(57)【要約】  本発明は、生物活性核酸を細胞内に導入可能な新しい構造の核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体及びこれを含む疾病の診断、予防又は治療用組成物に関し、より詳細には、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸が相補的に結合した核酸複合体を含有し、皮膚透過性及び皮膚残留性を有する皮膚透過性伝達体及びこれを含む疾病の診断、予防又は治療用組成物に関する。  本発明によれば、構造式（１）の構造を持つ核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体は、大きい分子量の薬物を効果的に伝達するための皮膚透過機能と体内有効性を同時に有する。本発明に係る伝達体は、特に、生物活性核酸又は様々な化合物の皮膚表皮及び真皮通過を可能にし、皮膚表面に塗布する外用的処置を可能にする。【選択図】  図３
2021520402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（１）の構造を持つ核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体：
構造式（１）
［Ａ≡Ｃ（＋）］
前記構造式（１）において、
Ａは、目的とする遺伝子と結合可能な配列又は目的とする遺伝子配列を有する生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生物活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
‘≡’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸間の相補的な結合を意味し、
Ａで表される生物活性核酸は全体的に負電荷又は中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を有するということを意味し、
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を帯びるように修飾されたペプチド核酸単量体を一つ以上含む。
【請求項２】
前記核酸複合体は皮膚残留性を有することを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項３】
前記核酸複合体は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質をさらに含み、下記構造式（２）の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体：
構造式（２）
［ｍＡ≡ｍＣ（＋）］
前記構造式（２）において、
‘ｍ’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質を意味する。
【請求項４】
前記生物活性核酸又はキャリアペプチド核酸は、それぞれの核酸の５’末端又は３’末端にエンドソーム脱出を助ける物質が結合していることを特徴とする、請求項３に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項５】
前記エンドソーム脱出を助ける物質は、ペプチド、脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）及びｐＨ感応性高分子（ｐＨ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項３に記載の核酸複合体。
【請求項６】
前記ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号４８）、ＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＦ（配列番号４９）及びヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）（１０）からなる群から選ばれ、
前記脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、脂質（Ｌｉｐｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、パルミチン酸セチル（ｃｅｔｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ポロキサマー１８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８）、Ｔｗｅｅｎ  ８５、トリステアリングリセリド（ｔｒｉｓｔｅａｒｉｎ  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）及びＴｗｅｅｎ  ８０からなる群から選ばれ、
前記接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、ポリ（アミドアミン）（ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ））又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）であり、
前記高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）は、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ））、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド）（ｐｏｌｙ（ｄ，ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ））、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）及びＰＬＧＡ−ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）からなる群から選ばれ、
前記無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、Ｆｅ２Ｏ３、Ｆｅ３Ｏ４、ＷＯ３及びＷＯ２．９からなる群から選ばれ、
前記陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、１−（アミノエチル）イミノビス［Ｎ−（オレイックイルシステイニル−１−アミノ−エチル）プロピオンアミド］（１−（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｂｉｓ［Ｎ−（ｏｌｅｉｃｙｌｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−１−ａｍｉｎｏ−ｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ］）、ＰＴＡのＮ−アルキル化誘導体（Ｎ−ａｌｋｙｌａｔｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ＰＴＡ）及び３，５−ジドデシルオキシベンズアミジン（３，５−ｄｉｄｏｄｅｃｙｌｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）からなる群から選ばれ、
前記陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）は、ビニルピロリドン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ  ａｃｉｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｉｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈａｔｅ），ポリイソブチレン（ｐｏｌｙｉｓｏｂｕｔｙｌｅｎｅ）及びポリ（Ｎ−ビニルカルバゾール）（ｐｏｌｙ（Ｎ−ｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ））からなる群から選ばれ、
前記ｐＨ感応性高分子（ｐＨ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）は、ポリ酸（ｐｏｌｙａｃｉｄｓ）、ポリ（アクリル酸）（ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（メタクリル酸）（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））及び加水分解されたポリアクリルアミド（ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の核酸複合体。
【請求項７】
前記核酸複合体は、治療性タンパク質、治療性化合物、治療性組成物、癌化学治療剤、トキシン、細胞毒性物質、消炎剤、関節炎治療剤、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、一つ以上の信号伝達経路を調節する化合物、抗体、核酸、核酸類似体、細胞、ウイルス、ファージ、ウイルス粒子、ファージ粒子、ウイルスカプシド、ファージカプシド、ウイルス様粒子、リポソーム、マイセル、ビーズ、ナノ粒子、マイクロ粒子、化学治療剤、造影剤、映像剤、標識（ｌａｂｅｌ）、標識化剤又はその混合物からなる群から選ばれるいずれか一つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項８】
前記生物活性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ及び修飾されたペプチド核酸からなる群から選ばれる核酸単量体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項９】
前記キャリアペプチド核酸は、前記生物活性核酸と塩基配列の一部或いは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項１０】
全体的に正電荷を有することを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項１１】
前記キャリアペプチド核酸は、全体的に正電荷を有するように１個以上のガンマ−又はアルファ−バックボーン修飾ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項１２】
前記ガンマ−或いはアルファ−バックボーン修飾ペプチド核酸単量体は、正電荷を持つアミノ酸を有する単量体が負電荷を持つアミノ酸を有する単量体に比べてより多く含まれ、全体的なキャリアペプチド核酸の電荷が陽性になることを特徴とする、請求項１１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項１３】
疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、クエンチャー、蛍光マーカー及び発光マーカーからなる群から選ばれる一つ以上の物質が生物活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸に結合していることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項１４】
前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸は、それぞれの核酸の５’−方向性及び３’−方向性によって平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）又は逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）に結合していることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項１５】
前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力は、生物活性核酸と生物活性核酸の目的とする遺伝子との結合力よりも低いことを特徴とする、請求項１に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項１６】
前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸は平行結合（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）又は部分特異結合（Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）することにより、生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力が生物活性核酸と生物活性核酸の目的とする遺伝子との結合力よりも低いことを特徴とする、請求項１５に記載の皮膚透過性伝達体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の皮膚透過性伝達体を含む疾病の診断用組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の皮膚透過性伝達体を含む疾病の予防又は治療用組成物。
【請求項１９】
前記疾病は、皮膚疾患、癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症、希少疾患及び重症疾患、心血管疾患、又は代謝性疾患であることを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記皮膚透過性伝達体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＩＦＩ１６、ＴＧＦβＲ２、ＥＲＢＢ３、ＴＬＲ２、ｓｍａｄ３及びＴＩＥＧ１からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であり、前記疾病は皮膚疾患であることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記皮膚疾患は、乾癬、皮膚癌、アトピー皮膚炎、皮膚損傷、色素沈着及びケロイド性疾患からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１８に記載の組成物を含む剤形。
【請求項２３】
剤形は、水性液、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、塗抹剤、パッチから選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項２２に記載の剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性核酸を細胞内に導入可能な核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体及びこれを含む疾病の診断、予防又は治療用組成物に関し、より詳細には、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸が相補的に結合した核酸複合体を含有し、皮膚透過性及び皮膚残留性を有する皮膚透過性伝達体及びこれを含む疾病の診断、予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的な薬剤と違い、核酸薬剤は標的特異的伝令ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ，ｍＲＮＡ）の発現を抑制するので、タンパク質を標的にする既存薬剤で治療が不可能だった研究領域を扱うことが可能になった（Ｋｏｌｅ  Ｒ．等，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２；１１；１２５−１４０．，Ｗｉｌｓｏｎ  Ｃ．等，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．２００６；１０：６０７−６１４．）。
