(57)【要約】  ［配列番号１］のアミノ酸配列又はそのバリアントを有するＳ１Ｈペプチドを使用する、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を阻害するための及びｈＧＨ媒介障害を処置するか又は予防するための組成物及び方法が説明されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１Ｈ［配列番号１］のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であり、且つＳ１Ｈペプチド中の保存的置換アミノ酸の置換のみで前記アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド又は天然には存在しないポリペプチド。
【請求項２】
Ｓ１Ｈ［配列番号１］のアミノ酸配列からなる、単離ポリペプチド又は天然には存在しないポリペプチド。
【請求項３】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内の小さく正しく折り畳まれたα−ヘリックスを模倣するＳ１Ｈペプチド又はその配列バリアント若しくは構造（環状）バリアントを含む、組成物。
【請求項４】
前記Ｓ１Ｈペプチドは、ヒト成長ホルモンレセプター（ｈＧＨＲ）と相互作用するｈＧＨの部位１内の領域である残基３６〜５１の間での前記ｈＧＨの配列模倣物である、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
Ｓ１Ｈペプチドは［配列番号１］を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、又は担体をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
対象のｈＧＨ媒介疾患と闘うための治療法であって、
アミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなるＳ１Ｈペプチドの有効な量を対象に投与して、前記対象中でのｈＧＨ作用を阻害するステップ
を含む、上記方法。
【請求項８】
対象中でのＳＴＡＴ５のリン酸化を阻害する方法であって、
アミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなるＳ１Ｈペプチドの有効な量を投与して、ＳＴＡＴ５のリン酸化を阻害するステップ
を含む、上記方法。
【請求項９】
対象中でのｈＧＨタンパク質作用を阻害する方法であって、
アミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなるＳ１Ｈペプチドの有効な量を対象に投与して、前記対象中でｈＧＨタンパク質を阻害するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１０】
ｈＧＨ関連障害を処置するか、予防するか、又は改善する方法であって、
アミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなるＳ１Ｈペプチドの有効な量を必要な対象に投与して、前記対象のｈＧＨ関連障害を処置するか、予防するか、又は改善するステップ
を含む、上記方法。
【請求項１１】
対象に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に由来する部位１ループペプチドを含むペプチドの治療上有効な量を投与するステップを含む、前記対象中でｈＧＨを阻害する方法であって、前記ペプチドは、ｈＧＨを阻害し、且つｈＧＨペプチド模倣物である、上記方法。
【請求項１２】
前記ペプチドを、薬学的に許容される担体と共に投与する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペプチドを、経口投与するか、経鼻投与するか、局所投与するか、静脈内投与するか、腹腔内投与するか、髄腔内投与するか、又は脳室内投与する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象はヒトである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象は脊椎動物である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象は哺乳動物である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｓ１Ｈペプチドは配列番号１からなる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記バリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対する少なくとも５０％の配列同一性を有するか、前記バリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するか、前記バリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するか、前記バリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又は前記バリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物及び／又は方法。
【請求項１９】
前記ｈＧＨ関連障害は、
先端巨大症；加齢黄斑変性症；がん；糖尿病；巨人症、血管眼疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、及び鎌状赤血球貧血の網膜症；並びに腎症
の内の１つ又は複数である、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物及び／又は方法。
【請求項２０】
成長ホルモン作用を阻害するための合成ペプチドの使用であって、前記合成ペプチドはアミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなる、上記使用。
【請求項２１】
成長ホルモン作用を阻害するための合成ペプチドの使用であって、前記合成ペプチドは残基３６〜５１の間でｈＧＨを模倣する、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]本出願は、２０１８年７月１１日に３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１１（ｂ）下で出願された米国仮出願第６２／６９６，４５８号に対する優先権を主張し、この明細書の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
[0002]本発明は、政府の支援を受けることなく行われた。政府は、本発明では権利を有しない。
配列表
[0003]本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており且つ全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年７月４日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、名称が３８３４＿６０２６４−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＯＵ−１８０１７＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが５，０９３バイトである。
【背景技術】
【０００２】
[0004]ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、細胞の成長、生殖、及び再生等を含む身体内の多くの生理作用を制御することにより重要な内分泌メディエータとして機能する１９１個のアミノ酸のペプチドである。ＨＧＨは、ｈＧＨレセプター（ｈＧＨＲ）との機能的相互作用を必要とする４つの主なヘリックス（Ａ〜Ｄ）を含む。過剰なｈＧＨ活性は、制御されていない骨及び臓器の成長を特徴とする症候群である先端巨大症の発症をもたらす可能性がある。先端巨大症は、未処置のままであると、骨の肥厚及び臓器の肥厚を引き起こす可能性がある。同様に、いくつかのタイプのがんでは、高レベルのｈＧＨが関与している。結果的に、ｈＧＨ作用を選択的に阻害し得る分子の開発に大きな関心が示されている。
【０００３】
[0005]合成ペプチドは、治療に関連するタンパク質−タンパク質相互作用を標的とするために、低分子及び大きいタンパク質の実行可能な代案を提供する。実際には、ペプチドベースの薬物は、潜在的な治療薬としての開発を容易にする固有の「中間的な余地」を占めている。例えば、長さが５０個のアミノ酸未満のペプチドを容易に合成し、実験室での化学合成手順により生成し得る。さらに、ペプチドを、安定した三次元構造へと折り畳むことで、潜在的な阻害剤を設計するための足場を提供するタンパク質相互作用ドメインを模倣するように操作し得る。これらの固有の特性のために、ペプチドベースの分子を、理論上、ほぼどんな生体分子相互作用も標的とするために開発し得る。
【０００４】
[0006]成長ホルモン作用の高度に選択的な阻害剤又はアンタゴニストを開発することが望ましいだろう。
[0007]この節で開示されている背景技術が先行技術を法的に構成することを認めるものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0008]第１の態様では、Ｓ１Ｈ［配列番号１］のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であり且つＳ１Ｈペプチド配列中の保存的置換アミノ酸の置換のみでこのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド又は天然には存在しないポリペプチドが本明細書で説明されている。
【０００６】
[0009]別の態様では、Ｓ１Ｈ作用のアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド又は天然には存在しないポリペプチドが本明細書で説明されている。
[0010]別の態様では、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）内の小さく正しく折り畳まれたα−ヘリックスを模倣するＳ１Ｈペプチド又はそのバリアントを含む組成物が本明細書で説明されている。
【０００７】
[0011]ある特定の実施形態では、このＳ１Ｈペプチドは、ヒト成長ホルモンレセプター（ｈＧＨＲ）と相互作用するｈＧＨの部位１内の領域である残基３６〜５１の間でのｈＧＨの領域の配列模倣物である。
【０００８】
[0012]ある特定の実施形態では、このＳ１Ｈペプチドは、［配列番号１］を含む。
[0013]ある特定の実施形態では、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、又は担体をさらに含む。
【０００９】
[0014]別の態様では、対象のヒトｈＧＨ媒介疾患と闘うための治療法であって、アミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなるＳ１Ｈペプチドの有効な量を対象に投与して、この対象中でのｈＧＨ作用を阻害するステップを含む方法が本明細書で説明されている。
【００１０】
[0015]別の態様では、対象中でのＳＴＡＴ５のｈＧＨにより誘発されるチロシンリン酸化を阻害する方法であって、アミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなるＳ１Ｈペプチドの有効な量を投与して、ＳＴＡＴ５のリン酸化を阻害するステップを含む方法が本明細書で説明されている。
【００１１】
[0016]別の態様では、対象中でのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）タンパク質作用を阻害する方法であって、アミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなるＳ１Ｈペプチドの有効な量を対象に投与して、この対象中でｈＧＨタンパク質を阻害するステップを含む方法が本明細書で説明されている。
【００１２】
