(57)【要約】  ファーバー病についての免疫表現型マーカーおよびその使用が、これらのマーカーに基づいてファーバー病を診断および処置する方法と同様に、開示される。【選択図】図３７Ａ
2021516757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象がファーバー病を有するかどうかを決定する方法であって、前記方法は、対象由来の生体試料中の、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄ  ＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを検出することを含み、
ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルが対照より高い場合、前記対象はファーバー病を有し、
ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルが対照よりも低い場合、前記対象はファーバー病を有する、方法。
【請求項２】
前記対象由来の試料中のＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋のレベルが、前記対象がファーバー病を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象由来の試料中のＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルが、前記対象がファーバー病を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象由来の試料中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋のレベルが、前記対象がファーバー病を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象由来の試料中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも低いＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋のレベルが、前記対象がファーバー病を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象由来の試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋のレベルが、前記対象がファーバー病を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象由来の試料中のＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルが、前記対象がファーバー病を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対象由来の試料中のＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルより低いＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルが、前記対象がファーバー病を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出が、前記対象由来の試料中のＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋およびＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルを検出することによって行われ、対照レベルよりも高いＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋および／またはＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルが、前記対象がファーバー病を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出が、前記対象由来の試料中のＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルを検出すること、および前記対象由来の試料中のＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルをさらに検出することによって行われ、対照レベルよりも高いＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルおよび／または対照レベルよりも低いＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベル、ならびに前記検出の組み合わせが、前記対象がファーバー病を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出が、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するために、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋から選択される少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のマーカーのレベルを検出することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料が、組織抽出物試料または血液試料である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、肝臓、脾臓、肺、または血液から得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
治療有効量の、ファーバー病の処置に有用な医薬組成物を投与することをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｒｈＡＣが、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの量である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ファーバー病の診断に使用するための説明書を伴った、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１８】
前記キットが、マーカーＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、またはＣＤ１９−ＣＤ３＋に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
ファーバー病を処置するための方法であって、前記方法は、
対象由来の試料中の、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを検出することであって、
ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルが対照より高い場合、前記対象はファーバー病を有し、
ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルが対照よりも低い場合、前記対象はファーバー病を有する、検出することと、
治療有効量の、ファーバー病の処置に有用な医薬組成物を投与することと、を含む、方法。
【請求項２０】
前記医薬組成物が、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｒｈＡＣが、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの量である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
対象がファーバー病を有するかどうかを決定するための方法およびバイオマーカー。
【背景技術】
【０００２】
ファーバー病（酸性セラミダーゼ欠乏症、脂肪肉芽腫症）は、リソソーム酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）遺伝子の変異によって引き起こされる希少なリソソーム蓄積障害である。酸性セラミダーゼは、セラミドのスフィンゴシンおよび脂肪酸への分解の原因であり、酸性セラミダーゼ活性の欠乏により、セラミドの蓄積が生ずる。
【０００３】
白血球は、ファーバー病の発病において役割を果たしている。泡沫状組織球（脂質を充填したマクロファージおよび単球由来の集団）による組織浸潤は、炎症とともに、疾患の特徴である肉芽腫の形成を促進する。肉芽腫およびセラミド誘発性慢性炎症状態の両方が組織の損傷をもたらす可能性があり、結合組織および関節、肺、肝臓、中枢神経系、および二次リンパ器官が最も明白に影響を受ける。しかしながら、ファーバー病を引き起こす免疫細胞の発達および活性化の特徴付けは十分には進展していない。
【０００４】
組換えヒト酸性セラミダーゼ、ｒｈＡＣによるファーバー病の進行性マウスノックインＡｓａｈ１Ｐ３６１Ｒ／Ｐ３６１Ｒモデルの処置は、組織セラミドおよび炎症を軽減することが示されている。２０１８年１月１２日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３５０９号およびＨｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｆａｒｂｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ，”ＢＢＡ  Ｃｌｉｎ．２０１７  Ｆｅｂ  １３；７：８５−９６における開示は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０００５】
しかしながら、ファーバー病の改善された診断および処置が引き続き必要とされている。ファーバー病を確認するための組織生検の従来の組織学的評価は、費用がかかり、侵襲性であり、痛み、出血、または死さえ引き起こし得る。例えばファーバー病を診断するため、および／またはファーバー病の処置の有効性を決定するために、ファーバー病の免疫表現型マーカーを使用する簡単な試験が非常に望ましい。本主題は、本明細書で論じるような他のニーズも満たす。
【発明の概要】
【０００６】
本説明に従って、いくつかの実施形態は、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するための方法に関し、該方法は、対象由来の生体試料中の、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを検出することを含み、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルが対照より高い場合、対象はファーバー病を有し、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルが対照よりも低い場合、対象はファーバー病を有する。
【０００７】
一実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【０００８】
一実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【０００９】
一実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００１０】
一実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルより低いＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００１１】
一実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００１２】
一実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも高いＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００１３】
一実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルを検出することをさらに含み、対照レベルよりも低いＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００１４】
いくつかの実施形態では、検出は、対象由来の試料中のＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋およびＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルを検出することによって行われ、対照レベルよりも高いＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋および／またはＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。いくつかの実施形態では、検出は、対象由来の試料中のＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルを検出すること、および対象由来の試料中のＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルをさらに検出することにより行われ、対照レベルよりも高いＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベル、および／または対照レベルよりも低いＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベル、ならびに該検出の組み合わせは、対象がファーバー病を有することを示す。他の実施形態では、検出は、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するために、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋から選択される、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のマーカーのレベルを検出することによって行われる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、生体試料は、組織抽出物試料または血液試料である。いくつかの実施形態では、生体試料は、肝臓、脾臓、肺、または血液から得られる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の、ファーバー病の処置に有用な医薬組成物を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの有効量のヒト組換え酸性セラミダーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒト組換え酸性セラミダーゼはＲＶＴ−８０１である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの有効量のヒト組換え酸性セラミダーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒト組換え酸性セラミダーゼはＲＶＴ−８０１である。
【００１９】
別の実施形態は、ファーバー病の診断に使用するための指示書を伴った、上記で詳述した方法のいずれかを実施するためのキットである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、キットは、マーカーＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、またはＣＤ１９−ＣＤ３＋に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む。
【００２１】
別の実施形態は、ファーバー病を処置するための方法であり、該方法は、対象由来の試料中の、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋から選択される少なくとも１つのマーカーのレベルを検出することであって、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルが対照よりも高い場合、対象は、ファーバー病を有し、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルが対照よりも低い場合、対象はファーバー病を有する、検出することと、治療有効量の、ファーバー病の処置に有用な医薬組成物を投与することと、を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの量のｒｈＡＣを含む。
【００２３】
追加の目的および利点は、一部は以下の説明に記載されており、一部は該説明から明らかであるか、または実施することによって知り得る。目的および利点は、付随する特許請求の範囲で特に指摘される構成要素および組み合わせによって実現および達成される。
【００２４】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示および説明だけのものであり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【００２５】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する付随する図面は、１つ（いくつか）の実施形態を例示し、本説明とともに、本明細書で記載される原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１に記載されるように、生存／死滅ｚｏｍｂｉｅ  ｒｅｄで染色されたファーバーマウスの脾臓における白血球亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（黒い輪郭は、リンパ球、単球、および顆粒球の分布を示す）を同定するフローサイトメトリーアッセイを示す。
【図２Ａ−２Ｂ】実施例１に記載されるように、生存／死滅ｚｏｍｂｉｅ  ｒｅｄで染色された４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔由来の脾臓抽出物についてのフローサイトメトリーアッセイを示す（黒の輪郭、生細胞）。
【図３Ａ−３Ｂ】実施例１に記載されるように、生存／死滅ｚｏｍｂｉｅ  ｒｅｄで染色された４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔由来の肺抽出物についてのフローサイトメトリーアッセイを示す（黒い輪郭、生細胞）。
【図４Ａ−４Ｂ】実施例１に記載されるように、生存／死滅ｚｏｍｂｉｅ  ｒｅｄで染色された４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔由来の肝臓抽出物についてのフローサイトメトリーアッセイを示す（黒い輪郭、生細胞）。
【図５Ａ−５Ｂ】実施例１に記載されるように、生存／死滅ｚｏｍｂｉｅ  ｒｅｄで染色された４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔由来の血液についてのフローサイトメトリーアッセイを示す（黒い輪郭、生細胞）。
【図６Ａ−６Ｂ】実施例１に記載されるように、４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔由来の脾臓および血液のフローサイトメトリーアッセイをそれぞれ示す。細胞懸濁液を、まず、ＣＤ４５（一般的な白血球マーカー）（黒い輪郭）の発現に基づいてゲーティングし、さらに、前方散乱（ＦＳＣ）、サイズの測定、および側方散乱（ＳＳＣ）、細胞粒度（ｃｅｌｌ  ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）の測定を含む、物理的パラメータについてゲーティングして、単球を選択した（ＳＳＣｍｉｄ／ＦＳＣｍｉｄ）。図６Ａは、脾臓のフローサイトメトリーアッセイを示す。図６Ｂは、血液のフローサイトメトリーアッセイを示す。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂのフローサイトメトリーアッセイから得られた４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび同齢の野生型同腹仔由来の脾臓および血液の白血球（ＣＤ４５＋細胞）および単球（ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ細胞）の頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）をそれぞれ示す。図７Ａは、脾臓における白血球（ＣＤ４５＋細胞）および単球（ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ細胞）の頻度を示す。図７Ｂは、血液中の白血球（ＣＤ４５＋細胞）および単球（ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ細胞）の頻度を示す。矢印は、ファーバーマウスの単球集団の変化を示す。
【図８Ａ−８Ｂ】実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔由来の肺および脾臓のフローサイトメトリーアッセイをそれぞれ示す。細胞懸濁液をＣＤ１１ｂ（単球／顆粒球系統マーカー）およびＭＨＣＩＩ（主要組織適合性複合体クラスＩＩ；抗原提示分子）の発現に基づいてゲーティングし、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）のサブセット：ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂ−、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｍｉｄ、およびＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉを同定した。図８Ａは、肺のフローサイトメトリーアッセイを示す。図８Ｂは、脾臓のフローサイトメトリーアッセイを示す。
【図９Ａ−９Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂに示すフローサイトメトリーアッセイからの、４週齢および８週齢ファーバーマウスおよび野生型同腹仔由来の肺および脾臓におけるマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）のサブセット：ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂ−、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｍｉｄ、およびＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉの頻度の定量化をそれぞれ示す。図９Ａは、肺におけるマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）のサブセットの頻度の定量化を示している。図９Ｂは、脾臓におけるマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）のサブセットの頻度の定量化を示している。
【図１０Ａ−１０Ｂ】実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔由来の肝臓および血液のフローサイトメトリーアッセイをそれぞれ示す。細胞懸濁液をＣＤ１１ｂ（単球／顆粒球系統マーカー）およびＭＨＣＩＩ（主要組織適合性複合体クラスＩＩ；抗原提示分子）の発現に基づいてゲーティングし、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）のサブセット：ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂ−、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｍｉｄ、およびＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉを同定した。図１０Ａは、肝臓のフローサイトメトリーアッセイを示している。図１０Ｂは、血液のフローサイトメトリーアッセイを示している。
