(57)【要約】本開示は、試料から核酸を単離するための方法であって、（ａ）混合物を生成するために、試料、前記試料の可溶化液、前記可溶化液の上清または前記試料、前記可溶化液もしくは前記上清の一部を、１またはそれを超える第一の剤（例えば、タンパク質沈殿剤）および１またはそれを超える第二の剤（例えば、阻害物質除去剤）と接触させること、（ｂ）工程（ａ）の前記混合物を固相および液相に分離すること、ここで、前記１またはそれを超える第二の剤は、前記固相中に主に存在すること、（ｃ）工程（ｂ）の前記液相から核酸を単離することを含む方法を提供する。このような方法で有用な組成物およびキットも開示される。１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤と１またはそれを超えるホスフェートを含む溶解試薬を用いて、試料、特に土壌または便試料などの複雑な試料から可溶化液を調製するための方法、組成物およびキットがさらに開示される。
2021520823.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から核酸を単離するための方法であって、
（ａ）混合物を得るために、試料、前記試料の可溶化液もしくは前記可溶化液の上清、または前記試料、前記可溶化液もしくは前記上清の一部を、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤ならびに塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤と接触させること、
（ｂ）工程（ａ）の混合物を固相および液相に分離すること、ここで、前記１またはそれを超える第二の剤は、前記固相中に主に存在し、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の液相から核酸を単離すること、
を含む方法。
【請求項２】
第一の剤が酢酸アンモニウムであり、および第二の剤が塩化アルミニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）の混合物中の１またはそれを超える第一の剤の総濃度が、０．１〜３Ｍ、例えば、０．１〜０．２５Ｍ、０．２５〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜２．５Ｍ、２．５〜３Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜２．５Ｍ、０．１〜３Ｍ、０．２５〜１Ｍ、０．２５〜１．５Ｍ、０．２５〜２Ｍ、０．２５〜２．５Ｍ、０．２５〜３Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜２．５Ｍ、０．５〜３Ｍ、１〜２Ｍ、１〜２．５Ｍ、１〜３Ｍ、２〜３Ｍ、好ましくは０．５〜２．５Ｍまたは１〜２Ｍである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）の混合物中の１またはそれを超える第二の剤の総濃度が、１〜１５０ｍＭ、例えば、１〜５ｍＭ、５〜２５ｍＭ、２５〜５０ｍＭ、５０〜７５ｍＭ、７５〜１００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、１〜２５ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜７５ｍＭ、１〜１００ｍＭ、１〜１５０ｍＭ、５〜５０ｍＭ、５〜７５ｍＭ、５〜１００ｍＭ、５〜１５０ｍＭ、２５〜７５ｍＭ、２５〜１００ｍＭ、２５〜１５０ｍＭ、５０〜１００ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ、７５〜１５０ｍＭ、好ましくは、５〜２５ｍＭまたは５〜５０ｍＭの範囲にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）で単離された核酸がＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
試料が、便試料、植物試料または環境試料、好ましくは、土壌、水または空気試料である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）が、前記試料、前記試料の可溶化液もしくは前記可溶化液の上清、または前記試料、前記可溶化液もしくは前記上清の一部を、１またはそれを超える第一の剤および１またはそれを超える第二の剤を含む組成物と接触させることによって実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料、前記試料の可溶化液または前記可溶化液の上清を１またはそれを超える第一の剤と接触させることと、前記試料、前記試料の可溶化液または前記可溶化液の上清を１またはそれを超える第二の剤と接触させることとの間に、沈殿、遠心分離またはろ過が実施されない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）が、
（ａ）（１）混合物を生成するために、前記試料、前記試料の可溶化液または前記可溶化液の上清を１またはそれを超える第一の剤と接触させること、
（ａ）（２）液相を得るために、工程（ａ）（１）の混合物を沈殿、遠心分離またはろ過すること、および
（ａ）（３）（ａ）（２）の液相を１またはそれを超える第二の剤と接触させること、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）が、溶解試薬の存在下で実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶解試薬が、チオシアン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸リチウム、過塩素酸リチウム、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせから選択されるカオトロピック剤を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶解試薬が、１またはそれを超えるホスフェートをさらに含む、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ホスフェートが、１またはそれを超える以下の特徴：
ａ）ホスフェート二塩基性である、
ｂ）ホスフェート中の陽イオン性部分がアンモニウム、ナトリウム、カリウムまたはリチウムから選択される、
ｃ）リン酸ナトリウム二塩基性である、
を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
溶解試薬が、チオシアン酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウム二塩基性を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
試料の可溶化液を生成するために、試料または試料の一部を溶解試薬と接触させることをさらに含み、工程（ａ）が、前記試料の可溶化液、前記可溶化液の上清、または前記可溶化液もしくは前記上清の一部を、１またはそれを超える第一の剤および１またはそれを超える第二の剤と接触させることを含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
溶解試薬中の１またはそれを超えるカオトロピック剤の総濃度が、０．０５〜５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜５Ｍ、好ましくは０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍの範囲にある、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
可溶化液中の１またはそれを超えるカオトロピック剤の最終濃度が合計で、０．０１〜４Ｍ、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜４Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．０１〜４Ｍ、０．０５〜０．５Ｍ、０．０５〜１Ｍ、０．０５〜１．５Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜４Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜４Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜４Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜４Ｍ、好ましくは、０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍである、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
溶解試薬中の１またはそれを超えるホスフェートの総濃度が、０．０５〜０．５Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍである、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
可溶化液中の１またはそれを超えるホスフェートの最終濃度が合計で、０．０１〜０．４Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍである、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
試料が、工程（ａ）において１またはそれを超える第二の剤と複合体を形成する混入物または阻害物質を含み、前記複合体が、１またはそれを超える第二の剤によって、工程（ｂ）の液相から沈殿および除去される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
（ｄ）工程（ｃ）で単離された核酸を分析すること、
をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｄ）が、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたは核酸配列決定を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）中の試料の量が、１グラム未満、好ましくは、０．５グラム未満である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤と、
（ｉｉ）塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤と、ならびに
（ｉｉｉ）必要に応じて水と、
を含む、から本質的になる、またはからなる、試料から核酸を単離するための組成物。
【請求項２５】
１またはそれを超える第一の剤が、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸セシウムまたはこれらの組み合わせであり、および第二の剤が塩化アルミニウムである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が水溶液である、請求項２４または請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
１またはそれを超える第一の剤の総濃度が、０．５〜１０Ｍ、例えば、０．５〜２．５Ｍ、２．５〜５Ｍ、５〜７．５Ｍ、７．５〜１０Ｍ、０．５〜５Ｍ、０．５〜７．５Ｍ、０．５〜１０Ｍ、２．５〜７．５Ｍ、２．５〜１０Ｍ、５〜１０Ｍ、好ましくは、０．５〜５Ｍ、０．５〜７．５Ｍ、２．５〜５Ｍ、２．５〜７．５Ｍ、１〜８Ｍまたは１．５〜７．５Ｍの範囲にある、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
１またはそれを超える第二の剤の総濃度が、１０〜５００ｍＭ、例えば、１０〜１００ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜５００ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、２００〜５００ｍＭ、３００〜５００ｍＭ、好ましくは、１０〜２００ｍＭ、１０〜５００ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜５００ｍＭまたは７５〜１５０ｍＭの範囲にある、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
試料から核酸を単離するためのキットであって、
（ａ）請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物、
または
（ｂ）（ｉ）酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤と、
（ｉｉ）塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤、
を含む、キット。
【請求項３０】
キットが、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
１またはそれを超える第一の剤が、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸セシウムまたはこれらの組み合わせであり、および第二の剤が塩化アルミニウムである、請求項２９または請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
核酸結合固体支持体をさらに含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
ＤＮＡ結合溶液、ＤＮＡ洗浄溶液、ＤＮＡ溶出溶液、ＲＮＡ結合溶液、ＲＮＡ洗浄溶液およびＲＮＡ溶出溶液から選択される１またはそれを超える溶液をさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
溶解試薬をさらに含む、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記溶解試薬が、チオシアン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸リチウム、過塩素酸リチウム、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超えるカオトロピック剤を含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記溶解試薬が、１またはそれを超えるホスフェートをさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記溶解試薬が、リン酸ナトリウム二塩基性およびチオシアン酸ナトリウムを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
溶解試薬中の１またはそれを超えるカオトロピック剤の総濃度が、０．０５〜５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜５Ｍ、好ましくは０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍの範囲にある、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
１またはそれを超えるホスフェートの総濃度が、０．０５〜０．５Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
試料から可溶化液を調製するための方法であって、
（ａ）可溶化液を生成するために、試料を、１またはそれを超えるホスフェートとチオシアン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸リチウム、過塩素酸リチウム、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超えるカオトロピック剤とを含む溶解試薬と接触させること、を含む方法。
【請求項４１】
前記溶解試薬が、リン酸ナトリウム二塩基性およびチオシアン酸ナトリウムを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記溶解試薬中の１またはそれを超えるホスフェートの総濃度が、０．０５〜０．５Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍの範囲にある、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記可溶化液中の１またはそれを超えるホスフェートの最終濃度が合計で、０．０１〜０．４Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍの範囲にある、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記溶解試薬中の１またはそれを超えるカオトロピック剤の総濃度が、０．０５〜５Ｍ、例えば、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜５Ｍ、好ましくは、０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍの範囲にある、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記可溶化液中の１またはそれを超えるカオトロピック剤の総濃度が、０．０１〜４Ｍ、例えば、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜４Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．０１〜４Ｍ、０．０５〜０．５Ｍ、０．０５〜１Ｍ、０．０５〜１．５Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜４Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜４Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜４Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜４Ｍ、好ましくは、０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍの範囲にある、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が、便試料、植物試料または環境試料、好ましくは、土壌、水または空気試料である、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料の機械的破壊をさらに含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記機械的破壊が高密度ビーズを用いて実施される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