【０００３】
オリゴ核酸（Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ベースの遺伝子発現調節の優れた効果及び様々な用途にもかかわらず、核酸に基づく治療剤を開発するには克服すべき妨害物が多数存在する。例えば、オリゴ核酸は核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）などによる損傷の危険があり、オリゴ核酸の電気的性質（電荷）と大きさによって受動拡散（ｐａｓｓｉｖｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）による細胞膜透過が不可能な点などがある。これらの問題点を解消するために、核酸の修飾を用いて生物学的安定性を確保しようとする努力が続いており、修飾された人工核酸（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）の場合、生物学的な活性の損失無しで標的核酸との親和性を高めることが可能になった。
【０００４】
修飾された人工核酸の一種であるペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ，ＰＮＡ）は、（２−アミノエチル）−グリシンペプチドバックボーン（（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｇｌｙｃｉｎｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）が導入された人工核酸であり、相補的な塩基配列を有するＲＮＡ及びＤＮＡに強く結合する性質を持っている。特に、前記ペプチド核酸は核酸分解酵素に対して抵抗性があり、生物学的安定性が高いので、様々なオリゴ核酸に基づく治療剤関連研究が行われている。しかし、前記ペプチド核酸は電気的中性を有する特性から、細胞内導入が難しい短所がある（Ｊｏｅｒｇｅｎｓｅｎ  Ｍ．等，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ２０１１，２１；２９−３７．）。
【０００５】
オリゴ核酸自体の細胞膜透過能力は非常に低く、特に、ＤＮＡ又はＲＮＡは負電荷を帯びているので、細胞の疎水性リン脂質二重膜を通過できず、単純拡散による細胞内伝達が難しい。レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）或いはＡＡＶ（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）などのウイルス運搬体の使用は、オリゴ核酸の細胞内導入を可能にするが、意図しない免疫活性と発癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の組換え可能性などの危険性がある（Ｃｏｕｔｏ  Ｌ．Ｂ．等，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０，５；５３４−５４２．）。
【０００６】
このような理由から、細胞毒性が少なく、免疫活性が低い非ウイルス性オリゴ核酸に基づく核酸運搬体開発の重要性が一層増大しており、その結果として、陽電荷性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ、安定した核酸脂質粒子（ｓｔａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ，ＳＮＡＬＰ）、ポリマー及び細胞−透過粒子（ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を用いた細胞導入手法が開発されている（Ｚｈｉ  Ｄ．等，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，２４；４８７−５１９．，Ｂｕｙｅｎｓ  Ｋ．等，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１２，１５８；３６２−７０．，ＲＯＳＳＩ，Ｊ．Ｊ．等，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６，１３：５８３−５８４．，Ｙｏｕｓｅｆｉ  Ａ．等，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１３，１７０；２０９−１８．，Ｔｒａｂｕｌｏ  Ｓ．等，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２０１３，１９；２８９５−９２３．）。
【０００７】
このような核酸伝達手法は、機能性残基を直接的な結合によって持っており、複合体形成のための段階を含み、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）構造のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）効率及び生体毒性などの問題点があり、オリゴ核酸導入機能の向上と製造手順及び副作用に関連した問題点の解消が必要である。
【０００８】
一方、皮膚は、ヒトの身体で表面積が最も大きい器官であり、適切な方法を用いれば効果的に薬物を伝達できる経路となる。したがって、通常、経皮伝達（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）と呼ばれる、皮膚を通じた治療用薬物などの生理的活性剤の投与は、相対的に簡単な薬物などの投与療法などの特徴から大きく関心を受けてきた。
【０００９】
構造的に皮膚は、２つの主要部分である、相対的に薄い最外層である表皮層（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｌａｙｅｒ）と、これよりも厚い、内側領域である真皮層（ｄｅｒｍｉｓ、ｄｅｒｍａｌ  ｌａｙｅｒ）とからなる。特に、表皮層の最外層である角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ）は、ケラチンで埋められた扁平な死んだ細胞からなる。角質層の扁平な死んだ細胞間の領域は、皮膚の天然障壁特性に寄与するラメラ相（ｌａｍｅｌｌａｒ  ｐｈａｓｅ）を形成する脂質で構成されている。皮膚の最外側に存在する角質層（ｓｔｒａｔｕｍ  ｃｏｒｎｅｕｍ）などが天然障壁として働き、治療用薬物などの外部物質の皮膚透過度は極端に低いため、大きい分子量且つ親水性の物質が伝達され難い。
【００１０】
このような皮膚への治療用薬物などの伝達時に皮膚障壁の外部物質に対する防御機序を克服するために様々な皮膚透過方法に関する研究が試みられてきたが、物理的に皮膚を損傷又は刺激せずに化学物質の特性を用いて薬物を伝達することは非常に難しいと考えられており、これを克服した素材に期待できる諸メリットから、開発の要求が続いている実情である。
【００１１】
このような要求に応じて、大きい分子量の薬物を効果的に伝達するためのリポソーム又はナノパーティクル、ペプチドリガンドなどの皮膚透過伝達素材に関連した研究が多数報告されており［Ｌａｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００７  Ｍａｙ；６６（２）：１５９−６４．）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ（Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００６  Ｎｏｖ；３１９（２）：７６５−７５．）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６  Ａｐｒ；２４（４）：４５５−６０．）］、これを用いた実用化段階への開発費用が嵩むにもかかわらず、伝達しようとする薬物の効率及び安定性は保障できず、皮膚透過機能と体内有効性を同時に有する素材の開発が要求されている。皮膚表面に塗布する外用的処置素材の有効性は、表皮及び真皮を通過しなければならない技術的課題から、多くの努力が要求される。
【００１２】
これと関連して、本発明者らは、生物活性核酸と全体的に正電荷を有するように修飾されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とが相補的に結合した核酸複合体において細胞透過性（ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）が驚くほど向上し、これを用いて標的遺伝子の発現を非常に効率的に調節できることを確認し、このような細胞毒性が低く、生物活性核酸の細胞透過性及び遺伝子発現調節能力が向上した新しい構造体に対する特許を出願したことがある（ＰＣＴ／ＫＲ２０１７／００８６３６）。
【００１３】
前記構造体及び治療用薬物などの皮膚透過及び細胞伝達機能が向上した伝達体に関して研究し続けた結果、本発明者らは、前記のような生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）と全体的に正電荷を有するように修飾されたキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）とが相補的に結合した核酸複合体が皮膚、好ましくは角質層及び／又は表皮層を非常に効率よく通過する特性を有し、当該核酸複合体を皮膚透過性伝達体として利用できることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
この背景技術に記載の前記情報は単に本発明の背景に関する理解を向上させるためのものであり、したがって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に既に周知である先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【００１５】
本発明の目的は、生物活性核酸及び／又は治療用薬物を皮膚を通して投与できる新しい構造の核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記皮膚透過性伝達体を含む疾病の診断、予防又は治療用組成物を提供することにある。
【００１７】
前記目的を達成するために、下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体を提供する。
構造式（１）
［Ａ≡Ｃ（＋）］
前記構造式（１）において、
Ａは、目的とする遺伝子と結合可能な配列又は目的とする遺伝子配列を有する生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生物活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
‘≡’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸間の相補的な結合を意味し、
Ａで表される生物活性核酸は、全体的に負電荷又は中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を有するということを意味し、
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を帯びるように修飾されたペプチド核酸単量体を一つ以上含む。
【００１８】
本発明はまた、前記皮膚透過性伝達体を含む疾病の診断用組成物及び予防又は治療用組成物を提供する。
【００１９】
本発明はまた、前記皮膚透過性伝達体を投与する段階を含む疾病の予防又は治療方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、疾病の予防又は治療のための前記皮膚透過性伝達体の用途を提供する。
【００２１】
本発明はまた、疾病の予防又は治療用薬剤の製造のための前記皮膚透過性伝達体の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図１Ａ〜図１Ｅは、皮膚透過性伝達体内の生物活性核酸とキャリアペプチド核酸が結合した構造を図式化した図である。
（Ａ）逆平行結合の形態で結合した構造、
（Ｂ）平行結合の形態で結合した構造、
（Ｃ）皮膚透過性伝達体に治療用薬物が結合した構造、
（Ｄ）皮膚透過性伝達体にエンドソーム脱出を助ける物質（ｍ）が結合した構造、
（Ｅ）皮膚透過性伝達体にエンドソーム脱出を助ける物質（ｍ）と治療用薬物がともに結合した構造。
図２は、皮膚角質層、表皮層及び真皮層を示す図である。
図３の（Ａ）はｓｉＲＮＡ  ｓｉｎｇｌｅ及びｄｕｐｌｅｘの皮膚伝達能力を示す図であり、ｓｉＲＮＡ単一では表皮から真皮への伝達が確認されなかったことを示し、（Ｂ）は核酸複合体の皮膚伝達能力を示す図であり、核酸複合体が表皮から真皮に伝達され、２４時間後には真皮まで伝達されたことを確認したことを示す。
図４Ａ〜図４Ｌは、ｃｙ３−標識されたｓｉＲＮＡの皮膚伝達（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）能力テスト結果を示す図である。
（Ａ）キャリアペプチド核酸と同じ長さの相補的に結合する生物活性核酸のチャージ（ｃｈａｒｇｅ）に変化を与え、ヌードマウスの背中に処理して１時間後の核酸複合体の皮膚伝達能力、
（Ｂ）生物活性核酸よりも短いキャリアペプチド核酸に相補的に結合する生物活性核酸のチャージに変化を与え、ヌードマウスの背中に処理して１時間後の核酸複合体の皮膚伝達能力、
（Ｃ）キャリアペプチド核酸と同じ長さの相補的に結合する生物活性核酸のチャージに変化を与え、ヌードマウスの背中に処理して３時間後の核酸複合体の皮膚伝達、
（Ｄ）生物活性核酸よりも短いキャリアペプチド核酸に相補的に結合する生物活性核酸のチャージに変化を与え、ヌードマウスの背中に処理して３時間後の核酸複合体の皮膚伝達能力、
（Ｅ）キャリアペプチド核酸と同じ長さの相補的に結合する生物活性核酸のチャージに変化を与え、ヌードマウスの背中に処理して２４時間後の核酸複合体の皮膚伝達能力、
（Ｆ）生物活性核酸よりも短いキャリアペプチド核酸に相補的に結合する生物活性核酸のチャージに変化を与え、ヌードマウスの背中に処理して２４時間後の核酸複合体の皮膚伝達能力、
（Ｇ）全体的に負電荷を干支は生物活性核酸に様々なチャージを有するキャリアペプチド核酸が結合した様々な複合体をヌードマウスの背中に処理して１時間後の皮膚伝達能力、
（Ｈ）全体的に負電荷を帯びる生物活性核酸に様々なチャージを有するキャリアペプチド核酸が結合した様々な複合体をヌードマウスの背中に処理して３時間後の皮膚伝達能力、
（Ｉ）全体的に負電荷を帯びる生物活性核酸に様々なチャージを有するキャリアペプチド核酸が結合した様々な複合体をヌードマウスの背中に処理して２４時間後の皮膚伝達能力、
（Ｊ）全体的に負電荷を帯びる生物活性核酸に様々な長さを有するキャリアペプチド核酸が結合した様々な複合体をヌードマウスの背中に処理して１時間後の皮膚伝達能力、
（Ｋ）全体的に負電荷を帯びる生物活性核酸に様々な長さを有するキャリアペプチド核酸が結合した様々な複合体をヌードマウスの背中に処理して３時間後の皮膚伝達能力、
（Ｌ）全体的に負電荷を帯びる生物活性核酸に様々な長さを有するキャリアペプチド核酸が結合した様々な複合体をヌードマウスの背中に処理して２４時間後の皮膚伝達能力。
図５Ａ〜図５Ｃは、低分子物質を含む核酸複合体の皮膚伝達能力を示す図である。
（Ａ）低分子物質を含む核酸複合体処理０時間後の皮膚伝達能力、
