(57)【要約】本明細書に記載される技術は、例えば経口または非経口投与のための、CAGEおよび少なくとも1つの活性化合物を含む組成物に関する。2021503468.tif 000027
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた活性化合物を経口投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の経口送達方法。
【請求項２】
CAGEと組み合わせた活性化合物を皮下、皮内、または静脈内投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の送達方法。
【請求項３】
CAGEと組み合わせた活性化合物を粘膜に投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の送達方法。
【請求項４】
粘膜が、鼻粘膜、口腔粘膜、または膣粘膜である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
CAGEと組み合わせた活性化合物を非経口投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の非経口送達方法。
【請求項６】
投与が腫瘍への送達を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
それを必要とする対象に、CAGEと組み合わせた活性化合物を注射により罹患組織中へ投与することにより、対象において疾患を治療する方法。
【請求項８】
疾患が、がん、脂肪、過形成、または組織増殖に起因する任意の他の疾患である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
CAGEが少なくとも0.1％ w/vの濃度である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
CAGEと組み合わせた活性化合物が1回投与される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
CAGEと組み合わせた活性化合物が複数回用量で投与される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
活性化合物が核酸分子を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
活性化合物が小分子を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
活性化合物がポリペプチドを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
活性化合物が抗体または抗体試薬を含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
活性化合物が化学療法化合物を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
活性化合物がインスリンを含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
活性化合物がGLP-1ポリペプチドまたはその模倣体もしくは類似体を含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
活性化合物が1〜20 mg/kgの投与量で提供される、請求項21〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
CAGEと組み合わせた活性化合物を含む、組成物。
【請求項２５】
CAGEが少なくとも0.1％ w/vまたは5％ w/wの濃度である、請求項24記載の組成物。
【請求項２６】
CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項24〜25のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７】
CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項24〜26のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８】
CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項24〜27のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２９】
活性化合物が核酸分子を含む、請求項24〜28のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０】
活性化合物が小分子を含む、請求項24〜28のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３１】
活性化合物がポリペプチドを含む、請求項24〜28のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３２】
活性化合物が抗体または抗体試薬を含む、請求項24〜31のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３３】
活性化合物が化学療法化合物を含む、請求項24〜32のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３４】
活性化合物がインスリンを含む、請求項24〜30のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３５】
活性化合物がGLP-1ポリペプチドまたはその模倣体もしくは類似体を含む、請求項24〜31のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３６】
活性化合物が1〜20 mg/kgの投与量で提供される、請求項34〜35のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３７】
さらなる薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項24〜36のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３８】
経口、皮下、または非経口製剤として製剤化された、請求項24〜37のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３９】
粘膜への投与のために製剤化された、請求項24〜38のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４０】
粘膜が、鼻粘膜、口腔粘膜、または膣粘膜である、請求項39記載の組成物。
【請求項４１】
経口製剤が、活性化合物およびCAGEの組み合わせを含む分解性カプセルである、請求項38記載の組成物。
【請求項４２】
活性化合物の生物活性が、CAGEの非存在下における活性と比較して改善または安定化される、請求項24〜41のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４３】
活性化合物およびCAGEの組み合わせが混和物である、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法または組成物。
【請求項４４】
活性化合物およびCAGEの組み合わせが、活性化合物を含むナノ粒子を含み、ナノ粒子が、CAGEを含む組成物における溶液または懸濁液中にある、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法または組成物。
【請求項４５】
イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた核酸分子を細胞と接触させる工程を含む、核酸分子を細胞へ送達する方法。
【請求項４６】
細胞が対象中の細胞であり、接触工程が、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた核酸分子を対象に投与することを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
核酸分子が、ベクター、発現ベクター、または阻害性核酸分子を含む、請求項45〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
CAGEが少なくとも0.1％ w/vまたは5％ w/wの濃度である、請求項45〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項45〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項45〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項45〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、請求項45〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
核酸分子およびCAGEの組み合わせが混和物である、請求項45〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
核酸分子およびCAGEの組み合わせが、核酸分子を含むナノ粒子を含み、ナノ粒子が、CAGEを含む組成物における溶液または懸濁液中にある、請求項45〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
経口送達、粘膜への送達、非経口送達、または疾患の治療に使用するための、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた少なくとも1つの活性化合物。
【請求項５６】
粘膜が、鼻粘膜、口腔粘膜、または膣粘膜である、請求項55記載の組み合わせ。
【請求項５７】
非経口投与が腫瘍への送達を含む、請求項55記載の組み合わせ。
【請求項５８】
治療が、罹患組織への前記組成物の注射を含む、請求項55記載の組み合わせ。
【請求項５９】
疾患が、がん、脂肪、過形成、または組織増殖に起因する任意の他の疾患である、請求項58記載の組み合わせ。
【請求項６０】
CAGEが少なくとも0.1％ w/vまたは5％ w/wの濃度である、請求項55〜59のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６１】
CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項55〜59のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６２】
CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項55〜61のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６３】
CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項55〜61のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６４】
イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、請求項55〜63のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６５】
CAGEと組み合わせた活性化合物が1回投与される、請求項55〜64のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６６】
CAGEと組み合わせた活性化合物が複数回用量で投与される、請求項55〜64のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６７】
活性化合物が核酸分子を含む、請求項55〜66のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６８】
活性化合物が小分子を含む、請求項55〜66のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項６９】
活性化合物がポリペプチドを含む、請求項55〜66のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項７０】
活性化合物が抗体または抗体試薬を含む、請求項55〜66のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項７１】
活性化合物が化学療法化合物を含む、請求項55〜66のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項７２】
活性化合物がインスリンを含む、請求項55〜66のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項７３】
活性化合物がGLP-1ポリペプチドまたはその模倣体もしくは類似体を含む、請求項55〜66のいずれか一項記載の組み合わせ。
【請求項７４】
活性化合物が1〜20 mg/kgの投与量で提供される、請求項73記載の組み合わせ。
【請求項７５】
イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物を対象に経口投与する工程を含む、肥満の治療、体重増加の予防、または対象の体重の低減方法。
【請求項７６】
CAGEが少なくとも0.1％ w/vの濃度である、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項75〜76のいずれか一項記載の方法。
【請求項７８】
CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項75〜77のいずれか一項記載の方法。
【請求項７９】
イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、請求項75〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
組成物が活性化合物をさらに含む、請求項75〜79のいずれか一項記載の方法。
【請求項８１】
活性化合物が、肥満の治療に治療効果がある、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
活性化合物が、肥満に関連する疾患の治療に治療効果がある、請求項80記載の方法。
【請求項８３】
活性化合物が小分子を含む、請求項80〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８４】
活性化合物がポリペプチドを含む、請求項80〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８５】
活性化合物が抗体または抗体試薬を含む、請求項80〜82のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
肥満の治療、体重増加の予防、または対象の体重の低減方法に使用するための、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含み、対象に経口投与される、組成物。
【請求項８７】
CAGEが少なくとも0.1％ w/vの濃度である、請求項86記載の組成物。
【請求項８８】
CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項86〜87のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８９】
CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項86〜87のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９０】
イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、請求項86〜89のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９１】
活性化合物をさらに含む、請求項86〜90のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９２】
活性化合物が、肥満の治療に治療効果がある、請求項91記載の組成物。
【請求項９３】
活性化合物が、肥満に関連する疾患の治療に治療効果がある、請求項91記載の組成物。
【請求項９４】
活性化合物が小分子を含む、請求項91〜93のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９５】
活性化合物がポリペプチドを含む、請求項91〜93のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９６】
活性化合物が抗体または抗体試薬を含む、請求項91〜93のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９７】
塩含有組成物と組み合わせた活性化合物を投与し、塩が少なくとも0.05Mの濃度で存在する、少なくとも1つの活性化合物の送達方法。
【請求項９８】
塩がイオン液体である、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
イオン液体がコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）である、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
陽イオンがコリンである、請求項99記載の方法。
【請求項１０１】
陰イオンがゲラネートまたはゲラン酸である、請求項99〜100のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
送達が、経口、皮下、皮内、静脈内、非経口、または粘膜に対してである、請求項97〜101のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０３】
送達が経口である、請求項97〜102のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０４】
塩が少なくとも0.05M、0.1M、0.5M、1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、またはより高い濃度で存在する、請求項97〜103のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０５】
塩が約0.05Mから約4Mの濃度で存在する、請求項97〜104のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０６】
塩が投与後に溶解する、請求項97〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０７】
塩が、純粋な液体または無水の液体である、請求項97〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０８】
塩が水溶液である、請求項97〜105のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０９】
投与が対象への投与である、請求項97〜108のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１０】
投与が、細胞および／または組織に接触させることである、請求項97〜108のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１１】
活性化合物が、核酸分子、化学療法化合物、小分子、ペプチド、および／または抗体もしくは抗体試薬を含む、請求項97〜110のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１２】
活性化合物が、塩の構成成分である、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
活性化合物が、インスリンまたはGLP-1ポリペプチドまたはその模倣体もしくは類似体を含む、請求項111記載の方法。
【請求項１１４】
a. 少なくとも0.05Mの濃度で存在する塩；および
b. 活性化合物
を含む、組成物。
【請求項１１５】
塩がイオン液体である、請求項114記載の組成物。
【請求項１１６】
イオン液体がコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）である、請求項115記載の組成物。
【請求項１１７】
陽イオンがコリンである、請求項116記載の組成物。
【請求項１１８】
陰イオンがゲラネートまたはゲラン酸である、請求項116または117記載の組成物。
【請求項１１９】
塩が少なくとも0.05M、0.1M、0.5M、1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、またはより高い濃度で存在する、請求項114〜118のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２０】
塩が約0.05Mから約4Mの濃度で存在する、請求項114〜119のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２１】
塩が、純粋な液体または無水の液体である、請求項114〜120のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２２】
塩が水溶液である、請求項114〜120のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２３】
活性化合物が、核酸分子、化学療法化合物、小分子、ペプチド、および／または抗体もしくは抗体試薬を含む、請求項114〜121のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２４】
活性化合物が、塩の構成成分である、請求項123記載の組成物。
【請求項１２５】
活性化合物が、インスリンまたはGLP-1ポリペプチドまたはその模倣体もしくは類似体を含む、請求項123記載の組成物。
【請求項１２６】
送達方法または治療方法に使用するための、請求項114〜125のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２７】
活性化合物の生物活性が、塩の非存在下における活性と比較して改善または安定化される、請求項97〜126のいずれか一項記載の方法または組成物。
【請求項１２８】
活性化合物および塩の組み合わせが混和物である、請求項97〜127のいずれか一項記載の方法または組成物。
【請求項１２９】
活性化合物および塩の組み合わせが、活性化合物を含むナノ粒子を含み、ナノ粒子が、塩を含む組成物における溶液または懸濁液中にある、請求項97〜128のいずれか一項記載の方法または組成物。
【請求項１３０】
それを必要とする対象に、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含みかつさらなる治療活性作用物質を含まない組成物を投与する工程を含む、対象において糖尿病、潰瘍、がん、または線維症を治療する方法。
【請求項１３１】
投与が注射を介する、請求項130記載の方法。
【請求項１３２】
投与が経口である、請求項130記載の方法。
【請求項１３３】
CAGEが少なくとも0.1％ w/vの濃度である、請求項130〜132のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３４】
CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項130〜133のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３５】
CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項130〜133のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３６】
CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項130〜133のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３７】
イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、請求項130〜136のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３８】
それを必要とする対象において糖尿病、潰瘍、がん、または線維症を治療する方法に使用するための、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含みかつさらなる治療活性作用物質を含まない、組成物。
【請求項１３９】
投与が注射を介する、請求項138記載の組成物。
【請求項１４０】
投与が経口である、請求項138記載の組成物。
【請求項１４１】
CAGEが少なくとも0.1％ w/vの濃度である、請求項138〜140のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４２】
CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項138〜141のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４３】
CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項138〜141のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４４】
CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、請求項138〜141のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１４５】
イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、請求項138〜144のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年11月17日に提出された米国仮出願第62/588,008号、2018年6月7日に提出された米国仮出願第62/681,852号、2018年6月7日に提出された米国仮出願第62/681,856号、2018年6月7日に提出された米国仮出願第62/681,861号、2018年6月7日に提出された米国仮出願第62/681,866号に、米国特許法第119条（e）に基づく恩典を主張する。これらの内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本明細書に記載される技術は、活性化合物の安定化および送達のためのイオン液体、例えばCAGEに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
多くの活性化合物、例えば薬学的に活性な化合物の取り込みは、溶媒中で化合物を送達することにより改善できる。しかしながら、そのような溶媒のほとんどは有毒な副作用を示し、および／または送達の時点で刺激物質として作用するため、そのようなアプローチはインビボでの使用にはしばしば不適切である。これらの毒性および刺激性の影響は、活性化合物の取り込みまたは性能におけるいかなる増加をも抑えるほど十分に深刻である。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書に示されるように、本発明者らは、特定のイオン液体であるCAGEが、驚くべきことに有害な副作用を引き起こさずに、活性化合物の取り込み動態の改善をもたらすことを見出した。この驚くべき効果は、担体溶媒によって引き起こされる毒性および刺激の影響を通常受けやすい多数の送達経路に当てはまる。CAGEは抗菌特性を有することが知られているため、この有毒な副作用の欠落は特に驚くべきことである。
【０００５】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた活性化合物を経口投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の経口送達方法である。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEと組み合わせた活性化合物を皮下、皮内、または静脈内投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の送達方法である。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEと組み合わせた活性化合物を粘膜に投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の送達方法である。
【０００６】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEと組み合わせた活性化合物を非経口投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の非経口送達方法である。いずれかの局面のいくつかの態様において、投与は腫瘍への送達を含む。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、それを必要とする対象に、CAGEと組み合わせた活性化合物を注射により罹患組織中へ投与することにより、対象において疾患を治療する方法である。いずれかの局面のいくつかの態様において、疾患は、がん、過剰な脂肪、脂肪、いぼ、過形成、または望ましくない組織増殖に起因する任意の他の疾患である。
【０００７】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEと組み合わせた活性化合物を含む組成物である。いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物はさらなる薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０００８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物は、経口、皮下、または非経口製剤として製剤化される。いずれかの局面のいくつかの態様において、経口製剤は活性化合物およびCAGEの組み合わせを含む分解性カプセルである。
【０００９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも0.1％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体の陰イオンはゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む。
【００１０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEと組み合わせた活性化合物は、1回投与される。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEと組み合わせた活性化合物は、複数回用量で投与される。
【００１１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は核酸分子を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は小分子を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物はポリペプチドを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は化学療法化合物を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物はインスリンを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は、抗体または抗体試薬を含む。
【００１２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物の生物活性は、CAGEの非存在下における活性と比較して改善または安定化される。
【００１３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物およびCAGEの組み合わせは混和物である。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物およびCAGEの組み合わせは、活性化合物を含むナノ粒子を含み、ナノ粒子は、CAGEを含む組成物における溶液または懸濁液中にある。
【００１４】
本明細書で実証されるように、本発明者らは、特定のイオン液体であるCAGEが、腸において親油性分子の取り込みを低減させることを見出した。したがって、CAGEは対象において脂肪吸収を低減させることができ、肥満の治療を提供するか、または体重／体重増加を低減させる。
【００１５】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書で提供されるのは、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物を対象に経口投与する工程を含む、肥満の治療、体重増加の予防、または対象の体重の低減方法である。
【００１６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも0.1％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体の陰イオンはゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む。
【００１７】
いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物は活性化合物をさらに含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は、肥満または肥満に関連する疾患の治療に治療効果がある。いずれかの局面のいくつかの態様において、小分子、ポリペプチド、または抗体もしくは抗体試薬。
【００１８】
本明細書に示されるように、塩（例えば、イオン液体またはCAGE）は0.05M以上の濃度で、薬物送達の有効性（例えば、細胞および／または細胞膜を通過する能力）における驚くべき増加を示す。したがって、本明細書に記載されるのは、塩含有組成物と組み合わせた活性化合物を投与し、塩が少なくとも0.05Mの濃度で存在する、少なくとも1つの活性化合物の送達方法である。本明細書にさらに記載されるのは、少なくとも0.05Mの濃度でCAGEを投与する、CAGEの送達方法である。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、塩が少なくとも0.05Mの濃度で存在する、塩および活性化合物を含む組成物である。
【００１９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、塩はイオン液体である。いずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体はコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）である。いずれかの局面のいくつかの態様において、陽イオンはコリンである。いずれかの局面のいくつかの態様において、陰イオンはゲラネートまたはゲラン酸である。
【００２０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、送達は、経口、皮下、皮内、静脈内、非経口、または粘膜に対してである。いずれかの局面のいくつかの態様において、送達は経口である。
【００２１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも0.05M、0.1M、0.5M、1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、またはより高い濃度で存在する。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は約0.05Mから約4Mの濃度で存在する。
【００２２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は投与後に溶解する。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は純粋な液体または無水の液体である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は水溶液である。
【００２３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、投与は、対象への投与である。いずれかの局面のいくつかの態様において、投与は、細胞および／または組織に接触させることである。
【００２４】
いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は、核酸分子、化学療法化合物、小分子、ペプチド、および／または抗体もしくは抗体試薬を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は塩の構成成分である。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物はインスリンを含む。
【００２５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物の生物活性は、塩の非存在下における活性と比較して改善または安定化される。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物および塩の組み合わせは混和物である。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物および塩の組み合わせは、活性化合物を含むナノ粒子を含み、ナノ粒子は、塩含有組成物における溶液または懸濁液中にある。
【００２６】
本明細書で実証されるように、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）は、インスリンの分解の阻害を含む、酵素阻害剤活性を有することが実証されている。したがって、本明細書で提供されるのは、特定の疾患を治療するためのイオン液体、例えばCAGEの使用に関する方法および組成物である。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象に酵素阻害療法を実施する方法である。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象において糖尿病、潰瘍、がん、または線維症を治療する方法である。
【００２７】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを含む組成物は、さらなる治療活性作用物質を含まない。いずれかの局面のいくつかの態様において、対象にCAGEを含む組成物が投与されている間の期間中、および／または対象がCAGEを含む組成物を含む治療計画を実施されている間の期間中、対象は病状（例えば、糖尿病、潰瘍、がん、または線維症）のためのさらなる治療活性作用物質を投与されない。
【００２８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、投与は注射を介するかまたは経口である。
【００２９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも0.1％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体の陰イオンはゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】CAGEの存在下における、Caco-2単層を横切るFITC-インスリン輸送の増強を示す。平均±S.E.（n＝6）として表されたデータ（* p＜0.01、** p＜0.001）。
【図２】図2A〜2Bは、Caco-2細胞の単層で覆われ、生理食塩水中に分散させたFITC-インスリン（図2A）および10 mM CAGE中に分散させたFITC-インスリン（図2B）とともに5時間インキュベートされたトランスウェル膜の代表的な共焦点顕微鏡写真画像を示す。画像は60倍の倍率で撮影された。画像は、DAPI標識核（青色）とFITC-インスリン（緑色）の重なりを示す。
【図３】CAGEによる処理の際のCaco-2細胞における密着結合の完全性に対する影響を示す。平均±S.E.（n＝6）として表されたデータ；（* p＜0.01、** p＜0.001）。
【図４】非糖尿病ラットにおいて空腸内投与した際に、インスリン-CAGEが血糖値を低下させる有効性を示す。平均±S.E.（n＝6）として表されたデータ。2 U/kg インスリンの皮下投与と比較して、2〜3.5時間からおよび5時間で、5 U/kg インスリン-CAGE処理ラットの有効性において有意に高い（p＜0.05）有効性が指摘された（*で表す）。
【図５】インスリンの経口バイオアベイラビリティの増強におけるCAGEの有効性を示す。平均±S.E.（n＝4）として表されたデータ。
【図６】経口投与のための細長いサイズ9のカプセルの内側に配置されたCAGEの写真を示す。
【図７】カプセルで経口投与されたインスリン-CAGEのインビボ有効性を示す。平均±S.E.（n＝6）として表されたデータ。皮下投与されたインスリンと比較して、様々な時点（*で表す）においてCAGE-インスリンの有意に高い（p＜0.05）有効性が観察された。
【図８】図8A〜8Eは、小腸組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色の顕微鏡写真を示す。（図8A）CAGEのみ（neat CAGE）の空腸内投与；（図8B）生理食塩水の空腸内投与；（図8C）CAGEのみの経口投与；（図8D）インスリン-生理食塩水の経口投与；（図8E）インスリン-CAGEの経口投与。スケールバー：200μm。挿入写真は、粘膜表面と50μmのスケールバー。
【図９】異なる月にCAGEから単離されたインスリンの円偏光二色性スペクトルを示す。インスリンをCAGEに分散し、RT（25℃）または4℃の冷蔵下で最長4か月間にわたって保存した。
【図１０】非糖尿病ラットにおいて、CAGEから単離されたインスリンが異なる時点で血糖値を低減させる有効性を示す。投与の1時間および2時間後（*で表す）に、新たに調製されたインスリンとRT（25℃）で3か月間保存されたインスリン-CAGEとの間で、生物活性において統計学的有意差（p＜0.05）が指摘された。平均±S.E.（n＝6）として表された全データ。
【図１１】左−CAGEに可溶化されたカンプトテシン（CPT）の4T1細胞に対する効果；右−CAGEに可溶化されたパクリタキセルの4T1細胞に対する効果、を示す。両方のグラフは、CAGEに可溶化された薬物がDMSOに可溶化されたものと同程度に効果があることを示す。
【図１２】CAGEから皮下送達されたインスリン（2 U/kg）（青）および対照（生理食塩水中2 U/kg、橙）およびCAGE単独（緑）の生物活性を示す。標準のインスリン-生理食塩水注射と比較して、CAGE中のインスリンは低血糖の実質的に長い持続をもたらした。
【図１３】室温（RT）および4℃でCAGE中に保存されたインスリンの生物活性を示す。生物活性は、室温で2か月間の保存の後ですら維持された。
【図１４】組織中のデキストランの分散に対するCAGEの効果を示す。生理食塩水（左端のパネル）と比較して、製剤にCAGEを添加すると、皮膚におけるデキストランの分散が増強される。増強の規模は、実施例2の表中に定量化されている。CAGEのみでは、デキストランの展開が2.6〜5.5倍の間に増強された。
【図１５】異なる月にCAGEから単離されたインスリンの円偏光二色性スペクトルを示す。インスリンをCAGEに分散し、室温（25℃）または4℃の冷蔵下で最長4か月間にわたって保存した。インスリンのアルファヘリックスの二次コンフォメーションは、CAGE中で長期間にわたって保持された。
【図１６】図16A〜16Bは、非糖尿病ラットにおいて空腸内投与した際に、インスリン-CAGEが血糖値を低下させる有効性を示す。図16Aは、空腹時効果に関連する血中グルコース変化について正規化した後の、様々な製剤の有効性を示す。生理食塩水単独を注射した動物を空腹群とみなし、生理食塩水群から得られた血中グルコースを差し引いた後でデータをプロットした。図16Bは、生理食塩水の血糖値で正規化せずに、最初のレベルと比較した血中グルコース変化を示す。すべてのデータを平均±標準誤差（S.E.）として表す（n＝6）。2 U/kg インスリンの皮下投与と比較して、研究の様々な時点で、5 U/kg インスリン-CAGE処理ラットの有効性において有意に高い（p＜0.05）有効性が指摘された（*で表す）。
【図１７】インスリンの経口バイオアベイラビリティの増強におけるCAGEの有効性を示す。平均±S.E.（n＝4）として表されたデータ。
【図１８】図18A〜18Bは、カプセルで経口投与されたインスリン-CAGEのインビボ有効性を示す。図18Aは、空腹時効果に関連する血中グルコース変化について正規化した後の、様々な製剤の有効性を示す。空のカプセルを注射した動物を空腹群とみなし、空のカプセル群から得られた血中グルコース変化を差し引いた後でデータをプロットした。図18Bは、空のカプセルの血糖値で正規化せずに、最初のレベルと比較した血中グルコース変化を示す。すべてのデータを平均±S.E.として表す（n＝6）。皮下投与されたインスリンと比較して、様々な時点（*で表す）においてCAGE-インスリンの有意に高い（p＜0.05）有効性が観察された。
【図１９】小腸組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色の顕微鏡写真を示す。切片は、CAGEのみまたは生理食塩水の空腸内投与；CAGEのみ、インスリン-生理食塩水、またはインスリン-CAGEカプセルの経口投与；およびインスリン、CAGEまたはインスリン-CAGEカプセルの7日間にわたる1日1回の反復投与後。スケールバー：200μm。挿入写真は、粘膜表面と50μmのスケールバー。
【図２０】CAGEのみのカプセルに続いて0.5時間後に10 U/kgのインスリンカプセルを連続投与した際の血中グルコース低下の有効性を示す。10 U/kgのインスリン溶液と、CAGEおよび10 U/kg インスリンの連続カプセル投与との間では、有効性に有意差は観察されなかった。平均±S.E.（n＝6）として表されたデータ。
【図２１】CAGEによる粘液粘度の低減を示す。CAGEなし（0％）、1および5％ w/v CAGEの模擬粘液について、50.12 1/sの剪断速度におけるcPでの平均粘度値を示す。平均±S.E.（n＝3）として表されたデータ；（* p＜0.001、CAGE処理なしと比較したCAGE処理）。
【図２２】GFP-プラスミドを使用した共焦点画像を示す。P3000（商標）Reagentは、送達媒体とコンジュゲートしたプラスミドの核への効率的な送達を助け、トランスフェクション効率の改善を助ける。P3000はリポソームではなく、小分子である可能性が最も高い。完全な培地交換の前の3日間にわたってトランスフェクションを行った。
