(57)【要約】本発明は、CD73を標的とする抗体および抗体-薬物複合体（ADC）、その製造方法と使用を公開する。また、本発明は前記のモノクローナル抗体およびADCを製造する方法を公開する。本発明のモノクローナル抗体および相応するADCは効率的に、高特異的に精製されたCD73タンパク質および多くの腫瘍細胞の表面のCD73に結合し、CD73酵素の触媒活性を遮断し、高い親和力および低い免疫原性を有し、かつ顕著な抗腫瘍作用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
配列番号10で示されるCDR1、
配列番号11で示されるCDR2、および
配列番号12で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号1で示されるCDR1、
配列番号2で示されるCDR2、および
配列番号3で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号21で示されるCDR1、
配列番号22で示されるCDR2、および
配列番号23で示されるCDR3を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、CD73結合親和力を維持する誘導配列を含む、前記重鎖可変領域。
【請求項２】
請求項1に記載の重鎖可変領域を有することを特徴とする、抗体の重鎖。
【請求項３】
抗体の軽鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
配列番号13で示されるCDR1'、
配列番号14で示されるCDR2'、および
配列番号15で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号4で示されるCDR1'、
配列番号5で示されるCDR2'、および
配列番号6で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号24で示されるCDR1'、
配列番号25で示されるCDR2'、および
配列番号26で示されるCDR3'を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、CD73結合親和力を維持する誘導配列を含む、前記軽鎖可変領域。
【請求項４】
請求項3に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、抗体の軽鎖。
【請求項５】
（1） 請求項1に記載の重鎖可変領域、および/または
（2） 請求項3に記載の軽鎖可変領域
あるいは、請求項2に記載の重鎖、および/または請求項4に記載の軽鎖
を有することを特徴とする、抗体。
【請求項６】
（i） 請求項1に記載の重鎖可変領域、請求項2に記載の重鎖、請求項3に記載の軽鎖可変領域、請求項4に記載の軽鎖、または請求項5に記載の抗体、ならびに
（ii） 任意の発現および/または精製を補助するタグ配列
を有することを特徴とする、組み換えタンパク質。
【請求項７】
CAR構築物であって、前記のCAR構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域scFV断片はCD73と特異的に結合する結合領域で、かつ前記scFvは本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、前記CAR構築物。
【請求項８】
外来の請求項7に記載のCAR構築物を発現することを特徴とする、組み換え免疫細胞。
【請求項９】
（a） 請求項1に記載の重鎖可変領域、請求項2に記載の重鎖、請求項3に記載の軽鎖可変領域、請求項4に記載の軽鎖、または請求項5に記載の抗体、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる抗体部分と、
（b） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分と
を含むことを特徴とする、抗体-薬物複合体。
【請求項１０】
前記抗体-薬物複合体ADCが、下記分子式で表されることを特徴とする、請求項9に記載の抗体-薬物複合体。
【化１】
2021516960.tif 000038
（ただし、
Abは抗CD73抗体である。
LUはリンカー（連結基とも呼ばれる）である。
Dは薬物である。
そして、下付き文字pは1〜10、好ましくは1〜8から選ばれる値である。）
【請求項１１】
LUが、6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MC-val-cit-PAB）、6-マレイミドカプロイル-アラニン-フェニルアラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MC-ala-phe-PAB）、マレイミドプロピオニル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MP-val-cit-PAB）、マレイミドプロピオニル-アラニン-フェニルアラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MP-ala-phe-PAB）、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)バレラート（SPP）、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボナート（SMCC）、N-ヒドロキシスクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)ブチレート（SPDB）またはN-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート（SIAB）および二置換マレイミド系リンカーからなる群から選ばれる、請求項10に記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１２】
Dが、
（i）マイタンシン誘導体（DM1、DM4）、オーリスタチンおよびドラスタチン、
（ii）モノメチルオーリスタチンE（MMAE）、モノメチルオーリスタチンF（MMAF）、モノメチルドラスタチン10（MMAD）系誘導体またはこれらの組み合わせ、ならびに
（iii）DNA損傷薬物、好ましくは、デュオカルマイシン、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）を含む前記のDNA損傷薬物
からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項10に記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１３】
前記抗体の重鎖可変領域の配列が、配列番号7、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号45、配列番号46、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41からなる群から選ばれ、かつ/または
前記抗体の軽鎖可変領域の配列が、配列番号8、配列番号9、配列番号19、配列番号20、配列番号30、配列番号36、配列番号47、配列番号37、配列番号42、配列番号43、配列番号44からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項9に記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１４】
前記キメラ抗体が、mAb001c、mAb001c-VK-SGS、mAb002c、mAb002c-VH-QG、mAb002c-VH-NA、mAb002c-VK-SG、mAb002c-VH-QG/VK-SG、mAb004c、mAb004c-VH-QG、mAb004c-VH-NA（明細書の表-1）からなる群から選ばれ、前記のヒト化抗体が、Hu001c-14、Hu001c-15、Hu001c-21、Hu001c-22、Hu001c-23、Hu001c-24、Hu001c-25、Hu001c-28、Hu001c-30、Hu001c-31、Hu001c-32、Hu002c-2、Hu002c-3、Hu002c-4、Hu002c-6、Hu002c-7、Hu002c-8、Hu002c-10、Hu002c-11、Hu002c-12、Hu002c-14、Hu002c-15、Hu002c-16（明細書の表-2）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項9に記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１５】
（a）検出試薬、検出プレートまたはキットの製造、ならびに/あるいは（b）CD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用されることを特徴とする請求項1に記載の重鎖可変領域、請求項2に記載の重鎖、請求項3に記載の軽鎖可変領域、請求項4に記載の軽鎖、または請求項5に記載の抗体、請求項6に記載の組み換えタンパク質、請求項8に記載の免疫細胞、請求項9に記載の抗体-薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分の使用。
【請求項１６】
CAR構築物であって、前記のCAR構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域scFV断片はCD73と特異的に結合する結合領域で、かつ前記scFvは本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする、前記CAR構築物。
【請求項１７】
外来の請求項7に記載のCAR構築物を発現することを特徴とする、組み換え免疫細胞。
【請求項１８】
（i） 請求項1に記載の重鎖可変領域、請求項2に記載の重鎖、請求項3に記載の軽鎖可変領域、請求項4に記載の軽鎖、または請求項5に記載の抗体、請求項6に記載の組み換えタンパク質、請求項8に記載の免疫細胞、請求項9に記載の抗体-薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分と、
(ii) 薬学的に許容される担体と
を含有することを特徴とする、薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関し、特にCD73を標的とする抗体および抗体-薬物複合体（ADC）、その製造方法と使用（CD73-targeting antibody and antibody-drug conjugate, preparation method and use thereof）に関する。
【背景技術】
【０００２】
CD73は、分子量が70KDの細胞外5-ヌクレオチダーゼ（NT5E）で、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）によって細胞の表面にアンカーされる。生理状態において、CD73は主に多くの組織、たとえば大腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節などの組織で発現される。細胞外に放出されたATP/ADPがCD39によって加水分解されて生成するアデノシン一リン酸（AMP）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）が一連の代謝によって生成するAMPは、CD73の触媒作用によってリン酸基が脱離して大量のアデノシン（Adenosine、ADO）が生成して組織の周囲に露出し、後者は相応するアデノシン受容体（A1AR、A2AR、A2BR、A3AR）に結合することによって細胞の多くの生理過程に関与する。
【０００３】
研究によって、CD73およびアデノシン経路が腫瘍の発生・進行に密接に関わることが示された。まず、それらは腫瘍の免疫逃避の発生を促進する。低酸素、炎症性因子（IFN-γ、TNF-α、IL-1β、TGF-βなど）および関連するシグナル経路（Wnt、cAMP）の活性化は腫瘍細胞のCD73の異常発現を誘導し、後者はAMPを触媒することによって大量のADOを生成させ、腫瘍の周囲を囲むようになり、抗腫瘍免疫抑制の「環」型微環境が形成し、腫瘍の免疫逃避の発生を促進するが、その主な機序は以下のものである。
【０００４】
1） ADOがCD8+T細胞の表面のアデノシン受容体（A2AR）に作用し、cAMPシグナル経路を介してその増殖・増幅を抑制し、そして関連する炎症促進サイトカインIFN-γ、TNF-αなどの放出を減少させることで、その細胞毒性作用を低下させる。
2） ADOがNK細胞と腫瘍細胞の間の接着に干渉することで、NK細胞の細胞毒性顆粒を放出する能力を低下させ、細胞毒性作用を弱める。
【０００５】
3） ADOが制御性T細胞（Treg）の表面のA2ARに結合することによってその増幅を促進し、その免疫抑制および抗炎症機能を強化させ、同時に、Tregの表面におけるCD73の触媒によるADOがCD8+エフェクターT細胞のA2ARに結合してNF-κBの活性化を抑制することで、炎症促進サイトカインおよびケモカインの分泌が減少する。臨床前の研究でも、野生型マウス由来のCD4+CD25+TregをTreg欠失マウスの体内に導入すると、結腸癌の進行が促進されるが、CD73欠失マウスのTregは何らの作用もないことから、CD73およびTregは腫瘍の免疫抑制の発生に重要な作用があることが示唆された。
4） ADOがM1型マクロファージの分化を抑制し、炎症促進サイトカインIL-12、TNF-α、iNOSなどの放出を減少させ、M2型マクロファージを活性化し、大量の抗炎症サイトカイン（TGF-β、アルギナーゼ1）を生成させることで、腫瘍の免疫逃避の発生を手伝う。
【０００６】
次に、CD73が腫瘍の生長および転移のプロセスを促進する。臨床前の研究の結果では、CD73は多くの腫瘍細胞、たとえば乳癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、非小細胞肺癌などで異常発現されることが示され、かつ臨床のデータでは、高発現のCD73が腫瘍患者の予後不良に密接に関連することが示された[Expert Rev Anticancer Ther. 2017;17:527]ことから、CD73は多くの腫瘍の臨床治療および予後の標的として有用であることが示唆された。
【０００７】
体外における研究では、CD73はB16F10メラノーマ細胞を担持するC57BL/6マウスの血管新生を促進し、CD73遮断薬は顕著に新生血管の数および血管床の成熟を抑制することが示された。また、CD73によるADOはサイクリンD1（Cyclin D1）を上方調節することによって微小血管内皮細胞の増殖、および血管内皮増殖因子（VEGF）の放出を促進し、腫瘍の血管新生を促進し、腫瘍の生長に十分なエネルギーを提供する。体内における研究では、CD73欠失マウスは腫瘍血管の減少を示すことから、CD73を標的とすると、抗血管新生系薬物（Bevacizumab）と併用し、腫瘍の臨床治療に新たなアプローチを提供することが可能になることが示唆された。
【０００８】
大量の研究では、ADOが腫瘍細胞の転移に密接に関連することが示された。膀胱癌の腫瘍サンプルを分析することにより、非リンパ節転移の腫瘍サンプルと比べ、リンパ節転移のサンプルにおけるCD73の発現が顕著に向上することが見出された。StaggらはCD73モノクローナル抗体[TY/23]でマウスを処理することによって有効に4T1.2の自発的肺転移を抑制することができ、もう一つの結果から、CD73モノクローナル抗体AD2がCD73の集合と取り込みを促進することにより、循環腫瘍細胞が続発性腫瘍巣を作り、大幅に腫瘍細胞の浸出およびほかの組織に定着する能力を制限することが証明された。同様に、臨床データの分析では、高発現のCD73が胃癌、膀胱癌、悪性メラノーマなどの転移に密接に関連することが示され、さらにCD73は腫瘍の転移に重要な作用があることが示唆された。
【０００９】
薬剤耐性は腫瘍治療における一つの難題および挑戦である。研究では、CD73は腫瘍の化学治療、超音波治療、標的治療および免疫治療などの耐性の発生に関与し、大幅に腫瘍治療の有効性を阻害することが示された[Discovery Today 2017；22:1686]。研究では、アドリアマイシン（Anthracycline）でトリプルネガティブ乳癌（TNBC）患者を治療する場合、高発現のCD73が病理学的完全奏効（pCR）に密接に関連し、すなわち、CD73低発現の患者はアドリアマイシンによる治療により良い応答を示し、機序の研究では、アドリアマイシンはCD73/CD39の発現を上方調節することにより、CD8+T細胞のIFN-γなどの分泌を抑制し、その抗腫瘍免疫作用を抑制することが示された。CD73を標的とするモノクローナル抗体は顕著にアドリアマイシンによる抗腫瘍免疫応答および抗腫瘍活性を増強することができる。また、一つのトラスツズマブ（Trastuzumab）でHer2+ 乳癌を治療する臨床試験において、CD73の高発現が予後不良に顕著に関連し、CD73を標的とするモノクローナル抗体をトラスツズマブと併用すると、CD8+T細胞を増加させ、MDSCの浸潤を減少させることで、協同の抗腫瘍作用が生じた[Cancer Res.2017;77:5652]。
【００１０】
抗体-薬物複合体（Antibody-drug conjugate、ADC）は、モノクローナル抗体が特異的に腫瘍細胞の表面の特定の抗原を認識するという特徴を利用することにより、精確に抗腫瘍薬（たとえば小分子化学治療薬など）を標的の腫瘍細胞に送達して放出することで、精確に腫瘍を殺傷するという目的を実現する。ADCは、分子量の大きさが適切で、安定性が高く、標的性が強く、毒性・副作用が小さいため、最も将来性のある抗腫瘍薬ともされている。しかし、ADCの開発を成功させるには、考慮と解決が必要な課題が多くあり、たとえば抗体は特異的に病変部位を認識し、免疫感作性が低く、効率的で迅速な細胞の取り込み作用が生じ、抗体-薬物リンカーは血液における安定性が高く、標的の細胞において特異的に活性化されて効率的に小分子薬物を放出し、カップリングされる小分子薬物は細胞殺傷能力が高いようなことが必要である。
【００１１】
上記のように、CD73は多くの腫瘍細胞で異常に発現され、腫瘍患者の予後不良に密接に関連する。CD73は主にアデノシン経路を介して抗腫瘍免疫抑制作用を果たし、腫瘍の生長、転移および血管新生を促進する。また、CD73は抗腫瘍薬の薬剤耐性の発生に関与し、腫瘍治療に大きな挑戦をもたらす。そのため、CD73を標的とするモノクローナル抗体薬物の開発は臨床において単独または併用のCD73異常発現の腫瘍患者の治療に新たなアプローチを提供する。同時に、現在、臨床では高特異性のヒトCD73に対する抗体-薬物複合体が欠けているため、腫瘍CD73を標的とし、薬物機能がより優れた抗体-薬物複合体の開発は、有する特徴と優勢を発揮し、CD73異常発現の癌の治療に新たな考えと将来性を提供する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ヒト由来CD73を標的とする抗体であって、CD73のアデノシン一リン酸（AMP）の加水分解を触媒してアデノシンを生成させる活性を阻害し、腫瘍の生長と転移の活性を抑制し、抗腫瘍治療の薬剤耐性の発生を減少させる抗体を提供する。
本発明の第一の側面では、抗体の重鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
配列番号10で示されるCDR1、
配列番号11で示されるCDR2、および
配列番号12で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号1で示されるCDR1、
配列番号2で示されるCDR2、および
配列番号3で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号21で示されるCDR1、
配列番号22で示されるCDR2、および
配列番号23で示されるCDR3を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、CD73結合親和力を維持する誘導配列を含む重鎖可変領域を提供する。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は、以下の相補性決定領域：
配列番号10、配列番号11、配列番号12で示されるmAb002cの重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、あるいは
配列番号1、配列番号2、配列番号3で示されるmAb001cの重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3、あるいは
配列番号21、配列番号22、配列番号23で示されるmAb004cの重鎖相補性決定領域HCDR1、HCDR2、HCDR3を含む。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は、さらに、ヒト由来のFR領域またはマウス由来のFR領域を含む。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号7で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号16、配列番号17、配列番号18で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号27、配列番号28、配列番号29で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号45、配列番号46で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
本発明の第二の側面では、抗体の重鎖であって、本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域を有する重鎖を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体の重鎖は、さらに、重鎖定常領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の重鎖定常領域は、ヒト由来のもの、マウス由来のものまたはウサギ由来のものである。
【００１６】
本発明の第三の側面では、抗体の軽鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
あるいは、
配列番号13で示されるCDR1'、
配列番号14で示されるCDR2'、および
配列番号15で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号4で示されるCDR1'、
配列番号5で示されるCDR2'、および
配列番号6で示されるCDR3'、
あるいは、
配列番号24で示されるCDR1'、
配列番号25で示されるCDR2'、および
配列番号26で示されるCDR3'を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、CD73結合親和力を維持する誘導配列を含む軽鎖可変領域を提供する。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は、以下の相補性決定領域：
配列番号13、配列番号14、配列番号15で示されるmAb002cの軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3、あるいは
配列番号4、配列番号5、配列番号6で示されるmAb001cの軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3、あるいは
配列番号24、配列番号25、配列番号26で示されるmAb004cの軽鎖相補性決定領域LCDR1、LCDR2、LCDR3を含む。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は、さらに、ヒト由来のFR領域またはマウス由来のFR領域を含む。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号8、配列番号9で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号19、配列番号20で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号30で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号36、配列番号37、配列番号47で示されるアミノ酸配列を有する。
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号42、配列番号43、配列番号44で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
本発明の第四の側面では、抗体の軽鎖であって、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域を有する軽鎖を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体の軽鎖は、さらに、軽鎖定常領域を含む。
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖定常領域は、ヒト由来のもの、マウス由来のものまたはウサギ由来のものである。
【００２０】
本発明の第五の側面では、
（1） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、および/または
（2） 本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、
あるいは、本発明の第二の側面に記載の重鎖、および/または本発明の第四の側面に記載の軽鎖
を有する抗体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの組み合わせから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ヒト化抗体のCDR領域は、1、2、または3個のアミノ酸の変化を含む。
もう一つの好適な例において、前記の動物はヒト以外の哺乳動物、好ましくはマウス、ヒツジ、ウサギである。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はモノクローナル抗体である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は部分的にまたは全部ヒト化したモノクローナル抗体である。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、元のアミノ酸配列のアミノ酸の合計の40％以下、好ましくは20％以下、より好ましくは10％以下である。
