(57)【要約】  ＴＡＧ７２を標的とするキメラ抗原受容体及び卵巣がん及び他のがんの治療のためのその使用が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体が、ｓｃＦｖ標的Ｔａｇ−７２（ＴＡＧ７２  ｓｃＦＶ）、スペーサー、膜貫通ドメイン、ＣＤ２８又は４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、核酸分子。
【請求項２】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン若しくは１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン若しくは１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体、又はＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくは１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ＴＡＧ７２  ｓｃＦＶは、ＩＤＥＣ、Ｖ１５及びＶ５９＿Ｖ１５から選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ４膜貫通ドメイン若しくは１〜２個のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン若しくは１〜２個のアミノ酸修飾を有するその変異体、又はＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくは１〜２個のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記スペーサーの領域は、配列番号２〜１２からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記スペーサーは、１０〜５０個のアミノ酸を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列、又は１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１２】
３〜１５個のアミノ酸のリンカーが、前記４−１ＢＢの共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記ＣＡＲは、配列番号２９のアミノ酸配列又は１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ｓｃＦｖは、配列番号１、３１又は３２のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１に記載の核酸分子を含むウイルスベクター。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクターにより形質導入された、ヒトＴ細胞集団。
【請求項１８】
セントラルメモリーＴ細胞を含む、請求項１７に記載のヒトＴ細胞集団。
【請求項１９】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクターにより形質導入された自己又は同種のヒトＴ細胞集団の投与を含む、患者の固形腫瘍を治療する方法であって、ここで、前記固形腫瘍は、Ｔａｇ−７２を発現する細胞を含む、方法。
【請求項２０】
前記キメラ抗原受容体は、局所的又は全身的に投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＡＧ７２発現細胞は、卵巣がん細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記キメラ抗原受容体は、単回又は反復投与により投与される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変されたＴ細胞、処方方法、及びＴＡＧ７２陽性細胞に対して選択的な抗がん剤として用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ１９陽性Ｂ細胞悪性腫瘍患者におけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞治療は、めざましい臨床反応を示し、最近、白血病及びリンパ腫患者に対する２つの画期的なＦＤＡ承認（非特許文献１及び２）が得られた。当該研究は、ＣＡＲ  極めて難治性疾患の症状であっても、がん患者におけるＴ細胞を、持続的及び完全奏効を誘導するように最適化しうることを示す。固形がんに対する効果的なＣＡＲ  Ｔ細胞療法の開発における主な障害は、腫瘍抗原を真に制限できないための、腫瘍外でのオンターゲット毒性の回避、及びＴ細胞の持続性と腫瘍トラフィッキングにより制限された持続的応答の達成である。（非特許文献３及び４）。これまで、ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異性を指向する腫瘍抗原の大部分は、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、及びＩＬ１３Ｒα２（非特許文献３及び５）があげられるが、これらに限定されない、過剰発現タンパク質を標的としてきた。当該分野はまだ発展途上であるが、固形腫瘍における当該タンパク質を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞の臨床的効能はやや限定されており（非特許文献６）、さらなる標的の同定及び限定されたＴ細胞耐久性への対処が、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の成功を阻む顕著な問題であり続けている。
【０００３】
腫瘍上の細胞表面タンパク質の異常なグリコシル化は、長い間、腫瘍の発生に関与し、かつ、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む、免疫療法の魅力的な標的である固有の糖タンパク質の特徴であった（非特許文献７及び８）。結腸、乳房、膵臓、及び卵巣を含む複数のがん種は、ムチンＭＵＣ１６及びＭＵＣ１、並びに腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ７２）を含む、糖タンパク質を過剰発現することが知られており、（非特許文献９）、これは、正常上皮と区別される。ＴＡＧ７２は、セリン及びトレオニン残基に大量のＯ−グリコシド結合がある、高分子量ムチンである（非特許文献１０）。当該３つの抗原の同時染色により、卵巣がんのほぼ１００％が同定され、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６の高発現が卵巣がん患者組織標本で示された（非特許文献１１）。重要なことに、上皮性卵巣がんの約９０％はＴＡＧ７２陽性であり、卵巣がんの複数の組織学的サブタイプにわたりＴＡＧ７２が存在することが示される。
【０００４】
ＴＡＧ７２の腫瘍関連シアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ抗原）に特異的なモノクローナル抗体がいくつか開発されており、その中には、よく研究されているクローンＣＣ４９（非特許文献１２）が含まれる。ＣＣ４９は、その後、画像診断及び放射線治療を用いた複数の前臨床試験及び臨床試験に利用され、抗体ヒト化の複数の試みにも関与している（非特許文献１３〜１９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Maude SL, Teachey DT, Porter DL,Grupp SA. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acutelymphoblastic leukemia. Blood. 2015; 125(26):4017-23
【非特許文献２】Jain MD, Davila ML. ConciseReview: Emerging Principles from the Clinical Application of Chimeric AntigenReceptor T Cell Therapies for B Cell Malignancies. Stem cells. 2018;36(1):36-44
【非特許文献３】Priceman SJ, Forman SJ, BrownCE. Smart CARs engineered for cancer immunotherapy. Current opinion inoncology. 2015;27(6):466-74
【非特許文献４】Chen N, Li X, Chintala NK, TanoZE, Adusumilli PS. Driving CARs on the uneven road of antigen heterogeneity insolid tumors. Current opinion in immunology. 2018; 51:103-10
【非特許文献５】Yong CSM, Dardalhon V, Devaud C,Taylor N, Darcy PK, Kershaw MH. CAR T-cell therapy of solid tumors. Immunologyand cell biology. 2017;9 5(4):356-63
【非特許文献６】Castellarin M, Watanabe K, JuneCH, Kloss CC, Posey AD, Jr. Driving cars to the clinic for solid tumors. Genetherapy. 2018. Epub 2018/06/09.
【非特許文献７】Steentoft C, Migliorini D, KingTR, Mandel U, June CH, Posey AD, Jr. Glycan-Directed Car-T Cells. Glycobiology.2018. Epub 2018/01/26
【非特許文献８】RodrIguez E, Schetters STT, vanKooyk Y. The tumour glyco-code as a novel immune checkpoint for immunotherapy.Nature reviews Immunology. 2018; 18(3):204-11. Epub 2018/02/06
【非特許文献９】Hollingsworth MA, Swanson BJ.Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nature reviewsCancer. 2004;4(1):45-60. Epub 2003/12/19
【非特許文献１０】Julien S, Videira PA, DelannoyP. Sialyl-tn in cancer: (how) did we miss the target? Biomolecules. 2012;2(4):435-66. Epub 2012/01/01
【非特許文献１１】Chauhan SC, Vinayek N, Maher DM,Bell MC, Dunham KA, Koch MD, Lio Y, Jaggi M. Combined staining of TAG72, MUC1,and CA125 improves labeling sensitivity in ovarian cancer: antigens formulti-targeted antibody-guided therapy. The journal of histochemistry andcytochemistry.2007; 55(8):867-75
【非特許文献１２】Muraro R, Kuroki M, WunderlichD, Poole DJ, Colcher D, Thor A, Greiner JW, Simpson JF, Molinolo A, Noguchi P,et al.  Generation and characterization of B72.3 second generationmonoclonal antibodies reactive with the tumor-associated glycoprotein 72antigen. Cancer research. 1988; 48(16):4588-96
【非特許文献１３】Cheng KT. Radioiodinatedanti-TAG72 CC49 Fab' antibody fragment. Molecular Imaging and Contrast AgentDatabase (MICAD). Bethesda MD2004
【非特許文献１４】Pavlinkova G, Booth BJ, BatraSK, Colcher D. Radioimmunotherapy of human colon cancer xenografts using adimeric single-chain Fv antibody construct. Clinical cancer research: anofficial journal of the American Association for Cancer Research.1999;5(9):2613-9
【非特許文献１５】Kashmiri SV, Shu L, Padlan EA,Milenic DE, Schlom J, Hand PH. Generation, characterization, and in vivostudies of humanized anticarcinoma antibody CC49. Hybridoma. 1995; 14(5):461-73
