(57)【要約】  免疫グロブリンＡおよび他の生物学的治療用タンパク質のための安定化した製剤。約ｐＨ５〜約８の少なくとも１つのｐＨ緩衝剤と、任意選択の非イオン性界面活性剤と、アミノ酸、糖／ポリオール、塩化物塩、カルボン酸、洗浄剤、天然タンパク質、タンパク質発現抽出物、およびその混合物からなる群から選択される１つ以上の任意選択の安定剤とを含んでなる製剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ約５〜約８のｐＨ緩衝剤に分散した治療上有効な量の免疫グロブリンを含んでなる安定化した予防用および／または治療用製剤であって、前記製剤は、任意選択の非イオン性界面活性剤および１つ以上の任意選択の安定剤をさらに含んでなり、前記製剤は、機械的撹拌および／または凍結／融解サイクル後に物理的および化学的安定性を示す、製剤。
【請求項２】
製剤が、製造、精製、および保存中に安定なままであり、少なくとも５０％の回収率の安定な免疫グロブリンを有する、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３】
製剤が、約２５℃および６０％ＲＨで最大約６ヵ月間の保存条件下で、少なくとも５０％の回収率の安定な免疫グロブリンを有する、請求項２に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４】
前記製剤が、消化管条件下で前記免疫グロブリンの安定性を示す、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項５】
前記免疫グロブリンがＩｇＡである、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項６】
前記製剤が、最大約２００ｍｇ／ｍｌのＩｇＡを含んでなる、請求項５に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項７】
前記ＩｇＡが、単量体ＩｇＡ、二量体ＩｇＡ、ｓＩｇＡ、ＩｇＡのグリコシル化型または非グリコシル化型、化学的バリアント、組換え型、それらのマイナー変異体、またはそれらの組合せである、請求項５に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項８】
前記ＩｇＡがｓＩｇＡである、請求項７に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項９】
前記ｓＩｇＡが組換えｓＩｇＡである、請求項８に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１０】
前記組換えｓＩｇＡが、植物系において発現している、請求項９に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１１】
前記製剤が、前記植物系において発現した組換えｓＩｇＡおよび単量体ＩｇＡの組合せを含んでなる、請求項１０に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１２】
前記植物系が単子葉植物である、請求項１０に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１３】
植物系が、コムギ(Triticum sps.)、イネ(Oryza sps.)、オオムギ(Hordeum sps.)、エンバク(Avena sps.)、ライムギ(Secale sps.)、トウモロコシ(corn)（トウモロコシ(maize)）(Zea sps.)、およびキビ(Pennisettum sps.)、ライコムギ、およびソルガムからなる群から選択される、請求項１０に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１４】
ｐＨ５〜７の、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１５】
ｐＨ６＋／−０．２の、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１６】
前記ｐＨ緩衝剤が、リン酸カリウム、クエン酸塩、ヒスチジン、酢酸塩、重炭酸塩、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１７】
前記ｐＨ緩衝剤の濃度が、約５０ｍＭ〜３００ｍＭである、請求項１６に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１８】
前記非イオン性界面活性剤が存在し、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項１９】
前記非イオン性界面活性剤が、１％（ｗ／ｖ）未満のレベルで前記製剤において使用される、請求項１８に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２０】
前記非イオン性界面活性剤が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）のレベルで前記製剤において使用される、請求項１８に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２１】
前記製剤が、アミノ酸、糖／ポリオール、塩化物塩、カルボン酸、洗浄剤、天然タンパク質、タンパク質発現抽出物、およびそれらの混合物からなる群から選択される前記安定剤の少なくとも１つをさらに含んでなる、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２２】
製剤における使用のための前記アミノ酸が、Ｌ−グルタミン、グリシン、リシン、Ｌ−アルギニン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２３】
前記アミノ酸が、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭのレベルで製剤において使用される、請求項２２に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２４】
製剤における使用のための前記糖／ポリオールが、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２５】
前記糖／ポリオールが、約１０重量／体積％（ｗ／ｖ）のレベルで製剤において使用される、請求項２４に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２６】
製剤における使用のための前記塩化物塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２７】
一価塩化物塩が、最大約１５０ｍＭのレベルで製剤において使用される、請求項２６に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２８】
二価塩化物塩が、最大約１５ｍＭのレベルで製剤において使用される、請求項２６に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項２９】
製剤における使用のための前記カルボン酸が、コハク酸塩、乳酸、リンゴ酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３０】
前記カルボン酸が、最大約１５０ｍＭのレベルで製剤において使用される、請求項２９に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３１】
製剤における使用のための前記洗浄剤が、カプリリルスルホベタイン、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、およびそれらの組合せからなる群から選択される双性イオン洗浄剤である、請求項２１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３２】
前記洗浄剤が、少なくとも０．８％（ｗ／ｖ）のレベルで製剤において使用される、請求項３１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３３】
製剤における使用のための前記天然タンパク質が、アルブミン、α−ラクトアルブミン、カゼイン、乳清、ラクトフェリン、リゾチーム、トリプトン、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３４】
前記天然タンパク質が、約６０％ｗ／ｗ〜約９６％ｗ／ｗのレベルで製剤において使用される、請求項３３に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３５】
前記免疫グロブリンが、宿主系において発現した組換えＩｇＡであり、前記タンパク質発現抽出物が、前記ＩｇＡと、前記宿主系からの前記ＩｇＡの抽出に由来するタンパク質抽出液とを含んでなる、請求項２１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３６】
前記タンパク質発現抽出物が精製されていない、請求項３５に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３７】
前記製剤が、最大約９９．３％ｗ／ｗの前記タンパク質発現抽出物を含んでなる、請求項３５に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３８】
前記タンパク質発現抽出物が、宿主系に対して内因性のタンパク質、脂肪、デンプン／炭水化物、繊維などの１つ以上をさらに含んでなる、請求項３５に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項３９】
前記宿主系が、コムギ(Triticum sps.)、イネ(Oryza sps.)、オオムギ(Hordeum sps.)、エンバク(Avena sps.)、ライムギ(Secale sps.)、トウモロコシ(corn)（トウモロコシ(maize)）(Zea sps.)、およびキビ(Pennisettum sps.)、ライコムギ、およびソルガムからなる群から選択される、請求項３５に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４０】
前記製剤が、スクロース、酒石酸塩、および／またはプルロニックＦ６８を実質的に含まない、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４１】
ＩｇＡ、リン酸カリウム緩衝剤、ポリソルベート８０、およびα−ラクトアルブミンを含んでなる、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４２】
ＩｇＡ、リン酸カリウム緩衝剤、ポリソルベート８０、およびミリスチルスルホベタインを含んでなる、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４３】
タンパク質発現抽出物中の組換えＩｇＡ、リン酸カリウムまたはヒスチジン緩衝剤、およびポリソルベート８０を含んでなる、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４４】
ＩｇＡ、ヒスチジン緩衝剤ｐＨ６．０＋／−０．２、およびポリソルベート８０を含んでなる、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４５】
ＩｇＡ、ヒスチジン緩衝剤ｐＨ６＋／−０．２、一価塩化物塩、およびポリソルベート８０を含んでなる、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４６】
液体懸濁剤、（凍結乾燥）散剤、硬もしくは軟シェル粉末充填非コーティングもしくは腸溶性コーティングカプセル剤、溶解錠剤、カプレット剤、遊離もしくはカプセル化小型錠剤、多粒子剤、ロゼンジ、香錠、顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、注射用溶液剤、液体ボーラス剤、経口液剤、経口懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、ゲル剤、バルクエマルション、噴霧ミスト、エアロゾル、マイクロもしくはナノエマルション、リポソーム、または坐剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される単位投与形の、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４７】
１つ以上の薬学上許容可能な保存剤／抗細菌剤、抗酸化剤、香味剤、着色剤、キレート剤、甘味剤、懸濁化剤、希釈剤、流動促進剤、滑沢剤、不活性担体、充填剤、または増量剤をさらに含んでなる、請求項１に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤。
【請求項４８】
治療上有効な量の請求項１〜４７のいずれか一項に記載の安定化した予防用および／または治療用製剤を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、予防または治療方法。
【請求項４９】
前記製剤が、障害もしくは疾患の臨床症状および／もしくは作用の発生率もしくは重症度を低減させる、ならびに／または対象における症状／作用の持続時間を低減させる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記製剤が、経口、直腸、非経口および粘膜送達法、ならびに、限定されるものではないが、舌下、局所、鼻腔、頬側、眼、膣内、吸入、静脈内、皮下、筋肉内、および注入を含む、全身投与経路または対象の組織領域への直接注射もしくは適用からなる群から選択される投与経路を介して投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記製剤が、単位投与形の一部として投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記単位投与形が、液体懸濁剤、（凍結乾燥）散剤、硬もしくは軟シェル粉末充填非コーティングもしくは腸溶性コーティングカプセル剤、溶解錠剤、カプレット剤、遊離もしくはカプセル化小型錠剤、多粒子剤、ロゼンジ、香錠、顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、注射用溶液剤、液体ボーラス剤、経口液剤、経口懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、ゲル剤、バルクエマルション、噴霧ミスト、エアロゾル、マイクロもしくはナノエマルション、リポソーム、または坐剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記製剤が、１日あたり対象の約１０μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の総治療用量レベルとして投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記製剤が、食事の少なくとも３０分前の空腹時に前記対象に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記製剤が、平均的な成人に対して１ｍｇ／日〜約５グラム／日の総治療用量レベルとして投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
前記免疫グロブリンの少なくとも３５％が、前記投与後に前記対象の消化管に治療上活性な形態で送達される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
抗体ベースの療法を用いて治療することができる疾患および／または病態、例えば、免疫不全、全身病態、粘膜を冒す炎症または障害、心血管病態、代謝症候群、肥満、骨粗鬆症、ニューロパチー、癌、感染性疾患、消化管障害、マイクロバイオーム媒介健康状態、ならびに慢性または急性下痢、クローン病、大腸炎、セリアック病、炎症性腸疾患、感染性疾患などの病態の治療、緩和および／または予防における使用のための、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫グロブリンが、感染病原体もしくはビルレンス因子、表面抗原、もしくはその宿主付着因子；炎症性サイトカインもしくはその受容体；成長因子／分裂促進因子もしくはその受容体；インテグリン；細胞付着および結合タンパク質；腫瘍抗原；バイオマーカー；またはタンパク質に特異的に結合し、それにより、疾患および／または病態を治療、緩和および／または予防する組換えＩｇＡである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記製剤が、前記対象に反復投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
前記製剤が、栄養補助食品、例えば、調製粉乳中のものまたはプロバイオティクスサプリメントとして投与される、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本出願は、２０１８年９月５日に出願された「ＳＴＡＢＬＥ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮ  Ａ」と題する米国仮出願番号第６２／７２７，３４５号、および２０１８年１２月１７日に出願された「ＯＲＡＬ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮ  Ａ」と題する米国仮出願番号第６２／７８０，５４４号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
