(57)【要約】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）関連免疫療法の使用の制御を強化するアプタマーベースのスイッチ技術が提供されている。アプタマーベースのスイッチは、リンカーを介してＣＡＲ結合アプタマーに結合した標的結合アプタマーを含有する合成ブリッジ分子を利用する。 ＣＡＲと対応するアプタマーブリッジを含有するシステムは、（ｉ）ブリッジの標的結合アプタマーを選択することによって任意の所望の抗原を標的とすることができ、（ｉｉ）標的結合アプタマーを変更することによって、ある標的から別の標的にリダイレクトすることができ、（ｉｉｉ） ブリッジの投与プロトコルを変更することにより、時間の経過に伴う個々の患者のニーズの変化に応じて投与することができ、（ｉｖ） 迅速または徐々にオンまたはオフを切り替えることができ、（ｖ）特定のＣＡＲ 治療のためのコンパニオン診断として使用することができ、（ｖｉ）体外または体内ＣＡＲの発現と統合でき、（ｖｉｉ）非免疫原性であり、（ｖｉｉｉ）生産コストが低い、免疫療法プラットフォームを提供し得る。
2021532745.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を標的に結合するためのアプタマーブリッジであって、１つ以上のＣＡＲ結合アプタマーおよび１つ以上の標的結合アプタマーを含むブリッジで、前記１つ以上のＣＡＲ結合アプタマーが１つ以上のリンカーによって前記標的結合アプタマーに接続され、前記１つ以上のＣＡＲ結合アプタマーのうちの少なくとも１つが前記ＣＡＲの細胞外ドメインに結合している、前記アプタマーブリッジ。
【請求項２】
前記ＣＡＲ細胞外ドメインが特異的にペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）を結合することができる、請求項１に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項３】
免疫細胞上に発現されるＣＡＲへのブリッジのＣＡＲ結合アプタマーの結合が免疫細胞を活性化する、請求項１または請求項２に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項４】
免疫細胞上に発現されるＣＡＲに対するＣＡＲ結合アプタマーの結合が免疫細胞を活性化しない、請求項１または請求項２に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項５】
前記免疫細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージであり、前記結合が、前記アプタマーブリッジの標的結合アプタマーに結合した標的細胞の破壊につながる、請求項３または請求項４に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項６】
前記リンカーが、共有結合、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ペプチド、ポリペプチド、オリゴ糖、多糖、合成ポリマー、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、トリアゾール、ナノ粒子、ミセル、リポソーム、細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択されるリンカー部分を含むか、またはからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項７】
免疫グロブリンペプチドまたはそのフラグメントを含有しない、請求項１〜６のいずれ一項に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項８】
ペプチドまたはポリペプチドを含まない、請求項１〜７のいずれ一項に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項９】
前記リンカー部分がＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＸＮＡから選択される一本鎖または二本鎖核酸を含む、請求項６に記載のアプタマーブリッジ。 
【請求項１０】
前記リンカー部分が免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項６に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項１１】
前記リンカー部分がグルカン、デキストラン、グリコーゲン、デンプン、およびそれらの誘導体からなる群から選択される多糖である、請求項６に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項１２】
前記リンカー部分がポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）およびポリ（βアミノエステル）（ＰＢＡＥ）から選択される合成ポリマーである、請求項６に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項１３】
前記ＣＡＲ細胞外ドメインが免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメントまたは誘導体を含む、請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンポリペプチドが単鎖Ｆｖである、請求項１０に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項１５】
前記ＰＮＥがヒトプロテオームに見つからないアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項１６】
前記ＰＮＥが、配列番号１〜７からなる群より選択される、請求項２に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項１７】
少なくとも１つの標的結合アプタマーが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、メソセリン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、Ｇｐ１００、チロシナーゼ、ｐ５３、ｒａｓ、ＭＵＣ１、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤ７０、ＣＤ７３、および変異ＳＯＤからなる群から選択された標的に結合する、請求項１〜請求項１６のいずれに記載のアプタマーブリッジ
【請求項１８】
２つ以上の同一または非同一のＣＡＲ結合アプタマーを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項１９】
２つ以上の同一または非同一の標的結合アプタマーを含む、請求項１８に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項２０】
環状、星形、デンドリマー、線形、分岐、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される分子形態を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項２１】
ＣＡＲ結合アプタマーの１つ以上と約７０〜約２００オングストロームの範囲内の１つ以上の標的結合アプタマーとの間に距離を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項２２】
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはマクロファージにおいて発現する場合に、前記ＣＡＲに結合する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項２３】
前記ＣＡＲに結合した際に、前記Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはマクロファージを活性化する、請求項２２に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項２４】
１つ以上のＣＡＲ結合アプタマーおよび１つ以上の標的結合アプタマーがそれぞれ１０μＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満、より好ましくは１００ｐＭ未満または１０ｐＭ未満の結合親和性を有する、請求項１〜請求項２３のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジ。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジと、前記ＣＡＲを発現する免疫細胞を含む、免疫療法のためのシステム。
【請求項２６】
前記アプタマーブリッジのＣＡＲ結合アプタマーに結合した際に前記免疫細胞が活性化される、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
がん、病原体、または炎症細胞またはタンパク質に対する免疫応答を増強させる、請求項２５または請求項２６に記載のシステムの使用。
【請求項２８】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジと、前記ＣＡＲをコードするウイルスベクターを含む、対象に免疫療法を提供するためのキット。
【請求項２９】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
さらに前記ＣＡＲ結合アプタマーまたはその一部の相補配列を有するアプタマーを含む、請求項２８または請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
（ｉ）生体内または 生体外の免疫細胞における発現のためのＣＡＲをコードするウイルスベクターと、（ｉｉ）前記ＣＡＲに高い親和性結合が可能なアプタマーを含む、対象に免疫療法を提供するためのキット。 
【請求項３２】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
請求項１〜請求項２４のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジと、前記ブリッジのＣＡＲ結合アプタマーと同じＣＡＲに結合するが、前記ブリッジによって結合される前記標的には結合しない、標識および／または非標識ＣＡＲ結合アプタマーとを含むキット。
【請求項３４】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジと、前記ブリッジの標的結合アプタマーと同じ標的に結合するが、前記ブリッジによって結合されたＣＡＲには結合しない、標識および／または非標識の標的結合アプタマーを含むキット。
【請求項３５】
その必要とする対象において免疫療法を行う方法であって、以下のステップを含む方法：
（ａ）  ＣＡＲを発現する細胞の集団を対象に投与し、ここで前記ＣＡＲは、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）を特異的に結合することができる細胞外ドメインを含み、および
（ｂ）  請求項１〜２４のいずれか一項に記載のアプタマーブリッジを対象に投与すること；
それによって、前記アプタマーブリッジが前記対象のＣＡＲ発現細胞に結合し、前記ＣＡＲ発現細胞と前記標的との相互作用を誘導する。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法は、さらに以下のステップを含む：
（ａ１）  前記ＣＡＲに結合する標識された単一特異性アプタマーを前記対象に投与し、前記対象に存在するＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞の量を決定すること。
【請求項３７】
前記工程（ｂ）が、ＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞の量が、前記免疫療法が成功するために必要と推定される所定量に達するか、超えた場合にのみ行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞の量が所定量以下に低下し、一定期間経過後にステップ（ａ１）が繰り返される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的が標的細胞上にあり、そしてその相互作用が標的細胞の死をもたらす、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記相互作用が対象において増強された免疫応答をもたらす、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記相互作用が対象における免疫寛容をもたらす、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記相互作用が対象における免疫応答の低下または終了をもたらす、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記増強された免疫応答ががん、病原体、または炎症細胞またはタンパク質に対するものである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫応答の強度または持続時間が、ステップ（ｂ）におけるアプタマーブリッジの投与量または投与期間によって調節される、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記免疫応答の強度または持続時間が次のステップによって制限される、請求項３５〜４４のいずれか一項に記載の方法:
（ｃ）  ＣＡＲ結合アプタマーまたはその一部のそれに対して相補的配列を有するアプタマー対象に投与すること。
【請求項４６】
さらに以下のステップを含む、請求項３５〜４５のいずれか一項に記載の方法：
（ａ０）  前記細胞内のＣＡＲを発現するウイルスベクターを用いて対象から細胞を形質導入すること。
【請求項４７】