【非特許文献１６】De Pascalis R, Gonzales NR,Padlan EA, Schuck P, Batra SK, Schlom J, Kashmiri SV. In vitro affinitymaturation of a specificity-determining region-grafted humanized anticarcinomaantibody: isolation and characterization of minimally immunogenic high-affinityvariants. Clinical cancer research: an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research. 2003; 9(15):5521-31
【非特許文献１７】Gonzales NR, Padlan EA, DePascalis R, Schuck P, Schlom J, Kashmiri SV. Minimizing immunogenicity of theSDR-grafted humanized antibody CC49 by genetic manipulation of the frameworkresidues. Molecular immunology. 2003;40(6):337-49
【非特許文献１８】Pavlinkova G, Colcher D, BoothBJ, Goel A, Wittel UA, Batra SK. Effects of humanization and gene shuffling onimmunogenicity and antigen binding of anti-TAG72 single-chain Fvs.International journal of cancer. 2001;94(5):717-26
【非特許文献１９】Hege KM, Bergsland EK, FisherGA, Nemunaitis JJ, Warren RS, McArthur JG, Lin AA, Schlom J, June CH, SherwinSA. Safety, tumor trafficking and immunogenicity of chimeric antigen receptor(CAR)-T cells specific for TAG72 in colorectal cancer. Journal forimmunotherapy of cancer. 2017; 5:22
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、様々ながん、例えば、卵巣がんの治療にＴＡＧ７２標的ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いる方法が記載される。
【０００７】
本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が記載され、ここで前記キメラ抗原受容体は、ｓｃＦｖ標的Ｔａｇ−７２、スペーサー、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又はＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【０００８】
様々な実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン若しくは１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン若しくは１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体、又はＣＤ２８膜貫通ドメイン若しくは１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択され；前記スペーサーは２０〜１５０個のアミノ酸を含み、かつ、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間に位置し；前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体であり；前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインであり；前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸修飾を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメインを含み；前記スペーサー領域は、配列番号２〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列又は１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含み；前記スペーサーは、１０〜５０個のアミノ酸を含み；前記４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２４又は１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体のアミノ酸配列を含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；３〜１５個のアミノ酸のリンカーは、４−１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体の間に位置し；前記ＣＡＲは、配列番号２９又は１〜５個のアミノ酸修飾を有するその変異体のアミノ酸配列を含み；前記ｓｃＦｖは、配列番号１、配列番号３３又は配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
また、本明細書には、本明細書に記載される核酸分子を含むウイルスベクター；本明細書に記載される核酸分子を含むベクターにより形質導入されたヒトＴ細胞集団（例えば、セントラルメモリーＴ細胞を含む集団）が開示される。
【００１０】
また、本明細書にはまた、本明細書に記載される核酸分子を含むベクターにより形質導入された自己又は同種のヒトＴ細胞集団の投与を含む、患者の固形腫瘍を治療する方法が記載され、前記固形腫瘍は、Ｔａｇ−７２を発現する細胞を含む。様々な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、局所的又は全身的に投与され；前記ＴＡＧ７２発現細胞は、卵巣がん細胞であり；前記キメラ抗原受容体は、単回又は反復投与により投与される。
【００１１】
様々な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、ＴＡＧ７２  ｓｃＦｖ（例えば、以下のアミノ酸配列：
【００１２】
【化１】
2021532793.tif 000002
（配列番号１）を含むｓｃＦｖであって、最大で５個〜最大で１０個の単一アミノ酸置換がある）を含む。
【００１３】
様々な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、ＴＡＧ７２  Ｖ１５  ｓｃＦｖ（例えば、以下のアミノ酸配列：
【００１４】
【化２】
2021532793.tif 000003
（配列番号３３）を含むｓｃＦｖであって、最大で５個〜最大で１０個の単一アミノ酸置換がある）を含む。
【００１５】
様々な実施形態では、前記キメラ抗原受容体は、ＴＡＧ７２  Ｖ５９＿Ｖ１５  ｓｃＦｖ（例えば、以下のアミノ酸配列：
【００１６】
【化３】
2021532793.tif 000004
（配列番号３４）を含むｓｃＦｖであって、最大で５個〜最大で１０個の単一アミノ酸置換がある）を含む。
【００１７】
当該ＣＡＲを発現するベクターを有するＴ細胞もまた、記載される。様々な実施形態では、当該形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも２０％、３０％又は４０％は、セントラルメモリーＴ細胞であり；当該形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも３０％は、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり；当該ヒトＴ細胞集団は、患者由来であり；かつ、当該ヒトＴ細胞集団は、患者の同種異系である。
【００１８】
ＴＡＧ７２標的ＣＡＲ
本明細書に記載されるＴＡＧ７２標的ＣＡＲは、ｓｃＦｖを標的化するＴＡＧ７２（例えば、以下のアミノ酸配列：
【００１９】
【化４】
2021532793.tif 000005
（配列番号１）を含むｓｃＦｖ、又は以下の配列：
【００２０】
【化５】
2021532793.tif 000006
（配列番号）及び、可撓性リンカーに結合された以下の配列
【００２１】
【化６】
2021532793.tif 000007
を含み；
以下の配列：
【００２２】
【化７】
2021532793.tif 000008
（配列番号３３）；又は
以下の配列：
【００２３】
【化８】
2021532793.tif 000009
（配列番号３４）を含む。
【００２４】
有用なＴＡＧ７２  ＣＡＲは、配列番号＿（シグナル配列欠失成熟ＣＡＲ）のアミノ酸配列からなるか、又はそれを含むことができ、又は当該ＴＡＧ７２  ＣＡＲは配列番号２９、３１、若しくは３２（ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を有する未成熟ＣＡＲ）のアミノ酸配列からなるか、又はそれを含みうる。当該ＣＡＲは、シグナル配列、例えば、ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体αシグナル配列（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ；配列番号＿＿）を含む形態で発現しうる。当該ＣＡＲは、例えば、Ｔ２Ａスキップ配列及び切断型ＥＧＦＲｔ等の、発現の追跡に有用なさらなる配列で発現されうる。したがって、当該ＣＡＲは、配列番号２９、３１、又は３２のアミノ酸配列を含みうるか、又はそれらからなることができ、又は配列番号２９、３１、又は３２と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含みうるか、又はそれらからなりうる。当該ＣＡＲは、１、２、３、４、又は５個までのアミノ酸変化（好ましくは保存的アミノ酸変化）を有する配列番号２９、３１、又は３２のいずれかのアミノ酸配列を含みうるか、又はそれからなりうる。
【００２５】
スペーサー領域
本明細書に記載されるＣＡＲは、スペーサーを、ＴＡＧ７２標的標的ドメイン（すなわち、ＴＡＧ７２標的ＳｃＦｖ又はその変異体）と膜貫通ドメインとの間に位置させて含みうる。様々な異なるスペーサーを用いうる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも部分、例えば、当該ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又はＣＨ３ドメイン若しくはその変異体を含む。以下の表１に、本明細書で提供されるＣＡＲにおいて用いられうる様々なスペーサーを記載する。
表１：スペーサー例
【００２６】
【表１】
2021532793.tif 000010
いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンのＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間にある配列、例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジの全部又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むか又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインをともに含む。当該免疫グロブリン由来の配列は、１個又はそれ以上のアミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４又は５個の置換、例えば、標的外結合を低下させる置換を含みうる。
【００２７】
当該ヒンジ／リンカー領域はまた、配列がＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）であるＩｇＧ４ヒンジ領域を含みうる。当該ヒンジ／リンカー領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）、続いてリンカー配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号２）、続いてＩｇＧ４  ＣＨ３配列ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）を含みうる。従って、当該リンカー／スペーサー領域全体は、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１１）という配列を含みうる。ある場合、当該スペーサーには、配列番号１１と比較して、１、２、３、４又は５個の単一アミノ酸変化（例えば、保存的変化）がある。ある場合、ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ／リンカー領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）による結合が低下するように、２つの位置（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）で変異する。
【００２８】
膜貫通ドメイン
