(57)【要約】  本開示は、生体サンプル中のタンパク質バイオマーカーの存在量及び／又は濃度を決定するための方法及び組成物を提供する。【選択図】図１
2021532360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、前記生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；そして
（２）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、前記少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、前記生体サンプル中のＣ１ｑの濃度を決定する前記少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量、を測定すること、
を含むアッセイ。
【請求項２】
ステップ（１）とステップ（２）との間で、前記生体サンプルに、前記少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む少なくとも１つの標識された合成Ｃ１ｑペプチドフラグメントを添加することをさらに含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの前記存在量を測定することが、ＳＲＭ−ＭＳによって得られた少なくとも１つのＣ１ｑペプチドに対応するシグナルを標準曲線と比較することを含む、請求項１又は請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記標準曲線が、
（ａ）既知量の精製Ｃ１ｑタンパク質とＣ１ｑ枯渇血清とを混合することによって少なくとも２つのＣ１ｑ濃度標準を調製し；
（ｂ）前記少なくとも２つのＣ１ｑ濃度標準に、前記Ｃ１ｑ濃度標準をタンパク質分解酵素と接触させた後に生成することが予想されるＣ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントと同じアミノ酸配列を有する少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを添加し；
（ｃ）前記少なくとも２つの標識されたＣ１ｑ濃度標準をタンパク質分解酵素と接触させて、Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；
（ｄ）選択反応モニタリング質量分析を実施して、Ｃ１ｑの前記少なくとも１つのペプチドフラグメントに対応するシグナルの強度、及び前記少なくとも２つの標識されたＣ１ｑ濃度標準の各々において前記少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントに対応するシグナルの強度を決定し；そして
（ｅ）前記シグナル及び前記既知量のＣ１ｑタンパク質を用いて標準曲線を決定すること、
を含む方法を用いて作成される、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記生体サンプルが：
ｉ）血液サンプル；及び／又は
ｉｉ）ヒトサンプル若しくは非ヒト霊長類サンプルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記少なくとも１つのペプチドフラグメントが：
ｉ）少なくとも５つのアミノ酸；及び／又は
ｉｉ）表２から選択されるペプチド；及び／又は
ｉｉｉ）ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）若しくはＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）；及び／又は
ｉｖ）ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）若しくはＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の少なくとも２つ；及び／又は
ｖ）ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）及びＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の各々、
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記選択反応モニタリング質量分析がＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアッセイ。
【請求項８】
少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含む組成物であって、前記組成物は、タンパク質Ｃ１ｑから選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含み、前記タンパク質Ｃ１ｑから選択される前記アミノ酸配列が、Ｃ１ｑを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させることによって生成するＣ１ｑペプチドフラグメントの配列である、組成物。
【請求項９】
前記Ｃ１ｑがヒト由来又は非ヒト霊長類由来である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの単離された合成ペプチドが少なくとも５つのアミノ酸を含む、請求項８〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのタンパク質分解酵素がトリプシンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアッセイ又は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの単離された合成ペプチドが標識されている、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの単離された合成ペプチドが表２から選択されるペプチドを含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの単離された合成ペプチドが、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）又はＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）を含み；任意選択的に、前記合成ペプチドＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）中のシステインが修飾され、また任意選択的に前記システインがカルバミドメチル化によって修飾される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも１つの遷移イオン対を含む組成物であって、前記組成物は前記タンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つの遷移イオン対を含み、前記少なくとも１つの遷移イオン対が、対応するｍ／ｚを有する前駆イオンと対応するイオンｍ／ｚを有するフラグメントイオンとからなり、前記遷移イオン対が、前駆体ＳＬＧＦＣ（Ｃａｍ）ＤＴＴＮＫ（配列番号４１）遷移対５７１．８−９４２．３、前駆体ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）遷移対３８３．１−５８１．１及び前駆体ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）遷移対４８７．０−３５０．３から選択される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、参照によりその内容が全体として本明細書中に組み込まれる、２０１８年８月８日に出願された、米国仮出願第６２／７１５，９７３号に対する優先権及びその利益を主張する。
【０００２】
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる配列表を含む。２０１９年７月２９日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、「ＲＥＧＥ−０１５−００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称であり、５０，２９５バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ１ｑは、自然免疫系の補体系に関与する重要で創薬可能なタンパク質である。ヒト由来の生体サンプル中のＣ１ｑの濃度を決定するためには、現在のところ、免疫ベースの方法がある。しかしながら、臨床前研究及び試験における重要なモデル生物である非ヒト霊長類由来のサンプル中のＣ１ｑの存在量をアッセイするための既存の免疫試薬は限られている。したがって、迅速で特異的かつ正確で、また高価で時間のかかる免疫試薬の開発を必要としない、ヒト、非ヒト霊長類及び他のモデル生物由来のサンプル中のＣ１ｑ濃度を決定することを対象とする方法及び組成物が当該技術分野で必要とされている。本開示はこれらのニーズに取り組む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生させ；そして（２）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑの濃度を決定する決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を測定することを含むアッセイを提供する。
【０００５】
前述のアッセイは、ステップ（１）とステップ（２）との間で、生体サンプルに、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む少なくとも１つの標識された合成Ｃ１ｑペプチドフラグメントを添加することをさらに含み得る。
【０００６】
前述のアッセイにおいて少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を測定することは、ＳＲＭ−ＭＳによって得られた少なくとも１つのＣ１ｑペプチドに対応するシグナルを標準曲線と比較することを含み得る。
【０００７】
本開示は、（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルを生成し；そして（３）シグナルを標準曲線と比較することによって、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを提供する。
【０００８】
前述のアッセイは、ステップ（１）とステップ（２）との間で、生体サンプルに、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを添加し、そしてステップ（２）とステップ（３）との間で、ＳＲＭ−ＭＳを実施して、少なくとも１つの標識された合成ペプチドに対応するシグナルを生成することをさらに含み得る。
【０００９】
生体サンプルは血液サンプルであり得る。生体サンプルはヒトサンプルであり得る。生体サンプルは非ヒト霊長類サンプルであり得る。
【００１０】
少なくとも１つのペプチドフラグメントは少なくとも５つのアミノ酸を含み得る。少なくとも１つのペプチドフラグメントは表２から選択されたペプチドを含み得る。
【００１１】
