(57)【要約】本開示は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。本開示は、抗原認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））を含み、増加されたレベルのＩＬ−３３を発現する、免疫応答性細胞に関する。ある特定の実施形態では、操作された免疫応答性細胞は、抗原指向性であり、増強された免疫活性化特性を有する。本開示の主題はまた、被験体における新生物を処置および／または予防する方法を提供する。
2021502828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体と、
（ｂ）外因性ＩＬ−３３ポリペプチドまたはその断片と
を含む、単離された免疫応答性細胞。
【請求項２】
（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体と、
（ｂ）内因性ＩＬ−３３遺伝子座における改変されたプロモーターであって、前記内因性ＩＬ−３３遺伝子の遺伝子発現を増強する、改変されたプロモーターと
を含む、単離された免疫応答性細胞。
【請求項３】
前記改変が、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターによる内因性プロモーターの置換え、または前記内因性ＩＬ−３３遺伝子座のプロモーター領域への構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの挿入を含む、請求項２に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項４】
前記構成的プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、およびＣＡＧプロモーターからなる群より選択される、請求項３に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項５】
前記誘導性プロモーターが、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターおよびエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）プロモーターからなる群より選択される、請求項３に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項６】
前記抗原が、腫瘍抗原または病原体抗原である、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項７】
前記外因性ＩＬ−３３ポリペプチドが、分泌される、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項８】
前記抗原認識受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項９】
前記抗原認識受容体が、外因性または内因性である、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１０】
前記抗原認識受容体が、組換えにより発現される、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１１】
前記抗原認識受容体が、ベクターから発現される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１２】
前記外因性ＩＬ−３３ポリペプチドが、ベクターから発現される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１３】
Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、リンパ系細胞を分化させることができるヒト胚性幹細胞および多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１４】
自家である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１５】
前記抗原が、腫瘍抗原である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１６】
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体−ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、Ｋ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ  ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩ、およびＥＲＢＢからなる群より選択される、請求項１５に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１７】
前記抗原が、ＣＤ１９である、請求項１６に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１８】
前記ＩＬ−３３ポリペプチドが、アミノ末端に異種シグナル配列を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項１９】
前記異種シグナル配列が、ＩＬ−２シグナル配列、カッパリーダー配列、ＣＤ８リーダー配列、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１８に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２０】
前記異種シグナル配列が、ＩＬ−２シグナル配列である、請求項１９に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２１】
前記抗原認識受容体が、ＣＡＲである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２２】
前記ＣＡＲが、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項２１に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２３】
前記ＣＡＲが、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない、請求項２２に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２４】
前記ＣＡＲが、１９ｚである、請求項２３に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２５】
前記ＩＬ−３３ペプチドが、配列番号４または配列番号２１に表記されている配列と少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２６】
前記ＩＬ−３３ペプチドが、配列番号４または配列番号２１に表記されているアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２７】
前記外因性ＩＬ−３３ポリペプチドが、前記免疫応答性細胞の免疫応答を増強する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２８】
前記外因性ＩＬ−３３ポリペプチドが、前記免疫応答性細胞の抗腫瘍サイトカイン産生を増加させる、請求項２７に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項２９】
前記抗腫瘍サイトカインが、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γからなる群より選択される、請求項２８に記載の単離された免疫応答性細胞。
【請求項３０】
有効量の請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項３１】
新生物を処置するためのものである、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
被験体における腫瘍負荷を低下させる方法であって、前記被験体に、有効量の免疫応答性細胞またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記免疫応答性細胞が、
（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体および外因性ＩＬ−３３ポリペプチド、または
（ｂ）抗原に結合する抗原認識受容体および内因性ＩＬ−３３遺伝子座における改変されたプロモーターであって、前記内因性ＩＬ−３３遺伝子の遺伝子発現を増強する、改変されたプロモーター
を含む、方法。
【請求項３３】
腫瘍細胞の数を低下させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍サイズを低下させる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体における前記腫瘍を根絶する、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
新生物を処置および／または予防する方法であって、被験体に、有効量の免疫応答性細胞またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記免疫応答性細胞が、
（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体および外因性ＩＬ−３３ポリペプチド、または
（ｂ）抗原に結合する抗原認識受容体および内因性ＩＬ−３３遺伝子座における改変されたプロモーターであって、前記内因性ＩＬ−３３遺伝子の遺伝子発現を増強する、改変されたプロモーター
を含む、方法。
【請求項３７】
新生物を有する被験体の生存を延長する方法であって、前記被験体に、有効量の免疫応答性細胞またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記免疫応答性細胞が、
（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体および外因性ＩＬ−３３ポリペプチド、または
（ｂ）抗原に結合する抗原認識受容体および内因性ＩＬ−３３遺伝子座における改変されたプロモーターであって、前記内因性ＩＬ−３３遺伝子の遺伝子発現を増強する、改変されたプロモーター
を含む、方法。
【請求項３８】
前記新生物が、血液がん、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫および卵巣がんからなる群より選択される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記新生物が、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病または非ホジキンリンパ腫であり、前記抗原が、ＣＤ１９である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記新生物が、卵巣であり、前記抗原が、ＭＵＣ１６である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
被験体における腫瘍抗原または病原体抗原に応答して免疫活性化サイトカイン産生を増加させる方法であって、前記被験体に、有効量の免疫応答性細胞またはそれを含む医薬組成物を投与するステップを含み、前記免疫応答性細胞が、
（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体および外因性ＩＬ−３３ポリペプチド、または
（ｂ）抗原に結合する抗原認識受容体および内因性ＩＬ−３３遺伝子座における改変されたプロモーターであって、前記内因性ＩＬ−３３遺伝子の遺伝子発現を増強する、改変されたプロモーター
を含む、方法。
【請求項４２】
前記免疫活性化サイトカインが、ＩＬ−２、ＧＭ−ＳＣＦおよびＩＦＮ−γからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫応答性細胞が、請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞である、請求項３２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記医薬組成物が、請求項３０または３１に記載の医薬組成物である、請求項３２から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
血液がんの処置を必要とする被験体における血液がんを処置する方法であって、前記被験体に、治療有効量のＴ細胞を投与するステップを含み、前記Ｔ細胞が、
（ａ）ＣＤ１９に結合する抗原認識受容体および外因性ＩＬ−３３ポリペプチド、または
（ｂ）ＣＤ１９に結合する抗原認識受容体および内因性ＩＬ−３３遺伝子座における改変されたプロモーターであって、前記内因性ＩＬ−３３遺伝子の遺伝子発現を増強する、改変されたプロモーター
を含む、方法。
【請求項４６】
前記血液がんが、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
抗原特異的免疫応答性細胞を産生するための方法であって、免疫応答性細胞に、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列と、（ｂ）外因性ＩＬ−３３ポリペプチドまたはその断片をコードする第２の核酸配列とを導入するステップを含み、前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列のそれぞれが、必要に応じて、プロモーターエレメントに作動可能に連結している、方法。
【請求項４８】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の一方または両方が、ベクター中に含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
それぞれが必要に応じてプロモーターエレメントに作動可能に連結した、（ａ）抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列と、（ｂ）外因性ＩＬ−３３ポリペプチドまたはその断片をコードする第２の核酸配列とを含む、核酸組成物。
【請求項５１】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の一方または両方が、ベクター中に含まれる、請求項５５に記載の核酸組成物。
【請求項５２】
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項５１に記載の核酸組成物。
【請求項５３】
請求項５０から５２のいずれか一項に記載の核酸組成物を含む、ベクター。
【請求項５４】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞、請求項３０もしくは３１に記載の医薬組成物、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の核酸組成物、または請求項５４に記載のベクターを含む、キット。
【請求項５５】
新生物、病原体感染、自己免疫性障害または同種異系移植を処置および／または予防するための説明書をさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
治療法における使用のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項５７】
腫瘍負荷の低下における使用のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項５８】
新生物の処置および／または予防における使用のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項５９】
新生物を有する被験体の生存の延長における使用のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項６０】
被験体における腫瘍抗原または病原体抗原に応答した免疫活性化サイトカイン産生の増加における使用のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項６１】
治療法における使用のための、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
腫瘍負荷の低下における使用のための、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
新生物の処置および／または予防における使用のための、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
新生物を有する被験体の生存の延長における使用のための、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
被験体における腫瘍抗原または病原体抗原に応答した免疫活性化サイトカイン産生の増加における使用のための、請求項３０または３１に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
腫瘍負荷の低下、新生物の処置および／もしくは予防、新生物を有する被験体の生存の延長、ならびに／または被験体における腫瘍抗原もしくは病原体抗原に応答した免疫活性化サイトカイン産生の増加のための医薬の製造における、請求項１から２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞の使用。
【請求項６７】
腫瘍負荷の低下、新生物の処置および／もしくは予防、新生物を有する被験体の生存の延長、ならびに／または被験体における腫瘍抗原もしくは病原体抗原に応答した免疫活性化サイトカイン産生の増加のための医薬の製造における、請求項３０または３１に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１１月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／５８５，８３３号に対する優先権を主張し、この仮出願の内容は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれ、この仮出願に対する優先権が主張される。
【０００２】
序論
本開示の主題は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。本開示の主題は、ＩＬ−３３ポリペプチドを発現するように操作された、抗原認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））を含む免疫応答性細胞に関する。このような操作された免疫応答性細胞は、抗原指向性であり、他のサイトカインの動員を促進し、抗標的有効性の増強を示す。
【背景技術】
【０００３】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病および非ホジキンリンパ腫を含む成人Ｂ細胞悪性疾患の大部分は、現在利用できる治療法があるにもかかわらず不治である。遺伝子操作された自家Ｔ細胞による養子療法は、黒色腫および緩徐進行性Ｂ細胞悪性疾患における治療有効性の証拠を示している。Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原に特異的な、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と命名された人工Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子の導入により、かかる腫瘍関連抗原を標的化するように改変することができる。免疫療法は、がんの処置をもたらす潜在力を有する標的化療法である。
しかし、悪性細胞は、免疫抑制性微小環境を生成するように適応して、免疫認識および排除から自身を保護する。この「敵対的」腫瘍微小環境は、標的化Ｔ細胞療法など、免疫応答の刺激が関与する処置方法に課題を課す。ＣＡＲまたはＴＣＲ操作されたＴ細胞の抗腫瘍効果の改善に向けた様々な改変がなされている。例えば、Ｐｅｇｒａｍらは、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）を構成的に分泌し、ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対する細胞傷害の増加を示した、ＣＡＲ操作されたＴ細胞のマウスモデルについて記載する（Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＬＯＯＤ，  Ｖｏｌ．  １１９，  Ｎｏ．  １８，  ２０１２）。しかし、ＩＬ−１２の分泌は、ＴおよびＢリンパ球の増殖および抗腫瘍効果を促進する重要なサイトカインであるインターロイキン２（ＩＬ−２）の抑制をもたらした。Ｄｏｔｔｉらは、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）および誘導性カスパーゼ−９に基づく自殺遺伝子（ｉＣ９）を構成的に分泌する、ＣＡＲ操作されたＴ細胞を開示し、これは、ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対する細胞傷害の増加を示した（ＵＳ２０１３００７１４１４（Ａ１））。この改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で、変化しないＩＬ−２発現レベルを実証した。したがって、新生物を処置するための新規治療戦略が早急に必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／００７１４１４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｅｇｒａｍら、ＢＬＯＯＤ（２０１２）Ｖｏｌ．１１９、Ｎｏ．１８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の主題は、（ａ）目的の標的抗原を指向する抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｂ）インターロイキン３３（「ＩＬ−３３」）ポリペプチドを発現（および分泌）する、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞または調節性Ｔ細胞）を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、免疫応答性細胞は、発現可能な形態で、ＩＬ−３３ポリペプチドをコードするヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｃｉｄ）（例えば、ＩＬ−３３ポリペプチドコード核酸）を含む。
本開示の主題はまた、（ａ）目的の標的抗原を指向する抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）と、（ｂ）内因性（ネイティブ）ＩＬ−３３遺伝子座における改変されたプロモーターであって、内因性ＩＬ−３３遺伝子座の遺伝子発現を増強する、改変されたプロモーターとを含む免疫応答性細胞を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、改変は、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターによる内因性プロモーターの置換え、または内因性ＩＬ−３３遺伝子座のプロモーター領域への構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの挿入を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、構成的プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、およびＣＡＧプロモーターからなる群より選択される。ある特定の非限定的な実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターおよびエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）プロモーターからなる群より選択される。
【０００７】
ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、ＩＬ−３３ポリペプチド（ＩＬ−３３タンパク質の成熟または非成熟形態）を構成的に発現する。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３ポリペプチドは、分泌される。抗原認識受容体は、ＴＣＲまたはＣＡＲであり得る。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞、リンパ系細胞を分化させることができるヒト胚性幹細胞および多能性幹細胞からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、自家である。
【０００８】
さらに、本開示の主題は、免疫応答を誘導および／もしくは増強するために、ならびに／または新生物（例えば、がん）、感染性疾患、および免疫応答増大から利益を得るであろう他の疾患／障害を処置および／もしくは予防するために、かかる免疫応答性細胞を使用する方法を提供する。
【０００９】
ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の主題は、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体を含み、（ｂ）ＩＬ−３３ポリペプチドを発現または分泌する、単離された免疫応答性細胞を提供する。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、外因性ＩＬ−３３ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、ＩＬ−３３ポリペプチドをコードする核酸を含む。ある特定の実施形態では、抗原への抗原認識受容体の結合は、免疫応答性細胞を活性化することができる。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。
【００１０】
本開示の主題は、有効量の本明細書に開示されている免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、新生物（例えば、がん）を処置および／または予防するための医薬組成物であり、抗原認識受容体が結合する抗原は、腫瘍抗原である。
【００１１】
本開示の主題は、治療法における使用のための、例えば、腫瘍負荷の低下、新生物の処置および／もしくは予防、新生物を有する被験体の生存の延長、ならびに／または被験体における腫瘍抗原もしくは病原体抗原に応答した免疫活性化サイトカイン産生の増加における使用のための、本明細書に開示されている免疫応答性細胞または本明細書に開示されている組成物を提供する。
【００１２】
本開示の主題はまた、被験体における新生物を処置および／または予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示されている免疫応答性細胞または医薬組成物を投与するステップを含む。本開示の主題はまた、被験体における腫瘍負荷を低下させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示されている免疫応答性細胞または医薬組成物を投与するステップを含む。本開示の主題は、新生物（例えば、がん）を有する被験体の生存を延長する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示されている免疫応答性細胞または医薬組成物を投与するステップを含む。
【００１３】
本開示の主題はまた、被験体における標的抗原に対する免疫応答を増強または増加させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示されている免疫応答性細胞または医薬組成物を投与するステップを含む。細胞は、標的抗原に対する被験体の免疫応答を増強するＩＬ−３３ポリペプチドを発現および分泌することができる。
【００１４】
本開示の主題は、被験体におけるがんまたは病原体に応答して免疫活性化サイトカイン産生を増加させる方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、被験体に、有効量の本明細書に開示されている免疫応答性細胞または医薬組成物を投与するステップを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、免疫活性化サイトカインは、ＩＬ−２、ＧＭ−ＳＣＦおよびＩＦＮ−γからなる群より選択される。ある特定の非限定的な実施形態では、免疫活性化サイトカインは、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３からなる群より選択される。本開示の主題は、それを必要とする被験体における血液がんを処置する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、被験体に、治療有効量の本明細書に開示されている免疫応答性細胞または医薬組成物を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体が結合する抗原は、ＣＤ１９である。
【００１５】
本開示の主題は、本明細書に開示されている免疫応答性細胞を産生するための方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、免疫応答性細胞に、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列と、（ｂ）ＩＬ−３３ポリペプチドをコードする第２の核酸配列とを導入するステップを含む。
【００１６】
本開示の主題は、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする第１の核酸配列と、（ｂ）ＩＬ−３３ポリペプチド（ＩＬ−３３の成熟または非成熟形態）をコードする第２の核酸配列とを含む、核酸組成物をさらに提供する。
【００１７】
ある特定の非限定的な実施形態では、第１または第２の核酸配列は、免疫応答性細胞において構成的にまたは誘導性に発現されるプロモーターエレメントに作動可能に連結されている。第１の核酸配列のプロモーターは、第２の核酸配列のプロモーターと同じであっても異なっていてもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、第１および第２の核酸配列のそれぞれが、免疫応答性細胞において構成的にまたは誘導性に発現されるプロモーターエレメントに作動可能に連結されている。第１および第２の核酸配列の一方または両方が、同じベクター（バイシストロニック）であっても別々のベクターであってもよいベクター中に含まれ得る。ある特定の非限定的な実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターである。
【００１８】
ある特定の実施形態では、核酸組成物は、ベクター中に含まれる。ある特定の非限定的な実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターである。本開示の主題はまた、本明細書に開示されている核酸組成物を含むベクターを提供する。
【００１９】
本開示の主題は、免疫応答を誘導および／もしくは増強するための、ならびに／または新生物（例えば、がん）もしくは病原体感染を処置および／もしくは予防するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、本明細書に開示されている免疫応答性細胞、本明細書に開示されている医薬組成物、本明細書に開示されている核酸組成物、または本明細書に開示されているベクターを含む。ある特定の実施形態では、キットは、免疫応答を誘導および／もしくは増強するための、ならびに／または新生物もしくは病原体感染を処置および／もしくは予防するための説明書をさらに含む。
【００２０】
様々な非限定的な実施形態では、免疫応答性細胞は、その意図されるレシピエント被験体に対して自家である。
【００２１】
本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、抗原認識受容体は、ＴＣＲまたはＣＡＲである。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、抗原認識受容体は、外因性または内因性である。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、抗原認識受容体は、組換えにより発現される。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、抗原認識受容体は、ベクターから発現される。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１９ｚである。
