(57)【要約】  マイクロ流体製造技術によって、「サイズが制御された」ガスが充填された微小胞の懸濁液を調製する方法であって、高い水中溶解度を有する第１の気体および低い水中溶解度を有する第２の気体を含む気体流を用いるステップを含む。【選択図】  図１
2021516684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガスが充填された微小胞の懸濁液を調製する方法であって、
−（ｉ）気体流および（ｉｉ）両親媒性微小胞安定化材料を含む水性液体流を提供するステップ；
−前記気体流および前記液体流を、それぞれの流入チャネルを通して接触ゾーンに向けて方向付けるステップ；
−前記気体流および前記液体流を、接触ゾーンから、校正されたオリフィスを通して方向付けて、前記ガスが充填された微小胞を含む水性懸濁液を得るステップ；および
−前記微小胞を含む前記懸濁液を流出チャネルに向けて方向付けるステップ；
を含み、
ここで前記気体流は、第１の気体および第２の気体を含み、前記第１の気体は高い水中溶解度を有し、前記第２の気体は低い水中溶解度を有する生体適合性フッ素化ガスであり、前記気体流における前記第２の気体の体積パーセンテージは、１８％〜２％である、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記気体流における前記第１の気体の体積パーセンテージは、１５％以下である、
方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記気体流における前記第１の気体の体積パーセンテージは、１３％以下である、
方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の方法であって、
前記第２の気体の体積パーセンテージは、少なくとも５％である、
方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の方法であって、
前記第１の気体は、０．０１よりも高い、水中溶解度（ブンゼン係数「α」として定義される）を有する、
方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記第１の気体は、０．５よりも高い水中溶解度を有する、
方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法であって、
前記第２の気体は、０．００８以下の水中溶解度を有する、
方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記第２の気体は、０．００１以下の水中溶解度を有する、
方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の方法であって、
前記第２の気体は、ペルフルオロ化ガスである、
方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記ペルフルオロ化ガスは、ＳＦ６、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０およびそれらの混合物からなる群から選択される、
方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法であって、
前記第１の気体は、空気、窒素、二酸化炭素およびそれらの混合物からなる群から選択される、
方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記気体は、二酸化炭素である、
方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の方法であって、
得られる、ガスが充填された微小胞は、体積で少なくとも４５％の、低い水中溶解度を有する気体の最終量を含む、
方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
低い水中溶解度を有する気体の前記最終量は、少なくとも６０％である、
方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載の方法であって、
前記両親媒性微小胞安定化材料は、リン脂質である、
方法。
【請求項１６】
請求項１５の方法であって、
前記両親媒性材料は、５．０〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で水性担体中に分散される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイズが制御された微小胞、例えば、ガスが充填された微小気泡を、特にフローフォーカシング装置を用いることによって調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガスが充填された微小胞は、超音波撮像技術における適切な造影剤として（造影超音波（ＣＥＵＳ）撮像として知られる）、または、治療的適用において、例えば超音波が介在する薬物送達と組み合わせて、一般に用いられる。これらの微小胞のガスは、典型的に、例えば、乳化剤、油類、増粘剤または糖類を含む安定化エンベロープ内にトラップまたはカプセル封入される。これらの安定化された気泡（適切な生理学的溶液内に分散される）は、典型的にそれらの調製に用いられる安定化材料に依拠して様々な専門用語で当該分野において一般に呼ばれて；これらの用語は、例えば、「マイクロスフェア」、「微小気泡」、「マイクロカプセル」または「マイクロバルーン」を含み、本明細書において包括的に、「ガスが充填された微小胞」（または短縮して「微小胞」）と呼ばれる。
【０００３】
特定の興味は、ガスが充填された微小胞の水性懸濁液であり、ここで、ガスの気泡は、気体と液体の界面に配置された安定化両親媒性材料（典型的にリン脂質）を含む非常に薄いエンベロープ（フィルム）によって、気体／液体界面において境界が作られている。これらの懸濁液は、典型的に、粉末化された両親媒性材料、例えば凍結乾燥された事前に形成されたリポソームまたは凍結乾燥もしくは噴霧乾燥された脂質溶液を、空気または任意の他のガスと、さらに水性担体と、撹拌しながら接触させて、ガスが充填された微小胞の懸濁液を生産することによって調製されて、それは、好ましくはその調製後すぐに投与することができる。安定化層は、上記のリン脂質に加えて、脂肪酸のような他の両親媒性材料も含んでよい。
【０００４】
調製の従来法は一般に、相対的に高い多分散性指数（ＰＤＩ）でのサイズ分布を有する、ガスが充填された微小胞懸濁液を提供して、微小胞の集団の標準偏差「ｓ」および平均サイズ「ｎ」の間の比：ＰＤＩ＝ｓ／ｎ＊１００％として数学的に定義される。例えば、典型的な調製方法は、約２〜３マイクロメートルの平均直径および約６０％のＰＤＩを有する微小胞を提供し得る。相対的に高いＰＤＩ（例えば６０％）を有する微小胞、特にガスが充填された微小胞は、一般に、実際の撮像技術の大部分に良好に適するが、そのようなＰＤＩは、それでもなお、前記撮像技術にさらに最適化され得る。さらに、特定の治療的超音波適用のために、ＰＤＩを最小限にすることが好ましい。
【０００５】
したがって、いわゆる「サイズが制御された」または「単分散」微小胞、すなわち、ガスが充填された微小胞製剤を調製するための方法が開発されていて、ここでＰＤＩは、１０％よりも低く、好ましくは５％よりも低く、さらにより好ましくは２％よりも低い。
【０００６】
単分散微小胞を調製するための適切な方法は、例えば、典型的にＴ接合またはフローフォーカシング装置を用いることによるマイクロ流体技術の使用を含む。手短には、フローフォーカシング装置において、気体成分の流れは、狭いオリフィスを通して液体成分の流れによって集められる。典型的に、液体成分は、エンベロープ形成材料（典型的に、リン脂質および／または脂肪酸を含む、脂質などの界面活性剤）を含み、それは、ガス状成分をトラップして所望のガスが充填された微小胞を形成し、それらは、前記エンベロープ形成材料によって合体および分離に対して安定化される。
【０００７】
参考文献２は、同一出願人の名義で、形成されたばかりの微小胞の所望の制御されたサイズを維持するために、製造装置の出口における微小胞の合体現象を制限する制御された温度条件を適用する、マイクロ流体の製造方法に関する。
【０００８】
しかしながら、上記方法を用いて合体現象を制限しても、製造プロセスの最後に回収される形成されたばかりのガスが充填された微小胞は、本質的に不安定になり得て、（所望の校正されたサイズに対して）より大きなサイズの微小胞の形成をもたらし、結果として、形成された微小胞の集団におけるＰＤＩの増大、および、最終的には、微小胞の液体懸濁液の上部において非常に大きな微小胞の望ましくないフォーム層の形成の可能性をもたらすことが観察された。参考文献１によって説明されるように、上清フォーム層内に含まれるそのような大きな微小気泡は、最終的にサイズが減少してその最終的な安定したサイズ（元の校正されたサイズに実質的に相当する）に到達するまで、数時間持続し得る。このＰＤＩ増大および関係がある起泡現象は、低い水性溶解度を有する気体、例えばＳＦ６、Ｃ３Ｆ８またはＣ４Ｆ１０（従来の造影剤微小気泡の持続性を改善するために一般に用いられる）を用いた場合に特に関連してくる。ＰＤＩ増大および関係がある起泡現象の両方とも、懸濁液が十分な時間（数時間、通常は数日、または密封されたコンテナー内に維持される場合はさらに長く）そのままにされる場合は原理的に可逆であるが、そのようなフォームの存在は、微小胞の使用（例えば投与）または生産された微小胞の懸濁液のその後の後処理に関して必然的な遅延を課すので、いずれにせよ非常に望ましくない。