少なくとも１つのペプチドフラグメントは、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）又はＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）を含み得る。少なくとも１つのペプチドフラグメントは、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）又はＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の少なくとも２つを含み得る。少なくとも１つのペプチドフラグメントは、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）及びＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の各々を含み得る。
【００１２】
選択反応モニタリング質量分析はＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳであり得る。
【００１３】
少なくとも１つのタンパク質分解酵素はトリプシンであり得る。
【００１４】
標準曲線は：（ａ）既知量の精製Ｃ１ｑタンパク質とＣ１ｑ枯渇血清とを混合することによって少なくとも２つのＣ１ｑ濃度標準を調製し；（ｂ）少なくとも２つのＣ１ｑ濃度標準に、Ｃ１ｑ濃度標準をタンパク質分解酵素と接触させた後に産生されることが予想されるＣ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントと同じアミノ酸配列を有する少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを添加し；（ｃ）少なくとも２つの標識されたＣ１ｑ濃度標準をタンパク質分解酵素と接触させて、Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（ｄ）選択反応モニタリング質量分析を実施して、Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントに対応するシグナルの強度及び少なくとも２つの標識されたＣ１ｑ濃度標準の各々における少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントに対応するシグナルの強度を決定し；そして（ｅ）シグナル及び既知量のＣ１ｑタンパク質を用いて標準曲線を決定することを含む方法を用いて作成することができる。
【００１５】
本開示は、少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含む組成物を提供し、当該組成物は、タンパク質Ｃ１ｑから選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含む。
【００１６】
少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含む組成物であって、当該組成物は、タンパク質Ｃ１ｑから選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含み、タンパク質Ｃ１ｑから選択されるアミノ酸配列は、Ｃ１ｑを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させることによって生じるＣ１ｑペプチドフラグメントの配列である。
【００１７】
Ｃ１ｑタンパク質はヒト由来であり得る。Ｃ１ｑタンパク質は非ヒト霊長類由来であり得る。
【００１８】
少なくとも１つの単離された合成ペプチドは少なくとも５つのアミノ酸を含み得る。
【００１９】
タンパク質Ｃ１ｑから選択されるアミノ酸配列は、Ｃ１ｑを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させることによって生じるＣ１ｑペプチドフラグメントの配列であり得る。少なくとも１つのタンパク質分解酵素はトリプシンであり得る。
【００２０】
少なくとも１つの単離された合成ペプチドを標識することができる。
【００２１】
少なくとも１つの単離された合成ペプチドは表２から選択されるペプチドを含み得る。
【００２２】
少なくとも１つの単離された合成ペプチドは、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）又はＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）を含み得る。合成ペプチドＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）中のシステインを修飾することができる。修飾はカルバミドメチル化であり得る。
【００２３】
本開示は、少なくとも１つの遷移イオン対を含む組成物を提供し、当該組成物は、タンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つの遷移イオン対を含み、少なくとも１つの遷移イオン対は、対応するｍ／ｚを有する前駆イオンと、対応するイオンｍ／ｚを有するフラグメントイオンとからなる。
【００２４】
Ｃ１ｑタンパク質はヒト由来であり得る。Ｃ１ｑタンパク質は非ヒト霊長類由来であり得る。
【００２５】
本開示は、少なくとも１つの遷移イオン対を含む組成物を提供し、当該組成物は、タンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つの遷移イオン対を含み、少なくとも１つの遷移イオン対は、対応するｍ／ｚを有する前駆イオンと、対応するイオンｍ／ｚを有するフラグメントイオンとからなり、遷移イオン対は、前駆体ＳＬＧＦＣ（Ｃａｍ）ＤＴＴＮＫ（配列番号４１）遷移対５７１．８−９４２．３、前駆体ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）遷移対３８３．１−５８１．１及び前駆体ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）遷移対４８７．０−３５０．３から選択される。上記態様のいずれも、任意の他の態様と組み合わせることができる。
【００２６】
別段の定めのない限り、本明細書中で使用するすべての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書では、文脈で明らかに別段の記載がない限り、単数形は複数も含む；例として、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という語は、単数又は複数であると理解され、「又は（ｏｒ）」という語は、包括的であると理解される。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つ以上の要素を意味する。本明細書全体にわたり「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変化形は、明記された要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の排除を意味しないと理解される。約は、明記された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書中で提示するすべての数値は「約」という語によって修飾される。
【００２７】
本明細書中で記載されているものと類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験で使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。すべての刊行物、本明細書中で言及するすべての特許出願、特許、及び他の引例は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書中で引用する引例は、請求する発明の先行技術であると認められるものではない。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示のみであり、限定的であることを意図しない。開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
上記特徴及びさらなる特徴は、添付の図面とあわせると、以下の詳細な説明からより明らかに理解されるであろう。
【００２９】
【図１】図１は、ヒト、サル、マウス及びラット由来のＣ１ｑのＡサブユニットのアミノ酸配列アラインメントである。
【図２】図２は、ヒト、サル、マウス及びラット由来のＣ１ｑのＢサブユニットのアミノ酸配列アラインメントである。
【図３】図３は、ヒト、サル、マウス及びラット由来のＣ１ｑのＣサブユニットのアミノ酸配列アラインメントである。
【図４】図４は、本開示の方法及びＣ１ｑタンパク質のＡサブユニット由来のペプチドを使用して作成した較正曲線である。
【図５】図５は、本開示の方法及びＣ１ｑタンパク質のＢサブユニット由来のペプチドを使用して作成した較正曲線である。
【図６】図６は、本開示の方法及びＣ１ｑタンパク質のＣサブユニット由来のペプチドを使用して作成した較正曲線である。
【図７】図７は、ブランク消化物、ダブルブランク、ブランク、及び定量下限（ＬＬＯＱ）サンプルにおけるＣ１ｑのＡ、Ｂ、及びＣサブユニット由来の選択されたペプチドの一連のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図８】図８は、ハイライトされたピークのシグナル対ノイズ及び応答値を示す検出限界（ＬＯＤ）及びＬＬＯＱサンプルにおけるＣ１ｑのＡ、Ｂ、及びＣサブユニット由来の選択されたペプチドの一連のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図９】図９は、ＵＬＯＱサンプルの分析前後でのブランク消化物サンプル中のＣ１ｑのＡ、Ｂ、及びＣサブユニット由来の選択されたペプチドの一連のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、２０００μｇ／ｍＬの二重特異性抗体、２０μｇ／ｍＬの二重特異性抗体を追加又は二重特異性抗体を追加していないダブルブランク（Ｌ００）標準溶液中のＣ１ｑのＡ、Ｂ、及びＣサブユニット由来の選択されたペプチド及びＬＬＯＱサンプルのＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。
【図１１】図１１は、本開示の方法を用いて測定した、二重特異性抗体と共にインキュベートしたサンプル中のＣ１ｑ中の相対感度を示す一連のチャートである。
【図１２】図１２は、本開示の方法を用いて異なる希釈剤中に異なる希釈因子で希釈されたサンプル中の内因性Ｃ１ｑについて測定された相対感度を示す一連のチャートである。
【図１３】図１３は、本開示の方法を用いて異なる希釈剤中に異なる希釈因子で希釈されたサンプル中のＣ１ｑについて測定された相対感度を示す一連のチャートである。
【図１４】図１４は、本開示の方法を用いて３回の凍結解凍サイクルに供するか又は４８時間オートサンプラー中で保存したサンプル中のＣ１ｑについて測定された濃度の精度を示す一連のチャートを示す。
【図１５】図１５は、本開示の方法及びＣ１ｑのＡサブユニット由来の選択されたペプチドを用いて決定された、投薬されたサルから得られた血液サンプルにおいて長時間にわたるＣ１ｑ濃度を示すチャートである。
