(57)【要約】  その中に所定の反応を受け入れるための可変温度反応器が記載されている。反応器は、反応セル、ヒータ、およびヒートシンクを備える。反応セルは、厚さＨＶおよび幅ＷＶを有する反応体積を有し、ここで、ＷＶ＞４ＨＶであり、反応体積のより大きな面積の面の１つが、厚さＨＷを有する外壁によって境界付けられている面によって画定されている。ヒータは前記外壁と接触している。ヒータは、反応体積により近い面に配置された発熱加熱要素と、反対側の面にあるヒータ支持体とを備える。ヒータ支持体はヒートシンクと接触しており、ヒータ支持体は加熱要素とヒートシンクとの間に熱抵抗ＲＴを与える。反応器は、熱拡散係数ＤＶを有する試薬で充填された場合、厚さ方向に拡散時間ｔＶを有し、ｔＶ＝ＨＶ２／ＤＶである。ｔＶは反応時定数ｔＲよりも小さい。外壁は熱拡散係数はＤＷを有し、熱拡散時間はｔＷ＝ＨＷ２／ＤＷ＜ｔＶである。
2021531975.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その中に所定の反応を受け入れるための可変温度反応器であって、
反応セル、ヒータ、およびヒートシンクを備え、
前記反応セルは、厚さＨＶおよび幅ＷＶを有する反応体積を有し、ここで、ＷＶ＞４ＨＶであり、前記反応体積のより大きな面積の面の１つが、厚さＨＷを有する外壁によって境界付けられている面によって画定されており、
前記ヒータは前記外壁と接触しており、
前記ヒータは、前記反応体積により近い面に配置された発熱ヒータ要素と、反対側の面にあるヒータ支持体とを備え、前記ヒータ支持体はヒートシンクと接触しており、そのため、前記ヒータ支持体は前記ヒータ要素と前記ヒートシンクとの間に熱抵抗ＲＴを提供し、
前記反応器は、熱拡散係数ＤＶを有する試薬で充填される場合、厚さ方向に拡散時間ｔＶを有し、ｔＶ＝ＨＶ２／ＤＶであり、ｔＶは反応時定数ｔＲよりも小さく、
前記外壁は熱拡散係数ＤＷを有し、熱拡散時間ｔＷ＝ＨＷ２／ＤＷ＜ｔＶを有する、可変温度反応器。
【請求項２】
前記ヒータ要素は、ヒータとしても温度センサとしても機能する、請求項１に記載の反応器。
【請求項３】
コントローラをさらに備え、前記ヒータは前記コントローラに接続され、前記コントローラによって制御されて、前記反応器の温度をより高い温度ＴＨｉｇｈとより低い温度ＴＬｏｗの間で変化させ、温度は両方とも前記ヒートシンクの温度ＴＳｉｎｋを超えている、請求項１または請求項２に記載の反応器。
【請求項４】
前記反応体積の厚さＨＶは２５０ミクロン未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項５】
前記反応セルは、幅ＷＶおよび長さＬＶを有する領域内に位置する蛇行チャネルによって形成される幅ＷＶおよび長さＬＶを有する反応体積を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項６】
前記反応体積は、ヒータが前記外壁の両方と接触し、かつヒートシンクが両方のヒータと接触している状態で、その大きな面積の面の両方で、厚さＨＷを有する外壁によって境界付けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項７】
前記ヒータ要素は抵抗性の加熱要素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項８】
前記ヒータ要素は導電性材料から製造され、前記ヒータ支持体は電気絶縁材料から製造される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項９】
前記ヒータは、前記ヒートシンクから分離可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１０】
前記ヒータ要素と前記ヒートシンクとの間の前記熱抵抗ＲＴが以下の関係を満たすように選択され、
ＲＴ＞（ＴＨＩＧＨ−ＴＳｉｎｋ）／ｐＨｅａｔおよび
０．５ＲＴ，Ｏｐｔ＜ＲＴ＜２ＲＴ，Ｏｐｔ
ここで、ＲＴ，Ｏｐｔ＝（ＴＨＩＧＨ＋ＴＬＯＷ−２ＴＳｉｎｋ）／ｐＨｅａｔ、
前記反応器は、出力ｐＨｅａｔを備えたヒータおよび温度ＴＳｉｎｋでのヒートシンクを使用して、より低い温度ＴＬＯＷとより高い温度ＴＨＩＧＨとの間を繰り返し循環するように構成されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１１】
前記ヒータ支持体の熱抵抗ＲＴと、前記充填された反応体積の熱容量、および前記反応体積と前記ヒータ要素との間に位置する前記薄い外壁の部分の熱容量の合計ＣＶとが、ＲＴＣＶ＜ｔＲの関係を満たし、ここでｔＲは反応時定数であるように構成されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１２】
前記充填された反応体積の熱容量と、前記反応体積と前記ヒータ要素との間に位置する前記薄い外壁の部分の熱容量の合計ＣＶと、前記ヒートシンクの熱容量ＣＳとが、ＣＳ／ＣＶ＞１００の関係を満たすように構成されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１３】
前記ヒートシンク材料の熱伝導率は、前記ヒータ支持体材料の熱伝導率の１０倍を超える、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１４】
前記反応体積と前記ヒートシンクとの間に位置する前記薄い外壁の部分およびヒータの熱容量は、前記反応体積の中の液体の熱容量よりも低い、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１５】
前記ヒートシンク材料の熱浸透率は、前記ヒータ支持体材料の熱浸透率の１０倍を超え、ここで、熱浸透率ｅは、前記材料の熱伝導率ｋ、密度ρ、および比熱容量ｃｐの関数であり、ｅ＝ｓｑｒｔ（ｋρｃｐ）として定義される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１６】
前記ヒータ要素は、前記反応体積の全領域にわたって延びる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１７】
前記ヒータ要素は抵抗性であり、長方形または正方形の形状を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１８】
前記ヒータ要素は、前記ヒータの動作温度範囲にわたって５００ｐｐｍ／Ｋを超える、好ましくは２，５００ｐｐｍ／Ｋを超える、より好ましくは１０，００ｐｐｍ／Ｋを超える抵抗温度係数の絶対値を有する導電性材料から製造される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項１９】
前記ヒータは、電気抵抗測定用のケルビン接点を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項２０】
前記ヒータ要素は、その中心近くよりもその周囲近くで単位面積あたりの熱出力が高くなるように構成されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項２１】
前記ヒータ要素は、１つまたは複数のガードヒータに囲まれメインヒータを備える、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項２２】
前記メインヒータは電流の流れの方向に細長く、ガードヒータは、前記メインヒータの長辺に隣接して配置されている、請求項２１に記載の反応器。
【請求項２３】
前記ヒータ要素のシート抵抗は、電流の流れの方向に垂直な前記ヒータ要素の縁部に位
置する端部ゾーンで局所的に増加する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項２４】
前記反応体積は、使用中に、核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に使用される試薬を含むように構成されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の反応器。
【請求項２５】
前記反応器は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）熱サイクルによってＤＮＡ増幅を実行するように構成されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の反応器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度の迅速な調整が必要とされる反応のための反応器に関する。本発明はまた、反応器のためのヒータ、ならびに駆動および感知回路、ならびに反応器を動作させる対応する方法にも関する。
【０００２】
そのような反応器が必要とされる一例のプロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅であり、反応器は、ＰＣＲの完了までの時間を短縮するための高速熱サイクリングに適している。別の例は、合成によるＤＮＡ塩基配列決定であり、多段階反応の各段階の温度を調整することにより、塩基の添加を最適化できる。
【０００３】
本発明の反応器はまた、溶液中のオリゴヌクレオチドの熱量測定検出によるＰＣＲの進行のモニタリングにも適している。反応器はまた、連続して接続された液体試料内の複数の位置でサブ試料の独立した分析を行うデジタルＰＣＲまたはマルチプレックスＰＣＲにも適している。
【０００４】
本発明はまた、反応体積の温度を迅速に調整し、高度の温度均一性と、正確な温度制御とを備えたヒータにも関する。
【０００５】
本発明はまた、ホイートストンブリッジ回路内に構成された試料ヒータおよび参照ヒータを使用する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）または示差熱分析（ＤＴＡ）のための装置にも関する。
【背景技術】
【０００６】
ＰＣＲでは、約６０℃と約９５℃の温度の間で温度サイクルを繰り返す必要がある。従来より、加熱と冷却はペルチェ素子を使用して行われ、温度を上げる必要がある場合はヒートシンクから試料に熱が送られ、温度を下げる必要がある場合には試料からヒートシンクに熱が送られる。ヒートシンクは多くの場合、ファンで冷却される。
【０００７】
このアプローチには多くの欠点があり、必要とされる装置が大きく、消費電力が大きいことである。熱サイクル中に温度を変える装置の部分の熱容量は、試料の熱容量よりも大幅に大きいため、エネルギー使用量が増加し、熱サイクルが遅くなる。温度上昇率は制限され、熱サイクリング時間が、ペルチェ素子、および試料と熱接触し試料を含むために使用される部品を通り、かつ試料自体を通る長い熱拡散時間によって拡大する。これらの要因により、ＰＣＲの熱サイクリングが遅くなり、エネルギー効率が悪くなる。
【０００８】
従来より、サーモサイクラーの制御には、ペルチェおよび試料から離れた温度センサが使用される。必然的に、ペルチェと比較して温度センサの熱応答に遅れが生じ、このことはシステムの熱制御を複雑にする。調整されたＰＩＤアルゴリズムが、温度上昇率を最大化し、オーバーシュートを最小化するために使用されることが多いが、これは開発し実装するのに複雑である場合があり、試料内で意図した時間と温度のプロファイルを実現できない場合がある。
【０００９】
さらなる欠点は、繰り返しの熱サイクルから生じる機械的応力のために、ペルチェ素子の寿命が制限されることである。
【００１０】
これらの欠点は、正確な温度制御と、急速な温度変化を必要とする他の反応にも当てはまる。
【００１１】
