(57)【要約】本発明は、操作された細胞溶解性免疫細胞であって、ｉ）目的のポリペプチド（ＰＯＩ）および第１の相互作用ドメインを含む放出性タンパク質；およびｉｉ）細胞の細胞内区画内に保持されており、第１のタンパク質相互作用ドメインに結合する第２の相互作用ドメインを含む保持タンパク質を含み、ここで、第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合は、作用因子の存在によって破壊されるため、作用因子の非存在下では、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合し、それにより、細胞内区画内にＰＯＩが保持され；それに対して、作用因子の存在下では、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合せず、ＰＯＩが細胞内区画から放出されて、細胞の表面に発現されるか、細胞によって分泌される、操作された細胞溶解性免疫細胞に関する。
2021520792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された細胞溶解性免疫細胞であって、
ｉ）目的のポリペプチド（ＰＯＩ）および第１の相互作用ドメインを含む放出性タンパク質；および
ｉｉ）前記細胞の細胞内区画内に保持されており、前記第１のタンパク質相互作用ドメインに結合する第２の相互作用ドメインを含む保持タンパク質
を含み、
ここで、前記第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合は、作用因子の存在によって破壊されるため、前記作用因子の非存在下では、前記第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合し、それにより、細胞内区画内に前記ＰＯＩが保持され；それに対して、前記作用因子の存在下では、前記第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合せず、前記ＰＯＩが前記細胞内区画から放出されて、前記細胞の表面に発現されるか、前記細胞によって分泌される、操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項２】
前記作用因子の存在下では、前記ＰＯＩが、前記細胞の表面に送り出されるか、前記細胞表面で発現される、請求項１に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項３】
前記作用因子の存在下では、前記ＰＯＩが前記細胞によって分泌される、請求項１に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項４】
前記第１のタンパク質相互作用ドメインと前記第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合が、前記第１のタンパク質相互作用ドメインまたは前記第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方に競合性に結合する前記作用因子によって破壊される、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項５】
前記第１のタンパク質相互作用ドメインと前記第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合が、前記第１のタンパク質相互作用ドメインまた前記第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方に、前記第１のタンパク質相互作用ドメインと前記第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の相互作用よりも高い親和性で結合する前記作用因子によって破壊される、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項６】
前記第１のタンパク質相互作用ドメインまた前記第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方がＴｅｔ抑制因子タンパク質（ＴｅｔＲ）またはそのバリアントを含み、前記第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方がＴｅｔＲ誘導ペプチド（ＴｉＰ）またはそのバリアントを含み、前記作用因子が、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはその類似体から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項７】
前記第１のタンパク質相互作用ドメインまたは前記第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方が、前記作用因子のペプチド模倣物である、請求項１〜５のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項８】
前記第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方が前記作用因子のペプチド模倣物であり、前記第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方が前記作用因子および前記ペプチド模倣物に結合することができ、ここで、前記タンパク質相互作用ドメインが、それが前記作用因子に結合するよりも低い親和性で前記ペプチド模倣物に結合する、請求項６に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項９】
前記第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方が、前記作用因子に結合することができる抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ／ナノボディ、ナノボディ、アフィボディ、フィブロネクチン人工抗体足場、アンチカリン、アフィリン、ＤＡＲＰｉｎ、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー、フィノマー、ドメイン抗体（ＤＡｂ）、アブジュリン／ナノ抗体、センチリン、アルファボディ、またはナノフィチンを含み、前記第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方が前記作用因子のペプチド模倣物である、請求項７または請求項８に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１０】
前記第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方が、ミノサイクリンを模倣するペプチドであり、前記第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方が、ミノサイクリンに結合するＶＨＨであり、前記作用因子が、ミノサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはその類似体から選択される、請求項７または請求項８に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１１】
前記作用因子が小分子である、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１２】
前記細胞内保持ドメインがゴルジ保持ドメインであり、好ましくは、SEKDEL（配列番号２８）配列、KDEL（配列番号２９）配列、KKXX（配列番号３０）モチーフ、KXKXX（配列番号３１）モチーフ、配列KYKSRRSFIDEKKMP（配列番号３２）を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテール、または配列MHRRRSRSCR（配列番号３３）を含むＨＬＡインバリアント鎖のフラグメントからなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１３】
前記細胞内保持ドメインが小胞体保持ドメインであり、好ましくは、リボフォリンＩ、リボフォリンＩＩ、ＳＥＣ６１、またはシトクロムｂ５から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１４】
前記細胞内保持ドメインが、前記保持タンパク質のＣ末端またはＮ末端に存在する、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１５】
前記ＰＯＩが免疫系調節因子である、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１６】
前記ＰＯＩがサイトカインまたはケモカインである、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１７】
前記サイトカインまたはケモカインが、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントによって制御される、請求項１６に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１８】
前記ＰＯＩが、ＩＬ１２、ｆｌｅｘｉＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１、およびＣＣＬ１９から選択される、請求項１６または請求項１７に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項１９】
前記ＰＯＩが、抗体、抗体断片、またはｄＡｂである、請求項１〜１７のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項２０】
前記ＰＯＩが毒素である、請求項１〜１７のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項２１】
前記ＰＯＩが分泌タンパク質である、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項２２】
前記ＰＯＩが膜タンパク質（例えば、細胞表面膜タンパク質または原形質膜タンパク質）である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項２３】
前記放出性タンパク質が２またはそれを超えるＰＯＩを含む、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、α−βＴ細胞、ＮＫ細胞、γ−δＴ細胞、またはサイトカイン誘導性キラー細胞である、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項２５】
前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞。
【請求項２６】
核酸構築物であって、
（ｉ）請求項１〜２５のいずれか１項に記載の放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）請求項１〜２５のいずれか１項に記載の保持タンパク質をコードする第２の核酸配列；および
（ｉｉｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする第３の核酸配列
を含む、核酸構築物。
【請求項２７】
核酸配列のキットであって、
（ｉ）請求項１〜２５のいずれか１項に記載の放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）請求項１〜２５のいずれか１項に記載の保持タンパク質をコードする第２の核酸配列；および
（ｉｉｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする第３の核酸配列
を含む、核酸配列のキット。
【請求項２８】
請求項２６に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２９】
ベクターのキットであって、
ｉ）請求項１〜２５のいずれか１項に記載の放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）請求項１〜２５のいずれか１項に記載の保持タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む第２のベクター；および
（ｉｉｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする第３の核酸配列を含む第３のベクター
を含む、ベクターのキット。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれかに記載の操作された細胞溶解性免疫細胞を作製する方法であって、細胞溶解性免疫細胞に、請求項２６に記載の核酸構築物、請求項２７に記載の第１、第２、および第３の核酸配列；請求項２８に記載のベクター、または請求項２９に記載の第１、第２、および第３のベクターを導入するステップを含む、方法。
【請求項３１】
細胞からのＰＯＩの分泌を調節する方法であって、細胞に、請求項２６に記載の核酸構築物、請求項２７に記載の第１、第２、および第３の核酸配列；請求項２８に記載のベクター、または請求項２９に記載の第１、第２、および第３のベクターを導入するステップ、および請求項１〜２５のいずれか１項に記載の作用因子を前記細胞に投与するステップを含む、方法。
【請求項３２】
細胞からのＰＯＩの分泌を調節する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の作用因子を、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞または請求項３０または請求項３１に記載の方法によって得ることができる細胞に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
前記細胞が、被験体から単離した試料に由来する、請求項３０〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞、請求項２６に記載の核酸構築物、請求項２７に記載の第１、第２、および第３の核酸配列、請求項２８に記載のベクター、請求項２９に記載の第１、第２、および第３のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項３５】
請求項１〜２５のいずれかに記載の細胞または請求項３０〜３２のいずれかに記載の方法によって得ることができる細胞を含む、医薬組成物。
【請求項３６】
疾患の処置および／または予防に使用するための請求項３４または３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
疾患を処置および／または予防する方法であって、請求項３４または３５に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項３８】
疾患を処置および／または予防する方法であって、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の作用因子を、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞が投与されている被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項３９】
以下のステップ：
（ｉ）試料を含む細胞を単離するステップ；
（ｉｉ）請求項２５に記載の核酸構築物、請求項２６に記載の第１、第２、および第３の核酸配列、請求項２７に記載のベクター、または請求項２８に記載の第１、第２、および第３のベクターを前記細胞に導入するステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ
を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸構築物またはベクターを、形質導入またはトランスフェクションによって導入する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記が自己由来である、請求項３７〜４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が同種異系である、請求項３７〜４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記被験体における毒性活性および／または抗腫瘍活性をモニタリングすることを含み、必要に応じて、有害な毒性作用を低下させるために前記被験体への請求項１〜２５のいずれか１項に記載の作用因子の投与を停止または低減するステップ；または抗腫瘍効果を増大させるために前記被験体への請求項１〜２５のいずれか１項に記載の作用因子の投与を増加させるステップをさらに含む、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における請求項３４または３５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４５】
前記疾患ががんである、請求項３６に記載の使用のための医薬組成物、請求項３７〜４３のいずれかに記載の方法、または請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の操作された細胞溶解性免疫細胞からのＰＯＩの分泌を増加させるための請求項１〜２５のいずれか１項に記載の作用因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的のタンパク質を分泌する操作された細胞溶解性免疫細胞に関し；特に、前述の目的のタンパク質の分泌を調節可能に誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
操作された細胞治療は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、および多発性骨髄腫（ＭＭ）などの多くのリンパ系悪性疾患の処置においては成功を収めているが、固形がんの処置はあまりうまくいっていない。固形がんがリンパ系がんより操作された細胞治療の標的となり難い理由は多数証明されており、腫瘍への接近、阻害性のシグナルおよび細胞に持続的に直面すること、ならびに腫瘍抗原発現の不均一性が挙げられる。固形がんなどの他のがんの処置を成功させるためには操作された細胞治療の効力を増大させる方法が必要である。
【０００３】
操作された細胞は、不利な微小環境に直面する。腫瘍微小環境をモジュレートすることにより、この不利な微小環境を、操作された免疫細胞傷害性細胞が増殖し、生存し、および／または生着できるより好ましい環境に変換することができ、それにより、より有効な操作された細胞治療を提供することができる。
【０００４】
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、腫瘍微小環境をモジュレートして免疫応答をがんに対して向け直すことに特に関心が持たれている強力な免疫調節性サイトカインである。ＩＬ−１２は全身毒性があるので、ＩＬ−１２を局所的に産生する方法が作り出されている（例えば、Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１，５６９７−５７０６（２０１１）による）。トランスジェニックＴ細胞のＩＬ−１２産生は、全身中毒レベルを高くする可能性がある。Ｚｈａｎｇらは、ＮＦＡＴプロモーターによって駆動される単鎖ＩＬ−１２をコードする遺伝子で形質導入された自己由来黒色腫の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を産生した。ＩＬ−１２放出を機能的に調節したとしても、重篤な臨床毒性および予測不可能な臨床毒性（ＩＬ−１２およびインターフェロンγの血清レベルが高くなることが含まれる）、臨床毒性（肝機能障害、高熱、および散発性の生命を脅かす血行力学的不安定が含まれる）が生じた。
【０００５】
したがって、腫瘍微小環境を調節可能にモジュレートし、それにより微小環境で増殖し、生存し、および／または生着するように操作された細胞溶解性免疫細胞の有効性を改善することができるアプローチが依然として必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１，５６９７−５７０６（２０１１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、目的のタンパク質（免疫調節性サイトカインなど）を調節可能に分泌することができる操作された細胞溶解性免疫細胞を開発した。この方法は、他の方法を使用した場合に構成性にまたは全身レベルで分泌されることが望ましくないか安全ではないタンパク質を調節可能に分泌させることが可能である。
【０００８】
本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞を、腫瘍微小環境への免疫調節性タンパク質の投与を調節するために使用し、それにより、かかるタンパク質の全身投与に関連し得る毒性作用を回避することができる。
【０００９】
本明細書中に記載されるように、第１のタンパク質相互作用ドメインは目的のタンパク質に作動可能に連結されており、第２のタンパク質相互作用ドメインは細胞内保持ドメインに作動可能に連結されている。作用因子の非存在下では、目的のタンパク質は、第１および第２のタンパク質相互作用ドメインとの間のタンパク質：タンパク質相互作用を介して細胞内に保持されている。作用因子の存在下では、作用因子が第１および第２のタンパク質相互作用ドメインとの間のタンパク質：タンパク質相互作用を破壊し、目的のタンパク質が細胞内区画から放出され、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞から分泌される。
【００１０】
したがって、１つの態様では、本発明は、操作された細胞溶解性免疫細胞であって、
ｉ）目的のポリペプチド（ＰＯＩ）および第１の相互作用ドメインを含む放出性タンパク質；および
