(57)【要約】  本発明は、三環式化合物の結晶形及びその製造方法を提供し、さらに、スフィンゴシン−１−リン酸のサブタイプ（Ｓ１Ｐ１）受容体の関連疾患を治療する薬物の製造における前記結晶形の使用を提供する。
2021511375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ線粉末回折パターンは、２θの値が６．６６±０．２°、１３．３０±０．２°、１５．５７±０．２°である位置に、特徴的な回折ピークを有する、化合物１の結晶形Ａ。
【化１】
2021511375.tif 000016
【請求項２】
Ｘ線粉末回折パターンは、２θの値が６．６６±０．２°、１３．３０±０．２°、１４．４６±０．２°、１５．５７±０．２°、１９．９９±０．２°、２１．８３±０．２°、２４．４１±０．２°、２５．２６±０．２°である位置に、特徴的な回折ピークを有する、請求項１に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項３】
Ｘ線粉末回折パターンは、２θの値が６．６６±０．２°、１２．２１±０．２°、１３．３０±０．２°、１４．４６±０．２°、１５．５７±０．２°、１６．７７±０．２°、１９．９９±０．２°、２１．８３±０．２°、２４．４１±０．２°、２５．２６±０．２°、２７．２０±０．２°である位置に、特徴的な回折ピークを有する、請求項２に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項４】
ＸＲＰＤパターンは図１に示すとおりである、請求項３に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項５】
示差走査熱量測定曲線は、１９９．２７℃±２℃の位置に吸熱ピークの開始点を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項６】
ＤＳＣパターンは図２に示すとおりである、請求項５に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項７】
熱重量分析曲線には、２５１．３９℃の前に有意な重量損失が示されず、２５１．３９℃の後に分解し始める、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項８】
ＴＧＡパターンは図３に示すとおりである、請求項７に記載の化合物１の結晶形Ａ。
【請求項９】
化合物１を、アセトニトリル、アルコール系溶媒、ケトン系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒、アルコール系溶媒と水との混合溶媒、アセトニトリルと水との混合溶媒、ケトン系溶媒と水との混合溶媒又はエーテル系溶媒と水との混合溶媒に加え、再結晶又はスラリー化して製造することを含む、結晶形Ａの製造方法。
【請求項１０】
前記アルコール系溶媒は、メタノール、エタノール及びイソプロパノールから選ばれる、請求項９に記載の結晶形Ａの製造方法。
【請求項１１】
前記ケトン系溶媒は、アセトン及びメチルエチルケトンから選ばれる、請求項９に記載の結晶形Ａの製造方法。
【請求項１２】
前記エーテル系溶媒は、エチレングリコールジメチルエーテルから選ばれる、請求項９に記載の結晶形Ａの製造方法。
【請求項１３】
前記エステル系溶媒は、酢酸エチルから選ばれる、請求項９に記載の結晶形Ａの製造方法。
【請求項１４】
アルコール系溶媒と水との混合溶媒は、エタノールと水との混合溶媒、メタノールと水との混合溶媒又はイソプロピルアルコールと水との混合溶媒である、請求項９に記載の結晶形Ａの製造方法。
【請求項１５】
ケトン系溶媒と水との混合溶媒は、アセトンと水との混合溶媒から選ばれる、請求項９に記載の結晶形Ａの製造方法。
【請求項１６】
前記アルコール系溶媒と水との混合溶媒において、アルコール系溶媒と水との体積比は、１：０．２〜１．５から選ばれる、請求項１４に記載の結晶形Ａの製造方法。
【請求項１７】
前記ケトン系溶媒と水との混合溶媒において、ケトン系溶媒と水との体積比は、１：０．３〜０．８から選ばれる、請求項１５に記載の結晶形Ａの製造方法。
【請求項１８】
前記アセトニトリルと水との混合溶媒において、アセトニトリルと水との体積比は、１：０．５〜１．５から選ばれる、請求項９に記載の結晶形Ａの製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物１の結晶形Ａの、Ｓ１Ｐ１受容体関連疾患を治療するための薬物の製造における使用。
【請求項２０】
前記Ｓ１Ｐ１受容体関連疾患は、炎症性腸疾患である、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、２０１８年１月１８日に提出された、出願番号２０１８１００４９８５３．２の中国特許出願の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、三環式化合物の結晶形及びその製造方法に関し、さらに、Ｓ１Ｐ１受容体関連疾患を治療するための薬物の製造における前記結晶形の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、細胞増殖、生存、リンパ球輸送、細胞骨格組織及び形態形成を含む広域スペクトルの生物活性を持つ多面的な脂質メディエーターである。スフィンゴシンは、酵素セラミドによって触媒され、セラミドから放出される。スフィンゴシンキナーゼによって触媒されるスフィンゴシンは、リン酸化されてスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を生成し、かつスフィンゴシン−１−リン酸受容体（Ｓ１ＰＲ）と作用して生物活性を生じさせる。