【０００９】
したがって、そのようなＰＤＩ増大および起泡現象を制限または避けるために、ガスが充填された微小胞を、マイクロ流体フローフォーカシングを用いた形成直後に迅速に安定化させる方法がなお必要である。
【００１０】
出願人は、低い水中溶解度を有する気体および高い水中溶解度を有する気体の混合物を製造プロセスにおいて用いることにより、前記の有り得るＰＤＩ増大および起泡現象を実質的に減少させることができることを見いだした。
【００１１】
参考文献２は、気体の混合物、特に、相対的に高い水中溶解度を有する５９〜９９．５％の気体Ａおよび相対的に低い水中溶解度を有する４１％〜０．５％の気体Ｂの混合物で満たされた微小気泡を開示する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、ガスが充填された微小胞の懸濁液を調製する方法に関し、以下のステップを含む：
−（ｉ）気体流および（ｉｉ）微小胞−安定化材料を含む水性液体流を提供するステップ；
−前記気体流および前記液体流を、それぞれの流入チャネルを通して接触ゾーンに向けて方向付けるステップ；
−前記気体流および前記液体流を、接触ゾーンから、校正されたオリフィスを通して方向付けて、前記ガスが充填された微小胞を含む水性懸濁液を得るステップ；および
−前記微小胞を含む前記懸濁液を流出チャネルに向けて方向付けるステップ；
ここで前記気体流は、第１の気体および第２の気体を含み、前記第１の気体は高い水中溶解度を有し、前記第２の気体は低い水中溶解度を有し、前記気体流における前記第２の気体の体積パーセンテージは１８％〜２％である。
【００１３】
好ましくは、前記気体流における前記第１の気体の体積パーセンテージは、１５％以下、より好ましくは１３％以下である。体積パーセンテージは、好ましくは少なくとも３％、より好ましくは少なくとも５％である。
【００１４】
水可溶性が高い気体は、好ましくは、０．０１よりも高い、より好ましくは０．１よりも高い、さらにより好ましくは０．５よりも高い、水中溶解度（ブンゼン係数「α」として定義される）を有する。低い水中溶解度を有する気体は、好ましくは、０．００８以下、より好ましくは０．００１以下、さらにより好ましくは０．０００８以下の水中溶解度を有する。特に好ましいものは、０．０００５以下の水中溶解度を有する気体である。
【００１５】
製造プロセスの完了後、生じる安定化された、ガスが充填された微小胞は、（気体の合計体積に対して）少なくとも４５％の前記第２の気体、好ましくは少なくとも６０％を典型的に含む。
【００１６】
微小胞−安定化材料は、好ましくはおよび両親媒性化合物、より好ましくはリン脂質である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マイクロ流体フローフォーカシング装置のコア部分の略図である。
【図２】本発明のフローフォーカシングプロセスに有用なマイクロ流体装置の例示的な略図（上面図）を示す。
【図３】本発明のプロセスに有用なデバイスの例示的な略図を示す。
【図４】気体混合器の概略的な例を示す。
【図５】本発明の製造方法のための設定の例示的な例を示す。
【図６】形成されたばかりのものから最終的な安定化されたガスが充填された微小胞までのサイズ減少の概略的な例を示す。
【図７】１００％水不溶性ガスを用いて調製された形成されたばかりのガスが充填された微小胞および安定化の間のそれぞれのサイズ修正の絵を示す。
【図８】ガスが充填された微小胞の調製における、水可溶性ガスおよび水不溶性ガスの混合物の使用の効果を模式的に示す。
【図９】本発明に係る、ガスが充填された微小胞の形成中の温度制御の実験的結果を示す。
【図１０】本発明に係る、他の両親媒性材料を用いた、ガスが充填された微小胞の形成中の温度制御の実験的結果を示す。
【図１１】ガスが充填された微小胞の懸濁液に対する冷却効果の実験的結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
マイクロ流体技術に従って調製されるガス状の微小気泡は、サイズ単分散性を維持するために、形成直後にガス溶解に対して急速に安定化される必要がある。ガス溶解は、主に、気体−液体界面間の表面張力から生じるラプラス圧力によって引き起こされる。適切な微小胞安定化剤（例えば、リン脂質または脂肪酸のような両親媒性化合物）を添加することによって、前記化合物の両親媒性分子は、気体−液体界面において単一層を形成して表面圧力を生じさせて、その結果、微小気泡を安定化させる。しかしながら、特に、形成されたばかりの微小胞のガス性内容物は（とりわけ、形成されたばかりの微小胞の周りの両親媒性分子の層の相対的に緩い充填（ｌｏｏｓｅ  ｐａｃｋｉｎｇ）のせいで、図６のＡを参照）、周囲の液体中に部分的に放出（または溶解）される傾向にある。気体−液体界面におけるリン脂質の単一層は、ガス溶解中に機械的に圧縮される間に、表面圧力を作り出すのに十分に高い脂質充填密度を有する状態に最終的に到達し、そして表面張力を相殺して、最終的に微小気泡をその最終寸法で安定化させる（図６のＢ）。一部の実施態様では、形成されたばかりの微小胞の初期半径（Ｒｉ）は、安定化された微小胞の最終半径（Ｒｆ）の約２倍である。Ｔ．Ｓｅｇｅｒｓによる上記の論文において言及されているように、溶解されたガスは、「オストワルド熟成」として知られる現象を通して、大きな微小胞および最終的にフォーム層の形成により、微小胞懸濁液の多分散性の増大の原因となる。
【００１９】
図７Ａは、１００％Ｃ４Ｆ１０ガスの気体流を用いることによって、マイクロ流体フローフォーカシング調製によって得られた、形成されたばかりのリン脂質安定化微小胞の代表的な画像を示し；これらの、形成されたばかりの微小胞は、形成直後に得られたものであり、したがって、画像から観察することができるように実質的に均一なサイズ分配を有する。しかしながら、図７Ｂに示されるように、その後、形成後の安定化の間に、一部の微小胞（白い矢印によって示される）は、形成されたばかりの微小胞の約半分の直径の、その最終的な安定化されたサイズまで急速に縮むが、他の微小胞（黒い矢印によって示される）は、縮んでいる微小胞によって液体懸濁液中に放出されたガスの内側拡散に起因するオストワルド熟成を介して成長して（完全性のために、中間の縮んでいる、または成長している段階の泡も図７Ｂに見られる）；結果として、微小胞の多分散性の分布が、その結果として大きなサイズの微小胞の存在に起因する泡形成とともに見られる。
【００２０】
上述したとおり、ＰＤＩ増大、および、微小胞の成長と関連する泡形成は、一般に可逆であるが（したがって、最終懸濁液は、実質的に単分散の微小胞を含む）、しかしながら、サイズ安定化および泡の消滅は多くの時間を要し得る。
【００２１】
したがって、出願人は、そのようなＰＤＩ増大および起泡現象は、上記に定義した適切な気体の混合物を用いることによって、劇的に減少させることができ、または実質的に避けることができることを見いだした。
【００２２】
特に、図８に示されるように、形成されたばかりの微小胞（図８のＡ）は、水中可溶性が高いガス（「ＨＳガス」、図８の微小胞において黒いバックグラウンドとして示される）および低い水中溶解度を有するガス（「ＬＳガス」、ＨＳガス内に分散された灰色のドットとして図８に示される）の混合物を含む。安定化段階中に、主要量の高可溶性ガスは急速に水中に急速に溶解するが、低可溶性ガスは、両親媒性化合物の高密度に充填された層内にトラップされたままであり（図８のＢ）、典型的に、ＨＳ溶解性ガスの少しの残量がその中に分散されている。溶解されたＬＳガスとは異なり（それは、微小胞が１００％のＬＳガスにより調製された場合に放出される）、溶解されたＨＳガスは、液相中に有利に溶解されたままであるので、いかなるオストワルド熟成も引き起こさない。出願人によって観察されたように、ＨＳガスの溶解度が高ければ高いほど、起泡現象およびＰＤＩ増大は低くなる。
【００２３】
本明細書および特許請求の範囲において、気体の水中溶解度は、２５℃で測定される気体のブンゼン係数「α」によって定義される。当技術分野で知られているように、ブンゼン係数は無次元値であり、それは、測定温度および１バールの分圧での純粋溶媒の単位体積によって吸収される気体の飽和体積に相当する（Ｔ＝２７３．１５ケルビン、ｐ＝１バールに換算される）。
【００２４】
適切なＨＳガスは、０．０１０以上、好ましくは０．１００以上、さらにより好ましくは０．５００以上のブンゼン係数を有する気体である。これらの気体はまた、好ましくは相対的に低い分子量（例えば、８０ダルトンよりも低い）も有する。そのような気体の例は、窒素（α＝０．０１４４、Ｍｗ  ２８．０１）、空気（α＝０．０１６７、Ｍｗ  ２８．９６）および二酸化炭素（α＝０．７６１４、Ｍｗ  ４４．０１）を含み、この後者は、水中溶解度がより高いので特に好ましい。
【００２５】
適切なＬＳガスは、０．００８０以下、より好ましくは０．００１０以下、さらにより好ましくは０．０００８以下のブンゼン係数を有するものである。特に好ましいものは、０．０００５以下の水中溶解度を有する気体である。これらの気体はまた、好ましくは相対的に高い分子量（例えば１２０ダルトンよりも高い、好ましくは１６０ダルトンよりも高い）も有する。
