(57)【要約】本発明は、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の治療剤としてのグラフェン量子ドットを提供する。本発明によるグラフェン量子ドットは、α−ｓｙｎフィブリル化を抑制したり既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルを分解し、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する作用効果を示す。したがって、本発明によるグラフェン量子ドットは、退行性神経疾患、炎症性疾患、代謝性疾患などの神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患治療剤として有用に使用され得る。【選択図】図１ａ
2021532041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面が負電荷を示し、
平均直径が０．５〜１０ｎｍであり、平均高さが０．１〜３ｎｍであり、
炭素と酸素のｗｔ％比率が４．０〜６．５：３．０〜６．０の比率で構成されたものである、グラフェン量子ドット。
【請求項２】
前記グラフェン量子ドットは、末端官能基としてカルボキシル基を含むものである、請求項１に記載のグラフェン量子ドット。
【請求項３】
前記末端官能基は、ＦＴ−ＩＲスペクトルでカルボキシル基の−Ｃ＝Ｏピークおよび芳香族−Ｃ＝Ｃ−ピークの吸光度の比率が１：１以上である、請求項２に記載のグラフェン量子ドット。
【請求項４】
前記吸光度の比率が１：１〜２：１である、請求項３に記載のグラフェン量子ドット。
【請求項５】
前記−Ｃ＝Ｏピークは、１７００〜１７５０ｃｍ−１に現れ、前記芳香族−Ｃ＝Ｃ−ピークは、１６００〜１６５０ｃｍ−１に現れるものである、請求項３に記載のグラフェン量子ドット。
【請求項６】
前記平均直径が１〜５ｎｍである、請求項１に記載のグラフェン量子ドット。
【請求項７】
前記平均高さが０．５〜２．５ｎｍである、請求項１に記載のグラフェン量子ドット。
【請求項８】
前記グラフェン量子ドットは、α−ｓｙｎフィブリル化を抑制したり、またはα−ｓｙｎフィブリルを分解するものである、請求項１に記載のグラフェン量子ドット。
【請求項９】
前記グラフェン量子ドットは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するものである、請求項１に記載のグラフェン量子ドット。
【請求項１０】
前記グラフェン量子ドットは、体内毒性がないものである、請求項１に記載のグラフェン量子ドット。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のグラフェン量子ドットを有効成分として含む、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
前記神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患は、退行性神経疾患、炎症性疾患または代謝性疾患である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記退行性神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルー・ゲーリック病、認知症、脳卒中、アミロイド症、線維症、脳症および多発性硬化症よりなる群から選ばれた1つ以上である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記炎症性疾患は、紅斑、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、1型糖尿病、ループス、慢性疲労症候群、線維筋肉痛、甲状腺機能低下症、甲状腺機能昂進症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、子宮内膜症、乾癬、白斑、全身性強皮症および潰瘍性大腸炎よりなる群から選ばれた1つ以上である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記代謝性疾患は、糖尿病、高血圧、高脂血症、脂質異常症および非アルコール性脂肪肝疾患よりなる群から選ばれた1つ以上である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のグラフェン量子ドットを有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療方法。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のグラフェン量子ドットを有効成分として含む組成物の神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラフェン量子ドットおよびその用途に関し、具体的に、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する退行性神経疾患、炎症性疾患または代謝性疾患の治療剤としてのグラフェン量子ドットおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ；α−ｓｙｎ）は、人間の脳に豊富なタンパク質であって、神経細胞（ニューロン）の末端で主に発見され、このような構造内でリン脂質およびタンパク質と相互作用するものと知られている。α−ｓｙｎは、異常に凝集すると、α−ｓｙｎフィブリル（α−ｓｙｎ  ｆｉｂｒｉｌｓ；α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ）を形成し、このようなα−ｓｙｎフィブリルによりシヌクレイン症（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ）、すなわち退行性神経疾患、代謝疾患などが発生するものと知られている。したがって、α−ｓｙｎのフィブリル化を抑制したり、すでに形成されているα−ｓｙｎフィブリルを分解することによって、退行性神経疾患、代謝疾患などを治療できる治療剤に対する開発が活発に行われている（韓国特許公開１０−２０１８−００８１４６５号）。しかしながら、まだシヌクレイン症に顕著な効果を示す実質的に使用可能な治療剤は全く無く、したがって、これに対する治療剤の開発が急を要するのが現状である。
【０００３】
一方、グラフェン量子ドットは、今まで単純に薬物伝達体の用途にのみ使用されてきた。しかしながら、本発明者らは、特定のグラフェン量子ドットがα−ｓｙｎフィブリル化を抑制したり、既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルを分解する作用効果を発見し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の治療活性を示すグラフェン量子ドットを提供することにある。
【０００５】
本発明の他の目的は、本発明によるグラフェン量子ドットの用途を提供することにある。
【０００６】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有す者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、表面が負電荷を示し、平均直径が０．５〜１０ｎｍであり、平均高さが０．１〜３ｎｍであり、炭素と酸素のｗｔ％比率が４．０〜６．５：３．０〜６．０の比率で構成されたグラフェン量子ドットを提供する。前記平均直径は、より好ましくは、１〜５ｎｍであり得、前記平均高さは、０．５〜２．５ｎｍであり得るが、これに制限されない。
【０００８】
本発明の一具体例において、前記グラフェン量子ドットは、末端官能基として、好ましくは、カルボキシル基を含むことができ、前記末端官能基は、好ましくは、ＦＴ−ＩＲスペクトルでカルボキシル基の−Ｃ＝Ｏピークおよび芳香族−Ｃ＝Ｃ−ピークの吸光度の比率が１：１以上であり、より好ましくは、前記吸光度の比率が１：１〜２：１であり得る。
【０００９】
本発明の他の具体例において、前記−Ｃ＝Ｏピークは、１７００〜１７５０ｃｍ−１に現れ、前記芳香族−Ｃ＝Ｃ−ピークは、１６００〜１６５０ｃｍ−１に現れることができる。
【００１０】
本発明のさらに他の具体例において、前記グラフェン量子ドットは、α−ｓｙｎフィブリル化を抑制したり、または既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルを分解することができ、血液脳関門を通過することができる。
【００１１】
本発明のさらに他の具体例において、前記グラフェン量子ドットは、体内毒性がなく、尿を通じて安定的に体外排出され得る。
【００１２】
また、本発明は、前記グラフェン量子ドットを有効成分として含む神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１３】
本発明の一具体例において、前記神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患は、退行性神経疾患、炎症性疾患または代謝性疾患であり、前記退行性神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルー・ゲーリック病、認知症、脳卒中、アミロイド症、線維症、脳症、多発性硬化症などであり得、前記炎症性疾患は、紅斑、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、1型糖尿病、ループス、慢性疲労症候群、線維筋肉痛、甲状腺機能低下症、甲状腺機能昂進症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、子宮内膜症、乾癬、白斑、全身性強皮症、潰瘍性大腸炎などであり得、前記代謝性疾患は、糖尿病、高血圧、高脂血症、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患などであり得るが、α−ｓｙｎの異常な線維化または凝集により発生できる疾患であれば、これに制限されない。
【００１４】
また、本発明は、前記グラフェン量子ドットを有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記グラフェン量子ドットを有効成分として含む組成物の神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療用途を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によるグラフェン量子ドットは、α−ｓｙｎフィブリルの形成を抑制したり既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルを分解することができ、血液脳関門を通過する作用効果を示すだけでなく、細胞毒性を示さない。したがって、本発明によるグラフェン量子ドットは、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する退行性神経疾患、炎症性疾患、代謝性疾患などの治療剤として効果的に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１ａ〜図１ｋは、α−ｓｙｎフィブリル化抑制および既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルの分解に対するグラフェン量子ドットの効果に対する分析結果である。
【図２】図２ａ〜図２ｈは、フィブリルの分解過程中にグラフェン量子ドットと既に形成されたα−ｓｙｎフィブリル間の相互作用に対する詳細な分析結果である。
【図３】図３ａ〜図３ｊは、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる神経細胞死滅と神経細胞間のα−ｓｙｎフィブリルの伝播にグラフェン量子ドットが及ぼす影響を示す結果である。
【図４】図４ａ〜図４ｏは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより誘導された病理現象にグラフェン量子ドットが及ぼす影響を示す結果である。
【図５】図５は、パーキンソン病の病因に対するグラフェン量子ドットの治療効果に対する概要を示す模式図である。
【図６】図６ａ〜図６ｇは、グラフェン量子ドットの合成とビオチン化およびビオチン−グラフェン量子ドットとα−ｓｙｎフィブリルの結合を分析した結果である。
【図７】図７は、α−ｓｙｎフィブリルの分解に対するグラフェン量子ドットの効果を示す結果である。
【図８】図８は、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓの分解に対するグラフェン量子ドットの効果を示す結果である。
【図９】図９は、合成されたグラフェン量子ドットの１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル分析結果である。
【図１０】図１０ａ〜図１０ｇは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより誘導された神経細胞死滅および制限された神経突起成長に対するグラフェン量子ドットの効果を示す結果である。
【図１１】図１１ａ〜図１１ｊは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより誘発されたミトコンドリア機能障害および活性酸素誘発に対するグラフェン量子ドットの効果を示す結果である。
【図１２】図１２ａ〜図１２ｈは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより誘導された様々な治療時点での１次神経細胞毒性および病理現象誘発に対するグラフェン量子ドットの効果および細胞ライブイメージング関連結果を示す結果である。
【図１３】図１３ａ〜図１３ｎは、グラフェン量子ドットの血液脳関門透過性を示す結果である。
【図１４】図１４は、中脳内部の黒質（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ）でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより誘導された神経膠細胞活性化に対するグラフェン量子ドットの影響を示す結果である。
【図１５】図１５ａ〜図１５ｃは、ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ形質転換マウスの脳幹で神経膠細胞活性化に対するグラフェン量子ドットの効果を示す結果である。
【図１６】図１６ａ〜図１６ｅは、グラフェン量子ドットの長期間にかけた試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）毒性効果に対する結果である。
【図１７】図１７ａ〜図１７ｈは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓに対するｎａｎｏ−ＧＯｓとｒＧＱＤｓの比較結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明者らは、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患に治療活性を示すことができるグラフェン量子ドットを発見し、本発明を完成した。本発明者らは、前記グラフェン量子ドットが、平均直径が０．５〜１０ｎｍであり、平均高さが０．１〜３ｎｍであり、炭素と酸素のｗｔ％比率が４．０〜６．５：３．０〜６．０の比率で構成された構造を示し、表面が負電荷を帯びるグラフェン量子ドットであることを確認した。また、前記グラフェン量子ドットが細胞および組織に全く毒性を示さないだけでなく、効果的に神経タンパク質、すなわちα−ｓｙｎの異常な線維化または凝集を効果的に予防および治療することができることを確認した。それだけでなく、前記グラフェン量子ドットは、血液脳関門を透過することができるので、α−ｓｙｎの異常な線維化または凝集による多様な退行性神経疾患、炎症性疾患、代謝疾患などにおいて顕著な治療効果を示すことを確認した。
【００１９】
本願明細書全般において、「グラフェン」という用語は、複数個の炭素原子が互いに共有結合で連結されて多環芳香族分子を形成したものを意味し、前記共有結合で連結された炭素原子は、基本反復単位として６員環を形成するが、５員環および／または７員環をさらに含むことも可能である。
【００２０】
本願明細書全般において、「グラフェン量子ドット（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ，ＧＱＤｓ）」という用語は、ナノサイズ断片を有するグラフェンを意味する。
【００２１】
本願明細書全般において、「還元グラフェン量子ドット」という用語は、還元過程を経て酸素原子比率が減少した酸化グラフェンを意味し、「ｒＧＱＤｓ」と略称することができる。
【００２２】
本願明細書全般において、「酸化グラフェン」という用語は、グラフェンオキシド（ｇｒａｐｈｅｎｅ  ｏｘｉｄｅｓ）とも呼ばれ、「ＧＯｓ」と略称することができる。グラフェン上にカルボキシル基、ヒドロキシ基、またはエポキシ基などの酸素原子を含有する官能基が結合された構造を含むことができるが、これに制限されない。
【００２３】
本願明細書全般において、「ナノ酸化グラフェン」という用語は、平均直径が１５ｎｍ以上であり、平均高さが５ｎｍ以上であるナノスケールの酸化グラフェンであって、「ｎａｎｏ−ＧＯｓ」と略称することができる。
【００２４】
以下では、本発明によるグラフェン量子ドットおよびその用途について詳しく説明する。
【００２５】
グラフェン量子ドット
本発明は、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患に治療活性を示すことができるグラフェン量子ドットを提供する。
【００２６】
具体的に、本発明によるグラフェン量子ドットは、表面が負電荷を示し、平均直径が約０．５〜約１０ｎｍであり、平均高さが約０．１〜約３ｎｍである。また、炭素と酸素のｗｔ％比率が４．０〜６．５：３．０〜６．０の比率で構成された構造である。
【００２７】
