(57)【要約】  本発明は下記工程を含むことを特徴とする、セル・オブジェクトに有効な試験化合物を同定する方法に関する：a)セル・オブジェクトを含んでいると疑われる液体検体を用意し、b)工程a)に記載の液体検体の質量分析法および／または破壊的分光光度法試験を実施し、c)工程b)で得られた質量分析スペクトルおよび／または分光光度スペクトルを、複数の既知セル・オブジェクトのこのようなスペクトルを含んだデータベースのエレメントと比較し、d)工程c)に記載の比較の過程で、工程a)に記載の検体中に存在するセル・オブジェクトを同定し、e)工程a)に記載の検体の非破壊的分光光度法試験を行い、この間に、検体の非破壊的分光光度スペクトルを、試験化合物をそれに添加しないで、および試験化合物を所定濃度または幾つかの異なる濃度でそれに添加してから記録し、かつ試験化合物の溶液の分光光度スペクトルの記録も行い、f)工程e)で得られた試験化合物を全く添加していない検体で測定された分光光度スペクトルを、試験化合物を添加して調製された１または２以上の検体の分光光度スペクトルと比較し、g)工程f)に記載の比較の結果から、試験化合物の有効濃度に関する結論を引出す。本発明はまたこの方法の実施に供する装置にも関する。
2021502111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含むことを特徴とする、セル・オブジェクトに効果のある試験化合物を同定する方法：
ａ）セル・オブジェクトを含んでいると疑われる液体検体を用意し、
ｂ）工程ａ）に記載の液体検体の質量分析法および／または破壊的分光光度法試験を実施し、
ｃ）工程ｂ）で得られた質量分析スペクトルおよび／または分光光度スペクトルを、複数の既知セル・オブジェクトのこのようなスペクトルを含んだデータベースのエレメントと比較し、
ｄ）工程ｃ）に記載の比較の過程で、工程ａ）に記載の検体中に存在するセル・オブジェクトを同定し、
ｅ）工程ａ）に記載の検体の非破壊的分光光度法試験を行い、この間に、検体の非破壊的分光光度スペクトルを、試験化合物をそれに添加しないで、および試験化合物を所定濃度または幾つかの異なる濃度でそれに添加してから記録し、かつ試験化合物の溶液の分光光度スペクトルの記録も行い、
ｆ）工程ｅ）で得られた試験化合物を全く添加していない検体で測定された分光光度スペクトルを、工程ｅ）で得られた試験化合物を添加して調製された１または２以上の検体の分光光度スペクトルと比較し、
ｇ）工程ｆ）に記載の比較の結果から、試験化合物の有効濃度に関する結論を引出す。
【請求項２】
工程ｂ）において質量分析法と破壊的分光光度法の両方の試験を行い、工程ｃ）に記載の比較を質量分析スペクトルと分光光度スペクトルの両方に関して行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）に記載の質量分析法試験を、５０〜２０００の質量電荷比範囲、好ましくは６００〜９００の質量電荷比範囲内で行うことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）および／または工程ｅ）の実施時の分光光度法試験としてＵＶ分光光度法またはラマン分光法試験、好ましくはラマン分光法試験を用いることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）に記載の破壊的分光光度法試験の場合に、破壊を超音波または電磁波、好ましくはレーザー光、さらにより好ましくは、波長約５３０ｎｍのレーザー光を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
セル・オブジェクトは微生物、好ましくは細菌、特に好ましくはヒトまたは動物の疾患を引き起こす細菌であり、この本方法の特に好ましい実施形態の場合の試験化合物は抗生物質であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｃ）に記載のデータベースのエレメントは、工程ｂ）に記載の試験を実施する時に使用したのと同種の機器を使用して記録されたスペクトルであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）に記載の比較、および／または工程ｄ）に記載の同定、および／または工程ｆ）に記載の比較、および／または工程ｇ）に記載の結論の導出がコンピュータ・アルゴリズムを用いて実施されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
検体が、感染による罹患が疑われる動物またはヒトの組織／部分の断片、粘膜スミア、体液由来の検体、或いは表皮の検体であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
動物が、家畜動物、好ましくは豚、畜牛、羊、馬、雄ウシ、山羊、家禽、魚、七面鳥、ガチョウ、鳩、アヒル、またはダチョウであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロ流体装置内で実施されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
セル・オブジェクトに効果のある試験化合物を同定するのに適した装置であって、下記を備えたマイクロ流体装置であることを特徴とする装置：
検体ホルダー（１）、第一ポンプ（１１）、第一分配弁（１２）、および質量分析器（１３）、
１または２以上の試験化合物ホルダー（２ａ，２ｂ，２ｃ）、および第二ポンプ（２１）、
油容器（３）、および第三ポンプ（３１）、
ドロップ・ディスペンサー（４）、第一の窓（５２ａ）とこれに物理的に同じか若しくは物理的に異なる第二の窓（５２ｂ）とを備えたマイクロ流体チューブ（５）、破壊エレメント（６）、分光光度計（７）、第二分配弁（５１）、およびコレクター（８）、
ここで、
第一ポンプ（１１）は、検体ホルダー（１）からの液体検体の一部分を、第一分配弁（１２）を経て質量分析器（１３）またはドロップ・ディスペンサー（４）のいずれかに搬送し、
第二ポンプ（２１）は、１または２以上の試験化合物ホルダー（２ａ,２ｂ,２ｃ）からの所定の試験化合物溶液をドロップ・ディスペンサー（４）に搬送し、
第三ポンプ（３１）は、油を、油容器（３）からドロップ・ディスペンサー（４）に搬送し、そして
ドロップ・ディスペンサー（４）は、第一ポンプ（１１）および第一分配弁（１２）を経てそれに搬送された液体検体の一部分（場合によりそれに第二ポンプ（２１）を経てそれに搬送された試験化合物溶液が混合する）と、それに第三ポンプ（３１）を経て搬送された油とを、交互にマイクロ流体チューブ（５）中に分配し、このチューブを通って液体検体部分と油滴とが交互に流れ、ここで
Ａ）破壊エレメント（６）が第一の窓（５２ａ）の前を通過する１または２以上の液体検体部分に破壊作用を発揮し、かつ第二の窓（５２ｂ）の前を通過する１または２以上の液体検体部分のスペクトルを分光光度計（７）を用いて記録し、次いでその１または２以上の液体検体部分は第二分配弁（５１）を経てコレクター（８）に搬送されるか、または
Ｂ）ドロップ・ディスペンサー（４）から流れる１または２以上の液体検体部分が破壊されずに第二の窓（５２ｂ）の前を通過し、かつその１または２以上の液体検体部分のスペクトルを分光計（７）で記録し、この液体検体部分は次いで第二分配弁（５１）を経てコレクター（８）に搬送されるか、または第二ポンプ（２１）を経てドロップ・ディスペンサー（４）内に戻され、その間に、試験化合物溶液が然るべき試験化合物ホルダー（２ａ,２ｂ,２ｃ）から第二ポンプ（２１）を経て所定の液体検体部分に添加され、それによりその試験化合物濃度が増大され、こうして変化した液体検体部分が破壊されずにマイクロ流体チューブ（５）を通って第二の窓（５２ｂ）の前をもう一度通過し、この液体検体部分のスペクトルが分光計（７）で記録され、次いでこれはコレクター（８）に搬送されるか、または前述したプロセスに従って試験した液体検体部分の試験化合物濃度がさらに一層増大され、そして、然るべき試験化合物ホルダー（２ａ,２ｂ,２ｃ）から第二ポンプ（２１）及びドロップ・ディスペンサー（４）を経てマイクロ流体チューブ（５）に搬送された試験化合物のスペクトルが分光計（７）で記録される。
【請求項１３】
マイクロ流体チューブ（５）の第一の窓（５２ａ）と第二の窓（５２ｂ）とが物理的に同じものであることを特徴とする、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
分光光度計（７）が、ＵＶ分光光度計またはラマン分光計、好ましくはラマン分光計であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の装置。
【請求項１５】
分光計（７）がラマン分光計であり、この同じラマン分光計が、それから発出されるレーザー光の結果として破壊エレメント（６）としても作用することを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
破壊エレメント（６）が電磁波を発するエレメント、好ましくはレーザー光を発するエレメント、さらにより好ましくは波長約５３０ｎｍのレーザー光を発するエレメントであることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
破壊エレメント（６）が超音波を発生するエレメントであることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
その温度を調節することができることを特徴とする、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
その内部に不活性雰囲気を生起させることができることを特徴とする、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に見出されるセル・オブジェクト（細胞物体）、特に微生物、並びにそれに抗して効果的に使用できる試験化合物、微生物の場合は抗生物質、を短時間に高精度で同定しうる処理の実施におけるマイクロ流体方法に関する。本発明の対象はまた、この方法を実施するのに役に立つマイクロ流体装置にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数十年に、病気を引き起こす感染を数時間以内に同定できる方法に対する需要がかなり高まってきた。さらに、ここ数年では、細菌耐性を短時間で同定することができる方法の需要が増大してきた。その理由は、細菌の耐性菌株に加えて、多剤耐性細菌、すなわち、いくつかの抗生物質に耐性の細菌が今は広がってきており、それがより重篤でしばしば致命的な病気をヒトおよび動物（特に家畜）の両方において引き起こすことがあるからである。世界銀行により公表されたデータ（薬剤耐性感染症‐経済の将来への脅威＜Drug-Resistant Infections - A Threat to Our Economic Future＞ ２０１７年３月、世界銀行、http://documents.worldbank.org/curated/en/323311493396993758/pdf/114679-REVISED-v2-Drug-Resistant-Infections-Final-Report.pdfを参照）から、多剤耐性細菌は２００９年から２０１１年の間に米国領土内で２百万人のヒトの病気を引き起こし、そのうち、約２万５千人は死に至ったことがわかる。２０１５年１０月８日のベルリン（ドイツ）でのＧ７国の会合で、Ｇ７国では５人に１人の感染症が抗生物質に耐性であることが述べられた（https://www.oecd.org/health/health-systems/AMR-Presentation-Kapferer-OECD-Berlin-October2015.pdf）。２０１６年には、多剤耐性細菌により引き起こされた疾患は、その前の７年間で６％の低下を見ることができたが、今後３５年のうちにこのような疾患は世界中で３億人の死を引き起こすであろうと推測されている。
【０００３】
