(57)【要約】エンゲージャー分子をコードする１つ以上の核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスが、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子及び１つ以上の治療用分子をコードする１つ以上の核酸配列を含む。さらに、腫瘍溶解性ウイルスを含有する医薬組成物及び腫瘍溶解性ウイルスを使用したがんの治療方法が、本明細書にて提供される。
2021508477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍溶解性ウイルスであって、
エフェクター細胞上に発現する抗原に特異的なエフェクタードメイン及び標的細胞上に発現する抗原に特異的な標的化ドメインを含むポリペプチドをコードする第１の組換え核酸を含み、
前記標的抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、
前記腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
腫瘍溶解性ウイルスであって、
ウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列を含み、かつ
エフェクター細胞上に発現する抗原に特異的なエフェクタードメイン及び標的細胞上に発現する標的抗原に結合する標的化ドメインを含むポリペプチドをコードする第１の核酸配列をさらに含み、
前記標的抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、
前記腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
前記１つ以上のｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−１２４７−５ｐによって認識される、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
前記１つ以上のｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、及びｍｉＲ−１２４７−５ｐから選択される複数のマイクロＲＮＡによって認識される、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍細胞内で優先的に複製することができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
前記組換え核酸が、サイトカイン、共刺激分子、免疫チェックポイントポリペプチド、抗血管新生因子、及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）からなる群から選択される免疫モジュレーターポリペプチドをコードする第２の核酸配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される、請求項７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
前記免疫チェックポイントポリペプチドが、
ｉ）ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ニューロピリン、もしくはＣＣＲ４の阻害剤、
ｉｉ）ＧＩＴＲ、ＯＸ−４０、もしくはＣＤ２８のアゴニスト、または
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の組み合わせを含む、
請求項７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０】
前記ＭＭＰがＭＭＰ９である、請求項７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＣＬ４、及びＣＸＣＬ１０から選択される、請求項７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
前記エンゲージャーポリペプチドが二部分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ポリペプチドであり、
抗体、抗体ドメイン、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）、Ｔａｎｄａｂ、ダイアボディ、フレキシボディ、ドック・アンド・ロック抗体、Ｓｃｏｒｐｉｏｎポリペプチド、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＢｉＴＥ、ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｃ改変ＩｇＧ、Ｆｃａｂ、Ｍａｂ２、またはＤＡＲＴポリペプチドから構成される、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
前記第１及び第２の核酸配列が、単一のプロモーター配列から発現する、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１４】
前記組換え核酸がマルチシストロン性配列である、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１５】
前記マルチシストロン性配列が、バイシストロン性配列またはトリシストロン性配列である、請求項１４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１６】
前記マルチシストロン性配列が、ピコルナウイルス２ａ様配列を含み、前記第１及び第２の核酸配列が、前記組換え核酸に存在する単一のプロモーター配列から発現する、請求項１５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１７】
前記エフェクター細胞が、Ｔ細胞またはＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１８】
前記エフェクター細胞上で発現する前記抗原が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＮＫＧ２Ｄである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１９】
前記第１及び第２の核酸が、７．２〜３８ｋｂのサイズを有する、請求項７〜１８のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２０】
腫瘍溶解性ウイルスであって、
エフェクター細胞上に発現する抗原に特異的なエフェクタードメイン及び標的細胞上に発現する抗原に特異的な標的化ドメインを含むポリペプチドをコードする第１の組換え核酸を含み、
前記エフェクター細胞の抗原がＣＤ３であり、
前記標的抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、
前記腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２１】
前記エンゲージャー分子が、配列番号７５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列を含む、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２２】
前記エンゲージャー分子が、配列番号７５のポリペプチド配列を含む、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２３】
前記エンゲージャー分子が、配列番号７５のポリペプチド配列からなる、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２４】
前記第１の組換え核酸が、配列番号７４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２５】
前記第１の組換え核酸が、配列番号７４を含む、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２６】
前記第１の組換え核酸が、配列番号７４からなる、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２７】
前記組換え核酸配列が、治療用分子をコードする第２の組換え核酸をさらに含む、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２８】
前記治療用分子がＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０、またはＭＭＰ９である、請求項２７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２９】
前記治療用分子がＩＬ−１２であり、前記組換え核酸配列が、配列番号５４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする、請求項２８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３０】
前記治療用分子がＩＬ−１５であり、前記組換え核酸配列が、配列番号５３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする、請求項２７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３１】
前記治療用分子がＣＸＣＬ１０であり、前記組換え核酸配列が、配列番号５５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする、請求項２８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３２】
前記治療用分子がＣＣＬ４であり、前記組換え核酸配列が、配列番号８０と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする、請求項２８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３３】
前記治療用分子がＭＭＰ９であり、前記組換え核酸配列が、配列番号３４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする、請求項２８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３４】
２つ以上の治療用分子をコードする１つ以上の追加の組換え核酸配列をさらに含む、請求項２０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３５】
前記２つ以上の治療用分子がＣＣＬ４、ＣＸＣＬ２０、及びＩＬ−１２のうち２つ以上を含む、請求項３４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３６】
前記２つ以上の治療用分子がＣＣＬ４、ＣＸＣＬ２０、及びＩＬ−１２の各々を含む、請求項３４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３７】
前記腫瘍溶解性ウイルスが偽型腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３８】
前記偽型腫瘍溶解性ウイルスが、ウイルスの宿主細胞への侵入に関与する１つ以上の修飾糖タンパク質を含む、請求項３７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３９】
前記１つ以上の修飾糖タンパク質が、１つ以上のアミノ酸変異を含む、請求項３８に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４０】
前記偽型腫瘍溶解性ウイルスが、前記ウイルス表面に存在する非ウイルスタンパク質を含む、請求項３７に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４１】
前記非ウイルスタンパク質が、標的細胞の細胞表面に発現するタンパク質に結合する、請求項４０に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４２】
前記標的細胞の細胞表面に発現する前記タンパク質が、がんと関連しない、請求項４１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４３】
前記偽型腫瘍溶解性ウイルスが、非偽型ウイルスと比較して変化した指向性を有する、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４４】
前記偽型腫瘍溶解性ウイルスが、非偽型ウイルスと比較して、毒性の減少及び／または非腫瘍細胞もしくは非腫瘍組織の侵入の減少をもたらす、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４５】
前記偽型腫瘍溶解性ウイルスが、非偽型ウイルスと比較して、毒性の増加及び／または腫瘍細胞もしくはがん組織の侵入の増加をもたらす、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４６】
前記腫瘍溶解性ウイルスが対象に静脈内投与される、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４７】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）、もしくはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）から選択されるか、またはこれらに由来する、先行請求項のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４８】
請求項１〜４７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む、医薬組成物。
【請求項４９】
前記腫瘍溶解性ウイルスが免疫応答を誘導する、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
免疫応答が標的細胞に対して選択的に細胞毒性である、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記標的細胞が固形腫瘍または血液癌由来である、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記組成物が静脈内投与可能である、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
がんの治療を必要とする対象におけるがんの治療方法であって、治療有効量の請求項１〜４７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５４】
追加の療法を必要とする前記対象に１つ以上の追加の療法を施すことをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記１つ以上の追加の療法が、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
治療を必要とする対象における１つ以上の腫瘍の治療方法であって、
治療有効量の請求項１〜４７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の医薬組成物を患者に投与することを含み、
前記１つ以上の腫瘍が腫瘍抗原を発現する、
前記方法。
【請求項５７】
エンゲージャーポリペプチド及び治療用ポリペプチドを腫瘍部位に送達する方法であって、
請求項１〜４７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に申請し提出するテキストの説明
ここに電子的に申請し提出するテキストの内容（配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＯＮＣＲ＿０１１＿００１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、データ生成日：２０１８年１２月２１日、ファイルサイズ：２０８キロバイト））は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ある特定の血液腫瘍及び固形腫瘍を有する患者は、依然として新しい治療を必要としている。細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍細胞に誘導するための二重特異性抗体の使用及び免疫エフェクター細胞上に抗原特異性を作り出すためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用は、治療上の利益をもたらすことが実証されている。また、腫瘍溶解性ウイルス技術は、現行の固形腫瘍の標準治療に対する有用な付加的技術であり、安全性プロファイルを有し、かつ腫瘍細胞を感染させ、腫瘍細胞中で複製し、腫瘍細胞を溶解する能力を有することが期待されている。しかしながら、二重特異性抗体、ＣＡＲ及び腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果は最適ではなく、腫瘍学、抗体、及び腫瘍溶解性ウイルス療法のさらなる進歩が引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
いくつかの実施形態では、本開示は、エフェクター細胞上に発現する抗原に特異的なエフェクタードメイン及び標的細胞上に発現する抗原に特異的な標的化ドメインを含むポリペプチドをコードする第１の組換え核酸を含み、標的抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）標的配列を含み、かつエフェクター細胞上に発現する抗原に特異的なエフェクタードメイン及び標的細胞上に発現する標的抗原に結合する標的化ドメインを含むポリペプチドをコードする第１の核酸配列をさらに含み、標的抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲ標的配列は、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、またはｍｉＲ−１２４７−５ｐによって認識される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲ標的配列は、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、及びｍｉＲ−１２４７−５ｐから選択される複数のマイクロＲＮＡによって認識される。
【０００４】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）に由来する。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞内で優先的に複製することができる。
【０００５】
いくつかの実施形態では、組換え核酸は、サイトカイン、共刺激分子、免疫チェックポイントポリペプチド、抗血管新生因子、及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）からなる群から選択される免疫モジュレーターポリペプチドをコードする第２の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４から選択される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントポリペプチドは、ｉ）ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ニューロピリン、もしくはＣＣＲ４の阻害剤、ｉｉ）ＧＩＴＲ、ＯＸ−４０、もしくはＣＤ２８のアゴニスト、またはｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＭＭＰはＭＭＰ９である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＣＬ４、及びＣＸＣＬ１０から選択される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、エンゲージャーポリペプチドは二部分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ポリペプチドであり、抗体、抗体ドメイン、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）、Ｔａｎｄａｂ、ダイアボディ、フレキシボディ、ドック・アンド・ロック抗体、Ｓｃｏｒｐｉｏｎポリペプチド、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＢｉＴＥ、ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｃ改変ＩｇＧ、Ｆｃａｂ、Ｍａｂ２、またはＤＡＲＴポリペプチドから構成される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、第１及び第２の核酸配列は、単一のプロモーター配列から発現する。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、マルチシストロン性配列である。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性配列は、バイシストロン性配列またはトリシストロン性配列である。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性配列はピコルナウイルス２ａ様配列を含み、第１及び第２の核酸配列が、組換え核酸に存在する単一のプロモーター配列から発現する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の核酸は、７．２〜３８ｋｂのサイズを有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージである。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞上で発現する抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＮＫＧ２Ｄである。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、エフェクター細胞上に発現する抗原に特異的なエフェクタードメイン及び標的細胞上に発現する抗原に特異的な標的化ドメインを含むポリペプチドをコードする第１の組換え核酸を含み、エフェクター細胞の抗原がＣＤ３であり、標的抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、配列番号７５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、配列番号７５のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、配列番号７５のポリペプチド配列からなる。いくつかの実施形態では、第１の組換え核酸は、配列番号７４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、第１の組換え核酸は、配列番号７４を含む。いくつかの実施形態では、第１の組換え核酸は、配列番号７４からなる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、治療用分子をコードする第２の組換え核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、治療用分子は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＸＣＬ１０またはＭＭＰ９である。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１２であり、組換え核酸配列は、配列番号５４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１５であり、組換え核酸配列は、配列番号５３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＸＣＬ１０であり、組換え核酸配列は、配列番号５５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＣＬ４であり、組換え核酸配列は、配列番号８０と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする。いくつかの実施形態では、治療用分子はＭＭＰ９であり、組換え核酸配列は、配列番号３４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする。
【００１１】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、２つ以上の治療用分子をコードする１つ以上の追加の組換え核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の治療用分子は、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ２０、及びＩＬ−１２のうち２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の治療用分子は、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ２０、及びＩＬ−１２の各々を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは偽型腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスの宿主細胞への侵入に関与する１つ以上の修飾糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾糖タンパク質は、１つ以上のアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス表面に存在する非ウイルスタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、非ウイルスタンパク質は、標的細胞の細胞表面に発現するタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、標的細胞の細胞表面に発現するタンパク質は、がんと関連しない。いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、非偽型ウイルスと比較して変化した指向性を有する。いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、非偽型ウイルスと比較して、毒性の減少及び／または非腫瘍細胞もしくは非腫瘍組織の侵入の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、非偽型ウイルスと比較して、毒性の増加及び／または腫瘍細胞もしくはがん組織の侵入の増加をもたらす。
【００１３】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは対象に静脈内投与される。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）、もしくはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）から選択されるか、またはこれらに由来する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は静脈内投与が可能である。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、免疫応答は、標的細胞に対して選択的に細胞毒性である。いくつかの実施形態では、標的細胞は固形腫瘍または血液癌由来である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはその医薬組成物を投与することを含む、がんの治療を必要とする対象におけるがんの治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、追加の療法を必要とする対象に１つ以上の追加の療法を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の療法は、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療有効量の本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはその医薬組成物を患者に投与することを含む、治療を必要とする対象における１つ以上の腫瘍の治療方法であって、この１つ以上の腫瘍が、腫瘍抗原を発現する方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはその医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、エンゲージャーポリペプチド及び治療用ポリペプチドを腫瘍部位に送達する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＣＤ１９−ＣＤ３二部分ポリペプチドのアミノ酸配列を示しており、この配列は、ＣＤ１９に対して作製された第１の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、第１のｓｃＦｖに連結された、ＣＤ３に対して作製された第２のｓｃＦｖとを含む。
【図２】バイシストロン性遺伝子によってコードされる、ＣＤ１９−ＣＤ３−ＩＬ１５コンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は二部分ポリペプチドをコードしており、このポリペプチドは、ＣＤ１９に対して作製された第１のｓｃＦｖと、第１のｓｃＦｖに連結された、ＣＤ３に対して作製された第２のｓｃＦｖとを含む。ＩＬ−１５をコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結されている。
【図３】マルチシストロン性遺伝子によってコードされる、ＣＤ１９−ＣＤ３−ＩＬ１２コンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は二部分ポリペプチドをコードしており、このポリペプチドは、ＣＤ１９に対して作製された第１のｓｃＦｖと、第１のｓｃＦｖに連結された、ＣＤ３に対して作製された第２のｓｃＦｖとを含む。ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットをコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結され、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットをコードする第３の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって連結されている。
【図４】バイシストロン性遺伝子によってコードされる、ＣＤ１９−ＣＤ３−ＣＸＣＬ１０コンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は二部分ポリペプチドをコードしており、このポリペプチドは、ＣＤ１９に対して作製された第１のｓｃＦｖと、第１のｓｃＦｖに連結された、ＣＤ３に対して作製された第２のｓｃＦｖとを含む。ＣＸＣＬ１０をコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結されている。
【図５】単一アミノ酸リンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む第１のタンパク質を含む、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３二部分ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図６】Ｇ４ＳモチーフリンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む第１のタンパク質を含む、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＬＬ二部分ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図７】バイシストロン性遺伝子によってコードされる、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＩＬ１５コンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は、単一アミノ酸リンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む二部分ポリペプチドをコードする。ＩＬ−１５をコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結されている。
【図８】バイシストロン性遺伝子によってコードされる、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＩＬ１５−ＬＬコンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は、Ｇ４ＳモチーフリンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む二部分ポリペプチドをコードする。ＩＬ−１５をコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結されている。
【図９】マルチシストロン性遺伝子によってコードされる、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＩＬ１２コンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は、単一アミノ酸リンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む二部分ポリペプチドをコードする。ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットをコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結され、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットをコードする第３の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって連結されている。
【図１０】マルチシストロン性遺伝子によってコードされる、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＩＬ１２−ＬＬコンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は、Ｇ４ＳモチーフリンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む二部分ポリペプチドをコードする。ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットをコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結され、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットをコードする第３の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって連結されている。
【図１１】バイシストロン性遺伝子によってコードされる、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＣＸＣＬ１０コンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は、単一アミノ酸リンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む二部分ポリペプチドをコードする。ＣＸＣＬ１０をコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結されている。
【図１２】バイシストロン性遺伝子によってコードされる、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＣＸＣＬ１０−ＬＬコンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は、Ｇ４ＳモチーフリンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む二部分ポリペプチドをコードする。ＣＸＣＬ１０をコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結されている。
【図１３】ＰＤＬ１−ＣＤ３二部分ポリペプチドのアミノ酸配列を示しており、この配列は、ＰＤＬ１に対して作製された第１のｓｃＦｖと、第１のｓｃＦｖに連結された、ＣＤ３に対して作製された第２のｓｃＦｖとを含む。
【図１４】バイシストロン性遺伝子によってコードされる、ＰＤＬ１−ＣＤ３−ＩＬ１５コンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は二部分ポリペプチドをコードしており、このポリペプチドは、ＰＤＬ１に対して作製された第１のｓｃＦｖと、第１のｓｃＦｖに連結された、ＣＤ３に対して作製された第２のｓｃＦｖとを含む。ＩＬ−１５をコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結されている。
【図１５】マルチシストロン性遺伝子によってコードされる、ＰＤＬ１−ＣＤ３−ＩＬ１２コンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は二部分ポリペプチドをコードしており、このポリペプチドは、ＰＤＬ１に対して作製された第１のｓｃＦｖと、第１のｓｃＦｖに連結された、ＣＤ３に対して作製された第２のｓｃＦｖとを含む。ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットをコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結され、ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットをコードする第３の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって連結されている。
【図１６】バイシストロン性遺伝子によってコードされる、ＰＤＬ１−ＣＤ３−ＣＸＣＬ１０コンストラクトのアミノ酸配列を示す。第１の遺伝子は二部分ポリペプチドをコードしており、このポリペプチドは、ＰＤＬ１に対して作製された第１のｓｃＦｖと、第１のｓｃＦｖに連結された、ＣＤ３に対して作製された第２のｓｃＦｖとを含む。ＣＸＣＬ１０をコードする第２の遺伝子は、Ｔ２Ａ自己切断ポリペプチドリンカーによって二部分遺伝子配列に連結されている。
【図１７】ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ三部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）ポリペプチドのアミノ酸配列を示しており、この配列は、ＣＤ３に対して作製された第１のｓｃＦｖを含み、第１のｓｃＦｖは、Ｇ４ＳモチーフリンカーによってＰＤＬ１に対して作製された第２のｓｃＦｖと連結されており、第２のｓｃＦｖはさらに、ＩｇＧ１ヒンジによってヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３ドメインに連結されている。
【図１８】Ａは、バイシストロン性遺伝子によってコードされるＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＭＭＰ９−ＳＬコンストラクトのアミノ酸配列を示し、Ｂは、バイシストロン性遺伝子によってコードされるＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＭＭＰ９−ＬＬコンストラクトのアミノ酸配列を示す。
【図１９】Ａは、ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクトのＣＤ３＋Ｔ細胞への結合を示し、Ｂは、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクトのＣＤ３＋Ｔ細胞への結合を示し、Ｃは、ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ三部分Ｔ細胞エンゲージャーのＣＤ３＋Ｔ細胞への結合を示す。
【図２０】図１９に示すＴ細胞エンゲージャーコンストラクトの結合の定量化を示す。
【図２１】Ａは、ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクトの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の使用によるＣＤ３特異的結合を示し、Ｂは、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクトの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の使用によるＣＤ３特異的結合を示し、Ｃは、ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ三部分Ｔ細胞エンゲージャーの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３の使用によるＣＤ３特異的結合を示す。
【図２２】ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクトのＣＤ４７結合ＳＩＲＰ１αアームの特異性を示す。
【図２３】ＣＤ１９−ＣＤ３及びＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクト（Ａ）のＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４７＋）への結合を示す。Ｂに、結合の百分率が定量化されている。
【図２４】ＣＤ１９−ＣＤ３及びＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクト（Ａ）のＵ２ＯＳ細胞（ＣＤ１９−ＣＤ４７＋）への結合を示す。Ｂに、結合の百分率が定量化されている。
【図２５】ＣＤ１９−ＣＤ３及びＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクト（Ａ）のＧＢＭ３０−ｌｕｃ細胞（ＣＤ１９−ＣＤ４７＋）への結合を示す。Ｂに、結合の百分率が定量化されている。
【図２６】ＣＤ１９−ＣＤ３及びＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクト（Ａ）のＵ２５１細胞（ＣＤ１９−ＣＤ４７＋）への結合を示す。Ｂに、結合の百分率が定量化されている。
【図２７】ＰＤＬ１−Ｆｃ−ＣＤ３三部分Ｔ細胞エンゲージャーのＵ２５１細胞への結合を示す。ＰＤＬ１−Ｆｃ−ＣＤ３コンストラクトの結合（Ｂ）を、抗ＰＤＬ１抗体の結合（Ａ）と比較する。Ｕ２５１細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩを発現しないため、結合はＦｃγＲによって媒介されない（Ｃ）。
【図２８】ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥ、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ、及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ三部分Ｔ細胞エンゲージャー媒介性の、Ｒａｊｉ細胞のＴ細胞依存性細胞傷害（ＴＤＣＣ）を示す。
【図２９】ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ三部分Ｔ細胞エンゲージャー媒介性の、ＴＨＰ１細胞のＴＤＣＣを示す。
【図３０】ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ三部分Ｔ細胞エンゲージャー媒介性の、Ｕ２５１細胞のＴＤＣＣを示す。
【図３１】オステオポンチン融合対照コンストラクトと比較した、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ媒介性の２９３Ｆ細胞のＴＤＣＣを示す。
【図３２】腫瘍溶解性ＨＳＶベクターからのＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクトの発現を示す。ショートリンカーを有するＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクト（レーン１〜４及び図５に示すレーン５〜６のＯＮＣＲ０８５）ならびにロングリンカーを有するＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥコンストラクト（図６に示すレーン７〜８のＯＮＣＲ０８７）の発現を示す。
【図３３】腫瘍溶解性ＨＳＶベクターからのＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ  ＢｉＴＥコンストラクトの発現を示す。精製したＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ  ＢｉＴＥタンパク質をレーン１〜４に示す。濃縮したウイルス上清をレーン５〜６に示す。
【図３４】ウイルスによって産生されたＳＩＲＰ１α−ＣＤ３、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＬＬ、及び  ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ  ＢｉＴＥコンストラクトによるＵ２５１細胞のＴＤＣＣを示す。Ａは、示されたＢｉＴＥコンストラクト及びＣＤ８＋Ｔ細胞とのインキュベーション後のＵ２５１細胞の培養物の写真を示す。Ｂは、細胞殺傷の百分率によって測定されフローサイトメトリーによって定量化された、ウイルスによって産生されたＢｉＴＥコンストラクトの活性を示す。