本発明によるグラフェン量子ドットは、表面に負電荷を示すので、α−ｓｙｎフィブリルの末端に結合することができ、これに伴い、α−ｓｙｎフィブリルの形成を抑制したり既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルを単量体に分解することができる。このようなメカニズムを通じて本発明によるグラフェン量子ドットは、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患、例えばパーキンソン病、レビー小体型認知症などの疾患に治療活性を示すことができる。
【００２８】
本発明によれば、本発明のグラフェン量子ドットは、末端官能基としてカルボキシル基、ケトン基、アルデヒド基、ヒドロキシ基、エポキシ基などの酸素原子含有官能基を含むことができる。特に、負電荷を示すカルボキシル基を主な官能基として含むことができる。
【００２９】
本発明の一具体例によれば、本発明のグラフェン量子ドットに対するＦＴ−ＩＲスペクトルで、前記カルボキシル基の−Ｃ＝Ｏピークおよび芳香族−Ｃ＝Ｃ−ピークの吸光度の比率が約１：１以上である。特に、前記吸光度の比率は、約１：１〜約３０：１、約１：１〜約２０：１、約１：１〜約１：１５、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：７、約１：１〜約１：５、約１：１〜約１：３または約１：１〜約２：１であり得る。ただし、前記吸光度の比率は、下限が約１：１である点に特徴があり、前記吸光度の比率が約１：１以上であれば構わない。
【００３０】
本発明において、前記−Ｃ＝Ｏピークは、約１７００〜約１７５０ｃｍ−１に現れるピークを意味し、前記芳香族−Ｃ＝Ｃ−ピークは、約１６００〜約１６５０ｃｍ−１に現れるピークを意味する。
【００３１】
本発明によるグラフェン量子ドットは、平均直径（ｌａｔｅｒａｌ  ｓｉｚｅ）が約０．５〜約１０ｎｍであり、平均高さ（ｈｅｉｇｈｔ）が約０．１〜約３ｎｍであって、ナノスケールの小さいサイズを示す。
【００３２】
具体的に、本発明によるグラフェン量子ドットの平均直径は、約０．５〜約１０ｎｍ、約０．７〜約７ｎｍ、約０．８〜約６ｎｍまたは約１〜約５ｎｍであり得る。
【００３３】
また、本発明によるグラフェン量子ドットの平均高さは、約０．１〜約３ｎｍ、約０．２〜約３ｎｍ、約０．３〜約３ｎｍ、約０．５〜約３ｎｍまたは約０．５〜約２．５ｎｍであり得る。
【００３４】
上記で言及した本発明のグラフェン量子ドットは、量子ドットの表面に生成された負電荷を用いてα−ｓｙｎ単量体のフィブリル化を抑制したり既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルを分解することができ、体内毒性がない。また、本発明のグラフェン量子ドットは、ナノスケールの小さいサイズを示すことによって、血液脳関門（ＢＢＢ）を容易に通過することができる。しかも、本発明のグラフェン誘導体は、体内に蓄積される問題点も発見されなかった。
【００３５】
したがって、本発明によるグラフェン量子ドットは、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の治療剤として有用に使用され得る。
【００３６】
グラフェン量子ドットの用途
本発明は、本発明によるグラフェン量子ドットの用途を提供する。
【００３７】
上記で記述したように、本発明のグラフェン量子ドットは、血液脳関門を通過してα−ｓｙｎフィブリル化を抑制したり既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルを単量体に分解することができる。したがって、本発明によるグラフェン量子ドットは、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の治療剤として有用に使用され得る。
【００３８】
本発明の一具体例によれば、本発明は、本発明によるグラフェン量子ドットを有効成分として含む神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００３９】
本発明において、前記神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患は、退行性神経疾患、炎症性疾患または代謝性疾患である。
【００４０】
具体的に、前記退行性神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルー・ゲーリック病、認知症、脳卒中、アミロイド症、線維症、脳症および多発性硬化症よりなる群から選ばれたものであり得る。ただし、これに制限されない。
【００４１】
また、前記炎症性疾患は、紅斑、アトピー、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、1型糖尿病、ループス、慢性疲労症候群、線維筋肉痛、甲状腺機能低下症、甲状腺機能昂進症、強皮症、ベーチェット病、炎症性腸疾患、重症筋無力症、メニエール症候群（Ｍｅｎｉｅｒｅ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、子宮内膜症、乾癬、白斑、全身性強皮症および潰瘍性大腸炎よりなる群から選ばれたものであり得る。ただし、これに制限されない。
【００４２】
また、前記代謝性疾患は、糖尿病、高血圧、高脂血症、脂質異常症および非アルコール性脂肪肝疾患よりなる群から選ばれたものであり得る。ただし、これに制限されない。
【００４３】
本発明の薬学的組成物は、投与のために本発明によるグラフェン量子ドットの他に追加で薬学的に許容可能な担体を１種以上さらに含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれら成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。したがって、本発明の薬学的組成物は、パッチ剤、液剤、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、坐剤などであり得る。これらの製剤は、当該分野において製剤化に使用される通常の方法またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示されている方法で製造することができ、各疾患によってまたは成分によって多様な製剤に製剤化することができる。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。本発明によるグラフェン量子ドットの１日投与量は、約１〜１０００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは、５〜１００ｍｇ／ｋｇであり、１日に１回〜数回に分けて投与することができる。
【００４５】
本発明の薬学的組成物は、本発明によるグラフェン量子ドットの他に同一または類似の薬効を示す有効成分を１種以上さらに含むことができる。
【００４６】
本発明の他の具体例によれば、本発明は、本発明によるグラフェン量子ドットの治療学的に有効な量の投与を含む神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００４７】
本発明において使用される「治療学的に有効な量」という用語は、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療に有効な前記グラフェン量子ドットの量を示す。
【００４８】
本発明の神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療方法は、前記グラフェン量子ドットを投与することによって、兆候の発現前に疾病それ自体を扱うだけでなく、これの兆候を阻害したり避けることをまた含む。疾患の管理において、特定活性成分の予防的または治療学的用量は、疾病または状態の本性（ｎａｔｕｒｅ）と深刻度、そして活性成分が投与される経路によって多様である。用量および用量の頻度は、個別患者の年齢、体重および反応によって多様である。適合な用量用法は、このような因子を当然考慮するこの分野における通常の知識を有する者により容易に選択され得る。また、本発明の神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防または治療方法は、前記グラフェン量子ドットと共に疾患治療に役に立つ追加的な活性製剤の治療学的に有効な量の投与をさらに含むことができ、追加的な活性製剤は、前記グラフェン量子ドットと共にシナジー効果または補助的効果を示すことができる。
【００４９】
本発明のさらに他の具体例によれば、本発明は、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の治療用薬剤の製造のための本発明によるグラフェン量子ドットの用途を提供する。前記薬剤の製造のためのグラフェン量子ドットは、許容される補助剤、希釈剤、担体などを混合することができ、その他活性剤制とともに複合製剤で製造されて、活性成分の相乗作用を有することができる。
【００５０】
本発明の用途、組成物、治療方法において言及された事項は、互いに矛盾しない限り、同一に適用される。
【００５１】
本明細書において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明による組成物の投与により神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【００５２】
本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本発明による組成物の投与により神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００５３】
本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、本発明の組成物が投与され得る対象を言い、その対象には制限がない。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明の理解を助けるために望ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００５５】
実施例：グラフェン量子ドット（ＧＱＤｓ）の製造
カーボンファイバー（０．９ｇ）を硫酸（３００ｍｌ）および硝酸（１００ｍｌ）混合溶液に添加した後、８０℃で２４時間の間加熱した（ｔｈｅｒｍｏ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ、図１参照）。そして、脱塩水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ）で希釈した後、再生ニトロセルロースメンブレン（Ｃａｔ＃：０６−６８０−２Ｇ；ＭＷＣＯ  １，０００ダルトン；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｉｃｅｎｔｉｆｉｃ）で透析して、酸と過量のカーボン断片を完全に除去した。そして、ＧＱＤ溶液を多孔性無機メンブレンフィルター（Ｃａｔ＃：６８０９−５００２；Ｗｈａｔｍａｎ−Ａｎｏｄｉｓｃ  ４７；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で真空濾過して、大きい粒子を除去した。その後、溶液を回転蒸発させて、パウダー形態のグラフェン量子ドット（ＧＱＤｓ）を収得した。獲得されたグラフェン量子ドットは、Ｇｒａｐｈｉｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎとエッジ官能基（ｅｄｇｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐｓ）を全部含んで主な元素成分である窒素（Ｎ）、炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）、硫黄（Ｓ）、および酸素（Ｏ）の元素分析（ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＥＡ）を実施した。元素分析は、Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｆｌａｓｈ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。その結果は、表１に示した。
【００５６】
【表１】
2021532041.tif 000003
【００５７】
表１に示されたように、本発明のグラフェン量子ドットは、核心元素である炭素と酸素のｗｔ％比率が５．２±１：４．０±１の比率で構成されていることを確認することができた。
【００５８】
比較例：ｎａｎｏ−ＧＯｓおよびｒＧＱＤｓの製造
ｎａｎｏ−ＧＯｓを製造するために、従来文献によって改善されたＨｕｍｍｅｒ方法により原始（ｐｒｉｓｔｉｎｅ）グラフェンオキシド（ＧＯｓ）を合成した。収得されたＧＯ粉末を脱塩水に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、３時間の間チップ−超音波処理して、ｎａｎｏ−ＧＯｓを収得した。
【００５９】
ＧＱＤｓの還元は、２時間の間２００℃でオートクレーブ基盤水熱法で行って、ｒＧＱＤｓを製造した。
【００６０】
前記生成物は、ＦＴ−ＩＲ分光器およびＡＦＭ分析で分析し、ｒＧＱＤｓと原始ＧＱＤｓは、ＡＦＭ結果において実際に差異がなかった。
【００６１】
実験方法
１．ＡＦＭイメージング
ＡＦＭイメージングのために、各試料（１０μｇ／ｍｌ）およびα−ｓｙｎフィブリル（１０μｇ／ｍｌ）を１ｃｍ２シリコン酸化物基板の上に落として常温で乾燥させた。ＸＥ−１００  ＡＦＭ（Ｐａｒｋ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて非接触モード（スキャンサイズ：２５μｍ２、スキャン速度：０．８Ｈｚ）で分析した。イメージは、ＸＥデータ収集プログラム（ＸＥＰ  １．８．０）で獲得した。
【００６２】
２．ＦＴ−ＩＲ測定
試料を高真空デシケーターで完全に乾燥させ、通常のＫＢｒペレット方法で製造した。そして、Ｎｉｃｏｌｅｔ  ６７００  ＦＴ−ＩＲスペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でスキャン回数３２回、波数範囲４０００〜４０ｃｍ−１の条件で測定した。
【００６３】
３．ＴｈＴ（ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｔ）蛍光および濁度（Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）分析
ＴｈＴ分析のために、各試料５０μｌを１６，０００×ｇで３０分間遠心分離した。そして、ペレットを１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて溶解させた２５μＭ  ＴｈＴ（Ｃａｔ＃：Ｔ３５１６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２００μｌに再懸濁させた。ＴｈＴ蛍光は、蛍光分光光度計を使用して４８２ｎｍ（４４０ｎｍで励起）で測定された。
【００６４】
濁度分析のために、α−ｓｙｎフィブリルをリン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を用いて１／１０の比率で希釈させた。そして、希釈されたα−ｓｙｎフィブリルをＣｏｒｎｉｎｇの９６ウェルプレートに移し、マルチモードマイクロプレートリーダーを用いて３６０ｎｍでの吸光度の強さを測定して、各試料の濁度を評価した。
【００６５】
４．ＴＥＭイメージング
試料を２分間グロー放電された４００メッシュカーボンコーティング銅グリッド（ＥＭＳ社製品）に吸着させた。そして、前記グリッドに迅速に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液を３滴を滴下して洗浄した後、それぞれ３０秒間０．７５％ギ酸ウラニルを連続的に２滴ずつ流した。ムラは、＃１ワットマン濾紙を使用して除去した。試料は、測定前に十分に乾燥して、８０ｋＶで作動する電子顕微鏡Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＣＭ  １２０  ＴＥＭとＡＭＴのＥＲ−８０  ＣＣＤ（８メガピクセル）を使用してデジタル化したイメージを獲得した。ニューロンの場合、１次培養した大脳皮質由来ニューロンをポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた３５ｍｍディッシュの上に１００，０００細胞／ウェルの密度で培養した。ニューロンは、ＤＩＶ１０に１μｇ／ｍｌのグラフェン量子ドットを含有したり含有しない１μｇ／ｍｌのＰＦＦｓを処理した。そして、７日後、ニューロンを１％ソジウムナイトライト（ｐＨ７．４）含有ＰＢＳで洗浄し、３％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、１．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド、１００ｍＭカコジレートおよび２．５％（ｖ／ｖ）スクロース（ｐＨ７．４）からなる固定液を使用して固定し、１時間の間ポスト固定させた。イメージは、Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｅｇａｖｉｅｗ  ＩＩＩデジタルカメラが装着されたＰｈｉｌｌｉｐｓ  ＥＭ  ４１０  ＴＥＭで収集された。
【００６６】
５．Ｄｏｔ−ｂｌｏｔ分析
Ｂｉｏ−Ｄｏｔ微細濾過装置（Ｃａｔ＃：１７０６４５；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して試料をあらかじめ濡らしたニトロセルロースメンブレン（孔隙サイズ：０．４５μｍ）にローディングし、負圧を用いて前記メンブレンに粘着させた。トリス緩衝食塩水（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で各メンブレンを洗浄した後、５％脱脂粉乳が含まれたツイン２０含有トリス緩衝食塩水でメンブレンをブロッキングした。試料を形態特異的ａｎｔｉ−α−ｓｙｎフィラメント抗体（Ｃａｔ＃：ａｂ２０９５３８；１：１，ａｂｃａｍ）で４℃で一晩中結合させ、引き続いて、ウサギから抽出したＨＲＰ接合二次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と常温で１時間の間培養した。そして、メンブレンをトリス緩衝食塩水で数回洗浄し、ＥＣＬ溶液を使用してイメージ化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。
