(57)【要約】【課題】Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体の提供。【解決手段】本発明は、Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関し、上記抗体は、下記式（Ｉ）で表される、３つのＣＤＲ領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）及び４つのヒンジ領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）からなるアミノ酸配列を有し、有利にはＦＲＥＴで測定した解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満である。      ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （Ｉ）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であって、下記式（Ｉ）で表される、３つのＣＤＲ領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）及び４つのヒンジ領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）からなるアミノ酸配列を有し、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （Ｉ）
上記抗体は、ＦＲＥＴで測定した完全なＧタンパク質αに対する解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満である、単一ドメイン抗体。
【請求項２】
ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号６５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、
ＣＤＲ２は、配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、及び配列番号６６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、及び配列番号６７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であって、下記式（Ｉ）で表される、３つのＣＤＲ領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）及び４つのヒンジ領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）からなるアミノ酸配列を有し、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （Ｉ）
ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号６５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、
ＣＤＲ２は、配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、及び配列番号６６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、及び配列番号６７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する、単一ドメイン抗体。
【請求項４】
ＣＤＲ１は配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２は配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＣＤＲ１は配列番号９と少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２は配列番号１０と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は配列番号１１と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＣＤＲ１は配列番号１７と少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２は配列番号１８と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は配列番号１９と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＣＤＲ１は配列番号２５と少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２は配列番号２６と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は配列番号２７と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＣＤＲ１は配列番号３３と少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２は配列番号３４と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は配列番号３５と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＣＤＲ１は配列番号４１と少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２は配列番号４２と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は配列番号４３と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＣＤＲ１は配列番号４９と少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２は配列番号５０と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は配列番号５１と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＣＤＲ１は配列番号５７と少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２は配列番号５８と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は配列番号５９と少なくとも８０％の相同性を有するか；あるいは
ＣＤＲ１は配列番号６５と少なくとも８０％の相同性を有し、ＣＤＲ２は配列番号６６と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は配列番号６７と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
ＦＲ１は、配列番号５、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、及び配列番号６８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、
ＦＲ２は、配列番号６、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５３、配列番号６１、及び配列番号６９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、
ＦＲ３は、配列番号７、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、及び配列番号７０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、且つ
ＦＲ４は、配列番号８、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、及び配列番号７１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
ＦＲ１は配列番号５と少なくとも８０％の相同性を有し、ＦＲ２は配列番号６と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ３は配列番号７と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＦＲ１は配列番号１２と少なくとも８０％の相同性を有し、ＦＲ２は配列番号１３と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ３は配列番号１４と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＦＲ１は配列番号２０と少なくとも８０％の相同性を有し、ＦＲ２は配列番号２１と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ３は配列番号２２と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＦＲ１は配列番号２８と少なくとも８０％の相同性を有し、ＦＲ２は配列番号２９と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ３は配列番号３０と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＦＲ１は配列番号３６と少なくとも８０％の相同性を有し、ＦＲ２は配列番号３７と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ３は配列番号３８と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＦＲ１は配列番号４４と少なくとも８０％の相同性を有し、ＦＲ２は配列番号４５と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ３は配列番号４６と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＦＲ１は配列番号５２と少なくとも８０％の相同性を有し、ＦＲ２は配列番号５３と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ３は配列番号５４と少なくとも８０％の相同性を有するか；
ＦＲ１は配列番号６０と少なくとも８０％の相同性を有し、ＦＲ２は配列番号６１と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ３は配列番号６２と少なくとも８０％の相同性を有するか；あるいは
ＦＲ１は配列番号６８と少なくとも８０％の相同性を有し、ＦＲ２は配列番号６９と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ３は配列番号７０と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
上記式（Ｉ）のアミノ酸配列が、配列番号４、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、及び配列番号７２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
上記式（Ｉ）のアミノ酸配列が、配列番号４、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、及び配列番号７２から選択されるアミノ酸配列と１００％の相同性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
上記抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＶＨＨ型重鎖可変領域（ＶＨＨ）、ＶＨ型重鎖抗体（ＶＨ  ＨｃＡｂ）、ＶＨＨ型重鎖抗体（ＶＨＨ  ＨｃＡｂ）、軟骨魚類由来抗免疫グロブリン新規抗原受容体ＩｇＧ重鎖抗体（Ｉｇ  ＮＡＲ）、又はＩｇ  ＮＡＲ可変領域（Ｖ−ＮＡＲ）から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
