(57)【要約】  本発明は抗ＢＴＬＡ抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２２、２３、２４、３１、３２及び３３から選ばれる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲドメイン及び/又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９及び３０から選ばれる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲドメインとを含む。本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子、対応する発現ベクター及び宿主細胞、並びに前記抗体又はその抗原結合フラグメント、核酸分子、発現ベクター及び宿主細胞の治療用途に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２２、２３、２４、３１、３２及び３３から選ばれる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲドメイン及び/又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９及び３０から選ばれる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲドメインを含む、ことを特徴とする単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖ＣＤＲのうち、ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１０、１６、２２及び３１から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、及び/又はそのＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１１、１７、２３及び３２から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、及び/又は、そのＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１２、１８、２４及び３３から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、及び/又は
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲのうち、ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１３、１９、２５及び２８から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、及び/又はそのＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、１４、２０、２６及び２９から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、及び/又はそのＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、１５、２１、２７及び３０から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列である、ことを特徴とする請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖ＣＤＲのうち、ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１０、１６、２２及び３１から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１１、１７、２３及び３２から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１２、１８、２４及び３３から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、及び/又は
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲのうち、ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１３、１９、２５及び２８から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、１４、２０、２６及び２９から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、１５、２１、２７及び３０から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列である、ことを特徴とする請求項２に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列は、以下のＡ−Ｅ群のうちのいずれか１つの群に示され、
【表１００】
2021532801.tif 000027
及び/又は
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は以下のＦ−Ｋ群のうちのいずれか１つの群に示される、
【表１０１】
2021532801.tif 000028
ことを特徴とする請求項２に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と軽鎖ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は以下のＩーＩＸ群のうちのいずれか１つの群に示される、
【表１０２】
2021532801.tif 000029
ことを特徴とする請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３７、３９、４１、４４、４６、４７及び４８から選ばれるいずれか１つに示されるアミノ酸配列であり、及び/又は
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３５、３８、４０、４２、４３及び４５から選ばれるいずれか１つに示されるアミノ酸配列である、ことを特徴とする請求項１に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４又は３５に示され、又は
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４又は３５に示され、又は
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示され、又は
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０又は４２に示され、又は
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示され、又は
前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、４７又は４８に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される、ことを特徴とする請求項６に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
単離核酸であって、
（１）請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列と、
（２）（１）前記ポリヌクレオチド配列の相補配列から選ばれる核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離核酸を含有する、ことを特徴とする発現ベクター又は該発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
医薬組成物であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載の発現ベクター又は宿主細胞、又はこれらの任意の組み合わせを含有する、ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載の発現ベクター又は宿主細胞の、ＢＴＬＡ媒介性疾患を治療又は予防するための医薬品の製造における使用
【請求項１３】
免疫抱合体であって、治療剤に結合された請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含有し、好ましくは前記治療剤は毒素、放射性同位体、医薬品又は細胞傷害性剤である、ことを特徴とする免疫抱合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物技術分野に属し、具体的には、ＢＴＬＡと結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、並びにその用途に関する。より具体的には、本発明は、ヒトＢＴＬＡを認識し、腫瘍、感染症、炎症、自己免疫疾患などの治療又は予防に用いられる活性抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
正と負の共刺激シグナルはＢ細胞とＴ細胞活性の調整において決定的な役割を果たし、そしてこれらのシグナルを介する分子が免疫調整剤の効果的なターゲットであることが証明された。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与のほか、ナイーブＴ細胞の最適な活性化にも正の共刺激が必要であり、負の共刺激は、自己免疫耐性の取得及びエフェクターＴ細胞機能の終了に必要なものとみなされる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上のＢ７．１又はＢ７．２と相互作用するときに、プロトタイプＴ細胞共刺激分子ＣＤ２８はＴＣＲの関与に応答してＴ細胞増殖と分化を促進するシグナルを発生させるが、ＣＤ２８ホモログの細胞毒性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）はＴ細胞増殖やエフェクター機能の抑制（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９：５６５−５９４、２００１；Ｅｇｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３：６１１−６１８、２００２）を介する。Ｂ７ファミリーと相同性のあるいくつかの新しい分子（Ａｂｂａｓら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５：１３４５−６、１９９９；Ｃｏｙｌｅら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：２０３−９、２００１；Ｃａｒｒｅｎｏら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０：２９−５３、２００２；Ｌｉａｎｇら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４：３８４−９０、２００２）がすでに発見されており、そしてＴ細胞活性化における作用が説明されている。
【０００３】
ＢとＴリンパ球アテニュエータＢＴＬＡはＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、該ファミリーはまたＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１も含む。モノクローナル抗体の添加によりＴ細胞増殖を向上させるという機能から、該ファミリーの最初のメンバーＣＤ２８及びＩＣＯＳが免疫活性化作用（Ｈｕｔｌｏｆｆら、１９９９）を有することが発見される。ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１などは負の調節タンパク質として記述されている。いくつかの生体内の研究からＢＴＬＡのリンパ球応答における抑制作用が証明されている。Ｍｕｒｐｈｙと同僚（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）により製造されたＢＴＬＡ欠陥のマウスでは、Ｔ依存性抗原に応答した時に産生するＩｇＧが３倍増加する。また、ＢＴＬＡ-マウスから分離したＴ細胞とＢ細胞はそれぞれ、ＣＤ３−と抗ＩｇＭを使用して抗原-受容体刺激を行うと、大きな増殖応答を示す（Ｗａｔａｎａｂｅ、２００３）。過剰発現研究において、ＢＴＬＡがＢ細胞受容体複合物及びＴ細胞受容体と会合することが発見られる。該研究結果と一致し、ＢＴＬＡ欠損リンパ球では、ＣｏｎＡ（Ｔ細胞）又はＬＰＳ（Ｂ細胞）を使用して抗原-受容体非依存性刺激を行うと、影響を受けず、そして抗ＢＴＬＡ抗体を使用しても調整されない。ＢＴＬＡノックアウトマウスでは、経時的には自発性自己免疫疾患が発症し、そして寿命が短縮される（Ｏｙａ、２００８）ことが明らかになる。ＢＴＬＡノックアウトマウスでは、自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）とアレルギー性気道炎症のモデルにおいて疾患の重症度が進行し、その2つのモデルのいずれもＴ細胞活性に依存する（Ｗａｔａｎａｂｅ、２００５；Ｄｅｐｐｏｎｇ、２００６）ことが示されている。
【０００４】
ヘルペスウイルスエントリーメディエータ（ＨＶＥＭ）はＢＴＬＡのリガンド（Ｓｃｕｌｌｙら、２００５）であることが明らかになる。ＨＶＥＭはＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、４個の細胞外システインリッチ領域（ＣＤＲｓ）を有し、６個の偽重複システインを含む。ＢＴＬＡ及びＨＶＥＭは主に細胞表面での動的発現によりＴ細胞とＡＰＣの機能を調整する。ＢＴＬＡは、リガンドと結合すると、Ｔ細胞増殖を抑制し、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５をダウンレギュレートし、また、ＩＦＮーγ、ＩＬー２、ＩＬー４、及びＩＬー１０などの産生を抑制するが、細胞アポトーシスを誘導できない。ＨＶＥＭは、ＢＴＬＡと結合すると、Ｔ細胞活性化と増殖のダウンレギュレート（Ｓｅｄｙ、２００５）を引き起こす。これらの研究結果から明らかなように、ＢＴＬＡの発現又はＢＴＬＡーＨＶＥＭ結合の状況は、Ｔ細胞の活性化と増殖に緊密に関連している。
【０００５】
抗体は医薬品に用いられる。一部の抗体は、生体内で治療薬として用いられる場合、不要な抗体免疫原性を引き起こすことがある。ほとんどのモノクローナル抗体が齧歯動物に由来するため、ヒトにおいて繰り返して使用すると、治療用抗体（たとえば、ヒト抗マウス抗体又はＨＡＭＡ）に対する免疫応答を招く。このような免疫応答は、少なくとも治療が効かないことを引き起こし、最悪な場合、潜在的で致命的なアレルギー反応を引き起こす。齧歯動物抗体の免疫原性を低減させる方法の１つは、キメラ抗体の産生を含み、この場合、マウス可変領域（Ｆｖ）とヒト定常領域とを融合する（Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−４３）。しかしながら、ヒト可変領域とマウス定常領域とのヘテロ接合体を注射したマウスには、ヒト可変領域に対する強い抗体応答が発生し、このことから、このようなキメラ抗体における完全な齧歯動物Ｆｖ領域の保留は依然として患者で有害な免疫原性を引き起こすことが明らかになる。
【０００６】
