(57)【要約】  約５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１であって、０．０２未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比を有するホスホリパーゼＡ１は、脂質含有食品マトリックスにおける使用方法、ホスホリパーゼを用いて且つ開示されるホスホリパーゼＡ１を用いる焼成改良剤も含む生地を焼成及び製造する方法と併せて提示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１を含む単離ポリペプチドであって、前記ホスホリパーゼＡ１は、０．０２未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比及び／又は０．１２未満のＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比を有する、単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
前記ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６又は８９／１１である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００９未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００８未満である、請求項４に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００７未満である、請求項５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００６未満である、請求項６に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００５未満である、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００４未満である、請求項８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００３未満である、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００２未満である、請求項１０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満である、請求項１１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１３】
前記ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である、請求項１２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６又は８９／１１である、請求項１２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１５】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１６】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項１５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１７】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項１５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項１５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２０】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項１９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項１５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２２】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項２１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２３】
生地を製造する方法であって、小麦粉、食塩、水、砂糖、脂肪、レシチン、油、乳化剤及び酵母からなる群から選択される生地成分を、請求項１〜２２、７５〜９２又は９５〜１０１のいずれか一項に記載のホスホリパーゼＡ１を含む単離ポリペプチドと混合するステップを含む方法。
【請求項２４】
請求項１〜２２、７５〜９２又は９５〜１０１のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む生地。
【請求項２５】
改善された生地伸展性及び／又は安定性を有する、請求項２４に記載の生地。
【請求項２６】
生地及び／又はそれから製造される焼成製品を改善するために有用な少なくとも１種の追加の酵素をさらに含む、請求項２４に記載の生地。
【請求項２７】
前記追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、前記ホスホリパーゼＡ１と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される、請求項２６に記載の生地。
【請求項２８】
前記アミラーゼは、エキソアミラーゼである、請求項２７に記載の生地。
【請求項２９】
前記エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである、請求項２８に記載の生地。
【請求項３０】
前記エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである、請求項２８に記載の生地。
【請求項３１】
前記非マルトース生成アミラーゼは、主に４〜８つのＤ−グルコピラノシル単位を含む１つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する、請求項３０に記載の生地。
【請求項３２】
前記追加の酵素は、ホスホリパーゼである、請求項２７に記載の生地。
【請求項３３】
前記ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する、請求項３２に記載の生地。
【請求項３４】
前記ホスホリパーゼは、配列番号１７及び／又は配列番号１８を含む、請求項３３に記載の生地。
【請求項３５】
請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の生地を焼成するステップを含む、焼成製品を調製する方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法によって得ることができる焼成製品。
【請求項３７】
改善されたクラム孔径、気泡の改善された均質性、クラストとクラムとが分離していないこと、増加した体積、増加したクラストのカリっとした食感及び改善されたオーブンスプリングからなる群から選択される少なくとも１つの改善された特性を有する、請求項３６に記載の焼成製品。
【請求項３８】
前記改善された特性は、クラストのカリっとした食感である、請求項３７に記載の焼成製品。
【請求項３９】
小麦粉と、請求項１〜２２、７５〜９２又は９５〜１０１のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドとを含む焼成用プレミックス。
【請求項４０】
生地及び／又はそれから製造される焼成製品を改善するために有用な少なくとも１種の追加の酵素をさらに含む、請求項３９に記載のプレミックス。
【請求項４１】
前記追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、前記ホスホリパーゼＡ１と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される、請求項４０に記載のプレミックス。
【請求項４２】
前記アミラーゼは、エキソアミラーゼである、請求項４１に記載のプレミックス。
【請求項４３】
前記エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである、請求項４２に記載のプレミックス。
【請求項４４】
前記エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである、請求項４２に記載のプレミックス。
【請求項４５】
前記非マルトース生成アミラーゼは、主に４〜８つのＤ−グルコピラノシル単位を含む１つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する、請求項４４に記載のプレミックス。
【請求項４６】
前記追加の酵素は、ホスホリパーゼである、請求項４１に記載のプレミックス。
【請求項４７】
前記ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する、請求項４６に記載のプレミックス。
【請求項４８】
前記ホスホリパーゼは、配列番号１７及び／又は配列番号１８を含む、請求項４７に記載のプレミックス。
【請求項４９】
請求項１〜２２、７５〜９２又は９５〜１０１のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む顆粒又は凝集粉を含有する焼成改良剤。
【請求項５０】
生地及び／又はそれから製造される焼成製品を改善するために有用な少なくとも１種の追加の酵素をさらに含む、請求項４９に記載の焼成改良剤。
【請求項５１】
前記追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、前記ホスホリパーゼＡ１と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される、請求項５０に記載の焼成改良剤。
【請求項５２】
前記アミラーゼは、エキソアミラーゼである、請求項５１に記載の焼成改良剤。
【請求項５３】
前記エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである、請求項５２に記載の焼成改良剤。
【請求項５４】
前記エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである、請求項５２に記載の焼成改良剤。
【請求項５５】
前記非マルトース生成アミラーゼは、主に４〜８つのＤ−グルコピラノシル単位を含む１つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する、請求項５４に記載の焼成改良剤。
【請求項５６】
前記追加の酵素は、ホスホリパーゼである、請求項５１に記載の焼成改良剤。
【請求項５７】
前記ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する、請求項５６に記載の焼成改良剤。
【請求項５８】
前記ホスホリパーゼは、配列番号１７及び／又は配列番号１８を含む、請求項５７に記載の焼成改良剤。
【請求項５９】
生地及び／又はそれから製造される焼成製品を改善するために有用な少なくとも１種の追加の酵素を添加するステップをさらに含む、請求項２３に記載の生地を製造する方法。
【請求項６０】
前記追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、前記ホスホリパーゼＡ１と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記アミラーゼは、エキソアミラーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記非マルトース生成アミラーゼは、主に４〜８つのＤ−グルコピラノシル単位を含む１つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記追加の酵素は、ホスホリパーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ホスホリパーゼは、配列番号１７及び／又は配列番号１８を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項１〜２２、７５〜９２又は９５〜１０１のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む酵素による乳化剤の処理を含む、リン脂質乳化剤の修飾の方法。
【請求項６９】
リン脂質は、レシチン又はリゾ−レシチンである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
脂質含有食品マトリックス中においてリゾリン脂質を生成する方法であって、前記脂質含有食品マトリックスに、請求項１〜２２、７５〜９２又は９５〜１０１のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを添加するステップを含む方法。
【請求項７１】
前記脂質含有食品マトリックスは、卵及び卵含有食品、焼き菓子製品の生地、加工肉、牛乳を主成分とする製品及び植物油からなる群から選択される、請求項７０に記載の脂質含有食品マトリックス中においてリゾリン脂質を生成する方法。
【請求項７２】
請求項１〜２２、７５〜９２又は９５〜１０１のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項７３】
請求項７２に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項７４】
請求項７３に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７５】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１９未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７６】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１８未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７７】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１７未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７８】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１６未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７９】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１５未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８０】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１４未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８１】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１３未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８２】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１２未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８３】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１１未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８４】
前記リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８５】
前記ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１１未満である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８６】
前記ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１０未満である、請求項８５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８７】
前記ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．０９未満である、請求項８６に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８８】
前記ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．０８未満、好ましは０．０７未満である、請求項８７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８９】
前記ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．０６未満である、請求項８８に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９０】
前記ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．０５未満である、請求項８９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９１】
前記ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．０４未満である、請求項９０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９２】
前記ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．０３未満である、請求項９１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９３】
乳化剤を添加するステップをさらに含む、請求項２３に記載の生地を製造する方法。
【請求項９４】
前記乳化剤は、ｉ）レシチン若しくはリゾ−レシチンなどのリン脂質乳化剤；又はｉｉ）ＤＡＴＥＭ、モノグリセリド若しくはジグリセリドなどの非リン脂質乳化剤からなる群から選択される、請求項９３に記載の生地を製造する方法。
【請求項９５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むホスホリパーゼＡ１酵素を含む単離ポリペプチド。
【請求項９６】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項９５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９７】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項９５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９８】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項９７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９９】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項９５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１００】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項９９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０１】
前記ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項９５に記載の単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホリパーゼ及び食品製造におけるそれらの使用に関する。本発明は、ホスホリパーゼを用いて生地及び焼成製品を製造する方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
生地におけるリパーゼの使用は、よく知られている。例えば、欧州特許第０５８５９８８号明細書では、生地にリパーゼを添加すると、それから焼成されたパンに抗老化効果がもたらされたことが証明されている。国際公開第９４／０４０３５号パンフレットは、リパーゼを生地に添加することによって柔らかさの改善を達成できることを教示している。また、外性リパーゼがパン体積を改変し得ることも証明されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ホスホリパーゼをはじめとするリパーゼは、生地及び焼成製品の調製におけるそのプラスの特性について記載されているが、従来技術のリパーゼは、概して多くの活性を有し、それらがリパーゼの潜在的に有益な効果を低減又は排除することから、従来技術のリパーゼの性能には多くの欠点がある。従って、今日、一部の食品用途、特に焼成において、より高度の特異性を有する改善されたリパーゼが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一態様によれば、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１を含む単離ポリペプチドであって、前記ホスホリパーゼＡ１は、０．０２未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比及び／又は０．１２未満のＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比を有する、単離ポリペプチドが提供される。任意選択で、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である。任意選択で、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、６５〜８５／２０〜３０又は７５〜９５／５〜１５である。任意選択で、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６又は８９／１１である。
【０００５】
任意選択で、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満である。任意選択で、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、６５〜８５／１５〜３５である。任意選択で、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である。任意選択で、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６である。任意選択で、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１２未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、７５〜９５／５〜１５である。任意選択で、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１２未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約８９／１１である。
【０００６】
任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０００７】
任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０００８】
任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０００９】
任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【００１０】
本発明の別の態様では、生地を製造する方法が提供され、この方法は、小麦粉、食塩、水、砂糖、脂肪、レシチン、油、乳化剤及び酵母からなる群から選択される生地成分を、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１を含む単離ポリペプチドと混合するステップを含み、ここで、前記ホスホリパーゼＡ１は、０．０２未満、好ましくは０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比及び／又は０．１２未満のＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比を有する。任意選択で、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、６５〜８５／１５〜３５又は７５〜９５／５〜２５である。任意選択で、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である。任意選択で、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６又は８９／１１である。任意選択で、乳化剤は、ｉ）レシチン若しくはリゾ−レシチンなどのリン脂質乳化剤；又はｉｉ）ＤＡＴＥＭ、モノグリセリド若しくはジグリセリドなどの非リン脂質乳化剤からなる群から選択される。
【００１１】
任意選択で、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満である。任意選択で、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、７０〜８０／２０〜３０である。任意選択で、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である。任意選択で、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６である。任意選択で、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１２未満であり、且つｎ１／ｓｎ２特異度比は、８５〜９５／５〜１５である。任意選択で、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１２未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約８９／１１である。
【００１２】