【図２３】濃度依存性を示す：CAGE（1：2）＋P3000。％はCAGE濃度を指す。P3000（エンハンサー試薬）の濃度は0.09％ v/vで一定に保たれた。完全な培地交換の前の3日間にわたってトランスフェクションを行った。
【図２４】CAGE組成の効果を示す：0.9％の濃度。過剰なゲラン酸が存在する場合（1：2および1：4）に最大のトランスフェクションが生じた。P3000エンハンサー濃度は、0.09 v/v％で一定に保たれた。完全な培地交換の前に、IL＋プラスミドで1日間にわたってトランスフェクションを行った。
【図２５】GFP-プラスミドを使用した共焦点画像を示す：対照。完全な培地交換の前の3日間にわたってトランスフェクションを行った。
【図２６】純粋なCAGE-1：1（黒色実線）、CAGE-1：2（灰色実線）、CAGE-1：3（黒色破線）、CAGE-1：4（灰色破線）についての室温における広角X線散乱パターンである。プレピーク（低qピーク）の位置はCAGE中のゲラン酸のモル比に影響を受けるが、隣接ピーク（高qピーク）の位置は影響を受けない。
【図２７Ａ】図27A〜27Dは、（図27A）CAGE-1：1、（図27B）-1：2、（図27C）-1：3、（図27D）-1：4についての室温における水和誘導ナノ構造遷移を示す広角X線散乱パターンを示す。プレピーク（低qピーク）と隣接ピークの位置および強度は、CAGE中の水分量およびゲラン酸のモル比に影響を受ける。-1：3および-1：4のようにゲラン酸のモル比がより高いと、広いピークから鋭いピークへの遷移に反映されるように、ナノ構造は秩序立ったものになった。黒色太線：純粋なCAGE；灰色実線：75％ w/w CAGE；黒色細線：50％ w/w CAGE；灰色／細かい破線：25％ w/w CAGE；および黒色／広い破線：5％ w/w CAGE。
【図２７Ｂ】図27A〜27Dは、（図27A）CAGE-1：1、（図27B）-1：2、（図27C）-1：3、（図27D）-1：4についての室温における水和誘導ナノ構造遷移を示す広角X線散乱パターンを示す。プレピーク（低qピーク）と隣接ピークの位置および強度は、CAGE中の水分量およびゲラン酸のモル比に影響を受ける。-1：3および-1：4のようにゲラン酸のモル比がより高いと、広いピークから鋭いピークへの遷移に反映されるように、ナノ構造は秩序立ったものになった。黒色太線：純粋なCAGE；灰色実線：75％ w/w CAGE；黒色細線：50％ w/w CAGE；灰色／細かい破線：25％ w/w CAGE；および黒色／広い破線：5％ w/w CAGE。
【図２７Ｃ】図27A〜27Dは、（図27A）CAGE-1：1、（図27B）-1：2、（図27C）-1：3、（図27D）-1：4についての室温における水和誘導ナノ構造遷移を示す広角X線散乱パターンを示す。プレピーク（低qピーク）と隣接ピークの位置および強度は、CAGE中の水分量およびゲラン酸のモル比に影響を受ける。-1：3および-1：4のようにゲラン酸のモル比がより高いと、広いピークから鋭いピークへの遷移に反映されるように、ナノ構造は秩序立ったものになった。黒色太線：純粋なCAGE；灰色実線：75％ w/w CAGE；黒色細線：50％ w/w CAGE；灰色／細かい破線：25％ w/w CAGE；および黒色／広い破線：5％ w/w CAGE。
【図２７Ｄ】図27A〜27Dは、（図27A）CAGE-1：1、（図27B）-1：2、（図27C）-1：3、（図27D）-1：4についての室温における水和誘導ナノ構造遷移を示す広角X線散乱パターンを示す。プレピーク（低qピーク）と隣接ピークの位置および強度は、CAGE中の水分量およびゲラン酸のモル比に影響を受ける。-1：3および-1：4のようにゲラン酸のモル比がより高いと、広いピークから鋭いピークへの遷移に反映されるように、ナノ構造は秩序立ったものになった。黒色太線：純粋なCAGE；灰色実線：75％ w/w CAGE；黒色細線：50％ w/w CAGE；灰色／細かい破線：25％ w/w CAGE；および黒色／広い破線：5％ w/w CAGE。
【図２８】25℃および1 s-1の剪断速度における純粋ならびに50％水和CAGE-1：2および-1：4のレオロジー挙動の代表的な遷移を示す。純粋なCAGE-1：2の粘度は、50％の水を添加することで減少したが、純粋な-1：4の粘度は増加した。濃灰色：純粋；および薄灰色：水和。挿入写真：より粘度の低い-1：2（50％ H2O、w/w）およびゲル状-1：4（50％ H2O、w/w）の写真。
【図２９】図29Aは、純粋なCAGE-1：4のニュートン特性（青色のプロット）および50％水和-1：4の非ニュートン特性（赤色のプロット）のグラフを示す。図29Bは、水和した50％水和-1：4の剪断減粘挙動のグラフを示す。濃灰色：純粋な-1：4；薄灰色：50％水和-1：4。レオロジー実験は25℃で行った。
【図３０】図30A〜30Dは、CMCを示す（図30A）CAGE-1：1、（図30B）-1：2、（図30C）-1：3、（図30D）-1：4の濃度に対するピレン放出の第1（I1）および第3（I3）振電バンドの比率のプロットを示し、これは急勾配に相当する。CAGE-1：3および-1：4は、2つの異なるナノ構造への2つの自己集合がおそらく原因で、2つのCMCを呈した。
【図３１】図31A〜31Fは、水中のDESナノ構造の低温TEM顕微鏡写真を示す。上部パネル：（図31A）5％、w/w、CAGE-1：2；（図31B）5％、w/w、CAGE-1：3；（図31C）5％、w/w、CAGE-1：4の水中油型マイクロエマルション；（図31D）20％、w/w、CAGE-1：2のミセル；（図31E）20％ CAGE-1：3の小胞；および（図31F）CAGE1：4の小胞。
【図３２】CAGE中で投与されたセマグルチドのPKおよびPDのグラフを示す。n＝3、平均＋／−SEM。EIAキットを介したセマグルチドについてT0時点は陽性であり、これらのT0値は破線のデータセットにおいて差し引かれている。
【図３３】異なる濃度のCAGEの存在下における、Caco-2単層を横切るルシファーイエロー輸送の増強を示す。平均±S.E.（n＝4）として表されたデータ（* p＜0.05、** p＜0.001、*** p＜0.0001；CAGE処理なしと比較したすべてのCAGE処理）。
【図３４】クマリン-6の受動的トランスサイトーシスに対する様々な濃度のCAGEの効果を示す。平均±S.E.（n＝4）として表されたデータ；（* p＜0.05；** p＜0.0001；10 mM CAGE処理群と比較したCAGE処理なし）。
【図３５】様々な濃度のCAGEで処理した際のCaco-2細胞の生存率を示す。5時間後にCAGEを培養培地から除去し、新鮮なDMEMに置き換えた。細胞生存率は、MTTアッセイを使用してさらに19時間（合計24時間）後に測定した。平均±S.E.（n＝4）として表されたデータ。
【図３６】Caco-2細胞の層で覆われ、様々な濃度のCAGEまたはPPSに分散させたFITC-インスリンとともに5時間インキュベートされたトランスウェル膜の代表的な共焦点顕微鏡写真画像を示す。画像は40倍の倍率で撮影された。画像は、DAPI標識核（青色）、FITC-インスリン（緑色）、およびDAPI染色とFITC-インスリンの重なりを示す。
【図３７】CAGEの存在下における、Caco-2単層を横切るFITC-インスリン輸送の増強を示す。平均±S.E.（n＝4）として表されたデータ（* p＜0.05、** p＜0.001；CAGE処理なしと比較したCAGE処理）。
【図３８】異なる濃度のCAGEの存在下における、Caco-2単層を横切るFITC-デキストラン輸送の増強を示す。平均±S.E.（n＝4）として表されたデータ（* p＜0.01、** p＜0.0001；CAGE処理なしと比較したCAGE処理）。
【図３９】様々な濃度のCAGEまたは10 mM カプリン酸ナトリウムで処理した際のCaco-2細胞における密着結合の完全性に対する影響を示す。平均±S.E.（n＝4）として表されたデータ；（* p＜0.05；** p＜0.0001；CAGE処理なしと比較したすべてのCAGE処理）。
【図４０】トリプシン消化に対するCAGEによるインスリンの安定性の増強を示す。平均±S.E.（n＝3）として表されたデータ；（* p＜0.01；** p＜0.001；インスリン-CAGE処理と比較したインスリン-PBS処理）。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
詳細な説明
本明細書に記載されるように、本発明者らは、イオン液体CAGE（コリンおよびゲラネートまたはゲラン酸（gernanic acid））が経口および／または非経口での使用に安全なだけでなく、ほとんどの溶媒について通常観察される負の副作用を伴わずに、CAGEの溶液中に含まれる活性化合物の送達を有意に改善することを実証した。実際に、部類としての溶媒は毒性という一般的な問題をもたらすため、「溶媒曝露」は、1つまたは複数の溶媒との接触の危険性を包含することを意味する、広く使用される医学用語である。溶媒曝露は、一般的に、選ばれた個々の溶媒への曝露と同様に、多数の病状の病因に寄与することが示されている。これを踏まえると、体の自然防御の多くを迂回する、特に経口および非経口投与経路を介した、本明細書で実証されたCAGEの安全性プロファイルは、特に驚くべき予期しないものである。
【００３２】
したがって、いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）と組み合わせた活性化合物を含む組成物を経口投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の経口送達方法である。
【００３３】
経口投与は、錠剤（分割錠またはコーティング錠を含むがこれらに限定されない）、丸薬、カプレット、カプセル、チュアブル錠、粉末パケット、カシェー、トローチ、ウエハース、エアロゾルスプレー、またはシロップ、エリキシル、水性液体中の、非水性液体中の、水中油型エマルション中の、もしくは油中水型エマルション中の溶液または懸濁液などであるがこれらに限定されない液体を提供することを含み得る。経口製剤は、錠剤（分割錠またはコーティング錠を含むがこれらに限定されない）、丸薬、カプレット、カプセル、チュアブル錠、粉末パケット、カシェー、トローチ、ウエハース、エアロゾルスプレー、またはシロップ、エリキシル、水性液体中の、非水性液体中の、水中油型エマルション中の、もしくは油中水型エマルション中の溶液または懸濁液などであるがこれらに限定されない液体などであるがこれらに限定されない個別の剤形を含み得る。そのような組成物は、所定の量のCAGEおよび少なくとも1つの活性化合物を含み、当業者に周知の調剤方法によって調製されてよい。一般的に、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia PA. (2005)を参照されたい。
【００３４】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、インスリンの経口製剤をCAGEと組み合わせて経口投与することを含む、糖尿病の治療方法である。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、GLP-1ポリペプチドまたはその模倣体／類似体の経口製剤をCAGEと組み合わせて経口投与することを含む、糖尿病の治療方法である。
【００３５】
本明細書では、例えば投与によって活性化合物が生物の内部に浸透することを可能にするために通過しなければならない細胞層の特徴において、経口投与と局所投与は大きく異なることが注記される。皮膚では、投与された組成物が横断する最初の層は表皮であり、これは層状扁平上皮と、次に基底層からなる。表皮には少なくとも5つの層があり、最もよく見られる細胞種はメルケル細胞、ケラチノサイト、マラノサイト（malanocyte）、およびランゲルハンス細胞である。注目すべきことに、皮膚の最も外側の表面は、25〜30細胞の深さの死細胞の層を含む。表皮の下は真皮であり、これは結合組織、血管、および様々な腺を含む。対照的に、経口投与の場合は、組成物はすぐに腸上皮に接触するが、これは2つの薄い下部の層を有する単層円柱上皮細胞の単一の層である。さらに、腸上皮は不透過性を提供するために密着結合を形成するが、皮膚は生物に外部障壁を形成するためにケラチンを含む。したがって、過度の損傷を引き起こさずにこれらの各組織を通過させるという問題は著しく多岐にわたり、経口投与の間に遭遇する組織は、明らかに刺激および毒性の影響をはるかに容易に受けやすい。
【００３６】
本明細書の他の箇所に記載されるように、CAGEは経口投与の間に遭遇する敏感な膜を横切って活性化合物を安全に運ぶことができる。同様に、CAGEは他の敏感な内部組織を横切って活性化合物を安全に送達することができる。
【００３７】
本明細書の実施例に記載されるように、CAGEはプロテアーゼ阻害剤および粘液溶解活性の両方を提供する。したがって、これは粘膜への／粘膜を横切る送達媒体として特に適切である。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEと組み合わせた活性化合物を粘膜、例えば鼻粘膜、口腔粘膜、または膣粘膜に投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の送達方法である。
【００３８】
CAGEは薬物を可溶化する役目も果たすため、高濃度の注射を可能にする。また、CAGEは、EtOHなどの昔ながらの可溶化担体よりも速い速度で組織中に拡散する。いくつかの態様において、理論に拘束されることは望まないが、CAGEは組織中へ拡散することもできるため、薬物の局所的沈殿を可能にする。沈殿した薬物はデポーを形成し、徐放性を呈し得る。
【００３９】
別の態様において、薬物はCAGEの局所拡散後であってすら、CAGEに可溶性のままであり続けてよく、循環への迅速かつ増強された送達へとつながってもよい。皮下送達には、しばしば複数回投与または放出制御製剤が必要となる。そのようなアプローチは、必ずしもタイミング自体に関するいかなる懸念が原因で実行されるわけでもなく、むしろ活性化合物の分解の前に全用量を確実に受けさせるために行われる。総量が効果を発揮できる前に活性化合物が分解または代謝されるため、ボーラス投与はしばしば効果がない。活性化合物を安定化するCAGEの能力のおかげで、そのようなアプローチは不要であり、すなわち放出制御機構の必要なしに、所望の総量を単回投与として送達できる。
【００４０】
したがって、いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEと組み合わせた活性化合物を投与する工程を含む、皮下、皮内、または静脈内投与による少なくとも1つの活性化合物の送達方法である。いずれかの局面のいくつかの態様において、皮下、皮内、または静脈内投与は、注射、カテーテル、ポートなどを介した投与を含む。
【００４１】
本発明者らは、CAGEがより高い濃度で細胞傷害性効果をもたらし、CAGEに曝露された細胞が50％を超えて死滅することをさらに実証した。これは、活性化合物自体が細胞傷害性または細胞増殖抑制性であるように設計されている場合、または1つまたは複数の細胞種（例えば、がん）の増殖を阻害することによって疾患を治療できる場合の適用について特に有用である。細胞傷害性に適したCAGEの濃度は、例えば標的組織の種類、使用されているCAGEの化学量論比、投与されている組成物の量、および／または所望の効果の程度に応じて変わり得る。
【００４２】
したがって、いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEと組み合わせた活性化合物を非経口投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の非経口送達方法である。いくつかの態様において、非経口投与は腫瘍、例えばがん腫瘍への送達を含む。
【００４３】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるような、CAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物は、非経口投薬形態であり得る。非経口剤形の投与は、汚染物質に対する患者の自然防御を通常迂回するので、好ましくは、非経口剤形は無菌であるか、または患者への投与前に滅菌できる。非経口剤形の例には、注射の準備ができている溶液、薬学的に許容される注射用媒体に溶解または懸濁する準備ができている乾燥製品、注射の準備ができている懸濁液、およびエマルションが含まれるが、これらに限定されない。さらに、DUROS（登録商標）型の剤形および用量ダンピングが含まれるが、これらに限定されない放出制御非経口剤形を患者の投与用に調製できる。
【００４４】
本明細書内に開示されるような、CAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物の非経口剤形を提供するのに使用できる適切な媒体は、当業者に周知である。例として以下が含まれるが、これらに限定されない：滅菌水；注射用水USP；生理食塩水溶液；グルコース溶液；塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、ブドウ糖注射液、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸リンゲル注射液などであるがこれらに限定されない水性媒体；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどであるがこれらに限定されない水混和性媒体；コーン油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどであるがこれらに限定されない非水性媒体。従来型の非経口剤形および放出制御非経口剤形を含む、本明細書に開示されるような、組成物中の成分の溶解度を改変または修正する化合物も本開示の非経口剤形に組み込むことができる。
【００４５】
従来型の剤形は、一般的に、製剤からの急速または即時の薬物放出をもたらす。薬物の薬理学および薬物動態学に応じて、従来型の剤形の使用は、患者の血液および他の組織における薬物の濃度の広い揺らぎにつながり得る。これらの揺らぎは、投薬頻度、作用の開始、有効性の持続期間、治療的血中レベルの維持、毒性、副作用などの多くのパラメーターに影響を与え得る。本明細書の上記に注記されるように、CAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物は、放出制御製剤を使用する特定の理由を取り除くことができるが、いくつかの態様において、方法および組成物は放出制御製剤で利用できることが本明細書で企図される。例えば薬物の作用の開始、作用の持続期間、治療濃度域内の血漿レベル、およびピーク血中レベルを制御するのに放出制御製剤を使用できる。特に、薬物の最大の効き目が確実に達成されると同時に、薬物の過少投与（すなわち、最低限の治療レベルを下回る）および薬物の毒性レベルの超過の両方から生じ得る潜在的な不利益な影響および安全性の懸念を最小限に抑えるために放出制御または持続放出の剤形または製剤を使用できる。いくつかの態様において、CAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物は、徐放性製剤で投与することができる。
【００４６】
放出制御医薬製品は、それらの非放出制御対応物によって達成されるよりも薬物療法を改善させるという共通の目標を有する。理想的には、医学的治療において最適に設計された放出制御調製物の使用は、最小限の量の時間で病状を治癒または制御するために使用される最小限の薬物物質によって特徴付けられる。放出制御製剤の利点には、以下が含まれる：1）薬物の活性の延長；2）投与頻度の低減；3）患者のコンプライアンスの向上；4）より少ない総薬物の使用；5）局所的または全身的な副作用の低減；6）薬物の蓄積の最小化；7）血中レベルの揺らぎの低減；8）治療の有効性の改善；9）薬物活性の相乗作用または喪失の低減；および10）疾患または病状の制御速度の改善。Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)。
【００４７】
ほとんどの放出制御製剤は、所望の治療効果を即座に産生する量の薬物（活性成分）を最初に放出し、長期間にわたってこの治療効果または予防効果のレベルを維持するように、他の量の薬物を徐々にかつ継続的に放出するように設計されている。体内でこの一定レベルの薬物を維持するためには、代謝されて体から排泄されている薬物の量に置き換わる速度で薬物が剤形から放出されなければならない。活性成分の放出制御は、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理学的条件または化合物を含むがこれらに限定されない様々な条件によって刺激され得る。
【００４８】
本開示の塩および組成物での使用のために、様々な公知の放出制御または持続放出剤形、製剤、およびデバイスを適合させることができる。例として米国特許第3,845,770号；米国特許第3,916,899号；米国特許第3,536,809号；米国特許第3,598,123号；米国特許第4,008,719号；米国特許第5674,533号；米国特許第5,059,595号；米国特許第5,591,767号；米国特許第5,120,548号；米国特許第5,073,543号；米国特許第5,639,476号；米国特許第5,354,556号；米国特許第5,733,566号；および米国特許第6,365,185 B1号に説明されているものが含まれるがこれらに限定されず、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。所望の放出プロファイルを様々な割合で提供するために、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧システム（OROS（登録商標）（Alza Corporation, Mountain View, Calif. USAなど））、またはそれらの組み合わせを使用して、1つまたは複数の有効成分の徐放または制御放出を提供するために、これらの剤形を使用できる。
【００４９】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、それを必要とする対象に、CAGEと組み合わせた活性化合物を注射により罹患組織中へ投与することにより、対象において疾患を治療する方法である。いくつかの態様において、罹患組織は病変細胞を含む組織である。いくつかの態様において、罹患組織は疾患の症状を示す組織である。適切な罹患組織の非限定的な例には、腫瘍組織、脂肪組織（fat tissue）、いぼ、望ましくない脂肪組織（adipose tissue）などが含まれる。
【００５０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、疾患は組織の増殖、例えば求められていない、異常な、または病的な組織の増殖に起因する疾患である。組織の増殖に起因する疾患は、健康な対象における組織の種類について正常なものとは異なる、組織の増殖の速度、組織の増殖の場所、または組織の増殖のパターン／構造によって引き起こされるか、または特徴付けられる任意の疾患であり得る。そのような疾患の非限定的な例は、腫瘍、がん、脂肪／肥満、いぼ、および／または過形成である。
【００５１】
本明細書で使用される「イオン液体（IL）」という用語は、室温で液体状態にある有機塩または有機塩の混合物を指す。この部類の溶媒は、工業処理、触媒作用、医薬、および電気化学を含む様々な分野で有用であることが示されている。イオン液体は、少なくとも1つの陰イオン成分および少なくとも1つの陽イオン成分を含む。イオン液体は、追加の水素結合供与体（すなわち、-OHまたは-NH基を提供できる任意の分子）を含むことができ、例としてアルコール、脂肪酸、およびアミンが含まれるが、これらに限定されない。少なくとも1つの陰イオン成分および少なくとも1つの陽イオン成分は、任意のモル比で存在してよい。例示的なモル比（陽イオン：陰イオン）には1：1、1：2、2：1、1：3、3：1、2：3、3：2、およびこれらの比率の間の範囲が含まれるが、これらに限定されない。イオン液体のさらなる考察については、例えばHough, et ah , “The third evolution of ionic liquids: active pharmaceutical ingredients”, New Journal of Chemistry, 31 : 1429 (2007)およびXu, et al., “Ionic Liquids: Ion Mobilities, Glass Temperatures, and Fragilities”, Journal of Physical Chemistry B, 107(25): 6170-6178 (2003)を参照されたく、これらのそれぞれは全体として参照により本明細書に組み込まれる。いずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体または溶媒は100℃未満で液体として存在する。いずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体または溶媒は室温で液体として存在する。
【００５２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるイオン液体はCAGE（Choline And GEranate）である。CAGEは陽イオンコリン（例えば、構造Iを参照）および陰イオンゲラネートまたはゲラン酸（例えば、構造IIおよびIIIを参照）を含むイオン液体である。CAGEの調製は、例えば国際特許公開WO 2015/066647に記載されているとおりであることができ、これは全体として参照により本明細書に組み込まれ、または本明細書の実施例に記載されているとおりであり得る。
2021503468.tif 000003
【００５３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体の陰イオンはゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体の陰イオンはゲラネートを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体の陰イオンはゲラン酸を含む。
【００５４】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも0.01％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも0.05％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも0.1％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも0.2％ w/v、少なくとも0.3％ w/v、少なくとも0.4％ w/v、少なくとも0.5％ w/v、少なくとも1％ w/v、またはより高い濃度である。
【００５５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約0.01％ w/vから約1％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは0.01％ w/vから1％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約0.05％ w/vから約0.5％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは0.05％ w/vから0.5％ w/vの濃度である。
【００５６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも25％ w/wの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは水中で少なくとも25％ w/wの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは生理食塩水または生理学的に適合する緩衝液中で少なくとも25％ w/wの濃度である。
【００５７】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約5％ w/wから約75％ w/wの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは5％ w/wから75％ w/wの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは水、生理食塩水、または生理学的に適合する緩衝液中で約5％ w/wから約75％ w/wの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは水、生理食塩水または生理学的に適合する緩衝液中で5％ w/wから75％ w/wの濃度である。
【００５８】
本明細書に記載されるように、CAGEの濃度および比率を変えることで、異なる構造を達成できる。水和の度合いを増加させると、天然の分子クラスターおよびイオンクラスターが破壊され、極性ドメインおよび非極性ドメイン、原子の隣接関係、ならびに分子内および分子間相互作用に影響を与えるナノスケールの再編成につながった。水和の度合いが高い＞75％ H2Oでは、前駆体のモル比に応じてDESのナノ構造が小胞、回転楕円体ミセル、およびo/w型マイクロエマルションに自己集合した。
【００５９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有し、約5％ w/wの濃度で、マイクロエマルションを提供する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：3から約1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有し、約20％ w/wの濃度で、小胞を提供する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：2のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有し、約20％ w/wの濃度で、ミセルを提供する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有し、約50％ w/wの濃度で、ゾル-ゲルを提供する。
【００６０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEはゲルまたは剪断減粘ニュートンゲルである。
【００６１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも25％ w/wの濃度で、少なくとも1：3のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは水中で少なくとも25％ w/wの濃度で、少なくとも1：3のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは少なくとも25％ w/wの濃度で、1：3または1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは水中で少なくとも25％ w/wの濃度で、1：3または1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEはゲルまたは剪断減粘ニュートンゲルである。
【００６２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEはw/wまたはw/vで100％である。
【００６３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約10：1から約1：10のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは10：1から1：10のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約5：1から約1：5のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは5：1から1：5のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約2：1から約1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは2：1から1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：1から約1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは1：1から1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは約1：1、1：2、1：3、または1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEは1：1、1：2、1：3、または1：4のコリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率を有する。図は、1：1の比率のCAGEを利用した図11を除いて、1：2の比率のCAGEで収集されたデータを示す。理論に束縛されることは望まないが、より高い比率のゲラン酸および／またはゲラネートを有する組成物はより高い疎水性および毒性を示し、より高い比率のコリンを有する組成物はより高い親水性を示し、より不活性である。いずれかの局面のいくつかの態様において、より高い比率のゲラン酸および／またはゲラネートを有する組成物はより高い疎水性を示し、より高い比率のコリンを有する組成物はより高い親水性を示す。
【００６４】
いずれかの局面のいくつかの態様において、例えば1つまたは複数の核酸分子がCAGEと組み合わせて提供される場合、コリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率は1：1より大きく、例えば1：2より大きく、約1：2から約1：4、または1：2から1：4である。
【００６５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物または製剤中のイオン液体（例えば、CAGE）濃度は、約0.1 mM〜20 mMである。いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物または製剤中のイオン液体（例えば、CAGE）濃度は、約0.5 mM〜20 mM、0.5 mM〜18 mM、0.5 mM〜16 mM、0.5 mM〜14 mM、0.5 mM〜12 mM、0.5 mM〜10 mM、0.5 mM〜8 mM、1 mM〜20 mM、1 mM〜18 mM、1 mM〜16 mM、1 mM〜14 mM、1 mM〜12 mM、1 mM〜10 mM、1 mM〜8 mM、2 mM〜20 mM、2 mM〜18 mM、2 mM〜16 mM、2 mM〜14 mM、2 mM〜12 mM、2 mM〜10 mM、2 mM〜8 mM、4 mM〜20 mM、4 mM〜18 mM、4 mM〜16 mM、4 mM〜14 mM、4 mM〜12 mM、4 mM〜10 mM、4 mM〜8 mM、6 mM〜20 mM、6 mM〜18 mM、6 mM〜14 mM、6 mM〜12 mM、6 mM〜10 mM、6 mM〜8 mM、8 mM〜20 mM、8 mM〜18 mM、8 mM〜16 mM、8 mM〜14 mM、8 mM〜12 mM、8 mM〜10 mM、10 mM〜20 mM、10 mM〜18 mM、10 mM〜16 mM、10 mM〜14 mM、10 mM〜12 mM、12 mM〜20 mM、12 mM〜18 mM、12 mM〜16 mM、12 mM〜14 mM、14 mM〜20 mM、14 mM〜18 mM、14 mM〜16 mM、16 mM〜20 mM、16 mM〜18 mM、または18 mM〜20 mMである。いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物または製剤中のイオン液体（例えば、CAGE）濃度は、約1 mM、約2 mM、約3 mM、約4 mM、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、または約20 mMである。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「と組み合わせた」は、任意の分子的または物理的配置で同じ製剤中、例えば混和物中、溶液中、混合物中、懸濁液中、コロイド中、エマルション中に存在する2つ以上の物質を指す。製剤は、均質または不均質な混合物であり得る。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物はCAGEとともに溶液中、混合物中、混和物中、懸濁液中などで、超構造、例えばナノ粒子、リポソーム、ベクター、細胞、足場などにより含まれ得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「活性化合物」または「活性作用物質」は、標的細胞または標的生物に効果を及ぼす任意の作用物質である。「化合物」および「作用物質」という用語は、普通は存在しないか、または細胞、組織、もしくは対象に投与および／または提供されるレベルでは存在しない任意の実体を指す。作用物質は、以下を含む群より選択できる：化学物質；小さい有機または無機分子；シグナル伝達分子；核酸配列；核酸類似体；タンパク質；ペプチド；酵素；アプタマー；ペプチド模倣体、ペプチド誘導体、ペプチド類似体、抗体；細胞内抗体（intrabody）；生体高分子、細菌、植物、菌類、または動物の細胞もしくは組織などの生物材料から作られた抽出物；天然または合成の組成物またはその機能的断片。いくつかの態様において、作用物質は、合成および天然の非タンパク質性実体を含むがこれらに限定されない、任意の化学物質、実体、または部分である。作用物質は、所望の活性および／または特性を有することが知られ得るか、または多様な化合物のライブラリーから選択できる。本明細書に記載される方法での使用が企図される活性化合物の非限定的な例には、小分子、ポリペプチド、核酸、化学治療／化学療法化合物、抗体、抗体試薬、ワクチン、GLP-1ポリペプチドもしくはその模倣体／類似体、およびインスリンが含まれる。
【００６８】
本明細書に記載される場合、核酸分子は、ベクター、発現ベクター、阻害性核酸、アプタマー、鋳型分子もしくはカセット（例えば、遺伝子編集用）、またはターゲティング分子（例えば、CRISPR-Cas技術用）、または細胞への送達が望まれる任意の他の核酸分子であり得る。核酸分子は、RNA、DNA、またはそれらの合成もしくは修飾バージョンであり得る。
【００６９】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた核酸分子を細胞と接触させる工程を含む、核酸分子を細胞へ送達する方法である。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は対象中の細胞であり、接触工程は、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた核酸分子を対象に投与する工程を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞はインビトロ、インビボ、またはエクスビボである。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は真核生物である。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は上皮細胞、例えば腸上皮細胞である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モル当たり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、1モル当たり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モル当たり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モル当たり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態を含み得るがこれらに限定されない化学作用物質を指す。
【００７１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は治療化合物または薬物、例えば対象における少なくとも1つの病状の治療に治療効果がある作用物質または化合物であり得る。様々な病状の治療化合物が当技術分野において公知であり、例えばワールドワイドウェブ上のdrugs.comで利用可能なデータベースまたはワールドワイドウェブ上のcatalog.data.gov/dataset/drugsfda-databaseで利用可能なFDA承認化合物のカタログを参照されたく、これらのそれぞれは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「化学療法剤」という用語は、異常な細胞増殖によって特徴付けられる疾患の治療において治療的有用性を有する任意の化学的または生物学的作用物質を指す。そのような疾患は、腫瘍、新生物、およびがんならびに過形成増殖によって特徴付けられる疾患を含む。これらの作用物質は、継続した増殖のためにがん細胞が依存する細胞活性を阻害するように機能し得る。すべての態様のいくつかの局面において、化学療法剤は細胞周期阻害剤または細胞分裂阻害剤である。本発明の方法において有用な化学療法剤の範疇には、アルキル化／アルカロイド剤、代謝拮抗剤、ホルモンもしくはホルモン類似体、および多岐にわたる抗腫瘍薬が含まれる。これらの作用物質のほとんどは、がん細胞に対して直接的または間接的に傷害性である。1つの態様において、化学療法剤は放射性分子である。
【００７３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は疎水性分子、例えばエストラジオール、テストステロン、イミキモド、コルチコステロン、パクリタキセル、ドキソルビシン、シスプラチン、および／またはカンプトテシンである。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は疎水性分子、例えばエストラジオール、テストステロン、パクリタキセル、ドキソルビシン、シスプラチン、および／またはカンプトテシンである。
【００７４】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEと組み合わせた少なくとも1つの活性化合物を含む組成物である。いくつかの態様において、医薬組成物はCAGEおよび本明細書に記載されるような1つまたは複数の活性化合物を含む。いくつかの態様において、医薬組成物は本質的にCAGEおよび本明細書に記載されるような1つまたは複数の活性化合物からなる。いくつかの態様において、医薬組成物はCAGEおよび本明細書に記載されるような1つまたは複数の活性化合物からなる。いくつかの態様において、医薬組成物は本質的にCAGEの水溶液および本明細書に記載されるような1つまたは複数の活性化合物からなる。いくつかの態様において、医薬組成物はCAGEの水溶液および本明細書に記載されるような1つまたは複数の活性化合物からなる。
【００７５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEおよび活性化合物を含む組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」、「生理学的に忍容される」という用語およびそれらの文法上のバリエーションは、組成物、担体、希釈剤、および試薬を指す場合、互換的に使用され、吐き気、めまい、胃の不調などの望ましくない生理学的効果を産生することなく、材料を哺乳動物へまたは哺乳動物上に投与できることを表す。薬学的に許容される担体は、そのように望まれない限り、それと混和されている作用物質に対する免疫応答の上昇を促進しない。その中に溶解または分散された有効成分を含む薬理学的組成物の調製は、当技術分野においてよく理解されており、製剤に基づいて限定される必要はない。通常そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能なように調製されるが、使用前に液体中で溶解に適切または懸濁液に適切な固体の形態でも調製し得る。調製物は乳化することもでき、またはリポソーム組成物として提示することもできる。活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合する賦形剤と、本明細書に記載される治療的方法での使用に適切な量で混合できる。適切な賦形剤には、例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせが含まれる。さらに、所望の場合、組成物は、活性成分の効き目を増強する湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤などの少量の補助物質を含み得る。本開示の治療組成物は、その中の成分の薬学的に許容される塩を含み得る。薬学的に許容される塩には、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）、酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシル基と形成された塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも由来し得る。生理学的に忍容される担体は、当技術分野において周知である。例示的な液体担体は、有効成分および水に加えて材料を含まないか、または生理学的pH値のリン酸ナトリウム、生理学的生理食塩水、または両方、例えばリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を含む無菌水溶液である。さらに加えて、水性担体は複数の緩衝塩ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質などの塩を含み得る。液体組成物は、水に加えておよび水を除外して、液相も含み得る。そのような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水油エマルションである。本明細書に記載される方法で使用される、特定の障害または病状の治療に効果がある活性作用物質の量は、障害または病状の本質に依存し、標準的な臨床技術によって決定できる。適切な医薬担体は、技術の本分野における標準的な参照テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciences, A. Osolに記載されている。例えば、注射による投与に適切な非経口組成物は、1.5重量％の活性成分を0.9％塩化ナトリウム溶液に溶解することで調製される。
【００７６】
医薬担体の文脈における「担体」という用語は、治療薬が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を指す。そのような医薬担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む、水および油などの無菌液体であり得る。医薬組成物が静脈内投与される場合は、水が好ましい担体である。生理食塩水溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール溶液も、特に注射可能な溶液のための液体担体として使用できる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。所望の場合、組成物は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとり得る。組成物は、トリグリセリドなどの昔ながらの結合剤かつ担体を用いて、坐剤として製剤化できる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。適切な医薬担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., 1990)に説明されている。製剤は投与方式に適したものであるべきである。