様々な膜貫通ドメインを用いうる。表２には、適当な膜貫通ドメインを例示する。スペーサー領域が存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサー領域のカルボキシ末端にある。
例２：膜貫通ドメインの例
【００２９】
【表２】
2021532793.tif 000011
共刺激ドメイン
共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適するいかなるドメインでありうる。ある場合、共シグナル伝達ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＭＲＰＶＱＴＱＥＥＤＧＣＲＦＥＥＥＧＣＥＬ（配列番号２４）と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はと同一である配列があげられる４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメインである。ある場合、当該４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメインは、配列番号２４と比較して、（好ましくは、保存的）１、２、３、４又は５個のアミノ酸変化がある。
当該共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの間に位置する。表３に、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と共に、適当な共刺激ドメインを例示する。
表３：  ＣＤ３ζドメインと共刺激ドメインの例
【００３０】
【表３】
2021532793.tif 000012
様々な実施形態では、共刺激ドメインは、表３に示される共刺激ドメイン又は１〜５個の（例えば、１又は２個）アミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５個の（例えば、１個又は２個）アミノ酸修飾を有するその変異体、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５個の（例えば、１個又は２個）アミノ酸修飾を有するその変異体、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜５個の（例えば、１個又は２個）アミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択される。特定の実施形態では、４−１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体は、１−５個の（例えば、１個又は２個）アミノ酸修飾を有する。いくつかの実施形態では、２つの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するその変異体、及び４−１ＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５個（例えば、１個又は２個）のアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するその変異体が存在する。様々な実施形態では、１〜５個（例えば、１個又は２個）アミノ酸修飾は置換である。当該共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ末端であり、２〜１０からなる短いリンカー、例えば、３つのアミノ酸（例えば、ＧＧＧ）が、共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの間に位置しうる。
【００３１】
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適するいかなるドメインでありうる。ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、以下の配列：ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２１）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一又は同一である配列を含む。ある場合では、当該ＣＤ３ζシグナル伝達は、配列番号２１と比較して、１、２、３、４又は５個（好ましくは保存的）がアミノ酸変化する。
【００３２】
切断型ＥＧＦＲ
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号２７）及び、以下の配列：ＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号２８）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一又は同一である配列を有する切断型ＥＧＦＲが続いてよい。ある場合、当該切断型ＥＧＦＲは、配列番号２８と比較して、１、２、３、４又は５個（好ましくは保存的）のアミノ酸が変化する。
【００３３】
「アミノ酸修飾」とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することをいう。当該置換は、非保存的（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸に変化させることにより）に、又は保存的（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸に変化させることにより）に、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させるように行いうる。当該保存的変化では、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能の変化がより少なくなる。以下に、アミノ酸の様々な群分けを例示する：１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０で正に荷電）。他の群はフェニル基をもつアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンである。
【００３４】
ある場合、ＴＡＧ７２  ＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列と、細胞質シグナル伝達テイルが欠失した切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）が続くベクターを用いて産生されうる。
当該配列では、ＥＧＦＲｔの共発現により、遺伝子修飾細胞が正確に測定されえ、遺伝子修飾細胞の正の選択、並びに養子移入後の治療用Ｔ細胞のインビボで効率的に細胞追跡しうる不活性な非免疫原性表面マーカーが提供される。サイトカインストーム及び標的外毒性を回避するための効率的な増殖制御は、Ｔ細胞免疫療法の成功にとって重要なハードルである。ＴＡＧ７２  ＣＡＲレンチウイルスベクターに組み込まれたＥＧＦＲｔは、自殺遺伝子として作用し、治療関連毒性の場合には、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を除去しうる。
【００３５】
本明細書中に記載されるＣＡＲは、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造されるが、当技術分野で公知のいかなる手段により製造されうる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当技術分野で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発等）により、簡便に調製し、完全なコード配列に組み立てうる。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞系、好ましくはＴリンパ球細胞系、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞系の形質転換に用いられる。
【００３６】
患者から単離された様々なＴ細胞サブセットを、ＣＡＲ発現用ベクターで形質導入しうる。セントラルメモリーＴ細胞は、有用なＴ細胞サブセットの１つである。セントラルメモリーＴ細胞は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離して、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に選択しうる。セントラルメモリーＴ細胞のために濃縮された細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化され得、例えば、ＴＡＧ７２  ＣＡＲの発現を指向するレンチウイルスベクター、並びにインビボ検出、アブレーション、及び潜在的ｅｘ  ｖｉｖｏ選択のための非免疫原性表面マーカーで形質導入されうる。活性化された／遺伝子修飾されたＴＡＧ７２セントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５を用いてインビトロで増殖させ、次いで凍結保存しうる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１Ａ−１Ｄは、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の概略図を示し、精製ＴＡＧ７２と共培養したＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の結果を示す。（Ａ）ＴＡＧ７２を標的とするヒト化ｓｃＦｖ（ＣＣ４９クローン）含有ＴＡＧ７２−ＣＡＲを有するレンチウイルス発現カセットと、１２９アミノ酸修飾ヒトＩｇＧ４  Ｆｃリンカー（ＣＨ２ドメインの空隙、ΔＣＨ２）、ＣＤ４膜貫通ドメイン、細胞質４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及び細胞溶解性ＣＤ３ζドメインを有するレンチウイルス発現カセットの図解である。Ｔ２Ａリボソームスキップ配列によりＣＡＲ配列から分離された切断非シグナル伝達ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）を発現させて、レンチウイルスで形質導入されたＴ細胞を同定した。（Ｂ）Ｍｏｃｋ（非形質導入）及びＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＣＤ１９ｔ発現についてフローサイトメトリーで評価し、レンチウイルスによるＣＡＲの形質導入（左）又はタンパク質Ｌを検出し、ｓｃＦｖ  （右）を検出した。（Ｃ）Ｍｏｃｋ（上）及びＴＡＧ７２ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（下）におけるＣＤ４及びＣＤ８の発現を示す。（Ｄ）活性化（ＣＤ１３７の発現）は、可溶性又はプレート結合精製ＴＡＧ７２抗原に対するインビトロで刺激したＣＡＲ  Ｔ細胞を用いたフローサイトメトリーで、示されたタンパク質量（単位）で２４時間評価した。
【図２】図２Ａ−２Ｂは、精製ＴＡＧ７２抗原に対するＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化の結果を示す。（Ａ）活性化（ＣＤ６９の発現）は、可溶性又はプレート結合精製ＴＡＧ７２抗原に対するインビトロ刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いたフローサイトメトリーにより、示されたタンパク質量（単位）で２４時間評価した。（Ｂ）プレート結合精製ＴＡＧ７２抗原に対するＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞からのＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ産生を示す。
【図３】図３Ａ−３Ｈは、ＴＡＧ７２陽性及びＴＡＧ７２陰性がん細胞とともに培養したＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた実験の結果を示す。（ａ）複数の卵巣及び結腸直腸（ＬＳ１７４Ｔ）がん細胞株のＴＡＧ７２表面発現のフローサイトメトリー分析である。（ｂ）材料及び方法の記載により、抗原陽性及び陰性腫瘍標的との２４時間及び７２時間の共培養後のＭｏｃｋに対するＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による腫瘍殺傷の定量化を行った。（ｃ）ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖は、示された腫瘍標的との共培養後２４時間及び７２時間で認められた。（ｄ，ｅ）Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の上清中のＩＦＮγ及びＩＬ−２レベルを、示された腫瘍標的との２４時間及び７２時間の共培養後にＥＬＩＳＡで定量した。（Ｆ）培養７２時間後に患者の腹水（ＯＡＳ）から採取した初代ヒト卵巣がん細胞のＴＡＧ７２表面発現のフローサイトメトリー分析である。（Ｇ）解凍したばかりのＯＡＳ細胞との７２時間の共培養後の、Ｍｏｃｋに対するＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による腫瘍殺傷及び（Ｈ）ＩＦＮγ産生の定量である。
【図４】図４は、ＯＶＣＡＲ３又はＯＶ９０腫瘍担持マウス由来の腹水におけるＴＡＧ７２発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図５】図５は、２４時間共培養アッセイにおける１０ユニットの可溶性ＴＡＧ７２の存在下又は非存在下におけるＯＶＣＡＲ３細胞のＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞媒介腫瘍殺傷の結果を示す。