【０００４】
スフィンゴシン−１−リン酸受容体１（Ｓ１ＰＲ１）は、内皮細胞分化遺伝子１（ＥＤＧ１）とも呼ばれ、Ｇタンパク質共役受容体であり、内皮細胞分化遺伝子（ＥＤＧ）受容体ファミリーに属し、Ｓ１ＰＲ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。スフィンゴシン−１−リン酸受容体（Ｓ１ＰＲ）には５つのサブタイプ（Ｓ１ＰＲ１−５）があり、スフィンゴシン−１−リン酸受容体１（Ｓ１ＰＲ１）は内皮細胞膜に豊富に分布している。他のＧタンパク質共役受容体と同様に、Ｓ１ＰＲ１は、細胞外からそのリガンドを検出し、かつ細胞内のシグナル伝達経路を活性化して細胞応答を引き起こす。
【０００５】
スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は人体にとって非常に重要であり、主に血管系と免疫系を調節する。小分子Ｓ１Ｐ１作動薬と阻害剤は、受容体へのスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）の結合メカニズムをシミュレートし、それらのシグナル系において重要な生理学的作用を有することが証明される。スフィンゴシン−１−リン酸受容体１（Ｓ１ＰＲ１）の作動は、リンパ球の輸送を妨害し、リンパ球をリンパ節及び他の二次リンパ器官に隔離することにより、迅速かつ可逆的なリンパ球減少症を引き起こす。臨床研究により、リンパ球の隔離が炎症や自己免疫疾患の反応を軽減し、免疫調節に不可欠であることが証明される。
【０００６】
現在、スフィンゴシン−１−リン酸受容体１（Ｓ１ＰＲ１）作動薬の開示されたインビボ薬効の研究は、自己免疫疾患の治療又は予防に使用される。新規なスフィンゴシン−１−リン酸受容体１（Ｓ１ＰＲ１）作動薬の発見と使用には、幅広い見込みがある。Ｏｚａｎｉｍｏｄは、Ｓ１ＰＲ１作動薬であり、その構造が以下のとおりである。
【化１】
2021511375.tif 000003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、Ｘ線粉末回折パターンが、２θの値が６．６６±０．２°、１３．３０±０．２°、１５．５７±０．２°である位置に、特徴的な回折ピークを有する化合物１の結晶形Ａを提供する。
【化２】
2021511375.tif 000004
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１の結晶形Ａは、Ｘ線粉末回折パターンが、２θの値が６．６６±０．２°、１３．３０±０．２°、１４．４６±０．２°、１５．５７±０．２°、１９．９９±０．２°、２１．８３±０．２°、２４．４１±０．２°、２５．２６±０．２°である位置に、特徴的な回折ピークを有する。
【０００９】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１の結晶形Ａは、Ｘ線粉末回折パターンが、２θの値が６．６６±０．２°、１２．２１±０．２°、１３．３０±０．２°、１４．４６±０．２°、１５．５７±０．２°、１６．７７±０．２°、１９．９９±０．２°、２１．８３±０．２°、２４．４１±０．２°、２５．２６±０．２°、２７．２０±０．２°である位置に、特徴的な回折ピークを有する。
【００１０】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１の結晶形Ａは、ＸＲＰＤパターンが図１に示すとおりである。
【００１１】
【表１】
2021511375.tif 000005
【００１２】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１の結晶形Ａは、示差走査熱量測定曲線が、１９９．２７℃±２℃の位置に吸熱ピークの開始点を有する。
【００１３】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１の結晶形Ａは、ＤＳＣパターンが図２に示すとおりである。
【００１４】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１の結晶形Ａは、熱重量分析曲線には、２５１．３９℃の前に有意な重量損失が示されず、２５１．３９℃の後に分解し始める。
【００１５】
本発明のいくつかの態様では、上記化合物１の結晶形Ａは、ＴＧＡパターンが図３に示すとおりである。
【００１６】
本発明はさらに、化合物１を、アセトニトリル、アルコール系溶媒、ケトン系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒、アルコール系溶媒と水との混合溶媒、アセトニトリルと水との混合溶媒、ケトン系溶媒と水との混合溶媒又はエーテル系溶媒と水との混合溶媒に加え、再結晶又はスラリー化して製造することを含む、結晶形Ａの製造方法を提供する。
【００１７】
本発明のいくつかの態様では、上記アルコール系溶媒は、メタノール、エタノール及びイソプロピルアルコールから選ばれる。
【００１８】