前記形質導入が体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で行われる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記の形質導入が対象（体内）において行われる、求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）関連免疫療法の使用の制御を強化するアプタマーベースのスイッチ技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、一本鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）抗体を利用して、患者のＴ細胞にがん細胞を認識して殺す能力を与える。しかし、初期の成功した適用にもかかわらず、ＣＡＲ  Ｔ細胞の使用は、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫応答の制御が困難であるため複雑であり、サイトカインの有害な過剰放出や望ましくない毒性をもたらし得る。さらに、オフターゲット反応が発生する可能性があり、腫瘍による抗原の逃避により、抗原特異性が変更された次のラウンドのＣＡＲ  Ｔ−細胞療法が必要になる可能性がある。したがって、相互作用を強化して特異性を高め、ＣＡＲを新しい抗原にリダイレクトするか、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を阻害または終了するための「オフ」または「キル」スイッチを開発する戦略を開発する必要がある。
【０００３】
ＣＡＲ  Ｔ−細胞と標的細胞との間の相互作用を媒介する適応性のある分子スイッチの患者への投与を可能にする、切り替え可能なＣＡＲ  Ｔ細胞アプローチが開発された。スイッチがない場合、ＣＡＲを媒介した免疫反応は起こらない。たとえば、キルスイッチを使用してＣＡＲ−Ｔ細胞を排除し、毒性を防ぐことができる（Straathof et al., Di Stasi et al.）。別のアプローチは、小分子スイッチの存在下で結合させるスプリットキメラ受容体を利用する（Wu et al.）。ＣＡＲと標的間の相互作用を媒介する抗体ベースのスイッチも開発されている（Tamada et al., Urbanska et al. (2012a), Urbanska et al.(2012b)）抗体スイッチ技術の変形では、標的特異的抗体は、ＣＡＲのｓｃＦｖ部分に結合するペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）と統合することができる（Rodgers et al.）。ＰＮＥは内因性エピトープとは異なり、単一のＰＮＥと抗ＰＮＥ ＣＡＲを異なる標的特異的抗体と組み合わせることにより、新しいスイッチを設計できるモジュラースイッチアプローチを可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、このアプローチでは依然として抗体分子の複雑なエンジニアリングが必要であり、特にｓｃＦｖが完全にヒト化されていない場合は、スイッチに対する免疫反応の可能性が生じる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本技術は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）関連の免疫療法を実施する際に高度な制御を生み出すアプタマーベースのスイッチ技術を提供する。本技術のアプタマーベースのスイッチ、すなわちアプタマーブリッジは、その最も基本的なレベルで、リンカーを介してＣＡＲ結合アプタマーに結合された標的結合アプタマーを含有する合成ブリッジ分子を利用する。ＣＡＲと対応するアプタマーブリッジを含有するシステムは、免疫療法プラットフォームを提供する。該プラットフォームは、（ｉ）ブリッジの標的結合アプタマーを選択することで任意の所望する抗原を標的にすることができ、（ｉｉ）標的結合アプタマーを変更することで１つの標的から別の標的へリダイレクトでき、（ｉｉｉ）ブリッジの投与プロトコルを変更することにより、時間の経過とともに変化する個々の患者のニーズにしたがって投薬することができ、（ｉｖ）すばやくまたは徐々にオンまたはオフに切り替えることができ、（ｖ）特定のＣＡＲ療法のコンパニオン診断として使用でき、（ｖｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）またはｅｘ  ｖｉｖｏ（生体外）の何れかのＣＡＲ発現と統合することができ、（ｖｉｉ）非免疫原性であり、
（ｖｉｉｉ）製造コストが低いものである。
【０００６】
本技術は、細胞方向転換アプタマー（例えば、二重特異性または多価アプタマー）を提供し、これは、アプタマーベースのＣＡＲ免疫療法システムにおけるアプタマーブリッジとして、ならびに細胞のインビボまたはエックスビボ遺伝子修飾のために使用することができる。本技術のアプタマーブリッジ、細胞、キット、および方法は、がん（例えば、血液学的または非血液学的、個々の細胞または固形腫瘍）、自己免疫疾患 （例えば、関節炎、重力筋無力症、ペンフィガス）、神経炎症性疾患、眼疾患、神経変性疾患（例えば、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病）、神経筋疾患（デュシェンヌ筋ジストロフィー、ＳＭＡを含む）、感染症（例えば、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、エボラ、結核、クリプトコッカス）、および代謝性疾患（例えば、１型糖尿病）の治療のための免疫療法として、を含む、多種多様な用途で使用することができる。それらはまた、画像化、細胞輸送の分析、および新しい免疫療法の研究開発を含む、そのような免疫療法で使用するための診断薬、キット、および方法を提供するために、ならびに幹細胞療法（例えば、ＨＳＣＴ）と組み合わせた場合の予防を提供するために使用することができる。
【０００７】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗原受容体細胞」または「ＣＡＲ細胞」は、遺伝的に単鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）抗体を発現するように生体外（ex vivo）または生体内(in vivo)で操作された細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、またはその他）であり、茎または膜貫通ドメインを介して受容体の細胞内ドメイン（ＣＤ３−ＴＣＲなど）に融合し、１つまたは複数の特定の抗原を認識して結合し、細胞性免疫応答を活性化する能力（例えば、がん細胞を殺すか、ウイルスに感染した細胞を破壊する能力）を細胞に与える。
【０００８】
本明細書で使用される場合、「抗原喪失」または「抗原エスケープ」は、腫瘍抗原のダウンレギュレーションまたは阻害性リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３）のアップレギュレーションなどの免疫療法への耐性または適応のいくつかのメカニズムのいずれかを指すことができる。これは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の障害、ＣＡＲ細胞がその標的（例えば、腫瘍部位）に到達できないこと、ＣＡＲの抗体部分に対する免疫（例えば、特にそれが完全にヒト化されていない場合のｓｃＦｖに対するＴ細胞応答）、ＣＡＲ−Ｔ細胞の適合性（すなわち、記憶の自己複製の可能性の低下および消耗の増加傾向）、または抗原のスプライシングまたは突然変異に寄与する。
【０００９】
候補アプタマーは、異なる配列の核酸のセットであり、そこから所望のアプタマーが選択される。候補アプタマーの供給源は、天然に存在する核酸またはその断片、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸、または前述の技術の組み合わせによって作製された核酸であり得る。
本技術で使用するための核酸は、例えば、その化学修飾を含むＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＸＮＡ（外来の核酸）分子であり得、一本鎖、二本鎖、または一本鎖と二本鎖の混合物のいずれかであり得る。
【００１０】
標的は、アプタマーに結合する構造単位、通常は生物学的実体の構成要素である。標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、薬物、栄養素、成長因子などの分子であり得る。標的は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、Ｂ細胞、腫瘍細胞、または病理学的に変更された細胞（例えば、ウイルスまたは他の微生物によって、または遺伝的再配列のために変更されたもの）などの細胞または細胞の一部であり得る。標的はまた、器官または細胞小器官であり得る。
【００１１】
結合親和性とは、リガンドと受容体など、互いに可逆的に結合する２つ以上の構造間の相互作用の強さをいう。結合親和性は、オンレート（ｋｏｎ）とオフレート（ｋｏｆｆ）の比率の動的平衡の尺度であり、結合の濃度依存性、または解離のギブスの自由エネルギー（ΔＧＤ）の決定からなどの、解離定数（Ｋｄ）または会合定数（ＫＡ）の決定を含む任意の既知の方法で測定または推定できる。結合親和性の増加は、相互作用する構造（例えば、リガンドと受容体）間のより強い分子間力から生じ、結合部位での滞留時間の増加をもたらす。より高い結合親和性を示すリガンドは、より高い「オン」率および／またはより低い「オフ」率を有し得る。より低い濃度のリガンドで完全な受容体活性が達成されるため、結合親和性の増加は治療用製品において有利であり得る。結合親和性は、多価構造における個々の非共有結合相互作用の複数の親和性の集合的な強さによって決定し得る。多価リガンドの全体的な結合親和性は、その個々の結合親和性、リガンドと受容体の両方の原子価、および相互作用する構造の立体配置に依存する。しかし乍ら、多量体構築物の全体的な結合親和性は、単に個々のアプタマーの個々の結合親和性の平均ではない。多量体構造の親和性に影響を与える要因には、リガンドと受容体の間の立体化学的適合、それらの間の接触領域のサイズ、および荷電基と疎水性基の分布が含まれる。
【００１２】
安全性プロファイルとは、薬物、治療、または介入およびそのような副作用の可能性に関連する副作用の収集をいう。より良い安全性プロファイルは、同じレベルの治療効果に関連する頻度および／または重篤性の低い副作用および／または有害事象から生じ得る。より良い安全性プロファイルは、改善された治療指数（ＴＩ）、すなわち、最小有効量と最大耐量の間のより大きな安全ウィンドウと関連付けることができる。
【００１３】
免疫応答は、抗原に対して特異的な体液性および／または細胞性反応の誘導をいう。体液性成分は、抗原に特異的な抗体の産生を含み得、一方、細胞媒介性成分は、抗原に対する遅延型過敏性および細胞毒性効果細胞の生成を含み得る。免疫細胞は、抗原との直接相互作用、免疫系の他の細胞との相互作用、サイトカインの放出および／または反応による、さまざまな方法で免疫応答に関与する。 
【００１４】
免疫系の活性化または刺激は、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫効果細胞の活性化によって媒介される。それは、樹状細胞などの抗原提示細胞の活性化および成熟によって媒介され得る。また、免疫チェックポイント分子を抑制することによるなど、抑制性経路の遮断によって媒介され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本技術のアプタマーブリッジのいくつかの実施態様の概略図を示している。
【図２】図２は、ＣＡＲプラットフォームのｉｎ ｖｉｖｏ発現と、アプタマーブリッジを介した標的化を一緒に使用したＣＡＲ  Ｔ細胞療法のシステムと方法の概略図を示している。
【図３】図３は、本技術による標的方向転換の方法の概略図である。
【図４】図４は、ペプチドネオ抗原と単量体アプタマーの配列表である。
【図５】図５は、単量体アプタマーのいくつかの予測される二次構造を示している。
【図６】図６は、アプタマーをリンクするためのクリック化学反応のスキームを示している。
【図７Ａ】図７Ａは、それぞれの抗原を発現する細胞および発現しない細胞への抗ＰＳＭＡアプタマーの結合を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、それぞれの抗原を発現する細胞および発現しない細胞への抗ＣＤ３アプタマーの結合を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、単量体および二量体（二重特異性）アプタマーのアガロースゲルを示している。
【図８Ｂ】図８Ｂも、単量体および二量体（二重特異性）アプタマーのアガロースゲルを示している。
【図９】図９は、血清中のＲＮＡアプタマーの経時変化を示している。
【図１０】図１０Ａ-Ｂは、ＰＳＭＡ陽性および陰性細胞に対する二重特異性アプタマーの結合親和性を示している。
【図１１】図１１Ａ−Ｂは、ＣＤ３陽性および陰性細胞に対する二重特異性アプタマーの結合親和性を示している。
【図１２】図１２は、ＰＳＭＡ陽性細胞に対する二重特異性アプタマーの細胞毒性を示している。
【図１３】図１３Ａは、いくつかの抗ＰＮＥ  ＲＮＡアプタマーの配列アラインメントを示している。図１３Ｂは、１３Ａからの２つのＲＮＡアプタマーの予測される二次構造を示している。
【図１４】図１４Ａ−Ｃは、受容体、ＣＤ１９ ＣＡＲ、またはＰＮＥ  ＣＡＲを発現しない細胞への抗ＣＡＲ  ＰＮＥアプタマーの結合を示している。
【図１５】図１５は、血清中の抗ＣＡＲ ＰＮＥ  ＲＮＡアプタマーの安定性を示している。