【図６】図６Ａ−６Ｆは、ＯＶＣＡＲ３腫瘍担持マウスにおけるＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の局所腹腔内送達を用いた実験の結果を示す。（Ａ）ＮＳＧマウスにおける５．０×１０６個のＯＶＣＡＲ３（ｅＧＦＰ／ｆｆｌｕｃ）腫瘍細胞の腹腔内生着、続いて、腫瘍注射後１４日目における５．０×１０６個のＭｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかの腹腔内送達を示す概略図である。（Ｂ）Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で静脈内又は腹腔内投与したマウスの代表的な生物発光流束イメージングである。（Ｃ）Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で静脈内又は腹腔内投与したＯＶＣＡＲ３（ｅＧＦＰ／ｆｆｌｕｃ）腫瘍担がんマウス由来の流束（各マウス）の定量である。１群Ｎ＝３（Ｄ）Ｍｏｃｋ及びＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処理マウスのカプラン・マイヤー生存率である。１群４匹以上のマウス。データは、２つの独立した実験の代表又はその組み合わせである。（Ｅ）治療後６、１３、２９日目の血中１μＬあたりのＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の定量である。１群Ｎ＝４。（Ｆ）処理後６日目及び１３日目の腫瘍担がんマウスの腹腔内におけるヒトＣＤ４５＋（ｈＣＤ４５）細胞及びマウスＣＤ４５＋（ｍＣＤ４５）細胞の頻度の代表的なフローサイトメトリー分析である。２つの独立した実験の代表的な画像である。
【図７】ＯＶＣＡＲ３モデルにおけるヒトＣＤ４５＋細胞の定量化；処理後６、１３、及び２９日目における血液１μＬ当たりのヒトＣＤ４５＋細胞の定量化を示す。１群Ｎ＝４。
【図８】図８Ａ−８Ｂは、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）又は経静脈投与（ｉ．ｖ．）により送達されたＯＶ９０腫瘍−担持マウスにおけるＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性の結果を示す；（Ａ）Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で経静脈投与又は腹腔内投与処理されたＯＶ９０（ｅＧＦＰ／ｆｆｌｕｃ）腫瘍−担持マウス由来流束の定量化（各マウス）を示す。（Ｂ）  Ｍｏｃｋ及びＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処理マウスのカプラン・マイヤー生存率である。１群４匹以上のマウス。
【図９】図９Ａ〜９Ｆは、ＯＶ９０腫瘍マウスにおけるＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回又は反復局所投与のいずれかによる実験結果を示す。（Ａ）  ＮＳＧマウスにおける５．０×１０６個のＯＶ９０（ｅＧＦＰ／ｆｆｌｕｃ）腫瘍細胞の腹腔内生着、続いて、腫瘍感染後８日目に５．０×１０６個のＭｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を単回又は反復腹腔内投与する方法を示す概略図である。（Ｂ）Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を単回又は反復処理したマウスの代表的な生物発光流束イメージングである。（Ｃ）  Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を単回又は反復腹腔内投与したＯＶ９０（ｅＧＦＰ／ｆｆｌｕｃ）腫瘍マウス由来流束（各マウス）の定量である。（Ｄ）全マウスの治療開始時（上）及び治療ピーク時（下）の相対腫瘍増殖動態の解析である。マン・ホイットニー検定を行い、ｐ値を算出した。（Ｅ）Ｍｏｃｋ及びＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処理したカプラン・マイヤー生存率である。各群５匹以上のマウス。（Ｆ）腫瘍注入後４２日目及び７０日目に単一及び反復処置マウスから採取した腫瘍におけるヒトＣＤ３細胞の組織像（上：１０倍、下：４０倍）である。データは２つの独立した実験の代表である。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｂは、ＯＶ９０モデルにおけるヒトＣＤ４５＋細胞の定量化；処理後７、１４、及び３４日目の血液１μＬ当たりのヒトＣＤ４５＋細胞の定量化を示す。１群Ｎ＝４。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｅは、卵巣がんにおける腫瘍関連糖タンパク質抗原の不均一性の結果及びＣＡＲ  Ｔ細胞媒介抗原逃避を定量化する実験を示す。（Ａ）ＯＶＣＡＲ８、ＯＶＣＡＲ３、及びＯＶ９０ヒト卵巣がん細胞株におけるＴＡＧ７２、ＭＵＣ１６、及びＭＵＣ１の表面発現のフローサイトメトリー分析である。（Ｂ）Ｍｏｃｋ及びＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞から採取した腹腔内固形腫瘍におけるＴＡＧ７２、ＭＵＣ１６、及びＭＵＣ１発現の組織学的検査では、ＯＶＣＡＲ３担がんマウスを治療９９日後に処理した。１０倍拡大。（Ｃ）腫瘍注入後４２、７０、１０５日目に単一及び反復処理したＯＶ９０腫瘍担持マウスから採取した固形腫瘍におけるＴＡＧ７２発現の組織像である。１０倍拡大。（Ｄ）腹水から採取したＯＶ９０腫瘍細胞におけるＴＡＧ７２発現のフローサイトメトリー分析は、単回又は反復腹腔内投与を受けたマウスから示された時点で行った。（Ｅ）Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養（１：１０  Ｅ：Ｔ比）後の４日目のＯＶＣＡＲ３細胞及び２８日目に増殖した腫瘍細胞におけるＴＡＧ７２の発現である。
【図１２】図１２は、ｈＴａｇ７２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔの注釈付きポリペプチド配列を示す（Ｔ２Ａ及びＣＤ１９ｔがある配列番号２６；Ｔ２Ａ及びＣＤ１９ｔがない配列番号２９）。ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａ及びＣＤ１９ｔがない配列番号３５。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、ヒト化ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍殺傷、活性化、及びＴ細胞増殖を示す。（Ａ）  ＯＶ９０及びＯＶＣＡＲ３細胞を、Ｍｏｃｋ、ＩＤＥＣ、Ｖ１５又はＶ５９／１５変異型ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかと７２時間、Ｅ：Ｔ１：２で共培養した。腫瘍の死滅は、モック治療条件に対する死滅％として表される。（Ｂ）  Ｔ細胞活性化は、表面ＣＤ１３７発現のフローサイトメトリー染色により７２時間の共培養アッセイから分析した。（Ｃ）  ７２時間後のＴ細胞増殖（倍数増殖）を、０日目に平板培養したＴ細胞数に対して測定した。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＯＶ９０腫瘍担持マウスにおけるヒト化ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回又は反復局所投与のいずれかによる実験の結果を示す。（Ａ）ＯＶ９０腫瘍細胞株上のＴＡＧ７２抗原の内因性発現をフローサイトメトリーで測定した。ＯＶ９０−ｆｆｌｕｃ細胞をＮＳＧマウスの腹腔内腔に注入（ｉ．ｐ．）し、生物発光イメージングにより追跡し、流束（写真／秒）として報告した。腫瘍注射後８日目に、腫瘍担持マウスの腹腔内に局所的に投与されたＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の５．０×１０６Ｍｏｃｋ、ＩＤＥＣ、又はＶ１５変異体のいずれかの単回又は反復投与を行った。（Ｂ）単一又は反復Ｔ細胞処理マウスの腫瘍量を生物発光イメージングにより定量した。破線はＴ細胞による初回治療と反復治療の時点を示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＯＶＣＡＲ３腫瘍担持マウスにおいてヒト化ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈内投与した結果を示す。（Ａ）内因性表面ＴＡＧ７２発現を、ＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞上のフローサイトメトリーで分析した。次いで、ＯＶＣＡＲ３−ｆｆｌｕｃ腫瘍をＮＳＧマウスの腹腔内に注射し、５．０×１０６Ｍｏｃｋ、ＩＤＥＣ又はＶ１５変異型ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回投与で静脈内投与した。（Ｂ）単回投与マウスの腫瘍量を生物発光イメージングにより定量化し、流束（写真／秒）として報告した。破線はＴ細胞による治療の時点を示す。（Ｃ）Ｍｏｃｋ、又はＩＤＥＣ及びＶ１５  ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性及び増殖性の定量化は、Ｔ細胞処理後６、１３及び２９日目のマウスにおいてフローサイトメトリー（血液１μＬあたりのＣＡＲ＋細胞）により血液中で定量化され、ＩＤＥＣに対するＶ１５変異体ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性及び増殖性の増加が強調された。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｅは、様々なヒト化Ｖ１５−ＣＡＲ設計がインビトロ抗腫瘍Ｔ細胞機能活性に影響を及ぼすことを示す。（Ａ）７つのＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞変異体（Ｖ１５  ｓｃＦｖクローンを有する）のＣＡＲ発現安定性である。（Ｂ−Ｅ）ＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）及びＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８−ｓＴｎ）を発現する腫瘍細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロ腫瘍殺傷活性、Ｔ細胞増殖、ＣＤ１３７＋活性化標識、及びＰＤ−１＋枯渇標識（７２時間）である。
【図１７】ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロサイトカイン産生に及ぼす様々なヒト化Ｖ１５−ＣＡＲ設計の影響を示す。腫瘍細胞を発現するＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）及びＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、ＯＶＣＡＲ８−ｓＴｎ）に対するＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロにおけるＩＦＮγ産生（２４時間）である。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは、ヒト化ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞のリアルタイムの長期的な殺傷及び増殖を示す。（Ａ）リアルタイム細胞毒性アッセイは、ＯＶ９０細胞を用いたｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ技術を用いて行った。４つのＴ細胞集団をエフェクター対標的比１対２０で平板培養し、１０日間観察した。細胞指数は、生腫瘍数を示す。（Ｂ）最終時点で、残りの細胞を収集し、フローサイトメトリーで分析した。
【図１９】図１９は、Ｔ２Ａ及びＣＤ１９ｔがないＴａｇ７２ｓｃＦｖ（ＩＤＥＣ）−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａの注釈付きポリペプチド配列を示す（配列番号３０）。ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドがない配列番号３５。
【図２０】Ｔ２Ａ及びＣＤ１９ｔがないＴａｇ７２ｓｃＦｖ（ｖ１５）−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａの注釈付きポリペプチド配列を示す（配列番号３１）。ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドがない配列番号３。