【００２２】
本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、抗原認識受容体は、ＴＣＲである。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、組換えＴＣＲである。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、天然に存在しないＴＣＲである。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、少なくとも１個のアミノ酸残基が、いずれかの天然に存在するＴＣＲと異なる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、少なくとも１個のアミノ酸残基が、天然に存在するＴＣＲから改変される。
【００２３】
本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、抗原認識受容体が結合する抗原は、腫瘍抗原または病原体抗原である。ある特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ−Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体−α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ−２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、κ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩ、ＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ、およびＥＲＢＢからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、抗原は、ＣＤ１９である。前記抗原に特異的に結合するアミノ酸配列は、本技術分野で公知である、または本技術分野で公知の方法を使用して調製することができる；例としては、免疫グロブリン、免疫グロブリンの可変領域（例えば、可変断片（「Ｆｖ」）または二価可変断片（「Ｆａｂ」））、単鎖抗体などが挙げられる。ある特定の実施形態では、抗原は、病原体抗原である。
【００２４】
本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な非限定的な実施形態では、外因性ＩＬ−３３ポリペプチドは、分泌される。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な非限定的な実施形態では、ＩＬ−３３ポリペプチドは、ベクター中に含まれる（およびそれから発現される）。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な非限定的な実施形態では、ＩＬ−３３ポリペプチドは、アミノ末端に異種シグナル配列（例えば、天然ではＩＬ−３３に会合していないシグナル配列）を含む。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、異種シグナル配列は、ＩＬ−２シグナル配列、カッパリーダー配列、ＣＤ８リーダー配列、ならびにＩＬ−３３ポリペプチド（成熟または非成熟のいずれか）の分泌を促進する能力を保持するそれらの組合せおよび／または合成変形形態からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３ペプチドは、ＩＬ−３３タンパク質の成熟形態、またはその機能的断片である。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３ペプチドは、配列番号４または配列番号２１に表記されている配列と少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３ペプチドは、配列番号４または配列番号２１に表記されているアミノ酸配列を含む。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、ＩＬ−３３ポリペプチドは、免疫応答性細胞の免疫応答を増強する。ある特定の実施形態では、外因性ＩＬ−３３ポリペプチドは、抗腫瘍サイトカイン産生を増加させる。ある特定の実施形態では、抗腫瘍サイトカインは、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γからなる群より選択される。
【００２５】
本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な非限定的な実施形態では、免疫応答性細胞は、抗原認識受容体単独を発現する（例えば、外因性ＩＬ−３３ポリペプチドを含まない）免疫応答性細胞と比較して、遷延されたＢ細胞形成不全を誘導する。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な非限定的な実施形態では、免疫応答性細胞は、内因性免疫細胞を活性化する。ある特定の実施形態では、内因性免疫細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージおよび内因性ＣＤ８  Ｔ細胞からなる群より選択される。本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な非限定的な実施形態では、免疫応答性細胞は、内因性免疫細胞集団を増加させる。
【００２６】
本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な実施形態では、本方法は、腫瘍細胞の数を低下させる、腫瘍サイズを低下させる、被験体における腫瘍を根絶する、被験体における腫瘍負荷を低下させる、被験体における腫瘍負荷を根絶する、再燃／再発までの期間を増加させる、および／または生存期間を増加させる。
【００２７】
本開示の主題を使用することができる説明的新生物としては、これらに限定されないが、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管（ｎｉｌｅ  ｄｕｃｔ）癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮がん、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が挙げられる。
【００２８】
本明細書に描写されている態様のいずれかの様々な非限定的な実施形態では、新生物は、血液がん、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫および卵巣がんのうちの１種または複数である。ある特定の実施形態では、血液がんは、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病および非ホジキンリンパ腫のうちの１種または複数である。ある特定の実施形態では、抗原は、ＣＤ１９である。ある特定の実施形態では、新生物は、卵巣がんであり、抗原は、ＭＵＣ１６である。
【００２９】
例として示され、本開示の主題を記載される具体的な実施形態に限定するものではない以下の詳細な記載は、添付の図面と合わせて理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｃは、様々なＣＡＲ構築物を表す。Ａ）ａｈ１９ｍＺ（マウス抗ヒトＣＤ１９ｓｃＦｖおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一世代ＣＡＲ。ａｈ１９ｍＺのためのアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列は、配列番号３０および３１にそれぞれ示す）；ａｈ１９ｍ２８Ｚ（マウス抗ヒトＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよびマウスＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ。ａｈ１９ｍ２８Ｚのためのアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列は、配列番号３４および３５にそれぞれ示す）；ａｍ１９ｍ２８Ｚ（ラット抗マウスＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよびマウスＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ。ａｈ１９ｍ２８Ｚのためのアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列は、配列番号６および７にそれぞれ示す）；ａｈ１９ｍＺｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（マウスのＩＬ−３３を分泌する第一世代ＣＡＲ（ａｈ１９ｍＺ））、ａｈ１９ｍ２８Ｚｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（マウスのＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ（ａｈ１９ｍ２８Ｚ））、ａｍ１９ｍ２８Ｚｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（マウスのＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ（ａｍ１９ｍ２８Ｚ））を含む様々なＣＡＲの概略図。全てのＣＡＲは、ＣＤ２８近位の細胞外および膜貫通ドメインをヒンジとして利用した。全てのマウスのＣＡＲ構築物では、サイトカインは自己切断Ｐ２ＡエレメントによってＣＡＲから分離された。Ｂ）構成的に分泌されるマウスのＩＬ３３を組み込む第一世代の抗マウスＣＤ１９  ｍｙｃ−タグＣＡＲ。Ｃ）構成的に分泌されるヒトのＩＬ３３を組み込む第一世代の抗ヒトＣＤ１９（ＳＪ２５Ｃ  ｓｃＦＶ）ＣＡＲ。全てのベクターは、ＳＦＧバックボーンを含んだ。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【００３１】
【図２】図２は、様々な改変Ｔ細胞のサイトカイン分泌を表す。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、単独でまたは抗原陽性腫瘍細胞、＋ＥＬ４ｈ１９ｍｉｔｏＣ（アッセイの間の増殖を阻止するためにＥＬ４ｈ１９細胞をマイトマイシンＣに曝露させた）と、１０：１のエフェクター：腫瘍比で共培養した。３６時間後に、上清を収集し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）を、ビーズベースの多重アッセイを利用して測定した。
【００３２】
【図３】図３は、様々な改変されたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害を表す。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、異なるエフェクター：腫瘍比で抗原陽性腫瘍細胞（ＥＬ４ｈ１９ｇｆｐＬＵＣ）と共培養した。２４時間後に、腫瘍細胞溶解を生物発光によって測定した。
【００３３】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｃは、様々な改変Ｔ細胞で処置した腫瘍保有マウスの生存曲線を表す。Ａ）全ての被験体の生存曲線。腫瘍接種の１日後に、ＥＬ４ｈ１９を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを１〜２×１０５個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置し、生存を追跡した。無処置：無処置の対照群；ａｍ１９ＭＴｍ２８Ｚ（ラット抗マウスＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよびマウスＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ）；ａｍ１９ＭＴｍ２８ＺｐＩＬ３３ｍａｔ（マウスのＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ（ｍ１９ＭＴｍ２８Ｚ））；ａｈ１９ｍＺ（マウス抗ヒトＣＤ１９ｓｃＦｖおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一世代ＣＡＲ）；ａｈ１９ｍ２８Ｚ（マウス抗ヒトＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよびマウスＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ）；ａｈ１９ｍＺｐＩＬ３３ｍａｔ（マウスのＩＬ−３３を分泌する第一世代ＣＡＲ（ａｈ１９ｍＺ））；ａｈ１９ｍ２８ＺｐＩＬ３３（マウスのＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ（ａｈ１９ｍ２８Ｚ））。メジアン生存数は、下の表に示す。Ｂ）ａｈ１９ｍ２８Ｚおよびａｈ１９ｍＺｐＩＬ３３ｍａｔ（ａｈ１９ｍＺ３３）の生存曲線。Ｃ）ａｈ１９ｍ２８Ｚおよびａｈ１９ｍ２８ＺｐＩＬ３３ｍａｔ（ａｈ１９ｍ２８Ｚ３３）の生存曲線。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【００３４】
【図５】図５は、様々な改変Ｔ細胞によるＢ細胞形成不全の誘導を表す。腫瘍接種の１日後に、ＥＬ４ｈ１９を有するＣ５７ＢＵ６マウスを２×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。８日目に、フローサイトメトリーによって末梢血をＢ細胞について評価し、ＣＤ４５＋細胞の百分率として定量化した。３８日目に、年齢を一致させた対照と一緒に生存マウスで、測定を繰り返した。
【００３５】
【図６】図６は、様々な改変Ｔ細胞によるＣＤ１１ｂ＋細胞の末梢分布の変更を表す。腫瘍接種の１日後に、ＥＬ４ｈ１９を有するＣ５７ＢＵ６マウスを２×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。８日目に、フローサイトメトリーによって末梢血を好中球（Ｇｒ−１ｈｉ）およびマクロファージ（Ｆ４／８０ｈｉ）について評価し、ＣＤ１１ｂ＋細胞の百分率として定量化した。
【００３６】
【図７−１】７Ａ〜７Ｃは、様々な改変Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ（Ａ）、ＩＬ−３３（Ｂ）およびＧＭ−ＣＳＦ（Ｃ）の血清レベルを表す。腫瘍接種の１日後に、ＥＬ４ｈ１９を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを２×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。８日目に、末梢血を収集し、ビーズベースの多重アッセイを利用してサイトカインを定量化した。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【００３７】
【図８】図８は、抗マウスＣＤ１９（１Ｄ３  ｓｃＦｖに由来するａｍ１９）ＣＡＲの構造を表す：ａｍ１９ｍＤＥＬ（非機能的ＣＡＲ）；ａｍ１９ｍＤＥＬｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（ＩＬ−３３を分泌する非機能的ＣＡＲ）；ａｍ１９ｍＺ（ラット抗マウスＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一世代ＣＡＲ。ａｍ１９ｍＺのためのアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列は、配列番号５および２０にそれぞれ示す）；ａｍ１９ｍＺｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（マウスのＩＬ−３３を分泌する第一世代ＣＡＲ（ａｍ１９ｍＺ））；ａｍ１９ｍ２８Ｚ（ラット抗マウスＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよびマウスＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ。ａｍ１９ｍ２８Ｚのためのアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列は、配列番号６および７にそれぞれ示す）；ａｍ１９ｍ２８Ｚｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（マウスのＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ（ａｍ１９ｍ２８Ｚ））。全ての構築物は、ＣＤ２８近位の細胞外および膜貫通ドメインをヒンジとして利用した。全てのマウスＩＬ−３３分泌構築物では、サイトカインは自己切断Ｐ２ＡエレメントによってＣＡＲから分離された。
【００３８】
【図９】図９は、様々な改変Ｔ細胞のＩＬ−３３分泌を表す。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、単独で、または抗原陽性腫瘍細胞、＋ＥＬ４ｈ１９Ｓｍ１９（ＥＬ４細胞はＳｉｇｍａから購入、マウスにノックイン）と、１：１のエフェクター：腫瘍比で共培養した。２４時間後、上清を収集し、ビーズベースの多重アッセイを利用してサイトカインを測定した。
【００３９】
【図１０】図１０は、様々な改変Ｔ細胞のＩＬ−２分泌を表す。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、単独で、または抗原陽性腫瘍細胞、＋ＥＬ４ｈ１９Ｓｍ１９（ＥＬ４細胞はＳｉｇｍａから購入、マウスにノックイン）と、１：１のエフェクター：腫瘍比で共培養した。２４時間後、上清を収集し、ビーズベースの多重アッセイを利用してサイトカインを測定した。
【００４０】
【図１１−１】図１１は、様々な改変Ｔ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦおよびインターフェロンガンマの分泌を表す。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、単独で、または抗原陽性腫瘍細胞、＋ＥＬ４ｈ１９Ｓｍ１９（ＥＬ４細胞はＳｉｇｍａから購入、マウスにノックイン）と、１：１のエフェクター：腫瘍比で共培養した。２４時間後、上清を収集し、ビーズベースの多重アッセイを利用してサイトカインを測定した。
【図１１−２】図１１は、様々な改変Ｔ細胞におけるＧＭ−ＣＳＦおよびインターフェロンガンマの分泌を表す。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、単独で、または抗原陽性腫瘍細胞、＋ＥＬ４ｈ１９Ｓｍ１９（ＥＬ４細胞はＳｉｇｍａから購入、マウスにノックイン）と、１：１のエフェクター：腫瘍比で共培養した。２４時間後、上清を収集し、ビーズベースの多重アッセイを利用してサイトカインを測定した。
【００４１】
【図１２】図１２は、様々な改変Ｔ細胞の処置後のＢ細胞形成不全を表す。漸増用量（マウス１匹につき１．２５×１０６から２０×１０６個）のＣＡＲ  Ｔ細胞を健康な腫瘍非保有Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、１５日目に、フローサイトメトリーによって末梢血をＢ細胞について評価し、ＣＤ４５＋細胞の百分率として定量化した。
【００４２】
【図１３−１】図１３は、様々な改変Ｔ細胞による処置後のＢ細胞回復を表す。漸増用量（マウス１匹につき１．２５×１０６から２０×１０６個）のＣＡＲ  Ｔ細胞を健康な腫瘍非保有Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、４２日目に、フローサイトメトリーによって末梢血をＢ細胞について評価し、ＣＤ４５＋細胞の百分率として定量化した。示した試料の間の平均の差、その９５％信頼区間および補正Ｐ値を表に示す。
【図１３−２】同上。
【００４３】
【図１４】図１４は、様々な改変Ｔ細胞で処置した腫瘍保有マウスの生存曲線を表す。腫瘍接種の１日後に、ＥＬ４Ｓｍ１９腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを２．５×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置し、生存を追跡した。無処置：無処置の対照群；ａｍ１９ＭＴｒｎ２８ＤＥＬ（細胞内シグナル伝達ドメインの無いＣＡＲ）；ａｍ１９ＭＴｍ２８ＤＥＬｐＩＬ３３ｍａｔ（マウスＩＬ−３３を分泌する細胞内シグナル伝達ドメインの無いＣＡＲ）；ａｍ１９ＭＴｍＺ（ラット抗マウスＣＤ１９ｓｃＦｖおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む）；ａｍ１９ＭＴｍＺｐ３３ｍａｔ（マウスのＩＬ−３３を分泌する第一世代ＣＡＲ（ａｍ１９ＭＴｍＺ））；ａｍ１９ＭＴｍ２８Ｚ（Ｍ１９２８Ｚ）（ラット抗マウスＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびマウスＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよびマウスＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ）；ａｍ１９ＭＴｍ２８Ｚｐ３３ｍａｔ（マウスのＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ（ａｍ１９ＭＴｍ２８Ｚ））。メジアン生存数を、下の表に示す。
【００４４】
【図１５】図１５は、抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲの構造を表す：ａｈ１９ｈＤＥＬ（シグナル伝達モチーフを欠いている、トランケーションされたＣＤ２８細胞内ドメインを含有する非機能的ＣＡＲ）；ａｈ１９ｈＺ（マウス抗ヒトＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む第一世代ＣＡＲ。ａｈ１９ｈＺのためのアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列は、配列番号３２および３３にそれぞれ示す）；ａｈ１９ｈＢＢＺ（マウス抗ヒトＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよびヒト４−１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ。ａｈ１９ｈＢＢＺのためのアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列は、配列番号３８および３９にそれぞれ示す）；ａｈ１９ｈ２８Ｚ（マウス抗ヒトＣＤ１９  ｓｃＦｖである抗原結合性ドメインおよびヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインおよびヒトＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ。ａｈ１９ｈ２８Ｚのためのアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列は、配列番号３６および３７にそれぞれ示す）；ａｈ１９ｈＤＥＬｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（ヒトＩＬ−３３を分泌する非機能的ＣＡＲ）；ａｈ１９ｈＺｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（ヒトＩＬ−３３を分泌する第一世代ＣＡＲ（ａｈ１９ｈＺ））；ａｈ１９ｈＢＢＺｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（ヒトＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ（ａｈ１９ｈＢＢＺ））；ａｈ１９ｈ２８Ｚｐ２Ａ＿ＩＬ−３３（ヒトＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ（ａｈ１９ｈ２８Ｚ））。全ての構築物は、ＣＤ２８近位の細胞外および膜貫通ドメインをヒンジとして利用した（４−１ＢＢベースの構築物を含む）。全てのヒトＩＬ−３３分泌構築物では、サイトカインは自己切断Ｐ２ＡエレメントによってＣＡＲから分離された。
【００４５】
【図１６−１】図１６は、様々なＣＡＲ構築物の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を表す。マウス由来の抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲに特異的であるＡｌｅｘａ−６４７コンジュゲート抗イディオタイプ抗体を使用して、ヒトベースの構築物で安定して形質導入されたＧＡＬＶ偽型化２９３ＧＰＧパッケージング細胞をＣＡＲの存在について評価した。形質導入されなかったＲＤ１１４（類似の２９３ＨＥＫ細胞）を陰性対照として使用した。
【図１６−２】同上。
【００４６】
【図１７】図１７は、様々なＣＡＲ構築物で形質導入されたパッケージング細胞のＩＬ−３３分泌を表す。レトロウイルス形質導入後にパッケージング細胞から上清を収集し、ビーズベースの多重アッセイによってサイトカイン濃度について評価した。
【００４７】
【図１８−１】図１８は、様々なＣＡＲ構築物の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を表す。ヒトベースの構築物で安定して形質導入されたヒトＴ細胞を、接種の５日後にＣＡＲの存在について評価した。形質導入していないヒトＴ細胞（ｈＴｃｅｍｐ）は、陰性対照の役目をした。
【図１８−２】同上。
【００４８】
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｃは、改変Ｔ細胞による細胞溶解を表す。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、異なるエフェクター：腫瘍比で、抗原陽性腫瘍細胞：Ａ）ＤＯＨＨ２、Ｂ）ＮＡＬＭ６、およびＣ）Ｒａｊｉと共培養し、２４時間後に、腫瘍細胞溶解を生物発光によって測定した。
【図１９−２】同上。
【００４９】
【図２０】図２０は、本開示の主題のある特定の実施形態による構築物の概略図である。
【００５０】
【図２１】図２１は、マウスＩＬ３３を分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞において分泌可能なＩＬ−３３が機能的であることを表す。ＩＬ３３を分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞は、組換えマウスのＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ）への曝露の際に抗原非依存性インターフェロンガンマ分泌の増加を実証した。
【００５１】
【図２２】図２２は、ヒトＩＬ３３を分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞において分泌可能なＩＬ−３３が機能的であることを表す。トランケーションされたＥＧＦＲを有する非機能的なＣＤ１９標的化ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｅｔ．ａｈ１９ｈＤＥＬｐ３３）は、ＩＬ−３３を分泌しない同等のＣＡＲ構築物（Ｅｔ．ａｈ１９ｈＤＥＬ）と比較して、漸増用量の組換えヒトＩＬ−１２への曝露の際に抗原非依存性インターフェロンガンマ分泌の増加を実証した。
【００５２】
【図２３】図２３は、ヒトＩＬ−３３を分泌する第一世代ＣＡＲ  Ｔ細胞において分泌可能なＩＬ−３３が機能的であることを表す。トランケーションされたＥＧＦＲを有する第一世代のヒトＣＤ１９標的化ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｅｔ．ａｈ１９ｈＺｐ３３）は、ＩＬ−３３を分泌しない同等のＣＡＲ構築物（Ｅｔ．ａｈ１９ｈＺ）と比較して、漸増用量の組換えヒトＩＬ−１２への曝露の際に抗原非依存性インターフェロンガンマ分泌の増加を実証した。
【００５３】
【図２４】図２４は、ヒトＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ  Ｔ細胞において分泌可能なＩＬ−３３が機能的であることを表す。トランケーションされたＥＧＦＲを有する第二世代のヒトＣＤ１９標的化ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｅｔ．ａｈ１９ｈ２８Ｚｐ３３）は、ＩＬ−３３を分泌しない同等のＣＡＲ構築物（Ｅｔ．ａｈ１９ｈ２８Ｚ）と比較して、漸増用量の組換えヒトＩＬ−１２への曝露の際に抗原非依存性インターフェロンガンマ分泌の増加を実証した。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本開示の主題は、抗原認識受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）および分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチド（例えば、外因性ＩＬ−３３ポリペプチド、またはＩＬ−３３ポリペプチドをコードする核酸）の組合せを含む、遺伝子改変された免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＣＴＬ細胞）を含む細胞を提供する。本開示の主題はまた、標的抗原に対する免疫応答を誘導および／もしくは増強するために、ならびに／または新生物もしくは抗原特異的免疫応答の増加が所望される他の疾患／障害を処置および／もしくは予防するために、かかる細胞を使用する方法を提供する。本開示の主題は、少なくとも一部には、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドが、抗原認識受容体を含む免疫応答性細胞（例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＴＣＲ発現Ｔ細胞）の抗腫瘍効果を増強するという発見に基づく。Ｔ細胞におけるＩＬ−３３ポリペプチドおよび抗原認識受容体（例えば、１９ｚ  ＣＡＲなどのＣＡＲ）の同時発現が、サイトカイン分泌増加をもたらすことが観察された。
【００５５】
悪性細胞は、免疫認識および排除から自身を保護するための一連の機構を発達させた。本開示の主題は、腫瘍根絶のための腫瘍微小環境内の免疫原性を提供し、従来の養子Ｔ細胞療法を上回る著しい進歩を表す。本開示の主題は、全身照射、高用量化学療法および／または注入後（ｐｏｓｔ−ｉｎｆｕｓｉｏｎ）サイトカイン支持による宿主の事前のコンディショニングなど、前述のいくつかのまたは全ての補助的処置の選択肢を提供する。
【００５６】
１．定義
他に規定されていない限り、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意義を有する。次の参考文献は、本開示の主題において使用されている用語の多くの一般定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２ｎｄ  ｅｄ．  １９９４）、Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，  １９８８）、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｒ．  Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （１９９１）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９１）。本明細書で使用される場合、次の用語は、他に指定されていない限り、後述するそれらに起因する意義を有する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される、特定の値に関する許容される誤差範囲内を意味し、これは、一部には、値が測定または決定される仕方、すなわち、測定システムの限界に依存するであろう。例えば、「約」は、本技術分野における実務に従った、３または３を超える標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％または最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に、生物システムまたは過程に関して、この用語は、値の１桁以内、例えば、５倍以内または２倍以内を意味することができる。
【００５８】