（ｂ）前記可溶化液、前記可溶化液の上清または前記可溶化液もしくは前記可溶化液の前記上清の一部を、タンパク質沈殿剤および１またはそれを超える阻害物質除去剤と接触させること、
をさらに含む、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記１またはそれを超えるタンパク質沈殿剤が、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記１またはそれを超える阻害物質除去剤が、塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせから選択される、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記１またはそれを超える阻害物質除去剤が、硫酸アンモニウムアルミニウム、硫酸アンモニウムアルミニウム１２水和物、硫酸カリウムアルミニウム、アルミニウムクロロハイドレート、硫酸アルミニウム、酸化カルシウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ）、アルミン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、塩化マグネシウムおよびこれらの組み合わせから選択される、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
（ｃ）工程（ｂ）の混合物から上清を得るために、工程（ｂ）の混合物を遠心分離すること、および
（ｄ）工程（ｃ）の上清から核酸を単離すること、
をさらに含む、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）チオシアン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸リチウム、過塩素酸リチウム、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超えるカオトロピック剤と、
（ｂ）１またはそれを超えるホスフェートと、
を含む溶解試薬。
【請求項５５】
前記溶解試薬が、リン酸ナトリウム二塩基性およびチオシアン酸ナトリウムを含む、請求項５４に記載の溶解試薬。
【請求項５６】
前記溶解試薬が溶液であり、前記溶液中の１またはそれを超えるカオトロピック剤の総濃度は、０．０５〜５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜５Ｍ、好ましくは０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍの範囲にある、請求項５４または請求項５５に記載の溶解試薬。
【請求項５７】
前記溶液中の１またはそれを超えるホスフェートの総濃度が、０．０５〜０．５Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍの範囲にある、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の溶解試薬。
【請求項５８】
試料から可溶化液を調製するためのキットであって、
（ｉ）（ａ）請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の溶解試薬、
または
（ｂ）（１）チオシアン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸リチウム、過塩素酸リチウム、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超えるカオトロピック剤と、
（２）１またはそれを超えるホスフェート、
を含む、キット。
【請求項５９】
（ｉｉ）前記試料の機械的破壊に適した高密度ビーズ、
をさらに含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
（ｉｉｉ）アミノ酸；短鎖脂肪酸の塩、例えば、酪酸ナトリウム；ポリスチレンスルホン酸ナトリウム；ポリアクリル酸ナトリウム；好ましくは、硫酸アンモニウム、グリコール酸アンモニウム、スルホ酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸セシウム、酢酸アンモニウム、β−アラニン、硫酸グアニジン、ヒスチジン、グリシンおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤、
をさらに含む請求項５８または請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記１またはそれを超える第一の剤が、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される、請求項５８または請求項５９に記載のキット。
【請求項６２】
（ｉｖ）塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ハフニウム（ＩＶ）、硫酸アンモニウムアルミニウム、硫酸アンモニウムアルミニウム１２水和物、硫酸カリウムアルミニウム、アルミニウムクロロハイドレート、酸化カルシウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ）、アルミン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、塩化マグネシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤、
をさらに含む、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６３】
前記１またはそれを超える第二の剤が、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ハフニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される、請求項６２に記載のキット。
【請求項６４】
前記第二の剤が硫酸アンモニウムアルミニウムまたは硫酸アンモニウムアルミニウム１２水和物である、請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
前記１またはそれを超える第一の剤および前記１またはそれを超える第二の剤が組成物を形成する、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６６】
前記組成物が溶液である、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記溶液中の１またはそれを超える第一の剤の総濃度が、０．５Ｍ〜１０Ｍ、例えば、１〜８Ｍまたは１．５〜７．５Ｍまたは０．１〜１Ｍ、例えば０．１〜０．７５Ｍの範囲にある、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記溶液中の１またはそれを超える第二の剤の総濃度が、０．０１Ｍ〜０．５Ｍ、０．０５〜０．２Ｍまたは０．０７５〜０．１５Ｍの範囲にある、請求項６６または請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
核酸結合固体支持体をさらに含む、請求項５８〜６８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７０】
ＤＮＡ結合溶液、ＤＮＡ洗浄溶液、ＤＮＡ溶出溶液、ＲＮＡ結合溶液、ＲＮＡ洗浄溶液およびＲＮＡ溶出溶液から選択される１またはそれを超える溶液をさらに含む、請求項５８〜６９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７１】
タンパク質結合固相をさらに含む、請求項５８〜７０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７２】
タンパク質結合溶液、タンパク質洗浄溶液およびタンパク質溶出溶液の１またはそれより多くをさらに含む、請求項５８〜７１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
技術分野
本開示は、試料の溶解ならびに土壌または便試料などの複雑な試料など、試料からの核酸の単離および阻害物質の除去に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
分子生物学ならびに疾患診断、法医学、食品科学および環境科学を含む関連分野において、高い収率と純度で核酸を単離することは極めて重要である。既存の技術は、土壌試料および便試料のような環境試料など、ある種の試料中の核酸を単離するときに低収率および／または低純度という問題を抱える。混入物質および阻害物質の存在は、単離された核酸の下流での分析を妨害する。特に、場合によっては、上記試料材料は、膨大な量の極めて多様な妨害成分を含有し、極めて複雑であるので、試料材料から生体分子を単離および精製するときに、多数の相互作用が起こり得る。既存の技術の欠点は、１つには、このような複雑な試料を溶解するための効果的な方法が存在しないことによる。さらに、特に、同じ試料からいくつかの異なる生体分子を単離し、およびまたは精製することが予定される場合には、阻害成分の除去は極めて困難である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
要旨
本開示は、試料由来の混入分子を枯渇させながら、核酸を単離するための方法、組成物およびキットを提供する。さらに、本開示は、試料から可溶化液を調製するための方法、組成物およびキットを提供する。
【０００４】
一態様において、本開示は、試料から核酸を単離するための方法であって、
（ａ）  混合物を得るために、試料、前記試料の可溶化液もしくは前記可溶化液の上清または前記試料、前記可溶化液もしくは前記上清の一部を、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤ならびに塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤と接触させること、
（ｂ）  工程（ａ）の前記混合物を、固相および液相に分離すること、ここで、前記１またはそれを超える第二の剤は、主として前記固相中にあり、ならびに
（ｃ）  工程（ｂ）の前記液相から核酸を単離すること、
を含む、方法を提供する。
【０００５】
別の態様において、本願は、試料から核酸を単離するための組成物であって、
（ｉ）  酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤と、
（ｉｉ）  塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤と、ならびに
（ｉｉｉ）  必要に応じて水と、
を含む、から本質的になる、またはからなる組成物を提供する。
【０００６】
別の態様において、本開示は、試料から核酸を単離するためのキットであって、
（ａ）  本明細書において提供される組成物、
または
（ｂ）
（ｉ）  酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤、ならびに
（ｉｉ）  塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤、
を含むキットを提供する。
【０００７】
別の態様において、本開示は、試料から可溶化液を調製するための方法であって、
（ａ）  可溶化液を生成するために、試料を、１またはそれを超えるホスフェートとチオシアン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸リチウム、過塩素酸リチウム、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせから選択されるカオトロピック剤とを含む溶解試薬と接触させること、を含む方法を提供する。
【０００８】
別の態様において、本開示は、溶解試薬であって、
（ａ）  チオシアン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸リチウム、過塩素酸リチウム、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせから選択されるカオトロピック剤と、
（ｂ）  １またはそれを超えるホスフェートと、
を含む溶解試薬を提供する。
【０００９】
別の態様において、本開示は、試料から可溶化液を調製するためのキットであって、
（ｉ）（ａ）  本明細書において提供される溶解試薬、
または
（ｂ）（１）  チオシアン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸リチウム、過塩素酸リチウム、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせから選択されるカオトロピック剤と、
（２）  １またはそれを超えるホスフェート、
を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１に従って単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００１１】
【図２】図２は、実施例２に従って単離されたＤＮＡ（上のパネル）、ＲＮＡ（中央のパネル）およびタンパク質（下のパネル）のゲル電気泳動を示す。
【００１２】
【図３】図３は、実施例３に従って単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００１３】
【図４】図４は、実施例４に従って単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００１４】
【図５】図５は、実施例５に従って単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００１５】
【図６Ａ】図６Ａは、ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用いて単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００１６】
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００１７】
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＰｏｗｅｒＦｅｃａｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００１８】
【図６Ｄ】図６Ｄは、本開示の例示的な方法（「新技術」）を用いて単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００１９】
【図６Ｅ】図６Ｅは、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて測定された、異なるキットを用いて糞便試料から単離されたＤＮＡの濃度を示すグラフである。
【００２０】
【図６Ｆ】図６Ｆは、Ｑｕｂｉｔを用いて測定された、異なるキットを用いて糞便試料から単離されたＤＮＡの濃度を示すグラフである。
【００２１】
【図７】図７は、実施例７に従って単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００２２】
【図８】図８は、実施例８に従って単離されたＤＮＡ（上側左）およびＲＮＡ（下側左）のゲル電気泳動ならびにＤＮＡ（上側右）およびＲＮＡ（下側右）の収率および純度を示す。
【００２３】
【図９】図９は、実施例９に従って単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００２４】
【図１０】図１０は、実施例１０に従って単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００２５】
【図１１】図１１は、実施例１１に従って単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【００２６】
【図１２】図１２は、実施例１２に従って単離されたＤＮＡのゲル電気泳動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
本開示は、試料から、特に、土壌試料および便試料のような環境などの複雑な試料からＤＮＡおよびＲＮＡを可溶化するために、試料を効果的に溶解するための方法、組成物およびキットを提供する。本明細書において提供される方法は、１またはそれを超えるホスフェートと、試料溶解の間に核酸を著しく分解することなく核酸を効果的に可溶化するための１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤とを含む溶解試薬を使用する。
【００２８】
さらに、本開示は、試料から、特に、土壌試料および便試料のような環境試料などの複雑な試料から単離された核酸から、混入物質（例えば、阻害物質）を効果的に除去するための方法、組成物およびキットも提供する。本明細書において提供される方法は、タンパク質および混入物質を沈殿させ、これらを核酸調製物から除去する上で、タンパク質沈殿剤および三価または四価の塩の新規組み合わせを使用する。
【００２９】
さらに、本明細書に開示されている試料溶解および阻害物質除去方法は、単離された核酸の完全性を犠牲にすることなく、核酸収率および純度を増加させるために互いに組み合わされ得る。
【００３０】
これらの方法は、ＲＮＡの量／ｇ土壌を犠牲にすることなく、著しくより少量の試料投入量、例えば、２ｇ〜２５０ｍｇを可能にする。これらの方法は、核酸単離の間に、スピンカラム型式での固体支持を使用し得、これにより自動化が可能になり、規模拡大および高処理量が容易になる。
【００３１】
以下の記述において、本明細書に提供されている任意の範囲は、その範囲中の全ての値を含む。
【００３２】
文脈上別段の指示がなければ、用語「または」は、「および／または」を含む意味で（すなわち、選択肢の一方、両方または選択肢の任意の組み合わせを意味するために）一般に使用されることにも留意すべきである。
【００３３】
また、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が反対の意味を指示しなければ、複数表記を含む。
【００３４】
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこれらの変形は同義的に使用され、非限定的に解釈されなければならない。
【００３５】