もう一つの好適な例において、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、1〜7個、好ましくは1〜3個、より好ましくは1個である。
もう一つの好適な例において、前記少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た配列は、相同性が少なくとも80％のアミノ酸配列である。
もう一つの好適な例において、前記少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た誘導配列は、細胞表面のCD73タンパク質または組み換えCD73タンパク質の酵素触媒を抑制する機能を有する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体の形態である。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記誘導配列は、CD73（たとえばヒトCD73タンパク質の細胞外領域、CD73-ECD）に対する親和力EC50が0.016〜0.2 nM、好ましくは0.016〜0.03 nM、より好ましくは0.016〜0.02 nMである。
もう一つの好適な例において、前記抗体は、
（a） CD73のアデノシン一リン酸（AMP）の加水分解を触媒してアデノシンを生成させる活性を抑制すること、
（b） 特異的に腫瘍細胞、および/または腫瘍微環境における免疫/ストローマ細胞のCD73に結合すること、
（c） 腫瘍/腫瘍微環境のCD73のAMPの加水分解を触媒する活性を抑制すること、
（d） 腫瘍細胞の遷移または転移を抑制すること、
（e） 腫瘍の生長を抑制し、併用時の抗腫瘍治療効果を向上させること、
（f） 免疫細胞の増殖・生存および機能を促進することにより、腫瘍免疫の効果を向上させること
からなる群から選ばれる1つまたは複数の特徴を有する。
【００２３】
本発明の第六の側面では、
（i） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、ならびに
（ii） 任意の発現および/または精製を補助するタグ配列
を有する組み換えタンパク質を提供する。
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列は6Hisタグを含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。
【００２４】
本発明の第七の側面では、CAR構築物であって、前記のCAR構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域scFV断片はCD73と特異的に結合する結合領域で、かつ前記scFvは本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域を有するCAR構築物を提供する。
本発明の第八の側面では、外来の本発明の第七の側面に記載のCAR構築物を発現する組み換え免疫細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、NK細胞、T細胞からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ヒト由来のものまたはヒト以外の哺乳動物（たとえばマウス）由来のものである。
【００２５】
本発明の第九の側面では、
（a） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体からなる群から選ばれる抗体部分、ならびに
（b） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分
を含む抗体-薬物複合体を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記のカップリング部分は化学結合またはリンカーを介してカップリングしている。
【００２６】
もう一つの好適な例において、前記抗体-薬物複合体（ADC）は以下の分子式で表される。
【化１】
2021516960.tif 000002
（ただし、
Abは抗CD73抗体である。
LUはリンカー（連結基とも呼ばれる）である。
Dは薬物である。
そして、下付き文字pは1〜10、好ましくは1〜8から選ばれる値である。）
【００２７】
もう一つの好適な例において、LUは、6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MC-val-cit-PAB）、6-マレイミドカプロイル-アラニン-フェニルアラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MC-ala-phe-PAB）、マレイミドプロピオニル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MP-val-cit-PAB）、マレイミドプロピオニル-アラニン-フェニルアラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MP-ala-phe-PAB）、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)バレラート（SPP）、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボナート（SMCC）、N-ヒドロキシスクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)ブチレート（SPDB）またはN-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート（SIAB）および二置換マレイミド系リンカーからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、LUは二置換マレイミド系リンカーである。
【００２８】
もう一つの好適な例において、前記の抗体-薬物複合体の構造は式Ia、Ibで表される。
【化２】
2021516960.tif 000003
（Ia）
【化３】
2021516960.tif 000004
（Ib）
（ただし、
Ar'は、置換または無置換のC6〜C10アリール基、置換または無置換の5〜12員ヘテロアリール基、置換または無置換のC6〜C10のアリーレン基、置換または無置換の5〜12員ヘテロアリーレン基からなる群から選ばれる。
L1はAr'基に連結した-O(CH2CH2O)n-で、ここで、nは1〜20から選ばれる任意の整数である。
L2は化学結合、またはAA-PAB構造で、ここで、AAは2〜4個のアミノ酸からなるポリペプチド断片で、PABはp-アミノベンジルカルバモイル基である。
CTDはアミド結合を介してL2に結合した細胞毒性系小分子薬物である。
mは1.0〜5.0、好ましくは3.0〜4.2、より好ましくは3.5〜4.5、さらに好ましくは3.8〜4.2、またさらに好ましくは3.9〜4.1、最も好ましくは4.0である。
AbはCD73を標的とする抗体である。）
もう一つの好適な例において、前記の式Ibは式IaにおけるN-フェニルマレイミドが開環した産物である。
【００２９】
もう一つの好適な例において、前記の複合体に一つまたは複数の薬物成分が共役結合している。
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記のカップリング部分は共役結合を介して（たとえばそれぞれリンカーに共役結合して）カップリングしている。
もう一つの好適な例において、前記の閉環または開環のマレイミド基が抗体のヒンジ領域のジスルフィド鎖が還元したチオール基に連結している。
もう一つの好適な例において、前記の抗体-薬物複合体は、前記抗体または抗体断片のヒンジ領域のジスルフィド鎖が還元して一対のシステイン残基が生成し、そして前記システイン残基におけるチオール基と式Icで表される置換マレイミド系リンカー-薬物複合体におけるアリールスルフィドが置換反応することにより、抗体-薬物複合体Iaおよび/またはIbを得る。
【００３０】
もう一つの好適な例において、前記の閉環または開環のマレイミド基が完全に還元した抗体に連結しており、すなわち、ヒンジ領域の2対のジスルフィド鎖が完全に断裂し、mは好ましくは3.8〜4.2、より好ましくは3.9〜4.1、最も好ましくは4.0である。
もう一つの好適な例において、前記Ar'は、フェニル基、ハロベンゼン、C1〜C4アルキルフェニル基、C1〜C4アルコキシフェニル基、2-ピリジル基、2-ピリミジニル基、1-メチルピリミジン-2-イル基、
【化４】
2021516960.tif 000005
からなる群から選ばれ、ここで、Wはカルボニル基に連結したアミン基R1で、R1は-NH2、
【化５】
2021516960.tif 000006
から選ばれ、ここで、C1〜C4アルキルフェニル基はさらに4-メチルフェニル基が好ましく、C1〜C4アルコキシフェニル基はさらに4-メトキシフェニル基が好ましい。
【００３１】
もう一つの好適な例において、Ar'は置換または無置換のフェニレン基またはピリジル基から選ばれ、前記の置換とは基における水素原子がハロゲン、C1〜C4アルキル基、C1〜C4アルコキシ基、トリフルオロメチル基、ニトリル基、アミド基からなる群から選ばれる1個または複数の置換基で置換されることである。
もう一つの好適な例において、前記のAAは、Val-Cit（バリン-シトルリン）、Val-Ala（バリン-アラニン）、Phe-Lys（フェニルアラニン-リシン）、Ala-Ala-Asn（アラニン-アラニン-アスパラギン）、D-Ala-Phe-Lys（D-アラニン-フェニルアラニン-リシン）、Gly-Gly-Phe-Gly（グリシン-グリシン-フェニルアラニン-グリシン）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００３２】
もう一つの好適な例において、薬物DまたはCTDは、
（i）マイタンシン誘導体（DM1、DM4）、オーリスタチンおよびドラスタチン、
（ii）モノメチルオーリスタチンE（MMAE）、モノメチルオーリスタチンF（MMAF）、モノメチルドラスタチン10（MMAD）系誘導体またはこれらの組み合わせ、ならびに
（iii）DNA損傷薬物、好ましくは、デュオカルマイシン、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）を含む前記のDNA損傷薬物
からなる群から選ばれる。
【００３３】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの組み合わせから選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖可変領域の配列は、配列番号7、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号45、配列番号46、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41からなる群から選ばれ、かつ/または
前記抗体の軽鎖可変領域の配列は、配列番号8、配列番号9、配列番号19、配列番号20、配列番号30、配列番号36、配列番号37、配列番号47、配列番号42、配列番号43、配列番号44からなる群から選ばれる。
【００３４】
もう一つの好適な例において、前記キメラ抗体は、mAb001c、mAb001c-VK-SGS、mAb002c、mAb002c-VH-QG、mAb002c-VH-NA、mAb002c-VK-SG、mAb002c-VH-QG/VK-SG、mAb004c、mAb004c-VH-QG、mAb004c-VH-NA（明細書の表-1）からなる群から選ばれ、前記のヒト化抗体は、Hu001c-14、Hu001c-15、Hu001c-21、Hu001c-22、Hu001c-23、Hu001c-24、Hu001c-25、Hu001c-28、Hu001c-30、Hu001c-31、Hu001c-32、Hu002c-2、Hu002c-3、Hu002c-4、Hu002c-6、Hu002c-7、Hu002c-8、Hu002c-10、Hu002c-11、Hu002c-12、Hu002c-14、Hu002c-15、Hu002c-16（明細書の表-2）からなる群から選ばれる。
【００３５】
本発明の第十の側面では、（a）検出試薬、検出プレートまたはキットの製造、ならびに/あるいは（b）CD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用される、本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第八の側面に記載の免疫細胞、本発明の第九の側面に記載の抗体-薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分の使用を提供する。
本発明のもう一つの側面では、（i）診断試薬の製造、ならびに/あるいは（b）CD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用される、本発明の第九の側面に記載の抗体-薬物複合体の使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記検出試薬、検出プレートまたはキットは、
（1）サンプルにおけるCD73タンパク質の検出、および/または
（2）腫瘍細胞における内因性のCD73タンパク質の検出、および/または
（3）CD73タンパク質を発現する腫瘍細胞の検出
に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬、検出プレートまたはキットは、CD73関連疾患の診断に使用される。
【００３６】
もう一つの好適な例において、前記の薬物は、CD73高発現の腫瘍、腫瘍の遷移、または腫瘍の薬剤耐性の治療または予防に使用される。
もう一つの好適な例において、前記の腫瘍の薬剤耐性は、腫瘍免疫治療薬の薬剤耐性、腫瘍標的治療薬の薬剤耐性、通常の腫瘍化学治療の薬剤耐性、放射線治療の非感受性を含む。
もう一つの好適な例において、前記の薬物は、
（a） CD73のアデノシン一リン酸（AMP）の加水分解を触媒してアデノシンを生成させる活性を抑制すること、
（b） 特異的に腫瘍細胞、および/または腫瘍微環境における免疫/ストローマ細胞のCD73に結合すること、
（c） 腫瘍/腫瘍微環境のCD73のAMPの加水分解を触媒する活性を抑制すること、
（d） 腫瘍細胞の遷移または転移を抑制すること、
（e） 腫瘍の生長を抑制し、併用時の抗腫瘍治療効果を向上させること、
（f） 免疫細胞の増殖・生存および機能を促進することにより、腫瘍免疫の効果を向上させること
からなる群から選ばれることに使用される。
【００３７】
もう一つの好適な例において、前記CD73関連疾患は、癌、自己免疫疾患、代謝関連疾患、感染疾患、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記CD73関連は、腫瘍の発生、生長および/または転移を含む。
もう一つの好適な例において、前記の癌は、固形腫瘍、血液癌を含む。
もう一つの好適な例において、前記の癌は、CD73高発現の腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記のCD73高発現の腫瘍は、乳癌、肺癌、膵臓腺癌、卵巣癌、前立腺癌、直腸癌、脳膠細胞腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の癌は、薬剤耐性の腫瘍である。
もう一つの好適な例において、前記のCD73高発現の腫瘍とは、腫瘍組織におけるCD73転写物および/またはタンパク質のレベルL1と正常組織における転写物および/またはタンパク質のレベルL0の比が、L1/L0≧2、好ましくは≧3である。
もう一つの好適な例において、前記代謝関連疾患は、糖尿病、食事性肥満および脂肪炎症を含む。
もう一つの好適な例において、前記感染疾患は、細菌およびウイルスの感染を含む。
【００３８】
本発明の第十一の側面では、
（i）  本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第八の側面に記載の免疫細胞、本発明の第九の側面に記載の抗体-薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分と、
（ii）  薬学的に許容される担体と
を含む薬物組成物を提供する。
本発明のもう一つの側面では、
（i）  本発明の第九の側面に記載の抗体-薬物複合体またはその組み合わせと、
（ii）  薬学的に許容される担体と
を含む薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は液体製剤である。
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は注射剤である。
【００３９】
本発明の第十二の側面では、
（1） 本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、あるいは
（2） 本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、
（3） 本発明の第七の側面に記載のCAR構築物
からなる群から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の第十三の側面では、本発明の第十二の側面に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、またはほかのベクターを含む。
【００４０】
本発明の第十四の側面では、遺伝子工学化された宿主細胞であって、本発明の第十三の側面に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに本発明の第十二の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
本発明の第十五の側面では、体外でサンプルにおけるCD73を検出（診断的なものまたは非診断的なものを含む）する方法であって、
（1）  体外において、前記サンプルを本発明の第五の側面に記載の抗体と接触させる工程、
（2）  抗原-抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルにCD73が存在することを意味する工程
を含む方法を提供する。
【００４１】
本発明の第十六の側面では、下地シート（支持プレート）と、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第九の側面に記載の免疫複合体を含有する測定バーとを含む検出プレートを提供する。
本発明の第十七の側面では、
（1）  本発明の第五の側面に記載の抗体を含有する第一の容器、および/または
（2）  本発明の第五の側面に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二の容器を含むか、
あるいは、本発明の第十六の側面に記載の検出プレートを含む
キットを提供する。
本発明の第十八の側面では、組み換えポリペプチドの製造方法であって、
（a） 発現に適切な条件において、本発明の第十四の側面に記載の宿主細胞を培養する工程、
（b） 培養物から、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質である、組み換えポリペプチドを単離する工程
を含む方法を提供する。
【００４２】
本発明の第十九の側面では、CD73関連疾患を治療する方法であって、必要な対象に本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第九の側面に記載の抗体-薬物複合体、または前記抗体を発現するCAR-T細胞、またはこれらの組み合わせを施用する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、必要な対象にほかの薬物または治療方法を併用して治療する工程を含む。
もう一つの好適な例において、前記のほかの薬物または治療方法は、抗腫瘍免疫治療薬、腫瘍標的治療薬、腫瘍化学治療、腫瘍放射線治療を含む。
もう一つの好適な例において、前記の抗腫瘍免疫治療薬は、PD-1、PD-L1モノクローナル抗体を含む。
【００４３】
本発明の第二十の側面では、キメラ抗体を製造する方法であって、
本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および/または本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列をヒト抗体の定常領域のヌクレオチド配列を含有する発現ベクターにクローニングした後、動物細胞に形質移入することによってヒト-マウスキメラ抗体を発現させる工程
を含む方法を提供する。
本発明の第二十一の側面では、ヒト化抗体を製造する方法であって、
本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および/または本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域におけるCDR領域のヌクレオチド配列をヒト由来抗体のFR領域を含有するヌクレオチド配列の鋳型に導入し、さらにそれをヒト抗体の定常領域を含有する発現ベクターにクローニングした後、動物細胞に形質移入することによってヒト化抗体を発現させる工程
を含む方法を提供する。
【００４４】
本発明の第二十二の側面では、腫瘍細胞の生長および遷移を抑制する方法であって、必要な対象に本発明の第五の側面に記載の抗体、前記抗体の抗体-薬物複合体、または前記抗体を発現するCAR-T細胞、またはこれらの組み合わせを施用する工程を含む方法を提供する。
本発明の第二十三の側面では、モデル動物の体内における腫瘍の生長を抑制する方法であって、必要な対象に本発明の第五の側面に記載の抗体、前記抗体の抗体-薬物複合体、または前記抗体を発現するCAR-T細胞を施用する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記薬物は単独で投与してよく、腫瘍免疫療法、腫瘍標的薬物、細胞毒性薬物、放射線治療を含む手段と併用してもよい。
【００４５】
本発明の第二十四の側面では、本発明の第九の側面に記載の抗体-薬物複合体の製造方法であって、
（1） 抗体を還元試薬と緩衝液において反応させ、還元された抗体を得る工程と、
（2） 式Icのリンカー-薬物複合体を工程（1）で得られた還元された抗体と緩衝液と有機溶媒の混合液において架橋（カップリング）させ、抗体-薬物複合体1aおよび/または1bを得る工程と
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記製造方法の架橋反応は、下記式で表される通りである。
【化６】
2021516960.tif 000007
【００４６】
もう一つの好適な例6において、前記工程（1）では、前記抗体は還元試薬で還元されることにより、抗体の鎖間ジスルフィド結合が還元され、チオール基が生成する。
もう一つの好適な例において、前記工程（1）では、還元試薬は、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）、β-メルカプトエタノール、β-メルカプトエチルアミン塩酸塩、またはジチオトレイトール（DTT）である。
もう一つの好適な例において、前記の緩衝液は、リン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム（KH2PO4-NaOH）/塩化ナトリウム（NaCl）/ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）緩衝液、リン酸水素二ナトリウム-クエン酸/塩化ナトリウム（NaCl）/ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、ホウ酸-ホウ砂/塩化ナトリウム（NaCl）/ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、ヒスチジン-水酸化ナトリウム/塩化ナトリウム（NaCl）/ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、およびPBS/ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）からなる群から選ばれる。
【００４７】
もう一つの好適な例において、前記の工程（2）では、有機溶媒の反応液における体積比が15％以下である。
もう一つの好適な例において、前記の工程（2）における有機溶媒は、アセトニトリル（ACN）、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルアセトアミド（DMA）、ジメチルスルホキシド（DMSO）からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の工程（2）では、前記の架橋反応は0〜37℃で行われる。
もう一つの好適な例において、前記の工程（1）では、β-メルカプトエタノール、β-メルカプトエチルアミン塩酸塩またはDTTで還元させ、前記の工程（1）と工程（2）の間に、さらに、還元反応が終了した後、産物から脱塩カラムまたは限外ろ過によって還元剤を除去する工程（1a）を含む。
もう一つの好適な例において、pH6〜8の緩衝液で、抗体-薬物複合体Iaを内部で抗体-薬物複合体Ibに転換させる。
【００４８】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好ましい技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
図面の説明
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図1は本発明の抗ヒトCD73抗体の発見である。図1Aは蛍光活性化セルソーター（FACS）による一連のオリジナルな抗ヒトCD73モノクローナル抗体（オリジナルハイブリドーマ、original hybridoma）の培養上清のヒト由来CD73高発現のMDA-MB-231（CD73-P）、CD73低発現のMDA-MB-453（CD73-N）の乳癌細胞に対する結合活性の検出である。示された5つの抗体はmAb001、mAb002、mAb003、mAb004、mAb005と番号を付けられた。図1Bは精製された5つの抗体のサブタイプの同定で、MDA-MB-231細胞に対する結合親和力で、FACS検出によるそのEC50はそれぞれ1.24nM、0.65nM、10.7nM、4.69nM、26.07nMである。
【図２】図2はPCRによって増幅されたmAb001、mAb002、mAb004の重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）の断片のアガロースゲル電気泳動の結果の図である。VH/VL断片は配列決定後、ヒト-マウスキメラ抗体の発現ベクターのクローニングおよび組み立てに使用された。