[0017]別の態様では、ｈＧＨ関連障害を処置するか、予防するか、又は改善する方法であって、アミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなるＳ１Ｈペプチドの有効な量を必要な対象に投与して、この対象のｈＧＨ関連障害を処置するか、予防するか、又は改善するステップを含む方法が本明細書で説明されている。
【００１３】
[0018]別の態様では、対象に、ｈＧＨで見出される部位１ヘリックスペプチドを含むペプチドの治療上有効な量を投与するステップを含む、対象中でｈＧＨ作用を処置する方法であって、このペプチドは、ｈＧＨを阻害し、且つｈＧＨペプチド模倣物である、方法が本明細書で説明されている。
【００１４】
[0019]ある特定の実施形態では、この組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、又は担体をさらに含む。
[0020]ある特定の実施形態では、このペプチドを、経口投与するか、経鼻投与するか、局所投与するか、静脈内投与するか、腹腔内投与するか、髄腔内投与するか、又は脳室内投与する。
【００１５】
[0021]ある特定の実施形態では、この対象は、ヒトである。
[0022]ある特定の実施形態では、この対象は、脊椎動物である。
[0023]ある特定の実施形態では、この対象は、哺乳動物である。
【００１６】
[0024]ある特定の実施形態では、このＳ１Ｈペプチドは、配列番号１からなる。
[0025]ある特定の実施形態では、このバリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するか、このバリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するか、このバリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するか、このバリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するか、又はこのバリアントは、Ｓ１Ｈのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００１７】
[0026]ある特定の実施形態では、このｈＧＨ関連障害は、先端巨大症；加齢黄斑変性症；がん；糖尿病；巨人症、血管眼疾患（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｙｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、及び鎌状赤血球貧血の網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ）；腎症；糖尿病誘発腎症（糸球体硬化症）、神経変性、並びにがん内の１つ又は複数である。
【００１８】
[0027]別の態様では、ｈＧＨ作用を阻害するための合成ペプチドの使用であって、この合成ペプチドは、アミノ酸配列［配列番号１］又はそのバリアントからなる、使用が本明細書で説明されている。
【００１９】
[0028]別の態様では、ｈＧＨ作用を阻害するための合成ペプチドの使用であって、この合成ペプチドは、残基３６〜５１の間でｈＧＨを模倣する、使用が本明細書で説明されている。
【００２０】
[0029]ある特定の実施形態では、好ましい成長阻害ペプチドは、部位１の表面トポグラフィの改変を特徴とする。これは、ｈＧＨの部位１ヘリックスにおいて完全長ｈＧＨの残基３６〜５１に対応する図１〜２から見られる。
【００２１】
[0030]別の態様では、過剰なｈＧＨの産生を伴う様々な疾患の処置方法であって、Ｓ１Ｈ又はそのバリアントを含むｈＧＨアンタゴニストの有効な量を投与するステップを含む方法が提供される。
【００２２】
[0031]具体的には、この方法は、先端巨大症、巨人症、がん、糖尿病、血管眼疾患（糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、加齢黄斑変性症、鎌状赤血球貧血の網膜症等）、並びに腎症及び神経変性を処置するステップを含む。
【００２３】
[0032]本発明の様々な目的及び利点は、添付の図面を考慮して読まれた場合に、好ましい実施形態の下記の詳細な説明から当業者に明らかになるだろう。
[0033]本特許又は本出願のファイルは、カラーで作成されている１若しくは複数枚の図面、及び／又は１枚若しくは複数枚の写真を含み得る。カラー図面及び／又は写真を含む本特許公報又は本特許出願公報のコピーは、請求及び必要な手数料の支払いにより、米国特許商標庁により提供されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】[0034]二量体化ｈＧＨレセプターに結合したｈＧＨの三次元結晶構造：ｈＧＨ（ピンク色）は、ｈＧＨＲ（灰色）に結合したリボンダイヤグラムとして示される。ｈＧＨの部位１へリックスは、紫色に着色されている。
【図２】[0035]ｈＧＨＲに結合した部位１ヘリックスの拡大。残基３６〜５１は、棒の表現で描写されている。
【図３】[0036]配列番号１の単離Ｓ１Ｈペプチドヘリックスのリボンダイヤグラム。ｈＧＨＲと接触する残基は、緑色に着色されており、且つ矢印で示されている。青色に着色された残基は、ｈＧＨＲと接触しない。色分けされた一次配列を、リボンダイヤグラムの下に示す。
【図４】[0037]Ｓ１Ｈ（３６〜５１）ペプチドの全化学構造。
【図５】[0038]精製されたペプチドＳ１Ｈの代表的な分析用ＨＰＬＣのクロマトグラム。
【図６】[0039]Ｓ１Ｈペプチドの代表的なマススペクトル。算出された質量：２０２５．０４ｍ／ｚ；観測された質量：２０２６．４６ｍ／ｚ。大きいピークは、（Ｍ＋２Ｈ＋）／２  質量：１０１３．５３（ｍ＋２Ｈ＋）／２ｚに対応する。
【図７】[0040]Ｓ１Ｈペプチド及び走査アラニンライブラリの波長依存性円偏光二色性スペクトル。赤色のスペクトルは、ＰＢＳのみ中のペプチドを示し、青色のスペクトルは、３０％ＴＦＥが補充されたＰＢＳ中のペプチドを表す。各ペプチドの一次配列を、ＣＤスペクトルの上に示す。左側の列は配列番号１〜６を示し、右側の列は配列番号７〜１１を示す。
【図８】[0041]本明細書で説明されているペプチドの配列及び質量データ。
【図９】[0042]阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）は、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ヒト黒色腫細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化を下方制御する。
【図１０】[0043]阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）は、ＩＭ９ヒトリンパ芽球細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化を下方制御する。
【図１１】[0044]阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）は、Ｌマウス線維芽細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化を下方制御する。
【図１２Ａ】[0045]ＳＫ−ＭＥＬ−２８ヒト黒色腫細胞中での上方制御するｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化におけるペプチド（Ｓ１Ｈ）のアゴニスト特性のＥＬＩＳＡ分析。
【図１２Ｂ】[0046]ＳＫ−ＭＥＬ−２８ヒト黒色腫細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化の下方制御における阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）のアンタゴニスト特性のＥＬＩＳＡ分析。
【図１３】[0047]ＳＫ−ＭＥＬ−２８ヒト黒色腫細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化の下方制御における阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）及び同じもののアラニン変異体のアンタゴニスト特性のＥＬＩＳＡ分析。矢印は、アンタゴニスト活性の低減を示すペプチド処理を示す。水平線は、市販のｈＧＨＲアンタゴニストＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ（登録商標）による阻害のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
[0048]例示的な実施形態を図示し且つ下記で説明するが、本開示の原理は、現在知られているか否かにかかわらず、任意の数の技術を使用して実行され得ることを最初に理解すべきである。本開示は、図示し且つ下記で説明する例示的な実行及び技術に限定されるべきでは決してない。加えて、別途具体的に言及されない限り、図面に描かれた物品は、必ずしも縮尺通りに描かれていない。
【００２６】
[0049]本開示全体を通して、様々な刊行物、特許、及び公開された特許明細書は、識別引用により参照されている／参照され得る。これらの刊行物、特許、及び公開された特許明細書のそのような開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に説明するために、その全体が参照により本開示に組み込まれる。
【００２７】
[0050]定義
[0051]本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、特定の用語の下記の説明が提供される。
【００２８】
[0052]本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を有する実施形態を包含する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「又は（ｏｒ）」は、別途内容が明確に指示しない限り、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味で概して用いられる。
【００２９】
[0053]本明細書で使用される場合、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は同類のものは、そのオープンエンドの意味で使用され、「含むが限定されない」を概して意味する。「から本質的になる」、「からなる」、及び同類のものは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び同類のものに包含されることが理解されるだろう。
【００３０】
[0054]「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。ペプチド又はポリペプチドは、全ての天然のアミノ酸又は様々な非天然のアミノ酸で構成され得、ＰＴＭ、環状ペプチド、及びこれらの任意の断片又はバリアントを含み得る。本明細書で使用される場合、「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、核酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む。核酸又はポリヌクレオチドは、二本鎖、一本鎖、又は三本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ（ｃＤＮＡを含む）であってもよいし、遺伝的起源又は合成起源のＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよく、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、並びに塩基（例えば、限定されないが、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシル、イノシン、及びキサンチンヒポキサンチン）の任意の組み合わせを含む。核酸又はポリヌクレオチドは、炭水化物、脂質、タンパク質、又は他の物質と組み合わされ得る。好ましくは、核酸はタンパク質をコードする。
【００３１】