【図１１】図８Ａ、図８Ｂ、図１０Ａ、および図１０Ｂに示されるフローサイトメトリーアッセイからの肺、脾臓、肝臓、および血液の間のＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ集団（活性化単球）の比較を示す。矢印は、ファーバーマウスおよび野生型の間の肺における単球集団の増加を示している。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図８Ａおよび図８Ｂのフローサイトメトリーアッセイにおいて同定され、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋（炎症誘発性マクロファージおよびＤＣ）およびＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ−の亜集団をそれぞれ同定するために、ＬＹ６Ｃの発現に基づいてさらにゲーティングされた、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−集団を示す。図１２Ａは、肺におけるＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−集団を示す。図１２Ｂは、脾臓におけるＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−集団を示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔由来の、図１２Ａおよび図１２Ｂで同定されたＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋細胞（炎症誘発性マクロファージおよびＤＣ）の比較をそれぞれ示す。図１３Ａは、肺におけるＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋細胞の比較を示す。図１３Ｂは、血液中のＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋細胞の比較を示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図８Ａおよび図８ＢのフローサイトメトリーアッセイからのＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂ＋細胞マーカーの発現レベルの分布および比較を示す。図１４Ａは、４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肺由来の試料におけるマーカーＣＤ２３、ＣＤ６８、およびＣＤ８６（活性化マクロファージ）の発現レベルに基づく、図８Ａおよび図８ＢのフローサイトメトリーアッセイからのＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂ＋細胞マーカーの発現レベルの分布を示す。図１４Ｂは、図１４Ａに示される測定から得られたＣＤ２３、ＣＤ６８、およびＣＤ８６（活性化マクロファージ）について、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって表されるマーカーの発現レベルの比較を示す。
【図１５Ａ−１５Ｂ】４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の１００，０００個の血液細胞あたりのＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋細胞（炎症誘発性マクロファージおよびＤＣ）の総数および頻度の比較を示す。図１５Ａは、４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の１００，０００個の血液細胞あたりのＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋細胞（炎症誘発性マクロファージおよびＤＣ）の総数の比較を示す。図１５Ｂは、４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肺におけるＣＤ４５ｂ＋ＣＤ２０６＋細胞の頻度（左パネル）および血液中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋の頻度（右パネル）を示す。
【図１６】４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肺由来の好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）および非好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−）を同定するための、ＣＤ１１ｂ＋および／またはＬｙ６Ｇ＋／−による実施例１のＣＤ４５＋細胞（白血球）のゲーティングを示す。
【図１７】４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓由来の好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）および非好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−）を同定するための、ＣＤ１１ｂ＋および／またはＬｙ６Ｇ＋／−による実施例１のＣＤ４５＋細胞（白血球）のゲーティングを示す。
【図１８】４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肝臓由来の好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）および非好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−）を同定するための、ＣＤ１１ｂ＋および／またはＬｙ６Ｇ＋／−による実施例１のＣＤ４５＋細胞（白血球）のゲーティングを示す。
【図１９】４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の血液由来の好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）および非好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−）を同定するための、ＣＤ１１ｂ＋および／またはＬｙ６Ｇ＋／−による実施例１のＣＤ４５＋細胞（白血球）のゲーティングを示す。
【図２０Ａ−２０Ｄ】実施例１による４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肺、脾臓、肝臓、血液における、図１６〜図１９で同定された好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）の頻度をそれぞれ比較する。図２０Ａは、肺における、図１６〜図１９で同定された好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）の頻度を比較する。図２０Ｂは、脾臓における、図１６〜図１９で同定された好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）の頻度を比較する。図２０ｃは、肝臓における、図１６〜図１９で同定された好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）の頻度を比較する。図２０Ｄは、血液中の、図１６〜図１９で同定された好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）の頻度を比較する。
【図２１】実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓における、ＣＤ４５およびＣＤ３（黒色の輪郭）について二重陽性としてＴ細胞を選択するためにさらにゲーティングされたＣＤ１９−細胞（非Ｂ細胞）を示す。
【図２２】実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肺における、ＣＤ４５およびＣＤ３（黒色の輪郭）について二重陽性としてＴ細胞を選択するためにさらにゲーティングされたＣＤ１９−細胞（非Ｂ細胞）を示す。
【図２３】実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の血液における、ＣＤ４５およびＣＤ３（黒色の輪郭）について二重陽性としてＴ細胞を選択するためにさらにゲーティングされたＣＤ１９−細胞（非Ｂ細胞）を示す。
【図２４】４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓、肺、および血液における、図２１〜図２３で同定されたＴ細胞（ＣＤ１９−ＣＤ３＋）集団の頻度を比較する。図２４Ａは、脾臓におけるＴ細胞（ＣＤ１９−ＣＤ３＋）集団の頻度を報告する。図２４Ｂは、肺におけるＴ細胞（ＣＤ１９−ＣＤ３＋）集団の頻度を報告する。図２４Ａは、血液中のＴ細胞（ＣＤ１９−ＣＤ３＋）集団の頻度を報告する。
【図２５】実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓由来のＣＤ１９（汎Ｂ細胞（ｐａｎ−Ｂ  ｃｅｌｌ）マーカー）（黒色の輪郭）の発現に基づいてさらにゲーティングされたＣＤ４５＋細胞を示す。
【図２６】実施例１による４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型マウスの脾臓由来のＣＤ３８（活性化リンパ球、形質芽球マーカー）の発現に基づいてさらにゲーティングされたＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）を示す。
【図２７Ａ−２７Ｂ】図２５および図２６のフローサイトメトリーアッセイからそれぞれ得られた、実施例１による４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓におけるＢ細胞および活性化Ｂ細胞の頻度をそれぞれ比較する。図２７Ａは、図２５のフローサイトメトリーアッセイから得られた、実施例１による４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓におけるＢ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋）の頻度を比較する。図２７Ｂは、図２６のフローサイトメトリーアッセイから得られた、実施例１による４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓における活性化Ｂ細胞または形質芽球（ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋）の頻度を比較する。
【図２８】実施例１による４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の血液由来のＣＤ３８（活性化リンパ球、形質芽球マーカー）の発現に基づいてさらにゲーティングされたＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）を示す。
【図２９Ａ−２９Ｂ】図２８のフローサイトメトリーアッセイから得られた、実施例１による４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓におけるＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）およびＣＤ１９＋ＣＤ３８＋細胞（活性化Ｂ細胞または形質芽球）の頻度をそれぞれ比較する。図２９Ａは、図２８のフローサイトメトリーアッセイから得られた、実施例１による４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓におけるＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）の頻度を比較する。図２９Ｂは、図２８に示されるフローサイトメトリーアッセイから得られた、実施例１による４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓におけるＣＤ１９＋ＣＤ３８＋細胞（活性化Ｂ細胞または形質芽球）の頻度を比較する。
【図３０Ａ−３０Ｂ】ＣＤ４５＋細胞についてゲーティングした、実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肺および肝臓のフローサイトメトリーアッセイをそれぞれ示す。黒色の輪郭は、ＣＤ４５ｈｉＳＳＣｈｉ集団を示す。図３０Ａは、ＣＤ４５＋細胞についてゲーティングした、実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肺のフローサイトメトリーアッセイを示す。黒色の輪郭は、ＣＤ４５ｈｉＳＳＣｈｉ集団を示す。図３０Ｂは、ＣＤ４５＋細胞についてゲーティングした、実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肝臓のフローサイトメトリーアッセイを示す。黒色の輪郭は、ＣＤ４５ｈｉＳＳＣｈｉ集団を示す。
【図３１】実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の脾臓由来のＣＤ２３＋（成熟Ｂ細胞、活性化マクロファージ、好酸球、濾胞樹状細胞、および血小板）によりさらにゲーティングされたＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄ細胞を示す。
【図３２Ａ−３２Ｂ】実施例１に記載される、４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肺由来のＣＤ２３＋（成熟Ｂ細胞、活性化マクロファージ、好酸球、濾胞樹状細胞、血小板）によりさらにゲーティングされたＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄ細胞およびその頻度を示す。図３２Ａは、実施例１に記載される４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型同腹仔の肺由来のＣＤ２３＋（成熟Ｂ細胞、活性化マクロファージ、好酸球、濾胞樹状細胞、血小板）によりさらにゲーティングされたＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄ細胞を示す。図３２Ｂは、４週齢および８週齢のファーバーマウスおよび野生型マウスの肺における、図３２Ａに示されるフローサイトメトリーアッセイからのＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋細胞の頻度の比較を示す。
【図３３Ａ−Ｄ】肺、脾臓、肝臓、および血液を含む、フローサイトメトリーアッセイから同定されたすべての細胞亜集団に基づく免疫フィンガープリントを示す。図３３Ａは、実施例１によるファーバーマウスの肺におけるフローサイトメトリーアッセイから同定されたすべての細胞亜集団に基づく免疫フィンガープリントを示す。図３３Ｂは、実施例１によるファーバーマウスの脾臓におけるフローサイトメトリーアッセイから同定されたすべての細胞亜集団に基づく免疫フィンガープリントを示す。図３３Ｃは、実施例１によるファーバーマウスの肝臓におけるフローサイトメトリーアッセイから同定されたすべての細胞亜集団に基づく免疫フィンガープリントを示す。図３３Ｄは、実施例１によるファーバーマウスの血液におけるフローサイトメトリーアッセイから同定されたすべての細胞亜集団に基づく免疫フィンガープリントを示す。
【図３４Ａ−３４Ｅ】実施例２に記載される組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）で処置されたファーバー「ノックイン」マウスにおけるマウス脾細胞の代表的な免疫表現型ゲーティング戦略を示す。図３４Ａ〜図３４Ｅ処理からの細胞破片を除去するために、サイズ（ＳＳＣｘＦＳＣ）に基づいて最初にゲーティングされた細胞集団（図３４Ａ）。この集団を、Ｚｏｍｂｉｅ  ｒｅｄ色素について陽性であった細胞集団を除去するために、生細胞および死細胞に基づいてさらにゲーティングした（図３４Ｂ）。次いで、ＣＤ４５＋集団を選択するために生細胞をゲーティングした（図３４Ｃ）。この集団を、Ｌｙ６ＧおよびＣＤ１１ｂの二重陽性であるＣＤ４５＋細胞または好中球の割合を決定するためにさらにゲーティングした（図３４Ｄ）。残りの集団を選択し、ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ−集団について選択するためにゲーティングし、試料種あたりの活性化単球の集団を決定した（図３４Ｅ）。
【図３５Ａ−３５Ｃ】野生型（ＷＴ）マウス、ビヒクル（生理食塩水）で処置したファーバー「ノックイン」マウス、または組換え型ヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）の反復投与で処置したファーバーマウスにおける脾臓免疫細胞集団を示す。実施例３に記載されるように、脾臓免疫細胞集団は、野生型脾臓免疫細胞集団と比較した場合、対照ファーバーマウスにおいて増加し、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）で処置したファーバーマウスにおいて減少する。図３５Ａは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋脾臓好中球の細胞集団を示す。図３５Ｂは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂｈｉＭＨＣＩＩ−活性化脾臓単球の細胞集団を示す。図３５Ｃは、４週齢および８週週齢のファーバーマウスならびに４〜８週の野生型マウスにおけるフローサイトメトリーアッセイから同定されたすべての細胞亜集団に基づく免疫フィンガープリントを示す。
【図３６Ａ−Ｃ】野生型マウス、ビヒクル（生理食塩水）で処置したファーバー「ノックイン」マウス、または組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）の反復投与で処置されたファーバーマウスの全身免疫細胞集団を示す。実施例４に記載されるように、全身免疫細胞集団は、野生型全身免疫細胞集団と比較した場合、対照ファーバーマウスで増加し、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）で処置したファーバーマウスで減少する。図３６Ａは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋血液好中球の細胞集団を示す。図３６Ｂは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂｈｉＭＨＣＩＩ−活性化血液単球の細胞集団を示す。図３６Ｃは、４週齢および８週齢のファーバーマウスならびに４〜８週齢の野生型マウスでのフローサイトメトリーアッセイから同定されたすべての細胞亜集団に基づく免疫フィンガープリントを示す。
【図３７Ａ−３７Ｄ】実施例５に記載されるように、野生型マウス、ビヒクル（生理食塩水）で処置したファーバー「ノックイン」マウス、または組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）の反復投与で処置したファーバーマウスにおける肺の免疫細胞集団（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）を示し、肺免疫細胞集団（ｌｕｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）は、野生型肺免疫細胞集団と比較した場合、対照ファーバーマウスにおいて増加し、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）で処置したファーバーマウスにおいて減少する。図３７Ａは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋肝臓好中球の細胞集団を示す。図３７Ｂは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂｈｉＭＣＨＣＩＩ−活性化肺単球の細胞集団を示す。図３７Ｃは、ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−活性化肺マクロファージの細胞集団を示す。図３７Ｄは、４週齢および８週齢のファーバーマウスならびに４〜８週齢の野生型マウスでのフローサイトメトリーアッセイから同定されたすべての細胞亜集団に基づく免疫フィンガープリントを示す。
【図３８Ａ−３８Ｂ】実施例６に記載されるように、野生型マウス、生理食塩水）で処置したファーバー「ノックイン」マウス、または組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）の反復投与で処置したファーバーマウスにおける肝免疫細胞集団（ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）を示し、肝臓免疫細胞集団（ｌｉｖｅｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）は、野生型肝臓免疫細胞集団と比較した場合、対照ファーバーマウスにおいて増加し、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）で処置したファーバーマウスにおいて減少する。図３８Ａは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋肝臓好中球の細胞集団を示す。図３８Ｂは、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂｈｉＭＣＨＣＩＩ−活性化肝臓単球の細胞集団を示す。
【００２７】
配列の説明
【表１−１】
2021516757.tif 000003
【表１−２】
2021516757.tif 000004
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
2021516757.tif 000007
【００２８】
一実施形態では、「ＲＶＴ−８０１」は、ファーバー病の処置のための活性化形態の組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）である。活性化ｒｈＡＣのαおよびβサブユニットは、ジスルフィド結合によって結合される。この分子は、ｒｈＡＣを発現するＤＮＡプラスミドベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍ細胞に由来する組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）である。Ｒｖｔ−８０１は、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＫＢコード：Ｑ１３５１０に基づく。
【００２９】
ＲＶＴ−８０１は、組換えにより生成された酸性セラミダーゼを、ｉ）陽イオン交換クロマトグラフィー、ｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、およびｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィーから選択される少なくとも２つのクロマトグラフィー工程に供する工程、および溶液中の組換えにより生成された酸性セラミダーゼを１つ以上のウイルス不活化工程に供する工程であって、ｒｈＡＣ溶液が３．７以下のｐＨに設定される、工程を含むプロセスにより、少なくとも９５％の活性化形態の純度に精製された、組換えにより生成された酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）を含む。ＲＶＴ−８０１のタンパク質配列は、配列番号１に対応する。
【００３０】
一実施形態では、ｒｈＡＣの精製は、２０１８年９月２４日に出願されたＰＣＴ／２０１８／０５２４６３に開示されているプロセスに従って実施してもよく、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ＲＶＴ−８０１ｒｈＡＣの治療効果は、重度のファーバー病のマウスモデルで確立されており（Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ，２０１７）、複数の研究で特徴付けられ、評価項目では、セラミドの蓄積の減少を伴う組織病理学的および免疫学的転帰に対するプラスの影響が記述されている。
【００３１】