ｉｉ）細胞の細胞内区画内に保持されており、第２の相互作用ドメインを含む保持タンパク質；
を含み、
ここで、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインが、作用因子の存在または非存在に応じて条件付きで相互作用することができる、操作された細胞溶解性免疫細胞を提供する。
【００１１】
操作された細胞溶解性免疫細胞は、
ｉ）目的のタンパク質（ＰＯＩ）、第１のタンパク質相互作用ドメイン、およびシグナルペプチドを含む放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列；および
ｉｉ）第２のタンパク質相互作用ドメイン、細胞内保持ドメイン、およびシグナルペプチドを含む保持タンパク質をコードする第２の核酸配列；
を含むことができ、
ここで、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインが、作用因子の存在または非存在に応じて条件付きで相互作用することができる。
【００１２】
第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメイン（second  protein  interaction）との間の相互作用は、作用因子の存在によって破壊され得るため、作用因子の非存在下では、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合し、それにより、細胞内区画内にＰＯＩが保持され；それに対して、作用因子の存在下では、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合せず、ＰＯＩが細胞内区画内に保持されない。
【００１３】
これに関して、本出願は、操作された細胞溶解性免疫細胞であって、
ｉ）目的のポリペプチド（ＰＯＩ）および第１の相互作用ドメインを含む放出性タンパク質；および
ｉｉ）細胞の細胞内区画内に保持されており、第１のタンパク質相互作用ドメインに結合する第２の相互作用ドメインを含む保持タンパク質
を含み、
ここで、第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合は、作用因子の存在によって破壊されるため、作用因子の非存在下では、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合し、それにより、細胞内区画内にＰＯＩが保持され；それに対して、作用因子の存在下では、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合せず、ＰＯＩが細胞内区画から放出されて、細胞の表面に発現されるか、細胞によって分泌される、操作された細胞溶解性免疫細胞を提供する。
【００１４】
作用因子の存在下では、ＰＯＩが送り出されて、細胞表面で発現され得る。
【００１５】
あるいは、作用因子の存在下では、ＰＯＩは、細胞によって分泌され得る。
【００１６】
第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の相互作用は、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方に競合性に結合する作用因子によって低下または破壊され得る。
【００１７】
第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の相互作用は、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方に、第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の相互作用よりも高い親和性で結合する作用因子によって破壊され得る。
【００１８】
第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方はＴｅｔ抑制因子タンパク質（ＴｅｔＲ）またはそのバリアントを含み得、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方はＴｅｔＲ誘導ペプチド（ＴｉＰ）またはそのバリアントを含み得る。この場合、作用因子は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはその類似体から選択され得る。
【００１９】
適切には、第１のタンパク質相互作用ドメインはＴｅｔ抑制因子タンパク質（ＴｅｔＲ）またはそのバリアントを含み得、第２のタンパク質相互作用ドメインはＴｅｔＲ誘導ペプチド（ＴｉＰ）またはそのバリアントを含み得る。適切には、第１のタンパク質相互作用ドメインはＴｅｔＲ誘導ペプチド（ＴｉＰ）またはそのバリアントを含み得、第２のタンパク質相互作用ドメインはＴｅｔ抑制因子タンパク質（ＴｅｔＲ）またはそのバリアントを含み得る。
【００２０】
第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインは、作用因子のペプチド模倣物であり得る。
【００２１】
第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方は作用因子のペプチド模倣物であり得、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方は作用因子およびペプチド模倣物に結合することができる場合があり、ここで、タンパク質相互作用ドメインは作用因子に結合するよりも低い親和性でペプチド模倣物に結合する。
【００２２】
適切には、第１のタンパク質相互作用ドメインは作用因子のペプチド模倣物であり得、第２のタンパク質相互作用ドメインは作用因子およびペプチド模倣物に結合することができる場合があり、ここで、第２のタンパク質相互作用ドメインは、作用因子に結合するよりも低い親和性でペプチド模倣物に結合する。適切には、第１のタンパク質相互作用ドメインは作用因子およびペプチド模倣物に結合することができる場合があり、第２のタンパク質相互作用ドメインは作用因子のペプチド模倣物であり得、ここで、第１のタンパク質相互作用ドメインは、作用因子に結合するよりも低い親和性でペプチド模倣物に結合する。
【００２３】
適切には、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方は、作用因子に結合することができる抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ／ナノボディ、ナノボディ、アフィボディ、フィブロネクチン人工抗体足場、アンチカリン、アフィリン、ＤＡＲＰｉｎ、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー、フィノマー、ドメイン抗体（ＤＡｂ）、アブジュリン／ナノ抗体、センチリン、アルファボディ、またはナノフィチンを含み得、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方は作用因子のペプチド模倣物であり得る。
【００２４】
適切には、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方は、ミノサイクリンを模倣するペプチドであり得、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方は、ミノサイクリンに結合するＶＨＨであり得、作用因子は、ミノサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはその類似体から選択され得る。
【００２５】
作用因子は小分子であり得る。
【００２６】
細胞内保持ドメインは、ゴルジ保持ドメインであり得る。適切には、保持ドメインは、SEKDEL（配列番号２８）配列、KDEL（配列番号２９）配列、KKXX（配列番号３０）モチーフ、KXKXX（配列番号３１）モチーフ、配列KYKSRRSFIDEKKMP（配列番号３２）を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテール、もしくは配列MHRRRSRSCR（配列番号３３）を含むＨＬＡインバリアント鎖のフラグメント、またはそのバリアントからなる群から選択され得る。
【００２７】
細胞内保持ドメインは、小胞体保持ドメインであり得る。適切には、小胞体保持ドメインは、リボフォリンＩ、リボフォリンＩＩ、ＳＥＣ６１、もしくはシトクロムｂ５、またはそのバリアントから選択され得る。
【００２８】
細胞内保持ドメインは、原形質膜保持ドメインであり得る。適切には、原形質膜保持ドメインは、Ｔｈｙ−１およびＰＲＮＰまたはそのバリアントから選択され得る。
【００２９】
細胞内保持ドメインは、保持タンパク質のＣ末端またはＮ末端に存在し得る。
【００３０】
ＰＯＩは免疫系調節因子であり得る。
【００３１】
ＰＯＩは、サイトカインまたはケモカインであり得る。適切には、サイトカインまたはケモカインは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントによって制御され得る。
【００３２】
適切には、ＰＯＩは、ＩＬ１２、ｆｌｅｘｉＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１、およびＣＣＬ１９から選択され得る。
【００３３】
ＰＯＩは、抗体、抗体断片、またはｄＡｂであり得る。
【００３４】
ＰＯＩは毒素であり得る。適切には、毒素は、ジフテリア毒素またはシュードモナスの毒素であり得る。
【００３５】
ＰＯＩは分泌タンパク質であり得る。ＰＯＩは、膜タンパク質（例えば、細胞表面膜タンパク質または原形質膜タンパク質）であり得る。
【００３６】
放出性タンパク質は、２またはそれを超えるＰＯＩをコードし得る。
【００３７】
操作された細胞溶解性免疫細胞は、α−βＴ細胞、ＮＫ細胞、γ−δＴ細胞、またはサイトカイン誘導性キラー細胞であり得る。
【００３８】
操作された細胞溶解性免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに含み得る。
【００３９】
１つの態様では、本発明は、核酸配列のキットであって、
（ｉ）本明細書中に定義の放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）本明細書中に定義の保持タンパク質をコードする第２の核酸配列；および
（ｉｉｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする第３の核酸配列
を含む、核酸配列のキットを提供する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、核酸構築物であって、
（ｉ）本明細書中に定義の放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列；
（ｉｉ）本明細書中に定義の保持タンパク質をコードする第２の核酸配列；および
（ｉｉｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする第３の核酸配列
を含む、核酸構築物を提供する。
【００４１】
１つの態様では、本発明は、本発明の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００４２】
１つの態様では、本発明は、ベクターのキットであって、
ｉ）本明細書中に定義の放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１のベクター；
（ｉｉ）本明細書中に定義の保持タンパク質をコードする第２の核酸配列を含む第２のベクター；および
（ｉｉｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする第３の核酸配列を含む第３のベクター
を含む、ベクターのキットを提供する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞を作製する方法であって、細胞溶解性免疫細胞に、本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の第１、第２、および第３の核酸配列；本発明のベクター、または本明細書中に定義の第１、第２、および第３のベクターを導入するステップを含む、方法を提供する。
【００４４】
１つの態様では、本発明は、細胞からのＰＯＩの分泌を調節する方法であって、細胞に、本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の第１、第２、および第３の核酸配列；本発明のベクター、または本明細書中に定義の第１、第２、および第３のベクターを導入するステップ、および本明細書中に定義の作用因子を細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、細胞からのＰＯＩの分泌を調節する方法であって、本明細書中に定義の作用因子を、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞または本発明の方法によって得ることができる細胞に投与することを含む、方法を提供する。
【００４６】
細胞は、被験体から単離した試料に由来し得る。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の細胞溶解性免疫細胞、本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の第１、第２、および第３の核酸配列、本発明のベクター、本明細書中に定義の第１、第２、および第３のベクターを含む医薬組成物を提供する。
【００４８】
１つの態様では、本発明は、本発明の細胞または本発明の方法によって得ることができる細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００４９】
さらなる態様では、本発明は、疾患の処置および／または予防に使用するための本発明の医薬組成物を提供する。
【００５０】
本発明は、さらに、疾患を処置および／または予防する方法であって、本発明の医薬組成物を必要とする被験体に投与するステップを含む、方法に関する。
【００５１】
１つの態様では、本発明は、疾患を処置および／または予防する方法であって、本明細書中に定義の作用因子を、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞が投与されている被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００５２】
方法は、以下のステップ：
（ｉ）試料を含む細胞を単離するステップ；
（ｉｉ）本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の第１、第２、および第３の核酸配列、本発明のベクター、または本明細書中に定義の第１、第２、および第３のベクターを細胞に導入するステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ
を含み得る。
【００５３】
核酸構築物またはベクターは、形質導入またはトランスフェクションによって導入され得る。
【００５４】
細胞は自己由来であり得る。細胞は同種異系であり得る。
【００５５】
本方法は、被験体における毒性活性および／または抗腫瘍活性をモニタリングすることを含んでよく、必要に応じて、有害な毒性作用を低下させるために被験体への本明細書中に定義の作用因子の投与を停止または低減するステップ；または抗腫瘍効果を増大させるために被験体への本明細書中に定義の作用因子の投与を増加させるステップをさらに含んでよい。
【００５６】
別の態様では、本発明は、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の医薬組成物の使用に関する。
【００５７】
疾患はがんであり得る。がんは神経芽細胞腫であり得る。がんは前立腺がんであり得る。
【００５８】
本発明は、さらに、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞からのＰＯＩの分泌を増加させるための本明細書中に定義の作用因子の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】放出性タンパク質が第１の相互作用ドメインおよび目的のタンパク質を含み、保持タンパク質が第２の相互作用ドメインおよび保持ドメインを含む、本発明の一実施形態を示す概要図。第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは、条件付きで相互作用することが可能である。
【図２】本発明の構築物を示す概要図。構築物は、左から右に、シグナルペプチド、第１のタンパク質相互作用ドメイン、および目的のタンパク質を含む放出性タンパク質をコードする核酸配列、ならびに左から右に、シグナルペプチド、第２のタンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持ドメインを含む保持タンパク質をコードする核酸配列を含む。自己切断ペプチドをコードする核酸配列（２Ａドメイン）は、放出性タンパク質をコードする核酸配列と保持タンパク質をコードする核酸配列との間に配置されている。
【図３】本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞の図解例。第１のタンパク質相互作用ドメインは、ＴｅｔＲ相互作用タンパク質（ＴｉＰ）を含み、目的のタンパク質はＩＬ−１２である。第２のタンパク質相互作用ドメインは、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）および小胞体保持ドメイン、KDEL（配列番号２９）を含む。Ａ）作用因子の非存在下では、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合し、それにより、小胞体内にＩＬ−１２が保持される。Ｂ）作用因子の存在下では、ＴｅｔＲとＴｉＰとの間のタンパク質：タンパク質相互作用は破壊され、ＴｉＰがＴｅｔＲから離脱する。ＩＬ−１２は小胞体内に保持されない。
【図４】対照抗体（配列番号１３）と比較した配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、および配列番号３７のペプチドのミノサイクリンdAb（配列番号８）へのミノサイクリン置換可能な結合を示すグラフ。
【図５Ａ】ＥＲに保持されたＩＬ１２のミノサイクリン誘導性分泌  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、細胞内ＫＤＥＬタグ化抗ミノサイクリンｄＡｂおよびｄＡｂ特異的ペプチド（ＧＷＡＲＡまたはＰＷＡＹＳ）タグ化ＩＬ−１２を発現する構築物で一過性にトランスフェクトした（Ａ）。ＨＡマーカー発現についての染色によってトランスフェクション効率を決定し、トランスフェクション効率は５０〜７０％の範囲であった（Ｂ）。培養培地を除去し、種々の濃度のミノサイクリン（０、１ｕＭ、および１０ｕＭ）を含む新鮮な培地と置換した。ミノサイクリン添加から２時間後および４時間後に上清を回収し、ＩＬ１２  ＥＬＩＳＡを読み取った（Ｃ）。
【図５Ｂ】ＥＲに保持されたＩＬ１２のミノサイクリン誘導性分泌  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、細胞内ＫＤＥＬタグ化抗ミノサイクリンｄＡｂおよびｄＡｂ特異的ペプチド（ＧＷＡＲＡまたはＰＷＡＹＳ）タグ化ＩＬ−１２を発現する構築物で一過性にトランスフェクトした（Ａ）。ＨＡマーカー発現についての染色によってトランスフェクション効率を決定し、トランスフェクション効率は５０〜７０％の範囲であった（Ｂ）。培養培地を除去し、種々の濃度のミノサイクリン（０、１ｕＭ、および１０ｕＭ）を含む新鮮な培地と置換した。ミノサイクリン添加から２時間後および４時間後に上清を回収し、ＩＬ１２  ＥＬＩＳＡを読み取った（Ｃ）。
【図５Ｃ】ＥＲに保持されたＩＬ１２のミノサイクリン誘導性分泌  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、細胞内ＫＤＥＬタグ化抗ミノサイクリンｄＡｂおよびｄＡｂ特異的ペプチド（ＧＷＡＲＡまたはＰＷＡＹＳ）タグ化ＩＬ−１２を発現する構築物で一過性にトランスフェクトした（Ａ）。ＨＡマーカー発現についての染色によってトランスフェクション効率を決定し、トランスフェクション効率は５０〜７０％の範囲であった（Ｂ）。培養培地を除去し、種々の濃度のミノサイクリン（０、１ｕＭ、および１０ｕＭ）を含む新鮮な培地と置換した。ミノサイクリン添加から２時間後および４時間後に上清を回収し、ＩＬ１２  ＥＬＩＳＡを読み取った（Ｃ）。
【図６】ダンプナー（dampener）を含む本発明の一実施形態を示す略図。
【図７】エンハンサーを含む本発明の一実施形態を示す略図。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
タンパク質相互作用ドメイン
本発明の第１のタンパク質相互作用ドメイン、第２のタンパク質相互作用ドメイン、および作用因子は、作用因子の存在または非存在に応じてタンパク質相互作用ドメインを条件付きで相互作用することが可能な分子／ペプチド／ドメインの任意の組み合わせであり得る。
【００６１】
第１および第２のタンパク質相互作用ドメインは、相互に特異的に結合することができる場合がある。
【００６２】
第１および第２のタンパク質相互作用ドメインとの間のタンパク質間相互作用は自発的に起こり得るが、作用因子（すなわち、結合の「破壊因子」として作用する個別の分子）の存在下で破壊され得る。
【００６３】