【００７７】
薬学的に許容される担体および希釈剤には、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒質が含まれる。そのような担体および希釈剤の使用は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体としての役目を果たすことができる材料のいくつかの非限定的な例には、以下が含まれる：（1）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；（2）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（3）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、および酢酸セルロース；（4）粉末トラガント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルクなどの潤滑剤；（8）カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；（9）落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの油；（10）プロピレングリコールなどのグリコール；（11）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（PEG）などのポリオール；（12）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（13）寒天；（14）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（15）アルギン酸；（16）発熱物質を含まない水；（17）等張生理食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（22）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤（23）血清アルブミン、HDL、およびLDLなどの血清成分；（22）エタノールなどのC2〜C12アルコール；ならびに（23）医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤、および抗酸化剤も製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は、本明細書において互換的に使用される。いくつかの態様において、担体は活性化合物の分解を阻害する。「薬学的に許容される担体」という用語は、組織培養培地を除く。
【００７８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEおよび活性化合物を含む組成物は、経口、皮下、静脈内、皮内、または非経口製剤として製剤化できる。いずれかの局面のいくつかの態様において、経口製剤は、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEおよび活性化合物を含む組成物を含む分解性カプセルであり得る。
【００７９】
本明細書に記載されるいずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物の生物活性は、CAGEの非存在下における活性と比較して改善または安定化される。本明細書に記載されるいずれかの局面のいくつかの態様において、イオン液体（例えば、CAGE）または溶媒は、イオン液体または溶媒が存在しない対照インスリンと比較して、皮膚を横切るインスリンの透過を大幅に増強する。
【００８０】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEで被覆されたカテーテルを用いて少なくとも活性化合物を対象に投与する方法である。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEで被覆されたカテーテルを体内へ配置することによって体液を収集する方法である。
【００８１】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEおよび活性化合物を含むもので、病状を有するかまたは有すると診断された対象を治療することに関する。糖尿病などの病状を有する対象は、糖尿病を診断する現在の方法を使用して、医師によって特定され得る。これらの病状を特徴付け、診断を助ける糖尿病の症状および／または合併症は、当技術分野において周知であり、体重減少、治癒遅延、多尿症、多飲症、多食症頭痛、皮膚のかゆみ、および疲労が含まれるが、これらに限定されない。例えば糖尿病の診断を助けてもよい検査には、血液検査（例えば、空腹時グルコースレベルについて）が含まれるが、これに限定されない。糖尿病の家族歴または糖尿病のリスク因子（例えば、過体重）への曝露も、対象が糖尿病を有する可能性が高いかを判断するのを、または糖尿病の診断を行うのを助け得る。
【００８２】
本明細書に記載される組成物および方法は、本明細書に記載される病状を有するかまたは有すると診断された対象に投与できる。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される病状の症状を緩和するために、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEおよび活性化合物を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「症状を緩和する」とは、病状に関連する任意のマーカーまたは症状を改良することである。同等の未処理対照と比較して、そのような低減は、任意の標準技術で測定して少なくとも5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％、またはより大きい。本明細書に記載される組成物を対象に投与するための様々な手段が当業者に公知である。そのような方法は、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、皮膚、注射、または腫瘍内投与を含み得るが、これらに限定されない。投与は局所的または全身的であり得る。
【００８３】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を緩和するのに必要な組成物の量を指し、所望の効果をもたらすための薬理学的組成物の十分な量に関する。したがって、「治療的有効量」という用語は、典型的な対象に投与された場合に特定の効果をもたらすのに十分な組成物の量を指す。本明細書で使用される有効量は、様々な文脈において、疾患の症状の発症を遅らせ、症状疾患の経過を改変し（例えば、疾患の症状の進行を遅延させるが、これに限定されない）、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量も含む。したがって、正確な「有効量」を特定することは、一般的に実行可能ではない。しかしながら、任意の所与の場合について、当業者はルーチン的な実験だけを使用して適した「有効量」を決定できる。
【００８４】
有効量、毒性、および治療的有効性は、例えばLD50（集団の50％に致死的な用量）およびED50（集団の50％に治療効果がある用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準的な医薬手順によって決定できる。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて変わり得る。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、LD50/ED50の比率として表すことができる。大きい治療指数を呈する組成物および方法が好ましい。治療的有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定できる。また、細胞培養または適した動物モデルにおいて決定されたIC50（すなわち、症状の半最大阻害を達成する活性化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルで用量を策定できる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定できる。任意の特定の投与量の効果は適切なバイオアッセイ、例えば、中でも血中グルコースのアッセイによってモニターできる。投与量は医師によって決定されることができ、観察された治療効果に合わせて必要に応じて調整され得る。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「糖尿病」は、膵臓によるインスリン分泌の欠乏または欠如によって特徴付けられる代謝性疾患である真性糖尿病を指す。本明細書全体を通して使用される場合、本明細書で別に特定されない限り、「糖尿病」は1型、2型、3型、および4型糖尿病を含む。糖尿病の開始は、通常、遺伝的原因と環境的原因の組み合わせが原因であり、異常に高い血糖値（高血糖症）という結果になる。糖尿病の最もよく見られる2つの形態は、インスリンの産生の下落（1型において）またはインスリンに対する体の応答の下落（2型および妊娠性において）のいずれかが原因である。どちらも高血糖症につながり、糖尿病の急性徴候：過剰な尿の産生、結果として代償性口渇および水分摂取の増加、霧視、原因不明の体重減少、嗜眠、およびエネルギー代謝の変化を主に引き起こす。糖尿病は多くの合併症を引き起こし得る。疾患が適当に制御されていないと急性合併症（低血糖症、ケトアシドーシス、または非ケトン性高浸透圧性昏睡）が生じることがある。重い長期的合併症（すなわち、慢性の副作用）は、心血管疾患（リスクの倍増）、慢性腎不全、網膜の損傷（失明につながり得る）、神経の損傷（数種類に及ぶ）、ならびにインポテンスおよび創傷治癒不良を引き起こすことのある微小血管の損傷を含む。創傷の治癒不良、特に足の創傷治癒不良は、壊疽そしておそらく切断につながり得る。いくつかの態様において、糖尿病は2型糖尿病であり得る。2型糖尿病（非インスリン依存性糖尿病（NIDDM）または成人発症型糖尿病）は、主としてインスリン抵抗性（インスリンに対する体の応答の下落）、相対的なインスリン欠乏、および高血糖症によって特徴付けられる代謝障害である。いくつかの態様において、対象は前糖尿病であり得、これは例えば空腹時血糖の上昇または食後血糖の上昇を有するとして特徴付けることができる。
【００８６】
グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）は、ヒトにおいて食物摂取および空腹感を低減することが知られており、グルコース恒常性に寄与するプログルカゴン遺伝子の転写産物に由来するインクレチンである。GLP-1模倣体は、現在2型糖尿病の治療に使用されている。最近の臨床試験において、これらの治療がグルコース恒常性を改善するだけでなく、体重減少の誘導にも成功することが示された。本明細書で使用される場合、「GLP-1ポリペプチド」はGLP-1の様々なプレおよびプロペプチドならびに切断産物を指し、例えばヒトの場合はGLP-1(1-37)（SEQ ID NO: 2）、GLP-1(7-36)（SEQ ID NO: 3）、およびGLP-1(7-37)（SEQ ID NO: 4）などである。いくつかの態様において、GLP-1ポリペプチドは、GLP-1(7-36)および／またはGLP-1(7-37)またはヒト以外の種に由来する相互に関連したポリペプチドであり得る。GLP-1ポリペプチドの配列は、当技術分野において多数の種について知られており、例えばヒトGLP-1（NCBI Gene ID: 2641）ポリペプチド（例えば、NCBI Ref Seq: NP_002045.1；SEQ ID NO: 1）およびSEQ ID NO: 2〜4などである。いくつかの態様において、GLP-1のプレまたはプロペプチド、例えばグルカゴンプレプロタンパク質（例えば、SEQ ID NO: 1）を、本明細書に記載される方法または組成物で使用できる。本明細書に記載されるいずれかのポリペプチドの天然対立遺伝子または変異体も、本明細書に記載される方法および組成物で使用することが具体的に企図される。
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【００８７】
様々なGLP-1模倣体が当技術分野において公知であり、糖尿病の治療に使用されている。GLP-1模倣体（または類似体）は、エキセンディン-4（ヒトGLP-1と相同性を有するドクトカゲ属（Heloderma）トカゲポリペプチド）およびその誘導体、DPP-IV耐性となるように修飾されたGLP-1類似体、または、例えば半減期を延長するために、様々なさらなる作用物質にコンジュゲートされたヒトGLP-1ポリペプチドを含み得る。GLP-1模倣体／類似体は、例えばエクセナチド、リキシセナチド、デュラグルチド、セマグルチド、アルビグルチド、LY2189265、リラグルチド、およびタスポグルチドを含み得る。そのような分子の例ならびにそれらの製造および活性のさらなる考察は、当技術分野において、例えばGupta. Indian J. Endocrinol Metab 17:413-421 (2013)；Garber. Diabetes Treatments 41:S279-S284 (2018)；米国特許公開第US 2009/0181912号；および国際特許公報第WO 2011/080103号に見出すことができ、これらのそれぞれは全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、一般的に異常な細胞が制御なく分裂し、近くの組織に侵入し得る疾患または病状の部類に関する。がん細胞は、血液およびリンパ系を通じて体の他の部分にも展開し得る。いくつかの主な種類のがんが存在する。上皮性悪性腫瘍は、皮膚または内臓を裏打ちもしくは覆う組織で発生するがんである。非上皮性悪性腫瘍は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織で発生するがんである。白血病は、骨髄などの造血組織で発生するがんで、多数の異常な血液細胞の産生および血液への侵入を引き起こす。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞で発生するがんである。中枢神経系がんは、脳および脊髄の組織で発生するがんである。
【００８９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、がんは原発性がんである。いずれかの局面のいくつかの態様において、がんは悪性がんである。本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞群が1つまたは複数の制御されない増殖（すなわち、正常限界を超える分裂）、侵入（すなわち、隣接組織への侵入および破壊）、ならびに転移（すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の場所への展開）を見せるがんを指す。本明細書で使用される場合、「転移する」という用語は、体の一部分から別の部分へのがんの展開を指す。展開した細胞によって形成された腫瘍は、「転移性腫瘍」または「転移がん」と呼ばれる。転移性腫瘍は、元の（原発性の）腫瘍中の細胞に似た細胞を含む。本明細書で使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、より大きく増殖してもよいが体の他の部分には展開しない腫瘍を指す。良性腫瘍は自己限定的であり、通常は侵入または転移しない。
【００９０】
「がん細胞」または「腫瘍細胞」は、がん性増殖または組織の個々の細胞を指す。腫瘍は一般的に、細胞の異常増殖によって形成される腫脹または病変を指し、良性、前悪性、または悪性であってよい。ほとんどのがん細胞は腫瘍を形成するが、白血病などのいくつかは必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成するがん細胞については、がん（細胞）および腫瘍（細胞）という用語が互換的に使用される。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「新生物」という用語は、組織の任意の新しくかつ異常な増殖、例えば、その増殖が正常組織の増殖を超過および非協調的である異常な組織塊を指す。したがって、新生物は良性新生物、前悪性新生物、または悪性新生物であり得る。
【００９２】
がんまたは腫瘍を有する対象は、対象の体内に存在する客観的に測定可能ながん細胞を有する対象である。この定義に含まれるのは、悪性で活発に増殖するがん、ならびに潜在的に休眠中の腫瘍もしくは微小転移巣である。元の場所から遊走して他の重要な臓器に播種したがんは、罹患した臓器の機能劣化を通じて最終的に対象の死亡につながり得る。
【００９３】
がんの例には、上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、芽細胞腫、非上皮性悪性腫瘍、白血病、基底細胞がん、胆道がん；膀胱がん；骨がん；脳およびCNSがん；乳がん；腹膜のがん；子宮頸がん；絨毛がん；結腸および直腸がん；結合組織がん；消化器系のがん；子宮内膜がん；食道がん；眼がん；頭頸部のがん；胃がん（胃腸がんを含む）；膠芽腫（GBM）；肝がん；肝細胞がん；上皮内新生物；腎臓がんまたは腎がん；喉頭がん；白血病；肝臓がん；肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、および肺の扁平上皮がん）；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔がん（例えば唇、舌、口、および咽頭）；卵巣がん；膵臓がん；前立腺がん；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸がん；呼吸器系のがん；唾液腺がん；肉腫；皮膚がん；扁平上皮がん；胃がん；精巣がん；甲状腺がん；子宮または子宮内膜がん；泌尿器系のがん；外陰がん；ならびに他の上皮性悪性腫瘍および非上皮性悪性腫瘍；ならびにB細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）；小リンパ球性（SL）NHL；中悪性度／濾胞性NHL；中悪性度びまん性NHL；高悪性度免疫芽球性NHL；高悪性度リンパ芽球性NHL；高悪性度小型非切れ込み核細胞性NHL；巨大腫瘤病変NHL；マントル細胞リンパ腫；AIDS関連リンパ腫；およびワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ球性白血病（CLL）；急性リンパ芽球性白血病（ALL）；有毛細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；および移植後リンパ増殖性疾患（PTLD）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、およびメイグス症候群に関連する異常な血管増殖が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
「がん細胞」は、必ずしも新しい遺伝材料の取り込みを伴わない自然発生的または誘導性の表現型変化を有する、インビボ、エクスビボのいずれかもしくは組織培養中の、がん性、前がん性、または形質転換細胞である。形質転換は、形質転換ウイルスによる感染および新しいゲノム核酸の組み込み、または外因性核酸の取り込みに起因し得るが、自然発生的または発がん物質への曝露に続いて、これにより内因性遺伝子が突然変異することにも起因し得る。形質転換／がんは、例えばヌードマウスなどの適切な動物宿主における形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣形成、足場非依存性、悪性腫瘍、増殖の接触阻害および密度制限の喪失、増殖因子または血清非依存性、腫瘍特異的マーカー、侵襲性または転移、および腫瘍増殖に関連する。
【００９５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物は、例えば病状についての別の治療を対象に行わない、単剤療法として投与される。
【００９６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、第2の作用物質および／または治療を、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物中で、もしくは別の製剤としてのいずれかにおいて、例えば併用療法の一部として対象に投与することをさらに含み得る。例えば、がん治療のための第2の作用物質および／または治療の非限定的な例は、放射線療法、手術、ゲムシタビン、シスプラスチン、パクリタキセル、カルボプラチン、ボルテゾミブ、AMG479、ボリノスタット、リツキシマブ、テモゾロミド、ラパマイシン、ABT-737、PI-103；チオテパおよびCYTOXAN（登録商標）シクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エレウテロビン；パンクラティスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロスウレア（nitrosurea）；エンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ1IおよびカリケアマイシンオメガI1（例えば、Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)を参照）などの抗生物質；ダイネマイシンAを含むダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連クロモプロテインエンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ADRIAMYCIN（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎；フロリン酸などの葉酸補充物質；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）多糖類複合体（JHS Natural Products, Eugene, Oreg.）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；2,2',2”-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にT-2毒素、ベラクリンA、ロリジンA、およびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばTAXOL（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）、ABRAXANE（登録商標）パクリタキセルのクレモフォールフリーでアルブミン操作されたナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.）、およびTAXOTERE（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR（登録商標）ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE.RTM.ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサール、CPT-11）（イリノテカンとともに5-FUおよびロイコボリンの治療計画を含む）；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（LV）；オキサリプラチン治療計画（FOLFOX）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（Tykerb.RTM.）；細胞増殖を低減するPKC-アルファ阻害剤、Raf阻害剤、H-Ras阻害剤、EGFR阻害剤（例えば、エルロチニブ（Tarceva（登録商標）））およびVEGF-A阻害剤ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含み得る。加えて、治療方法は放射線または放射線療法の使用をさらに含み得る。さらに、治療方法は外科的治療の使用をさらに含み得る。
【００９７】
特定の態様において、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物の有効用量は、患者に1回投与できる。特定の態様において、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物の有効用量は、患者に繰り返し投与できる。全身投与の場合、本明細書に記載される組成物、例えばCAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物の治療量、例えば0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、またはより多くを対象に投与できる。
【００９８】
いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は約1 U/kg〜約20 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は1 U/kg〜20 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は20 U/kg未満であり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は約2 U/kg〜約10 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、2 U/kg〜10 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、約2 U/kg〜約5 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、2 U/kg〜5 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、約5 U/kg〜約10 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は5 U/kg〜10 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、2 U/kg、5 U/kg、または10 U/kgであり得る。
【００９９】
いくつかの態様において、最初の治療計画の後、より少ない頻度で治療を行うことができる。例えば、隔週で3か月間の治療の後、6か月間または1年間以上、治療を月に1回繰り返すことができる。本明細書に記載される方法による治療は、病状のマーカーまたは症状のレベルを、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％以上低減させることができる。
【０１００】
本明細書に記載される組成物の投与量は、医師によって決定されることができ、観察された治療効果に合わせて必要に応じて調整され得る。治療の期間および頻度に関して、熟練した臨床医は、治療がいつ治療的な恩恵をもたらすかを決定し、投与量を増加または減少させるか、投与頻度を増加または減少させるか、治療を中断するか、治療を再開するか、または治療計画に他の改変を加えるかを決定するために、通常は対象をモニターする。投薬スケジュールは、活性化合物に対する対象の感受性などの多数の臨床的因子に応じて、週に1回から毎日まで変わり得る。活性物質の所望の用量または量は1回で投与することができ、または2つから4つのより少ない用量（subdose）などのより少ない用量に分割し、一定の期間にわたって、例えば1日を通して適した間隔でまたは他の適したスケジュールで投与することができる。いくつかの態様において、投与は慢性的、例えば数週間または数か月の期間にわたって毎日1つまたは複数の用量および／または治療で行い得る。投薬および／または治療スケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1か月、2か月、3か月、4か月、5か月、もしくは6か月、またはより長い期間にわたって、毎日、1日2回、1日3回、または1日4回以上の投与である。本明細書に記載される組成物、例えばCAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物は、一定の期間にわたって、例えば5分間、10分間、15分間、20分間、または25分間の期間にわたって投与できる。
【０１０１】
本明細書に記載される方法による、本明細書に記載される組成物の投与についての投与量範囲は、例えば活性化合物の形態、その効力、および本明細書に記載される病状の症状、マーカー、または指標を低減させたいと所望する程度、例えば症状またはマーカーについて所望される低減のパーセンテージに依存する。投与量は、不利益な副作用を引き起こすほど多くすべきでない。一般的に、投与量は患者の年齢、病状、および性別によって変わり、当業者によって決定され得る。何らかの合併症の場合、投与量は個々の医師によっても調整され得る。
【０１０２】
例えば、本明細書に記載される病状の治療において記載される組成物の有効性、または本明細書に記載される応答を誘導するための組成物の有効性は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、本明細書に記載される病状の徴候または症状の1つまたは複数が有益な方法で改変されるか、他の臨床的に認められている症状が改善もしくは改良すらされるか、または所望の応答が、例えば本明細書に記載される方法による治療後に少なくとも10％誘導されれば、「有効な治療」という用語が本明細書で使用されるように、治療は「有効な治療」とみなされる。有効性は、例えば本明細書に記載される方法によって治療される病状のマーカー、指標、症状、および／または発生率、または任意の他の適した測定可能なパラメーターを測定することで評価できる。有効性は、入院によって評価される個体が悪化しなかったこと、または医療介入の必要性（すなわち、疾患の進行が停止）によっても測定できる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知および／または本明細書に記載されている。治療は、個体または動物（いくつかの非限定的な例はヒトまたは動物を含む）における疾患の任意の治療を含み、かつ以下を含む：（1）疾患を阻害する、例えば症状の悪化（例えば、疼痛または炎症）を予防する；または（2）疾患の重症度を軽減する、例えば症状の後退を引き起こす。疾患の治療のための有効量は、それを必要とする対象に投与された場合、その疾患について、有効な治療という用語が本明細書で定義されるように、有効な治療という結果になるのに十分な量を意味する。作用物質の有効性は、病状または所望の応答の物理的指標を評価することで決定できる。そのようなパラメーターのいずれか1つ、またはパラメーターの任意の組み合わせを測定することで投与および／または治療の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。有効性は、本明細書に記載される病状の動物モデルにおいて、例えば糖尿病またはがんの治療について評価することができる。実験動物モデルを使用する場合、マーカーにおいて統計的に有意な変化が観察される場合に、治療の有効性が証明される。
【０１０３】
本明細書に記載される組成物、例えばCAGEを少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物の所与の用量の評価を可能にするインビトロおよび動物モデルアッセイが本明細書で提供される。非限定的な例として、CAGEをインスリンと組み合わせて含む組成物の用量の効果は、本明細書の実施例に記載されるマウスモデルを使用することによって評価できる。
【０１０４】
肥満の発生率は上昇しており、食事療法などの既存の治療は、長期間の成功率が低いことで悪名が高い。肥満を低減させるかまたは体重増加率を低減させるための追加の治療および戦略は、肥満自体および過剰な体重によって引き起こされるかまたは憎悪する病状の数の両方に対処するために非常に重要である。本明細書に記載されるように、本発明者らは、イオン液体CAGE（コリンおよびゲラネートまたはゲラン酸（gernanic acid））が腸において疎水性／親油性分子の取り込みを低減させることを実証した。したがって、本明細書で提供されるのは、そのようなことを必要とする対象にCAGEを投与することで肥満を治療する方法および／または体重／体重増加を低減させる方法である。
【０１０５】
さらに、CAGEは経口投与の間に遭遇する敏感な膜を横切って活性化合物を安全に運ぶことができる。したがって、いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを含む組成物は活性化合物／作用物質をさらに含む。したがって、いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを活性化合物／作用物質と組み合わせて含む組成物が対象に投与される。
【０１０６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は肥満の治療に治療効果がある。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は肥満に関連する疾患の治療に治療効果がある。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は肥満によって引き起こされる疾患の治療に治療効果がある。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は肥満を引き起こす疾患の治療に治療効果がある。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物はメタボリックシンドロームの治療に治療効果がある。
【０１０７】
いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は疎水性分子、例えばエストラジオール、テストステロン、イミキモド、コルチコステロン、パクリタキセル、ドキソルビシン、シスプラチン、および／またはカンプトテシンである。いずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物は疎水性分子、例えばエストラジオール、テストステロン、コルチコステロン、パクリタキセル、ドキソルビシン、シスプラチン、および／またはカンプトテシンである。
【０１０８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物はCAGEを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物は本質的にCAGEからなる。いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物はCAGEからなる。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを含む組成物は、例えば病状についての別の治療を対象に行わない、単剤療法として投与される。
【０１０９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物はCAGEおよび少なくとも1つの活性化合物を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物は本質的にCAGEおよび少なくとも1つの活性化合物からなる。いずれかの局面のいくつかの態様において、組成物はCAGEおよび少なくとも1つの活性化合物からなる。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEおよび少なくとも1つの活性化合物を含む組成物は、例えば病状についての別の治療を対象に行わない、単剤療法として投与される。
【０１１０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEおよび任意で活性化合物を含む組成物は、経口、皮下、静脈内、皮内、または非経口製剤として製剤化できる。いずれかの局面のいくつかの態様において、経口製剤はCAGEおよび任意で活性化合物を含む組成物を含む分解性カプセルであり得る。
【０１１１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを含む組成物が投与される対象は、肥満、過剰体重を有するか、有すると診断されたか、または肥満、過剰体重の治療もしくは体重増加の予防が必要な対象である。いくつかの態様において、対象は過体重である。本明細書に記載される方法は、肥満の治療、体重増加の低減、体重増加の防止、体重減少の促進などの方法を含む。そのような方法は、例えば代謝の健康を促進することができ、審美的理由のために追求されることができ、および／または高いBMIまたは体重を有する患者に対して禁忌である外科的介入のために患者を準備させることができる。いくつかの態様において、例えば対象が過体重および／または肥満である場合、体重減少は医学的に必要であり得、および／または医学的に指示され得る。いくつかの態様において、例えば体重減少が医学的に必要および／または医学的に指示されているかいないかにかかわらず対象が減量を所望する場合、減量は美容目的であり得る。
【０１１２】
「肥満」という用語は、体内の過剰な脂肪を指す。肥満は、当業者に認められ利用されている任意の尺度によって決定できる。現在のところ、認められている肥満の尺度はボディマスインデックス（BMI）であり、これは、メートルでの身長の2乗と比較したキログラムでの体重の尺度である。一般的に、20歳を超える成人については、約18.5と24.9との間のBMIは正常とみなされ、約25.0と29.9との間のBMIは過体重とみなされ、約30.0以上のBMIは肥満とみなされ、そして約40以上のBMIは病的な肥満とみなされる。（例えば、Gallagher et al. (2000) Am J Clin Nutr 72:694-701を参照されたい。）これらのBMI範囲は、疾患のリスク増加に対する体重の影響に基づいている。高いBMIおよび肥満に関連するいくつかのよく見られる病状には、心血管疾患、高血圧（すなわち、高血圧症）、変形性関節症、がん、および糖尿病が含まれる。BMIは体脂肪と相関するが、BMIと実際の体脂肪との間の関係は年齢および性別によって異なる。例えば同じBMIの場合、女性は男性よりも高い体脂肪率を有する可能性がより高い。さらに、正常、過体重、および肥満を区別するBMI閾値は、他の因子の中でも、例えば年齢、性別、民族性、体の健康度、および体型によって変わり得る。いくつかの態様において、肥満を有する対象は、本明細書に記載される治療を行う前に、少なくとも約25 kg/m2のボディマスインデックスを有する対象であり得る。いくつかの態様において、肥満を有する対象は、本明細書に記載される治療を行う前に、少なくとも約30 kg/m2のボディマスインデックスを有する対象であり得る。
【０１１３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを含む組成物が投与される対象は、代謝障害もしくはメタボリックシンドロームを有するか、有すると診断されたか、またはその治療が必要な対象である。「代謝障害」という用語は、例えばインスリン抵抗性などの、グルコース調節または血糖制御が正常に機能しないまたは改変されていることに関連するか、それによって深刻化する任意の障害を指す。そのような障害には肥満；過剰な脂肪組織；糖尿病；脂肪肝疾患；非アルコール性脂肪肝疾患；メタボリックシンドローム；異脂肪血症；高血圧症；高血糖症；および心血管疾患が含まれるが、これらに限定されない。「メタボリックシンドローム」は代謝障害とは全く異なり、一緒に発生すると心血管疾患および糖尿病を発症するリスクを増加させる医学的障害の組み合わせを指す。メタボリックシンドロームの多数の定義が、例えばAmerican Heart AssociationおよびInternational Diabetes Foundationによって確立されている。ほんの一例として、WHOは、メタボリックシンドロームを糖尿病、耐糖能異常、空腹時血糖異常もしくはインスリン抵抗性異常のいずれか1つ、ならびに以下のうちの2つ：140/90 mmHg以上の血圧、脂質異常症、中心性肥満、および微量アルブミン尿、の存在として定義している。いくつかの態様において、代謝障害は、以下からなる群より選択され得る：肥満；過剰な脂肪組織；糖尿病；および心血管疾患。
【０１１４】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、病状を有するかまたは有すると診断された対象をCAGEおよび活性化合物を含む組成物で治療することに関する。糖尿病などの病状を有する対象は、糖尿病を診断する現在の方法を使用して、医師によって特定され得る。これらの病状を特徴付け、診断を助ける糖尿病の症状および／または合併症は、当技術分野において周知であり、体重減少、治癒遅延、多尿症、多飲症、多食症頭痛、皮膚のかゆみ、および疲労が含まれるが、これらに限定されない。例えば糖尿病の診断を助けてもよい検査には、血液検査（例えば、空腹時グルコースレベルについて）が含まれるが、これに限定されない。糖尿病の家族歴または糖尿病のリスク因子（例えば、過体重）への曝露も、対象が糖尿病を有する可能性が高いかを判断するのを、または糖尿病の診断を行うのを助け得る。
【０１１５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本方法によって治療される対象は、糖尿病を有さないかまたは有すると診断されていない対象である。いずれかの局面のいくつかの態様において、本方法によって治療される対象は、インスリンを投与されていない対象である。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを含む組成物はインスリンを含まない。いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを含む組成物は、別の薬学的な有効成分および／または糖尿病の治療に治療効果がある別の作用物質を含まない。
【０１１６】
多くの活性化合物、例えば薬学的に活性な化合物の取り込みは、溶媒中で化合物を送達することにより改善できる。しかしながら、そのような溶媒のほとんどは有毒な副作用を示し、および／または送達の時点で刺激物質として作用するため、そのようなアプローチはインビボでの使用にはしばしば不適切である。本明細書に記載されるのは、改善された送達動態とともに低い毒性を提供できる方法および組成物である。
【０１１７】
本明細書に記載されるように、塩が50 mM以上で、細胞／細胞膜を通過するためのそれらの能力および任意の関連分子が同じことを行う能力を増加させるためのそれらの能力において驚くべきかつ有意な増加を示すことを本発明者らは発見した。したがって、本明細書に記載されるのは、高モル濃度の塩、例えば0.05 Mを超える塩の使用に関する薬物送達の方法である。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「塩」は化合物が電気的に中性であるように、少なくとも1つの陽イオンおよび少なくとも1つの陰イオンを含むイオン性化合物を指す。塩は、無機または有機、多原子または単原子イオンを含み得る。塩はアルカリ塩であり得る。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩はイオン液体である。
【０１１９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも0.01％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも0.05％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも0.1％ w/vの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも0.2％ w/v、少なくとも0.3％ w/v、少なくとも0.4％ w/v、少なくとも0.5％ w/v、少なくとも1％ w/v以上の濃度である。
【０１２０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも20 mMの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも約20 mMの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも25 mMの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも約25 mMの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも50 mMの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも約50 mMの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも100 mM、500 mM、1 M、2 M、3 M以上の濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は少なくとも約100 mM、500 mM、1 M、2 M、3 M以上の濃度である。
【０１２１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は、約50 mM〜約4 Mの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は、50 mM〜4 Mの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は、約500 mM〜約4 Mの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は、500 mM〜4 Mの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は、約1 M〜約4 Mの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は、1 M〜4 Mの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は、約2 M〜約4 Mの濃度である。いずれかの局面のいくつかの態様において、塩は、2 M〜4 Mの濃度である。
【０１２２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、例えば1つまたは複数の核酸分子がCAGEと組み合わせて提供される場合、コリン：ゲラン酸（またはゲラネート）の比率は1：1より大きく、例えば1：2より大きく、約1：2から約1：4、または1：2から1：4である。
【０１２３】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、（例えば0.05 M以上の濃度の）塩と組み合わせた少なくとも1つの活性化合物を含む組成物である。いくつかの態様において、医薬組成物は塩および本明細書に記載される1つまたは複数の活性化合物を含む。いくつかの態様において、医薬組成物は本質的に塩および本明細書に記載される1つまたは複数の活性化合物からなる。いくつかの態様において、医薬組成物は塩および本明細書に記載される1つまたは複数の活性化合物からなる。いくつかの態様において、医薬組成物は本質的に塩の水溶液および本明細書に記載される1つまたは複数の活性化合物からなる。いくつかの態様において、医薬組成物は塩の水溶液および本明細書に記載される1つまたは複数の活性化合物からなる。