熱サイクリングに対する代替の従来技術のアプローチは、固定温度の水浴またはヒータの間で試料を移動させることである。３つの例を図１〜図３に示す。図１では、試料は水槽の間で移し替えられ、図２では、試料はヒータブロック間で移し替えられる。これらの解決法は、可動する部品のために、機械的な複雑さが大きく、必要なスペースが大きくなる。図３では、試料は２つのヒータブロックの上の通る蛇行経路を含むマイクロ流体チップの中を通されるが、試料がマイクロ流体チャネルの大きな表面積に曝されるという欠点がある。これには２つの欠点があり、試料と試薬がチャネル壁に付着する可能性があり、感度が低下し、試料体積の要件が増加し、試薬のコストが増加し、そしてマイクロ流体チップのサイズおよびコストも増大する。
【００１２】
図３に示す長い蛇行チャネルのサイズと表面積が大きいのは、チャネルが、通常１ｍｍを超える距離で空間的に分離された２つの異なる温度ゾーンの間を通過する必要があるためである。さらに、試料体積は蛇行チャネルの内部体積よりも小さいため、チャネルの表面積と試料体積の比が大きくなる。
【００１３】
温度変化に必要な時間が、熱サイクリングの総時間の大部分を占めることがないように、十分に速い速度で熱サイクリングを実行することが望ましい。熱サイクリングの総時間は、温度変化の時間と反応の時間の合計であり、ＰＣＲ反応の最も時間がかかる部分は伸長段階であり、これは、１００塩基対の典型的な配列長に対して約１秒以上を必要とする。したがって、温度上昇のためには１秒未満の時間を目標とする。ＰＣＲの目標温度は通常６０℃から９５℃の間であるため、温度変化の時間を１秒まで短縮するには、加熱と冷却のために７０℃／ｓ以上の温度上昇率を達成することが必要である。必要な総時間は温度変化に必要な時間ではなく、反応時間によって支配されるため、これよりはるかに高い温度上昇率（２００℃／ｓ以上）では速度の利点が制限される。
【発明の概要】
【００１４】
本発明において、本発明者等は、機械的移動システムまたは長い蛇行チャネルの欠点を持たない、約１００℃／秒で高速熱サイクリングを実行するための反応器を開示する。蛇行チャネルの場合と比較して、幅の広いチャネルの中に試料を含むことで側壁の表面積を縮小することが可能である。幅の広いチャネルを使用する場合、支持されていない大きなスパンを回避し、流体チャネルの機械的強度を高めるために、リブやピラーなどの内部支持構造を導入する必要がある場合がある。
【００１５】
加えて、本発明では、蛇行チャネルを含む反応器を開示する。いくつかの蛇行チャネルには上で説明したように欠点があるが、別のアプローチでは、時間の経過と共に温度を変動させることができる単一のヒータ上に配置されたより短い蛇行チャネルの中に試料を含めることも可能である。この場合、試料は増幅中に異なる温度ゾーンの間を流れることがなく、代わりにヒータの温度が時間と共に変動する。これにより、蛇行チャネルの長さを短くすることができ、チャネルの内部体積を試料の体積と等しくすることができ、チャネルの表面積と試料の体積の比を低下させることが可能である。さらなる利点は、この構成が定量的ＰＣＲ実験に便利であり、ＰＣＲ実験では増幅されたＤＮＡの濃度を、例えば蛍光プローブや挿入色素を使用して単一の位置で経時的にモニタすることができる。
【００１６】
反応器は３つの主要な要素を含み、温度制御されるべき体積を中に含む反応セル、熱を吸収するヒートシンク、および反応セルおよびヒートシンクと熱接触するヒータである。ヒータは、反応セルに接触する面に発熱ヒータ要素を有し、ヒートシンクに接触する面にヒータ支持体を有する。ヒータ支持体の熱抵抗は、目標反応温度、ヒートシンク温度、および電力要件の所与のセットに対して低い熱サイクルタイムを与えるように選択される。
【００１７】
一態様では、本発明は、その中に所定の反応を受け入れるための可変温度反応器を提供し、反応器は、反応セル、ヒータ、およびヒートシンクを備え、
反応セルは、厚さＨＶおよび幅ＷＶを有する反応体積を有し、ここで、ＷＶ＞４ＨＶであり、反応体積のより大きな面積の面の１つが、厚さＨＷを有する外壁によって境界付けられている面によって画定されており、
ヒータは前記外壁と接触しており、
この場合、ヒータは、反応体積により近い面に配置された発熱ヒータ要素と、反対側の面にあるヒータ支持体とを備え、ヒータ支持体はヒートシンクと接触しているため、ヒータ支持体はヒータ要素とヒートシンクとの間に熱抵抗ＲＴを提供し、
この場合、反応器は、熱拡散係数ＤＶを有する試薬で充填される場合、厚さ方向に拡散時間ｔＶを有し、ｔＶ＝ＨＶ２／ＤＶであり、ｔＶは反応時定数ｔＲよりも小さく、
外壁は熱拡散係数ＤＷを有し、熱拡散時間ｔＷ＝ＨＷ２／ＤＷ＜ｔＶを有する。
【００１８】
好ましくは、ヒータ要素は、ヒータとしても温度センサとしても機能する。
【００１９】
好ましくは、反応器は、コントローラをさらに備え、ヒータはコントローラに接続され、反応器の温度をより高い温度ＴＨｉｇｈとより低い温度ＴＬｏｗとの間で変化させるようにコントローラによって制御され、温度は両方ともヒートシンクの温度ＴＳｉｎｋを超えている。
【００２０】
好ましくは、反応体積の厚さＨＶは、２５０ミクロン未満である。
【００２１】
好ましくは、反応セルは、幅ＷＶおよび長さＬＶを有する領域内に位置する蛇行チャネルによって形成される幅ＷＶおよび長さＬＶを有する反応体積を含む。
【００２２】
好ましくは、反応体積は、厚さＨＷを有する外壁によってその大きな面積の面の両方において境界付けられており、ヒータは前記両方の外壁と接触しており、かつヒートシンクは両方のヒータと接触している。
【００２３】
好ましくは、ヒータ要素は抵抗性加熱要素である。
【００２４】
好ましくは、ヒータ要素は導電性材料から製造され、ヒータ支持体は電気絶縁材料から製造される。
【００２５】
好ましくは、ヒータはヒートシンクから分離可能である。
【００２６】
好ましくは、反応器は、ヒータ要素とヒートシンクとの間の熱抵抗ＲＴが以下の関係式
ＲＴ＞（ＴＨＩＧＨ−ＴＳｉｎｋ）／ｐＨｅａｔおよび
０．５ＲＴ，Ｏｐｔ＜ＲＴ＜２ＲＴ，Ｏｐｔ
ここで、ＲＴ，Ｏｐｔ＝（ＴＨＩＧＨ＋ＴＬＯＷ−２ＴＳｉｎｋ）／ｐＨｅａｔを満たすように選択され、
反応器は、出力ｐＨｅａｔを備えたヒータおよび温度ＴＳｉｎｋのヒートシンクを使用して、より低い温度ＴＬＯＷとより高い温度ＴＨＩＧＨとの間を繰り返し循環するように構成されている。
【００２７】
好ましくは、反応器は、ヒータ支持体の熱抵抗ＲＴと、充填された反応体積の熱容量と、反応体積とヒータ要素との間に位置する薄い外壁の部分の熱容量との合計ＣＶがＲＴＣＶ＜ｔＲの関係を満たし、ここで、ｔＲは反応の時定数であるように構成されている。
【００２８】
好ましくは、反応器は、充填された反応体積の熱容量と、反応体積とヒータ要素との間
に位置する薄い外壁の部分の熱容量の合計ＣＶと、ヒートシンクの熱の熱容量ＣＳが、関係ＣＳ／ＣＶ＞１００を満たすように構成されている。
【００２９】
好ましくは、ヒートシンク材料の熱伝導率は、ヒータ支持体材料の熱伝導率の１０倍超である。
【００３０】
好ましくは、反応体積とヒートシンクとの間に位置する薄い外壁の部分およびヒータの熱容量は、反応体積の中の液体の熱容量よりも低い。
【００３１】
好ましくは、ヒートシンク材料の熱浸透率は、ヒータ支持体材料の熱浸透率の１０倍超であり、ここで、熱浸透率ｅは、材料の熱伝導率ｋ、密度ρ、および比熱容量ｃｐの関数であり、ｅ＝ｓｑｒｔ（ｋρｃｐ）として定義される。
【００３２】
好ましくは、ヒータ要素は、反応体積の全領域にわたって延びる。
【００３３】
好ましくは、ヒータ要素は抵抗性であり、長方形または正方形の形状を有する。
【００３４】
好ましくは、ヒータ要素は、ヒータの動作温度範囲にわたって、５００ｐｐｍ／Ｋを超える、好ましくは２，５００ｐｐｍ／Ｋを超える、より好ましくは１０，００ｐｐｍ／Ｋを超える抵抗温度係数の絶対値を有する導電性材料から製造される。
【００３５】
好ましくは、ヒータは、電気抵抗測定のためのケルビン接点を含む。
【００３６】
好ましくは、ヒータ要素は、その中心近くよりもその周囲近くで単位面積あたりの熱出力が高くなるように構成される。
【００３７】
好ましくは、ヒータ要素は、１つまたは複数のガードヒータに囲まれたメインヒータを備える。
【００３８】
好ましくは、メインヒータは、電流が流れる方向に細長く、またこの場合、ガードヒータがメインヒータの長辺に隣接して配置されている。
【００３９】
好ましくは、ヒータ要素のシート抵抗は、電流の流れの方向に垂直なヒータ要素の縁部に位置する端部ゾーンで局所的に増加する。
【００４０】
好ましくは、反応体積は、使用中に、核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に使用される試薬を中に含むように構成される。
【００４１】
好ましくは、反応器は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）熱サイクリングによってＤＮＡ増幅を実行するように構成される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
次に、本発明の例を、添付の図面を参照して説明する。
【００４３】
【図１】従来技術のシステムおよび方法を示す図である。
【図２】従来技術のシステムおよび方法を示す図である。
【図３】従来技術のシステムおよび方法を示す図である。
【図４】従来技術のシステムおよび方法を示す図である。
【図５】従来技術のシステムおよび方法を示す図である。
【図６】従来技術のシステムおよび方法を示す図である。
【図７】従来技術のシステムおよび方法を示す図である。
【図８Ａ】本発明による例示的な反応器の図を示す図である。
【図８Ｂ】本発明による例示的な反応器の図を示す図である。
【図９Ａ】本発明による例示的な反応器の図を示す図である。
【図９Ｂ】本発明による例示的な反応器の図を示す図である。
【図１０Ａ】本発明による例示的な反応器を示す図である。
【図１０Ｂ】本発明による例示的な反応器を示す図である。
【図１１】本発明による例示的な反応器を示す図である。
【図１２】本発明による代替の反応器の幾何学形状の断面図である。
【図１３Ａ】本発明で使用することができる反応セルカバーの例を示す図である。
【図１３Ｂ】本発明で使用することができる反応セルカバーの例を示す図である。
【図１４Ａ】本発明で使用することができる反応セルカバーの例を示す図である。
【図１４Ｂ】本発明で使用することができる反応セルカバーの例を示す図である。
【図１５】本発明による反応器の分解組立図である。
【図１６】本発明で使用される反応セルの２つの形式を示す図である。
【図１７】本発明の動作中、時間６０秒までの同時のＤＮＡ増幅および拡散と、それに続く６０秒の時間が経った後のＤＮＡ拡散のシミュレーションを示す図である。
【図１８】本発明で使用された２つの例示的なセルについて、ＰＣＲ増幅の開始後１００秒の時間でのＤＮＡ濃度を示す図である。
【図１９】ＰＣＲ増幅の開始後１００秒の時間での位置を有する本発明を使用する方法における濃度変動を示す図である。
【図２０】本発明で使用することができる流体セルアレイを示す図である。
【図２１】本発明で使用することができる流体セルアレイを示す図である。
【図２２Ａ】本発明で使用することができる流体セルアレイを示す図である。
【図２２Ｂ】本発明で使用することができる流体セルアレイを示す図である。
【図２３Ａ】本発明による反応体積を示す図である。
【図２３Ｂ】本発明による反応体積を示す図である。
【図２３Ｃ】本発明による反応体積を示す図である。
【図２４Ａ】本発明による反応体積を示す図である。
【図２４Ｂ】本発明による反応体積を示す図である。
【図２５】本発明によるヒータの例を示す図である。
【図２６】本発明によるヒータの例を示す図である。
【図２７】本発明によるヒータの例を示す図である。
【図２８】本発明によるヒータの例を示す図である。
【図２９Ａ】本発明によるヒータの例を示す図である。