【図１６】図１６は、ＣＡＲ−ＰＮＥで形質導入された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への抗ＣＡＲ  ＰＮＥアプタマーの結合を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本技術は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法などの免疫療法で使用するためのアプタマーベースのスイッチを提供する。アプタマースイッチは、ＣＡＲ発現免疫細胞と、がん細胞や病原体の細胞などの標的細胞との間の物理的な橋渡し（ブリッジ）として機能する。ただし、アプタマースイッチまたはブリッジは、免疫反応の特異性と強度を調節するための機敏で迅速に適応できるツールとしても機能する。それらのＣＡＲ結合および標的結合機能は両方ともアプタマーによって実行されるため、アプタマーブリッジを迅速に選択し、抗体ベースのアプローチでは対応できない迅速なペースおよび低コストで、生体外(in vitro)で患者の進化するニーズに適合させることができる。さらに、本技術のアプタマーブリッジは、例えば、ポリマーでコーティングされたウイルスベクター粒子からの、ＣＡＲをコードするベクターの直接注射、および選択された免疫細胞およびＣＡＲの発現のインビボ形質導入（すなわち、免疫療法の対象の体内での形質導入）と組み合わせることができ、従来の生体外(ex vivo)での形質導入およびＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖と比較して、さらに時間とコストを節約しながら高度な免疫療法を実現する。
【００１７】
細胞方向転換アプタマー技術（例えば、二重特異性または多価結合）および本技術のアプタマーブリッジ、ならびにそれらを含むシステムおよびキットは、自家または異種のがん療法および免疫療法を含む様々な用途で使用することができる。本技術の細胞方向転換アプタマー技術、アプタマーブリッジ、アプタマーベースのＣＡＲ免疫療法システム、キット、および方法は、がんの処置を含む多種多様な免疫療法（例えば、血液学的または非血液学的）、個々の細胞または固形腫瘍）、自己免疫疾患（例、関節炎、重力筋無力症、ペンフィガス）、神経炎症性疾患、眼疾患、神経変性疾患（例、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病）、神経筋疾患（デュシェンヌ病、ＳＭＡ）、感染症（例えば、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、エボラ、結核、クリプトコッカス）、および代謝性疾患（例えば、１型糖尿病）に採用され得る。それらはまた、画像化、細胞輸送の分析、および新しい免疫療法の研究開発を含む、そのような免疫療法で使用するための診断薬、キット、および方法を提供するために、ならびに幹細胞療法（例えば、ＨＳＣＴ）と組み合わせた場合の予防を提供するために使用することができる。
【００１８】
アプタマーブリッジは、がんや感染症に対する細胞媒介性免疫応答などの免疫反応の質と強度を改善することにより、免疫療法を強化することができる。さらに、アプタマーブリッジを使用して、万能のＣＡＲを多くの異なる標的に向けたり、免疫応答を別の標的にリダイレクトしたりすることができる。アプタマーブリッジを使用して、免疫応答の強さを調整したり、異なる標的のアプタマーブリッジを投与したり、アプタマーブリッジの投与量や投与スケジュールを経時的に調整したりするだけで、応答をオンまたはオフにすることもできる。アプタマーブリッジのさらなる使用は、ＰＤＬ−１などの阻害性リガンドを免疫刺激効果に変換すること、すなわち、アプタマーブリッジの標的結合アプタマーを阻害性リガンドに結合するアプタマーで置き換えることにより、阻害性リガンドをＣＡＲ−結合リガンドに変換することである。
【００１９】
本技術によるＣＡＲ療法は、通常、免疫療法を必要とする対象へのＣＡＲ発現細胞の導入から始まる。ＣＡＲ細胞は、例えば、対象から除去された細胞をウイルスベクターで形質導入するか、またはそれらをプラスミドまたはトランスポゾンで形質導入することによって生体外（ex vivo）で得ることができ、これにより、ＣＡＲが細胞上で発現され、続いて細胞が培地で増殖し、静脈内注射などにより増殖した細胞の対象への導入を行う。あるいは、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを、例えば静脈内注射によって対象に投与することができ、その結果、ＣＡＲは、所望の免疫細胞（自己または同種Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞など）で発現される。いずれの方法でも、ＣＡＲ発現細胞のベースラインが対象の体内で確立されると、標的をＣＡＲのｓｃＦｖ部分に結合することによって活性化されると、ＣＡＲ細胞は増殖する。
【００２０】
十分な数のＣＡＲ細胞を含有する対象への適切なアプタマーブリッジの投与は、ブリッジのＣＡＲ結合アプタマーがＣＡＲに結合する際に、ブリッジの標的結合アプタマーによって指定される標的に対する免疫応答を引き起こす。結果として生じる免疫応答の強さは、経時的に変化する可能性があり、対象におけるＣＡＲ細胞の数、標的へのＣＡＲ細胞のアクセス、および標的でのアプタマーブリッジの濃度の関数である。 免疫応答の強さは、ＣＡＲ細胞の数を調整することによって、および／または投与されるブリッジの量を増減することによって、または投与されるブリッジの投薬間の時間間隔を短縮または増加することによってブリッジの濃度を調整することによって、上または下に調整できる。
【００２１】
本技術の治療法では、免疫療法を開始するためにアプタマーブリッジを投与する前に、対象におけるＣＡＲ細胞の総量を推定し、そうして投与プロトコル（例えば、投薬量、投薬回数、および／または投与間隔）が設計され（例えば、アルゴリズムを使用して）、免疫応答の所望の強度および／または持続時間が生み出される。免疫応答の強さは、既知の方法（例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析）を使用して、患者からの血液サンプル中の特定の活性化免疫細胞の数と種類を定量化するために、あるいはそのようなサンプル中の特定のサイトカインのレベルを決定することにより監視できる。免疫応答が強すぎて患者に危険をもたらす可能性がある場合は、アプタマーブリッジの投与量または投与頻度を減らすか、完全に停止するか、または以下を含む「キル」スイッチを投与することにより、応答を減らすことができる。すなわち、単一のＣＡＲ結合アプタマー（それはＣＡＲへのアプタマーブリッジの結合を邪魔する）、ＣＡＲに結合してアプタマーブリッジの結合を邪魔するペプチドまたは抗体、単一の標的結合アプタマー（それは標的へのアプタマーブリッジの結合を邪魔する）、またはＣＡＲまたは標的抗原からの可溶性ドメインまたはエピトープなどである。
【００２２】
本技術のアプタマーブリッジを使用して、ＣＡＲ細胞を別の標的にリダイレクトすることができる。これは、最初の標的による抗原の逃避、または最初の標的に対する弱い応答の場合に有用であり得、異なるまたは追加の標的の追求を必要とする。この方法の一実施態様において、異なる（例えば、第２以降の）アプタマーブリッジが対象に投与され、これは、同じまたは類似のＣＡＲ結合アプタマーを有するが、第１のブリッジとは異なる標的結合アプタマーを有する。 別の実施態様において、第１の標的に直接標的化される（すなわち、ＣＡＲスイッチを使用せずに）従来のＣＡＲが対象の細胞上に発現され、アプタマーブリッジが対象に投与されて、ＣＡＲ応答を異なる（第２以上の）標的へのＣＡＲ応答をリディレクトする。アプタマーブリッジは、標的結合ＣＡＲに特異的なＣＡＲ結合アプタマーおよび標的結合アプタマーを含み、２つのアプタマーがリンカーによって結合されている。このアプローチは、免疫療法を調整するため、または最適な標的または標的の組み合わせを見つけるために、同じ対象内の異なる標的と連続してまたは同時に数回（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）使用することができる。本技術のアプタマーブリッジの一実施態様は、対象内のＣＡＲ細胞または標的のいずれかを画像化または定量化する際に使用するための検出可能な標識に結合されている。例えば、該ブリッジは、リンカーまたは、ＣＡＲ結合アプタマーまたはＰＥＴスキャンで使用するための標的結合アプタマーのいずれかに取り付けられた１８Ｆ部分を含むことができる。同じ方法は、治療のためにアプタマーブリッジで使用される個々のアプタマー（ＣＡＲ結合または標的結合のいずれか）を使用して実施することができる。 この方法は、例えば、治療を開始する前または治療中に対象のＣＡＲ細胞を定量化するために使用することができる。
【００２３】
本技術のアプタマーブリッジは、連結部分によって共有結合または非共有結合された２つ以上のアプタマーを含有する。２つ以上のアプタマーは、ＣＡＲ結合部分および標的結合部分を形成し、これらのそれぞれは、１つ以上のアプタマーを含有する。ＣＡＲ結合アプタマーは、Ｔ細胞などの免疫細胞中において発現されたＣＡＲに結合し、いくつかの実施態様では免疫細胞を活性化するが、他の実施態様では（例えば、「キル」スイッチとして作用する場合）、免疫細胞を活性化しない。標的は、免疫療法の意図された標的、すなわち、排除を目的とした細胞である。したがって、ＣＡＲ発現細胞とアプタマーブリッジは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法などの免疫療法におけるシステムとして一緒に使用することを目的としている。アプタマーブリッジのＣＡＲおよび標的への結合は、好ましくは高親和性結合である。標的は、タンパク質（細胞表面受容体タンパク質など）、細胞、小分子、または核酸であり得る。標的は、がん細胞などの標的細胞の表面に位置することが好ましく、対象の他の細胞（正常細胞）に見られる場合と見られない場合がある。
【００２４】
いくつかの実施態様では、標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＢＣＭＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、メソセリン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、Ｇｐ１００、チロシナーゼ、ｐ５３、ｒａｓ、Ｆｔｔ３、ＮＫＧ２Ｄ Ｌｉｇａｎｇ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＭＵＣ１、ＳＡＰ−１、スルビビン、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ４０、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ７９Ｂ、ｃＭｅｔ、ＰＣＳＫ９、ＩＬ−４ＲＡ、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＯＸ−４０、または変異ＳＯＤなどの腫瘍抗原である。アプタマーブリッジの成分アプタマーはまた、そのような標的の組み合わせに特異的に結合することができる。いくつかの実施態様において、標的は、ｇａｇ、逆転写酵素、ｔａｔ、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質、スポロゾイト周囲タンパク質、ＨＣＶ非構造タンパク質、ヘマグルチニンなどの感染性病原体の抗原である。アプタマーブリッジは、そのような標的の組合せに特異的に結合することもできる。
【００２５】
好ましい実施態様において、１つまたは複数のＣＡＲ結合アプタマーは、ペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）、すなわち抗ＰＮＥ  ＣＡＲに対して親和性を有するＣＡＲの細胞外ドメインへの特異的結合のために選択される。ＰＮＥは対象の体内に存在しないエピトープであるため、抗ＰＮＥ  ＣＡＲを発現する免疫細胞は内因性生体分子によって活性化されないが、免疫細胞のために、「オン」スイッチとして機能するアプタマーブリッジの対象への投与を待ち、ＣＡＲ発現細胞を所望の抗原または抗原を有する細胞型に標的化する。ＣＡＲ発現免疫細胞の免疫活性化および生体内（in vivo）増殖は、ＰＮＥを含有するペプチド、または単量体型のブリッジのＣＡＲ結合アプタマーまたは標的結合アプタマーのいずれかを対象に投与することによってオフにすることができ、そのうちの１つは、標的によるＣＡＲ発現免疫細胞の活性化を終了させるであろう。
【００２６】
ＰＮＥは、宿主のプロテオームに見られない（例えば、ヒトプロテオームには見られない）、抗ＰＮＥ  ＣＡＲを得ることができる、任意のペプチドエピトープであり得る。好ましいＰＮＥの例は、Saccharomyces cerevisiae由来のＧＣＮ４転写因子のペプチドフラグメント（ＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬ、配列番号１）である。高親和性（Ｋｄ = ５．２ ｐＭ）で５２ＳＲ４単鎖抗体を含むＣＡＲ結合ＧＣＮ４は、Rodgersらによって説明されている。ＣＡＲおよび対応するアプタマーブリッジでの使用に適したさらなるＰＮＥには、以下が含まれる：
【００２７】
（ｉ）黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢのＮ末端１５−マーペプチドＥＳＱＰＤＰＫＰＤＥＬＨＫＳＳ（配列番号２）、それに結合する抗体と対になり、Clin. Vaccine Immunol.17(11):1708~1717に記載されている；
（ｉｉ）大腸菌マイコトキシンであるデオキシニバレノールは、それに結合するｓｃＦｖと対になっており、Protein Expr. Purif. 35(1): 84-92に記載されている；
（ｉｉｉ）BiomedInt. Res. Int. 2018; 2018： 5809028に記載されている抗体と対になったＨＰＶ−１６タンパク質Ｅ５；
（ｉｖ）狂犬病ウイルスタンパク質およびそれに結合するｓｃＦｖであり、Protein Expression and Purification 86（2012）75-81に記載されている；
（ｖ）それに結合するｓｃＦｖと対になってBioconjugateChem. 2010、21、1134〜1141に記載されているインフルエンザＡマトリックスタンパク質；
【００２８】
（ｖｉ）ＨＢＶのプレＳ２タンパク質のアミノ酸１３４〜１４５（PRVRGLYFPAGG、配列番号３）、それに結合するｓｃＦｖと対になっており、ViralImmunol. 2018 May 30に記載されている；
