(57)【要約】  説明されているのは、グルコアミラーゼを使用してデンプン含有物質を糖化する方法、発酵産物を製造する方法、及びこの方法により製造された発酵産物、並びに本願で説明されているグルコアミラーゼの内の少なくとも１種を使用して反芻動物中でのデンプン消化率を増加させる方法である。【選択図】図１
2021516058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプン基質を糖化する方法であって、前記デンプン基質と、
ａ．配列番号７、若しくは８、若しくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｂ．配列番号７若しくは８のアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｃ．配列番号７若しくは８の触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｄ．配列番号９の触媒ドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
ｅ．シグナルペプチダーゼによるか若しくは発現宿主からの分泌中での翻訳後修飾による、配列番号１、２、若しくは３のポリペプチドのプロセシングにより生じる成熟ポリペプチド
からなる群から選択されるグルコアミラーゼとを接触させることを含み、
前記糖化を、２．０〜６．０のｐＨで実行する、
方法。
【請求項２】
前記デンプン基質の糖化により、高グルコースシロップが生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高グルコースシロップは、少なくとも９５．５％のグルコースからなるリストから選択されるグルコースの量を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記高グルコースシロップを最終生成物へと発酵させることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
糖化及び発酵を同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスとして実行する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記最終生成物はアルコールであり、例えばエタノールである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記最終生成物は、アミノ酸、有機酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、リシン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、バイオディーゼル、及びイソプレンからなる群から選択される生化学物質である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項８】
前記デンプン基質は、乾燥固体（ＤＳ）が約５％〜９９％、１５％〜５０％、又は４０〜９９％である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記デンプン基質は、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、コメ、ソルガム、ふすま、キャッサバ、ミロ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、タピオカ、及びこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記デンプン基質は、液化デンプン、ゼラチン化デンプン、又は顆粒状デンプンを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記デンプン基質に、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、レドックス酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、ヒドロラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、又はこれらの組み合わせを添加することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
デンプン基質を糖化し且つ発酵させて、最終生成物を生成する方法であって、前記デンプン基質と、
ａ）配列番号７、若しくは８、若しくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号７若しくは８のアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号７若しくは８の触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号９の触媒ドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
ｅ）シグナルペプチダーゼによるか若しくは発現宿主からの分泌中での翻訳後修飾による、配列番号１、２、若しくは３のポリペプチドのプロセシングにより生じる成熟ポリペプチド
からなる群から選択されるグルコアミラーゼとを接触させることを含み、
前記糖化及び発酵を、２．０〜６．０のｐＨで実行し、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ５．０で実行し、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ４．０で実行し、より好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ３．０で実行する、
方法。
【請求項１３】
糖化及び発酵を同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスとして実行する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記最終生成物はアルコールであり、例えばエタノールである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記糖化され且つ発酵したデンプン基質により、同一のデンプン基質とＡｎＧＡとの接触と比較して、ＤＰ３＋のレベルが低下し、且つＤＰ１のレベルが上昇する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記最終生成物は、アミノ酸、有機酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、リシン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、バイオディーゼル、及びイソプレンからなる群から選択される生化学物質である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１７】
動物中でのデンプン消化率を増加させる方法であって、動物用の飼料に、飼料添加剤として、
ａ）配列番号７、若しくは８、若しくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号７若しくは８のアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号７若しくは８の触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号９の触媒ドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
ｅ）シグナルペプチダーゼによるか若しくは発現宿主からの分泌中での翻訳後修飾による、配列番号１、２、若しくは３のポリペプチドのプロセシングにより生じる成熟ポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のグルコアミラーゼを添加することを含み、前記グルコアミラーゼは、（ａ）ｐＨ６のみでの又は第一胃液の存在下での酵素の活性と比較して、ペプシン又は第一胃液の存在下における３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有するか、又は少なくとも２０％高い残留活性を有し、（ｂ）前記酵素は、膵アミラーゼと共に機能してグルコース収量を増加させる、
方法。
【請求項１８】
前記動物が反芻動物である場合には、前記酵素は、第一胃、第四胃、及び小腸を含む、前記反芻動物の３種の消化室の内の少なくとも２種で活性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１種のグルコアミラーゼは、生デンプンを使用するグルコース放出アッセイで測定した場合に生デンプンを加水分解し得る、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号４、５、又は６のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレチド。
【請求項２１】
発現宿主中におけるコードされるポリペプチドの産生を制御する１種又は複数種の制御配列に作動可能に連結されている請求項２０に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記調節配列は、コードヌクレオチド配列に対して異種であるか、又は前記調節配列及びコード配列は、自然界で共に見出されるように配列されていない、ベクター。
【請求項２２】
請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞。
【請求項２３】
トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ）、又はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の細胞である、請求項２２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、又はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の細胞である、請求項２２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２５】
エタノール生産微生物である、請求項２２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２６】
プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂肪分解酵素、メタロ脂肪分解酵素、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、アルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、トランスフェラーゼ、又はこれらの組み合わせを含む群から選択される１種又は複数種の追加の酵素をさらに発現して分泌する、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
下記からなる群から選択される少なくとも１種のグルコアミラーゼを含む、飼料添加剤組成物又はプレミックス：
（ａ）配列番号７、８、若しくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号７、８、若しくは９のアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号７、８、若しくは９の触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号７、８、若しくは９のリンカー及び触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；又は
（ｅ）シグナルペプチダーゼによるか若しくは発現宿主からの分泌中での翻訳後修飾による、配列番号１、２、若しくは３のポリペプチドのプロセシングにより生じる成熟ポリペプチド；並びに／又は
（ｆ）任意選択的に少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミン。
【請求項２８】
プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、及びフィターゼからなる群から選択される酵素の内の１つ又は複数をさらに含む、請求項２７に記載の飼料添加剤組成物又はプレミックス。
【請求項２９】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸菌、及び酵母からなる群から選択される１種又は複数種の直接給餌微生物をさらに含む、請求項２７又は２８に記載の飼料添加剤組成物又はプレミックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７８５７５号に対する優先権を主張し、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、少なくとも１種のグルコアミラーゼを使用してデンプン含有物質を糖化する及び／又は加水分解する方法に関する。本開示のグルコアミラーゼを、デンプンの消化を増強するための動物用飼料添加剤としても使用し得る。さらに、本開示はまた、発酵産物を製造する方法、及びこの方法により製造される発酵産物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
グルコアミラーゼ（１，４−アルファ−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）は、デンプン又は関連するオリゴ糖分子及び多糖分子の非還元末端からのＤ−グルコースの放出を触媒する酵素である。グルコアミラーゼは、数種の糸状菌及び酵母により産生される。
【０００４】
グルコアミラーゼの１つの非限定的な主な用途は、部分的にプロセシングされたデンプン／デキストリンのグルコースへの糖化であり、このグルコースは、多くの発酵プロセスに必須の基質である。次いで、このグルコースは、発酵生物を使用して、直接的に又は間接的に発酵産物へと変換され得る。市販の発酵産物の例として、下記が挙げられる：アルコール（例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール）；有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、グルコン酸塩、乳酸、コハク酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸）；ケトン（例えばアセトン）；アミノ酸（例えばグルタミン酸）；気体（例えば、Ｈ２及びＣＯ２）、及びより複雑な化合物。
【０００５】
多様な群の微生物がグルコアミラーゼを産生することが報告されているが、商業目的のためのグルコアミラーゼは、この酵素を細胞外に大量に分泌することから、従来では糸状菌を用いて製造されてきた。
【０００６】
糖化又は発酵を低ｐＨで実行してもよく、なぜならば、典型的には発酵生物はｐＨを急速に下げ、一部のラクトバチルス属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）は、約３．５までｐＨをさらに下げ得るからである。別の態様では、低ｐＨ値により、汚染のリスクが最小限に抑えられるだろう。しかしながら、商業的に使用されている真菌グルコアミラーゼには、低いｐＨ感度、又は低ｐＨ（例えば６未満のｐＨ等）での低い性能／活性等の特定の制限がある。
【０００７】
ペプシンの存在下において低ｐＨで活性であるグルコアミラーゼは、反芻動物用の飼料添加剤として有用であり得る。反芻動物用の飼料添加剤として使用される酵素は、主に線維分解酵素であり、例えば、セルラーゼ、ベータ−グルカナーゼ、及びヘミセルラーゼである（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．）Ａ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｅｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｓ．Ｃａｎ．Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．８４：２３−３６の表１）。反芻動物用のデンプンヒドロラーゼに関する報告は限られている。
【０００８】
飼料中の及び飼料源中のデンプンの消化率は非常に変動しやすく、且つデンプン及び飼料マトリックスの両方の物理的構造等の多くの因子に依存する。２００５年２月１７日に公開された米国特許出願公開第２００５／００３７０５３号明細書には、アミラーゼ活性を有し、且つ単胃動物（例えば家禽及びブタ）用のデンプンを含む飼料中の難消化性デンプンを分解し得る酵素の使用が開示されている。２００８年１月１７日に公開された国際公開第２００８／０６８８１号パンフレットには、乳量、食餌の見かけの消化率、飼料乾物の消失、体重増加、及び／又は飼料変換率を改善するための、ウシ亜科の反芻動物用の飼料中での細菌アミラーゼの使用が開示されている。２０１５年９月３日に公開された国際公開第２０１５／１２８３６６号パンフレットには、トウモロコシ及び／又はトウモロコシサイレージの消化率を改善するための、特に、乳量、体重増加、及び／又は飼料変換率を改善するための、ウシ亜科の反芻動物用の飼料中での、１種又は複数種のプロテアーゼと組み合わせた細菌アミラーゼの使用が開示されている。従って、動物のデンプン消化率を増加させることが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、糖化及び／若しくは発酵の最中での低ｐＨ耐性を改善するために、又はデンプン含有飼料が給餌された動物のデンプン消化率を増加させるために、新規のグルコアミラーゼを探索する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、少なくとも１種のグルコアミラーゼを使用してデンプン含物質を糖化する方法に関する。また、本開示のグルコアミラーゼを動物用の飼料添加剤として使用して、デンプンの消化も増強し得る。本方法の態様及び実施形態を、下記の独立して番号を付した段落で説明する。
１．一態様では、デンプン基質を糖化する方法であって、デンプン基質と、
ａ）配列番号７、若しくは８、若しくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号７若しくは８のアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号７若しくは８の触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号９の触媒ドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
ｅ）シグナルペプチダーゼによるか若しくは発現宿主からの分泌中での翻訳後修飾による、配列番号１、２、若しくは３のポリペプチドのプロセシングにより生じる成熟ポリペプチド
からなる群から選択されるグルコアミラーゼとを接触させることを含み、
糖化を、２．０〜６．０のｐＨで実行する、
方法。
２．デンプン基質の糖化により高グルコースシロップが生じる、段落１に記載の方法の一部の実施形態。
３．高グルコースシロップは、少なくとも９５．５％のグルコースからなるリストから選択されるグルコースの量を含む、段落１又は２に記載の方法の一部の実施形態。
４．高グルコースシロップを最終生成物へと発酵させることをさらに含む、段落１〜３のいずれか一つに記載の方法の一部の実施形態。
５．糖化及び発酵を同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスとして実行する、段落４に記載の方法の一部の実施形態。
６．最終生成物はアルコールであり、例えばエタノールである、段落４又は５に記載の方法の一部の実施形態。
７．最終生成物は、アミノ酸、有機酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、リシン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、バイオディーゼル、及びイソプレンからなる群から選択される生化学物質である、段落４又は５に記載の方法の一部の実施形態。
８．デンプン基質は、乾燥固形分（ＤＳ）が約５％〜９９％、１５％〜５０％、又は４０〜９９％である、段落１〜７のいずれか一つに記載の方法の一部の実施形態。
９．デンプン基質は、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、コメ、ソルガム、ふすま、キャッサバ、ミロ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、タピオカ、及びこれらの任意の組み合わせから選択される、段落１〜８のいずれか一つに記載の方法の一部の実施形態。
１０．デンプン基質は、液化デンプン、ゼラチン化デンプン、又は顆粒状デンプンを含む、段落１〜９のいずれか一つに記載の方法の一部の実施形態。
１１．デンプン基質に、ヘキソキナーゼ、キシラナーゼ、グルコースイソメラーゼ、キシロースイソメラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、トレハラーゼ、イソアミラーゼ、レドックス酵素、エステラーゼ、トランスフェラーゼ、ペクチナーゼ、ヒドロラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、又はこれらの組み合わせを添加することをさらに含む、段落１〜１０のいずれか一つに記載の方法の一部の実施形態。
１２．別の態様では、デンプン基質を糖化し且つ発酵させて、最終生成物を生成する方法であって、デンプン基質と、
ａ）配列番号７、若しくは８、若しくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号７若しくは８のアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号７若しくは８の触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号９の触媒ドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
ｅ）シグナルペプチダーゼによるか若しくは発現宿主からの分泌中での翻訳後修飾による、配列番号１、２、若しくは３のポリペプチドのプロセシングにより生じる成熟ポリペプチド
からなる群から選択されるグルコアミラーゼとを接触させることを含み、