配列表
以下の出願は、２２ＫＢとして２０１９年９月４日に作成された「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ」と題するＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして提出された、コンピューター可読形式（ＣＲＦ）の配列表を含む。ＣＲＦの内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００３】
発明の分野
本発明は、分泌性免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）、ならびに改善された保存安定性および／または経口安定性を有する他の治療用タンパク質を含む、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の新規な製剤に着目したものである。
【背景技術】
【０００４】
タンパク質分子は、種々のストレス条件下、例えば、溶出および中和の段階で遭遇する過酷な酸性および塩基性ｐＨ条件下で化学分解を受ける。さらに、緩衝液中に存在する特定の種類の賦形剤および／または塩が、タンパク質の化学分解に影響を及ぼす可能性がある。一般的な化学修飾およびタンパク質分子の分解の原因には、脱アミド化、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ脱離、およびジスルフィド交換（すなわち、ジスルフィドスクランブリング）、ならびにタンパク質分解が含まれる。ｐＨとは別に、保存、輸送、および取扱い中に上昇した温度は、化学分解を促進し得る。まとめると、化学修飾に関する我々の知識ベースは、この１０年にわたって大幅に増加している。いくつかの研究が、脱アミド化は、ＡｓｎおよびＧｌｎ側鎖アミドの加水分解が関与する主要分解経路であり、結果的に、電荷プロファイルの変化および断片化をもたらすことを示している。このような化学修飾は、機能活性の喪失を引き起こし、免疫原性を誘発し、物理的不安定性をもたらす。
【０００５】
タンパク質分子は一般に、ストレス条件、例えば、熱ストレス、剪断応力、水−空気界面応力、およびｐＨ誘発性ストレス（すなわち、最適以下の酸性／塩基性環境により誘発されたストレス）に対して感受性であり、その総てが、凝集、変性、および沈殿をもたらし得る。物理的不安定性は、タンパク質分子の可溶性または不溶性凝集と関連していることが多く、これは、免疫原性、抗薬物抗体の発生、ならびに活性および／または治療効力の喪失を誘発し得る。例えば、タンパク質分子は、製造プロセス、例えば、濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、ならびに溶出および中和の段階での高／低ｐＨシフトが関与することが多い精製（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）の段階で、物理的ストレスに曝露する。製造プロセスに加えて、輸送、保存、または投与中に上昇した温度へのタンパク質分子の曝露は、物理的凝集に至る可能性があり、最終的に効力の喪失にも至る場合がある。したがって、前臨床試験および臨床試験を含む生物学的治療剤の開発の全段階において、安定な液体製剤を有する必要性が存在する。
【０００６】
治療効力に関して、タンパク質ベースの薬剤および生物学的製剤は、製造および保存中だけでなく、投与および身体内への全身または局所送達時にも、それらの構造および機能の完全性を維持しなければならない。送達時の安定性は、例えば、炎症性腸疾患、自己免疫障害、過敏性腸症候群、および感染性疾患（この総てが、重大な罹病率および死亡率を引き起こす）を含む消化管の疾患を治療するために非常に重要である。副作用が最小限である製剤を使用した、局所的かつ有効な消化器系疾患の治療の重大な必要性が存在する。タンパク質分子は、消化管における標的部位への送達中に、物理分解、化学分解およびタンパク質分解に遭遇する。高濃度のペプシンによるタンパク質分解とともに、胃の過酷な酸性ｐＨは、生物学的治療剤、例えば、タンパク質の経口送達に対して恐るべき最初の課題を作り出す。この段階に次いで、胃から小腸への移行が生じるが、小腸は、塩基性に近いｐＨであり、タンパク質を小さなペプチドに分解する酵素の中でも、トリプシン、キモトリプシン、およびアミラーゼなどのタンパク質分解酵素を含有する。同様に、小腸から大腸への移行の後に、細菌由来プロテアーゼが、経口送達されたタンパク質を分解する。
【０００７】
免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体は、粘膜の免疫機能に必須の役割を果たし、粘膜バリアーへのアクセスを制限することによって、病原微生物および抗原から保護する。一部の例では、ＩｇＡは、病原微生物と直接相互作用し、それらの病原能を中和する。ＩｇＡは、有益な微生物を消化管でコロニー形成させる役割も果たし、これは、哺乳動物において改善された健康転帰をもたらすことが示されている。
【０００８】
ＩｇＡは、４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合で相互接続された、２つのアルファ（α）重鎖および２つのカッパ（κ）軽鎖（配列番号１〜２）を含んでなる。代表的な配列を、本明細書に開示する。免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、異なる起源から産生された、ＩｇＡ１（配列番号３〜４、可変および定常）およびＩｇＡ２（ＩｇＡ２ｍ１（配列番号５）、ＩｇＡ２ｍ２（配列番号６）、およびＩｇＡ２ｎ（配列番号７）、異なるα重鎖により区別されるアロタイプである）のサブクラスを含む。免疫グロブリンＡは、単一成分または単量体ＩｇＡ、二量体ＩｇＡ、および分泌型ＩｇＡの混合物を表し得る。Ｊ鎖（配列番号８）および分泌成分（ＳＣ）（配列番号９）は、単量体ＩｇＡを、二量体ＩｇＡおよび分泌型ＩｇＡと呼ばれる大きな集合体に連結させる分子間ジスルフィドを形成する。ＩｇＡの二量体型は、単一のＪ鎖により互いに連結された２つのＩｇＡモノマーを含んでなるが、分泌成分を欠く。二量体ＩｇＡは、分泌成分の単一のコピーに結合し、ｓＩｇＡ１およびｓＩｇＡ２（ｓＩｇＡ２ｍ１、ｓＩｇＡ２ｍ２およびＩｇＡ２ｎアロタイプを含む）を形成し得る。上記のように、生合成条件、環境条件およびストレス条件に基づき、ＩｇＡ分子は、異なる翻訳後修飾、例えば、グリコシル化および非グリコシル化バリアント、脱アミド化、酸化、リン酸化、糖化ならびに他の化学修飾および微小変異を含有し得る。
【０００９】
ホメオスタシスの維持におけるＩｇＡの寄与は、免疫学的排除、抗炎症特性、および共生生物のホメオスタシスを介して媒介される。このことは、ＩｇＡが母乳中に高レベルで存在し、新生児の細菌感染を予防しているという事実によって強調される。ヒト乳中のＩｇＡは、７０％ＩｇＡ１および３０％ＩｇＡ２サブクラスから構成されると推定される。人体の粘膜表面に高度に濃縮されているｓＩｇＡの種類は、粘膜環境においてそれらが頑強である可能性が高いこと、潜在的に高い治療効果、潜在的に好ましい薬理学的プロファイル、および他の免疫グロブリンがアクセスできない免疫応答経路を活性化する能力のために、特に重要である。多くの病原性の感染病原体および疾患が、粘膜において人体に関与するため、好適な用量で送達できる治療剤としてのｓＩｇＡの開発は、非常に関心が持たれる領域である。しかしながら、このような試みは、安定なＩｇＡ製剤を欠いていることによって、著しく妨害されている。
【００１０】
一般に、治療剤の経口送達は、注入または注射よりも好都合であり、消化管（ＧＩ）への治療剤の直接的な標的送達によって、向上した安全性を提供する。しかしながら、胃および腸の条件下での治療量のＩｇＡの安定性は、消化管の過酷な酸性環境およびタンパク質分解環境のために、困難なものとなっている。疾患の治療のために消化管にＩｇＡを送達できる安定な経口製剤の必要性は、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、代謝症候群、肥満、マイクロバイオーム媒介疾患、および他の病態に対する療法の進歩にとって重要であろう。さらに、治療用ＩｇＡは、このような病態に対する一次治療または支持的治療としての健康な消化管マイクロバイオームを確立または再確立するための重要な役割を果たし得る。
【００１１】
ＩｇＡを化学分解および酵素分解から保護する製剤は、このため、腸および結腸における種々の疾患の治療のための治療用量を効果的に送達することが非常に要求される。ＩｇＡの経口送達は、全身免疫抑制を引き起こすことなく、潜在的な副作用が最小限で、局所送達ならびに感染症および炎症の治療を提供するため、有益である。さらに、その大きな分子量（３８０ｋＤａ）のために、経口送達されたＩｇＡの血流への全身吸収が起こる可能性は低く、ＩｇＡは、消化管の管腔区画または表面に隔離される。このため、現在の標準的な治療的送達法、例えば、注入、皮下注射または関連する送達様式と比較して、優れた安全性プロファイルが期待される。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書に記載の製剤は、天然の構造／コンフォメーションを保持し、保存中のＩｇＡの凝集、断片化、および沈殿を防止する。記載の製剤は、熱ストレス、凍結融解、および／または撹拌に対する安定性を与える。さらに、本明細書に記載の特定の製剤は、例えば消化管におけるＩｇＡの酸分解およびタンパク質分解を防止するように特別に設計されている。本発明は、ＩｇＡの保存および取扱い安定性を意図的に改善し、消化管における安定性をさらに改善する、１つ以上のさらなる安定剤と組み合わせたｐＨ緩衝剤から構成されるＩｇＡの製剤を詳述する。安定性の改善は、投与頻度を減少し、治療に必要な治療用量を減少することにより、患者の便宜を改善し、結果的に患者のコンプライアンスを改善することが期待される。
【００１３】
本明細書における開発された製剤は、その機能活性を維持しながら、ＩｇＡの物理的安定性、化学的安定性、およびタンパク質分解の安定性を改善する。全体的に、本明細書に記載のＩｇＡは、消化管に対する重大な損傷が関与することで知られる感染性疾患および炎症性疾患の治療に使用される。このような疾患には、潰瘍性大腸炎、セリアック病、ならびにクローン病（炎症性腸疾患）、細菌およびウイルス感染性疾患、ならびに実質的な健康問題を引き起こすことで知られる関連病態が含まれる。さらに、腸マイクロバイオームの健康な確立または再確立を標的としたＩｇＡの経口送達は、技術の新規な応用であろう。
【００１４】
一つの側面において、約５〜約８のｐＨのｐＨ緩衝剤に分散したＩｇＡを含んでなる安定化した予防用および／または治療用製剤であって、前記製剤は、前記製剤が機械的撹拌および／または凍結／融解サイクル後に物理的および化学的安定性を示すように、非イオン性界面活性剤および１つ以上のさらなる安定剤をさらに含んでなる、製剤が本明細書に記載される。好ましくは、前記製剤は、経口安定性をさらに示す。
【００１５】
一つの側面において、予防的および／または治療的治療方法のためにこのような製剤を使用する方法も、本明細書に記載される。方法は、中和免疫グロブリンの経口送達を含む。一つ以上の実施形態において、このような免疫グロブリンは、感染病原体（および／またはそれらのビルレンス因子、表面抗原、もしくは宿主付着因子）、炎症性サイトカインまたはそれらの受容体、成長因子／分裂促進因子またはそれらの受容体、インテグリン、細胞付着タンパク質および結合タンパク質、腫瘍抗原、バイオマーカーおよびタンパク質などに結合して中和し、種々の病態および疾患の症状または重症度を阻害および／または低減させる。さらに、新たに出現した研究は、多数の病態が、副交感神経経路および交感神経経路に沿って、消化管から身体の他の領域、例えば脳幹に伝播し、これまでは消化管と無関係と考えられていた種々の病態をもたらすことを示唆している。例えば、不溶性原線維を形成するアルファ−シヌクレインの凝集は、多数のシヌクレイン病、例えば、パーキンソン病、レビー小体型認知症および多系統萎縮症の特徴である。しかしながら、このようなものを含む消化管症状は、疾患の診断の数十年前に検出され得る。このため、本明細書に記載の経口的に安定な製剤は、例えば、アルファ−シヌクレインの凝集を阻害することによって、消化管におけるこのような病態の早期病理を標的とする疾患修飾療法としての有望な使用を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】４０℃で１０日間インキュベーションした後の試験したｐＨおよび緩衝液条件下でのＶｅｎ−Ａの回収率を、変性ＳＥＣにより測定した。対照（１００％）は、ストレス条件下で試験したサンプルの調製に使用したクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ３．７中のＶｅｎ−Ａの新鮮ストレス無負荷ストックサンプルであった。回収したＶｅｎ−Ａは、ＳＥＣクロマトグラム下の総面積のパーセントとして表した。
【図２】４０℃、６０％ＲＨで１０日間インキュベーションした後の試験したｐＨおよび緩衝液条件下でのＶｅｎ−Ａの回収率を、ネイティブＳＥＣにより測定した。対照（１００％）は、ストレス条件下で試験したサンプルの調製に使用したクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ３．７中のＶｅｎ−Ａのストレス無負荷ストックサンプル由来であった。回収したＶｅｎ−Ａは、ＳＥＣクロマトグラム下の総面積のパーセントとして表した。
【図３】４０℃、６０％ＲＨで１０日間インキュベーションした後の試験したｐＨおよび緩衝液条件下でのＶｅｎ−Ａの修飾度を、ＣＥＸにより測定した。回収したＶｅｎ−Ａは、ＣＥＸクロマトグラム下の総面積のパーセントとして表した。
【図４】４０℃、６０％ＲＨで１０日間インキュベーションした後のＶｅｎ−Ａの熱安定性（Ｖｅｎ−Ａ変性温度、Ｔｍ）に対するｐＨの効果を、示差走査マイクロカロリメトリー（ＤＳＣ）により測定した。
【図５】４０℃で１０日間インキュベーションした後のｈＴＮＦ−αを用いたＬ９２９細胞ベースアッセイにおけるＶｅｎ−Ａの効力に対するｐＨの効果。陽性対照  −  アダリムマブＩｇＧ、アイソタイプ対照  −  ｓＩｇＡ、対照  −  Ｖｅｎ−Ａ参照標準。
【図６】４０℃で１０日間インキュベーションした後のｍＴＮＦ−αを用いたＬ９２９細胞ベースアッセイにおけるＶｅｎ−Ａの効力に対するｐＨの効果。陽性対照  −  アダリムマブＩｇＧ、アイソタイプ対照  −  ｓＩｇＡ、対照  −  Ｖｅｎ−Ａ参照標準。
【図７】４０℃で１０日間インキュベーションした後の異なる緩衝液条件下でのＶｅｎ−Ａの回収率を、ＳＥＣにより測定した。回収したＶｅｎ−Ａは、ＳＥＣクロマトグラム下の総面積のパーセントとして表した。
【図８】ＤＳＣによるＶｅｎ−Ａの変性温度（Ｔｍ℃）に対する緩衝液（ｐＨ６）の効果。Ｖｅｎ−Ａを、４０℃で１０日間、異なる緩衝液条件下でインキュベートした。
【図９】４０℃で１０日間インキュベーションした後のｐＨ６．０のリン酸カリウム緩衝液中のＶｅｎ−Ａの回収率に対する安定剤の効果を、ＳＥＣにより測定した。回収したＶｅｎ−Ａは、ＳＥＣクロマトグラム下の総面積のパーセントとして表した。サンプル調製中に酒石酸塩を含有する製剤において沈殿（ｐｐｔ）が認められ、さらなる分析は実施しなかった。
【図１０】４０℃で１０日間インキュベーションした後のｐＨ６．０のリン酸カリウム緩衝液中のＶｅｎ−ＡのＨＭＷＳの凝集およびＬＭＷＳの断片化に対する安定剤の効果を、ＳＥＣにより測定した。サンプル調製中に酒石酸塩を含有する製剤において沈殿（ｐｐｔ）が認められ、さらなる分析は実施しなかった。
【図１１】４０℃で１０日間インキュベーションした後のｐＨ６．０のリン酸カリウム緩衝液中のＶｅｎ−Ａの回収率に対する安定剤の効果を、ＵＶ−ＶＩＳにより測定した。サンプル調製中に酒石酸塩を含有する製剤において沈殿（ｐｐｔ）が認められ、さらなる分析は実施しなかった。
【図１２】４０℃で１０日間インキュベーションした後のｐＨ６．０のリン酸カリウム緩衝液中のＶｅｎ−Ａの回収率に対する安定剤の効果を、ＳＥＣにより測定した。回収したＶｅｎ−Ａは、ＳＥＣクロマトグラム下の総面積のパーセントとして表した。
【図１３】４０℃で１０日間インキュベーションした後のｐＨ６．０のリン酸カリウム緩衝液中のＶｅｎ−Ａの回収率に対する安定剤の効果を、ＵＶ−ＶＩＳにより測定した。
【図１４】凍結融解後のＶｅｎ−Ａの回収率（％）に対する安定剤の効果を、ＳＥＣにより測定した。
【図１５】撹拌後のＶｅｎ−Ａの回収率（％）に対する安定剤の効果を、ＳＥＣにより測定した。
【図１６】凍結融解後のＶｅｎ−Ａの回収率に対する安定剤の効果を、ＵＶ−ＶＩＳにより測定した。
【図１７】撹拌後のＶｅｎ−Ａの回収率に対する安定剤の効果を、ＵＶ−ＶＩＳにより測定した。
【図１８】Ｖｅｎ−Ａの回収率に対するポリソルベート８０の効果。Ｖｅｎ−Ａの回収率（％）に対するポリソルベート８０の効果を、ＵＶ−ＶＩＳにより測定した。
【図１９】Ｖｅｎ−Ａの回収率（％）に対するポリソルベート８０の効果を、ＳＥＣにより測定した。
【図２０】選択された製剤におけるＶｅｎ−Ａの回収率（％）を、ＵＶ−ＶＩＳにより測定した。
【図２１】選択された製剤におけるＶｅｎ−Ａの効力を、ｍＴＮＦ−αを用いたＬ９２９細胞ベースアッセイにより測定した。
【図２２】選択された製剤におけるＶｅｎ−Ａの効力を、ｈＴＮＦ−αを用いたＬ９２９細胞ベースアッセイにより測定した。
【図２３】凍結融解および撹拌後の選択された製剤におけるＶｅｎ−Ａの高濃度製剤の回収率を、ＵＶ−ＶＩＳにより測定した。