（ｖｉｉ）J. of Virological Methods 257（2018）73-78に記載されているｓｃＦｖと対になったアヒル肝炎ウイルス１型のＶＰ３ペプチド； 
（ｖｉｉｉ）Appl Microbiol Biotechnol. 2017年12月; 101（23-24）：8331-8344に記載されているｓｃＦｖと対になったウシヘルペスウイルス１型の糖タンパク質Ｄからのペプチド（MEESKGYEPP、配列番号４）； 
（ｉｘ）南アフリカ領土２（ＳＡＴ２）の口蹄疫ウイルスのＶＰ１タンパク質のアミノ酸１５９を含み、それに結合するｓｃＦｖと対になっており、Virus Research 167（2012）370-379に記載されているペプチド； 
（ｘ）ネズミチフス菌由来のＯｍｐＤのペプチド（DRTNNQVKA、配列番号５）は、それに結合するｓｃＦｖと対になっており、Veterinary Microbiology 147（2011）162-169に記載されている；
【００２９】
（ｘｉ）大腸菌由来のイソフェリチンのペプチドであり、それに結合するｓｃＦｖと対になっており、Journal of Biotechnology 102（2003）177/189に記載されている；
（ｘｉｉ）ブドウの葉巻関連ウイルス３コートタンパク質のＮ末端に位置するペプチド（AQEPPRQ、配列番号６）で、それに結合するｓｃＦｖと対になっており、Arch. Virol. (2008) 153:1075-1084に記載されている； 
（ｘｉｉｉ）ＳＡＲＳ−ＣｏＶのＮタンパク質のペプチド（PTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQ、配列番号７）で、それに結合するｓｃＦｖと対になっており、Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2004、36（8）541-547に記載されている； 
（ｘｉｖ）ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質のアミノ酸１〜１５を含み、それに結合するｓｃＦｖと対になっており、J.Virol. 2004年4月; 78(7):3792-3796に記載されているペプチド； および（ｘｖ）ＨＣＶ ＮＳ３のヘリカーゼドメインのアミノ酸１３６３〜１４５４からのペプチドであり、それに結合するｓｃＦｖと対になっており、J. Hepatology 37（2002）660〜668,  Virol 1994; 68：4829〜4836,およびArchVirol 1997; 142：601-610に記載されている。本技術のアプタマーブリッジと組み合わせることができる万能のＣＡＲの他の例は、J.Autoimmun. 2013 May.42 :105-16; Blood Cancer J. 2016 Aug, 6(8): e458; Oncotarget. 2017 Dec 12, 8(65):108584-108603; Oncotarget 2017 May 9, 8(19): 31368-31385; Oncotarget 2018 Jan 26, 9(7): 7487-7500; およびＷＯ２０１６−０３０４１４に記載されている。
【００３０】
アプタマーブリッジの連結部分は、個々のアプタマー間の単純な１つまたは複数の共有結合であり得るか、または炭化水素、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、核酸、ペプチド、炭水化物、または脂質などの合成または天然に存在するポリマーであり得る。特定の実施態様では、連結部分はペプチドではない。特定の実施態様では、アプタマーブリッジはペプチドを欠いており、ポリペプチドおよびタンパク質を欠いている。連結部分はまた、ナノスケール構造（ポリマー、タンパク質、ナノ粒子、ナノチューブ、ナノ結晶、ナノワイヤー、ナノリボン、ナノ結晶、ミセル、またはリポソームなど）、またはマイクロスケール構造（マイクロビーズまたは細胞など）、またはより大きな構造（固体支持体など）の形態をとることができる。 好ましくは、連結部分は生分解性ポリマーである。連結部分は、線状、分岐、環状、またはこれらの構造の組み合わせであるポリマーであり得る。連結部分はまた、デンドリマー構造、またはハブまたは星型構造（２つ以上のアプタマーが結合しているコア構造など）のバックボーンとして機能し得る。非共有会合の場合、２つ以上の個々のアプタマーは、アプタマー間で直接、または連結部分との相互作用を介して、非共有相互作用を介して結合することができる。非共有相互作用は、例えば、１つ以上の水素結合、イオン結合、疎水性結合、ファンデルワールス相互作用、またはそれらの組み合わせであり得る。ストレプトアビジン−ビオチンなどの高親和性結合対を使用して、アプタマーブリッジ内のアプタマーを非共有連結させることができる。
【００３１】
リンカーまたは連結部分は、単量体アプタマーユニットを共有的にまたは非共有的に結び付ける任意の化学部分であり得る。リンカーは、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、または炭水化物を含有し得るか、またはそれら構成し得る。リンカーは、細胞受容体、リガンド、または脂質を含有し得るか、またはそれらから構成し得る。リンカーは、置換または非置換のアルキル鎖または環構造などの炭化水素鎖またはポリマー、ポリエチレングリコールポリマー、または修飾または非修飾のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含有し得るか、またはそれらから構成し得る。リンカーは、単一の共有結合である場合もあれば、１つ以上のイオン結合、水素結合、疎水性結合、またはファンデルワールス相互作用を含む場合もある。リンカーは、ジスルフィド架橋、ヘパリンまたはヘパラン硫酸塩由来のオリゴ糖（グリコソアミノグリカン）、化学的架橋剤、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、またはトリアゾールを含み得る。リンカーは酵素によって開裂可能であり、個々のアプタマーの放出および／またはアプタマーブリッジによるＣＡＲ−標的相互作用の停止を可能にする。
【００３２】
リンカーは、正味の正、負、または中性の電荷を持つことができる。リンカーは、多量体構築物中の個々の単量体アプタマーユニットの機能的特性の保存を確実にし、ＣＡＲおよび標的への結合を促進するため、またはそれらの相互作用を促進するために、必要に応じて柔軟または剛性にすることができる。リンカーは、５〜２０個のグリシンおよび／またはセリン残基のポリマーなどの柔軟な部分を含み得る。リンカーはまた、グルタメート、アラニン、リジン、および／またはロイシンのポリマーなどの、剛性で定義された構造を含有することができる。リンカーは、ヒンジ部分またはスペーサー部分を含むことができる。リンカーは、置換または非置換のＣ ２−Ｃ ５０鎖または環構造、ポリエチレングリコールポリマー（例えば、ヘキサエチレングリコール）、または修飾または非修飾オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。リンカーは、ヘパリンまたはヘパラン硫酸塩由来のオリゴ糖（グリコソアミノグリカン）、化学架橋剤、ペプチド、ポリペプチド、ヒドラゾン、チオエーテル、またはエステルを含むことができる。 
【００３３】
Ｃ２−Ｃ５０リンカーは、２〜５０個の炭素原子（飽和または不飽和、直鎖、分岐、または環状）、０〜１０個のアリール基、０〜１０個のヘテロアリール基、および０〜１０個の複素環基の骨格を含むことができ、それらは任意選択的にエーテル結合（例えば、１以上のエチレングリコール単位−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−を含むがこれらに限定されない、１以上のアルキレングリコール単位）；１以上の１，３−プロパンジオール単位；アミン、アミド、またはチオエーテルを含有する。各骨格炭素原子（すなわち、−Ｈ置換基のみを含む）独立して非置換であり得るか、またはＣ１〜Ｃ３アルキル、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−Ｓ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、ハロゲン、−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、および−ＮＨ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から選択される１以上の基で置換されていてもよい。いくつかの実施態様において、リンカーは、Ｃ２−Ｃ２０リンカー、Ｃ２−Ｃ１０リンカー、Ｃ２−Ｃ８リンカー、Ｃ２−Ｃ６リンカー、Ｃ２−Ｃ５リンカー、Ｃ２−Ｃ４リンカー、またはＣ３リンカーであり、ここで、各炭素は、上記のように独立して置換され得る。
【００３４】
特定の実施態様において、例えばイオン結合、水素結合、疎水性結合、ファンデルワールス相互作用、またはそれらの混合物を介して媒介されるアプタマー間に非共有結合があり、個々のアプタマーを結び付ける介在する連結部分はない。 単一の多量体アプタマー構築物はまた、特定のアプタマーを接続する介在リンカー部分を介した共有結合、および介在リンカー部分なしの、アプタマー間の他の結合サイトでの非共有結合の混合物を使用することができる。
【００３５】
リンカーは、任意選択で１つ以上の機能を持つことができます。例えば、いくつかの実施態様において、リンカーは、温度および／またはｐＨに感受性であり、これは、リンカーが、コンフォメーションを変化させるか、または事前に設計された温度および／またはｐＨの範囲で開裂されることを意味する。
【００３６】
アプタマーブリッジのＣＡＲ結合部分および標的結合部分のそれぞれは、単一のアプタマーを含むことができ、または２つ以上の同一または非同一のアプタマーユニットを含むことができる。 ２つ以上の同一のアプタマー、または同一ではないが同じ標的に結合するアプタマーの使用は、特に与えられた標的分子の複数のコピーを持っている細胞などの標的について、異なって提示される同じ標的の結合または結合の協同性を通じて、結合親和性を大幅に高めることができる。。同一の単量体アプタマーは、完全に同一のヌクレオチド配列（１００％同一）を有するか、または約９９％同一、約９８％同一、約９７％同一、約９６％同一、約９５％同一、約９４％同一同一、約９３％同一、約９２％同一、約９１％同一、または約９０％同一、または少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列を有することができる。 
【００３７】
アプタマーブリッジのＣＡＲ結合部分および標的結合部分のそれぞれは、同一ではなく、同じまたは異なる標的に結合する２つ以上の個々のアプタマーを含むことができる。非同一のアプタマーは、構造、ヌクレオチド配列、および／または結合特異性または結合親和性が異なる可能性がある。 このようなブリッジは、タンパク質の異なるエピトープまたは標的細胞の異なる表面タンパク質、または異なるＣＡＲなどの標的上の２つ以上の異なるサイトに特異的に結合し、それによって標的に対する親和性および／または特異性を増加させるか、または異なる標的細胞および／または異なるＣＡＲ発現細胞に結合する。異なる標的細胞および／または異なるＣＡＲ発現細胞が関与する作用の組み合わせを通じて、所望の治療効果を最大化するように、異なる標的または異なるＣＡＲＳを選択することができる。
【００３８】
ＣＡＲ細胞の機能は、それらを標的細胞上の２つ以上の抗原、例えば、ＣＤ１９とＣＤ２２、ＣＤ１９とＣＤ１２３、またはＣＤ１９とＢＣＭＡなどの所与の腫瘍細胞上の２つ以上の抗原に向けさせることによって改善され得る。このようなアプローチは、腫瘍抗原の喪失を克服し、応答の持続性を改善するのを達成するために役立ち得る。 アプタマーブリッジは、標的結合部分で２つ以上のアプタマーを一緒に連結することによって、同じ標的細胞上のＣＡＲおよび２つ以上の抗原を認識するように操作することができる。このアプローチは、２つの腫瘍関連抗原受容体を同時に発現するようにＴ細胞を操作することに類似しているが、抗体の二重標的制限を超えて拡張され、抗体ベースのＣＡＲスイッチよりも低コストと高い柔軟性を提供する。
【００３９】
本技術のアプタマーブリッジ構築物は、免疫療法組成物に使用することができる。そのような組成物の実施態様は、アプタマーブリッジおよび賦形剤を含む。アプタマーブリッジは、他の分子、またはリポソーム、マイクロまたはナノ粒子、受容体または細胞を標的とする分子、または取り込み、分布、および／または吸収を支援するための経口、局所または他の製剤などの構造と関連付けることができる。いくつかの実施態様では、アプタマーブリッジは、カプセル化されるか、共役（複合体）化されるか、またはそうでなければ治療薬送達ビヒクルと関連付けられる。いくつかの実施態様において、治療薬送達ビヒクルは、ウイルスベクターなどの遺伝子送達ビヒクルであるか、またはウイルスベクターを含む。 ウイルスベクターは、発現ベクターまたはプラスミドなどの任意のタイプの適切なベクターであり得る。好ましい実施態様では、ベクターはレンチウイルスベクターである。好ましい実施態様において、ＣＡＲコード化ベクターは、最初に対象に投与され、ＣＡＲ発現の初期ベースライン、およびいくつかの実施態様において、ＣＡＲ細胞増殖は、標的に対する免疫応答を活性化するために、対象にアプタマーブリッジを投与する前に、対象において確立される。ＣＡＲ発現、および任意選択でＣＡＲ発現細胞の増殖は、例えば、標識化形態でＣＡＲ結合アプタマー（アプタマーブリッジのＣＡＲ結合部分など）を投与することによって、対象において検出および／または定量化することができる。 続いて末梢血細胞の結合標識を決定するか、体内の標識の分布を決定する。
【００４０】