【００６７】
６．ＢＮ−ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＢＮ−ＰＡＧＥの場合、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥＴＭサンプル用意キット（Ｃａｔ＃：ＢＮ２００８；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してα−ｓｙｎフィブリルおよびα−ｓｙｎ  ＰＦＦを用意し、２００Ｖで９０分間ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥＴＭ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１６％ビス−トリスゲル（Ｃａｔ＃：ＢＮ１００２Ｂｏｘ；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して電気泳動した。カソード（ｃａｔｈｏｄｅ）緩衝溶液は、５０ｍＭトリシン（ｔｒｉｃｉｎｅ）、１５ｍＭビス−トリスおよび０．０２％ブリリアントブルーＧ（ｐＨ７．０）を含有し、アノード（ａｎｏｄｅ）緩衝溶液は、５０ｍＭビス−トリス（ｐＨ７．０）で構成される。ゲルは、ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔＴＭシルバー染色キット（Ｃａｔ＃：ＬＣ６０７０；Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造社の指針に基づいて染色した。
【００６８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、１０ＤＩＶ大脳皮質由来神経細胞を７日間５μｇ／ｍｌグラフェン量子ドットの存在または不在下でα−ｓｙｎ  ＰＦＦ（５μｇ／ｍｌ）で処理した。神経細胞の可用タンパク質は、４℃でＰＢＳ溶液内１％ＴＸ−１００とタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）およびリン酸化タンパク質分解酵素（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）抑制剤のカクテル（Ｃａｔ＃：ＰＰＣ１０１０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて用意した。その後、溶解物を４℃で１２，０００×ｇで３０分間超音波処理した。ペレットを数回洗浄し、不溶性タンパク質の調製のために、２％ＳＤＳを含むＰＢＳに懸濁させた。２Ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｃａｔ＃：１６１０７３７，Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用して前記溶解物を希釈させた。引き続いて、２０μｇのタンパク質をＮｏｖｅｘＴＭ  ８−１６％トリス−グリシンゲル（Ｃａｔ＃：ＸＰ０８１６０ＢＯＸ，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にローディングし、１３０Ｖで８５分間電気泳動を行った。次に、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、５％脱脂粉乳を含む０．１％ツイン２０含有トリスを含む生理食塩水で１時間の間ブロッキングし、ａｎｔｉ−ｐＳ１２９−α−ｓｙｎ（Ｃａｔ＃：ａｂ５９２６４，１：１，０００，ａｂｃａｍ）、ＳＮＡＰ２５（Ｃａｔ＃：１１１−００２，１：２，０００，Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＶＡＭＰ２（Ｃａｔ＃：ａｂ３３４７，１：１，０００，ａｂｃａｍ）抗体を４℃で一晩中接合した後、ウサギまたはマウスから分離したＨＲＰ接合２次抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で常温で１時間の間培養した。ブロットは、ＥＣＬ溶液で視覚化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで分析した。
【００６９】
７．超音波処理されたα−ｓｙｎ  ＰＦＦの製造
α−ｓｙｎ  ＰＦＦは、Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌｉ−Ｄａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ９，２１３５−２１４６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１４．１４３（２０１４））により報告された従来の方法によって用意した。マウス組換え全長α−ｓｙｎをアンピシリン耐性バクテリア発現ベクターｐＲＫ１７２にクローニングした。次に、プラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｃａｔ＃：２３０４５，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入させて使用した。バクテリア培養後、前記言及された文献に従ってα−ｓｙｎ単量体を分離して、アニオン交換、透析およびサイズ排除クロマトグラフィーを含む様々な精製段階を通じて純粋に精製した。試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）α−ｓｙｎフィブリルは、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）オービタルミキサー（Ｃａｔ＃：５３８４０００２０）を使用して３７℃、１，０００ｒｐｍで７日間撹拌して凝集させた。α−ｓｙｎフィブリルの断片は、１／８”プローブ−ソニケーターを有する超音波装置を使用して２０％強度で総６０回のパルス（それぞれ〜０．５秒）を処理して作った。前記断片を１次培養された神経細胞と３７℃で７日間培養した後に、前記断片が神経細胞内で自然に成熟したフィブリルに変換され、細胞に対する毒性を示すことを確認した。
【００７０】
８．グラフェン量子ドットのビオチン化および結合分析
機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓａｔｉｏｎ）のために、グラフェン量子ドットにカルボキシル基を導入するために、５０ｍｇのグラフェン量子ドットを接合緩衝液（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．７）に溶解させた。引き続いて、１２．５ｍｇのＥＤＣ試薬（Ｎ−３（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｃａｔ＃：０３４４９，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、カルボキシル基をグラフェン量子ドットにカルボキシル基を導入した。１時間の間撹拌させた後、ＥＤＣ−活性化したグラフェン量子ドットに２５ｍｇのＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ３−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｃａｔ＃：２１３４７，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して、１２時間の間グラフェン量子ドットとビオチンとの間にアミド結合を形成させた。前記溶液を再生ニトロセルロース  メンブレン（Ｃａｔ＃：０６−６８０−２Ｇ、ＭＷＣＯ  １，０００  Ｄａｌｔｏｎｓ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で透析して、未反応ビオチンおよびＥＤＣ試薬を除去した。次に、前記溶液を回転濃縮器を使用して粉末形態の最終生成物を収得した。グラフェン量子ドットとα−ｓｙｎフィブリル間の結合分析のために、５ｍｇ／ｍｌのα−ｓｙｎフィブリルを５ｍｇ／ｍｌのビオチン化したグラフェン量子ドットおよびストレプトアビジン結合０．８ｎｍ金ナノ粒子（Ｃａｔ＃：８００．０９９，Ａｕｒｉｏｎ）とともに１時間の間培養した。その後、ビオチン化−グラフェン量子ドットに高い親和性で結合されたストレプトアビジン結合超小型金粒子は、ＧｏｌｄＥｎｈａｎｃｅＴＭ  ＥＭ  Ｐｌｕｓ溶液（Ｃａｔ＃：２１１４，Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）で５分間増強させた。未反応溶液を１００ｋＤａ  ＭＷＣＯスピンカラム（Ｃａｔ＃：ＵＦＣ５１００２４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｓｉｇｍａ）で除去した後、ＴＥＭ分析を行った。
【００７１】
９．１５Ｎ−標識されたα−ｓｙｎの精製
α−ｓｙｎ過発現のために、ｐＲＫ１７２ベクターにクローニングされたα−ｓｙｎ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）で導入した。同位元素−標識されたα−ｓｙｎの製造のために、リットル当たり０．５ｇの１５ＮＨ４Ｃｌおよび１ｇの１３Ｃグルコース（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）を含有するＭ９培地で１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと共に３７℃で細胞を成長させた。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した後、熱処理された細胞溶解物をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌアニオン交換、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００のサイズ排除およびＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカチオンクロマトグラフィーを使用して連続的に精製した。前記精製されたα−ｓｙｎを新しい２０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）１２Ｌで３回透析し、−８０℃で１ｍｇ／ｍｌの濃度で分注して保管した。実験直前に４℃でＮａｎｏｓｅｐ  １０Ｋメンブレン（Ｐａｌｌ  Ｇｅｌｍａｎ、ドイツ）を使用して試料を５ｍｇ／ｍｌで濃縮した。
【００７２】
１０．ＮＭＲ分光分析
α−ｓｙｎとグラフェン量子ドット間の相互作用に対する詳細なＮＭＲ研究は、ｃｒｙｏ−ｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｂｅが装着された９５０ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ、ドイツ）を使用して行った。均一に分類された１５Ｎ−標識α−ｓｙｎ（５ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ）をＧＱＤ（５ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ）と３７℃で３日間１，０００ｒｐｍで撹拌して反応させた。１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定のために、１０％含有２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を使用して１５Ｎ−標識α−ｓｙｎ試料を製造した。α−ｓｙｎおよびグラフェン量子ドットと反応したα−ｓｙｎの１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルは、３７℃で得られた。得られたデータをＮＭＲＰｉｐｅ２４で処理し、Ｓｐａｒｋｙ２５で分析した。
【００７３】
１１．シミュレーション細部事項
分子レベルでグラフェン量子ドットとα−ｓｙｎフィブリル間の相互作用を調査するために、Ｇｒｏｍａｃｓ  ５．１で２００ｎｓの分子力学（ＭＤ）シミュレーションを行った。α−ｓｙｎの疎水性ＮＡＣドメイン（残基７１〜８２）の初期構造は、ＣＨＡＲＭＭ  ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄを有するｓｓＮＭＲ構造（ＰＤＢ  ＩＤ：２Ｎ０Ａ）から適用され、グラフェン量子ドットの構造は、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｇｅｎｆｆ．ｐａｒａｍｃｈｅｍ．ｏｒｇ．のプロトコルによりＣＧｅｎＦＦで設計された。
【００７４】
１２．ＣＤ測定
α−ｓｙｎフィブリル（５ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ）をグラフェン量子ドット水溶液（５ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ）と混合し、７日間３７℃、１，０００ｒｐｍで振とう培養下に解重合させた。ｆａｒ−ＵＶ  ＣＤ測定の場合、試料を蒸留水で希釈（１／２）した。Ｊ−８１５分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、日本）と長さ０．２ｍｍの石英キューベットを使用して１９０ｎｍ〜２６０ｎｍのＣＤスペクトルを０．５ｎｍ間隔で測定した。緩衝溶液のスペクトルは、試料スペクトルから除外した。ＣＤ信号は、平均残留楕円率［θ］に対してｄｅｇｃｍ２／ｄｍｏｌの単位で正規化した。α−ｓｙｎフィブリルと解重合されたα−ｓｙｎフィブリルの分画二次構造含量は、ＤｉｃｈｒｏＷｅｂオンラインサーバーのＣＯＮＴＩＮ／ＬＬアルゴリズムを使用して計算した。ＣＯＮＴＩＮ／ＬＬを使用して計算するとき、ＤｉｃｈｒｏＷｅｂの参照セット７を使用し、１９０〜２４０ｎｍの波長範囲に合うように最適化した。
【００７５】
１３．１次神経細胞培養
マウス大脳皮質由来１次神経細胞は、１５日になったＣ５７ＢＬ／６マウス胚芽を使用して用意した。分離した神経細胞は、Ｂ２７補充因子（Ｃａｔ＃：１７５０４０４４，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＬ−グルタミン（Ｃａｔ＃：２５０３０１４９，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉａ（Ｃａｔ＃：２１１０３０４９，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で構成された培養培地に用意して、５０μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（Ｃａｔ＃：Ｐ６４０７，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングされた培養ディッシュにプレーティングされた。培養液は、１週間に２回交換して、３７℃、７％ＣＯ２培養器で維持された。培養されてから５日後に、神経膠細胞（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の成長を抑制するために、３０μＭの５−フルオロ−２'−デオキシウリジン（Ｃａｔ＃：Ｆ０５０３，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理した。マウスを使用した実験に対するすべての手続きは、ジョンズ・ホプキンズ大学の動物管理および使用委員会の指針に基づいて承認され遵守された。
【００７６】
１４．細胞生存および細胞毒性分析
細胞生存および細胞毒性分析のために、１次大脳皮質神経細胞をポリ−Ｄ−リジン  コーティングガラスカバースリップに密度１０，０００細胞／ｃｍ２で培養し、７％ＣＯ２培養器で１週間に２回培地を交換しつつ培養した。１次培養された神経細胞の細胞毒性は、グラフェン量子ドット（１μｇ／ｍｌ）の不在または存在下に７日間１０ＤＩＶマウス大脳皮質神経細胞にα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（１μｇ／ｍｌ）を処理した後、ＬＤＨ細胞毒性分析キット（Ｃａｔ＃：８８９５４，Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。また、ＴＵＮＥＬ分析キット（Ｃａｔ＃：１２１５６７９２９１０，Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞死滅を決定した。１次培養された神経細胞の生存力をａｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞生存能分析キット（Ｃａｔ＃：ＤＡＬ１０２５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓＴＭ）および神経突起派生物染色キット（Ｃａｔ＃：Ａ１５００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓＴＭ）を使用して測定した。前記神経突起派生物染色キットは、神経突起派生の標識として細胞メンブレン表面を染色するオレンジ色染料、および細胞内エステラーゼにより非蛍光基質から緑色蛍光生成物に転換される細胞透過性染色を含む。
【００７７】
１５．体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）免疫蛍光