（Ｂ）低分子物質を含む核酸複合体処理３時間後の皮膚伝達能力、
（Ｃ）低分子物質を含む核酸複合体処理２４時間後の皮膚伝達能力。
図６Ａ〜図６Ｆは、ＩＦＩ１６を標的遺伝子とする核酸複合体の皮膚疾患である乾癬に対する実験管試験及び動物試験における治療効果を示す図である。
（Ａ）ＩＬ−１７Ａによって誘導されたヒト由来角質細胞株で細胞生存率、
（Ｂ）ＩＬ−１７Ａによって誘導されたヒト由来角質細胞株で標的遺伝子の発現及び下位経路遺伝子の発現、
（Ｃ）イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）で誘導した乾癬疾患動物モデルにおいてマウス耳の乾癬表現型が減少すること示す写真、
（Ｄ）イミキモドで誘導した乾癬疾患動物モデルにおいてマウス耳の厚さが減少し、標的遺伝子の発現が減少することを示す図、
（Ｅ）イミキモドで誘導した乾癬疾患動物モデルにおいてイミキモドによって増加したマウスの耳組織の表皮の厚さが核酸複合体によって減少することをＨ＆Ｅ染色で示す図、
（Ｆ）イミキモドで誘導した乾癬疾患動物モデルにおいてイミキモドによって増加したマウスの耳組織の乾癬マーカ−（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｍａｒｋｅｒ）であるＣＤ３、ＣＤ１１ｃの発現が核酸複合体によって減少することを免疫染色法で示す図。
図７Ａ及び図７Ｂは、ＴＧＦβＲ２を標的遺伝子とする核酸複合体の転移性皮膚黒色腫細胞株における細胞転移能力抑制効果を示す図である（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｗｉｔｈ  ＴＧＦβＲ２  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＰＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）。
（Ａ）ＴＧＦβ−２で誘導された皮膚転移性黒色腫細胞株で標的遺伝子発現及び下位経路遺伝子の発現、
（Ｂ）ＴＧＦβ−２で誘導された皮膚転移性黒色腫細胞株で細胞の転移能力。
図８Ａ〜図８Ｊは、ＴＬＲ２を標的遺伝子とする核酸複合体のアトピー皮膚炎誘導様細胞モデル及びアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおける治療効果を示す図である。
（Ａ）ＤＮＣＢで誘導したヒト由来角質細胞株で細胞生存率変化、
（Ｂ）ＤＮＣＢで誘導したヒト由来角質細胞株で標的遺伝子発現及び下位経路遺伝子の発現、
（Ｃ）ＮＣ／Ｎｇａマウスで核酸複合体によってマウスのアトピー皮膚炎表現型が減少することを示す写真、
（Ｄ）イエダニ抽出物を用いてアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスで核酸複合体によって血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣの濃度が減少することを示す図、
（Ｅ）ＤＮＣＢを用いてアトピー皮膚炎を誘発したＢａｌｂ／Ｃマウスで核酸複合体によってマウスのアトピー皮膚炎表現型が減少することを示す写真、
（Ｆ）ＤＮＣＢを用いてアトピー皮膚炎を誘発したＢａｌｂ／Ｃマウスで核酸複合体によって血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣの濃度が減少することを示す図、
（Ｇ）イエダニ抽出物を用いてアトピー皮膚炎を誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスで核酸複合体による表皮厚さの減少を示す図、
（Ｈ）ＤＮＣＢを用いてアトピー皮膚炎を誘発したＢａｌｂ／Ｃマウスで核酸複合体による表皮厚さの減少を示す図、
（Ｉ）イエダニ抽出物を用いてアトピー皮膚炎を誘発したＮＶ／Ｎｇａマウスで核酸複合体による炎症性マーカーＣＤ３が減少することを示す図、
（Ｊ）ＤＮＣＢを用いてアトピー皮膚炎を誘発したＮＶ／Ｎｇａマウスで核酸複合体による炎症性マーカーＣＤ３が減少することを示す図。
図９Ａ及び図９Ｂは、ｓｍａｄ３を標的遺伝子とする核酸複合体のヒト由来角質細胞株における細胞損傷回復効果を示す図である。
（Ａ）ＴＧＦβ−１で誘導されたヒト由来角質細胞株で怪我後回復能、
（Ｂ）ＴＧＦβ−１で誘導されたヒト由来角質細胞株で標的遺伝子発現。
図１０Ａ及び図１０Ｂは、ＴＩＥＧ１を標的遺伝子とする核酸複合体のケロイド性線維芽細胞細胞における細胞成長抑制効果を示す図である。
（Ａ）怪我後肥大症組織から分離した細胞株で細胞生存率、
（Ｂ）怪我後肥大症組織から分離した細胞株で標的遺伝子及び下位経路遺伝子の発現。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野に周知されており、通常用いられるものである。
【００２４】
本発明の一実施例において、生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸が相補的に結合した核酸複合体が、皮膚透過性及び皮膚残留性があることを確認し、皮膚表面塗布によって疾病の治療に活用できることを確認した。
【００２５】
したがって、本発明は一観点において、下記構造式（１）の構造を有する核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体に関する。
構造式（１）
［Ａ≡Ｃ（＋）］
前記構造式（１）において、
Ａは、目的とする遺伝子と結合可能な配列又は目的とする遺伝子配列を有する生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
Ｃは、生物活性核酸と結合可能なキャリアペプチド核酸（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）であり、
‘≡’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸間の相補的な結合を意味し、
Ａで表される生物活性核酸は、全体的に負電荷又は中性を有し、
Ｃ（＋）は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を有するということを意味し、
キャリアペプチド核酸は、キャリアペプチド核酸が全体的に正電荷を帯びるように修飾されたペプチド核酸単量体を一つ以上含む。
【００２６】
本発明において構造式（１）による核酸複合体における生物活性核酸とキャリアペプチド核酸は逆平行結合（ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）又は平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）形態を有することができる（図１Ａ及び図１Ｂ参照）。
【００２７】
本発明において“皮膚透過性伝達体”とは、生物活性物質を細胞内に伝達するための手段であり、皮膚との接触によって生物活性物質を体内、窮極的に細胞内に浸透させることができる伝達物質を意味し、具体的には、皮膚の表皮層の最外層である角質層及び／又は表皮層を通過して、表皮層や真皮層に目的する薬物を伝達したり、或いは真皮層も通過して体内に目的する薬物を伝達できる能力を有する物質を意味する。
【００２８】
本発明に係る皮膚透過性伝達体は、構造式（１）による核酸複合体における全体的な電荷量（ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）及び／又は核酸複合体における生物活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸の個数などによって角質層、表皮層又は真皮層に残留したり、或いは真皮層まで通過して体内に目的する薬物を伝達することができる。
【００２９】
これによって、本発明において、前記核酸複合体を含む皮膚透過伝達体は、皮膚残留性を有することを特徴とし得る。本発明の一実施例において、皮膚角質層、表皮層及び真皮層に前記生物活性核酸が存在することを確認した。
【００３０】
本発明において、“皮膚透過性伝達体”において生物活性核酸自体が治療用薬物として働いてもよく（図１Ａ及び図１Ｂ参照）、また“皮膚透過性伝達体”に疾病の治療のための治療用薬物などがさらに結合した形態であってもよい（図１Ｃ参照）。
【００３１】
すなわち、構造式１による核酸複合体自体が皮膚透過性伝達体でありながら治療剤として用いられてもよく、核酸複合体に治療用薬物が結合した形態で用いられてもよい。
【００３２】
特に、本発明に係る“皮膚透過性伝達体”は、皮膚を通して体内に経皮伝達（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）された後、目的する細胞内に伝達され得る特性を有し、前記核酸複合体を含有するいかなる形態でも利用可能である。
【００３３】
本発明において、“生物活性核酸”は、発現を減少させようとする目的する標的遺伝子と結合できる相補的な配列、特に当該目的する標的遺伝子のｍＲＮＡに結合できる相補的な配列を有するか、発現させようとする標的遺伝子の発現を促進する配列を含む核酸を含む核酸であり、当該遺伝子の発現を抑制又は促進するなどの遺伝子発現調節に関与する核酸を意味し、発現を減少又は増加させようとする標的遺伝子に相補的な配列を有する核酸であるか、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ配列に相補的な配列の核酸であり得る。
【００３４】
特に、本発明における“生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）”は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で標的遺伝子及びこれを含む塩基配列と結合して当該遺伝子の固有機能（例えば、転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）発現又はタンパク質発現）を活性化又は阻害させたり、或いはｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ）を調節（例えば、エクソンスキッピング（ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ））するなどの機能を果たすことを特徴とし得る。前記塩基配列は、遺伝子調節部位（ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又は遺伝子部位（ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はスプライシング調節部位（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であることを特徴とし得る。前記遺伝子調節部位は、プロモーター、転写エンハンサー、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ウイルスパッケージング配列、及び選択マーカーから選択されることを特徴とし得る。前記遺伝子部位はエクソン又はイントロンであり得、前記遺伝子部位は遺伝子の転写開始部位の１０、５、３、１ｋｂ又は５００、３００、２００ｂｐ内に、例えば、開始部位の上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）又は下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に存在できる。また、前記スプライシング調節部位は、エクソンスキッピング、 隠されたスプライシング（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）、擬似スプライス部位活性化（ｐｓｅｕｄｏ−ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、イントロン保持（ｉｎｔｒｏｎ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、選択的スプライシングディレギュレーション（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）関連配列を含むことができる。
【００３５】
本発明において“キャリアペプチド核酸”は、生物活性核酸と一部或いは全部の塩基が相補的に結合して機能性を付与する核酸を意味し、本発明で用いられるキャリアペプチド核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）だけでなく、これと類似な修飾された核酸を使用することもでき、ペプチド核酸が好ましいが、これに限定されるものではない。
【００３６】
本発明において、前記皮膚透過伝達体に含まれる核酸複合体は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質をさらに含み、下記構造式（２）の構造を有することを特徴とし得る。
【００３７】
すなわち、本発明に係る“皮膚透過性伝達体”は、エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質が結合した形態であり得る（構造式（２）、図１Ｄ及び図１Ｅ参照）。
【００３８】
構造式（２）
［ｍＡ≡ｍＣ（＋）］
前記構造式（２）において、
‘ｍ’は、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸のエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）を助ける物質を意味する。
【００３９】
本発明において、前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸は、それぞれの核酸の５’末端と３’末端にエンドソーム脱出を助ける物質を含むことを特徴とし得る。
【００４０】
本発明において、“エンドソーム脱出を助ける物質”は、エンドソーム内部の浸透圧を増加させたり、エンドソームの膜を不安定化させる方法によって生物活性核酸のエンドソームで脱出を助けることを特徴とし得る。生物活性核酸がより効率的で迅速に核や細胞質に移動して標的遺伝子に出会って作用するように助けることを意味する（Ｄ．Ｗ．Ｐａｃｋ，Ａ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｐｕｎ，Ｐ．Ｓ．Ｓｔａｙｔｏｎ，“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．，４，５８１−５９３（２００５））。
【００４１】
前記エンドソーム脱出を助ける物質として生物活性核酸にはＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＦ（配列番号４９）の配列を有するペプチドがリンカー媒介で連結可能であり、キャリアペプチド核酸もヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）（１０）をリンカー媒介で連結する方法で結合することを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００４２】
本発明において、前記エンドソーム脱出を助ける物質は、ペプチド、脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）及びｐＨ感応性高分子（ｐＨ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とし得る。
【００４３】