【図２１】図２１は、Ｔ２Ａ及びＣＤ１９ｔ（配列番号３２）がないＴａｇ７２ｓｃＦｖ（ｖ５９＿ｖ１５）−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａの注釈付きポリペプチド配列を示す。ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドがない配列番号３７。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本開示では、ヒト化抗ヒトＴＡＧ７２  ｓｃＦｖ抗原結合ドメイン及び４−１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＴＡＧ７２−ＢＢζ）を有する第２世代ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成及び抗腫瘍効果を記載する。ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞は、複数のＴＡＧ７２を発現するヒト卵巣がん細胞株及び細胞培養で増殖した患者卵巣がん腹水由来の上皮細胞に対して強力な抗原依存性細胞毒性を示した。腹膜卵巣腫瘍モデルでは、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞をインビボ局所送達すると、抗原陽性疾患が除去され、かつ、マウスの全生存期間が延びた。対照的に、ＣＡＲ  Ｔ細胞の静脈内送達は疾患のコントロールには効果がなかった。さらに、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の局所反復注入により、単独治療と比較して疾患制御がより持続的に促進された。当該前臨床所見は、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、卵巣がんの実行可能な治療選択肢であることを裏付けるとともに、ＴＡＧ７２を発現する複数の固形がんへのより広範な適用を強調する。
【００３９】
〔実施例〕
本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
【００４０】
〔材料及び方法〕
以下の材料及び方法を、本明細書に記載した実施例で用いた。
【００４１】
細胞株
上皮性卵巣がん株ＯＶＣＡＲ３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１６１）を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Hyclone）及び１Ｘ抗生物質抗真菌剤（１ＸＡＡ、Gibco）（完全ＲＰＭＩ）含有ＲＰＭＩ−１６４０（Lonza）で培養した。転移性腹水由来の上皮性卵巣がん株ＯＶ９０（ＣＲＬ１１７３２）を、水酸化ナトリウム（Sigma）及び最終濃度２０％ＦＢＳ及び１×ＡＡを用いてｐＨ７．０に調整したＭＣＤＢ１０５培地（Sigma）及び培地１９９（Thermo）の１：１混合液中で培養した。上皮性類子宮類卵巣がん株ＣＯＶ３６２．４（Sigma）を、１０％ＦＢＳ、１ＸＡＡ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Irvine Scientific）及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Fisher Scientific）（完全ＤＭＥＭ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、LifeTechnologies）で培養した。上皮性卵巣がん株ＯＶＣＡＲ８は、寛大にもシティオブホープのＣａｒｌｏｔｔａ  Ｇｌａｃｋｉｎ博士から供与されたものであり、完全ＲＰＭＩ−１６４０で培養した。上皮性卵巣がん株ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ‐７７）と結腸上皮がん株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＬ‐１８８）を完全ＤＭＥＭで培養した。すべての細胞を５％  ＣＯ２３７℃で培養した。
【００４２】
ＤＮＡ構築物とレンチウイルス産生
腫瘍細胞を、既報（２２；Ｐｒｉｃｅｍａｎ  ＳＪ，  Ｇｅｒｄｔｓ  ＥＡ，  Ｔｉｌａｋａｗａｒｄａｎｅ  Ｄ，Ｋｅｎｎｅｗｉｃｋ  ＫＴ，  Ｍｕｒａｄ  ＪＰ，  Ｐａｒｋ  ＡＫ，  Ｊｅａｎｇ  Ｂ，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ，  Ｙａｎｇ  Ｘ，  Ｕｒａｋ  Ｒ，  Ｗｅｎｇ  Ｌ，  Ｃｈａｎｇ  ＷＣ，  Ｗｒｉｇｈｔ  Ｓ，  Ｐａｌ  Ｓ，  Ｒｅｉｔｅｒ  ＲＥ，  Ｗｕ  ＡＭ，  Ｂｒｏｗｎ  ＣＥ，  Ｆｏｒｍａｎ  ＳＪ．  Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＰＳＣＡ＋  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１８；  ７（２）：ｅ１３８０７６４）のＥＦ１αプロモーターの制御下でｅＧＦＰ／ｆｌｕｃ融合を担持するｅＨＩＶ７レンチウイルスを用いた形質導入により、増強緑色蛍光タンパク質及びホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ／ｆｌｕｃ）を発現するように改変した。当該ＣＡＲ構築物に用いたヒト化ｓｃＦｖ配列は、ＴＡＧ７２を標的とするモノクローナル抗体クローンｈｕＣＣ４９から得られた（１７）。細胞外スペーサードメインは、ＩｇＧ４  Ｆｃスペーサーの１２９アミノ酸の中長ＣＨ２欠失型（ΔＣＨ２）を含んでいた（Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ  Ｍ，  Ｍａｒｄｉｒｏｓ  Ａ，  Ｕｒａｋ  Ｒ，  Ｗａｎｇ  Ｘ，  Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬＪ，  Ｂｅｒｎａｎｋｅ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｔｅｄ  ＩｇＧ４  Ｆｃ  ｓｐａｃｅｒ  ａｖｏｉｄ  ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  （２０１５）  ２３：７５７−６８）。含まれる細胞内の補助刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインを有する４−１ＢＢであった。ＣＤ３ζ細胞溶解ドメインは、既報である（２２）。当該ＣＡＲ配列を、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列により切断ＣＤ１９遺伝子（ＣＤ１９ｔ）から分離し、ＥＦ１αプロモーターの制御下で、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルス骨格中でクローニングした。
【００４３】
レンチウイルスは、既報（２２、Ｐｒｉｃｅｍａｎ  ＳＪ，  Ｔｉｌａｋａｗａｒｄａｎｅ  Ｄ，  Ｊｅａｎｇ  Ｂ，  Ａｇｕｉｌａｒ  Ｂ，  Ｍｕｒａｄ  ＪＰ，  Ｐａｒｋ  ＡＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  ＨＥＲ２（＋）  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２０１８）  ２４：９５−１０５）同様に作製した。簡潔には、２９３Ｔ細胞を、改変リン酸カルシウム法を用いてパッケージングプラスミド及びＣＡＲレンチウイルス骨格プラスミドでトランスフェクトした。３〜４日後にウイルス上清を採取し、２ｍＭマグネシウム及び２５Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（ＥＭＤミリポア）で処理した。高速遠心分離で上清を濃縮し、レンチウイルスペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−乳糖溶液（ＰＢＳ１００ｍＬ当たり乳糖４ｇ）に再懸濁し、−８０℃で分注保存した。レンチウイルス力価は、ＣＤ１９ｔ発現に基づいてＨＴ１０８０細胞を用いて定量した。
【００４４】
Ｔ細胞単離、レンチウイルス形質導入、及びＥｘ  ｖｉｖｏ増殖
白血球除去輸血製品は、シティオブホープ内部審査会（ＩＲＢ）により承認されたプロトコルに基づき、同意を得た研究参加者（健康なドナー）から入手した。白血球除去輸血の日に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  （ＧＥヘルスケア）上での密度勾配遠心分離、続いてＰＢＳ／ＥＤＴＡ  （MiltenyiBiotec）で複数洗浄して単離した。細胞を室温（ＲＴ）で回転子上に一晩静置し、次いで洗浄し、１０％  ＦＢＳ（完全Ｘ−ＶＩＶＯ）を含むＸ−ＶＩＶＯ  Ｔ細胞培地（Lonza）に再懸濁した。最大５．０×１０９個のＰＢＭＣを、抗ＣＤ１４及び抗ＣＤ２５マイクロビーズ（MiltenyiBiotec）と共に室温で３０分間インキュベートし、製造業者のプロトコルに従ってＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム（MiltenyiBiotec）を用いて磁気的に除去し、これらを枯渇ＰＢＭＣ（ｄＰＢＭＣ）とした。ｄＰＢＭＣをＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５（StemCell  Technologies）で、次の処理まで凍結した。
【００４５】
Ｔ細胞の活性化及び形質導入を、既報（２２）のように実施した。簡潔には、新たに解凍したｄＰＢＭＣを１回洗浄し、１００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２、Novartis  Oncology）及び０．５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）含有完全Ｘ−ＶＩＶで培養した。ＣＡＲレンチウイルス形質導入のため、Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８  ダイナビーズ（登録商標）（LifeTechnologies）、硫酸プロタミン（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、サイトカイン混合物（上記のように）、及びビーズ刺激の翌日の１の多重度又は感染（ＭＯＩ）で所望のレンチウイルスと共に培養した。次いで、細胞を培養し、２〜３日毎にサイトカインを含む新鮮な完全Ｘ−ＶＩＶＯで補充した。７日後、ビーズを磁気的に除去し、細胞を、サイトカインを含む完全Ｘ−ＶＩＶＯ中でさらに増殖させて所望の細胞収率を達成させた。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、製造業者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＣＤ１９  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｉ又はＩＩ（StemCell  Technologies）を用いて、ＣＤ１９ｔ用に積極的に選択した。さらなる拡張後、細胞を、インビトロ機能アッセイ及びインビボ腫瘍モデルの前に、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）  ＣＳ５中で凍結した。ＣＡＲ  Ｔ細胞の純度及び表現型をフローサイトメトリーで検証した。
【００４６】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析のため、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋又は２％ＦＢＳ及び１×ＡＡ含有フェノールレッド（ＨＢＳＳ−／−、LifeTechnologies）非含有Ｈａｎｋ平衡食塩溶液）に再懸濁した。細胞を一次抗体と共に暗所４℃で３０分間インキュベートした。二次染色には、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ５１０（ＢＶ５１０）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はＡＰＣ−Ｃｙ７（又はＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０）結合抗体を用いて、暗所で４℃３０分間インキュベートする前に細胞を２回洗浄した。ＣＤ３（BDBiosciences、クローン：ＳＫ７）、ＣＤ４（BDBiosciences、クローン：ＳＫ３）、ＣＤ８（BDBiosciences、クローン：ＳＫ１）、ＣＤ１４（BDBiosciences、クローン：ＭΦＰ９）、ＣＤ１９（BDBiosciences、クローン：ＳＪ２５Ｃ１）、ＣＤ２５（BDBiosciences、クローン：２Ａ３）、マウスＣＤ４５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン：３０−Ｆ１１）、ＣＤ４５（BDBiosciences、クローン：２Ｄ１）、ＣＤ６９（BDBiosciences、クローン：Ｌ７８）、ＣＤ１３７（BDBiosciences、クローン：４Ｂ４−１）、ＭＵＣ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、クローン１６Ａ）、ＭＵＣ１６（Ａｂｃａｍ、クローンＸ７５又はＥＰＳＩＳＲ２３）、ビオチン化Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌ（GenscriptUSA）（Ｚｈｅｎｇ  Ｚ，  Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  Ｎ，  Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＡＲ）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  （２０１２）  １０：２９）、ＴＡＧ７２（クローン、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヤギ抗マウス免疫グロブリン（BDBiosciences）、及びストレプトアビジン（BDBiosciences）を用いた。細胞生存率は、４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Sigma）を用いて測定した。フローサイトメトリーをMACSQuantAnalyzer10（MiltenyiBiotec）で行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（v10、TreeStar）で分析した。