ポリ−Ｄ−リジンコーティングをしたカバースリップに２０，０００細胞／ｃｍ２の密度でマウス１次大脳皮質神経細胞をプレーティングした。４％ＰＦＡを使用して神経細胞を固定した後、５％正常ロバ血清（Ｃａｔ＃：０１７−０００−１２１，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、２％ウシ血清アルブミン（Ｃａｔ＃：Ａ７０３０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．１％Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００（Ｃａｔ＃：Ｔ８７８７，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１時間の間室温でブロッキングした。ａｎｔｉ−８−ＯＨＧ（Ｃａｔ＃：ａｂ６２６２３，１：１，０００，ａｂｃａｍ）、ａｎｔｉ−ｐＳ１２９−α−ｓｙｎ（Ｃａｔ＃：ａｂ５９２６４，１：１，０００，ａｂｃａｍ）およびａｎｔｉ−ＭＡＰ２（Ｃａｔ＃：ＭＡＢ３４１８，１：１，０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体と共に４℃で一晩中培養した。試料を０．１％Ｔｒｉｏｎ  Ｘ−１００が含有されているＰＢＳで洗浄した後、ＦＩＴＣ接合２次抗体（ロバ抗マウスＦＩＴＣ；Ｃａｔ＃：７１５−０９５−１５１，ロバ抗ウサギＦＩＴＣ；Ｃａｔ＃：７１１−０９５−１５２，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびＣｙ３接合２次抗体（ロバ抗マウスＦＩＴＣ；Ｃａｔ＃：７１５−１６５−１５１，ロバ抗ウサギＣＹ３；Ｃａｔ＃：７１１−１６５−１５２７，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の混合物をカバースリップと共に常温で１時間の間培養した。蛍光イメージは、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ７１０，Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏｎｆｏｃｌａ）を通じて獲得した。
【００７８】
１６．複合体Ｉ活性分析
ミトコンドリア複合体Ｉ酵素活性は、複合体Ｉ酵素活性マイクロプレート分析キット（Ｃａｔ＃：ａｂ１０９７２１，ａｂｃａｍ）を使用して製造社の指示によって測定した。簡略に、１次大脳皮質神経細胞は、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた６ｃｍ培養ディッシュの上に１，０００，０００細胞／ディッシュの密度でプレーティングされた。神経細胞は、体外で１０日目に１μｇ／ｍｌのグラフェン量子ドットの存在または不在下にα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ  １μｇ／ｍｌで処理された。７日間処理後、１／１０体積の洗剤が含まれたＰＢＳを用いて１次神経細胞からタンパク質を抽出し、氷の上で３０分間培養した。試料の最終タンパク質濃度を５．５ｍｇ／ｍｌに調節した後、１２，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上澄み液をマイクロプレートウェルに載置し、室温で３時間の間培養した。３時間後、プレートを緩衝液で２回洗浄後、分析溶液２００μｌを添加した。ミトコンドリア複合体Ｉ酵素活性は、ＯＤ４５０で約１分間隔で３０分間測定した。
【００７９】
１７．ミトコンドリア形態の評価
大脳皮質１次神経細胞は、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされたガラスカバースリップ上に１０，０００細胞／ｃｍ２の濃度でプレーティングされた。１次培養された大脳皮質神経細胞は、ＤＩＶ１０で１μｇ／ｍｌのグラフェン量子ドットの存在または不在下にα−ｓｙｎ  ＰＦＦ  １μｇ／ｍｌで処理した。７日間処理後、神経細胞は、製造社の指針に基づいてＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲｏｓプローブ（Ｃａｔ＃：Ｍ７５１０，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色された。簡略に、１次神経細胞を１００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ  ＣＭＴＭＲｏｓプローブとともに３０分間培養した後、細胞イメージング溶液（Ｃａｔ＃：Ａ１４２９ＤＪ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄した。染色されたミトコンドリアは、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０）を使用して映像化し、長さまたは縦横比（ＡＰ、ミトコンドリアと同等な楕円の長軸と短軸の比）のようなミトコンドリア形態学的特徴をＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。
【００８０】
１８．酸素消費率の決定
酸素消費率（Ｏｘｙｇｅｎ  Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ，ＯＣＲ）は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ  ｃｅｌｌ  ｍｉｔｏストレステストキット（Ｃａｔ＃：１０３０１５，Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して製造社の指針を次のように修正して測定した。簡単に、１次培養した大脳皮質神経細胞をタツノオトシゴＸＦ２４細胞培養プレートの上に５００，０００細胞／ウェルの濃度でプレーティングした。神経細胞は、ＤＩＶ１０で１μｇ／ｍｌグラフェン量子ドットの存在または不在下にα−ｓｙｎ  ＰＦＦ  １μｇ／ｍｌで処理された。７日間処理後、ニューロンを暖かいＰＢＳで洗浄し、タツノオトシゴ分析培地で３７℃、１時間の間培養した。その後、プレートをＸＦ２４  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｉｃｉｎｃｅ）に入れ、酸素消費率を測定した。酸素消費率は、１分間混合、１分間待機および２分間測定のプロトコルで３７℃で測定した後、ＣＯ２がない培養器で４５分間培養した後、ＸＦ２４分析器で分析した。オリゴマイシン、カルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）およびロテノンを順次に注入して、基礎呼吸、呼吸鎖のカップリングおよびミトコンドリア呼吸容量を評価した。測定された酸素消費率は、各ウェルのタンパク質濃度を使用して標準化した。データは、対照群と比較してその変化を百分率で表示した。
【００８１】
１９．ライブイメージング
低速共焦点ライブイメージングのために、１次大脳皮質神経細胞は、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされたガラスボトムディッシュ（Ｃａｔ＃：１５０６８２，ＮｕｎｃＴＭ）の上に１０，０００の細胞をプレーティングし、３７℃、７％ＣＯ２培養器で培養した。ＤＩＶ７で、１次培養された神経細胞をＦＩＴＣ標識されたα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ、１μｇ／ｍｌ  ＧＱＤｓ−ビオチンおよびストレプトアビジンＱｄｏｔ複合体および細胞イメージングソリューションを含有する１００ｎＭ  ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒＴＭ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−２２（Ｃａｔ＃：Ｌ７５２５，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに１時間の間培養した。培養ディッシュを温度調節されたＣＯ２培養システムが装着されたＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０）に装着した後、４８８ｎｍおよび５６１ｎｍレーザー励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）で指定された間隔で低速イメージをキャプチャーした。
【００８２】
２０．微細流体チャンバー
トリプルコンパートメント微細流体装置（Ｔｒｉｐｌｅ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ）は、Ｘｏｎａ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ（Ｃａｔ＃：ＴＣＮＤ１０００）を使用した。ガラスカバースリップは、微細流体装置に付着される前にポリ−Ｄ−リジンでコーティングした。チャンバー当たり約１００，０００個の神経細胞をプレーティングし、ＤＩＶ７に０．５μｇのＧＱＤｓをチャンバー１（Ｃ１）またはチャンバー２（Ｃ２）に前処理した後、チャンバー１（Ｃ１）に０．５μｇのα−ｓｙｎ  ＰＦＦを処理した。第１チャンバーでα−ｓｙｎ  ＰＦＦの処理は、すべての試験グループで行われて、次のチャンバーに適切な伝送条件を生成した。流体フローの方向を調節するために、３つの区画の間には、培地体積の５０μｌ−差異が維持された。神経細胞は、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ処理後、１４日に４％ＰＦＡを含むＰＢＳを使用して固定した。チャンバー内の固定された神経細胞は、５％正常ロバ血清、２％ウシ血清アルブミン、０．１％トリトンＸ−１００を含有するブロッキング溶液を使用して常温で１時間の間培養した。神経細胞は、４℃で一晩中ａｎｔｉ−ｐＳ１２９−α−ｓｙｎ（Ｃａｔ＃：ａｂ５９２６４，１：１，０００，ａｂｃａｍ）およびａｎｔｉ−ＭＡＰ２（Ｃａｔ＃：ＭＡＢ３４１８，１：１，０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体で培養し、チャンバーを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳを使用して洗浄後、常温でＦＩＴＣ接合２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびＣｙ３接合２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の混合物で室温で１時間の間培養した。蛍光イメージは、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡を通じて収得した。
【００８３】
２１．動物
ジョンズ・ホプキンス医学研究所の動物管理および使用委員会の承認を得た国立動物健康管理研究所の動物管理および使用ガイド指針に基づいてすべての実験手続きを行った。ヒトのα−ｓｙｎ−Ａ５３Ｔ形質転換マウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ，Ｐｒｎｐ−ＳＮＣＡ＊  Ａ５３Ｔ；２３  Ｍｋｌｅ／Ｊ、ｓｔｏｃｋ＃：００６８２３）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂから購入した。
【００８４】
２２．グラフェン量子ドットの体外（ｉｎ  ｖｉｖｏ）血液脳関門透過性
体外血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ−Ｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）透過実験のための１次培養したマウス星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）は、Ｃ５８ＢＬ／６マウス１０匹を用いて用意した。簡単に、１次培養された混合された神経膠細胞は、（ｎｅｕｒｏｇｌｉａ）は、１−ｄ−ｏｌｄ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて用意した。隔離された大脳皮質から髄膜（ｍｅｎｉｎｇｅｓ）を除去し、１９ゲージ、０．５インチのニードルを付着した３０ｍｌ注射器で大脳皮質を破砕した。引き続いて、細胞を１０％ＦＢＳ、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミンおよび抗生剤／抗菌剤（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が補充されたＤＭＥＭで７５ｃｍ２  Ｔ−フラスコにプレーティングした。混合された神経膠細胞は、３７℃で５％ＣＯ２培養器で維持され、培養液は、週２回交替された。２週後、星状細胞隔離キット（Ｃａｔ＃：１３０−０９６−０５３，Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して純粋な星状細胞を分離した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの１次脳微細血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）は、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社から購入した。高純度（＞９５％）星状細胞とＢＭＥＣは、細胞特異マーカーＧＦＡＰ（星状細胞用）とＣＤ３１（ＢＭＥＣ用、Ｃａｔ＃：ａｂ２８３６４，１：５００，ａｂｃａｍ）マーカーを染色してモニタリングした。体外血液脳関門の製作のために、コラーゲンコーティングされた０．４μｍのｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｓｅｒｔｓ（Ｃａｔ＃：ＣＬＳ３４９１，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の下面に１０６細胞／ｍｌの星状細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間の間培養した。引き続いて、１０７細胞／ｍｌのＢＭＥＣがインサートの上にプレーティングされた６ウェルプレートの上にチャンバーを用心深く位置させた。体外ＢＢＢの構造的完全性を確認するために、ＢＭＥＣシーディング後、０、２、４、６および８日に上皮ボルト／オーム（ＴＥＥＲ）計測器（Ｃａｔ＃：３００５２３，ＥＶＯＭ２，ｗｏｒｌｄ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して上皮電気抵抗を測定した。完全性を確認するために、トランスウェルの内部（血液側）に血液脳関門透過性３ｋＤａデキストラン−フルオレセイン（Ｃａｔ＃：Ｄ３３０６，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をローディングし、蛍光分光光度計（デキストラン−フルオレセインに対してＥｘ＝４９４ｎｍ／Ｅｍ＝５２１ｎｍ、血液脳関門不透過性デキストランローダミンに対してＥｘ＝５５５ｎｍ／Ｅｍ＝５８０ｎｍ）で比率を測定した。内部（血中側）および外部（細胞膜）のＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅＴＭ  ＤＭＥＭ培地（Ｃａｔ＃：Ａ１８９６７０１，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して５２０ｎｍ（Ｅｘ＝３１０ｎｍ）で残っているグラフェン量子ドット、ビオチン−グラフェン量子ドット、ｎａｎｏ−ＧＯおよびｒＧＱＤｓの濃度を測定した。
【００８５】
２３．エクソソーム分離
放出されたエクソソームでグラフェン量子ドット−ビオチンの濃度を測定するために、ＢＭＥＣまたは星状細胞を６ｃｍ培養ディッシュに敷設し、５μｇのグラフェン量子ドット−ビオチンを１２時間の間処理した。１２時間後、培養培地を交換した後、２４時間および４８時間後にエクソソーム分離試薬（Ｃａｔ＃：４４７８３５９，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してエクソソームを分離した。
【００８６】
２４．グラフェン量子ドットの生体内（Ｉｎ  ｖｉｖｏ）血液脳関門透過性
グラフェン量子ドット−ビオチンの生体内免疫染色のために、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに２ｍｇ／ｋｇグラフェン量子ドット−ビオチンを腹腔注射した。脳を分離し、４％ＰＦＡで６時間の間固定させた後、４８時間の間３０％スクロースに脱水化過程を行い、免疫組織化学分析を行った。嗅球（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｕｌｂ）、新皮質（ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ）、中脳（ｍｉｄｂｒａｉｎ）および小脳（ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）のグラフェン量子ドット−ビオチン信号をＤＡＢキットを使用して視覚化した。上記で言及した領域の細胞でのグラフェン量子ドット−ビオチン陽性信号は、製造社の指針に基づいてＧｏｌｄＥｎｈａｎｃｅＴＭＥＭ  Ｐｌｕｓ溶液を使用して２０分間培養した後、免疫ＥＭ染色で確認した。生体内血液脳関門実験で、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、ビオチン（２ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを腹腔または静脈注射した。７日および１４日に、脳および血液を収得し、脳を１％ＴＸ−１００を含むＰＢＳで均質化させた。常温で３０分間放置して全血を凝固させ、凝固物を２，０００×ｇで１０分間遠心分離して除去した。グラフェン量子ドット−ビオチンの濃度は、ＱｕａｎｔＴａｇビオチン定量キット（Ｃａｔ＃：ＢＤＫ−２０００，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して測定した。グラフェン量子ドット−ビオチンの脳／血しょう濃度の比率は、脳／血しょうの比率に対して計算した。
【００８７】
２５．ドーパミン神経細胞死滅の立体学的評価