また、齧歯動物の可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）ループをヒトのフレームワークに移植する（即ちヒト化）ことは、齧歯動物配列を最低に低減させることにさらに用いられる。Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： １５３４。しかしながら、ＣＤＲループを交換しても、開始抗体と相同な結合性質を有する抗体を均一に産生することができない。ヒト化抗体では、抗原結合の親和力を維持するために、フレームワーク残基（ＦＲ）（関与ＣＤＲループによりサポートされている残基）を変える必要がある場合は多い。Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７０９。多数のヒト化抗体構築体においてＣＤＲ移植とフレームワーク残基維持が使用されていることが報告されているが、特定配列が所望の結合性質及び/又は生物学的性質を有する抗体を発生させたか否かは予測しにくい。たとえばＱｕｅｅｎら、（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９；Ｇｏｒｍａｎら、（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４１８１；及びＨｏｄｇｓｏｎ、（１９９１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）、９：４２１−５を参照する。さらに、従来の研究のほとんどでは動物の軽鎖と重鎖可変配列に異なるヒト配列が使用されることにより、このような研究の予測性には問題が生じる。既知の抗体の配列が使用されており、又はより一般的には既知のＸ線結晶構造を有する抗体たとえば抗体ＮＥＷ、及びＫＯＬの配列が使用されている。たとえばＪｏｎｅｓら、同上；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、同上；及びＧｏｒｍａｎなど、同上。少数のヒト化構築体の正確な配列情報が報告された。
【０００７】
ヒト障害（たとえば炎症障害、自己免疫障害や増殖性障害）を治療する抗ＢＴＬＡ抗体、特に抗ＢＴＬＡモノクローナル抗体への需要が存在している。このような抗体は、好ましくはヒト受検者において低免疫原性を有することが可能であり、不良な免疫応答を引き起こさずに繰り返して投与できる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、１種又は複数種の抗ヒトＢＴＬＡ抗体又はその抗原結合フラグメント、及び前記抗体又はその抗原結合フラグメントの疾患治療における用途に関する。
【０００９】
１つ又は複数の実施形態では、本発明はヒトＢＴＬＡ（Ｂ-及びＴ-リンパ球アテニュエータ）と特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、それは、以下から選ばれる１種又は複数種の性質を有する。
Ａ）、ＢＴＬＡとＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリーメディエータ）との結合をブロックすること
Ｂ）、カニクイザルＢＴＬＡと交差反応すること
Ｃ）、ヒトＢＴＬＡと結合されたＫD≦０．２８ｎＭ；又は
Ｄ）、ＡＤＣＣ効果を介しないこと。
【００１０】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２２、２３、２４、３１、３２及び３３、から選ばれる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲドメインと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９及び３０から選ばれる少なくとも１つの重鎖から選ばれる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲドメインと、を含むヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。
【００１１】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は以下のＡーＥ群のうちのいずれか１つの群に示され、
【００１２】
【表Ａ】
2021532801.tif 000002
及び/又はその重鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のＦーＫ群のうちのいずれか１つの群に示される。
【００１３】
【表Ｂ】
2021532801.tif 000003
【００１４】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その重鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のＩ−ＩＸ群のうちのいずれか１つの群に示される。
【００１５】
【表Ｃ】
2021532801.tif 000004
【００１６】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、それは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含み、そのうち、軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３７、３９、４１、４４、４６、４７又は４８に示されるアミノ酸配列から選ばれ、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３５、３８、４０、４２、４３又は４５に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【００１７】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される。
【００１８】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される。
【００１９】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される。
【００２０】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される。
【００２１】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される。
【００２２】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示される。
【００２３】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示される。
【００２４】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示される。
【００２５】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される。
【００２６】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される。
【００２７】
１つ又は複数の実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示され、その重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される。
【００２８】
１つ又は複数の実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントはＩｇＧタイプであり、より好ましくはＩｇＧ４サブタイプである。
【００２９】
１つ又は複数の実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントは一本鎖Ｆｖ抗体であり、ある実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントはＦａｂ抗体であり、ある実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントはＦａｂ'抗体であり、ある実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは（Ｆａｂ'）2抗体である。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、本明細書の前記任意の抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＬドメイン又はＶＨドメインを含む分離ポリペプチドに関する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、本明細書の前記任意の抗体又は抗原結合フラグメントのＶＬドメインとＶＨドメインをコードする単離核酸に関する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、本明細書の前記１種又は複数種の抗体又はその抗原結合フラグメントと薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む組成物に関する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、本明細書で開示された抗体又はその抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、宿主細胞、免疫抱合体又は医薬組成物を治療有効量でこれを必要とする対象に投与することを含む、本明細書の前記１種又は複数種の抗体又はその抗原結合フラグメントを用いてＢＴＬＡ活性を解消、抑制又は低減することにより疾患を予防又は治療する方法に関する。好ましくは、前記疾患又は障害の予防又は治療は、ＢＴＬＡ活性の解消、抑制又は低減により達成され、好ましくは、示される疾患又は病巣は癌、感染症又は炎症疾患から選ばれる。
別の実施形態では、本発明はまた、前記抗体又は抗原結合フラグメント、核酸、発現ベクター、宿主細胞、免疫抱合体又は医薬組成物の、疾患又は障害を治療又は予防する医薬品の製造における用途に関し、前記疾患又は障害は好ましくは、癌、感染症又は炎症疾患から選ばれ得るＢＴＬＡ媒介性疾患である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ヒトＢＴＬＡ細胞外ドメインタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【図２】フローサイトメーターにより検出されたＢＴＬＡとＨＶＥＭとの結合能力である。
【図３】キメラ抗体がヒトＢＴＬＡと結合したＥＬＩＳＡ実験である。
【図４】キメラ抗体によるＢＴＬＡーＨＶＥＭ結合ブロック能力である。
【図５】キメラ抗体によるＴ細胞活性への影響の実験である。
【図６】ヒト化抗体とＢＴＬＡとの特異的結合の実験である。
【図７】ヒト化抗体と２９３Ｆ細胞上のｈＢＴＬＡとの結合の実験である。
【図８】ヒト化抗体によるＢＴＬＡと細胞表面のＨＶＥＭとの結合へのブロックの実験である。
【図９】ヒト化抗体によるT細胞活性化促進の実験である。
【図１０】ヒト化抗体１７とさまざまな種ＢＴＬＡとの結合の比較実験である。
【図１１】ｈｕ１８によるＭＣ３８−ｈＨＶＥＭ細胞移植ＢーｈＢＴＬＡマウスの腫瘍体積への影響である。
【図１２】試験品によるＭＣ３８−ｈＨＶＥＭ細胞移植ＢーｈＢＴＬＡマウスの体重への影響である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
哺乳動物の免疫系は、Ｔリンパ球とＢリンパ球の潜在的な有害活性を抑制する複数の経路を発展している。各種のサイトカイン-受容体経路と受容体（たとえばＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１及びＢＴＬＡ）に関する共刺激経路が含まれる。ＣＤ２８−Ｂ７相互作用は正の共刺激経路の例（即ちＣＤ２８抗原特異的トリガーに対するメンバーのＴ細胞応答をトリガーする）であるが、他の３種類の受容体は抑制的共刺激経路として表現する。ＣＴＬＡ−４、ＰＰＤ−１及びＢＴＬＡは重複しているが一意の発現のプロファイルを示し、Ｔリンパ球とＢリンパ球やほかの免疫細胞の活性を制限する（Ｄｅｐｐｏｎｇら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ ２００６；Ｔａｏら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５を参照）。ＣＴＬＡ−４とＣＤ２８はＢ７．１とＢ７．２（ＣＤ８０とＣＤ８６）を競合的に結合し、リンパ節と脾臓中のナイーブＴ細胞の活性化に元のしきい値を設定するが、ＰＤ−１とＢＴＬＡはそれぞれ特有のリガンド（それぞれＰＤ−Ｌ１／−Ｌ２とＨＶＥＭを有し、末梢Ｔ細胞ホメオスタシスと再活性化（Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７を参照）を制御するようである。
【００３６】
ＢＴＬＡはＢ細胞とＴ細胞の活性化をダウンレギュレートする。名前が示すように、ＢとＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）は休止、及び活性化のＢリンパ球とＴのリンパ球の両方に発現されている。ＢＴＬＡはＩ型膜貫通糖タンパク質であり、チロシンモチーフを抑制する複数の細胞質尾部を含む（Ｗａｔａｎａｂｅ、２００３）。ＢＴＬＡはＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーメンバーのある構造的類似性を有するものの、独特の性質を有する。ＢＴＬＡは複数種の免疫性疾患、炎症疾患や増殖性疾患に関連している。したがって、疾患を治療するためにヒトＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ結合をブロックし得るモノクローナル抗体医薬品の開発は長期間にわたって期待される。
【００３７】
［定義］
本発明をより容易に理解できるように、技術用語を以下のように定義する。本明細書の別の部分で明確に定義しない限り、使用されるすべての他の技術用語は、本発明の当業者が通常理解する定義を有する。
【００３８】
本明細書では、文脈から別に明確に規定しない限り、細胞又は受容体について使用される「活性化」、「刺激」と「処理」、たとえば細胞又は受容体について使用されるリガンド活性化、刺激又は処理は同じ定義を有する。「リガンド」は天然リガンドと合成リガンド、たとえばサイトカイン、サイトカインバリアント、アナログ、変異タンパク質、及び抗体由来の結合化合物を含む。「リガンド」は、小分子、たとえばサイトカインのペプチド模倣物や抗体のペプチド模倣物も含む。「活性化」は内部メカニズム及び外部や環境の要因により調整された細胞の活性化を指す。「応答/反応」、たとえば細胞、組織、器官又は生体の応答は、生化学又は生理学的行動（たとえば生物学的区画内の濃度、密度、接着又は移動、遺伝子発現速度又は分化状態）の変化を含み、ここで、変化は、活性化、刺激又は処理に関連するか、又はたとえば遺伝子プログラミングなどの内部メカニズムに関連する。
【００３９】
分子の「活性」は、この分子とリガンド又は受容体との結合、触媒活性、遺伝子発現又は細胞シグナル伝達、分化又は成熟を刺激する能力、抗原活性、他の分子を調整する活性などを説明するか、これらを意味する。分子の「活性」とは、細胞-細胞間の相互作用（たとえば接着）の調整又は保持における活性、又は細胞構造（たとえば細胞膜又は細胞骨格）の保持における活性をも指す。「活性」とは、比活性、たとえば［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］又は［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画における濃度なども指す。「活性」とは、自然免疫系又は適応免疫系の成分の調整を指す。「増殖活性」は、たとえば正常な細胞分裂及び癌、腫瘍、異形成、細胞形質転換、転移や血管新生にとって必須な活性又はこれらに明確に関連している活性の促進を含む。