【図３】図3はHEK293T細胞によって発現される3つのヒト-マウスキメラ抗体（chimeric antibody）mAb001c、mAb002c、mAb004cがさらにMabSelect（商標） SuRe（商標）カラムによる精製スペクトルである。
【００５０】
【図４】図4はELISAによるヒト-マウスキメラ抗体mAb001c、mAb002c、mAb004cのCD73-ECDに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の測定である。
【図５】図5はmAb001c、mAb002c、mAb004cの組み換えヒトCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）である。
【図６】図6は蛍光活性化セルソーター（FACS）によるmAb001c、mAb002c、mAb004cの乳癌のMDA-MB-453、MDA-MB-231、肺癌のNCI-H460、NCI-H1299、Calu-6、膵臓腺癌のSW1990、脳膠細胞腫のU87MGの細胞表面のCD73受容体に対する結合率（MFI）の検出である。本試験では、3×105 個の細胞を5μg/mLの抗体と混合し、1時間インキュベートした後、検出した。
【００５１】
【図７】図7は腫瘍細胞の表面のCD73タンパク質レベルがその酵素活性に密接に関連することを示す。CD73高発現（U87MG、Calu-1、NCI-H1299）およびCD73低発現（MDA-MB-453）の細胞株を使用し、示された細胞数でアデノシン一リン酸（AMP）と3時間インキュベートした後、酵素活性を測定した。
【図８】図8はmAb001c、mAb002c、mAb004cのMDA-MB-231の細胞表面CD73に対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出結果である。本試験では、1×105 個の細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、検出した。
【図９】図9はmAb001c、mAb002c、mAb004cのNCI-H1299の細胞表面CD73に対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出結果である。本試験では、1×105 個の細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、検出した。
【００５２】
【図１０】図10はmAb001c、mAb002c、mAb004cのMDA-MB-231の細胞表面のCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）の検出である。
【図１１】図11はmAb001c、mAb002c、mAb004cのNCI-H1299の細胞表面のCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）の検出である。
【図１２】図12はmAb001c、mAb002c、mAb004cのCalu-1の細胞表面のCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）の検出である。
【００５３】
【図１３】図13はELISAによる一連のmAb001c突然変異体、mAb002c突然変異体、mAb004c突然変異体のCD73-ECDに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出である。
【図１４】図14はELISAによるmAb001cのヒト化抗体系列Hu001c-14〜15、Hu001c-21〜28、Hu001c-30〜32のCD73-ECDに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出である。
【図１５】図15はELISAによるmAb002cのヒト化抗体系列Hu002c-2〜16のCD73-ECDに対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出である。
【００５４】
【図１６】図16はmAb001cのヒト化抗体系列Hu001c-14〜15、Hu001c-21〜28、Hu001c-30〜32の組み換えヒトCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）の検出である。
【図１７】図17はmAb002cのヒト化抗体系列Hu002c-2〜16の組み換えヒトCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）の検出である。
【図１８】図18はFACSによるmAb001c突然変異体系列、mAb002c突然変異体系列のMDA-MB-231の細胞表面CD73に対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出である。本試験では、1×105 個の細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、検出した。
【００５５】
【図１９】図19はFACSによるmAb001cのヒト化抗体系列Hu001c-14、Hu001c-22〜28、Hu001c-30〜32のMDA-MB-231の細胞表面CD73に対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出である。本試験では、1×105 個の細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、検出した。
【図２０】図20はFACSによるmAb001cのヒト化抗体系列Hu001c-14、Hu001c-22〜28、Hu001c-30〜32のNCI-H1299の細胞表面CD73に対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出である。本試験では、1×105 個の細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、検出した。
【図２１】図21はFACSによるmAb002cのヒト化抗体系列Hu002c-2〜16のMDA-MB-231の細胞表面CD73に対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出である。本試験では、1×105 個の細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、検出した。
【００５６】
【図２２】図22はFACSによるmAb002cのヒト化抗体系列Hu002c-2〜16のNCI-H1299の細胞表面CD73に対する結合親和力（Binding affinity EC50）の検出である。本試験では、1×105 個の細胞を示された濃度勾配の抗体と混合し、1時間インキュベートした後、検出した。
【図２３】図23はmAb001cのヒト化抗体系列Hu001c-14〜15、Hu001c-21〜28、Hu001c-30〜32のNCI-H1299の細胞表面のCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）の検出である。
【図２４】図24はmAb002cのヒト化抗体系列Hu002c-2〜16のNCI-H1299の細胞表面のCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）の検出である。
【００５７】
【図２５】図25はmAb001c、mAb002c、mAb004cとMDA-MB-231細胞の結合による細胞内におけるリソソームへの取り込み（Internalization）である。前記抗体（5μg/mL）を細胞と4℃で1時間、または37℃で4時間インキュベートした後の共焦点レーザー顕微鏡における観察結果である。
【図２６】図26は前記CD73ヒト化抗体の体内におかる抗腫瘍活性の試験である。体内試験では、CD73高発現のU87MG脳膠細胞腫を50μgの抗体と均一に混合した後、ヌードマウスの背中の皮下に接種し、週に2〜3回観察し、腫瘍体積およびマウスの体重を測定した。
【図２７】図27は前記CD73ヒト化抗体の体内におかる抗腫瘍活性の試験である。体内試験では、U87MG脳膠細胞腫を50μgの抗体と均一に混合した後、ヌードマウスの背中の皮下に接種し、週に2〜3回観察し、腫瘍体積およびマウスの体重を測定した。
【００５８】
【図２８】図28は前記CD73ヒト化抗体の体内におかる抗腫瘍活性の試験である。体内試験では、CD73高発現のNCI-H1299非小細胞肺癌細胞を50μgの抗体と均一に混合した後、ヌードマウスの背中の皮下に接種し、週に2〜3回観察し、腫瘍体積およびマウスの体重を測定した。
【図２９】図29は前記CD73ヒト化抗体の体内におかる抗腫瘍活性の試験である。体内試験では、NCI-H1299非小細胞肺癌細胞を50μgの抗体と均一に混合した後、ヌードマウスの背中の皮下に接種し、週に2〜3回観察し、腫瘍体積およびマウスの体重を測定した。
【図３０】図30はイムノブロット試験（ウエスタンブロット、Western blot）によるCD73タンパク質の高侵襲で高転移の基底型乳癌および管腔型乳癌の細胞株における発現状況の検出である。
【００５９】
【図３１】図31は癌細胞株エンサイクロペディア（Cancer Cell Line Encyclopedia、CCLE）データベースのCD73 mRNAの高侵襲で高転移の基底型（Basal-type）対管腔型（Luminal-type）の乳癌細胞株における発現レベルの分析である。
【図３２】図32はイムノブロット試験（ウエスタンブロット、Western blot）によるCD73タンパク質の異なる肺癌細胞株における発現状況の検出である。
【図３３】図33は癌細胞株エンサイクロペディア（Cancer Cell Line Encyclopedia、CCLE）データベースのCD73 mRNAの非小細胞肺癌（NSCLC）対小細胞肺癌（SCLC）の細胞株における発現レベルの分析である。
【００６０】
【図３４】図34はヒト化抗体Hu001c-14が有効にアデノシン一リン酸(AMP)のヒトT細胞に対する増殖抑制作用を逆転させることができることを示す。試験では、選別によって得られたCD3+ヒトT細胞を使用し、それを5日培養した後、細胞増殖率を統計した。
【図３５】図35はヒト化抗体Hu002c-3が有効にAMPのヒトT細胞に対する増殖抑制作用を逆転させることができることを示す。試験では、選別によって得られたCD3+ヒトT細胞を使用し、それを5日培養した後、細胞増殖率を統計した。
【図３６】図36はヒト化抗体Hu001c-14が有効にAMPのヒトT細胞のINF-γの発現に対する抑制作用を逆転させることができることを示す。試験では、選別によって得られたCD3+ヒトT細胞を使用し、それを5日培養した後、T細胞の培養上清を検出した。
【００６１】
【図３７】図37はヒト化抗体Hu002c-3が有効にAMPのヒトT細胞のINF-γの発現に対する抑制作用を逆転させることができることを示す。試験では、選別によって得られたCD3+ヒトT細胞を使用し、それを5日培養した後、T細胞の培養上清を検出した。
【図３８】図38は蛍光活性化セルソーター（FACS）による乳癌のMDA-MB-453、HCC1937、MDA-MB-231、肺癌のNCI-H460、NCI-H292、NCI-H441、Calu-6、NCI-H1299、Calu-1、膵臓腺癌のSW1990、脳膠細胞腫のU87MGの細胞表面のCD73受容体の発現レベル（MFI）の検出である。本試験では、1×105 個の細胞を10μg/mLのmAb001cと混合し、1時間インキュベートした後、検出した。
【図３９】図39はヒト化CD73抗体Hu001c-14、Hu001c-15とMDA-MB-231細胞の結合による細胞内におけるリソソームへの取り込み（Internalization）である。前記抗体（5μg/mL）を細胞と4℃で1時間、または37℃で4時間インキュベートした後の共焦点レーザー顕微鏡における観察結果である。
【００６２】
【図４０】図40は抗体-薬物複合体Hu001c14-vcMMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）のグラフである。
【図４１】図41は抗体-薬物複合体Hu001c14-BL20-MMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）のグラフである。
【図４２】図42はモノクローナル抗体Hu001c-14の質量分析グラフである。
【図４３】図43は抗体-薬物複合体Hu001c14-vcMMAEの質量分析グラフである。
【図４４】図44は抗体-薬物複合体Hu001c14-BL20-MMAEの質量分析グラフである。
【００６３】
【図４５】図45は抗体-薬物複合体Hu001c15-vcMMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）のグラフである。
【図４６】図46は抗体-薬物複合体Hu001c15-BL20-MMAEの疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）のグラフである。
【図４７】図47はモノクローナル抗体Hu001c-15の質量分析グラフである。
【図４８】図48は抗体-薬物複合体Hu001c15-vcMMAEの質量分析グラフである。
【図４９】図49は抗体-薬物複合体Hu001c15-BL20-MMAEの質量分析グラフである。
【００６４】
【図５０】図50はCD73抗体-薬物複合体の乳癌細胞MDA-MB-453に対する増殖抑制活性の検出結果である。
【図５１】図51はCD73抗体-薬物複合体の肺癌細胞Calu-1に対する増殖抑制活性の検出結果である。
【図５２】図52はCD73抗体-薬物複合体の膠細胞腫U87MGに対する増殖抑制活性の検出結果である。
【図５３】図53はCD73抗体-薬物複合体の肺癌細胞Calu-6に対する増殖抑制活性の検出結果である。
【００６５】
【図５４】図54はCD73抗体-薬物複合体の肺癌細胞NCI-H441に対する増殖抑制活性の検出結果である。
【図５５】図55はCD73抗体-薬物複合体の肺癌細胞NCI-H292に対する増殖抑制活性の検出結果である。
【図５６】図56はCD73抗体-薬物複合体のトリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231に対する増殖抑制活性の検出結果である。
【００６６】
【図５７】図57はCD73抗体-薬物複合体の肺癌細胞PC9に対する増殖抑制活性の検出結果である。
【図５８】図58はCD73抗体-薬物複合体の肺癌細胞HCC827に対する増殖抑制活性の検出結果である。
【図５９】図59はCD73抗体-薬物複合体の肺癌細胞NCI-H1975に対する増殖抑制活性の検出結果である。
【図６０】図60はCD73-薬物複合体の細胞毒活性（IC50値）が被験細胞のCD73発現レベルに直接関連し、標的特異的細胞毒性を表すことを示す。
【００６７】
【図６１】図61はヒトT細胞（CD3陽性選別で得られた）のCD73抗体、抗体-薬物複合体（いずれも10 nM）、またはAMP（0.3 mM）で処理された後の生長状況である。選ばれた時点でFACSによって生細胞数を読み取り、生長曲線を作った。
【図６２】図62はヒトT細胞を異なる濃度のCD73抗体-薬物複合体と5日インキュベートした後、一定の体積における生細胞数を読み取り、増殖率（溶媒/緩衝液に対して）で描いた抑制曲線である。
【図６３】図63はCD73抗体-薬物複合体の体内における抗腫瘍活性である。CD73高発現のU87MG脳膠細胞腫をヌードマウスの背中の皮下に接種してから10日目に腫瘍体積を測定してランダムに群分けを行い（n=8）、計2回（10、17日目）静脈内投与し、投与量はいずれも5 mg/kgであった。
【００６８】
【図６４】図64はCD73抗体-薬物複合体の体内における抗腫瘍活性である。U87MG脳膠細胞腫を接種してから22日目にランダムに群分けを行い（n=8）、計2回（22、29日目）Hu001c14-BL20-MMAE（3 mg/kg、1 mg/kg）、Hu001c14-vc-MMAE（3 mg/kg）を静脈内投与した。
【図６５】図65はCD73抗体-薬物複合体の体内における抗腫瘍活性である。CD73高発現の非小細胞肺癌NCI-H441細胞をヌードマウスの背中の皮下に接種してから19日目にランダムに群分けを行い（n=8）、計2回（19、26日目）静脈内投与し、投与量は3 mg/kg、1 mg/kgであった。
【図６６】図66はCD73抗体-薬物複合体の体内における抗腫瘍活性である。NCI-H441細胞を接種してから12日目にランダムに群分けを行い（n=8）、計2回（12、19日目）静脈内投与し、投与量はそれぞれ1 mg/kg、0.3 mg/kgであった。
【００６９】
【図６７】図67はCD73抗体-薬物複合体の体内における抗腫瘍活性である。CD73高発現の非小細胞肺癌NCI-H292細胞をヌードマウスの背中の皮下に接種した。図67Aは腫瘍生長の観察で、接種から11日目にランダムに群分け（n=8）および投与（11、18日目）を行い、2群の抗体-複合体の投与量はいずれも3 mg/kg、1 mg/kgであった。図67Bは大体積の腫瘍の消退の観察で、接種から23日目にランダムに群分け（n=8）および投与（23、30日目）を行い、抗体-複合体の投与量は5 mg/kgで、ドセタキセル（docetaxel）は15 mg/kgであった。
【図６８】図68はHu001c系列のヒト化抗体の組み換えカニクイザルCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）の検出である。
【図６９】図69はHu002c系列のヒト化抗体の組み換えカニクイザルCD73酵素触媒機能に対する抑制活性（IC50）の検出である。
【００７０】
【図７０】図70はHu001c14-vcMMAE（被験物番号FD114-ADC）のカニクイザル安全性試験における血液学指標の検出結果である。
【図７１】図71はHu001c14-vcMMAE（被験物番号FD114-ADC）のカニクイザル安全性試験における血液凝集指標の検出結果である。
【図７２】図72はHu001c14-vcMMAE（被験物番号FD114-ADC）のカニクイザル安全性試験における血漿生化学指標の検出結果である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、意外に、5つの抗CD73モノクローナル抗体を得たが、それぞれmAb001〜mAb005と名付けた。活性測定の結果から、mAb001(IgG1-κ)、mAb002(IgG1-κ)、mAb004(IgG2b-κ)を選択してヒト-マウスキメラ抗体mAb001c、mAb002c、mAb004cを構築した。前記の抗体は高度に特異的にCD73抗原に結合することができ、ELISAによるそのEC50はそれぞれ0.024 nM、0.016 nM、0.038 nMであった。そして、前記の抗体は顕著な抗腫瘍活性を有しながら、哺乳動物自身に顕著に毒性・副作用がない。また、mAb001c、mAb002cに基づいて設計されたヒト化抗体および相応する抗体-薬物複合体（ADC）も優れた特性を有する。また、本発明の新規なリンカーによって得られたCD73抗体-薬物複合体の製品は、均一性が高く、体内外における安定性をさらに向上させるという優勢を有する。これに基づき、本発明を完成させた。
【００７２】
抗体
本明細書で用いられるように、用語「抗体」または「免疫グロブリン」は同様な構造特徴を持つ、約150000ダルトンのヘテロテトラマーの糖タンパク質で、2つの同じ軽鎖（L）と2つの同じ重鎖（H）からなるものである。各軽鎖は、重鎖に1つの共有ジスルフィド結合によって結合しているが、重鎖間のジスルフィド結合の数は、免疫グロブリンのアイソタイプによるものである。各重鎖および軽鎖も、それぞれ一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合を有する。各重鎖は、1つの末端に可変領域（VH）を有し、その先に多数の定常領域を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変領域（VL）を有し、他方の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の一つ目の定常領域と、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と対向している。特殊なアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成している。
【００７３】
本明細書で用いられるように、用語の「可変」とは、抗体において可変領域のある部分が配列で異なっており、これによって各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が構成されることを指す。しかし、可変性は、均一に抗体の可変領域全体に分布しているわけではない。軽鎖と重鎖の可変領域における相補性決定領域（CDR）または超可変領域と呼ばれる3つの断片に集中している。可変領域において、比較的に保存的な部分は、フレームワーク領域（FR）FRと呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域に、それぞれ、基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する3つのCDRで連結され、場合によって部分βシート構造となる4つのFR領域が含まれる。各鎖におけるCDRは、FR領域で密接し、かつ他方の鎖のCDRと一緒に抗体の抗原結合部位（Kabatら、NIH Publ. No. 91-3242, 卷I，647-669頁（1991）を参照する）を形成している。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば抗体の抗体依存細胞毒性に参与するなどの異なるエフェクター機能を示す。
【００７４】
脊椎動物の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づき、明らかに異なる二種類（κおよびλと呼ばれる）のいずれかに分類することができる。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づき、異なるクラスに分類することができる。免疫グロブリンには、主として5つのクラス、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、そのうちのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、たとえばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2に分類することができる。異なるクラスの免疫グロブリンの重鎖の定常領域に応じて、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は本分野の技術者熟知である。
【００７５】
一般的に、抗体の抗原結合特性は、重鎖および軽鎖の可変領域に位置する3つの特定の領域によって特徴付けられ、可変領域（CDR）と呼ばれ、4つのフレームワーク領域（FR）に分かれ、4つのFRのアミノ酸配列が比較的に保存され、直接結合反応に関与しない。これらのCDRは環状構造を形成し、その中のFRで形成されるβシートによって空間構造上で近づき、重鎖におけるCDRおよび相応の軽鎖におけるCDRが抗体の抗原結合部位を構成する。同類の抗体のアミノ酸配列の比較によってどのアミノ酸がFRあるいはCDR領域を構成するか確認することができる。
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
【００７６】
本発明において、抗体は当業者に熟知の技術によって製造されるマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または全ヒト抗体を含む。組み換え抗体、たとえばキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、ヒトの部分および非ヒトの部分を含み、標準のDNA組み換え技術によって得ることができ、いずれも有用な抗体である。キメラ抗体は一つの分子で、そのうちの異なる部分が異なる動物種由来で、たとえばマウス由来のモノクローナル抗体の可変領域、およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有するキメラ抗体である（たとえば米国特許4,816,567および米国特許4,816,397を参照するが、ここで引用の形によって全体として本明細書に取り入れる）。ヒト化抗体とはヒト以外の種由来の抗体分子で、一つまたは複数のヒト以外の種由来の相補性決定領域（CDR）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する（米国特許5,585,089を参照するが、ここで引用の形によって全体として本明細書に取り入れる）。これらのキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、本分野で熟知されるDNA組み換え技術によって製造することができる。
【００７７】
本発明において、抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性でもよい。
本発明において、本発明の抗体は、さらにその保存的変異体を含み、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、10個以下、好ましくは8個以下、より好ましくは5個以下、最も好ましくは3個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Aのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【００７８】
表A
【表１】
2021516960.tif 000008
【００７９】
抗CD73抗体
本発明は、3種類のCD73を標的とする高特異性で高親和力の抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列を、前記軽鎖は軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列を含有する抗体を提供する。
１．  好ましくは、重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列、軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列は以下のポリペプチド配列を有するHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む。
【００８０】
a1）HCDR1は配列番号1のNYYIY、配列番号10のSYWMH、または配列番号21のDYNMDである。