すべての実験手続きは、ジョンズ・ホプキンス医学研究所の動物管理および使用委員会の承認を得た国立動物健康管理研究所の動物管理および使用ガイド指針に基づいて行われた。８〜１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ６マウスをＪａｃｋｓｏｎ実験室から購入した。マウスをペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔させ、ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｃａｔ＃：Ｍｏｄｅｌ  ９００；Ｄａｖｉｄ  ＫＯＰＦ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて２μｌのＰＢＳまたはＰＦＦｓ（５μｇ／２μｌ）を線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）の片方半球に注射した。実験群には、５０μｌのＧＱＤ（マウス当たり５０μｇ）を６ヶ月間隔週で腹腔注射した。注射６ヶ月後、マウスをＰＢＳに引き続いて４％ＰＦＡで灌流した。１２時間の間４％ＰＦＡで固定した後、脳を３０％スクロースで脱水し、免疫組織化学法で分析した。中脳黒質（ＳＮ，ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ）を含む脳全体を５０μｍの冠状切片で切って、毎４番目の切片を死滅細胞数の分析に使用した。ウサギ多クローンａｎｔｉ−ＴＨ（Ｃａｔ＃：ＮＢ３００−１９；１：１，０００；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））、ウサギ多クローンａｎｔｉ−ｐＳ１２９−α−ｓｙｎ（Ｃａｔ＃：ａｂ５９２６４；１：１，０００；ａｂｃａｍ）をブロッキング溶液と共に培養した。ＤＡＢキット（Ｃａｔ＃：ＳＫ−４１００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して視覚化した後、ビオチン化した２次抗体およびストレプトアビジン接合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｃａｔ＃：ＰＫ−６１０１；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で培養した。染色された組織切片をスライドの上に載置した後、チオニンを使用してＮｉｓｓｌボディーを染色した。ＳＮでＴＨおよびＮｉｓｓｌ陽性神経細胞の総数をＳｔｅｒｅｏ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（ＭＢＦ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のＯｐｔｉｃａｌ  Ｆａｃｔｉｏｎａｔｏｒプローブプログラムを使用して測定した。
【００８８】
２６．生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）神経膠細胞免疫組織化学
動物の脳をＰＢＳおよび４％  ＰＦＡで灌流した。死後固定後、凍結させた後、切片を作って、ａｎｔｉ−Ｉｂａ−１抗体（Ｃａｔ＃：０１９−１９７４１；１：１，０００；Ｗａｋｏ）またはａｎｔｉ−ＧＦＡＰ抗体（Ｃａｔ＃：Ｚ０３３４；１：２，０００；Ｄａｋ）とともに培養した。培養した組織は、再びビオチン接合されたａｎｔｉウサギ抗体およびＡＢＣ試薬（Ｃａｔ＃：ＰＫ−６１０１；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に培養した後、ＤＡＢペルオキシダーゼ基質（Ｃａｔ＃：ＳＫ−４１００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して各切片を染色した。ＳＮでの神経膠細胞の数および密度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／、ＮＩＨ）で測定した。主要な器官病理組織検査のために、８〜１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにグラフェン量子ドット５０μｇを６週間隔週で腹腔注射した。６ヶ月の注射後、動物をＰＢＳと４％ＰＦＡを使用して灌流および固定した。肝、腎臓および脾臓を分離し、Ｈ＆Ｅ染色キット（Ｃａｔ＃：Ｈ−３５０２；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色した。
【００８９】
２７．α−ｓｙｎ凝集形成分析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をガラススライド上にプレーティングし、Ａ５３Ｔ変異があるｍｙｃ−標識α−ｓｙｎ変異体（ｐＣＭＶ５−ｍｙｃ−ＳＮＣＡ−Ａ５３Ｔ、ｋｉｎｄｌｙ  ｇｉｆｔｅｄ  ｂｙ  Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ．Ｓｕｄｏｆ）を有するｐＣＭＶ５ベクターでトランスフェクションした後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）またはグラフェン量子ドット（０．１μｇ／ｍｌ）を処理した。処理４８時間後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％ＰＦＡを含有するＰＢＳを使用して２０分間室温で固定した。そして、ＰＢＳで３回洗浄した後、固定された細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が含有されたＰＢＳを用いて４分間洗浄した。その後、細胞をＰＢＳで３回さらに洗浄し、５％ロバ血清が含有されたＰＢＳで２０分間ブロッキングさせた。α−ｓｙｎ発現は、α−ｓｙｎ抗体（Ｃａｔ＃：６１０７８７；１：１，０００；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してモニタリングした。レーザースキャニング共焦点顕微鏡で５５０ｎｍおよび５７０ｎｍに現れる信号をイメージ化した。フィールド当たり免疫陽性凝集体の数を測定した後、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，ＮＩＨ）を使用して定量し、ＤＡＰＩで染色された細胞の数を用いて標準化した。
【００９０】
２８．行動分析
（１）シリンダーテスト（ｃｙｌｉｎｄｅｒ  ｔｅｓｔ）
非対称的な前肢の使用をテストに用いた。２０ｃｍの透明プラスチックシリンダーに実験動物を入れ、シリンダー壁に前足が接触する回数を測定した。動物当たり２０〜３０回程度（接触に対して前方／後方および正反対に完全に実行された場合）の壁接触を測定した。損傷した大脳に相当する前肢接触の回数は、全体前肢接触の回数で割って百分率で表現された。互いに異なるグループに対して盲目の審査官がすべての分析を行った。
【００９１】
（２）ポールテスト（ｐｏｌｅ  ｔｅｓｔ）
すべての動物は、行動実験に先立って３０分間順応させた。行動実験用ポールは、包帯ガーゼで包まれた直径９ｍｍの７５ｃｍ金属ポールを使用して作った。マウスを柱の頂で（極の頂から７．５ｃｍ）頭を上に向かうように配置し、電柱の柱に到達するのにかかる総時間を記録した。実際実験に先立ってすべてのマウスを２日間連続訓練させた。各訓練セッションは、３回の個別的な訓練で構成し、試験当日にすべてのマウスを３回のセッションで評価し、総時間を記録した。テストおよび録画を中断する最大遮断時間は、６０秒であった。ターンダウン、下り坂、総時間（秒）に対する結果を記録した。
【００９２】
（３）クラスピングテスト（ｃｌａｓｐｉｎｇ  ｔｅｓｔ）
ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎマウスの場合、後肢のクラスピングがテストされた。尻尾を掴んだ動物の後肢のクラスピングを１０秒間観察し、各テストに対する点数は、下記の基準によって決定された。
１）点数０：後肢が外側に持続的に広がって腹部から遠ざかる場合。
２）点数１：1つの後肢が腹部側に５秒以上後退した場合。
３）点数２：2つの後肢が部分的に腹部側に５秒以上後退した場合。
４）点数３：両側の後肢が完全に後退して５秒以上腹部に触れた場合。
【００９３】
２９．統計
データは、少なくとも３回の独立的な実験から平均±標準偏差で測定された。統計的有意性を評価するために、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後分析と共に Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔテストやＡＮＯＶＡテストを行った。ｐ＜０．０５の評価は、有意なものと見なされた。
【００９４】
実験結果
１．α−ｓｙｎフィブリル化およびフィブリル分解に対するグラフェン量子ドットの効果
図１ａは、本発明によって製作されたグラフェン量子ドットの有無によるα−ｓｙｎフィブリル化およびフィブリル分解効果に対する模式図である。
【００９５】
図１ｂは、ＴｈＴ蛍光結果を用いてα−ｓｙｎフィブリル化程度を定量化したグラフである。図１ｂに示されたように、α−ｓｙｎのみが存在する場合には、α−ｓｙｎフィブリル化が急激に増加して蛍光値が増加するが、グラフェン量子ドットを共に反応させた場合には、１５０時間後にもα−ｓｙｎフィブリルが形成されないため、蛍光値の変化がないことを確認することができた。
【００９６】
図１ｃは、０、２、４、６、８、１０、１２、２４、７２および１６８時間の各反応時点で濁度分析結果（ｎ＝４、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストを通したツーウェイＡＮＯＶＡ、エラーバーは標準偏差）を示すグラフである。図１ｃに示されたように、α−ｓｙｎのみが存在する場合には、α−ｓｙｎフィブリル化が急激に増加して濁度が増加するが、グラフェン量子ドットを共に反応させた場合には、α−ｓｙｎフィブリルが形成されないため、濁度が増加しないことを確認することができた。
【００９７】
図１ｄは、グラフェン量子ドットの存在（右側）および不在（左側）下でフィブリル化させた後、ＴＥＭで確認したイメージである。図１ｄに示されたように、グラフェン量子ドットがない場合、α−ｓｙｎフィブリル化が進行されたが、グラフェン量子ドットを共に反応させた場合、７日経過後にもα−ｓｙｎフィブリルが形成されないことを確認することができた。
【００９８】
図１ｅは、ＴｈＴ蛍光によりモニタリングされた反応の標本を使用してグラフェン量子ドットと共に培養後に既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルの分解結果を示すグラフである。図１ｅに示されたように、α−ｓｙｎフィブリルとグラフェン量子ドットを共に反応させた場合、α−ｓｙｎフィブリルが分解されてＴｈＴ蛍光値が減少することを確認することができた。
【００９９】
図１ｆは、様々な反応時点（０、１、３、１２、２４、７２および１６８時間、各時点でｎ＝４、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストを通したツーウェイＡＮＯＶＡ、エラーバーは標準偏差）による濁度分析結果を示すグラフである。図１ｆに示されたように、α−ｓｙｎフィブリルとグラフェン量子ドットを共に反応させた場合、α−ｓｙｎフィブリルが分解されて濁度が減少することを確認することができた。
【０１００】
図１ｇは、グラフェン量子ドットのα−ｓｙｎフィブリル分解効果に対して終端間長さ（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ  ｌｅｎｇｔｈ、各時点でｎ＝５０フィブリル）およびフィブリル数（各時点でｎ＝４）を示すグラフである。図１ｇに示されたように、グラフェン量子ドットとα−ｓｙｎフィブリルを６時間反応させた後には、α−ｓｙｎフィブリルの長さが顕著に減少し、２４時間後には、α−ｓｙｎフィブリルの数も減少することを確認することができた。
【０１０１】
図１ｈは、グラフェン量子ドットの存在下に同じ時点（０、６、１２、２４および７２時間）で残留するα−ｓｙｎフィブリルの量をα−ｓｙｎフィブリルの終端間長さとα−ｓｙｎフィブリル数との積で分析した結果を示すグラフである。図１ｈに示されたように、グラフェン量子ドットによりα−ｓｙｎフィブリルの量が顕著に減少することを確認することができた。
【０１０２】
図１ｉは、グラフェン量子ドットの不在（上段）または存在（下段）下で様々な反応時点（６時間、１２時間、１日、３日および７日）後にα−ｓｙｎフィブリルのＴＥＭイメージである。図１ｉに示されたように、グラフェン量子ドットの存在下でα−ｓｙｎフィブリルの長さが減少し、形成されていたα−ｓｙｎフィブリルが効果的に分解されることを直接的に確認することができた。
【０１０３】
図１ｊは、α−ｓｙｎフィラメント特異的抗体を用いて多様な反応時点（０時間、１２時間、１日、３日および７日）でｄｏｔ−ｂｌｏｔ分析によるα−ｓｙｎフィブリルの測定結果を示すものである。図１ｊに示されたように、反応時間が増加するほどα−ｓｙｎフィブリルの量は顕著に減少し、７日目にはα−ｓｙｎフィブリルが検出されないことを確認することができた。
【０１０４】
図１ｋは、多様な反応時点（０時間、３時間、６時間、１２時間、１日、３日および７日）後に反応の標本として用意されたα−ｓｙｎのＢＮ−ＰＡＧＥ分析結果を示すものである。図１ｋに示されたように、グラフェン量子ドットと反応７日目には、α−ｓｙｎフィブリルがすべて分解されて単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）状態で存在することを確認することができた。
【０１０５】
上記結果を通じて、本発明のグラフェン量子ドットがα−ｓｙｎのフィブリル化を抑制させることができるだけでなく、既に形成されているα−ｓｙｎフィブリルを効果的に分解することができることを確認した。
【０１０６】
２．分解過程中にグラフェン量子ドットと既に形成されたα−ｓｙｎフィブリル間の相互作用に対する分析
図２ａは、ビオチン化したグラフェン量子ドットとα−ｓｙｎフィブリル間の結合をＴＥＭを使用して低倍率および高倍率で確認した結果である。三角形形状の矢印は、超小型金−ストレプトアビジンナノ粒子と結合したビオチン化したグラフェン量子ドットを示す。図２ａに示されたように、グラフェン量子ドットとα−ｓｙｎフィブリルとが結合されていることを確認することができた。
【０１０７】
図２ｂは、培養１時間後に分解過程でα−ｓｙｎフィブリルの平均幅の長さ変化（各グループ毎にｎ＝２０、＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔテスト、エラーバーは標準偏差）を示すグラフである。図２ｂに示されたように、グラフェン量子ドットがα−ｓｙｎフィブリルと結合されて平均幅が増加したことを確認することができた。
【０１０８】
図２ｃは、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルから得られたＮＭＲ化学的移動差異を示すグラフである。グラフェン量子ドットと結合した後、各残留物に対するＮＭＲの化学的移動の減少した強度比を確認することができる。図２ｃに示されたように、α−ｓｙｎフィブリルのＮＡＣとＣ−末端部分にグラフェン量子ドットが結合したことを確認することができた。
【０１０９】
図２ｄは、時間経過シミュレーション動力学を用いてグラフェン量子ドットと既に形成されたα−ｓｙｎフィブリル間の相互作用と６５ｎｓまでのスナップショットイメージである。図２ｄに示されたように、グラフェン量子ドットがα−ｓｙｎフィブリルに結合してα−ｓｙｎフィブリルの構造を変更させることを予測することができた。
【０１１０】
図２ｅは、原子位置のＲＭＳＤに対する時間依存性プロット、α−ｓｙｎフィブリルグループ（黒色）およびα−ｓｙｎフィブリルとグラフェン量子ドットグループ（赤色）に対するＳＡＳＡ、全ポテンシャルエネルギー（△Ｕｔｏｔ）、静電気エネルギー（△Ｅｌｅｃ）およびα−ｓｙｎフィブリルおよびグラフェン量子ドットグループに対するファンデルワールスエネルギー（△Ｅｖａｎ）を示す結果である。
【０１１１】
図２ｆは、ＤＳＳＰアルゴリズムにより計算された時間依存性プロットを示すものである。図２ｆに示されたように、ベータ−ｓｈｅｅｔが減少し、アルファ−ｈｅｌｉｘが増加することを確認することができた。
【０１１２】
図２ｇは、７日間培養した後、グラフェン量子ドットの不在および存在下にα−ｓｙｎ単量体とα−ｓｙｎフィブリルのＣＤスペクトルを示すグラフである。
【０１１３】
図２ｈは、ＣＯＮＴＩＮ／ＬＬのアルゴリズムを使用して計算されたグラフェン量子ドットによるα−ｓｙｎフィブリルおよび分解されたα−ｓｙｎフィブリルの部分２次構造の含有比率を示すグラフである。図２ｈに示されたように、β−ｓｈｅｅｔが減少し、α−ｈｅｌｉｘが増加することを確認することができた。
【０１１４】
上記結果を通じて、本発明のグラフェン量子ドットは、α−ｓｙｎフィブリルに直接的に結合してα−ｓｙｎフィブリルの構造を変形させることによって、α−ｓｙｎフィブリルの分解を促進させることができることを確認することができた。
【０１１５】
３．試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる神経細胞の死滅および病理現象、転移に及ぼすグラフェン量子ドットの影響
図３ａ〜図３ｃは、１０ＤＩＶマウス由来大脳皮質神経細胞で７日間（ｎ＝４）グラフェン量子ドット（１μｇ／ｍｌ）の不在および存在下にα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（１μｇ／ｍｌ）を処理し、ＴＵＮＥＬにより評価された神経細胞の死滅（図３ａ）、ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（図３ｂ）およびＬＤＨ分析（図３ｃ）結果を示すグラフである。図３ａ〜図３ｃに示されたように、グラフェン量子ドットは、細胞に毒性を示さず、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより現れる細胞毒性を有意的に減少させることを確認することができた。
【０１１６】
図３ｄは、ｐ−α−ｓｙｎ抗体を用いて免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）を行った結果を示すイメージであり、図３ｅは、β−アクチンで標準化したＳＤＳ不溶性分画のｐ−α−ｓｙｎの量を定量化したグラフである（ｎ＝３）。図３ｄおよび図３ｅに示されたように、グラフェン量子ドットを共に処理した場合には、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが顕著に減少することを確認することができた。
【０１１７】
図３ｆは、神経細胞でのｐ−α−ｓｙｎおよびｐ−α−ｓｙｎ抗体免疫顕微鏡イメージであり、図３ｇは、ＰＢＳ対照群（ｎ＝３）で標準化したｐ−α−ｓｙｎ免疫蛍光強度の程度を定量したグラフである。図３ｆおよび図３ｇに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを処理した実験群では、赤色蛍光が顕著に増加したが、グラフェン量子ドットと共に処理した場合には、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが分解されて赤色蛍光値が顕著に減少したことを確認することができた。