本明細書において使用される「これらの組み合わせ（ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」という用語は、本用語に先行する列記された項目の全ての可能な組み合わせのうちの１つを表す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃまたはこれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣのいずれか１つを表すことが意図される。同様に、本明細書において使用される「これらの組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ）」という用語は、本用語に先行する列記された項目の全ての可能な組み合わせを表す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃおよびこれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣおよびＡＢＣの全てを表すことが意図される。
【００３６】
Ｉ．  試料の溶解
一態様において、本開示は、試料を、１またはそれを超えるホスフェートと１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤とを含む溶解試薬と接触させることを含む、試料から可溶化液を調製するための方法を提供する。得られた可溶化液は、関心対象の生体分子（例えば、核酸、タンパク質）を単離または検出するために使用され得る。
【００３７】
Ａ．  試料
試料は、生体試料、環境試料および食品試料など、関心対象の生体分子を含有する任意の試料、特に、単離された核酸の調製物中に存在する場合、単離された核酸の下流での分析を妨害する阻害物質を含有する試料であり得る。
【００３８】
本明細書において使用される用語「生体試料」は、臓器、組織、細胞、体液（例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液または尿）、綿棒試料、便試料および植物試料（例えば、種子、葉、根、茎、花、細胞または植物組織培養由来の組織）を含むがこれらに限定されない、生物被験体から得られるまたは生物被験体によって産生される試料を表す。生体試料は、原核生物起源または真核生物起源であり得る。いくつかの実施形態において、生体試料は、哺乳動物、とくにヒトのものである。
【００３９】
本明細書において提供される方法は、便試料から生体分子を単離する上で特に有用である。便試料由来の生体分子（例えば、核酸）の分析によって、細菌およびウイルスの感染性因子の検出、食事、プロバイオティクスおよび抗生物質の使用から生じる変化のモニタリングならびに腫瘍特異的変化の検出が可能となり、腫瘍特異的変化の検出は、消化管の腫瘍の初期診断におけるパラメータとして使用され得る。
【００４０】
本明細書において使用される用語「環境試料」は、関心対象の生体分子を含有する任意の環境材料（すなわち、地球および空間中に含有される材料）を表す。環境材料は、土壌、水および空気中の材料であり得る。生体分子には、環境材料中の生きたまたは死んだ生物由来の生体分子が含まれる。
【００４１】
本明細書において使用される用語「土壌」は、土壌（例えば、鉢植え用混合物、泥）、堆積物（例えば、海洋堆積物、湖沼堆積物、河川堆積物）、堆肥（ｍａｎｕｒｅ）（ニワトリまたはシチメンショウのような家禽の堆肥、ウマの堆肥、ウシの堆肥、ヤギの堆肥、ヒツジの堆肥）、ごみ埋め立て地（ｌａｎｄｆｉｌｌ）、コンポストなどの環境試料を表す。
【００４２】
本明細書において使用される用語「食品試料」は、未加工食品、加工食品、肉、魚、家禽、植物、卵、乳製品、パン製品、チョコレート、ピーナッツバター、飲料などを含む、動物（例えば、ヒト）によって消費するための材料、物質または組成物を表す。食品試料には、食品試料を培地と接触させ、試料中に存在する場合に微生物が増殖するのに適した条件下でこの混合物をインキュベートすることによって作製される食品集積培養物も含まれ得る。
【００４３】
生体分子の分解を最小限に抑制しながら、生体分子を可溶化するその高い効率性のために、本開示の方法は、グラム試料当たりの核酸の取得量を犠牲にすることなく、伝統的に必要とされる（例えば、２グラム）より、少量の出発材料（例えば、１グラム未満、０．５グラム未満または０．２５グラム未満）の使用を可能にする。例えば、出発材料は、０．０１グラム〜１グラム、０．０１グラム〜０．５グラム、０．０１グラム〜０．２５グラム、０．０５グラム〜１グラム、０．０５グラム〜０．５グラム、０．０５グラム〜０．２５グラム、０．１グラム〜１グラム、０．１グラム〜０．５グラムまたは０．１グラム〜０．２５グラムの範囲にあり得る。
【００４４】
Ｂ．  溶解試薬
試料を収集した後に、その後の単離または検出のため、生体分子を放出するために、試料は、通例、溶解される。本明細書に開示されている方法に従う試料の溶解は、１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤および１またはそれを超えるホスフェート（および必要に応じて水）を含む、から本質的になる、またはからなる溶解試薬を使用する。
【００４５】
カオトロピック剤は、タンパク質および核酸などの高分子の構造を破壊し、タンパク質および核酸などの高分子を変性させる。カオトロピック溶質は、水素結合、ファンデルワールス力および疎水性効果などの、高分子構造および機能がそれに依存する非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨害することによって系のエントロピーを増加させる。例示的なカオトロピック剤としては、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジン、尿素またはリチウム塩が挙げられる。
【００４６】
「相対的に穏やかな」カオトロピック剤は、より強いカオトロピック剤であるチオシアン酸グアニジニウム（ＧｕＳＣＮ）または塩化グアニジニウム（ＧｕＣｌ）より少なくタンパク質を変性させるが、より弱いカオトロピック剤である塩化ナトリウムより多くタンパク質を変性させるカオトロピック剤を表す。したがって、このような相対的に穏やかなカオトロピック剤は、タンパク質を精製および／または単離するためにも使用され得る。このような相対的に穏やかな（「より少ない侵襲性の」とも称される）カオトロピック剤としては、相対的に強い陰イオンが相対的に弱い陽イオンと組み合わされまたは相対的に強い陽イオンが相対的に弱い陰イオンと組み合わされるある種のホフマイスター系列カオトロープ陽イオン／陰イオン組み合わせが挙げられる。
【００４７】
ホフマイスター系列は、イオンがタンパク質を塩析するまたは塩溶する能力の順番でのイオンの分類である。この塩の系列は、タンパク質の溶解度に対して、ならびにタンパク質の二次構造および三次構造の安定性に対して一貫した効果を有する。陰イオンは、陽イオンより大きな効果を有するようであり、例示的な陰イオンは、通常、以下のように順序付けられる。
ＣＯ３２−＞Ｆ−またはＳＯ４２−＞ＨＰＯ４２−＞アセテート＞Ｃｌ−＞Ｂｒ−＞ＮＯ３−＞ＣｌＯ３−＞Ｉ−＞ＣｌＯ４−＞ＳＣＮ−
【００４８】
例示的な陽イオンの順序は、通常、以下のように与えられる。
Ｎ（ＣＨ３）４＋＞Ｃｓ＋＞Ｒｂ＋＞ＮＨ４＋＞Ｋ＋＞Ｎａ＋＞Ｌｉ＋＞Ｍｇ２＋＞Ｃａ２＋＞グアニジニウム
【００４９】
例示的な相対的に穏やかなカオトロピック剤としては、ＮａＳＣＮ、ＮａＣＯ３、ＫＳＣＮ、ＮＨ４ＳＣＮ、ＬｉＳＣＮ、ＬｉＣｌＯ４、硫酸グアニジンおよびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、相対的に穏やかなカオトロピック剤は、ＮａＳＣＮまたはＮａＣＯ３である。
【００５０】
相対的に穏やかなカオトロピック剤としては、タンパク質を可溶化する上でＭｇ２＋より弱い陽イオンと対を成した強い陰イオン、ＳＣＮ−を有する塩；タンパク質を可溶化する上でＭｇ２＋より弱い陽イオンと対を成した強い陰イオン、ＣｌＯ４−を有する塩；およびタンパク質を可溶化する上でＮＨ４＋より強い陽イオンと対を成した弱い陰イオン、ＣＯ３２−を有する塩が挙げられ得る。
【００５１】
相対的に穏やかなカオトロピック剤（例えば、ＮａＳＣＮ）は、ＧｕＳＣＮまたはＧｕＣｌなどのより強いカオトロピック剤とＲｂＳＣＮなどのより弱いカオトロピック剤の間で望ましいバランスを取る。このようなより少ない侵襲性のカオトロピック剤は、典型的には、試料、特に、複雑な試料（例えば、便試料）を溶解するための機械的破壊などのさらなる機構を必要とする。しかしながら、より少ない侵襲性のカオトロピック剤は、生体分子を下流の単離または検出工程用に利用可能にするために、ホモジナイゼーションの間に生体分子を効果的に可溶化することができる。他方、強いカオトロピック剤および界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）は、完全な細胞溶解を達成することができるが、生体分子の分解（例えば、核酸の分解）という犠牲を生じる。より少ない侵襲性のカオトロピック剤は、このような生体分子の分解を最小限に抑えながら、生体分子（例えば、核酸）を可溶化することができる点で特有である。
【００５２】
溶解試薬中の相対的に穏やかなカオトロピック剤の濃度は、０．０５〜５Ｍ、例えば、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜５Ｍ、好ましくは、０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍの範囲にあり得る。可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中の相対的に穏やかなカオトロピック剤の最終濃度は、０．０１〜４Ｍ、例えば、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜４Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．０１〜４Ｍ、０．０５〜０．５Ｍ、０．０５〜１Ｍ、０．０５〜１．５Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜４Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜４Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜４Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜４Ｍ、好ましくは、０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍであり得る。
【００５３】
例えば、溶解試薬中のＮａＳＣＮの濃度は、０．５〜２Ｍ、好ましくは、０．８〜１．２Ｍであり得る。可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中のＮａＳＣＮの最終濃度は、０．１〜１．８Ｍ、好ましくは、０．５〜１．１Ｍであり得る。
【００５４】
溶解試薬中のＮａ２ＣＯ３の濃度は、０．０５〜０．２Ｍ、好ましくは、０．０８〜０．１２Ｍであり得る。可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中のＮａ２ＣＯ３の最終濃度は、０．０１〜０．４Ｍ、好ましくは、０．０４〜０．１５Ｍであり得る。
【００５５】
複数の相対的に穏やかなカオトロピック剤が溶解試薬中に存在する場合、溶解試薬中の合わせたカオトロピック剤の総濃度は、０．０５〜５Ｍ、例えば、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜５Ｍ、好ましくは、０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍの範囲にあり得る。溶解試薬中の個々のカオトロピック剤の濃度は、０．０１〜４．５Ｍ、例えば、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜４．５Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜４．５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜４．５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜４．５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．５Ｍまたは０．１〜２Ｍの範囲にあり得る。可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中の合わせたカオトロピック剤の総最終濃度は、０．０１〜４Ｍ、例えば、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜４Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．０１〜４Ｍ、０．０５〜０．５Ｍ、０．０５〜１Ｍ、０．０５〜１．５Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜４Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜４Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜４Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜４Ｍ、好ましくは、０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍであり得る。可溶化液中の個々のカオトロピック剤の最終濃度は、０．００１〜３．５Ｍ、例えば、０．００１〜０．０１Ｍ、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜３．５Ｍ、０．００１〜０．１Ｍ、０．００１〜０．５Ｍ、０．００１〜１Ｍ、０．００１〜１．５Ｍ、０．００１〜２Ｍ、０．００１〜３．５Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．０１〜３．５Ｍ、０．０５〜０．５Ｍ、０．０５〜１Ｍ、０．０５〜１．５Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜３．５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜３．５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜３．５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜３．５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．５Ｍまたは０．１〜２Ｍであり得る。
【００５６】
１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤に加えて、溶解試薬は１またはそれを超えるホスフェートをさらに含み得る。ホスフェートは、土壌粒子の均一な破壊を達成し、土壌有機物を可溶化し、土壌から腐植質の物質を抽出する上で特に有用である。さらに、理論に拘泥することを望むものではないが、遊離のホスフェート基（ＰＯ４３−）も、阻害物質除去剤と競合的に相互作用することによって、阻害物質除去剤（例えば、ＡｌＣｌ３）と核酸のホスホジエステル基との間での錯体形成も防止または低減すると考えられる。例示的なホスフェートとして、ホスフェート一塩基性、ホスフェート二塩基性およびホスフェート三塩基性ならびに１またはそれを超える遊離のホスフェート基を含有するその他の化合物、例えば、リン酸ナトリウム一塩基性、リン酸ナトリウム二塩基性、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム一塩基性、リン酸カリウム二塩基性、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム一塩基性、リン酸アンモニウム二塩基性、リン酸アンモニウム、リン酸リチウム一塩基性、リン酸リチウム二塩基性、リン酸リチウム、リン酸三ナトリウム、ポリ（ビニルホスホン酸）ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ピロホスフェート、三リン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、その他のリン含有オキシアニオンおよびこれらの組み合わせが挙げられる。ホスフェート中の陽イオン部分としては、アンモニウム、ナトリウム、カリウムおよびリチウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
溶解試薬中のホスフェートの濃度は、０．０５〜０．５Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍであり得る。可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中のホスフェートの最終濃度は、０．０１〜０．４Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍであり得る。複数のホスフェートが溶解試薬中に存在する場合、溶解試薬中の合わせたホスフェートの総濃度は、０．０５〜０．５Ｍ、好ましくは０．１〜０．２Ｍの範囲にあり得る。溶解試薬中の個々のホスフェートの濃度は、０．０１〜０．４５Ｍ、例えば、０．０１〜０．１Ｍ、０．１〜０．２Ｍ、０．２〜０．３Ｍ、０．３〜０．４５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．２Ｍの範囲にあり得る。可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中の合わせたホスフェートの総最終濃度は、０．０１〜０．４Ｍ、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．４Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍであり得る。可溶化液中の個々のホスフェートの最終濃度は、０．００１〜０．３５Ｍ、例えば、０．００１〜０．０１Ｍ、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．３５Ｍ、０．１〜０．２Ｍ、０．２〜０．３５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．２Ｍの範囲にあり得る。
【００５８】
溶解試薬としては、非イオン性、陽イオン性、陰イオン性（ドデシル硫酸ナトリウム）または双性イオン性界面活性剤などの、１またはそれを超える界面活性剤も挙げることができる。例示的な界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、サルコシル、ラウリルサルコシン酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、コール酸、デオキシコール酸、ベンズアミドタウロコーレート（ＢＡＴＣ）、オクチルフェノールポリエトキシレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ｔｅｒｔ−オクチルフェノキシポリ（オキシエチレン）エタノール、１，４−ピペラジンビス−（エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１１４）およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５９】