a2）HCDR2は配列番号2のWIYPGNLNIKYNEKFKGで、配列番号11のEINPSNGRSNYNEKFKS、または配列番号22のDINPNNGGSVYNQKFKGである。
a3）HCDR3は配列番号3のDDNYAWFAY、配列番号12のRGVSGNYFDY、または配列番号23のITGTGYWSFDVである。
a4）LCDR1は配列番号4のKASQDVSTAVA、配列番号13のKASQDINTYLS、または配列番号24のRASENIYSNLAである。
a5）LCDR2は配列番号5のWTNTRHT、配列番号14のRSNILVD、または配列番号25のGATNLAEである。あるいは、
a6）LCDR3は配列番号6のQQHYSTPFT、配列番号15のLQYDEFPYT、または配列番号26のQHFWGIPWTである。
a7）上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列が少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、CD73結合親和力を有する配列。
【００８１】
もう一つの好適な例において、前記少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た配列は、好適に、相同性が少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％のアミノ酸配列である。
好ましくは、前記の抗体は細胞表面のCD73タンパク質および組み換えCD73タンパク質の酵素触媒を抑制する機能を有し、迅速に細胞によって取り込まれてリソソームに入ることができる。
【００８２】
本発明の抗体は二本鎖または一本鎖抗体でもよく、そして動物由来抗体、キメラ抗体、ヒト-動物キメラ抗体、好ましくはヒト化抗体、より好ましくは全ヒト化抗体から選ばれてもよい。
本発明に係る抗体の誘導体は、一本鎖抗体、およびまたは抗体断片、たとえばFab、Fab'、(Fab')2あるいは当該分野におけるほかの既知の抗体の誘導体など、ならびにIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM抗体またはほかのサブタイプの抗体のうちの任意の一つまたは複数でもよい。
ここで、前記動物は、哺乳動物、たとえばマウスが好ましい。
本発明の抗体は、ヒトCD73を標的とするキメラ抗体、ヒト化抗体、CDR接木および/または修飾の抗体でもよい。
【００８３】
本発明の一つの好適な実施例において、上記配列番号1〜3、配列番号10〜12、配列番号21〜23のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、CD73結合親和力を有する配列は、重鎖可変領域（VH）のCDR領域に位置する。
本発明の一つの好適な実施例において、上記配列番号4〜6、配列番号13〜15、配列番号24〜26のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、CD73結合親和力を有する配列は、軽鎖可変領域（VL）のCDR領域に位置する。
【００８４】
本発明の一つのより好適な実施例において、VH CDR1、CDR2、CDR3はそれぞれ独立に配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号10、配列番号11、配列番号12、または配列番号21、配列番号22、配列番号23のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、CD73結合親和力を有する配列から、VL CDR1、CDR2、CDR3はそれぞれ独立に配列番号4、配列番号5、配列番号6、または配列番号13、配列番号14、配列番号15、または配列番号24、配列番号25、配列番号26のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも1個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換を経た、CD73結合親和力を有する配列から選ばれる。
【００８５】
本発明の上記内容において、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、好ましくは元のアミノ酸配列のアミノ酸の合計の40％以下、より好ましくは35％以下、より好ましくは1〜33％、より好ましくは5〜30％、より好ましくは10〜25％、より好ましくは15〜20％である。
本発明の上記内容において、より好適に、前記付加、欠失、修飾および/または置換のアミノ酸の数は、1〜7個、より好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、より好ましくは1〜2個でもよい。
【００８６】
もう一つの好適な例において、前記の抗体はオリジナルなマウス由来抗体mAb001、mAb002、mAb003、mAb004、mAb005である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はヒト-マウスキメラ抗体mAb001c、mAb001c-VK-SGS、mAb002c、mAb002c-VH-QG、mAb002c-VH-NA、mAb002c-VK-SG、mAb002c-VH-QG/VK-SG、mAb004c、mAb004c-VH-QG、mAb004c-VH-NAである。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はヒト化抗体Hu001c-14、Hu001c-15、Hu001c-21、Hu001c-22、Hu001c-23、Hu001c-24、Hu001c-25、Hu001c-28、Hu001c-30、Hu001c-31、Hu001c-32である。
もう一つの好適な例において、前記の抗体はヒト化抗体Hu002c-2、Hu002c-3、Hu002c-4、Hu002c-6、Hu002c-7、Hu002c-8、Hu002c-10、Hu002c-11、Hu002c-12、Hu002c-14、Hu002c-15、Hu002c-16である。
【００８７】
もう一つの好適な例において、前記キメラ抗体の重鎖および軽鎖の可変領域（VH/VL）のアミノ酸配列の番号は表1に示される。
もう一つの好適な例において、前記ヒト化抗体の重鎖および軽鎖の可変領域（VH/VL）のアミノ酸配列の番号は表2に示される。
本発明の3種類の抗体は、併用してもよく、CAR構築物、CAR構築物を含む組み換え免疫細胞、抗体-薬物複合体などの構築に使用してもよく、（a）検出試薬、検出プレートまたはキットの製造、ならびに/あるいは（b）CD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用してもよい。
本発明の配列表に係る各配列が表す意味は以下の通りである。
【００８８】
【表２】
2021516960.tif 000009
【００８９】
抗体の製造
本発明の抗体またはその断片のDNA分子の配列は、通常の技術で、たとえば、PCR増幅あるいはゲノムライブラリースクリーニングなどの方法によって得ることができる。また、軽鎖および重鎖のコード配列を一体に融合し、一本鎖抗体を形成してもよい。
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
【００９０】
現在、前記の本発明の抗体（またはその断片、あるいはその誘導体）をコードするDNA配列を全部化学合成で得ることがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
さらに、本発明は、上記の適当なDNA配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。好適な動物細胞は、CHO-S、HEK-293細胞を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
通常、本発明の抗体の発現に適切な条件で、形質転換で得られた宿主細胞を培養する。そして、通常のグロブリンの精製工程、例えばプロテインA-Sepharose、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの本分野の技術者に熟知の通常の分離精製手段で精製し、本発明のの抗体を得る。
得られたモノクローナル抗体は、通常の手段で同定することができる。たとえば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、あるいは体外結合試験（たとえば放射免疫測定（RIA）または酵素結合免疫吸着測定（ELISA））で測定することができる。モノクローナル抗体の結合親和力は、例えばMunson等, Anal. Biochem.,107:220(1980)のScatchard分析で測定することができる。
【００９２】
本発明の抗体は、細胞内又は細胞膜において発現し、或いは細胞外に分泌することができる。必要であれば、その物理・化学的特性およびほかの特性を利用して各種の単離方法で組み換えタンパク質を単離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）及びほかの各種の液体クロマトグラフィー技術、並びにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
【００９３】
抗体-薬物複合体（ADC）
また、本発明は本発明の抗体に基づいた抗体-薬物複合体（antibody-drug conjugate、ADC）を提供する。
典型的に、前記抗体-薬物複合体は前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体と前記エフェクター分子がカップリング、好ましくは化学的にカップリングしている。ここで、前記エフェクター分子は治療活性を有する薬物が好ましい。また、前記エフェクター分子は毒素タンパク質、化学治療薬、小分子薬物または放射性核種のうちの一つまたは複数でもよい。
【００９４】
本発明の抗体と前記エフェクター分子の間はカップリング剤によってカップリングしてもよい。前記のカップリング剤の例は、非選択性カップリング剤、カルボキシ基を利用するカップリング剤、ペプチド鎖、ジスルフィド結合を利用するカップリング剤のうちの任意の一つまたは複数でもよい。前記非選択性カップリング剤とは、エフェクター分子と抗体を共役結合させて連結する化合物、たとえばグルタルアルデヒドなどである。前記カルボキシ基を利用するカップリング剤は、シスアコニット酸無水物系カップリング剤（たとえばシスアコニット酸無水物）、アシルヒドラゾン系カップリング剤（カップリング部位はアシルヒドラゾンである）のうちの任意の一つまたは複数でもよい。
【００９５】
抗体における一部の残基（たとえばCysやLysなど）は多くの機能基との連結に使用され、イメージング試薬（たとえば発色基や蛍光基）、診断試薬（たとえばMRI造影剤や放射性同位元素）、安定剤（たとえばエチレングリコール重合体）および治療剤を含む。抗体は機能剤にカップリングして抗体-機能剤の複合体を形成してもよい。機能剤（たとえば薬物、検出試薬、安定剤）は抗体にカップリング（共役結合）されている。機能剤は直接、またはリンカーを介して間接に抗体に連結してもよい。
典型的な本発明に適するカップリング形態は、K-LockとC-Lockの2種類のカップリング形態を含む。K-Lockのカップリング形態では、薬物分子が抗体の配列におけるリシン（K）残基にカップリングし、C-Lockのカップリング形態では、薬物分子が抗体の配列におけるシステイン残基（C）にカップリングする。
【００９６】
抗体は薬物がカップリングすることによって抗体-薬物複合体（ADC）になってもよい。典型的に、ADCは薬物と抗体の間に位置するリンカーを含む。リンカーは分解できるリンカーでもよく、分解できないリンカーでもよい。分解できるリンカーは、典型的に、細胞内の環境において分解しやすく、たとえば目的の部位で分解することにより、薬物が抗体から放出される。適切な分解できるリンカーは、たとえば、細胞内におけるプロテアーゼ（たとえばリソソームプロテアーゼやエンドソームプロテアーゼ）によって分解できるペプチジル含有リンカーを含む酵素によって分解されるリンカー、あるいはグルクロニダーゼによって分解できるグルクロン酸含有リンカーのような糖リンカーを含む。ペプチジルリンカーは、たとえばジペプチド、たとえばバリン-シトルリン、フェニルアラニン-リシンやバリン-アラニンを含んでもよい。ほかの適切な分解できるリンカーは、たとえば、pH感受性リンカー（たとえばpHが5.5未満になると加水分解するリンカー、たとえばヒドラゾンリンカー）および還元条件において分解できるリンカー（ジスルフィド結合リンカー）を含む。分解できないリンカーは典型的に抗体がプロテアーゼによって加水分解される条件において薬物を放出する。
【００９７】
抗体に連結する前、リンカーはあるアミノ酸残基と反応できる活性反応基を有し、連結は活性反応基を介して実現する。チオール基に特異的な活性反応基が好ましく、たとえばマレイミド系化合物、ハロゲン化アミド（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化エステル（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化メチルケトン（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ハロゲン化ベンジル（たとえばヨウ化、臭化または塩化のもの）、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、水銀誘導体、たとえば3,6-ジ(水銀メチル)ジオキサン（対イオンは酢酸イオン、塩素イオンまたは硝酸イオンである）、およびポリメチレンジメチルスルフィドチオスルホネートを含む。リンカーは、たとえば、チオスクシンイミドを介して抗体に連結したマレイミドを含んでもよい。
【００９８】
薬物は任意の細胞毒性薬物、細胞生長を抑制する薬物または免疫抑制薬物でもよい。実施形態において、リンカーは抗体と薬物を連結し、薬物はリンカーと結合できる機能性基を有する。たとえば、薬物はリンカーと結合できるアミノ基、カルボキシ基、チオール基、ヒドロキシ基、またはケトン基を有してもよい。薬物が直接リンカーに連結する場合、薬物は抗体に連結する前、反応する活性基を有する。
【００９９】
有用な薬物の種類は、たとえば、抗チューブリン薬、DNA副溝結合試薬、DNA複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、抗代謝薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどを含む。特に有用な細胞毒性薬物系の例は、たとえば、DNA副溝結合試薬、DNAアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、たとえばオーリスタチン（auristatin）、カンプトテシン（camptothecin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エトポシド（etoposide）、メイタンシン（maytansine）およびメイタンシノイド（maytansinoid）（たとえばDM1やDM4）、タキサン（taxane）、ベンゾジアゼピン系（benzodiazepine）またはベンゾジアゼピン含有薬物（benzodiazepine containing drug）（たとえばピロロ[1,4]ベンゾジアゼピン系（PBDs）、インドリノベンゾジアゼピン系（indolinobenzodiazepines）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン系（oxazolidinobenzodiazepines））およびビンカアルカロイド(vinca alkaloid)を含む。
【０１００】
本発明において、薬物-リンカーは一つの簡単な工程でADCの形成に使用することができる。別の実施形態において、二機能性リンカー化合物は二工程または多工程の方法でADCの形成に使用することができる。たとえば、システイン残基が第一の工程でリンカーの反応活性部分と反応し、そして後の工程で、リンカーにおける機能性基が薬物と反応することで、ADCになる。
【０１０１】
通常、特異的に薬物部分における適切な反応活性基と反応しやすいように、リンカーにおける機能性基を選択する。非限定的な例として、アジ化合物に基づいた部分は特異的な薬物部分における反応性アルキニル基との反応に使用することができる。薬物はアジ基とアルキニル基の間の1,3-双極子を介して付加することで、リンカーに共役結合する。ほかの有用な機能性基は、たとえばケトン類およびアルデヒド類（ヒドラジド類およびアルコキシアミンとの反応に適する）、ホスフィン（アジ基との反応に適する）、イソシアネートおよびイソチオシアネート（アミン類およびアルコール類との反応に適する）、および活性化したエステル類、たとえばN-ヒドロキシスクシンイミドエステル（アミン類およびアルコール類との反応に適する）を含む。これらおよびほかの連結手段は、たとえば「生物カップリング技術」、第二版（Elsevier）に記載されるように、当業者に熟知されている。当業者には、薬物部分およびリンカーの選択性反応について、相補対の反応活性機能基を選択する場合、当該相補対のいずれでも、リンカーにも薬物にも使用することができる。
【０１０２】
また、本発明は、ADCを製造する方法であって、さらに、抗体を薬物-リンカー化合物と、抗体複合体（ADC）の形成に足りる条件において結合させる工程を含んでもよい方法を提供する。
一部の実施形態において、本発明の方法は、抗体-リンカー複合体の形成に足りる条件において、抗体を二機能性リンカー化合物と結合させる工程を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、さらに、薬物部分がリンカーを介して抗体に共役結合するのに足りる条件において、抗体リンカー複合体を薬物部分と結合させる工程を含む。
【０１０３】
一部の実施形態において、抗体-薬物複合体ADCは以下の分子式で表される。
【化７】
2021516960.tif 000010
（ただし、
Abは抗体である。
LUはリンカーである。
Dは薬物である。
そして、下付き文字pは1〜10、好ましくは1〜8から選ばれる値である。）
【０１０４】
薬物（Drug）
本明細書で用いられるように、「薬物」とは広義的に任意の所望の生物活性を有し、かつ本発明に係る複合体が製造しやすいように反応性官能基を有する化合物である。所望の生物活性は、ヒトまたはほかの動物の疾患の診断、治癒、緩和、治療、予防を含む。そのため、必要な反応性官能基を有するものであれば、用語「薬物」に係る化合物は、正式の国家薬局方、およびたとえば米国の正式の同じような療法・薬局方、正式の全国処方集、またはその任意の増刊などで確認された薬物を含む。典型的な薬物は、医師用卓上参考書（PDR）および米国食品医薬品局（FDA）のオレンジブックに示された。もちろん、新薬の発見と発展に従い、これらの薬物も本発明に係る薬物複合体における「薬物」に取り入れられる。
【０１０５】
本発明のADCの構成に使用できる薬物は、細胞毒性薬剤（たとえば細胞毒性系小分子薬物）を含むが、これに限定されない。
用語「細胞毒性薬剤」とは細胞の発現活性、細胞機能を抑制または阻害する物質ならびに/あるいは細胞を破壊する物質である。当該用語は、放射性同位元素、化学治療剤および毒素、たとえば細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素を含み、その断片および/またはバリアントも含まれる。細胞毒性薬剤の例は、オーリスタチン類（たとえば、オーリスタチンE、オーリスタチンF、MMAEおよびMMAF）、クロルテトラサイクリン、マイタンシノイド、リシン、リシンA-鎖、コンブレタスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、cc1065、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（PE）A、PE40、アブリン、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（curicin）、クロチン、カリケアミシン、サボンソウ(Sapaonaria officinalis)阻害剤および糖質コルチコイドおよびほかの化学治療剤、および放射性同位元素、たとえばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212または213、P32およびLu177を含むLuの放射性同位元素を含むが、これらに限定されない。抗体は、プロドラッグをその活性形態に転換できる抗癌プロドラッグ活性化酵素とカップリングしてもよい。
【０１０６】
好適な小分子薬物は高細胞毒性を有する化合物で、好ましくはモノメチルオーリスタチン（monomethyl auristatin）、カリケアミシン、メイタンシノイド、またはこれらの組み合わせで、より好ましくはモノメチルオーリスタチンE（MMAE）、モノメチルオーリスタチンD（MMAD）、モノメチルオーリスタチンF（MMAF）、またはこれらの組み合わせから選ばれる。
より好ましくは、前記の薬物とは、癌治療に使用される細胞毒性薬物、または所望の生物活性を有するタンパク質もしくはポリペプチド、たとえば毒素、たとえばアブリン、リシンA、緑膿菌外毒素やジフテリア毒素で、ほかの適切なタンパク質は腫瘍壊死因子、インターフェロン-α、インターフェロン-β、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織型プラスミノーゲン活性化因子、および生物反応調節製剤、たとえばリンホカイン、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-6（IL-6）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、顆粒球コロニー刺激因子、またはほかの成長因子を含む。
【０１０７】
一つの好適な本発明の薬物はマイタンシンまたはメイタンシノイドである。マイタンシン化合物はチューブリンによる微小管の形成を抑制することによって細胞増殖を抑制する。メイタンシノイドはマイタンシンの誘導体である。マイタンシンおよびメイタンシノイドはいずれも効率的な細胞毒性を有するが、癌治療の臨床使用において大きく制限され、これは主にこのような分子の腫瘍に対する低選択性のためである。しかし、このような高細胞毒性によって抗体-薬物複合体の薬物部分の第一候補になる。以下、デアセチルマイタンシンの構造が示された。
【化８】
2021516960.tif 000011
【０１０８】
もう一つの好適な本発明の薬物はオーリスタチン系薬物である。オーリスタチン系薬物はドラスタチン10（Dolastatin10）の類似体で、後者は海洋軟体動物アメフラシの体内から分離された、生物活性を有するポリペプチドである。ドラスタチン10はチューブリン（ビンクリスチンと同様の結合領域）に結合することによってチューブリンの重合を抑制する。ドラスタチン10、オーリスタチンPE、オーリスタチンEはいずれも線形ポリペプチドで、4個のアミノ酸（そのうち、3個のアミノ酸はドラスタチン系化合物の特有なものである）およびC末端アミド基を含有する。2つの代表的なオーリスタチン系化合物の、モノメチルオーリスタチンE（MMAE）およびモノメチルオーリスタチンF（MMAF）は、いずれも抗体-薬物複合体の薬物の第一候補である。
【化９】
2021516960.tif 000012
モノメチルオーリスタチンE（MMAE）
【化１０】
2021516960.tif 000013
モノメチルオーリスタチンF（MMAF）
【化１１】
2021516960.tif 000014
モノメチルドラスタチン10（MMAD）
【０１０９】
もう一つの好適な本発明の薬物はピロロベンゾジアゼピン類（ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン、pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepines、PBDs）またはPBD二量体類（PBD dimers）である。PBDは、ストレプトマイセス菌によって生成される天然産物で、その独特な特性は、DNA副溝、正確にプリン-グアニン-プリン配列において、無回転の共役付加物になれることにある。PBDを部分の小分子として使用するDNA配列へのターゲッティング、そして新規な抗癌・抗菌薬としての使用は、注目されてきた。フレキシブルな炭素鎖で2つのPBD単位のC8/C8'のヒドロキシ基を連結して得られる二量体は強化された生物活性を有する。PBD二量体は、配列選択性のDNA損傷を起こし、たとえば逆順の5'-Pu-GATC-Py-3'鎖の間で架橋することにより、その生物活性につながるとされている。これらの化合物は、効率的な細胞毒性薬物と証明され、抗体-薬物複合体の薬物の候補として有用である。
【化１２】
2021516960.tif 000015
【０１１０】
PBD二量体
もう一つの好適な本発明の薬物はPNU-159682誘導体で、PNU-159682はネモルビシン（Nemorubicin）のヒト肝臓ミクロソームにおける主な活性代謝物で、MMDXおよびアドリアマイシンと比べ、活性が3000倍向上した。
【化１３】
2021516960.tif 000016
一方、薬物は上記で言及された種類に限らず、抗体-薬物複合体に使用可能なすべての薬物を含む。そして、特にリンカーとのアミド結合を介して、たとえばアルカリ性アミン基（第一級アミンまたは第二級アミン）を有することによって配位する細胞毒素で、たとえば上記で示された細胞毒素D1〜D14の構造である。
【０１１１】
CD73抗体-薬物複合体
本発明は、抗体-薬物複合体に関し、より具体的に、治療への使用を有するCD73抗体-薬物複合体に関する。リンカーを介して抗CD73抗体を化学治療薬または小分子毒素とカップリングさせることができる。また、本発明は、抗CD73抗体-薬物複合体によって哺乳動物の細胞または関連する病理的状況を治療する方法に関する。
本発明は、新規な二置換マレイミド系リンカーをCD73を標的とする抗体にカップリングさせ、当該リンカーは全部/部分的に抗体の軽鎖-重鎖および重鎖-軽鎖のジスルフィド結合が還元されたシステインのチオール基にクロスカップリングしてもよく、そしてこのようなカップリング方法によって得られるCD73を標的とするCD73抗体-薬物複合体は、従来の抗体-薬物複合体よりも、より狭い薬物/抗体比（DAR）の分布を有する
【０１１２】
【化１４】
2021516960.tif 000017
（Ia）
【化１５】
2021516960.tif 000018
（Ib）
（ただし、
Ar'は、置換または無置換のC6〜C12アリーレン基、置換または無置換の5-12員ヘテロアリーレン基からなる群から選ばれる。
L1はAr'基に連結した-O(CH2CH2O)n-で、ここで、nは1〜20から選ばれる任意の整数である。