本発明のこの態様および全ての態様で使用することができる活性ＡＣおよび不活性ＡＣ前駆体タンパク質の一実施形態には、内容が参照により全体が本明細書に組み入れられるＵＳ２０１６／００３８５７４の表１に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、配列番号１のホモログであるタンパク質であるタンパク質である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、配列番号２の核酸分子によってコードされる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、配列番号３の核酸分子によってコードされる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、配列番号４の核酸分子によってコードされる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７７９２４．３またはＮＭ＿１７７９２４．４で定義される通りであり、それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に示される完全な配列であるか、または単に配列のコード領域であり得る。コード領域は、例えば、配列番号２のヌクレオチド３１３〜１５００、または配列番号３もしくは配列番号４に見出される対応するコード領域であり得る。しかしながら、当業者に周知のように、遺伝暗号は縮重し、したがって、開示されているものの範囲外になることなく、他のコドンを使用して同じタンパク質をコードすることができる。アミノ酸配列は既知であるため、アミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列が許容される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２のヌクレオチド３１３〜３７５によってコードされるアミノ酸配列である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、生成されるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基１〜２１のシグナルペプチドを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、生成されるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基１〜２１のシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、酵素が異なるサブユニットにプロセシングされる翻訳後プロセシング中に除去される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、タンパク質が発現される細胞に対して最適化されたコドンである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、αサブユニット、βサブユニットなどを含む。いくつかの実施形態では、生成されるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１４２、４５〜１３９、１３４〜３７９、１４３〜３９５、または１〜３９５のペプチドを含む。ペプチドは、単一のタンパク質または酵素を形成するための異なる配列のポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質はアミノ酸残基１〜２１を含まない。これらの領域は、単一のヌクレオチド配列もしくは別々のヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の組み合わせによってコードされ得る。本明細書で論じるように、タンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を使用することができ、配列番号２、配列番号３、または配列番号４として本明細書に記載されている配列に限定されない。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、酸性セラミダーゼ（ＡＣ）活性を有するが、以下の実施例で生成されるｒｈＡＣなどの検出可能な酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を有しない。酸性スフィンゴミエリナーゼ活性は、例えば、熱不活化により除去してもよい。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／００３８５７４号を参照のこと。熱不活化により、ｒｈＡＣ調製物から他の汚染タンパク質が除去されてもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態では、精製された、組換えにより生成された酸性セラミダーゼは、少なくとも９０％、９３％、９５％、９８％、もしくは９９％の純度、または１００％の純度を有する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、精製された、組換えにより生成された酸性セラミダーゼは、検出可能な酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を有さない。
【００４３】
いくつかの実施形態では、組換えにより生成された酸性セラミダーゼの酸性スフィンゴミエリナーゼ活性は、熱を使用せずに除去される。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本出願は、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するためのマーカー、方法、デバイス、試薬、システム、およびキットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のマーカーを使用して、対象がファーバー病を有するかどうかを決定する方法が提供される。記載されたマーカーを有する対象におけるファーバー病を処置する方法も開示される。
【００４５】
Ａ．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法、デバイス、および材料を本発明の実施に使用することができるが、特定の方法、デバイス、および材料が本明細書に記載される。
【００４６】
当業者は、本明細書に記載されるものと同様または同等の多くの方法および材料が、本発明の実施に使用してもよいことを認識するであろう。本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。
【００４７】
本明細書に引用されるすべての刊行物、公開された特許文書、および特許出願は、個々の刊行物、公開された特許文書、または特許出願が、参照により組み込まれるとして具体的かつ個別に示されたことと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
本明細書で使用する場合「ａ」または「ａｎ」という用語は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【００４９】
本明細書で使用する場合「約」という用語は、数値が概算であり、小さな変動が開示された実施形態の実施に大きな影響を及ぼさないことを意味する。数値の限定が使用される場合、文脈によってそうでないことが示されない限り、「約」は、数値が±１０％変動し、開示された実施形態の範囲内に留まり得ることを意味する。
【００５０】
本明細書で使用する場合「動物」という用語は、ヒト、ならびに野生動物、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）、および家畜（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）などの非ヒト脊椎動物を含むが、これらに限定されない。動物は「対象」とも称し得る。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「マーカー」および「マーカー」は、互換的に使用され、個体における正常もしくは異常な過程の兆候または個体における疾患もしくは他の状態の兆候を示すか、あるいはそれらの兆候である、標的分子を指す。より具体的には、「マーカー」または「マーカー」は、正常であるかまたは異常であるかにかかわらず、および異常な場合には慢性であるかまたは急性であるかにかかわらず、特定の生理学的状態またはプロセスの存在に関連する解剖学的、生理学的、生化学的、または分子的パラメータである。マーカーは、実験室アッセイおよび医用画像を含む様々な方法によって検出および測定可能である。いくつかの実施形態では、マーカーは標的タンパク質である。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「マーカーレベル」および「レベル」は、生体試料中のマーカーを検出するための任意の分析方法を使用して行われ、生体試料中のマーカーの、該マーカーのための、または該マーカーに対応する、存在、不存在、絶対量または濃度、相対量または濃度、力価、レベル、発現レベル、測定されたレベルの比などを示す測定を指す。「レベル」の正確な性質は、マーカーを検出するために使用される特定の分析方法の特定の設計および構成要素に依存する。
【００５３】
標的分子の「対照レベル」または「対照」は、疾患もしくは状態を有していない個体由来の、または疾患もしくは状態を有する疑いのない個体由来の、同じ試料の種類における標的分子のレベルを指す。標的分子の「対照レベル」は、本方法が実施されるたびに決定する必要はなく、特定の試料中のレベルが正常レベルよりも高いかまたは低いかを決定するための参照または閾値として使用される以前に決定されたレベルであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における対照レベルは、ファーバー病を有さない１人以上の対象で観察されたレベルである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における対照レベルは、複数の正常な対象、またはファーバー病を有していない対象で観察された統計的変動を任意選択でプラスまたはマイナスした平均的または平均レベルである。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「担体」という用語は、化合物とともに投与される希釈剤、補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）、または賦形剤を意味する。薬学的担体は、水および油などの液体であり得、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む。薬学的担体はまた、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤（ａｕｘｉｌｉａｒｙ）、安定剤、増粘剤、潤滑剤、および着色剤を使用することができる。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの任意の形式の含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの任意の形式の有する（ｈａｖｉｎｇ））、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」や「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの任意の形式の含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ））、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」や「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの任意の形式の包む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ））は、包括的またはオープンエンドであり、追加の示されていない要素または方法ステップを除外しない。さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用される用語は、「からなる」または「本質的にからなる」という用語と併せて使用できることが理解される。
【００５６】
本明細書で使用する場合「接触させる」という用語は、インビトロ系またはインビボ系において２つの要素を引き合わせることを意味する。例えば、個体、対象、または細胞へのｒｈＡＣポリペプチドの「接触」には、ポリペプチドをヒトなどの個体または患者に投与すること、ならびに例えば、化合物をポリペプチドを含む細胞または精製された調製物を含む試料に導入することを含む。さらに、接触は、ポリペプチドをコードする核酸分子で細胞をトランスフェクトすることまたは感染させることを指し得る。
【００５７】
「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」、「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」、およびそれらの変形は、個体に関する１つ以上の兆候、症状、データ、または他の関連情報に基づく、個体の健康状況または状態の検出、決定、または認識を指す。個体の健康状況は、健康／正常として診断され（すなわち、疾患または状態がないとの診断）、または病気／異常として診断され得る（すなわち、疾患もしくは状態が存在するとの診断、または疾患もしくは状態の特徴があると評価される診断）。「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」、「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」などの用語は、特定の疾患または状態に関して、疾患の最初の検出、疾患の特徴付けまたは分類、病気の進行、寛解、または再発の検出、および個人に対する処置または治療を行った後の疾患反応の検出を包含する。ファーバー病の診断には、ファーバー病を有する個体と有していない個体とを区別することが含まれる。
【００５８】
対象に送達される酵素の「有効量」は、ファーバー病の臨床経過を改善するのに十分な量であり、臨床的改善は、当業者に周知の様々な定義されたパラメータのいずれかによって測定される。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「Ｘ〜Ｙの整数」という語句は、端点を含む任意の整数を意味する。例えば、「Ｘ〜Ｙの整数」という語句は、１、２、３、４、または５を意味する。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、本明細書に記載の化合物が、従来の技術などによって、（ａ）植物もしくは細胞などの天然供給源、または（ｂ）合成有機化学反応混合物のいずれかの他の成分から分離されることを意味する。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「哺乳動物」という用語は、げっ歯類（すなわち、マウス、ラット、またはモルモット）、サル、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、またはヒトを意味する。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織との接触での使用に好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を意味する。いくつかの実施形態では、「薬学的に許容される」は、動物、より具体的にはヒトでの使用のために、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書で使用する場合、「それを必要とする」という語句は、対象が特定の方法または処置を必要としていると同定されることを意味する。いくつかの実施形態では、同定は、任意の診断手段によるものであり得る。本明細書に記載の方法および処置のいずれかにおいて、対象はそれを必要とし得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、単離された場合、単離物が、単離物の重量で、本明細書に記載の化合物を少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％含むことを意味する。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、互換的に使用され、マウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、またはヒトなどの霊長類などの哺乳動物を含む、任意の動物を意味する。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「実質的に単離された」という語句は、化合物が形成または検出される環境から少なくとも部分的または実質的に分離されている化合物を意味する。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」という語句は、研究者、獣医、医師、または他の臨床医によって組織、系、動物、個体、またはヒトにおいて求められている生物学的または医学的応答を生じさせる活性化合物または医薬品の量を意味する。治療効果は、処置される障害または所望の生物学的効果に依存する。したがって、治療効果は、障害に関連する症状の重症度の低下および／もしくは障害の進行阻害（部分的もしくは完全）、または障害もしくは副作用効果の改善された処置、治癒、予防、もしくは排除であり得る。治療応答を生じさせるために必要な量は、対象の年齢、健康状態、サイズ、および性別に基づいて決定することができる。最適な量はまた、処置に対する対象の応答のモニタリングに基づいて決定することができる。
【００６７】
Ｂ．マーカー
いくつかの実施形態では、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するために、単独または様々な組み合わせのいずれかで使用するための１つ以上のマーカーが提供される。以下で詳細に説明するように、例示的な実施形態は、表２に提供されるマーカーを含む。
【表２】
2021516757.tif 000008
【００６８】
表２は、ファーバー病を有する対象から得られた試料を、ファーバー病を有していない対象由来の試料から区別するのに有用な１１個のマーカーを列挙している。
【００６９】
いくつかの実施形態では、表２の１つ以上のマーカーは、対象がファーバー病を有するか、または対象がファーバー病を有する可能性を決定するために、単独または様々な組み合わせで使用するために提供される。いくつかの実施形態では、表２の１つ以上のマーカーは、対象が酸性セラミダーゼ欠損症、脂肪肉芽腫症、および／またはセラミド誘発性慢性炎症状態を有するかどうかを決定するために有用である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、表２に列挙される１つ以上のマーカーは、ファーバー病を発症するリスクのある対象を同定するのに有用である。いくつかの実施形態では、表２に列挙される１つ以上のマーカーは、酸性セラミダーゼ欠乏症、脂肪肉芽腫症、および／またはセラミド誘発性慢性炎症状態のリスクがある対象を同定するのに有用である。いくつかの実施形態では、表２に列挙される１つ以上のマーカーは、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するために、単独または様々な組み合わせのいずれかで使用するために提供される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するために、単独または様々な組み合わせのいずれかで使用するためのマーカーの１つ以上のセットが提供される。以下で詳細に説明するように、例示的な実施形態は、表３に提供されるマーカーのセットを含む。マーカーのセットは、フローサイトメトリーアッセイでの表２に列挙される特定のマーカーを発現する集団を同定するためのゲーティング戦略を使用して同定された。
【表３】
2021516757.tif 000009
【００７２】
いくつかの実施形態では、方法は、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するために、対象由来の試料中の表３に列挙されたマーカーのうちの少なくとも１セットのレベルを検出することを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、方法は、対象がファーバー病を有するかどうかを決定することを含み、表３に列挙されたマーカーセット由来のＮセットのマーカーを有するマーカーパネルを形成することと、対象由来の試料中のパネルの各マーカーセットのレベルを検出することと、を含み、Ｎは少なくとも１である。いくつかの実施形態では、Ｎは少なくとも２であり、もしくはＮは少なくとも３であり、もしくはＮは少なくとも４であり、もしくはＮは少なくとも５であり、もしくはＮは５であり、もしくはＮは６であり、もしくはＮは７であり、もしくはＮは８であり、もしくはＮは９であり、またはＮは１０である。いくつかの実施形態では、方法は、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するために、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋、ＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄ、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋、およびＣＤ１９−ＣＤ３＋から選択されるマーカーのうちの少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０個のセットのレベルを検出することを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋のレベルを検出することを含み、対照レベルよりも高いＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００７５】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルを検出することを含み、対照レベルよりも高いＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００７６】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋のレベルを検出することを含み、対照レベルよりも高いＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００７７】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋のレベルを検出することを含み、対照レベルよりも低いＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００７８】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋のレベルを検出することを含み、対照レベルよりも高いＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００７９】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルを検出することを含み、対照レベルよりも高いＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００８０】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルを検出することを含み、対照レベルよりも低いＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００８１】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋およびＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルを検出することを含み、対照レベルよりも高いＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋および／またはＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋のレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００８２】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中のＣＤ１９＋ＣＤ３８＋およびＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルを検出することを含み、ＣＤ１９＋ＣＤ３８＋のレベルが対照レベルよりも高く、ＣＤ１９−ＣＤ３＋のレベルが対照レベルよりも高いことは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００８３】
本明細書で同定されたマーカーは、ファーバー病を有効に同定するために使用することができるマーカーのサブセットまたはパネルについてのいくつかの選択肢を提供する。本明細書で同定されたマーカーは、酸性セラミダーゼ欠乏症、脂肪肉芽腫症、および／またはセラミド誘発性慢性炎症状態を有効に同定するために使用することができるマーカーのサブセットまたはパネルについての多くの選択肢を提供する。適切な数のそのようなマーカーの選択は、選択されたマーカーの特定の組み合わせに依存してもよい。さらに、本明細書に記載される方法のいずれにおいても、明示的に示された場合を除き、マーカーのパネルは、表２または表３に示されていない追加のマーカーを含んでもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、方法は、対象がファーバー病を有するかどうかを決定するために、対象由来の試料中の表２に列挙された少なくとも１つのマーカーのレベルを検出することを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、方法は、対象由来の試料中の、表３に列挙されたマーカーのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のセットのレベルを検出することを含み、少なくとも１つのマーカーのレベルは、対象がファーバー病を有することを示す。