【００２６】
適切なＬＳガスは、フッ素化ガス、好ましくはペルフルオロ化ガスを含む。フッ素化ガスは、少なくとも１つのフッ素原子を含む物質、例えば、フッ素化炭化水素（１つまたは複数の炭素原子およびフッ素を含む有機化合物）；六フッ化硫黄；フッ素化、好ましくはペルフルオロ化ケトン類、例えばペルフルオロアセトン；およびフッ素化、好ましくはペルフルオロ化エーテル類、例えばペルフルオロジエチルエーテルを含む。好ましい化合物は、ペルフルオロ化ガス、例えばＳＦ６、またはペルフルオロカーボン（ペルフルオロ化炭化水素）、すなわち全ての水素原子がフッ素原子によって置換されている炭化水素であり、それらは、特に安定的な、ガスが充填された微小胞懸濁液を形成することが知られている。
【００２７】
用語ペルフルオロカーボンは、飽和、不飽和、および環状ペルフルオロカーボンを含む。生体適合性の、生理的に許容できるペルフルオロカーボンの例は：ペルフルオロアルカン類、例えば、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン（例えばペルフルオロ−ｎ−ブタンであり、ペルフルオロ−イソブタンのような他の異性体と混合されていてもよい）、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサンまたはペルフルオロヘプタン；ペルフルオロアルケン類、例えば、ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン（例えばペルフルオロブト−２エン）またはペルフルオロブタジエン；ペルフルオロアルキン類（例えばペルフルオロブト−２−イン）；およびペルフルオロシクロアルカン類（例えばペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサンおよびペルフルオロシクロヘプタン）である。好ましい飽和ペルフルオロカーボンは、例えば、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ１２およびＣ６Ｆ１４を含む。特に好ましい気体は、室温でガス状形態であるものであり、ＳＦ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０を含む。
【００２８】
出願人によって観察されたように、ＨＳガスと混合された、１８体積％以下（好ましくは１５％または１３％またはそれよりも低い）のＬＳガスを含む気体の混合物を用いることによって、形成されたばかりの微小胞は、安定化の間に、ＨＳガスを容易および好適に放出するが、ＬＳガスは微小胞内にトラップされたままである。このことは、典型的に、最終的な安定化された微小胞内に含まれる気体の全体積の少なくとも４５％、好ましくは少なくとも６０％の、実質的により高い量のＬＳが中に含まれた、安定化されたガスが充填された微小胞をもたらす。例えば、特定の実施態様では（形成されたばかりから安定化された微小胞までの体積収縮が約８倍である場合）、調製ガス混合物中、１３％のＬＳガスの体積含有量で調製された微小胞は、最終的に安定化された形態中、約７０％のＬＳガスの濃度を有することが観察された。同様に、調製ガス混合物中、５％のＬＳガスの体積含有量で調製された微小胞は、最終的に安定化された形態中、約５０％のＬＳガスの濃度を有していた。
【００２９】
一方で、微小胞の許容できる持続性または圧力耐性値を可能にするために（血管中の相対的に高い血圧へ投与されて曝された際に微小胞が循環し続けるために一般に望ましい）、ＬＳガスの体積は、好ましくは調製気体流の全体積の少なくとも２％であることが観察された。より好ましくは、調製気体流中のＬＳガスの体積は、気体中の全体積の少なくとも３％、さらにより好ましくは少なくとも５％である。
【００３０】
微小胞−安定化材料
ガスが充填された微小胞の安定化層の形成に適切な材料（すなわち微小胞−安定化材料）は、当技術分野で知られているものである。これらは、好ましくは、両親媒性材料を含む。本発明の方法での使用に適切な両親媒性材料は、例えば、リン脂質；リゾリン脂質；脂肪酸類、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸またはオレイン酸；ポリマーを保有する脂質、例えば、キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、「ペグ化脂質」とも呼ばれる；スルホン化モノ−  ジ−、オリゴ−または多糖類を保有する脂質；コレステロール、コレステロール硫酸またはヘミこはく酸コレステロール；ヘミこはく酸トコフェロール；エーテルを含む脂質またはエステル結合脂肪酸；重合脂質；リン酸ジアセチル；リン酸ジセチル；セラミド類；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸ステアリン酸）、ポリオキシエチレン脂肪族アルコール類、ポリオキシエチレン脂肪族アルコールエーテル類、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル類、グリセロールポリエチレングリコールリシノール酸、エトキシ化大豆ステロール類、エトキシ化ヒマシ油またはエチレンオキシド（ＥＯ）およびプロピレンオキシド（ＰＯ）ブロック共重合体；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７−デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、コレステロールグルコン酸、ラノステロールグルコン酸、またはエルゴステロールグルコン酸を含む、糖酸類のステロールエステル類；ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコン酸、ミリストイルグルコン酸、またはステアロイルグルコン酸を含む、アルコール類および糖酸類のエステル；スクロースラウリン酸、フルクトースラウリン酸、スクロースパルミチン酸、スクロースステアリン酸、グルクロン酸、グルコン酸またはポリウロン酸を含む、脂肪酸類と糖類のエステル類；サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、またはジギトキシゲニンを含む、サポニン類；グリセロールまたは脂肪酸とのグリセロールモノエステル類（グリセロールモノパルミテート、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノミリステートまたはグリセロールモノラウレートを含む）；ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはｎ−オクタデシルアルコールを含む、長鎖アルコール類；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ジガラクトシル−ジグリセリド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド；１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；Ｎ−スクシニルジオレイルホスファ���ジルエタノールアミン；１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンまたはパルミトイルホモシステイン；アルキルアミン類またはアルキルアンモニウム塩類、以下を含む、少なくとも１つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）、アルキル鎖、例えば、Ｎ−ステアリルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジステアリルアミン、Ｎ−ヘキサデシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアミン、Ｎ−ステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ−ヘキサデシルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアンモニウム塩化物、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）；第３級または第４級アンモニウム塩類、以下を含む、１つまたは好ましくは２つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）、アシル鎖（（Ｃ３−Ｃ６）アルキレン橋を通してＮ原子に連結される）、例えば、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−オレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＤＡＰ）；およびそれらの混合物または組み合わせを含む。
【００３１】
好ましい実施態様によれば、微小胞のエンベロープを形成する化合物の少なくとも１つは、任意の他の上記に挙げた材料と混合されていてもよいリン脂質である。本明細書によれば、用語「リン脂質」は、任意の両親媒性リン脂質化合物を包含することが意図されて、その分子は、特に、最終的な微小胞の懸濁液における気体と水の界面において、材料の安定化フィルムを（典型的に、モノ分子層の形態で）形成することが可能である。したがって、これらの材料は、当該分野において、「フィルム形成リン脂質」とも呼ばれる。