溶解試薬中の合わせた界面活性剤の総濃度は、界面活性剤が液体であれば、０．０１％〜１５％（ｖ／ｖ）の範囲にあり得、または界面活性剤が固体であれば、０．０１％〜１５％（ｗ／ｖ）の範囲にあり得る。溶解試薬中の個々の界面活性剤の濃度は、０．００１〜１５％、例えば、０．００５〜１２％、０．０１〜１０％、０．１〜８％、０．０５〜６％、０．１〜４％、０．５〜２％、０．８〜１％、好ましくは、０．０１〜１５％の範囲にあり得る。可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中の合わせた界面活性剤の総最終濃度は、０．００５％〜１２％、例えば、０．００５％〜０．０５％、０．０５％〜０．５％、０．５％〜５％、５％〜１２％、０．０５％〜１０％、０．１％〜１０％または０．５％〜５％であり得る。溶解試薬中の個々の界面活性剤の総最終濃度は、０．００１〜１２％、例えば、０．００５〜１０％、０．０１〜８％、０．０５〜６％、０．０５〜６％、０．１〜４％、０．２〜２％、０．５〜１％、好ましくは、０．００１〜１２％の範囲にあり得る。
【００６０】
ある他の実施形態において、溶解試薬は、ＳＤＳなどの界面活性剤を一切含まない。
【００６１】
溶解試薬は、試料中の混入物質と溶解および可溶化の間に遊離された核酸との間の相互作用をブロックしまたは低減する１またはそれを超えるブロッキング剤をさらに含有し得る。例示的なブロッキング剤としては、カゼイン、ポリアクリル酸およびポリスチレンスルホネートが挙げられる。このようなブロッキング剤は、正に帯電した基（例えば、金属イオン）を有する試料中の粒子（例えば、土壌粒子）と試料から放出された核酸との間の静電的相互作用をブロックする上で有用である。このような相互作用は、妨害しなければ、試料からの核酸収率の著しい減少を引き起こし得る。
【００６２】
溶解試薬中の合わせたブロッキング剤の総濃度は、０．０１〜０．５Ｍの関連する官能基（例えば、ポリアクリル酸の場合には、カルボキシレート；スルホネート、ホスフェート）の範囲にあり得る。溶解試薬中の個々のブロッキング剤の濃度は、０．００１〜０．５Ｍの範囲にあり得る。可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中の合わせたブロッキング剤の総最終濃度は、２〜４００ｍＭの範囲にあり得る。溶解試薬中の個々のブロッキング剤の最終濃度は、０．２〜４００ｍＭの範囲にあり得る。ある他の実施形態において、溶解試薬は、ブロッキング剤を一切含まない。
【００６３】
溶解試薬は、上記カオトロピック剤またはホスフェート以外に１またはそれを超える塩をさらに含有し得る。例示的な塩としては、ＮａＣｌ、ＮａＦ、ＬｉＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＩ、ＲｂＣｌ、ＣｓＣｌ、ＲｂＢｒ、ＣｓＢｒ、ＲｂＩ、Ｃｓｌおよびこれらの組み合わせが挙げられる。溶解試薬中の合わせた塩の総濃度は、１０〜５００ｍＭ、例えば、３０〜３００ｍＭまたは５０〜２００ｍＭの範囲にあり得る。溶解試薬中の個々の塩の濃度は、１〜５００ｍＭ、例えば、１０〜２００ｍＭまたは２５〜１００ｍＭの範囲にあり得る。ある他の実施形態において、溶解試薬は、さらなる塩（例えば、ＮａＣｌ）を一切含まない。
【００６４】
溶解試薬は、溶解が安定なｐＨで起こるように、１またはそれを超える緩衝物質をさらに含有し得る。溶解試薬のｐＨは、ｐＨ６〜ｐＨ１２、例えば、ｐＨ６〜ｐＨ８、ｐＨ７〜ｐＨ９、ｐＨ８〜ｐＨ１０およびｐＨ８〜ｐＨ１１およびｐＨ７〜ｐＨ１０の範囲にあり得る。
【００６５】
いずれも上述されているとおりの１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤と１またはそれを超えるホスフェートとを含む、から本質的になる、またはからなる溶解試薬は、その固体状態であり得る。好ましくは、溶解試薬は、１またはそれを超える上記相対的に穏やかなカオトロピック剤と、１またはそれを超える上記ホスフェートと、水とを含む、から本質的になる、またはからなる溶液である。好ましくは、１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤は、ＮａＳＣＮもしくはＮａＣＯ３、特にＮａＳＣＮを含み、またはＮａＳＣＮもしくはＮａＣＯ３、特にＮａＳＣＮである１。またはそれを超えるホスフェートは、好ましくは、リン酸ナトリウム二塩基性を含み、またはリン酸ナトリウム二塩基性である。例示的な好ましい溶解試薬は、０．５〜２Ｍ  ＮａＳＣＮおよび０．１〜０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含み、から本質的になり、またはからなる。別の例示的な好ましい溶解試薬は、０．０５〜０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３および０．１〜０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含み、から本質的になり、またはからなる。
【００６６】
Ｃ．  溶解過程
本明細書において提供される試料から可溶化液を調製するための方法は、関心対象の生体分子に適した条件下で、このような分子の著しい分解なしに生体分子を可溶化するのに十分な時間、試料を上記１またはそれを超える溶解試薬と接触させることを含む。以下に記載されている本開示のある態様は核酸の単離に焦点を当てているが、上記溶解試薬は、核酸の単離のために試料を溶解するのに有用であるのみならず、タンパク質を単離する、精製するおよび／または検出するなどの他の目的のために試料を溶解するのにも有用である。
【００６７】
１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤と１またはそれを超えるホスフェートとを含む、から本質的になる、またはからなる溶解試薬は、物理的破壊および酵素的溶解などの１またはそれを超える他の試料溶解方法と組み合わせて使用され得る。
【００６８】
試料の物理的破壊としては、超音波処理、温度変化、機械力、剪断力、機械的振動もしくはボルテックス装置を使用する機械的破壊またはこのような方法の１つの組み合わせが挙げられる。
【００６９】
機械的破壊としては、ビードビーティングおよび／またはホモジナイズ法の使用が挙げられ得る。機械的破壊のために有用なビーズは、ガラス、セラミック、金属、鉱物（ｍｉｎｅｒａｌ）またはこのような材料の２またはそれより多くの１つの組み合わせから作られ得る、またはこれらを含み得る。ビーズのサイズは、０．０５ｍｍ〜３ｍｍの範囲であり得る。例示的なビーズとしては、０．７ｍｍガーネットビーズ、０．１５ｍｍガーネットビーズ、０．１ｍｍガラスビーズ、０．５ｍｍガラスビーズ、０．１ｍｍセラミックビーズ、０．５ｍｍセラミックビーズ、１．４ｍｍセラミックビーズ、０．１ｍｍイットリウム安定化ジルコニウムビーズ、０．５ｍｍイットリウム安定化ジルコニウムビーズ、またはこのようなビーズの１つの組み合わせ（例えば、同じ量の０．１ｍｍガラスビーズと０．５ｍｍガラスビーズ）が挙げられる。ある好ましい実施形態において、ビーズは、少なくとも６．０の密度（ｇ／ｃｃ）を有する高密度ビーズ、例えば、イットリウム安定化ジルコニウムビーズ、セリウム安定化ビーズおよびステンレス鋼ビーズである。ビードビーティングは、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ  ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＡＭＢＩＯＮ（商標）Ｖｏｒｔｅｘ  Ａｄａｐｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）およびＯｍｉｎｉ  Ｂｅａｄ  Ｒｕｐｔｅｒ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、ＯＭＮＩ  Ｉｎｔ’ｌ、Ｋｅｎｎｅｓａｗ，ＧＡ）およびＯＰＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによる様々なホモジナイズ装置などの、ビーズチューブアダプターまたはビードビーターとともにボルテックス混合器を用いて実施され得る。ビードビーティングの速度および期間は、試料の種類およびサイズに応じて変動し得る（例えば、Ｇｉｂｂｏｎｓら、Ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ、ＯＰＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ参照）。例えば、ビードビーティングは、ビードビーターの最大速度で、１〜２０分間、例えば、５〜１０分間、１０〜２０分間または５〜１５分間、実施され得る。
【００７０】
本明細書に開示されている溶解試薬は、好ましくは、便試料などの複雑な試料から生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）を単離する上で、機械的破壊（例えば、ビードビーティング）と組み合わせて使用される。生体分子は、微生物起源であり得る。
【００７１】
溶解試薬は、酵素的溶解と組み合わせても使用され得、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼなどの使用が含まれる。
【００７２】
タンパク質を単離するための可溶化液を生成するために溶解試薬が使用される場合、溶解は、タンパク質変性を回避または軽減するために、低温（例えば、４℃）で実施され得る。単離されたタンパク質の下流の分析（例えば、質量分光分析）が変性されていないタンパク質を必要としないいくつかの他の実施形態において、溶解は、より高い温度（例えば、２０〜２５℃）で実施され得る。さらに、一般的に、プロテアーゼは、溶解試薬中に含まれない。代わりに、好ましくは、試料溶解およびその後のタンパク質単離の間にタンパク質分解を防止または軽減するために、試料溶解の直前に、試料材料、溶解試薬または試料材料と溶解試薬の混合物に、プロテイナーゼ阻害物質（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから得られるＨａｌｔプロテアーゼ阻害物質）が添加される。同様に、酸化によって引き起こされるタンパク質又は酵素の活性の喪失を回避するために、試料溶解の直前に、還元剤（例えば、β−メルカプトエタノール）が、試料材料、溶解試薬または試料材料と溶解試薬の混合物に添加され得る。
【００７３】
得られた可溶化液は、試料から生体分子を単離する方法中のその後の工程（例えば、阻害物質除去）において直接使用され得る。好ましくは、可溶化液は、ろ過、沈降または好ましくは遠心分離によって、試料から放出された生体分子を含む液相と、試料からの固体粒子または残留物を含有する固相とに分離される。得られた液相（すなわち、上清）またはその一部は、生体分子を単離し、および／または阻害物質を除去するために使用され得る。
【００７４】
Ｄ．  キット
関連する態様において、本開示は、（ａ）上記溶解試薬、または（ｂ）別々に提供される溶解試薬の、１またはそれを超えるホスフェートと１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤とを含む、試料から可溶化液を調製するためのキットを提供する。
【００７５】
キットは、試料（例えば、便試料）を機械的に破壊するために、ホモジナイズ材料（すなわち、ビーズ、好ましくは、高密度ビーズなどの、試料をホモジナイズする上で有用な物質）をさらに含み得る。
【００７６】
キットは、１またはそれを超えるタンパク質沈殿剤として機能する１またはそれを超える第一の剤をさらに含み得る。例示的なタンパク質沈殿剤としては、以下に記載されているとおり、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム、好ましくは、酢酸ナトリウムおよび酢酸セシウムが挙げられる。
【００７７】
または、キットは、試料中のタンパク質の官能基を競合的に結合し、これにより、このような基が試料から混入物を枯渇させる上で有用な多価の塩の多価の陽イオンと相互作用するのを抑制する１またはそれを超える分子スクリーンとして機能する１またはそれを超える第一の剤をさらに含み得る。このような剤は、タンパク質および必要に応じてその他の生体分子（例えば、核酸）を単離するための可溶化液を生成する上で有用である。分子スクリーンは、低分子量カルボキシレート、低分子量サルフェート、カルボキシレートポリマー、スルホン化ポリマーおよびこれらの複数の混合物から選択され得る。例示的な分子スクリーンとしては、アミノ酸；短鎖脂肪酸の塩、例えば、酪酸ナトリウム；ポリスチレンスルホン酸ナトリウム；ポリアクリル酸ナトリウム；好ましくは、硫酸アンモニウム、グリコール酸アンモニウム、スルホ酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸セシウム、酢酸アンモニウム、β−アラニン、硫酸グアニジン、ヒスチジン、グリシンおよびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００７８】
第一の剤のいくつか（例えば、酢酸アンモニウム）は、相対的に高濃度において（例えば、以下に記載されているとおりの、可溶化液、第一の剤および１またはそれを超える第二の剤を含む混合物中で１〜２Ｍにおいて）タンパク質沈殿剤として機能し得るが、相対的に低い濃度において（例えば、タンパク質沈殿剤として機能するときの濃度より５〜１５倍低い濃度において）分子スクリーンとして機能し得る。
【００７９】
キットは、１またはそれを超える阻害物質除去剤として機能する１またはそれを超える第二の剤をさらに含み得る。例示的な阻害物質除去剤としては、硫酸アンモニウムアルミニウム、硫酸アンモニウムアルミニウム１２水和物、硫酸アンモニウム、硫酸カリウムアルミニウム、アルミニウムクロロハイドレート、酸化カルシウム、塩化鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ）、アルミン酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ハフニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、阻害物質除去剤としては、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ハフニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８０】
１またはそれを超える第一の剤および１またはそれを超える第二の剤は、固体形態でまたは溶液として組成物を形成し得る。
【００８１】
組成物が溶液であり、１またはそれを超える第一の剤がタンパク質沈殿剤として機能する実施形態においては、溶液中の１もしくはそれを超える第一の剤の総濃度は、０．５Ｍ〜１０Ｍ、１〜８Ｍまたは１．５〜７．５Ｍ、好ましくは、０．５〜５Ｍ、０．５〜７．５Ｍ、２．５〜５Ｍ、２．５〜７．５Ｍ、１〜８Ｍもしくは１．５〜７．５Ｍの範囲にあり；ならびに／または、溶液中の１もしくはそれを超える第二の剤の総濃度は、１０〜５００ｍＭ、例えば、１０〜１００ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、１０〜２００ｍＭ、１０〜３００ｍＭ、１０〜４００ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜５００ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、２００〜５００ｍＭ、および３００〜５００ｍＭ、好ましくは、１０〜２００ｍＭ、１０〜５００ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜５００ｍＭまたは７５〜１５０ｍＭの範囲にある。組成物が複数の第一の剤を含む場合、個々の第一の剤の濃度は、０．１〜９．５Ｍ、例えば、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜２．５Ｍ、２．５〜５Ｍ、５〜７．５Ｍ、７．５〜９．５Ｍ、０．１〜２．５Ｍ、０．１〜５Ｍ、０．１〜７．５Ｍ、０．５〜５Ｍ、０．５〜７．５Ｍ、０．５〜９．５Ｍ、２．５〜７．５Ｍ、２．５〜９．５Ｍ、５〜９．５Ｍ、好ましくは、０．１〜５Ｍ、０．５〜７．５Ｍ、２．５〜５Ｍ、２．５〜７．５Ｍ、１〜８Ｍまたは１．５〜７．５Ｍの範囲にあり得る。組成物が複数の第二の剤を含む場合、個々の第二の剤の濃度は、１〜４５０ｍＭ、例えば、１〜１０ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜４５０ｍＭ、１〜２００ｍＭ、１〜３００ｍＭ、１〜４００ｍＭ、１〜４５０ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜４５０ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、２００〜４５０ｍＭ、３００〜４５０ｍＭ、好ましくは、１〜２００ｍＭ、１０〜４５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜４５０ｍＭまたは７５〜１５０ｍＭの範囲にあり得る。
【００８２】
組成物が溶液であり、１またはそれを超える第一の剤が分子スクリーンとして機能する実施形態においては、溶液中の１もしくはそれを超える第一の剤の総濃度は、０．１〜１Ｍ、例えば、０．１〜０．２５Ｍ、０．２５〜０．５Ｍ、０．５〜０．７５Ｍ、０．７５〜１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．１〜０．７５Ｍ、０．２５〜０．７５Ｍ、０．１〜０．９５Ｍ、０．２５〜１Ｍもしくは０．５〜１Ｍ、好ましくは、０．１〜０．７５Ｍの範囲にあり；ならびに／または、溶液中の１もしくはそれを超える第二の剤の総濃度は、１０〜５００ｍＭ、例えば、１０〜１００ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜５００ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、２００〜５００ｍＭ、３００〜５００ｍＭ、好ましくは、１０〜２００ｍＭ、１０〜５００ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜５００ｍＭまたは７５〜１５０ｍＭの範囲にある。組成物が複数の第一の剤を含む場合、個々の第一の剤の濃度は、０．０１〜０．９５Ｍ、例えば、０．０１〜０．１Ｍ、０．１〜０．２５Ｍ、０．２５〜０．５Ｍ、０．５〜０．７５Ｍ、０．７５〜０．９５Ｍ、０．０１〜０．２５Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜０．７５Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．１〜０．７５Ｍ、０．２５〜０．７５Ｍ、０．２５〜０．９５Ｍまたは０．５〜０．９５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．７５Ｍの範囲にあり得る。組成物が複数の第二の剤を含む場合、個々の第二の剤の濃度は、１〜４５０ｍＭ、例えば、１〜１０ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜４５０ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜４５０ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、２００〜４５０ｍＭ、３００〜４５０ｍＭ、好ましくは、１〜１００ｍＭ、１０〜２００ｍＭ、１０〜４５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜４５０ｍＭまたは７５〜１５０ｍＭの範囲にあり得る。