本発明において、前記ペプチドは、ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号４８）、ＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＦ（配列番号４９）及びヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）（１０）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【００４４】
本発明において、前記脂質ナノ物質（ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、脂質（Ｌｉｐｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）、パルミチン酸セチル（ｃｅｔｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ポロキサマー１８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８）、Ｔｗｅｅｎ  ８５、トリステアリングリセリド（ｔｒｉｓｔｅａｒｉｎ  ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）及びＴｗｅｅｎ  ８０からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【００４５】
本発明において、前記接合体ナノ物質（ｐｏｌｙｐｌｅｘ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、ポリ（アミドアミン）（ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ））又はＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）であることを特徴とし得る。
【００４６】
本発明において、前記高分子ナノ球（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）は、ポリカプロラクトン（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ））、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ）、ポリグリコール酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド）（ｐｏｌｙ（ｄ，ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ））、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）及びＰＬＧＡ−ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【００４７】
本発明において、前記無機物ナノ物質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）はＦｅ２Ｏ３Ｆｅ３Ｏ４、ＷＯ３及びＷＯ２．９からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【００４８】
本発明において、前記陽イオン脂質ナノ物質（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）は、１−（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｂｉｓ［Ｎ−（ｏｌｅｉｃｙｌｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−１−ａｍｉｎｏ−ｅｔｈｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ］、ＰＴＡのＮ−アルキル化誘導体（Ｎ−ａｌｋｙｌａｔｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ＰＴＡ）及び３，５−ジドデシルオキシベンズアミジン（３，５−ｄｉｄｏｄｅｃｙｌｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【００４９】
本発明において、前記陽イオン高分子（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）は、ビニルピロリドン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩（ｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ−Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ  ａｃｉｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｉｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｐｈａｔｅ）、ポリイソブチレン（ｐｏｌｙｉｓｏｂｕｔｙｌｅｎｅ）及びポリ（Ｎ−ビニルカルバゾール）（ｐｏｌｙ（Ｎ−ｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ））から構成される群から選ばれることを特徴とし得る。
【００５０】
本発明において、前記ｐＨ感応性高分子（ｐＨ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）は、ポリ酸（ｐｏｌｙａｃｉｄｓ）、ポリ（アクリル酸）（ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））、ポリ（メタクリル酸）（ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ））及び加水分解されたポリアクリルアミド（ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
【００５１】
本発明において、前記皮膚透過性伝達体に含まれる核酸複合体は、前述したように、治療用薬物、例えば治療用タンパク質、治療用化合物、癌化学治療剤、トキシン、細胞毒性物質、消炎剤、関節炎治療剤、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのようなＲＮＡｉ、アンチセンス、核酸、核酸類似体、細胞、ウイルス、ファージ、ウイルス粒子、ファージ粒子、ウイルスカプシド、ファージカプシド、ウイルス様粒子、リポソーム、マイセル、ビーズ、ナノ粒子、マイクロ粒子、化学治療剤、造影剤、映像剤、標識（ｌａｂｅｌ）、標識化剤又はその配合物からなる群から選ばれるいずれか一つ以上をさらに含むことを特徴とし得る。
【００５２】
本発明に係る皮膚透過性伝達体に含まれる核酸複合体と治療用薬物は共有結合又はリンカー−媒介された形態で結合され得る。
【００５３】
本発明において、前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸はそれぞれ２〜５０個、好ましくは５〜３０個、より一層好ましくは１０〜２５個、最も好ましくは１５〜１７個の核酸単量体を含むことを特徴とし得る。
【００５４】
前記生物活性核酸は天然（ｎａｔｕｒａｌ）核酸塩基及び／又は修飾された核酸単量体からなっていることを特徴とし得る。
【００５５】
本発明において、前記生物活性核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾された核酸であるＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＭＯ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＧＮＡ（ｇｌｙｃｏｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＮＡ（ｔｈｒｅｏｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びＤＮＡｚｙｍｅからなる群から選ばれることを特徴とし、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾された核酸であるＰＮＡ、ＰＭＯ、ＬＮＡ、ＧＮＡ及びＴＮＡからなる群から選ばれることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００５６】
本発明において、前記生物活性核酸に使用された単量体がＰＮＡの場合、生物活性ペプチド核酸といい、他の単量体が使用された場合にも同じ方式で呼ぶ。
【００５７】
本発明において、前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸は、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、２’０−メチル（２’０−ｍｅｔｈｙｌ）、２’メトキシ−エチル（２’  ｍｅｔｈｏｘｙ−ｅｔｈｙｌ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）及びホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）から構成される群から選ばれるいずれか一つ以上の官能基をさらに含むことを特徴とし得る。
【００５８】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸は、前記生物活性核酸と塩基配列の一部或いは全部が相補的な配列で構成されることを特徴とし得る。特に、キャリアペプチド核酸は、ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）を一つ以上含むことができ、キャリアペプチド核酸の全てがユニバーザル塩基からなってもよい。
【００５９】
本発明において、前記皮膚透過性伝達体に含まれる核酸複合体内の前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸のそれぞれは、電気的特性が全体的に、正電荷（陽性）、負電荷（陰性）又は中性電荷を有することを特徴とする複合体であり得る。
【００６０】
前記電気的特性の表現において、“全体的に”との意味は、個別塩基の電気的特性ではなく全体的な生物活性核酸又はキャリアペプチド核酸のそれぞれの電荷が外部から見て全体的な電気的特性であることを意味し、例えば、生物活性核酸内の一部単量体が陽性を有しても、陰性を有する単量体の個数が相対的に多く存在する場合には、生物活性核酸は“全体的に”電気的特性からして負電荷を有するものであり、キャリアペプチド核酸内の一部塩基及び／又はバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）が陰性を有しても、陽性を有する塩基及び／又はバックボーンの個数が相対的に多く存在する場合には、キャリアペプチド核酸は“全体的に”電気的特性からして正電荷を有するものである。
【００６１】
このような観点で、本発明の構造式（１）の構造を有する核酸複合体は、全体的に正電荷を有することを特徴とし得る。前記構造式（１）による核酸複合体において、好ましくは前記生物活性核酸は全体的に電気的特性からして負電荷又は中性の特性を有し、前記キャリアペプチド核酸は全体的に電気的特性からして正電荷特性を有することを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【００６２】
本発明において、前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸の電気的特性の付与は、修飾されたペプチド核酸単量体を使用することができ、修飾されたペプチド核酸単量体は、正電荷を有するキャリアペプチド核酸として、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ，ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，Ｏｒｎ）及びアミノ酸類似体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の正電荷のアミノ酸を含み、負電荷を有するキャリアペプチド核酸として、負電荷のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ）又はアミノ酸類似体の負電荷のアミノ酸を含むことを特徴とし得る。
【００６３】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸は全体的に正電荷を有するように１個以上のガンマ−又はアルファ−バックボーン修飾ペプチド核酸単量体を含むことを特徴とし得る。
【００６４】
前記ガンマ−或いはアルファ−バックボーン修飾ペプチド核酸単量体は、電気的陽性を有するように、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ，Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）、ジアミノ酪酸（Ｄｉａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ，ＤＡＢ）、オルニチン（Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ，Ｏｒｎ）及びアミノ酸類似体からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の正電荷を有するアミノ酸をバックボーンに含むことを特徴とし得る。
【００６５】
本発明において、電荷付与のためのペプチド核酸単量体の修飾は、前記バックボーン修飾の他にも、ヌクレオ塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）が修飾されたペプチド核酸単量体を使用することができる。好ましくは、電気的陽性を有するようにアミン、トリアゾール、イミダゾール残基をヌクレオ塩基に含んだり、或いは電気的陰性を有するようにカルボン酸を塩基に含むことを特徴とし得る。
【００６６】
本発明において、前記キャリアペプチド核酸の修飾ペプチド核酸単量体は、負電荷をバックボーン或いはヌクレオ塩基にさらに含んでもよいが、修飾ペプチド核酸単量体は、正電荷を有する単量体が負電荷を有する単量体に比べて多く含まれ、全体的にキャリアペプチド核酸の電荷が陽性になることが好ましい。
【００６７】
好ましくは、本発明に係る前記構造式（１）の核酸複合体は、全体的に陽の電荷を有することを特徴とする。
【００６８】
本発明に係る前記構造式（１）の核酸複合体において、疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー又は蛍光／発光マーカーなどからなる群から選ばれる一つ以上の物質が生物活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸に結合していることを特徴とし、好ましくは、前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー及びイメージングのための蛍光／発光マーカーなどからなる群から選ばれる一つ以上の物質は、前記キャリアペプチド核酸に結合したものであり得る。
【００６９】
本発明において前記疎水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、親水性残基（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ）、標的抗原特異的抗体、アプタマー、クエンチャー、蛍光マーカー及び発光マーカーからなる群から選ばれる一つ以上の物質と生物活性核酸及び／又はキャリアペプチド核酸の結合は、単純共有結合又はリンカーで媒介した共有結合であることを特徴とし得るが、これに限定されるものではない（表１参照）。好ましくは、前記核酸運搬体に結合した細胞透過、溶解度、安定性、運搬及びイメージング関連物質（例えば、疎水性残基など）は、標的遺伝子の発現を調節する生物活性核酸と独立して存在する。
