓ１１９Ａ））を検査した（図１Ｃ）。ＳＯＳ応答の選択的抑制は、ｐＩＮＦ３によるＵＢＰ保持率の適度な増大をもたらしたが、この増大は、ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯで観察された場合よりも低かった。ｐＩＮＦ４およびｐＩＮＦ５では、選択的ＳＯＳ抑制は、ＵＢＰ保持率の中程度の増大しかもたらさず、これはｒｅｃＡ  ＳＳＯで観察された場合よりもかなり低いものであった。これらの結果は、ＲｅｃＡによって媒介されたＵＢＰ損失の大部分が、ＲＥＲを介してかつＳＯＳ応答の誘発を介さずに、生じることを実証する。
【０２０２】
ＰｏｌＩＩはＵＢＰを含有するＤＮＡの複製に関与する
データは、ＵＢＰ損失の多くがＲＥＲを介して媒介されることを示唆するが、ｌｅｘＡ（Ｓ１１９Ａ）ＳＳＯによるＵＢＰ保持率の僅かな配列特異的増加は、１つまたはそれ以上のＳＯＳ調節タンパク質も寄与する可能性があることを示唆する。３種のＳＯＳ調節ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｏｌＩＩ、ＰｏｌＩＶ、およびＰｏｌＶの関与を調査した。確かに、ＰｏｌＩＶおよびＰｏｌＶは、「非命令的」損傷ヌクレオチドでのＤＮＡ合成を媒介するそれらの能力が周知である、「損傷乗り越え」ポリメラーゼである。しかし、ｄｉｎＢおよびｕｍｕＣＤ（それぞれ、ＰｏｌＩＶ、およびＰｏｌＶの前駆体をコードする）の欠失は、ｐＩＮＦ１またはｐＩＮＦ２のいずれかでＵＢＰ保持率に影響を及ぼさなかった（図１Ｄ）。ΔｄｉｎＢΔｕｍｕＤＣ  ＳＳＯとは対照的に、ｐｏｌＢ（ＰｏｌＩＩをコードする）の欠失は、ｐＩＮＦ１およびｐＩＮＦ２の両方でＵＢＰ損失の劇的な増大をもたらした（図１Ｄ）。全体としてこれらのデータは、ＲＥＲが、ＵＢＰ損失への主な経路を構成すること、およびＰｏｌＩＩが、ＵＢＰ保持率への重要な経路を提供することを実証する。ＰｏｌＩＩの生成は、ＳＯＳの誘発によって増加するが、データは、その有益な役割が、付随して誘発されたＲＥＲの有害な影響によって失われることを示唆する。
【０２０３】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩもＵＢＰを含有するＤＮＡの複製に関与する
低減されたが依然として検出可能な、ΔｐｏｌＢ  ＳＳＯでのＵＢＰの保持率は、ＰｏｌＩＶおよびＰｏｌＶをコードする遺伝子が欠失するごく僅かな影響と共に、残りのＤＮＡポリメラーゼ、ＰｏｌＩおよびＰｏｌＩＩＩの１つまたは両方もＵＢＰの保持率に関与しなければならいことを強力に示唆する。ＰｏｌＩまたはＰｏｌＩＩＩがＵＢＰを含有するＤＮＡの複製に関与するか否かを特に検査する場合、それらの３’−５’エキソヌクレアーゼ（「プルーフリーディング」）活性が変異を介して（それぞれ、ＰｏｌＩｅｘｏ−、ｐｏｌＡ（Ｄ４２４Ａ、Ｋ８９０Ｒ）、およびＰｏｌＩＩＩｅｘｏ−、ｄｎａＱ（Ｄ１２Ｎ））排除されたまたは損なわれた株を構成し特徴付けた（図４および図６）。ＰｏｌＩエキソヌクレアーゼ活性の欠失はＵＢＰ保持率に対して効果を発揮しなかったが、ＰｏｌＩＩＩエキソヌクレアーゼ欠失変異体は、ＵＢＰ保持率の劇的な低減を示した。このデータは、野生型細胞において、ＰｏｌＩではなくＰｏｌＩＩＩが、ＵＢＰを含有するＤＮＡの複製に関与することを明らかに示す。
【０２０４】
ＰｏｌＩまたはＰｏｌＩＩＩ変異体の任意の効果がＰｏｌＩＩおよび／またはＲＥＲの活性によってマスクされたか否かを決定するために、ＵＢＰ保持率を、ΔｐｏｌＢ、またはΔｐｏｌＢΔｒｅｃＡ  ＳＳＯで検査した。結果は、ＵＢＰがΔｐｏｌＢΔｒｅｃＡ  ＳＳＯで十分保持されたことを示し、Ｐｏｌ  ＩＩ以外のポリメラーゼが、ＲＥＲ媒介型損失との競合なしで高レベルのＵＢＰ保持を媒介できることを実証する（図１Ｄ）。ＰｏｌＩＩＩエキソヌクレアーゼ変異体は、ΔｐｏｌＢおよびΔｐｏｌＢΔｒｅｃＡ  ＳＳＯの両方で減少したＵＢＰ保持率を再び示した。しかし、野生型細胞とは対照的に、ＰｏｌＩエキソヌクレアーゼ活性の欠失は、ΔｐｏｌＢおよびΔｐｏｌＢΔｒｅｃＡ  ＳＳＯで著しいかつ反対の効果を発揮し、その保持率はそれぞれ増加し減少した。これらのデータは、ＰｏｌＩＩに加え、ＰｏｌＩＩＩがＵＢＰの保持率に関与することを実証し、ＲＥＲが存在しない場合にはＰｏｌＩも同様である。
【０２０５】
ＵＢＰを含有するＤＮＡの複製のためのモデル
特定の理論に拘泥するものではないが、本明細書に記述される結果は、大腸菌ＳＳＯでｄＮａＭ−ｄＴＰＴ３  ＵＢＰを含有するＤＮＡを複製するための下記のモデルを示唆する（図２）。ＰｏｌＩＩＩを持つレプリソームが、前進的リーディングまたはラギング鎖複製中に非天然ヌクレオチドに遭遇する場合、ＰｏｌＩＩＩは、天然または非天然ヌクレオチドのいずれかを組み込む。天然ヌクレオチドが組み込まれる場合、プルーフリーディングの速度は、継続される伸長に競合し、おそらくはこの伸長よりも効率的であり、したがって天然ヌクレオチドは一般に、ＰｏｌＩＩＩのプルーフリーディング活性を介して除去される。しかし、正しいＵＢＰが合成された場合、より効率的な伸長が除去を防止し、レプリソームがＤＮＡを合成し続ける。ポリメラーゼから出て行くにつれ、新生二本鎖はＭＭＲ複合体によってスキャンされ、プルーフリーディングを逃れた任意のミス対合天然ヌクレオチドを優先的になくすことによってＵＢＰ保持率をさらに増大させる。
【０２０６】
さらに正しいＵＢＰの伸長は、天然合成よりもそれほど効率的ではないようなので、ＰｏｌＩＩＩは解離する可能性もある。止めたフォークは、鋳型内で非天然ヌクレオチドの直前で終端する伸長鎖の場合のように、現時点ではＲＥＲの基質であり、同種天然配列を使用して合成を再開し、したがってＵＢＰ損失に関する支配的メカニズムを提供する。しかし、ＲｅｃＡ媒介型ＲＥＲとの競合で、ＰｏｌＩＩは、止めたフォークを救済することができ、高いＵＢＰ保持率で合成を再開し、その後、おそらくはＰｏｌＩＩＩをもたらして正常な複製フォークの再確立をもたらす。ＰｏｌＩの関与は、より複雑である。野生型細胞において、ＰｏｌＩは、ＵＢＰを含有するＤＮＡの複製に関与するように見えない。対照的に、ＰｏｌＩＩおよびＲｅｃＡが非存在であると、ＰｏｌＩは関与せず、それに応じてＰｏｌＩエキソヌクレアーゼ活性の欠失が、減少したＵＢＰ保持率をもたらす。しかし、エキソヌクレアーゼ活性がなくなると、ＰｏｌＩは、ＰｏｌＩＩがなくなった場合に関与することができ、この場合はＲＥＲとの競合によって保持率が増大する。
【０２０７】
ＰｏｌＩＩには、２つの推定される役割があることが認められ、その役割とは：（１）効率的に伸長できないミス対合をＰｏｌＩＩＩが合成した後に、止めたフォークをＰｏｌＩＩが救済する場合には、複製の再開；および（２）ＰｏｌＩＩがＲＥＲと競合して、鎖間架橋ＤＮＡに対する細胞応答の一部としてＮＥＲによって創出されたギャップを満たすことである。興味深いことに、ＲＥＲと競合するＵＢＰで止めた複製フォークを救済する際のＰｏｌＩＩの喚起された役割は、推定される自然の役割の両方の態様に驚くほど似ている。しかし、ＵＢＰを含有するＤＮＡの複製に対するこの効果は、その排除によりこれまで観察された中で最も有意な表現型である。
【０２０８】
ＳＳＯの最適化