アプタマーブリッジの構成要素アプタマーは、アプタマー構造または配列に対する任意の所望の修飾を含み得る。修飾は、候補アプタマーの１つ以上のリボースまたはデオキシリボース部分に導入された置換を含み得る。修飾には、候補配列の１以上のリン酸塩部分における置換を含み得る。修飾には、候補アプタマーの１以上のプリンまたはピリミジン部分における置換、または候補アプタマーの天然ヌクレオチドの代わりに非天然または希少天然ヌクレオチドを使用することを含み得る。化学修飾は、ヌクレオチド間リン酸塩のホスホロチオエートまたはボラノリン酸による置換、ビオチン、アジドまたはアルキン基の付加など、ヌクレオチド間リン酸塩結合に導入することができる。フッ素、ＬＮＡ（閉じ込め核酸）ユニット、または２’−Ｏ−アルキル修飾の導入など、化学修飾をリボース環のＣ２’位置に導入することができる。アプタマーの１以上のヌクレオシドは、（２’−アミノ（２’−ＮＨ２ ）、２’−フルオロ（２'−Ｆ）、または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ））などの２’位の糖修飾、シトシン環外アミンでの修飾、ヌクレオシド間連結修飾、または５−メチルシトシンから選択される修飾を含み得る。アプタマーは、３’キャップ、５’キャップ、および／または３'末端に逆位デオキシチミジンを含み得る。２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、偽性ウリジン（ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、閉じ込め核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）などの非天然ヌクレオチドなどの希少ヌクレオチド、またはスレオース核酸（ＴＮＡ）は、一般的に発生するヌクレオチドの代わりに使用できる。非天然核酸（ゼノ核酸（ＸＮＡ））も含めることができる。 
【００４１】
標的に対するアプタマーを作製または選択するための任意の適切な方法を使用して、アプタマーブリッジの構成要素アプタマーを得ることができる。たとえば、アプタマーは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）によって識別できる。ＳＥＬＥＸは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。簡単に言えば、ＳＥＬＥＸは、標的と接触する様々なヌクレオチド配列を含有する複数の核酸（すなわち、候補アプタマー配列）から始まる。結合していない核酸は、アプタマーと標的の複合体を形成する核酸から分離される。次に、アプタマーと標的の複合体が解離され、核酸が増幅され、結合、分離、解離、および増幅のステップが、標的に対して次第に高い親和性のアプタマーの集団をもたらすために、所望されるだけ多くのサイクルを通して繰り返される。選択と増幅のサイクルは、サイクルのさらなる繰り返しで結合親和性の有意な改善が達成されなくなるまで繰り返すことができる。  
【００４２】
単一のアプタマーが同定される前に、選択と増幅のサイクルを中断することができる。 そのような場合、アプタマーの集団が同定され、これは、アプタマーと標的との結合を可能にする配列、構造、またはモチーフに関する重要な情報を提供することができる。候補アプタマーのそのような集団はまた、アプタマーのどの部分が標的結合にとって重要ではないかを知らせることができる。この情報は、他のアプタマーの生成を同じ標的に導くことができる。このように生成されたアプタマーは、ＳＥＬＥＸの新しいラウンドの入力として使用でき、より優れた結合親和性またはその他の関心のある特性を備えたアプタマーを潜在的に生成する。
【００４３】
いくつかの実施態様では、候補アプタマーブリッジなどの多量体アプタマー構築物を含有する候補アプタマー配列が形成され、その後、多量体構築物としてさらなるラウンドの選択に供される。多量体候補アプタマー構築物は、個々の候補アプタマー部分を連結部分と連結し、任意選択で、そのような構築物を１以上のＳＥＬＥＸのラウンド用の入力として使用することによって作製することができる。いくつかの実施態様において、個々のアプタマーは、１つ以上のラウンドのＳＥＬＥＸを介して独立して選択され、そして最終的に、連結部分と一緒に連結される。したがって、単量体アプタマーおよび多量体アプタマー構築物の多量体化は、ＳＥＬＥＸ手順の前、最中、または後に実行することができる。
【００４４】
アプタマーブリッジの構成要素アプタマーを選択するために、標的細胞上の標的に結合するアプタマーと比較して、ＣＡＲに結合するアプタマーに対して異なる方法で選択を行うことができる。標的細胞に結合するアプタマーの選択は、候補アプタマーを無傷の標的細胞、組換え細胞、病原体細胞、ウイルス様粒子、または精製された標的タンパク質またはペプチドエピトープと、または標的細胞からの膜調製物、または抗原性表面タンパク質を含有する組換え細胞と関連付けることによって行うことができる。しかしながら、抗ＰＮＥ ＣＡＲに結合するアプタマーの選択は、候補アプタマーを、ＰＮＥの存在下および非存在下で細胞上に発現された抗ＰＮＥ  ＣＡＲと接触させることによって実施することができる。したがって、この方法によれば、抗ＰＮＥ ＣＡＲに対して所望の結合親和性を有するアプタマーは、ＰＮＥを含有するペプチドを添加することによって、ＰＮＥの非存在下でのＣＡＲへの結合を置換することができるものである。しかし、アプタマーは、ＰＮＥ結合部位に隣接するなど、異なるＣＡＲの領域からのペプチドを使用して選択することもでき、この方法で選択されたアプタマーは、ＰＮＥによって置き換えられない可能性があるが、抗ＰＮＥ  ＣＡＲに対して高い親和性結合を提供し得る。さらに、免疫療法の成功を促進するために、ＣＡＲを発現するＴ細胞などのＣＡＲ発現細胞の活性化は、アプタマー選択プロセス中に監視されるべきである。この目的のために、候補のＣＡＲ結合アプタマーの選択は、候補の標的結合アプタマーとともに、アプタマースイッチに設置された候補のＣＡＲ結合アプタマーを使用して実行することができる。
【００４５】
アプタマーブリッジの成分アプタマーは、任意の所望の長さを有することができる。いくつかの実施態様では、成分アプタマーは少なくとも約１５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、成分アプタマーは約１００個のヌクレオチドを含む。アプタマーブリッジの長さは、ブリッジを介して相互作用する細胞間の距離を決定することができる。このように、ブリッジの長さは、約７０〜約２００オングストローム、または約７０〜約１５０オングストローム、または約１００〜約１７０オングストローム、または約１２０〜約１５０オングストロームの範囲が望ましい。
【００４６】
本技術は、任意の所望する結合親和性を有するアプタマーを識別または生成するために使用し得る。好ましい実施態様では、１以上の選択されたアプタマーは、高親和性（特異的）結合のために約１ｐＭから約１０ｎＭまでの目標に結合するためのＫｄを有し、低親和性結合の場合は約１００ｎＭから１０μＭ程度である。 いくつかの実施態様において、アプタマーは、約１ｐＭから約１０μＭまで、約１ｐＭから約１μＭ；約１ｐＭから約１００ｎＭ；約１００ｐＭから約１０μＭ；約１００ｐＭから約１μＭ；約１００ｐＭから約１００ｎＭ；または約１ｎＭから約１０μＭまで；約１ｎＭから約１μＭ；約１ｎＭから約２００ｎＭ；約１ｎＭから約１００ｎＭ；約５００ｎＭから約１０μＭ；または約５００ｎＭから約１μＭまでのＫｄを有する。いくつかの実施態様では、アプタマーブリッジ内の成分アプタマーの結合親和性は、単量体候補アプタマーの親和性の４〜５０倍高い。いくつかの実施態様では、アプタマーブリッジの成分アプタマーと １つ以上の標的との親和性は、ブリッジ内の多量化度、ブリッジに含まれる成分アプタマー、またはリンカーを変更することによって微調整し得る。 特定の実施態様において、ブリッジのＣＡＲ結合部分および／または標的結合部分が多価であり、つまり、ＣＡＲまたは標的上の同一または異なる部位に結合する２つ以上の個々のアプタマーを含有することを意味する。多価アプタマー構造物は、ＣＡＲまたは標的に対する高い結合特異性および／または高い結合親和性の利点を提供する。 多元性アプタマーの結合親和性は、単一アプタマーのそれよりもはるかに高い可能性があり、それは多量体複合体の結合が、個々の結合サイトの間で正の協同性または正のアロステリズムを示すことができるためである。 多量体アプタマーブリッジ部分で結合サイトを慎重に選択して結合させる能力は、有害または毒性作用を制限し、効果的な処置効果を高めることにより、安全性プロファイルを高める。
【００４７】
いくつかの実施態様において、アプタマーブリッジのアプタマーは、ビオチンアビジンまたはポリエチレングリコールなどの別の化合物との複合化によって安定化および／または多量化される。いくつかの実施態様において、アプタマーは固体の支持体を用いて合成される。
【００４８】
本明細書で公開されているアプタマーブリッジは、増殖性疾患または感染症の予防または処置に有用である。 本発明の１つの側面は、アプタマーブリッジまたは免疫療法製剤またはアプタマーブリッジを含む治療剤送達ビヒクルを投与することにより、がんや感染を予防または処置する方法である。
【００４９】
本発明はまた、アプタマーブリッジまたは免疫療法製剤またはアプタマーブリッジを含む治療剤送達ビヒクルを投与することにより、対象のがんまたは感染症に対する免疫応答を誘導または増強する方法を提供する。
【００５０】
本発明は、さらに、ＣＡＲを発現する免疫細胞と、免疫応答または増強された免疫応答が所望される標的細胞を特異的に関連付ける方法を提供する。標的細胞上にＣＡＲと分子標的の両方に結合特異性を有するアプタマーブリッジを投与すると、ＣＡＲ発現免疫細胞の活性化、標的細胞に対する免疫応答の開始または増強に繋がる。
【実施例】
【００５１】
［実施例１］  ＰＳＭＡおよびＣＤ３に特異的な二重特異性アプタマーの調製
Ａ１０  ＲＮＡアプタマー（配列番号８）は、ヒト前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）に対して選択され、ｓｉＲＮＡの前立腺特異的送達剤（McNamara et al. 2006-Dassieら 2009)として使用される３９個のヌクレオチド長の配列である。
ＣＥＬＴＩＣ_１Ｓ、ＣＥＬＴＩＣ_１９ｓ、ＣＥＬＴＩＣ-ｃｏｒｅはＤＮＡアプタマー（配列番号 ９、１０、１１）、ＡＲＡＣＤ３−３７００００６およびＡＲＡＣＤ３−００１０２０９はＲＮＡアプタマー（配列番号１２および１３）であり、これらはすべてヒトＣＤ３に対して以前に選択されている。
これらのＤＮＡまたは２’−デオキシ−２’−フルオロチミジン修飾ＲＮＡ（２'Ｆ−ＲＮＡ）アプタマーは、標準的な固相リンアミダイト化学を介して合成されたＨＰＬＣ−ＲＰ精製された単一標準オリゴとして、ベースクリック（ドイツ、ノイリード）から購入された。抗ＣＤ３アプタマーは、抗ＣＤ３モノクローナル抗体（データは示されていない）とは異なり、共刺激性抗ＣＤ２８抗体と併用しても、サイトカイン分泌または表面マーカー発現を活性化させなかった。
【００５２】
Ａ１０アプタマーは、その後のトリアゾール・ヌクレオチド間二量化のために、その３‘末端にアジド基で修飾された。ビオチンは、アプタマー配列とビオチン旗の間に１６原子混合極性スペーサーを導入するビオチン−ＴＥＧとして、Ａ１０アプタマーの５‘−末端に添加された。 Ａ１０のＣｙ５ ラベル付きバージョン も合成された。その後のトリアゾール・ヌクレトリアゾール・ヌクレオチドＥＲＴＩＣ_１ｓ、ＣＥＬＴＩＣ_１９ｓ、ＣＥＬＴＩＣ_コア、ＡＲＡＣＤ３−３７００００６、ＡＲＡＣＤ３−００１０２０９は、５’末端のアルキン基で修飾された。分子量、純度、完全性はＨＰＬＣ−ＭＳ によって検証された。 ＰＳＭＡ陽性およびＰＳＭＡ陰性細胞について、Ａ１０抗ＰＳＭＡ  ＲＮＡアプタマーの親和性および特異性が評価された（図７Ａ）。
【００５３】
抗ＰＳＭＡ Ａ１０および抗ＣＤ３アプタマーは、メーカーの指示に従って、オリゴ２−クリックキットＬ（ベースクリック、ドイツ・ノイリード）にて４５℃で６０分間行った銅触媒クリック反応によってヘテロ二量化された。３０分の間に１００Ｖにて１ＸＴＢＥバッファ（Invitrogen社）で移行した３％アガロースゲル上の反応生成物は、ゲル電気泳動によって分離された。ゲルをバイオ・ラッドイメージングシステムを用いて可視化し、その結果を図８Ａと８Ｂに示す。二量体アプタマーに対応するゲルスライスをゲルから切り出し、核酸を２５ｍＭのＮａＣｌ−ＴＥバッファー中で受動溶出することにより、８℃で７２時間抽出した。二特異性アプタマーダイマーは、標準的な酢酸ナトリウム沈殿法によって回収され、滅菌水に再懸濁され、使用まで−２０℃で保存された。
【００５４】
［実施例２］ＰＳＭＡに特異的なアプタマーＡ１０の機能安定性
Ａ１０ ＲＮＡアプタマーの安定性は、５％ ＦＢＳを含有するダルベッコのリン酸塩バッファ生理食塩水（ＤＰＢＳ）またはＦＢＳだけで測定した。ビオチン化アプタマーは８５℃で５分変性した後、氷ブロック上で直ちに４℃まで５分間冷却した。その後、アプタマーをＦＢＳの５％または純粋なＦＢＳ中で補ったＤＰＢＳ中、最終濃度 ２ μＭに希釈した。試料は３７℃で１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、または２４時間の間培養した。対照試料は３７℃で培養なしで新しく調製されたアプタマーを含んでいた。その後、各溶液に１００ｎＭストレプトアビジンＰＥを加え、アプタマーをＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞で培養した（ヒト前立腺癌−ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４０）。その後、５％ ＦＢＳを含むＤＰＢＳバッファーまたは純ＦＢＳ中のアプタマーＡ１０の半減期は、３７℃の培養時間の関数としての蛍光陽性細胞数の変化に基づいて、ＹＬ−１チャネル上のフローサイトメトリーを用いて測定した。測定結果を図９に示す。５％の血清を含有するＤＰＢＳバッファー中で培養されたアプタマー Ａ１０は、２４時間にわたって安定していた。純粋な血清で試験すると、培養の最初の２時間以内に結合活性の半分が失われた。
【００５５】
［実施例３］細胞上に発現される標的に対する抗ＰＳＭＡ×抗ＣＤ３二重特異性アプタマーの親和性および特異性の決定。