糖化及び発酵を、２．０〜６．０のｐＨで実行し、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ５．０で実行し、好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ４．０で実行し、より好ましくはｐＨ２．０〜ｐＨ３．０で実行する、
方法。
１３．糖化及び発酵を同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスとして実行する、段落１２に記載の方法の一部の実施形態。
１４．最終生成物はアルコールであり、例えばエタノールである、段落１２又は１３に記載の方法の一部の実施形態。
１５．糖化され且つ発酵したデンプン基質により、同一のデンプン基質とＡｎＧＡとの接触と比較して、ＤＰ３＋のレベルが低下し、且つＤＰ１のレベルが上昇する、段落１２に記載の方法の一部の実施形態。
１６．最終生成物は、アミノ酸、有機酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、リシン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、バイオディーゼル、及びイソプレンからなる群から選択される生化学物質である、段落１２又は１３に記載の方法の一部の実施形態。
１７．別の態様では、動物中でのデンプン消化率を増加させる方法であって、動物用の飼料に、飼料添加剤として、
ａ）配列番号７、若しくは８、若しくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号７若しくは８のアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号７若しくは８の触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号９の触媒ドメインのアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は
ｅ）シグナルペプチダーゼによるか若しくは発現宿主からの分泌中での翻訳後修飾による、配列番号１、２、若しくは３のポリペプチドのプロセシングにより生じる成熟ポリペプチド
からなる群から選択される少なくとも１種のグルコアミラーゼを添加することを含み、
前記グルコアミラーゼは、（ａ）ｐＨ６のみでの又は第一胃液（ｒｕｍｉｎ  ｆｌｕｉｄ）（例えばペプシン含有第一胃液）の存在下での酵素の活性と比較して、ペプシン又は第一胃液（ｒｕｍｉｎ  ｆｌｕｉｄ）（例えばペプシン含有第一胃液）の存在下における３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有するか、又は少なくとも２０％高い残留活性を有し、（ｂ）酵素は、膵アミラーゼと共に機能してグルコース収量を増加させる、
方法。
１８．動物が反芻動物である場合には、前記酵素は、第一胃、第四胃、及び小腸を含む、反芻動物の３種の消化室の内の少なくとも２種で活性である、段落１７に記載の方法の一部の実施形態。
１９．前記少なくとも１種のグルコアミラーゼは生デンプンを加水分解し得る、段落１６又は１７に記載の方法の一部の実施形態。
２０．別の態様では、配列番号４、５、又は６のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
２１．別の態様では、発現宿主中におけるコードされるポリペプチドの産生を制御する１種又は複数種の制御配列に作動可能に連結されている段落２０に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記調節配列は、コードヌクレオチド配列に対して異種であるか、又は前記調節配列及びコード配列は、自然界で共に見出されるように配列されていない、ベクター。
２２．別の態様では、段落２０に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞。
２３．トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ）、又はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の細胞である、段落２２に記載の組換え宿主細胞の一部の実施形態。
２４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、又はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の細胞である、段落２２に記載の組換え宿主細胞の一部の実施形態。
２５．エタノール生産微生物である、段落２２に記載の宿主細胞の一部の実施形態。
２６．プロテアーゼ、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂肪分解酵素、メタロ脂肪分解酵素（ｍｅｔａｌｌｏｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、アルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、フィターゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、トランスフェラーゼ、又はこれらの組み合わせを含む群から選択される１種又は複数種の追加の酵素をさらに発現して分泌する、段落２２〜２５のいずれか一つに記載の組換え宿主細胞の一部の実施形態。
２７．別の態様では、下記からなる群から選択される少なくとも１種のグルコアミラーゼを含む飼料添加剤組成物又はプレミックス：
（ａ）配列番号７、８、若しくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号７、８、若しくは９のアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号７、８、若しくは９の触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号７、８、若しくは９のリンカー及び触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；又は
（ｅ）シグナルペプチダーゼによるか若しくは発現宿主からの分泌中での翻訳後修飾による、配列番号１、２、若しくは３のポリペプチドのプロセシングにより生じる成熟ポリペプチド；並びに／又は
（ｆ）任意選択的に少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミン。
２８．プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、及びフィターゼからなる群から選択される酵素の内の１つ又は複数をさらに含む、段落２７に記載の飼料添加剤組成物又はプレミックスの一部の実施形態。
２９．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸菌、及び酵母からなる群から選択される１種又は複数種の直接給餌微生物をさらに含む、段落２７又は２８に記載の飼料添加剤組成物又はプレミックスの一部の実施形態。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＴｅＧＡ、ＦｒａＧＡ１、ＷｃｏＧＡ１、及び他の真菌グルコアミラーゼのＣＬＵＳＴＡＬＷ多重配列アラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
下記の配列は、米国連邦規則法典第３７巻規則１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願のための要件−配列規則」）を順守しており、且つ世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）、欧州特許条約（ＥＰＣ）及び特許協力条約（ＰＣＴ）規則５．２及び４９．５（ａ−ｂｉｓ）、並びに実施細則の第２０８章及び附属書Ｃの配列表要件と一致している。ヌクレオチド及びアミノ酸の配列データのために使用される記号及びフォーマットは、米国連邦規則法典第３７巻§１．８２２に規定された規則を順守している。
【００１３】
配列番号１は、ＦｒａＧＡ１の前駆体タンパク質配列である。
【００１４】
配列番号２は、ＷｃｏＧＡ１の前駆体タンパク質配列である。
【００１５】
配列番号３は、ＴｅＧＡの前駆体タンパク質配列である。
【００１６】
配列番号４は、ＦｒａＧＡ１遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００１７】
配列番号５は、ＷｃｏＧＡ１遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号６は、ＴｅＧＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号７は、ＦｒａＧＡ１の予測される成熟タンパク質配列である。
【００２０】
配列番号８は、ＷｃｏＧＡ１の予測される成熟タンパク質配列である。
【００２１】
配列番号９は、ＴｅＧＡの成熟タンパク質配列である。
【００２２】
配列番号１０は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の野生型グルコアミラーゼであり、ＮＣＢＩアクセッションナンバーがＸＰ＿００１３９０５３０．１である。
【００２３】
配列番号１１は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来の野生型グルコアミラーゼであり、ＰＤＢアクセッションナンバーが２ＶＮ４＿Ａである。
【００２４】
配列番号１２は、ＫＺＴ６７２６３．１（ＮＣＢＩアクセッションナンバー）である。
【００２５】
配列番号１３は、ＸＰ＿００２４７５３６９．１（ＮＣＢＩアクセッションナンバー）である。
【００２６】
配列番号１４は、米国特許出願公開第２００９０３２５２４０号明細書で説明されいてる配列番号１８４７である。
【００２７】
配列番号１５は、ＫＺＴ０９２２６．１（ＮＣＢＩアクセッションナンバー）である。
【００２８】
配列番号１６は、国際公開第２０１６１９６２０２号パンフレットで説明されている配列番号１２である。
【００２９】
配列番号１７は、米国特許出願公開第２０１７０３１４００３号明細書で説明されている配列番号２である。
【００３０】
配列番号１８は、ＧＡＤ９５６３９．１（ＮＣＢＩアクセッションナンバー）である。
【００３１】
配列番号１９は、米国特許出願公開第２０１７０３０６３０９号明細書で説明されている配列番号２３である。
【００３２】
配列番号２０は、ＣＡＣ２８０７６．１（ＮＣＢＩアクセッションナンバー）である。
【００３３】
引用した全ての特許、特許出願、及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示では、多くの用語及び略語が使用される。特に断らない限り、下記の定義が適用される。
【００３４】
「含む」という用語は、特許請求の範囲で言及されるような述べられた特徴、整数、工程、又は成分の存在を意味するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、工程、成分、又はこれらの群の存在又は追加を排除するものではない。「含む」という用語は、「から本質的になる」及び「からなる」という用語により包含される実施形態を含むことが意図されている。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語により包含される実施形態を含むことが意図されている。数値と結び付けて本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途この用語が文脈中で具体的に定義されていない限り、数値の±０．５の範囲を指す。例えば、「約６のｐＨ値」という語句は、別途ｐＨ値が具体的に定義されていない限り、５．５〜６．５のｐＨ値を指す。
【００３５】
別途定義されない限り、使用される全ての技術用語及び科学用語は、関連する科学分野における通常の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明を説明する用語の内の多くの通常の意味を提供する。
【００３６】
「グルコアミラーゼ（１，４−アルファ−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）の活性」という用語は、本明細書では、デンプン又は関連するオリゴ糖分子及び多糖分子の非還元末端からのＤ−グルコースの放出を触媒する酵素活性として定義される。グルコアミラーゼの大部分は、様々な長さのＯ−グリコシル化リンカー領域によりデンプン結合ドメインに接続された触媒ドメインからなるマルチドメイン酵素である。多数のグルコアミラーゼの結晶構造が決定されており、且つ説明されている（Ｊ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐａｅｔｚｅｌ  ２０１１．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｖｏｌ．６７  ｐａｇｅｓ  １８８−１９２“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ”及びＪ．Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  Ｖｏｌ．  １５４２  ｐａｇｅ  ２７５−２９３“Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”を参照されたい。
【００３７】
「デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）又は炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ＳＢＤは、９つのＣＢＭファミリに分類され得る。デンプンは、エネルギー源として、多数の様々なデンプン分解酵素により分解される。しかしながら、これらのわずか約１０％が、生デンプンに結合して分解し得る。これらの酵素は通常、デンプン顆粒への付着を媒介するデンプン結合ドメインと呼ばれる、異なる配列構造モジュールを有する。ＳＢＤは、デンプン（多糖）基質、又はマルトサッカリド、アルファ−、ベータ、及びガンマ−シクロデキストリン、並びに同類のものに優先的に結合するアミノ酸配列を指す。これらは、通常、微生物デンプン分解酵素の約１０％で見出される約１００個のアミノ酸残基のモチーフである。
【００３８】
「触媒ドメイン（ＣＤ）」という用語は、基質の加水分解用の活性部位を含むポリペプチドの構造領域を指す。
【００３９】
「グリコシドヒドロラーゼ」という用語は、「グリコシダーゼ」及び「グリコシルヒドロラーゼ」と互換的に使用される。グリコシドヒドロラーゼは、複合糖（限定されないがデンプン等の多糖）中でのグリコシド結合の加水分解を助ける。グリコシドヒドロラーゼは、このグリコシドヒドロラーゼがオリゴ糖鎖／多糖鎖の（通常は非還元型の）末端又は中間それぞれで機能するかどうかに依存して、外部又は内部で作用するものとしても分類され得る。グリコシドヒドロラーゼはまた、配列又は構造に基づく方法によっても分類され得る。
【００４０】
「飼料」という用語は、家畜を飼育する際に動物に給餌される製品に関して使用される。「飼料」及び「動物飼料」という用語は、互換的に使用される。好ましい実施形態では、食物又は飼料は、非反芻動物及び反芻動物が消費するためのものである。
【００４１】
「直接給餌微生物」（「ＤＦＭ」）という用語は、本明細書で使用される場合、生きている（生存可能な）天然型微生物の供給源である。ＤＦＭのカテゴリーには、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、乳酸菌、及び酵母が含まれる。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、胞子を形成する独特のグラム陽性桿菌である。乳酸菌の種類として、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。酵母は細菌ではない。この微生物は、植物群の真菌に属する。
【００４２】
「ペプシン」という用語は、本明細書で使用される場合、２．０〜３．５の低ｐＨでタンパク質をより小さいペプチドに分解する酵素を指し、即ち、アスパラギン酸ペプチダーゼファミリＡ１に属するプロテアーゼのことである。ペプシンは、産生されて胃に分泌され、ヒト及び動物の消化系での主要な消化酵素の内の１つであり、食物中の又は飼料中のタンパク質の消化を助ける。
【００４３】
「反芻動物」という用語は、本明細書で使用される場合、主に微生物の作用により、消化の前に特殊な胃において植物ベースの食物を発酵させることによって、この食物から栄養素を獲得し得る哺乳動物を指す。
【００４４】
「反芻動物の消化室」という用語は、本明細書で使用される場合、第一胃、第二胃、第三胃、第四胃、及び小腸を指す（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），ｐａｇｅｓ  １５６−１９１）。第四胃は、単胃の胃と全くの同等物である。
【００４５】
「顆粒状デンプン」という用語は、生の（未調理の）デンプンを指し、例えば、糊化を受けていない顆粒状デンプンを指す。
【００４６】
「顆粒状デンプン加水分解（ＧＳＨ）酵素」及び「顆粒状デンプン加水分解（ＧＳＨ）活性」という用語は、本明細書では互換的に使用され、動物（特に反芻動物）の消化管で見出される条件に相当する消化管関連条件下において顆粒状の形態のデンプンを加水分解する能力を有する酵素を指す。
【００４７】
「単離（された）」という用語は、天然では存在しない形態又は環境にある物質を意味する。単離物質の非限定的な例として、下記が挙げられる：（１）天然では存在しないあらゆる物質、（２）天然では結び付いている天然に存在する成分の内の１つ若しくは複数若しくは全てから少なくとも部分的に除去されているあらゆる物質（例えば、限定されないが、あらゆる宿主細胞、酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチド、又は補因子）；（３）天然で見出される物質に対してヒトの手により改変されているあらゆる物質；又は（４）天然で結び付いている他の成分と比較して量を増加させることにより改変されているあらゆる物質。「単離核酸分子」、「単離ポリヌクレオチド」、及び「単離核酸断片」という用語は互換的に使用され、任意選択的に合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、又は改変ヌクレオチド塩基を含む、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーを指す。
【００４８】
「精製（された）」という用語は、核酸又はポリペプチドに適用される場合、一般に、当該技術分野で公知の分析技術により決定した場合に他の成分を本質的に含まない核酸又はポリペプチドを意味する（例えば、精製されたポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液、及び／又は密度勾配遠心分離に供された媒体において、分離したバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じる核酸又はポリペプチドは、「精製されて」いる。
【００４９】
「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列を含む。本開示全体を通して、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に準拠して定義されている、アミノ酸に関する１文字コード及び３文字コードが使用される。遺伝子コードの縮重に起因して、ポリペプチドが複数種のヌクレオチド配列によりコードされ得ることも理解されている。
【００５０】
タンパク質、ポリペプチド、又は酵素の用語「成熟」形態は、シグナルペプチド配列又はプロペプチド配列を含まないタンパク質、ポリペプチド、又は酵素の機能的形態を指す。
【００５１】
タンパク質又はペプチドの用語「前駆体」形態は、タンパク質の形態であって、このタンパク質のアミノ末端又はカルボニル末端に作動可能に連結されているプロ配列を有するタンパク質の形態を指す。この前駆体はまた、プロ配列のアミノ末端に作動可能に連結されている「シグナル」配列も有し得る。
【００５２】
上述したように、調節配列は、目的のコード配列／遺伝子に、センス方向又はアンチセンス方向で作動可能に連結され得る。
【００５３】
「プロモーター」又は「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写が始まる場所を規定するＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位のすぐ上流又は５’末端に位置する。プロモーターは、その全体が、天然配列（即ち、天然に存在する配列）に由来してもよいし、天然で見出される様々なプロモーターに由来する様々な要素で構成されてもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含んでいてさえもよい。様々なプロモーターが、様々な組織若しくは細胞型において、又は発達の様々な段階で、又は様々な環境若しくは生理学的条件に反応して、遺伝子の発現を指示し得ることが、当業者に理解される（「誘導性プロモーター」）。
【００５４】
「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、転写の終結等の、ｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする配列を含む。
【００５５】
「形質転換」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸分子の宿主生物中への移動又は導入を指す。核酸分子は、ＤＮＡの直鎖形態又は環状形態として導入され得る。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであってもよいし、産生宿主のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸を含む産生宿主は、「形質転換」生物、若しくは「組換え」生物、若しくは「遺伝子導入」生物、又は「形質転換体」と称される。
【００５６】