上記抗体の検出を可能にする分子と結合している請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
上記分子は、ペプチドタグ、酵素、放射性核種、蛍光化合物、発光化合物、染料、有利にはＦＲＥＴパートナー対のメンバーから選択される、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）をコードする核酸配列。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸配列を有する組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクター又は請求項１２に記載の核酸配列を有する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体分野、特にＧタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の分野に関する。本発明に係るｓｄＡｂは、その検出を可能にする分子と結合した重鎖抗体（ＨｃＡｂ）等の形態でＦＲＥＴに使用にするのに特に好適である。
【背景技術】
【０００２】
「Ｇタンパク質共役受容体」すなわち「ＧＰＣＲ」は、哺乳類で最もよく見られる膜受容体である。これらの受容体は、様々な生理学的プロセス（例えば、視覚、嗅覚、多数のホルモンや神経ペプチドの作用の仲介等）に関連する多種多様な細胞応答の起点である。これらの受容体は、例えば、光子、イオン、嗅覚分子、味覚分子、アミノ酸、核酸、脂質、カンナビノイド等の外因性分子、ケモカイン、又はホルモン等、非常に多様な性質のリガンドによって活性化される。
【０００３】
これらの受容体は、αヘリックス形態の膜貫通領域を７つ有し、それぞれの領域が２２〜２４個のアミノ酸を有している。ヒトのＧＰＣＲは、ロドプシン（Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）、接着因子（Ａｄｈｅｓｉｏｎ）、セクレチン（Ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、及びフリズルド／苦味（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｔａｓｔｅ  ２）と呼ばれる５つの主要なファミリーに分類される（非特許文献１）。ＧＰＣＲは、リガンドによる活性化レベルに応じて、機能的立体構造状態を基礎立体構造状態に対して変化させる。特定のリガンドと結合することでＧＰＣＲが活性化されると、そのアゴニスト／受容体複合体の立体構造が変化することによって、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を活性化できる。
【０００４】
Ｇタンパク質は、細胞外部からのシグナルを細胞内部に伝達することを目的とした生化学反応カスケードを開始することで、ＧＰＣＲからの活性化シグナルを伝達するヘテロ３量体タンパク質である。Ｇタンパク質は細胞膜の内面に位置し、３つのサブユニット（α、β、γ）から形成されている。αサブユニットはＧＤＰ又はＧＴＰのいずれかのグアニンヌクレオチドと結合することができる。
【０００５】
ＧＰＣＲ及びＧタンパク質の一般に述べられる作用メカニズムを図１に示し、以下に概要を示す。
・不活性な休止状態では、Ｇタンパク質のαサブユニットはＧＤＰヌクレオチドに結合している（ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質）。
・ＧＰＣＲの活性化後、ＧＰＣＲはＧタンパク質のαサブユニットに結合し、以下の２つの工程（１）及び（２）からなるＧタンパク質活性化プロセスを引き起こす。（１）Ｇタンパク質のＧＤＰが放出されて空のＧタンパク質となり、不活性なＧＰＣＲ／空のＧタンパク質複合体が形成される。（２）ＧＴＰが結合してＧＴＰ形態の活性Ｇタンパク質が形成される（ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質）。第一の工程では、受容体に結合したＧタンパク質はいわゆる「空の形態」である。文献では、この状態は一過性とされている。というのは、ＧＴＰヌクレオチドがＧタンパク質のαサブユニットにすぐに結合するといわれているからである。また、活性化Ｇタンパク質のβ／γサブユニットがαサブユニットから解離する。
・次いで、ＧＴＰに結合した完全なＧタンパク質のαサブユニットは、エフェクターに結合してエフェクターを活性化させる。すると、エフェクターはシグナル伝達経路を活性化させて、細胞応答が起こる。
・次いで、ＧＴＰはＧタンパク質のαサブユニットにより加水分解されてＧＤＰとなり、αサブユニットがβ／γサブユニットと再結合して、ＧＤＰに結合した完全なＧタンパク質を再形成する（不活性状態）。
【０００６】
Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｏ１、Ｇαｏ２、Ｇαｑ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇαｓ、Ｇαｚ、Ｇαｔ１、Ｇαｔ２、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇα１５、Ｇα１６、又はＧαｇｕｓという少なくとも１７個の異なるαサブユニットが存在する。
【０００７】
ＧＰＣＲは多くのシグナル伝達経路に関与していることから、先行技術において、その活性を研究するための手段が開発されており、多くの場合、治療活性を有する可能性のあるこれらの受容体の新規なリガンドを同定することを目的としている。そのような手段の例としては、ＧＴＰの非加水分解性又は低加水分解性放射性誘導体、特にＧＴＰ−γ−Ｓ（受容体が活性化されるとＧタンパク質αに結合する）の使用が挙げられる。また、ルシフェラーゼ（その発現は、受容体が活性化することで産生される二次メッセンジャーによって制御される）等の酵素活性の測定に基づく組換えシステムがある。また、細胞表面レベルでのＧＰＣＲ活性化を検知するための抗体が合成されている（非特許文献２）。また、Ｇタンパク質αとＧタンパク質β／γとの界面に結合することでＧＰＣＲ／Ｇタンパク質複合体を安定化させることができるナノ抗体を提案する特許文献１が挙げられる。
【０００８】
しかしながら、先行技術の手段において、Ｇタンパク質のαサブユニットを特異的に検出できるものはなく、ましてや、特にＦＲＥＴで使用するための、Ｇタンパク質αに結合するｓｄＡｂはない。従って、本発明は、Ｇタンパク質α（Ｇタンパク質α）に結合する重鎖抗体（ＨｃＡｂ）等の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を提案しており、有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第２７２３７６４号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３
【非特許文献２】Ｄａｍｉｅｎ  Ｍａｕｒｅｌ．Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｄｅｓ  ｒｅｃｅｐｔｅｕｒｓ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ａｕｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｅｓ  Ｇ：ｄｅｕｘ  ｏｕ  ｐｌｕｓ？  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｄｅ  ＦＲＥＴ  ｅｎ  ｔｅｍｐｓ  ｒｅｓｏｌｕ  ａｕ  ｃａｓ  ｄｕ  ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ  ＧＡＢＡＢ．Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ．Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  １  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００６，フランス語
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【００１２】
本発明の第１の主題は、Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関し、上記抗体は、下記式（Ｉ）で表される、３つのＣＤＲ領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）及び４つのヒンジ領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）からなるアミノ酸配列を有し、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （Ｉ）
上記抗体は、ＦＲＥＴで測定した完全なＧタンパク質αに対する解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満である。
【００１３】
本発明の第２の主題は、Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関し、上記抗体は、下記式（Ｉ）で表される、３つのＣＤＲ領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）及び４つのヒンジ領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）からなるアミノ酸配列を有し、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （Ｉ）
・ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号６５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、
・ＣＤＲ２は、配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、及び配列番号６６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、且つ
・ＣＤＲ３は、配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、及び配列番号６７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する。
【００１４】
本発明の第３の主題は、本発明に係る単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）をコードする核酸配列に関する。
【００１５】
本発明の第４の主題は、本発明に係る核酸配列を有する組換えベクターに関する。
【００１６】
本発明の第５の主題は、本発明に係るベクター又は本発明に係る核酸配列を有する細胞に関する。
【００１７】
別段の指示がない限り、「本発明に係る抗体」、「本発明の抗体」、「本発明に係るｓｄＡｂ」、又は「本発明のｓｄＡｂ」は、本発明に係る第１の主題と本発明に係る第２の主題の両方を指す。
【００１８】
本発明の各主題を以下に詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＧＰＣＲの活性化メカニズム及びＧタンパク質αの活性化の各段階、すなわち不活性化形態（ＧＤＰに結合したＧタンパク質α）と活性化形態（ＧＴＰに結合したＧタンパク質α）とを示す。
【図２】図３〜１１で実施される、重鎖可変領域（ＶＨ）の親和性（Ｋｄ）を測定するＨＴＲＦ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイの原理を示す。
【図３】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＶＨ  Ｆ９の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＴＰｇＳ（１０μＭ）をロードする。ＶＨ  Ｆ９／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは３２ｎＭである。