【図２４】ＳＩＦにおけるＩｇＡ製剤（表５）の安定性。安定剤タンパク質を製剤に加え、ＩｇＡを安定化させた。
【図２５】ＳＧＦにおけるＩｇＡ製剤（表５）の安定性。安定剤タンパク質を製剤に加え、ＩｇＡを安定化させた。
【図２６】ＳＧＦにおけるＩｇＡ製剤（表６）の安定性。界面活性剤を製剤に加え、ＩｇＡを安定化させた。
【図２７】ＳＩＦにおけるＩｇＡ製剤（表６）の安定性。界面活性剤を製剤に加え、ＩｇＡを安定化させた。
【図２８】ＳＧＦにおけるＩｇＡ製剤（表７）の安定性。異なる強度およびｐＨの緩衝液を試験し、ＩｇＡのタンパク質分解を防いだ。
【図２９】人工胃液（ＳＧＦ）および人工腸液（ＳＩＦ）におけるＩｇＡ製剤（表８）の安定性。未処理ＩｇＡを有する発現系抽出物を使用して、ＩｇＡ製剤のタンパク質分解を防いだ。
【図３０】イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）モデルの臨床的有効性。対照製剤と比較した、経口投与された安定化したｓＩｇＡ（Ｖｅｎ−Ｂ）製剤。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本発明は、ＩｇＡの安定化した製剤、特に、経口投与、あるいは、直腸、静脈内および皮下などの作用部位（消化管）に薬剤を運ぶ他の経路のための製剤に関する。製剤は、一般に、非イオン性界面活性剤および１つ以上の任意選択の安定剤とともに、約５〜約８のｐＨのｐＨ緩衝剤に分散した生物学的治療用タンパク質（例えば、ＩｇＡ）を含んでなる。
【００１８】
本発明の複数の実施形態に係る製剤は、単量体ＩｇＡ、二量体ＩｇＡ、ｓＩｇＡ、ＩｇＡのグリコシル化型または非グリコシル化型、化学的バリアント、組換え型、それらのマイナー変異体、またはそれらの組合せ／混合物を安定化するために使用され得る。好ましくは、モノクローナルＩｇＡが製剤において使用される。特に断りのない限り、用語「ＩｇＡ」または「免疫グロブリンＡ」は、前述の形態のいずれかを包含することを言及しやすくするために使用される。ＩｇＡタンパク質配列は、特定の標的に特異的となるように構成要素のカッパ（κ）軽鎖およびアルファ（α）重鎖の可変領域を変化させることによって、標的とする使用のために修飾され得る。異なる標的を有するＩｇＡ分子間で異なる特異的な配列は、一般に、アルファ重鎖およびカッパ軽鎖の可変小領域の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）に限定される。これらの標的特異的配列の差は、ＩｇＡの異なるアロタイプまたはサブタイプ、例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２ｍ１、ＩｇＡ２ｍ２、およびＩｇＡ２ｎを区別するものとは異なると理解される。後者の配列の差は、各アルファ重鎖の定常小領域に位置する。
【００１９】
例えば、Ｖｅｎ−アルファ（「Ｖｅｎ−Ａ」）は、ヒトＴＮＦ−αに特異的に結合する組換えヒトモノクローナルｓＩｇＡ分子である。Ｖｅｎ−Ａは、４つの特異的なアルファ（α）重鎖、４つの特異的なカッパ（κ）軽鎖、１つの連結鎖および１つの分泌成分鎖からなる。成熟Ｖｅｎ−Ａは、合計で３３６３個のアミノ酸から構成され、これは、その総分子質量に対しておよそ３７５ｋＤａを占める。４つのカッパ（κ）軽鎖の各々は、長さが２１４アミノ酸であり、およそ２３ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。４つのアルファ（α）重鎖の各々は、アロタイプα１のものであり、長さが４７４アミノ酸であり、およそ５１ｋＤａのタンパク質ＭＷを有する。連結鎖は、１３７アミノ酸を含有し、およそ１６ｋＤａの計算タンパク質ＭＷを有する。最後に、Ｖｅｎ−Ａ分泌成分鎖は、５８５アミノ酸を含有し、およそ６４ｋＤａのタンパク質ＭＷを有する。重鎖および軽鎖の各ペアは、ＴＮＦ−αに対する１つの結合部位を形成するため、完全なＶｅｎ−Ａ  ｓＩｇＡ集合体は、最大４つの個々のＴＮＦ−αモノマーにおそらく結合する。Ｖｅｎ−ＡのＴＮＦ−αへの結合は、ＴＮＦ−αの界面（それを介して、ＴＮＦ−αはその細胞表面受容体（ＴＮＦ−α受容体またはＴＮＦＲ）と相互作用する）を立体的に閉塞し、よって、ＴＮＦ−αが炎症促進性シグナル伝達経路を開始することが防止される。
【００２０】
同様に、Ｖｅｎ−ベータ（「Ｖｅｎ−Ｂ」）は、表面抗原および毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）の微小線毛成分ｃｆａＥを特異的に標的とするアロタイプＩｇＡ１またはＩｇＡ２ｍ１の一組の組換えヒトモノクローナルｓＩｇＡ分子を含んでなる。異なるアロタイプは、それらの抗原結合領域が異なるアルファ（α）重鎖配列を有すること、およびアロタイプ特異的な配列の差を有することを特徴とする。しかしながら、総てのＶｅｎ−Ｂ  ＩｇＡ分子は、病原性ＥＴＥＣ細菌と宿主（ヒト）腸の上皮細胞との間の結合を媒介し、細菌が腸でコロニー形成することを可能にするＥＴＥＣ  ｃｆａＥ抗原タンパク質を標的とする。個々の成熟Ｖｅｎ−Ｂ型は各々、合計で３３１５〜３３７５個のアミノ酸から構成され、これは、それらの総分子質量に対しておよそ３７２〜３７７ｋＤａを占める。４つのカッパ（κ）軽鎖の各々は、長さが２１４アミノ酸であり、およそ２３ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有する。４つのアルファ（α）重鎖の各々は、長さが４７３〜４７７（アロタイプα１）または４６２（アロタイプα２ｍ１）アミノ酸であり、およそ５０〜５１ｋＤａのタンパク質ＭＷを有する。定義上、連結鎖および分泌鎖は、ＶｅｎＡまたは他の種類のｓＩｇＡ分子のものと同一である。Ｖｅｎ−ＢのＥＴＥＣ  ｃｆａＥへの結合は、ＥＴＥＣ細菌のヒト腸上皮への付着を遮断することを意図する。
【００２１】
Ｖｅｎ−ＡおよびＶｅｎ−Ｂは、引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第６，６４２，４３７号および同第６，９９１，８２４号に記載のような、植物発現系、好ましくは、単子葉植物、最も好ましくは、イネ、オオムギ、コムギ、エンバク、ライムギ、トウモロコシ(corn)（トウモロコシ(maize)）、キビ、ライコムギ、およびソルガムにおいて組換えＤＮＡ技術により産生されたｓＩｇＡの特に好ましい形態である。植物発現系において産生された他の組換えタンパク質と同様に、植物において発現したＩｇＡ／ｓＩｇＡは、哺乳動物発現系において発現した天然ＩｇＡおよびＩｇＡと比較して、単純な（複雑ではない）グリコシル化プロファイルを有し、均質または均一にグリコシル化されていることを特徴とする可能性が高い。具体的には、植物において発現した組換えタンパク質のＮ結合型グリコシル化は、比較的小さな二分岐および三分岐の高マンノース型オリゴ糖を有する、かなり均一かつ均質なコアグリコシル化から主になる。同様に、哺乳動物の天然ＩｇＡは、アルファ−１アロタイプ重鎖上にＯ−グリコシル化部位を有するが、植物系において発現した組換えタンパク質は、Ｏ−グリコシル化の特徴的な非存在を有する。このため、哺乳動物細胞培養物において産生された天然ｓＩｇＡまたはｓＩｇＡは、Ｎ結合型グリコシル化およびＯ結合型グリコシル化の両方が潜在的に関与する、複雑かつ多様な構造的に不均質なグリコフォームを示すが、均一、均質なコアまたは単純Ｎ結合型グリコシル化パターンが、植物において産生されたｓＩｇＡの特徴であろう。
【００２２】
一つ以上の実施形態において、このような植物発現系に由来する生抽出物は、好ましくは、異なる形態のＩｇＡの混合物（例えば、組換えｓＩｇＡおよび単量体ＩｇＡの混合物）を含んでなる。すなわち、ｓＩｇＡに集合する４種類の鎖が、組換えｓＩｇＡの製造に使用される植物系において存在し、同時に発現する。すなわち、鎖は、抽出／精製後に互いに再構成されないが、むしろ同時発現し、ＩｇＡおよびｓＩｇＡ集合体が、発現している植物細胞内でイン・ビボにおいて生じる。ｓＩｇＡに関する集合経路は、前駆体としてのＩｇＡを必ず含むため、植物細胞は、ＩｇＡおよびｓＩｇＡの両方を発現し、その結果、ＩｇＡへの連結鎖および分泌鎖の組込みの効率に基づいて、形態の混合物が生じる。これらのＩｇＡ型は、製造および精製の段階で互いに分離し得るか、または、各種の特徴を利用するために、一緒に維持され得る。このような特徴には、下流免疫経路の異なるレベルの活性化および天然微生物叢との異なる相互作用、および抗原との異なる相互作用が含まれる。
【００２３】
さらに、植物において発現したＩｇＡは、特定の宿主発現系に特有の多数の植物宿主タンパク質を伴う。ｓＩｇＡおよびＩｇＡを含む免疫グロブリンの製造において実質的に関心が持たれる領域は、製造プロセス中の宿主細胞（発現系特異的）タンパク質（ＨＣＰ）の制御である。最終的な精製および処方された免疫グロブリン製品におけるＨＣＰの正確な量および同一性を制御する試みがますますなされている。植物において産生されたｓＩｇＡはまた、植物宿主／植物発現系特異的ＨＣＰ、例えば、種子貯蔵タンパク質の存在を特徴とする。植物原料中に高レベルで存在する構造タンパク質および炭水化物を含む他の植物成分も、このようなサンプル中に存在し得る。子実は、食品医薬品局によってＧＲＡＳ（一般に安全と認められる(Generally Recognized as Safe)）に分類されているため、このようなＨＣＰおよび他の植物宿主高分子は、経口治療的投与中に健康または安全上の危害を呈さないことに注目すべきである。
【００２４】
対照的に、動物細胞培養系において組換え発現したｓＩｇＡおよびＩｇＡは、これらの系に特有の宿主細胞タンパク質、脂質またはグリカン／オリゴ糖、およびこれらの系の外来性病原体を伴い得る。特に、マイコプラズマ、真核生物寄生虫（例えば、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ、Ｔ．ｃｒｕｚｉｉ、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．）および特に動物ウイルス（ヒトに感染し得る一部の高病原性ウイルスを含む）は、哺乳動物細胞培養物の既知の潜在的な汚染菌である。このような病原体またはそれらの構成要素は、動物細胞培養物から製造された組換えｓＩｇＡ／ＩｇＡのサンプル中に存在し得る。生物体から、例えば、ウシまたはヒトの初乳から直接得られた天然ＩｇＡ／ｓＩｇＡまたは血清ＩｇＡは、同様に、ＨＣＰを含有すること、および起源の生物体を感染させることで知られる外来性病原菌、寄生虫、またはウイルスを潜在的に含有することが期待され得る。動物起源の病原体には、プリオン病としても知られる伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）に関係付けられる病原体が含まれる。ＴＳＥは、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、クールー病、致死性家族性不眠症、およびゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）を含む、脳を「海綿状」の外観にする小さな穴を特徴とする退行性脳障害である。ＣＪＤは、グレートブリテンおよびいくつかの他の欧州諸国において報告されており、これは、「狂牛病」としても知られるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）と呼ばれるＴＳＥ病を有するウシ由来の牛肉を消費した結果であったと考えられている。動物において認められた他のＴＳＥには、ヒツジおよびヤギを冒すスクレイピー；エルクおよびシカを冒す慢性消耗病；などが含まれる。これらの例は、汚染された食物／飼料がおそらく原因である。ＣＪＤおよび他のＴＳＥは、実験室においてマウスおよび他の動物に実験的に伝播される場合もある。ＴＳＥは、プリオンと呼ばれる異常な型のタンパク質により引き起こされる。ＴＳＥを引き起こすプリオンは、感染した組織、体液、または汚染された医療機器との接触を通じて伝播し得る。通常の滅菌では、ＴＳＥの伝播は予防されず、プリオン汚染は、死体由来脳組織サンプルなしでは検出することができない。植物において発現したＩｇＡは、動物成分、動物起源材料、または動物起源の他の誘導体（例えば、タンパク質、代謝廃棄物、および人畜共通病原体汚染菌）を含まないという利点を有することが分かるであろう。
【００２５】
前述にもかかわらず、本明細書に記載の治療用タンパク質を安定化するための本発明のアプローチは、ＣＨＯ、酵母、タバコ、藻類などの他の発現系において産生されたＩｇＡおよびｓＩｇＡの製剤にも適用可能であることが分かるであろう。さらに、本発明は、単に消化管内のもの以外の治療標的に対する投与のためのＩｇＡおよびｓＩｇＡの製剤に適用されることが分かるであろう。
【００２６】
さらに、本明細書に記載の根底にある（プラットフォーム）安定化製剤は、他の生物学的治療剤、例えば、免疫グロブリンＧおよび免疫グロブリンＭ、または胃および腸の条件下でタンパク質分解性に分解されることで知られる任意の他の生物学的製品に対しても使用され得ることが分かるであろう。全体的に、本明細書に記載のプラットフォーム製剤は、製造、保存、取扱い中、ならびに胃、小腸、および結腸の各々における投与された生物学的製剤の送達時に、安定性を提供する。製剤は、例えば、腸および結腸における感染病原体またはビルレンス因子を中和することによって、疾患を標的とするように設計されており、食事の前および／または後、好ましくは、優れた治療効果のために食事の少なくとも３０分前の空腹時に摂取することができる。
【００２７】
本発明に係る製剤は、「安定化」されており、これは、製剤中のＩｇＡが、典型的な処理、保存、および／または取扱いのストレス要因、例えば、機械的ストレス、熱ストレス、および／または凍結融解ストレスの下で安定なままであることを意味する。一般に、製剤は、特定の温度での長期保存下；凍結融解サイクル後；および／または撹拌後に安定なままである。一般に、「安定な」タンパク質とは、二次および三次構造の最小限の（もしくは全くない）変化、最小限の（もしくは全くない）分解もしくは凝集、断片化の最小限の（もしくは全くない）徴候、および／または化学修飾（例えば、酸化、還元、脱アミド化）などを示し、かつ、ストレス要因に供された場合でさえ、その物理的および化学的安定性ならびに保存中の生物活性を保持するように、タンパク質一次構造の完全性を維持するタンパク質である。一つ以上の実施形態において、本明細書において適用される安定性基準は、製剤中のＩｇＡが、保存、凍結融解サイクル、または撹拌ストレス試験に供される前のその初期質量と比較して、その全質量の６０％超、好ましくは、５０％超、最も好ましくは、２０％超変化しないことを意味する。言い換えれば、ＨＰＬＣによって測定される、製剤中のタンパク質の好ましくは６０％以下、好ましくは、５０％以下、より好ましくは、２０％以下が、保存中におよびストレス条件下で分解される。
【００２８】
用語「経口安定性」は、本明細書で使用する場合、投与時の経口／直腸安定性、すなわち、ＧＩ条件下の安定性に対してさらに特異的である。容易に参照できるように、本明細書においては一般に「経口」安定性といい、これは、特に断りのない限り、直腸投与様式を包含する。特に、本明細書における「経口的に安定な」製剤は、３７℃でインキュベートした場合、人工胃液（ＳＧＦ）において少なくとも１５分間、および人工腸液（ＳＩＦ）において少なくとも３０分間安定性を示す製剤を指す。一般に、経口的に「安定な」タンパク質とは、二次および三次構造の最小限の（もしくは全くない）変化、最小限の（もしくは全くない）分解もしくは凝集、断片化の最小限の（もしくは全くない）徴候、および／または化学修飾（例えば、酸化）などを示し、かつ、本明細書に記載のＳＧＦおよびＳＩＦ条件を含む生理学的に適切なイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）条件を用いて測定された、その物理的および化学的安定性ならびにイン・ビボの生物活性を保持するように、タンパク質一次構造の完全性を維持するタンパク質である。ＳＧＦおよびＳＩＦにおける経口安定性試験に関して、分解は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてモニタリングすることができる。一つ以上の実施形態において、「経口安定性」に関して本明細書において適用される安定性基準は、（ＳＧＦおよびＳＩＦ条件に曝露させることによって試験した）消化後に回収されたインタクトＩｇＡのパーセンテージが、ＩｇＡの開始量と比較して、３５％超、好ましくは、５５％超、より好ましくは、８０％超であることを意味する。回収率パーセントは、限定されるものではないが、クロマトグラフィー、質量分析、分光法、バイオレイヤー干渉法、電気泳動、イムノアッセイ、または他のイン・ビトロおよびイン・ビボアッセイを含むタンパク質定量化のための標準的な分析法を用いて、測定することができる。言い換えれば、ＳＧＦおよび／またはＳＩＦ  イン・ビトロ試験を用いて測定される、製剤中のタンパク質の好ましくは６５％以下、好ましくは、４５％以下、好ましくは、２０％以下が、消化中に分解される。
【００２９】
一つ以上の実施形態において、本発明に係る安定化した製剤は、５〜８のｐＨの薬学上許容可能なｐＨ緩衝剤に分散したＩｇＡを含んでなる。本明細書で使用する場合、用語「薬学上許容可能な」は、それが、過剰な毒性、刺激、またはアレルギー応答を引き起こすことなく対象に投与することができる点、およびそれが、許容されない生物学的効果を引き起こさず、それが含まれる組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用しないという点で、生物学的にまたはその他の点で望ましくなくないことを意味する。薬学上許容可能なｐＨ緩衝剤は、当業者に周知であろうように、ＩｇＡまたは他の剤の任意の分解を最小限にするように、かつ、対象における任意の有害な副作用を最小限にするように、当然選択されるであろう。薬学上許容可能な成分は、獣医学的使用およびヒト医薬的使用に許容可能なものを含み、投与経路（経口、直腸など）に依存するであろう。