細胞上に発現した標的タンパク質に対する抗ＰＳＭＡｘ抗ＣＤ３二特異性アプタマーの親和性と特異性は、フローサイトメトリーによって評価された。これらの研究は、ＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病ヒト細胞株−ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、ＣＤ３陰性ラモス（バーキットリンパ腫ヒト細胞株−ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９６）、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌−ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４０）およびＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３（ヒト前立腺癌−ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）細胞上でＦＢＳの５％を補充した、ＳＥＬＥＸバッファー中のビオチン化ＲＮＡ／ＤＮＡアプタマー培養、またはＤＰＢＳバッファー中のＲＮＡ／ＲＮＡアプタマーでの培養によって行われた。
【００５６】
細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco Invitrogen社）中で、使用前に１０％のＦＢＳ（Gibco Invitrogen社）と １％ペニシリン／ステップマイシン（Gibco Invitrogen社）で補充して培養した。実験の前に、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｍｏｓ、ＬｎＣａＰ、およびＰＣ−３細胞（２．５×１０５セル／ウェル ）を９６ウェルプレートで播種し、２５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄みは廃棄され、ペレット化細胞を３７℃で予熱した２００μＬのＳＥＬＥＸまたはＤＰＢＳ−５％のＦＢＳバッファーで２回洗浄した。各洗浄ステップの後に、２５００ｒｐｍでの遠心分離を２分間行った。アプタマーは５分間８５℃で変性し、直ちに４℃の氷ブロックに５分間静置した。その後、試験サンプルを２つの異なる濃度範囲で希釈した。３、１０、３０、１００および３００ ｎＭ（ＣＤ３結合アッセイ）および３０、１００および３００ｎＭ（ＰＳＭＡ結合アッセイ）の後に、１００ｎＭフィコエリスリン標識ストレプトアビジン（ストレプトアビジン−ＰＥ、eBioscience社）を各溶液に添加する。Jurkat、Ramos、LnCap、PC-3細胞をアプタマー希釈液（１００μＬ／ウェル）で再懸濁し、５％ ＣＯ ２加湿雰囲気中で３７℃で３０分間培養した 。
【００５７】
対照として、細胞は、ＣＤ３モノクローナル抗体（ＰＥラベル、ＯＫＴ３ヒト抗ＣＤ３、Invitrogen社）、ＰＳＭＡモノクローナル抗体（アレクサフルオール４８８ラベル化、ＧＣＰ−０５ヒト抗ＰＳＭＡ、Invitrogen社）、ＰＥ−ストレプトアビジンまたは追加の試薬なしでそれぞれのバッファーで培養した。培養後、細胞を２分間２５００ｒｐｍで遠心分離し、結合されていない配列を有する上澄み液を廃棄した。ペレット化細胞は、ＳＥＬＥＸまたはＤＰＢＳ−５％のＦＢＳバッファー（２００μＬ／ウェル）で洗浄し、遠心分離し、弱く非特異的に付着した配列をすべて除去するために、２回遠心分離した。その後、５％のＣＯ２加湿雰囲気中で 、細胞を１ｍｇ／ｍＬサーモン精子ＤＮＡ溶液（１００μＬ／ウェル）で３７℃で洗浄した。３０分後、サーモン精液を２分間２５００ｒｐｍで遠心分離によって除去し、細胞をＳＥＬＥＸまたはＤＰＢＳ−５％のバッファー（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、遠心分離を行った。その後、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を添付したJurkat、Ramos、LnCap、PC-3細胞を固定し （ＢＤ ＣｅｌｌＦｉｘ溶液＃３４０１８１）、蛍光陽性細胞をＹＬ−１チャネル上のフローサイトメトリー （AttuneNXt; Invitrogen, Inc.） でカウントした。
【００５８】
ＰＳＭＡ陽性細胞への結合研究の結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。３個のＲＮＡ／ＤＮＡアプタマー（A10 x Celtic_1S、A10 x celtic_19S、A10 x Celtic_Core）と２つのＲＮＡ／ＲＮＡアプタマー（A10 x ARACD3-3700006、A10 x ARACD3-0010209）をＡ１０単量体アプタマーと一緒に分析した。比較のために、試験された試薬のＰＳＭＡ陰性のＰＣ−３細胞への結合も測定した。Ａ１０では、試験された最高濃度で信号の飽和に達することなく、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞への用量依存的結合が観察された。信号の強度は、抗体対照と同じくらい強かった。Ａ１０モノマーのＰＣ−３細胞への残留結合は、試験された最高濃度でのみ観察された。すべての二重特異性ＰＳＭＡｘＣＤ３アプタマーは、Ａ１０モノマーと同様の結合特性を示したが、ＰＳＭＡ陰性細胞への残留結合が減少したため、標的陽性細胞の特異性が改善された。試験された濃度ごとに、二重特異性アプタマーの信号強度はＡ１０モノマーで測定されたものよりも優れており、ヘテロ二量体化により親和性が改善されたことを示唆している。
【００５９】
別の実験では、同じアプタマーのＣＤ３陽性ＪｕｒｋａｔおよびＣＤ−３陰性Ｒａｍｏｓ細胞への結合が検討された。 図１１Ａおよび１１Ｂを参照されたい。 予想通り、Ａ１０アプタマーはこれらの２つの細胞株に結合しなかった。抗ＣＤ３モノマーのＲａｍｏｓ細胞への残留結合は、試験された最高濃度でのみ観察された。すべての二重特異性ＰＳＭＡｘＣＤ３アプタマーは、同様の用量依存性結合を示したが、ＣＤ３陰性細胞への残留結合が強く低下したため、標的陽性細胞に対する特異性は優れていた。試験された濃度ごとに、二重特異性アプタマーの信号強度は抗ＣＤ３モノマーに対して測定されたものよりも劣っており、ヘテロ二量体化により親和性が低下したことを示唆している。
これらの結果は、ヘテロ二量化後、異なる標的に対して選択されたアプタマーの結合特性は、別々に評価したときに立体障害のために破壊されないことを示唆している。選択されたパートナーによっては、二量化時に各標的の特異性と親和性が向上することさえある。
【００６０】
［実施例４］表面プラズモン共鳴で測定したＰＳＭＡおよびＣＤ３を標的とする二重特異性アプタマーの結合
結合親和性の測定は、BiAcore T200測定器（ＧＥヘルスケア社）を使用して実施した。アプタマーとＣＤ３およびＰＳＭＡタンパク質の間の相互作用を分析するために、ビオチン化アプタマーの３００共振ユニットをシリーズＳセンサーチップＳＡ（ＧＥヘルスケア社）の製造者の指示書（ＧＥヘルスケア社）に従って固定化した。ＤＰＢＳ バッファーが実行バッファーとして使用された。相互作用は、３０μｌ／分の流量で「単一速度論サイクル」モードで、ヒトＣＤ３ ε／γ、ＣＤ３ ε／δ、ｌｇＧ１ Ｆｃ、ＰＳＭＡ（Acro Biosystems社）の異なる濃度を注入することによって測定した。使用された最も高いアプタマー濃度は３００ｎＭであった。他の濃度は３倍希釈によって得られた。相互作用のすべての運動データは、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して評価された。
【００６１】
単量体および二重特異性アプタマーのＫＤ値の比較は 、二量化がその特定の標的に対する各サブユニットの結合特性を妨げないことを示している。ＰＳＭＡとＣＤ３ ε／γの同時結合は、１０μｌ／分の流量で手動注入モードで記録し、飽和濃度で第１標的の溶液を注入し、次に第２標的の溶液を飽和濃度で注入することによって記録することができる。逆配列を有する第２の注入が行われる。どちらの配列においても、同じ強度の反応をもたらす各注射は、第１抗原に対する結合部位が占有されている間、二重特異性アプタマーの両腕が第２の標的を結合できることを示している。モノマーが標的溶液の両方の注射に応答しないことは、二重特異性アプタマーが両方の標的を同時に結合できることを示している。
【００６２】
［実施例５］ＰＳＭＡおよびＣＤ３に特異的な二重特異性アプタマーの生物活性
細胞毒性アッセイは、非刺激末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して実施された。新しく調製したＰＢＭＣは、健康的なドナー（Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes）から得られたバフィーコートから単離された。血液をＤＰＢＳで希釈した後、ＰＢＭＣをＦＩＣＯＬＬ密度勾配（FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.077 GE Healthcare社）で分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco Invitrogen社製）で再懸濁し、５ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度を得た 。これらのＰＢＭＣは効果細胞として使用された。
【００６３】
ＬＮＣａＰ標的細胞は、細胞培養培地中の３７℃で３０分間２μＭのカルセインＡＭ（Trevigen Inc社、MD、Gaithersburg、アメリカ）で標識化された。カルセインＡＭフルオロクロームは、生きたＬＮＣａＰ細胞内に閉じ込められ、リディレクトされた溶解時にのみ放出される色素である。細胞培養培地で２回洗浄した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地で５ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度に調整され、アッセイ反応ごとに５０，０００細胞の１００μｌアリコートを使用した。３７℃／５％ＣＯ２での標準反応は４時間持続し、５ｘ１０４細胞カルセインＡＭ標識化標的細胞を、５ｘ１０５ＰＢＭＣＳ（Ｅ／Ｔ比 １：１０）、２０μｌの二重特異性アプタマー溶液を総体積２００μｌ中１μＭで使用した。細胞毒性反応の後、培養培地中に放出された色素を蛍光リーダー（VariosKan Lux、ThermFisher、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）で定量し、細胞毒性化合物が存在しない対照反応と蛍光信号が完全に溶解した細胞（アプタマーは、Chemometec, Allerod, Denmarkから購入したＡ１００試薬に置き換えられた）について決定された反応からの蛍光信号と比較された。これらの測定値に基づいて、特定の細胞毒性は、式：［蛍光（サンプル）−蛍光（対照）］／［蛍光（全溶解）−蛍光（対照）］ ｘ１００に従って、計算された。
【００６４】
１０：１の単一のＥ：Ｔ比を有するアプタマー１００ｎＭの存在下で４時間の培養後に得られた細胞毒性アッセイの結果を図１２に示す。ＰＳＭＡＸＣＤ３二重特異性ＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーでは、０〜弱い特異細胞殺害活性（＜１０％）が観察された。ＲＮＡ／ＲＮＡアプタマーA10 x ARACD3-3700006およびA10 x ARACD3-0010209で優れた特異的細胞毒性を測定し、ＬＮＣａＰ細胞の４０〜５０％の殺傷を誘発した。ＣＤ３結合部分を欠いた対照単量体Ａ１０は、細胞毒性を誘発しなかった。
これらの結果は、設計されたアプタマースイッチは、エフェクターＴリンパ球を標的細胞に誘発し、細胞溶解機械をリダイレクトし、特定の細胞集団を排除できることを示唆している。
【００６５】
［実施例６］アンチＣＡＲ  ＰＮＥアパタマー
ライブラリとプライマー
初期のＲＮＡライブラリテンプレートとプライマーは、ＩＤＴ（Coralville、米国アイオワ州）によって一本鎖ＤＮＡ：
：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-(N20)-TTTCTGCAGCGATTCTTGTTT-(N10)-GGAGAATGAGGAACCCAGTGCAG-3’、5’-TAATACGACTCACTATAGGGCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA
T-3’（順方向プライマー）、
5’-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3’ （逆方向プライマー）として合成された。２次構造に対するプライマーの影響を最小限にするために、５‘および３‘不変のプライマー領域を補完する２つの短い「ブロッキング」シーケンス（ＩＤＴから購入）を合成した。5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGG-3’ （順方向ブロッキング配列）、5’-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3’（逆方向ブロッキング配列）。 ライブラリの不変中心領域を補完する追加のビオチン化の「キャプチャ」配列もＩＤＴによって合成された：5’−ビオチン−GTC-PEG-6 スペーサー−CAAGAATCGCTGCAG-3’。すべての材料は２５０ｎｍｏｌスケールで注文され、脱塩精製を受けた。
【００６６】
ＲＮＡアプタマー選択用のＲＮＡライブラリを２’フルオロ−（２'Ｆ−） ピリミジンで修飾し、最終アプリケーションでの安定性を高めた。Ｔ７プライマーは、チタンＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Clontech; マウンテンビュー、米国カリフォルニア州）とプライマー拡張のためのライブラリ鋳型配列と組み合わせた。プライマー拡張材料は、Durascribe(R) T7転写キット（Epicentre; Madison、米国ウィスコンシン州）を使用して転写され、８Ｍ尿素（続編ＮＥ試薬、パートＡおよびパートＢ）で変性ポリアクリルアミドで精製され、American Bioanalytical（Natick、米国マサチューセッツ州）から購入された。 選択中、ライブラリは製造元のプロトコルに従ってSupercript IV逆転写酵素（Invitrogen社; カリフォルニア州カールスバッド）を用いて逆転写され、Clontech社のチタンＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅された。選択中、ライブラリは以下のＰＣＲプロトコル（９５℃で１０秒、６０℃では３０秒、９５℃で６０秒間初期HotStartアクティベーションを実施）を使用して増幅された。その後、Durascribe(R) T7転写キットを使用してＲＮＡライブラリを転写し、ポリアクリルアミドゲル上で精製した （ＰＡＧＥ）。 ４℃で一晩精製後ライブラリ回収のためのゲル溶出バッファーは、０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（いずれもTeknovaから購入）、０．２％ ＳＤＳ（Amrescoから購入）、ｐＨ７．４に調製した。 