【００４０】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官又は生体液で使用される「投与」と「治療」とは、外因性医薬品、治療薬、診断薬又は組成物と動物、ヒト、受検者、細胞、組織、器官又は生体液とを接触させることを意味する。「投与」と「治療」は、たとえば治療、薬物動態、診断、研究や実験方法を意味し得る。細胞の治療は、試薬と細胞を接触させること、及び試薬と流体（ここで該流体と細胞を接触させる）とを接触させることを含む。「投与」と「治療」は、また、生体外及びインビトロ治療、たとえば試薬、診断、結合化合物又は別の細胞を用いた細胞に対する生体外及びインビトロ治療も意味する。「治療」は、治療医薬品たとえば本発明の任意の抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する組成物を、内部又は外部からことを必要とする患者に投与することをも含む。通常、治療対象となる患者又は集団の１種又は複数種の疾患症状を効果的に低減させ得る量で、本明細書の前記抗体又はその抗原結合フラグメント又は対応する医薬組成物を投与することで、これらの症状の解消を誘導するか、これらの症状の進行を抑制することにより任意の臨床的に測定可能な程度を実現する。任意の特定の疾患症状を効果的に低減させる治療医薬品の量（「治療有効量ともいう」）は、たとえば患者の疾患の状態、年齢、体重及び患者において所望の反応を引き起こす医薬品の能力などの要因に応じて変化し得る。医者や他のプロのヘルスケアプロバイダが疾患症状を認定する時によく使用する重症度又は進行状態についての任意の臨床的な測定においてこの症状が低減したか否かを認定することが可能である。
【００４１】
用語「受検者」又は「患者」は任意の生体を含むが、好ましくは動物であり、より好ましくは哺乳動物（たとえばラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）であり、最も好ましくはヒトである。
【００４２】
本明細書では、「投与」又は「治療」は、侵襲的経路、たとえば本明細書の前記のいずれか１つの抗ＢＴＬＡ抗体又はその抗原結合フラグメント又はそれに対応する医薬組成物を注射投与することにより実現できる。非侵襲的経路（たとえば経口投与；たとえば丸剤、カプセル剤又は錠剤で経口投与する）投与は本発明の範囲内である。本発明の一実施形態では、抗ＢＴＬＡ抗体又はその抗原結合フラグメント又はその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、関節内（たとえば関節炎に罹った関節）を経路に、吸入投与、エアロゾル送達、又は腫瘍内投与において与えられる。
【００４３】
本明細書の前記のいずれか１つの抗ＢＴＬＡ抗体又はその抗原結合フラグメント又はそれに対応する組成物は本分野で公知する医療装置において投与し得られる。たとえば、本発明の医薬組成物は皮下注射針により注射投与するか、又は静脈内注射針により注射投与されることができる。
【００４４】
ある実施形態では、本明細書の前記のいずれか１つの抗ＢＴＬＡ抗体又はその抗原結合フラグメント又はそれに対応する医薬組成物は単独して又は組み合わせて使用して、このような治療又は予防を必要とする受検者の任意の疾患又は病状を治療又は予防することができる。
【００４５】
本明細書では、用語「ＢとＴリンパ球アテニュエータ」及び「ＢＴＬＡ」遺伝子/タンパク質は交換可能に使用することができ、バリアント、アイソタイプ、ホモログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、及びパラログ（ｐａｒａｌｏｇ）を含む。たとえば、いくつかの実施形態では、ヒトＢＴＬＡ特異的抗体は、非ヒト種に由来するＢＴＬＡと交差反応し得る。他の実施形態では、ヒトＢＴＬＡ特異的抗体は、ヒトＢＴＬＡに対して完全に特異的であってもよく、且つ種の交差反応性又は他のタイプの交差反応性を有さない。特に断らない限り、用語「ヒトＢＴＬＡ」又は「ｈＢＴＬＡ」とは、ヒトＢＴＬＡ配列を指す。特に断らない限り、ヒトＢＴＬＡ配列は、すべてのヒトアイソタイプとＢＴＬＡバリアント、たとえばＧｅｎＢａｎｋ登録番号がＡＡＰ４４００３であるヒトＢＴＬＡの完全アミノ酸配列を含む。また、少なくとも２種のヒトＢＴＬＡトランスクリプトバリアントが存在し、トランスクリプトバリアント１はタンパク質長さが２８９個のアミノ酸（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿８６１４４５）のタンパク質をコードし、登録番号ＡＡＰ４４００３のＢＴＬＡ配列とは約９８％の同一性を有し、トランスクリプトバリアント２はタンパク質長さが２４１個のアミノ酸のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１０７８８２６）をコードする。
【００４６】
ＢＴＬＡは免疫応答の負の調整因子であり、そのＣ末端の抑制モチーフは、ＩＬー２産生とＴ細胞増殖の抑制に関与する（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４、６７０−６７９、２００３；Ｃｈｅｍｎｉｔｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７６、６６０３−６６１４、２００６）。また、ヒトＢＴＬＡは、本発明の前記抗体と特異的に結合するＢＴＬＡの細胞外ドメイン中のエピトープであってもよい。
【００４７】
具体的なＢＴＬＡ配列では、その細胞外ヌクレオチド配列は一般にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９のヒトＢＴＬＡの細胞外ドメイン又は他のアイソタイプのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有し、且つ他の種（たとえばマウス）のＢＴＬＡアミノ酸配列と比べると、ヒトのアミノ酸配列であると同定されたアミノ酸残基を含む。いくつかの場合、ヒトＢＴＬＡ細胞外ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９のヒトＢＴＬＡ細胞外ドメイン又は他のアイソタイプ又はバリアントと少なくとも９５％又は、さらに少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し得る。
【００４８】
用語「免疫応答」とは、たとえばリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球と上記細胞又は肝から産生する可溶性大分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の作用を指し、該作用により、侵入病原体、病原体を感染した細胞又は組織、癌細胞又は自体免疫又は病理学的炎症の場合の正常なヒト細胞又は組織が人体から選択的に損害、破壊又は除去される。
【００４９】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、所望の生物学的活性を有する任意の形態の抗体を意味する。したがって、最も広義に使用される場合、それは、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体、及びキャメル化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体を含むが、これらに制限されない。本明細書で使用される用語「抗ＢＴＬＡ抗体」又は抗体の「抗原結合フラグメント」とは、ＢＴＬＡと結合し、ＢＴＬＡとＨＶＥＭとの結合をブロックする抗体であり、抗体のフラグメント又は誘導体を含み、通常、抗体の少なくともいくつかの結合特異性を保持する抗体の抗原結合領域又は可変領域（たとえば１つ又は複数ＣＤＲ）の少なくとも１つフラグメントを含む。抗体結合フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、及びＦｖフラグメント、二重抗体、線形抗体、ｓｃ−Ｆｖなどの一本鎖抗体分子、抗体フラグメントから形成されるナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、及び多重特異性抗体を含むが、これらに制限されない。ＢＴＬＡ結合活性がモル濃度で示される場合、結合フラグメント又は誘導体は、通常、そのＢＴＬＡ結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、結合フラグメント又は誘導体は、少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％以上の抗体のＢＴＬＡ結合親和力を保持する。抗ＢＴＬＡ抗原結合フラグメントは、その生物学的活性を明らかに変えない保存又は非保存アミノ酸置換（抗体の「保存バリアントという」又は「機能性保存バリアント」）を含み得ることが期待される。
【００５０】
「単離抗体」とは、抗体又はその抗原結合フラグメントの精製状態を指し、且つこのような場合、該分子は実質的には他の生物分子、たとえば核酸、タンパク質、脂質、糖や、細胞破片と成長培地などの他の物質を含まないことを意味する。用語「分離（した）」とは、本明細書の前記抗体又はその抗原結合フラグメントの実験又は治療への使用を明らかに干渉する量で存在しない限り、このような物質が完全に存在しない、又は水、緩衝液又は塩が存在しないことを意味するのではない。
【００５１】
本明細書で使用される用語「機能的フラグメント」又は「抗原結合フラグメント」は、特に抗体フラグメント、たとえばＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖーＦｃフラグメント又は二重抗体、又は化学修飾又はリポソームに混合することにより半減期を増加させ得る任意のフラグメントを指し、前記化学修飾はたとえばポリ（アルキレン）グリコールたとえばポリエチレングリコール（「ポリエチレングリコール化、ＰＥＧ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ'）2−ＰＥＧ 又はＦａｂ'−ＰＥＧのポリエチレングリコール化フラグメントという）（「ＰＥＧ」はポリエチレングリコール）の添加であり、前記フラグメントはＥＧＦＲ結合活性を有する。好ましくは、前記機能的フラグメントは、抗体由来の可変重鎖又は可変軽鎖の一部の配列から構成されるか、又はこれらを含み、前記一部の配列は、その由来となる抗体と同じ結合特異性と十分な親和力を保留するのに十分であり、ＢＴＬＡの場合、好ましくは、少なくともその由来となる抗体親和力の１／１００に等しく、より好ましくは、少なくとも１／１０に等しい。この機能的フラグメントは、少なくとも5個のアミノ酸、好ましくはその由来となる抗体配列の１０、１５、２５、５０及び１００個の連続アミノ酸を含む。
【００５２】
「Ｆａｂフラグメント」は１本の軽鎖、ＣＨ１及び１本の重鎖の可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は他方の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
【００５３】
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１とＣＨ２ドメインを含む２個の重鎖フラグメントを含有する。該２個の重鎖フラグメントは２個以上のジスルフィド結合及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用を通じて一体に保持される。
【００５４】
「Ｆａｂ'フラグメント」は１本の軽鎖と１本の重鎖の部分又はフラグメントを含有し、該重鎖の部分又はフラグメントはＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間の領域を含有し、それにより、２個のＦａｂ'フラグメントの２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ'）2分子が形成される。
【００５５】
「Ｆ（ａｂ'）2フラグメント」は２本の軽鎖とＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に介在する定常領域の一部の２本の重鎖とを含有し、それにより、２本の重鎖の間に鎖ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ'）2フラグメントは２本の重鎖間のジスルフィド結合を通じて一体に保持されている２個のＦａｂ'フラグメントからなる。
「Ｆｖ領域」は重鎖と軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域がない。
【００５６】
用語「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体とは、抗体のＶＨとＶＬドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。ｓｃＦｖポリペプチドは一般にはＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンガーをさらに含み、それにより、ｓｃＦｖは抗原結合用の所望の構造を形成できる。
【００５７】
「ドメイン抗体」とは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域だけを含有する免疫機能性免疫グロブリンフラグメントである。いくつかの場合、２個以上のＶＨ領域はペプチドリンガーと共有結合して二価ドメイン抗体を形成する。二価ドメイン抗体の２個のＶＨ領域は、同じ又は異なる抗原にターゲティングできる。
【００５８】
「二価抗体」は２個の抗原結合部位を含む。いくつかの場合、２個の結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は二重特異性であってもよい。
【００５９】
特に断らない限り、本明細書で使用される「抗ＢＴＬＡ抗体」とは、ヒトＢＴＬＡ又はそのバリアント又はその任意の抗原フラグメントに対して産生する抗体のことである。
【００６０】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体群から得る抗体であり、即ち、天然に存在し得る少量の変異以外、この群からなる各抗体は同じである。モノクローナル抗体は高い特異性を持ち、単一の抗原エピトープに対するものである。それに対して、通常の（ポリクローナル）抗体製造物は、通常、異なるエピトープに対する大量の（又は異なるエピトープに対して特異性を有する）抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体群から得た抗体の特徴を示し、任意の特定の方法を通じて抗体を産生する必要があると解釈されない。たとえば、本発明で使用されるモノクローナル抗体はハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ方法により製造され得る。またファージ抗体ライブラリーにより「モノクローナル抗体」を分離してもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、ここで、重鎖及び/又は軽鎖の一部は、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同じ又は相同であり、一方、この鎖の残りの部分は、別の種に由来する又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、及びこのような抗体のフラグメントの対応する配列と同じ又は相同であり、これらは所望の生物学的活性を有すればよい。
【００６２】