【００７０】
本発明において、前述したように、前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸の相補的な結合形態は、大きく、逆平行結合（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）と平行結合（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）の形態を有することを特徴とし得る。前記相補的な結合形態は、生物活性核酸の目的配列（生物活性核酸と相補的な配列）の存在下で分離される構造を有する。
【００７１】
前記逆平行結合と平行結合は、ＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＰＮＡの結合方式において、５’−方向性と３’−方向性によって決定される。逆平行結合は一般的なＤＮＡ−ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＰＮＡの結合方式であり、本発明に係る構造式（１）の核酸複合体を取り上げて説明すると、生物活性核酸は５’から３’方向に、キャリアペプチド核酸は３’から５’方向に互いに結合する形態を意味する。平行結合は逆平行結合に比べては結合力が多少劣る形態であり、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸の両方とも５’から３’方向に又は３’から５’方向に互いに結合する形態を意味する。
【００７２】
本発明に係る構造式（１）の核酸複合体において、好ましくは前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力は、生物活性核酸と生物活性核酸の目的とする遺伝子、特に目的遺伝子のｍＲＮＡとの結合力よりも低いことを特徴とし得る。前記結合力は、融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ又はＴｍによって決定される。
【００７３】
前記生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸の結合力（融解温度、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｍ）を生物活性核酸と生物活性核酸の目的とする遺伝子、特に目的遺伝子のｍＲＮＡとの結合力よりも低くするための具体的な方法は、例えば、前記生物活性核酸とキャリアペプチド核酸が平行結合（Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ）又は部分特異結合（Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）することを特徴とし得るが、これに限定されるものではない。
【００７４】
他の例として、前記キャリアペプチド核酸がリンカー、ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）及び生物活性核酸の対応する塩基と相補的でない塩基を有するペプチド核酸塩基から構成された群から選ばれる一つ以上のペプチド核酸塩基を有することを特徴とし得るが、これに限定されるものではない（表１参照）。
【００７５】
本発明において、前記ユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）などの天然塩基と選択性無しで結合し、相補的な結合力よりも低い結合力を有する塩基としてイノシンＰＮＡ（ｉｎｏｓｉｎｅ  ＰＮＡ）、インドールＰＮＡ（ｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）、ニトロインドールＰＮＡ（ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ＰＮＡ）及び無塩基（ａｂａｓｉｃ）からなる群から選ばれる一つ以上を使用でき、好ましくはイノシンＰＮＡを使用することを特徴とし得る。
【００７６】
【表１】
2021520402.tif 000003
【００７７】
前記表１で、Ｎは核酸の塩基（ＡＴＧＣ）で、＊はアンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）配列と相補的でない配列で、＄はユニバーザル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）で、＝はリンカーであり、５’−、３’−は核酸（塩基）の方向性を表す。
【００７８】
本発明において、前記核酸複合体の機能調節のための核酸の結合形態と電気的性質組合せを提供し、前記核酸の結合形態と電気的性質組合せで粒子サイズ及び作用時点を調節し、細胞透過性、溶解度及び特異度を向上させることを特徴とし得る。
【００７９】
本発明において、前記生物活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の結合力調節により、目的遺伝子の存在下で、生物活性ペプチド核酸が目的配列と結合する時点（生物活性核酸の目的配列への置換される時点、標的特異的分離及び結合時点）などの調節が可能である。
【００８０】
本発明に係る構造式（１）の核酸複合体において、生物活性核酸の目的遺伝子への置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）時点、標的特異的分離及び結合（ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ）時点の調節は、複合体の非特異結合のためのキャリアペプチド核酸の非特異塩基、ユニバーザル塩基及びリンカーの有無、個数及び位置によって調節が可能であることを特徴とし得る。前記ペプチド複合体の相補的な結合の形態である平行（ｐａｒａｌｌｅｌ）又は逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）形態の結合などと前記条件の組合せによって調節が可能であることを特徴とし得る。
【００８１】
本発明において、前記構造式（１）の核酸複合体の粒子は５ｎｍ〜３００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜８０ｎｍ、最も好ましくは１５ｎｍ〜７０ｎｍの大きさを有することを特徴とし得る。
【００８２】
本発明において、前記核酸複合体の粒子サイズは、生物活性ペプチド核酸とキャリアペプチド核酸の電荷バランス（ｃｈａｒｇｅ  ｂａｌａｎｃｅ）を調節することによって調節されることを特徴とし得る。具体的には、キャリアペプチド核酸の正電荷が増加すると粒子のサイズが小さくなるが、キャリアペプチド核酸の正電荷が一定レベルを超えると粒子のサイズが大きくなる特徴を有する。また、粒子サイズを決定する他の重要な要素として、複合体をなす生物活性ペプチド核酸電荷による全般的なキャリアペプチド核酸との適切な電荷バランスによって粒子サイズが決定される。
【００８３】
本発明に係るキャリアペプチド核酸の正電荷は、１個〜７個（正電荷を有する単量体が１個〜７個含まれることを意味する。）、好ましくは２個〜５個、最も好ましくは２個〜３個であり、生物活性核酸の電荷は電荷バランスのネットチャージ（ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）が負電荷０個〜５個、好ましくは０個〜３個である。
【００８４】
本発明において、前記構造式（１）の核酸複合体は、生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸が適切な条件で混成化されることによって製造され得る。
【００８５】
本発明の“混成化”は、相補的な一本鎖核酸二本鎖核酸を形成することを意味する。混成化は、２本の核酸鎖間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ）に起こったり又は一部の不整合（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こることができる。混成化に必要な相補性の程度は混成化条件によって変わり、特に結合温度によって調節可能である。
【００８６】
本発明は、他の観点において、前記構造式（１）又は構造式（２）の構造を持つ核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体を含む疾病の診断用組成物に関する。
【００８７】
好ましくは、本発明に係る皮膚透過性伝達体が疾病の診断目的に用いられる場合、構造式（１）による前記生物活性核酸又はキャリアペプチド核酸の両末端には、レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とレポーター蛍光を消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）可能なクエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合できる。前記レポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＨＥＸ（２’，４’，５’，７’，−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙ−４，７−ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及びＣＹ５から構成される群から選ばれる一つ以上であり得、好ましくは、ＣＹ５を使用する。前記クエンチャーはＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２及びＤａｂｃｙｌから構成される群から選ばれるいずれか一つ以上であり得るが、これに限定されるものではない。
【００８８】
本発明は、さらに他の観点において、前記構造式（１）又は構造式（２）の構造を有する核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体を含む疾病の予防又は治療用組成物に関する。
【００８９】
本発明は、さらに他の観点において、前記構造式（１）又は構造式（２）の構造を有する核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体を、予防又は治療が必要な患者に投与することを特徴とする疾病の予防又は治療方法を提供する。
【００９０】
本発明は、さらに他の観点において、疾病の予防又は治療のための前記構造式（１）又は構造式（２）の構造を有する核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体の用途に関する。
【００９１】
本発明は、さらに他の観点において、疾病の予防又は治療用薬剤の製造のための前記構造式（１）又は構造式（２）の構造を有する核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体の使用に関する。
【００９２】
本発明の“標的遺伝子”は、活性、抑制又は標識しようとする核酸配列（塩基配列）を意味し、用語“標的核酸”と同一のものであり、本明細書で同じ意味で使われる。
【００９３】
前記標的遺伝子を含む標的核酸（塩基配列）が生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で前記複合体と接触（結合）すると、キャリアペプチド核酸から生物活性核酸が分離され、生物学的活性を示す。
【００９４】
本発明において、前記構造式（１）又は構造式（２）の構造を有する核酸複合体を用いて診断又は予防、治療可能な疾病は、前記核酸複合体内の生物活性核酸が結合する標的遺伝子又は核酸複合体と結合した治療用薬物によって決定され得、
【００９５】
好ましくは、皮膚疾患、例えば乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、アトピー皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）を含むアトピー疾患（ａｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）などの皮膚癌（ｓｋｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）、ケロイド（Ｋｅｌｏｉｄ）性疾患、皮膚損傷及び色素沈着などの疾患、腫瘍又は癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症、希少疾患及び重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患などの治療に用いられ得るが、これに限定されるものではない。
【００９６】
一方、本発明において、用語“治療用組成物”は、“医薬（薬剤学的、薬学的）組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）”と同じ意味で使用でき、本発明の生物活性核酸及び前記核酸と結合するキャリアペプチド核酸を含む核酸複合体を有効成分として含み、前記核酸複合体に目的する疾患を治療するための治療用薬物がさらに結合した形態であり得る。
【００９７】
これによって、本発明において、前記皮膚通過伝達体を含む治療用組成物を用いて予防又は治療可能な疾病は、皮膚疾患、例えば乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、アトピー皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）を含むアトピー疾患（ａｔｏｐｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）などの皮膚癌（ｓｋｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）、ケロイド（ケロイド）性疾患、皮膚損傷及び色素沈着などの疾患、腫瘍又は癌、炎症性疾患、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症、希少疾患及び重症疾患、心血管疾患、代謝性疾患などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００９８】
本発明の治療用組成物は、標準医薬実施にしたがって皮膚伝達形態の剤形に剤形化できる。それらの剤形は、有効成分の他に、薬学的に許容される、特に皮膚に適用可能な形態の剤形に適した担体、賦形剤、補助剤又は希釈剤などの添加物を含有することもできる。
【００９９】
好ましくは、本発明に係る治療用組成物は、水性液、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、塗抹剤又はパッチの形態に剤形化できる。
【０１００】
最も好ましくは、水性液の形態に剤形化でき、このとき、水性液は蒸留水及びバッファー溶液の形態が用いられ得る。
【０１０１】
用語“薬学的に許容される（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）”とは、化合物の生物学的活性と物性を損傷させない特性を意味する。
【０１０２】
用語“担体（ｃａｒｒｉｅｒ）”とは、細胞又は組織内への核酸複合体の付加を容易にする化合物と定義される。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞又は組織内への多くの有機化合物の投入を容易にする通常の担体である。