第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の相互作用は、作用因子の存在によって破壊され得るため、作用因子の非存在下では、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合し、それにより、細胞内区画内にＰＯＩが保持され；それに対して、作用因子の存在下では、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインは結合せず、ＰＯＩが細胞内区画内に保持されない。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「破壊された」は、第１および第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合が作用因子の添加によって減少するか完全に消失されることを意味する。適切には、第１および第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合は、作用因子の添加によって、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％減少し得る。
【００６５】
第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の相互作用は、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方に競合性に結合する作用因子によって破壊され得る。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「作用因子の競合的結合」は、第１および第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合を防止する作用因子の結合を指す。作用因子は、一方のタンパク質ドメインの、他方のタンパク質ドメイン上の相互結合部位と相互作用する結合部位に直接結合することによって競合的に結合し得る。あるいは、作用因子は、一方のタンパク質ドメインの、他方のタンパク質ドメイン上の相互結合部位と相互作用する結合部位と重複する領域への結合によって競合的に結合し得る。
【００６７】
作用因子は、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインに、第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合よりも高い親和性で特異的に結合できる場合がある。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、「より高い親和性」は、作用因子が、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方に、第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の結合親和性の少なくとも５、１０、２０、５０、１００、１０００、または１００００倍の親和性で結合することを意味する。
【００６９】
結合親和性および競合的結合の測定のためのアッセイは、当該分野で公知である（放射性リガンド結合アッセイ（飽和結合、スキャッチャードプロットが含まれる）、非放射性リガンド結合アッセイ（蛍光偏光、蛍光共鳴エネルギー移動、および表面プラズモン共鳴／Ｂｉａｃｏｒｅが含まれる）、および固相リガンド結合アッセイなど）。
【００７０】
例えば、結合システムは、任意のペプチド：ペプチドタンパク質相互作用ドメインシステムに基づき得る。
【００７１】
第１または第２のタンパク質相互作用ドメインは、作用因子のペプチド模倣物であり得る。
【００７２】
適切には、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちのいずれかは、ペプチドに結合するペプチド結合ドメインを含み得、他方のタンパク質相互作用ドメインは、ペプチドより低い親和性でペプチド結合ドメインに結合するペプチド模倣物を含み得る。これらの実施形態では、作用因子としてペプチドを使用すると、競合的結合を介したペプチド結合ドメインへのペプチド模倣物の結合が破壊され得る。ペプチド模倣物は、「野生型」ペプチドに類似のアミノ酸配列を有し得るが、１またはそれを超える（one  of  more）アミノ酸が変化して、ペプチド結合ドメインに対する結合親和性を低下させている。
【００７３】
作用因子は、第１のタンパク質相互作用ドメインまたは第２のタンパク質相互作用ドメインに、第１のタンパク質相互作用ドメインと第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の親和性の少なくとも５，１０、２０、５０、１００、１０００、または１００００倍の親和性で結合し得る。
【００７４】
タンパク質間相互作用を破壊する小分子作用因子は、長きに亘って製薬目的のために開発されてきた（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ；Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ＩＳＢＮ：９７８−３−６４２−１７０８２−９（本明細書中で参考として援用される）で概説されている）。その相互作用が破壊されるタンパク質またはペプチド（またはこれらのタンパク質の関連する断片）を第１および／または第２のタンパク質相互作用ドメインとして使用することができ、小分子は作用因子として使用され得る。
【００７５】
小分子などの作用因子を使用してその相互作用が破壊され得るタンパク質／ペプチドのリストを、以下の表に示す。これらの破壊可能なタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）は、本発明で使用され得る。これらのＰＰＩについてのさらなる情報は、Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００８（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０：ｅ８（本明細書中で参考として援用される））から入手可能である。
【表２】
2021520792.tif 000003
【００７６】
上記例示のＰＰＩシステムに加えて、タンパク質に結合する小分子の相互作用を模倣するペプチドを生成するためのペプチド配列のファージディスプレイを使用して、他のＰＰＩシステムを生成することができることが理解される。
【００７７】
他の実施形態では、本発明のタンパク質相互作用ドメインとして使用するための小分子に結合する抗体を生成することができる。適切な抗体の生成方法は、当該分野で周知である。
【００７８】
本明細書中に記載の放出性タンパク質および保持タンパク質は、リンカーを含み得る。リンカー（またはスペーサー）は、タンパク質内の複数のドメインを分離する短い配列である。リンカーは、隣接タンパク質ドメインが相互に移動できるようにするグリシンおよびセリン反復などの可動性残基を含み得る。適切には、放出性および／または保持タンパク質は、１またはそれを超えるセリン−グリシンリンカードメインを含み得る。リンカーは、十分な可動性が得られる任意の長さであり得る。適切には、リンカーは、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれを超える残基長であり得る。
【００７９】
Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）システム
ポリペプチドの共局在を調節するための小分子システムは当該分野で公知である（例えば、Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）、ＴｅｔＲ相互作用タンパク質（ＴｉＰ）、テトラサイクリンシステム）。
【００８０】
Ｔｅｔオペロンは、哺乳動物細胞での使用に適合している周知の生物学的オペロンである。ＴｅｔＲは、ホモ二量体としてテトラサイクリンに結合して高次構造が変化し、次いで、ＴｅｔＲ分子のＤＮＡ結合をモジュレートする。Ｋｌｏｔｚｓｃｈｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９  Ａｐｒ；３７（６）：１７７８−８８（本明細書中で参考として援用される））は、ＴｅｔＲを活性化するファージディスプレイ由来ペプチドを記載していた。このタンパク質（ＴｅｔＲ相互作用タンパク質／ＴｉＰ）は、テトラサイクリン結合部位と重複するが同一ではない結合部位をＴｅｔＲ内に有する。したがって、ＴｉＰおよびテトラサイクリンは、ＴｅｔＲの結合について競合する。
【００８１】
本発明の細胞では、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方は、ＴｅｔＲまたはＴｉＰを含み得（からなり得）、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方は、対応する相補性結合パートナーまたはそのバリアントであり得る。
【００８２】
ＴｅｔＲおよびＴＩＰのアミノ酸配列を以下に示す：
ＴｅｔＲのアミノ酸配列を配列番号１に記載する。
【化１】
2021520792.tif 000004
【００８３】
ＴｉＰのアミノ酸配列を配列番号２に記載する−MWTWNAYAFAAP（配列番号２）。
【００８４】
いくつかの実施形態では、リンカー（セリン−グリシンリンカーなど）を、別のタンパク質からＴｉＰを分離するために使用することができる。リンカーは、ＴｉＰがそれ自体正確に配向し、そして／またはＴｉＰが連結しているタンパク質からＴｉＰを分離する可動性を可能にすることができる。
【００８５】
例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列は、ＴｉＰおよびセリン−グリシンリンカーのアミノ酸配列を含む（（ＳＧＧＧＳ）−MWTWNAYAFAAPSGGGS（配列番号３）。
【００８６】
第１および第２のタンパク質相互作用ドメインがＴｅｔＲまたはＴｉＰである場合、作用因子は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはその類似体であり得る。類似体は、ＴｅｔＲに特異的に結合する能力を保持しているか、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリンと比較してＴｅｔＲへの結合親和性が増大しているかより高いテトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはミノサイクリンのバリアントを指す。
【００８７】
ＴｅｔＲおよび／またはＴｉＰのバリアント配列は、配列番号１〜３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得、但し、バリアント配列が、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはその類似体の存在下で破壊される有効な結合システムを提供することを条件とする。すなわち、前述の配列が、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはその類似体の存在下で破壊され得る本発明のタンパク質相互作用ドメインの共局在を容易にすることを条件とする。
【００８８】
２つのポリペプチド配列間の同一性率を、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにて無料で利用可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定することができる。適切には、同一性率は、参照配列および／またはクエリー配列全体にわたって決定される。
【００８９】
１つの実施形態では、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方は、ＴｅｔＲもしくはＴｉＰまたはそのバリアントを含み得（からなり得）、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方は、対応する相補性結合パートナーまたはそのバリアントであり得、作用因子は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはその類似体であり得、目的のタンパク質は、本明細書中に記載の任意のＰＯＩであり得る。
【００９０】
１つの実施形態では、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方は、ＴｅｔＲもしくはＴｉＰまたはそのバリアントを含み得（からなり得）、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方は、対応する相補性結合パートナーまたはそのバリアントであり得、目的のタンパク質は、ｆｌｅｘｉ  ＩＬ−１２であり得る。
【００９１】
１つの実施形態では、第１の核酸配列は、ｆｌｅｘｉＩＬ−１２、ＴｉＰタンパク質相互作用ドメイン、およびシグナルペプチドを含む放出性タンパク質をコードし得る。適切には、ｆｌｅｘｉＩＬ−１２、ＴｉＰ（またはそのバリアント）、およびシグナルペプチドをコードする核酸配列は、作動可能に連結されている。適切には、シグナルペプチドは、マウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチド配列であり得る。この実施形態では、第２の核酸配列は、ＴｅｔＲ（またはそのバリアント）、細胞内保持ドメイン、およびシグナルペプチドを含む保持タンパク質をコードし得る。適切には、ＴｅｔＲ、細胞内保持ドメイン、およびシグナルペプチドをコードする核酸配列は、作動可能に連結されている。適切には、細胞内保持ドメインは、SEKDEL（配列番号２８）であり得る。
【００９２】
１つの実施形態では、放出性タンパク質は、配列番号５に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化２】
2021520792.tif 000005
【００９３】
配列番号５は、順番に、マウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチド配列（下線で示す）、ＴＩＰ配列（太字の斜体で示す）、ヒトＩＬ−１２βサブユニット（通常の文字で示す）セリングリシンリンカー（太字で示す）、およびヒトＩＬ−１２αサブユニット（斜体で示す）を含む。
【００９４】
１つの実施形態では、放出性タンパク質は、配列番号６に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化３】
2021520792.tif 000006
【００９５】
配列番号６は、順番に、アミノ酸位置９にリジン変異を有するマウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチド配列（下線で示す）、ＴＩＰ配列（太字の斜体で示す）、ヒトＩＬ−１２βサブユニット（通常の文字で示す）、セリングリシンリンカー（太字で示す）、およびヒトＩＬ−１２αサブユニット（斜体で示す）を含む。
【００９６】
アミノ酸位置９でのリジン置換により、シグナルペプチドの効率が低下し、それにより、ＥＲに侵入し、細胞から分泌され得るＴｉＰ−ＩＬ−１２の量が減少する。
【００９７】
１つの実施形態では、保持タンパク質は、配列番号７に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化４】
2021520792.tif 000007
【００９８】
配列番号７は、順番に、マウスＩｇ重鎖Ｖ領域１０２シグナルペプチド配列（下線で示す）、ＴｅｔＲ配列（通常の文字で示す）、セリン−グリシンリンカー（太字で示す）、およびSEKDEL（配列番号２８）ＥＲ保持ドメイン（斜体で示す）を含む。
【００９９】
配列番号５〜７のバリアント配列は、配列番号５〜７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得、但し、バリアント配列が、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはその類似体の存在下で破壊される有効な結合システムを提供することを条件とする。すなわち、前述の配列が、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、またはその類似体の存在下で破壊され得る本発明のタンパク質相互作用ドメインの共局在を容易にすることを条件とする。
【０１００】
別の実施形態では、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方は、小分子などの作用因子に結合するドメイン抗体などの抗体を含み得る。
【０１０１】
１つの実施形態では、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方は、作用因子に結合することができる抗体、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ／ナノボディ、ナノボディ、アフィボディ、フィブロネクチン人工抗体足場、アンチカリン、アフィリン、ＤＡＲＰｉｎ、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー、フィノマー、ドメイン抗体（ＤＡｂ）、アブジュリン／ナノ抗体、センチリン、アルファボディ、またはナノフィチンを含み、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方は作用因子のペプチド模倣物である。
【０１０２】
１つの実施形態では、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの一方は、ミノサイクリンを模倣するペプチドであり、第１または第２のタンパク質相互作用ドメインのうちの他方は、ミノサイクリンに結合する抗体であり、作用因子は、ミノサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン（ｄｏｘｏｃｙｃｌｉｎｅ）、またはその類似体から選択される。
【０１０３】
ミノサイクリンペプチド模倣物は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含み得る：ACPXWAXXFC（配列番号４１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）。
【０１０４】
ミノサイクリンを模倣する第１または第２のタンパク質相互作用ドメインは、以下の群から選択されるペプチドであり得る：
ACPGWARAFC（配列番号３４）；ACPHWAQAFC（配列番号３５）；ACPQWAMMFC（配列番号３６）、およびACPPWAYSFC（配列番号３７）。
【０１０５】
適切には、ミノサイクリンを模倣する第１または第２のタンパク質相互作用ドメインは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含み得る（からなり得る）。適切には、ミノサイクリンを模倣する第１または第２のタンパク質相互作用ドメインは、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含み得る（からなり得る）。適切には、ミノサイクリンを模倣する第１または第２のタンパク質相互作用ドメインは、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含み得る（からなり得る）。適切には、ミノサイクリンを模倣する第１または第２のタンパク質相互作用ドメインは、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含み得る（からなり得る）。
【０１０６】
ミノサイクリンに結合するドメイン抗体などの抗体は、配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有し得る。
【化５】
2021520792.tif 000008
【０１０７】
ミノサイクリン（またはそのバリアント）に結合するドメイン抗体などの抗体は、配列番号９に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有し得る。
【化６】
2021520792.tif 000009
【０１０８】
ミノサイクリン（またはそのバリアント）に結合するドメイン抗体などの抗体は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有し得る。
【化７】
2021520792.tif 000010
【０１０９】
ミノサイクリン（またはそのバリアント）に結合するドメイン抗体などの抗体は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有し得る。
【化８】
2021520792.tif 000011
【０１１０】
ミノサイクリン（またはそのバリアント）に結合するドメイン抗体などの抗体は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有し得る。
【化９】
2021520792.tif 000012
【０１１１】
ミノサイクリン（またはそのバリアント）に結合するドメイン抗体などの抗体は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列またはそのバリアントを有し得る。
【化１０】
2021520792.tif 000013
【０１１２】
配列番号８〜１３のバリアント配列は、配列番８〜１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得、但し、バリアント配列が、ミノサイクリンまたはその類似体に結合できることを条件とする。
【０１１３】
本発明は、ＰＯＩを分泌する操作された細胞溶解性免疫細胞を提供し、ここで、前述のＰＯＩの分泌は「調整可能（tunable）」である。本明細書中で使用される場合、「調整可能な」は、操作された細胞溶解性免疫細胞によってＰＯＩの分泌を増加させるか、減少させるか、またはオフにすることが可能であることを意味する。
【０１１４】
分泌を、いくつかの方法で調整することができる。例えば、放出性タンパク質と保持タンパク質の比を、分泌を増加または減少させるように改変することができる。ＰＯＩと細胞内保持ドメインとの比を、分泌を増加または減少させるように改変することができる。分泌を適切に増加させるために、ＰＯＩの細胞内保持ドメインに対する比を高くすることができ、その逆も同様である。
【０１１５】
タンパク質の比は、２つのタンパク質上の１またはそれを超えるシグナルペプチドの効率をモジュレートすることによって改変され得る。シグナルペプチドの効率をモジュレートする方法は、ＷＯ２０１６／１７４４０９号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１１６】