本発明のいくつかの態様では、上記ケトン系溶媒は、アセトン及びメチルエチルケトンから選ばれる。
【００１９】
本発明のいくつかの態様では、上記エーテル系溶媒は、エチレングリコールジメチルエーテルから選択される。
【００２０】
本発明のいくつかの態様では、上記エステル系溶媒は、酢酸エチルから選ばれる。
【００２１】
本発明のいくつかの態様では、上記アルコール系溶媒と水との混合溶媒は、エタノールと水との混合溶媒、メタノールと水との混合溶媒又はイソプロピルアルコールと水との混合溶媒である。
【００２２】
本発明のいくつかの態様では、上記ケトン系溶媒と水との混合溶媒は、アセトンと水との混合溶媒から選ばれる。
【００２３】
本発明のいくつかの態様では、上記アルコール系溶媒と水との混合溶媒において、アルコール系溶媒と水との体積比は、１：０．２〜１．５から選ばれる。
【００２４】
本発明のいくつかの態様では、上記ケトン系溶媒と水との混合溶媒において、ケトン系溶媒と水との体積比は、１：０．３〜０．８から選ばれる。
【００２５】
本発明のいくつかの態様では、上記アセトニトリルと水との混合溶媒において、アセトニトリルと水との体積比は、１：０．５〜１．５から選ばれる。
【００２６】
本発明はさらに、上記化合物１の結晶形Ａの、Ｓ１Ｐ１受容体関連疾患を治療するための薬物の製造における使用を提供する。
【００２７】
本発明のいくつかの態様では、上記Ｓ１Ｐ１受容体関連疾患は、炎症性腸疾患である。
【発明の効果】
【００２８】
化合物１の結晶形Ａは、特性が安定し、吸湿性が低く、製薬化の見込みがよい。本発明に係る化合物１の結晶形Ａは、安定性に優れ、容易に製薬化できる。化合物１は、Ｓ１Ｐ１関連経路に顕著な阻害効果があり、かつＴＮＢＳにより誘発された超急性の感染性腸疾患のＳＤラットモデルを通じて、化合物１の結晶形Ａが潰瘍性大腸炎に顕著な阻害効果を有することが分かる。Ｏｚａｎｉｍｏｄと比較して、化合物１は、ラットの薬物動態の単一又は部分的な指標を顕著に向上させることができる。
定義及び説明
【００２９】
特に説明しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び語句は、以下の意味を含むものとする。特定の語句や用語は、特別な定義がない限り、不明確又は不明瞭であるとみなされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書で商品名が現れる場合、その対応する商品又はその活性成分を指すものとする。
【００３０】
本発明の中間体化合物は、以下に列挙する具体的な実施形態、それらを他の化学合成方法と組み合わせることによって形成される実施形態、及び当業者に周知の均等置換形態を含む、当業者に周知の様々な合成方法によって製造でき、好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の具体的な実施形態における化学反応は、本発明の化学変化及びそれに必要な試薬及び材料に好適な溶媒中でなされたものである。本発明に係る化合物を得るために、当業者が、既存の実施形態に基づいて合成ステップ又は反応フローを変更又は選択することが必要となる場合がある。
【００３２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を何ら限定するものではない。
【００３３】
本発明で使用される全ての溶媒は市販されるものであり、さらに精製することなく使用することができる。
【００３４】
本発明は、以下の略語を採用する：ＤＭＦはジメチルホルムアミドを表し、ＭｓＯＨはメタンスルホン酸を表し、ＥｔＯＨはエタノールを表し、ＮａＯＨは水酸化ナトリウムを表し、Ｍはｍｏｌ／Ｌを表す。
【００３５】
化合物は手動又はＣｈｅｍＤｒａｗソフトウェアで命名され、市販の化合物は、サプライヤーのカタログ名を採用する。
【００３６】
本発明に係るＸ線粉末回折パターン（Ｘ−ｒａｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）方法
試験方法：約１０〜２０ｍｇのサンプルはＸＲＰＤ検出に用いられる。
詳細なＸＲＰＤパラメータは以下のとおりである：
光管：Ｃｕ、Ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）
光管電圧：４０ｋＶ、光管電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：４〜４０ｄｅｇ
ステップ径：０．０２ｄｅｇ
ステップサイズ：０．１２秒
サンプルディスク回転数：１５ｒｐｍ
【００３７】
本発明に係る示差熱分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法
試験方法：サンプル（〜１ｍｇ）をアルミニウム製ＤＳＣパンに入れて試験し、５０ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件下で、サンプルを室温から３００℃に１０℃／ｍｉｎの加熱速度で加熱する。
【００３８】
本発明に係る熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）方法
試験方法：サンプル（２〜５ｍｇ）をＴＧＡプラチナポットに入れて試験し、２５ｍＬ／ｍｉｎのＮ２の条件下で、サンプルを室温から２０％重量損失まで加熱する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】化合物１の結晶形ＡのＣｕ−Ｋα放射のＸＲＰＤパターンである。