[0055]本明細書で使用される場合、核酸の「相補体」は、本明細書では、高ストリンジェンシーの条件下で別の核酸を識別するのに十分な相同性を有するか又はこの別の核酸とハイブリダイズする核酸分子を指す。高ストリンジェンシー条件は、当分野で既知である（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００１）を参照されたい）。ストリンジェントな条件は配列に依存しており、且つ状況に応じて異なり得る。本明細書で使用される場合、用語「ｃＤＮＡ」は、単離ＤＮＡポリヌクレオチド、又はｍＲＮＡ分子若しくはＲＮＡ分子に由来する核酸分子、又はこれらの任意の断片、誘導体、若しくは相補体を指す。ｃＤＮＡは、二本鎖であってもよいし、一本鎖であってもよいし、又は三本鎖であってもよく、組換え的に又は合成的に起源を有してもよく、且つコードの及び／又は非コードの５’配列及び／又は３’配列を表してもよい。
【００３２】
[0056]加えて、「相補的」は、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの領域に完全に相補的なものを意味するだけでなく、ある特定の場合では少なくとも４０％の、ある特定の場合では５０％の、ある特定の場合では６０％の、ある特定の場合では７０％の、少なくとも８０％、９０％、及び９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するものも意味する。ヌクレオチド配列間の相同性の程度を、様々な方法（例えば、アルゴリズム、ＢＬＡＳＴ等）により決定し得る。
【００３３】
[0057]本明細書で使用される場合、核酸及び／又は核酸配列は、これらが共通の祖先の核酸又は核酸配列から天然に又は人工的に由来する場合に、「相同」である。相同性は、一般に、２種以上の核酸若しくはタンパク質（又はこれらの配列）間の配列同一性から推測される。相同性の確立で有用な配列間の同一性の正確なパーセンテージは、相同性を確立するための問題の核酸及びタンパク質により異なる。より高いレベルの配列同一性（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上）も使用して、相同性を確立し得る。配列類似性のパーセンテージを決定する方法（例えば、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴＮ）が一般に利用可能である。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公に利用可能である。
【００３４】
[0058]いくつかの実施形態では、「バリアント模倣物」が提供される。本明細書で使用される場合、用語「バリアント模倣物」は、活性化された配列を模倣するであろう１つ又は複数のアミノ酸を含むものである。あるいは、バリアント模倣物は、不活性化してもよいし、模倣物を含む不活性化産物となってもよい。同様に企図されるのは、バリアント及び誘導体を含むポリペプチドに基づく組成物のいくつかのタイプである。これらには、置換型の、挿入型の、欠失型の、及び共有結合型のバリアント及び誘導体が含まれる。用語「誘導体」は、用語「バリアント」と同義で使用されるが、一般には、参照分子又は出発分子に対して任意の方法で改変されている及び／又は変更されている分子を指す。
【００３５】
[0059]従って、参照配列（特に、本明細書で開示されているポリペプチド配列）に関して置換、挿入及び／又は付加、欠失、並びに共有結合改変を含むポリペプチドをコードすることは、本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明のペプチド配列に、（例えば、Ｎ末端又はＣ末端で）配列タグ又はアミノ酸（例えば、１つ若しくは複数のリジン）を付加し得る。配列タグを、ペプチドの精製又は局在化に使用し得る。リジンを使用して、ペプチドの溶解度を増加させ得るか、又はビオチン化を可能にし得る。あるいは、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択的に欠失させて、トランケート型配列を生じ得る。ある特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基又はＮ末端残基）を、配列の使用（例えば、可溶性であるより大きい配列の一部としての又は固体支持体に連結された配列の発現）に応じて選択的に欠失させ得る。
【００３６】
[0060]「置換型バリアント」は、ポリペプチドを指す場合には、天然配列又は出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており且つ同一の位置で代わりに別のアミノ酸が挿入されているものである。この置換は、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されている単一であってもよいし、同一分子中で２つ以上のアミノ酸が置換されている複数であってもよい。同様に、置換されたアミノ酸は、Ｌバージョン又はＤバージョンの可能性がある。
【００３７】
[0061]本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、同様のサイズ、電荷、又は極性の別のアミノ酸による配列中に通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例として、非極性（疎水性）残基（例えば、イソロイシン、バリン、及びロイシン）の別の非極性残基への置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例として、ある極性（親水性）残基の別のものへ（例えば、アルギニンとリジンとの間、グルアミンとアスパラギンとの間、及びスレオニンとセリンとの間）の置換が挙げられる。加えて、ある塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、若しくはヒスチジン）の別のものへの置換又はある酸性残基（例えば、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸）の別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例として、非極性（疎水性）アミノ酸残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニン）の極性（親水性）残基（例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、若しくはリジン）への置換、及び／又は極性残基の非極性残基への置換が挙げられる。
【００３８】
[0062]「挿入型バリアント」は、ポリペプチドを指す場合には、天然配列又は出発配列中の特定の位置でアミノ酸のすぐ隣に１つ又は複数のアミノ酸が挿入されているものである。アミノ酸の「すぐ隣」は、アミノ酸のアルファ−カルボキシ官能基又はアルファ−アミノ官能基のいずれかに接続されていることを意味する。
【００３９】
[0063]「欠失型バリアント」は、ポリペプチドを指す場合には、天然アミノ酸配列又は出発アミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失型バリアントは、この分子の特定の領域中で１つ又は複数のアミノ酸が欠失されているだろう。
【００４０】
[0064]「共有結合型誘導体」は、ポリペプチドを指す場合には、有機のタンパク質性誘導体化剤若しくは非タンパク質性誘導体化剤、及び／又は翻訳後修飾による、天然タンパク質又は出発タンパク質の改変を含む。共有結合改変は、伝統的に、タンパク質の標的とされるアミノ酸残基と、選択された側鎖若しくは末端残基と反応し得る有機誘導体化剤とを反応させることにより導入されるか、又は選択された組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾のメカニズムを利用することにより導入される。結果として得られる共有結合型誘導体は、生物活性に重要な残基の同定、イムノアッセイ、又は組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の調製を目的とするプログラムで有用である。そのような改変は、当分野での通常の技術の範囲内であり、且つ必要以上の実験を行うことなく実施される。
【００４１】
[0065]「置換型バリアント」は、ポリペプチドを指す場合には、天然配列又は出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており且つ同一の位置で代わりに別のアミノ酸が挿入されているものである。このアミノ酸は、Ｌ立体構造又はＤ立体構造を有する可能性がある。この置換は、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されている単一であってもよいし、同一分子中で２つ以上のアミノ酸が置換されている複数であってもよい。
【００４２】
[0066]本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、同様のサイズ、電荷、又は極性の別のアミノ酸による配列中に通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例として、非極性（疎水性）残基（例えば、イソロイシン、バリン、及びロイシン）の別の非極性残基への置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例として、ある極性（親水性）残基の別のものへ（例えば、アルギニンとリジンとの間、グルアミンとアスパラギンとの間、及びスレオニンとセリンとの間）の置換が挙げられる。加えて、ある塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、若しくはヒスチジン）の別のものへの置換又はある酸性残基（例えば、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸）の別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例として、非極性（疎水性）アミノ酸残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニン）の極性（親水性）残基（例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、若しくはリジン）への置換、及び／又は極性残基の非極性残基への置換が挙げられる。
【００４３】
[0067]「挿入型バリアント」は、ポリペプチドを指す場合には、天然配列又は出発配列中の特定の位置でアミノ酸のすぐ隣に１つ又は複数のアミノ酸が挿入されているものである。アミノ酸の「すぐ隣」は、アミノ酸のアルファ−カルボキシ官能基又はアルファ−アミノ官能基のいずれかに接続されていることを意味する。
【００４４】
[0068]「欠失型バリアント」は、ポリペプチドを指す場合には、天然アミノ酸配列又は出発アミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失型バリアントは、この分子の特定の領域中で１つ又は複数のアミノ酸が欠失されているだろう。
【００４５】
[0069]「共有結合型誘導体」は、ポリペプチドを指す場合には、有機のタンパク質性誘導体化剤若しくは非タンパク質性誘導体化剤、及び／又は翻訳後修飾による、天然タンパク質又は出発タンパク質の改変を含む。共有結合改変は、伝統的に、タンパク質の標的とされるアミノ酸残基と、選択された側鎖若しくは末端残基と反応し得る有機誘導体化剤とを反応させることにより導入されるか、又は選択された組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾のメカニズムを利用することにより導入される。結果として得られる共有結合型誘導体は、生物活性に重要な残基の同定、イムノアッセイ、又は組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の調製を目的とするプログラムで有用である。そのような改変は、当分野での通常の技術の範囲内であり、且つ必要以上の実験を行うことなく実施される。
【００４６】
[0070]「特徴」は、ポリペプチドを指す場合には、分子の別々のアミノ酸配列ベースの成分として定義される。コードされたポリペプチドの特徴は、表面発現（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）、局所的な立体構造形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
【００４７】