ＵＢＰ保持率は、ＲｅｃＡおよびＰｏｌＩＩの操作を通して最適化することができる。この可能性を調査するために、ｒｅｃＡを失わせて、かつＳＯＳ抑制解除レベルで構成的に発現したＰｏｌＩＩありでまたはなしで、ＳＳＯを最適化した（それぞれ、ΔｒｅｃＡおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ）（図６）。これらの株（ＹＺ３）は、染色体座から最適化されたＰｔＮＴＴ２トランスポーターも発現した（ΔｌａｃＺＹＡ：：ＰｌａｃＵＶ５−ＰｔＮＴＴ２（６６−５７５））（図４）。比較のため、同じ染色体組込みトランスポーターを持つ野生型株（ＷＴ−Ｏｐｔ）を使用した。ＳＳＯを、ｐＩＮＦ１、ｐＩＮＦ５、またはｐＩＮＦ６で形質転換し（図３Ａ）、ｐＩＮＦ６で、その保持率が特に難しい配列にＵＢＰを埋め込み、プラスミドを個々のコロニーから回収してＵＢＰ保持率を特徴付けた。この場合、固体成長培地の選択を導入して、先の実験で決定された平均ＵＢＰ保持率とは対照的に個々のクローンにおけるＵＢＰ保持率の分析を可能にした。ＵＢＰ保持率の分布を、全てのＳＳＯにおける各プラスミドで観察したが、分布は、ＷＴ−Ｏｐｔ  ＳＳＯに比べて、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔで、特にＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯで、より高い保持率へとシフトした。さらに、ＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯのみが、検査した各配列構成における検出できないＵＢＰ損失で、クローンを生成した。特に、このことはｐＩＮＦ６も言えることであり、そのために野生型ＳＳＯでの保持率は検出できず、Ｃａｓ９選択で強化された場合に中程度（＜６０％）でしかなかった。
【０２０９】
遺伝的に最適化されたΔｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯが、染色体へのＵＢＰの組込みを容易にできるか否かを、評価した。ａｒｓＢ座に対して配列ＧＴＡＸＴＧＡ（Ｘ＝ＮａＭ）を標的とする組込みカセットを構成し、ラムダレッド組換えを使用して、カセットをＷＴ−Ｏｐｔの染色体、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ、およびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯに組み込んだ。ＵＢＰ保持率に関する組込み体のスクリーニングは、ΔｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯから、１００％の保持率を有するクローンを特定したが、著しい努力にも関わらず、本発明者らは９１％よりも高いＵＢＰ保持率を持つＷＴ−Ｏｐｔクローンを単離することができず（図７）、これは著しいＵＢＰ損失が、必要とされる成長工程中に生じたことを示唆している。染色体組込みＵＢＰの効果を特徴付けるため、中期対数期細胞の一定分量を、ｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰを含むまたは含まない成長培地に接種した（図３Ｂ、図８）。ΔｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ組込み体は、非天然三リン酸が提供されなかった場合に成長が不十分であり、これは鋳型内の非天然ヌクレオチドを効率的にバイパスするのにＲＥＲが必要とされるモデルと矛盾がなかった。しかし、この成長欠陥は、ｄＮａＭＴＰおよびｄＴＰＴ３ＴＰが提供された場合に、両方のＳＳＯにおいてほぼ完全に排除された。したがって、ｒｅｃＡの欠失およびＰｏｌＩＩの過発現は、適応度に対して最小限の結果しか持たない染色体において、ＵＢＰの高レベルの保持率を容易にする。
【０２１０】
最後に、遺伝的に最適化された株が、染色体組込みＵＢＰの長期安定性を容易にするか否かを、評価した。先の研究は、保持率に関するＣａｓ９媒介選択がないと、長期成長中にプラスミド由来ＵＢＰが失われることを実証した。ＷＴ−Ｏｐｔ、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ、およびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ組込み体を、成長の多くの世代にわたって連続継代し、ＵＢＰ保持率を特徴付けた（図３Ｃ）。ＷＴ−Ｏｐｔでは、ＵＢＰは、約４０世代までゆっくりと失われ、次いでより素早く失われて完全な損失が第９０世代まで観察された。損失の明らかに二相性の動態は、少なくとも１つの追加のプロセスが、さらにＲＥＲに関与することを示唆する。確かに配列決定は、ＵＢＰ保持率の急落の時点でＰｔＮＴＴ２遺伝子を排除した大規模染色体再編を明らかにした（図１０）。ＷＴ−Ｏｐｔ、ΔｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯの両方とは対照的に、ＰｔＮＴＴ２は無傷のままであり、ゲノムＵＢＰの保持率は、特にＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯのときに高いままであり、１３７世代後に５５％超のままであった。
【０２１１】
これらの結果は、ｒｅｃＡ欠失が複製中にＵＢＰ保持率を容易にするだけではなく、長期成長中にトランスポーターの安定性を著しく増大することを実証する。観察された保持率は、９９．６％を超える倍加当たりの忠実度に該当し、これは倍加当たりの細胞のごく僅かな割合（＜０．４％）の、染色体ＵＢＰの損失に該当する。したがって、現行の研究では用いなかったＣａｓ９−エラー排除システムと共に、このエラー予防システムは、広範な配列構成においてＵＢＰの保持率を可能にすべきであり、したがってＵＢＰにより可能になった新しい情報の全体の保存を可能にすべきである。
【０２１２】
地球上の全ての生命の最終共通祖先以来、生物学的情報は、４つのアルファベット文字で保存されてきた。ＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ  ＳＳＯの再プログラムされたレプリソームは、このアルファベットの無制限な拡張に向かって著しい進歩を表し、第１の進歩は細胞自体の最適化を通して媒介された。研究の第１の目標は、ＵＢＰをどのように複製するかを理解すること、およびＳＳＯを最適化するためにその情報を使用することであったが、結果は、困難な複製をどのように正常に管理するかという研究への新規な経路も提供する。例えば、データは、ＵＢＰを含有するＤＮＡのかなりの割合がＰｏｌＩＩＩによって複製されることを示唆するが、かなりの量がそうではないことも明らかに示し、これらの場合には、データは、ＰｏｌＩＩ媒介型複製の再開とＲｅｃＡ媒介型ＲＥＲとの間の興味深い競合を明らかにする。そのような競合は、困難な複製中で一般的とされ、ＰｏｌＩＩの通常の役割を特定する際の難題に関与した可能性がある。さらに、ＭＭＲがＵＢＰを認識することが不可能であることは、螺旋歪みのみが不十分であり、プロセスが、非天然ヌクレオチドで利用可能ではない核酸塩基との特定の相互作用を必要とすることを示唆する。最後に、ｒｅｃＡの欠失によって得られた、増大した遺伝的安定性は、アンバー抑圧を介した遺伝子コードの拡張で方向付けられた方法に関して有意な意味を有することもできるが、それはこれらの方法が、伸長した成長に対して遺伝的不安定性も被るからである。２３これらの興味深い課題とは無関係に、再プログラムされたＳＳＯは、ここで、その染色体内に含まれる増大した生物学的情報のより安定な保持率を可能にし、この情報を、非カノニカルアミノ酸を持つタンパク質の形態で検索できるという先の実証により、合成生物学の中心的な目標−新しい形態および機能を持つ生命の創出を、達成するプラットフォームを提供すべきである。