【０１２４】
いくつかの態様において、塩は無水塩、例えば、水に希釈または溶解されていないイオン液体である。いくつかの態様において、塩は水溶液として提供される。
【０１２５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、（例えば0.05 M以上の濃度の）塩および活性化合物を含む組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
【０１２６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、（例えば0.05 M以上の濃度の）塩および活性化合物を含む組成物は、経口、皮下、静脈内、皮内、または非経口製剤として製剤化できる。いずれかの局面のいくつかの態様において、経口製剤は、塩および活性化合物を含む組成物を含む分解性カプセルであり得る。
【０１２７】
別の態様において、薬物はCAGEの局所拡散後であってすら、CAGEなどの塩に可溶性のままであり続けてよく、循環への迅速かつ増強された送達へとつながってもよい。皮下送達には、しばしば複数回投与または放出制御製剤が必要となる。そのようなアプローチは、必ずしもタイミング自体に関するいかなる懸念が原因で実行されるわけでもなく、むしろ活性化合物の分解の前に全用量を確実に受けさせるために行われる。総量が効果を発揮できる前に活性化合物が分解または代謝されるため、ボーラス投与はしばしば効果がない。活性化合物を安定化するCAGEの能力のおかげで、そのようなアプローチは不要であり、すなわち放出制御機構の必要なしに、所望の総量を単回投与として送達できる。
【０１２８】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、それを必要とする対象に、塩と組み合わせた活性化合物を注射により罹患組織中へ投与することにより、対象において疾患を治療する方法である。いくつかの態様において、罹患組織は病変細胞を含む組織である。いくつかの態様において、罹患組織は疾患の症状を示す組織である。適切な罹患組織の非限定的な例には、腫瘍組織、脂肪組織（fat tissue）、脂肪組織（adipose tissue）、いぼなどが含まれる。いずれかの局面のいくつかの態様において、適切な罹患組織には、腫瘍組織、脂肪組織（fat tissue）、脂肪組織（adipose tissue）などが含まれる。
【０１２９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、疾患は組織の増殖、例えば求められていない、異常な、または病的な組織の増殖に起因する疾患である。組織の増殖に起因する疾患は、健康な対象における組織の種類について正常なものとは異なる、組織の増殖の速度、組織の増殖の場所、または組織の増殖のパターン／構造によって引き起こされるか、または特徴付けられる任意の疾患であり得る。そのような疾患の非限定的な例は、腫瘍、がん、脂肪／肥満、いぼ、および／または過形成である。いずれかの局面のいくつかの態様において、そのような疾患は腫瘍、がん、脂肪／肥満、および／または過形成である。
【０１３０】
本明細書に記載されるいずれかの局面のいくつかの態様において、活性化合物の生物活性は、0.05 Mを超える濃度の塩の非存在下における活性と比較して改善または安定化される。本明細書に記載されるいずれかの局面のいくつかの態様において、塩（例えば、CAGE）または溶媒は、イオン液体または溶媒が存在しない対照インスリンと比較して、皮膚を横切るインスリンの透過を大幅に増強する。
【０１３１】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、0.05 Mを超える濃度の塩で被覆されたカテーテルを用いて少なくとも活性化合物を対象に投与する方法である。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、0.05 Mを超える濃度の塩で被覆されたカテーテルを体内へ配置することによって体液を収集する方法である。
【０１３２】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、0.05 Mを超える濃度の塩および活性化合物を含む組成物で、病状を有するかまたは有すると診断された対象を治療することに関する。糖尿病などの病状を有する対象は、糖尿病を診断する現在の方法を使用して、医師によって特定され得る。これらの病状を特徴付け、診断を助ける糖尿病の症状および／または合併症は、当技術分野において周知であり、体重減少、治癒遅延、多尿症、多飲症、多食症頭痛、皮膚のかゆみ、および疲労が含まれるが、これらに限定されない。例えば糖尿病の診断を助けてもよい検査には、血液検査（例えば、空腹時グルコースレベルについて）が含まれるが、これに限定されない。糖尿病の家族歴または糖尿病のリスク因子（例えば、過体重）への曝露も、対象が糖尿病を有する可能性が高いかを判断するのを、または糖尿病の診断を行うのを助け得る。
【０１３３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、0.05 Mを超える濃度の塩を含む組成物は、例えば病状についての別の治療を対象に行わない、単剤療法として投与される。そのような態様において、塩またはその成分は、治療されている疾患に対して治療的有効性を有し得る。
【０１３４】
いずれかの局面のいくつかの態様において、0.05 Mを超える濃度の塩を本明細書に記載される少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物は、例えば病状についての別の治療を対象に行わない、単剤療法として投与される。
【０１３５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、第2の作用物質および／または治療を、0.05 Mを超える濃度の塩を少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物中で、もしくは別の製剤としてのいずれかにおいて、例えば併用療法の一部として対象に投与することをさらに含み得る。
【０１３６】
特定の態様において、0.05 M以上の濃度の塩を本明細書に記載される少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物の有効用量は、患者に1回投与できる。特定の態様において、0.05 M以上の濃度の塩を少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物の有効用量は、患者に繰り返し投与できる。全身投与の場合、0.05 M以上の濃度の塩を少なくとも1つの活性化合物と組み合わせて含む組成物の治療量、例えば0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、またはより多くを対象に投与できる。
【０１３７】
いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は約1 U/kg〜約20 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は1 U/kg〜20 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は20 U/kg未満であり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は約2 U/kg〜約10 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、2 U/kg〜10 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、約2 U/kg〜約5 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、2 U/kg〜5 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、約5 U/kg〜約10 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は5 U/kg〜10 U/kgであり得る。いくつかの態様において、活性化合物はインスリンであり、インスリンの濃度または投与量は、2 U/kg、5 U/kg、または10 U/kgであり得る。
【０１３８】
酵素阻害剤は、例えばインスリン分解酵素阻害剤、ACE阻害剤、およびアラファ（alapha）-グルコシダーゼ阻害剤のすべてが治療的アプローチとして探究されてきた糖尿病を含む多数の病状の治療の選択肢である。したがって、安全で効果がある酵素阻害剤は、多数の病状の治療において関心対象となっている。いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物を対象に投与する工程を含む、それを必要とする対象において糖尿病、潰瘍、がん、または線維症を治療する方法である。いくつかの態様において、CAGEを含む組成物は、さらなる治療活性作用物質を含まない。
【０１３９】
イオン液体CAGE（コリンおよびゲラネートまたはゲラン酸（gernanic acid））は、経口および／または非経口での使用に安全であるが、ほとんどの溶媒について通常観察される負の副作用を伴わない。実際に、部類としての溶媒は一般的に毒性の問題を引き起こすため、「溶媒曝露」は、1つまたは複数の溶媒との接触の危険性を包含することを意味する、広く使用される医学用語である。溶媒曝露は、一般的に、個々の溶媒を選んで曝露するのと同様に、多数の病状の病因に寄与することが示されている。これを踏まえると、体の自然防御の多くを迂回する、特に経口および非経口投与経路を介したCAGEの安全性プロファイルは、特に驚くべき予期しないものである。
【０１４０】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、CAGEを含む組成物である。いくつかの態様において、組成物はCAGEを含む医薬組成物である。いくつかの態様において、医薬組成物は本質的にCAGEからなる。いくつかの態様において、医薬組成物はCAGEからなる。いくつかの態様において、医薬組成物は本質的にCAGEの水溶液からなる。いくつかの態様において、医薬組成物はCAGEの水溶液からなる。
【０１４１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを含む組成物は、経口、皮下、静脈内、皮内、または非経口製剤として製剤化できる。いずれかの局面のいくつかの態様において、経口製剤はCAGEを含む組成物を含む分解性カプセルであり得る。特定の態様において、CAGEを含む組成物の有効用量は、患者に1回投与できる。特定の態様において、CAGEを含む組成物の有効用量は、患者に繰り返し投与できる。
【０１４２】
いずれかの態様の1つの局面において、本明細書に記載されるのは、それを必要とする対象に、CAGEを注射により罹患組織中へ投与することにより、対象において疾患を治療する方法である。いくつかの態様において、罹患組織は病変細胞を含む組織である。いくつかの態様において、罹患組織は疾患の症状を示す組織である。適切な罹患組織の非限定的な例には、腫瘍組織、脂肪組織（fat tissue）、脂肪組織（adipose tissue）、いぼなどが含まれる。いずれかの局面のいくつかの態様において、罹患組織には、腫瘍組織、脂肪組織（fat tissue）、脂肪組織（adipose tissue）などが含まれる。疾患は、例えばがん、線維症、または潰瘍であり得る。
【０１４３】
線維症の病状は、細胞外マトリックスに有利に瘢痕組織の蓄積を低減させることにより、細胞外マトリックスを産生および／または維持することで恩恵を受ける。本明細書で使用される場合、「線維症」は、臓器または組織の正常な構成要素としてよりはむしろ、修復または反応過程としての線維組織の形成を指す。線維症は、任意の特定の組織における線維芽細胞の蓄積および正常な沈着を超えるコラーゲンの沈着によって特徴付けられる。線維症は、炎症、刺激、または治癒の結果として生じ得る。線維性の病状について治療を必要とする対象は、線維性の病状を有するか、または有すると診断されたか、または有するリスクがある任意の対象である。線維症の病状の非限定的な例には、肺線維症；瘢痕；皮膚の瘢痕；外傷；創傷；慢性創傷（例えば、糖尿病患者の場合）、角膜欠損；角膜潰瘍；角膜創傷；糖尿病性潰瘍；潰瘍；敗血症；関節炎；特発性肺線維症；嚢胞性線維症；肝硬変；心内膜心筋線維症；縦隔線維症；骨髄線維症；後腹膜線維症；進行性塊状線維症；腎性全身性線維症；クローン病；ケロイド；強皮症；全身性硬化症；関節線維症；癒着性関節包炎；肺線維症；肝線維症；腎線維症；心臓線維症；血管線維症；皮膚線維症；目の線維症；骨髄線維症；喘息；サルコイドーシス；COPD；気腫；住血吸虫症（nschistomasomiasis）；胆管炎；糖尿病性腎症；ループス腎炎；血管形成術後の動脈（aterial）再狭窄；アテローム性動脈硬化症；火傷の瘢痕；肥厚性瘢痕；腎性線維化皮膚症；白内障手術後；増殖性硝子体網膜症；ペロニー病；デュピュイトラン拘縮（Duputren's contracture）；皮膚筋炎；および移植片対宿主病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「潰瘍」は、体膜の破損または破壊を指す。いくつかの態様において、潰瘍は罹患組織の炎症および／または壊死によって引き起こされ得る。潰瘍は、皮膚潰瘍（例えば褥瘡、糖尿病性潰瘍、潰瘍性皮膚炎など）、角膜潰瘍、口腔潰瘍、消化性潰瘍、静脈性潰瘍、ストレス潰瘍、または潰瘍性大腸炎であり得る。
【０１４５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、CAGEを含む組成物は、例えば病状についての別の治療を対象に行わない、単剤療法として投与される。
【０１４６】
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および語句の意味を以下に提供する。特に明記されていない限り、または文脈から暗示される場合を除き、以下の用語および語句は、以下に提供する意味を含む。本発明の範囲は特許請求の範囲だけによって限定されるため、本定義は特定の態様の説明を助けるために提供され、特許請求の範囲に係る発明を限定することを意図しない。特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当技術分野における当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野における用語の用法と本明細書で提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、明細書内で提供される定義が優先されるものとする。
【０１４７】
便宜上、本明細書において、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに収集する。
【０１４８】
「減少する」、「低減した」、「低減」、または「阻害する」という用語はすべて、本明細書において統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。いくつかの態様において、「低減する」、「低減」または「減少する」または「阻害する」は、参照レベル（例えば、所与の治療または作用物質の非存在）と比較して少なくとも10％の減少を通常意味し、例えば少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、またはそれより大きい減少を含み得る。本明細書で使用される場合、「低減」または「阻害」は、参照レベルと比較して完全な阻害または低減を包含しない。「完全阻害」は、参照レベルと比較して100％の阻害である。減少は、好ましくは、所与の障害のない個体について正常範囲内として認められるレベルまで下げることができる。
【０１４９】
「増加した」、「増加」、「増強する」、または「活性化する」という用語はすべて、本明細書において静的に有意な量の増加を意味するために使用される。いくつかの態様において、「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％の増加、または100％を含むそれ以下の増加、または参照レベルと比較して10〜100％の間の任意の増加、または少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍、または少なくとも約10倍の増加、または参照レベルと比較して2倍から10倍以上の間の任意の増加を意味し得る。マーカーまたは症状の文脈では、「増加」はそのようなレベルにおける統計的に有意な増加である。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「対象」はヒトまたは動物を意味する。通例、動物は霊長類、げっ歯類、家畜、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類にはチンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびアカゲザルなどのマカクが含まれる。げっ歯類にはマウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物にはウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、家ネコなどのネコ種、イヌ、キツネ、オオカミなどのイヌ種、ニワトリ、エミュー、ダチョウなどの鳥種、ならびにマス、ナマズ、およびサケなどの魚が含まれる。いくつかの態様において、対象は哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。「個体」、「患者」、および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１５１】
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、本明細書に記載される病状の動物モデルを表す対象として有利に使用できる。対象は男性／雄または女性／雌であり得る。
【０１５２】
対象は、治療を必要とする病状またはそのような病状に関連する1つまたは複数の合併症であると以前に診断されているか、または悩まされていると特定されているか、または有するものであることができ、任意で、その病状または病状に関連する1つまたは複数の合併症について既に治療を受けたものであり得る。あるいは、対象はその病状または病状に関連する1つまたは複数の合併症を有すると以前に診断されていないものでもあり得る。例えば、対象はその病状または病状に関連する1つまたは複数の合併症についての1つまたは複数のリスク因子を呈するもの、またはリスク因子を呈さない対象であり得る。
【０１５３】
特定の病状について治療を「必要とする対象」は、その病状を有するか、その病状を有すると診断されたか、またはその病状を発症するリスクがある対象であり得る。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、隣接する残基のアルファアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を表すために本明細書において互換的に使用される。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能に関係なく、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含む、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」はしばしば比較的大きいポリペプチドに関して使用される一方で、「ペプチド」という用語はしばしば小さいポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の用法は重複する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、遺伝子産物およびその断片を指す場合、本明細書において互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の同等物、変異体、断片、ならびに前述のものの類似体が含まれる。
【０１５５】
本明細書に記載される様々な態様において、記載された特定のポリペプチドのいずれかの変異体（天然またはその他）、対立遺伝子、ホモログ、保存的修飾変異体、および／または保存的置換変異体が包含されることがさらに企図される。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸を改変する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、改変が化学的に類似したアミノ酸とのアミノ酸の置換という結果になりかつポリペプチドの所望の活性が保持される「保存的修飾変異体」であることを認識する。そのような保存的修飾変異体は、本開示と一貫した多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加され、これらを除くものではない。
【０１５６】
所与のアミノ酸は、ある脂肪族残基で別のものを置換する（例えば、Ile、Val、Leu、またはAlaを互いに置換する）、またはある極性残基で別のものを置換する（例えば、LysおよびArg；GluおよびAsp；またはGlnおよびAsnの間）など、類似した生理化学的特徴を有する残基で置き換えることができる。他のそのような保存的置換、例えば類似した疎水性特徴を有する領域全体の置換は周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書に記載されるアッセイのいずれか1つにおいて試験し、所望の活性、例えば、天然または参照ポリペプチドの活性および特異性が保持されていることを確認できる。
【０１５７】
アミノ酸は、それらの側鎖の特性における類似性によってグループ化することができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)において）：（1）非極性：Ala（A）、Val（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）；（2）非荷電極性：Gly（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）；（3）酸性：Asp（D）、Glu（E）；（4）塩基性：Lys（K）、Arg（R）、His（H）。あるいは、天然の残基は、共通する側鎖の特性に基づいてグループに分類できる：（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；（3）酸性：Asp、Glu；（4）塩基性：His、Lys、Arg；（5）鎖配向に影響を与える残基：Gly、Pro；（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。特定の保存的置換には、例えばAlaをGlyまたはSerに；ArgをLysに；AsnをGlnまたはHisに；AspをGluに；CysをSerに；GlnをAsnに；GluをAspに；GlyをAlaまたはProに；HisをAsnまたはGlnに；IleをLeuまたはValに；LeuをIleまたはValに；LysをArg、Gln、またはGluに；MetをLeu、Tyr、またはIleに；PheをMet、Leu、またはTyrに；SerをThrに；ThrをSerに；TrpをTyrに；TyrをTrpに；および／またはPheをVal、Ile、またはLeuにすることが含まれる。
【０１５８】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載されるアミノ酸配列の1つの機能的断片であり得る。本明細書で使用される場合、「機能的断片」は、本明細書で以下に記載されるアッセイによって野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも50％を保持するペプチドの断片または区分である。機能的断片は、本明細書に開示される配列の保存的置換を含み得る。
【０１５９】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、本明細書に記載される配列の変異体であり得る。いくつかの態様において、変異体は保存的修飾変異体である。保存的置換変異体は、例えば、天然ヌクレオチド配列の突然変異によって得ることができる。本明細書で称される「変異体」は、天然または参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、1つまたは複数の欠失、挿入、または置換のために天然または参照ポリペプチドのものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変異体ポリペプチドをコードするDNA配列は、天然または参照DNA配列と比較した場合、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、活性を保持する変異体タンパク質またはその断片をコードする配列を包含する。多種多様な、PCRに基づく部位特異的変異誘発アプローチが当技術分野において公知であり、当業者によって適用され得る。
【０１６０】
変異アミノ酸またはDNA配列は、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはそれを超えて、天然または参照配列と同一であり得る。天然配列と突然変異配列との間の相同性の度合い（同一性率）は、例えばワールドワイドウェブ上でこの目的のために広く使用される自由に利用可能なコンピュータープログラム（例えば、デフォルト設定のBLASTpまたはBLASTn）を用いて2つの配列を比較することで決定できる。
【０１６１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、変異体は、本明細書で提供される参照配列の1つに対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％以上の配列相同性を有し、その参照配列の野生型活性、例えばインクレチン活性を保持するポリペプチドであり得る。いずれかの局面のいくつかの態様において、変異体は、本明細書で提供される天然の参照配列の1つに対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％以上の配列相同性を有し、その参照配列の野生型活性、例えばインクレチン活性を保持するポリペプチドであり得る。いずれかの局面のいくつかの態様において、変異体は、本明細書で提供される参照配列の1つに対して少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％以上の配列相同性を有し、その参照配列の野生型活性、例えばインクレチン活性を保持する天然のポリペプチドであり得る。
【０１６２】
天然アミノ酸配列の改変は、当業者に公知の多数の技術のいずれかによって達成できる。突然変異は、例えば天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位の側面に位置する突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入できる。ライゲーション後に、結果として得られた再構築配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。あるいは、必要な置換、欠失、または挿入によって改変された特定のコドンを有する改変ヌクレオチド配列を提供するために、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発手順を使用できる。そのような改変を加えるための技術はとてもよく確立されており、例えばWalderら（Gene 42:133, 1986）；Bauerら（Gene 37:73, 1985）；Craik（BioTechniques, January 1985, 12-19）；Smithら（Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981）；ならびに米国特許第4,518,584号および第4,737,462号に開示されたものを含み、これらは全体として参照により本明細書に組み込まれる。ポリペプチドの正しいコンフォメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性の改善および異常な架橋の予防のために、一般的にはセリンで置換できる。逆に、システイン結合をポリペプチドに追加して、その安定性を改善し、またはオリゴマー化を促進することができる。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。この用語は、例えば免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体（dAb）、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体（dual specific antibody）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体（bispecific antibody）、それらの機能的に活性なエピトープ結合部分、および／または二機能性ハイブリッド抗体を含む、2つの免疫グロブリン重鎖および2つの免疫グロブリン軽鎖からなる抗体、ならびに完全長抗体およびその抗原結合部分を含む様々な形態も指す。各重鎖は、重鎖の可変領域（ここではHCVRまたはVHと略される）および前記重鎖の定常領域で構成される。重鎖定常領域は、3つのドメインCH1、CH2、およびCH3からなる。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（ここではLCVRまたはVLと略される）および前記軽鎖の定常領域で構成される。軽鎖定常領域はCLドメインからなる。VHおよびVL領域は、相補性決定領域（CDR）と称され、フレームワーク領域（FR）と称される保存領域が織り交ざった超可変領域にさらに分割されてよい。したがって、各VHおよびVL領域は、N末端からC末端へと次の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置された3つのCDRおよび4つのFRからなる。この構造は、当業者には周知である。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「抗体試薬」という用語は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体または抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。いくつかの態様において、抗体試薬はモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体は重（H）鎖可変領域（本明細書ではVHと略される）および軽（L）鎖可変領域（本明細書ではVLと略される）を含み得る。別の例において、抗体は2つの重（H）鎖可変領域および2つの軽（L）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合断片（例えば一本鎖抗体、FabおよびsFab断片、F（ab'）2、Fd断片、Fv断片、scFv、およびドメイン抗体（dAb）断片ならびに完全抗体を包含する。
【０１６５】
抗体および／または抗体試薬は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体（dual specific antibody）、抗イディオタイプ抗体、二重特異性抗体（bispecific antibody）、およびそれらの機能的に活性なエピトープ結合部分を含み得る。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそれらの類似体の単位が組み込まれた任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は変性二本鎖DNAの1本の核酸鎖であり得る。あるいは、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であり得る。1つの局面において、核酸はDNAであり得る。別の局面において、核酸はRNAであり得る。適切なDNAは、例えばcDNAを含み得る。適切なRNAは、例えばmRNAを含み得る。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「阻害性核酸」は、標的、例えば二本鎖RNA（dsRNA）、阻害性RNA（iRNA）などの発現を阻害できる核酸分子を指す。
【０１６８】
二本鎖RNA分子（dsRNA）は、RNA干渉（RNAi）として知られる高度に保存された調節機構において遺伝子発現を遮断することが示されている。本明細書に記載される阻害性核酸は、長さが30ヌクレオチド以下、すなわち長さが15〜30ヌクレオチド、一般的に長さが19〜24ヌクレオチドであり、標的とされるmRNA転写物の少なくとも一部分に実質的に相補的な領域を有するRNA鎖（アンチセンス鎖）を含み得る。これらのiRNAを使用すると、mRNA転写物を標的とした分解が可能になり、標的の発現および／または活性の減少という結果になる。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「iRNA」という用語は、RNA（または本明細書で以下に記載されるような修飾核酸）を含み、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）経路を介してRNA転写物を標的とした切断を媒介する作用物質を指す。いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載されるiRNAは、標的の発現および／または活性の阻害をもたらす。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞を阻害剤（例えばiRNA）と接触させると、細胞中の標的mRNAレベルにおいて、iRNAが存在しない場合に細胞中で見出される標的mRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、100％を含むそれ以下の減少という結果になる。いずれかの局面のいくつかの態様において、阻害剤（例えばiRNA）を対象に投与すると、対象中の標的mRNAレベルにおいて、iRNAが存在しない場合に対象中で見出される標的mRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、100％を含むそれ以下の減少という結果になる。
【０１７０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、iRNAはdsRNAであり得る。dsRNAは、dsRNAが使用される条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分に相補的な2本のRNA鎖を含む。dsRNAの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的な、および一般的に完全に相補的な相補性領域を含む。標的配列は、標的の発現の間に形成されたmRNAの配列に由来することができ、例えば、それは1つまたは複数のイントロン境界に及ぶことができる。他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせた場合、2本の鎖がハイブリダイズして二重鎖構造を形成するような、アンチセンス鎖に相補的な領域を含む。一般的に、二重鎖構造は、長さが15および30塩基対を含む15〜30塩基対の間、より一般的には長さが18および25塩基対を含む18〜25塩基対の間、さらにより一般的には長さが19および24塩基対を含む19〜24塩基対の間、最も一般的には長さが19および21塩基対を含む19〜21塩基対の間である。同様に、標的配列に対する相補性領域は、長さが15および30塩基対を含む15〜30塩基対の間、より一般的には長さが18および25塩基対を含む18〜25塩基対の間、さらにより一般的には長さが19および24塩基対を含む19〜24塩基対の間、最も一般的には長さがヌクレオチド長で19および21塩基対を含む19〜21塩基対の間である。いずれかの局面のいくつかの態様において、dsRNAは、長さが15および20ヌクレオチドを含む15〜20ヌクレオチドの間であり、別の態様において、dsRNAは、長さが25および30ヌクレオチドを含む25〜30ヌクレオチドの間である。当業者が認識するように、切断のための標的となるRNAの標的とされる領域は、ほとんどの場合、より大きいRNA分子の部分であり、しばしばmRNA分子である。関連する場合、mRNA標的の一「部分」は、RNAi指定切断（RNAi-directed cleavage）（すなわち、RISC経路を通じた切断）の基質となるのに十分な長さのmRNA標的の連続する配列である。9塩基対という短い二重鎖を有するdsRNAが、ある状況下では、RNAi指定RNA切断を媒介し得る。ほとんどの場合、標的は少なくとも15ヌクレオチド長、好ましくは15〜30ヌクレオチド長である。
【０１７１】
阻害性核酸の種類の例示的な態様は、当技術分野において周知の、例えばsiRNA、shRNA、miRNA、および／またはamiRNAを含み得る。
【０１７２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、iRNAのRNA、例えばdsRNAは、安定性または他の有益な特徴を増強するために化学的に修飾される。本明細書に記載される核酸は、“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されるような、当技術分野においてよく確立されている方法によって合成および／または修飾されてよく、これは参照により本明細書に組み込まれる。修飾は、例えば（a）末端修飾、例えば5'末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆結合（inverted linkage）など）、3'末端修飾（コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、逆結合など）、（b）塩基修飾、例えば安定化塩基、不安定化塩基、またはパートナーの拡張レパートリーと塩基対を形成する塩基での置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役塩基、（c）糖修飾（例えば2’位または4’位）または糖の置換、ならびに（d）ホスホジエステル結合の修飾または置換を含む骨格修飾、を含む。本明細書に記載される態様において有用なRNA化合物の具体例は、修飾骨格を含むか、または天然のヌクレオシド間結合を含まないRNAが含まれるが、これらに限定されない。修飾骨格を有するRNAは、とりわけ、骨格にリン原子を有さないものが含まれる。この明細書の目的のために、および当技術分野においてときどき参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾RNAもオリゴヌクレオシドとみなされ得る。いずれかの局面のいくつかの態様において、修飾RNAは、そのヌクレオシド間骨格にリン原子を有する。
【０１７３】
修飾RNA骨格は、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および通常の3'-5'結合を有するボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が3'-5'から5'-3'または2'-5'から5'-2'に結合している、逆の極性を有するもの）を含み得る。様々な塩、混合塩、および遊離酸の形態も含まれる。その中にリン原子を含まない修飾RNA骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；他の、混合N、O、S、およびCH2の成分部分を有するもの、ヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、および特に-CH2-NH-CH2-、-CH2-N（CH3）-O-CH2-[メチレン（メチルイミノ）またはMMI骨格として知られる]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-および-N(CH3)-CH2-CH2-[ここで、天然ホスホジエステル骨格は-O-P-O-CH2-として表される]、を有するものが含まれる。
【０１７４】
iRNAでの使用に適切または企図される他のRNA模倣体では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が、新規の基によって置き換えられる。塩基単位は、適した核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。そのようなオリゴマー化合物の1つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているRNA模倣体は、ペプチド核酸（PNA）と称される。PNA化合物では、RNAの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している。
【０１７５】
iRNAのRNAは、1つまたは複数のロックド核酸（LNA）を含むようにも修飾され得る。ロックド核酸は、リボース部分が2'および4'炭素を接続する追加の橋を含む、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、リボースを3'-エンド構造コンフォメーション中に効果的に「ロック」する。ロックド核酸をsiRNAに追加すると、血清中のsiRNAの安定性が増加し、非特異的な効果が低減することが示されている（Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193）。
【０１７６】
修飾RNAは、1つまたは複数の置換糖部分も含み得る。本明細書に記載されるiRNA、例えばdsRNAは、2'位に以下の1つを含み得る：OH；F；O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-、もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換C1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであってよい。例示的な適切な修飾は、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2、ここでnおよびmは1〜約10である。いずれかの局面のいくつかの態様において、dsRNAは2'位に以下の1つを含む：C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、iRNAの薬物動態特性を改善するための基、またはiRNAの薬力学的特性を改善するための基、および類似した特性を有する他の置換基。いずれかの局面のいくつかの態様において、修飾は2'メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-(2-メトキシエチル)または2'-MOEとしても知られる）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）、すなわちアルコキシ-アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書の以下の実施例に記載されるように、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち2'-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基、ならびに本明細書の以下の実施例にも記載される2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において2'-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2'-DMAEOEとしても知られる）、すなわち2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2である。
【０１７７】
他の修飾は、2'-メトキシ（2'-OCH3）、2'-アミノプロポキシ（2'-OCH2CH2CH2NH2）および2'-フルオロ（2'-F）を含む。類似した修飾は、iRNAのRNA上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上または2'-5'結合dsRNA中の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位にも加え得る。iRNAは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体も有してよい。
【０１７８】
阻害性核酸は、核酸塩基（当技術分野において、しばしば単に「塩基」と称される）の修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「非修飾」または「天然」の核酸塩基は、プリン塩基アデニン（A）およびグアニン（G）、ならびにピリミジン塩基チミン（T）、シトシン（C）、およびウラシル（U）を含む。修飾核酸塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2-プロピルならびにアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル アナル（8-hydroxyl anal）他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルならびに他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-ダアザアデニン（7-daazaadenine）および3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基を含む。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で特徴とされる阻害性核酸の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、および5-プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6、および0-6置換プリンを含む。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、さらにいっそう特に2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合、例示的な塩基置換である。
【０１７９】
上記に記載された修飾核酸、骨格、および核酸塩基の調製は、当技術分野において周知である。
【０１８０】