本発明の別の態様では、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素を含む生地が提供され、ここで、ホスホリパーゼＡ１は、０．０２未満、好ましくは０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比及び／又は０．１２未満のＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比を有する。任意選択で、生地は、例えば、本発明のホスホリパーゼＡ１酵素を含まない生地と比較して改善された伸展性及び／又は安定性を有する。別の態様では、本明細書に記載の酵素を含む生地が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様では、焼成製品を調製する方法であって、前述した生地を焼成する方法が提供される。本発明の別の態様では、焼成製品が提供される。任意選択で、焼成製品は、改善されたクラム孔径、気泡の改善された均質性、クラストとクラムとが分離していないこと、増加した体積、増加したクラストのカリっとした食感及び改善されたオーブンスプリングからなる群から選択される、少なくとも１つの改善された特性を有する。任意選択で、改善された特性は、増加したクラストのカリっとした食感である。任意選択で、前記特性は、本発明のホスホリパーゼＡ１酵素を含まない生地から調製した焼成製品と比較して改善される。別の態様では、本明細書に記載の酵素を含むか又は本明細書に記載の酵素を含む生地から調製される焼成製品が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様では、小麦粉と、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素とを含む焼成用プレミックスが提供され、ここで、ホスホリパーゼＡ１は、０．０２未満、好ましくは０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比及び／又は０．１２未満のＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比を有する。別の態様では、本明細書に記載の酵素を含む焼成用プレミックスが提供される。本発明の別の態様では、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素を含む顆粒又は凝集粉を含む焼成改良剤が提供され、ここで、ホスホリパーゼＡ１は、０．０２未満、好ましくは０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比及び／又は０．１２未満のＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比を有する。別の態様では、本明細書に記載の酵素を含む顆粒又は凝集粉を含む焼成改良剤が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様では、前述した通り、生地及び／又はそれから製造される焼成製品を改善するのに有用な少なくとも１種の追加の酵素が含まれる生地を製造する方法が提供される。任意選択で、追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、前記ホスホリパーゼＡ１と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される。任意選択で、アミラーゼは、エキソアミラーゼである。任意選択で、エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである。任意選択で、エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである。任意選択で、非マルトース生成アミラーゼは、主に４〜８つのＤ−グルコピラノシル単位を含む１つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する。任意選択で、追加の酵素は、ホスホリパーゼである。任意選択で、追加の酵素は、ガラクトリパーゼ活性を有する。任意選択で、追加の酵素は、配列番号１７及び／又は配列番号１８を含むホスホリパーゼである。
【００１６】
本発明の別の態様では、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素による乳化剤の処理を含む、リン脂質乳化剤の修飾の方法であり、ホスホリパーゼＡ１は、０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比を有する。任意選択で、リン脂質乳化剤は、レシチン又はリゾレシチンである。
【００１７】
本発明の別の態様では、脂質含有食品マトリックス中においてリゾリン脂質を生成する方法であって、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素を脂質含有食品マトリックスに添加するステップを含む方法が提供され、ここで、ホスホリパーゼＡ１は、０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比を有する。任意選択で、脂質含有食品マトリックスは、卵及び卵含有食品、焼き菓子製品の生地、加工肉、牛乳を主成分とする製品、植物油並びにケーキ及びクッキーなどの焼き菓子製品からなる群から選択される。
【００１８】
任意選択で、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１９、０．０１８、０．０１７、０．０１６、０．０１５、０．０１４、０．０１３、０．０１２、０．０１１又は０．０１０未満である。
【００１９】
任意選択で、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満である。
【００２０】
本発明の別の態様では、前述した通り、乳化剤を添加するステップをさらに含む、生地を製造する方法が提供される。任意選択で、乳化剤は、ｉ）レシチン若しくはリゾ−レシチンなどのリン脂質乳化剤；又はｉｉ）ＤＡＴＥＭ、モノグリセリド若しくはジグリセリドなどの非リン脂質乳化剤からなる群から選択される。ＤＡＴＥＭは、例えば、Ｐａｎｏｄａｎ（登録商標）の商品名で入手可能である。
【００２１】
本発明の別の態様では、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むホスホリパーゼＡ１酵素を含む単離ポリペプチドが提供される。任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【００２２】
任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【００２３】
任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【００２４】
任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。任意選択で、ホスホリパーゼＡ１酵素は、配列番号６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。任意選択で、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６から構成されるか又は実質的に構成され得る。
【００２５】
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来のホスホリパーゼ変異体の完全長アミノ酸配列（完全長ＣＲＣ０８３１０）を示す。
【００２６】
配列番号２は、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）由来のホスホリパーゼ変異体の予測される成熟型アミノ酸配列（予測成熟型ＣＲＣ０８３１０）を示す。
【００２７】
配列番号３は、ペスタロチオプシス・フィシ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｆｉｃｉ）由来のホスホリパーゼ変異体の完全長アミノ酸配列（完全長ＣＲＣ０８３１６）を示す。
【００２８】
配列番号４は、ペスタロチオプシス・フィシ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｆｉｃｉ）由来のホスホリパーゼ変異体の予測される成熟型アミノ酸配列（予測成熟型ＣＲＣ０８３１６）を示す。
【００２９】
配列番号５は、メタリジウム・グイズホウエンス（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｇｕｉｚｈｏｕｅｎｓｅ）（メタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）としても知られる）由来のホスホリパーゼ変異体の完全長アミノ酸配列（完全長ＣＲＣ０８３１９）を示す。
【００３０】
配列番号６は、メタリジウム・グイズホウエンス（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｇｕｉｚｈｏｕｅｎｓｅ）（メタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）としても知られる）由来のホスホリパーゼ変異体の予測される成熟型アミノ酸配列（予測成熟型ＣＲＣ０８３１９）を示す。
【００３１】
配列番号７は、ディアポルテ・アンペリナ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ａｍｐｅｌｉｎａ）由来のホスホリパーゼ変異体の完全長アミノ酸配列（完全長ＣＲＣ０８４０５）を示す。
【００３２】
配列番号８は、ディアポルテ・アンペリナ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ａｍｐｅｌｉｎａ）由来のホスホリパーゼ変異体の予測される成熟型アミノ酸配列（予測成熟型ＣＲＣ０８４０５）を示す。
【００３３】
配列番号９は、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）由来のホスホリパーゼ変異体の完全長アミノ酸配列（完全長ＣＲＣ０８４１８）を示す。
【００３４】
配列番号１０は、イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）由来のホスホリパーゼ変異体の予測される成熟型アミノ酸配列（予測成熟型ＣＲＣ０８４１８）を示す。
【００３５】
配列番号１１は、ネオネクトリア・ジチシマ（Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ  ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）由来のホスホリパーゼ変異体の完全長アミノ酸配列（完全長ＣＲＣ０８８２６）を示す。
【００３６】
配列番号１２は、ネオネクトリア・ジチシマ（Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ  ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）由来のホスホリパーゼ変異体の予測される成熟型アミノ酸配列（予測成熟型ＣＲＣ０８８２６）を示す。
【００３７】
配列番号１３は、トリコデルマ・ガムシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇａｍｓｉｉ）由来のホスホリパーゼ変異体の完全長アミノ酸配列（完全長ＣＲＣ０８８３３）を示す。
【００３８】
配列番号１４は、トリコデルマ・ガムシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇａｍｓｉｉ）由来のホスホリパーゼ変異体の予測される成熟型アミノ酸配列（予測成熟型ＣＲＣ０８８３３）を示す。
【００３９】
配列番号１５は、メタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）由来のホスホリパーゼ変異体の完全長アミノ酸配列（完全長ＣＲＣ０８８４５）を示す。
【００４０】
配列番号１６は、メタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）由来のホスホリパーゼ変異体の予測される成熟型アミノ酸配列（予測成熟型ＣＲＣ０８８４５）を示す。
【００４１】
配列番号１７は、商品Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０に使用されるホスホリパーゼＡ１の成熟型アミノ酸配列を示す。
【００４２】
配列番号１８は、商品Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆに使用されるホスホリパーゼＡ１の完全長アミノ酸配列を示す。
【００４３】
配列番号１９は、完全長ＣＲＣ０８３１０のコドン最適化合成核酸配列を示す。
【００４４】
配列番号２０は、完全長ＣＲＣ０８３１６のコドン最適化合成核酸配列を示す。
【００４５】
配列番号２１は、完全長ＣＲＣ０８３１９のコドン最適化合成核酸配列を示す。
【００４６】
配列番号２２は、完全長ＣＲＣ０８４０５のコドン最適化合成核酸配列を示す。
【００４７】
配列番号２３は、完全長ＣＲＣ０８４１８のコドン最適化合成核酸配列を示す。
【００４８】
配列番号２４は、完全長ＣＲＣ０８８２６のコドン最適化合成核酸配列を示す。
【００４９】
配列番号２５は、完全長ＣＲＣ０８８３３のコドン最適化合成核酸配列を示す。
【００５０】
配列番号２６は、完全長ＣＲＣ０８８４５のコドン最適化合成核酸配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量（タンパク質ｍｇ／小麦粉ｋｇに基づく相対用量）の関数として表されるクラスティロール比体積（ｃｃｍ／ｇ）を描く。
【図１Ｂ】ＣＲＣ０８３１９の用量の関数として表されるクラスティロール比体積（ｃｃｍ／ｇ）を描く。
【図２Ａ】Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆを用いた生地脂質プロファイリングを描く。
【図２Ｂ】ＣＲＣ０８３１９を用いた生地脂質プロファイリングを描く。
【図３】ＳＯＬＥＣ  Ｆの存在あり及びなしでの「ＣＲＣ０８３１９＋Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０」の効果としてのスポンジ及び生地比体積を描く。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本教示の実施では、別に記載のない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学及び生化学の従来の技術を使用し、それらは、当業者の技術の範囲内である。こうした技術は、文献において十分に説明されており、例えば以下のものがある：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０）及びＴｈｅ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ（Ｉｎｇｌｅｄｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９）並びにＥｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｌｉｎｄｈｏｒｓｔｅ，２００７）。
【００５３】
本明細書に別に定義されない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は、全て本教示が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明で使用される多くの用語の一般的辞書を当業者に提供する。本明細書に記載されるものと類似の又は均等な任意の方法及び技術を本教示の実施又は試験に使用することができる。
【００５４】
本明細書に記載される数値の範囲は、その範囲を画定する数値を包含する。
【００５５】
略語
ＮＡＰＥ  −  Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン
ＮＡＬＰＥ  −  Ｎ−アシルリゾホスファチジルエタノールアミン
ＮＡＧＰＥ  −  Ｎ−アシルグリセロホスホエタノールアミン
ＤＧＤＧ  −  ジガラクトシルジグリセリド
ＤＧＭＧ  −  ジガラクトシルモノグリセリド
ＭＧＤＧ  −  モノガラクトシルジグリセリド
ＭＧＭＧ  −  モノガラクトシルモノグリセリド
ＰＣ  −  ホスファチジルコリン
ＬＰＣ  −  リゾホスファチジルコリン
ＰＬＡ  −  ホスホリパーゼＡ１
ＤＡＴＥＭ  −  モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル
【００５６】
定義
ポリペプチドに関して、「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、１つ又は複数のアミノ酸位置に人為的な置換、挿入又は欠失を含まない天然に存在するポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関して、「野生型」、「親」又は「参照」といった用語は、人為的なヌクレオシド変化を含まない天然に存在するポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドを包含する。
【００５７】
野生型ポリペプチドと言うとき、ポリペプチドの成熟形態を含むと理解される。「成熟型」ポリペプチド又はその変異体は、シグナル配列が例えばポリペプチドの発現中又は発現後にポリペプチドの未成熟型から切断されて存在しないものである。
【００５８】
ポリペプチドに関して、「変異体」という用語は、それがアミノ酸の１つ又は複数の天然又は人為的な置換、挿入又は欠失を含むという点で指定の野生型、親又は参照ポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関して、「変異体」という用語は、指定の野生型、親又は参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親又は参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかであろう。
【００５９】
対象細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用される場合、「組換え」という用語は、対象がそのネイティブ状態から修飾されていることを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態で存在しない遺伝子を発現するか、又は天然に存在するものと異なるレベル若しくは異なる条件下でネイティブ遺伝子を発現する。組換え核酸は、１つ若しくは複数のヌクレオチドだけネイティブ配列と異なり、且つ／又は異種配列、例えば発現ベクター中の異種プロモータに作動可能に連結している。組換えタンパク質は、１つ若しくは複数のアミノ酸だけネイティブ配列と異なり得、且つ／又は異種配列と融合している。ホスホリパーゼをコードする核酸を含むベクターは、組換えベクターである。
【００６０】
「回収された」、「単離された」及び「分離された」という用語は、天然に見出されるとき、自然に結合している少なくとも１つの他の物質又は成分から取り出される化合物、タンパク質（ポリペプチド）、細胞、核酸、アミノ酸又は他の指定された物質若しくは成分を指す。その「単離された」ポリペプチドとして、限定されないが、異種宿主細胞中に発現された分泌ポリペプチドを含有する培養ブロスが挙げられる。
【００６１】
「精製された」という用語は、比較的純粋な状態、例えば少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋又はさらに少なくとも約９９％純粋である物質（例えば、単離ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を指す。
【００６２】
「濃縮された」という用語は、約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋又はさらに少なくとも約７０％純粋である物質（例えば、単離ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を指す。
【００６３】
酵素に関して、「ｐＨ範囲」とは、酵素が触媒活性を発揮するｐＨ値の範囲を指す。
【００６４】
酵素に関して、「ｐＨ安定な」及び「ｐＨ安定性」という用語は、酵素が所定の期間（例えば、１５分、３０分、１時間）にわたって広範囲のｐＨ値にわたり活性を保持する能力に関する。
【００６５】
「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」と同義であり、互いに置き換え可能に使用される。こうしたアミノ酸配列が活性を呈示する場合、これらは、「酵素」と呼ばれることもある。アミノ酸残基を表す従来の１文字又は３文字コードが使用され、その際、アミノ酸配列は、標準的なアミノ末端からカルボキシ末端への配向（すなわちＮ→Ｃ）で表示される。
【００６６】
「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖及びポリペプチドをコードすることができる合成分子を包含する。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、且つ化学修飾であり得る。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、置き換え可能に使用される。遺伝子コードが変性であることから、特定のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンを用い得、本組成物及び方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。別に記載のない限り、核酸配列は、５’〜３’の配向で表示される。
【００６７】
「ハイブリダイゼーション」は、ブロットハイブリダイゼーション技術及びＰＣＲ技術に際して起こるように、核酸の１本の鎖が相補鎖とデュプレックスを形成する、すなわち塩基対合するプロセスを指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として、以下の条件下でのハイブリダイゼーションが挙げられる：６５℃及び０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０）。ハイブリダイゼーション、デュプレックス核酸は、融解温度（Ｔｍ）により特徴付けられ、ここで、ハイブリダイズした核酸の半分が相補鎖と対合していない。デュプレックス内のミスマッチヌクレオチドは、Ｔｍを低下させる。極めてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６８℃及び０．１×ＳＳＣを含む。
【００６８】
「合成」分子は、生物ではなく、インビトロ化学又は酵素合成により生成される。
【００６９】
細胞に関して使用される「形質転換された」、「安定に形質転換された」及び「トランスジェニック」という用語は、細胞が、ゲノムに組み込まれた又は複数の世代を通して維持されるエピソームとして担持された非ネイティブ（例えば、異種）核酸配列を含むことを意味する。
【００７０】
細胞への核酸配列の挿入に関連して、「導入された」という用語は、当技術分野で周知の通り、「トランスフェクション」、「形質転換」又は「形質導入」を意味する。
【００７１】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、発現ベクター、ファージ、ウイルス又は目的のポリペプチド（例えば、ホスホリパーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む他のＤＮＡ構築物が導入されている生物である。例示的な宿主株は、目的のポリペプチドを発現することができる微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌及び酵母）である。「宿主細胞」という用語は、細胞から作製されたプロトプラストを含む。
【００７２】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、「異種」という用語は、宿主細胞中に天然に存在しないポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
【００７３】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、「内在性」という用語は、宿主細胞中に天然に存在するポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。
【００７４】
「発現」という用語は、ポリペプチドが核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスは、転写及び翻訳の両方を含む。
【００７５】
「選択マーカ」又は「選択可能なマーカ」は、その遺伝子を担持する宿主細胞の選択を促進するために宿主において発現させることができる遺伝子を指す。選択可能なマーカの例として、限定されないが、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン若しくはクロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞に代謝的利益、例えば栄養的利益を付与する遺伝子が挙げられる。
【００７６】
「ベクター」は、１つ又は複数の細胞型に核酸を導入するために設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが挙げられる。
【００７７】
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指し、このコード配列は、好適な宿主においてＤＮＡの発現を実施することができる好適な制御配列と作動可能に連結している。こうした制御配列として、転写を実施するためのプロモータ、転写を制御するための任意選択のオペレータ配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列を挙げることができる。
【００７８】
「作動可能に連結した」という用語は、指定の構成要素が、意図される様式でそれらが機能することを可能にする関係性（限定されないが、並置など）にあることを意味する。例えば、調節配列をコード配列と作動可能に連結して、コード配列の発現が調節配列の制御下にあるようにする。
【００７９】
「シグナル配列」は、タンパク質のＮ末端部分に結合したアミノ酸の配列であり、これは、細胞外のタンパク質の分泌を促進する。細胞外タンパク質の成熟型は、シグナル配列を欠失しているが、これは、分泌プロセス中に切断される。
【００８０】
「生物学的に活性」は、酵素活性などの指定された生物学的活性を有する配列を指す。
【００８１】
用語「比活性」は、特定の条件下で単位時間当たり酵素又は酵素調製物により産物に変換することができる基質のモル数を指す。比活性は、一般に、タンパク質の単位（Ｕ）／ｍｇとして表される。代わりに、比活性は、特定の条件下で単位時間当たり酵素又は酵素調製物により生成される産物のモル数を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「配列同一性（％）」とは、特定の配列が、デフォルトパラメータと共にＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを用いてアライメントされたとき、指定の参照配列中のものと同一のアミノ酸残基を少なくとも特定のパーセンテージで有することを意味する。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０を参照されたい。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメータは、以下の通りである。
ギャップオープニングペナルティ：１０．０
ギャップ伸張ペナルティ：０．０５
タンパク質重み付け行列：ＢＬＯＳＵＭ行列
ＤＮＡ重み付け行列：ＩＵＢ
異なる配列の遅延％：４０
ギャップ間距離：８
ＤＮＡ転位の重み：０．５０
親水性残基リスト：ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ
負値行列の使用：オフ
残基特異的ペナルティの切り替え（Ｔｏｇｇｌｅ）：オン
親水性ペナルティの切り替え：オン
末端ギャップ分程ペナルティの切り替え：オフ
【００８３】
欠失は、参照配列と比較した非同一残基として計数する。各末端に存在する欠失を算入する。例えば、成熟型６１７残基ポリペプチドのＣ末端で５アミノ酸の欠失を有する変異体は、成熟型ポリペプチドに対して９９％の配列同一性パーセントを有する（６１２／６１７同一残基×１００、最寄りの整数に四捨五入）。このような変異体は、成熟型ポリペプチドに対して「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含されることになる。