【００８６】
いくつかの実施形態では、マーカーは、酸性セラミダーゼ欠乏症を有さない個体と比較して、酸性セラミダーゼ欠乏症を有する個体において異なるレベルで存在する。いくつかの実施形態では、マーカーは、脂肪肉芽腫症を有さない個体と比較して、脂肪肉芽腫症を有する個体において異なるレベルで存在する。いくつかの実施形態では、マーカーは、セラミド誘発性慢性炎症状態を有さない個体と比較して、セラミド誘発慢性炎症状態を有する個体において異なるレベルで存在する。個体におけるマーカーの異なるレベルの検出は、例えば、個体がファーバー病を有するかどうかの決定を可能にするために使用することができる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、血液試料を用いる方法は非侵襲的であるので、ファーバー病の発症について個体をモニタリングするか、またはファーバー病もしくは酸性セラミダーゼ欠乏症を発症するリスクのある個体をモニタリングするために、本明細書に記載のマーカーのいずれかを使用してもよい。酸性セラミダーゼ欠乏症を早期に検出することにより、ｒｈＡＣによる処置などの医学的介入または処置がより有効であり得る。
【００８８】
さらに、いくつかの実施形態では、経時にわたる個体における１つ以上のマーカーの差次的発現レベルは、特定の治療レジメンに対する個体の応答を示し得る。したがって、本発明の一実施形態は、ファーバー病処置レジメンの有効性を決定する方法を含む。いくつかの実施形態では、追跡モニタリング中の１つ以上のマーカーの発現の変化は、特定の処置が有効であるか、または治療レジメンが調整されるべきであることを示し得る。１つ以上のマーカーの発現レベルは、処置レジメンを開始する前および／または処置レジメン中に決定してもよい。
【００８９】
マーカーレベルを独立した（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ）診断試験として試験することに加えて、マーカーレベルは、他のファーバー病スクリーニングまたは診断方法と組み合わせて行うこともできる。いくつかの例では、本明細書に記載するマーカーを使用する方法は、ファーバー病のより積極的な処置、より頻繁なフォローアップスクリーニングなどを実施するための医学的および経済的正当化を促進し得る。マーカーはまた、診断試験によって個体が疾患を発症する可能性があることが示唆されている場合、ファーバー病を発症するリスクがあるがファーバー病と診断されていない個体における処置を開始するために使用してもよい。他のファーバー病診断方法と組み合わせてマーカーレベルを試験することに加え、マーカーに関する情報は、他の種類のデータ、特にファーバー病についての個人のリスクを示すデータと組み合わせて評価することもできる。
【００９０】
Ｃ．マーカーの検出
本明細書に記載されるマーカーについてのマーカーレベルは、様々な既知の分析方法のいずれかを使用して検出することができる。一実施形態では、マーカーレベルは、捕捉試薬を使用して検出される。様々な実施形態では、捕捉試薬は、溶液中のマーカーに曝露することができ、または捕捉試薬が固体支持体上に固定化されている際にマーカーに曝露することができる。他の実施形態では、捕捉試薬は、固体支持体上の第２の特徴と反応する特徴を含む。捕捉試薬は、実施する分析の種類に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、捕捉試薬には、抗体、小分子、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ断片、リガンド結合受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、ならびにこれらの修飾物および断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、捕捉試薬には抗体が含まれる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、マーカーレベルは、生体試料中のマーカーから直接検出される。いくつかの実施形態では、マーカーは、生体試料中の２つ以上のマーカーの同時検出を可能にする多重化フォーマットを使用して検出される。
【００９２】
いくつかのそのような実施形態では、方法は、対象由来の試料または試料の一部を少なくとも１つの捕捉試薬と接触させることを含み、各捕捉試薬は、レベルが検出されるマーカーまたはマーカーのセットに特異的に結合する。
【００９３】
さらに、いくつかの実施形態では、生体試料は、多くの個体から生体試料を採取してそれらをプールすることによって、または各個体の生体試料のアリコートをプールすることによって得てもよい。プールされた試料は、単一の個体由来の試料について本明細書に記載のように処置してもよく、例えば、プールされた試料において予後不良が確立された場合、各個体の生体試料を再試験して、どの個体がファーバー病を有しているかを同定することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、マーカー／捕捉試薬複合体の成分を標識して、マーカーレベルの検出を可能にするために、蛍光タグを使用することができる。様々な実施形態では、既知の技術を使用して、蛍光標識を本明細書に記載のマーカーのいずれかに特異的な捕捉試薬に結合することができ、次いで、蛍光標識を使用して、対応するマーカーレベルを検出することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、蛍光標識は蛍光色素分子である。いくつかの実施形態では、蛍光色素分子には、インドリウム環の３炭素上の置換基が化学反応基または結合物質を含む、少なくとも１つの置換インドリウム環系が含まれる。いくつかの実施形態では、色素分子には、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００などのＡｌｅｘＦｌｕｏｒ色素分子（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれる。いくつかの実施形態では、色素分子には、例えばＢＶ４２１、ＢＶ５１０、ＢＶ６０５、ＢＶ６５０、またはＢＶ７１１などのＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）色素分子（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれる。いくつかの実施形態では、色素分子には、Ｃｙ５またはＣｙ７が含まれる。いくつかの実施形態では、色素分子には、例えば２つの異なるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ分子などの第１の種類および第２の種類の色素分子が含まれる。いくつかの実施形態では、色素分子は、第１の種類および第２の種類の色素分子を含み、２つの色素分子は、異なる発光スペクトルを有する。
【００９６】
蛍光は、幅広いアッセイフォーマットに適応する様々な機器を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマーカーのマーカーレベルは、一重（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）または多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）免疫アッセイ、組織学的／細胞学的方法などを含む分析方法を使用して検出することができる。免疫アッセイ方法は、対応する標的または分析物に対する抗体の反応に基づき、特定のアッセイ形式に応じて、試料中の分析物を検出することができる。免疫反応性に基づくアッセイ法の特異性および感度を改善するために、モノクローナル抗体およびその断片が、それらの特異的なエピトープ認識に起因してしばしば使用される。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して標的に対する親和性が高いことに起因して、様々な免疫アッセイでも成功裏に使用されている。免疫アッセイは、広範な生体試料マトリックスで使用できるように設計されている。免疫アッセイのフォーマットは、定性的、半定量的、および定量的な結果を提供するように設計されている。
【００９７】
フローサイトメトリー法をマーカーの検出のために使用してもよい。フローサイトメトリーを実施する方法は、当技術分野で既知である。一般に、細胞、好ましくは血液細胞が、抗体とともにインキュベートされる。好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体が蛍光マーカーで標識されていることがより好ましい。抗体が蛍光マーカーで標識されていない場合、二次抗体は、一次抗体と免疫反応性があり、蛍光マーカーを含む。過剰なまたは未結合の抗体が確実に除去されるように十分に洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー用に準備する。フローサイトメトリーは、試料の調製、取得、および分析の間の短いターンアラウンド時間を提供し、個々の細胞サブセット（非常にまれなサブセットを含む）の正確な列挙を可能にし、詳細な分子表現型のための機会を提供する。
【００９８】
Ｄ．キット
本明細書に記載されるマーカーの任意の組み合わせは、本明細書に開示される方法を実施する際に使用するためなどの好適なキットを使用して検出することができる。さらに、任意のキットは、蛍光部分などの、本明細書に記載の１つ以上の検出可能な標識を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、生体試料中の１つ以上のマーカーを検出するための１つ以上の捕捉試薬（例えば、少なくとも１つの抗体など）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、生体試料が得られた個体がファーバー病を有するかどうかを予測するための１つ以上のソフトウェアまたはコンピュータプログラム製品を任意選択で含む。あるいは、１つ以上のコンピュータプログラム製品ではなく、ヒトによって上記のステップを手動で実施するための１つ以上の指示を提供することができる。キットにはまた、デバイスおよび試薬の使用、試料の取り扱い、およびデータの分析に関する指示も含まれる。さらに、キットは、生体試料を分析し、その分析結果を報告するためのコンピューターシステムまたはソフトウェアとともに使用してもよい。キットはまた、生体試料を処理するための１つ以上の試薬（例えば、可溶化緩衝液、界面活性剤、洗浄液、または緩衝液）を含むことができる。本明細書に記載のキットのいずれも、例えば、緩衝液、遮断剤、抗体捕捉剤、陽性対照試料、陰性対照試料、ソフトウェア、ならびにプロトコル、指針、および参照データなどの情報を含むこともできる。
【００９９】
Ｅ．処置方法
いくつかの実施形態では、対象がファーバー病（または酸性セラミド欠乏症）を有すると決定された後、対象は、疾患の悪化を遅延または防止するための治療レジメンを受ける。いくつかの実施形態では、対象は、ｒｈＡＣなどの治療剤を与えられる。ｒｈＡＣでファーバー病を処置する例示的な方法は、２０１８年１月１２日に提出された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１３５０９号、およびＨｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｆａｒｂｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ，”ＢＢＡ  Ｃｌｉｎ．２０１７  Ｆｅｂ  １３；７：８５−９６（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）に記載され、これらは参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ファーバー病をモニタリングする方法が提供される。疾患状態および治療の有効性をモニタリングするために、当業者に既知の任意の方法を使用してもよい。疾患状態の臨床モニターには、セラミドレベル、体重、関節の長さ、炎症、またはファーバー病に関連することが既知である他の臨床表現型が含まれてもよいが、これらに限定されない。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、対象がファーバー病を有するかどうかを決定する本方法は、時間０に実施される。いくつかの実施形態では、方法は、対象における疾患の進行をモニタリングするために、時間１、および任意選択で時間２、および任意選択で時間３などに再度実施される。いくつかの実施形態では、個体の疾患の現在の状態に応じて、および／または疾患が進行すると考えられるもしくは予測される速度に応じて、異なるマーカーが異なる時点で使用される。
【０１０２】
本明細書で使用される、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置された（ｔｒｅａｔｅｄ）」、または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、目的が望ましくない生理学的状態、障害、もしくは疾患を抑制する（軽減する）か、または有益もしくは所望の臨床的結果を得ることである、治療的処置および予防的手段の両方を意味する。例えば、有益なまたは所望の臨床結果には、症状の緩和；状態、障害、もしくは疾患の程度の減少；状態、障害、もしくは疾患状態の安定（すなわち悪化していない）状態；状態、障害、もしくは疾患の進行の開始遅延または減速；検出可能かもしくは検出不能かに関わらず、状態、障害、もしくは疾患状態の緩和、または寛解（部分的または全体的のいずれでも）；必ずしも患者が認識できるとは限らない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善；あるいは状態、障害、もしくは疾患の改善増強または改善が含まれるが、これに限定されない。したがって、「ファーバー病の処置」または「ファーバー病を処置すること」は、ファーバー病または本明細書に記載の他の状態に関連する一次事象または二次症状のいずれかを緩和または改善する活動を意味する。
【０１０３】
さらに、明確にするために別々の実施形態の文脈で記載されている本明細書で記載の特定の特徴は、組み合わせて単一の実施形態で提供することもできることを理解されたい。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている様々な特徴は、別々に、または任意の好適なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１０４】
本明細書には様々な医薬組成物が記載されており、患者および医師の好みに基づいて使用することができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、医薬組成物は溶液である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ｒｈＡＣを含む細胞馴化培地を含む。本明細書で使用する場合、「細胞馴化培地」という用語は、ｒｈＡＣを発現する細胞を培養するために使用される細胞培養培地を指し、タンパク質が培地に分泌され、次いでタンパク質が培地から単離または精製される。いくつかの実施形態では、対象を処置するために、溶媒が使用される。溶媒は、例えば、本明細書に記載の状態、症状、または障害のいずれかを処置するために対象の皮膚に適用することができる。
【０１０５】
本明細書に記載の投与経路に添加して、いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象の皮膚に接触させることにより投与される。いくつかの実施形態では、投与は、非経口投与である。いくつかの実施形態では、投与は、医薬組成物を対象に注射することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、腹腔内注射または静脈内注射である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ファーバー病の処置を必要とする対象においてファーバー病を処置する方法が提供され、該方法は、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）を細胞中で発現させること、発現したｒｈＡＣを細胞から単離すること、および約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの有効量の単離された発現ｒｈＡＣを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）を細胞中で発現させることは、ｒｈＡＣをコードするベクターを細胞に移入することを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｒｈＡＣをコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載の分子、または本明細書により詳細に記載のｒｈＡＣポリペプチドもしくはそのホモログをコードする任意の他の核酸分子である。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。例えば、ベクターは、レトロウイルスベクター、またはアデノウイルス、ＡＡＶなどのＤＮＡウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｒｈＡＣに作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、もしくはそれらの任意の組み合わせ、または哺乳動物細胞において活性である任意の他のプロモーターである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞にトランスフェクトするかまたは感染させる。ベクターを細胞に導入する方法は重要ではなく、細胞中でｒｈＡＣポリペプチドを十分に発現させるために任意の方法を使用することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞ではない。いくつかの実施形態では、細胞はハムスター細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、無血清または実質的に無血清環境で増殖させることができる。いくつかの実施形態では、細胞はＣＨＯ−Ｋ１細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はマウス骨髄腫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＮＳ０細胞である。いくつかの実施形態では、投与される有効量は、本明細書の上記および下記に記載される通りである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のように投与される。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、対象に、経口的に、吸入により、鼻腔内注入により、局所に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内注射により、動脈内注射により、筋肉内注射により、胸腔内に、腹腔内に、髄腔内に、または粘膜への適用により投与される。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、「ｒｈＡＣ」という用語は、組換えヒト酸性セラミダーゼを指す。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、配列番号１のホモログであるタンパク質であるタンパク質である。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、配列番号２の核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、配列番号３の核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは、配列番号４の核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７７９２４．３またはＮＭ＿１７７９２４．４で定義される通りであり、それらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、または配列番号４に示される完全な配列であるか、または単に配列のコード領域であり得る。コード領域は、例えば、配列番号２のヌクレオチド３１３〜１５００、または配列番号３もしくは配列番号４に見出される対応するコード領域であり得る。しかしながら、当業者に周知のように、遺伝暗号は縮重し、したがって、開示されているものの範囲外になることなく、他のコドンを使用して同じタンパク質をコードすることができる。アミノ酸配列は既知であるため、アミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列が許容される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列はシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２のヌクレオチド３１３〜３７５によってコードされるアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、生成されるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基１〜２１のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、生成されるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基１〜２１のシグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、酵素が異なるサブユニットにプロセシングされる翻訳後プロセシング中に除去される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、タンパク質が発現される細胞に対して最適化されたコドンである。いくつかの実施形態では、タンパク質は、αサブユニット、βサブユニットなどを含む。いくつかの実施形態では、生成されるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１４２、４５〜１３９、１３４〜３７９、１４３〜３９５、または１〜３９５のペプチドを含む。ペプチドは、単一のタンパク質または酵素を形成するための異なる配列のポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質はアミノ酸残基１〜２１を含まない。これらの領域は、単一のヌクレオチド配列もしくは別々のヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の組み合わせによってコードされ得る。本明細書で論じるように、タンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を使用することができ、配列番号２、配列番号３、または配列番号４として本明細書に記載されている配列に限定されない。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣは酸性セラミダーゼ（ＡＣ）活性を有するが、検出可能な酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を有さない。酸性スフィンゴミエリナーゼ活性は、例えば、熱不活化により除去してもよい。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／００３８５７４号を参照のこと。熱不活化により、ｒｈＡＣ調製物から他の汚染タンパク質が除去されてもよい。
【０１１４】
「ホモログ」という用語は、参照配列に対して８０％〜１００％の配列同一性を有するタンパク質配列を指す。２つのペプチド鎖間の同一性パーセントは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．９．０．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，カールスバッド、カリフォルニア州）のＡｌｉｇｎＸモジュールのデフォルト設定を使用したペアワイズアラインメント（ｐａｉｒ  ｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によって決定することができる。いくつかの実施形態では、ホモログは、本明細書に記載の配列、例えば、配列番号１と、少なくとも８０、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％、または約８０、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、対象に送達されるタンパク質は、本明細書に記載の配列と比較して保存的置換。表４に示される非限定的な例示的保存的置換は、開示された主題の範囲内に含まれる。酵素の機能、例えば安定性または酵素活性を改善するために、置換してもよい。保存的置換により、そのような修飾がなされる分子と同様の機能的および化学的特徴を有する分子が生成される。例示的なアミノ酸置換を以下の表４に示す。