【００８３】
キットは、１またはそれを超える以下の成分をさらに含み得る。
タンパク質結合溶液、
タンパク質洗浄溶液、
タンパク質溶出溶液、
核酸結合固体支持体（例えば、ＤＮＡ結合固体支持体、ＲＮＡ結合固体支持体およびＤＮＡとＲＮＡの両方を結合することができる固体支持体）、
ＤＮＡ結合溶液、
ＤＮＡ洗浄溶液、
ＤＮＡ溶出溶液、
ＲＮＡ結合溶液、
ＲＮＡ洗浄溶液、
ＲＮＡ溶出溶液、および
１またはそれを超える器（ｖｅｓｓｅｌｓ）または容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）（例えば、収集チューブ）。
【００８４】
「タンパク質結合溶液」は、タンパク質結合固体支持体へのタンパク質の結合を容易にするまたは強化する溶液を表す。結合溶液は、緩衝溶液（例えば、シトレート緩衝液）および１またはそれを超える塩（例えば、ＮａＣｌ）を含み得る。結合混合物中の塩の最終濃度は、１〜５Ｍ、例えば、２〜３Ｍの範囲にあり得る。
【００８５】
「タンパク質結合固体支持体」は、タンパク質一般（すなわち、全タンパク質）または関心対象の特定のタンパク質を含むタンパク質を結合することができる固体支持体を表す。例示的なタンパク質結合固体支持体としては、シリカスピンフィルター膜、シリカスピンカラム、シリカ被覆された磁気ビーズ、珪藻土およびシリカ粒子の細分された懸濁液が挙げられる。
【００８６】
「タンパク質洗浄溶液」は、タンパク質結合固体支持体に結合されたタンパク質から混入物を除去する上で有用な溶液、例えば、エタノールを含有する溶液を表す。
【００８７】
「タンパク質溶出溶液」は、タンパク質結合固体支持体に結合されたタンパク質を溶出する上で有用な溶液を表す。例示的なタンパク質溶出溶液としては、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）を必要に応じて含有する緩衝溶液（例えば、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液）が挙げられる。
【００８８】
核酸の単離において有用な固体支持体および溶液は、以下の「核酸の単離」の節に記載されているとおりである。
【００８９】
関連する態様において、本開示は、可溶化液を調製するおよび／または試料から生体分子を単離する上での上記キットの使用を提供する。
【００９０】
ＩＩ．  核酸の単離
別の態様において、本開示は、試料から核酸を単離するための方法であって、
（ａ）  混合物を得るために、試料、前記試料の可溶化液もしくは前記可溶化液の上清または前記試料、前記可溶化液もしくは前記上清の一部を、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤ならびに塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤と接触させること、
（ｂ）  工程（ａ）の前記混合物を、固相および液相に分離すること、ここで、前記１またはそれを超える第二の剤は、主として前記固相中にあり、ならびに
（ｃ）  工程（ｂ）の前記液相から核酸を単離すること、
を含む、方法を提供する。
【００９１】
Ａ．  方法
１．  試料の溶解
本明細書において提供される方法に従って核酸を単離するための試料は、生体試料、環境試料および食品試料など、核酸を含有する任意の試料、特に、単離された核酸の調製物中に存在する場合、単離された核酸の下流での分析を妨害し得る阻害物質を含有する試料であり得る。
【００９２】
様々な種類の試料は、上の節「Ｉ．試料の溶解、サブセクション「Ａ．試料」に記載されているとおりである。好ましい試料としては、土壌試料および便試料が挙げられる。
【００９３】
出発材料として必要とされる試料の量は、試料から単離された核酸の下流での分析に応じて変動し得る。阻害物質を枯渇させながら核酸を単離する上でのその高い効率性のために、本開示の方法は、グラム試料当たりの核酸の取得量を犠牲にすることなく、伝統的に必要とされる（例えば、２グラム）より、少量の出発材料（例えば、１グラム未満、０．５グラム未満または０．２５グラム未満）の使用を可能にする。例えば、出発材料は、０．０１グラム〜１グラム、０．０１グラム〜０．５グラム、０．０１グラム〜０．２５グラム、０．０５グラム〜１グラム、０．０５グラム〜０．５グラム、０．０５グラム〜０．２５グラム、０．１グラム〜１グラム、０．１グラム〜０．５グラムまたは０．１グラム〜０．２５グラムの範囲にあり得る。
【００９４】
試料を収集した後に、核酸を放出するために、このような分子が単離される前に、試料は、通例、溶解される。試料の溶解は、阻害物質の除去と同時に、好ましくは、阻害物質の除去より前に実施され得る。
【００９５】
試料の溶解は、物理的破壊、化学的溶解、酵素的溶解またはこれらの組み合わせによって実施され得る。試料中に存在する所定の試料の種類および生物に応じて、異なる試料破壊方法を使用し得る。例えば、ヒト細胞およびウイルスのキャプシドは塩または界面活性剤によって容易に溶解されるが、細菌の芽胞または接合子嚢は、より侵襲性の高い化学的、酵素的または物理的方法を必要とする。
【００９６】
物理的な破壊および酵素的溶解は、上の節「Ｉ．試料の溶解、サブセクション「Ｃ．溶解過程」に記載されているとおりである。
【００９７】
化学的溶解としては、１またはそれを超えるカオトロピック剤を含む溶解試薬の使用が挙げられる。例示的なカオトロピック剤としては、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジン、尿素またはリチウム塩が挙げられる。好ましくは、１またはそれを超えるカオトロピック剤は、上の節「Ｉ．試料の溶解、サブセクション「Ｂ．溶解試薬」に記載されているとおりの相対的に穏やかなカオトロピック剤である。
【００９８】
溶解試薬中の１またはそれを超えるカオトロピック剤の総濃度は、
０．０５〜５Ｍ、例えば、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜５Ｍ、好ましくは、０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍの範囲にあり得る。複数のカオトロピック剤が溶解試薬中に存在する場合、溶解試薬中の個々のカオトロピック剤の濃度は、０．０１〜４．５Ｍ、例えば、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜４．５Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜４．５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜４．５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜４．５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．５Ｍまたは０．１〜２Ｍの範囲にあり得る。
【００９９】
可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中の１またはそれを超えるカオトロピック剤の最終総濃度は、０．０１〜４Ｍ、例えば、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜４Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．０１〜４Ｍ、０．０５〜０．５Ｍ、０．０５〜１Ｍ、０．０５〜１．５Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜４Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜４Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜４Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜４Ｍ、好ましくは、０．０５〜０．５Ｍまたは０．５〜２Ｍであり得る。複数のカオトロピック剤が可溶化液中に存在する場合、可溶化液中の個々のカオトロピック剤の濃度は、０．００１〜３．５Ｍ、例えば、０．００１〜０．０１Ｍ、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜３．５Ｍ、０．００１〜０．１Ｍ、０．００１〜０．５Ｍ、０．００１〜１Ｍ、０．００１〜１．５Ｍ、０．００１〜２Ｍ、０．００１〜３．５Ｍ、０．０１〜０．１Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．０１〜３．５Ｍ、０．０５〜０．５Ｍ、０．０５〜１Ｍ、０．０５〜１．５Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜２Ｍ、０．０５〜３．５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜３．５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜３．５Ｍ、１〜２Ｍまたは１〜３．５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．５Ｍまたは０．１〜２Ｍの範囲にあり得る。
【０１００】
溶解試薬は、上の「試料の溶解」の節に記載されているように、１またはそれを超えるホスフェートをさらに含み得る。溶解試薬中の１またはそれを超えるホスフェートの総濃度は、０．０５〜０．５Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍであり得る。溶解試薬中の個々のホスフェートの濃度は（複数のホスフェートが溶解試薬中に存在する場合）、０．０１〜０．４５Ｍ、例えば、０．０１〜０．１Ｍ、０．１〜０．２Ｍ、０．２〜０．３Ｍ、０．３〜０．４５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．２Ｍの範囲にあり得る。可溶化液（すなわち、試料と溶解試薬の混合物）中の１またはそれを超えるホスフェートの最終総濃度は、０．０１〜０．４Ｍ、好ましくは、０．１〜０．２Ｍであり得る。可溶化液中の個々のホスフェートの最終濃度は（複数のホスフェートが可溶化液中に存在する場合）、０．００１〜０．３５Ｍ、例えば、０．００１〜０．０１Ｍ、０．０１〜０．０５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜０．３５Ｍ、０．１〜０．２Ｍ、０．２〜０．３５Ｍ、好ましくは、０．０１〜０．２Ｍの範囲にあり得る。
【０１０１】
溶解試薬は、溶解が安定なｐＨで起こるように、１つまたはそれを超える以下の成分：１またはそれを超える界面活性剤、１またはそれを超えるブロッキング剤、１またはそれを超える上記カオトロピック剤またはホスフェート以外の塩および１またはそれを超える緩衝物質をさらに含み得る。このような追加の成分およびそれらの濃度も、上記節「Ｉ．試料の溶解、サブセクション「Ｂ．溶解試薬」に記載されているとおりである。
【０１０２】
好ましくは、上記節「Ｉ．試料の溶解、サブセクション「Ｂ．溶解試薬」に記載されている１またはそれを超える相対的に穏やかなカオトロピック剤および１またはそれを超えるホスフェートを含む溶解試薬が、本明細書において提供される試料から核酸を単離するための方法において使用される。
【０１０３】
試料の可溶化液は、本明細書に開示されている核酸を単離する方法中の工程（ａ）において直接使用され得る。好ましくは、可溶化液は、ろ過、沈降または好ましくは遠心分離によって、試料から放出された核酸を含む液相と、試料からの固体粒子または残留物を含有する固相とに分離される。得られた液相（すなわち、上清）またはその一部は、核酸を単離し、阻害物質を除去するために使用され得る。
【０１０４】
２．  阻害物質の除去
本明細書において提供される方法は、試料から核酸を単離し、単離された核酸から阻害物質を除去し、単離された核酸の効果的な下流での分析を可能にする。具体的には、本明細書に開示されている方法の工程（ａ）は、混合物を得るために、試料、前記試料の可溶化液、前記試料の上清または前記試料、前記可溶化液もしくは前記上清の一部を、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤ならびに塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤と接触させることである。工程（ｂ）は、工程（ａ）の混合物を固相および液相に分離することであり、ここで、１またはそれを超える阻害物質除去剤は、主として前記固相中にあり、したがって、液相から除去され、その後、核酸を単離する上で使用される。
【０１０５】
１またはそれを超える第一の剤は、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウム、好ましくは酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムおよび酢酸セシウムから選択される。
【０１０６】
ある実施形態において、１またはそれを超える第一の剤は、塩化ナトリウムまたは酢酸カリウムを含まない。
【０１０７】
工程（ａ）の混合物中の合わせた第一の剤の総濃度は、０．１〜３Ｍ、例えば、０．１〜０．２５Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜２．５Ｍ、０．１〜３Ｍ、０．２５〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜２．５Ｍ、２．５〜３Ｍ、０．２５〜１Ｍ、０．２５〜１．５Ｍ、０．２５〜２Ｍ、０．２５〜２．５Ｍ、０．２５〜３Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜２．５Ｍ、０．５〜３Ｍ、１〜２Ｍ、１〜２．５Ｍ、１〜３Ｍ、２〜３Ｍ、好ましくは０．５〜２．５Ｍまたは１〜２Ｍの範囲にあり得る。複数の第一の剤が工程（ａ）の混合物中に存在する場合、工程（ａ）の混合物中の個々の第一の剤の濃度は、０．０１〜２．５Ｍ、例えば、０．０１〜０．１Ｍ、０．１〜０．２５Ｍ、０．２５〜０．５Ｍ、０．５〜１Ｍ、１〜１．５Ｍ、１．５〜２Ｍ、２〜２．５Ｍ、０．０１〜０．５Ｍ、０．０１〜１Ｍ、０．０１〜１．５Ｍ、０．０１〜２Ｍ、０．０１〜２．５Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．１〜１Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜２．５Ｍ、０．２５〜１Ｍ、０．２５〜１．５Ｍ、０．２５〜２Ｍ、０．２５〜２．５Ｍ、０．５〜１．５Ｍ、０．５〜２Ｍ、０．５〜２．５Ｍ、１〜２Ｍ、１〜２．５Ｍ、好ましくは、０．１〜２Ｍまたは０．５〜２Ｍの範囲にあり得る。
【０１０８】
１またはそれを超える第一の剤は、工程（ａ）において、タンパク質沈殿剤として機能し得、「タンパク質沈殿剤」と称され得る。
【０１０９】
１またはそれを超える第二の剤は、阻害物質除去剤として機能し、「阻害物質除去剤」と称され得る。阻害物質除去剤は、３または４の原子価を有する陽イオンを含有する３価または４価の塩である。例示的な阻害物質除去剤としては、塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ハフニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせ、好ましくは、塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、より好ましくは、塩化アルミニウムが挙げられる。
【０１１０】
工程（ａ）の混合物中の１またはそれを超える第二の剤の総濃度は、１〜１５０ｍＭ、例えば、１〜５ｍＭ、５〜２５ｍＭ、２５〜５０ｍＭ、５０〜７５ｍＭ、７５〜１００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、１〜２５ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜７５ｍＭ、１〜１００ｍＭ、１〜１５０ｍＭ、５〜５０ｍＭ、５〜７５ｍＭ、５〜１００ｍＭ、５〜１５０ｍＭ、２５〜７５ｍＭ、２５〜１００ｍＭ、２５〜１５０ｍＭ、５０〜１００ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ、７５〜１５０ｍＭ、好ましくは、５〜２５ｍＭまたは５〜５０ｍＭの範囲にあり得る。複数の第二の剤が工程（ａ）の混合物中に存在する場合、工程（ａ）の混合物中の個々の第二の剤の濃度は、０．１〜１４５ｍＭ、例えば、０．１〜１ｍＭ、１〜５ｍＭ、５〜２５ｍＭ、２５〜５０ｍＭ、５０〜７５ｍＭ、７５〜１００ｍＭ、１００〜１４５ｍＭ、０．１〜５ｍＭ、０．１〜２５ｍＭ、０．１〜５０ｍＭ、０．１〜７５ｍＭ、０．１〜１００ｍＭ、０．１〜１４５ｍＭ、１〜２５ｍＭ、１〜５０ｍＭ、１〜７５ｍＭ、１〜１００ｍＭ、１〜１４５ｍＭ、５〜５０ｍＭ、５〜７５ｍＭ、５〜１００ｍＭ、５〜１４５ｍＭ、２５〜７５ｍＭ、２５〜１００ｍＭ、２５〜１４５ｍＭ、５０〜１００ｍＭ、５０〜１４５ｍＭ、７５〜１４５ｍＭ、好ましくは、１〜２５ｍＭまたは５〜５０ｍＭの範囲にあり得る。
【０１１１】
沈殿剤として機能する場合を含む上記第一の剤のいずれもが、阻害物質除去剤として機能する場合を含む上記第二の剤のいずれとも組み合わされて、本明細書において提供される方法の阻害物質除去過程において使用され得る。例えば、酢酸アンモニウムは、以下の阻害物質除去剤：塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ハフニウム（ＩＶ）またはこれらの組み合わせと組み合わされ得る。同様に、酢酸ナトリウムは、以下の阻害物質除去剤：塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ハフニウム（ＩＶ）またはこれらの組み合わせと組み合わされ得、酢酸セシウムは、以下の阻害物質除去剤：塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ハフニウム（ＩＶ）またはこれらの組み合わせと組み合わされ得る。別の選択肢は、塩化アルミニウムを、以下のタンパク質沈殿剤：酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムまたはこれらの組み合わせと組み合わせることである。さらに、２またはそれを超える上記第一の剤のいずれもが、本明細書において提供される方法の阻害物質除去過程において、上記第二の剤のいずれとも組み合わせて使用され得；上記第一の剤のいずれもが、本明細書において提供される方法の阻害物質除去過程において、２またはそれを超える上記第二の剤のいずれとも組み合わせて使用され得；２またはそれを超える上記第一の剤のいずれもが、本明細書において提供される方法の阻害物質除去過程において、２またはそれを超える上記第二の剤のいずれとも組み合わせて使用され得る。