【００８４】
「融合」ポリペプチド配列は、２つの対象ポリペプチド配列間でペプチド結合を介して結合、すなわち作動可能に連結される。
【００８５】
「糸状菌」という用語は、真菌亜門（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）、特にチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）種の全ての糸状形態を指す。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「その」は、文脈から明らかに別の指示がない限り、単数及び複数の指示語の両方を包含する。
【００８７】
本明細書で使用される「含んでいる」、「含む」及び「含んでなる」という用語は、「包含している」、「包含する」又は「含有している」、「含有する」と同義であり、包括的又は制限がなく、且つ追加的、非記載メンバー、要素又は方法ステップを排除しない。本明細書で使用される「含んでいる」、「含む」及び「含んでなる」という用語は、「から構成されている」、「構成される」及び「から構成される」という用語を含むことが理解される。
【００８８】
端点による数値範囲の記載は、それぞれの範囲内に包括される全ての数値及び分数並びに挙げられる端点を包含する。
【００８９】
パラメータ、量、時間の長さなどの測定可能な値に関して本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、指定された値及びその値からの＋／−１０％以下、好ましくは＋１〜５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらに好ましくは＋／−０．１％以下の変動を、そうした変動が開示される本発明で実施することが適切である限り、包含することが意図される。修飾語「約」又は「およそ」が指す値は、それ自体で明示的且つ優先的に開示されることを理解すべきである。
【００９０】
「１つ又は複数」又は「少なくとも１つ」という用語、例えばメンバー群の１つ若しくは複数又は少なくとも１つのメンバーなどは、さらなる例示により、それ自体で明らかであるが、この用語は、とりわけ、前記メンバーのいずれか１つ又は前記メンバーのいずれか２つ以上、例えば前記メンバーのいずれか＞３つ、＞４つ、＞５つ、＞６つ若しくは＞７つ等及び最大で全ての前記メンバーを指すことも包含する。
【００９１】
本明細書で引用される参照文献は、全て参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。特に、明示的に参照される全ての参照文献の教示内容を参照により組み込む。
【００９２】
別に定義されない限り、技術及び科学用語を含め、本発明の開示に使用される用語は、全て本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。さらなるガイダンスの手段として、本発明の教示内容のよりよい理解のために用語の定義が含まれる。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「リパーゼ」という用語は、酵素エントリーＥＣ３．１．１．３により定義されるトリアシルグリセロールリパーゼを指す。リパーゼは、トリアシルグリセロールの加水分解を触媒して、遊離脂肪酸（飽和又は不飽和）、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及びグリセロールをもたらす。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「ホスホリパーゼ」という用語は、加水分解の部位に応じて、リン脂質を脂肪酸（飽和又は不飽和）、リゾリン脂質、ジアシルグリセロール、コリンリン酸及びホスファチジン酸塩に加水分解する酵素を指す。ホスホリパーゼは、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ型にさらに分類される。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「ホスホリパーゼＡ」という用語は、リン脂質の脂肪酸成分のエステル結合の加水分解を触媒する酵素を指す。識別することができる２つの異なるタイプのホスホリパーゼＡ活性がある。酵素エントリーＥＣ３．１．１．３２で定義されるホスホリパーゼＡ１と、酵素エントリーＥＣ３．１．１．４で定義されるホスホリパーゼＡ２とは、それぞれジアシルグリセロリン脂質からｓｎ１及びｓｎ２位置の１つの脂肪アシル基の脱アシルを触媒して、リゾリン脂質を産生する。
【００９６】
ホスホリパーゼＡ１及びＡ２は、それぞれｓｎ１及びｓｎ２位置の１つの脂肪酸基の脱アシルを触媒する。従って、ホスホリパーゼＡ１（本明細書ではＰＬＡ１と呼ばれることもある）は、一方の位置の脂肪酸とグリセリン残基との間の結合を加水分解して、リン脂質の１−アシル基を加水分解する。ホスホリパーゼＡ２（本明細書ではＰＬＡ２と呼ばれることもある）は、２−アシル基の加水分解を触媒する。
【００９７】
ホスホリパーゼによるリン脂質の加水分解により、リゾリン脂質と呼ばれる化合物が産生される。このように、ホスホリパーゼＡ１によるリン脂質の選択的加水分解により、２−アシルリゾリン脂質が産生される。ホスホリパーゼＡ２によるリン脂質の加水分解により、１−アシルリゾリン脂質が産生される。別のホスホリパーゼは、リゾリン脂質中に残留する脂肪アシル基の加水分解を触媒する「リゾホスホリパーゼ」である。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「ｓｎ１／ｓｎ２特異度比」という語句は、以下にさらに詳細に述べる通り、相対ＰＬＡ２活性で割った相対ＰＬＡ１活性として定義される。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比」という語句は、以下にさらに詳細に述べる通り、（ＬＰＣ−Ｕ／ｍｇタンパク質）／（ＰＣ−Ｕ／ｍｇタンパク質）を意味する。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比」という語句は、以下にさらに詳細に述べる通り、（ＮＡＬＰＥ−Ｕ／ｍｇタンパク質）／（ＮＡＰＥ−Ｕ／ｍｇタンパク質）を意味する。
【０１０１】
他の定義は、以下に記述する。
【０１０２】
別の突然変異
一部の実施形態では、本発明のリン脂質は、別の性能又は安定性利益を賦与する１つ又は複数の突然変異をさらに含む。例示的な性能利益として、限定されないが、熱安定性の向上、貯蔵安定性の向上、可溶性の増大、ｐＨプロフィールの改変、比活性の増大、基質特異性の修飾、基質結合の修飾、ｐＨ依存性活性の修飾、ｐＨ依存性安定性の修飾、酸化安定性の向上及び発現の増大が挙げられる。一部の事例では、性能利益は、比較的低い温度で実現される。一部の実施形態では、性能利益は、比較的高い温度で実現される。
【０１０３】
さらに、本発明のホスホリパーゼは、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。例示的な保存的アミノ酸置換を表１に挙げる。
【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
読者は、上に挙げた保存的突然変異のいくつかが遺伝子操作により生成することができ、他のものが遺伝子又は別の手段で合成アミノ酸をポリペプチドに導入することにより生成されることを理解するであろう。
【０１０６】
本発明のホスホリパーゼは、「前駆体」、「未成熟型」若しくは「完全長」（その場合、ホスホリパーゼは、シグナル配列を含む）であるか又は「成熟型」（その場合、シグナル配列が欠失している）であり得、さらにタンパク質分解及び／又は非タンパク質分解プロセシングによりＮ及び／又はＣ末端で短縮され得る。一般に、ポリペプチドの成熟型が概して最も有用である。別に注記のない限り、本明細書で使用されるアミノ酸残基番号付けは、それぞれのホスホリパーゼポリペプチドの成熟型を指す。得られるポリペプチドがホスホリパーゼ活性を保持する限り、本発明のホスホリパーゼポリペプチドを短縮して、Ｎ又はＣ末端を除去し得る。さらに、ホスホリパーゼ酵素は、より長いアミノ酸配列から得られる活性断片であり得る。活性断片は、完全長酵素の活性の一部又は全部を保持することによって特徴付けられるが、Ｎ末端、Ｃ末端からの欠失若しくは内部の欠失又はそれぞれの組合せを有する。
【０１０７】
本発明のホスホリパーゼは、第１のホスホリパーゼポリペプチドの少なくとも部分と、第２のホスホリパーゼポリペプチドの少なくとも部分とを含むという点で「キメラ」又は「ハイブリッド」ポリペプチドであり得る。本発明のホスホリパーゼは、追跡又は精製を可能にするための異種シグナル配列、エピトープなどをさらに含み得る。例示的な異種シグナル配列は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ（ＬＡＴ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＡｍｙＥ又はＡｐｒＥ）及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ＣｅｌＡに由来する。
【０１０８】
変異体ホスホリパーゼの産生
本発明のホスホリパーゼは、例えば、分泌又は細胞内発現により、宿主細胞中に産生させることができる。ホスホリパーゼを含む培養細胞材料（例えば、全細胞ブロス）は、細胞培地中へのホスホリパーゼの分泌後に取得することができる。任意選択で、ホスホリパーゼは、最終ホスホリパーゼの要望される純度に応じて、宿主細胞から単離するか、又は細胞ブロスから単離することもできる。当技術分野で公知の方法に従ってホスホリパーゼをコードする遺伝子をクローン化して、発現させることができる。好適な宿主細胞として、細菌、真菌（酵母及び糸状菌を含む）並びに植物細胞（藻を含む）が挙げられる。特に有用な宿主細胞として、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）が挙げられる。他の宿主細胞として、細菌細胞、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）並びにストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、Ｅ．Ｃｏｌｉ（大腸菌）が挙げられる。
【０１０９】
宿主細胞は、相同性又は異種ホスホリパーゼ、すなわち宿主細胞と同じ種ではないホスホリパーゼ又は１つ若しくは複数の他の酵素をコードする核酸をさらに発現し得る。ホスホリパーゼは、変異体ホスホリパーゼであり得る。さらに、宿主は、１つ又は複数の補助酵素、タンパク質、ペプチドを発現し得る。
【０１１０】
ベクター
ホスホリパーゼをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物は、宿主細胞に発現されるように構築することができる。遺伝コードの既知の縮重により、常用の技術で、同一のアミノ酸配列をコードする変異体ポリヌクレオチドを設計及び作製することができる。また、特定の宿主細胞についてコドン使用を最適化することも当技術分野で公知である。ホスホリパーゼをコードする核酸をベクターに組み込むことができる。以下に開示するような公知の形質転換技術を用いて、ベクターを宿主細胞に移入することができる。
【０１１１】
ベクターは、宿主細胞に形質転換し、そこで複製することができるいずれのベクターでもあり得る。例えば、ホスホリパーゼをコードする核酸を含むベクターは、ベクターを増殖及び増幅する手段として、細菌宿主細胞に形質転換させ、そこで複製させることができる。また、ベクターを発現宿主に形質転換して、コード化核酸を機能性ホスホリパーゼとして発現させることもできる。発現宿主として役立つ宿主細胞は、例えば、糸状菌を含み得る。真菌遺伝子学ストックセンター（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＦＧＳＣ）菌株カタログは、真菌宿主細胞での発現に好適なベクターの一覧を掲載している。ＦＧＳＣ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ（最終更新日２００７年１月１７日）を参照されたい。代表的なベクターは、ｐＪＧ１５３であり、これは、細菌宿主において複製することができる、プロモータのないＣｒｅ発現ベクターである。Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｕｎｅ  ２０１１）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７：３１９６−２２を参照されたい。ホスホリパーゼをコードする核酸を含み、且つそれを発現するようにｐＪＧ１５３を常用の技術で修飾することができる。
【０１１２】
ホスホリパーゼをコードする核酸を好適なプロモータに作動可能に連結することができ、これは、宿主細胞での転写を可能にする。プロモータは、選択した宿主細胞において転写活性を示すいずれのＤＮＡ配列であり得るか、又は宿主細胞と相同性若しくは異種いずれかのタンパク質をコードする遺伝子由来であり得る。特に細菌宿主において、ホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列の転写を指令するための例示的なプロモータは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモータ、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡ又はｃｅｌＡプロモータ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモータ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモータ、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモータ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモータなどである。真菌宿主細胞での転写の場合、有用なプロモータの例は、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。ホスホリパーゼをコードする遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌種に発現させる場合、好適なプロモータを、例えばＴ７プロモータ及びファージλプロモータをはじめとするバクテリオファージプロモータから選択することができる。酵母での発現に好適なプロモータの例として、限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ  １及びＧａｌ  １０プロモータ並びにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモータが挙げられる。ｃｂｈ１は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来の内在性、誘導性プロモータである。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｂｙ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｉ  ｇｅｎｅ（ｃｂｈ１）ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，”Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）４０（２）：１５８−６５を参照されたい。
【０１１３】
コード配列をシグナル配列に作動可能に連結することができる。シグナル配列をコードするＤＮＡは、発現させようとするホスホリパーゼ遺伝子と天然に結合されたＤＮＡ配列又は異なる属若しくは種由来のＤＮＡ配列であり得る。シグナル配列と、ＤＮＡ構築物又はベクターを含むプロモータ配列とは、真菌宿主細胞に導入することができ、また同じ供給源から得ることもできる。例えば、シグナル配列は、ｃｂｈ１プロモータに作動可能に連結したｃｂｈ１シグナル配列である。
【０１１４】
発現ベクターは、好適な転写ターミネータを含み得、真核生物の場合、変異体ホスホリパーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結したポリアデニル化配列を含み得る。終結及びポリアデニル化配列は、好適には、プロモータと同じ供給源に由来するものであり得る。
【０１１５】
ベクターは、ベクターを宿主細胞で複製させることができるＤＮＡ配列をさらに含み得る。こうした配列の例は、プラスミド：ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製起点である。
【０１１６】
また、ベクターは、選択可能なマーカ、例えばその産物が、単離された宿主細胞の欠損を補足する遺伝子、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール若しくはテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含み得る。さらに、ベクターは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカ、例えばａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ及びｘｘｓＣ、ヒグロマイシン耐性をもたらすマーカみ得るか、又は当技術分野で周知のような共形質転換により選択を達成することもできる。例えば、国際公開第９１／１７２４３号パンフレットを参照されたい。
【０１１７】
例えば、特定の細菌又は真菌を宿主細胞として使用して、大量のホスホリパーゼを産生させた後、濃縮又は精製に付す場合、いくつかの点で細胞内発現が有利となり得る。また、培地中へのホスホリパーゼの細胞外分泌を用いて、単離ポリペプチドを含む培養細胞材料を作製することもできる。
【０１１８】
発現ベクターは、典型的に、クローニングベクターの構成要素、例えば選択された宿主生物でのベクターの自律的複製を可能にするエレメント並びに選択目的のための１つ又は複数の表現型として検出可能なマーカを含む。発現ベクターは、通常、プロモータ、オペレータ、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル並びに任意選択で抑制遺伝子又は１つ若しくは複数の活性化遺伝子などの対照ヌクレオチド配列を含む。加えて、発現ベクターは、ペルオキシソームなどの宿主細胞オルガネラ又は特定の宿主細胞コンパートメントに対してホスホリパーゼをターゲティングすることができるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。こうしたターゲティング配列として、限定されないが、配列、ＳＫＬが挙げられる。制御配列の指令下での発現の場合、ホスホリパーゼの核酸配列を、発現に関して適切な様式で制御配列と作動可能に連結させる。
【０１１９】
ホスホリパーゼをコードするＤＮＡ構築物、プロモータ、ターミネータ及び他のエレメントをそれぞれ連結し、複製に必要な情報を含む好適なベクターにそれらを挿入するために用いられる手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９及び３ｒｄ  ｅｄ．，２００１を参照）。
【０１２０】
宿主細胞の形質転換及び培養
ＤＮＡ構築物又は発現ベクターのいずれかを含む単離細胞をホスホリパーゼの組換え産生における宿主細胞として使用するのが有利である。細胞は、好都合には、宿主染色体にＤＮＡ構築物を（１つ又は複数のコピーで）組み込むことにより、酵素をコードするＤＮＡ構築物で形質転換し得る。この組込みは、ＤＮＡ配列が細胞内に安定に維持される傾向が高いことから、概して有利であると考えられる。宿主染色体へのＤＮＡ構築物の組込みは、従来の方法、例えば相同又は異種組換えに従って実施し得る。代わりに、様々なタイプの宿主細胞に関して上に説明したように、細胞を発現ベクターで形質転換し得る。
【０１２１】
好適な細菌宿主生物の例は、グラム陽性菌種、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバチルス（以前にはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）及びバチルス・チューリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むバチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；ストレプトマイセス・ミュリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）などのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種；ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）などのラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種をはじめとする乳酸菌種；ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）をはじめとするラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種；リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種；ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）種；並びにストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種である。代わりに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をはじめとする腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）又はシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属するグラム陰性菌種の株を宿主生物として選択することもできる。
【０１２２】
好適な酵母宿主生物は、生物工学的に適切な酵母種、例えば、限定されないが、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種若しくはクルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、又はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をはじめとするサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、又は例えばＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）種などのシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する種から選択することができる。メチロトローフ酵母、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株を宿主生物として使用することができる。代わりに、宿主生物は、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種であり得る。糸状菌の中で好適な宿主生物として、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）又はアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）が挙げられる。代わりに、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、例えばフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の株又はリゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種、例えばリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）の株を宿主生物として使用することもできる。他の好適な株として、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）種及びムコール属（Ｍｕｃｏｒ）種が挙げられる。加えて、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種を宿主として使用することもできる。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主宿主の形質転換のための好適な手順は、例えば、欧州特許第２３８０２３号明細書に記載されているものを含む。真菌宿主細胞により発現されるホスホリパーゼは、グリコシル化することができ、換言すれば、グリコシル部分を含むことになる。グリコシル化パターンは、野生型ホスホリパーゼに存在するものと同じであるか又は異なり得る。グリコシル化のタイプ及び／又は程度は、酵素及び／又は生化学的特性に変化をもたらし得る。
【０１２３】
発現宿主から遺伝子を欠失させるのが有利となる場合もあり、その場合、遺伝子欠損は、形質転換した発現ベクターにより解消することができる。既知の方法を用いて、１つ又は複数の不活性化遺伝子を有する真菌宿主細胞を取得することができる。遺伝子不活性化は、その遺伝子による機能性タンパク質の発現が妨げられるような、完全若しくは部分的欠失により、不活性化の挿入により、又は意図される目的のために遺伝子を非機能性にするいずれか他の手段により達成され得る。クローン化されたトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種又は他の糸状菌宿主由来の任意の遺伝子、例えばｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１及びｅｇｌ２遺伝子を欠失させることができる。遺伝子欠失は、不活性化させようとする所望の遺伝子の形態を当技術分野で公知の方法によりプラスミドに挿入することによって達成され得る。
【０１２４】
宿主細胞へのＤＮＡ構築物又はベクターの導入は、形質転換；エレクトロポレーション；核マイクロインジェクション；形質導入；トランスフェクション、例えば、リポフェクション媒介及びＤＥＡＥ−デキストリン媒介トランスフェクション；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション；ＤＮＡコートマイクロプロジェクタイルによる高速衝撃；並びにプロトプラスト融合などの技術を含む。一般的な形質転換技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）（前掲）を参照されたい。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）における異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書に記載されている。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株の形質転換については、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：９９１−１００１も参照されたい。ベクター系を用いて、遺伝的安定形質転換体を構築することができ、これにより、ホスホリパーゼをコードする核酸を宿主細胞染色体に安定に組み込む。次に、公知の方法により、形質転換体を選択し、精製する。
【０１２５】
