(57)【要約】  本発明は、リン脂質と組み合わせたアメリカンクランベリー抽出物を含む組成物、ならびに尿路感染症の予防および治療におけるその使用に関する。本発明はまた、前記組成物の調製方法、および前記組成物を含む経口投与用製剤に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）組成物の総重量の２０重量％〜５０重量％の範囲の量のワクシニウムマクロカルポン(Vaccinium macrocarpon)抽出物、および
ｂ）組成物の総重量の５０重量％〜８０重量％の範囲の量の少なくとも１つのリン脂質、
を含む組成物。
【請求項２】
前記ワクシニウムマクロカルポン抽出物が、前記抽出物の全重量の１５重量％〜４０重量％の範囲のプロアントシアニジン含有量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
水溶性または水不溶性希釈剤、潤滑剤および／または流動促進剤および界面活性剤から選択される１つ以上の技術的補助剤をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
希釈剤が、マルトデキストリン、マンニトール、イソマルトまたはそれらの組み合わせではない、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ａ）組成物の総重量の２０重量％〜５０重量％の範囲の量のワクシニウムマクロカルポン(Vaccinium macrocarpon)抽出物、および
ｂ）組成物の総重量の５０重量％〜８０重量％の範囲の量の少なくとも１つのリン脂質、
を含む組成物を調製するための方法であって、
該方法は、溶液または分散液を得るための、ワクシニウムマクロカルポン抽出物、少なくとも１つのリン脂質、および任意選択で水溶性または水不溶性希釈剤、潤滑剤および／または流動促進剤および界面活性剤から選択される１以上の技術的補助剤の、３０℃〜９０℃の範囲の温度での可溶化または分散化と、続いての溶液または分散液を乾燥させて固体組成物を得ることとを含む、方法。
【請求項６】
有機溶媒がエチルアルコール、酢酸エチルおよびアセトンから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ワクシニウムマクロカルポン抽出物と少なくとも１つのリン脂質との同時可溶化または分散、続いて１つ以上の補助剤の任意選択の添加を含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
溶液または分散液を得るために、ワクシニウムマクロカルポン抽出物または少なくとも１つのリン脂質を有機溶媒中に可溶化または分散させ、続いて、少なくとも１つのリン脂質またはワクシニウムマクロカルポン抽出物、および任意選択で１つ以上の技術的補助剤を前記溶液または分散液に添加することを含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
１種以上の補助剤が、それらの重量が組成物の全重量の１％〜３０％の範囲の量で使用される、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法によって得られる固体組成物。
【請求項１１】
下部尿路の感染症の予防または治療のための医薬組成物および／または栄養補助食品組成物の調製のための、請求項１〜５または１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
１つ以上の薬学的および／または栄養学的に許容される賦形剤と混合した、請求項１〜５または１０のいずれか１項に記載の組成物を含む固形製剤。
【請求項１３】
リン脂質との混合物ではなく、遊離形態のワクシニウムマクロカルポン抽出物の追加部分をさらに含む、請求項１２に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物抽出物を含む医薬組成物または栄養補助食品組成物に関し、特に尿路の細菌感染の治療および予防に有用な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アメリカンクランベリー (Vaccinium macrocarpon Aiton)のジュースおよび抽出物は下部尿路感染症の治療および予防のための多数の臨床試験の主題を形成した(Burleigh A.E. et al.Nutr J 2013;12:139,Ledda A.et al.,Eur Rev Med Pharmacol Sci 2017;21:389-393、Jepson RG.et al.Cochrane Database Syst Rev 2012;10:CD001321）。下部尿路の再発性感染症は、成人女性の約50％が罹患し(Wang A et al.Prim Care 2013;40:687-706）、頻度は低いもの男性にも罹患する可能性がある。男性では、エージングの結果として尿路が構造的および機能的に変化するため、下部尿路感染症の発生率が年齢とともに有意に上昇する。この変化は、通常、良性前立腺過形成として知られる状態として現れる(Schaeffer AJ et al.N Engl J Med 2016；374：562−571）。