本明細書で使用される「キメラ抗体」とは、第１の抗体の可変ドメインと第２の抗体の定常ドメインとを有する抗体であり、第１の抗体と第２の抗体は異なる種に由来する。通常、可変ドメインは、齧歯動物などの実験動物から入手する抗体（「親抗体」）であり、定常ドメイン配列はヒト抗体から入手し、それにより、親齧歯動物抗体に比べて、得たキメラ抗体は、ヒト受検者において不良免疫応答を誘導する可能性が低くなる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書のモノクローナル抗体は、キャメル化単一ドメイン抗体をさらに含む。たとえばＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５を参照。
【００６４】
本明細書で使用される用語「二重抗体」とは、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、前記フラグメントは、同一ポリペプチド鎖（ＶＨーＶＬ又はＶＬーＶＨ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖の２個のドメインの間のペアリングが不可能になるほど短いリンガーを使用することにより、該ドメインと別の鎖の相補ドメインがペアリングさせられて２個の抗原結合部位を産生する。
【００６５】
本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」とは、ヒトと非ヒト（たとえばマウス、ラット）抗体に由来する配列を含有する抗体の形態である。一般には、ヒト化抗体は、実質的にすべての少なくとも１個、通常、２個の可変ドメインを含み、ここで、すべて又は実質的にすべての超可変領域は、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に相当し、すべて又は実質的にすべてのフレームワーク（ＦＲ）領域は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は、任意選択に、少なくとも一部のヒト免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を含む。
【００６６】
総じていえば、基本的な抗体構造単位が四量体を含むことが知られている。各四量体は、２個の同じポリペプチド鎖対を含み、１対は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を含む。各鎖のアミノ末端部分又はフラグメントは、主に抗原認識を行う約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含み得る。各鎖のカルボキシル末端部分又はフラグメントは、主にエフェクター機能を果たす定常領域を限定し得る。通常、ヒト軽鎖をκとλ軽鎖に分類する。さらに、通常、ヒト重鎖をμ、δ、γ、α又はεに、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥに定義する。軽鎖と重鎖では、可変領域と定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を通じて連結され、重鎖はまた約１０個あまりのアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第７章（Ｐａｕｌ、Ｗ．編、第２版を参照する。Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））。
【００６７】
各軽鎖／重鎖対の可変領域はペアリングして抗体結合部位を形成する。したがって、完全なＩｇＧ抗体は一般には２個の結合部位を有する。二機能性又は二重特異性抗体以外、２個の結合部位は通常同じである。
【００６８】
通常、各鎖は３個の超可変領域（相補性決定領域又はＣＤＲ）を通じて連結された同じ比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の通用構造を有する。各対の２本の鎖のＣＤＲは、通常、フレームワーク領域を通じて揃えるとこで特定エピトープと結合する。。総じていえば、軽鎖と重鎖の両方は、Ｎ末端からＣ末端までのドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。一般には、以下の文献における定義に従って、各ドメインのアミノ酸を指定する。Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．；第５版；ＮＩＨ公告号９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５；Ｋａｂａｔら（１９７７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７） Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７又はＣｈｏｔｈｉａら（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２ ：８７８−８８３。
【００６９】
本明細書で使用される用語「超可変領域」とは、抗原結合を行う抗体アミノ酸残基である。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。本明細書で使用される用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、本明細書においてＣＤＲ残基と定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７０】
「有効量」は、医学的な障害の症状又は症候の改善又は予防に十分な量を意味する。有効量は、また、診断を可能に、又は簡便にするのに十分な量を意味する。特定の患者又は獣医対象に対する有効量は、たとえば治療対象の病状、患者の全体的な健康状況、投与の方法や経路、用量や副作用の重症度などの要因に応じて変化し得る。有効量は、明らかな副作用又は毒性作用を回避できる最大用量又は投与態様である。結果として、診断測定又はパラメータは、少なくとも５％、通常少なくとも１０％、より一般的には少なくとも２０％、最も一般的には少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、更好適には少なくとも８０％、最も好適には少なくとも９０％改良でき、１００％は、正常な受検者で見られる診断パラメータとして定義される（たとえばＭａｙｎａｒｄら（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ； Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ ＣｌｉｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ、Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫを参照）。
【００７１】
「相同性」とは、２個のポリヌクレオチド配列の間又は２個のポリペプチド配列の間の配列の類似性を指す。比較される２個の配列のうちある位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットに占められている場合、たとえば２個のＤＮＡ分子のそれぞれのある位置がアデニンに占められている場合、該位置上の分子は相同である。２個の配列間の相同性百分率は、２個の配列が共有するマッチ位置又は相同位置の数を比較される位置数で割って１００をかけた関数である。たとえば、配列に対して最適比較を行う場合、２個の配列の１０ 個の位置のうち６個がマッチし又は相同であると、２個の配列は６０％相同である。一般には、２個の配列を比較する場合、最大百分率の相同性を得るために比較を行う。
【００７２】
本明細書では、「免疫障害」は、たとえば病理学的炎症、炎症障害、自己免疫障害又は疾患を含む。「免疫障害」は、また、感染、持続感染や増殖性病状、たとえば癌、腫瘍や血管新生を意味し、疫系による根絶に抵抗する感染、腫瘍や癌を含む。「癌性病状」は、たとえば癌、癌細胞、腫瘍、血管新生や前癌病状、たとえば異形成を含む。本明細書で現れる「免疫病巣」と「癌性病状」の両方は好ましくはＢＴＬＡを介する。
【００７３】
「炎症障害」とは、その病理のすべて又は一部が、たとえば免疫系細胞の数の変化、移動速度の変化や活性化の変化により引き起こされる障害又は病理状況である。免疫系細胞は、たとえばＴ細胞、Ｂ細胞、単球又はマクロファージ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹枝状細胞、ミクログリア、ＮＫ 細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、好酸球、肥満細胞や免疫学に特に関連する任意の他の細胞、たとえばサイトカイン産生内皮細胞又は上皮細胞を含む。本明細書で現れる「炎症障害」は好ましくはＢＴＬＡを介する。
【００７４】
「単離核酸分子」とは、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成した又はいくちかの組み合わせからのＤＮＡ又はＲＮＡを意味し、ポリヌクレオチドのすべて又は一部と会合せず（ここで単離ポリヌクレオチドは天然に存在する）、又は天然に連結されていないポリヌクレオチドと連結されている。本開示内容の目的に関しては、特定ヌクレオチド配列「を含む」「核酸分子」は完全な染色体を含まないと理解すべきである。所定の配列以外、所定の核酸配列「を含む」単離核酸分子は、１０個又は２０個以上と多い他のタンパク質又はその一部の又はフラグメントのコード配列を含むか、又は効果的に連結されて当該核酸配列のコード領域の発現を制御する調節配列、及び/又はベクター配列を含むことができる。
【００７５】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」という表現は交換可能に使用され、このような名称はすべて子孫を含む。したがって、用語「形質転換体」と「形質転換細胞」は、接代回数を問わずに、初代表題細胞とそれから得た培養物を含む。また、意図的又は意図的ではない変異により、すべての子孫のＤＮＡ内容物は完全に同じではない可能性があることを了解する必要がある。最初の形質転換細胞からスクリーニングした同じ機能又は生物学的活性を有する変異型子孫が含まれている。異なる名称に指定されているが、文脈から明確である。
【００７６】
本発明の前記宿主細胞は、原核宿主細胞、真核宿主細胞又はファージであり得る。原核宿主細胞は大腸菌、枯草菌、ストレプトミセス又はミラビリス変形菌などであり得る。真核宿主細胞は、たとえば、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、分裂酵母、トリコデルマなどの真菌；アーミーワームなどの昆虫細胞；タバコなどの植物細胞；ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞などの哺乳動物細胞であり得る。いくつかの実施態様では、本発明の前記宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞又はＣＯＳ細胞である。
【００７７】
本明細書で使用される「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」は一般には、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するには目標領域末端又はそれ以外の配列情報が必ず入手可能であり、これらのプライマーは増幅対象テンプレートの反対鎖の配列と同じ又は類似する。２個のプライマーの５′末端ヌクレオチドは増幅材料の末端と一致してもよい。ＰＣＲは特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定ＤＮＡ配列及び細胞からの全ＲＮＡ、ファージ又はプラスミド配列で転写されたｃＤＮＡなどを増幅することに用いられる。一般にはＭｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３ ；Ｅｒｌｉｃｈ編（１９８９）ＰＣＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ）を参照する。本明細書で使用されるＰＣＲは、（一意ではない）核酸試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の１つの例であり、該方法は、プライマーとしての既知の核酸と核酸ポリメラーゼを用いて特定の核酸フラグメントを増幅又は産生することを含む。
【００７８】
［ヒトＢＴＬＡ特異的抗体］
本発明は、要するに、ＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメント、及びこのような抗体又はその抗原結合フラグメントの用途を提供する。より具体的には、本発明は、単離抗ＢＴＬＡ抗体又はその抗原結合フラグメント及びこれらの抗体又はその抗原結合フラグメントの、疾患の治療と予防における使用を提供する。抗ＢＴＬＡ抗体の例は、本明細書の前記ｃｈ７、ｃｈ１２、ｃｈ１７、ｃｈ２２、ｃｈ２７、ｈｕ１７、ｈｕ１８、及びｈｕ１９を含むが、これらに制限されない。
【００７９】
本発明はヒトＢＴＬＡ（Ｂ-及びＴ-リンパ球アテニュエータ）と結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは以下の１種又は複数種の性質を有する：Ａ）、ＢＴＬＡとＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリーメディエータ）との結合をブロックすること；Ｂ）、カニクイザルＢＴＬＡと交差反応すること；Ｃ）、ヒトＢＴＬＡと結合されたＫD≦０．２８ｎＭ。
【００８０】
１つ又は複数の実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖ＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２２、２３、２４、３１、３２及び３３から選ばれる少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含む。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖ＣＤＲのうち、ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１０、１６、２２及び３１から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であってもよく、いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖ＣＤＲのうち、ＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１１、１７、２３及び３２から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であってもよく、いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖ＣＤＲのうち、ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１２、１８、２４及び３３から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であってもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖ＣＤＲのうち、ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１０、１６、２２及び３１から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であってもよく、ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１１、１７、２３及び３２から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１２、１８、２４及び３３から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、その軽鎖のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列は以下のＡーＥ群のうちのいずれか１つの群に示される。