耐性、特に多剤耐性の細菌の問題はヒトの健康をますます圧迫するだけでなく、家畜についてもそうである。これに関して、耐性および多剤耐性細菌に対する格闘は、食物連鎖の安全性を確立することにより始まり、抗生物質を過剰使用するうちに、これらの薬剤が食肉の摂取により人体に入りこみ、対内で耐性を生ずる可能性がある（２０１７年、抗菌剤の消費並びにヒトおよび食物生産家畜からの細菌の抗菌耐性の出現の統合分析に関するＥＣＤＣ／ＥＦＳＡ／ＥＭＡ第二回ジョイントリポート−Joint Interagency Antimicrobial Consumption and Resistance Analysis (JIACRA) Report. EFSA Journal 2017;15(7):4872, 135 pp.）。
【０００４】
現在、一部の国々では、抗生物質が、実際の感染症のケースのみならず、予防の形態でも動物に投与されてきた。このやり方は、耐性および多剤耐性細菌の発生に極めて有利に作用し、ヒトをも危険にさらす。
【０００５】
畜産農場で家畜の迅速なスクリーニングを実施すれば、個々の感染した動物をすばやく同定し、それらを健康な動物から隔離することが可能となり得て、従って、全体の家畜集団を望ましくない感染の影響からより効果的に保護することができる。そのため、次は、家畜レベルでの抗生物質に対する問題の微生物の耐性を決定することも重要となる。それを通して、ヒトに広がる感染の波を避けることができる可能性があるからである。
【０００６】
上記から、ヒトの健康および畜産農業の両方に関して、感染症を引き起こす微生物の同定と、次に実際に同定された、検体（サンプル）中に存在する微生物に対して有効な抗生物質の同定とを助けることができる方法を提供することが必要である。耐性および多剤耐性の出現の可能性が増えている結果として、既知の細菌に抗するのに用いる抗生物質を決める時に、文献に見出されうる情報に頼るのでは不十分であり、それよりもある細菌に対するある抗生物質の効力を個々のケースごとに経験的に決めることの方が好ましい。
【０００７】
細菌感染症に対する格闘の第一段階の一つは、その感染症を引き起こす細菌の同定である。従来の培養手法の使用はこれに大きな役割を果たしている。このプロセスの要諦は、ある細菌を含んでいると疑われる検体を適当な培地上にプレーティングし、培養（インキュベーション）することである。このような条件下で細菌は増殖し始め、次いで２４時間後また場合により数日後にはその細菌は目視できるコロニーの形態で培地上に現われる。より正確な同定が必要な場合には、特異的または特定の培地で増殖させる目的で特定のコロニーから検体を採取することができ、それを次に別の培地上に散布し（塗沫培養）、もう一度培養することができる。この結果、同じ細菌の複数の別個の培養物が利用可能となろう。培地上に現れた細菌コロニーは、当業者であれば目視で容易に評価することができ、評価方法は文献で詳細に扱われてきた（例えば、the International Journal of Food Microbiology, vol. 31, 1-3, August 1996, pp 45-58 を参照）。所定の細菌コロニーは、種およびセロタイプ(抗原型)のより精密な同定のために生化学的反応を受けさせることができ、コロニーの評価には他の分子的な方法も使用できる（例えば、Innovare Journale of Life Science, Vol. １, Issue １, Vashist Hemraj, Sharma Diksha, Guputa Avneet: 汎用の生化学的細菌試験の概観）。細菌種の決定に加えて、別の重要な側面はそれらの量の決定である。それにより、培養法を使用する場合に、実証済みで信頼できるプロトコルが利用可能になる。その提示はすぐ上の同じ刊行物中に見られうる。
【０００８】
従って、旧来の培養法は古くて徹底的に試験された手法であるが、それは未だ今日でも発展しつつある。このような方法の範囲内で、色素産生性および蛍光発生性、そして選択的および示差的培地の使用といった、試験の信頼性を高めることができる解決策が開発されてきた（例えば、Applied and Environmental Microbiology, Sept. 1977, P. 274-279, Edmund M. Powers and Thomas G. Latt U.S. Army Natick Research and Development Command, Natick, Massachusetts 01760 単純化４８時間ＩＭＶｉｃ試験：寒天プレート法を参照）。
【０００９】
しかし、培養法の欠点は、時間がかかり、その間に感染が連続的に広がりうることである。細菌の菌株の種類によっては（例えば、ある種のサルモネラ菌株の場合）、培養工程自体の前に増菌工程を実施しなければならない（これが全体の処理時間の時間的要求（必要時間）をさらに１２〜２４時間増大させる）ことにより、培養法の必要時間も長くなる。
【００１０】
培養法と組み合わせた抗生物質耐性試験は、有効と思われる培養プロセスを経て作成された細菌コロニーに抗生物質の調合物を添加して、どの抗生物質調合物が検査下で細菌コロニーを死滅させるかを検査することにより行われる。
【００１１】
抗生物質の耐性を実証するために今日でも最も広範に使用されている方法は、上述した培養法に基づいている耐性ディスクの使用である。このような耐性ディスクの使用の要諦は、ある抗生物質を含んでいるディスクを、その細菌を目視可能に含んでいる培地上に置き、そのディスク近傍で細菌が死滅しているか否か（例えば、細菌の存在のために不透明になった培地が、抗生物質の効果により透明になるか否か）を検査することである。このようなディスク近傍で細菌が死滅しているなら、これは、その抗生物質がその細菌に有効であることを意味する。耐性ディスクの使用は、最初の培養物を増殖させるのに少なくとも２４〜４８時間を一般に必要とし、その後にさらなる増殖サイクルを必要とする。最初の増殖中にまず検体内中に見出された細菌を単離しなければならず、次に第二の増殖サイクル中に、耐性ディスクに使用するために個々のコロニーから新たな培養物を増殖させなければならないからである。
【００１２】
この培養法で適当な抗生物質を同定しなければならないなら、これに要する時間は、内部の実験室試験の場合でほぼ２４〜７２時間（培養に１２〜４８時間、抗生物質試験に１２〜２４時間）であり、外部の認可実験室を使用する場合には、搬送に必要な時間の結果、必要時間は３〜６時間増大する。
【００１３】
最新技術に従った細菌同定、従って、細菌感染同定方法の大部分は、旧来の培養法に基づいている。その主な理由は、最初の検体において、細菌細胞から組織細胞を単離すること、または試験中にそれらの間で区別することが難しいからである。そのため、同定前に、組織細胞の数に比べた細菌細胞の数を増大させる必要がある。さらに、この種の測定を信頼できるようにするために、検出限界を超える細菌の量が必要である。
【００１４】
しかし、検体の細菌含有量の増殖は時間のかかるプロセスであり、存在する細菌の性質に関する情報（細菌菌株、およびそれに抗して有効に使用できる抗生物質）は、感染の広がりを効果的に防止するためにできるだけ早くに利用可能となる必要がある。
【００１５】
これが、その使用によって培養法より著しく短時間で検体中の細菌を同定するのを可能にする数多くの方法がこれまでに開発されてきた理由である。ヒトおよび動物の病気における病原体をわずか数時間で同定するために診断学市場では数多くの解決策を今では見出すことができる。
【００１６】
例えば、多様な微生物（真菌及び細菌）を素早く同定することができる自動化装置である、迅速試験に適したＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＶＩＴＥＫ  ２装置が知られている（詳細については、http//:www.biomerieux-usa.com/clinical/vitek-2-healthcareを参照）。この装置は、検体評価および同定実施のために、微生物、細菌セロタイプの指紋（フィンガープリント）を基礎とするデータベースを使用する。この指紋は、ＭＩＣ試験（最小発育阻止濃度）、即ち、全抗生物質スペクトルに関係する抗生物質耐性試験の用量−効果曲線の結果に基づいて得られたパターンにより提供され、これをデータベース中に格納されたパターンと比べる。微生物の同定は試薬カードを用いて行われる。各試薬カードは、６４の異なる試験基質を含んだ１枚のシートである。この試薬カード中で検体と基質のインキュベーションが行われ、そのために本装置は適切な雰囲気および温度を提供する。各種基質に対する反応が透過型光学システムを用いて装置により監視される。得られた反応に基づいて、装置は、比較的に短時間（３〜７時間）のうちに高い精度で所定の微生物を同定することができる。このシステムの欠点は、事前に培養が必要であることと、多様な種類の微生物を含んだ検体の場合には使用できないことである。
【００１７】
国際特許出願公開公報ＷＯ１９９４／０２８４２０号は、培養物および食品検体中のサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌菌株の同定のためのＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定）法を開示する。この方法は、２４時間の培養段階の後に、発光分析法を用いて所定検体中の上記細菌の定量的および定性的分析を実施可能にする直接ＥＬＩＳＡ法である。その利点は、適当な細菌特異性抗体を用いることにより他の細菌の同定にも適していることである。その欠点は、同定すべき個々の各細菌に対する抗体を有する必要があることと、少なくとも２４時間の培養段階も必要なことである。
【００１８】
国際特許出願公開公報ＷＯ２００６／０８５９４８号は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技法に基づく方法を開示する。その要諦は、同定すべき細菌に特有な核酸を同定することである。分析のためにＤＮＡの小片を倍増（増幅）させることを可能にする。この技法は、正確な細菌同定が可能であり、かつ少ない検体量を扱うことができる。さらに、旧来の培養手法よりは迅速（１２〜２４時間）であるが、その欠点は死滅した細菌も同定されることである。これは、死滅細胞由来であっても検体中に存在する全ＤＮＡを同定するからで、それにより、いわゆる擬陽性の結果を生じうる。この方法の別の欠点は、事前に同定すべき細菌に由来するＤＮＡ配列の断片が必要なことと、この方法に従ったプロセスが遅いことである。
【００１９】
米国特許公報ＵＳ５０５９５２７Ａは、グラム陰性細菌のエンドトキシンを同定する方法を開示し、これは個々の細菌が自身の脂質組成により特徴づけられることに基づいている。この方法の過程において、脂質は超臨界抽出を用いて検体から得られ、次いでこれをヒドロキシ脂肪酸のメチルエステルに変換させる。得られたエステルをガスクロマトグラフィーおよび質量分析法を用いて同定する。得られた脂質分布をデータベースと比較することにより細菌の同定が可能となる。この方法の利点は、検体の長時間の培養を行う必要がないため感度が高いことと、この方法が自動化されうることである。その欠点は、検体の調製時に超臨界抽出用の特別な設備が必要なことと、化学反応を行う必要があることである。
【００２０】