下部尿路感染症の主な病原菌は大腸菌であり、次いでプロテウス属、腐性ブドウ球菌、クレブシエラ属等の腸内細菌科である(Kahlmeter G.JAntimicrob Chemother 2000;46:15-22）。
【０００３】
下部尿路感染症は、１年に少なくとも３回、または６カ月に２回のエピソードが発生した場合、再発性と分類される。上記エピソードの頻度は抗生物質の予防投与によって減少させることができるが、長期の抗生物質治療は医療費を増大させ、抗菌薬治療の効力に対する耐性、および腸内細菌叢の変化を生じさせる可能性がある。
【０００４】
したがって、反復性下部尿路感染症の発症を予防できる非抗生物質治療の同定は、非常に興味深いと思われる。
【０００５】
可能な非抗生物質治療には、アメリカンクランベリー抽出物を含有する食餌サプリメントが含まれ、これには多大な注意が払われている。アメリカンクランベリーはプロアントシアニジン（ＰＡＣ）、フラボノール、ポリフェノールおよびヒドロキシシンナム酸を含む多数の有機物質を含有し、これらは、それらの活性代謝産物と共に、直接および間接の両方の殺菌活性を有する。後者は、尿路上皮粘膜への付着を防ぎ、それによって前記病原体によるバイオフィルムの形成を妨げる能力に起因する。前記抗癒着活性は特に、アメリカンクランベリーの主要な活性成分であるプロアントシアニジンについて実証されている。In vitro試験及びin vivo試験において、プロアントシアニジンはEscherichia coliのＰ線毛の尿路上皮粘膜への付着を阻害することが示されている(Howell AB.et al. N Engl J Med 1998；339：1085-1086，Di Martino P et al. J Urol 2006;24:21-27）。
【０００６】
アメリカンクランベリー抽出物中に存在する活性成分の主要な代謝産物の幾つか、例えばプロトカテク酸および没食子酸の、下部尿路感染の原因となる株に対する抗菌活性は、例えば、Kakkar,Sahil et al., ISRN pharmacology 2014（2014），Miklasinka，Maria et al.,Molecules 20.8(2015):13536−13549およびJayaraman、Premkumar,et al.,International journal of biological sciences 6.6（2010):556−Mensah、J.K.et al.,Current Science Perspectives 1.2（2015):69−76）に記載されている。
【０００７】
しかし、尿路感染症の治療および予防におけるアメリカンクランベリー誘導体について現在までに得られている有効性データは、多少のばらつきがある。これは、部分的には十分に特徴付けられいないで、再現性もない、過度に低い活性成分含量を有する抽出物の使用によるものであり、とりわけ、経口投与後に活性成分の吸収を促進することができず、活性代謝産物が尿中の有効濃度に達することを可能にしない、不適切な組成物および製剤の使用によるものである。
【０００８】
したがって、経口投与後のアメリカンクランベリーの活性成分およびその代謝産物の吸収を促進し、尿中で有効濃度に達することを確実にすることができる組成物が利用できることは、尿路感染症の治療および予防において、抗生物質治療の代替または相補的である重要なツールとなり得る。
【０００９】
植物抽出物と天然または合成リン脂質との組み合わせから得られた構成は、例えばEP 0209037(IdB Holding S.p.A.)、EP 0275005(Indena S.p.A.)、EP 0283713(Indena S.p.A.)およびWO 2007/118631(Indena S.p.A.)に記載されている。
【００１０】