【図４】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＶＨ  Ｆ１１の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＴＰｇＳ（１０μＭ）をロードする。ＶＨ  Ｆ１１／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは３ｎＭである。
【図５】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＶＨ  Ｂ１１の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＴＰｇＳ（１０μＭ）をロードする。ＶＨ  Ｂ１１／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは１ｎＭである。
【図６】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＶＨ  Ｆ４の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＴＰｇＳ（１０μＭ）をロードする。ＶＨ  Ｆ４／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは３１ｎＭである。
【図７】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＶＨ  Ｇ６の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＴＰｇＳ（１０μＭ）をロードする。ＶＨ  Ｇ６／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは９５ｎＭである。
【図８】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＶＨ  Ａ１０の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＤＰ（１０μＭ）をロードする。ＶＨ  Ａ１０／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは１５ｎＭである。
【図９】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＶＨ  Ｇ７の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＤＰ（１０μＭ）をロードする。ＶＨ  Ｇ７／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは３１ｎＭである。
【図１０】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＶＨ  Ｆ２の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＤＰ（１０μＭ）をロードする。ＶＨ  Ｆ２／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは１４ｎＭである。
【図１１】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＶＨ  Ｅ２の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＤＰ（１０μＭ）をロードする。ＶＨ  Ｅ２／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは７２ｎＭである。
【図１２】図１３〜１６で実施される、ＶＨ型ＨｃＡｂ（ＶＨ  ＨｃＡｂ）の親和性（Ｋｄ）を測定するＴＲ−ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）アッセイの原理を示す。
【図１３】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＨｃＡｂ−Ｂ１１の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図１２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＴＰｇＳ（１０μＭ）をロードする。ＨｃＡｂ−Ｂ１１／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは１ｎＭである。
【図１４】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＨｃＡｂ−Ｆ９の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図１２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＴＰｇＳ（１０μＭ）をロードする。ＨｃＡｂ−Ｆ９／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは３ｎＭである。
【図１５】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＨｃＡｂ−Ｇ７の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図１２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＤＰ（１０μＭ）をロードする。ＨｃＡｂ−Ｇ７／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは５ｎＭである。
【図１６】ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイによるＨｃＡｂ−Ａ１０の親和性（Ｋｄ）測定を示す。図１２で詳述したアッセイの原理を用いる。Ｇαｉ１タンパク質に過剰のＧＤＰ（１０μＭ）をロードする。ＨｃＡｂ−Ａ１０／Ｇαｉ１タンパク質相互作用について得られたＫｄは３ｎＭである。
【図１７】本発明に係るｓｄＡｂ抗体が取り得る様々な形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本出願人らは、完全なＧタンパク質αに対する親和性が良好な、Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を開発した。このｓｄＡｂは、治療薬、診断薬、及び／又はＧタンパク質α検出薬として、特にＦＲＥＴ型プロセスにおけるＧタンパク質α検出薬として、特に強力な手段となる。
【００２１】
定義
「抗Ｇタンパク質α抗体」、「Ｇタンパク質αに結合する抗体」、及び「Ｇタンパク質αに特異的に結合する抗体」という用語は交換可能であり、Ｇタンパク質αを標的にすることで抗体が検出薬（例えばＦＲＥＴアッセイ用）、診断薬、及び／又は治療薬として有用となるのに充分な親和性でＧタンパク質αに結合する抗体を意味する。
【００２２】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子によりコードされる、抗原と結合可能なポリペプチドを意味すると理解される。本明細書において「抗体」という用語はその最も広い意味において使用され、所望の抗原結合活性を有する多様な抗体構造を包含するものであり、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。「従来の」抗体（例えば、ヒトのＧ型免疫グロブリン（ＩｇＧ）が該当する）は、軽鎖と呼ばれる同一のポリペプチド鎖と、重鎖と呼ばれる２本の同一のポリペプチド鎖との２対を含む四量体の形態である。各鎖のＮ末端には可変領域があり（重鎖の場合は「ＶＨ」、軽鎖の場合は「ＶＬ」）、これら２つの可変領域ＶＨ及びＶＬによって抗原認識が可能となる。各可変領域は、通常、４つの「ヒンジ領域」（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４と呼ばれる）と、抗原との結合に直接関与する「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる）と含む。一般的に、各可変領域はＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４という形態を有する。通常（例えばヒトのＩｇＧが該当する）、抗原との結合は２つの可変領域（すなわち、軽鎖可変領域ＶＬと重鎖可変領域ＶＨ）の対により行われる。すなわち、１つの抗原結合部位の形成には６つのＣＤＲが関与する。
【００２３】
一方、単一ドメイン抗体の場合、抗原結合部位の形成に関与するのは３つのＣＤＲのみである。従って、単一ドメイン抗体の抗原結合部位は３つのＣＤＲにより形成される。そのため、「単一ドメイン抗体」及び「ｓｄＡｂ」という用語は交換可能であり、抗原との結合を単一の可変領域により行う抗体を指す。ｓｄＡｂは、（ｉ）その他の可変領域とは独立して抗原に結合する、抗原に結合可能な重鎖可変領域（ＶＨ）又はその断片を含むか、あるいはそれからなる抗体、（ｉｉ）その他の可変領域とは独立して抗原に結合する、抗原に結合可能な軽鎖可変領域（ＶＬ）又はその断片を含むか、あるいはそれからなる抗体、又は（ｉｉｉ）その他の可変領域とは独立して抗原に結合する、抗原に結合可能なＶＨＨ型重鎖可変領域（ＶＨＨ）又はその断片を含むか、あるいはそれからなる抗体であってもよい。
【００２４】
「ＶＨ型重鎖抗体」又は「ＶＨ  ＨｃＡｂ」とは、ＶＨ型可変領域をそれぞれ含む２本の重鎖からなる抗体を意味すると理解される。特に、各重鎖はＣＨ２及びＣＨ３断片と上記ＶＨ型可変領域とからなる。
【００２５】
「ＶＨＨ型重鎖抗体」又は「ＶＨＨ  ＨｃＡｂ」とは、ＶＨＨ型可変領域をそれぞれ含む２本の重鎖からなる抗体を意味すると理解される。特に、各重鎖はＣＨ２及びＣＨ３断片と上記ＶＨＨ型可変領域とからなる。
【００２６】
本発明の目的において、「完全なＧタンパク質α」又は「Ｇタンパク質αの完全な形態」という用語は、ＧＴＰ、ＧＤＰ、又はこれらの類似体、例えば非加水分解性若しくは低加水分解性ＧＴＰに結合したＧタンパク質αを意味する。従って、これらの用語は、ＧＤＰ若しくはＧＤＰ類似体に結合したＧタンパク質α（「ＧＤＰに結合したＧタンパク質α」）、又はＧＴＰ若しくはＧＴＰ類似体、例えば非加水分解性若しくは低加水分解性ＧＴＰに結合したＧタンパク質α（「ＧＴＰに結合したＧタンパク質α」）を意味する。完全なＧタンパク質α（ＧＤＰに結合したＧタンパク質α又はＧＴＰに結合したＧタンパク質α）を図１に示す。
【００２７】
「ＧＤＰ」という用語はグアノシン二リン酸を意味する。
【００２８】
「ＧＴＰ」という用語はグアノシン三リン酸を意味する。
【００２９】
「非加水分解性若しくは低加水分解性ＧＴＰ」という用語は、加水分解しない、あるいはわずかだけ加水分解してＧＤＰになるＧＴＰ類似体を意味する。例としては、ＧＴＰガンマＳ（「ＧＴＰｇＳ」や「ＧＴＰγＳ」の頭字語でも知られる）（ＣＡＳ番号３７５８９−８０−３）、ＧｐｐＮＨｐ（ＣＡＳ番号１４８８９２−９１−５）、又はＧｐｐＣｐ（ＣＡＳ番号１０４７０−５７−２）が挙げられる。
【００３０】
本発明の目的において、「空のＧタンパク質α」又は「Ｇタンパク質αの空の形態」という用語は、ＧＴＰにもＧＤＰにも結合していないＧタンパク質αを意味する。文献では、空のＧタンパク質αは、ＧＤＰに結合したＧタンパク質αとＧＴＰに結合したＧタンパク質αとの間の一過性の状態として説明されている。空のＧタンパク質αは図１に示されている。
【００３１】
「親和性」という用語は、ある分子（例えばｓｄＡｂ）とそのパートナー（例えば完全なＧタンパク質α等の抗原）との間の全ての非共有結合性相互作用の力を指す。通常、親和性は解離定数（Ｋｄ）で表される。解離定数（Ｋｄ）は、ＦＲＥＴやＳＰＲ等の周知の方法で測定できる。
【００３２】
「ＦＲＥＴ」（「蛍光共鳴エネルギー移動」）という用語は、２つの蛍光分子間のエネルギー移動を意味する。ＦＲＥＴは、エネルギー供与体とエネルギー受容体との双極子−双極子相互作用による非放射性エネルギー移動として定義される。この物理的現象は、これらの分子間のエネルギー互換性を必要とする。これは、供与体の発光スペクトルが受容体の吸収スペクトルと少なくとも部分的に重なっていなければならないことを意味する。フェルスターの理論によると、ＦＲＥＴは、２つの分子、すなわち供与体及び受容体を隔てる距離に依存するプロセスであり、これらの分子が互いに近接していると、ＦＲＥＴシグナルが放出される。本発明の文脈において、解離定数（Ｋｄ）は、例えば実施例で説明するようにＦＲＥＴにより測定する。