「免疫応答性細胞を活性化する」とは、免疫応答の惹起をもたらす、細胞におけるシグナルトランスダクションの誘導またはタンパク質発現の変化を意味する。例えば、ＣＤ３鎖が、リガンド結合および免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）に応答してクラスター形成すると、シグナルトランスダクションカスケードが産生される。ある特定の実施形態では、内因性ＴＣＲまたは外因性ＣＡＲが抗原に結合すると、結合した受容体の付近にある多くの分子（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８、ＣＤ３γ／δ／ε／ζなど）のクラスター形成を含む免疫シナプスの形成が起こる。膜結合シグナル伝達分子のこのクラスター形成は、ＣＤ３鎖内に含有されるＩＴＡＭモチーフがリン酸化されるようになることを可能にする。このリン酸化は次いで、Ｔ細胞活性化経路を惹起し、最終的に、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１などの転写因子を活性化する。これらの転写因子は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を惹起するために、Ｔ細胞の網羅的遺伝子発現を誘導して、増殖およびマスターレギュレーターＴ細胞タンパク質の発現のためのＩＬ−２産生を増加させる。
【００５９】
「免疫応答性細胞を刺激する」とは、頑強かつ持続した免疫応答をもたらすシグナルを意味する。様々な実施形態では、これは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）活性化後に起こる、またはＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−ｌＢＢ）、ＯＸ４０、ＣＤ４０およびＩＣＯＳが挙げられるがこれらに限定されない、受容体を介して付随的に媒介される。複数の刺激シグナルを受けることが、頑強かつ長期のＴ細胞媒介性免疫応答の開始に重要となり得る。Ｔ細胞は、急速に阻害され、抗原に対して無応答性になる場合がある。これらの共刺激シグナルの効果は変動し得るが、一般に、完全かつ持続した根絶のために抗原に頑強に応答する、長寿命で、増殖性で、抗アポトーシス性のＴ細胞を生成するために、遺伝子発現増加をもたらす。
【００６０】
用語「抗原認識受容体」は、本明細書で使用される場合、抗原へのその結合に応答して免疫細胞または免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる受容体を指す。抗原認識受容体の非限定的な例としては、ネイティブまたは内因性Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）およびキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、無傷抗体分子のみならず、免疫原結合能力を保持する抗体分子の断片も意味する。かかる断片はまた、本技術分野で周知であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で通常用いられる。したがって、本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、無傷免疫グロブリン分子のみならず、周知活性断片Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂも意味する。無傷抗体のＦｅ断片を欠くＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片は、循環からより迅速に排除され、無傷抗体よりも少ない非特異的組織結合を有する場合がある（Ｗａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２４：３１６−３２５  （１９８３））。本明細書で使用される場合、抗体は、ネイティブ抗体全体、二特異性抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチドおよび非従来型抗体を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと省略）および重鎖定常（ＣＨ）領域で構成される。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと省略）および軽鎖定常ＣＬ領域で構成される。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と命名された領域が散りばめられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名された高頻度可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序で配置された、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重および軽鎖の高頻度可変領域である、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ４ｔｈ  Ｕ．  Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  （１９８７）を参照されたい。一般に、抗体は、可変領域に３個の重鎖および３個の軽鎖ＣＤＲまたはＣＤＲ領域を含む。ＣＤＲは、抗原またはエピトープへの抗体の結合のための接触残基の大部分を提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ方式を使用して描写される（Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２）。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、共有結合により連結されてＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を形成した、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。ＶＨおよびＶＬは、直接的に連接される、またはＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、もしくはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端と接続するペプチドコードリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５アミノ酸）によって連接される。リンカーは通常、可撓性のためにグリシンリッチであると共に、溶解度のためにセリンまたはスレオニンリッチである。定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、本来の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：５８７９−５８８３，  １９８８）によって記載された、ＶＨおよびＶＬコード配列を含む核酸から発現させることができる。米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号、ならびに米国特許出願公開第２００５０１９６７５４号および同第２００５０１９６７５４号も参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニスト性ｓｃＦｖについて記載されている（例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｒｂｉｄｏｍａ  （Ｌａｒｃｈｍｔ）  ２００８  ２７（６）：４５５−５１、Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃａｃｈｅｘｉａ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｍｕｓｃｌｅ  ２０１２  Ａｕｇｕｓｔ  １２、Ｓｈｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｕｎｏｌ  ２００９  １８３（４）：２２７７−８５、Ｇｉｏｍａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００７  ９７（６）：９５５−６３、Ｆｉｆｅ  ｅｔａ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｓｔ  ２００６  １１６（８）：２２５２−６１、Ｂｒｏｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９７  ３（３）：１７３−８４；Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５  ２（１０：３１−４０）を参照）。刺激活性を有するアゴニスト性ｓｃＦｖについて記載されている（例えば、Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｉ  Ｃｈｅｒｎ  ２００３  ２５２７８（３８）：３６７４０−７、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １９９７  １５（８）：７６８−７１、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７  １７（５−６）：４２７−５５；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＣｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００３  １６３８（３）：２５７−６６を参照）。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、結合強度の尺度を意味する。親和性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の立体化学的適合の近さに、それらの間の接触区域のサイズに、および／または荷電および疎水性基の分布に依存し得る。本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、可逆的複合体の形成後の抗原−抗体結合の強度を指す「アビディティー」も含む。抗原に対する抗体の親和性を計算するための方法は、本技術分野で公知であり、これらに限定されないが、様々な抗原結合実験、例えば、機能アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）が挙げられる。
【００６５】
用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、本明細書で使用される場合、免疫応答性細胞を活性化または刺激することができる細胞内シグナル伝達ドメイン、および膜貫通ドメインに融合された、細胞外抗原結合ドメインを含む分子を指す。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。ｓｃＦｖは、抗体の可変重および軽領域の融合に由来することができる。あるいはまたはその上、ｓｃＦｖは、Ｆａｂ’に由来することができる（抗体に由来する代わりに、例えば、Ｆａｂライブラリーから得られる）。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに、次いで、細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗原に対して高い結合親和性またはアビディティーを有するように選択される。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」は、目的のポリペプチド（例えば、ＩＬ−３３ポリペプチド）またはその断片をコードするいずれかの核酸分子を含む。かかる核酸分子は、内因性核酸配列と１００％相同または同一である必要はないが、実質的な同一性を示すことができる。内因性配列に対し「実質的な同一性」または「実質的な相同性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載されている遺伝子）またはその部分の間で二本鎖分子を形成するための一対を意味する（例えば、Ｗａｈｌ，  Ｇ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｓ．  Ｌ．  Ｂｅｒｇｅｒ  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，  Ａ．  Ｒ．  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２：５０７を参照）。
【００６７】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび７５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、例えば、約５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、例えば、約２５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満となるであろう。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得ることができる一方、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％ホルムアミド、例えば、少なくとも約５０％ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、例えば、少なくとも約３７℃、または少なくとも約４２℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、洗剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの包含または排除など、変動する追加的なパラメータは、当業者にとって周知である。適宜これらの様々な条件を組み合わせることにより、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、３０℃で、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳにおいて起こるであろう。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、３７℃で、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）において起こるであろう。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、４２℃で、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび２００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡにおいて起こるであろう。これらの条件における有用な変形形態は、当業者にとって容易に明らかとなるであろう。
【００６８】
大部分の適用のため、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップも、ストリンジェンシーが変動するであろう。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上述の通り、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を減少させることにより、または温度を増加させることにより増加させることができる。例えば、洗浄ステップのためのストリンジェントな塩濃度は、約３０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３ｍＭクエン酸三ナトリウム未満、例えば、約１５ｍＭ  ＮａＣｌおよび１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム未満であり得る。洗浄ステップのためのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、例えば、少なくとも約４２℃、または少なくとも約６８℃の温度を含むであろう。ある特定の実施形態では、洗浄ステップは、２５℃で、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳにおいて起こるであろう。ある特定の実施形態では、洗浄ステップは、４２℃で、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳにおいて起こるであろう。ある特定の実施形態では、洗浄ステップは、６８℃で、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳにおいて起こるであろう。これらの条件における追加的な変形形態は、当業者にとって容易に明らかとなるであろう。ハイブリダイゼーション技法は、当業者にとって周知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，  １９７７）、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｇｎｅｓｓ  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ７２：３９６１，  １９７５）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１）、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  （Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９８７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００６９】
「実質的に同一」または「実質的に相同」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されているアミノ酸配列のうちのいずれか１種）または核酸配列（例えば、本明細書に記載されている核酸配列のうちのいずれか１種）と少なくとも約５０％相同または同一を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。ある特定の実施形態では、かかる配列は、比較に使用されるアミノ酸または核酸の配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または少なくとも約１００％相同または同一である。
【００７０】
配列同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５の配列解析ソフトウェアパッケージ、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰまたはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用することにより測定することができる。かかるソフトウェアは、様々な置換、欠失および／または他の改変に相同性の程度を割り当てることにより、同一または同様の配列をマッチさせる。保存的置換は典型的に、次の群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチにおいて、密接に関係した配列を指し示すｅ−３〜ｅ−１００の間の確率スコアによりＢＬＡＳＴプログラムを使用することができる。
【００７１】
「類似体」とは、参照ポリペプチドまたは核酸分子の機能を有する、構造的に関係したポリペプチドまたは核酸分子を意味する。
【００７２】
用語「リガンド」は、本明細書で使用される場合、受容体に結合する分子を指す。ある特定の実施形態では、リガンドは、別の細胞上の受容体に結合し、細胞間の認識および／または相互作用を可能にする。
【００７３】
用語「構成的発現」または「構成的に発現される」は、本明細書で使用される場合、あらゆる生理的条件下での発現または発現されることを指す。
【００７４】
「疾患」とは、細胞、組織または臓器の正常機能を損傷またはこれに干渉する、いずれかの状態、疾患または障害、例えば、新生物および細胞の病原体感染を意味する。
【００７５】
「有効量」とは、治療効果を有するのに十分な量を意味する。ある特定の実施形態では、「有効量」は、新生物の継続した増殖、成長または転移（例えば、浸潤または遊走）の抑止、好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）または阻害に十分な量である。
【００７６】
「寛容の強制」とは、移植された臓器または組織を標的とする自己反応性細胞または免疫応答性細胞の活性の予防を意味する。
【００７７】
「内因性」とは、細胞または組織において正常に発現される核酸分子またはポリペプチドを意味する。
【００７８】
「外因性」とは、細胞に内因性に存在しない核酸分子またはポリペプチドを意味する。用語「外因性」は、したがって、外来性、異種および過剰発現される核酸分子およびポリペプチドなど、細胞において発現されるいずれかの組換え核酸分子またはポリペプチドを包含することになる。「外因性」核酸とは、ネイティブ野生型細胞に存在しない核酸を意味する；例えば、外因性核酸は、内因性対応物から、配列、位置／場所またはその両方が変動し得る。明確にするために、外因性核酸は、そのネイティブ内因性対応物と比べて同じまたは異なる配列を有することができ；細胞それ自体またはその前駆細胞への遺伝子操作によって導入することができ、必要に応じて、非ネイティブプロモーターまたは分泌配列など、代替制御配列へと連結することができる。
【００７９】
「異種核酸分子またはポリペプチド」とは、細胞にまたは細胞から得られる試料に通常存在しない核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）またはポリペプチドを意味する。この核酸は、別の生物に由来し得る、または例えば、細胞もしくは試料において通常発現されないｍＲＮＡ分子であり得る。
【００８０】
「免疫応答性細胞」とは、免疫応答において機能する細胞、またはその前駆細胞もしくは後代を意味する。
【００８１】
「モジュレートする」とは、正にまたは負に変更することを意味する。例示的なモジュレーションは、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％または約１００％の変化を含む。
【００８２】
「増加させる」とは、少なくとも約５％正に変更することを意味する。変更は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、またはそれよりも高いのものであり得る。
【００８３】
「低下させる」とは、少なくとも約５％負に変更することを意味する。変更は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、またはさらには約１００％のものであり得る。
【００８４】
「単離された細胞」とは、細胞に天然では付随する分子および／または細胞成分から分離された細胞を意味する。
【００８５】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、変動する程度まで、そのネイティブ状態において見出される、通常それに付随する成分を含まない材料を指す。「単離する」は、本来の供給源または周囲のものからの分離の程度を表示する。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を表示する。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物も、タンパク質の生物学的特性に実際的に影響を与えない、または他の有害な帰結を引き起こさないように十分に、他の材料を含まない。すなわち、細胞材料、ウイルス材料、または組換えＤＮＡ技法によって産生される場合は培養培地、または化学合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないのであれば、核酸またはペプチドは、精製されている。純度および均一性は典型的に、分析化学技法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１本のバンドを生じることを表示することができる。改変、例えば、リン酸化またはグリコシル化に付すことができるタンパク質に関して、異なる改変は、別々に精製され得る異なる単離されたタンパク質を生じることができる。
【００８６】
用語「抗原結合ドメイン」は、本明細書で使用される場合、細胞上に存在する特定の抗原決定基または抗原決定基のセットに特異的に結合することができるドメインを指す。
【００８７】
「リンカー」は、本明細書で使用される場合、２個またはそれよりも多いポリペプチドまたは核酸を互いに接続できるように共有結合により付着する官能基（例えば、化学物質またはポリペプチド）を意味するものとする。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」は、２個のタンパク質を互いにカップリングする（例えば、ＶＨおよびＶＬドメインをカップリングする）のに使用される１個または複数のアミノ酸を指す。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号２３］に表記されている配列を含む。
【００８８】
「新生物」とは、細胞または組織の病理学的増殖、およびその後の、他の組織または臓器へのその遊走または浸潤によって特徴付けられる疾患を意味する。新生物成長は典型的に、制御されず進行性であり、正常細胞の繁殖を誘発しないまたはその休止を引き起こすであろう条件下で起こる。新生物は、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮および腟からなる群より選択される臓器またはそれらの組織もしくは細胞型が挙げられるがこれらに限定されない、種々の細胞型、組織または臓器を冒すことができる。新生物は、肉腫、癌腫または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などの、がんを含む。
【００８９】
「受容体」とは、１種または複数のリガンドに選択的に結合する、細胞膜上に存在するポリペプチドまたはその部分を意味する。
【００９０】
「認識する」とは、標的に選択的に結合することを意味する。腫瘍を認識するＴ細胞は、腫瘍抗原に結合する受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現することができる。
【００９１】
「参照」または「対照」とは、比較の標準を意味する。例えば、ＣＡＲおよびｓｃＦｖを発現する細胞によるｓｃＦｖ−抗原結合のレベルは、ＣＡＲ単独を発現する対応する細胞におけるｓｃＦｖ−抗原結合のレベルと比較することができる。
【００９２】
「分泌される」とは、分泌経路を経て、小胞体、ゴルジ装置を通り、細胞原形質膜において一過的に融合し、タンパク質を細胞の外側に放出する小胞として、細胞から放出されるポリペプチドを意味する。
【００９３】
「シグナル配列」または「リーダー配列」とは、分泌経路へのその進入を方向付ける、新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在するペプチド配列（例えば、５、１０、１５、２０、２５または３０アミノ酸）を意味する。例示的なリーダー配列としては、これらに限定されないが、ＩＬ−２シグナル配列：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ［配列番号８］（ヒト）、ＭＹＳＭＱＬＡＳＣＶＴＬＴＬＶＬＬＶＮＳ［配列番号２４］（マウス）、カッパリーダー配列：ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ［配列番号２５］（ヒト）、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ［配列番号２６］（マウス）、ＣＤ８リーダー配列：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ［配列番号２７］（ヒト）、トランケートされたヒトＣＤ８シグナルペプチド：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡ［配列番号６２］（ヒト）、アルブミンシグナル配列：ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＳＳＡＹＳ［配列番号２８］（ヒト）、およびプロラクチンシグナル配列：ＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＣＱＧＶＶＳ［配列番号２９］（ヒト）が挙げられる。
【００９４】
「可溶性」とは、水性環境において（例えば、膜結合していない）自由に拡散可能なポリペプチドを意味する。
【００９５】
「特異的に結合する」とは、本開示のポリペプチドを天然に含む試料、例えば、生体試料において、目的の生物学的分子（例えば、ポリペプチド）を認識しこれに結合するが、他の分子を実質的に認識したりこれに結合したりしないポリペプチドまたはその断片を意味する。
【００９６】
用語「腫瘍抗原」は、本明細書で使用される場合、正常または非ＩＳ新生物細胞と比較して、腫瘍細胞上に特有にまたは差次的に発現される抗原（例えば、ポリペプチド）を指す。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、抗原認識受容体（例えば、ＣＤ１９、ＭＵＣ−１６）を介して免疫応答を活性化もしくは誘導することができる、または受容体−リガンド結合（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ−Ｌｌ／Ｌ２、Ｂ７．１／２）を介して免疫応答を抑制することができる、腫瘍によって発現されるいずれかのポリペプチドを含む。
【００９７】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、米国特許法におけるそれらに起因する広い意義を有することが意図され、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」その他を意味することができる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「処置」は、処置されている個体または細胞の疾患経過を変更する試みでの臨床介入を指し、予防のため、または臨床病理学の経過中に行うことができる。処置の治療効果は、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的または間接的ないずれか病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患進行速度の減少、病状の好転または緩和、および寛解または改善された予後を限定することなく含む。疾患または障害の進行を予防することにより、処置は、罹患したもしくは診断された被験体、または障害を有すると疑われる被験体における障害による悪化を予防することができるが、処置は、障害のリスクがあるまたは障害を有すると疑われる被験体における障害または障害の症状の開始を予防することもできる。
【００９９】
本明細書における「個体」または「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物としては、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、家畜、競技用動物（ｓｐｏｒｔ  ａｎｉｍａｌ）、齧歯類およびペットが挙げられる。非ヒト動物被験体の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどの齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに類人猿およびサルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。用語「免疫無防備状態の」は、本明細書で使用される場合、免疫不全である被験体を指す。この被験体は、健康な免疫系を有する人物において疾患を通常は引き起こさないが、不十分に機能するまたは抑制された免疫系を有する人々を冒すことができる生物に起因する感染である、日和見感染に対して非常に脆弱である。
【０１００】
本開示の主題の他の態様について、次の開示において記載するが、これは、本開示の主題の範囲内にある。
【０１０１】
２．抗原認識受容体
本開示は、目的の抗原に結合する抗原認識受容体を提供する。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。抗原認識受容体は、腫瘍抗原または病原体抗原に結合することができる。
【０１０２】
２．１．抗原