【図３５】Ａｍｉｃｏｎ限外ろ過が、抗ＨＳＶポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングによって確認されるように、試料からウイルスを効果的に除去することを示しており、ＢｉＴＥによる殺傷はＢｉＴＥに起因し、ウイルス感染に起因しないことが示された。
【図３６】偽型腫瘍溶解性ウイルス及び組換え腫瘍溶解性ウイルスの産生、ならびに偽型腫瘍溶解性ウイルス及び組換え腫瘍溶解性ウイルスのそれぞれによる標的細胞の感染の模式図表現を示す。
【図３７】第１の遺伝子がＩｇＧ１  Ｆｃドメインに連結された抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖをコードし、第２の遺伝子が単一アミノ酸リンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む二部分ポリペプチドをコードする、バイシストロン性遺伝子によってコードされるＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＳＬ）コンストラクトのアミノ酸配列を示す。
【図３８】第１の遺伝子がＩｇＧ１  Ｆｃドメインに連結された抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖをコードし、第２の遺伝子がＧ４ＳモチーフリンカーによってＣＤ３に対して作製されたｓｃＦｖに連結された、ＳＩＲＰ１αの最初の１２０個のアミノ酸を含む二部分ポリペプチドをコードする、バイシストロン性遺伝子によってコードされるＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＬＬ）コンストラクトのアミノ酸配列を示す。
【図３９】ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＰＤＬ１−Ｆｃ発現プラスミドの模式図を示す。一方はＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＳＬ）に対し、一方はＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＬＬ）に対する、２つのプラスミドコンストラクトが生成された。
【図４０】トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清からのＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ（ＳＬ）、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ（ＬＬ）及び抗ＰＤＬ１−Ｆｃ化合物の精製を示す。Ａは、クーマシーにより評価された抗ＰＤＬ１−Ｆｃ化合物の精製を示す。Ｂは、抗Ｈｉｓ検出抗体を用いたウエスタンブロット法によって評価されたＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ化合物の精製を示す。
【図４１】ＰＤ１／ＰＤＬ１遮断アッセイの結果を示す。Ａ〜Ｂは、アッセイの模式図を示す。Ｃは、トランスフェクトされた２９３細胞から産生された抗ＰＤＬ１−Ｆｃ化合物を用いたＰＤ１／ＰＤＬ１遮断アッセイの結果を示す。
【図４２】ＦＡＰ−ＣＤ３  ＢｉＴＥを発現しているｏＨＳＶ（ＯＮＣＲ−１４８）による治療後、ならびにＯＮＣＲ−１４８と、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ１０、及びＩＬ−１２を発現しているｏＨＳＶ（ＯＮＣＲ−１５３）とによる併用治療後の腫瘍増殖抑制を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本開示は、新規改変腫瘍溶解性ウイルス、特に、固形腫瘍（例えば、進行性固形腫瘍）及び血液悪性腫瘍を含むがんの治療のための多部分（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔｅ）ポリペプチド及び／または他の治療用ポリペプチドを産生する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスによって産生される多部分ポリペプチド及び／または治療用ポリペプチドは、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）のエフェクター細胞媒介性の溶解などによって、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果を媒介及び／または増強する。本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、多部分ポリペプチドの発現の結果としてのエフェクター細胞媒介性の標的細胞の細胞溶解、及び標的細胞のウイルス媒介性の崩壊を含む、多重の（例えば、二重の）作用様式を有し得る。本開示は、改変腫瘍溶解性ウイルスを含む治療用組成物ならびに固形腫瘍及び血液悪性腫瘍の治療における使用方法をさらに提供する。
【００２０】
概要
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス、それらの組成物、及びがんの治療のための使用方法を提供する。本明細書で提供される腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャーポリペプチド及び／または他の治療用分子をコードする組換え核酸を含む。一般に、エンゲージャーポリペプチドはエフェクター細胞エンゲージャーとして作用し、通常、エフェクター細胞上に発現する細胞表面分子に対して作製された第１のドメイン（例えば、エフェクタードメイン）、及び標的細胞抗原に対して作製された第２のドメイン（例えば、標的化ドメイン）または他の細胞表面分子（例えば、活性化ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスによってコードされるエンゲージャー分子は、（例えば、１つ以上のエンゲージャードメイン、１つ以上の標的化ドメイン、または１つ以上の活性化ドメイン及び任意で１つ以上の他の機能ドメインを含む）二部分ポリペプチド、三部分ポリペプチドまたは多部分ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスの指向性を調節して腫瘍細胞及び／または周囲の腫瘍間質に特異的なウイルス感染をもたらすため、及び／または他の有益な目的のため、偽型化または他の組換え技術によってさらに改変される。
【００２１】
治療有効量の本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの医薬組成物を、それを必要とするヒト対象に送達する工程を含むがんの治療方法も提供される。そのような方法は、任意で、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせなどのさらなるがん療法をヒト対象に送達する工程を含む。
【００２２】
定義
本明細書で使用する場合、文脈上別途明確に示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」には、複数形への言及が含まれる。
【００２３】
本明細書全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、記載された要素もしくは完全体または要素群もしくは完全体群の包含を意味するが、いかなる他の要素もしくは完全体または要素群もしくは完全体群の排除を意味するものではないことが理解されよう。
【００２４】
本出願で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、等価物として使用される。本出願において使用されるあらゆる数字は、約／およその有無に関わらず、関連技術の当業者によって理解されるあらゆる標準的な変動を包含することを意味する。特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、別途記載のない限りまたは別途内容から明らかでない限り（かかる数が可能な値の１００％を超え得る場合を除く）、記載された基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）において、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲に属する値の範囲を指す。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」または「対象（ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」または「個体」は、家畜、農業動物または野生動物を含むヒトまたは非ヒト哺乳動物などの哺乳動物、ならびに鳥類及び水生動物を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象はウシ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、ブタなどの家畜類（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどの家禽、ならびにイヌ及びネコなどの家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）である。いくつかの実施形態（例えば、特に研究の文脈において）では、対象は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、または近交系ブタなどのブタである。特定の実施形態では、対象はヒトである。「患者」は、疾患、障害、もしくは状態を患っているか、もしくは発症するリスクがあるか、またはそれ以外の本明細書に提供される組成物及び方法を必要とする対象である。いずれの用語も、医療従事者（例えば、医者、正看護師、ナース・プラクティショナー、医師助手、病院職員またはホスピス職員）の（例えば定常的なまたは断続的な）管理を特徴とする状況を必要とせず、また状況に限定されない。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患または状態、特にがんの治療または改善における成功のあらゆる兆候を指す。治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）、または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができ、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの組成物を、それを必要とする患者または対象に送達することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、治療には例えば、１つ以上の疾患もしくは状態の症状の重症度を軽減、遅延もしくは緩和すること、及び／または対象もしくは患者が経験する疾患、欠損、障害、もしくは有害状態の症状の頻度を低減することが含まれる。ここで、「治療するまたは予防する」は本明細書において、疾患または状態のある程度の治療または改善をもたらす方法を指すために使用され、状態の完全な予防を含むがこれに限定されない、治療または改善をもたらす方向に向かう結果の範囲を意図する。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「予防すること」は、患者または対象における疾患または状態、例えば腫瘍形成の予防を指し、「予防的治療」と称されることもある。疾患発症の予防は、疾患症状の完全な予防、疾患発症の遅延、または後続して発症する疾患における症状の重症度の緩和を指し得る。非限定的な例示的な例として、腫瘍または他の形態のがんを発症するリスクのある個体が本発明の方法で治療され、腫瘍または他の形態のがんを後に発症しない場合、少なくとも一定期間にわたって、その個体において疾患は予防されている。
【００２８】
用語「治療有効量」及び「治療有効用量」は、本明細書において互換的に使用され、有益な効果をもたらすために、またはその他有害で非有益な事象を減少させるために十分な腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの組成物の量（例えば、疾患を治療するために十分な量または用量）を指す。治療有効量または治療有効用量内に含まれる腫瘍溶解性ウイルスの正確な量または用量は、治療の目的、対象または患者の体重、性別、年齢、及び全体的な健康状態、投与経路、投与のタイミング、ならびに治療される疾患の性質を含む様々な要因に依存する。所与の対象または患者に対する治療有効量は、既知の技術を使用して当業者によって確認することができる。（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１−３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、及びＰｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）を参照のこと）。
【００２９】
「偽型」は、ウイルス粒子の一部（例えば、エンベロープまたはカプシド）が、異種ウイルス由来のウイルスタンパク質もしくは非ウイルスタンパク質などの１つ以上の異種タンパク質及び／または１つ以上の改変ウイルスコートタンパク質を含む、ウイルス粒子を指す。非ウイルスタンパク質（「標的化部分」とも称される）は、抗体及びそれらの抗原結合断片を含み得る。
【００３０】
用語「標的化部分」は、本明細書では、ウイルス粒子と選択された細胞型との間の相互作用を誘導するために、選択された細胞型の細胞表面上のタンパク質に結合することができるウイルス粒子に連結した異種タンパク質を指す。標的化部分は共有結合または非共有結合で連結され得、一般に、例えば、Ｅ１、Ｅ２またはＥ３などのエンベロープタンパク質に連結される。代表的な標的化部分には、抗体、それらの抗原結合断片、及び受容体リガンドが含まれる。ウイルス「エンベロープ」タンパク質、または「Ｅｎｖ」タンパク質は、ビリオンの表面脂質二重層に存在し、感染しやすい宿主細胞への吸着及びウイルス侵入を媒介するように機能する任意のポリペプチド配列を指す。
【００３１】
用語「ベクター」は、本明細書では、別の核酸分子を導入または輸送することができる核酸分子を指すために使用される。導入される核酸は、通常、ベクター核酸分子に連結（例えば、ベクター核酸分子内に挿入）される。ベクターは、細胞内で自律複製を誘導する配列を含み得、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルス（すなわち、ウイルスベクターまたは腫瘍溶解性ウイルスベクター）であり、導入される核酸配列は、エンゲージャー分子及び／または治療用分子をコードする組換え核酸配列である。ウイルスベクターは、時に、「組換えウイルス」または「ウイルス」と称されることがある。用語「腫瘍溶解性ウイルス」及び「腫瘍溶解性ベクター」は、本明細書において互換的に使用される。
【００３２】
「核酸ゲノム」または「ウイルスゲノム」は、ウイルス粒子の核酸成分を指し、これは、ゲノムの複製及び／または組み込みに必要な任意のタンパク質を含むウイルス粒子のゲノムをコードする。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムはウイルスベクターとして作用し、プロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子を含み得る。プロモーターは、遺伝子固有のまたは遺伝子に対して異種のいずれかであり得、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る。本明細書に記載のウイルスゲノムは任意のウイルスをベースにすることができ、ＲＮＡゲノムまたはＤＮＡゲノムであり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。核酸ゲノムはＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科に由来することが好ましい。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「レトロウイルスベクター」はＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスベースのウイルスベクターを指す。レトロウイルスベクターは通常、野生型（ＷＴ）の形態において核酸ゲノムを含有する。
【００３４】
用語「抗体断片またはその誘導体」は、少なくとも１つのＣＤＲを含有し、標的抗原に特異的に結合することができるポリペプチド配列を含む。この用語はさらに、一本鎖抗体もしくはその断片、合成抗体、抗体断片、例えばＣａｍｅｌ  Ｉｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）など、またはこれらのいずれかの化学修飾誘導体に関する。いくつかの実施形態では、抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖（複数可）は、例えば、アミノ酸の欠失（複数可）、挿入（複数可）、置換（複数可）、付加（複数可）及び／または組換え（複数可）、及び／または任意の他の修飾（複数可）（例えば、グリコシル化及びリン酸化などの翻訳後修飾及び化学修飾）を単独でまたは組み合わせのいずれかで使用することによりさらに修飾される。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎をなすＤＮＡ配列にそのような修飾を導入するための方法は、当業者によく知られている。
【００３５】
本開示に従って使用される用語「一本鎖」は、好ましくは単一の核酸分子によってコードされる共直線性アミノ酸配列の形態である、２つ以上のポリペプチド配列の共有結合を指す。
【００３６】
用語「への結合」及び「との相互作用」は、本明細書において互換的に使用され、少なくとも２つの「抗原相互作用部位」の互いの相互作用を指す。「抗原相互作用部位」は、抗原または抗原の群と特異的に相互作用することができるポリペプチドのモチーフ（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を指す。結合／相互作用は、「特異的相互作用」または「特異的結合」を定義するとも理解される。
【００３７】
用語「特異的結合」または「特異的相互作用」は、本明細書で定義される標的分子の少なくとも２つのアミノ酸と特異的に相互作用及び／または結合することができる、抗原相互作用部位を指す。この用語は、類似構造のポリペプチドと交差反応しないように、またはほとんど交差反応しないように、本明細書で定義される標的分子の特定の領域（例えば、エピトープ）間を区別する抗原相互作用部位の能力に関する。いくつかの実施形態では、エピトープは線状である。いくつかの実施形態では、エピトープは、ヒト標的分子またはその一部の２つの領域からなる立体構造エピトープ、構造的エピトープまたは不連続エピトープである。本開示の文脈において、立体構造エピトープは、一次配列では離れており、折り畳まれたタンパク質の表面上で集合する、２つ以上の別個のアミノ酸配列によって定義される。検討中の抗原結合コンストラクトの一団の特異性及び／または交差反応性は、例えば、一団のコンストラクトの、目的のポリペプチドとの結合ならびに従来の条件下における、（構造的に及び／または機能的に）より密接に関連するか、またはより関連性の低い多数のポリペプチドとの結合を評価することによって試験することができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８及びＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと）。目的のポリペプチド／タンパク質に結合し、かつ他のポリペプチドのいずれにも結合しないか、またはほとんど結合しないコンストラクトのみが、目的のポリペプチド／タンパク質に特異的であるとみなされる。抗原相互作用部位の特異的抗原との特異的な相互作用の例としては、リガンドの相互作用であって、その特異的受容体へ結合するとシグナルを誘導する相互作用、リガンドのその受容体への特異性、例えば特異的サイトカイン受容体に結合するサイトカイン、及び特に、抗体の抗原相互作用部位の抗原エピトープへの結合が挙げられる。
【００３８】
場合によっては、抗原相互作用部位の特異的抗原との特異的相互作用は、例えば、抗原のコンフォメーション変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因するシグナルの開始をもたらす。いくつかの実施形態では、特異的結合は「鍵と鍵穴の原理」を包含する。したがって、いくつかの実施形態では、抗原相互作用部位のアミノ酸配列中の特異的モチーフが抗原の特異的モチーフと相互作用し、それらの一次構造、二次構造、三次構造の結果として、または当該構造の二次修飾の結果として互いに結合する。いくつかの実施形態では、抗原相互作用部位のその特異的抗原との特異的相互作用は、抗原相互作用部位のその抗原への単一の結合をもたらす。
【００３９】
腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を感染させ、腫瘍細胞中で複製し、腫瘍細胞を溶解することができ、さらに、複製の連続的なラウンドにおいて他の腫瘍細胞へ拡散することができる。過去の腫瘍溶解性ウイルス療法は、前臨床モデル及び臨床試験において有望であることが示されてきたが、これらの腫瘍溶解性ウイルス、例えばワクシニアの抗腫瘍効果は最適ではなかった。例えば、これらのウイルスは、腫瘍全体の限定的なウイルス拡散及び／または腫瘍内での抗腫瘍Ｔ細胞応答の限定的な活性化を示した。したがって、本開示は、１）腫瘍浸潤及びエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化を促進する、及び／または２）ウイルスに感染していない腫瘍細胞を効果的に溶解する（バイスタンダー殺傷としても知られる）腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、以下の有利な特性：
（ａ）ウイルスは腫瘍溶解性であり、以前に記載されている他の腫瘍溶解性ウイルスと比較して、著しく高い腫瘍溶解活性を有する；
（ｂ）ウイルスは腫瘍細胞内で優先的に複製し、他の腫瘍溶解性ウイルスと比較して、著しく高い複製能力を有する；
（ｃ）ウイルスは休止細胞のみならず、活発に分裂している細胞をも感染させる；
（ｄ）ウイルスは強力な自然免疫応答、液性免疫応答、及び細胞性免疫応答を誘導する；
（ｅ）ウイルスは完全に細胞質的に複製する。すなわち、ウイルスを宿主細胞のゲノムに組み込むことはできず、また複製可能ウイルス中に組換えることもできない；
（ｆ）１つ以上の天然のウイルス糖タンパク質は、異種エンベロープタンパク質と交換可能である、のうちの１つ以上を有する。
【００４１】
偽型腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの実施形態では、本発明は、偽型腫瘍溶解性ウイルスを提供する。一般的に、ウイルスは最も効率的に感染させる固有の宿主細胞集団を有する。例えば、レトロウイルスは固有の宿主細胞の範囲が限られており、他方、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスは比較的広い範囲の宿主細胞を効果的に感染させることができるものの、一部の細胞型はこれらのウイルスによる感染に抵抗性である。ウイルス表面のタンパク質（例えば、エンベロープタンパク質またはカプシドタンパク質）は感受性宿主細胞への付着及び侵入を媒介し、それによって、ウイルスの指向性、すなわち、特定の細胞型または組織型を感染させる特定のウイルスの能力を決定する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス表面に単一の種類のタンパク質を含む。例えば、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルスは、それらの膜を被覆する単一のタンパク質を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス表面に２種類以上のタンパク質を含む。例えば、アデノウイルスは、エンベロープタンパク質及びウイルス表面から離れて伸長する線維の両方で被覆されている。
【００４２】
ウイルス表面のタンパク質は、ヘパリン硫酸などの細胞表面分子に結合し、それによってウイルスを潜在的な宿主細胞の表面に局在化させることができる。ウイルス表面のタンパク質は、ウイルスと、ウイルス侵入を媒介するためにウイルスタンパク質の構造変化を誘導する宿主細胞上に発現する特異的タンパク質受容体との間の相互作用を媒介することもできる。あるいは、ウイルス表面のタンパク質と細胞受容体の間の相互作用は、エンドソームへのウイルスの内在化を促進することができ、そこでは、エンドソーム内腔の酸性化がウイルスコートのリフォールディングを誘導する。いずれの場合も、潜在的な宿主細胞へのウイルス侵入は、少なくとも１つのウイルス表面上の分子と少なくとも１つの細胞表面上の分子との間の好適な相互作用を必要とする。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスコート（例えば、ウイルスエンベロープまたはウイルスカプシド）を含み、ウイルスコートの表面上に存在するタンパク質（例えば、ウイルスエンベロープタンパク質またはウイルスカプシドタンパク質）が、ウイルス侵入のための潜在的な標的細胞の認識を調節する。場合によっては、ウイルスが侵入する潜在的な標的細胞を決定するこのプロセスは、宿主指向性と称される。いくつかの実施形態では、宿主指向性は、受容体のウイルス認識が細胞レベルで生じる細胞指向性、または細胞受容体のウイルス認識が組織レベルで生じる組織指向性である。場合によっては、ウイルスのウイルスコートは単一の細胞型上に存在する受容体を認識する。その他の場合では、ウイルスのウイルスコートは複数の細胞型（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の異なる細胞型）上に存在する受容体を認識する。場合によっては、ウイルスのウイルスコートは単一の組織型上に存在する細胞受容体を認識する。その他の場合では、ウイルスのウイルスコートは複数の組織型（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の異なる組織型）上に存在する細胞受容体を認識する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス指向性を制限または制御するため（すなわち、腫瘍溶解性ウイルスが感染させることのできる異なる細胞型または組織型の数を減少させるため）偽型化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の偽型腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルス指向性を拡大するため（すなわち、偽型腫瘍溶解性ウイルスが感染させることのできる異なる細胞型または組織型の数を増加させるため）偽型化される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、１つ以上の内在性ウイルスコートタンパク質における１つ以上のアミノ酸変異（例えば、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／または置換）を含むウイルスコートを含む。いくつかの実施形態では、偽型ウイルスは、１つ以上の異種ウイルスタンパク質を含むウイルスコートを含むか、または内在性ウイルスコートタンパク質のうち１つ以上が置換もしくは改変されている。いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、異種ウイルス由来のコートタンパク質を組み込むように改変されたウイルスコートを含む。いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、第１のウイルスのウイルスコートが第２のウイルスコートに交換され、第２のウイルスのウイルスコートによって偽型腫瘍溶解性ウイルスが特定の細胞型または組織型を感染させることが可能となる、ウイルスコートを含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、標的化部分などの１つ以上の異種の非ウイルスタンパク質を含むウイルスコートを含む。いくつかの実施形態では、非ウイルス性の標的化部分は、抗体、それらの抗原結合断片、及び／または受容体リガンドを含み得る。いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスのウイルスコートは、１つ以上のキメラタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質はビリオンへの組み込みに必要な内在性ウイルスタンパク質の一部、さらに、特定の宿主細胞タンパク質と相互作用するように設計されたタンパク質または核酸（例えば、標的化部分）で構成される。
【００４７】
非ウイルス性の標的化部分は、選択された細胞型の表面上の対応する受容体またはリガンドと結合することができ、それによってウイルス粒子と選択された細胞型との間の相互作用を導くことができる任意の部分であり得る。場合によっては、当該技術分野で既知の任意の細胞表面の生体物質（例えば、タンパク質、脂質、もしくは炭水化物）、または特定の細胞型もしくは組織型（例えば腫瘍もしくは腫瘍細胞、または腫瘍関連間質もしくは間質細胞）に差次的に発現するか、あるいは存在する、未だ同定されていないあらゆる細胞表面の生体物質が、本発明の腫瘍溶解性ウイルスの潜在的な標的として使用され得る。特定の実施形態では、細胞表面物質はタンパク質である。いくつかの実施形態では、標的化部分は疾患、例えば、がん（例えば、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、リンパ腫、白血病、黒色腫など）；自己免疫疾患（例えば、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、糖尿病など）；ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶ、及びＨＰＶによる感染を含む感染症；遺伝性疾患、例えば、鎌状赤血球貧血症、嚢胞性線維症、テイ・サックス、Ｊ３−サラセミア、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、血友病などを示す細胞表面抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的化部分は、特定の細胞型または組織型に特異的な細胞表面抗原、例えば、神経、肺、腎臓、筋肉、血管、甲状腺、眼球、乳房、卵巣、精巣、または前立腺の組織に存在する細胞表面抗原を標的とする。
【００４８】
標的化のための例示的な抗原及び細胞表面分子としては、例えば、Ｐ糖タンパク質、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）、カドヘリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、ＡＢＣＧ２トランスポーター、卵巣癌抗原ＣＡ１２５、免疫グロブリン、インテグリン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、樹状細胞特異的細胞間接着分子３結合ノンインテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、チログロブリン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、筋原性分化促進因子１（ＭｙｏＤ−１）、Ｌｅｕ−７（ＣＤ５７）、ＬｅｕＭ−１、モノクローナル抗体Ｋｉ−６７（Ｋｉ−６７）によって定義される細胞増殖関連ヒト核抗原、ウイルスエンベロープタンパク質、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、トランスフェリン受容体などが挙げられる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ウイルスコートはカプシドを含む。場合によっては、カプシドはプロトマーと呼ばれるオリゴマータンパク質サブユニットから組み立てられる。いくつかの実施形態では、カプシドは１つの型のプロトマーもしくはタンパク質から組み立てられるか、または、２つ、３つ、４つもしくはそれ以上の型のプロトマーもしくはタンパク質から組み立てられる。いくつかの実施形態では、ウイルスコートはウイルスエンベロープを含む。場合によっては、ウイルスエンベロープはリン脂質二重層及び宿主膜から得られたタンパク質などのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスエンベロープは、宿主細胞によって発現する受容体の認識及び受容体への付着のための糖タンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の偽型腫瘍溶解性ウイルスは、１つ以上の異種糖タンパク質（ＧＰ）、または改変された（すなわち、アミノ酸変異による）１つ以上の内在性ＧＰを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の偽型腫瘍溶解性ウイルスは、ＶＳＶ由来の１つ以上のＧＰを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の偽型腫瘍溶解性ウイルスは、リッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、アルファウイルスＧＰ（例えば、ＲＲＶ  ＧＰ及びＳＦＶ  ＧＰ）、シンドビスウイルス、フィロウイルス、及びバキュロウイルス（例えば、ＧＰ６４）に由来する１つ以上のＧＰを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の偽型腫瘍溶解性ウイルスは、ｉ）非偽型ウイルスと比較して変化した指向性、及び／またはｉｉ）正常細胞もしくは正常組織の感染性などの非有益な影響の減少もしくは消失、及び／またはｉｉｉ）がん細胞もしくはがん組織の感染性などの有益な効果の増加を示す。例えば、いくつかの実施形態では、偽型ウイルスは、非偽型ウイルスと比較して、毒性の減少または非腫瘍細胞もしくは非腫瘍組織の感染の減少を示す。いくつかの実施形態では、偽型ウイルスは、対応する非偽型ウイルスが感染させることのできない細胞型または組織型を感染させることができる。いくつかの実施形態では、偽型ウイルスは、非偽型ウイルスと比較して、細胞型または組織型を優先的に感染させることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される偽型腫瘍溶解性ウイルスは、選択的に腫瘍細胞に侵入すること、腫瘍細胞中で複製すること、及び／または腫瘍細胞を溶解することができる。そのような実施形態を図３６に示し、ここで、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、偽型腫瘍溶解性ウイルスの標的細胞への侵入を可能とする異なる（例えば、異種の）ウイルス由来のウイルス糖タンパク質の組み込みによって、標的細胞へ侵入する。対照的に、非偽型腫瘍溶解性ウイルスはエンベロープタンパク質の非許容的な性質により、標的細胞へ侵入することができない。場合によっては、選択的に腫瘍細胞に侵入し、腫瘍細胞中で複製し、及び／または腫瘍細胞を溶解する偽型腫瘍溶解性ウイルスの能力は、減少したか、さもなければ無効である細胞インターフェロン（ＩＦＮ）応答に起因する。いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスは、細胞ＩＦＮ応答を干渉または障害することにより偽型または改変ウイルスの複製を亢進する、免疫調節ポリペプチドなどのエンゲージャー分子及び／または治療用分子を産生する。
【００５２】
本明細書に記載の偽型腫瘍溶解性ウイルスは、種々のウイルス由来であり得、その非限定的な例としては、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）、粘液腫ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）、及びニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の偽型腫瘍溶解性ウイルスは、実質的に任意の細胞型を感染させることができる。腫瘍溶解療法に使用するための例示的なレンチウイルスは、ＶＳＶ由来のエンベロープタンパク質であるＧタンパク質（ＧＰ）で被覆されたサル免疫不全ウイルスである。場合によっては、このウイルスはＶＳＶ  Ｇ偽型レンチウイルスと称され、ほぼ例外のない細胞のセットを感染させることが知られている。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明は組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）及びＶＳＶベクターを提供する。ＶＳＶゲノムは、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ及びＧタンパク質をコードする５つの遺伝子ｌ、ｍ、ｎ、ｐ及びｇを含み、これらはウイルスの複製に不可欠である。Ｎは、ＶＳＶのゲノムＲＮＡをパッケージングする核タンパク質である。ＶＳＶゲノムはＲＮＡ−タンパク質複合体として複製され、Ｌ及びＰは共に、ＶＳＶゲノムを複製しＶＳＶ  ｍＲＮＡを転写するポリメラーゼ複合体を形成する。Ｍは、脂質エンベロープとヌクレオカプシドの間に構造上の支持を提供するマトリックスタンパク質であり、細胞膜での粒子の発芽に重要である。Ｇは、ウイルスエンベロープに組み込まれるエンベロープタンパク質であり、ウイルスの感染性及び指向性に不可欠である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明の偽型腫瘍溶解性ウイルスは正常脳細胞、すなわち神経細胞に対して偽型化されたＶＳＶウイルスであり、かつ大幅に軽減された毒性を示す。向神経性は、腫瘍溶解性ＶＳＶのすべての適用において用量制限因子であるため、本発明のいくつかの実施形態に従うベクターの使用は、固形腫瘍のすべての腫瘍型に対しての使用である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、偽型ＶＳＶベクターは、（ｉ）ＶＳＶは非細胞毒性である、（ｉｉ）ベクターは感染力の減少を伴わずに、超遠心分離によって濃縮される、及び（ｉｉｉ）ベクターは腫瘍細胞に対する指向性を示し、他方、神経細胞及び他の非腫瘍細胞には非効率的に感染する、を含む１つ以上の重要な特質を有する。複製可能ウイルスの治療用途における使用中の安全性を高めるために、本発明のいくつかの実施形態は、複製、腫瘍溶解、及びＶＳＶウイルスの産生が、少なくとも２つの複製欠損性の相互補完的なベクターに感染した細胞内のみで行われることを確実にするベクター系を提供する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質（例えば、ウイルスコートタンパク質またはコア遺伝物質）は、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、または両方のウイルス型から得られる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡウイルスは一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡウイルス、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡウイルス、またはｓｓＤＮＡ領域及びｄｓＤＮＡ領域の両方を含むＤＮＡウイルスである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡウイルスは一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルスまたは二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態では、ｓｓＲＮＡウイルスはさらに、ポジティブセンスＲＮＡウイルスまたはネガティブセンスＲＮＡウイルスに分類される。
【００５７】
場合によっては、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質は、以下の科：Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｌｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｌａｃｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｆａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｎｄｏｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＴｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅのいずれか１つのｄｓＤＮＡウイルスから得られる。
【００５８】
いくつかの場合では、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質は、以下の科：Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＳｐｉｒａｖｉｒｉｄａｅのいずれか１つのｓｓＤＮＡウイルスから得られる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質は、ｓｓＤＮＡ領域及びｄｓＤＮＡ領域の両方を含むＤＮＡウイルスから得られる。いくつかの場合では、ＤＮＡウイルスはプレオリポウイルス（ｐｌｅｏｌｉｐｏｖｉｒｕｓ）群に由来する。いくつかの場合では、プレオリポウイルスには、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｃａ多形性ウイルス１、Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍ多形性ウイルス１、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ多形性ウイルス１、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ多形性ウイルス２、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ多形性ウイルス３、またはＨａｌｏｒｕｂｒｕｍ多形性ウイルス６が含まれる。
【００６０】
いくつかの場合では、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質は、以下の科：Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｅｎｄｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｇａｖｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、ＲｏｔａｖｉｒｕｓまたはＴｏｔｉｖｉｒｉｄａｅのいずれか１つのｄｓＲＮＡウイルスから得られる。
【００６１】
場合によっては、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質は、以下の科：Ａｌｐｈａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｐｈａｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｖｅｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｅｔａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｒｍｏｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｇａｍｍａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｆｌａｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｓｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｅｒｍｕｔｏｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｅｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｙｍｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＶｉｒｇａｖｉｒｉｄａｅのいずれか１つのポジティブセンスｓｓＲＮＡウイルスから得られる。
【００６２】
いくつかの場合では、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質は、以下の科：Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｙａｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｐｈｉｏｖｉｒｉｄａｅ、またはＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅのいずれか１つのネガティブセンスｓｓＲＮＡウイルスから得られる。
【００６３】
場合によっては、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質は、正二十面体または複雑なカプシド対称性を備えた腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスから得られる。いくつかの場合では、正二十面体の腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスは裸であるか、またはエンベロープを含む。腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスの例示的な科としては、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、３６〜３８ｋｂのゲノムサイズを有するアデノウイルス）、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（例えば、１２０〜２００ｋｂのゲノムサイズを有するＨＳＶ１）、及びＰｏｘｖｉｒｉｄａｅ（例えば、１３０〜２８０ｋｂのゲノムサイズを有するワクシニアウイルス及び粘液腫ウイルス）が挙げられる。
【００６４】
いくつかの場合では、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質は、正二十面体またはらせん状のカプシド対称性を有するものを含む、腫瘍溶解性ＲＮＡウイルスから得られる。いくつかの場合では、正二十面体の腫瘍溶解性ウイルスはエンベロープがなく裸であり、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、２２〜２７ｋｂのゲノムを有するレオウイルス）及びＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、７．２〜８．４ｋｂのゲノムサイズを有するポリオウイルス）を含む。他の場合では、らせん状の腫瘍溶解ＲＮＡウイルスは包被されており、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、１３〜１６ｋｂのゲノムサイズを有するＶＳＶ）、及びＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、１６〜２０ｋｂのゲノムサイズを有するＭＶ及びＮＤＶ）を含む。
【００６５】
場合によっては、偽型腫瘍溶解性ウイルスを産生するための遺伝物質は、エーベルソン白血病ウイルス、エーベルソンマウス白血病ウイルス、エーベルソンウイルス、急性喉頭気管支炎ウイルス、アデレードリバーウイルス、アデノ随伴ウイルス群、アデノウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、アフリカブタコレラウイルス、ＡＩＤＳウイルス、アリューシャンミンク病パルボウイルス、アルファレトロウイルス、アルファウイルス、ＡＬＶ関連ウイルス、アマパリウイルス、アフタウイルス、アクアレオウイルス、アルボウイルス、アルボウイルスＣ、アルボウイルスＡ群、アルボウイルスＢ群、アレナウイルス属、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルテリウイルス、アストロウイルス、クモザルヘルペスウイルス属、オーエスキー病ウイルス、アウラウイルス、アウスダック（Ａｕｓｄｕｋ）疾患ウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、アビアデノウイルス、トリ赤芽球症ウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、トリ２３ａｐｕｌｏｓｅウイルス、トリリンパ腫症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリパラミクソウイルス、トリ肺脳炎ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、トリＣ型レトロウイルス属、アビヘパドナウイルス、アビポックスウイルス、Ｂウイルス、Ｂ１９ウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス、ヒヒヘルペスウイルス、バキュロウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、ベリマー（Ｂｅｒｒｉｍａｈ）ウイルス、ベータレトロウイルス、ビルナウイルス、ビットナーウイルス、ＢＫウイルス、ブラッククリークカナルウイルス、ブルータングウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、ボルナ（Ｂｏｍａ）病ウイルス、ヒツジボーダー病ウイルス、ボルナウイルス、ウシアルファヘルペスウイルス１、ウシアルファヘルペスウイルス２、ウシコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ２３ａｐｕｌｏｓｅウイルス、ウシ乳頭炎ウイルス、ウシパピローマウイルス、ウシ２３ａｐｕｌｏｓ口内炎ウイルス、ウシパルボウイルス、ウシ合胞体ウイルス、ウシＣ型オンコウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、バギークリークウイルス、弾丸型ウイルス群、ブンヤムウェラウイルス超群、ブニヤウイルス、バーキットリンパ腫ウイルス、ブワンバ熱、ＣＡウイルス、カリシウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクダ痘ウイルス、カナリア痘瘡ウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌ微小ウイルス、イヌパルボウイルス、カノデルガジト（Ｃａｎｏ  Ｄｅｌｇａｄｉｔｏ）ウイルス、ヤギ関節炎ウイルス、ヤギ脳炎ウイルス、ヤギヘルペスウイルス、ヤギポックスウイルス、カルジオウイルス、テンジクネズミ科ヘルペスウイルス１、オナガザル科ヘルペスウイルス１、オナガザルヘルペスウイルス１、オナガザルヘルペスウイルス２、チャンディプラウイルス、チャングイノラウイルス、ブチナマズウイルス、チャールビルウイルス、水痘ウイルス、チクングニアウイルス、チンパンジーヘルペスウイルス、チャブレオウイルス、シロザケウイルス、球菌ウイルス、ギンザケレ���ウイルス、媾疹ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、コルティウイルス、コロンビアＳＫウイルス、感冒ウイルス、伝染性膿瘡ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、コロナウイルス、コリパルタウイルス、コリーザウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、ＣＰＶ（細胞質多角体病ウイルス）、コオロギ麻痺ウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、クループ随伴ウイルス、クリプトウイルス、サイポウイルス、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス群、細胞質多角体病ウイルス、シカパピローマウイルス、デルタレトロウイルス、デング熱ウイルス、デンソウイルス、ディペンドウイルス、ドーリウイルス、ディプロマ（ｄｉｐｌｏｍａ）ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、アヒル肝炎ウイルス１、アヒル肝炎ウイルス２、デュオウイルス（ｄｕｏｖｉｒｕｓ）、ドゥベンヘイジウイルス、チヂレバネウイルスＤＷＶ、東部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ＥＢウイルス、エボラウイルス、エボラ様ウイルス、エコーウイルス、エコーウイルス、エコーウイルス１０、エコーウイルス２８、エコーウイルス９、エクトロメリアウイルス、ＥＥＥウイルス、ＥＩＡウイルス、ＥＩＡウイルス、脳炎ウイルス、脳心筋炎群ウイルス、脳心筋炎ウイルス、エンテロウイルス、酵素上昇ウイルス、酵素上昇ウイルス（ＬＤＨ）、流行性出血性ウイルス、家畜流行性出血病ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ウマアルファヘルペスウイルス１、ウマアルファヘルペスウイルス４、ウマヘルペスウイルス２、ウマ流産ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマ脳症ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ウマモルビリウイルス、ウマ鼻肺炎ウイルス、ウマライノウイルス、ユーベナンジー（Ｅｕｂｅｎａｎｇｕ）ウイルス、ヨーロッパヘラジカパピローマウイルス、ヨーロッパブタコレラウイルス、エバーグレーズウイルス、アイアッハウイルス、ネコヘルペスウイルス１、ネコカリチウイルス、ネコ線維肉腫ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコ白血病／肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコ合胞体ウイルス、フィロウイルス、フランダーズウイルス、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、フォートモーガンウイルス、フォーコーナーズハンタウイルス、トリアデノウイルス１、鶏痘ウイルス、フレンドウイルス、ガンマレトロウイルス、ＧＢ肝炎ウイルス、ＧＢウイルス、ドイツ風疹ウイルス、ゲタウイルス、テナガザル白血病ウイルス、腺熱ウイルス、ヤギ痘ウイルス、ゴールデン２４ａｐｕｌｏウイルス、ゴノメタ（Ｇｏｎｏｍｅｔａ）ウイルス、ガチョウパルボウイルス、顆粒病ウイルス、グロスウイルス、地リスＢ型肝炎ウイルス、Ａ群アルボウイルス、グアナリトウイルス、モルモットサイトメガロウイルス、モルモットＣ型ウイルス、ハンターンウイルス、ハンタウイルス、ハマグリレオウイルス、野ウサギ線維腫ウイルス、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、赤血球吸着ウイルス２、センダイウイルス、出血熱ウイルス、２４ａｐｕｌｏウイルス、ヘニパウイルス、ヘパドナウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ���肝炎ウイルス群、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｆ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス、肝炎ウイルス、肝炎ウイルス（非ヒト）、肝脳脊髄炎（ｈｅｐａｔｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）レオウイルス３、ヘパトウイルス、サギＢ型肝炎ウイルス、ヘルペスＢウイルス、単純ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルス７、ヘルペスウイルスａｔｅｌｅｓ、ヘルペスウイルスｈｏｍｉｎｉｓ、ヘルペスウイルス感染症、ヘルペスウイルスｓａｉｍｉｒｉ、ヘルペスウイルスｓｕｉｓ、ヘルペスウイルスｖａｒｉｃｅｌｌａｅ、ハイランドＪウイルス、ヒラメラブドウイルス、ブタコレラウイルス、ヒトアデノウイルス２、ヒトアルファヘルペスウイルス１、ヒトアルファヘルペスウイルス２、ヒトアルファヘルペスウイルス３、ヒトＢリンパ球向性ウイルス、ヒトベータヘルペスウイルス５、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス群、ヒトフォーミーウイルス、ヒトガンマヘルペスウイルス４、ヒトガンマヘルペスウイルス６、ヒトＡ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス１群、ヒトヘルペスウイルス２群、ヒトヘルペスウイルス３群、ヒトヘルペスウイルス４群、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス８、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒト免疫不全ウイルス２、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩ、ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩ、ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩＩ、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス２型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩ、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩＩ、イクノウイルス、乳児胃腸炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、インフルエンザウイルスＤ、インフルエンザウイルスｐｒ８、昆虫イリデッセントウイルス、昆虫ウイルス、イリドウイルス、日本Ｂウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ケメロボウイルス、キルハムラットウイルス、クラマスウイルス、コロンゴ（Ｋｏｌｏｎｇｏ）ウイルス、朝鮮出血熱ウイルス、クンバ（ｋｕｍｂａ）ウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、キジラガ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス、ラクロスウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ラングールウイルス、ラピーヌパルボウイルス、ラッサ熱ウイルス、ラッサウイルス、潜伏性ラットウイルス、ＬＣＭウイルス、リーキー（Ｌｅａｋｙ）ウイルス、レンチウイルス、レポリポックスウイルス、白血病ウイルス、ロイコウイルス、ランピースキン病ウイルス、リンパ節症関連ウイルス、リンホクリプトウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、リンパ増殖性ウイルス群、マチュポウイルス、狂掻痒症ウイルス、哺乳類Ｂ型オンコウイ���ス群、哺乳類Ｂ型レトロウイルス、哺乳類Ｃ型レトロウイルス群、哺乳類Ｄ型レトロウイルス、乳癌ウイルス、マプエラウイルス、マールブルグウイルス、マールブルグ様ウイルス、マソンファイザーサルウイルス、マストアデノウイルス、マヤロウイルス、ＭＥウイルス、麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）ウイルス、メナングルウイルス、メンゴウイルス、メンゴウイルス、ミデルブルフウイルス、ミルカー結節ウイルス、ミンク腸炎ウイルス、マウス微小ウイルス、ＭＬＶ関連ウイルス、ＭＭウイルス、モコラウイルス、モラシポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サルＢウイルス、サル痘ウイルス、モノネガウイルス目、麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）、マウントエルゴンコウモリウイルス、マウスサイトメガロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、マウスＫウイルス、マウス白血病ウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス微小ウイルス、マウス肺炎ウイルス、マウス灰白髄炎ウイルス、マウスポリオーマウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス痘ウイルス、モザンビークウイルス、ムカンボウイルス、粘膜病ウイルス、ムンプスウイルス、ネズミベータヘルペスウイルス１、ネズミサイトメガロウイルス２、マウスサイトメガロウイルス群、マウス脳脊髄炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、マウス白血病ウイルス、マウス小結節誘発ウイルス、マウスポリオーマウイルス、マウス肉腫ウイルス、ムロメガロウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、粘液腫ウイルス、ミクソウイルス、多形性ミクソウイルス、ミクソウイルスパロティティディス（ｐａｒｏｔｉｔｉｄｉｓ）、ナイロビヒツジ病ウイルス、ナイロウイルス、ナニルナウイルス（Ｎａｎｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、ナリバ（Ｎａｒｉｖａ）ウイルス、ンデュモ（Ｎｄｕｍｏ）ウイルス、ニースリング（Ｎｅｅｔｈｌｉｎｇ）ウイルス、ネルソンベイウイルス、向神経性ウイルス、新世界アレナウイルス、新生児肺臓炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、非細胞病原性ウイルス、ノーウォークウイルス、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）、ニップルネック（ｎｉｐｐｌｅ  ｎｅｃｋ）ウイルス、オニョンニョンウイルス、オケルボ（Ｏｃｋｅｌｂｏ）ウイルス、腫瘍ウイルス、腫瘍ウイルス様粒子、オンコルナウイルス、オルビウイルス、オルフウイルス、オロポーシェウイルス、オルソヘパドナウイルス、オルトミクソウイルス、オルソポックスウイルス、オ
ルソレオウイルス、オルンゴ、ヒツジパピローマウイルス、ヒツジカタル熱ウイルス、ヨザルヘルペスウイルス、パリアムウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルスｓｙｌｖｉｌａｇｉ、パポバウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、パラミクソウイルス、パラポックスウイルス、パラワクシニアウイルス、パルボウイルス、パルボウイルスＢ１９、パルボウイルス群、ペスチウイルス、フレボウイルス、アザラシジステンパーウイルス、ピコドナウイルス、ピコルナウイルス、ブタサイトメガロウイルス−鳩痘ウイルス、ピリウイルス、ピクスナウイルス、マウス肺炎ウイルス、ニューモウイルス、灰白髄炎ウイルス、ポリオウイルス、ポリドナウイルス、多角体ウイルス、ポリオーマウイルス、ポリオーマウイルス、ポリオーマウイルスｂｏｖｉｓ、ポリオーマウイルスｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉ、ポリオーマウイルスｈｏｍｉｎｉｓ２、ポリオーマウイルスｍａｃｃａｃａｅ１、ポリオーマウイルスｍｕｒｉｓ１、ポリオーマウイルスｍｕｒｉｓ２、ポリオーマウイルスｐａｐｉｏｎｉｓ１、ポリオーマウイルスｐａｐｉｏｎｉｓ２、ポリオーマウイルスｓｙｌｖｉｌａｇｉ、ポンジン（Ｐｏｎｇｉｎｅ）ヘルペスウイルス１、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタＣ型ウイルス、ポックスウイルス、ポックスウイルス、ポックスウイルスｖａｒｉｏｌａｅ、プロスペクトヒルウイルス、プロウイルス、偽牛痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、オウム痘ウイルス、ウズラ痘ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、ウサギ腎臓空胞形成ウイルス、ウサギパピローマウイルス、狂犬病ウイルス、アライグマパルボウイルス、アライグマ痘ウイルス、ラニケットウイルス、ラットサイトメガロウイルス、ラットパルボウイルス、ラットウイルス、ローシャーウイルス、組換えワクシニアウイルス、組換えウイルス、レオウイルス、レオウイルス１、レオウイルス２、レオウイルス３、爬虫類Ｃ型ウイルス、呼吸器感染症ウイルス、呼吸系発疹ウイルス、呼吸器ウイルス、細網内皮症ウイルス、ラブドウイルス、ラブドウイルスｃａｒｐｉａ、ラジノウイルス、ライノウイルス、リジディオウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ライリーウイルス、牛疫ウイルス、ＲＮＡ腫瘍ウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルス、麻疹（ｒｏｕｇｅｏｌｅ）ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、風疹ウイルス、麻疹（ｒｕｂｅｏｌａ）ウイルス、ルビウイルス、ロシア秋脳炎ウイルス、ＳＡ１１シミアンウイルス、ＳＡ２ウイルス、サビアウイルス、サギヤマウイルス、サイミリヘルペスウイルス１、唾液腺ウイルス、サシチョウバエ熱ウイルス群、サンジンバ（Ｓａｎｄｊｉｍｂａ）ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＳＤＡＶ（唾液腺涙腺炎ウイルス）、アザラシ痘ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ソウルウイルス、ヒツジ痘ウイルス、ショープ線維腫ウイルス、ショープ乳頭腫ウイルス、サルフォーミーウイルス、サルＡ型肝炎ウイルス、サルヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、サルＴ細胞リンパ増殖性ウイルス、シミアンウイルス、シミアンウイルス４０、シンプレックスウイルス、シンノンブルウイルス、シンドビスウイルス、痘瘡ウイルス、南米出血熱ウイルス、スズメ痘ウイルス、スプーマウイルス、リス線維腫ウイルス、リスザルレトロウイルス、ＳＳＶ１ウイルス群、ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球向性ウイルス）Ｉ型、ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球向性ウイルス）ＩＩ型、ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球向性ウイルス）ＩＩＩ型、口内炎２７ａｐｕｌｏｓｅウイルス、顎下ウイルス、ブタアルファヘルペスウイルス１、ブタヘルペスウイルス２、スイポックスウイルス、沼地熱ウイルス、ブタ痘ウイルス、スイスマウス白血病ウイルス、ＴＡＣウイルス、タカリベ複合ウイルス、タカリベウイルス、タナ痘ウイルス、タテラポックスウイルス、テンチレオウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、タイラーウイルス、トゴトウイルス、トッタパラヤンウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ティオマンウイルス、トガウイルス、トロウイルス、腫瘍ウイルス、ツパイウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、シチメンチョウ痘ウイルス、Ｃ型レトロウイルス、Ｄ型オンコウイルス、Ｄ型レトロウイルス群、潰瘍性疾患ラブドウイルス、ウナウイルス、ウークニエミウイルス群、ワクシニアウイルス、空胞ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、バリセロウイルス、バリコラ（Ｖａｒｉｃｏｌａ）ウイルス、天然痘メジャーウイルス、痘瘡ウイルス、ウアシン・ギシュー病ウイルス、ＶＥＥウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ベシクロウイルス、ヴィリュイスクウイルス、クサリヘビレトロウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、ビスナマエディウイルス、ビスナウイルス、ハタネズミ痘ウイルス、ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）、ウォーラルウイルス、ウォリゴウイルス、疣贅ウイルス、ＷＥＥウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ワタロアウイルス、冬季嘔吐ウイルス、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス、ウーリーサル肉腫ウイルス、創傷腫瘍ウイルス、ＷＲＳＶウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバウイルス、ヤタポックスウイルス、黄熱病ウイルス、及びヤグボグダノバク（Ｙｕｇ  Ｂｏｇｄａｎｏｖａｃ）ウイルスなどのウイルスから得られる。
【００６６】
偽型腫瘍溶解性ウイルスの生成方法
場合によっては、本明細書に記載の偽型腫瘍溶解性ウイルスは、当技術分野で周知の方法を使用して生成される。場合によっては、方法は、１つ以上のトランスフェクション工程及び１つ以上の感染工程を含む。場合によっては、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、または植物細胞株などの細胞株を本明細書に記載の偽型腫瘍溶解性ウイルスに感染させて、１つ以上のウイルスを産生する。例示的な哺乳動物細胞株としては、２９３Ａ細胞株、２９３ＦＴ細胞株、２９３Ｆ細胞、２９３Ｈ細胞、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）Ｔ−ＲＥｘ（商標）２９３細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−２９３細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−３Ｔ３細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＢＨＫ細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＣＨＯ細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−ＣＶ−１細胞株、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−Ｊｕｒｋａｔ細胞株、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ−Ｓ細胞、ＧｒｉｐＴｉｔｅ（商標）２９３ＭＳＲ細胞株、ＧＳ−ＣＨＯ細胞株、ＨｅｐａＲＧ（商標）細胞、Ｔ−ＲＥｘ（商標）Ｊｕｒｋａｔ細胞株、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞株、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＣＨＯ細胞株、Ｔ−ＲＥｘ（商標）−ＨｅＬａ細胞株、３Ｔ６、Ａ５４９、Ａ９、ＡｔＴ−２０、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、ＢＨＫ−２１、ＢＨＬ−１００、ＢＴ、Ｃａｃｏ−２、Ｃｈａｎｇ、Ｃｌｏｎｅ  ９、Ｃｌｏｎｅ  Ｍ−３、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−３、ＣＯＳ−７、ＣＲＦＫ、ＣＶ−１、Ｄ−１７、Ｄａｕｄｉ、ＧＨ１、ＧＨ３、Ｈ９、ＨａＫ、ＨＣＴ−１５、ＨＥｐ−２、ＨＬ−６０、ＨＴ−１０８０、ＨＴ−２９、ＨＵＶＥＣ、Ｉ−１０、ＩＭ−９、ＪＥＧ−２、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｋ−５６２、ＫＢ、ＫＧ−１、Ｌ２、ＬＬＣ−ＷＲＣ  ２５６、ＭｃＣｏｙ、ＭＣＦ７、ＶＥＲＯ、ＷＩ−３８、ＷＩＳＨ、ＸＣ、またはＹ−１が挙げられる。例示的な昆虫細胞株としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞、またはｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞が挙げられる。例示的な植物細胞株としては、例えば、Ｐｈａｅｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｏｕｃｈｅｔｉｉなどの藻類細胞が挙げられる。
【００６７】
偽型腫瘍溶解性ベクターなどの組換え腫瘍溶解性ベクター及びベクターコンストラクトの大規模生成のために、当業者に既知の任意の方法が使用される。例えば、マスターシードストック及びワーキングシードストックは、適格な初代ＣＥＦにおいてＧＭＰ条件下で調製され得るか、または他の方法によって調製され得る。場合によっては、細胞を表面積の大きなフラスコにプレーティングし、コンフルエント近くまで増殖させ、選択したＭＯＩで感染させる。次に、産生されたウイルスは精製され得る。いくつかの場合では、細胞は採取され、細胞内のウイルスは機械的破壊によって放出される。いくつかの実施形態では、細胞デブリは孔の大きなデプスろ過により除去され、及び／または宿主細胞ＤＮＡはエンドヌクレアーゼで消化される。いくつかの場合では、ウイルス粒子は続いてタンジェンシャルフローろ過と、それに続くダイアフィルトレーションによって精製及び濃縮される。得られた濃縮されたウイルスを、１つ以上の安定剤を含有する緩衝液で希釈して製剤化し、バイアルに充填して凍結乾燥することができる。組成物及び製剤は、後の使用のために保存することができる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥されたウイルスは、１つ以上の希釈剤を添加することにより再溶解される。
【００６８】
マイクロＲＮＡ減弱型腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の標的配列がウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された、腫瘍溶解性ウイルスを提供する。用語「マイクロＲＮＡ」及び「ｍｉＲＮＡ」及び「ｍｉＲ」は、本明細書において互換的に使用され、その標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解または翻訳抑制のために誘導することにより遺伝子発現を制御する、内因性の小さなノンコーディングＲＮＡを指す。ｍｉＲは、複数のがん種を含む広範な病態において、差次的に発現する。いくつかの態様では、特定のがん種またはがん組織のがん細胞は、非がん性対照細胞と比較して、ｍｉＲの差次的発現を示す。本明細書で使用する場合、用語「ｏｎｃｏｍｉＲ」は発がん、悪性転換、及び／または転移に（正または負のいずれかで）関係するｍｉＲを指す。いくつかの態様では、特定のｏｎｃｏｍｉＲの発現レベルは、特定のがんの発生または維持に関係している。このようなｍｉＲは、本明細書において、「がん促進性ｍｉＲ」と称される。いくつかの実施形態では、特定のｏｎｃｏｍｉＲの発現は、発がん及び／または転移の予防及び／または遅延に関係している。このようなｏｎｃｏｍｉＲは、その発現ががんの発生を予防または抑制することから、本明細書において「腫瘍抑制ｍｉＲ」または「腫瘍抑制性ｍｉＲ」と称される。
【００６９】
本発明の一態様は、ウイルス複製に必要な１つ以上のウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された１つ以上の腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡ標的配列のコピーを複数含む、組換え腫瘍溶解性ウイルス（またはウイルスベクター）を含む。特定の実施形態では、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個のウイルス複製に必要なウイルス遺伝子の遺伝子座に挿入された、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。正常（非がん性）細胞で発現する腫瘍抑制ｍＲＮＡは、このような標的配列に結合し、ｍｉＲＮＡ標的配列を含有するウイルス遺伝子の発現を抑制することができ、これにより、健康な非がん性細胞におけるウイルス複製が制限される。このような組換え腫瘍溶解性ウイルス及び／またはベクターは、腫瘍抑制性ｍｉＲを発現しない細胞またはその発現が低下している細胞と比較して、組み込まれた腫瘍抑制性ｍｉＲ標的配列に結合することができる腫瘍抑制性ｍｉＲを発現する細胞において、ウイルス複製の減少または減弱をもたらすことから、本明細書において「ｍｉＲ減弱型」または「複製制限型」と称される。ウイルス複製に必要な重要な遺伝子に腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡを組み込むことによって、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡを発現している正常二倍体細胞においてはウイルス複製を条件的に抑制することができ、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡを発現していない細胞においてはウイルス複製は正常に進行し得る。このような実施形態では、健康な非がん性細胞は、正常細胞から、組換えウイルスベクターによる感染の溶解作用から保護される。例示的なｍｉＲ減弱型腫瘍溶解性ウイルスは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１３２５５２号に記載されており、これは、参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−２１９ａ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３７８ｇ、ｍｉＲ−３７８ｉ、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−８８５、ｍｉＲ−１２４７−５ｐ、またはｍｉＲ−４２８４のための１つ以上の標的配列。
【００７０】
エンゲージャー分子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスはエンゲージャー分子、例えばエンゲージャーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。本発明のエンゲージャー分子は、それぞれが異なる細胞表面分子に結合することができる少なくとも２つのドメインを含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は二部分ポリペプチド（すなわち、それぞれが異なる細胞表面分子に結合する２つのドメインを含む）である。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は三部分ポリペプチドまたは多部分ポリペプチド（すなわち、それぞれが異なる細胞表面分子に結合する３つ以上のドメインを含む）である。そのような実施形態では、エンゲージャー分子は、１つ以上のエフェクタードメイン及び１つ以上の活性化ドメインまたは標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、１つ以上の二量体化ドメインまたは三量体化ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、（ｉ）エフェクタードメイン、（ｉｉ）活性化ドメインまたは標的化ドメイン、及び（ｉｉｉ）追加のドメイン、例えば追加のエフェクタードメイン、追加の活性化ドメイン、追加の標的化ドメイン、治療用分子ドメイン（例えば、以下に記載されるサイトカイン、共刺激ドメイン、免疫チェックポイント阻害剤、または抗血管新生因子）、またはそれらの組み合わせを含む三部分ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、エンゲージャーは第１のポリペプチドであり、１つ以上の他のドメイン、例えば、サイトカイン、共刺激ドメイン、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を阻害するドメインのうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせを有する第２のポリペプチドと共に、腫瘍溶解性ウイルス内に提供される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、同一のベクター（例えば、ウイルスベクター）にコードされる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、異なるベクター（例えば、ウイルスベクター）にコードされる。特定の実施形態では、サイトカインはＩＬ−１５、ＩＬ−２、及び／またはＩＬ−７である。他の特定の実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７である。他の特定の実施形態では、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を阻害するドメインは、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、またはＢ７−Ｈ４である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明のエンゲージャー分子は、次のフォーマット：ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎヘテロダイマー（２＋１）、Ｆｃ−ＤＡＲＴ、Ａｚｙｍｅｒｔｒｉｃ（商標）二重特異性抗体、Ｂｉｎａｎｂｏｄｙ、ｍｕｌｔｉ−ＤＡＲＰｉｎ、抗体、抗体ドメイン、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）、Ｔａｎｄａｂ、ダイアボディ、フレキシボディ、ドック・アンド・ロック抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＢｉＴＥ、ＤｕｏＢｏｄｙ、Ｆｃ改変ＩｇＧ、Ｆｃａｂ、Ｍａｂ２、またはＤＡＲＴポリペプチドのうちの１つである。
【００７３】
いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は抗体またはその抗原結合断片（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆｖ、ミニボディまたはダイアボディ）を含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、三機能性抗体、Ｆａｂ２、二重特異性ｓｃＦｖ、例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二価ミニボディ、二重特異性ダイアボディ、ＤｕｏＢｏｄｙまたはＭａｂ２である。特定の実施形態では、エンゲージャー分子は二部分Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）または三部分Ｔ細胞エンゲージャー（ＴｉＴＥ）である。いくつかの実施形態では、これらの抗体由来の断片または誘導体は、化学的、生化学的、または分子生物学的方法によって改変され得る。場合によっては、本明細書に記載のエンゲージャー分子の構築に使用される抗体またはそれらの抗原結合断片は、ヒト化されたコンストラクトまたは脱免疫化されたコンストラクトである。ポリペプチド、特に抗体コンストラクトのヒト化及び／または脱免疫化のための方法は当業者に周知である。対応する方法は当該技術分野において周知かつ記載されており、特に、実験マニュアルに記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８９  ａｎｄ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１、Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、Ｇｏｌｅｍｉｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００２を参照のこと）。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子のドメインは、リガンド、ペプチド、細胞表面受容体を認識しそれと相互作用するペプチドを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子の２つ以上のドメインは、リンカーによって連結されている。場合によっては、リンカーは任意の適切な長さであり、そのようなパラメータは常に当該技術分野において最適化されている。例えば、リンカーは、各ドメインが互いに独立して、その差次的な結合特異性を保持できることを保証するのに十分な長さ及び配列である。用語「ペプチドリンカー」は、定義されたコンストラクトの第１のドメイン及び第２のドメインのアミノ酸配列が共に連結されるアミノ酸配列を指す。場合によっては、そのようなペプチドリンカーの１つの技術的特徴は、当該ペプチドリンカーがあらゆる重合活性を含まず、及び／または二次構造の形成を促進しないことである。そのようなペプチドリンカーは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１−３０）、及びＲａａｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３−８０）に記載されている。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドリンカーは、５個未満のアミノ酸、４個未満のアミノ酸、３個未満のアミノ酸、２個未満のアミノ酸、または１個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは単一アミノ酸リンカーである。そのような実施形態では、単一アミノ酸は、典型的にはグリシン（Ｇｌｙ）である。いくつかの実施形態では、いかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。融合され作動可能に連結されたコンストラクトを調製するための方法及びそれらの哺乳動物細胞または細菌細胞における発現は、当該技術分野において周知である（例えば、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４４４０号、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．１９８９  ａｎｄ  １９９４、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと）。
【００７５】
いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、２つの抗体由来の結合ドメインを含む一本鎖二重特異性抗体コンストラクトである。このような実施形態では、結合ドメインのうちの１つが、第１の細胞表面分子と特異的に結合／相互作用できる抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域（またはそれらの部分）を含み、ならびに第２の結合ドメインが、第２の細胞表面分子と特異的に結合／相互作用できる抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域（またはそれらの部分）を含む。特定の実施形態では、２つの抗体由来の結合ドメインはそれぞれ、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、特にＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖二重特異性抗体コンストラクトはダイアボディである。いくつかの実施形態では、一本鎖二重特異性抗体コンストラクトは一本鎖二重特異性ｓｃＦｖであり、２つのｓｃＦｖはペプチドまたはリンカー配列によって連結されている。いくつかの実施形態では、一本鎖二重特異性ｓｃＦｖは、細胞からの分泌を可能にするシグナルペプチドをさらに含む。二重特異性一本鎖分子は当該技術分野で周知であり、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４４４０号、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，（１９９７），４５，１９３−１９７、Ｌｏｆｔｉｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３、及びＢｒｕｈｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６に記載されている。
【００７６】
いくつかの実施形態では、一本鎖二重特異性ｓｃＦｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの分子フォーマットは、シグナルペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号２または配列番号４のシグナル配列）に続いて、それぞれが共に連結した１つのＶＨ鎖及び１つのＶＬ鎖を含む２つ以上のｓｃＦｖ領域（例えば、第１のｓｃＦｖ及び第２のｓｃＦｖ）を含む。特定の実施形態では、２つ以上の抗体由来の領域はｓｃＦｖであり、ペプチドリンカーで連鎖され、一本鎖二重特異性ｓｃＦｖコンストラクトを形成する。いくつかの実施形態では、二重特異性ｓｃＦｖは、タンデムｂｉ−ｓｃＦｖまたはダイアボディである。一本鎖二重特異性ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、以下のものを含む様々なフォーマットで配列され得る。ここで、「Ｌ」はリンカーである：ＶＨ１−Ｌ−ＶＬ１−Ｌ−ＶＨ２−Ｌ−ＶＬ２、ＶＬ１−Ｌ−ＶＨ１−Ｌ−ＶＨ２−Ｌ−ＶＬ２、ＶＨ１−Ｌ−ＶＬ１−Ｌ−ＶＬ２−Ｌ−ＶＨ２、ＶＬ１−Ｌ−ＶＨ１−Ｌ−ＶＬ２−Ｌ−ＶＨ２、ＶＨ２−Ｌ−ＶＬ２−Ｌ−ＶＨ１−Ｌ−ＶＬ１、ＶＬ２−Ｌ−ＶＨ２−Ｌ−ＶＨ１−Ｌ−ＶＬ１、ＶＨ２−Ｌ−ＶＬ２−Ｌｙ−ＶＬ１−Ｌ−ＶＨ１、ＶＬ２−Ｌ−ＶＨ２−Ｌ−ＶＬ１−Ｌ−ＶＨ１、ＶＨ１−Ｌ−ＶＨ２−Ｌ−ＶＬ２−Ｌ−ＶＬ１、ＶＬ２−Ｌ−ＶＬ１−Ｌ−ＶＨ１−Ｌ−ＶＨ２、ＶＨ２−Ｌ−ＶＨ１−Ｌ−ＶＬ１−Ｌ−ＶＬ２、またはＶＬ１−Ｌ−ＶＬ２−Ｌ−ＶＨ２−Ｌ−ＶＨ１。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明のエンゲージャー分子は、細胞表面分子の特定のコンフォメーション／構造エピトープ（複数可）と特異的に結合／相互作用する。したがって、いくつかの例における特異性は、当該技術分野における既知の方法ならびに本明細書に開示及び記載の方法によって、実験的に決定される。そのような方法には、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射性免疫沈降法（ＲＩＰ）、電気化学発光（ＥＣＬ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及びペプチドスキャンが含まれるがこれらに限定されない。
【００７８】
いくつかの実施形態では、エンゲージャーポリペプチドは、エフェクタードメイン及び標的化ドメインまたは活性化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、各ドメインはＮ末端からＣ末端までの任意の順序で存在する。例えば、いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、Ｎ末端エフェクタードメイン及びＣ末端標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、Ｎ末端標的化ドメイン及びＣ末端エフェクタードメインを含み得る。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、Ｎ末端エフェクタードメイン及びＣ末端活性化ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、Ｎ末端活性化ドメイン及びＣ末端エフェクタードメインを含み得る。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、標的細胞上の複数の抗原の標的化が可能となるように、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）の標的化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）のエフェクタードメインを含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）の活性化ドメインを含む。本開示のいくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、タグまたは標識などの、組換えにより生成されたコンストラクトの単離及び／または調製のための追加のドメインを含む。タグまたは標識は、ヒスチジンタグ（配列番号１２）などの短いペプチド配列であり得、または蛍光標識もしくは放射性標識などの画像化が可能なタグもしくは標識であり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、エンゲージャーポリペプチドは、エフェクタードメイン及び標的化ドメインまたは活性化ドメインを含む。「エフェクタードメイン」は、エフェクター細胞の表面に存在する分子を認識し、それに結合する。本明細書で使用する場合、用語「エフェクター細胞」は、標的細胞の死を促進することを含む免疫応答を媒介することができる任意の哺乳動物細胞型を指す。特定の実施形態では、本発明のエフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、顆粒球（例えば、好中球、好塩基球、マスト細胞、もしくは好酸球）、マクロファージ、単球、または樹状細胞などの免疫細胞である。例示的なエフェクター細胞型としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及びマクロファージが挙げられる。当業者は、エフェクター細胞の異なる群が、特定の型の細胞表面分子の発現を共有する場合があるが、エフェクタードメインに認識される細胞表面分子の性質は、エフェクター細胞の性質によって異なり得ることを認識するであろう。例えば、Ｔ細胞はＮＫ細胞またはマクロファージとは異なる表面受容体を発現する。例示的な例として、ＣＤ３はＴ細胞により発現し、ＮＫ細胞またはマクロファージによっては発現しない受容体であり、これに対して、ＣＤ１、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／またはＮＫｐ３０は、Ｔ細胞によっては発現せず、ＮＫ細胞により発現する受容体である。したがって、場合によっては、Ｔ細胞を活性化するエンゲージャー分子は、ＮＫ細胞、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、または他の型のエフェクター細胞を活性化するエンゲージャー分子とは異なるエフェクタードメインを有する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞レパートリーは、Ｔ細胞の多数のサブタイプ、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴｃまたはＣＴＬ）、メモリーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、及び／またはＴｈ２２細胞）、サプレッサーＴ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ））、粘膜関連インバリアントＴ細胞、及びγδＴ細胞で構成される。場合によっては、あるＴ細胞サブタイプにより発現する１つ以上の表面受容体は、他のＴ細胞サブタイプによっては発現しない。場合によっては、あるＴ細胞サブタイプにより発現する１つ以上の表面受容体は、少なくとも１つの他のＴ細胞サブタイプにより発現する。場合によっては、あるＴ細胞サブタイプにより発現する１つ以上の表面受容体は、通常、すべての、またはほとんどのＴ細胞サブタイプにより発現する。例えば、ＣＤ３はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のシグナル成分であり、複数のＴ細胞サブタイプにおいて発現する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＴ細胞であり、エンゲージャー分子のエフェクタードメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εもしくはＣＤ３ξ）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５７、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ９６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ２７８及び／またはＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４としても知られる）の１つ以上の成分に結合する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＮＫＴ細胞であり、エンゲージャー分子のエフェクタードメインは１つ以上のＣＤ３またはインバリアントＴＣＲの成分に結合する。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＮＫ細胞であり、エンゲージャー分子のエフェクタードメインは、ＣＤ１６、ＣＤ９４／ＮＫＧ２（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、またはキラー活性化受容体（ＫＡＲ）に結合する。リンパ球上に発現することができ、エンゲージャー分子のエフェクタードメインに結合され得るさらなる細胞表面分子には、Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって発現するＣＤ４８が含まれる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞の表面に存在する分子へのエフェクタードメインの結合により、エフェクター細胞の活性化が生じる。いくつかの実施形態では、エフェクター細胞の活性化により、（ｉ）エフェクター細胞の増殖の増加、（ｉｉ）エフェクター細胞の１つ以上の細胞表面タンパク質の発現または活性における変化、（ｉｉｉ）エフェクター細胞によって発現する１つ以上の細胞内タンパク質の発現または活性における変化、（ｉｖ）サイトカイン、ケモカインまたは活性酸素種などの、エフェクター細胞によって産生及び／または分泌される因子の量または性質における変化、（ｖ）エフェクター細胞の形態における変化、（ｖｉ）１つ以上のケモカイン受容体の発現の増加または低下などによる、エフェクター細胞の走化性の潜在能力における変化、（ｖｉｉ）細胞溶解活性の増強及び／または食作用活性の増強などの、エフェクター細胞の機能的活性における変化、及び／または（ｖｉｉｉ）標的細胞に対する細胞毒性の増強、のうちの１つ以上が生じる。エフェクター細胞またはエフェクター細胞集団の活性化は、当該技術分野において既知の任意の手段で測定することができる。例えば、増殖、タンパク質発現、産生、または分泌における変化は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学法、免疫沈降法、または免疫蛍光法によって測定でき、細胞形態における変化は、当該技術分野において既知の様々な種類の顕微鏡検査法によって測定できる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、エンゲージャーポリペプチドは、エフェクタードメイン及び活性化ドメインを含む。エンゲージャー分子の「活性化ドメイン」は、細胞表面に発現するタンパク質に結合し、細胞活性化をもたらす。いくつかの実施形態では、活性化ドメインによって認識される細胞表面タンパク質及びエフェクタードメインによって認識される細胞表面タンパク質は、いずれもエフェクター細胞上に発現する。しかしながら、活性化ドメインによって認識される細胞表面タンパク質は、エフェクタードメインによって認識される細胞表面タンパク質とは異なる。特定の実施形態では、活性化ドメインは、エフェクター細胞機能の負の制御因子（例えば、免疫チェックポイント分子または他の阻害性分子）である細胞表面タンパク質に結合する。活性化ドメインによる標的化のための例示的な細胞表面抗原としては、２Ｂ４、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＡＬ９、ＧＩＴＲ、ＨＡＶＣＲ２、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、ＬＩＧＨＴ、ＭＡＲＣＯ、ＰＳ、ＳＬＡＭ、ＴＩＧＨＴ、ＶＩＳＴＡ、ＶＴＣＮ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ２、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＦＩＴＲ、ＣＤ２７、ＳＬＡＭＦ７、及びＣＤ２００が挙げられる。特定の実施形態では、活性化ドメイン及びエフェクタードメインを含むエンゲージャー分子は、エフェクター細胞の活性化を増強し、それによってエフェクター細胞による１つ以上のバイスタンダー標的細胞の破壊を促進する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、エンゲージャーポリペプチドは、エフェクタードメイン及び標的化ドメインを含む。エンゲージャー分子の「標的化ドメイン」は、標的細胞によって発現する細胞表面分子に結合する。本明細書で使用する場合、用語「標的細胞」は、殺傷、攻撃、破壊、及び／または制御されるべき哺乳動物細胞を指す。特に、標的細胞は、がん細胞、細菌感染細胞、ウイルス感染細胞、真菌感染細胞、及び／または自己免疫性細胞などの、同一の細胞型の正常細胞と比較して何らかの点で変化した細胞である。特定の実施形態では、本発明の標的細胞はがん細胞（例えば、腫瘍細胞）である。いくつかの実施形態では、標的細胞及びエフェクター細胞へのエンゲージャー分子の結合は、エフェクター細胞を標的細胞に近接させ、それによってエフェクター細胞による標的細胞の破壊を容易にする。標的細胞の破壊（すなわち、死）は、（例えば、ＡｎｎｅｘｉｎＶ、ヨウ化プロピジウム、もしくは他の手段による）フローサイトメトリー、細胞計数、及び／または標的細胞の細胞形態を判定するための顕微鏡検査法などの当該技術分野において既知の任意の方法により判定することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子の標的化ドメインは、標的化ドメインと標的細胞によって発現する表面抗原（例えば、標的細胞抗原）との相互作用を介して、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）をエフェクター細胞付近へと導く。いくつかの実施形態では、標的細胞抗原は腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）であり、腫瘍細胞によってのみ発現する。いくつかの実施形態では、標的細胞は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり、腫瘍細胞及び１つ以上の型の正常細胞または非腫瘍細胞によって発現する。いくつかの場合では、ＴＳＡは１つ以上の型の正常細胞または非腫瘍細胞にも存在するが、主に腫瘍細胞によって発現する。場合によっては、腫瘍抗原（例えば、ＴＳＡまたはＴＡＡ）は１つのがん種に存在する。場合によっては、腫瘍抗原は複数のがん種に存在する。一実施形態では、腫瘍抗原は、血液癌細胞上で発現する。別の実施形態では、腫瘍抗原は、固形腫瘍細胞上で発現する。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、神経膠芽腫、非小細胞肺癌、非小細胞肺癌以外の肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、脾臓癌、皮膚癌、神経膠芽腫以外の脳癌、腎臓癌、甲状腺癌などである。より具体的な実施形態では、腫瘍抗原は、個体の腫瘍細胞によって発現する。
【００８６】
特定の実施形態では、エンゲージャー分子の標的化ドメインは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）に特異的に結合する。特定の実施形態では、標的化ドメインは、抗体もしくは抗体断片もしくは抗原結合断片またはそれらの一部、例えば、ＴＡＡまたはＴＳＡに特異的なモノクローナル抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ミニボディ、またはダイアボディを含む。特定の実施形態では、エンゲージャーの標的化ドメインは、ＴＡＡまたはＴＳＡに特異的なｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは、がん細胞上で発現する。一実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは、血液癌細胞上で発現する。別の実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは、固形腫瘍細胞上で発現する。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、神経膠芽腫、非小細胞肺癌、非小細胞肺癌以外の肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、脾臓癌、皮膚癌、神経膠芽腫以外の脳癌、腎臓癌、甲状腺癌などである。より具体的な実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは、個体の腫瘍細胞によって発現する。
【００８７】
例示的な腫瘍抗原（例えば、ＴＳＡまたはＴＡＡ）としては、５Ｔ４、８Ｈ９、ＡＢＣＧ２、アブセントインメラノーマ２（ＡＩＭ２）、アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴ−Ｖ，β１，６−Ν）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン受容体、Ｔ細胞認識抗原（ＡＲＴ）−１、ＡＲＴ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＢＣＭＡ、ＢＭＩ１ポリコーム環フィンガー腫瘍遺伝子（ＢＭＩ１）、ＣＡ−１２５（ＭＵＣ１６としても知られる）、炭酸脱水酵素（ＣＡ）−６、ＣＡ−９（ＣＡＩＸとしても知られる）、カドヘリン、カルシウム結合チロシン−（Ｙ）−リン酸化調節型（ＣＡＢＹＲ）、癌／精巣抗原２（ＣＴＡＧ２）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、カテプシンＢ、カベオリン−１（Ｃａｖ−１）、ＣＣＲ８、ＣＤ１０（ネプリライシン、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、及び共通急性リンパ芽球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）としても知られる）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１５、ＣＤ１７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ４５、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８、ＣＥＡＣＡＭ５、モノクローナル抗体Ｋｉ−６７（Ｋｉ−６７）によって定義される細胞増殖関連ヒト核抗原、ケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）、ＣＤ７４、ＣＳＡＧファミリーメンバー２（ＣＳＡＧ２）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、ＭＣＳＰとしても知られる）、サイクリンＢ、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、システインリッチ分泌タンパク質３（ＣＲＩＳＰ３）、樹状細胞特異的細胞間接着分子３結合ノンインテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ｚｅｓｔｅホモログ２（ＥＺＨ２）エンハンサー、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨ受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）、ＥｐｈＡ２／上皮キナーゼ（ＥｐｈＡ２／Ｅｃｋ）、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮カルシウム依存性接着（Ｅ−カドヘリン）、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＥＲＢＢ３、ＥｒｂＢ３／４、ＥＲＢＢ４、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、遠位上流結合エレメント１（ＦＵＢＰ１）、ＦＡＲ、葉酸結合タンパク質（葉酸受容体α（ＦＲα）を含むＦＢＰ）、フェリチン重ポリペプチド１  精巣特異的発現（ＦＴＨＬ１７）、胎児ＡｃｈＲ、ＦＧＦＲ３、ｆｏｓ関連抗原１（Ｆｒａ−１／Ｆｏｓｌ  １）、Ｇ抗原１（ＧＡＧＥ１）、ガングリオシド／ＧＤ２、ＧＤ３、神経膠腫関連腫瘍遺伝子ホモログ１（Ｇｌｉ１）、糖タンパク質１００（ＧＰ１００）、グリピカン−３、ＧＰＡ３３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｈ６０、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−ＡＩ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ）、ヒトＫｕヘテロ二量体タンパク質サブユニット（ｕ７０／８０）、ヒトＬＩ細胞接着分子（ＬＩＣＡＭ）、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１Ｒ２、ＩＬ−１Ｒα、免疫グロブリン、インテグリン��インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２）、カッパ軽鎖、乳酸脱水素酵素Ｃ（ＬＤＨＣ）、ラムダ軽鎖、ＬＡＭＰ−１（ＣＤ１０７ｂとしても知られる）、レイリン（ＬＡＹＮ）、Ｌｅｕ−７（ＣＤ５７）、ＬｅｕＭ−１、ルイス−Ｙ、ＬＩＶ−１、Ｌｉｖｉｎ（ＢＩＲＣ７としても知られる）、メラノーマ抗原ファミリーＡ（ＭＡＧＥＡ）１、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ４、メラノーマ抗原ファミリーＢ６（ＭＡＧＥＢ６）、Ｔ細胞認識メラノーマ抗原（ＭＡＲＴ−１）、メソテリン、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１（ＭＡＰＫ１）、ムチン（ＭＵＣ）−１、多剤耐性タンパク質３（ＭＲＰ−３）、筋原性分化促進因子−１（ＭｙｏＤ−１）、ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２Ａ（ＮａＰｉ２ａ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、腫瘍壊死領域、ネクチン４、ネスチン、ニューヨーク食道扁平上皮癌１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、ＮＫＧ２Ｄリガンド（マウスＮＫＧＤ２リガンドＲａｅ−１α、Ｒａｅ−１β、Ｒａｅ−１γ、及びＲａｅ−１δ、ならびにヒトＮＫＧ２Ｄリガンド  ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）及びＭＩＣＢ、及びＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、及びＵＬＢＰ６を含む）、ＮＬＲファミリー、抗体Ｋｉ６７（Ｋｉ６７）の核増殖関連抗原、オリゴデンドロサイト転写因子（ＯＬＩＧ２）、がん胎児性フィブロネクチン変異体、ｐ５３、Ｐ−カドヘリン、ＰＤＺ結合キナーゼ（ＰＢ）、Ｐ糖タンパク質、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、プロスペロホメオボックスタンパク質１（ＰＲＯＸ１）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ピリンドメイン含有４（ＮＬＲＰ４）、Ｒａｓ、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ２、ＳＡＲＴ３、性決定領域Ｙボックス（ＳＯＸ）−２、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１１、ＳＬＩＴＲＫ６、核Ｘ連鎖ファミリーメンバーＡ１関連精子タンパク質（ＳＰＡＮＸＡ１）、Ｔ細胞認識扁平上皮癌抗原（ＳＡＲＴ）−１、滑膜肉腫Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）、ＳＳＸ４、ＳＳＸ５、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、テネイシン、精巣特異的１０（ＴＳＧＡ１０）、精巣特異的セリンキナーゼ６（ＴＳＳＫ６）、チログロブリン、ＴＭＥＭ９７、ＴＲＰ−２、ｔｕｂｂｙ様タンパク質（ＴＵＬＰ２）、チロシナーゼ、チロシン関連タンパク（ＴＲＰ）−１、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体（ＵＰＡＲ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ−Ｒ２を含む、ＫＤＲとしても知られる）、ＶＥＧＦ、ウイルスエンベロープタンパク質、ｖ−ｒａｆマウス肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログＢ１（ＢＲＡＦ）、ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ−１）、Ｘ抗原ファミリーメンバー２（ＸＡＧＥ２）、ジンクフィンガータンパク質１６５（ＺＮＦ１６５）、ανβ６  インテグリン、ならびにβ−カテニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）
いくつかの実施形態では、標的抗原は、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２、またＡＲＣＣ２、ＣＴＰＡ、ＣＴＰＰ１、及びＥＣＫとしても知られる）である。ＥＰＨＡ２タンパク質は、タンパク質チロシンキナーゼファミリーのエフリン受容体サブファミリーのメンバーである。このサブファミリーにおける受容体は、通常、単一のキナーゼドメイン及びＣｙｓリッチドメイン及び２つのフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを含む細胞外領域を含み、本開示の抗体の実施形態は、任意のこれらのドメインを標的にする。例示的なヒトＥｐｈＡ２核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００４４３１．５及びＮＭ＿００１３２９０９０．１で提供され、例示的なヒトＥｐｈＡ２ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００４４２２．２及びＮＰ＿００１３１６０１９．１に存在する。
【００８９】
チロシンキナーゼ受容体ファミリーのうち最大のグループであるＥｐｈファミリーは、エフリン（Ｅｐｈ受容体相互作用タンパク質）リガンドに対する配列相同性及び結合親和性により分類される受容体のＥｐｈＡ（ＥｐｈＡ１〜１０）またはＥｐｈＢ（ＥｐｈＢ１〜６）サブクラスから構成される。ヒトＥｐｈＡ２遺伝子は第１染色体に位置し、１３０ｋＤａの見かけの分子量を有する９７６個のアミノ酸の受容体型チロシンキナーゼをコードし、マウスＥｐｈＡ２に対して９０％のアミノ酸配列相同性を有する。Ｅｐｈファミリーは、細胞外の保存されたＮ末端リガンド結合ドメイン、それに続く上皮成長因子様モチーフを備えたシステインリッチドメイン及び２つのフィブロネクチンＩＩＩ型リピートを含む。細胞外モチーフの後には、膜貫通領域ならびに膜近傍領域、チロシンキナーゼドメイン、ステライルαモチーフ（ＳＡＭ）、及びシナプス後領域（ディスクラージ（ｄｉｓｃ  ｌａｒｇｅ）及び閉鎖帯タンパク質（ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ）（ＰＤＺ）ドメイン結合モチーフ）を包含する細胞質領域が続く。ＥｐｈＡ２は、他のＥｐｈ受容体と２５〜３５％の配列相同性を示し、チロシン残基は膜近傍及びキナーゼドメイン内に保存されている。
【００９０】
ＥｐｈＡ２  ｍＲＮＡの発現は、皮膚、骨髄、胸腺、子宮、精巣、前立腺、膀胱、腎臓、小腸、結腸、脾臓、肝臓、肺、及び脳において観察される。結腸、皮膚、腎臓、及び肺におけるＥｐｈＡ２の発現は、骨髄と比較して１０倍超増加している。ＥｐｈＡ２は、外胚葉細胞の原腸形成中及び発生中の後脳における初期胚形成中にも発現する。皮膚では、ＥｐｈＡ２は表皮及び毛包のケラチノサイトに存在し、真皮細胞（線維芽細胞、血管細胞及び炎症細胞）には存在しない。ＥｐｈＡ２は、思春期の雌マウスの増殖性乳腺にも発現し、発情周期中に差次的に発現する。ＥｐｈＡ２は、乳癌、胃癌、黒色腫、卵巣癌、肺癌（ｌｕｎｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、神経膠腫、膀胱癌、前立腺癌、食道癌、腎癌、結腸癌、及び外陰癌などのいくつかの癌でも過剰発現する。特に、高レベルのＥｐｈＡ２は、悪性癌由来の細胞株及び進行形の癌において検出される。多くの異なるがん種の前臨床モデル及び臨床検体におけるＥｐｈＡ２の過剰発現を考慮すると、ＥｐｈＡ２の発現レベルの上昇は、がんの転帰の予測及びがんの臨床管理のいずれにおいても有益である。がん細胞と比較して、正常細胞において差次的であるＥｐｈＡ２の発現はまた、治療標的としてのその重要性を示している。
【００９１】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）
いくつかの実施形態では、標的抗原は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２、またＥＲＢＢ２、ＮＥＵ、ＮＧＬ、ＨＥＲ２、ＴＫＲ１、ＣＤ３４０、ＨＥＲ−２、ＭＬＮ  １９、ＨＥＲ−２／ｎｅｕとも称される）である。ＨＥＲ２は、チロシンキナーゼ活性を有する上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーであり、上皮成長因子受容体（ＥＦＲ／ＥｒｂＢ）ファミリーのＨＥＲ２遺伝子によってコードされる。受容体の二量体化は、受容体の細胞質ドメイン内のチロシン残基の自己リン酸化をもたらし、細胞増殖及び腫瘍形成を引き起こす種々のシグナル伝達経路を開始させる。ＨＥＲ２の増幅または過剰発現は多数の異なるがんに関連しており、予後バイオマーカー及び予測バイオマーカーとして機能し得る。例えば、ＨＥＲ２の増幅または過剰発現は、乳癌のおよそ１５〜３０％、胃癌／胃食道癌の１０〜３０％で発生する。胃癌試験において、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現及びＨＥＲ２遺伝子の増殖は、切除した２００個の腫瘍のうち、それぞれ２３％及び２７％に見られた。さらに、２６０個の胃癌の試験において、ＨＥＲ２の過剰発現は独立した負の予後因子であり、ＨＥＲ２の染色強度は腫瘍サイズ、漿膜浸潤、及びリンパ節転移と相関した。追加の試験において、食道癌の０〜８３％でＨＥＲ２が過剰発現しており、扁平上皮癌（０〜５６％）と比較して、腺癌で陽性率がより高くなる（１０〜８３％）傾向にあることが報告されている。ＨＥＲ２の過剰発現は、卵巣癌、子宮体部癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、及び頭頸部癌にも見られる。例えば、ＨＥＲ２の過剰発現は、卵巣癌患者の２０〜３０％で報告されている。子宮体部漿液性癌では、報告されているＨＥＲ２過剰発現率は１４％〜８０％の範囲であり、ＨＥＲ２増幅率は２１％〜４７％である。
【００９２】
例示的なヒトＨＥＲ２核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００４４４８．３、ＮＭ＿００１００５８６２．２、ＮＭ＿００１２８９９３６．１、ＮＭ＿００１２８９９３７．１、及びＮＭ＿００１２８９９３８．１に提供されている。例示的なヒトＨＥＲ２ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００４４３９．２、ＮＰ＿００１００５８６２．１、ＮＰ＿００１２７６８６５．１、ＮＰ＿００１２７６８６６．１、及びＮＰ＿００１２７６８６７．１に提供されている。
【００９３】
ジシアロガングリオシドＧＤ２
いくつかの実施形態では、標的抗原はジシアロガングリオシドＧＤ２である。ＧＤ２は主に細胞表面に発現する、シアル酸含有スフィンゴ糖脂質である。この炭水化物抗原の機能は完全には理解されていないが、しかしながら、腫瘍細胞の細胞外マトリックスへの付着に重要な役割を果たすと考えられている。いくつかの正常組織の間質成分及び脾臓の白脾髄におけるＧＤ２の発現が記載されているが、正常の胎児組織及び成人組織におけるＧＤ２の発現は、主に中央神経系、末梢神経、及び皮膚のメラノサイトに限定されている。悪性細胞では、ＧＤ２は神経芽細胞腫及び大部分の黒色腫において均一に発現し、骨肉腫及び軟部組織肉腫、小細胞肺癌及び脳腫瘍を含む、他の種々の腫瘍においては様々な程度で発現する。ＧＤ２は細胞表面に集中して存在し、細胞膜に埋め込まれたセラミド部分の２つの炭化水素鎖及び細胞外表面上に位置するオリゴ糖を有しており、それらは細胞外分子または隣接細胞の表面のための認識点を提示する。ＧＤ２は、その細胞表面における局在化と組み合わされた比較的腫瘍選択的な発現のために、腫瘍特異的抗体療法のための魅力的な標的である。ＧＤ２を標的化するための例示的な抗原結合ドメインは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｎａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１０；１０（２）：２００−２０９に記載されているもの、及びモノクローナル抗体ジヌツキシマブ（Ｐｌｏｅｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２０１６；（５０（５）：４１６−４２２）である。
【００９４】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）
いくつかの実施形態では、標的抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ、またＦＡＰＡ、ＳＩＭＰ、ＤＰＰＩＶ、及びＦＡＰａｌｐｈａとしても知られる）である。ＦＡＰは胚発生中に発現する１７０ｋＤａの膜結合ゼラチナーゼであり（Ｎｉｅｄｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２００１；４５（２）：４４５−７）、成人においては膵臓アルファ細胞中（Ｂｕｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；１４３（５）：４９７−５０４）、多能性骨髄間質細胞中（Ｂａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ．２００８；１４２（５）：８２７−３０）、及び子宮間質（Ｄｏｌｚｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００５；５：１０）に発現する。ＦＡＰ発現は、すべてのヒトがん種のうち９０％を超える活性化間質線維芽細胞に見られる（Ｐｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１８；３７（３２）：４３４３−４３５７、Ｂｕｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１８；２３：１９３３−１９６８）。
【００９５】
例示的なヒトＦＡＰの核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＭ＿００１２９１８０７．２及びＮＭ＿００４４６０．５に提供されている。例示的なヒトＦＡＰのポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＰ＿００１２７８７３６．１及びＮＰ＿００４４５１．２に提供されている。ＦＡＰの標的化のための例示的な抗原結合ドメインは当該技術分野で周知であり、モノクローナル抗体シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；９（５）：１６３９−４７、Ｈｏｆｈｅｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ．２００３；２６（１）：４４−８）ならびにＴｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｊｕｎ  ３；２１０（６）：１１２５−３５、Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １９９０；８７（１８）：７２３５−７２３９、Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１９：３６１３−２５（２００９）、Ｇｏｓｃｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ３２：８９−９６（２００８）、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１７；２（１９）、Ｌａｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１８；９（１）：９４８、米国特許第６，４５５，６７７号、米国特許出願公開第２０１４−０３７００１９号、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／０５７１５１号、同第２００１／０６８７０８号、同第ＷＯ２００７／０７７１７３号、同第ＷＯ２０１２／０２０００６号、同第ＷＯ２０１４／０５５４４２号、及び同第ＷＯ２０１６／０５５４３２号に記載されているものが挙げられる。例示的な抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖ配列は、配列番号７３に提供されている。
【００９６】
治療用分子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及び１つ以上の治療用分子をコードする１つ以上の追加の核酸配列を含む。本明細書で使用する場合、「治療用分子」は本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスの治療効果を増強させる分子を指す。一般に、本明細書に記載の治療用分子は、タンパク質、核酸またはそれらの組み合わせである。例示的な治療用分子としては、サイトカイン、ケモカイン、抗体またはそれらの抗原結合断片、プロテアーゼ、ＲＮＡポリヌクレオチド、及びＤＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、治療用分子は、細胞性免疫応答を刺激または活性化することにより、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスの治療効果を増加または増強させることができる。いくつかの実施形態では、治療用分子は、抑制性または調節性の免疫応答に拮抗することにより、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスの治療効果を増加または増強させることができる。いくつかの実施形態では、抑制性免疫応答の低下は、腫瘍微小環境で生じる。場合によっては、治療用分子による抑制性免疫応答の低下は、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解効果を増強させる。いくつかの実施形態では、治療用分子はさらに、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスで治療した対象における免疫調節性Ｔ細胞の活性を減少させる。いくつかの実施形態では、治療用分子はタンパク質の産生レベルを核酸レベルもしくはタンパク質レベルで調節もしくは障害するか、または、タンパク質の機能を妨害する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及び１つ以上の治療用分子をコードする核酸配列は、同一のベクターまたはウイルス内に含まれる。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及び１つ以上の治療用分子をコードする核酸配列は、異なるベクターまたはウイルスに含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、治療用分子はポリペプチドである。場合によっては、ポリペプチドは免疫モジュレーターポリペプチドである。いくつかの場合では、免疫モジュレーターポリペプチドは、サイトカイン、共刺激ドメイン、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を阻害するドメイン（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）、またはそれらの組み合わせである。
【００９９】
いくつかの実施形態では、免疫モジュレーターポリペプチドは、１つ以上の細胞型、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、樹状細胞、及び／またはＴ細胞の活性を調節する。例示的なＴｒｅｇ調節性ポリペプチドとしては、ＣＣＲ４、Ｈｅｌｉｏｓ、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ニューロピリン、ニューリチン、ＣＤ１０３、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、及びＳｗａｐ７０が挙げられる。例示的なＭＤＳＣ調節性ポリペプチドとしては、ＴＧＦ−βＲ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦγ、インターロイキン、例えば、ＩＬ−β、ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、ＴＧＦ−β１、Ｍ−ＣＳＦ、プロスタグランジンＥ２／ＰＧＥ２、プロスタグランジンＥシンターゼ２、Ｓ１００Ａ８、及びＶＥＧＦが挙げられる。例示的な樹状細胞指向性の調節性ポリペプチドとしては、ＧＭ−ＣＳＦ及び／またはＩＬ−１３が挙げられる。例示的なＴ細胞指向性の調節性ポリペプチドとしては、ＩＬ−１２、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、もしくはＩＬ−２８、またはＩＬ−１２、ＯＸ−４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、もしくはＩＬ−２８を含む経路を刺激する抗体が挙げられる。
【０１００】
他の実施形態では、治療用ポリペプチドは線維性間質を調節する。例示的な線維性間質性ポリペプチドとしては、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、プロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、細胞外マトリックス、特に腫瘍微小環境内の細胞外マトリックスを変化させることができる。例示的なプロテアーゼとしては、ＭＭＰ９、コラゲナーゼ及びエラスターゼなどのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が挙げられる。
【０１０１】
治療用分子としてのサイトカイン
いくつかの場合では、免疫モジュレーターポリペプチドは、サイトカインである。サイトカインは細胞シグナル伝達に関与する約５〜２０ｋＤａの小さなタンパク質のカテゴリーであり、ケモカイン、インターフェロン（ＩＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、及び特に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。ケモカインは、細胞の遊走を誘導するための走化性因子としての役割を果たし、ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ、及びＸＣの４つのサブファミリーに分類される。例示的なケモカインとしては、ＣＣサブファミリーからのケモカイン、例えば、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９（またはＣＣＬ１０）、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、及びＣＣＬ２８；ＣＸＣサブファミリー、例えばＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、及びＣＸＣＬ１７；ＸＣサブファミリー、例えばＸＣＬ１及びＸＣＬ２；ならびにＣＸ３Ｃサブファミリー、例えばＣＸ３ＣＬ１が挙げられる。
【０１０２】
インターフェロン（ＩＦＮ）には、Ｉ型ＩＦＮ（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、及びＩＦＮ−ω）、ＩＩ型ＩＦＮ（例えば、ＩＦＮ−γ）、及びＩＩＩ型ＩＦＮが含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−αはさらに、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、及びＩＦＮＡ２１を含む約１３のサブタイプに分類される。インターロイキンはＴ細胞及びＢ細胞、ならびに他の造血細胞を含む免疫細胞の発生及び分化を促進する、サイトカインの広義のクラスである。例示的なインターロイキンとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、及びＩＬ−３６が挙げられる。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、アポトーシスを調節するサイトカインのグループである。場合によっては、ＴＮＦファミリー内に、ＴＮＦα、リンホトキシンアルファ（ＬＴ−α）、リンホトキシンベータ（ＬＴ−β）、Ｔ細胞抗原ｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ、またＣＤ１５４とも呼ばれる）、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）が含まれるがこれらに限定されない、約１９のメンバーが存在する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャーをコードする核酸配列及びサイトカインをコードする追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインはＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ０、及びＣＣＬ４から選択される。
【０１０４】
治療用分子としての共刺激ドメイン
いくつかの実施形態では、免疫モジュレーターポリペプチドは、共刺激ドメインである。いくつかの場合では、共刺激ドメインは、抗原特異的細胞毒性を増強させる。いくつかの場合では、共刺激ドメインはさらに、サイトカイン産生を増強させる。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ−４０Ｌ）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１３７Ｌ（４１ＢＢＬ）、またはＣＤ２２４を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャーをコードする核酸配列及び共刺激ドメインをコードする追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、またはＣＤ２２４から選択される。
【０１０６】
治療用分子としての免疫チェックポイントポリペプチド
いくつかの実施形態では、免疫モジュレーターポリペプチドは、免疫チェックポイントポリペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫モジュレーターポリペプチドは、Ｔ細胞活性化の負の調節分子を阻害する免疫チェックポイント阻害剤ポリペプチドである。免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の細胞表面上の分子のグループである免疫チェックポイント分子に結合する。場合によっては、これらの分子は、抗腫瘍免疫応答を下方調節または阻害するための「ブレーキ」として効果的に機能する。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント分子の活性を調節または阻害する任意の分子を指す。場合によっては、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、抗体誘導体（例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマーまたはペプチド）を含む。
【０１０７】
例示的な免疫チェックポイント分子としては、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ１、またＢ７−Ｈ１、ＣＤ２７４としても知られる）、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３  （ＨＡＶＣＲ２）、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＧＡＬ９、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ、及びＶＩＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及び免疫チェックポイント阻害剤をコードする追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、１つ以上の免疫チェックポイント分子の発現または活性を低下させる。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント分子とそのリガンドとの間の相互作用を低下させる（例えば、ＰＤ−１とＰＤＬ１との間の相互作用を低下させる）。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は１つ以上のＰＤＬ１、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２）、Ａ２ａＲ、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ３  （ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＧＡＬ９、ＨＶＥＭ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＧＩＴ、及びＶＩＳＴＡを阻害する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤＬ１阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤＬ１に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片、またはヒト化抗体もしくはキメラ抗体もしくはそれらの抗原結合断片）である。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１の発現または活性を低下させる。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤ−１とＰＤＬ１との間の相互作用を低下させる。例示的なＰＤＬ１阻害剤としては、抗ＰＤＬ１抗体、ＲＮＡｉ分子（例えば、抗ＰＤＬ１  ＲＮＡｉ）、アンチセンス分子（例えば、抗ＰＤＬ１アンチセンスＲＮＡ）、またはドミナントネガティブタンパク質（例えば、ドミナントネガティブＰＤＬ１タンパク質）が挙げられる。例示的な抗ＰＤＬ１抗体としては、クローンＥＨ１２、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，ＲＧ７４４６）、抗マウスＰＤＬ１抗体  クローン１０Ｆ．９Ｇ２（ＢｉｏＸｃｅｌｌ，Ｃａｔ＃  ＢＥ０１０１）、抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体  ＭＤＸ−１１０５（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂのＢＭＳ−９３６５５９及びＢＭＳ−９３５５５９）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、マウス抗ＰＤＬ１  クローン２９Ｅ．２Ａ３、ならびにＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＭＥＤＩ４７３６が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤＬ１抗体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０７９１７４号、同第ＷＯ２０１０／０３６９５９号、同第ＷＯ２０１３／０５６７１６号、同第ＷＯ２００７／００５８７４号、同第ＷＯ２０１０／０８９４１１号、同第ＷＯ２０１０／０７７６３４号、同第ＷＯ２００４／００４７７１号、同第ＷＯ２００６／１３３３９６号、同第ＷＯ２０１３／０９９０６号、同第ＷＯ２０１２／１４５４９３号、同第ＷＯ２０１３／１８１６３４号、米国特許出願公開第２０１４０２９４８９８号、または中国特許出願公開第ＣＮ１０１１０４６４０号に開示されている抗ＰＤＬ１抗体である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１阻害剤はＰＤＬ１発現の核酸阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１阻害剤は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／１２７１８０号または同第ＷＯ２０１１／０００８４１号で開示されているものである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及びＥＨ１２、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈのＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６）、ＢｉｏＸｃｅｌｌの抗マウスＰＤＬ１抗体  クローン１０Ｆ．９Ｇ２（Ｃａｔ＃  ＢＥ０１０１）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒ’ｓ  Ｓｑｕｉｂｂの抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体  ＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９）及びＢＭＳ−９３５５５９、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、マウス抗ＰＤＬ１  クローン２９Ｅ．２Ａ３、ならびにＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＭＥＤＩ４７３６から選択されるＰＤＬ１阻害剤をコードする追加の核酸配列を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ−Ｌ２阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ２阻害剤はＰＤ−Ｌ２に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体もしくは断片、またはヒト化抗体もしくはキメラ抗体もしくはそれらの断片）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ２阻害剤は、ＰＤ−Ｌ２の発現または活性を低下させる。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ２阻害剤は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を低下させる。例示的なＰＤ−Ｌ２阻害剤としては、抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ２抗体）、ＲＮＡｉ分子（例えば、抗ＰＤ−Ｌ２  ＲＮＡｉ）、アンチセンス分子（例えば、抗ＰＤ−Ｌ２アンチセンスＲＮＡ）、またはドミナントネガティブタンパク質（例えば、ドミナントネガティブＰＤ−Ｌ２タンパク質）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ２阻害剤は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＡＭＰ−２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ２阻害剤はｒＨＩｇＭ１２Ｂ７である。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及びＰＤ−Ｌ２阻害剤をコードする追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ２阻害剤は、ＡＭＰ−２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）またはｒＨＩｇＭ１２Ｂ７から選択される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ１阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１阻害剤はＰＤ−１に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体もしくは断片、またはヒト化抗体もしくはキメラ抗体もしくはそれらの断片）である。例示的なＰＤ−１に対する抗体としては、ＢｉｏＸｃｅｌｌの抗マウスＰＤ−１抗体  クローンＪ４３（Ｃａｔ＃  ＢＥ００３３−２）、ＢｉｏＸｃｅｌｌの抗マウスＰＤ−１抗体  クローンＲＭＰ１−１４（Ｃａｔ＃  ＢＥ０１４６）、マウスＰＤ−１抗体  クローンＥＨ１２、ＭｅｒｃｋのＭＫ−３４７５抗マウスＰＤ−１抗体（キイトルーダ、ペンブロリズマブ、ランブロリズマブ）、ＡＮＢ０１１として知られるＡｎａｐｔｙｓＢｉｏの抗ＰＤ−１抗体、ＭＤＸ−１  １０６抗体（ＯＮＯ−４５３８）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂのヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＡＭＰ−５１４、及びＡＭＰ−２２４、ならびにＣｕｒｅＴｅｃｈ  Ｌｔｄのピディリズマブ（ＣＴ−０１１）が挙げられる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列ならびにＡＮＢ０１１、抗体ＭＤＸ−１１０６（ＯＮＯ−４５３８）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂのヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＡＭＰ−５１４、及びＡＭＰ−２２４、ならびにピディリズマブ（ＣＴ−０１１）から選択されるＰＤ１阻害剤をコードする追加の核酸配列を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ−４阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤はＣＴＬＡ−４に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体もしくは断片、またはヒト化抗体もしくはキメラ抗体もしくはそれらの断片）である。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、抗原提示細胞上で発現するＣＤ８０（Ｂ７−１）及び／またはＣＤ８６（Ｂ７−２）へのＣＴＬＡ−４の結合を遮断する。ＣＴＬＡ−４に対する例示的な抗体としては、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、ＭＤＸ−０１０、ＢＭＳ−７３４０１６及びＭＤＸ−１０１としても知られる、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの抗ＣＴＬＡ−４抗体  クローン９Ｈ１０、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５、２０６、チシリムマブ、Ｐｆｉｚｅｒ）、ならびにＡｂｃａｍの抗ＣＴＬＡ−４抗体  クローンＢＮＩ３が挙げられる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／０１４４２４号、同第ＷＯ２００４／０３５６０７号、同第ＷＯ２００３／０８６４５９号、同第ＷＯ２０１２／１２０１２５号、同第ＷＯ２０００／０３７５０４号、同第ＷＯ２００９／１００１４０号、同第ＷＯ２００６／０９６４９号、同第ＷＯ２００５／０９２３８０号、同第ＷＯ２００７／１２３７３７号、同第ＷＯ２００６／０２９２１９号、同第ＷＯ２０１０／０９７９５９７号、同第ＷＯ２００６／１２１６８号、同第ＷＯ１９９７／０２０５７４号、米国特許出願公開第２００５／０２０１９９４号、または欧州特許出願公開第ＥＰ１２１２４２２号のいずれかで開示されているものである。さらなるＣＴＬＡ−４抗体は、米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第５，９７７，３１８号、同第６，０５１，２２７号、同第６，６８２，７３６号、同第６，９８４，７２０号、同第７，１０９，００３号、同第７，１３２，２８１号、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号及び同第ＷＯ００／３７５０４号、ならびに米国特許出願公開第２００２／００３９５８１号及び同第２００２／０８６０１４号に記載されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９８／４２７５２号、米国特許第６，６８２，７３６号及び同第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（１７）：１００６７−１００７１（１９９８）、Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．２５０５（２００４）（抗体  ＣＰ−６７５２０６）、Ｍｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：５３０１−５３０４（１９９８）のいずれかで開示されているものである。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９６／０４０９１５号に開示されているようなＣＴＬＡ−４リガンドである。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、ＲＮＡｉ分子などのＣＴＬＡ−４発現の核酸阻害剤である。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  ＲＮＡｉ分子は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／０３２６１９号及び同第ＷＯ２００１／０２９０５８号、米国特許出願公開第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００３／００５６２３５号、同第２００４／２６５８３９号、同第２００５／０１００９１３号、同第２００６／００２４７９８号、同第２００８／００５０３４２号、同第２００８／００８１３７３号、同第２００８／０２４８５７６号、及び同第２００８／０５５４４３号、及び／または米国特許第６，５０６，５５９号、同第７，２８２，５６４号、同第７，５３８，０９５号及び同第７，５６０，４３８号のいずれかに記載されているものの形態をとる。場合によっては、抗ＣＴＬＡ４  ＲＮＡｉ分子は、欧州特許第ＥＰ  １３０９７２６号に記載されているものなどの二本鎖ＲＮＡｉ分子である。場合によっては、抗ＣＴＬＡ−４  ＲＮＡｉ分子は、米国特許第７，０５６，７０４号及び第７，０７８，１９６号に記載されているものなどの二本鎖ＲＮＡｉ分子である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４阻害剤は、Ｄｅｌ６０またはＭ９−１４  ｄｅｌ５５などの、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０８１０２１号に記載されているものなどのアプタマーである。さらに、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ−４  ＲＮＡｉ分子は米国特許第５，８９８，０３１号、同第６，１０７，０９４号、同第７，４３２，２４９号、及び同第７，４３２，２５０号、ならびに欧州出願第ＥＰ０９２８２９０号に記載されているものなどのＲＮＡ分子である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列、及びＣＴＬＡ−４阻害剤をコードする追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４阻害剤は、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、ＭＤＸ−０１０、ＢＭＳ−７３４０１６及びＭＤＸ−１０１としても知られる）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの抗ＣＴＬＡ−４抗体  クローン９Ｈ１０、Ｐｆｉｚｅｒのトレメリムマブ（ＣＰ−６７５、２０６、チシリムマブ）、ならびにＡｂｃａｍの抗ＣＴＬＡ−４抗体  クローンＢＮＩ３から選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３阻害剤はＬＡＧ３に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体もしくは断片、またはヒト化抗体もしくはキメラ抗体もしくはそれらの断片）である。追加の実施形態では、ＬＡＧ３に対する抗体は、ＬＡＧ３と主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子との相互作用を遮断する。ＬＡＧ３に対する例示的な抗体としては、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの抗Ｌａｇ−３抗体  クローンｅＢｉｏＣ９Ｂ７Ｗ（Ｃ９Ｂ７Ｗ）、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの抗Ｌａｇ３抗体  ＬＳ−Ｂ２２３７、ＩｍｍｕｔｅｐのＩＭＰ３２１（ＩｍｍｕＦａｃｔ）、抗Ｌａｇ３抗体  ＢＭＳ−９８６０１６、及びＬＡＧ−３キメラ抗体  Ａ９Ｈ１２が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０１９５７０号、同第ＷＯ２００８／１３２６０１号、または同第ＷＯ２００４／０７８９２８号で開示されている抗ＬＡＧ３抗体である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及びＬＡＧ３阻害剤をコードする追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３阻害剤は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの抗Ｌａｇ−３抗体  クローンｅＢｉｏＣ９Ｂ７Ｗ（Ｃ９Ｂ７Ｗ）、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの抗Ｌａｇ３抗体  ＬＳ−Ｂ２２３７、ＩｍｍｕｔｅｐのＩＭＰ３２１（ＩｍｍｕＦａｃｔ）、抗Ｌａｇ３抗体  ＢＭＳ−９８６０１６、及びＬＡＧ−３キメラ抗体  Ａ９Ｈ１２から選択される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＴＩＭ３阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３阻害剤はＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２とも称される）に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体もしくは断片、またはヒト化抗体もしくはキメラ抗体もしくはそれらの断片）である。追加の実施形態では、ＴＩＭ３に対する抗体は、ＴＩＭ３とガレクチン９（Ｇａｌ９）との相互作用を遮断する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体は、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／００６４９０号、同第ＷＯ２０１１／５５６０７号、同第ＷＯ２０１１／１５９８７７号、または同第ＷＯ２００１／１７０５７号に開示されている抗ＴＩＭ３抗体である。別の実施形態では、ＴＩＭ３阻害剤は、国際ＰＣＴ公開第２００９／０５２６２３号に開示されているＴＩＭ３阻害剤である。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及びＴＩＭ３阻害剤をコードする追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ３阻害剤は、ＴＩＭ３とＧａｌ９との相互作用を遮断する抗体である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＢ７−Ｈ３阻害剤である。いくつかの実施形態では、Ｂ７−Ｈ３阻害剤はＢ７−Ｈ３に対する抗体（例えば、モノクローナル抗体もしくは断片、またはヒト化抗体もしくはキメラ抗体もしくはそれらの断片）である。いくつかの実施形態では、Ｂ７−Ｈ３阻害剤はＭＧＡ２７１（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）である。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及びＢ７−Ｈ３阻害剤をコードする追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ７−Ｈ３阻害剤はＭＧＡ２７１である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントポリペプチドは、エフェクター細胞上で発現する細胞表面分子のアゴニスト（すなわち、免疫チェックポイント活性化物質）である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント活性化物質は、抗体、抗体誘導体（例えば、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマーまたはペプチド）を含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント活性化物質は、２Ｂ４、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＣＤ２７６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、誘導性Ｔ細胞共刺激物質（ＩＣＯＳ）、コラーゲン構造を有するマクロファージ受容体（ＭＡＲＣＯ）、ＯＸ−４０、ホスファチジルセリン（ＰＳ）受容体、ＳＬＡＭ受容体（ＣＤ２を含む）、及びＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）から選択される細胞表面分子を活性化する。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする核酸配列及び免疫チェックポイント活性化物質をコードする追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント活性化物質は、１つ以上の活性化細胞表面分子の発現または活性を増加させる。いくつかの実施形態では、免疫活性化物質は、２Ｂ４、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１６０、ＣＤ２２６、ＣＤ２７６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＭＡＲＣＯ、ＯＸ−４０、ＰＳ受容体、ＳＬＡＭ受容体（ＣＤ２を含む）、及びＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）のうち１つ以上を活性化する。
【０１２４】
治療用分子としての抗血管新生因子
いくつかの実施形態では、治療用分子は、抗血管新生因子などのポリペプチドである。血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）または新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）は、構築された血管ネットワークからの新しい微小血管の形成である。場合によっては、血管新生プロセスは、内皮細胞（ＥＣ）及び循環内皮前駆細胞、周皮細胞、血管平滑筋細胞、幹細胞を含む間質細胞、及び実質細胞などの多数の細胞型からの伝達が含まれる。これらの伝達または相互作用は、ＶＥＧＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、またはアンジオポエチンなどの分泌因子を通じて生じる。場合によっては、抗血管新生因子は、内皮細胞（ＥＣ）、循環内皮前駆細胞、周皮細胞、血管平滑筋細胞、幹細胞を含む間質細胞、及び実質細胞の細胞型の相互作用の１つ以上を妨害するポリペプチドである。場合によっては、抗血管新生因子は、ＶＥＧＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、またはアンジオポエチンなどの分泌因子の相互作用の１つ以上を妨害するポリペプチドである。
【０１２５】
他の実施形態では、制御性Ｔ細胞を調節する治療用ポリペプチドをコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスが提供される。場合によっては、制御性Ｔ細胞は自己抗原に対する寛容性を維持し、場合によっては自己免疫を抑制する。いくつかの場合では、ＴｒｅｇはエフェクターＴ細胞の誘導及び増殖を抑制または下方制御する。例示的なＴｒｅｇ調節性ポリペプチドとしては、ＣＣＲ４、Ｈｅｌｉｏｓ、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ニューロピリン、ニューリチン、ＣＤ１０３、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、及びＳｗａｐ７０が挙げられる。
【０１２６】
他の実施形態では、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を調節する治療用ポリペプチドをコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスが提供される。ＭＤＳＣは骨髄系統由来の不均一な免疫細胞の集団（骨髄幹細胞に起源を持つ異なる細胞型のクラスター）であり、樹状細胞、マクロファージ及び好中球も含まれる。場合によっては、骨髄系細胞はＴ細胞と相互作用してＴ細胞の機能を調節する。例示的なＭＤＳＣ調節性ポリペプチドとしては、ＴＧＦ−βＲ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＮＦ−γ、インターロイキン、例えば、ＩＬ−β、ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、ＴＧＦ−β１、Ｍ−ＣＳＦ、プロスタグランジンＥ２／ＰＧＥ２、プロスタグランジンＥシンターゼ２、Ｓ１００Ａ８、及びＶＥＧＦが挙げられる。
【０１２７】
他の実施形態では、線維性間質を調節する治療用ポリペプチドをコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスが提供される。いくつかの実施形態では、線維症は慢性または再発性のいずれかの炎症に応答して生じる。時間の経過とともに、繰り返される炎症が組織を刺激し瘢痕化させ、線維性組織の蓄積を引き起こす。場合によっては、十分な線維性物質が生じた場合、線維性物質は間質線維症へと変化する。
【０１２８】
治療用分子としての核酸ポリマー
いくつかの実施形態では、治療用分子は核酸ポリマーである。場合によっては、核酸ポリマーはＲＮＡポリマーである。場合によっては、ＲＮＡポリマーはアンチセンスポリマーであり、それらの配列はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）標的配列に相補的である。場合によっては、ＲＮＡポリマーはマイクロＲＮＡポリマーである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリマーは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のｉｎ  ｖｉｖｏ生成を可能にするＤＮＡ指向性ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）配列を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡポリマーは、標的遺伝子の発現を抑制する異なる組織型または細胞型に発現する短いノンコーディングＲＮＡである。例えば、ｍｉＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって、キャッピングされポリアデニル化された初期転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の一部として転写される。場合によっては、一次転写産物はＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断されて、およそ７０ｎｔのステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成され、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡはさらに細胞質のＤｉｃｅｒリボヌクレアーゼによって切断されて、成熟ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスｍｉＲＮＡスター（ｍｉＲＮＡ＊）産物が産生される。場合によっては、成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ＲＩＳＣはｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対形成を介して標的ｍＲＮＡを認識し、場合によっては、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害または不安定化をもたらす。
【０１３０】
場合によっては、調節不全のマイクロＲＮＡの発現は、１つ以上のがん種と相関する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡはｏｎｃｏｍｉＲと称される。場合によっては、調節不全のマイクロＲＮＡの発現は、亢進した発現である。場合によっては、マイクロＲＮＡの亢進した発現レベルは、１つ以上のがん種に関連する。例えば、マイクロＲＮＡ−１５５（ｍｉＲ−１５５）の過剰発現はバーキットリンパ腫または喉頭扁平上皮癌（ＬＳＣＣ）などのがんで観察され、マイクロＲＮＡ−２１（ｍｉＲ−２１）の過剰発現は乳癌で観察されている。いくつかの実施形態では、亢進した発現レベルを伴う例示的なマイクロＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１０ファミリー（例えば、ｍｉＲ−１０ｂ）、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ファミリー（例えば、ｍｉＲ−１０６ａ）、ｍｉＲ−１２５ファミリー（例えば、ｍｉＲ−１２５ｂ）、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ファミリー（例えば、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ）、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、及びｍｉＲ−１２４７−５ｐが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３１】
場合によっては、核酸ポリマーはアンチセンスポリマーであり、それらの配列はｏｎｃｏｍｉＲを相補する。場合によっては、核酸ポリマーはアンチセンスポリマーであり、それらの配列は過剰発現を特徴とするｏｎｃｏｍｉＲを相補する。場合によっては、核酸ポリマーはアンチセンスポリマーであり、それらの配列はマイクロＲＮＡ標的配列を相補する。場合によっては、核酸ポリマーはアンチセンスポリマーであり、それらの配列は過剰発現を特徴とするマイクロＲＮＡ標的配列を相補する。場合によっては、治療用分子はアンチセンスポリマーであり、それらの配列はマイクロＲＮＡ標的配列を相補する。場合によっては、治療用分子はアンチセンスポリマーであり、それらの配列は過剰発現を特徴とするマイクロＲＮＡ標的配列を相補する。場合によっては、過剰発現レベルはマイクロＲＮＡの内在性発現レベルと関連している。
【０１３２】
場合によっては、調節不全のマイクロＲＮＡの発現は、低下した発現である。場合によっては、マイクロＲＮＡの低下した発現レベルは、１つ以上のがん種に関連する。例えば、ｍｉＲ−３１のレベルの枯渇が、ヒト及びマウスの両方の転移性乳癌細胞株で観察されている。いくつかの実施形態では、低下した発現レベルを伴う例示的なマイクロＲＮＡとしてはｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３４ファミリー（例えば、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ及びｍｉＲ−３４ｃ）、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９６ａ、及びｍｉＲ−２００ファミリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
場合によっては、核酸ポリマーはｏｎｃｏｍｉＲである。場合によっては、このｏｎｃｏｍｉＲは内在性ｏｎｃｏｍｉＲと同等であり、内在性ｏｎｃｏｍｉＲは低下した発現レベルを特徴とする。場合によっては、核酸ポリマーはマイクロＲＮＡポリマーである。場合によっては、治療用分子はマイクロＲＮＡポリマーである。場合によっては、このマイクロＲＮＡは内在性マイクロＲＮＡポリマーと同等であり、内在性マイクロＲＮＡは低下した発現レベルを特徴とする。
【０１３４】
上述した通り、場合によっては、ＲＮＡポリマーはＤＮＡ指向性ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）配列を含む。場合によっては、ｓｈＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスのウイルスベクターなどのウイルスベクターにパッケージングされる。場合によっては、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に侵入すると、ウイルスゲノムがプロセシングされてコードされたｓｈＲＮＡが産生される。次に、ｓｈＲＮＡは内在性の宿主系によりプロセシングされ、ＲＮＡｉ経路に侵入し、所望の遺伝子標的を調節またはサイレンシングする。場合によっては、遺伝子標的はがん種において過剰発現する遺伝子である。場合によっては、遺伝子標的は固形腫瘍において過剰発現する遺伝子である。場合によっては、遺伝子標的は血液癌において過剰発現する遺伝子である。がんにおいて過剰発現する例示的な遺伝子としては、ＴＰ５３、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ムチン１−細胞表面関連（ＭＵＣ１）、ヒト下垂体腫瘍形質転換遺伝子１（ｈＰＰＴＧ１）、前立腺癌及び乳癌過剰発現遺伝子１タンパク質（ＰＢＯＶ１）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
場合によっては、核酸ポリマーはｄｄＲＮＡｉ配列を含む。場合によっては、核酸ポリマーは、がんにおいて過剰発現する遺伝子を標的とするｄｄＲＮＡｉ配列を含む。場合によっては、治療用分子はｄｄＲＮＡｉ配列を含む。場合によっては、治療用分子は、がんにおいて過剰発現する遺伝子を標的とするｄｄＲＮＡｉ配列を含む。
【０１３６】
例示的な腫瘍溶解性ウイルス及びエンゲージャー分子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、エフェクタードメイン及び標的化ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトである。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、エフェクタードメイン及び活性化ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトである。いくつかの実施形態では、エンゲージャー分子は、（ｉ）エフェクタードメイン、（ｉｉ）活性化ドメインまたは標的化ドメイン、及び（ｉｉｉ）追加のドメイン、例えば追加のエフェクタードメイン、追加の活性化ドメイン、追加の標的化ドメイン、治療用分子ドメイン（例えば、サイトカイン、共刺激ドメイン、免疫チェックポイント阻害剤または抗血管新生因子）またはそれらの組み合わせを含む三部分ポリペプチドである。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする第１のポリヌクレオチド配列及び治療用分子をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリヌクレオチド配列は、同一のベクター（例えば、同一の腫瘍溶解性ウイルス）に含まれる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、異なるベクター（例えば、異なる腫瘍溶解性ウイルス）にコードされる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エフェクタードメイン及び標的化ドメインを含むエンゲージャー分子をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、エフェクタードメインは１つ以上のＣＤ３成分に結合する。いくつかのこのような実施形態では、標的化ドメインはＦＡＰ及びＣＤ１９から選択される標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エフェクタードメイン及び活性化ドメインを含むエンゲージャー分子をコードする第１のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、エフェクタードメインは１つ以上のＣＤ３成分に結合する。いくつかのこのような実施形態では、活性化ドメインはＣＤ４７、ＰＤ１、及びＰＤＬ１から選択される細胞表面分子に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エフェクタードメイン及び標的化ドメインまたは活性化ドメインを含むエンゲージャー分子をコードする第１のポリヌクレオチド配列、ならびに治療用分子をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかのこのような実施形態では、治療用分子はサイトカイン、共刺激ドメイン、及び免疫チェックポイント阻害剤から選択される。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＣＣＬ４、及びＣＸＣＬ１０から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ２７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から選択される細胞表面分子と結合しそれを活性化させる分子から選択される。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤分子は、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、及びＢ７−Ｈ４から選択される細胞表面分子と結合しそれを阻害する分子から選択される。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エフェクタードメインを含むエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、このエフェクタードメインは抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、配列番号２０または配列番号７７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片、及び配列番号２２または配列番号７６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは配列番号２０または配列番号７７と１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片、及び配列番号２２または配列番号７６と１００％同一である重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、配列番号２０または配列番号７７を含む軽鎖可変断片、及び配列番号２２または配列番号７６を含む重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、配列番号２０または配列番号７７からなる軽鎖可変断片、及び配列番号２２または配列番号７６からなる重鎖可変断片を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは軽鎖可変断片及び重鎖可変断片を含み、軽鎖可変断片をコードする核酸配列が、配列番号１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、重鎖可変断片をコードする核酸配列が、配列番号２１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、軽鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号１９の核酸配列と１００％同一であり、重鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号２１と１００％同一である。いくつかの実施形態では、軽鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号１９を含み、重鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号２１を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号１９からなり、重鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号２１からなる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、標的化ドメインを含むエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、この標的化ドメインは抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖは、配列番号１６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片、及び配列番号１８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖは配列番号１６と１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片、及び配列番号１８と１００％同一である重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖは配列番号１６を含む軽鎖可変断片及び配列番号１８を含む重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖは配列番号１６からなる軽鎖可変断片及び配列番号１８からなる重鎖可変断片を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖは軽鎖可変断片及び重鎖可変断片を含み、軽鎖可変断片をコードする核酸配列は、配列番号１５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、重鎖可変断片をコードする核酸配列は、配列番号１７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、軽鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号１５と１００％同一であり、重鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号１７と１００％同一である。いくつかの実施形態では、軽鎖可変断片の核酸配列をコードする核酸配列は配列番号１５を含み、重鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号１７を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変断片の核酸配列をコードする核酸配列は配列番号１５からなり、重鎖可変断片の核酸配列をコードする核酸配列は配列番号１７からなる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、標的化ドメインを含むエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、この標的化ドメインは抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖは、配列番号７１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片、及び配列番号７２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖは配列番号７１と１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片、及び配列番号７２と１００％同一である重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖは、配列番号７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖは、配列番号７１のアミノ酸配列からなる軽鎖可変断片及び配列番号７２のアミノ酸配列からなる重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号７５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号７５と１００％同一である。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号７５を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号７５からなる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７４と１００％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７４を含む。いくつかの実施形態では、抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号７４からなる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、活性化ドメインを含むエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、この活性化ドメインは抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖは、配列番号３６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片、及び配列番号３８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖは配列番号３６と１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片、及び配列番号３８と１００％同一である重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖは配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変断片及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖは、配列番号３６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変断片及び配列番号３８のアミノ酸配列からなる重鎖可変断片を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖは軽鎖可変断片及び重鎖可変断片を含み、軽鎖可変断片をコードする核酸配列が、配列番号３５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり、重鎖可変断片をコードする核酸配列が、配列番号３７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、軽鎖可変断片の核酸配列をコードする核酸配列は、配列番号３５と１００％同一であり、重鎖可変断片をコードする核酸配列は、配列番号３７と１００％同一である。いくつかの実施形態では、軽鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号３５を含み、重鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号３７を含む。いくつかの実施形態では、軽鎖可変断片をコードする核酸配列は配列番号３５からなり、重鎖可変断片の核酸配列をコードする核酸配列は配列番号３７からなる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＳＩＲＰ１αポリペプチド断片を含む活性化ドメインを含むエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ１αポリペプチド断片は、配列番号３２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ１αポリペプチド断片は、配列番号３２と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ１αポリペプチド断片は、配列番号３２を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ１αポリペプチド断片は、配列番号３２からなる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ１αポリペプチド断片をコードする核酸配列は、配列番号３１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ１αポリペプチド断片をコードする核酸配列は、配列番号３１と１００％同一である。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ１αポリペプチド断片をコードする核酸配列は、配列番号３１を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ１αポリペプチド断片をコードする核酸配列は、配列番号３１からなる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする第１の核酸配列及び治療用分子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１５であり、配列番号２４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１５であり、配列番号２４と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１５であり、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１５であり、配列番号２４のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１５であり、配列番号２３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１５であり、配列番号２３と１００％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１５であり、配列番号２３を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１５であり、配列番号２３からなる核酸配列によってコードされる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする第１の核酸配列及び治療用分子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１２  ｐ３５及び／またはＩＬ−１２  ｐ４０であり、それぞれ配列番号２６または配列番号２８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１２  ｐ３５及び／またはＩＬ−１２  ｐ４０であり、それぞれ配列番号２６または配列番号２８と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１２  ｐ３５及び／またはＩＬ−１２  ｐ４０であり、それぞれ配列番号２６または配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１２  ｐ３５及び／またはＩＬ−１２  ｐ４０であり、それぞれ配列番号２６または配列番号２８のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１２  ｐ３５及び／またはＩＬ−１２  ｐ４０であり、それぞれ配列番号２５または配列番号２７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１２  ｐ３５及び／またはＩＬ−１２  ｐ４０であり、それぞれ配列番号２５または配列番号２７と１００％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１２  ｐ３５及び／またはＩＬ−１２  ｐ４０であり、それぞれ配列番号２５または配列番号２７を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＩＬ−１２  ｐ３５及び／またはＩＬ−１２  ｐ４０であり、それぞれ配列番号２５または配列番号２７からなる核酸配列によってコードされる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする第１の核酸配列及び治療用分子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＸＣＬ１０であり、配列番号３０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＸＣＬ１０であり、配列番号３０と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＸＣＬ１０であり、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＸＣＬ１０であり、配列番号３０のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＸＣＬ１０であり、配列番号２９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＸＣＬ１０であり、配列番号ＸＸ２９Ｘと１００％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＸＣＬ１０であり、配列番号２９を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＸＣＬ１０であり、配列番号２９からなる核酸配列によってコードされる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする第１の核酸配列及び治療用分子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＣＬ４であり、配列番号８０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＣＬ４であり、配列番号８０と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＣＬ４であり、配列番号８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＣＣＬ４であり、配列番号８０のアミノ酸配列からなる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子をコードする第１の核酸配列及び治療用分子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＭＭＰ９であり、配列番号３４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＭＭＰ９であり、配列番号３４と１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＭＭＰ９であり、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用分子はＭＭＰ９であり、配列番号３４のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＭＭＰ９であり、配列番号３３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＭＭＰ９であり、配列番号３３と１００％同一である核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＭＭＰ９であり、配列番号３３を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、治療用分子はＭＭＰ９であり、配列番号３３からなる核酸配列によってコードされる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含むエフェクタードメイン及びＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを含む標的化ドメインを含む、本明細書においてＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥまたはＣＤ１９  ＢｉＴＥと称されるエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。例示的なＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥの模式図を図１（配列番号４４）に示す。このような実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖは、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６）によって共に連結される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードする第１の核酸配列及びＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０またはＣＣＬ４などの治療用分子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及び治療用分子をコードする核酸配列は別個の核酸配列であり、ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及び治療用分子は別個のタンパク質としてコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、バイシストロン性またはマルチシストロン性の核酸配列を含み、第１の核酸配列はＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードし、第２の核酸配列は、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５（図２、配列番号５３）、ＩＬ−１２（図３、配列番号５４）、またはＣＸＣＬ１０（図４、配列番号５５）をコードする。このような実施形態では、ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥ（例えば、配列番号４４）は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドリンカー（配列番号１４）によって、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５（配列番号２４）、ＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号２８）、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号２６）、及び／またはＣＸＣＬ１０（配列番号３０）と連結される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含むエフェクタードメイン及びＦＡＰに結合するｓｃＦｖを含む活性化ドメインを含む、本明細書においてＦＡＰ−ＣＤ３  ＢｉＴＥまたはＦＡＰ  ＢｉＴＥ（配列番号７５）と称されるエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。このような実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ及び抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖは、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６）によって共に連結される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＦＡＰ−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードする第１の核酸配列及びＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０またはＣＣＬ４などの治療用分子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＡＰ−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及び治療用分子をコードする核酸配列は別個の核酸配列であり、ＦＡＰ−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及び治療用分子は別個のタンパク質としてコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、バイシストロン性またはマルチシストロン性の核酸配列を含み、第１の核酸配列はＦＡＰ−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードし、第２の核酸配列は、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０またはＣＣＬ４をコードする。いくつかのこのような実施形態では、コードされたＦＡＰ−ＣＤ３  ＢｉＴＥ（例えば、配列番号７４）は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドリンカー（配列番号１４）によって、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５（配列番号２４）、ＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号２８）、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号２６）、ＣＸＣＬ１０（配列番号３０）及び／またはＣＣＬ４（配列番号８０）と連結される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含むエフェクタードメイン及びＣＤ４７（配列番号３２）に結合するＳＩＲＰ１αポリペプチド断片を含む活性化ドメインを含む、本明細書においてＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥまたはＳＩＲＰ１α  ＢｉＴＥと称されるエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。例示的なＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥの模式図を、図５（ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＳＬ）、配列番号４６）及び図６（ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＬＬ）、配列番号４８）に示す。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ及びＳＩＲＰ１αペプチド断片は、単一アミノ酸リンカー、すなわち「ショートリンカー」（ＳＬ）によって共に連結される（例えば、図５に示すＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＳＬ））。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ及びＳＩＲＰ１αペプチド断片は、Ｇ４Ｓリンカー、すなわち「ロングリンカー」（ＬＬ）によって共に連結される（例えば、図６に示すＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＬＬ））。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードする第１の核酸配列及びＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０またはＣＣＬ４などの治療用分子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及び治療用分子をコードする核酸配列は別個の核酸配列であり、ＦＡＰ−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及び治療用分子は別個のタンパク質としてコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、バイシストロン性またはマルチシストロン性の核酸配列を含み、第１の核酸配列はＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードし、第２の核酸配列は、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５（図７、配列番号５６及び図８、配列番号５７）、ＩＬ−１２（図９、配列番号５８及び図１０、配列番号５９）、またはＣＸＣＬ１０（図１１、配列番号６０及び図１２、配列番号６１）をコードする。このような実施形態では、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ（例えば、配列番号４６または配列番号４８）は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドリンカー（配列番号１４）によって、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５（配列番号２４）、ＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号２８）、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号２６）、及び／またはＣＸＣＬ１０（配列番号３０）と連結される。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、バイシストロン性またはマルチシストロン性の核酸配列を含み、第１の核酸配列はＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードし、第２の核酸配列は、治療用分子、例えば、ＭＭＰ９（図１８Ａ、配列番号６５及び図１８Ｂ、配列番号６６）をコードする。このような実施形態では、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ（例えば、配列番号６５または配列番号６６）は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドリンカー（配列番号１４）によってＭＭＰ９ポリペプチド（配列番号３４）に連結される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、バイシストロン性またはマルチシストロン性の核酸配列を含み、第１の核酸配列はＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードし、第２の核酸配列は、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３−Ｈｉｎｇｅ、配列番号４０を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン）と連結された抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖを含む治療用分子、例えば、図３７（配列番号６８）に示すＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＳＬ）コンストラクトまたは図３８（配列番号７０）に示すＳＩＲＰ１α−ＣＤ３−ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＬＬ）コンストラクトをコードする。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含むエフェクタードメイン及びＰＤＬ１に結合するｓｃＦｖを含む活性化ドメインを含む、本明細書においてＰＤＬ１−ＣＤ３  ＢｉＴＥまたはＰＤＬ１  ＢｉＴＥと称されるエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。例示的なＰＤＬ１−ＣＤ３  ＢｉＴＥを図１３（配列番号５０）に示す。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ及び抗ＰＤＬ１  ｓｃＦｖは、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号６）によって共に連結される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、ＰＤＬ１−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードする第１の核酸配列及びＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０またはＣＣＬ４などの治療用分子をコードする第２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤＬ１−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及び治療用分子をコードする核酸配列は別個の核酸配列であり、ＰＤＬ１−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及び治療用分子は別個のタンパク質としてコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、バイシストロン性またはマルチシストロン性の核酸配列を含み、第１の核酸配列はＰＤＬ１−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードし、第２の核酸配列は、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５（図１４、配列番号６２）、ＩＬ−１２（図１５、配列番号６３）、またはＣＸＣＬ１０（図１６、配列番号６４）をコードする。このような実施形態では、ＳＩＲＰ１α  ＢｉＴＥ（例えば、配列番号５０）は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドリンカー（配列番号１４）によって、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５（配列番号２４）、ＩＬ−１２  ｐ３５（配列番号２８）、ＩＬ−１２  ｐ４０（配列番号２６）、及び／またはＣＸＣＬ１０（配列番号３０）と連結される。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスはエンゲージャー分子をコードするポリヌクレオチド配列を含み、エンゲージャー分子は三部分エンゲージャー分子であり、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含むエフェクタードメイン、ＰＤＬ１に結合するｓｃＦｖを含む活性化ドメイン及びＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む（例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３−Ｈｉｎｇｅ、配列番号４０を含む）第３のドメインを含み、エンゲージャー分子は１つ以上のＦｃγＲに結合することができ、本明細書においてＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ三部分Ｔ細胞エンゲージャー、またはＴｉＴＥ、またはＰＤＬ１  ＴｉＴＥと称される。例示的なＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ  ＴｉＴＥの模式図を図１７（配列番号５２）に示す。
【０１６０】
例示的なエンゲージャー分子及び治療用分子のアミノ酸配列を表１に示す。
【０１６１】
表１：例示的なエンゲージャー分子のアミノ酸配列
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【０１６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６７、及び配列番号６９から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６７、及び配列番号６９から選択される核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６７、及び配列番号６９から選択される核酸配列と１００％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号６７、及び配列番号６９から選択される核酸配列からなる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、及び配列番号５２から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるエンゲージャー分子及び／または治療用分子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、及び配列番号５２から選択されるアミノ酸配列と１００％同一であるエンゲージャー分子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、及び配列番号５２から選択されるアミノ酸配列を含むエンゲージャー分子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、及び配列番号５２から選択されるアミノ酸配列からなるエンゲージャー分子をコードする核酸配列を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、エンゲージャー分子及び治療用分子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換え核酸配列は、配列番号５３〜配列番号６６、配列番号６８及び配列番号７０から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むエンゲージャー分子及び治療用分子をコードする。いくつかの実施形態では、組換え核酸配列は、配列番号５３〜配列番号６６、配列番号６８及び配列番号７０から選択されるアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を含むエンゲージャー分子及び治療用分子をコードする。いくつかの実施形態では、組換え核酸配列は、配列番号５３〜配列番号６６、配列番号６８及び配列番号７０から選択されるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含むエンゲージャー分子及び治療用分子をコードする。
【０１６５】
表２：例示的なエンゲージャー分子の核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【表２−１１】
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【表２−１２】
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【表２−１３】
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【表２−１４】
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【表２−１５】
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【０１６６】
エンゲージャー分子の追加の例示的な実施形態には、（例えば、配列番号２０及び配列番号２２から構成される）抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含むエフェクタードメイン、及びＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、またはＧＩＴＲなどの細胞表面タンパク質に結合するｓｃＦｖを含む活性化ドメインを含むエンゲージャー分子が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、バイシストロン性またはマルチシストロン性の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、（例えば、配列番号２０及び配列番号２２から構成される）抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含むエフェクタードメイン及びＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＣＤ４７、またはＧＩＴＲなどの細胞表面タンパク質に結合するｓｃＦｖを含む活性化ドメインを含むエンゲージャー分子をコードし、第２の核酸配列は、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５（配列番号２４）、ＩＬ−１２（配列番号２６及び配列番号２８）、ＣＸＣＬ１０（配列番号３０）、またはＭＭＰ９（配列番号３４）をコードする。このような実施形態では、エンゲージャー分子は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドリンカー（配列番号１４）によって、治療用分子ポリペプチドに連結される。
【０１６７】
エンゲージャー分子の追加の例示的な実施形態には、（例えば、配列番号２０及び配列番号２２から構成される）抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含むエフェクタードメインならびにＳＬＡＭＦ７（ＣＤ３１９としても知られる）またはＣＤ２７（ＣＤ２７の膜結合形態もしくはＣＤ２７の可溶性形態のいずれか）に結合するｓｃＦｖを含む標的化ドメインを含むエンゲージャー分子が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、バイシストロン性またはマルチシストロン性の核酸配列を含み、第１の核酸配列は、（例えば、配列番号２０及び配列番号２２から構成される）抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含むエフェクタードメインならびにＳＬＡＭＦ７またはＣＤ２７などの標的細胞抗原に結合するｓｃＦｖを含む抗原認識ドメインを含むエンゲージャー分子をコードし、第２の核酸配列は、治療用分子、例えば、ＩＬ−１５（配列番号２４）、ＩＬ−１２（配列番号２６及び配列番号２８）、ＣＸＣＬ１０（配列番号３０）、またはＭＭＰ９（配列番号３４）をコードする。このような実施形態では、エンゲージャー分子は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドリンカー（配列番号１４）によって、治療用分子ポリペプチドに連結される。
【０１６８】
本明細書に記載のエンゲージャー分子による標的に適した追加の細胞表面タンパク質を以下の表３に示す。治療用分子としての使用に適した追加のタンパク質を以下の表４に示す。
【０１６９】
表３：エンゲージャー分子による標的化に適した細胞表面タンパク質
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１７０】
表４：治療用分子としての使用に適したタンパク質
【表４】
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【０１７１】
腫瘍溶解性ウイルスの治療的使用
いくつかの実施形態では、本発明は、がん性疾患の予防、治療、及び／または改善のための組成物及び使用方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、有効量（例えば、治療有効量）の本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスをそれを必要とする対象に投与することを含み、このウイルスは、エンゲージャー分子またはエンゲージャー分子及び治療用分子を発現する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、微小残存病変、早期固形腫瘍、進行性固形腫瘍及び／または転移性固形腫瘍を含むすべてのステージのがん及びすべてのがん種に対して有用である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、多数の異なるがんと関連する種々の固形腫瘍の治療に用いられる。用語「固形腫瘍」は、リンパ性癌に観察される転移以外の再発性または治療抵抗性の腫瘍、及び転移（位置を問わない）を指す。
【０１７３】
例示的な固形腫瘍としては、脳及びその他の中枢神経系腫瘍（例えば、髄膜、脳、脊髄、脳神経の腫瘍、及び中枢神経系のその他の部分の腫瘍、例えば神経膠芽腫または髄質芽細胞腫）；頭部及び／または頸部癌；乳房腫瘍；循環系腫瘍（例えば、心臓、縦隔及び胸膜、及び他の胸腔内臓器の腫瘍、血管腫瘍及び腫瘍関連血管組織）；排出系腫瘍（例えば、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、その他の不特定の泌尿器）；胃腸管腫瘍（例えば、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸Ｓ状結腸移行部、直腸、肛門、及び肛門管）、肝臓及び肝内胆管、胆嚢、胆道のその他の不特定の部分、膵臓、その他及び消化器官が関係する腫瘍；頭部及び頸部；口腔（口唇、舌、歯肉、口腔底、口蓋、及び口のその他の部分、耳下腺、及び唾液腺のその他の部分、扁桃、中咽頭、鼻咽頭、梨状洞、下咽頭、及び口唇内のその他の部位、口腔、及び咽頭）；生殖器系腫瘍（例えば、外陰、膣、子宮頸部、子宮体、子宮、卵巣、及び女性生殖器と関連したその他の部位、胎盤、陰茎、前立腺、精巣、及び男性生殖器と関連したその他の部位）；呼吸器腫瘍（例えば、鼻腔及び中耳、副鼻腔、喉頭、気管、気管支、及び肺、例えば小細胞肺癌または非小細胞肺癌）；骨格系腫瘍（例えば、四肢の骨及び関節軟骨、骨の関節軟骨及びその他の部位）；皮膚腫瘍（例えば、皮膚の悪性黒色腫、非黒色腫皮膚癌、皮膚の基底細胞癌、皮膚の扁平上皮癌、中皮腫、カポジ肉腫）；ならびに末梢神経及び自律神経系、結合組織及び軟部組織、後腹膜腔及び腹膜、眼及び付属器、甲状腺、副腎及びその他の内分泌腺及び関連構造物を含む他の組織に関係する腫瘍、リンパ節の続発性及び不特定の悪性新生物、呼吸器系及び消化器系の続発性悪性新生物、及びその他の部位の続発性悪性新生物、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫または他の固形腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７４】
特定の実施形態では、固形腫瘍は脳腫瘍である。場合によっては、脳腫瘍は、神経膠腫、特に上衣腫、乏突起膠腫、乏突起星細胞腫、星細胞腫、神経膠芽腫、または髄芽腫を含むがこれらに限定されない。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、血液癌の治療に用いられる。本明細書では、用語「血液癌」は血液系の癌を指し、再発性または治療抵抗性の血液癌、及び転移した血液癌（位置を問わない）を含む。場合によっては、血液癌はＴ細胞悪性腫瘍またはＢ細胞悪性腫瘍である。例示的なＴ細胞悪性腫瘍としては、非特定型末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ−ＮＯＳ）、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾ガンマ−デルタＴ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、鼻性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、または治療関連Ｔ細胞リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
例示的なＢ細胞悪性腫瘍としては、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高リスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、またはリンパ腫様肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、血液癌は再発性または治療抵抗性の血液癌である。いくつかの場合では、血液癌は転移した血液癌である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはウイルス感染細胞の死に先だって、例えば感染の１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間もしくは２４時間以内、または感染の２日、３日、４日、５日、もしくは６日以内に、エンゲージャー分子及び／または治療用ポリペプチドの高レベルの発現を引き起こすように設計される。エンゲージャー分子及び／または治療用ポリペプチドの発現は、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、または特に電気泳動を含む、当該技術分野において既知の方法によって測定することができる。一般に、治療用分子に関する「高レベルの発現」は、腫瘍溶解性ウイルスに感染していない細胞における対応するポリペプチドの基底レベルの発現よりも高い発現のレベルを指す。
【０１７８】
組成物及び投与経路
いくつかの実施形態では、治療有効量の腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物が対象に投与される。本開示によれば、用語「医薬組成物」は、個体に投与するための組成物を指す。本明細書に記載の組成物の投与は、局所的または全身的であり得、異なる方法、例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、局所投与、または皮内投与により達成され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、当該技術分野において既知の任意の方法により投与される。例えば、本明細書に記載の組成物は、静脈内に、腫瘍内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所的に、腫瘍内に、筋肉内に、髄腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼球内に、経口で、局所的に、吸入で、注射で、注入で、持続注入で、局所灌流で、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、または脂質組成物で対象に投与され得る。特定の実施形態では、組成物は、注入または注射を介して個体に投与される。いくつかの実施形態では、投与は非経口、例えば静脈内である。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスまたはその組成物は、例えば、内部標的部位または外部標的部位へのパーティクルガンによる送達によって、または動脈内の部位へのカテーテルによって、標的部位に直接投与される。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、皮下または静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの組成物は、静脈内または動脈内に投与される。
【０１７９】
好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、非経口投与、経皮投与、管腔内投与、動脈内投与、髄腔内投与、静脈内投与、またはがん内への直接投与のための特定の投与経路用に製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含む。本明細書において「薬学的にまたは薬理学的に許容可能」とは、動物、またはヒトに適宜投与した際に、副作用、アレルギー反応または他の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。「薬学的に許容可能な担体」には、任意の及びすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、緩衝剤、安定化配合物、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好適な医薬担体の例は、当該技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば、油／水エマルション、種々の種類の湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される。いくつかの実施形態では、補助的な活性成分もまた、組成物中に混合される。ヒトへの投与に関して、本明細書に記載の組成物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される無菌性、発熱性、及び一般的な安全性及び純度基準に合致する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの好適な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒などの担体を含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合には必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防止は、当該技術分野において既知の種々の抗菌剤及び抗真菌剤によりもたらされる。多くの場合、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。いくつかの実施形態では、注射可能組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによってもたらされる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスは、中性形態または塩の形態で組成物中に配合される。薬学的に許容可能な塩には、（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）酸付加塩を含み、これらは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導される。
【０１８２】
注射用途に好適な医薬形態としては、無菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。いくつかの場合では、形態は無菌かつ流体である。いくつかの場合では、形態は、製造及び特定の貯蔵パラメータ（例えば、冷蔵及び冷凍）の条件下で安定であり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護される。本発明のいくつかの実施形態の水性組成物は、薬学的に許容可能な担体または水性媒体中に溶解または分散した、有効量のウイルス、核酸、治療用タンパク質、ペプチド、コンストラクト、刺激剤、阻害剤などを含む。前述のいずれかを発現しているベクターの水性組成物も企図される。
【０１８３】
特定の実施形態では、生体物質は必要に応じて、広範囲に透析され望ましくない小分子量の分子を除去され、及び／または所望の溶媒へとより迅速に調剤するために凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、活性化合物またはコンストラクトは、非経口投与用に製剤化され、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、鼻腔内または腹腔内経路を介した注射用に製剤化される。対象のワクチン接種または追加免疫に使用される任意の経路が使用される。活性成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）または活性成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）を含有する水性組成物の調製は、本開示を考慮すれば、当業者には既知である。一般に、このような組成物は、注射可能剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され、注射前に液体を添加することによって溶液または懸濁液を調製するために使用するのに好適な固体の形態もまた調製され、調製物はまた、乳化される。
【０１８４】
場合によっては、腫瘍溶解性ウイルスは、注射用の薬学的に許容可能な製剤中に分散される。いくつかの実施形態では、無菌注射可能溶液は、活性化合物またはコンストラクトを上で列挙した任意の他の成分と共に適切な溶媒中に必要な量で混合し、必要に応じて、続いてろ過滅菌することによって調製される。
【０１８５】
本明細書に記載の組成物は、配合されると、治療される疾患及び投与剤形と適合する様式により、治療上有効な量で投与される。製剤は、種々の剤形、例えば、上述の注射可能溶液の様式で容易に投与されるが、徐放カプセルまたは微粒子及びマイクロスフェアなどとしても投与される。
【０１８６】
水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液を必要に応じて適切に緩衝剤で処理し、まず、液体希釈剤を十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、皮下投与及び腹腔内投与に特に好適である。これに関連して、使用される無菌水性媒体は、本開示を考慮すれば当業者には既知である。例えば、１用量を１ｍＬの等張のＮａＣｌ溶液に溶解させ、１０００ｍＬの皮下注入流体に添加するか、または注入予定部位に注射する。
【０１８７】
非経口投与、例えば静脈内注射、腫瘍内注射、皮内注射または筋肉内注射用に製剤化した化合物に加えて、他の薬学的に許容可能な形態としては、例えば、経口投与用の錠剤または他の固形物、リポソーム製剤、持続放出カプセル、生分解性及び現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ウイルスは免疫認識を阻害するためにカプセル化され、腫瘍部位に配置される。
【０１８９】
場合によっては、非経口投与用の調製物は、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、及びエマルションを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液が含まれる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンガーまたは固定油が挙げられる。静脈内媒体としては、体液及び栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンガーデキストロースベースのもの）などが挙げられる。防腐剤及び他の添加物、例えば、抗生物質、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガスなども存在する。さらに、本開示の医薬組成物は、タンパク質性担体、例えば、好ましくはヒト由来である血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどを含み得る。本開示の医薬組成物は、タンパク質性二重特異性一本鎖抗体コンストラクトまたは核酸分子または（本開示に記載の通りに）これらをコードするベクターに加えて、医薬組成物の使用目的に応じて、生物学的に活性な薬剤をさらに含み得ることが想定される。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、連続的にベクターを放出する腫瘍浸潤性ウイルス産生細胞は、ウイルスの腫瘍溶解及び治療用遺伝子の導入効率を向上させるため、腫瘍内への直接注入用に製剤化される。
【０１９１】
鼻腔内製剤は当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第４，４７６，１１６号、同第５，１１６，８１７号及び同第６，３９１，４５２号に記載されている。これら及び当該技術分野において周知の他の技術に従って調製される製剤は、ベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、フルオロカーボン、及び／または当該技術分野において既知の他の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製される。例えば、Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄ．（１９９５）を参照のこと。好ましくは、これらの組成物及び製剤は、適切な非毒性の薬学的に許容可能な成分を用いて調製される。これらの成分は、経鼻剤形の調製における当業者には既知であり、これらのいくつかは、当該分野の標準的参考文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５に見られる。適切な担体の選択は、例えば、溶液、懸濁液、軟膏、またはゲルなどの所望の経鼻剤形の正確な性質に大きく依存する。一般に、経鼻剤形は有効成分に加えて大量の水を含有する。微量の他の成分、例えば、ｐＨ調整剤、乳化剤または分散剤、防腐剤、界面活性剤、ゲル化剤、または緩衝剤及び他の安定化剤及び可溶化剤なども存在する。経鼻剤形は、鼻分泌物と等張である。
【０１９２】
本明細書に記載の吸入による投与については、エアロゾル、ミストまたは粉末の形態である。本明細書に記載の医薬組成物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーより提供されるエアロゾルスプレーの形態で便利に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることにより決定される。単なる例示として、吸入器または注入器で使用するためのゼラチンなどのカプセル及びカートリッジは、本明細書に記載の化合物の粉末混合物及びラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤を含有して製剤化される。
【０１９３】
治療有効量及び治療レジメン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルス及びそれらの組成物は、治療有効量で対象に投与される。治療有効量は、治療される対象、対象の状態（例えば、全体的な健康状態）、必要な保護、治療される疾患、投与経路、及び／またはウイルスの性質に依存する。いくつかの実施形態では、投与の責任者（例えば、主治医）が、個体に対する適切な用量を決定する。医療分野において周知のように、あらゆる患者に対する投与量は、患者のサイズ、体重、体表面積、年齢、性別及び全体的な健康状態、投与される特定の化合物、治療される特定の疾患、投与のタイミング及び投与経路、ならびに併用投与されている他の薬剤を含む、多くの要因に依存する。したがって、集団全体に投与されるウイルスであっても、各個別の患者に対して、その個体に対する適切な投与量のために各患者がモニタリングされることが予想され、このような患者をモニタリングする行為は、当該技術分野において日常的である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスの治療有効量は、単回用量で投与される。本発明のいくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの組成物は、約１×１０＋５ｐｆｕ〜約１×１０＋１５ｐｆｕ（プラーク形成単位）、約１×１０＋８ｐｆｕ〜約１×１０＋１５ｐｆｕ、約１×１０＋１０ｐｆｕ〜約１×１０＋１５ｐｆｕ、または約１×１０＋８ｐｆｕ〜約１×１０＋１２ｐｆｕの範囲の用量で対象に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの組成物は、約１０５ｐｆｕ、１０６ｐｆｕ、１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、１０９ｐｆｕ、１０１０ｐｆｕ、１０１１ｐｆｕ、１０１２ｐｆｕ、１０１３ｐｆｕ、１０１４ｐｆｕ、または１０１５ｐｆｕのウイルス用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、用量は、組成物が投与されている対象の年齢に依存する。例えば、対象が若年である場合、より低い用量が必要とされる場合があり、対象が成人のヒト対象である場合、より高い用量が必要とされる場合がある。特定の実施形態では、例えば、若年対象は約１×１０＋８ｐｆｕ及び約１×１０＋１０ｐｆｕの用量を受け、一方で成人のヒト対象は約１×１０＋１０ｐｆｕ〜約１×１０＋１２ｐｆｕの用量を受ける。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療有効量の腫瘍溶解性ウイルスは、２回以上の用量にわたって投与される。いくつかの実施形態では、２回以上の用量は、同時に（例えば、同日にまたは短期間に）投与されるかまたは適切な間隔で、例えば、１日あたり２回、３回、４回またはそれ以上のサブ用量で投与される。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの組成物は、対象に１回、投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルス及びそれらの組成物は、対象に２回以上、投与される。例えば、本明細書に開示の組成物は、１回、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上を含む複数回投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物は、対象における必要性または病原性生物もしくは状態への曝露（例えば、がん）に応じて、ある期間にわたり、毎日もしくは週ごとに、または月ごとに、隔年ごとに、もしくは１年ごとに対象に投与され得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス及びそれらの組成物は、長期間にわたり対象によって維持されるような方法で製剤化され、そのような量及び／または頻度で投与される。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの組成物は、治療用途のために投与されるか、または例えば寛解状態にある患者のためなどの維持療法として投与される。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの組成物は、毎月１回、２か月に１回、６か月に１回、１年に１回、１年に２回、１年に３回、２年に１回、３年に１回、または５年に１回投与される。
【０１９７】
患者の状態を改善するいくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスまたはそれらの組成物は、医師の裁量によって継続的に投与され得る。いくつかの実施形態では、用量組成物は一時的に減量され、及び／または組成物の投与は特定の期間（すなわち、「休薬日」）、一時的に停止される。いくつかの実施形態では、休薬日の長さは２日と１年との間で変動し、単なる例示として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日が含まれる。休薬日中の用量の減量は、１０％〜１００％であり、単なる例示として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が含まれる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、患者の状態に改善が生じると、必要に応じて維持量が投与され得る。いくつかの実施形態では、組成物の投与量及び／または投与頻度は、症状の関数として、改善された疾患、障害または状態が保持されるレベルまで減少される。いくつかの実施形態では、何らかの症状が再発した際に、患者は長期的な間欠的治療を必要とする場合がある。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、このような治療レジメンの毒性及び治療効果は、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）の決定を含むがこれらに限定されない、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的処置によって決定される。毒性作用と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を策定するために使用される。そのような化合物の投与量は、最小限の毒性のＥＣ５０を含む循環濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、採用される剤形及び使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
【０２００】
場合によっては、腫瘍抗原発現レベルは、患者における治療の進展の評価のために、患者を層別化するために、及び／または治療レジメンを調整するために評価される。場合によっては、腫瘍抗原発現レベルの評価は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）（半定量的または定量的ＩＨＣを含む）または他の抗体ベースのアッセイ（ウエスタンブロット法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、放射性免疫沈降法（ＲＩＰ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫測定法、化学発光測定法、生物発光測定法、ゲル電気泳動）の使用を含むか、またはこれらの遺伝子の転写を定量化することによる（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼプロテクション、ノーザンブロット法、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による）、間接的な使用を含む。場合によっては、細胞、例えばリンパ球は、ＦＡＣ技術を用いて分析されるか、または抗体を使用したパラフィン包埋腫瘍切片を用いて分析される。
【０２０１】
場合によっては、抗体は、免疫組織化学法、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロッティングなどの技術によって、標的細胞のタンパク質内容物の特性を明らかにするために用いられる。いくつかの場合では、これは、例えば、腫瘍溶解性ウイルス療法に好ましく応答する可能性のある対象の存在の有無のための選別及び／または腫瘍溶解性ウイルスと免疫刺激剤との併用投与の必要性の選別を提供する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、免疫組織化学法は、生検からの組織試料に対して実施される。いくつかの場合では、試料は新鮮な状態でまたは凍結状態で検査される。場合によっては、細胞内に提示される抗原に対する抗体は、スライド上の試料に添加され、抗体は抗原が存在する場合は必ず結合する。いくつかの実施形態では、次いで、過剰な抗体が洗浄除去される。いくつかの場合では、細胞に結合したままの抗体は、顕微鏡下での可視化のために二次抗体によりさらに標識される。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、試験試料は対象から、例えば、組織（例えば、腫瘍生検）、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、血液、血漿、血清、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、リンパ液、リンパ球、滑液及び尿などから得られる。特定の実施形態では、試験試料は、ＣＳＦまたは腫瘍組織から得られる。他の特定の実施形態では、試験試料は腫瘍組織から得られ、例えば、試料中のＣＤ４＋細胞及び／またはＣＤ８＋細胞の相対数が測定され、及び／または試料中の１つ以上のＴｈ１サイトカイン及び／またはＴｈ２サイトカインレベルが、例えば、Ｔｈ１サイトカイン及び／またはＴｈ２サイトカインに対する抗体を含む試料からの固定した細胞及び透過処理した細胞を免疫蛍光染色することによって測定される。他の特定の実施形態では、検査試料は血液から得られ、例えば、試料中の１つ以上のＴｈ１サイトカイン及び／またはＴｈ２サイトカインのレベルがＥＬＩＳＡによって測定される。
【０２０４】
併用療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルス、発現コンストラクト、核酸分子及び／またはベクターは、他の治療剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス及び追加の治療剤は、同一の組成物中に配合される。このような実施形態では、組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス及び追加の治療剤は、別個の組成物中（例えば、患者または対象への投与に適した２つ以上の組成物）に配合される。本開示は、他のがん療法、例えば、二重特異性抗体コンストラクト、標的化毒素またはＴ細胞療法を含む免疫細胞を介して作用するものを含む他の化合物との併用投与プロトコルをさらに包含する。本発明の組成物（複数可）の併用投与のための臨床レジメンは、他の組成物との同時併用投与、他の組成物の前及び／または後の投与を包含する。特定の併用療法としては、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、及び／または他の種類の免疫療法が挙げられる。いくつかの実施形態では、治療有効量の腫瘍溶解性ウイルスが、追加の治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与される。場合によっては、追加の治療剤は、化学療法剤、ステロイド、免疫療法剤、標的療法、またはそれらの組み合わせである。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物がアジュバント療法と組み合わせて投与される。例えば、活性化アジュバント治療剤は、１つ以上の投与（例えば、ウイルスの腫瘍内注射）の前に、投与と同時に、または投与の後に投与される。例えば、アジュバント療法は、ＣｐＧ配列を含むＤＮＡ分子によるＴＬＲ９の活性化、または（例えば、ＲＮＡリガンドによる）ＴＬＲ９の活性化などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドの調節を含む。その他のアジュバント治療には、抗体または他のポリペプチドを刺激すること（例えば、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）による、ＣＤ４０またはＧＩＴＲそれぞれの活性化）が含まれる。さらに、ＳＴＩＮＧを調節する環状ジヌクレオチド（例えば、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）が提供される。他の活性化アジュバントには、ＩＬ−３３などのインターロイキンが含まれる。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ベンダムスチン、ボルテゾミブ、レナリドマイド、イデラリシブ（ＧＳ−１１０１）、ボリノスタット、エベロリムス、パノビノスタット、テムシロリムス、ロミデプシン、ボリノスタット、フルダラビン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、ペントスタチン、プレドニソン、エトポシド、プロカルバジン、及びサリドマイドから選択される薬剤を含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、多剤治療レジメンである。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＨｙｐｅｒＣＶＡＤレジメン（シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、デキサメサゾンとメトトレキサート及びシタラビンを交互に）を含む。いくつかの実施形態では、ＨｙｐｅｒＣＶＡＤレジメンはリツキシマブと組み合わせて投与される。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、Ｒ−ＣＨＯＰレジメン（リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソン）を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＦＣＲレジメン（ＦＣＲ（フルダラビン、シクロホスファミド、リツキシマブ））を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＦＣＭＲレジメン（フルダラビン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、リツキシマブ）を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＦＭＲレジメン（フルダラビン、ミトキサントロン、リツキシマブ）を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＰＣＲレジメン（ペントスタチン、シクロホスファミド、リツキシマブ）を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＰＥＰＣレジメン（プレドニソン、エトポシド、プロカルバジン、シクロホスファミド）を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタンまたは１３１Ｉ−トシツモマブを用いた放射免疫療法を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、自家幹細胞移植である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ナイトロジェンマスタード、例えば、ベンダムスチン、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、プレドニムスチン、トロホスファミドなど；ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファンなどのスルホン酸アルキル；カルボコン、チオテパ、トリアジコンなどのエチレンイミン；カルムスチン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンなどのニトロソウレア；エポキシド、例えばエトグルシドなど；その他のアルキル化剤、例えばダカルバジン、ミトブロニトール、ピポブロマン、テモゾロミドなど；葉酸類似体、例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、ラルチトレキセドなど；プリン類似体、例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ネララビン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アザシチジン、カペシタビン、カルモフール、シタラビン、デシタビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフールなど；ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビンなど；ポドフィロトキシン誘導体、例えば、エトポシド、テニポシドなど；コルヒチン誘導体、例えば、デメコルシンなど；タキサン、例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、パクリタキセルポリグルメックスなど；その他の植物アルカロイド及び天然産物、例えば、トラベクテジンなど；アクチノマイシン、例えば、ダクチノマイシンなど；アントラサイクリン、例えば、アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｎｃｉｎ）など；その他の細胞毒性抗生物質、例えば、ブレオマイシン、イクサベピロン、マイトマイシン、プリカマイシンなど；白金化合物、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンなど；メチルヒドラジン、例えば、プロカルバジンなど；増感剤、例えば、アミノレブリン酸、エファプロキシラル、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、テモポルフィンなど；プロテインキナーゼ阻害剤、例えば、ダサチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ（ｐａｚｏｎａｎｉｂ）、ソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムスなど；その他の抗腫瘍剤、例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、イリノテカン、ロニダミン、マソプロコール、ミルテホシン（ｍｉｌｔｅｆｏｓｅｉｎ）、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ロミデプシン、シチマジーンセラデノベック、チアゾフリン、トポテカン、トレチノイン、ボリノスタットなど；エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベノール（ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｎｏｌ）、エチニルエストラジオール、ホスフェストロール、リン酸ポリエストラジオールなど；プロゲストゲン、例えば、ゲストノロン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロールなど；ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、例えば、ブセレリン、ゴセレリン、リュープロレリン、トリプトレリンなど；抗エストロゲン、例えば、フルベストラント、タモキシフェン、トレミフェンなど；抗アンドロゲン、例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酵素阻害剤、アミノグルテチミド、アナストロゾール、エキセメスタン、ホルメスタン、レトロゾール、ボロゾールなど；その他のホルモンアンタゴニスト、例えばアバレリックス、デガレリクスなど；免疫賦活剤、例えば、ヒスタミン二塩酸塩、ミファムルチド、ピドチモド、プレリキサホル、ロキニメックス、チモペンチンなど；免疫抑制剤、例えば、エベロリムス、グスペリムス、レフルノミド、ミコフェノール酸、シロリムスなど；カルシニューリン阻害剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムスなど；その他の免疫抑制剤、例えば、アザチオプリン、レナリドミド、メトトレキサート、サリドマイドなど；ならびに放射性医薬品、例えば、イオベングアンなどから選択される。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、成長因子などから選択される。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、アンセスチム、フィルグラスチム、レノグラスチム、モルグラモスチム、ペグフィルグラスチム、サルグラモスチム；インターフェロン、例えば、天然ＩＦＮα、ＩＦＮα−２ａ、ＩＦＮα−２ｂ、ＩＦＮアルファコン−１、ＩＦＮα−ｎ１、天然ＩＦＮβ、ＩＦＮβ−１ａ、ＩＦＮβ−１ｂ、ＩＦＮγ、ペグインターフェロンα−２ａ、ペグインターフェロンα−２ｂなど；インターロイキン、例えば、アルデスロイキン、オプレルベキンなど；その他の免疫賦活剤、例えば、ＢＣＧワクチン、酢酸グラチラマー、ヒスタミン二塩酸塩、イムノシアニン、レンチナン、メラノーマワクチン、ミファムルチド、ペガデマーゼ、ピドチモド、プレリキサホル、ポリＩ：Ｃ、ポリＩＣＬＣ、ロキニメックス、タソネルミン、チモペンチンなど；免疫抑制剤、例えば、アバタセプト、アベチムス、アレファセプト、抗リンパ球免疫グロブリン（ウマ）、抗胸腺細胞免疫グロブリン（ウサギ）、エクリズマブ、エファリズマブ、エベロリムス、グスペリムス、レフルノミド、ムロモナブ（ｍｕｒｏｍａｂ）−ＣＤ３、ミコフェノール酸、ナタリズマブ、シロリムスなど；ＴＮＦα阻害剤、例えば、アダリムマブ、アフェリモマブ、セルトリズマブペゴル、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブなど；インターロイキン阻害剤、例えば、アナキンラ、バシリキシマブ、カナキヌマブ、ダクリズマブ、メポリズマブ、リロナセプト、トシリズマブ、ウステキヌマブなど；カルシニューリン阻害剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムスなど；その他の免疫抑制剤、例えば、アザチオプリン、レナリドミド、メトトレキサート、サリドマイドなどから選択される。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、セルトリズマブペゴル、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、インフリキシマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブなど、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、エドレコロマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トラスツズマブなど；免疫抑制剤、エクリズマブ、エファリズマブ、ムロモナブ（ｍｕｒｏｍａｂ）−ＣＤ３、ナタリズマブ；ＴＮＦアルファ阻害剤、例えば、アダリムマブ、アフェリモマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、インフリキシマブなど；インターロイキン阻害剤、バシリキシマブ、カナキヌマブ、ダクリズマブ、メポリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ；放射性医薬品、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ；追加のモノクローナル抗体、例えば、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アレムツズマブ、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体Ｘｍａｂ２５１３、抗ＭＥＴモノクローナル抗体ＭｅｔＭａｂ、アポリズマブ、アポマブ（ａｐｏｍａｂ）、アルシツモマブ、バシリキシマブ、二重特異性抗体２Ｂ１、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カプロマブペンデチド、シズツムマブ、クローディキシマブ、コナツムマブ、ダセツズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エプラツズマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、フィギツムマブ、フレソリムマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イノツズマブオゾガミシン、イピリムマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、マパツズマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、モノクローナル抗体ＣＣ４９、ネシツムマブ、ニモツズマブ、オレゴボマブ、ペルツズマブ、ラマクリマブ（ｒａｍａｃｕｒｉｍａｂ）、ラニビズマブ、シプリズマブ、ソネプシズマブ（ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、タネズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ベルツズマブ、ビジリズマブ、ボロシキシマブ、ザルツムマブから選択される。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、細胞シグナル伝達ネットワーク（例えば、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル伝達経路、Ｂ細胞受容体及びＩｇＥ受容体からのシグナル伝達）などの腫瘍微小環境に作用する薬剤から選択される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達阻害剤またはｓｙｃキナーゼ阻害剤である。一実施形態では、ｓｙｋ阻害剤はＲ７８８である。別の実施形態では、単なる例示として、エンザスタウリンなどのＰＫＣγ阻害剤である。
【０２１５】
腫瘍微小環境に作用する薬剤の例としては、ＰＩ３Ｋシグナル伝達阻害剤、ｓｙｃキナーゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、例えば、ダサチニブ、エルロチニブ、エベロリムス、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ（ｐａｚｏｎａｎｉｂ）、ソラフェニブ、スニチニブ、テムシロリムスなど；その他の血管新生阻害剤、例えばＧＴ−１１１、ＪＩ−１０１、Ｒ１５３０など；その他のキナーゼ阻害剤、例えばＡＣ２２０、ＡＣ４８０、ＡＣＥ−０４１、ＡＭＧ９００、ＡＰ２４５３４、Ａｒｒｙ−６１４、ＡＴ７５１９、ＡＴ９２８３、ＡＶ−９５１、アキシチニブ、ＡＺＤ１１５２、ＡＺＤ７７６２、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ８９３１、バフェチニブ、ＢＡＹ７３−４５０６、ＢＧＪ３９８、ＢＧＴ２２６、ＢＩ８１１２８３、ＢＩ６７２７、ＢＩＢＦ１１２０、ＢＩＢＷ２９９２、ＢＭＳ−６９０１５４、ＢＭＳ−７７７６０７、ＢＭＳ−８６３２３３、ＢＳＫ−４６１３６４、ＣＡＬ−１０１、ＣＥＰ−１１９８１、ＣＹＣ１１６、ＤＣＣ−２０３６、ディナシクリブ、ドビチニブ乳酸塩、Ｅ７０５０、ＥＭＤ１２１４０６３、ＥＮＭＤ−２０７６、ホスタマチニブジナトリウム、ＧＳＫ２２５６０９８、ＧＳＫ６９０６９３、ＩＮＣＢ１８４２４、ＩＮＮＯ−４０６、ＪＮＪ−２６４８３３２７、ＪＸ−５９４、ＫＸ２−３９１、リニファニブ、ＬＹ２６０３６１８、ＭＧＣＤ２６５、ＭＫ−０４５７、ＭＫ１４９６、ＭＬＮ８０５４、ＭＬＮ８２３７、ＭＰ４７０、ＮＭＳ−１１１６３５４、ＮＭＳ−１２８６９３７、ＯＮ０１９１９．Ｎａ、ＯＳＩ−０２７、ＯＳＩ−９３０、Ｂｔｋ阻害剤、ＰＦ−００５６２２７１、ＰＦ−０２３４１０６６、ＰＦ−０３８１４７３５、ＰＦ−０４２１７９０３、ＰＦ−０４５５４８７８、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−３７５８３０９、ＰＨＡ−７３９３５８、ＰＬＣ３３９７、プロゲニポイエチン（ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ）、Ｒ５４７、Ｒ７６３、ラムシルマブ、レゴラフェニブ、ＲＯ５１８５４２６、ＳＡＲ１０３１６８、ＳＣＨ７２７９６５、ＳＧＩ−１１７６、ＳＧＸ５２３、ＳＮＳ−３１４、ＴＡＫ−５９３、ＴＡＫ−９０１、ＴＫＩ２５８、ＴＬＮ−２３２、ＴＴＰ６０７、ＸＬ１４７、ＸＬ２２８、ＸＬ２８１ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ４１８、ＸＬ７６５などが挙げられる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達の阻害剤、例えば、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ０３２５９０１、ＡＲＲＹ−１４２８８６、ＳＢ２３９０６３、ＳＰ６００１２５、ＢＡＹ４３−９００６、ワートマニン、またはＬＹ２９４００２；Ｓｙｋ阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤；及び抗体（例えば、リツキサン）から選択される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリクス；抗背側化形態形成タンパク質１；抗アンドロゲン薬、前立腺癌；抗エストロゲン薬；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子調節剤；アポトーシス調節剤；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アクシナスタチン１；アクシナスタチン２；アクシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリア痘ＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタントラキノン；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファ��ラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルビシン塩酸塩；ホルフェニメクス；ホルメスタン；ホストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様成長因子１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセタート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；モノホスホリルリピドＡ＋マイコバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍抑制因子１ベース療法；マスタード抗がん剤；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節剤；一酸化窒素抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導因子；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；��ナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペグアスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡベース免疫調節剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質転移酵素阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ  １８６エチドロン酸；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣薬；セムスチン；老化由来阻害因子１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達阻害モジュレーター；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプタートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス（ｓｐａｒｆｏｓｉｃ）酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキサイド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣薬；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンスズ；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；泌尿生殖洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子療法；ベラレソール；ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマーから選択される。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然産物、またはホルモン、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシルなど）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチンなど）、またはトリアゼン（ダカルバジンなど）から選択される。代謝拮抗剤の例としては、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）、またはピリミジン類似体（例えば、シタラビン）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物がアジュバント療法と組み合わせて投与される。例えば、活性化アジュバント治療剤は、１つ以上の投与（例えば、ウイルスの腫瘍内注射）の前に、投与と同時に、または投与の後に投与される。例えば、アジュバント療法は、ＣｐＧ配列を含むＤＮＡ分子によるＴＬＲ９の活性化、または（例えば、ＲＮＡリガンドによる）ＴＬＲ９の活性化などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドの調節を含む。その他のアジュバント治療には、抗体または他のポリペプチドを刺激すること（例えば、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）による、ＣＤ４０またはＧＩＴＲそれぞれの活性化）が含まれる。さらに、ＳＴＩＮＧを調節する環状ジヌクレオチド（例えば、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ）が提供される。他の活性化アジュバントには、ＩＬ−３３などのインターロイキンが含まれる。場合によっては、本明細書に記載の医薬組成物がアジュバント療法と組み合わせて投与される。
【０２２０】
キット
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の腫瘍溶解性ウイルス、本明細書に記載の核酸配列、本明細書に記載のベクター、及び／または本明細書に記載の宿主細胞を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、単独で、またはそれを必要とする個体に投与されるさらなる治療剤との組み合わせのいずれかで、本明細書で上述したような医薬組成物を含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療方法における薬剤としての、本発明によるベクター及びウイルス産生細胞の使用のためのキットを提供する。特に、本発明のいくつかの実施形態によるベクター及びウイルス産生細胞は、対象の固形腫瘍の療法または治療に使用される。いくつかの実施形態では、治療効果は、組換えベクター及びウイルスの腫瘍溶解特性によって、ならびに治療用遺伝子の使用によってもたらされる。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、方法及び組成物と共に使用するためのキットを提供する。いくつかの実施形態は、１つ以上の固形腫瘍を有する対象の発症を減少させるため、または対象を治療するために使用されるワクチン組成物を備えるキットに関する。他の実施形態は、本明細書に記載の分子コンストラクトを作製及び使用するためのキットに関する。場合によっては、キットには、適切な容器、例えば、バイアル、チューブ、ミニチューブまたはマイクロチューブ、試験管、フラスコ、ビン、シリンジまたは他の容器も含まれる。追加の成分または薬剤が提供される場合、キットは、この薬剤または成分が置かれる１つ以上の追加の容器を含む。本明細書のキットは、コンストラクト、ワクチン組成物及び他の任意の試薬容器を、市販のために厳重に密封して収容するための手段も含む。このような容器には、その中に所望のバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形プラスチック容器が含まれる。所望により、他の抗ウイルス剤、抗真菌剤、または抗菌剤などの１つ以上の追加の薬剤が、記載されている組成物のために、例えばワクチンとして使用する組成物のために必要とされる。
【０２２３】
本明細書に言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２２４】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、記載された実施形態をさらに説明する。本発明の好ましい実施形態を本明細書に図示し、かつ説明したが、このような実施形態は単なる例示として提供されることが当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく多くの変形、変更、及び代用が想到されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替手段が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物を包含することが意図される。
【０２２５】
実施例１：偽型ＶＳＶ−Ｇの調製
次のプロトコルを採用して、ＶＳＶ−糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）にＨＩＶ１−ｇａｇタンパク質及びｒｅｖタンパク質を結合させることにより、例示的な偽型ＶＳＶ−Ｇを調製した。
【０２２６】
細胞培養及びトランスフェクション：次のパッケージングプラスミド：ＨＩＶ−１  ＧＡＧ／ＰＯＬ発現ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ＨＩＶ−１  ＲＥＶ発現ｐＲＳＶ／ＲＥＶ、及びｐＭＤ２．Ｇ  ５  ６０  ５．８  ＶＳＶ糖タンパク質のＤＮＡを、２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションのために混合し調製した。５００μＬの予備加熱したＯｐｔｉｍｅｍＩＩ培地にＤＮＡ混合物を添加した。ポリエチレンイミントランスフェクション試薬（ＰＥＩ）のワーキングストックを、１×ＰＢＳ、ｐＨ４．５中で１μｇ／μＬで調製し、ＰＥＩ：ＤＮＡの体積／重量比を４：１に維持しながら、８８μＬのワーキングストックを混合物に添加した。混合物を短時間ボルテックスし、室温で５〜１０分間放置して、ＰＥＩ：ＤＮＡトランスフェクション複合体を形成した。１０％の血清及び１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを添加した１５ｍＬのＤＭＥＭ中、１５ｃｍのディッシュあたり合計２．５×１０６の低継代（Ｐ２０未満）の２９３Ｔ細胞を播種した。トランスフェクションの２時間前に、細胞培養培地を吸引し、１５ｍＬの予備加熱した新鮮増殖培地（ＧＭ）に交換した。次に、トランスフェクション複合体を１５ｃｍの各プレートへ滴加し、短時間かき混ぜて混合し、１０％ＣＯ２、３５℃で８時間インキュベートした。８時間後、培地を２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１０％の血清を含有する１０ｍＬの新鮮増殖培地に交換した。次に、混合物をトランスフェクション後４８時間インキュベートした。
【０２２７】
ウイルスの回収：各ディッシュからの培地を除去し、プールし、０．２２μｍの低タンパク質結合／高速フローフィルタユニットを通してろ過して４℃で保管した。５ｍＬ容量の新鮮増殖培地を各ディッシュに添加して、４℃で一晩インキュベートした（トランスフェクション後６０〜７２時間）。先の工程と同様、各ディッシュからの培地の第２ロットを回収し、先の培地の産物と共にプールした。プラスミドのキャリーオーバーを、ＤＮＡＳＥ−Ｉ（１ｍｇ／ｍＬのストック）で消化して除去した。１μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２を添加した１μｇ／ｍＬのウイルス上清溶液を室温で３０分間インキュベートし、続いて４℃で２〜４時間インキュベートした。ろ過した上清は直接培養細胞上に使用することができ、またはアリコートにして−８０℃で保存することもできる。偽型ＶＳＶ−Ｇウイルスの上清は、所望により濃縮または精製することができる。
【０２２８】
実施例２：ＣＤ２８−ＣＡ１２５二重特異性抗体エンゲージャー分子を発現する偽型ＶＳＶ−Ｇの構築
偽型ＶＳＶ−Ｇを実施例１に記載されているように調製し、抗ＣＤ２８分子を含むエフェクタードメイン及び抗ＣＡ１２５分子を含む標的化ドメインを含むエンゲージャーポリペプチドをコードする核酸ならびに抗ＰＤ１免疫調節ペプチドをコードする核酸を発現するように、さらに処理した。得られた腫瘍溶解性ウイルスは、ＣＤ２８−ＣＡ１２５エンゲージャー分子及び抗ＰＤ１治療用分子（ＣＤ２８−ＣＡ１２５−ＰＤ１  ＶＳＶ−Ｇ）をコードする偽型腫瘍溶解性ＶＳＶ−Ｇウイルスである。
【０２２９】
実施例３：ＣＤ２８−ＣＡ１２５−ＰＤ１  ＶＳＶ−Ｇは、ヒトＴ細胞を活性化させ抗腫瘍活性を示す
ヒトＴ細胞は、偽型ＣＤ２８−ＣＡ１２５−ＰＤ１  ＶＳＶ−Ｇウイルスに感染する。ウイルス感染の２４〜４８時間後、Ｔ細胞培養培地を回収し、炎症誘発性サイトカインの存在を確認した。これらの結果は、ＣＤ２８−ＣＡ１２５−ＰＤ１  ＶＳＶ−Ｇに感染したヒトＴ細胞の細胞培養上清中のＩＦＮ−β及びＩＬ−２などの炎症誘発性サイトカインの存在から明らかなように、Ｔ細胞がＣＤ２８−ＣＡ１２５−ＰＤ１  ＶＳＶ−Ｇによって活性化されることを示す。
【０２３０】
ＫＡＴＯ３細胞株由来のＥｐｈＡ２過剰発現胃癌細胞を、偽型ＣＤ２８−ＣＡ１２５−ＰＤ１  ＶＳＶ−Ｇウイルスまたは非偽型ＣＤ２８−ＣＡ１２５−ＰＤ１  ＶＳＶウイルスに感染させ、細胞増殖を評価する。これらの結果は非偽型ＣＤ２８−ＣＡ１２５−ＰＤ１  ＶＳＶウイルスに感染したＫＡＴＯ３細胞と比較して、偽型ＣＤ２８−ＣＡ１２５−ＰＤ１  ＶＳＶ−Ｇに感染したＫＡＴＯ３細胞の細胞中では細胞増殖が顕著に減少することを示す。
【０２３１】
実施例４：ＣＤ１９−ＣＤ３、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃエンゲージャー分子はＣＤ３を介してＴ細胞に特異的に結合する
二部分（ＣＤ１９−ＣＤ３及びＳＩＲＰ１α−ＣＤ３）エンゲージャー分子及び三部分（ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ）エンゲージャー分子のＴ細胞への結合を評価した。簡単に述べると、２５，０００個のＴ細胞を２００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で１２日間刺激した。１２日後、Ｔ細胞を様々なエンゲージャー分子の濃度で（ＣＤ１９−ＣＤ３及びＳＩＲＰ１α−ＣＤ３については５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬまたは２０００ｎｇ／ｍＬで、ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃについては非希釈上清で）室温で２０分間、三連でインキュベートした。次に細胞を２回洗浄し、その後、さらに２０分間、５００ｎｇ／ｍＬの抗６ＸＨｉｓ  ＡＰＣ抗体で染色した。細胞を再度洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で処理して、死細胞をその後の分析から除外した。染色した細胞をＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓａサイトメーターによるフローサイトメトリーによって分析し、染色に対して陽性である細胞集団の百分率を二次のみの対照の２％に設定した。
【０２３２】
ＣＤ１９−ＣＤ３（図１９Ａ）、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（図１９Ｂ）及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ（図１９Ｃ）の結果は、二次抗体単独と比較した、エンゲージャー分子に対して陽性である細胞の百分率の増加に示されているように、これらの分子のＣＤ３結合部分がＣＤ３発現２９３Ｆ  Ｔ細胞に機能的に結合することを示す。具体的には、陽性細胞の百分率の用量依存的な増加がＣＤ１９−ＣＤ３（図１９Ａ）で観察され、一方で、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３コンストラクトはすべての濃度で最大の結合を示した。使用した非希釈のＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ上清の量は、大半のＴ細胞とのコンストラクトの結合をもたらした（図１９Ｃ）。
【０２３３】
この実験の結果は、図２０に定量化されている。具体的には、すべてのコンストラクトはエンゲージャー分子を添加していない試料と比較して、陽性Ｔ細胞百分率の著しい増加を示した。
【０２３４】
さらなる実験により、ＣＤ１９−ＣＤ３、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃの結合は、エンゲージャー分子の抗ＣＤ３ドメインとＴ細胞によって発現するＣＤ３との相互作用により媒介されることが示された。Ｔ細胞をエンゲージャー分子に曝露させる前に、Ｔ細胞を抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）と共にインキュベートした。ＯＫＴ３とのプレインキュベーションは、ＣＤ１９−ＣＤ３エンゲージャーの結合を阻害し、ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃエンゲージャーの結合を大幅に減少させた。ＯＫＴ３とのプレインキュベーションによるＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャーの結合阻害の欠如（図２１Ｃ）は、これらの試料におけるＯＫＴ３によるＣＤ３の阻害が不完全であることに起因する可能性が高いと考えられる。
【０２３５】
実施例５：ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３コンストラクトはＣＤ４７に特異的に結合する
ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャーコンストラクトの結合特異性を測定するため、実験を実施した。Ｒａｊｉ細胞をＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャーと室温で２０分間、プレインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、蛍光標識した抗ＣＤ４７モノクローナル抗体と室温で２０分間インキュベートして、その後、細胞を洗浄しフローサイトメトリーで分析した。ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャーとプレインキュベートされなかったＲａｊｉ細胞は、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の顕著な結合を示した（図２２、ＩｇＧ対照のヒストグラムと抗ＣＤ４７のヒストグラムとの対比）。Ｒａｊｉ細胞のＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャーとのプレインキュベーションは、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の結合を遮断した（図２２、抗ＣＤ４７のヒストグラムと抗ＣＤ４７＋ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３のヒストグラムとの対比）。
【０２３６】
実施例６：ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャー分子及びＣＤ１９−ＣＤ３エンゲージャー分子の標的細胞への結合
ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ及びＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥのＲａｊｉ（ＣＤ１９＋ＣＤ４７＋、図２３）、Ｕ２ＯＳ（ＣＤ１９−ＣＤ４７＋、図２４）、ＧＢＭ３０−ｌｕｃ（ＣＤ１９−ＣＤ４７＋、図２５）、及びＵ２５１（ＣＤ１９−ＣＤ４７＋、図２６）標的細胞型へ結合する能力を測定するために、実験を実施した。標的細胞型ごとに、細胞を５００ｎｇ／ｍＬまたは１０００ｎｇ／ｍＬの（ｉ）Ｈｉｓタグ付き可溶性ＳＩＲＰ１α、（ｉｉ）ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥまたは（ｉｉｉ）ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥのいずれかで処理した。次に、細胞を蛍光標識した抗Ｈｉｓ抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２３７】
ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＣＤ１９−ＣＤ３のＣＤ１９＋ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞への結合の結果を、図２３に示す。ＩｇＧ対照のヒストグラムと比較して、エンゲージャーのヒストグラムの右方向へのシフトに示されているように、可溶性ＳＩＲＰ１α、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ、及びＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥは、陰性対照のＩｇ（２°のみ）と比較して、Ｒａｊｉ細胞に結合することが可能であった（図２３Ａ）。ＢｉＴＥ陽性細胞の百分率を示す結合データの定量化を、図２３Ｂに示す。
【０２３８】
ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＣＤ１９−ＣＤ３のＣＤ１９−ＣＤ４７＋Ｕ２ＯＳ細胞への結合の結果を、図２４に示す。ＩｇＧ対照のヒストグラムと比較して、エンゲージャーのヒストグラムの右方向へのシフトに示されているように、陰性対照のＩｇ（２°のみ）と比較して、可溶性ＳＩＲＰ１α、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥは使用したすべての濃度においてＵ２ＯＳ細胞に結合することが可能であった（図２４Ａ）。ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥはＵ２ＯＳ細胞との結合が不可能であったが、これはＵ２０Ｓ細胞によるＣＤ１９の発現の欠如に基づいて予想されていた。ＢｉＴＥ陽性細胞の百分率を示す結合データの定量化を、図２４Ｂに示す。
【０２３９】
ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＣＤ１９−ＣＤ３のＣＤ１９−ＣＤ４７＋ＧＢＭ３０−ｌｕｃ細胞への結合の結果を、図２５に示す。ＩｇＧ対照のヒストグラムと比較して、エンゲージャーのヒストグラムの右方向へのシフトに示されているように、陰性対照のＩｇ（２°のみ）と比較して、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥは使用したすべての濃度においてＧＢＭ３０−ｌｕｃ細胞に結合することが可能であった（図２５Ａ）。対照的に、ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥはＧＢＭ３０細胞との結合が不可能であったが、これはＧＢＭ３０−ｌｕｃ細胞によるＣＤ１９の発現の欠如に基づいて予想されていた。ＢｉＴＥ陽性細胞の百分率を示す結合データの定量化を、図２５Ｂに示す。
【０２４０】
ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＣＤ１９−ＣＤ３のＣＤ１９−ＣＤ４７＋Ｕ２５１細胞への結合の結果を、図２６に示す。ＩｇＧ対照のヒストグラムと比較して、エンゲージャーのヒストグラムの右方向へのシフトに示されているように、陰性対照のＩｇ（２°のみ）と比較して、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥは使用したすべての濃度においてＵ２５１細胞に結合することが可能であった（図２６Ａ）。対照的に、ＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥはＵ２５１細胞との結合が不可能であったが、これはＵ２５１細胞によるＣＤ１９の発現の欠如に基づいて予想されていた。ＢｉＴＥ陽性細胞の百分率を示す結合データの定量化を、図２６Ｂに示す。
【０２４１】
実施例７：ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ  ＴｉＴＥのＵ２５１細胞への結合は、ＦｃγＲではなくＣＤ４７によって媒介される
ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ  ＴｉＴＥコンストラクトは標的細胞に結合することができる２つのドメイン（抗ＰＤＬ１及びＦｃドメイン）を含むことから、これらのコンストラクトの結合特異性を評価するために実験を実施した。ＣＤ１９−ＣＤ４７＋Ｕ２５１細胞を、２μｇ／ｍＬの蛍光標識した抗ＰＤＬ１抗体、アイソタイプ対照、またはＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃのトランスフェクション上清で処理した。陰性対照Ｉｇと比較して、ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ  ＴｉＴＥはＵ２５１細胞に結合した（図２７Ｂ）。この観察された結合が、ＣＤ４７との相互作用によるものか、それともＵ２５１細胞によって発現するＦｃγＲとの相互作用によるものかを評価するために、Ｕ２５１細胞上のＦｃγＲの発現を測定した。細胞を２μｇ／ｍＬのフルオロフォア結合抗ＣＤ１６／３２（ＦｃγＲＩＩＩ／ＦｃγＲＩＩを認識）モノクローナル抗体またはフルオロフォア結合抗ＣＤ６４（ＦｃγＲＩを認識）モノクローナル抗体とともに、室温で２０分間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａサイトメーターを使用してフローサイトメトリーで分析した。図２７Ｃに示すように、Ｕ２５１細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ細胞を発現せず、ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃコンストラクトの結合は、ＦｃγＲではなく、ＣＤ４７との相互作用によって媒介されたことが示された。
【０２４２】
実施例８：ＣＤ１９−ＣＤ３、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃコンストラクトは標的細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性殺傷を刺激する
ＣＤ１９−ＣＤ３、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃコンストラクトの、標的細胞の殺傷を媒介する能力を測定するために実験を実施した。簡単に述べると、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２及びＤｙｎａｂｅａｄｓの存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞を８〜１２日間刺激した。標的細胞と共培養する前に、すべてのＤｙｎａｂｅａｄｓを磁石で除去し、細胞を洗浄してＩＬ−２を除去した。Ｒａｊｉ（図２８）、ＴＨＰ１（図２９）、Ｕ２５１（図３０）、及び２９３Ｆ（図３１）標的細胞を、プレーティング前に蛍光膜色素ＰＫＨ６７の緑色で標識した。次に、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を、１０００ｎｇ／ｍＬのＣＤ１９−ＣＤ３  ＢｉＴＥ、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ、またはＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃのトランスフェクション上清の１：３の希釈物と共に、標的細胞と１：１のエフェクター対標的比で共培養した。標的細胞とエフェクター細胞の共培養物を１８時間インキュベートし、その後７−ＡＡＤで染色して、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓａサイトメーターでフローサイトメトリーによる生死分析を実施した。
【０２４３】
これらの実験結果は、ＣＤ１９−ＣＤ３、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃエンゲージャーコンストラクトがすべて、Ｒａｊｉ標的細胞のエフェクター細胞媒介性の死を誘導可能であったことを示しており（図２８）、Ｒａｊｉ細胞上のＣＤ１９−ＣＤ３、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃエンゲージャー分子の各々のＥＣ５０を以下の表５に示す。
【０２４４】
表５：Ｒａｊｉ細胞上のエンゲージャー分子のＥＣ５０
【表５】
2021508477.tif 000038
【０２４５】
これらの実験結果はさらに、ＣＤ１９−ＣＤ３コンストラクトではなくＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃエンゲージャーコンストラクトが、ＴＨＰ１標的細胞のエフェクター細胞媒介性の死を誘導可能であったことを示す（図２９）。これは、ＴＨＰ１細胞によるＣＤ１９の発現の欠如／比較的低い発現に起因する可能性が高いと考えられる。
【０２４６】
さらに、ＰＤＬ１−ＣＤ３−ＦｃエンゲージャーコンストラクトはＵ２５１標的細胞のエフェクター細胞媒介性の死を誘導可能であったが（図３０）、Ｕ２５１細胞によるＣＤ１９の発現の欠如に起因して、ＣＤ１９−ＣＤ３コンストラクトはＵ２５１細胞のエフェクター細胞媒介性の死を誘導しなかった。Ｕ２５１細胞上のＣＤ１９−ＣＤ３及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃコンストラクトの各々のＥＣ５０を以下の表６に示す。
【０２４７】
表６：Ｕ２５１細胞上のエンゲージャー分子のＥＣ５０
【表６】
2021508477.tif 000039
【０２４８】
さらに、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャーコンストラクトは２９３Ｆ標的細胞のエフェクター細胞媒介性の死を誘導可能であり（図３１）、これは、対照のオステオポンチン融合タンパク質（ＯＰＮ  １）と比較して、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３含有培養物中の細胞死が増加したことにより示されている。２９３Ｆ細胞上のＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャー分子のＥＣ５０を以下の表７に示す。
【０２４９】
表７：２９３Ｆ細胞上のＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャー分子のＥＣ５０
【表７】
2021508477.tif 000040
【０２５０】
実施例９：ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ  ＢｉＴＥは、初代ＮＫ細胞のＵ２５１細胞の殺傷を増強する
ＰＤＬ１−ＣＤ３−ＦｃコンストラクトのＮＫ細胞媒介性の標的細胞の殺傷を誘導する能力を評価するために、実験を実施する。簡単に述べると、Ｕ２５１細胞を細胞膜色素ＰＫＨ６７の緑色で標識し、次いで播種して一晩ウェルに接着させる（図３２）。次に、初代ＮＫ細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、ウイルスによって産生された様々な量のＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃタンパク質と共に、１：１のエフェクター対標的比で各ウェルに添加する。エフェクター／標的細胞の共培養物を、７−ＡＡＤ染色による生死分析の前に、３７℃で６時間インキュベートする。染色した細胞をＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓａサイトメーターによるフローサイトメトリーにより分析する。
【０２５１】
これらの結果はウイルスによって産生されたＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ化合物が、Ｕ２５１などの標的細胞のＮＫ細胞媒介性の死を刺激することができることを立証する。
【０２５２】
実施例１０：ｏＨＳＶ感染Ｖｅｒｏ細胞はＳＩＲＰ−１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥを発現する
ここに記載されている腫瘍溶解性ウイルスがエンゲージャー分子を産生できることを立証するため、Ｖｅｒｏ細胞を、ショートリンカー（ＳＬ）（ＯＮＣＲ−０８５；２Ａ５Ｂ  ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＳＬ）ＢｉＴＥ）もしくはロングリンカー（ＬＬ）  （ＯＮＣＲ−０８７；２Ａ５Ｂ  ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＬＬ）ＢｉＴＥ）のいずれかを有するＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥ発現ｏＨＳＶ（図３２）またはＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃ  ＴｉＴＥ発現ｏＨＳＶ（ＯＮＣＲ−０８９、図３３）に感染させた。細胞を３日間感染させ、その後、感染細胞の上清を１００Ｋ  ＭＷＣＯの限外ろ過膜に通してあらゆるウイルス粒子を除去した。フロースルーを１０Ｋ  ＭＷＣＯの限外ろ過膜で濃縮した。次いで、濃縮したウイルス上清及び１００ｎｇ、５０ｎｇ、２５ｎｇ、または１２．５ｎｇの精製したＳＩＲＰ１α−ＣＤ３タンパク質またはＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃタンパク質をＰＡＧＥによって分析し、その後、ウイルス上清に存在するエンゲージャータンパク質の量を測定するために、抗６ｘＨｉｓ検出抗体を用いてウエスタンブロッティングした。
【０２５３】
結果は、ＯＮＣＲ−０８５またはＯＮＣＲ−０８７のいずれかに感染した細胞は、それぞれＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＳＬ）タンパク質及びＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＬＬ）タンパク質を産生したことを立証する（図３２）。さらに、ＯＮＣＲ−０８９に感染した細胞は、ＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃタンパク質を産生した（図３３）。１００Ｋ及び１０ＫのＡｍｉｃｏｎろ過ならびに濃縮工程の残存ウイルスを除去する能力を、ウエスタンブロット法によって評価した。ウイルス上清を清澄化するためのワークフローは、上清の低速遠心分離、その後の０．８μｍのろ過膜を通したろ過で構成される。次いで、上清ろ液をＡｍｉｃｏｎ  １００ｋＤａフィルタに通してウイルスを取り込み、次いでろ液をＡｍｉｃｏｎ  １０ｋＤａフィルタに通してろ過して残留タンパク質を取り込む。ウイルス感染細胞の上清のアリコートをＡｍｉｃｏｎフィルタで処理する前後に採取し、抗ＨＳＶポリクローナル抗体でブロッティングして、ＨＳＶの存在を確認した。これらの結果は、エンゲージャーコンストラクトの精製に使用した限外ろ過工程がウイルスを効果的に除去したことを示す（図３５）。したがって、これらのエンゲージャーコンストラクトの存在下で観察されたあらゆる標的細胞の殺傷は、標的細胞のウイルス感染の結果ではなく、エンゲージャーコンストラクトそのものによるものである。
【０２５４】
実施例１１：ウイルスによって産生されたＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャーコンストラクト及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃエンゲージャーコンストラクトは、標的細胞のエフェクター細胞媒介性の殺傷を誘導した
ウイルスによって産生されたエンゲージャー分子（ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３コンストラクト及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃコンストラクト）の標的細胞殺傷を媒介する能力を評価するために実験を実施した。簡単に述べると、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＳＬ）、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＬＬ）及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃタンパク質を、実施例１０に記載の通りにＶｅｒｏ細胞から調製した。５０μＬの得られたＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＳＬ）、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＬＬ）及びＰＤＬ１−ＣＤ３−Ｆｃエンゲージャータンパク質のタンパク質試料を、２０％ＦＢＳ含有組織培養培地で１：１に希釈した。次いで、希釈したエンゲージャータンパク質を、蛍光標識したＵ２５１標的細胞と標的対エフェクター比１：１で１８時間共培養した活性化ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞と共にインキュベートした。Ｕ２５１細胞の細胞死を、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓａサイトメーターによるフローサイトメトリーによって評価した。
【０２５５】
この実験の結果は、ウイルスによって産生されたエンゲージャーコンストラクトがＵ２５１標的細胞のＴ細胞媒介性殺傷を誘導することを実証する（図３４Ａ）。これらの結果は、図３４Ｂで定量化されている。
【０２５６】
実施例１２：２９３Ｔ細胞からのＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＰＤＬ１−Ｆｃ化合物の発現
ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャー分子及びＰＤＬ１−Ｆｃ治療用分子をコードする２つの発現プラスミドを生成した。一方のコンストラクトには、ＨＡタグ付きＰＤＬ１−Ｆｃをコードする第１の遺伝子が含まれ、第１の遺伝子は、Ｈｉｓタグ付きＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードする第２の遺伝子と連結していた。ＳＩＲＰ１αのアミノ酸配列を、単一アミノ酸リンカー（すなわち、ショートリンカー）によって抗ＣＤ３  ｓｃＦｖと連結させた（ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＳＬ）、図３７）。もう一方のコンストラクトには、ＰＤＬ１−Ｆｃをコードする第１の遺伝子が含まれ、第１の遺伝子はＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥをコードする第２の遺伝子と連結していた。ＳＩＲＰ１αのアミノ酸配列を、Ｇ４Ｓリンカー（すなわち、ロングリンカー）によって抗ＣＤ３  ｓｃＦｖと連結させた（ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＬＬ）、図３８）。これらのコンストラクトをプラスミド（図３９）に挿入し、得られたＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＰＤＬ１−Ｆｃ発現プラスミドを、２９３  Ｆｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ  Ｔ細胞にトランスフェクトした。プラスミドのトランスフェクションの４日後、培養上清を回収した。
【０２５７】
ＨｉＴｒａｐカラムのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、抗ＰＤＬ１−Ｆｃ化合物を培養上清から精製した。簡単に述べると、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＬＬ）またはＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＰＤＬ１−Ｆｃ（ＬＬ）発現プラスミドのいずれかでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清をカラムに充填し、ＨＡタグのカラムへの結合によって、抗ＰＤＬ１−Ｆｃ化合物を精製した。抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロット法によるＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥの検出のため、フロースルーを回収した（図４０Ｂ）。カラムを洗浄バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。結合した抗ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質をＩｇＧ溶出バッファー（ｐＨ２．８、Ｐｉｅｒｃｅ）で溶出し、ｐＨ８の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで直ちに中和した。
【０２５８】
次いで、異なる溶出画分の抗ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質の含有量をクーマシー染色により可視化した。簡単に述べると、溶出画分を１８０ボルトで１時間、ＭＯＰＳバッファー中で４％〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲルで泳動させた。ゲルを１時間、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ中で染色し、次いで水で脱染した。各溶出画分の抗ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質含有量を図４０Ａに示す。クーマシー分析後、溶出画分を合わせて４℃でＰＢＳに対して透析し、次いで、抗ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質の全濃度をＢＣＡアッセイで測定した。
【０２５９】
実施例１３：単離されたＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質は、標的細胞のＴ細胞媒介性の死を刺激する
抗ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質の標的細胞のエフェクター細胞媒介性の死を誘導する能力を、ＰＤ１／ＰＤＬ１遮断アッセイによって評価した。アッセイの全体的な模式図を図４１Ａ〜４１Ｂに示す。簡単に述べると、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＤＬ１発現標的細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）と共培養した。次に、実施例１２に記載されているように単離された様々な濃度の抗ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質を培養物に加えた。使用した抗ＰＤＬ１−Ｆｃの最高濃度は５０μｇ／ｍＬであった。次いで、２．５倍の段階希釈を８回実施し、抗ＰＤＬ１−Ｆｃの濃度の残りを生成した。抗ＰＤＬ１−Ｆｃの存在下（図４１Ｂ）及び非存在下（図４１Ａ）におけるＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞毒性アッセイにより、細胞死を分析した。結果は、図４１Ｃに定量化されている。抗ＰＤＬ１−ＦｃのＥＣ５０を表８に示す。これらの結果は、本明細書に記載の発現コンストラクトから生成された抗ＰＤＬ１−Ｆｃ治療用分子が、標的細胞のエフェクター細胞媒介性の死を媒介可能であることを立証する。
【０２６０】
表８．抗ＰＤＬ１−Ｆｃ化合物のＥＣ５０
【表８】
2021508477.tif 000041
【０２６１】
実施例１４：ｏＨＳＶ感染Ｖｅｒｏ細胞は、ＭＭＰ９治療用分子及び抗ＰＤＬ１−Ｆｃ治療用分子を発現する
実施例１０に記載されているようにエンゲージャー分子を産生することに加えて、ここに記載されている腫瘍溶解性ウイルスがＭＭＰ９治療用分子及び抗ＰＤＬ１−Ｆｃ治療用分子を産生できることを立証するために実験を実施する。Ｖｅｒｏ細胞を、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＰＤＬ１−ＦｃコンストラクトＢｉＴＥ発現ｏＨＳＶ（図３７及び図３８）またはＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＭＭＰ９コンストラクト発現ｏＨＳＶ（図１８Ａ及び図１８Ｂ）に感染させる。細胞を３日間感染させ、その後、感染細胞の上清を１００Ｋ  ＭＷＣＯの限外ろ過膜に通してあらゆるウイルス粒子を除去する。フロースルーを１０Ｋ  ＭＷＣＯの限外ろ過膜で濃縮する。ＭＭＰ９及び抗ＰＤＬ１−Ｆｃを、実施例１１に概説されているプロトコルに従って、ろ過して濃縮した上清から精製する。プロテインＡで単離したＭＭＰ９及び抗ＰＤＬ１画分をＰＡＧＥで分析した後、クーマシー染色する。プロテインＡのフロースルー中に存在するＳＩＲＰ１α−ＣＤ３  ＢｉＴＥを抗６ｘＨｉｓ検出抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析する。
【０２６２】
結果は、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＰＤＬ１−ＦｃコンストラクトまたはＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＭＭＰ９コンストラクトのいずれかをコードするｏＨＳＶベクターに感染した細胞は、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＳＬ）ＢｉＴＥタンパク質及びＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＬＬ）ＢｉＴＥタンパク質、ＭＭＰ９、ならびに抗ＰＤＬ１−Ｆｃを産生することを立証する。
【０２６３】
実施例１５：ウイルスによって産生されたＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＭＭＰ９エンゲージャーコンストラクト及びＳＩＲＰ１α−ＣＤ３／ＰＤＬ１−Ｆｃエンゲージャーコンストラクトは、標的細胞のエフェクター細胞媒介性の殺傷を誘導する
ウイルスによって産生されたエンゲージャー分子（ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３）ならびに治療用分子（ＭＭＰ９及び抗ＰＤＬ１−Ｆｃ）の標的細胞殺傷を媒介する能力を評価するために、実験を実施する。簡単に述べると、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＳＬ）、ＳＩＲＰ１α−ＣＤ３（ＬＬ）、ＭＭＰ９、及び抗ＰＤＬ１−Ｆｃタンパク質を、実施例１３に記載されているようにＶｅｒｏ細胞から調製する。５０μＬの得られたタンパク質試料を、２０％ＦＢＳ含有組織培養培地で希釈する。次いで、希釈したタンパク質を、活性化ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞またはＮＫエフェクター細胞と共にインキュベートし、蛍光標識した標的細胞と標的対エフェクター比１：１で１８時間共培養した。標的細胞の細胞死を、ＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓａサイトメーターによるフローサイトメトリーによって評価する。
【０２６４】
この実験の結果は、ウイルスによって産生されたＳＩＲＰ１α−ＣＤ３エンゲージャーコンストラクト及び治療用分子ＭＭＰ９及び抗ＰＤＬ１−Ｆｃが、標的細胞のＴ細胞及び／またはＮＫ細胞媒介性殺傷を誘導することを実証する。
【０２６５】
実施例１６：単離されたＦＡＰ−ＣＤ３エンゲージャー分子はＦＡＰ及びＴ細胞に結合する
二部分（ＦＡＰ−ＣＤ３）エンゲージャー分子のＴ細胞への結合を評価する。簡単に述べると、２５，０００個のＴ細胞を２００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２で１２日間刺激する。１２日後、Ｔ細胞を様々なエンゲージャー分子の濃度で（５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬまたは２０００ｎｇ／ｍＬ）、室温で２０分間、三連でインキュベートする。次に細胞を２回洗浄し、その後、さらに２０分間、５００ｎｇ／ｍＬの抗６ＸＨｉｓ  ＡＰＣ抗体で染色する。細胞を再度洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で処理して、死細胞をその後の分析から除外する。染色した細胞をＢＤ  ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓａサイトメーターによるフローサイトメトリーによって分析し、染色に対して陽性である細胞集団の百分率を二次のみの対照の２％に設定する。
【０２６６】
二部分（ＦＡＰ−ＣＤ３）エンゲージャー分子の腫瘍細胞への結合の評価。簡単に述べると、ＦＡＢを安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３または陰性対照細胞（ＨＥＫ２９３）を、５００ｎｇ／ｍＬまたは１０００ｎｇ／ｍＬの（ｉ）Ｈｉｓタグ付き可溶性ＦＡＰまたは（ｉｉ）Ｈｉｓタグ付きＦｃの陰性対照タンパク質のいずれかで処置する。細胞を蛍光標識した抗Ｈｉｓ抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析する。
【０２６７】
実施例１７：ＦＡＰ−ＣＤ３エンゲージャー分子をコードする再標的化されたｏＨＳＶの静脈内送達
ＨＳＶのｇＤ糖タンパク質を、ＥＧＦＲ受容体を介してウイルス侵入を媒介するように改変し、ＦＡＰ−ＣＤ３をコードするように設計した。ＦＡＰ−ＣＤ３をコードする再標的化されたＯＮＣＲウイルスの腫瘍殺傷を誘導する能力を試験するために、５×１０６個のＡ４３１細胞をヌードマウスの右側腹部に皮下移植する。側腹部の腫瘍が約１００ｍｍ３に達した時点で、マウスに１×１０６ＰＦＵ、３×１０６ＰＦＵ、１×１０７ＰＦＵのＯＮＣＲ−ＥＧＦＲ−（ＦＡＰ−ＣＤ３）の単回用量、または溶媒（ＰＢＳ）を静脈内注射する。腫瘍測定値を２〜３日ごとに記録する。腫瘍増殖抑制を、溶媒対照処置群と対比して算出する。
【０２６８】
実施例１８：ＦＡＰ−ＣＤ３エンゲージャー分子をコードするｏＨＳＶの腫瘍内送達
二部分ＦＡＰ−ＣＤ３エンゲージャー分子をコードするｏＨＳＶのｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を抑制する能力を評価するために実験を実施した。ｓをコードするＯＮＣＲ−１４８ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖抑制を誘導することができる。簡単に述べると、線維芽細胞活性化タンパク質（ＭＣ３８−ＦＡＰ）を発現している５×１０５個のマウス結腸癌細胞を、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側腹部に皮下移植した。腫瘍が約１００ｍｍ３の体積に達した時点でマウスを実験群に分け、３×１０６ＰＦＵのｏｓＨＳＶ  ＯＮＣＲ−１４８（二部分ＦＡＰ−ＣＤ３をコードしている）またはＯＮＣＲ−１４６（二部分ＦＡＰ−ＣＤ１９をコードしている陰性対照ウイルス）を腫瘍内注射（ＩＴ）した。溶媒対照にはＰＢＳを腫瘍内注射した。３日ごとに反復投与し、合計で３回用量を投与した。腫瘍の測定を電子ノギスを用いて週に２回実施し、変形楕円体式（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ  ｆｏｒｍｕｌａ）：ＴＶ＝１／２（長さ×幅２）に基づいて腫瘍体積（ＴＶ）を算出した。腫瘍増殖の抑制を溶媒投与群と対比して判定した。
【０２６９】
ｏＨＳＶによるＦＡＰ−ＣＤ３エンゲージャー分子の発現の腫瘍増殖に対する作用を評価するため、マウスを実験群に分け、３×１０６ＰＦＵのＯＮＣＲ−１４８（二部分ＦＡＰ−ＣＤ３をコードしているｏＨＳＶ）またはＯＮＣＲ−１４６（二部分ＦＡＰ−ＣＤ１９をコードしている陰性対照ウイルス）を腫瘍内注射（ＩＴ）した。図４２に示されているように、ＯＮＣＲ−１４８で処置したマウスは、注射した（同側の）腫瘍及び遠位の（対側の）腫瘍のいずれにおいても著しい腫瘍増殖抑制を示した。
【０２７０】
腫瘍微小環境内でＴ細胞活性化及び抗原提示を促進するペイロード（ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４）の腫瘍増殖抑制に対する付加的な作用を判定するために、さらなる実験を実施した。マウスに、溶媒対照、３×１０６ＰＦＵ／用量のＯＮＣＲ−１４８（二部分ＦＡＰ−ＣＤ３をコードしているｏＨＳＶ）、３×１０６ＰＦＵ／用量のＯＮＣＲ−１５３（ＩＬ−１２、ＣＸＣＬ１０、及びＣＣＬ４をコードしているｏＨＳＶ）、または（総ウイルス量３×１０６ＰＦＵ／用量に対して）それぞれ１．５×１０６ＰＦＵのＯＮＣＲ−１４８及びＯＮＣＲ−１５３の混合物を腫瘍内注射した。追加の対照群を、ＯＮＣＲ−１４６（二部分ＦＡＰ−ＣＤ１９をコードしている陰性対照ウイルス）またはＯＮＣＲ−１４６及びＯＮＣＲ−１５３で処置した。
【０２７１】
図４２に示すように、ＯＮＣＲ−１４８及びＯＮＣＲ−１５３は、組み合わせた場合、いずれかのウイルス単独で観察されたものよりも強力な抗腫瘍効果を誘発した。併用ウイルス療法は、注射した（同側の）腫瘍及び遠位の（対側の）腫瘍においてそれぞれ９０％及び８０％の腫瘍増殖抑制をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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