「組換え」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、化学合成によるか、又は遺伝子操作技術による核酸の単離セグメントの操作による、本来なら別々の、核酸配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせを指す。例えば、１つ又は複数のセグメント又は遺伝子が、自然に又は実験的操作により、異なる分子から挿入されているか、同一分子の別の部分から挿入されているか、又は人工的配列から挿入されているＤＮＡは、遺伝子中での、及びその後に生物中での、新規な配列の導入を生じさせる。「組換え」、「遺伝子導入」、「形質転換された」、「操作された」、又は「外来遺伝子発現のために改変された」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００５７】
「組換え構築物」、「発現構築物」、「組換え発現構築物」、及び「発現カセット」という用語は、本明細書では互換的に使用される。組換え構築物は、天然では一緒に見出されるとは限らない核酸断片（例えば、調節配列及びコード配列）の人工的な組み合わせを含む。例えば、構築物は、異なる起源に由来する調節配列及びコード配列を含んでもよいし、同一起源に由来するが天然で見出されるのとは異なる様式で配列された調節配列及びコード配列を含んでもよい。そのような構築物は、単独で使用されてもよいし、ベクターと共に使用されてもよい。
【００５８】
「パーセント同一性」という用語は、配列を比較することにより決定した場合の、２つ以上のポリペプチド配列間の関係のことであるか、又は２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係のことである。当該技術分野では、「同一性」はまた、場合によっては一連のそのような配列間で一致するヌクレオチド又はアミノ酸の数により決定した場合の、ポリペプチド配列間の又はポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」及び「類似性」は、既知の方法により容易に算出され得、この方法として、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）で説明されてるものが挙げられるが、これに限定されない。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムで成文化されている。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「％同一性」、又はパーセント同一性」、又は「ＰＩＤ」は、タンパク質配列の同一性を指す。パーセント同一性は、当該技術分野で既知の標準的技術を使用して決定され得る。有用なアルゴリズムとして、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０；及びＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照されたい）が挙げられる。ＢＬＡＳＴプログラムは、数種の検索パラメータを使用するが、そのほとんどはデフォルト値に設定される。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、生物学的類似性に関して最も関連する配列を見出すが、２０個未満の残基のクエリ配列には推奨されていない（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２，１９９７；及びＳｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２９：２９９４−３００５，２００１）。核酸配列検索用の例示的なデフォルトＢＬＡＳＴパラメータとして、下記が挙げられる：隣接ワード閾値（Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ  ｗｏｒｄｓ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝１１；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス（Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ）＝ＮＵＣ．３．１（マッチ＝１、ミスマッチ＝−３）；ギャップオープニング（Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ）＝５；及びギャップエクステンション（Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝２。アミノ酸配列検索用の例示的なデフォルトＢＬＡＳＴパラメータとして、下記が挙げられる：ワードサイズ（Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）＝３；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープニング＝１１；及びギャップエクステンション＝１。パーセント（％）アミノ酸配列同一性値は、一致する同一残基の数を、最適／最大アラインメントのためにプログラムにより作られたあらゆるギャップを含む「参照」配列の総残基数で除算することにより決定される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、「参照」配列を「クエリ」配列と称する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「相同タンパク質」又は「相同酵素」は、一次構造、二次構造、及び／又は三次構造において明確な類似性を有するタンパク質を指す。タンパク質相同性は、タンパク質がアラインされた場合の、直鎖アミノ酸配列の類似性を指し得る。タンパク質配列の相同性検索を、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＰ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを０．００１の閾値（Ｅ−値カットオフ）で使用して実行し得る。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｍａｄｄｅ  ＴＬ，Ｓｈａｆｆｅｒ  ＡＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｓｅｔ  １；２５（１７）：３３８９−４０２）。この情報を使用してタンパク質配列をグループ化し得、アミノ酸配列を使用して系統樹も構築し得る。Ｍｅｇａｌｉｇｎプログラム、ＡｌｉｇｎＸプログラム、ＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ；Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）：２７６−２７７（２０００））、又は類似のプログラムを使用して、配列アラインメント及びパーセント同一性の算出も実施し得る。ＣＬＵＳＴＡＬ法（例えばＣＬＵＳＴＡＬＷ）をデフォルトパラメータで使用して、配列の多重アラインメントも実施し得る。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アラインメントに好適なパラメータとして、下記が挙げられる：ギャップイグジスタンスペナルティ（ＧＡＰ  Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１５、ギャップエクステンション＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えばＧｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４、及びＫＴＵＰＬＥ＝１。
【００６１】
本明細書では、ある特定の態様の特徴として、様々なポリペプチドのアミノ酸配列、及びポリヌクレオチド配列が開示されている。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されている配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％、又は９０％〜９５％同一である、この配列の変異体を使用し得る。或いは、ある特定の実施形態での変異体ポリペプチド配列又は変異体ポリヌクレオチド配列は、本明細書で開示されている配列と少なくとも８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し得る。変異体アミノ酸配列又は変異体ポリヌクレオチド配列は、開示されている配列と同一の機能を有するか、又は開示されている配列の機能の少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％を有する。
【００６２】
一態様では、成熟ポリペプチドは、ＳｉｇｎａｌＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）プログラムに基づいて、配列番号１のアミノ酸１７〜５６７、配列番号２のアミノ酸１８〜５６９、及び配列番号３のアミノ酸２８〜６１８である。
【００６３】
「核酸」という用語は、ポリペプチドをコードし得るＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖、及び合成分子を包含する。核酸は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよく、且つ化学的に修飾されていてもよい。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。遺伝子コードが縮重していることから、複数種のコドンを使用して特定のアミノ酸をコードし得、本組成物及び本方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。別途示さない限り、核酸配列は、５’から３’の方向で表される。
【００６４】
「コード配列」という用語は、ヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列のタンパク質産物のアミノ酸配列を直接指定するヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームにより決定され、オープンリーディングフレームは、通常、ＡＴＧ開始コドン又は代替開始コドン（例えばＧＴＧ及びＴＴＧ）で始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ等の終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡであってもよいし、ｃＤＮＡであってもよいし、合成であってもよいし、組換えヌクレオチド配列であってもよい。
【００６５】
「合成」分子は、生物によるのではなく、インビトロでの化学合成又は酵素合成により生成される。
【００６６】
「宿主株」又は「宿主細胞」とは、目的のポリペプチド（例えばアミラーゼ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ファージ、ウイルス、又は他のＤＮＡ構築物が導入されている生物のことである。例示的な宿主株は、目的のポリペプチドを発現し得、及び／又は糖類を発酵し得る微生物細胞（例えば、細菌、糸状菌、及び酵母）である。「宿主細胞」という用語には、細胞から作製されたプロトプラストが含まれる。
【００６７】
「発現」という用語は、核酸配列に基づいてポリペプチドが生成されるプロセスを指す。このプロセスには、転写及び翻訳の両方が含まれる。
【００６８】
「最終生成物」という用語は、エタノール等のアルコールを指すか、又はアミノ酸、有機酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、リシン、イタコン酸、１，３−プロパンジオール、バイオディーゼル、及びイソプレンからなる群から選択される生化学物質を指す。
【００６９】
「ベクター」という用語は、核酸を１種又は複数種の細胞型に導入するように設計されているポリヌクレオチド配列を指す。ベクターとして、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット、及び同類のものが挙げられる。
【００７０】
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、コード配列が、好適な宿主中でＤＮＡの発現を生じさせ得る好適な制御配列に作動可能に連結されている、ＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列として、転写を生じさせるためのプロモーター、転写を制御するための任意選択的なオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列が挙げられ得る。
【００７１】
本明細書では、「制御配列」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての成分を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して天然であってもよいし外来であってもよいか、又は互いに天然であってもよいし外来であってもよい。そのような制御配列として、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列には、プロモーター、並びに転写停止シグナル及び翻訳停止シグナルが含まれる。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特定の制限部位を導入する目的のリンカーと共に設けられ得る。
【００７２】
「作動可能に連結されている」という用語は、指定された構成成分が、これらが意図された様式で機能することを許容する関係（並列が挙げられるがこれに限定されない）にあることを意味する。例えば、調節配列は、コード配列の発現がこの調節配列の制御下にあるように、このコード配列に作動可能に連結されている。
【００７３】
「シグナル配列」とは、細胞外へのタンパク質の分泌を容易にする、タンパク質のＮ末端部分に付着しているアミノ酸の配列のことである。細胞外タンパク質の成熟形態はシグナル配列を欠き、このシグナル配列は、分泌プロセス中に開裂除去される。
【００７４】
「生物学的に活性な」は、酵素活性のような指定された生物学的活性を有する配列を指す。
【００７５】
「比活性」という用語は、特定の条件下において、単位時間当たりで酵素又は酵素調製物により生成物に変換され得る基質のモル数を指す。比活性は、一般に、単位数（Ｕ）／ｍｇタンパク質で表される。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「残留活性」という用語は、特定の条件（変更された温度又は変更されたｐＨが挙げられるが、これらに限定されない）でインキュベートしたか又はインキュベートせずに測定した基質に対する活性の比率を指す。
【００７７】
ポリペプチドに関連する「野生型」、「親」、又は「参照」という用語は、１箇所又は複数箇所のアミノ酸位置で人為的な置換、挿入、又は欠失を含まない天然型ポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関連する「野生型」、「親」、又は「参照」という用語は、人為的なヌクレオシド改変を含まない天然型ポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型ポリペプチド、親ポリペプチド、又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然型ポリヌクレオチドに限定されず、野生型ポリペプチド、親ポリペプチド、又は参照ポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドを包含することに留意されたい。
【００７８】
酵素に関連する「熱的に安定な」、「熱安定性の」、及び「熱安定性」という用語は、酵素の、高温への曝露後に活性を保持する能力を指す。アミラーゼ酵素等の酵素の熱安定性は、規定の条件下で酵素活性の半分が失われる、分、時間、又は日数で示される、この酵素の半減期（ｔ１／２）により測定される。この半減期は、例えば、高温への曝露（即ち、高温によるチャレンジ）後の残留アミラーゼ活性を測定することにより算出され得る。「熱的に安定な」及び「熱安定性の」という用語は、指定された温度までの加熱の前に添加剤中で存在した／活性であった酵素の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、又は９８％が、室温まで冷却された後も依然として存在する／活性であることを意味する。好ましくは、指定された温度までの加熱の前に添加剤中に存在し且つ活性である酵素の少なくとも約８０％が、室温まで冷却された後も依然として存在し且つ活性である。
【００７９】
酵素に関連する「ｐＨ範囲」は、この酵素が触媒活性を示すｐＨ値の範囲を指す。
【００８０】
酵素に関連する「ｐＨ安定性の」及び「ｐＨ安定性」という用語は、この酵素の、所定の期間（例えば、１５分間、３０分間、１時間）にわたり広範囲のｐＨ値で活性を保持する能力に関する。
【００８１】
「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」という語句は、微生物（例えばエタノール生産微生物）及び少なくとも１種の酵素（例えばアミラーゼ）が同一のプロセス工程中に存在する、生化学物質の製造におけるプロセスを指す。ＳＳＦとして、同一の反応容器中での、同時期に起きる、デンプン基質（顆粒状、液化、又は可溶化）の糖類（例えばグルコース）への加水分解、及びこの糖類のアルコール又は他の生化学物質又は生体物質への発酵が挙げられる。
【００８２】
「スラリー」とは、水中に不溶性デンプン顆粒を含む水性混合物のことである。
【００８３】
「全糖含量」という用語は、単糖類、オリゴ糖類、及び多糖類等の、デンプン組成物中に存在する全可溶性糖含有量を指す。
【００８４】
「乾燥固体」（ｄｓ）という用語は、水中に溶解した乾燥固体、水中に分散した乾燥固体、又は両方の組み合わせを指す。そのため、乾燥固体として、顆粒状デンプン、及びこの顆粒状デンプンの加水分解生成物（例えばグルコース）が挙げられる。
【００８５】
「乾燥固体含有率」は、乾燥固体が分散している及び／又は溶解している水に対する重量パーセンテージとして、溶解している乾燥固体及び分散している乾燥固体の両方のパーセンテージを指す。デンプンの初期の乾燥固体含有率は、顆粒状デンプンの重量に水の重量を加えたものに対する、水分含量を補正した顆粒状デンプンの重量である。その後の乾燥固体含有率は、加えられたか又は失われたあらゆる水及び化学的に得られたものに関して調整された初期含有率から決定され得る。その後の溶解乾燥固体含有率は、下記で示すように屈折率から測定され得る。８
【００８６】
「高ＤＳ」という用語は、３８％（重量／重量）を超える乾燥固体含有率を有する水性デンプンスラリーを指す。
【００８７】
「乾燥物質デンプン」は、デンプンスラリー等の基質の乾燥デンプン含有量を指し、タンパク質、線維、及び水等の非デンプン成分のあらゆる寄与分を基質の質量から減算することにより決定され得る。例えば、顆粒状デンプンスラリーが２０％（重量／重量）の含水率及び１％（重量／重量）のタンパク質含有率を有する場合には、顆粒状デンプン１００ｋｇは、７９ｋｇの乾燥デンプン含有量を有する。乾燥物質デンプンは、使用する酵素の単位数の決定で使用され得る。
【００８８】
「液化物」は、デンプン又はデンプン含有穀物スラリー（マッシュ）の調理（加熱）及び液化（粘度の低下）の生成物を指す。
【００８９】
「液化」又は「液化させる」は、デンプン（又はデンプン含有穀物）が、より短い鎖及びより低い粘性のデキストリンに変換されるプロセスを指す。
【００９０】
「重合度（ＤＰ）」は、所与の糖類中のアンヒドログルコピラノース単位数（ｎ）を指す。ＤＰ１の例は、グルコース及びフルクトース等の単糖類である。ＤＰ２の例は、マルトース及びスクロース等の二糖類である。ＤＰ４＋（＞ＤＰ３）は、重合度が３を超えるポリマーを意味する。
【００９１】
「接触させる」という用語は、期待される結果に影響を及ぼすよう十分に近接して、参照成分（例えば、限定されないが、酵素、基質、及び発酵生物）を配置することを指し、参照成文として、基質に作用する酵素、又は基質を発酵させる発酵生物が挙げられる。当業者は、溶液を混合することにより「接触」が引き起こされ得ることを認識するだろう。
【００９２】
「エタノール生産微生物」は、糖又は他の炭水化物をエタノールに変換させる能力を備える微生物を指す。
【００９３】
「生化学物質」という用語は、クエン酸、乳酸、コハク酸、グルタミン酸一ナトリウム、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸カリウム、グルコノデルタ−ラクトン、エリトルビン酸ナトリウム、オメガ３脂肪酸、ブタノール、イソ−ブタノール、アミノ酸、リシン、イタコン酸、他の有機酸、１，３−プロパンジオール、ビタミン、若しくはイソプレン、又は他の生体材料等の微生物の代謝産物を指す。
【００９４】
「約」という用語は、参照値の±１５％を指す。
【００９５】
下記の略語／頭字語は、別途規定されない限り下記の意味を有する：
ＥＣ  酵素委員会
ＣＡＺｙ  炭水化物活性酵素
ｗ／ｖ  重量／体積
ｗ／ｗ  重量／重量
ｖ／ｖ  体積／体積
ｗｔ％  重量％
℃  摂氏温度
ｇ又はｇｍ  グラム
μｇ  マイクログラム
ｍｇ  ミリグラム
ｋｇ  キログラム
μＬ及びμｌ  マイクロリットル
ｍＬ及びｍｌ  ミリリットル
ｍｍ  ミリメートル
μｍ  マイクロメートル
ｍｏｌ  モル
ｍｍｏｌ  ミリモル
Ｍ  モル濃度
ｍＭ  ミリモル濃度
μＭ  マイクロモル濃度
ｎｍ  ナノメートル
Ｕ  単位
ｐｐｍ  百万分率
ｈｒ及びｈ  時間
【００９６】
第１の態様では、本発明は、配列番号７、８、又は９のポリペプチドに対して少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、さらには少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を好ましくは有するアミノ酸配列を含み、且つグルコアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００９７】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号７、８、又は９のポリペプチドと１０個のアミノ酸が異なり、好ましくは９個のアミノ酸が異なり、好ましくは８個のアミノ酸が異なり、好ましくは７個のアミノ酸が異なり、好ましくは６個のアミノ酸が異なり、好ましくは５個のアミノ酸が異なり、より好ましくは４個のアミノ酸が異なり、さらにより好ましくは３個のアミノ酸が異なり、最も好ましくは２個のアミノ酸が異なり、さらに最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む相同ポリペプチドである。