【実施例２】
【０２１３】
方法および材料
ｐＩＮＦ／ＵＢＰ含有ＤＮＡ構成
ｐＩＮＦ（図Ｓ８）を、下記の改変を有する、既に報告されている３、ｐＵＣＸ２とｄＮａＭ−ｄＴＰＴ３対を含有するインサートｄｓＤＮＡとの、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅアセンブリにより構成した。ＵＢＰ含有ｄｓＤＮＡは、化学的に合成したＵＢＰ含有オリゴヌクレオチド（０．０２５ｎｇ／μＬ）、ＢｓａＩ部位およびベクターホモロジーを導入するプライマー（１μＭ、表Ｓ１）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（１００μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１００μＭ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、ＭｇＳＯ４（１．２ｍＭ）、ＯｎｅＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２５Ｕ／μＬ）、およびＯｎｅＴａｑ標準反応緩衝液（１×、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む、５０μＬのＰＣＲで生成した。反応は、下記の温度レジームを経て、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００システム上で繰り返した（時間の単位ｍｍ：ｓｓ）：［９４℃００：３０｜２５×（９４℃００：３０｜４７℃００：３０｜６８℃０４：００）］。得られたＵＢＰ含有ｄｓＤＮＡを、製造業者の推奨に従い、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。ｐＩＮＦアセンブリの場合、ｐＵＣＸ２（１μｇ）およびインサートＤＮＡを１：４のモル比で、ＡＴＰ（１ｍＭ）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（６．６５Ｕ／μＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＢｓａＩ−ＨＦ（０．６６Ｕ／μＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、およびＣｕｔＳｍａｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（１×、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む８０μＬの反応物中で合わせ、下記の温度レジーム：［３７℃２０分｜４０×（３７℃５分｜１６℃１０分｜２２℃５分）｜３７℃２０分｜５０℃１５分｜７０℃３０分］に供した。次いでＢｓａＩ−ＨＦ（０．３３Ｕ／μＬ）およびＴ５エキソヌクレアーゼ（０．１６Ｕ／μＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、反応物を３７℃で１時間インキュベートして、インサートなしであらゆるｐＵＣＸ２を除去した。この反応物を、３体積の１：１ＤＮＡ洗浄物：ＤＮＡ結合緩衝液と混合し、その後にシリカカラムに結合したこと以外、反応物を製造業者の推奨に従ってＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５を使用して精製した。
【０２１４】
ａｒｓＢ座用のＵＢＰノックインカセット（図Ｓ４）を、ＵＢＰを含有する１５０ｂｐ  ｄｓＤＮＡとｐＫＤ１３のカナマイシン耐性遺伝子とのＰＣＲオーバーラップにより生成した。１５０ｂｐ  ＤＮＡは、上記と同じ反応溶液条件と、下記の温度レジーム（時間の単位ｍｍ：ｓｓ）［９８℃０２：００｜５×（９８℃００：１０｜５０℃００：１０｜６８℃０４：００）｜１５×（９８℃００：１０｜５８℃００：１０｜６８℃０４：００）］とを使用して５０μＬのＰＣＲで生成した。カナマイシン耐性遺伝子アンプリコンを、製造業者の推奨に従いＱ５ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅オフｐＫＤ１３により生成した。長いＤＮＡ（約２００ｂｐまたはそれ以上）の増幅は、ｄＴＰＴ３ＴＰの存在によって阻害される。したがって、ＵＢＰ含有アンプリコンおよびカナマイシン耐性遺伝子アンプリコンのオーバーラップアセンブリＰＣＲを、下記の溶液条件：ＵＢＰ含有アンプリコン（０．０２ｎｇ／μＬ）、カナマイシン耐性遺伝子アンプリコン（０．０２ｎｇ／μＬ）、プライマー（１μＭ、表Ｓ１）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１００μＭ）、ｄＮＴＰ（２００μＭ）、ＭｇＳＯ４（１．２ｍＭ）、ＯｎｅＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０２５Ｕ／μＬ）、およびＯｎｅＴａｑ標準反応緩衝液（１×）で、大規模に行った（反応混合物２ｍＬを、４０の個々の５０μＬ反応物に分割する）。反応物を、下記の温度レジーム（時間の単位ｍｍ：ｓｓ）：［９８℃０２：００｜５×（９８℃００：１０｜５０℃００：１０｜６８℃０４：００）｜１５×（９８℃００：１０｜５８℃００：１０｜６８℃０４：００）］に供した。これらの反応物を溜め、製造業者の推奨に従いＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５を使用して濃縮した。
【０２１５】
遺伝子ノックアウトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ  ＵＢＰ複製
全ての遺伝子ノックアウト（図１および図Ｓ２）を、下記のプロトコールに従いｐＩＮＦ由来ＵＢＰを複製するそれらの能力に関してアッセイした。エレクトロコンピテント細胞を、細胞をペレット化しかつ４℃の滅菌脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）５０ｍＬで２回洗浄することによって、中期対数期細胞（ＯＤ６０００．３５〜０．７）の４５ｍＬの培養物から製造した。洗浄した細胞を、４℃の滅菌脱イオン水に、４０〜６０の最終ＯＤ６００で再懸濁した。細胞５０μＬを、Ｇｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅでアセンブルされたｐＩＮＦ２ｎｇと混合し、エレクトロポレーションキュベット（２ｍｍのギャップ、Ｃａｔ．＃ＦＢ１０２、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移した。エレクトロポレーションは、製造業者の推奨に従い（電圧２５ｋＶ、キャパシタ２．５μＦ、抵抗器２００Ω）、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して行った。