【００３２】
両親媒性リン脂質化合物は、典型的に、少なくとも１つのリン酸基および少なくとも１つ、好ましくは２つの、脂溶性長鎖炭化水素基を含む。
【００３３】
適切なリン脂質の例は、１つまたは好ましくは２つの（等しい、または異なる）脂肪酸残基およびリン酸とグリセロールのエステルを含み、ここで、リン酸残基は、次々に、例えば、コリン（ホスファチジルコリン−ＰＣ）、セリン（ホスファチジルセリン−ＰＳ）、グリセロール（ホスファチジルグリセロール−ＰＧ）、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥ）、イノシトール（ホスファチジルイノシトール）などの親水性基に結合される。ただ１つの脂肪酸残基とリン脂質のエステルは、一般に、当該分野において、リン脂質の「リゾ」形態または「リゾリン脂質」と呼ばれる。リン脂質内に存在する脂肪酸残基は一般に、典型的に１２〜２４個の炭素原子、好ましくは１４〜２２個を含む長鎖脂肪酸類であり；脂肪族鎖は、１つまたは複数の不飽和を含んでよく、または、好ましくは完全に飽和である。リン脂質に含まれる適切な脂肪酸の例は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。好ましくは、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸のような飽和脂肪酸が例示される。
【００３４】
リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸類、すなわち、脂肪酸とグリセロール−リン酸のジエステル類；スフィンゴミエリン類のようなスフィンゴ脂質類、すなわち、脂肪酸とのグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖によって置換されているホスファチジルコリンアナログ；カルジオリピン類、すなわち、脂肪酸と１，３−ジホスファチジルグリセロールのエステル類；糖脂質類、例えば、ガングリオシドＧＭ１（またはＧＭ２）またはセレブロシド類；糖脂質；スルファチド類およびグリコスフィンゴリピド類である。
【００３５】
本明細書において用いられる、用語「リン脂質」は、単独または混合物としてのいずれかで用いられ得る、天然起源、半合成または合成のいずれかで調製された産物を含む。
【００３６】
天然起源のリン脂質の例は、天然レシチン類（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）、例えば、典型的に、大豆または卵黄レシチン類である。
【００３７】
半合成リン脂質の例は、天然起源レシチン類の部分的または完全に水素化された誘導体である。好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルである。
【００３８】
好ましいリン脂質の例は、例えば、ジラウロイル−ホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイル−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣ）、ジペンタデカノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）、ジラウロイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジアラキドイルホスファチジル−グリセロール（ＤＡＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、およびジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、ジラウロイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）である。
【００３９】
適切なリン脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のような親水性ポリマーが、それに結合することによって改変されたリン脂質をさらに含む。好ましいポリマー改変リン脂質は、「ペグ化リン脂質」、すなわち、ＰＥＧポリマーに結合したリン脂質を含む。ペグ化リン脂質の例は、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン類（短縮して「ＰＥ−ＰＥＧ」）、すなわち、親水性エタノールアミン部分が変数分子量（例えば３００〜２００００ダルトン、好ましくは５００〜５０００ダルトン）のＰＥＧ分子に結合されたホスファチジルエタノールアミン類、例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ（またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＥ−ＰＥＧまたはＤＯＰＥ−ＰＥＧ）である。例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００は、約２０００の平均分子量を有するＰＥＧポリマーがそれに付着したＤＰＰＥを指す。
【００４０】
特に好ましいリン脂質は、ＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳおよびエチル−ＤＳＰＣである。最も好ましいのは、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＳおよびＤＳＰＣである。
【００４１】
リン脂質の混合物、例えば、ＤＳＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、エチル−ＤＳＰＣおよび／またはエチル−ＤＰＰＣと、ＤＰＰＥおよび／またはＤＳＰＥ（ペグ化誘導体を含む）、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよび／またはＤＡＰＣの混合物も用いられ得る。
【００４２】
例えば、リン脂質の混合物は、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジン酸誘導体およびペグ化ホスファチジルエタノールアミン、例えばＤＳＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＡ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＧ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含んでよい。
【００４３】
本発明の一実施態様によれば、リン脂質は、微小胞の安定化エンベロープの主な構成要素であり、ガスが充填された微小胞のエンベロープを形成する構成要素の合計量の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも７５％の量である。一部の好ましい実施態様では、エンベロープの実質的に全体（すなわち少なくとも９０％ｗ／ｗ）は、リン脂質から形成され得る。
【００４４】
リン脂質は、任意の上記に挙げた両親媒性化合物との混合で好適に用いられ得る。したがって、例えば、コレステロール、エルゴステロール、植物ステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、没食子酸プロピルまたはパルミチン酸アスコルビルのような脂質類、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸およびそれらの誘導体のような脂肪酸、またはブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または他の非リン脂質化合物は、前述のリン脂質の１つまたは複数に、例えば、好ましくは０〜５０重量％の範囲、より好ましくは２５％までの比率で、任意選択で添加されてもよい。例えば、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＧ／パルミチン酸、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ／ステアリン酸、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ／ステアリン酸、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／ステアリン酸またはＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／ステアリン酸を含む、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｉｌｐｉｄ）および脂肪酸を含む両親媒性材料の混合物が有利に用いられ得る。
【００４５】
本発明の方法によって調製される微小胞は、任意選択で標的化リガンドを含んでもよい。
【００４６】