【００３３】
本発明の目的において、「相同性」とは、比較ウィンドウにアライメントした２つの配列を比較して算出する。配列のアライメントによって、比較ウィンドウ内の２つの配列に共通している位置（ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を求めることができる。そして、共通位置の数を比較ウィンドウ内の全位置数で割り、１００を乗じることで、相同性％が得られる。配列相同性％の決定は手動で行ってもよく、周知のコンピュータープログラムを用いて行ってもよい。
【００３４】
本発明に係る抗体に関して「精製された」及び「単離された」とは、抗体が、他に同じ種類の生体高分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味すると理解される。本明細書において「精製された」という用語は、存在している全ての高分子に対して、抗体が好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、更に好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％であることを意味する。
【００３５】
ｓｄＡｂ抗体
本発明の第１の主題は、Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関し、上記抗体は、下記式（Ｉ）で表される、３つの相補性決定領域「ＣＤＲ」（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）及び４つのヒンジ領域「ＦＲ」（ＦＲ１〜ＦＲ４）からなるアミノ酸配列を有し、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （Ｉ）
ＦＲＥＴで測定した完全なＧタンパク質αに対する解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満である。
【００３６】
第１の主題によれば、上記ｓｄＡｂは完全なＧタンパク質α（ＧＴＰ若しくはその類似体の１種に結合したＧタンパク質α、又はＧＤＰ若しくはその類似体の１種に結合したＧタンパク質α）と結合し、ＦＲＥＴで測定した解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満であり、例えば親和性定数が７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満、例えば、１ｎＭと１０ｎＭとの間、１０ｎＭと１００ｎＭとの間、１０ｎＭと７５ｎＭとの間、又は１０ｎＭと５０ｎＭとの間である。
【００３７】
第１の主題によれば、完全なＧタンパク質αを単独で、又はアルミニウム塩、フロイントアジュバント、若しくは鉱油等のアジュバントと組み合わせて投与することを含むラクダ類の免疫化によって、上記ｓｄＡｂを得ることができる。投与量を１０μｇと１０ｍｇとの間として、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内経路を介して、好ましくは皮下経路を介して、投与してもよい。上記投与は数回繰り返してもよく、各投与は、最適な免疫応答を得るために１日以上間隔を空けてもよい。その後、産生された抗体を、当業者に公知である従来の精製技術によって末梢血単核細胞から回収できる。例えば、この抗体をコードするｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）を行ってｃＤＮＡを得て、これをベクターにクローニングした後、ＥＬＩＳＡプレートに固定した完全なＧタンパク質αを用いて「ファージディスプレイライブラリー」により選択することで回収できる。
【００３８】
特に、本発明に係る抗体は、実施例１で述べるプロトコルを実施して得ることができる。
【００３９】
本発明の第１の主題の特定の実施形態において、
・ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号６５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、
・ＣＤＲ２は、配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、及び配列番号６６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つ
・ＣＤＲ３は、配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、及び配列番号６７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有する。
【００４０】
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、式（Ｉ）に従うよう容易に互いに組み合わせることができる。当業者であれば、所望の解離定数（Ｋｄ）を有する本発明に係るｓｄＡｂを得るためにこれらの配列をどの程度組み合わせることができるかを困難なく決定できる。
【００４１】
本発明の第２の主題は、Ｇタンパク質αに結合する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関し、上記抗体は、下記式（Ｉ）で表される、３つのＣＤＲ領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）及び４つのヒンジ領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）からなるアミノ酸配列を有し、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４  （Ｉ）
・ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号６５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、
・ＣＤＲ２は、配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、及び配列番号６６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つ
・ＣＤＲ３は、配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、及び配列番号６７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有する。
【００４２】
Ｇタンパク質αはヒト由来であっても動物由来であってもよい。本発明に係るｓｄＡｂは、Ｇαｉタンパク質（Ｇαｉ）、例えば、Ｇαｉ１タンパク質、Ｇαｉ２タンパク質、又はＧαｉ３タンパク質と結合することが有利である。ヒト由来Ｇαｉ１タンパク質は、アイソフォーム１のＵｎｉＰｒｏｔ識別子がＰ６３０９６−１であり、アイソフォーム２のＵｎｉＰｒｏｔ識別子がＰ６３０９６−２である。ヒト由来Ｇαｉ１タンパク質をコードする遺伝子は「ＧＮＡＩ１」として知られている（遺伝子ＩＤ：２７７０、ＮＣＢＩ）。
【００４３】
本発明に係るｓｄＡｂは様々な形態であってよい。例えば、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＶＨＨ型重鎖可変領域（ＶＨＨ）、ＶＨ型重鎖抗体（ＶＨ  ＨｃＡｂ）、ＶＨＨ型重鎖抗体（ＶＨＨ  ＨｃＡｂ）、軟骨魚類由来抗免疫グロブリン新規抗原受容体ＩｇＧ重鎖抗体（Ｉｇ  ＮＡＲ）、又はＩｇ  ＮＡＲ可変領域（Ｖ−ＮＡＲ）であってよい。本発明に係る抗体構造の例を図１７に示す。
【００４４】
本発明に係る抗体の好ましい実施形態において、
・ＣＤＲ１は、配列番号１と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＣＤＲ２は、配列番号２と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は、配列番号３と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＣＤＲ１は、配列番号９と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＣＤＲ２は、配列番号１０と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は、配列番号１１と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＣＤＲ１は、配列番号１７と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＣＤＲ２は、配列番号１８と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は、配列番号１９と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＣＤＲ１は、配列番号２５と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＣＤＲ２は、配列番号２６と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は、配列番号２７と少なくとも８０％の相同性を有するか；
・ＣＤＲ１は、配列番号３３と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＣＤＲ２は、配列番号３４と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は、配列番号３５と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＣＤＲ１は、配列番号４１と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＣＤＲ２は、配列番号４２と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は、配列番号４３と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＣＤＲ１は、配列番号４９と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＣＤＲ２は、配列番号５０と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は、配列番号５１と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＣＤＲ１は、配列番号５７と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＣＤＲ２は、配列番号５８と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は、配列番号５９と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；あるいは
・ＣＤＲ１は、配列番号６５と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＣＤＲ２は、配列番号６６と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＣＤＲ３は、配列番号６７と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有する。
【００４５】
本発明に係る抗体の好ましい実施形態において、
・ＦＲ１は、配列番号５、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、及び配列番号６８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、