例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の調製は、真菌の菌糸体からのプロトプラストの調製を含み得る。Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６を参照されたい。菌糸体は、発芽した栄養胞子から得ることができる。細胞壁を消化する酵素で菌糸体を処理することにより、プロトプラストが得られる。プロトプラストは、懸濁培地中の浸透圧安定剤の存在により保護される。これらの安定剤として、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫化マグネシウムなどが挙げられる。通常、これらの安定剤の濃度は、０．８Ｍ〜１．２Ｍの範囲で変動し、例えばソルビトールの１．２Ｍ溶液を懸濁培地に使用することができる。
【０１２６】
トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種株へのＤＮＡの取込みは、カルシウムイオン濃度に左右される。一般に、約１０〜５０ｍＭのＣａＣｌ２を取込み溶液中に使用する。別の好適な化合物としては、緩衝系、例えばＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）又は１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ６．０及びポリエチレングリコールなどが挙げられる。ポリエチレングリコールは、細胞膜に融合すると考えられ、従って培地の内容物をトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種株の細胞質中に送達することを可能にする。この融合は、多くの場合、プラスミドＤＮＡの複数のコピーを宿主染色体中に組み込んだままにする。
【０１２７】
通常、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の形質転換では、典型的に１０５〜１０７／ｍＬ、特に２×１０７／ｍＬの濃度において、透過性処理に付したプロトプラスト又は細胞を使用する。適切な溶液（例えば、１．２Ｍソルビトール及び５０ｍＭ  ＣａＣｌ２）中１００μＬの容量の上記プロトプラスト又は細胞を所望のＤＮＡと混合し得る。一般に、高濃度のＰＥＧを取込み溶液に添加する。０．１〜１容量の２５％ＰＥＧ４０００をプロトプラスト懸濁液に添加することができるが；約０．２５容量をプロトプラスト懸濁液に添加するのが有用である。形質転換を促進するために、ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウムなどの添加剤を取込み溶液に添加し得る。他の真菌宿主細胞についても同様の手順が利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書を参照されたい。
【０１２８】
発現
ホスホリパーゼを生成する方法は、酵素の生成を促進する条件下で前述のような宿主細胞を培養するステップと、細胞及び／又は培地から酵素を回収するステップとを含み得る。
【０１２９】
細胞を培養するために使用する培地は、対象の宿主細胞の増殖及びホスホリパーゼの発現の達成に好適な任意の一般的培地であり得る。好適な培地及び培地要素は、供給業者から入手可能であるか、又は公開された調製法（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログに記載されているもの）に従って調製され得る。
【０１３０】
宿主細胞から分泌される酵素を全ブロス調製に使用することができる。本発明の方法では、組換え微生物の馴化全発酵ブロスの調製は、ホスホリパーゼの発現をもたらす当技術分野で公知の任意の培養方法を用いて達成することができる。従って、発酵は、研究所又は工業用発酵装置内での振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、流加又は固形発酵など）を含むものとして理解され得、これは、好適な培地中且つホスホリパーゼの発現又は単離を可能にする条件下で実施される。「馴化全発酵ブロス」という用語は、本明細書において、培地、細胞外タンパク質（例えば、酵素）及び細胞バイオマスを含む発酵材料の未分画内容物として定義される。「馴化全発酵ブロス」という用語は、当技術分野で公知の方法を用いて溶解又は透過処理された細胞バイオマスも包含するが理解される。
【０１３１】
宿主細胞から分泌される酵素は、公知の手順により培地から好都合に回収することができ、こうした手順は、遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離するステップ、硫酸アンモニウムなどの塩を用いて、培地のタンパク質性成分を沈殿させた後、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を使用するステップなどを含む。ベクター中のホスホリパーゼをコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞によるコード配列の発現を賦与することができる制御配列に作動可能に連結することができ、換言すれば、ベクターは、発現ベクターである。例えば、制御配列に指令される転写のレベルを転写モジュレータに対してより応答性にするために、さらに別の転写調節エレメントの付加により、制御配列を修飾し得る。制御配列は、特にプロモータを含み得る。
【０１３２】
ホスホリパーゼの発現を可能にする適切な条件下で宿主細胞を培養することができる。酵素の発現は、酵素が連続的に産生されるように構成的であるか又は誘導性であり得、その場合、発現を開始するのに刺激を必要とする。誘導性発現の場合、タンパク質の生成は、必要に応じて、例えば誘導物質、例えばデキサメタゾン又はＩＰＴＧ又はソホロースを培地に添加することにより開始することができる。ポリペプチドは、インビトロ無細胞系、例えばＴＮＴ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウサギ網状赤血球系で組換えにより生成することもできる。
【０１３３】
発現宿主は、好気性条件下、宿主に適切な培地中で培養することもできる。宿主及び所望のホスホリパーゼの生産の必要に応じて、振盪又は攪拌と曝気との組合せを実施し得、生成は、宿主に適した温度、例えば約２５℃〜約７５℃（例えば、３０℃〜４５℃）で起こる。培養は、約１２〜約１００時間又はそれを超えて（並びにそれらの間の任意の値の時間、例えば２４〜７２時間）行うことができる。典型的に、培養ブロスは、やはりホスホリパーゼの生産に関する宿主に必要な培養条件に応じて約４．０〜約８．０のｐＨである。
【０１３４】
ホスホリパーゼを濃縮又は精製する方法
発酵、分離及び濃縮技術は、当技術分野で周知であり、ホスホリパーゼポリペプチド含有溶液を調製するために従来の方法を用いることができる。
【０１３５】
発酵後、発酵ブロスを取得し、残った未処理発酵材料を含め、微生物細胞及び様々な懸濁固形物を従来の分離方法により除去して、ホスホリパーゼ溶液を取得する。一般に、濾過、遠心分離、精密濾過、回転式真空ドラム濾過、限外濾過、遠心分離とそれに続く限外濾過、抽出又はクロマトグラフィーなどが使用される。
【０１３６】
回収を最適化するために、ホスホリパーゼポリペプチド含有溶液を濃縮することが望ましい。濃縮していない溶液を使用する場合、濃縮又は精製酵素沈殿物を収集するためにより長いインキュベーション時間が必要になる。
【０１３７】
所望の酵素レベルが得られるまで、従来の濃縮方法を用いて、酵素含有溶液を濃縮する。酵素含有溶液の濃縮は、本明細書で述べた技術のいずれによっても達成され得る。例示的な濃縮及び精製方法として、限定されないが、回転式真空濾過及び／又は限外濾過が挙げられる。
【０１３８】
濃縮されたホスホリパーゼポリペプチド含有溶液の酵素活性が所望のレベルに達するまで、酵素溶液を濃縮酵素溶液に濃縮する。
【０１３９】
濃縮は、例えば、金属ハロゲン化物沈殿剤などの沈殿剤を用いて実施され得る。金属ハロゲン化物沈殿剤として、限定されないが、アルカリ金属塩化物、アルカリ金属臭化物及びこれらの金属ハロゲン化物の２種以上のブレンドが挙げられる。例示的な金属ハロゲン化物としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム及びこれらの金属ハロゲン化物の２種以上のブレンドが挙げられる。金属ハロゲン化物沈殿剤である塩化ナトリウムは、保存料としても使用することができる。
【０１４０】
金属ハロゲン化物沈殿剤は、ホスホリパーゼを沈殿させるのに有効な量で使用する。酵素の沈殿を起こすのに有効な金属ハロゲン化物の少なくとも有効量及び最適量並びにインキュベーション時間、ｐＨ、温度及び酵素の濃度を含め、最大回収のための沈殿の条件の選択は、常用的試験後、当業者に容易に明らかであろう。
【０１４１】
一般に、少なくとも約５％ｗ／ｖ（重量／体積）〜約２５％ｗ／ｖの金属ハロゲン化物を濃縮酵素溶液に添加するが、通常、少なくとも約８％ｗ／ｖである。一般に、約２５％ｗ／ｖ以下の金属ハロゲン化物を濃縮酵素溶液に添加するが、通常、約２０％ｗ／ｖ以下である。金属ハロゲン化物沈殿剤の最適濃度は、中でも、具体的なホスホリパーゼポリペプチドの性質及び濃縮酵素溶液中のその濃度に応じて変動する。
【０１４２】
酵素を沈殿させる別の方法は、有機化合物を使用するものである。例示的な有機化合物沈殿剤として、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４−ヒドロキシ安息香酸のアルキルエステル及びこれら有機化合物の２種以上のブレンドが挙げられる。有機化合物沈殿剤の添加は、金属ハロゲン化物沈殿剤の添加前、それと同時又はその後に実施することができ、有機化合物及び金属ハロゲン化物の両沈殿剤の添加は、順次又は同時のいずれかで実施され得る。
【０１４３】
一般に、有機沈殿剤は、ナトリウム又はカリウム塩などの４−ヒドロキシ安息香酸のアルカリ金属塩、４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖又は分岐アルキルエステル（アルキル基は、１〜１２個の炭素原子を含有する）及びこれらの有機化合物の２種以上のブレンドからなる群から選択される。有機化合物沈殿剤は、例えば、４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖又は分岐アルキルエステル（アルキル基は、１〜１０個の炭素原子を含有する）及びこれら有機化合物の２種以上のブレンドであり得る。例示的な有機化合物は、４−ヒドロキシ安息香酸の直鎖アルキルエステル（アルキル基は、１〜６個の炭素原子を含有する）及びこれらの有機化合物の２種以上のブレンドである。４−ヒドロキシ安息香酸のメチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のプロピルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のブチルエステル、４−ヒドロキシ安息香酸のエチルエステル及びこれらの有機化合物の２種以上のブレンドも使用することができる。さらに別の有機化合物として、限定されないが、４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル（メチルＰＡＲＡＢＥＮと称する）、４−ヒドロキシ安息香酸プロピルエステル（プロピルＰＡＲＡＢＥＮと称する）も挙げられ、これらは、両方とも保存料でもある。さらに詳細な説明については、例えば、米国特許第５，２８１，５２６号明細書を参照されたい。
【０１４４】
有機化合物沈殿剤の添加は、ｐＨ、温度、ホスホリパーゼ濃度、沈殿剤濃度及びインキュベーション時間に関して、沈殿条件の高い融通性という利点を提供する。
【０１４５】
有機化合物沈殿剤は、金属ハロゲン化物沈殿剤による酵素の沈殿を改善するのに有効な量で使用する。有機化合物沈殿剤の少なくとも有効量及び最適量並びにインキュベーション時間、ｐＨ、温度及び酵素の濃度を含め、最大回収のための沈殿の条件の選択は、本開示を考慮し、常用的試験後、当業者に容易に明らかであろう。
【０１４６】
一般に、少なくとも約０．０１％ｗ／ｖの有機化合物沈殿剤を濃縮酵素溶液に添加するが、通常、少なくとも約０．０２％ｗ／ｖである。一般に、約０．３％ｗ／ｖ以下の有機化合物沈殿剤を濃縮酵素溶液に添加するが、通常、約０．２％ｗ／ｖ以下である。
【０１４７】
金属ハロゲン化物沈殿剤及び有機化合物沈殿剤を含有する濃縮ポリペプチド溶液は、あるｐＨに調節することができ、これは、必然的に濃縮又は精製しようとする酵素に応じて変動する。一般に、ｐＨは、ホスホリパーゼの等電点付近のレベルで調節する。ｐＨは、等電点（ｐＩ）より約２．５ｐＨ単位低い〜等電点（ｐＩ）より約２．５ｐＨ単位高い範囲のｐＨに調節することができる。
【０１４８】
濃縮又は精製酵素沈殿物を取得するのに必要なインキュベーション時間は、具体的な酵素の性質、酵素の濃度並びに具体的な沈殿剤及びその（それらの）濃度に応じて変動する。一般に、酵素を沈殿させるのに有効な時間は、約１〜約３０時間であり；通常、約２５時間以下である。有機化合物沈殿剤の存在下では、インキュベーション時間を約１０時間未満、ほとんどの場合に約６時間まで短縮することができる。
【０１４９】
一般に、インキュベーション中の温度は、約４℃〜約５０℃である。通常、本方法は、約１０℃〜約４５℃（例えば、約２０℃〜約４０℃）で実施する。沈殿を誘導するための最適温度は、使用する溶液条件及び酵素又は沈殿剤に応じて変動する。
【０１５０】
濃縮又は精製酵素沈殿物の全体的回収及び工程を実施する効率は、酵素、添加した金属ハロゲン化物及び添加した有機化合物を含む溶液を攪拌することによって改善される。攪拌ステップは、金属ハロゲン化物及び有機化合物の添加の工程及びそれに続くインキュベーション時間中の両方で実施する。好適な攪拌方法としては、機械的攪拌若しくは振盪、激しい攪拌又は任意の類似技術が挙げられる。
【０１５１】
インキュベーション時間後、濃縮又は精製酵素を、解離した色素及びその他の不純物から分離し、例えば濾過、遠心分離、精密濾過、回転式真空濾過、限外濾過、加圧濾過、交差メンブレン精密濾過、交差流メンブレン精密濾過などの従来の分離技術により収集する。酵素沈殿物のさらなる濃縮又は精製は、沈殿物を水で洗浄することによって達成することができる。例えば、濃縮又は精製酵素沈殿物を、金属ハロゲン化物沈殿剤を含有する水又は金属ハロゲン化物及び有機化合物沈殿剤を含有する水で洗浄する。
【０１５２】
発酵中、ホスホリパーゼポリペプチドは、培養ブロス中に蓄積する。所望のホスホリパーゼの単離、濃縮又は精製のために、培養ブロスを遠心分離又は濾過することにより細胞を除去し、得られた無細胞液を酵素濃縮又は精製のために使用する。一実施形態では、無細胞ブロスを、約７０％飽和の硫酸アンモニウムを用いた塩析に付し；次に、７０％飽和−沈殿物画分をバッファーに溶解させてから、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１００カラムなどのカラムに適用し、溶離して、酵素活性画分を回収する。さらなる濃縮又は精製のために、イオン交換クロマトグラフィーなどの従来の手順を使用し得る。濃縮又は精製酵素は、液体（溶液、スラリー）又は固体（顆粒、粉末）のいずれかである最終製品に製造することができる。
【０１５３】
好ましい実施形態の説明
本発明の一態様によれば、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１を含む単離ポリペプチドが提供され、前記ホスホリパーゼＡ１は、０．０２未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比及び／又は０．１２未満のＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比を有する。好ましくは、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、６５〜８５／１５〜３５、好ましくは６５〜８０／２０〜３５、より好ましくは７０〜８５／１５〜３０、さらに好ましくは７０〜８０／２０〜３０；又は７５〜９５／５〜２５、好ましくは８０〜９５／５〜２０、より好ましくは８５〜９５／５〜１５である。好ましくは、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である。他の好ましい実施形態では、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６又は８９／１１である。別の実施形態では、本発明の単離ポリペプチドは、本明細書に提供されるホスホリパーゼＡ１から構成されるか又は実質的に構成され得る。６５〜８５／１５〜３５、好ましくは６５〜８０／２０〜３５、より好ましくは７０〜８５／１５〜３０、さらに好ましくは７０〜８０／２０〜３０のｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）基質に対しであり；７５〜９５／５〜２５、好ましくは８０〜９５／５〜２０、より好ましくは８５〜９５／５〜１５のｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、ＮＡＰＥ基質に対してである。７４／２６のｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）基質に対してであり；８９／１１のｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、ＮＡＰＥ基質に対してである。
【０１５４】
好ましくは、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満である。別のより好ましい実施形態では、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、６５〜８５／１５〜３５、好ましくは６５〜８５／２０〜３５、より好ましくは７０〜８５／１５〜３０、さらに好ましくは７０〜８０／２０〜３０である。また別の好ましい実施形態では、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である。さらに別の好ましい実施形態では、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６である。
【０１５５】
好ましくは、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満である。
【０１５６】
好ましくは、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、７５〜９５／５〜２５、好ましくは８０〜９５／５〜２０、より好ましくは８５〜９５／５〜１５である。
【０１５７】
好ましくは、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約８９／１１である。
【０１５８】
他の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０１５９】
他の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０１６０】
他の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０１６１】
他の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０１６２】
本発明の別の態様では、前述した単離ポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離ポリヌクレオチドが提供される。また、単離ポリヌクレオチドを有する組換え発現ベクターも提供される。さらに、組換え発現ベクターを有する宿主細胞も提供される。
【０１６３】
本発明の別の態様では、生地を製造する方法が提供され、この方法は、小麦粉、食塩、水、砂糖、脂肪、レシチン、油、乳化剤及び酵母からなる群から選択される生地成分を、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１を含む単離ポリペプチドと混合するステップを含み、ここで、前記ホスホリパーゼＡ１は、０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比及び／又は０．１２未満のＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比を有する。好ましくは、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、６５〜８５／１５〜３５、好ましくは６５〜８０／２０〜３５、より好ましくは７０〜８５／１５〜３０、さらに好ましくは７０〜８０／２０〜３０；又は７５〜９５／５〜２５、好ましくは８０〜９５／５〜２０、より好ましくは８５〜９５／５〜１５である。好ましくは、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である。他の好ましい実施形態では、ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６又は８９／１１である。任意選択で、乳化剤は、ｉ）レシチン若しくはリゾ−レシチンなどのリン脂質乳化剤；又はｉｉ）ＤＡＴＥＭ、モノグリセリド若しくはジグリセリドなどの非リン脂質乳化剤からなる群から選択される。
【０１６４】
好ましくは、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満である。より好ましい実施形態では、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、６５〜８５／１５〜３５、好ましくは６５〜８０／２０〜３５、より好ましくは７０〜８５／１５〜３０、さらに好ましくは７０〜８０／２０〜３０である。また別の好ましい実施形態では、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約６０／４０、７０／３０、８０／２０、９０／１０、９５／５又は９９／１である。さらに別の好ましい実施形態では、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約７４／２６である。さらにまた別の好ましい実施形態では、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、７５〜９５／５〜２５、好ましくは８０〜９５／５〜２０、より好ましくは８５〜９５／５〜１５である。さらに別の好ましい実施形態では、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満であり、且つｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、約８９／１１である。
【０１６５】
他の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０１６６】
他の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０１６７】
他の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０１６８】
他の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である。
【０１６９】
本発明の別の態様では、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素を含む生地が提供され、ここで、ホスホリパーゼＡ１は、０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比を有する。好ましくは、生地は、改善された伸展性及び／又は安定性を有する。本発明の別の態様では、生地は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、ホスホリパーゼＡ１と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種の追加の酵素をさらに含む。好ましくは、アミラーゼは、エキソアミラーゼである。好ましくは、エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである。好ましくは、エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである。より好ましくは、非マルトース生成アミラーゼは、主に４〜８つのＤ−グルコピラノシル単位を含む１つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する。別の好ましい実施形態では、追加の酵素は、ホスホリパーゼである。より好ましくは、ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する。別の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼは、配列番号１７及び／又は配列番号１８である。
【０１７０】
本発明の別の態様では、焼成製品を調製する方法であって、前述した生地を焼成する方法が提供される。本発明の別の態様では、焼成製品が提供される。好ましくは、焼成製品は、改善されたクラム孔径、気泡の改善された均質性、クラストとクラムとの分離がないこと、増加した体積、増加したクラストのカリっとした食感及び改善されたオーブンスプリングからなる群から選択される、少なくとも１つの改善された特性を有する。より好ましくは、改善された特性は、増加したクラストのカリっとした食感である。
【０１７１】
本発明の別の態様では、小麦粉と、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素とを含む焼成用プレミックスが提供され、ここで、ホスホリパーゼＡ１は、０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比を有する。本発明の別の態様では、焼成用プレミックスは、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、ホスホリパーゼＡ１と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種の追加の酵素を有する。好ましくは、アミラーゼは、エキソアミラーゼである。好ましくは、エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである。好ましくは、エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである。より好ましくは、非マルトース生成アミラーゼは、主に４〜８つのＤ−グルコピラノシル単位を含む１つ又は複数の直鎖状マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する。好ましくは、追加の酵素は、ホスホリパーゼである。より好ましくは、ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する。別の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼは、配列番号１７及び／又は配列番号１８である。
【０１７２】
本発明の別の態様では、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素を含む顆粒又は凝集粉を含む焼成改良剤が提供され、ここで、ホスホリパーゼＡ１は、０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比を有する。本発明の別の態様では、焼成改良剤は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、ホスホリパーゼＡ１と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種の追加の酵素を含む。好ましくは、アミラーゼは、エキソアミラーゼである。好ましくは、エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである。好ましくは、エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである。より好ましくは、非マルトース生成アミラーゼは、主に４〜８つのＤ−グルコピラノシル単位を含む１つ又は複数の直鎖状マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する。好ましくは、追加の酵素は、ホスホリパーゼである。より好ましくは、ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する。別の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼは、配列番号１７及び／又は配列番号１８である。