【００８３】
【表Ｄ】
2021532801.tif 000005
【００８４】
１つ又は複数の実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２５、２６、２７、２８、２９及び３０から選ばれる少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを含む。たとえば、いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲのうち、ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１３、１９、２５及び２８から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であってもよく、いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲのうち、ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、１４、２０、２６及び２９から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であってもよく、いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲのうち、ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、１５、２１、２７及び３０から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であってもよい。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖ＣＤＲのうち、ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１３、１９、２５及び２８から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、１４、２０、２６及び２９から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、１５、２１、２７及び３０から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、その重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下のＦ−Ｋ群のうちのいずれか１つの群に示される。
【００８７】
【表Ｅ】
2021532801.tif 000006
【００８８】
１つ又は複数の実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖ＣＤＲのうち、ＬＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１０、１６、２２及び３１から選ばれるいずれか１つの配列であり、ＬＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１１、１７、２３及び３２から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列でありＬＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１２、１８、２４及び３３から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、その重鎖ＣＤＲのうち、ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１３、１９、２５及び２８から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、５、１４、２０、２６及び２９から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列であり、ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、６、１５、２１、２７及び３０から選ばれるいずれか１つのＣＤＲ配列である。
【００８９】
１つ又は複数の実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、その軽鎖のＬＣＤＲ、ＬＣＤＲ、及びＬＣＤＲ配列は以下のＡーＥ群のうちのいずれか１つの群に示される。
【００９０】
【表Ｆ】
2021532801.tif 000007
【００９１】
及び/又はその重鎖ＣＤＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は以下のＦ−Ｋ群のうちのいずれか１つの群に示される。
【００９２】
【表Ｇ】
2021532801.tif 000008
【００９３】
本明細書で開示された軽鎖の各ＣＤＲ配列、特に各ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列と、重鎖の各ＣＤＲ配列、特に各ＨＣＤＲ１、ＨＬＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列は、任意に組み合わせられることを理解する必要である。たとえば、本明細書でＬＣＤＲ１と定義されている配列のうち任意の１本の配列は、本明細書でＬＣＤＲ２と定義されている配列のうち任意の１本、ＬＣＤＲ３と定義されている配列のうちの任意の１本、ＨＣＤＲ１と定義されている配列のうちの任意の１本、ＨＣＤＲ２と定義されている配列のうちの任意の１本、及びＨＣＤＲ３と定義されている配列のうちの任意の１本と組み合わせて、本明細書の前記ヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントに含まれる完全な６個のＣＤＲドメインを形成し得る。
【００９４】
したがって、一例として、１つ又は複数の実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントにおいて、その重鎖ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と、軽鎖ＣＤＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は以下のＩーＩＸ群のうちのいずれか１つの群に示される。
【００９５】
【表Ｈ】
2021532801.tif 000009
【００９６】
１つ又は複数の実施形態では、本発明に係るヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３７、３９、４１、４４、４６、４７及び４８から選ばれるいずれか１つに示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列、及び/又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３５、３８、４０、４２、４３及び４５から選ばれるいずれか１つに示される重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
【００９７】
１つ又は複数の実施形態では、本発明の単離抗体は、重鎖定常領域、好ましくはヒト定常領域、たとえばγ１、γ２、γ３又はγ４ヒト重鎖定常領域又はそのバリアントを含む。別の実施形態では、本発明の単離抗体は、軽鎖定常領域、好ましくはヒト軽鎖定常領域、たとえばλ又はκヒト軽鎖領域又はそのバリアントを含む。限定的ではない例として、ヒト重鎖定常領域はγ４、ヒト軽鎖定常領域はκであってもよい。一実施形態では、抗体のＦｃ領域は、保存修飾又は保存置換又は保存変異を有するγ４であり得る。
【００９８】
本明細書では、用語「保存修飾バリアント」又は「保存置換」又は「保存変異」とは、タンパク質中のアミノ酸が類似した性質（たとえば電荷、側鎖の大きさ、疎水性/親水性、主鎖のコンホメーションや剛性など）を有するほかのアミノ酸で置換され、それにより、タンパク質の生物学的活性を変えずに頻繁に変化可能にすることを意味する。当業者が理解できるように、ポリペプチドの必須ではない領域の単一のアミノ酸置換は一般には生物学的活性を明らかに変化させることはない（たとえばＷａｔｓｏｎら、（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、第２２４頁（第４版）を参照）。また、構造又は機能的に類似したアミノ酸の置換は生物学的活性を破壊する可能性が低い。本発明の各実施形態の抗体又はその抗原結合フラグメントは、下記配列を有するポリペプチド鎖を含む。本明細書で開示された具体的なアミノ酸配列（たとえばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７及び４８）と比較するときに、多くとも０（変化無し）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０個以上の保存アミノ酸置換、たとえば、０〜２０個のアミノ酸置換、又は１〜１５、１〜１０、１〜８、１〜５個の置換、又は上記の任意の２個の数からなる範囲内での置換を含む。
【００９９】
したがって、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの機能性保存バリアント、即ち、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの１つ又は複数のアミノ酸残基が抗体全体のコンホメーションと機能を変えずに変化したバリアントをも含み、アミノ酸が類似した性質のアミノ酸で置換されたものを含むが、これらに制限されない。通常、置換数は、前記範囲内であってもよく、０〜２０個の保存置換が挙げられる。
【０１００】
１つ又は複数の実施形態では、本発明のヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントは一本鎖Ｆｖ抗体であり、いくつかの実施形態では、該抗体又はその抗原結合フラグメントはＦａｂ抗体であり、いくつかの実施形態では、該抗体又はその抗原結合フラグメントはＦａｂ'抗体であり、いくつかの実施形態では、該抗体又はその抗原結合フラグメントは（Ｆａｂ'）2抗体である。
【０１０１】
１つ又は複数の実施形態では、本発明のヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４又は３５に示される。
【０１０２】
１つ又は複数の実施形態では、本発明のヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４又は３５に示される。
【０１０３】
１つ又は複数の実施形態では、本発明のヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される。
【０１０４】
１つ又は複数の実施形態では、本発明のヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０又は４２に示される。
【０１０５】
１つ又は複数の実施形態では、本発明のヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示される。
【０１０６】
１つ又は複数の実施形態では、本発明のヒトＢＴＬＡと結合する単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、４７又は４８に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される。
【０１０７】
本発明は、また、本発明の単離抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸、たとえばＤＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の単離核酸は、少なくとも１つの成熟抗体軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと少なくとも１つの成熟抗体重鎖可変（ＶＨ）ドメインとを含む抗体又はその抗原結合フラグメントをコードし、ここでＶＬドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−８、１０−１２、１６−１８、２２−２４及び３１−３３から選ばれる配列を有する少なくとも３個のＣＤＲを含み、ＶＨドメインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−３、４−６、１３−１５，１９−２１、２５−２７及び２８−３０から選ばれる配列を有する少なくとも３個のＣＤＲを含む。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。一実施形態では、単離核酸は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５の成熟軽鎖と重鎖可変領域の配列をコードする。１つ又は複数の実施形態では、単離核酸は、単一の核酸分子上の軽鎖と重鎖の両方をコードし、他の実施形態では、２個以上の独立した核酸分子上に軽鎖と重鎖をコードする。
【０１０８】
本発明は、また、本発明の単離核酸を含む発現ベクターを提供する。また、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、また、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを産生する方法に関する。
【０１０９】
本発明は、また、本明細書の前記抗体ｃｈ７、ｃｈ１２、ｃｈ１７、ｃｈ２２、ｃｈ２７、ｈｕ１７、ｈｕ１８及びｈｕ１９と同様にヒトＢＴＬＡ上の同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、たとえば本発明の任意の抗体の結合を交差してブロックし得る抗体に関する。
【０１１０】
［疾患及びその治療又は予防］
本発明は、また、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント（好ましくはヒト化抗体）を用いて、単離抗体又はその抗原結合フラグメントによる治療を必要とする受検者（ヒト受検者を含む）を治療又は予防する方法を提供する。該方法は、通常、治療又は予防有効量の本発明のいずれか１つの実施形態の前記抗体又はその抗原結合フラグメント、又は前記抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物を、これを必要とする対象に、投与することを含む。実際の状況に応じて適切な投与方式を選択する。、この投与方式には、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与、関節内投与（たとえば関節炎に罹った関節において）、吸入、エアロゾル送達又は腫瘍内投与などが含まれるが、これらに制限されない。
【０１１１】