・ＦＲ２は、配列番号６、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５３、配列番号６１、及び配列番号６９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つ
・ＦＲ３は、配列番号７、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、及び配列番号７０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つ
・ＦＲ４は、配列番号８、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、及び配列番号７１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有する。
【００４６】
有利には、本発明に係る抗体の好ましい実施形態において、
・ＦＲ１は、配列番号５と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ２は、配列番号６と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ３は、配列番号７と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＦＲ４は、配列番号８と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＦＲ１は、配列番号１２と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ２は、配列番号１３と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ３、好ましくは少なくとも９０％の相同性、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性は、配列番号１４と少なくとも８０％の相同性を有し、且つＦＲ４は、配列番号１５と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＦＲ１は、配列番号２０と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ２は、配列番号２１と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ３は、配列番号２２と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＦＲ４は、配列番号２３と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＦＲ１は、配列番号２８と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ２は、配列番号２９と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ３は、配列番号３０と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＦＲ４は、配列番号３１と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＦＲ１は、配列番号３６と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ２は、配列番号３７と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ３は、配列番号３８と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＦＲ４は、配列番号３９と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＦＲ１は、配列番号４４と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ２は、配列番号４５と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ３は、配列番号４６と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＦＲ４は、配列番号４７と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＦＲ１は、配列番号５２と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ２は、配列番号５３と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ３は、配列番号５４と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＦＲ４は、配列番号５５と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；
・ＦＲ１は、配列番号６０と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ２は、配列番号６１と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ３は、配列番号６２と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＦＲ４は、配列番号６３と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有するか；あるいは
・ＦＲ１は、配列番号６８と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ２は、配列番号６９と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、ＦＲ３は、配列番号７０と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つＦＲ４は、配列番号７１と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有する。
【００４７】
本発明に係る抗体の特に好ましい実施形態において、式（Ｉ）のアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、及び配列番号７２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有する。
【００４８】
本発明に係る抗体は、単離された形態で及び／又は膜環境に存在するＧタンパク質αと結合できる。例えば、上記抗体は、１種以上のＧＰＣＲ及び１種以上のＧタンパク質αを有する膜の調製物に存在するＧタンパク質αと結合してもよい。
【００４９】
本発明に係る抗体はタンパク質に結合することから、Ｇタンパク質αがＧＰＣＲと複合体を形成しなくても、本発明に係る抗体はＧタンパク質に結合することができる。
【００５０】
第１の特定の実施形態において、本発明に係る抗体は、空のＧタンパク質αと比較して完全なＧタンパク質αに対する親和性、特にＧＴＰγＳに結合したＧタンパク質αに対する親和性がより良好である。従って、ＦＲＥＴで測定した本発明の抗体の「空のＧタンパク質αに対するＫｄ／完全なＧタンパク質αに対するＫｄ」比は２以上であり、例えば、２．５以上、５以上、又は１０以上であり、且つ
・ＣＤＲ１は、配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、
・ＣＤＲ２は、配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つ
・ＣＤＲ３は、配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有する。
【００５１】
第２の特定の実施例において、本発明に係る抗体は、完全なＧタンパク質αと比較して空のＧタンパク質αに対する親和性がより良好である。従って、ＦＲＥＴで測定した本発明の抗体の「完全なＧタンパク質αに対するＫｄ／空のＧタンパク質αに対するＫｄ」比は５以上であり、例えば、１０以上、２０以上、又は５０以上であり、且つ
・ＣＤＲ１は、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号６５から選択されるアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、
・ＣＤＲ２は、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有し、且つ
・ＣＤＲ３は、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性を有し、例えば、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の相同性を有する。
【００５２】
本発明に係る抗体は、ＦＲＥＴアッセイの実施において、特に完全なＧタンパク質α又は空のＧタンパク質αを検出するために、特に有利である。
【００５３】
従って、本発明に係る抗体は、その検出を可能にする分子と結合していてもよい。これはペプチドタグであってよく、例えば６ＸＨｉｓタグであってよい。また、基質存在下で比色分析、蛍光、又は発光により検出可能なシグナルを生成できる酵素であってもよく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はホースラディッシュペルオキシダーゼであってもよい。また、放射性核種、蛍光化合物、発光化合物、又は染料であってもよい。本発明に係る抗体は、ＦＲＥＴパートナー対のメンバーと結合していることが有利である。
【００５４】
ＦＲＥＴパートナー対
ＦＲＥＴパートナー対は、エネルギー供与体蛍光化合物及びエネルギー受容体蛍光化合物からなることが好ましい。
【００５５】
ＦＲＥＴは、エネルギー供与体とエネルギー受容体との双極子−双極子相互作用による非放射性エネルギー移動として定義される。この物理的現象は、これら分子間のエネルギー互換性を必要とする。これは、供与体の発光スペクトルが受容体の吸収スペクトルと少なくとも部分的に重なっていなければならないことを意味する。フェルスターの理論によると、ＦＲＥＴは、２つの分子、すなわち供与体及び受容体を隔てる距離に依存するプロセスであり、これらの分子が互いに近接しており、供与体化合物がその吸収ピークのいずれかに対応する波長で励起されると、エネルギー移動が生じて、供与体の発光波長で放出される発光が減少し、受容体の発光波長で放出される発光が増加する。
【００５６】
ＦＲＥＴシグナルを得るための供与体／受容体フルオロフォア対の選択は、当業者の能力の範囲内である。ＦＲＥＴ現象の研究に用いることができる供与体／受容体の対は、特にＪｏｓｅｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚの著作（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９９））に記載されており、当業者は参照することができる。
【００５７】
寿命の長いエネルギー供与体蛍光化合物（＞０．１ミリ秒、好ましくは０．５〜６ミリ秒の範囲）、特に希土類キレート又はクリプテートは、測定培地から放出される自己蛍光現象を排除しながら、時間分解測定、すなわちＴＲ−ＦＲＥＴシグナル測定を行うことができるため、有利である。このため、また通常は、これらは本発明に係る方法を実施するために好ましい。
【００５８】
ジスプロシウム（Ｄｙ３＋）、サマリウム（Ｓｍ３＋）、ネオジム（Ｎｄ３＋）、イッテルビウム（Ｙｂ３＋）、又はエルビウム（Ｅｒ３＋）の錯体も本発明の目的に好適な希土類錯体であるが、ユーロピウム（Ｅｕ３＋）又はテルビウム（Ｔｂ３＋）のキレート及びクリプテートが特に好ましい。
【００５９】
多数の希土類錯体が開示されており、多くが現在ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、及びＣｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社から販売されている。
【００６０】
本発明の目的に好適な希土類キレート又はクリプテートの例は以下の通りである。