【図２９Ｂ】本発明によるヒータの例を示す図である。
【図２９Ｃ】本発明によるヒータの例を示す図である。
【図２９Ｄ】本発明によるヒータの例を示す図である。
【図３０】本発明によるヒータの例を示す図である。
【図３１】本発明で使用することができるヒートシンクを示す図である。
【図３２】反応中の本発明の動作特性および出力特性を表すグラフである。
【図３３】反応中の本発明の動作特性および出力特性を表すグラフである。
【図３４】反応中の本発明の動作特性および出力特性を表すグラフである。
【図３５】反応中の本発明の動作特性および出力特性を表すグラフである。
【図３６】本発明の動作特性を示す別のグラフである。
【図３７】本発明の動作特性を示す別のグラフである。
【図３８】本発明の動作特性を示す別のグラフである。
【図３９】本発明による回路を示す図である。
【図４０】本発明による回路を示す図である。
【図４１】本発明による回路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
図１（従来技術）は、異なる温度に保持された水浴間で試料を移動することによる熱サイクリングを示す。装置は概略式の形態で（Ａ）で示されている。試料の温度と位置は、（Ｂ）において時間に対してプロットされている。参照：Ｆａｒｒａｒ、Ｊ．Ｓ．ａｎｄ
Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ｃ．Ｔ．（２０１５）Ｅｘｔｒｅｍｅ  ＰＣＲ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  １５−６０Ｓｅｃｏｎｄｓ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６１：１  １４５−１５３。
【００４５】
図２（従来技術）は、異なる温度に保持されたヒータブロック間で試料を移動することによる熱サイクリングを示している。参照：国際公開第２０１２１６１５６６号パンフレット。
【００４６】
図３（従来技術）は、高温ゾーンと低温ゾーンを交互に通過する蛇行経路を通るように試料を通過させることによる熱サイクリングを示している。参照：Ｔｒａｕｂａ、Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｗｉｔｔｗｅｒ、Ｃ．Ｔ．（２０１７）Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  ＰＣＲ：＜１  Ｍｉｎｕｔｅ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ
Ｔｈｉｎ  Ｆｉｌｍ  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０、２１９−２３１。
【００４７】
図４（従来技術）は、非混和性の液体、通常はフッ素化オイルに含まれる試料の液滴を作成することによるデジタルＰＣＲを示している。参照：Ｈｉｎｄｓｏｎ、Ｂ．Ｊ．（２０１１）Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ、８３、８６０４−８６１０。
【００４８】
図５（従来技術）は、スリップチップデバイスの上面図および側面図を示している。スリップチップは、２つの部品の相対運動を使用して、デジタルＰＣＲまたはマルチプレックスＰＣＲ用の分離されたサブ試料を作成する。参照：米国特許第９，４１５，３９２Ｂ２号明細書。
【００４９】
図６（従来技術）は、最初に試料液体を充填し、次にガス透過性障壁を通過することができ、かつ試料を切り離された分量に分割するガスを充填することによるデジタルＰＣＲのデジタル化を示している。参照：国際公開第２０１８０９４０９１号パンフレット。
【００５０】
図７（従来技術）は、０．０２４４ｍＭのＰＮＡ（ＴＧ）／ＤＮＡ二重溶液、０．０３０３ｍＭのＤＮＡ（ＴＧ）／ＤＮＡ二重溶液、および緩衝液の２回の繰り返しＤＳＣ走査を示している。温度走査速度は６０Ｋ／ｈで、セル容量は０．５１１ｍｌであった。参照：Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ、Ｍ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｆ．Ｐ．（１９９９）Ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＰＮＡ／ＤＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ／ＤＮＡ
ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、４８０１−４８０６。
【００５１】
本発明が採用されるタイプの反応の場合、熱サイクリングは、ヒータと試料との間の熱拡散時間を、目標サイクルタイムと比較して短くすることを必要とする。熱拡散時間ｔは次の式で与えられ、
ｔ＝Ｒ２／ＤＴ、
ここで、Ｒは特徴的な長さのスケールであり、ＤＴは材料の熱拡散係数である。以下の表１は、以下で説明する反応器の設計例を示しており、ここでは、反応体積および薄い外
壁の熱拡散時間は両方とも、１００塩基対の配列で約１秒と見なされるＰＣＲの反応時間よりも短くなっている。
【００５２】
効率的に加熱するために、試料の熱容量に対して、反応セル材料の熱容量とヒータの熱容量の比を最小にすることが望ましい。反応体積の熱容量は、反応セルの熱容量とヒータの熱容量の合計の大部分、好ましくは１０％よりも大きく、より好ましくは５０％よりも大きくなければならない。
【００５３】
反応体積を加熱するために、ヒータ要素がオンに切り替えられ、ヒータ要素によって生成された熱が反応体積およびヒートシンクに流れ込む。反応体積を冷却するために、ヒータ要素がオフに切り替えられ、熱が反応体積からヒータを通ってヒートシンクに流れる。ヒートシンクの熱容量は、反応を完了するために必要な一連の熱サイクルにわたるヒートシンクの温度上昇を制限するために、反応セルとヒータを組み合わせた熱容量よりもはるかに大きくなるように選択される。以下に提供される例では、ヒートシンクの熱容量は、ヒータと反応セルを組み合わせた熱容量の１００倍を超えている。ヒートシンクの温度上昇をさらに制限するために、ヒートシンクは、例えば自然対流または強制対流、液体循環、噴霧冷却、またはヒートパイプまたはペルチェデバイスへの接続によって継続的に冷却することができる。
【００５４】
所与の温度プロファイルとヒートシンク温度ＴＳｉｎｋおよびヒータ要素出力ｐＨｅａｔに関する熱サイクリング時間を最小限に抑えるように、ヒータ支持体ＲＴの熱抵抗を最適化することができる。ＴＬＯＷとＴＨＩＧＨの間の熱サイクリングに必要な時間は、加熱時間が冷却時間と等しい場合に最小化され、この条件は、ＲＴ＝ＲＴ，Ｏｐｔの場合、次のように満たされる。
ＲＴ，Ｏｐｔ＝（ＴＨＩＧＨ＋ＴＬＯＷ−２ＴＳｉｎｋ）／ｐＨｅａｔ
【００５５】
軸方向はヒータと反応セルとの間の接触面に垂直であり、かつ横方向はヒータと反応セルとの間の接触面の平面内にあると定義する。横方向の熱流は反応セル内の温度勾配および温度の不均一性を意味するため、温度制御の精度を低下させるには、横方向の熱流を制限することが望ましい。
【００５６】
横方向の熱流を制限するために、反応体積は、側面の面積がヒータ要素に最も近い面の面積よりも小さくなるように、高さＨＶ（軸方向）と幅ＷＶ（横方向）の比を有するように選択される。この条件は、次のように正方形または円形の反応体積の場合に満たされる。
ＷＶ＞４ＨＶ
【００５７】
横方向の熱流をさらに制限するために、ヒータ要素は、その縁部の近くでより高い熱出力を有し、かつ反応体積を超えて延びるように設計され得る。その縁部近くのヒータ要素のより高い熱出力は、横方向の熱流を補償し、反応体積全体でより均一な温度条件を提供することができる。
【００５８】
電気ヒータ要素は、正方形または長方形の形状の発熱領域を有してよく、発熱領域の２つの向かい合う側に電気端子を備え、一方の端子から他方の端子に電流が流れる方向を有する。このようなヒータ要素の温度均一性を改善するための１つのアプローチは、電気端子の側面近くのヒータ要素のシート抵抗を増加させて、単位面積あたりの熱出力が、ヒータ要素の中心近くの熱出力に対して、これらの側面近くで局所的に増加するようにすることである。温度均一性をさらに改善するために、電流の流れの方向に平行な側面に沿ってヒータ要素の熱出力を増加させることも望ましい。これは、これらの側面の近くで電流密度が増加し、ヒータ要素の中心近くの熱出力に対して、単位面積あたりの熱出力が増加す
るように、これらの側面の近くのシート抵抗を局所的に低下させることによって行うことができる。
【００５９】
ヒータ要素の抵抗は、材料の厚さを減少させることによって、または電気伝導経路の長さを拡大し、かつ電気伝導経路の断面積を減少させる効果がある穴またはスロットまたは材料の変動で材料をパターン化することによって、局所的に増大させることができる。これらの穴またはスロットの特徴は、反応体積内の温度均一性を妨げないように、反応体積の厚さと比べて小さくする必要がある。
【００６０】
ガードヒータを使用することで、ヒータの縁部の横方向の熱流をさらに制限することができる。ガードヒータは、ヒータ要素の縁部の近くに配置され、かつメインヒータ要素の目標温度に近い温度を維持するように駆動される追加のヒータである。ガードヒータの単位面積ユニットあたりの熱出力は、横方向の熱損失を補償するために、メインヒータ要素の単位面積ユニットあたりの熱出力よりも高くなっている。ガードヒータは、メインヒータ要素と同じ温度設定値で閉ループ制御で動作されてよい、または、ガードヒータは、メインヒータ要素と同じコントローラまたはオン／オフタイミングであるが、特有の温度設定値で温度均一性を最適化するように調整することができる異なる駆動電圧で動作されてもよい。
【００６１】
反応器は、片面セルまたは両面セルとして構成することができる。片面構成には、ヒータと接触する薄い外壁が１つある反応セルがあり、ヒータはヒートシンクと接触している。両面構成には、ヒータと接触する２つの薄い外壁を備えた反応セルがあり、ヒータはヒートシンクと接触している。
【００６２】
反応セル、ヒータ、およびヒートシンクは、平面形状または湾曲した形状を採ることができる。構築を容易にし、反応を光学的に監視するために、平面形態が好ましい場合がある。しかしながら、部分的球形または円筒形などの他の形態も可能であり、これらは、張力をかけられた柔軟な反応セルおよびヒータ層が互いと良好な熱接触する、および通常は剛性の金属部品であるヒートシンクと良好な熱接触するのを可能にするという利点を有する場合がある。
【表１】
2021531975.tif 000003
【００６３】
空間的に分離された温度センサによるヒータ要素の熱制御は、ヒータ要素における温度変化と温度センサにおける温度変化との間にタイムラグがあるため、難しい問題を持ち込む。このタイムラグは、オーバーシュートやヒータ要素温度の振動などの問題を引き起こす可能性がある。これらの問題を回避するために、ヒータ要素は、ヒータ要素の抵抗を使用してその温度を決定する温度センサとして構成されてよい。ヒータ要素は、正の抵抗温度係数（金属など）または負の抵抗温度係数（金属酸化物または他の誘電体など）を有してよい。いずれの場合も、ヒータ要素の抵抗温度係数（ＴＣＲ）の大きさが大きく、好ましくは５００ｐｐｍ／Ｋを超える、より好ましくは２，５００ｐｐｍ／Ｋを超える、最も好ましくは１０，０００ｐｐｍ／Ｋを超えることが望ましい。
【００６４】
ヒータ要素には、ヒータ要素の抵抗のより正確な測定、およびより正確な温度測定を可能にするために、４端子ケルビン接点が備わっていてもよい。
【００６５】