WO2010/150051(Lipoid GmbH)は、活性植物成分または植物抽出物、糖、好ましくはマルトデキストリン、およびリン脂質を含有する組成物を記載する。前記組成物は、成分を水中に室温で同時にまたは連続的に溶解または分散させることによって得られる。この工程に続いて、均質化、濾過および乾燥のプロセス、および任意選択で所望の粒径に粉砕するプロセスが行われる。特に、WO2010/150051は、０．５重量％〜４０重量％の範囲の活性植物成分含量、１０重量％〜９０重量％の範囲のマルトデキストリン含量、および０．５重量％〜３０重量％の範囲のリン脂質含量を特許請求している。前記文献は、この組成物が輸送および貯蔵の間の高い安定性、ならびに医薬、栄養および化粧品産業のための種々の製剤への組み込みの容易さを特徴とすることを記載している。これはまた、組成物が良好な溶解性および湿潤性を特徴とし、これが活性植物成分の高いバイオアベイラビリティを保証すると記載している。WO2010/150051に引用されている活性植物成分には、アメリカンクランベリー抽出物(Vaccinium macrocarpon)が含まれる。しかしながら、アメリカンクランベリー抽出物を含有する組成物は特に記載されていない。さらに、組成物中に含まれる活性成分のバイオアベイラビリティーの実際の増加、特に、有効濃度の活性代謝産物が経口投与後に排泄された尿中に到達することを実証するためのin vivoデータは引用されておらず、これは、尿感染に対する治癒的および予防的作用のための前提条件を表す。
【００１１】
従って、尿中の有効成分、特にそれらの代謝産物の測定可能で有効なレベルを保証する、アメリカンクランベリーに基づく組成物を提供する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は典型的には固体形態である組成物に関し、
ａ）組成物の総重量の２０重量％〜５０重量％の範囲の量のワクシニウムマクロカルポン(Vaccinium macrocarpon)抽出物、および
ｂ）組成物の総重量の５０重量％〜８０重量％の範囲の量の少なくとも１つのリン脂質、
を含む組成物である。
【００１３】
本発明はまた、該組成物の製造方法、および該組成物を含む経口投与用の医薬製剤または栄養補助製剤に関する。本発明はまた、上記の組成物、および尿路感染症の治療および予防に使用するための対応する製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例６での尿中のエピカテキンのＨＰＬＣ質量分析による定量結果を示すヒストグラムである。
【図２】実施例６での尿中のミリセチン−３−Ｏ−グルコシドのＨＰＬＣ質量分析による定量結果を示すヒストグラムである。
【図３】実施例６での尿中のミリセチン−３−β−Ｏ−ガラクトシドのＨＰＬＣ質量分析による定量結果を示すヒストグラムである。
【図４】実施例６での尿中のカテキン−３−Ｏ−ガラートＨＰＬＣ質量分析による定量結果を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
驚くべきことに、アメリカンクランベリー（ワクシニウムミルティルス(Vaccinium myrtillus)）抽出物、好ましくは高プロアントシアニジン（ＰＡＣ）含量を特徴とする抽出物を、特に以下に記載する調製方法の手段によって、高割合のリン脂質（ＰＬ）と組み合わせることによって、抽出物中に含まれる活性成分の有効尿中濃度の測定可能な有効濃度にインビボで達することができることが見出された。特に、本発明による組成物は同じプロアントシアニジン含量を有するがリン脂質と組み合わせないアメリカンクランベリー抽出物よりも少量で投与することができ、同時に尿中で、したがって尿路上皮粘膜と接触して有効濃度に到達することを依然として保証することが見出された。
【００１６】
また、驚くべきことに、本発明による製剤の投与後、主な代謝産物は異なる時間に、特に、「そのまま」の抽出物を含有する対照製剤、すなわちリン脂質を含有しない対照製剤の投与後に観察される時間よりも遅い時間に、尿中に出現することが見出された。したがって、本発明は、リン脂質と組み合わされたアメリカンクランベリー抽出物および「そのまま」の、すなわちリン脂質と組み合わされていないアメリカンクランベリー抽出物を含有する製剤にも関する。
【００１７】
本発明による組成物は、
ａ）好ましくは１５〜４０％(w/w)の範囲のプロアントシアニジン含有量によって特徴付けられる、２０〜５０％(w/w)のアメリカンクランベリー抽出物、および
ｂ）リン脂質又はリン脂質の混合物の５０〜８０％(w/w)、
を含む。
【００１８】
本発明による組成物は組成物の物理的特性を改善し、配合物へのそれらの組み込みを容易にする希釈剤、流動促進剤または潤滑剤のような１種以上の技術的補助剤を、組成物の総重量に対して、任意選択で１〜３０重量％含有することができる。
【００１９】