受検者は、通常、ＢＴＬＡ媒介性疾患、つまり、ＢＴＬＡ活性の解消、抑制又は低減により改善できる疾患に罹患している。通常、ＢＴＬＡ媒介性疾患は、免疫抑制に関連するすべての疾患であり、自己免疫疾患、移植拒絶反応、腫瘍などを含む。この腫瘍にはメラノーマ、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、骨癌、皮膚癌、頭癌又は首癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、睾丸癌、食道癌、小腸癌、子宮頸癌、膣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副腎癌、軟部組織癌、尿道癌、慢性あるいは急性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、小児期固形腫、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎又は尿管癌、腎盂癌、中枢神経系の新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、石綿により誘発されるものを含む環境誘発癌、これらの前記癌の組み合わせを含む。自己免疫疾患は、器官特異的自己免疫疾患及び全身性自己免疫疾患を含み、前記器官特異的自己免疫疾患は、慢性リンパ球性甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、潰瘍性結腸炎、慢性萎縮性胃炎を伴う悪性貧血、肺出血腎炎症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、多発性脳脊髄硬化症、急性特発性多神経炎などを含み、前記全身性自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、全身性血管炎、強皮症、天胞瘡、皮膚筋炎、混合性結合組織病、自己免疫性溶血性貧血、潰瘍性結腸炎などを含む。
【０１１２】
このような治療方法は、腫瘍ワクチン、標準的な腫瘍化学療法の治療薬、他の免疫誘導剤などの１つ以上の他の治療薬を投与することも含むことができる。
【０１１３】
［薬入れ］
本発明はまた、本発明の併用薬の成分を含む薬入れの形態の薬入れを提供する。本発明の薬入れは、１種又は複数種の成分を含み、このような成分には、本明細書の前記ＢＴＬＡと特異的結合する抗体又は抗原結合フラグメント（たとえば抗体ｃｈ７、ｃｈ１２、ｃｈ１８、ｃｈ２２、ｃｈ２７、ｈｕ１７、ｈｕ１８及びｈｕ１９が挙げられるが、上記抗体に制限されない）と１種又は複数種の他の成分が含まれるが、これらに制限されなく、本明細書の前記薬学的に許容される担体及び/又は化学療法薬、が含まれるが、これらに制限されない。前記抗体又は抗原結合フラグメント及び/又は化学療法薬を単なる組成物にするか、又は医薬組成物において薬学的に許容される担体と組み合わせることができる。
【０１１４】
一実施形態では、薬入れは、１つの容器（たとえば滅菌ガラス又はプラスチックバイアル）における本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント（たとえば抗体ｃｈ７、ｃｈ１２、ｃｈ１７、ｃｈ２２、ｃｈ２７、ｈｕ１７、ｈｕ１８及びｈｕ１９が含まれるが、上記抗体に制限されない）又はその医薬組成物と、別の容器（たとえば滅菌ガラス又はプラスチックバイアル）における本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント又はその医薬組成物及び/又は化学療法薬と、を含む。
【０１１５】
本発明の別の実施形態では、薬入れは、本発明の併用薬を含み、単一の共用容器における抗体又は抗原結合フラグメント（たとえば抗体ｃｈ７、ｃｈ１２、ｃｈ１７、ｃｈ２２、ｃｈ２７、ｈｕ１７、ｈｕ１８及びｈｕ１９が挙げられるが、上記抗体に制限されない）が薬学的に許容される担体とともに、必要に応じて配合した１種又は複数種の化学療法薬の成分と併用して、必要に応じて医薬組成物に用いる場合を含む。
【０１１６】
薬入れは薬入れに収納された医薬組成物と剤形の情報を含む薬品の取扱書を含んでもよい。このような情報は一般には患者や医者が当該医薬組成物及び剤形を効果的かつ安全に使用することを補助する。たとえば、薬品の取扱書において、本発明の併用薬に関する以下の情報を提供することができる。薬物動態、薬効学、臨床研究、効果パラメータ、適応症と用法、禁忌症、警告事項、予防措置、副作用、過剰使用、適切な用量と投与、供給仕様、適切な保管条件、参照、メーカー/卸売業者情報、特許情報。
【０１１７】
［医薬組成物及び投与］
本発明は、本明細書の前記いずれか１つの抗ヒトＢＴＬＡ抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物も含む。本明細書で使用される用語「医薬組成物」は、ある特定の目的を達成するために一緒に組み合わされる少なくとも１つの医薬品と、必要に応じて薬学的に使用可能な担体又は補助材料との組み合わせを意味する。いくつかの実施態様では、本発明の目的を達成するために協働し得る限り、前記医薬組成物は、時間的及び/又は空間的に分離された組み合わせを含む。たとえば、前記医薬組成物に含まれる成分は（たとえば、本発明の抗体、核酸分子、核酸分子の組み合わせる及び/又は抱合体に応じて）全体として対象に投薬するか、又は別々対象に投薬することができる。前記医薬組成物に含まれる成分が別々対象に投薬される場合、前記成分は同時に又は順次対象に投薬できる。好ましくは、前記薬学的に使用可能な担体は、水、緩衝水溶液、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）などの等張食塩溶液、グルコース、マニトール、デキストロース、乳糖、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール又はポリアルキレングリコールたとえばポリプロピレングリコール、トリグリセリドなどである。使用される薬学的に使用可能な担体のタイプは、特に、本発明に係る組成物が経口投与、経鼻投与、皮内投与、皮下投与、筋内投与又は静脈投与用として調製されるかどうかにより決まる。本発明に係る組成物は、湿潤剤、乳化剤又は緩衝液物質を添加剤として含むことができる。本発明の免疫抱合体は、治療剤と結合する本明細書のいずれか１つの実施形態の前記抗体又はその抗原結合フラグメントを含有することができ、好ましくは前記治療剤は、本分野で周知しておる、免疫抱合体の製造によく使用される免疫毒素、放射性同位体、医薬品又は細胞傷害性剤である。
【０１１８】
本発明の抗ヒトＢＴＬＡ抗体又はその抗原結合フラグメントの医薬組成物又は無菌組成物を製造するために、該抗体又はその抗原結合フラグメントと薬学的に許容される担体又は賦形剤とを混合することができる。たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８４）を参照する。
【０１１９】
本発明の医薬組成物を本分野で公知する各種の適切な投与剤形に製造することができる。この剤形には、凍結乾燥粉、膏剤、水溶液剤又は懸濁剤などが含まれるが、これらに制限されない。許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することで以下の形態の治療剤と診断剤の剤形を製造することができる。たとえば凍結乾燥粉、膏剤、水溶液剤又は懸濁剤（たとえばＨａｒｄｍａｎ ら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ ；Ｇｅｎｎａｒｏ （２０００） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、及びＷｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ ；Ｗｅｉｎｅｒ及びＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照）。
【０１２０】
投与態様は、治療用抗体の血清又は組織回転率、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性及び生物学的マトリックスにおける標的細胞のアクセス可能性を含むいくつかの因素によるものである。好ましい投与態様では、十分な治療用抗体を送達することで、不良な副作用を最低にしながらターゲット疾患の状態を改善する。したがって、送達する生物学的薬剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）の量は、部分的には具体的な治療用抗体と治療対象の病状の重症度により決まる。適切な用量の治療用抗体の選択についての指導を取得できる（たとえばＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ ；Ｂａｅｒｔら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８ ：６０１−６０８ ；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１： １９６６−１９７３ ；Ｓｌａｍｏｎら（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４ ：７８３−７９２ ；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２ ：６１３−６１９ ；Ｇｈｏｓｈら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８ ：２４−３２ ；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３ ：１５９４−１６０２を参照）。
【０１２１】
［使用］
本発明は、本明細書のいずれか１つの実施形態の前記抗ＢＴＬＡ抗体及びその抗原結合フラグメントの、ＢＴＬＡ媒介性疾患の治療、予防及び診断における使用を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、ＢＴＬＡ媒介性疾患を治療、予防及び診断するための本明細書のいずれか１つの実施形態の前記抗ＢＴＬＡ抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。
【実施例】
【０１２２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態及び態様を証明し、さらに解釈するために以下の実施例を提供し、本発明の範囲を制限すると解釈られない。
【０１２３】
［実施例１、真核発現プラスミドへのヒトＢＴＬＡ細胞外ドメインのクローン］
Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ.からヒトＢＴＬＡ遺伝子ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドＨＧ１１８９５ーＧーＮを購入し、フォワードプライマー５'−ｇｔａｃＧＣＴＣＴＴＣＡＴＧＴａａａｇａａｔｃａｔｇｔｇａｔｇｔａｃａｇｃｔｔｔａ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）とリバースプライマー５'−ｇａｔｃＧＣＴＣＴＴＣＴＡＧＣａｔａｃａｇｇａｇｃｃａｇｇｇｔｃｔｇｃｔｔｇｃｃａ−３'（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）、ＰＣＲを用いてヒトＢＴＬＡ細胞外フラグメント（ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示される）を増幅した。増幅フラグメントをＢＳＰＱＩで酵素消化した後、自作した真核発現プラスミドシステム（ＨＸ１−ＦＣ）に挿入し、ヒトＢＴＬＡ細胞外ドメインタンパク質（ｈＢＴＬＡ−ＥＣＤ−ＦＣ）の発現プラスミドを生成した。このプラスミドを用いてＰＥＩにより２９３Ｅ細胞をトランスフェクションし、６日間後、培地上清を収集して、アフィニティークロマトグラフィーによりヒトＢＴＬＡ細胞外ドメイン組換えタンパク質（ｈＢＴＬＡ−ＥＣＤ−ＦＣ）を精製した。
図１はヒトＢＴＬＡ細胞外ドメインタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図を示す。
【０１２４】
［実施例２、ＦＡＣＳによる組換えタンパク質ｈＢＴＬＡ−ＥＣＤ−ＦＣと細胞上のヒトＨＶＥＭの結合の検出］
ヒトＨＶＥＭ（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ：ＮＰ＿００３８１１．２）を発現させた２９３Ｆ安定トランスフェクション細胞株の構築（ｈＨＶＥＭ−２９３Ｆ）。ｈＨＶＥＭ−２９３Ｆ細胞懸濁液とビオチン標識ｈＢＴＬＡ（３００ｎｇ／ｍＬ）とを混合し、室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄した後、５μｇ／ｍｌのＮＡ−ＰＥを加えて３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄した後、フローサイトメーター検出によりＢＴＬＡ組換えタンパク質と２９３Ｆ細胞表面のＨＶＥＭとの結合を確認した。結果を図２に示す。
【０１２５】
［実施例３、抗ＢＴＬＡマウス抗体の製造］
＜３．１、動物免疫＞
実施例１で得られた組換えタンパク質ｈＢＴＬＡ−ＥＣＤ−ＦＣを抗原として等量の免疫アジュバント（フロイントアジュバント）と混合し、５匹の６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｅラットを皮下免疫した。最初免疫以降、２週間おきにブースト免疫を１回行い、合計６回免疫した。
＜３．２、細胞融合＞
最後のブースト免疫後、マウスの股間のリンパ節を取り、生理食塩水にてミーリングした後、リンパ球を豊富に含む懸濁液を、一般的なエレクトロトランスフェクション方法（ＢＴＸ社のエレクトロトランスフェクション装置のハンドブックを参照）に従ってＳＰ２／０細胞と融合した。融合細胞を、ＨＡＴを含有するＤＥＭＭ完全培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて８％ＣＯ2、３７℃条件で培養した。
【０１２６】
［実施例４、ハイブリドーマ細胞のスクリーニング実験］
１１５００株の異なるポリクローナルハイブリドーマ細胞において、酵素（ＥＬＩＳＡ）反応により、５６０株の分泌した、抗体がヒトＢＴＬＡタンパク質に結合し得るクローンをスクリーニングした。この５６０株のクローンのうち、３３株は２９３Ｆ細胞で発現させたＢＴＬＡに結合でき、この３３株のクローンのうち、１６株はビオチン標識ヒトＢＴＬＡと２９３Ｆ上ＨＶＥＭとの結合を抑制する能力を有する。ここでこの１６株のクローンのうちの前の４株（２Ｄ１２、３Ｂ３、３Ｅ３、及び６Ａ７）を重点として検討し、後続実験を行い、具体的なスクリーニングの実験方法を以下に示す。
＜４．１、ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマ抗体とｈＢＴＬＡとの結合の検出＞
酵素反応（ＥＬＩＳＡ）により、分泌した抗体がｈＢＴＬＡに結合するハイブリドーマ細胞株をスクリーニングした。３８４ウェルマイクロプレートを、１μｇ／ｍｌのｈＢＴＬＡで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を捨てて、洗浄緩衝液で回３洗浄し、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液を加えて６０分間ブロックした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ハイブリドーマ培養上清を加え、室温で６０分間インキュベート後、洗浄緩衝液で３回リンスした。その後、１：５０００倍で希釈したＨＰＲ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を加え、室温で３０分間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回リンスした後、３０μｌ  ＴＭＢ基質溶液を加えて発色させ、室温で１０分間反応させた後、３０μｌの塩酸溶液（２Ｍ）で反応を停止し、４５０ｎｍで吸光度を読み出した。
＜４．２、ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマ抗体結合ｈＢＴＬＡの種特異性の検出＞