【０１７３】
本発明の別の態様では、前述した通り、生地及び／又はそれから製造される焼成製品を改善するのに有用な少なくとも１種の追加の酵素が含まれる生地を製造する方法が提供される。好ましくは、追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、ホスホリパーゼＡ１と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される。好ましくは、アミラーゼは、エキソアミラーゼである。好ましくは、エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである。好ましくは、エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである。より好ましくは、非マルトース生成アミラーゼは、主に４〜８つのＤ−グルコピラノシル単位を含む１つ又は複数の直鎖状マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する。好ましくは、追加の酵素は、ホスホリパーゼである。より好ましくは、ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する。別の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼは、配列番号１７及び／又は配列番号１８である。
【０１７４】
本発明の別の態様では、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素による乳化剤の処理を含む、リン脂質乳化剤の修飾の方法であり、ホスホリパーゼＡ１は、０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比を有する。任意選択で、リン脂質乳化剤は、レシチン又はリゾレシチンである。任意選択で、リン脂質乳化剤は、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン又はホスファチジルセリンである。
【０１７５】
本発明の別の態様では、脂質含有食品マトリックス中においてリゾリン脂質を生成する方法であって、約５５／４５以上のｓｎ１／ｓｎ２特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼＡ１酵素を脂質含有食品マトリックスに添加するステップを含む方法が提供され、ここで、ホスホリパーゼＡ１は、０．０１未満のリゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比を有する。好ましくは、脂質含有食品マトリックスは、卵及び卵含有食品、焼き菓子製品の生地、加工肉、牛乳を主成分とする製品、植物油並びにケーキ及びクッキーなどの焼き菓子製品からなる群から選択される。
【０１７６】
別の好ましい実施形態では、リゾホスホリパーゼ／ホスホリパーゼ活性比は、０．０１９、０．０１８、０．０１７、０．０１６、０．０１５、０．０１４、０．０１３、０．０１２、０．０１１又は０．０１０未満である。
【０１７７】
また別の好ましい実施形態では、ＮＡＬＰＥ／ＮＡＰＥ活性比は、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２又は０．００１未満である。
【０１７８】
本発明の別の態様では、前述した通り、乳化剤を添加するステップをさらに含む、生地を製造する方法が提供される。好ましくは、乳化剤は、ｉ）レシチン若しくはリゾ−レシチンなどのリン脂質乳化剤；又はｉｉ）ＤＡＴＥＭ、モノグリセリド若しくはジグリセリドなどの非リン脂質乳化剤からなる群から選択される。
【０１７９】
本発明の別の態様では、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成されるホスホリパーゼＡ１酵素を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成される単離ポリペプチドが提供される。好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成される酵素である。
【０１８０】
別の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成される酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成される酵素である。
【０１８１】
別の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成される酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成される酵素である。
【０１８２】
別の好ましい実施形態では、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成される酵素である。より好ましくは、ホスホリパーゼＡ１は、配列番号６と１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成される酵素である。
【０１８３】
本発明の別の態様では、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６の活性断片を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成されるホスホリパーゼＡ１酵素を含むか、それから構成されるか又は実質的に構成される単離ポリペプチドが提供される。
【０１８４】
一実施形態では、配列番号２の断片は、配列番号１のアミノ酸２８〜１４９若しくは配列番号１のＧｌｎ２８〜Ｇｌｙ１４９又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１８５】
一実施形態では、配列番号４の断片は、配列番号３のアミノ酸２６〜１４９若しくは配列番号３のＧｌｎ２６〜Ｌｙｓ１４９又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１８６】
一実施形態では、配列番号６の断片は、配列番号５のアミノ酸２８〜１４６若しくは配列番号５のＧｌｎ２８〜Ｔｈｒ１４６又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１８７】
一実施形態では、配列番号８の断片は、配列番号７のアミノ酸２８〜１４６若しくは配列番号７のＧｌｎ２８〜Ｔｈｒ１４９又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１８８】
一実施形態では、配列番号１０の断片は、配列番号９のアミノ酸３４〜１５７若しくは配列番号９のＧｌｎ３４〜Ｇｌｙ１５７又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１８９】
一実施形態では、配列番号１２の断片は、配列番号１１のアミノ酸３０〜１４６若しくは配列番号１１のＡｌａ３０〜Ａｓｐ１４６又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１９０】
一実施形態では、配列番号１２の断片は、配列番号１１のアミノ酸３０〜１５１若しくは配列番号１１のＡｌａ３０〜Ｋｙｓ１５１又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１９１】
一実施形態では、配列番号１４の断片は、配列番号１３のアミノ酸２８〜１２４若しくは配列番号１３のＧｌｎ２８〜Ｇｌｙ１２４又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１９２】
一実施形態では、配列番号１４の断片は、配列番号１３のアミノ酸２８〜１４１若しくは配列番号１３のＧｌｎ２８〜Ｐｈｅ１４１又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１９３】
一実施形態では、配列番号１４の断片は、配列番号１３のアミノ酸２８〜１４５若しくは配列番号１３のＧｌｎ２８〜Ａｓｐ１４５又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１９４】
一実施形態では、配列番号１４の断片は、配列番号１３のアミノ酸２８〜１４９若しくは配列番号１３のＧｌｎ２８〜Ｇｌｙ１４９又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１９５】
一実施形態では、配列番号１６の断片は、配列番号１５のアミノ酸２９〜１３８、２９〜１３９、２９〜１４０、２９〜１４１、２９〜１４２、２９〜１４３、２９〜１４４、２９〜１４５、２９〜１４６、２９〜１４７若しくは２９〜１４８又はそれらと８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の同一性を有する配列である。
【０１９６】
アッセイ及び方法
酵素特性決定アッセイ  −  活性アッセイ及びホスホリパーゼ位置特異性の決定のためのアッセイ
ＰＣ−Ｐアッセイ：
ホスホリパーゼ活性（ＰＣ−Ｕ）は、以下のアッセイを用いて決定することができる：
基質：１．７１％Ｌ−α−ホスファチジルコリンダイズ（９５％）（Ａｖａｎｔｉ  ４４１６０１Ｇ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒｅ  Ｌｉｐｉｄｓ，ＵＳＡ）、６．２５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ１００（ＳｉｇｍａＸ−１００）と、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７に溶解させた。
【０１９７】
アッセイ手順：
試料、較正試料及び対照試料を０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０に溶解させた。９６ウェルマイクロタイタープレート及びＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ  Ｃ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析を実施した。アッセイは、３０℃で実施した。２００μＬの基質をサーモスタットで１８０秒間３０℃に維持した後、５０μＬの酵素試料を添加した。酵素法を６００秒継続した。酵素法の工程中に遊離された遊離脂肪酸の量を、ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したＮＥＦＡキットを用いて測定した。
【０１９８】
このアッセイキットは、次の２つの試薬から構成される。
ＮＥＦＡ−ＨＲ（１）：
以下を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０：
０．５３Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）
０．３１ｍＭ補酵素Ａ（ＣｏＡ）
４．３ｍＭアデノシン５−三リン酸二ナトリウム塩（ＡＴＰ）
１．５ｍＭ  ４−アミノ−アンチピリン（４−ＡＡ）
２．６Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）
０．０６２％アジ化ナトリウム
ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）：
２．４ｍＭ  ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（Ｅ−ヒドロキシエチル）−アニリン（ＭＥＨＡ）
１２Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯＤ）
１４Ｕ／ｍＬのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
【０１９９】
インキュベーション後、１０μｌの酵素法混合物を、１５０μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（１）を含有する新しいマイクロタイタープレートに移してから、３０℃で２４０秒間インキュベートした。その後、７５μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（２）を添加し、混合物を３０℃で２４０秒間インキュベートした。次に、ＯＤ５４０ｎｍを測定した。
【０２００】
オレイン酸から作成した検量線に基づいて酵素活性（μｍｏｌ  ＦＦＡ／（ｍｉｎ・ｍＬ））を計算した。酵素活性ＰＣ−Ｕは、アッセイ条件下において、毎分酵素試料体積ミリリットル当たり産生されるマイクロモルの脂肪酸として計算した。
【数１】
2021508446.tif 000003
ＯＤ＝抽出試料のＯＤ暗試料のＯＤ
２５０μｌ＝基質及び酵素の総体積
５０μｌ＝酵素溶液の体積
Ｄ＝試料の希釈度
Ｓ＝検量線の傾き（ＯＤ（μｍｏｌ／ｍＬ））
１０＝酵素法の反応時間（分（ｍｉｎ））
【０２０１】
ＬＰＣ−Ｐアッセイ：
リゾ−ホスホリパーゼ活性（ＬＰＣ−Ｕ）は、以下のアッセイを用いて決定することができる：
基質：１．１８％の１−オレオイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ８４５８７５Ｐ，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄ，ＵＳＡ）、６．２５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ１００（ＳｉｇｍａＸ−１００）と、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７に溶解させた。
【０２０２】
アッセイ手順：
試料、較正試料及び対照試料を、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０に溶解させた。９６ウェルマイクロタイタープレート及びＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ  Ｃ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析を実施した。アッセイは、３０℃で実施した。２００μＬの基質をサーモスタットで１８０秒間３０℃に維持した後、５０μＬの酵素試料を添加した。酵素法を６００秒継続した。酵素法の工程中に遊離された遊離脂肪酸の量を、ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したＮＥＦＡキットを用いて測定した。
【０２０３】
このアッセイキットは、次の２つの試薬から構成される。
ＮＥＦＡ−ＨＲ（１）：
以下を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０：
０．５３Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）
０．３１ｍＭ補酵素Ａ（ＣｏＡ）
４．３ｍＭアデノシン５−三リン酸二ナトリウム塩（ＡＴＰ）
１．５ｍＭ  ４−アミノ−アンチピリン（４−ＡＡ）
２．６Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）
０．０６２％アジ化ナトリウム
ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）：
２．４ｍＭ  ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（Ｅ−ヒドロキシエチル）−アニリン（ＭＥＨＡ）
１２Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯＤ）
１４Ｕ／ｍＬのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
【０２０４】
インキュベーション後、１０μｌの酵素法混合物を、１５０μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（１）を含有する新しいマイクロタイタープレートに移してから、３０℃で２４０秒間インキュベートした。その後、７５μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（２）を添加し、混合物を３０℃で２４０秒間インキュベートした。次に、ＯＤ５４０ｎｍを測定した。
【０２０５】
オレイン酸から作成した検量線に基づいて酵素活性（μｍｏｌ  ＦＦＡ／（ｍｉｎ・ｍＬ））を計算した。酵素活性ＬＰＣ−Ｕは、アッセイ条件下において、毎分酵素試料の体積ミリリットル当たり産生されるマイクロモル脂肪酸として計算した。
【数２】
2021508446.tif 000004
ＯＤ＝抽出試料のＯＤ暗試料のＯＤ
２５０μｌ＝基質及び酵素の総体積
５０μｌ＝酵素溶液の体積
Ｄ＝試料の希釈度
Ｓ＝検量線の傾き（ＯＤ（μｍｏｌ／ｍＬ））
１０＝酵素法の反応時間（分（ｍｉｎ））
【０２０６】
ＮＡＰＥ−Ｐアッセイ：
ＮＡＰＥホスホリパーゼ活性（ＮＡＰＥ−Ｕ）は、以下のアッセイを用いて決定することができる：
基質：２．２５％のパルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−リノレオイル（１６：０〜１８：２  ＰＥ−Ｎ１８：２）（Ａｖａｎｔｉ７９２００３，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄ，ＵＳＡ）、６．２５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ１００（ＳｉｇｍａＸ−１００）と、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７に溶解させた。
【０２０７】
アッセイ手順：
試料、較正試料及び対照試料を、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０に溶解させた。９６ウェルマイクロタイタープレート及びＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ  Ｃ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析を実施した。アッセイは、３０℃で実施した。２００μＬの基質をサーモスタットで１８０秒間３０℃に維持した後、５０μＬの酵素試料を添加した。酵素法を６００秒継続した。酵素法の工程中に遊離された遊離脂肪酸の量を、ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したＮＥＦＡキットを用いて測定した。
【０２０８】
このアッセイキットは、２つの試薬から構成される。
ＮＥＦＡ−ＨＲ（１）：
以下を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０：
０．５３Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）
０．３１ｍＭ補酵素Ａ（ＣｏＡ）
４．３ｍＭアデノシン５−三リン酸二ナトリウム塩（ＡＴＰ）
１．５ｍＭ  ４−アミノ−アンチピリン（４−ＡＡ）
２．６Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）
０．０６２％アジ化ナトリウム
ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）：
２．４ｍＭ  ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（Ｅ−ヒドロキシエチル）−アニリン（ＭＥＨＡ）
１２Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯＤ）
１４Ｕ／ｍＬのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
【０２０９】
インキュベーション後、１０μｌの酵素法混合物を、１５０μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（１）を含有する新しいマイクロタイタープレートに移してから、３０℃で２４０秒間インキュベートした。その後、７５μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（２）を添加し、混合物を３０℃で２４０秒間インキュベートした。次に、ＯＤ５４０ｎｍを測定した。
【０２１０】
オレイン酸から作成した検量線に基づいて酵素活性（μｍｏｌ  ＦＦＡ／（ｍｉｎ・ｍＬ））を計算した。酵素活性ＮＡＰＥ−Ｕ  ｐＨ７は、アッセイ条件下において、毎分産生されるマイクロモル脂肪酸として計算した。
【０２１１】
オレイン酸から作成した検量線に基づいて酵素活性（μｍｏｌ  ＦＦＡ／（ｍｉｎ・ｍＬ））を計算した。酵素活性ＮＡＰＥ−Ｕは、アッセイ条件下において、毎分酵素試料のミリリットル体積当たり産生されるマイクロモル脂肪酸として計算した。
【数３】
2021508446.tif 000005
ＯＤ＝抽出試料のＯＤ暗試料のＯＤ
２５０μｌ＝基質及び酵素の総体積
５０μｌ＝酵素溶液の体積
Ｄ＝試料の希釈度
Ｓ＝検量線の傾き（ＯＤ（μｍｏｌ／ｍＬ））
１０＝酵素法の反応時間（分（ｍｉｎ））
【０２１２】
ＮＡＬＰＥ−Ｐアッセイ：
ＮＡＬＰＥホスホリパーゼ活性（ＮＡＬＰＥ−Ｕ）は、以下のアッセイを用いて決定することができる：
基質：１．６８％の１−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−リノレオイル（１６：０−ＮＡＬＰＥ−Ｎ１８：２）、（Ａｖａｎｔｉ７９１７５９，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，ＵＳＡ）、６．２５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ１００（ＳｉｇｍａＸ−１００）と、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７に溶解させた。
【０２１３】
アッセイ手順：
試料、較正試料及び対照試料を、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０に溶解させた。９６ウェルマイクロタイタープレート及びＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ  Ｃ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分析を実施した。アッセイは、３０℃で実施した。２００μＬの基質をサーモスタットで１８０秒間３０℃に維持した後、５０μＬの酵素試料を添加した。酵素法を６００秒継続した。酵素法の工程中に遊離された遊離脂肪酸の量を、ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したＮＥＦＡキットを用いて測定した。
【０２１４】
このアッセイキットは、次の２つの試薬から構成される。
ＮＥＦＡ−ＨＲ（１）：
以下を含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０：
０．５３Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）
０．３１ｍＭ補酵素Ａ（ＣｏＡ）
４．３ｍＭアデノシン５−三リン酸二ナトリウム塩（ＡＴＰ）
１．５ｍＭ  ４−アミノ−アンチピリン（４−ＡＡ）
２．６Ｕ／ｍＬのアスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ）
０．０６２％アジ化ナトリウム
ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）：
２．４ｍＭ  ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（Ｅ−ヒドロキシエチル）−アニリン（ＭＥＨＡ）
１２Ｕ／ｍＬのアシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＯＤ）
１４Ｕ／ｍＬのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）
【０２１５】
インキュベーション後、１０μｌの酵素法混合物を、１５０μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（１）を含有する新しいマイクロタイタープレートに移してから、３０℃で２４０秒間インキュベートした。その後、７５μＬのＮＥＦＡ−ＨＲ（２）を添加し、混合物を３０℃で２４０秒間インキュベートした。次に、ＯＤ５４０ｎｍを測定した。
【０２１６】
オレイン酸から作成した検量線に基づいて酵素活性（μｍｏｌ  ＦＦＡ／（ｍｉｎ・ｍＬ））を計算した。酵素活性ＮＡＬＰＥ−Ｕは、アッセイ条件下において、毎分酵素試料の体積ミリリットル当たり産生されるマイクロモル脂肪酸として計算した。
【数４】
2021508446.tif 000006
ＯＤ＝抽出試料のＯＤ暗試料のＯＤ
２５０μｌ＝基質及び酵素の総体積
５０μｌ＝酵素溶液の体積
Ｄ＝試料の希釈度
Ｓ＝検量線の傾き（ＯＤ（μｍｏｌ／ｍＬ））
１０＝酵素法の反応時間（分（ｍｉｎ））
【０２１７】
ＰＣ（ホスホファチジルコリン）に対するホスホリパーゼ活性並びにｓｎ１及びｓｎ２位置特異性の決定のためのアッセイ
基質：０．６％  １６：０〜１８：１  ＰＣ、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ８５０４５７，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，ＵＳＡ）、０．４％ＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ，Ｘ−１００）と、５ｍＭ  ＣａＣｌ２とを０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７に溶解させた。
【０２１８】
アッセイ手順：
２ｍＬの基質を３０℃でインキュベートし、０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー中で１０分の反応（磁気攪拌）後に消費された２〜１０％基質に相当する０．１ｍｌの酵素希釈物を添加した。
【０２１９】
反応を停止させて、遊離脂肪酸をプロトン化するために、４０μＬの４Ｍ  ＨＣｌを添加した。１ｍＬの９９％エタノールを添加し、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで混合した。０．５ｍｇのＣ１７：０脂肪酸（マルガリン酸）を含有する５ｍＬのＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を添加した。Ｖｏｒｔｅｘミキサーで５秒間試料を再度混合してから、２５ｒｐｍのロータミキサー（Ｓｔｕａｒｔ  Ｒｏｔａｒｔｏｒ  ＳＢ２）で３０分間抽出した。試料を１５２０ｇで１０分間遠心分離した。
【０２２０】
１つの５００ｍｇアミン（ＮＨ２）−Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＳＰＥカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）をＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｓｙｓｔｅｍに配置した。カラムを８ｍＬの石油−エーテルで調整した。抽出から得られたＭＴＢＥ相をカラムに適用し、以下を用いて溶離した。