L2は化学結合、またはAA-PAB構造で、ここで、AAは2〜4個のアミノ酸からなるポリペプチド断片で、PABはp-アミノベンジルカルバモイル基である。
CTDはアミド結合を介してL2に結合した細胞毒性系小分子薬物である。
mは3.8〜4.2である。
AbはCD73を標的とする抗体である。）
【０１１３】
本発明は、カップリング方法であって、毒素小分子を特定のリンカーを介してCD73を標的とする抗体にカップリングさせ、抗体の親和性を変えずに大幅に腫瘍細胞に対する殺傷力を向上させる方法を提供する。
本発明は、ジアリールチオマレイミド単位および一つのカップリング基を含むリンカーまたはカップリング試薬を提供する。ジアリールチオマレイミド単位は抗体鎖間のチオール基（還元後）の架橋に、カップリング基は小分子薬物または薬物-リンカー単位とのカップリングに使用される。当該ジアリールチオマレイミド単位と抗体における開放のシステイン-システインのジスルフィド結合の2つの硫黄原子の二座結合（bidentate binding）のため、これらのADCは均質で単座リンカーを含有するADCよりも強い安定性を有する。そのため、向上した体内における半減期を有し、全身性放出の細胞毒素の量を減少し、そして単座リンカーのADCよりも安全な薬物性質を有する。
【０１１４】
一方、生成する薬物-リンカー単位は当該リンカーを介して抗体とカップリングし、部分的に鎖間で架橋した複合体が生成する。従来の抗体-薬物複合体と比べ、本発明の方法によって製造される抗体-薬物複合体の薬物/抗体比（DAR）の分布がより狭いことで、大幅に製品の均一性および薬理学特性の均一性を向上させる。当該抗体-薬物複合体は目的の細胞群、たとえば腫瘍細胞を標的に薬物を送達することに使用できる。抗体-薬物複合体は特異的に細胞表面のタンパク質に結合し、生成する結合物が細胞内に取り込まれる。細胞内において、薬物は活性薬物の形態で放出して効果を果たす。抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗原と結合できる抗体断片、または抗体Fc融合タンパク質、またはタンパク質を含む。「薬物」は高活性薬物で（定義の部分を参照する）、一部の場合、薬物はポリエチレングリコールでもよい。
【０１１５】
本発明によって提供されるカップリング製品は、混合物ではあるが、従来の手段によってカップリングした抗体-薬物複合体と比べ、そのDAR分布の範囲が狭い。その平均DAR値は4近くで、最適な抗体-薬物複合体の平均DAR値（2〜4）の範囲に近い。また、カップリング製品はネイキッド抗体（DAR=0）を含有しないことが極めて少なく、この成分は細胞毒性による殺傷に貢献しない。同時に、カップリング製品は重度カップリング製品（DAR=8）も含有せず、低DARの成分よりも、この成分の体内における消失速度が速い。そのため、本発明によって提供される抗体-薬物複合体の製品は非均一性が大幅に改善された。
【０１１６】
リンカー-薬物複合体
本発明において、リンカー-薬物複合体は式Icで表される置換マレイミド系リンカー-薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む。
【化１６】
2021516960.tif 000019
(Ic)
（ただし、
RはXまたはArS-である。
Xはハロゲンからなる群から選ばれ、好ましくは臭素またはヨウ素である。
Ar'は、置換または無置換のC6〜C10アリール基、置換または無置換の5〜12員ヘテロアリール基、置換または無置換のC6〜C10のアリーレン基、置換または無置換の5〜12員ヘテロアリーレン基からなる群から選ばれる。
L1はAr'基に連結した-O(CH2CH2O)n-で、ここで、nは1〜20、好ましくは1〜10から選ばれる任意の整数である。
L2は化学結合またはAA-PAB構造で、ここで、AAはジペプチドまたはトリペプチドまたはテトラペプチドの断片（すなわち、2〜4個のアミノ酸がペプチド結合を介して連結してなる断片）で、PABはp-アミノベンジルカルバモイル基である。
CTDはアミド結合を介してL2に結合した細胞毒性系小分子薬物および/または自己免疫疾患の治療薬および抗炎症薬である。）
【０１１７】
前記の式Icの化合物は、以下の群から選ばれる：
【化１７−１】
2021516960.tif 000020
【化１７−２】
2021516960.tif 000021
など。
【０１１８】
式Icで表される化合物の合成と製造
式Icで表される化合物の通常の製造の流れは以下の通りである。
nグリコールとブロモ酢酸t-ブチルの反応によって中間体Aを得た後、置換のニトロフルオロベンゼンと芳香求核置換させて中間体Bを得る。また、中間体Bは、p-トルエンスルホン酸エステルで保護された中間体Fと置換のニトロフルオロフェノールの反応によって得ることもできる。中間体Bにおけるニトロ基をアミノ基に還元させて中間体Cを得た後、2,3-ジブロモ無水マレイン酸と環化反応させて中間体Dを得た後、さらにアリールチオフェノールと置換反応させてリンカー断片分子Eを得る。ジペプチド/トリペプチド-PAB細胞毒性薬物を持つリンカーと縮合させることにより、一連の分子Fを得ることができる。反応経路は以下の通りである。
【０１１９】
【化１８】
2021516960.tif 000022
【０１２０】
Ic-4を例として、具体的にその製造の流れを説明する。
【化１９】
2021516960.tif 000023
１．１．１  中間体A-1（工程a）
【化２０】
2021516960.tif 000024
トリグリコール(92 g, 613 mmol)をtBuOH (200 ml)に溶解させた。氷浴においてKOtBu(22.91 g, 204 mmol)を入れて半時間撹拌し、アルゴンガスの保護下で、ブロモ酢酸t-ブチル(39.8 g, 204 mmol)のtBuOH(40 ml)溶液を滴下し、室温で一晩撹拌した。翌日に、TLCによって反応の終了が検出された。回転蒸留によってt-ブタノールを除去した後、残留物に400mlのジクロロメタンを入れ、有機相を400mlの水で洗浄し、当該水相を300mlのジクロロメタンで1回抽出し、有機相を合併して飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、回転蒸留で溶媒を除去した。粗製品を石油エーテル：酢酸エチル=3:1-->1:1のカラムクロマトグラフィーにかけ、中間体A-1(24 g, 収率44.5％)を得たが、黄色の油状物であった。
【０１２１】
１．１．２  中間体B-1（工程b）
【化２１】
2021516960.tif 000025
250ml丸底フラスコにおいて中間体A-1(4 g, 15.13 mmol)、トリエチルアミン(2.53 ml, 18.16 mmol)およびジメチルアミノピリジン(0.370 g, 3.03 mmol)を100mLの分子篩で乾燥されたジクロロメタンに溶解させて撹拌し、氷浴においてp-トルエンスルホニルクロリド(3.17 g, 16.65 mmol)を分けて入れ、室温に移してアルゴンガスの保護下で一晩撹拌した。
反応系に100mlのジクロロメタンを入れて抽出し、200mlの1N希塩酸で1回洗浄し、200mlの水で2回洗浄し、200mlの飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、回転蒸留で有機相を乾燥した。200〜300メッシュのシリカゲルでカラムを充填し、PE:EA=5:1-2:1の溶離でカラムクロマトグラフィーによって分離した。回転蒸留で乾燥して中間体B-1(2.8 g, 収率44.2％)を得た。
【０１２２】
１．１．３  中間体C-1（工程c）
【化２２】
2021516960.tif 000026
中間体B-1(3 g, 7.19 mmol)、2,6-ジフルオロ-4-ニトロフェノール(1 g, 7.19 mmol)を20mlのDMFに溶解させ、K2CO3(1.9 g, 14.4 mmol)を入れ、100度に加熱して5時間撹拌した。回転蒸留で溶媒を除去し、200mlのジクロロメタンを入れて溶解させ、抽出し、それぞれ200mlの1N希塩酸、200mlの水および200mlの飽和食塩水で1回ずつ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、回転蒸留で乾燥し、200〜300メッシュのシリカゲルでカラムを充填し、PE:EA=5:1-3:1の溶離でカラムクロマトグラフィーによって精製し、回転蒸留で乾燥して中間体C-1(2 g, 収率72％)を得た。
【０１２３】
１．１．４  中間体D-1（工程d）
【化２３】
2021516960.tif 000027
中間体B-1(6 g, 15.57 mmol)を100 mlの無水エタノールに溶解させて溶液を10％Pd-Cが1.2g入った反応フラスコに入れた。6時間水素転化反応させ（1 atm、38℃）、TLCによって完全に反応したことが検出された。珪藻土で反応液をろ過し、ケーキをエタノールで洗浄し、ろ液を回転蒸発で乾燥し、中間体D-1(4.8 g, 収率87％)を得たが、黄色の油状物であった。
【０１２４】
１．１．５  化合物E-1（工程e）
【化２４】
2021516960.tif 000028
中間体D-1(1.0 g, 2.81 mmol)を量って平行反応管に入れ、窒素ガスの保護下においてAcOH(3 ml)を入れ、撹拌して溶解させた。その後、ゆっくり3,4-ジブロモ無水マレイン酸(0.72 g, 2.81 mmol)を入れた。窒素ガスの保護下で110℃に加熱して一晩撹拌した。TLCによって反応が検出された。反応液を室温に冷却した後、回転蒸発で溶媒を除去し、そしてトルエンを入れて回転蒸発で2回乾燥し、褐色の油状物である化合物E-1を得た。精製せずにそのまま次の工程の反応に使用した。
【０１２５】
１．１．６  化合物F-1の合成（工程f）
【化２５】
2021516960.tif 000029
化合物E-1(2.0 g, 3.72 mmol)を量って100ml丸底フラスコに入れ、窒素ガスの保護下において30 mlの無水ジクロロメタンを入れて撹拌して溶解させた。4-(N-モルホリルカルボニル)チオフェノール(1.66g, 7.45 mmol)を窒素ガスの保護下で反応液に入れ、溶解後、氷浴においてゆっくりDIPEA(1.3mL ml, 7.45 mmol)を滴下し、完了後、5分間撹拌し、氷浴を撤去した。窒素ガスの保護下において室温で2時間撹拌し、TLCで反応終了が検出された。
減圧で蒸発させて溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(200メッシュ〜300メッシュのシリカゲル)によって分離・精製し、ジクロロメタンをカラムに充填して洗浄した後、ゆっくり極性を上げて2％から10％のメタノールを流し、収集して蒸発で溶媒を除去してサフラン色の油状産物F-1(2.2g, 収率72％)を得た。LC-MS(M+)理論値: 821.2、実測値: 821.3 (ESI, M+H+)。
【０１２６】
１．１．７  化合物G-1（Ic-1）の合成（工程g）
【化２６】
2021516960.tif 000030
100ml丸底フラスコに化合物E-9(300 mg, 0.365 mmol)を量って入れ、窒素ガスの保護下で無水DMF(20 mL)を入れて完全に溶解させた後、順にHATU(166 mg, 0.438 mmol)およびDIEA(0.127 ml, 0.730 mmol)を量ってフラスコに入れた。室温で15分間撹拌した後、化合物VC-PAB-MMAE(416 mg, 0.365 mmol)を入れ、窒素ガスの保護下において室温で一晩撹拌した。TLCとHPLCによって反応を一晩モニタリングしたところ、原料F1がなくなった。減圧で蒸発で溶媒を除去し、定量分析を行った後、逆相HPLCによって精製し、産物を得たが、黄色の無定形の粉末であった。LC-MS(M+)理論値: 1961.9、実測値: 1962.7 (ESI, M+H+)。
【０１２７】
CD73抗体-薬物複合体の製造
抗体-薬物複合体の製造経路は以下の通りである。抗体の鎖間ジスルフィド結合が還元され、2n個（たとえば8個）のチオール基が生成する。本発明の置換マレイミド系リンカー-薬物複合体（式Ic）は還元された抗体のチオール基とカップリングし、相応する抗体-薬物複合体が生成し、そのうち、当該抗体-薬物複合体に以下に示される一つまたは二つの形態が存在する。
【化２７】
2021516960.tif 000031
【０１２８】
一つの典型的な製造方法は、抗体原液を反応緩衝液で2〜10mg/mLになるように希釈し、140〜200倍の過剰量モル比のジチオトレイトール（DTT）を入れるか、または6.0〜20倍の過剰量モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を入れ、反応液を10〜35℃で2〜48時間撹拌すること、ここで、前記反応緩衝液は、50mM リン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム(KH2PO4-NaOH)/150mM 塩化ナトリウム(NaCl)/1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9；50mM リン酸水素二ナトリウム-クエン酸/150mM 塩化ナトリウム(NaCl)/1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9；50mM ホウ酸-ホウ砂/150mM 塩化ナトリウム(NaCl)/1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9；50mM ヒスチジン-水酸化ナトリウム/150mM 塩化ナトリウム(NaCl)/1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9およびPBS//1mM ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH 6-9という比率で調製される緩衝液でもよいことを含む。
【０１２９】
上記反応液を0〜10℃に冷却し、DTTで還元する場合、還元反応が完了した後、脱塩カラムまたは限外ろ過によって過剰量のDTTを除去する必要があり、さらに置換マレイミド系化合物（予め10mg/mlでアセトニトリル(ACN)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)またはジエチルアセトアミド(DMA)に溶解させたもの）を反応液における有機溶媒の体積比が15％以下になるように入れ、0〜37℃で2〜4時間撹拌しながらカップリング反応させる。TCEPで還元する場合、残ったTCEPを除去することなく、そのまま置換マレイミド系化合物を入れてカップリングさせることができる。
【０１３０】
脱塩カラムによってカップリング反応混合物をコハク酸ナトリウム/NaCl緩衝液またはヒスチジン-酢酸/ショ糖ゲルでろ過して精製し、UV280紫外吸収値によってピークサンプルを収集する。または数回限外ろ過する。その後、ろ過によって除菌し、得られる産物を低温で保存する。好適な温度は-100〜60℃で、ろ過装置の孔径は0.15〜0.3μmが好ましい。
得られる抗体-薬物複合体の薬物抗体比（DAR）は比較的に均一である。本発明の異なるマレイミドリンカー（リンカー断片）を使用する場合、ADC産物の均一性が非常に高い（通常、DAR優位産物（たとえばDARが約4のもの）はすべてのADCの少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％またはそれ以上を占める）。DARがある程度ばらつくADCについて、均一性がより良いサンプルが必要な場合、さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）、分子排除クロマトグラフィー（SEC）、イオン交換クロマトグラフィー（IEC）によって分離・精製してもよいが、これらの方法に限定されない。
【０１３１】
検出用途およびキット
本発明の抗体またはそのADCは検出に有用で、たとえば検体を検出することによって診断情報を提供することができる。
本発明において、使用される検体（サンプル）は細胞、組織検体および生検標本を含む。本発明で用いられる用語「生検」は当業者に既知のすべての種類の生検を含む。そのため、本発明で使用される生検は、たとえば腫瘍の切除検体、内視鏡方法あるいは器官の穿刺または針刺しによって調製された組織検体を含む。
本発明で使用される検体は固定または保存された細胞または組織検体を含む。
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）を含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。好適な例において、本発明の抗体は検出プレートに固定されてもよい。
【０１３２】
応用
本発明は、本発明の用途、たとえば診断製剤の製造、あるいはCD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用される用途を提供する。前記CD73関連疾患は、腫瘍の発生、生長および/または転移、腫瘍薬剤耐性疾患、炎症、代謝関連疾患などを含む。
本発明の抗体、ADCまたはCAR-Tなどの使用は、以下のものを含むが、これらに限定されない。
（i）腫瘍、特にCD73高発現の腫瘍の発生、生長および/または転移を診断、予防および/または治療する。前記腫瘍は、乳癌（たとえばトリプルネガティブ乳癌）、肺癌（たとえば非小細胞肺癌）、膵臓腺癌、悪性脳膠細胞腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、腎臓癌、結直腸癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、白血病、骨髄癌、血管肉腫など、特にトリプルネガティブ乳癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌、悪性脳膠細胞腫、より好ましくはトリプルネガティブ乳癌および/または非小細胞肺癌を含むが、これらに限定されない。
（ii）自己免疫疾患を診断、予防および/または治療する。前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、乾癬、多発性硬化症を含むが、これらに限定されない。
（iii）炎症を診断、予防および/または治療する。前記炎症は、リウマチ性関節炎、骨関節炎、強直性脊椎炎、痛風、ライター症候群、乾癬性関節炎、感染性関節炎、結核性関節炎、ウイルス性関節炎、真菌性関節炎、糸球体性腎炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性肺損傷、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症を含むが、これらに限定されない。
（iv）代謝関連疾患を診断、予防および/または治療する。前記代謝関連疾患は、糖尿病、食事性肥満および脂肪炎症を含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
薬物組成物
さらに、本発明は組成物を提供する。好適な例において、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質またはそのADCまたは相応するCAR-T細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ここで、pH値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、pH値は通常5〜8程度、好ましくは6〜8程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腫瘍内、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
本発明に係る抗体は、ヌクレオチド配列によって細胞内で発現されて細胞治療に使用してもよく、たとえば、前記抗体はキメラ抗原受容体T細胞免疫療法（CAR-T）などに使用することができる。
本発明の薬物組成物は直接CD73タンパク質分子との結合に使用することができるため、腫瘍などの疾患の予防および治療に有用である。また、ほかの治療剤と併用してもよい。
【０１３４】
本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば0.001〜99wt％、好ましくは0.01〜90wt％、より好ましくは0.1〜80wt％）の本発明の上記のモノクローナル抗体（またはその複合体）と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約1μg／kg体重〜約5mg／kg体重である。また、本発明のポリペプチドはほかの治療剤と併用することが出来る。
【０１３５】
薬物組成物の使用時、安全有効量の免疫抱合体を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約10μg/kg体重で、かつ多くの場合、約50mg/kg体重以下で、好ましくは当該投与量が約10μg/kg体重〜約20mg/kg体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
【０１３６】
ADCについて、本発明によって提供される抗体-薬物複合体は特定の細胞群を標的とし、細胞表面の特異的なタンパク質（抗原）に結合することにより、結合物の取り込みまたは薬物の浸入によって薬物を活性形態で細胞内に放出させることができるため、本発明の抗体-薬物複合体は目的の疾患の治療に使用することが可能で、前記の抗体-薬物複合体は治療有効量で適切な経路を介して被験者（たとえばヒト）に投与することができる。治療が必要な被験者は特定の抗原の活性または発現量に関連する疾患に罹患するというリスク、または疑いがある患者でもよい。このような患者は通常の健康診断によって同定することができる。
本発明の抗体-薬物複合体で治療する場合、本分野の通常の方法によって送達することができる。たとえば、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解可能なナノカプセル、または生物粘着性ミクロスフェアによって細胞に導入することができる。あるいは、前記核酸またはベクターは現場で直接注射または輸液ポンプによって送達することができる。
【０１３７】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（a）本発明の抗体は優れた生物活性および特異性を有し、かつ高い親和力（ELISA測定によるそのEC50は0.016〜0.038nMである)を有し、CD73酵素機能の抑制活性（酵素活性測定によるそのIC50は0.025〜0.039nMである）を有する。また、腫瘍細胞のCD73に良い結合親和力(FACS測定によるそのEC50は0.35〜2.5nMである)を有し、かつ腫瘍CD73酵素の機能を抑制し(IC50値は0.2nM〜0.6nMである)、CD73を標的とする治療抗体として有用である。
（b）本発明のヒト化抗体はマウス由来抗体に相当する活性のみならず、より低い免疫原性を有する。
（c）本発明の抗体およびADCはいずれも顕著な体内抗腫瘍活性を有しながら、哺乳動物、たとえばモデルマウス自身に明らかな毒性・副作用がない。
（d）本発明の抗体はヒトリンパ球に顕著な増殖保護作用を有し、有効にアデノシン一リン酸（AMP）のT細胞に対する増殖抑制を逆転させてINF-γの発現と分泌を促進することができ、そのEC50は0.01〜0.08nMである。
【０１３８】
（e）本発明に係る抗体-薬物複合体（ADC）は優れたCD73依存性の抗腫瘍活性を有し、すなわち、CD73正常または低発現の細胞には顕著な毒性・副作用がないが、CD73高発現の腫瘍細胞には非常に高い殺傷活性を有し、細胞増殖抑制試験で測定されたそのIC50は0.02nM〜0.05nMである。
（f）本発明に係る抗体-薬物複合体（ADC）は正常ヒトリンパ球の増殖に顕著な毒性・副作用がなく、細胞増殖抑制試験で測定されたそのIC50は＞100nMである。
（g）本発明に係る抗体-薬物複合体（ADC）は哺乳動物、たとえばカニクイザルに高度または意外な毒性・副作用を示さず、臨床薬物として応用する潜在的な将来性がある。
（h）本発明によって提供される新規なリンカーは、簡単な化学方法によってCD73を標的とする抗体とカップリングすることができ、従来のカップリング手段と比べ、このようなリンカーで得られるCD73抗体-薬物複合体はDAR値の分布が非常に狭いため、生成する製品は均一性が高く、得られる複合体における単一の分布の成分（DAR：4）が80％以上で、複合体の体外腫瘍細胞増殖の抑制活性は従来のmcVC-PAB複合体よりも生物学活性、安全性などの薬らしさの面においてある程度向上または維持する。
（i）本発明はマレイミドのジスルフィド鎖の橋架けによってより良い安定性を有し、Ar'部位に置換基を導入することによってマレイミドの開環・加水分解の反応速度を調節してマレイミドの開環後の環化・二次加水分解反応を緩和さることができ、体内においてスルフィド交換反応および開環後の環化・二次加水分解反応が生じにくく、さらにCD73抗体-薬物複合体の体外と体内の安定性を強化させる。
【０１３９】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下記実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。細胞株は通常の市販品で、またはATCCから購入され、プラスミドはいずれも市販品であった。
【０１４０】
実施例1  ヒトCD73を標的とするモノクローナル抗体の発見と製造
工程（１）、ハイブリドーマ細胞の製造：
まず、ヒトCD73タンパク質の細胞外領域（CD73-ECD）を抗原として製造した。NCBI:NP_002517.1アミノ酸の27番目から547番目を参照し、遺伝子クローニング技術および哺乳動物ベクター発現系によって炭素末端ポリヒスチジンタグ（C-terminus polyhistidine-tagged）が付いた抗原を得たが、具体的なアミノ酸配列は以下の通りである(配列番号48)：
WELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKAHHHHHHHHHH
【０１４１】
上記で製造されたCD73細胞外領域のタンパク質によってBalb/cマウスを免疫させ、CD73細胞外領域のタンパク質の使用量は50μg/匹で、免疫脾臓細胞を製造した。良いタイミングでマウス骨髄腫細胞（SP2/0）製造して細胞を飼育して融合に備えた。
上記3種類の細胞を準備できたら、PEGを介して免疫脾臓細胞とSP2/0細胞を融合させ、PEGを除去し、飼育細胞を含有するHAT完全培地で再懸濁させ、96ウェルプレートに接種して培養し、ELISA/FACS法によって陽性ウェルをスクリーニングした。最後に、さらに陽性ウェルの細胞に対して有限希釈法によってクローン化培養を行い、ELISAまたはFACSによって力価が高く、形態が良く、単一クローンで生長する細胞をスクリーニングし、続いて連続3回の陽性クローン率がすべて100％になるまでサブクローニングによるスクリーニングを行い、当該細胞株に対して増幅培養およびライブラリー構築が行えるようになった。