【０１０３】
用語“希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）”とは、対象化合物の生物学的活性形態を安定化させるだけでなく、化合物を溶解させる水で希釈される化合物と定義される。バッファー溶液に溶解されている塩は、当該分野で希釈剤として用いられる。通常用いられるバッファー溶液は、リン酸塩バッファー食塩水であり、これはヒト溶液の塩状態を摸倣しているためである。バッファー塩は低い濃度で溶液のｐＨを制御できるので、バッファー希釈剤が化合物の生物学的活性を変形することは稀である。
【０１０４】
本発明における核酸複合体を含有する物質は、患者に、それ単独で又は併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）のように他の活性成分と併用して又は適当な担体や賦形剤と共に混合された医薬組成物として投与できる。
【０１０５】
本発明における使用に適した医薬組成物には、活性成分がそれらの意図した目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より具体的に、治療的有効量は、治療される客体の生存を延長したり、疾患の症状を防止、軽減又は緩和させるのに有効な化合物の量を意味する。治療的有効量の決定は、特に、ここに提供された詳細な開示内容の側面において、通常の技術者の能力範囲内にある。
【０１０６】
本発明で用いられる用語“予防”は、前記皮膚透過性伝達体を含む治療用組成物の投与（又は塗布）により疾患の発病を予防したり、その進行を抑制させる全ての行為を意味する。
【０１０７】
また、本発明で用いられる用語“治療”は、前記皮膚透過性伝達体を含む治療用組成物の投与（又は塗布）により疾患の症状が好転又は完治する全ての行為を意味する。
【０１０８】
本発明において、前記皮膚透過性伝達体を含む疾病の予防又は治療用組成物は、好ましくは皮膚疾患の予防又は治療用組成物であることを特徴とし得る。前記核酸複合体内に含まれた生物活性核酸が結合する標的遺伝子は、ＩＦＩ１６、ＴＧＦβＲ２、ＴＬＲ２、ｓｍａｄ３及びＴＩＥＧ１からなる群から選ばれるいずれか一つ以上を挙げることができるが、これに限定されない。前記皮膚疾患は、乾癬、皮膚癌、アトピー疾患又はケロイド性疾患及び色素沈着などがあるが、これに限定されるものではない。
【０１０９】
好ましくは、本発明は乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）治療用組成物を提供する。本発明に係る乾癬治療用組成物は、配列番号２２で表されるＩＦＩ１６特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号２３又は２４の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１０】
本発明はまた、悪性黒色腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ）治療用組成物を提供する。本発明に係る悪性黒色腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ）治療用組成物は、配列番号２５又は２６の配列であるＴＧＦＲβ２特異的生物活性ペプチド核酸又はそれぞれこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号２７〜３０の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１１】
本発明はまた、アトピー皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）治療用組成物を提供する。本発明に係るアトピー皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）治療用組成物は、配列番号３１又は３２の配列であるＴＬＲ２特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号３３〜３５の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１２】
本発明はまた、皮膚損傷治療用組成物を提供する。前記治療用組成物は皮膚創傷治療（ｓｋｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）を含む皮膚再生（ｓｋｉｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のためのものであるが、これに制限されるものではない。本発明に係る皮膚損傷治療用組成物は、配列番号３６又は３７の配列であるｓｍａｄ３特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号３８〜４１の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１３】
本発明はまた、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）治療用組成物を提供する。本発明に係るケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）治療用組成物は、配列番号４２又は４３の配列であるＴＩＥＧ１特異的生物活性ペプチド核酸及びこれに相補的なキャリアペプチド核酸を含む。キャリアペプチド核酸は、好ましくは、配列番号４４〜４７の配列を有することができ、前記配列の一部がユニバーザル塩基に置換されて用いられてもよい。
【０１１４】
本発明において、前記皮膚透過性伝達体に含まれた核酸複合体は、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）などの伝達体を用いて投与（又は塗布）しもてよい。前記リポソームは、リンパ組織のような特定組織に対して前記複合体を標的化したり、或いは感染細胞に対して選択的に標的化することに役立てることができ、また、前記複合体が含まれた組成物の半減期を増加させることに役立てることができる。リポソームにはエマルジョン、フォーム（ｆｏａｍ）、マイセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層（ｌａｍｅｌｌａｒ  ｌａｙｅｒ）などがある。このような製剤において、送達される前記複合体は、単独で又は特定細胞を対象に、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体のようなリンパ細胞のうち優勢な受容体に結合する分子と共に又はその他治療組成物と共に、リポソームの一部として混入させる。したがって、本発明の所定複合体で充填又は塗布されて（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）前記核酸複合体組成物を送達するリポソームは、リンパ細胞の前記部位に指向され得る。
【０１１５】
本発明によって使用するためのリポソームは一般に、中性及び負電荷リン脂質及びコレステロールなどのステロールをはじめとする標準ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）−形成脂質から形成される。一般に、例えば、血流中のリポソームの安定性、酸不安定性（ａｃｉｄ  ｌａｂｉｌｉｔｙ）及びリポソームのサイズなどを考慮して脂質を選択する。リポソーム製造には様々な方法を用いることができる。例えば、文献［Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９：４６７，１９８０）、及び米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号及び第５，０１９，３６９号］に記載のような方法を用いることができる。
【０１１６】
本発明は、さらに他の観点において、前記構造式（１）又は構造式（２）の構造を有する核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体を個体に投与（又は塗布）して疾病を治療し抑制（又は緩和）する方法を提供する。
【０１１７】
本発明に係る伝達体を用いて治療可能な疾患は、使用される生物活性核酸の特性によって決定され得るが、特に制限されない。
【０１１８】
本発明に係る伝達体を含む組成物は、上記の疾患を治療するために又は前記疾患の症状を抑制（又は緩和）するために医薬として効果的な量で皮膚に適用され得る。皮膚疾患の種類、患者の年齢、体重、症状の特性及び程度、現在治療法の種類、治療回数、適用形態及び経路などの様々な要因によって変わり得るが、当該分野における専門家によって容易に決定され得る。本発明の組成物は、上述した薬理学的又は生理学的成分を共に適用したり順次に適用でき、また、追加の従来の治療剤と併用して適用されてもよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に適用され得る。このような適用は単一又は多重適用であり得る。
【０１１９】
本発明において、“個体”は、本発明に係る皮膚透過性伝達体を投与（塗布）して軽減、抑制又は治療可能な状態又は疾患を病んでいるかその危険がある哺乳動物を意味し、好ましくはヒトを意味する。
【０１２０】
また、本発明の化合物の人体に対する投与量（塗布量）は、患者の年齢、体重、性別、投与（塗布）形態、健康状態及び疾患程度によって変わってもよく、体重が７０kgである成人患者を基準にする時、一般に０．００１〜１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／日であり、医師又は薬剤師の判断によって一定時間間隔で１日１回又は数回分割投与（塗布）してもよい。
【０１２１】
本明細書に記載されている皮膚透過性伝達体又はこれを含む組成物の毒性と治療効率性は、例えば、ＬＤ５０（群集の５０％に対する致死量）、ＥＤ５０（群集の５０％に対して治療効果を有する線量）、ＩＣ５０（群集の５０％に対して治療抑制効果を有する線量）を決定するために、細胞培養又は実験動物における標準製薬過程によって算定され得る。毒性と治療効果間の線量比が治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０（又は、ＩＣ５０）間の比率として表現され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養分析から得られたデータは、ヒトに使用する線量の範囲を算定するために用いることができる。当該化合物の投与量（ｄｏｓａｇｅ）又は塗布量は、好ましくは、毒性がないか或いは殆どない状態でＥＤ５０（又は、ＩＣ５０）を含む循環濃度の範囲内にある。
【０１２２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものとして解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【０１２３】
実施例１：生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）及びキャリアペプチド核酸、及びそれらを用いた複合体の製造
本発明に係る構造式（１）の核酸複合体の皮膚透過効果及び皮膚残留効果の検証のために、標的遺伝子として乾癬疾患標的遺伝子であるＩＦＩ１６を使用した。ＩＦＩ１６は、乾癬疾患を持つ患者の皮膚で共通に発現するタンパク質であり、乾癬治療において主要標的になると予測されている（Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １６  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  ｂｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ６：２５３８１）。
【０１２４】
皮膚透過効果及び皮膚残留効果を確認するために、ＩＦＩ１６に対する生物活性核酸（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）としてアンチセンスペプチド核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＰＮＡ）及びＲＮＡを使用した。
【０１２５】
本発明の生物活性核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＰＮＡ及びＲＮＡ）は、配列番号１〜９に記載される配列で構成されている。本実施例で用いられたペプチド核酸ベース生物活性核酸はイメージングのための蛍光（Ｃｙ３）を３’末端に結合させた。その塩基配列、単量体修飾及び構造は、下記表２の通りである。
【０１２６】
本発明で使用した全てのペプチド核酸は、パナジン（ＰＡＮＡＧＥＮＥ、韓国）でＨＰＬＣ精製方法によって合成した。本発明の実施例による全てのキャリアペプチド核酸は、配列番号１０〜２１に記載される配列で構成されている（表２）。
【０１２７】
【表２】
2021520402.tif 000004
【０１２８】
単量体の修飾は、電気的な性質を付与するためにペプチド核酸のバックボーンを、電気的陽性はリシン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ，（＋）と表記）で、電気的陰性はグルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ，Ｇｌｕ，Ｅ，（−）と表記）で修飾されたペプチドバックボーンを有するように作製した。
【０１２９】
それぞれの生物活性核酸とキャリアペプチド核酸の組合せは、ＤＭＳＯ下で混成化され、その結果、生物活性核酸とキャリアペプチド核酸で構成された複合体が作製された。
【０１３０】
実施例２：生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む核酸複合体の皮膚透過効果分析
実施例１で製造された複合体の皮膚透過効果を確認するために、ヌードマウスの背中に一定量を塗布して１、３、２４時間放置した後、塗布した部位の組織を生検した。生検した組織を４％ホルマリン溶液に固定して１日間放置した後、凍結切片機を用いてマウスの背中組織を２０μｍに切片し、スライドにマウンティングした。マウンティングした組職に対して蛍光顕微鏡を用いて複合体の皮膚透過の有無を確認した。
【０１３１】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表３の通りである。
【０１３２】
【表３】
2021520402.tif 000005
【０１３３】
その結果、図３及び図４Ａ〜図４Ｌに示すように、核酸複合体の様々な組合せにおいて１、３、２４時間で組合せ別皮膚伝達効果を確認した。
【０１３４】
実施例３：構造式（１）の構造を持つ複合体を含有し、低分子物質をリンカー媒介で連結した皮膚透過性伝達体を用いた皮膚透過効果分析
実施例１で製造された複合体と比較して複合体に低分子物質をリンカー媒介で連結した皮膚透過性伝達体の皮膚透過効果を確認するために、ヌードマウスの背中に一定量塗布して０、３、２４時間放置した後、塗布した部位の組織を生検した。生検した組織を４％ホルマリン溶液に固定して１日間放置した後、凍結切片機を用いてマウスの背中組織を２０μｍに切片し、スライドにマウンティングした。マウンティングした組職に対して、蛍光顕微鏡を用いて、皮膚透過性伝達体である核酸複合体に低分子物質を連結した時の皮膚伝達効果を確認した。
【０１３５】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表４の通りである。
【０１３６】
【表４】
2021520402.tif 000006
【０１３７】