好ましい態様では、組成物が１：１〜１：４の範囲の抽出物とリン脂質との重量比に対応する、アメリカンクランベリー抽出物と、リン脂質またはリン脂質の混合物とからなる。別の好ましい態様では、組成物がアメリカンクランベリー抽出物、リン脂質またはリン脂質の混合物、および１つ以上の補助剤から、上記に特定した量でなる。アメリカンクランベリー抽出物およびリン脂質は、報告された比率および条件下で、抽出物の成分の化学的機能とリン脂質の成分の化学的機能との間の相互作用に続いて、分子複合体の形態をとることができる。
【００２０】
本発明の目的のために、「アメリカンクランベリー抽出物」という表現は、Vaccinium macrocarponベリーからの有機抽出のプロセスによって得られるエキス、および好ましくはそれらを粉砕することによって得られるジュースから得られるエキスを同定する。その後、抽出物を濃縮して、唯一ではないが、バイオマスの主要な活性成分であると考えられるプロアントシアニジンの含有量を増加させることができる。抽出物は、ＤＭＡＣ（４−ジメチルアミノシンナムアルデヒド）比色法（R. L. Prior et al., J Sci Food Agric 2010； 90； 1473−1478）によって測定して、好ましくは１５％〜４０％(w/w)、より好ましくは２５％〜３５％(w/w)の範囲のプロアントシアニジン含量を有する。
【００２１】
高いプロアントシアニジン含量を有するクランベリー抽出物の好ましい例は、Indena S.p.から Anthocran(登録商標)として市販されている。
【００２２】
本発明の目的のために、用語「リン脂質」は、大豆、ひまわりまたは他の植物もしくは動物源、好ましくは植物源から得ることができる、同一または異なるアシル基、主にパルミチン、ステアリン、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸誘導体を有する、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルエタノールアミンから選択される、レシチンを特定する。リン脂質に言及する用語「混合物」は、同一の植物源または異なる植物源に由来するレシチンの混合物を特定する。「少なくとも1つのリン脂質」という用語は、単一のリン脂質またはリン脂質の混合物を特定する。
【００２３】
本発明の組成物に含有させることができる補助剤は、典型的には下記の１種以上から選択される：
・室温で水溶性または水不溶性である希釈剤、例えば微晶質セルロース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、マンニトール、マルトデキストリン、イソマルトまたはそれらの組み合わせ；
・二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、またはそれらの組み合わせなどの潤滑剤および／または流動促進剤；
・スクロースエステル、ポリソルベート、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、Ｄ−α−トコフェリル−ポリエチレングリコールスクシネート（ビタミンE TPGS)またはそれらの組み合わせなどの界面活性剤。
【００２４】
これらおよびさらなる賦形剤は、Remington: "The Science and Practice of Pharmacy"、22nd edition、Pharmaceutical Press、2013に記載されている。
【００２５】
好ましい態様では、組成物は糖を含有せず、特にマルトデキストリン、マンニトール、イソマルトまたはそれらの組み合わせを含有しない。
【００２６】
第２の態様において、本発明は、組成物を得るための方法、および該方法によって得ることができる組成物に関する。
【００２７】
特に、本方法は、３０℃〜９０℃、好ましくは５０℃〜９０℃の範囲の温度で、好ましくはエチルアルコール、酢酸エチルおよびアセトンから選択される医薬および／または栄養補助食品用途に適した有機溶媒中に、アメリカンクランベリー抽出物および少なくとも１つのリン脂質、および任意選択で少なくとも１つの補助剤を可溶化または分散させて、有機溶媒をその後除去して本発明による固体組成物を得ることを含む。
【００２８】
その好ましい態様では、この方法が有機溶媒中でのアメリカクランベリー抽出物および少なくとも１種のリン脂質の同時可溶化または分散、続いて１種以上の補助剤の任意選択の添加を含む。前記態様によれば、本製法は、以下の工程、を含む：
a-1）溶液または均一な分散液が得られるまで、抽出物およびリン脂質を、好ましくはエチルアルコール、酢酸エチルおよびアセトンから選択される１０〜２０容量の有機溶媒に溶解または分散させる工程；
b-1）工程ａ）で得られた溶液／分散液を、３０℃〜９０℃、好ましくは５０℃〜９０℃の範囲の温度で加熱し、典型的には、溶液または均一な分散液が得られるまで、系を撹拌下に維持する工程(加熱は、抽出物およびリン脂質の溶解度を最大にするために必要である)；