【０１４２】
工程（２）、ヒトCD73を標的とするマウス由来モノクローナル抗体の精製：
工程（１）でスクリーニングされたハイブリドーマ細胞をローラーボトルにおいて14日増幅培養した後、細胞の培養上清を収集し、0.22μmろ膜でろ過した後、得られた培養上清を一定の速度で予め平衡化されたプロテインA樹脂カラムに入れ、そして0.1M Tris-HCl（pH=8.0、1.5M NaCl含有）でカラムを平衡化した。その後、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液で平衡カラムを溶離し、溶離液を収集して定量し、SDS-PAGE電気泳動、SEC-HPLCおよび内毒素検出を行った。得られた精製抗体を分けて-80℃で凍結保存して使用に備えた。
【０１４３】
工程（３）、ヒトCD73を標的とするマウス由来モノクローナル抗体の生物活性および特異性の確認：
スクリーニングを繰り返し、選ばれた5つのハイブリドーマモノクローナル抗体に対して生物活性および標的特異性の測定を行った。図1Aに示すように、蛍光活性化セルソーター（FACS）によって単一クローン細胞培養液の上清を検出したところ、5つの抗体はいずれも特異的にヒト由来CD73高発現のMDA-MB-231細胞（CD73-P）には結合することができたが、CD73低発現のMDA-MB-453細胞（CD73-N）には顕著な結合活性がなかった。その後、精製された抗体サンプルに対して勾配希釈、FACS検出を行ったところ、図1Bに示すように、mAb001、mAb002、mAb003、mAb004、mAb005はMDA-MB-231細胞に優れた結合親和力を有し、FACS検出によるそのEC50はそれぞれ1.24nM、0.65nM、10.7nM、4.69nM、26.07nMである。
【０１４４】
実施例2  抗体の配列決定、相補性決定領域（CDR）の同定
優れた特異性および親和力から、優先的にmAb001、mAb002、mAb004を選んで配列決定を行った。プライマーを設計して通常のPCR技術によって重鎖（VH）、軽鎖（VL）の可変領域の断片（図2を参照する）を増幅し、ベクターにクローニングし、配列決定した。通常の配列決定およびKabatデータベースを使用した分析により、以下の重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列、相補性決定領域（CDR）の情報を得た（下線「＿」で示されたのはCDR-1/2/3のアミノ酸配列である）。
【０１４５】
配列番号7 mAb001の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGKSTLTADKSSSTAFMQLSSLTSEDSAVYFCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号16 mAb002の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号27 mAb004の重鎖可変領域（VH）のアミノ酸配列
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
【０１４６】
配列番号8 mAb001の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGNTSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
配列番号19 mAb002の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVDGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
配列番号30 mAb004の軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYGATNLAEGVPSRFSGSGLGTQYSLKISSLQSEDFGSYYCQHFWGIPWTFGGGTKLEIK
【０１４７】
実施例3  ヒト-マウスキメラ抗体の製造、キメラ抗体の点突然変異
遺伝子組み換え技術によって3組の可変領域の配列（配列番号7、配列番号16、配列番号27、配列番号8、配列番号19、配列番号30を参照する）をヒトIgG1重鎖定常領域およびκ鎖定常領域を含有するベクターにクローニングし、配列決定で間違いがないと確認されたら、形質移入技術および哺乳動物発現系（FreeStyle（商標）293T細胞）によって構築されたキメラ型抗体を発現させて精製し（図3を参照する）、得られたヒト-マウスキメラ型抗体をそれぞれmAb001c、mAb002c、mAb004cと名付けた。
前記抗体の可変領域の配列は数個の不利なアミノ酸を含有し、それに対して点突然変異による改造を行った。以下、点突然変異された後の重鎖可変領域（VH）、軽鎖可変領域（VL）のアミノ酸配列(下線「＿」で示されたのはCDRのアミノ酸配列である)。
【０１４８】
配列番号9 mAb001-VL-SGS
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGSGSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
配列番号17 mAb002-VH-QG
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号18 mAb002-VH-NA
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNARSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
【０１４９】
配列番号20 mAb002-VL-SG
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVSGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
配列番号28 mAb004-VH-QG
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNQGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
配列番号29 mAb004-VH-NA
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
【０１５０】
上記点突然変異鋳型にマッチするように得られた点突然変異（PTM）をhIgG1ベクターにクローニングして点突然変異した相応するキメラ抗体の突然変異体を得た。
上記のようなヒト-マウスキメラ抗体および前記抗体突然変異体の番号、前記抗体の重鎖および軽鎖の番号を表-1にまとめた。
表-1：ヒト-マウスキメラ抗体およびその突然変異体
【表３】
2021516960.tif 000032
【０１５１】
実施例4  キメラ抗体のヒトCD73抗原に対する親和力のELISA測定
コーティング液でCD73タンパク質の細胞外領域（CD73-ECD）を1μg/mLになるように希釈し、ELISAプレートを100μL/ウェル、4℃で一晩コーティングした。残った抗原を洗い流し、1％BSAで室温で2hブロッキングした後、3倍勾配で希釈された各モノクローナル抗体を100μL/ウェルで入れ、室温で1hインキュベートした。結合しなかった抗体を洗い流し、適切な濃度で西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗マウスの二次抗体を100μL/ウェルで入れ、室温で0.5hインキュベートした。結合しなかった二次抗体を洗い流し、TMB呈色液を入れて約15min反応させ、1N HCLを50μL/ウェルで入れ、呈色反応を停止させた後、450nmにおける吸光度を測定し、そしてデータを分析した。
検出結果は図4に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはCD73-ECDに対して強い親和性を有し、EC50がそれぞれ0.024nM、0.016nM、0.038nMであった。
検出結果は図13に示すように、前記mAb001c/mAb002c/mAb004c突然変異体のELISAによるEC50値は0.05 nM〜0.093nMであった。
【０１５２】
実施例5  キメラ抗体の組み換えヒトCD73酵素触媒機能に対する抑制活性の測定
抗原希釈液でヒト組み換えCD73酵素（CD73細胞外領域）を0.1μg/mLになるように希釈し、均一に96ウェル低吸着培養プレートに25μL/ウェルで敷いた。50μLの3倍勾配で2nMから0.0009nMに希釈されたCD73抗体を培養プレートに入れ、均一に混合し（最終濃度は1nM〜0.00045nMである）、37℃で1hインキュベートした後、25μLの1.2mM AMPおよび0.4mM ATPを含有する混合液を入れ、37℃で1hインキュベートした。上記反応液を50μL取り出してもう一つの96ウェルプレートに入れ、各ウェルに50μLのCellTiter-Glo試薬を入れ、均一に混合して光を避けて3〜5min反応させ、マイクロプレートリーダーによって蛍光シグナル強度を検出した。
【０１５３】
検出結果は図5に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはいずれも顕著に組み換えCD73プロテアーゼのAMPを加水分解する活性を抑制し、そのIC50がそれぞれ0.025nM、0.031nM、0.039nMであった。
検出結果は図16に示すように、mAb001c-Vk-SGSのIC50は0.02nMであった。
検出結果は図17に示すように、mAb002c-VH-QG/VK-SGのIC50は0.038nM、0.06nMであった。
【０１５４】
実施例6  キメラ抗体の腫瘍細胞の表面のCD73に対する特異的結合
CD73高発現のトリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231、非小細胞肺癌細胞NCI-H1299、Calu-1、脳膠細胞腫細胞U87MG、膵臓腺癌細胞SW1990とともに、CD73低発現の乳癌細胞MDA-MB-453、非小細胞肺癌細胞NCI-H460を使用し、キメラ抗体の細胞表面のCD73に対する結合状況を測定した。3×105個の腫瘍細胞を抗体と均一に混合した後（最終濃度5μg/mL）、4℃で1hインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった一次抗体を除去し、さらに標的細胞をPEで標識された二次抗体と4℃で30minインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった二次抗体を除去し、最後に細胞を200μLのPBSに再懸濁させ、蛍光活性化セルソーター（FACS）によって結合率を検出した。
【０１５５】
検出結果は図6に示すように、前記キメラ抗体はいずれもCD73高発現の腫瘍細胞を特異的に認識して結合し、結合率の蛍光強度の順序はCalu-1、NCI-H1299、U87MG、SW1990、MDA-MB-231の順で、CD73低発現の腫瘍細胞MDA-MB-453、NCI-H460は極めて弱い結合蛍光強度を示した。Calu-1、MDA-MB-453と抗体の結合率（MFI）を比較すると、mAb001c結合率の差は250倍で、mAb002cは978倍で、mAb004cは856倍であった。
【０１５６】
実施例7  腫瘍細胞の表面のCD73タンパク質レベルがその酵素活性に密接に関連する
CD73高発現（U87MG、Calu-1、NCI-H1299）、CD73低発現（MDA-MB-453）の細胞株を使用し、細胞表面のCD73タンパク質の量と酵素活性の関連性を研究した。まず、100μLの上記各細胞株の数を2倍勾配で20000から625に希釈し、均一に96ウェル細胞培養プレートに敷き、37℃で16h培養した後、無血清の培地で3回洗浄して残った血清を除去し、ゆっくり50μLの300μM AMPを入れ、均一に混合し、37℃で3h培養した。気をつけて25μLの培養液上清を取り出し、もう一つの96ウェルプレートに入れ、25μLの100μM ATPを入れ、均一に混合した。各ウェルに50μLのCellTiter-Glo試薬を入れ、均一に混合して光を避けて3〜5min反応させ、マイクロプレートリーダーによって蛍光シグナル強度を検出した。
結果は図7に示すように、検出試験の線形範囲内で、CD73低発現のMDA-MB-453細胞は極めて低量（バックグランドレベル）の酵素活性しか示さず、CD73高発現の3株の細胞はいずれも高い酵素活性を示したことから、腫瘍細胞の表面のCD73タンパク質レベルがその酵素活性に密接に関連することが確認された。
【０１５７】
実施例8  キメラ抗体の腫瘍細胞の表面のCD73に対する結合親和力の測定
CD73高発現のトリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231、非小細胞肺癌細胞NCI-H1299を標的細胞とし、100μLの3倍勾配で200nMから0.091nMに希釈された被験抗体を一次抗体とし、それぞれ100μのLRPMI-1640無血清培地に懸濁させた1×105個のMDA-MB-231と均一に混合し、あるいは100μLの3倍勾配で100nMから0.046nMに希釈されたmAb001c、mAb002c、mAb004cを一次抗体として100μLのRPMI-1640無血清培地に懸濁させた1×105個のNCI-H1299細胞と均一に混合した後、4℃で1hインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった一次抗体を除去し、さらに標的細胞を200μLの2μg/mLのPEで標識された二次抗体と4℃で30minインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった二次抗体を除去し、最後に細胞を200μLのPBSに再懸濁させ、フローサイトメトリーによって被験抗体の相応する細胞表面CD73に対する結合親和力（Binding affinity）を測定した。
【０１５８】
検出結果は図8に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはMDA-MB-231に対して優れた結合親和力を有し、EC50がそれぞれ0.7nM、0.36nM、2.5nMであった。
検出結果は図9に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはNCI-H1299に対して優れた結合親和力を有し、EC50がそれぞれ1.0nM、0.39nM、2.2nMであった。
検出結果は図18に示すように、前記mAb001c/mAb002cの誘導突然変異体はMDA-MB-231に同様に優れた結合親和力を有し、mAb001c-VK-SGSのEC50値は1.39nMで、mAb002c-VH-QG/NAのEC50値は0.43nMで、mAb002c-VK-SGのEC50値は0.46nMであった。
上記結果のように、本実施例のモノクローナル抗体はヒト由来腫瘍細胞のCD73を作用標的とすることができる。
【０１５９】
実施例9  キメラ抗体の腫瘍細胞の表面のCD73酵素の触媒機能に対する影響
CD73高発現のトリプルネガティブ乳癌細胞MDA-MB-231、非小細胞肺癌細胞NCI-H1299およびCalu-1を標的細胞とした。適切な数の腫瘍細胞（予備実験によって確認された）を96ウェルプレートに敷き、37℃で16時間培養した後、無血清RPMI-1640培地で細胞を3回洗浄し、50μLの3倍勾配で200nMから0.091nMに希釈された被験抗体を96ウェルプレートに入れ、37℃で30minインキュベートした後、25μLの0.9mMのAMPを入れ、37℃、5％CO2で3h培養した（抗体の最終濃度は133.3nM〜0.06nMである）。上記培養上清を25μL取り出してもう一つの96ウェルプレートに入れ、25μLの0.1mM ATPを入れ、均一に混合した。各ウェルに50μLのCellTiter-Glo試薬を入れ、均一に混合して光を避けて3〜5min反応させ、マイクロプレートリーダーによって蛍光シグナル強度を検出した。
【０１６０】
検出結果は図10に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはいずれも顕著にMDA-MB-231細胞の表面のCD73のAMPの加水分解を触媒する機能を抑制し、IC50がそれぞれ1.858nM、0.791nMおよび4.164nMであった。
検出結果は図11に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはNCI-H1299細胞の表面のCD73のAMPの加水分解を触媒する機能を抑制し、IC50がそれぞれ0.236nM、0.191nM、0.385nMであった。
検出結果は図12に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはCalu-1細胞の表面のCD73のAMPの加水分解を触媒する機能を抑制し、IC50がそれぞれ0.506nM、0.281nM、0.630nMであった。
【０１６１】
実施例10  ヒト化抗体の製造
Germlineデータベースから検索してmAb001c、mAb002cの非CDR領域に最もマッチするヒト化鋳型を選択した後、ヒト由来鋳型のCDR領域の代わりに抗体のCDR領域を選ばれたヒト化鋳型に導入し、さらたIgG1の定常領域と組み換え、同時にマウス由来抗体の3次元構造を元に、残基を包埋し、CDR領域と直接相互作用がある残基、およびVLとVHの配座に大きく影響する残基に対して復帰突然変異を行った。
具体的に、mAb001cのヒト化を行って7つのヒト化重鎖の可変領域（配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号45、配列番号46）、および3つのヒト化軽鎖の可変領域（配列番号36、配列番号37、配列番号47）を得た。
【０１６２】
配列番号31 mAb001-VH_HuG.3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号32 mAb001-VH_HuG.5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号33 mAb001-VH_HuG.6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
【０１６３】
配列番号34 mAb001-VH_HuG.7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号35 mAb001-VH_HuG.8
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号45 mAb001-VH_HuG.9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号46 mAb001-VH_HuG.10
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
【０１６４】
配列番号36 mAb001-VK_HuG.1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
配列番号37 mAb001-VK_HuG.2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
配列番号 47 mAb001-VK_HuG.0
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
【０１６５】
具体的に、mAb002cのヒト化を行って4つのヒト化重鎖の可変領域（配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41）および3つのヒト化軽鎖の可変領域（配列番号42、配列番号43、配列番号44）を得た。
【０１６６】
配列番号38 mAb002-VH_HuG0 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号39 mAb002-VH_HuG1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号40 mAb002-VH_HuG2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号41 mAb002-VH_HuG3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVKKAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
【０１６７】
配列番号42 mAb002-VK_HuG1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKAPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGQGTKLEIK
配列番号43 mAb002-VK_HuG2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
配列番号44 mAb002-VK_HuG3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFAIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
【０１６８】
遺伝子組み換え技術によって設計されたヒト化可変領域の配列をヒトIgG1重鎖定常領域およびκ鎖定常領域を含有するベクターにクローニングし、配列決定で間違いがないと確認されたら、形質移入技術および哺乳動物発現系（FreeStyle（商標） 293T細胞）によって構築されたヒト化抗体を発現させた。それぞれこれらのヒト化の重鎖および軽鎖を組み合わせて発現させ、最終的にmAb001c系列で11のヒト化抗体を、mAb002系列で12のヒト化抗体を得たが、各抗体の相応する重鎖および軽鎖の組み合わせを表-2に示す。
【０１６９】
表-2：ヒト化抗体
【表４】
2021516960.tif 000033
【０１７０】
実施例11  ヒト化抗体のCD73に対する親和力
表2におけるヒト化抗体を勾配希釈し、ELISA法によってそのCD73タンパク質に対する親和力を測定したが、実験方法は実施例4を参照する。
実験結果は図14、図15に示すように、前記2組のヒト化抗体はいずれもCD73タンパク質に対して強い結合親和力を有し、EC50値が0.02nM〜0.13nMであった。
【０１７１】
実施例12  ヒト化抗体のヒトCD73酵素の機能に対する抑制作用
表2におけるヒト化抗体を勾配希釈し、実施例5の方法に従って抗体の組み換えCD73酵素の活性に対する影響を測定した。
実験結果は図16、図17に示すように、前記2組のヒト化抗体はいずれもCD73酵素に対して極めて強い抑制効果を有し、そのIC50値が0.02nM〜0.3nMであった。
【０１７２】
実施例13  ヒト化抗体の腫瘍細胞のCD73に対する結合
フローサイトメトリーによって表2におけるヒト化抗体のMDA-MB-231、NCI-H1299肺癌細胞の表面のCD73に対する親和力を測定したが、実験方法は実施例6を参照する。
試験結果は図19、図21に示すように、前記2組のヒト化抗体はMDA-MB-231細胞の表面のCD73に対して高い親和活性を有し、EC50値が0.2nM〜0.8nMであった。
試験結果は図20、図22に示すように、前記2組のヒト化抗体はNCI-H1299細胞の表面のCD73に対して高い親和活性を有し、EC50値が0.3nM〜1.4nMであった。
【０１７３】
実施例14  ヒト化抗体の腫瘍細胞のCD73酵素の機能に対する抑制活性
表2におけるヒト化抗体のNCI-H1299細胞の表面のCD73酵素の機能に対する影響を測定したが、実験方法は実施例8を参照する。
実験結果は図23、図24に示すように、前記2組のヒト化抗体はNCI-H1299細胞の表面のCD73酵素に対して高い抑制活性を有し、IC50値が0.2nM〜0.6nMであった。
【０１７４】
実施例15  CD73キメラ抗体と腫瘍細胞の結合による細胞内におけるリソソームへの取り込み
50％の密度でMDA-MB-231細胞を共焦点レーザーシャーレに敷き、37℃で6 h培養した後、5μg/mLのCD73抗体を入れ、それぞれ37℃で4hまたは4℃で1hインキュベートし、PBSで3回洗浄して細胞と結合しなかった抗体を除去し、4％のパラホルムアルデヒドで室温で30min固定した。PBSで3回洗浄し、0.4％ Triton X-100で10min透過処理した。PBSで3回洗浄した後、37℃の条件においてLamp-2（ウサギ抗ヒト）抗体を1hインキュベートし、細胞リソソームの位置を標識した。PBSで結合しなかった抗体を洗い流し、37℃でR-PEで標識されたヒツジ抗ヒト二次抗体およびAlexa Fluor 488で標識されたロバ抗ウサギ二次抗体を30 minインキュベートした。結合しなかった二次抗体を洗い流し、DAPIで10min染色して細胞核の位置を標識した後、共焦点レーザー顕微鏡（20×）によって抗体の取り込み状況を観察した。
【０１７５】
結果は図25に示すように、mAb001c、mAb002c、mAb004cはいずれも迅速かつ大幅にMDA-MB-231細胞によってリソソームに取り込まれた。当該結果から、本発明の抗体は抗体-薬物複合体（ADC）の製造に適することが示され、CD73-ADCは良いADC薬物特性を有し、広域で高特異性のCD73陽性腫瘍を標的とする治療薬に有用であるという将来性が示唆された。
【０１７６】
実施例16  ヒト化CD73抗体のヌードマウス移植腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性
ランダムに免疫欠陥裸ヌードマウス（Balb/c,nude）をいくつかの群に分け、100μLの5×106のU87MG、または9×106のNCI-H1299を含有する細胞懸濁液を100μLの示されたヒト化抗体と均一に混合し（最終濃度は50μg/腫瘍である）、さらに200μLの細胞-抗体混合液をヌードマウスの背中の皮下に接種した(n=4)。hIgG1をサブタイプがマッチする陰性対照とした。抗体の皮下腫瘍の生長に対する抑制作用を観察し、週に2〜3回ヌードマウスの体重および腫瘍の大きさを測定し、腫瘍生長曲線を描き、活性を評価した。
【０１７７】
結果は図26に示すように、ヒト化抗体Hu001c-14、ヒト化抗体Hu002c-3〜8はいずれも顕著にU87MG腫瘍のヌードマウスの体内における生長を抑制した。
結果は図27に示すように、ヒト化抗体Hu001c-14、ヒト化抗体Hu001c-24〜32はいずれも顕著にU87MG腫瘍のヌードマウスの体内における生長を抑制した。
