(57)【要約】本願は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するヒト化および／または脱免疫化抗体、抗体断片または抗体誘導体、および前記抗体、抗体断片または抗体誘導体を前立腺癌および他の腫瘍性疾患ならびに神経疾患の治療に使用するための方法に関する（図１）。
2021532778.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のＣＤＲ  Ｈ１配列、
配列番号２、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１に記載の配列のいずれかから選択されるＣＤＲ  Ｈ２配列、および
配列番号３に記載のＣＤＲ  Ｈ３配列
を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、ならびに
配列番号４、配列番号８および配列番号１０に記載の配列のいずれかから選択されるＣＤＲ  Ｌ１配列、
配列番号５および配列番号１２に記載の配列のいずれかから選択されるＣＤＲ  Ｌ２配列、および
配列番号６に記載のＣＤＲ  Ｌ３配列
を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含むが、
配列番号１に記載のＣＤＲ  Ｈ１配列、配列番号２に記載のＣＤＲ  Ｈ２配列、配列番号３に記載のＣＤＲ  Ｈ３配列、配列番号４に記載のＣＤＲ  Ｌ１配列、配列番号５に記載のＣＤＲ  Ｌ２配列、および配列番号６に記載のＣＤＲ  Ｌ３配列の組合せを含まず、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の細胞外ドメインに結合する、ヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項２】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１９に記載のいずれかの配列から選択される配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％の配列相同性を有するＶＨドメインを含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項３】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１９に記載のいずれかの配列から選択されるＶＨドメイン配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項４】
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択される配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％の配列相同性を有するＶＬドメインを含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項５】
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項６】
配列番号１３に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列、または
配列番号１５に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列、または
配列番号１７に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列、または
配列番号１９に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列を含む、
請求項１に記載のヒト化抗体または抗体断片もしくはその抗体誘導体。
【請求項７】
重鎖が配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号２７のいずれかの配列を含む、請求項３に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項８】
軽鎖が配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８のいずれかの配列を含む、請求項５に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項９】
配列番号２１、２３、２５または２７のいずれかの配列を含む少なくとも１つの重鎖、および配列番号２２、２４、２６または２８のいずれかの配列を含む少なくとも１つの軽鎖を含む、ヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項１０】
配列番号２７を含む少なくとも１つの重鎖、および配列番号２８を含む少なくとも１つの軽鎖を含む、ヒト化抗体またはその抗体断片または抗体誘導体。
【請求項１１】
ＥＣ50＜０．４μｇ／ｍｌの親和性でＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する、前記請求項のいずれかに記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項１２】
抗体がグリコシル化されている、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項１３】
グリカンが、重鎖のアスパラギン２９７におけるＮ−結合オリゴ糖鎖である、請求項１２に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項１４】
前記前立腺特異的膜抗原がヒト前立腺特異的膜抗原である、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体である、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項１６】
抗体がアイソタイプＩｇＧである、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項１７】
抗体断片が可変ドメイン（Ｆｖ）、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ）2断片からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体断片。
【請求項１８】
抗体誘導体が一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のヒト化抗体誘導体。
【請求項１９】
治療薬に、場合によりリンカー部分を介して結合された、前記請求項のいずれかに記載のヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項２０】
少なくとも薬学的に許容される担体とともに、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体を含む、ＰＳＭＡの過剰発現に関連する医学的障害の治療のための医薬製剤。
【請求項２１】
ＰＳＭＡの過剰発現に関連する医学的障害が前立腺癌である、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
前記製剤が、少なくとも静脈内、筋肉内または皮下投与に適している、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