[0071]本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指す場合には、用語「表面発現」は、最外層の溶媒に曝露された表面上に現れるタンパク質のポリペプチドベースの成分を指す。
【００４８】
[0072]本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指す場合には、用語「局所的な立体構造形状」は、タンパク質の定義可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチドベースの構造的発現を意味する。
【００４９】
[0073]本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指す場合には、用語「折り畳み」は、エネルギー最小化の際のアミノ酸配列の結果としての立体構造を指す。折り畳みは、折り畳みプロセスの二次レベル又は三次レベルで起こり得る。二次レベルの折り畳みの例として、ベータシート及びアルファヘリックスが挙げられる。三次折り畳みの例として、エネルギー力の凝集又は分離に起因して形成されたドメイン及び領域が挙げられる。このようにして形成された領域として、疎水性ポケット及び親水性ポケット、並びに同類のものが挙げられる。
【００５０】
[0074]本明細書で使用される場合、用語「回転」は、タンパク質立体構造に関連する場合には、ペプチド又はポリペプチドの骨格の方向を変更する屈曲を意味しており、１つ、２つ、３つ、又はより多くのアミノ酸残基を伴い得る。
【００５１】
[0075]本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指す場合には、用語「ループ」は、ペプチド又はポリペプチドの骨格の方向を反転させる役割を果たし得るポリペプチドの構造的特徴を指す。このループがポリペプチド中で見出され、且つ骨格の方向を変更するのみである場合には、ループは、４個以上のアミノ酸残基を含み得る。ループは、開いていてもよいし、閉じていてもよい。閉じたループ又は「環状」ループは、架橋部位間に２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はより多くのアミノ酸を含み得る。そのような架橋部位は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチド中で典型的なシステイン−システイン架橋（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を含み得るか、又は代替的には架橋部位は、本明細書で使用されるジブロモジルイル剤（ｄｉｂｒｏｍｏｚｙｌｙｌ  ａｇｅｎｔ）等の非タンパク質ベースであり得る。環状ペプチドはまた、非天然アミノ酸側鎖間の分子内架橋（即ち、オレフィンメタセシス）によっても、ヘッドトゥーテール（Ｎ末端からＣ末端）環化によっても、又はＮ末端若しくはＣ末端での水素結合代替を介しても、生成され得る。
【００５２】
[0076]本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指す場合には、用語「半ループ」は、この半ループが由来するループとしてのアミノ酸残基の少なくとも半数を有する、特定されたループの部分を指す。ループは必ずしも偶数のアミノ酸残基を含むとは限らないことが理解される。従って、ループが奇数のアミノ酸を含むか又は含むと特定された場合では、この奇数のループの半ループは、このループの整数部分又は次の整数部分（ループのアミノ酸の数／２＋／−０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７個のアミノ酸のループと特定されたループは、３個のアミノ酸又は４個のアミノ酸の半ループを生じる可能性がある（７／２＝３．５＋／−０．５で３又は４）。
【００５３】
[0077]本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指す場合には、用語「ドメイン」は、１つ又は複数の特定可能な構造上の又は機能上の特徴又は特性（例えば、結合能力、タンパク質−タンパク質相互作用の部位としての役割を果たす）を有する、ポリペプチドのモチーフを指す。
【００５４】
[0078]本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指す場合には、用語「半ドメイン」は、この半ドメインが由来するドメインとしてのアミノ酸残基の少なくとも半数を有する、特定されたドメインの部分を意味する。ドメインは必ずしも偶数のアミノ酸残基を含むとは限らないことが理解される。従って、ドメインが奇数のアミノ酸を含むか又は含むと特定された場合では、この奇数のドメインの半ドメインは、このドメインの整数部分又は次の整数部分（ドメインのアミノ酸の数／２＋／−０．５個のアミノ酸）を含む。例えば、７個のアミノ酸のドメインと特定されたドメインは、３個のアミノ酸又は４個のアミノ酸の半ドメインを生じる可能性がある（７／２＝３．５＋／−０．５で３又は４）。サブドメインがドメイン又は半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメインは、このサブドメインが由来するドメイン又は半ドメインで特定された構造上の又は機能上の特性の全て未満を含むことも理解される。本明細書のドメイン型の内のいずれかを含むアミノ酸は、ポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない（即ち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、又はサブドメインを生じ得る）ことも理解される。
【００５５】
[0079]本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指す場合には、用語「部位」は、アミノ酸ベースの実施形態に属する場合に、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義で使用される。部位は、本発明のポリペプチドベースの分子内で改変され得るか、操作され得るか、変更され得るか、誘導体化され得るか、又は変化され得る、ペプチド又はポリペプチド内の位置を表す。
【００５６】
[0080]本明細書で使用される場合、用語「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」又は「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」は、ポリペプチドを指す場合には、ペプチド又はポリペプチドの端を指す。そのような端は、ペプチド又はポリペプチドの最初の又は最後の部位に限定されるだけでなく、末端領域中のさらなるアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸により終了しているか又はアセチル基（ＣＯＣＨ３）若しくはフルオロフォアによりキャップされている）と、Ｃ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）又はアミド基（ＣＯＮＨ２）を有するアミノ酸により終了している）との両方を有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、ある場合には、ジスルフィド結合又は非共有結合力（多量体、オリゴマー）によりまとめられた複数のポリペプチド鎖で形成されている。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有するだろう。あるいは、ポリペプチドの末端は、これらが場合によっては有機複合体等の非ポリペプチドベースの部分で始まるか又は終わるように改変され得る。
【００５７】
[0081]これらの特徴の内のいずれかが、一次構築物によりコードされるポリペプチドの所望の成分として特定されるか又は定義されると、これらの特徴のいくつかの操作及び／又は改変の内のいずれかは、移動、交換、反転、欠失、ランダム化、又は複製により実施され得る。さらに、特徴の操作が分子への改変と同一の結果をもたらし得ることが理解される。例えば、ドメインの欠失を伴った操作は、完全長未満の分子をコードする核酸の改変と同程度の分子の長さの変更をもたらすだろう。
【００５８】
[0082]改変及び操作は、当分野で既知の方法（例えば、限定されないが、部位特異的変異誘発又はペプチド環化）により達成され得る。次いで、結果として生じた改変分子を、本明細書で説明されているもの等のインビトロ若しくはインビボでのアッセイを使用するか、又は当分野で既知の任意の他の適切なスクリーニングアッセイを使用して、活性に関して試験し得る。
【００５９】
[0083]ポリペプチドは、一連の実験により発見されるコンセンサス配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「コンセンサス」配列は、１箇所又は複数箇所の部位で可変性を可能にする配列の集団を表す単一の配列である。
【００６０】
[0084]核酸薬剤は、例えばプラスミドであり得る。そのようなプラスミドは、そのようなタンパク質、そのバリアント又はアイソフォームをコードする核酸配列を含み得るが、組換えウイルスベクター等の他のタイプの核酸薬剤も本発明の目的のために使用し得ることを理解すべきである。本発明の一実施形態では、核酸（例えばプラスミド）は、少なくとも１種のバリアント又はアイソフォームをコードする。
【００６１】
[0085]本明細書で使用される場合、用語「プラスミド」は、染色体には結合しない環状二本鎖ＤＮＡを概して指す。このＤＮＡは、例えば、染色体又はエピソームに由来するプラスミドであり得る。本発明のプラスミドは、任意選択で、転写のイニシエーター又はプロモーターと、転写のエンハンサー、転写のターミネーター、翻訳制御配列、及び／又はプロモーターとターミネーターとの間に位置する別個の一連の制限エンドヌクレアーゼ認識部位とを含み得る。プラスミドでは、目的のポリヌクレオチド挿入物（例えば、関連するタンパク質をコードするもの）を、適切なプロモーターに作動可能に連結させるだろう。このプロモーターは、その天然のプロモーターであってもよいし、又は宿主に由来するプロモーターであってもよい。プロモーター及びエンハンサーはまた、組織特異的プロモーター（例えば、脂肪細胞特異的プロモーター又は他の組織特異的プロモーター）であってもよい。プロモーター及びエンハンサーは、さらに制御可能であり得、遺伝子の発現がもはや望まれていない場合にオフにされ得る。本発明での使用のためのプロモーター／エンハンサーの非限定的な例として、アクチンプロモーター／エンハンサー及びウイルスプロモーター／エンハンサーが挙げられる。他の適切なプロモーター／エンハンサーは、当業者に既知であるだろう。
【００６２】
[0086]本明細書で使用される場合、「治療」は、診断及び処置の両方を含む総称である。これらの方法では、「治療」は、疾患を処置するための任意の治療（例えば、限定されないが、医薬組成物、遺伝子治療、及び生物学的治療（例えば、抗体及びケモカインの投与））であり得ることが認識されるだろう。そのため、本明細書で説明されている方法を使用して、治療前に、治療中に、及び治療後に、例えば疾患状態の低減を評価するために患者又は対象を評価し得る。
【００６３】
[0087]本明細書で使用される場合、「補助的療法」は、一次処置の効果を改善するために一次処置と組み合わせて使用される処置である。
[0088]本明細書で使用される場合、「臨床転帰」は、疾患若しくは障害の処置後での又は処置されていない患者の健康状態を指す。臨床転帰として下記が挙げられるが、これらに限定されない：死亡までの時間の長さの増加、死亡までの時間の長さの減少、生存の可能性の増加、死亡リスクの増加、生存率、無病生存率、慢性疾患、転移、進行性又は侵襲性の疾患、疾患の再発、死亡、及び治療に対する良好又は不良の反応。
【００６４】
[0089]本明細書で使用される場合、「生存率の低下」は、患者の死亡前の時間の長さの減少、又は患者の死亡リスクの増加を指す。
[0090]本明細書で使用される場合、「患者」は、ヒト及び非ヒト動物を含む。処置に好ましい患者は、ヒトである。「患者」、「個体」、及び「対象」は、本明細書では互換的に使用される。
【００６５】
[0091]本明細書で使用される場合、疾患を「予防する」は、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置する」は、疾患又は病的状態の徴候又は症状が発症し始めた後にそれらを改善する治療的介入を指す。「改善する」は、疾患の徴候又は症状の数又は重症度の低減を指す。