【図２】化合物１の結晶形ＡのＤＳＣパターンである。
【図３】化合物１の結晶形ＡのＴＧＡパターンである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の内容をよりよく理解させるために、以下、具体的な実施例を参照してさらに説明するが、具体的な実施形態は本発明の内容を限定するものではない。
【００４１】
実施例１：化合物１の製造
【化３】
2021511375.tif 000006
【００４２】
ステップ１
化合物１−１（２０．０ｇ、９４．８ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に溶解し、ビス（トリメチルシリル）アミドリチウム（１Ｍテトラヒドロフラン溶液、１１３ｍＬ）を−７８℃で滴下し、この温度で３０分間撹拌して反応させた。次に、反応液にブロモ酢酸エチル（１７．４ｇ、１０４ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２５℃で２時間撹拌して反応させた。反応液に水（２００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（３００ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０：１石油エーテル／酢酸エチル、Ｒｆ＝０．７）で分離精製して、化合物１−２（１５．０ｇ、淡黄色油状物）を得た。収率は、５３％である。
【００４３】
１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．８７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．１１（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、３．３３−３．１０（ｍ、１Ｈ）、２．９６−２．８７（ｍ、２Ｈ）、２．６９−２．６５（ｍ、２Ｈ）、１．１９（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、３Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ計算値［Ｍ＋Ｈ］＋は２９７及び２９９であり、実測値は２９７及び２９９である。
【００４４】
ステップ２
化合物１−２（２５．０ｇ、８４．１ｍｍｏｌ）を無水エタノール（３００ｍＬ）に溶解し、酢酸アンモニウム（６４．９ｇ、８４１ｍｍｏｌ）を２５℃で加え、この温度で１時間撹拌して反応させた。次に、反応液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１５．９ｇ、２５２ｍｍｏｌ）を加え、反応液を８０℃で１２時間撹拌して反応させた。反応液に水（３００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（４００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（３００ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０：１酢酸エチル／メタノール、Ｒｆ＝０．４）で分離精製して、化合物１−３（１０．０ｇ、淡黄色油状物）を得た。収率は、４７％である。ＭＳ−ＥＳＩ計算値［Ｍ＋Ｈ］＋は２５２及び２５４であり、実測値は２５２及び２５４である。
【００４５】
ステップ３
化合物１−３（１０．０ｇ、３９．７ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（２．３８ｇ、５９．５ｍｍｏｌ、純度６０％）を０℃で数回に分けて加え、この温度で３０分間撹拌して反応させた。次に、反応液に化合物１−４（９．４９ｇ、３９．７ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２５℃で２時間撹拌して反応させた。反応液に水（２００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（３００ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１：１石油エーテル／酢酸エチル、Ｒｆ＝０．５）で分離精製して、化合物１−５（５．００ｇ、無色油状物）を得た。収率は、３１％である。
【００４６】
１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ、ｄ４−ＭｅＯＨ）δ７．４６−７．４２（ｍ、２Ｈ）、７．１２（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．１７（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．７０−３．６７（ｍ、３Ｈ）、３．２４−３．２３（ｍ、１Ｈ）、３．１８−３．１６（ｍ、２Ｈ）、２．７０−２．６８（ｍ、２Ｈ）、２．３４−２．３３（ｍ、１Ｈ）、０．８４（ｓ、９Ｈ）、０．０１（ｓ、６Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ計算値［Ｍ＋Ｈ］＋は４１０及び４１２であり、実測値は４１０及び４１２である。