【００９８】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号７、８、若しくは９のポリペプチドの変異体であるか、又はこの変異体の、グルコアミラーゼ活性を有する断片である。
【００９９】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣｌｕｓｔａｌＸ  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１７８４６０３６により予測される配列番号１のアミノ酸１７〜４７０、配列番号２のアミノ酸１８〜４７２、又は配列番号３のアミノ酸２８〜５００を含む触媒領域である。
【０１００】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、低ｐＨで安定であり、且つ低ｐＨでグルコアミラーゼ活性を保持する。本発明のポリペプチドは、約２．０〜約５．０（例えば、約２．０〜約４．０、約２．０〜約３．０、約２．０〜約２．５等）の範囲のｐＨ値で低ｐＨ安定性を示している。例えば、ｐＨ２．０〜約３．０で、本発明のポリペプチドは、高温（例えば、少なくとも４０℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、又はより高い温度）にて長時間（例えば、少なくとも４時間、少なくとも１７時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、又はさらに長い時間）にわたりグルコース生成活性のほとんどを保持する。
【０１０１】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、又はさらに長い時間にわたるインキュベーション時間により、約３０〜約７０℃（例えば、約３０℃〜約６０℃、約４０℃〜約６０℃等）の温度範囲にて、約３のｐＨで、又はさらには約２のｐＨで、（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のグルコアミラーゼ）ＡｎＧＡと比較して良好な糖化能力を有する。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチドを、少なくとも１７時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、又はさらに長い時間にわたるインキュベーション時間により、約３０℃〜約７０℃（例えば、約３０℃〜約６０℃、約３０℃〜約５０℃等）の温度範囲にて、約３のｐＨで、又はさらには約２のｐＨで、現在市販のグルコアミラーゼ製品と比較して、同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスで使用し得るか、又は低ｐＨ発酵で使用し得る。
【０１０３】
第２の態様では、本グルコアミラーゼは、配列番号７、８、又は９のアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基の保存的置換を含む。例示的な保存的アミノ酸置換を表１に列挙する。いくつかの保存的変異は遺伝子操作により作製され得るが、他の保存的変異は、他の手段により合成アミノ酸をポリペプチドに導入することにより作製される。
【表１】
2021516058.tif 000003
【０１０４】
一部の実施形態では、本グルコアミラーゼは、配列番号７、８、若しくは９のアミノ酸配列又はその相同配列に対する１個又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、又は付加を含む。一部の実施形態では、本グルコアミラーゼは、１個又は数個のアミノ酸残基の保存的置換により、配列番号７、８、又は９のアミノ酸配列から得られる。一部の実施形態では、本グルコアミラーゼは、配列番号７、８又は９のアミノ酸配列に対する１個又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、又は付加により、配列番号７、８、又は９のアミノ酸配列から得られる。全ての場合において、「１個又は数個のアミノ酸残基」という語句は、１０個以下のアミノ酸残基を指し、即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基を指す。配列番号７、８、又は９の成熟ポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入は、最大１０個であり得、好ましくは最大９個であり得、より好ましくは最大８個であり得、より好ましくは最大７個であり得、より好ましくは最大６個であり得、より好ましくは最大５個であり得、より好ましくは最大４個であり得、さらにより好ましくは最大３個であり得、最も好ましくは最大２個であり得、さらに最も好ましくは最大１個であり得る。
【０１０５】
或いは、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的特性が変更されるような性質のものである。例えば、アミノ酸の変化により、ポリペプチドの熱安定性が改善され得、基質特異性が変更され得、最適ｐＨが変化し得、及び同類のことが起き得る。
【０１０６】
単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を、既知の変異誘発法、組換え法、及び／又はシャフリング法を使用し、続いてＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；又は同第９５／２２６２５号パンフレットで開示されているもの等の、関連するスクリーニング手順を使用することにより、実施して試験し得る。使用し得る他の方法として、下記が挙げられる：エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）。
【０１０７】
変異誘発／シャフリング法を、宿主細胞により発現された、クローン化されて変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせ得る（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする変異誘発ＤＮＡ分子を、宿主細胞から回収して、当該技術分野における標準的な方法を使用して迅速に配列決定し得る。これらの方法により、目的のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定し得、これらの方法を、構造が未知のポリペプチドに適用し得る。
【０１０８】
グルコアミラーゼは、第１のグルコアミラーゼの少なくとも一部と、第２のアミラーゼ、グルコアミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、若しくは他のデンプン分解酵素、又は限定されないがセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の他のグリコシルヒドロラーゼ（ドメインスワップアミラーゼとして最近「再発見されている」キメラアミラーゼを含む）の少なくとも一部とを含むという点で、「キメラ」ポリペプチド又は「ハイブリッド」ポリペプチドであり得る。本グルコアミラーゼは、異種シグナル配列、トラッキング若しくは精製を可能にするエピトープ、又は同類のものをさらに含み得る。
【０１０９】
本グルコアミラーゼは、例えば分泌又は細胞内発現により、宿主細胞内中で産生され得る。グルコアミラーゼを含む培養細胞材料（例えば、全細胞ブロス）を、グルコアミラーゼの細胞培地への分泌後に得ることができる。任意選択により、グルコアミラーゼを、最終グルコアミラーゼの所望の純度に応じて、宿主細胞から単離し得るか、又はさらに細胞ブロスから単離し得る。グルコアミラーゼをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の方法に従って、クローニングして発現させ得る。好適な宿主細胞として、細菌、真菌（酵母及び糸状菌を含む）、並びに植物細胞（藻類を含む）が挙げられる。特に有用な宿主細胞として、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉ）、又はミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）が挙げられる。他の宿主細胞として、細菌細胞（例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
【０１１０】
加えて、宿主は、１種又は複数種のアクセサリー酵素、タンパク質、ペプチドを発現し得る。これらは、液化、糖化、発酵、ＳＳＦ、及び下流のプロセスに有益であり得る。さらに、宿主細胞は、様々な原料を消化するために使用される酵素に加えて、エタノール及び他の生化学物質又は生体材料を産生し得る。そのような宿主細胞は、酵素を添加する必要性を低減させるか又は排除するために、発酵プロセス又は同時糖化発酵プロセスに有用であり得る。
【０１１１】
グルコアミラーゼポリペプチドをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を、宿主細胞中での発現に好適であるように構築し得る。遺伝子コードの既知の縮重のために、同一のアミノ酸配列をコードする様々なポリヌクレオチドを、定型的な技能により設計して作製し得る。所望の宿主細胞に応じて、発現の試行前にコドン最適化が必要とされる場合があることも既知である。
【０１１２】
本開示のグルコアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ベクター中に組み込み得る。ベクターを、既知の形質転換技術（例えば、下記に開示されるもの）を使用して宿主細胞に導入し得る。
【０１１３】
好適なベクターは、宿主細胞に形質転換されてこの宿主細胞内で複製され得るものであり得る。例えば、本開示のグルコアミラーゼポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを、このベクターの増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ）及び増殖（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）の手段として、細菌宿主細胞に形質転換して複製し得る。このベクターを、コードポリヌクレオチドが機能的グルコアミラーゼ酵素として発現されるように、発現宿主に適切に形質転換し得る。
【０１１４】
本発明のグルコアミラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞中での転写を可能とするプロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示すあらゆるＤＮＡ配列であり得、且つ宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子由来であり得る。
【０１１５】
このコード配列は、シグナル配列と作動可能に連結され得る。このシグナル配列をコードするＤＮＡは、発現させる目的のグルコアミラーゼ遺伝子と天然に会合しているＤＮＡ配列であってもよいし、このグルコアミラーゼとは異なる属又は種に由来してもよい。ＤＮＡ構築物又はベクターを構成するシグナル配列及びプロモーター配列は、真菌宿主細胞に導入され得、且つ同一起源に由来し得る。例えば、シグナル配列は、Ｃｂｈ１プロモーターに作動可能に連結されているトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１シグナル配列であり得る。
【０１１６】
発現ベクターは、好適な転写ターミネーターと、真核生物中では、グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されているポリアデニル化配列とをも含み得る。終結配列及びポリアデニル化配列は、適切には、プロモーターと同一の供給源に由来し得る。
【０１１７】
ベクターは、選択可能マーカーも含み得、例えば、産物が単離宿主細胞の欠陥を補う遺伝子も含み得、例えば、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するｄａｌ遺伝子、又は抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、若しくはテトラサイクリン耐性）を付与する遺伝子も含み得る。さらに、ベクターは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）選択マーカー（例えば、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、及びｎｉａＤ）、ハイグロマイシン耐性を生じさせるマーカーを含んでもよいし、選択を、当該技術分野で既知のもの等の同時形質転換により達成してもよい。例えば、国際公開第９１／１７２４３号パンフレットを参照されたい。
【０１１８】
細胞内発現は、一部の観点からは、例えば、大量のアルファ−グルコシダーゼの産生及びその後の富化又は精製のために、宿主細胞としてある特定の細菌又は真菌を使用した場合に、有利であり得る。或いは、細胞培地中へのグルコアミラーゼの細胞外分泌を用いても、単離されたグルコアミラーゼを含む培養細胞材料を作製し得る。
【０１１９】
グルコアミラーゼをコードするＤＮＡ構築物、プロモーター、ターミネーター、及び他のエレメントをそれぞれライゲートするために使用される手順、並びにこれらを、複製に必要な情報を含む好適なベクター中に挿入するために使用される手順は、当業者に既知であり、且つ容易に利用可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９，及び３ｒｄ  ｅｄ．，２００１を参照されたい。
【０１２０】
ＤＮＡ構築物又は発現ベクターのいずれかを含む単離細胞は、グルコアミラーゼの組換え産生における宿主細胞として有利に使用される。この細胞は、この酵素をコードするＤＮＡ構築物で、便宜的にはこのＤＮＡ構築物を宿主の染色体に（１つ又は複数のコピー数で）組み込むことにより形質転換され得る。このＤＮＡ配列は細胞中で安定して維持され易いことから、この組込みは有利であると一般に考えられている。宿主の染色体へのＤＮＡ構築物の組込みを、従来方法に従って実施し得、例えば、相同組換え又は非相同組換えにより実施し得る。或いは、この細胞を、様々なタイプの宿主細胞と関連した発現ベクターで形質転換させ得る。
【０１２１】
好適な細菌宿主生物の例はグラム陽性細菌種であり、例えば、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、例えば、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ブレービス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ（以前はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））・ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、及びバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の種、例えばストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓ）；乳酸菌の種、例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）；ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、例えばラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）；ロイコノストック種（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）；ペディオコッカス種（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）；並びにストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）である。或いは、宿主生物として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属するか又はシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に属するグラム陰性細菌種の株が選択され得る。
【０１２２】
好適な酵母宿主生物は、バイオテクノロジー関連の酵母種から選択され得、この酵母種として下記が挙げられるが、これらに限定されない：酵母種、例えば、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、ハンゼヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）、若しくはクリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイニア属（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ）、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、又はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又はシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する種、例えば、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）種。宿主生物として、メチロトローフ酵母種であるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の株を使用し得る。或いは、宿主生物はハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種であり得る。
【０１２３】
糸状菌中の好適な宿主生物として、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種が挙げられ、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、又はアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）が挙げられる。或いは、宿主生物として、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）等のフサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の株、又はリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）等のリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）種の株を使用し得る。他の好適な株として、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）及びムコール属（Ｍｕｃｏｒ）の種が挙げられる。加えて、宿主として、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）を使用し得る。真菌宿主細胞により発現されたグルコアミラーゼはグリコシル化され得、即ちグリコシル部分を含むであろう。グリコシル化パターンは、野生型グルコアミラーゼで存在するものと同一であり得るか、又は異なり得る。グリコシル化のタイプ及び／又は程度により、酵素的特性及び／又は生化学的特性の変化が付与され得る。
【０１２４】
形質転換された発現ベクターにより遺伝子欠損が治癒され得る発現宿主から遺伝子を欠失させることが有利である。既知の方法を使用して、１種又は複数種の不活性化遺伝子を有する真菌宿主細胞を得ることができる。クローニングされている、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）又は他の糸状菌宿主からの任意の遺伝子（例えば、ｃｂｈ１遺伝子、ｃｂｈ２遺伝子、ｅｇｌ１遺伝子、及びｅｇｌ２遺伝子）を欠失させ得る。遺伝子欠失を、当該技術分野で既知の方法により、不活性化する所望の遺伝子のある形態をプラスミドに挿入することにより達成させ得る。
【０１２５】
宿主細胞へのＤＮＡ構築物又はベクターの導入として、下記の技術が挙げられる：例えば、形質転換；電気穿孔；核マイクロインジェクション；形質導入；遺伝子導入、例えば、リポフェクション媒介遺伝子導入、及びＤＥＡＥ−デキストリン媒介遺伝子導入；リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション；ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルによる高速衝突；並びにプロトプラスト融合。一般的な形質転換技術は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）上記参照を参照されたい。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）での異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書で説明されている。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株の形質転換については、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：９９１−１００１も参照されたい。遺伝子的に安定な形質転換体を、アルファ−グルコシダーゼをコードする核酸が宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれるベクターシステムにより構築し得る。次いで、既知の技術により、形質転換体を選択して精製する。
【０１２６】
グルコアミラーゼを製造する方法は、この酵素の産生を促す条件下で宿主細胞を培養すること、及びこの細胞及び／又は培養培地からこの酵素を回収することを含み得る。
【０１２７】
細胞の培養に使用する培地は、宿主細胞を増殖させ且つグルコアミラーゼポリペプチドの発現を得るのに好適なあらゆる従来の培地であり得る。好適な培地及び培地成分は、商業的供給業者から入手可能であるか、又は公開されたレシピ（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログで説明されている）に従って調製され得る。
【０１２８】