【００４７】
インビトロ腫瘍殺傷及びＴ細胞機能アッセイ
腫瘍殺傷アッセイのため、ＣＡＲ  Ｔ細胞及び腫瘍標的を、９６穴プレート中の外因性サイトカインの非存在下で、完全Ｘ−ＶＩＶＯ中の示されたエフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比で２４〜７２時間共培養し、上記のようにフローサイトメトリーで分析した。ＣＡＲ  Ｔ細胞による腫瘍殺傷は、標的をＭｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞との共培養で観察されたものと比較してＣＤ４５陰性細胞数を比較して、算出した。Ｔ細胞活性化アッセイのため、ＣＡＲ  Ｔ細胞及び腫瘍標的を、所定の時点のため、９６穴プレート中の外因性サイトカインの非存在下で、完全Ｘ−ＶＩＶＯ中で示されたＥ：Ｔ比で共培養し、そしてＴ細胞活性化の特異的マーカーについてフローサイトメトリーで分析した。凍結培養されていない患者の原発性卵巣がん腹水（ＯＡＳ３、ＯＡＳ４、及びＯＡＳ７）を解凍し、ＴＡＧ７２発現について直接分析し、Ｔ細胞機能アッセイで評価した。簡潔には、シティオブホープ国立医療センター（ＣＯＨ）の外科スタッフから、ＣＯＨ内部審査会（ＩＲＢ）及び検体保護局の承認を得て、滅菌真空容器で腹水を採取した。ＣＯＨ  ＩＲＢは、既報のとおり（２６）、すべての検体は識別されず、腹水材料を廃棄したため、書面によるインフォームドコンセントの必要性を撤回した。
【００４８】
プレート結合抗原でのＴ細胞活性化アッセイのため、精製された可溶性ＴＡＧ７２抗原（BioRad）を、９６穴平坦底高親和性プレート（Corning）中、１×ＰＢＳ中４℃にて指示されたＴＡＧ７２単位で一晩、二重に平板培養した。次いで、合計１０４個のＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、１００μＬの固定容量で各ウェルに添加し、そしてフローサイトメトリーによる活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ１３７）分析用の細胞収集前に、所定の時間インキュベートした。サイトカイン産生の分析用に上清も採取した。
【００４９】
ＥＬＩＳＡサイトカインアッセイ
プレート結合ＴＡＧ７２抗原上の腫瘍殺傷アッセイ又はＣＡＲ  Ｔ細胞活性化アッセイ由来の上清を、所定の時間に収集し、さらなる使用のために−２０℃で凍結した。次に、分泌されたヒトＩＦＮγ及びＩＬ−２について各々、ヒトＩＦＮγ及びＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  Ready-SET-GO!（登録商標）ＥＬＩＳＡキット製造業者のプロトコルに従って上清を分析した。WallacVictor3  1420  Counter(Perkin-Elmer)及びWallac  1420  Workstationソフトウェアを用いて、４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【００５０】
インビボ腫瘍試験
すべての動物実験は、シティオブホープ施設動物ケア・使用委員会が承認したプロトコルに基づいて実施した。インビボ腫瘍研究のため、ＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０細胞（５．０×１０６）を最終容量の５００μｌのＨＢＳＳ−／−で調製し、６〜８週齢の雌ＮＳＧマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により生着させた。腫瘍の増殖は、少なくとも週１回、バイオホトニック画像（Xenogen、LagoX）により追跡し、流束シグナルを生体画像ソフトウェア（Xenogen）で分析した。画像化のために、マウスに、４．２９ｍｇ／マウスのＰＢＳ中に懸濁した１５０μＬのＤ−ルシフェリンカリウム塩（PerkinElmer）を腹腔内注射した。いったん流束シグナルが所望のレベルに達すると、ＯＶ９０については８日目、ＯＶＣＡＲ３については１４日目に、Ｔ細胞を１ＸＰＢＳ中で調製し、マウスに５．０×１０６Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を５００μＬ又は２００μＬ静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。ＯＶ９０腫瘍モデルでは、腹腔内投与による反復処理の効果を試験した。ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を８日目に開始し、その後、腫瘍生着後追加の指示日に投与した場合の影響を検討した。人道的終点を用いて生存期間を決定した。腹水による腹部膨満、努力性又は呼吸困難、明確な体重減少、可動性障害、瀕死状態のエビデンス等の苦痛の徴候が認められた場合、マウスを安楽死させた。所定の時点又は瀕死状態で、マウスを安楽死させ、組織及び／又は腹水を収集し、以下に記載するようにフローサイトメトリー及び免疫組織化学用に処理した。
【００５１】
ヘパリン／ＰＢＳ溶液（１０００ユニット／ｍＬ、Sagent  Pharmaceuticals）を含むポリスチレンチューブにヘパリン処理したキャピラリーチューブ（ChaseScientific）を通して、イソフルラン麻酔マウスから後眼窩出血により末梢血を採取した。各ＲＯ採血量（約１２０μＬ／マウス）を血液１μＬ当たりの細胞定量用に記録した。赤血球（ＲＢＣ）を、製造業者のプロトコルに従って１×赤血球溶解緩衝液（Sigma）で溶解し、次いで、洗浄し、染色し、上記のようにフローサイトメトリーで分析した。安楽死させたマウスから、５ｍＬの冷たい１×ＰＢＳを腹腔内に注入して、腹水由来の細胞を採取し、注射器で吸引し、次の処理まで氷上で保存した。赤血球除去腹水を洗浄し、染色し、上記の抗体及び方法を用いて、腫瘍関連糖タンパク質発現及びＣＡＲ  Ｔ細胞についてフローサイトメトリーで分析した。
【００５２】
免疫組織化学
腫瘍組織を４％パラホルムアルデヒド（４％ＰＦＡ、BostonBioProducts）中で３日間まで固定し、次の処理まで７０％エタノール中で保存した。免疫組織化学はシティオブホープ病理学コアが行った。簡潔には、パラフィン包埋切片（１０μｍ）を、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ、Sigma-Aldrich）、マウス抗ヒトＣＤ３（ＤＡＫＯ）、マウス抗ヒトＴＡＧ７２（ＡＢ１６８３８、Abcam）、ウサギ抗ヒトＭＵＣ１（ＡＢ４５１６７、Abcam）、ＭＵＣ１６（ＡＢ１１０７、Abcam）で染色した。画像は、Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ  ２．０ＨＴデジタルスライドスキャナ及び関連するＮＤＰ．ｖｉｅｗ２ソフトウェア（Hamamatzu）を用いて獲得した。
【００５３】
統計解析
データは、特断の限り、平均値±標準誤差で示す。別段の記載がない限り、対のない両側スチューデントのｔ検定を用いて群間の統計的比較を行い、ｐ値を算出した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ＮＳ（有意ではない）。
【実施例１】
【００５４】
４−１ＢＢ細胞内補助刺激ドメインを有するＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の構築及びＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＴＡＧ７２に対して活性を示すことの検証
４−１ＢＢ細胞内補助刺激ドメインを含むＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞が精製されたＴＡＧ７２に対して効果的に活性化を示すか否かの決定のため、上記細胞を、可溶性ＴＡＧ７２又はプレート結合ＴＡＧ７２のいずれかで漸増量の存在下で増殖させ、活性化の指標であるＣＤ１３７発現を測定した。
【００５５】
結果
既報２２のように、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲレンチウイルスを用いて、ＣＤ１４＋及びＣＤ２５＋細胞（ｄＰＢＭＣ）を除去したヒト健常ドナー由来の末梢血単核細胞を形質導入した。ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、調製工程中（ＣＤ１９ｔ＋選択に基づく）に濃縮され、Ｔ細胞表面に安定に発現した（図１Ｂ）。ＣＡＲ  Ｔ細胞はｅｘ  ｖｉｖｏで増殖し、その動態は類似し、Ｍｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞に対するＣＤ４：ＣＤ８比は同等であった（図１Ｃ）。重要なことに、ＴＡＧ７２に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化の最初の尺度として、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、プレート結合したが非可溶性精製ＴＡＧ７２と共に培養した場合、表面上で用量依存性のＣＤ１３７発現を示した（図１Ｄ）。さらに、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、血小板結合ＴＡＧ７２（非可溶性精製ＴＡＧ７２）と共に培養した場合、他の活性因子指標、特に細胞表面ＣＤ６９発現及びＩＦＮγ放出の用量依存的誘導を示した（図２）。
【実施例２】
【００５６】
ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がインビトロでＴＡＧ７２陽性卵巣がん細胞を選択的に標的とし、その活性化を示すことの検証
ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＴＡＧ７２陽性がん細胞に対して選択的活性を示すか否かの決定のため、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＴＡＧ７２陽性又はＴＡＧ７２陰性卵巣がん細胞の存在下で増殖させ、卵巣がん細胞の死滅率を定量した。
【００５７】
結果
ＴＡＧ７２陽性がん細胞に対するＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の選択的活性（標的細胞の標的化及び細胞死の付与を含む）の評価の第一段階として、ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ８、ＣＯＶ３６２．４、ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０を含むヒト卵巣がん細胞株及びＴＡＧ７２＋結腸がん細胞株ＬＳ１７４ＴにおけるＴＡＧ７２発現を評価し、ＴＡＧ７２陽性がん細胞株を同定した。以前の研究では、卵巣腫瘍患者サンプルの免疫組織化学及びヒト卵巣がん細胞株のウェスタンブロット法により、ＴＡＧ７２の発現が示された（非特許文献１１；Ｐｏｎｎｕｓａｍｙ  ＭＰ，  Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ  Ｇ，Ｓｉｎｇｈ  ＡＰ，  Ｃｈａｕｈａｎ  ＳＣ，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ＳＬ，  Ｊａｉｎ  Ｍ，  Ｓｍｉｔｈ  Ｌ，  Ｄａｖｉｓ  ＪＳ，  Ｒｅｍｍｅｎｇａ  ＳＷ，  Ｂａｔｒａ  ＳＫ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＴＡＧ−７２  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔａｇｅ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔｅｒｓ．２００７；２５１（２）：２４７−５７）。フローサイトメトリーで、ＴＡＧ７２はＯＶＣＡＲ３細胞（約４２％）及びＯＶ９０細胞（約９０％）でより多く発現され、ＣＯＶ３６２．４細胞では非常に低いレベルで検出された（図３Ａ）。ＴＡＧ７２は、ＳＫＯＶ３及びＯＶＣＡＲ８細胞上に存在しなかった。腫瘍細胞の免疫蛍光染色により、ＴＡＧ７２の発現及び細胞表面及び細胞内での細胞局在が確認された。特に、腫瘍動物の腹水から採取したＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０細胞上のＴＡＧ７２の発現は、インビトロ培養細胞と比較して高かった（図４）。
【００５８】