結果は図28に示すように、ヒト化抗体Hu001c-14〜15、ヒト化抗体Hu002c-3〜8はいずれも顕著にNCI-H1299腫瘍のヌードマウスの体内における生長を抑制した。
結果は図29に示すように、ヒト化抗体Hu001c-14〜15、ヒト化抗体Hu001c-23〜32はいずれも顕著にNCI-H1299腫瘍のヌードマウスの体内における生長を抑制した。
【０１７８】
実施例17  CD73のトリプルネガティブ乳癌における高度な異常活性化
まず、複数の異なる分子の種類の乳癌細胞株に対し、細胞の全タンパク質を調製し、精確に定量した後、イムノブロット試験（ウエスタンブロット、Western blot）によってCD73タンパク質の発現レベルを検出した。
結果は図30に示すように、CD73タンパク質は一部の高侵襲で高転移の基底型乳癌（Basal-type、臨床においてトリプルネガティブ乳癌として表れることが多い）細胞株では高度な異常活性化・発現を示したが、悪性度が比較的に低い管腔型乳癌（Luminal-type、臨床においてホルモン受容体陽性乳癌として表れることが多い）細胞株では陰性またはわずかな発現を示した。
その後、癌細胞株エンサイクロペディア（Cancer Cell Line Encyclopedia、CCLE）データベースにおける乳癌細胞株のCD73 mRNA発現レベルを分析した。結果は図31に示すように、高侵襲で高転移の基底型乳癌細胞株におけるCD73 mRNAの発現レベルはいずれも管腔型乳癌細胞株よりも高く、かつ統計学的に有意であった。そのため、本発明のCD73を標的とする抗体は、トリプルネガティブ乳癌を診断、予防および治療する使用においてより顕著な効果がある。
【０１７９】
実施例18  CD73の肺癌における高度な異常活性化・発現
まず、複数の異なる組織由来で、異なる分子の種類の肺癌細胞株に対し、細胞の全タンパク質を調製し、精確に定量した後、イムノブロット試験（ウエスタンブロット、Western blot）によってCD73タンパク質の発現レベルを検出した。
結果は図32に示すように、CD73タンパク質は多くの非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株において異常に活性化して発現した。
その後、CCLEデータベースにおける肺癌細胞株のCD73 mRNAレベルを分析した。結果は図32に示すように、非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株におけるCD73 mRNA発現レベルが小細胞肺癌（SCLC）よりも高く、本発明のCD73を標的とする抗体は、非小細胞肺癌（NSCLC）を診断、予防および治療する使用においてより顕著な効果があることが示唆された。
【０１８０】
実施例19  ヒト化CD73抗体のT細胞の増殖およびIFN-γの発現に対する保護作用
PBMCの再生、増幅およびスクリーニング：まず、500ng/mLのCD3/CD28抗体および100IU/mLのIL-2を含有する培地でPBMCを3〜4日再生培養した後、スクリーニングキット（Stemcell、Cat#1795）によってPBMCをスクリーニングしてCD3陽性のT細胞を得た。
【０１８１】
T細胞増殖試験：上記スクリーニングで得られたT細胞を蛍光標識し、予め調製されたCFSE（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、carboxyfluorescein succinimidyl ester）を細胞懸濁液（最終濃度2.5μM）に入れ、37℃で5min標識した後、PBSで3回洗浄した。その後、CFSEで標識されたT細胞を96ウェルプレートに敷き（1〜2×104個細胞/ウェル）、各ウェルに50μLの勾配希釈された抗体（最終濃度10nM〜0.0001nM、n=4）を入れ、そして50μLのアデノシン一リン酸（AMP、最終濃度0.2mM）を入れ、均一に混合し、4〜5日培養した後、培養上清を収集し、蛍光活性化セルソーター（FACS）によって読み取って所定の体積の細胞数を統計し、Flowjoソフトによって細胞増殖曲線を描いてEC50値を計算した。
【０１８２】
T細胞IFN-γの検出：50μL/ウェルのT細胞の培養上清を取ってIFN-γタンパク質濃度の検出に使用し、ELISAキット（連科生物技術有限公司、Cat#EK180HS-48）を使用し、そしてキットによって提供される技術・操作工程を参照した。
結果は図34、図35に示すように、ヒト化CD73抗体Hu001c-14、Hu002c-3はヒトT細胞に顕著な増殖保護作用を有し、有効にAMPのT細胞に対する増殖抑制を逆転させ、そのEC50がそれぞれ0.08±0.01nMおよび0.01±0.001nMであった。
結果は図36、図37に示すように、ヒト化CD73抗体Hu001c-14、Hu002c-3は有効にAMPのT細胞のINF-γの発現/分泌に対する抑制作用を逆転させた。
【０１８３】
実施例20  前記CD73抗体と既存技術の比較
US20160194407で公開されたMEDI9447抗体の重鎖、軽鎖の可変領域の配列（VH/VL）から、その重鎖、軽鎖の可変領域を人工合成し、それぞれヒトIgG1重鎖定常領域を含有するベクター、κ鎖定常領域またはλ鎖定常領域を含有するベクターにクローニングし、配列決定で間違いがないと確認されたら、FreeStyle（商標） 293T細胞系において発現および精製した後、それぞれMEDI9447-κ(本発明のCD73抗体に一致する）またはMEDI9447-λを得、抗体を製造する実験条件が実施例3、実施例10に一致するようにした。
【０１８４】
重鎖可変領域（VH）配列番号49
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAYSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGRVDEWGRGTLVTVSS
軽鎖可変領域（VL）配列番号50
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSLSNIGRNPVNWYQQLPGTAPKLLIYLDNLRLSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSHPGWTFGGGTKLTVL
【０１８５】
実施例4-8における方法を参照し、上記で製造されたMEDI9447-κおよびmAb001cとmAb002c抗体のCD73-ECDタンパク質に対するELISA親和力、組み換えヒトCD73酵素に対する抑制活性、腫瘍細胞に対する結合親和力、腫瘍細胞のCD73酵素に対する抑制活性を検出し、研究結果を表-3にまとめた。
表-3：抗体の測定活性
【表５】
2021516960.tif 000034
【０１８６】
同時に、製造されたMEDI9447-κ抗体を体内抗腫瘍活性試験に使用し、CD73高発現のU87MG脳膠細胞腫を体内腫瘍モデルとし、抗体を5×106個の細胞と混合した後、ヌードマウスの背中の皮下に接種し（50μg抗体/腫瘍）、腫瘍の生長および体重の変化を計31日観察した。図26は体内薬効実験の各群の腫瘍生長曲線を示し、31日目の抗腫瘍活性を表-4にまとめた。
表-4：ヒト化抗体のヌードマウス体内における抗腫瘍活性
【表６】
2021516960.tif 000035
【０１８７】
同様に、図27はもう1組のヒト化抗体のU87MG膠細胞腫体内実験における腫瘍生長曲線を示し、33日目の抗腫瘍活性を表-5にまとめた。
表-5：ヒト化抗体のヌードマウス体内における抗腫瘍活性
【表７】
2021516960.tif 000036
上記のように、本発明のCD73抗体は高い親和力を有し、既存技術と比べ、本発明のHu002c系列、Hu001c系列のヒト化抗体はいずれも良好またはそれ以上の体外および/または体内の抗腫瘍活性を有する。
【０１８８】
実施例21  ADC薬効測定のための細胞表面にCD73高発現の腫瘍細胞株のスクリーニング
1×105個の腫瘍細胞を抗体mAb001cと均一に混合した後（最終濃度10μg/mL）、4℃で1hインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった一次抗体を除去し、さらに標的細胞をPEで標識された二次抗体と4℃で30minインキュベートし、PBSで細胞を2回洗浄して結合しなかった二次抗体を除去し、最後に細胞を200μLのPBSに再懸濁させ、蛍光活性化セルソーター（FACS）によって結合率を検出した。
検出結果は図38に示すように、mAb001cはCD73高発現の腫瘍細胞を特異的に認識して結合し、結合率の蛍光強度の順序はCalu-1、NCI-H1299、U87MG、Calu-6、NCI-H441、NCI-H292、SW1990、MDA-MB-231の順で、CD73低発現の腫瘍細胞MDA-MB-453、NCI-H460は極めて弱い結合蛍光強度を示した。
【０１８９】
実施例22  CD73ヒト化抗体と腫瘍細胞の結合による細胞内におけるリソソームへの取り込み
50％の密度でMDA-MB-231細胞を共焦点レーザーシャーレに敷き、37℃で6 h培養した後、5μg/mLのCD73抗体を入れ、それぞれ37℃で4hまたは4℃で1hインキュベートし、PBSで3回洗浄して細胞と結合しなかった抗体を除去し、4％のパラホルムアルデヒドで室温で30min固定した。PBSで3回洗浄し、0.4％ Triton X-100で10min透過処理した。PBSで3回洗浄した後、37℃の条件においてLamp-2（ウサギ抗ヒト）抗体を1hインキュベートし、細胞リソソームの位置を標識した。PBSで結合しなかった抗体を洗い流し、37℃でR-PEで標識されたヒツジ抗ヒト二次抗体およびAlexa Fluor 488で標識されたロバ抗ウサギ二次抗体を30 minインキュベートした。結合しなかった二次抗体を洗い流し、DAPIで10min染色して細胞核の位置を標識した後、共焦点レーザー顕微鏡（20×）によって抗体の取り込み状況を観察した。
結果は図39に示すように、Hu001c-14、Hu001c-15はいずれも迅速かつ大幅にMDA-MB-231細胞によってリソソームに取り込まれた。当該結果から、本発明の抗体は抗体-薬物複合体（ADC）の製造に適することが示され、CD73-ADCは良いADC薬物特性を有し、広域で高特異性のCD73陽性腫瘍を標的とする治療薬に有用であるという将来性が示唆された。
【０１９０】
実施例23  Hu001c14-vcMMAE、Hu001c14-BL20-MMAEの製造
CD73を標的とするヒト化抗体Hu001c-14原液にPBS/EDTA（pH=7.4）緩衝液をその濃度が20 mg/mlになるように入れた後、2.6 eqのTCEPで25℃で2時間還元させ、取り出した後、氷の上に置いて冷却し、精製せずにそのまま6.0 eqのmc-VC-PAB-MMAE（上海皓元化学から購入され、予めDMAに溶解させた）を入れ、0℃で1時間反応させ、システインを入れて反応を停止させた。G25脱塩カラムによって過剰量の小分子を除去し、そして20mM クエン酸-クエン酸ナトリウム/6％ショ糖、pH 6.6の緩衝液に置換し、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をHu001c14-vcMMAEと名付けた。ヒト化抗体Hu001c-14の質量分析グラフ（図42）とその抗体複合体Hu001c14-vcMMAEのHICおよび質量分析グラフ（図40、図43）のいずれからも、抗体がカップリング反応した後、抗体複合体Hu001c14-vcMMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、平均DAR値が約4.0であったことが示された。
【０１９１】
ヒト化抗体Hu001c-14原液を50mM リン酸二水素ナトリウム-リン酸水素二ナトリウム（NaH2PO4-Na2HPO4）/150mM 塩化ナトリウム（NaCl）/2mM エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、pH 7.0の反応緩衝液に置換し、その濃度が10mg/mLになるようにし、10倍過剰量のモル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を入れ、反応液を25℃で4時間撹拌した。上記反応液を20℃に冷却し、適量のジエチルアセトアミド（DMA）を入れ、さらに6倍過剰量のモル比の化合物Ic-4（10mg/mlで予めDMAに溶解させたもの）を反応系におけるDMAの体積比が10％以下になるように入れ、20℃で2.0時間撹拌しながらカップリングさせた。脱塩カラムによってカップリング反応混合物をpH 7.5のTris-塩酸/ショ糖ゲルでろ過して精製し、UV280紫外吸収値によってピークサンプルを収集する。その後、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をHu001c14-BL20-MMAEと名付けた。ヒト化抗体Hu001c-14の質量分析グラフ（図42）とその抗体複合体Hu001c14-BL20-MMAEのHICおよび質量分析グラフ（図41、図44）のいずれからも、抗体Hu001c-14がカップリング反応した後、抗体複合体Hu001c14-BL20-MMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、DARが約4.0であったことが示された。
【０１９２】
実施例24  Hu001c15-vcMMAE、Hu001c15-BL20-MMAEの製造
CD73を標的とするヒト化抗体Hu001c-15原液にPBS/EDTA（pH=7.4）緩衝液をその濃度が20mg/mlになるように入れた後、2.6 eqのTCEPで25℃で2時間還元させ、取り出した後、氷の上に置いて冷却し、精製せずにそのまま6.0 eqのmc-VC-PAB-MMAE（上海皓元化学から購入され、予めDMAに溶解させた）を入れ、0℃で1時間反応させ、システインを入れて反応を停止させた。G25脱塩カラムによって過剰量の小分子を除去し、そして20mM クエン酸-クエン酸ナトリウム/6％ショ糖、pH 6.6の緩衝液に置換し、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をHu001c15-vcMMAEと名付けた。抗体Hu001c-15の質量分析グラフ（図47）とその抗体複合体Hu001c15-vcMMAEのHICおよび質量分析グラフ（図45、図48）のいずれからも、抗体Hu001c-15がカップリング反応した後、抗体複合体Hu001c15-vcMMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、平均DAR値が約4.0であったことが示された。
【０１９３】
Hu001c-15原液を50mM リン酸二水素ナトリウム-リン酸水素二ナトリウム（NaH2PO4-Na2HPO4）/150mM 塩化ナトリウム（NaCl）/2mM エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、pH 7.0の反応緩衝液に置換し、その濃度が10mg/mLになるようにし、10倍過剰量のモル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を入れ、反応液を25℃で4時間撹拌した。上記反応液を20℃に冷却し、適量のジエチルアセトアミド（DMA）を入れ、さらに6倍過剰量のモル比の化合物Ic-4（10mg/mlで予めDMAに溶解させたもの）を反応系におけるDMAの体積比が10％以下になるように入れ、20℃で2.0時間撹拌しながらカップリングさせた。脱塩カラムによってカップリング反応混合物をpH 7.5のTris-塩酸/ショ糖ゲルでろ過して精製し、UV280紫外吸収値によってピークサンプルを収集する。その後、孔径0.22μmのろ過装置によって除菌し、-80℃で保存したが、得られた抗体複合体をHu001c15-BL20-MMAEと名付けた。抗体Hu001c-15の質量分析グラフ（図47）とその抗体複合体Hu001c15-BL20-MMAEのHICおよび質量分析グラフ（図46、図49）のいずれからも、抗体Hu001c-15がカップリング反応した後、抗体複合体Hu001c15-BL20-MMAEになり、複合体の分子量が予測値に合致し、DARが約4.0であったことが示された。
【０１９４】
実施例25  CD73抗体-薬物複合体（CD73-ADC）のCD73高発現の腫瘍細胞に対する体外抗腫瘍活性
本実施例で使用された細胞系は米国培養細胞系統保存機関（ATCC）または中国科学院細胞ライブラリーから購入され、相応する説明に従って培養され、MDA-MB-453、Calu-1、U87MG、Calu-6、NCI-H441、NCI-H292、MDA-MB-231、PC9、HCC827、NCI-H1975が含まれる。対数増殖期にある上記細胞を、それぞれ800〜2500個細胞/ウェルの密度（細胞の増殖速度による）で96ウェル細胞培養プレートに150μL/ウェルで接種し、37℃、5％ CO2で5〜12 h培養した後、それぞれ異なる濃度のCD73-ADCを入れ、各薬物濃度に2〜4個の重複ウェル、および相応する溶媒対照とブランク対照のウェルを設け、5〜6日作用させた後（細胞の増殖速度によるが、細胞分裂の回数が十分になるようにした）、培養液を捨て、MTS反応液（Promegaから購入、cat# G3581）を100μL/ウェルで入れ、37℃で所定の色の深さになるまで反応させ、各群の細胞活力を測定し（OD490nm）、そして生存率=(OD投与-ODブランク)/(OD対照-ODブランク)×100％という式で細胞生存率を計算した。GraphPad Prism 5ソフトによって上記データを分析し、そしてそれぞれ上記CD73抗体-薬物複合体の異なる細胞株におけるIC50値を計算した。
【０１９５】
4種類の好適なヒトCD73-ADCとしてHu001c14-BL20-MMAE、Hu001c14-vcMMAE、Hu001c15-BL20-MMAE、Hu001c15-vcMMAEの体外抗腫瘍活性の結果をそれぞれ図50〜図59に示す。
図50に示すように、CD73-ADCはCD73低発現の細胞MDA-MB-453に対する増殖抑制作用が顕著ではなかったが、CD73高発現のCalu-1（図51）、U87MG（図52）、Calu-6（図53）、NCI-H441（図54）、NCI-H292（図55）、MDA-MB-231（図56）、PC9（図57）、HCC827（図58）、NCI-H1975（図59）のいずれにも強い細胞増殖抑制作用を示した。
全体的に、CD73-ADCの細胞毒活性（IC50値）から、CD73-薬物複合体の細胞毒活性が被験細胞のCD73発現レベルに直接関連することが示されることから、CD73を標的とする特異的細胞毒性と判断された（図60）。表-6に一部の細胞増殖抑制試験のIC50値をまとめた。
【０１９６】
表-6：CD73ヒト化抗体-薬物複合体の体外抗腫瘍活性
【表８】
2021516960.tif 000037
【０１９７】
実施例26  CD73-ADCのヒトT細胞の増殖に対する影響
ヒト末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell、PBMC）凍結保存管はいずれもJiangsu Xidier Biological Technology Co. Ltd.によって提供された。まず、500ng/mLのCD3/CD28抗体および100IU/mLのIL-2を含有する培地でPBMCを3〜4日再生培養した後、スクリーニングキット（提供先：Stemcell、Cat#1795）によってスクリーニングしてCD3陽性のT細胞を得、さらに蛍光標識した。予め調製された蛍光色素CFSE（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、carboxyfluorescein succinimidyl ester）を細胞懸濁液（最終濃度2.5μM）に入れ、37℃で5minインキュベートし、PBSで3回洗浄した後、試験に使用した。
【０１９８】
まず、T細胞増殖曲線に対する影響を観察するために、CFSEで標識されたT細胞を96ウェルプレートに敷き（5000個細胞/ウェル）、溶媒（緩衝液）、CD73抗体、CD73-ADC、対照hIgG1-ADC（いずれも10 nM）、または0.3mM アデノシン一リン酸（AMP）を入れ、培養の3、6、9、12日目に蛍光活性化セルソーター（FACS）によって読み取って生細胞数を統計し、生長曲線を描いた。図61に示すように、溶媒およびhIgG1-BL20-MMAEと比べ、10nMのHu001c14-BL20-MMAEはT細胞の増殖曲線を顕著に変えることがなかった。しかし、予想通りに、AMPは顕著にT細胞の増殖率を低下させた。
また、もう一つの試験において、CFSEで標識されたT細胞を96ウェルプレートに敷き（2×104個細胞/ウェル）、各ウェルに勾配希釈されたCD73-ADC（最終濃度100nM〜0.00128nM、n=3）または対照溶媒を入れ、5日培養した後、FACSによって生細胞数を読み取り、投与量曲線図を作ってIC50値を計算した。図62に示すように、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEは被験濃度の区間では顕著な毒性・副作用を示さなかった（IC50＞100nM）。
【０１９９】
実施例27  CD73-ADC体内抗腫瘍活性
それぞれ200μLの5×106 U87MG、NCI-H441、NCI-H292を含有する細胞懸濁液を免疫欠陥マウス（Balb/c,nude）の背中の皮下に接種した。腫瘍体積が100〜300 mm3に生長したら、腫瘍体積の大きさおよびヌードマウスの体重によってランダムに群分けを行い（n=8）、それぞれ5mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kgの投与量で、週に1回尾静脈から投与し、計2週間投与した。同時に、hIgG（hIgG1-MMAE）を陰性対照とし、15mg/kgドセタキセル（Docetaxel）を陽性対照とした。週に2〜3回腫瘍体積およびヌードマウスの体重を測定して記録することによって腫瘍の生長曲線を描いた。腫瘍体積（V）の計算式は、V=1/2×a×b2で、ここで、a、bはそれぞれ腫瘍の長さ、幅を表す。
3種類の好適なヒト化CD73-ADCとしてHu001c14-BL20-MMAE、Hu001c14-vcMMAE、Hu001c15-BL20-MMAEの体内抗腫瘍活性の結果をそれぞれ図63〜図67に示す。
【０２００】
図63に示すように、5mg/kgのHu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEでは、完全にCD73高発現のU87MG腫瘍の生長を抑制し、腫瘍が消退し、投与停止から30日超でも腫瘍の生長の回復が見られなかった。
図64に示すように、U87MG腫瘍モデルにおいて、Hu001c14-BL20-MMAEは3mg/kg、1mg/kgで投与する場合、投与量に関連する治療効果を示した。そして、同等の3mg/kgの投与量では、Hu001c14-BL20-MMAEはHu001c14-vcMMAEよりも強い抗腫瘍活性を示したことから、BL20-MMAEリンカーはより優れたことが示された。
【０２０１】
図65に示すように、NCI-H441腫瘍モデルにおいて、Hu001c14-BL20-MMAEは3mg/kg、1mg/kgで投与した後、いずれも顕著な腫瘍の消退につながったことから、NCI-H441腫瘍はCD73-ADCに対する高度な感受性を有することが示された。
図66に示すように、NCI-H441腫瘍モデルにおいて、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEは1mg/kgで投与した後、いずれも顕著な腫瘍の消退につながり、0.3mg/kgで投与した後も顕著な抗腫瘍活性があったことから、NCI-H441腫瘍はCD73-ADCに対する高度な感受性を有することがさらに明らかになった。
図67に示すように、NCI-H292腫瘍モデルにおいて、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEは3mg/kg、1mg/kgで投与した後、いずれも完全に腫瘍の生長を抑制した（図67A）。もう一つの独立した腫瘍消退試験において、腫瘍体積が〜700mm3になったら投与し、5mg/kg Hu001c14-BL20-MMAEの治療効果が顕著に5mg/kg Docetaxelよりも優れた(図67B)。
【０２０２】
実施例28  CD73ヒト化抗体のカニクイザルCD73酵素の活性に対する抑制作用
カニクイザルCD73/NT5E細胞外領域の配列(EHH53214.1; Met1-Lys547)で炭素末端にポリヒスチジンタグが付いた組み換えカニクイザルCD73酵素を製造し、具体的なアミノ酸配列は配列番号48で示される。
表2におけるヒト化抗体を勾配希釈し、実施例5の方法に従って抗体の組み換えカニクイザルCD73酵素の活性に対する影響を測定した。
試験結果は図68、図69に示すように、前記2組のヒト化抗体はいずれもカニクイザルCD73酵素に対して予想された抑制効果を有し、IC50値の範囲がそのヒトCD73酵素に対する陽区性活性に相当する。
【０２０３】
実施例29  CD73-ADCのカニクイザルに対する安全性試験
雌のカニクイザルを2匹使用し、単回の静脈内投与によって3 mg/kgのHu001c14-vcMMAE（被験物番号FD114-ADC）を投与した後、連続21日観察し、22日目に再び静脈内投与によって6mg/kgのHu001c14-vcMMAE（被験物番号FD114-ADC）を投与し、さらに連続21日観察した後（計42日後）安楽死させて解剖した。試験期間では、ケージサイド観察（cageside observation）、体重、飼料消耗量、血液学、血液凝集、血漿生化学、免疫表現型(6 mg/kg投与後の21日目のみで検出された)、形態学の肉眼観察および生物分析といった指標を評価した。
【０２０４】
その結果、各投与量において、動物は臨床症状、体重、飼料消耗量および形態学の肉眼観察のいずれの面でも薬物に関連する顕著な変化は見られなかったことが示された。血液学指標：3および6 mg/kgで投与した後の7日目にいずれもRBC、HGBおよびHCTのわずかな減少が見られ、RET、WBCおよびその分類（主にNEUT、MONOおよびEOS）が顕著に減少した。3 mg/kgで投与した後の14日目および21日目にまだRBC、HGBおよびHCTのわずかな減少が見られたが、6 mg/kgで投与した後の14日目および/または21日目に上記変化が完全に回復したか回復する傾向にあった（図70）。血液凝集指標：3 mg/kgで投与した後の14日目に2/2の動物にFIBの一過性のわずかな増加が見られた。6mg/kgで投与した後、1/2の動物にFIBのわずかな増加が見られ、投与後の21日目に回復する傾向が見られた（図71）。血漿液生化学指標：3および6 mg/kgで投与した後、いずれも顕著な薬物に関連する血漿生化学の変化が見られなかった（図72）。免疫表現型：6 mg/kgで投与した後の21日目に、1/2の動物にCD3+CD4+のわずかな増加、CD3-CD20+のわずかな減少が見られた。全体的に、本試験の条件において、カニクイザルに単回投与量漸増の方式によって3および6 mg/kgのHu001c14-vcMMAEを静脈内投与する場合、動物はいずれも良い耐性を示し、投与後、主に赤血球系/顆粒球系の細胞数の減少およびフィブリノゲンの増加が見られ、投与停止後、回復することができる。最大耐量（MTD）は6 mg/kg超である。