当該技術分野で公知の発酵方法のいずれかを好適に使用して、上記で説明されているような形質転換真菌株又は誘導真菌株を発酵させ得る。一部の実施形態では、真菌細胞を、バッチ発酵条件下で増殖させるか、又は連続発酵条件下で増殖させる。
【０１２９】
分離技術及び濃縮技術は当該技術分野で既知であり、従来の方法を使用して、本発明のグルコアミラーゼポリペプチドを含む濃縮溶液又はブロスを調製し得る。
【０１３０】
発酵後に発酵ブロスが得られ、グルコアミラーゼ溶液を得るために、微生物細胞と、残留する生発酵材料等の様々な懸濁固体とを、従来の分離技術により除去する。ろ過、遠心分離、精密ろ過、回転真空ドラムろ過、限外ろ過、遠心分離及びその後の限外ろ過、抽出、若しくはクロマトグラフィー、又は同類のものが一般に使用される。
【０１３１】
時には、回収を最適化するために、グルコアミラーゼポリペプチドを含む溶液又はブロスを濃縮することが望ましい場合がある。未濃縮の溶液又はブロスの使用により、典型的には、富化されたか又は精製された酵素沈降物を集めるためのインキュベーション時間が増加するであろう。
【０１３２】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物にも関する。一部の実施形態では、この酵素組成物では、配列番号７、８、又は９のポリペプチドに対して好ましくは少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及びさらには少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つグルコアミラーゼ活性を有すポリペプチドも使用し得る。好ましくは、この組成物は、薄い色、低臭気、及び許容される貯蔵安定性等の望ましい特性をもたらすように製剤化される。ポリペプチド。
【０１３３】
この組成物は、主要酵素成分（例えば単一成分組成物）として、本発明のポリペプチドを含み得る。或いは、この組成物は、複数種の酵素活性（例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ベータ−アミラーゼ、イソアミラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リゾチーム、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、プルラナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、又はこれらの組み合わせ）を含み得、これらの酵素は、当業者に公知の有効な量で添加され得る。
【０１３４】
このポリペプチド組成物は、当該技術分野で既知の方法に従って調製され得、且つ液体組成物の形態又は乾燥組成物の形態であり得る。例えば、本グルコアミラーゼを含む組成物は、水性又は非水性の製剤、顆粒、粉末、ゲル、スラリー、ペースト等であり得、これらは、バッファー、塩、保存料、水、共溶媒、界面活性剤、及び同類のものと一緒に、本明細書に列挙した追加の酵素の内の任意の１つ又は複数をさらに含み得る。そのような組成物は、スラリー、水浴、洗濯機、食品又は飲料製品等に既に存在する内因性酵素又は他の成分（例えば、内因性植物（藻類を含む）酵素、先行する処理工程からの残留酵素、及び同類のもの）と共同して機能し得る。この組成物に含めるポリペプチドを、当該技術分野で既知の方法に従って安定化させ得る。
【０１３５】
この組成物は、ポリペプチドを発現する細胞であり得、例えば、発酵で生成物を産生し得る細胞であり得る。そのような細胞は、好適な安定剤と共にクリーム又は乾燥形態で提供され得る。そのような細胞は、上記したもの等の追加のポリペプチドをさらに発現し得る。
【０１３６】
本発明のポリペプチド又は組成物の好ましい使用例を下記に示す。本発明のポリペプチド組成物の投与量、及びこの組成物を使用する他の条件を、当該技術分野で既知の方法に基づいて決定し得る。
【０１３７】
本発明はまた、液化プロセス、糖化プロセス、及び／又は発酵プロセスにおける本発明のポリペプチド又は組成物の使用にも関する。このポリペプチド又は組成物を、単一のプロセス（例えば、液化プロセス、糖化プロセス、又は発酵プロセス）で使用し得る。このポリペプチド又は組成物を、好ましくはデンプン変換に関連して、プロセスの組み合わせで使用してもよく、例えば、液化プロセス及び糖化プロセスで使用してもよいし、液化プロセス及び発酵プロセスで使用してもよいし、糖化プロセス及び発酵プロセスで使用してもよい。
【０１３８】
液化デンプンは、任意選択により別の酵素の存在下で、アルファ−アミラーゼ及びグルコアミラーゼを使用して、より低ＤＰ（例えば、ＤＰ１＋ＤＰ２）の糖類に富むシロップに糖化され得る。糖化生成物の正確な組成は、使用する酵素の組み合わせ及び加工処理するデンプンの種類に依存する。有利には、提供されたグルコアミラーゼを使用して得られるシロップは、糖化デンプン中の全オリゴ糖に対する重量パーセントが３０％を超える（例えば、４５％〜６５％又は５５％〜６５％）ＤＰ２を含み得る。糖化デンプン中の（ＤＰ１＋ＤＰ２）の重量パーセントは、約７０％を超え得る（例えば７５％〜８５％又は８０％〜８５％）。
【０１３９】
液化は、一般に連続プロセスとして実行されるが、糖化は、バッチプロセスとして行なわれることが多い。糖化条件は、液化物の性質及び利用可能な酵素の種類に依存する。場合により、糖化プロセスは、約６０〜６５℃の温度及び約４．０〜４．５のｐＨ（例えばｐＨ４．３）を含み得る。糖化を、例えば、約４０℃、約５０℃、又は約５５℃と、約６０℃、又は約６５℃との間の温度で実施し得、液化物を冷却する必要がある。必要に応じてｐＨも調整し得る。糖化を、通常、充填するか又は空にするのに数時間を要する場合がある撹拌槽中で行なう。酵素は、典型的には、タンクに充填される際に乾燥固体に対して一定の割合で添加されるか、又は充填段階の開始時に単回量として添加される。シロップを製造するための糖化反応を、典型的には、約２４〜７２時間（例えば２４〜４８時間）にわたり実行する。しかしながら、３０〜６５℃（典型的には約６０℃）の温度で典型的には４０〜９０分の予備糖化を行い、続いて同時糖化発酵（ＳＳＦ）で完全糖化を行なうことのみが一般的である。一実施形態では、本発明のプロセスは、同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセス前にデンプン含有材料を予備糖化することを含む。この予備糖化を、ＳＳＦに移行する前に高温（例えば、５０〜８５℃、好ましくは６０〜７５℃）で実行し得る。好ましくは、糖化を、約３０℃〜約７５℃の比較的高い温度範囲（例えば４５℃〜７５℃又は５０℃〜７５℃）で最適に行なう。比較的高い温度で糖化プロセスを行なうことにより、このプロセスを、比較的短い時間で実行し得るか、或いは、このプロセスを、比較的低い酵素投与量を使用して実行し得る。さらに、液化及び／又は糖化プロセスを比較的高い温度で実行する場合には、微生物汚染のリスクが低減される。
【０１４０】
本発明の好ましい態様では、液化及び／又は糖化は、順次に又は同時に実施される液化プロセス及び糖化プロセスを含む。
【０１４１】
可溶性デンプン加水分解物（特にグルコースに富むシロップ）を、典型的には３２℃前後（例えば３０℃〜３５℃）の温度において、このデンプン加水分解物と発酵生物とを接触させることにより発酵させ得る。「発酵生物」とは、発酵プロセスでの使用に好適であり且つ所望の発酵産物を産生し得るあらゆる生物（例えば細菌生物及び真菌生物）を指す。特に好適な発酵生物は、グルコース又はマルトース等の糖を直接的に又は間接的に所望の発酵産物へと発酵し得る（即ち変換し得る）。発酵生物の例として、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを発現する酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））並びに細菌（例えばザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ））が挙げられる。エタノール生産微生物は、キシロースをキシルロースに変換するキシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを発現し得る。例えば、比較的高温に抵抗し得るエタノール生産微生物の改良株は、当該技術分野で既知であり、且つ使用され得る。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ  ２７：１０４９−５６を参照されたい。市販の酵母として、例えば下記が挙げられる：Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ（ＴＭ）／Ｌｅｓａｆｆｒｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ／Ｌｅｓａｆｆｒｅ，ＵＳＡから入手可能）ＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ  Ｙｅａｓｔ，ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｕｒｎｓ  Ｐｈｉｌｐ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡから入手可能）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（Ａｌｌｔｅｃｈから入手可能）、ＧＥＲＴ  ＳＴＲＡＮＤ（Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）、ＳＹＮＥＲＸＩＡ（登録商標）ＡＤＹ（ＤｕＰｏｎｔから入手可能）、ＳＹＮＥＲＸＩＡ（登録商標）ＴＨＲＩＶＥ（ＤｕＰｏｎｔから入手可能）、ＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓから入手可能）。発酵の温度及びｐＨは、発酵生物に依存するであろう。発酵によりクエン酸及び乳酸等の他の代謝産物を産生する微生物も、当該技術分野で既知である。例えば、Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ（２００７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２５：２４４−６３；Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２７：１４５−５２を参照されたい。
【０１４２】
糖化プロセス及び発酵プロセスを、ＳＳＦプロセスとして実行し得る。ＳＳＦプロセスを、ＳＳＦ全体を通してグルコアミラーゼを連続的に発現して分泌する真菌細胞により行ない得る。グルコアミラーゼを発現する真菌細胞はまた、発酵微生物（例えばエタノール生産微生物）でもあり得る。そのため、エタノールの製造を、外部からの酵素の添加が比較的少量で済むか又はその必要がないほどに十分なグルコアミラーゼを発現する真菌細胞を使用して実行し得る。真菌宿主細胞は、適切に操作された真菌株由来であり得る。グルコアミラーゼに加えて、他の酵素を発現して分泌する真菌宿主細胞も使用し得る。そのような細胞は、アミラーゼ及び／若しくはプルラナーゼ、フィターゼ、アルファ−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、ベータ−アミラーゼセルラーゼ、キシラナーゼ、他のヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、エステラーゼ、レドックス酵素、トランスフェラーゼ、又は他の酵素を発現し得る。発酵に続いて、その後のエタノールの回収を行ない得る。
【０１４３】
本発明によれば、発酵として、下記を製造するために使用される発酵プロセスが挙げられるが、これに限定されない：アルコール（例えば、エタノール、メタノール、ブタノール）；有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸）；ケトン（例えばアセトン）；アミノ酸（例えばグルタミン酸）；気体（例えば、Ｈ２及びＣＯ２）；抗生物質（例えば、ペニシリン及びテトラサイクリン）；酵素；ビタミン（例えば、リボフラビン、Ｂ１２、ベータ−カロテン）；並びにホルモン。そのような好ましい実施形態では、このプロセスを、典型的には、３〜７の範囲のｐＨ（好ましくはｐＨ３．５〜６、又はより好ましくはｐＨ４〜５）にて、２８℃〜３６℃（例えば２９℃〜３５℃、例えば３０℃〜３４℃、例えば３２℃前後）の温度で実行する。
【０１４４】
他の実施形態では、低ｐＨ値により、競合する生物がもはや増殖し得ないことから、汚染のリスクが最小限に抑えられるだろう。典型的には、発酵生物はｐＨを約４．０〜４．５へと急速に下げ、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の一部はｐＨを約３．５へとさらに下げることから、本発明の発酵プロセスを低ｐＨで実行し得、例えば有機酸の発酵のために実行し得る。溶液中に存在する遊離乳酸の量（例えば、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約８０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約１００ｇ／Ｌの乳酸塩）が、比較的低いｐＨをもたらす。遊離酸の形態で存在する乳酸塩の割合が高いほど、溶液のｐＨは低い。例えば、培地のｐＨが乳酸のｐＫａ（約３．８）と等しい場合には、乳酸塩の５０％が遊離酸の形態で存在する。ｐＨ４．２では、遊離酸としての乳酸塩の約３１％、ｐＨ４．０及び３．９では、それぞれ約４１％及び４７％
【０１４５】
本発明は、生デンプン又は顆粒状デンプンからグルコース及び他の糖類を製造するための本発明のグルコアミラーゼの使用を提供する。一般に、本発明のグルコアミラーゼを、単独で、又はアルファ−アミラーゼの存在下において、生デンプンの加水分解（ＲＳＨ）プロセス又は顆粒状デンプンの加水分解（ＧＳＨ）プロセスで使用して、所望の糖及び発酵産物を製造し得る。顆粒状デンプンは、ゼラチン化温度未満で酵素加水分解により可溶化される。そのような「低温」システム（「ノークック」又は「コールドクック」としても既知である）は、従来のシステムと比べて高濃度の乾燥固体（例えば最大４５％）を処理し得ることが報告されている。
【０１４６】
「生デンプン加水分解」プロセス（ＲＳＨ）は、従来のデンプン処理プロセスと異なり、典型的には少なくともグルコアミラーゼ及び／又はアミラーゼの存在下において、デンプン基質のゼラチン化温度以下で顆粒状デンプンを順次に又は同時に糖化及び発酵させることを含む。水中で加熱されたデンプンは、５０℃〜７５℃でゼラチン化を開始するが、ゼラチン化の正確な温度は特定のデンプンに依存する。例えば、ゼラチン化温度は、植物種、植物種の特定の種類、及び成長条件に従って変動し得る。本発明との関連では、所与のデンプンのゼラチン化温度は、Ｇｏｒｉｎｓｔｅｉｎ．Ｓ．ａｎｄ  Ｌｉｉ．Ｃ．，Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｒｋｅ，Ｖｏｌ．４４（１２）ｐｐ．４６１−４６６（１９９２）により説明されている方法を使用して、デンプン顆粒の５％で複屈折が失われる温度である。
【０１４７】
また、本発明のグルコアミラーゼを、少なくとも４個のグルコシル残基を含む分子中のアルファ−（１，６）−グルコシド結合のみを加水分解する酵素と組み合わせて使用し得る。好ましくは、本発明のグルコアミラーゼを、プルラナーゼ又はイソアミラーゼと組み合わせて使用する。デンプンの脱分枝のためのイソアミラーゼ及びプルラナーゼの使用、酵素の分子特性、及びグルコアミラーゼと酵素の潜在的同時使用については、Ｇ．Ｍ．Ａ．ｖａｎ  Ｂｅｙｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔａｒｃｈ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５，１０１−１４２で説明されている。
【０１４８】
用語「発酵産物」は、発酵生物を使用する発酵プロセスを含むプロセスにより生成される生成物を意味する。本発明に従って意図される発酵産物として、下記が挙げられる：アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、グリセリン、ソルビトール、及びキシリトール）；有機酸（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ギ酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸、及びキシロン酸）；ケトン（例えばアセトン）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、セリン、及びトレオニン）；アルカン（例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、及びドデカン）；シクロアルカン（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、及びシクロオクタン）；アルケン（例えば、ペンテン、ヘキセン、ヘプテン、及びオクテン）；気体（例えば、メタン、水素（Ｈ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、及び一酸化炭素（ＣＯ））；抗生物質（例えば、ペニシリン及びテトラサイクリン）；酵素；ビタミン（例えば、リボフラビン、Ｂ１２、ベータ−カロテン）；並びにホルモン。
【０１４９】
好ましい態様では、発酵産物は、エタノール、例えば燃料用エタノール；飲用エタノール、即ち飲用中性スピリット；又は工業用エタノール、若しくは消耗アルコール産業（例えば、ビール及びワイン）、乳業（例えば、発酵乳製品）、皮革産業、及びタバコ産業で使用される製品である。好ましいビールの種類には、エール、スタウト、ポーター、ラガー、ビター、モルトリカー、高アルコールビール、低アルコールビール、低カロリービール、又はライトビールが含まれる。使用される好ましい発酵プロセスとして、当該技術分野で公知のアルコール発酵プロセスが挙げられる。好ましい発酵プロセスは、公知の嫌気性発酵プロセスである
【０１５０】
ビールを製造するためのプロセスは、当該技術分野で公知である。例えば、Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅ（２００４）“Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ，”Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（ＶＬＢ），３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎを参照されたい。簡潔に説明すると、このプロセスは、（ａ）マッシュを調製すること、（ｂ）このマッシュをろ過して麦芽汁を調製すること、及び（ｃ）この麦芽汁を発酵させて発酵飲料（例えばビール）を得ることを含む。
【０１５１】
アミラーゼ並びに任意選択的にプルラナーゼ及び／又はイソアミラーゼと組み合わせてグルコアミラーゼを含む醸造組成物を、上記の工程（ａ）のマッシュに添加し得、即ち、このマッシュの調製中に添加し得る。或いは、又は加えて、この醸造組成物を、上記の工程（ｂ）のマッシュに添加し得、即ち、このマッシュのろ過中に添加し得る。或いは、又は加えて、この醸造組成物を、上記の工程（ｃ）の麦芽汁に添加し得、即ち、この麦芽汁の発酵中に添加し得る。
【０１５２】
さらに別の態様では、本明細書で説明されているグルコアミラーゼを、デンプン消化率を増加させるための動物用の飼料添加剤としても使用し得る。本明細書で説明されているのは、動物中でのデンプン消化率を増加させる方法であって、動物用の飼料に、飼料添加剤として、
（ｇ）配列番号７、８、若しくは９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｈ）配列番号７、８、若しくは９のアミノ酸配列に対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
（ｉ）配列番号７、８、若しくは９の触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；
（ｊ）配列番号７、８、若しくは９のリンカー及び触媒ドメインに対して少なくとも８３％の同一性を有するポリペプチド；又は
（ｋ）シグナルペプチダーゼによるか若しくは発現宿主からの分泌中での翻訳後修飾による、配列番号１、２、若しくは３のポリペプチドのプロセシングにより生じる成熟ポリペプチド；
からなる群から選択される少なくとも１種のグルコアミラーゼを添加することを含み、前記グルコアミラーゼは、（ａ）ｐＨ６のみでの又は第一胃液（ｒｕｍｉｎ  ｆｌｕｉｄ）（例えばペプシン含有第一胃液）の存在下での酵素の活性と比較して、ペプシン又は第一胃液（ｒｕｍｉｎ  ｆｌｕｉｄ）（例えばペプシン含有第一胃液）の存在下における３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有するか、又は少なくとも２０％高い残留活性を有し、（ｂ）この酵素は、膵アミラーゼと共に機能してグルコース収量を増加させる、
方法である。
【０１５３】
別の態様では、動物が反芻動物である場合には、この酵素は、第一胃、第四胃、及び小腸を含む、反芻動物の３種の消化室の内の少なくとも２種で活性である。第一胃は最大の区画であり、１５０〜２００リットル（４０〜５０ガロン）の容積がある。
【０１５４】
反芻動物は、この反芻動物の微生物／酵素消化系により、粗飼料をタンパク質及びエネルギーに変換する独特の能力を有する。従って、反芻動物は、地球の生態学及び食物連鎖において重要な役割を果たす。
【０１５５】
反芻動物と非反芻動物との主な違いは、反芻動物が、第一胃、第二胃、第三胃、及び第四胃からなる４区画の胃を有することである。第四胃は、単胃の胃と全くの同等物である（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），ｐａｇｅｓ  １５６−１９１）。
【０１５６】
消化系には、数十億の微生物が存在する。これらの微生物は、ウシが飼料中の栄養素を消化して利用するのを助ける。効率的な飼料利用及び高い乳量を達成するためには、細菌に最適な条件を与えなければならない。飼料を消化するのは細菌である。実際には、ウシに給餌することは、このウシの第一胃内の微生物に給餌することを伴う。発酵プロセスは、第一胃及び第二胃で起こる。ウシの第一胃は、大きな発酵槽のようなものである。２００種を超える様々な細菌、及び２０種の原生動物は、ウシが線維状飼料及び非タンパク質性窒素源を利用するのを助ける。発酵は、例えば微生物が炭水化物を揮発性脂肪酸及びガスへと変換する場合に、グルコース等の分子が嫌気的に分解される化学プロセスである。このプロセスにより、ウシは、セルロース線維をエネルギーに変換することが可能になる。発酵中に第一胃内で生じるガス（５００〜１５００リットル／日）（１５０〜４００ガロン）の内、２０〜４０％はメタン及び二酸化炭素からなる。発酵ガスの生成は、かなりのエネルギー損失があることを表す。イオノフォア等のある特定の発酵改質剤は、これらのガスエネルギー損失を低減することにより、反芻動物のエネルギー効率を改善する。