【０１１５】
【表４】
2021516757.tif 000010
【０１１６】
本明細書で使用する場合、「不活性酸性セラミダーゼ」、「不活性ＡＣ」、または「不活性酸性セラミダーゼ前駆体」、「不活性ＡＣ前駆体」、または（ＡＣプレタンパク質）は、活性型への自己タンパク質分解切断を受けていないＡＣ前駆体タンパク質を指す。本発明のこの態様および全ての態様の組換え酸性セラミダーゼでの使用に好適な不活性ＡＣ前駆体および活性ＡＣは、組織、細胞、および／または処置される対象に対して同種（すなわち、同じ種に由来する）または異種（すなわち、異なる種に由来する）であり得る。酸性セラミダーゼ（例えばＡＣ）前駆体タンパク質は、自己タンパク質分解により切断されて活性型（αサブユニットおよびβサブユニットからなる）となる。ヒトＡＣ切断および活性化のメカニズムは、（Ｓｈｔｒａｉｚｅｎｔ，２００８）で報告されている。活性化は、細胞内環境によっても促進され、種にわたってセラミダーゼ前駆体タンパク質の切断部位における高度に保存された配列に基づき、全てではないにしても、ほとんどの細胞型で発生すると予想される。したがって、本明細書で使用されるセラミダーゼは、活性セラミダーゼおよびセラミダーゼ前駆体タンパク質の両方を含み、セラミダーゼ前駆体タンパク質は、自己タンパク質分解切断によって活性セラミダーゼタンパク質に変換される。前駆体タンパク質が目的の細胞によって取り込まれ、それによって活性セラミダーゼに変換される実施形態、および前駆体タンパク質が異なる細胞または作用物質（例えば、培養物中に存在する）によって活性セラミダーゼに変換される実施形態の両方が企図される。
【０１１７】
本発明のこの態様および全ての態様で使用することができる活性ＡＣおよび不活性ＡＣ前駆体タンパク質には、ＵＳ  ２０１６／００３８５７４の表１に記載されているものが含まれるが、それらに限定されず、その内容は参照により全体が本明細書に組み入れられる。
【表５】
2021516757.tif 000011
【０１１８】
本発明のこの態様および全ての態様において使用することができる活性ＡＣおよび不活性ＡＣ前駆体タンパク質には、限定するものではないが、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／００３８５７４Ａ１号として公開された、Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．（発明者）Ｉｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ（出願人），２０１６年２月１１日，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｈｅｍの表１に記載されているものが含まれる。
【０１１９】
一実施形態では、活性化形態の組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）が、ファーバー病の処置のために利用される。活性化ｒｈＡＣのαおよびβサブユニットは、ジスルフィド結合によって結合される。この分子は、ｒｈＡＣを発現するＤＮＡプラスミドベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍ細胞に由来する組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）である。一実施形態では、ｒｈＡＣは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢコード：Ｑ１３５１０に基づく。
【０１２０】
一実施形態では、組換えにより生成された酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）は、組換えにより生成された酸性セラミダーゼを、ｉ）陽イオン交換クロマトグラフィー、ｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、およびｉｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィーから選択される少なくとも２つのクロマトグラフィー工程に供する工程、および溶液中の組換えにより生成された酸性セラミダーゼを１つ以上のウイルス不活化工程に供する工程であって、ｒｈＡＣ溶液が３．７以下のｐＨに設定される、工程を含むプロセスにより、少なくとも９５％活性化形態の純度に精製される。一実施形態では、ｒｈＡＣのタンパク質配列は、配列番号１に対応する。
【０１２１】
一実施形態では、ｒｈＡＣの精製は、２０１８年９月２４日に出願されたＰＣＴ／２０１８／０５２４６３に開示されるプロセスに従って実施してもよく、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。ＲＶＴ−８０１ｒｈＡＣの治療効果は、重度のファーバー病のマウスモデルで確立されており（Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ，２０１７）、複数の研究で特徴付けられ、評価項目では、セラミドの蓄積の減少を伴う組織病理学的および免疫学的転帰に対するプラスの影響が記述されている。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、精製された、組換えにより生成された酸性セラミダーゼは、少なくとも９０％、９３％、９５％、９８％、もしくは９９％の純度、または１００％の純度を有する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、精製された、組換えにより生成された酸性セラミダーゼは、検出可能な酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を有さない。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、組換えにより生成された酸性セラミダーゼの酸性スフィンゴミエリナーゼ活性は、熱を使用せずに除去される。
【０１２５】
本明細書で使用される「と組み合わせて」という用語は、記載された薬剤を、単一の薬剤として同時に、または任意の順序で単一の薬剤として逐次、混合物中で一緒に対象に投与することができることを意味する。本明細書で使用される「と組み合わせて」という用語は、記載された薬剤を、単一の薬剤として同時に、または任意の順序で単一の薬剤として逐次、混合物中で一緒に対象に投与することができることを意味する。
【０１２６】
本明細書に記載のように、いくつかの実施形態では、タンパク質は細胞から生成される。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である「ＣＨＯ細胞」である。本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸配列は、本明細書に記載のタンパク質の少なくとも１つをコードするゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。ｃＤＮＡの使用は、所望のタンパク質の合成を達成するために、宿主細胞に適切な遺伝子発現要素が遺伝子と組み合わされることを必要とする。ｃＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡスプライシングシステムを欠く細菌中または他の宿主中で発現され得るという点で、ｃＤＮＡ配列の使用はゲノム配列（イントロンを含む）よりも有利であり得る。当業者は、タンパク質を発現するための最良のシステムを決定することができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、その全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／００３８５７４号に従って生成される。
【０１２８】
遺伝暗号は縮重するため、特定のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンを使用することができる。遺伝暗号を使用して、１つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを同定することができ、それらの各々は、本明細書に記載のアミノ酸配列をコードすることができるであろう。
【０１２９】
ファーバー病またはそれに関連する状態を処置するために対象に投与される酵素は、精製し得る。タンパク質に関して「精製された」という用語は、その自然環境において分子と結合する他の物質を実質的に含まないタンパク質を指す。例えば、精製されたタンパク質は、該タンパク質が由来する細胞または組織由来の細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、単離されたタンパク質が分析するのに十分な純度であるか、または少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）の純度、少なくとも８０％〜９０％（ｗ／ｗ）の純度、９０〜９５％の純度、および少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（ｗ／ｗ）の純度の調製物を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、限定するものではないがＣＨＯ細胞などの細胞から精製される。
【０１３０】
タンパク質を含む投与、組成物、およびキット
いくつかの実施形態では、方法は、治療または予防有効量の、本明細書に記載の１つ以上のタンパク質をファーバー病を有する患者またはファーバー病を有する疑いのある対象に投与することを含む。
【０１３１】
対象の処置は、治療有効量の本明細書に記載のタンパク質の投与を含んでもよい。
【０１３２】
タンパク質は、本明細書に記載のキットで提供され得る。
【０１３３】
タンパク質は、単独で、または追加の治療剤と混合して使用または投与することができる。追加の治療剤の例には、酸性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤（例えば、アミトリプチリン（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｃｉｄ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，”Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２：７１６−７２４（２０１０）、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）およびセラミドシンターゼの阻害剤（例えば、Ｓｈｉｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ，”Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，９４：５５８−５６５（２０１２）、これは参照により全体が本明細書に組み込まれる））が含まれる。追加の治療剤は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１６／００３８５７４号に記載のセラミダーゼ混合物であり得る。
【０１３４】
セラミド蓄積の減少が実証されたファーバー病の本研究で示されるように、酵素補充療法（ＥＲＴ）は効果的であり得るが、薬物、すなわち、効力を低下し得る補充酵素に対する抗体が生じ得る。ここで、本発明者らは、反復投与は忍容性が良好であることを示し、これは、疾患の症状の軽減をもたらす、補充酵素、特に本明細書および例えば米国特許出願公開第２０１６／００３８５７４号に記載の方法に従って生成される酵素を反復投与する処置レジメンを支持する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ファーバー病の処置を必要とする対象においてファーバー病を処置する方法は、約１週間に１回間、２週間、３週間、もしくは４週に１回、または１ヶ月、約１０週間、約２０週間、もしくは約３０週間、１年間、５年間、１０年間、または２５年間、もしくは患者の生存期間中に１回の、有効量の組換えヒト酸性セラミダーゼを含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１３６】
好適なビヒクルおよびそれらの製剤化およびパッケージングは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ４０  ａｎｄ  ４１）に記載されている：作用の持続時間を制御するために、追加の薬学的方法を使用してもよい。制御放出製剤は、化合物を錯化または吸収するためのポリマーの使用により達成してもよい。制御放出製剤によって作用の持続時間を制御する別の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどのポリマー材料の粒子に、化合物を組み込むことである。あるいは、これらの薬剤をポリマー粒子に組み込む代わりに、これらの物質を、例えば界面重合で調製されたマイクロカプセル中に、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入し、またはコロイド状薬剤送達システム中に、例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル、またはマクロエマルション中に封入することがきる。
【０１３７】
例示的な送達デバイスには、ネブライザー、アトマイザー、リポソーム（能動的および受動的薬物送達技術の両方を含む）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１−５）；Ｂａｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５，Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｉｖａｌｅｎｔ  ｉｏｎｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｌａｍｅｌｌａｅ  ｏｆ  ｓｗｏｌｌｅｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−５２；Ｈｓｕ  Ｃ．Ｃ．（発明者），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（譲受人），１９９７年８月５日，Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｕ．Ｓ．特許第５，６５３，９９６号として公開；Ｌｅｅ，Ｋ．−Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（ｉｎｖｅｎｔｏｒｓ），Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌｏｗｓ  ｏｆ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｕ．Ｓ．特許第５，６４３，５９９号として公開；Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｊ．Ｗ．（発明者），Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｂｉｌａｙｅｒ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｕ．Ｓ．特許第５，８８５，６１３号として公開；Ｄｚａｕ，Ｖ．Ｊ，ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ，Ｙａｓｕｆｕｍｉ（発明者），Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｖｉａ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ａｓ  Ｕ．Ｓ．特許第５，６３１，２３７号として公開；およびＬｏｕｇｈｒｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（発明者），Ｔｈｅ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ａｓｓｉｇｎｅｅ），Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．特許第５，０５９，４２１号として公開；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｔｈｙ１  ＩｇＧ１  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｔｏ  ＡＫＲ−Ａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８０２：２５９−７３）、経皮パッチ、移植、移植可能または注射可能なタンパク質デポー組成物、およびシリンジが含まれるが、これらに限定されない。当業者に既知の他の送達システムもまた、所望の器官、組織、または細胞へのセラミダーゼの送達を達成するために使用することができる。
【０１３８】
一般に、全身用量のタンパク質を投与する場合、約１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜１μｋｇ、１μｋｇ／ｋｇ〜１００μｋｇ／ｋｇ、１００μｋｇ／ｋｇ〜５００μｋｇ／ｋｇ、５００μｋｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（レシピエントの体重）の範囲であるタンパク質投与量をレシピエントに提供することが望ましいが、より低いまたはより高い投与量を投与してもよい。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、投与されるｒｈＡＣの有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ファーバー病と診断された対象に、２週間ごとに、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＣまたは約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＣを投与する。一実施形態では、投与量は、４週目に１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇに増加させる。投与レベルが個々の対象によって忍容されない場合、その対象についての用量は、必要に応じて、２ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇに減らすか、または５ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇに減らしてもよい。ｒｈＡＣは、少なくとも１０、２０、もしくは３０週間または対象の生存期間中、２週間ごとに投与してもよい。例示的な一実施形態では、対象はファーバー病と診断され、以下を有するとして同定される：１）皮下結節、および／もしくは２）対照値の３０％未満である、白血球、培養皮膚線維芽細胞、または他の生物学的供給源（例えば、血漿）の酸性セラミダーゼ活性値、ならびに／または３）バイオインフォマティクス、遺伝子発現研究、および／または他の方法により、酸性セラミダーゼタンパク質の機能喪失の可能性を示す、酸性セラミダーゼ遺伝子（ＡＳＡＨ１）の両方の対立遺伝子内のヌクレオチド変化。いくつかの実施形態では、対象に、２週間ごとに２８週間、ｒｈＡＣを投与する。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣの送達は、静脈内注入（例えば、生理食塩水注入）による。いくつかの実施形態では、約２ｍｇ／ｋｇで開始し、約５ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＣに増加させる（例えば、４週目で５ｍｇ／ｋｇに増加させる）。
【０１４１】
追加の実施形態では、処置を必要とする対象におけるファーバー病に関連する炎症を処置する方法が開示され、該方法は、例えば、週に１回、２週毎に１回、または月に１回の反復投与で、少なくとも１０週間、もしくは少なくとも２０週間、２８週間、または対象の生存期間中、約１ｍｇ〜約５ｍｇ／ｋｇまたは約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの有効量の組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内注入による。一実施形態では、ファーバー病の処置を必要とする対象においてファーバー病を処置する方法は、例えば、週に１回、２週毎に１回、または月に１回の反復投与で、少なくとも１０週間もしくは２０週間、２８週間、または対象の生存期間中、約１ｍｇ〜約５ｍｇ／ｋｇまたは約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの有効量の組換えヒト酸性セラミダーゼ（ｒｈＡＣ）を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１４２】
投与量は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、または月に１回投与され得る。いくつかの実施形態では、用量は週に１回投与される。処置はまた、単回投与スケジュールで与えられてもよいし、または処置の主な経過が、１〜１０回の別々の投与を伴い、続いて、応答を維持および／または増強するために必要な後続の時間間隔で他の投与が与えられ、例えば、２回目の投与については週に１回、１〜４ヶ月間であり、必要に応じて数ヶ月後にその後の投与とする、複数回投与スケジュールで与えられてもよい。好適な処置スケジュールの例には、（ｉ）０、１ヶ月、および６ヶ月、（ｉｉ）０、７日、および１ヶ月、（ｉｉｉ）０、および１ヶ月、（ｉｖ）０および６ヶ月、または疾患の症状を軽減するか、もしくは疾患の重症度を軽減することが期待される所望の応答を生じさせるのに十分な他のスケジュールが含まれる。上記に記載されたものなどであるがこれらに限定されない他の処置スケジュールも使用することができる。
【０１４３】
本開示の特定の態様では、処置は、対象が新生児の場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０歳未満で、または１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜２５、１〜５０、１〜６０、１〜７０、もしくは１〜８０歳（例えば、１〜２、１〜３など）で開始される。いくつかの実施形態では、対象は１６〜６１歳である。いくつかの実施形態では、対象は１６歳で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は１２〜６９歳である。いくつかの実施形態では、対象は１２歳で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は１９〜７４歳である。いくつかの実施形態では、対象は１９歳で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は４〜６２歳である。いくつかの実施形態では、対象は４歳で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は７〜４２歳である。いくつかの実施形態では、対象は７歳で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は１〜６ヶ月である。いくつかの実施形態では、対象は生まれたばかりの時点で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は６〜４３歳である。いくつかの実施形態では、対象は６歳で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は５〜３１歳である。いくつかの実施形態では、対象は５歳で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は５〜５７歳である。いくつかの実施形態では、対象は５〜２９歳である。いくつかの実施形態では、対象は１〜３歳である。いくつかの実施形態では、対象は１歳で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は１０〜７０歳である。いくつかの実施形態では、対象は１０歳で処置を開始する。いくつかの実施形態では、対象は、５〜８０歳、１０〜７０歳、２０〜７５歳、５〜６０歳、または５〜３０歳である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ファーバー病と診断された対象に、２週間ごとに、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＣまたは約２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＣを投与する。一実施形態では、投与量は、４週目に１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇに増加させる。投与レベルが個々の対象によって忍容されない場合、その対象についての用量は、必要に応じて、２ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇに減らすか、または５ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇに減らしてもよい。ｒｈＡＣは、少なくとも１０、２０、もしくは３０週間または対象の生存期間中、２週間ごとに投与してもよい。一実施形態では、対象はファーバー病と診断され、以下を有するとして同定される：１）皮下結節、および／もしくは２）対照値の３０％未満である、白血球、培養皮膚線維芽細胞、または他の生物学的供給源（例えば、血漿）の酸性セラミダーゼ活性値、ならびに／または３）バイオインフォマティクス、遺伝子発現研究、および／または他の方法により、酸性セラミダーゼタンパク質の機能喪失の可能性を示す、酸性セラミダーゼ遺伝子（ＡＳＡＨ１）の両方の対立遺伝子内のヌクレオチド変化。いくつかの実施形態では、対象に、２週間ごとに２８週間、ｒｈＡＣを投与する。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＣの送達は、静脈内注入（例えば、生理食塩水注入）による。いくつかの実施形態では、約２ｍｇ／ｋｇで開始し、約５ｍｇ／ｋｇのｒｈＡＣに増加させる（例えば、４週目で５ｍｇ／ｋｇに増加させる）。