本発明者らのＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗原依存性活性を評価するため、ＴＡＧ７２陽性及び陰性卵巣腫瘍標的との共培養アッセイを、Ｅ：Ｔ比１：１〜１：２で行い、それらの殺傷能を測定した。２４時間後、抗原特異的Ｔ細胞媒介性殺傷活性は、Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞と比較してＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で明らかであった（図３Ｂ）。ＴＡＧ７２発現標的中、平均５９％のＬＳ１７４Ｔ、７９％のＯＶＣＡＲ３、及び６７％のＯＶ９０細胞が殺傷された。７２時間後、同じ腫瘍株の殺傷は各々、７７％、９０％、９７％に増えた。ＴＡＧ７２Ｂζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の、ＴＡＧ７２陰性又は低発現ＳＫＯＶ３、ＯＶＣＡＲ８、及びＣＯＶ３６２．４細胞の殺傷は最小限であった。７２時間後、ＴＡＧ７２陽性腫瘍細胞に対するＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖は２〜３倍であった（図３Ｃ）。同様の腫瘍殺傷は、より低いＥ：Ｔ比１：１０で観察され、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の強力な殺傷能が示された。ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍殺傷能が、腫瘍細胞から放出された可溶性ＴＡＧ７２により受けた影響は最小限であった（図５）。ＣＡＲ  Ｔ細胞からのサイトカイン産生を、Ｔ細胞活性の付加的な尺度として測定した。ＩＦＮγ及びＩＬ−２サイトカイン産生は、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を抗原陽性腫瘍標的であるＯＶＣＡＲ３、ＬＳ１７４Ｔ及びＯＶ９０と共培養した場合にのみ観察された（図３Ｄ及び３Ｅ）。ＩＬ−２産生は初期時点（Ｔ＝２４時間）でピークに達し、その後の時点（Ｔ＝７２時間）ではＯＶＣＡＲ３に対してのみ検出可能であったのに対して、ＩＦＮγレベルは７２時間全体にわたって上昇を示した。
【実施例３】
【００５９】
ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が卵巣がん腹水由来のＴＡＧ７２陽性細胞をインビトロで選択的に標的とすることの検証
さらに、ＴＡＧ７２が卵巣がんＣＡＲ標的であり、本発明者らのＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍活性を確認するため、ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞を３名の患者（ＯＡＳ３、ＯＡＳ４、ＯＡＳ７）のヒト卵巣がん腹水の存在下で増殖させた。
【００６０】
結果
ＯＡＳ３、ＯＡＳ４、及びＯＡＳ７由来の、解凍されたばかりの腹水は、フローサイトメトリーで各々、６２％、８０％、及び６７％のＴＡＧ７２を発現したが、培養７２時間後には各々２％、５３％、及び１９％に低下した（図３Ｆ）。特定の理論に縛られることを望まないが、ＴＡＧ７２発現低下は、ＴＡＧ７２発現の維持に対するｅｘ  ｖｉｖｏ培養条件の影響を反映しうる（Ｈｏｒａｎ  Ｈａｎｄ  Ｐ，  Ｃｏｌｃｈｅｒ  Ｄ，  Ｓａｌｏｍｏｎ  Ｄ，  Ｒｉｄｇｅ  Ｊ，  Ｎｏｇｕｃｈｉ  Ｐ，  Ｓｃｈｌｏｍ  Ｊ．  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐａｔｉａｌ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １９８５；  ４５（２）：８３３−４０）。ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、腹水との共培養７２時間後に細胞溶解活性を示し、ＴＡＧ７２−陰性ＯＡＳ３細胞に対して検出可能な抗腫瘍活性を示さず、ＴＡＧ７２−陽性ＯＡＳ４及びＯＡＳ７細胞の強力かつ選択的なＣＡＲ媒介性殺傷を示した（図３Ｇ）。ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＯＡＳ４に対してＩＦＮγ及びＩＬ−２を産生したが、ＯＡＳ３及びＯＡＳ７細胞に対しては産生しなかった（図３Ｈ）。これらのデータは、ＴＡＧ７２‐ＣＡＲ  Ｔ細胞がインビトロで卵巣がん腹水由来のＴＡＧ７２陽性細胞を選択的に標的化することを示唆する。
【実施例４】
【００６１】
マウスモデルにおいて、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がインビボで卵巣腹水に局所的に送達され、強力な抗腫瘍活性を示し、マウスの生存を延ばすことの検証
ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボにおける治療可能性を評価するため、免疫不全ＮＳＧマウスでＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＴＡＧ７２陽性ＯＶＣＡＲ３腫瘍を選択的に標的とする能力を試験した。このマウスモデルは、後期ヒト疾患で観察される腹膜卵巣腫瘍に類似する。ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により送達した。
【００６２】
結果
ＯＶＣＡＲ３細胞をレンチウイルスで形質導入してｅＧＦＰ／ｆｆｌｕｃを発現させ、非侵襲的光学イメージングを介して腫瘍増殖を追跡させえた。腫瘍腹腔内投与注射の１４日後、マウスをＭｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（５．０×１０６）で全身静脈内（ｉ．ｖ．）又は局所腹腔内投与送達により処理した（図６Ａ）。局所腹腔内投与送達を介してＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスでは、迅速な抗腫瘍効果が観察され、処置の１〜２週間後に最大の抗腫瘍反応に達した（図６Ｂ及び６Ｃ）。局所送達と比較して、ＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞の経静脈投与送達の抗腫瘍応答は限定された。マウスの抗腫瘍反応は３〜４週間持続したが、最終的にはマウスで腫瘍再発が観察された。ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の局所腹腔内投与送達は、マウスの生存を有意に延び、経静脈投与送達により観察された利益は限定されていた（図６Ｄ）。
【００６３】
腹腔内投与療法と経静脈投与療法の間で観察された潜在的な相違に対処するため、マウスの血中及び腹水中のＣＡＲ  Ｔ細胞を定量した。注目すべきことに、腹腔内投与後６日目のマウスの血中にはかなりの数のＣＡＲ  Ｔ細胞（ｈｕＣＤ４５＋ＣＤ１９ｔ＋）が認められ、同じ時点で静脈内投与されたマウスの血中のＣＡＲ  Ｔ細胞は５倍以上も少なかった（図６Ｅ及び図７）。しかし、腹腔内投与したマウスと腹腔内投与したマウスの血中ＣＡＲ  Ｔ細胞数は、投与後１〜２週間で増加し、投与後４週間で有意に減少した。処置したマウスの腹水中のＣＡＲ  Ｔ細胞は、腹腔内処置後６日目に腫瘍部位に維持され、同時点で静脈内処置したマウスでは検出可能なＣＡＲ  Ｔ細胞は検出されなかった。しかし、投与後１３日目に、静脈内投与及び腹腔内投与したマウスでは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のレベルは同程度であった（図６Ｆ）。特定の理論に縛られることを望まないが、当該データは、ＣＡＲ  Ｔ細胞が経静脈投与送達後に最終的に腫瘍に到達するが、腹腔内投与送達と比較して動態が遅延することを示唆しており、これがこの投与経路による観察された治療の欠如の一因でありうる。大部分はＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞である可能性が高いＣＤ４５陰性細胞は、腹腔内投与ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処理マウスでは有意に枯渇したが、腹腔内投与又は経静脈投与したＭｏｃｋＴ細胞又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与したマウスでは枯渇しなかった。当該データは、マウスの腹膜卵巣腫瘍を標的とする効果的な方法として、ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の局所的な腹腔内送達を支持する。
【実施例５】
【００６４】
ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がＯＶ９０腹腔内投与モデルにおいてＴＡＧ７２陽性細胞を選択的に標的とすることの検証及び単回投与と反復投与との効能の比較
ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおける選択的標的ＴＡＧ７２陽性細胞に対するＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の効能を評価するため、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を単回又は複数回反復投与し、経時的に腫瘍サイズを評価した。
【００６５】
結果
特に、ＯＶ９０腹腔内投与モデルは、ＯＶＣＡＲ３と比較して、インビトロでより均一なＴＡＧ７２発現を示す（図３Ａ）。ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおける局所ＣＡＲ  Ｔ細胞送達は、ＯＶＣＡＲ３モデル腹腔内投与と比較してＴＡＧ７２細胞の選択的標的化を示した。対照的に、静脈内投与のＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処理は、ＯＶ９０モデルでは抗腫瘍効果を示さなかった（図８）。このモデルでは、おそらくこのモデルの積極的な性質により、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の腹腔内投与により、全生存期間が約２５日延びただけであった（図８）。この観察結果を踏まえて、単回投与と比較したＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の反復投与の効能が評価され、治療応答が明らかに改善された（図９Ａ）。ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回投与と比較して、１ヵ月にわたる反復投与は、ＯＶ９０モデルにおいてより持続的な抗腫瘍反応を示した（図９Ｂ及び９Ｃ）。相対腫瘍増殖動態としてプロットすると、反復投与は単回投与と比較して腫瘍のより広範な退縮を促進し、腫瘍のより持続的な制御を促進した（図９Ｄ）。
【００６６】
本試験では、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を反復投与したマウス（５５日間の利益）では、単回投与（３０日間の利益）と比較して、全生存期間が有意に延長した（図９Ｅ）。反復投与したマウスの腹膜腫瘍では、Ｔ細胞数が増加した（図９Ｆ）。しかし、重要なことは、ＯＶＣＡＲ３モデルと比較して、ＯＶ９０保有マウスの血中ＣＡＲ  Ｔ細胞数、増殖性及び持続性の低下が観察されたことである（図１０）。これらの結果は、特定の理論に縛られることを望まないが、このより侵攻的な腫瘍モデルは、Ｔ細胞の機能及び全体的なＣＡＲ  Ｔ細胞の効力を妨げる抑制メカニズムも有しうることを示唆する。まとめると、これらのデータは、卵巣がん異種移植モデルにおいてＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の強力な抗腫瘍活性を実証し、また、局所送達されたＣＡＲ  Ｔ細胞の反復投与は、単回投与と比較して、腫瘍をより強く制御しうることも示唆する。
【実施例６】
【００６７】
ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞療法後の腫瘍再発が抗原逃避を示すことの判定
上記実施例でＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が腫瘍再発前に低下することが観察されたことを考慮し、腫瘍におけるＴＡＧ７２の発現を経時的に定量化し、ＴＡＧ７２発現の消失がＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞数の低下と相関するかを判定した。
【００６８】
結果
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法に対する主要な耐性機序の一つは、最終的な抗原喪失又は逃避を促進する固形腫瘍に存在する腫瘍抗原の不均一性である（非特許文献４）。２つのインビボモデル（上記実施例の）におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の消失が腫瘍再発前におこったことを考えると、腫瘍におけるＴＡＧ７２発現の潜在的消失は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の消失と相関する。前者を評価するため、Ｍｏｃｋ及びＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞処理マウス由来の腫瘍におけるＴＡＧ７２の発現を、治療前及び治療後で経時的に測定した。ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、及びＭＵＣ１６は全て卵巣がんの潜在的標的として同定されたので、ＴＡＧ７２陰性ＯＶＣＡＲ８、及びＴＡＧ７２陽性ＯＶＣＡＲ３及びＯＶ９０細胞上の当該細胞表面抗原の発現を定量した。ＯＶＣＡＲ８によるＭＵＣ１の発現はわずかに低レベルであり、ＴＡＧ７２及びＭＵＣ１６では存在しなかったが、ＯＶＣＡＲ３は３種類の抗原すべてを様々なレベルで発現し、ＯＶ９０によるＭＵＣ１の発現は低く、ＭＵＣ１６では発現しなかった（図１１Ａ）。したがって、Ｍｏｃｋ又はＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処理したマウス由来のＯＶＣＡＲ３腫瘍における当該抗原の発現を定量した。Ｔ細胞注入の１２週間後に、Ｍｏｃｋ処理マウス由来の腫瘍は、ＴＡＧ７２（細胞系のフローサイトメトリー分析に類似）、ＭＵＣ１６、及びＭＵＣ１の発現は不均一であった（図１１Ｂ）。しかし、ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処理したマウスからの初期時点での腫瘍再発は、ＭＵＣ１６及びＭＵＣ１の発現を維持しつつ、ＴＡＧ７２発現が劇的に低下した。同様に、ＯＶ９０腫瘍モデルにおけるＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の反復処理によってもまた、治療後の早期再発腫瘍におけるＴＡＧ７２発現が低下した（図１１Ｅ）。特に、ＴＡＧ７２の発現は、後の時点での腫瘍再発、固形腫瘍及び腹水において高レベルで検出された（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。この所見をさらにインビトロで確認するため、ＣＡＲ  Ｔ細胞共培養後の腫瘍細胞におけるＴＡＧ７２の発現を定量化し、ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養の非存在下で増殖した腫瘍細胞と比較して低下していることが見いだされた（図１１Ｅ）。全体として、当該データは、抗原逃避がＴＡＧ７２‐ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞療法後の腫瘍再発に重要な機能を担いうることを示唆する。