前立腺癌の治療に使用するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体の有効量を患者に投与することを含む、前立腺癌に罹患している患者の治療方法。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のヒト化抗体、その抗体断片もしくは抗体誘導体をコードする核酸。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のヒト化抗体、その抗体断片もしくは抗体誘導体を産生することができる宿主細胞。
【請求項２７】
宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞株である、請求項２７に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するヒト化および／または脱免疫化抗体、抗体断片または抗体誘導体、および前記抗体、抗体断片または抗体誘導体を前立腺癌および他の腫瘍性ならびに神経疾患の治療に使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ‐アセチル‐Ｌ‐アスパルチル‐Ｌ‐グルタミン酸ペプチダーゼＩ  （ＮＡＡＬＡＤａｓｅ  Ｉ）またはＮ‐アセチル‐アスパルチルグルタミン酸（ＮＡＡＧ）ペプチダーゼとしても知られる前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、ヒト葉酸ヒドロラーゼ（ＦＯＬＨ１）遺伝子によってコードされる酵素である。ＰＳＭＡは、異なる生理的役割を果たす膜結合型細胞表面ペプチダーゼであり、前立腺、腎臓、小腸、中枢および末梢神経系などの様々な組織で発現する。悪性前立腺上皮細胞や、膠芽腫、乳癌、膀胱癌を含む多数の固形腫瘍悪性疾患の血管内皮細胞に高発現している。このタンパク質は、統合失調症およびＡＬＳを含む様々な神経疾患にも関与している。
【０００３】
ＰＳＭＡはクラスＩＩの膜貫通糖タンパク質で、Ｎ末端細胞質尾部は１８アミノ酸（ａａ  １−１８）と短く、膜貫通ヘリックスは１本（ａａ  １９−４３）で、細胞外部分はａａ  ４４−７５０からなり、分子量は約８４ｋＤａである（Ｂａｒｉｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００４）。短いＮ末端細胞質尾部は、クラスリン、クラスリンアダプタータンパク質２、フィラミンＡ（ＦＬＮａ）、およびカベオリン‐１などのＰＳＭＡ結合基質の一部のエンドサイトーシスを支配する膜骨格タンパク質と相互作用することが示されている。細胞外部分はさらに３つのドメインに分けられる。プロテアーゼ（ａａ  ５７−１１６とａａ  ３５２−５９０）、頂端部分（ａａ  １１７−３５１）、Ｃ末端あるいは二量体化ドメイン（ａａ  ５９１−７５０）である。これらの部分はまとめて基質／リガンド認識機能を果たしている（Ｂａｒｉｎｋａら、２０１２）（図１）。ａａ配列とドメイン構成に関して、ＰＳＭＡの３三次元細胞外構造はトランスフェリン受容体（Ｔｆｒ）に似ている。ＰＳＭＡは二量体の形成でのみ酵素活性を示す。グリコシル化だけでなく二量体化も正しい立体構造と分子の酵素活性に必須である。
【０００４】
正常ヒト前立腺におけるＰＳＭＡ発現と局在は、前立腺管を取り囲む上皮の細胞質と頂端側と関連している。前立腺組織の異形成性および腫瘍性形質転換は、ＰＳＭＡの頂端膜から管腔表面への移動をもたらす。ＰＳＭＡはもともと前立腺特異的であると考えられていたが、より最近の研究から、小腸上皮（刷子縁）細胞、近位尿細管細胞および唾液腺のほか、神経系でも発現していることが示されている。
【０００５】
小腸では、ＰＳＭＡは近位空腸の刷子縁に位置し、そこでポリ−γ−グルタミン酸葉酸上のヒドロラーゼとして作用し、モノグルタミン酸化葉酸を血流中に能動輸送する（Ｎａｖｒａｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０１４）。したがって、それは少なくともヒトとブタにおいて加水分解とエンドサイトーシスの両方の機能を示す。エンドサイトーシスによる内在化は、受容体を介したエンドサイトーシスによってクラスリン被覆ピットを介して起こる。神経系では、ＮＡＡＧ−ヒドロラーゼとも呼ばれるＰＳＭＡが、哺乳類の脳に広く分布する神経伝達物質であるＮＡＡＧをグルタミン酸とＮ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）に加水分解する触媒作用をもつ。異なる組織におけるＰＳＭＡの異なる役割は、ＰＳＭＡ発現細胞に特異的に薬物や小分子の送達を標的とする様々な治療アプローチの広範な探索のきっかけとなっている（Ｅｖａｎｓら、２０１６年）。
【０００６】
ＰＳＭＡ発現レベルは、正常で健康な組織と比較して、由来の異なる悪性組織で高い（Ｅｖａｎｓら、２０１６；  Ｈａｆｆｎｅｒら、２００９）。この発現様式は、癌の進行と浸潤におけるＰＳＭＡの役割を直接的に意味し、この分子を固形癌の診断と治療のための望ましい標的とする。
【０００７】
いくつかの理由から、ＰＳＭＡは前立腺癌における理想的な標的である。まず、ほとんどすべての前立腺癌細胞で有意に過剰発現している。前立腺癌細胞上の発現のレベルは正常組織の１００〜１０００倍である。ＰＳＭＡはほぼ全ての前立腺癌で発現しており、ＰＥＴでＰＳＭＡ陰性であったのは原発前立腺癌または前立腺癌病変の５〜１０％のみであった（Ｅｉｂｅｒら、２０１７年）。
【０００８】
第２に、進行期、高悪性度転移性疾患、ホルモン不応性前立腺癌および転移性去勢抵抗性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）において、その発現はさらに増加している。
【０００９】
第三に、ＰＳＡ、前立腺酸性フォスファターゼおよび前立腺分泌タンパク質のような他の前立腺関連抗原とは対照的に、ＩＩ型内在性膜細胞表層タンパク質としてのＰＳＭＡは分泌されないため、従って、例えば抗体または他のリガンド媒介療法のための優れた標的である。細胞外ドメインの活性中心に結合した後、ＰＳＭＡリガンドは細胞内に取り込まれる。その後のエンドソームリサイクルにより沈着が増加し、腫瘍の取り込み、貯留、およびその後の治療用途のための高い局所用量が増強される。
【００１０】
一般に、前立腺癌転移は、骨髄およびリンパ節に頻繁に起こり、そこは高レベルの循環抗体を取り込み、リンパ腫や乳がんなどの他の腫瘍型ではモノクローナル抗体療法によく反応してきた位置である（Ｎａｎｕｓら、２００３年）。
【００１１】
前立腺癌において、ＰＳＭＡの発現はアンドロゲンにより負に調節される（イスラエルら、１９９３）。遺伝子転写解析は、アンドロゲンがＰＳＭＡ遺伝子のプロモーターを抑制できることを実証した。したがって、アンドロゲン除去療法の開始は、ＰＳＭＡ発現の早期だが一時的なアップレギュレーション、延長アンドロゲン除去療法下でのダウンレギュレーション、最後にアンドロゲン耐性腫瘍におけるＰＳＭＡの過剰発現を誘導する。これらの効果は、治療法および診断の改善に活用できる可能性がある（Ｅｉｂｅｒら、２０１７年）。前立腺癌転移におけるＰＳＭＡの直接的な役割はまだ完全には解明されていないが、アンドロゲン感受性細胞に対するホルモンアンドロゲン除去療法はＰＳＭＡレベルを増大させることが示されており、ＰＳＭＡの発現の増加により細胞は侵襲性が低くなった。一方、ＰＳＭＡをノックダウンすると、浸潤活性が５倍に増加した。
【００１２】