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、腫瘍抗原に結合する。いずれかの腫瘍抗原（抗原ペプチド）を、本明細書に記載されている腫瘍関連の実施形態において使用することができる。抗原の供給源としては、これに限定されないが、がんタンパク質が挙げられる。抗原は、ペプチドとして、または無傷タンパク質もしくはその部分として発現させることができる。無傷タンパク質またはその部分は、ネイティブであっても、変異誘発されていてもよい。腫瘍抗原の非限定的な例としては、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡｌＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）、上皮糖タンパク質−４０（ＥＧＰ−４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂ−Ｂ２、３、４（ｅｒｂ−Ｂ２、３、４）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体−α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２）、κ−軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ルイスＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、黒色腫抗原ファミリーＡ、１（ＭＡＧＥ−Ａ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ムチン１（ＭＵＣ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん−精巣抗原ＮＹ−ＥＳ０−１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ−１）、ＢＣＭＡ、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩ、ＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥおよびＥＲＢＢが挙げられる。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＤ１９に結合する。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、マウスＣＤ１９ポリペプチドに結合する。ある特定の実施形態では、マウスＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号５８に表記されているアミノ酸配列を含む。
【化１】
2021502828.tif 000003
【０１０４】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ヒトＣＤ１９ポリペプチドに結合する。ある特定の実施形態では、ヒトＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号５９に表記されているアミノ酸配列を含む。
【化２】
2021502828.tif 000004
【０１０５】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ヒトまたはマウスＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメインに結合する。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、例えば、免疫無防備状態の被験体における、例えば、病原体感染または他の感染性疾患の処置および／または予防における使用のために、病原体抗原に結合する。病原体の非限定的な例としては、疾患を引き起こすことができる、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原生動物が挙げられる。
【０１０７】
ウイルスの非限定的な例としては、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ＨＩＶ−１（ＨＤＴＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶＥまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される）またはＨＩＶ−ＩＩＩ、およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の単離菌など、ヒト免疫不全ウイルス）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす株）、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）、Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）、Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フレボウイルスおよびナイロ（Ｎａｉｒａ）ウイルス）、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｕｒｓｅｓ）およびロタウイルス）、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分のアデノウイルス）、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）、ならびに未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の病原因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原因子（クラス１＝内部的に伝染、クラス２＝非経口的に伝染（すなわち、Ｃ型肝炎）、ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が挙げられる。
【０１０８】
細菌の非限定的な例としては、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられる。感染性細菌の具体例としては、これらに限定されないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（緑色連鎖球菌（ｖｉｒｉｄａｎｓ）群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性ｓｐｓ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、ＲｉｃｋｅｔｔｓｉａおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉが挙げられる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、病原体抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に存在するウイルス抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に存在するウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に存在するウイルス抗原、またはインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原である。
【０１１０】
２．２．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＴＣＲである。ＴＣＲは、インバリアントＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現された２本の可変鎖からなるジスルフィド連結されたヘテロ二量体タンパク質である。ＴＣＲは、Ｔ細胞の表面に見出され、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合されたペプチドとしての抗原の認識の原因となる。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、アルファ鎖およびベータ鎖（それぞれＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、ガンマ鎖およびデルタ鎖（それぞれＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）を含む。
【０１１１】
ＴＣＲの各鎖は、２個の細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域で構成される。定常領域は、細胞膜に対して近位にあり、これに続いて、膜貫通領域および短い細胞質テイルがある。可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。両方の鎖の可変ドメインはそれぞれ、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、３個の二量体シグナル伝達モジュールＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／εおよびＣＤ２４７ζ／ζまたはζ／ηと受容体複合体を形成することができる。ＴＣＲ複合体が、その抗原およびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と係合すると、ＴＣＲ複合体を発現するＴ細胞が活性化される。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、組換えＴＣＲである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、天然に存在しないＴＣＲである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、いずれか天然に存在するＴＣＲとは、少なくとも１個のアミノ酸残基が異なる。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、いずれか天然に存在するＴＣＲとは、少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００個またはそれよりも多いアミノ酸残基が異なる。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、天然に存在するＴＣＲから、少なくとも１個のアミノ酸残基が改変されている。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、天然に存在するＴＣＲから、少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００個またはそれよりも多いアミノ酸残基が改変されている。
【０１１４】
２．３．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞に目的の特異性をグラフトまたは付与する、操作された受容体である。ＣＡＲを使用して、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性をグラフトすることができる；そのコード配列の移入は、レトロウイルスベクターによって容易となる。
【０１１５】
３世代のＣＡＲが存在する。「第一世代」ＣＡＲは、典型的に、細胞質／細胞内シグナル伝達ドメインに融合された膜貫通ドメインに融合された、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）で構成される。「第一世代」ＣＡＲは、ｄｅ  ｎｏｖｏ抗原認識を提供し、ＨＬＡ媒介性抗原提示に依存せず、単一の融合分子におけるそのＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを介してＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化を引き起こすことができる。「第二世代」ＣＡＲは、様々な共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０）由来の細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞質テイルに付加して、Ｔ細胞に追加的なシグナルを提供する。「第二世代」ＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８または４−１ＢＢ）および活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供するＣＡＲを含む。「第三世代」ＣＡＲは、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８および４−１ＢＢ）および活性化（ＣＤ３ζ）を提供するＣＡＲを含む。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、第一世代ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、第二世代ＣＡＲである。
【０１１６】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはその類似体において具体化）は、約２×１０−７Ｍまたはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、Ｋｄは、約２×１０−７Ｍもしくはそれ未満、約１×１０−７Ｍもしくはそれ未満、約９×１０−８Ｍもしくはそれ未満、約１×１０−８Ｍもしくはそれ未満、約９×１０−９Ｍもしくはそれ未満、約５×１０−９Ｍもしくはそれ未満、約４×１０−９Ｍもしくはそれ未満、約３×１０−９もしくはそれ未満、約２×１０−９Ｍもしくはそれ未満、または約１×１０−９Ｍもしくはそれ未満である。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約３×１０−９Ｍまたはそれ未満である。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約１×１０−９Ｍ〜約３×１０−７Ｍである。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約１．５×１０−９Ｍ〜約３×１０−７Ｍである。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約１．５×１０−９Ｍ〜約２．７×１０−７Ｍである。
【０１１７】
細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはその類似体における）の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、一般に、目的の複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体またはｓｃＦｖ）を用いることにより、特に興味深いタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えば、ｓｃＦｖを放射性標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用することができる（例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｂ．，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｍａｒｃｈ，  １９８６を参照）。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、蛍光マーカーで標識される。蛍光マーカーの非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、ＡｚｕｒｉｔｅおよびｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、ＣｅｒｕｌｅａｎおよびＣｙＰｅｔ）および黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＶｅｎｕｓおよびＹＰｅｔ）が挙げられる。
【０１１８】
本開示の主題に従って、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができ、細胞外抗原結合ドメインは、抗原、例えば、腫瘍抗原または病原体抗原に特異的に結合する。
【０１１９】
２．３．１．ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン
ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒトｓｃＦｖ、ヒト化ｓｃＦｖまたはマウスｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、必要に応じて架橋されたＦａｂである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ）２である。ある特定の実施形態では、前述の分子のいずれかが、異種配列との融合タンパク質に含まれて、細胞外抗原結合ドメインを形成してもよい。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、抗原−Ｆｃ融合タンパク質によりｓｃＦｖファージライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。ある特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、抗原は、病原体抗原である。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、マウスｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、マウスＣＤ１９ポリペプチドに結合するマウスｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、マウスＣＤ１９ポリペプチド（例えば、配列番号５８に表記されているアミノ酸配列を含むマウスＣＤ１９ポリペプチド）に特異的に結合する、マウスｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５７に表記されている。ある特定の実施形態では、マウスｓｃＦｖは、配列番号４６に表記されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ある特定の実施形態では、マウスｓｃＦｖは、配列番号４７に表記されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、マウスｓｃＦｖは、配列番号４６に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４７に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬを、必要に応じて、（ｉｉｉ）ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列、例えば、リンカーペプチドと共に含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号２３に表記されている配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４６と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。例えば、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４６と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相同であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４６に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４７と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。例えば、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４７と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相同であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４７に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４６と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４７と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４６に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４７に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４０に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４１に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号４２に表記されているアミノ酸配列、その保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４０に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４１に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号４２に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４３に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４４に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号４５に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４３に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４４に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号４５に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４０に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４１に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号４２に表記されているアミノ酸配列、その保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号４３に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４４に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号４５に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４０に表記されている配列を有するアミノ酸を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４１に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号４２に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号４３に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４４に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号４５に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１９ポリペプチドに結合するマウスｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号６０のアミノ酸配列を含み、ヒトＣＤ１９ポリペプチド（例えば、配列番号５９に表記されているアミノ酸配列を含むヒトＣＤ１９ポリペプチド）に特異的に結合する、マウスｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、配列番号６０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６１に表記されている。ある特定の実施形態では、マウスｓｃＦｖは、配列番号５４に表記されているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ある特定の実施形態では、マウスｓｃＦｖは、配列番号５５に表記されているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、マウスｓｃＦｖは、配列番号５４に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５５に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬを、必要に応じて、（ｉｉｉ）ＶＨとＶＬとの間のリンカー配列、例えば、リンカーペプチドと共に含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号２３に表記されている配列を有するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５４と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。例えば、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５４と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相同であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５４に表記されているアミノ配列を含むＶＨを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５５と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。例えば、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５５と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相同であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５５に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５４と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５５と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５４に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号５５に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４８に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４９に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号５０に表記されているアミノ酸配列、その保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４８に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４９に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号５０に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５１に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５２に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号５３に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号５１に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５２に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号５３に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４８に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４９に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号５０に表記されているアミノ酸配列、その保存的改変を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号５１に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５２に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号５３に表記されているアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４８に表記されている配列を有するアミノ酸を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４９に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号５０に表記されているアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号５１に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号５２に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号５３に表記されているアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【表１】
2021502828.tif 000005
【０１２２】
【表２】
2021502828.tif 000006
【０１２３】
本明細書で使用される場合、用語「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含む本開示のＣＡＲ（例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン）の結合特徴に有意に影響を与えないまたはこれを変更しないアミノ酸改変を指す。保存的改変は、アミノ酸置換、付加および欠失を含むことができる。改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発など、本技術分野で公知の標準技法によって、本開示のＣＡＲのヒトｓｃＦｖに導入することができる。アミノ酸は、電荷および極性など、その物理化学的特性に従って群へと分類することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同じ群内のアミノ酸に置き換えられる置換である。例えば、アミノ酸は、電荷によって分類することができる：正に荷電したアミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンを含み、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸を含み、中性電荷のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含む。加えて、アミノ酸は、極性によって分類することができる：極性アミノ酸は、アルギニン（塩基性極性）、アスパラギン、アスパラギン酸（酸性極性）、グルタミン酸（酸性極性）、グルタミン、ヒスチジン（塩基性極性）、リシン（塩基性極性）、セリン、スレオニンおよびチロシンを含み；非極性アミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンを含む。よって、ＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸残基は、同じ群由来の他のアミノ酸残基に置き換えることができ、変更された抗体は、本明細書に記載されている機能アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上の（ｃ）〜（ｌ）に表記されている機能）に関して検査することができる。ある特定の実施形態では、指定の配列またはＣＤＲ領域内の１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下の残基が変更される。