【００６６】
[0092]本明細書で使用される場合、「予後不良」は、生存率の低下を概して指し、換言すると、死亡リスクの増加又は死亡までの時間の減少を概して指す。予後不良はまた、疾患の重症度の上昇も指し得る。
【００６７】
[0093]本明細書で使用される場合、「スクリーニング」は、そのような疾患に影響を及ぼす候補薬剤を評価して同定するために使用されるプロセスを指す。
[0094]本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、及び構成されている（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的であるか又はオープンエンドであり、且つ追加の列挙されていない部材、要素、又は方法の工程を排除しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「構成されている（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」はまた、用語「からなる」も含む。
【００６８】
[0095]本明細書で使用される場合、「約」は、測定可能な値（例えば、パラメータ、量、時間的な持続時間、及び同類のもの）を概して指し、開示された本発明で実施するのに変動が適切である限りにおいて、指定された値の＋／−１０％以下の、好ましくは＋／−５％以下の、より好ましくは＋／−１％以下の、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変動を包含することを意味する。修飾語句「約」が指す値それ自体も具体的に（及び好ましくは）開示されていることを理解すべきである。
【００６９】
[0096]本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つ以上の項目のリストで使用される場合には、この列挙された項目のいずれか１つを単独で採用し得るか又はこの列挙された項目の２つ以上の任意の組み合わせを採用し得ることを意味する。例えば、リストが、群Ａ、Ｂ、及び／又はＣを含むと説明されている場合には、このリストは、Ａのみ；Ｂのみ；Ｃのみ；Ａ及びＢの組み合わせ；Ａ及びＣの組み合わせ、Ｂ及びＣの組み合わせ；又はＡ、Ｂ、及びＣの組み合わせを含み得る。
【００７０】
[0097]全般的な説明
[0098]本明細書で説明されているのは、完全長ｈＧＨの残基３６〜５１に対応するｈＧＨ部位１ヘリックス（Ｓ１Ｈ）のペプチドベースの模倣物である。現在では、ｈＧＨ  Ｓ１Ｈの直接配列模倣物であるこれらのペプチドは、ｈＧＨＲに結合して天然ホルモンの結合を競合的に阻害すると考えられる。
【００７１】
[0099]本明細書では、Ｓ１Ｈヘリカル模倣物が、ＩＭ９細胞及びＳＫ−ＭＥＬ細胞でのｈＧＨにより媒介されるチロシンリン酸化又はＳＴＡＴ５の活性化を阻害することが示されている。
【００７２】
[00100]同様に、本明細書では、ヘリカル傾向が、ＳＴＡＴ５リン酸化又は任意の他のｈＧＨにより誘発される細胞内シグナル伝達経路を介したｈＧＨＲシグナル伝達を阻害するというこれらのペプチドの能力に有意な影響を及ぼすことも示されている。
【００７３】
[00101]同様に本明細書で説明されているのは、ｈＧＨ作用を阻害する化合物である。この化合物は、過去のｈＧＨ化合物と比べて有効であり、安価であり、及び／又はおそらく血清半減期が長い。
【００７４】
[00102]この化合物は、先端巨大症を有する患者の処置で有用であり、加えて、ｈＧＨ反応性がんを有する患者の処置でも有用である。
[00103]この化合物は、この化合物を長時間作用する経口活性薬剤へと製剤化し得るような操作に適している小さいヘリカルペプチドである。
【００７５】
[00104]現在では、このペプチド（Ｓ１Ｈ）は、１日当たり１回の注射又はおそらくより少ない頻度に適した血清半減期で経口活性（注射なし）であると考えられる。
[00105]Ｓ１Ｈは、先端巨大症、全てのｈＧＨ反応性（即ち、ｈＧＨＲを発現するヒトの）がん、又はｈＧＨレベルが上昇しているか若しくはｈＧＨ作用が増強されている任意の障害の処置に有用である。
【００７６】
[00106]非限定的な一例は、血清ｈＧＨレベルが高く且つ増殖性の糖尿病性網膜症及び腎症（nephrology）に関与しているコントロール不良な１型糖尿病である。
[00107]ｈＧＨ作用の特徴は、ｈＧＨＲへのｈＧＨの結合及びｈＧＨＲ関連のＪＡＫ２のトランス活性化の後のＳＴＡＴ５（Ａ及びＢ）転写因子タンパク質の急速なチロシンリン酸化である。このリン酸化現象は急速（ｈＧＨ添加後数分）であり、ｈＧＨＲ活性化のリードアウトとして使用されている。ｈＧＨ作用の阻害剤は、多くの細胞（例えば、ＩＭ９、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、マウス線維芽細胞、及びｈＧＨＲを発現する他の細胞）でのｈＧＨ−ｈＧＨＲにより媒介されるＳＴＡＴ５チロシンリン酸化をブロックする。
【００７７】
[00108]Ｓ１Ｈペプチド阻害剤
[00109]Ｓ１Ｈペプチド阻害剤は、ｈＧＨ刺激後のチロシンｐＳＴＡＴ５レベルを用量依存的に頑強にブロックする。
【００７８】
[00110]Ｓ１Ｈは、ｈＧＨの部位１内の小さく正しく折り畳まれたα−ヘリックスを模倣する短い（１６個のアミノ酸）のペプチドである。このＳ１Ｈペプチドは、ｈＧＨＲと相互作用するｈＧＨの部位１内の領域である残基３６〜５１の間でのｈＧＨのほぼ完全な配列模倣物である。Ｘ線結晶構造解析のデータに基づくと、この領域は、良好なｈＧＨ：ｈＧＨＲ相互作用に不可欠である。
【００７９】
[00111]Ｓ１Ｈは、ｈＧＨ：ｈＧＨＲ相互作用の強力な阻害剤である。さらに、本明細書で説明されているのは、Ｓ１Ｈ配列内のどの特定の残基がヘリカル傾向に重要であるか及び生細胞でのｈＧＨシグナル伝達の阻害に重要であるかを決定するための走査アラニン変異誘発の使用である。
【実施例】
【００８０】
[00112]実施例
[00113]本発明のある特定の実施形態は、本明細書の実施例で定義されている。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すと同時に例示のみを目的として示されることを理解すべきである。上記の議論及びこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認し得、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、本発明を様々な用途及び条件に適応させるために本発明の様々な変更及び改変を行い得る。
【００８１】
[00114]方法
[00115]試薬及び化学物質
[00116]Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＡＭ樹脂、Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸、及びＰｙＣｌｏｃｋをそれぞれ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から購入した。ピペリジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、ＲＩＰＡ溶解緩衝液、及びＢｒａｄｆｏｒｄ試薬を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。アセトニトリル（ＡＣＮ）を、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から購入した。ヒト悪性黒色腫細胞系統ＳＫ−ＭＥＬ−２８；ヒトＢリンパ芽球細胞系統ＩＭ９；ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０培地、及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。抗生物質−抗真菌剤、Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル、並びに化学発光検出試薬を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。組換えｈＧＨを、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｏｎｌｉｎｅ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）から購入した。モノクローナルウサギβ−アクチン４９７０Ｓ一次抗体及びウサギｐＳＴＡＴ５（Ｙ６９４）９３５１Ｌ一次抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から購入した。全ての他の材料を商業的供給源から購入し、さらに精製することなく使用した。
【００８２】
[00117]ペプチド合成
[00118]全てのペプチドを、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）手順を使用してＰＡＬ−ＡＭ樹脂上で合成した。全ての反応を、反応物及び出発物質の取り出しを容易にするためにフリットガラス反応容器中において２５μｍｏｌスケールで実施した。アミノ酸及びＦｍｏｃの脱保護を、インハウスで作成されたソフトウェアプログラムを使用するマイクロ波加速反応システム（ＣＥＭ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ＮＣ）で実施した。本明細書で概説されている各カップリング反応と脱保護反応との間で、新鮮なＮＭＰを使用する複数回の洗浄を実施した。ＮＭＰ中の５当量（ｅｑ）のＦｍｏｃ−保護アミノ酸、５ｅｑのＰｙＣｌｏｃｋ、及び１０ｅｑのＤＩＥＡで、脱保護された樹脂を処理することにより、アミド結合の形成が達成された。全ての当量は、樹脂ローディングレベルに基づく。アスパルチミド（ａｓｐａｒｔｉｍｉｄｅ）形成を最小限に抑えるために０．１Ｍ  ＨＯＢｔを含む２５％（ｖ／ｖ）ピペリジンでペプチド−樹脂を処理することにより、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を除去した。アミノ酸のカップリング及び脱保護の反復サイクルを、所望の配列長のペプチドが達成されるまで繰り返した。合成後、室温で２０分にわたり、ＮＭＰ中の６％（ｖ／ｖ）無水酢酸及び６％（ｖ／ｖ）４−メチルモルヒネで、脱保護されたペプチド−樹脂を処理することにより、ペプチドをキャップした。この工程を繰り返し、次いで、このキャップされたペプチド−樹脂をＮＭＰで完全に洗浄して、あらゆる未反応の出発物質を除去した。洗浄後、この樹脂をＮＭＰで５回洗浄し、ＮＭＰ及びジクロロメタンの交互の体積で５回洗浄し、最後にジクロロメタンで５回洗浄した。次いで、この樹脂を減圧下で乾燥させて、残留する溶媒を除去した。
【００８３】
[00119]ペプチドの切断及び精製
[00120]合成の完了後、８８％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％（ｖ／ｖ）水、５％（ｖ／ｖ）フェノール、及び２％（ｖ／ｖ）トリイソプロピルシランの切断カクテルを添加することにより、乾燥した樹脂結合ペプチドを包括的に脱保護して切断させた。次いで、この反応物を、ＣＥＭマイクロ波反応器中において３８℃で３０分にわたりインキュベートした。切断サイクルの完了後、このペプチドを冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離によりペレット化し、適切な量の水性ＡＣＮに再懸濁させた。次いで、この溶液を凍結乾燥させて、残留する溶媒を除去した。乾燥後、粗ペプチド粉末を適量の水性ＡＣＮに再懸濁させ、ＰｒｏＳｔａｒ（登録商標）ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して半調製スケールの逆相Ｃ１８カラム（Ｇｒａｃｅ、１０μｍ、２５０×１０ｍｍ）に通して精製した。ペプチドを、溶媒Ａ（水中の０．１％  ＴＦＡ）に対する１５〜４５％溶媒Ｂ（ＡＣＮ中の０．１％  ＴＦＡ）の直線勾配で３０分かけて溶出させた。吸光スペクトルを２１４ｎｍ及び２８０ｎｍでモニタリングして、ペプチド生成物を区別した。溶出したペプチドの同一性を、質量分析により評価した。生成物ピークを組み合わせ、凍結乾燥を２回行った。精製されたペプチド生成物を水に溶解させてペプチドストックを作製し、４℃で保存した。全てのペプチド濃度を、それぞれの一次配列に基づいて算出された吸光係数を使用して定量した。ペプチドは、この保存条件下では少なくとも１年にわたり安定であることが分かった。