ヒータ要素の材料が所望のシート抵抗よりも低い場合、それは、シート抵抗を増加させるために、電流の流れの方向に垂直なスロットまたはギャップでパターン化されてもよい。
【００６６】
ヒータ要素が所望のシート抵抗よりも高い場合、この場合、ヒータ要素を通る経路長を短くし、電流の流れの断面積を大きくするために、互いにかみ合った接触端子が備わっていてもよい。
【００６７】
熱サイクリングの間、およびいくつかの熱サイクルの終わりに、反応の状態をモニタすることが望ましい。特に、ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、蛍光標識色素または電気化学的に活性な標識を使用して検出することができる。これらの方法にはそれぞれ、コストがかかるか、またはＰＣＲ増幅プロセスを阻害する可能性のある標識に関する要件、複雑な光学計測器および試料との光学的インターフェースに関する要件、および試料との電気化学的インターフェースに関する要件という欠点がある。
【００６８】
本発明は、融解温度での熱容量の増加をもたらす、熱サイクルの加熱段階中に融解の熱を検出することによって、増幅されたＤＮＡの熱量測定検出を実現する。これにより、最小限の追加の計測器ハードウェアで、標識のない方法でＰＣＲ増幅を継続的にモニタすることが可能になる。
【００６９】
本発明の反応器の形式は、走査熱量測定検出に非常に適しており、その理由は、その設計によって急速な温度上昇率が可能になり、また反応体積に含まれる試料の熱容量が、ヒータ、反応セルおよび試料の総熱容量のうちのかなりの部分であるためである。これらの要因により、熱量測定信号の強度が高まり、熱量測定検出の感度が向上する。
【００７０】
ＤＮＡ融解温度での熱容量の増加によってＤＮＡの存在を検出するために、示差熱分析（ＤＴＡ）法を使用することができ、この方法では、試料セルと参照セルの温度差は、試料と参照の両方に等しい熱入力で、温度が融点を通過して上昇している間、温度または時間の関数として測定される。反応の過程にわたる示差温度走査の進展をモニタすることで、反応生成物の濃度の変化を検出することができる。別の方法は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用し、この方法では、試料セルと参照セルに対する熱流束入力の差は、試料セルと参照セル両方の温度を上昇させ、等しく保たれている間、温度または時間の関数として測定される。
【００７１】
ＡＣ熱量測定を、パルス式または振動形のヒータ駆動装置を使用して本発明と組み合わせることで、熱量測定のロバスト性および感度を高めることができる。一例のアプローチは、駆動周波数で正弦波駆動電圧で抵抗ヒータを駆動し、駆動周波数の２倍で振動する熱出力を生成することである。ヒータ要素の温度も駆動周波数の２倍で振動し、この振動の振幅は試料の熱容量に依存することになる。温度振動の振幅は、ヒータがゼロ以外の抵抗温度係数を有する温度センサとしても構成されている場合、ヒータ要素の電気抵抗の振動を測定することによって検出することができる。このアプローチの利点は、この方法がヒータ抵抗における低速ＤＣドリフトの影響を受けることがなく、温度振動の同期検出を使用して外部ノイズの発生源を排除することができる点である。
【００７２】
ＡＣ熱量測定に関する熱入力の周波数の最適な範囲は、振動性の熱源によって生成される温度振動の侵入度Ｌを考慮することによって推定することができる（参照：Ｍａｒｉｎ
，Ｅ．（２０１０）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｌａｔ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｅｄｕｃ．，１，５６−６０）。
【数１】
2021531975.tif 000004
【００７３】
ＤＴは熱が拡散する材料の熱拡散係数であり、ωは熱源の振動の角周波数である。片側のみにヒータを備えた反応器の場合、反応体積の高さＨＶ以下の侵入度Ｌを与える条件を選択することが好ましい。より高い周波数の振動と、より小さな侵入度を使用することの利点は、熱量測定がＨＶの変動に影響されにくく、これにより試料と参照反応体積の幾何学形状の違いに対する感度を低下させる点である。
【００７４】
条件Ｌ≦ＨＶは、周波数２ｆＤＲＩＶＥで振動する熱出力を生成するために、抵抗ヒータ要素に印加される周波数ｆＤＲＩＶＥの正弦波電気駆動装置に対して生じ、ここで、ｆＤＲＩＶＥは次の条件を満たす。
【数２】
2021531975.tif 000005
【００７５】
片側のみにヒータを備えた反応器の場合、および本発明による典型的な反応体積の場合、高さＨＶ＝１００μｍ、水の熱拡散係数ＤＶ＝１．４３×１０−７ｍ２／ｓ、およびｆＤＲＩＶＥ≧２．３Ｈｚである。
【００７６】
両側にヒータを備えた反応器の場合、侵入度Ｌは、反応体積の高さの半分以下であること、および本発明による典型的な反応体積の場合、高さＨＶ＝１００μｍ、水の熱拡散係数ＤＶ＝１．４３×１０−７ｍ２／ｓ、およびｆＤＲＩＶＥ≧９．１Ｈｚであることが好ましい。一般に、両側にヒータを備えた反応器の場合、ｆＤＲＩＶＥは次の条件を満たす。
【数３】
2021531975.tif 000006
【００７７】
また、侵入度Ｌは、反応体積と接触する薄い外壁の厚さＨＷ以上であることが望ましい。これは条件
【数４】
2021531975.tif 000007
を与える。
【００７８】
本発明による典型的な反応体積の場合、壁の厚さＨＷ＝２４μｍ、ポリプロピレン壁の熱拡散係数ＤＷ＝８．２６×１０−８ｍ２／ｓ、およびｆＤＲＩＶＥ≦２３Ｈｚである。好ましくは、本明細書で言及されるように、「体積」はまた、体積を定義する「容器」または「セル」を意味する場合があり、逆もまた同様である。
【００７９】
ＡＣ熱量測定法を使用する場合、ＡＣ電気駆動装置の周波数の２倍の周波数でヒータ抵抗の変動を測定することが有利である。周波数ωの正弦波電気駆動波形をヒータ要素に供給することで、周波数２ωでそこに温度の揺らぎが発生し、それに応じて２ωで抵抗の揺らぎが発生する。これはさらに３ωでの電圧の揺らぎにつながる。「３−ω」法を使用してＡＣ電気駆動装置の周波数の３倍の周波数での電圧の揺らぎを測定することで、狭帯域検出技術を使用できるようになり、向上した信号対雑音比を提供する。
【００８０】
示差熱量測定法を使用する場合、電気抵抗ヒータ要素をホイートストンブリッジ回路内での試料反応および参照反応用に構成することが有利である。このアプローチにより、試料温度と参照温度の差が直接測定されることが可能になり、かつ試料温度と参照温度を個別に検出し、その後２つの比較的大きな分量の間の小さな差を計算することに関連する誤差を回避することが可能になる。
【００８１】
ホイートストンブリッジの別の構成では、試料と参照はそれぞれ２つのヒータ要素で加熱され、４つのヒータ要素はフルブリッジ構成で構成されているため、ブリッジ回路の電圧出力は所与の温度差に関して２倍になる。
【００８２】
試料ヒータ要素と参照ヒータ要素の抵抗の差により、ブリッジ回路の出力はゼロにならず、試料と参照の加熱が不均一になる可能性がある。試料と参照が同じ温度のときにブリッジ回路の出力がゼロになるようにブリッジ回路の均衡を保ち、また電圧がブリッジ回路の両端に印加されたときに試料と参照が同じ電力入力を受け取るようにブリッジ回路の均衡を保つことも望ましい。電圧と電力の均衡保持の組み合わせは、直列または並列構成の４つのトリム抵抗器で実現することができる。
【００８３】
デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ試薬を含む試料を最初にいくつかの別々のパーティション（例えば、液滴または壁で仕切られた領域）内でサブ試料に分割し、その後すべてのサブ試料を温度サイクルにかけてＰＣＲ反応の進行を可能にする技術である。
【００８４】
この目的は、元の試料中の１つまたは複数のターゲットオリゴヌクレオチドの濃度を、リアルタイムＰＣＲで可能な濃度よりもより精密に、かつ正確に判定することである。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲ反応の測定値がしきい値を超えるために必要とされる増幅サイクル数であるＣＴを求めることによって、ＤＮＡ濃度を定量化する。ＤＮＡの開始濃度はＣＴに関連しており、濃度が高いほど、ＣＴの値は小さくなる。
【００８５】
ＰＣＲが正常に進行したサブ試料の数の統計的分析により、試料中のＤＮＡ濃度をより正確に、かつより精密に推定することが可能になる。ＰＣＲが進行するサブ試料には、１つ以上のターゲットオリゴヌクレオチドが含まれている必要があるのに対して、ＰＣＲが進行していないサブ試料には含まれていないと見なされる。統計的方法では、濃度を正確に測定するために多数のサブ試料が必要であり、典型的には１０００を超えるサブ試料が使用され、より高い感度が必要なアプリケーションでは１０，０００を超えるサブ試料が使用される。
【００８６】
既存のデジタルＰＣＲ技術の重大な欠点は、最初に試料をサブ試料に分割する必要があることにある。この要件により、プロセスに関連する複雑さとハードウェアコストが大幅に増加する。液滴デジタルＰＣＲには、より複雑な反応セルを使用したマイクロ流体液滴の生成、水性試料と非混和性オイルの正確に制御された流れ、およびＰＣＲ増幅前の液滴生成のための追加の時間が必要とされる。液滴デジタルＰＣＲの代わりにガスを使用して反応体積を分割する。これには、制御された試料の追加と、それに続く制御されたガスの追加と、ガスを逃がすためのガス透過性の障壁の使用が必要である。
【００８７】
本発明は、試料が切り離されたサブ試料に分割されない、壁がなく、液滴のないデジタルＰＣＲシステムおよび方法を提供する。代わりに、ＰＣＲは、試料内のいくつかの反応ゾーンの中で進行し（または進行しない）、これらの反応ゾーンは、それらが経験する温度の範囲によってのみ画定される。反応ゾーンの間には物理的な障壁がなく、ある反応ゾーンから別の反応ゾーンへのオリゴヌクレオチドの移動は、溶液中のオリゴヌクレオチドの比較的遅い拡散によってのみ阻止される。試料は、サブ試料の間に固体、非混和性液体、またはガスの障壁がない連続する一連の液体として含まれる。これは、ＰＣＲを短いサイクルタイムで実行できることによって可能になり、その結果３０〜５０サイクルのＰＣＲ増幅を１００〜２００秒未満で完了することができ、拡散のための時間および拡散が発生し得る距離を制限する。
【００８８】
このアプローチの変形形態では、部分的な障壁を導入して、後続の反応の検出と分析を容易にするためにサブ試料の位置を規定する、および隣接するサブ試料の位置の間の拡散速度を低下させ、これによりサブ試料を、より厳密に離間させることを可能にし、かつ所与のサイズの反応器と試料の総量に対するサブ試料の数を増加させてもよい。
【００８９】
長さ［ｂｐサイズ］を有する、水中の二本鎖ＤＮＡ分子の拡散係数ＤＤＮＡは、次の式（参照：Ｌｕｋａｃｓ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ＤＮＡ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７５（３）：１６２５−９）を使用して計算することができる。
ＤＤＮＡ＝［ｂｐサイズ］−０．７２×４．９×１０−６ｃｍ２／ｓ
【００９０】
ＰＣＲ増幅の典型的なターゲットを表す、１００塩基対のＤＮＡ配列の拡散を検討する。１００秒のタイムスケールでの拡散長ＲＤは８４μｍであるため、増幅されたＤＮＡの分離したクラスターは、１００秒にわたってほぼこの距離だけ広がることになる。高さＨＶの反応体積に関するデジタルＰＣＲの試料パーティションの当量ＶＰは、次のように計算することができる。
Ｖｐ＝πＲｎ２Ｈｖ
【００９１】