形質転換された細胞を、クロラムフェニコール（３３μｇ／ｍＬ）およびリン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ９５０μＬ中で希釈した。希釈した細胞４０μＬを、クロラムフェニコール（３３μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する最終体積２００μＬの２×ＹＴ中でさらに希釈し、１．５ｍＬの試験管に移し、３７℃および２３０ＲＰＭで１時間回収した。回収した細胞１０μＬを、９６ウェルプレートのウェル内で（＃６５５１６１、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ参照）、クロラムフェニコール（３３μｇ／ｍＬ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびリン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する最終体積１００μＬの２×ＹＴ中で希釈した。さらに、回収した細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）およびリン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ寒天（２％）に播いて、形質転換効率を評価した。９６ウェルおよび形質転換効率プレートを、それぞれ４℃および３７℃で一晩（約１２時間）保持した。形質転換効率プレートを検査して、９６ウェルプレート内の全てのサンプルが、冷蔵前に少なくとも５０のコロニー形成単位を受容したことを確実にした。次いで９６ウェルプレートを、３７℃および２３０ＲＰＭに移した。細胞をペレット化し、デカンテーションし、０．６〜０．９２ＯＤ６００に達した後に凍結した。ｉｎ  ｖｉｖｏで複製されたｐＩＮＦを、製造業者の推奨に従いＺＲプラスミドＭｉｎｉｐｒｅｐ−クラシックキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ）および５μｇシリカカラム（Ｃａｔ．＃Ｄ４００３、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して単離し、ビオチン−シフトＰＣＲ分析に進めた（補足情報参照）。この手順は、エレクトロコンピテント細胞の製造から開始して、各ノックアウト株ごとに、少なくとも三重に行った。
【０２１６】
これらの条件下、複製物および株は、ｐＩＮＦ複製実験中に、同一ではなく類似の数の細胞倍加を受けることに、留意すべきである。しかし、複製のｐＩＮＦ非調節起点に起因して、細胞のマッチングは複製物間で倍加し、株は、ｐＩＮＦ複製事象の数のマッチングに対応する。したがって、図１および３Ａのデータは、推定された忠実度とは対照的に保持率％値として報告され（さらなる考察に関する補足情報参照）、そのように解釈されるべきである。
【０２１７】
クローンｐＩＮＦの試験
最適化された株がｐＩＮＦをクローニングする能力を、下記の修正を加えて上述のように評価した（図３Ａ）。回収後、回収された培養物の希釈物を、寒天（２％）、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ上に播いた。プレートを、３７℃で約１２時間インキュベートした。個々のコロニーを採取し、９６ウェルプレートのウェル内で、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ１００μＬに移した。９６ウェルプレートを、４℃で約１２時間保持し、次いで３７℃および２３０ＲＰＭに移した。細胞をペレット化し、デカンテーションし、０．６〜０．９のＯＤ６００に達した後に凍結した。ｉｎ  ｖｉｖｏで複製されたｐＩＮＦを、製造業者の推奨に従い、ＺＲプラスミドＭｉｎｉｐｒｅｐ−クラッシックキットを使用して単離し、ビオチン−シフトＰＣＲ分析に進めた（補足情報参照）。
【０２１８】
これらの実験で使用されたＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ株は（図３Ａ）、前者のｒｅｃＡ座で、ｎｅｏカセットを有したことに留意すべきである（Ｐ＿ｐｏｌＢ（−）ｌｅｘＡ−ｐｏｌＢ＋ＦＲＴ＋ΔｒｅｃＡ＋ＫａｎＲ＋ｌａｃＺＹＡ：：Ｐ＿ｌａｃＵＶ５−ΔΔ（ＣｏＯｐ）ｃｏｌ  ２．１、表Ｓ１）。
【０２１９】
ａｒｓＢでのＵＢＰ組込み
ａｒｓＢ座に関するＵＢＰ組込みカセットを、上述のようにかつ図Ｓ４に示されるように構成した。このカセットの組込みは、下記の修正を加えた標準ラムダレッド組換え２４を使用して行った。ｐＫＤ４６を保有する株の一晩培養物（ＷＴ−Ｏｐｔ、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ、およびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔを、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴに加えたもの）を希釈して、アムピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ中、０．０３ＯＤ６００にした。培養物を、約０．１ＯＤ６００に成長させ、次いで０．４％のＬ−（＋）−アラビノースを誘発させ、約０．４ＯＤ６００まで成長を継続させた。エレクトロコンピテント細胞を、上述のようにこれらの培養物から製造した。エレクトロコンピテント細胞５０μＬを、上述の組込みカセット９６０ｎｇと混合し（１９２ｎｇ／μＬで５μＬ）、上述のように電気穿孔した。形質転換した細胞を、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ１ｍＬの最終体積に希釈し、１．５ｍＬの試験管に移し、３７℃および２３０ＲＰＭで２時間にわたり回収させた。細胞をペレット化し、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、ＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ１１５μＬに再懸濁した。この細胞懸濁液の１５μＬのサンプルを、寒天（２％）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ上に播いた。プレートを、３７℃で１４から２４時間インキュベートした。コロニーを採取し、４８ウェルプレート（＃６７７１８０、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ参照）内で、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、ＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ５００μＬに移した。プレートを、４℃で約１２時間冷蔵した後に３７℃および２３０ＲＰＭでインキュベートし、または直接インキュベートした。０．６〜１ＯＤ６００に達した後、培養物を下記の通りサンプル採取した：１００μＬを、１００μＬのグリセリン（５０％）と合わせ、−８０℃で凍結した；３５０μＬをペレット化し、後のゲノムＤＮＡの単離のために凍結した；５０μＬをペレット化し、２００μＬの脱イオン水で１回洗浄し、ペレット化し、２００μＬに再懸濁した。