米国特許公報ＵＳ６１７７２６６Ｂ１は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法）に基づく細菌の高速同定方法に関する。その基礎は、ソフトイオン化技法であり、それにより所定細菌に特徴的なタンパク質の非破壊試験を行うことが可能となる。ＭＡＲＤＩは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化である。この光イオン化解決策は、よく制御可能なイオン化を与え、それにより、酵素、ホルモン、分子量が数十万ダルトンの生体分子、タンパク質などの非常に熱感受性の高い物質の質量分析法試験を行うことが可能となる。制御可能なレーザー源から発出する励起エネルギーがマトリックスにより吸収され、試験すべき分子に転換される。マトリックスを適切に選択することにより、濃縮相内の分子に関して穏やかなエネルギー移動を達成することができる。この後、生成したイオンは、大フィールドエネルギー加速器システム（６０〜１００ｋＶ）により、次に通常は高速分析器に連結される（ＴＯＦ）ことにより濃縮相から溶発または脱離される。大分子量（大きいと１０5〜１０6ダルトン）のイオンを測定することができ、この組み合わせがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦである。測定の過程で、検体由来の質量プロファイル（指紋）に基づいて所定の微生物を同定することができる。今日、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、最少量で存在する化合物の存在を同定することができる分析測定システムであり、〜１０7／ｍｌの濃度のマトリックスから物質を同定することさえできる。その欠点は、純粋な細菌培養物に由来する検体を取り扱う方がより良いことである。この方法は従来の方法より高速でより精度の高い細菌同定を可能にするが、２４〜７２時間の培養時間を避けることはできないので、十分に高速であるとはなお考えられていない。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ手法の欠点の一つは並はずれて高価なことである。
【００２１】
上述したように、細菌の同定それ自体が不十分であるのは、存在する可能性のある耐性または多剤耐性のために、計画中の効果的な治療のために実際に同定されている細菌に抗して使用できる抗生物質を同定することも必要であるからである。
【００２２】
前述したＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＶＩＴＥＫ  ２装置、またはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社によりカタログ番号Ｒ８３１１００２で製造される装置（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R8311002を参照）のように、ヒトの臨床研究の過程で使用される市販装置もあり、これらはある種の細菌に関して特異的に抗生物質耐性を決めるのに使用することができる。しかし、これらの機器は高価であり、それらの適用性は制限される。なぜなら、これらの機器を用いて開始することができる手順の過程で測定前に通常は培養を行わなければならないからである。その例外は酵素反応に基づく試験であり、この場合には、ユーザーは色の反応を予測するだけである（例えば、https://www.thermofisher.com/hu/en/home/industrial/microbiology/microbial-identification/biochemical-identification/biochemical-id-panels.htmlを参照）。さらに、これらの方法の適用性は嫌気性細菌と好気性細菌とに、そして細菌タイプの異なるグループに分割される。即ち、異なる細菌グループを試験するのに異なる種類の装置が必要である。培養せずに酵素反応を用いる方法の欠点は、所定の酵素反応に特異的な基質が必要であることと、色の反応を検出するためにさらなる試薬をシステムにインプットする必要があることである。
【００２３】
患者のベッド脇で所定のある細菌を迅速に同定するのに適した迅速試験も知られている。通常、これらの試験は色の反応に基づくものであり、諾否（yes or no）型の応答を与え、それらの適用性も狭い細菌スペクトルをカバーするだけであるため、少数の細菌菌株を同定するのに使用できるだけである。
【００２４】
現在利用可能な方法を用いる場合、動物体または人体のいずれかである哺乳動物の体内における細菌感染の試験は、その感染を引き起こす細菌が、体内のバランスが失われた後に優勢となり始め、増殖し、血液循環中に入り込み、そこからそれが病的変化を引き起こすらしい各種器官に侵入したなら可能となる。旧来の培養プロセスに基づく試験法を用いた場合、最低４８時間または７２ｈ時間もが、さらにはその数倍の時間数が、感染細菌の同定と抗生物質耐性の決定のために必要になることがある。感染の背後にある細菌およびその抗生物質耐性が決定されてしまうまで細菌感染により生ずる疾患の治療を開始すべきではないが、実際は、臨床症状、目視で検出できる身体的変化および一般的経験に基づいて徴候が現れた時点で、換言すると、当該細菌やその抗生物質耐性の知識がないままに、治療がそれでも開始される。これは、数日続く実験室試験に必要な時間中に、例えば畜産農場で感染の広がりが著しい損害を引き起こすことがあるので、感染の成り行きを妥当な時間のうちに予防するために行われる。実際、この結果として、医師が疾患を誤診し、使用した抗生物質が体内に存在する病原菌の治療には不適切であるという事態が起こりうる。この慣行の別の深刻な結果は、病原性状態をまだ生じていない病原菌または細菌に対する抗生物質耐性を発生させることである。さらに、根拠のない迅速診断の場合には、投与された抗生物質療法が既にある耐性のために有効ではなく、この時間の無駄により、細菌の増殖が助長され、ヒトであるか動物であるかに関係なく患者の症状および身体的状態がかなり悪化し、感染の広がりを止められないことがしばしば起こる。
【００２５】
本発明の発明者らは、検体中に存在する細菌を高い精度で同定しうる方法を以前に開発した。出発点は、全ての細胞膜の主要な構成成分が複数のリン脂質であり、それらの比率は個々の細菌に特有なことであった。この方法の要諦は、同定される細菌を含有すると推定される検体から質量分析（ＭＳ）イメージを作成することであった。この方法は、リン脂質を同定するのに適した５０〜２０００、好ましくはこの範囲内で６００〜９００の質量電荷比範囲において測定を行うことを含む。これにより、所定の細菌に特有なリン脂質パターンを含んでいるＭＳスペクトルが得られる。このようにして得られたＭＳスペクトルを、既知細菌のＭＳスペクトルを含んだエレメントからなるデータベースのエレメントと比較すると、使用したデータベースがかかるＭＳスペクトルを含んでいる限り、試験検体中に見られた細菌を同定することができる。
【００２６】
本発明の発明者らが過去に開発し、上に概括した質量分析法は、上述した米国特許ＵＳ６１７７２６６Ｂ１に記載された方法より好ましい。この米国特許に開示された方法の過程では、いわゆるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ手法を用いて細菌のタンパク質分をマップ化するが、この手法は所望のスペクトルを得る前に、プレインキュベーション、培養、次にさらに７〜１４時間が必ず先行する。培養を経ていない検体では、ＴＯＦモジュールを使用する結果として、この手法は非常に感度が鋭敏であるため、高いノイズレベルが妨害してしまう。本発明の発明者らにより開発された方法の過程では、細菌のリン脂質濃度をマップ化するが、これは予備的なインキュベーションを必要とせず、所望のスペクトルを約３時間で得ることができる。
【００２７】
さらに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロセスはマトリックスを必要とし、このプロセス中にタンパク質は断片化されないかもしれない。本発明の発明者らが用いた方法では、マトリックスの必要がなく、リン脂質分子は断片化される。公知のように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳプロセスを用いた場合には、内部標準細菌を検体と混合しなければならないが、この操作は我々が用いたＭＳ法では必要ない。その理由は、ＭＡＬＤＩは比較的低い電圧を用いたソフトイオン技法であるのに対し、我々が用いた単純なＭＳの場合には、電圧を変動させることができ、電圧を高めることによりリン脂質分子が断片化し始める、即ち、可変イオン化を用いる、からである。この場合、可変イオン化手法が必要であるのは、イオン化度の最適な決定により、リン脂質分子並びにそれらの断片として現れる非極性および極性成分の質を同定することが可能となるからである。断片化の結果として、データの量が何倍も増大される。このすべてを比較すれば、米国特許ＵＳ６１７７２６６Ｂ１に記載された方法より、我々が以前に開発したより高速、より単純かつより安価なＭＳ法を用いて、細菌のより詳しいＭＳスペクトルが得られうる。
【００２８】
上記に基づいて、治療に関して選択決定をする時に顧問医師／獣医を支援するすばやく実施可能な方法、およびかかる方法を実施できるアクセスの容易な装置が求められている。その方法は、検体中に存在する微生物を高い信頼性で同定し、このような同定された微生物を死滅させることができる抗生物質およびその大体の用量を決定することができる。これに基づいて、主に発生した感染症を効果的に治療するのにどの抗生物質を使用したらよいかについて、および投与する必要のあるその抗生物質の用量についての決定である、必要な工程の決定をすばやくなすことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】ＵＳ６１７７２６６Ｂ１
【発明の概要】
【００３０】
本発明者らは、感染性疾患を引き起こす微生物のリン脂質パターンの質量分析データベースおよび／または感染性疾患を引き起こす微生物の分光光度データベースを用意し、微生物を含んでいると疑われる検体を質量分析法および分光光度法（分光測光法）試験に供し、試験の結果として得られたスペクトルを、データベース中に含まれるスペクトルと比較すれば、試験した検体中に存在する微生物を適正に同定することができ、さらにその検体におそらく有効な抗生物質の溶液を変化させた濃度で検体に添加した後に、それを分光光度法試験に供すれば、同定された微生物に対して有効な抗生物質およびその有効用量を短時間で決定できることを知見した。
【００３１】
また、すべてのセル・オブジェクト（細胞物体）の細胞膜は、所定の生命形態に特有の割合で各種リン脂質を含有しているので、本発明は微生物を同定するのに適しているばかりか、あらゆるセル・オブジェクトと、このセル・オブジェクトに著しく影響する、または実際にはそれを死滅させることができる化合物をも同定することができることを知見した。
【００３２】
上記目的および知見に従って、セル・オブジェクトに効果のある試験化合物を同定するのに供する方法により課題が解決された。この方法は下記工程を含んでいる：
ａ）セル・オブジェクトを含んでいると疑われる液体検体を用意し、
ｂ）工程ａ）に記載の液体検体の質量分析法および／または破壊的分光光度法試験を実施し、
ｃ）工程ｂ）で得られた質量分析スペクトルおよび／または分光光度スペクトルを、複数の既知セル・オブジェクトのこのようなスペクトルを含んだデータベースのエレメントと比較し、
ｄ）工程ｃ）に記載の比較の過程で、工程ａ）に記載の検体中に存在するセル・オブジェクトを同定し、
ｅ）工程ａ）に記載の検体の非破壊的分光光度法試験を行い、この間に、検体の非破壊的分光光度スペクトルを、試験化合物をそれに添加しないで、および試験化合物を所定濃度または幾つかの異なる濃度でそれに添加してから記録し、かつ試験化合物の溶液の分光光度スペクトルの記録も行い、
ｆ）工程ｅ）で得られた試験化合物を全く添加していない検体で測定された分光光度スペクトルを、工程ｅ）で得られた試験化合物を添加して調製された１または２以上の検体の分光光度スペクトルと比較し、
ｇ）工程ｆ）に記載の比較の結果から試験化合物の有効濃度に関する結論を引き出す。
【００３３】
本発明に係る方法の１つの好ましい実施形態によれば、工程ｂ）において質量分析法と破壊的分光光度法の両方の試験を行い、工程ｃ）に記載の比較を質量分析スペクトルと分光光度スペクトルの両方に関して行う。
【００３４】
本発明に係る方法の別の好ましい実施形態によれば、工程ｂ）に記載の質量分析法試験を、５０〜２０００の質量電荷比範囲、好ましくは６００〜９００の質量電荷比の範囲内で行う。
【００３５】
本発明に係る方法の別の好ましい実施形態によれば、工程ｂ）および／または工程ｅ）の実施時の分光光度法試験としてＵＶ分光光度法またはラマン分光法試験を用いる。