【実施例７】
【００６９】
ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞がインビトロでＴＡＧ７２陽性卵巣がん細胞を選択的に標的とし、その活性化を示すことの検証
ヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞もまたＴＡＧ７２陽性がん細胞を効果的に殺傷するかを判定するため、ヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＴＡＧ７２陽性卵巣がん細胞の存在下で増殖させ、死滅した卵巣がん細胞の比率を定量した。
【００７０】
結果
抗ＴＡＧ−７２抗体クローンＣＣ４９のヒト化変異体（ＩＤＥＣ−ＴＡＧ７２−ＢＢｚ、Ｖ１５−ＴＡＧ７２−ＢＢｚ、又はＶ５９／１５−ＴＡＧ７２−ＢＢｚ）から、ＩＤＥＣ、Ｖ１５、又は複合Ｖ５９／Ｖ１５抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）のいずれかを発現する一連の代表的な４−１ＢＢＢ共刺激ＣＡＲ  Ｔ細胞；図１９−２１（カルボキシ末端に存在するＴ２Ａ及びＣＤ１ｔ配列なしで示される）を作製した。当該ＣＡＲはすべて、同じ細胞外ドメイン（ヒンジのアミノ酸１０におけるＰへの変異を伴うＩｇＧ４ヒンジ；配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ及びヒトＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを有するリンカー）、ＣＤ４膜貫通ドメイン、及び４−１ＢＢ細胞内補助刺激シグナル伝達ドメインを利用する。これらのヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＯＶ９０又はＯＶＣＡＲ３卵巣がん細胞のいずれかの存在下で増殖させ、死滅した卵巣がん細胞の比率を定量した。インビトロでは、ＩＤＥＣ及びＶ１５  ＴＡＧ７２−ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＴＡＧ７２を発現する卵巣がん細胞株への曝露後に、同等の強力なＴ細胞媒介性抗原依存性細胞傷害、活性化及びＴ細胞増殖を示す（図１３Ａ−１３Ｃ）。Ｖ５９／１５  ＴＡＧ７２−ＢＢｚ  ＣＡＲは、このアッセイではほとんど活性を示さかったため、次の実験から除した。
【実施例８】
【００７１】
ヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおいてＴＡＧ７２陽性細胞を選択的に標的とすることの検証及びＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回投与と反復投与による効能の比較
ＯＶ９０腹腔内投与モデルにおける選択的標的ＴＡＧ７２陽性細胞に対するヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の効能評価のため、ヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を単回又は複数回反復投与して、経時的に腫瘍サイズを評価した。
【００７２】
結果
ＯＶ９０腫瘍細胞株上のＴＡＧ７２抗原の内因性発現をフローサイトメトリーで測定した。ＯＶ９０−ｆｆｌｕｃ細胞をＮＳＧマウスの腹腔（ｉ．ｐ．）内腔に注入し、生物発光イメージングにより追跡し、流束（写真／秒）として報告した。腫瘍注射後８日目に、腫瘍マウスの腹腔内にＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の５．０×１０６  Ｍｏｃｋ、ＩＤＥＣ、又はＶ１５変異体を局所的に投与した（図１４Ａ）。単一又は反復Ｔ細胞処理マウスの腫瘍量を生物発光イメージングにより定量した。破線はＴ細胞による初回治療と反復治療の時点を示す。興味深いことに、発明者らにより、インビボ卵巣腫瘍モデルを用いた、Ｖ１５−ＴＡＧ７２−ＢＢｚによる局所腹腔内投与により、ＩＤＥＣ−ＴＡＧ７２−ＢＢｚ  ＣＡＲよりも抗原陽性標的（ＯＶ９０移植腫瘍）の腫瘍量が大幅に低下したことが示された（図１４Ａ−１４Ｂ）。この観察結果を踏まえて、単回投与と比較したＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の反復投与の効能を評価したところ、治療応答が明らかに改善された（図１４Ｂ）。ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回投与と比較して、５０日間以上にわたる反復投与により、ＯＶ９０モデルにおける抗腫瘍反応は持続された（図１４Ｂ）。
【実施例９】
【００７３】
ヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、OVCAR3腹腔内投与モデルにおいてＴＡＧ７２陽性細胞を選択的に標的とすることの検証及び単回投与レジメンとして投与したＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性の比較
ＯＶＣＡＲ３腹腔内投与モデルにおける選択的標的ＴＡＧ７２陽性細胞に対するヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の効能を評価するため、ヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を単回投与し、経時的に腫瘍サイズを評価した。
【００７４】
結果
内因性表面ＴＡＧ７２発現を、ＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞上のフローサイトメトリーで分析した。次に、ＯＶＣＡＲ３−ｆｆｌｕｃ腫瘍をＮＳＧマウスの腹腔内に注入し、５．０×１０６Ｍｏｃｋ、ＩＤＥＣ又はＶ１５変異型ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を単回投与して静脈内投与した（図１５Ａ）。単回投与マウスの腫瘍量を生物発光イメージングにより定量化し、流束（写真／秒）として報告した。破線はＴ細胞による治療の時点を示す。興味深いことに、Ｖ１５−ＴＡＧ７２−ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を静脈内投与（ｉ．ｖ．）し、ＩＤＥＣ−ＴＡＧ７２−ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は投与しない場合、ＯＶＣＡＲ３担がんマウスに対する強力な抗腫瘍反応を媒介することができる（図１５Ｂ）。Ｖ１５−ＴＡＧ７２−ＢＢｚ  ＣＡＲのインビボにおけるこの抗腫瘍反応は、ある部分、ＩＤＥＣ−ＴＡＧ７２−ＢＢｚと比較した、増殖増加が介在し、その結果、反応寿命が延びた（図１５Ｃ）。（図１５Ｃ）。
【実施例１０】
【００７５】
ヒト化ＴＡＧ７２−ＢＢζ  ＣＡＲ  Ｔ細胞設計が腫瘍殺傷、Ｔ細胞増殖、活性化、枯渇、及びサイトカイン産生に影響することの判定
ヒト化ＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の設計評価のため、Ｖ１５  ｓｃＦｖを特徴とし、リンカー、膜貫通及び共刺激ドメインを変化させた、一連の代表的なＴＡＧ７２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製した。
【００７６】
結果
Ｖ１５  ｓｃＦｖクローンを有する７つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞変異体は全て、ＣＡＲ発現安定性を示した（図１６Ａ）。インビトロ腫瘍殺傷活性では、ヒト化ＴＡＧ７２ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８−ｓＴｎ）又はＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）卵巣がん細胞のいずれかの存在下で増殖させ、死滅した卵巣がん細胞の比率を定量した。７つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞変異体は全て、ＴＡＧ７２−陽性ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８−ｓＴｎ細胞の強力で選択的なＣＡＲ介在性の殺傷を示し、ＴＡＧ７２−陰性ＤＵ１４５及びＯＶＣＡＲ８細胞に対する検出可能な抗腫瘍活性は示されなかった（図１６Ｂ）。Ｔ細胞の増殖は様々で、ＴＡＧ７２陰性ＤＵ１４５及びＯＶＣＡＲ８細胞よりもＴＡＧ７２陽性ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８−ｓＴｎ細胞の方が高かった（図１６Ｃ）。ＣＤ１３７＋活性化指標は、代表的なヒト化ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞変異体が、ＴＡＧ７２−陰性ＤＵ１４５及びＯＶＣＡＲ８細胞よりも、ＴＡＧ７２−陽性ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８−ｓＴｎ細胞において多様であり、より高いことが示された（図１６Ｄ）。腫瘍細胞を発現するＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）及びＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＯＶＣＡＲ８−ｓＴｎ）に対するＣＡＲ  Ｔ細胞のＰＤ−１＋枯渇標識（７２時間）。
【００７７】
様々なＶ１５−ＣＡＲデザインはまた、ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロサイトカイン産生に影響を及ぼす。腫瘍細胞を発現するＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）及びＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、ＯＶＣＡＲ８−ｓＴｎ）に対するＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロでのＩＦＮγ産生（２４時間）。ＣＤ２８ｔｍ−ＢＢｚ構築物を有するＣＡＲは、ＣＤ４ｔｍ−ＢＢｚ構築物と比較して同様の抗腫瘍活性を示すが、ＣＤ２８ｔｍは、いくつかのＴＡＧ７２陽性腫瘍細胞においてより大きなサイトカイン産生を与える（図１７）。
【００７８】
様々なＶ１５−ＣＡＲ設計はまた、ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロサイトカイン産生に影響を及ぼす。腫瘍細胞を発現するＴＡＧ７２陰性（ＤＵ１４５、ＯＶＣＡＲ８）及びＴＡＧ７２陽性（ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、ＯＶＣＡＲ８−ｓＴｎ）に対するＣＡＲ  Ｔ細胞のインビトロにおけるＩＦＮγ産生（２４時間）である。ＣＤ２８ｔｍ−ＢＢｚ構築物を有するＣＡＲは、ＣＤ４ｔｍ−ＢＢｚ構築物と比較して同様の抗腫瘍活性を示すが、ＣＤ２８ｔｍは、いくつかのＴＡＧ７２陽性腫瘍細胞において、サイトカイン産生が高まる（図１７）。ＯＶ９０細胞及び少数の代表的なヒト化ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞変異体を用いたｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅ法を用いて、リアルタイム細胞毒性アッセイを実施した。４つのＴ細胞集団をエフェクター対標的比１対２０で平板培養し、１０日間観察した。細胞指数は、生腫瘍数を示す。３つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞変異体は全て、この長期殺傷アッセイにおいて強力な抗腫瘍活性を示した（図１８Ａ）。長期殺傷アッセイの終点にて、残存細胞を収集し、フローサイトメトリーで分析した。３つの代表的なヒト化ＴＡＧ７２−ＣＡＲ  Ｔ細胞変異体すべてについてＴ細胞増殖が示された（図１８Ｂ）。
【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
2021532793000001.app
【国際調査報告】
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2021532793.tif 000035
2021532793.tif 000036
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