【００３０】
安定化製剤における使用のための好ましいｐＨ緩衝剤は、約５〜約８（例えば、５〜８のｐＫａを有する化合物）、好ましくは、約５．５〜約７．５、より好ましくは、約５〜約７、さらにより好ましくは、約６（＋／−０．２）の標的ｐＨ範囲の緩衝能を有する緩衝剤である。このため、安定化製剤は、約５〜約８、好ましくは、約５．５〜約７．５、より好ましくは、約５〜約７、さらにより好ましくは、約６（＋／−０．２）のｐＨを有するであろう。一つ以上の実施形態において、安定化した製剤は、５〜６のｐＨを有するであろう。一つ以上の実施形態において、安定化した製剤は、約７（＋／−０．２）のｐＨを有するであろう。一つ以上の実施形態において、安定化した製剤は、約８（＋／−０．２）のｐＨを有するであろう。製剤のｐＨは、任意の薬学上許容可能な酸性化剤または塩基、例えば、リン酸または水酸化カリウムなどを使用して、および緩衝系の濃度を上げることによって、調整することができる。
【００３１】
好適なｐＨ緩衝剤は、リン酸カリウム、クエン酸塩、ヒスチジン、酢酸塩、重炭酸塩（ナトリウム）、およびそれらの組合せからなる群から選択され、リン酸カリウムおよびヒスチジンが特に好ましい。安定化した製剤中の緩衝液濃度は、選択された緩衝液、製剤中の他の成分、およびそれらの相対濃度に応じて変わり得る。１つ以上のさらなる安定剤が製剤に含まれる場合、より低い緩衝液濃度が、安定性を付与し、ｐＨを標的範囲に維持するために必要であり得ることが分かるであろう。広く企図される緩衝液濃度は、約１０ｍＭ〜約１，０００ｍＭである。好ましい製剤は、少なくとも約５０ｍＭ、好ましくは、少なくとも約１００ｍＭ、より好ましくは、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、さらにより好ましくは、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭの緩衝液濃度を含んでなる。一つ以上の実施形態において、安定化した製剤は、単一の緩衝液を含んでなる。一つ以上の実施形態において、緩衝液の混合物が使用され得る。ｐＨ緩衝剤は、化合物（一般に、塩基型）を精製水（例えば、蒸留水、重水素化水、超純水、脱イオン水）に溶解させることによって、および適当な酸を用いて、ｐＨを指定された値まで滴定することによって、調製することができる。ｐＨ緩衝剤は、市販されてもおり、および／または、溶液中もしくは必要な際に使用するために再構成できる乾燥化合物として保存することができる。
【００３２】
一つ以上の実施形態において、最初の安定化した製剤は、少なくとも１つのｐＨ緩衝剤と、物理的安定性のための少量の非イオン性界面活性剤とを含んでなり、それに対して、ＩｇＡとともに、他の安定剤を加えることができる。製剤における使用のための例示的な非イオン性界面活性剤は、組成物を物理的に安定化し、成分の沈殿または分離を避けるのに十分な量のポリソルベート、例えば、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるものである。特に、非イオン性界面活性剤は、製剤中の治療用タンパク質の非特異的相互作用および凝集を低減し、表面電荷を調整して溶解度を増加させるために、低レベルで含まれる。存在する場合、非イオン性界面活性剤は、１％（ｗ／ｖ）未満、好ましくは、０．５％（ｗ／ｖ）未満のレベルで、製剤において使用される。より好ましくは、製剤中の非イオン性界面活性剤のレベルは、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、約０．０２５％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、約０．０３％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）、さらにより好ましくは、約０．０５％（ｗ／ｖ）（＋／−０．０２％）の範囲である。
【００３３】
有利には、安定化した製剤は、アミノ酸、糖／ポリオール、塩化物塩、カルボン酸、洗浄剤、天然タンパク質、タンパク質発現抽出物、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの安定剤をさらに含んでなるであろう。一つ以上の実施形態において、安定剤は、植物、哺乳動物、酵母、または真菌のいずれかの起源であることが好ましい。一つ以上の実施形態において、好ましい製剤は、昆虫起源の成分を含まない。
【００３４】
製剤における使用のための例示的なアミノ酸は、Ｌ−グルタミン、グリシン、リシン、Ｌ−アルギニン、およびそれらの組合せからなる群から選択され、Ｌ−グルタミンおよびグリシンが特に好ましい。存在する場合、アミノ酸は、最大約５００ｍＭ、好ましくは、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好ましくは、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのレベルで、製剤において使用される。
【００３５】
製剤における使用のための例示的な糖／ポリオールは、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、およびそれらの組合せからなる群から選択される。存在する場合、糖／ポリオールは、最大約１０重量／体積％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは、約５％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）のレベルで、製剤において使用される。一つ以上の実施形態において、製剤は、好ましくは、スクロースを実質的に含まない。
【００３６】
製剤における使用のための例示的な塩化物塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、およびそれらの組合せからなる群から選択される。存在する場合、一価塩化物塩は、最大約１５０ｍＭ、好ましくは、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、より好ましくは、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのレベルで、製剤において使用される。存在する場合、二価塩化物塩は、最大約１５ｍＭ、好ましくは、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、より好ましくは、約５ｍＭ〜約１０ｍＭのレベルで、製剤において使用される。
【００３７】
製剤における使用のための例示的なカルボン酸は、コハク酸塩、乳酸、リンゴ酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される。存在する場合、カルボン酸は、最大約１５０ｍＭ、好ましくは、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、より好ましくは、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのレベルで、製剤において使用される。一つ以上の実施形態において、製剤は、好ましくは、酒石酸塩を実質的に含まない。
【００３８】
一つ以上の実施形態において、１つ以上のさらなる安定剤を、以下のような、例えば経口投与された製剤に関して、タンパク質分解に対する安定性を増大させるために使用することができる。
【００３９】
製剤における使用のための例示的な洗浄剤は、双性イオン洗浄剤、例えば、カプリリルスルホベタイン、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、およびそれらの組合せからなる群から選択されるスルホベタインである。存在する場合、洗浄剤は、少なくとも０．８％（ｗ／ｖ）、好ましくは、約０．８％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）のレベルで、製剤において使用される。一つ以上の実施形態において、製剤は、好ましくは、プルロニックＦ６８を実質的に含まない。
【００４０】
製剤における使用のための例示的な天然タンパク質には、アルブミン、α−ラクトアルブミン、カゼイン、乳清、ラクトフェリン、リゾチーム、トリプトン、およびそれらの組合せが含まれる。存在する場合、天然タンパク質は、少なくとも１％ｗ／ｗ、好ましくは、約１％ｗ／ｗ〜約９９％ｗ／ｗ、より好ましくは、約６０％ｗ／ｗ〜約９６％ｗ／ｗ、さらにより好ましくは、約８０％ｗ／ｗ〜約９６％ｗ／ｗのレベルで、製剤において使用される。
【００４１】
一つ以上の実施形態において、宿主発現系に由来するタンパク質抽出物は、経口安定剤として製剤に含まれる。すなわち、精製ＩｇＡの代わりに（またはそれに加えて）、製剤は、発現系から抽出された発現ＩｇＡ（他の構成要素のうち）を含有する宿主発現系抽出液を含む。一つ以上の実施形態において、植物ベースの発現系は、ＩｇＡ、例えば、コムギ(Triticum sps.)、イネ(Oryza sps.)、オオムギ(Hordeum sps.)、エンバク(Avena sps.)、ライムギ(Secale sps.)、トウモロコシ(corn)（トウモロコシ(maize)）(Zea sps.)、およびキビ(Pennisettum sps.)、ライコムギ、およびソルガム(Sorghum bicolor)を含む穀類を製造するために使用される。
【００４２】
製剤における使用のための例示的なタンパク質抽出物は、ＩｇＡを発現する種子、子実、葉、根、茎または果実を含む種々の植物組織に由来し得る。他の発現系には、藻類、酵母、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）などが含まれ、これらは、ＩｇＡを発現するように設計することができる。これらの系に由来するタンパク質発現抽出物は、宿主系に対して内因性であるタンパク質、脂肪、デンプン／炭水化物、繊維などを含む他の構成要素を含むであろう。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの他の構成要素は、それらの精製されていない形態で製剤に含まれる場合、胃および腸の条件下での分解からＩｇＡを保護するさらなる層を提供すると考えられている。
【００４３】
使用した発現系にもかかわらず、得られた発現産物は、各種類の発現系に対する好適な技法を用いて、製剤における使用のための宿主発現系から抽出されている。抽出法は、発現した１つまたは複数のタンパク質に対する損傷が最小限になるように、好ましくは非変性条件下で行われることが分かるであろう。溶媒は、活性の喪失なく、タンパク質の可溶化および／または抽出のために使用することができる。植物ベースの発現系の場合、上記のように形質転換された細胞は、植物を再生するために使用され、植物は、栽培実践を通じて、成熟させる。結果的に、異種／組換え生物学的治療用タンパク質が、植物組織において産生される。次いで、必要に応じて、植物組織を処理し、タンパク質の抽出を促進することができる。これらのタンパク質は、変性および非変性条件を含み得る規定の抽出条件下で抽出することができる。植物処理手順は、粉砕、濾過、加熱、加圧、塩抽出、蒸発などを含み得る。例えば、宿主発現系植物材料の一部を機械的に処理して、小麦粉、粉末、ペースト、あらびき粉、または他の粉砕された形態を形成することができ、次いで、これを、水性および／または有機抽出液と接触させる。場合により、抽出物をさらに処理して、抽出物を部分的に濃縮し、および／または望まれない成分を除去することができる。好ましい方法において、子実または種子、例えばイネ種子を処理または製粉して、小麦粉、粉末、ペースト、またはホモジネートとし、次いで、得られた処理された宿主発現系原料を、１つの抽出培地または複数の抽出培地、例えば、水溶液、リン酸緩衝生理食塩水、重炭酸アンモニウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、塩化物塩溶液、重炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどに懸濁させる。
【００４４】
一つ以上の実施形態において、発現系抽出物は、製剤における使用のために精製されない（例えば、クロマトグラフィーを介して）。しかしながら、必要に応じて、濃縮するか（例えば、遠心分離により）、またはそうでなければ、大規模濾過（約２０μｍ〜０．２μｍまで）法により濾過してもよい。一般に、本明細書に記載のイネ発現系を用いて、得られた抽出物の約０．７％は、タンパク質（ＩｇＡを含む）を含んでなる。このため、製剤において、タンパク質とは別に、抽出物自体は、最大約９９．３％ｗ／ｗ、好ましくは、約６０％ｗ／ｗ〜約９９．３％ｗ／ｗ、より好ましくは、約８０％ｗ／ｗ〜約９９．３％ｗ／ｗのレベルで、製剤中に存在する。
【００４５】
製剤は、ＩｇＡをｐＨ緩衝剤に分散させることによって、調製する。一つ以上の実施形態において、抽出されたＩｇＡは、例えば、選択された緩衝系を用いて繰り返し希釈および濃縮して、処方のためにＩｇＡを単離することによって、その抽出培地から最初に分離してもよい。ＩｇＡは、製剤において使用する前に、さらに精製してもよい。さらに、ＩｇＡは、製剤において使用する前に、凍結乾燥および再構成してもよい。ＩｇＡはまた、溶液中に保存し、次いで、製剤において使用する前に解凍してもよい。にもかかわらず、ＩｇＡは、非イオン性界面活性剤とともに、選択されたｐＨ値でｐＨ緩衝剤に分散させる。本明細書に記載の１つ以上のさらなる安定剤を、ＩｇＡとともに製剤に分散させてもよい。
【００４６】
製剤は、所望の投与経路に関して好適な形式に従って調製することができ、他の形態の中でも、液体懸濁剤および／または乾燥（凍結乾燥）散剤であり得る。例示的な投与形態には、硬もしくは軟シェル粉末充填非コーティングもしくは腸溶性コーティングカプセル剤、溶解錠剤、カプレット剤、遊離もしくはカプセル化小型錠剤、多粒子剤、ロゼンジ、香錠、顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、注射用溶液剤、液体ボーラス剤、経口液剤、経口懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、ゲル剤、バルクエマルション、噴霧ミスト、エアロゾル、マイクロもしくはナノエマルション、リポソーム、または坐剤などが含まれる。さらに、これらの製剤は、投与時に液体に懸濁される散剤として調製することができる。これらの製剤は、直接投与してもよく、または、対象の飲食物、例えば、栄養補助食品、例えば、調製粉乳中のものもしくは小児用栄養ドリンクに加えるように調製することもできる。
【００４７】
さらに、本明細書に記載の製剤は、薬学上許容可能な保存剤／抗細菌剤（例えば、安息香酸）、抗酸化剤、香味剤、着色剤、キレート剤、甘味剤、懸濁化剤、希釈剤、流動促進剤、滑沢剤などを含んでなり得る。さらに、製剤は、多数の不活性担体、充填剤、または増量剤、例えば、デンプン、シクロデキストリン、塩、オスモライト、金属などを用いて、分散または懸濁または圧縮してもよい。
【００４８】
製剤は、単一の生物学的治療用タンパク質（例えば、ＩｇＡ）を含有してもよいし、または必要に応じて、生物学的治療用タンパク質の組合せを含んでもよい。さらに、さらなる治療剤および／または予防剤を、組合せ療法の一部として、製剤とともに含めることができる。
【００４９】
一つ以上の実施形態において、安定化した製剤は、製造、精製、および保存中に安定なままであり、ストレス要因、例えば、撹拌および／または凍結融解に供された後、安定なＩｇＡの少なくとも５０％の回収率（開始ＩｇＡレベルと比較して）を有する。
【００５０】
一つ以上の実施形態において、安定化した製剤は、安定なままであり、ＧＩ条件（例えば、ＳＧＦおよび／またはＳＩＦのいずれか）に供された後、安定なＩｇＡの少なくとも３５％の回収率（開始ＩｇＡレベルと比較して）を有する。
【００５１】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、ＩｇＡ、ヒスチジンｐＨ緩衝剤、ポリソルベート８０、および塩化カリウムを含んでなる（から本質的になるまたはからなりさえする）。
【００５２】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、ＩｇＡ、リン酸カリウムｐＨ緩衝剤、Ｌ−グルタミン、ソルビトール、塩化ナトリウム、およびコハク酸塩を含んでなる（から本質的になるまたはからなりさえする）。
【００５３】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、ＩｇＡ、リン酸カリウムｐＨ緩衝剤、ソルビトール、塩化ナトリウム、およびコハク酸塩を含んでなる（から本質的になるまたはからなりさえする）。
【００５４】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、ＩｇＡ、リン酸カリウムｐＨ緩衝剤、ソルビトール、および塩化ナトリウムを含んでなる（から本質的になるまたはからなりさえする）。
【００５５】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、ＩｇＡ、任意選択のリン酸カリウムｐＨ緩衝剤、および約０．０２５％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、好ましくは、約０．０５％〜約０．１％のポリソルベート８０、より好ましくは、約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含んでなる。