【０１２４】
特異的配列（例えば、配列番号４６、４７、５４および５５）に対し少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％（例えば、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％）相同性を有するＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、指定の配列（複数可）と比べて置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含有することができるが、標的抗原（例えば、ＣＤ１９）に結合する能力を保持することができる。ある特定の実施形態では、総計１〜１０個のアミノ酸が、特異的配列（例えば、配列番号４６、４７、５４および５５）において置換、挿入および／または欠失される。ある特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、細胞外抗原結合ドメインのＣＤＲの外側の領域（例えば、ＦＲ）において起こる。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４６、４７、５４および５５からなる群より選択されるＶＨおよび／またはＶＬ配列を含み、これは、当該配列（配列番号４６、４７、５４および５５）の翻訳後改変を含む。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、２種のアミノ酸配列の間のパーセント相同性は、２種の配列の間のパーセント同一性に等しい。２種の配列の間のパーセント同一性は、２種の配列の最適な整列のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一位置の＃／位置の総＃×１００）。２種の配列の間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【０１２６】
２種のアミノ酸配列の間のパーセント相同性は、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、ギャップ長さペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれたＥ．  Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｍｉｌｌｅｒ  （Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ４：１１−１７  （１９８８））のアルゴリズムを使用して決定することができる。加えて、２種のアミノ酸配列の間のパーセント相同性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さウエイト１、２、３、４、５または６を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可）におけるＧＡＰプログラムに取り込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４−４５３  （１９７０））アルゴリズムを使用して決定することができる。
【０１２７】
その上またはあるいは、本開示の主題のアミノ酸配列は、「問い合わせ配列」として使用して、公開データベースに対する検索を行って、例えば、関連配列を同定することがさらにできる。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３により行って、本明細書に開示されている指定の配列（例えば、ｓｃＦｖ  ｍ９０３、ｍ９０４、ｍ９０５、ｍ９０６およびｍ９００の重および軽鎖可変領域配列）と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ入り整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されている通りにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【０１２８】
２．３．２．ＣＡＲの膜貫通ドメイン
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜の少なくとも部分にまたがる疎水性アルファヘリックスを含む。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性をもたらす。抗原認識後に、受容体がクラスター形成し、シグナルが細胞に伝達される。本開示の主題に従って、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答に関連するタンパク質に基づかない）、またはこれらの組合せを含むことができる。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、下に提示される通りの、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１１３９３４５．１を有する配列（配列番号９）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むまたはこれを有する（本明細書における相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準ソフトウェアを使用して決定することができる）、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０および最大２３５アミノ酸の長さである、配列番号９の連続した部分であるアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。あるいはまたはその上、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸１〜２３５、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００または２００〜２３５のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号９のアミノ酸１３７〜２０９のアミノ酸配列を含むまたはこれを有するＣＤ８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインを含む。
【化３】
2021502828.tif 000007
【０１３０】
ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、下に提示される通りの、ＮＣＢＩ参照番号：ＡＡＡ９２５３３．１を有する配列（配列番号１０）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むまたはこれを有する（本明細書における相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準ソフトウェアを使用して決定することができる）、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、少なくとも約２０または少なくとも約３０または少なくとも約４０または少なくとも約５０または少なくとも約６０または少なくとも約７０または少なくとも約１００または少なくとも約２００および最大２４７アミノ酸の長さである、配列番号１０の連続した部分であるアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。あるいはまたはその上、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸１〜２４７、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、１５１〜２１９または２００〜２４７のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸１５１〜２１９のアミノ酸配列を含むまたはこれを有するＣＤ８ポリペプチドを含む膜貫通ドメインを含む。
【化４】
2021502828.tif 000008
【０１３１】
ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、下に提示されている、配列番号１１に表記されているアミノ酸配列を含むまたはこれを有する：
【化５】
2021502828.tif 000009
【０１３２】
本開示の主題に従って、「ＣＤ８核酸分子」は、ＣＤ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、配列番号１１に表記されているアミノ酸配列を有するＣＤ８ポリペプチドをコードするＣＤ８核酸分子は、下に提示される通りの、配列番号１２に表記されている配列を有する核酸を含むまたはこれを有する。
【化６】
2021502828.tif 000010
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ１０７４７またはＮＰ＿００６１３０（配列番号２）を有する配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０および最大２２０アミノ酸の長さである、配列番号２の連続した部分であるアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。あるいはまたはその上、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２２０、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１１４〜２２０、１５０〜２００または２００〜２２０のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインに含まれるＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１５３〜１７９のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。
【０１３５】
配列番号２を下に提示する：
【化７】
2021502828.tif 000011
【０１３６】
本開示の主題に従って、「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸１５３〜１７９を有するＣＤ２８ポリペプチドをコードするＣＤ２８核酸分子は、下に提示される通りの、配列番号２２に表記されている配列を有する核酸を含むまたはこれを有する。
【化８】
2021502828.tif 000012
【０１３７】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、マウスＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。マウスＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号７３と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。配列番号７３を下に提示する：
【化９】
2021502828.tif 000013
【０１３８】
配列番号７３のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号７４に表記されている。
【化１０】
2021502828.tif 000014
【０１３９】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。ヒトＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号７５と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。配列番号７５を下に提示する：
【化１１】
2021502828.tif 000015
【０１４０】
配列番号７５のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号７６に表記されている。
【化１２】
2021502828.tif 000016
【０１４１】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域を含むこともできる。スペーサー領域は、抗原結合ドメインを異なる方向で配向して抗原認識を容易にすることを可能にするように十分に可撓性であり得る。スペーサー領域は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域、または免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、およびＣＤ３の部分、ＣＤ２８ポリペプチドの部分（例えば、配列番号２の部分）、ＣＤ８ポリペプチドの部分（例えば、配列番号９の部分または配列番号１０の部分）、前述のいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％相同であるその変形形態、または合成スペーサー配列となることができる。
【０１４２】
２．３．３．ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞（例えば、リンパ系系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）を活性化または刺激することができるＣＤ３ζポリペプチドを含む。ＣＤ３ζは、３個のＩＴＡＭを含み、抗原が結合された後に、細胞（例えば、リンパ系系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインは、内因性ＴＣＲからのシグナルの一次伝達因子である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９３２１７０を有する配列（配列番号１）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むまたはこれを有する、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０および最大１６４アミノ酸の長さである、配列番号１の連続した部分であるアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。あるいはまたはその上、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜１６４、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０または１５０〜１６４のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸５２〜１６４のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。
【０１４３】
配列番号１を下に提示する：
【化１３】
2021502828.tif 000017
【０１４４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１１０６８６４．２を有する配列（配列番号１３）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むまたはこれを有する、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、少なくとも約２０または少なくとも約３０または少なくとも約４０または少なくとも約５０または少なくとも約９０または少なくとも約１００および最大１８８アミノ酸の長さである、配列番号１３の連続した部分であるアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。あるいはまたはその上、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸１〜１６４、１〜５０、５０〜１００、５２〜１４２、１００〜１５０または１５０〜１８８のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸５２〜１４２のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。
【０１４５】
配列番号１３を下に提示する：
【化１４】
2021502828.tif 000018
【０１４６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、下に提示する配列番号１４に表記されているアミノ酸配列を含むまたはこれを有する：
【化１５】
2021502828.tif 000019
【０１４７】
本開示の主題に従って、「ＣＤ３ζ核酸分子」は、ＣＤ３ζポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態では、配列番号１４に表記されているアミノ酸配列を有するＣＤ３ζポリペプチドをコードするＣＤ３ζ核酸分子は、下に提示される通りの、配列番号１５に表記されているヌクレオチド配列を含むまたはこれを有する。
【０１４８】
【化１６】
2021502828.tif 000020
【０１４９】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、マウスＣＤ３ζポリペプチドを含む。マウスＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号６９と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。配列番号６９を下に提示する：
【化１７】
2021502828.tif 000021
【０１５０】
配列番号６９のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号７０に表記されている。
【化１８】
2021502828.tif 000022
【０１５１】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。ヒトＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号７１と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。配列番号７１を下に提示する：
【化１９】
2021502828.tif 000023
【０１５２】
配列番号７１のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号７２に表記されている。
【化２０】
2021502828.tif 000024
【０１５３】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領域を含まない、すなわち、ＣＡＲは、第一世代ＣＡＲである。
【０１５４】
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、共刺激領域は、最適なリンパ球活性化をもたらすことができる、少なくとも１個の共刺激分子を含む。本明細書で使用される場合、「共刺激分子」は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に要求される、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子を指す。少なくとも１個の共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ−１０ポリペプチドまたはこれらの組合せを含むことができる。共刺激分子は、細胞表面に発現されるタンパク質である共刺激リガンドに結合することができ、この共刺激リガンドは、その受容体への結合の際に共刺激応答、すなわち、抗原がそのＣＡＲ分子に結合するときにもたらされる刺激をもたらす細胞内応答を産生する。共刺激リガンドとしては、これらに限定されないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌおよび４−１ＢＢＬが挙げられる。一例として、４−１ＢＢリガンド（すなわち、４−１ＢＢＬ）は、ＣＡＲシグナルと組み合わせて、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のエフェクター細胞機能を誘導する細胞内シグナルをもたらすために、４−１ＢＢ（「ＣＤ１３７」としても公知）に結合することができる。４−１ＢＢ、ＩＣＯＳまたはＤＡＰ−１０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．７，４４６，１９０に開示されている。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ１０７４７またはＮＰ＿００６１３０を有する配列（配列番号２）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも４０または少なくとも５０および最大２２０アミノ酸の長さである、配列番号２の連続した部分であるアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。あるいはまたはその上、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２２０、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１１４〜２２０、１５０〜２００または２００〜２２０のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２のアミノ酸１８０〜２２０のアミノ酸配列を含むまたはこれを有するＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０３１６６８．３を有する配列（配列番号１６）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むまたはこれを有する、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも約２０または少なくとも約３０または少なくとも約４０または少なくとも約５０および最大２１８アミノ酸の長さである、配列番号１６の連続した部分であるアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。あるいはまたはその上、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸１〜２１８、１〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１１４〜２２０、１５０〜２００、１７８〜２１８または２００〜２２０のアミノ酸配列を含むまたはこれを有する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの共刺激シグナル伝達領域は、配列番号１６のアミノ酸１７８〜２１８を含むまたはこれを有するＣＤ２８ポリペプチドを含む。
【０１５７】
配列番号１６を下に提示する：
【化２１】
2021502828.tif 000025
【０１５８】
本開示の主題に従って、「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの共刺激シグナル伝達領域に含まれるＣＤ２８ポリペプチド（例えば、配列番号１６のアミノ酸１７８〜２１８）をコードするＣＤ２８核酸分子は、下に提示する配列番号１７に表記されているヌクレオチド配列を含むまたはこれを有する。
【化２２】
2021502828.tif 000026
【０１５９】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８のマウス細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２８のマウス細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６５と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。配列番号６５を下に提示する：
【化２３】
2021502828.tif 000027
【０１６０】
配列番号６５のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号６６に表記されている。
【化２４】
2021502828.tif 000028
【０１６１】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８のヒト細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２８のヒト細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６７と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。配列番号６７を下に提示する：
【化２５】
2021502828.tif 000029
【０１６２】
配列番号６７のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号６８に表記されている。
【化２６】
2021502828.tif 000030
【０１６３】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２個の共刺激分子：ＣＤ２８および４−１ＢＢまたはＣＤ２８およびＯＸ４０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。
【０１６４】
４−１ＢＢは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用することができ、刺激活性を有することができる。４−１ＢＢポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ４１２７３またはＮＰ＿００１５５２を有する配列（配列番号３）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。
【０１６５】
配列番号３を下に提示する：
【化２７】
2021502828.tif 000031
【０１６６】
本開示の主題に従って、「４−１ＢＢ核酸分子」は、４−１ＢＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６３と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。配列番号６３を下に提示する：
【化２８】
2021502828.tif 000032
【０１６８】
配列番号６３のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号６４に表記されている。
【化２９】
2021502828.tif 000033
【０１６９】
ＯＸ４０ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ４３４８９またはＮＰ＿００３３１８を有する配列（配列番号１８）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。
配列番号１８を下に提示する：
【化３０】
2021502828.tif 000034
【０１７０】
本開示の主題に従って、「ＯＸ４０核酸分子」は、ＯＸ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１７１】
ＩＣＯＳポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０３６２２４を有する配列（配列番号１９）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、またはその断片を含むことができるまたはこれを有することができる、および／あるいは最大１または最大２または最大３個の保存的アミノ酸置換を必要に応じて含むことができる。
【０１７２】
配列番号１９を下に提示する：
【化３１】
2021502828.tif 000035
【０１７３】
本開示の主題に従って、「ＩＣＯＳ核酸分子」は、ＩＣＯＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ヒト細胞において核酸配列を発現させるための誘導性プロモーターをさらに含む。ＣＡＲ遺伝子の発現における使用のためのプロモーターは、ユビキチンＣ（ＵｂｉＣ）プロモーターなど、構成的プロモーターであり得る。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ１９（例えば、マウスＣＤ１９）に結合する細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζポリペプチド（例えば、マウスＣＤ３ζポリペプチド）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領域を含まない、すなわち、ＣＡＲは、第一世代ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、「ｍ１９ｍｚ」（または「ａｍ１９ｍｚ」）と命名される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ（例えば、ｍ１９ｍｚ）は、下に提示する配列番号５に表記されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同であるアミノ酸配列を含む。
【化３２】
2021502828.tif 000036
【０１７６】
配列番号５は、アミノ酸１〜２７にＣＤ８リーダー配列を含み、ＣＤ１９（例えば、マウスＣＤ１９）に結合することができる。
【０１７７】
配列番号５のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号２０に表記されている。
【化３３】
2021502828.tif 000037
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ１９（例えば、マウスＣＤ１９）に結合する細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζポリペプチド（例えば、マウスＣＤ３ζポリペプチド）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８ポリペプチド（例えば、マウスＣＤ２８ポリペプチド）を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、「ｍ１９ｍ２８ｚ」（または「ａｍ１９ｍ２８ｚ」）と命名される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ（例えば、ｍ１９ｍ２８ｚ）は、下に提示する配列番号６に表記されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同であるアミノ酸配列を含む。
【化３４】
2021502828.tif 000038
【０１７９】
配列番号６は、アミノ酸１〜２７にＣＤ８リーダー配列を含み、ＣＤ１９（例えば、マウスＣＤ１９）に結合することができる。
【０１８０】
配列番号６のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号７に表記されている。
【化３５】
2021502828.tif 000039
【化３６】
2021502828.tif 000040
【０１８１】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζポリペプチド（例えば、マウスＣＤ３ζポリペプチド）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領域を含まない、すなわち、ＣＡＲは、第一世代ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、「ａｈ１９ｍｚ」と命名される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ（例えば、ａｈ１９ｍｚ）は、下に提示する配列番号３０に表記されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同であるアミノ酸配列を含む。