【００８４】
[00121]ＭＳ及び分析用ＨＰＬＣによるペプチドの全般的なキャラクタリゼーション
[00122]全てのペプチドの同一性を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して確認した。５００〜２２００のｍ／ｚ範囲でＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（登録商標）Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して、質量を収集した。分析のために、ペプチドを、適量の水中の１０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮに溶解させ、ＥＳＩシステムに直接注入した。データを、Ｘｃａｌｉｂｕｒ  ｖ３．０（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＭａｇＴｒａｎ  ｖ１．０（登録商標）デコンボリューションソフトウェア（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）を使用して処理した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰｒｏＳｔａｒシステムを使用する分析用逆相ＨＰＬＣにより、ペプチド純度を決定した。分析用ＨＰＬＣによる分析のために、ペプチドを、水中に２．５μＭの最終濃度で溶解させ、逆相Ｃ１８カラム（Ｇｒａｃｅ、５μｍ、５０×２．１ｍｍ）に通して注入した。ペプチド生成物を、溶媒Ａ（水中の０．１％  ＴＦＡ）に対する５〜９５％溶媒Ｂ（ＡＣＮ中の０．１％  ＴＦＡ）の直線勾配で２０分かけて溶出させた。全てのペプチドを、分析用ＨＰＬＣクロマトグラムの生成物ピーク積分により決定した場合の＞９５％まで精製した。分析用ＨＰＬＣのデータを、ＯｐｅｎＬａｂ  ＣＤＳ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）バージョン１．０６及びＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（登録商標）バージョン４．５（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して処理した。
【００８５】
[00123]ペプチド生成物の構造キャラクタリゼーション
[00124]各ペプチドの溶液相構造を、波長依存性の円偏光二色性（ＣＤ）で評価した。分析するために、水中に溶解したストックペプチドを、３０％（ｖ／ｖ）２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を含むか又は含まないリン酸緩衝生理食塩水で２０μＭの最終濃度まで希釈した。次いで、このペプチド溶液を、２５℃で１０分にわたりインキュベートした。次いで、波長スキャンを、２５℃にて２６０〜１９０ｎｍでＪａｓｃｏ  Ｊ−７１５分光偏光計により実施した。最終スペクトルを、４つのスキャンのバックグラウンド減算（緩衝液のみ）平均から生成した。データを、Ｊ−７００（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．５（Ｊａｓｃｏ）及びＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（登録商標）バージョン４．５（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して処理した。
【００８６】
[00125]細胞培養及びｈＧＨ処理
[00126]ヒト悪性黒色腫細胞系統−ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＳＫ−ＭＥＬ−３０、ヒトリンパ芽球ＩＭ９細胞、マウス線維芽細胞Ｌ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＡＴＣＣプロトコルで示されているように、ＳＫ−ＭＥＬ−２８をＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）で増殖させて維持し、ＩＭ９及びＬ細胞をそれぞれＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）及びＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）で増殖させた。完全増殖培地に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＡＴＣＣ）及び１×抗生物質−抗真菌剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を補充した。細胞を、加湿インキュベーター中において３７℃／５％ＣＯ２で増殖させた。培地を、４８時間毎に入れ替えた。明記されていない限り、ｈＧＨは、この培地には存在していないか、又は外部から添加されていない。付着細胞のｈＧＨ処理のために、播種後１２〜１６時間で、細胞を、血清フリー増殖培地で４時間にわたり血清飢餓させ、ｈＧＨ（又はコントロールとしてのＰＢＳ）を、言及した濃度（５０ｎｇ／ｍＬ＝２．５ｎＭ、又は他の濃度）で添加した。懸濁細胞（ＩＭ９細胞）のｈＧＨ処理のために、室温（ＲＴ）で５分にわたり１４０×ｇにて遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去し、血清フリー培地に再懸濁させて４時間にわたり飢餓させ、本明細書で説明されているように処理した。その後、別途言及されていない限り、ｐＳＴＡＴ５検出のために、細胞を２０分にわたりインキュベートした。組換えｈＧＨを、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｏｎｌｉｎｅ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）から購入した。候補アゴニスト（ｈＧＨは存在しない）による処理のために、同一のプロトコルを使用した。候補アンタゴニスト（ｈＧＨは存在する）による処理のために、このアンタゴニストを、ＲＴで、ｈＧＨの添加の１〜２分前に添加した。ｈＧＨＲ−拮抗作用の陽性コントロールとして、ペグビソマント（１００ｎＭ）を使用した。
【００８７】
[00127]タンパク質抽出
[00128]対応する時点で、処理後に全タンパク質を回収した。処理後、製造業者のプロトコルに従って、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１．５×Ｈａｌｔプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００ｕＬ／１００万個の細胞）を使用して、この細胞から全タンパク質を抽出した。簡潔に説明すると、冷却したＲＩＰＡ緩衝液を添加し、４℃で５分にわたりインキュベートした。次いで、細胞を滅菌細胞スクレーパーで急速に擦り落として、細胞を溶解させた。細胞溶解物を短時間（２秒オン／１秒オフのパルスで１分間）超音波処理し、４℃で１０分にわたり８，０００×ｇで遠心分離することにより清澄化し、上清を収集し、その後の使用のために−８０℃で保存した。各サンプルは、１つの実験当たり３回の反復のプールであり、各実験を３回行った。
【００８８】
[00129]Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び標準物質としての１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して、タンパク質濃度を推定した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ２５０（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）及びＳｏｆｔｍａｘＰｒｏ（登録商標）ｖ４．７．１ソフトウェアを使用して、５９５ｎｍでの吸光度を測定した。
【００８９】
[00130]ウエスタンブロッティング（ＷＢ）
[00131]ウエスタンブロッティングを、下記の確立されている実験手順に従って実施した。簡潔に説明すると、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェットトランスファー法（４℃で１６時間にわたり２０Ｖ）を使用して活性化ＰＶＤＦ膜に移し、２５℃で２時間にわたり１×ＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝生理食塩水、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００によりｐＨ７．２）中の５％ＢＳＡでブロックし、４℃で１６時間にわたり（下記に示す特定の希釈にて）一次抗体と共にインキュベートし、最後に、２５℃で２時間にわたり（下記に示す特定の希釈にて）対応する二次抗体と共にインキュベートした。次いで、膜を洗浄し、Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ（登録商標）検出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理し、ＧｅｌＤｏｃ（登録商標）（Ｂｉｏｒａｄ）蛍光リーダーを使用して化学発光シグナルを捕捉した。ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを使用して曲線下面積からバンド強度を測定することにより、ブロットのデンシトメトリー分析を行った。
【００９０】
[00132]特定の希釈での一次抗体を使用して、下記のヒトタンパク質を検出した：ｐＳＴＡＴ５Ｂ（Ｙ６９９）＋ＳＴＡＴ５Ｂ（Ｙ６９４）（ウサギ、１：５０００、ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ４１９０１）、ＳＴＡＴ５（ウサギ、１：１００、ＣＳＴ  ＃９３５８Ｓ）、Ｐ（Ｙ６９４）−ＳＴＡＴ５（ポリクローナルウサギ、１：１０００、ＣＳＴ  ＃９３５１）、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（ウサギ、１：２０００、ＣＳＴ  ＃９１０２Ｓ）、Ｐ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（ウサギ、１：３０００、ＣＳＴ  ＃４３７０Ｐ）、Ａｋｔ（ウサギ、１：２０００、ＣＳＴ  ＃４６８５Ｓ）、Ｐ−Ａｋｔ（ウサギ、１：１０００、ＣＳＴ  ＃４０５８Ｓ）、Ｐ−Ｊａｋ２（ウサギ、１：２００、ＧｅｎｅＴｅｘ＃６１１２２；ウサギ、１：１００、ＣＳＴ  ＃８０８２）、ＪＡＫ２（マウス、１：２００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃ＳＡＢ４２００４８３）、ｍＴＯＲ（ウサギ、１：１０００、ＣＳＴ  ＃２９８３）、Ｐ−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８）（ウサギ、１：２０００、ＣＳＴ  ＃５５３６）、Ｐ−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４８１）（ウサギ、１：２０００、ＣＳＴ  ＃２９７４）、β−アクチン（ヤギ、１：３０００、ＳＣＢＴ  ＃ｓｃ１６１６）、ＧＡＰＤＨ（ヤギ、１：３０００、ＳＣＢＴ  ＃ｓｃ２０３５７）用のモノクローナルＡｂ。
【００９１】
[00133]使用した二次抗体は下記であった：抗ウサギＨＲＰ結合ＩｇＧ（ロバ、１：２０００、ＣＳＴ  ＃７０７４Ｐ２；１：２０００、ＧＥ  ＃ＮＡ９３４）、又は抗ヤギＨＲＰ結合ＩｇＧ（ロバ、１：１０００、ＳＣＢＴ  ＃ｓｃ２０２０）、又は抗マウスＨＲＰ結合ＩｇＧ（ラット、１：１０００、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｏｎｌｉｎｅ  ＃ＡＢＩＮ１５８９９７５）。
【００９２】
[00134]ＥＬＩＳＡ