【００５６】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、ＩｇＡ、リン酸カリウムｐＨ緩衝剤、ポリソルベート８０、およびα−ラクトアルブミンを含んでなる（から本質的になるまたはからなりさえする）。
【００５７】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、ＩｇＡ、リン酸カリウムｐＨ緩衝剤、ポリソルベート８０、およびミリスチルスルホベタインを含んでなる（から本質的になるまたはからなりさえする）。
【００５８】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、宿主発現抽出物中のＩｇＡ、リン酸カリウムまたはヒスチジンｐＨ緩衝剤、およびポリソルベート８０（約０．０５％ｗ／ｖ）を含んでなる（から本質的になるまたはからなりさえする）。
【００５９】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、ＩｇＡ、任意選択のヒスチジンｐＨ緩衝剤、および約０．０２５％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、好ましくは、約０．０５％〜約０．１％のポリソルベート８０、より好ましくは、約０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含んでなる（から本質的になるまたはからなりさえする）。好ましくは、約１０００ｍＭのヒスチジンｐＨ６．０および約０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０である。
【００６０】
一つ以上の実施形態において、例示的な安定化した製剤は、ＩｇＡおよび重炭酸塩（ナトリウム）緩衝剤、用量あたり最大２グラムを含んでなる（から本質的になるまたはからなりさえする）。
【００６１】
実施形態にかかわらず、安定化した製剤は、製剤に分散した治療上有効な量のＩｇＡを含んでなるであろう。いくつかの実施形態において、製剤は、最大約２００ｍｇ／ｍｌのＩｇＡ、好ましくは、最大約１７０ｍｇ／ｍｌのＩｇＡ、より好ましくは、本明細書に記載の約１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌのＩｇＡ、さらにより好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌのＩｇＡを含んでなるであろう。本明細書で使用する場合、用語「治療上有効な」とは、研究者または臨床家により探究中の組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する、特に、いくつかの所望の治療効果を誘発する量および／または期間を指す。例えば、一つ以上の実施形態において、治療上有効な量および期間は、患者における体重のキログラムあたり約１０μｇ〜キログラム体重あたり約１００ｍｇの一日量を表すＩｇＡの有効量を送達する量および期間である。当業者ならば、量または期間は、病態が完全には予防または根絶されていないが、部分的に改善している場合でも、「治療上有効」であるとみなされ得ることを認識する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、製剤は、言及されたもの以外のいかなる他の成分も実質的に含まないが、用語「実質的に含まない」とは、残存量もしくは偶発量または不純物が、少量（例えば、１００重量％とみなす製剤の総重量に対して、約０．１重量％未満、好ましくは、約０．０１重量％未満）で存在し得ると認識されるものの、成分が、意図的に加えられていない、または製剤の一部ではないことを意味する。例えば、一つ以上の実施形態において、安定化した製剤は、プロテアーゼ／ペプチダーゼ阻害剤、例えば、トリプシン阻害剤、ピューロマイシン二塩酸塩、アプロチニン、およびＮ−アセチルシステインを実質的に含まない。一つ以上の実施形態において、安定化した製剤は、動物起源成分を実質的に含まない。
【００６３】
本明細書に開示される複数の実施形態に係る製剤は、抗体ベースの療法を用いて治療することができる種々の疾患および／または病態、例えば、免疫不全、全身病態、粘膜を冒す炎症または障害、心血管病態、代謝症候群、肥満、骨粗鬆症、ニューロパチー、癌、感染性疾患（細菌、ウイルスもしくは真菌）、消化管障害、マイクロバイオーム媒介健康状態、ならびに慢性または急性下痢、クローン病、大腸炎、セリアック病、炎症性腸疾患、感染性疾患などの病態の治療、緩和および／または予防において有用である。製剤は、免疫グロブリンサプリメント、例えば、乳児および新生児の保育のための初乳サプリメント、例えば、調製粉乳中のものとしても使用され得る。免疫グロブリンサプリメントは、リーキーガットに対処するためにも有用であり、または、対象におけるマイクロバイオームを治療、修復もしくは確立／再確立するためのプロバイオティクス製剤の一部である。このため、本明細書に記載の複数の実施形態は、治療的および／または予防的使用を有し、特に、免疫グロブリンにより媒介される種々の病態、特にＩｇＡ欠損症の予防的治療に使用することができる。
【００６４】
一般に、安定化した製剤は、予防的に、すなわち、対象が障害の観察可能な臨床症状を示す前に、投与される。あるいは、安定化した製剤は、すでに障害の観察可能な臨床症状を示している対象に投与することができる。いずれの場合においても、これらの安定化したＩｇＡ製剤は、障害の臨床症状および／もしくは作用の発生率もしくは重症度を低減させるため、ならびに／または対象における症状／作用の持続時間を低減させるために使用することができる。
【００６５】
方法は、安定化した製剤を、それを必要とする対象に経口または直腸投与することを含んでなる。他の好適な投与経路には、非経口および粘膜送達法、ならびに、限定されるものではないが、舌下、局所、鼻腔、頬側、眼、膣内、吸入、静脈内、皮下、筋肉内、注入を含む、全身投与経路または対象の組織領域への直接注射もしくは適用が含まれる。
【００６６】
製剤は、有利には、ＩｇＡの活性型を対象に送達するための、処理、配合、包装、保存、輸送、および投与中に安定なままである。製剤は、ストレス条件、例えば、振盪または撹拌、高温、および凍結融解サイクルに供された場合に安定であるように特別に設計されたものである。製剤は、有効成分および患者の治療のための最終完成製剤の処理および製造、ならびに前臨床試験および臨床試験において使用することができる。
【００６７】
製剤は、好ましくは、約２５℃および６０％ＲＨで最大約６ヵ月間、約４０℃および６０％ＲＨで最大約３ヵ月間、約４℃で少なくとも約１２ヵ月間、約−２０℃で少なくとも約２４ヵ月間、ならびに約−８０℃で少なくとも約６０ヵ月間の保存条件下で安定である。
【００６８】
経口製剤は、有利には、ＩｇＡの活性型を対象の消化管に送達するための、消化中に（例えば、胃および腸の条件下で）安定なままである。これらの製剤は、このような条件下で安定であるように特別に設計されたものである。
【００６９】
本発明の種々の実施形態のさらなる利点は、本明細書における開示および以下の実施例を参照すれば、当業者に明らかであろう。本明細書に記載の種々の実施形態は、本明細書において特に断りのない限り、必ずしも相互排他的ではないことが分かるであろう。例えば、一つの実施形態において記載のまたは示される特色は、他の複数の実施形態にも含まれ得るが、必ずしも含まれるわけではない。このため、本発明は、本明細書に記載の特定の複数の実施形態の様々な組合せおよび／または統合を包含する。
【００７０】
本明細書で使用する場合、２つ以上の項目の列挙において使用される場合の句「および／または」は、列挙項目のいずれか１つが単独で使用され得るか、または列挙項目の２つ以上の任意の組合せが使用され得ることを意味する。例えば、組成物が、成分Ａ、Ｂ、および／またはＣを含有するまたは除外すると記載されている場合、組成物は、Ａ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡおよびＢの組合せ；ＡおよびＣの組合せ；ＢおよびＣの組合せ；またはＡ、Ｂ、およびＣの組合せを含有または除外し得る。
【００７１】
本明細書はまた、本発明の種々の実施形態に関連する特定のパラメーターを定量化するために、数値範囲を使用している。数値範囲が提示される場合、そのような範囲は、範囲の下限値のみを列挙するクレーム限定および範囲の上限値のみを列挙するクレーム限定に対する文字によるサポートを提供するものと解釈されると理解されるべきである。例えば、約１０〜約１００という開示された数値範囲は、「約１０超」（上限なし）を列挙するクレームおよび「約１００未満」（下限なし）を列挙するクレームに対する文字によるサポートを提供する。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は、本発明に従った方法を示す。しかしながら、これらの実施例は例示によって提供され、その中のいずれも、本発明の全体的な範囲を限定するものとしてみなされるべきではないと理解されるべきである。
【００７３】
材料と方法
免疫グロブリンＡ
実験は、動物、ヒト、または微生物起源の任意の副産物からの汚染のない、Ｖｅｎｔｒｉａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＥｘｐｒｅｓｓＴｅｃ（商標）プラットフォームからの植物において発現したＩｇＡを用いて実施した。
【００７４】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
実験は、４℃に調整され、検出波長２８０ｎｍ〜２１５ｎｍに設定された温度制御オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。対応するＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ  ＳＥＣ  ３００Å、７．８×５０ｍｍ、２．７μｍ  ＬＣガードカラムを有するＡｇｉｌｅｎｔ  ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ  ＳＥＣ  ３００Å、２．７μｍ、７．８×３００ｍｍカラムを、キャラクタリゼーションに使用した。最初に、１５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有する移動相および０．２ｍＬ／分の一定流速で、カラムを２０ＣＶに対して平衡化した。カラムオーブン温度は、２５℃に設定した。１ｍｇ／ｍＬで調製したサンプルを、１０μＬの容量で注入し、ランを３０分間モニタリングした。同様の方法およびカラムを用いて、サンプルをまた、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、１％ギ酸、２０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を含有する移動相で分析した。データは、Ｏｐｅｎ  ＬＡＢ  ＣＤＳ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎエディションＲｅｖ．Ｃ．０１．０８［２１０］またはＲｅｖ．Ｃ．０１．０７  ＳＲ３［４６５］で処理した。
【００７５】
陽イオン交換クロマトグラフィー
実験は、４℃に調整され、検出波長２８０ｎｍ〜２１５ｎｍに設定された温度制御オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。対応するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＭＡｂ、ＮＰ５、５μｍ、非多孔質４．０×１０ｍｍ  ＬＣガードカラムを有するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＭＡｂ、ＮＰ５、５μｍ  ４．６×２５０ｍｍカラムを、キャラクタリゼーションに使用した。サンプルは、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ５．０（移動相Ａ）から１０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５（移動相Ｂ）へのステップグラジエントで分析した。カラムは、流速０．８ｍＬ／分の移動相Ａで２０ＣＶに対して平衡化した。移動相Ａのステップグラジエントは、５分間１００％に維持し、次いで、４０分以内に１０％〜０％に減少させた。最後に、０％を１０分間維持した。カラムオーブン温度は、３０℃に設定した。１ｍｇ／ｍＬで調製したサンプルを、１０μＬの容量で注入し、ランを６０分間モニタリングした。データは、Ｏｐｅｎ  ＬＡＢ  ＣＤＳ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎエディションＲｅｖ．Ｃ．０１．０８［２１０］またはＲｅｖ．Ｃ．０１．０７  ＳＲ３［４６５］を用いて解析した。
【００７６】
サンプル調製およびストレス条件
Ａｍｉｃｏｎ超遠心０．５ｍｌフィルター（３０００  ＭＷＣＯ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｌｔｄ）を用いて、広範なダイアフィルトレーションおよび所望の製剤組成物との緩衝液交換により、１ｍｇ／ｍｌの処方サンプルを原液から調製した。
【００７７】
熱ストレス：処方サンプルを、４０℃、６０％相対湿度（ＲＨ）で１０日間インキュベートした。
【００７８】
凍結融解条件：処方サンプルを、３７℃で１０分間の保持時間および−８０℃で２時間の保持時間を有する５サイクルの凍結融解に供した。
【００７９】
撹拌：処方サンプルを、室温にて３０ｒｐｍで１６時間の回転ミキサーでの撹拌に供した。
【００８０】
ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計：サンプルを、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。吸光度を２８０ｎｍで測定し、ｓＩｇＡに用いた比吸光係数（ｄ）は、ｄ０．１％２８０ｎｍ＝１．３７５（Ｌ×ｇ−１×ｃｍ−１）であった。ｓＩｇＡの分子量は、およそ３８０ｋＤａである。
【００８１】
高濃度製剤：高濃度製剤試験用のサンプルを、５ｍｇ／ｍｌ超の濃度で調製した。
【００８２】
Ｖｅｎ−Ａ安定製剤のためのスクリーニングｐＨ条件
生物学的治療剤の安定製剤開発は、物理化学的特徴および生理化学的特徴の両方に関する深い知識を必要とする。ｐＨは、化学分解に対する著明な効果を有し得るため、目的のタンパク質が化学的および物理的に安定であるｐＨ範囲を理解することが重要である。ｐＨ依存的な化学分解／修飾の例は、脱アミド化、酸化、タンパク質分解、ベータ脱離、およびジスルフィドスクランブリングである。
【００８３】
Ｖｅｎ−Ａを、ｐＨ２〜ｐＨ１０で処方し、６０％ＲＨにおいて４０℃で１０日間インキュベートした。サンプルを、ネイティブＳＥＣ−ＨＰＬＣおよび変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて分析し、インキュベーション中の高分子量種（ＨＭＷＳ）および低分子量種（ＬＭＷＳ）の形成に対するｐＨの効果を比較した。得られたデータは、製剤開発にとって最も安定なｐＨ範囲を同定するために使用した。陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いて、化学分解のために生成したＶｅｎ−Ａの酸性種および塩基性種を同定した。
【００８４】
最高のＶｅｎ−Ａの回収率（％）となる製剤条件を選択した。２０ｍＭクエン酸塩ｐＨ２、ｐＨ３、およびｐＨ４におけるＶｅｎ−Ａ製剤は、それぞれ６６％、３９％、および１６％の回収率（曲線下総面積、ＴＡＵＣ）をもたらした（図１）。ストレス無負荷対照サンプルを原液から調製し、これを用いて、異なるｐＨ条件のサンプルを調製した。対照サンプルは、９８％（ＴＡＵＣ）の回収率を示し、２％未満のＬＭＷＳを含有していた。同様に、２０ｍＭクエン酸塩ｐＨ６、ｐＨ７、およびｐＨ８における製剤は、それぞれ７５％、８５％、および８５％の回収率をもたらした（図１）。データは、ｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ範囲において、比較的高い化学的安定性を示した。このため、Ｖｅｎ−Ａは、最適な化学的安定性のために、このｐＨ領域で処方されるべきである。Ｖｅｎ−Ａは、トリス２０ｍＭ  ｐＨ８、ｐＨ９、およびｐＨ１０においても処方し、それぞれ８５％、８９％、および８９％の回収率をもたらした（図１）。全体的に、変性ＳＥＣから収集したデータは、製剤にとって最適なｐＨ領域は、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、およびｐＨ９、好ましくは、ｐＨ６、ｐＨ７およびｐＨ８であることを示した（図１）。
【００８５】
タンパク質の複雑な性質のために、製剤開発は、安定性に影響を及ぼす因子の選択および同定のための直交解析法を必要とする。したがって、変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣに加えて、ネイティブＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、最適なｐＨ条件をスクリーニングおよび同定した。異なるｐＨの製剤を調製するために使用した対照サンプル（ストレス無負荷）は、９９％の単量体種を示し、ＬＭＷＳは１％未満であった（図２）。４０℃および６０％ＲＨで保存後、ｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４、およびｐＨ５で処方されたサンプルは、それぞれ０％、０％、６％および５％の単量体種（すなわち、不十分な製剤ｐＨ）を示した（図２）。対照的に、ｐＨ６、ｐＨ７、およびｐＨ８の製剤は、８５％、６５％および８１％を示した（図２）。ネイティブＳＥＣのデータは、ｐＨ６、ｐＨ７、およびｐＨ８が、良好な製剤ｐＨ条件であったことを示した（図２）。主ピークの最高の面積％を有するｐＨ６およびｐＨ８の製剤を選択した（図２）。また、２０ｍＭトリスｐＨ９およびｐＨ１０における製剤は、それぞれ５５％および５０％の主ピークを示した。データは、Ｖｅｎ−Ａは、より酸性のｐＨではなく、ｐＨ６超のｐＨ値においてより安定であることを示した。全体的に、最も安定なものから比較的安定性が低いものを列挙すると、ｐＨ６＞ｐＨ８＞ｐＨ７の製剤となる。