【図１６】図１６は、本開示の方法及びＣ１ｑのＢサブユニット由来の選択されたペプチドを用いて決定された、投薬されたサルから得られた血液サンプルにおいて長時間にわたるＣ１ｑ濃度を示すチャートである。
【図１７】図１７は、本開示の方法及びＣ１ｑのＣサブユニット由来の選択されたペプチドを用いて決定された、投薬されたサルから得られた血液サンプルにおいて長時間にわたるＣ１ｑ濃度を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示は、生体サンプルにおけるタンパク質バイオマーカーの存在量及び／又は濃度を決定するための方法及び組成物を提供する。いくつかの態様において、このタンパク質バイオマーカーはタンパク質Ｃ１ｑである。いくつかの態様において、本開示の方法は、液体クロマトグラフィー選択反応モニタリング質量分析（ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ）分析を含む。
【００３１】
補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）は、自然免疫系の一部である補体系に関与するタンパク質複合体である。Ｃ１ｑはＣ１ｒ及びＣ１ｓと一緒になって、Ｃ１複合体を形成する。Ｃ１ｑは、１８個のポリペプチドサブユニット：６個のＡ−サブユニット、６個のＢ−サブユニット、及び６個のＣ−サブユニットから構成される４００ｋＤａタンパク質である。補体阻害剤は、いくつかの疾患の治療で成功裏に用いられてきた。Ｃ１ｑ標的化モノクローナル抗体は、伝統的な補体経路を含む自己免疫疾患用療法として見込みがある。Ｃ１ｑ標的治療法の開発には、実験室での研究及び臨床試験の間に生体サンプル中のＣ１ｑレベルの濃度を決定するための方法が必要である。現在のところ、ヒトサンプル中のＣ１ｑ存在量を決定するには、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイの使用が必要となる。さらに、非ヒト霊長類サンプル中のＣ１ｑを分析するための免疫試薬は限られており、それらは臨床前研究及び試験の重要な態様である。したがって、ヒト、非ヒト霊長類及び他のモデル生物由来の生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定するための改善されたアッセイが必要とされる。
【００３２】
ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ法は、標的タンパク質に対する絶対的構造特異性及び好適な内部標準が利用される場合は標的タンパク質濃度の相対若しくは絶対測定の両方を提供するので、液体クロマトグラフィー選択反応モニタリング質量分析（ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ）法が非常に望ましい。
【００３３】
本開示の方法
本開示の様々な方法を本明細書中で詳細に記載する。
【００３４】
本開示は：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；そして（２）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を測定することを含むアッセイを含む方法を提供する。
【００３５】
いくつかの態様において、前述の方法は、ステップ（１）とステップ（２）との間で、生体サンプルに、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む少なくとも１つの標識された合成Ｃ１ｑペプチドフラグメントを添加することをさらに含み得る。
【００３６】
本開示はまた：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルを生成し；そして（３）シグナルを標準曲線と比較することによって、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを含む方法も提供する。
【００３７】
いくつかの態様において、前述の方法は、ステップ（１）とステップ（２）との間で、生体サンプルに、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを添加し、そしてステップ（２）とステップ（３）との間で、ＳＲＭ−ＭＳを実施して、少なくとも１つの標識された合成ペプチドに対応するシグナルを生成することをさらに含み得る。
【００３８】
いくつかの態様において、生体サンプルは血液サンプルであり得る。好ましい態様では、生体サンプルは血清サンプルであり得る。いくつかの態様において、生体サンプルはヒトサンプルであり得る。あるいは、生体サンプルは非ヒト霊長類サンプルであり得る。非ヒト霊長類はＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ又はＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａであり得る。
【００３９】
いくつかの態様において、Ｃ１ｑタンパク質は、ヒトＣ１ｑタンパク質であり得る。他の態様では、Ｃ１ｑタンパク質は、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  Ｃ１ｑタンパク質である。さらに別の態様では、Ｃ１ｑタンパク質はｃａｎ  ｂｅ  Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ  Ｃ１ｑタンパク質であり得る。Ｃ１ｑタンパク質は表１に示す配列のいずれかを含み得る。
【００４０】
【表１−１】
2021532360.tif 000003
【表１−２】
2021532360.tif 000004
【表１−３】
2021532360.tif 000005
【表１−４】
2021532360.tif 000006
【００４１】
前述の方法のいくつかの態様において、タンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０又は少なくとも２０のアミノ酸を含む。
【００４２】
前述の方法のいくつかの態様において、タンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントは表２から選択されるペプチドを含む。他の態様では、少なくとも１つのペプチドフラグメントは、タンパク質Ｃ１ｑのトリプシンペプチドを含む。
【００４３】
【表２】
2021532360.tif 000007
【００４４】
前述の方法のいくつかの態様において、タンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントは、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）又はＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）を含む。他の態様では、少なくとも１つのペプチドフラグメントは、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）又はＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の少なくとも２つを含む。さらに別の態様において、少なくとも１つのペプチドフラグメントは、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）及びＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の各々を含む。
【００４５】
したがって、本開示は：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントであって、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）及びＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の各々を含む少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）ＳＲＭ−ＭＳを実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルであって、前駆体ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）遷移対５７１．８−９４２．３、前駆体ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）遷移対３８３．１−５８１．１、及び前駆体ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）遷移対４８７．０−３５０．３の各々を含む遷移イオン対に係るＳＲＭ−ＭＳシグナルを生成し；そして（３）シグナルを標準曲線と比較することによって、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを含む方法を包含する。
【００４６】
本開示はまた：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントであって、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）及びＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の各々を含む少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）生体サンプルに、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）及びＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の各々のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを添加し；（３）ＳＲＭ−ＭＳを実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルであって、前駆体ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）遷移対５７１．８−９４２．３、前駆体ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）遷移対３８３．１−５８１．１、及び前駆体ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）遷移対４８７．０−３５０．３の各々を含む遷移イオン対に係るＳＲＭ−ＭＳシグナルと、少なくとも１つの標識された合成ペプチドに対応するシグナルと、を生成し；そして（４）シグナルを標準曲線と比較することによって、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを含む方法も包含する。
【００４７】
本開示はまた：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントであって、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）を含む少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルであって、前駆体ＳＬＧＦＣ（Ｃａｍ）ＤＴＴＮＫ（配列番号４１）遷移対５７１．８−９４２．３を含む遷移イオン対に係るＳＲＭ−ＭＳシグナルを生成し；そして（３）正規化シグナルを標準曲線と比較することによって、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを含む方法も包含する。