別の実施形態では、作用因子に対するタンパク質相互作用ドメインの親和性を改変することによって分泌を調整することができる。あるいは、タンパク質相互作用ドメインに対する親和性がより高いかより低い作用因子を使用することによって分泌を調整することができる。
【０１１７】
放出性タンパク質
本明細書中で使用される場合、「放出性タンパク質」は、保持タンパク質から脱離することができるタンパク質を指す。放出性タンパク質は、一方の区画から他方の区画へ移動することができ、例えば、放出性タンパク質は、細胞から分泌されるか、原形質膜に移動することができる場合がある。
【０１１８】
適切には、放出性タンパク質は、タンパク質を分泌経路に方向づけるシグナルペプチドを含み得る。適切には、放出性タンパク質は、例えばアンカードメインまたは膜貫通ドメインを含む膜タンパク質であり得る。
【０１１９】
目的のタンパク質（ＰＯＩ）
本明細書中で使用される場合、「目的のタンパク質」、「ＰＯＩ」は、細胞溶解性免疫細胞が発現するか分泌するように操作されたタンパク質を指す。
【０１２０】
ＰＯＩは、分泌が調節されることが望ましい（例えば、腫瘍微小環境内での分泌が調節されることが望ましい）任意のタンパク質であり得る。適切には、ＰＯＩは、免疫系調節因子である。適切には、ＰＯＩは、腫瘍微小環境をモジュレートすることができる場合がある。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、「免疫系調節因子」は、ＰＯＩが免疫系に影響を及ぼすことができることを意味する。
【０１２２】
ＰＯＩは、免疫応答を増大させることによって免疫系をモジュレートすることができる。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、「腫瘍微小環境をモジュレートすることができる」は、ＰＯＩが腫瘍微小環境に影響を及ぼすか、腫瘍微小環境を変化させることができることを意味する。
【０１２４】
ＰＯＩは、腫瘍の成長または腫瘍の生存を抑制するように腫瘍微小環境を改変することができる。
【０１２５】
適切には、ＰＯＩは、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその断片（ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片など）、または毒素であり得る。
【０１２６】
適切には、ＰＯＩは、免疫調節性であり得る。ＰＯＩは、阻害シグナル（例えば、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１））を遮断し得る。ＰＯＩは、ＰＤ１遮断抗体であり得る。ＰＯＩは、免疫系（例えば、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４またはＯＸＯ４０）作動薬、４１ＢＢ作動薬、または誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）作動薬）を活性化し得る。ＰＯＩはＯＸＯ４０アゴニストであり得る。ＰＯＩは、４１ＢＢアゴニストであり得る。ＰＯＩはＩＣＯＳアゴニストであり得る。
【０１２７】
ＰＤ１遮断抗体（クローン５Ｃ４）の配列を、配列番号１４に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号１４に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化１１】
2021520792.tif 000014
【０１２８】
ＯＸ４０アゴニスト（三量体コイルドコイルＯＸ４０Ｌ）の配列を、配列番号１５に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号１５に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化１２】
2021520792.tif 000015
【０１２９】
コイルドコイル配列を太字で示す。
【０１３０】
４１ＢＢアゴニスト（三量体コイルドコイル４１ＢＢＬ）の配列を、配列番号１６に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号１６に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化１３】
2021520792.tif 000016
【０１３１】
コイルドコイル配列を太字で示す。
【０１３２】
ＰＯＩはサイトカインであり得る。ＰＯＩはケモカインであり得る。
【０１３３】
ＰＯＩは、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ｆｌｅｘｉＩＬ−１２、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（インターロイキン−１５）、インターロイキン−２１、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）から選択され得る。
【０１３４】
適切には、ＰＯＩはＩＬ−１２であり得る。
【０１３５】
適切には、ＰＯＩはＩＬ−１２であり得る。適切には、ＰＯＩは、ＩＬ−１２αサブユニットおよびＩＬ−１２βサブユニットを含み得る。適切には、ＩＬ−１２αサブユニットおよび／またはＩＬ−１２βサブユニットは、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッションＰ２９４５９および／またはＰ２９４６０にそれぞれ記載のアミノ酸配列を含み得る。
【０１３６】
ＵｎｉＰｒｏｔアクセッションＰ２９４５９由来のＩＬ−１２αサブユニットのアミノ酸配列を、配列番号１７に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号１７に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化１４】
2021520792.tif 000017
【０１３７】
ＵｎｉＰｒｏｔアクセッションＰ２９４６０由来のＩＬ−１２βサブユニットのアミノ酸配列を、配列番号１８に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号１８に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化１５】
2021520792.tif 000018
【０１３８】
適切には、ＰＯＩはｆｌｅｘｉ  ＩＬ−１２であり得る。ｆｌｅｘｉ  ＩＬ−１２は、可動性リンカー（セリン−グリシン反復を含むリンカーなど）によって連結されたヒトＩＬ−１２のｐ３５およびｐ４０サブユニットを含む。
【０１３９】
ｆｌｅｘｉ  ＩＬ−１２のアミノ酸配列を、配列番号１９に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号１９に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化１６】
2021520792.tif 000019
【０１４０】
ヒトＩＬ−１２βサブユニットを通常の文字で示し、セリングリシンリンカーを太字で示し、ヒトＩＬ−１２αサブユニットを斜体で示す。
【０１４１】
ＩＬ−７のアミノ酸配列を、配列番号２０に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号２０に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化１７】
2021520792.tif 000020
【０１４２】
ＩＬ−１５のアミノ酸配列を、配列番号２１に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号２１に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化１８】
2021520792.tif 000021
【０１４３】
ＩＬ−２１のアミノ酸配列を、配列番号２２に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号２２に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化１９】
2021520792.tif 000022
【０１４４】
ＣＣＬ１９のアミノ酸配列を、配列番号２３に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号２３に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化２０】
2021520792.tif 000023
【０１４５】
ＰＯＩは抗体であり得る。適切には、ＰＯＩは、抗体、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ））、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨ／ナノボディ、ナノボディ、アフィボディ、フィブロネクチン人工抗体足場、アンチカリン、アフィリン、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、ＶＮＡＲ、ｉＢｏｄｙ、アフィマー、フィノマー、ドメイン抗体（ＤＡｂ）、アブジュリン／ナノ抗体、センチリン、アルファボディ、またはナノフィチンであり得る。
【０１４６】
ＰＯＩは毒素であり得る。適切には、毒素はジフテリア毒素であり得る。適切には、毒素はシュードモナス毒素であり得る。適切には、毒素は赤痢菌毒素であり得る。
【０１４７】
ジフテリア毒素のアミノ酸配列を、配列番号２４に記載する。適切には、ＰＯＩは、配列番号２４に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
【化２１】
2021520792.tif 000024
【０１４８】
配列番号１４〜２４のバリアント配列は、配列番１４〜２４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得、但し、バリアント配列が、目的のタンパク質として機能できることを条件とする。バリアント配列は、配列番号１４〜２４の少なくとも１つの機能（免疫系調節因子として作用する能力または腫瘍環境をモジュレートする能力など）を保持している。
【０１４９】
ＰＯＩは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメントによって制御され得る。
【０１５０】
ＮＦＡＴ応答エレメントは、配列番号４に記載のヌクレオチド酸配列を含み得る：GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT（配列番号４）。
【０１５１】
ＮＦＡＴ応答エレメントは、３、４、５、または６個の反復単位などの反復単位を含み得る。適切には、ＮＦＡＴ応答エレメントは、３、４、５、または６個の配列番号４の反復単位を含み得る。ＮＦＡＴ応答エレメントは、プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の前に配置され得る。
【０１５２】
操作された細胞溶解性免疫細胞は、２またはそれを超えるＰＯＩ（２個のＰＯＩ、３個のＰＯＩ、４個のＰＯＩ、または５個またはそれを超えるＰＯＩなど）をコードする核酸配列を含み得る。適切には、放出性タンパク質は、２またはそれを超えるＰＯＩを含み得る。
【０１５３】
２またはそれを超えるＰＯＩは、サイトカイン、ケモカイン、抗体、および／または毒素の組み合わせであり得る。適切には、ＰＯＩの組み合わせは、相乗作用を示し得る。適切には、組み合わせは、サイトカインおよびケモカイン（ＩＬ−７およびＣＣＬ１９など）の組み合わせであり得る。
【０１５４】
ＰＯＩは、本明細書中に定義の第１のタンパク質相互作用ドメインに作動可能に連結され得る。ＰＯＩは、本明細書中に定義のシグナルペプチドおよび第１のタンパク質相互作用ドメインの両方に作動可能に連結され得る。
【０１５５】
１つの実施形態では、本明細書中に定義の放出性タンパク質および保持タンパク質は、同一の核酸分子によってコードされる。この実施形態を、図２に示す。
【０１５６】
本明細書中で使用される場合、「融合タンパク質」は、個別のタンパク質をコードする２またはそれを超える核酸配列の連結によって作製されたタンパク質である。
【０１５７】
適切には、本明細書中に定義の放出性タンパク質は、融合タンパク質であり得、第１のタンパク質相互作用ドメインに融合したＰＯＩを含み得る。適切には、本明細書中に定義の放出性タンパク質は、第１のタンパク質相互作用ドメインおよびシグナルペプチドの両方に融合したＰＯＩを含み得る融合タンパク質であり得る。
【０１５８】
ＰＯＩは分泌タンパク質であり得る。適切には、本発明は、細胞からの分泌タンパク質の放出を調節する方法であって、ここで、ＰＯＩは分泌タンパク質である、方法を提供する。
【０１５９】
本明細書中で使用される「膜タンパク質」は、タンパク質を細胞膜に係留するアンカーとして作用する膜係留成分（membrane  tethering  component）を含むタンパク質を意味する。
【０１６０】
膜係留成分は、膜局在ドメインを含み得る。これは、原形質膜に近位の位置にタンパク質を付着または保持させる任意の配列であり得る。
【０１６１】
膜局在ドメインは、新生ポリペプチドを最初にＥＲ膜に付着させる配列であり得るか、この配列を含み得る。膜材料がＥＲからゴルジに、最終的には原形質膜に「流れる」ので、タンパク質は、合成／移動プロセスの終了時に膜に会合したままである。
【０１６２】
膜局在ドメインは、例えば、膜貫通ドメインもしくは膜貫通配列、膜透過停止配列、ＧＰＩアンカー、またはミリストイル化／プレニル化／パルミトイル化部位を含み得る。
【０１６３】
あるいは、膜局在ドメインは、例えば膜近位実体への結合によって細胞膜に存在するタンパク質または他の実体に膜係留成分を方向づけることができる。膜係留成分は、例えば、免疫シナプスに関与する分子（ＴＣＲ／ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８など）に結合するドメインを含み得る。
【０１６４】
ミリストイル化は、ミリスチン酸由来のミリストイル基がアミド結合によって末端グリシン残基のα−アミノ基に共有結合する脂質化修飾である。ミリスチン酸は、ｎ−テトラデカン酸としても公知の１４−炭素飽和脂肪酸である。共翻訳的にかまたは翻訳後にのいずれかで修飾を追加することができる。Ｎ−ミリストイルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）は、細胞質内でのミリスチン酸付加反応を触媒する。疎水性ミリストイル基が細胞膜内のリン脂質と相互作用するので、ミリストイル化するとタンパク質が膜を標的にし、膜にタンパク質が付着される。
【０１６５】
本発明の膜係留成分は、ＮＭＴ酵素によってミリストイル化され得る配列を含み得る。本発明の細胞の膜係留成分は、細胞内で発現されたときにミリストイル基を含み得る。
【０１６６】
膜係留成分は、以下などのコンセンサス配列を含み得る：ＮＭＴ酵素によって認識されるＮＨ２−Ｇ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｓ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８。
【０１６７】
パルミトイル化は、タンパク質のシステイン残基、それほど多くはないが、セリン残基およびトレオニン残基への脂肪酸（パルミチン酸など）の共有結合による付加（covalent  attachment）である。パルミトイル化は、タンパク質の疎水性を増強し、膜会合を誘導するために使用することができる。プレニル化およびミリストイル化と対照的に、パルミトイル化は、通常は不可逆である（パルミチン酸とタンパク質との間の結合がチオエステル結合であることが多いため）。逆反応は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼによって触媒される。
【０１６８】
Ｇタンパク質を介したシグナル伝達では、αサブユニットのパルミトイル化、γサブユニットのプレニル化、およびミリストイル化は、原形質膜の内面へのＧタンパク質の係留に関与し、その結果Ｇタンパク質がその受容体と相互作用することができる。
【０１６９】
膜係留成分は、パルミトイル化され得る配列を含み得る。膜係留成分は、細胞内で発現されたときに膜局在化させるさらなる脂肪酸を含み得る。
【０１７０】
プレニル化（イソプレニル化または脂質化としても公知）は、タンパク質または化学化合物への疎水性分子の付加である。プレニル基（３−メチル−ブタ−２−エン−１−イル）は、ＧＰＩアンカーのような脂質アンカーに類似して、細胞膜への付着を容易にする。
【０１７１】
タンパク質プレニル化は、標的タンパク質のＣ末端システイン（単数または複数）へのファルネシル部分またはゲラニル−ゲラニル部分のいずれかの移行を伴う。細胞内でプレニル化する酵素は３種存在する（ファルネシルトランスフェラーゼ、Ｃａａｘプロテアーゼ、およびゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＩ）。
【０１７２】
膜係留成分は、プレニル化され得る配列を含み得る。膜係留成分は、細胞内で発現されたときに膜局在化させる１またはそれを超えるプレニル基を含み得る。
【０１７３】
本明細書中で使用される「膜貫通ドメイン」は、膜にまたがるタンパク質配列である。膜貫通ドメインは、膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造物であり得る。これは、典型的には、いくつかの疎水性残基から構成されるαヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを、本発明の膜タンパク質に膜貫通部分を供給するために使用することができる。
【０１７４】
タンパク質の膜貫通ドメインの存在および全長（span）を、当業者がＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を使用して決定することができる。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的簡潔な構造（すなわち、膜にまたがるのに十分な長さの疎水性αヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列）であることを考慮すると、人工的に設計されたＴＭドメインも使用することができる（米国特許第７０５２９０６Ｂ１号は、合成膜貫通成分を記載している）。
【０１７５】
ＰＯＩは、膜タンパク質（例えば、膜係留成分を含むタンパク質、膜貫通ドメインを含むタンパク質）であり得る。適切には、ＰＯＩは、任意のタイプの膜タンパク質であり得、以下が含まれるが、これらに限定されない：タイプＩ、ＩＩ、およびＩＩ（一回貫通分子）およびタイプＩＶ（複数回貫通分子）膜タンパク質。適切には、本発明は、膜タンパク質が細胞の原形質膜に移動するように細胞の内側からの膜タンパク質の放出を調節する方法であって、ここで、ＰＯＩが膜タンパク質である、方法を提供する。
【０１７６】
本発明で使用することができる膜タンパク質の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｓｒｃファミリーキナーゼ（例えば、Ｆｙｎ、Ｓｒｃ、Ｌｃｋ）、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ１４８、ＣＤ４５、ＳＨＰ−１、またはＳＨＰ−２、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ１、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ．ＣＤ３３、ＣＤ３１、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲまたはＨＶＥＭまたはＳｉｇｌｅｃ−５、６、７、８、９、１０、もしくは１１およびキメラ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体。本発明で使用することができる膜タンパク質の他の例には、膜結合サイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ１７、およびＩＬ１５など）が含まれる。
【０１７７】
本明細書中で使用される場合、「エンハンサー」は、本発明の細胞溶解性免疫細胞の活性（例えば、シグナル伝達）および／または持続を増強することができるタンパク質を意味する。例えば、エンハンサーは、本発明の細胞溶解性免疫細胞の細胞活性化、抗原応答性、増殖および／または持続を増強することができる場合がある。
【０１７８】
適切には、エンハンサーは、膜係留成分およびエンハンサードメインを含み得る。
【０１７９】
「膜係留成分」は、シグナル増強成分またはシグナル減衰成分を細胞膜の細胞内面に係留するアンカーとして作用する。
【０１８０】
適切には、エンハンサードメインは、シグナルリン酸化増幅ドメイン（例えば、キナーゼ）であり得る。
【０１８１】
リン酸化増幅ドメインは、ＩＴＡＭのリン酸化を直接または間接的に増幅させることができるリン酸化増幅エンドドメインであり得る。例えば、リン酸化増幅エンドドメインは、１またはそれを超えるＩＴＡＭ（単数または複数）のリン酸化を直接または間接的に増幅することができる場合がある。
【０１８２】
リン酸化の直接増幅の例は、キナーゼによるリン酸化である。ＳＲＣファミリーキナーゼ（ＳＲＫ）タンパク質のチロシンキナーゼドメインは、ＩＴＡＭ上のチロシン残基を直接リン酸化することができる。
【０１８３】
リン酸化の間接的増幅の例は、キナーゼの動員を介した増幅である。例えば、ＣＤ４共受容体およびＣＤ８共受容体の細胞内ドメインは、ＣＡＲ  Ｔ細胞抗原複合体とクラスター化し、さらにＳＲＫタンパク質を動員することによってＩＴＡＭのリン酸化を間接的に増幅し、次いで、ＩＴＡＭを直接リン酸化する。これらの共受容体はまた、ＣＡＲ  Ｔ細胞抗原複合体をさらに安定化し、Ｔ細胞活性化に必要なＣＡＲ  Ｔ細胞受容体複合体を介したシグナル伝達を最適にする。