c-1）任意選択で工程b−1）における溶液または分散液に１種以上の補助剤を添加し、溶液または均一な分散液が得られるまで、工程ｂ）におけるのと同じ温度条件下で撹拌を維持する工程；
d-1）工程ｂ）またはｃ）で得られた溶液または分散液から、好ましくは低圧で、より好ましくは１０〜６０ＭＰＡで蒸発させることによって溶媒を除去し、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは７０℃の範囲の温度を維持し、任意選択で、５０〜９０℃の範囲の温度に設定されたストーブ中で真空下で乾燥させることによって溶媒除去を完了させ、典型的には残留溶媒に関するＩＣＨガイドラインＱ３ｃ（Ｒ６）に規定された限界を下回る溶媒残渣を有する固体組成物が得られるまで、溶媒を除去する工程；および
e-1）工程ｄ）の終わりに得られた固体組成物を０．２５〜２．０mmメッシュスクリーン上で調整し、任意選択で好ましくはステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムおよび二酸化ケイ素、好ましくは二酸化ケイ素から選択される滑沢剤および／または流動促進剤を添加する工程；
を含む。
【００２９】
別の好ましい態様では、本方法が溶液または分散液が得られるまで溶媒中での抽出物の可溶化または分散、および少なくとも１つのリン脂質、および任意選択で１つ以上の補助剤を前記溶液または分散液に添加することを含む。特に、前記態様によれば、本製法は以下の工程を含む：
a-2）均一な溶液または分散液が得られるまで、有機溶媒中にアメリカンクランベリー抽出物またはリン脂質を可溶化または分散させる工程；
b-2）得られた溶液または分散液にアメリカンクランベリー抽出物またはリン脂質を添加し、加熱し、工程ｂ）に記載の実験条件下で撹拌しながら混合物を維持する工程；
プロセスが完了するまで、前述の工程c−1）、d−1）およびe−1）を続行する。
疑いを避けるために、本発明の目的のために、用語「溶液」は目視検査で透明に見える液体組成物を示し、用語「分散液」は目視検査で懸濁粒子を含み、不透明かつ曇って見えるが、依然として均一である液体組成物を示す。
【００３０】
さらに、数値範囲が本説明及び特許請求の範囲に明記されている場合、範囲の両端は含まれるものとみなされる。
【００３１】
「製法」という用語は「方法」と同義である；
「少なくとも１つ」および「１つ以上」という表現は同等であり、互換的に使用することができる；
その第３の態様において、本発明は、１つ以上の薬学的にまたは栄養学的に許容される賦形剤と混合された本発明による組成物を含む経口投与用の固体製剤に関する。製剤の例は顆粒、錠剤およびカプセルを含み、これらは、所望により、改変リリースに適しており、当業者は公知の方法によって、および公知の賦形剤、例えば、Remington: "the Science and Practice of Pharmacy"、22nd edition、Pharmaceutical Press、2013に記載されているものと一緒に調製することができる。製剤は典型的には製剤の総重量に対して２０％〜５０％w/wの範囲の量の製剤を含み、これは、１用量当たり３０〜８０mgの範囲の抽出物含量、および１用量当たり９mg〜２５mgの範囲のプロアントシアニジン摂取を確実にするような方法である。好ましい実施形態によれば、製剤は、好ましくは本発明による組成物に加えて、上記の製法によって得ることができる組成物、および抽出物「そのまま」、すなわちリン脂質と組み合わされていないものを含む。
【００３２】
その第４の態様において、本発明は尿路感染症、特に下部尿路感染症の予防または治療のための方法に関し、それは、組成物または製剤、好ましくは製剤を、それを必要とする患者に投与することを含む。本方法は、好ましくは９〜２５mgの範囲の毎日のプロアントシアニジン摂取を確実にするような、本発明による組成物または好ましくは製剤の量の投与を含む。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。
【００３４】
実験の部
材料
アメリカンクランベリー抽出物(Vaccinium macrocarpon Aiton)は、Indena S.p.からAnthocran(登録商標)  という商標で市販されている。
【００３５】
大豆レシチンまたはヒマワリレシチンをＣａｒｇｉｌｌから入手した。実施例３で使用したマルトデキストリンはRoquetteから入手した。実施例３で使用した二酸化ケイ素は、Grace GmbH & Co.から入手した。実施例４および５で使用した微結晶セルロースはFMC Biopolymerから入手し、実施例４および５で使用したステアリン酸マグネシウムはPeter Grevenから入手し、実施例５で使用したリン酸二カルシウム二水和物はBudenheimから入手し、実施例５で使用したポリビニルポリピロリドンはAshlandから入手した。