【００６７】
ＲＮＡアプタマー選択
ＲＮＡライブラリのスクリーニングは、メルティングオフアプローチを用いた選択の６ラウンドで行われた。 選択の１〜６ラウンドは、安定なＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ヒト胚腎臓−ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）上で実施され、細胞表面上のペプチドネオエピトープ（ＰＮＥ）に対して方向付けされたＧＣＮ４（Ｓ２５Ｒ１４）ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）を発現し、安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で、負の選択ステップに対して抗ＣＤ１９ＣＡＲを包み込む（ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株はアメリカ型細胞コレクションから得られ、ＤＭＥＭ培地（Gibco Invitrogen社）で培養され、１０％ＦＢＳ（Gibco Invitrogen社）と１％ペニシリン／ステプトマイシン（Gibco Invitrogen社）が補充された。すべての選択は、１０％の血清マトリックスを補ったＤＭＥＭ培地で実施され、ＳＥＬＥＸラウンドのそれぞれは以下の手順を含んでいた：ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ上のＲＮＡライブラリの固定化、カウンター選択、標的との培養、標的を認識した配列の逆転写、ＰＣＲ増幅、およびＲＮＡへの転写。 各ラウンドの前に、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズのアリコート（MyOne Streptavidin T1 Dynabeads(TM)、典型的には、バイオチン化材料１ピコモルのバイオチン化材料をダイナビード(TM)２０μｇごとに使用し、必要な逼迫度に応じて量は異なる）は、２００ μＬ ＰＢＳ−Ｔ（最終濃度は ０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０、ｐＨ ７．４ 洗浄バッファーで３回予備洗浄した。さらに、標的細胞および対標的細胞をトリプシン処理で採取し、５，０００ｘ ｇで遠心分離によりペレット化し、ＤＰＢＳバッファーで２回洗浄してから２００μＬのＤＰＢＳバッファー中で懸濁した。１ラウンドあたりの細胞数の概略を表１に示す。ＲＮＡライブラリは、血清を含まないＤＭＥＭ培地（９０℃で１分間変性し、６０℃で５分間、２３℃で５分間アニーリングした）で、プライマーブロッキング配列と捕捉配列の２倍のライブラリモル量で再折り畳された。これは、一定のプライマー領域のアプタマーの二次構造への影響を最小限に抑え、ストレプトアビジン-ビオチン結合相互作用を介して磁気ビーズによってライブラリを捕捉し、外核細胞からアプタマーの末端を保護するために行われた。
【００６８】
再折り畳みとプライマーブロッキングの後、室温で１５分間培養によって磁性ビーズ上にライブラリを捕捉した。 その後、磁気ビーズを溶液から分離し、３７℃で２００μＬの選択バッファーで３回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔおよび非特異的に結合されたライブラリ種を除去した。固定化されたＲＮＡライブラリを備えた磁気ビーズは、３７℃で  １０６個の対セル調製中２００μＬでカウンター選択培養を行い 、その結果、磁気ビーズから非特異的な配列の放出をもたらした。その後、非特異的なライブラリメンバーを廃棄し、磁気ビーズを ２００μＬ の選択バッファーで７ 分間６回洗浄し、１ 時間 (DPBS で 37 ℃ で 7 分、３分間磁気的に分離し、上澄み液を廃棄し、そのプロセスを繰り返す）特定されていないライブラリメンバーは、肯定的な選択ステップの間、応答するために生き残ることができる可能性が減少する。肯定的な選択は、ラウンド１−４の間、３７℃で６０分間、およびラウンド５−６の間３０分間、２００μＬの陽性細胞調製による磁気ビーズＲＮＡライブラリの培養と、並列評価（表１の細胞カウント）から構成されていた。 肯定的な選択が完了すると、標的を認識した配列を含有する上澄み液を磁気ビーズから分離し、回収した。その後、上澄み液は、磁気ビーズが完全に除去されたことを確認するために、第２の磁気分離を受けた。標的となったＨＥＫ２９３Ｔ ＣＡＲ ＰＮＥ細胞を５，０００ｘｇで遠心分離によりペレット化し、２００μＬのＤＰＢＳバッファーで１回洗浄し、弱く会合したアプタマー種を除去した。ライブラリは７０℃での熱変性によって細胞から回収された。すべてのラウンドで回収されたライブラリは、ＭＰＣ試薬（Lucigen Corp、米国ウィスコンシン州ミドルトン）によるタンパク質沈殿、エタノール沈殿、サンプルの濃縮を受け、８Ｍの尿素でＰＡＧＥを１０％変性させることによって精製された。ライブラリは、製造元の指示に従って上付きＩＶ逆転写酵素を用いて逆転写し、チタン(R) Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅し、製造元の指示に従ってデュラスクリブ(R) Ｔ７転写キットを使用して転写した。転写生成物は、８Ｍの尿素で １０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製された。ゲルスライスを切除し、ゲル溶出バッファー中で一晩４℃で溶出し、ＲＮＡライブラリの濃度をナノドロップ−１０００上の２６０ｎｍで吸光度を測定して計算した。ＳＥＬＥＸプロセスの連続ラウンド中、ＲＮＡライブラリの濃度と標的細胞番号は徐々に低下した。 追加の並列評価と「クロスオーバーフィットネステスト」が実施され、選択後の生物情報学分析中に良好なアプタマー候補の同定が容易になった。
【００６９】
【表１】
2021532745.tif 000003
【００７０】
アプタマー候補は、MiniSeq Mid Output（１５０サイクル）システム（Illumina社）を用いた次世代シークエンシングによって選ばれた。 さらなるテストのためにいくつかのアプタマーが選択された。 この目的のために、２‘−デオキシ−２‘−フルオロチミジン修飾ＲＮＡアプタマーをEurogentec-Kaneka（ベルギー、リエージュ）から、標準的な固相リンアミダイト化学によって合成されたＨＰＬＣ−ＲＰ精製された単鎖オリゴとして購入した。 ビオチンは、アプタマー配列とビオチン旗の間に１６個の原子混合極性スペーサーを導入するビオチン−ＴＥＧとして、アプタマーの５‘末端に添加された。 分子量、純度、完全性はＨＰＬＣ−ＭＳ によって検証された。これらのアプタマーの核酸配列を図１３Ａに示す。
【００７１】
［実施例７］ヒト細胞に発現する標的に対する抗ＣＡＲ  ＰＮＥアプタマーの親和性と特異性の決定
細胞に発現したタンパク質を標的とするために、ARAA-00100001、ARAA-05200001、ARAA-0060095、ARAA-01300011、ARAA-01700001アプタマーの親和性および特異性をフローサイトメトリーで評価した。これらの研究は、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＣＡＲ ＣＤ１９（ＣＤ１９抗原に対して方向付けされたＣＡＲに対するレンチウイルスベクトル符号化で形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞株）およびＨＥＫ２９３Ｔ−ＣＡＲ ＰＮＥ（ＰＮＥペプチドに対して方向づけされたＣＡＲをコード化するレンチウイルスベクトルで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞株）細胞に対して、ＤＰＢＳバッファー中のビオチン化アプタマーで培養することによって行われ、ＦＢＳの５％で補充された。
【００７２】
細胞はＤＭＥＭ培地（Gibco Invitrogen社）中で培養され、使用前に１０％のＦＢＳ（Gibco Invitrogen社）および１％ペニシリン／ステプトマイシン（Gibco Invitrogen社）を補足された。実験の前に、細胞（２．５ｘ１０５細胞／ウェル）を９６ウェルプレートで播種し、２５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄み液は廃棄され、ペレット化細胞は３７℃で予熱したＤＰＢＳ−５％ＦＢＳバッファー２００μＬで２回洗浄した。各洗浄ステップの後に、２５００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。アプタマーは８５℃で５分間変性し、直ちに４℃の氷ブロックに５分間静置した。配列は、その後、２つの異なる濃度範囲で希釈し：３０，１００および３００ｎＭ（５アプタマー候補の一次試験）および３０、５０、７５および１００ｎＭ（ARAA-00100001およびARAA-01700001による染色の繰り返し）、続いて１００ｎＭフィコエリスリン標識ストレプトアビジン（StreptaVidin-PE、eBioscience社）を各溶液に添加した。細胞はアプタマー希釈液（１００μＬ／ウェル）で再懸濁し、５％ ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃で３０分間培養した。
【００７３】
対照として、細胞は、追加の試薬なしでＰＮＥペプチド（Alexa Fluor ４８８ラベル、Provepharm社、マルセイユ、フランス）、ストレプトアビジン−ＰＥ（eBioscience社）またはそれぞれのバッファーで培養した。培養後、細胞を２分間２５００ｒｐｍで遠心分離し、結合されていない配列を有する上澄み液を廃棄した。ペレット化細胞をＤＰＢＳ−５％ ＦＢＳバッファ（２００μＬ／ウェル）で洗浄し、２回遠心分離して弱く非特異的に付着した配列をすべて除去した。その後、５％のＣＯ２加湿雰囲気中で 、細胞を１ｍｇ／ｍＬサーモン精子ＤＮＡ溶液（１００μＬ／ウェル）で３７℃で洗浄した。３０分後、サーモン精液を２５００ｒｐｍで２分間遠心分離によって除去し、細胞をＤＰＢＳ−５％のバッファー（２００μＬ／ウェル）でさらに２回洗浄した後、遠心分離を行った。その後、ＤＮＡ配列が結合した細胞を固定し（BD CellFix溶液 #340181）、蛍光陽性細胞をＹＬ−１チャネル上のフローサイトメトリー(attunenXt; Invitrogen, Inc.社) でカウントした。
【００７４】
図１４Ａに、HEK293T、HEK293T-CAR CD19、HEK293T-CAR PNEへの結合研究の結果を示す。アプタマーARA-00100001およびARAA-01700001では、ＣＡＲ ＰＮＥ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への用量依存的結合が、試験された最高濃度で信号の飽和に達することなく観察された。信号の強度はＰＮＥペプチド対照よりも強かった。両方のアプタマーのＣＡＲ ＰＮＥ陰性細胞への残留結合が５０ｎＭを超える濃度で観察された。ARAA-05200001、ARAA-0060095、ARAA-01300011は、これらの３つのアプタマーがＣＡＲ ＰＮＥに特異的ではなかったことを示す、３つのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株間の分染を示さなかった。アプタマーARA-00100001とARAA-01700001との結合研究をより広い濃度で繰り返し、一次実験の結果を確認した（図１４Ｂおよび１４Ｃ参照）。
【００７５】
別の実験では、同じアプタマーのＣＡＲ ＰＮＥを発現するヒトＰＢＭＣへの結合について研究した。ＰＢＭＣは、実施例５で既に説明されているように献血者から単離され、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco Invitrogen社）で培養され、３７℃、５％ ＣＯ２で１０％ ＦＢＳ（Gibco Invitrogen社）と １％ ペニシリン／ステプトマイシン（Gibco Invitrogen社）とで補充した。ＰＮＥペプチドに対して方向づけされたＣＡＲのためのレンチウイルスベクトル符号化による２時間の形質導入の後、細胞は上記の方法に従って結合研究を行う前に、さらに７２時間培養中に保持された。図１６に示すように、３００ｎＭを超える濃度で停滞期に到達した両方のアプタマーで、用量依存性の信号を測定した。信号の強度はＰＮＥペプチド対照よりも強かった。
【００７６】
両方の実験は、ＰＮＥペプチドを認識するＣＡＲに対して選択されたARAA-00100001とARAA-01700001アプタマーは、この特定のキメラ抗原受容体を発現するように設計されたヒト細胞上で発現されたそれらの標的を特異的に認識することができることを示している。
【００７７】
［実施例８］ＣＡＲ−ＰＮＥに特異的なアプタマーの血清安定性