【００３６】
本発明に係る方法の別の好ましい実施形態において、工程ｂ）に記載の破壊的分光光度法試験の場合に、破壊を超音波または電磁波（electromagnetic radiation）、好ましくはレーザー光、さらにより好ましくは、波長約５３０ｎｍのレーザー光を用いて行う。
【００３７】
本発明に係る方法の別の好ましい実施形態によれば、セル・オブジェクトは微生物、好ましくは細菌、特に好ましくはヒトまたは動物の疾患を引き起こす細菌であり、この特に好ましい実施形態の場合の試験化合物は抗生物質である。
【００３８】
本発明に係る方法の別の好ましい実施形態によれば、工程ｃ）に記載のデータベースのエレメントは、工程ｂ）に記載の試験を実施する時に使用したのと同種の機器を使用して記録されたスペクトルである。
【００３９】
本発明に係る方法の別の好ましい実施形態によれば、工程ｃ）に記載の比較、および／または工程ｄ）に記載の同定、および／または工程ｆ）に記載の比較、および／または工程ｇ）に記載の結論の導出は、コンピュータ・アルゴリズムを用いて実施される。
【００４０】
本発明に係る方法の別の好ましい実施形態によれば、検体は、感染による罹患が疑われる動物またはヒトの組織／部分の断片、粘膜スミア（塗沫）、体液由来の検体、或いは表皮の検体である。これに関して、動物は好ましくは家畜動物、特に、豚、畜牛（cattle）、羊、馬、雄ウシ（oxen）、山羊、家禽、魚、七面鳥、ガチョウ、鳩、アヒル、ダチョウを意味するものである。
【００４１】
本発明に係る方法は、好ましくはマイクロ流体装置で実施される。
【００４２】
上記目的および認識によれば、課題が、セル・オブジェクトに効果のある試験化合物を同定するのに供する、下記を備えたマイクロ流体装置である装置により解決された：
検体ホルダー１、第一ポンプ１１、第一分配弁１２、および質量分析器１３、
１または２以上の試験化合物ホルダー２ａ，２ｂ，２ｃ、および第二ポンプ２１、
油容器３、および第三ポンプ３１、
ドロップ・ディスペンサー（液滴配分器）４、第一の窓５２ａとこれと物理的に同じか若しくは物理的に異なる第二の窓５２ｂとを含むマイクロ流体チューブ５、破壊エレメント６、分光光度計７、第二分配弁５１、およびコレクター８、
ここで、
第一ポンプ１１は、検体ホルダー１からの液体検体の一部分を、第一分配弁１２を経て質量分析器１３またはドロップ・ディスペンサー４のいずれかに搬送し、第二ポンプ２１は、所定の試験化合物溶液を、１または２以上の試験化合物ホルダー２ａ,２ｂ,２ｃからドロップ・ディスペンサー４に搬送し、
第三ポンプ３１は、油を、油容器３からドロップ・ディスペンサー４に搬送し、そして
ドロップ・ディスペンサー４は、第一ポンプ１１および第一分配弁１２を経てそれに搬送された液体検体の一部分（場合によりそれに、第二ポンプ２１を経てそれに搬送された試験化合物溶液が混合する）と、それに第三ポンプ３１を経て搬送された油とを、交互にマイクロ流体チューブ５中に分配し、このチューブを通って液体検体の部分と油滴（オイル・ドロップ）とが交互に流れ、
Ａ）破壊エレメント６が第一の窓５２ａの前を通過する１または２以上の液体検体部分に破壊作用を発揮し、かつ第二の窓５２ｂの前を通過する１または２以上の液体検体部分のスペクトルを分光光度計７を用いて記録し、次いで１または２以上の液体検体部分を第二分配弁５１を経てコレクター８に搬送し、または
Ｂ）ドロップ・ディスペンサー４から流れる１または２以上の液体検体部分が破壊されずに第二の窓５２ｂの前を通過し、かつ１または２以上の液体検体部分のスペクトルを分光計７で記録し、この液体検体部分を次いで第二分配弁５１を経てコレクター８に搬送し、または第二ポンプ２１を経てドロップ・ディスペンサー４内に戻し、その間に、試験化合物溶液を然るべき試験化合物ホルダー２ａ,２ｂ,２ｃから第二ポンプ２１を経て所定の液体検体部分に添加し、それによりその試験化合物濃度を増大させ、こうして変化した液体検体部分が破壊されずにマイクロ流体チューブ５を通って第二の窓５２ｂの前を再び通過し、この液体検体部分のスペクトルを分光計７で記録し、次いでこれをコレクター８に搬送するか、または前述したプロセスに従って試験した液体検体部分の試験化合物濃度をさらに一層増大させ、そして、然るべき試験化合物ホルダー２ａ,２ｂ,２ｃから第二ポンプ２１及びドロップ・ディスペンサー４を経てマイクロ流体チューブ５に搬送された試験化合物のスペクトルを分光計７で記録する。
【００４３】
本発明の別の好適態様によれば、マイクロ流体チューブ５の第一の窓５２ａと第二の窓５２ｂとは物理的に同じものである。
【００４４】
本発明の好適態様によれば、分光計７は、ＵＶ分光光度計またはラマン分光計であり、好ましくはラマン分光計である。
【００４５】
本発明のさらに別の好適態様によれば、分光計７はラマン分光計であり、この同じラマン分光計が、それから発出されるレーザー光の結果として破壊エレメント６としても作用する。
【００４６】
本発明のさらに別の好適態様によれば、破壊エレメント６は電磁波を発出するエレメント、好ましくはレーザー光、さらにより好ましくは波長約５３０ｎｍのレーザー光を発出するエレメントである。
【００４７】
本発明のさらに別の好適態様によれば、破壊エレメント６は超音波を発生するエレメントである。
【００４８】
本発明の１好適態様によれば、本発明にかかるマイクロ流体装置の温度を調節することができる。
【００４９】
本発明に係るマイクロ流体装置の１好適態様によれば、その内部に不活性雰囲気を生起させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は本発明に係るマイクロ流体装置の動作の概要図を示す。
【図２】図２ａは動物胃腸組織由来の検体中に存在するカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）のＭＳスペクトルを示し、図２ｂは食品由来の検体中に存在するウェルシュ菌（Clostridium perfringens）のＭＳスペクトルを示し、図２ｃはヒト組織由来の検体中に存在する大腸菌（Escherichia coli）のＭＳスペクトルを示し、図２ｄは、動物脚関節組織由来の検体中に存在する黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＭＳスペクトルを示す。
【図３】図３ａは１００％強度、７８５ｎｍレーザー光を照射した純培養物由来の大腸菌のラマンスペクトルを示し、図３ｂはスルホンアミド系抗生物質で２０分処理後に１００％強度、７８５ｎｍレーザー光を照射した純培養物由来の大腸菌のラマンスペクトルを示し、図３ｃはスルホンアミド系抗生物質で３０分処理後に１００％強度、７８５ｎｍレーザー光を照射した純培養物由来の大腸菌のラマンスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明に関して、微生物とは、顕微鏡的生物、即ち、裸眼には見えない生物を意味するものである。微生物は、細菌、真菌、古細菌および原生生物でよい。これに関して、ウイルスおよびプリオンは生物とは考えない。それらは微生物の概念中に包含されるとは考慮されない。
【００５２】
本発明に関して、上記に従った微生物や、微生物であるとは考慮されないオブジェクトであって１つまたは最大で少ない数の生体細胞からなるオブジェクトは、包括してセル・オブジェクトと呼ばれ、それらはそのサイズの結果として、マイクロ流体装置内で取り扱うことができる（下を参照）。微生物に加え、セル・オブジェクトは、それに制限されないが、植物、動物およびヒトの細胞、藻類、真菌、細胞培養物から採取した細胞、血液細胞、キメラ、幹細胞、および人工細胞をも包含する。
【００５３】
本発明に係る方法を使用することにより、１つの検体中の１つ、さらには数種類ものセル・オブジェクトを同定することができる。本明細書においてセル・オブジェクトという用語を単数形で使用する場合、前後関係から何か他の意味を誘導しうることができなければ、それはただ１種類のセル・オブジェクトだけを意味するとは解されない。
【００５４】
本発明に関して、検体とは、例えば、感染の広がりと格闘する、または予防するために、同定を求められるセル・オブジェクト、好ましくは微生物を含んでいると疑われる生物学的検体を意味するものである。検体は、必ずではないが典型的には、感染した動物またはヒトの感染が疑われる組織片／部分、粘膜スミア、体液の検体、表皮の検体、または検査体由来の任意の材料である。これに関して、動物は、好ましくは家畜、特に、豚、畜牛、羊、馬、雄ウシ、山羊、家禽、魚、七面鳥、ガチョウ、鳩、アヒル、ダチョウである。従って、検体は、それに限られないが、例えば、次のようなものでよい：生体の内臓から採取した生検材料、死亡した動物または人間の内臓から採取した検体（このような内臓＜体内器官＞は、例えば、胃腸系を構成する器官、呼吸器系を構成する器官、血液循環系を構成する器官、神経系を構成する器官、骨格系および筋肉系を構成する器官、排出（排泄）系を構成する器官、並びに生殖器官および腺を包含する）。検体はまた、口腔、鼻孔、および喉頭から採取したスミア、生殖器、尿管および直腸の粘膜から採取したスミアでもよく、それはまた皮膚、毛髪、毛、羽根、鱗、爪、鉤爪、耳道、肛門またはそれらの付近から採取した検体、生殖器若しくはその近傍、排出腔若しくはその近傍、眼若しくはその近傍、口器若しくはその近傍から採取した検体でもよく、それはまた、血液、尿、精液、膣分泌物、鼻分泌物、涙液、汗、糞便、卵、並びに新生児／新生動物の場合には胎盤、臍帯から採取した検体であってもよく、胎膜も検体の供給源となりうる。上述したように、検体は、必ずヒトまたは動物由来である必要はなく、同定可能な微生物を含んでいる可能性がある他の何らかの種類の検体でもよい。このような検体の例は、それに限られないが、細胞培養物、土壌片、衣類布地片、衣類由来の検体、病院用具／物体、畜産農業に使用される道具／物体、あらゆる廃棄物、食品検体、食品原材料、食事に使用される道具／物体、飼料、薬品、包装材料、表面由来の検体（建造物、輸送手段、生産設備など）、事件現場からの証拠物、などでよい。
【００５５】
本発明に関して、試験化合物は、セル・オブジェクトに対して何らかの効果を有するか否かを決めるために本発明に係る方法で試験されるあらゆる化合物を意味するものである。試験化合物は、典型的には、微生物、特に細菌を試験する場合には、抗生物質であると考えられる。これに関して、効果とは、その試験化合物がそのセル・オブジェクトの有意な特性変化を生ずる時を意味するものである。本発明に関して、この効果は、ラマン分光法のような非破壊的分光光度法試験を用いて検査される。換言すると、ある濃度のある試験化合物が、セル・オブジェクトの分光光度スペクトルに何らかの変化を生じさせるか否かが決定される。従って、本発明に関して、使用した分光光度法で実証することができない変化は、効果であるとは見なされない。本発明に係る方法に対して特に好ましく試験されるセル・オブジェクトである細菌に対して作用する試験化合物である抗生物質の効果について、効果とはその細菌が死滅することからなる。
【００５６】
本発明に関して、抗生物質は、微生物を死滅させることができるすべての試験化合物を意味するものである。本発明に関して、同定された微生物に対して（抗して）有効な（効果のある）抗生物質について言及する場合、同定された微生物菌株に対して通常有効な抗生物質を意味するとは解されない。そうではなく、試験した検体中に見いだされうる微生物の代表的個体に対して有効な抗生物質の意味である。それでも、当業者には自明なように、このようにして同定された抗生物質は、当然、非常に高い蓋然性で同定された微生物菌株の他の代表的個体に対しても有効である。
【００５７】
マイクロ流体装置と呼ばれるのは、１つまたは複数の相の液体、スラッジ、懸濁液、気体（ガス）、蒸気を連続的または間欠的に搬送するのに適し、かつそれらの流れを操縦するのに適した、低圧（真空若しくは減圧、大気圧）または高圧（数百若しくは数千バールのような）システムである。このシステムは、ディスペンサー、ノズル、ポンプ、ニードル、バルブ（弁）、フィルター、ミキサー、反応器、セパレーター、ディストリビューター、並びに、化学的および生物学的反応を能動的若しくは受動的、直接的若しくは間接的に生じさせることができ、分析を行うことができる構成部品を備えうる。不可欠ではないが、場合により、本システムは、機械的若しくは電子的調節、制御および評価ユニットを備えるべきである。構成部品はチューブネットワークにより連結され、チューブの直径は約１．０ｍｍを超えず、表面積：体積比は液体および高圧液体状態ガスの層流の生起に好ましい値である。