用語「標的化リガンド」は、生体内の任意の生物学的または病理学的部位に向かう、本発明の組成物の微小胞の標的化活性（例えば選択的結合を含む）を有する、またはそれを促進することが可能な、任意の化合物、部分または残基をその意味の中に含む。標的化リガンドが関連し得る標的は、組織、例えば、心筋組織（心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）および心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）を含む）、膜質組織（内皮および上皮を含む）、薄膜、結合組織（間質組織を含む）または腫瘍；血塊；および受容体、例えば、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体断片、および免疫グロブリンに関する細胞表面受容体、および、ステロイドホルモンに関する細胞質受容体を含む。
【００４７】
標的化リガンドは、合成、半合成、または天然起源であってよい。標的化リガンドとして作用し得る材料または物質は、例えば、限定されないが、抗体、抗体フラグメント、受容体分子、受容体結合分子、糖タンパク質およびレクチンを含む、タンパク質；オリゴペプチドおよびポリペプチドを含むペプチド；ペプチド模倣薬；単糖類および多糖類を含む、糖類；ビタミン類；ステロイド類、ステロイドアナログ類、ホルモン類、補助因子、生物活性剤およびヌクレオシド、ヌクレオチド、および、ポリヌクレオチドを含む遺伝物質を含む。
【００４８】
標的化リガンドは、それ自体が両親媒性化合物であってよく（微小胞の他の構成要素と混合される）、または、微小胞の形成に用いられる両親媒性分子（例えばリン脂質）に結合された化合物であってよい。
【００４９】
好ましい一実施態様では、標的化リガンドは、共有結合を通して、微小胞の安定化エンベロープを形成している両親媒性分子（例えばリン脂質）に結合され得る。所望の標的化リガンドを共有結合するために、微小胞エンベロープを形成している両親媒性化合物の少なくとも一部は適切な反応性部分を含み、それに対して、相補官能性を含む標的化リガンドが、公知技術に従って、例えば微小胞の両親媒性構成要素を含む分散物にそれを加えることによって、結合される。好ましくは、両親媒性化合物は、親水性ポリマーを保有する脂質、例えば以前に述べられたもの、好ましくはペグ化リン脂質である。この場合では、標的化リガンドは、親水性ポリマー上の適切な反応性部分に連結される。両親媒性化合物は、微小胞を調製する前に所望の標的化リガンドと組み合わせられ得て、そのようにして得られた組み合わせは、微小胞の調製のために用いられ得る。あるいは、微小胞は、最初に製造されてよく、それは、標的化リガンドの対応する相補部分と相互作用することが可能な適切な部分を有する化合物（脂質またはポリマー改変脂質）を含み；その後に、所望の標的化リガンドが微小胞懸濁液に加えられて、微小胞上の対応する相補部分に結合する。代替の実施態様によれば、標的化リガンドは、物理的および／または静電気相互作用を介して微小胞と適切に関連されてもよい。
【００５０】
水性液体流
本発明の方法に従って校正されたガスが充填された微小胞を調製するための水性液体流は、例えば５．０〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは７．５〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度で、水性担体中に分散された両親媒性材料（上記に定義）を含む。
【００５１】
好ましくは生理的に許容できる適切な水性担体は、水（好ましくは滅菌水）、塩水などの水溶液（注入のための最終産物が低張でないように有利に平衡化され得る）、または、１つまたは複数の浸透圧調節物質の溶液を含む。浸透圧調節物質は、塩類または糖類、糖アルコール類、グリコール類または他の非イオン性ポリオール材料（例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）、キトサン誘導体、例えば、カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサンまたはゲル化化合物、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルスターチまたはデキストランを含む。
【００５２】
代替の実施態様では、治療的疎水性物質を微小胞内に取り込むためにさらなる油相が加えられ得る。この目的を達成するために、２つのさらなる導管が、例えば参考文献２によって説明されるように所望の油相を供給するために、装置において提供されてよい。形成された、ガスが充填された微小胞は、ガスと両親媒性材料の安定化層との間の界面に配置された油のフィルムを有し、それは、所望の治療的薬剤がローディングされていてよい。適切な油類は、室温で液体である任意の生体適合性の油を含んでよく、例えば、飽和または不飽和（Ｃ２−Ｃ１８）アルキル鎖とグリセロールのモノ−、ジ−またはトリ−エステル（ホモ−またはヘテロ−アルキルエステル類を含む）、例えば、グリセロールモノブチリン、グリセロールモノリノール酸、１，２−ジヘキサノイルグリセロール、１，２ジオクタノイルグリセロール、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール、トリアセチン、トリブチリン、トリカプロイン、トリカプリリン、トリカプリン、およびそれらの混合物；または天然の油類、例えば、大豆油、オリーブ油、ベニバナ種子油、ヒマワリ種子油、ピーナッツ油およびそれらの混合物を含む。
【００５３】
混合された気体流
本発明の方法に従って校正された微小胞を調製するための気体流は、上記に例示されたガス状の化合物の混合物を、上記に例示されたそれぞれの体積比で含む。
【００５４】
図４は、本発明に係るプロセスにおいて有用な気体混合装置の概略を示す。気体混合装置は、２つの気体コンテナー４０１および４０２を備え、それぞれＨＳガスおよびＬＳガスで満たされている。各ガスの流れは、対応するマスフローコントローラー（ＭＣＦ）、４０３および４０４によってそれぞれ制御される。ＭＣＦは、所望の混合比を設定および維持するために、制御ユニット４０５（例えば、ＬａｂＶｉｅｗ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓまたはＭａｔｌａｂ，Ｍａｔｈｗｏｒｋｓのようなプログラム言語において実行される、パソコン上にインストールされた、カスタマイズされたソフトウェアプログラム）によって制御される。圧力センサー４０６は、微小胞が形成されるマイクロ流体チップ４０７へ導く、気体混合物を含む排出チャネル（ｏｕｔｐｕｔ  ｃｈａｎｎｅｌ）内の実際の圧力を測定する。このようにして、マイクロ流体チップに作用する所望の気体流が所望の設定に従って制御および調節され得て、それに応じて、同一の混合比を維持するようにＭＣＦが制御され得る。図４に示される装置は、マイクロ流体フローフォーカシングによる微小胞の形成に特に必要な条件下で、実質的に異なる水性溶解度を有する２つの気体を正確に混合するために用いることができる。このようにして、非常に安定した、校正された微小胞を、最適なＰＤＩ、最適な収量で、そして、泡を形成する大きな泡の存在なく、再現可能な方法で製造することができる。
【００５５】
有利に、同時係属出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７１７８８に例示される調製方法（合体を制限するために、形成されたばかりの微小胞の温度が制御される）を用いることができる。
【００５６】
図１は、本発明のプロセスに有用なフローフォーカシング装置（「マイクロ流体チップ」）のコア部分１００の略図を示す。チップは、（混合された）気体流１０１’を供給するための第１の供給チャネル１０１と、両親媒性材料を含む液体流を供給するための２つの追加の供給チャネル１０２ａおよび１０２ｂとを備える。
【００５７】
混合された気体流および２つの液体流は、接触ゾーン１０３の方へ向けられて、それから、校正されたオリフィス１０４（図１に点線として示される）を通るように向けられる。校正されたオリフィスは、校正されたチャネル１０４’（好ましくはオリフィスと同じ横断面を有する）に接続されて、それから、流出チャネル１０６の最初の部分１０５に接続される。代替の実施態様（図示せず）では、校正されたオリフィス１０４は、流出チャネル１０６の最初の部分１０５に直接的に接続された、すなわち、校正されたチャネルが間にない、ノズルであってもよい。微小胞１０３’は、校正されたオリフィス内で形成されて、校正されたチャネル１０４’を通って流出チャネル１０６の最初の部分１０５へ向けられる。流出チャネルの水力直径は一般に、校正されたオリフィスの水力直径よりも大きく、典型的に、校正されたオリフィスの最初の直径から流出チャネル１０６の最後の直径へと増大していて、それは、微小胞の懸濁液を回収するためのコンテナー（例えば密封されたバイアル）にフローフォーカシング装置を接続する回収チューブ（図示せず）の水力直径に実質的に対応する。
【００５８】
流出チャネルの最初の部分において場合により生じる微小胞の望ましくない合体現象は、装置の流出チャネルの最初の部分１０５における微小胞の温度を制御することにより、および好ましくは、接触ゾーン１０３および校正されたオリフィス１０４における微小胞の温度も制御することにより、実質的に減少され得る。
【００５９】