【化３７】
2021502828.tif 000041
【０１８２】
配列番号３０は、アミノ酸１〜１８にＣＤ８リーダー配列を含み、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合することができる。
【０１８３】
配列番号３０のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号３１に表記されている。
【化３８】
2021502828.tif 000042
【化３９】
2021502828.tif 000043
【０１８４】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３ζポリペプチド）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領域を含まない、すなわち、ＣＡＲは、第一世代ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、「ａｈ１９ｈｚ」と命名される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ（例えば、ａｈ１９ｈｚ）は、下に提示する配列番号３２に表記されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同であるアミノ酸配列を含む。
【化４０】
2021502828.tif 000044
【０１８５】
配列番号３２は、アミノ酸１〜１８にＣＤ８リーダー配列を含み、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合することができる。
【０１８６】
配列番号３２のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号３３に表記されている。
【化４１】
2021502828.tif 000045
【化４２】
2021502828.tif 000046
【０１８７】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζポリペプチド（例えば、マウスＣＤ３ζポリペプチド）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８ポリペプチド（例えば、マウスＣＤ２８ポリペプチド）を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、「ａｈ１９ｍ２８ｚ」と命名される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ（例えば、ａｈ１９ｍ２８ｚ）は、下に提示する配列番号３４に表記されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同であるアミノ酸配列を含む。
【化４３】
2021502828.tif 000047
【０１８８】
配列番号３４は、アミノ酸１〜１８にＣＤ８リーダー配列を含み、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合することができる。
【０１８９】
配列番号３４のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号３５に表記されている。
【化４４】
2021502828.tif 000048
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３ζポリペプチド）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ２８ポリペプチド）を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、「ａｈ１９ｈ２８ｚ」と命名される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ（例えば、ａｈ１９ｈ２８ｚ）は、下に提示する配列番号３６に表記されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同であるアミノ酸配列を含む。
【化４５】
2021502828.tif 000049
【化４６】
2021502828.tif 000050
【０１９１】
配列番号３６は、アミノ酸１〜１８にＣＤ８リーダー配列を含み、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合することができる。
【０１９２】
配列番号３６のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号３７に表記されている。
【化４７】
2021502828.tif 000051
【０１９３】
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する細胞外抗原結合ドメイン、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン、およびＣＤ３ζポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ３ζポリペプチド）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに４−１ＢＢポリペプチド（例えば、ヒト４−１ＢＢポリペプチド）を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、「ａｈ１９ｈＢＢｚ」と命名される。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ（例えば、ａｈ１９ｈＢＢｚ）は、下に提示する配列番号３８に表記されているアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同であるアミノ酸配列を含む。
【化４８】
2021502828.tif 000052
【０１９４】
配列番号３８は、アミノ酸１〜１８にＣＤ８リーダー配列を含み、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合することができる。
【０１９５】
配列番号３８のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、下に提示する配列番号３９に表記されている。
【化４９】
2021502828.tif 000053
【０１９６】
本開示の主題はまた、抗原に結合する抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列と、外因性ＩＬ−３３ポリペプチドをコードする第２の核酸配列とを含む、核酸組成物を提供する。
【０１９７】
３．免疫応答性細胞
本開示の主題は、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）および（ｂ）分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドを含む免疫応答性細胞を提供する。ある特定の実施形態では、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドは、外因性ＩＬ−３３ポリペプチドである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、免疫応答性細胞を活性化することが可能である。ある特定の実施形態では、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチド（例えば、外因性ＩＬ−３３ポリペプチド、例えばＩＬ−３３ポリペプチドをコードする核酸）は、免疫応答性細胞の抗腫瘍効果を促進することが可能である。免疫応答性細胞は、細胞が抗原認識受容体および外因性ＩＬ−３３ポリペプチドを同時発現するように、抗原認識受容体および外因性ＩＬ−３３ポリペプチドで形質導入することができる。
【０１９８】
本開示の主題の免疫応答性細胞は、リンパ系統の細胞であってよい。Ｂ、Ｔおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ系統は、抗体生成、細胞性免疫系の調節、血液中の外来作用物質の検出、宿主にとって外来の細胞の検出などを可能にする。リンパ系統の免疫応答性細胞の非限定的な例には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、胚性幹細胞および多能性幹細胞が含まれる（例えば、リンパ系細胞を分化させることができるもの）。Ｔ細胞は、胸腺で成熟し、主に細胞媒介性免疫の役割を担うリンパ球であってよい。Ｔ細胞は、適応免疫系に関与する。本開示の主題のＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または、幹様メモリーＴ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞：例えば、ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞を含む）、調節Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても公知）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連の不変Ｔ細胞およびγδＴ細胞を限定されずに含む、任意のタイプのＴ細胞であってよい。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死を誘導することが可能なＴリンパ球のサブセットである。患者自身のＴ細胞は、抗原認識受容体、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲの導入を通して特異的抗原を標的にするように遺伝子改変することができる。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってよい。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１９９】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞媒介性免疫の一部であり、先天性免疫応答の間に作用するリンパ球であってよい。ＮＫ細胞は、標的細胞に対するそれらの細胞傷害作用を実行するために、事前の活性化を必要としない。
【０２００】
本開示の主題のヒトリンパ球のタイプには、限定されずに、末梢ドナーリンパ球、例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：３５−４５（ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Ｍｏｒｇａｎ，  Ｒ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１２６−１２９（αおよびβヘテロ二量体を含む完全長腫瘍抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Ｐａｎｅｌｌｉ，  Ｍ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４９５−５０４；Ｐａｎｅｌｌｉ，  Ｍ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０００  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４３８２−４３９２（腫瘍生検における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養を開示する）、およびＤｕｐｏｎｔ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：５４１７−５４２７；Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ，  Ｇ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００３  Ｂｌｏｏｄ  １０２：２４９８−２５０５（人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルス処理樹状細胞を用いた選択的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ増大させた抗原特異的末梢血白血球を開示する）に開示されるものが含まれる。免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、自己、非自己（例えば、同種）であってよく、または操作された前駆細胞もしくは幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導することができる。
【０２０１】
本開示の免疫応答性細胞は、腫瘍微小環境をモジュレートすることが可能である。腫瘍は、免疫認識および排除からそれ自身を保護するための悪性細胞による一連の機構を含む、宿主免疫応答に敵対する微小環境を有する。この「敵対的な腫瘍微小環境」は、浸潤調節ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、ＴＧＦ−βを含む免疫抑制サイトカインを含む様々な免疫抑制因子、および、活性化Ｔ細胞（ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１）によって発現される免疫抑制受容体を標的にするリガンドの発現を含む。免疫抑制のこれらの機構は、寛容の維持および不適当な免疫応答の抑制において役割を果たすが、腫瘍微小環境の中では、これらの機構は有効な抗腫瘍免疫応答を妨げる。まとめると、これらの免疫抑制因子は、標的化腫瘍細胞との遭遇の際に養子的に導入されるＣＡＲ改変Ｔ細胞の顕著なアナジーまたはアポトーシスを誘導することができる。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞は、ＩＬ−３３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３を限定されずに含む、抗腫瘍サイトカインの分泌の増加を有する。ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞は、ＩＬ−３３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２またはその組合せの分泌の増加を有する。
【０２０３】
インターロイキン−３３
インターロイキン３３（ＩＬ−３３）（ＤＶＳ２７；ＩＬ１Ｆ１１；ＮＦ−ＨＥＶ；ＮＦＥＨＥＶ；Ｃ９ｏｒｆ２６；ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：９０８６５（ヒト）、７７１２５（マウス）、３６１７４９（ラット）、５０７０５４（ウシ）、１０００５９９０８（ウマ）としても公知）は、ＩＬ１ＲＬ１／ＳＴ２受容体に結合するサイトカインをコードする遺伝子である。ＩＬ−３３は、ある特定のタイプのＴ細胞の成熟および他の免疫応答性細胞、例えば肥満細胞、好塩基球、好酸球およびナチュラルキラー細胞の活性化に関与する。ＩＬ−３３のタンパク質生成物には、限定されずに、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１８６５６９．１、ＮＰ＿００１１８６５７０．１、ＮＰ＿００１３００９７３．１、ＮＰ＿００１３００９７４．１、ＮＰ＿００１３００９７５．１、ＮＰ＿００１３００９７６．１、ＮＰ＿００１３００９７７．１、ＮＰ＿００１３４０７３１．１、ＮＰ＿２５４２７４．１、ＸＰ＿０１６８７０７７４．１およびＸＰ＿０１１５１６３６３．１が含まれる。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、用語「ＩＬ−３３」または「ＩＬ−３３サイトカイン」は、細胞からの分泌後のＩＬ−３３の生物活性形態（例えば、シグナルペプチドが切断された形態）を指す。ヒトＩＬ−３３の非限定的な例は、下で提供される配列番号４に示す以下のアミノ酸配列を有する。
【化５０】
2021502828.tif 000054
【０２０５】
ある特定の実施形態では、マウスＩＬ−３３ポリペプチドは、下で提供される配列番号２１に示すアミノ酸配列を含むかまたは有する。ある特定の実施形態では、マウスＩＬ−３３ポリペプチドは、配列番号２１に示す配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％相同または同一であるアミノ酸配列を含むかまたは有する。
【化５１】
2021502828.tif 000055
【０２０６】
ある特定の実施形態では、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドは、そのサイトカイン部分が、ＩＬ−３３のタンパク質生成物のサイトカイン部分（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ：２６５２５（ヒト）、５４４５０（マウス）、３１１７８３（ラット）、５１８５１４（ウシ）、６１１８６９（イヌ）、１０００６５１５４（ウマ））、または免疫賦活活性を有するその断片と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同であるポリペプチドまたはタンパク質を指す。ある特定の非限定的な実施形態では、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドは、必要に応じてリンカーペプチドが連結したサイトカイン部分およびシグナルペプチドを含む。分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドの非限定的な例には、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１１８６５６９．１、ＮＰ＿００１１８６５７０．１、ＮＰ＿００１３００９７３．１、ＮＰ＿００１３００９７４．１、ＮＰ＿００１３００９７５．１、ＮＰ＿００１３００９７６．１、ＮＰ＿００１３００９７７．１、ＮＰ＿００１３４０７３１．１、ＮＰ＿２５４２７４．１、ＸＰ＿０１６８７０７７４．１およびＸＰ＿０１１５１６３６３．１が含まれる。
【０２０７】
ある特定の非限定的な実施形態では、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドは、シグナルペプチド、例えばＩＬ−２シグナルペプチド、カッパリーダー配列、ＣＤ８リーダー配列または本質的に同等の活性を有するペプチドを含む。ある特定の実施形態では、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドは、ＩＬ−２シグナルペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−２シグナルペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列を含むかまたは有する。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞は、長期にわたるＢ細胞形成不全を誘導することが可能である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体および分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチド（例えば、外因性ＩＬ−３３ポリペプチド）を含む免疫応答性細胞は、抗原認識受容体だけを含む（例えば、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドを含まない）免疫応答性細胞と比較して、Ｂ細胞集団を少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％低減する。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞は、内因性免疫細胞を活性化することが可能である。ある特定の実施形態では、内因性免疫細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、樹状細胞および内因性ＣＤ８  Ｔ細胞からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される免疫応答性細胞は、内因性免疫細胞集団を増加させる。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体および分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチド（例えば、外因性ＩＬ−３３ポリペプチド）を含む免疫応答性細胞は、抗原認識受容体だけを含む（例えば、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドを含まない）免疫応答性細胞と比較して、内因性免疫細胞集団を少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１０００％またはそれより多く増加させる。
【０２１０】
ＣＴＬの精製されていない供給源は、当技術分野で公知の任意のもの、例えば、骨髄、胎児、新生児または成人または他の造血細胞供給源、例えば、胎児の肝臓、末梢血またはさい帯血であってよい。細胞を分離するために、様々な技術を用いることができる。例えば、負の選択方法は、最初に非ＣＴＬを除去することができる。正と負の両方の選択のための、特定の細胞系統および／または分化のステージに関連したマーカーを同定するために、ｍＡｂは特に有用である。
【０２１１】
比較的粗い分離によって、大きな割合の最終分化細胞を最初に除去することができる。例えば、磁気ビーズ分離を最初に使用して多数の無関係な細胞を除去することができ、例えば、全造血細胞の少なくとも約８０％、通常少なくとも７０％が細胞単離の前に除去される。
【０２１２】
分離の手順には、限定されずに、密度勾配遠心分離；再凝固（ｒｅｓｅｔｔｉｎｇ）；細胞密度を改変する粒子とのカップリング；抗体コート磁気ビーズによる磁気分離；親和性クロマトグラフィー；補体および細胞毒素を限定されずに含む、ｍＡｂに連結されるかもしくはそれと併用される細胞傷害剤；ならびに、固体マトリックス、例えばプレート、チップに付着した抗体によるパニング、エラトリエーションまたは任意の他の便利な技術が含まれる。
【０２１３】
分離および分析の技術には、限定されずにフローサイトメトリーが含まれ、それは様々な程度の洗練度、例えば、複数のカラーチャネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルを有することができる。
【０２１４】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの死細胞に関連した色素を用いることによって、細胞を死細胞に対して選択することができる。ある特定の実施形態では、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）もしくは０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地、または任意の他の好適な、例えば、無菌の、等張性の培地で細胞は収集される。
【０２１５】
４．ベクター
免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の遺伝子改変は、組換えＤＮＡ構築物によって実質的に均一な細胞組成物を形質導入することによって達成することができる。ある特定の実施形態では、細胞へのＤＮＡ構築物の導入のために、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスのいずれか）が用いられる。例えば、抗原認識受容体をコードするポリヌクレオチドをレトロウイルスベクターにクローニングすることができ、その内因性のプロモーターから、レトロウイルスの末端反復配列から、または目的の標的細胞型に特異的であるプロモーターから発現を引き起こすことができる。非ウイルスベクターを、同様に使用することができる。
【０２１６】
抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を含むように免疫応答性細胞を最初に遺伝子改変するために、レトロウイルスベクターが形質導入のために一般的に用いられるが、任意の他の好適なウイルスベクターまたは非ウイルス送達システムを使用することができる。抗原認識受容体およびＩＬ−３３ポリペプチドは、単一の、多シストロン発現カセットに、単一のベクターの複数の発現カセットに、または複数のベクターに構築することができる。ポリシストロン性発現カセットを作製するエレメントの例には、限定されずに、様々なウイルスおよび非ウイルスのリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ、例えば、ＦＧＦ−１  ＩＲＥＳ、ＦＧＦ−２  ＩＲＥＳ、ＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ、ＩＧＦ−ＩＩ  ＩＲＥＳ、ＮＦ−κＢ  ＩＲＥＳ、ＲＵＮＸ１  ＩＲＥＳ、ｐ５３  ＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳおよび脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ）、および切断可能リンカー（例えば、２Ａペプチド、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａペプチド）が含まれる。レトロウイルスベクターおよび適当なパッケージング系の組合せも好適であり、その場合、カプシドタンパク質はヒト細胞を感染させるのに機能的である。ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：４３１−４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６：２８９５−２９０２）；およびＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４）を限定されずに含む、様々な両栄養性ウイルス産生細胞系が公知である。非両栄養性粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶエンベロープで偽型化された粒子および当技術分野で公知の任意の他のものも好適である。
【０２１７】
形質導入の可能な方法には、例えば、Ｂｒｅｇｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４１８−１４２２の方法による産生細胞との細胞の直接の共培養、または、例えば、Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔ．  ２２：２２３−２３０；およびＨｕｇｈｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８９：１８１７の方法による、ウイルス上清だけとのもしくは適当な増殖因子およびポリカチオンを伴うまたは伴わない濃縮ベクターストックとの培養が含まれる。
【０２１８】
免疫応答性細胞を改変するために、他の形質導入ウイルスベクターを使用することができる。ある特定の実施形態では、選択されるベクターは、高効率の感染と安定した組入れおよび発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４２３−４３０，  １９９７；Ｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８３３−８４４，  １９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６６４１−６６４９，  １９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７，  １９９６およびＭｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：１０３１９，  １９９７を参照）。使用することができる他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルスまたはヘルペスウイルス、例えばエプスタインバーウイルスが含まれる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５−１４，  １９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１，  １９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４，  １９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：５５−６１，  １９９０；Ｓｈａｒｐ，  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：１２７７−１２７８，  １９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６：３１１−３２２，  １９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：４０１−４０９，  １９８４；Ｍｏｅｎ，  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  １７：４０７−４１６，  １９９１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９８０−９９０，  １９８９；ＬｅＧａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０，  １９９３およびＪｏｈｎｓｏｎ，  Ｃｈｅｓｔ  １０７：７７Ｓ−  ８３Ｓ，  １９９５のベクターも参照）。レトロウイルスのベクターは特によく開発され、臨床場面で使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ  ３２３：３７０，  １９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，３９９，３４６号）。
【０２１９】
免疫応答性細胞の遺伝子改変のために、非ウイルスアプローチを用いることもできる。例えば、リポフェクションの存在下で核酸を投与することによって（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４：７４１３，  １９８７；Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７：２５９，  １９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ２９８：２７８，  １９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：５１２，  １９８３）、アシアロオロソムコイド−ポリリシンコンジュゲーション（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３：１４６２１，  １９８８；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４：１６９８５，  １９８９）、または外科的条件下のマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５，  １９９０）によって、核酸分子を免疫応答性細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法およびプロトプラスト融合を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションが含まれる。細胞へのＤＮＡの送達のために、リポソームも潜在的に有益であり得る。被験体の罹患組織への正常な遺伝子の移植は、培養可能な細胞型（例えば、自己または異種初代細胞またはその後代）に正常な核酸をｅｘ  ｖｉｖｏで導入することによって達成することもでき、その後、細胞（または、その後代）は、標的化組織に注射されるか、全身的に注射される。組換え受容体は、トランスポザーゼまたは標的化ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ）を使用して誘導するか得ることもできる。ＲＮＡ電気穿孔法によって、一時的な発現を得ることができる。
【０２２０】