例えば、部位特異的投与は、関節内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、脳内、脳室内、結腸内、子宮頸内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸腔内（ｉｎｔｒａｐｌｅｕｒａｌ）、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内（ｉｎｔｒａｔｈｏｒａｃｉｃ）、子宮内、膀胱内、病変内、膣内、直腸、経口、口腔内、舌下、鼻腔内、または経皮の手段などの体のコンパートメントまたは腔に対するものであってもよい。
【０１４５】
本明細書に記載の治療用組成物は、非経口（皮下、筋肉内、もしくは静脈内）、または特に液体溶液もしくは懸濁液の形態での任意の他の投与の使用のために調製することができる。製剤はまた、注射可能な製剤に好適であり得る。いくつかの実施形態では、注射可能な製剤は無菌である。いくつかの実施形態では、注射可能な製剤は発熱物質を含まない。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載の抗原以外の他の抗原に結合する他の抗体を含まない。
【０１４６】
治療用組成物はまた、薬学的に許容される補助剤、賦形剤、および／または安定剤を含んでもよく、錠剤、カプセル剤、粉剤、溶剤、懸濁剤、または乳剤などの固体または液体形態であり得る。このような追加の薬学的に許容される成分は、様々な酵素補充療法組成物において使用されており、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ポリソルベート、塩化ナトリウム、ヒスチジン、スクロース、トレハロース、グリシン、および／または注射用水を含むが、限定されない。いくつかの実施形態では、塩は、水和物（例えば、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸一水和物、リン酸一ナトリウム一水和物、および／またはリン酸二ナトリウム七水和物）である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のように投与される。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、対象に、経口的に、吸入により、鼻腔内注入により、局所に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内注射により、動脈内注射により、筋肉内注射により、胸腔内に、腹腔内に、髄腔内に、または粘膜への適用により投与される。
【０１４８】
本明細書に記載の治療用組成物は、非経口（皮下、筋肉内、もしくは静脈内）、または特に液体溶液もしくは懸濁液の形態での任意の他の投与の使用のために調製することができる。製剤はまた、注射可能な製剤に好適であり得る。いくつかの実施形態では、注射可能な製剤は無菌である。いくつかの実施形態では、注射可能な製剤は発熱物質を含まない。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載の抗原以外の他の抗原に結合する他の抗体を含まない。
【０１４９】
ファーバー病もしくはｒｈＡＣ活性に関連する他の状態を処置することができるｒｈＡＣのタンパク質またはｒｈＡＣに関連する病状を処置するための使用は、関連する症状または病状の軽減、解消、または改善に影響を与えるのに十分な量で対象に提供されることを意図している。そのような病状には、対象における本明細書に記載のファーバー病の症状が含まれる。薬剤の投与量、投与経路、および投与スケジュールがそのような応答に影響を与えるのに十分である場合、量は、症状の軽減に「影響を与える」のに十分または「治療有効量」であると言う。タンパク質に対する応答は、画像化技術または組織試料のエクスビボ分析などによる、対象の影響を受けた組織、臓器、または細胞の分析によって測定することができる。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理機能に検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に重要である。いくつかの実施形態では、量は、対象が受けるファーバー病の症状を処置、改善、または抑制するために使用することができる量である場合、治療有効量である。そのような量の非限定的な例が本明細書に提供されているが、文脈が別の量を指示す場合、そのような量に限定されることは意図されていない。
【０１５０】
タンパク質は、薬学的に有用な組成物を調製するために既知の方法に従って製剤化することができ、それにより、これらの材料またはそれらの機能的誘導体は、薬学的に許容される担体ビヒクルと混合して組み合わされる。
【０１５１】
ファーバー病もしくはｒｈＡＣ活性に関連する他の状態を処置することができるｒｈＡＣのタンパク質またはｒｈＡＣに関連する病状を処置するための使用は、関連する症状または病状の軽減、解消、または改善に影響を与えるのに十分な量で対象に提供されることを意図している。そのような病状には、対象における本明細書に記載のファーバー病の症状が含まれる。薬剤の投与量、投与経路、および投与スケジュールがそのような応答に影響を与えるのに十分である場合、量は、症状の軽減に「影響を与える」のに十分または「治療有効量」であると言う。タンパク質に対する応答は、画像化技術または組織試料のエクスビボ分析などによる、対象の影響を受けた組織、臓器、または細胞の分析によって測定することができる。薬剤は、その存在がレシピエント患者の生理機能に検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に重要である。いくつかの実施形態では、量は、対象が受けるファーバー病の症状を処置、改善、または抑制するために使用することができる量である場合、治療有効量である。そのような量の非限定的な例が本明細書に提供されているが、文脈が別の量を指示す場合、そのような量に限定されることは意図されていない。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、処置の有効性は、以下の手段のいずれかによって評価される：
●ｒｈＡＣによる２８週間の処置後の正味結節（≧５ｍｍ）数のベースラインからの変化率。
●正味結節（≧１０ｍｍ）数のベースラインからの変化率およびｒｈＡＣによる２８週間の処置後のプラセボとの比較。
●結節の総数（サイズに関係なく）のベースラインからの変化率、およびｒｈＡＣによる２８週間の処置後のプラセボとの比較。
●選択した関節の関節可動域のベースラインからの変化および変化率、ならびにｒｈＡＣによる２８週間の処置後のプラセボとの比較。
●６分間の歩行距離のベースラインからの変化および変化率、ならびにｒｈＡＣによる２８週間の処置後のプラセボとの比較。
●肺機能検査のベースラインからの変化および変化率、ならびにｒｈＡＣによる２８週間の処置後のプラセボとの比較。
●ＦＤＴスコアのベースラインからの変化および変化率、ならびにｒｈＡＣによる２８週間の処置後のプラセボとの比較。
●２８週間にわたるｒｈＡＣまたはプラセボによる処置中の年齢に対する体重および身長のＺスコアのベースラインからの変化および変化率。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ファーバーマウスまたは健康なマウスに異なる用量で投与した後のＲＶＴ−８０１の薬物動態は、非コンパートメント法に基づいて評価される。非コンパートメント薬物動態法は、特に、当該技術分野で既知の以下の測定基準を用いて、濃度−時間グラフの曲線下の面積を推定することにより、薬物への曝露を推定する。
【表６】
2021516757.tif 000012
【０１５４】
いくつかの実施形態では、処置の組織特異的有効性は、上記の非コンパートメント薬物動態法に基づいてＲＶＴ−８０１の組織特異的薬物動態を決定することによって評価される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ファーバー病マウスの有効用量に対応するＲＶＴ−８０１のヒト等価用量（ＨＥＤ）が推定される。本明細書でのＨＥＤの非臨床評価は２つの方法に基づく：１）体表面積（ＢＳＡ）による非臨床種およびヒトの間のスケール調整に関するＦＤＡガイダンス、および２）セラミド蓄積の主要組織としてのおよびＲＶＴ−８０１の取り込みが優勢な肝臓および脾臓についての種間の臓器：体重比。
【０１５６】
体表面積によるスケール調整：ファーバーマウスＭＥＤ（最大有効用量）に対するベンチマークであり、ヒト成人または小児のＢＳＡおよび体重に基づく、ＨＥＤ（ここで、ＨＥＤ＝動物の用量＊（動物の体重／ヒト体重）０．３３は、６０ｋｇの成人では約０．８１ｍｇ／ｋｇ、および１５ｋｇの小児では約１．２ｍｇ／ｋｇの用量であることを示す。
【０１５７】
臓器：体重比によるスケール調整：ＰＫ研究により、血管系からのクリアランスメカニズムが組織への取り込みおよび／または分布に関連していることが示されたため、組織重量対体重比が用量に影響を及ぼし、ＢＳＡモデルは、それ自体では十分に予測できない場合がある。ＨＥＤ＝ＭＥＤ＊（組織ヒト／ＢＷヒト）／（組織マウス／ＢＷマウス）を使用すると、マウスでの１０ｍｇ／ｋｇ用量は、ヒト成人および小児の肝臓および脾臓に基づき、ヒト成人での約３〜５ｍｇ／ｋｇの用量に相当し、または１５ｋｇの小児では４〜５ｍｇ／ｋｇの用量に相当する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＨＥＤは、上記の２つのスケール調整手法を組み合わせることによって決定してもよい。
【０１５９】
本明細書に記載の実施形態を実施するのに有用である、本明細書および以下に記載されるキットも提供される。いくつかの実施形態では、キットは、上記のポリペプチドを含むか、または該ポリペプチドに関連してパッケージ化された、第１の容器を含む。キットはまた、実施形態を実施するのに必要または便利な関連溶液を含むか、または該関連溶液に関連してパッケージ化された、別の容器を含んでもよい。容器はガラス、プラスチック、またはホイルで作ることができ、バイアル、ボトル、ポーチ、チューブ、バッグなどとすることができる。キットはまた、実施形態を実施するための手順などの書面の情報、または第１の容器手段に含まれる試薬量などの分析情報を含んでもよい。容器は、書面の情報と一緒に、別の容器装置、例えば箱または袋に入っていてもよい。
【０１６０】
本明細書で提供されるさらに別の態様は、ファーバー病を処置するためのキットである。いくつかの実施形態では、キットは、ｒｈＡＣポリペプチドまたはこれをコードする核酸分子を含む少なくとも１つの容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ｒｈＡＣを発現するように構成された細胞を含む容器を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、キットは、ｒｈＡＣを発現する細胞由来の馴化培地を含む。いくつかの実施形態では、馴化培地は、ＣＨＯ細胞に由来する。
【０１６１】
次に、以下の実施例を参照して主題を説明する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、特許請求の範囲は、これらの実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、本明細書で提供される教示の結果として明らかとなる全ての変形を包含すると解釈されるべきである。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすために変更または修正され得る様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０１６２】
実施例１
材料および方法
動物の選択および試料の収集
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７に従って、ファーバーマウス（Ａｓａｈ１Ｐ３６１Ｒ／Ｐ３６１Ｒ）およびほぼ同齢の野生型ＣＤ−１マウス（Ａｓａｈ１Ｐ３６１Ｒ／Ｐ３６１Ｒの親系統）を養った。
【０１６３】
フローサイトメトリーによる特徴付けのために、全血、肝臓、肺、および脾臓を４〜８週齢の同齢のファーバーおよび野生型マウス（ｎ＝３）から収集した。
【０１６４】
血液試料を、心臓穿刺または他の承認された手段によって群ごとにすべての動物から収集し、各マウスから最大量の血液試料を生成した。血液試料を個々のリチウムヘパリンバイアル中に収集し、穏やかに数回反転させて抗凝固剤を分散させた。血液試料を２つの等しいアリコートに分けた。その後の脂質プロファイリングのために、１つ目のアリコートを凍結した。２つ目のアリコートを適切に標識したポリスチレンチューブに入れ、フローサイトメトリー処理まで氷上に置いた。
【０１６５】
最終血液試料の収集直後の剖検時に、組織を収集した。完全で無傷の肝臓、脾臓、および肺を、１群あたり最大３匹の動物から収集した。各組織を取り出し、穏やかに吸い取って乾かした。各組織を個々の事前に標識したバイアルに入れ、これを組織収集の前に（キャップ付きで）ひと纏めとした。組織を含むキャップ付きバイアルの質量を測定した。緩衝液、保存料、または抗生物質を組織に添加しなかった。組織質量（すなわち、試料＋バイアルの質量−バイアルの質量）を報告した。組織を凍結する前に、フローサイトメトリーによる分析のために指定された肝臓、脾臓、および肺の一部（約０．０２５ｇ）を取り出し、３〜５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ）を含む適切なサイズのポリスチレンペトリ皿に入れた。探索的評価項目のために単一細胞懸濁液に処理されるまで、試料を含むペトリ皿を氷上で保存した。フローサイトメトリーに使用した質量を記録した。各小片の質量決定の直後に、脂質分析を目的としたすべての組織試料を−７０℃で凍結保存し、その後、生物分析ラボに発送した。
【０１６６】
単一細胞懸濁液への組織処理
（ａ）血液
等容量のＰＢＳを各血液試料に添加し、２ｍＬの１ＸＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をさらに添加した。試料を穏やかにボルテックスし、暗所において室温で１０分間インキュベートし、遠心分離機によって３回洗浄した。細胞を２０ｘ１０６個の細胞／ｍＬでアッセイ緩衝液（Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ中の５％正常ラット血清（ＮＲＳ））に再懸濁した。染色するまで試料を氷上で保存した。
【０１６７】
（ｂ）脾臓および肝臓
２つの顕微鏡スライドの艶消し部分を使用して、脾臓または肝臓組織を均質化した。スライドは、すべての細胞がＰＢＳ中で収集されることを確実にするため、ペトリ皿中に提供されるＰＢＳを有していた。均質化後、すべてのＰＢＳ（このとき、単一の細胞および組織の小片を含む）を回収し、ストレーナーが組み込まれたＦａｌｃｏｎチューブでフィルター均質化した。３００ｘｇで５分間遠心し、上清を除去した後、細胞を１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、続いて２ｍＬの１ＸＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した。次いで、細胞懸濁液を穏やかにボルテックスし、暗所において室温で１０分間インキュベートした。遠心分離機によって３回洗浄した後、細胞を２０ｘ１０６個の細胞／ｍＬでアッセイ緩衝液（ＰＢＳ中の５％ＮＲＳ）に再懸濁した。染色するまで試料を氷上で保存した。
【０１６８】
（ｃ）肺
消化培地は、ＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および５Ｕ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）を使用して調製した。肺を小片に切り、ペトリ皿中で肺あたり５ｍｌの消化培地に懸濁し、３７℃で振とうしながら約１．５時間（しかし２時間以内）インキュベートした。２つの顕微鏡スライドの艶消し部分を使用して、肺組織を均質化した。スライドは、すべての細胞が収集されることを確実にするため、ペトリ皿中に提供される消化培地を有していた。均質化後、すべての消化培地（このとき、単一細胞および組織の小片を含む）を回収し、ストレーナーが組み込まれたＦａｌｃｏｎチューブを介してフィルター均質化した。３００ｘｇで５分間遠心し、上清を除去した後、細胞を１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、続いて２ｍＬの１ＸＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した。次いで、細胞懸濁液を穏やかにボルテックスし、暗所において室温で１０分間インキュベートした。遠心分離機によって３回洗浄した後、細胞をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ中の５％ＮＲＳ）に２０ｘ１０６個の細胞／ｍＬで再懸濁した。染色するまで試料を氷上で保存した。
【０１６９】
フローサイトメトリー試料染色
染色手順は次のように行った。製造業者の指示書に従って、一次染色後に１：２００の生存／死滅Ｚｏｍｂｉｅ  ｒｅｄを細胞に添加した。表面マーカーの染色および生存／死滅集団の同定に続いて、細胞を３００ｕＬのＢＤ  ＦＡＣＳ／Ｌｙｓｉｎｇ  Ｆｉｘａｔｉｖｅに再懸濁し、任意の赤血球を溶解した。対照を抗体最適化研究から使用した。試料を染色するための抗体のセットを以下のようにして調製した。
【表７】
2021516757.tif 000013
【表８】
2021516757.tif 000014
【０１７０】
使用した抗体の容量をタイトレーション（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）実験中に決定した。１００μＬの細胞試料を９６ウェルＶ底プレートに添加した。単一の染色対照のセット（１００μＬ／ウェル）をコンペンセーション（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）のために調製し、すべての動物由来のプールされた試料を使用して、蛍光マイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）（ＦＭＯ）対照のセットを各組織に対して調製した。プレートを５００ｘｇで５分間遠沈した。緩衝液を除去し、試料を氷上で約１０分間、１００μＬの１μｇ／ｍＬ  ＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ  Ｂｌｏｃｋ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１０１３２０））で再懸濁した。このインキュベーションに続いて、１００μＬの適切な抗体セットを各試料に添加し、試料プレートを覆い、氷上で約３０分間インキュベートした。次に、試料プレートを５００ｘｇで５分間遠沈して上清を除去した。細胞を２００μＬのアッセイ緩衝液（ＰＢＳ中の５％ＮＲＳ）に再懸濁した。試料プレートを５００ｘｇで５分間遠沈して上清を除去し、細胞を２００μＬのＦｉｘａｔｉｖｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、３３９８６０）に再懸濁した。試料を４℃で覆って保存した。
【０１７１】
フローサイトメトリーの試料取得および分析
試料を、Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＳＲＩＩ機器で取得した。単一染色試料を使用して電圧を適切に調整し、最適な信号対雑音比、コンペンセーションマトリックス（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）の適用、およびすべてのフルオロフォアチャネルの適切な標識付けを確保した。１００万のイベントまたは試料の最大容量が各試料について記録された。ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０ソフトウェアを使用して、得られたフローサイトメトリーデータを分析した。
【０１７２】
結果
４〜８週齢のファーバーマウス（Ａｓａｈ１Ｐ３６１Ｒ／Ｐ３６１Ｒ）および同齢の野生型マウスから収集した血液ならびに肝臓、脾臓、および肺組織における細胞組成および活性化状態を比較するために、フローサイトメトリーデータを分析した。
【０１７３】
組織にわたる生存率の評価
図１〜図５Ｂに示されるフローサイトメトリーアッセイは、野生型マウスにおけるバルク細胞分布および一般的な細胞容態に関する情報を示す。単球はＳＳＣｍｉｄＦＳＣｍｉｄとして同定されることに注意されたい。この分布からの変化は、疾患状態を示し得る。
【０１７４】
脾臓は、ファーバーマウスと野生型マウスとの間の細胞生存率に顕著な違いを示した。野生型対照と比較してファーバーマウスでの脾臓生存率の低下は、セラミドの直接的な影響に関連するか、または炎症プロセスによるものであり得る（図２Ａおよび２Ｂ）。ファーバーマウスにおける肺生存率は、野生型対照と同様であり（図３Ａおよび３Ｂ）、これは細胞死の単一段階のみを区別する能力を反映し得る。野生型対照と比較して、ファーバーマウスでの同様の肝臓および血液生存率が観察された（図４Ａ、４Ｂ、５Ａ、および５Ｂ）。
【０１７５】
ＣＤ４５＋
白血球（ＣＤ４５＋）細胞の頻度の増加または細胞分布の変化は、主に慢性の炎症または感染によって媒介される。ファーバーマウスおよび野生型マウスでのＣＤ４５＋細胞の％およびＣＤ４５＋コンパートメントの構成に関して、注目すべき変化があった。図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、および７Ｂは、４〜８週齢のファーバーマウスおよび同齢の野生型マウスの脾臓および血液中の白血球（ＣＤ４５＋細胞）および単球（ＳＳＣｍｉｄ／ＦＳＣｍｉｄ）の集団を比較している。白血球（ＣＤ４５＋細胞）の頻度は、脾臓では比較的同様のレベルを維持した。図７Ａおよび７Ｂに示されるように（矢印で示す）、単球の頻度は、野生型マウスと比較してファーバーマウスで増加した。さらに、単球の頻度は、野生型と比較してファーバーマウスの脾臓において５倍以上増加した。これは末梢の頻度と相関し、脾臓組織での変化を反映している。
【０１７６】
ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ（活性化単球）
単球／顆粒球はさらにエフェクター亜集団に分けられる。（Ｍｉｓｈａｒｉｎｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｏｃｔ；４９（４）：５０３−１０．）。サブセットの中で、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ集団は活性化単球を示す。図９Ａに示されるように、野生型と比較して、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｍｉｄの減少を同時に伴った、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ集団の著しい増加が、ファーバーマウスの肺で観察された。同様に、野生型と比較して、図９Ｂに示されるように、ＭＨＣＩＩ−−ＣＤ１１ｂｈｉ集団の著しい増加が、ファーバーマウスの脾臓で観察された（図９Ｂおよび１０Ａ）。組織でのこの頻度の増加は、血液でも反映される（図１０Ｂ）。ファーバーマウスの組織および末梢での活性化単球（ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ）の頻度の増加に関するこれらの発見（図１１）は、ファーバー病の免疫表現型マーカーとしてのＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉを支持している。