・１つ以上のピリジン単位を含むランタニドクリプテート。そのような希土類クリプテートは、例えば、欧州特許第０１８０４９２号、欧州特許第０３２１３５３号、欧州特許第０６０１１１３号、及び国際公開第０１／９６８７７号に記載されている。テルビウム（Ｔｂ３＋）又はユウロピウム（Ｅｕ３＋）のクリプテートは本発明の目的に特に好適である。ランタニドクリプテートはＣｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社から販売されている。例としては、下記式のユウロピウムクリプテート（反応性基（ここではＮＨ２基等）を介して標識対象の化合物と結合させることができる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
【化１】
2021531796.tif 000002
【００６２】
【化２】
2021531796.tif 000003
【００６３】
・特に米国特許第４，７６１，４８１号、第５，０３２，６７７号、第５，０５５，５７８号、第５，１０６，９５７号、第５，１１６，９８９号、第４，７６１，４８１号、第４，８０１，７２２号、第４，７９４，１９１号、第４，６３７，９８８号、第４，６７０，５７２号、第４，８３７，１６９号、及び第４，８５９，７７７号に記載されたランタニドキレート。欧州特許第０４０３５９３号、米国特許第５，３２４，８２５号、米国特許第５，２０２，４２３号、及び米国特許第５，３１６，９０９号には、テルピリジン等の九座リガンドからなるキレートが記載されている。ランタニドキレートはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社から販売されている。
【００６４】
・Ｐｏｏｌｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００５，３，１０１３−１０２４，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｍｉｓｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ”に記載されたものなど、芳香環を有する発色団により置換されたキレート剤（テトラアザシクロドデカン等）からなるランタニド錯体もまた用いることができる。国際公開第２００９／０１０５８０号に記載された錯体もまた用いることができる。
【００６５】
・欧州特許第１１５４９９１号及び第１１５４９９０号に記載されたランタニドクリプテートもまた用いることができる。
【００６６】
・下記式のテルビウムクリプテート（反応性基（ここではＮＨ２基等）を介して標識対象の化合物に結合させることができる）。その合成は、国際公開第２００８／０６３７２１号（８９ページの化合物６ａ）に記載されている。
【００６７】
【化３】
2021531796.tif 000004
【００６８】
・Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社から販売されているＬｕｍｉｐｈｏｒｅ社製テルビウムクリプテートＬｕｍｉ４−Ｔｂ。
【００６９】
・Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ社製の下記式の量子染料（反応性基（ここではＮＣＳ）を介して標識対象の化合物に結合させることができる）。
【００７０】
【化４】
2021531796.tif 000005
【００７１】
・ルテニウムキレート、特にルテニウムイオン及びいくつかのビピリジンからなる錯体（例えばルテニウム（ＩＩ）トリス（２，２’−ビピリジン））。
【００７２】
・Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から販売されている下記式のテルビウムキレートＤＴＰＡ−ｃｓ１２４Ｔｂ（反応性基Ｒを介して標識対象の化合物に結合させることができる）。その合成は、米国特許第５，６２２，８２１号に記載されている。
【００７３】
【化５】
2021531796.tif 000006
【００７４】
・Ｌａｔｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １９９７，７５：１４９−１６９）に記載された下記式のテルビウムキレート。
【００７５】
【化６】
2021531796.tif 000007
【００７６】
供与体蛍光化合物は、ユウロピウムクリプテート、ユウロピウムキレート、テルビウムキレート、テルビウムクリプテート、ルテニウムキレート、及び量子染料から選択されることが特に有利であり、ユウロピウム又はテルビウムのキレート及びクリプテートが特に好ましい。
【００７７】
受容体蛍光化合物の吸収スペクトルは、供与体の発光スペクトルと重なっている必要があり（Ｍａｔｈｉｓ  Ｇ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９３、３９（９）：１９５３−１９５９）、受容体蛍光化合物は以下の群から選択されてもよい：アロフィコシアニン、特に商品名ＸＬ６６５で知られているもの；発光有機分子、例えば、ローダミン、シアニン（Ｃｙ５等）、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体（「Ｂｏｄｉｐｙ」として販売）、「Ａｔｔｏ」として知られているフルオロフォア、「ＤＹ」として知られているフルオロフォア、「Ａｌｅｘａ」として知られている化合物、ニトロベンゾオキサジアゾール。受容体蛍光化合物は、アロフィコシアニン、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ボロンジピロメテン誘導体、ニトロベンゾオキサジアゾールから選択されることが有利である。
【００７８】
「シアニン」及び「ローダミン」という表現はそれぞれ、「シアニン誘導体」及び「ローダミン誘導体」を意味すると理解されるべきである。当業者は、市販されているこれらの各種フルオロフォアを知っている。
【００７９】
「Ａｌｅｘａ」化合物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されている。「Ａｔｔｏ」化合物はＡｔｔｏ−ｔｅｃ社から販売されている。「ＤＹ」化合物はＤｙｏｍｉｃｓ社から販売されている。「Ｃｙ」化合物はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から販売されている。他の化合物はＳｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ、又はＡｃｒｏｓ社等の様々な化学試薬供給業者から販売されている。
【００８０】
本発明の目的において、受容体蛍光化合物としては、シアニン又はフルオレセインの誘導体が好ましい。
【００８１】
エネルギー受容体又は供与体化合物による抗体の標識
本発明に係る抗体は、フルオロフォアで直接的（共有結合的）又は間接的に標識してもよい。ＦＲＥＴパートナーの少なくとも一方を第１又は第２の抗体と共有結合させることが好ましく、ＦＲＥＴパートナーの両方をそれぞれ第１及び第２の抗体と共有結合させることが更に好ましい。
【００８２】
蛍光供与体又は受容体化合物による本発明に係る抗体の直接標識は、反応性基を用いる従来の結合法で行われる。蛍光供与体又は受容体化合物は通常、「官能化された」形態で販売されている。すなわち、これらの化合物は、標識対象の化合物（この場合は本発明に係る抗体）に存在する官能基と反応できる反応性基を有している。
【００８３】
典型的には、供与体又は受容体蛍光化合物に存在する反応性基は、求電子性基又は求核性基であって、それぞれ適切な求核性基又は求電子性基の存在下に置かれると共有結合を形成できる基である。例示として、求電子性／求核性基の対と、これらの基が一緒になって形成される共有結合の種類とを以下にまとめる。
【００８４】
【表０】
2021531796.tif 000008
【００８５】
＊：活性化エステルは、式ＣＯＹで表される基を意味すると理解される。式中、Ｙは以下の通りである。
・スクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ４ＮＯ２）基及びスルホスクシンイミジルオキシ（−ＯＣ４Ｈ３ＮＯ２−ＳＯ３Ｈ）基から選択される脱離基。
・ニトロ基、フルオロ基、クロロ基、シアノ基、及びトリフルオロメチル基等の少なくとも１つの求電子性置換基で置換されているか又は置換されていないアリールオキシ基。そのため活性化アリールエステルを形成する。
・カルボジイミド基で活性化されたカルボン酸。無水物−ＯＣＯＲａ又は−ＯＣＮＲａＮＨＲｂを形成する。式中、Ｒａ及びＲｂは同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のパーフルオロアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、及びシクロヘキシル基から選択される。
・３−ジメチルアミノプロピル又はＮ−モルホリノエチル。
【００８６】
市販の供与体及び受容体蛍光化合物は通常、マレイミド官能基又は活性化エステルを含み、最も多くの場合、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）基で活性化されたエステルを含む。これらはそれぞれチオール基及びアミン基と反応するため、抗体の標識に用いることができる。標識された抗体は、本発明に係る抗体にグラフトされた標識分子の平均数を表す最終モル比（ＦＭＲ）で特徴付けられる。
【００８７】
本発明に係る抗体に元から存在する以下の官能基のうちのいずれかを用いることが有利な場合がある：末端アミノ基、末端カルボキシレート基、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシレート基、リシンのアミノ基、アルギニンのグアニジン基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基、トリプトファンのインドール環、メチオニンのチオエーテル基、並びにヒスチジンのイミダゾール基。
【００８８】
本発明に係る抗体を蛍光化合物で標識する別の手法では、ＮＨＳ基やマレイミド基等の反応性基を抗体に導入し、その反応性基と反応して共有結合を形成する官能基を有するフルオロフォアの存在下に置く。
【００８９】
本発明に係る標識された抗体がＧタンパク質αに対する親和性を充分に保持していることを確認することが重要である。これは、本発明に係る標識された抗体のＧタンパク質αに対する親和性定数を算出できる従来の結合実験によって簡単に調べることができる。
【００９０】
また、それ自体が蛍光化合物に共有結合した「二次」抗体であって、本発明に係る抗体、又はこの本発明に係る抗体に存在するハプテン（ジニトロフェニル基、ドゴキシゲニン基、フルオレセイン、又はＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、若しくは６−ＨＩＳタグ等）を特異的に認識する抗体をインキュベーション培地に導入することなどによって、本発明に係る抗体を間接的に蛍光化合物で標識してもよい。二次抗体は抗種抗体であってよい。
【００９１】
他の非常に伝統的な間接標識法では、標識対象の本発明に係る抗体にビオチンを結合させてから、フルオロフォアで標識されたストレプトアビジンの存在下、このビオチン化リガンドをインキュベートする。本発明に係る抗体のビオチンによる標識は、当業者の一般的な知識の範囲内であり、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社は、例えば商品名「ｄ２」（品番６１０ＳＡＤＬＡ）でフルオロフォアで標識されたストレプトアビジンを販売している。
【００９２】
ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル測定
ＴＲ−ＦＲＥＴシグナル測定は、パルス線源を用いて測定培地を供与体化合物の励起帯で励起した後に、好ましくは１〜５００マイクロ秒（μ秒）の遅延時間後、１０〜２０００μ秒間行う。遅延時間は５０μ秒（時間分解）であることが更に好ましい。
【００９３】
ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルは、測定された発光の強度又はその寿命からなっていてよい。
【００９４】
本発明に係る抗体はポリペプチドに存在していてもよい。また、固体支持体に固定されていてもよい。