【００５８】
ピコおよびナノ流体装置は、そのチューブ径が約１μｍを超えない点で、マイクロ流体装置とは異なる。
【００５９】
メソ流体装置は、そのチューブ径が約１．０ｍｍを超える点で、マイクロ流体装置とは異なり、表面積：体積比は必ずしも層流の発生を助長せず、この種の装置は乱流の単相または多相システムを取り扱うのに理想的である。
【００６０】
上記に記載の通り、本発明は、セル・オブジェクトに効果を有する試験化合物を同定することができる方法に関する。ここで、同定とは、どの試験化合物が所定のセル・オブジェクトに対して分光光度法を用いて同定できる効果を有しているかを意味するだけでなく、試験化合物が問題の効果を発揮する濃度をも意味するものである。
【００６１】
本発明に係る方法の工程ａ）として、上記に従ったセル・オブジェクトを含んでいると疑われる液体検体を用意する。
【００６２】
試験を行う前に、検体が液体でない場合には、マイクロ流体装置でそれを試験するために、試験実施前に検体を液体状態にする必要がある。その要諦は、セル・オブジェクトを含有していると疑われる検体を、このセル・オブジェクトを損傷しないか、または少なくとも試験化合物で試験すべきその特性を変化させないような緩衝液に入れることである。例えば、細菌に及ぼす抗生物質の効果を試験する場合には、その細菌が液体検体中で死滅すべきではないことを考慮しなければならない。試験すべき特性が維持される液体媒質の種類はそれ自体セル・オブジェクトの特性であることは当業者には自明である。換言すると、工程ａ)の過程で実施すべき手段は当業者の必須知識に属する。セル・オブジェクトを含有する検体をこのような緩衝液に入れること、即ち、検体調製は、溶解、洗浄、浸漬、希釈などにより行われうる。
【００６３】
試験すべき液体検体がその検体の性質の結果として既に（液体で）入手可能であり、従って工程ａ）を実施するためにさらなる手段を実施しなくてよい場合があることは当業者には自明である。そのような検体としては、廃水または飲料水から採取した検体が挙げられる。無論、このような場合も工程ａ）の実施と見なされる。
【００６４】
本発明に係る方法で試験される検体に関して、特に試験の目的が、当該検体が試験されるセル・オブジェクトを本当に含有しているかどうかを決定することである場合には、検体が試験されるセル・オブジェクトを含む疑いがあるだけでよいというだけでよいことに留意すべきである。検体がこのようなセル・オブジェクトを含有していないなら、このことは、本方法の工程ｄ）の実施中に決定されよう。そうなれば、本方法を続ける理由がなくなる。
【００６５】
上述したように、工程ａ）に記載の液体検体の質量分析法および／または破壊的分光光度法試験が、本発明に係る方法の工程ｂ）として行われる。従って、本発明によれば、質量分析法と分光光度法という２つのプロセスのいずれか一方または他方、あるいはその両方が使用される。その理由は、この工程が、次の工程ｃ）およびｄ）のためのデータを提供する、換言すると、目的は試験検体中のセル・オブジェクトの同定にあるからである。質量分析法と分光光度法のどちらも当業者には周知の試験方法である。
【００６６】
この同定は、質量分析法試験を用いて、または破壊的分光光度法試験により行いうる。本発明の好適態様によれば、両方の分光法（分光測定法）を用いる。同じ検体に二つの異なる方法を用いることより、得られた結果の精度が著しく高くなり、こうして、個々の試験方法の特有の性質に由来する誤差を克服することができるからである。
【００６７】
質量分析法試験中に起こっていることは本質的に、液体状態にされた検体が、化学的破壊の実施を伴うか、伴わずに、ＭＳ装置内に入れられ、そこで、それが分解する設定条件に応じてイオン化されて、細胞壁を構成するリン脂質が断片化され、それらの質量を求めた後にそのセル・オブジェクトの指紋（フィンガープリント）が得られる。
【００６８】
破壊的分光光度法試験の過程で行われる処置は本質的に、検体を、それが含有していると疑われるセル・オブジェクトが破壊されるように処理することである。こうして得られた液体の分光光度スペクトルは、あるセル・オブジェクトに固有のものである。換言すると、これはそのセル・オブジェクトの指紋を提供する。
【００６９】
工程ｂ）に記載の質量分析法試験は、好ましくは５０〜２０００の質量電荷比範囲、より好ましくは６００〜９００の質量電荷比範囲内で行われる。この質量電荷比範囲が細胞膜を構成するリン脂質のＭＳ同定を行うのに適しているからである。換言すると、この範囲内で実施された試験は、試験したセル・オブジェクトの適切に詳細なリン脂質指紋を与える。イオン化の量はＭＳ試験の過程で変動させることができ、従って、一方ではより大きなサイズのリン脂質分子を同定することができ、他方では、より小さな非極性および極性断片も同定することができる。二つの最も普通のリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は典型的なスペクトル構成成分である。
【００７０】
工程ｂ）に記載の破壊的分光光度法試験の過程で行われる破壊は、記録されたスペクトルが細胞内部からの細胞成分を詳細に示すための試験検体中のセル・オブジェクトの破壊を意味するものである。この破壊は、破壊試験に適した従来技術から公知の手段、例えば、電磁波（例、レーザー光）、酵素破壊、超音波破壊、熱作用破壊、放射線破壊（radiation destruction）、化学物質（例、酸、アルカリ、高イオン強度溶液、蒸留水など）により行われる破壊で実施しうる。
【００７１】
工程ｂ）に記載の破壊は、好ましくは超音波または電磁波を用いて、好ましくはレーザー光、より一層好ましくは波長約５３０ｎｍのレーザー光を用いて実施される。最も好ましくは、分光光度法装置としてラマン分光計を使用する場合、破壊は、この装置を用いて発生させた高エネルギーレーザー光を用いて起こる。ラマンスペクトルそれ自体は、その後、このような破壊直後に低エネルギーレーザー光を用いて記録することができる。電磁波（例、レーザー光）の波長が小さいほどそのエネルギーが大きいことは当業者には自明である。我々の経験によれば、波長５３０ｎｍのレーザー光がセル・オブジェクトの破壊に適している。無論、より低いカテゴリーの波長の他の電磁波もこの目的に適しており、波長を増大させることにより破壊効果が低減されることも自明であるが、有効性の限度がぼやけてくる。電磁波のエネルギーは、強度を変化させることにより、０％と１００％の範囲内で左右させることもできる。後で説明するように、より低エネルギーの電磁波は、工程ｅ）に記載の非破壊的分光光度法試験のために使用される。我々の実験中、波長７８５ｎｍのレーザー光がラマン分光法で特に好適であることが判明した。非破壊的分光光度法試験により短波長の電磁波しか利用可能でない場合には、そのより短波長から生ずるより高いエネルギーを、強度の低下により、より低レベルに低減させてもよい。まとめると、破壊的または非破壊的分光光度法試験に対して適宜に高いまたは低いエネルギーの電磁波が使用されることになり、このエネルギーは、使用する波長と強度の両方により調節しうる。それでも、レーザー光で破壊を実施する場合には、波長約５３０ｎｍのレーザー光が特に好ましい。理由は、この破壊プロセスが容易に自動化でき、迅速であり、添加すべき化学物質がまったく不要で、我々の実験の場合によい結果を生じたからである。
【００７２】
工程ｂ）の実施の結果として、試験検体中のセル・オブジェクトについてＭＳおよび分光光度スペクトルが得られる。これらのスペクトルはそのセル・オブジェクトに特有のものである。
【００７３】
工程ｂ）および／またはｅ）の実施の過程で、分光光度法試験としてはＵＶ分光光度法またはラマン分光法試験が好ましくは使用され、最も好ましくはラマン分光法試験が使用される。これら二つの分光光度法試験方法の利点は、本発明に係る方法の目的を考慮すると、これらの方法は精度レベルが適当であり、素早く実施でき、マイクロ流体装置中に容易に組み込むことができることである。両方の分光法が我々の実験の過程で適用に好適であることが確かめられた。ラマン分光手法のさらなる利点は、この場合に使用するレーザー光を、これが破壊工程中にも使用されるとともに非破壊的スペクトルの記録の実施にも使用されるように調整（チューニング）できることである。ラマン分光法の使用はまた、試験検体が典型的には水性媒質中で入手できることを考えて、水分子の存在が測定を乱さないことからも好ましい。
【００７４】
本発明に係る方法の工程ｃ）では、上述した通り、工程ｂ）で得られた質量分析スペクトルおよび／または分光光度スペクトルを、既知セル・オブジェクトのこのようなスペクトルを含んでいるデータベースのエレメントと比較する。この比較は、本質的には、測定したスペクトルと、データベース中の対応するスペクトルの相互からの減算である。この工程は上述したデータベースの存在を仮定している。従って、これらのデータベースはデータベースのエレメントとしてＭＳまたは分光光度スペクトルを含んでおり、そのスペクトルは細菌のような公知セル・オブジェクトについて予め記録されていた。換言すると、かかるデータベース中の各エレメントは、スペクトルとその対応するセル・オブジェクトの名称または他の識別子とを含んでいる。これは、かかるデータベースが複数のスペクトルを含んでいて、そのそれぞれについて、それらが細菌のようなどのセル・オブジェクトに対応しているかについて既知であることを意味する。これらのデータベースは、デジタル・フォーマットで、例えば、コンピュータ上に、またはリモートアクセスコンピュータ上（例、クラウド中）で、デジタルデータキャリアー上で、さらには紙のような物理的キャリアー上で利用可能である。本発明によれば、デジタル・フォーマットで利用可能なスペクトルが好ましい。
【００７５】
いくつかのデータベース、即ち、いくつかのＭＳデータベース、またはいくつかの分光光度データベース、または両方の種類のいくつかのデータベース、を工程ｃ）において使用してもよいことは当業者には自明である。また、ＭＳデータベースと分光光度データベースが同じセル・オブジェクトに関係するスペクトルを必ずしも含んでいなくてもよいことも当然である。換言すると、それらは必ずしも同じセル・オブジェクトに関係していなくてもよい。それでも、使用したＭＳデータベースと分光光度データベースは同じセル・オブジェクトに関係することが好ましい。なぜなら、これはセル・オブジェクトの同定に対してより大きな精度を確保するからである。
【００７６】
本発明に係る方法で記録されたスペクトルは、公知の手法、例えば、目視検査により、またはコンピュータ・アルゴリズムを用いて上述したデータベースに従ったスペクトルと比較しうる。もちろん、ＭＳ分光器で記録されたスペクトルはＭＳスペクトルを含んでいるデータベースのエレメントと比較し、分光光度分光器で記録されたスペクトルはこの種のスペクトルを含んでいるデータベースのエレメントと比較する。ＭＳスペクトルと分光光度スペクトルの両方を比較するのに使える方法は当業者には公知である。
【００７７】
比較は、主成分分析と判別分析を一緒に実施することにより行われる。その基本は、データベースに記録された既知微生物をいくつかのグループに配置し、次いで検体をそのスペクトルに基づいて上記グループの一つに配置することである。検体がどのグループにも確実に分類できない場合には、それを未知スペクトルのグループに配置する。質量数に基づいて検査された質量電荷比範囲内で強度値ペアを確立した後、これらのペアを間隔をとって配置し、どのグループに検体の指紋が相関するかを検査した。検体がいくつかの種類のセル・オブジェクトを含有している場合でも、使用した主成分分析と判別分析の結果として得られた質量スペクトルにより試験検体中の複数種のセル・オブジェクトを明確に同定することが可能となる。このような場合、データベースから個々に同定された複数セル・オブジェクトの質量スペクトルと他のノイズとして求められた質量範囲が相互から減算され、その結果、こうして得られたデータにより、検体混合物中に見いだされた各種セル・オブジェクトを相互から単離することが可能となる。