１．画分  ８ｍＬの溶媒Ａ：ＭＴＢＥ：２−プロパノール（２：１）
２．画分  ８ｍＬの溶媒Ｂ：アセトン：ギ酸（１００：２）
【０２２１】
溶媒を約０．２５ｍＬ／ｍｉｎで溶離した。
【０２２２】
収集した脂肪酸画分（画分２）を乾燥まで蒸発させた後、脂肪酸をＧＬＣにより分析した。内部標準脂肪酸Ｃ１７：０に基づいて、Ｃ１６：０及びＣ１８：１脂肪酸の量を決定した。
【０２２３】
酵素活性は、アッセイ条件下で毎分産生されるμｍｏｌ脂肪酸として計算した。
【数５】
2021508446.tif 000007
（式中、
Ａ＝％Ｃ１６：０脂肪酸＋％Ｃ１８：１脂肪酸
２＝ｍＬ基質
１００００００＝ｍｏｌのμｍｏｌへの変換
Ｄ＝酵素希釈率
ＭＷ＝産生されたＣ１６：０脂肪酸及びＣ１８：１脂肪酸の平均モル重量
１０＝反応時間（分）
０．１＝アッセイに添加された酵素（ｍＬ））
【０２２４】
相対ＰＬＡ１酵素活性は、以下のように計算した。
【数６】
2021508446.tif 000008
【０２２５】
相対ＰＬＡ２酵素活性は、以下のように計算した。
【数７】
2021508446.tif 000009
【０２２６】
ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、以下のように表す。
ｓｎ１／ｓｎ２特異度比＝相対ＰＬＡ１活性／相対ＰＬＡ２活性
【０２２７】
ＮＡＰＥ（Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン）に対するホスホリパーゼ活性並びにｓｎ１及びｓｎ２位置特異性の決定のためのアッセイ
基質：０．７９％  １６：０〜１８：２（ＰＥ−Ｎ１８：２）ＮＡＰＥ、パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−リノレオイル（Ａｖａｎｔｉ７９２００３，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄ，ＵＳＡ）、０．４％ＴＲＩＴＯＮ（商標）−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ，Ｘ−１００）と、５ｍＭ  ＣａＣｌ２とを０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７に溶解させた。
【０２２８】
アッセイ手順：
２ｍＬの基質を３０℃でインキュベートし、０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳバッファー中で１０分の反応（磁気攪拌）後に消費された２〜１０％基質に相当する０．１ｍｌの酵素希釈物を添加した。
【０２２９】
反応を停止させ、遊離脂肪酸をプロトン化するために、４０μＬの４Ｍ  ＨＣｌを添加した。１ｍＬの９９％エタノールを添加し、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで混合した。０．５ｍｇのＣ１７：０脂肪酸（マルガリン酸）を含有する５ｍＬのＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）を添加した。Ｖｏｒｔｅｘミキサーで５秒試料を再度混合してから、２５ｒｐｍのロータミキサー（Ｓｔｕａｒｔ  Ｒｏｔａｒｔｏｒ  ＳＢ２）で３０分間抽出した。試料を１５２０ｇで１０分間遠心分離した。
【０２３０】
１つの５００ｍｇアミン（ＮＨ２）−Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  ＳＰＥカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）をＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｓｙｓｔｅｍに配置した。カラムを８ｍＬの石油−エーテルで調整した。抽出から得られたＭＴＢＥ相をカラムに適用し、以下により溶離した。
１．画分  ８ｍＬの溶媒Ａ：ＭＴＢＥ：２−プロパノール（２：１）
２．画分  ８ｍＬの溶媒Ｂ：アセトン：ギ酸（１００：２）
【０２３１】
溶媒を約０．２５ｍＬ／ｍｉｎで溶離した。
【０２３２】
収集した脂肪酸画分（画分２）を乾燥まで蒸発させた後、脂肪酸をＧＬＣにより分析した。内部標準脂肪酸Ｃ１７：０に基づいて、Ｃ１６：０及びＣ１８：２脂肪酸の量を決定した。
【０２３３】
酵素活性は、アッセイ条件下で毎分産生されるμｍｏｌ脂肪酸として計算した。
【数８】
2021508446.tif 000010
（式中、
Ａ＝％Ｃ１６：０脂肪酸＋％Ｃ１８：２脂肪酸
２＝ｍＬ基質
１００００００＝ｍｏｌのμｍｏｌへの変換
Ｄ＝酵素希釈率
ＭＷ＝産生されたＣ１６：０脂肪酸及びＣ１８：１脂肪酸の平均モル重量
１０＝反応時間（分）
０．１＝アッセイに添加された酵素（ｍＬ））
【０２３４】
相対ＰＬＡ１酵素活性は、以下のように計算した。
【数９】
2021508446.tif 000011
【０２３５】
相対ＰＬＡ２酵素活性は、以下のように計算した。
【数１０】
2021508446.tif 000012
【０２３６】
ｓｎ１／ｓｎ２特異度比は、以下のように表す。
ｓｎ１／ｓｎ２特異度比＝相対ＰＬＡ１活性／相対ＰＬＡ２活性
【０２３７】
ガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）：
遊離脂肪酸は、トリメチルシリル誘導体（ＴＭＳ）としてＧＬＣにより分析した。
【０２３８】
装置
・ＷＣＯＴフューズドシリカカラム１２．５ｍ×０．２５ｍｍ  ＩＤ×０．１μ膜厚の５％フェニル−メチル−シリコーン（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ製のＣＰ  Ｓｉｌ  ８  ＣＢ）を備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｌａｒｕｓ  ６００毛管ガスクロマトグラフ
・キャリアガス：ヘリウム
・インジェクタ：ＰＳＳＩコールドスプリット噴射（初期温度９０℃、３９５℃まで加熱）、容積１．０μｌ
・検出器ＦＩＤ：３９５℃。
【０２３９】
【表２】
2021508446.tif 000013
【０２４０】
試料調製：
蒸発させた試料を１．５ｍｌのヘプタン：ピリジン、２：１に溶解させる。５００μｌの試料溶液をクリンプバイアルに移す。１００μｌのＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミド）を添加し、６０℃で１５分間反応させる。
【０２４１】
焼成適用
【０２４２】
【表３】
2021508446.tif 000014
【０２４３】
Ｄｉｏｓｎａスパイラルミキサーで混錬する。分析による小麦粉の給水率：４００ＢＵ−２％。
【０２４４】
手順
ボウル内で全ての材料を低速で１分混合した後、水を添加して、低速で２分、次に高速で６．５分混錬する。生地の温度は、約２６℃でなければならない。１３５０ｇの生地を計量して、手で丸く成型する。温蔵庫内で生地を３０℃で１０分寝かせる。
【０２４５】
「ＧＬＩＭＩＫ（商標）ラウンダー」（設定は、装置にある表に従う）で生地を３０個の球状生地に成型する。
【０２４６】
生地を３４℃、８５％ＲＨで４５分間発酵させた後、２００℃／２１スチームで１３分、さらにダンパーを開放して５分間焼成する（ＭＩＷＥオーブンプログラム１）。焼成後、ロールを周囲温度で２５分間冷却させた後、計量し、体積を測定する。
【０２４７】
当業者が生地及びパンの特徴を評価する。
【０２４８】
【表４】
2021508446.tif 000015
【０２４９】
Ｈｏｂａｒｔミキサーによる混練。
手順
スポンジ：ボウル内で全ての材料を速度１で１分混合し、速度２で３分混合する。スポンジ温度は、約２５．５℃でなければならない。蓋のないボウル内で、スポンジを３０℃、８５％ＲＨで３時間発酵させる。
【０２５０】
生地：スポンジと、食塩を除く全ての残りの材料とを低速で２分、次に中速で３分混合する（氷水を使用）。食塩を添加し、中速で３分混合する。４５０ｇの生地片を計量し、成型する（少なめに計量  −  標準計量では生地５５０ｇ）。生地を周囲温度で１０分寝かせる。以下の設定のＢｅｎｉｅｒ  ＭＳ５００で成型する：
実施  −１６
ドラムプレス  ３
プレッシャーボード前  ４．０（衝撃の場合３．５）
プレッシャーボード後ろ  ３．５（衝撃の場合３．１）
前方幅  ３３０、後方幅  ２９０。
【０２５１】
油を塗った焼き型に生地を入れ、４３℃、９５％ＲＨで７０分（長めの発酵−標準発酵は６０分）発酵させる。６．５ｃｍの高さから、生地の入った焼き型をテーブルに２回落とすことにより、ローフの半分に衝撃を加える。２００℃で２６分焼成する（ＭＩＷＥオーブンプログラム４）。焼き型からパンを取り出し、７０分間冷却した後、計量し、体積を測定する。
【０２５２】
当業者が生地及びパンの特徴を評価する。
【０２５３】
【表５】
2021508446.tif 000016
【０２５４】
【表６】
2021508446.tif 000017
【０２５５】
生地脂質の抽出。
十分に発酵した生地の試料を冷凍し、凍結乾燥させた。乾燥生地を粉砕し、篩にかけた。粉砕し、篩い分けた試料１．５ｇを１．５ｇの担体（珪藻土、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐ／Ｎ：６０−０３３８５４）と混合し、ＡＳＥ１０ｍｌ試料管に移した。４０℃でＤｉｏｎｅｘ  ＡＳＥ３５０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、溶媒としての水飽和ブタノール及び１０分の静的ランタイムで、抽出を実施した。抽出後、６０℃及び１０００ｒｐｍのＳｃａｎ  Ｓｐｅｅｄ  ４０（Ｓｃａｎｖａｃ，Ｌａｂｏｇｅｎｅ  ＡＰＳ）を用いて、溶媒を蒸発させた。乾燥した脂質を３．７５ｍｌのヘプタン：イソプロパノール（３：２）に溶解させた。
【０２５６】
生地から抽出したリン脂質のＨＰＬＣ分析：
荷電化粒子検出器（Ｃｈａｒｇｅｄ  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いた液体クロマトグラフィーにより、生地脂質試料を分析した。カラムは、順相カラム（ＤＩＯＬ）であり、移動相は、１ｍＭギ酸アンモニウムの添加を含むＡ：アセトン／メタノール  ９６／４及び１ｍＭギ酸アンモニウムの添加を含むＢ：アセトン／メタノール／Ｈ２Ｏ  ６０／３４／６の傾きであった。
【０２５７】
ＮＡＬＰＥを定量標準として使用した。
【０２５８】
計器類：
Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＵＨＰＬＣ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
ＶＡＮＱＯＩＳＨ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
カラム：Ｆｏｒｔｉｓ  ＨＩＬＩＣ  Ｄｉｏｌ，１．７μｍ、５０×２．１ｍｍ。
【０２５９】
【表７】
2021508446.tif 000018
【０２６０】
カラム温度は、３０℃であり、注入量は、４μＬであった。
【０２６１】
試料調製：
注入される前、「生地脂質の抽出」に記載した通りに、生地から脂質を抽出し、０．４５μＭフィルターを通して濾過した。
【０２６２】
計算：
Ｃｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを用いて、クロマトグラムを統合し、ＮＡＬＰＥ標準曲線に基づいてＮＡＰＥ、ＮＡＬＰＥ及びＮＡＧＰＥのモル濃度を計算した。
【０２６３】
結果の表示：
初めに、全ての生地についての「平均総モル脂質（ＮＡＰＥ＋ＮＡＬＰＥ＋ＮＡＧＰＥ）」に対して各成分それぞれのモルレベルを正規化することにより、ＮＡＰＥ、ＮＡＬＰＥ及びＮＡＧＰＥそれぞれの脂質レベルを取得した。以下のそれぞれの脂質レベルは、陰性対照（酵素を添加していない）中のＮＡＰＥレベルに対して表示する。従って、ＮＡＰＥは、１（陰性対照）で開始する。ＮＡＬＰＥ及びＮＡＧＰＥは、ＮＡＰＥ開始レベルに対して得られるレベルとして表示する。
【０２６４】
化学構造
以下の構造において、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ１２〜Ｃ２４炭化水素である。Ｃ１２〜２４炭化水素は、飽和又は不飽和のいずれかである。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同じ又は異なる炭化水素であり得る。
【０２６５】
【化１】
2021508446.tif 000019
【化２】
2021508446.tif 000020
【０２６６】
以下に記載する実施形態は、例として提供されるに過ぎず、本発明の概念をいずれか特定の酵素に限定するものとして解釈すべきではないことに留意すべきである。
【実施例】
【０２６７】
実施例１  −  ＣＲＣ０８３１０−ＴｈａＰｌａ１
トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）ホスホリパーゼＴｈａＰｌａ１（ＣＲＣ０８３１０）のクローニング
ＣＲＣ０８３１０と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がトリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）において同定されたが、これは、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）から決定される通り、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＫＫＯ９８７５６．１）と１００％の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長ＣＲＣ０８３１０のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号１９に記載される。完全長ＣＲＣ０８３１０遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号１に示す。ＳｉｇｎａｌＰバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予測されるように、このタンパク質は、Ｎ末端に１６アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、ＣＲＣ０８３１０が、分泌された酵素であることを示唆している。ＣＲＣ０８３１０の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号２に記載される。
【０２６８】
実施例２  −  ＣＲＣ０８３１０の発現
完全長ＣＲＣ０８３１０タンパク質（配列番号１９）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載のｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同じ）に挿入して、プラスミドｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８３１０を取得した。ｐＧＸＴベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ及びｐｙｒ２選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８３１０は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来のプロモータ（ｃｂｈＩ）及びｃｂｈＩターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
【０２６９】
次に、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９）を用いて、ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８３１０プラスミドを好適なトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株に形質転換した（公開ＰＣＴ出願国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載の方法）。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する固形培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換コロニーは、約１週間で出現した。アセトアミドプレートでの増殖後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレートで５日の増殖後、安定な形質を呈示する形質転換体を９６ウェルマイクロタイタープレート内の２００μＬグルコース／ソホロース合成培地に接種した。マイクロタイタープレートを２８℃の酸素グロースチャンバー内で５日間インキュベートした。これらの培養物からの上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質発現を確認した。最も高いタンパク質発現を有する安定な株を選択し、グルコース／ソホロース合成培地を含む２５０ｍＬ振盪フラスコ内での発酵に付した。
【０２７０】
実施例３  −  ＣＲＣ０８３１６−ＰｆｉＰｌａ１
ペスタロチオプシス・フィシ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｆｉｃｉ）Ｗ１０６−１ホスホリパーゼＰｆｉＰｌａ１（ＣＲＣ０８３１６）のクローニング
ＣＲＣ０８３１６と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がペスタロチオプシス・フィシ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ  ｆｉｃｉ）Ｗ１０６−１において同定されたが、これは、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）から決定される通り、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＥＴＳ８１２５０．１）と１００％の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長ＣＲＣ０８３１６のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号２０に記載される。完全長ＣＲＣ０８３１６遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号３に示す。ＳｉｇｎａｌＰバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予測されるように、このタンパク質は、Ｎ末端に１８アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、ＣＲＣ０８３１６が、分泌された酵素であることを示唆している。ＣＲＣ０８３１６の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号４に記載される。
【０２７１】
実施例４  −  ＣＲＣ０８３１６の発現
完全長ＣＲＣ０８３１６タンパク質（配列番号２０）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載のｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同じ）に挿入して、プラスミドｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８３１６を取得した。ｐＧＸＴベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ及びｐｙｒ２選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８３１６は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来のプロモータ（ｃｂｈＩ）及びｃｂｈＩターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。次に、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９）を用いて、ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８３１６プラスミドを好適なトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株に形質転換した（公開ＰＣＴ出願国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載の方法）。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する固形培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換コロニーは、約１週間で出現した。アセトアミドプレートでの増殖後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレートで５日の増殖後、安定な形質を呈示する形質転換体を９６ウェルマイクロタイタープレート内の２００μＬグルコース／ソホロース合成培地に接種した。マイクロタイタープレートを２８℃の酸素グロースチャンバー内で５日間インキュベートした。これらの培養物からの上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質発現を確認した。最も高いタンパク質発現を有する安定な株を選択し、グルコース／ソホロース合成培地を含む２５０ｍＬ振盪フラスコ内での発酵に付した。
【０２７２】
ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて、未処理のブロスを約８０ｍＬに濃縮した。次に、硫酸アンモニウムを最終濃度１Ｍまで濃縮溶液に添加した。濾過後、得られた可溶性画分を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び１Ｍ硫酸アンモニウムを含有するローディングバッファーで前均衡した６０ｍＬフェニル−ＦＦセファロースカラムに適用した。標的タンパク質を２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び０．５〜０．３Ｍ硫酸アンモニウムの勾配を用いるカラムから溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で前均衡したＨｉＬｏａｄ  Ｑ＿ＨＰセファロースカラムにロードした。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）及び０〜０．４ＭのＮａＣｌ勾配を用いるカラムから標的タンパク質を溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ装置により濃縮した後、次の使用まで、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）及び４０％グリセロール中に−２０℃で保存した。
【０２７３】
実施例５  −  ＣＲＣ０８３１９−ＭｇｕＰｌａ１
メタリジウム・グイズホウエンス（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｇｕｉｚｈｏｕｅｎｓｅ）ＡＲＳＥＦ  ９７７ホスホリパーゼＭｇｕＰｌａ１（ＣＲＣ０８３１９）のクローニング
ＣＲＣ０８３１９と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がメタリジウム・グイズホウエンス（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ｇｕｉｚｈｏｕｅｎｓｅ）ＡＲＳＥＦ  ９７７において同定されたが、これは、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）から決定される通り、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＫＩＤ９２４７７．１）と１００％の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長ＣＲＣ０８３１９のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号２１に記載される。完全長ＣＲＣ０８３１９遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号５に示す。ＳｉｇｎａｌＰバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予測されるように、このタンパク質は、Ｎ末端に１６アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、ＣＲＣ０８３１９が、分泌された酵素であることを示唆している。ＣＲＣ０８３１９の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号６に記載される。
【０２７４】
実施例６  −  ＣＲＣ０８３１９の発現
完全長ＣＲＣ０８３１９タンパク質（配列番号２１）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載のｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同じ）に挿入して、プラスミドｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８３１９を取得した。ｐＧＸＴベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ及びｐｙｒ２選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８３１９は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来のプロモータ（ｃｂｈＩ）及びｃｂｈＩターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
【０２７５】
次に、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９）を用いて、ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８３１９プラスミドを好適なトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株に形質転換した（公開ＰＣＴ出願国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載の方法）。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する固形培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換コロニーは、約１週間で出現した。アセトアミドプレートでの増殖後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレートで５日の増殖後、安定な形質を呈示する形質転換体を９６ウェルマイクロタイタープレート内の２００μＬグルコース／ソホロース合成培地に接種した。マイクロタイタープレートを２８℃の酸素グロースチャンバー内で５日間インキュベートした。これらの培養物からの上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質発現を確認した。最も高いタンパク質発現を有する安定な株を選択し、グルコース／ソホロース合成培地を含む２５０ｍＬ振盪フラスコ内での発酵に付した。