前立腺癌は、男性で最も多く診断される癌であり、西洋文化では２番目に多い死因である。疾患の進行に伴う有意な死亡率および罹病率のため、新たな標的治療が緊急に必要とされている。現在、前立腺癌の治療について評価されている様々な手法がある。小分子、アプタマーまたは抗体は、化学療法薬の標的送達のためにＰＳＭＡを利用するための特異的リガンドとして使用されている（レビューのためにＥｖａｎｓら、２０１６を参照）。ＰＳＭＡを介する自殺遺伝子療法と同様に、例えばＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡまたはアプタマーに基づくＰＳＭＡを標的とした遺伝子療法アプローチが現在評価段階にある。前立腺癌の限局性疾患患者の約２５％に現在使用されている放射性免疫療法において（Ｃｏｏｐｅｒｂｅｒｇら、２０１０年）、放射性核種にモノクローナル抗体またはアプタマーなどの標的リガンドを追加することにより、ＰＳＭＡのような癌関連細胞表面抗原の標的化、ひいては望ましくない副作用および用量増強の低減が可能となる。ＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞に対するＣＴＬ活性を誘導するための、ＰＳＭＡに対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する初代培養樹状細胞（ＤＣ）またはＴ細胞に基づく免疫療法は、臨床段階にある。
【００１３】
ＰＳＭＡと結合する抗体は、先行技術において記載されている。ＰＳＭＡは、ヒト前立腺腺癌（ＬＮＣａｐ）細胞株（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら、１９８６）から単離された、部分的に精製された細胞膜画分で免疫化されたマウスに由来するマウスモノクローナル抗体７Ｅ１１によって最初に特徴付けられた。この最初に公開されたＰＳＭＡに対するモノクローナル抗体は、ＰＳＭＡの細胞内ドメインのＮ末端（ＭＷＮＬＬＨ）を認識する（Ｔｒｏｙｅｒら、１９９５）。
【００１４】
ＰＳＭＡの細胞外ドメインに対する４つのマウスＩｇＧモノクローナル抗体（Ｊ５９１、Ｊ４１５、Ｊ５３３およびＥ９９）が調製されており、これは、７Ｅ１１とは対照的に、細胞の外側に位置する２つの異なる非競合エピトープを認識する（Ｌｉｕら、１９９７；  Ｎａｎｕｓら、２００３）。
【００１５】
Ｗｏｌｆら（２０１０ａ）は、３種類のマウス抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体３／Ａ１２、３／Ｅ７、および３／Ｆ１１を作製し、ＰＳＭＡ陽性前立腺癌ＬＮＣａＰサブ細胞株Ｃ４−２に強い結合を示し、平均最大半量飽和濃度は９〜１７ｎＭであった（ＥＰ  １８８３６９８  Ｂ２）。この抗体により、試験した全正常および腫瘍性前立腺組織標本の上皮細胞が染色された。競合結合試験で明らかになったように、３種類のモノクローナル抗体は異なる細胞外ＰＳＭＡエピトープに結合している。３／Ａ１２のエピトープは、抗体Ｊ５９１のそれに近いか部分的に重複していることが分かった。
【００１６】
モノクローナル抗体３／Ｆ１１からファージディスプレイ法により単離したＤ７と呼ばれる抗ＰＳＭＡ単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を用いて、シュードモナスエキソトキシンＡのＤ７のｃＤＮＡへのＣ末端連結による免疫毒素の構築を行った。この免疫毒素はＰＳＭＡ陽性前立腺癌増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏで阻害した（Ｗｏｌｆら、２０１０ｂ）。
【００１７】
未精製ＬＮＣａＰ細胞溶解物で免疫したマウスに由来するモノクローナル抗体３／Ａ１２、３／Ｅ７、３／Ｆ１１で得られた結果とは対照的に、同じ研究者らは、精製ＰＳＭＡで免疫したマウスから３種類のモノクローナル抗体Ｋ７、Ｋ１２、およびＤ２０を得た。これらのモノクローナル抗体は、単離した抗原に対してのみ高い反応性を示したが、生存ＬＮＣａＰ細胞とは弱い反応または反応を示さなかった（Ｅｌｓａｓｓｅｒ−Ｂｅｉｌｅら、２００６）。
【００１８】
Ｔｙｋｖａｒｔら（２０１４）により、１３種類のＰＳＭＡ特異的マウスモノクローナル抗体を、天然および変性抗原に対する結合活性の観点から特徴付けた。
【００１９】
ＷＯ２００１００９１９２（Ｍｅｄａｒｅｘ）は、前立腺特異的膜抗原に対するヒトモノクローナル抗体の開発について記載している。ヒト抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体は、マウスを精製ＰＳＭＡまたはＰＳＭＡ抗原の濃縮調製物で免疫することにより作製した。このような精製された抗原は、イオン性界面活性剤による細胞溶解後に免疫吸着により精製されているので、変性ＰＳＭＡである。
【００２０】
ＷＯ１９９７０３５６１６（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、前立腺特異的膜抗原の細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体について記載している。Ｃ末端ペプチドまたはＰＳＭＡ発現腫瘍膜標本を用いて免疫化を行った。得られたモノクローナル抗体はＰＳＭＡ発現細胞に特異的に結合しなかったため、診断または治療目的に用いることはできない。
【００２１】
Ｂａｎｄｅｒら（２００３）は、前立腺特異的膜抗原に対するモノクローナル抗体を開示した。免疫化は精製した抗原で行ったので、モノクローナル抗体は細胞結合に適しておらず、これらのモノクローナル抗体のいずれからもｓｃＦｖは得られなかった。ＷＯ１９９８／０３８７３では、前立腺特異的膜抗原の細胞外ドメインを認識する同じ抗体またはその結合部分を記載しているが、抗体の結合部分が実際に抗原に結合することを示すことはできなかった。
【００２２】
抗体医薬品を開発する際には、免疫原性が極めて重要な関心事となる（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，  ２００８）。治療を目的として使用される全ての外因性タンパク質は、レシピエントにおいて抗薬物抗体生成を引き起こす危険性をもたらし（Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ  ２００２）、非ヒト由来の治療タンパク質および抗体の使用は、通常、抗薬物抗体の生成と関連することが見出されており、しばしば有害な免疫複合体の生成および／または治療薬の中和につながる。抗体の起源や性質に加えて、疾患の種類、投与経路、レシピエントの遺伝的背景など、他の因子が免疫原性に影響することが示されている。
【００２３】
したがって、様々な理由から、先行技術から上述された抗ＰＳＭＡ抗体は、特に、その免疫原性の可能性、標的認識の欠如、または不十分な結合親和性のために、ヒト治療に適していない。
【００２４】
（発明の概要）
先行技術にかんがみて、本発明の１つの目的は、従って、本願に記載されているように、高親和性、特にＰＳＭＡの細胞外ドメインのエピトープで前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するヒト化抗体、抗体断片または抗体誘導体を提供することであった。
【００２５】
本明細書に開示されている抗体、抗体断片またはその抗体誘導体は、特に適切なリガンド親和性を維持する好ましいＶＨおよびＶＬベースの抗原結合領域のヒト化配列を含む。前記ヒト化配列を得るためのアミノ酸配列改変は、ＣＤＲ領域および／または元の抗体のフレームワーク領域、および／または抗体定常領域配列に起こり得る。
【００２６】
本発明のさらなる目的の１つは、天然の細胞表面ＰＳＭＡに特異的に結合し、したがって前立腺癌の標的抗原としてＰＳＭＡに焦点を当てた診断および治療への応用において価値を有する抗体を提供することであった。
【００２７】
本発明のさらなる目的の１つは、前立腺癌または神経障害の治療方法に使用するための化合物を提供することであった。
【００２８】
本発明のさらなる目的の１つは、ＰＳＭＡを発現する前立腺癌細胞を破壊する化合物を提供することであった。
【００２９】
本発明の別の目的は、ヒトにおける免疫原性は低いかまたは免疫原性がない抗体、抗体断片またはその抗体誘導体を提供することであった。好ましくは、この抗体はモノクローナル抗体、抗体断片またはその抗体誘導体である。
【００３０】