特に、流出チャネルの最初の部分は、好ましくは、液体流内に含まれて微小胞の安定化エンベロープを形成している両親媒性材料の転移温度（Ｔｍ）に対して２０％低い温度よりも低くない温度（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｏｔ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ２０％  ｌｏｗｅｒ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｅｃｔ  ｔｏ）で維持される。より好ましくは、前記温度は、両親媒性材料のＴｍに対して１０％低い温度よりも低くない（ｎｏｔ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  １０％  ｌｏｗｅｒ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｅｃｔ  ｔｏ）。一般に、Ｔｍよりも過度に高い温度を有する必要はないが、そのような温度は、両親媒性材料の熱分解耐性と両立させて必要に応じて高くてよく；例えば、温度は、両親媒性材料のＴｍよりも２０％まで高くてよく、好ましくは１０％まで高くてよい。好ましい実施態様では、前記温度は、両親媒性材料のＴｍであるか、またはわずかにそれより上である（例えば５℃まで、より高い）。温度制御は、微小胞の水性懸濁液の流れが実質的に定常の速度にまだ到達していない流出チャネルのゾーンにおいて、例えば、絶対速度勾配が約１０ｓ−１よりも高い場合に、特に有用である。チップの形状に応じて、前記ゾーンは、校正されたオリフィスから約０．１ｍｍ〜１００ｍｍ、好ましくは１．０〜５０ｍｍ、より好ましくは２．０〜３０ｍｍの長さにわたってよい。
【００６０】
有利に、温度は、上記に規定のパラメーターを、接触ゾーンおよび校正されたオリフィス（および、存在する場合は校正されたチャネル）にも適用することによって、同様に制御され得る。
【００６１】
適用される制御された温度は、形成された微小胞の間の合体の実質的な減少を提供する。
【００６２】
実験部分において詳細に示されるように、両親媒性材料のＴｍまたはその付近に温度を維持することにより、合体の減少が、（熱が加えられない場合に必要な、より高い濃度と比較して）実質的により低い濃度の両親媒性材料を用いることによって観察される。
【００６３】
フローフォーカシング装置は、（例えば参考文献３を参照）に記載されるような、当技術分野で知られている任意のものであってよい。好ましくは、フローフォーカシング装置は、例えば参考文献４に記載のもののようなチップを備える。
【００６４】
図２の概略図に関して、チップ２００は、第１の流入チャネル２０１（それを通して気体混合物の流れが供給される）および２つの流入チャネル２０２’および２０２”（それを通して液体流が提供される）を備えてよい。前記流入チャネルのそれぞれは、それぞれのチューブ（図示せず）を通してそれぞれのリザーバーに接続される。チップは、それぞれのチューブを通して微小胞の懸濁液を回収するように適合されたコンテナー（図示せず）に接続された流出チャネル２０３をさらに備える。校正されたオリフィスに近い、流入チャネル２０１ａおよび２０２ａの最後の部分の横断面は、チャネル２０１ｂおよび２０２ｂの残部に対して実質的に減少される。この最後の部分２０１ａおよび２０２ａの横断面は、２５〜１・１０４μｍ２まで、好ましくは２００〜１・１０３μｍ２まで変化してよく、有利に、校正されたオリフィスの横断面に実質的に対応する。流入チャネルの最初の部分の横断面は、１・１０３〜１・１０６μｍ２まで、好ましくは１・１０４〜１・１０５μｍ２まで変化してよく、一方で、それらの長さは、５０ｍｍ〜１ｍｍまで、好ましくは２ｍｍ〜５ｍｍまで変化してよい。同様に、流出チャネルの最初の部分２０３ａの横断面（図１における校正されたチャネルに対応する）も相対的に減少して；その断面は、一般に、調製される微小胞の所望の直径に従って校正される（例えば参考文献４を参照）。例えば、５μｍの平均直径を有する単分散微小胞を調製するために、校正されたオリフィスおよび校正されたチャネルは、約２５０〜２５００μｍ２の断面積を有する。有利に、流入チャネルの横断面および流出チャネルの横断面は実質的に同じであり、それぞれの最後の部分および最初の部分の横断面も同様である。校正されたチャネル２０３ａの長さは、約０．０５ｍｍ〜約１０ｍｍまで、好ましくは１ｍｍ〜５ｍｍまで変化してよく、一方で、流出チャネルの全長は、１００ｍｍまで、好ましくは５０ｍｍまで、より好ましくは３０ｍｍまでであってよい。典型的に、チップは、石英ガラス、溶融シリカの両半分、または任意のプラスチック（例えばポリ（メチルメタクリレート））材料から作られる。チャネルは、所望の深さおよび幅の全体に関して、各半分の内側表面を、乾燥または湿潤のいずれかでエッチングすることによって生産され得る。例えば、表面は、１４μｍの一定の深さで、接触ゾーンに近いそれぞれの校正された部分に関しては１５〜２０μｍの幅で、残りの部分に関しては０．５〜１．０ｍｍの幅で、エッチングされ得る。本発明のプロセスでの使用に適切な市販チップは、例えば、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）またはＭｉｃｒｏｎｉｔ（Ｅｎｓｃｈｅｄｅ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能である。
【００６５】
好ましい実施態様によれば、形成された微小胞の単分散性を維持するために、懸濁液はそれから、好ましくは回収ゾーン内の懸濁液の流れが実質的に定常の速度に到達した時点で、両親媒性材料のＴｍよりも低い温度まで急速に冷却されてよい。
【００６６】
図３に関して、フローフォーカシング装置のコア部分を備えるユニット３００（例えば図２に記載のチップ）は、例えば恒温浴を用いて、上述のように、両親媒性材料のＴｍに近いまたはわずかにそれよりも上の所望の温度で維持され得る。気体流および両親媒性材料を含む流体流は、それぞれの供給チューブ（例えば１００〜１０００μｍ、好ましくは１５０〜２５０μｍの内径を有する）を介してユニット３００へ、それぞれの気体混合装置３０１（例えば図４に示されるものなど）およびリザーバー３０２からユニット３００に供給される。流出チューブ３０３は、ユニット３００の流出チャネル（図示せず）を、適切な回収コンテナー３０４、例えば密封されたバイアルに接続する。微小胞の形成から数秒以内に、好ましくは懸濁液の流れが実質的に定常の速度に到達したらすぐに、微小胞の懸濁液の冷却を始めることが一般に有利である。典型的に、前記冷却は、微小胞の形成から１８０秒以内、好ましくは６０秒以内、より好ましくは１０秒以内、さらにより好ましくは２秒以内に開始され得る。フローフォーカシング装置の形状に応じて、定常の流れは一般に、微小胞の形成後、数ミリ秒以内または実にそれ未満で到達されて；冷却はしたがって、微小胞の形成後、１ミリ秒から始めて適用され得る。典型的に微小胞の懸濁液は、形成後、数ミリ秒未満以内にユニット３００の出口に到達するので、冷却は、ユニット３００を出る流出チューブの最初の部分へ有利に適用され得る。したがって、流出チューブの最初の部分は、ガスが充填された微小胞の懸濁液の温度を微小胞の安定化エンベロープを形成している両親媒性材料のＴｍ未満に減少させるために、適切な冷却手段３０５、例えば熱交換器による冷却に有利に供される。冷却に供される流出チューブの最初の部分の長さは、例えばユニット３００の加熱温度、適用される冷却の有効性、接触時間などに依存して、例えば１ｃｍ〜１００ｃｍまで、好ましくは５ｃｍ〜１０ｃｍまで変化し得る。
【００６７】
微小胞懸濁液が回収されるコンテナー３０４は、好ましくは（ガラス）バイアルであり、一般に、密封されたクロージャ−（例えばゴム栓）を有する。前記コンテナーは、周囲圧力で、好ましくは、製造プロセスで用いられる同一のＬＳガスが事前に充填されている。バイアルの液体充填によって生じる過剰圧力を均等にするために、通気デバイス（例えばニードル）が好ましくはコンテナー内に挿入される。
【００６８】
本明細書において両親媒性材料の転移温度Ｔｍに言及する場合、前記温度は、単一の両親媒性構成要素または両親媒性構成要素の混合物のいずれかを指してよい。
【００６９】
特に、安定化エンベロープを形成している両親媒性材料が、異なる両親媒性構成要素の混合物である場合は、前記Ｔｍは一般に、両親媒性構成要素の前記混合物のＴｍと呼ばれる。両親媒性材料の混合物については、測定されるＴｍは一般に、混合物の個々の構成要素のＴｍのモル比加重平均に相当する。
【００７０】
水性脂質混合物のＴｍは、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いることによって有利に測定され得る。リン脂質を含む両親媒性材料（純粋または混合）のＴｍの測定は、例えば、ＤＳＣ−Ｑ２０００装置（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ  ＵＳＡ）を用いて行われ得る。パラメーター、例えば、転移が開始してそのピークに到達する温度および転移のエンタルピーが、Ｔｍを決定するために測定される。測定の詳細は実験部分に提供される。
【００７１】
図５は、校正された微小胞の生産に用いられるマイクロ流体フローフォーカシング装置の例を示す。ＬＳガスおよびＨＳガスの混合物を含む気体流５０２（例えば、図４の混合装置から）、および、液体流５０１（両親媒性材料、例えばリン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｌｐｉｄ）、脂肪酸またはそれらの混合物を含む）が、マイクロ流体チップ５０３へ供給されて、オリフィス５０４を通して微小胞を生産する。微小胞懸濁液は、好ましくは周囲圧力でＬＳガスによって予め満たされたバイアル５０５内に回収される。通気デバイス（例えばニードル５０６）は、好ましくは、バイアルの液体充填によって生じた過剰圧力を均等にするために用いられる。微小胞懸濁液の回収の最後に、通気デバイスは好ましくは除去されて、コンテナーは、外部雰囲気とのさらなるガス交換を避けるために好ましくは密封される。