【００４８】
本開示はまた：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントであって、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）を含む少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）生体サンプルに、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを添加し；（３）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルであって、前駆体ＳＬＧＦＣ（Ｃａｍ）ＤＴＴＮＫ（配列番号４１）遷移対５７１．８−９４２．３を含む遷移イオン対に係るものである前記ＳＲＭ−ＭＳシグナルと、少なくとも１つの標識された合成ペプチドに対応するシグナルとを生成し；そして（４）正規化シグナルを標準曲線と比較することによって少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを含む方法も包含する。
【００４９】
本開示はまた：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントであって、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）を含む少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルであって、前駆体ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）遷移対３８３．１−５８１．１を含む遷移イオン対に係るＳＲＭ−ＭＳシグナルを生成し；そして（３）シグナルを標準曲線と比較することによって、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを含む方法も包含する。
【００５０】
本開示はまた：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントであって、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）を含む少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）生体サンプルに、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）のアミノ酸配列を同じアミノ酸配列を含む少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを添加し；（３）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルであって、前駆体ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）遷移対３８３．１−５８１．１を含む遷移イオン対に係るＳＲＭ−ＭＳシグナル、及び少なくとも１つの標識された合成ペプチドに対応するシグナルを産生し；そして（４）シグナルを標準曲線と比較することによって、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを含む方法も包含する。
【００５１】
本開示はまた：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントであって、ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）を含む少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルであって、前駆体ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）遷移対４８７．０−３５０．３を含む遷移イオン対に係るＳＲＭ−ＭＳシグナルを生成し；そして（３）シグナルを標準曲線と比較することによって、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを含む方法も包含する。
【００５２】
本開示は：（１）生体サンプルを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と接触させて、生体サンプル中に存在するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントであって、ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）を含む少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（２）生体サンプルに、ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを添加し；（３）選択反応モニタリング質量分析（ＳＲＭ−ＭＳ）を実施して、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントに対応するシグナルであって、前駆体ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）遷移対４８７．０−３５０．３を含む遷移イオン対に係るＳＲＭ−ＭＳシグナル、及び少なくとも１つの標識された合成ペプチドに対応するシグナルを生成し；そして（４）シグナルを標準曲線と比較することによって、少なくとも１つのＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量であって、生体サンプル中のＣ１ｑ濃度を決定する、を含むアッセイを含む方法も包含する少なくともＣ１ｑペプチドフラグメントの存在量を決定することを含むアッセイを含む方法も包含する。
【００５３】
本開示の方法のいくつかの態様では、選択反応モニタリング質量分析はＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳである。
【００５４】
本開示の方法のいくつかの態様では、少なくとも１つのタンパク質分解酵素はトリプシンである。限定されるものではないが、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｎプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ、Ａｓｐ−Ｎプロテアーゼ又はキモトリプシンを含む他の好適なタンパク質分解酵素は、当業者には公知であろう。
【００５５】
本開示の方法のいくつかの態様では、標準曲線は：（ａ）既知量の精製Ｃ１ｑタンパク質とＣ１ｑ枯渇血清とを混合することによって少なくとも２つのＣ１ｑ濃度標準を調製し；（ｂ）少なくとも２つのＣ１ｑ濃度標準に、Ｃ１ｑ濃度標準をタンパク質分解酵素と接触させた後に産生されることが予想されるＣ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントと同じアミノ酸配列を有する少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを添加し；（ｃ）少なくとも２つの標識されたＣ１ｑ濃度標準をタンパク質分解酵素と接触させて、Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントを産生し；（ｄ）選択反応モニタリング質量分析を実施して、Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントに対応するシグナルの強度及び少なくとも２つの標識されたＣ１ｑ濃度標準の各々における少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントに対応するシグナルの強度を決定し；そして（ｅ）シグナル及び既知量のＣ１ｑタンパク質を用いて標準曲線を決定することを含む方法を用いて産生することができる。
【００５６】
いくつかの態様において、標準曲線は、少なくとも３、又は少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は少なくとも８、又は少なくとも９、又は少なくとも１０のＣ１ｑ濃度標準を用いて作成することができる。いくつかの態様において、Ｃ１ｑ濃度標準の調製は、精製Ｃ１ｑタンパク質をＣ１ｑ枯渇血清中に希釈又は連続希釈することを含み得、希釈因子は、１：１、１：１．５、又は１：２、又は１：２．５、又は１：３、又は１：３．５、又は１：４、又は１：５、又は１：６、又は１：７、又は１：８、又は１：９、又は１：１０、又は１：１００、又は１：１０００、又は１：１〜１：１００００の範囲内の任意の希釈因子であり得る。
【００５７】
本開示の方法のいくつかの態様では、少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントは、生体サンプルをタンパク質分解酵素と接触させる前に、生体サンプルに添加することができる。
【００５８】
本開示のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントを本開示の方法のトラブルシューティングのために使用することができる。
【００５９】
本開示のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの標識された合成ペプチドフラグメントに相当するシグナルを使用して、標識された合成ペプチドフラグメントが相当するタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つのペプチドフラグメントのシグナルを正規化することができる。
【００６０】
本開示の方法のいくつかの態様では、Ｃ１ｑ標準曲線を使用して生体サンプル中のＣ１ｑ存在量を測定することができる。所定の標準サンプル中のＣ１ｑペプチドの存在量を規定することができ、結果を、生体サンプル中に見られる、対応するＣ１ｑペプチドからのＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ結果と比較した。これにより、生体サンプル中のペプチドの存在量の算出が可能になる。したがって、サンプル中のペプチドの存在量を知ることによって、それが相当するタンパク質の存在量を決定する。
【００６１】
本開示の組成物
本開示の様々な組成物を本明細書中で詳細に記載する。
【００６２】
本開示は、少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含む組成物を提供し、当該組成物は、タンパク質Ｃ１ｑから選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含む。
【００６３】
合成ペプチドは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて生成させることができる。これらの方法は、細菌における発現又は真核細胞溶解物におけるインビトロ発現などの組換え発現技術を含み得る。これらの方法は固相合成も含み得る。