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、原核細胞で発見されたゲノム編集ツールである。ゲノム編集のために利用される場合、このシステムはＣａｓ９（そのガイドとしてｃｒＲＮＡを利用してＤＮＡを改変することができるタンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９と活性複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（一般的にヘアピンループの形態）に結合する領域とともにそれを宿主ＤＮＡの正しい部分に誘導するためにＣａｓ９によって使用されるＲＮＡを含有する）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡに結合してＣａｓ９と活性複合体を形成する）、およびＤＮＡ修復鋳型（特異的ＤＮＡ配列の挿入を可能にする細胞修復プロセスを誘導するＤＮＡ）の必要に応じた部分を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、標的細胞をトランスフェクトするために、プラスミドをしばしば用いる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９が細胞の中の標的ＤＮＡを同定し、それに直接的に結合するために使用する配列であるので、各適用のために設計する必要がある。ＣＡＲ発現カセットを有する修復鋳型もまた、切断のいずれかの側の配列と重複し、挿入配列をコードしなければならないので、各適用のために設計する必要がある。複数のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを一緒にパッケージして、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。細胞にトランスフェクトさせるために、このｓｇＲＮＡをＣａｓ９遺伝子と一緒に連結させ、プラスミドにすることができる。
【０２２１】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は人工制限酵素であり、それは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生成される。ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼがゲノムの中の所望の配列を標的にすることを可能にする特異的ＤＮＡ配列を標的にするように操作することができる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合性ドメインは、複数の個々のジンクフィンガー反復配列を一般的に含有し、複数の塩基対を各々認識することができる。新しいジンクフィンガードメインを生成する最も一般的な方法は、公知の特異性のより小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。ＺＦＮにおける最も一般的な切断ドメインは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩからの非特異的切断ドメインである。内因性相同組換え（ＨＲ）機構およびＣＡＲ発現カセットを有する相同性ＤＮＡ鋳型を使用して、ＣＡＲ発現カセットをゲノムに挿入するためにＺＦＮを使用することができる。標的化配列がＺＦＮによって切断される場合、ＨＲ機構は損傷染色体と相同性ＤＮＡ鋳型の間の相同性を検索し、次に、染色体の２つの切断末端の間の鋳型の配列をコピーし、それによって相同性ＤＮＡ鋳型をゲノムに組み入れる。
【０２２２】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特異的配列を切断するように操作することができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮシステムは、ＺＦＮとほとんど同じ原理で作動する。それらは、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合性ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生成される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特異的ヌクレオチドのために強力な認識を有する２つの可変位置を有する３３〜３４アミノ酸の反復モチーフで構成される。これらのＴＡＬＥのアレイをアセンブルすることによって、所望のＤＮＡ配列に結合し、それによってゲノムの特異的位置で切断するようにヌクレアーゼを誘導するように、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合性ドメインを操作することができる。ポリヌクレオチド療法で使用するためのｃＤＮＡ発現は、任意の好適なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはメタロチオネインプロモーター）から誘導することができ、任意の適当な哺乳動物の調節エレメントまたはイントロン（例えば、伸長因子１ａエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節することができる。例えば、所望により、核酸の発現を誘導するために、特異的細胞型において遺伝子発現を優先的に誘導することが公知のエンハンサーを使用することができる。使用されるエンハンサーには、限定されずに、組織または細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものを含めることができる。あるいは、ゲノムクローンが治療構築物として使用される場合、同族の調節配列によって、または、所望により、上記のプロモーターまたは調節エレメントのいずれかを含む、異種供給源に由来する調節配列によって調節を媒介することができる。
【０２２３】
結果として生じる細胞は未改変の細胞のためのものと類似した条件の下で成長させることができ、それによって、改変された細胞を様々な目的のために増大させ、使用することができる。
【０２２４】
５．内因性ＩＬ−３３遺伝子発現を強化すること
ＩＬ−３３遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域を改変し、それによって免疫応答性細胞におけるＩＬ−３３の内因性発現を強化するために、任意の標的化ゲノム編集方法を使用することができる。ある特定の実施形態では、改変は、内因性のプロモーターの構成的プロモーターもしくは誘導可能なプロモーターによる置換、または、ＩＬ−３３遺伝子座のプロモーター領域への構成的プロモーターもしくは誘導可能なプロモーターの挿入を含む。ある特定の実施形態では、内因性ＩＬ−３３遺伝子の遺伝子発現を引き起こすために、構成的プロモーターはＩＬ−３３遺伝子座に配置される。適格な構成的プロモーターには、限定されずに、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ベータ−アクチンプロモーターおよびＣＡＧプロモーターが含まれる。あるいは、またはさらに、内因性ＩＬ−３３遺伝子の遺伝子発現を引き起こすために、条件的または誘導可能なプロモーターがＩＬ−３３遺伝子座に配置される。条件的プロモーターの非限定的な例には、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターおよびエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）プロモーターが含まれる。さらに、エンハンサーエレメントをプロモーター領域以外の領域に置くことができる。
【０２２５】
６．ゲノム編集方法
ＩＬ−３３遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域を改変するために、任意の標的化ゲノム編集方法を使用することができる。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域を改変するために、ＣＲＩＳＰＲシステムが使用される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域を改変するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼが使用される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−３３遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域を改変するために、ＴＡＬＥＮシステムが使用される。
【０２２６】
ゲノム編集剤／システムを送達するための方法は、必要性によって異なってもよい。ある特定の実施形態では、選択されるゲノム編集方法の構成成分は、１つまたは複数のプラスミドの中のＤＮＡ構築物として送達される。ある特定の実施形態では、構成成分は、ウイルスベクターを通して送達される。一般的な送達方法には、限定されずに、電気穿孔法、マイクロインジェクション、遺伝子銃、インパレフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、静水圧、連続的注入、超音波処理、マグネトフェクション、アデノ随伴ウイルス、ウイルスベクターのエンベロープタンパク質偽型化、複製能のあるベクターのシスおよびトランス作用性エレメント、単純ヘルペスウイルス、および化学的ビヒクル（例えば、オリゴヌクレオチド、リポプレックス、ポリマーソム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、ポリプレックス、デンドリマー、無機ナノ粒子および細胞透過性ペプチド）が含まれる。
【０２２７】
改変は、ＩＬ−３３遺伝子座の中のどこにでも、またはＩＬ−３３遺伝子の遺伝子発現に影響を及ぼすことができるどこにでも作製することができる。ある特定の実施形態では、改変は、ＩＬ−３３遺伝子の転写開始部位の上流に存在する。ある特定の実施形態では、改変は、ＩＬ−３３遺伝子の転写開始部位とタンパク質コード領域の間に存在する。ある特定の実施形態では、改変は、ＩＬ−３３遺伝子のタンパク質コード領域の下流に存在する。ある特定の実施形態では、改変は、ＩＬ−３３遺伝子の転写開始部位の上流に存在し、ここで、改変は新しい転写開始部位を生成する。
【０２２８】
７．ポリペプチドおよび類似体
本開示の主題には、免疫応答性細胞において発現される場合にそれらの抗新生物活性を強化する方法で改変される、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ３ζおよびＩＬ−３３ポリペプチドまたはその断片も含まれる。本開示の主題は、配列に変更を生成することによってアミノ酸配列または核酸配列を最適化する方法を提供する。そのような変更は、ある特定の変異、欠失、挿入または翻訳後修飾を含むことができる。本開示の主題は、本明細書に開示される任意の天然に存在するポリペプチド（ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ３ζおよびＩＬ−３３を限定されずに含む）の類似体をさらに含む。類似体は、アミノ酸配列の差、翻訳後修飾、またはそれらの両方が本明細書に開示される天然に存在するポリペプチドと異なってもよい。類似体は、本開示の主題の天然に存在するアミノ酸配列の全体または一部と、少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９％またはそれより高い相同性を示すことができる。配列比較の長さは、少なくとも５、１０、１５または２０アミノ酸残基、例えば少なくとも２５、５０または７５アミノ酸残基であるか、または１００アミノ酸残基を超える。再び、同一性の程度を決定する例示的なアプローチにおいて、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ−３とｅ−１００の間の確率スコアは緊密に関連した配列を示している。改変には、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的誘導体化、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化またはグリコシル化が含まれ、そのような改変は、ポリペプチドの合成もしくはプロセシングの間に、または、単離された修飾酵素による処置の後に起こることができる。類似体は、一次配列の変更によって天然に存在するポリペプチドと異なることもできる。これらには、天然のおよび誘導された（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｄ  ｅｄ．），  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記に記載の通りに、照射もしくはエタンメチルスルフェートへの曝露によるランダム変異誘発、または部位特異的変異誘発からもたらされる）遺伝的改変体が含まれる。環化されたペプチド、分子およびＬ−アミノ酸以外の残基を含有する類似体、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しないかもしくは合成のアミノ酸、例えば、ベータもしくはガンマアミノ酸も含まれる。
【０２２９】
完全長ポリペプチドに加えて、本開示の主題は、本明細書に開示されるポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか１つの断片も提供する。本明細書で使用される場合、用語「断片」は、少なくとも５、１０、１３または１５アミノ酸を意味する。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも２０個の連続したアミノ酸、少なくとも３０個の連続したアミノ酸または少なくとも５０個の連続したアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも６０〜８０個、１００個、２００個、３００個またはそれより多くの連続したアミノ酸を含む。断片は、当業者に公知の方法によって生成することができるか、または正常なタンパク質プロセシング（例えば、生物活性のために必要とされないアミノ酸の新生ポリペプチドからの除去、または、選択的ｍＲＮＡスプライシングまたは選択的タンパク質プロセシング事象によるアミノ酸の除去）からもたらすことができる。
【０２３０】
非タンパク質類似体は、本明細書に開示されるタンパク質（例えば、ＩＬ−３３）の機能的活性を模倣するように設計された化学的構造を有する。そのような類似体は、元のポリペプチドの生理活性を超えることがある。類似体設計の方法は当技術分野で周知であり、類似体の合成は、免疫応答性細胞において発現されるときに、生じる類似体が元のポリペプチドの抗新生物活性を増加させるように化学構造を改変することによって、そのような方法によって実行することができる。これらの化学的改変には、限定されずに、代替のＲ基を置換すること、および参照ポリペプチドの特異的炭素原子での飽和度を変えることが含まれる。ある特定の実施形態では、タンパク質類似体はｉｎ  ｖｉｖｏ分解に比較的抵抗性であり、投与の際により長期にわたる治療効果をもたらす。機能的活性を測定するためのアッセイには、限定されずに、以下の実施例に記載されるものが含まれる。
【０２３１】
８．投与
本開示の免疫応答性細胞を含む組成物は、抗原への免疫応答を誘導および／もしくは強化するために、ならびに／または新生物、病原体感染もしくは感染性疾患を処置および／もしくは予防するために、被験体に全身的にまたは直接的に提供することができる。ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物は、目的の臓器（例えば、新生物によって冒された臓器）に直接的に注射される。あるいは、本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物は、例えば、循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって目的の臓器に間接的に提供される。Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＣＴＬ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの生成を増加させるために、細胞または組成物の投与の前、間または後に、増大および分化剤を提供することができる。
【０２３２】
本開示の免疫応答性細胞は、任意の生理的に許容されるビヒクルの中で、通常は血管内に投与することができるが、細胞が再生および分化のための適当な部位を見出すことができる骨または他の便利な部位（例えば、胸腺）にそれらを導入することもできる。通常、少なくとも約１×１０５個の細胞が投与され、最終的に約１×１０１０個またはそれより多くまで到達する。本開示の免疫応答性細胞は、精製された細胞集団を含むことができる。当業者は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）などの様々な周知の方法を使用して、集団の中の本開示の免疫応答性細胞の百分率を容易に決定することができる。本開示の免疫応答性細胞を含む集団における純度の好適な範囲は、約５０％〜約５５％、約５％〜約６０％および約６５％〜約７０％である。ある特定の実施形態では、純度は、約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、または約８０％〜約８５％である。ある特定の実施形態では、純度は、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％または約９５％〜約１００％である。投薬量は、当業者が容易に調整することができる（例えば、純度の減少は、投薬量の増加を必要とすることがある）。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入することができる。
【０２３３】
本開示の組成物は、本開示の免疫応答性細胞またはそれらの前駆細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であってよい。投与は、自家または異種であってよい。例えば、免疫応答性細胞または前駆細胞は、１人の被験体から得ることができ、同じ被験体または異なる、適合する被験体に投与することができる。末梢血由来の（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来の）免疫応答性細胞またはそれらの後代は、カテーテル投与、全身性注射、局所注射、静脈内注射または非経口投与を含む局所注射を通して投与することができる。本開示の主題の治療組成物（例えば、本開示の免疫応答性細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、それは、単位投薬量注射形態（溶液、懸濁物、乳剤）に製剤化することができる。
【０２３４】
９．製剤
本開示の免疫応答性細胞を含む組成物は、選択されるｐＨに緩衝することができる、無菌の液体調製物、例えば、等張性の水溶液、懸濁物、乳剤、分散物または粘性組成物として都合よく提供することができる。液体調製物は、ゲル剤、他の粘性組成物および固体組成物より調製するのが通常容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに若干より便利である。他方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適当な粘度範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物は担体を含むことができ、それは、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）および好適なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。
【０２３５】
無菌の注射可能な溶液は、所望されるように様々な量の他の成分と一緒に必要な量の適当な溶媒に遺伝子改変免疫応答性細胞を組み込むことによって調製することができる。そのような組成物は、好適な担体、希釈剤または賦形剤、例えば無菌水、生理的食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合してもよい。組成物は、凍結乾燥されてもよい。組成物は、所望の投与経路および調製物によって、湿潤、分散または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色剤などの補助物質を含有することができる。過度の実験無しで好適な調製物を調製するために、標準のテキスト、例えば、参照により本明細書に組み込まれる“ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ”，  １７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８５を参照することができる。
【０２３６】
抗微生物保存剤、抗酸化剤、キレート化剤および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を強化する様々な添加剤を加えることができる。微生物活動の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることができる。注射用医薬形態の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかし、本開示の主題により、使用されるいかなるビヒクル、希釈剤または添加剤も、遺伝子改変免疫応答性細胞またはそれらの前駆細胞と適合しなければならないだろう。
【０２３７】
組成物は等張性であってよく、すなわち、それらは血液および涙液と同じ浸透圧を有することができる。組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウムまたは他の薬学的に許容される薬剤、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機の溶質を使用して達成することができる。塩化ナトリウムは、特にナトリウムイオンを含有する緩衝液のためのものである。
【０２３８】
組成物の粘度は、所望により、薬学的に許容される増粘剤を使用して選択されるレベルに維持することができる。例えば、メチルセルロースは容易におよび経済的に入手可能であり、作業が容易である。他の好適な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが含まれる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に依存してよい。重要な点は、選択される粘度を達成する量を使用することである。明らかに、好適な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形、例えば液体剤形の性質（例えば、組成物が、溶液、懸濁物、ゲルまたは別の液体形態、例えば時限放出形態もしくは液体充填形態に製剤化されるかどうか）に依存する。
【０２３９】
投与される細胞の量は、処置されている被験体によって異なる。一実施形態では、約１０４〜約１０１０、約１０５〜約１０９、または約１０６〜約１０８個の本開示の免疫応答性細胞がヒト被験体に投与される。より有効な細胞は、さらに少ない数で投与することができる。ある特定の実施形態では、少なくとも約１×１０８、約２×１０８、約３×１０８、約４×１０８または約５×１０８個の本開示の免疫応答性細胞がヒト被験体に投与される。有効な用量とみなされるものの正確な決定は、特定の被験体のサイズ、年齢、性別、体重および状態を含む、各被験体に個々の因子に基づくことができる。投薬量は、本開示および当技術分野に関する知識から、当業者が容易に確認することができる。
【０２４０】
当業者は、組成物中の、および方法で投与されることになる、細胞ならびに必要に応じた添加剤、ビヒクルおよび／または担体の量を容易に決定することができる。一般的に、任意の添加剤（活性細胞（複数可）および／または薬剤（複数可）に加えて）が、リン酸緩衝食塩水の中に０．００１〜５０（重量）％溶液の量で存在し、有効成分は、マイクログラムからミリグラムのオーダーで、例えば約０．０００１〜約５重量％、約０．０００１〜約１重量％、約０．０００１〜約０．０５重量％または約０．００１〜約２０重量％、約０．０１〜約１０重量％または約０．０５〜約５重量％で存在する。動物またはヒトに投与される任意の組成物のために、以下を決定することができる：例えば好適な動物モデル、例えばマウスなどの齧歯動物における致死用量（ＬＤ）およびＬＤ５０の決定による毒性；好適な応答を導き出す、組成物（複数可）の投薬量、その中の構成成分の濃度、および組成物（複数可）の投与のタイミング。そのような決定は、当業者の知識、本開示および本明細書に引用される文書からの過度の実験を必要としない。また、逐次投与のための時間は、過度の実験無しで確認することができる。
【０２４１】
１０．処置方法
本開示の主題は、それを必要とする被験体において免疫応答を誘導および／または増加させる方法を提供する。本開示の免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、被験体において新生物を処置および／または予防するために使用することができる。本開示の免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、新生物を患っている被験体の生存を延長するために使用することができる。本開示の免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、被験体、例えば免疫無防備状態のヒト被験体において、病原体感染または他の感染性疾患を処置および／または予防するために使用することもできる。そのような方法は、既存の状態の緩和または再発の予防である、所望の効果を達成するために有効な量の本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む。処置のために、投与される量は、所望の効果をもたらすのに有効な量である。有効量は、１回のまたは一連の投与で提供することができる。有効量は、ボーラスで、または連続かん流によって提供することができる。
【０２４２】
「有効量」（または、「治療有効量」）は、処置により有益または所望の臨床結果を達成するのに十分な量である。有効量は、１または複数の用量で被験体に投与することができる。処置に関して、有効量は、疾患を緩和、好転、安定化、逆転もしくはその進行を減速させるか、またはさもなければ疾患の病理学的帰結を低減するのに十分な量である。有効量は医師によって一般的に症例ごとに決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するために適当な投薬量を決定する場合、いくつかの因子が一般的に考慮される。これらの因子には、被験体の年齢、性別および体重、処置されている状態、状態の重症度ならびに投与される免疫応答性細胞の形態および有効濃度が含まれる。
【０２４３】
抗原特異的Ｔ細胞を使用した養子免疫療法のために、約１０６〜１０１０（例えば、約１０９）の範囲内の細胞用量が一般的に注入される。宿主への本開示の細胞の投与およびそれに続く分化の際に、特異的抗原に対して特異的に向けられるＴ細胞が誘導される。改変された細胞は、静脈内、皮下、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）、腫瘍内、髄腔内、胸膜腔内、腹腔内、および胸腺に直接を限定されずに含む、当技術分野で公知の任意の方法によって投与することができる。
【０２４４】
本開示の主題は、被験体において新生物を処置および／または予防する方法を提供する。本方法は、有効量の本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物を、新生物を有する被験体に投与することを含むことができる。
【０２４５】
新生物の非限定的な例には、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫）、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸管がん、肝がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、咽喉がん、黒色腫、神経芽細胞腫、腺癌、神経膠腫、軟部組織肉腫および様々な癌腫（前立腺および小細胞肺がんを含む）が含まれる。好適な癌腫には、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、希突起膠細胞腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、膵管腺癌、小および大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮癌、気管支肺胞癌、上皮腺癌およびその肝転移、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝細胞癌、胆管癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、基底細胞癌、汗腺癌、乳頭状癌、脂腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、および重鎖病、管および小葉の腺癌などの乳房腫瘍、子宮頸管の扁平上皮および腺癌、子宮および卵巣の上皮癌、前立腺腺癌、膀胱の移行性扁平上皮癌、ＢおよびＴ細胞リンパ腫（結節性およびびまん性）プラズマ細胞腫、急性および慢性白血病、悪性黒色腫、軟部組織肉腫および平滑筋肉腫を限定されずに含む、腫瘍学の分野で公知の任意のものがさらに含まれる。ある特定の実施形態では、新生物は、血液がん（例えば白血病、リンパ腫および骨髄腫）、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸管がん、肝がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫および咽喉がんからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、従来の治療的介入に適していない、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫）または卵巣がんを処置および／または予防するために使用することができる。
【０２４６】
被験体は、進行した形態の疾患を有し得、その場合、処置の目的は疾患進行の軽減もしくは逆転、および／または副作用の好転を含むことができる。被験体は、既に処置されている状態の病歴を有することができ、その場合、治療目的は再発リスクの減少または遅延を一般的に含む。
【０２４７】
療法のための好適なヒト被験体は、臨床上の判定基準によって区別することができる２つの処置群を一般的に含む。「進行疾患」または「高い腫瘍負荷」を有する被験体は、臨床的に測定可能な腫瘍を有するものである。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍質量に基づいて検出することができるものである（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、ソノグラフ、乳房Ｘ線像またはＸ線；陽性の生化学的または組織病理マーカーはそれ自体でこの集団を同定するには不十分である）。被験体の状態を緩和する目的で抗腫瘍応答を導き出すために、医薬組成物がこれらの被験体に投与される。理想的には、腫瘍質量の低減がその結果として起こるが、あらゆる臨床上の改善が利益を構成する。臨床上の改善には、腫瘍の進行のリスクもしくは速度の減少または病理学的帰結における低減が含まれる。
【０２４８】
好適な被験体の第２の群は、「アジュバント群」として当技術分野で公知である。これらは、新生物の病歴を有しているが、別のモードの療法に応答性である個体である。前の療法は、外科的切除、放射線療法および伝統的化学療法を限定されずに含むことができた。その結果、これらの個体は、臨床的に測定可能な腫瘍を有しない。しかし、彼らは、元の腫瘍部位の近くの、または転移による疾患の進行のリスクがあることが疑われている。この群は、高リスクおよび低リスク個体にさらに細分化することができる。細分化は、初期の処置の前後に観察される特徴に基づいて行われる。これらの特徴は臨床分野で公知であり、各異なる新生物のために適切に規定される。高リスクサブグループで一般的な特徴は、腫瘍が隣接組織に侵入したか、またはリンパ節の関与を示すものである。
【０２４９】
別の群は新生物への遺伝的素因を有するが、新生物の証明された臨床徴候がまだない。例えば、乳がんに関連した遺伝子変異の試験で陽性であるがまだ妊娠年齢である女性は、予防手術を実行することが好適になるまで、新生物の発生を防止するための予防的処置において、本明細書に記載される免疫応答性細胞の１つまたは複数を受けることを望み得る。
【０２５０】
腫瘍抗原に結合する抗原認識受容体および免疫応答性細胞の抗腫瘍効果を強化する分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチド（例えば、外因性ＩＬ−３３ポリペプチド）の表面発現の結果として、養子的に導入されたＴまたはＮＫ細胞は、腫瘍部位で増強された選択的な細胞溶解活性を与えられる。さらにまた、腫瘍へのそれらの局在化またはウイルス感染およびそれらの増殖の後に、Ｔ細胞は、生理的抗腫瘍または抗ウイルス応答に関与する広範囲の免疫細胞（腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ−、ＮＫＴ細胞、樹状細胞およびマクロファージ）のために、腫瘍またはウイルス感染部位を高度伝導性環境（ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）に転換する。