【００７２】
使用
本発明の方法に従って調製される微小胞は、特に超音波および磁気共鳴を含む、様々な診断および／または治療的技術において用いられ得る。
【００７３】
診断技術は、ガスが充填された微小胞の使用が動物（ヒトを含む）の体の一部または部分の可視化を高めるのを可能にする任意の方法を含み、前臨床および臨床研究目的のための撮像を含む。様々な撮像技術が、例えば、基本およびハーモニックＢモード撮像、振幅変調、パルスまたは転相撮像および基本およびハーモニックドップラー撮像を含む、超音波適用において用いられ得て；必要に応じて三次元撮像技術が用いられ得る。
【００７４】
診断使用のための微小胞は、例えばそれらのそれぞれの組成、撮像される組織または臓器および／または選択される撮像技術に依存して、体重のｋｇあたり約０．０１〜約１．０μＬのガスの濃度で（例えば注入によって）投与され得る。この一般的な濃度範囲は、もちろん、特定の撮像適用に応じて、例えば、振幅変調およびパルス反転撮像のような、非常に低い投与量でシグナルが観察され得る場合、変化し得る。
【００７５】
あり得る他の診断撮像適用は、シンチグラフィー、光撮像、および、Ｘ線位相コントラスト撮像を含むＸ線撮像を含む。
【００７６】
治療的技術は、患者の治療（上記に定義）の任意の方法を含み、それ自体として（例えば、虚血性脳卒中、凝血溶解などの、超音波が介在する治療）、または治療的薬剤と組み合わせて（例えば、薬物送達、遺伝子治療において、またはワクチンとしての使用において、例えば、選択部位または組織への生体活性化合物の送達のために）、微小胞の使用を含み、それ自体によって、または、様々な物理的方法（例えば超音波が介在する送達を含む）による特定の活性化の際に、生物学的効果をインビトロおよび／またはインビボで与える要因となり、または与えることが可能である。
【００７７】
治療的処置のための微小胞は、例えばそれらのそれぞれの組成、治療される対象のタイプ、治療される組織または臓器および／または適用される治療的方法に依存して、典型的に、体重のｋｇあたり約０．０１〜約５．０μＬのガスの濃度で投与されてよい。
【００７８】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するのを助ける。
【実施例】
【００７９】
2021516684.tif 000003
【００８０】
［実施例１］
ガスが充填された微小胞の調製
市販のチップホルダー（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、パートナンバー：３００００２４、３０００１０９、３００００２１）内に取り付けられて、チップから気体および液体供給チューブ（Ｐｅｅｋ  Ｕｐｃｈｕｒｃｈ，１／１６インチ  Ｏ．Ｄ，１５０μｍ  Ｉ．Ｄ．）への漏れを防いだ接続を可能にする、市販のマイクロ流体フローフォーカシング装置（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，小液滴チップ、１４μｍエッチング深さ、パートナンバー３２００１３６）を用いて微小胞を合成した。微小胞形成チャネルは、１７μｍの幅および１３５μｍの長さを有した。全体的なチャネル深さは１４μｍであった。チップおよびそのホルダーを、２０倍拡大対物（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＬＭＰＬＡＮ  ２０ｘ）およびＣＣＤカメラ（Ｌｕｍｅｎｅｒａ，ＬＭ１５６Ｍ）を備える倒立顕微鏡上に取り付けられた、光学的に透明な温度制御された水浴内に置いた。恒温浴の温度は５０℃に設定された（液体流中の両親媒性材料の混合物の転移温度よりもわずかに低い温度に対応する）。
【００８１】
液体流中の両親媒性材料は以下であった：
ＤＳＰＣ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（９：１の各モル比）。混合物に関するＴｍは、５５℃であると実験によって決定された。
【００８２】
材料を、上記モル比で２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、攪拌下で６０℃にて、両親媒性材料が完全に溶解するまで、２：１（容量比）クロロホルム／メタノール混合物に添加した。それから、溶媒を減圧下で蒸発させて、得られたフィルムを減圧下で一晩乾燥させた。それから、乾燥された材料を、６０℃にて撹拌下で３０分間、塩水（０．９％ＮａＣｌ）中に（１５ｍｇ／ｍＬの濃度で）再分散させた。それから、ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）を用いて分散物を超音波処理して、材料を均一に分散させた。それから、ポリカーボネートフィルター（０．４５μｍポアサイズ）を用いて調製物を濾過して、室温まで冷却して脱気した。
【００８３】
変数体積比のＨＳガスおよびＬＳガスを含む、ガスが充填された微小胞を、図４に模式的に示されるのと同様に気体混合装置を用いて調製した。手短には、２つの気体コンテナーを、それぞれＨＳガスとしてＣＯ２およびＬＳガスとしてＣ３Ｆ８で満たした。各ガスの気体流をそれぞれのマスフローコントローラーによって制御した：（ｉ）ＥＬ−Ｆｌｏｗ：ＨＳガスに関してＦ２００ＣＶ−００２−ＲＡＤ−１１−Ｋ、および（ｉｉ）Ｌｏｗ−ΔＰ−Ｆｌｏｗ：ＬＳガスに関してＦ−２００ＤＶ−ＲＡＤ−１１−Ｚ（ガスコントローラーは両方とも、Ｂｒｏｎｋｈｏｒｓｔ，Ｒｕｕｒｌｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。マスフローコントローラーは、所望の混合比を設定および維持するために、パソコン上にインストールされたＭａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）において実行されるカスタマイズされたソフトウェアプログラムによって制御された。圧力センサー（ＰＳＥ５３０−Ｍ５−Ｌ；ＳＭＣ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）は、マイクロ流体チップへ導く流出チャネル内の気体混合物における実際の圧力を測定して；１．８バールの気体圧力を微小胞の形成に用いた。液体並流速度を、別個のマスフローコントローラー（Ｍｉｎｉ  Ｃｏｒｉ  Ｆｌｏｗ：Ｍ１３Ｖ１４Ｉ−ＭＡＤ−１１−Ｋ−Ｓ；Ｂｒｏｎｋｈｏｒｓｔ，Ｒｕｕｒｌｏ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて制御した。約１４０μＬ／分の液体並流速度を用いて、フローフォーカシング装置をジェット噴射レジームで運転して、約４μｍの直径（モード）を有する微小胞を生産した。
【００８４】
それから、微小胞懸濁液を、Ｃ３Ｆ８で飽和された密封されたベント式バイアル内に回収した。
【００８５】
様々な調製のために、バイアル内に回収された液体懸濁液の上に形成されるフォーム層の相対的な高さを、液体懸濁液の高さの相対的なパーセンテージとして測定した。結果を以下の表Ｉに示す。
2021516684.tif 000004
【００８６】
上記の表から推察されるように、２０％よりも高いＬＳガスの体積は、ガスが充填された微小胞の水性懸濁液の上の望ましくないフォーム形成を実質的に増大させる。一方、１３％以下、好ましくは１０％以下のＬＳガスの量は、フォーム形成を実質的に減少させる。
【００８７】
［実施例２］
圧力耐性およびＬＳガス濃度の決定
実施例１の調製を、ＬＳガスとしてＣ４Ｆ１０でＣ３Ｆ８を置き換えることによって繰り返した。５％Ｃ４Ｆ１０ガスを用いた３回の調製および１３％Ｃ４Ｆ１０ガスを用いた２回の調製を、以下の手順に従って、ガスが充填された微小胞の圧力耐性に関して試験した。圧力耐性は、静水過圧の関数として光学的な吸光度の測定から決定される。０ｍｍＨｇ過圧で測定された吸光度の５０％に相当する静水過圧（ｍｍＨｇで表される；１ｍｍＨｇ＝１３３．３パスカル）は、圧力耐性値、すなわちＰｃ５０と考えられる。
【００８８】
吸光度は、改変された分光光度計（Ｊｅｎｗａｙ  ６３００，Ｂａｒｌｏｗｏｒｌｄ  Ｊｅｎｗａｙ，Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）を用いて、７００ｎｍの波長で測定された。Ｑｕａｓｉ−静的圧縮を微小気泡の懸濁液に加えて、ＬａｂＶｉｅｗ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で書き込まれた社内開発ソフトウェアプログラムによって制御される比例弁（Ｔ２０００，Ｍａｒｓｈ  Ｂｅｌｌｏｆｒａｍ，Ｎｅｗｅｌｌ，ＷＶ）によって制御された圧縮空気を用いて、４．２ｍｍＨｇ／ｓの割合で増大する過圧を介して、気密のキュベット内に閉じ込めた。
【００８９】
５％のＣ４Ｆ１０を用いた３回の調製に関して測定されたＰｃ５０は６００〜７８０ｍｍＨｇの範囲であり、１３％のＣ４Ｆ１０を用いた２回の調製に関して測定されたＰｃ５０は、７０５〜７２７ｍｍＨｇの範囲であり、異なる調製に関して、同程度の圧力耐性を示した。