【０２２０】
細胞懸濁液を、コロニービオチン−シフトＰＣＲによって分析した（補足情報参照）。ゲノムＤＮＡを、製造業者の推奨に従い、ＰｕｒｅＬｉｎｋゲノムＤＮＡミニキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、高いコロニービオチン−シフトＰＣＲパーセントシフト値（≧８０％）を示すサンプル用に保存した凍結細胞ペレットから単離した。ゲノムＤＮＡを、ビオチン−シフトＰＣＲによって分析した（補足情報参照）。この分析は、全ての遺伝子バックグラウンドに関して、高い保持率クローン（保持率Ｂ≧９０％）を明らかにした。これらの結果は、ＵＢＰの首尾良くなされた染色体組込みと、染色体ＤＮＡでのＵＢＰの著しく高い保持率とを確認したが、細胞は、細胞を高い細胞密度でインキュベートするプロトコールの要件を前提とするなら、組込みプロトコール中にそれらのｄＴＰＴ３ＴＰおよびｄＮａＭＴＰの培地を失うことが疑われた。大腸菌の、活発に成長する培養物は、細胞外ｄＴＰＴ３ＴＰおよびｄＮａＭＴＰを分解して、それらの対応する二および一リン酸およびヌクレオシド種にすることが公知である５。この可能性に対処するために、最高保持率サンプルのグリセロールのストックを使用して、９６ウェルプレートで、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ１００μＬを接種した。培養物を、３７℃および２３０ＲＰＭで、約０．６ＯＤ６００まで成長させた。この培養物からの細胞を、上述のように播き、採取し、成長させ、サンプルとして得た。この「再播種」手順は、検出できない染色体ＵＢＰ損失を持つ（保持率Ｂ＝１００％）ΔｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ  ＳＳＯに関するクローンを、迅速に明らかにした。しかし、ＷＴ−Ｏｐｔ  ＳＳＯに関して１２クローンをスクリーニングしたにも関わらず、保持率Ｂ＞９１％のクローンは発見されなかった。したがって、倍加時間および継代実験用に再播種手順を受けなかったＷＴ−Ｏｐｔ組込み体（保持率Ｂ＝９１％）を使用することを選択する。ΔｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔの場合、倍加時間および継代実験に関して保持率Ｂ＝１００％を持つそれぞれ１つのクローンを選択した。
【０２２１】
これらの実験で使用されるＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ株は（図３Ｂおよび図３Ｃ）、前者のｒｅｃＡ座でｎｅｏカセットを持たなかったことに留意すべきである（Ｐ＿ｐｏｌＢ（−）ｌｅｘＡ−ｐｏｌＢ＋ΔｒｅｃＡ＋ＦＲＴ＋ｌａｃＺＹＡ：：Ｐ＿ｌａｃＵＶ５−ΔΔ（ＣｏＯｐ）ｃｏｌ  １．１、表Ｓ１）。
【０２２２】
株倍加時間の決定
中期対数期細胞ＷＴ−Ｏｐｔ、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ、およびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ  ＳＳＯ、ならびにそれらの対応する染色体ＵＢＰ組込み体（上述）を、下記の手順を使用して製造した。飽和一晩培養物を、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）であってグリセリンストックスタブ（ｓｔａｂ）からのものを含有する２×ＹＴを接種し、３７℃および２３０ＲＰＭで一晩成長させる（約１４時間）ことによって製造した。これらの細胞を、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する５００μＬの２×ＹＴで、０．０３ＯＤ６００に希釈した。成長を、ＯＤ６００によりモニタした。細胞が中期対数期（０．３〜０．５ＯＤ６００）に到達したら、４８ウェルプレート内で、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する５００μＬの２×ＹＴで、またはクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴで、０．０１３ＯＤ６００に希釈し、３７℃および２３０ＲＰＭで成長させた。ＯＤ６００を、３０分ごとに測定した。この手順を、一晩培養物の接種から開始して、各株ごとに三重に行った。
【０２２３】
各実験からのＯＤ６００のデータを分析して、理論細胞倍加時間を得た（図３Ｂおよび図Ｓ５）。指数関数的成長期（０．０１〜０．９）に対応するＯＤ６００測定値を、Ｒバージョン３．２．４を使用した下記の指数関数的成長モデルに当て嵌めた：２５
【数１】
2021508466.tif 000024
【０２２４】
ＯＤｉが、時間（ｔ）でＯＤ６００である場合、ＯＤ０は、所与のデータ集合に関して最小ＯＤ６００値であり、Ｃｇｒｏｗｔｈは、成長定数である。Ｃｇｒｏｗｔｈは、「ｎｌｓ（）」コマンドを使用して当て嵌めた。倍加時間（ＤＴ）を、下記の方程式を使用して計算した：
【数２】
2021508466.tif 000025
【０２２５】
ゲノムＵＢＰを保持する株の継代
ＷＴ−Ｏｐｔ、ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ、およびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ  ＳＳＯ（上述）からの染色体ＵＢＰ組込み体のグリセリンストックスタブを使用して、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ５００μＬを接種した。細胞を、３７℃、２３０ＲＰＭで、中期対数期（０．５〜０．８ＯＤ６００）まで成長させ、次いで４８ウェルプレート内で、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）、ｄＴＰＴ３ＴＰ（３７．５μＭ）、ｄＮａＭＴＰ（１５０μＭ）、およびＫＰｉ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を含有する２×ＹＴ５００μＬ中、０．０３ＯＤ６００まで希釈し、３７℃、２３０ＲＰＭで成長させた。０．０３ＯＤ６００で接種された培養物を、継代に関する出発点（倍加＝０）と見なした。培養物を、約５細胞倍加に相当する１〜１．５ＯＤ６００まで成長させた。０．０３から１〜１．５ＯＤ６００までのこの成長を、１つの継代が約５細胞倍加に相当する１「継代」と見なした。これらのサンプルが１〜１．５ＯＤ６００に達した後、同じ組成の新鮮な培地中で細胞を０．０３ＯＤ６００に希釈することにより、別の継代を開始した。希釈後、１〜１．５ＯＤ６００培養物を、下記の通りサンプル採取した：１００μＬを、１００μＬのグリセリン（５０％）と合わせ、−８０℃で凍結した；３５０μＬをペレット化し、ゲノムＤＮＡの後の単離のために凍結した；および５０μＬをペレット化し、２００μＬの脱イオン水で１回洗浄し、ペレット化し、２００μＬ中に再懸濁した。継代プロセスを、３つ全ての株に関して、合計で約８０細胞倍加に相当する１５継代まで繰り返した。
【０２２６】