これにより、１００μｍの反応体積の高さに対して２．２ｎｌの容量が得られ、デジタルＰＣＲで通常必要とされるように、通常５μｌの試料を１０００を超えるパーティションに分割することが可能になる。デジタルＰＣＲを使用してＤＮＡ濃度を定量化する場合は、試料を多数のパーティションに分割することが望ましく、パーティションの数が多いほど測定の精度が高まり、より広い範囲の濃度を測定できるようになるためである。したがって、１００μｍ程度の小さな反応体積セルの高さと組み合わせた、１００ｓ程度の高速増幅により、一般的なＰＣＲ試料の量（通常は最大２０μｌ）をデジタルＰＣＲで分析することが可能になる。
【００９２】
小さなパーティション体積を可能にすることに加えて、本発明に記載の反応器の平坦な反応体積の形状は、デジタルカメラなどのアレイ検出器を使用するデジタルＰＣＲのための増幅されたＤＮＡの蛍光検出にも便利である。
【００９３】
マルチプレックスＰＣＲは、試料を分析して複数の異なるオリゴヌクレオチド配列の存在を検出する技術である。従来のアプローチの１つは、異なる蛍光波長の蛍光標識を使用して異なる種の検出を多重化することであるが、このアプローチは通常、蛍光波長が重複するため、最大約６種の検出までに制限される。代替の従来のアプローチは、試料を、固体、非混和性の液体または気体であり得る障壁によって分割された異なる反応体積に細分することである。このアプローチには、上記のデジタルＰＣＲの場合と同じように、複雑
さが高まり、分析時間が長くなるという欠点がある。
【００９４】
図８は、本発明による片面反応器Ａ（左）および両面反応器Ｂ（右）を示している。各反応器は、１つまたは複数のヒータおよびヒートシンクを備えた反応セルを備える。ヒータは、ヒートシンクと接触しているヒータ支持体上に発熱ヒータ要素を備える。ヒータ支持体は、より硬く、より剛性の高いヒータ支持層と、より硬く、より剛性のあるヒートシンクとの間の良好な熱接触を実現するために、より柔らかく、より柔軟な熱パッド層を含んでもよい。片面ヒータを備えた反応器である実施形態Ａは、単一のヒータおよびヒートシンクと、側壁、薄い外壁およびカバーを備えた反応器とを含む。実施形態Ａでは、反応体積は、カバー、側壁、および薄い外壁によって囲まれている。両面ヒータを備えた反応器である実施形態Ｂは、側壁を取り囲む２つの薄い外壁を備えた反応セルを備える。実施形態Ｂでは、反応体積は、側壁および薄い外壁によって囲まれている。
【００９５】
図９は、本発明による片面反応器Ａ（左）および両面反応器Ｂ（右）の側面図を示している。
【００９６】
図１０は、本発明による熱パッドのない片面反応器Ａ（左）および両面反応器Ｂ（右）の側面図を示している。
【００９７】
図１１は、本発明による反応器の寸法を示しており、反応セルの高さＨＶ、薄壁の厚さＨＷ、ヒータ支持体の高さＨＨ、熱パッドの高さＨＰ、ヒートシンクの高さＨＳおよび反応セルの幅ＷＶを示している。
【００９８】
図１２は、様々な反応器の幾何学形状の断面図を示す。すべてに、ヒートシンクと接触しているヒータと接触している反応セルが含まれる。平面幾何学形状が（Ａ）に、曲線幾何学形状が（Ｂ）に、円筒形の幾何学形状が（Ｃ）に示される。すべての場合において、反応体積は、２つのより大きな面積の実質的に平行な壁と、より小さな面積の側壁とによって境界付けられている。大きな面積の壁の少なくとも１つは、ヒータと接触している薄い外壁である。
【００９９】
上述したように、反応セルは、平面または湾曲した形態を有することができる。しかしながら、反応セル内で、熱サイクリングが適用される１つまたは複数の反応体積は、いくつかの方法で構築されてもよい。
【０１００】
図１３は、流体ポートを形成する貫通穴と、反応体積を画定するくぼんだ特徴部と、反応体積を流体ポートに接続する流体チャネルとを備える実質的に平坦な部分を備える、本発明の実施形態で使用される反応セルカバーのカバーを示す。カバーは完全なもの（Ａ）と、断面（Ｂ）で示されている。
【０１０１】
図１４は、流体チャネルによって流体ポートに接続された反応体積を備える、本発明の実施形態で使用される反応セルカバーの平面図を示す。反応体積は、細長い、または長方形の形状（Ａ）または実質的に正方形の形状（Ｂ）を有する場合がある。
【０１０２】
図１５は、反応セル、ヒータ、およびヒートシンクのアセンブリを含む、本発明による反応器の分解組立図を示す。反応セルは２つの反応体積を含み、各反応体積は、反応体積の縁部を越えて横方向に延びるヒータ要素の上に位置する。ヒータはヒートシンクと熱的に接触する（任意選択で、この図には示されていない熱パッドを介して）。ヒータ要素領域の周囲近くに配置された断熱エアギャップを使用して、ヒータからヒートシンクへの熱流の速度を局所的に低下させ、それにより、ヒータ要素領域の縁部が中心よりも低温になる傾向を抑制し、かつ反応体積内の熱均一性を改善することができる。
【０１０３】
図１６は、本発明の実施形態で使用される反応セルの２つの形式を示しており、（Ａ）複数の試料用の反応セル（８つの試料形式が示される）と、（Ｂ）複数の検出位置を有する単一試料用の反応セルである。検出位置は、増幅されたＤＮＡが検出される位置の数が、試料中の標的配列の濃度を計算するのに使用されるデジタルＰＣＲを実施するために使用されてよい。検出位置はまた、例えば異なる検出位置に異なる配列特有のＰＣＲプライマーを提供することによって、複数の異なる標的配列を検出するために、マルチプレックスＰＣＲを実施するために使用されてもよい。図１６（Ａ）および図１６（Ｂ）のそれぞれの反応セルは、単一のヒータ要素に関連する単一の反応体積を有してよい。
【０１０４】
一実施形態では、試料が不連続なサブ試料に分割されない、壁のないマルチプレックスＰＣＲシステムおよび方法が提供される。代わりに、反応器には、異なるオリゴヌクレオチド配列の増幅または検出のための様々な試薬のアレイが事前に装填されており、様々な試薬は異なる位置に存在する。次に試料が反応器に装填され、連続する一連の液体として分析される。標的特有の試薬の間隔は、ある位置から隣接する位置までの距離が、検出反応に必要な時間に対する、通常はオリゴヌクレオチド検出の場合は３０〜５０サイクルのＰＣＲの拡散長よりも大きくなるように選択される。
【０１０５】
異なる標的配列のＰＣＲ増幅の場合、この例では、異なるプライマー対は、例えば一列のプライマー対を、反応セルの大きな面積の壁の１つにある一列の位置に堆積し、続いて乾燥することによって、反応体積の中の異なる位置に事前に装填することができる。プライマー特有の増幅は、各プライマー対の位置で発生することができ、この増幅の結果は、ＰＣＲ増幅が、反応生成物またはプライマーが、隣接する位置に拡散するのに必要とする時間より短い時間で実行されると仮定するという条件で、隣接する位置でのＰＣＲ増幅の結果とは無関係に判定することができる。
【０１０６】
典型的なプライマーは、約２０塩基のオリゴヌクレオチド配列であり、ターゲットＤＮＡ配列よりも短く、それに応じてより大きな拡散係数を有する。ＤＮＡ拡散と同じ式を適用すると、２０塩基のプライマーは時間１００秒以内で１５１μｍ拡散する可能性がある。独立した検出では、多重化検出に関する隣接する位置は、この距離の少なくとも２倍、好ましくはこの距離の少なくとも４〜６倍離す必要がある。一例として、高さ１００μｍ、面積５０ｍｍ２、および隣接する位置の間隔が約１ｍｍの５μｌの反応体積を考えることができる。各検出位置は１ｍｍ２の領域を占め、多重化のための５０の独立した検出位置を提供する。
【０１０７】
拡散制限チャネルを使用して、反応の継続時間の間、隣接する反応ゾーン間の試薬および反応生成物の拡散を制限することができる。図１７は、本発明による反応器において、時間６０秒までの同時のＤＮＡ増幅および拡散と、それに続く６０秒の時間が経った後のＤＮＡ拡散のシミュレーションを示している。シミュレーションの開始時に、中央のセルには１つのＤＮＡ分子が含まれており、これは２秒のサイクルタイムでＰＣＲによって増幅される。拡散制限チャネルのある反応セルの場合は実線で示され、拡散制限チャネルのない反応セルの場合は破線で示されている。隣接するゾーンで大きな拡散と増幅が発生し得る前に、１つの反応ゾーンにおいて完全に増幅するには高速増幅が必要である。この例では、拡散制限チャネルのある隣接するセルのＤＮＡ濃度は時間６０秒でのメインのセルのＤＮＡ濃度の約５％であるが、拡散制限チャネルのない場合の隣接するセルのＤＮＡ濃度は約３５％である。
【０１０８】
図１８は、２つの場合について、時間１００秒での本発明を使用する方法におけるＤＮＡ濃度のシミュレーションの結果を示しており、Ａは拡散制限チャネルのない反応セルであり、Ｂは拡散制限チャネルによって分離された別々の反応ゾーン（検出位置）を有する
反応セルである。隣接するセルへのＤＮＡ拡散は、拡散制限チャネルによって抑制される。どちらの場合も、ＰＣＲ増幅は６０秒の間シミュレートされ（１サイクルあたり２秒間のＰＣＲ増幅の３０サイクル）、その後さらに４０秒間拡散される。図１８（Ａ）および図１８（Ｂ）のそれぞれの反応セルは、単一のヒータ要素に関連する単一の反応体積を有してよい。
【０１０９】
図１９は、ＰＣＲ増幅の開始後の時間１００秒の位置と共に、本発明を使用する方法における濃度変動を示す。拡散障壁は、ＤＮＡが増幅された位置の近くで高濃度のＤＮＡを維持し、隣接する反応位置では低濃度を維持するのに役立つ。これにより、デジタルＰＣＲまたはマルチプレックスＰＣＲまたはその他の反応を、試薬と試料の流れのための連続的な流体経路を備えた反応器において実行することができるため、反応体積を分離するための液滴やその他の手段は不要になる。
【０１１０】
図２０は、本発明による隣接する反応ゾーン間の拡散を制限するより小さなチャネルによって接続された一列の反応ゾーンを備えた流体セルの２つの異なる設計を示している。反応ゾーンは、異なる位置で異なるＤＮＡ配列の多重増幅および検出を実行するために、ＰＣＲプライマーなどの異なる試薬を含む場合がある。あるいは、デジタルＰＣＲを実行するために、反応ゾーンにはすべて同じ試薬が含まれる場合もある。拡散制限チャネルは、分離した反応ゾーンを提供するために油中に水滴を生成する必要なしに、反応ゾーンの列を充填させることを可能にし、これにより、反応を単純化し、反応を実行するコストを低下させる。図２０（Ａ）および図２０（Ｂ）のそれぞれの流体セルは、単一のヒータ要素に関連する単一の反応体積を有してよい。
【０１１１】
図２１は、拡散制限３４０によって分離された反応ゾーン３３０を有する流体セルの詳細を示している。反応ゾーンからの流体経路は再結合して、反応生成物を収集し、反応セルから外に移すことを可能にする。
【０１１２】
図２２は、流体経路を再結合した反応セルの出口の詳細を示している。気泡の形成を回避するために、毛細管破裂圧力が流れ方向に増加して、一連の毛細管流れ制限が流体経路に配置される。図２２（Ａ）において、より大きな半径方向毛細管流れ制限３５１は、より小さな半径方向毛細管流れ制限３５２よりも低い破裂圧力を有する。２つのチャネルからの流れが合流すると、隣接するチャネルが充填されるまで１つのチャネルが毛細管の流れの制限のところに固定され、その時点で２つの前進する液体の最前部のメニスカスが接触し、気泡が発生することなく流れが再結合する。図２２（Ｂ）では、液体の流れは、より小さな毛細管半径方向流れ制限地点３５２で停止され、その一方で、液体は、より大きな毛細管半径方向流れ制限地点３５１を通過して流れる。前進するメニスカスが各制限地点３５２に到達すると、液体の流れが再結合する。
【０１１３】