酵素反応（ＥＬＩＳＡ）によりハイブリドーマの分泌した抗体がカニクイザルＢＴＬＡに結合するハイブリドーマ細胞株をスクリーニングした。９６ウェルマイクロプレートを、１μｇ／ｍｌのカニクイザルＢＴＬＡで被覆し、室温で６０分間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を捨てて、洗浄緩衝液で回３洗浄し、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液を加えて６０分間ブロックした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ハイブリドーマ培養上清を加え、室温で６０分間インキュベート後、洗浄緩衝液で３回リンスした。その後、１：５０００倍で希釈したＨＰＲ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を加え、室温で３０分間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回リンスした後、１００μｌ  ＴＭＢ基質溶液を加えて発色させ、室温で１０分間反応させた後、１００μｌの塩酸溶液（２Ｍ）で反応を停止して４５０ｎｍで吸光度を読み出した。
＜４．３、ＦＡＣＳによるハイブリドーマ抗体のＢＴＬＡとＨＶＥＭ結合へのブロック作用の検出＞
３３株の抗体培養液の上清とビオチン標識ヒトＢＴＬＡ（３００ｎｇ／ｍＬ）とを混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、混合物とｈＨＶＥＭー２９３Ｆ安定トランスフェクション細胞株懸濁液とを室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄した後、５μｇ／ｍｌのＮＡ−ＰＥを加えて３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄した後、フローサイトメーター検出により、ハイブリドーマ細胞の分泌した抗体がヒトＢＴＬＡと２９３Ｆ細胞表面のＨＶＥＭとの結合をブロックする作用を有することを確認した。
【０１２７】
［実施例５、候補抗体の可変領域配列の取得（Ｋａｂａｔ又はＩＭＧＴで示される）］
縮重プライマーＰＣＲに基づく方法により、候補ハイブリドーマで発現させたマウス抗体可変領域のＤＮＡ配列を測定した。簡単に言えば、ハイブリドーマ細胞株をそれぞれ拡大培養し、１０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌで全ＲＮＡを抽出した。これをテンプレートとして、第１の鎖ｃＤＮＡを合成した後、第１の鎖ｃＤＮＡを後続のテンプレートとしてＰＣＲにより対応する可変領域配列を増幅し、使用されるＰＣＲプライマーはＩｇ−プライマー群に基づくものである。ＰＣＲ産物を回収して精製し、増幅産物をシーケンシングしたところ、候補ハイブリドーマの重鎖可変領域と軽鎖可変領域配列が得られた。
【０１２８】
ＮＣＢＩ Ｉｇ−Ｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ． ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を用いて生殖細胞系と再配置Ｉｇ可変領域配列データベースから共有配列を検索した。Ｋａｂａｔ（Ｗｕ，Ｔ．Ｔ及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ． １９７０ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１３２：２１１−２５０）及びＩＭＧＴシステム（Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．−Ｐ．ら、１９９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７，２０９−２１２）に基づき、配列注釈及びインターネットに基づく配列分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． Ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌとｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ． ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を通じて相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定した。
【０１２９】
ハイブリドーマ細胞がコードする軽鎖と重鎖可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列は以下に示され（ここで太字の下線を付いた部分はＫａｂａｔシステムに従って分類されたＣＤＲｓであり、太字斜体はＩＭＧＴシステムに従って分類されたＣＤＲｓである）：
【０１３０】
【表Ｉ−１】
2021532801.tif 000010
【０１３１】
【表Ｉ−２】
2021532801.tif 000011
【０１３２】
【表Ｉ−３】
2021532801.tif 000012
【０１３３】
［実施例６、キメラ抗体発現ベクターの構築］
標準的なＰＣＲ技術により候補マウス抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の遺伝子をそれぞれヒトＩｇＧ４のＦＣ及びκ鎖定常領域のＮ末端に融合し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入することにより、キメラ型重鎖又は軽鎖の発現プラスミドを構築した。後続のキメラ抗体はすべて上記重鎖と軽鎖の発現ベクタープラスミドを２つずつ組み合わせて発現細胞をトランスフェクションした後、精製して抽出することにより得られ、キメラ抗体ｃｈ７、ｃｈ１２、ｃｈ１７、ｃｈ２２及びｃｈ２７が得られた。ハイブリドーマ細胞がコードする軽鎖と重鎖の可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列は以下に示される。
【０１３４】
【表Ｊ−１】
2021532801.tif 000013
【０１３５】
【表Ｊ−２】
2021532801.tif 000014
【０１３６】
［実施例７、ＥＬＩＳＡによるキメラ抗体とｈＢＴＬＡとの結合の検出］
酵素反応（ＥＬＩＳＡ）によりキメラ抗体のｈＢＴＬＡとの結合能力を検出した。０．５μｇ／ｍｌのｈＢＴＬＡで９６ウェルマイクロプレートを被覆し、３７℃の恒温で６０分間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を捨てて、洗浄緩衝液で回３洗浄し、２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液を加えて６０分間ブロックした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、勾配希釈した抗体を加え、３７℃で６０分間インキュベート後、洗浄緩衝液で３回リンスし、その後、１：１００００倍で希釈したＨＲＰ標識マウス抗ヒトＩｇＧ４二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートして、洗浄緩衝液で３回リンスした後、１００μｌ  ＴＭＢ基質溶液を加えて発色させ、室温で３０分間反応後、１００μｌ２Ｍの塩酸溶液で反応を停止し、４５０ｎｍで吸光度を読み出した。
結果として、図３に示すように、キメラ抗体ｃｈ７、ｃｈ１２、ｃｈ１７、ｃｈ２２及びｃｈ２７はｈＢＴＬＡと特異的結合し得る。そのＥＣ50値を下表１に示す。
【０１３７】
【表１】
2021532801.tif 000015
【０１３８】
［実施例８、ＦＡＣＳによるキメラ抗体のＢＴＬＡとＨＶＥＭとの結合へのブロック作用の検出］
ＦＡＣＳにより、キメラ抗体の、ｈＢＴＬＡが２９３Ｆ細胞上のｈＨＶＥＭに結合して発現することへのブロック能力を検出した。ｈＨＶＥＭ−２９３Ｆを細胞に安定的に発現させて消化した後、遠心分離してＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、細胞量が２．５×１０4個の／５０ｕｌとなるように９６ウェル丸底板のウェルに加え、予めビオチンで標識させたｈＢＴＬＡ（１ｕｇ／ｍｌ）タンパク質を加えて混合し、４°Ｃで１５分間インキュベートし、次に、５０ｕｌの異なる濃度のキメラ抗体希釈液（開始は５ｕｇ／ｍｌ、３倍で滴定）を加えて均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した後、１００ｕｌヤギ抗ヒトＩｇＧーＰＥ抗体を加え、遮光下３０ｍｉｎインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＡＣＳ検出を行った。洗浄した細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びレシピエント生体の内在化を防止する０．０２％アジ化ナトリウムを含有する４°Ｃ緩衝剤に再懸濁させた後、フローサイトメトリーにより分析した。ＦＳＣ／ＳＳＣゲートからＰＩ陽性細胞を排除し、生細胞についてゲート制御を行い、その幾何学的平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計測した。ＰｒｉｓｍTMソフトウェアのＳ形用量-応答モデルを用いてデータを分析した。
結果として、図４と下記表２に示すように、キメラ抗体ｃｈ１２、ｃｈ１７、ｃｈ２２、及びｃｈ２７は、ヒトＢＴＬＡと細胞表面のＨＶＥＭとの結合を効果的にブロックできる。
【０１３９】
【表２】
2021532801.tif 000016
【０１４０】
［実施例９、ルシフェラーゼレポーター遺伝子実験による、キメラ抗体のＴ細胞活性への影響の検出］
抗原提示細胞（ＡＰＣ）において主な組織適合性複合体Ｉ類又はクラスＩＩタンパク質を通じて提示した特異性ペプチドのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を刺激により識別することにより、Ｔ細胞を活性化させた。活性化させたＴＣＲはシグナリングイベントのカスケードを起動させ、これは、転写因子（たとえば活性化子-タンパク質−ｌ（ＡＰーＩ）、活性化させたＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）又は活性化させたＢ細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー（ＮＦκｂ））により駆動されるレポーター遺伝子を通じて監視できる。Ｔ細胞への構成又は誘導発現させた共同受容体の接合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）によりＴ細胞応答を調整した。プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ１）とＢＴＬＡはＴ細胞活性の負の調整物である。ＰＤー１とＢＴＬＡはそれぞれＡＰＣ又は癌細胞を含む標的細胞で発現させたそのリガンド（ＰＤーＬ１）及びＨＶＥＭと相互作用し、このような相互作用により、ホスファターゼをＴＣＲシグナルサム（ｓｉｇｎａｌｏｓｏｍｅ）に集めて抑制シグナルを送達することで、ポジティブシグナル伝達の抑制を発生させる。２個のエンジニアリングされた安定発現細胞系Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴーＬｕｃ／ｈＰＤ−１ーｈＢＴＬＡ）とＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ｈＰＤーＬ１／ｈＨＶＥＭ）を構築して、ＡＰＣとＴ細胞の間の相互作用により誘導されたＴ細胞シグナル伝達を測定した。
【０１４１】
ｈＰＤーＬ１／ｈＨＶＥＭを安定的に発現させたＣＨＯ細胞を９６ウェル板に接種し、各ウェルの細胞量を５×１０4とし、３７℃、７％ＣＯ2で一晩培養し、細胞上清を除去し、ウェルごとに４０ｕｌキメラ抗ＢＴＬＡ抗体希釈液（開始濃度６０ｕｇ／ｍｌ、３倍で滴定）を加え、４０ｕｌを加えるとｈＰＤーＬ１／ｈＢＴＬＡ／ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼのＪｕｒｋａｔレポーター細胞を持続的に発現でき、全細胞数を１×１０5細胞とし、３７℃、７％ＣＯ2で６時間培養し、ルシフェラーゼ試薬を加え、マイクロプレートリーダーにより発光値を検出した。
結果として、図５と下記表３に示すように、キメラ抗体ｃｈ１２、ｃｈ１７、ｃｈ２２、及びｃｈ２７はＢＴＬＡとＰＤー１を介するＴ細胞活性抑制作用を効果的に抑制できる。
【０１４２】
【表３】
2021532801.tif 000017
【０１４３】
［実施例１０、抗体のヒト化改変］
上記で得たハイブリドーマ細胞の分泌した抗体の可変領域配列に従って、ヒト化改変を行った。簡単に言えば、ヒト化改変の過程には、以下のステップを含む。
Ａ、各ハイブリドーマ細胞の分泌した抗体の遺伝子配列とヒト胚性抗体の遺伝子配列とを比較し、相同性の高い配列を探す。
Ｂ、ＨＬＡーＤＲ親和性を分析して調べて、親和力の低いヒト胚性フレームワーク配列を選択する。
Ｃ、コンピュータシミュレーション技術を利用して、分子ドッキングにより可変領域及びその周辺のフレームワークアミノ酸配列を分析し、その空間的な結合方式を調べる。静電力、ファンデルワールス力、親疎水性やエントロピー値を計算することにより、各ハイブリドーマ細胞の分泌した抗体の遺伝子配列のうちｈＢＴＬＡと作用して空間フレームワークをメンテナンスし得る重要な単一のアミノ酸を分析し、それを、選択されたヒト胚性遺伝子フレームワークにグラフトし、これに基づいて、保留しなければならないフレームワーク領域のアミノ酸の部位をマークし、ヒト化抗体を合成した（Ｐｉｎｉ， Ａ．ら， ｅｔ ａｌ． （１９９８）． ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ： ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ １０ ｓｕｂｎａｎｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｅｌｕｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７３（３４）： ２１７６９−２１７７６）。これに基づいて以下の複数のヒト化抗体が得られた。それには、クローンとして、ｈｕ１７、ｈｕ１８及びｈｕ１９が含まれる。
【０１４４】
ｈｕ１７：
重鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５；
軽鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６；
ｈｕ１８：
重鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５；
軽鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７；
ｈｕ１９：
重鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５；
軽鎖アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８。
【０１４５】
［実施例１１、ＥＬＩＳＡによるヒト化抗体とｈＢＴＬＡとの結合の検出］
通常のＥＬＩＳＡ検出方法によりヒト化抗体とｈＢＴＬＡとの結合特異性を検出した。０．５μｇ／ｍｌのｈＢＴＬＡで９６ウェルマイクロプレートを被覆し、３７℃の恒温で６０分間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を捨てて、洗浄緩衝液で回３洗浄し、２％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液を加えて６０分間ブロックした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、勾配希釈した抗体を加え、３７℃で６０分間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回リンスし、その後、１：１００００倍で希釈したＨＰＲ標識マウス抗ヒトＩｇＧ４二次抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回リンスした後、１００μｌ  ＴＭＢ基質溶液を加えて発色させ、室温で３０分間反応後、１００μｌ  ２Ｍの塩酸溶液で反応を停止して、４５０ｎｍで吸光度を読み出した。