本発明の別の目的は、好ましくはアマトキシンを含む、前立腺癌および他の疾患の治療方法に使用するための抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供することであった。
【００３１】
本発明によるヒト化配列、特に標的分子への結合に関与するＶＨおよびＶＬ領域のＣＤＲ配列が、実施例で実証されているように特異的かつ強力な結合を示し、抗体のヒト化後に通常必要とされるいかなる親和性成熟も伴わずに元のマウス抗体３Ｆ１１の結合特徴を保持するか、またはそれを超えさえすることは、全く驚くべきことであった。当業者は、ヒト化バリアントの結合特性が、オリジナルのマウス抗体よりも優れた結合特性は言うまでもなく、類似したものになるとは予想していなかったであろう。可変ドメイン、特にＣＤＲにおける配列変化を考慮すると、本明細書で示されたヒト化配列の有益な結合特徴は驚くべき技術的効果と考えられなければならない。
【００３２】
さらに、本発明によるヒト化配列では、真核生物宿主細胞で発現させた場合、親抗体配列よりも有意に良好な発現収量が得られたことは、完全な驚きであった。したがって、本発明によるヒト化抗体のバイオテクノロジー産生、またはその抗体断片または抗体誘導体は、親抗体配列を用いるよりもかなり安価に行うことができる。
【００３３】
これらおよび他の目的は、独立した請求項に従った方法および手段によって達成される。従属請求項は、具体的な実施形態に関連する。
【００３４】
本発明およびその特徴の一般的な利点を以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ホモ二量体としてのＰＳＭＡ膜貫通タンパク質の模式図（エバンスら、２０１６年から）。
【図２】抗体の模式図。２本の同一の重鎖（Ｈ鎖）と２本の同一の軽鎖（Ｌ鎖）を示すＩｇＧ構造。Ｈ鎖には、３つのＣドメイン（ＣH１〜ＣH３）と１つのＶHの４つのドメインがある。Ｌ鎖は１つのＣLドメインと１つのＶLドメインを持つ。Ｆｖ断片（四角で示す）は抗原と相互作用する分子の部分である。ＶLとＶHの非共有結合対合によって構成される。Ｆｖ断片は、超可変ループの配置を示す抗原から見たところが示されている（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，  ２００８から）。
【図３】抗体３Ｆ１１のヒト化／脱免疫化バリアントの可変重鎖（ＶＨ）領域の配列アラインメント。マウス３Ｆ１１−ｗｔに対するアミノ酸置換は太字である。
【図４】抗体３Ｆ１１のヒト化／脱免疫化バリアントの可変軽鎖（ＶＬ）領域の配列アラインメント。マウス３Ｆ１１−ｗｔに対するアミノ酸置換は太字である。
【図５】還元条件下でヒト化３Ｆ１１抗体バリアント１３−１６の分析のためのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色。ゲル上のウェルあたり１μｇの試料および対照を装填した。
【図６】ヒト化３Ｆ１１抗体バリアントの結合用量−応答曲線。シンボルは、１回の実験について正規化した結合データの複製試料（ヒト化試料でｎ＝２、キメラ３Ｆ１１−ｗｔ抗体でｎ＝８）の平均±ＳＥＭを表す。ＭＦＩ対対数用量変換データは、最大および最小ＭＦＩ値を用いて正規化した。すべての場合においてＲ2≧０．９９である。
【図７】ヒト化３Ｆ１１抗体バリアントに対するＥＣ50結合。シンボルは平均ＥＣ50を表し、バーは９５％信頼区間（ＣＩ）を示す。黒点線は３Ｆ１１−ｗｔ抗体（ｎ＝８）の９５％ＣＩを示し、赤点線は１回の実験の３Ｆ１１−ｖａｒ７（ｎ＝１）の９５％ＣＩを示す。最も高い結合活性（３Ｆ１１−ｖａｒ７）を有するバリアントおよびｗｔ抗体は、塗りつぶされたシンボルで強調される。
【発明の詳細な説明】
【００３６】
本発明を詳細に説明する前に、本発明は説明されたデバイスの特定の構成要素部分に限定されず、あるいはそのようなデバイスおよび方法は変化する可能性があるので、説明された方法のプロセス工程に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別途指示しない限り、単数形および／または複数形の参照を含むことに留意されたい。さらに、数値によって区切られるパラメータ範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの限界値を含むものとみなされることを理解されたい。
【００３７】
さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。一実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連しても開示されることを意味する。１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。当業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、および本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。
【００３８】
さらに、本明細書で参照される先行技術文献の内容は、参照により援用される。これは、特に、標準的または通常方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による援用は、主に、十分な可能な開示を提供し、長時間の繰り返しを回避する目的を有する。
【００３９】
本明細書中で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片またはそれに由来するｃＤＮＡによってコードされる１つ以上のポリペプチド鎖からなるタンパク質を意味する。前記免疫グロブリン遺伝子には、軽鎖カッパ、ラムダおよび重鎖アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミュー定常領域遺伝子ならびに多くの様々な可変領域遺伝子のいずれかが含まれる。
【００４０】
基本的な免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは通常、軽鎖（Ｌ、分子量約２５ｋＤａ）と重鎖（Ｈ、分子量約５０〜７０ｋＤａ）の２本の同一なポリペプチド鎖対からなる四量体である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨまたはＶHと略す）と重鎖定常領域（ＣＨまたはＣHと略す）で構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖には、軽鎖可変領域（ＶＬまたはＶ  Lと略す）と軽鎖定常領域（ＣＬまたはＣ  Lと略す）が含まれている。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに超可変性の領域に細分化することができ、これらはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域の間に挿入された相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。各ＶＨおよびＶＬ領域は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配列する３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されている。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを形成している。
【００４１】
ＣＤＲは、抗体またはその抗原結合部分の結合にとって最も重要である。ＦＲは、抗原の結合に必要な三次元構造が保持されていれば、他の配列に置き換えることができる。構築物の構造変化は、抗原への十分な結合の損失につながることが最も多い。
【００４２】