図２３は、反応体積２２０が幅ＷＶ、長さＬＶおよび高さＨＶを有する反応セルの別の実施形態を示す。この例では、支持されていない大きなスパンを有する幅広の流体チャネルを回避することにより、セルの構造がより堅牢になる。反応体積２２０は、ヒータ要素５００と位置合わせを正しくして位置決めされ、ヒータ要素５００によって加熱されるように構成され、また反応体積領域ＷＶ×ＬＶ全体に試料を分配する高さＨＶを有する蛇行流体チャネル２７０から構築される。寸法は、例えば、ＷＶ＝２．５ｍｍ、ＬＶ＝１６ｍｍ、およびＨＶ＝０．１ｍｍであり得る。このような形態を有する反応体積を含む反応セルは、流体経路が容易に制御され、気泡を洗い流すことができ、また部品は、薄い外壁２３０を流体セルに取り付けるためのエンボス加工および積層プロセスを使用して製造することができるなどのいくつかの利点を提供する。ＰＣＲ増幅を行うために、試料を反応体積に導入し、液体の動きを停止させ、正圧をかけ、次いで反応体積を熱サイクルさせる。ＰＣＲプライマーは、蛇行チャネルに沿った線形アレイとして提供されてよい。プライマ
ーは、それらの溶解性を考慮して選択されてよく、その結果、プライマーは、チャネルに沿って実質的に固定された状態のままである。
【０１１４】
図２４は、蛇行した流体チャネルを備えた別の実施形態を示す。この実施形態では、４つの反応体積２２０は、蛇行した流体チャネル２７０を介して単一の試料から充填され、ヒータ要素５００によって熱サイクルされるように構成されている。各反応体積の幅はＷＶ、長さはＬＶである。この実施形態では、寸法は、例えば、ＷＶ＝２．０ｍｍ、ＬＶ＝３．６ｍｍ、およびＨＶ＝０．１ｍｍであってよい。
【０１１５】
図２５は、要素全体の温度均一性を高めるために、ヒータ要素の縁部近くで加熱を増大させるために、中程度のシート抵抗のゾーン、低いシート抵抗のゾーン、および高いシート抵抗のゾーンを有する本発明の実施形態で使用される導電性ヒータ要素を示す。ヒータ要素は、電気絶縁支持体上に支持された薄膜導体から形成される。ヒータ要素のシート抵抗は、導電性薄膜に穴を形成することによって局所的に増加され、穴の面積の割合が大きいほど、シート抵抗を大きく増加させる。電流が電気端子の間を流れることで、上および下の高い抵抗のゾーンでシート抵抗が増加することにより、より高い加熱電力密度をもたらし、左と右のより低い抵抗のゾーンで電流密度が増加することにより、より高い加熱電力密度をもたらす。ヒータはまた、通常不透明である導電層に穴を形成することによって部分的に透明にされる。部分的に透明なヒータ要素は、反応の光学的モニタリング、特に増幅されたＤＮＡの蛍光検出を可能にするのに役立つ。
【０１１６】
図２６は、本発明の実施形態で使用されるヒータ要素におけるエッジ効果補償に対する代替のアプローチを示している。ガードヒータがメインヒータの１つまたは複数の縁部に設けられ、ガードヒータはガードヒータと同じ温度設定値まで電気的に駆動される。メインヒータはまた、端部近くで増大した加熱をもたらし、これによりエッジ効果を抑えるために、より高い電気抵抗を有する端部ヒータゾーンも有する。メインヒータには４端子ケルビン接続が備わっているため、その抵抗を正確に測定し、ヒータ要素の温度を計算するのに使用することができる。結果として得られる温度測定値は、ヒータの駆動力および熱サイクリングの動作を制御するために使用される。
【０１１７】
図２７は、縁部の２つの近くにガードヒータが配置されたメインヒータを備える、本発明の実施形態で使用されるヒータ要素を示す。この場合、メインヒータは細長く、ガードヒータは長辺の近くに配置されている。メインヒータには低い抵抗の中央ゾーンと、高い抵抗の端部ゾーンとがあり、ヒータの長方向に流れる電流によって高い抵抗の端部ゾーンの熱出力が増加し、この増加した熱出力がエッジ効果を補償し、ヒータの温度均一性を高めることになる。細長いヒータ要素の利点は、製造するのに便利であり、かつ気泡を閉じ込めることなく充填するのに便利な細長い反応体積の形状に一致することである。メインヒータの穿孔はヒータを部分的に透明にする。
【０１１８】
図２８は、本発明の実施形態で使用される２つの反応体積のためのヒータの設計を示す。ヒータは、メインヒータ要素の長辺に隣接する３つのガードヒータ要素を備えた２つの細長いメインヒータ要素を含む。メインヒータの端部ゾーンは、薄膜導体（Ｂ）における穴の面積分率を増やすことによって作製されるより高いシート抵抗を有し、その一方でメインヒータの中央ゾーンは、薄膜導体（Ａ）における穴の面積分率を減少させることによって作製されるより低いシート抵抗を有する。メインヒータにはケルビン接点が備わっていることで、ヒータ抵抗を正確に測定することができる。温度によるヒータ抵抗の変化は、ヒータ温度をモニタし、制御するために使用される。ガードヒータには個別の電気接点が設けられて、独立した電気駆動と制御を可能にする。外側のガードヒータは、内側のガードヒータよりも抵抗が低くなるように設計されてよく、その結果、すべてのガードヒータが同じ電圧で駆動された場合、外側のガードヒータがより多くの熱を生成し、これは、
より大きな熱出力がヒータの縁部でのより大きな熱損失を補償するため、温度均一性を向上させる。
【０１１９】
図２９は、抵抗を変化させるためにパターン化された電極を備えた、本発明の実施形態で使用されるヒータを示す。ヒータ（Ａ）は２つのメインヒータを有し、これらは、その短い端部の近くにより高い抵抗の領域を有し、中央により低い抵抗の領域を有する。抵抗は、可変の導体幾何学形状を提供するギャップ領域の幾何学形状によって調整することができる。（Ｂ）は、より高い抵抗の領域と、より低い抵抗の領域の一例を示す。細長いギャップが、ヒータ要素のシート抵抗を増加させるために、電流の方向に対して垂直に配向される。アスペクト比が大きいギャップほど抵抗の高い端部ゾーンを提供し、アスペクト比が小さいギャップほど抵抗の低い中心ゾーンを提供する。メインヒータの設計は、並列の電気伝導経路を設けることによって、単一の軌道の破損に対して堅牢である。ガードヒータはメインヒータの長辺近くに配置される。同じ駆動電圧で駆動したときにより大きな熱出力を提供するために、外側のガードヒータ（Ｃ）は内側のガードヒータ（Ｄ）よりも低い抵抗を有する。
【０１２０】
ヒータ要素は、反応体積の厚さＨＶよりも小さい直径を有する任意の穴と実質的に連続しており、または加熱要素内に細長いギャップがある場合、ギャップ幅は反応体積の厚さＨＶよりも小さくなることが理解されよう。
【０１２１】
図３０は、加熱および温度感知のために低い抵抗の相互嵌合型電極と、高い抵抗の領域との組み合わせを使用する、本発明の実施形態で使用されるヒータ要素を示す。高い抵抗の領域は、対象の温度範囲で大きな抵抗温度係数（ＴＣＲ）を有する酸化バナジウムなどの金属酸化物材料を使用して製造することができ、低い抵抗の交互嵌合型電極は、高い抵抗の加熱および検知領域よりもシート抵抗が低い金、アルミニウム、または銅などの金属の薄膜を使用して製造することができる。
【０１２２】
図３１は、部分的に透明なヒータ要素と組み合わせて使用される場合に、反応の光学的モニタリングを可能にするために穴が開けられた本発明の実施形態で使用されるヒートシンクを示す。穴の直径およびピッチは、反応セルの温度均一性を乱さないように十分に小さくなるように選択される。典型的な例では、厚さ２ｍｍのアルミニウムのヒートシンクブロックに２ｍｍのピッチで直径１ｍｍの穴を使用する。この構成により、反応器の両側にヒータとヒートシンクがある場合でも、反応を光学的にモニタリングすることが可能である。
【０１２３】
図３２は、本発明による、熱抵抗を介してヒートシンクに接続されたヒータの経時的な温度変動（Ａ）を示している。ヒータは、上限設定温度に達するまで（時間＝０．２６秒）１０Ｗの固定電力で駆動され、下限設定温度に達するまで（時間＝０．５９秒）ヒータ電力はゼロに減少される。所与のヒータ電力とヒータ形状に関して、（Ｂ）に示すように、熱サイクリング時間を最小化する熱抵抗が存在する。１０Ｗヒータの場合、最適な熱抵抗は約１０Ｋ／Ｗである。ヒータの出力が高いほど、熱サイクリング時間を最小限に抑えるために必要な熱抵抗は低くなり、ヒータの出力が低いほど、熱サイクリング時間を最小限に抑えるために必要な熱抵抗は高くなる。例えば、５Ｗヒータには２０Ｋ／Ｗの熱抵抗が必要であり、２０Ｗヒータには５Ｋ／Ｗが必要である。
【０１２４】
図３３は、本発明による例示的な反応器における０．４秒、０．８秒、および１．６秒の熱サイクリング時間に対するヒータ出力および熱抵抗の変動を示している。一定の熱サイクリング時間に対して、必要とされるヒータ出力を最小限に抑える最適な熱抵抗が存在する。
【０１２５】
図３４は、９０℃と６０℃の間で駆動される、本発明の実施形態で使用されるヒータの経時的な温度変動を示している。熱サイクリング時間は２秒である。実線は温度設定値を示し、点線は温度測定値を示す。
【０１２６】
図３５は、本発明の実施形態の反応器を使用して得られるＤＮＡ融解曲線データを示す。二本鎖ＤＮＡの存在は、挿入色素ＳＹＢＲ−ＧＲＥＥＮを使用して示され、これは、温度がＤＮＡの融解温度、この場合は８３℃前後を超えると、蛍光の急激な減少を示す。温度による蛍光の変動がＡに示され、勾配−ｄＦ／ｄＴがＢに示される。
【０１２７】
図３６は、本発明の実施形態の反応器を使用する、熱サイクル後のＰＣＲ増幅のＤＮＡ増幅曲線データを示す。上のグラフは、時間に対する挿入色素の蛍光を示しており、約１２０秒でバックグラウンドレベルを超えるＤＮＡ濃度の成長を示している。下のグラフは、時間に対する温度を示す。最初のホットスタートを使用してポリメラーゼ酵素を活性化し、その後、９５℃の高温と６０℃の低温で５秒の熱サイクリング時間が使用される。
【０１２８】
図３７は、本発明の一実施形態において、ＤＮＡ融解の熱量測定検出を実行するために使用される試料セルと参照セルとの温度差を示す。試料セルには１μＭのＤＮＡ濃度が含まれており、参照セルにはＤＮＡが含まれていない。ＤＮＡ融解による熱容量の増加は、試料セルと参照セルが等しい電力で駆動されるときに温度の低下を引き起こす。直流駆動はＡに示され、交流駆動はＢに示される。交流駆動は、ＤＮＡが融解遷移を行っているときに、駆動周波数の２倍の温度振動を提供する。交流駆動によって生成された信号の電気的検出は、直流駆動よりも検出し易い場合がある。交流駆動の周波数は、反応器の高さを通る熱拡散の時間にほぼ等しい加熱期間を与えるように選択される。加熱期間は、正弦波駆動のサイクルタイムの１／４に等しくなる。
【０１２９】
図３８は、２０秒のホットスタート期間と、それに続く５秒の熱サイクルを３０回繰り返す、本発明を使用する方法におけるＰＣＲ増幅スキームの温度プロファイルを示す。示差走査熱量測定は、次のように、すなわちベースラインの示差温度走査（温度に対する試料セルと参照セルの温度差を記録する）がホットスタート期間の温度上昇中に測定されるように、増幅されたＤＮＡを検出するために使用される。エンドポイント温度走査は、最後のＰＣＲサイクルの温度上昇中に行われる。ベースライン走査とエンドポイント走査の差は、ＤＮＡの融解の熱に比例する。
【０１３０】
図３９は、ＤＮＡ融解の熱量測定検出のための本発明によるブリッジ回路を示す。試料セルは抵抗器Ｒ１とＲ４によって加熱され、参照セルは抵抗器Ｒ２とＲ３によって加熱される。ＤＮＡ溶融の場合、試料セルはより低い温度を有することになり、Ｒ１とＲ４の抵抗値は低下され、増幅器Ｘ１の正（非反転）入力でより高い電圧が生成され、増幅器Ｘ１の負（反転）入力でより低い電圧が生成される。これにより、Ｘ１から正の出力が得られる。この場合、直流駆動Ｖ１が示されているが、交流駆動を使用することもできる。正弦波交流駆動の場合、周波数選択検出方式を使用して、駆動周波数の２倍の信号のみを検出することができる。方形波駆動（パルス＋Ｖまたは０Ｖ）の場合、周波数選択検出を使用して、駆動周波数と同じ周波数の信号を検出することができる。小さな温度差から測定可能な信号電圧を生成するために、ヒータ抵抗器は大きな温度係数の抵抗を有することが望ましい。別のアプローチでは、試料セルと参照セルとの間に接続された熱電対が、セル間の温度差に比例した信号電圧を生成する。
【０１３１】