その結果、図５Ａ〜図５Ｃに示すように、低分子物質をリンカー媒介で連結した皮膚透過性核酸複合体でも既存核酸複合体と同様に３時間以降から皮膚伝達効果が現れることを蛍光顕微鏡で確認した。
【０１３８】
実施例４：構造式（１）の構造を持つ複合体を含有する皮膚透過性伝達体を用いた乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）治療効果分析
実施例１によって下記表５の構造で製造されたＩＦＩ１６を標的遺伝子とする生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む皮膚透過性伝達体を用いて乾癬治療効果を分析した。
【０１３９】
【表５】
2021520402.tif 000007
【０１４０】
実施例４−１：細胞培養
ＣＬＳ（ＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）から入手したヒト角質細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。乾癬様細胞モデルを作るためにＩＬ−１７Ａを１０ｎｇ／ｍＬで処理して培養した。
【０１４１】
実施例４−２：ＭＴＴ（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）を用いて角質細胞株で細胞生存率分析
実施例１によって表５の構造で製造された生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて９６ウェルプレートに６×１０３に細胞をシードし、２４時間培養後に、実施例４−１の条件で培養されたヒト由来角質細胞株にＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１Ｘ  ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬ濃度で製造し、ウェル当たり２０μＬで処理して４時間培養後、ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）をスペクトロフォトメータで測定して分析した。
【０１４２】
配列番号２２及び配列番号２３の核酸複合体を用いた（ＰＮＡ４）。その結果、図６Ａに示すように、ＩＬ−１７Ａで誘導された乾癬様細胞モデルにおいて核酸複合体によって細胞生存率が濃度依存的に減少することを確認した。
【０１４３】
実施例４−３：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
ヒト由来角質細胞株は、６ウェルプレートに１×１０５で細胞をシードし、２４時間培養後、実施例４−１の条件で実験を行って生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファーを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク溶解物（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｙｓａｔｅ）を得た。タンパク溶解物は、ＢＣＡ分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動してサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）にタンパク質を移した後、１次抗体であるＩＦＩ１６（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ｐ−ＮＦｋＢ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日間放置した。１Ｘ  ＴＢＳ−Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヤギ抗ウサギ（Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ）（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）を１：２０００に処理し、常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭウェストフェムト最大感度基質（ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて角質細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【０１４４】
表５の配列番号２２及び配列番号２３の核酸複合体に対して角質細胞株におけるＩＦＩ１６タンパク質及び下位経路遺伝子の発現パターン分析した。その結果、図６Ｂに示すように、核酸複合体を通して濃度依存的に標的遺伝子の発現及び下位経路遺伝子の発現が時間によって抑制されることを確認した。
【０１４５】
実施例４−４：イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）を用いた乾癬誘導動物モデルにおける乾癬表現型効果分析
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの右耳に毎日６２．５ｍｇの５％イミキモドを塗布して７日間乾癬誘導動物モデルを作り、表５の配列番号２２及び配列番号２３の核酸複合体に対して乾癬モデル表現型を写真で分析し、耳の厚さをマイクロメーターで測定した。
【０１４６】
その結果、乾癬表現型が核酸複合体グループで減少することを確認し（図６Ｃ）、耳の厚さの測定から、乾癬を誘導した動物グループと比較した時、核酸複合体を塗布したグループで耳の厚さが減少することが確認できた（図６Ｄ；ＰＮＡ１は剤形を含んでいない核酸複合体であり、ＰＮＡ２はクリーム剤形を含む核酸複合体）。
【０１４７】
実施例４−５：Ｈ＆Ｅ染色で乾癬誘導動物モデルにおける表現型分析
実施例４−４の条件で実験を行い、最終実験終了日にマウスの耳組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日間固定し、固定した組織をパラフィン包埋して組織を５μｍにセクションし、スライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職をヘマトキシリン：エオイン染色溶液に一定時間染色し、１Ｘ  ＰＢＳで水洗した後、顕微鏡で分析した。
【０１４８】
その結果、図６Ｅに示すように、乾癬を誘導した対照群に比べて核酸複合体を処理したグループにおいて皮膚の表皮の異常増殖が減少したことが確認できた。
【０１４９】
実施例４−６：免疫染色で乾癬誘導動物モデルにおける組織内炎症性マーカー分析
実施例４−４の条件で実験を行い、最終実験終了日にマウスの耳組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日間固定し、固定した組織をパラフィン包埋して５μｍにセクションし、スライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職を０．５％  ＢＳＡ溶液に１時間ブロッキングし、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃの１次抗体溶液を処理して１日間処理した。次いで、１次抗体溶液を除去し、１Ｘ  ＰＢＳで洗浄した後に２次抗体溶液を処理して常温で２時間処理し、ＤＡＢ染色により分析した。
【０１５０】
その結果、図６Ｆに示すように、組織内炎症性マーカーであるＣＤ３とＣＤ１１ｃが、乾癬誘導した対照群に比べて核酸複合体グループにおいて減少することを確認した。
【０１５１】
実施例５：構造式（１）の構造を持つ複合体を含有する皮膚透過性伝達体を用いた悪性黒色腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ）治療効果分析
核酸複合体の悪性黒色腫治療効果分析のために標的遺伝子としてＴＧＦβＲ２を使用した。癌転移作用機序のうちＴＧＦβ−２によって活性化される機序を抑制するＲＮＡベース治療剤の開発が確認されたので、ペプチド核酸複合体を用いた治療効果を検証しようとした。
【０１５２】
【表６】
2021520402.tif 000008
【０１５３】
実施例５−１：細胞培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手した皮膚転移性黒色腫（Ａ３７５ＳＭ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。細胞の転移性確認のためにＴＧＦβ−２を５ｎｇ／ｍＬで処理して培養した。
【０１５４】
実施例５−２：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
転移性皮膚黒色腫細胞株は、６ウェルプレートに１×１０５で細胞をシードし、２４時間培養後、実施例５−１の条件で実験を行って生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファーを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク溶解物を得た。タンパク溶解物は、ＢＣＡ分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動してサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＴＧＦβＲ２（Ａｂｃａｍ、米国）、ＭＭＰ９（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、ｐ−Ａｋｔ１（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日間放置した。１Ｘ  ＴＢＳ−Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス（Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）を１：２０００に処理し、常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて転移性皮膚黒色腫細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【０１５５】
転移性皮膚黒色腫細胞株におけるＴＧＦβＲ２タンパク質及び下位経路遺伝子の発現パターン分析した。本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表７の通りである。
【０１５６】
【表７】
2021520402.tif 000009
【０１５７】
その結果、図７Ａに示すように、核酸複合体によって濃度依存的に標的遺伝子の発現及び下位経路遺伝子の発現が時間によって抑制されることを確認した。
【０１５８】
実施例５−３：細胞移動能力分析（Ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）で核酸複合体を用いた細胞移動能力抑制効果分析
転移性皮膚黒色腫細胞株は、２４ウェルのトランスウェルプレートに２×１０４で細胞を上チャンバーにシードし、全てのチャンバーにはウシ胎児血清のない培地を処理して２４時間培養後、実施例５−１の条件で実験を行い、生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を上チャンバーに処理し、下チャンバーにＴＧＦβ−２を２０ｎｇ／ｍＬで処理して２４、４８、７２時間培養した後、細胞の移動能力を０．５％クリスタルバイオレットで染色した。染色した細胞をメタノールで処理してクリスタルバイオレットを溶かした後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１５９】
前記表７の核酸複合体に対して転移性皮膚黒色腫細胞株における細胞移動力抑制効果を分析した。その結果、図７Ｂに示すように、核酸複合体によって時間別に細胞移動能力が抑制されることを確認した。
【０１６０】
実施例６：構造式（１）の構造を持つ複合体を含有する皮膚透過性伝達体を用いたアトピー皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）治療効果分析
核酸複合体のアトピー皮膚炎治療効果分析のために標的遺伝子としてＴＬＲ２（Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）を使用した。アレルギー誘発物質や細菌が皮膚に浸透する時に発現する遺伝子であるＴＬＲ２はアトピー皮膚炎患者には過発現しており、皮膚内炎症性サイトカインによる炎症増加によってアトピー皮膚炎を悪化させる。このため、ＴＬＲ２はアトピー皮膚炎において主要標的になると予測されている。
【０１６１】
【表８】
2021520402.tif 000010
【０１６２】
実施例６−１：細胞培養
ＣＬＳ（ＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）から入手したヒト角質細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。アトピー皮膚炎様細胞モデルを作るためにイエダニ抽出液５ｎｇ／ｍＬとＤＮＣＢ（２−ｄｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）５μＭを処理して２４時間培養した。
【０１６３】
実施例６−２：ＭＴＴ（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）で角質細胞株における細胞生存率分析
実施例６−１の実験条件で９６ウェルにヒト由来角質細胞株を６×１０３でシードし、２４時間培養した後、表５の構造で製造された生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて処理された細胞株にＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１Ｘ  ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬ濃度に製造し、ウェル当たり２０μＬで処理して４時間培養後、ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）をスペクトロフォトメータで測定して分析した。
【０１６４】
その結果、図８Ａに示すように、イエダニ抽出物又はＤＮＣＢで誘導されたアトピー皮膚炎様細胞モデルにおいて核酸複合体によって細胞生存率が濃度依存的に減少することを確認した。
【０１６５】
実施例６−３：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
ヒト由来角質細胞株は、６ウェルプレートに１×１０５で細胞をシードし、２４時間培養後、実施例６−１の条件で実験を行って生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファーを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク溶解物を得た。タンパク溶解物をＢＣＡ分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動してサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＴＬＲ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、ＭＭＰ９（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、ｐ−ＮＦｋＢ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ＭｙＤ８８（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）、ＴＡＲＣ（Ａｂｃａｍ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日間放置した。１Ｘ  ＴＢＳ−Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）を１：２０００に処理し、常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて角質細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【０１６６】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表９の通りである。