【００９５】
本発明の別の態様は、本発明に係る抗体を含む複合体、例えば、本発明に係る抗体及びＧタンパク質αを含む複合体に関する。
【００９６】
本発明に係る抗体は、「ヒト化」版であってもよく、これは、例えば、上記抗体のアミノ酸配列中（特にＦＲ中）の１つ以上のアミノ酸を、従来のヒト四量体抗体の対応する位置に現れる１つ以上のアミノ酸で置換することで得られる。いくつかのヒト化技術が文献に記載されており、当業者は、本発明に係る抗体を調製する目的でそれらを困難なく実施することができる。
【００９７】
本発明に係る抗体は、当該分野で公知である任意の技術で作製することができ、例えば、限定されることはないが、任意の化学的、生物学的、遺伝学的、又は酵素的技術を単独で又は組み合わせて用いてよい。
【００９８】
所望の抗体のアミノ酸配列が既知であれば、当業者は、ポリペプチド作製のための従来技術を用いて該抗体を容易に作製できる。例えば、本発明に係る抗体は、周知の固相法を用いて、好ましくは市販のポリペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｎｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）により製造されたもの等）を用い、製造元の指示に従って合成できる。変形例として、文献で公知の組換えＤＮＡ技術で本発明に係る抗体を合成してもよい。例えば、発明に係る抗体は、該抗体をコードする核酸配列を１つ以上の発現ベクターに組み込み、所望の抗体を発現することになる適切な宿主細胞にこのベクターを導入した後、上記核酸配列を発現させることで得られる。
【００９９】
本発明に係る抗体は、例えば所望の抗体を発現する宿主細胞の培養上清から、クロマトグラフィー及び／又はアフィニティーカラムでの精製等の公知の精製技術を実施して、精製（又は単離）することが有利である。
【０１００】
他の主題
本発明の第３の主題は、本発明に係る抗体をコードする核酸配列に関する。
【０１０１】
本発明の第４の主題は、本発明に係る核酸配列を有する組換えベクターに関する。本発明の文脈においては、抗体の作製に適した任意の種類のベクターを用いることができる。上記ベクターは、例えばプロモーター配列や制御配列等、本発明に係る抗体の作製に必要な核酸配列を有することになる。適切なベクターの作製については広く文献に記載されている。
【０１０２】
本発明の第５の主題は、本発明に係るベクター又は本発明に係る核酸配列を有する細胞に関する。本発明に係る細胞は、広く文献に記載されている方法で得ることができ、例えば、本発明に係るベクター又は核酸配列で細胞クローンをトランスフェクトすることで得ることができる。本発明は特定の細胞種に限定されない。本発明の文脈においては、抗体を産生可能な任意の細胞を使用できる。上記細胞は、哺乳類細胞（例えばヒト細胞又はマウス細胞）等の真核細胞、細菌等の原核細胞、又は酵母であってもよい。
【０１０３】
以下の図及び実施例により本発明を更に説明する。しかしながら、これらの実施例及び図はいかなる形でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１０４】
【表Ａ−１】
2021531796.tif 000009
【０１０５】
【表Ａ−２】
2021531796.tif 000010
【０１０６】
【表Ａ−３】
2021531796.tif 000011
【実施例】
【０１０７】
実施例１：ラマの免疫化及びｓｄＡｂライブラリーの構築
ＧＤＰ又はＧＴＰｇＳに結合した組換えヒトタンパク質ＴＳＴ−Ｇαｉ１（ＴＥＶリンカーを介してＮ末端がＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇ（ＴＳＴ）タグ（ＩＢＡ）で標識されたＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｐ６３０９６−１のＧαｉ１タンパク質）で、２頭のラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）を皮下免疫した。これまでに（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｒｕｅｄａ，Ｂｅｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｅｈａｒ  Ｃｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００９）で述べられている通り、大腸菌株ＴＧ１においてＶＨ／ＶＨＨライブラリーの構築を行った。得られたライブラリーの多様性は１０８クローンを超えていた。
【０１０８】
ファージ−ＶＨ／ＶＨＨ粒子の作製
５０ｍＬの２ＹＴＡ（アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有する２ＹＴ）に５０μＬの細菌ライブラリーを播種し、振とう（２５０ｒｐｍ）させながら３７℃でインキュベートしてＯＤ６００を０．４と０．６との間とした。この細菌を、振とうさせずに、感染多重度を２０とし、３０分間３７℃でファージＫＭ１３に感染させた。培養液を３０００ｇで１０分間遠心分離し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する２ＹＴＡ２５０ｍＬに細菌ペレットを再懸濁させて、振とうさせながら３０℃で一晩かけてＶＨ−ファージを作製した。培養液を１０本のチューブに分け、３０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。各チューブについて、新しい清潔なチューブ内の上清に５ｍＬの２０％ＰＥＧ８０００、２．５ｍＭのＮａＣｌを加え、氷上で１時間インキュベートしてファージ粒子を沈殿させた。この溶液を３０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、ファージ含有ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁させた。別の遠心分離工程（２分、１６０００ｇ）を行って細菌混入物を除去し、新しいチューブ内の上清に２００μＬのＰＥＧ８０００ＮａＣｌを加えた。氷上に３０分間置き、最終遠心分離（５分、１６０００ｇ）を行った後、ファージ含有ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁させて、すぐに選択に使用できる状態のファージ−ＶＨを得た。
【０１０９】
ファージディスプレイによるＶＨ／ＶＨＨ選択
固定化されたＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎを含むプレート（ＩＢＡ＃２−４１０１−００１）上でファージライブラリーを枯渇させることで、抗Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  ＶＨが選択されないようにする工程を行った後、予め１０μＭのＧＤＰを３７℃で２時間ロードし、２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で室温にて１時間飽和させたＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇと融合した組換えヒトＧαｉ１を含むＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎプレート上で第１の選択サイクルを実施した。室温で２時間インキュベートした後、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ  ＰＢＳ及びＰＢＳで洗浄した。結合したファージを、振とうさせながら、１ｍｇ／ｍＬのトリプシン溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で３０分間溶出した。ファージを回収し、ＴＧ１細菌株に感染させて増幅した。予め１０μＭのＧＴＰをロードしたＧαｉ１に対して同様の方法で第２の選択サイクルを実施した。第２のストラテジーでは、ヌクレオチドの非存在下、Ｇαｉ１に対する選択を２ラウンド行った。第３のストラテジーは、Ｇαｉの活性立体構造（ＧＴＰ）に特異的なＶＨの選択を促進することを目的としており、予め１０μＭのＧＴＰｇＳをロードしたＧαｉ１  Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇに対して２回の選択サイクルを行い、次いで、予め１０μＭのＧＤＰをロードしたＧαｉ１  Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇで被覆したプレート上で枯渇工程を行った。９６ウェル深型ウェルプレートにおいて、２％グルコースを含有する２ＹＴＡ４００μＬ中で個々のＴＧ１コロニーを培養した。一晩増殖させた後、培養液を２０％グリセリン中、−８０℃で凍結させ、残りの培養液は、２ＹＴＡ中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した可溶性ＶＨの作製に用いた。ＶＨを含む上清はスクリーニングアッセイに用いた。
【０１１０】
ＶＨの作製及び精製
ＶＨを大規模に作製するために、陽性ファージミドを大腸菌株ＢＬ２１  ＤＥ３に形質転換した。形質転換細菌を４００ｍＬの２ＹＴＡ中で培養してＯＤ６００値を０．７とし、１００μＭのＩＰＴＧで誘導して、振とうさせながら３０℃で一晩増殖させた。細菌を遠心分離で回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解させた。３０００ｇで２０分間遠心分離した後、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティークロマトグラフィーを用い、製造元の指示に従って上清からＶＨを精製した。
【０１１１】
ＶＨ−ＨｃＡｂの作製
遺伝子合成（Ｇｅｎｅｃｕｓｔ）によって、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３領域をコードする遺伝子、次いで６ヒスチジンタグと融合させることで、ＶＨ遺伝子をｐＨＬｓｅｃベクターにクローニングした（Ａｒｉｃｅｓｃｕ  ＡＲ，Ｌｕ  Ｗ，Ｊｏｎｅｓ  ＥＹ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００６  Ｏｃｔ；６２（Ｐｔ１０）：１２４３−５０）。対応するプラスミドを用いて浮遊適応ＨＥＫ２９３株をトランスフェクトし、この細胞を製造元の指示に従って撹拌しながらインキュベートした（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。５日後、回収した上清をそのまま用いて、製造元の指示に従ってＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）アフィニティークロマトグラフィーによってＨｃＡｂを精製した。
【０１１２】
実施例２：ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）における本発明に係る単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の親和性定数（Ｋｄ）の測定
材料
組換えＴＳＴ−Ｇαｉ１タンパク質（ＴＥＶリンカーを介してＮ末端がＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇ（ＴＳＴ）タグ（ＩＢＡ）で標識されたＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｐ６３０９６−１のＧαｉ１タンパク質）をＳｆ９昆虫細胞（バキュロウイルスを介した感染）で産生させてから、ＴｗｉｎＳｔｒｅｐｔａｇ（ＴＳＴ）タグを介したアフィニティーカラム（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ高容量樹脂（ＩＢＡ、カタログ：２−１２０８−００２））で精製した。
【０１１３】
受容体ｄ２によるＴＲ−ＦＲＥＴ検出に適合性があるＬｕｍｉ４（登録商標）−Ｔｂ供与体蛍光プローブで抗ＴＳＴ抗体（抗Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ、カタログ参照番号２−１５１７−００１、ＩＢＡ製）を標識した。このようにして得た抗体を「抗ＴＳＴ抗体−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ」と呼んだ。