抗ＣＡＲ  ＰＮＥ  ＲＮＡアプタマーの安定性（ARAA-00100001およびARAA-01700001）は、５％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＤＰＢＳバッファー、１０％ＦＢＳまたは純粋なＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で研究された。アプタマーは８５℃で５分間変性した後、氷ブロック上で直ちに４℃まで５分間で冷却した。その後、５％のＦＢＳを補充したＤＰＢＳバッファ−、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地、または純粋なＦＢＳ血清中の２μＭの最終濃度まで配列を希釈した。試料は３７℃で１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、または２４時間で培養した。対照サンプルは、３７℃で培養することなく新たに調製されたアプタマーを含んでいた。それぞれの緩衝液中のアプタマーの半減期は、変性電気泳動法を用いてアガロースゲル上での移動によって以下のように決定された：異なる培養時間のアプタマーサンプルをホルムアミド含有負荷バッファー（熱科学、ThermoScientific, Waltham,MA、米国）と８５℃で５分間変性した後、ＲＮＡ染色マーカーとしてSYBRsafe （Invitrogen）を含有する新しく調製した３％アガロースゲルに、各サンプルの １５μＬ を配置した。アガロースゲル上のＲＮＡアプタマーの移行は、２０分の間に１００Ｖを印加することにより、１ＸＴＢＥバッファー（Invitrogen社）で行われた。ゲルをバイオ・ラッド画像化システムを用いて可視化し、その結果を図１５に示す。ＲＮＡ信号の強度が４時間後に減少し始めたため、両方のアプタマーは、培養の異なる条件下で少なくとも２時間安定であった。
【００７８】
［実施例９］ＰＳＭＡおよびＣＡＲ−ＰＮＥに特有の二重特異性アプタマーの調製
ARAA-00100001 と ARAA-01700001アプタマーはベースクリック（Neuried、 ドイツ）から、ＨＰＬＣ−ＲＰで精製した標準的な固相リンアミダイト化学を介して合成された２’Ｆ ＲＮＡオリゴとして購入された。
Ａ１０ ２’Ｆ−ＲＮＡアプタマーは、その後のトリアゾール・ヌクレオチド間二量化のために、その３‘末端でアジド基によって修飾された。ビオチンは、アプタマー配列とビオチン旗の間に１６原子混合極性スペーサーを導入するビオチン−ＴＥＧとして、Ａ１０アプタマーの５‘−末端に添加された。ARAA-00100001 と ARAA-01700001 は、その後のトリアゾール・ヌクレオチド間二量化のために、アルキン基によって５’−末端で修飾した。分子量、純度、完全性はＨＰＬＣ−ＭＳ によって検証された。
実施例１で説明した手順は、二重特異性抗-ＰＳＭＡ Ａ１０および抗-ＣＡＲ  ＰＮＥアプタマーを調製するために使用された。クリック反応の結果を図８Ａに示す。
【００７９】
［実施例１０］細胞に発現する標的に対する抗ＰＳＭＡ×抗ＣＡＲ  ＰＮＥ二重特異性アプタマーの親和性および特異性の決定
細胞に発現するタンパク質を標的にする抗ＰＳＭＡ×抗ＣＡＲ  ＰＮＥアプタマーの親和性と特異性は、フローサイトメトリーによって評価された。これらの研究は、実施例３に記載されているように、５％ ＦＢＳ含有ＤＰＢＳバッファーのＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ（ヒト前立腺癌−ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４０）およびＰＳＭＡ陰性ＰＣ−３（ヒト前立腺癌−ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）に対して実施された。アプタマーは単一の濃度範囲内で試験された：３０、１００および３００ ｎＭ。
ＰＳＭＡ陽性細胞への結合研究の結果を図１０Ａに示す。Ａ１０単量体アプタマーとともに、A10 x ARAA-00100001、A10 x ARAA-01700001の２個のＲＮＡ／ＲＮＡアプタマーを分析した。比較のために、試験された試薬のＰＳＭＡ陰性のＰＣ−３細胞への結合も測定した。
【００８０】
Ａ１０では、試験された最高濃度で信号の飽和に達することなく、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣａＰ細胞への用量依存的結合が観察された。信号の強度は、抗体対照と同じくらい強かった。Ａ１０モノマーのＰＣ−３細胞への残留結合は、試験された最高濃度でのみ観察された。二重特異性ＰＳＭＡ ｘ ＣＡＲ ＰＮＥアプタマーはいずれもＡ１０モノマーと同様の結合特性を示したが、ＰＳＭＡ陰性細胞への残留結合が減少したため、標的陽性細胞に対する特異性が改善された。試験された濃度ごとに、二重特異性アプタマーの信号強度はＡ１０モノマーで測定されたものよりも優れており、ヘテロ二量体化により親和性が改善されたことを示唆している。
実施例９と１０の結果は、異なる標的に対して選択されたアプタマーのヘテロ二量化が、別々に評価されたときに、各部分の結合特性に著しい影響を与えないことを示唆している。
【００８１】
［実施例１１］ＣＡＲ−ＰＮＥおよびＰＳＭＡに特異的な二重特異性アプタマーの生物活性
細胞毒性アッセイは、非刺激末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して行われる。新しく調製されたＰＢＭＣは、健康的なドナー（フランスの血液施設、ローンズ-アルペス部門）から得られたバフィーコートから単離される。血液をＤＰＢＳで希釈した後、ＰＢＭＣをＦＩＣＯＬＬ密度勾配（FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.077  ＧＥヘルスケア社）上で分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco Invitrogen社）で再懸濁し、５ｘ１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度を得る 。これらのＰＢＭＣは、ＣＡＲ−ＰＮＥ受容体を発現するレンチウイルスベクトルで形質導入される。これらのＰＢＭＣ−ＣＡＲ−ＰＮＥは効果細胞として使用される。
【００８２】
ＬＮＣａＰ標的細胞は、細胞培養培地中の３７℃で３０分間、２μＭカルセインＡＭ（Trevigen Inc社, Gaithersburg, MD, 米国）で標識化される。カルセインＡＭフルオロクロームは、生きたＬＮＣａＰ細胞内に閉じ込められ、リディレクトされた溶解時にのみ放出される色素である。細胞培養培地で２回洗浄した後、ＲＰＭＩ−１６４０培地で５ｘ１０５個の細胞／ｍｌの細胞密度を調整し、アッセイ反応ごとに１００μｌの５０，０００セルのアリクォートを使用する。３７℃／５％ＣＯ２での標準反応は４時間持続し、５ｘ１０４個の細胞のカルセインＡＭ標識化標的細胞、５ｘ１０５個のＰＢＭＣＳ−ＣＡＲ−ＰＮＥ（Ｅ／Ｔ比１：１０）、２０μｌの二重特異性アプタマー溶液を総体積２００μｌで１μＭで使用する。細胞毒性反応の後、培養培地中に放出された色素を蛍光リーダー（VarioSkan Lux, ThermoFisher, マサチューセッツ州ウォルサム、米国）で定量し、細胞毒性化合物が存在しない対照反応と蛍光信号が完全に溶解した細胞（アプタマーは、Chemometec, Allerod, デンマークから購入したＡ１００試薬に置き換えられた）について決定された反応からの蛍光信号と比較される。これらの測定値に基づいて、特定の細胞毒性は、式：［蛍光（サンプル）−蛍光（対照）］／［蛍光（全溶解）−蛍光（対照）］ｘ１００に従って、計算される。
【００８３】
１０：１の単一のＥ：Ｔ比を有するアプタマー１００ｎＭの存在下で４時間の培養後に得られた細胞毒性アッセイの結果が決定される。特異的な細胞毒性は、ＲＮＡ／ＲＮＡアプタマーＡ１０ｘＰＮＥで測定され、３０％を超えるＬＮＣａＰ細胞の殺傷を誘発する。ＰＮＥ結合部分を欠く対照単量体Ａ１０は、細胞毒性を誘発しない。
この結果から、設計されたアプタマースイッチは、エフェクターＴリンパ球を標的細胞に誘発し、細胞溶解機械をリダイレクトし、特定の細胞集団を排除できることを示すことができる。
【００８４】
［実施例１２］抗ＣＤ３ｘ抗ＰＳＭＡアプタマーを用いた前臨床モデルにおけるがんの処置
マウスにおける単量体アプタマーと比較して、異なる多量性アプタマー構造物のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性および毒性を評価する。ＰＳＭＡ陽性腫瘍を有する成体マウスは、ＣＤ３およびＰＳＭＡに特異的に結合するアプタマーを投与され、異なるマウス群においては、アプタマーは単量体型または多量体型のいずれかである。有効性は、腫瘍の大きさ、腫瘍の増殖およびその速度、ならびに処置群と対照群における生存率を測定することによって評価される。毒性は、処置群と対照群における副作用の発生率によって評価される。
【００８５】
［実施例１３］ＣＡＲ−Ｔアプタマースイッチを用いた前臨床モデルにおけるがんの処置
マウスにおける単量体アプタマーと比較して、スイッチアプタマー構造物のｉｎ  ｖｉｖｏの有効性および毒性を評価する。多量体アプタマーは、ＣＡＲ  Ｔ細胞ベースの治療薬の活性をオンにするスイッチとして調製されている。腫瘍を有する成体マウスは、最初にＣＡＲ  ＰＮＥで形質導入されたＴ細胞を注射され、そしてＰＳＭＡ、またはＨＥＲ２、またはＣＤ１９、またはＣＤ２０またはＣＤ２２腫瘍関連標的と融合した抗ＣＡＲ  ＰＮＥアプタマーから作製された多量体アプタマーを注入される。有効性は、腫瘍の大きさ、腫瘍の増殖およびその速度、ならびに処置群と対照群における生存率を測定することによって評価される。毒性は、処置群と対照群における副作用の発生率によって評価される。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「から本質的になる」は、請求項の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない物質またはステップの包含を許容する。本明細書では、用語「含む（comprising）」の記述は、特に組成物の構成成分の説明、または装置の構成要素の説明において、「から本質的になる（consisting essentially of）」または「からなる（consisting of）」と置き換えることができる。
本技術を特定の好ましい実施態様と共に説明したが、当業者であれば、前述の明細書を読んだ後に、本明細書に記載の組成物および方法に対して、さまざまな変更、同等物との置換およびその他の改変を行うことができる。
【００８７】
参考文献
Dassie JP, et al.,「最適化されたアプタマー−ｓｉＲＮＡキメラの全身投与は、ＰＳＭＡ発現腫瘍の退縮を促進する」Nat. Biotechnol 27, 839 (2009).
Di Stasi A, et al., 「養子細胞療法のための安全スイッチとしての誘導アポトーシス」N Engl J Med 365, 1673 (2011).
McNamara JO, et al.,「アプタマーｓｉＲＮＡキメラによるｓｉＲＮＡの細胞型特異的な輸送」Nat. Biotechnol 24, 1005 (2006).
Rodgers DT, et al.,「Ｂ細胞悪性腫瘍に対するＣＡ−Ｔ細胞のスイッチを介した活性化および再標的化」PNAS 113, E459 (2016).
Straathof KC, et al.,「Ｔ細胞治療のための誘導性カスパーゼ９安全スイッチ」Blood 105,4247 (2005).
Tamada K, et al., 「タグ抗体を用いた様々ながんタイプへの遺伝子改変Ｔ細胞リダイレクト」
Clin Cancer Res 18, 6436 (2012).Urbanska K, et al., 「新規のＴ細胞抗原受容体の使用による、がんの養子免疫療法の普遍的戦略」
Cancer Res 72,1844 (2012a).Urbanska K, et al.,「抗原標的化のための新規ユニバーサル免疫受容体の開発：無限の彼方へ」OncoImmunology 1, 777 (2012b).
Wu CY, et al., 「低分子ゲートキメラ受容体を介した治療用Ｔ細胞の遠隔制御」 Science 350, aab4077 (2015).
【図１】
2021532745.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2021532745.tif 000018
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月31日(2021.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
［実施例６］アンチＣＡＲ  ＰＮＥアパタマー
ライブラリとプライマー
初期のＲＮＡライブラリテンプレートとプライマーは、ＩＤＴ（Coralville、米国アイオワ州）によって一本鎖ＤＮＡ：
：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-(N20)-TTTCTGCAGCGATTCTTGTTT-(N10)-GGAGAATGAGGAACCCAGTGCAG-3’(鋳型、配列番号１４)、5’-TAATACGACTCACTATAGGGCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA
T-3’（順方向プライマー；配列番号１５）、
5’-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3’ （逆方向プライマー；配列番号１６）として合成された。２次構造に対するプライマーの影響を最小限にするために、５‘および３‘不変のプライマー領域を補完する２つの短い「ブロッキング」シーケンス（ＩＤＴから購入）を合成した。5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGG-3’ （順方向ブロッキング配列；配列番号１７）、5’-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3’（逆方向ブロッキング配列；配列番号１８）。 ライブラリの不変中心領域を補完する追加のビオチン化の「キャプチャ」配列もＩＤＴによって合成された：5’−ビオチン−GTC-PEG-6 スペーサー−CAAGAATCGCTGCAG-3’（配列番号１９)。すべての材料は２５０ｎｍｏｌスケールで注文され、脱塩精製を受けた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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