【００７８】
当業者には自明であるが、本発明に関して、比較は、同一方法を用いて記録されたスペクトルの比較を意味する。換言すると、ＭＳスペクトルはＭＳスペクトルと比較され、分光光度法はこの用語で記述されているものの、当然ながら、ＵＶ分光光度スペクトルは別のＵＶ分光光度スペクトルだけと比較することができ、同様にラマンスペクトルもラマンスペクトルだけと比較することができる。さらに、スペクトルが比較可能であるために同一性が求められる他のパラメータもあるかもしれない。
【００７９】
比較の結果は、データベースが、本発明に係る方法の過程で記録されたスペクトルに類似のスペクトルを含んでいるか否かを決定することである。
【００８０】
すべての当業者が知っている測定性能に関する一般的な原理によれば、測定条件の類似性が大きいほど、２以上の測定の結果の比較可能性が大きくなり、測定を同一タイプの装置により同一条件下で実施するのが最善である。この一般原理は、本発明に従って実施されたＭＳおよび分光光度測定についてもあてはまる。上に説明したように、本発明の実施中に測定されたＭＳおよび分光光度スペクトルを、事前に作成されたデータベースのＭＳおよび分光光度スペクトルと比較し、検体に存在するセル・オブジェクトを同定するのを可能にするほどの類似性がデータベース中のどれかにあるか否かを検査し、さらにその検体中のセル・オブジェクトに及ぼす試験化合物の効果を検査し、その検査過程では、試験化合物を含有しない検体で記録された分光光度スペクトルを、各種濃度で試験化合物を含有する検体の分光光度スペクトルと比較する。当然、異なる条件下で異なる装置を使用して記録されたスペクトルを比較することもできるが、条件が類似しているほど、比較の結果の精度がより高まる。換言すると、スペクトルを同種の装置で記録すれば、異なる種類の装置で記録されたスペクトルと比較する時に比べて、より高精度の結果が得られる。
【００８１】
工程ｃ）において、ＭＳスペクトルデータベース中の１または２以上のスペクトルがＭＳ試験中に記録されたＭＳスペクトルに類似していると認められるか、またはラマンスペクトルデータベース中の１または２以上のスペクトルが分光光度法試験中に記録された分光光度スペクトルに類似していると認められた場合には、次に工程ｄ）において、そのデータベースから、工程ａ）に記載の検体について記録されたスペクトルに類似のスペクトル（１つまたは複数）を持つのが、どの１または２以上のセル・オブジェクト、例えば、細菌、であるかを決めることができる。従って、このようにして、試験検体中に含まれているセル・オブジェクトを同定することができる。上から、本発明に係る方法を用いて、ある検体から１種類のセル・オブジェクトの正体を決めることができるだけでなく、数種類のセル・オブジェクトについても同定できることを理解しうる。
【００８２】
本発明によれば、ＭＳ分光法と分光光度法のどちらもセル・オブジェクトの同定に使用することができ、同じ検体に両方の方法を使用することもできる。どの方法を選択するかの決定は、どちらの装置が利用可能であるか、および工程ｃ）に記載の比較にどのデータベースにアクセスできるかによる。本発明に関して、両方の方法を用いて検体を検査できるなら、こうして、個々の方法の独自の特徴に起因する不確実性の少なくとも一部を排除することができ、検体中に存在するセル・オブジェクトをより高い精度で同定することができるので好ましい。
【００８３】
工程ｄ）の実施中に、工程ａ）に記載の検体においてセル・オブジェクトが何ら同定されない場合には、試験した検体は、工程ｃ）に記載のデータベース中にそのスペクトルを有するセル・オブジェクトを含有していないという結論を引き出すことができる。これは、工程ａ）に記載の検体が確実にセル・オブジェクトを何ら含有していないことを意味するものではない。例えば、同じ５種類の細菌について記録されたスペクトルを含んでいるＭＳおよび分光光度スペクトルデータベースを使用した場合、工程ｄ）の実施過程で１つの検体中に細菌が同定されないなら、それは、その検体がデータベース中に含まれていたいずれの細菌も含有しないことを意味するが、これに基づいて、他の細菌および／または微生物の存在を排除することはできない。
【００８４】
工程ａ）に記載の検体中のセル・オブジェクトが工程ｄ）において同定された後、次の工程ｅ）は、そのセル・オブジェクトに恐らく効果があると考えられる試験化合物の試験を包含する。例えば、調査が、検体中の細菌を死滅させることができる抗生物質の種類および用量を決めることに向けられているなら、文献に従って工程ｄ）で同定された細菌に対して有効な試験化合物として１種または２種以上の抗生物質を使用する。
【００８５】
工程ｅ）においては非破壊的分光光度法試験を実施することが重要である。換言すると、工程ａ）に記載の液体検体を、破壊工程を実施せずに分光光度計に配置する。これは無傷の細胞を検査することを意味する。工程ｅ）の場合、レーザー光のような電磁波は、非破壊的分光光度法測定のために、その波長および強度が、検体中の存在が疑われるセル・オブジェクトを損傷しないような十分に低エネルギーのものである電磁波を使用しなければならない。ラマン分光法の場合、波長７８５ｎｍのレーザー光がこの目的に適していることが証明された。
【００８６】
工程ｅ）によれば、まず、試験化合物を添加していない検体について分光光度スペクトルを記録する。こうして得られたスペクトルは参照基準となる。換言すると、このスペクトルに比べて起こる変化が検査される。試験される試験化合物を所定の複数濃度で添加した検体の分光光度スペクトルも、必須ではないが好ましくは同じ測定条件下で記録する。さらに、試験化合物の溶液のスペクトルも記録する。このスペクトルにより、試験化合物を含有する液体検体部分のスペクトルを補正することができる。
【００８７】
あるセル・オブジェクトに関して試験に値する試験化合物の濃度の決定は、当業者に必須の知識に属する。ある液体検体分を試験化合物と共にインキュベーションする必要のある時間量があるからである。一方で、当業者は個々のセル・オブジェクトに対して有効な試験化合物の濃度を文献から知ることがあるからである。例えば、医学目的に頒布された抗生物質がある細菌に対してどの用量で使用できるかは一般に公知であり、それから本発明に従った試験に必要な濃度を算出することができる。これは、本発明に係る方法の過程で試す価値のある濃度を決めるためのよい初期基準である。試験化合物の恐らく有効であろう濃度がわからない場合、当然、広い濃度範囲を用いて試験を開始し、結果に照らして範囲を狭めるのが価値あるやり方である。また、当業者は、文献からのデータに基づいてインキュベーション時間を容易に決定することができる。例えば、細菌に対して有効な抗生物質を試験する場合、約２０分のインキュベーション時間で通常は十分である。
【００８８】
本発明に係る方法において、求められる問題が、試験化合物があるセル・オブジェクトに対してある一定濃度で有効であるか否かであるなら、試験化合物を１つの濃度だけで試験することも可能である。換言すると、単一測定点に関係する試験も本発明の保護範囲に属する。理論的には測定点の数に上限はなく、これは測定設備、利用可能な検体および試験化合物の量、並びに試験実施に利用可能な時間の長さにより決まり、これらのパラメータはケースごとに変化する。
【００８９】
工程ｅ）において記録されたスペクトル、即ち、試験化合物無添加の検体および試験化合物を各種濃度で含有する検体の分光光度スペクトル、並びに試験化合物それ自体の溶液のスペクトル、が利用可能であれば、次に工程ｆ）において、参照スペクトル（即ち、試験化合物を含有しない検体で記録されたスペクトル）と、試験化合物を各種濃度で含有する検体で記録されたスペクトルとを比較し、この比較を試験化合物の溶液のスペクトルを用いて補正する。比較をする過程では、試験化合物がセル・オブジェクト中に何らかの変化（例、溶菌）を引き起こしたか否かを決定してもよい。その結果、その分光光度スペクトルは変化する。この変化は、例えば、試験化合物の効果の結果として、試験したセル・オブジェクトの細胞が溶解することにより生ずることがあり、または、例えば、細胞の代謝がその効果により変化して、そのため代謝産物の変化がスペクトル中に観察されうる。
【００９０】
工程ｇ）では、工程ｆ）に従った比較の結果から結論が導かれる。試験化合物をそれが有効であるより低い濃度で使用したなら、スペクトルには有意な変化は期待しえず、試験化合物を有効濃度またはそれより高濃度で使用したなら、比較をする過程で有意な変化を期待することができる。この結果から、当業者は、試験化合物の有効濃度が始まる濃度値を明確に結論づけることができる。
【００９１】
試験の目的が必要とするなら、かろうじて有効である濃度値の近傍のより狭い濃度範囲内のいくつかの濃度値を用いて本発明に係る方法を実施することにも価値があろう。それにより、有効濃度に関する結果がより精密になる。
【００９２】
従って、本発明に係る方法は、セル・オブジェクトの同定と、このようなセル・オブジェクトに関して有効な試験化合物の有効濃度の決定とに関する。実際、まず、感染を引き起こす微生物、最も頻繁には細菌が、このような方法を必要としている。細菌性のヒトまたは動物感染症を引き起こす病原菌の同定とそれに有効な抗生物質の種類および有効濃度の決定はしばしば必要となり、そのような場合、この情報を決定するのに必要な時間の長さも意味のあるファクターである。本発明に係る方法は、例えば、畜産農場での感染の調査、またはヒトの健康管理機関での使用に特に適しており、その感染は、微生物、最も多くは細菌、により通常引き起こされる。本発明の方法の実施により、例えば、養鶏場で起こっている感染を治療するのにどの種類および用量の抗生物質を使用する必要があるかを数時間以内に決定することができるので、死亡を著しく防止することができる。ヒトの感染の場合、それを引き起こす微生物の種類、即ち、好ましくは細菌の種類とそれに対して使用できる抗生物質の種類および用量、をできるだけ早く決定することがなぜひときわ重要であるかも当業者には自明である。
【００９３】
本発明に係る方法が好ましくは微生物の同定、さらにより好ましくは細菌の同定に使用されることに関して、これと調和して、本発明に係る方法で試験する検体は、好ましくは感染症に罹患しているらしい動物またはヒトの組織／部分の断片、例えば、粘膜スミア、体液由来の検体、または表皮の検体、である。これらの検体種は、最も頻繁に試験を必要とし、必要なら容易にアクセスできる種類である。このような検体は、生きている人畜、さらには死んだ／淘汰された動物や死亡したヒトからも生検を実施することにより得ることができる。検体採取の方法、位置および種類は、すべて当業者がその問題の知識内で決定できるパラメータである。さらに、本発明の特に好ましい使用が畜産農業の場合であるので、家畜由来の検体が当然特に好ましい。家畜としては、特に、豚、畜牛、羊、馬、雄ウシ、山羊、家禽（鶏）、魚、七面鳥、ガチョウ、鳩、アヒル、およびダチョウの場合であり、これらでは、動物の密度が高いため、感染がきわめて短時間のうちにきわめて大きな損害を引き起こすことがあり、従って、本発明のような迅速で非常に精度のよい同定方法の使用がこのような畜産農業の場合には特に重要である。
【００９４】
個々の方法で記録されたスペクトルの比較［工程ｃ）および工程ｆ）のような］およびそれらの評価［工程ｄ）および工程ｇ）のような］は、例えば、目視検査により実施しうる。この過程では、例えば、経験を積んだ当業者ならセル・オブジェクトについて記録されたスペクトルを検査することにより、そのスペクトルが、既知の複数セル・オブジェクトについて利用可能なスペクトルのどれに類似しているかを決めることができる。この過程では、紙に印刷されたスペクトルとコンピュータスクリーン上に表示されたスペクトルの両方を使用することができる。この場合、比較を行う者にとって、スペクトル上の測定点のいくつかをより精密に決定することが必要になる場合がある。これは、スペクトル上のスケールを読み取るか、これがない場合には定規または他の測定器具を使って行うことができる。ただし、今日では、コンピュータ・アルゴリズムがスペクトルの比較および評価に広くかつ一般的に使用されている。これは本発明の観点からも好ましい。コンピュータ・アルゴリズムの使用は、目視評価より著しく速く、かつより精密な結果を与えるからである。さらに、今日ではこれがよりアクセス性が高くて比較的安価な解決策となっている。