【０１１２】
第一の剤および第二の剤の好ましい組み合わせとしては、酢酸アンモニウムと塩化アルミニウム、酢酸ナトリウムと塩化アルミニウム、酢酸セシウムと塩化アルミニウムが挙げられる。
【０１１３】
工程（ａ）では、試料、前記試料の可溶化液もしくは前記可溶化液の上清または前記試料、前記可溶化液もしくは前記上清の一部（「試料材料」と総称される）を、まず、１またはそれを超える第一の剤と接触させ得る。試料材料と１またはそれを超える第一の剤を混合した後に、得られた混合物は、例えば、沈殿、遠心分離またはろ過によって、固相と液相に分離され得、次いで、液相を、１またはそれを超える第二の剤と接触させる。好ましくは、試料材料を１またはそれを超える第一の剤と接触させることと、得られた混合物を１またはそれを超える第二の剤と接触させることとの間に、固相と液相の分離は起こらない。換言すれば、好ましくは、１またはそれを超える第一の剤との接触から生じた混合物は、１またはそれを超える第二の剤とさらに混合されるべき上清を生成するために遠心分離、ろ過、沈殿またはその他の処理をされない。
【０１１４】
または、試料材料は、まず、１またはそれを超える第二の剤と、次いで、１またはそれを超える第一の剤と接触させ得る。このような実施形態においては、試料材料と１またはそれを超える第二の剤の混合物は、好ましくは、１またはそれを超える第一の剤とさらに混合されるべき上清を生成するために遠心分離、ろ過またはその他の処理をされない。
【０１１５】
好ましくは、試料材料は、１またはそれを超える第一の剤および１またはそれを超える第二の剤と同時に接触させる。例えば、試料材料は、１またはそれを超える第一の剤と１またはそれを超える第二の剤とを含む組成物（例えば、溶液）と混合され得る。１またはそれを超える第一の剤および１またはそれを超える第二の剤ならびに例示的な好ましい溶液の濃度は、以下の「組成物」のサブセクション中に詳しく記載されている。
【０１１６】
工程（ａ）の混合物は、その固相をその液相から分離するために、工程（ｂ）において遠心分離され、ろ過され、沈殿され、またはその他処理され、ここで、前記１またはそれを超える第二の剤は、主として（５０％を超えて）固相中にある。１またはそれを超える第二の剤は、試料由来の阻害物質およびその他の混入材料と複合体を形成し、ここで、複合体は、工程（ｂ）において、沈殿され、またはその他液相から除去される。
【０１１７】
ある実施形態において、１またはそれを超える第二の剤の６０％、７０％または８０％、好ましくは、９０％超、またはより好ましくは、９５％超が、工程（ｂ）において、液相から除去される。
【０１１８】
本明細書において使用される用語「阻害物質」は、試料から単離されたＤＮＡおよび／またはＲＮＡを伴う反応を妨害し、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの操作に対して有害な効果を有する任意の物質を表す。阻害物質としては、例えば、基質としてＤＮＡまたはＲＮＡを使用する酵素反応の阻害物質およびＤＮＡまたはＲＮＡのハイブリッド形成を破壊する混入物質が挙げられる。
【０１１９】
試料の種類に応じて、阻害物質は異なり得る。例えば、便試料中の阻害物質としては、ヘモグロブリンおよびその代謝物、ビリルビン、胆汁酸および胆汁酸誘導体、消化されていないもしくは部分的に消化された繊維または消化されていないもしくは部分的に消化された食物ならびに多糖が挙げられる。
【０１２０】
土壌試料由来の阻害物質は、微生物が植物残渣を分解するときに形成される腐植質の物質を含み、金属イオンおよび粘土鉱物へのその反応部位の共有結合によって分解に対して安定化される。阻害物質は、糖類、ペプチドおよびフェノールが付着された多環式芳香族化合物を含む。土壌中の腐植質の物質の主な種類は、フミン酸およびフルボ酸である。さらなる腐植質の物質としては、腐植質のポリマーおよびフミンが挙げられる。
【０１２１】
さらなる例示的な阻害物質としては、キチン、分解植物材料、コンポスト由来の有機化合物、フェノール類、フェノール系ポリマーまたはオリゴマー、ポリフェノール、多糖およびタンニンが挙げられる。
【０１２２】
本明細書において提供される方法は、試料から１またはそれを超える阻害物質を実質的に除去することができる。試料材料、必要に応じて溶解試薬、および１またはそれを超える第一の剤および１またはそれを超える剤を含む混合物を固相と液相に分離した後に、試料由来の阻害物質の２０％もしくはそれ未満、好ましくは、１８％もしくはそれ未満、１５％もしくはそれ未満、１３％もしくはそれ未満、または１０％もしくはそれ未満、より好ましくは、５％もしくはそれ未満、３％もしくはそれ未満、２％もしくはそれ未満または１％もしくはそれ未満が液相中に残存する場合、阻害物質は実質的に除去される。
【０１２３】
ある実施形態において、阻害物質は、単離された核酸のＰＣＲ増幅を阻害し、「ＰＣＲ阻害物質」と称される。本明細書において使用される「ＰＣＲ増幅」としては、ｑＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲなどの様々な種類のＰＣＲ反応が挙げられる。特定の阻害物質除去過程によるこのような阻害物質の除去は、阻害物質除去過程を用いて単離された核酸を使用するＰＣＲ反応のある特徴（例えば、Ｃｔ値）を、阻害剤除去過程なしに単離された核酸を用いたＰＣＲ反応と比較することによって評価され得る。ＰＣＲ反応間でのＣｔ値の低下の程度は、ＰＣＲ阻害物質を枯渇させる上での、阻害物質除去過程の有効性を示し得る。
【０１２４】
３．  核酸の単離
工程（ｂ）において得られた液相は、続いて、核酸を単離するために使用される。
【０１２５】
本明細書において使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖核酸を含み、任意のＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、コスミドＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡ）または任意のＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｓｎＲＮＡ）であり得る。
【０１２６】
溶液からＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの両方を単離するのに適した任意の方法を使用し得る。好ましくは、核酸の単離において、核酸結合固体支持体が使用される。例示的な固体支持体としては、シリカマトリックス、ガラス粒子、珪藻土、磁気ビーズ、ニトロセルロース、ナイロンおよび陰イオン交換材料が挙げられる。固体支持体は、緩い粒子、フィルター、膜、繊維もしくは織物または格子の形態であり得、チューブ、カラム、好ましくはスピンカラムなどの器中に含有され得る。
【０１２７】
固体支持体への核酸の結合を容易にし、または強化するために、結合溶液を使用され得る。結合溶液は、阻害物質除去過程の間に試料材料をタンパク質沈殿剤および阻害物質除去剤と接触させる前に、試料溶解の間（例えば、溶解試薬の存在下での試料の機械的破壊後）に添加され得る。または、結合溶液は、阻害物質除去過程後に得られた液相に添加され得る。
【０１２８】
例示的なＤＮＡ結合溶液は、カオトロピック剤（例えば、ＧｕＳＣＮまたはＧｕＨＣｌ）、アルコール（例えば、エタノールまたはイソプロパノール）または両方を含み得る。例示的なＤＮＡ結合溶液は、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌなどの緩衝物質をさらに含み得る。
【０１２９】
ＤＮＡとＲＮＡの両方が試料から単離される実施形態においては、ＤＮＡの単離とＲＮＡの単離は、平行して実施され得る。換言すれば、工程（ｂ）の液相は、少なくとも２つの部分、すなわち１つはＤＮＡ単離用に、１つはＲＮＡ単離用に分けられる。好ましくは、ＤＮＡおよびＲＮＡは、逐次的に単離される。
【０１３０】
ＤＮＡとＲＮＡを逐次的に単離する方法は、公知である（例えば、米国特許第８，８８９，３９３号、国際公開第２００４／１０８９２５号参照）。好ましくは、ＤＮＡを結合するための固体支持体とＲＮＡを結合するための固体支持体とが使用される。ＤＮＡを結合するための固体支持体は、ＲＮＡを結合するための固体支持体と同一であり得、または異なり得る。同一の固体支持体がＤＮＡおよびＲＮＡ単離のために使用される場合、結合する混合物の成分および／またはそれらの濃度を調整することによって、固体支持体へのＤＮＡおよびＲＮＡの差異のある結合が達成され得る。例えば、素通り画分がエタノールと混合され得る間に、まずＤＮＡを結合するためにシリカスピンカラムを使用し得、得られた混合物は、ＲＮＡを結合するために第二のシリカスピンカラムに適用される（Ｔｒｉａｎｔ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｒｅｄｉｔｙ  １００：２４６−５０，２００９）。
【０１３１】
固相に結合した後に、固相に結合されたＤＮＡまたはＲＮＡは洗浄され得、続いて固相から溶出され得る。ＤＮＡ洗浄溶液は、カオトロピック剤（例えば、ＧｕＨＣｌ）、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール）または両方を含み得る。ＤＮＡ洗浄溶液は、緩衝物質（例えば、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））および／または塩（例えば、ＮａＣｌ）をさらに含み得る。ＤＮＡ溶出溶液は、緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液）または水であり得る。
【０１３２】
ＲＮＡ結合溶液は、アルコール（例えば、エタノール、イソプロパノール）および必要に応じて別の有機溶媒（例えば、アセトン）を含み得る。ＲＮＡ洗浄溶液は、１またはそれを超える以下のもの：緩衝物質（例えば、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌおよびＴｒｉｓ塩基）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、アルコールおよび塩（例えば、ＮａＣｌ）を含み得る。ＲＮＡは、ＤＥＰＣ処理された水またはその他ＲＮアーゼを含まない水を用いて、固体支持体から溶出され得る。
【０１３３】
核酸を単離する方法の例示的な実施形態は、以下の実施例１３および１４により詳しく記載されている。例えば、実施例１４において、土壌試料は、試料から核酸およびタンパク質を効率的に可溶化するために、ビードビーティングと組み合わせた溶解試薬によって溶解される。可溶化液は、ＤＮＡ結合溶液と混合される。ＤＮＡはシリカスピンカラムに結合され、次いで、ＲＮＡを含有する素通り画分は、第二のシリカスピンカラム上に全ＲＮＡを結合する溶液と合わされる。次いで、固定化されたＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含有する各スピンカラムを洗浄し、固定化されたＤＮＡまたはＲＮＡは溶出される。
【０１３４】
単離された核酸の収率および純度は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）ＮＤ１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、ＱＵＢＩＴ（商標）Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上でのＱＵＢＩＴ（商標）ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｑ３２８５４）およびＱＵＢＩＴ（商標）ｄｓＤＮＡ  Ｂｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｑ３２８５３）、ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＲＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて決定され得る。ＤＮＡの収率は、分光光度計および蛍光光度計によって異なって測定され得る。ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光光度計によって測定されたＤＮＡ濃度は、いくつかの事例では、ＱＵＢＩＴ（商標）蛍光光度計によって測定されたＤＮＡ濃度より高いことが観察されてきた。
【０１３５】
単離されたＤＮＡおよびＲＮＡの純度は、例えば、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）ＮＤＩＯＯＯ分光高度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて、Ａ２６０／Ａ２８０ｎｍ比、Ａ２６０／Ａ２３０ｎｍ比およびＡ３４０を測定することによって評価され得る。
【０１３６】
純粋なＤＮＡおよびＲＮＡは、それぞれ、１．８および２．０のＡ２６０／Ａ２８０ｎｍ比を有する。タンパク質またはフェノールが著しく混入する場合、Ａ２６０／Ａ２８０比は上に与えられた値より低いであろう。
【０１３７】
Ａ２６０／Ａ２３０ｎｍ比は、２３０ｎｍにおいて吸収する混入物の指標である。純粋なＤＮＡおよびＲＮＡは、２．０〜２．２のＡ２６０／Ａ２３０ｎｍ比を有する。２３０ｎｍでの著しい吸収は、フェノレートイオン、チオシアネート（ｔｈｉｏｃｖａｎａｔｅｓ）およびその他の有機化合物による混入を示す。
【０１３８】
３４０ｎｍにおける吸収（すなわち、Ａ３４０）は、通常、光散乱によって引き起こされ、粒子状物質の存在を示す。
【０１３９】
本明細書において提供される方法に従って単離されたＤＮＡは、１またはそれを超える以下の特徴を有し得る。
（１）  そのＡ２６０／Ａ２８０は、１．６〜２．０、好ましくは、１．７〜１．９、より好ましくは、１．７５〜１．８５の範囲にある。
（２）  そのＡ２６０／Ａ２３０は、１．０〜２．５、好ましくは、１．５〜２．２の範囲にある。
（３）  そのＡ３４０は、０〜０．１５、好ましくは、０〜０．１、より好ましくは、０〜０．０５の範囲にある。
【０１４０】
本明細書において提供される方法に従って単離されたＲＮＡは、１またはそれを超える以下の特徴を有し得る。
（１）そのＡ２６０／Ａ２８０は、１．８〜２．２、好ましくは、１．９〜２．１、より好ましくは、１．９５〜２．０５の範囲にある。
（２）  そのＡ２６０／Ａ２３０は、１．０〜２．５、好ましくは、１．５〜２．２の範囲にある。
（３）  そのＡ３４０は、０〜０．１５、好ましくは、０〜０．１、より好ましくは、０〜０．０５の範囲にある。
【０１４１】
単離されたＤＮＡの完全性は、抽出されたＤＮＡをアガロースゲル上で可視化することによって評価され得る。単離されたＲＮＡの完全性も、ゲル電気泳動を用いて、抽出されたＲＮＡを可視化することによって評価され得る。
【０１４２】
単離されたＤＮＡは、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ローリングサークル複製、リガーゼ連鎖反応、配列決定（例えば、次世代配列決定、サザン、ドットおよびスロットブロット分析、ＤＮＡメチル化分析、質量分析および電気泳動を含む任意の用途において分析または使用され得る。
【０１４３】
単離されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレー、ｃＤＮＡ合成、ノーザン、ドット、およびスロットブロット分析、およびマイクロアレイ分析などの任意の用途において分析または使用され得る。
【０１４４】
Ｂ．  組成物
関連する態様において、本開示は、試料から核酸を単離する間に阻害物質を除去する上で有用な組成物を提供する。組成物は、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸セシウムおよびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第一の剤と、塩化アルミニウム、酢酸エルビウム（ＩＩＩ）、塩化エルビウム（ＩＩＩ）、塩化ホルミウム、塩化ハフニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＶ）およびこれらの組み合わせから選択される１またはそれを超える第二の剤と、必要に応じて水と、を含み、から本質的になり、またはからなる。
【０１４５】
第一の剤、第二の剤および第一の剤と第二の剤の組み合わせは、上記節ＩＩ．「核酸の単離」、サブセクション「Ａ．方法」に上述されているとおりである。
【０１４６】
組成物は、好ましくは、水溶液である。このような事例では、溶液中の１またはそれを超える第一の剤の総濃度が、０．５〜１０Ｍ、例えば、０．５〜２．５Ｍ、２．５〜５Ｍ、５〜７．５Ｍ、７．５〜１０Ｍ、０．５〜５Ｍ、０．５〜７．５Ｍ、０．５〜１０Ｍ、２．５〜７．５Ｍ、２．５〜１０Ｍ、５〜１０Ｍ、好ましくは、０．５〜５Ｍ、０．５〜７．５Ｍ、２．５〜５Ｍ、２．５〜７．５Ｍ、１〜８Ｍまたは１．５〜７．５Ｍの範囲にあり得る。複数の第一の剤が溶液中に存在する場合、溶液中の個々の第一の剤の濃度は、０．１〜９．５Ｍ、例えば、０．１〜０．５Ｍ、０．５〜２．５Ｍ、２．５〜５Ｍ、５〜７．５Ｍ、７．５〜９．５Ｍ、０．１〜２．５Ｍ、０．１〜５Ｍ、０．１〜７．５Ｍ、０．５〜５Ｍ、０．５〜７．５Ｍ、０．５〜９．５Ｍ、２．５〜７．５Ｍ、２．５〜９．５Ｍ、５〜９．５Ｍ、好ましくは、０．１〜５Ｍ、０．５〜７．５Ｍ、２．５〜５Ｍ、２．５〜７．５Ｍ、１〜８Ｍまたは１．５〜７．５Ｍの範囲にあり得る。溶液中の１またはそれを超える第二の剤の総濃度は、１０〜５００ｍＭ、例えば、１０〜１００ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜５００ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、２００〜５００ｍＭ、３００〜５００ｍＭ、好ましくは、１０〜２００ｍＭ、１０〜５００ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜５００ｍＭまたは７５〜１５０ｍＭの範囲にあり得る。複数の第二の剤が溶液中に存在する場合、溶液中の個々の第二の剤の濃度は、１〜４５０ｍＭ、例えば、１〜１０ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、４００〜４５０ｍＭ、１〜２００ｍＭ、１〜３００ｍＭ、１〜４００ｍＭ、１〜４５０ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜４５０ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、２００〜４５０ｍＭ、３００〜４５０ｍＭ、好ましくは、１〜２００ｍＭ、１０〜４５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜４５０ｍＭまたは７５〜１５０ｍＭの範囲にあり得る。