【０１６７】
【表９】
2021520402.tif 000011
【０１６８】
その結果、図８Ｂに示すように、核酸複合体によって濃度依存的に標的遺伝子の発現及び下位経路遺伝子の発現が時間によって抑制されることを確認した。
【０１６９】
実施例６−４：イエダニ抽出物及びＤＮＣＢを用いたアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおけるアトピー皮膚炎表現型効果分析
ＮＣ／Ｎｇａマウスの背中を除毛し、ＡＤクリーム（イエダニ抽出物クリーム、Ｂｉｏｓｔｉｒ、日本）を１００ｍｇずつ１週に２回で総３週間塗布し、イエダニによるアトピー皮膚炎誘発動物モデルを構築した。また、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの背中を除毛し、１週に２回で総３週間５０μＭのＤＮＣＢを塗布し、新居症候群によるアトピー皮膚炎誘発動物モデルを構築した。１週間総３回クリーム剤形の核酸複合体を処理し、アトピー皮膚炎動物モデル表現型を写真で分析し、背中部位の育毛程度をＩｍａｇｅＪで測定した。
【０１７０】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１０の通りである。
【０１７１】
【表１０】
2021520402.tif 000012
【０１７２】
図８Ｃ及び８Ｅに示すように、アトピー皮膚炎表現型が核酸複合体グループで減少することを確認した。
【０１７３】
実施例６−５：血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣ濃度変化分析
実施例６−４の条件で行った動物実験において最終実験終了日にマウス血液を眼窩採血によって収集して常温で２時間以上放置し、遠心分離機（１４，０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）を用いて血清を収集した。収集した血清をＩｇＥ  ＥＬＩＳＡキット（ゴマバイオテック、韓国）及びＴＡＲＣ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、米国）から提供する実験方法に従って血清内ＩｇＥ及びＴＡＲＣの濃度を測定した。
【０１７４】
その結果、図８Ｄ及び図８Ｆに示すように、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて核酸複合体を処理したグループにおいてＩｇＥ及びＴＡＲＣの濃度が陰性対照群と類似なレベルに減少したことが確認できた。
【０１７５】
実施例６−６：Ｈ＆Ｅ染色でアトピー皮膚炎誘導動物モデルにおける組織内表現型分析
実施例６−４の条件で実験を行い、最終実験終了日にマウスの耳組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日間固定し、固定した組織をパラフィン包埋して組織を５μｍにセクションし、スライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職をヘマトキシリン：エオイン染色溶液に一定時間染色し、１Ｘ  ＰＢＳで水洗した後、顕微鏡で分析した。
【０１７６】
その結果、図８Ｇ及び図８Ｈに示すように、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて核酸複合体を処理したグループにおいて皮膚の表皮の異常増殖が減少したことが確認できた。
【０１７７】
実施例６−７：免疫染色で乾癬誘導動物モデルにおける組織内炎症性マーカー分析
実施例６−４の条件で実験を行い、最終実験終了日にマウスの背中組織を生検して４％ホルマリン溶液に１日間固定し、固定した組織をパラフィン包埋して５μｍにセクションし、スライドガラスにマウンティングした。マウンティングした組職を０．５％  ＢＳＡ溶液に１時間ブロッキングし、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃの１次抗体溶液を処理して１日間処理した。次いで、１次抗体溶液を除去し、１Ｘ  ＰＢＳで洗浄した後、２次抗体溶液を処理して常温で２時間処理し、ＤＡＢ染色により分析した。
【０１７８】
その結果、図８Ｉ及び８Ｊに示すように、組織内炎症性マーカーであるＣＤ３が、アトピー皮膚炎を誘導した対照群に比べて核酸複合体グループにおいて減少することを確認した。
【０１７９】
実施例７：構造式（１）の構造を持つ複合体を含有する皮膚透過性伝達体を用いた皮膚再生（ｓｋｉｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）効果分析
核酸複合体の皮膚再生効果分析のために標的遺伝子としてｓｍａｄ３を使用した。ｓｍａｄ３は怪我した皮膚で過発現するタンパク質であり、皮膚再生において主要標的になると予測されている
【０１８０】
【表１１】
2021520402.tif 000013
【０１８１】
実施例７−１：細胞培養
ＣＬＳ（ＣＬＳ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ドイツ）から入手したヒト角質細胞（ＨａＣａＴ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。細胞の移動能力を確認するために、ＴＧＦβ−１を５ｎｇ／ｍＬで処理して培養した。
【０１８２】
実施例７−２：怪我後再生分析（Ｗｏｕｎｄ−Ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）で核酸複合体を用いた細胞移動能力向上効果分析
ヒト由来角質細胞株は、１２ウェルプレートに２×１０４で細胞をシードし、ウシ胎児血清のない培地を処理して２４時間培養後、実施例７−１の条件で実験を行って生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、ＴＧＦβ−１を５ｎｇ／ｍＬで処理して２４、４８時間培養した後、細胞の移動能力を顕微鏡で分析した。
【０１８３】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１２の通りである。
【０１８４】
【表１２】
2021520402.tif 000014
【０１８５】
その結果、図９Ａに示すように、ＴＧＦβ−１を処理した陽性対照群に比べて核酸複合体を処理したグループにおいて細胞の移動能力が向上することを確認した。
【０１８６】
実施例７−３：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現分析
ヒト由来角質細胞株は、６ウェルプレートに１×１０５で細胞をシードし、２４時間培養後、実施例７−１の条件で実験を行って生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８時間培養した後、ＲＩＰＡバッファーを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク溶解物を得た。タンパク溶解物は、ＢＣＡ分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動してサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるｐ−ｓｍａｄ３（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日間放置した。１Ｘ  ＴＢＳ−Ｔを用いて洗浄し、２次抗体であるヤギ抗ウサギ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）を１：２０００に処理し、常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いて角質細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【０１８７】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１３の通りである。
【０１８８】
【表１３】
2021520402.tif 000015
【０１８９】
その結果、図９Ｂに示すように、核酸複合体によって濃度別に標的遺伝子の発現及び下位経路遺伝子の発現が時間によって抑制されることを確認した。
【０１９０】
実施例８：構造式（１）の構造を持つ複合体を含有する皮膚透過性伝達体を用いたケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）治療効果分析
核酸複合体の怪我後肥大症（ケロイド、ｋｅｌｏｉｄｓ）治療効果分析のために標的遺伝子としてＴＩＥＧ１を使用した。ＴＩＥＧ１はケロイド患者の皮膚組織で過発現するタンパク質であり、ケロイド治療において主要標的になると予測されている。
【０１９１】
【表１４】
2021520402.tif 000016
【０１９２】
実施例８−１：細胞培養
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手したケロイド線維芽細胞細胞（ＫＥＬ  ＦＩＢ）を、ＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、ウェルジン、韓国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【０１９３】
実施例８−２：ＭＴＴ（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）でケロイド線維芽細胞細胞株における細胞生存率分析
実施例８−１の実験条件で９６ウェルにケロイド線維芽細胞細胞株を６×１０３でシードし、２４時間培養した後、表５の構造で製造された生物活性核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を用いて処理された細胞株に、ＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）溶液を１Ｘ  ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬ濃度に製造し、ウェル当たり２０μＬで処理して４時間培養後、ＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）をスペクトロフォトメータで測定して分析した。
【０１９４】
本実施例で使用した核酸複合体の組合せは、下記表１５の通りである。
【０１９５】
【表１５】
2021520402.tif 000017
【０１９６】
その結果、図１０Ａに示すように、ケロイド線維芽細胞細胞株において核酸複合体によって細胞生存率が濃度依存的に減少することを確認した。
【０１９７】
実施例８−３：ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で遺伝子発現の分析
ケロイド線維芽細胞細胞株は、６ウェルプレートに１×１０５で細胞をシードし、２４時間培養後、実施例８−１の条件で実験を行って生物活性ペプチド核酸及びキャリアペプチド核酸を含む複合体を処理し、２４、４８、７２時間培養した後、ＲＩＰＡバッファーを各ウェルに３０μＬずつ添加してタンパク溶解物を得た。タンパク溶解物は、ＢＣＡ分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を用いてタンパク質の量を定量し、タンパク質３０μｇを電気泳動してサイズ別に分離し、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移した後、１次抗体であるＴＩＥＧ１（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、ｐ−ｓｍａｄ２（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）、ｓｍａｄ７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を１：１０００に処理し、４℃で１日間放置した。１Ｘ  ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、２次抗体であるヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、米国）を１：２０００に処理し、常温で２時間放置した。ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＴＭウェストフェムト最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、米国）を処理し、Ｉｍａｇｅ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ドイツ）装備を用いてケロイド線維芽細胞細胞株において標的遺伝子の発現抑制効率を分析した。
【０１９８】
前記表１４の核酸複合体に対して角質細胞株におけるＴＩＥＧ１タンパク質及び下位経路遺伝子の発現パターン分析した。その結果、図１０Ｂに示すように、核酸複合体によって濃度依存的に標的遺伝子の発現及び下位経路遺伝子の発現が時間によって抑制されることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
本発明によれば、構造式（１）の構造を持つ核酸複合体を含有する皮膚透過性伝達体は、大きい分子量の薬物を効果的に伝達するための皮膚透過機能と体内有効性を同時に有する。
【０２００】
本発明に係る伝達体は、特に、生物活性核酸又は様々な化合物の皮膚角質層、表皮層及び／又は真皮層通過を可能にし、皮膚表面に塗布される治療用薬物の外用的処置及び血液などの体内循環系に目的する薬物が伝達されることを可能にする。
【０２０１】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
2021520402.tif 000030
【図４Ｇ】
2021520402.tif 000031
【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
2021520402.tif 000033
【図４Ｊ】
2021520402.tif 000034
【図４Ｋ】
2021520402.tif 000035
【図４Ｌ】
2021520402.tif 000036
【図５Ａ】
2021520402.tif 000037
【図５Ｂ】
2021520402.tif 000038
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
2021520402.tif 000059
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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