本発明で特徴とされる阻害性核酸の別の修飾は、iRNAの活性、細胞分布、薬物動態特性、または細胞取り込みを増強する1つまたは複数のリガンド、部分、またはコンジュゲートを阻害性核酸へ化学的に結合させることを伴う。そのような部分には、コレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4: 1053-1060）、チオエーテル、例えばベリル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309；Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118；Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330；Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54）、リン脂質、例えばジヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホネート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654；Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937）などの脂質部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物を指す。本明細書中で使用される場合、ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性であり得る。「ベクター」という用語は、正しい制御要素と関連した場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移動できる任意の遺伝要素を包含する。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、組換えベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを含み得るが、これらに限定されない。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に結合した配列からのRNAまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、必ずしもではないが、しばしば細胞にとって異種である。発現ベクターは追加の要素を含んでよく、例えば発現ベクターは2つの複製系を有してよく、したがってそれが2つの生物、例えば発現のためにヒト細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において維持されることを可能にする。「発現」という用語は、該当する場合、例えば転写、転写プロセシング、翻訳、ならびにタンパク質の折り畳み、修飾、およびプロセシングを含むが、これらに限定されない、RNAおよびタンパク質の産生、ならびに必要に応じてタンパク質の分泌に関与する細胞過程を指す。「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。「遺伝子」という用語は、適した調節配列に機能的に連結された場合にインビトロまたはインビボでRNAに転写（DNA）される核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域の前後の領域、例えば5'非翻訳（5' UTR）または「リーダー」配列および3' UTRまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコード区分（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも1つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージされる能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに本明細書に記載されるようなポリペプチドをコードする核酸を含み得る。ベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞中に任意の核酸を移動させる目的で利用されてよい。ウイルスベクターの多数の形態が当技術分野において公知である。
【０１８４】
「組換えベクター」によって意味するのは、インビボで発現することができる異種核酸配列または「導入遺伝子」を含むベクターである。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの態様において、他の適切な組成物および療法と組み合わせられることを理解されたい。いくつかの態様において、ベクターはエピソーム性である。適切なエピソームベクターの使用により、対象において、染色体DNA外に高コピー数で関心対象のヌクレオチドを維持し、それにより染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段が提供される。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、「治療している」、または「改良」という用語は、例えば本明細書に記載される病状または疾患などの、疾患または障害に関連する病状の進行または重症度を逆転、緩和、改良、阻害、遅延、または停止することが目的である治療的処置を指す。「治療している」という用語は、病状、疾患、または障害の少なくとも1つの不利益な影響または症状を低減または緩和していることを含む。1つまたは複数の症状または臨床マーカーが低減されれば、治療は一般的に「有効」である。あるいは、疾患の進行が低減または停止されれば、治療は「有効」である。すなわち、「治療」には症状またはマーカーの改善だけでなく、治療を行わない場合に予期されるものと比較した、症状の進行もしくは悪化の中止または少なくとも遅延も含まれる。有益または望ましい臨床結果は、検出可能であろうと検出不可能であろうと、1つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の下落、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅れまたは遅延、疾患状態の改良または一時緩和、（部分であろうと完全であろうと）寛解、および／または死亡率の減少を含むが、これらに限定されない。疾患の「治療」という用語は、疾患の症状または副作用の軽減をもたらすこと（対症療法を含む）も含む。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される担体、例えば製薬業界において広く使用される担体と組み合わせた活性作用物質を指す。「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、もしくは他の問題または合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適切な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書で使用される。いずれかの局面のいくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、水以外の担体であり得る。いずれかの局面のいくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、クリーム、エマルション、ゲル、リポソーム、ナノ粒子、および／または軟膏であり得る。いずれかの局面のいくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、人工的または操作された担体、例えば有効成分が自然界で生じることが見出されない担体であり得る。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、所望の部位での少なくとも部分的な作用物質の送達という結果になる方法または経路により、本明細書に開示されるような化合物を対象中に配置することを指す。本明細書に開示される化合物を含む医薬組成物は、対象において有効な治療という結果になる任意の適した経路によって投与できる。
【０１８８】
「有効量」という用語は、病状に関連する症状の少なくともいくらかの改良をもたらすのに十分な組成物の量を意味する。1つの態様において、「有効量」は、病状を有する対象において、病状のマーカーまたは症状を減少させる組成物の量を意味する。
【０１８９】
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は統計的有意性を指し、一般的に、2つの標準偏差（2SD）より大きい差を意味する。
【０１９０】
作業例以外において、または別段の指示がない限り、本明細書で使用される成分量または反応条件を表すすべての数は、すべての場合に「約」という用語で修飾されると理解されるべきである。パーセンテージに関連して使用される場合、「約」という用語は±1％を意味し得る。
【０１９１】
本明細書で使用される場合、「含んでいる」または「含む」という用語は、必須であろうとなかろうと特定されていない要素を包含する可能性があるものの、本発明に必須の方法および組成物ならびにその各々の成分に関して使用される。本明細書で使用される場合、「含んでいる」という用語は、提示された定義済みの要素に加えて、他の要素も存在できることを意味する。「含んでいる」の使用は、限定というよりはむしろ包含を示す。
【０１９２】
「からなる」という用語は、本明細書に記載される組成物、方法、およびその各々の成分を指し、その態様の説明に記載されていない任意の要素を含まない。
【０１９３】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の態様に必要な要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基本的および新規または機能的な特徴に実質的に影響を与えない追加の要素の存在を可能にする。
【０１９４】
「ある（a）」、「ある（an）」、および「その（the）」という単数形の用語は、文脈が他に明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という言葉は、文脈が他に明確に示さない限り、「および」を含むことを意図している。本開示の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似したまたは同等の方法および材料を使用できるが、適切な方法および材料は以下に記載されている。「例えば（e.g.）」という略語はラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、「例えば（e.g.）」という略語は、「例えば」という用語と同義である。
【０１９５】
本明細書に開示される本発明の代替要素または態様のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別にまたはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見出される他の要素との任意の組み合わせで、言及および主張されることができる。グループの1つまたは複数のメンバーは、利便性および／または特許性の理由により、グループに包含させ、またグループから削除することができる。そのような任意の包含または削除が生じた場合、本明細書において、明細書は修正されたグループを含むとみなされ、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの書面による記載を充足する。
【０１９６】
本明細書で別段の定義がない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する当技術分野における当業者によって広く理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、したがって変わり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、これは特許請求の範囲によって専ら定義される。免疫学および分子生物学における一般用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, l9th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006；Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)；Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)；Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)、Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005；およびCurrent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)に見出すことができ、これらの内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９７】
当業者は、使用する化学療法剤を容易に特定できる（例えば、Physicians' Cancer Chemotherapy Drug Manual 2014, Edward Chu, Vincent T. DeVita Jr., Jones & Bartlett Learning；Principles of Cancer Therapy, Chapter 85 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 18th edition；Therapeutic Targeting of Cancer Cells: Era of Molecularly Targeted Agents and Cancer Pharmacology, Chs. 28-29 in Abeloff s Clinical Oncology, 2013 Elsevier；およびFischer D S (ed): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 2003を参照されたい）。
【０１９８】
他の用語は、本発明の様々な局面の説明内において、本明細書で定義される。
【０１９９】
本出願の全体を通して引用される、参考文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む、すべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用されてもよい、そのような出版物に記載される方法論を説明および開示する目的のために、参照により本明細書に明白に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日よりも前のそれらの開示について専ら提供される。これに関して、先行発明という理由で、または他のいかなる理由によっても、そのような開示に先行する権利が本発明者らに与えられないことを承認するものと解釈されるべきではない。これらの書類の内容に関する日付または表示に関するすべての陳述は、本出願人らが利用可能な情報に基づいており、これらの書類の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
【０２００】
本開示の態様の説明は、包括的であることも、または開示された精密な形態に本開示を限定することも意図しない。本開示の具体的な態様および例は、例示を目的として本明細書に記載されるが、関連技術分野における当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法の工程または機能は所与の順序で示されるが、代替となる態様では機能を異なる順序で実行してもよいか、または機能は実質的に同時に実行されてもよい。本明細書で提供される本開示の教示は、必要に応じて、他の手順または方法に適用できる。本明細書に記載される様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面は、もし必要であれば、上記の参考文献および出願の組成物、機能、および概念を使用するために修正することができ、本開示のなおさらなる態様を提供することができる。さらに、生物学的な機能の同等性を考慮すれば、種類または量において生物学的または化学的作用に影響を与えずに、タンパク質構造にいくつかの変化を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらのおよび他の変化を本開示に加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０２０１】
前述の態様のいずれかの具体的な要素を、他の態様の要素と組み合わせるか、または置換することができる。さらに、本開示の特定の態様に関連する利点を、これらの態様の文脈において説明してきたが、他の態様もそのような利点を呈してよく、かつ必ずしもすべての態様がそのような利点を呈して本開示の範囲内にある必要はない。
【０２０２】
本明細書に記載される技術を、以下の実施例によってさらに例示するが、これらの実施例は決してさらなる限定であると解釈されるべきではない。
【０２０３】
本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、以下の番号が付けられた項のいずれかによって定義できる：
1.  有機陽イオンおよび有機／無機陰イオンを有する塩のグループを含む、イオン液体または溶媒。
2.  有機陽イオンおよび有機／無機陰イオンが、それぞれコリンおよびゲラネートもしくはゲラン酸である、項1のイオン液体または溶媒。
3.  100℃未満で液体として存在する、項1または2のイオン液体または溶媒。
4.  室温で液体として存在する、項1、2、または3のイオン液体または溶媒。
5.  イオン液体または溶媒が存在しない対照インスリンと比較して、皮膚を横切るインスリンの透過を大幅に増強する、項1〜4のいずれかのイオン液体または溶媒。
6.  項1〜5のいずれかのイオン液体とインスリンとを含む、組成物。
7.  薬学的に許容される担体をさらに含む、項6の組成物。
8.  経口製剤として製剤化された、項6または7の組成物。
9.  コリンおよびゲラネートを含むイオン液体とインスリンとを含む、組成物。
10.  薬学的に許容される担体をさらに含む、項9の組成物。
11.  コリンおよびゲラネートを含むイオン液体、インスリン、ならびに薬学的に許容される担体を含む、経口製剤。
12.  項1〜5のいずれかのイオン液体を含む、経口送達用のインスリン製剤。
13.  薬学的に許容される担体をさらに含む、項12の経口送達用のインスリン製剤。
14.  項1〜5のいずれかのイオン液体を治療薬物と混和し、混和物を対象に経口投与する工程を含む、治療薬物の経口送達方法。
15.  混和物が経口製剤である、項14の方法。
16.  コリンおよびゲラネートとインスリンとを含むインスリンの経口製剤を経口投与する工程を含み、コリンおよびゲラネートがイオン液体溶媒を形成する、糖尿病の治療方法。
17.  組成物または製剤中のイオン液体濃度が約0.1 mM〜20 mMである、項6〜10のいずれかの組成物、または項11〜13のいずれかの製剤、または項14〜16のいずれかの方法。
18.  組成物または製剤中のイオン液体濃度が、約0.5 mM〜20 mM、0.5 mM〜18 mM、0.5 mM〜16 mM、0.5 mM〜14 mM、0.5 mM〜12 mM、0.5 mM〜10 mM、0.5 mM〜8 mM、1 mM〜20 mM、1 mM〜18 mM 、1 mM〜16 mM、1 mM〜14 mM、1 mM〜12 mM、1 mM〜10 mM、1 mM〜8 mM、2 mM〜20 mM、2 mM〜18 mM、2 mM〜16 mM、2 mM〜14 mM、2 mM〜12 mM、2 mM〜10 mM、2 mM〜8 mM、4 mM〜20 mM、4 mM〜18 mM、4 mM〜16 mM、4 mM〜14 mM、4 mM〜12 mM、4 mM〜10 mM、4 mM〜8 mM、6 mM〜20 mM、6 mM〜18 mM、6 mM〜14 mM、6 mM〜12 mM、6 mM〜10 mM、6 mM〜8 mM、8 mM〜20 mM、8 mM〜18 mM、8 mM〜16 mM、8 mM〜14 mM、8 mM〜12 mM、8 mM〜10 mM、10 mM〜20 mM、10 mM〜18 mM、10 mM〜16 mM、10 mM〜14 mM、10 mM〜12 mM、12 mM〜20 mM、12 mM〜18 mM、12 mM〜16 mM、12 mM〜14 mM、14 mM〜20 mM、14 mM〜18 mM、14 mM〜16 mM、16 mM〜20 mM、16 mM〜18 mM、または18 mM〜20 mMである、項6〜10のいずれかの組成物、または項11〜13のいずれかの製剤、または項14〜16のいずれかの方法。
19.  組成物中のイオン液体濃度が、約1 mM、約2 mM、約3 mM、約4 mM、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、または約20 mMである、項17の組成物。
【０２０４】
本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、以下の番号が付けられた項のいずれかによって定義できる：
1.  イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた活性化合物を経口投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の経口送達方法。
2.  CAGEと組み合わせた活性化合物を皮下、皮内、または静脈内投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の送達方法。
3.  CAGEと組み合わせた活性化合物を粘膜に投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の送達方法。
4.  粘膜が、鼻粘膜、口腔粘膜、または膣粘膜である、項3の方法。
5.  CAGEと組み合わせた活性化合物を非経口投与する工程を含む、少なくとも1つの活性化合物の非経口送達方法。
6.  投与が腫瘍への送達を含む、項5の方法。
7.  それを必要とする対象に、CAGEと組み合わせた活性化合物を注射により罹患組織中へ投与することにより、対象において疾患を治療する方法。
8.  疾患が、がん、脂肪、いぼ、過形成、または組織増殖に起因する任意の他の疾患である、項7の方法。
9.  CAGEが少なくとも0.1％ w/vの濃度である、項1〜8の方法。
10.  CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項1〜9の方法。
11.  CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項1〜9の方法。
12.  CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項1〜9の方法。
13.  イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、項1〜12の方法。
14.  CAGEと組み合わせた活性化合物が1回投与される、項1〜13の方法。
15.  CAGEと組み合わせた活性化合物が複数回用量で投与される、項1〜14の方法。
16.  活性化合物が核酸分子を含む、項1〜15の方法。
17.  活性化合物が小分子を含む、項1〜15の方法。
18.  活性化合物がポリペプチドを含む、項1〜15の方法。
19.  活性化合物が抗体または抗体試薬を含む、項1〜15の方法。
20.  活性化合物が化学療法化合物を含む、項1〜19の方法。
21.  活性化合物がインスリンを含む、項1〜20の方法。
22.  インスリンが1〜20 mg/kgの投与量で提供される、項21の方法。
23.  CAGEと組み合わせた活性化合物を含む、組成物。
24.  CAGEが少なくとも0.1％ w/vの濃度である、項23の組成物。
25.  CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項23〜24の組成物。
26.  CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項23〜24の組成物。
27.  CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項23〜24の組成物。
28.  活性化合物が核酸分子を含む、項23〜27の組成物。
29.  活性化合物が小分子を含む、項23〜27の組成物。
30.  活性化合物がポリペプチドを含む、項23〜27の組成物。
31.  活性化合物が抗体または抗体試薬を含む、項23〜27の組成物。
32.  活性化合物が化学療法化合物を含む、項23〜31の組成物。
33.  活性化合物がインスリンを含む、項23〜32の組成物。
34.  インスリンが1〜20 mg/kgの投与量で提供される、項233の組成物。
35.  さらなる薬学的に許容される担体をさらに含む、項23〜34の組成物。
36.  経口、皮下、または非経口製剤として製剤化された、項23〜35の組成物。
37.  粘膜への投与のために製剤化された、項23〜36の組成物。
38.  粘膜が、鼻粘膜、口腔粘膜、または膣粘膜である、項37の組成物。
39.  経口製剤が、活性化合物およびCAGEの組み合わせを含む分解性カプセルである、項36の組成物。
40.  活性化合物の生物活性が、CAGEの非存在下における活性と比較して改善または安定化される、項23〜39の組成物。
41.  活性化合物およびCAGEの組み合わせが混和物である、項1〜40の方法または組成物。
42.  活性化合物およびCAGEの組み合わせが、活性化合物を含むナノ粒子を含み、ナノ粒子が、CAGEを含む組成物における溶液または懸濁液中にある、項1〜40の方法または組成物。
43.  イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた核酸分子を細胞と接触させる工程を含む、核酸分子を細胞へ送達する方法。
44.  細胞が対象中の細胞であり、接触工程が、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた核酸分子を対象に投与することを含む、項43の方法。
45.  核酸分子が、ベクター、発現ベクター、または阻害性核酸分子を含む、項43〜44の方法。
46.  CAGEが少なくとも0.1％ w/vの濃度である、項43〜45の方法。
47.  CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項43〜46の方法。
48.  CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項43〜46の方法。
49.  CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項43〜46の方法。
50.  イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、項43〜49の方法。
51.  核酸分子およびCAGEの組み合わせが混和物である、項43〜50の方法。
52.  核酸分子およびCAGEの組み合わせが、核酸分子を含むナノ粒子を含み、ナノ粒子が、CAGEを含む組成物における溶液または懸濁液中にある、項43〜50の方法。
53.  経口送達、粘膜への送達、非経口送達、または疾患の治療に使用するための、イオン液体であるコリンおよびゲラネート（Choline And GEranate；CAGE）を含む組成物と組み合わせた少なくとも1つの活性化合物。
54.  粘膜が、鼻粘膜、口腔粘膜、または膣粘膜である、項53の組み合わせ。
55.  非経口投与が腫瘍への送達を含む、項53の組み合わせ。
56.  治療が、罹患組織への前記組成物の注射を含む、項53の組み合わせ。
57.  疾患が、がん、脂肪、いぼ、過形成、または組織増殖に起因する任意の他の疾患である、項56の組み合わせ。
58.  CAGEが少なくとも0.1％ w/vの濃度である、項53〜57の組み合わせ。
59.  CAGEが、約2：1から約1：10の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項53〜58の組み合わせ。
60.  CAGEが、約1：1から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項53〜59の組み合わせ。
61.  CAGEが、約1：2から約1：4の比率のコリン：ゲラン酸またはゲラネートを含む、項53〜59の組み合わせ。
62.  イオン液体の陰イオンがゲラネートおよび／またはゲラン酸を含む、項53〜61の組み合わせ。
63.  CAGEと組み合わせた活性化合物が1回投与される、項53〜62の組み合わせ。
64.  CAGEと組み合わせた活性化合物が複数回用量で投与される、項53〜62の組み合わせ。
65.  活性化合物が核酸分子を含む、項53〜64の組み合わせ。
66.  活性化合物が小分子を含む、項53〜65の組み合わせ。
67.  活性化合物がポリペプチドを含む、項53〜65の組み合わせ。
68.  活性化合物が抗体または抗体試薬を含む、項53〜65の組み合わせ。
69.  活性化合物が化学療法化合物を含む、項53〜65の組み合わせ。
70.  活性化合物がインスリンを含む、項53〜65の組み合わせ。
71.  インスリンが1〜20 mg/kgの投与量で提供される、項70の組み合わせ。
【実施例】
【０２０５】
実施例1：インスリンの経口送達のための非常に効果がある溶媒としてのコリン-ゲラネート
略語
AUC      濃度曲線下面積
BSM      基礎播種培地
CAGE     コリンおよびゲラネート
CD       円偏光二色性
CLSM     共焦点レーザー走査顕微鏡法
DAPI     4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩
DMEM     ダルベッコ変法イーグル培地
DMSO     ジメチルスルホキシド
F        バイオアベイラビリティ
FBS      ウシ胎仔血清
FITC     フルオレセインイソチオシアネート
GIT      胃腸管
IC50     半最大阻害濃度
IJ       空腸内
Kel       消失速度定数
MTT      3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド
PBS      リン酸緩衝生理食塩水
P/S      ペニシリンおよびストレプトマイシン
RT       室温
SQ       皮下
t1/2      半減期
TEER     経上皮電気抵抗
【０２０６】
世界中の糖尿病症例の上昇および注射可能なインスリンを用いた血糖管理に対する患者の順守の欠落に伴い、効率的な経口インスリン製剤の開発が緊急に必要とされている。しかしながら、胃腸管は生物学的製剤の経口送達に対する厄介な障壁をもたらす。ここで、本発明者らはコリンおよびゲラネート（CAGE）イオン液体を使用した非常に効果がある経口インスリン製剤の開発を報告する。インビボで、ラットにおける空腸投与の後、インスリン-CAGEは並外れた51％という薬物動態バイオアベイラビリティおよび66％という薬力学的バイオアベイラビリティを示した。低用量のインスリン（3〜10 U/kg）は、皮下注射されたインスリンと異なり、より長期間（最大12時間）持続する血糖値の有意な減少をもたらした。10 U/kgのインスリン-CAGEが、経口経管栄養を用いて腸溶性コーティングカプセルで経口送達された場合、最大45％の血中グルコースの持続的な減少が観察された。製剤は高い生体適合性を呈し、室温で2か月間および冷蔵下で少なくとも4か月間安定であった。まとめると、結果は、CAGEが有望な経口送達賦形剤であり、注射物質として現在販売されているインスリンおよび他の生物学的製剤の経口送達についてさらに探究されるべきであることを示している。
【０２０７】
薬物投与の経口経路は、その投与の簡単さ、高い患者コンプライアンス、および低い製造コストが原因で、注射よりも好まれる。しかしながら、薬物吸収に対する様々な胃腸障壁が原因で、生物学的製剤の送達には不適切である。例えば、インスリンは1型糖尿病の管理に不可欠な薬剤である。現在は皮下注射として投与されているが、その侵襲性が原因で患者の順守の欠落と関連している。経口送達されるインスリンは患者のコンプライアンスを著しく増強することができ、膵臓インスリンの生理学的経路を綿密に模倣する。経口／膵臓インスリンは肝臓に門脈を介して輸送され、そこで80％が保持され、残りは体循環に到達し、体循環と比較して門脈中の最大3倍高いインスリン濃度を作り出す。インスリンが皮下注射された場合、門脈中のインスリン濃度（約20％のみ）と比較してより高い全身インスリン濃度が原因で、この門脈-末梢インスリン勾配が破壊され、グリコーゲン貯蔵とグルコース出力との間の肝臓の微妙なバランスが破壊され、しばしば高血糖症という結果になり、これをより高いインスリン用量で治療した場合、低血糖症につながり得る。
【０２０８】
経口インスリン製品の追求は何十年も前に始まった。生物学的製剤の経口吸収に対する胃腸障壁を克服するためにいくつかの戦略が開発されたが、すべての臨床的ハードルを乗り越えるのに成功した製剤はなく、したがって現在市販されている経口インスリン製品は存在しない。第II相臨床試験が完了したか、または現在第II相臨床試験中の製品には、経口インスリン取り込みを改善するための添加物を含む腸溶性コーティングカプセル（Diabetology LtdによるCapsulin（商標）およびOramed LtdによるORMD-0801）、肝指向リポソームインスリン（hepatic directed liposomal insulin；Diasome Pharmaceuticals Inc.によるHDV-Insulin）、ポリエチレングリコール（PEG）とコンジュゲートしたインスリン（Biocon Ltd.によるIN-105）、Oshadi担体中のインスリン-プロインスリン-c-ペプチド（Oshadi drug administration LtdによるOshadli Icp）、および胃腸管吸収促進技術（Novo NordiskによるGIPET 1）を使用した長時間作用型インスリン類似体錠剤が含まれる。
【０２０９】
さらに、多くの製品は、多段階の製剤化手順、様々な添加物、またはタンパク質の化学修飾を必要とし、それらはそれら自体の欠点を有する。世界的な糖尿病の蔓延が新たに出現したのに伴い、安全で効果があり、かつ簡単に拡張可能な経口インスリン製品の開発に切迫感がある。
【０２１０】
本発明者らは、インスリンのイオン液体（IL）に基づく経口製剤を開発し、その安全性、有効性、および長期安定性を決定した。イオン液体は、100℃未満の融点を有する有機／無機塩で構成されており、様々な新規の化学および製薬技術において広く使用されている。本作業において、本発明者らは、以前に抗生物質およびインスリンの経皮送達で顕著な有効性を示した、室温で安定なコリンおよびゲラネート（CAGE）の深共晶溶媒を利用した。インスリンを単一段階の過程でCAGEに分散させ、インビトロおよびインビボの両方でその安全性および有効性を、ならびにその保存安定性を査定した。この研究は、優れた経口有効性、生体適合性、および長期安定性を有するインスリンの経口バイオアベイラビリティのかつてない改善を実証する。
【０２１１】
腸の単層を横切るFITC-インスリン輸送の決定
本発明者らは、10 mM CAGEまたは生理食塩水を使用した、Caco-2単層を横切るFITC-インスリンの5時間長の輸送実験を設計した。この研究では、インスリン-CAGE処理細胞は、インスリン-生理食塩水処理群と比較して、開始から有意に高い輸送を示した（図1）。両群について、FITC-インスリン輸送は時間とともに着実に増加し、研究全体を通して、CAGEで処理された単層では、インスリン-生理食塩水処理細胞と比較して、すべての時点にわたってインスリンの少なくとも3倍高い輸送が観察された。研究の最後の5時間の時点には、インスリン-CAGE処理細胞におけるFITC-インスリン輸送は30％に達したが、インスリン-生理食塩水処理細胞では10％であった。
【０２１２】
これらの結果は、研究の最後におけるトランスウェル膜の共焦点イメージングを通じて裏付けられた。画像は、インスリン-生理食塩水と比較した場合、インスリン-CAGEとインキュベートした細胞によるFITC-インスリンのより高い取り込みを明らかに示した（図2A〜2B）。
【０２１３】
CAGEによる処理の際のCaco-2細胞における密着結合の完全性を決定するためにTEERを測定した。インスリン-生理食塩水処理細胞では、最初の3時間にわたってTEERは元の値の100％に近いままであり、研究の最後の5時間の時点までに2.5％だけ減少して98.5±2.64％となった（図3）。しかしながら、インスリン-CAGE処理細胞では、TEERは2時間および3時間でそれぞれ88.35±0.86および77.43±3.48％に有意に減少した。3時間を超えるとTEERは上昇し始め、4時間で初期値の82.94±2.64％に到達し、最終的に5時間で91.3±1.73％に到達したが、これはインスリン-生理食塩水処理細胞と有意には異ならなかった。CAGEによってもたらされるTEERのこれらの変化は、CAGEが腸の密着結合を一時的に開かせて、細胞を横切るインスリン輸送を助けることを示唆する。しかしながら、密着結合の過渡的な開口の他に、CAGEによるこれらの細胞を横切るインスリンの輸送を手助けするように働き始める複数の機構が存在するかもしれず、解明が必要である。
【０２１４】
空腸内投与の際のインスリン-CAGEのインビボ有効性
インスリン-CAGEの血糖値を低下させる有効性を計測するために、3〜5 U/kgのインスリンをその対照と同時にCAGE中に分散させ、麻酔したラットの空腸内に投与し、続いて合計5時間にわたって0.5時間ごとに血中グルコースをモニターした（図4）。3 U/kgのインスリン-CAGEを投与したラットでは、血液は0.5から着実に降下し始め、2.5時間までに初期値の55％（55.37±5.64％）に到達した。この時点を超えると、血中グルコースの降下はプラトーに達し、研究の最後の5時間の時点までに初期値の53％（53.12±3.16％）に到達した。5 U/kgのインスリン-CAGEで処理した群は血糖値の急激な減少を示し、1.5時間および2時間以内に約65％の降下に至った（それぞれ36.73±4.46および35.37±5.25％）。血糖値の急速な降下にさらされた非糖尿病ラットで通常観察されるように、体のグルコース恒常性機構が作動することが原因で、血糖値はその後増加した。5時間の最後には、血糖値は初期レベルの約74％（73.93±5.72％）であった。2 U/kgのインスリンを皮下注射したラットも、5 U/kgのインスリン-CAGE空腸内投与と類似した血中グルコース降下パターンを示した。しかしながら、血中グルコース降下の程度は、空腸内投与された5 U/kgのインスリン-CAGEよりも低かった。51％という最大の降下が1時間で観察され（初期レベルの48.76±7.55％）、研究の最後の5時間の時点では100％に急速に回復した（101.61±6.69％）。より早い時点では、皮下投与されたインスリンと5 U/kg インスリン-CAGEとの間で有効性に有意差は指摘されなかった。しかしながら、図6に明らかに見られるように、CAGEは研究の最後までインスリンの作用を有意に持続させた。3 U/kgのインスリン-CAGE空腸内投与でも類似した持続的なインスリンの生物活性が指摘された。CAGEのみ、生理食塩水、または3 U/kgのインスリン-生理食塩水の空腸内投与などの他の製剤対照は、前述の群で観察されたような、血糖値の急速な降下をもたらさなかった。これらすべての対照群において、血中グルコースは5時間で初期レベルの約25％までゆっくりと（継続した絶食が原因である可能性が最も高い）低下した。
【０２１５】
インスリンの吸収および排出の薬物動態を、異なる時点での血清インスリンレベルを測定することにより決定した（図5）。インスリン濃度は、2 U/kgのインスリンの皮下注射および5 U/kg インスリン-CAGEの空腸内投与後1時間以内に急速に増加し、引き続いて降下し、排出は類似したパターンに従った。一方、空腸内投与された3 U/kgのインスリン-生理食塩水については、血清インスリン濃度はほとんど増加しなかった。血清インスリン濃度を用いて計算された薬物動態パラメーターにより、空腸内投与されたインスリン-CAGEの排出半減期は、SQインスリンよりも約2倍高いことが示された（表1）。このように計算された5 U/kg IJインスリン-CAGEの経口バイオアベイラビリティは50.6％であることが見出された。
【０２１６】
（表１）空腸内与薬されたインスリン-CAGEおよび皮下投与されたインスリン溶液の薬物動態パラメーター
2021503468.tif 000005
【０２１７】
本発明者らの研究では、51％の空腸バイオアベイラビリティが得られ、これは他の経口インスリン製剤の間で見られる中で最も高いものの1つでもある。インスリン-CAGEの排出半減期は皮下注射インスリンよりも概ね2倍高く、より持続的な有効性を示すことも注記すべきである。
【０２１８】
カプセル中で経口送達されたインスリン-CAGEのインビボ有効性
空腸内投与された際のインスリンの経口バイオアベイラビリティを増強するCAGEのかなりの有効性により、本発明者らは、カプセル中で経口送達されたインスリン-CAGEを使用して類似した有効性が達成できるかどうかを調査しようと考えた。この目的のために、本発明者らは10 U/kgのインスリン-CAGEおよびその対照を、図6に説明するように細長いサイズ9のカプセル中に配置し、それらを一晩絶食させたラットに経口経管栄養を使用して投与した。
【０２１９】
10 U/kgのインスリン-CAGEで処理した群は、研究の開始後1および2時間で血糖値の急速な降下を示した（それぞれ初期レベルの68.58±2.12および62.32±1.58％）（図7）。この時点を超えると、血中グルコースは12時間で初期レベルのおよそ56％（56.66±2.31％）までゆっくりとしかし着実に降下した。対照的に、2 U/kgのインスリンの皮下投与は、1時間で血糖値の急速な50％降下（51.43±5.25％）につながり、その後4時間で約88％まで着実に上昇した。その後、血糖値はCAGEのみ、空のカプセル、およびインスリン-生理食塩水の製剤対照と類似したパターンで降下した。これらの対照を経口投与した場合、時間とともに血糖値のゆっくりとした着実な減少が観察され（継続的な絶食が原因である可能性が最も高い）、12時間で約25％の減少に終わった。皮下投与されたインスリンと異なり、および空腸内投与と一致して、4時間から始まり研究の最後の12時間の時点までCAGEがインスリンの有意に持続した作用につながったことは注記すべきである。
【０２２０】
CAGEの空腸内および経口投与後の腸の組織学的解析
組織学的検査では、CAGEまたは生理食塩水で処理されたラットの間で小腸組織の形態に顕著な差は示されなかった（図8A〜8E）。腸組織は、空腸内投与の5時間後または経口投与の12時間後のいずれかに収集され、小腸組織に著しい構造的損傷は示されなかった。特に、すべての組織に指状の絨毛が存在する。結果は、CAGEの腸との優れた生体適合性を明らかに示し、それにより、その経口投与への適合性が検証された。
【０２２１】
CAGE中のインスリンの二次構造
インスリンは、その受容体結合、したがって生物活性に必須の固有のアルファヘリックスコンフォメーションを有する。以前の研究によって、インスリンは室温（RT、25℃）で17時間保存された後に、CAGE中でそのアルファヘリックスコンフォメーションを保持することが実証されている［Banerjee et al, AHM, 2017］。しかしながら、インスリンをCAGE中により長期間分散させた場合、コンフォメーションが守られるかどうかは不明である。この目的のために、本発明者らはインスリン-CAGEをRT（直射日光を避けて）または4℃の冷蔵下で保存し、CDを使用して、4か月間の期間にわたって二次構造を毎月査定した。結果は、およそ207および222 nmに二重の負の底値が存在したことを示し、これはCDグラフにおけるアルファヘリックスの典型的な表現である（図9）。新鮮なインスリンと、RTで最大3か月間または冷蔵下で最大4か月間保存されたものとの間で、楕円率の形状または度合いに差は見られなかった。この結果は、CAGEが長期間にわたってインスリンの安定性を保持するのに役立つことを示唆し、このことは引き続いてインビボの生物活性評価を通じて確認された。一般的に、凍結乾燥された標準的なインスリンは室温で最大3〜4週間にわたって安定であるが、4℃で保存されたインスリン溶液は2〜7日間だけしか安定ではない（例えば、ワールドワイドウェブ上のprospecbio.com/Insulin_Humanで利用可能な記録を参照されたい）。
【０２２２】
インビボ生物活性評価を通じたCAGE中のインスリンの安定性の確認
CD安定性研究で得られた励みになる結果により、本発明者らは、安定性の結果を確認するために、インスリンの生物活性を非糖尿病ラットにおいて査定しようと考えた。この目的のために、一晩絶食させたラットに、（CAGEから単離し、滅菌生理食塩水に再懸濁した）1 U/kgのインスリンを皮下注射し、血中グルコースを8時間の期間にわたってモニターした（図10）。新たに調製されたインスリン溶液（生理食塩水中のインスリン）は、1時間で約50％の血糖値の降下（50.73±2.47％）をもたらし、次の1時間も保持された（49.59±4.4％）。その後、血糖値は5時間で元のレベルの約92％（92.05±4.8％）に上昇し、継続的な絶食の結果として、再びゆっくりと初期値の約30％まで落ち込んだ。比較すると、様々な温度および異なる時点で保存されたCAGEから単離されたインスリンは類似したパターンに従い、注射後1および2時間で類似した血糖値の降下を示し、新鮮なインスリンと比較して降下率に有意差はなかった。しかしながら、RTで3か月間保存されたインスリンについては、有効性の有意な減衰が観察された。この群では、インスリン注射の1および2時間後に血糖値の38％の降下だけが指摘され（それぞれ61.57±2.38％および61.98±3.19％）、RTでの2か月の保存後にインスリンがその生物活性のいくらかを喪失することを示していた。しかしながら、CAGEとともに4℃で保存されたインスリンは、4か月の保存後ですら生物活性のいかなる喪失も示さなかった。このことは、インスリンの長期保存についてCAGEが優れた溶媒であることを明らかに説明している。4℃におけるCAGE中のインスリンの安定性の最長時間を決定するために、さらなる研究が必要である。
【０２２３】
考察
過去数十年間にわたって、糖尿病の有病率はそれほどまでに着実に成長したため、現在では「世紀の蔓延」と称されている（1）。糖尿病症例の上昇はすべての国で報告されており、低中所得国で最も急速に成長し、中東および北アフリカ地域で最大の有病率である（1〜3）。最近の世界保健機関の報告によると、糖尿病は2012年に全世界で150万人の死亡の原因であり、高血糖症関連の併存疾患が原因でさらに320万人が死亡した（3）。米国では、2015年に3030万人（人口の約9.4％）がこの疾患に悩まされていると報告され、毎年150万の新しい症例が診断される（4）。この疾患の管理についての現在の提案には、単独またはメトホルミンなどの経口血糖降下薬と組み合わせたインスリン療法が含まれる（5）。インスリン療法を単独で受けている個体は、しばしば1日2回の中等度作用型インスリンまたは1日1回の長時間作用型インスリンのいずれかの投与を必要とする（5）。インスリンは、外来診療所で経口丸薬として利用可能ではなく、専ら皮下注射として投与される。しかしながら、高血糖症の管理ならびに神経障害、腎症、および網膜症のリスクを和らげるその効き目にもかかわらず、注射可能なインスリンは、疼痛、日常活動への干渉、およびきまりの悪さが原因で患者のコンプライアンスがより低く、60％もの患者における意図的な怠慢および長期的な血糖制御不良という結果になる（6、7）。これは、ヘモグロビンA1Cレベルの上昇および糖尿病関連合併症が原因となる入院の増加へとつながる（6）。この問題を避けるために、MannKind Corporationは、食後血糖管理のための吸入可能な速効型インスリン製剤Afrezza（登録商標）を開発したが、肺がんおよび糖尿病性ケトアシドーシスのより高い発生率、肺機能の減少、ならびに慢性肺疾患患者における急性気管支痙攣のより高い発症リスクなどの関連する肺リスクは、患者がインスリン吸入療法へと切り替えるのを思いとどまらせるかもしれない（8）。糖尿病の指数関数的成長および規模を考えると、患者に訴求し、製剤に基づく不利益な影響を回避するインスリン療法を開発することが必要不可欠である。