【０１１４】
９種の重鎖可変領域（ＶＨ）（Ｆ９：配列番号２４、Ｆ４：配列番号４０、Ｂ１１：配列番号１６、Ｆ１１：配列番号４、Ｇ６：配列番号３２、Ａ１０：配列番号４８、Ｅ２：配列番号６４、Ｆ２：配列番号５６、及びＧ７：配列番号７２）を大規模に作製するために、これらのＶＨをコードするファージミドを大腸菌株ＢＬ２１  ＤＥ３に形質転換した。形質転換細菌を４００ｍＬの２ＹＴＡ中で培養してＯＤ６００値を０．７とし、１００μＭのＩＰＴＧで誘導して、撹拌しながら３０℃で一晩増殖させた。細菌を遠心分離で回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解させた。３０００ｇで２０分間遠心分離した後、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティークロマトグラフィーを用い、製造元の指示に従って上清からＶＨを精製した。
【０１１５】
ＶＨ型重鎖抗体（ＶＨ−ＨｃＡｂ）を作製するために、遺伝子合成（Ｇｅｎｅｃｕｓｔ）によって、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードする遺伝子、次いで６ヒスチジンタグと融合させることで、ＶＨ遺伝子をｐＨＬｓｅｃベクターにクローニングした（Ａｒｉｃｅｓｃｕ  ＡＲ、Ｌｕ  Ｗ，Ｊｏｎｅｓ  ＥＹ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００６  Ｏｃｔ；６２（Ｐｔ１０）：１２４３−５０）。対応するプラスミドを用いて浮遊適応ＨＥＫ２９３株をトランスフェクトし、この細胞を製造元の指示に従って撹拌しながらインキュベートした（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）。５日後、回収した上清をそのまま用いて、製造元の指示に従ってＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）アフィニティークロマトグラフィーによってＶＨ−ＨｃＡｂを精製した。
【０１１６】
抗ＴＳＴ抗体の標識に用いた供与体Ｌｕｍｉ４−ＴｂによるＴＲ−ＦＲＥＴ検出に適合性がある受容体蛍光プローブｄ２で、得られたｓｄＡｂ（ＶＨ又はＶＨ−ＨｃＡｂ）を標識した。この標識された抗体を「抗Ｇαｉ抗体−ｄ２」と呼んだ。
【０１１７】
ＧＤＰ及びＧＴＰγＳヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（それぞれカタログ参照番号Ｇ７１２７及びＧ８６３４）。
【０１１８】
３８４ウェル低容量白色プレート（背面白色）は、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅから購入した（カタログ参照番号７８４０７５）。
【０１１９】
方法
１）試薬の調製
すべての試薬は、緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＢＳＡ）で希釈した。組換えＴＳＴ−Ｇαｉ１タンパク質は、４倍調製してウェル中の最終濃度１ｎＭで使用した（別段の指示が無い限り）。ＧＤＰ又はＧＴＰγＳヌクレオチドは、４倍調製してウェル中の最終濃度１０μＭで使用した。抗ＴＳＴ抗体−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂは、４倍調製してウェル中の最終濃度０．２５ｎＭで使用した。各種の抗Ｇαｉ−ｄ２抗体は、４倍調製して、グラフに記載したウェル中の最終濃度を目指し、最大で２００ｎＭであった。
【０１２０】
２）３８４ウェルプレートでの試薬の分配
・ＴＳＴ−Ｇαｉ１タンパク質：５μＬ
・ヌクレオチド（ＧＤＰ又はＧＴＰｇＳ）：５μＬ
・抗ＴＳＴ抗体−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ（供与体）：５μＬ
・抗Ｇαｉ抗体−ｄ２（受容体）：５μＬ
【０１２１】
非特異的シグナル（バックグラウンド蛍光ノイズ）は、２種の検出試薬（供与体及び受容体で標識）、すなわち抗ＴＳＴ抗体−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（供与体）及び抗Ｇαｉ抗体−ｄ２（受容体）のみを含み、他の成分はそれらの希釈緩衝液で置き換えたウェルで測定した。
【０１２２】
３）ＨＴＲＦシグナルの読取り
プレートを２１℃で２０時間インキュベートし、次いでＨＴＲＦシグナルを以下の構成でＰＨＥＲＡｓｔａｒリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）によって測定した。
・モジュール：ＨＴＲＦ（励起：３３７ｎｍ、発光：６６５ｎｍ及び６２０ｎｍ）
・励起：レーザー、４０フラッシュ
・読取りウィンドウ：遅延：６０μ秒−積算：４００μ秒
【０１２３】
４）シグナル処理
６６５ｎｍ及び６２０ｎｍの生シグナルから下記式によってＨＴＲＦ比を算出した。
ＨＴＲＦ比＝（６６５ｎｍのシグナル／６２０ｎｍのシグナル）×１０，０００
【０１２４】
５）重鎖可変領域ＶＨの親和性（Ｋｄ）測定用ＴＲ−ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）アッセイの原理
ＴＲ−ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）試験によって、各種抗体のＧαｉ１タンパク質に対する親和性（Ｋｄ）を測定することができた。この試験の原理を図２に示す。精製してＴＳＴで標識した組換えＧαｉ１タンパク質（ＴＳＴ−Ｇαｉ１タンパク質）を一定濃度（１ｎＭ）とし、過剰のヌクレオチド（ＧＤＰ又はＧＴＰｇＳ）（１０μＭ）、一定濃度（０．５ｎＭ）の供与体Ｌｕｍｉ４−Ｔｂで標識した抗ＴＳＴ抗体（抗ＴＳＴ抗体−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ）、及び濃度を漸増させた受容体ｄ２で標識したＶＨ型単一ドメイン抗体（抗ＧαｉＶＨ抗体−ｄ２）の存在下に置いた。その後、全ＨＴＲＦシグナルを得た。
【０１２５】
並行して、Ｇαｉ１タンパク質無しの条件を実施して、非特異的なＨＴＲＦシグナルを測定した。
【０１２６】
その後、全シグナルから非特異的シグナルを差し引くことで、抗体とＧαｉ１タンパク質との相互作用による特異的なＨＴＲＦシグナルを算出した。そして、特異的なＨＴＲＦシグナルのデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアで「１部位特異的結合」フィットによって解析した。その後、抗体のＧαｉ１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を求めた。ＧＴＰγｓに結合したＧタンパク質αに結合する抗体で得た結果と、ＧＤＰに結合したＧタンパク質αに結合する抗体で得た結果とを下記表１及び表２に示す。
【０１２７】
６）ＶＨ型重鎖抗体（ＶＨ  ＨｃＡｂ）の親和性（Ｋｄ）測定用ＨＴＲＦ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイの原理
各種ＶＨ−ＨｃＡｂのＧαｉ１タンパク質に対する親和性（Ｋｄ）を測定するために実施したＴＲ−ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）アッセイの原理を図１２に示す。精製してＴＳＴで標識した組換えＧαｉ１タンパク質（ＴＳＴ−Ｇαｉ１タンパク質）を一定濃度（１ｎＭ）とし、過剰のヌクレオチド（ＧＤＰ又はＧＴＰｇＳ）（１０μＭ）、一定濃度（０．５ｎＭ）の供与体Ｌｕｍｉ４−Ｔｂで標識した抗ＴＳＴ抗体（抗Ｔａｇ  Ａｂ−供与体）、一定濃度（５０ｎＭ）の受容体ｄ２で標識した抗６ＨＩＳ抗体（抗６ＨＩＳ受容体抗体、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ＃６１ＨＩＳＤＬＦ）、及び濃度を漸増させた６ＨＩＳで標識したＶＨ−ＨｃＡｂ抗体（６ＨＩＳ−Ｆｃ−ｓｄＡｂ）の存在下に置いた。その後、全ＨＴＲＦシグナルを得た。
【０１２８】
並行して、Ｇαｉ１タンパク質無しの条件を実施して、非特異的なＨＴＲＦシグナルを測定した。
【０１２９】
その後、全シグナルから非特異的シグナルを差し引くことで、ＶＨ−ＨｃＡｂとＧαｉ１タンパク質との相互作用による特異的なＨＴＲＦシグナルを算出した。そして、特異的なＨＴＲＦシグナルのデータをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアで「１部位特異的結合」フィットによって解析した。その後、ＶＨ−ＨｃＡｂのＧαｉ１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を求めた。抗体ＨｃＡｂ−Ｂ１１、ＨｃＡｂ−Ｆ９、ＨｃＡｂ−Ｇ７、ＨｃＡｂ−Ａ１０で得た結果を下記表３に示す。
【０１３０】
結果
図３〜１１に上記ＶＨについて得られた飽和曲線を示す。
【０１３１】
上記ＶＨ（Ｆ９、Ｆ１１、Ｂ１１、Ｆ４、及びＧ６）は、ＧＴＰγＳに結合したＧタンパク質αに対する親和性が高くなり、解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満であり、１ｎＭ（例えば抗体Ｂ１１の場合）まで低くなった。
【０１３２】
【表１】
2021531796.tif 000012
【０１３３】
上記ＶＨ（Ａ１０、Ｇ７、Ｆ２、及びＥ２）は、ＧＤＰに結合したＧタンパク質αに対する親和性が高くなり、解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満であり、１４ｎＭ（例えば抗体Ｆ２の場合）まで低くなった。
【０１３４】
【表２】
2021531796.tif 000013
【０１３５】
図１３〜１６に上記ＶＨ  ＨｃＡｂについて得られた飽和曲線を示す。
【０１３６】
上記抗体ＨｃＡｂ−Ｂ１１、ＨｃＡｂ−Ｆ９、ＨｃＡｂ−Ｇ７、及びＨｃＡｂ−Ａ１０は、ＧＤＰ又はＧＴＰγＳに結合したＧタンパク質αに対する親和性が高くなり、解離定数（Ｋｄ）が１０ｎＭ未満であり、１ｎＭ（例えば、ＧＴＰγＳに結合したＧタンパク質αに結合する抗体ＨｃＡｂ−Ｂ１１の場合）まで低くなった。
【０１３７】
【表３】
2021531796.tif 000014
【図１】
2021531796.tif 000015
【図２】
2021531796.tif 000016
【図３】
2021531796.tif 000017
【図４】
2021531796.tif 000018
【図５】
2021531796.tif 000019
【図６】
2021531796.tif 000020
【図７】
2021531796.tif 000021
【図８】
2021531796.tif 000022
【図９】
2021531796.tif 000023
【図１０】
2021531796.tif 000024
【図１１】
2021531796.tif 000025
【図１２】
2021531796.tif 000026
【図１３】
2021531796.tif 000027
【図１４】
2021531796.tif 000028
【図１５】
2021531796.tif 000029
【図１６】
2021531796.tif 000030
【図１７】
2021531796.tif 000031
【配列表】
2021531796000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月30日(2021.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
【表１】
2021531796.tif 000032
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
【表２】
2021531796.tif 000033
【国際調査報告】
2021531796.tif 000034
2021531796.tif 000035
2021531796.tif 000036
2021531796.tif 000037
2021531796.tif 000038
2021531796.tif 000039