【００４７】
ステップ４
化合物１−５（５．００ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解し、反応液にシアン化亜鉛（２．８６ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１．４１ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を加え、反応液を窒素下で１００℃で１６時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、水（３０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（４０ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１：１石油エーテル／酢酸エチル、Ｒｆ＝０．４）で分離精製して、化合物１−６（３．１０ｇ、無色油状物）を得た。収率は、７１％である。
【００４８】
１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ、ｄ４−ＭｅＯＨ）δ７．８７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．７０（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４７（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．２６（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．８２−３．７０（ｍ、３Ｈ）、３．５１−３．４９（ｍ、１Ｈ）、３．３０−３．２７（ｍ、１Ｈ）、３．０１−２．８１（ｍ、３Ｈ）、２．４５−２．４１（ｍ、１Ｈ）、０．９３（ｓ、９Ｈ）、０．００（ｓ、６Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ計算値［Ｍ＋Ｈ］＋は３５７であり、実測値は３５７である。
【００４９】
ステップ５
化合物１−６（３．００ｇ、８．４１ｍｍｏｌ）を無水エタノール（８ｍＬ）に溶解し、反応液に塩酸ヒドロキシルアミン（１．７５ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３．４０ｇ、３３．６ｍｍｏｌ）を加え、反応液を窒素下で６０℃で１２時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、水（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（４０ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（０：１石油エーテル／酢酸エチル、Ｒｆ＝０．４）で分離精製して、化合物１−７（３．００ｇ、白色固体）を得た。収率は、９２％である。
【００５０】
１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．４９（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．２１（ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、５．０７（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．７３（ｓ、２Ｈ）、３．７８−３．７６（ｍ、１Ｈ）、３．６７−３．６２（ｍ、２Ｈ）、３．４４−３．４２（ｍ、１Ｈ）、２．９７−２．９０（ｍ、３Ｈ）、２．７１−２．６５（ｍ、１Ｈ）、２．３７−２．３３（ｍ、１Ｈ）、０．８４（ｓ、９Ｈ）、０．００（ｓ、６Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ計算値［Ｍ＋Ｈ］＋は３９０であり、実測値は３９０である。
【００５１】
ステップ６
化合物１−８（６９５ｍｇ、３．３９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解した。反応液に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（７６３ｍｇ，５．６５ｍｍｏｌ）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．０８ｇ，５．６５ｍｍｏｌ）を加え、反応液を窒素下で２５℃で０．５時間撹拌した。次に、反応液に化合物１−７（１．１０ｇ、２．８２ｍｍｏｌ）を加え、反応液を２５℃で１時間撹拌した。８０℃に昇温し、反応液を８０℃で１２時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、水（３０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（２５ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧濃縮した。残留物を高速液体クロマトグラフィーで分離精製して化合物１−９を得た。
【００５２】