図４０は、追加の直列抵抗器Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８を使用して、ブリッジ回路の差動電圧出力を最小化し、かつＲ１およびＲ４を備える試料ヒータの電力出力と、Ｒ２およびＲ３を備える参照ヒータとの差を最小化する、本発明による平衡回路を示す。Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８の値は、製造時に設定することも、検出前に調整することもで
きる。Ｘ１を飽和させることなく、高い増幅ゲインと高感度の検出を可能にするために、ブリッジ回路の電圧の不均衡を最小限に抑えることが望ましい。両方のセルが同時にＤＮＡ融解温度に到達し、２つのセル間のＤＮＡ濃度の差に比例する信号を提供することを保証するために、試料セルと参照セルに対する電力の入力は等しいことが望ましい。
【０１３２】
図４１は、ブリッジ回路の差動電圧出力を最小化し、かつ試料ヒータと参照ヒータの電力出力の差を最小化するために、本発明で使用され得る追加の並列抵抗器Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８を示す。
【０１３３】
当業者によって理解されるように、本発明を達成するために記載される他の例のいずれかと組み合わせて使用することができる、本発明によるいくつかの例示的な反応器、ヒータ、および回路構造を説明する。
【０１３４】
アプリケーションの主題には、さらに次の番号付きの条項が含まれる。
【０１３５】
１．その中に所定の反応を受け入れるための可変温度反応器であって、
反応セル、ヒータ、およびヒートシンクを備え、
反応セルは、厚さＨＶおよび幅ＷＶを有する反応体積を有し、ここで、ＷＶ＞４ＨＶであり、反応体積のより大きな面積の面の１つが、厚さＨＷを有する外壁によって境界付けられている面によって画定されており、
ヒータは前記外壁と接触しており、
ヒータは、反応体積により近い面に配置された発熱ヒータ要素と、反対側の面にあるヒータ支持体とを備え、ヒータ支持体はヒートシンクと接触しており、そのため、ヒータ支持体はヒータ要素とヒートシンクとの間に熱抵抗ＲＴを提供し、
反応器は、熱拡散係数ＤＶを有する試薬で充填される場合、厚さ方向に拡散時間ｔＶを有し、ｔＶ＝ＨＶ２／ＤＶであり、ｔＶは反応時定数ｔＲよりも小さく、
外壁は熱拡散係数ＤＷを有し、熱拡散時間ｔＷ＝ＨＷ２／ＤＷ＜ｔＶを有する、可変温度反応器。
【０１３６】
２．ヒータ要素は、ヒータとしても温度センサとしても機能する、条項１の反応器。
【０１３７】
３．コントローラをさらに備え、ヒータはコントローラに接続され、コントローラによって制御されて、反応器の温度をより高い温度ＴＨｉｇｈとより低い温度ＴＬｏｗの間で変化させ、温度は両方ともヒートシンクの温度ＴＳｉｎｋを超えている、条項１または条項２の反応器。
【０１３８】
４．反応体積の厚さＨＶは２５０ミクロン未満である、条項１から３のいずれか一項の反応器。
【０１３９】
５．反応セルは、幅ＷＶおよび長さＬＶを有する領域内に位置する蛇行チャネルによって形成される幅ＷＶおよび長さＬＶを有する反応体積を含む、条項１から４のいずれか一項の反応器。
【０１４０】
６．反応体積は、ヒータが前記外壁の両方と接触し、かつヒートシンクが両方のヒータと接触している状態で、その大きな面積の面の両方で、厚さＨＷを有する外壁によって境界付けられる、条項１から５のいずれか一項の反応器。
【０１４１】
７．ヒータ要素は抵抗性の加熱要素である、条項１から６のいずれか一項の反応器。
【０１４２】
８．ヒータ要素は導電性材料から製造され、ヒータ支持体は電気絶縁材料から製造され
る、条項１から７のいずれか一項の反応器。
【０１４３】
９．ヒータ支持体は、より硬く、より剛性のあるヒートシンク層と接触している、より柔らかく、より柔軟な層から形成される、条項１から８のいずれか一項の反応器。
【０１４４】
１０．ヒータ支持体は、より柔らかく、より柔軟な層と接触している、より硬く、より剛性の層からさらに形成され、この場合、より柔らかく、より柔軟な層はヒートシンク層と接触している、条項９の反応器。
【０１４５】
１１．反応セルはヒータから分離可能である、条項１から１０のいずれか一項の反応器。
【０１４６】
１２．ヒータはヒートシンクから分離可能である、条項１から１１のいずれか一項の反応器。
【０１４７】
１３．ヒートシンクが強制空冷または循環液体冷却または噴霧冷却またはヒートパイプ、あるいはペルチェ素子またはヒートポンプによる能動冷却によって冷却される、条項１から１２のいずれか一項の反応器。
【０１４８】
１４．反応セルは、流体の入口ポートおよび出口ポートを反応体積に接続する入口チャネルおよび出口チャネルを有する、条項１から１３のいずれか一項の反応器。
【０１４９】
１５．反応セルは不活性ポリマーである液体接触材料を含む、条項１から１４のいずれか一項の反応器。
【０１５０】
１６．ヒータ要素とヒートシンクとの間の熱抵抗ＲＴが以下の関係を満たすように選択され、
ＲＴ＞（ＴＨＩＧＨ−ＴＳｉｎｋ）／ｐＨｅａｔおよび
０．５ＲＴ，Ｏｐｔ＜ＲＴ＜２ＲＴ，Ｏｐｔ
ここで、ＲＴ，Ｏｐｔ＝（ＴＨＩＧＨ＋ＴＬＯＷ−２ＴＳｉｎｋ）／ｐＨｅａｔ、
反応器は、出力ｐＨｅａｔを備えたヒータおよび温度ＴＳｉｎｋでのヒートシンクを使用して、より低い温度ＴＬＯＷとより高い温度ＴＨＩＧＨとの間を繰り返し循環するように構成されている、条項１から１５のいずれか一項の反応器。
【０１５１】
１７．ヒータ支持体の熱抵抗ＲＴ、および充填された反応体積の熱容量と、反応体積とヒータ要素との間に位置する薄い外壁の部分の熱容量の合計ＣＶが、ＲＴＣＶ＜ｔＲの関係を満たし、ここで、ｔＲは反応時定数であるように構成されている、条項１から１６のいずれか一項の反応器。
【０１５２】
１８．充填された反応体積の熱容量と、反応体積とヒータ要素との間に位置する薄い外壁の部分の熱容量の合計ＣＶと、ヒートシンクの熱容量ＣＳが、ＣＳ／ＣＶ＞１００の関係を満たすように構成されている、条項１から１７のいずれか一項の反応器。
【０１５３】
１９．ヒートシンク材料の熱伝導率は、ヒータ支持体材料の熱伝導率の１０倍を超える、条項１から１８のいずれか一項の反応器。
【０１５４】
２０．反応体積とヒートシンクとの間に位置する薄い外壁の部分およびヒータの熱容量は、反応体積の中の液体の熱容量よりも低い、条項１から１９のいずれか一項の反応器。
【０１５５】
２１．ヒートシンク材料の熱浸透率は、ヒータ支持体材料の熱浸透率の１０倍を超え、
ここで、熱浸透率ｅは、材料の熱伝導率ｋ、密度ρ、および比熱容量ｃｐの関数であり、ｅ＝ｓｑｒｔ（ｋρｃｐ）として定義される、条項１から２０のいずれか一項の反応器。
【０１５６】
２２．ヒータ要素は反応体積の全領域にわたって延びる、条項１から２１のいずれか一項の反応器。
【０１５７】
２３．ヒータ要素は抵抗性であり、長方形または正方形の形状を有する、条項１から２２のいずれか一項の反応器。
【０１５８】
２４．ヒータ要素は、ヒータの動作温度範囲にわたって５００ｐｐｍ／Ｋを超える抵抗温度係数の絶対値を有する導電性材料から製造される、条項１から２３のいずれか一項の反応器。
【０１５９】
２５．ヒータ要素は、ヒータの動作温度範囲にわたって２，５００ｐｐｍ／Ｋを超える抵抗温度係数の絶対値を有する導電性材料から製造される、条項１から２４のいずれか一項の反応器。
【０１６０】
２６．ヒータ要素は、ヒータの動作温度範囲にわたって１０，００ｐｐｍ／Ｋを超える抵抗温度係数の絶対値を有する導電性材料から製造される、条項１から２５のいずれか一項の反応器。
【０１６１】
２７．ヒータ要素は、導電性材料を蒸発させる、またはスパッタリングする、または印刷する、または積層する、またはリソグラフィーでパターン化する、またはレーザーパターン化することによって製造される、条項１から２６のいずれか一項のヒータ。
【０１６２】
２８．ヒータ要素は正のＴＣＲを有する導電性材料から製造され、Ｐｔ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｕのうちの１つを含み得る、条項１から２７のいずれか一項の反応器。
【０１６３】
２９．抵抗性加熱要素は、酸化バナジウムなどの、温度が上昇するにつれて電気絶縁性から導電性に遷移する金属酸化物などの負のＴＣＲを有する材料から製造される、条項１から２８のいずれか一項の反応器。
【０１６４】
３０．電気接点がヒータ要素の向かい合う角に設けられ、電流は、電気接点の角におけるより広い幅から、電気接点縁部の遠位側におけるより狭い幅まで縮小する、先細になった幅を有する電気を伝導する軌道によって、ヒータ要素の向かい合う縁部に沿って分配される、条項１から２９のいずれか一項の反応器。
【０１６５】
３１．ヒータは電気抵抗測定用のケルビン接点を含む、条項１から３０のいずれか一項の反応器。
【０１６６】
３２．ヒータ要素は、その中心近くよりもその周囲近くで単位面積あたりの熱出力が高くなるように構成されている、条項１から３１のいずれか一項の反応器。
【０１６７】
３３．ヒータ要素は、２つの向かい合う縁部に沿って電気接点を有する正方形または長方形の形状を有し、電気接点の縁部により高いシート抵抗領域を備え、他の２つの縁部により低いシート抵抗領域を備える、条項３２の反応器。
【０１６８】
３４．ヒータ要素は、１つまたは複数のガードヒータに囲まれたメインヒータを備える、条項１から３３のいずれか一項の反応器。
【０１６９】
３５．ガードヒータの温度をメインヒータと同じ温度設定値に制御する手段を備える、条項３４の反応器。
【０１７０】
３６．ガードヒータはメインヒータよりもシート抵抗が低い、条項３４または３５の反応器。
【０１７１】
３７．メインヒータは電流の流れの方向に細長く、ガードヒータがメインヒータの長辺に隣接して配置されている、条項３４から３６のいずれか一項の反応器。
【０１７２】
３８．ヒータ要素のシート抵抗は、電流の流れの方向に垂直なヒータ要素の縁部に位置する端部ゾーンで局所的に増加する、条項１から３７のいずれか一項の反応器。
【０１７３】
３９．ヒータ要素のシート抵抗は、電流の流れの方向に平行なヒータ要素の縁部に位置する側部ゾーンで局所的に減少する、条項１から３８のいずれか一項の反応器。
【０１７４】
４０．ヒータ要素内の増加したシート抵抗は、例えば、穴またはスロットのアレイによって穿孔された導電性材料の層を形成することによって、導電性材料の部分的な被覆によって提供される、条項３８の反応器。
【０１７５】
４１．ヒータ支持体またはヒートシンクは、ヒータ要素の周囲近くおよびヒータ要素とヒートシンクとの間に位置する断熱層を備える、条項１から４０のいずれか一項の反応器。
【０１７６】
４２．反応体積は、使用中、核酸配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に使用される試薬を含むように構成されている、条項１から４１のいずれか一項の反応器。
【０１７７】
４３．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）熱サイクリングによるＤＮＡ増幅を実施するように構成されている、条項１から４１のいずれか一項の反応器。
【０１７８】
４４．反応器は、多段階反応における異なる反応段階に対して異なる温度設定値で温度を制御するように構成されたコントローラを備える、条項１から４３のいずれか一項の反応器。
【０１７９】
４５．反応器はＤＮＡ配列のための多段階反応を実行するように構成されている、条項４４の反応器。
【０１８０】
４６．ヒートシンクは、反応体積の光学的検査を可能にするための穴を備える、条項１から４５のいずれか一項の反応器。
【０１８１】
４７．反応体積における反応の結果が、蛍光または比色またはＵＶ吸収または電気化学または熱量測定または電気泳動またはオリゴヌクレオチド感知を使用して検出されるように構成されている、条項１から４６のいずれか一項の反応器。