【０１４７】
第一の剤および第二の剤を含む例示的な好ましい溶液としては、以下のものが挙げられる。
（１）  １〜８Ｍ（好ましくは、２．５〜５Ｍ）酢酸アンモニウムと２０〜２００ｍＭ塩化アルミニウムを含有する溶液；
（２）  １〜１０Ｍ（好ましくは、１〜８Ｍ）酢酸ナトリウムと２０〜２００ｍＭ塩化アルミニウムを含有する溶液；
（３）  １〜８Ｍ（好ましくは、１〜５Ｍ）酢酸セシウムと２０〜２００ｍＭ塩化アルミニウムを含有する溶液；
（４）  １〜８Ｍ（好ましくは、２．５〜５Ｍ）酢酸アンモニウムと２０〜２００ｍＭ酢酸エルビウム（ＩＩＩ）を含有する溶液；
（５）  １〜１０Ｍ（好ましくは、１〜８Ｍ）酢酸ナトリウムと２０〜２００ｍＭ酢酸エルビウム（ＩＩＩ）を含有する溶液；
（６）  １〜８Ｍ（好ましくは、１〜５Ｍ）酢酸セシウムと２０〜２００ｍＭ酢酸エルビウム（ＩＩＩ）を含有する溶液；
（７）  １〜８Ｍ（好ましくは、２．５〜５Ｍ）酢酸アンモニウムと２０〜２００ｍＭ塩化エルビウム（ＩＩＩ）を含有する溶液；
（８）  １〜１０Ｍ（好ましくは、１〜８Ｍ）酢酸ナトリウムと２０〜２００ｍＭ塩化エルビウム（ＩＩＩ）を含有する溶液；
（９）  １〜８Ｍ（好ましくは、１〜５Ｍ）酢酸セシウムと２０〜２００ｍＭ塩化エルビウム（ＩＩＩ）を含有する溶液；
（１０）  １〜８Ｍ（好ましくは、２．５〜５Ｍ）酢酸アンモニウムと２０〜２００ｍＭ塩化ホルミウムを含有する溶液；
（１１）  １〜１０Ｍ（好ましくは、１〜８Ｍ）酢酸ナトリウムと２０〜２００ｍＭ塩化ホルミウムを含有する溶液；および
（１２）  １〜８Ｍ（好ましくは、１〜５Ｍ）酢酸セシウムと２０〜２００ｍＭ塩化ホルミウムを含有する溶液。
【０１４８】
または、組成物は、固体形態であり得る。このような事例では、適量の水が組成物に添加されたときに、組成物が既に溶液である場合において、得られた溶液が、上記のとおりの１またはそれを超える第一の剤と１またはそれを超える第二の剤の濃度を有するように、組成物は、１またはそれを超える第一の剤および１またはそれを超える第二の剤を含み、から本質的になり、またはからなる。添加される水は、試料中の水からも生じ得る、すなわち、塩の組み合わせが水性試料材料に直接添加され得る。
【０１４９】
関連する態様において、本開示は、試料から核酸を単離する上での上記組成物の使用を提供する。
【０１５０】
Ｃ．  キット
別の態様において、本開示は、試料から核酸を単離するためのキットを提供する。キットは、上記節「ＩＩ．「核酸の単離」、サブセクション「組成物」に記載されているとおり、１またはそれを超える第一の剤および１またはそれを超える第二の剤を含む組成物を含む。または、キットは、別々に提供される１またはそれを超える第一の剤と１またはそれを超える第二の剤とを含む。
【０１５１】
キットは、１またはそれを超える以下の成分をさらに含み得る。
溶解試薬
ホモジナイズ材料、
核酸結合固体支持体、
ＤＮＡ結合溶液、
ＤＮＡ洗浄溶液、
ＤＮＡ溶出溶液、
ＲＮＡ結合溶液、
ＲＮＡ洗浄溶液、
ＲＮＡ溶出溶液、および
１またはそれを超える器（ｖｅｓｓｅｌｓ）または容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）（例えば、収集チューブ）。
【０１５２】
溶解試薬は、好ましくは、上記節「Ｉ．試料の溶解」に記載されているとおりの、ホスフェートおよび相対的に穏やかなカオトロピック剤を含む、から本質的になる、またはからなる溶解試薬である。
【０１５３】
ホモジナイズ材料は、上記節「Ｉ．試料の溶解、サブセクション「Ｃ．溶解過程」に上記されているとおりの、試料をホモジナイズする上で有用な物質、例えば、ビーズ、好ましくは、試料を機械的に破壊するための高密度ビーズを表す。
【０１５４】
その他の必要に応じて存在するキット成分は、上記節「Ｉ．試料の溶解」、サブセクション「Ｄ．キット」に記載されているとおりである。
【０１５５】
関連する態様において、本開示は、試料から核酸を単離する上での上記キットの使用を提供する。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例では、以下の試薬が参照される。
溶解試薬Ｉ：１Ｍ  ＮａＳＣＮ、０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４。
溶解試薬ＩＩ：０．０９Ｍチオシアン酸グアニジン、０．１３Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．００６Ｍ  ＮａＣｌ、１．７６Ｍ酢酸アンモニウム、０．２５％ＳＤＳ、０．１０％消泡剤Ａ。
溶解溶液Ｉ：０．１８Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１２Ｍ  ＧｕＳＣＮ、ｐＨ８．８〜９．２。
溶解溶液ＩＩ：０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基、４％ＳＤＳ（０．１４Ｍ）、ｐＨ１０．７５〜１１．２５。
ＤＮＡ結合溶液Ｉ：カオトロピック剤を含有する。
ＤＮＡ結合溶液ＩＩ：カオトロピック剤、緩衝剤およびイソプロパノールを含有する。
ＤＮＡ結合溶液ＩＩＩ：エタノールを含有する。
ＤＮＡ結合溶液ＩＶ：カオトロピック剤、緩衝剤塩基およびエタノールを含有する。
ＤＮＡ洗浄溶液Ｉ：カオトロピック剤、緩衝剤およびイソプロパノール、およびエタノールを含有する。
ＤＮＡ洗浄溶液ＩＩ：緩衝剤、キレート剤、塩およびエタノールを含有する。
ＤＮＡ溶出溶液：わずかに塩基性のｐＨを有する緩衝剤を含有する。
ＲＮＡ結合溶液：アセトンおよびエタノールを含有する。
ＲＮＡ洗浄溶液：緩衝剤、キレート剤、塩およびアルコールを含有する。
タンパク質結合溶液：塩および酸性ｐＨを有する緩衝剤を含有する。
タンパク質洗浄溶液：エタノールを含有する。
タンパク質溶出溶液：わずかに塩基性のｐＨを有する緩衝剤および界面活性剤を含有する。
【０１５７】
［実施例１］
便試料からのＤＮＡ単離に対する阻害物質の除去ありまたはなしでの溶解試薬の効果
本実施例は、便試料からのＤＮＡ単離に対する阻害物質の除去ありまたはなしでの異なる溶解試薬の効果を調べる。
【０１５８】
４つの異なる実験（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）は、以下の表に示されているように実施した。ＡおよびＢは、本開示の例示的な溶解試薬（「溶解試薬Ｉ」）を使用したのに対して、ＣおよびＤは、既存の溶解試薬（「溶解試薬ＩＩ」）を使用した。ＡおよびＣは阻害物質の除去を実施しなかったのに対して、ＢおよびＤは実施した。
【０１５９】
【表１】
2021520823.tif 000003
【０１６０】
単離されたＤＮＡの収率および純度は、下表に示されている。
【表２】
2021520823.tif 000004
【０１６１】
上の結果は、供給者の指示に従って、ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて得られた。
【０１６２】
【表３】
2021520823.tif 000005
【０１６３】
上の結果は、供給者の指示に従って、ＴＨＥＲＭＯＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）ＮＤ−１０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて得られた。
【０１６４】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動は、図１に示されている。
【０１６５】
これらの結果は、溶解試薬ＩＩと比べて、溶解試薬Ｉはずっと多くのＤＮＡを抽出し、可溶化したことを示す。阻害物質の除去なしでは、２つの溶解方法間のＤＮＡ収率の差は４７％であった。阻害物質の除去ありでは、差は５２％であった。
【０１６６】
［実施例２］
便試料からのＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離に対する酢酸アンモニウムの用量設定の効果
本実施例は、便試料からのＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離に対する様々な濃度の酢酸アンモニウムの効果を調べる。
【０１６７】
イヌの便を以前に集め、直ちに凍結した。本実験のために使用した分割量は一回融解されたことがあった。最大の設定にしたボルテックス上で、１０分間、混合ジルコニウムビーズチューブ（１．２ｇ  ０．１ｍｍ＋１．２ｇ  ０．５ｍｍ）中において、ビードビーティングを行った。溶解およびＤＮＡ結合溶液の添加後に、全ての上清をプールした。各チューブから約８００μＬを回収したが、阻害物質除去工程のために、７５０μＬを再度分取した。ＮＨ４ＯＡｃの濃度は全て、硫酸アンモニウムアルミニウム１２水和物（ＡＡＳＤ）と合わされた後の濃度である。
【０１６８】
【表４】
2021520823.tif 000006
【０１６９】
単離された核酸の収率および純度は、下表に示されている。
【表５】
2021520823.tif 000007
【０１７０】
【表６】
2021520823.tif 000008
【０１７１】
上表から得られた結果は、供給者の指示に従って、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）ＱＵＢＩＴ（商標）蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて得られた。
【０１７２】
単離されたＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のゲル電気泳動は、それぞれ、図２の上、中央および下のパネルに示されている。
【０１７３】
これらの結果は、３．７５Ｍ酢酸アンモニウムが実質的なＤＮＡの喪失およびＤＮＡ結合の低下を引き起こしたことを示す。酢酸アンモニウムが０．９３７５Ｍでまたはそれを下回って使用された場合に、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離は全て改善され、対照（３．７５Ｍ酢酸アンモニウム）に匹敵しまたはそれを上回った。少なくとも１．０のＡ２６０／Ａ２３０を有する全ての核酸およびタンパク質に対する最高の収率は、ＤＮＡについてはＥ（０．２３４３７５Ｍ酢酸アンモニウム）、ＲＮＡについてはＤ（０．４６８７５Ｍ酢酸アンモニウム）であった。
【０１７４】
［実施例３］
土壌試料からのＤＮＡ単離
本実施例は、土壌試料からのＤＮＡ単離に対する異なる溶解および／または阻害物質除去方法の効果を調べる。
【０１７５】
ＤＮＡ単離は、下表に示されているとおりに実施した。対照（試料５）を除き、全ての試料は４つ組で行った。
【０１７６】
【表７】
2021520823.tif 000009
【０１７７】
庭園土壌（ＶＶＧ）：高濃度のＰＣＲ阻害性化合物を含有する極めて肥えた庭園土壌。
【０１７８】
単離されたＤＮＡの収率および純度は、下表に示されている。
【０１７９】
【表８−１】
2021520823.tif 000010
【表８−２】
2021520823.tif 000011
【０１８０】
【表９】
2021520823.tif 000012
【０１８１】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動は、図３に示されている。
【０１８２】
これらの結果は、試料１および３の条件は、最低量のＤＮＡ剪断によって、最高のＤＮＡ収率をもたらしたことを示す。ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒはＤＮＡ収率を劇的に改善しなかったが、ビードビーティングに対して通常費やされる時間を節約した。試料２は最高の収率をもたらしたが、ＤＮＡはより小さな断片であった。阻害物質の除去前に可溶化液はほぼ黒かったので、これらの試料の純度は極めて良かった。試料４は、ガーネットビーズを使用した。ジルコニウムビーズチューブは、これらの試料を２０ｎｇ／μＬ（２μｇ）上回った。試料５は、伝統的なプロトコールであり、対照として使用した。本実験は、ＤＮＡ収率が２５０％向上され得ることを示す。
【０１８３】
［実施例４］
土壌試料からのＤＮＡ単離に対する異なる溶解緩衝液の効果
本実施例は、土壌試料からのＤＮＡ単離に対する異なる溶解緩衝液の効果を調べる。
【０１８４】
ＤＮＡ単離は、下表に示されているとおりに実施した。全ての試料は、２つ組で行った。いずれの点でも、試料はプールしなかった。
【０１８５】
【表１０】
2021520823.tif 000013
【０１８６】
単離されたＤＮＡの収率および純度は、下表に示されている。
【表１１】
2021520823.tif 000014
【０１８７】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動は、図４に示されている。
【０１８８】
これらの結果は、試料１  ＤＮＡは、ホスフェートのみ対照（試料４）より高いＤＮＡ収率を有するように見受けられたことを示し、ホスフェートのみの溶解緩衝液へＮａＳＣＮを添加することがＤＮＡ収率を改善したことを示唆する。ＤＮＡ結合溶液ＩＩＩ中のエタノールはＲＮＡも結合させたので、ゲルおよびｎａｎｏｄｒｏｐを用いて試料２のＤＮＡ収率を決定することは困難であった。試料３は、高品質のＤＮＡをもたらした。
【０１８９】
［実施例５］
便試料からのＤＮＡ単離に対する異なる溶解緩衝液の効果
本実施例は、便試料からのＤＮＡ単離に対する異なる溶解の効果を調べる。
【０１９０】
全ての試料は２つ組で行い、下表に示されているように、２つのパートで処理した。全ての試料は溶解後にプールした。各試料に、５４０ｕＬを分配した。
【０１９１】
パート１
【表１２】
2021520823.tif 000015
【０１９２】
パート２
【表１３】
2021520823.tif 000016
【０１９３】
「Ｐ１から得たＢＴ１」は、群１（１．２ｇ  ０．１ｍｍおよび１．２ｇ  ０．５ｍｍビーズ＋０．１８Ｍホスフェート）中のビーズチューブ組成物（緩衝物質を含む）を表す。この同じビーズチューブを群８において使用したが、溶解および上清の除去後に、溶解工程の間に放出された場合に、ＤＮＡを可溶化できたかどうかをチェックするために、ビーズチューブ中に１Ｍ  ＮａＳＣＮ＋０．１８Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４を再び添加した。
【０１９４】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動が、図５に示されている。
【０１９５】
これらの結果は、便試料中での微生物の溶解のためにＮａＳＣＮが必要とされるように見受けられたことを示す。具体的には、ホスフェートに加えて溶解溶液中にＮａＳＣＮを含有する試料５および７からＤＮＡが単離されたのに対して、溶解溶液中にＮａＳＣＮを含有しない他の試料からはほとんどＤＮＡが単離されなかった。
【０１９６】
［実施例６］
異なるキット間での、便試料からのＤＮＡ単離の比較
本実施例は、異なる市販のキット（試験１〜３）および本開示の例示的な方法（「新技術」、試験４）の間での、便試料からのＤＮＡ単離を比較する。
【０１９７】
全ての試料は、３つ組で行った。各キットのプロトコールに従った。ビードビーティングは、全てのキットにわたって標準化した。ビーズチューブは、最高速度で１０分間ホモジナイズした。
【０１９８】
【表１４−１】
2021520823.tif 000017
【表１４−２】
2021520823.tif 000018
【０１９９】
「Ｏ」および「Ｙ」という表記は、高齢者「Ｏ」ドナーから得たヒト便試料と若年者「Ｙ」ドナーから得たヒト便試料に対応する。「高齢」ドナーは６５歳以上であり、「若年」ドアーは５０歳未満であった。
【０２００】
ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ試料Ａは、Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ  ＩＶ  Ｓｐｉｎ  Ｆｉｌｔｅｒを閉塞させた。試料は２つのスピンフィルターに分けられたが、遠心分離後に可溶化液を再度合わせた。
【０２０１】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動は、図６Ａ（ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）、図６Ｂ（ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、図６Ｃ（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｏｉｌ）および図６Ｄ（Ｎｅｗ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）に示されている。
【０２０２】
ＮａｎｏＤｒｏｐによって測定された異なるキットによる単離されたＤＮＡの濃度が、下表および図６Ｅに示されている。
【０２０３】
【表１５】
2021520823.tif 000019
【０２０４】
Ｑｕｂｉｔによって測定された異なるキットによる単離されたＤＮＡの純度および濃度が、下表および図６Ｆに示されている。
【０２０５】
【表１６−１】
2021520823.tif 000020
【表１６−２】
2021520823.tif 000021
【０２０６】
これらの結果は、本開示に係る新技術が全てのキットの中で最も高いＤＮＡ収率をもたらしたことを示す。特に、この新技術は、高齢者の便試料からＤＮＡを単離したときに、性能が他の全てのキットより４００％超優れていた。
【０２０７】
［実施例７］
別の三価金属塩を用いた土壌試料からの阻害物質の除去
本実施例は、土壌試料から阻害物質を除去する上で、硫酸アンモニウムアルミニウム１２水和物と類似する他の三価金属塩を試験する。
【０２０８】
全ての試料は、２つ組で行い、阻害物質の除去前にプールした。
【０２０９】
【表１７】
2021520823.tif 000022
【０２１０】
ＬＣＣ：ラコスタキャニオン（Ｌａ  Ｃｏｓｔａ  Ｃａｎｙｏｎ）から得た土壌試料。これは、ＰＣＲ阻害物質含量が極めて高い、中度の高バイオマス土壌である。
【０２１１】
単離されたＤＮＡの収率および純度が、下表に示されている。
【表１８】
2021520823.tif 000023
【０２１２】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動は、図７に示されている。
【０２１３】
単離されたＤＮＡ中での阻害を定量するために、以下に設定されているとおりのＰＣＲを使用した。
【０２１４】
【表１９】
2021520823.tif 000024
【０２１５】
ＰＣＲサイクリングは、以下のとおり実施した。９５℃５分間、ならびに９５℃１５秒間および６０℃３０秒間を４５サイクル。
【０２１６】
これらの結果は、下表に示されている。
【表２０】
2021520823.tif 000025