１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ、ｄ４−ＭｅＯＨ）δ８．４６−８．４２（ｍ、２Ｈ）、８．１９（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．７８（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．５１−７．４４（ｍ、２Ｈ）、５．２６（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．９９−４．９４（ｍ、１Ｈ）、３．８３−３．７１（ｍ、４Ｈ）、３．２６−３．２３（ｍ、２Ｈ）、３．１５−３．１３（ｍ、１Ｈ）、２．９２−２．８６（ｍ、１Ｈ）、２．４８−２．４３（ｍ、１Ｈ）、１．４７（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ計算値［Ｍ＋Ｈ］＋は４４５であり、実測値は４４５である。
【００５３】
ステップ７
化合物１−９（２００ｍｇ、０．４５０ｍｍｏｌ）をキラル液体クロマトグラフィーで分離精製して化合物１−１０及び化合物１を得た。
【００５４】
ＳＦＣ分離方法：
クロマトグラフィーカラム：ＡＤ  ２５０ｍｍ×３０ｍｍ、１０μｍ。
移動相：Ａ：二酸化炭素。Ｂ：４５％〜４５％。エタノール（０．１％アンモニア水を含む）。
流速：８０ｍＬ／ｍｉｎ。
カラム温度：４０℃。
【００５５】
化合物１−１０の効率的なキラル液相カラムの保持時間：５．２７６分間。
【００５６】
１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ、ｄ４−ＭｅＯＨ）δ８．４２−８．４０（ｍ、２Ｈ）、８．１７（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．７７（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．５０−７．４２（ｍ、２Ｈ）、５．２６（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．９９−４．９５（ｍ、１Ｈ）、３．８１−３．７１（ｍ、４Ｈ）、３．２６−３．２３（ｍ、２Ｈ）、３．１３−３．０８（ｍ、１Ｈ）、２．９２−２．８６（ｍ、１Ｈ）、２．４８−２．４４（ｍ、１Ｈ）、１．４７（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ計算値［Ｍ＋Ｈ］＋は４４５であり、実測値は４４５である。
【００５７】
化合物１の効率的なキラル液相カラムの保持時間：６．４２７分間。
【００５８】
１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ、ｄ４−ＭｅＯＨ）δ８．４５−８．４２（ｍ、２Ｈ）、８．１９（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．７８（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．５１−７．４４（ｍ、２Ｈ）、５．２７（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、４．９９−４．９４（ｍ、１Ｈ）、３．８３−３．７１（ｍ、４Ｈ）、３．２６−３．２３（ｍ、２Ｈ）、３．１５−３．１３（ｍ、１Ｈ）、２．９２−２．８８（ｍ、１Ｈ）、２．４８−２．４４（ｍ、１Ｈ）、１．４７（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＭＳ−ＥＳＩ計算値［Ｍ＋Ｈ］＋は４４５であり、実測値は４４５である。
【００５９】
実施例２：化合物１の結晶形Ａの製造
化合物１（８０ｇ）をエタノール（２Ｌ）に加え、８０℃に加熱して９６時間撹拌した。反応系を室温まで降温し、濾過し、濾過ケーキを収集した。濾過ケーキを真空乾燥させて化合物１の結晶形Ａを得た。
【００６０】
約５０ｍｇの化合物１をサンプル瓶に入れて、下表の溶媒又は混合溶媒にそれぞれ加えた。４０℃で２日間連続して振とうした後に遠心分離し、上記得られた残留固体を収集して４０℃で一晩真空乾燥させて、化合物１の結晶形Ａを得た。
【００６１】
【表２】
2021511375.tif 000007
【００６２】
約３０ｍｇの化合物１をサンプル瓶に入れ、４ｍＬのテトラヒドロフランを加え、５ｍｉｎ超音波処理により溶解し、サンプルを５０℃のマグネチックスターラー上に置いて１時間撹拌し、上澄みを取り、瓶口をアルミ箔紙で覆い、多数の小穴を開け、ドラフトチャンバー内に置いて、サンプルを自然に揮発させた（遮光放置）。得られた残留固体を室温で一晩真空乾燥させた後、真空乾燥オーブン中で３０℃で４時間乾燥させて、化合物１の結晶形Ａを得た。
【００６３】
約３０ｍｇの化合物１をサンプル瓶に入れ、４ｍＬのアセトンを加え、３０ｍｉｎ超音波処理により溶解し、サンプルを５０℃のマグネチックスターラー上に置いて１時間撹拌し、さらに２ｍＬのアセトンを加え、撹拌し続け、３０分間熱時濾過した。濾液をガラス瓶に入れ、アルミ箔紙で瓶口を覆い、多数の小穴を開け、ドラフトチャンバー内に置いて、サンプルを自然に揮発させた（遮光放置）。得られた残留固体を室温で一晩真空乾燥させた後、真空乾燥オーブン中で３０℃で４時間乾燥させて、化合物１の結晶形Ａを得た。
【００６４】