【００６４】
合成ペプチドをアイソトープで標識することができる。それらを標識することができるアイソトープには、13Ｃ、2Ｈ、15Ｎ及び18Ｏが含まれる。標識されたペプチドは、少なくとも１つの13Ｃ標識及び／又は15Ｎ標識リジン残基、又は少なくとも１つの13Ｃ標識及び／又は15Ｎ標識アルギニン残基を含み得る。ペプチドはまた、極性溶媒も含み得る。極性溶媒は、水及びエタノールと水との混合物を含み得る。
【００６５】
本開示の組成物のいくつかの態様において、Ｃ１ｑタンパク質はヒトＣ１ｑタンパク質であり得る。他の態様では、Ｃ１ｑタンパク質はＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  Ｃ１ｑタンパク質である。さらに別の態様では、Ｃ１ｑタンパク質はＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａであり得る。Ｃ１ｑタンパク質は表１に示す配列のいずれかを含み得る。
【００６６】
本開示の組成物のいくつかの態様において、少なくとも１つの単離された合成ペプチドは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０又は少なくとも２０個のアミノ酸を含む。
【００６７】
本開示の組成物のいくつかの態様において、単離された合成ペプチドは、Ｃ１ｑをタンパク質分解酵素と接触させることによって生じるＣ１ｑペプチドフラグメントの配列を含む。好ましい態様では、タンパク質分解酵素はトリプシンである。したがって、好ましい態様では、単離された合成ペプチドはＣ１ｑのトリプシンペプチドである。
【００６８】
本開示の組成物のいくつかの態様では、単離された合成ペプチドを標識する。単離された合成ペプチドはアイソトープで標識することができる。それらを標識することができるアイソトープには、限定されるものではないが、13Ｃ、2Ｈ、15Ｎ及び18Ｏが含まれ得る。ペプチドはまた、極性溶媒も含み得る。極性溶媒は、水、エタノールと水とアセトニトリルとの混合物を含み得る。
【００６９】
本開示の組成物のいくつかの態様において、単離された合成ペプチドは表２から選択されるペプチドを含む。他の態様では、組成物は表２に記載する任意の２つのペプチドを含む。他の態様では、組成物は、表２で記載する、任意の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９個のペプチドを含んでいた。
【００７０】
好ましい態様において、本開示の組成物は、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）又はＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）を含む少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含み得る。組成物は、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）又はＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の少なくとも２つを含む、少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含み得る。更に別の態様では、組成物は、ＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）又はＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）の各々を含む少なくとも１つの単離された合成ペプチドを含み得る。
【００７１】
本開示の組成物のいくつかの態様において、合成ペプチドＳＬＧＦＣＤＴＴＮＫ（配列番号２６）中のシステインを修飾することができる。修飾はカルバミドメチル化であり得る。
【００７２】
本開示は少なくとも１つの遷移イオン対を含む組成物を提供し、当該組成物は、タンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つの遷移イオン対を含み、少なくとも１つの遷移イオン対は、対応するｍ／ｚを有する前駆イオンと、対応するイオンｍ／ｚを有するフラグメントイオンとからなる。
【００７３】
本開示の組成物のいくつかの態様では、Ｃ１ｑタンパク質はヒトＣ１ｑタンパク質であり得る。他の態様では、Ｃ１ｑタンパク質は、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  Ｃ１ｑタンパク質である。さらに別の態様では、Ｃ１ｑタンパク質はＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａであり得る。Ｃ１ｑタンパク質は、表１に示す配列のいずれかを含み得る。
【００７４】
本開示は、少なくとも１つの遷移イオン対を含む組成物を提供し、当該組成物はタンパク質Ｃ１ｑの少なくとも１つの遷移イオン対を含み、少なくとも１つの遷移イオン対は、対応するｍ／ｚを有する前駆イオンと、対応するイオンｍ／ｚを有するフラグメントイオンとからなり、遷移イオン対は、前駆体ＳＬＧＦＣ（Ｃａｍ）ＤＴＴＮＫ（配列番号４１）遷移対５７１．８−９４２．３、前駆体ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）遷移対３８３．１−５８１．１及び前駆体ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）遷移対４８７．０−３５０．３から選択される。
【００７５】
定義
本明細書中で使用する場合、「ｍ／ｚ」は、イオンの質量対電荷比を意味する。
【００７６】
本明細書中で使用する場合、「ＭＳ／ＭＳ」は、質量分析の複数の段階を含み、フラグメント化のある形態が段階間で起こる、質量分析の一種である、タンデム質量分析を表す。
【００７７】
本明細書中で使用する場合、「ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ」は、「選択反応モニタリング」の頭字語であり、「ＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ」又は「ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳ」と交換可能に使用することができる。
【００７８】
ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳはタンデム質量分析の高度に選択的な方法であり、所望の検体（複数可）を除くすべての分子及び汚染物質を効果的にろ過して除去する見込みがある。これは、分析サンプルが所定の分析ウインドウ内のいくつかのアイソバリック種を含み得る複合混合物である場合、特に有益である。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ法は、三連四重極質量分析計を利用することができ、これは、当該技術分野で公知のように、３つの四重極ロッドセットを含む。集団選択の第一段階は第一四重極ロッドセットにおいて実施され、選択的に伝播されたイオンは第二の四重極ロッドセットにおいてフラグメント化される。結果として得られた遷移（生成物）イオンは第三の四重極ロッドセットに搬送され、これは集団選択の第二段階を実施する。第三の四重極ロッドセットを介して伝達された生成物イオンは検出器によって測定され、これは選択的に伝達された生成物イオンの数を表すシグナルを生成する。第一及び第三の四重極に適用されるＲＦ及びＤＣ電位を調整して、狭い指定範囲内にあるｍ／ｚ値を有する（それぞれの）前駆体及び生成物イオンを選択する。適切な遷移（前駆体及び生成物イオンのｍ／ｚ値）を特定することによって、標的化タンパク質に相当するペプチドは、高度の感度及び選択性で測定することができる。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳにおけるシグナル対ノイズ比は、多くの場合、特定の検体を選択的に標的化（フィルター）するのではなく、サンプルにおいてすべての検体を調査することを目的とする従来型タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）実験よりも優れている。
【００７９】
ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ質量分析は気相イオンのフラグメント化を含み、質量分析の異なる段階の間で行われる。イオンをフラグメント化するために使用される多くの方法があり、これらにより、様々なタイプのフラグメント化と、したがって分子の構造及び組成に関する様々な情報を得ることができる。ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳスペクトルにおいて観察される遷移イオンがいくつかの異なる因子から得られ、これらは、限定されるものではないが、一次配列、内部エネルギーの量、エネルギーを導入する手段、及び荷電状態が挙げられる。遷移は、検出される少なくとも１つの荷電を搬送しなければならない。ペプチドの本来のＮ末端を含む遷移上にある場合、イオンはａ、ｂ又はｃのいずれかとして分類され、一方、荷電がペプチドの本来のＣ末端を含む遷移上にある場合、イオンはｘ、ｙ又はｚのいずれかとして分類される。下付き文字は、遷移中の残基の位置（例えば、Ｃ末端からのｘ1の第一ペプチド残基、Ｃ末端からのｙ2の第二ペプチド残基、及びＣ末端からのｚ3の第三ペプチド残基など）を示す。
【００８０】
−Ｎ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ−で表される一般的なペプチド繰り返し単位において、ｘイオン及びカルボニル−炭素結合（すなわち、Ｃ（Ｏ）−Ｃ）の切断から得られるイオン。ｘイオンはアシリウムイオンであり、ａイオンはイミニウムイオンである。ｙイオン及びｂイオンは、カルボニル−窒素結合（すなわち、Ｃ（Ｏ）−Ｎ、アミド結合としても知られる）の切断により得られる。この場合、ｙイオンはアンモニウムイオンであり、ｂイオンはアシリウムイオンである。最後に、ｚイオン及びｃイオンは、窒素−炭素（すなわち、Ｃ−Ｎ）結合の切断により得られる。ｚイオンはカルボカチオンであり、ｃイオンはアンモニウムイオンである。
【００８１】
上付き文字は、バックボーンフラグメント化に加えて、ニュートラルロスを示すために使用される場合があり、例えば、アンモニアの損失の＊や、水の損失の°である。プロトンに加えて、ｃイオン及びｙイオンは、前駆体ペプチドから追加のプロトンを除去し得る。エレクトロスプレーイオン化では、トリプシンペプチドは、１より多い電荷を有し得る。
【００８２】
内部遷移は二重バックボーン切断から生じる。これらは、ｂ型及びｙ型切断（すなわち、ｂ及びｙイオンを生じる切断）の組み合わせによって形成することができる。内部切断イオンはまた、ａ型及びｙ型切断の組み合わせによって形成することもできる。ａ型及びｙ型切断の組み合わせによって形成される単一側鎖を用いた内部遷移は、イミニウムイオン（イモニウム又はインモニウムイオンとも称する場合がある）と呼ばれる。これらのイオンは、対応するアミノ酸の一文字コードで標識される。
【００８３】
低エネルギーＣＩＤ（すなわち、三連四重極又はイオントラップにおける衝突によって誘発された解離）は、主にそのバックボーンに沿った正電荷を有するペプチドのフラグメント化を含み、主にａ、ｂ及びｙイオンを生成する。