継代全体を通して、コロニービオチン−シフトＰＣＲ分析（補足情報参照）を、細胞懸濁サンプルに関して行った。これは、１５継代後に保持率がＷＴ−Ｏｐｔで１０％未満に低下したことを明らかにした。したがって、この株はもはや継代しなかった。対照的に、保持率は、Δｒｅｃ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔにおいて、６０〜８０％で維持された。したがって追加の継代を、これらの株に関して上述のように行った。保持率はここで合計１６継代にわたり変化しないままであった。したがってこれらの株を、継代当たり約１３細胞倍加に相当する、より高い希釈係数で、４つの追加の継代に供した（約０．０００１から１．５ＯＤ６００から成長）。この時点で、ΔｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ組込み体は、約１３０細胞倍加を経験し、ＵＢＰ保持率は、コロニービオチン−シフトＰＣＲ分析によれば４０％超のままであった。他の継代は不要と考えられ、実験は、継代中に集められたゲノムＤＮＡサンプルのより過酷な分析のために停止した。この実験を、ゲノム組込み体グリセリンストックスタブでの培地の接種から開始して三重に行った。
【０２２７】
継代実験の終了後、ゲノムＤＮＡを単離し、ビオチン−シフトＰＣＲによって分析した（図３Ｃ）（補足情報参照）。ＷＴ−ＯｐｔにおけるＵＢＰのゆっくりとした、次いで素早い損失は、多数のプロセスがＵＢＰ損失に関与することを示唆した。ＰｌａｃＵＶ５−ＰｔＮＴＴ２（６６−５７５）は、ＰｔＮＴＴ２の発現が僅かな成長欠陥を引き起こすので、実験中に変異している可能性があることが疑われた３。したがって、変異を通してトランスポーターを不活性化する細胞は、適応度の利益を得ると共に、実験集団を素早く支配することができる。この仮説は、ＷＴ−Ｏｐｔ継代の終わりからの個々のクローンの単離と、精製されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析とを通して調査された（補足情報および図Ｓ７参照）。いくつかのクローンの間を移動するプライマーは、ｃａｔと、ＰｔＮＴＴ２（６６−５７５）を含むｉｎｓＢ−４との間の全ての遺伝子が、これらの細胞において欠失したことを明らかにした。ｉｎｓＢ−４遺伝子は、ＩＳ１トランスポゾンの転位に必要とされる１種または２種のタンパク質をコードする。２６１つのクローンの配列決定は、ＰｔＮＴＴ２（６６−５７５）（Ｔ１４９５）で挿入されたＩＳ１が、１５８９０塩基対欠失に相当することを確認した。
【０２２８】
ＰｔＮＴＴ２（６６−５７５）変異事象の確認後、欠失変異体の出現を、ＷＴ−Ｏｐｔ組込み体継代からのゲノムＤＮＡサンプルのＰＣＲ分析によって評価した（補足情報および図Ｓ７Ｂ参照）。この分析は、ＩＳ−１媒介型ＰｔＮＴＴ２（６６−５７５）欠失事象に対応するサイズのいくつかのアンプリコンが、ＵＢＰ損失の急速期中に、継代サンプルで出現することを明らかにした。
【０２２９】
ＰｏｌＩＩ＋ΔｒｅｃＡ−Ｏｐｔ組込み体の１つの複製物は、ＷＴ−Ｏｐｔ組込み体と同時にＵＢＰを素早く失ったことも観察され、この複製物が継代中にＷＴ−Ｏｐｔ細胞で汚染されていたことを強力に示唆している。この可能性は、コロニーＰＣＲ分析を使用して確認され、この複製物が、ＵＢＰの急速損失に対応する継代でＷＴ−Ｏｐｔ細胞により汚染されるようになったことが明らかにされた（補足情報および図Ｓ６参照）。したがって、この複製物からのデータは、ＷＴ−Ｏｐｔ細胞汚染のないサンプルからしか使用されなかった。
【０２３０】
細菌株およびプラスミド
この研究で使用される全ての株（表Ｓ１；個別の補足ファイルとして提供）を、他に指示されない限り、ラムダレッド組換えを経て大腸菌−ＢＬ２１（ＤＥ３）から構成した。遺伝子ノックアウトカセットは、関連あるプライマー（表Ｓ１）によるＫｅｉｏコレクション株のゲノムＤＮＡまたはｐＫＤ１３のいずれかのＰＣＲ増幅を通して得られた（製造業者の推奨（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に従いＯｎｅＴａｑまたはＱ５を使用して）。機能的遺伝子ノックインカセット、ｐｏｌＡ（Ｄ４２４Ａ、Ｋ８９０Ｒ）およびＰｏｌＩＩ＋（図Ｓ４）を、オーバーラップＰＣＲを経て構成した。株は、ｌａｃＺＹＡ座でのｐＡＣＳ２もしくはｐＡＣＳ２−ｄｎａＱ（Ｄ１２Ｎ）の形質転換またはＰｌａｃＵＶ５−ＰｔＮＴＴ２（６６−５７５）＋ｃａｔカセットのいずれかの組込みを通した、ＸＴＰ移入に有能とされた（図Ｓ１）。ｐＡＣＳ２およびＰｌａｃＵＶ５−ＰｔＮＴＴ２（６６−５７５）＋ｃａｔの構成については、既に記述されている。３  ｐＡＣＳ２−ｄｎａＱ（Ｄ１２Ｎ）は、ＰＣＲアンプリコンのＧｉｂｓｏｎアセンブリにより構成した。ＰｔＮＴＴ２機能を、放射性ｄＡＴＰ摂取アッセイを使用して、全ての関連ある株において確認した。
【０２３１】
エキソヌクレアーゼ欠損ＰｏｌＩおよびＩＩＩ
ＤＮＡ  ＰｏｌＩおよびＩＩＩは、それぞれ、条件付で必須のおよび必須の遺伝子である。したがって、ＳＯＳ調節ポリメラーゼとは異なって、遺伝子ノックアウトにより検査することができなかった。代わりに、これらの酵素に関する３’−５’エキソヌクレアーゼ欠損変異体を構成した。ＰｏｌＩ（ｐｏｌＡ）は、そのエキソヌクレアーゼドメインの活性部位（Ｄ４２４Ａ）を変異させることによって、３’−５’エキソヌクレアーゼを欠損させた。これはラムダレッド組換えの２つの相を経て実現された（図Ｓ４）。第１のｐｏｌＡを切断してその５’−３’エキソヌクレアーゼドメインにした（ポリメラーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼドメインの両方を除去する）。第２のポリメラーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを、Ｄ４２４Ａ変異で再導入した。遺伝子の長さに起因して、ＰＣＲ変異を、組込みに使用されるアンプリコンで発生させた。この結果、Ｋ８９０Ｒ変異が得られた。しかし、Ｋ８９０は、タンパク質の無秩序なループ上の表面露出残基であるので、アルギニンに対するその変異は、タンパク質の機能に最小限の影響を及ぼすことが予測された。さらに、リシンからアルギニンは、残基の近似的な電荷およびサイズを維持する。
【０２３２】
ＤＮＡ  ＰｏｌＩＩＩホロ酵素は、個別のポリメラーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ酵素を持つマルチ酵素複合体である。エキソヌクレアーゼ酵素（ｄｎａＱ）は、その編集作業に加えてＰｏｌＩＩＩホモ酵素で構造的な役割を演ずると考えられる。したがって、ｄｎａＱの欠損はＰｏｌＩＩＩ編集作業を除去するが、代償変異がホロ酵素のその他の部分に加えられない限り、細胞成長も防止する。したがって、プラスミド、ｐＡＣＳ２＋ｄｎａＱ（Ｄ１２Ｎ）からの変異誘発物ｄｎａＱ変異体（Ｄ１２Ｎ）の発現を経て、ＵＢＰ複製におけるＰｏｌＩＩＩの役割を試験することを選択する（図Ｓ１）。マルチコピープラスミドからのｄｎａＱ（Ｄ１２Ｎ）の発現は、遺伝子の染色体コピーからの野生型ＤｎａＱの発現に関わらず、大腸菌で優性変異誘発物表現型を生成することが既に実証されている。ｐＡＣＳ２＋ｄｎａＱ（Ｄ１２Ｎ）は、自然遺伝子プロモーターの両方によりｄｎａＱ（Ｄ１２Ｎ）を発現する。
【０２３３】
ＳＳＯの遺伝子最適化からの適応コスト