【０１８２】
４８．複数の熱サイクルにわたる反応測定の進展をモニタリングすることによって反応出力が検出されるように構成されている、条項１から４７のいずれか一項の反応器。
【０１８３】
４９．反応センサが反応体積の外壁内に配置されているか、または反応体積の外壁と接触している、条項１から４８のいずれか一項の反応器。
【０１８４】
５０．反応器内の試料の熱容量の変化を測定するための測定構成要素を備えることにより、反応の結果の熱量測定検出用に構成されている、条項１から４９のいずれか一項の反応器。
【０１８５】
５１．反応器は、試料反応および参照反応を使用するように構成されていることにより、ＤＴＡまたはＤＳＣ用に構成されている、条項１から５０のいずれか一項の反応器。
【０１８６】
５２．異なる時間に測定された第２の温度走査から第１の温度走査を差し引くための手段を備えることにより、ベースライン補正を伴うＤＴＡまたはＤＳＣ用に構成されている、条項１から５０のいずれか一項の反応器。
【０１８７】
５３．反応の結果を標識なしで検出するように構成されている、条項１から５２のいずれか一項の反応器。
【０１８８】
５４．試料反応体積および参照反応体積を加熱しながら測定が行われるように構成されている、条項５１の反応器。
【０１８９】
５５．ＤＮＡまたはＲＮＡである反応生成物を取り扱うように構成され、かつ反応生成物の融解が熱量測定で検出されるように構成されている、条項１から５４のいずれか一項の反応器。
【０１９０】
５６．最初のＤＴＡまたはＤＳＣ測定は、ＤＮＡのＰＣＲ増幅のための熱サイクリングに先行するホットスタート段階のために試料および参照の温度を上昇させる間に実行され、２番目のＤＴＡまたはＤＳＣ測定は、ＤＮＡのＰＣＲ増幅のための熱サイクリングに続いて実行されるように構成されている、条項５１または５４の反応器。
【０１９１】
５７．少なくとも１つの反応体積は試料材料を含み、少なくとも１つの反応体積は使用中の参照材料を含む、条項１から５６のいずれか一項の複数の反応器。
【０１９２】
５８．ヒータ要素は、ヒータにパルス式または振動性の熱出力を提供するように構成された駆動装置を有する、条項１から５７のいずれか一項の反応器。
【０１９３】
５９．高さＨＶを有する反応体積と、熱拡散係数ＤＶを有する内容物と、厚さＨＷおよび熱拡散係数ＤＷを有する薄い反応チャンバ壁とが、片側のみがヒータによって加熱されるように構成されており、ここでヒータ駆動装置の周波数は、関係式
【数５】
2021531975.tif 000008
を満たす、条項１から５８のいずれか一項の反応器。
【０１９４】
６０．高さＨＶを有する反応体積と、熱拡散係数ＤＶを有する内容物と、厚さＨＷおよび熱拡散係数ＤＷを有する薄い反応チャンバ壁とが、両側がヒータによって加熱されるように構成されており、ヒータ駆動装置の周波数は、関係式
【数６】
2021531975.tif 000009
を満たす、条項１から５９のいずれか一項の反応器。
【０１９５】
６１．駆動周波数で正弦波形で駆動される抵抗ヒータ要素をさらに備え、駆動周波数の２倍の周波数でヒータ要素抵抗の変動を測定することによって、または駆動周波数の３倍でのヒータ電圧または電流の変動を測定することによって、ヒータ要素の温度を測定するための手段を備える、条項１から６０のいずれか一項の反応器。
【０１９６】
６２．試料と参照の温度差が、ブリッジ回路内に配置された試料抵抗ヒータ、参照抵抗ヒータおよび２つの固定抵抗器を使用して感知される、条項１から６１のいずれか一項の反応器。
【０１９７】
６３．試料と参照の温度差は、ブリッジ回路内に配置された２つの試料抵抗ヒータと、２つの参照抵抗ヒータとを使用して感知され、ブリッジ回路の各側に、試料容器と参照容器のそれぞれからの１つの抵抗ヒータが含まれる、条項１から６１のいずれか一項の反応器。
【０１９８】
６４．トリム抵抗器を使用して、ブリッジ回路の出力電圧と、試料容器および参照容器に印加されるヒータ出力を同時に均衡させる、条項６２または６３の反応器。
【０１９９】
６５．ヒータ要素は、反応体積の光学的検査を可能にするための穴を備える、条項１から６４のいずれか一項の反応器。
【０２００】
６６．ヒータ要素は、光の透過、および反応の光学的モニタリングを可能にする穴またはスロットまたはギャップまたは蛇行経路で形成される、条項１から６５のいずれか一項の反応器。
【０２０１】
６７．ヒータ要素は、ＩＴＯまたはグラフェンまたはナノワイヤ材料などの透明な導電性材料から形成される、条項１から６６のいずれか一項の反応器。
【０２０２】
６８．反応体積は、複数の空間的に隔てられたゾーンを含み、異なる試薬が反応体積の異なるゾーンに配置され、ゾーン間隔は、反応時定数ｔＲの時間スケールでの反応生成物の質量拡散長と試薬の質量拡散長の大きい方よりも大きく、異なる反応が、各反応ゾーンの中で独立してモニタされる、条項１から６７のいずれか一項の反応器。
【０２０３】
６９．サイクルタイムｔＣで反応体積をＮ回熱サイクルするための手段をさらに備え、試薬ピッチは、ＮにｔＣを掛けたものに等しい拡散時間での反応生成物および試薬の質量拡散長よりも大きい、条項６８の反応器。
【０２０４】
７０．使用中の反応体積の各ゾーンに同じ試薬が配置されている場合、各ゾーン内の反応生成物の有無を検出するために各ゾーンを独立してモニタする手段が設けられる、条項６８または６９の反応器。
【０２０５】
７１．使用中の分析物の濃度を計算するために、反応生成物を含むゾーンと、反応生成物を含まないゾーンの数の統計を処理するためのプロセッサをさらに備える、条項６８から７０のいずれか一項の反応器。
【０２０６】
７２．反応体積内に少なくとも１００の反応ゾーンがある場合、または反応体積内に少なくとも１，０００の反応ゾーンがある場合、または反応体積内に少なくとも１０，０００の反応ゾーンがある場合の、条項６８から７１のいずれか一項の反応器。
【０２０７】
７３．反応体積が、反応ゾーンの断面積の０．２５未満の断面積を有する拡散制限チャネルによって接続された反応ゾーンに分割され、ここで拡散制限チャネルは、反応ゾーンの幅の０．２５を超える長さを有する、条項６８から７２のいずれか一項の反応器。
【０２０８】
７４．加熱要素を備え、加熱要素は、ヒータとしても温度センサとしても機能する、可変温度反応器用のヒータ。
【０２０９】
７５．ヒータ要素は抵抗性であり、長方形または正方形の形状を有する、条項７４のヒータ。
【０２１０】
７６．ヒータ要素は、ヒータの動作温度範囲にわたって５００ｐｐｍ／Ｋを超える抵抗温度係数の絶対値を有する導電性材料から製造される、条項７４または７５のヒータ。
【０２１１】
７７．ヒータ要素は、ヒータの動作温度範囲にわたって２，５００ｐｐｍ／Ｋを超える抵抗温度係数の絶対値を有する導電性材料から製造される、条項７４から７６のいずれか一項のヒータ。
【０２１２】
７８．ヒータ要素は、ヒータの動作温度範囲にわたって１０，００ｐｐｍ／Ｋを超える抵抗温度係数の絶対値を有する導電性材料から製造される、条項７４から７７のいずれか一項のヒータ。
【０２１３】
７９．ヒータ要素は、導電性材料を蒸発させる、またはスパッタリングする、または印刷する、または積層する、またはリソグラフィーでパターン化する、またはレーザーパターン化することによって製造される、条項７４から７８のいずれか一項のヒータ。
【０２１４】
８０．ヒータ要素は正のＴＣＲを有する導電性材料から製造され、Ｐｔ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｕのうちの１つを含み得る、条項７４から７９のいずれか一項のヒータ。
【０２１５】
８１．抵抗性加熱要素は、酸化バナジウムなどの、温度が上昇するにつれて電気絶縁性から導電性に遷移する金属酸化物などの負のＴＣＲを有する材料から製造される、条項７４から８０のいずれか一項のヒータ。
【０２１６】
８２．電気接点がヒータ要素の対向する角に設けられ、電流は、電気接点の角におけるより広い幅から、電気接点縁部の遠位側におけるより狭い幅まで縮小する、先細になった幅を有する電気を伝導する軌道によって、ヒータ要素の向かい合う縁部に沿って分配される、条項７４から８１のいずれか一項のヒータ。
【０２１７】
８３．ヒータは電気抵抗測定用のケルビン接点を含む、条項７４から８２のいずれか一項のヒータ。
【０２１８】
８４．ヒータ要素は、その中心近くよりもその周囲近くで単位面積あたりの熱出力が高くなるように構成されている、条項７４から８３のいずれか一項のヒータ。
【０２１９】
８５．ヒータ要素は、２つの向かい合う縁部に沿って電気接点を有する正方形または長方形の形状を有し、電気接点の縁部により高いシート抵抗領域を備え、他の２つの縁部により低いシート抵抗領域を備える、条項８４のヒータ。
【０２２０】
８６．ヒータ要素は、１つまたは複数のガードヒータに囲まれたメインヒータを備える、条項７４から８５のいずれか一項のヒータ。
【０２２１】
８７．ガードヒータの温度をメインヒータと同じ温度設定値に制御する手段を備える、条項８６のヒータ。
【０２２２】
８８．ガードヒータはメインヒータよりもシート抵抗が低い、条項８６または８７のヒータ。
【０２２３】
８９．メインヒータは電流の流れの方向に細長く、ガードヒータがメインヒータの長辺に隣接して配置されている、条項８６から８８のいずれか一項のヒータ。
【０２２４】
９０．ヒータ要素のシート抵抗は、電流の流れの方向に垂直なヒータ要素の縁部に位置する端部ゾーンで局所的に増加する、条項７４から８９のいずれか一項のヒータ。
【０２２５】
９１．ヒータ要素のシート抵抗は、電流の流れの方向に平行なヒータ要素の縁部に位置する側部ゾーンで局所的に減少する、条項７４から９０のいずれか一項のヒータ。
【０２２６】
９２．ヒータ要素内の増加したシート抵抗は、例えば、穴またはスロットのアレイによって穿孔された導電性材料の層を形成することによって、導電性材料の部分的な被覆によって提供される、条項９１のヒータ。
【０２２７】
９３．試料抵抗ヒータおよび参照抵抗ヒータに電力を供給するための手段と、ブリッジ回路内に配置された試料抵抗ヒータ、参照抵抗ヒータ、および２つの固定抵抗器をモニタすることによって、試料と参照の温度差を感知するための手段とを備える、可変温度反応器のための駆動および感知回路。
【０２２８】
９４．ブリッジ回路内に配置された２つの試料抵抗ヒータ、および２つの参照抵抗ヒータに電力を供給する手段と、２つの試料抵抗ヒータ、および２つの参照抵抗ヒータをモニタすることによって、試料と参照との温度差を測定する手段とを備え、ブリッジ回路の各側は、使用時に試料容器と参照容器のそれぞれからの１つの抵抗ヒータが含まれるように構成される、可変温度反応器用の駆動および感知回路。
【０２２９】
９５．ブリッジ回路の出力電圧と、試料容器および参照容器に印加されるヒータ出力を同時に均衡させるためのトリム抵抗器をさらに備える、条項９３または９４の回路。
【０２３０】
９６．可変温度反応からの測定値を提供するために、条項１から９５のいずれか一項の反応器、ヒータ、および回路を動作させる方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
2021531975.tif 000036
【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
2021531975.tif 000040
【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
2021531975.tif 000048
【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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