【０１１８】
図３ｈは、病理学的α−ｓｙｎ転移を確認するための３つのチャンバーで構成された微細流体装置の模式図である。
【０１１９】
図３ｉは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを追加し、１４日後、微細流体装置で観察されたｐ−α−ｓｙｎ免疫染色された神経細胞の代表的なイメージである。そして、図３ｊは、ｐ−α−ｓｙｎ免疫蛍光強度を定量化して示すグラフである。ｐ−α−ｓｙｎにより占有された領域を各チャンバーで測定した（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ＮＳ、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストを通したツーウェイＡＮＯＶＡ、エラーバーは標準偏差）。図３ｉおよび図３ｊに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを一番目のカラムに処理した対照群の場合には、すべてのカラムで赤色蛍光（α−ｓｙｎフィブリル）が高く観察された反面、グラフェン量子ドットとα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを共に一番目のカラム（Ｃ１）に処理した実験群とα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを一番目のカラムに、グラフェン量子ドットを２番目カラム（Ｃ２）に処理した実験群は、全部α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓの量が顕著に減少して赤色蛍光がほとんど観察されないことを確認することができた。
【０１２０】
上記結果を通じて、本発明のグラフェン量子ドットは、神経細胞内でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによるα−ｓｙｎフィブリル化を顕著に抑制することができることを確認した。また、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが神経細胞内で転移されるに従ってグラフェン量子ドットも共に転移されたα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによるフィブリル化を抑制することができることを確認した。これを通じて、本発明のグラフェン量子ドットを用いてα−ｓｙｎフィブリル化による神経細胞間の疾病転移抑制および治療するのに効果的に使用することができることを確認することができた。
【０１２１】
４．生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でα−ｓｙｎが誘導された病理学でのグラフェン量子ドットの効果
図４ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの線条体にα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（５μｇ）を注入した座標を示す模式図である。５０μｇのグラフェン量子ドットまたはＰＢＳを隔週で６ヶ月間腹腔注射した。
【０１２２】
図４ｂは、グラフェン量子ドットの不在（上段）または存在（下段）下にα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ注入された半球ＳＮの代表的なＴＨ免疫組織化学染色に対するイメージである。図４ｂに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓのみを注入した実験群では、神経細胞が死滅されて陰影が減少した反面、グラフェン量子ドットを共に投与した実験群では、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる神経細胞死滅が抑制されて陰影程度が正常対照群と類似に回復したことを確認することができた。
【０１２３】
図４ｃは、グラフェン量子ドットの注入があるグループとないグループ（各グループ当たりｎ＝６）に６ヶ月間のα−ｓｙｎ  ＰＦＦ注射後に立体分析を通じてＳＮでＴＨ−およびＮｉｓｓｌ−陽性神経細胞の数を立体学的に計算した結果を示すグラフである。図４ｃに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓとグラフェンを共に投与した実験群では、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる神経細胞死滅が減少することを確認することができた。
【０１２４】
図４ｄは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが注入された半球の線条体での代表的なＴＨ−免疫組織化学染色イメージであり、図４ｅは、線条体でＴＨ−免疫陽性線維の密度を定量化した結果を示すグラフである（各グループ当たりｎ＝５〜６）。図４ｄおよび図４ｅに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓとグラフェン量子ドットを共に投与した実験群では、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによるＴＨ−免疫陽性線維の密度減少が回復することを確認することができた。
【０１２５】
図４ｆは、マウスの前足の使用で測定した行動的欠損評価のうちシリンダーテスト結果を示すグラフである（各グループ当たりｎ＝５〜６）。また、図４ｇは、マウスの行動的欠損評価のうちポールを握って把握できる能力であるポールテスト結果を示すグラフである（各グループ当たりｎ＝５〜６）。図４ｆおよび図４ｇに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓの投与による異常なマウスの行動がグラフェン量子ドットを共に投与する場合には、正常マウス対照群と類似した行動類型を示すことを確認することができた。
【０１２６】
図４ｈは、線条体およびα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが注入された半球のＳＮで代表的なｐ−α−ｓｙｎの免疫染色イメージを示すイメージであり、図４ｉは、線条体およびＳＮ（ｎ＝５）でｐ−α−ｓｙｎの免疫反応性神経細胞の定量化結果を示すグラフである。図４ｈおよび図４ｉに示されたように、グラフェン量子ドットを共に投与した実験群では、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ陽性神経細胞の数が顕著に減少したことを確認することができた。
【０１２７】
図４ｊは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが注入された半球（ｐ−α−ｓｙｎ陽性ニューロン：赤色点、ｐ−α−ｓｙｎ陽性神経突起：赤色線）のＣＮＳでのＬＢ／ＬＮ類似病理の分布を示す模式図である。図４ｊに示されたように、グラフェン量子ドットを共に投与した実験群では、病理分布程度が顕著に減少したことを確認することができた。
【０１２８】
図４ｋは、ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ  Ｔｇモデルの観測領域に対する模式図である。５０μｇのグラフェン量子ドットまたはＰＢＳを４ヶ月間隔週で腹腔注射した。
【０１２９】
図４ｌは、ｄｏｔ−ｂｌｏｔ分析によるｐ−α−ｓｙｎおよびα−ｓｙｎフィブリルを測定したイメージである。図４ｌに示されたように、グラフェン量子ドットを投与した実験群の場合には、脳幹（ｂｒａｉｎｓｔｅｍ）でｐ−α−ｓｙｎおよびα−ｓｙｎフィブリルが顕著に減少したことを確認することができた。
【０１３０】
図４ｍは、ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ  Ｔｇの皮質、腹側中脳および脳幹での代表的なα−ｓｙｎ免疫染色イメージ（各グループ当たりｎ＝５）である。図４ｍに示されたように、ｈＡ５３Ｔ  α−ｓｙｎ  Ｔｇマウスの皮質（ｃｏｒｔｅｘ）、腹側中脳（ｖｅｎｔｒａｌ  ｍｉｄｂｒａｉｎ）、および脳幹で全部α−ｓｙｎが凝集している構造が観察される反面、グラフェン量子ドットを投与した実験群の場合には、α−ｓｙｎが凝集した構造がほとんど観察されないことを確認することができた。
【０１３１】
図４ｎは、ｈＡ５３Ｔ皮質（Ｃｔｘ）、腹側中脳（ＶＭ）および脳幹（ＢＳ）でｐ−α−ｓｙｎ免疫反応性神経細胞の定量化（各グループ当たり５個）結果を示すグラフである。図４ｎに示されたように、グラフェン量子ドットを投与した実験群の場合には、ｐ−α−ｓｙｎ免疫反応性神経細胞の数が顕著に減少したことを確認することができた。
【０１３２】
図４ｏは、マウスの行動的欠損評価のうちクラスピングテスト結果を示すグラフ（左側）と、マウスの行動的欠損評価のうちポール（ｐｏｌｅ）実験結果を示すグラフ（右側）である（各グループ当たりｎ＝５）。図４ｏに示されたように、ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ  Ｔｇマウスは、欠損行動が増加したが、グラフェン量子ドットを投与した実験群の場合には、欠損行動が回復することを確認することができた。
【０１３３】
上記結果を通じて、本発明のグラフェン量子ドットは、ｉｎ  ｖｉｖｏでも効果的にα−ｓｙｎの異常な線維化または凝集を効果的に抑制したり、形成されたα−ｓｙｎ凝集体を効果的に分解して、α−ｓｙｎの異常な線維化または凝集により現れる病的症状を治療することができることを確認することができた。
【０１３４】
５．シヌクレイン症の病因に対するグラフェン量子ドットの治療効果
図５は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの病理学的α−ｓｙｎ凝集現象の転移および増殖により誘発された病因に対するグラフェン量子ドットの抗凝集効能に対する模式図である。グラフェン量子ドットがない場合、病理学的α−ｓｙｎ単量体は、自発的線維化を経て線維状凝集体を形成し、結局、ドーパミン性ニューロン、ＬＢ／ＬＮ類似体構成および行動異常を誘導する。反面、グラフェン量子ドットは、α−ｓｙｎのフィブリル化を抑制し、形成されたフィブリルを単量体に分解して、ドーパミン性神経細胞の損失、異常なα−ｓｙｎフィブリルにより誘発されるＬＢ／ＬＮ類似体および行動障害を予防および治療することができる。
【０１３５】
６．グラフェン量子ドットの合成とビオチン化およびグラフェン量子ドット−ビオチンとα−ｓｙｎフィブリルの結合分析
図６ａは、カーボンファイバーで熱酸化切断で合成されるグラフェン量子ドットを示す模式図である。
【０１３６】
図６ｂは、合成されたグラフェン量子ドットのＡＦＭイメージであり、図６ｃは、グラフェン量子ドットの厚さ分布を示すグラフである。図６ｂおよび図６ｃに示されたように、グラフェン量子ドットの平均高さは、０．１〜３ｎｍであることを確認することができた。
【０１３７】
図６ｄは、グラフェン量子ドットをビオチン化させる合成手続きの模式図である。
【０１３８】
図６ｅは、グラフェン量子ドット（黒色線）およびビオチン化したグラフェン量子ドット（赤色線）のＦＴ−ＩＲスペクトルである。図６ｅに示されたように、グラフェン量子ドットをビオチン化させる場合、官能基に変化があることを確認することができた。
【０１３９】
図６ｆは、ビオチン化したグラフェン量子ドットとナノゴールド−ストレプトアビジン間の結合親和度のための製造段階を示す模式図であり、図６ｇは、グラフェン量子ドット−ビオチン−ナノゴールド−ストレプトアビジン複合体（左側）とナノゴールド−ストレプトアビジン複合体（右側）の存在下で７日後に既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルのＴＥＭイメージである。図６ｇに示されたように、ビオチン化したグラフェン量子ドットも、α−ｓｙｎフィブリルに結合して、α−ｓｙｎフィブリルを分解することを確認することができた。
【０１４０】
７．α−ｓｙｎフィブリルの分解に対するグラフェン量子ドットの効果
図７ａは、多様な反応時点（０、６、１２、２４および７２時間、各時点でｎ＝５０フィブリル）でα−ｓｙｎフィブリル長さの分布を示すグラフである。図７ａに示されたように、反応前には、６００ｎｍ以上の長いα−ｓｙｎフィブリルが観察されたが、反応時間が長くなるほど単量体形態のα−ｓｙｎが観察されることを確認することができた。
【０１４１】
図７ｂは、多様な反応時点（０、２４および４８時間）後にα−ｓｙｎフィブリルのＡＦＭイメージを示し、指定された領域の代表的なラインプロファイル（グラフェン量子ドット：青色線、α−ｓｙｎフィブリル：赤色線）を示すものである。図７ｂに示されたように、α−ｓｙｎフィブリルとグラフェン量子ドットを反応させた後にも、高さには大きな差異がないことを確認することができた。
【０１４２】
８．α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓの分解に対するグラフェン量子ドットの効果
図８ａは、グラフェン量子ドット（５ｍｇ／ｍｌ）の不在（上段）および存在（下段）下に１時間の間反応させた線維化α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（５ｍｇ／ｍｌ）の代表的なＴＥＭイメージであり、図８ｂは、１時間の間反応させた後、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓの終端間長さ（ｎ＝２８６；ＰＦＦｓ、ｎ＝２４９；ＰＦＦｓ＋ＧＱＤｓ、＊＊＊Ｐ＜０．００１；Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−テスト、エラーバーは標準偏差）を示すグラフである。図８ａおよび図８ｂに示されたように、グラフェン量子ドットが線維化α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを分解して終端間長さが減少したことを確認することができた。
【０１４３】
図８ｃは、多様な反応時間後に残存するα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓと分解されたα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓの量をＢＮ−ＰＡＧＥにより評価した結果を示すイメージである。図８ｃに示されたように、反応時間が長くなるほどα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが分解されて単量体形態で存在することを確認することができた。
【０１４４】
９．１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル分析
図９ａは、１５Ｎ−標識α−ｓｙｎ単量体（黒色）のみが培養された場合とグラフェン量子ドットと共に培養されたα−ｓｙｎ（赤色）の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルが完全に重なることを示す。割り当てられた残基は、１５Ｎ−標識α−ｓｙｎ単量体グループだけで現れた。図９ｂは、グラフェン量子ドットと共に培養された１５Ｎ−標識α−ｓｙｎ単量体の完全なＨＳＱＣスペクトルを示す。１５Ｎ−標識α−ｓｙｎ単量体グループのピーク強度に基づいて、ピーク強度での非減少または最小減少を有する残留物（赤色）、ピーク強度での顕著な減少を有する残留物（青色）および消えた残留物（黒色）は、目立って現れる。これを通じて、グラフェン量子ドットがα−ｓｙｎを構成するアミノ酸のＮ−末端または正電荷を帯びる残基と結合することを確認した。
【０１４５】
１０．α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより誘導された神経細胞死滅および制限された神経突起生成に対するグラフェン量子ドットの効果
図１０ａは、代表的なＴＵＮＥＬ−陽性神経細胞のイメージである。ＤＩＶ１０  １次大脳皮質神経細胞にグラフェン量子ドット（１μｇ／ｍｌ）の不在および存在下でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（１μｇ／ｍｌ）を処理した。ＴＵＮＥＬ分析は、７日間培養した後に行われた。図１０ａに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓのみを処理した実験群の場合には、赤色蛍光が多数観察される反面、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓとグラフェン量子ドットを共に処理した実験群の場合には、赤色蛍光が減少して、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる細胞死滅が減少したことを確認することができた。
【０１４６】
図１０ｂは、外部細胞膜（赤色）および細胞透過性生存指数（緑色）により染色された神経突起の成長程度および細胞生存能検定の代表的な顕微鏡イメージであり、図１０ｃおよび図１０ｄは、神経突起成長および神経細胞生存能力を定量化した結果を示すグラフである。図１０ｂ〜図１０ｄに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを単独で処理した実験群では、神経突起の成長も減少し、細胞生存率も減少した反面、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓとグラフェン量子ドットを共に処理した実験群の場合には、対照群と類似した神経突起成長率を示すことを確認することができた。また、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる細胞死滅が抑制されることを確認することができた。
【０１４７】