【０２２４】
経口送達は患者の高いコンプライアンスを享受するが、タンパク質またはペプチド薬物などの高分子の送達には適切でない。これは、経口送達された薬物が、タンパク質／ペプチド薬物を分解できる胃の酸性環境を横断する必要があるという事実が原因である。これは、腸溶性または他の保護コーティングされたシステムでそれらをカプセル化することにより回避できる。しかしながら、それらの保護用ケーシングから腸内で放出される際に、ペプチド／タンパク質薬物は腸のタンパク質分解環境に投げ込まれ、常駐酵素によってより小さいアミノ酸単位へと簡単に切断される。ある割合の薬物がタンパク質分解から逃れても、腸の粘液層および腸細胞を通じて無傷の分子として血液循環へと吸収されるのはほぼ不可能である。不安定なGI通過時間および腸における特定のインスリン取り込み機構の欠落が原因で、経口インスリン吸収はさらに邪魔される（9）。GI通過の間のインスリン構造のいかなる乱れも、著しい変性および生物活性の喪失につながるかもしれない。したがって、当然のことながら、タンパク質およびペプチド薬物は1％未満とごくわずかな経口バイオアベイラビリティしか有さず、用量の100％が薬理学的活性に利用可能な注射可能な製剤とははっきりと相違している（10）。何人かの研究者は、インスリン分子を修飾し、それを新規担体にカプセル化し、腸溶性コーティング、吸収促進剤、またはタンパク質分解阻害剤を使用して、インスリンの低い経口バイオアベイラビリティという多年にわたる問題を解決しようとした。いくつかの例には、経口インスリン送達のためのPLGA（ポリ[乳酸-コ-グリコール酸]）に基づくナノ粒子の使用が含まれる。Panらは、PLGAナノ粒子に搭載された10 U/kg インスリンを使用して10.3％の薬理学的バイオアベイラビリティを得たが、Cuiと同僚は、PLGAおよびPLGA-55ナノ粒子に配置された20 U/kg インスリンを使用して、それぞれ3.68および6.27％の経口バイオアベイラビリティを得た（11、12）。Sarmentoらは、キトサン-デキストランナノ粒子を使用してインスリンをカプセル化し、粒子中にそれぞれ50および100 U/kgのインスリンを配置した後、5.6および3.4％の薬理学的バイオアベイラビリティを観察した（13）。アルギネート-キトサンナノ粒子は、50および100 U/kgのインスリン用量について、インスリンの経口バイオアベイラビリティをそれぞれ6.8および3.4％に改善した（14）。Zhangと同僚は、50 U/kgのインスリンを固体脂質ナノ粒子（SLN）および小麦胚芽凝集素で修飾されたSLNにカプセル化し、それぞれ4.46および6.08％の薬理学的バイオアベイラビリティを得た（15）。同じように、Ansariらは、経口投与されたインスリン溶液と比較して、SLNを使用したインスリンの経口バイオアベイラビリティが5倍に増強されたことを報告した（8.26％対1.7％）（16）。インスリンの高い経口バイオアベイラビリティ（37.6％）は、生分解性ポリイソブチルシアノアクリレートナノスフェア中で75 U/kgのインスリンを経口送達することにより達成された（17）。タンパク質の経口送達を改善する他の戦略は、グリココール酸ナトリウム、アプロチニン、大豆トリプシン阻害剤、バシトラシン、およびメシル酸カモスタットなどのタンパク質分解酵素阻害剤の使用を伴い、経口送達インスリンの有効性の改善に有望であるこ��が示されている（18）。トランスフェリンのような標的リガンドまたはTATペプチドのような細胞浸透性ペプチドを付着させるなどのインスリンの化学修飾は、腸細胞を横切るインスリンのトランスサイトーシスを手助けすることが示されている（19、20）。インスリンへのポリエチレングリコール（PEG）の短鎖のコンジュゲーションを通じて得られたインスリン類似体IN-105は、溶解度、タンパク質分解に対する安定性、および腸管吸収の改善を通じて、T2DMの患者において食後に血中グルコースを経口用量依存的に低減させることが実証されている（21、22）。吸収促進剤には、経細胞取り込みのための腸上皮の細胞膜構造の調節または傍細胞輸送のための密着結合透過性のいずれかによって機能する、胆汁酸塩、界面活性剤、脂肪酸、カルシウムイオンキレート剤、キトサン／チオール化キトサンなどの特定のポリマー、および閉鎖帯毒素（zona occluden toxin）が含まれる（18）。
【０２２５】
ILは、有機陽イオンおよび有機／無機陰イオンを有する一群の塩を構成し、通常100℃未満では液体であるが、室温で液体として存在するものもある（23）。異なるイオンを対にすることにより、とりわけ生体触媒、酵素過程、タンパク質の安定性、透過促進剤、および可溶化剤の分野における広範囲の製薬用途について、ILは異なる物理化学的特性、例えば粘度、疎水性、溶解性、および生分解性を有するように誂えることができる（23〜29）。本発明者らは、最近、皮膚を横切るインスリンの透過を大幅に増強する、コリン-ゲラネート（CAGE）に基づくILを設計した（27）。
【０２２６】
経口送達されたCAGEの生体適合性は、最初に、腸管吸収および障壁のモデルとして広く使用されているヒト腸Caco-2細胞株を使用してインビトロで試験された（30、31）。インキュベーションの12〜48時間の期間についてIC50値は≧10 mMであり、これは高濃度のCAGEが腸細胞に細胞毒性を有さないことを示唆し、したがって安全な経口薬物送達作用物質としてのCAGEの潜在的な有用性が実証された。
【０２２７】
腸細胞を横切るインスリンの輸送におけるCAGEの有効性を決定するために、本発明者らはインスリンを10 mM CAGEに分散させ、製剤をCaco-2細胞とともに5時間インキュベートした。生理食塩水中のインスリンと比較して、CAGEは研究期間の全体を通して、インスリンの輸送を3〜4倍に有意に増強した。細胞での密着結合の完全性において、一時的ではあるが有意な降下も指摘され、細胞を横切るインスリンの輸送の増強に寄与したと仮定される。しかしながら、他の複数の機構の相互作用もインスリンのトランスサイトーシスを増大させる要因となったかもしれず、調査が必要である。CAGEが密着結合の完全性において過渡的な減少だけを引き起こし、細胞は5時間以内に概ね基礎レベルまで接合の完全性を回復させたことを注記するのは重要であり、このことは、他の多くの透過促進剤と異なり、CAGEが腸上皮構造を永続的または長期間にわたってのいずれにおいても損なわないため、それに起因するいかなる毒性も和らげることを明らかに示唆している。
【０２２８】
材料および方法 
CAGEの調製
本発明者らの以前の研究［Zakrewsky PNAS 2014］に従ってCAGE溶媒を合成した。手短に言えば、不純物を除去するために＜−70℃のアセトン中で少なくとも5回再結晶させた2当量のゲラン酸のみ（20 g、0.119モル、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）を500 mL丸底フラスコ内の1当量の重炭酸コリン（80 wt％溶液、12.275 g、0.059モル、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）に添加した。CO2の放出が止まるまで混合物を40℃で攪拌し、60℃で2時間の回転蒸発、続いて真空オーブンにおいて60℃で48時間乾燥させることにより水を除去した。25℃における物理的特徴評価は、以前の値と良好な一致を示した。NMRスペクトル（500-MHz Varian機器、Palo Alto、CAを使用して収集）も以前の調製物と良好に一致した：
2021503468.tif 000006
【０２２９】
96ウェルプレートおよびトランスウェルにおけるCaco-2単層培養
ヒト上皮結腸直腸腺がん細胞（Caco-2、ATCC、Manassas、VA）を1,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種し、10％ ウシ胎仔血清（FBS）および1％ ペニシリン-ストレプトマイシン（P/S）（ThermoFisher Scientific、Waltham、MA）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）において37℃、5％ CO2で21日間培養して完全に分化させ、コンフルエントな単層を形成させた。この期間の間、第1週は2日ごと、ならびに第2週および第3週は隔日で細胞培地を交換した。
【０２３０】
トランスウェルにおける輸送実験のために、3日間の急速なCaco-2増殖システムを使用した。MITOシーラム+ イクステンダーを補充したCorning（登録商標）の基礎播種培地（BSM）に細胞を配置し、24ウェルプレートの内部に配置されたMillicell（登録商標）のPCFインサート上に400,000細胞/mlの密度で播種した。製造業者の推奨に従って、培地を含む500μlの細胞を頂端側に配置し、1000μlの無細胞BSMを基底外側に置いた。37℃、5％ CO2で24時間インキュベートした後、さらに2〜4日間にわたって、MITOシーラム+ イクステンダーを補充した同量の腸細胞分化培地に培地を置き換えた。定期的にTEERを測定し、細胞間の十分な密着結合の完全性を示す200 ohms.cm2より上に到達したときに輸送研究を実行した。
【０２３１】
CAGEのインビトロ経口生体適合性評価
この研究では、96ウェルプレートで増殖させたCaco-2細胞を利用した。CAGEをDMEMで希釈して25〜3.125 mMの範囲の濃度にした。CAGE希釈液の3つの異なる組を作製した（3つの希釈複製物）。培地を各ウェルから吸引し、各希釈液を6ウェルへ分配した（ウェルあたり100 uL）（6細胞複製物）。対照ウェルは培地だけで満たした。細胞を37℃、5％ CO2で12、24、または48時間インキュベートした。各時点でCAGE-培地混合物をウェルから吸引し、MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用して細胞生存率を評価した。MTT粉末（ThermoFisher Scientific、Waltham、MA）を培地と混合して0.5 mg/mLの濃度にし、各ウェル（100 uL）に添加して、37℃、5％ CO2で4時間インキュベートした。MTT溶液を除去し、100 uLのジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）を各ウェルに添加した。プレートをホイルで包んで20分間振盪し、次にマイクロプレートリーダー（M220 Infinite Pro、Tecan Group Ltd、Morrisville、NY）を使用して570 nmで吸光度を読み取った。未処理細胞の生存率の値を使用して、吸光度の読み取り値を正規化した。
【０２３２】
FITC-インスリン輸送アッセイ
実験を開始する前に、頂端側（200μl）および基底外側（600μl）の両方において、トランスウェル中の既存の培地を、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに置き換え、細胞を30分間インキュベートした。その後、頂端側の培地を、10 mM CAGEを含ませてまたは含ませずに調製し、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに可溶化した200μlの500μg/ml FITC-インスリンに置き換えた。頂端側にFITC-インスリンを添加した直後に、100μlのアリコートを基底外側から取り除き、等量の新鮮なDMEMに置き換えた。これを1、2、3、4、および5時間の時点で繰り返した。研究の間、トランスウェルプレートを37℃、5％ CO2のインキュベーターの内部で100 rpmで回転している振盪機の上に配置し、前述の期間にだけ取り出してアリコートを除去した。研究の最後の5時間の時点の後に、プレートリーダー（Tecan、Infinite M1000、Mannedorf、Switzerland）を使用して、495／520 nmの励起／発光波長でアリコートのFITC-インスリン濃度を測定し、時間に対するFITC-インスリン輸送の％としてプロットした。さらに、トランスウェルからアリコートを取り除いたすべての時点でTEERを測定し、時間に対する初期値からの％変化としてプロットした。
【０２３３】
Caco-2細胞によるFITC-インスリン取り込みの定性分析のために、FITC-インスリン輸送研究からのトランスウェルを研究の最後にPBSで2回洗浄し、続いて100μlの4％ パラホルムアルデヒドを添加し、4℃に一晩保った。翌日、ウェルからパラホルムアルデヒドを吸引し、膜をPBSで2回洗浄し、トランスウェル膜を切り出した。次に、これらの膜をスライドグラス上に静かに配置し、そこに4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩（DAPI）を含む封入剤（Vectashield（商標） Hardset、Vector Laboratories、Burlingame、CA）を添加し、次に膜をスライドグラスで覆った。Olympus Fluoview 1000（商標）スペクトル共焦点機器を60倍の倍率で使用して膜の共焦点イメージングを撮影した。
【０２３４】
空腸内投与の際のインスリン-CAGEの有効性および薬物動態パラメーターの査定
インスリン-CAGEの空腸内投与の有効性を、一晩絶食させたが水の自由な利用を与えた非糖尿病のWistar成雄ラットにおいて決定した。研究を開始する前にラットを麻酔し、腹部の毛を刈り取り、70％ エタノールおよびベタジンを使用してその領域の手術の準備をした。腹部に切開を加え、腸を露出させた。空腸の位置を特定し、CAGEに分散させた3もしくは5 U/kg インスリンのいずれかを100μl、または対照（生理食塩水中の3 U/kg インスリン、CAGEのみ、および生理食塩水）を100μl注射した。3匹のラットだけで試験した生理食塩水を除いて、各製剤は6匹のラットで試験した。その後、腸の区域を腹部へ戻し、筋肉および皮膚を縫合した。最初および研究の最後の5時間の時点まで0.5時間ごとに、市販のグルコースメーターを使用して血中グルコースを決定した。動物は研究全体を通して麻酔されたままであり、その最後に安楽死させ、もしあれば毒性を決定するためのさらなる組織学的検査のために注射部位の周りの腸の区域を除去した。有効性を比較するために、3匹のラットからなる別の群に、生理食塩水中の2 U/kg インスリンを皮下注射した。時間に対するt＝0での最初の読み取り値に関する血糖値の％変化として結果をプロットした。
【０２３５】
5 U/kgのインスリン-CAGEを空腸内に、3 U/kgのインスリン-生理食塩水を空腸内に、および2 U/kgのインスリン-生理食塩水を皮下に注射されたラットから0、1、2、3、および5時間の時点でおよそ250μLの血液をBD Vacutainer（登録商標）レッドトップチューブに収集することにより、CAGEを通じて送達されるインスリンの薬物動態を査定した。標準的なプロトコールに従って全血から血清を分離した。手短に言えば、血液試料をRTで15〜30分間静置して血栓を形成させ、続いて2,000 gで10分間遠心分離した。次に、透明な上澄み（血清）を清潔なチューブに収集し、手順の間は氷中に、その後インスリン含量をさらに解析するまで−20℃で保存した。血清試料中のインスリン濃度を査定するために、ヒトインスリンELISAキット（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA）を使用し、製造業者のプロトコールに従って各時点でのインスリン濃度を決定した。時間に対する血清インスリン濃度のプロットから消失速度定数（Kel）、排出半減期（t1/2）、濃度曲線下面積（AUC）、および％経口バイオアベイラビリティ（F）などの薬物動態パラメーターを計算した。
【０２３６】
インビボでの経口有効性
経口経路を通じて投与されたインスリン-CAGEの有効性を決定するために、80μlのCAGEを収容できる細長いサイズ9のカプセル（Torpac、Fairfield、NJ）を使用した。これらのカプセルに、80μlの10 U/kg インスリン-CAGE、CAGEのみ、または空のままのいずれかを充填した。これに続いて、胃の酸性環境でのカプセルの分解を予防し、カプセル化されたCAGEの腸部位特異的送達を提供するために、イソプロパノールに溶解した12.5％ w/v Eudragit（登録商標）L-100でカプセルを3回腸溶性コーティングした。経口有効性の研究のために、非糖尿病のWistar成雄ラットを一晩絶食させたが水の自由な利用を与えた。翌日、経口経管栄養を用いてカプセルをラットに投与し、続いて胃内容排出を促進するために5 mg/kgの塩酸メトクロプラミドを皮下投与した。その後、市販のグルコースメーターを使用して血中グルコースを測定し、引き続いて1時間ごとに12時間まで測定した。研究期間の全体を通してラットを絶食させた。生理食塩水中の10 U/kg インスリンという対照も、製剤を溶液として（カプセル中ではなく）経口投与することで試験した。さらに、皮下注射した2 U/kg インスリン-生理食塩水の有効性も査定した。10 U/kg インスリン-CAGEおよびCAGEのみについては製剤あたり6匹のラット群を使用したが、空のカプセル、10 U/kg インスリン溶液、および皮下注射した2 U/kg インスリン-生理食塩水の有効性を研究するためには群あたり3匹のラットを利用した。時間に対する血糖値の変化率として結果をプロットした。
【０２３７】
組織の組織学
組織を10％ 緩衝ホルマリンで固定し、エタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。腸組織の5ミクロン断面を脱パラフィンし、再水和させ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。光学顕微鏡を10倍および40倍の倍率で使用して組織学的形態を検査した（Olympus BX60（商標）正立複式顕微鏡）。
【０２３８】
CAGE中のインスリン安定性の評価
ヒトインスリンを含む試料（100 U、3.5 mg、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）を2 mLマイクロ遠心チューブ内の1 mLのCAGEまたはPBSのいずれかに懸濁し、室温（25℃）または冷蔵下（4℃）でインキュベートした。1か月後およびその後だいたい毎月、合計4か月間にわたって試料を10000×gで10分間遠心分離し、ピペットを介してCAGEを除去し、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で柔らかいインスリンペレットを洗浄し、再び遠心分離した。PBS-CAGEを除去し、遠心分離の間にインスリンがペレットを形成しなくなるまで洗浄／遠心分離の工程を繰り返した。
【０２３９】
円偏光二色性（CD）研究：
タンパク質の二次構造を示す遠UV領域（190〜250 nm）のスペクトルを収集するために、400 uLの試料を搭載した長方形の石英セル（経路長1 mm、Starna Cells、1-Q-q、Atascadero、CA）を用いて円偏光二色性分光光度法（Jasco J-1500、Easton、MD）を実行した。
【０２４０】
インビボでの生物学的有効性評価：
こうして得られたインスリンを非糖尿病のWistar成雄ラットに1 U/kgの用量で皮下注射することにより、CAGEから単離されたインスリンの生物活性を査定した。市販のグルコースメーターを使用して血糖値を8時間モニターし、新たに調製されたインスリン溶液と比較した。すべての動物実験は、University of California Santa Barbaraの動物福祉委員会のガイドライン（animal care committee guidelines）およびNational Research Councilの実験動物資源研究所の動物の管理と使用に関するガイド（Guide for the Care and Use of Animals of the Institute of Laboratory Animal Resources）に従って実行した。インスリン注射の前にラットを一晩絶食させたが水の自由な利用を与え、食物消費が原因の血中グルコースの変動を排除するために、研究全体を通して絶食を継続した。時間に対する初期レベルと比較した血中グルコースの％変化として結果をプロットした。
【０２４１】
データ解析
すべてのデータは平均±標準誤差（S.E.）として表示される。統計解析のために、スチューデントT-検定を利用した。p＜0.05で有意差とみなした。すべての実験は少なくとも三重に行った。
【０２４２】
参考文献
2021503468.tif 000007
2021503468.tif 000008
2021503468.tif 000009
2021503468.tif 000010
【０２４３】
実施例2：組織への送達のためのイオン液体
疎水性薬物の可溶化は、昔から薬物送達における主要なハードルである。化学療法薬物を含む多くの小分子は、非常に疎水的な性質であり、可溶化のために複雑な戦略を必要とする。本発明は、この目的のためのイオン液体の使用を説明する。この開示の別の目的は、注射部位から組織への薬物の分散を増強するためのイオン液体の使用を実証することである。この開示の別の目的は、皮下または皮内空間への送達後の薬物のバイオアベイラビリティを増強するためのイオン液体の使用を実証することである。
【０２４４】
深共晶溶媒（DES）およびイオン液体（IL）は、薬物の送達を増強し得るとともにバイオフィルム形成細菌を破壊／中和する役目を果たし得る。さらに、エタノールなどの従来型の化学的浸透促進剤と比較して、本明細書に記載される組成物は細胞に対してより低い毒性を示し、それにより多くの化学的促進剤に特徴的な組織刺激の問題を和らげた。DESは化合物の混合物であり、個々の成分よりも集合的により低い凍結温度を有する一方で、ILは有機陽イオンおよび有機／無機陰イオンからなる塩で、室温で安定かつ液体形態である。本明細書で提供される実証の前には、CAGEを含むイオン液体の、非経口投与のための疎水性薬物および生物学的製剤を可溶化する能力ならびに薬物の分散および吸収を増強するためのその使用は究明されていなかった。
【０２４５】
方法
CAGEの調製
コリンゲラネート深共晶を合成した。手短に言えば、2当量のゲラン酸のみ（50.0 g、0.297モル、Sigma Aldrich、St. Louis、MO）を500 mL丸底フラスコ内で、アセトン中において−70℃で5回再結晶させ、1当量の重炭酸コリン（80％ wt溶液、30.7 g、0.297モル、Sigma Aldrich、St. Louis、MO）に添加した。CO2の放出が止まるまで混合物を室温で攪拌した。60℃で2時間の回転蒸発および真空オーブンにおいて60℃で96時間の乾燥により残存H2Oを除去した。25℃における物理的特徴評価は公表値と良好に一致しており、以下のとおりである：密度、0.989±0.00l g/mL；および導電率、0.0427±0.0005 mS/cm。NMRスペクトルが提供される。NMRの割り当ても公表された割り当てと良好に一致し、以下に含まれる：
2021503468.tif 000011
【０２４６】
物理的特徴評価
最終生成物の同一性を検証するために、NMR分光法を実行した。DMSO-d6中で約50 mMの試料濃度を使用して、600-MHz Varian機器上で1Hおよび13C NMRスペクトルを収集した。1Hスペクトルは、パルス間の2秒間の緩和遅延で128スキャンにわたって平均化した。13Cスペクトルは、パルス間の2秒間の緩和遅延で512スキャンにわたって平均化した。1 mLメスフラスコおよび分析天秤を使用して密度を3回測定した。導電率は、KCl標準溶液で較正されたフロータイプの導電率電極（Horiba、Kyoto、Japan）を備えたDS-71導電率計（Horiba、Kyoto、Japan）で測定した。0.25 mLの試料を使用して、試料ごとに導電率を25℃で3回測定した。
【０２４７】
インビボ実験
正常ラットにおいて、CAGEからのインスリン送達の有効性を評価した。実験日の前に、動物を一晩絶食させたが水の自由な利用を与えた。投与前にインスリンをCAGEに懸濁した。動物を麻酔し、インスリン-CAGEを皮下注射した。対照実験のために、CAGE単独またはインスリン-生理食塩水を注射した。市販の血中グルコースメーターを使用して、異なる時間間隔で尾静脈からの血糖値を測定した。
【０２４８】
インビトロ細胞培養実験
カルセイン-AM細胞生存率アッセイ（Life Technologies）を使用して、薬物搭載リポソームのインビトロ抗がん有効性を決定した。4T1細胞を96ウェル細胞培養プレートに、総量100μLの培地にウェルあたり11,000細胞またはウェルあたり1,000細胞の密度で播種し、一晩接着させた。次に、リポソームを含む新鮮な培地に培地を置き換え、4T1細胞とともにそれぞれ48時間インキュベートした。薬物とインキュベートした後、培地を吸引し、PBS中の1μM カルセイン-AMに室温で30分間置き換えた。細胞内で加水分解されたカルセイン-AMの蛍光強度を、490 nmおよび520 nmの励起および発光波長を使用して測定した。未処理細胞の蛍光から実験ウェル中の生細胞の蛍光を差し引いて、未処理細胞に対して正規化することで分数細胞阻害（fractional cell inhibition）を計算した。
【０２４９】
組織における分子の展開に対するCAGEの効果
注射した点から組織内への分子の分布を増強するのにCAGEを使用できるかを決定するために実験を実行した。これらの実験は、モデル組織として皮膚を使用して行った。この目的のために、1 mg/mlの標識（FITCまたはAntoniaRed）した150 kDaのデキストランを、1：1 CAGEのみ、50％ CAGE（生理食塩水で希釈）、10％ CAGE（生理食塩水で希釈）、または生理食塩水のいずれかに懸濁した。5 cm×5 cmの正方形のブタ皮膚の片側に50 ulの各試料を皮内注射した。2種類に異なって標識された同じCAGE濃度の試料を同じ正方形へ注射した。試料をRTで2時間（本発明者らがトレーニングを受けている間）インキュベートし、次に撮像した。試料を37℃でさらに2時間インキュベートし、再度撮像した。2時間の試料は異なる露出であった（本発明者らは、まだシステムを学習していた）。4時間の試料はすべて同じ露出で撮影した。各試料および時点について、ImageJ（商標）を使用して領域の周りに手動で輪郭を描くことにより蛍光領域の大きさを推定した。
【０２５０】
結果
溶解度：
2つの疎水性薬物、パクリタキセルおよびカンプトテシンのCAGE中の溶解度を決定した。両薬物は実際に水に不溶性であり、可溶化戦略または薬物化学の改変を必要とする。例えば、水中でのパクリタキセルの溶解性の欠落は、現在外来診療所で使用されているクレモホールという溶媒の使用につながった。しかしながら、クレモホールは毒性の問題に悩まされている。一方、カンプトテシンは、溶媒の欠落が原因で臨床的に使用されておらず、代替となる化学形態であるイリノテカンが臨床的に使用されている。両薬物を可溶化するCAGEの能力は、代替物に対して明らかな利点をもたらす。
パクリタキセル：200 ＋／− 48 mg/ml
カンプトテシン：54 mg/ml
【０２５１】
疎水性薬物を可溶化するCAGEのこの能力は、例えばエストラジオール、テストステロン、イミキモド、コルチコステロン、パクリタキセル、ドキソルビシン、シスプラチン、カンプトテシンなどの様々な薬物に使用できる。これらの疎水性薬物は現在、多くの適用、特に注射に基づく送達システムに使用できないエタノールまたはDMSOなどの溶媒を含む複雑な戦略を必要とする。あるいは、ミセルに薬物を可溶化する戦略が開発されてきた。ミセルの使用は可溶化には有用であるが、薬物特性形態が「小分子」からコロイドに実質的に変化する。この変質は、治療結果を著しく変化させる。CAGE中の薬物の可溶化は、この限定に直接的に対処できる。CAGEはいくつかの可能な方法で使用できる。1つの方法では、可溶化された薬物は、経口または経皮適用などの局所適用のために製剤化できる。この適用におけるCAGEの第一の寄与は、障壁を横切る薬物拡散のための高濃度勾配を提供するために、製剤内に可溶化した薬物を留めておくことである。別の適用において、CAGE中の薬物溶液は皮内、皮下、または静脈内に注射できる。このような製剤において、CAGEは薬物を可溶化する役目を果たすため、高濃度の注射を可能にする。1つの態様において、注射の際にCAGEは組織中へ拡散することができるため、薬物の局所的沈殿を可能にする。沈殿した薬物はデポーを形成し、徐放性を呈することができる。別の態様において、薬物はCAGEの局所拡散後であってすら、CAGEに可溶性のままであり続けてよく、循環への迅速かつ増強された送達へとつながってもよい。
【０２５２】
CAGEに溶解された化学療法薬物のインビトロ有効性：
CAGE中に可溶化されたカンプトテシンおよびパクリタキセルの4T1がん細胞に対する効果を試験した。DMSO中に溶解された同じ薬物という陽性対照を使用した。DMSOはインビトロ研究で使用される溶媒ではあるが、臨床的に許容される代替物ではないことを注記する。
【０２５３】
ここで説明される態様は、複数の方法で使用できる。1つの形態において、化学療法薬物はCAGEに可溶化され、腫瘍中へ直接的に送達される。可溶化された化学療法薬物は腫瘍中へ拡散してよいため、治療効果を可能にする。CAGE自体も高濃度で細胞傷害性効果を有することを注記する。1つの態様において、CAGEを腫瘍中へ直接的に注射して局所的細胞傷害性効果を達成することができる。このような治療は、肝臓、膵臓、または乳房中の腫瘍などの固形腫瘍の治療に使用できる。1つの態様において、CAGEを脂肪組織中へ直接的に注射して溶解を促進することができる。CAGEは、溶解により脂肪細胞を直接的に溶解するか、またはマクロファージ／免疫細胞媒介クリアランスを促進するのに十分な破壊を誘導するかのいずれかが可能である。
【０２５４】
CAGEからのインスリン送達のインビボ有効性：
CAGEから送達されたインスリンは、生物活性が非常に高かった。CAGE中のインスリンの単純な懸濁液を皮下注射した。この製剤は、生理食塩水中のインスリン溶液よりも優れた実質的な低血糖をもたらした（図12）。
【０２５５】
図12に記載される態様は、複数の方法で使用できる。1つの形態において、CAGEは生物学的製剤の循環への吸収を増強させるのに使用できる。抗体などの大きい生物学的製剤は、皮下空間へ注射した後、体循環への吸収が制限される。CAGEを添加することにより、そのバイオアベイラビリティを増強できる。別の態様において、CAGEは注射された薬物の薬物動態を変化させるのに使用できる。例えば、皮下注射部位から急速に吸収されるインスリンは、CAGEの添加により持続的な吸収を呈するようにさせることができる（図12）。
【０２５６】
生体分子の安定化：
CAGEにおけるインスリンの安定性を評価した。インスリンをCAGEに懸濁し、室温または4℃で放置した。1か月または2か月後、インスリンを皮下注射し、その生物活性を血糖応答に基づいて評価した（図13）。室温で保存されたインスリン-CAGEの生物活性は2か月後の天然インスリンに匹敵したため、生体分子の安定化に対するCAGEの効果が実証された。
【０２５７】
CAGEによる生体分子の安定化は、ワクチンの分解を守るために使用できる。ワクチンは通常、水性製剤で製剤化され、活性を維持するには冷蔵が必要である。この低温流通体系の要件が、世界の遠隔地にワクチンを送達するのを困難にする。CAGEは、室温でワクチンの活性を守るのに使用できる。
【０２５８】
組織内の分散の増強：
AntoniaRedで標識したすべてのデキストラン試料は、2時間時点と4時間時点との間で中程度に展開するように見えた。FTICで標識したデキストラン試料は、面積が約2倍に増加したCAGEのみの試料を除いて、2時間と4時間との間では展開するように見えなかった。（例えば、図14を参照）
【０２５９】
この態様は、複数の方法で使用できる。1つの形態において、CAGEは腫瘍またはいぼなどの局所病状の治療のために、注射後に組織中へのそれ自体の分布を増強させるために使用できる。CAGEの局所組織に対する効果は、化学療法剤などの可溶化された薬物の分布を増強させるためにも使用できる。
【０２６０】
本明細書で使用される「イオン液体」という用語は、室温で液体状態にある有機塩または有機塩の混合物を指す。この部類の溶媒は、工業処理、触媒作用、医薬、および電気化学を含む様々な分野で有用であることが示されている。イオン液体は、少なくとも1つの陰イオン成分および少なくとも1つの陽イオン成分を含む。任意で、ILは追加の水素結合供与体（すなわち、-OHまたは-NH基を提供できる任意の分子）を含み、例としてアルコール、脂肪酸、およびアミンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、陽イオン成分または陰イオン成分も薬物である。
【０２６１】
ILの挙動はイオン相互作用によって支配されているが、深共晶溶媒（DES）は水素結合からの強い寄与を呈する。主に現在の定義の限定が原因で、イオン種および中性種を含むシステムの分類は複雑である。この点に関して、組成物、イオン液体、および深共晶溶媒について本明細書で提供される定義および説明は、当分野において他者により適用されるかもしれないため、専門用語を制御するものである。
【０２６２】
少なくとも1つの陰イオン成分および少なくとも1つの陽イオン成分は、任意のモル比で存在してよい。例示的なモル比（陽イオン：陰イオン）には1：1、1：2、2：1、1：3、3：1、2：3、3：2、およびこれらの比率の間の範囲が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ILは深共晶溶媒（DES）である。DESは特別な特性を有するイオン性溶媒の一種で、個々の成分のいずれよりもはるかに低い融点を有する共晶を形成する混合物で構成される。例示的なDESにはオレイン酸コリン、ヘキサン酸コリン、ゲラン酸コリン、マロン酸コリン（コリンマロン酸二ナトリウム）、および尿素-コリンが含まれるが、これらに限定されない。これらにおいては、イオンが1：1で対になるのを過剰なカルボン酸塩が妨げるため、製剤はDESであり、真のイオン液体ではない。IL／DESの調製に使用されるイオンは、コリンまたはジェネリック酸（generic acid）以外の分子を含み得る。例えば、コリンの誘導体または類似体を陽イオンとして使用できる。同時に、類似体または誘導体またはゲラン酸も陰イオンとして使用できる。
【０２６３】
送達される薬物は、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、または他の任意の治療効果がある分子を含んでよい。
【０２６４】
実施例3：経口インスリン送達のためのイオン液体
世界中の糖尿病症例の上昇および注射可能なインスリンを用いた血糖管理に対する患者の順守の欠落に伴い、効率的な経口インスリン製剤の開発が緊急に必要とされている。しかしながら、胃腸管は生物学的製剤の経口送達に対する厄介な障壁をもたらす。本明細書に記載されるのは、コリンおよびゲラネート（CAGE）イオン液体を使用した非常に効果がある経口インスリン製剤の開発である。CAGEはインスリンの傍細胞輸送を有意に増強し、それを酵素分解から保護し、粘液層と相互作用することでそれを薄くするという結果になった。インビボにおいて、ラットにおける空腸投与の後、インスリン-CAGEは並外れた薬物動態および薬力学の結果を示した。低用量のインスリン（3〜10 U/kg）は、皮下注射されたインスリンと異なり、より長期間（最大12時間）持続する血糖値の有意な減少をもたらした。10 U/kgのインスリン-CAGEが経口経管栄養を用いて腸溶性コーティングカプセルで経口送達された場合、最大45％の血中グルコースの持続的な減少が観察された。製剤は高い生体適合性を呈し、室温で2か月間および冷蔵下で少なくとも4か月間安定であった。まとめると、結果は、注射物質として現在販売されているインスリンおよび他の生物学的製剤の経口送達について、CAGEが有望な経口送達媒体であることを示している。
【０２６５】
インスリンは現在、注射可能な製剤として利用可能であるが、経口製品は患者のより高いコンプライアンスを享受し、世界中の糖尿病患者の生活の質を著しく改善するであろう。しかしながら、インスリンなどのタンパク質の経口送達は、高分子の経口吸収に対する様々な胃腸障壁が原因で難易度が高い。本明細書に記載されるのは、胃腸障壁を効率的に避けることで経口インスリン吸収を有意に増強する、安全で非常に効果があるイオン液体に基づく経口インスリン製剤の開発である。その上、製剤は室温および冷蔵下で良好な安定性を示した。
【０２６６】
薬物投与の経口経路は、その投与の簡単さ、高い患者コンプライアンス、および低い製造コストが原因で、注射よりも好まれる。しかしながら、薬物吸収に対する様々な胃腸障壁が原因で、生物学的製剤の送達には不適切である。例えば、インスリンは1型糖尿病の管理に不可欠な薬剤である。現在は皮下注射として投与されているが、注射に関連する痛みおよび針恐怖症が原因で患者の順守の欠落と関連している（1）。経口送達されるインスリンは患者のコンプライアンスを著しく増強することができる。さらに、膵臓インスリンの生理学的経路を綿密に模倣する（2、3）。経口／膵臓インスリンは肝臓に門脈を介して輸送され、そこで80％が保持され、残りは体循環に到達し、体循環と比較して門脈中の最大3倍高いインスリン濃度を作り出す（3）。インスリンが皮下注射された場合、門脈中のインスリン濃度（約20％のみ）と比較してより高い全身インスリン濃度が原因で、この門脈-末梢インスリン勾配が破壊され、グリコーゲン貯蔵とグルコース出力との間の肝臓の微妙なバランスが破壊される。これはしばしば高血糖症という結果になり、これをより高いインスリン用量で治療した場合、低血糖症につながり得る（3、4）。
【０２６７】
経口インスリン製品の追求は何十年も前に始まった。生物学的製剤の経口吸収に対する胃腸障壁を克服するためにいくつかの戦略が開発された。しかしながら、すべての臨床的ハードルを乗り越えるのに成功した製剤はなく、したがって現在市販されている経口インスリン製品は存在しない。第II相臨床試験が完了したか、または現在第II相臨床試験中の製品には、経口インスリン取り込みを改善するための添加物を含む腸溶性コーティングカプセル（Diabetology LtdによるCapsulin（商標）およびOramed LtdによるORMD-0801）、肝指向リポソームインスリン（hepatic directed liposomal insulin；Diasome Pharmaceuticals Inc.によるHDV-Insulin）、ポリエチレングリコール（PEG）とコンジュゲートしたインスリン（Biocon Ltd.によるIN-105）、Oshadi担体中のインスリン-プロインスリン-c-ペプチド（Oshadi drug administration LtdによるOshadli Icp）、および胃腸管吸収促進技術（Novo NordiskによるGIPET 1）を使用した長時間作用型インスリン類似体錠剤が含まれる（5〜7）。さらに、多くの製品は、多段階の製剤化手順、様々な添加物、またはタンパク質の化学修飾を必要とし、それらはそれら自体の欠点を有する。世界的な糖尿病の蔓延が新たに出現したのに伴い、安全で効果があり、かつ簡単に拡張可能な経口インスリン製品の開発に切迫感がある。
【０２６８】
本明細書に記載されるのは、インスリンのイオン液体（IL）に基づく経口製剤ならびにその安全性、有効性、および長期安定性の実証である。イオン液体は、100℃未満の融点を有する有機／無機塩で構成されている（8〜10）。本明細書では、室温で安定なコリンおよびゲラネート（CAGE）の深共晶溶媒を利用した（11、12）。インスリンを単一段階の過程でCAGEに分散させ、インビトロおよびインビボの両方でその安全性および有効性を、ならびにその保存安定性を査定した。この研究は、優れた経口有効性、生体適合性、および長期安定性を有するインスリンの経口バイオアベイラビリティのかつてない改善を実証する。
【０２６９】
結果
インスリンはCAGE中で長期間にわたって安定であった
インスリンは、その受容体相互作用、およびしたがって生物活性に必須の固有のアルファヘリックスコンフォメーションを有する（13）。CAGEとともに経口送達の機能的試験を実行する前に、インスリンがCAGE中で長期間にわたって安定かどうかを評価した。インスリン-CAGEを室温（直射日光を避けて）または4℃の冷蔵下で保存し、円偏光二色性（CD）を使用して、CAGEから単離したインスリンの二次構造を4か月間の期間にわたって毎月査定した。結果は、およそ207および222 nmに二重の負の底値が存在したことを示し、これはCDグラフにおけるアルファヘリックスの典型的な表現である（図15）。新しく調製されたインスリン溶液と、RTまたは4℃でそれぞれ最大3か月間および4か月間CAGE中で保存されたインスリンとの間で、楕円率の形状または度合いに差は見られなかった。この結果は、CAGEが長期間にわたってインスリンの二次構造を守ることを示している。
【０２７０】
CD安定性データを検証するために、異なる時点でCAGEから単離されたインスリンの生物活性を、非糖尿病ラットで査定した。この目的のために、一晩絶食させたラットにインスリン（CAGEから単離し、滅菌生理食塩水に再懸濁した）を皮下注射し、血中グルコースを8時間の期間にわたってモニターした。新鮮なインスリンと、RTで1〜2か月間または4℃で1〜4か月間保存したインスリン-CAGEとの間では、生物活性に有意差は見られなかった（図10）。RTで3か月間保存されたインスリンについては、有効性の減衰が観察されたが、CAGEとともに4℃で保存されたインスリンは、4か月の保存後ですら生物活性のいかなる喪失も示さなかった。このことは、インスリンの長期保存についてCAGEが優れた溶媒であることを明らかに説明している。
【０２７１】
空腸内投与の際に、インスリン-CAGEは著明な低血糖を引き起こし、例示的な薬物動態を示した
インスリン-CAGEの血糖値を低下させる有効性を計測するために、3〜5 U/kgのインスリンをCAGE中に分散させ、麻酔した非糖尿病ラットの空腸内に投与し、続いて合計5時間にわたって0.5時間ごとに血中グルコースをモニターした（図16）。3 U/kgのインスリン-CAGEを投与したラットは、0.5時間から血糖値の着実な降下を示し、2.5時間で初期値の45％降下した（55±6％）。この時点を超えると、血糖値はプラトーに達し、5時間で47％に終わった。5 U/kgのインスリン-CAGEで処理した群は血糖値の急激な減少を示し、1.5および2時間以内に約65％の降下に至った（それぞれ37±5および35±5％）。その後血中グルコースは増加したが、これは血糖値の突然かつ急速な減少にさらされた非糖尿病ラットにおける通常の恒常性反応である。5時間の最後には、血糖値は初期レベルの74％であった。2 U/kgのインスリンを皮下注射したラットも類似した血中グルコース降下パターンを示したが、5 U/kgのインスリン-CAGEと比較してより低い程度であった。51％という最大の降下が1時間で観察され（初期レベルの49±8％）、研究の最後の5時間の時点では100％に急速に回復した（101±7％）。CAGEのみ、生理食塩水、または3 U/kgのインスリン-生理食塩水の空腸内投与などの対照は、血中グルコースの有意な降下をもたらさなかった。これらすべての対照群において、血中グルコースは5時間で初期レベルの約25％までゆっくりと（継続した絶食が原因である可能性が最も高い）減少した。インスリンの吸収および排出の薬物動態を、異なる時点での血清インスリンレベルを測定することにより決定した（図17）。インスリン濃度は、2 U/kg インスリンのSQ注射および5 U/kg インスリン-CAGEの空腸内（IJ）投与後1時間以内に急速に増加し、引き続いて降下し、排出は類似したパターンに従った。血清インスリン濃度を用いて計算された薬物動態パラメーターにより、空腸内投与されたインスリン-CAGEの排出半減期は、SQインスリンよりも概ね2倍高いことが示された（表2）。このように計算された5 U/kg IJインスリン-CAGEの経口バイオアベイラビリティは51％であることが見出された。有効性のプロットから計算された製剤の薬力学的バイオアベイラビリティは66％であった。逆に、IJ投与された5 U/kgのインスリン-生理食塩水は、時間とともにインスリンレベルのいかなる増加も示さなかった。
【０２７２】
（表２）空腸内与薬されたインスリン-CAGEおよび皮下投与されたインスリン溶液の薬物動態パラメーター
2021503468.tif 000012
＊消失速度定数（Kel）；半減期（t1/2）；濃度曲線下面積（AUC）；バイオアベイラビリティ（F）
【０２７３】
カプセルで経口投与されたインスリン-CAGEは、血糖値の低下において注目すべき有効性を示した
空腸内投与された際のインスリンの経口バイオアベイラビリティを増強するCAGEの顕著な有効性により、本発明者らは、カプセルを使用した経口送達の際のその有効性を調査しようと考えた。この目的のために、10 U/kgのインスリン-CAGEまたはその対照を、腸溶性コーティングされた細長いサイズ9のカプセル中に配置し、経口経管栄養を使用して非糖尿病ラットに投与した。
【０２７４】
10 U/kgのインスリン-CAGEで処理した群は、カプセル投与後2時間以内に血糖値の急速な38％の降下を示した（初期レベルの62±2％）（図18）。この時点を超えると、血中グルコースは10時間でおよそ45％ゆっくりとしかし着実に降下した（55±3％）。対照的に、2 U/kgのインスリンの皮下投与は、1時間で血糖値の急速な49％降下につながり（51±5％）、これは着実に上昇し、引き続いて4時間で初期値の88％のピークに達した。その後、血糖値はCAGEのみ、空のカプセル、およびインスリン-生理食塩水の製剤対照と類似したパターンで降下した。IJ投与で以前に観察されたように、カプセル中のインスリン-CAGEは、SQインスリンと異なり、研究の最後まで有意に持続した有効性を示した。
【０２７５】
CAGEがただ1つで透過促進剤として作用するかどうかを評価するために、本発明者らが投与したラットにカプセル中のCAGEのみを投与し、続いて0.5時間の遅延後に、カプセル中の10 U/kgのインスリン粉末を投与した（図20）。研究の最初の数時間に、インスリン-CAGEの同時投与と連続投与との間で有効性に有意差が観察されたが（図20と図18を比較されたい）、すべての時点を通じて、インスリン溶液（CAGEなし）とインスリンおよびCAGEの連続投与との間に有意差は観察されなかった（図20）。この研究は、インスリンおよびCAGEを一緒に投与すると有意な有効性がもたらされることをさらに示している。
【０２７６】
CAGEはインビボで良好な経口生体適合性を示した
空腸投与の5時間後、経口カプセル投与の12時間後、または1日1回の反復投与の7日後に収集された小腸試料の組織学的検査は、CAGEと生理食塩水処理動物／インスリン処理動物との間で形態に顕著な差を示さなかった（図19）。さらに、小腸組織に著しい構造的損傷は指摘されなかった。特に、すべての組織に指状の絨毛が見出された。結果は、CAGEの腸組織との優れた生体適合性を明らかに見せ、それにより、製剤の経口投与への適合性を検証する。
【０２７７】
考察
過去数十年間にわたって、糖尿病の有病率があまりに着実に成長したため、現在では「世紀の蔓延」と称されている（14）。糖尿病症例の上昇はすべての国で報告されており、低中所得国で最も急速に成長し、中東および北アフリカ地域で最大の有病率である（14〜16）。最近の世界保健機関の報告によると、糖尿病は2012年に全世界で150万人の死亡の原因であり、高血糖症関連の併存疾患が原因でさらに320万人が死亡した（16）。米国では、2015年に3030万人（人口の約9.4％）がこの疾患に悩まされていると報告され、毎年150万の新しい症例が診断される（17）。この疾患の管理についての現在の提案には、単独またはメトホルミンなどの経口血糖降下薬と組み合わせたインスリン療法が含まれる（18）。インスリン療法を単独で受けている個体は、しばしば1日2回の中等度作用型インスリンまたは1日1回の長時間作用型インスリンのいずれかの投与を必要とする（18）。インスリンは、外来診療所で経口丸薬として利用可能ではなく、専ら皮下注射として投与される。しかしながら、高血糖症の管理ならびに神経障害、腎症、および網膜症のリスクを和らげるその効き目にもかかわらず、注射可能なインスリンは、疼痛、日常活動への干渉、およびきまりの悪さが原因で患者のコンプライアンスがより低く、60％もの患者における意図的な怠慢および長期的な血糖制御不良という結果になる（5、19）。これは、ヘモグロビンA1Cレベルの上昇、および糖尿病関連合併症が原因となる入院の増加へとつながる（19）。この問題を避けるために、MannKind Corporationは、食後血糖管理のための吸入可能な速効型インスリン製剤Afrezza（登録商標）を開発したが、肺がんおよび糖尿病性ケトアシドーシスのより高い発生率、肺機能の減少、ならびに慢性肺疾患患者における急性気管支痙攣のより高い発症リスクなどの肺リスクと関連している（20）。糖尿病の急速な成長および規模を考えると、患者に訴求し、製剤に基づく不利益な影響を回避するインスリン療法を開発することが必要不可欠である。