（モノクローナル）抗体の用語「抗原結合部分」とは、その天然型において前立腺特異的膜抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を意味する。抗体の抗原結合部分の例としては、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、およびＶＨドメインと単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）からなるｄＡｂ断片が挙げられる。
【００４３】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」とは、均質な抗体集団を有する抗体組成物、すなわち、全免疫グロブリンまたはその断片もしくは誘導体からなる均質な集団を意味する。特に好ましい、そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ、またはそれらの断片または誘導体からなる群より選択される。
【００４４】
本明細書中で使用される「断片」という言葉は、標的結合能を保持するこのような抗体の断片、例えば、ＣＤＲ  （相補性決定領域）、超可変領域、可変ドメイン（Ｆｖ）、ＩｇＧ重鎖（ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）、ＩｇＧ軽鎖（ＶＬおよびＣＬ領域からなる）、および／またはＦａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2を指す。
【００４５】
本明細書中で使用される「誘導体」という用語は、構造的には異なるが、依然としていくつかの構造的関連性を有するタンパク質構築物、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2、ならびに二重特異性、三重特異性またはより高い特異性の抗体構築物を指す。これらの項目はすべて以下に説明する。
【００４６】
当業者に知られている他の抗体誘導体は、ダイアボディ、ラクダ抗体、ドメイン抗体、ｓｃＦｖからなる２本の鎖を有する二価ホモ二量体、ＩｇＡ（Ｊ鎖と分泌成分によって結合された２つのＩｇＧ構造）、サメ抗体、新世界霊長類のフレームワークに加えて非新世界霊長類ＣＤＲからなる抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量体構築物、ＣＤＲを含む他の足場タンパク質フォーマット、および抗体コンジュゲート（薬物、毒素、サイトカイン、アプタマー、デソキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸、治療用ポリペプチド、放射性同位元素または標識に連結されている例えば抗体、またはその断片もしくは誘導体）である。前記骨格タンパク質フォーマットは、例えば、アンキリンおよびアフィリンタンパク質などを含み得る。
【００４７】
本明細書中で使用される、用語「Ｆａｂ」は、抗原結合領域を含むＩｇＧ断片に関するものであり、前記断片は、抗体の各々の重鎖および軽鎖からの１つの定常および１つの可変ドメインで構成される。
【００４８】
本明細書中で使用される、「Ｆ（ａｂ）2」という言葉は、ジスルフィド結合によって互いに結合した２つのＦａｂ断片からなるＩｇＧ断片に関する。
【００４９】
本明細書中で使用される「ｓｃＦｖ」という言葉は、一本鎖可変断片が、通常セリン（Ｓ）および／またはグリシン（Ｇ）残基を含む短いリンカーと共に連結された、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合体であることに関する。このキメラ分子は、定常領域を除去し、リンカーペプチドを導入するにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。
【００５０】
改変された抗体フォーマットは、例えば、二重または三重特異性抗体構築物、抗体ベースの融合タンパク質、免疫コンジュゲートなどである。
【００５１】
ＩｇＧ，ｓｃＦｖ，Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2は当業者によく知られた抗体フォーマットである。関連する有効化技術は、それぞれの教科書から入手することができる。
【００５２】
マウス由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗体を誘発する可能性のある別種由来のタンパク質を含むため、望ましくない免疫学的副作用を引き起こす可能性がある。この問題を克服するために、抗体のヒト化および成熟化方法は、非ヒト親抗体の特異性および親和性を理想的には依然として保持しながら、ヒトに適用した場合に最小限の免疫原性を有する抗体分子を生成するように設計されている（レビューはＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ  ２００８を参照のこと）。これらの方法を用いて、例えば、マウスＭＡｂフレームワーク領域を対応するヒトフレームワーク領域に置き換える（いわゆるＣＤＲ移植）。ＷＯ２００９０７８６１は、組換えＤＮＡ技術によって、非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト定常領域に結びつけることによって、マウス抗体のヒト化形態の作製を開示する。Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｏｕｎｃｉｌによるＵＳ６５４８６４０にはＣＤＲ移植技術が記載されており、ＣｅｌｌｔｅｃｈによるＵＳ５８５９２０５にはヒト化抗体の産生が記載されている。
【００５３】
しかしながら、ＣＤＲのコンホメーションを維持するためには、いわゆるＶｅｒｎｉｅｒゾーンの支持フレームワーク残基のセットが重要であるため（Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒｓ  １９９２）、ＣＤＲ移植によるヒト化はしばしば結合親和性の有意な低下またはさらには損失をもたらす。これらの残基は、超可変ループ構造を安定化し、その位置を改変する役割を担い、抗体親和性を微調整する。ヒトフレームワークにマウス残基を再導入する（クイーンら１９８９）ことで、この課題に対処できる。このような置換は一般に「復帰変異（ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」と呼ばれる。
【００５４】
免疫原性とは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に提示されたＨＬＡ  （ヒト白血球抗原）クラスＩＩ分子に結合したペプチドを特異的なＴ細胞レセプターが認識することによって引き起こされるヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞応答を誘導する能力である。ペプチドは抗原提示細胞によって細胞内に取り込まれたタンパク質から産生され、エンドソームによる切断経路を介してプロセシングされる。ＨＬＡクラスＩＩ分子に十分な親和性をもつペプチドのみがＡＰＣの細胞表面に提示され、おそらくＴｈ応答を引き起こす可能性がある。
【００５５】
脱免疫化として知られるプロセスを用いれば、Ｔｈエピトープを除去することによって免疫原性をさらに低下させることができる（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ２００２；  Ｂａｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ  ２００７）。これは、それぞれの治療タンパク質中のどのペプチドがＨＬＡクラスＩＩ分子に結合できるかを予測し、続いてＨＬＡクラスＩＩ分子に対するペプチド結合親和性を排除または低下させる置換を導入することにより達成される。
【００５６】
いくつかのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子があり、ＨＬＡクラスＩＩ分子はアルファ鎖とベータ鎖からなり、それぞれが異なる遺伝子から発現し、変異が増加し（ＤＲＡ／ＤＲＢ、ＤＱＡ／ＤＱＢ、およびＤＰＡ／ＤＰＢ）、ほとんどすべてが高度に多型である；ＤＲＡのみが非多型である。脱免疫化時の焦点は、ＤＱおよびＤＰよりも高いレベルで発現することが知られているＤＲアロタイプにある。個々のエピトープの関連性の評価は、集団におけるアロタイプの重要性（発生頻度）とＨＬＡ‐ペプチド複合体結合強度の定性的評価と同様に、乱交雑の基準、すなわち、特定エピトープが結合するＨＬＡアロタイプの数に基づいている。個々のＴ細胞集団は、抗体のような内因性タンパク質の「自己ペプチド」を認識しないように選択されてきたので、通常はＴｈ応答を誘導すべきではない（既知の）自己ペプチドに対応するペプチドに対して、脱免疫するタンパク質をスクリーニングすることができる。
【００５７】
本明細書中で使用される「ヒト化抗体」という言葉は、抗体、断片またはその誘導体に関するものであり、この用語は、抗体の定常領域および／またはフレームワーク領域の少なくとも一部、および任意にＣＤＲ領域の一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来するか、またはヒト免疫グロブリン配列に調整される。
【００５８】
請求項に記載されている核酸またはアミノ酸配列の配列バリアントであって、クレームされている配列同一性％（相同性）により定義され、本発明に係る抗体、断片または抗体の誘導体の前記特性を維持するものも、本発明の範囲に含まれる。用語「配列同一性」は、配列アラインメントを実施する際の同一ヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージに関連する。
【００５９】
本明細書中で使用される、用語「アミノ酸置換」は、タンパク質のアミノ酸配列の改変に関するものであり、ここで、１つ以上のアミノ酸が同じ数の異なるアミノ酸と置換され、元のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を含むタンパク質が生成される。保存的アミノ酸置換は、類似の大きさ、電荷、極性および／または立体構造による、タンパク質の構造および機能に有意に影響しない置換に関係すると理解される。その意味での保存的アミノ酸の群、例えば、非極性アミノ酸であるＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕ；芳香族アミノ酸であるＰｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ；正電荷を帯びたアミノ酸であるＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ；ならびに負電荷を帯びたアミノ酸であるＡｓｐおよびＧｌｕを表す。
【００６０】
本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の細胞外ドメインに結合するヒト化抗体またはその抗体断片または抗体誘導体に関する。
【００６１】
以下では、好ましいＣＤＲ配列について考察する。ＣＤＲは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の細胞外ドメインにできるように、適当なタンパク質フレームワークで構成されていることを理解することが大切である。
【００６２】
本発明はまた、
−ＧＸ1ＴＸ2ＴＸ3Ｘ4（ＣＤＲ  Ｈ１）[式中、Ｘ1，Ｘ2，Ｘ3およびＸ4は各々Ｙ、Ｆ、Ｗである]、
−ＧＩＳＰＧＤＸ5ＮＸ6ＮＹＸ7Ｘ8Ｘ9ＦＸ10Ｇ（ＣＤＲ  Ｈ２）[式中、Ｘ5はＧ、Ｓであり、Ｘ6はＴ、Ｖであり、Ｘ7はＮ、Ａであり、Ｘ8はＥ、Ｑであり、Ｘ9はＮ、Ｋであり、Ｘ10はＫ、Ｑである]、および
−ＤＧＮＸ11ＰＸ12Ｘ13ＡＭＤＳ（ＣＤＲ  Ｈ３）[式中、Ｘ11，Ｘ12，Ｘ13は各々Ｙ，Ｆ，Ｗである]
のＣＤＲ配列を含むＶＨドメインを含む、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合するヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体を提供する。
【００６３】
本発明はまた、ＶＨドメインがＣＤＲ  Ｈ１配列ＧＹＴＦＴＹＦ（配列番号１）を含む、前記ヒト化抗体、またはその抗体断片または抗体誘導体を提供する。
【００６４】
本発明はさらに、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する、前記ヒト化抗体、またはその抗体断片または抗体誘導体を提供し、ここで、ＶＨドメインはＣＤＲ  Ｈ２配列、配列番号２または配列番号７または配列番号９または配列番号１１を含む。
【００６５】
本発明はさらに、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する、前記ヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関するものであって、ここで、ＶＨドメインはＣＤＲ  Ｈ３配列ＤＧＮＦＰＹＹＡＭＤＳ  （配列番号３）を含む。
【００６６】
好ましい実施態様において、ＰＳＭＡの細胞外ドメインへの結合、抗体、またはその抗体断片または抗体誘導体は、
・配列番号１および
・配列番号２または配列番号７または配列番号９または配列番号１１
・および配列番号３
を含むＶＨドメインを含む。
【００６７】
さらに好ましい実施形態では、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体は、配列番号１３、１５、１７または１９のいずれかを含むＶＨドメインを含む。
【００６８】
本発明はまた、
−ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＸ1ＧＸ2ＴＸ3ＬＨ（ＣＤＲ  Ｌ１）［式中、Ｘ1がＮ、Ｓであり；Ｘ2がＮ、Ｑであり；Ｘ3がＹ、Ｆ、Ｗである］、
−ＴＶＳＮＲＸ4Ｓ（ＣＤＲ  Ｌ２）［式中、Ｘ4がＡ、Ｙ、Ｆ、Ｗである］、および
−ＳＱＳＴＨＶＰＴ（ＣＤＲ  Ｌ３）
のＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含み、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する、ヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【００６９】
好ましい実施態様において、前記抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体は、ＣＤＲ  Ｌ１配列、配列番号４または配列番号８または配列番号１０を含むＶＬドメインを含む。
【００７０】
別の好ましい実施形態では、前記抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体は、ＣＤＲ  Ｌ２配列、配列番号５または配列番号１２を含むＶＬドメインを含む。
【００７１】
さらなる好ましい実施態様において、前記抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体は、
・配列番号４または配列番号８または配列番号１０、および
・配列番号５または配列番号１２、
・および配列番号６
の組合せを含むＶＬドメインを含む。
【００７２】
本発明は特に、配列番号１４、１６、１８または２０のいずれかを含むＶＬドメインを含む抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【００７３】