これらの結果は、試験された三価金属塩の全てが、様々なＤＮＡ喪失度で、ＡＡＳＤより効果的に土壌阻害物質を除去したことを示す。ＡｌＣｌ３（試験２）は、最小量のＤＮＡを除去しながら最高量の阻害物質を除去した。
【０２１７】
［実施例８］
異なる溶解試薬および阻害物質除去溶液を用いた、土壌試料からのＤＮＡおよびＲＮＡの単離
本実施例は、土壌試料からのＤＮＡおよびＲＮＡ単離に対する異なる溶解溶液および阻害物質除去の効果を示す。
【０２１８】
プロトコール：
−０．２５ｇ土壌をビーズチューブに加え、
−６５０ｕＬの溶解試薬ＩＩ（チューブ１〜４）または８１０ｕＬの溶解試薬Ｉ（チューブ５〜７）を加え、
−７ｕＬのβ−ＭＥと１００ｕＬのフェノールを加え（チューブ１〜７）、
−１０分間、高設定でのボルテックス上でホモジナイズし、
−上清を取り出し、新しいチューブに入れ、
−１５０ｕＬの０．１２Ｍ  ＡＡＳＤ（チューブ１〜４）または２５０ｕＬの３．７５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ、９６ｍＭ  ＡＡＳＤ（チューブ５〜７）を加え、５分インキュベートし、回転し、上清を除去する。
【０２１９】
ＤＮＡを結合する：
−等しい容量のＤＮＡ結合溶液ＩＶ（チューブ１〜４）または等しい容量のＤＮＡ結合溶液Ｉを加え、
−７５０ｕＬをスピンカラムの中に入れ、遠心分離し、素通り画分を別個の２ｍＬチューブ中に保ち（すなわち、ＲＮＡ素通り画分）、全ての可溶化液がスピンカラムを通過するまで繰り返す。
【０２２０】
ＲＮＡを結合する：
−ＲＮＡを結合するために、５ｍＬチューブ中に等しい容量の１００％エタノール（約１ｍＬ）を加え、
−７５０ｕＬをスピンカラムの中に入れ、遠心分離し、全ての可溶化液がスピンカラムを通過するまで繰り返す。
【０２２１】
ＤＮＡ／ＲＮＡを洗浄する：
−６５０ｕＬのＲＮＡ洗浄溶液でスピンカラムを洗浄し、次いで、６５０ｕＬのエタノールでスピンカラムを洗浄し（チューブ１〜４）、または６００ｕＬのＤＮＡ洗浄溶液Ｉでスピンカラムを洗浄し、次いで、６００μＬのＤＮＡ洗浄溶液ＩＩでスピンカラムを洗浄し、
−１０，０００で２分間、遠心分離して脱水し、
−新しいチューブにスピンフィルターを加え、
−１００ｕＬＨ２Ｏ中にＤＮＡ／ＲＮＡを溶出する（チューブ１〜７）
【０２２２】
【表２１】
2021520823.tif 000026
【０２２３】
結果は、図８に示されている。具体的には、図８の上左パネルは単離されたＤＮＡのゲル電気泳動であり、下左パネル（ｐａｎｅ）は、単離されたＲＮＡのゲル電気泳動であり、上右の表は、単離されたＤＮＡの収率および純度であり、下右の表は、単離されたＲＮＡの収率および純度である。
【０２２４】
これらの結果は、酢酸アンモニウムとＡＡＳＤを含む阻害物質除去溶液と組み合わせた溶解試薬Ｉを用いたＤＮＡおよびＲＮＡの収率が、ＡＡＳＤと組み合わせた溶解試薬ＩＩを用いたＤＮＡおよびＲＮＡの収率より著しく高かったことを示す。
【０２２５】
［実施例９］
塩化アルミニウムを用いた土壌試料からの阻害物質の除去
本実施例は、塩化アルミニウムが土壌試料から阻害物質を除去する上で効果的であったことを示す。
【０２２６】
試料１および３は、５つの反復からなったのに対して、試料２および４は２つ組みで行った。
【０２２７】
【表２２】
2021520823.tif 000027
【０２２８】
単離されたＤＮＡの収率および純度が、下表に示されている。
【０２２９】
【表２３−１】
2021520823.tif 000028
【表２３−２】
2021520823.tif 000029
【０２３０】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動は、図９に示されている。
【０２３１】
単離されたＤＮＡ中での阻害を定量するために、以下に設定されているとおりのＰＣＲを使用した。
【０２３２】
【表２４】
2021520823.tif 000030
【０２３３】
ＰＣＲサイクリングは、以下のとおり実施した。９５℃５分間、ならびに９５℃１５秒間および６０℃３０秒間を４５サイクル。
【０２３４】
これらの結果は、下表に示されている。
【０２３５】
【表２５−１】
2021520823.tif 000031
【表２５−２】
2021520823.tif 000032
【０２３６】
これらの結果は、ＡｌＣｌ３が、両方の土壌の種類において、対照（ＡＡＳＤ）と等しいＤＮＡ収率をもたらしたことを示す。ＡｌＣｌ３は、ＶＶＧにおいて３．８から１へ、ＬＣＣにおいて５から０．５へ、ｄＣｔを低下させ、両土壌試料からＰＣＲ阻害化合物を除去する上で、ＡｌＣｌ３がＡＡＳＤより有効であったことを示す。
【０２３７】
［実施例１０］
土壌試料からのＤＮＡ単離に対する酢酸カリウムと硫酸アンモニウムの効果
本実施例は、土壌試料からのＤＮＡ単離に対する酢酸カリウムと硫酸アンモニウムの効果を調べる。
【０２３８】
ＤＮＡ単離は、下表に示されているとおりに実施した。全ての試料は、２つ組で行った。
【０２３９】
【表２６】
2021520823.tif 000033
【０２４０】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動は、図１０に示されている。
【０２４１】
Ｎａｎｏｄｒｏｐによって測定された単離されたＤＮＡの収率および純度が、下表に示されている。
【表２７】
2021520823.tif 000034
【０２４２】
これらの結果は、実験Ｄ１ｂおよびＤ３ａによって得られたＤＮＡ収率と純度は対照実験０と類似していたが、実験Ｄ１ａはより少ないＤＮＡをもたらしたことを示す。したがって、硫酸アンモニウムは、土壌試料からのＤＮＡ単離に対して酢酸アンモニウムと類似の効果を有していたが、酢酸カリウムは、酢酸アンモニウムより少ないＤＮＡをもたらした。
【０２４３】
［実施例１１］
土壌試料からのＤＮＡ単離に対する酢酸ナトリウムと塩化ナトリウムの効果
本実施例は、土壌試料からのＤＮＡ単離に対する酢酸ナトリウムと塩化ナトリウムの効果を調べる。
【０２４４】
ＤＮＡ単離は、下表に示されているとおりに実施した。全ての試料は、２つ組で行った。全ての同様の試料（１〜６）は、ビードビーティング後にプールした。５５０ｕｌを各収集チューブに分配した。
【０２４５】
【表２８】
2021520823.tif 000035
【０２４６】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動が、図１１に示されている。
【０２４７】
Ｎａｎｏｄｒｏｐによって測定された単離されたＤＮＡの収率および純度が、下表に示されている。
【０２４８】
【表２９】
2021520823.tif 000036
【０２４９】
これらの結果は、試験された濃度で酢酸ナトリウムを使用したＤＮＡ収率（実験１〜３）は、溶解溶液ＩＩを含めずに酢酸アンモニウムを使用したＤＮＡ収率（実験６）と同様であったが、試験濃度で塩化ナトリウムを使用したＤＮＡ収率（実験４および５）は、溶解溶液ＩＩを含めずに酢酸アンモニウムを使用したＤＮＡ収率（実験６）より低かった。実験６と７を比較すると、ＤＮＡ単離の間に溶解溶液ＩＩを含めることはＤＮＡ収率を低下させたことを示す。
【０２５０】
［実施例１２］
土壌試料からのＤＮＡ単離に対する酢酸セシウムと塩化セシウムの効果
本実施例は、土壌試料からのＤＮＡ単離に対する酢酸セシウムと塩化セシウムの効果を調べる。
【０２５１】
ＤＮＡ単離は、下表に示されているとおりに実施した。全ての試料は、２つ組で行った。全ての同様の試料（１〜７）は、ビードビーティング後にプールした。５５０ｕｌを各収集チューブに分配した。
【０２５２】
【表３０】
2021520823.tif 000037
【０２５３】
単離されたＤＮＡのゲル電気泳動が、図１２に示されている。
【０２５４】
Ｎａｎｏｄｒｏｐによって測定された単離されたＤＮＡの収率および純度が、下表に示されている。
【０２５５】
【表３１−１】
2021520823.tif 000038
【表３１−２】
2021520823.tif 000039
【０２５６】
これらの結果は、ＤＮＡ収率が、酢酸セシウム濃度が増加するにつれて減少したことを示す（実験１〜３）。試験された最小の濃度での酢酸セシウム（実験１）は、酢酸アンモニウムを使用するが溶解溶液ＩＩを使用しない対照（実験７）より高いＤＮＡ収率を与えた。試験したいずれのＣｓＣｌ濃度においても、ＤＮＡは単離されなかった。
【０２５７】
［実施例１３］
土壌または便試料からＤＮＡを単離するための例示的な方法
本実施例は、本開示に従って土壌または便試料からＤＮＡを単離するための例示的な方法を記載する。
【０２５８】
プロトコールの概要
化学的および機械的ホモジナイゼーションを用いて、土壌または便試料を溶解する。試料を含有する混合ジルコニウムビーズチューブに溶解緩衝液を添加する。ビードビーティングは、ビーズチューブアダプターまたは高出力のＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒとともに、標準的な卓上ボルテックスを用いて実施することができる。次いで、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ阻害化合物を除去するために、一段階の沈殿反応に未精製可溶化液を供する。阻害物質除去後に、精製された可溶化液をＤＮＡ結合溶液と混合し、シリカスピンフィルター膜を通過させる。二段階の洗浄レジメンで膜を洗浄する。次いで、ＤＮＡ溶出緩衝液を用いて、シリカに結合したＤＮＡを溶出する。
【０２５９】
詳細なプロトコール
溶解：
１．イットリウム安定化ジルコニウム混合ビーズチューブ（例えば、０．１および０．５ｍｍビーズ、それぞれ１グラム）中に最大２５０ｍｇの土壌（または便）を加える。
２．８００μＬの溶解緩衝液（例えば、ＮａＳＣＮおよびＮａ２ＨＰＯ４を含有する緩衝液）を加える。
３．混合するために、高設定でボルテックスにかける。
４．最高速度で１０分間、ビードビーティングを行う。
５．１５，０００×ｇで１分間、ビーズチューブを遠心分離する。
６．新しい収集チューブに上清（予想５５０μＬ）を移す。
【０２６０】
阻害物質の除去：
７．２００μＬの阻害物質除去溶液（例えば、ＮＨ４ＯＡｃおよびＡｌＣｌ３を含有する溶液）を加える。
８．混合するために、高設定でボルテックスにかける。
９．１５，０００×ｇで１分間、チューブを遠心分離する。
１０．新しい収集チューブに上清（予想６５０μＬ）を移す。
【０２６１】
ＤＮＡ結合：
１１．４５０μＬのＤＮＡ結合溶液Ｉを加える。
１２．混合するために、高設定でボルテックスにかける。
１３．スピンカラム中に５５０μＬを搭載する。
１４．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。素通り画分を廃棄する。
１５．スピンカラム中に残りの可溶化液の容量を搭載する。
１６．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。素通り画分を廃棄する。
【０２６２】
ＤＮＡ洗浄：
１７．６５０μＬのＤＮＡ洗浄溶液Ｉをスピンカラム上に加える。
１８．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。素通り画分を廃棄する。
１９．５００μＬのＤＮＡ洗浄溶液ＩＩをスピンカラム上に加える。
２０．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。素通り画分を廃棄する。
２１．１５，０００×ｇで２分間、空のスピンカラムを遠心分離する。
２２．スピンカラムを新しい収集チューブに移す。
【０２６３】
ＤＮＡ溶出：
２３．スピンカラム膜の中心に１００μＬのＤＮＡ溶出溶液を加える。
２４．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。スピンカラムを廃棄する。
【０２６４】
［実施例１４］
土壌試料からＤＮＡおよびＲＮＡを単離するための例示的な方法
本実施例は、本開示に従って土壌試料からＤＮＡおよびＲＮＡを単離するための例示的な方法を記載する。
【０２６５】
プロトコールの概要
化学的および機械的ホモジナイゼーションを用いて、最大２５０ｍｇの土壌を溶解する。試料を含有する混合ジルコニウムビーズチューブに溶解緩衝液を添加する。ビードビーティングは、ビーズチューブアダプターまたは高出力のＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒとともに、標準的な卓上ボルテックスを用いて実施することができる。次いで、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ阻害化合物を除去するために、一段階の沈殿反応に未精製可溶化液を供する。阻害物質除去後に、精製された可溶化液をＤＮＡ結合溶液と混合し、シリカスピンフィルター膜を通過させる。ＤＮＡ素通り画分に等容量のイソプロパノールを加え、全ＲＮＡを捕捉するために、この溶液を第二のスピンカラムに通過させる。二段階の洗浄レジメンで両方の膜を洗浄する。次いで、シリカに結合したＤＮＡとＲＮＡを溶出する。
【０２６６】
詳細なプロトコール
溶解：
１．イットリウム安定化ジルコニウム混合ビーズチューブ（例えば、０．１および０．５ｍｍビーズ、それぞれ１グラム）中に最大２５０ｍｇの土壌を加える。
２．８００μＬの溶解緩衝液（例えば、ＮａＳＣＮおよびＮａ２ＨＰＯ４を含有する緩衝液）、７μＬのβ−メルカプトエタノールおよび１００μＬのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（ＰＩＣ）を加え、Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０で平衡化する。
３．混合するために、高設定でボルテックスにかける。
４．最高速度で１０分間、ビードビーティングを行う。
５．１５，０００×ｇで１分間、ビーズチューブを遠心分離する。
６．新しい収集チューブに上清（予想５００μＬ）を移す。
【０２６７】
阻害物質の除去：
７．２５０μＬの阻害物質除去溶液（例えば、ＮＨ４ＯＡｃおよびＡｌＣｌ３を含有する溶液）を加える。
８．混合するために、高設定でボルテックスにかける。
９．１５，０００×ｇで１分間、チューブを遠心分離する。
１０．新しい収集チューブに上清（予想６５０μＬ）を移す。
【０２６８】
ＤＮＡ結合：
１１．４５０μＬのＤＮＡ結合溶液Ｉを加える。
１２．混合するために、高設定でボルテックスにかける。
１３．スピンカラム中に５５０μＬを搭載する。
１４．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。ＲＮＡを含有する素通り画分を保持する。
１５．スピンカラム中に残りの可溶化液の容量を搭載する。
１６．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。ＲＮＡを含有する素通り画分を保持する。
１７．ＲＮＡが単離されている間に、固定化されたＤＮＡを有するスピンカラムを＋４℃に置く。
【０２６９】
ＲＮＡ結合：
１８．上からの保持されたスピンカラム素通り画分に１０００μＬのイソプロパノールを加える。
１９．スピンカラム上に７５０μＬのＲＮＡ含有可溶化液を搭載する。
２０．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。素通り画分を廃棄する。
２１．全ての可溶化液がスピンカラムを通して処理されるまで、可溶化液の搭載および遠心分離を繰り返す。
【０２７０】
ＤＮＡおよびＲＮＡ洗浄：
２２．６５０μＬのＤＮＡ洗浄溶液Ｉをスピンカラム上に加える。
２３．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。素通り画分を廃棄する。
２４．６５０μＬのＤＮＡ洗浄溶液２をスピンカラム上に加える。
２５．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。素通り画分を廃棄する。
２６．１５，０００×ｇで２分間、空のスピンカラムを遠心分離する。
２７．スピンカラムを新しい収集チューブに移す。
【０２７１】
ＤＮＡ溶出：
２８．スピンカラム膜の中心に１００μＬのＤＮＡ溶出溶液を加える。
２９．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。スピンカラムを廃棄する。
【０２７２】
ＲＮＡ溶出：
３０．スピンカラム膜の中心に１００μＬのＲＮアーゼを含まない水を加える。
３１．１５，０００×ｇで１分間、スピンカラムを遠心分離する。スピンカラムを廃棄する。
【０２７３】
上記されている様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。２０１８年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／６６２，０６３号を含む、本明細書中に引用されているおよび／または出願データシート中に列記されている全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、参考文献またはその一部の組み込みが本開示と矛盾する場合を除き、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。様々な特許、出願および刊行物の概念を使用してさらなる実施形態を提供することが必要であれば、実施形態の態様は改変することができる。
【０２７４】
上記記述に照らして、実施形態に対してこれらおよびその他の変化を施すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用されている用語は、本明細書および特許請求の範囲中に開示されている具体的な実施形態に特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではなく、かかる特許請求の範囲の権利が及ぶ均等物の全範囲とともに全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
2021520823.tif 000040
【図２】
2021520823.tif 000041
【図３】
2021520823.tif 000042
【図４】
2021520823.tif 000043
【図５】
2021520823.tif 000044
【図６Ａ】
2021520823.tif 000045
【図６Ｂ】
2021520823.tif 000046
【図６Ｃ】
2021520823.tif 000047
【図６Ｄ】
2021520823.tif 000048
【図６Ｅ】
2021520823.tif 000049
【図６Ｆ】
2021520823.tif 000050
【図７】
2021520823.tif 000051
【図８】
2021520823.tif 000052
【図９】
2021520823.tif 000053
【図１０】
2021520823.tif 000054
【図１１】
2021520823.tif 000055
【図１２】
2021520823.tif 000056
【国際調査報告】
2021520823.tif 000057
2021520823.tif 000058
2021520823.tif 000059
2021520823.tif 000060
2021520823.tif 000061