[00135]ウエスタンブロットに使用したサンプルを、製造業者の指示に従って、リン酸化ＳＴＡＴ５Ａ（Ｙ６９４）及びＳＴＡＴ５Ｂ（Ｙ６９９）を検出するためにＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号８５−８６１１２−１１；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ｐＳＴＡＴ５レベルに関して並行に定量した。簡潔に説明すると、サンプル（１ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを、抗体カクテル５０μＬを含むＥＬＩＳＡウェルに添加し、２時間にわたり、３００ｒｐｍで振盪させつつＲＴでインキュベートした。次いで、ウェルを完全に洗浄し、３００ｒｐｍで振盪させつつＲＴで１時間にわたり検出試薬を添加することにより結合を定量した。インキュベーション後、停止試薬を添加し、分光光度計を使用して４５０ｎｍでウェルを読み取った。実験を３重で実施した。
【００９３】
[00136]統計解析
[00137]Ｒソフトウェア（ｖｅｒ３．０．２）を使用して、パラメトリック統計解析及びノンパラメトリック統計解析を行った。デンシトメトリー分析及びＥＬＩＳＡの結果を、対応のあるスチューデントのＴ検定により比較し、（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用して）ＡＮＯＶＡを実施して、有意性に関して比較した（ｐ＜０．０５が有意と見なされる）。
【００９４】
[00138]図１〜２は、二量体化ｈＧＨＲに結合したｈＧＨの三次元結晶構造を示す。図１は、ｈＧＨ（ピンク色）が、ｈＧＨ（灰色）に結合したリボンダイヤグラムとして示されることを示す。ｈＧＨの部位１へリックスは、紫色に着色されている。図２は、ｈＧＨＲに結合した部位１ヘリックスの拡大を示す。残基３６〜５１は、棒の表現で描写されている。
【００９５】
[00139]図３は、Ｓ１Ｈペプチドヘリックスのリボンダイヤグラムを示す。ｈＧＨＲと接触する残基は、緑色に着色されており、且つ矢印で示されている。青色に着色された残基は、ｈＧＨＲと接触しない。色分けされた一次配列を、リボンダイヤグラムの下に示す。
【００９６】
[00140]図４は、Ｓ１Ｈ（３６〜５１）ペプチドの全化学構造である。Ｎ末端がアセチル基でキャップされていることを示し、Ｃ末端はアミドである。
[00141]図５は、精製されたペプチドＳ１Ｈの代表的な分析用ＨＰＬＣのクロマトグラムを示す。保持時間（分）を、トレースの上に示す。スペクトルを２１４ｎｍでモニタリングした。ｍＡＵ：ミリ吸光度単位。
【００９７】
[00142]図６は、Ｓ１Ｈペプチドの代表的なマススペクトルを示す。算出された質量：２０２５．０４ｍ／ｚ；観測された質量：２０２６．４６ｍ／ｚ。大きいピークは、（Ｍ＋２Ｈ＋）／２  質量：１０１３．５３（ｍ＋２Ｈ＋）／２ｚに対応する。
【００９８】
[00143]図７は、Ｓ１Ｈペプチド［配列番号１］及び配列番号２〜１１の走査アラニンライブラリの波長依存性円偏光二色性スペクトルを示す。赤色のスペクトルは、ＰＢＳのみ中のペプチドを示し、青色のスペクトルは、３０％ＴＦＥが補充されたＰＢＳ中のペプチドを表す。全てのスペクトルを２５℃で収集した。各ペプチドの一次配列を、ＣＤスペクトルの上に示す。
【００９９】
[00144]図８は、本明細書で説明されているペプチドの配列及び質量データを示す表である。
[00145]図９  阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）が、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ヒト黒色腫細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化を下方制御することを示すウエスタンブロット。ヒトＳＫ−ＭＥＬ−２８黒色腫細胞を、２０分にわたり、２５及び２５０ｎＭでのペプチド阻害剤と共に又はこのペプチド阻害剤なしで、２．５ｎＭ  組換えｈＧＨで共処理し、ｐＳＴＡＴ５レベルに関してアッセイした。β−アクチン（ＡＣＴＢ）を、ローディングコントロールとして使用した。
【０１００】
[00146]図１０  阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）が、ＩＭ９ヒトリンパ芽球細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化を下方制御することを示すウエスタンブロット。ヒトＩＭ９細胞を、２０分にわたり、２５及び２５０ｎＭでのペプチド阻害剤と共に又はこのペプチド阻害剤なしで、２．５ｎＭ  組換えｈＧＨで共処理し、ホスホＳＴＡＴ５レベルに関してアッセイした。β−アクチン（ＡＣＴＢ）を、ローディングコントロールとして使用した。
【０１０１】
[00147]図１１  阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）が、Ｌマウス線維芽細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化を下方制御することを示すウエスタンブロット。この細胞を、２０分にわたり、２５及び２５０ｎＭでのペプチド阻害剤と共に又はこのペプチド阻害剤なしで、２．５ｎＭ  組換えｈＧＨで共処理し、ホスホＳＴＡＴ５レベルに関してアッセイした。β−アクチン（ＡＣＴＢ）を、ローディングコントロールとして推定した。
【０１０２】
[00148]図１２Ａは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ヒト黒色腫細胞中での上方制御するｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化におけるペプチド（Ｓ１Ｈ）のアゴニスト特性のＥＬＩＳＡ分析を示す。図１２Ｂは、ＳＫ−ＭＥＬ−２８ヒト黒色腫細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化の下方制御における阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）のアンタゴニスト特性のＥＬＩＳＡ分析を示す。この細胞を、２０分にわたり、２５及び２５０ｎＭでのペプチド阻害剤と共に又はこのペプチド阻害剤なしで、２．５ｎＭ  組換えｈＧＨで共処理し、サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＳＴＡＴ５Ａ及びＳＴＡＴ５Ｂに対するモノクローナル抗体を使用してｐＳＴＡＴ５レベルに関してアッセイした。［ｐｅｇｖｉｓ＝ペグビソマント］；［ＧＨ＝ヒト成長ホルモン］。
【０１０３】
[00149]図１３は、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８ヒト黒色腫細胞中でのｈＧＨにより媒介されるＳＴＡＴ５のリン酸化の下方制御における阻害ペプチド（Ｓ１Ｈ）及び同じもののアラニン変異体のアンタゴニスト特性のＥＬＩＳＡ分析を示す。この細胞を、２０分にわたり、２５０ｎＭでのペプチド阻害剤と共に又はこのペプチド阻害剤なしで、２．５ｎＭ  組換えｈＧＨで共処理し、サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ｐＳＴＡＴ５Ａ及びｐＳＴＡＴ５Ｂに対するモノクローナル抗体を使用してｐＳＴＡＴ５レベルに関してアッセイした。矢印は、アンタゴニスト活性の低減を示すペプチド処理を示す。水平線は、市販のｈＧＨＲアンタゴニストＰｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ（登録商標）による阻害のレベルを示す。［ＧＨ＝ヒト成長ホルモン］。
【０１０４】
[00150]Ｓ１Ｈにより処置可能な成長ホルモン障害の例
[00151]本発明の方法により処置され得る疾患は、下記の基準の内の１つ又は複数を特徴とする疾患である：ｈＧＨ産生レベルの上昇、血清ｈＧＨレベルの上昇、ｈＧＨＲ産生レベルの上昇、及びｈＧＨに対するｈＧＨＲの細胞反応の上昇。
【０１０５】
[00152]用語「上昇」は、本明細書で使用される場合、正常な個体でのレベルと比較した、罹患した人（又は動物）の組織でのｈＧＨ産生、ｈＧＨＲ産生、又はｈＧＨにより媒介される細胞反応の正常レベルに関して使用される。本発明の方法により処置され得る疾患として下記が挙げられるが、これらに限定されない：先端巨大症、巨人症、がん、糖尿病、血管眼疾患（糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、加齢黄斑変性症、鎌状赤血球貧血の網膜症等）、及び腎症。
【０１０６】
[00153]主題の方法により処置され得るがんとして、ｈＧＨＲを発現する腫瘍細胞を含むがんが挙げられるが、これに限定されない。本発明の方法により処置され得るがんとして下記が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
[00154]心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、及び奇形腫。
[00155]肺：気管支原性癌（扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫。
【０１０８】
[00156]消化器：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）。
【０１０９】
[00157]尿生殖器管：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱及び尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）。
【０１１０】
[00158]肝臓：肝細胞腫（肝細胞癌）、胆管細胞癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫。
[00159]骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨腫、及び巨細胞腫瘍。
【０１１１】
[00160]神経系：頭蓋骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨膜炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星細胞腫、髄芽腫、グリオーマ、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性膠芽腫、乏突起膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄（神経線維腫、髄膜腫、グリオーマ、肉腫）。
【０１１２】
[00161]婦人科：子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、子宮内膜性腫瘍、セリオブラストーマ（ｃｅｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、明細胞癌、未分類の癌腫］、顆粒膜−卵胞膜細胞腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状横紋筋肉腫［胎児性横紋筋肉腫］、ファロピウス管（癌腫）。
【０１１３】
[00162]血液：血液（骨髄性白血病［急性及び慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］。
【０１１４】
[00163]皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、ほくろ、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬。
[00164]副腎：神経芽細胞腫。
【０１１５】
[00165]他のがん：乳がん、結腸／結腸直腸がん、甲状腺がん。
[00166]医薬組成物