【０１７７】
ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−Ｌｙ６Ｃ＋（炎症誘発性単球系統）
ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−は、ＬＹ６Ｃにさらに細分化することができる。Ｌｙ６Ｃ＋単球は、炎症誘発性に分化する可能性が高い。ＬＹ６Ｃ−単球は、Ｍ２マクロファージに分化し、抗炎症性である可能性が高い。図１３Ａに示されるように、ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−集団の炎症誘発性ＬＹ６Ｃ＋サブセットは、野生型マウスと比較して、ファーバーマウスの肺で増加した。ファーバーマウスの脾臓および血液ではＬｙ６Ｃ＋炎症誘発性細胞の同様の頻度であった。（図１２Ｂおよび１３Ｂ）。これらの発見は、インサイチューの炎症環境が炎症誘発性細胞の生成をさらに促進し得ることを示している。ファーバーマウスでは、炎症誘発性マクロファージおよび樹状細胞のこの増加も血中で検出され、ファーバー病の末梢マーカーとしてのＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＬｙ６Ｃ＋を支持した。
【０１７８】
ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＣＤ８６＋（活性化炎症誘発性マクロファージおよび樹状細胞）
図１４Ａおよび１４Ｂは、ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣ−ＤＣ集団内のＣＤ２３、ＣＤ６８、およびＣＤ８６活性化マーカーが、野生型マウスと比較して、ファーバーマウスの肺で増加したことを示している。特に、ファーバーマウスでのＭＨＣ−ＣＤ１１ｂ＋集団内のＣＤ８６の発現増加（図１４Ｂ、右パネル）は、免疫細胞の動員および活性化を誘導するように細胞を刺激し、炎症反応を持続させる能力を示している。この結果は、ファーバー病の免疫表現型マーカーとしてのＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉ  ＣＤ８６＋を支持している。
【０１７９】
ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３８＋およびＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋（マクロファージの極性化）
ファーバーマウスでは、炎症誘発性マクロファージが増加し、抗炎症性マクロファージが減少している（図１５Ａおよび１５Ｂ）。マクロファージの極性化は、サイトカイン環境および栄養源によって調節される。サイトカイン／ケモカインは、走化性を駆動し、標的細胞での細胞変化を誘導することができる細胞シグナル伝達分子である。
【０１８０】
ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋（好中球）
図１６〜１９および２０Ａ〜２０Ｄに示されるように、ファーバーマウスのすべての肺、脾臓、および肝臓は、４週齢までに好中球（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋）の頻度の増加を示した（野生型と比較して２〜７倍の増加）。好中球の増加は、組織にわたってファーバーマウスと野生型マウスとの間の最も顕著な差別化因子であった（下記の表８を参照のこと）。好中球浸潤の早期かつ強力な増加は、単球の動員を含むその後の免疫応答を駆動するのに役立ち、したがって、炎症誘発性サイトカインの生成を介してファーバーマウスの病状に寄与し得る。
【０１８１】
さらに、図２０Ｄに示されるように、組織常在型好中球の頻度の増加はファーバーマウスの血液でも反映され、これはファーバー病の強力な表現型マーカーとしてのＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋を支持した。
【０１８２】
ＣＤ１９ｂ−ＣＤ３＋（Ｔ細胞）
図２１〜２４に示されるように、ファーバーマウスの脾臓、肺、および血液はすべて、４週間および８週間の両方でＴ細胞（ＣＤ１９ｂ−ＣＤ３＋）の頻度の低下を示した（図２４）。この発見は、ファーバーマウスにおける胸腺構造の大きな破壊および胸腺Ｔ細胞の減少に関する以前の観察（Ｄｗｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、ならびにリンパ球の発達および腸への移動の調節におけるスフィンゴシン１−リン酸依存性に関する以前の観察（Ｋｕｎｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）と一致している。
【０１８３】
ＣＤ１９ｂ＋ＣＤ３８＋（活性化Ｂ細胞）
図２５および２７Ａに示されるように、ファーバーマウスは、ＣＤ１９＋から明らかであるように脾臓でのＢ細胞の頻度が増加している。脾臓におけるＢ細胞コンパートメント内において、ファーバーマウスは、ＣＤ３８＋から明らかであるように活性化Ｂ細胞（形質芽球）の頻度が増加した（図２６および２７Ｂ）。図２８、２９Ａ、および２９Ｂに示されるように、活性化Ｂ細胞の頻度の増加は末梢において反映された。Ｔ細胞の減少は胸腺の破壊に関連している可能性があるのに対し、活性化Ｂ細胞の増加は抗原提示細胞の豊富さに起因している可能性がある。Ｔ細胞およびＢ細胞の動態は、単球（および誘導された亜集団）および好中球の浸潤および活性化に続いて、応答が起こることを示唆している。
【０１８４】
ＣＤ４５ｈｉＳＳｈｉ（好酸球または好塩基球）
ファーバーマウスの肺では、免疫細胞の全体的頻度は、いずれの年齢でも野生型マウスと比較して減少した（図３０Ａ）。特に、ＣＤ４５ｈｉＳＳｈｉ細胞（図３０Ａ、黒色の輪郭）は、ファーバーマウスでは完全に消失した。
【０１８５】
ファーバーマウスの肝臓では、免疫細胞の頻度は、概して、ファーバーマウスおよび野生型マウスの両方で低かった（図３０Ｂ）。肝臓は、主に肝細胞（ＣＤ４５−）肝細胞成分の７０％）からなる複雑な組織構造を有し、肝内リンパ球（ＩＨＬ）が残りの非実質細胞（３０％）のうちの１６〜２２％を構成する。８週齢のファーバーマウスにおけるＣＤ４５＋ＳＳｈｉ細胞は、４週齢のファーバーマウスおよび野生型マウスと比較して、いずれの年齢でもわずかに増加した。
【０１８６】
ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂｍｉｄＣＤ２３＋
ＣＤ２３は、成熟Ｂ細胞、活性化マクロファージ、好酸球、濾胞樹状細胞、および血小板に発現する。ＣＤ２３＋細胞の喪失は、ファーバーマウスの脾臓および肺における活性化を示す。血液試料ではＣＤ２３は見出されなかった。
【表９】
2021516757.tif 000015
【０１８７】
表８は、ファーバー病の診断用の同定されたマーカーの概要を提供する。同齢の野生型マウス由来の対照試料と比較して、「１−２」はマーカー発現の１〜２の倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）、「２−５」は２〜５の倍率変化、「＞５」は５超の倍率変化を示し、「−」は「未試験または未決定」を示す。「累積」スコアは、４つの組織すべておよび血液試料におけるマーカー発現の合計であり、「＋＋＋」は５超の倍率変化を示し、「＋＋」は３〜４の倍率変化を示し、「＋」は３未満の倍率変化を示す。括弧は、野生型対照と比較して負の変化または減少を示す。
【０１８８】
単球集団の特徴付けにより、ＭＨＣＩＩ−ＣＤ１１ｂｈｉＬｙ６Ｃ＋細胞の頻度の顕著な増加が明らかになった。これらの細胞は、ＣＤ８６の発現から明らかなように高度に活性化され、ＣＤ３８の発現に基づくと、炎症誘発性Ｍ１表現型に偏っていた。ＣＤ２０６＋抗炎症Ｍ２マクロファージが同時に減少することが同定された。マクロファージコンパートメントに加えて、脾臓、肝臓、および肺における好中球の大幅な増加は、４週齢までに明らかとなった（野生型に対して２〜７倍）。適応免疫コンパートメントの顕著な違いも認められ、形質芽球（免疫グロブリン産生形質細胞の前駆体）の頻度が明らかに増加し、これは炎症誘発性単球の増加に続いて起こる可能性が高かった。
【０１８９】
免疫フィンガープリント
図３３Ａ〜３３Ｄは、ファーバーマウスの肺、脾臓、肝臓および血液で同定されたすべてのサブセットに基づく免疫フィンガープリントの例を示している。
【０１９０】
ｒｈＡＣで処置されたファーバーマウスの組織の免疫表現型に対するｒｈＡＣの影響を示すために、さらなる研究が行われるであろう。組織は、炎症誘発性マーカー（例えば、ＣＤ３８、Ｌｙ６Ｇ）、および抗炎症性マーカー（例えば、ＣＤ２０６）、ならびに汎単球（ｐａｎ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）マーカー（例えば、ＣＤ１１ｂ）を含む、表２、３、および７に列挙されているファーバー病の診断に使用される上記で同定されたマーカーで染色することができる。
【０１９１】
実施例２野生型、ファーバーマウス、および組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）で処置したファーバーマウスを、免疫細胞集団構成について分析した。ファーバーマウスモデルを使用したが、その理由は、該ファーバーマウスモデルが、非機能性形態の酸性セラミダーゼを生成するホモ接合型Ａｓａｈ１Ｐ３６１Ｒ／Ｐ３６１Ｒ動物を作製するために、重症発症ＦＤ患者において同定される単一ヌクレオチドミスセンス変異を有するＷ４／１２９Ｓｖ／ＣＤ−１バックグランドで確立された「ノックイン」マウスモデルであるからである。この疾患モデルは、複数の組織の単球浸潤を再現するので、この疾患モデルを使用してファーバー病の免疫環境を研究するのに有用である。
【０１９２】
ファーバーマウス（ＰＣＲにより遺伝子型を確認した）に、離乳直後（３〜４週齢）に開始して、週１回で４回、１０ｍｇ／ｋｇ／投与の組換えヒト酸性セラミダーゼ（ＲＶＴ−８０１）の腹腔内（ＩＰ）用量を投与し、４回目および最後のＲＶＴ−８０１投与後に剖検のために（７週齢で）犠牲死させた。対照野生型およびファーバーマウスにはビヒクルを投与せず、各遺伝子型の３匹の対照動物を剖検し、４週齢または８週齢での評価のために試料を収集した。示された時点において、ファーバーマウスおよび同腹仔対照（野生型）を採取して、セラミド蓄積の主要組織（脾臓、肝臓、および肺）における免疫細胞の組成を評価した。さらに、末梢での組織特異的炎症を関連付けるために血液を収集した。試料を処理して単一細胞懸濁液とし、下記の表９（パネル１）および表１０（パネル２）に従って染色し、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを作動させた。単一染色試料（コンペンセーションビーズ）および蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）試料は、研究のための対照として機能した。ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０を使用して生データファイルを分析し、代表的なゲーティング戦略を図３４Ａ〜Ｅに示す。
【０１９３】
結果。図３４Ａ〜Ｅ処理からの細胞破片を除去するために、サイズ（ＳＳＣｘＦＳＣ）に基づいて最初にゲーティングされた細胞集団（図３４Ａ）。この集団を、Ｚｏｍｂｉｅ  ｒｅｄ色素について陽性であった細胞集団を除去するために、生細胞および死細胞に基づいてさらにゲーティングした（図３５Ｂ）。次いで、ＣＤ４５＋集団を選択するために、生細胞をゲーティングした（図３４Ｃ）。この集団を、Ｌｙ６ＧおよびＣＤ１１ｂの二重陽性であるＣＤ４５＋細胞または好中球の割合を決定するためにさらにゲーティングした（図３４Ｄ）。残りの集団を選択し、ＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ−について選択するためにゲーティングし、試料種あたりの活性化単球の集団を決定した（図３４Ｅ）。これは、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０を使用して、全血、脾臓、肝臓、および肺の試料に対してこの方法で行った。活性化マクロファージについて選択するために、肺試料をさらにゲーティングした。
【表１０】
2021516757.tif 000016
【表１１】
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【０１９４】
実施例３脾臓免疫細胞集団。結果を図３５Ａおよび図３５Ｂに示す。対照の４週齢および８週齢の野生型マウスおよびファーバーマウスの脾臓から、炎症状態に特徴的である炎症性細胞集団を分析した。Ｌｙ６ＧＣＤ１１ｂ二重陽性ＣＤ４５＋好中球およびＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ−ＣＤ４５＋活性化単球の集団を、３週齢で開始して、週１回、４週間にわたって合計４回の投与による、１０ｍｇ／ｋｇ／投与のＲＶＴ−８０１を投与した７週齢のファーバーマウスから決定した。同齢のファーバーマウスおよび同腹仔対照（野生型）の脾臓における免疫細胞の頻度の倍率変化の違いについてのヒートマップ分析。各列は個々の動物を表す。平均野生型値を１に設定することにより、倍率変化を計算した。
【０１９５】
実施例４全身性（血液）免疫細胞集団。結果を図３６Ａ〜図３６Ｃに示す。炎症状態に特徴的な炎症性細胞集団を、対照の４週齢および８週齢の野生型マウスおよびファーバーマウスの血液試料から分析した。Ｌｙ６Ｇ、ＣＤ１１ｂ二重陽性ＣＤ４５＋好中球、およびＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ−ＣＤ４５＋活性化単球の集団を、３週齢で開始して、週１回、４週間にわたって合計４回の投与による、１０ｍｇ／ｋｇ／投与のＲＶＴ−８０１を投与した７週齢のファーバーマウスから決定した。同齢のファーバーマウスおよび同腹仔対照（野生型）の血液中の免疫細胞の頻度の倍率変化の違いについてのヒートマップ分析。各列は個々の動物を表す。平均野生型値を１に設定することにより、倍率変化を計算した。
【０１９６】
実施例５肺の免疫細胞集団。結果を図３７Ａ〜図３７Ｄに示す。炎症状態に特徴的な炎症性細胞集団を、対照の４週齢および８週齢の野生型マウスおよびファーバーマウスの肺組織から分析した。Ｌｙ６Ｇ、ＣＤ１１ｂ二重陽性ＣＤ４５＋好中球、およびＣＤ１１ｂ＋ＭＨＣＩＩ−ＣＤ４５＋活性化単球の集団を、３週齢で開始して、週１回、４週間にわたって合計４回の投与による、１０ｍｇ／ｋｇ／投与のＲＶＴ−８０１を投与した７週齢のファーバーマウスから決定した。同齢のファーバーマウスおよび同腹仔対照（野生型）の肺における免疫細胞の頻度の倍率変化の違いについてのヒートマップ分析。各列は個々の動物を表す。平均野生型値を１に設定することにより、倍率変化を計算した。ＣＤ４５＋Ｌｙ６Ｃ−ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｂ−である追加のマクロファージ集団も図３７Ｃで報告する。
【０１９７】
実施例６肝免疫細胞集団。結果を図３８Ａ〜図３８Ｂに示す。炎症状態に特徴的な炎症性細胞集団を、対照の４週齢および８週齢の野生型およびファーバーマウスの肝臓組織から分析した。Ｌｙ６Ｇ／ＣＤ１１ｂ二重陽性ＣＤ４５＋好中球およびＣＤ１１ｂ＋ｈｉＭＨＣＩＩ−ＣＤ４５＋活性化単球の集団を、３週齢で開始して、週１回、４週間にわたって合計４回の投与による、１０ｍｇ／ｋｇ／投与のＲＶＴ−８０１を投与した７週齢のファーバーマウスから決定した。
【０１９８】
文脈に基づき明らかである意図された目的のために、参照によりその全体が組み込まれる、本出願で議じられた参考文献。
【０１９９】
Ａｌａｙｏｕｂｉ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｃ．Ａｕ，Ｓ．Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｖ．Ｇａｒｃｉａ，Ｓ．Ｄｗｏｒｓｋｉ，Ｓ．Ｅｌ−Ｇｈａｍｒａｓｎｉ，Ｋ．Ｎ．Ｋｉｒｏｕａｃ，Ｍ．Ｊ．Ｅｘｅｒｔｉｅｒ，Ｚ．Ｊ．Ｘｉｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．Ｐｒｉｖｅ，Ｃ．Ｍ．Ｓｉｍｏｎａｒｏ，Ｊ．Ｃａｓａｓ，Ｇ．Ｆａｂｒｉａｓ，Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｐ．Ｖ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．Ｈａｋｅｍ，Ｔ．Ｌｅｖａｄｅ，ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｍｅｄｉｎ（２０１３）．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃｅｒａｍｉｄｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｎｄ  ｖａｒｉｅｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，５：８２７−８４２．
【０２００】
Ｂａｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｊａｎｇ，Ｋ．Ｈ．，Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｊｉｎ，Ｈ．Ｋ．（２００４）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｃｉｄ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｕｔｅｓ  ｉｎ  Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｉｃｅ．Ｅｘｐ  Ａｎｉｍ，５３：４１７−４２１．
【０２０１】
Ｂｅｃｋｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｌｕｔｈ，Ａ．，Ｄｏｒｉｎｇ，Ｇ．，Ｋｌｅｕｓｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｇｕｌｂｉｎｓ，Ｅ．（２０１０）Ａｃｉｄ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｙｓｔｉｃ  ＦｉｂｒｏｓｉｓＡｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２（６）：７１６−７２４．
【０２０２】
Ｂｅｒｎａｒｄｏ，Ｋ．，Ｒ．Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｔ．Ｚｅｎｋ，Ｒ．Ｊ．Ｄｅｓｎｉｃｋ，Ｋ．Ｆｅｒｌｉｎｚ，Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｓａｎｄｈｏｆｆ（１９９５）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７０：１１０９８−１１１０２．
【０２０３】
Ｂｏａｄｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｌｕ，Ｊ．Ｚ．，Ｈｕｉ，Ｅ．Ｋ．，Ｌｉｎ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．（２０１６）Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｌｐｈａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｎｅｔｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ  ｉｎ  Ｓａｎｆｉｌｌｉｐｐｏ  ｔｙｐｅ  Ｂ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓＭｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，１３：１３８５−９２
【０２０４】
Ｃｈａｔｅｌｕｔ，Ｍ．，Ｈａｒｚｅｒ，Ｋ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｍａｎｏｕ，Ｈ．，Ｆｅｕｎｔｅｕｎ，Ｊ．，Ｐｉｅｒａｇｇｉ，Ｍ．Ｔ．，Ｐａｔｏｎ，Ｂ．Ｃ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｂａｓｉｌｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｔｈｉｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｓａｌｖａｙｒｅ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｌｅｖａｄｅ，Ｔ．（１９９７）．Ｍｏｄｅｌ  ＳＶ４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓａｐｏｓｉｎ  ａｎｄ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ，２６２：６１−７６．
【０２０５】
Ｄｅｓｎｉｃｋ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．（２０１２）．Ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ２０  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，１３：３０７−３３５．
【０２０６】
Ｄｗｏｒｓｋｉ，Ｓ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，Ｆｕｒｌｏｎｇｅｒ，Ｃ．，Ｍｏｒｅａｕ，Ｊ．Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｍｉｔｓｕ，Ｍ．，Ｔｒｅｎｔａｄｕｅ，Ｊ．，Ａｕ，Ｂ．Ｃ．，Ｐａｉｇｅ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｎ，Ｊ．Ａ．（２０１５）．Ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，１００（５）：ｅ１６２−１６５．
【０２０７】
Ｄｗｏｒｓｋｉ，Ｓ．，Ｌｕ，Ｐ．，Ｋｈａｎ，Ａ．，Ｍａｒａｎｄａ，Ｂ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｊ．，Ｐａｒｉｎｉ，Ｒ．，Ｄｉ  Ｒｏｃｃｏ，Ｍ．，Ｈｕｇｌｅ，Ｂ．，Ｙｏｓｈｉｍｉｔｓｕ，Ｍ．，Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｍａｋａｙ，Ｂ．，Ａｒｓｌａｎ，Ｎ．，Ｇｕｅｌｂｅｒｔ，Ｎ．，Ｅｈｌｅｒｔ，Ｋ．，Ｊａｒｉｓｃｈ，Ａ．，Ｇａｒｄｎｅｒ−Ｍｅｄｗｉｎ，Ｊ．，Ｄａｇｈｅｒ，Ｒ．，Ｔｅｒｒｅｒｉ，Ｍ．Ｔ．，Ｌｏｒｅｎｃｏ，Ｃ．Ｍ．，Ｂａｒｉｌｌａｓ−Ａｒｉａｓ，Ｌ．，Ｔａｎｐａｉｂｏｏｎ，Ｐ．，Ｓｏｌｙｏｍ，Ａ．，Ｎｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｈｅ，Ｘ．，Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．，Ｌｅｖａｄｅ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｍｅｄｉｎ，Ｊ．Ａ．（２０１７）．Ａｃｉｄ  Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｐｌａｓｍａ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１８６３（２）：３８６−３９４（Ｅｐｕｂ  Ｄｅｃ．２０１６  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｄｉｓ．２０１６．１１．０３１）．
【０２０８】
Ｅｌｉｙａｈｕ，Ｅ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｈ．，Ｓｈｔｒａｉｚｅｎｔ，Ｎ．，Ｈｅ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．（２００７）Ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２１：１４０３−９．
【０２０９】