本発明はまた、上記のＶＨ  ＣＤＲ配列の少なくとも１つと、上記のＶＬ  ＣＤＲ配列の少なくとも１つとの組合せを含む、抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【００７４】
本発明はまた、配列番号１３、１５、１７および１９からなる群から選択されるＶＨドメイン配列の少なくとも１つ、ならびに配列番号１４、１６、１８および２０からなる群から選択されるＶＬドメイン配列の少なくとも１つの組合せを含む、前記抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【００７５】
本発明はまた、ＥＣ50＜０．４μｇ／ｍｌの親和性、好ましくはＥＣ50＜０．３μｇ／ｍｌの親和性、最も好ましくはＥＣ50＜０．４μｇ／ｍｌの親和性で、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する、上記の任意のそのような抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【００７６】
前記ヒト化抗ＰＳＭＡ抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体をグリコシル化することができる。グリカンは、重鎖のアスパラギン２９７のＮ−結合オリゴ糖鎖であり得る。
【００７７】
前記前立腺特異的膜抗原は、哺乳類、非霊長類、霊長類、特にヒト前立腺特異的膜抗原であり得る。
【００７８】
本発明による抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体は、モノクローナル抗体であり得る。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであり得る。
【００７９】
本発明は、可変ドメイン（Ｆｖ）、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ）2断片からなる群より選択される抗体断片に関する。本発明はまた、好ましくは一本鎖Ｆｖ  （ｓｃＦｖ）である抗体誘導体に関する。
【００８０】
好ましい実施態様においては、本出願に記載された、ヒト化抗体、またはｓｃＦｖのようなその断片もしくは誘導体は、天然の細胞表面ＰＳＭＡに特異的に結合するので、例えば前立腺癌の標的抗原としてＰＳＭＡに焦点を当てた診断および治療への応用において価値を有するであろう。ＰＳＭＡは、特異的な三次および四次構造を有する前立腺癌細胞上で発現されるので、特に、この細胞立体構造に対する抗体は、生存可能な前立腺癌細胞およびＰＳＭＡ発現組織を認識し、かつ強く結合することができる。従って、本研究の目的の１つは、前立腺癌の治療的および診断的ターゲティングに用いることができる、そのような抗体、またはその断片もしくは誘導体を生成することであった。
【００８１】
好ましい態様において、本発明はさらに、場合によりリンカー部分を介して治療薬に結合された、上記のようなヒト化抗体、またはその断片もしくは誘導体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ、または免疫コンジュゲートとも呼ばれる）に関する。
【００８２】
前記治療薬は、例えば、薬物、化学療法剤、細胞毒性剤、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、毒素、増殖阻害剤、アプタマー、デソキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のような核酸、治療用ポリペプチド、または放射性物質であり得る。
【００８３】
ＡＤＣは、治療薬と抗ＰＳＭＡ抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体との間のリンカー領域を含み得る。リンカーは、例えば、限定されるわけではないが、切断剤または酸性ｐＨ条件によって切断可能である。
【００８４】
本発明の別の態様では、ヒト化抗ＰＳＭＡ抗体またはその断片もしくは誘導体が提供され、この抗体は医薬製剤中に処方されている。
【００８５】
水性形態では、前記医薬製剤は、投与準備済でもよく、一方、凍結乾燥形態では、前記製剤は、例えば、限定されないが、例えば、ベンジルアルコール、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、レチニルパルミテート、およびセレンのような抗酸化剤、アミノ酸システインおよびメチオニン、クエン酸およびクエン酸ナトリウム、パラベン類メチルパラベンおよびプロピルパラベンのような合成防腐剤を含んでもよく、または含まなくてもよい注射用水を加えることによって、液状形態に移すことができる。
【００８６】
前記医薬製剤は、さらに、例えばアミノ酸、糖ポリオール、二糖類および／または多糖類であり得る１つ以上の安定剤を含み得る。前記医薬製剤は、１つ以上の界面活性剤、１つ以上の等張化剤、および／または１つ以上の金属イオンキレート剤、および／または１つ以上の防腐剤をさらに含むことができる。
【００８７】
本明細書に記載される医薬製剤は、少なくとも静脈内、筋肉内または皮下投与に適している。あるいは、本発明による抗体は、一定期間にわたる生物学的に活性な薬剤の持続的放出を可能にするデポ剤で提供されてもよい。
【００８８】
本発明のさらに別の態様では、充填済み注射器もしくはペン、バイアル、または注入バッグのような一次包装が提供され、これは、本発明の以前の態様による前記製剤および／または前記ヒト化抗ＰＳＭＡ抗体、またはその断片または誘導体を含む。
【００８９】
充填済み注射器またはペンは、凍結乾燥形態（次いで、投与前に、例えば注射用水で溶解されなければならない）、または水性形態のいずれかで製剤を含有していてもよい。前記注射器またはペンは、単回使用のみのディスポーザブルの物品であることが多く、容量が０．１〜２０ｍｌの場合がある。しかしながら、注射器またはペンは、多回使用または多回投与注射器またはペンでもよい。
【００９０】
前記バイアルはまた、凍結乾燥形態または水性形態の製剤を含有していてもよく、単回または複数回の使用装置として役立つことがある。複数回使用装置として、前記バイアルはより大きな容量を有することができる。前記輸液バッグは、通常、水性形態の製剤を含み、２０〜５０００ｍｌの容量を有し得る。
【００９１】
前記医薬製剤は、ＰＳＭＡの過剰発現に関連する医学的障害の治療を目的とし、少なくとも薬学的に許容される担体とともに、本明細書に記載されるヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体を含む。
【００９２】
ＰＳＭＡの過剰発現に関連する前記医学的障害は、例えば、前立腺癌または神経疾患であり得る。ヒト化抗ＰＳＭＡ抗体またはその断片もしくは誘導体は、体液性もしくは細胞性免疫機能を活性化することにより、または上述のように結合されたサイトトキシンもしくは放射能で腫瘍を標的とすることにより、抗腫瘍作用を媒介することができる。
【００９３】
本発明は、前立腺癌の治療に使用するために本明細書に記載される抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【００９４】
本発明はまた、本明細書に記載されるように、抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体の有効量を投与することを含む、前立腺癌に罹患している患者を治療する方法に関する。
【００９５】
本発明の別の態様は、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体を含む腫瘍細胞の検出のための診断キットに関し、これにより、適切な検出試薬およびデバイスと結合した後に、その検出が可能になる。また、本発明は、同定される腫瘍細胞を単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体と接触させる腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ同定のための方法を提供し、これは適切な分析装置によって検出できる標識を担持する。この標識は、例えば、手術または生検後に得られたヒト組織の切片において、腫瘍細胞の診断的同定を可能にする。