結果を図６に示し、ヒト化抗体ｈｕ１７、ｈｕ１８、及びｈｕ１９は、ｈＢＴＬＡと特異的に結合し得る。そのＥＣ50値を下表４に示す。
【０１４６】
【表４】
2021532801.tif 000018
【０１４７】
［実施例１２、ＦＡＣＳによる、ヒト化抗体と２９３Ｆ細胞上のｈＢＴＬＡとの結合の検出］
細胞に基づくフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、ヒト化抗ＢＴＬＡ抗体と細胞で発現させたｈＢＴＬＡとの結合能力を測定した。ｈＢＴＬＡを発現させた２９３Ｆ細胞を消化した後、遠心分離してＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、細胞量が２．５×１０4、体積が５０ｕｌとなるように、９６ウェル丸底板のウェルに加え、５０ｕｌの異なる濃度の抗体希釈液（開始濃度１０ｕｌ／ｍｌ、３倍で滴定）を加えて均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した後、１００ｕｌのヤギ抗ヒトＩｇＧーＰＥ抗体を加え、遮光下３０ｍｉｎインキュベートし、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した後、ＦＡＣＳ検出を行った。洗浄した細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びレシピエント生体の内在化を防止するための０．０２％アジ化ナトリウムを含有する４°Ｃ緩衝剤に再懸濁させた後、フローサイトメトリーにより分析した。ＦＳＣ／ＳＳＣゲートからＰＩ陽性細胞を排除し、生細胞に対してゲート制御を行い、その幾何学的平均蛍光強度を計測した。ＰｒｉｓｍTMソフトウェアのＳ形用量−応答モデルを用いてデータを分析した。
結果として、図７に示すように、ヒト化抗体ｈｕ１７、ｈｕ１８、ｈｕ１９、及び２９３Ｆ細胞上のｈＢＴＬＡは効果的に結合できる。各抗体のＥＣ５０値を下記表５に示す。
【０１４８】
【表５】
2021532801.tif 000019
【０１４９】
［実施例１３、ＦＡＣＳによるヒト化抗体のＢＴＬＡとＨＶＥＭとの結合へのブロック作用の検出］
細胞に基づくフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定し、ｈＢＴＬＡが２９３Ｆ細胞上の ｈＨＶＥＭに結合されて発現することに対するヒト化抗体のブロック能力を検出した。ｈＨＶＥＭー２９３Ｆを安定的に発現させた細胞を消化した後、遠心分離してＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、細胞量が２．５×１０4個、体積が５０ｕｌとなるように、９６ウェル丸底板のウェルに加え、予めビオチンで標識させたｈＢＴＬＡ（１ｕｇ／ｍｌ）タンパク質を加えて混合し、４°Cで１５分間インキュベートし、次に、５０ｕｌの異なる濃度のヒト化抗体希釈液（開始５ｕｇ／ｍｌ、３倍で滴定）を加えて均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄した後、１００ｕｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ抗体を加え、遮光下３０ｍｉｎインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＡＣＳ検出を行った。洗浄した細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）及びレシピエント生体の内在化を防止するための０．０２％アジ化ナトリウムを含有する４°Ｃ緩衝剤に再懸濁させた後、フローサイトメトリーにより分析した。ＦＳＣ／ＳＳＣゲートからＰＩ陽性細胞を排除し、生細胞に対してゲート制御を行い、その幾何学的平均蛍光強度を計測した。ＰｒｉｓｍTMソフトウェアのＳ形用量−応答モデルを用いてデータを分析した。
結果として、図８に示すように、ヒト化抗体ｈｕ１７、ｈｕ１８、ｈｕ１９は、ＢＴＬＡと細胞表面のＨＶＥＭとの結合を効果的にブロックできる。各抗体のＩＣ５０値を下記表６に示す。
【０１５０】
【表６】
2021532801.tif 000020
【０１５１】
［実施例１４、ヒト化抗ＢＴＬＡ抗体によるＴ細胞活性化の促進］
ｈＰＤーＬ１／ｈＨＶＥＭを安定的に発現させたＣＨＯ細胞を９６ウェル板に接種し、各ウェルの細胞量を５×１０4とし、３７℃、７％ＣＯ2で一晩培養し、細胞上清を除去し、ウェルごとに４０ｕｌのヒト化抗ＢＴＬＡ抗体希釈液（開始濃度６０ｕｇ／ｍｌ、３倍の濃度で勾配希釈）を加え、ｈＰＤー１／ｈＢＴＬＡ／ＮＦＡＴ-ルシフェラーゼのを持続的に発現できる４０ｕｌのＪｕｒｋａｔレポーター細胞を加え全細胞数を１×１０5細胞とし、３７℃、７％ＣＯ2で６時間培養し、ルシフェラーゼ試薬を加え、マイクロプレートリーダーにより発光値を検出した。
結果として、図９に示すように、ヒト化抗ＢＴＬＡ抗体ｈｕ１７、ｈｕ１８は、Ｔ細胞活性化を効果的に促進できる。各抗体のＥＣ５０値を下記表７に示す。
【０１５２】
【表７】
2021532801.tif 000021
【０１５３】
［実施例１５、ヒト化抗ＢＴＬＡ抗体とｈＢＴＬＡとの親和力］
ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製のＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を用いて検出実験を行い、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５チップを装置にセットし、系の緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を用いた。ＢＴＬＡーＦｃ抗原をチップの検出チャンネルにおいて結合し、４００ｍＭ ＥＤＣ与１００ｍＭ ＮＨＳの混合液を１０μＬ／ｍｉｎで４２０ｓかけて活性化チップの表面に注入し、ＢＴＬＡ−Ｆｃ抗原を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム/酢酸（ｐＨ ５．５）緩衝液に希釈して、最終濃度を２０μｇ／ｍＬとし、１０μＬ／ｍｉｎで注入して結合し、１Ｍエタノールアミン-塩酸溶液（ｐＨ ８．５）を１０μＬ／ｍｉｎで注入し４２０ｓかけてブロックした。
【０１５４】
Ｂｉａｃｏｒｅ系緩衝液を用いて抗体を２倍で勾配希釈し、合計６個の濃度点がある。濃度勾配は、２４ｎＭ、１２ｎＭ、６ｎＭ、３ｎＭ、１．５ｎＭ、及び０．７５ｎＭであり、これらのうち、２４ｎＭは重複テストである。データ分析には、ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製のデータ分析ソフトウェアＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョンナンバー３．０が使用された。データフィッティングには、モデル１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇが使用される。フィッティングにより抗体と抗原との間の結合の速度定数である結合速度Ｋａ（１／Ｍｓ）、解離速度Ｋｄ（１／ｓ）、親和力定数ＫＤ（Ｍ）が得られ、結果は表８に示される。
【０１５５】
【表８】
2021532801.tif 000022
【０１５６】
［実施例１６、ヒト化抗体とさまざまな種ＢＴＬＡとの結合の速度論的特性］
キメラ抗体とカニクイザル由来及びマウス由来のＢＴＬＡとの間の交差反応を検出するために、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ検定が使用された。簡単に言えば、ヒトＢＴＬＡ、カニクイザルＢＴＬＡ又はマウスＢＴＬＡを活性化させたＣＭ５生物学的センサチップに結合して、約１００〜２００個の応答単位（ＲＵ）を得て、その後、ＩＭエタノールアミンで未反応基をブロックした。３０回/分間でＳＰＲ作動緩衝液に、０．１２ｎＭから９０ｎＭまで濃度が増加していくヒト化抗体サンプルを注射し、空白流動室からのＲＵを減算することにより異なる種源ＢＴＬＡの場合の結合応答を算出した。
結果を図１０に示す。ｈｕ１７とさまざまな種ＢＴＬＡとの結合の比較結果から明らかなように、ｈｕ１７は、ヒトＢＴＬＡと高親和力を有するだけでなく、カニクイザル由来ＢＴＬＡとは類似した親和力を有し、しかし、マウスＢＴＬＡとはほぼ結合しなかった。
【０１５７】
［実施例１７、ヒト化抗体によるマウス腫瘍成長への抑制作用］
ＭＣ３８細胞（ＡＴＣＣ）にＨｘｐーｈＨＶＥＭプラスミドをエレクトロトランスフェクションして、ＭＣ３８ーｈＨＶＥＭ細胞バンクを構築し、その後、限界希釈法により細胞サブクローンを行い、フローサイトメーターにより単一クローンをスクリーニングし、ＭＣ３８ーｈＨＶＥＭ細胞を得て、次に、ＭＣ３８−ｈＨＶＥＭ細胞を１×１０6個の／０．１ｍＬ濃度でＢーｈＢＴＬＡヒト化雌マウスの右側の皮下に接種し、腫瘍が約１１８ｍｍ3まで成長すると、腫瘍の体積に応じてランダムに群分け、１群を８匹とし、合計５群に分け、それぞれ、Ｇ１ ０．９％塩化ナトリウム注射液溶剤対照群、Ｇ２ ＫＬＨ（１０ｍｇ／ｋｇ）陰性対照群、Ｇ３ ｈｕ１８（１ｍｇ／ｋｇ）群、Ｇ４ ｈｕ１８（３ｍｇ／ｋｇ）群及びＧ５ ｈｕ１８（１０ｍｇ／ｋｇ）群とした。すべての群の投与経路は腹腔内注射とし、１週間ごとに２回投与し、連続的に７回投与し、最後回の投与４日間後、実験を終了した。毎週腫瘍の体積及び体重を２回測定し、マウスの体重と腫瘍の体積を記録した。実験終了時、動物を安楽死させ、腫瘍を取り重量を測り、写真を撮り、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩTW％）を算出した。
【０１５８】
各群の試験品によるＭＣ３８−ｈＨＶＥＭ細胞移植ＢーｈＢＴＬＡマウスの腫瘍体積への影響の結果を表９及び図１１に示す。初回投与してから２１日間後、ＫＬＨ（１０ｍｇ／ｋｇ）陰性対照群の平均腫瘍体積は１５６０±２５６ｍｍ3であり、他の投与群の平均腫瘍体積はそれぞれ１０７３±２２４ｍｍ3、７４７±２６８ｍｍ3、及び８６８±２１１ｍｍ3であった。各投与群とＫＬＨ陰性対照群とを比較すると、ＴＧＩTVｐはそれぞれ３３．７％、５６．４％、及び４８．０％であり、Ｐ値はそれぞれ０．１７５、０．０４６、及び０．０５６であり、このことから、試験医薬品ｈｕ１８は、３ｍｇ／ｋｇ用量のレベルでは、腫瘍成長に対して一定の抑制作用を有することが示された。
【０１５９】
【表９】
2021532801.tif 000023
【０１６０】
各群の試験品によるＭＣ３８−ｈＨＶＥＭ細胞移植ＢーｈＢＴＬＡマウスの体重への影響結果を表１０と図１２に示す。すべての実験動物は、投与期間に亘って、活動や摂食の状態が良好であり、各投与群の動物の体重には一定の程度の上昇が認められた。実験期間には実験動物の死亡がなかった。投与してから２１日間後、ＫＬＨ陰性対照群のマウスの体重と比較すると、各投与群のマウスの体重には有意な変化がなく（Ｐ＞０．０５）、このことから、実験動物の試験品への抵抗性が良好であることは分かった。
【０１６１】
【表１０】
2021532801.tif 000024
【０１６２】
［実施例１８、ヒト化抗体ｈｕ１８にはＡＤＣＣ効果や機能がなかった］
抗体が細胞表面の標的タンパク質に結合され、その後、エフェクター細胞で発現させたＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に連結されると、ＡＤＣＣを起動させた。ヒトＩｇＧ１はＦｃγＲに対し、特にＦｃγＲ−Ｉ及びＦｃγＲ−ＩＩＩＡに対して、ＩｇＧ４よりも明らかに高い結合親和力を示すことが明確に記載されている。この親和力はＡＤＣＣを活性化するＩｇＧ１の強度と関わっている。ＡＤＣＣに関しては、抗体が細胞表面のターゲット及びＣ１ｑタンパク質と架橋し、次に、補体複合体形成及び標的細胞分解のカスケード反応時、ＣＤＣが活性化された。ＡＤＣＣ及びＣＤＣの代理として、抗体のＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合の検出は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣＣの基本指標として機能できる。したがって、本発明では、ｂｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥ）を用いて、モノクローナル抗体の主なＦｃγＲへの結合の速度論的親和力を評定した。
【０１６３】
ＧＥの抗−Ｈｉｓ抗体はセンサウエハに固定されている。組換えヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）Ｖ１７６、組換えヒトＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２ａ）Ｖ１６７、組換えヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、及び組換えヒトＦｃＲｎを含む各種のＦｃ受容体がキャプチャーされ、その後、一連の希釈した組換えヒト抗-ＢＴＬＡ抗体（即ちｈｕ１８）が注射され、相互作用の結合性質が検出されて分析された。ｈｕ１８はＩｇＧ４サブタイプ抗体であり、ｈｕ１８−ＩｇＧ１はＩｇＧ１サブタイプであり、ｈｕ１８とは同じＦａｂを共有し、陽性対照とされた。
【０１６４】
結果として、表１１に示すように、ＩｇＧ１サブタイプの対照抗体に比べて、ＩｇＧ４サブタイプの組換えヒト抗-ＢＴＬＡ抗体は、Ｆｃ受容体との結合が弱く、ｈｕ１８抗体は、ＩｇＧ１サブタイプ対照抗体に比べて、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）Ｖ１７６との相互作用が４００倍弱くなった。このことからｈｕ１８はＡＤＣＣ効果が低く又はなかったことが分かった。表１２に示すように、ｈｕ１８抗体はＣ１ｑと結合せず、一方、ｈｕ１８−ＩｇＧ１抗体はＣ１ｑと結合できる。
【０１６５】
【表１１】
2021532801.tif 000025
【０１６６】
【表１２】
2021532801.tif 000026
【図１】
2021532801.tif 000030
【図２】
2021532801.tif 000031
【図３】
2021532801.tif 000032
【図４】
2021532801.tif 000033
【図５】
2021532801.tif 000034
【図６】
2021532801.tif 000035
【図７】
2021532801.tif 000036
【図８】
2021532801.tif 000037
【図９】
2021532801.tif 000038
【図１０】
2021532801.tif 000039
【図１１】
2021532801.tif 000040
【図１２】
2021532801.tif 000041
【配列表】
2021532801000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月17日(2021.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2021532801000001.app
【国際調査報告】
2021532801.tif 000042
2021532801.tif 000043
2021532801.tif 000044
2021532801.tif 000045
2021532801.tif 000046
2021532801.tif 000047
2021532801.tif 000048
2021532801.tif 000049