【０２７６】
ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて、未処理のブロスを約８０ｍＬに濃縮した。次に、硫酸アンモニウムを最終濃度１Ｍまで濃縮溶液に添加した。濾過後、得られた可溶性画分を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び１Ｍ硫酸アンモニウムを含有するローディングバッファーで前均衡した６０ｍＬフェニル−ＦＦセファロースカラムに適用した。標的タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び０．２５Ｍ硫酸アンモニウムを用いるカラムから溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１０％グリセロールをさらに補充した２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で前均衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲル濾過カラムにロードした。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ装置により濃縮した後、次の使用まで、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び４０％グリセロールを補充した２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中に−２０℃で保存した。
【０２７７】
実施例７  −  ＣＲＣ０８４０５−ＤａｍＰｌａ１
ディアポルテ・アンペリナ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ａｍｐｅｌｉｎａ）ホスホリパーゼＤａｍＰｌａ１（ＣＲＣ０８４０５）のクローニング
ＣＲＣ０８４０５と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がディアポルテ・アンペリナ（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ  ａｍｐｅｌｉｎａ）において同定されたが、これは、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）から決定される通り、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＫＫＹ３６５４８．１）と１００％の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長ＣＲＣ０８４０５のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号２２に記載される。完全長ＣＲＣ０８４０５遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号７に示す。ＳｉｇｎａｌＰバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予測されるように、このタンパク質は、Ｎ末端に１８アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、ＣＲＣ０８４０５が、分泌された酵素であることを示唆している。ＣＲＣ０８４０５の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号８に記載される。
【０２７８】
実施例８  −  ＣＲＣ０８４０５の発現
完全長ＣＲＣ０８４０５タンパク質（配列番号２２）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載のｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同じ）に挿入して、プラスミドｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８４０５を取得した。ｐＧＸＴベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ及びｐｙｒ２選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８４０５は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来のプロモータ（ｃｂｈＩ）及びｃｂｈＩターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
【０２７９】
次に、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９）を用いて、ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８４０５プラスミドを好適なトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株に形質転換した（公開ＰＣＴ出願国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載の方法）。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する固形培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換コロニーは、約１週間で出現した。アセトアミドプレートでの増殖後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレートで５日の増殖後、安定な形質を呈示する形質転換体を９６ウェルマイクロタイタープレート内の２００μＬグルコース／ソホロース合成培地に接種した。マイクロタイタープレートを２８℃の酸素グロースチャンバー内で５日間インキュベートした。これらの培養物からの上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質発現を確認した。最も高いタンパク質発現を有する安定な株を選択し、グルコース／ソホロース合成培地を含む２５０ｍＬ振盪フラスコ内での発酵に付した。
【０２８０】
ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて、未処理のブロスを約８０ｍＬに濃縮した。次に、硫酸アンモニウムを最終濃度１Ｍまで濃縮溶液に添加した。濾過後、得られた可溶性画分を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び１Ｍ硫酸アンモニウムを含有するローディングバッファーで前均衡した６０ｍＬフェニル−ＦＦセファロースカラムに適用した。標的タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を用いるカラムから溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で前均衡したＨｉＰｒｅｐ  Ｑ−ＸＬセファロースカラムにロードした。標的タンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）及び０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ装置により濃縮した後、次の使用まで、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び４０％グリセロールを補充した２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）中に−２０℃で保存した。
【０２８１】
実施例９  −  ＣＲＣ０８４１８−ＭｏｒＰｌａ３
イネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）Ｙ３４ホスホリパーゼＭｏｒＰｌａ３（ＣＲＣ０８４１８）のクローニング
ＣＲＣ０８４１８と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がイネいもち病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）Ｙ３４において同定されたが、これは、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）から決定される通り、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＥＬＱ４１９７８．１）と１００％の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長ＣＲＣ０８４１８のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号２３に記載される。完全長ＣＲＣ０８４１８遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号９に示す。ＳｉｇｎａｌＰバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予測されるように、このタンパク質は、Ｎ末端に２５アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、ＣＲＣ０８４１８が、分泌された酵素であることを示唆している。ＣＲＣ０８４１８の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号１０に記載される。
【０２８２】
実施例１０  −  ＣＲＣ０８４１８の発現
完全長ＣＲＣ０８４１８タンパク質（配列番号２３）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載のｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同じ）に挿入して、プラスミドｐＧＸＴ−ＣＲＣ０４１８を取得した。ｐＧＸＴベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ及びｐｙｒ２選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８４１８は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来のプロモータ（ｃｂｈＩ）及びｃｂｈＩターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
【０２８３】
次に、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９）を用いて、ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８４１８プラスミドを好適なトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株に形質転換した（公開ＰＣＴ出願国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載の方法）。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する固形培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換コロニーは、約１週間で出現した。アセトアミドプレートでの増殖後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレートで５日の増殖後、安定な形質を呈示する形質転換体を９６ウェルマイクロタイタープレート内の２００μＬグルコース／ソホロース合成培地に接種した。マイクロタイタープレートを２８℃の酸素グロースチャンバー内で５日間インキュベートした。これらの培養物からの上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質発現を確認した。最も高いタンパク質発現を有する安定な株を選択し、グルコース／ソホロース合成培地を含む２５０ｍＬ振盪フラスコ内での発酵に付した。
【０２８４】
ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて、未処理のブロスを約８０ｍＬに濃縮した。次に、硫酸アンモニウムを最終濃度０．８Ｍまで濃縮溶液に添加した。濾過後、得られた可溶性画分を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び１Ｍ硫酸アンモニウムを含有するローディングバッファーで前均衡した６０ｍＬフェニル−ＦＦセファロースカラムに適用した。標的タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を用いるカラムから溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で前均衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲル濾過カラムにロードした。次に、活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ装置により濃縮した後、次の使用まで、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）及び４０％グリセロールを有する２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中に−２０℃で保存した。
【０２８５】
実施例１１  −  ＣＲＣ０８８２６−ＮｄｉＰｌａ１
ネオネクトリア・ジチシマ（Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ  ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）ホスホリパーゼＮｄｉＰｌａ１（ＣＲＣ０８８２６）のクローニング
ＣＲＣ０８８２６と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がネオネクトリア・ジチシマ（Ｎｅｏｎｅｃｔｒｉａ  ｄｉｔｉｓｓｉｍａ）において同定されたが、これは、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）から決定される通り、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＫＰＭ４５０１２．１）と１００％の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長ＣＲＣ０８８２６のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号２４に記載される。完全長ＣＲＣ０８８２６遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号１１に示す。ＳｉｇｎａｌＰバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予測されるように、このタンパク質は、Ｎ末端に１６アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、ＣＲＣ０８８２６が、分泌された酵素であることを示唆している。ＣＲＣ０８８２６の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号１２に記載される。
【０２８６】
実施例１２  −  ＣＲＣ０８８２６の発現
完全長ＣＲＣ０８８２６タンパク質（配列番号２４）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載のｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同じ）に挿入して、プラスミドｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８８２６を取得した。ｐＧＸＴベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ及びｐｙｒ２選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８８２６は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来のプロモータ（ｃｂｈＩ）及びｃｂｈＩターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
【０２８７】
次に、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９）を用いて、ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８８２６プラスミドを好適なトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株に形質転換した（公開ＰＣＴ出願国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載の方法）。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する固形培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換コロニーは、約１週間で出現した。アセトアミドプレートでの増殖後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレートで５日の増殖後、安定な形質を呈示する形質転換体を９６ウェルマイクロタイタープレート内の２００μＬグルコース／ソホロース合成培地に接種した。マイクロタイタープレートを２８℃の酸素グロースチャンバー内で５日間インキュベートした。これらの培養物からの上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質発現を確認した。最も高いタンパク質発現を有する安定な株を選択し、グルコース／ソホロース合成培地を含む２５０ｍＬ振盪フラスコ内での発酵に付した。
【０２８８】
ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて、未処理のブロスを約８０ｍＬに濃縮した。次に、硫酸アンモニウムを最終濃度１Ｍまで濃縮溶液に添加した。濾過後、得られた可溶性画分を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び１Ｍ硫酸アンモニウムを含有するローディングバッファーで前均衡したＨｉＰｒｅｐフェニルＦＦ  １６／１０カラムに適用した。標的タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び０．５〜０Ｍ硫酸アンモニウムの勾配を用いるカラムから溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で前均衡したＨｉＰｒｅｐ  Ｑ  ＦＦ  １６／１０カラムにロードした。標的タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）及び０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌで前均衡したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  Ｐｒｅｐカラムにロードした。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び１Ｍ硫酸アンモニウムを含有するローディングバッファーで前均衡したＨｉＰｒｅｐフェニルＨＰ  １６／１０カラムにロードした。標的タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び０．７５〜０Ｍ硫酸アンモニウムの勾配を用いて溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ装置により濃縮した後、次の使用まで、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び４０％グリセロール中に−２０℃で保存した。
【０２８９】
実施例１３  −  ＣＲＣ０８８３３−ＴｇａＰｌａ１
トリコデルマ・ガムシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇａｍｓｉｉ）ホスホリパーゼＴｇａＰｌａ１（ＣＲＣ０８８３３）のクローニング
ＣＲＣ０８８３３と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がトリコデルマ・ガムシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｇａｍｓｉｉ）において同定されたが、これは、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）から決定される通り、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＫＵＦ０４７４５．１）と１００％の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長ＣＲＣ０８８３３のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号２５に記載される。完全長ＣＲＣ０８８３３遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号１３に示す。ＳｉｇｎａｌＰバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予測されるように、このタンパク質は、Ｎ末端に１６アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、ＣＲＣ０８８３３が、分泌された酵素であることを示唆している。ＣＲＣ０８８２６の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号１４に記載される。
【０２９０】
実施例１４  −  ＣＲＣ０８８３３の発現
完全長ＣＲＣ０８８３３タンパク質（配列番号２５）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載のｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同じ）に挿入して、プラスミドｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８８３３を取得した。ｐＧＸＴベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ及びｐｙｒ２選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８８３３は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来のプロモータ（ｃｂｈＩ）及びｃｂｈＩターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
【０２９１】
次に、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９）を用いて、ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８８３３プラスミドを好適なトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株に形質転換した（公開ＰＣＴ出願国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載の方法）。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する固形培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換コロニーは、約１週間で出現した。アセトアミドプレートでの増殖後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレートで５日の増殖後、安定な形質を呈示する形質転換体を９６ウェルマイクロタイタープレート内の２００μＬグルコース／ソホロース合成培地に接種した。マイクロタイタープレートを２８℃の酸素グロースチャンバー内で５日間インキュベートした。これらの培養物からの上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質発現を確認した。最も高いタンパク質発現を有する安定な株を選択し、グルコース／ソホロース合成培地を含む２５０ｍＬ振盪フラスコ内での発酵に付した。
【０２９２】
ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて、未処理のブロスを約８０ｍＬに濃縮した。次に、硫酸アンモニウムを最終濃度１Ｍまで濃縮溶液に添加した。濾過後、得られた可溶性画分を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び１Ｍ硫酸アンモニウムを含有するローディングバッファーで前均衡した６０ｍＬフェニル−ＦＦセファロースカラムに適用した。標的タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び０．５Ｍ硫酸アンモニウムを用いるカラムから溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で前均衡したＨｉＬｏａｄ  Ｑ＿ＸＬセファロースカラムにロードした。標的タンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）及び０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ装置により濃縮した後、次の使用まで、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）及び４０％グリセロール中に−２０℃で保存した。
【０２９３】
実施例１５  −  ＣＲＣ０８８４５−ＭａｎＰｌａ１
メタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）ＢＲＩＰ  ５３２９３ホスホリパーゼＭａｎＰｌａ１（ＣＲＣ０８８４５）のクローニング
ＣＲＣ０８８４５と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がメタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）ＢＲＩＰ  ５３２９３において同定されたが、これは、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）から決定される通り、ＮＣＢＩデータベースから入手可能な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＫＪＫ８４２０４．１）と１００％の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長ＣＲＣ０８８４５のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号２６に記載される。完全長ＣＲＣ０８８４５遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号１５に示す。ＳｉｇｎａｌＰバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５−７８６）により予測されるように、このタンパク質は、Ｎ末端に１７アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、ＣＲＣ０８８４５が、分泌された酵素であることを示唆している。ＣＲＣ０８８４５の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号１６に記載される。