[00167]本明細書で説明されている医薬組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と共に製剤化され得る。本明細書で開示されている組成物は、固体、液体、又はエアロゾルの形態で投与するかどうかに応じて、及び注射のような投与経路のために無菌である必要があるかどうかに応じて、様々なタイプの担体を含み得る。本明細書で開示されている組成物を適切な方法で投与し得、例えば、限定されないが、局所的に（即ち、経皮的に）投与し得るか、皮下で投与し得るか、経鼻的に投与し得るか、経口的に投与し得るか、エアロゾルで投与し得るか、直接標的細胞を浸す局所灌流により投与し得るか、洗浄を介して投与し得るか、クリームで投与し得るか、脂質組成物（例えばリポソーム）で投与し得るか、好都合な局所投与のためのエリキシル若しくは溶液として製剤化し得るか、徐放剤形として製剤化し得るか、又は当業者に既知であるだろう他の方法若しくは前述の任意の組み合わせにより投与し得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５を参照されたい）。
【０１１６】
[00168]本明細書で提供される組成物は、ヒト等の動物の処置に有用である。本開示に従ってヒト患者を処置する方法は、本明細書で説明されている組成物の投与を含む。
[00169]語句「薬学的」又は「薬学的に許容される」は、例えばヒト等の動物に投与された場合に、有害な反応、アレルギー反応、又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。担体又は希釈剤は、有効な治療剤のためのビヒクル、賦形剤、又は媒体として機能する固体材料、半固体材料、又は液体材料であり得る。本開示の医薬組成物で用いられ得る希釈剤又は担体のいくつかの例は、下記である：ラクトース、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、プロピレングリコール、流動パラフィン、白色パラフィン、カオリン、ヒュームド二酸化ケイ素、微結晶性セルロース、ケイ酸カルシウム、シリカ、ポリビニルピロリドン、セトステアリルアルコール、デンプン、加工デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、カカオバター、エトキシル化エステル、カカオ脂、ラッカセイ油、アルギン酸塩、トラガント、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、乳酸エチル、メチルヒドロキシベンゾエート及びプロピルヒドロキシベンゾエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート及びオレイルアルコール、並びに噴霧剤、例えば、トリクロロモノフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、及びジクロロテトラフルオロエタン。
【０１１７】
[00170]語句「化学療法薬」は、がんと診断されている対象の処置で使用されることが既知である治療薬を指す。本開示の化学療法薬の一般的なクラスのいくつかの例として、下記が挙げられる：アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩ及びＩＩの阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体及び前駆体類似体、ペプチド抗生物質、白金ベースの薬剤、レチノイド、並びにビンカアルカロイド及び誘導体、並びにがん細胞上の抗原に特異的な様々な抗体。これらの一般的なクラスに関して、具体例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ドキソルビシン（アドリアマイシン）、トシル酸ソラフェニブ、シスプラチン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、リンシチニブ、クリゾチニブ、及びカボザンチニブ。
【０１１８】
[00171]遊離塩基又は薬学的に許容される塩として本明細書で開示されている組成物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水で調製し得る。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物で、並びに油で、分散液も調製し得る。保存及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を予防するために保存剤を含む。使用に適した医薬形態として、無菌の水溶液又は水性分散液、及び無菌溶液又は無菌分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。ある特定の場合では、この形態は無菌であるべきであり、且つ容易な注射性が存在する程度まで流動性を持つべきである。この形態は、製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、且つ微生物（例えば細菌及び真菌）の汚染作用に対して任意選択的に保存され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（即ち、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、並びに同類のもの）、これらの適切な混合物、並びに／又は植物油を含む溶媒又は分散媒であり得る。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、及び同類のもの）によりもたらされ得る。多くの場合では、等張剤（例えば、限定されないが、糖及び塩化ナトリウム）を含むことが好ましい場合がある。
【０１１９】
[00172]局所投与用の医薬組成物として、薬用として製剤化された組成物（例えば、軟膏、ペースト、クリーム、又は粉末）が挙げられ得る。軟膏は、局所適用のための全ての油性、吸着性、乳化性、及び水溶性の基剤組成物を含み、クリーム及びローションは、乳化性基剤のみを含む組成物である。局所投与される医薬は、皮膚を通した有効成分の吸収を容易にするために浸透促進剤を含み得る。適切な浸透促進剤として、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、及びルアロカプラム（ｌｕａｒｏｃａｐｒａｍ）が挙げられる。局所適用のための組成物の可能な基剤として、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、及びワセリン、並びに任意の他の適切な吸収性、乳化性、又は水溶性の軟膏基剤が挙げられる。局所製剤は、この組成物を保存し且つ均一な混合物をもたらすために、必要に応じて、乳化剤、ゲル化剤、及び抗菌保存剤も含み得る。この組成物の経皮投与はまた、「パッチ」の使用も含み得る。例えば、このパッチは、１種又は複数種の組成物を一定期間にわたり予め決定された速度で連続的に供給し得る。
【０１２０】
[00173]本明細書で開示されている組成物をエアロゾルを介して送達し得ることが、さらに想定される。用語エアロゾルは、液化ガス噴射剤又は加圧ガス噴射剤に分散された、微細に分割された固体又は液体の粒子のコロイド系を指す。典型的なエアロゾルは、液体噴射剤中の又は液体噴射剤と適切な溶媒との混合物中の有効成分の懸濁液を含む。適切な噴射剤として、炭化水素及び炭化水素エーテルが挙げられる。適切な容器は、この噴射剤に必要な圧力に従って異なり得る。エアロゾルの投与は、対象の年齢、体重、並びに症状の重症度及び反応に従って異なり得る。
【０１２１】
[00174]投与量
[00175]動物患者又はヒト患者に投与される、本明細書で開示されている組成物の実際の投与量を、身体的因子及び生理学的因子（例えば、体重、状態の重症度、処置する疾患の種類、過去又は現在の治療的介入、患者の突発性疾患、及び投与経路）により決定し得る。投与量及び投与経路に応じて、好ましい投与量及び／又は有効量の投与回数を、対象の反応に従って変更し得る。本開示の化合物は、一般に、広い投与量範囲にわたり有効である。いずれにしても、投与に関与する専門家は、組成物中の有効成分の濃度、及び個々の対象に適した用量を決定し得る。
【０１２２】
[00176]当然のことながら、各治療上有用な組成物中の有効化合物の量を、適切な投与量をこの化合物の任意の所与の単位用量で得ることができるように調製し得る。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、及び他の薬理学的な考慮事項等の因子が、そのような医薬製剤を調製する者により企図され得、従って、様々な投与量及び処置レジメンが望ましい場合がある。
【０１２３】
[00177]他の非限定的な例では、用量はまた、１回の投与当たり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重、又はより多く、及び本明細書で導き出され得る任意の範囲も含み得る。本明細書で列挙されている数字から導き出され得る範囲の非限定的な例では、上記で説明されている数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重等の範囲を投与し得る。投与量は多くの因子に依存する可能性があり、いずれにしても適切な専門家により決定され得る。従って、本明細書で説明されている投与量は、限定することを意図されていない。
【０１２４】
[00178]いくつかの実施形態では、本組成物は、追加の有効成分をさらに含む。少なくとも１種の化合物又は追加の有効成分を含む医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００３により例示されるように、本開示を考慮して当業者に既知であり得る。さらに、動物（例えばヒト）への投与のために、調製は、生物学的基準のＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅにより要求される無菌性、発熱性、並びに全般的な安全性及び純度の基準を満たすべきであることが理解され得る。
【０１２５】
[00179]本組成物の包装
[00180]製剤後、本組成物を、送達及びエンドユーザーによる使用に適した方法で包装する。一実施形態では、この組成物を適切なディスペンサーに入れてエンドユーザーへと輸送する。最終容器の例として、ポンプボトル、圧搾ボトル、ジャー、チューブ、カプセル、又はバイアルが挙げられ得る。
【０１２６】
[00181]本明細書で説明されている組成物及び方法を、キットの一部として具体化し得る。そのようなキットの非限定的な例は、組成物を調製するための成分を含み、容器は、組み合わされた構成で存在してもよいし、存在しなくてもよい。ある特定の実施形態では、このキットは、この組成物を投与するための手段（例えば、局所塗布具又はシリンジ）をさらに含む。このキットは、主題の方法を実施するためにこのキットの構成要素を使用するための指示書をさらに含み得る。主題の方法を実施するための指示書は、一般に、適切な記録媒体に記録されている。例えば、指示書は、パッケージインサートとしてキット中に存在してもよいし、キット又はその構成要素の容器のラベリングで存在してもよい。他の実施形態では、指示書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、フラッシュドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ、又はディスケット）上に存在する電子記憶データファイルとして存在する。他の実施形態では、実際の指示書はキット中には存在しないが、例えばインターネットを介して遠隔情報源から指示書を入手するための手段が設けられている。この実施形態の一例は、ウェブアドレスを含むキットであり、このウェブアドレスで指示書を見ることができ、及び／又はこのウェブアドレスから指示書をダウンロードすることができる。この指示書と同様に、この指示書を得るためのこの手段が、適切な基材上に記録されている。
【０１２７】
[00182]本発明を、様々な実施形態及び好ましい実施形態を参照して説明しているが、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得、且つ等価物がその要素に置換され得ることを、当業者は理解すべきである。加えて、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、本発明の教示に特定の状況又は材料を適合させるために、多くの改変を行い得る。
【０１２８】
[00183]従って、本発明は、本発明を実行するために企図されている、本明細書で開示されている特定の実施形態に限定されず、本発明は、特許請求の範囲に含まれる全ての実施形態を含むことが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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