【００８６】
理想的には、タンパク質分子は、製剤のための選択されたｐＨにおいて、化学修飾されるべきではない。製剤緩衝液中での保存の前に、タンパク質分子は、製造プロセス中で化学修飾される場合がある。これは、タンパク質が遭遇し得る無数のプロセス、例えば、穏やかな様式で行わない場合、最終的に脱アミド化および断片化に至るアフィニティークロマトグラフィーにおける溶出および中和の段階での過酷なｐＨ条件を考慮すれば、驚くべきことではない。Ｖｅｎ−Ａの分解に至る修飾に関するさらなる情報を集めるために、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて、サンプルがストレスに供された後に生成した酸性種および塩基性種をモニタリングした。ＣＥＸは、タンパク質分子の酸性種および塩基性種を分離する強力な分析法である。酸性種（主ピークの前に溶出するもの）は、より負に帯電し（例えば、脱アミド化が原因で）、一方、塩基性種（主ピークの後のもの）は、主ピークと比較して、より正に帯電する。ＣＥＸクロマトグラム上の主要な非修飾ピークの電荷プロファイルの変化は、ｐＨ依存的であり、タンパク質の化学的安定性またはその欠如と相関する。したがって、ＣＥＸを用いて、主ピーク（非修飾）の最高面積％を維持する最小の修飾が存在するｐＨ領域を同定した。
【００８７】
対照サンプルは、５％の酸性種および６％の塩基性種を示し、主ピークの面積％は、ＴＡＵＣの８９％であった（図３）。対照の化学修飾は、製造中におそらく生成された。ｐＨ２〜ｐＨ５の製剤において、非修飾ピークは存在せず（０％ＴＡＵＣ、不十分な製剤ｐＨ）、このことは、有意な分解を示し、この不安定なｐＨ範囲をさらに明確化するものであった。ｐＨ２〜ｐＨ５で認められた種の大部分は酸性種であり、これはおそらく、分解の主要経路としての脱アミド化が原因であった。ｐＨ６で処方されたサンプルは、７２％の主ピーク（すなわち、非修飾）、１９％の酸性種、および９％の塩基性種を示した（図３）。これらのデータは、選択されたストレス条件下でのより低いｐＨ値と比較して、ｐＨ６における有意な化学的安定性を示した。同様に、ｐＨ７で処方されたサンプルは、５８％の主ピーク、４２％の酸性種、および０％の塩基性種を示した（図３）。ｐＨ７、ｐＨ８、およびｐＨ９の製剤は、それぞれ７９％、７４％、および８２％のＶｅｎ−Ａの回収率を示し、主ピークは大部分が非修飾であり、それらの総てが、比較的安定な溶液条件を示している。まとめると、これらの観察所見は、Ｖｅｎ−Ａは、最適な製剤条件（ｐＨ６＞ｐＨ８＞ｐＨ７）として、ｐＨ＞６、好ましくは、ｐＨ６．０および８で化学的に安定であることを示している。
【００８８】
ｐＨ２〜１０のＶｅｎ−Ａのコンフォメーション安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて評価した。溶液のｐＨは、機能活性の必須要件である、タンパク質三次コンフォメーションの安定性に対する既知の寄与因子である。したがって、コンフォメーション安定性のモニタリングは、製剤開発の不可欠な部分である。一般に、低いタンパク質変性温度（Ｔｍ）値をもたらすｐＨ条件は、特定の特質、例えば、高安定性、溶解性、および最小限の凝集が、一連の分析法を用いて認められない限り、製剤にとって好ましいものではない。ｐＨ２において転移は認められず、摂動三次コンフォメーション（不安定なコンフォメーション）が示され、ｐＨ２は、製剤にとって不適であることが示唆された。ｐＨ３、ｐＨ４、およびｐＨ５における製剤条件は、それぞれ６１℃、６７℃、および７１℃に等しいＴｍを示した（図４）。ｐＨ値の増加に伴い、Ｔｍ値が徐々に増加する傾向が認められ、さらなるコンフォメーション安定性が示された（図４）。ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８およびｐＨ９において、Ｔｍ値は、７２℃で安定なままであり、製剤にとって好ましいものであった（図４）。この例外的に類似したＴｍ値は、ｐＨが変化しながら、Ｖｅｎ−Ａの安定なコンフォメーションを示し、これは、製剤開発に好適な条件である。ｐＨ１０（不十分な製剤ｐＨ）において熱転移は認められず、これはおそらく、摂動三次構造またはコンフォメーション不安定性が原因であった。ｐＨ７および８の製剤は良好な安定性を提供するが、ｐＨ６の製剤が好ましい（図４）。
【００８９】
サンプルを、４０℃、６０％でストレスに供し、Ｌ９２９細胞ベースバイオアッセイを用いて、それらの機能活性について試験した（図５および図６）。効力の測定に加えて、バイオアッセイは、タンパク質治療剤の構造的完全性を確認するのに役立ち得る。ｐＨ２〜ｐＨ５で処方されたサンプルは、低い結合親和性を示し、効力の喪失が示唆されたが（図４）、これはおそらく、ＳＥＣ、ＤＳＣ、およびＣＥＸから示される構造的完全性の喪失が原因である（図１、図２、図３および図４）。また、ｐＨ６超で処方されたサンプルは、高い結合親和性を示し、構造的完全性はストレス条件後に維持されたことが示唆された（図５および図６）。全体的に、マウス腫瘍壊死因子アルファ（ｍＴＮＦ−α）を用いた効力アッセイにおいて認められた傾向は、分析的キャラクタリゼーションと顕著に類似していた。しかしながら、Ｌ９２９マウス（Ｃ３Ｈ／Ａｎ）線維芽細胞不死化細胞株をヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｈＴＮＦ−α）とともにインキュベートした場合、差は明らかとはならなかった（図６）。
【００９０】
Ｖｅｎ−Ａ安定製剤のためのスクリーニング緩衝液
ネイティブサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）のデータに基づき、最適な安定性のためにｐＨ６を選択した（図１、図２、図３、および図４）。製剤開発における次の工程は、化学分解および物理分解が最小限なコンフォメーション安定性を維持する緩衝液を選択することであった。ｐＨ６の潜在的な製剤緩衝液には、２０ｍＭ酢酸塩、２０ｍＭリン酸カリウム、２０ｍＭクエン酸塩、および２０ｍＭヒスチジンが含まれる。製剤を、４０℃、６０％ＲＨでストレスに１０日間供し、ＳＥＣ、ＤＳＣを用いて分析し、溶液の澄明性に関して目視検査した。これにより、Ｖｅｎ−Ａの最適な安定性のための潜在的な製剤緩衝液の選択が可能となる。ｐＨ６の２０ｍＭ酢酸塩、２０ｍＭクエン酸塩、２０ｍＭヒスチジンにおける製剤は、８７％超のＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図７）。同様に、２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６は、ＬＭＷＳが９％未満である９１％超の主ピークを示し、製剤緩衝液としての適合性が示された（図７）。酢酸塩およびリン酸カリウム緩衝液において澄明な溶液が認められ、ヒスチジンおよびクエン酸塩緩衝液において関連する濁りが認められた。さらに、クエン酸塩、リン酸塩およびヒスチジン製剤は、７２℃超のＴｍ値を示し、高い熱安定性が示された（図８）。潜在的な製剤緩衝液は、クエン酸塩、ヒスチジン、リン酸カリウムである。しかしながら、さらなる製剤最適化のためにリン酸カリウムを選択した。全体的に、最も好ましいものから比較的好ましくないものを列挙すると、リン酸カリウム＞クエン酸塩＞ヒスチジンとなる。酢酸塩緩衝液を製剤に使用した場合（不十分な製剤緩衝液）、熱転移は認められなかった。
【００９１】
安定剤を含有するＶｅｎ−Ａの製剤
安定剤は、タンパク質の天然のコンフォメーションを安定化することができ、かつ、タンパク質、水、空気−水界面、および容器表面との相互作用による凝集を抑制することができる。しかしながら、一部の安定剤は、タンパク質を不安定化することでも知られる。したがって、安定剤のスクリーニングは、タンパク質の安定製剤開発にとって非常に重要である。安定剤を、２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に加え、製剤を、４０℃、６０％ＲＨでストレスに１０日間供した。
【００９２】
アミノ酸を含有する製剤
アミノ酸は、優先的な除外、直接的なタンパク質結合によりタンパク質を安定化し、緩衝能および抗酸化特性を提供することができる。例えば、アルギニンは、粘度を減少させ、タンパク質の溶解度を増加させる。リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、およびグリシンを含む４つのアミノ酸をスクリーニングした。安定剤の濃度を、１００ｍＭに調整した。リシンおよびアルギニンを含有する製剤は、それぞれ８２％および８７％のＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図９）。同様に、Ｌ−グルタミンおよびグリシンを含有した両製剤は、明らかなＨＭＷＳがない９０％超の主ピークを示した（図９）。全体的に、リシン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−グルタミンを有する製剤は、Ｖｅｎ−Ａの回収率を提供した（図９）。しかしながら、２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０中の安定剤としてのＬ−グルタミンおよびグリシンを有する２つの製剤が、最適であることが判明した（図９）。回収率％、ＨＭＷＳ、およびＬＭＷＳを評価した後の安定剤の順位は、Ｌ−グルタミン＞グリシン＞アルギニン＞リシンである。
【００９３】
糖およびポリオールを含有する製剤
用語「糖」は、単糖、二糖、および多糖を指す。糖の例としては、限定されるものではないが、スクロース、グルコース、デキストロースなどが挙げられる。同様に、用語「ポリオール」は、複数のヒドロキシ基を含有するアルコールを指す。ポリオールの例としては、限定されるものではないが、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。単糖（糖）は、タンパク質と反発相互作用を示し、天然のコンフォメーション状態を好むタンパク質表面から優先的に除去される。反発相互作用は、タンパク質の周囲に水の殻を作り出し、天然状態を安定化させる一方で、凝集の傾向および速度も低減させる。１０％の濃度の単糖およびポリオールを含有するＶｅｎ−Ａの４つの製剤を調製した。スクロース、トレハロース、マンニトール、およびソルビトールを含む安定剤を、４０℃、６０％ＲＨで１０日間のインキュベーション後に検討した。スクロースを含有する製剤は、３０％がＬＭＷＳである７０％のＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図９〜１０）。ストレス後に生成された高レベルのＬＭＷＳは、スクロースの不安定化効果を示す。１０％トレハロースを含有する製剤は、ＬＭＷＳが低レベルである９２％のＶｅｎ−Ａの回収率を示し、Ｖｅｎ−Ａに対する安定化効果が示唆された（図９〜１０）。同様に、１０％マンニトールおよび１０％ソルビトールを含有する製剤は、両方とも、それぞれ９２％のＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図９〜１０）。したがって、安定剤としてのトレハロース、マンニトール、およびソルビトールは、製剤におけるＶｅｎ−Ａの最適な安定化を示した。ランク順は、ソルビトール、トレハロース、マンニトール＞スクロースである。全体的に、スクロースは、他のポリオールおよび糖と比較して、最低の回収率を示した。
【００９４】
塩を含有する製剤
塩を含有する製剤は、タンパク質と反発相互作用を示す場合があり、タンパク質表面から優先的に除外される。優先的な除外を用いて、塩は、タンパク質の溶解度および凝集を調節する。タンパク質の安定性に対する塩の効果は、溶液のｐＨおよび使用するイオンの種類に依存する。したがって、製剤を最適化するための塩のスクリーニングが必要である。この試験では、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含む一般的な塩を試験した。１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有するＶｅｎ−Ａの製剤は、９４％の主ピークを示し、ＬＭＷＳが最小限である安定化効果が示された（図９）。同様の結果が、１０ｍＭ塩化マグネシウムで認められた（図９）。したがって、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムの両方とも、良好な安定剤であり、製剤におけるＶｅｎ−Ａの優れた安定性を示した（図９）。ＵＶ−ＶＩＳを用いたタンパク質の回収率の測定では、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ塩化マグネシウムを含有する製剤でそれぞれ８４％および９３％が示された（図１１）。まとめると、塩化マグネシウムまたは塩化ナトリウムを含有する製剤は、最適な安定性を示した。
【００９５】
カルボン酸を含有する製剤
１０ｍＭ乳酸およびリンゴ酸におけるＶｅｎ−Ａの製剤は、それぞれ８６％および９０％のＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図９）。１００ｍＭ酒石酸塩におけるＶｅｎ−Ａの製剤は、沈殿を示し、さらに分析しなかった（不十分な安定剤）。１００ｍＭコハク酸塩を含有する製剤は、９１％の回収率を示し、優れた安定化効果を示した（図９）。乳酸、リンゴ酸、およびコハク酸塩を含有する製剤に関して、ＵＶ−ＶＩＳを用いて回収率を測定し、それぞれ７２％、６４％、および９０％のＶｅｎ−Ａの回収率が示された（図１１）。このため、ＵＶ−ＶＩＳおよびＳＥＣのデータに基づくと、コハク酸塩が、Ｖｅｎ−Ａ製剤に対する最高の安定化効果を示した。乳酸およびリンゴ酸はＨＭＷＳを示したが、コハク酸塩は、明らかなＨＭＷＳを示さなかった。ランク順は、コハク酸塩＞乳酸およびリンゴ酸である。酒石酸塩は、不十分な安定剤であり、一般に好ましくない。
【００９６】
界面活性剤を含有する製剤
凝集を抑制し、タンパク質フォールディングを支援する（すなわち、シャペロンとしての役割を果たす）ことにより、タンパク質を安定化するために、非イオン性界面活性剤を使用した。また、機械的ストレス（例えば、振盪）により誘導された凝集からタンパク質を保護するため、ならびに凍結、および凍結乾燥プロセス中にタンパク質を安定化するために、界面活性剤も使用した。２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０中の０．２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびプルロニックＦ−６８を含有するＶｅｎ−Ａ製剤を検討した。ポリソルベート２０が、８６％のＶｅｎ−Ａの回収率で最高の安定性を示した（図９）。同様に、ポリソルベート２０およびプルロニックＦ−６８は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで７７．４％および４９％のＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図９）。ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびプルロニックＦ−６８（不十分な安定剤）に関して、ＵＶ−ＶＩＳを用いて測定したＶｅｎ−Ａの回収率は、それぞれ９７％、６２％、および２７％であった（図１１）。ポリソルベート８０を含有する製剤は、優れた回収率および安定性を示した。好ましい製剤としては、ポリソルベート８０＞ポリソルベート２０＞プルロニックＦ６８が含まれる。プルロニックＦ−６８を含有する製剤において、沈殿が認められた。したがって、プルロニックＦ−６８は、不十分な安定剤である。
【００９７】
安定剤の組合せを含有する製剤
さらなる製剤最適化のために、Ｌ−グルタミン、ソルビトール、塩化ナトリウム、およびコハク酸塩を選択した（図１２）。複数の安定剤を１つの製剤に組み合わせると、タンパク質の安定性に対する効果が、陽性または陰性となる可能性がある。したがって、異なる製剤の組合せを設計およびスクリーニングすることが、タンパク質の安定性を確認するために必要である。さらなる製剤最適化のために、界面活性剤であるポリソルベート８０を選択した。高濃度では、界面活性剤はタンパク質を不安定化するが、低濃度では、タンパク質の安定性を十分に増大させない場合がある。したがって、タンパク質を安定化する界面活性剤の標的濃度を決定することが必須である。先行試験（すなわち、スクリーニング）からは、選択された安定剤の存在下では有意な化学分解は認められなかったため、製剤最適化では、物理的安定性に着目した。製剤を、ストレス条件としての撹拌および凍結融解に供し、最適な回収率および安定性を提供する安定剤の組合せを同定した。製剤は、完全実施要因実験計画（ＤＯＥ、ＪＭＰ１４．０．０）を用いて設計した。４つの選択された安定剤の組合せを用いて、１６個の製剤を検討した。安定剤なしの製剤（Ｆ９）は、対照として検討した。記号（−）および（＋）は、それぞれ製剤における安定剤の非存在および存在を示す（表１）。製剤は、完全実施要因ＤＯＥから作成された順序で調製した。
【００９８】