【０２５１】
さらに、本開示の主題は、被験体、例えば免疫無防備状態の被験体において、病原体感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染または原虫感染）を処置および／または予防する方法を提供する。本方法は、有効量の本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物を、病原体感染を有する被験体に投与することを含むことができる。処置に感受性である例示的なウイルス感染には、限定されずに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびインフルエンザウイルス感染が含まれる。
【０２５２】
免疫学的合併症（「悪性のＴ細胞トランスフォーメーション」として公知）、例えば移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）のリスクを避けるか最小にするために、または、健康組織が腫瘍細胞と同じ標的抗原を発現し、ＧｖＨＤと類似の転帰につながる場合、さらなる改変を本開示の免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することができる。この問題への潜在的解決方法は、本開示の免疫応答性細胞に自殺遺伝子を組み入れることである。好適な自殺遺伝子には、限定されずに、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ−ｔｋ）、誘導可能なカスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ−９）およびトランケーションされたヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドが含まれる。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ＥＧＦＲｔポリペプチドである。ＥＧＦＲｔポリペプチドは、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ）を投与することによって、Ｔ細胞排除を可能にする。ＥＧＦＲｔは、本開示のＣＡＲの抗原認識受容体の上流に共有結合することができる。例示的な実施形態を、図２０に示す。本開示のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターの中に、自殺遺伝子が含まれてもよい。このように、悪性Ｔ細胞トランスフォーメーション（例えば、ＧＶＨＤ）の間の、自殺遺伝子を活性化するように設計されたプロドラッグ（例えば、ｉＣａｓｐ−９を活性化することができるプロドラッグ（例えばＡＰ１９０３））の投与は、自殺遺伝子活性化ＣＡＲ発現Ｔ細胞においてアポトーシスを誘発する。本開示のＣＡＲへの自殺遺伝子の組込みは、大半のＣＡＲ  Ｔ細胞を非常に短時間で排除する能力によって安全性のさらなるレベルを与える。自殺遺伝子を組み込んだ本開示の免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後の所与の時点で先制して排除することができるか、または毒性の最も初期の徴候で根絶させることができる。
【０２５３】
１１．キット
本開示の主題は、免疫応答を誘導および／もしくは強化するための、ならびに／または被験体において新生物もしくは病原体感染を処置および／もしくは予防するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、有効量の本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む医薬組成物を含む。ある特定の実施形態では、キットは、無菌の容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、小袋、ブリスターパックまたは当技術分野で公知の他の好適な容器の形態であってよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、積層紙、金属箔または医薬の保持のために好適な他の材料で作製することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、目的の抗原に向けられた抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする単離された核酸分子、および必要に応じて同じまたは異なるベクターに含めることができる、発現可能な（および、分泌可能な）形態のＩＬ−３３ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。
【０２５４】
所望により、免疫応答性細胞および／または核酸分子は、新生物または病原体または免疫障害を有するかそれを起こすリスクがある被験体に、細胞または核酸分子を投与するための指示と一緒に提供される。指示は、新生物または病原体感染の処置および／または予防のための組成物の使用に関する情報を一般的に含む。ある特定の実施形態では、指示は、以下の少なくとも１つを含む：治療剤の説明；新生物、病原体感染もしくは免疫障害もしくはその症状の処置もしくは予防のための投薬量計画および投与；注意；警告；適応症；禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）；過量投与情報；有害反応；動物薬理学；臨床試験；ならびに／または参考文献。指示は、容器（存在する場合）の上に直接的に、または容器に貼付される表示として、または容器の中にもしくはそれと一緒に供給される別個のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダとして印刷することができる。
【実施例】
【０２５５】
本開示の実施は、別途指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を用い、それらは十分に当業者の認識の範囲内である。そのような技術は、文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  １９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  （Ｇａｉｔ，  １９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  （Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  １９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （Ｗｅｉｒ，  １９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”  （Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，  １９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  （Ａｕｓｕｂｅｌ，  １９８７）；“ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，  （Ｍｕｌｌｉｓ，  １９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （Ｃｏｌｉｇａｎ，  １９９１）に詳細に説明されている。これらの技術は本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用可能であり、このように、本開示の主題の作製および実施で考慮することができる。特定の実施形態のために特に有益な技術は、続くセクションにおいて議論される。
【０２５６】
以下の実施例は、本開示の細胞および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために示され、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではない。
【０２５７】
（実施例１  インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）分泌ＣＡＲ−Ｔ細胞）
序論
第一世代の抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよび分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチド、または、第二世代の抗ＣＤ１９  ＣＡＲおよび分泌可能なマウスＩＬ−３３ポリペプチドを発現する遺伝子改変Ｔ細胞を生成した。分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチドを含まない対照の抗ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ−Ｔ細胞は改善を示した。ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ−Ｔ細胞は、マウスモデルにおいて延長した生存曲線を示した。
【０２５８】
結果
ＣＡＲ構築物
分泌可能なマウスＩＬ−３３ポリペプチドを伴うまたは伴わない様々な抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物、例えば、図１Ａに示すような、ａｈ１９ｍＺ、ａｈ１９ｍ２８Ｚ、ａｈ１９ｍＺｐ２Ａ＿ＩＬ−３３、ａｈ１９ｍ２８Ｚ、ａｈ１９ｍ２８Ｚｐ２Ａ＿ＩＬ−３３、ａｍ１９ｍ２８Ｚおよびａｍ１９ｍ２８Ｚｐ２Ａ＿ＩＬ−３３を、ＳＦＧレトロウイルスベクターバックボーンの中に構築した。図１Ｂは、構成的に分泌されるマウスＩＬ−３３を組み込んでいる第一世代の抗マウスＣＤ１９  ｍｙｃ−タグＣＡＲの構築物を示し、構築物で使用されたマウスＩＬ−３３成熟ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２１に示す。
【０２５９】
図１Ｃは、構成的に分泌されるヒトＩＬ−３３を組み込んでいる第一世代の抗ヒトＣＤ１９（ＳＪ２５Ｃ  ｓｃＦｖ）ＣＡＲの構築物を示し、構築物で使用されたヒトＩＬ−３３成熟ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４に示す。
【０２６０】
上記の様々な構築物の１つで、Ｔ細胞を形質導入させた。
【０２６１】
増加したサイトカイン分泌
改変されたＴ細胞のサイトカイン分泌をフローサイトメトリーによって分析し、その結果を図２に示す。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、単独でまたは抗原陽性腫瘍細胞、＋ＥＬ４ｈ  １９ｍｉｔｏＣ（アッセイの間の増殖を阻止するためにＥＬ４ｈ  １９細胞をマイトマイシンＣに曝露させた）と、１０：１のエフェクター：腫瘍比で共培養した。３６時間後に、上清を収集し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）を、ビーズベースの多重アッセイを利用して測定した。分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチド無しでＣＡＲだけを発現するＴ細胞と比較して、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ−Ｔ細胞は、単独で、および抗原陽性腫瘍細胞と共培養した場合、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−ガンマの増加した分泌を示した（図２を参照）。
【０２６２】
増加したｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害
改変されたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害を分析した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、異なるエフェクター：腫瘍比（Ｅ：Ｔ比）で抗原陽性（ヒトＣＤ１９＋）腫瘍細胞（ＥＬ４ｈ１９ｇｆｐＬＵＣ）と共培養した。２４時間後に、腫瘍細胞溶解を生物発光によって測定し、結果を図３に示す。図３に示すように、ＩＬ−３３を分泌する第一世代ＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、ａｈ１９ｍＺ．ＩＬ３３）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害は、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチド無しの第一世代ＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、ａｈ１９ｍＺ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害より高かったこと、およびＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、ａｈ１９ｍ２８Ｚ．ＩＬ３３）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害は、分泌可能なＩＬ−３３ポリペプチド無しの第二世代ＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、ａｈ１９ｍ２８Ｚ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害に類似していることを示す。
【０２６３】
腫瘍保有マウスの生存
次に、疾患の同系、免疫適格モデルの文脈において、改変されたＴ細胞を研究し、ここでは、ＥＬ４ｈＣＤ１９＋腫瘍保有同系免疫適格マウスの長期生存を評価した。ヒトＣＤ１９を異所的に発現したＳｉｇｍａからの１×１０６個のＥＬ４腫瘍細胞（ＥＬ４ｈ１９）で、Ｃ５７ＢＬ／８マウスを接種した。腫瘍接種の１日後に、様々なＣＡＲ構築物で形質導入した１×１０６〜２×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞でマウスをその後処置し、生存を追跡した。全ての被験体の生存曲線を、図４Ａ〜４Ｃに示す。図４Ａ〜４Ｃに示すように、ＩＬ−３３を分泌する第一世代ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＩＬ−３３を分泌する第二世代ＣＡＲ  Ｔ細胞（ａｈ１９ｍＺｐＩＬ３３ｍａｔおよびａｈ１９ｍ２８ＺｐＩＬ３３）の両方が、腫瘍保有マウスにおいて長期生存を誘導した。
【０２６４】
Ｂ細胞形成不全
Ｂ細胞集団に対する改変されたＴ細胞の効果を、分析した。腫瘍接種の１日後に、ＥＬ４ｈ１９を有するＣ５７ＢＵ６マウスを２×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。８日目に、フローサイトメトリーによって末梢血をＢ細胞について評価し、ＣＤ４５＋細胞の百分率として定量化した。３８日目に、年齢を一致させた対照と一緒に、生存マウスで測定を繰り返した。図５に示すように、ＩＬ−３３を分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞による処置は、生存マウスにおける８日目および３８日目の両方でのＢ細胞の枯渇につながった。したがって、ＩＬ−３３を分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞は、急速かつ長引くＢ細胞形成不全を誘導した。
【０２６５】
ＣＤ１１ｂ＋細胞の末梢分布
ＣＤ１１ｂ＋好中球およびマクロファージに対する改変されたＴ細胞の効果を分析した。腫瘍接種の１日後に、ＥＬ４ｈ１９を有するＣ５７ＢＵ６マウスを２×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。８日目に、フローサイトメトリーによって末梢血を好中球（Ｇｒ−１ｈｉ）およびマクロファージ（Ｆ４／８０ｈｉ）について評価し、ＣＤ１１ｂ＋細胞の百分率として定量化した。図６に示すように、ＩＬ−３３を分泌する第一世代ＣＡＲ  Ｔ細胞による処置は、無処置の対照群と比較してＣＤ１１ｂ＋好中球の集団を増加させ、ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの集団を減少させた。
【０２６６】
末梢サイトカインレベル
血液中のサイトカインレベルに対する改変されたＴ細胞の効果を分析した。腫瘍接種の１日後に、ＥＬ４ｈ１９を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを２×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。８日目に、末梢血を収集し、ビーズベースの多重アッセイを利用してサイトカインを定量化した。図７に示すように、ＩＬ−３３を分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞による処置は、対照群と比較してインターフェロンガンマ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３３の血清中レベルの増加につながった。
【０２６７】
（実施例２  マウスモデルにおけるインターロイキン−３３（ＩＬ−３３）分泌ＣＡＲ−Ｔ細胞）
マウスＩＬ−３３分泌ＣＡＲ構築物
ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ−Ｔ細胞の生物学的効果を、マウスモデルにおいて分析した。ａｍ１９ｍＤＥＬ、ａｍ１９ｍＤＥＬｐ２Ａ＿ＩＬ−３３、ａｍ１９ｍＺ、ａｍ１９ｍＺｐ２Ａ＿ＩＬ−３３、ａｍ１９ｍ２８Ｚおよびａｍ１９ｍ２８Ｚｐ２Ａ＿ＩＬ−３３を含む分泌可能なマウスＩＬ−３３ポリペプチドを伴うまたは伴わない様々な抗マウスＣＤ１９  ＣＡＲ構築物を、図８に示すようにＳＦＧレトロウイルスベクターバックボーンの中に構築した。抗マウスＣＤ１９（ａｍ１９）は、１Ｄ３  ｓｃＦｖに由来した。全ての構築物は、ＣＤ２８近位の細胞外および膜貫通ドメインをヒンジとして利用した。全てのマウスＩＬ−３３分泌構築物では、サイトカインは自己切断Ｐ２ＡエレメントによってＣＡＲから分離された。
【０２６８】
増加したサイトカイン分泌
上記の構築物の１つで形質導入したＴ細胞の間で、ＩＬ−３３分泌を分析した。これらの改変Ｔ細胞を、単独で、または抗原陽性腫瘍細胞、＋ＥＬ４ｈ１９Ｓｍ１９（ＥＬ４細胞はＳｉｇｍａから購入、マウスにノックイン）と、１：１のエフェクター：腫瘍比で共培養した。２４時間後、上清を収集し、ビーズベースの多重アッセイを利用してサイトカインを測定した。図９に示すように、可溶性ＩＬ−３３の検出可能なレベルが、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞において観察された。
【０２６９】
他の抗腫瘍サイトカインの分泌も評価した。改変されたＴ細胞を、単独で、または抗原陽性腫瘍細胞、＋ＥＬ４ｈ１９Ｓｍ１９（ＥＬ４細胞はＳｉｇｍａから購入、マウスにノックイン）と、１：１のエフェクター：腫瘍比で共培養した。２４時間後、上清を収集し、ビーズベースの多重アッセイを利用してサイトカインを測定した。図１０に示すように、第二世代のＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞は、刺激によりＩＬ−２を分泌し、キメラ共刺激ドメインの機能を実証した。図１１に示すように、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原刺激と無関係にＧＭ−ＣＳＦおよびインターフェロンガンマを分泌し、この分泌は、抗原および共刺激ドメインの存在下でさらに強化されたことを示す。
【０２７０】
Ｂ細胞形成不全
Ｂ細胞集団に対する改変されたＴ細胞（ａｍ１９ｍＺ−ＩＬ３３）の効果を分析した。漸増用量（マウス１匹につき１．２５×１０６から２０×１０６）の改変Ｔ細胞を健康な腫瘍非保有Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与し、１５日目に、フローサイトメトリーによって末梢血をＢ細胞について評価し、ＣＤ４５＋細胞の百分率として定量化した。さらに、Ｂ細胞回復を追跡した。４２日目に、フローサイトメトリーによって末梢血をＢ細胞について評価し、ＣＤ４５＋細胞の百分率として定量化した。図１２に示すように、ＣＤ４５＋Ｂ細胞集団は、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞（ａｍ１９ｍＺ−ＩＬ３３）による処置の後に有意に減少した。この結果は、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞が、前処置化学療法の不在下でＢ細胞形成不全を誘導したことを裏付ける。図１３に示すように、ＩＬ−３３を分泌する第一世代のＣＡＲ（ａｍ１９ｍＺ−ＩＬ３３）Ｔ細胞による処置の後のＢ細胞回復は、用量依存的である。Ｂ細胞集団は、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞のより高い用量（例えば、１０×１０６および２０×１０６個のＴ細胞）で処置したマウスと比較して、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞のより低い用量（例えば、１．２５×１０６および２．５×１０６個のＴ細胞）で処置したマウスにおいて有意に回復した。
【０２７１】
腫瘍保有マウスの生存
次に、疾患の同系、免疫適格モデルの文脈において、改変されたＴ細胞を研究し、ここでは、ＥＬ４Ｓｍ１９腫瘍保有同系免疫適格マウスの長期生存を評価した。腫瘍接種の１日後に、ＥＬ４Ｓｍ１９腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを２．５×１０６個の改変されたＴ細胞で処置し、生存を追跡した。図１４に示すように、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞（ａｍ１９ＭＴｍＺｐ３３ｍａｔおよびａｍ１９ＭＴｍ２８Ｚｐ３３ｍａｔ）は、腫瘍保有マウスにおいて長期生存を誘導した。
【０２７２】
（実施例３  ヒトモデルにおけるインターロイキン−３３（ＩＬ−３３）分泌ＣＡＲ−Ｔ細胞）
ヒトＩＬ−３３分泌ＣＡＲ構築物
ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ−Ｔ細胞の生物学的効果を、ヒトモデルにおいて分析した。ａｈ１９ｈＤＥＬ、ａｈ１９ｈＺ、ａｈ１９ｈＢＢＺ、ａｈ１９ｈ２８Ｚ、ａｈ１９ｈＤＥＬｐ２Ａ＿ＩＬ−３３、ａｈ１９ｈＺｐ２Ａ＿ＩＬ−３３、ａｈ１９ｈＢＢＺｐ２ａ＿ＩＬ−３３およびａｈ１９ｈ２８Ｚｐ２Ａ＿ＩＬ−３３を含む分泌可能なヒトＩＬ−３３ポリペプチドを伴うまたは伴わない様々な抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ構築物を、図１５に示すようにＳＦＧレトロウイルスベクターバックボーンの中に構築した。全ての構築物は、ＣＤ２８近位の細胞外および膜貫通ドメインをヒンジとして利用した（４−１ＢＢベースの構築物を含む）。全てのヒトＩＬ−３３分泌構築物では、サイトカインは自己切断Ｐ２ＡエレメントによってＣＡＲから分離された。
【０２７３】
上記の構築物の１つで、Ｔ細胞を形質導入させた。
【０２７４】
細胞表面ＣＡＲ発現
細胞表面での改変されたＴ細胞のＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって分析し、結果を図１６に示す。図１６に示すように、ヒトベースの構築物で安定して形質導入したＧＡＬＶ偽型化２９３ＧＰＧパッケージング細胞は、それらの表面に検出可能なＣＡＲを有していた。マウス由来の抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲに特異的であるＡｌｅｘａ−６４７コンジュゲート抗イディオタイプ抗体を使用して、パッケージング細胞をＣＡＲの存在について評価した。形質導入されなかったＲＤ１１４（類似の２９３ＨＥＫ細胞）を陰性対照として使用した。
【０２７５】
改変されたＴ細胞の表面ＣＡＲ発現もフローサイトメトリーによって分析し、その結果を図１８に示す。図１８に示すように、ヒトベースの構築物で安定して形質導入したヒトＴ細胞は、それらの表面に検出可能なＣＤＲを有していた。ヒトＴ細胞を、接種の５日後にＣＡＲの存在について評価した。形質導入していないヒトＴ細胞（ｈＴｃｅｍｐ）は、陰性対照の役目をした。
【０２７６】
増加したサイトカイン分泌
改変されたＴ細胞におけるＩＬ−３３の分泌を分析し、その結果を図１７に示す。図１７に示すように、ヒトベースの構築物で安定して形質導入したＧＡＬＶ偽型化２９３ＧＰＧパッケージング細胞は、ヒトＩＬ−３３の検出可能なレベルを分泌した。レトロウイルス形質導入後にパッケージング細胞から上清を収集し、ビーズベースの多重アッセイによってサイトカイン濃度について評価した。
【０２７７】
細胞溶解効力
改変されたＴ細胞の細胞溶解効力を分析した。ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ構築物および対照構築物で形質導入したＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＤＯＨＨ２、ＮＡＬＭ６およびＲａｊｉなどの抗原陽性腫瘍細胞と異なるエフェクター：腫瘍比で共培養し、２４時間後に、腫瘍細胞溶解を生物発光によって測定した。図１９に示すように、ＩＬ−３３分泌ヒト抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、それらのサイトカインを分泌しない対応物と比較して有意に強化された用量依存的ＣＤ１９＋標的細胞溶解を提示した。
【０２７８】
（実施例４）
組換えＩＬ−１２およびＩＬ−３３の組合せが、Ｔ細胞によるインターフェロンガンマの抗原非依存的分泌に導くことができることが、以前に実証された。この現象は、ＩＬ−３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ−３３が機能的であるかどうか決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを開発するために活用された。このアッセイでは、ＣＡＲ  Ｔ細胞への外因性の組換えＩＬ−１２の付加は、抗原不在下でのそれらのＩＬ３３を分泌しない対応物と比較して、ＩＬ３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞によるより高いインターフェロンガンマ分泌に導くはずである。
【０２７９】
方法および材料
マウス脾臓を採収し、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するために使用した。この実験では、使用したＣＡＲ構築物はバイオレット励起性ＧＦＰ（ｖＧ）蛍光性タグを組み込み、抗体を使用せずにＣＡＲ  Ｔ細胞を検出することを可能にした。さらに、これらのＣＡＲ構築物は抗マウスＣＤ１９標的化ｓｃＦｖ（ａｍ１９ＭＴ）の後に組み込まれたＭＹＣタグも有し、抗ＭＹＣタグ抗体によるＣＡＲ検出または架橋を可能にした。５つの異なるＣＡＲ  Ｔ細胞構築物を製造した：
１．ｖＧ．ａｍ１９ＭＴｄｅｌ：トランケーションされた非シグナル伝達ＣＤ２８細胞内ドメインを有する非機能的ＣＡＲ  Ｔ細胞
２．ｖＧ．ａｍ１９ＭＴＺ：第一世代のＣＡＲ  Ｔ細胞
３．ｖＧ．ａｍ１９ＭＴＺ３３：第一世代のＩＬ３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞
４．ｖＧ．ａｍ１９ＭＴ２８Ｚ：第二世代のＣＤ２８ベースのＣＡＲ  Ｔ細胞
５．ｖＧ．ａｍ１９ＭＴ２８Ｚ３３：第二世代のＣＤ２８ベースのＩＬ３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞
【０２８０】
製造の後、続いて、１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度の組換えマウスＩＬ−１２（ｒｍＩＬ１２）の付加を伴ってまたは伴わずに、９６ウェルプレートに１ウェルにつき１００，０００個のＣＡＲ陽性細胞でＣＡＲ  Ｔ細胞を三連で播種した。２４時間後、上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズベースの多重アッセイを使用して可溶性サイトカインを測定した。
【０２８１】
結果
図２１に示すように、ＩＬ３３分泌構築物は、１０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ１２の状況でそれらのＩＬ３３を分泌しない対応物と比較して増加したインターフェロンガンマ分泌を実証した。このアッセイは、ＩＬ３３分泌マウスＣＡＲ  Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ３３は、ＩＬ−１２の存在下および抗原の不在下でＣＡＲ  Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ分泌の増加に導いたので、機能的であったことを実証した。
【０２８２】
（実施例５）
実施例４と同様に、分泌可能なＩＬ−３３の機能を、ヒトＩＬ３３分泌ＣＡＲ  Ｔ細胞において試験した。
【０２８３】
方法および材料
ＣＤ１９標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するために、健康ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を利用した。この実験では、使用したＣＡＲ構築物は、抗ヒトＣＤ１９標的化ｓｃＦｖ（ａｈ１９）の前に、トランケーションされたＥＧＦＲ（Ｅｔ）を組み込んだ。６つの異なるＣＡＲ  Ｔ細胞を製造した：
１．Ｅｔ．ａｈ１９ｈＤＥＬ：トランケーションされた非シグナル伝達ＣＤ２８細胞内ドメインを有する非機能的ＣＡＲ  Ｔ細胞
２．Ｅｔ．ａｈ１９ｈＤＥＬｐ３３：トランケーションされた非シグナル伝達ＣＤ２８細胞内ドメインをＰ２Ａエレメントおよび分泌可能なＩＬ３３遺伝子（ｐ３３）に沿って有する非機能的ＣＡＲ  Ｔ細胞
３．Ｅｔ．ａｈ１９ｈＺ：第一世代のＣＡＲ  Ｔ細胞
４．Ｅｔ．ａｈ１９ｈＺｐ３３：Ｐ２Ａエレメントおよび分泌可能なＩＬ３３遺伝子（ｐ３３）を組み込んだ第一世代のＣＡＲ  Ｔ細胞
５．Ｅｔ．ａｈ１９ｈ２８Ｚ：第二世代のＣＡＲ  Ｔ細胞
６．Ｅｔ．ａｈ１９ｈ２８Ｚｐ３３：Ｐ２Ａエレメントおよび分泌可能なＩＬ３３遺伝子（ｐ３３）を組み込んだ第二世代のＣＤ２８ベースのＣＡＲ  Ｔ細胞
【０２８４】
製造の後、続いて、１および１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度の組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈＩＬ−１２）の付加を伴ってまたは伴わずに、９６ウェルプレートに１ウェルにつき１００，０００個のＣＡＲ陽性細胞でＣＡＲ  Ｔ細胞を三連で播種した。２４時間後、上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズベースの多重アッセイを使用して可溶性サイトカインを測定した。
【０２８５】
結果
図２２〜２４に示すように、ＩＬ３３分泌構築物は、漸増濃度のｒｈＩＬ−１２の状況でそれらのＩＬ３３を分泌しない対応物と比較して増加したインターフェロンガンマ分泌を実証した。このアッセイは、ＩＬ３３分泌ヒトＣＡＲ  Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ３３は、ＩＬ−１２の漸増用量の存在下および抗原の不在下でＣＡＲ  Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ分泌の増加に導いたので、機能的であったことを実証した。
【０２８６】
本開示の主題の実施形態
前述の記載から、様々な用法および条件に対してそれを採択するために本開示の主題に変更および修正を加えることができることが、明らかになる。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。
【０２８７】
本明細書における変数の任意の定義におけるエレメントのリストの列挙は、任意の単一のエレメントまたは掲載エレメントの組合せ（または、下位組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部との組合せとしてその実施形態を含む。
【０２８８】
この明細書で指摘される全ての特許および刊行物は、各独立した特許および刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
2021502828.tif 000056
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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