図１０ｅは、ＳＮＡＰ２５およびＶＡＭＰ２タンパク質レベルの免疫ブロット分析結果を示すグラフである。１０ＤＩＶ  １次大脳皮質神経細胞にグラフェン量子ドット（５μｇ／ｍｌ）の不在および存在下でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（５μｇ／ｍｌ）を処理し、７日間培養し、免疫ブロットを実施した。図１０ｆは、ＳＮＡＰ２５の発現レベルをベータ−アクチン発現レベルで標準化した後に定量化（ｎ＝３）して示すグラフであり、図１０ｇは、ＶＡＭＰ２発現レベルをベータ−アクチン発現レベルで標準化した後に定量した（ｎ＝３）結果を示すグラフである。図１０ｅ〜図１０ｇに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを単独で処理した実験群では、ＳＮＡＰ２５およびＶＡＭＰ２タンパク質の発現が有意的に減少したが、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓとグラフェン量子ドットを共に処理した実験群の場合には、対照群と類似したレベルで発現することを確認することができた。
【０１４８】
１１．α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより誘発されたミトコンドリア機能障害および酸化ストレス誘発に対するグラフェン量子ドットの効果
図１１ａは、グラフェン量子ドット（１μｇ／ｍｌ）の不在および存在下でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（１μｇ／ｍｌ）を処理し７日間培養した主な大脳皮質神経細胞の代表的な８−ＯＨＧ（８−ｈｙｄｒｏｘｙｇｕａｎｉｎｅ）免疫染色イメージであり（各グループ当たりｎ＝４）、図１１ｂは、８−ＯＨＧの量を免疫蛍光レベルで定量化したグラフである。図１１ａおよび図１１ｂに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを単独で処理した場合には、酸化ストレスが増加するが、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓとグラフェン量子ドットを共に処理した場合には、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる酸化ストレスが減少することを確認することができた。
【０１４９】
図１１ｃは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（１μｇ／ｍｌ）とグラフェン量子ドット（１μｇ／ｍｌ）を処理し７日間培養した後、ミトコンドリア複合体の活性を測定した結果を示すグラフである。図１１ｃに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによるミトコンドリア複合体活性抑制がグラフェン量子ドットにより回復されることを確認することができた。
【０１５０】
図１１ｄは、代表的なＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ陽性顕微鏡イメージである。１０ＤＩＶの１次大脳皮質神経細胞にグラフェン量子ドット（１μｇ／ｍｌ）の不在および存在下でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（１μｇ／ｍｌ）を処理した。７日間培養した後、ミトコンドリアをＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）ＣＭＴＭＲｏｓ（赤色）で標識した。図１１ｅは、染色されたミトコンドリアの長さを定量化した結果を示すグラフであり（各グループ当たりｎ＝５０）、図１１ｆは、染色されたミトコンドリアの縦横比を示すグラフである（各グループ当たりｎ＝５０）。そして、図１１ｇは、染色されたミトコンドリアの低倍率および高倍率の代表的なＴＥＭイメージである。図１１ｄ〜図１１ｇに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによるミトコンドリアの長さおよび縦横比の減少がグラフェン量子ドットにより回復されることを確認することができた。
【０１５１】
図１１ｈは、ニューロンに対するマイクロプレート基盤の呼吸測定数値を示すグラフである。酸素消費率は、２４時間の間グラフェン量子ドット（１μｇ／ｍｌ）の不在および存在下でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（１μｇ／ｍｌ）を処理した１次皮質ニューロンを用いてＸＦ２４  Ｓｅａｈｏｒｓｅ分析器で測定した（各グループ当たりｎ＝４）。図１１ｉは、呼吸測定結果の基底呼吸率を定量化したグラフであり、図１１ｊは、呼吸測定結果の最大呼吸率を定量化したグラフである。図１１ｈ〜図１１ｊに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる呼吸率減少がグラフェン量子ドットにより回復されることを確認することができた。
【０１５２】
上記結果を通じて、本発明のグラフェン量子ドットは、α−ｓｙｎの異常な線維化または凝集による酸化ストレス、ミトコンドリアの形態異常、機能不全に対して緩和または治療効果を示すことを確認することができた。
【０１５３】
１２．グラフェン量子ドットの様々な処理時点でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより誘導された１次神経細胞の毒性および病理的現象に対するグラフェン量子ドットの効果および細胞ライブイメージング
１０ＤＩＶマウスの大脳皮質神経細胞に３日前（ｎ＝４，Ｂｅｆｏｒｅ）、同時（ｎ＝４，Ｓｉｍｕｌ）およびグラフェン量子ドット処理（１μｇ／ｍｌ）後に培養３日目（ｎ＝４，Ａｆｔｅｒ）にα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（１μｇ／ｍｌ）を処理した。
【０１５４】
図１２ａは、ａｌａｒｍａｒＢｌｕｅ蛍光分析結果を示す結果である。図１２ａに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる細胞死滅がグラフェン量子ドットにより抑制されることを確認することができた。グラフェン量子ドット処理３日前にα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを処理した場合、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓとグラフェン量子ドットを同時に処理した場合、グラフェン量子ドットを処理し３日後にα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを処理した場合、全部細胞死滅が効果的に抑制されることを確認することができた。
【０１５５】
図１２ｂは、ＬＤＨ分析結果を示すグラフである。図１２ｂに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによるＬＤＨ分泌がグラフェン量子ドットにより抑制されることを確認することができ、これを通じて、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓによる細胞死滅がグラフェン量子ドットの処理により効果的に抑制されることを確認することができた。
【０１５６】
図１２ｃは、ｄｏｔ−ｂｌｏｔ分析によるｐ−α−ｓｙｎの代表的なイメージであり、図１２ｄは、ＰＢＳ対照群（各グループ当たりｎ＝４）で標準化した定量化した結果を示すグラフである。図１２ｃおよび図１２ｄに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓがグラフェン量子ドットにより効果的に分解されることを確認することができた。
【０１５７】
図１２ｅは、７日間培養した後、ｐ−α−ｓｙｎ抗体による代表的なｐ−α−ｓｙｎ免疫染色蛍光顕微鏡イメージであり、図１２ｆは、ＰＢＳ対照群として標準化したｐ−α−ｓｙｎの免疫蛍光強度を定量化して示すグラフである（各グループ当たりｎ＝４）。図１２ｅおよび図１２ｆに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓがグラフェン量子ドットにより効果的に分解されることを確認することができた。
【０１５８】
図１２ｇは、グラフェン量子ドットとα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが神経細胞のリソソームに共に位置することをライブ映像で確認したものである。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（青色）、グラフェン量子ドット−ビオチン−ストレプトアビジンＱｄｏｔ複合体（赤色）およびＦＩＴＣ−標識α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ（緑色）を使用した。
【０１５９】
図１２ｈは、グラフェン量子ドットによるα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓの分解過程は、ライブ  イメージングを用いて低速蛍光信号をモニタリングしたことを示す。
【０１６０】
上記結果を通じて、本発明のグラフェン量子ドットは、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓの形成前に、同時に、または形成後に処理したとき、全部効果的にα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを分解することを確認することができた。これを通じて、本発明のグラフェン量子ドットは、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患の予防および治療用途に全部使用され得ることを確認することができた。
【０１６１】
１３．グラフェン量子ドットの血液脳関門透過性
図１３ａは、血液脳関門透過性体外実験の模式図である。
【０１６２】
図１３ｂは、脳微細血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）および星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）の合流単一層形成をそれぞれＣＤ３１（内皮細胞マーカー）またはＧＦＡＰ（星状細胞マーカー）抗体で免疫蛍光染色により確認した結果を示す。
【０１６３】
図１３ｃは、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を多様な時点（０、２、４、６および８日、各グループ当たりｎ＝４、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストで1元ＡＮＯＶＡ、エラーバーは標準偏差）で測定した結果を示す。
【０１６４】
図１３ｄは、内皮細胞単一層および星状細胞の透過性をデキストランフルオレセイン（３ｋＤａ）およびデキストラン−ローダミン（２，０００ｋＤａ）を使用して血液側と脳側間内の比率を測定することによって観察した結果を示す。
【０１６５】
図１３ｅは、時間経過によるグラフェン量子ドットおよびグラフェン量子ドット−ビオチンの透過性を定量化したグラフである。図１３ｅに示されたように、グラフェン量子ドットおよびビオチン化したグラフェン量子ドットは全部高い細胞透過性を示すことを確認することができた。
【０１６６】
図１３ｆは、グラフェン量子ドットとグラフェン量子ドット−ビオチンのα−ｓｙｎフィブリル分解能力をｄｏｔ−ｂｌｏｔで観察した結果を示すイメージである。図１３ｆに示されたように、グラフェン量子ドットおよびビオチン化したグラフェン量子ドットは、全部内皮細胞単一層および星状細胞層を全部透過してα−ｓｙｎフィブリルを効果的に分解することを確認することができた。
【０１６７】
図１３ｇは、ＴｈＴおよび濁度分析結果を示すグラフである（各グループ当たりｎ＝４、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストで1元ＡＮＯＶＡ、エラーバーは標準偏差）。図１３ｇに示されたように、グラフェン量子ドットおよびビオチン化したグラフェン量子ドットは、全部内皮細胞単一層および星状細胞層を全部透過してα−ｓｙｎフィブリルを効果的に分解して濁度が効果的に減少したことを確認することができた。
【０１６８】
図１３ｈは、グラフェン量子ドット−ビオチンで１時間培養後に１次培養されたＢＭＥＣおよび星状細胞の共焦点レーザースキャニング顕微鏡のイメージである。グラフェン量子ドット−ビオチンは、ＱｄｏｔＴＭ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎで、リソソームはＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒオレンジで表示されている。図１３ｈに示されたように、内皮細胞および星状細胞のリソソームにビオチン化したグラフェン量子ドットが存在することを確認することができた。
【０１６９】
図１３ｉは、ＢＭＥＣまたは星状細胞から抽出したエクソソーム内のグラフェン量子ドット−ビオチンを定量化したグラフである。細胞死滅後２４および４８時間に分離したエクソソームを用いてグラフェン量子ドット−ビオチンの量を測定した（各グループ当たり、ｎ＝３）。図１３ｉに示されたように、反応時間が増加するほど内皮細胞および星状細胞内に含まれているビオチン化したグラフェン量子ドットの量が増加することを確認することができた。
【０１７０】
図１３ｊは、グラフェン量子ドット−ビオチン（２ｍｇ／ｋｇ）をマウスに腹腔注射した後、小脳、中脳、嗅球（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｕｌｂ）、および新皮質（ｎｅｏｃｏｒｔｅｘ）に存在するビオチン化したグラフェン量子ドットをアビジン−ビオチン複合体検出方法または免疫ゴールド（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ）方法で染色して免疫組織化学で確認した結果を示すイメージである。ＤＡＢ陽性染色信号は、ビヒクル注入対照群に比べてグラフェン量子ドット−ビオチンが注射されたマウスで高く検出された。免疫ゴールド（ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ）陽性信号は、ニューロン内部（赤色三角形）またはニューロン外部（青色三角形）で全部観察された。図１３ｊに示されたように、ビオチン化したグラフェン量子ドットがｉｎ  ｖｉｖｏでもＢＢＢ層を全部通過することを確認することができた。
【０１７１】
図１３ｋは、グラフェン量子ドット−ビオチンの腹腔内注入（ｉ．ｐ．；赤色バー）と静脈内注入（ｉ．ｖ．；青色バー）の差異を比較した結果を示すグラフである。2つの注入方法は、全部結果は実質的に差異がないことを確認することができ、これを通じて、グラフェン量子ドットの注入方法による効果差異がないことを確認することができた。
【０１７２】
図１３ｌは、隔週でグラフェン量子ドット−ビオチンを注射した後、ビオチン定量キットを使用して１〜８週、３ヶ月および６ヶ月（各グループ当たり、ｎ＝４）のグラフェン量子ドット−ビオチン濃度を測定した。図１３ｌに示されたように、ビオチン化したグラフェン量子ドットの注射回数が増加するほど体内に残っているグラフェン量子ドットも増加することを確認することができた。
【０１７３】
図１３ｍは、グラフェン量子ドット−ビオチン２ｍｇ／ｋｇを１回腹腔注射した後、１時間、７日、１４日後に（各グループ当たり、ｎ＝４）脳（緑色バー）と血しょう（青色バー）での濃度を測定した結果を示すグラフである。また、図１３ｎは、隔週で多回注射した後、３ヶ月および６ヶ月後に脳（緑色バー）と血しょう（青色バー）での濃度を測定した結果を示すグラフである。図１３ｍおよび図１３ｎに示されたように、１回注射した場合にも、１４日間体内にグラフェン量子ドットが残っていることを確認することができ、多回接種した場合には、６ヶ月までもグラフェン量子ドットが残っていることを確認することができた。
【０１７４】
上記結果を通じて、本発明のグラフェン量子ドットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで全部血液脳関門を効果的に透過することができるだけでなく、体内に長期間残っていることを確認することができた。これを通じて、本発明のグラフェン量子ドットを神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する疾患に対する高い治療効果を示すことができることを確認することができた。
【０１７５】
１４．黒質（ＳＮ）でα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ−誘導された神経膠細胞活性化に対するグラフェン量子ドットの影響
図１４ａは、低倍率および高倍率のＳＮでＩｂａ−１に対する代表的な免疫組織化学染色を実施したイメージである。α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが注入されたＳＮ半球に属するミクログリアを特異的マーカーであるＩｂａ−１（イオン化カルシウム結合タンパク質、ミクログリア／マクロファージの特異的マーカー）で染色した。そして、図１４ｂは、染色されたＩｂａ−１−陽性ミクログリアを定量化したグラフである（ｎ＝５）。図１４ａおよび図１４ｂに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより増加したＩｂａ−１−陽性ミクログリアがグラフェン量子ドットにより抑制されることを確認することができた。
【０１７６】
図１４ｃは、低倍率および高倍率のＳＮでＧＦＡＰに対する代表的な免疫組織化学を検査したイメージである。α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓが注入された半球のＳＮで星状細胞をＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ；星状細胞の特異的マーカー）抗体で染色した。そして、図１４ｄは、染色されたＧＦＡＰ強度を定量化したグラフである。ＧＦＡＰ強度は、ＰＢＳ注入対照群（各グループ当たりｎ＝５）に対して標準化された（＊Ｐ＜０．０５；ＮＳ、有意でない；ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストを使用する２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、エラーバーは標準偏差）。図１４ｃおよび図１４ｄに示されたように、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより増加した星状細胞がグラフェン量子ドットにより抑制されることを確認することができた。