【００３６】
実施例１〜３において、パーセンテージは、組成物の総重量に対する重量パーセンテージである。
【００３７】
調製例
実施例１：アメリカンクランベリー抽出物および大豆レシチンを含有する組成物（Ｃ１）
アメリカンクランベリー(Vaccinium macrocarpon) 抽出物          ２５．０％
大豆レシチン                                                  ７５．０％
組成物は、以下の製法によって得られた：
１．抽出物および大豆レシチンを、磁気撹拌下で、水飽和酢酸エチルの、抽出物およびレシチンの総重量に対して10容量中に分散させた。
２．工程１で得られた分散液を加熱還流し（約７０℃）、前記条件下で撹拌しながら３時間放置した。
３．温度を≦70℃に維持しながら、工程２で得られた分散液から溶媒を低圧蒸発によって除去した。
４．工程３で得られた生成物の乾燥は、ＩＣＨガイドラインＱ３Ｃ（Ｒ６）に規定された限界に適合する酢酸エチル残渣が得られるまで、真空下、５０℃でストーブ中で続けた。
工程４で得られた生成物を６０メッシュスクリーンで調整した。
【００３８】
実施例２：アメリカンクランベリー抽出物および大豆レシチンを含有する組成物（Ｃ２）
アメリカクランベリー(Vaccinium macrocarpon)抽出物              ３３．３％
大豆レシチン                                                   ６６．７％
組成物は、以下の製法によって得られた：
１．大豆レシチンを１５容量の工業用エタノール中に磁気撹拌下で懸濁させ、分散液が得られるまで５０℃に加熱した。
２．アメリカンクランベリー抽出物を、磁気撹拌下で工程１で得られた分散液に添加した。分散液を加熱還流し（約７０℃）、前記条件下で撹拌しながら２時間放置した。
３．温度を≦７０℃に維持しながら、工程３で得られた分散液から溶媒を低圧蒸発によって除去した。
４．工程３で得られた生成物の乾燥は、ＩＣＨガイドラインＱ３Ｃ（Ｒ６）に規定された限界に適合する溶媒残渣が得られるまで、真空下、５０℃でストーブ中で続けた。
５．  工程４で得られた生成物を２０メッシュスクリーンで調整した。
【００３９】
実施例３：アメリカンクランベリー抽出物、ヒマワリレシチン、マルトデキストリンおよび二酸化ケイ素を含有する組成物（Ｃ３）
アメリカクランベリー(Vaccinium macrocarpon)抽出物          ３０．０％
ヒマワリレシチン                                           ５５．０％
マルトデキストリン                                         １３．０％
二酸化ケイ素                                                 ２．０％
組成物は、以下の製法によって得られた：
１．抽出物を、磁気撹拌下で10容量の水飽和酢酸エチルに分散させた。
２．ステップ１で得られた分散液に、磁気撹拌下でレシチンを添加した。
３．分散液を加熱還流し（約７０℃）、前記条件下で撹拌しながら２時間放置した。
４．工程３で得られた分散液にマルトデキストリンを添加し、工程３に記載したのと同じ撹拌および温度条件を３０分間維持した。
５．温度を≦７０℃に維持しながら、工程４で得られた分散液から溶媒を低圧蒸発によって除去した。
６．工程５で得られた生成物の乾燥は、ＩＣＨガイドラインＱ３Ｃ（Ｒ６）に規定された限界に適合する溶媒残渣が得られるまで、真空下、５０℃でストーブ中で続けた。
７．工程６で得られた生成物を２０メッシュスクリーンで調整した。
８．二酸化ケイ素を、混合物の２％に等しい量で工程７で得られた生成物に添加し、Ｖ−ミキサー（MultiGel）中で約２分間混合した。
【００４０】
実施例４：組成物（Ｃ１）を含有する硬カプセルの形態の製剤（Ｆ１）
組成物（Ｃ１）                                                １２０．０ ｍｇ
結晶セルロース                                                １３３．５ ｍｇ
二酸化ケイ素                                                      ４．５ ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                          ２．０ ｍｇ