約３０ｍｇの化合物１に２ｍＬのテトラヒドロフランを加え、３０ｍｉｎ超音波処理により溶解し、サンプルを５０℃のマグネチックスターラー上に置いて遮光撹拌し、１時間後、さらに１ｍＬのテトラヒドロフランを加え、撹拌し続け、３０ｍｉｎ後にサンプル液を熱時濾過し、濾液をガラス瓶に入れ、サンプル液を−５℃の冷蔵庫に入れて冷却した。３日間後に白色固体が析出し、サンプルを遠心分離し、上澄みを除去し、固体を３０℃の真空オーブンに入れて一晩乾燥させて化合物１の結晶形Ａを得た。
【００６５】
試験例１：結晶形Ａの固体安定性試験
【００６６】
結晶形Ａを開口のままに恒温恒湿容器に入れ、４０℃／湿度７５％（開口）の条件下で加速試験を行い、１ヶ月目、２ヶ月目、及び３ヶ月目にサンプリングして検出し、検出結果を０日目の初期検出結果と比較し、試験結果を下記表２に示す。
【００６７】
【表３】
2021511375.tif 000008
【００６８】
分析方法：
【表４】
2021511375.tif 000009
【００６９】
結論：化合物１の結晶形Ａの総不純物量は増加せず、良好な物理的安定性を示す。
【００７０】
試験例２：Ｓ１Ｐ１受容体作動活性の測定試験
一．細胞処理
１．ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞株を標準プログラムに従って解凍した。
２．細胞を２０マイクロリットルの３８４ウェルのマイクロウェルプレートに接種し、３７℃で適切な時間インキュベートした。
【００７１】
二．作動薬
１．作動薬の測定については、反応を誘発するために、細胞を測定対象のサンプルと培養した。
２．測定対象の保存液を緩衝液に５倍希釈した。
３．５マイクロリットルの５倍希釈液を細胞に加え、３７℃で９０〜１８０分間インキュベートした。溶媒濃度は１％である。
【００７２】
三．シグナル検出
１．１２．５マイクロリットル又は１５マイクロリットルのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ検出試薬を５０％の体積比で単回加え、室温で１時間インキュベートしてシグナル信号を生成した。
２．マイクロプレートをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＭ機器で読み取り、化学発光シグナル検出を行った。
【００７３】
四．データ分析
１．ＣＢＩＳデータ分析スイートを用いて化合物の活性分析を行った。
２．計算式：
％活性＝１００％×（平均試験サンプルＲＬＵ−平均溶媒ＲＬＵ）／（平均最大対照リガンド−平均溶媒ＲＬＵ）  試験結果を表３に示す。
【００７４】
【表５】
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結論：化合物１は、顕著な、さらに予期しないＳ１Ｐ１受容体作動活性を有する。
【００７５】
試験例３：化合物の薬物動態評価
【００７６】
試験目的：化合物のＳＤラット体内の薬物動態を試験する。
【００７７】
試験材料：
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（雄性、２００〜３００ｇ、７〜９週齢、上海斯莱克）
【００７８】
試験操作：化合物を静脈内注射及び経口投与した後のげっ歯類動物の薬物動態特徴を標準的なプロトコルで試験し、試験では、候補化合物を透明な溶液に調製し、ラットに単回静脈内注射及び経口投与した。静脈注射及び経口投与のための溶媒は、一定割合のヒドロキシプロピルβシクロデキストリン水溶液又は生理食塩水である。２４時間以内に全血サンプルを収集し、３０００ｇで１５分間遠心分離し、上澄みを分離して血漿サンプルを得て、内部標準を含む４倍体積のアセトニトリル溶液を加えてタンパク質を沈殿させ、遠心分離して上澄みを取り、等倍体積の水を加えて遠心分離し、上澄みを取ってサンプルに注入し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析方法で血中薬物濃度を定量分析し、ピーク濃度、ピーク時間、クリアランス率、半減期、薬物時間曲線下の面積、バイオアベイラビリティなどの薬物動態パラメータを算出した。試験結果を表４に示す。
【００７９】
【表６】
2021511375.tif 000011
【００８０】
結論：Ｏｚａｎｉｍｏｄと比較して、化合物１は、ラットの薬物動態の単一又は部分的な指標を顕著に向上させることができる。
【００８１】
実験例４：ラットの血中リンパ球に対する単回経口投与の影響
【００８２】
正常なＳＰＦ級の雄性ＳＤラットに単回強制経口投与した。実験を、溶媒対照群、参照化合物Ｏｚａｎｉｍｏｄ群、化合物１−０．３ｍｇ／ｋｇ用量群、化合物１−１．０ｍｇ／ｋｇ用量群及び化合物１−３ｍｇ／ｋｇ用量群という５つの群に分けた。投与の０．５時間前と投与の４、８、２４時間後に採血し、かつ１０％Ｋ２−ＥＤＴＡで抗凝固処理した。抗凝固の血液サンプルを４℃の環境に置き、生理食塩水で１：４倍希釈し、血球分析装置で迅速に試験し、血液１リットル当たりのリンパ球数と白血球の総数に占めるパーセンテージを算出した。ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェアを使用して、平均値±標準誤差を算出し、ｔｗｏ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを使用して、有意差検定を行った。ｐ＜０．０５の場合、２つの群間に有意差があるとみなされる。
【００８３】