【００９５】
上述したように、本発明に係る方法は、マイクロ流体装置内で実施することが好ましい。かかる装置の使用が好ましいのは、マイクロ流体装置が小サイズであるため持ち運びが容易であるためである。従って、例えば、本装置を感染が発生した畜産農場に例えば自動車で容易に運ぶことができ、その結果として、検体を離れた実験室まで搬送しなくて済むので、感染の同定および適当な抗生物質の決定に要する時間を著しく短縮することができる。マイクロ流体装置はまた、セル・オブジェクトを含有する検体を、マイクロ流体反応器により取り扱うことができる数ミリリットルといった量で提供できる点でも特に好適である。
【００９６】
本発明は、本方法を実施するのに供するマイクロ流体装置にも関する。
【００９７】
本発明に係るマイクロ流体装置の操作スキームを図１に示す。まず、液体を入れておくのに使用する容器、液体の移動に用いるポンプ、液体分配弁、ドロップ・ディスペンサー、マイクロ流体チューブおよびコレクターなどのマイクロ流体装置に用いる構成要素は、いずれも現状技術により公知であることに触れておく必要がある。また、マイクロ流体装置内で実施されるプロセス、例えば、ポンプ、ディスペンサーおよび他の部品要素により実施されるプロセスは、コンピュータ（マイクロプロセッサ）により制御され、調和させられることも当業者にとって自明である。コンピュータは、予めインプットされたアルゴリズムに基づいて課題を格納し、実行する。簡略化のため、制御コンピュータ（マイクロプロセッサ）は図示していない。
【００９８】
従って、マイクロ流体装置は、内部に調製された液体検体を入れておく検体ホルダー１を備える。第一ポンプ１１が液体検体部分を検体ホルダー１から分配弁１２に搬送する。ここから液体検体は次の二つの経路に沿って進みうる：分配弁１２から質量分析器１３またはドロップ・ディスペンサー４のいずれかに進む。液体検体が質量分析器１３に進む場合、そこでそのＭＳスペクトルが記録され、後で使用するために制御コンピュータに格納される。記録がなされた後、液体検体部分はコレクター８または別のコレクター（図示せず）に取り出される。
【００９９】
マイクロ流体装置は、１または２以上の試験化合物ホルダー２ａ,２ｂ,２ｃを備える。図には１例として３つの試験化合物ホルダーを示したが、本発明に係るマイクロ流体装置が数多くのホルダーを備えてもよく、ホルダーの数は本発明の要諦に影響しないことは当業者には自明である。ホルダーの数は、マイクロ流体装置での試験のために調製できる異なる種類の試験化合物の試験化合物の数を決定する。例えば、マイクロ流体装置が養鶏場で最も頻繁に発生する５種類の細菌感染症を試験するために設計されているなら、５種類の可能性ある抗生物質溶液のために装置内に５つの試験化合物ホルダーを設置するのが賢い。このような例示の装置が５つのホルダーを持たず、これより少ない数しか持たない場合、同定後に同定された細菌に有効であると思われる抗生物質溶液をマイクロ流体装置のホルダーに入れることだけが価値がある。第二ポンプ２１は試験化合物ホルダーからの溶液をドロップ・ディスペンサー４に搬送する。試験化合物の溶液は、試験化合物を含有する液体検体部分のスペクトルの補正を可能にするためにそれ単独で測定されるか、または試験化合物の溶液は、試験化合物への効果を試験するために、セル・オブジェクトの含有が疑われる液体検体部分に、１つまたは異なる２以上の濃度で加えられる。
【０１００】
マイクロ流体装置はまた油容器３を備え、これから第三のポンプ３１が油をドロップ・ディスペンサー４に搬送する。油容器内の油の機能は、マイクロ流体チューブ５内を流れる液体中において個々の液体検体の部分同士を互いから分離する媒質を提供することである。これに関して油は連続相と見なされる。本発明に関して、この油は、水と実質的に混ざらず、従ってセパレーターの機能を果たすことができる、任意の非極性媒質でよい。この油は、同定すべきセル・オブジェクトに作用を及ぼしうる物質を含有していないことも重要である。これは試験結果に影響しうるからである。セパレーター機能を果たすことに加えて、油の別の役割は個々の液体検体部分を空気から遮断してシールすることである。これにより嫌気性のセル・オブジェクトの試験を行うことも可能になる。本発明に関して、下記の群から選ばれた物質を油として制限なしに使用しうる：鉱油、シリコーン油、食用油、真空精製油（vacuum oil）、パラフィン油。
【０１０１】
マイクロ流体装置の重要な構成要素がドロップ・ディスペンサー４である。この要素の機能は、各種ポンプの操作によって個々のホルダーから、またマイクロ流体装置の別の部分から（後記を参照）到着する液体を、制御コンピュータの命令に従った量および順序でマイクロ流体チューブ５中に分配することである。換言すると、ドロップ・ディスペンサー４は、マイクロ流体チューブ５内を引き続いて流れる一連の液体検体部分と油とを創生する。
【０１０２】
マイクロ流体チューブ５は、油滴で分離された個々の液体検体部分が内部を流れるパイプラインである。マイクロ流体チューブ５は第一の窓５２ａとこれと物理的に同じかまたは物理的に異なる第二の窓５２ｂとを含んでいる。換言すると、マイクロ流体装置の構造設計に応じて、２工程の過程においてマイクロ流体チューブ５に窓を使用しなければならない。これら２工程は異なる離れた場所で、または同じ場所で実施しうる。従って、離間した２つの窓を備えておらず、２工程の実施に必要な１つの窓しかない構造設計も考えられる。これら２工程のうち、１つの工程は破壊であり、これは破壊エレメント６を用いて実施され、他の１つは分光光度計７により実施される測定である。
【０１０３】
本発明に係る方法によれば、本発明に係るマイクロ流体装置内で液体検体部分について下記操作が実施される：
−質量分析器１３を用いて液体検体部分のＭＳスペクトルが記録され、この検体は次いでコレクターに搬送される、
−Ａ）の場合、別の液体検体部分が破壊エレメント６を用いて破壊に供され、その分光光度スペクトルが分光光度計７により記録され、その検体もコレクターに搬送される、
−Ｂ）の場合、さらに別の液体検体部分の分光光度スペクトルが、非破壊的やり方で、試験化合物を添加せずに、分光光度計７を用いて記録される、次に
−この同じ検体の分光光度スペクトルが、試験化合物を添加して、分光光度計７を用いて記録される、
−この同じ液体検体部分に試験化合物溶液を添加し、その分光光度スペクトルを測定することを、試験化合物の有効濃度を確かに決定するのに必要な回数だけ繰り返し、この後、その液体検体部分はコレクターに搬送される、
−試験化合物の溶液のスペクトルが記録される。
【０１０４】
破壊エレメント６は、その後、液体検体部分に作用し、第一の窓５２ａを通してその破壊効果を発揮することができる。窓５２ａは、採用した破壊の種類に応じたやり方で設置する。換言すると、破壊を達成するための材料を加える必要があるなら、この材料は、付近を流れる液体検体に、この窓を通して液体検体に添加することができる。破壊を例えばレーザー光を用いて行うなら、この窓は、レーザー光がマイクロ流体チューブ５の壁をここで貫通することができるように設置する。この場合、チューブ壁は石英製とすることができる。非破壊的試験を液体検体部分について実施する場合、液体検体部分が付近を通過するなら、破壊エレメントは無論不活性とする。
【０１０５】
マイクロ流体チューブ５を通って流れる液体は、窓５２ｂを通して分光光度計７により検査を受けることができる。ここでは、マイクロ流体チューブ５の材料は分光光度計が使用する波長範囲を透過させるように設置する。分光光度計７は、例えば、ＵＶ分光光度計またはラマン分光計でよい。
【０１０６】
これに関して、分光光度計が発する光の強度は通常は制御することができ、本発明に係るマイクロ流体装置に関しては、窓５２ａと５２ｂとが物理的に同じものであって、この１つの窓を通して、破壊工程実施するために破壊的強度の光による最初の照射が行われ、次に、その直後に破壊された検体のスペクトルを、分光光度計を用いて記録しうるという構造設計が考えられる。この好ましい本発明に係る配置では、破壊エレメント６と分光光度計７は、当然同じデバイスであり、このデバイスが２つの機能を果たす。
【０１０７】
換言すると、２つの窓が物理的に同じ窓である場合に典型的に実施されうる構造設計では、破壊エレメント６は電磁波であり、この電磁波が、分光光度法試験がそれを通して行われるのと同じ窓を通して液体検体部分に到達する。電磁波は好ましくは破壊エレメント６が発するレーザー光であり、さらに一層好ましくは波長が約５３０ｎｍのレーザー光である。これは、レーザー光のエネルギーを容易に調節することができ、そのビームを容易に操縦し、正確に指向させることができるからである。得られた経験によると、波長約５３０ｎｍの入射レーザー光がセル・オブジェクトの破壊に対して特に好ましい。
【０１０８】
特に好ましい態様によると、分光光度計７はラマン分光計である。これは、ラマン分光計は、上に詳述した破壊工程には関係なく、寸法およびそのエネルギー要求の両方に関してマイクロ流体装置での操作に容易に適合させうるからである。さらに、これは本発明の目的に対応する解像度でスペクトルを記録することができる。別の利点は、ラマン分光法試験はセル・オブジェクトを損傷しないので、例えば、試験化合物の濃度系列の効果を試験したい場合に、同じ検体を複数回の機会に測定することができる。
【０１０９】
別のより一層好ましい態様によれば、分光光度計７はラマン分光計であり、同じラマン分光計が破壊エレメント６としても働く。これは、ラマン分光計が発するレーザー光の強度を制御することができ、その結果、セル・オブジェクトを死滅させるレーザー光を発することができ、こうして破壊エレメント６として機能することができ、次に細胞を死滅させずにセル・オブジェクトのラマンスペクトルを記録することができるレーザー光を発することができ、従って、こうして非破壊的分光光度法工程に対する分光光度計７としても機能することもできる。この場合、第一の窓５２ａおよび第二の窓５２ｂは単一の窓を構成する。
【０１１０】
本発明の別の好ましい態様によれば、超音波を発生するエレメントを破壊エレメント６として使用してもよい。超音波がセル・オブジェクトを死滅させるのに使用できることは以前から当業者には知られてきた。この場合、超音波発生ヘッドが第一の窓５２ａを通してマイクロ流体チューブ５内を流れる液体中に突き出る。当然、この場合は、第一の窓５２ａと第二の窓５２ｂとは物理的に異なる。
【０１１１】
マイクロ流体装置の制御コンピュータは、ある所定瞬間にあるドロップ（液滴）がマイクロ流体チューブ５内でどこを移動しているかについての情報列を与える。こうして、コンピュータは、事前に入力されたプログラムに基づいて、液体検体部分について何をしなければならないのか、即ち、破壊を伴うか、または伴わないスペクトルの記録、および試験化合物を添加する必要があるかどうか、必要があるとしてどの試験化合物をどの濃度で添加するか、などを決めることができる。
【０１１２】
マイクロ流体チューブ５は第二分配弁５１に接続される。この弁は、液体検体部分を、これが第二ポンプ２１を経てドロップ・ディスペンサー４に戻るように向かわせるか、またはこれがコレクター８に引き取られるように向かわせる。
【０１１３】
液体検体部分が、第二ポンプ２１を経てドロップ・ディスペンサー４に引き取られる場合、第二ポンプ２１は、試験化合物ホルダー２ａ,２ｂ,２ｃからの試験化合物溶液をこの液体検体部分と混合する。こうして、その試験化合物の濃度が増大したこの液体検体部分は、ドロップ・ディスペンサー４を経てマイクロ流体チューブ５に戻され、試験化合物の濃度がより高くなっているが同じ検体の分光光度スペクトルを分光光度計７で記録することが可能となる。この後、分配弁５１を経て、この液体検体部分は再び試験サイクルに引き取られるか、またはコレクター８に引き取られる。