【０２０５】
上記のように、CD73-ADCに関する実施例の研究では、以下のようなことが明らかになった。
１、  CD73ヒト化抗体-薬物複合体Hu001c14-vcMMAE、Hu001c15-vcMMAE、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEはいずれも良いCD73特異的な腫瘍細胞殺傷活性を有し、すなわち、CD73高発現の腫瘍細胞の増殖に極めて強い抑制作用を有するが、CD73低発現の細胞の増殖に顕著な毒性がない。
２、  CD73ヒト化抗体-薬物複合体Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEは、健常者のT細胞の細胞増殖に顕著な毒性がない。
【０２０６】
３、  従来のmcVC-PABカップリング技術のHu001c14-vcMMAE、Hu001c15-vcMMAEと比べ、本発明の新規なリンカーで製造されたHu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEは相当するかそれ以上の抗腫瘍活性を有する（表-6）。
４、  新規なリンカーのより優れた均一性および安定性のため、Hu001c14-BL20-MMAE、Hu001c15-BL20-MMAEはいずれもより低い非特異性の（標的化部分（targeting moiety）の脱離による）毒性・副作用を示し、たとえば、そのCD73低発現のMDA-MB-453に対する細胞毒性のIC50値がさらに向上した（図50、表-6）。
５、  Hu001c14-vcMMAEを静脈内投与によってカニクイザル（3mg/kg、6mg/kg）に投与する初歩的な毒理試験から、CD73-ADCは予想に合致する制御可能な安全性を示すため、臨床で応用する潜在的な将来性がある。
【０２０７】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【０２０８】
抗体配列
配列番号1: mAb001 HCDR1
NYYIY
配列番号2: mAb001 HCDR2
WIYPGNLNIKYNEKFKG
配列番号3: mAb001 HCDR3
DDNYAWFAY
配列番号4: mAb001 LCDR1
KASQDVSTAVA
配列番号5: mAb001 LCDR2
WTNTRHT
配列番号6: mAb001 LCDR3
QQHYSTPFT
配列番号7: mAb001-VH
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGKSTLTADKSSSTAFMQLSSLTSEDSAVYFCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号8: mAb001-VL
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGNTSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
配列番号9: mAb001-VL-SGS
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWTNTRHTGVPDRFTGSGSGTEHTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTTLEIK
【０２０９】
配列番号10: mAb002 HCDR1
SYWMH
配列番号11: mAb002 HCDR2
EINPSNGRSNYNEKFKS
配列番号12: mAb002 HCDR3
RGVSGNYFDY
配列番号13: mAb002 LCDR1
KASQDINTYLS
配列番号14: mAb002 LCDR2
RSNILVD
配列番号15: mAb002 LCDR3
LQYDEFPYT
【０２１０】
配列番号16: mAb002-VH
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号17: mAb002-VH-QG
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号18: mAb002-VH-NA
QVQLQQPGAELVKPGASVRLSCKASGYTLTSYWMHWVKKRPGQGLEWIGEINPSNARSNYNEKFKSKATLTVDRSSSTVYMQLGSLTSEDSAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTTLTVSS
配列番号19: mAb002-VL
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVDGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
配列番号20: mAb002-VL-SG
DIKMTQSPSSMYASLGERVTMTCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRSNILVSGVPSRFSGSRSGQDYYLTITSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLELK
【０２１１】
配列番号21: mAb004 HCDR1
DYNMD
配列番号22: mAb004 HCDR2
DINPNNGGSVYNQKFKG
配列番号23: mAb004 HCDR3
ITGTGYWSFDV
配列番号24: mAb004 LCDR1
RASENIYSNLA
配列番号25: mAb004 LCDR2
GATNLAE
配列番号26: mAb004 LCDR3
QHFWGIPWT
【０２１２】
配列番号27: mAb004-VH
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
配列番号28: mAb004-VH-QG
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNQGGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
配列番号29: mAb004-VH-NA
EVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVKQSHGKSLEWIGDINPNNAGSVYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDTAVYYCGRITGTGYWSFDVWGTGTTVTVSP
配列番号30: mAb004-VL
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYGATNLAEGVPSRFSGSGLGTQYSLKISSLQSEDFGSYYCQHFWGIPWTFGGGTKLEIK
【０２１３】
配列番号31: mAb001-VH_HuG.3
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWMGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号32: mAb001-VH_HuG.5
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号33: mAb001-VH_HuG.6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号34: mAb001-VH_HuG.7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号35: mAb001-VH_HuG.8 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTNYYIYWVKQRPGQGLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRVTITADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号36: mAb001-VK_HuG.1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
配列番号37: mAb001-VK_HuG.2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKSPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDHTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
【０２１４】
配列番号38: mAb002-VH_HuG0 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号39: mAb002-VH_HuG1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSRVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号40: mAb002-VH_HuG2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号41: mAb002-VH_HuG3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSYWMHWVKKAPGQGLEWIGEINPSQGRSNYNEKFKSKVTLTVDRSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRGVSGNYFDYWGQGTLVTVSS
配列番号42: mAb002-VK_HuG1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKAPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGQGTKLEIK
配列番号43: mAb002-VK_HuG2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
配列番号44: mAb002-VK_HuG3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLSWFQQKPGKSPKSLIYRSNILVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFAIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK
【０２１５】
配列番号45: mAb001-VH_HuG.9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号46: mAb001-VH_HuG.10
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYIYWVKQRPGQRLEWIGWIYPGNLNIKYNEKFKGRSTLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDDNYAWFAYWGQGTLVTVSS
配列番号47: mAb001-VK_HuG.0
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWTNTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPFTFGQGTKLEIK
【０２１６】
配列番号48：Human CD73-ECD
WELTILHTNDVHSRLEQTSEDSSKCVNASRCMGGVARLFTKVQQIRRAEPNVLLLDAGDQYQGTIWFTVYKGAEVAHFMNALRYDAMALGNHEFDNGVEGLIEPLLKEAKFPILSANIKAKGPLASQISGLYLPYKVLPVGDEVVGIVGYTSKETPFLSNPGTNLVFEDEITALQPEVDKLKTLNVNKIIALGHSGFEMDKLIAQKVRGVDVVVGGHSNTFLYTGNPPSKEVPAGKYPFIVTSDDGRKVPVVQAYAFGKYLGYLKIEFDERGNVISSHGNPILLNSSIPEDPSIKADINKWRIKLDNYSTQELGKTIVYLDGSSQSCRFRECNMGNLICDAMINNNLRHTDEMFWNHVSMCILNGGGIRSPIDERNNGTITWENLAAVLPFGGTFDLVQLKGSTLKKAFEHSVHRYGQSTGEFLQVGGIHVVYDLSRKPGDRVVKLDVLCTKCRVPSYDPLKMDEVYKVILPNFLANGGDGFQMIKDELLRHDSGDQDINVVSTYISKMKVIYPAVEGRIKAHHHHHHHHHH
配列番号49: MEDI9447重鎖可変領域(MEDI9447-VH)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAYSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYGRVDEWGRGTLVTVSS
配列番号50: MEDI9447軽鎖可変領域(MEDI9447-VL)
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSLSNIGRNPVNWYQQLPGTAPKLLIYLDNLRLSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSHPGWTFGGGTKLTVL
【図１】
2021516960.tif 000039
【図２】
2021516960.tif 000040
【図３】
2021516960.tif 000041
【図４】
2021516960.tif 000042
【図５】
2021516960.tif 000043
【図６】
2021516960.tif 000044
【図７】
2021516960.tif 000045
【図８】
2021516960.tif 000046
【図９】
2021516960.tif 000047
【図１０】
2021516960.tif 000048
【図１１】
2021516960.tif 000049
【図１２】
2021516960.tif 000050
【図１３】
2021516960.tif 000051
【図１４】
2021516960.tif 000052
【図１５】
2021516960.tif 000053
【図１６】
2021516960.tif 000054
【図１７】
2021516960.tif 000055
【図１８】
2021516960.tif 000056
【図１９】
2021516960.tif 000057
【図２０】
2021516960.tif 000058
【図２１】
2021516960.tif 000059
【図２２】
2021516960.tif 000060
【図２３】
2021516960.tif 000061
【図２４】
2021516960.tif 000062
【図２５】
2021516960.tif 000063
【図２６】
2021516960.tif 000064
【図２７】
2021516960.tif 000065
【図２８】
2021516960.tif 000066
【図２９】
2021516960.tif 000067
【図３０】
2021516960.tif 000068
【図３１】
2021516960.tif 000069
【図３２】
2021516960.tif 000070
【図３３】
2021516960.tif 000071
【図３４】
2021516960.tif 000072
【図３５】
2021516960.tif 000073
【図３６】
2021516960.tif 000074
【図３７】
2021516960.tif 000075
【図３８】
2021516960.tif 000076
【図３９】
2021516960.tif 000077
【図４０】
2021516960.tif 000078
【図４１】
2021516960.tif 000079
【図４２】
2021516960.tif 000080
【図４３】
2021516960.tif 000081
【図４４】
2021516960.tif 000082
【図４５】
2021516960.tif 000083
【図４６】
2021516960.tif 000084
【図４７】
2021516960.tif 000085
【図４８】
2021516960.tif 000086
【図４９】
2021516960.tif 000087
【図５０】
2021516960.tif 000088
【図５１】
2021516960.tif 000089
【図５２】
2021516960.tif 000090
【図５３】
2021516960.tif 000091
【図５４】
2021516960.tif 000092
【図５５】
2021516960.tif 000093
【図５６】
2021516960.tif 000094
【図５７】
2021516960.tif 000095
【図５８】
2021516960.tif 000096
【図５９】
2021516960.tif 000097
【図６０】
2021516960.tif 000098
【図６１】
2021516960.tif 000099
【図６２】
2021516960.tif 000100
【図６３】
2021516960.tif 000101
【図６４】
2021516960.tif 000102
【図６５】
2021516960.tif 000103
【図６６】
2021516960.tif 000104
【図６７】
2021516960.tif 000105
【図６８】
2021516960.tif 000106
【図６９】
2021516960.tif 000107
【図７０】
2021516960.tif 000108
【図７１】
2021516960.tif 000109
【図７２】
2021516960.tif 000110
【配列表】
2021516960000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月4日(2020.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
配列番号10で示されるCDR1、
配列番号11で示されるCDR2、および
配列番号12で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号1で示されるCDR1、
配列番号2で示されるCDR2、および
配列番号3で示されるCDR3、
あるいは、
配列番号21で示されるCDR1、
配列番号22で示されるCDR2、および
配列番号23で示されるCDR3を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および/または置換がありながら、CD73結合親和力を維持する誘導配列を含む、前記重鎖可変領域。
【請求項２】
抗体の軽鎖可変領域であって、以下の3つの相補性決定領域CDR：
（1） 請求項1に記載の重鎖可変領域、および/または
（2） 以下の3つの相補性決定領域CDR：
配列番号13で示されるCDR1'、
配列番号14で示されるCDR2'、および
配列番号15で示されるCDR3'、
または、
配列番号4で示されるCDR1'、
配列番号5で示されるCDR2'、および
配列番号6で示されるCDR3'、
または、
配列番号24で示されるCDR1'、
配列番号25で示されるCDR2'、および
配列番号26で示されるCDR3'、を含む軽鎖可変領域、
あるいは、前記重鎖可変領域を有する重鎖および/または前記軽鎖可変領域を有する軽鎖
を含む、抗体。
【請求項３】
（i） 請求項２に記載の抗体、および
（ii） 任意の発現および/または精製を補助するタグ配列
を含む、組み換えタンパク質。
【請求項４】
CAR構築物であって、前記のCAR構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域scFV断片はCD73と特異的に結合する結合領域で、かつ、前記scFvは、請求項１に記載の重鎖可変領域と、以下の3つの相補性決定領域CDR：
配列番号13で示されるCDR1'、
配列番号14で示されるCDR2'、および
配列番号15で示されるCDR3'、
または、
配列番号4で示されるCDR1'、
配列番号5で示されるCDR2'、および
配列番号6で示されるCDR3'、
または、
配列番号24で示されるCDR1'、
配列番号25で示されるCDR2'、および
配列番号26で示されるCDR3'、
を含む軽鎖可変領域とを有する、前記CAR構築物。
【請求項５】
外来の請求項４に記載のCAR構築物を発現することを特徴とする、組み換え免疫細胞。
【請求項６】
（a） 請求項２に記載の抗体と、
（b） 検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分とカップリングするカップリング部分と
を含む、抗体-薬物複合体。
【請求項７】
前記抗体-薬物複合体ADCが、下記分子式で表される、請求項６に記載の抗体-薬物複合体。
【化１】
2021516960.tif 000111
（ただし、
Abは抗CD73抗体である。
LUはリンカー（連結基とも呼ばれる）である。
Dは薬物である。
そして、下付き文字pは1〜10、好ましくは1〜8から選ばれる値である。）
【請求項８】
LUが、6-マレイミドカプロイル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MC-val-cit-PAB）、6-マレイミドカプロイル-アラニン-フェニルアラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MC-ala-phe-PAB）、マレイミドプロピオニル-バリン-シトルリン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MP-val-cit-PAB）、マレイミドプロピオニル-アラニン-フェニルアラニン-p-アミノベンジルオキシカルボニル（MP-ala-phe-PAB）、N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)バレラート（SPP）、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボナート（SMCC）、N-ヒドロキシスクシンイミジル4-(2-ピリジルジチオ)ブチレート（SPDB）またはN-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)アミノベンゾエート（SIAB）および二置換マレイミド系リンカーからなる群から選ばれる、請求項７に記載の抗体-薬物複合体。
【請求項９】
Dが、
（i）マイタンシン誘導体（DM1、DM4）、オーリスタチンおよびドラスタチン、
（ii）モノメチルオーリスタチンE（MMAE）、モノメチルオーリスタチンF（MMAF）、モノメチルドラスタチン10（MMAD）系誘導体またはこれらの組み合わせ、ならびに
（iii）DNA損傷薬物、好ましくは、デュオカルマイシン、ピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン（PBD）を含む前記のDNA損傷薬物
からなる群から選ばれる、請求項７に記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１０】
前記抗体の重鎖可変領域の配列が、配列番号7、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号45、配列番号46、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41からなる群から選ばれ、かつ/または
前記抗体の軽鎖可変領域の配列が、配列番号8、配列番号9、配列番号19、配列番号20、配列番号30、配列番号36、配列番号47、配列番号37、配列番号42、配列番号43、配列番号44からなる群から選ばれる、請求項６に記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１１】
前記キメラ抗体が、mAb001c、mAb001c-VK-SGS、mAb002c、mAb002c-VH-QG、mAb002c-VHNA、mAb002c-VK-SG、mAb002c-VH-QG/VK-SG、mAb004c、mAb004c-VH-QG、mAb004c-VH-NA（明細書の表-1）からなる群から選ばれ、前記のヒト化抗体が、Hu001c-14、Hu001c-15、Hu001c-21、Hu001c-22、Hu001c-23、Hu001c-24、Hu001c-25、Hu001c-28、Hu001c-30、Hu001c-31、Hu001c-32、Hu002c-2、Hu002c-3、Hu002c-4、Hu002c-6、Hu002c-7、Hu002c-8、Hu002c-10、Hu002c-11、Hu002c-12、Hu002c-14、Hu002c-15、Hu002c-16（明細書の表-2）からなる群から選ばれる、請求項６に記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１２】
（a）検出試薬、検出プレートまたはキットの製造、ならびに/あるいは（b）CD73関連疾患を予防および/または治療する薬物の製造に使用される、請求項1に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の抗体、請求項３に記載の組み換えタンパク質、請求項５に記載の免疫細胞、請求項６に記載の抗体-薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分の使用。
【請求項１３】
（i） 請求項２に記載の抗体、請求項３に記載の組み換えタンパク質、請求項５に記載の免疫細胞、請求項６に記載の抗体-薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分と、
(ii) 薬学的に許容される担体と
を含有する、薬物組成物。
【国際調査報告】
2021516960.tif 000112
2021516960.tif 000113
2021516960.tif 000114
2021516960.tif 000115