【０１７７】
上記結果を通じて、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓにより増加する神経炎症細胞がグラフェン量子ドットにより抑制されることを確認することができた。
【０１７８】
１５．ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ形質転換マウスの脳幹で膠質細胞活性化に対するグラフェン量子ドットの効果
本発明のグラフェン量子ドットが脳幹で膠質細胞の活性化に及ぼす影響を確認するために、ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ  Ｔｇマウスの脳幹の青斑（ｌｏｃｕｓ  ｃｏｅｒｕｌｅｕｓ；ＬＣ）を用いて実験を進めた。
【０１７９】
図１５ａは、低倍率および高倍率の脳幹のＬＣでミクログリアの免疫組織化学法で染色したイメージと染色されたＩｂａ−１−陽性ミクログリアを定量化したグラフである（各グループは、ｎ＝５、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ＮＳは、有意でない、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストを使用する２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、エラーバーは標準偏差）。ｎＴｇまたはｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ  Ｔｇの脳幹でのミクログリアは、Ｉｂａ−１で染色された。図１５ａに示されたように、ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ  Ｔｇマウスで増加したＩｂａ−１−陽性ミクログリアが、グラフェン量子ドットを投与することによって減少されることを確認することができた。
【０１８０】
図１５ｂは、低倍率および高倍率の脳幹でＧＦＡＰを免疫組織化学法で染色したイメージと染色されたＧＦＡＰを定量化したグラフである。相対ＧＦＡＰ強度は、ＰＢＳ注入対照群（ｎ＝５、各グループ）に対して標準化した。図１５ｂに示されたように、ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ  Ｔｇマウスで増加したＧＦＡＰが、グラフェン量子ドットを投与することによって減少されることを確認することができた。
【０１８１】
図１５ｃは、ｈＡ５３Ｔα−ｓｙｎ過発現を有するＨＥＫ２９３細胞でα−ｓｙｎ凝集体形成に対するＧＱＤｓの効果を確認したイメージとフィールド当たり免疫陽性凝集体の数を定量化し、標準化（ｎ＝７、＊＊Ｐ＜０．０１，エラーバーは標準偏差）したグラフである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＣＭＶ５−ｍｙｃ−Ａ５３Ｔα−ｓｙｎを導入し、試験群にグラフェン量子ドット（０．１μｇ／ｍｌ）を処理した。グラフェン量子ドットを処理し４８時間後に、細胞をα−ｓｙｎ抗体で免疫染色した。白色矢印は、α−ｓｙｎ凝集体を意味する。図１５ｃに示されたように、α−ｓｙｎ凝集体の形成がグラフェン量子ドットにより効果的に抑制されることを確認することができた。
【０１８２】
１６．グラフェン量子ドットの長期間試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）毒性検査
図１６ａは、ａｌａｍａｒＢｌｕｅおよびＬＤＨ分析法で７日間培養したＤＩＶ１０大脳皮質神経細胞でグラフェン量子ドットの細胞毒性を測定したグラフである（ｎ＝４、各時点、ＮＳは、有意でない、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストを使用する１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、エラーバーは標準偏差）。図１６ａに示されたように、グラフェン量子ドットは、長期間培養時にも細胞毒性を示さないことを確認することができた。
【０１８３】
図１６ｂは、グラフェン量子ドットが注入されたマウスの生存曲線を示すグラフである。５０μｇのグラフェン量子ドットまたはビヒクルをＣ５７ＢＬ／６マウスに６ヶ月間腹腔注射し、グラフェン量子ドットの生体内毒性をモニタリングした（各グループ当たりｎ＝２０）。統計的に８ヶ月後にグラフェン量子ドットとビヒクル注入対照群との間に有意な差異がないことを確認することができた。
【０１８４】
図１６ｃは、主要な器官をｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎおよびｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）で染色したイメージである。図１６ｃに示されたように、グラフェン量子ドットが主要な器官に毒性を示さないことを確認することができた。
【０１８５】
図１６ｄは、グラフェン量子ドット−ビオチンの生体内追跡のための注入およびサンプリング方法の計画模式図であり、図１６ｅは、脳（赤色）または尿（青色）で時間によるグラフェン量子ドット−ビオチンの濃度を測定したグラフである。５０μｇのグラフェン量子ドット−ビオチンをＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔注射し、多様な時点（１、３、７および１４日）で測定した。図１６ｅに示されたように、ビオチン化したグラフェン量子ドットが尿を通じて排出されて、体内での濃度が減少することを確認することができた。
【０１８６】
上記結果を通じて、本発明のグラフェン量子ドットは、体内で毒性を示さず、注射した後、時間が経つと、尿を通じて安定的に排出されることを確認することができた。
【０１８７】
１７．α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓに対するｎａｎｏ−ＧＯｓとｒＧＱＤｓの比較
図１７ａは、機能的グループに対する指定されたピークを有する原始グラフェン量子ドット（黒色）、ｎａｎｏ−ＧＯｓ（ナノグラフェンオキシド、緑色）および還元ＧＱＤｓ（ｒＧＱＤｓ、紫色）のＦＴ−ＩＲスペクトルを示すグラフである。そして、図１７ｂは、代表的なラインプロファイルを有するｎａｎｏ−ＧＯｓおよびグラフェン量子ドットのＡＦＭイメージである。図１７ｂに示されたように、ｎａｎｏ−ＧＯｓは、平均５ｎｍ程度の高さを示すが、グラフェン量子ドットの場合には、０．１〜３ｎｍの高さを示すことを確認することができた。
【０１８８】
図１７ｃは、それぞれの物質２０μｇ／ｍｌを細胞に処理し、７２時間の間培養した後、細胞毒性を定量化したグラフである（各グループ当たりｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、エラーバーは標準偏差）。図１７ｃに示されたように、還元グラフェン量子ドットとｎａｎｏ−ＧＯｓの場合には、細胞毒性を示すが、グラフェン量子ドットの場合には、細胞毒性を示さないことを確認することができた。
【０１８９】
図１７ｄは、それぞれの物質（１、１０および２０μｇ／ｍｌ）を多様な濃度で処理した後、１２、２４および７２時間にａｌａｒｍａｒＢｌｕｅ分析を使用してＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞での細胞毒性をモニタリングしたグラフである。図１７ｄに示されたように、還元グラフェン量子ドットとｎａｎｏ−ＧＯｓの場合には、細胞毒性を示すが、グラフェン量子ドットの場合には、細胞毒性を示さないことを確認することができた。
【０１９０】
図１７ｅは、ｄｏｔ  ｂｌｏｔで評価したグラフェン量子ドット、ｎａｎｏ−ＧＯｓおよびｒＧＱＤｓのα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓ分解効果を比較したイメージである。図１７ｅに示されたように、還元グラフェン量子ドットとｎａｎｏ−ＧＯｓの場合には、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを分解する効果がないことを確認することができた。
【０１９１】
そして、図１７ｆは、ＴｈＴおよび濁度分析を示すグラフである（各グループ当たりｎ＝４、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意でない、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉテストで１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ、エラーバーは標準偏差）。図１７ｆに示されたように、グラフェン量子ドットの場合には、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを効果的に分解して濁度および蛍光値が減少するが、還元グラフェン量子ドットとｎａｎｏ−ＧＯｓの場合には、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを分解しないことを確認することができた。
【０１９２】
図１７ｇは、それぞれの物質５ｍｇ／ｍｌをα−ｓｙｎ  ＰＦＦｓと共に処理し、７日間反応させた後に獲得されたＴＥＭイメージである。図１７ｇに示されたように、還元グラフェン量子ドットとｎａｎｏ−ＧＯｓの場合には、α−ｓｙｎ  ＰＦＦｓを分解しないことを確認することができた。
【０１９３】
図１７ｈは、血液脳関門透過性体外実験を通じてグラフェン量子ドット、ｎａｎｏ−ＧＯｓおよびｒＧＱＤｓの体外血液脳関門透過性を測定したグラフである。図１７ｈに示されたように、グラフェン量子ドットと還元グラフェン量子ドットの場合には、血液脳関門を通過するが、ｎａｎｏ−ＧＯｓの場合には、通過率が低いことを確認することができた。
【０１９４】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【０１９５】
本発明のグラフェン量子ドットは、細胞毒性がなく、α−ｓｙｎフィブリル形成を抑制したり既に形成されたα−ｓｙｎフィブリルを分解することができ、血液脳関門を通過する作用効果を示すので、神経タンパク質の異常な線維化または凝集に関連する多様な疾患の治療剤として幅広く使用され得るものと期待される。
【図１ａ】
2021532041.tif 000004
【図１ｂ】
2021532041.tif 000005
【図１ｃ】
2021532041.tif 000006
【図１ｄ】
2021532041.tif 000007
【図１ｅ】
2021532041.tif 000008
【図１ｆ】
2021532041.tif 000009
【図１ｇ】
2021532041.tif 000010
【図１ｈ】
2021532041.tif 000011
【図１ｉ】
2021532041.tif 000012
【図１ｊ】
2021532041.tif 000013
【図１ｋ】
2021532041.tif 000014
【図２ａ】
2021532041.tif 000015
【図２ｂ】
2021532041.tif 000016
【図２ｃ】
2021532041.tif 000017
【図２ｄ】
2021532041.tif 000018
【図２ｅ】
2021532041.tif 000019
【図２ｆ】
2021532041.tif 000020
【図２ｇ】
2021532041.tif 000021
【図２ｈ】
2021532041.tif 000022
【図３ａ】
2021532041.tif 000023
【図３ｂ】
2021532041.tif 000024
【図３ｃ】
2021532041.tif 000025
【図３ｄ】
2021532041.tif 000026
【図３ｅ】
2021532041.tif 000027
【図３ｆ】
2021532041.tif 000028
【図３ｇ】
2021532041.tif 000029
【図３ｈ】
2021532041.tif 000030
【図３ｉ】
2021532041.tif 000031
【図３ｊ】
2021532041.tif 000032
【図４ａ】
2021532041.tif 000033
【図４ｂ】
2021532041.tif 000034
【図４ｃ】
2021532041.tif 000035
【図４ｄ】
2021532041.tif 000036
【図４ｅ】
2021532041.tif 000037
【図４ｆ】
2021532041.tif 000038
【図４ｇ】
2021532041.tif 000039
【図４ｈ】
2021532041.tif 000040
【図４ｉ】
2021532041.tif 000041
【図４ｊ】
2021532041.tif 000042
【図４ｋ】
2021532041.tif 000043
【図４ｌ】
2021532041.tif 000044
【図４ｍ】
2021532041.tif 000045
【図４ｎ】
2021532041.tif 000046
【図４ｏ】
2021532041.tif 000047
【図５】
2021532041.tif 000048
【図６ａ】
2021532041.tif 000049
【図６ｂ】
2021532041.tif 000050
【図６ｃ】
2021532041.tif 000051
【図６ｄ】
2021532041.tif 000052
【図６ｅ】
2021532041.tif 000053
【図６ｆ】
2021532041.tif 000054
【図６ｇ】
2021532041.tif 000055
【図７ａ】
2021532041.tif 000056
【図７ｂ】
2021532041.tif 000057
【図８ａ】
2021532041.tif 000058
【図８ｂ】
2021532041.tif 000059
【図８ｃ】
2021532041.tif 000060
【図９ａ】
2021532041.tif 000061
【図９ｂ】
2021532041.tif 000062
【図１０ａ】
2021532041.tif 000063
【図１０ｂ】
2021532041.tif 000064
【図１０ｃ】
2021532041.tif 000065
【図１０ｄ】
2021532041.tif 000066
【図１０ｅ】
2021532041.tif 000067
【図１０ｆ】
2021532041.tif 000068
【図１０ｇ】
2021532041.tif 000069
【図１１ａ】
2021532041.tif 000070
【図１１ｂ】
2021532041.tif 000071
【図１１ｃ】
2021532041.tif 000072
【図１１ｄ】
2021532041.tif 000073
【図１１ｅ】
2021532041.tif 000074
【図１１ｆ】
2021532041.tif 000075
【図１１ｇ】
2021532041.tif 000076
【図１１ｈ】
2021532041.tif 000077
【図１１ｉ】
2021532041.tif 000078
【図１１ｊ】
2021532041.tif 000079
【図１２ａ】
2021532041.tif 000080
【図１２ｂ】
2021532041.tif 000081
【図１２ｃ】
2021532041.tif 000082
【図１２ｄ】
2021532041.tif 000083
【図１２ｅ】
2021532041.tif 000084
【図１２ｆ】
2021532041.tif 000085
【図１２ｇ】
2021532041.tif 000086
【図１２ｈ】
2021532041.tif 000087
【図１３ａ】
2021532041.tif 000088
【図１３ｂ】
2021532041.tif 000089
【図１３ｃ】
2021532041.tif 000090
【図１３ｄ】
2021532041.tif 000091
【図１３ｅ】
2021532041.tif 000092
【図１３ｆ】
2021532041.tif 000093
【図１３ｇ】
2021532041.tif 000094
【図１３ｈ】
2021532041.tif 000095
【図１３ｉ】
2021532041.tif 000096
【図１３ｊ】
2021532041.tif 000097
【図１３ｋ】
2021532041.tif 000098
【図１３ｌ】
2021532041.tif 000099
【図１３ｍ】
2021532041.tif 000100
【図１３ｎ】
2021532041.tif 000101
【図１４ａ】
2021532041.tif 000102
【図１４ｂ】
2021532041.tif 000103
【図１４ｃ】
2021532041.tif 000104
【図１４ｄ】
2021532041.tif 000105
【図１５ａ】
2021532041.tif 000106
【図１５ｂ】
2021532041.tif 000107
【図１５ｃ】
2021532041.tif 000108
【図１６ａ】
2021532041.tif 000109
【図１６ｂ】
2021532041.tif 000110
【図１６ｃ】
2021532041.tif 000111
【図１６ｄ】
2021532041.tif 000112
【図１６ｅ】
2021532041.tif 000113
【図１７ａ】
2021532041.tif 000114
【図１７ｂ】
2021532041.tif 000115
【図１７ｃ】
2021532041.tif 000116
【図１７ｄ】
2021532041.tif 000117
【図１７ｅ】
2021532041.tif 000118
【図１７ｆ】
2021532041.tif 000119
【図１７ｇ】
2021532041.tif 000120
【図１７ｈ】
2021532041.tif 000121
【国際調査報告】
2021532041.tif 000122
2021532041.tif 000123
2021532041.tif 000124
2021532041.tif 000125
2021532041.tif 000126
2021532041.tif 000127