【０２７８】
経口送達は患者の高いコンプライアンスを享受するが、生物学的製剤の送達には適切でない。これは、経口送達された薬物が、タンパク質／ペプチド薬物を分解できる胃の酸性環境を横断する必要があるという事実が原因である。これは、腸溶性または他の保護コーティングされたシステムでそれらをカプセル化することにより回避できる。しかしながら、それらの保護用ケーシングから腸内で放出される際に、ペプチド／タンパク質薬物は腸のタンパク質分解環境に投げ込まれ、常駐酵素によってより小さいアミノ酸単位へと簡単に切断される。ある割合の薬物がタンパク質分解から逃れても、腸の粘液層および腸細胞を通じて無傷の分子として体循環へと吸収されるのは難易度が高い。不安定なGI通過時間および腸における特定のインスリン取り込み機構の欠落が原因で、経口インスリン吸収はさらに邪魔される（21）。GI通過の間のインスリン構造の乱れは、著しい変性および生物活性の喪失につながるかもしれない。したがって、当然のことながら、タンパク質およびペプチド薬物は1％未満とごくわずかな経口バイオアベイラビリティしか有さず、用量の100％が薬理学的活性に利用可能な注射可能な製剤とははっきりと相違している（22）。何人かの研究者は、インスリン分子を修飾し、それを新規担体にカプセル化し、または腸溶性コーティング、吸収促進剤、もしくはタンパク質分解阻害剤を使用して、インスリンの低い経口バイオアベイラビリティという多年にわたる問題を解決しようとした。いくつかの例には、経口インスリン送達のためのポリ[乳酸-コ-グリコール酸]（PLGA）またはキトサンに基づくナノ粒子の使用が含まれる。Panらは、PLGAナノ粒子に搭載された10 U/kg インスリンを使用して10.3％の、およびキトサンナノ粒子中の21 U/kg インスリンを使用して15.3％の薬理学的バイオアベイラビリティを得たが、Cuiと同僚は、PLGAおよびPLGA-55ナノ粒子に配置された20 U/kg インスリンを使用して、それぞれ3.7および6.3％の経口バイオアベイラビリティを得た（23〜25）。Sarmentoと仕事仲間は、キトサン-デキストランナノ粒子を使用してインスリンをカプセル化し、粒子中にそれぞれ50および100 U/kgのインスリンを配置した後、5.6および3.4％の薬理学的バイオアベイラビリティを観察した（26）。アルギネート-キトサンナノ粒子は、50および100 U/kgのインスリン用量について、インスリンの経口バイオアベイラビリティをそれぞれ6.8および3.4％に改善した（27）。Zhangと同僚は、50 U/kgのインスリンを固体脂質ナノ粒子（SLN）および小麦胚芽凝集素で修飾されたSLNにカプセル化し、それぞれ4.5および6.1％の薬理学的バイオアベイラビリティを得た（28）。同じように、Ansariらは、経口投与されたインスリン溶液と比較して、SLNを使用したインスリンの経口バイオアベイラビリティが5倍に増強されたことを報告した（8.3％対1.7％）（29）。インスリンの高い経口バイオアベイラビリティ（37.6％）は、生分解性ポリイソブチルシアノアクリレートナノスフェア中でインスリンを経口送達することにより達成されたが、75 U/kgという高用量が使用された（30）。タンパク質の経口送達を改善する他の戦略は、グリココール酸ナトリウム、アプロチニン、大豆トリプシン阻害剤、バシトラシン、およびメシル酸カモスタットなどのタンパク質分解酵素阻害剤の使用を伴う（31）。トランスフェリンのような標的リガンドまたはTATペプチドのような細胞浸透性ペプチドを付着させるなどのインスリンの化学修飾は、腸細胞を横切るインスリンのトランスサイトーシスを手助けすることが示されている（32、33）。インスリンへのPEGの短鎖のコンジュゲーションを通じて得られたインスリン類似体IN-105は、溶解度、タンパク質分解に対する安定性、および腸管吸収の改善を通じて、2型糖尿病の患者において食後に血中グルコースを経口用量依存的に低減させることが実証されている（34、35）。吸収促進剤には、経細胞取り込みのための腸上皮の細胞膜構造の調節または傍細胞輸送のための密着結合透過性のいずれかによって機能する、胆汁酸塩、界面活性剤、脂肪酸、カルシウムイオンキレート剤、キトサン／チオール化キトサンなどの特定のポリマー、および閉鎖帯毒素が含まれる（31）。
【０２７９】
ILは、有機陽イオンおよび有機／無機陰イオンを有する一群の塩を構成し、通常100℃未満では液体である（36）。コリンおよびゲラン酸は、両方とも食品医薬品局（FDA）によってGRAS（一般に安全と見なされる（Generally Regarded as Safe））成分として認められている。レシチンの重要な構成要素であるコリンは植物および動物の両方に存在し、様々な生理学的機能に必要であり、3,400 mg/kgの経口致死量50％（LD50）を有する一方で、食品の香味料として広く使用されるゲラン酸は、ラットにおいて3,700 mg/kgの経口LD50を有する（43、44）。さらに、イオン液体の毒性の包括的な論評において、コリンは他の様々な陽イオン性頭部基の中で最も低い毒性を示すことが見出された（45）。本研究では、単回投与後の経口CAGE用量は80 mg（80μL）であり、これは約27 mgのコリンおよび53 mgのゲラン酸で構成されている。したがって、個々の構成要素の経口LD50よりはるかに低い用量が投与された。コリンの適当な摂取量は、1日あたり男性で550 mgおよび女性で425 mgとみなされている（46）。一方、ゲラン酸はよく見られる食品添加物であり、カルダモン、レモングラス、プチグレイン、およびその他の精油中に見出される（47）。
【０２８０】
CAGEは、1および5％ w/v濃度でムチンヒドロゲルの粘度を有意に減少させることが見出され（図21）、CAGEが高分子の経口取り込みにおける肝要な障壁であるインビボの粘液浸透を手助けすることが示された。
【０２８１】
インビボで、CAGEは空腸内またはカプセル中のいずれかで投与された場合、インスリンの経口取り込みの増強において卓越した有効性を示した。空腸内注射された3 U/kgのインスリン-CAGEは5時間で血糖値の47％の降下につながり、これは皮下注射された2 U/kgのインスリンで観察された降下に匹敵した。5 U/kgのインスリン-CAGEを使用すると、2時間で血糖値のさらにいっそう激烈な65％の降下が観察され、研究の残りの期間にわたって、皮下注射されたインスリンと比較して、レベルは有意に低いままであった。これは、そのような顕著な有効性を実証している文献で見出された最も低い経口インスリン用量の1つである。他の注目すべき作業の中で、Panと同僚は、PLGA粒子中の10 U/kg インスリンを経口投与した際に、4時間で血糖値が52％降下したことを実証した（24）。20 U/kgのインスリンを搭載した、ビタミンB12にコンジュゲートしたデキストランナノ粒子を使用して、Chalasaniらは血中グルコースの70〜75％の降下および29.4％の経口バイオアベイラビリティを得た（51）。イヌにおける胆汁酸塩混合ミセルを使用した10 U/kg インスリンの空腸内投与は、1.8％の絶対バイオアベイラビリティを呈した（52）。ラットにおいて、50 U/kgのインスリンを搭載した長方形の粘膜付着性パッチを空腸内に配置すると、3.9％の相対的バイオアベイラビリティにつながった。透過促進薬物であるジメチルパルミトイルアンモニオプロパンスルホナート（PPS）の存在下で、相対的バイオアベイラビリティは7.7％に増加した（53）。Yinと仕事仲間は、ラットにおいて、50 U/kgのインスリンをカプセル化したトリメチルキトサン-システインコンジュゲートナノ粒子の腸内注射により血糖値が70％減少したことを示した（54）。インスリンの経口吸収を改善するのにLabrasol（商標）を使用して、Takadaとグループは回腸内および結腸内投与について、それぞれ0.25および0.2％のバイオアベイラビリティを観察した（55）。200 IU/kgを含むレシチンに基づくマイクロエマルションの胃内送達は、正常ラットにおいて0.148（アプロチニンなし）および0.159（アプロチニンあり）のバイオアベイラビリティという結果になった（56）。
【０２８２】
本明細書において、インスリンの高い空腸バイオアベイラビリティが指摘された。インスリン-CAGEの排出半減期は、皮下注射されたインスリンの概ね2倍高かったことも指摘され、これはより持続的な有効性を示している。これまでに観察された有意な有効性を検証するために、腸溶性コーティングカプセル中にインスリン-CAGEをさらにカプセル化し、ラットに経口投与した。腸溶性コーティングは、胃の酸性環境におけるカプセルの崩壊を予防し、小腸のよりアルカリ性の環境でだけ、カプセル化された材料を放出する（57）。したがって、腸溶性コーティング技術を使用して胃を迂回することで、胃酸による生物学的製剤の分解が予防される。腸におけるインスリン-CAGEの放出の際の用量希釈を説明するために、IJ送達で使用されたものよりも高いインスリン用量（10 U/kg）を使用した。この場合も、インスリン-CAGEは皮下注射されたインスリンと比較して、類似した程度の血中グルコースの降下を産生した。ただし、SQインスリンと異なり、インスリン-CAGEの効き目は研究の最後の12時間の時点まで持続し、長時間作用型経口インスリン製剤への適合性が実証された。CAGEのみの投与に続いて0.5時間後にインスリンを投与しても、いかなる有意な血中グルコース低下の有効性という結果にもならなかった（図20）。このことは、有意なインビボ有効性を達成するためにはインスリンおよびCAGEの同時投与が必要であることを示している。
【０２８３】
高い有効性に加えて、CAGEは外来診療所における潜在的な適用のための生体適合性および長期安定性を呈した（図19）。インビボでの安全性を決定するために、単回用量投与後または1週間にわたって1日1回の反復用量投与後のいずれかにCAGEのみまたはインスリン-CAGEで処理されたラットの小腸切片を単離したところ、空腸内または経口投与後に形態学的レベルで毒性がなかったことが見出され、インビボにおけるCAGEの優れた経口忍容性が実証された。
【０２８４】
二次構造およびインビボ生物活性査定を通じて評価したところ、インスリン-CAGEはRTで2か月間および4℃で少なくとも4か月間安定していた（図15および10）。インスリンの物理化学的分解は、主として加水分解、凝集、および分子間変質反応が原因で生じ、効力の喪失につながる（60）。イオン液体は、タンパク質の水分子との相互作用を予防できる一方で、プロトン性イオン液体は、いくつかのアミノ酸およびインスリンの天然のコンフォメーションを安定化し、その自己凝集傾向を和らげることが報告されている（59、61）。理論に拘束されることは望まないが、CAGEのみとともにインスリンを保存することでタンパク質の水との相互作用が予防され、加水分解相互作用が和らげられ、そのアルファヘリックス二次構造が安定化されることが本明細書において企図される。インスリンの単量体型が生物活性型であることを考慮すると、CAGE中のインスリンの増強された経口生物活性は、インスリン分子が腸細胞および体循環に単量体として提示されることにも部分的に帰するかもしれない。
【０２８５】
概して、本明細書に記載されるのは、臨床使用について途方もない潜在力を有する非常に効果のある経口インスリン製剤の開発である。インスリン-CAGEは単一段階の過程で苦もなく調製できるため、工業生産のために簡単に規模拡大できる。この製品はインスリン構造の修飾または複雑なナノ構造の開発を必要としないため、多段階製剤化開発の間の、修飾されたタンパク質に対する免疫反応の生成または有効成分の喪失を妨げることができる。さらに、これはインスリンおよびGRAS成分でできたイオン液体だけで構成される単純かつ頑丈な製剤で、有効性を増強するためのいかなる添加剤を使用する必要性をも排除する。製剤はインビボにおいて、とても低いインスリン用量で重度の有効性を実証した。腸溶性コーティングカプセル中でインスリン-CAGEを送達することにより、本発明者らはインスリンの胃腸分解をうまく切り抜け、その腸管透過性を増強し、これにより生物学的製剤の経口送達の障壁を克服する。さらに、この製剤は生体適合性があり、良好な長期安定性を有する。この研究の結果により、外来診療所における経口インスリン送達の実現を促進することができる。
【０２８６】
材料および方法
材料
ゲラン酸、重炭酸コリン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、FITC-インスリン、FITC-デキストラン、カプリン酸ナトリウム（純度98％）、ムチン、およびヒトインスリンはSigma-Aldrich（St. Louis、MO、USA）から購入し、ウシトリプシンはMP Biomedicals（Santa Ana、CA、USA）から得た。Caco-2ヒト結腸直腸腺がん細胞はAmerican Type Culture Collection（Manassas、VA、USA）から買い、フェノールレッド、ウシ胎仔血清（FBS）、ペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）溶液を含むまたは含まないダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）、ならびに0.25％ トリプシン溶液はThermo Fisher Scientific（Waltham、MA、USA）から購入した。基礎播種培地（BSM）を含む腸上皮増殖培地、腸細胞分化培地（EDM）、およびMITO+ シーラムイクステンダーはCorning（Corning、NY、USA）から購入した。Millicell（登録商標）-PCF細胞培養インサート（孔径3.0μm、直径12 mm）およびTEER測定デバイスMillicell（登録商標）-ERSはMillipore Sigma（Burlington、MA、USA）から得て、TEER測定電極はWorld Precision Instruments, Inc（Sarasota、FL、USA）から得た。パラホルムアルデヒド（16％ w/v）および塩酸メトクロプラミドはAlfa Aesar（Ward Hill、MA、USA）から購入し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩（DAPI）とともにVectashield Hardset（商標）をVector laboratories Inc（Burlingame、CA、USA）から得た。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）細胞毒性キットおよびヒトインスリンELISAキットはThermoFisher Scientific（Waltham、MA、USA）から得た。200〜300 gの間の重量のWistar雄ラットはCharles River Laboratories（Wilmington、MA、USA）から購入し、血中グルコース測定メーター（Aimstrip plus）をそのストリップとともにFisher Scientific（Pittsburgh、PA、USA）から購入した。カプセル経口経管栄養およびサイズ9の細長いカプセルはTorpac（Fairfield、MA、USA）から得た。ヘマトキシリンおよびエオシン溶液はSigma Aldrich（St. Louis、MO、USA）から購入した。使用した他のすべての試薬は分析グレードのものであった。
【０２８７】
CAGEおよびインスリン-CAGEの調製
本発明者らの以前の研究（38）に従ってCAGEを合成した。手短に言えば、不純物を除去するために＜−70℃のアセトン中で少なくとも5回再結晶させた2当量のゲラン酸のみ（20 g、0.119モル）を500 mL丸底フラスコ内の1当量の重炭酸コリン（80 wt％溶液、12.275 g、0.059モル）に添加した。CO2の放出が止まるまで混合物を40℃で攪拌し、60℃で2時間の回転蒸発、続いて真空オーブンにおいて60℃で48時間乾燥させることにより水を除去した。25℃における物理的特徴評価は、以前の値と良好な一致を示した。NMRスペクトル（500-MHz Varian機器、Palo Alto、CAを使用して収集）も以前の調製物と良好に一致した：
2021503468.tif 000013
インスリン-CAGEは、所定の量のインスリン粉末を特定の体積のCAGEに添加し、続いて5分間ボルテックスすることにより調製した。
【０２８８】
CAGE中のインスリン安定性の評価
ヒトインスリンを含む試料（100 U、3.5 mg）を2 mLマイクロ遠心チューブ内の1 mLのCAGEまたはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のいずれかに懸濁し、室温（25℃）または冷蔵下（4℃）でインキュベートした。1か月後およびその後だいたい毎月、合計4か月間にわたって試料を10000×gで10分間遠心分離し、ピペットを介してCAGEを除去し、1 mLのPBSで柔らかいインスリンペレットを洗浄し、再び遠心分離した。PBS-CAGEを除去し、遠心分離の間にインスリンがペレットを形成しなくなるまで洗浄／遠心分離の工程を繰り返した。収集されたインスリンは、CDを使用してその安定性を、およびインビボの生物活性を解析した（SIで記載）。タンパク質の二次構造を示す遠UV領域（190〜250 nm）のスペクトルを収集するために、400μLの試料を搭載した長方形の石英セル（経路長1 mm、Starna Cells、1-Q-q、Atascadero、CA）を用いてCD分光光度法（Jasco J-1500、Easton、MD）を実行した。
【０２８９】
空腸内投与の際のインスリン-CAGEの有効性の決定および薬物動態パラメーターの査定
空腸内注射されたインスリン-CAGEの有効性を、一晩絶食させたが水の自由な利用を与えた非糖尿病のWistar成雄ラットにおいて決定した。抗糖尿病有効性研究の前の絶食はルーチン的に行っている（29、62、63）。食物摂取の量および時間に基づいて動物間で変わり得る、摂食の結果としての血糖値の揺らぎを回避するのに役立つ。すべての動物実験はUniversity of California Santa Barbaraの動物福祉委員会のガイドライン（animal care committee guidelines）およびNational Research Councilの実験動物資源研究所の動物の管理と使用に関するガイド（Guide for the Care and Use of Animals of the Institute of Laboratory Animal Resources）に従って実行した。研究を開始する前にラットを麻酔し、腹部の毛を刈り取り、70％ エタノールおよびベタジンを使用して手術の領域の準備をした。腹部に切開を加え、腸を露出させた。空腸の位置を特定し、3もしくは5 U/kg インスリン-CAGEのいずれかを100μL、または対照を100μL注射した。腸を露出させた後、すなわち注射の直前に0時間の血中グルコースを測定した。3匹のラットだけで試験した生理食塩水を除いて、各製剤は6匹のラットで試験した。その後、腸の区域を腹部へ戻し、筋肉および皮膚を縫合した。最初および研究の最後の5時間の時点まで0.5時間ごとに、市販のグルコースメーターを使用して血中グルコースを決定した。麻酔の間の動物における体温の喪失は、手術前には温度制御された加温パッドの上に動物を配置し、続いて手術後は追加のタオルカバーで予防した。動物は研究全体を通して麻酔されたままであり、5時間後に安楽死させた。研究の最後の5時間の時点で、もしあれば毒性を決定するためのさらなる組織学的検査のために注射部位の周りの腸の区域を除去した。有効性を比較するために、3匹のラットからなる別の群に、生理食塩水中の2 U/kg インスリンを皮下注射した。時間に対する最初の読み取り値に関する血糖値の％変化として結果をプロットした。さらに、生理食塩水群を絶食対照とみなし、生理食塩水群の血糖値を差し引いた後でグラフをプロットした。5 U/kgのインスリン-CAGEを空腸内に、5 U/kgのインスリン-生理食塩水を空腸内に、および2 U/kgのインスリン-生理食塩水を皮下に注射されたラットから0、1、2、3、および5時間の時点でおよそ250μLの血液をBD Vacutainer（登録商標）レッドトップチューブ（Becton, Dickinson and Company、Franklin Lanes、NJ、USA）に収集することで、インスリン-CAGEの薬物動態を査定した。標準的なプロトコールに従って全血から血清を分離した。手短に言えば、血液試料をRTで15〜30分間静置して凝固させ、続いて2,000 gで10分間遠心分離した。次に、透明な上澄み（血清）を清潔なチューブに収集し、手順の間は氷中に、その後インスリン含量をさらに解析するまで−20℃で保存した。血清試料中のインスリン濃度を査定するために、ヒトインスリンELISAを使用し、製造業者のプロトコールに従って各時点でのインスリン濃度を決定した。時間に対する血清インスリン濃度のプロットから消失速度定数（Kel）、半減期（t1/2）、濃度曲線下面積（AUC）、および％バイオアベイラビリティ（F）などの薬物動態パラメーターを計算した。有効性のプロットから得られたAUCを使用して薬力学的バイオアベイラビリティを計算した。
【０２９０】
インビボでの経口有効性
経口経路を通じて投与されたインスリン-CAGEの有効性を決定するために、細長いサイズ9のカプセルを使用した。これらのカプセルに、80μLの10 U/kg インスリン-CAGE、CAGEのみ、または空のままのいずれかを充填した。これに続いて、イソプロパノールに溶解した12.5％ w/v Eudragit（登録商標）L-100でカプセルを3回腸溶性コーティングした。経口有効性の研究のために、非糖尿病のWistar成雄ラットを一晩絶食させたが水の自由な利用を与えた。翌日、経口経管栄養を用いてカプセルをラットに投与し、続いて胃内容排出を促進するために5 mg/kgの塩酸メトクロプラミドを皮下投与した。その後、市販のグルコースメーターを使用して血中グルコースを測定し、引き続いて1時間ごとに12時間まで測定した。研究期間の全体を通してラットを絶食させた。生理食塩水中の10 U/kg インスリンという対照も、製剤を溶液として（カプセルなしで）経口投与することで試験した。さらに、皮下注射した2 U/kg インスリン-生理食塩水の有効性を査定した。10 U/kg インスリン-CAGEおよびCAGEのみについては製剤あたり6匹のラット群を使用したが、空のカプセル、10 U/kg インスリン溶液、および皮下注射した2 U/kg インスリン-生理食塩水の有効性を研究するためには群あたり3匹のラットを利用した。時間に対する血糖値の変化率として結果をプロットした。さらに、空のカプセル群を絶食対照とみなし、空のカプセル群の血糖値を差し引いた後でグラフをプロットした。研究の12時間後、ラットを安楽死させ、小腸切片を組織の組織学のために収集した。
【０２９１】
反復用量の生体適合性
非糖尿病ラットにおいて、CAGEのみのカプセル、10 U/kgのインスリン-CAGEカプセル、およびカプセル中の10 U/kg インスリンを7日間の期間にわたって1日1回反復投与した後で、反復用量投与の際のCAGEの生体適合性を査定した。8日目にすべての動物を安楽死させ、それらの小腸組織切片を組織の組織学のために収集した。
【０２９２】
組織の組織学
小腸組織を10％ 緩衝ホルマリンで固定し、エタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。腸組織の5ミクロン断面を脱パラフィンし、再水和させ、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。光学顕微鏡を10倍および40倍の倍率で使用して組織学的形態を検査した（Olympus BX60（商標）正立複式顕微鏡）。
【０２９３】
データ解析
すべてのデータは平均±標準誤差（S.E.）として表示される。統計解析のために、スチューデントT-検定を利用した。p＜0.05で有意差とみなした。すべての実験は少なくとも三重に行った。
【０２９４】
参考文献
2021503468.tif 000014
2021503468.tif 000015
2021503468.tif 000016
2021503468.tif 000017
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【０２９５】
実施例4：実施例3の補足材料
結果
CAGEから単離されたインスリンの生物活性は、長期保存後も保持されていた
CDを使用して得たインスリン-CAGEの長期安定性データを検証するために、異なる月にCAGEから単離されたインスリンの生物活性を非糖尿病ラットにおいて査定した（図10）。新たに調製されたインスリン溶液（生理食塩水中のインスリン）は、1時間で約49％の血糖値の降下（51±2％）をもたらし、次の1時間も持続した（50±4％）。その後、血糖値は5時間で92％（92±5％）に上昇し、継続的な絶食の結果として、再びゆっくりと初期値の約30％まで落ち込んだ。比較すると、様々な温度および異なる時点で保存されたCAGEから単離されたインスリンは、注射後1および2時間で類似したパターンおよび血糖値の降下に従い、新鮮なインスリンと比較して降下率に有意差はなかった。しかしながら、室温（RT）で3か月間保存されたインスリンについては、有効性の有意な低減が観察された。この群では、インスリン注射の1および2時間後に血糖値の有意により低い38％の降下が指摘され（それぞれ62±2％および62±3％）、RTでの2か月の保存後にインスリンがその生物活性のいくらかを喪失することを示していた。しかしながら、CAGEとともに4℃で保存されたインスリンは、少なくとも4か月の保存についてその生物活性を保持した。
【０２９６】
有意な治療的有効性のためには、CAGEおよびインスリンの同時投与が必要である
CAGEのみおよび10 U/kgのインスリンを0.5時間後に別々に投与した場合、血中グルコースはゆっくりと降下し、10 U/kgのインスリン溶液と比較して、どの時点でも有意差は得られなかった（図20）。研究の10時間の時点で、両群について血中グルコースの降下は初期レベルのおよそ34％であった（連続投与およびインスリン溶液について、それぞれ66.3±4.9および66.9±7.1％）。これは、CAGEが腸膜のいかなる長期透過化も引き起こさず、有意な血中グルコース低下有効性は、インスリン-CAGE混和物としてインスリンおよびCAGEを同時投与した際にだけ達成できることを示していた。
【０２９７】
Caco-2単層生存率に対するCAGEの影響力
Caco-2腸細胞に対するCAGEの効果をインビトロで研究した。MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞増殖アッセイを使用して最初に細胞生存率を決定した。様々な濃度のCAGEに単層を5時間曝露し、細胞生存率の値をCAGE処理なしの対照に対して正規化した（図21）。10 mM CAGEでは細胞増殖への不利益な影響は観察されず、25 mM CAGEを使用すると86％の高い細胞生存率が得られた。50 mM CAGEでは、わずかに下落した69％の生存率が得られた。
【０２９８】
CAGEは、腸の単層を横切るインスリンの輸送を有意に増強した
0、10、25、および50 mMのCAGEを使用して、Caco-2単層を横切るフルオレセインイソチオシアネート（FITC）-インスリンの5時間長の輸送実験を開発した。両群において、FITC-インスリン輸送は研究全体を通して時間とともに着実に増加した（データは示さず）。
【０２９９】
これらの結果は、研究の最後の5時間の時点におけるトランスウェル膜の共焦点画像を通じて裏付けられた。画像は、対照細胞と比較して、CAGEの増加する濃度とともにCaco-2細胞によるFITC-インスリンのより高い取り込みを明らかに示す（データは示さず）。
【０３００】
腸細胞を横切るCAGE媒介薬物輸送は、主として傍細胞性である
腸上皮を横切る分子の輸送は、傍細胞性または経細胞性のいずれかであり得る。Caco-2単層を横切る薬物の輸送をCAGEが増強する機構を査定するために、様々な濃度のCAGEの存在下において、傍細胞および受動経細胞輸送の両方を、それらの輸送に特異的なマーカーを使用して調査した。この目的のために、4 kDa FITC-デキストラン（傍細胞輸送の特異的マーカー）の輸送を評価した（1）。
【０３０１】
インスリンのサイズと類似したサイズを有する4 kDa FITC-デキストランの輸送も、25および50 mM CAGEの存在下で、様々な時点において有意に増強された（データは示さず）。しかしながら、CAGEが分子の傍細胞輸送を改善したかどうかを確認するために、様々な濃度のCAGEで処理されたCaco-2細胞の密着結合の完全性を、経上皮電気抵抗（TEER）を測定し、確立された透過促進剤であるカプリン酸ナトリウムと比較することで評価した（データは示さず）（2）。対照細胞では、TEERは最初の3時間でわずかに約10％降下し、その後5時間までに初期値に回復し、研究の最後の24時間の時点まで変化しなかった。しかしながら、10 mM CAGEで処理した際には、TEERは1時間で29％降下し、1および5時間の時点では対照と有意に異なった。このTEERの降下は過渡的であることが見出され、細胞は24時間以内に密着結合の完全性を完全に回復した。
【０３０２】
カプリン酸ナトリウムが原因のTEERの降下は50 mM CAGEのものと類似していたが、この群における密着結合の完全性は、研究の最後の24時間の時点までに初期レベルの36％にさらに減少した。10〜25 mM CAGEによってもたらされたTEERの変化は、これらの濃度において、細胞を横切るインスリン輸送を助ける腸の密着結合をCAGEが一時的に開かせることを示唆している。粘液浸透および酵素分解に対する安定性などの、CAGEによって媒介される他の経口吸収増強機構も引き続いて査定した。
【０３０３】
CAGEは粘液を薄くすることにつながった
模擬粘液（SM）とともにインキュベートされたCAGEは、粘度におけるとても著しい降下という結果になった（図21）。SMは、胃粘液について報告されたのと類似した剪断減粘プロファイルを呈し（4）、SM粘度プロファイルは、健常ヒト十二指腸胃粘液についての文献値と比較して遜色がなかった（5）。例えば46 1/sの剪断速度では、50.12 1/sで測定されたSM平均値11.3 cPと比較して、文献値は12.3 cPであった。1および5％のCAGE（それぞれ23および115 mM）を添加すると、測定された全剪断範囲の全体を通して粘度が低減した。粘度の低減は、CAGEがインビボで粘液浸透を手助けし、したがって腸管上皮へのインスリンの送達を促進する一方で、管腔、粘膜、および上皮部位におけるタンパク質分解から保護することを示している。
【０３０４】
方法
CAGE中のインスリンの長期安定性のインビボ評価
CAGEから単離された1 U/kgのインスリンを非糖尿病のWistar成雄ラットに皮下注射することにより、RTまたは4℃で保存されたインスリン-CAGEの生物活性を異なる月に査定した。市販のグルコースメーターを使用して血糖値を8時間モニターし、新たに調製され、皮下注射された1 U/kgのインスリン溶液と比較した。インスリン注射の前にラットを一晩絶食させたが水の自由な利用を与え、食物消費が原因の血中グルコースの変動を排除するために、研究全体を通して絶食を継続した。時間に対する初期レベルと比較した血中グルコースの％変化として結果をプロットした。
【０３０５】
インスリンおよびCAGEの連続投与
非糖尿病のWistarラットを一晩8時間絶食させたが、自由裁量での水の利用を与えた。その後、腸溶性コーティングカプセル中のCAGEのみをラットに経口投与し、続いて胃内容排出を誘導するために5 mg/kgのメトクロプラミドを注射した。この時点で0時間の血中グルコースを査定した。約0.5時間後、腸溶性コーティングカプセル中の10 U/kgのインスリン粉末をラットに投与した。研究の最後の12時間の時点まで、水を自由に利用させながら絶食を継続し、様々な時点で血中グルコースを査定した。時間に対する、初期レベルと比較した血中グルコースの％変化として結果をプロットした。
【０３０６】
96ウェルプレートおよびトランスウェルにおけるCaco-2単層培養
トランスウェルにおける輸送実験のために、3日間の急速なCaco-2増殖システムを使用した。MITOシーラム+ イクステンダーを補充したCorning（登録商標）の基礎播種培地（BSM）に細胞を配置し、24ウェルプレートの内部に配置されたMillicell（登録商標）のPCFインサート上に400,000細胞/mLの密度で播種した。製造業者の推奨に従って、培地を含む500μLの細胞を頂端側に配置し、1000μLの無細胞BSMを基底外側に置いた。37℃、5％ CO2で24時間インキュベートした後、さらに2〜4日間にわたって、MITOシーラム+ イクステンダーを補充した同量の腸細胞分化培地に培地を置き換えた。定期的にTEERを測定し、細胞間の十分な密着結合の完全性を示す200 ohms.cm2より上に到達したときに輸送研究を実行した。
【０３０７】
CAGEのCaco-2細胞生存率査定
この研究では、96ウェルプレートで増殖させたCaco-2細胞を使用した。CAGEをダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で希釈して10〜50 mMの範囲の濃度にした。CAGE希釈液の3つの異なる組を作製した（3つの希釈複製物）。培地を各ウェルから吸引し、各希釈液を6ウェルへ分配した（ウェルあたり100μL）（6細胞複製物）。対照ウェルは培地だけで満たした。異なる濃度のCAGEとともに細胞を37℃、5％ CO2で5時間インキュベートし、続いて新鮮なDMEMに培地を置き換えた。さらに19時間（合計で24時間まで）細胞を増殖させ、MTTアッセイを使用して細胞生存率を評価した。MTT粉末を培地と混合して0.5 mg/mLの濃度にし、各ウェル（100μL）に添加して、37℃、5％ CO2で4時間インキュベートした。その後、MTT溶液を除去し、100μLのジメチルスルホキシド（DMSO）を各ウェルに添加した。プレートをホイルで包んで20分間振盪し、次にマイクロプレートリーダー（M220 Infinite Pro、Tecan Group Ltd、Morrisville、NY）を使用して570 nmで吸光度を読み取った。未処理細胞の生存率の値を使用して、吸光度の読み取り値を正規化した。
【０３０８】
インビトロにおけるインスリン輸送アッセイ
実験を開始する前に、頂端側（200μL）および基底外側（600μL）の両方において、トランスウェル中の既存の培地を、フェノールレッド、ウシ胎仔血清（FBS）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）を含まないDMEMに置き換え、細胞を30分間インキュベートした。その後、頂端側の培地を、10、25、もしくは50 mM CAGEを含ませてまたは含ませずに調製し、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに可溶化した200μLの500μg/mL FITC-インスリンに置き換えた。頂端側にFITC-インスリンを添加した直後に、100μLのアリコートを基底外側から取り除き、等量の新鮮なDMEMに置き換えた。これを1、2、3、4、および5時間の時点で繰り返した。研究の間、トランスウェルプレートを37℃、5％ CO2のインキュベーターの内部で100 rpmで回転している振盪機の上に配置し、前述の期間にだけ取り出してアリコートを除去した。研究の最後の5時間の時点の後に、プレートリーダー（Tecan、Infinite M1000、Mannedorf、Switzerland）を使用して、495／520 nmの励起／発光波長でアリコートのFITC-インスリン濃度を測定し、時間に対するFITC-インスリン輸送の％としてプロットした。さらに、トランスウェルからアリコートを取り除いたすべての時点でTEERを測定し、時間に対する基底外側チャンバー濃度としてプロットした。
【０３０９】
Caco-2細胞によるFITC-インスリン取り込みの定性分析のために、FITC-インスリン輸送研究からのトランスウェルを研究の最後にHBSSで2回洗浄し、続いて100μLの4％ パラホルムアルデヒドを添加し、4℃に一晩保った。翌日、ウェルからパラホルムアルデヒドを吸引し、膜をPBSで2回洗浄し、トランスウェル膜を切り、スライドグラス上に静かに配置した。（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩）DAPIを含む封入剤を膜に添加し、カバーグラスで覆った。Olympus Fluoview（商標）1000スペクトル共焦点機器を40倍の倍率で使用して膜の共焦点イメージングを撮影した。
【０３１０】
インビトロにおけるFITC-デキストラン輸送アッセイ
実験を開始する前に、頂端側（200μL）および基底外側（600μL）の両方において、トランスウェル中の培地を、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに置き換え、細胞を30分間インキュベートした。その後、頂端側の培地を、10、25、および50 mM CAGEを含ませてまたは含ませずに調製し、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに可溶化した、DMSO中（最終濃度10％）の200μLの500μg/mL 4 kDa FITC-デキストランに置き換えた。頂端側に被験物質を添加した直後に、100μLのアリコートを基底外側から取り除き、等量の新鮮なDMEMに置き換えた。これを1、2、3、4、および5時間の時点で繰り返した。研究の間、トランスウェルプレートを37℃、5％ CO2のインキュベーターの内部で100 rpmで回転している振盪機の上に配置し、各時点にだけ取り出してアリコートを除去した。研究の最後の5時間の時点の後に、プレートリーダー（BioTek Synergy NEO HTS（商標）マイクロプレートリーダー(Winooski、VT、USA)）を使用して、それぞれ485／530、495／520、および468／568 nmの励起／発光波長でFTIC-デキストラン濃度を有するアリコート中の蛍光を測定した。各被験物質についての較正溶液を調製し、FITC-デキストランの蛍光読み取り値を使用して解析し、時間に対する基底外側チャンバー濃度プロットのプロットに使用した。
【０３１１】
TEER値に対するCAGEおよびカプリン酸ナトリウムの効果
実験を開始する前に、頂端側（200μL）および基底外側（600μL）の両方において、トランスウェル中の既存の培地を、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに置き換え、細胞を少なくとも30分間インキュベートした。各インサートについてTEER値を記録した。その後、頂端側の培地を、200μLの10、25、および50 mM CAGEのいずれかまたは10 mM カプリン酸ナトリウムに置き換えた。研究の間、トランスウェルプレートを37℃、5％ CO2のインキュベーターの内部で100 rpmで回転している振盪機の上に配置し、1、2、3、4、5、および24時間の時点で追加のTEER測定を実行するためにだけ取り出した。時間に対する初期値からの％変化としてTEERをプロットした。
【０３１２】
CAGEのムチンとの相互作用
2％乾燥ブタムチンを生理食塩水と混合し、ムチンが完全に溶解するまでボルテックスすることで模擬粘液を作製した。約1および5％のCAGE（それぞれ23および115 mM）をSMに添加し、40 mm直径のアルミニウム2°円錐形状を有するAR-G2レオメーター（TA Instruments、New Castle、DE、USA）を使用して、1〜100 1/sの剪断速度範囲にわたって25℃で粘度を測定した。
【０３１３】
実施例5
GFPプラスミドトランスフェクションプロトコール
Caco-2細胞を、トランスフェクション試薬を添加する前日に、96ウェル半領域または24ウェル組織培養処理プレートのいずれかに80％の密着度で播種した。リポフェクタミントランスフェクション研究のために、リポフェクタミン3000試薬（最終濃度0.07％または0.13％）をOpti-Mem培地で調製し、混合した。P3000エンハンサー試薬（最終濃度0.09％v/v）を含むOpti-Mem培地でGFPプラスミド（96ウェル半領域プレートの場合は50 ng/ウェルまたは24ウェルプレートの場合は250 ng/ウェル）を希釈することにより、プラスミドDNAのマスターミックスを別々に調製した。希釈したリポフェクタミン3000試薬のチューブにプラスミドDNAのマスターミックスを1：1の比率で加えた。混合物を室温で20分間インキュベートして、プラスミドを陽イオン性リポフェクタミンに組み込ませた。次に、完全な細胞培養培地中の細胞にDNA-脂質複合体混合物を0.07％または0.13％の最終濃度で直接的に添加した。96ウェル半領域プレートの総量は100 uL、24ウェルプレートについては500 uLであった。3日間のインキュベーション後にこのトランスフェクション混合物を除去し、DPBSで洗浄し、完全なDMEM細胞培養培地と置き換えた。
【０３１４】
リポフェクタミン3000の代わりに、0.13％、0.26％、0.5％、0.71％、および0.9％の最終濃度でCAGEの異なるバリアント（1：1、1：2、1：4、2：1）とともに上記と同じプロトコールを使用した。P3000エンハンサー試薬を使用した場合、最終濃度は同じ0.09％に維持された。1日または3日後にトランスフェクション混合物を除去し、DPBSで洗浄し、完全なDMEM細胞培養培地と置き換えた。
【０３１５】
共焦点顕微鏡を使用してGFP発現の存在を撮像した（図22〜25）。このデータは、CAGEがDNAを細胞へ送達できることを実証する。
【０３１６】
実施例6：水和CAGEのナノ構造遷移
コリンおよびゲラン酸共晶混合物（CAGE）などのイオン液体は、刺激的な生物医学的適用を見出したが、水和条件下でのそれらの構造はほとんど理解されていない。本明細書に記載されるのは、モデル両親媒性深共晶溶媒CAGEのナノ構造における水和誘導性および成分依存性の遷移である。広角X線散乱および低温透過型電子顕微鏡で、ナノスケールの形態学的遷移を確認した。水和により、天然の分子クラスターおよびイオンクラスターが破壊され、極性ドメインおよび非極性ドメイン、陽イオンおよび陰イオンの交互配置、ならびに原子の隣接関係が再編成された。水和の度合いが高いと（＞75％ H20）、ナノスケールのクラスターは、濃度および組成に応じて小胞、ミセル、またはマイクロエマルションへ自己集合する。これらのナノスケールの形態学的変化は、巨視的挙動の変化にもつながった。具体的には、より高いモル比のゲラン酸では、水和CAGEはニュートン溶媒から剪断減粘非ニュートンゲルへの遷移を起こした。これらの結果は、イオン液体のナノ構造は、それらの水和および成分のモル比を制御することによって整えることができることを実証しており、特定の適用のためにこれらの材料をカスタマイズする新しいアプローチを提示している。
【０３１７】
深共晶溶媒（DES）は、ルイスまたはブレンステッド-ローリー酸および塩基を様々なモル比で混合することにより製剤化されるイオン液体の特別な範疇である。1-3DESは、前駆体の化学および／またはモル比によって整えられる、配位または水素結合ネットワークによって結合された非対称的な分子クラスターおよびイオンクラスターの複雑な集合体である。3〜18最終的に、DESのナノ構造は配位または水素結合ネットワークの完全性に依存するため、水を含む水素供与体の影響を受けやすい。5水素結合ネットワークは、これらの溶媒を吸湿性および保水性にし、5これはこれらの物理化学的特性に影響を与える特徴的な挙動である。例えば、吸収された水は融点を減少させ19、本来のDESのナノ構造を破壊する。5定義によれば、ILの挙動はイオン相互作用によって支配されているが、DESは水素結合からの強い寄与を呈する。CAGEは主にイオン種、コリニウム、およびゲラネートで構成され、100℃未満の融点を有するため、ILの定義にはまる。同時に、CAGEは中性のゲラン酸も含むため、古典的なILではない。主に現在の定義の限定が原因で、イオン種および中性種を含むシステムの分類は複雑である。したがって、本明細書で提供される組成物、イオン液体、およびDESの定義および説明は、用語が当技術分野における他の場所でどのように適用されてよいかを制御するものである。
【０３１８】
これらの相互作用を解体するための以前のアプローチは、典型的な塩化コリン／尿素4、5、10、15、17、19、20などの全面的に親水性のDES、または長鎖脂肪酸塩および長鎖脂肪酸に由来するものなどの完全に疎水性の類似体に焦点を当てている。18両親媒性の深共晶溶媒およびイオン液体3、21は新しい機会を開く。
【０３１９】
本明細書に記載されるのは、CAGEの水和誘導性および成分依存性のナノ構造再編成の調査である。
【０３２０】
広角X線散乱（WAXS）、蛍光分光法、および低温透過型電子顕微鏡法を用いて、水和の増加および前駆体のモル比の変化によって誘導されるナノ構造遷移を体系的に精査した。化学的および生化学的過程における水の広汎性は、これらの遷移を調査するためのモデルトリガーとしての水和の選択を告げる。本明細書に記載されるのは、CAGEの新しい適用を開く、ナノスケールの形態学およびレオロジーにおける顕著な水和誘導性および成分依存性の遷移である。
【０３２１】
結果および考察
本明細書に記載されるのは、CAGE-x：yの簡易な合成経路で、xおよびyは、それぞれコリンおよびゲラン酸のモル当量である。合成には、親水性の重炭酸コリンを様々なモル当量の疎水性のゲラン酸と混合することが含まれる。ゲラン酸の濃度を変えることで、CAGEのナノ構造における水素結合相互作用、ファンデルワールス力、および疎水性の役割を解体することが可能になった。ゲラン酸中のカルボン酸官能基はその水素結合特性で周知であるが、アルケニル尾部は疎水性でファンデルワールス相互作用に従事する。一方、ゲラン酸よりも高いモル当量のコリンを有するCAGEバリアントは、そのような設計は重炭酸塩を含み、これはナノ構造に干渉するかもしれない化学種であり、この研究の目的を妨害するので回避された。全体として、本明細書で提供される戦略は、どのように水和がCAGEの分子クラスターおよびイオンクラスターを破壊して、ナノスケールのレベルで構造遷移を誘導するかの研究を便利に可能にする。
【０３２２】
純粋なCAGEの広角X線散乱パターンを使用して、水和CAGEのナノスケール組織を評価した（図26）。すべての純粋なCAGEは、一般的な酸濃度に敏感な低qピークとともに、q＝0.22-0.28Å-1およびq＝1.43Å-1に2つの突出した散乱ピークを呈した（図26）。個別の陽イオンおよび陰イオンに由来する、従来型のイオン液体のX線散乱プロファイルは、通常、極性ドメインおよび非極性ドメインが交互に現れることによる対称性が原因の低q「プレピーク」、陽イオンおよび陰イオンが交互に現れることに帰する中q「電荷」ピーク、ならびに隣接原子の分子間および分子内パッキングに起因する高q「隣接」ピークを含む3つのピークを特徴とする。26〜30イオン液体の構造および官能基に応じて、プレピーク、電荷ピーク、または両方が散乱プロファイルから失われ得る。5、28、39、31、32低qピークは0.22-0.28Å-1に、および高qピークは1.43Å-1に、それぞれプレピークおよび隣接ピークとして割り当てられた。ひょっとしたら電荷ピークの従属成分（subcomponent）のピークおよびアンチピークが相殺されたこと28、または交互に現れる個別の陽イオンおよび陰イオンが存在しないことが原因で、電荷ピークは散乱信号から失われた。