【００８４】
１つ以上の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）精製ステップをその後のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ分析ステップ前に実施する。伝統的なＬＣ分析はサンプル成分とカラム充填材との間の化学的相互作用に依存し、カラムを通るサンプルの層流は、関心対象の検体を試験サンプルから分離するための基盤である。当業者は、そのようなカラムにおける分離が拡散過程であることを理解するであろう。様々なカラム充填材がサンプルのクロマトグラフ分離に利用可能であり、適切な分離プロトコルの選択は、サンプル特性、関心対象の検体、存在する妨害物質及びそれらの特性などに依存する経験過程である。様々な充填化学を、ニーズ（例えば、精製される化合物の構造、極性、及び溶解度）に応じて使用することができる。様々な態様において、カラムは、極性、イオン交換（カチオン及びアニオンの両方）、疎水性相互作用、フェニル、Ｃ−２、Ｃ−８、Ｃ−１８カラム、多孔質ポリマー上の極性コーティング、又は商業的に入手可能なその他のものである。クロマトグラフィーの間、材料の分離は、溶離剤（「移動相」としても知られる）の選択、勾配溶出及び勾配条件の選択、温度などの変数によって影響を受ける。ある特定の態様において、検体は、関心対象の検体がカラム充填材によって可逆的に保持される一方で、１つ以上の他の材料は保持されない条件下でサンプルをカラムにかけることによって精製することができる。これらの態様では、関心対象の検体がカラムによって保持される第一移動相条件を用いることができ、第二移動相条件をその後用い、保持されていない材料を洗い流したら、保持された材料をカラムから分離することができる。別法として、１つ以上の他の材料と比較して異なる速度で関心対象の検体が溶出する移動相条件かでサンプルをカラムにかけることによって検体を生成することができる。上述のように、そのような手順で、１つ以上の関心対象の検体の量をサンプルの１つ以上の他の成分と比較して濃縮することができる。
【００８５】
以下のパラメータを使用して、特定のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳシステムのもとでタンパク質のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳアッセイを特定する：（１）タンパク質のトリプシンペプチド；（２）ペプチドの保持時間（ＲＴ）；（３）ペプチド前駆イオンのｍ／ｚ値；（４）前駆イオンをイオン化するために使用されるクラスタ分離電位；（５）ペプチド前駆イオンから生じるフラグメントイオンのｍ／ｚ値；及び（６）特定のペプチドについて最適化されるペプチド前駆イオンをフラグメント化するために使用される衝突エネルギー（ＣＥ）。
【００８６】
本明細書中で使用する場合、「ＩＳＰ」は「内部標準ペプチド」を指す。
【００８７】
本明細書中で開示する方法によるペプチド遷移の正確な定量化を促進するために、関心対象のペプチドのアイソトープで標識された合成体のセットを既知量で内部標準としての使用のためのサンプルに添加することができる。アイソトープで標識されたペプチドは対応するサロゲートペプチドと同じ物理的及び化学的性質を有するので、それらはクロマトグラフカラムから共溶出し、結果として得られるマススペクトルに関して容易に同定可能である。標識された標準の添加は、タンパク質消化の前又は後で行うことができる。アイソトープで標識されたペプチドを合成する方法は当業者には公知であろう。したがって、いくつかの態様において、実験サンプルは内部標準ペプチドを含む。他の態様は、外部標準又はペプチド定量化のための他の手段を利用することができる。
【００８８】
本明細書中で使用する場合、「トリプシンペプチド」は、タンパク質のトリプシンでの処理によって形成されるペプチドを指す。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、用語「標準曲線」は、用語「較正曲線」と交換可能に使用することができる。
【００９０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別段の記載がない限り、複数の指示対象を包含する。
【００９１】
具体的に明記されていないか又は文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用する場合、用語「又は（ｏｒ）」は、「又は（ｏｒ）」と「及び（ａｎｄ）」との両方を含み、対象とすると理解される。
【００９２】
具体的に明記されていないか又は文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用する場合、用語「約」は、当該技術分野の一般公差の範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内と理解される。約は、明記された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書中で提示されるすべての数値は用語「約」で修飾される。
【００９３】
別段の定めのない限り、本明細書中で使用されるすべての科学技術用語は本発明が関連する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で記載するものと類似又は均等な他のプローブ、組成物、方法、及びキットを本開示の実施で使用することができるが、好ましい材料及び方法を本明細書中で記載する。本明細書中で使用する専門用語は、特定の態様を記載するためだけのものであり、限定することを意図するものではないと理解すべきである。
【実施例】
【００９４】
実施例１  本開示の方法を使用したＣ１ｑ濃度標準曲線の決定
Ｃ１ｑ標準及び品質管理（ＱＣ）サンプルを含む、既知Ｃ１ｑ濃度のＣ１ｑ基準溶液のセットを使用して、較正曲線とも称する標準曲線を作製するために本開示の方法を使用した。本開示の方法の感度及び精度も試験した。
【００９５】
調製したＣ１ｑ標準サンプルを使用して較正曲線を作成し、以下のガイドラインを使用して適用した：
精製Ｃ１ｑタンパク質を実験サンプルと同じ生体マトリックス中に希釈した。
試験したＣ１Ｑ基準溶液のセットは、ダブルブランク、ブランク、及び少なくとも６つの非ゼロ濃度のＣ１ｑから構成されていた。
定量下限（ＬＬＯＱ）は、ＬＬＯＱサンプルの測定された応答がブランクサンプルの応答と比較して少なくとも５倍であるので、精度が公称濃度の２５％以内であり、変動係数が２５％未満であるＣ１ｑタンパク質の濃度と定義される。
定量上限（ＵＬＯＱ）は、精度が公称濃度の２０％以内であり、変動係数が２０％未満であるように定義される。
【００９６】
較正曲線は、以下のガイドラインを使用して作成し適用したＣ１ｑ  ＱＣサンプルを用いて作成した：
少なくとも３つの濃度のＱＣサンプルを調製し、較正のために使用した。
各ＱＣサンプルを二連で調製した。
ＱＣサンプルは、アッセイの低、中及び高定量範囲を対象とし、低ＱＣ（ＬＱＣ）サンプルはＬＬＯＱの濃度の３倍以内であった。
ＱＣサンプルの少なくとも６７％の精度は公称濃度の２０％以内であった。
各レベルでのＱＣサンプルの少なくとも５０％の精度は公称濃度の２０％以内であった。
最小数のＱＣサンプルは未知サンプルの数の少なくとも５％以上又は６つの総ＱＣサンプルであった。
ＱＣサンプルは、Ｃ１ｑ基準溶液の調製のためにストック溶液とは別のＣ１ｑストック溶液を用いて調製した。
【００９７】
材料：
精製ヒト補体タンパク質Ｃ１ｑ（Ｑｕｉｄｅｌ、Ｉｔｅｍ＃Ａ４００）
補体Ｃ１ｑ枯渇血清、ヒト（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃２３４４０１−１ＭＬ）
ＳＬＧＦＣ（Ｃａｍ）ＤＴＴＮＫ（配列番号４１）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）
ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）
ＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）
二重特異性モノクローナル抗体薬剤候補
再懸濁緩衝液を追加したシーケンシング等級の修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃．Ｖ５１１７）
ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  １．０Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１５５６７−０２７）
ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  １．０Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃１５５６８−０２５）
ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  １．０Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．５（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｃａｔ＃Ｊ６１０３８）
尿素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ｕ５１２８−１００Ｇ）
ＴＣＥＰ  ＨＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ＃２０４９１）
ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃａｔ＃Ａ３２２１−１０ＶＬ）
ギ酸（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｃａｔ＃２８９０５）
アセトニトリル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃａｔ＃Ａ９５５−４）
ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ１３０  Ｃ１８カラム、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｐａｒｔ＃  １８６００３５５５４）
９６ウェルプレート、０．５ｍＬ、ポリプロピレン（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐａｒｔ＃５０４２−１３８６）
２５ｍＬの使い捨て試薬容器（ＶｉｓｔａＬａｂ、Ｐａｒｔ＃  ３０５４−１００４）
ＴｒｉｐｌｅＱｕａｄ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｍｏｄｅｌ＃６４９５）
１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｍｏｄｅｌ＃１２９０）
【００９８】
サンプル調製
２００μｇ／ｍＬのＣ１ｑストック溶液を、Ｃ１ｑ枯渇ヒト血清及び、２０μｇ／ｍＬの二重特異性モノクローナル抗体薬剤候補を含むアッセイ希釈緩衝液（ＡＤＢ）中で調製した。Ｃ１ｑストック溶液を１〜３、６回連続希釈して、６つのＣ１ｑ標準溶液（Ｌ６〜Ｌ１）を調製した。ＬＬＯＱ（定量下限）、低ＱＣ、中ＱＣ、高ＱＣ、及びＵＬＯＱ（定量上限）サンプルをＣ１ｑストック溶液から独立してＡＤＢ中で調製した。ＡＤＢのアリコートをＬ０（ブランク）サンプルとして保存した。Ｃ１ｑ標準及びＱＣ溶液の濃度を表３に記載する。
【００９９】
【表３】
2021532360.tif 000008
【０１００】
以下のアイソトープ標識内部標準ペプチド（ＩＳＰ）を、０．１％ギ酸中３０％アセトニトリル中で６〜１２ｍＭに再構成して、アイソトープ標識ＩＳＰ溶液：ＳＬＧＦＣ（Ｃａｍ）ＤＴＴＮＫ（配列番号４１）、ＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）、及びＱＴＨＱＰＰＡＰＮＳＬＩＲ（配列番号３６）を作製した。
【０１０１】
各Ｃ１ｑサンプルを１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び２０μｇ／ｍＬの二重特異性抗体中で５０倍に希釈した。各々５μＬの希釈されたＣ１ｑサンプルを次いで変性させ、２０μＬの８Ｍ尿素及び１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）中、５６℃で振盪しながら３０分間還元した。５μＬの５０ｍＭヨードアセトアミドを次いで各サンプルに添加し、サンプルを次いで暗所にて２５℃で振盪しながら３０分間インキュベートした。１０μＬの適切なアイソトープ標識ＩＳＰ溶液を次いで各サンプルに添加した。ＩＳＰの添加後、１００μＬの０．０１μｇ／μＬトリプシンも各サンプルに添加した。サンプルを次いで３７℃にて暗所で振盪しながら４時間インキュベートした。５μＬの２０％のギ酸をサンプルに添加して、トリプシン消化反応をクエンチした。サンプルを混合し、４６８０ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０１０２】
ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ分析
ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ分析を、１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ  ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｍｏｄｅｌ＃１２９０）を備えたＴｒｉｐｌｅＱｕａｄ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｍｏｄｅｌ＃６４９５）で実施した。使用したＬＣ勾配を表４に記載し、ここで、緩衝液Ａは０．１％水中ギ酸からなり、緩衝液Ｂは０．１％アセトニトリル中ギ酸から構成されていた。
【０１０３】
【表４】
2021532360.tif 000009
【０１０４】
ＳＲＭ−ＭＳ分析はサンプル中の天然のＣ１ｑペプチドフラグメントとアイソトープ標識ペプチドとを同時にモニタリングした。２つの遷移（天然及び重標識（ｈｅａｖｙ  ｌａｂｅｌ））のピーク面積を集め、天然アイソトープ標識Ｃ１ｑペプチドの両方について報告した。各Ｃ１ｑ標準及びＱＣサンプルについて、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳによって分析されたＣ１ｑタンパク質のデータ出力は、下記表５に記載する３つの選択されたペプチドの各々からの２つの遷移測定（天然及び重標識）からなる６つの測定値を得た。
【０１０５】
【表５】
2021532360.tif 000010
【０１０６】
表５中の３つのペプチドの各々は、Ｃ１ｑの異なるサブユニットから得られる。サブユニットＢ由来のペプチドフラグメントを定量ペプチド（本明細書中ではサブユニットＢペプチドと称する）として使用し、サブユニットＡ（本明細書中ではサブユニットＡペプチドと称する）及びＣ（本明細書中ではサブユニットＣペプチドと称する）由来のペプチドフラグメントを確認ペプチドとして使用した。アイソトープ標識ＩＳＰは、３つの選択されたペプチドの各々と同じであり、本明細書中でアイソトープ標識サブユニットＡ対照ペプチド、アイソトープ標識サブユニットＢ対照ペプチド、及びアイソトープ標識サブユニットＣ対照ペプチドと称するアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
表５に記載する３つのペプチドを、これらのペプチドがＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳアッセイ中のＣ１ｑ濃度を定量するための最良のペプチドであることを示す先の結果に基づいた。これらのペプチドの選択は、ヒトとサル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）との間のペプチド配列の保存に一部基づいていた。図１は、  サブユニットＡペプチドをハイライトしたヒト、サル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、マウス及びラットＣ１ｑのサブユニットＡの配列アラインメントを示す。図２は、サブユニットＢペプチドをハイライトするヒト、サル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）及びマウス及びラットＣ１ｑのサブユニットＢの配列アラインメントを示す。図３は、サブユニットＣペプチドをハイライトするヒト、サル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、マウス及びラットＣ１ｑのサブユニットＣの配列アラインメントを示す。Ｃ１ｑのＡ、Ｂ及びＣサブユニットの各々から得られる複数のトリプシンペプチドをまず試験した。試験したペプチドを表２に示す。
【０１０８】
結果
各Ｃ１ｑ標準サンプル及び各Ｃ１ｑ  ＱＣサンプルを、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。各サンプルについて、６つのシグナル：天然のサブユニットＡペプチドに対応するシグナル、天然のサブユニットＢペプチドに対応するシグナル、天然のサブユニットＣペプチドに対応するシグナル、アイソトープ標識サブユニットＡ対照ペプチドに対応するシグナル、アイソトープ標識サブユニットＢ対照ペプチドに対応するシグナル及びアイソトープ標識サブユニットＣ対照ペプチドに対応するシグナルが記録された。アイソトープ標識ペプチドのデータを、アッセイ性能トラブルシューティングのための内部標準として使用した。
【０１０９】
３つの選択されたペプチド（サブユニットＡペプチド、サブユニットＢペプチド、及びサブユニットＣペプチド）の各々について、Ｃ１ｑ標準サンプルから記録された正規化ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳシグナルをそれらのサンプルの対応する公称濃度に対してプロットすることによって較正曲線を作成した。図４は、サブユニットＡペプチドに相当するシグナルを用いて作成された較正曲線を示す。図５は、サブユニットＢペプチドに相当するシグナルを用いて作成された較正曲線を示す。図６は、サブユニットＣペプチドに相当するシグナルを用いて作成された較正曲線を示す。図４〜６について、黒色の点は濃度Ｌ１〜Ｌ６のＣ１ｑ標準サンプルを表す。青色の三角は、ＬＬＯＱ、ＬＱＣ、ＭＱＣ、ＨＱＣ、及びＵＬＯＱ  濃度のＣ１ｑ  ＱＣサンプルを表す。
【０１１０】
較正曲線を作成した後、較正曲線に相当するＱＣサンプル中の３つの標的ペプチドの各々のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳシグナルを比較することによって、ＱＣサンプルの濃度を決定した。アッセイの精度は、決定された濃度をＱＣサンプルの公称濃度と比較することによって評価した。比較結果を表６〜８に示す。
【０１１１】
【表６】
2021532360.tif 000011
【０１１２】
【表７】
2021532360.tif 000012
【０１１３】
【表８】
2021532360.tif 000013
【０１１４】
これらの結果は、アッセイが正確かつ高精度であることを示す。これらはまた、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳにより高い応答が記録され、シグナルはバックグラウンド干渉がないので、Ｃ１ｑのサブユニットＢ由来のペプチドＩＡＦＳＡＴＲ（配列番号２９）の使用で最良の結果が得られたことも示している。
【０１１５】
ＬＬＯＱ及び検出限界（ＬＯＤ）
図７の左及び中央のカラムに示すように、サブユニットＡペプチド及びサブユニットＢペプチドについてＬＬＯＱ濃度（０．２７μｇ／ｍＬ）で記録されたマスクロマトグラムは、ブランク及びダブルブランクサンプルにおけるペプチドピークと同じ捕捉時間に位置するバックグラウンドピークを殆ど乃至全く示さなかった。しかしながら、図７の右パネルに示すように、サブユニットＣペプチドについて記録されたマスクロマトグラムはブランク及びダブルブランクサンプルにおいてバックグラウンドピークを示した。ブランクサンプルにおいてバックグラウンドピークの曲線の下の面積は、サンプルピークの曲線の下の面積の約５％であった。全体として、図８に示すように、ＬＬＯＱ濃度でのサブユニットＡペプチド、サブユニットＢペプチド及びサブユニットＣペプチドのシグナル対ノイズ比は、それぞれ、５１、３６、９４であり、検出限界（ＬＯＤ）濃度では、それぞれ、７、９及び６であった。
【０１１６】
実施例２  本開示の方法の試験器具キャリーオーバー
本開示の方法は同じ器具に対して連続実験を実施するために使用する場合があるので、最後のサンプルからのキャリーオーバーが次のサンプルのアッセイを妨害しないことを確実にすることが重要である。本開示の方法を実施する間の器具キャリーオーバーを測定した。
【０１１７】
ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳクロマトグラムをまずブランク消化物サンプルについて記録した。直後、ＵＬＯＱ濃度（６６．７μｇ／ｍＬ）のＣ１ｑ  ＱＣサンプルのマスクロマトグラムを同じ器具で記録した。最後に、第二ブランク消化物サンプルをＵＬＯＱサンプルの分析後に同じ器具で分析した。図９に示すように、サブユニットＡ、サブユニットＢ又はサブユニットＣペプチドのＵＬＯＱサンプルの分析前後でブランク消化物クロマトグラムにおいて有意な変化はなかった。これらの結果は、本開示の方法の器具キャリーオーバーが最小であることを示す。
【０１１８】
実施例３  本開示の方法の薬剤耐性の試験
抗体薬剤の存在が本開示の方法を妨害するか否かを調べるために、様々な濃度（０、２０μｇ／ｍＬ、又は２０００μｇ／ｍＬ）の二重特異性抗体をダブルブランク（ブランクマトリックスのみ、内部標準なし；Ｌ００）濃度のＣ１ｑ基準サンプルに添加した。図１０に示すように、二重特異性抗体の添加は、記録されたマスクロマトグラムにおいて有意な変化をもたらさなかった。
【０１１９】