【０１５７】
第一胃及び第二胃は基本的に１つの区画であるが、機能が異なる。発酵作用の多くは第一胃で起こるが、第二胃は、第三胃への通過の又は逆流の開始領域として働く。
【０１５８】
理想的な第一胃のｐＨ値は６〜７である。第一胃の微生物は、この範囲内で最も健康である。ｐＨ値が過度に変化すると、ある種の微生物が排除され、飼料の利用が低下する。セルロース（干し草、サイレージ等）を消化する微生物は、ｐＨ値が６．０未満では、増殖し得ないか、又はセルロースを発酵させ得ない。第一胃のｐＨが６未満に低下する場合には、第一胃はアシドーシスであると考えられる。反芻動物のアシドーシスは急性であり得、ｐＨの急激で激しい低下を伴う。高産生群でより一般的なのは、第一胃の低ｐＨの慢性的で間欠的な期間を特徴とする、無症状アシドーシスである。
【０１５９】
上述したように、飼料中のデンプンの消化率は非常に変動しやすく、且つデンプン及び飼料マトリックスの両方の物理的構造等の多くの因子に依存する。
【０１６０】
反芻動物用の飼料添加剤としての少なくとも１種のグルコアミラーゼの使用により、動物の飼料におけるデンプン消化率を改善し得、前記グルコアミラーゼは、（ａ）ｐＨ６のみでの又は第一胃液（ｒｕｍｉｎ  ｆｌｕｉｄ）（例えばペプシン含有第一胃液）の存在下での酵素の活性と比較して、ペプシン又は第一胃液（ｒｕｍｉｎ  ｆｌｕｉｄ）（例えばペプシン含有第一胃液）の存在下における３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性（例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、若しくは８０％高い活性、これらのパーセンテージの間の全ての値を含む）を有するか、又は少なくとも２０％高い残留活性（例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、若しくは８０％高い残留活性、これらのパーセンテージの間の全ての値を含む）を有し、（ｂ）このヒドロラーゼは、動物の消化室中に存在する消化酵素と共に機能して、グルコース収量を増加させ且つデンプン消化率を増加させることを発見している。
【０１６１】
本明細書で説明されているグルコアミラーゼの内のいずれかを、単独で使用してもよいし、少なくとも１種の直接給餌微生物と組み合わせて使用してもよい。ＤＦＭのカテゴリーには、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸菌、及び酵母が含まれる。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）は、胞子を形成する独特のグラム陽性桿菌である。この胞子は極めて安定性であり、熱、水分、及びｐＨ範囲等の環境条件に耐え得る。この胞子は、動物により摂取された場合には活性な栄養細胞へと発芽し、ミール及びペレット化飼料で使用され得る。
【０１６２】
「動物飼料」、「飼料（ｆｅｅｄ）」、「飼料（ｆｅｅｄｓｔｕｆｆ）」、及び「飼い葉」という用語は互換的に使用され、下記を含む群から選択される１種又は複数種の飼料材料を含み得る：ａ）穀物類、例えば、小粒穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、及びこれらの組み合わせ）、並びに／又は大粒穀類（例えば、トウモロコシ若しくはソルガム）；ｂ）穀物類からの副産物、例えば、トウモロコシグルテンミール、可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｌｕｂｌｅ）（ＤＤＧＳ）（特に、トウモロコシをベースとする可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ｃＤＤＧＳ）、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショーツ、コメふすま、もみ殻、カラスムギ殻、パーム核、及びシトラスパルプ；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピン、エンドウ豆、ソラマメ、ワタ、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉及び骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、ゴマ等の供給源から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油脂；並びに／又はｅ）ミネラル及びビタミン。
【０１６３】
機能性飼料等の飼料として使用されるか又はこの飼料の調製で使用される場合には、本発明の酵素又は飼料添加剤組成物を、下記の内の１つ又は複数と共に使用し得る：栄養学的に許容される担体、栄養学的に許容される希釈剤、栄養学的に許容される添加剤、栄養学的に許容されるアジュバント、栄養学的に活性な成分。例えば、タンパク質、ペプチド、スクロース、ラクトース、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム、ソルビン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、ソルビン酸マグネシウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メチルパラベン、及びプロピルパラベンからなる群から選択される少なくとも１種の成分を挙げることができるだろう。
【０１６４】
好ましい実施形態では、本発明の酵素又は飼料添加剤組成物は、飼料を形成するために飼料成分と混合される。用語「飼料成分」は、本明細書で使用される場合、飼料の全て又は一部を意味する。飼料の一部は、飼料の１種の成分を意味してもよいし、飼料の複数種の成分（例えば、２種、又は３種、又は４種、又はより多く）を意味してもよい。一実施形態では、「飼料成分」という用語は、プレミックス又はプレミックス成分を包含する。好ましくは、飼料は、飼い葉又はそのプレミックス、配合飼料又はそのプレミックスであり得る。
【０１６５】
本発明に係る飼料添加剤組成物は、配合飼料と混合されてもよいし、配合飼料成分と混合されてもよいし、配合飼料のプレミックスに混合されてもよいし、飼い葉に混合されてもよいし、飼い葉成分に混合されてもよいし、飼い葉のプレミックスに混合されてもよい。
【０１６６】
本明細書で説明されている任意の飼料は、下記を含む群から選択される１種又は複数種の飼料材料を含み得る：ａ）穀物類、例えば、小粒穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、ライコムギ、及びこれらの組み合わせ）、並びに／又は大粒穀物（例えば、トウモロコシ若しくはソルガム）；ｂ）穀類の副産物、例えば、トウモロコシグルテンミール、ウエットケーキ（特に、トウモロコシをベースとするウエットケーキ）、乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧ）（特に、トウモロコシをベースとする乾燥穀類蒸留粕（ｃＤＤＧ））、可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特に、トウモロコシをベースとする可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ｃＤＤＧＳ））、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショーツ、コメふすま、もみ殻、カラスムギ殻、パーム核、及びシトラスパルプ；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピン、エンドウ豆、ソラマメ、ワタ、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉及び骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、ゴマ等の供給源から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油脂；ｅ）ミネラル及びビタミン。
【０１６７】
「配合飼料」という用語は、ミール、ペレット、ナッツ、ケーキ、又は粉砕物の形態の市販の飼料を意味する。配合飼料は、様々な原材料及び添加剤からブレンドされ得る。このブレンド物は、標的動物の特定の要件に従って配合される。
【０１６８】
配合飼料は、１日に必要な栄養素の全てを提供する完全飼料であり得るか、食料の一部（タンパク質、エネルギー）を提供する濃縮物であり得るか、又はミネラル及びビタミン等の追加の微量栄養素のみを提供するサプリメントであり得る。
【０１６９】
配合飼料で使用される主成分は飼料用穀物であり、この飼料用穀物として、トウモロコシ、コムギ、キャノーラミール、ナタネミール、ルピン、ダイズ、ソルガム、カラスムギ、及びオオムギが挙げられる。
【０１７０】
好適には、本明細書で言及されているプレミックスは、微量成分（例えば、ビタミン、ミネラル、化学保存料、抗生物質、発酵産物、及び他の必須成分）から構成されている組成物であり得る。プレミックスは、通常、市販の食料にブレンドするのに適した組成物である。
【０１７１】
一実施形態では、飼料は、トウモロコシ、ＤＤＧＳ（例えばｃＤＤＧＳ）、コムギ、コムギふすま、又はこれらの任意の組み合わせを含むか、又はこれらからなる。
【０１７２】
一実施形態では、飼料成分は、トウモロコシ、ＤＤＧＳ（例えばｃＤＤＧＳ）、コムギ、コムギふすま、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。一実施形態では、飼料は、トウモロコシ、ＤＤＧＳ（例えばｃＤＤＧＳ）、又はこれらの組み合わせを含むか、又はこれらからなる。
【０１７３】
本明細書で説明されている飼料は、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも６０重量％のトウモロコシ及びダイズミール若しくはトウモロコシ及び高脂肪大豆、又はコムギミール若しくはヒマワリミールを含み得る。
【０１７４】
例えば、飼料は、約５〜約４０％のトウモロコシＤＤＧＳを含み得る。家禽の場合には、飼料は、平均して約７〜１５％のトウモロコシＤＤＧＳを含み得る。ブタの場合には、飼料は、平均して５〜４０％のトウモロコシＤＤＧＳを含み得る。飼料は、単一穀粒としてのトウモロコシも含み得、この場合には、飼料は、約３５％〜約８０％のトウモロコシを含み得る。
【０１７５】
飼料は、下記の内の１つ又は複数であり得る：配合飼料及びプレミックス、例えば、ペレット、ナッツ、又は（ウシ）ケーキ；作物又は作物残渣：トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、カラスムギ、オオムギコプラ、わら、もみ殻、サトウダイコンの屑；魚粉；肉及び骨粉；糖蜜；油粕（ｏｉｌ  ｃａｋｅ）及び油粕（ｐｒｅｓｓ  ｃａｋｅ）；オリゴ糖；保存された飼料植物：サイレージ；海藻；種子及び穀物（全体、又は粉砕、摩砕等により調製されたもの）；発芽した穀物及びマメ科植物；酵母抽出物。
【０１７６】
「飼料」という用語は、本明細書で使用される場合、一部の実施形態ではペットフードを包含する。ペットフードは、ドッグフード又はキャットフード等の、ペットによる消費が意図された植物性物質又は動物性物質である。ドッグフード及びキャットフード等のペットフードは、イヌ用のキブル等の乾燥形態であってもよいし、湿式缶詰形態であってもよい。キャットフードは、アミノ酸であるタウリンを含んでもよい。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「接触した」という用語は、製品（例えば飼料）への本明細書で説明されているグルコアミラーゼ（又はグルコアミラーゼを含む組成物）の間接的な又は直接的な塗布を指す。使用され得る塗布方法の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：飼料添加剤組成物を含む材料で製品を処理すること、飼料添加剤組成物と製品とを混合することによる直接的な塗布、製品表面上に飼料添加剤組成物を噴霧すること、又は飼料添加剤組成物の調製物中に製品を浸漬すること。一実施形態では、本発明の飼料添加剤組成物は、好ましくは、製品（例えば飼料）と混合される。或いは、飼料添加剤組成物は、飼料の乳濁液又は原料に含まれ得る。これにより、この組成物に能力上の利点が付与される。
【０１７８】
本明細書で説明されている少なくとも１種のグルコアミラーゼ（又は本明細書で説明されている少なくとも１種のグルコアミラーゼを含む酵素組成物）を均質化して粉末が製造され得ることも可能である。
【０１７９】
代替の好ましい実施形態では、少なくとも１種のグルコアミラーゼを含む酵素組成物を、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレット（ＴＰＴ顆粒と称される）又は同第１９９７／０１６０７６号パンフレット又は同第１９９２／０１２６４５号パンフレットで説明されているような顆粒に製剤化し得る。「ＴＰＴ」は、熱防護技術を意味する。
【０１８０】
別の態様では、飼料添加剤組成物が顆粒に形成される場合には、この顆粒は、タンパク質コア上にコーティングされた水和障壁塩を含む。そのような塩コーティングの利点は、耐熱性の改善、貯蔵安定性の改善、及び、塩コーティングがない場合には酵素に悪影響を及ぼす他の飼料添加剤からの保護である。好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、２０℃にて、０．２５を超える水分活性又は６０％を超える恒湿を有する。一部の実施形態では、この塩コーティングは、Ｎａ２ＳＯ４を含む。
【０１８１】
本明細書で説明されている少なくとも１種のグルコアミラーゼ（又は本明細書で説明されている少なくとも１種のグルコアミラーゼを含む酵素組成物）を調製する方法はまた、粉末をペレット化するさらなる工程も含み得る。この粉末を、当該技術分野で既知の他の成分と混合し得る。この粉末、又はこの粉末を含む混合物を、ダイに通して押し出し得、得られたストランドを、可変長の好適なペレットへと切断する。
【０１８２】
任意選択により、このペレット化工程は、ペレットの形成前に、蒸気処理又はコンディショニング段階を含み得る。粉末を含む混合物を、コンディショナー（例えば、蒸気注入を有するミキサー）に入れ得る。この混合物は、コンディショナー中で６０〜１００℃等の特定の温度まで加熱され、典型的な温度は、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃であるだろう。滞留時間は、数秒間から、数分間、さらには数時間まで可変であり得る。例えば、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、１分２分、５分、１０分、１５分、３０分、及び１時間。本明細書で説明されているグリコシドヒドロラーゼ（又は本明細書で説明されているグリコシドヒドロラーゼを含む酵素組成物）は、任意の適切な飼料材料への添加に好適であることが理解されるだろう。
任意選択により、この飼料はまた、例えばカルシウム等の追加のミネラル、及び／又は追加のビタミンも含み得る。一部の実施形態では、この飼料は、トウモロコシダイズミールミックスである。
【０１８３】
飼料は、典型的には飼料ミルで製造され、この飼料ミルでは、最初に原料が好適な粒径に粉砕され、次いで適切な添加剤と混合される。次いで、飼料を、マッシュ又はペレットとして製造し得、後者は、典型的には、温度を目標レベルまで上昇させ、次いで飼料をダイに通して、特定のサイズのペレットを製造する方法を含む。このペレットを冷却する。続いて、脂肪及び酵素等の液体添加剤を添加し得る。飼料の製造はまた、特に、少なくとも蒸気の使用を含み得る好適な技術による、ペレット化の前の押し出し又は膨張を含むさらなる工程を含み得る。
【０１８４】
飼料添加剤組成物及び／又はこれを含む飼料を、任意の好適な形態で使用し得る。飼料添加剤組成物を、固体若しくは液体の調製物、又はその代替物の形態で使用し得る。固体調製物の例として、粉末、ペースト、巨丸剤、カプセル、ペレット、錠剤、粉剤、及び顆粒が挙げられ、これらは、湿潤性であってもよいし、噴霧乾燥されていてもよいし、凍結乾燥されていてもよい。液体調製物の例として、水溶液、有機溶液又は水性−有機溶液、懸濁液、及び乳濁液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
好ましくは、食物又は飼料添加剤組成物は、少なくとも１種の生理学的に許容される担体を含み得る。この生理学的に許容される担体は、好ましくは、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、及びこれらの混合物の内の少なくとも１つから選択される。さらなる実施形態では、食物又は飼料添加剤は、金属イオンキレート剤をさらに含み得る。この金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡ又はクエン酸から選択され得る。
【０１８６】
一部の実施形態では、食物又は飼料添加剤組成物は、本明細書で説明されているグリコシドヒドロラーゼを、少なくとも０．０００１ｇ／ｋｇ、０．００１ｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｇ／ｋｇ、少なくとも１ｇ／ｋｇ、少なくとも５ｇ／ｋｇ、少なくとも７．５ｇ／ｋｇ、少なくとも１０．０ｇ／ｋｇ、少なくとも１５．０ｇ／ｋｇ、少なくとも２０．０ｇ／ｋｇ、少なくとも２５．０ｇ／ｋｇのレベルで含む。一部の実施形態では、食物又は飼料添加剤組成物は、食物又は飼料の材料に添加される場合に飼料材料が１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、２〜５０ｍｇ／ｋｇ、又は２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で本明細書で説明されているグリコシドヒドロラーゼを含むようなレベルで含む。本発明の一部の実施形態では、食物又は飼料の材料は、飼料又は食物の材料１ｋｇ当たり、少なくとも１００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、５０００００、１００００００、又は２００００００単位のグリコシドヒドロラーゼを含む。
【０１８７】
本明細書で説明されている少なくとも１種のグルコアミラーゼ及び本明細書で説明されている組成物の内のいずれかを含む製剤を、この製剤が確実に活性酵素を含む任意の好適な方法で製造し得る。そのような製剤は、液体、乾燥粉末、又は顆粒であり得る。好ましくは、飼料添加剤組成物は、飼料ペレット上に又は飼料ペレットに添加するのに好適な固体形態である。
【０１８８】
一実施形態では、動物飼料を、コア；活性物質；及び少なくとも１つのコーティングを含む飼料組成物の顆粒に製剤化し得、この顆粒の活性物質は、ａ）飼料ペレット化プロセス、ｂ）蒸気加熱飼料前処理プロセス、ｃ）貯蔵、ｄ）非ペレット化混合物中の成分としての貯蔵、並びにｅ）微量ミネラル、有機酸、還元糖、ビタミン、塩化コリン、及び酸性又は塩基性の飼料基剤ミックス又は飼料プレミックスを生じる化合物から選択される少なくとも１つの化合物を含む飼料基剤ミックス中の又は飼料プレミックス中の成分としての貯蔵の内の１つ又は複数から選択された条件後に、少なくとも５０％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも８０％の活性を維持する。
【０１８９】
顆粒に関して、少なくとも１つのコーティングは、この顆粒の少なくとも５５重量／重量％を占める水分水和物質を含み得、及び／又は少なくとも１つのコーティングは、２つのコーティングを含み得る。これら２つのコーティングは、水分水和コーティングと、水分障壁コーティングとであり得る。一部の実施形態では、この水分水和コーティングは、この顆粒の２５重量／重量％〜６０重量／重量％であり得、この水分障壁コーティングは、この顆粒の２重量／重量％〜１５重量／重量％であり得る。この水分水和コーティングは、無機塩、スクロース、デンプン、及びマルトデキストリンから選択され得、この水分障壁コーティングは、ポリマー、ガム、ホエイ、及びデンプンから選択され得る。
【０１９０】
顆粒を、飼料ペレット化プロセスを使用して製造し得、飼料前処理プロセスを、最大数分にわたり７０℃〜９５℃（例えば８５℃〜９５℃）で行ない得る。
【０１９１】
顆粒は、ポリマー及びガムから選択される水分障壁コーティングを有し得、水分水和材料は無機塩であり得る。水分水和コーティングは、顆粒の２５重量／重量％〜４５重量／重量％であり得、水分障壁コーティングは、顆粒の２重量／重量％〜１０重量／重量％であり得る。
【０１９２】
或いは、組成物は、消費に好適な液体製剤中に存在し、好ましくは、そのような液体消費物は、バッファー、塩、ソルビトール、及び／又はグリセロールの内の１つ又は複数を含む。
【０１９３】
また、飼料添加剤組成物は、例えば粉砕コムギ等の担体基材上に酵素を塗布する（例えば噴霧する）ことにより製剤化され得る。
【０１９４】
一実施形態では、飼料添加剤組成物は、プレミックスとして製剤化され得る。単なる一例として、このプレミックスは、１種若しくは複数種のミネラル及び／又は１種若しくは複数種のビタミン等の１種又は複数種の飼料成分を含み得る。
【０１９５】
一部の実施形態では、少なくとも１種のグルコアミラーゼは、生理学的に許容される担体中に存在するであろう。好適な担体は、大きくて緩やかに代謝される巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子）であり得る。薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩等の鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩等の有機酸の塩）を使用し得る。製剤化されると、本発明の組成物を反芻動物に直接投与し得る。
【０１９６】
加えて、本明細書で開示されているグルコアミラーゼ含有組成物を、１種又は複数種の追加成分の酵素（例えば、さらなる飼料酵素、又は醸造酵素若しくは麦芽酵素、又は穀物プロセシング酵素、又はコムギグルテン−デンプン分離酵素）と共にさらに製剤化し得る（例えばこの酵素とブレンドし得る）。
【０１９７】