【００９６】
本発明はまた、前記ヒト化抗ＰＳＭＡ抗体、またはその断片もしくは誘導体を産生することができる宿主細胞、および本発明の前記抗体のコード配列を含む組換えプラスミドをトランスフェクトした細胞株に関する。
【００９７】
本発明の別の好ましい実施形態によると、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。本発明のさらに別の好ましい実施態様によれば、前記宿主細胞は、例えばベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ２１）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＳＰ２／０またはＮＳ０）、ヒト胚性腎細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３）、ヒト網膜由来細胞（例えば、ＰＥＲ−Ｃ６）、および羊膜細胞（例えば、ＣＡＰ）を含む群から選択される少なくとも１つである。
【００９８】
１つの実施形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞株（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＸＢ、またはＣＨＯ−ｄｈｆｒ-）である。
【００９９】
本発明はまた、本出願に記載されるようなＰＳＭＡに結合する、ヒト化抗体、その抗体断片または抗体誘導体をコードする核酸に関する。
【０１００】
１つの実施形態において、本発明は、
配列番号１に記載のＣＤＲ  Ｈ１配列、
配列番号２、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１に記載の配列のいずれかから選択されるＣＤＲ  Ｈ２配列、および
配列番号３に記載のＣＤＲ  Ｈ３配列
を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、ならびに
配列番号４、配列番号８および配列番号１０に記載の配列のいずれかから選択されるＣＤＲ  Ｌ１配列、
配列番号５および配列番号１２に記載の配列のいずれかから選択されるＣＤＲ  Ｌ２配列、および
配列番号６に記載のＣＤＲ  Ｌ３配列
を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含むが、
配列番号１に記載のＣＤＲ  Ｈ１配列、配列番号２に記載のＣＤＲ  Ｈ２配列、配列番号３に記載のＣＤＲ  Ｈ３配列、配列番号４に記載のＣＤＲ  Ｌ１配列、配列番号５に記載のＣＤＲ  Ｌ２配列、および配列番号６に記載のＣＤＲ  Ｌ３配列の組合せを含まず、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の細胞外ドメインに結合する、
ヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１０１】
疑義を避けるために、前記ＣＤＲの考えられる２４の組合せ（すなわち、１つのＣＤＲ  Ｈ１、１つのＣＤＲ  Ｈ２、１つのＣＤＲ  Ｈ３、１つのＣＤＲ  Ｌ１、１つのＣＤＲ  Ｌ２、および１つのＣＤＲ  Ｌ３の組合せ）はすべて、本明細書において個別に開示されるものとみなされる。
【０１０２】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１９のいずれかの配列から選択される配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％の配列相同性を有するＶＨドメインを含む、ヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１０３】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１９のいずれかの配列から選択されるＶＨドメイン配列を含む、ヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１０４】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０のいずれかの配列から選択される配列に対して少なくとも９０％、好ましくは９５％の配列相同性を有するＶＬドメインを含む、ヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１０５】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列を含む、ヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１０６】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１３に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列、または配列番号１５に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列、または配列番号１７に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列、または配列番号１９に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列を含む、ヒト化抗体または抗体断片もしくはその抗体誘導体に関する。
【０１０７】
１つの実施形態において、本発明は、ヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関するものであり、ここで、重鎖が配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号２７のいずれかの配列を含む。
【０１０８】
一実施形態では、本発明は、軽鎖が配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、または配列番号２８の配列のいずれかを含む、ヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１０９】
一実施形態では、本発明は、配列番号２１、２３、２５または２７のいずれかの配列を含む少なくとも１つの重鎖、および配列番号２２、２４、２６または２８のいずれかの配列を含む少なくとも１つの軽鎖を含む、ヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１１０】
好ましい態様において、本発明は、配列番号２７を含む少なくとも１つの重鎖、および配列番号２８を含む少なくとも１つの軽鎖を含む、ヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１１１】
１つの実施形態において、本発明は、ＥＣ50＜０．４μｇ／ｍｌの親和性でＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する、本発明のヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１１２】
１つの実施形態において、本発明は、抗体がグリコシル化されている、本発明のヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。前記グリコシル化は、重鎖のアスパラギン２９７のