(57)【要約】  本発明は、強直性脊椎炎(AS)の診断、予後および治療のためのバイオマーカーおよび標的に関する。本発明はまた、ASの動物モデルを作製する方法、それから作製された動物モデル、およびそのような動物モデルを使用してASの治療において薬学的に活性な薬剤をスクリーニングする方法に関する。
2021532376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
強直性脊椎炎(AS)を検出するため、および/またはASのレントゲン写真の重症度の進行のリスクを予測するための方法であって、
(i)対象からの生体サンプルを提供すること；および
(ii)サンプル中のASマーカーとしてALPL遺伝子産物を検出すること；
を含む、方法。
【請求項２】
遺伝子産物が、タンパク質またはRNA転写物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ALPL遺伝子産物あ、非特異的アルカリホスファターゼ(TNAP)である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ALPL遺伝子産物が、骨特異的TNAP(BAP)である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
マーカーが、ALPL遺伝子産物に特異的に結合する薬剤で検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
検出が、イムノアッセイ、質量分析アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション検出アッセイ、および/または逆トランスフェラーゼ−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生体サンプルが、体液サンプルまたは組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出の結果を参照レベルと比較すること、比較がALPL遺伝子産物のレベルの上昇を示す場合、対象をASを有する、および/またはASの放射線写真の重症度の進行のリスクがあると特定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ASの発生またはASのレントゲン写真の重症度の進行のリスクを確認するために、対象にさらなるAS診断アッセイを適用することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
レントゲン写真の重症度が、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、脊髄強直性およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるASの1つ以上のレントゲン写真的特徴を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
抗AS治療法および/または薬剤で対象を治療することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
抗AS治療法が、外科手術および/または物理療法を含み、薬剤が、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIS)、免疫抑制剤、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)ブロッカー阻害剤、抗インターロイキン-6阻害剤、インターロイキン17A阻害剤および/またはTNAP阻害剤を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
AS患者におけるASの進行を監視するための方法であって、
(a)第1の時点で、患者からの第1の生体サンプルを提供すること；
(b)第1の時点より後の第2の時点で、患者からの第2の生体サンプルを提供すること；
(c)第1および第2の生体サンプル中のASマーカーとしてのALPL遺伝子産物のレベルを測定すること；および
(d)第1および第2の生体サンプル中のALPL遺伝子産物のレベルに基づいて患者のAS進行を決定すること(ここで、第1の生体サンプルと比較して第2の生体サンプル中のALPL遺伝子産物のレベルの上昇は、AS進行を示す)；
を含む、方法。
【請求項１４】
ASの進行が、ASのレントゲン写真の重症度のレベルが高いことを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
レントゲン写真の重症度が、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、脊髄強直性およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるASの1つ以上のレントゲン写真的特徴を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
治療有効量のTNAP阻害剤を、必要としている対象に投与することを含む、ASの治療方法。
【請求項１７】
方法が、ASの1つ以上の状態を軽減または緩和するのに有効である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ASの状態が、レントゲン写真の重症度を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
レントゲン写真の重症度が、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、脊髄強直性およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるASの1つ以上のレントゲン写真的特徴を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
TNAP阻害剤が、レバミゾール、硫酸ベリリウム四水和物、パミドロネートまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
TNAP阻害剤が、抗AS治療法および/または他の薬剤と組み合わせて投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ASを治療するための薬剤を製造するためのTNAP阻害剤の使用。
【請求項２３】
薬剤が、ASの1つ以上の状態を軽減または緩和するのに有効である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
ASの状態が、レントゲン写真の重症度を含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
レントゲン写真の重症度が、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、脊髄強直性およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるASの1つ以上のレントゲン写真的特徴を含む、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ASの治療における使用のためのTNAP阻害剤。
【請求項２７】
ASの1つ以上の症状/状態を軽減または緩和することにおける使用のための、請求項２６に記載のTNAP阻害剤。
【請求項２８】
ASの状態が、レントゲン写真の重症度を含む、請求項２７に記載のTNAP阻害剤。
【請求項２９】
レントゲン写真の重症度が、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、脊髄強直性およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるASの1つ以上のレントゲン写真的特徴を含む、請求項２８に記載のTNAP阻害剤。
【請求項３０】
ASの非ヒト動物モデルを作成するための方法であって、
(i)AS患者からの脊椎強直に罹患した脊椎の骨髄からの骨髄間葉系幹細胞(BMSC)を提供するステップ；
(ii)免疫不全マウスの腰椎セグメントの薄層に隣接する領域にBMSCを移植するステップ；および
(iii)ASの1つ以上の症状/状態を誘発するのに適した状態で、動物を成長させるステップ；
を含む、方法。
【請求項３１】
腰椎セグメントが、L4〜L5であり、および/またはASの1つ以上の症状/状態が、レントゲン写真の重症度を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
レントゲン写真の重症度が、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、脊髄強直性およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるASの1つ以上のレントゲン写真的特徴を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項３０に記載の方法によって作成されたASの非ヒト動物モデル。
【請求項３４】
ASの治療に有効な薬剤をスクリーニングする方法であって、
(i)請求項３０に記載の方法によって作成された、ASの非ヒト動物モデルに試験薬剤を投与するステップ；および
(ii)ASの状態/症状の少なくとも1つが軽減または緩和されているかどうかを判断するステップ；
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法119条の下に、2018年7月10日出願の米国仮出願第62/696,020号の利益を主張し、上記出願の開示の全体は、参照することにより本出願に包含される。
技術分野
本発明は、強直性脊椎炎(AS)の診断、予後および治療のためのバイオマーカーおよび標的に関する。本発明はまた、ASの動物モデルを作製する方法、それから作製された動物モデル、およびそのような動物モデルを使用してASの治療において薬学的に活性な薬剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
強直性脊椎炎(AS)は、炎症性脊椎炎、末梢関節炎、腱付着部炎を特徴とする慢性関節炎の一種である。通常、それは若年成人男性に発生し、ヒト白血球抗原(HLA)-B27と強い関連がある1。慢性的な脊椎の炎症に加えて、患者の3分の1で2年以内に新しい骨の形成が頻繁に観察され、永久的な障害につながる可能性のある隣接する椎体(靭帯骨棘)の骨化と強直性を引き起こす2。非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、炎症を改善する抗腫瘍壊死因子(TNF)-α、またはインターロイキン-17遮断薬などの治療にもかかわらず、それらは靭帯骨棘形成を完全に阻止することはできない3-9。MRIイメージングは、新しい靭帯骨棘の大部分が、炎症のない椎骨ユニットで発生したという証拠も提供した10。したがって、靭帯骨棘形成は炎症から切り離される可能性がある10-12。インサイチュでの間質活性化の病理学的メカニズムをさらに理解することは、脊髄強直を予防するための最優先事項である。AS患者由来のMSCの骨形成が変化することが報告されているが13,14、靭帯骨棘の病巣とその根底にある遺伝子経路におけるMSCの役割はほとんど知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ASの診断、予後および治療のためのアプローチ、ならびにASの治療のための効果的な薬剤をスクリーニングするためのプラットフォームを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概略
本発明において、我々はAS MSCを確立し、AS MSCにおける強化されたTNAP(ALPL遺伝子産物)が、AS MSCによって誘発される骨付加の病理学的メカニズムに必要であり、TNAPの遮断がAS MSCの異常な鉱化を阻害することを見出した。また、ASの治療に有効な薬剤のスクリーニングに有用なAS MSCを使用したAS動物モデルを確立した。さらに、ALPL遺伝子産物(血清TNAP/または骨ALPレベル)が、強直性脊椎炎(AS)、特にASのレントゲン写真の重症度と高度に相関し、したがって、ASを診断するため、およびまたAS患者の進行を監視するためのバイオマーカーとしても役立つことを被験者で実証した。
【０００５】
1つの態様では、本発明は、(i)対象からの生体サンプルを提供すること；および(ii)サンプル中のASマーカーとしてALPL遺伝子産物を検出すること；を含む、強直性脊椎炎(AS)を検出するための方法、および/またはASのレントゲン写真の重症度の進行のリスクを予測するための方法を提供する。
【０００６】
いくつかの実施態様では、遺伝子産物は、タンパク質またはRNA転写物を含む。
【０００７】
いくつかの実施態様では、ALPL遺伝子産物は、非特異的アルカリホスファターゼ(TNAP)である。
【０００８】
いくつかの実施態様では、ALPL遺伝子産物は、骨特異的TNAP(BAP)である。
【０００９】
いくつかの実施態様では、マーカーは、ALPL遺伝子産物に特異的に結合する薬剤、たとえば、抗体またはプライマー/プローブで検出される。
【００１０】
いくつかの実施態様では、検出は、イムノアッセイ、質量分析アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション検出アッセイ、および/または逆トランスフェラーゼ−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって実施される。
【００１１】
いくつかの実施態様では、生体サンプルは、たとえば、血液または血清などの体液サンプル、またはたとえば、骨髄スライスなどの組織サンプルである。
【００１２】
いくつかの実施態様では、該方法はさらに、検出の結果を参照レベルと比較すること、比較がALPL遺伝子産物のレベルの上昇を示す場合、対象を、ASを有する、および/またはASの放射線写真の重症度の進行のリスクがあると特定することを含む。
【００１３】
いくつかの実施態様では、該方法は、ASの発生またはASのレントゲン写真の重症度の進行のリスクを確認するために、対象にさらなるAS診断アッセイを適用することをさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施態様では、レントゲン写真の重症度は、侵食、硬化、方形化(squaring)、靭帯骨棘形成、骨橋、脊髄強直性およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるASの1つ以上のレントゲン写真的特徴を含む。
【００１５】
いくつかの実施態様では、この方法はさらに、抗AS治療法(たとえば、外科手術および/または物理療法)および/または薬剤(たとえば、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIS)、免疫抑制剤、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)ブロッカー阻害剤、抗インターロイキン-6阻害剤、インターロイキン17A阻害剤、および/またはTNAP阻害剤(BAP阻害剤を含む))で対象を治療することを含む。
【００１６】
特に、以下を含む、本発明の方法は、AS患者におけるASの進行を監視するのに有用である：
(a)第1の時点で、患者からの第1の生体サンプルを提供すること；
(b)第1の時点より後の第2の時点で、患者からの第2の生体サンプルを提供すること；
(c)第1および第2の生体サンプル中のASマーカーとしてのALPL遺伝子産物のレベルを測定すること；および
(d)第1および第2の生体サンプル中のALPL遺伝子産物のレベルに基づいて患者のAS進行を決定すること(ここで、第1の生体サンプルと比較して第2の生体サンプル中のALPL遺伝子産物のレベルの上昇は、AS進行を示す)。
【００１７】
もう1つの態様では、本発明は、ASの治療に使用するためのTNAP阻害剤を提供する。治療有効量のTNAP阻害剤を必要としている対象に投与することを含む、ASを治療するための方法も提供される。ASを治療するための薬剤を製造するためのTNAP阻害剤の使用もまた、本明細書に記載される。
【００１８】
いくつかの実施態様では、この方法は、ASの1つ以上の状態、特にレントゲン写真の重症度を軽減または緩和するのに効果的である。
【００１９】
いくつかの実施態様では、TNAP阻害剤は、レバミゾール、硫酸ベリリウム四水和物、パミドロネートまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施態様では、TNAP阻害剤は、抗AS治療法(たとえば、外科手術および/または物理療法)および/または他の薬剤(たとえば、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIS)、免疫抑制剤、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)ブロッカー阻害剤、抗インターロイキン-6阻害剤、および/またはインターロイキン17A阻害剤)と組み合わせて投与される。
【００２１】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、全体的な骨塩密度(BMD)を変化させない。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、以下のステップを含む、ASの動物モデルを作成するための方法を提供する：
(i)AS患者からの脊椎強直に罹患した脊椎の骨髄からの骨髄間葉系幹細胞(BMSC)を提供すること；
(ii)免疫不全マウスの腰椎セグメントの薄層に隣接する領域(たとえば、L4〜L5)にBMSCを移植すること；および
(iii)ASの1つ以上の症状/状態を誘発するのに適した状態で、特にレントゲン写真の重症度(たとえば、浸食、硬化、方形化(squaring)、靭帯骨棘形成、骨橋、脊椎強直性など)を進行させるのに適した状態でマウスを成長させる。
【００２３】
また、本明細書に記載の方法によって作製されたASの動物モデルを提供する。
【００２４】
いくつかの実施態様では、動物モデルは、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、イヌ、およびサルなどの哺乳動物である。
【００２５】
さらに、本発明は、以下のステップを含む、ASの治療に有効な薬剤をスクリーニングする方法を提供する：
(i)本明細書に記載されるように動物モデルに試験薬剤を投与すること；および
(ii)AS状態/症状の少なくとも1つが軽減または緩和されているかどうかを判断すること。
【００２６】
動物モデルにおけるAS状態／症状の少なくとも1つを軽減または緩和するのに有用な試験薬剤は、ASを治療するための候補薬剤と見なされる。
【００２７】
ASマーカーに特異的に結合する薬剤(たとえば、抗体)、および方法を実施するための説明書を含む、本明細書に記載の方法を実施するためのキットも提供される。
【００２８】
本発明の1つ以上の実施態様の詳細を、以下の説明に記載する。本発明の他の特徴または利点は、いくつかの実施態様の以下の詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からも明らかであろう。
【００２９】
前述の概要、ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、よりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現在好ましい実施態様が図面に示される。しかしながら、本発明は、示された正確な配置および手段に限定されないことを理解すべきである。
図面では：
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ−Ｉ】図1A-1Iは、骨形成誘導下のAS MSCにおけるRunx2に依存しない加速された鉱化を示す。図1A：N MSCと比較して、示された日に骨形成条件下で培養されたAS MSCにおける増強された鉱化のARS染色。図1B：光学密度(O.D.)測定によるARS染色の代表的な定量結果であり、示された日の3つのAS MSCと3つのN MSCの間の鉱化の速度を示す。図1C：骨形成誘導下の0日目および7日目のAS MSCおよびN MSCにおけるRunx2 mRNAレベルのPh1C、RT-QPCR。図1D-1F：MSCにRunx2(shRunx2)または対照(shCtrl)レンチウイルスベクターに対するshRNAをトランスフェクトし、次に、骨形成条件下で培養した。図1D：RT-QPCRは、2つの独立したshRunx2によるノックダウン効率を示す。図1E：AS MSCの鉱化に対するRunx2ノックダウンの効果を示すARS染色。図1F：ARS染色のO.D.測定によって分析された(図1E)の定量結果。図1G：DAPI(青)およびオステオアドヘリン特異的抗体(緑)による骨形成誘導下での14日目のAS MSCおよびN MSCの免疫蛍光染色。図1Hおよび図1I：骨形成誘導下の7日目のAS MSCおよびN MSCにおけるオステオカルシン(図1H)およびコラーゲン1A1(図1I)のmRNAレベルを示すRT-QPCR。結果は、少なくとも3回の独立した実験からのものである。データは、平均±標準誤差(SEM)(n＝3)を示す。* P＜0.05、** P＜0.01、*** P＜0.001、**** P＜0.0001、スチューデントのt検定による。スケールバー＝200 μm(a、e)；20 μm(g)。
【図２Ａ−Ｍ】図2A-2Mは、骨形成誘導下のAS MSCにおける異常な鉱化にTNAPの発現増強が不可欠であることを示す。図2A-2C：ALP酵素活性で測定した骨形成誘導後0日および7日でのAS MSCおよびN MSCのALP活性およびTNAPレベル(図2A)、RT-QPCRで測定したTNAPmRNAレベル(図2B)、およびイムノブロット(図2C)。図2D-2E：ARS染色(図2D)および定量化(図2E)によって決定された骨形成誘導下のAS MSCの鉱化に対するTNAP阻害剤(100μMレバミゾール、100μM硫酸ベリリウム、または1μg/mlパミドロネート)の効果。図2F-2H：ALP活性(図2F)、TNAP mRNA(図2G)およびタンパク質レベル(図2H)は、骨形成誘導の7日後にAS MSCのshTNAPによって抑制された。図2I-2J：ARS染色(図2I)および定量化(図2J)によって決定される骨形成誘導下の2つのshTNAPによるAS MSCの加速された鉱化の阻害。図2K-2M：ARS染色(図2K)および定量化(図2L)によって決定されたN MSCにおけるレンチウイルス形質導入を介したTNAP(p-TNAP)の過剰発現。図2M：イムノブロットは、TNAPタンパク質の発現を示す。結果は、少なくとも3回の独立した実験からのものである。データは、平均±SEMを示す。* P＜0.05、*** P＜0.001、**** P＜0.0001、スチューデントのt検定による。スケールバー＝200 μm( 図2D、図2I、図2K)
【図３Ａ−Ｄ】図3A-3Dは、TNAP遮断が、NOD-SCIDマウスのAS MSCによって誘発される新規骨付加を阻害することを示す。図3A-3D：腰椎セグメントL4〜L5の右椎弓板に隣接してAS MSCまたはN MSC(図3A)を移植するか、shCtrlまたはshTNAPで形質導入されたAS MSC(図3B)を移植するか、またはAS MSCの移植に加えて、H2O、レバミゾール(10mg/kg)、硫酸ベリリウム(7.5mg/kg)、またはパミドロネート(0.3mg/kg)(図3C)を毎日経口投与したNOD-SCIDマウスの腰椎マイクロコンピューター断層撮影の代表的な画像。移植後3週間、画像を撮影した。L4〜L6の縦断面(左)、L4の高倍率縦断面(中央)、L4の横断面(右)を示す。新規骨付加は、赤い長方形(中央)および白い矢印(右)で強調表示される。各群の3匹のマウスの代表的な画像を示す。図3D：各グループの新規骨付加(mm3)の量。データは平均±SEMを示す(AS MSCまたはN MSCの各グループでn＝9、shTNAPまたはshCtrlで形質導入されたAS MSCの各グループでn＝9、AS MSC＋H2O、レバミゾール、硫酸ベリリウムまたはパミドロネートの毎日の経口投与の各グループでn＝9)。* P＜0.05、** P＜0.01、*** P＜0.001、スチューデントのt検定による。
【図４Ａ−Ｄ】図4A-4Dは、AS患者のBM(骨髄)および血清中のTNAPが健康な個人のものと比較して有意に上昇しており、AS患者のレントゲン写真の重症度と関連していることを示す。図4A：AS患者および正常対照からのBMのTNAP特異的抗体によるIHC染色。差し込み図は、四角で囲まれた領域の拡大を表す。図4B-4D：TNAP抗体(茶色)および示された二次一次抗体(青色)による二重IHC染色を示す。TNAP/CD68(単球系統)(図4B)、TNAP/ミエロペルオキシダーゼ(MPO)(骨髄系統)(図4C)、TNAP/CD44(MSC)(図4D)の共局在化は濃い紫色として視覚化された。差し込み図は、四角で囲まれた領域からの拡大(400x)を表す；上の画像は、顕微鏡画像であり、下の画像は、スペクトルライブラリを用いたスペクトルアンミキシング技術による合成疑似カラー画像である(TNAP抗体で茶色に染色し、二次抗体で青色に染色)。TNAP/MPO、TNAP/CD68、およびTNAP/CD44の共局在化は、青緑色で表された。スケールバー＝50μm(図4A-4D)。
【図５】図5は、骨形成誘導下のAS MSCにおける異常な鉱化のためにTNAPの発現増強が必要であることを示す。MSCは、β-グリセロホスフェート(BGP)の添加の有りまたは無しで、増殖培地(GM)で培養され、鉱化はARS染色によって決定された。(左パネル)AS MSCおよびN MSCにおける鉱化のARS染色(スケールバー＝200μm)。(右パネル)(t)におけるARS染色の定量結果。データは平均±SEMである。結果は、3回行われた2つの独立した実験からのものであった。* P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001、スチューデントのt検定による。
【図６】図6は、TNAP阻害剤の経口投与から12週間後の骨塩密度を示す。大腿骨の骨塩密度を、AS MSCの移植およびH2O(n＝4)、レバミゾール(10 mg/kg)(n＝3)、硫酸ベリリウ(7.5 mg/kg)(n＝3)、またはパミドロネート(0.3 mg/kg)(n＝3)の毎日の経口投与後、NOD-SCIDマウスでマイクロCTによって測定した。
【図７】図7は、非AS患者対照のBMにおけるTNAP発現を示す。TNAP特異的抗体による非AS患者からのBMのIHC染色。スケールバー＝50μm。差し込み図は、四角で囲まれた領域の拡大を表す。
【図８】図8は、0〜3、3〜7、および7〜10日目に骨形成誘導下でAS MSCおよびN MSCによって分泌されるサイトカインの発現を示す。データは平均±SEMである。結果は、3回行われた2つの独立した実験からのものであった。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な記載
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、たとえば、「構成要素」への言及は、当業者に知られている複数のそのような構成要素およびそれらの同等物を含む。
【００３３】
「含む(comprise)」または「含む(comprising)」という用語は、一般に、1つ以上の特徴、成分、または構成要素の存在を可能にすることを意味する、包む(include)/含む(ncluding)という意味で使用される。「含む(comprise)」または「含む(comprising)」という用語は、「からなる(consists)」または「からなる(consisting of)」という用語を包含する。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、それが使用される状況に応じてある程度変化しうる、当業者によって理解される許容可能な逸脱の程度を意味する。一般に、「約」または「およそ」は、引用された値の周囲に±10％の範囲を有する数値を意味しうる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、本明細書で交換可能に使用される「核酸フラグメント」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)などの天然に存在する核酸を含むヌクレオチド単位、ならびに非天然に存在する核酸などの核酸類似体から構成されるポリマーを意味する。したがって、これらの用語には、一本鎖、二本鎖、または多本鎖のDNAまたはRNA、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然の化学的または生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが包含されるが、これらに限定されない。核酸断片がDNA配列(すなわち、A、T、G、C)によって表される場合、これは、「U」を「T」に置き換えるRNA配列(すなわち、A、U、G、C)も包含することが理解されるであろう。
【００３６】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列に対して相補的であり、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするために使用される特定のオリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーは、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、または逆転写酵素のいずれかによって触媒されるヌクレオチド重合の開始点として機能する。たとえば、本明細書で使用されるALPL遺伝子のためのプライマーは、それぞれ、個々の標的遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズしてヌクレオチド重合を開始し、プライマーの設計に基づいて予想通りにヌクレオチド産物を生成することができるものである。ALPL遺伝子のためのプライマーの例は、AGACTGCGCCTGGTAGTTGT(配列番号：1)およびCCTCCTCGGAAGACACTCTG(配列番号：2)である。
【００３７】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「プローブ」という用語は、ハイブリダイゼーション中にサンプル中に存在する特定のポリヌクレオチド配列を同定するために使用されうる、定義された核酸セグメント(またはヌクレオチド類似体セグメント、たとえば、本明細書で定義されるポリヌクレオチド)を示し、該核酸セグメントは、同定される特定のポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。典型的には、プローブは、たとえば、フルオロフォアまたは放射性核種または酵素などのレポーター分子の組み込みによって何らかの方法で標識されるので、検出可能なシグナルを生成することができる。たとえば、本明細書で使用されるALPL遺伝子のプローブは、それぞれ、個々の標的遺伝子の対応するヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし、そのようなハイブリダイゼーションによって引き起こされる検出可能なシグナルを生成することができるものである。
【００３８】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖が塩基対形成を介して相補鎖と結合する任意のプロセスを含むものとする。関連する技術は当技術分野でよく知られており、たとえば、Sambrook et al.、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、and Frederick M.A. et al.、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、Inc. (2001)に記載されている。通常、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびpHにて、特定された配列に対する熱融点(Tm)よりも約5〜30℃低くなるように選択される。より典型的には、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびpHにて、特定された配列のTmよりも約5〜15℃低くなるように選択される。たとえば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、塩濃度が約1.0Mナトリウム(または他の塩)イオン未満であり、典型的には、約pH7.0〜約pH8.3にて約0.01〜約1Mナトリウムイオン濃度であり、温度が、短いプローブ(たとえば、10〜50ヌクレオチド)については少なくとも約25℃、長いプローブ(たとえば、50ヌクレオチドを超える)については少なくとも約55℃であるものである。長いプローブ(たとえば、50ヌクレオチドを超える)についての例示的な非ストリンジェントまたは低ストリンジェンシー条件は、20 mM Tris、pH8.5、50 mM KCl、および2 mM MgCl2の緩衝液、および25℃の反応温度を含む。
【００３９】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「コードする」という用語は、定義されたヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)または定義されたアミノ酸配列およびそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する遺伝子産物の合成のためのテンプレートとして機能するための、ポリヌクレオチド(たとえば、遺伝子、cDNA、またはmRNA)中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を示す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「発現」という用語は、スプライシングされていないRNA、mRNA、スプライス変異体mRNA、ポリペプチドまたはタンパク質、翻訳後修飾ポリペプチド、スプライス変異体ポリペプチドなどの遺伝子産物を産生するための遺伝子にコードされる遺伝子情報の実現を示す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「発現レベル」という用語は、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって決定することができる、細胞内の特定の遺伝子によって発現される遺伝子産物の量を示す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、本明細書で互換的に使用される「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を示し、これは、コード化および非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に結合することができる免疫グロブリンタンパク質を意味する。本明細書で使用される抗体は、抗体全体、ならびに目的のエピトープ、抗原、または抗原性フラグメントに結合することができる任意の抗体フラグメント(たとえば、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv)を包含することを意味する。本発明の抗体は、免疫反応性または免疫特異的であり、したがって、たとえば、非特異的アルカリホスファターゼ(TNAP)などのALPL遺伝子産物などの目的のタンパク質に特異的かつ選択的に結合する。目的のタンパク質に対する抗体は、好ましくは免疫特異的であり、すなわち、関連物質と実質的に交差反応性ではないが、種間でそれらの相同体を認識しうる。「抗体」という用語は、すべてのタイプの抗体(たとえば、モノクローナルおよびポリクローナル)を包含する。
【００４４】
本発明によれば、ALPL遺伝子産物は、強直性脊椎炎(AS)の発生を検出するため、および/またはASのレントゲン写真の重症度の進行のリスクを予測するためのASマーカーとして使用することができる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、生物学的マーカー(またはバイオマーカーまたはマーカーと呼ばれる)は、正常または異常な生物学的プロセス/状態、疾患、病原性プロセス、または治療または治療的介入への応答の指標として客観的に測定および評価される特性である。マーカーは、特定の生物学的プロセス/状態を示す特徴またはパターンまたは特徴の集合の有無を含むことができる。マーカーは通常、診断および予後診断の目的で使用される。しかしながら、それは、AS治療薬の有効性の評価を含む、治療、モニタリング、薬物スクリーニング、および本明細書に記載の他の目的のために使用されうる。
【００４６】
本明細書で使用される「診断」は、一般に、対象が所与の疾患、障害または機能不全によって影響を受ける可能性が高いかどうかに関する決定を含む。当業者はしばしば、1つ以上の診断指標、すなわち、マーカー、その存在、不在、またはその量が、疾患、障害または機能不全の有無を示すことに基づいて診断を行う。
【００４７】
本明細書で使用される「予後」は、一般に、臨床状態または疾患の予想される経過および結果の予測を意味する。患者の予後は、通常、疾患の好ましいか、または好ましくない経過または結果を示す疾患の要因または症状を評価することによってなされる。「予後」という用語は、必ずしも100％の精度で状態の経過または結果を予測する能力を意味するとは限らないことが理解される。代わりに、当業者は、「予後」という用語が、特定の経過または結果が生じる可能性が増加すること、すなわち、経過または結果が、特定の状態を示していない患者と比較した場合、特定の状態を示している患者で発生する可能性が高くなることを意味することを理解するであろう。良好な予後は通常、ASの症状が少ないなどの有益な臨床転帰または見通しを意味し、一方、不良な予後は、通常、ASの症状が多いなどの不良な臨床転帰または見通しを意味することが理解されるであろう。特定の実施態様では、ASの症状は、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、脊髄強直性およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される1つ以上のレントゲン写真の特徴を含むレントゲン写真の重症度である。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」および「患者」という用語は、診断、予後、治療、または治療が必要とされる哺乳動物対象、特にヒトを示すことができる。他の対象には、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが含まれうる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「異常レベル」は、参照レベルと比較して増加するレベルを意味しうる。たとえば、異常レベルは、基準レベルよりも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または100％を超えて高くなりうる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の試験対象におけるバイオマーカーの発現レベルを、過去の値に基づく標準レベルと比較する。たとえば、標準レベルは、被験者のコホートから得られた対応する生体サンプルにおけるそのようなバイオマーカーの平均または中央値の発現レベルに基づいて設定することができる。たとえば、被験者のコホートは、臨床試験に登録されたAS患者のグループでありうる。いくつかの実施態様では、基準レベルは、正常な個人または疾患のない組織や細胞などのサンプルで測定されたレベルを示しうる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用されるバイオマーカーの「低発現」および「高発現」は、サンプル中に見出されるバイオマーカーのレベルを示す相対的な用語である。いくつかの実施態様では、次に、サンプル中のそのようなバイオマーカーの発現が平均または中央値の発現レベルより上(高)または下(低)であるかどうかに基づいて、低および高発現を各サンプルに割り当てることができる。いくつかの実施態様では、低発現および高発現は、非罹患サンプルにおけるバイオマーカー発現レベルの比較によって決定することができ、低発現は、非罹患サンプルにおける発現レベルよりも低いか、または同等の発現レベルを示し、高発現は、非罹患における発現レベルよりも高い発現レベルを示しうる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ALPL」という用語は、ヒトにおけるアルカリホスファターゼ(ALP)、組織非特異的アイソザイム(すなわち、非特異的アルカリホスファターゼ(TNAP))をコードする遺伝子である。ALPは、脱リン酸化およびトランスリン酸化反応を触媒することができる、非遍在性外部酵素の大きいスーパーファミリーである。それは、TNAP、別々の遺伝子によってコードされる胎盤、生殖細胞、および腸のALPを含む4つのアイソザイムからなる。最後の3つは2番染色体上に一緒にあり、最初の1つは組織非特異的形態が1番染色体上にある。この遺伝子の産物は、特定の組織では発現されない膜結合型グリコシル化酵素であり、したがって、酵素の組織非特異的形態と呼ばれる。ALPL遺伝子によってコードされるTNAPは、選択的スプライシング転写変異体とともに肝臓/骨/腎臓組織に分布する20、21。ピロリン酸塩を加水分解し、無機リン酸塩を提供して鉱化作用を促進する20、21。上記のバイオマーカー遺伝子のヌクレオチド配列およびそれらの遺伝子産物の対応するアミノ酸配列は、当技術分野で周知である。たとえば、ホモサピエンスALPL、転写変異体1、mRNA/タンパク質：NM_000478/NP_000469.3；ホモサピエンスALPL、転写変異体2、mRNA/タンパク質：NM_001127501.4/NP_001120973.2；ホモサピエンスALPL、転写変異体3、mRNA/タンパク質：NM_001177520.3/NP_001170991.1；ホモサピエンスALPL、転写変異体4、mRNA/タンパク質：NM_001369803.2/NP_001356732.1；ホモサピエンスALPL、転写変異体5、mRNA/タンパク質:：NM_001369804.2/NP_001356733.1。
【００５２】
本明細書に記載の方法を実施するために、必要とする対象から生体サンプルを得ることができ、生物学的サンプル中のマーカーは、イムノアッセイ、質量分析アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション検出アッセイ、および/または逆トランスフェラーゼ−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)などの当技術分野で知られている任意の方法を介して検出または測定することができる。生体サンプルは、体液サンプル、たとえば、血液または血清または組織サンプル、たとえば、 骨髄スライスでありうる。マーカーの検出は、定量的または定性的でありうる。1つの実施態様では、必要とする対象から得られたサンプルを、マーカーの有無について分析する。必要とする対象から得られたサンプルにおいてマーカーが検出された場合、その対象は、ASを有するか、またはASのレントゲン写真の重症度の進行のリスクがあると識別される。参照レベルは、正常な対象またはそのような対象のプールから得られうる対照サンプル中のマーカーのレベルを表すことができる。いくつかの例では、対照サンプル中のマーカーのレベルは、たとえば、イムノアッセイなどの通常のアッセイを使用して、対照サンプルでは検出することができず(すなわち、参照値が０である)、同じアッセイを使用した対象からの生体サンプルにおいて検出されたマーカーの存在は、ASの発生またはASの放射線学的重症度の進行のリスクを示しうる。いくつかの例では、ASの進行を監視するために、マーカーのレベルを異なる時点で測定することができる。たとえば、2つの生体サンプルは、2つの異なる時点で候補対象から得られる。マーカーのレベルが時間の経過とともに増加する傾向が観察される場合、たとえば、後で取得されたサンプルのマーカーのレベルが、先に取得されたサンプルのレベルよりも高い場合、対象は、ASの予後が不良、特にASのレントゲン写真の重症度のレベルが高いと判断される。
【００５３】
生体サンプル中の本明細書に記載されているバイオマーカーの存在および量は、日常的な技術によって決定することができる。
【００５４】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のバイオマーカーの存在および／または量は、質量分析によって決定することができ、これにより、高感度および高再現性での分析物の直接測定が可能になる。多くの質量分析法が利用可能である。質量分析の例として、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS-MS)、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化/飛行時間(MALDI-TOF)、および表面増強レーザー脱離イオン化/飛行時間(SELDI-TOF)が挙げられるが、これらに限定されない。このアプローチの1つの特定の例は、タンデム質量分析(MS/MS)であり、これには、通常、何らかの形の断片化によって分離された、質量選択または分析の複数のステップが含まれる。
【００５５】
いくつかの実施態様では、バイオマーカーの存在および/または量は、イムノアッセイによって決定することができる。イムノアッセイの例として、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)、免疫蛍光アッセイ(IFA)、ELFA(酵素結合蛍光イムノアッセイ)、エレクトロケミルミネッセンス(ECL)、およびキャピラリーゲル電気泳動(CGE)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、バイオマーカーの存在および/またはレベルは、バイオマーカーに特異的に結合する抗体など、前記バイオマーカーを特異的に認識する作用剤を使用して決定することができる。
【００５６】
他の実施態様では、バイオマーカーの存在および/または量は、1つ以上の遺伝子のmRNAレベルを測定することによって決定することができる。記載されているように遺伝子のヌクレオチド配列を特異的に認識するプライマーまたはプローブの使用に基づくアッセイを測定に使用することができ、該アッセイは、これらに限定されないが、逆トランスフェラーゼ-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)およびインサイチュハイブリダイゼーション(ISH)などであり、その手順は当技術分野でよく知られている。プライマーまたはプローブは、目的の核酸領域に基づいて当業者によって容易に設計および合成されうる。本発明で使用される適切なプライマーまたはプローブは、当技術分野で開示されるような目的の遺伝子のヌクレオチド配列を考慮して、任意の適切な方法を使用して設計されうることが理解されるであろう。
【００５７】
本明細書で使用される抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。特定のタンパク質に対するポリクローナル抗体は、適切な実験動物に有効量のペプチドまたは抗原成分を注射し、動物から血清を収集し、既知の免疫吸着技術のいずれかによって特定の血清を単離することによって調製される。本発明で使用されるポリクローナル抗体を産生するために容易に使用することができる動物として、ニワトリ、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ウマなどが挙げられる。
【００５８】
特定の実施態様では、ASバイオマーカーとしてのALPL遺伝子産物は、骨特異的TNAP(BAP)、肝臓特異的TNAP、および/または腎臓特異的TNAPなどのTNAPタンパク質である。いくつかの実施態様では、ASバイオマーカーとしてのTNAPタンパク質として、骨特異的TNAP(BAP)および/または肝臓特異的TNAPが挙げられる。1つの例では、ASバイオマーカーとしてのTNAPタンパク質は、骨特異的TNAP(BAP)である。
【００５９】
いくつかの実施態様では、候補個体に由来するサンプル中のバイオマーカーの量を標準値と比較して、候補個体がASの予後が陰性であるかどうかを決定することができる。標準値は、ASの集団における本明細書に記載のバイオマーカーの平均量または中央値を表すことができる。典型的には、そのようなAS患者の集団は、たとえば、年齢および/または民族的背景において候補者と一致するように選択される。好ましくは、そのようなAS患者の集団および候補個体は同じ種のものである。
【００６０】
ヒト患者などの個人が予後不良であると診断される場合、その個人は、疾患の発生を確認するため、および/または疾患の病期および進行を決定するために、さらなる検査(たとえば、外科的生検またはX線画像、磁気共鳴画像(MRI)、または超音波などの画像法を含む日常的な物理的検査)を受けることができる。
【００６１】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の方法は、AS患者を治療して、疾患に関連する症状を少なくとも軽減することをさらに含むことができる。治療は、任意の従来の抗AS療法(たとえば、外科手術および/または理学療法)および/または薬剤(たとえば、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIS)、免疫抑制剤、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)ブロッカー阻害剤、抗インターロイキン-6阻害剤、インターロイキン17A阻害剤、および/または本明細書に記載のTNAP阻害剤)でありうる。
【００６２】
本発明の方法を実施するためのキットも提供される。具体的には、キットは、本明細書に記載されるようにマーカーを特異的に検出することができる試薬(たとえば、抗体、プライマー、プローブ、または標識試薬)を含む。キットは、キットを使用して、疾患の予後を予測するため、および/または疾患の進行を監視するために、生体サンプル中のマーカーの存在または量を検出するためのさらなる説明書を含むことができる。本明細書に記載の検出試薬などの構成要素は、キットの形態で一緒に包装することができる。たとえば、検出試薬は、別々の容器にパッケージすることができ、たとえば、核酸(プライマーまたはプローブ)または抗体(固体マトリックスに結合するか、またはそれらをマトリックスに結合するための試薬と別々にパッケージ化される)、対照試薬(陽性および/または陰性)、および/または検出可能な標識、ならびにアッセイを実施するための説明書(たとえば、書かれたもの、テープ、VCR、CD-ROMなど)もキットに含まれうる。キットのアッセイフォーマットは、たとえば、ノーザンハイブリダイゼーション、チップまたはELISAでありうる。さらに、予後を予測するための方法を実行するための、および/または疾患の進行を監視するためのそのような試薬の使用が提供される。試薬は、担体、たとえば、検出または診断目的のための組成物を形成するための薬学的に許容される担体と混合することができる。そのような担体の例として、注射可能な生理食塩水、注射可能な蒸留水、注射可能な緩衝液などが挙げられる。
【００６３】
別の態様では、本発明は、TNAP阻害剤がASを治療するための有効成分として使用されうるという予想外の発見に基づく。したがって、本発明は、TNAPの阻害によるASの治療に関する。
【００６４】
具体的には、TNAP(発現または活性)の阻害は、TNAP阻害剤によって行われる。TNAP阻害剤の例として、核酸分子(たとえば、対応する遺伝子に向けられたアンチセンス核酸分子または対応する核酸に向けられた小分子干渉RNA(siRNA))、ポリペプチド(たとえば、抗体)、または小分子TNAP阻害化合物が挙げられる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、合成されるか、または自然界に見出される、一般に分子量が1モルあたり10,000グラム未満、特に1モルあたり5,000グラム未満、特に1モルあたり2000グラム未満、特に1モルあたり1,000グラム未満の有機または無機分子を意味する。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の小分子は、非ポリマー、たとえば、非タンパク質または核酸ベースの化学分子などを意味する。TNAP阻害剤としての小分子の例として、レバミゾール、硫酸ベリリウム四水和物、パミドロネートが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
本明細書で使用される「治療する」または「治療」という用語は、治癒(cure)、治癒(heal)、緩和(alleviate)、緩和(relieve)、変更、治療、改善(ameliorate)、改善(improve)すること、または障害、障害の症状または状態、障害によって誘発される身体障害、または障害または状態の症状の進行に影響を与えることを目的として、障害、障害の症状または状態、または障害の進行に苦しむ対象への1つ以上の活性剤を含む組成物の適用または投与を示す。
【００６８】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、治療される対象に所望の治療効果を与えるための有効成分の量を示す。たとえば、ASを治療するための有効量は、1つ以上の症状または状態またはその進行、特にASのレントゲン写真の特徴、たとえば、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、および脊髄強直性を禁止、改善、緩和、軽減または予防することができる量でありうる。症状は、当技術分野で知られている方法、たとえば、X線またはMRI画像を使用して決定および評価することができる。当業者は、本明細書の開示、確立された方法、および彼ら自身の経験に基づいて、それぞれの場合の投与量を決定することができる。
【００６９】
いくつかの実施態様では、有効量の有効成分は、薬学的に許容される担体とともに、送達および吸収の目的のために適切な形態の医薬組成物に処方されうる。投与様式に応じて、本発明の医薬組成物は、好ましくは、約0.1重量％〜約100重量％の有効成分を含み、重量パーセントは、組成物全体の重量に基づいて計算される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、担体が組成物中の有効成分と適合性であり、好ましくは前記有効成分を安定化することができ、治療を受ける個体にとって安全であることを意味する。前記担体は、有効成分に対する希釈剤、ビヒクル、賦形剤、またはマトリックスでありうる。適切な賦形剤のいくつかの例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルボース、マンノース、デンプン、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントガム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。組成物は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油などの滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピルなどの保存剤；甘味料；ならびに香味料をさらに含みうる。本発明の組成物は、患者への投与後の有効成分の迅速な、継続的な、または遅延した放出の効果を提供することができる。
【００７１】
本発明によれば、前記組成物の形態は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、パケット、トローチ、エリキシル、懸濁液、ローション、溶液、シロップ、軟質および硬質ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液、および包装粉末でありうる。
【００７２】
本発明の組成物は、経口、非経口(筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内など)、経皮、坐剤、および鼻腔内の方法などの任意の生理学的に許容される経路を介して送達することができる。非経口投与に関しては、それは、溶液を血液に対して等張にするのに十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含み得る滅菌水溶液の形態で使用されるのが好ましい。水溶液は、必要に応じて適切に緩衝することができる(好ましくは3〜9のpH値で)。無菌条件下での適切な非経口組成物の調製は、当業者に周知の標準的な薬理学的技術を用いて達成することができ、余分な創造的労力は必要とされない。
【００７３】
本発明によれば、TNAP阻害剤は、ASを治療する必要のある対象に投与することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載のTNAP阻害剤またはそれを含む組成物を必要とする対象に投与することによってASを治療するための方法を提供する。特に、本明細書に記載のTNAP阻害剤は、(i)TNAPの酵素活性または発現レベルを阻害し、(ii)1つ以上の症状または状態またはその進行、特にASのレントゲン写真の特徴、たとえば、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、および脊髄強直性を低減または防止するのに有効な量で投与される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のTNAP阻害剤は、AS患者の骨密度(たとえば、全体的な骨塩密度(BMD))を実質的に低下させない量で投与される。より具体的には、本明細書に記載のTNAP阻害剤は、AS患者に骨粗鬆症をもたらさない量で投与される。
【００７４】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のTNAP阻害剤は、たとえば、外科手術および/または理学療法、および/または限定的ではないが、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬(NSAIS)、免疫抑制剤、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)ブロッカー阻害剤、抗インターロイキン-6阻害剤、インターロイキン17A阻害剤などのASの既知の薬剤などの従来の抗AS治療法と組み合わせて投与することができる。
【００７５】
さらなる態様において、本発明は、ASの非ヒト動物モデルを作製するための方法を提供する。また、このように作製されたASの非ヒト動物モデルも提供される。
【００７６】
いくつかの実施態様では、この方法は、
(i)AS患者からの脊髄強直に苦しんでいる脊椎の骨髄から骨髄間葉系幹細胞(BMSC)を提供する；
(ii)免疫不全の非ヒト動物の腰椎セグメントの椎弓板に隣接する領域にBMSCを移植する；および
(iii)ASの1つ以上の症状/状態を誘発するのに適した状態で動物を成長させる；ステップを含む。
【００７７】
特定の実施態様では、腰椎セグメントは、L4〜L5である。
【００７８】
特定の実施態様では、AS症状／状態は、レントゲン写真の重症度(たとえば、侵食、硬化、方形化、靭帯骨棘形成、骨橋、および脊髄強直性およびそれらの任意の組み合わせ)を含む。
【００７９】
いくつかの実施態様では、動物モデルは、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、イヌ、およびサルなどの哺乳動物である。
【００８０】
本発明によれば、動物モデルは、ASを治療するための候補薬剤のスクリーニングに使用することができる。
【００８１】
したがって、本発明はさらに、本明細書に記載の動物モデルに基づく候補抗AS剤をスクリーニングするためのプラットフォームとしての方法を提供する。
【００８２】
特に、この方法は、(i)動物モデルに試験薬を投与するステップ、および(ii)AS症状/状態の少なくとも1つが軽減または緩和されるかどうかを測定するステップを含み、ここで、少なくとも1つのAS症状/状態の軽減または軽減は、試験剤がASの治療に有用な候補薬剤であることを示す。
【００８３】
本発明は、限定ではなく実証の目的で提供される以下の実施例によってさらに説明される。当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施態様において多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例】
【００８４】
1.材料および方法
1.1 ヒト対象
すべてのドナーは、ヘルシンキ宣言に従ってサンプリングする前に書面によるインフォームドコンセントを提供した。研究プロトコルは、Taipei Tzu Chi Hospital、Buddhist Tzu Chi Medical Foundation、Taipei Veteran General Hospital、Academic Sinica(すべて台湾内)および英国のRoyal National Hospital for Rheumatic Diseasesの研究倫理委員会によって承認された。
【００８５】
骨髄(BM)サンプルを、脊椎骨切り術(A1、A2、A3)および非AS対照(C1、C2、C3)を受けた強直性脊椎炎(AS)患者からのMSC分離のために取得した。MSC分離のためのすべてのBMドナーは台湾人である。さらに、2つの独立したコホートが、レントゲン写真的進行傾向のある高リスクAS患者の予測末梢血マーカーの研究のために採用された。「台湾のコホート」は、AS診断のための修正ニューヨーク基準を満たした104人の患者とTaipei Tzu Chi Hospitalの50人の健康な対照から構成される。この集団の一部(レントゲン写真的変化を遡及的に追跡した37人のAS患者)は、「台湾のコホート」の縦断的ASサブグループを構成した。184人のAS患者の「英国のコホート」は、英国のRoyal National Hospital for Rheumatic Diseasesで募集された。臨床評価とレントゲン写真評価は同じ日に取得された。臨床評価には以下が含まれる：AS疾患期間；血清学的検査(HLA-B27、C反応性タンパク質または赤血球沈降速度)；バス強直性脊椎炎疾患活動性指数(BASDAI；範囲、0〜10)の検証済みバージョンによる疾患活動性スコアリング；スコアが4以上の場合は、疾患の管理が最適ではないことを示す)。2つの信頼できるスコアリングシステム、検証済みバージョンのバス強直性脊椎炎放射線指数-合計スコア(BASRI-合計)は、台湾のコホートで取得され、修正ストーク強直性脊椎炎脊椎スコア(mSASSS)は、両方のコホートで採用された。BASRIの合計スコアは、腰椎、頸椎、仙腸関節および股関節の合計スコアであった(範囲：2〜20)。mSASSSでは、頸椎と腰椎の前部を、24の脊椎レベル(各脊椎レベルで0〜3の範囲、範囲：0〜72)でスコアリングすることによって評価した。
【００８６】
バス強直性脊椎炎機能指数(BASFI)も記録された。これは、機能制限の程度を決定するための検証済みの指標であり、平均視覚アナログ尺度(0は「簡単」および10は「不可能」)を使用してテストの質問に回答する。10のスケールの平均は、BASFIスコアに0〜10の値を与える。さらに、ASが患者の健康に対する影響を反映したバス強直性脊椎炎グローバルスコア(BAS-G)を得た。2つのスコアの平均により、BAS-Gスコアは0〜10になる。スコアが高いほど、患者の幸健康に対する病気の知覚される影響が大きくなる。
【００８７】
1.2 AS患者からの脊髄強直症の影響を受けた組織内のBM-MSCの単離
脊椎短縮骨切り術を受けた3人のAS患者(A1、A2、A3)からの脊椎強直に関与する組織内のBMからのMSC(AS MSC)を単離した。同様の部位にてBMから外傷手術を受けた3人の非AS個人(C1、C2、C3)のMSC(N MSC)を対照として使用した。すべて台湾人である。これらの検体を細かく刻み、抗生物質-抗真菌溶液を含むアルファ最小必須培地(α-MEM；Gibco、Grand Island、NY、USA)でリンスした後、1mg/mLコラゲナーゼD(Roche、Basel、Switzerland)で消化した。37℃で一晩インキュベートした後、消化した組織を40μmナイロンフィルターでろ過して破片を除去した。細胞を遠心分離によって収集し、培養皿にプレーティングして付着させた。48時間以内およびその後3日ごとに培地を交換することによって、非接着細胞を除去した。コンフルエンスに達したら、細胞を回収して継代培養した。継代3にて、初代MSCのアリコートを液体窒素で凍結保存し、実験のために増殖させた。ASMSCとNMSCの同じ継代(p3〜p5)を比較した。
【００８８】
1.3 MSCの特性評価
MSCのマーカーの細胞表面発現を分析するために、MSCを以下の抗ヒト抗体で標識した：CD31-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD29-FITC、CD45-FITC、およびCD105-FITC(すべてAncell、Bayport、MN、USAから)。マウスアイソタイプ抗体(Ancell)を対照とした。全体として、FACScanto Flow Cytometer(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ、USA)を使用して、100,000個の標識細胞を取得して分析した。データ分析にはFCSExpress v3.0(De Novo Software、Glendale、CA、USA)を使用した
【００８９】
MSCの三系統分化能を特徴づけるために、MSCを3つの培養条件で処理した。最初の培養条件は骨形成誘導であり、それによりα-MEMが、10％ウシ胎児血清(Gibco)、50μg/mLのアスコルビン酸塩-2リン酸(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA)、10nmol/Lのデキサメタゾン(Sigma-Aldrich)、および１10 mmol/Lのβ−グリセロホスフェート(Sigma-Aldrich)に補足された。2番目の培養条件は脂肪生成誘導であり、これによりα-MEMが、10％ウシ胎児血清、50μg/mのLアスコルビン酸-2リン酸、100nmol/Lのデキサメタゾン、50μg/mLのインドメタシン(Sigma-Aldrich)および10μg/mLインスリン(Gibco)に補足された。3番目の培養条件は軟骨形成誘導であり、それにより無血清α-MEMが、50μg/mLのアスコルビン酸-2リン酸、100nmol/Lのデキサメタゾン、50 mg/mLのインスリン-トランスフェリン-セレン-プレミックス(Gibco)、および10ng/mLの形質転換成長因子-β1(Prepotech、Rocky Hill、NJ、USA)が補足された。培地は3日ごとに交換された。分化の形態的特徴が現れた後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定した。骨形成培養によって処理された細胞を、鉱化のためにアリザリンレッドS(Sigma-Aldrich)で染色した。アリザリンレッドS染色の定量化は、プレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA、USA)を使用して、抽出された色素の光学密度(OD)を550 nmで測定することによって行った。脂肪生成または軟骨形成培養条件で処理された細胞を、オイルレッドO(Sigma-Aldrich)またはアルシアンブルー(ScyTek、Cache、UT、USA)で染色し、それぞれ脂肪生成および軟骨形成の分化を評価した。
【００９０】
1.4 骨形成誘導下のMSCのTNAP阻害剤処理
MSCを6ウェルプレートあたり8×104細胞で播種し、レバミゾール(100 μM；Sigma-Aldrich)(非競合的TNAP阻害剤)、硫酸ベリリウム四水和物(競合的TNAP阻害剤)(100μM；Santa Cruz Biotechnology)、またはパミドロネート(非競合的TNAP阻害剤)(1μg/ml；Sigma-Aldrich)の存在または不在下にて、5％CO2インキュベーション、37℃で骨形成誘導培地で増殖させた。形態学的分化後、細胞をアリザリンレッドS染色に付した。
【００９１】
1.5 逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT-QPCR)
全RNAを、製造元の指示に従ってRNeasy Miniキット(Qiagen、Hilden、Germany)を使用して抽出した。大容量cDNA逆転写キット(AppliedBiosystems、Waltham、MA、USA)を使用して、2μgのトータルRNAからファーストストランドcDNAを合成した。RT-QPCRを、Prism 7300シーケンス検出システム(Applied Biosystems)にてSYBR GreenPCRマスターミックスで実行した。マーカー遺伝子の相対的定量を、内部対照遺伝子としてグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を使用するΔCt法に従って行った。RT-QPCRに使用される特定のプライマーを以下に示す。
【表２】
2021532376.tif 000004
【００９２】
1.6 免疫ブロット法
細胞溶解物を、M-PER(登録商標)タンパク質抽出試薬(Pierce、Rockford、IL、USA)とプロテアーゼ阻害剤カクテル(HaltTM； Pierce)を使用して調製した。タンパク質溶解物(20〜40μg)を10％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に移した。PVDF膜をTBST(20mM Tris-HCl [pH 7.6]、137mM NaCl、1％Tween 20)中の5％ブロッティンググレードミルクでブロックした。次に、PVDF膜を指定の一次抗体で4℃で一晩プローブし、洗浄しまし、次に、対応する二次抗体でさらに1時間プローブした。免疫反応性タンパク質を、製造元の指示に従って、ウエスタンブライトシリウス化学発光検出試薬(Advansta、Menlo Park、CA、USA)によって検出した。化学発光シグナルの画像を、LAS 3000システム(富士フイルム、東京、日本)を使用して捕捉した。使用した一次抗体は、ラット抗TNAP抗体(1μg/mL；R&D Systems、Minneapolis、MN、USA)、ウサギ抗GAPDH抗体(1：10000；Gentex、Zeeland、MI、USA)およびマウス抗ベータ-アクチン抗体(1：10000；ThermoFisher scientific)であった。使用した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体は、ヤギ抗ラットIgGおよび抗ウサギIgG(すべて1：5000希釈、Sigma-Aldrich製)であった。イ免疫ブロット実験を少なくとも2回行った。すべてのタンパク質バンド密度を、GAPDHまたはベータアクチンローディング対照の密度に正規化した。
【００９３】
1.7 細胞内ALP活性の測定
蛍光ALP活性検出キット(Abcam、Cambridge、UK)を使用して、細胞内ALP活性を測定した。簡単に説明すると、細胞(5×104)を100μLのアッセイ緩衝液でホモジナイズし、4-メチルウンベリフェリルホスフェート二ナトリウム塩基質を添加した。ALPは、非蛍光性の4-メチルウンベリフェリルホスフェート基質のリン酸基を切断し、蛍光性の4-メチルウンベリフェロンを生成する。30分後に停止液を加え、蛍光マイクロタイタープレートリーダー(Spectramax Gemini；Molecular Devices)を用いて360/440nmの励起/発光波長での蛍光強度を測定した。サンプル中のALP活性を、次の式を使用して計算した：ALP活性＝A/V/T(mU/mL)、ここで、Aはサンプルによって生成された4-メチルウンベリフェロンの量(nmol)、Vはアッセイウェル(mL)に添加されたサンプルの量、およびTは反応時間(分)である。
【００９４】
1.8 レンチウイルスベクターを介したRNA干渉
TNAP(TRCN0000052005、標的配列：GCGCAAGAGACACTGAAATAT、(配列番号：7))およびTRCN0000052007、標的配列：ACTGCCATCCTGTATGGCAAT、(配列番号：8))のためのショートヘアピンRNA(shRNA)発現プラスミドおよびバクテリアクローンは、RNAi Core Facility、Academia Sinica(Taipei、Taiwan)から入手した。ALPL cDNAフラグメントは、Genome Research Center、National Yang-Ming University(Clone：066116)の「哺乳類遺伝子コレクション」(クローン：066116)から得られたプラスミドから切り出され、Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(Thermo)を用いたPCRによって増幅された。ALPLフラグメントをpLAS2w.Ppuroベクター(RNAi Core Facility、Academia Sinica)にNheIおよびEcoRIサイト(NEB)でのライゲーションにより挿入した。レンチウイルスベクターの調製および形質導入のための手順は、以前に記載されたように実施された36、37。サブコンフルエントなMSCに、8μg/mLのポリブレン(Sigma-Aldrich)の存在下で多重度5のレンチウイルスベクターを形質導入した。24時間後、培養培地を、ピューロマイシン(1μg/mL)を含む新鮮な増殖培地と交換して、形質導入された細胞を48時間選択した。
【００９５】
1.9 免疫蛍光染色
MSCを骨形成誘導下で14日間培養した後、PBSで2回リンスし、4％パラホルムアルデヒドで室温で20分間固定した後、0.1％TritonX-100で室温で5分間透過処理した。次に、細胞を、PBST中の1％ウシ血清アルブミンによって室温で1時間ブロックした。ブロッキング緩衝液中のマウス抗オステオアドヘリン抗体(1：500希釈、R＆D)を添加し、4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄した後、二次抗体(Alexa fluor-488と結合したヤギ抗マウス抗体)(1：400；Invitrogen)とともに室温で1時間インキュベートした。細胞核を、PBS中の4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Sigma-Aldrich)で対比染色した。蛍光画像を共焦点顕微鏡(Carl Zeiss LSM510)で検査し、Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DICM27で撮影した。
【００９６】
1.10 免疫組織化学染色
免疫組織化学染色用のBM(骨髄)スライスを、3人のAS患者(A1、A2、およびA3)、2人の健康な個人(C4、C5)および1人の非AS患者対照(C6)から得た。非AS患者対照は、リンパ腫の精密検査のために骨髄生検を受けて、リンパ腫がなかった患者であった。その中で、健康な対照(C4、C5)は白人であり、それらのBMスライドをUS Biomax(Rockville、MD、USA)から購入した。AS患者および非AS患者対照は、台湾人であった。BM組織のパラフィンブロックを4μmのスライスに切断し、標準的なプロトコルを使用して処理した。切片をTris/EDTA(pH9)溶液(Thermo Fisher Scientific)中のAntigen Retrieval Reagentで処理し、リン酸緩衝生理食塩水中の0.1％Triton X-100で15分間インキュベートした後、3％ヒト血清(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)でブロッキングした。切片をウサギ抗TNAP抗体(1：200希釈；Abcam)とともに4℃で一晩インキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体(Dako)とともに室温で1時間インキュベートした。褐色の発色は、色原体3,3'-ジアミノベンジジン(Thermo Fisher Scientific)とのインキュベーションによって実施された。必要に応じて、核をヘマトキシリン(Thermo Fisher Scientific)で対比染色した。切片を水道水で5分間洗浄し、脱水し、カバースリップを取り付けた。
【００９７】
二重染色のために、上記のようにHRPを使用してウサギ抗TNAP抗体(1：200希釈； Abcam)で最初の染色を発色させた後、切片を以下の二次一次抗体：骨髄細胞系列のためのウサギ抗-MPO(1：1000 一晩希釈；DAKO)、単球系列のためのマウス抗-CD68(1：200 室温で3時間希釈；DAKO)、またはMSCのためのウサギ抗-CD44(1：200 4℃で一晩希釈；Abcam)とインキュベートした後、アルカリホスファターゼ結合二次抗体と室温で1時間インキュベートした。青色の発色は、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート、トルイジン塩(Roche)とのインキュベーションによって実施された。切片を水道水で5分間洗浄し、脱水し、カバースリップを取り付けた。
【００９８】
TNAP陽性細胞を同定するために、TNAP/MPO、TNAP/CD68、およびTNAP/CD44陽性細胞の共局在を、MetaMorphic Offlineバージョン7.8.2.0ソフトウェアを使用したスペクトルイメージング技術を使用して説明した。スペクトルライブラリを使用してスペクトルをアンミキシングした後(TNAP抗体体で茶色に染色、別の二次抗体で青色に染色)、TNAP/MPO、TNAP/CD68、およびTNAP/CD44の共局在化がターコイズ色で表される合成疑似カラー画像を作成した。
【００９９】
1.11 動物モデル
動物実験プロトコルは、Taipei Tzu Chi General Hospitalの動物管理利用委員会によって承認された。NOD-SCIDマウス(8〜10週)をBioLASCO(Taipei、Taiwan)から購入し、特定菌フリー環境で維持した。ヒトMSCを、培養物中のβ-グリセロホスフェートで5日間処理し、フィブリン(5μlフィブリンに106細胞)(Baxter、Vienna、Austria)に包埋し、NOD SCIDマウスの腰椎セグメントL4〜L5の右椎弓板に隣接する領域に移植した。腰椎の椎弓板を、鉗子を使用して皮質剥離した。手術後、マウスに0.9％リン酸塩食(Dyets、Bethlehem、PA、USA)を給餌した。腰椎のマイクロコンピューター断層撮影(SkyScan 1076；Kontich、Belgium)を移植の3週間後に行った。AS MSCを移植し、H2Oレバミゾール(10mg/kg)、硫酸ベリリウム四水和物(7.5mg/kg)、またはパミドロネート(0.3mg/kg)を12週間毎日経口投与した後、NOD-SCIDマウスのマイクロコンピューター断層撮影によって大腿骨の骨塩密度を測定した。新規骨付加の定量的量は、Bruker CT-Volumeバージョン2.0ソフトウェアによって取得された。
【０１００】
1.12 血清BAPレベルの測定
ヒト対象からの血液サンプルをEDTA処理チューブに収集した。LIASONアナライザーによるDiaSorin LIASON BAP OSTASEアッセイ(1ステップ遅延添加サンドイッチ化学発光免疫アッセイ)を使用して、骨特異的TNAP(BAP)のレベルを測定するために血清を収集した。製造元によれば、5.1〜20.2μg/Lの血清BAPレベルの基準範囲は正常であると見なされた。
【０１０１】
1.13 サイトカイン放出
サイトカイン産生を決定するために、MSCを骨形成誘導下で培養した。3、7、および10日目に上清を収集した。Human Milliplexキット(Merck Millipore、Billerica、MA、USA)を製造元の指示に従って使用して、サイトカインを検出した。データを、Luminex 200機器(Luminex、Austin、TX、USA)によって取得し、Milliplex analyst v5.1(Merck Millipore)によって分析した。
【０１０２】
1.14 マイクロアレイ分析
総RNAを、0、3、7日目に骨形成誘導下のAS MSCとN MSCから調製し、中央研究院(Academia Sinica)のGRC Microarray Core Facilityにて、ヒトマイクロアレイチップ(Affymetrix、Santa Clara、CA、USA)のために使用した。GeneChip(登録商標)3'IVT Expressキット(Thermo Scientific、Waltham、MA、USA)を使用した、逆転写、ビオチン結合ヌクレオチドの取り込み/断片化、および線形RNAの35〜200ntのビオチン標識フラグメントへの変換の逐次手法を着手した。次に、サンプルをGeneChip Human Genome U133 Plus2.0アレイにハイブリダイズさせた。アレイの洗浄と染色を、Fluidics Station 450(Thermo Scientific)を使用して行い、アレイデータを、GeneChip Scanner 3000(Thermo Scientific)を使用して取得した。最後に、アレイデータをGeneSpring GX v12(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、USA)によって分析した。
【０１０３】
1.15 統計分析
データを、平均±平均の標準誤差(SEM)または平均±標準偏差(SD)として示す。データを、スチューデントのt検定、マンホイットニーのU検定、またはフィッシャーの直接確率検定によって分析した。変数間の相関を、スピアマンの順位相関検定で決定した。P＜0.05を有意であると見なした。データを、SPSSまたはPrismv6.01によって分析した。
【０１０４】
2．結果
2.1 骨形成誘導下のAS MSCにおける加速された鉱化の病理学的表現型はRunx2に依存しない
ASにおける間質前駆細胞の活性化を研究するために、3人のAS患者(AS MSC)の脊髄強直に関与する組織内のBM-MSCからエクスビボ細胞培養モデルを確立した。これらの細胞を、外傷手術を受けた非ASコントロールのBM-MSC(N MSC)と比較した。これらの細胞は線維芽細胞様の形態を採用し、BM-MSCの特徴的な表面マーカーを発現した。それらは、特定の標準的な誘導法によってアッセイされるように、三系統の分化の可能性を有した16。
【０１０５】
AS MSCとN MSCの間の骨形成能を評価するために、骨形成誘導培地で培養した。注目すべきことに、カルシウム沈着のためのアリザリンレッドS(ARS)による染色は、3つのN MSC(図1A、図1B)と比較して、3つのAS MSCで有意に加速された鉱化速度を示した。一般に、カルシウム沈着は、MSCの骨芽細胞への分化を示唆しており、これは、ラント関連転写因子(Runx)2によって調節される17。Wingless(Wnt)18経路と骨形成タンパク質(BMP)19経路の両方が、Runx2を介した骨芽細胞形成への正常なMSCの関与にとって重要であることが知られている。しかしながら、我々は、これらの経路の関与が、AS患者のインビトロAS MSC培養またはインビボBM標本のいずれにおいても鉱化作用の加速に寄与することを発見しなかった。また、AS MSCでは鉱化作用の加速が見られたが、Runx2の発現はAS MSCとN MSCで同等であった(図1C)。さらに、shRNAによるAS MSCのRunx2ノックダウン(図1D)は、加速された鉱化作用に影響を与えなかった(図1E、図1F)。同様に、オステオアドヘリン、オステオカルシンおよびコラーゲン1A1などの骨芽細胞マーカーの発現は、骨形成誘導後のAS MSCとN MSCの間で同等であった(図1G-図1I)。これらの結果は、異常な鉱化が、Runx-2依存性骨芽細胞形成ではなく、骨形成誘導後のAS MSCの病理学的表現型に寄与することを示す。
【０１０６】
2.2 TNAPの発現増強は、骨形成誘導下のAS MSCにおける異常な鉱化に不可欠である
AS MSCの加速された石灰化の調節メカニズムをさらに調査するために、マイクロアレイ分析により、0、3、および7日目の骨形成誘導後のAS MSCとN MSCの間の遺伝子発現を分析した。骨形成誘導後、AS MSCでは、N MSCと比較して、2倍以上、それぞれ188個の遺伝子と136個の遺伝子がアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた。これらのうち、骨形成に関与する遺伝子は、Ingenuity Pathway Analysisによって明らかにされた。RT-QPCRによる骨形成に関与する遺伝子のさらなる検証により、組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNAP)発現およびアルカリホスファターゼ(ALP)活性の上昇は、骨形成誘導の前後の両方で、N MSCと比較して、AS MSCにおける異なる鉱化の加速速度に最も密接に関連していることが明らかになった。ALPは、脱リン酸化およびトランスリン酸化反応を触媒することができる非遍在性外部酵素の大きなスーパーファミリーである。それは、別々の遺伝子によってコードされるTNAP、胎盤、生殖細胞、および腸のALPを含む4つのアイソザイムからなる。その中で、TNAPはALPL遺伝子によってコードされ、選択的スプライシング転写変異体とともに肝臓/骨/腎臓組織に分布する20、21。ピロリン酸塩を加水分解し、無機リン酸塩を提供して鉱化作用を促進する20、21。AS MSCの異常な鉱化におけるTNAPの役割を決定するために、骨形成培養物を非競合(レバミゾール22またはパミドロネート23)および競合(ベリリウム硫酸塩24)TNAP阻害剤で処理した(図2D、図2E)。TNAPが、TNAPに対する2つの独立したshRNAによってサイレンシングされた場合、AS MSCにおける加速された鉱化作用の同様の減少が観察された(図2F-2J)。さらに、N MSCにおけるレンチウイルス形質導入を介したTNAP過剰発現は、強化された鉱化作用を示した(図2K-2M)。さらに、β-グリセロホスフェート(TNAPの基質)の存在下で増殖培地(GM)中でMSCを培養した21(図5)。予想通り、GM中で培養されたNMSCは石灰化しなかった。しかしながら、AS MSCへのβ-グリセロホスフェートの添加は、N MSCよりも高い鉱化率を示し、AS MSCでのTNAPの発現増加は、その基質の存在下で加速された鉱化を誘導するのに十分であることを示唆する。まとめると、これらの結果は、TNAPの発現の増強、がAS MSCにおける鉱化の加速に不可欠であることを示す。
【０１０７】
2.3 TNAP遮断は、NOD-SCIDマウスのAS MSCによって誘発される新規骨付加を阻害する
次に、TNAP阻害剤の治療可能性をテストするために使用することができる病理学的骨付加を模倣するために、AS MSCベースのインビボ疾患モデルを確立した。特に、N MSCではなく、AS MSCを移植されたNOD-SCIDマウスは、腰椎セグメントL4-5の右椎弓板に隣接して、新規骨付加を発達させた(図3A)。さらに、対照のshRNA形質導入AS MSCと比較して、TNAPがshRNAによってサイレンシングされた場合、AS MSCの移植によって誘発された異所性骨付加はブロックされた(図3B)。一貫して、TNAP阻害剤の経口投与は、AS MSCを移植したNOD-SCIDマウスにおいて新規骨付加を大きく無効にしたが(図3C)、全体的な骨塩密度(BMD)は変化させなかった(図6)。群間の新規骨付加の定量的体積を示した(図3D)。これらの結果は、TNAP遮断が、NOD-SCIDマウスにおいてAS MSCによって誘発される新規骨付加を阻害する可能性があることを示唆する。
【０１０８】
2.4 血清骨特異的TNAPレベルは、AS患者のレントゲン写真の重症度と有意に関連しており、予後マーカーとなる可能性がある
次に、我々は、AS患者のBMまたは末梢血でTNAPの発現増強が検出することができるかどうかを疑問に思った。BM標本の免疫組織化学(IHC)染色は、健康な個人(図4A)および非AS患者対照(図7)と比較して、AS患者のBMにおけるTNAPの発現の増加を明らかにした。IHC二重染色は、ほとんどのTNAP陽性細胞が骨髄細胞系列(ミエロペルオキシダーゼ+)、単球(CD68+)系統またはMSC(CD44+)であることを示した(図4B、4C、4D)。さらに、血清TNAPの代わりに、2つの別々のコホートからのサンプルを使用して肝臓と腎臓からのTNAPの干渉を除外するために骨特異的TNAP(BAP)の血清レベルを測定した：1つは104人のAS患者と50人の健康な対照を含む台湾のコホートであり、コントロール、他方は184人のAS患者を含む英国のコホートである。それらの人口統計学的特徴およびサブグループ/コホート間の比較的差異を示しれた(表1-3)。台湾と英国のコホートで血清BAPレベルが上昇した(>20.2μg/L)AS患者の割合は、それぞれ9.61％と25.54％であった。全体として、血清BAPレベルは、台湾のコホートでは健康な対照(12.954±5.538μg/Lおよび6.296±2.110μg/L；P＜0.001)よりAS患者で有意に高かったが、血清BAPレベルは、英国のコホートでは17.607±8.055μg/Lであった。
【０１０９】
【表３】
2021532376.tif 000005
【０１１０】
【表４】
2021532376.tif 000006
【０１１１】
【表５】
2021532376.tif 000007
【０１１２】
次に、血清BAPレベルが臨床パラメーターと相関しているかどうかをテストした。レントゲン写真の重症度を、バス強直性脊椎炎放射線指数-合計スコア(BASRI-合計)または修正ストーク強直性脊椎炎脊椎スコア(mSASSS)によって測定した。注目すべきことに、AS患者の血清BAPレベルとレントゲン写真の重症度の間には有意な正の相関があった(mSASSSによる両方のコホートでP＜0.05；BASRIによる台湾のコホートでP＜0.001；英国のコホートではBASRIの合計は記録されなかった)(表4a)。同様に、AS患者のレントゲン写真の重症度を予測するために使用することができる危険因子を明らかにするために、さまざまなモデルを使用して多変量回帰分析を実行した。これらの結果は、台湾のコホートでは血清BAPレベル、疾患期間、CRPが独立した危険因子であったのに対し、英国のコホートでは、血清BAPレベル、疾患期間、男性の性別が独立した危険因子であることを示した(表4b)。注目すべきことに、血清BAPレベルと疾患期間は、分析の異なるモデルに関係なく、2つの一般的な予測因子である。次に、台湾のコホートでレントゲン写真の変化を縦断的に追跡した37人のAS患者のデータを分析した(表5)。この縦断的ASサブグループ分析では、血清BAPレベルとCRPが、AS患者の年間レントゲン写真の進行を予測するための2つの独立した危険因子であることがわかった(表4c)。要約すると、台湾と英国の両方のコホートの分析は、血清BAPレベルが脊椎強直のリスクが高いAS患者の予後バイオマーカーである可能性があることを示した。
【０１１３】
【表６】
2021532376.tif 000008
【０１１４】
表4b：「台湾および英国のコホート」のAS患者におけるレントゲン写真の重症度を予測するための多変量線形回帰分析
【表７】
2021532376.tif 000009
【０１１５】
表4c：「台湾コホート」の縦方向ASサブグループにおける「毎年のレントゲン写真の変化」を予測するための多変量線形回帰分析*
【表８】
2021532376.tif 000010
【０１１６】
【表９】
2021532376.tif 000011
【０１１７】
3．概要
ここでは、脊椎骨切り術後のAS患者(AS MSC)の強直脊椎の強直組織の骨髄から間葉系間質細胞を確立した。これは、骨切り術中の間質前駆細胞の活性化の研究、およびAS患者の強直を解決するための薬物を特定するための潜在的な細胞ベースのプラットフォームに使用することができる。本発明に由来するAS MSCは、骨形成誘導後の加速された鉱化の異常な表現型を示し、その組織の非特異的アルカリホスファターゼ(TNAP)活性が高度に発現された。本発明に由来するAS MSCは、NOD-SCIDマウスの脊椎に移植された場合、動物に異所性骨付加を誘発することができ、良好な動物モデルとして役立つ。
【０１１８】
重要なことに、レバミゾールまたは窒素含有ビスホスフェート(パミドロネートなど)などの非競合的化学阻害剤によるTNAPの遮断は、培養中のASMSCのこの異常な鉱化を阻害する。レバミゾールまたはパミドロネートの経口投与後、NOD-SCIDマウスにおけるAS MSCの移植によって誘発された異所性骨付加は遮断されるであろう。興味深いことに、レバミゾールは数年前から駆虫薬として使用されてきた25。いくつかの研究は、レバミゾールがT制御性細胞に対する提案された作用でAS患者の炎症をわずかに軽減できることを報告している26-29。しかしながら、TNAP阻害による靭帯骨棘形成の遮断におけるその臨床応用は調査されていない。レバミゾールの長期処置は、我々の実験において処置されたマウスの骨密度に影響を与えなかった。さらに、もう1つの重要な見通しは、TNAP阻害と骨粗鬆症予防の両方に影響を与える、窒素含有二リン酸(パミドロネートなど)が探索に値する二つの目的を果たす薬を開発することである23。ビスホスフェートは、破骨細胞の骨吸収を阻害することにより骨粗鬆症治療に広く使用されてきたが、それらの骨フック構造でMg2+/Zn2+をキレート化することによりTNAP酵素を阻害することもできる23。興味深いことに、我々のデータは、パミドロネートが骨形成誘導下でAS MSCの強化された鉱化をブロックするだけでなく、我々のAS-MSCベースの動物モデルにおける新規骨付加を阻害することを特定した。パミドロネートの臨床応用は、マクロファージ/単球系統における炎症誘発性サイトカインの調節など、その抗炎症効果を介してAS疾患活動性の制御に提案されているが30-35、血清BAPレベルの低下に対する効果を示唆した研究は1つだけである34。従来技術では、靭帯骨棘形成の遮断に対するその効果を示す利用可能なデータはない。
【０１１９】
したがって、ここで確立されたAS MSCは、将来AS患者の脊椎固定術の問題を解決するための潜在的な治療の効果を調査するための有用なプラットフォームとして役立つ可能性がある。
【０１２０】
また、我々は、高い血清TNAP/または骨特異的ALP(BAP)レベルが、AS患者のレントゲン写真の重症度と有意に相関することを実証し、これは、将来の脊髄強直症のAS患者の高リスクを予測するための潜在的な予後バイオマーカーとなるであろう。この発見は、潜在的に容易なX線進行を伴うAS患者のハイリスクグループを臨床医が早期に特定するのに非常に役立つ可能性があり、経口レバミゾールまたは選択的TNAP阻害剤による早期処置と組み合わせると、AS患者の脊髄強直を阻止する潜在的な有効性が見込まれる。
【０１２１】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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