本明細書で開示されているグルコアミラーゼ含有組成物での使用に好適な追加の酵素酵素は、下記からなる群から選択される酵素の内の１つ又は複数であり得る：エンドグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）；セロビオヒドロラーゼ（ｃｅｌｌｉｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、セルラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．７４）、リケナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７３）、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、脂質アシルトランスフェラーゼ（一般にはＥ．Ｃ．２．３．１．ｘに分類される）、ホスホリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２、若しくはＥ．Ｃ．３．１．１．５）、フィターゼ（例えば６−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）若しくは３−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８）、アルファ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、他のキシラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３２、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３７、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７３）、グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｇ．３．２．１．３）、プロテアーゼ（例えば、スブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）、若しくはバシロリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．２８）、若しくはアルカリ性セリンプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．ｘ）、若しくはケラチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．ｘ．ｘ））、並びに／又はマンナナーゼ（例えばβ−マンナナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．７８））。
【０１９８】
（例えば飼料用途に関する）一実施形態では、他の成分の酵素は、下記からなる群から選択される酵素の内の１つ又は複数であり得る：アミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、Ｇ４−形成アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６０）、β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２）、及びγ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）；並びに／又はプロテアーゼ（例えば、スブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２）、若しくはバシロリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．２８）、若しくはアルカリ性セリンプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．ｘ）、若しくはケラチナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．ｘ．ｘ））。
【０１９９】
（例えば飼料用途に関する）一実施形態では、他の成分の酵素は、アミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１））及びプロテアーゼ（例えばスブチリシン（Ｅ．Ｃ．３．４．２１．６２））の組み合わせであり得る。
【０２００】
（例えば飼料用途に関する）一実施形態では、他の成分の酵素は、β−グルカナーゼ（例えば、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．２．１．６）であり得る。
【０２０１】
（例えば飼料用途に関する）一実施形態では、他の成分の酵素は、マンナナーゼ（例えばβ−マンナナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．７８））であり得る。
【０２０２】
（例えば飼料用途に関する）一実施形態では、他の成分の酵素は、リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、脂質アシルトランスフェラーゼ（一般には、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘに分類される）、又はホスホリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２、若しくはＥ．Ｃ．３．１．１．５）、好適なリパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）であり得る。
【０２０３】
（特に飼料用途に関する）一実施形態では、他の成分の酵素は、セリンプロテアーゼ（例えばＥ．Ｃ．３．４．２１、スブチリシン）、トリプシン様Ｓ１若しくはＳ２プロテアーゼ、又はメタロプロテアーゼ（例えばＥ．Ｃ．３．４．２４、バシロリシン）、又はアスパルチルプロテアーゼ（例えばＥ．Ｃ．３．４．２３）であり得る。
【実施例】
【０２０４】
別途本明細書で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【０２０５】
本開示は、下記の実施例においてさらに定義される。実施例は、ある特定の実施形態を示しているものの、例示のみを目的として与えられていることを理解すべきである。上記の考察及び実施例から、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認し得、且つ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件に適合するように様々な変更及び修正を加え得る。
【０２０６】
実施例１
グルコアミラーゼの配列
ＦｒａＧＡ１遺伝子の核酸配列と、ＦｒａＧＡ１遺伝子によりコードされる仮定上のタンパク質のアミノ酸配列とを、ＮＣＢＩデータベースで見出した（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＷ＿０１２１３３２００．１（遺伝子）及びＸＰ＿０１２１７８１３９（タンパク質））。
【０２０７】
ＦｒａＧＡ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１として示す。
【化１】
2021516058.tif 000004
【０２０８】
ＷｃｏＧＡ１遺伝子の核酸配列と、ＷｃｏＧＡ１遺伝子によりコードされる仮定上のタンパク質のアミノ酸配列とを、ＪＧＩデータベースで見出した（ＪＧＩアクセッション番号：Ｗｏｌｃｏ１１５００９０（遺伝子）及びＷｏｌｃｏ１１４９９４５（タンパク質））。Ｎ末端シグナルペプチドを、ＳｉｇｎａｌＰソフトウェアバージョン４．０（Ｎｏｒｄａｈｌ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：７８５−７８６）により予測した。
【０２０９】
ＷｃｏＧＡ１前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２として示す。
【化２】
2021516058.tif 000005
【０２１０】
タラロマイセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来のＴｅＧＡ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３として示す。
【化３】
2021516058.tif 000006
【０２１１】
実施例２
グルコアミラーゼの発現
完全長のＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１をコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＴＴＴ発現ベクター（公開されたＰＣＴ出願国際公開第２０１１／０６３３０８号パンフレットで説明されている）に挿入した。ＴｅＧＡをコードするＤＮＡ配列を合成し、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクター（米国特許出願公開第２０１１／０１３６１９７Ａ１号明細書で説明されている）に挿入した。
【０２１２】
発現に使用するＦｒａＧＡ１遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号４として下記に示す。
【化４】
2021516058.tif 000007
【０２１３】
発現に使用するＷｃｏＧＡ１遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号５として下記に示す。
【化５】
2021516058.tif 000008
【０２１４】
発現に使用するＴｅＧＡ遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号６として下記に示す。
【化６】
2021516058.tif 000009
【０２１５】
ＦｒａＧＡ１酵素をコードするプラスミド、ＷｃｏＧＡ１酵素をコードするプラスミド、及びＴｅＧＡ酵素をコードするプラスミドを、プロトプラスト形質転換を使用して、好適なトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株に形質転換した（Ｔｅ’ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：３９３−９９，２００２）。国際公開第２０１６／１３８３１５号パンフレットで説明されている方法により、形質転換体を選択して発酵させた。これらの培養物の上清を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び酵素活性アッセイによりタンパク質発現を確認した。
【０２１６】
ＦｒａＧＡ１を、ベータ−シクロデキストリン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６親和性クロマトグラフィー、及びその後のゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。ＷｃｏＧＡ１を、ベータ−シクロデキストリン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６親和性クロマトグラフィー、及びその後の疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製した。ＴｅＧＡを、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びその後のベータ−シクロデキストリン結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６親和性クロマトグラフィーにより精製した。グルコアミラーゼ活性アッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。標的のタンパク質を含む画分をプールし、１０  Ｋ  ＭＷＣＯを備えるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５デバイスを使用して濃縮した。次いで、濃縮溶液を、バッファーＡでＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。標的のタンパク質は単一ピークでカラムから溶出し、再びプールして濃縮した。精製した試料は純度が９０％を超えており、使用するまで−８０℃にて４０％グリセロール中で保存する。
【０２１７】
ＦｒａＧＡ１の予測される成熟タンパク質配列を、配列番号７として下記に示す。
【化７】
2021516058.tif 000010
【０２１８】
ＷｃｏＧＡ１の予測される成熟タンパク質配列を、配列番号８として下記に示す。
【化８】
2021516058.tif 000011
【０２１９】
ＴｅＧＡの成熟タンパク質配列を、配列番号９として下記に示す。
【化９】
2021516058.tif 000012
【０２２０】
実施例３
低ｐＨでの及びペプシンの存在下でのグルコアミラーゼの安定性
グルコアミラーゼＴｅＧＡ、ＦｒａＧＡ１、及びＷｃｏＧＡ１の精製済試料の安定性を、低ｐＨ条件で及びペプシンの存在下で分析した。これらの酵素を、５０ｍＭ  グリシン−ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．０）中のペプシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ７０００）と共にインキュベートし、５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）で調製した１％（重量／重量）可溶性デンプンを、活性測定の基質として使用した。グルコアミラーゼ及びペプシンを１：０又は１：５０の比（重量／重量）で最初に混合し、ここで、グルコアミラーゼを１００ｐｐｍで投与し、その後に、得られた混合物を３０分にわたり４０℃でインキュベートした。一方、各グルコアミラーゼの１００ｐｐｍアリコートを、３０分にわたり４０℃にて５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ６．５）中でインキュベートし、これらは、未処理コントロールとしての役割を果たした。活性測定を開始するために、酵素希釈液（直線的な範囲で選択された酵素用量、又はブランクコントロールとしての水のみ）１０μＬを、基質（１％デンプン）溶液９０μＬが入った９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）に加えた。その後、このＭＴＰを密封し、４０℃及び１１５０ｒｐｍにてｉＥＭＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で１０分にわたりインキュベートした。グルコアミラーゼ活性を、結合グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ｃｏｕｐｌｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ／ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＧＯＸ／ＨＲＰ）法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５（１９８０）：３８９−３９７）を使用して測定するグルコース放出速度として決定した。表２に示すように、酵素活性の尺度としてグルコース放出を使用すると、ＦｒａＧａ１グルコアミラーゼ、ＷｃｏＧＡ１グルコアミラーゼ、及びＴｅＧＡグルコアミラーゼは、ｐＨ２．０で全ての活性を失うトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）野生型グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ、ｐｄｂファイル２ＶＮ４＿Ａ、配列番号１１）とは異なり、外来性ペプシンの存在下非存在下にて、ｐＨ２．０バッファー中で安定している。
【表２】
2021516058.tif 000013
【０２２１】
実施例４
低ｐＨでのマルトデキストリンに対するグルコアミラーゼのグルコース生成活性
マルトデキストリン基質に対するグルコアミラーゼ活性を、酵素を５ｐｐｍで投与した糖組成物を分析することにより、ｐＨ３で測定した。グルコアミラーゼ：ＴｅＧＡ、ＦｒａＧＡ１、ＷｃｏＧＡ１、ＡｎＧＡ（アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）野生型グルコアミラーゼ、アクセッション番号ＸＰ＿００１３９０５３０．１、配列番号１０）、及びＴｒＧＡ（トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）野生型グルコアミラーゼ、ｐｄｂファイル２ＶＮ４＿Ａ、配列番号１１）を、Ｓｔａｐｌｅ  Ｆｌａｖｏｕｒ  ＆  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．から得たＭＡＬＴＲＩＮ（登録商標）Ｍ０４０（ＤＥ４−７を含むマルトデキストリン）で試験した。この反応を、２５ｍＭ  グリシン／酢酸Ｎａ／ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ３．０中のマルトリン（Ｍａｌｔｒｉｎ）基質（５重量／体積％）溶液９０μＬに、精製済グルコアミラーゼの５０ｐｐｍ試料１０μＬを添加することにより開始させた。インキュベーションを、それぞれ４時間及び２２時間にわたり５５℃にてＰＣＲインキュベータ中で実行した。この反応を、０．５Ｍ  ＮａＯＨ  ５０μＬの添加、及び２分にわたる撹拌器中での混合により停止させた。プレートを遠心分離して上清を回収し、次いで、この上清を５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で２０倍に希釈した。これらの試料（１０μＬ）を、屈折率検出器、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ−ＲＦＱ  Ｆａｓｔ  Ｆｒｕｉｔカラムカラム、及びＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄガードカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣを使用して分析した。５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４の移動相を、８５℃で１．０ｍＬ／分の流速にてアプライした。ＤＰ１、２、３、及び３＋に相当するピークを同定した。全ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３、及びＤＰ３＋の分率としてのＤＰ１のピーク面積割合を算出し、表３に示す。ＦｒａＧＡ１グルコアミラーゼ、ＷｃｏＧＡ１グルコアミラーゼ、及びＴｅＧＡグルコアミラーゼは、ＡｎＧＡ及びＴｒＧＡと比べて高いグルコース生成活性を示した。
【表３】
2021516058.tif 000014
【０２２２】
実施例５
低ｐＨで測定した、グルコアミラーゼのデンプン液化物に対するグルコース生成活性
グルコアミラーゼＦｒａＧＡ１、ＷｃｏＧＡ１、ＴｒＧＡ、及びＡｎＧＡをデンプン液化物で評価して、低ｐＨでのグルコース生成活性並びにＤＰ３及びＤＰ３＋の加水分解を測定した。コーンスターチ液化物（３２％ｄｓ、アルファ−アミラーゼ前処理済）のｐＨを、ｐＨ３．０に調整した。上記の基質（１０ｇ）及びグルコアミラーゼ（０．２５ｍｇ／ｇｄｓで投与した）を、それぞれ３２℃及び５５℃でインキュベートした。この反応混合物（１００μＬ）を、１７時間、２４時間、４１時間、４８時間、６３時間、又は７２時間にわたりインキュベートし、その時点で、１５分にわたり１００℃で加熱して反応をクエンチした。遠心分離後に、上清を新たな容器に移し、実施例４において上記で説明したのと同一条件を使用するＨＰＬＣ分析のために、５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で４００倍に希釈した。表４で報告する値は、全ＤＰ１、ＤＰ２、ＤＰ３、及びＤＰ３＋の分率としての各ＤＰｎのピーク面積割合である。表４の結果は、ＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１が、等しいタンパク質量（０．２５ｍｇ／ｇｄｓ）で投与し且つｐＨ３で３２℃にてインキュベートした場合に、ＴｒＧＡ及びＡｎＧＡと比べて高いグルコース生成活性及び速いＤＰ３＋加水分解を示したことを示す。インキュベーション温度を５５℃まで上昇させた場合には、ＷｃｏＧＡ１及びＦｒａＧＡ１は、ＤＰ３＋を非常に効率的に加水分解し、それぞれ１７時間のインキュベーション後に３％、４％、及び５％のＤＰ３＋しか残らなかったが、ＴｒＧＡ反応及びＡｎＧＡ反応それぞれでは１８％及び１３％が残った。
【０２２３】
ＦｒａＧＡ１、ＷｃｏＧＡ１、ＴｒＧＡ、及びＡｎＧＡを、ｐＨ２．０でのデンプン液化物に対する活性に関してさらに評価した。インキュベーション手順は、酵素を０．２ｍｇ／ｇｄｓで投与し且つインキュベーションをｐＨ２．０で実行したことを除いて、上記で説明したのと同一であった。試料を、４時間、２１時間、２９時間、４５時間、５３時間、及び７０時間で採取した。ｐＨ２では、表５に示すように、ＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１は、ＤＰ３＋加水分解速度及び最終的なＤＰ１変換に関してＴｒＧＡ及びＡｎＧＡを大きく上回っていた。ＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１は、それぞれ３２℃及び５５℃での７０時間のインキュベーション後に９０％以上及び７２％以上のＤＰ１を産生したが、ＴｒＧＡは５４％及び３％しか生じなかった。これらの結果は、ＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１が、ｐＨ２．０〜３．０及び３０〜５５℃での有意な活性により、糖化プロセス及び同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスにおいて高い潜在力を有することを示す。
【表４】
2021516058.tif 000015
【表５】
2021516058.tif 000016
【０２２４】
実施例６
ｐＨ３．５及び４．５での糖化に対するグルコアミラーゼの評価