Ｅｌｉｙａｈｕ，Ｅ．，Ｎ．Ｓｈｔｒａｉｚｅｎｔ，Ｋ．Ｍａｒｔｉｎｕｚｚｉ，Ｊ．Ｂａｒｒｉｔｔ，Ｘ．Ｈｅ，Ｈ．Ｗｅｉ，Ｓ．Ｃｈａｕｂａｌ，Ａ．Ｂ．Ｃｏｐｐｅｒｍａｎ，ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ（２０１０）．Ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ，２４：１２２９−１２３８．
【０２１０】
Ｅｌｉｙａｈｕ，Ｅ．，Ｎ．Ｓｈｔｒａｉｚｅｎｔ，Ｒ．Ｓｈａｌｇｉ  ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ（２０１２）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｏｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３０：７３５−７４８．
【０２１１】
Ｆａｒｂｅｒ，Ｓ．（１９５２）Ａ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ−ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ“Ｌｉｐｏｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ”−ａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｗｉｔｈ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ，ａｎｄ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ，Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ａｎｄ  Ｈａｎｄ−Ｓｃｈｕｌｌｅｒ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ，８４：４９９。
【０２１２】
Ｆｒｏｈｂｅｒｇｈ，Ｍ．Ｅ．，Ｇｕｅｖａｒａ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｒｅｉｓａｍｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｂａｒｂｅ，Ｍ．Ｆ．，Ｈｅ，Ｘ．，Ｓｉｍｏｎａｒｏ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．（２０１６）Ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｄｅｆｅｃｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２４：７５２−７６２．
【０２１３】
Ｇａｔｔ，Ｓ．（１９６３）．Ｅｎｚｙｍｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｒａｍｉｄｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２３８：３１３１−３１３３．
【０２１４】
Ｈｅ，Ｘ．，Ｎ．Ｏｋｉｎｏ，Ｒ．Ｄｈａｍｉ，Ａ．Ｄａｇａｎ，Ｓ．Ｇａｔｔ，Ｈ．Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｋ．Ｓａｎｄｈｏｆｆ，ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ（２００３）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｉｄ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８（３５）：３２９７８−３２９８６．
【０２１５】
Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｆａｒｂｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ，”ＢＢＡ  Ｃｌｉｎ．２０１７  Ｆｅｂ  １３；７：８５−９６．
【０２１６】
Ｈｏｌｌａｋ，Ｃ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗｉｊｂｕｒｇ，Ｆ．Ａ．（２０１４）．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ，３７：５８７−５９８．
【０２１７】
Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ，Ｋ．Ａ．，Ａｍｉｃｉ，Ｓ．Ａ．，Ｗｅｂｂ，Ｌ．Ｍ．，Ｒｕｉｚ−Ｒｏｓａｄｏ，Ｊｄ．Ｄ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ，Ｐ．Ｇ．，Ｐａｒｔｉｄａ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｕｅｒａｕ−ｄｅ−Ａｒｅｌｌａｎｏ，Ｍ．（２０１５）Ｎｏｖｅｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｔｏ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍ１  ａｎｄ  Ｍ２  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（１２）：ｅ０１４５３４２．
【０２１８】
Ｋｏｃｈ，Ｊ．，Ｓ．Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ｌｉ，Ｌ．Ｅ．Ｑｕｉｎｔｅｒｎ，Ｋ．Ｂｅｒｎａｒｄｏ，Ｏ．Ｌｅｖｒａｎ，Ｄ．Ｓｃｈｎａｂｅｌ，Ｒ．Ｊ．Ｄｅｓｎｉｃｋ，Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｓａｎｄｈｏｆｆ（１９９６）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｌｅｓｉｏｎ  ｃａｕｓｉｎｇ  Ｆａｒｂｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７１（５１）：３３１１０−３３１１５．
【０２１９】
Ｊｕｎ  Ｋｕｎｉｓａｗａ，Ｙｏｓｕｋｅ  Ｋｕｒａｓｈｉｍａ，Ｍｏｒｉｏ  Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｍａｓａｓｈｉ  Ｇｏｈｄａ，Ｉｚｕｍｉ  Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｉｋｕｋｏ  Ｏｇａｈａｒａ，Ｎａｍｊｕ  Ｋｉｍ，Ｍｉｋｉ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，ａｎｄ  Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｋｉｙｏｎｏ（２００７）．Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ  １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＪＥＭ，２０４（１０）：２３３５−２３４８．
【０２２０】
Ｌｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｘ．Ｈｅ，Ｂ．Ｌｅｖｙ，Ｆ．Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ａｒａｉ，Ｄ．Ａ．Ａｄｌｅｒ，Ｃ．Ｍ．Ｄｉｓｔｅｃｈｅ，Ｊ．Ｋｏｃｈ，Ｋ．Ｓａｎｄｈｏｆｆ，ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ（１９９９）．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ（ａｓａｈ）：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｔｉｏｎ，ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６２（２）：２２３−２３１．
【０２２１】
Ｌｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｓ．Ｂ．Ｈｏｎｇ，Ｇ．Ｋｏｐａｌ，Ｘ．Ｈｅ，Ｔ．Ｌｉｎｋｅ，Ｗ．Ｓ．Ｈｏｕ，Ｊ．Ｋｏｃｈ，Ｓ．Ｇａｔｔ，Ｋ．Ｓａｎｄｈｏｆｆ，ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ（１９９８）．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５０（２）：２６７−２７４．
【０２２２】
Ｌｉ，Ｃ．Ｍ．，Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｍ．Ｓｉｍｏｎａｒｏ，Ｘ．Ｈｅ，Ｒ．Ｅ．Ｇｏｒｄｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｄ．Ｅｈｌｅｉｔｅｒ，Ｆ．Ｐａｒｉｓ，Ｋ．Ｍａｎｏｖａ，Ｓ．Ｈｅｐｂｉｌｄｉｋｌｅｒ，Ｚ．Ｆｕｋｓ，Ｋ．Ｓａｎｄｈｏｆｆ，Ｒ．Ｋｏｌｅｓｎｉｃｋ，ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ（２００２）．Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｌｉｐｉｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７９（２）：２１８−２２４．
【０２２３】
Ｍｉｓｈａｒｉｎ  ＡＶ，Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｎｅｂｒｅｄａ  Ｌ，Ｍｕｔｌｕ  ＧＭ，Ｂｕｄｉｎｇｅｒ  ＧＲＳ，ａｎｄ  Ｐｅｒｌｍａｎ  Ｈ（２０１３）．Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｕｎｇ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４９（４）：５０３−５１０．
【０２２４】
Ｍｕｒｒａｙ  ＪＭ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＡＭ，Ｖｉｔｓｋｙ  Ａ，Ｈａｗｅｓ  Ｍ，Ｃｈｕａｎｇ  ＷＬ，Ｐａｃｈｅｃｏ  Ｊ，Ｗｉｌｓｏｎ  Ｓ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＪＭ，Ｔｈｕｒｂｅｒｇ  ＢＬ，Ｋａｒｅｙ  ＫＰ，ａｎｄ  Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｌ．（２０１５）．Ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ（ｒｈＡＳＭ）ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ：ｔｈｅ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ，１１４：２１７−２２５．
【０２２５】
Ｏｋｉｎｏ，Ｎ．，Ｈｅ，Ｘ．，Ｓ．Ｇａｔｔ，Ｋ．Ｓａｎｄｈｏｆｆ，Ｍ．Ｉｔｏ，ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ（２００３）．Ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８（３２）：２９９４８−２９９５３．
【０２２６】
Ｒｅａｌｉｎｉ，Ｎ．，Ｐａｌｅｓｅ，Ｆ．，Ｐｉｚｚｉｒａｎｉ，Ｄ．，Ｐｏｎｔｉｓ，Ｓ．，Ｂａｓｉｔ，Ａ．，Ｂａｃｈ，Ａ．，Ｇａｎｅｓａｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｐｉｏｍｅｌｌｉ，Ｄ．（２０１５）．Ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，Ｎ２９１：２４２２−２４３４．
【０２２７】
Ｒｏｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｙ．，Ｋｉｍ，Ｅ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｊａｎｇ，Ｈ．Ｊ．（２０１６）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｓｅｓ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，５２：１６３−７２．
【０２２８】
Ｓｈｉｆｆｍａｎｎ，Ｓ．，Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｄ．，Ｂｉｒｏｄ，Ｋ．，Ｆｅｒｒｅｉｒｏｓ，Ｎ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｙ．，Ｚｉｖｋｏｖｉｃ，Ａ．，Ｇｅｉｓｓｌｉｎｇｅｒ，Ｇ．，Ｇｒｏｓｃｈ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔａｒｋ，Ｈ．（２０１２）．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，９４（２）：５５８−５６５．
【０２２９】
Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．（２０１６）．Ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｐｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１８６２：１４５９−１４７１．
【０２３０】
Ｓｉｍｏｎａｒｏ，Ｃ．Ｍ．，Ｓａｃｈｏｔ，Ｓ．，Ｇｅ，Ｙ．，Ｈｅ，Ｘ．，ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｖ．Ａ．，Ｅｌｉｙａｈｕ，Ｅ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｕｎ，Ｈ．Ｂ．，Ｍａｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｈａｓｋｉｎｓ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．（２０１３）Ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８：ｅ６２７１５．
【０２３１】
Ｓｈｔｒａｉｚｅｎｔ，Ｎ．，Ｅ．Ｅｌｉｙａｈｕ，Ｊ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｘ．Ｈｅ，Ｒ．Ｓｈａｌｇｉ  ａｎｄ  Ｅ．Ｈ．Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ（２００８）．Ａｕｔｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８３（１７）：１１２５３−１１２５９．
【０２３２】
Ｓｕｇｉｔａ，Ｍ．，Ｄｕｌａｎｅｙ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｍｏｓｅｒ，ＨＷ（１９７２）．Ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｆａｒｂｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ（ｌｉｐｏｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｉｓ）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７８（４０６５）：１１００−１１０２．
【０２３３】
Ｙｕ  ＦＰ，Ｉｓｌａｍ  Ｄ，Ｓｉｋｏｒａ  Ｊ，Ｄｗｏｒｓｋｉ  Ｓ，Ｇｕｒｋａ’  Ｊ，Ｌｏｐｅｚ−Ｖａｓｑｕｅｚ  Ｌ，Ｌｉｕ  Ｍ，Ｋｕｅｂｌｅｒ  ＷＭ，Ｌｅｖａｄｅ  Ｔ，Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｍｅｄｉｎ  ＪＡ（２０１７）．。Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｃｉｄ  ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｐｒｅｓｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２２，２０１７，Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）．
【０２３４】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、公開物、およびアクセッション番号の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３５】
本開示は様々な実施形態を参照して開示されてきたが、本開示の真の精神および範囲から逸脱することなく、他の実施形態およびこれらの変形が当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような実施形態および同等の変形を含むと解釈されることを意図している。
【０２３６】
等価物（Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）
前述の明細書は、当業者が実施形態を実施できるようにするのに十分であると考えられる。前述の説明および実施例は、特定の実施形態を詳述し、発明者らによって企図された最良の形態を説明している。しかしながら、前述の内容がいかに詳細にテキストに現れても、実施形態は多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲およびその均等物に従って解釈されるべきであることが理解される。
【０２３７】
本明細書で使用する場合約という用語は、明示的に示されているかどうかに関係なく、例えば、整数、分数、およびパーセンテージを含む数値を指す。約という用語は、当業者が列挙された値と同等であると考える（例えば、同じ関数または結果を有する）数値の範囲（例えば、列挙された範囲の＋／−５〜１０％）を指す。）。数値や範囲の列挙の前に少なくともなどの用語が使用されている場合、その用語は、列挙に提供されている全ての値または範囲を変更する。場合によっては、約という用語には、最も近い有効数字に四捨五入された数値が含まれる場合がある。
【図１】
2021516757.tif 000018
【図２Ａ−１】
2021516757.tif 000019
【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ−１】
2021516757.tif 000021
【図２Ｂ−２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
2021516757.tif 000030
【図５Ａ−１】
2021516757.tif 000031
【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図６Ａ−１】
2021516757.tif 000035
【図６Ａ−２】
2021516757.tif 000036
【図６Ｂ−１】
2021516757.tif 000037
【図６Ｂ−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2021516757.tif 000040
【図８Ａ−１】
2021516757.tif 000041
【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ−１】
2021516757.tif 000043
【図８Ｂ−２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ−１】
2021516757.tif 000047
【図１０Ａ−２】
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【図１０Ｂ−１】
2021516757.tif 000049
【図１０Ｂ−２】
2021516757.tif 000050
【図１１】
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【図１２Ａ−１】
2021516757.tif 000052
【図１２Ａ−２】
2021516757.tif 000053
【図１２Ｂ−１】
2021516757.tif 000054
【図１２Ｂ−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
2021516757.tif 000060
【図１５Ｂ】
2021516757.tif 000061
【図１６−１】
2021516757.tif 000062
【図１６−２】
2021516757.tif 000063
【図１７−１】
2021516757.tif 000064
【図１７−２】
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【図１８−１】
2021516757.tif 000066
【図１８−２】
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【図１９−１】
2021516757.tif 000068
【図１９−２】
2021516757.tif 000069
【図２０Ａ】
2021516757.tif 000070
【図２０Ｂ】
2021516757.tif 000071
【図２０Ｃ】
2021516757.tif 000072
【図２０Ｄ】
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【図２１−１】
2021516757.tif 000074
【図２１−２】
2021516757.tif 000075
【図２２−１】
2021516757.tif 000076
【図２２−２】
2021516757.tif 000077
【図２３−１】
2021516757.tif 000078
【図２３−２】
2021516757.tif 000079
【図２４】
2021516757.tif 000080
【図２５−１】
2021516757.tif 000081
【図２５−２】
2021516757.tif 000082
【図２６−１】
2021516757.tif 000083
【図２６−２】
2021516757.tif 000084
【図２７Ａ】
2021516757.tif 000085
【図２７Ｂ】
2021516757.tif 000086
【図２８−１】
2021516757.tif 000087
【図２８−２】
2021516757.tif 000088
【図２９Ａ】
2021516757.tif 000089
【図２９Ｂ】
2021516757.tif 000090
【図３０Ａ−１】
2021516757.tif 000091
【図３０Ａ−２】
2021516757.tif 000092
【図３０Ｂ−１】
2021516757.tif 000093
【図３０Ｂ−２】
2021516757.tif 000094
【図３１−１】
2021516757.tif 000095
【図３１−２】
2021516757.tif 000096
【図３２Ａ−１】
2021516757.tif 000097
【図３２Ａ−２】
2021516757.tif 000098
【図３２Ｂ】
2021516757.tif 000099
【図３３Ａ】
2021516757.tif 000100
【図３３Ｂ】
2021516757.tif 000101
【図３３Ｃ】
2021516757.tif 000102
【図３３Ｄ】
2021516757.tif 000103
【図３４Ａ−Ｅ】
2021516757.tif 000104
【図３５Ａ】
2021516757.tif 000105
【図３５Ｂ】
2021516757.tif 000106
【図３５Ｃ】
2021516757.tif 000107
【図３６Ａ】
2021516757.tif 000108
【図３６Ｂ】
2021516757.tif 000109
【図３６Ｃ】
2021516757.tif 000110
【図３７Ａ】
2021516757.tif 000111
【図３７Ｂ】
2021516757.tif 000112
【図３７Ｃ】
2021516757.tif 000113
【図３７Ｄ】
2021516757.tif 000114
【図３８Ａ】
2021516757.tif 000115
【図３８Ｂ】
2021516757.tif 000116
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月8日(2020.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021516757000001.app
【国際調査報告】
2021516757.tif 000117
2021516757.tif 000118
2021516757.tif 000119
2021516757.tif 000120