【０１８４】
リン酸化増幅ドメインは、ＳＲＫタンパク質のチロシンキナーゼドメインの全てまたは一部を含み得る。
【０１８５】
あるいはまたはさらに、リン酸化増幅ドメインは、ＣＤ４共受容体またはＣＤ８共受容体の細胞内ドメインの全てまたは一部を含み得る。
【０１８６】
エンハンサードメインは、腫瘍微小環境から細胞を保護する因子（例えば、４−１ＢＢＬまたはＣＤ４０Ｌ）であり得る。
【０１８７】
エンハンサードメインは、キメラ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体であり得る。
【０１８８】
適切には、キメラＴＮＦ受容体は、ＴＮＦＲリガンドに結合することができる結合ドメインおよびＴＮＦＲシグナル伝達ドメインを含み得る。適切には、抗原結合ドメインは、Ｄ３Ｒ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ、またはＦｎ１４のリガンド結合ドメインを含み得る。適切には、シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＧＩＴＲエンドドメインのシグナル伝達部分を含み得る。
【０１８９】
１つの実施形態では、ＰＯＩ（膜ＰＯＩなど）はエンハンサーであり得る。
【０１９０】
本明細書中で使用される場合、「ダンプナー」または「シグナルダンパー」は、細胞膜の細胞内側に配置されたときにシグナル伝達を阻害するタンパク質を意味する。
【０１９１】
例えば、ダンプナーは、ＣＡＲエンドドメインまたはＴＣＲエンドドメインの近位に配置されたときにＣＡＲ媒介シグナル伝達またはＴＣＲ媒介シグナル伝達を阻害し得る。
【０１９２】
シグナルダンプナーは、ＣＡＲ媒介細胞シグナル伝達またはＴＣＲ媒介細胞シグナル伝達を完全に阻害し、ＣＡＲ媒介細胞活性化を有効に「オフにする」ことができる。あるいは、シグナルダンプナーは、部分阻害を引き起こし、ＣＡＲ媒介細胞シグナル伝達を有効に「低下させる」ことができる。
【０１９３】
シグナルダンプナーが存在すると、シグナル伝達成分を介したシグナル伝達が、シグナルダンプナーの非存在下で生じるシグナル伝達の１／２、１／５、１／１０、１／５０、１／１００、１／１，０００、または１／１０，０００になり得る。
【０１９４】
ＣＡＲ媒介シグナル伝達またはＴＣＲ媒介シグナル伝達を、当該分野で公知の種々の方法によって決定することができる。かかる方法は、シグナル伝達をアッセイすること（例えば、特定のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のレベル、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）の分解、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化、および細胞内カルシウムイオン濃度の上昇をアッセイすること）を含む。Ｔ細胞クローンの拡大増殖（clonal  expansion）、細胞表面上の活性化マーカーの上方制御、エフェクター細胞への分化、および細胞傷害性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）分泌の誘導などの機能の読み取りも利用することができる。
【０１９５】
適切には、ダンプナーは、膜係留成分およびシグナル減衰ドメインを含み得る。
【０１９６】
シグナル減衰ドメインは、ＩＴＡＭを脱リン酸化することができるホスファターゼなどのホスファターゼを含み得る。
【０１９７】
シグナルダンプナーのシグナル減衰ドメインは、受容体様チロシンホスファターゼの全てまたは一部を含み得る。ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐａｔａｓｅ）は、Ｔ細胞シグナル伝達に関与するエレメント（ＰＬＣγ１および／またはＬＡＴなど）のリン酸化および／または機能を干渉し得る。
【０１９８】
シグナル減衰ドメインは、Ｔ細胞活性化の調節に関与する１またはそれを超えるホスファターゼ（ＣＤ１４８、ＣＤ４５、ＳＨＰ−１、またはＳＨＰ−２など）のホスファターゼドメインを含み得る。
【０１９９】
適切には、細胞内区画から膜へのダンプナー（例えば、ホスファターゼ）の放出は、ＣＡＲまたはＴＣＲ媒介シグナル伝達を減衰させる。
【０２００】
シグナル減衰成分のシグナル減衰ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達を阻害する免疫制御性分子の実施形態の全てまたは一部を含み得る。例えば、シグナル減衰ドメインは、Ｔ細胞活性化を阻害する免疫抑制受容体由来のエンドドメインを含み得る。抑制性受容体は、ＣＤ２８またはＳｉｇｌｅｃファミリーのメンバーであり得る（ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ１、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ．ＣＤ３３、ＣＤ３１、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲもしくはＨＶＥＭ、またはＳｉｇｌｅｃ−５、６、７、８、９、１０、もしくは１１）など。
【０２０１】
シグナル減衰ドメインは、１またはそれを超える免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含み得る。
【０２０２】
ＩＴＩＭは、免疫系の多数の抑制性受容体の細胞質側末端に見出されるアミノ酸（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬｘＹｘｘＩ／Ｖ／Ｌ）の保存配列である。ＩＴＩＭプロセシング抑制性受容体がそのリガンドと相互作用した後、そのＩＴＩＭモチーフは、Ｓｒｃキナーゼの酵素によってリン酸化されるようになる。
【０２０３】
免疫抑制性受容体（ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、２Ｂ４、ＧＰ４９Ｂ、Ｐｉｒ−Ｂ、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ２２、Ｓｉｇｌｅｃ７、Ｓｉｇｌｅｃ９、ＫＬＲＧ１、ＩＬＴ２、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ５、ならびにＫｉｌｌｅｒ抑制性受容体ファミリー（ＫＩＲ）（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、およびＫＩＲ３ＤＬ３が含まれる）など）は、ＩＴＩＭを含む。
【０２０４】
チロシン−プロテインキナーゼＣＳＫ（Ｃ末端Ｓｒｃキナーゼ）は、ＳｒｃファミリーキナーゼのＣ末端に存在するチロシン残基をリン酸化する酵素である（ＵｎｉＰｒｏｔＩＤ：Ｐ４１２４０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ４１２４０））。シグナル減衰ドメインは、ＣＳＫのチロシンキナーゼドメインを含み得る。
【０２０５】
１つの実施形態では、ＰＯＩ（膜ＰＯＩなど）は、ダンプナーであり得る。
【０２０６】
適切には、ＰＯＩは、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞がＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを含むときのダンプナーであり得る。
【０２０７】
シグナルペプチド
古典的なタンパク質分泌経路は、小胞体（ＥＲ）を介する。本明細書中に記載の放出性タンパク質および保持タンパク質は、シグナル配列を含み得るため、タンパク質が細胞の内側で発現されるとき、新生タンパク質がＥＲに方向づけられる。
【０２０８】
用語「シグナルペプチド」は、「シグナル配列」と同義である。
【０２０９】
シグナルペプチドは、典型的には新規に合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在し、分泌経路に向かう運命にある、一般に５〜３０アミノ酸長の短いペプチドである。これらのタンパク質には、一定のオルガネラ（例えば、小胞体、ゴルジ、またはエンドソーム）のいずれかの内側に存在し、細胞から分泌されるタンパク質、および膜貫通タンパク質が含まれる。
【０２１０】
シグナルペプチドは、一般に、一本鎖αヘリックスを形成する傾向がある長鎖疎水性アミノ酸であるコア配列を含む。シグナルペプチドは、短い正電荷のアミノ酸鎖から始まる場合があり、これは、移動中のポリペプチドの適切なトポロジーを堅持するのに役立つ。シグナルペプチドの末端では、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸鎖が存在する。シグナルペプチダーゼは、移動中または移動完了後のいずれかにシグナルペプチドを切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼによって消化される。
【０２１１】
シグナルペプチドは、いくつかのカルボキシ末端シグナルペプチドが知られているが、一般に、分子のアミノ末端に存在する。
【０２１２】
シグナル配列は、典型的には、疎水性コア領域（ｈ−領域）、これに隣接するｎ−領域およびｃ−領域からなる三部構造を有する。後者は、シグナルペプチダーゼ（ＳＰａｓｅ）コンセンサス切断部位を含む。通常は、シグナル配列は共翻訳的に切断され、得られた切断シグナル配列はシグナルペプチドと名付けられている。
【０２１３】
シグナル配列を、ソフトウェア技術（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｓｉ．ｄｅ／を参照のこと）を使用して検出するか予測することができる。
【０２１４】
非常に多くのシグナル配列が公知であり、データベースから入手できる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ  ｌｉｓｔｓ  ２１０９では、そのデータベース内に哺乳動物シグナルペプチドが確認される。
【０２１５】
１つの実施形態では、タンパク質は、タンパク質を小胞体（ＥＲ）内に移動させることができるシグナルペプチドに作動可能に連結され得る。タンパク質は、タンパク質をＥＲ内に移動させることができるシグナルペプチドに作動可能に連結されるように操作され得る。適切には、タンパク質は、通常は天然では作動可能に連結されないシグナルペプチドに作動可能に連結され得る。適切には、タンパク質とシグナルペプチドの組み合わせは合成であり得る（例えば、天然では見出されない）。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、変化したシグナルペプチド（効率性で劣るシグナルペプチドなど）を使用することができる。変化したシグナルペプチドを使用すると、臨床上の必要性に応じて系が調整される場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、効率性で劣るシグナルペプチドを使用すると、系からの漏出が低下する（例えば、作用因子の非存在下での分泌または移動が低下する）
【０２１７】
タンパク質の比は、２つのタンパク質上の１またはそれを超えるシグナルペプチドの効率をモジュレートすることによって改変され得る。シグナルペプチドの効率をモジュレートする方法は、ＷＯ２０１６／１７４４０９号（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０２１８】
適切には、シグナルペプチドは、マウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチドまたはそのバリアントであり得る。マウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を、配列番号２５に記載する。適切には、シグナルペプチドは、配列番号２５またはそのバリアントを含み得る。
METDTLLLWVLLLWVPGSTG（配列番号２５）。
【０２１９】
適切には、バリアントマウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２６に記載の配列を含み得る。
METDTLLLKVLLLWVPGSTG（配列番号２６）。
【０２２０】
このバリアントマウスＩｇκ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチド配列は、配列番号２６に記載の野生型配列に関してアミノ酸位置番号９（下線）にリジン変異を含む。適切には、このシグナルペプチドは、配列番号２６またはそのバリアントを含み得る。
【０２２１】
アミノ酸位置番号９でのリジン変異によるこの置換は、シグナルペプチドの効率を低下させ、それにより、ＥＲへのタンパク質の侵入量が低下し、膜に分泌または移動されるタンパク質の総量が低下する。
【０２２２】
適切には、シグナルペプチドは、マウスＩｇ重鎖Ｖ領域シグナルペプチド配列であり得る。マウスＩｇ重鎖Ｖ領域シグナルペプチドのアミノ酸配列を、配列番号２７に記載する。適切には、シグナルペプチドは、配列番号２７に記載の配列またはそのバリアントを含み得る。
MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号２７）。
【０２２３】
配列番号２５〜２７のバリアント配列は、配列番２５〜２７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得、但し、バリアント配列が、シグナルペプチドとして機能できることを条件とする。バリアント配列は、新生タンパク質をＥＲに向かわせる能力を保持している。
【０２２４】
別の実施形態では、タンパク質は、ＥＲ内に移動させることができるシグナルペプチドに作動可能に連結され得る。適切には、タンパク質は、通常天然で作動可能に連結されるシグナルペプチドに作動可能に連結され得る。適切には、タンパク質は、野生型シグナルペプチドを含み得る（例えば、タンパク質とシグナルペプチドの組み合わせは天然に存在する）。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、ＰＯＩは膜タンパク質であり、膜透過停止アンカー配列（stop-transfer  anchor  sequence）で脂質膜に係留されている。他の実施形態では、ＰＯＩは膜タンパク質であり、シグナルアンカー配列で脂質膜に係留されている。他の実施形態では、ＰＯＩは膜タンパク質であり、そのＮ末端ドメインはサイトゾルに向かっている。さらなる実施形態では、ＰＯＩは膜タンパク質（ｐｒｔｅｉｎ）であり、そのＮ末端ドメインは内腔に向かっている。
【０２２６】
作用因子
第１および第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の相互作用は、作用因子の存在または非存在に応じた条件付き相互作用である。
【０２２７】
作用因子は、細胞の細胞質または細胞内区画に送達され得る場合があり、細胞内結合に利用可能であり得る。
【０２２８】
適切には、作用因子は小分子であり得る。作用因子は、ステロイド、メトトレキサート、カフェイン、コカイン、または抗生物質などの小分子であり得る。
【０２２９】
ステロイドは、４つの「縮合」炭素環を有する有機化合物である。ステロイドの例には、食物脂質であるコレステロール、性ホルモンであるエストラジオールおよびテストステロン、ならびに抗炎症薬であるデキサメタゾンが含まれる。
【０２３０】
ステロイドのコア構造は、以下の４つの「縮合」環に結合した１７個の炭素原子から構成される：３つの６員シクロヘキサン環（第１の図中のＡ、Ｂ、およびＣ環）および１つの５員シクロペンタン環（Ｄ環）。ステロイドは、この４環コアに結合した官能基および環の酸化状態によって様々である。ステロールは、３位にヒドロキシル基およびコレスタン由来の骨格を有するステロイドの形態である。
【０２３１】
メトトレキサート（ＭＴＸ）は、以前はアメトプテリンとして公知であり、代謝拮抗物質および抗葉酸薬である。
【０２３２】
カフェインは、プリン環を有するメチルキサンチンアルカロイドである。カフェインは、中枢神経系の刺激薬であるが、食品医薬品局によって一般に安全とみなされている（ＧＲＡＳ）。中毒量は、成人では１０グラム超であり、典型的な用量である５００ミリグラム／日未満よりはるかに高い。コーヒー一杯には８０〜１７５ｍｇのカフェインが含まれている。
【０２３３】
コカインは、ベンゾイルメチルエクゴニンまたはコークとしても公知であり、強い刺激薬である。コカイン（メチル（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−３−（ベンゾイルオキシ）−８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン−２−カルボキシラート）の種々のアナログが公知である（立体異性体；３β−フェニル環置換類似体；２β−置換類似体；コカインのＮ修飾類似体；３β−カルバモイル類似体；３β−アルキル−３−ベンジルトロパン；６／７置換コカイン；６−アルキル−３−ベンジルトロパン；およびピペリジンホモログが含まれる。
【０２３４】
抗生物質または抗細菌薬は、細菌感染の処置および予防で使用される抗菌剤の一形態である。抗菌性抗生物質は、一般に、その作用機序、化学構造、または活性領域に基づいて分類される。そのほとんどが、細菌の機能または成長過程を標的にする。細菌細胞壁を標的にするもの（ペニシリンおよびセファロスポリン）、細胞膜を標的にするもの（ポリミキシン）、または必須細菌酵素を妨害するもの（リファマイシン、リピアルマイシン、キノロン、およびスルホンアミド）は、殺菌活性を有する。タンパク質合成を標的にするもの（マクロライド、リンコサミド、およびテトラサイクリン）は、通常、静菌性を示す（殺菌性アミノグリコシドを除く）。さらなる分類は、その標的特異性に基づく。「狭域スペクトル」抗菌性抗生物質は、特定の細菌タイプ（グラム陰性菌またはグラム陽性菌など）を標的にし、それに対して、広域スペクトル抗生物質は、広範な細菌に影響を及ぼす。以下の４つの新規の抗菌性抗生物質クラスがこの１０年で臨床使用されている：環状リポペプチド（ダプトマイシンなど）、グリシルサイクリン（チゲサイクリンなど）、オキサゾリジノン（リネゾリドなど）、およびリピアルマイシン（フィダキソマイシンなど）。
【０２３５】
作用因子は、例えば、抗生物質（テトラサイクリンなど）またはその誘導体（ドキシサイクリンまたはミノサイクリンなど）であり得る。
【０２３６】
細胞内保持ドメイン
本明細書中で使用される「保持タンパク質」は、細胞内保持ドメインを含むタンパク質を意味する。
【０２３７】
適切には、保持タンパク質は、細胞内保持ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインを含み得る。
【０２３８】
細胞内保持ドメインは、所与の細胞内区画に常在する任意のタンパク質またはタンパク質ドメインであり得る。これは、前述のタンパク質またはドメインの大部分が所与の区画に存在することを意味する。少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の前述のタンパク質またはドメインが、細胞内の前述の区画に存在する。保持ドメインは、本発明の目的のタンパク質が作用因子の非存在下で細胞から分泌されるかまたは原形質膜に移動されるのを防止する。
【０２３９】
本明細書中で使用される場合、「区画」または「細胞内区画」は、細胞の所与のサブドメインを指す。区画は、オルガネラ（多小胞体、ゴルジ装置、エンドソーム、リソソームなど）またはオルガネラのエレメント（エンドソームの多胞体、ゴルジ装置のシス槽、メディアル槽、またはトランス槽など）または原形質膜もしくは原形質膜のサブドメイン（頂端ドメイン、基底外側ドメイン、軸索ドメインなど）またはマイクロドメイン（接着斑または密着結合など）であり得る。
【０２４０】
「細胞内区画」は、細胞内の一区画を指す。
【０２４１】
本発明によれば、ＰＯＩは、第１および第２のタンパク質相互作用ドメインとの間の条件付き相互作用によって細胞内または特定の細胞区画内に保持され得、ここで、タンパク質相互作用ドメインのうちの一方は細胞内保持ドメインを含む。
【０２４２】
古典的なタンパク質分泌経路は、ＥＲを介する。分泌タンパク質は、典型的にはシグナルペプチドを有し、それにより、ＥＲ内にタンパク質が移動する。分泌タンパク質は膜貫通ドメインを有さず、ＥＲを通過し続けて細胞表面に出て、そこでそれらは膜に保持されない。
【０２４３】
１型膜結合タンパク質は、典型的にはシグナルペプチドを含み、膜透過停止アンカー配列で脂質膜に係留されている。膜貫通ドメインは、ＩＩ型、ＩＩＩ型、および複数回膜貫通型膜結合タンパク質を分泌経路に向かわせることができ、これは、切断されず、かつ典型的にはシグナルアンカー配列で係留されていることを除いて、シグナル配列に類似している。
【０２４４】
いくつかのシグナルペプチドは、ゴルジ保持モチーフを含む。これらのタンパク質はＥＲに侵入するがゴルジ保持モチーフが認識されるため、ゴルジに戻され分泌されない。
【０２４５】
保持ドメインは、ゴルジに常在するタンパク質またはドメインであり得る。適切には、ゴルジ保持ドメインは、以下を含む群から選択され得る：ギアンチン（ＧｏｌｇＢ１、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＋００４４８７．３）、ＴＧＮ３８／４６、Ｍｅｎｋｅｓ受容体およびゴルジ酵素（ＭａｎＩＩ（α−１，３−１，６マンノシダーゼ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００８５４９）など）、シアリルトランスフェラーゼ（β−ガラクトサミドα２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｅ）１、ＮＭ＿００３０３２）、ＧａｌＴ（β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１、ＮＭ＿００１４９７）アデノウイルスＥ１９、ＨＬＡインバリアント鎖、または局在化ドメインを含むその断片。
【０２４６】