配合物（Ｆ１）は、以下の製法によって得られた：
１．組成物（Ｃ１）を微結晶セルロースとのＶミキサー（MultiGel）中で約5分間混合した。
２．工程１で得られた混合物に二酸化ケイ素を添加し、混合を約2分間続けた。
３．ステアリン酸マグネシウムを工程２で得られた混合物に添加し、混合を約1分間続けた。
４．工程３で得られた混合物を、２６０mg／カプセルの速度で、硬質ゼラチンまたは植物ベースのカプセルに分割した。
【００４１】
実施例５：組成物（Ｃ１）を含有する錠剤の形態の製剤（Ｆ２）
組成物（Ｃ１）                                               １２０．０ ｍｇ
リン酸二カルシウム二水和物                                   １８０．０ ｍｇ
結晶セルロース                                               １５０．０ ｍｇ
ポリビニルポリピロリドン                                       ３０．０ ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                       １０．０ ｍｇ  
コロイドシリコンジオキシド                                     １０．０ ｍｇ
配合物（Ｆ１）は、以下の方法によって得られた：
１．組成物（Ｃ１）を、Ｖミキサー（MultiGel）中で、リン酸二カルシウム二水和物、微結晶セルロースおよびポリビニルポリピロリドンと約１０分間混合した。
２．工程１で得られた混合物に二酸化ケイ素を添加し、混合を約２分間続けた。
３．ステアリン酸マグネシウムを工程2で得られた混合物に添加し、混合を約１分間続けた。
４．工程３で得られた混合物を、１２mmの直径を有する丸い凹型パンチダイを備えたロータリー錠剤プレスで圧縮した。
【００４２】
生体内分析
実施例６：組成物（Ｃ１）を含有する製剤の有効成分および有効代謝産物の尿中定量
この検討は、健康なボランティア（低ポリフェノール食餌の非喫煙女性）に、１週間、１日２カプセルを投与することによって実施し、各カプセルは、リン脂質と関連しない１２０mgのアメリカンクランベリー抽出物を含有し、３０％のプロアントシアニジン（合計３６mgのプロアントシアニジン（対照カプセル（Ｆ０））を含有する。１週間のウォッシュアウト期間の後、同じボランティアに、３０％のプロアントシアニジンを含有するアメリカンクランベリー抽出物３０mgに対応する組成物（Ｃ１）１２０mgをそれぞれ含有する、実施例４に従って調製した製剤（Ｆ１）の２つのカプセルを再び１週間与えた。尿を、対照カプセル（Ｆ０）及び製剤（Ｆ１）のカプセルの両方の最初の投与前、ならびに最後の投与の１、２、４、６、１０、１２および２４時間後に採取した。投与された生成物に関連する分析物の尿中での同定および定量のために、収集された尿サンプルをトリクロロ酢酸の１％溶液で１：５ｖ／ｖに希釈し、次いでHyperSep（登録商標）Ｃ１８カラム上で固相で抽出した。次いで、尿中に存在する抽出された代謝産物を、酸および酵素加水分解に供し、続いて、分離のためにZorbax SB−C18カラムおよび検出器として三重四重極質量分析計(TSQ Quantum（登録商標） Triple Quadrupole)を使用して、ＨＰＬＣ質量分析によって定量した。
【００４３】
驚くべきことに、アメリカンクランベリー抽出物の量、従って１２０ｍｇの組成物（Ｃ１）を含有する製剤（Ｆ１）と共に投与されたプロアントシアニジンの量は、抽出物「そのまま」を含有するカプセル［対照カプセル（Ｆ０）］と共に投与された量よりも４倍少なく、いくつかの代謝産物はプロアントシアニジンおよび抽出物の他の活性成分（フラボノールおよびフェノール酸）の両方に由来し、製剤（Ｆ１）の投与後により豊富であった。特に、抽出物の投与量に関連して、以下の代謝産物：エピカテキン、カテキン−３−Ｏ−ガラート、ミリセチン−３−β−Ｏ−ガラクトシド、ミリセチン−３−Ｏ−グルコシド、クエルセチン−３−O−ラミノシド、イソラムネチン−３−Ｏ−グルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−グルコシド、没食子酸、馬尿酸およびプロトカテク酸、がより豊富であった。
【００４４】