【０１１４】
もはや試験が必要ない液体検体部分はコレクター８に引き取られる。コレクター８の内容物は、コレクター８内に含まれているセル・オブジェクト、試験化合物および他の物質（油など）を考慮しながら当業者に公知の手法で廃棄しうる。
【０１１５】
本発明に係るマイクロ流体装置の好適態様によれば、その温度は制御されうるが、最も好ましくは約３７℃〜約４２℃の温度範囲内で制御される。その理由は、セル・オブジェクトが異なると最適な温度も異なり、従って、試験するセル・オブジェクトに最適な温度で本発明に係る方法を実施することが好ましい。例えば、感染症の場合、多様な生き物の体温は異なるので、個々の生き物を攻撃する細菌についての試験はこの温度（体温）で実施する価値がある。この温度は当業者には自明である。例えば、鶏の場合には４２℃で、ヒトの感染症の場合には３７℃で試験を実施する価値がある。温度制御できることはまた、試験するセル・オブジェクトを所定温度に保持することにより、それが増殖し、その場合には試験化合物の効果のより高精度のイメージが得られるかもしれないので、本発明に係るマイクロ流体装置には好ましい特徴、即ち、利点となる。例えば、細菌に対して発揮される抗生物質の効果の場合、このことは、細菌の最適増殖温度を維持することにより抗生物質の効果が非常に素早く生じてくるので特に好ましい。この理由は、抗生物質の効果は、細菌が増殖するときにこれが新たな細胞壁の形成を防止することにあるからである。これは生成する新たな細菌が細胞溶解を受けることを意味し、このことは分光光度法を用いて容易に同定することができる。
【０１１６】
本発明に係るマイクロ流体装置内には不活性雰囲気も作り出すことができる。これは、どの工程においても検体が空気と接触することがないことを意味する。換言すると、検体は酸素の作用に曝されない。当然、このためには、マイクロ流体装置は遮断される必要があり（ハウジングそれ自体および／または個々の構成要素）、不活性雰囲気を付与するガス（例、窒素、アルゴン）の導入も確保されなければならない。このすべてが当業者の必須知識に属する。不活性雰囲気による試験環境は、嫌気性細菌のような嫌気性セル・オブジェクトの試験を可能にする。
【０１１７】
実施例
実施例１
ＭＳスペクトルに関する実施例
図２の一連の図は、多様な場所から採取された検体から同定された細菌のＭＳスペクトルを示す。図２ａは動物組織由来の検体中のカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）のＭＳスペクトルを示し、図２ｂは食品由来の検体中のウェルシュ菌（Clostridium perfringens）のＭＳスペクトルを示し、図２ｃはヒト組織由来の検体中の大腸菌（Escherichia coli）のＭＳスペクトルを示し、図２ｄは、動物組織由来の検体中の黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＭＳスペクトルを示す。これらのスペクトルはリン脂質の詳細な同定に適した６００〜９００ｍ／ｚの範囲内で記録された。これらのスペクトルは多量のディテール（詳細事項）を有していて、従って、個々の細菌のリン脂質指紋を表示するのに適していることが明らかに見られうる。
【０１１８】
実施例２
ラマンスペクトルに関する実施例
図３の一連の図は、大腸菌のラマンスペクトルを示し、これは本発明に関して非破壊的条件下で記録されたものである。図３ａに示したスペクトルは、１００％強度、７８５ｎｍのレーザー光で得たものであり、図３ｂに示したスペクトルは、２０分のスルホンアミド系抗生物質による処理後に１００％強度、７８５ｎｍレーザー光により得たものであり、図３ｃに示したスペクトルは、３０分のスルホンアミド系抗生物質による処理後に１００％強度、７８５ｎｍレーザー光により得たものである。スルホンアミド系抗生物質処理がラマンスペクトルを著しく変化させたこと、換言するとスルホンアミドが大腸菌に効果があることは容易に認められる。また、セル・オブジェクトの存在に関係するピークが２０分の処理後に著しく低減し、それらは３０分のスルホンアミド系抗生物質処理の後にはより一層低減したことも認められる。換言すると、７８５ｎｍのレーザー光で実施した非破壊的ラマン分光法試験を用いて大腸菌に対するスルホンアミド系抗生物質処理の効果を明確に実証することができる。
【０１１９】
実施例３
ブロイラー鶏に最も高頻度で感染する５種類の細菌の質量分析データベースを作成した。これらの細菌は次の通りである：大腸菌、黄色ブドウ球菌、ウェルシュ菌、カンピロバクター・ジェジュニおよびサルモネラ菌。畜産農場のブロイラー鶏に由来する合計７１の検体を試験した。質量分析法を用いて、これらのうち６８例において感染を引き起こす細菌が正確に同定された。
【０１２０】
実施例４
経験に基づいて、ある畜産農場において感染していると疑われる１０羽のブロイラー鶏を獣医が選んだ。獣医は午前中にこれらの解剖を行い、罹患が見られた器官から検体を採取し、これらの検体を従来の培養法を用いて試験した。これらの器官を実施例３に記載の５種類の細菌について質量分析法試験に供した。１０個の器官検体の試験が３時間で行われたのに対し、従来の手順を用いた場合には２４〜７２時間で評価可能な結果が得られた。結果は９５％のケースで同じであった。結果を次の表１にまとめる。
【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
本明細書においてはセル・オブジェクトとして細菌を、試験化合物として抗生物質を例に挙げて本発明を説明したが、これは本発明がこれらに制限されることを意味しない。
【０１２３】
多くの非細菌性のセル・オブジェクトが存在し、それに対して多様な試験化合物を同様に試験することができる。基本的には、マイクロ流体装置内で試験しうる液体検体にすることができる任意のセル・オブジェクトを、本発明に係る方法および装置で分析することができ、他の観点からは、試験される試験化合物は、ラマン分光計法を用いて同定しうるセル・オブジェクト内である変化を引き起こす。このような用途の例としては、真菌−抗真菌薬および藻−殺生物性活性物質があり、これらも無論、本発明の保護範囲に属する。
【０１２４】
本発明の利点としては、後での試験のためにまず純培養物を常に作成する現今のやり方とは異なり、純培養物由来の検体についてのみならず、組織から直接採取した検体の場合にも使用できることを強調することが重要である。スペクトルのデータベースに現れないセル・オブジェクトの存在が同定を妨害しないからである。しかし、スペクトルのデータベースに現れないセル・オブジェクトの存在は本装置で同定することができる。というのも、同定できないリン脂質の指紋がその後に利用可能になるだろうから。これはある場合には重要な情報である。即ち、これは検体中に未知のセル・オブジェクトがあることを意味し、それは予測されなかった感染性細菌であるかもしれないのである。この場合、その未知セル・オブジェクトを最先端技術に従った方法を用いて同定できるように、検体を適切な設備を持った実験室に運ぶことができる。このようにして同定されたセル・オブジェクトが感染を引き起こす細菌であることが明らかになったら、それに関係するスペクトルを記録し、本発明に従ったマイクロ流体システムのスペクトルデータベースにロードすることができる。この時点から先は、このそれまで未知のセル・オブジェクトの同定はもはや問題を生じないだろう。最先端技術に従った発色性培養基質の使用に基づいた同定も時間のかかる処置であり、このプロセス自体が２４〜７２時間を要する上、細菌菌株のための新たな発色性培養基質の開発にも数カ月、さらには数年かかることもある。
【０１２５】
上に詳述したように、多剤耐性細菌の問題はますます深刻である。本発明に係る方法および装置は、ある検体から１種または２種以上の細菌を同定し、同定された細菌に対して有効な抗生物質の種類および濃度を決定するのに適している。従って、検体中に存在する細菌が、文献によればそれに対して有効である抗生物質に耐性であれば、本発明の装置を用いて本発明の方法を実施することにより、これが非常にすばやく明らかとなるので、他の異なるいくつかの抗生物質を試験する機会ができ、数時間のうちにこの耐性または多剤耐性細菌に対して有効な抗生物質の種類と濃度を同定することができる。本発明に従って決定された有効濃度からある所定のヒトまたは動物に対する有効用量を算出することは当業者の必須知識に属することは留意されるべきである。
【０１２６】
本発明の別の利点は、現行技術より迅速な同定を可能にすることである。現行技術に従って公知の方法を実施するには通常２４〜２７時間が必要であるが、本発明では、この時間を３時間ほどまで短縮することができる。同定のスピードは、一方では、試験を現場で実施することができるように、利用可能な方法が携帯可能な装置で使用できるか否かに左右される。本発明に係る方法はマイクロ流体装置に適合されうるので、本方法はこの要件と合致する。本発明を実施するのに必要なデバイスをマイクロ流体装置内に設置する（上記の分光光度計、質量分析器などを含む）ことにより、自動車で容易に運ぶことができる装置が利用可能となろう。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、現行技術によれば、細菌のタンパク質含有量に基づいてこのような微生物の指紋を決定するのに適しているが、サイズが大きく非常に高価な装置であるので、実用的観点からはこの手法を携帯可能な装置に適合させることが排除される。
【０１２７】
本発明の別の利点は、検体中にいくつかのセル・オブジェクトが存在し、それらのスペクトルがデータベース中にあれば、それらの同時同定の実施が問題とならないことである。例えば、ある畜産農場で２種類の異なる細菌に由来する感染が発生した場合、本発明に係る方法および装置を用いて、それらの両方を同定することができ、それらの両方に対して有効な抗生物質の種類および用量も決定することができる。
【０１２８】
本発明に従ったマイクロ流体装置は、この装置が検体を希釈することも可能にするため、本発明に係る方法の実施に好適である。換言すると、試験中に最初の検体の濃度が高過ぎて容易に評価できるスペクトルをそれから記録することができないことが判明したら、この検体を緩衝液で希釈することによりこの問題を解決することができる。当然、このためにマイクロ流体装置は多くの緩衝液容器（図１には示さず）を備えていてもよく、プログラムまたはオペレータを制御するアルゴリズムは、影響を受けた液体検体部分を希釈する決定をなしうる。
【０１２９】
本発明に係る方法は、マイクロ流体装置とは別の他の装置で実施することもでき、ピコ流体、ナノ流体およびメソ流体システムにも単純に適合させることができることは当業者には自明である。そのような場合、本願明細書に記載したセル・オブジェクトの定義も当然ながら改められよう。
【図１】
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【図２．ａ】
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【図２．ｂ】
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【図２．ｃ】
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【図２．ｄ】
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【図３．ａ】
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【図３．ｂ】
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【図３．ｃ】
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【国際調査報告】
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