細胞内保持ドメインは、ゴルジ保持ドメインであり得る。ゴルジ保持ドメインは、SEKDEL（配列番号２８）配列、KDEL（配列番号２９）配列、KKXX（配列番号３０）モチーフ、KXKXX（配列番号３１）モチーフ、配列KYKSRRSFIDEKKMP（配列番号３２）を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテール、または配列MHRRRSRSCR（配列番号３３）を含むヒト白血球抗原（ＨＬＡ）インバリアント鎖のフラグメントからなる群から選択され得る。
【０２４７】
適切には、保持ドメインはKDEL（配列番号２９）配列であり得る。ＫＤＥＬ配列は、タンパク質がＥＲから分泌されるのを防止する。ＫＤＥＬ配列を有するタンパク質は、ＥＲ内腔への逆行性輸送によってゴルジ装置から回収される。タンパク質は、ＫＤＥＬ配列が切断された後はＥＲから遊離するのみである。したがって、ＥＲに常在するタンパク質は、ＫＤＥＬ配列を含む限り、ＥＲ内に保持される。
【０２４８】
適切には、保持ドメインは、KKXX（配列番号３０）モチーフであり得る。適切には、KKXXドメインは、タンパク質のＣ末端に存在し得る。KKXXは、コートタンパク質（ＣＯＰＩ）複合体との相互作用を介した逆行性輸送によって、ゴルジ装置のシス末端からのＥＲ膜タンパク質の回収を担う。
【０２４９】
適切には、保持ドメインはKXKXX（配列番号３１）モチーフであり得る。
【０２５０】
適切には、保持ドメインは、配列KYKSRRSFIDEKKMP（配列番号３２）を含むアデノウイルスＥ１９タンパク質のテールであり得る。
【０２５１】
適切には、保持ドメインは、配列MHRRRSRSCR（配列番号３３）を含むＨＬＡのインバリアント鎖のＮの末端フラグメントであり得る。
【０２５２】
保持ドメインは、ＥＲに常在するタンパク質またはドメインであり得る。
【０２５３】
ＥＲ保持ドメインは、以下を含む群から選択され得る：ＥＲに常在するインバリアント鎖のイソ型（Ｉｉ３３）、リボフォリンＩ、リボフォリンＩＩ、ＳＥＣ６１、もしくはシトクロムｂ５、または局在化ドメインを含むその断片。ＥＲ局在化ドメインの例は、リボフォリンＩＩ（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＢＣ０６０５５６．１）のＥＲ局在化ドメインである。
【０２５４】
細胞内保持ドメインはＥＲ保持ドメインであり得る。
【０２５５】
保持ドメインは、原形質膜に常在するタンパク質またはドメインであり得る。細胞内保持ドメインは原形質膜保持ドメインであり得る。
【０２５６】
原形質膜保持ドメインは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）係留タンパク質（Ｔｈｙ−１細胞表面抗原（Ｔｈｙ−１）およびプリオンタンパク質（ＰＲＮＰ）など）から選択され得る。
【０２５７】
保持ドメインは、タンパク質相互作用ドメインのＣ末端であり得る。
【０２５８】
保持ドメインは、タンパク質相互作用ドメインのＮ末端であり得る。
【０２５９】
適切には、本明細書中に定義の保持タンパク質は、本明細書中に定義の第２のタンパク質相互作用ドメインに作動可能に連結された細胞内保持ドメインを含み得る。細胞内保持ドメインは、本明細書中に定義のシグナルペプチドおよび第２のタンパク質相互作用ドメインの両方に作動可能に連結され得る。
【０２６０】
適切には、本明細書中に定義の保持タンパク質は融合タンパク質であり得、第２のタンパク質相互作用ドメインに融合した細胞内保持ドメインを含み得る。適切には、本明細書中に定義の保持タンパク質は、第２のタンパク質相互作用ドメインとシグナルペプチドの両方に融合した細胞内保持ドメインおよび／または膜貫通ドメインを含み得る融合タンパク質であり得る。適切には、本明細書中に定義の保持タンパク質は融合タンパク質であり得、細胞内ドメインとシグナルペプチドの両方に融合した第２のタンパク質相互作用ドメインおよび／または膜貫通ドメインを含み得る。
【０２６１】
細胞
本発明は、操作された細胞溶解性免疫細胞であって、目的のポリペプチド（ＰＯＩ）および第１の相互作用ドメインを含む放出性タンパク質；および、細胞の細胞内区画内に保持されており、第２の相互作用ドメインを含む保持タンパク質を含み；ここで、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインが、作用因子の存在または非存在に応じて条件付きで相互作用することができる、操作された細胞溶解性免疫細胞に関する。
【０２６２】
細胞は、目的のタンパク質（ＰＯＩ）、第１のタンパク質相互作用ドメイン、およびシグナルペプチドを含む放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列；および
第２のタンパク質相互作用ドメイン、細胞内保持ドメイン、およびシグナルペプチドを含む保持タンパク質をコードする第２の核酸配列を含むことができ、ここで、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインが、作用因子の存在または非存在に応じて条件付きで相互作用することができる。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、ＰＯＩは分泌性タンパク質であり、作用因子の存在下で細胞によって分泌される。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、ＰＯＩは膜タンパク質であり、作用因子の存在下で原形質膜に送り出される。本発明はまた、本発明の方法によって得ることができる（または得た）操作された細胞溶解性免疫細胞に関する。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をさらに含む。
【０２６６】
本明細書中で使用される「操作された細胞」は、細胞によって天然にコードされない核酸配列を含むか発現するように改変された細胞を意味する。細胞を操作する方法は当該分野で公知であり、例えば、形質導入（レトロウイルスまたはレンチウイルスの形質導入など）、トランスフェクション（ＤＮＡまたはＲＮＡベースの一過性トランスフェクションなど）（リポフェクション、ポリエチレングリコール、リン酸カルシウム、およびエレクトロポレーションが含まれる）による細胞の遺伝子改変が含まれるが、これらに限定されない。核酸配列を細胞に導入するのに適切な任意の方法を使用することができる。
【０２６７】
したがって、放出性タンパク質および保持タンパク質をそれぞれコードする第１および第２の核酸配列は、対応する非改変の細胞（例えば、非改変のα−βＴ細胞、ＮＫ細胞、γ−δＴ細胞、またはサイトカイン誘導性キラー細胞）によって天然に発現されない。
【０２６８】
適切には、操作された細胞は、例えば、形質導入またはトランスフェクションによってゲノムが改変されている細胞である。適切には、操作された細胞は、そのゲノムがレトロウイルス形質導入によって改変されている細胞である。適切には、操作された細胞は、そのゲノムがレンチウイルス形質導入によって改変されている細胞である。
【０２６９】
本明細書中で使用される場合、用語「導入された」は、外来のＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入する方法を指す。本明細書中で使用される場合、導入されたという用語には、形質導入法およびトランスフェクション法の両方が含まれる。トランスフェクションは、非ウイルス法によって細胞に核酸を導入するプロセスである。形質導入は、ウイルスベクターを介して細胞に外来のＤＮＡまたはＲＮＡを導入するプロセスである。
【０２７０】
本発明の操作された細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションが含まれる多数の手段のうちの１つによる放出性タンパク質および保持タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの導入によって生成され得る。
【０２７１】
放出性タンパク質および保持タンパク質をコードする核酸配列の導入前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体または抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の両方での処置によって、細胞を活性化および／または拡大増殖させることができる。本明細書中で使用される場合、「活性化された」は、増殖するか、分化するか、エフェクター機能を開始するように細胞が刺激されていることを意味する。
【０２７２】
細胞活性化を測定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、フローサイトメトリーによる活性化マーカーの発現（ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ３８、またはＨＬＡ−ＤＲの発現など）の測定または細胞内サイトカインの測定が含まれる。
【０２７３】
本明細書中で使用される場合、「拡大増殖された（expanded）」は、細胞または細胞集団が増殖するように誘導されていることを意味する。
【０２７４】
細胞集団の拡大増殖を、例えば、集団中に存在する細胞数のカウントによって測定することができる。細胞の表現型を、フローサイトメトリーなどの当該分野で公知の方法によって決定することができる。
【０２７５】
本明細書中で使用される「細胞溶解性免疫細胞」は、他の細胞を直接死滅させる細胞である。細胞溶解性細胞は、がん性細胞；ウイルス感染細胞、または他の損傷細胞を死滅させることができる。細胞溶解性免疫細胞には、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。
【０２７６】
細胞溶解性免疫細胞は、細胞性免疫において中心的役割を果たすあるタイプのリンパ球であるＴ細胞またはＴリンパ球であり得る。Ｔ細胞を、細胞表面上のＴＣＲの存在によって他のリンパ球（Ｂ細胞およびＮＫ細胞など）と区別することができる。
【０２７７】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関与する。ＣＴＬは、その表面にＣＤ８を発現する。ＣＴＬはＣＤ８＋Ｔ細胞として公知であり得る。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原への結合によってその標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシン、および制御性Ｔ細胞によって分泌される他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞をアネルギー状態に不活性化することができ、それにより実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防する。
【０２７８】
適切には、本発明の細胞はＴ細胞であり得る。適切には、Ｔ細胞はα−βＴ細胞であり得る。適切には、Ｔ細胞はγ−δＴ細胞であり得る。
【０２７９】
ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、先天性免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の一種である。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞からの先天性シグナルに対してＭＨＣ依存性様式で迅速に応答する。
【０２８０】
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ系前駆細胞から分化した第３の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺で分化および成熟し、次いで、循環内に進入することが公知である。
【０２８１】
適切には、本発明の細胞は、野生型キラー（ＮＫ）細胞であり得る。適切には、本発明の細胞はサイトカイン誘導性キラー細胞であり得る。
【０２８２】
細胞は、患者自身の末梢血（第１のパーティ）、または造血幹細胞移植の状況におけるドナー由来の末梢血（第２のパーティ）、または無関係のドナー由来の末梢血（第３のパーティ）に由来し得る。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子（単数または複数）の形質導入前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、例えば、活性化および／または拡大増殖させることができる。
【０２８３】
あるいは、細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来し得る。あるいは、溶解機能を保持している不死化Ｔ細胞株を使用することができる。
【０２８４】
細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）であり得る。移植のためのＨＳＣを、適切に適合したドナーの骨髄から、薬理学的用量のサイトカイン（Ｇ−ＣＳＦなど）の投与による動員後の末梢血の白血球搬出によって（末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ））、または出産後の胎盤から回収した臍帯血（ＵＣＢ）から得ることができる。骨髄、ＰＢＳＣ、またはＵＣＢを無処理で移植することができるか、ＨＳＣを、ＣＤ３４表面抗原に対するモノクローナル抗体での免疫選択によって富化することができる。
【０２８５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
古典的なＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）が細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続しているキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式または標的抗原のリガンドに基づき得る。スペーサードメインは、バインダーを膜から隔離し、適切に配向するのに必要であり得る。一般に使用されるスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。抗原に応じて、例えば、ＣＤ８α由来のストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジのみには、より小型のスペーサーで十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜中のタンパク質を係留し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【０２８６】
初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。従って、これらの第１世代の受容体は、免疫学的シグナル１を伝達し、同族標的細胞のＴ細胞死滅を誘発するのに十分であったが、Ｔ細胞が増殖および生存するように完全に活性化することはできなかった。この限界を克服するために、化合物エンドドメインが以下のように構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分をＣＤ３ζの細胞内部分と融合することにより、抗原認識後に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代の受容体が得られる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これにより、最も強力な共刺激シグナル（すなわち、Ｔ細胞増殖を誘発する免疫学的シグナル２）が供給される。ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン（生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４−１ＢＢなど）を含むいくつかの受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナル、および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにより強力な第３世代のＣＡＲをここに記載している。
【０２８７】
ＣＡＲをコードする核酸を、例えば、レトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に移入することができる。このようにして、多数の抗原特異的Ｔ細胞を、養子細胞移入のために生成することができる。ＣＡＲが標的抗原に結合するとき、この結合により、ＣＡＲが発現されるＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的にされた抗原を発現する細胞に仕向ける。
【０２８８】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識する古典的ＣＡＲの一部である。
【０２８９】
多数の抗原結合ドメインが当該分野で公知であり、抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づいた抗原結合ドメインが含まれる。例えば、抗原結合ドメインは、以下を含み得る：モノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；標的抗原の野生型リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；ラクダ科動物などの単鎖ドメイン結合剤；Ｄａｒｐｉｎなどの人工単一結合剤；またはＴ細胞受容体由来の単鎖。
【０２９０】
以下の表１に示すように、種々の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。本発明で使用される抗原結合ドメインは、本明細書中に記載のＴＡＡに結合することができるドメインであり得る。
【表１】
2021520792.tif 000025
【０２９１】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがる古典的ＣＡＲの配列である。膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含み得る。膜貫通ドメインは、受容体に良好な安定性をもたらすＣＤ２８に由来し得る。
【０２９２】
ＣＡＲまたはＴＣＲシグナルペプチド
本発明で使用するためのＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲは、シグナルペプチドを含み得るため、シグナルペプチドがＴ細胞などの細胞内で発現される場合、新生タンパク質は小胞体に向かい、その後に細胞表面に向かい、そこで発現される。
【０２９３】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファ−ヘリックスを形成する傾向がある長いストレッチの疎水性アミノ酸を含み得る。シグナルペプチドは、短い正電荷のアミノ酸ストレッチから始まってよく、このストレッチは、転位置中にポリペプチドの適切なトポロジーを強化するのに役立つ。シグナルペプチドの最後に、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断されるアミノ酸ストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、転位置中または転位置の完了後のいずれかに切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼによって消化される。
【０２９４】
スペーサードメイン
受容体は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに接続するスペーサー配列を含み得る。可動性スペーサーにより、抗原結合ドメインを結合が容易になるように異なる方向に配向することが可能である。
【０２９５】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはヒトＣＤ８ストークもしくはマウスＣＤ８ストークを含み得る。スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替リンカー配列を代替的に含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーを、Ｆｃ結合モチーフを除去するように変更することができる。
【０２９６】
細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。
【０２９７】
最も一般的に使用されているシグナル伝達ドメインの成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ゼータエンドドメインの成分である。これは、抗原への結合後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要であり得る。例えば、増殖／生存シグナルを伝達するために、キメラのＣＤ２８およびＯＸ４０をＣＤ３−ゼータと共に使用することができるか、３つ全てを共に使用することができる。
【０２９８】
細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得るか、これを含み得る。
【０２９９】
細胞内シグナル伝達ドメインは、１またはそれを超える免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み得る。ＩＴＡＭは、免疫系の一定の細胞表面タンパク質の細胞質側尾部中に２回反復された４アミノ酸の保存配列である。このモチーフは、任意の２つの他のアミノ酸によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンを含み、シグネチャーＹｘｘＬ／Ｉが与えられる。これらのシグネチャーのうちの２つが、典型的には、分子の尾部中で６アミノ酸と８アミノ酸との間のアミノ酸によって分離されている（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉ）。
【０３００】