【表１】
2021536489.tif 000003
【００９９】
製剤Ｆ１は、ＳＥＣを用いて測定された、凍結融解および撹拌後のそれぞれ５４％および３１％の主ピークのＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図１４〜１５）。製剤Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８、Ｆ１０、Ｆ１１、およびＦ１６は、８０％超のＶｅｎ−Ａの回収率を示し、撹拌中のより高い安定性が示された（図１５）。さらに、これらの製剤は、ＵＶ−ＶＩＳキャラクタリゼーションに基づき、８５％超の回収率を示した（図１４〜１５）。同様に、製剤Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ８、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１１、Ｆ１３、およびＦ１６は、ＵＶ−ＶＩＳに基づき、８０％より優れたＶｅｎ−Ａの回収率を示し（図１６）、製造および処理にとって好適な製剤条件が示された。５回の凍結融解サイクル後、Ｆ５およびＦ１０は、８３％より優れたＶｅｎ−Ａの回収率を示し（図１６〜１７）、安定な製剤条件が示された。製剤Ｆ２、Ｆ３、Ｆ８、およびＦ１６は、６５％より優れたＶｅｎ−Ａの回収率を示し（図１６〜１７）、比較的安定な製剤条件が示された。また、Ｆ３、Ｆ５、およびＦ１０は、ＵＶ−ＶＩＳ法によって８１％より優れたＶｅｎ−Ａの回収率を示し（図１６〜１７）、望ましい製剤条件として同定された。安定剤の２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０を有さない製剤（Ｆ９）は、撹拌および凍結融解後に最低のＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図１４〜１７）。全体的に、安定剤の組合せの大部分が、Ｖｅｎ−Ａ製剤に対するある程度の安定化効果を示した（図１４〜１７）。
【０１００】
ポリソルベート８０は、０．０２５％、０．０５％、０．１％、および０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で処方された。０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含有する製剤は、ＵＶ−ＶＩＳを用いて測定された、凍結融解後の９７％超のＶｅｎ−Ａの回収率および撹拌後の８７％のＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図１８）。同様に、２０ｍＭリン酸カリウム中の０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて測定された、凍結融解後の９５％のＶｅｎ−Ａの回収率および撹拌後の６５％のＶｅｎ−Ａの回収率を示した（図１９）。一般に、ポリソルベート８０の全濃度が、安定化効果を示した。Ｖｅｎ−Ａの最適な回収率および安定性は、製剤中の０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０の濃度で達成された（図１８〜１９）。全体的に、ポリソルベート８０は、濃度０．０２５％〜０．２％（ｗ／ｖ）で安定化を示し、ランク順は、０．０５％＞０．０２５％、０．１％＞０．２％（ｗ／ｖ）である。
【０１０１】
撹拌および凍結融解のストレス条件に供した後に優れた回収率を示した４つの製剤を選択した。安定剤の組合せは、安定剤なしの製剤と比較した場合、相乗的な安定化効果を示した（図２０および表２）。
【０１０２】
【表２】
2021536489.tif 000004
【０１０３】
選択された製剤におけるＶｅｎ−Ａの効力を、マウスＴＮＦ−α（ｍＴＮＦ−α）およびヒトＴＮＦ−α（ｈＴＮＦ−α）を用いたＬ９２９細胞ベースバイオアッセイを使用して、検討した。全体的に、Ｖｅｎ−Ａは、総ての選択された製剤において高い効力を示した（図２１〜２２）。Ｖｅｎ−Ａは、選択された製剤において高濃度（５〜２０ｍｇ／ｍｌ）で処方された。データは、高い回収率（９０％超）を示し、安定な製剤条件が示された（図２０）。
【０１０４】
ＳＧＦにおける免疫グロブリンＡのタンパク質分解
人工胃液（ＳＧＦ）を調製するために、０．２ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を、約０．９Ｌの精製水に溶かした。次に、緩衝液を、１Ｎ塩酸でｐＨ１．６に調整した。調製を完了するために（下記の表３参照）、０．１２ｇの空腹時人工胃液粉末を、以前にｐＨ１．６に調整した１リットルの緩衝液に溶かした（２倍濃度のＦａＳＳＧＦを産生した）。
【０１０５】
ＩｇＡ製剤を、ＨＣｌ緩衝液ｐＨ１．６中で４ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、２倍ＦａＳＳＧＦと混合し、終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。同様に、対照を、ペプシンを含まないＳＧＦ中で２ｍｇ／ｍＬの濃度のＩｇＡから構成されるように調製した。サンプルを、３７℃で１５分間インキュベートし、変性サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて分析した。
【０１０６】
【表３】
2021536489.tif 000005
【０１０７】
ＳＩＦにおける免疫グロブリンＡのタンパク質分解
およそ０．９Ｌの精製水に、０．４２ｇの水酸化ナトリウムペレット（ＮａＯＨ）、３．９５ｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ）、および６．１９ｇの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を溶かした。次に、緩衝液を、１Ｎ水酸化ナトリウムまたは１Ｎ塩酸でｐＨ６．５に調整した。空腹時ＳＩＦ（ＦａＳＳＩＦ−Ｖ１）を調製するために、４．４８ｇの粉末（すなわち、２倍ＦａＳＳＩＦ−Ｖ１）を、１リットルのリン酸緩衝液ｐＨ６．５に溶かした。パンクレアチンを液体に加え、終濃度２０ｍｇ／ｍｌ（２倍）とした。
【０１０８】
特に断りのない限り、４ｍｇ／ｍｌの濃度のＩｇＡ製剤を、適当な緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液）ｐＨ６．０、０．０５％ポリソルベート８０中で調製し、パンクレアチン（２倍）を含有する人工液と混合し、終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。消化におけるパンクレアチンの終濃度は、１０ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０９】
【表４】
2021536489.tif 000006
【０１１０】
同様に、対照ＩｇＡサンプルを、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、０．０５％ポリソルベート８０中で４ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、パンクレアチンを含まないＳＩＦ（２倍）と混合し、終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。同様に、パンクレアチンを含まないＳＩＦ中の２ｍｇ／ｍｌの濃度の対照ＩｇＡを調製した。サンプルを、３７℃で３０分間インキュベートし、変性サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて分析した。
【０１１１】
安定剤を含有するＳＩＦにおける免疫グロブリンＡのタンパク質分解
２ｍｇ／ｍｌの濃度のＩｇＡ製剤を、安定剤を含有するＳＩＦにおいて１時間消化させた。また、サンプルを、対照として安定剤を含まないＳＩＦにおいて消化させた。インタクトＩｇＡのＳＥＣクロマトグラムのピーク面積を、総ての安定剤に対して消化中にモニタリングした。
【０１１２】
安定剤を含有するＳＧＦにおける免疫グロブリンＡのタンパク質分解
２ｍｇ／ｍＬの濃度のＩｇＡ製剤を、安定剤を含有するＳＧＦにおいて１５分間消化させた。また、安定剤を含まないサンプを、対照として使用し、変性サイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定した。インタクトタンパク質の消化を、変性ＳＥＣを用いてモニタリングした。
【０１１３】
プロテインＬアフィニティークロマトグラフィー
消化の有無を問わず、ＩｇＡおよび宿主発現系抽出物を含有する製剤を、プロテインＬクロマトグラフィーを用いて精製した。ＨＰＬＣ分析を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ機器を用いて実施し、１ｍｌのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌ−６５０Ｆ樹脂を有するカラムを室内で充填し、流速１ｍｌ／分および２８０ｎｍでのＵＶ検出を使用した。簡単に述べれば、カラムを、１０カラム容量（ＣＶ）の１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で平衡化した。ローディングの前に、サンプルをｐＨ７に調整し、２００μｌをカラムに注入した。０〜５分において１００％  １０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、５〜１０分において１００％  １０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０での、ステップグラジエントを用いた。高塩を除去するために、１０〜１５分で移動相を１００％ローディング緩衝液に切り替えた。最後に、１５〜２２分で、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ２．０を用いて、ＩｇＡを溶出させ、１ｍｌの画分を回収し、ＳＥＣを用いたさらなる分析のために濃縮した。その後のランのために、カラムを１０ＣＶローディング緩衝液で平衡化した。
【０１１４】
安定剤として天然タンパク質を含有する免疫グロブリンＡの製剤
精製ＩｇＡ、０．０５％ポリソルベート８０、および２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０を含有する基本製剤を、安定剤としての種々の天然タンパク質、すなわち、アルブミン、α−ラクトアルブミン、カゼイン、乳清、ラクトフェリン、リゾチームと合わせ、ＳＩＦおよびＳＧＦにおいて試験した。また、両液におけるＩｇＡの安定化のために、トリプトンを使用した。ラクトフェリン、α−ラクトアルブミン、リゾチーム、およびトリプトンの製剤において使用した濃度は、５０ｍｇ／ｍｌであった。同様に、製剤中のアルブミン、乳清、およびカゼインの濃度は、それぞれ１８ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、および１０ｍｇ／ｍｌであった。安定性に関して試験した全製剤中のＩｇＡ濃度を、２ｍｇ／ｍｌに維持し、消化時間は、ＳＧＦにおいて１５分およびＳＩＦにおいて３０分であった。ＩｇＡの安定性を、ＳＥＣを用いてモニタリングした。
【０１１５】
【表５】
2021536489.tif 000007
【０１１６】
界面活性剤を含有する免疫グロブリンＡの製剤
精製ＩｇＡ、０．０５％ポリソルベート８０、および２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０を含有する基本製剤を、種々の界面活性剤、すなわち、カプリリルスルホベタイン、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、およびステアリルスルホベタインと合わせた。６．２５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する原液を、各界面活性剤に対して調製した。製剤は、２ｍｇ／ｍｌのＩｇＡおよび２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含有するように調製した。サンプルを、ＳＧＦにおいて１５分間およびＳＩＦにおいて３０分間消化させた。ＩｇＡのタンパク質分解を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてモニタリングした。
【０１１７】
【表６】
2021536489.tif 000008
【０１１８】
緩衝液を含有する免疫グロブリンＡの製剤
（特に断りのない限り）０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を有する精製ＩｇＡの製剤を、異なる緩衝系を用いて調製した。２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０、２５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、２５０ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０、１０００ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ６．０、１０００ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ５．０、および１０００ｍＭヒスチジン緩衝液ｐＨ４．０中で、ＩｇＡを４ｍｇ／ｍｌで調製した。製剤の安定性を、ＳＧＦにおいて試験した。
【０１１９】
【表７】
2021536489.tif 000009
【０１２０】
宿主発現系抽出物を有する免疫グロブリンＡの製剤
宿主組換え発現系（イネ）由来の精製されていないＩｇＡ抽出物を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０、および０．０５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０に溶かし、ＳＧＦにおいて試験した。
【０１２１】
【表８】
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【０１２２】
動物モデルにおける好ましいｓＩｇＡ（Ｖｅｎ−Ａ）の安定化
経口送達されたＶｅｎ−Ａの有効性を、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導炎症性腸疾患（ＩＢＤ）動物モデルにおいて分析する。２５０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０、０．０５％ｗ／ｖポリソルベート８０、５０ｍＭ塩化カリウムを含有する安定化製剤Ｆ４１を使用することができる。Ｃ５７ＢＬ／６雌、６〜８週齢のマウスの１０個の群を、この試験に使用し、１群あたり１０匹のマウスとする。群は、以下のように分類される：
１．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＤＳＳなし
２．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１．２５％ＤＳＳ自由摂取
３．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１．２５％ＤＳＳ自由摂取、Ｆ４１などの製剤で処置、Ｖｅｎ−Ａなし、２００μＬ経口強制、連日
４．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１．２５％ＤＳＳ自由摂取、８％クレモフォールＥＬ中５０ｍｇ／ｋｇシクロスポリンＡで処置、水中５％ＥｔＯＨ、２００μＬ経口強制、連日
５．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１．２５％ＤＳＳ自由摂取、５ｍｇ／ｋｇヒュミラ（アダリムマブ）で処置、ＩＰ３日毎
６．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１．２５％ＤＳＳ自由摂取、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ツイーン−２０中１０００μｇ組換えアルブミンで処置；ｐＨ７．５、２００μＬ経口強制、連日
７．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１．２５％ＤＳＳ自由摂取、例えばＦ４１中１０００μｇ組換え処方Ｖｅｎ−Ａで処置、２００μＬ経口強制、連日
８．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１．２５％ＤＳＳ自由摂取、例えばＦ４１中３００μｇ組換え処方Ｖｅｎ−Ａで処置；ｐＨ７．５、２００μＬ経口強制、連日
９．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１．２５％ＤＳＳ自由摂取、例えばＦ４１中１００μｇ組換え処方Ｖｅｎ−Ａで処置、２００μＬ経口強制、連日
１０．Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１．２５％ＤＳＳ自由摂取、例えばＦ４１中３０μｇ組換え処方Ｖｅｎ−Ａで処置、２００μＬ経口強制、連日
【０１２３】