【０２９４】
実施例１６  −  ＣＲＣ０８８４５の発現
完全長ＣＲＣ０８８４５タンパク質（配列番号２６）をコードするコドン最適化合成ＤＮＡ配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）発現ベクターｐＧＸＴ（参照により本明細書に組み込まれる公開ＰＣＴ出願国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載のｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同じ）に挿入して、プラスミドｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８８４５を取得した。ｐＧＸＴベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｐｙｒＧ遺伝子がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ及びｐｙｒ２選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８８４５は、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩ由来のプロモータ（ｃｂｈＩ）及びｃｂｈＩターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
【０２９５】
次に、プロトプラスト形質転換（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９）を用いて、ｐＧＸＴ−ＣＲＣ０８８４５プラスミドを好適なトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株に形質転換した（公開ＰＣＴ出願国際公開第０５／００１０３６号パンフレットに記載の方法）。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する固形培地（アセトアミド０．６ｇ／Ｌ；塩化セシウム１．６８ｇ／Ｌ；グルコース２０ｇ／Ｌ；リン酸二水素カリウム１５ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／Ｌ；塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／Ｌ；硫酸鉄（ＩＩ）５ｍｇ／Ｌ；硫酸亜鉛１．４ｍｇ／Ｌ；塩化コバルト（ＩＩ）１ｍｇ／Ｌ；硫酸マンガン（ＩＩ）１．６ｍｇ／Ｌ；寒天２０ｇ／Ｌ；ｐＨ４．２５）上で形質転換体を選択した。形質転換コロニーは、約１週間で出現した。アセトアミドプレートでの増殖後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレートで５日の増殖後、安定な形質を呈示する形質転換体を９６ウェルマイクロタイタープレート内の２００μＬグルコース／ソホロース合成培地に接種した。マイクロタイタープレートを２８℃の酸素グロースチャンバー内で５日間インキュベートした。これらの培養物からの上清を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりタンパク質発現を確認した。最も高いタンパク質発現を有する安定な株を選択し、グルコース／ソホロース合成培地を含む２５０ｍＬ振盪フラスコ内での発酵に付した。
【０２９６】
ＶｉｖａＦｌｏｗ  ２００限外濾過装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を用いて、未処理のブロスを約８０ｍＬに濃縮した。次に、硫酸アンモニウムを最終濃度１Ｍまで濃縮溶液に添加した。濾過後、得られた可溶性画分を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び１Ｍ硫酸アンモニウムを含有するローディングバッファーで前均衡したブチルＦＦカラムに適用した。標的タンパク質を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び０．３〜０Ｍ硫酸アンモニウムの勾配を用いるカラムから溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）で前均衡したＱ  ＨＰカラムにロードした。標的タンパク質を、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）及び０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮した後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）で前均衡したＱ  ＨＰカラムにロードした。標的タンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）及び０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。活性の標的タンパク質を含有する画分をプールし、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ装置により濃縮した後、次の使用まで、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び４０％グリセロール中に−２０℃で保存した。
【０２９７】
実施例１７．Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０及びＬｉｐｏｐａｎ  Ｆと比較した本発明のホスホリパーゼの特性決定
酵素特性決定は、「アッセイ及び方法」に記載した活性法に従い、様々な脂質基質を用いた比活性の決定により実施する。Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０は、ＤｕＰｏｎｔの商品である。Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０は、ｓｎ１位置の極性脂質に作用する。Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０の活性酵素成分は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０１２，７３２号明細書に配列番号６として記載されている（本明細書では配列番号１７としても記載される）。この酵素は、ガラクトリパーゼ及びホスホリパーゼ活性の両方を有することがわかっている。Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓの商品である。Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの活性酵素は、ｓｎ１位置の極性脂質に作用し、参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第０８６９１６７Ｂ号明細書の配列番号２に記載されている（本明細書では配列番号１８としても記載される）。この酵素は、ガラクトリパーゼ活性を有することもわかっている。
【０２９８】
ホスファチジルコリン基質（ＰＣ−Ｐアッセイ）、リゾホスファチジルコリン基質（ＬＰＣ−Ｐアッセイ）、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン基質（ＮＡＰＥ−Ｐアッセイ）及びリゾ−Ｎ−アシルホスファチジルエタノールコリン基質（ＮＡＬＰＥ−Ｐアッセイ）を用いて、比活性を決定する。活性は、タンパク質濃度に対して示され、異なる基質を用いた様々な酵素の比活性を表示する（表２を参照されたい）。
【０２９９】
【表８】
2021508446.tif 000021
【０３００】
表２からわかるように、全ての酵素（Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０及びＬｉｐｏｐａｎ  Ｆを除く）がＬＰＣ及びＮＡＬＰＥ基質に対して非常に低い比活性を示す。ＬＰＣ対ＰＣの比並びにＮＡＬＰＥ対ＮＡＰＥ活性の比を表３に示す。
【０３０１】
【表９】
2021508446.tif 000022
【０３０２】
表３から、試験対象の候補は、Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０及びＬｉｐｏｐａｎ  Ｆなどの既存の市販酵素製品よりも、リン脂質基質に比べてリゾリン脂質基質に対して有意により低い活性を示すことが明らかである。
【０３０３】
評価対象の候補は、驚くべきことに、リゾホスホリパーゼ活性が全くないか又は極めて低いことを特徴とする新しい群のホスホリパーゼ（「非リゾ−ホスホリパーゼ」）を提供する。
【０３０４】
既存の市販製品は、それぞれ０．０２及び０．１３を超えるＬＰＣ−Ｕ／ＰＣ−Ｕ又はＮＡＬＰＥ−Ｕ／ＮＡＰＥ−Ｕ比を示すが、これと対照的に、「非リゾ−ホスホリパーゼ」は、それぞれ０．００２及び０．００１６未満の比を示す。このように、「非リゾ−ホスホリパーゼ」の比は、既存の市販製品よりそれぞれ１０及び８０倍低い。
【０３０５】
「非リゾ−ホスホリパーゼ」活性のこの特徴は、脂質を含有する食品マトリックス中に乳化成分を生成するより頑健なシステムの機会を提供する。「非リゾ−ホスホリパーゼ」は、既存の市販の酵素に見られる過剰用量のリスクを排除することにより、より頑健なシステムを提供する。「非リゾ−ホスホリパーゼ」は、生成される乳化成分（リゾ−リン脂質様、すなわちＬＰＣ又はＮＡＬＰＥ）の分解というリスクを冒すことなく、乳化成分の生成を可能にする。従って、リゾ−リン脂質成分が生成されるだけでなく、さらに加水分解／分解されるという、市販の酵素に観察される「ロールオーバー効果」が排除され、全体的としてより高レベルの乳化成分の可能性をもたらす。
【０３０６】
実施例１８．ホスホリパーゼ位置特異性の特性決定。
特定設計のＰＣ及びＮＡＰＥ基質からの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の遊離の測定により、酵素位置特異性について特性決定した。ＦＦＡ測定は、「アッセイ及び方法」において、「ホスホリパーゼ活性並びにＰＣ（ホスファチジルコリン）に対するｓｎ１及びｓｎ２位置特異性の決定のためのアッセイ」及び「ホスホリパーゼ活性並びにＮＡＰＥ（Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン）に対するｓｎ１及びｓｎ２位置特異性の決定のためのアッセイ」後の「ガスクロマトグラフィー（ＧＬＣ）」に記載されている通り、ＧＬＣ分析により実施した。
【０３０７】
ＧＬＣ分析により遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の遊離を検定することによって特異性を決定した。内部標準（脂肪酸Ｃ１７：０）に基づいて、ＰＣアッセイではＣ１６：０及びＣ１８：１脂肪酸の量を、ＮＡＰＥアッセイではＣ１６：０及びＣ１８：２脂肪酸の量をそれぞれ測定した。位置特異性は、相対ＰＬＡ１活性（％）及び相対ＰＬＡ２活性（％）として表す。ＰＣ及びＮＡＰＥ位置特異性アッセイをそれぞれ用いた様々な候補の特異性決定については、表４及び４ａを参照されたい。
【０３０８】
【表１０】
2021508446.tif 000023
【０３０９】
【表１１】
2021508446.tif 000024
【０３１０】
実施例１９．市販のホスホリパーゼＬｉｐｏｐａｎ  Ｆに対する「非リゾ−ホスホリパーゼ」の適用効果及び生地脂質プロファイリングを試験する焼成実験
この実験では、用量を増加することによる適用効果及び生地マトリックスの相関脂質プロファイリングを示すために、既存の市販ホスホリパーゼ製品Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆをクラスティロール（Ｃｒｕｓｔｙ  Ｒｏｌｌ）実験計画で試験した。さらに、「非リゾ−ホスホリパーゼ」ＣＲＣ０８３１９の適用効果及び生地脂質プロファイリングを比較試験した。
【０３１１】
クラスティロール焼成は、上の「アッセイ及び方法」セクションに記載した「クラスティロール」の説明に従って実施した。
【０３１２】
適用試験の実験計画及び焼成評価からの結果並びに生地脂質プロファイリングは、それぞれ表５（Ａ及びＢ）、図１（Ａ及びＢ）並びに図２に表示する（Ａ及びＢ）。
【０３１３】
表５Ａ及びＢ．クラスティロール焼成における酵素用量応答試験の実験計画。
用量は、全てＬｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量に対する用量として（ｍｇタンパク質／ｋｇ小麦粉の基準で比較して）表される。Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量は、記載される焼成計画で最も高い比体積をもたらす用量として定義される。最適Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量は、「１」として表される。負の対照は、「０」により表される。
【０３１４】
例えば、Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量応答試験２（表５Ａ）：０．１０のＬｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量は、この試験でのＬｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量が「０．１０×Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量」であったこと、又は換言すれば、この試験でのＬｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量が、Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量を示す試験で使用される用量の１０％であったことを示している（試験は、最も高い比体積を示す（試験４））。
【０３１５】
【表１２】
2021508446.tif 000025
【０３１６】
【表１３】
2021508446.tif 000026
【０３１７】
図１Ａは、Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量の関数として表されるクラスティロール比体積（ｃｃｍ／ｇ）を描く。
【０３１８】
Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量は、記載の焼成計画で最も高い比体積をもたらすＬｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量として定義され、最適Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量は、「１」で表される。表示される他の全ての用量は、最適Ｌｉｐｏｐａｎ用量（ｍｇタンパク質／ｋｇ小麦粉の基準で）と比較したものである。０は、負の対照を表す。Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの用量応答である。０は、負の対照（酵素添加なし）を示し、「１」は、最適Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量（＝最も高い比体積）を示す。
【０３１９】
図１Ｂは、「ＣＲＣ０８３１９−非リゾ−ホスホリパーゼ」の用量応答を描く。０は、負の対照（酵素添加なし）を示し、ＣＲＣ０８３１９用量は、最適Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量に対して（ｍｇタンパク質／ｋｇ小麦粉を基準とする相対用量）表される。
【０３２０】
Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆは、「１×最適用量」により表される最適用量を示す。Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの用量が増加すると、比体積の減少により表される過剰用量を示す。対照的に、ＣＲＣ０８３１９の用量の増加は、比体積の連続的増加又は安定状態を示す。
【０３２１】
完全に発酵させた生地を冷凍し、凍結乾燥させた後、乾燥生地中の脂質を水飽和ブタノールで抽出し、アッセイ及び方法に記載した手順に従ってＨＰＬＣにより分析した。結果を図２に示す。
【０３２２】
比体積に対する適用効果は、脂質プロフィールにより支持される。既存の市販製品（Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆ）は、ＮＡＰＥのＮＡＬＰＥへの加水分解を示し、用量が高くなると、ＮＡＬＰＥからＮＡＧＰＥへのさらなる加水分解を示し、これは、比体積の減少と連係している。
【０３２３】
ＮＡＰＥの８０％加水分解（ＮＡＰＥは、開始レベル（開始レベル＝０×最適用量（負の対照））の２０％まで減少）で、Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆは、約６０％のＮＡＬＰＥ生成を呈示する。このＮＡＰＥの８０％加水分解及びＮＡＬＰＥの６０％生成は、Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量（最も高い比体積＝１×最適用量）と相関する。Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆは、比体積と、ＮＡＬＰＥレベルのピークとの間に連係を示す。Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの場合、約６０％でのＮＡＬＰＥレベルのピーク後、より高い試験用量（最適用量（１）を超える用量）でＮＡＬＰＥの減少が起こり、これは、ＮＡＧＰＥの形成と連係していることが明らかである。最も高い用量のＬｉｐｏｐａｎ  Ｆで最も高いレベルのＮＡＧＰＥが観測される。
【０３２４】
対照的に、「非リゾ−ホスホリパーゼ」（ＣＲＣ０８３１９）は、ＮＡＰＥからＮＡＬＰＥへの完全な転化を呈示する。ＮＡＰＥの８０％加水分解（ＮＡＰＥは、開始レベルの２０％まで減少）で、ＮＡＬＰＥレベルは、８０％である。ＮＡＰＥがさらに加水分解すると、「非リゾ−ホスホリパーゼ」は、ＮＡＬＰＥレベルの連続的増加又は安定状態を示し、これは、比体積とも連係している。
【０３２５】
ＮＡＰＥの十分な加水分解（＞９０〜９５％の加水分解）で、ＮＡＬＰＥレベルの連続的増加又は安定状態と共に反応均衡が現れ始める。
【０３２６】
「非リゾ−ホスホリパーゼ」が、Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量の２０倍（完全なＮＡＰＥ加水分解（約１０％の残留ＮＡＰＥ）をもたらす「非リゾ−ホスホリパーゼ」の用量の４〜６倍に相当する）投与された場合でも、ＮＡＧＰＥレベルは、依然として５％に満たない。
【０３２７】
実施例２０．脂質含有食品マトリックスへの非リゾ−ホスホリパーゼの適用
非リゾ−ホスホリパーゼは、例えば、卵黄及び全卵、加工肉、植物油の精錬、チーズなどの乳製品、並びにパンなどの焼成製品、並びにケーキ及びクッキーをはじめとする焼き菓子製品などの焼成製品に使用することができる。
【０３２８】
卵黄を含有する製品
卵黄は、その乳化特性のために食品産業での使用がよく知られている。卵黄中の脂質の約３０％は、リン脂質であり、これが卵黄の乳化特性に寄与している。マヨネーズ、ソース、ドレッシング及びケーキを含む多くの商品において、卵黄の乳化特性が活用されている。しかし、一部の食品用途では、卵黄の乳化特性は、分離なしで均質な製品を取得するのに十分ではない。例えば、マヨネーズの場合、高温で製品を殺菌すると、製品の分離を引き起こす。卵黄（及び卵黄を含有する食品）中のリン脂質をリゾリン脂質に修飾するために、非リゾ−ホスホリパーゼを用いることができる。酵素修飾卵黄を用いて、高温殺菌での製品の分離を回避することができる。
【０３２９】
加工肉製品
非リゾ−ホスホリパーゼを加工肉製品に使用することができる。非リゾ−ホスホリパーゼは、加工肉製品の乳化の改善に寄与すると共に、稠度の向上及び調理損失の低減に寄与する。加工肉に添加された非リゾ−ホスホリパーゼは、食肉のリン脂質をリゾリン脂質に転化する。リゾリン脂質の乳化特性のために、この成分は、食肉中の脂肪の乳化改善によって稠度の向上及び調理によって生じる損失の低減に寄与する。
【０３３０】
植物油
ダイズ油などの未処理の植物油は、１〜２％のリン脂質を含有する。リン脂質は、油の品質を高めると共に、油中の沈殿を防止するために精製工程中に油から除去される。リン脂質の除去は、精油工程中のいわゆる精錬工程によって実施される。精錬は、化学又は酵素手段によって実施することができる。精錬工程では、「非リゾ−ホスホリパーゼ」を用いて、リン脂質をリゾリン脂質に転化することができ、これは、より水溶性であり、水での洗浄により油から除去することができる。リン脂質の酵素的加水分解は、過酷なアルカリ性又は酸性条件を必要とする化学的精錬と比較してより穏やかな工程である。非リゾホスホリパーゼを用いた精錬で生じる廃液は、より少量である。
【０３３１】
乳製品
非リゾ−ホスホリパーゼを乳製品に用いることができる。非リゾ−ホスホリパーゼは、チーズ生産での生産量増加に寄与する。牛乳に添加された非リゾ−ホスホリパーゼは、乳リン脂質をリゾリン脂質に転化する。リゾリン脂質の乳化特性のために、これは、より多くの脂質をチーズカードに閉じ込めることによってチーズ生産量の増加に寄与することになる。
【０３３２】
焼き菓子製品
卵は、ほとんどのケーキ製品の主要な部分である。非リゾ−ホスホリパーゼを用いて、リゾ−リン脂質の生成により卵のリン脂質を修飾することができ、これは、ケーキ混合工程中の乳化の改善に寄与して、より柔らかく、且つより柔軟なクラムを付与する。また、非リゾ−ホスホリパーゼをケーキ生地に直接使用して、小麦粉のリン脂質を修飾することもできる。
【０３３３】
実施例２１．追加基質−レシチン（ＳＯＬＥＣ  Ｆ）の存在下での「非リゾ−ホスホリパーゼ」の焼成効果
この実施例では、「非リゾ−ホスホリパーゼ」ＣＲＣ０８３１９とＰｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０の組合せをＳＯＬＥＣ  Ｆの形態の追加基質の存在下及び非存在下で試験した。ＳＯＬＥＣ  Ｆは、ＤｕＰｏｎｔの商品である。ＳＯＬＥＣ  Ｆは、取り扱いが容易な脱油ダイズレシチンである。「非リゾ−ホスホリパーゼ」ＣＲＣ０８３１９とＰｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０は、追加基質の存在下で衝撃及び非衝撃量の両方に著しい改善を示す。ＣＲＣ０８３１９及びＰｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０の非存在下での追加基質の効果は非常に限定的であり、衝撃安定性に関して恐らくマイナスですらある。スポンジ及び生地焼成の流れは、上の「アッセイ及び方法」セクションに記載される「スポンジ及び生地」の説明に従って実施した。
【０３３４】
適用試験の実験計画及び焼成評価からの結果をそれぞれ表６及び図３に表示する。
【０３３５】
実施例１９に示すように、ＣＲＣ０８３１９の用量は、Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量に対する用量として（ｍｇタンパク質／ｋｇ小麦粉の基準で比較して）表示される。Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量は、実施例１９に示すクラスティロール焼成計画で最も高い比体積を付与する用量として定義される。最適なＬｉｐｏｐａｎ  Ｆ用量は、「１」で表し、負の対照は、「０」として示す。
【０３３６】
例えば、この試験において５×のＣＲＣ０８３１９用量は、実施例１９のクラスティロール適用試験に示すように「５×Ｌｉｐｏｐａｎ  Ｆの最適用量」（ｍｇタンパク質／ｋｇ小麦粉の基準で）であった。
【０３３７】
【表１４】
2021508446.tif 000027
【０３３８】
図３は、ＳＯＬＥＣ  Ｆの存在下及び非存在下の「ＣＲＣ０８３１９＋Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０」の効果としてのスポンジ及び生地の相対比体積を示す。
【０３３９】
図３は、衝撃及び非衝撃ローフの相対比体積（負の非衝撃対照と比較して）を示す。スポンジ及び生地試験は、ＳＯＬＥＣ  Ｆの非存在下において、負の対照（Ｎｅｇ  Ｃｔｒｌ）に対する「ＣＲＣ０８３１９＋Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０」の比体積の明らかな増加（非衝撃及び衝撃）を示す。ＳＯＬＥＣ  Ｆの存在下の「ＣＲＣ０８３１９＋Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０」の効果は、追加ＳＯＬＥＣ  Ｆの非存在下の「ＣＲＣ０８３１９＋Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ  ４０８０」に対して、比体積のさらなる増加をもたらす。
【０３４０】
以上では、明快な理解のために、例示及び例としてある程度詳細に本発明を説明してきたが、添付の特許請求の範囲を逸脱することなく、特定の変更形態及び修正形態がなされ得る。さらに、本明細書に記載される各参照文献は、各参照文献が参照により個別に組み込まれているのと同じ程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。ウェブサイト又はアクセッション番号を含め、全ての引用の内容は、時間と共に変化し得ることから、本出願の出願日の時点で有効なバージョンが意図される。文脈から明白である場合を除き、実施形態の任意のステップ、要素、態様、特徴をいずれか他のものと組み合わせて用いることができる。
【０３４１】
配列表
【化３】
2021508446.tif 000028
【化４】
2021508446.tif 000029
【化５】
2021508446.tif 000030
【化６】
2021508446.tif 000031
【化７】
2021508446.tif 000032
【化８】
2021508446.tif 000033
【化９】
2021508446.tif 000034
【化１０】
2021508446.tif 000035
【化１１】
2021508446.tif 000036
【化１２】
2021508446.tif 000037
【化１３】
2021508446.tif 000038
【化１４】
2021508446.tif 000039
【化１５】
2021508446.tif 000040
【化１６】
2021508446.tif 000041
【化１７】
2021508446.tif 000042
【化１８】
2021508446.tif 000043
【化１９】
2021508446.tif 000044
【化２０】
2021508446.tif 000045
【化２１】
2021508446.tif 000046
【化２２】
2021508446.tif 000047
【化２３】
2021508446.tif 000048
【図１】
2021508446.tif 000049
【図２】
2021508446.tif 000050
【図３】
2021508446.tif 000051
【配列表】
2021508446000001.app
【国際調査報告】
2021508446.tif 000052
2021508446.tif 000053
2021508446.tif 000054
2021508446.tif 000055
2021508446.tif 000056
2021508446.tif 000057
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