ｒｅｃＡの欠失は、多くの配列でＵＢＰの大幅に改善された保持率を、明らかにもたらす。これは非常に望ましいが、ｒｅｃＡ欠失は、いくらかの適応コストを保持する。ｒｅｃＡにおける株の欠失は、ＤＮＡ損傷に対してより低い耐性を有することが公知である。しかし、ＳＳＯの全ての近々の適用例が高度に制御された環境で生じるなら、本発明者らは、これに問題があるとは予想されない。さらに、ｒｅｃＡ欠失は、図Ｓ５で測定したときに、倍加時間を増加させる。しかし、これらの実験は、ｄＮａＭＴＰとｄＴＰＴ３ＴＰとの存在下または非存在の下で成長する染色体ＵＢＰを保持する株に関して成長速度の相違を示すために、主に行った。いくつかの要因が、測定された倍加時間に対して直接関係する株の適応度を複雑にする。主な難題は、溶液中の細胞が、細胞数を実際に増加させるのではなくその形態を変えることによって、ＯＤ６００を増大させる可能性があることである。それとは無関係に、Ｌ  ｒｅｃＡ−Ｏｐｔ（ＷＴ−Ｏｐｔよりも約１８分長い）に関して測定された倍加時間は、ｒｅｃＡの欠失が、著しく低減した成長速度をもたらすことを示唆する。しかし、この修正の利益が与えられれば、この低減した成長速度は許容されるトレードオフになる。図８におけるいくつかのデータポイントを合理化することが難しいことも、留意すべきである。例えば、染色体ＵＢＰの存在は、Ｌ  ｒｅｃＡ−ＯｐｔおよびＰｏｌＩＩ＋Ｌ  ｒｅｃＡ−Ｏｐｔで倍加時間を減少させるようである。
【０２３４】
ビオチン−シフト分析
ｐＩＮＦおよび染色体ＤＮＡでのＵＢＰの保持を、下記の修正を加えて前述のように測定した。全てのビオチン−シフトＰＣＲを、プライマー（１  ｉｉＭ、表Ｓ１）、ｄ５ＳＩＣＳＴＰ（６５  ｉｉＭ）、ｄＭＭＯ２ｂｉｏＴＰ（６５μＭ）、ｄＮＴＰ（４００  ｉｉＭ）、ＭｇＳＯ４（２．２ｍＭ）、ＯｎｅＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．０１８Ｕ／ｉｉＬ）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（０．００７Ｕ／ｉｉＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（１×、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＯｎｅＴａｑ標準反応緩衝液（１×）を含む１５−ｉｉＬ体積中で実験した。ビオチン−シフトＰＣＲに添加されたサンプルＤＮＡの量および温度レジームは、サンプルの性質に応じて変化させた。
【０２３５】
遺伝子ノックアウト実験からのｉｎ  ｖｉｖｏ複製ｐＩＮＦでは（図１）、ｐＩＮＦおよびｐＡＣＳ２  ＤＮＡがＺＲプラスミドＭｉｎｉｐｒｅｐ−Ｃｌａｓｓｉｃキットによって共に捕捉されるので、ｐＩＮＦ  ＤＮＡの正確な濃度を決定できなかった。したがって、精製されたサンプルの０．５ｔｉｌ（約３ｎｇのｔｏｔａｌ  ＤＮＡ）を、ビオチンシフトＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡとして使用した。反応物を、ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ実時間ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）において、下記の温度レジームに供した（時間の単位ｍｍ：ｓｓ）：［９６℃０２：００｜１２〜１８×（９６℃００：１５｜４８℃００：１５｜６８℃０４：００）］。反応の進行を、ＳＹＢＲグリーンＩ蛍光によってモニタし、反応を停止させ、反応物がＰＣＲの対数期を出た直後（典型的には１７サイクル）、６８℃の工程の終わりに４℃で保存した。クローンｐＩＮＦ実験では（図３Ａ）、精製されたプラスミドＤＮＡ３ｎｇを、ビオチン−シフトＰＣＲ分析用の鋳型ＤＮＡとして使用した。反応物を、同じ温度レジームに供し、上記のようにモニタした。
【０２３６】
Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ構成ｐＩＮＦおよびＵＢＰ含有オリゴヌクレオチドを、ビオチン−シフトＰＣＲ用の鋳型ＤＮＡとして、サンプルを、それぞれ１ｎｇおよび７．５ｐｇ使用して、上述のように増幅した。
【０２３７】
染色体ＵＢＰ実験では、精製されたゲノムＤＮＡの、コロニービオチンシフトＰＣＲおよびビオチンシフトＰＣＲ増幅を共に、行った。コロニービオチンシフトＰＣＲでは、細胞懸濁液２ｔｉＬ（上記参照）を、鋳型としてビオチンシフトＰＣＲに添加した。反応物を、下記の温度レジームに供し、上記のようにモニタした（時間の単位ｍｍ：ｓｓ）：［９６℃０２：００｜５×（９６℃００：１５｜６０℃００：１５｜６８℃０４：００）｜２０〜２２×（９６℃００：１５｜４８℃００：１５｜６８℃０４：００）］。精製されたゲノムＤＮＡのビオチンシフトＰＣＲ増幅の場合、精製されたゲノムＤＮＡ  ３０〜１２５ｎｇを、ビオチンシフトＰＣＲ用の鋳型として使用した。これらの反応物を、下記の温度レジームに供し、上記のようにモニタした（時間の単位ｍｍ：ｓｓ）：［９６℃０２：００｜５×（９６℃００：１５｜６０℃００：１５｜６８℃０４：００）｜１０〜１６×（９６℃００：１５｜４８℃００：１５｜６８℃０４：００）］。
【０２３８】
上述のビオチンシフトＰＣＲのいずれかからのビオチン標識アンプリコンのパーセンテージを、ビオチン−シフトＰＣＲ  １ｔｉｌと、ストレプトアビジン２．５ｔｉｌ（２ｔｉｇ／μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＰｕｒｐｌｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅ  １ｔｉｌ（６×、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とを混合し、ストレプトアビジン−ＤＮＡ複合体を、天然６％ポリアクリルアミドゲル上で分解することによって決定した。ゲルを、１×ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む５０ｍＬのＴＢＥ中で染色した。ゲルを、５２０ＤＦ３０  ６２ｍｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）フィルターを備えたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で撮像した。画像露光時間を制限して、目的の帯域での画素に関するＣＣＤの飽和を防止した。ＤＮＡおよびストレプトアビジン−ＤＮＡバンドの蛍光強度を、局所バックグラウンド除去を使用するＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアｖ４．６．９（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量した。次いでパーセントシフト（Ｓ）を、ＤＮＡ（ＶＤＮＡ）およびストレプトアビジン−ＤＮＡ（ＶＳＡ−ＤＮＡ）バンドの画素体積に基づいて、各サンプルごとに計算した。
【０２３９】