ＩＴＡＭは、免疫細胞におけるシグナル伝達に重要である。それ故、ＩＴＡＭは、重要な細胞シグナル伝達分子（Ｔ細胞受容体複合体のＣＤ３およびζ鎖、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９アルファ鎖およびベータ鎖、ならびに一定のＦｃ受容体など）の尾部に見出される。これらのモチーフ内のチロシン残基は、受容体分子のそのリガンドとの相互作用後にリン酸化されるようになり、細胞のシグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のためのドッキング部位を形成する。
【０３０１】
細胞内シグナル伝達ドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３−ζエンドドメインを含み得るか、ＣＤ３−ζエンドドメインから本質的になり得るか、ＣＤ３−ζエンドドメインからなり得る。古典的には、ＣＤ３−ζエンドドメインは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。
【０３０２】
細胞内シグナル伝達ドメインは、さらなる共刺激シグナル伝達を含み得る。例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても公知）をＣＤ３−ζと共に使用するか、ＣＤ２８およびＯＸ４０をＣＤ３−ζと共に使用して、増殖／生存シグナルを伝達することができる。
【０３０３】
適切には、ＣＡＲは、以下の一般的な形式を有し得る：抗原結合ドメイン−ＴＣＲエレメント。
【０３０４】
本明細書中で使用される場合、「ＴＣＲエレメント」は、ＴＣＲ受容体複合体の成分のドメインまたはその一部を意味する。ＴＣＲエレメントは、細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメイン（例えば、ＴＣＲエレメントの細胞内シグナル伝達ドメイン）を含み得る（例えば、有し得る）。
【０３０５】
ＴＣＲエレメントを、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖から選択することができる。
【０３０６】
適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖の細胞外ドメインを含み得る。適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖の膜貫通ドメインを含み得る。適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖の細胞内ドメインを含み得る。適切には、ＴＣＲエレメントは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、ＣＤ３デルタ鎖、またはＣＤ３イプシロン鎖を含み得る。
【０３０７】
トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原のフラグメントを主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして認識することを担うＴ細胞表面上に見出される分子である。
【０３０８】
ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖から構成されるヘテロ二量体である。ヒトでは、９５％のＴ細胞において、ＴＣＲはアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）からなるのに対して、５％のＴ細胞において、ＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）からなる。
【０３０９】
ＴＣＲが抗原ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と会合するとき、シグナル伝達を介してＴリンパ球が活性化される。
【０３１０】
従来の抗体指向標的抗原と対照的に、ＴＣＲによって認識される抗原は、プロセシングされてペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に送達される潜在的な細胞内タンパク質のアレイ全体を含み得る。
【０３１１】
細胞中にＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子を人為的に導入するか；細胞中にベクターを使用してＴＲＧ遺伝子およびＴＲＤ遺伝子を導入することによって異種（すなわち、非天然）ＴＣＲ分子を発現するように細胞を操作することが可能である。例えば、操作したＴＣＲの遺伝子を自己由来Ｔ細胞に再導入し、Ｔ細胞養子療法のために患者に戻すことができる。かかる「異種」ＴＣＲを、本明細書中で「トランスジェニックＴＣＲ」と呼ぶこともできる。
【０３１２】
核酸構築物／核酸配列のキット
本発明は、核酸構築物であって、
（ｉ）目的のタンパク質（ＰＯＩ）および第１のタンパク質相互作用ドメインを含み得る本明細書中に定義の放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）第２のタンパク質相互作用ドメインおよび細胞内保持ドメインを含み得る、保持タンパク質をコードする第２の核酸配列であって；
ここで、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインが、作用因子の存在または非存在に応じて条件付きで相互作用することができる、第２の核酸配列；および
（ｉｉｉ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする第３の核酸配列
を含む核酸構築物を提供する。
【０３１３】
本発明はまた、本発明の核酸配列を含むキットを提供する。例えば、キットは、
（ｉ）目的のタンパク質（ＰＯＩ）および第１のタンパク質相互作用ドメインを含む本明細書中に定義の放出性タンパク質をコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）第２のタンパク質相互作用ドメインおよび細胞内保持ドメインを含み得る、保持タンパク質をコードする第２の核酸配列であって；
ここで、第１のタンパク質相互作用ドメインおよび第２のタンパク質相互作用ドメインが、作用因子の存在または非存在に応じて条件付きで相互作用することができる、第２の核酸配列；および
（ｉｖ）ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする第３の核酸配列
を含み得る。
【０３１４】
適切には、キットは、本明細書中に定義の作用因子をさらに含み得る。
【０３１５】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、相互に同義であることが意図される。
【０３１６】
適切には、核酸構築物は、本発明の成分（本発明が提供したＰＯＩ、第１および第２のタンパク質相互作用ドメイン、細胞内保持ドメイン、ならびにＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲなど）をコードする複数の核酸配列を含み得る。例えば、核酸構築物は、２つ、３つ、４つ，またはそれを超える、本発明の異なる成分をコードする核酸配列を含み得る。適切には、複数の核酸配列は、本明細書中に定義の共発現部位によって分離され得る。
【０３１７】
当業者は、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が遺伝暗号の縮重の結果として同一のポリペプチドをコードすることができることを理解する。さらに、当業者は、日常的な技術を使用して、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように本明細書中に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチドを置換することができると理解すべきである。適切には、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞、特に、本明細書中に記載の細胞溶解性免疫細胞中で発現できるようにコドン最適化される。
【０３１８】
本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。本発明の核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。本発明の核酸はまた、本発明の核酸内に合成または改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が当該分野で公知である。これらの改変には、メチルホスホナート骨格およびホスホロチオアート骨格、分子の３’末端および／または５’末端でのアクリジン鎖またはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載の使用のために、当該分野で利用可能な任意の方法によってポリヌクレオチドを改変することができると理解すべきである。かかる改変を、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を向上させるように行うことができる。
【０３１９】
ヌクレオチド配列に関連する用語「バリアント」、「ホモログ」、または「誘導体」には、ヌクレオチド配列に対する１（またはそれを超える）核酸の任意の置換、変形、改変、置き換え、欠失、または付加が含まれる。
【０３２０】
共発現部位
共発現部位は、本発明の放出性タンパク質および保持タンパク質をコードする核酸配列を共発現することができる核酸配列を指すために使用される。
【０３２１】
適切には、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間に共発現部位が存在し得る。適切には、放出性タンパク質をコードする核酸配列と、保持タンパク質をコードする核酸配列と、ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列との間に共発現部位が存在し得る。
【０３２２】
共発現部位は、操作されたポリヌクレオチドが切断部位（単数または複数）によって連結されたトランスジェニック合成生物経路の酵素をコードするように切断部位をコードする配列であり得る。典型的には、共発現部位は、トランスジェニック合成生物経路の個別の酵素をコードする隣接するポリヌクレオチド配列の間に存在する
【０３２３】
適切には、複数の共発現部位が操作されたポリヌクレオチド中に存在する実施形態では、同一の共発現部位を使用することができる。
【０３２４】
好ましくは、共発現部位は切断部位である。切断部位は、２つのポリペプチドが分離するようになることが可能な任意の配列であり得る。切断部位は、ポリペプチドが産生されたときにいかなる外部の切断活性も必要とせずに個別のペプチドに直ちに切断されるように自己切断し得る。
【０３２５】
用語「切断」を本明細書中で便宜上使用するが、切断部位により、古典的な切断以外の機序によってペプチドを個別の実体に分離することができる。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）について、以下の「切断」活性を説明するための種々のモデルが提案されている：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解活性、自己タンパク質分解活性、または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。かかる「切断」の正確な機序は、切断部位がタンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに個別の実体としてタンパク質を発現する限り、本発明の目的には重要でない。
【０３２６】
切断部位は、フューリン切断部位であり得る。フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質転換酵素ファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在的な前駆体タンパク質をその生物学的に活性な生成物にプロセシングするプロタンパク質転換酵素である。フューリンは、カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼであり、その対となる塩基性アミノ酸プロセシング部位で前駆体タンパク質を効率的に切断することができる。フューリン基質の例には、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロ−ベータ−セクレターゼ、膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニット、およびフォンウィルブランド因子が含まれる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列（規範的に、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）のすぐ下流のタンパク質を切断し、ゴルジ装置中に豊富に存在する。
【０３２７】
切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得る。
【０３２８】
ＴＥＶプロテアーゼは、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方において融合タンパク質の切断を制御するために頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、
【化２２】
2021520792.tif 000026
である。哺乳動物細胞（ヒト細胞など）は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞中で発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼは哺乳動物細胞中でも発現されなければならない。
【０３２９】
切断部位は、自己切断ペプチドをコードし得る。「自己切断ペプチド」は、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが産生されたときに、いかなる外部の切断活性も必要とせずに個別かつ分離した第１および第２のポリペプチドに直ちに「切断される」か分離されるように機能するペプチドを指す。
【０３３０】
自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体がＣ末端で「切断している」２Ａによって媒介される。アフトウイルス（ａｐｔｈｏｖｉｒｕｓ）（口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなど）では、２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短い部分であり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存プロリン残基）と共に、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントを示す（上記のＤｏｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ（２００１））。
【０３３１】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルス（ａｐｔｈｏ−）またはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、タイプＣロタウイルス、ならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ内の反復配列および上記の細菌配列（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）で見出されている。
【０３３２】
共発現配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は、内部プロモーターであり得る。
【０３３３】
ベクター
本発明はまた、１またはそれを超える本発明の核酸配列（単数または複数）または核酸構築物（単数または複数）を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。かかるベクターは、本明細書中に定義の放出性タンパク質、保持タンパク質、およびＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを発現するように核酸配列（単数または複数）または構築物（単数または複数）を宿主細胞に導入するために使用され得る。
【０３３４】
適切には、ベクターは、本発明が提供する異なる成分をコードする複数の核酸配列を含み得る。例えば、ベクターは、２つ、３つ、４つ、またはそれを超える、本発明の異なる成分（ＰＯＩ、タンパク質相互作用ドメイン、細胞内保持ドメイン、およびＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲなど）をコードする核酸配列を含み得る。適切には、複数の核酸配列は、本明細書中に定義の共発現部位によって分離され得る。
【０３３５】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター（レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなど）、またはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０３３６】
ベクターは、細胞にトランスフェクトするか形質導入することが可能であり得る。
【０３３７】
医薬組成物
本発明はまた、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞または本発明の方法によって得ることができる（例えば、得られた）細胞を含む医薬組成物に関する。
【０３３８】
本発明はまた、本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の第１、第２、および第３の核酸配列；本発明のベクター、または本明細書中に記載の第１、第２、および第３のベクターを含む医薬組成物を提供する。特に、本発明は、本発明による細胞を含む医薬組成物に関する。
【０３３９】
医薬組成物は、さらに、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
【０３４０】
処置方法
本発明は、疾患を処置および／または予防する方法であって、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞もしくは本発明の方法によって得ることができる（例えば、得られた）細胞、または本発明の核酸構築物、または本明細書中に定義の第１、第２、および第３の核酸配列；本発明のベクターもしくは本明細書中に記載の第１、第２、および第３のベクターを被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【０３４１】
適切には、本発明の疾患を処置および／または予防する方法は、（例えば、上記の医薬組成物中の）本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞を被験体に投与することを含み得る。
【０３４２】
本発明はまた、被験体における疾患を処置および／または予防する方法であって、ここで、被験体は本発明の細胞を含み、方法は、作用因子を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。そのようなものとして、この方法は、本発明の細胞を既に含む被験体に作用因子を投与することを含む。
【０３４３】
適切には、本発明の疾患を処置および／または予防する方法は、本明細書中に定義の作用因子を、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞が投与されている被験体に投与することを含み得る。
【０３４４】
疾患を処置する方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。この態様では、疾患に関連する少なくとも１つの症状を緩和、軽減、または改善し、そして／または疾患の進行を遅延、軽減、または遮断するために、既存の疾患または容態を有する被験体に細胞を投与することができる。
【０３４５】
疾患を予防する方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。この態様では、未だ罹患しておらず、そして／または疾患のいかなる症状も示していない被験体に、疾患の原因を予防するか損なわせるか、疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を軽減または予防するために細胞を投与することができる。被験体は、疾患の素因を有し得るか、発症リスクがあると考えられ得る。
【０３４６】
本発明は、
（ｉ）細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の第１、第２、および第３の核酸配列、本発明のベクター、または本明細書中の第１、第２、および第３のベクターを細胞に導入するステップ；および
（ｖ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ
を含み得る。
【０３４７】
適切には、核酸構築物、ベクター（単数または複数）または核酸は、形質導入によって導入され得る。適切には、核酸構築物、ベクター（単数または複数）または核酸は、トランスフェクションによって導入され得る。
【０３４８】
適切には、細胞は自己由来であり得る。適切には、細胞は同種異系であり得る。
【０３４９】
本発明によって提供された疾患を処置する方法は、疾患の進行および／または任意の毒性活性をモニタリングすることを含み得る。
【０３５０】
適切には、本方法は、有害な毒性作用を低下させるために被験体への本明細書中に定義の作用因子の投与を停止または低減すること含んでよく；あるいは、本方法は、抗腫瘍効果を増大させるために被験体への本明細書中に定義の作用因子の投与を増加させることを含んでよい。
【０３５１】
作用因子は小分子であり得る。いくつかの実施形態では、作用因子は、ミノサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、またはその類似体から選択され得る。