ＬＱＣ、ＭＱＣ及びＨＱＣ濃度（それぞれ、０．８μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ及び５０．０μｇ／ｍＬ）のＣ１ｑ基準サンプルを二重特異性抗体の非存在下又は０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、若しくは２０００μｇ／ｍＬの二重特異性抗体のいずれかと共にインキュベートし、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。Ｃ１ｑアッセイにおいてこれらの濃度の二重特異性抗体は、ニートな血清中１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、又は１００ｍｇ／ｍＬの二重特異性抗体に相当していた。これらの濃度を薬物動態でとらえると、５０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与した場合、二重特異性抗体６のピーク血清濃度（Ｃmax）は１．２５〜１．５ｍｇ／ｍＬである。図１１に示すように、二重特異性抗体を添加することによって、サブユニットＡ、サブユニットＢ及びサブユニットＣペプチドのシグナル回復が実際に改善される。図１１において、各群におけるピンク色又は一番目の棒グラフは二重特異性抗体の非存在下でインキュベートされたサンプルに相当し；各群における黄色又は二番目の棒グラフは２０μｇ／ｍＬの二重特異性抗体と共にインキュベートされたサンプルに相当し；各群における緑色又は三番目の棒グラフは４０μｇ／ｍＬの二重特異性抗体と共にインキュベートされたサンプルに相当し；各群における青色又は四番目の棒グラフは２０００μｇ／ｍＬの二重特異性抗体と共にインキュベートされたサンプルに相当する。
【０１２０】
実施例４  本開示の方法の希釈回復及び希釈直線性の試験
本開示の方法における内因性Ｃ１ｑシグナルの回復も、様々な希釈剤中、様々な希釈因子で希釈されたサンプルにおいて試験した。試験した希釈剤は、２０μｇ／ｍＬの二重特異性抗体、２％枯渇ヒト血清、０．１％ＢＳＡ及びトリス−ＨＣｌ溶液と共にインキュベートした２％枯渇ヒト血清を含んでいた。これらのサンプルを２０倍、５０倍及び１００倍に希釈し、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳを使用して希釈物を分析した。図１２に示すように、二重特異性抗体の添加によって、さらに高い希釈因子でも、サブユニットＡ、サブユニットＢ及びサブユニットＣペプチドシグナルの回復が改善される。０．１％ＢＳＡ及びトリス−ＨＣｌで希釈されたサンプルでのシグナルの回復はより低かった。図１２において、各群における青色または一番目の棒グラフは、２０μｇ／ｍＬの二重特異性抗体とともにインキュベートした２％枯渇ヒト血清で希釈されたサンプルに相当し；各群におけるオレンジ色又は二番目の棒グラフは２％枯渇ヒト血清で希釈されたサンプルに相当し；各群における緑色又は三番目の棒グラフは０．１％ＢＳＡで希釈されたサンプルに相当し；各群における紫色又は四番目の棒グラフはトリス−ＨＣｌで希釈されたサンプルに相当する。
【０１２１】
異なる希釈剤を使用したＣ１ｑ参考基準からのシグナルの回復も試験した。ＬＱＣ、ＭＱＣ及びＨＱＣ濃度（それぞれ、０．８μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ及び５０．０μｇ／ｍＬ）のＣ１ｑ基準サンプルを、２０μｇ／ｍＬの二重特異性抗体と共にインキュベートした２％枯渇ヒト血清、２％枯渇ヒト血清又は０．１％ＢＳＡのいずれかで希釈した。図１３に示すように、二重特異性抗体は、サブユニットＡ、サブユニットＢ及びサブユニットＣペプチドシグナルの回復を改善した。図１３において、各群中の青色又は一番目の棒グラフは、２０μｇ／ｍＬの二重特異性抗体と共にインキュベートした２％枯渇ヒト血清で希釈したサンプルに相当し；各群中のオレンジ色又は二番目の棒グラフは、２％枯渇ヒト血清で希釈したサンプルに相当し；各群中の緑色又は三番目の棒グラフは、０．１％ＢＳＡで希釈したサンプルに相当する。
【０１２２】
本開示の方法の希釈直線性を試験するために、プールしたヒト血清、オスサル、及びメスサルサンプルを２０倍、５０倍、及び１００倍に希釈した。これらの希釈したサンプル中の内因性Ｃ１ｑ濃度を、本開示の方法を用いて決定した。この試験の結果を下記表９に示す。
【０１２３】
【表９】
2021532360.tif 000014
【０１２４】
実施例５  本開示の方法におけるサンプル調製再現性及びサンプル安定性
本開示の方法のサンプル調製再現性は、ＬＬＯＱ、ＬＱＣ、ＭＱＣ、ＨＱＣ、及びＵＬＯＱ濃度にてＣ１ｑ  ＱＣサンプルを用いて試験した。注射再現性のために、同じＱＣサンプルのアリコートを、同じ日（ｉｎｔｒａ−ｄａｙ）又は異なる日（ｉｎｔｅｒ−ｄａｙ）のいずれかにアッセイ器具に注入した。サンプル調製再現性のために、サンプルを同日（ｉｎｔｒａ−ｄａｙ）又は異なる日（ｉｎｔｅｒ−ｄａｙ）のいずれかでＱＣ溶液から調製した。各状態に対して３個のサンプルを試験し、各状態に対する３個のサンプルの相対的標準偏差を下記表１０に示す。
【０１２５】
【表１０】
2021532360.tif 000015
【０１２６】
サンプル安定性に関して、ＬＬＯＱ、ＬＱＣ、ＭＱＣ、ＨＱＣ、及びＵＬＯＱ濃度（それぞれ、０．３μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、５０．０μｇ／ｍＬ、及び６６．７μｇ／ｍＬ）のＣ１ｑ  ＱＣサンプルを、３回の凍結解凍サイクルに供するか、又は４８時間オートサンプラー中で保存した後、それらのＣ１ｑ濃度をＣ１ｑアッセイによって決定した。図１４に示すように、本開示の方法の精度は、３回の凍結解凍サイクルによって、又はオートサンプラー中で４８時間保存することによって、大きく影響を受けなかった。図１４のチャートの最上列で、各群における一番目の棒グラフは、凍結前に新たに分析したサンプルに相当する；各群における二番目の棒グラフは、３回の凍結解凍サイクルに供したサンプルに相当する。図１４のチャートの最下列で、各群における一番目の棒グラフは、新たに分析したサンプルに相当する；各群における二番目の棒グラフは、オートサンプラー中で４８時間貯蔵した後に分析したサンプルに相当する。
【０１２７】
別の実験で、７２時間貯蔵も試験し、サンプル劣化又は損失は観察されなかった。
【０１２８】
実施例６  本開示の方法における内部標準ペプチドに関連するアッセイ変形
内部標準ペプチド（ＩＳＰ）と呼ばれる重アイソトープ標識ペプチドは、サブユニットＡ、サブユニットＢ及びサブユニットＣペプチドと同じアミノ酸配列を有する。ＬＬＯＱ、ＬＱＣ、ＭＱＣ、ＨＱＣ、及びＵＬＯＱ濃度（それぞれ、０．３μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、６．３μｇ／ｍＬ、５０．０μｇ／ｍＬ及び６６．７μｇ／ｍＬ）のＣ１ｑ  ＱＣサンプルを各ＩＳＰの存在下及び非存在下で分析した。この分析の結果を表１１に示す。ＩＳＰを含むことは分析を妨害しなかった。したがって、アイソトープ標識ペプチドを保持時間確認、器具性能較正、及びトラブルシューティングのために使用した。
【０１２９】
【表１１】
2021532360.tif 000016
【０１３０】
実施例６  本開示の方法を使用して処置したサル由来の血液サンプル中のＣ１ｑの定量
本開示の方法を使用して、二重特異性抗体で処置したサルの血液サンプル中に存在するＣ１ｑタンパク質の濃度を定量した。サル群指定及び服用レベルを表１２に示す。
【０１３１】
【表１２】
2021532360.tif 000017
【０１３２】
１群には、２ｍＬ／ｋｇの服用量で緩徐ボーラス静脈内注射（ｓｌｏｗ  ｂｏｌｕｓ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によりアイソタイプ対照抗体を希釈投与した。２、３、及び４群には、２ｍＬ／ｋｇの用量で緩徐ボーラス静脈内注射により希釈された二重特異性抗体を投与した。０．５ｍＬの血液サンプルを以下のスケジュールにしたがって集めた：投薬前サンプル及び投薬後約５分のサンプルを第１日に集めた；その後のサンプルは、投薬後２４時間、７２時間及び１６８時間で集めた；サンプルはまた、投薬後第１４日、投薬後第４２日及び投薬後第５６日の各々で１回集めた。血液サンプルを収集後１時間遠心分離し、収集した血清サンプルを、５０μＬずつ、４つのアリコートに分割した。
【０１３３】
各サル血清サンプルを、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び２０μｇ／ｍＬの二重特異性抗体中で５０倍に希釈した。５μＬの各々の希釈されたサル血清サンプルを次いで変性させ、２０μＬの８Ｍ尿素及び１０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）中、５６℃にて振盪しながら３０分還元させた。５μＬの５０ｍＭヨードアセトアミドを次に各サンプルに添加し、サンプルを次いで暗所にて２５℃で振盪しながら３０分間インキュベートした。１０μＬの適切なアイソトープ標識内部標準ペプチド溶液（実施例１を参照）を添加した後、１００μＬの０．０１μｇ／μＬトリプシンを各サンプルに添加した。サンプルを次いで３７℃にて暗所で振盪しながら４時間インキュベートした。５μＬの２０％のギ酸をサンプルに添加して、トリプシン消化反応をクエンチした。サンプルを混合し、４６８０ｒｐｍで５分間混合した後、それらをＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【０１３４】
各サル血清サンプルについて、ＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳ／ＭＳを使用して、サブユニットＡペプチド、サブユニットＢペプチド及びサブユニットＣペプチドに対応するシグナル、並びにアイソトープ標識内部標準ペプチドに対応するシグナルを記録した。
【０１３５】
投薬されたサルの血清サンプルの各々におけるＣ１ｑ濃度は、サブユニットＡ、サブユニットＢ及びサブユニットＣペプチドのシグナルを較正曲線（実施例１で記載するように作成）と比較することによって決定した。サブユニットＡペプチド、サブユニットＢペプチド及びサブユニットＣペプチドによって決定されるＣ１ｑの濃度を、表１３〜１５に示す。サル血液中のＣ１ｑ濃度の投薬後の時間経過を図１５〜１７に示す。図１５は、サブユニットＡペプチドを使用して定量した投薬サルサンプル中のＣ１ｑ濃度を示す。図１６は、サブユニットＢペプチドを使用して定量した投薬サルサンプル中のＣ１ｑ濃度を示す。図１７は、サブユニットＣペプチドを使用して定量した投薬サルサンプル中のＣ１ｑ濃度を示す。図１５〜１７において、青色の線は１群のサルに相当し、赤色の線は２群のサルに相当し、緑色の線は３群のサルに相当し、紫色の線は４群のサルに相当する。
【０１３６】
【表１３】
2021532360.tif 000018
【０１３７】
＊推定Ｃ１ｑ濃度。ＬＬＯＱ（０．２７μｇ／ｍＬ）より低いがＬＯＤ（０．０２７μｇ／ｍＬ）より高い濃度。
【０１３８】
【表１４】
2021532360.tif 000019
【０１３９】
＊推定Ｃ１ｑ濃度。ＬＬＯＱ（０．２７μｇ／ｍＬ）より低いがＬＯＤ（０．０２７μｇ／ｍＬ）より高い濃度。
【０１４０】
【表１５】
2021532360.tif 000020
【０１４１】
＊推定Ｃ１ｑ濃度。ＬＬＯＱ（０．２７μｇ／ｍＬ）より低いがＬＯＤ（０．０２７μｇ／ｍＬ）より高い濃度。
【図１】
2021532360.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021532360.tif 000030
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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