ＦｒａＧＡ１、及びＷｃｏＧＡ１、及びＡｎＧＡの糖化能力を、従来のｐＨ４．５条件及びより低いｐＨ３．５で評価した。ＤＰ１産生を、等しい酵素投与量で処理した後の糖組成を分析することにより測定した。グルコアミラーゼ（５０μｇ／ｇｄｓで投与した）及びアルファ−アミラーゼ前処理コーンスターチ液化物（３２％ｄｓ）のインキュベーションを、６０℃、ｐＨ３．５及び４．５で実施し、試料を、２４時間、４８時間、及び７２時間で採取した。全てのインキュベーションを、１５分にわたり１００℃で加熱することによりクエンチした。遠心分離後、各試料から上清を新たなチューブに移し、ＨＰＬＣ分析のために、５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で４００倍に希釈した。ＨＰＬＣ分離を、１．０ｍＬ／分の流速での５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４の均一濃度勾配による８０℃で、Ｆａｓｔ  ｆｒｕｉｔカラム（１００ｍｍ×７．８ｍｍ）によるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣシステムを使用して実施した。オリゴ糖産生物を、屈折率検出器を使用して検出した。試料のグルコース生成活性を表６に要約する。４８時間のインキュベーション後のｐＨ３．５でのＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１によるＤＰ１産生は、７２時間のインキュベーション後にｐＨ４．５でＡｎＧＡを使用した結果と同等であった。
【表６】
2021516058.tif 000017
【０２２５】
実施例７
反芻動物消化条件下でのＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１の安定性
ＦｒａＧＡ１酵素及びＷｃｏＧＡ１酵素の安定性を、下記で説明するようなインビトロでの反芻動物消化条件下で、ｐＨ２．２、５．６、及び６．５にて測定した。
ｐＨ５．６でのアッセイ条件：反応混合物は、地元の乳牛（Ｆｏｕｌｕｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から採取した第一胃液（測定したｐＨは５．６であった）１ｍＬと、グルコアミラーゼ（ＦｒａＧＡ１のタンパク質濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、ＷｃｏＧＡ１のタンパク質濃度は６．５ｍｇ／ｍＬであった）２０μＬとを含んだ。この反応混合物を、１００ｒｐｍで振とうさせつつ、１０時間にわたり４０℃で維持した。５℃で維持した反応混合物はコントロールとしての役割を果たし、ブランクの場合には酵素を添加しなかった。各酵素処理又はブランクを三重で実施した。インキュベーション期間の終了時に、１０％（重量／重量）コーンスターチ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ−４１２６）０．５ｍＬを添加し、試料を、２４０ｒｐｍで振とうさせつつ４０℃で１４０分にわたりさらにインキュベートした。残留活性のパーセント（％）を、下記のように算出した：ブランクを減算した４０℃での酵素とのインキュベーション後の活性を、ブランクを減算した５℃での酵素とのインキュベーション後の活性で除算し、１００を乗算した。
ｐＨ６．５でのアッセイ条件：この条件は、ｐＨを６．５に調整し且つＤＴＴを２０ｍＭまで添加したことを除いて、ｐＨ５．６に関して上記で説明したのと同一であった。
ｐＨ２．２でのアッセイ条件：採取後に凍結した第一胃液を、使用前に解凍して遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿物を、精製水で１：３の比（沈殿物対水）にて懸濁させた。懸濁したスラリーのｐＨを、ｐＨ２．２に調整した。０．６ｍＬのアリコートを、６０ｍＭ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）中のペプシン（２５００Ｕ  ペプシン／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ７０００）０．４ｍＬと、各グルコアミラーゼ（ＦｒａＧＡ１のタンパク質濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、ＷｃｏＧＡ１のタンパク質濃度は６．５ｍｇ／ｍＬであった）２０μＬとが入った２ｍＬチューブに加えた。この反応混合物を、１００ｒｐｍで振とうさせつつ３時間にわたり４０℃でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、２５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．５に懸濁させた１５％（重量／重量）コーンスターチ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ−４１２６）０．５ｍＬを添加し、試料を４０℃で３時間にわたりインキュベートした。残留活性のパーセント（％）を、下記のように算出した：ブランクを減算した４０℃での酵素とのインキュベーション後の活性を、ブランクを減算したプレインキュベーションなしの活性（コントロール）で除算し、１００を乗算した。
【０２２６】
各反応の終了時に、アッセイチューブを遠心分離し、上清をＰＣＲプレートに移して、５分にわたり９５℃で加熱処理した。この加熱処理されたＰＣＲチューブ中の試料を９６ウェルフィルタプレート上で流し、各ろ液の１０ｕＬアリコートを使用して、７５℃にてＢｉｏＲａｄ炭水化物カラム（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｎ）及び溶出液としての水を使用するＨＰＬＣによりグルコース含有量を定量した。グルコース含有量を、デンプン基質に対するグルコアミラーゼの尺度として使用した。表７で示すように、グルコアミラーゼＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１は、１０時間後のｐＨ５．６及びｐＨ６．５での４０℃でのインキュベーション後に、６０〜７０％の残留活性を保持することを観察した。３時間にわたるｐＨ２．２及び４０℃でのブタペプシンの存在下でのインキュベーション後に、これら２種のグルコアミラーゼは約９０％の活性を保持することも観察した。
【表７】
2021516058.tif 000018
【０２２７】
実施例８
小腸消化条件下でのＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１の安定性及び活性
小腸消化条件をシミュレートするために、Ｍｅｎｋｅ及びＳｔｅｉｎｇａｓｓにより説明されているプロトコルに従って、１部の第一胃液と、２部の人口第一胃液とを混合した（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｘ．，Ａ．Ｓｕｓｅｎｂｅｔｈ，ａｎｄ  Ｋ．Ｈ．Ｓｕｅｄｅｋｕｍ．２００２．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇａｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｒｉｃｅ  ｓｔｒａｗｓ，ｇｒａｓｓ  ｈａｙ，ａｎｄ  ｍｕｌｂｅｒｒｙ  ｌｅａｖｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８０：５１７−５２４）。トウモロコシ粉を１０％（重量／重量）の最終濃度まで添加し、ｐＨ６．５に調整した。この混合物１ｍＬを、ブタパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７５４５、５０ｍｇ／ｍＬパンクレアチンストック溶液）５０μＬ及びグルコアミラーゼ試料（ＦｒａＧＡ１  ０．０８ｍｇ又はＷｃｏＧＡ  ０．１０ｍｇ）１５μＬと混合した。ブランク試料の場合には、パンクレアチンもグルコアミラーゼも添加しなかった。この反応を、２４０ｒｐｍで振とうさせつつ、３時間にわたり４０℃で実行した。次いで、この反応混合物を１０分にわたり４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清１５０μＬをＰＣＲプレートに移し、５分にわたり９５℃で加熱した。アリコート５０μＬを０．４５μｍフィルタプレートに移し、水９０μＬを加え、このプレートを１５分にわたり４０００ｒｐｍで遠心分離した。ろ液を、実施例７で説明されているＨＰＬＣにより、グルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、及びマルトトリオース（Ｇ３）の含有量に関して分析した。各処理又はブランクの反応を三重で実施し、平均値を表８で報告する。Ｓｔｄ．ｄｅｖは標準偏差を意味する。
【表８】
2021516058.tif 000019
【０２２８】
表８で示すように、ブタパンクレアチンは、トウモロコシ粉からグルコース、マルトース、及びマルトトリオースを放出する。ＦｒａＧＡ１酵素及びＷｃｏＧＡ１酵素は両方とも、トウモロコシ粉中の生デンプンからグルコースを放出する。ＷｃｏＧＡ１はまた、この実験条件下で、マルトースのレベルも低下させ得た。グルコアミラーゼとパンクレアチンとの組み合わせにより、グルコース、マルトースが生成され、且つマルトトリオースが減少する。これらの結果は、グルコアミラーゼが、（製造業者により報告されているように）ブタパンクレアチン中に存在する消化性プロテアーゼの存在下であっても、パンクレアチン中に存在するアルファ−アミラーゼと共に機能し得ることを示唆する。インビボでは、生成されたグルコースは動物により直接吸収される可能性があり、形成されたマルトースは、小腸の上皮細胞上のブラシ境界結合マルトース−グルコアミラーゼ（ｂｒｕｓｈ  ｂｏｒｄｅｒ  ｂｏｕｎｄ  ｍａｌｔａｓｅ−ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）によりグルコースへと変換される可能性がある。コーンデント（ｃｏｒｎ  ｄｅｎｔ）から作られたトウモロコシ粉は下記の組成を有し：乾物８８．２％、粗タンパク質９．３％、酸性デタージェント繊維２．０％、アミラーゼで処理した中性デタージェント繊維６．６％、非繊維性炭水化物７８．５％、及び全可消化養分８９．０％、このトウモロコシ粉を２００μｍ未満まで粉砕した。
【０２２９】
実施例９
トウモロコシに対する第一胃発酵における乾物消化及びガスの生成を増加させるためのＦｒａＧＡ１
基質としてデントコーン（４ｍｍ粉砕）を使用するインビトロでのバッチ発酵システムにおける乾物消化率（ＤＭＤ）、ガス生成、デンプン消化率、及びｐＨへのＦｒａＧＡ１の効果を評価した。ＦｒａＧＡ１の有効性を、３回の別々の実行（各実行において酵素用量の組み合わせ毎に４回の反復）で、３種の用量（給餌ベースとして０、０．２５、０．５、及び０．７５ｍｇ／ｇの基質）で評価した。各酵素の有効性を、既に説明されている発酵セットアップにおける緩衝化第一胃内容物及び基質のインキュベーション後の第一胃発酵パターンで決定した（Ａｄｅｓｏｇａｎ，Ａ．Ｔ．，Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｎ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｓ．Ｃ．２００５．Ａｎｉｍ．Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２３：２１１−２２３；Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｎ．Ａ．，ａｎｄ  Ａ．Ｔ．Ａｄｅｓｏｇａｎ．２００８．Ａｎｉｍ．Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１４５：８４−９４；Ｇｏｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ｋ．ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ．１９７０．Ａｇｒｉｃ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｎｏ．３７９．ＡＲＳ  ＵＳＤＡ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ｐｐ．２０）。このインビトロでのバッチ発酵システムで使用したデントコーンの組成を、実施例８で示した。４ｍｍに粉砕したデントコーン０．５ｇの試料を、４回の反復でＦ５７フィルタバッグ（ＡＮＫＯＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｃｅｄｏｎ，ＮＹ）中で秤量した。酵素ＦｒａＧＡ１を０．１Ｍ  クエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ６．０）で調製し、基質１グラム当たり酵素タンパク質０、０．２５、０．５、及び０．７５ｍｇで、フィルタバッグ中の粉砕デントコーン上に添加した。次いで、このフィルタバッグをＵｌｉｎｅ  Ｔａｂｌｅｔｏｐ  Ｐｏｌｙ  Ｂａｇ  Ｓｅａｌｅｒ（Ｉｍｐｕｌｓｅ（登録商標）ｔｙｐｅ  ＡＩＥ−２００）で密封し、緩衝化された第一胃液（５２ｍＬ）が入った１６０ｍＬ血清ボトルに直ちに入れた。フィルタバッグのみが入ったブランクボトル、及び緩衝化された第一胃液の横に粉砕デントコーン（酵素なし）のみが入ったコントロールも含めた。次いで、これらのボトルをゴム栓で閉じ、アルミニウムシールで密封した。これらのボトルを、通風インキュベータ中で３９℃にて７時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの終了時に、デントコーンの残渣が入ったフィルタバッグを、４８時間にわたり６０℃でオーブン乾燥させ、ＤＭＤを定量するために秤量した。これらのボトル内のガス圧を圧力トランスデューサーで測定し、７時間のインキュベーション後に後からガス体積に変換した。ガス圧のガス体積への変換に下記式を使用した：ガス体積（ｍＬ）＝（ガス圧（ｐｓｉ）×４．８８４３）＋３．１２９６。実験条件に基づいて、この方程式を公式化した。
【０２３０】
緩衝化第一胃液の調製は、下記の通りであった：トータル混合飼料（ＴＭＲ）を摂取してから２〜３時間後に、３頭の乳を出すホルスタイン乳牛であって、第一胃にカニューレを挿入した乳牛から第一胃液を吸引した。乾物をベースとして、第一胃にカニューレを挿入した乳牛に給餌したＴＭＲ成分組成物は、下記からなった：コーンサイレージ３８．２％、粉砕された殻付きトウモロコシ２７．３％、ダイズミール１４．５％（粗タンパク質４４％）、シトラスパルプ９．１％、フィードロットプレミックス４．５％、アルファルファ干し草中間花（ａｌｆａｌｆａ  ｈａｙ  ｍｉｄ  ｂｌｏｏｍ）４．０％、エネルギーブースター（ＭＳ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｄｕｎｄｅｅ，ＩＬ）１．８％、及びＮｏｖａｓｉｌ（ＢＡＳＦ，Ｇｅｒｍａｎｙ）０．５％。採取した第一胃液を４層のチーズクロスに通してろ過した後、予め温めた人工唾液（３９℃）と混合した。この人工唾液の成分は、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏの微量ミネラル溶液、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏの多量ミネラル溶液、（ＮＨ４）２ＨＣＯ３及びＮａＨＣＯ３のバッファー溶液、トリプチカーゼペプトン溶液（トリプトン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ，ＵＳＡ）、酸化還元指示薬レサズリン、並びにシステインＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＯＨ、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ、及び蒸留水を含む還元溶液を含んだ（Ｇｏｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ｋ．ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ．１９７０．Ａｇｒｉｃ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｎｏ．３７９．ＡＲＳ  ＵＳＤＡ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ｐｐ．２０）。第一胃液と人工唾液との体積比は、１：２であった。
【０２３１】
統計的分析：実施例９の全ての実験に関して、収集したデータを、ＳＡＳのＧＬＩＭＭＩＸ手順（バージョン９．１；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して分析した。実験を、各実行を１つのブロックとみなして、完全な無作為化ブロック設計として設計した。異なる用量で酵素を試験した場合、モデルでは用量を固定効果として使用した。応答変数は、インビトロでのＤＭＤ及びガス産生を含んだ。実行を１つのランダム因子とみなした。このモデルの固定効果は、インキュベーション後の様々な時間で測定した発酵パラメータのサンプリング時間を含んだ。最終分析を実施する前に、ＳＡＳのＵＮＩＶＡＲＩＡＴＥ手順を使用して、外れ値及び正規性について残差を検査した。処理効果をＰ＜０．０５で有意とし、任意の傾向を０．０５≦Ｐ≦０．１０と定義した。
【０２３２】
結果：下記の表９に示す結果は、本明細書で説明されているインビトロでの第一胃発酵条件下で、グルコアミラーゼＦｒａＧＡ１が用量依存的にＤＭＤ及びガス産生を増加させることを示す。粉砕されたデントコーン１グラム当たり酵素タンパク質０、０．２５、及び０．５ｍｇの用量では、デンプン消化率の増加の傾向があった。酵素の投与量に関わらず、ｐＨは完全に一定であった。
【表９】
2021516058.tif 000020
【０２３３】
実施例１０
タンパク質配列の比較
関連するタンパク質を、検索パラメータをデフォルト値に設定して、ＮＣＢＩデータベース及びＧｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースに対して、ＦｒａＧＡ１の予測される成熟アミノ酸配列（配列番号７）、ＷｃｏＧＡ１の予測される成熟アミノ酸配列（配列番号８）、及びＴｅＧＡの予測される成熟アミノ酸配列（配列番号９）を使用するＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−４０２，１９９７）により同定し、サブセットを、表１０Ａ及び表１０Ｂ（ＦｒａＧＡ１）、表１１Ａ及び表１１Ｂ（ＷｃｏＧＡ１）、並びに表１２Ａ及び表１２Ｂ（ＴｅＧＡ）にそれぞれ示す。同一残基の数を、ペアワイズアラインメントにおいてアラインした残基の数で除算することにより、両方の検索セットに関するパーセント同一性（ＰＩＤ）を定義する。表に「配列長さ」として示される値は、列記されたアクセッション番号で参照されるタンパク質の（アミノ酸の）長さに一致し、「アラインされた長さ」は、アラインメント及びＰＩＤ算出に使用される配列を指す。
【表１０Ａ】
2021516058.tif 000021
【表１０Ｂ】
2021516058.tif 000022
【表１１Ａ】
2021516058.tif 000023
【表１１Ｂ】
2021516058.tif 000024
【表１２Ａ】
2021516058.tif 000025
【表１２Ｂ】
2021516058.tif 000026
【０２３４】
ＦｒａＧＡ１（配列番号７）；ＷｃｏＧＡ１（配列番号８）；ＴｅＧＡ（配列番号９）；ＡｎＧＡ（ＸＰ＿００１３９０５３０．１のａａ２５〜６４０、配列番号１０）；ＴｒＧＡ（２ＶＮ４＿Ａ、配列番号１１）；ＫＺＴ６７２６３．１（配列番号１２のａａ１９〜５７１；ＸＰ＿００２４７５３６９．１（配列番号１３のａａ１８〜５６９）；米国特許出願公開第２００９０３２５２４０号明細書−１８４７（配列番号１４のａａ１７〜５７０）；ＫＺＴ０９２２６．１（配列番号１５のａａ１８〜５７０）；国際公開第２０１６１９６２０２号パンフレット−００１２（配列番号１６）；米国特許出願公開第２０１７０３１４００３号明細書−０００２（配列番号１７のａａ１９〜５７５）；ＧＡＤ９５６３９．１（配列番号１８のａａ３８〜６２２）；米国特許出願公開第２０１７０３０６３０９号明細書−００２３（配列番号１９）；及びＣＡＣ２８０７６．１（配列番号２０のａａ２９〜６１８）の予測される成熟配列のアラインメントを、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３−４６８０，１９９４）を使用して、デフォルトパラメータで実施した。多重配列アラインメントを図１に示す。
【０２３５】
実施例１１
ｐＨ１．９、４．５、及び６．０でのグルコアミラーゼの相対活性
反芻動物の消化系で経験するものを模倣する条件下で、グルコアミラーゼＦｒａＧＡ１及びＷｃｏＧＡ１に関して、コーンスターチ基質からのグルコース放出を測定した。各反応混合物は、１ｍＬ体積中に、精製済酵素０．１ｍｇと、１０％（重量／体積）コーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ−４１２６）とを含んだ。ｐＨ１．９での反応の場合には、希釈剤として０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．９）を使用し、反応物はまた、１０００単位のブタペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−７０００）も含んだ。ｐＨ４．５での反応の場合には、０．１ＭグリシンのｐＨを、５Ｎ  ＮａＯＨを使用して４．５に調整し、ペプシンを省略した。ｐＨ６．０での反応の場合には、希釈剤として０．１Ｍ  Ｍｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）を使用し、ペプシンを省略した。
【０２３６】
これらの反応を、２時間にわたり振とうさせつつ４０℃で実行した。試料を遠心分離して、上清と、未反応のコーンスターチ顆粒とを分離した。上清を１０分にわたり９９℃で加熱し、ろ過し、ろ液２０μｌを、Ｎａ−炭水化物カラムを使用するＨＰＬＣに注入して分離し、１ｍｇ／ｍＬでグルコース標準を使用して、生成されたグルコースを定量した。
【０２３７】
これらの反応の結果を表１３に示す。グルコース放出活性を、反応物１ｍＬ当たりの放出されたグルコースｍｇとして表す。両方のグルコアミラーゼが、ｐＨ１．９及び６．０と比較してｐＨ４．５で最も高い活性を示した。驚くべきことに、両方のグルコアミラーゼがペプシンの存在下においてｐＨ１．９で活性を示し、且つｐＨ１．９での活性はｐＨ６．０での活性の８０％超であることを発見した。
【表１３】
2021516058.tif 000027
【図１】
2021516058.tif 000028
【配列表】
2021516058000001.app
【国際調査報告】
2021516058.tif 000029
2021516058.tif 000030
2021516058.tif 000031
2021516058.tif 000032