【０３５２】
本発明によって提供された疾患を処置する方法は、疾患の進行をモニタリングすることならびに任意の毒性活性をモニタリングすることならびに許容され得るレベルの疾患の進行および毒性活性が得られるように被験体への作用因子の投与用量を調整することを含み得る。
【０３５３】
「疾患の進行をモニタリングすること」は、疾患に関連する症状が軽減／改善または増大／悪化するかどうかを決定するために、その症状を経時的に評価することを意味する。
【０３５４】
「毒性活性」は、本発明の細胞を被験体に投与した後の前述の細胞を原因とする有害作用に関する。毒性活性には、例えば、免疫学的毒性、胆汁毒性、および呼吸窮迫症候群が含まれ得る。
【０３５５】
そのため、被験体への作用因子の投与用量または投与頻度を、疾患の進行および毒性活性の両方を許容され得るレベルにするために変化させることができる。「許容され得る」と決定される具体的な疾患の進行および毒性活性のレベルは、特定の環境に応じて変動し、かかる基準に関して評価すべきである。
【０３５６】
作用因子は、医薬組成物の形態で投与され得る。医薬組成物は、さらに、薬学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。医薬組成物は、必要に応じて、１またはそれを超えるさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。
【０３５７】
本発明は、疾患の処置および／または予防に使用するための本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞、本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の第１、第２、および第３の核酸配列、本発明のベクター、または本発明の第１、第２、および第３のベクターを提供する。特に、本発明は、疾患の処置および／または予防に使用するための本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞を提供する。
【０３５８】
本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞、本発明の核酸構築物、本明細書中に定義の第１、第２、および第３の核酸配列、本発明のベクター、または本発明の第１、第２、および第３のベクターに関する。特に、本発明は、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞の使用に関する。
【０３５９】
本発明の方法によって処置および／または予防すべき疾患は、がんであり得る。
【０３６０】
がんは、神経芽細胞腫、前立腺がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞癌）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、および甲状腺がんなどのがんであり得る。
【０３６１】
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を死滅させることができる場合がある。標的細胞は、ＴＡＡの発現、例えば、上記の表１に提供したＴＡＡの発現によって認識できる場合がある。がんは、表１に列挙したがんであり得る。
【０３６２】
細胞の作製方法
本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞は、多数の手段（ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションが含まれる）のうちの１つによって本明細書中に定義のＰＯＩ、タンパク質相互作用ドメイン、および細胞内保持ドメインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成され得る。
【０３６３】
本発明の細胞は、
（ｉｉ）（例えば、形質導入またはトランスフェクションによって）本発明の核酸構築物もしくはベクター、または上記定義の第１、第２、および第３の核酸配列、または上記定義の第１、第２、および第３のベクターを細胞に導入すること
によって作製され得る。
【０３６４】
適切には、細胞は、被験体から単離した試料に由来し得る。
【０３６５】
分泌を調節する方法
本発明はまた、細胞からのＰＯＩの分泌を調節する方法を提供する。
【０３６６】
方法は、
本発明の核酸構築物、上記定義の第１、第２、および第３の核酸配列；本発明のベクター、または上記定義の第１、第２、および第３のベクターを細胞に導入するステップ、および本明細書中に定義の作用因子を細胞に投与するステップを含み得る。
【０３６７】
細胞からのＰＯＩの分泌を調節する方法は、本明細書中に定義の作用因子を本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞または本発明の方法によって得ることができる細胞に投与することを含み得る。
【０３６８】
本発明は、さらに、本発明の操作された細胞溶解性免疫細胞からのＰＯＩの分泌を増大させるための本明細書中に定義の作用因子の使用に関する。
【０３６９】
発明のさらなる態様
以下の番号をつけたパラグラフは、本発明のさらなる態様に関する。
【０３７０】
１．以下の群から選択されるペプチド：ACPGWARAFC（配列番号３４）；ACPHWAQAFC（配列番号３５）；ACPQWAMMFC（配列番号３６）、およびACPPWAYSFC（配列番号３７）。
【０３７１】
２．置換可能な結合系であって、
ａ）ミノサイクリンに結合し、以下の相補性決定領域：アミノ酸配列GRTFSSYN（配列番号３８）を有するＣＤＲ１、アミノ酸配列ISWSGART（配列番号３９）を有するＣＤＲ２；アミノ酸配列AAGRGWGTEAILDY（配列番号４０）を有するＣＤＲ３を有するドメイン抗体（ｄＡｂ）；および
ｂ）ｄＡｂに結合し、ｄＡｂへのミノサイクリンの結合によって置き換えられるパラグラフ１に記載のペプチド
を含む置換可能な結合系。
【０３７２】
３．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）システムであって、
（ｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびミノサイクリンに結合し、以下の相補性決定領域：アミノ酸配列GRTFSSYN（配列番号３８）を有するＣＤＲ１、アミノ酸配列ISWSGART（配列番号３９）を有するＣＤＲ２；アミノ酸配列AAGRGWGTEAILDY（配列番号４０）を有するＣＤＲ３を有するドメイン抗体（ｄＡｂ）を含む受容体成分；および
（ｉｉ）シグナル伝達ドメインおよび受容体成分のｄＡｂに結合する以下の群：ACPGWARAFC（配列番号３４）；ACPHWAQAFC（配列番号３５）；ACPQWAMMFC（配列番号３６）、およびACPPWAYSFC（配列番号３７）から選択されるペプチドを含む細胞内シグナル伝達成分
を含み、
ここで、ｄＡｂおよび環状ペプチドの結合は、標的化合物の存在によって破壊されるため、標的化合物の非存在下では、受容体成分およびシグナル伝達成分はヘテロ二量体化し、抗原結合ドメインが抗原に結合するとシグナル伝達ドメインを介してシグナルが伝達され；それに対して、標的化合物の存在下では、受容体成分およびシグナル伝達成分はヘテロ二量体化されず、抗原結合ドメインが抗原と結合してもシグナル伝達ドメインを介してシグナルは伝達されない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）システム。
【０３７３】
４．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）システムであって、
（ｉ）シグナル伝達ドメイン、およびミノサイクリンに結合し、以下の相補性決定領域：アミノ酸配列GRTFSSYN（配列番号３８）を有するＣＤＲ１、アミノ酸配列ISWSGART（配列番号３９）を有するＣＤＲ２；アミノ酸配列AAGRGWGTEAILDY（配列番号４０）を有するＣＤＲ３を有するドメイン抗体を含む細胞内シグナル伝達成分；
（ｉｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達成分のｄＡｂに結合する以下の群：ACPGWARAFC（配列番号３４）；ACPHWAQAFC（配列番号３５）；ACPQWAMMFC（配列番号３６）、およびACPPWAYSFC（配列番号３７）から選択されるペプチドを含む受容体成分
を含み、
ここで、ｄＡｂおよび環状ペプチドの結合は、標的化合物の存在によって破壊されるため、標的化合物の非存在下では、受容体成分およびシグナル伝達成分はヘテロ二量体化し、抗原結合ドメインが抗原に結合するとシグナル伝達ドメインを介してシグナルが伝達され；それに対して、標的化合物の存在下では、受容体成分およびシグナル伝達成分はヘテロ二量体化されず、抗原結合ドメインが抗原と結合してもシグナル伝達ドメインを介してシグナルは伝達されない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）システム。
【０３７４】
５．パラグラフ３または４に記載のＣＡＲシステムを含む細胞。
【０３７５】
６．パラグラフ３または４に記載のＣＡＲシステムをコードする核酸構築物であって、受容体成分をコードする第１の核酸配列および細胞内シグナル伝達成分をコードする第２の核酸配列を含む、核酸構築物。
【０３７６】
７．パラグラフ６に記載の核酸構築物を含むベクター。
【０３７７】
８．ｅｘ  ｖｉｖｏにてパラグラフ６の核酸構築物で細胞を形質導入するかトランスフェクトすることを含む、パラグラフ５に記載の細胞を作製する方法。
【０３７８】
９．パラグラフ５に記載の複数の細胞を含む医薬組成物。
【０３７９】
１０．パラグラフ９に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、がんを処置する方法。
【０３８０】
１１．がんの処置に使用するための医薬組成物の製造におけるパラグラフ５に記載の細胞。
【０３８１】
１２．がんの処置に使用するためのパラグラフ９に記載の医薬組成物。
【０３８２】
１３．ミノサイクリンまたはその誘導体を細胞に投与するステップを含む、パラグラフ５に記載の細胞におけるＣＡＲシグナル伝達を阻害する方法。
【０３８３】
１４．ミノサイクリンまたはその誘導体を被験体に投与するステップを含む、パラグラフ５に記載の細胞を含む被験体におけるＣＡＲシグナル伝達を阻害する方法。
【０３８４】
本開示は、本明細書中に開示の例示的な方法および材料に制限されず、本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の方法および材料を、本開示の実施形態の実施または試験において使用することができる。数値の範囲は、範囲を定義する数字を含む。別段の指示がない限り、それぞれ、任意の核酸配列を、左から右に５’から３’への方向で記載し；アミノ酸配列を、左から右にアミノからカルボキシへの方向に記載する。
【０３８５】
値の範囲を提供する場合、文脈上明確に別段の指示がない限り、前述の範囲の上限と下限との間の各々の介在値も、最小単位の１０分の１まで具体的に開示されていると理解される。任意の所定の値または所定の範囲内の介在値と任意の他の所定の値またはその所定の範囲内の介在値との間の各々のより小さい範囲が本開示に含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して前述の範囲内に含まれても除外されてもよく、限度のいずれかまたは両方がより小さな範囲に含まれるか、含まれない各範囲も本開示内に含まれ、但し、所定の範囲内に任意の具体的に除外される限度があるものとする。所定の範囲が限度の一方または両方を含む場合、含まれる限度のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【０３８６】
本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上そうでないと明確に示されない限り、複数形が含まれることに留意しなければならない。
【０３８７】
本明細書中で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「〜から構成される」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」と同義であり、包括的または非制限であり、さらなる列挙されていない部材、要素、方法のステップを排除しない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「〜から構成される」には、用語「〜からなる」も含まれる。
【０３８８】
本明細書中で考察した刊行物を、本発明の出願日より前の開示のみを目的として提供している。本明細書において、かかる刊行物が添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することを承認すると解釈されるべきではない。
【０３８９】
本発明を、ここに、実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明の実施において当業者を補助することを意図し、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
【実施例】
【０３９０】
実施例１−ミノサイクリンｄＡｂに結合するペプチドの生成
ミノサイクリンｄＡｂ−Ｆｃをビーズ上に固定した。ミノサイクリンｄＡｂは配列番号８によってコードされた。ファージ−ペプチドコロニースクリーニングを、１μＭミノサイクリンを使用するか使用しないで行った。
【０３９１】
ペプチドライブラリーパニングで配列番号８によってコードされるミノサイクリンｄＡｂに対する置換可能な特異性を有するペプチドを同定した。配列番号１３を含む抗体を、対照抗体として使用した（対照抗体は、配列番号８と異なるＣＤＲを含む）。
【０３９２】
ミノサイクリンｄＡｂに対する置換可能な特異性を有する４つのペプチドを同定した。ペプチドは以下である：ACPGWARAFC（配列番号３４）；ACPHWAQAFC（配列番号３５）；ACPQWAMMFC（配列番号３６）、およびACPPWAYSFC（配列番号３７）。
【０３９３】
これらのペプチドの各々を使用した結合実験の結果を、図４に示す。
【０３９４】
実施例２−ＫＤＥＬタグ化ｄＡｂおよびミノサイクリン解離ペプチドによるＩＬ１２分泌の調節
ミノサイクリンに対する親和性を有するｄＡｂおよびｄＡｂに結合することができるが、ミノサイクリンの存在下で解離するいくつかのペプチド（配列番号３４〜配列番号３７）からなるプラットフォームを生成した。
【０３９５】
ＫＤＥＬアミノ酸配列を使用して、ＥＲ／ゴルジ装置内にタンパク質を保持した。ミノサイクリン特異的ｄＡｂをＫＤＥＬ配列でタグ化したため、ＥＲ／ゴルジ内に前述のｄＡｂが係留され、一方でｄＡｂに対する親和性を有するペプチドで目的の分子（ＩＬ１２）がタグ化され、それにより目的の分子が保持される。ミノサイクリンを添加すると、ｄＡｂ−ペプチド複合体が解離し、それにより、ペプチドタグ化分子を分泌することができる。
【０３９６】
ミノサイクリンペプチド模倣物に融合したＩＬ１２を使用してこの仮説を試験するために、一連の構築物を設計した。ＩＬ１２は、それ自体でＴ細胞に対する増殖効果による目的の分子ならびに細胞上清からのＥＬＩＳＡ分析によってアッセイすることができる分泌タンパク質の都合の良いモデルの両方を兼ねている。
【０３９７】
方法
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、翌日のトランスフェクションのために５０〜６０％のコンフルエンシーが達成されるように、３×１０６で９６ウェルプレートに播種した。トランスフェクションマスターミックスを、３０μＬのＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬を４７０μＬの普通のＩＭＤＭに添加し、５分間インキュベートすることによって作製した。各ウェルについて、次いで、０．１３μｇのプラスミドＤＮＡを５．２μＬのＩＭＤＭ−Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅマスターミックスに添加し、１５分間インキュベートした。次いで、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ−ＤＮＡ複合体を含むトランスフェクションミックスを、細胞に添加した。全てのインキュベーションを室温で行った。
【０３９８】
以下の構築物を試験した：
・対照（ＮＴ）：構築物なし（すなわち、バックグラウンドレベルのＩＬ１２）。
・「ＷＡＲＡ−ＩＬ１２＋アミノＫＤＥＬ」で標識した構築物：ミノサイクリンペプチド模倣物（配列番号３４）およびFlexi-IL12（配列番号１９）およびミノサイクリンdAB（配列番号８）をコードし、ＫＤＥＬ配列を有する。
・「ＷＡＹＳ−ＩＬ１２＋アミノＫＤＥＬ」で標識した構築物：ミノサイクリンペプチド模倣物（配列番号３７）およびFlexi-IL12（配列番号１９）およびミノサイクリンdAB（配列番号８）をコードし、ＫＤＥＬ配列を有する。
・「ＷＡＲＡ−ＩＬ１２＋アミノ」で標識した構築物：ミノサイクリンペプチド模倣物（配列番号３４）およびFlexi-IL12（配列番号１９）およびミノサイクリンdAB（配列番号８）をコードし、ＫＤＥＬ配列を持たない。
・「ＷＡＹＳ−ＩＬ１２＋アミノ」で標識した構築物：ミノサイクリンペプチド模倣物（配列番号３７）およびFlexi-IL12およびミノサイクリンdAB（配列番号８）をコードし、ＫＤＥＬ配列を持たない。
【０３９９】
トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクトした細胞を含む犠牲ウェル（sacrificial  well）を、ＦＩＴＣ抗ＨＡ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、９０１５０７）を使用した細胞の染色によってトランスフェクション効率について試験した。トランスフェクションの確認の際に、培養培地を細胞から除去し、種々の濃度のミノサイクリンを補充した新鮮な培地を添加した。ミノサイクリン添加の２時間後および４時間後、製造者の指示にしたがってＩＬ１２  ＥＬＩＳＡを行った（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４３１７０４）。
【０４００】
結果
全ての結果を、ＥＬＩＳＡキットの一部として提供されたＩＬ１２検量線を使用して正規化した。
【０４０１】
結果（図５に示す）は、ＩＬ１２がその高い発現のためにペプチドタグの存在の影響を受けないことを示す。非形質導入細胞は、いかなる条件や時点においてもＩＬ１２を産生せず、ＩＬ１２バックグラウンドを計算して差し引く必要がなく、このアッセイにおけるノイズは最小であった。
【０４０２】
ＫＤＥＬ係留ミノサイクリンｄＡｂの存在下で２つのペプチドＷＡＲＡ配列番号３４（高親和性）およびＷＡＹＳ配列番号３７（低親和性）に融合されたＩＬ１２は、全ての時点で０μＭから１００μＭまで濃度依存性にＩＬ１２分泌が増加することを示す。
【０４０３】
実施例３−保持による分泌調節のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
Ｔ細胞を、ＣＤ１９  ＣＡＲ、ＣＤ１９ＣＡＲ−２Ａ−ｆｌｅｘｉＩＬ−１２（ＩＬ−１２を構成性に発現する）、およびＣＤ１９ＣＡＲ−２Ａ−ＴｉＰ−ＦｌｅｘｉＩＬ１２−２Ａ−Ｓ−ＴｅｔＲ−ｓｅｋｄｅｌ（ＩＬ−１２を調整可能に発現する）を発現するように形質導入する。Ｔ細胞を、異なる濃度のミノサイクリン中で培養する。４８時間後に上清を回収し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用してＩＬ−１２を定量する。
【０４０４】
異なるＣＡＲ  Ｔ細胞の機能特性を、ＣＤ１９標的との標準的な共培養法を使用して定量し、フローサイトメトリーおよび異なる濃度のミノサイクリンの存在下でのサイトカイン放出によってその機能を判定した。
【０４０５】
実施例４−保持による分泌調節のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＮＯＤｓｃｉｄγ（ＮＳＧ）マウスに、尾静脈注射によってＲａｊｉ細胞を移植する。実施例１で形質導入したＴ細胞を、尾静脈注射によってマウスに投与する。異なるＣＡＲ  Ｔ細胞の投与と同様に、マウスをコホートにさらに分け、腹腔内注射によって異なる濃度のミノサイクリンを投与する。尾静脈注射によってマウスから採血し、ＥＬＩＳＡを使用して血清ＩＬ−１２を定量する。
【０４０６】
上記明細書中に記載の全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。本発明の記載の方法およびシステムの種々の修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の実施形態と併せて記載しているが、特許請求の範囲に記載の発現がかかる特定の実施形態に過度に制限されるべきではないと理解すべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな本発明の実施のための記載の様式の種々の修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１】
2021520792.tif 000027
【図２】
2021520792.tif 000028
【図３】
2021520792.tif 000029
【図４】
2021520792.tif 000030
【図５Ａ】
2021520792.tif 000031
【図５Ｂ】
2021520792.tif 000032
【図５Ｃ】
2021520792.tif 000033
【図６】
2021520792.tif 000034
【図７】
2021520792.tif 000035
【配列表】
2021520792000001.app
【国際調査報告】
2021520792.tif 000036
2021520792.tif 000037
2021520792.tif 000038
2021520792.tif 000039