【００９０】
最終的な安定化された微小気泡内のＬＳガスの濃度も、以下の手順に従って測定した。１ｍＬの容量の微小胞懸濁液を別個の密封されたバイアル内に注入して、６０分間超音波処理して全ての微小胞を破壊して、１時間休ませた。それから、ヘッドスペース内のＬＳガスの量をガスクロマトグラフィーによって測定した。
【００９１】
５％のＣ４Ｆ１０および９５％のＣＯ２の濃度で調製された安定化された微小気泡内のＣ４Ｆ１０の最終濃度は５０％であり、１３％のＣ４Ｆ１０および８７％のＣＯ２の濃度で調製された微小気泡内のＣ４Ｆ１０の最終濃度は７０％であった。
【００９２】
［実施例３］
両親媒性材料の水性分散物の調製
異なる相転移温度（Ｔｍ）を有する両親媒性材料の２つの混合物を用いた：
Ｍ１：ＤＳＰＣ：ＤＰＰＡ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（Ｔｍ＝５５℃）
Ｍ２：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＡ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（Ｔｍ＝４４℃）
両方とも、８：１：１のモル比。
【００９３】
材料を、上記モル比で、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、撹拌下で６０℃にて、両親媒性材料が完全に溶解するまで、２：１（容量比）クロロホルム／メタノール混合物に添加した。それから、減圧下で溶媒を蒸発させて、得られたフィルムを減圧下で一晩乾燥させた。それから、乾燥された材料を、６０℃にて撹拌下で３０分間、グリセロール、プロピレングリコール、および水の混合物（ＧＰＷ、５：５：９０の容量比）中に、（「微小胞の調製」の部分に詳述されるように５〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度で）再分散させた。ＴＲＩＳバッファー（２０ｍＭ）を添加してｐＨ値を７に調節した。それから、ｔｉｐ  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）を用いて分散物を超音波処理して、材料を均一に分散させた。それから、ポリカーボネートフィルター（０．４５μｍポアサイズ）を用いて調製物を濾過して、室温まで冷却して脱気した。
【００９４】
転移温度の測定
両親媒性材料（純粋なＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ、および、ＤＰＰＣ：ＤＰＰＡ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００またはＤＳＰＣ：ＤＰＰＡ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００の混合物）の転移温度を、Ｔｚｅｒｏアルミニウム坩堝（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ  ＵＳＡ）を備える市販の示差走査熱量計ＤＳＣ−Ｑ２０００を用いて決定した。温度および熱の流れを含むシステム校正を、インジウム金属を用いて行なった（融合エンタルピー２８．７１  Ｊ／ｇ±０．５  Ｊ／ｇ；融解開始温度１５６．６℃±０．２５℃）。
【００９５】
ＧＰＷ／ＴＲＩＳにおける両親媒性材料（純粋または混合）の分散物を、ＤＳＣ測定のために上述の手順に従って調製した（それぞれ約３０μＬ、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）。
【００９６】
ＤＳＣ測定は、２０℃〜８０℃の温度範囲にわたって２℃／分の一定温度速度で加熱することによって行われた。窒素を５０ｍＬ／分の流速でパージガスとして用いた。
【００９７】
結果を以下の表ＩＩに示す。
2021516684.tif 000005
【００９８】
［実施例４］
ガスが充填された微小胞の調製
実施例１に記載したのと同一のマイクロ流体チップを用いて微小胞を合成した。シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  ＰＨＤ  ４４００）を用いて液体並流速度を制御した。ガス（ＳＦ６）を、圧力センサー（Ｏｍｅｇａ，ＤＰＧ１０００Ｂ−３０Ｇ）に接続された圧力調整器（Ｏｍｅｇａ，ＰＲＧ１０１−２５）を用いて圧力制御した。個々の微小胞は、記録された光学画像から自動的に検出されて、Ｍａｔｌａｂソフトウェア（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いて、ＰＣ上で、オフラインでそれらのサイズを測定した。実施例１とは異なり、２つの異なる液体並流速度を試験して（４５μＬ／分または５５μＬ／分）、フローフォーカシング装置を、滴下レジーム下またはより好ましい噴射レジーム下で、それぞれ運転した。
【００９９】
微小胞懸濁液を密封されたバイアル内に回収して、室温で保管した。
【０１００】
形成された微小胞を加熱する効果
図９ａ〜９ｅは、５〜１５ｍｇ／ｍＬの範囲の両親媒性材料の濃度で（それぞれ、図９ａ〜９ｅ）、マイクロ流体チップ（図２に示されるものと同様）を含む異なる温度の恒温浴で、上記のように調製されたＤＳＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００懸濁液（Ｔｍ５５℃）の液体並流を用いて得られた結果を示す。四角（■）は、滴下レジーム下で行われた実験を示し、三角（▲）は、より好ましい噴射レジーム下で行われた実験を示す。
【０１０１】
これらの図において観察され得るように、微小胞の合体のパーセンテージ（Ｃ［％］）は、噴射レジームと比較して滴下レジームにおいて一般により低い。さらに、滴下レジーム下および噴射レジーム下の両方とも、温度を上げることにより合体を減少させる有利な効果が明らかである。特に噴射レジームを考慮すると、７．５ｍｇ／ｍＬの濃度に関して（図９ｂ）、両親媒性混合物のＴｍ（５５℃）まで、またはそれよりも高く温度を上げることは、約１０％またはそれよりも少ない微小胞の合体をもたらす。さらに噴射レジームに注目すると、両親媒性材料のＴｍまたはそれよりも高い同様の加熱は、１０ｍｇ／ｍＬの両親媒性材料の濃度に関して１％未満の合体を提供する（図９ｃ）。両親媒性材料の濃度を１５ｍｇ／ｍＬに増大させることによって（図９ｅ）、同様の結果を室温で得ることができる。この場合、両親媒性材料の濃度は、５０％増大される必要があることに注意する。
【０１０２】
したがって、これらの結果は、温度を両親媒性材料のＴｍ付近に維持することによって、（より低い温度での同一の調製に関して測定される、より高い合体と比較して）合体作用の減少を得ることができることを示す。結果は、温度を両親媒性材料のＴｍ付近に維持することによって、（熱が加えられない場合に必要とされる、より高い濃度と比較して）実質的により低い濃度の両親媒性材料を用いて同様のパーセンテージの合体が得られ得ることをさらに示す。
【０１０３】
図１０は、１０ｍｇ／ｍＬの両親媒性材料の濃度で、異なる温度の恒温浴で、上記のように調製された、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００懸濁液（Ｔｍ４４℃）の液体並流を用いて得られた結果を示す。上述の結果と同様に、この場合においても、１％以下の合体が、両親媒性材料のＴｍに近いまたはそれよりも高い温度に加熱した場合に得られる。
【０１０４】
懸濁液を下流冷却する効果
微小胞の分散度に対する下流冷却の効果を評価するために、異なる冷却条件を試験した。
【０１０５】
設定Ａによれば（早期冷却の懸濁液）、懸濁液は、微小胞形成の３ｍｓ後に熱交換器（２０℃）を通過して、懸濁液の温度をＴｍよりも低い温度に（特に室温）、急に下げた。それに応じて、恒温浴内のチップから出ているチューブは、チップの出口からおよそ０．５ｍｍ後に熱交換器を通過した。
【０１０６】
設定Ｂによれば（後期冷却の懸濁液）、懸濁液は、微小胞形成の３分後にようやく同じ熱交換器を通過した。それに応じて、この２つめの構成では、チップから出ているチューブは、１ｍｍの内径を有するチューブによって置き換えられて、このチューブは、およそ２０ｃｍの長さを恒温浴内に維持されて、それから熱交換器を通過した。
【０１０７】
両方の設定は、５５、６５および７５μＬ／分の流速で試験されて、結果をそれぞれ図１１ａ、１１ｂおよび１１ｃに示す（Ｘ軸＝直径（ｍｍ）、Ｙ軸＝数による微小胞の相対カウント）。図１１ａ〜１１ｃでは、破線は後期冷却の調製のサイズ分布を示し、実線は早期冷却の調製のサイズ分布を示す。これらの図から、早期冷却の懸濁液のＰＤＩは、対応する後期冷却の懸濁液のＰＤＩと比較してより低いことが明らかである。さらに、これらの図から、微小胞の平均サイズは、流速の増大に伴い低減することが理解され得る。
【０１０８】
両親媒性材料の他の混合物、特に、以前に例示された両親媒性材料の組み合わせを用いて、同様の結果が得られ得る。
【０１０９】
2021516684.tif 000006
【図１】
2021516684.tif 000007
【図２】
2021516684.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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