単回経口投与により、１．０ｍｇ／ｋｇのＯｚａｎｉｍｏｄと０．３、１．０、３．０ｍｇ／ｋｇの化合物１の血中リンパ球数は、８時間以内に最大減少率に達し、それぞれ８４．３９％、６６．８７％、８３．０９％及び８５．９２％である。化合物１は、３つの濃度でいずれも血中リンパ球数を明らかに減少させる効果を有し、溶媒対照群と比較して、低用量群はＰ＜０．００１であり、化合物１の中高用量群はＰ＜０．０００１であり、１．０ｍｇ／ｋｇのＯｚａｎｉｍｏｄと０．３、１．０、３．０ｍｇ／ｋｇの化合物１による血中リンパ球の２４時間後の減少率は、それぞれ４７．２６％、−４４．９８％、０．２２％及び５５．１５％であり、化合物１は、用量依存的な傾向があり（高用量群は低用量群と比較してｐ＜０．０５である）、かつＯｚａｎｉｍｏｄ群と比較して有意差がある（低用量群は、Ｏｚａｎｉｍｏｄ群と比較してｐ＜０．０００１であり、中用量群は、Ｏｚａｎｉｍｏｄ群と比較してｐ＜０．０５である）。
【００８４】
０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇの化合物１の用量では、リンパ球のパーセンテージは投与の４時間と８時間後に顕著に減少し、投与の８時間後に最も低い。投与の２４時間後、各群のリンパ球のパーセンテージは、いずれも投与前のレベルに戻った。化合物１−１ｍｇ／ｋｇ用量群をＯｚａｎｉｍｏｄ群と比較すると、投与後の各時点で、ラットの血中リンパ球のパーセンテージに有意差がない。
【００８５】
【表７】
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【００８６】
【表８】
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【００８７】
結論：上記結果は、正常なラットにおいて、化合物１の単回経口投与が末梢血中リンパ球数と白血球中のリンパ球のパーセンテージを用量効果関係で顕著に減少させ、０．３ｍｇ／ｋｇの低用量で血中リンパ球数を顕著に減少させる効果があることを示唆している。リンパ球数は、２４時間でＯｚａｎｉｍｏｄ群よりも早く回復する（同じ用量で比較し、ｐ＜０．０５である）。同じ用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）で、ラットの血中リンパ球のパーセンテージはＯｚａｎｉｍｏｄ群のものと同じである。
【００８８】
実験例５：ＴＮＢＳにより誘発された急性感染性腸疾患（ＩＢＤ）の雌性ＳＤラットモデルの薬力学的試験
【００８９】
雌性ＳＤラットを、モデル群、プレドニゾロン−１０ｍｇ／ｋｇ群、Ｏｚａｎｉｍｏｄ−０．３ｍｇ／ｋｇ群、Ｏｚａｎｉｍｏｄ−１．０ｍｇ／ｋｇ群、化合物１−０．１ｍｇ／ｋｇ群、化合物１−０．３ｍｇ／ｋｇ群及び化合物１−０．６ｍｇ／ｋｇ群という７つの群に分けた。すべての動物をペントバルビタールナトリウムで深く麻酔し、ＴＮＢＳ−５０％アルコール溶液を使用して肛門から腸腔内に挿入してモデルを作成し、動物の肛門をつまみ、動物を逆さまにして５分間保持し、漏れがないことを確認して、動物をケージに戻した。
【００９０】
モデル作成後の１時間後、試験化合物を１日１回、合計７日間経口投与した。モデル群には同体積の薬物溶媒を与えた。試験化合物を毎日投与する前に、動物の体重を量り、動物の毎日の糞便の特徴をモニターし、臨床観察により採点した。投与終了後の翌日に、すべての動物を安楽死させ、結腸（肛門から盲部まで）を採取し、結腸の長さ及び重量を測定し、病変のサイズを肉眼解剖学的に採点し、結腸病変の肉眼解剖学的画像を収集し、組織を１０％中性ホルマリン溶液に固定し、病理組織学的分析を行った。化合物１−０．６ｍｇ／ｋｇ用量群は、結腸損傷領域に明らかな治療効果を示し、測定データは３．４２ｃｍ２であり、モデル群（５．６８ｃｍ２）と比較して顕著に減少し、プレドニゾロン−１０ｍｇ／ｋｇ群及びＯｚａｎｉｍｏｄ−１．０ｍｇ／ｋｇ群の治療効果よりも優れている。組織学的検査の結果は、化合物１−０．６ｍｇ／ｋｇ群の腸粘膜の炎症細胞浸潤度が減少し、潰瘍スコア、炎症スコア及び総損傷スコアがそれぞれ２．００、３．２９及び５．２９であり、モデル群（３．２９、４．４３、７．７１）よりも顕著に低下し、治療効果がプレドニゾロン−１０ｍｇ／ｋｇ群のものと同じであり、かつＯｚａｎｉｍｏｄ−１．０ｍｇ／ｋｇのものよりも優れていることを示す。試験終了後、解剖し、化合物１−０．６ｍｇ／ｋｇ投与群は、結腸潰瘍と浮腫の症状がモデル群と比較していずれも軽減され、プレドニゾロン−１０ｍｇ／ｋｇ群は、結腸潰瘍が減少せず、浮腫領域が減少する傾向がある。各群の結腸重量及び重量と長さとの比は、モデル群と比較して有意差がない。
【００９１】
【表９】
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【００９２】
【表１０】
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【００９３】
結論：本研究では、０．６ｍｇ／ｋｇの用量の化合物１の、ＴＮＢＳにより誘発された急性大腸炎のラットモデルの潰瘍状況と炎症状況を顕著に減少させるという治療効果は、プレドニゾロン−１０ｍｇ／ｋｇ群の治療効果と同じであり、かつＯｚａｎｉｍｏｄ−１．０ｍｇ／ｋｇ群の治療効果よりも優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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