この実験的観察を表すヒストグラムを添付の図１〜４に示し、これらは、アメリカンクランベリー抽出物の４つの主要成分：エピカテキン（図１）、ミリセチン−３−O−グルコシド（図２）、ミリセチン−３−β−Ｏ−ガラクトシド（図３）およびカテキン−３−O−ガラート（図４）の曲線下方の面積（ＡＵＣ）を示す。用語「クランベリー」は対照カプセル（Ｆ０）の投与で得られたデータを指し、一方、用語「リン脂質複合体(Phytosome)」は、組成物（Ｃ１）を含有するカプセルの投与で得られたデータを指す。
【００４５】
前記データは、本発明による組成物がリン脂質と会合していないクレンベリー抽出物とは異なり、抽出物の活性成分の主要代謝産物の測定可能で有効なレベルが尿中で、したがって細菌感染の基質を表す尿路上皮粘膜と接触して到達することを保証することを確認する。
【００４６】
驚くべきことに、クランベリー抽出物「そのまま」を含有する対照製剤（Ｆ０）が投与されたか、または本発明による製剤（Ｆ１）が投与されたかに応じて、種々の代謝産物が異なる時間に尿中に出現することも見出され、以下のヒストグラムによって明らかに示されるように、ここで、対照製剤（Ｆ０）の投与に対応する値は「クランベリー」と表記され、一方、本発明による製剤（Ｆ１）の投与に対応する値は「リン脂質複合体」と表記される。
【００４７】
この知見は「そのまま」（すなわち、リン脂質と関連しない）抽出物を本発明の組成物と組み合わせることによって、下部尿路の尿路上皮粘膜において長期間持続する抗菌作用を保証することができ、したがって、前記再発性感染に対するより有効な予防作用を保証することを実証する。
【００４８】
実施例７： カンジダアルビカンス(Candida albicans)の各種菌株による付着およびバイオフィルム形成の抑制における組成（Ｃ１）を含む製剤の有効性の検討
組成物（C1）を含む製剤の有効性をex-vivo試験で評価し、特に膣スワブから得たCandida albicansの様々な株を接種した細胞培養、およびCandida albicansの参考菌株（SC5314）に対する細胞接着およびバイオフィルム形成阻害効果を評価した。バイオフィルム形成の程度はゲンチアナバイオレットで染色し、続いて５４０ｎｍでの分光光度読み取りによって定量した。
【００４９】
健康な女性ボランティアを、１日２カプセルで１週間処置した。各々のカプセルは、リン脂質と関連しない１２０mgのアメリカンクランベリー抽出物を含み、３０％のプロアントシアニジン（合計３６mgのプロアントシアニジンを含む）（対照カプセル（Ｆ０）。次に、バイオフィルムを有する細胞培養物を前記ボランティアの尿と接触させて置き、前記尿を凍結乾燥し、細胞培養に使用したのと同じ培地（RPMI−1640）で再構成した。１週間のウォッシュアウト期間の後、同じ健康なボランティアを、各々が１２０mgの組成物（Ｃ１）（３０％のプロアントシアニジンを含有する３０mgのアメリカンクランベリー抽出物に対応する）を含有する製剤（Ｆ１）の１日２つのカプセルで１週間処置した。両方の場合において、尿は、処置に必要とされる最後のカプセルが採取された１、２、４、６、１０、１２および２４時間後に採取された。
【００５０】
以下の表１は、細胞培養物上に存在するバイオフィルムの程度を定量化する、５４０nmでの分光光度測定値に関連する吸光度データを示す。Upre (Ｆ０)  およびUpre（Ｆ１） の値は、投与前の尿測定値を示している。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
値の比較は、１２０mgのアメリカンクランベリー［対照カプセル（Ｆ０）］で処理した場合、１時間後および１２時間後に採取した尿試料において、ならびに製剤（Ｆ１）のカプセルで処理した被験者において２時間後および１２時間後に採取した尿試料において、阻害活性が明らかに現れることを実証する。驚くべきことに、製剤（Ｆ１）はアメリカンクランベリー抽出物の量を含み、その結果、「そのまま」の抽出物（対照カプセル）を含むカプセルで投与された量（Ｆ０）の４倍低いプロアントシアニジンの量を含むが、上記の時間での阻害活性は同等であった。驚くべきことに、最大阻害活性は製剤（Ｆ０）の抽出物（１時間および１２時間、Ｐ＜０．０００１、マン−ホイットニー試験）および製剤（Ｆ１）（２時間および１２時間、Ｐ＜０．０００１）の投与の場合に異なる時間で起こることも見出され、アメリカンクランベリー抽出物「そのまま」（すなわち、リン脂質と会合していない）を本発明の組成物と組み合わせることによって、接着およびバイオフィルム形成を阻害するより長期間持続する作用が、カンジダアルビカンスの様々な株に対して保証され、したがって、再発性尿路感染に対するより有効な予防作用が保証され得ることが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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