【０３２３】
ブラッグの法則：d＝2π/qから計算された極性ドメインと非極性ドメインとの間の相関距離（d）は、ゲラン酸のモル当量が1から4に増加するにつれて、27.3Åから22.7Åに減少した（図26）。ゲラン酸含量が増加すると、極性ドメインと非極性ドメインとの間の距離は増加すると予期されるため、これは直観に反している。この特異な挙動を説明するのは複雑になり得るが、非極性アルケニル尾部に対するファンデルワールス力の影響の増加、および高濃度でのゲラン酸の極性カルボキシル頭部に対する水素結合相互作用に基づいてそれを理論的に説明することができる。理論に拘束されることは望まないが、誘引性の分子間相互作用のいずれかまたは両方が、CAGEの状況における分子クラスターおよびイオンクラスターのコンパクトなパッキングを誘導してdを減少させることができる。よく見られるイオン液体の非極性炭化水素区分が増加するにつれて、特にこの区分がブレンステッド塩基または陽イオン上にある場合、dが増加すると以前に報告されたことを考慮すると、観測された相関は独特である。26、29、30
【０３２４】
図27A〜27DはWAXSデータを示し、水和の度合いを増加させると、極性ドメインと非極性ドメインとの間の相関距離が減少したことを示す。プレピークの消失によって証明されるように、CAGE濃度が25％ w/w（換言すれば、75％水和）に降下するにつれて、極性ドメインおよび非極性ドメインが交互に現れることが原因で、すべてのCAGEバリアントは対称性を失った（図27A〜27D）。データは、純粋なCAGEの本来の分子クラスターおよびイオンクラスターから水の液体構造への遷移、そして重要なことに、分子間および分子内レベルでのCAGEのナノ構造の再編成を暗示している。理論に拘束されることは望まないが、極性ドメインおよび非極性ドメイン、ならびに原子の隣接関係に影響を与える水和誘導性の現象は、プレピークおよび隣接ピークの強度および位置の変化に反映されるように、このナノ構造の遷移の引き金を引くことが企図される（図27A〜27D）。水和が増加するとプレピークの強度だけが減少し、プレピークの位置または隣接ピークの強度にはごくわずかな影響しか有さないため、これらのピークの強度および位置の同時シフトは独特である。5、32他者は、極性ドメインおよび非極性ドメインが交互に現れるのを破壊すると対称性が破損し、究極的にはプレピークの完全な消失につながるというシナリオを報告している。27、33水のゲラン酸カルボキシル頭部との強い水素結合能力は、誘引性のファンデルワールス力を圧倒および破壊し、水和の度合いが低い（＜50％ H20、w/w）非極性アルケニル尾部を隔離してdを増加させ、プレピークが消失するにつれて対称性が反映されるまで、熱力学的理由により、高い度合いの水和において（＞75％ H20、w/w）、本来のナノ構造を異なる形態へと再配置することが企図される。
【０３２５】
疎水性ゲラン酸の親水性コリンに対するモル比が1から4に増加するにつれて、極性ドメインと非極性ドメインとの間の距離は、水和の効果に対する応答性がより高くなった。例えば、純粋DESから50％ CAGE-水混合物に変化すると、CAGE-1：1、-1：2、-1：3、および-1：4における極性ドメインと非極性ドメインとの間の距離は、それぞれ11％、37％、86％、および88％増加した。逆に、隣接ピークに対応する原子間の分子内および分子間距離は、CAGE-1：1およびCAGE-1：3においてそれぞれ14％および5％減少することで実証されるように、水和に対する応答性がより低くなった。結果は、CAGEに水を添加すると、特に疎水性成分の親水性成分に対するモル比がCAGE-1：4のように高い場合、極性ドメインおよび非極性ドメインが隔離され、CAGE-1：1のように比率が低い場合、ドメインが凝集することを示している。
【０３２６】
CAGE-1：1および-1：2におけるナノ構造遷移は、CAGE-1：3および-1：4のものとは質的に異なるため、CAGEのナノ構造に対するゲラン酸の強い寄与を強調する。純粋で水和した-1：1および-1：2は広いプレピークを呈し、電荷ピークが欠落していた一方で、水和した-1：3および-1：4は鋭い多重散乱プレピークおよび電荷ピークを特徴としていた（図27A〜27D、75％ w/wおよび50％ w/w）。これらの水和した-1：3および-1：4における広いピークから鋭いピークへの遷移は、おそらく水素結合水分子の存在下における分子間力のより良好な整列が理由で、交互に現れる極性ドメインおよび非極性ドメインがより良好な秩序だったナノ構造へ再編成されることを示す。このような再整列は、本研究で見出されたように、粘度などの他の巨視的特性に影響を与え得る（図28）。50％水和-1：1および-1：2のゼロに近い剪断粘度はそれらの純粋な類似体のものよりも低かったが、50％水和-1：3および-1：4のものはそれらの純粋な類似体のものよりも高かった（図28）。50％水和CAGE-1：4-水混合物の目視試験により、粘度のより低い純粋な類似体および50％水和-1：2とは対照的に、ゲル状の挙動が明らかになった（図28）。CAGE-1：4で説明される、より高いバリアントのゾル-ゲル遷移は、薬物送達のための新しい可能性をもたらす。
【０３２７】
レオロジーのデータは、24時間まで安定なゲルが非ニュートン挙動を呈したことを示し、これは親CAGEのニュートン特性とは対照的であった（図29A）。増加する剪断速度を適用した際には、明らかに相互接続した水素結合ネットワークの断裂が原因で、ゲルの粘度が目に見えて減少した（図29B）。興味深いことに、剪断力を除去すると粘度は有限時間内に正常に戻り、これは断裂したネットワークの再建が高速であることを示し、試験された剪断速度内での剪断減粘挙動を示唆する。34
【０３２８】
すべてのCAGEは、水和の度合いが高いと（＞75％ H20、w/w）、自己集合を起こした（図30A〜30D）。これらのCAGEバリアントに本来備わる両親媒性に基づけば、増加する水和とともに自己集合することは予想されていた。ピレン含有DES-水混合物（＞60％ H2O、w/w）の定常状態蛍光分光学的調査は、臨界ミセル化濃度（CMC）を明らかにすることにより、自己集合の寸評を提供する（図30A〜30D）。濃度に対する、ピレン放出の第1（I1）振電バンドの第3（I3）振電バンドに対する比率のプロットの勾配における突出した変化は、両親媒性物質のCMCに対応する。通常、プロットは、ピレンがそこへ優先的に分配される疎水性コアを有する明確に定義されたナノ構造への両親媒性物質の自己集合に対応する急勾配を有するシグモイド型プロファイルを呈する。図30A〜30DはCMCを示し、CAGEバリアントの自己集合過程における質的な差を明らかにしている。より高いゲラン酸含量を有する組成物、CAGE-1：3および-1：4は、最も低いCMC（2.5％ CAGE、w/w）を呈した。定性的に、CAGE-1：1および-1：2における自己集合過程は、CAGE-1：3および-1：4についてのものとは異なっていた。前者のグループは、研究された濃度範囲内における1つの突出した勾配だけを特徴としたが、後者は2つの勾配、したがって2つのCMCを呈した。複数の勾配は、水性媒体中のCAGEのナノ構造における遷移に帰せられる。
【０３２９】
仮定を確認するために、低温透過型電子顕微鏡を使用して、異なるCMCに対応する濃度である5％および20％、w/w、CAGE-水混合物におけるナノ構造の形態を目視で試験した。5％、w/w、CAGE-1：2-、-1：3-、または-1：4-水混合物は、水中油（o/w）型マイクロエマルション（おそらく水相に分散したゲラン酸に富む油相）を形成し、その後、混合物中のCAGEの濃度が20％に増加するにつれて、異なる形態へ遷移した（図31A〜31F）。間違いなく、CAGE濃度が5％から20％に増加するとともに、CAGE-1：2は特徴的なo/w型マイクロエマルションの形態35からミセルに典型的なナノ構造へ遷移したが36、37、CAGE-1：3および-1：4は小胞へ再編成された（図31A〜31F）。
【０３３０】
とても少ないイオン液体しかこの挙動を呈さないため、38ナノ構造遷移は通常ではないが、非イオン性界面活性剤／共界面活性剤のo/w型エマルションではよく見られることがある。39、40後者のシステムでは、水濃度に応じてo/w液滴ナノ構造が層状構造へ遷移し、小胞へ剥離すると仮定されている。39、40
【０３３１】
CAGEのナノ構造、ならびにそれらの濃度および組成依存的な遷移は、いくつかの基本的および実際的な意味合いを有する。基本的なレベルでは、これらの研究はナノスケールレベルでのCAGEの挙動に新しい洞察をもたらす。自己集合は、薄層および小胞などの異なる形態のナノ構造への従属成分の再編成を推進するため、材料科学における多くの特性にとって極めて重要である。多くの化学的および生化学的な最先端において両親媒性CAGEの新たに出現した探査は、最も偏在する水素供与体である水によって誘導される分子再編成を理解する必要性を作り出す。このナノ構造再編成は、個別の陽イオンおよび陰イオンに由来する従来型の両親媒性イオン液体についてはよく特徴付けられているが26、41〜57、新たに出現した両親媒性CAGEについては不明のままである。
【０３３２】
CAGE-水相互作用の理解は、さらなる適用を開発するためにも重要である。皮膚環境はかなり乾燥しており、CAGEの水和レベルを著しく改変する可能性は低いが、腸環境は非常に水和しており、CAGEを迅速に高い度合いの水和に曝露する。したがって、CAGEの特性に対する水和の影響を理解することは、これらの適用における薬物輸送を理解するために、およびそのさらなる生物医学的適用を開発するために重要である。
【０３３３】
考察
本明細書では、成分の水和の度合いおよびモル比がCAGEのナノ構造にとって決定的であることを説明している。例えば、CAGE-1：4（95％水和）は5％、w/wでo/w型マイクロエマルションを形成したが、20％、w/w（80％水和）は小胞へ自己集合した。20％、w/w、CAGE-1：4または-1：3の小胞ナノ構造は、20％、w/w、CAGE-1：2のミセルナノ構造とは全く異なった。このデータは、水和の増加する度合いによって天然の分子クラスターおよびイオンクラスターが破壊され、極性ドメインおよび非極性ドメイン、原子の隣接関係、ならびに分子内および分子間相互作用に影響を与えるナノスケールの再編成につながることを示している。水和の度合いが高い＞75％ H2Oでは、CAGEのナノ構造は、前駆体のモル比に応じて小胞、回転楕円体ミセル、およびo/w型マイクロエマルションへ自己集合した。疎水性成分に対する親水性成分のモル比が低い場合、例えばCAGE-1：4では、50％水和のような水の存在により、水素結合相互作用の影響の増加が原因で、ゾル-ゲル遷移が誘導された。データは、CAGEのナノ構造を整え、特定の適用についてそれらをカスタマイズするための新しいパラメーターを明らかにする。
【０３３４】
実験方法
材料
重炭酸コリン（H2O中で80％）、ゲラン酸（85％、テクニカルグレード）、およびピレン（99％、蛍光グレード）はSigma Aldrichから得た。重炭酸コリンおよびピレンは供給元から受領したままで使用し、ゲラン酸は、以前に説明したように、低温（−70℃）のゲラン酸-アセトン溶液（70％、v/v）から再結晶（5×）させて精製した。
【０３３５】
CAGEの調製
以前に説明したプロトコールを使用してCAGEを調製した。手短に言えば、適したモル当量の重炭酸コリンおよび再結晶化させたゲラン酸を混合し、CO2の放出が止まるまで室温で攪拌した。一例として、CAGE-1：2を得るには、1モル当量の重炭酸コリンを2モル当量のゲラン酸と混合した。反応の副産物である水を、最初に60℃で20分間回転蒸発させ、次に40℃の真空オーブンで48時間除去した。この長い乾燥期間は、CAGEのみの水分含量の不一致をごくわずかな量まで低減させるのに適当である。水和CAGEは、適した量の二重脱イオン水をCAGEに添加し、30秒間ボルテックスして一貫した混合物を達成することにより調製した。
【０３３６】
広角X線散乱実験
Osmicスタガードパラボラ多層光学系（Osmic staggered parabolic multilayer optics）と連動するRigaku 002微小焦点X線源およびDectris Pilatus 300K検出器を用いたSAXSLAB機器を使用して、CAGEのWAXSデータを入手した。異なるパーセンテージの水（0、25、50、および75％ H2O、w/w）を含む水和CAGEを1.5 mmの毛細管へ搭載し、水の吸収または蒸発を予防するためにエポキシ接着剤で密封して、次に0.08 mbarまでポンプ排気された大きい真空チャンバーに導入した。実験では0.154 nmのX線波長および109.1 mmのベヘン酸銀で較正された試料-検出器間距離を使用した。すべてのWAXS実験は室温で行った。SAXSGUI v2.15.01ソフトウェアで処理した後、水で満たした毛細管からの寄与を試料の散乱プロファイルから差し引いた。
【０３３７】
レオロジー実験
平行プレート形状（直径：50 mm）が取り付けられたTA ARES G2ひずみ制御レオメーターでCAGEのレオロジー特性を測定した。CAGEのみおよび水和CAGE（0、25、および50％ H2O、w/w）に対してフロースイープおよびフロー温度勾配のレオロジー実験を行った。剪断速度および応力に対して粘度データをプロットして、CAGEの剪断減粘およびニュートン挙動を得た。
【０３３８】
臨界ミセル濃度の決定
ピレンプローブを用いた蛍光分光法をHoriba Fluorolog-3蛍光光度計で行い、水和CAGEの臨界ミセル濃度（CMC）の決定に使用した。CAGEバリアントを適した量の二重蒸留水と混合して、ピレンを1×10−6 Mの濃度まで添加したCAGE-H20混合物（20.0、10.0、5.00、2.50、および1.25％ CAGE、w/w）を得た。蛍光実験ではピレンを334 nmで励起し、発光を340〜550 nmの間でスキャンし、373 nmの第1（I1）および384 nmの第3（I3）振電バンドを記録した。CAGE濃度に対する、I1/I3のプロットの勾配における最大変化に対応する濃度をCMCとした。
【０３３９】
低温透過型電子顕微鏡イメージング
低温TEMイメージングのために、本発明者らはHoley Carbonグリッド上で水和CAGEバリアント（80％および95％ H20、w/w）を−80℃のエタン中で急速に凍結させ、JEOL 2100 TEMまたはFEI Tecnai Artica CryoTEMを使用して液体窒素温度で試料を撮像した。
【０３４０】
参考文献
2021503468.tif 000019
2021503468.tif 000020
2021503468.tif 000021
2021503468.tif 000022
2021503468.tif 000023
【０３４１】
実施例7
非糖尿病のWistar雄ラットにおけるセマグルチド研究
総量250 uL中の0.12 mg/kg（30 nmol/kg）のセマグルチドを、意識のある動物へSC注射した。4時間後、BGを測定した。血清を収集して、0、30、60、120、および240分のセマグルチド濃度を測定した（図32）。
【０３４２】
総量100 uLのCAGE中の1.2 mg/kg（10×SC用量）のセマグルチドを、実験の持続期間にわたって麻酔下の動物へ腹部手術を介して空腸内注射した。4時間後、BGを測定した。血清を収集して、0、30、60、120、および240分のセマグルチド濃度を測定した（図32）。
【０３４３】
競合的EIAを介して血清セマグルチド濃度（ng/mL）を決定したところ、CAGEの空腸内投与後に血中に有意なセマグルチドが検出された。
【０３４４】
実施例8
結果
CAGEのCaco-2単層との相互作用をインビトロで研究した。ルシファーイエローの輸送は、CAGEとともに濃度依存的な増強を呈した（図33）。
【０３４５】
その後、CAGEの存在下におけるクマリン-6（受動的トランスサイトーシスの蛍光マーカー）の経細胞透過性を評価した。驚くべきことに、CAGEは低濃度であってすらクマリン-6の経細胞取り込みを低減させた（図34）。
【０３４６】
結果
腸細胞を横切るCAGE媒介薬物輸送は、主として傍細胞性である
腸上皮を横切る分子の輸送は、傍細胞性または経細胞性のいずれかであり得る。Caco-2単層を横切る薬物の輸送をCAGEが増強する機構を査定するために、様々な濃度のCAGEの存在下において、傍細胞および受動経細胞輸送の両方を、それらの輸送に特異的なマーカーを使用して調査した。この目的のために、ルシファーイエローの輸送を評価した。ルシファーイエローの輸送は、10〜50 mM CAGEの存在下ですべての時点にわたって有意に増強された（図33）。最も低い10 mMのCAGE濃度では、輸送は約2倍に増強された。
【０３４７】
50 mMのCAGEを使用すると、ルシファーイエローの輸送はマーカー単独と比較して有意に増強され、様々な時点において7〜10倍に増強された。一方、インスリンのサイズと類似したサイズを有する4 kDa FITC-デキストランの輸送も、25および50 mM CAGEの存在下でそれぞれ2〜6および6〜13倍に、様々な時点において有意に増強された（図33）。
【０３４８】
傍細胞経路を探求した後に、CAGEの存在下における腸細胞を横切る分子の経細胞輸送を、クマリン-6（受動的経細胞輸送の蛍光マーカー）を使用して査定した。10〜50 mM CAGEの存在下では、クマリン-6トランスサイトーシスはすべての時点で有意に減少し、CAGEが主として薬物の受動的トランスサイトーシスを手助けしないことを示した（図34）。このCAGEの存在下でクマリン-6のトランスサイトーシスが和らげられたことは、もしあれば細胞膜の乱れが減少したことを指摘するため、CAGEの腸細胞との優れた生体適合性を指摘する。
【０３４９】
方法
96ウェルプレートおよびトランスウェルにおけるCaco-2単層培養
トランスウェルにおける輸送実験のために、3日間の急速なCaco-2増殖システムを使用した。MITOシーラム+ イクステンダーを補充したCorning（登録商標）の基礎播種培地（BSM）に細胞を配置し、24ウェルプレートの内部に配置されたMillicell（登録商標）のPCFインサート上に400,000細胞/mLの密度で播種した。製造業者の推奨に従って、培地を含む500μLの細胞を頂端側に配置し、1000μLの無細胞BSMを基底外側に置いた。37℃、5％ CO2で24時間インキュベートした後、さらに2〜4日間にわたって、MITOシーラム+ イクステンダーを補充した同量の腸細胞分化培地に培地を置き換えた。
【０３５０】
インビトロにおけるルシファーイエローおよびクマリン-6輸送アッセイ
実験を開始する前に、頂端側（200μL）および基底外側（600μL）の両方において、トランスウェル中の培地を、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに置き換え、細胞を30分間インキュベートした。その後、頂端側の培地を、10、25、および50 mM CAGEを含ませてまたは含ませずに調製し、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに可溶化した、DMSO中（最終濃度10％）の200μLの500μg/mL ルシファーイエロー（LY）または5μg/mL クマリン-6に置き換えた。頂端側に被験物質を添加した直後に、100μLのアリコートを基底外側から取り除き、等量の新鮮なDMEMに置き換えた。これを1、2、3、4、および5時間の時点で繰り返した。研究の間、トランスウェルプレートを37℃、5％ CO2のインキュベーターの内部で100 rpmで回転している振盪機の上に配置し、各時点にだけ取り出してアリコートを除去した。研究の最後の5時間の時点の後に、プレートリーダー（BioTek Synergy NEO HTS（商標）マイクロプレートリーダー(Winooski、VT、USA)）を使用して、それぞれ485／530、495／520、および468／568 nmの励起／発光波長でLYおよびクマリン-6濃度を有するアリコート中の蛍光を測定した。各被験物質についての較正溶液を調製し、LYおよびクマリン-6の蛍光読み取り値を使用して解析し、時間に対する基底外側チャンバー濃度プロットのプロットに使用した。
【０３５１】
材料
ゲラン酸、重炭酸コリン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、FITC-インスリン、FITC-デキストラン、カプリン酸ナトリウム（純度98％）、ムチン、クマリン-6、およびヒトインスリンはSigma-Aldrich（St. Louis、MO、USA）から購入し、ウシトリプシンはMP Biomedicals（Santa Ana、CA、USA）から得た。Caco-2ヒト結腸直腸腺がん細胞はAmerican Type Culture Collection（Manassas、VA、USA）から買い、フェノールレッド、ウシ胎仔血清（FBS）、ペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）溶液を含むまたは含まないダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）、ならびに0.25％ トリプシン溶液はThermo Fisher Scientific（Waltham、MA、USA）から購入した。基礎播種培地（BSM）を含む腸上皮増殖培地、腸細胞分化培地（EDM）、およびMITO+ シーラムイクステンダーはCorning（Corning、NY、USA）から購入した。Millicell（登録商標）-PCF細胞培養インサート（孔径3.0μm、直径12 mm）およびTEER測定デバイスMillicell（登録商標）-ERSはMillipore Sigma（Burlington、MA、USA）から得て、TEER測定電極はWorld Precision Instruments, Inc（Sarasota、FL、USA）から得た。パラホルムアルデヒド（16％ w/v）および塩酸メトクロプラミドはAlfa Aesar（Ward Hill、MA、USA）から購入し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩（DAPI）とともにVectashield Hardset（商標）をVector laboratories Inc（Burlingame、CA、USA）から得た。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）細胞毒性キットおよびヒトインスリンELISAキットはThermoFisher Scientific（Waltham、MA、USA）から得た。200〜300 gの間の重量のWistar雄ラットはCharles River Laboratories（Wilmington、MA、USA）から購入し、血中グルコース測定メーター（Aimstrip plus）をそのストリップとともにFisher Scientific（Pittsburgh、PA、USA）から購入した。カプセル経口経管栄養およびサイズ9の細長いカプセルはTorpac（Fairfield、MA、USA）から得た。ヘマトキシリンおよびエオシン溶液はSigma Aldrich（St. Louis、MO、USA）から購入した。ルシファーイエローはVWR（Radnor、PA、USA）から購入した。使用した他のすべての試薬は分析グレードのものであった。
【０３５２】
CAGEおよびインスリン-CAGEの調製
本発明者らの以前の研究に従ってCAGEを合成した。手短に言えば、不純物を除去するために＜−70℃のアセトン中で少なくとも5回再結晶させた2当量のゲラン酸のみ（20 g、0.119モル）を500 mL丸底フラスコ内の1当量の重炭酸コリン（80 wt％溶液、12.275 g、0.059モル）に添加した。CO2の放出が止まるまで混合物を40℃で攪拌し、60℃で2時間の回転蒸発、続いて真空オーブンにおいて60℃で48時間乾燥させることにより水を除去した。25℃における物理的特徴評価は、以前の値と良好な一致を示した。NMRスペクトル（500-MHz Varian機器、Palo Alto、CAを使用して収集）も以前の調製物と良好に一致した：
2021503468.tif 000024
インスリン-CAGEは、所定の量のインスリン粉末を特定の体積のCAGEに添加し、続いて5分間ボルテックスすることにより調製した。
【０３５３】
データ解析
すべてのデータは平均±標準誤差（S.E.）として表示される。統計解析のために、スチューデントT-検定を利用した。p＜0.05で有意差とみなした。すべての実験は少なくとも三重に行った。
【０３５４】
実施例9
CAGEはCaco-2細胞に対して濃度依存的な効果を呈した（図35）。CAGEは濃度依存的なインスリン輸送の増強も呈し、50 mM CAGEでは＞10倍の増強であった（図36および36）。増強の機構は、傍細胞経路によって媒介される可能性が高い。さらに、4 kDa FITC-デキストラン（インスリンに匹敵するサイズ）の輸送も濃度依存的に増加し、13倍の増強に達した（図38）。これは、経上皮電気抵抗（TEER）の決定を通じて腸の密着結合の完全性を測定することにより裏付けられた。以前に観察されたように、CAGEに5時間曝露した際にTEERの濃度依存的な減少が観察され、続いて濃度依存的に回復した（図39）。10 mM CAGEで細胞を処理すると、1および5時間の時点でTEERが有意に減少する結果になったが、25および50 mM CAGEで処理すると、すべての時点でTEERの有意な（40〜50％）減少ならびに24時間以内にTEERが初期レベルのそれぞれ90および58％へ回復するのにつながった。参考までに、周知の透過促進薬物であるカプリン酸ナトリウムへの曝露後のTEERの降下も測定した。
【０３５５】
材料および方法
材料
ゲラン酸、重炭酸コリン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、FITC-インスリン、FITC-デキストラン、カプリン酸ナトリウム（純度98％）、ムチン、およびヒトインスリンはSigma-Aldrich（St. Louis、MO、USA）から購入し、ウシトリプシンはMP Biomedicals（Santa Ana、CA、USA）から得た。Caco-2ヒト結腸直腸腺がん細胞はAmerican Type Culture Collection（Manassas、VA、USA）から買い、フェノールレッド、ウシ胎仔血清（FBS）、ペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）溶液を含むまたは含まないダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）、ならびに0.25％ トリプシン溶液はThermo Fisher Scientific（Waltham、MA、USA）から購入した。基礎播種培地（BSM）を含む腸上皮増殖培地、腸細胞分化培地（EDM）、およびMITO+ シーラムイクステンダーはCorning（Corning、NY、USA）から購入した。Millicell（登録商標）-PCF細胞培養インサート（孔径3.0μm、直径12 mm）およびTEER測定デバイスMillicell（登録商標）-ERSはMillipore Sigma（Burlington、MA、USA）から得て、TEER測定電極はWorld Precision Instruments, Inc（Sarasota、FL、USA）から得た。パラホルムアルデヒド（16％ w/v）および塩酸メトクロプラミドはAlfa Aesar（Ward Hill、MA、USA）から購入し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩（DAPI）とともにVectashield Hardset（商標）をVector laboratories Inc（Burlingame、CA、USA）から得た。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）細胞毒性キットおよびヒトインスリンELISAキットはThermoFisher Scientific（Waltham、MA、USA）から得た。200〜300 gの間の重量のWistar雄ラットはCharles River Laboratories（Wilmington、MA、USA）から購入し、血中グルコース測定メーター（Aimstrip plus）をそのストリップとともにFisher Scientific（Pittsburgh、PA、USA）から購入した。カプセル経口経管栄養およびサイズ9の細長いカプセルはTorpac（Fairfield、MA、USA）から得た。ヘマトキシリンおよびエオシン溶液はSigma Aldrich（St. Louis、MO、USA）から購入した。使用した他のすべての試薬は分析グレードのものであった。
【０３５６】
CAGEおよびインスリン-CAGEの調製
本発明者らの以前の研究（38）に従ってCAGEを合成した。手短に言えば、不純物を除去するために＜−70℃のアセトン中で少なくとも5回再結晶させた2当量のゲラン酸のみ（20 g、0.119モル）を500 mL丸底フラスコ内の1当量の重炭酸コリン（80 wt％溶液、12.275 g、0.059モル）に添加した。CO2の放出が止まるまで混合物を40℃で攪拌し、60℃で2時間の回転蒸発、続いて真空オーブンにおいて60℃で48時間乾燥させることにより水を除去した。25℃における物理的特徴評価は、以前の値と良好な一致を示した。NMRスペクトル（500-MHz Varian機器、Palo Alto、CAを使用して収集）も以前の調製物と良好に一致した：
2021503468.tif 000025
インスリン-CAGEは、所定の量のインスリン粉末を特定の体積のCAGEに添加し、続いて5分間ボルテックスすることにより調製した。
【０３５７】
CAGEは、腸の単層を横切るインスリンの輸送を有意に増強した
0、10、25、および50 mMのCAGEを使用して、Caco-2単層を横切るフルオレセインイソチオシアネート（FITC）-インスリンの5時間長の輸送実験を開発した。両群において、FITC-インスリン輸送は研究全体を通して時間とともに着実に増加したが、50 mMのインスリン-CAGE処理細胞は、CAGEなしの対照細胞と比較して、開始から有意にとても高い輸送を示した（図36）。50 mM CAGEで処理した単層では、未処理の細胞と比較して、すべての時点において＞10倍高いインスリン輸送が観察された。一方、10および25 mMのCAGEは、FITC-インスリン輸送を1.5〜2倍増強した。
【０３５８】
これらの結果は、研究の最後の5時間の時点におけるトランスウェル膜の共焦点画像を通じて裏付けられた。画像は、対照細胞と比較して、CAGEの増加する濃度とともにCaco-2細胞によるFITC-インスリンのより高い取り込みを明らかに示す（図36）。
【０３５９】
腸細胞を横切るCAGE媒介薬物輸送は、主として傍細胞性である
腸上皮を横切る分子の輸送は、傍細胞性または経細胞性のいずれかであり得る。Caco-2単層を横切る薬物の輸送をCAGEが増強する機構を査定するために、様々な濃度のCAGEの存在下において、傍細胞および受動経細胞輸送の両方を、それらの輸送に特異的なマーカーを使用して調査した。この目的のために、4 kDa FITC-デキストラン（傍細胞輸送の特異的マーカー）の輸送を評価した。
【０３６０】
インスリンのサイズと類似したサイズを有する4 kDa FITC-デキストランの輸送も、25および50 mM CAGEの存在下で、様々な時点においてそれぞれ2〜6および6〜13倍に有意に増強された（図38）。しかしながら、CAGEが分子の傍細胞輸送を改善したかどうかを確認するために、様々な濃度のCAGEで処理されたCaco-2細胞の密着結合の完全性を、経上皮電気抵抗（TEER）を測定し、確立された透過促進剤であるカプリン酸ナトリウムと比較することで評価した（図39）。対照細胞では、TEERは最初の3時間でわずかに約10％降下し、その後5時間までに初期値に回復し、研究の最後の24時間の時点まで変化しなかった。しかしながら、10 mM CAGEで処理した際には、TEERは1時間で29％降下し、1および5時間の時点では対照と有意に異なった。このTEERの降下は過渡的であることが見出され、細胞は24時間以内に密着結合の完全性を完全に回復した。
【０３６１】
密着結合の完全性は、25 mM（約40％降下）および50 mM CAGE（約50％降下）とともにインキュベートした際も有意に減少した。しかしながら、25 mM CAGEでは初期レベルの約90％の良好な回復が観察された。50 mM CAGEでは、TEERは24時間で初期レベルの58％にわずかに回復した。一方、カプリン酸ナトリウムが原因のTEERの降下は50 mM CAGEのものと類似していたが、この群における密着結合の完全性は、研究の最後の24時間の時点までに初期レベルの36％にさらに減少した。10〜25 mM CAGEによってもたらされたTEERの変化は、これらの濃度において、細胞を横切るインスリン輸送を助ける腸の密着結合をCAGEが一時的に開かせることを示唆している。粘液浸透および酵素分解に対する安定性などの、CAGEによって媒介される他の経口吸収増強機構も引き続いて査定した。
【０３６２】
96ウェルプレートおよびトランスウェルにおけるCaco-2単層培養
トランスウェルにおける輸送実験のために、3日間の急速なCaco-2増殖システムを使用した。MITOシーラム+ イクステンダーを補充したCorning（登録商標）の基礎播種培地（BSM）に細胞を配置し、24ウェルプレートの内部に配置されたMillicell（登録商標）のPCFインサート上に400,000細胞/mLの密度で播種した。製造業者の推奨に従って、培地を含む500μLの細胞を頂端側に配置し、1000μLの無細胞BSMを基底外側に置いた。37℃、5％ CO2で24時間インキュベートした後、さらに2〜4日間にわたって、MITOシーラム+ イクステンダーを補充した同量の腸細胞分化培地に培地を置き換えた。定期的にTEERを測定し、細胞間の十分な密着結合の完全性を示す200 ohms.cm2より上に到達したときに輸送研究を実行した。
【０３６３】
インビトロにおけるインスリン輸送アッセイ
実験を開始する前に、頂端側（200μL）および基底外側（600μL）の両方において、トランスウェル中の既存の培地を、フェノールレッド、ウシ胎仔血清（FBS）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）を含まないDMEMに置き換え、細胞を30分間インキュベートした。その後、頂端側の培地を、10、25、もしくは50 mM CAGEを含ませてまたは含ませずに調製し、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに可溶化した200μLの500μg/mL FITC-インスリンに置き換えた。頂端側にFITC-インスリンを添加した直後に、100μLのアリコートを基底外側から取り除き、等量の新鮮なDMEMに置き換えた。これを1、2、3、4、および5時間の時点で繰り返した。研究の間、トランスウェルプレートを37℃、5％ CO2のインキュベーターの内部で100 rpmで回転している振盪機の上に配置し、前述の期間にだけ取り出してアリコートを除去した。研究の最後の5時間の時点の後に、プレートリーダー（Tecan、Infinite M1000、Mannedorf、Switzerland）を使用して、495／520 nmの励起／発光波長でアリコートのFITC-インスリン濃度を測定し、時間に対するFITC-インスリン輸送の％としてプロットした。さらに、トランスウェルからアリコートを取り除いたすべての時点でTEERを測定し、時間に対する基底外側チャンバー濃度としてプロットした。
【０３６４】
Caco-2細胞によるFITC-インスリン取り込みの定性分析のために、FITC-インスリン輸送研究からのトランスウェルを研究の最後にHBSSで2回洗浄し、続いて100μLの4％ パラホルムアルデヒドを添加し、4℃に一晩保った。翌日、ウェルからパラホルムアルデヒドを吸引し、膜をPBSで2回洗浄し、トランスウェル膜を切り、スライドグラス上に静かに配置した。（4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩）DAPIを含む封入剤を膜に添加し、カバーグラスで覆った。Olympus Fluoview（商標）1000スペクトル共焦点機器を40倍の倍率で使用して膜の共焦点イメージングを撮影した。
【０３６５】
インビトロにおけるFITC-デキストラン輸送アッセイ
実験を開始する前に、頂端側（200μL）および基底外側（600μL）の両方において、トランスウェル中の培地を、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに置き換え、細胞を30分間インキュベートした。その後、頂端側の培地を、10、25、および50 mM CAGEを含ませてまたは含ませずに調製し、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに可溶化した、DMSO中（最終濃度10％）の200μLの500μg/mL 4 kDa FITC-デキストランに置き換えた。頂端側に被験物質を添加した直後に、100μLのアリコートを基底外側から取り除き、等量の新鮮なDMEMに置き換えた。これを1、2、3、4、および5時間の時点で繰り返した。研究の間、トランスウェルプレートを37℃、5％ CO2のインキュベーターの内部で100 rpmで回転している振盪機の上に配置し、各時点にだけ取り出してアリコートを除去した。研究の最後の5時間の時点の後に、プレートリーダー（BioTek Synergy NEO HTS（商標）マイクロプレートリーダー(Winooski、VT、USA)）を使用して、それぞれ485／530、495／520、および468／568 nmの励起／発光波長でFTIC-デキストラン濃度を有するアリコート中の蛍光を測定した。各被験物質についての較正溶液を調製し、FITC-デキストランの蛍光読み取り値を使用して解析し、時間に対する基底外側チャンバー濃度プロットのプロットに使用した。
【０３６６】
TEER値に対するCAGEおよびカプリン酸ナトリウムの効果
実験を開始する前に、頂端側（200μL）および基底外側（600μL）の両方において、トランスウェル中の既存の培地を、フェノールレッド、FBS、およびP/Sを含まないDMEMに置き換え、細胞を少なくとも30分間インキュベートした。各インサートについてTEER値を記録した。その後、頂端側の培地を、200μLの10、25、および50 mM CAGEのいずれかまたは10 mM カプリン酸ナトリウムに置き換えた。研究の間、トランスウェルプレートを37℃、5％ CO2のインキュベーターの内部で100 rpmで回転している振盪機の上に配置し、1、2、3、4、5、および24時間の時点で追加のTEER測定を実行するためにだけ取り出した。時間に対する初期値からの％変化としてTEERをプロットした。
【０３６７】
実施例10
緩衝液対照と比較して、CAGEはインスリンのトリプシン消化を有意に妨害した（図40）。これは、特に1時間からずっと研究の最後の24時間の時点まで指摘された。より早い期間における酵素分解に対する保護は、無傷のインスリンの最大限の経口吸収を可能にするのに決定的である。
【０３６８】
CAGEは、物理的障壁を形成し、腸の酵素のタンパク質分解活性を穏やかにして、搭載されたインスリンに対する腸の酵素の接近を限定することにより、酵素分解を予防する可能性が高い。酵素活性は周囲の環境によっても調節され、ILはアセトニトリルのような極性有機溶媒と同程度に酵素の表面から水を除去できることが分子動力学シミュレーション研究により示されている。この情報および本発明者らの機構研究に基づいて、CAGEがインスリンを酵素分解から保護することが本明細書において企図される。
【０３６９】
インスリンの酵素分解は、CAGEによって有意に減衰した
インビボにおいてCAGEを用いて観察されたインスリンの薬物動態／薬力学の改善は、腸のタンパク質分解環境におけるCAGE中のインスリンの安定性の改善が原因であり得ると仮定された。この目的のために、CAGE中のインスリンまたは緩衝液中のインスリンをトリプシンとともに24時間インキュベートし、溶液中に残っている無傷のインスリンのパーセンテージを様々な時点で測定した。結果は、CAGEが緩衝液対照と比較して、1時間からずっとインスリンのタンパク質分解を有意に（p＜0.001）とても予防したことを示している（図40）。CAGEとともに2時間インキュベートした後では、インスリン分解において29％の差が得られた。研究の最後の24時間の時点には、緩衝液対照中のインスリンは概ね完全に分解されたが（5±0.4％のみが無傷）、CAGE中のインスリンの約4分の1はなお無傷のままであった（24±0.2％）。この研究は、タンパク質分解に対してCAGEがインスリンに有意な安定性を提供し、これは、経口取り込み後の腸の部位および体循環の両方において、薬物の半減期を改善する役割を果たすかもしれないことを明らかに説明した。
【０３７０】
材料および方法 
材料
ゲラン酸、重炭酸コリン、ジメチルスルホキシド（DMSO）、FITC-インスリン、FITC-デキストラン、カプリン酸ナトリウム（純度98％）、ムチン、およびヒトインスリンはSigma-Aldrich（St. Louis、MO、USA）から購入し、ウシトリプシンはMP Biomedicals（Santa Ana、CA、USA）から得た。Caco-2ヒト結腸直腸腺がん細胞はAmerican Type Culture Collection（Manassas、VA、USA）から買い、フェノールレッド、ウシ胎仔血清（FBS）、ペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）溶液を含むまたは含まないダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）、ならびに0.25％ トリプシン溶液はThermo Fisher Scientific（Waltham、MA、USA）から購入した。基礎播種培地（BSM）を含む腸上皮増殖培地、腸細胞分化培地（EDM）、およびMITO+ シーラムイクステンダーはCorning（Corning、NY、USA）から購入した。Millicell（登録商標）-PCF細胞培養インサート（孔径3.0μm、直径12 mm）およびTEER測定デバイスMillicell（登録商標）-ERSはMillipore Sigma（Burlington、MA、USA）から得て、TEER測定電極はWorld Precision Instruments, Inc（Sarasota、FL、USA）から得た。パラホルムアルデヒド（16％ w/v）および塩酸メトクロプラミドはAlfa Aesar（Ward Hill、MA、USA）から購入し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩（DAPI）とともにVectashield Hardset（商標）をVector laboratories Inc（Burlingame、CA、USA）から得た。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）細胞毒性キットおよびヒトインスリンELISAキットはThermoFisher Scientific（Waltham、MA、USA）から得た。200〜300 gの間の重量のWistar雄ラットはCharles River Laboratories（Wilmington、MA、USA）から購入し、血中グルコース測定メーター（Aimstrip plus）をそのストリップとともにFisher Scientific（Pittsburgh、PA、USA）から購入した。カプセル経口経管栄養およびサイズ9の細長いカプセルはTorpac（Fairfield、MA、USA）から得た。ヘマトキシリンおよびエオシン溶液はSigma Aldrich（St. Louis、MO、USA）から購入した。使用した他のすべての試薬は分析グレードのものであった。
【０３７１】
CAGEおよびインスリン-CAGEの調製
本発明者らの以前の研究（38）に従ってCAGEを合成した。手短に言えば、不純物を除去するために＜−70℃のアセトン中で少なくとも5回再結晶させた2当量のゲラン酸のみ（20 g、0.119モル）を500 mL丸底フラスコ内の1当量の重炭酸コリン（80 wt％溶液、12.275 g、0.059モル）に添加した。CO2の放出が止まるまで混合物を40℃で攪拌し、60℃で2時間の回転蒸発、続いて真空オーブンにおいて60℃で48時間乾燥させることにより水を除去した。25℃における物理的特徴評価は、以前の値と良好な一致を示した。NMRスペクトル（500-MHz Varian機器、Palo Alto、CAを使用して収集）も以前の調製物と良好に一致した：
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インスリン-CAGEは、所定の量のインスリン粉末を特定の体積のCAGEに添加し、続いて5分間ボルテックスすることにより調製した。
【０３７２】
データ解析
すべてのデータは平均±標準誤差（S.E.）として表示される。統計解析のために、スチューデントT-検定を利用した。p＜0.05で有意差とみなした。すべての実験は少なくとも三重に行った。
【０３７３】
インスリンの分解に対するCAGEの効果
インスリンのトリプシン媒介分解に対するCAGEの効果を、等モル濃度のヒトインスリンおよびウシトリプシンを含む溶液において37℃で研究した。手短に言えば、2 mLのCAGEのみまたはインスリンのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）溶液（86μM）を3 mLのトリプシンのDPBS溶液（57μM）に添加し、ボルテックスし、37℃でインキュベートした。ボルテックスの直後（時間＝0h；t0）および所定の時間間隔で、0.1 mLのインスリン-トリプシン混合物を等分し、0.1 mLの氷冷0.1％ トリフルオロ酢酸／アセトニトリル溶液（69：31、v/v）を添加することにより酵素活性を阻害した。異なる時点における溶液中の無傷のインスリンの量を決定するために、液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）で試料を解析した。解析には、1290 Infinity LC（商標）バイナリポンプ、サーモスタットカラム区画、1290 Infinityオートサンプラー、Agilent 1290ダイオードアレイ検出器、およびAgilent 6140四重極MSDシステムで構成されるAgilent 1290/6140超高性能液体クロマトグラフィー／質量分析計を使用した。解析のために、3μLの試料をAgilent 300SB-C18、2.1×75 mm、5μmへ注入し、25℃に維持し、0.1％ ギ酸（FA）（A）および0.1％ FAを含むアセトニトリル（B）を含む脱イオン水の勾配混合液からなる移動相で溶出した。95〜5％（0分間）、0〜100％（10分間）、0〜100％（15分間）、95〜5％（15.1分間）、95〜5％（18分間）のA：B勾配を各実行で使用した。質量分析計は、（M＋5H）＋5および（M＋6H）＋6イオンについての選択されたイオンモニターモードで収集するように設定し、試料中に残っているインスリンを定量化するためにピーク面積を抽出した。t0のものと比較した、各時間間隔において残っているインスリンのパーセンテージを計算した。すべての実験は三重に行い、平均±標準偏差で報告されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月16日(2020.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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