０日目に、マウスを、飲料水中ＤＳＳ（１．２５％ｗ／ｖ）で、続く６日間処置する。新鮮ＤＳＳ溶液は、試験の中途である３日目に交換する。さらに、０日目から開始して、ＤＳＳ処置群は、各投与日と同時に、シクロスポリン、偽緩衝液もしくは対照、またはＶｅｎ−Ａの連日強制投与を受ける。さらなる対照であるアダリムマブは、３日毎に腹膜内送達する。６日目に、ＤＳＳ溶液を飲料水と交換する。マウスを、体重減少および糞中血液含量に関して１０日目までモニタリングする。マウスはその後屠殺するが、その直前に、心臓穿刺により血液を採取し、凝血させる。血清は、血清化学分析および全身Ｖｅｎ−Ａレベルの定量のために保存する。さらに、糞便および管腔内容物を、Ｖｅｎ−Ａの測定のために採取する。さらに、白血球フローサイトメトリー分析によるさらなる炎症プロファイリングのために、脾臓、腸間膜リンパ節および結腸組織を切除する。
【０１２４】
死後組織学的検査を行い、これには、腸および結腸組織のリンパ球浸潤のＨ＆Ｅ染色、アルシアンブルー(Alcan blue)染色、および免疫組織化学的評価が含まれる。後者は、ＣＤ３＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、ＣＤ６８＋単球／マクロファージ、および好中性顆粒球（ミエロペルオキシダーゼマーカー）に対する特異的な染色を含む。浸潤、陰窩破壊、および杯細胞喪失を含む組織学的パラメーターを測定する。さらに、以下のような複数の組織学的パラメーターを段階分けするために、スコアリングシステムを適用する：炎症の重症度（０〜３：なし、軽度、中等度、重度）、傷害の程度（０〜３：なし、粘膜、粘膜および粘膜下、経壁）、および陰窩損傷（０〜４：なし、基底の１／３が損傷、基底の２／３が損傷、表面上皮のみが無傷、陰窩および上皮の全体が喪失）。各パラメーターのスコアに、組織の関与のパーセンテージを反映する係数を乗じる（×１：０〜２５％、×２：２６〜５０％、×３：５１〜７５％、×４：７６〜１００％）。可能な最大スコアは４０である。体重減少、結腸の長さ、脾臓の大きさの減少、および腸出血の程度を含む、さらなる非組織学的パラメーターを記録する。
【０１２５】
盲腸および小腸から採取したサンプルに対して、薬物動態プロファイリングを行う。全盲腸内容物を開き、採取した後、内容物を秤量し、採取緩衝液（ＰＢＳ＋０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１ｍｇ／ｍＬダイズトリプシンインヒビター、ＰＭＳＦ）に再懸濁し、ホモジナイズする。腸内容物を、採取緩衝液での洗浄により採取し、遠心分離し、濾過して細菌汚染物質を除去する。糞便サンプルを同様に秤量し、採取緩衝液に再懸濁し、ホモジナイズし、遠心分離する。総ての採取したサンプルは、さらなる分析のために−２０℃で保存する。
【０１２６】
フローサイトメトリー分析のために、細胞を、リンパ節、脾臓、および結腸粘膜固有層から単離する。腸間膜リンパ節を、細胞採取のために７０μｍセルストレーナーに押し付ける。結腸細胞採取のために、結腸を腸間膜に沿って開き、管腔内容物をすすぎ落とした後、組織をＰＢＳ＋１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で１ｃｍ切片に切り出す。組織をボルテックスし、７０μｍ組織ストレーナーを通過させる。残存する組織を、１ｍｇ／ｍＬ  ＶＩＩＩ型コラゲナーゼを用いて消化させ、７０μｍセルストレーナーで再度濾過し、細胞計数に使用する。結腸ＣＤ４＋細胞を、フローサイトメトリーのためにポジティブセレクションにより単離する。全３区画からの細胞を、ＣＤ４、インターフェロン−ガンマ、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３に対するフローサイトメトリー用に保証された蛍光抗体を用いて特徴付ける。
【０１２７】
動物モデル試験における好ましいｓＩｇＡ（Ｖｅｎ−Ｂ）の安定化
上記のものと類似したプロトコールに従って、前臨床動物モデル試験を行った。上記のもののような製剤が、イン・ビボの文脈で有益な効果を有するかどうかを試験するために、ｓＩｇＡの好ましい形態であるＶｅｎ−Ｂを、Ｆ４１と名付けたＦ３２のバリアント（２５０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０、０．０５％ｗ／ｖポリソルベート８０、５０ｍＭ塩化カリウム）において処方した。上記のように、Ｖｅｎ−Ｂは、病原性ＥＴＥＣ細菌と宿主腸上皮細胞との間の結合を媒介し、細菌が腸でコロニー形成することを可能にする、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）の表面抗原を特異的に標的とするアロタイプＩｇＡ１またはＩｇＡ２ｍ１の一組の組換えヒトモノクローナルｓＩｇＡ分子を含んでなる。ＥＴＥＣ  ｃｆａＥに対するＶｅｎ−Ｂ抗体のいずれかの結合は、ＥＴＥＣ細菌がヒト腸上皮に付着することを遮断し、ＥＴＥＣにより誘導される下痢および関連症状を予防することを意図している。Ｖｅｎ−Ｂ抗体セットのメンバーを、Ｆ４１において、および１倍リン酸緩衝生理食塩水の対照製剤（Ｆ４２）において処方し、ＥＴＥＣ感染症の前臨床実験動物モデルにおいて試験した。Ｆ４１において処方されたＶｅｎ−Ｂは、各動物の１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で経口投与され、この前臨床動物（マウス）モデルにおいて非常に臨床的に有効であったが（１００％）（図３０）、このことは、ＥＴＥＣにより誘導される下痢および関連症状が、処置マウスの１００％において予防されたことを意味する。比較して、対照Ｆ４２製剤において処方されたＶｅｎ−Ｂは、実質的に不十分な臨床的有効性スコアを示した。ＥＴＥＣ負荷は、試験製剤の投与と同時に行った。
【０１２８】
【表９】
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【０１２９】
考察
安定剤としての天然タンパク質
腸および胃の条件下でＩｇＡを安定化するための安定剤として、天然タンパク質を選択した。試験したこのような安定剤には、アルブミン、カゼイン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、リゾチーム、乳清およびトリプトンが含まれる。安定剤を、腸および胃の条件下でのそれらの安定化効果に関して試験した。安定化天然タンパク質なしの製剤を、対照として試験した。天然タンパク質安定剤なしでのＳＩＦおよびＳＧＦにおけるＩｇＡの分解は速く、過酷なタンパク質分解条件が例示された。しかしながら、天然タンパク質を含有する製剤は、腸液および胃液におけるそれぞれ３０分間および１５分間の消化後に有意な安定性を示した。安定剤を含んでなる製剤間に、安定性の差が認められた。消化後に回収されたインタクトＩｇＡのパーセンテージは、以下の通りである（図２４）：α−ラクトアルブミンを含有する製剤８７％超、ラクトフェリン、リゾチーム、および乳清を含有する製剤８０％超に対し、トリプトンおよびカゼインを含有する製剤は、それぞれ７２％および６０％超を示した。天然タンパク質を含んでなるそれらの製剤は、さらなる安定化を提供するために、界面活性剤および緩衝液などのさらなる安定剤を含有することもできる。全体的に、ＩｇＡの安定化における天然タンパク質のランク順は、α−ラクトアルブミン＞ラクトフェリン＞リゾチームおよび乳清＞トリプトン＞カゼインである。
【０１３０】
天然タンパク質を含有する製剤の安定性は、胃の条件下でも試験した。安定化天然タンパク質なしのＩｇＡの製剤は、１５分以内に急速に分解し、サイズ排除クロマトグラフィーにより９％のインタクトＩｇＡを示した。このデータは、疾患の有効な治療のために、ＩｇＡを安定化するように製剤を設計する必要性を示した。アルブミン、α−ラクトアルブミン、カゼイン、ラクトフェリン、リゾチーム、乳清、およびトリプトンを含有する製剤を試験し、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定された６８％超のインタクトＩｇＡを示した（図２５）。ラクトフェリンを含有する製剤は、消化後に５９％超のインタクトＩｇＡを示した。ＩｇＡの安定化における安定剤のランク順は、以下の通りである：α−ラクトアルブミン＞カゼイン＞乳清、トリプトンおよびアルブミン＞リゾチーム＞ラクトフェリン（図２５）。２つ以上の天然タンパク質を、単一の製剤に使用することができる。また、これらの天然タンパク質は、腸および結腸における治療のために安定なＩｇＡを送達するために、界面活性剤および緩衝液などの他の安定剤とともに使用することができる。製剤中の天然タンパク質の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ超、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ超、さらにより好ましくは、３６ｍｇ／ｍｌ超であり得る。高レベルのカゼインは、製剤において沈殿を示したが、高濃度のそれらの天然タンパク質は、ヒトにとって安全であることが知られている。
【０１３１】
界面活性剤安定剤
胃液および腸液におけるＩｇＡを安定化するために、薬学上許容可能な界面活性剤を使用した。このような界面活性剤には、カプリリルスルホベタイン、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、およびステアリルスルホベタインが含まれる。使用した界面活性剤の濃度は、２％（ｗ／ｖ）超であった。製剤中の界面活性剤のパーセンテージは、２％（ｗ／ｖ）超、好ましくは、０．０５％（ｗ／ｖ）超、より好ましくは、１％（ｗ／ｖ）超であり得る。胃の条件下での消化の１５分後、カプリリルスルホベタインおよびステアリルスルホベタインを含有する製剤は、インタクト（回収された）ＩｇＡのパーセントが、それぞれ４２％および５１％超であったことを示した（図２６）。ラウリルスルホベタインおよびミリスチルスルホベタインを含有する製剤は、それぞれ８２％および８９％のインタクトＩｇＡを示した。ＩｇＡの安定化における界面活性剤のランク順は、以下の通りである：ミリスチルスルホベタイン＞ラウリルスルホベタイン＞ステアリルスルホベタイン＞カプリリルスルホベタイン（図２６）。
【０１３２】
界面活性剤を含有する製剤は、腸の条件下でのそれらの安定性に関しても試験した。安定剤なしの同じ製剤と比較した場合、界面活性剤を含有する製剤に、有意な安定性が認められた。ステアリルスルホベタインおよびミリスチルスルホベタインを含有する製剤は、それぞれ７８％および７７％超のインタクトＩｇＡを示した（図２７）。同様に、カプリリルスルホベタインおよびラウリルスルホベタインを含んでなる製剤は、それぞれ６８％および５１％のインタクトＩｇＡを示した。ＩｇＡの安定化における界面活性剤のランク順は、以下の通りである：ステアリルスルホベタイン＞ミリスチルスルホベタイン＞カプリリルスルホベタイン＞ラウリルスルホベタイン（図２７）。２つ以上の界面活性剤を、天然タンパク質および安定化緩衝液などの他の安定剤とともに使用することができる。
【０１３３】
一般に、ドデシル硫酸ナトリウムで沈殿が認められた。また、低濃度（０．８％未満）の界面活性剤は、不十分な保護を示した。
【０１３４】
安定化緩衝液
１０ｍＭ重炭酸塩、２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、２５０ｍＭリン酸カリウム、および２５０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０を含むいくつかの異なる緩衝液を、ＩｇＡを安定化するために使用した。ＳＧＦにおける消化の１５分後に、２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０を含有する製剤は、６２％のインタクトＩｇＡを示し、一方、ｐＨ９の１０ｍＭ重炭酸塩（ポリソルベート８０なし）は、３７％のインタクトＩｇＡを示した（表７；図２８）。２５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０を含有する製剤は、ほぼ１００％のインタクトＩｇＡを示し、２５０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０および１０００ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０を含有する製剤も同様であった。１０００ｍＭヒスチジン緩衝液を、ＳＧＦ培地と１：９（ｖ／ｖ）で混合した。調製したＩｇＡの濃度は２０ｍｇ／ｍｌであり、これをＳＧＦと混合し、終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。比較して、１０００ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．０、１０００ｍＭヒスチジン、ｐＨ４．０は、ＳＧＦ（すなわち、１：９（ｖ／ｖ））における消化の１５分後に、それぞれ約６９％および１７％のインタクトＩｇＡを示した（図２８）。これらの結果は、ｐＨ６．０で緩衝された開発製剤におけるＩｇＡの高い安定性を示した。全体的に、製剤は、以下のようにランク付けされる：１０００ｍＭヒスチジンｐＨ６．０、２５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、２５０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０、＞２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、＞１０ｍＭ重炭酸塩緩衝液ｐＨ９（図２８）。他の同等な緩衝液は、５ｍＭ超、好ましくは、５０ｍＭ超、より好ましくは、５００ｍＭ超の濃度で調製されたクエン酸塩、酢酸塩、トリス、グリシンおよびアルギニンである。
【０１３５】
タンパク質発現系抽出物
前述の製剤におけるように、イネ発現系由来の精製ＩｇＡを使用する代わりに、宿主発現系由来の未処理ＩｇＡ抽出物を、経口安定性製剤に使用することができる。実施例において、抽出物は、イネ発現系由来の水性タンパク質抽出液、および発現系から抽出されたＩｇＡを含む関連する可溶性画分を含んでいた。この抽出物は、使用される発現系に応じて、デンプン／炭水化物、脂肪、繊維、および他のタンパク質も含み得ることが分かるであろう。抽出物は、濾過または濃縮することができるが、好ましくは、その生／未処理状態で使用される。抽出液は、水、塩、および／または適当な緩衝系を含む。
【０１３６】
ＳＩＦにおいて消化された、発現抽出物を含有する製剤は、ＳＩＦにおける消化の３０分後に、インタクトＩｇＡのほぼ１００％の回収率を示した（図２９）。このデータは、潜在的な治療応用である植物抽出物において処方した場合、ＩｇＡの安定性を示した。２０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６．０、および０．０５％ポリソルベート８０でさらに処方した場合、製剤は、８１％超のインタクトタンパク質を示した（図２９）。緩衝系なしでは、回収率は、ＳＧＦにおいてわずか３０％であった。
【０１３７】
安定化のための阻害剤
安定剤としての種々の阻害剤を、人工腸液および人工胃液において試験した。試験した安定剤は、トリプシン阻害剤、ピューロマイシン二塩酸塩、アプロチニン、およびＮ−アセチルシステインを含む。製剤において使用した安定剤の濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬであった。阻害剤を含有する製剤は、検出可能な主ピークを示さず、有意なタンパク質分解および不安定な組成物が示された。このため、阻害剤はさらに探究しなかった。他のクラスの安定剤と比較して、阻害剤は、人工の腸および胃の条件下でＩｇＡに対する保護を提供しない。
【０１３８】
治療的送達中の製剤によるｓＩｇＡの安定化
記載したように、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）感染症の実験的前臨床動物モデルにおける経口投与による試験のために、ｓＩｇＡの好ましい例であるＶｅｎ−Ｂを、製剤Ｆ４１（ヒスチジンｐＨ６．０、０．０５％ポリソルベート８０および塩化カリウムを含有する）において処方した。対照溶液であるリン酸緩衝生理食塩水中の同じｓＩｇＡは、有効ではなかったが、経口送達されたＶｅｎ−Ｂの安定化した製剤は、高い臨床的有効性を示した（図３０）。これらのデータは、ｓＩｇＡの治療応用を密接に近似する文脈における、安定性および、おそらく抗原結合を含む機能の保存を示した。特に、データは、経口送達中のｓＩｇＡの安定性と一致している。
【０１３９】
記載のこの製剤および他の製剤は、他の治療応用においてｓＩｇＡを同様に安定化することを意図することが分かるであろう。例えば、上記のＶｅｎ−Ａは、ヒトＴＮＦ−αに特異的に結合する組換えヒトモノクローナルｓＩｇＡ分子である。この好ましいｓＩｇＡは、消化器系、特に、小腸および大腸の慢性炎症を特徴とする疾患の実験動物モデルにおける経口投与のために、Ｆ４１または他の記載の安定化製剤において処方できる可能性がある。このような疾患には、炎症性腸疾患、大腸炎、およびクローン病が含まれる。経口送達中のＶｅｎ−Ａの安定化は、胃および腸におけるｓＩｇＡの生存およびタンパク質分解に対するｓＩｇＡの抵抗性を増大させると思われ、腸の内層（粘膜固有層および内膜）における炎症およびＴＮＦ−α沈着の部位への活性Ｖｅｎ−Ａの送達を増大させた。Ｖｅｎ−Ａの生存および作用部位へのＶｅｎ−Ａの送達の増大は、典型的な標準治療である静脈内またはＩＶ注入された抗体と比較して、より有効な抗炎症効果、ならびにより低いｓＩｇＡ用量およびより少ない副作用での治療的処置を促進するという利益を与えるであろう。炎症性サイトカインを標的とする経口的に活性な抗体の開発は、消化管における標的抗体の急速な分解のために、現在までのところは実現しにくい状況である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021536489.tif 000042
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