ビオチン−シフトＰＣＲ分析によるＵＢＰ保持率の定量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ構成ＵＢＰ含有ＤＮＡのシフト値に対して、サンプルシフト値の正規化を必要とする。遺伝子ノックアウトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ複製実験では（図１）、サンプルのパーセントシフト値（ＳＳ）を、ｉｎ  ｖｉｖｏ複製実験（保持率Ａ）を開始するのに使用したＧｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅアセンブルｐＩＮＦ（ＳＧＧ）のパーセントシフトに対して正規化した。
【０２４０】
ｄＴＰＴ３−ｄＮａＭおよび関連する類似体は、高い忠実度で１０かつ限られた配列構成バイアスで１１、ＰＣＲにおいて複製されることが実証されてきたが、ＵＢＰは、ＰＣＲにおいて、ある頻度で変異する。したがって、ＰＣＲ発生ＵＢＰ含有ＤＮＡのＧｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅアセンブリによるｐＩＮＦ生成は、いくらかの変異体、完全に天然のｐＩＮＦの生成をもたらす。図１に提示される実験が、個々のｐＩＮＦ形質転換体を単離しなかったなら、これらの完全に天然のｐＩＮＦは、実験細胞に形質転換し、ＵＢＰ含有ｐＩＮＦと一緒に複製されることになる。このことは、上限を、所与のサンプルに関する理論的最大パーセントシフト値に置く。ＵＢＰ損失がｉｎ  ｖｉｖｏで生じない場合、ｉｎ  ｖｉｖｏサンプルのパーセントシフトは、実験を開始するのに使用されるＧｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅアセンブルｐＩＮＦの場合に等しくなる（保持率Ａ＝１００％）。いくつかの複製物（特に、ΔｒｅｃＡバックグラウンド）は、１００％保持率Ａを示した。このことは、Ｇｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅアセンブルｐＩＮＦのサンプル採取から得られるようである。形質転換が、ＵＢＰ含有プラスミドのみの形質転換を図らずももたらし、かつ細胞が、ＵＢＰ損失のないこれらのプラスミドを複製する場合、ＳＳのＳＧＧに対する正規化は、１００％よりも大きい値をもたらすことになる。ＵＢＰ複製が、完全な忠実度で生じる場合、同じ論理が、Ｇｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅアセンブルｐＩＮＦの任意のサンプル採取に適用され、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ生成物よりも高いパーセンテージのＵＢＰ含有ｐＩＮＦを、細胞内でもたらす。したがって、このことは、高いＵＢＰ保持率に起因して、ΔｒｅｃＡ株において最も明らかである。
【０２４１】
クローンｐＩＮＦおよび染色体ＵＢＰ実験（図３）は、個々のｐＩＮＦ形質転換体を試験した。したがってＰＣＲ変異した完全天然ｐＩＮＦは、ＵＢＰ含量を示さない（ＳＳ＝０％）個々のクローンを生成することができるが、ＵＢＰ含有ｐＩＮＦを受容するその他のクローンの保持率に影響を及ぼさない。したがって、ＵＢＰ含有ｐＩＮＦを受容しかつ忠実に複製するＳＳＯは、化学合成されたＵＢＰ含有オリゴヌクレオチドのビオチン−シフトＰＣＲ分析のシフト値（１００％のＵＢＰ含量を有すると想定される）と一致するシフト値を、有すると予測することができる。サンプルシフト値を、図３に示される実験に関する保持率の値（保持率Ｂ）に変換するために、サンプルシフト値（ＳＳ）を、化学合成されたＵＢＰ含有オリゴヌクレオチド（ＳＯ）のシフト値に対して正規化した。ＵＢＰ損失がｉｎ  ｖｉｖｏで生じない場合、ｉｎ  ｖｉｖｏサンプルのパーセントシフトは、化学合成されたＵＢＰ含有オリゴヌクレオチドの場合（保持率Ｂ＝１００％）に等しくなる。
【０２４２】
外れ値および低いＧｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅアセンブルｐＩＮＦ除去率
集められた全てのデータを、下記を例外として提示する。１つの外れ値（Ｇｒｕｂｂｓ試験による）を、図１Ｂから除去した。このデータポイントは、ＴＣＡＸＡＧＴ配列を複製するΔｕｖｒＣ変異体に関して保持率がないことを示した。上述のように、図１の実験を開始するのに使用されるＧｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅアセンブルｐＩＮＦのＵＢＰ保持率は、上限を、ｉｎ  ｖｉｖｏ複製後に実現可能な保持率に置く。いくつかのＧｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅアセンブルｐＩＮＦの製造は、非常に低い保持率を示した。これらの構成体により集められたｉｎ  ｖｉｖｏ複製データは、提示されていない。特に、データは、Ｇｏｌｄｅｎ  ＧａｔｅアセンブルｐＩＮＦの％シフト値が、各配列に関する下記のカットオフ：ＧＴＡＸＡＧＡ−６０％、ＴＣＡＸＡＧＴ−７０％、ＴＣＧＸＧＧＴ−５５％、ＴＣＴＸＧＧＴ−５０％、ＴＣＣＸＣＧＴ−５５％、およびＴＣＣＸＧＧＴ−５５％よりも下である場合、廃棄された。
【実施例３】
【０２４３】
ＩＳ１のノックアウトはヌクレオシド三リン酸トランスポーターＰｔＮＴＴ２の安定性を増大させる
輸送可能なエレメント、ＩＳ１の欠失が、長期成長中に、ヌクレオシド三リン酸トランスポーター、ｐｔＮＴＴ２の増大した安定性（活性により明らか）に関与したか否かを評価するために、ＹＺ３およびΔＩＳ１を、２×ＹＴ＋５０ｍＭ  ＫＰｉ＋５ｕｇ／ｍＬクロル（培地）中で三重に連続継代し、ｐｔＮＴＴ２活性に関してアッセイした（Ｒａｄ／ＯＤ６００）。継代１は、グリセリンストックスタブを含む培地７００ｕＬの接種を通して開始した。培養物を一晩（約１５時間）成長させて、飽和させた。細胞を、新鮮な培地７００ｕＬ中に、３５０倍に希釈した。これを合計６継代繰り返した。次いで細胞を、さらに４回継代し、その希釈係数は３５０，０００倍まで増加した。継代した集団ｐｔＮＴＴ２の活性の評価は、ΔＩＳ１株が、おそらくはＩＳ１媒介型ＰｔＮＴＴ２欠失経路の排除を通して、長期成長中に、より大きいｐｔＮＴＴ２活性を維持することを実証する。ＰｔＮＴＴ２の欠失は、非天然塩基対（ＵＢＰ）の損失に関与したので、これらの結果は、ＩＳ１媒介型ｐｔＮＴＴ２欠失経路に欠ける、操作された宿主細胞または半合成生物が、非天然塩基対の増大した保持率を示すことになり、したがって、非天然アミノ酸を含むポリペプチド、ならびにそれらをコードする核酸分子の生成の増大を示唆する。
【０２４４】
本開示の好ましい実施形態について、本明細書で示し記述してきたが、そのような実施形態は単なる例示として提供されることが当業者に明らかにされよう。数多くの変更例、変形例、および置換例が、本開示から逸脱することなくここで当業者なら思い浮かべるであろう。本明細書に記述される本開示の実施形態の様々な代替例を、本開示の実施に際して用いられることが、理解されるべきである。下記の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、それによって、これらの特許請求の範囲内にある方法および構造とそれらの均等物が包含されることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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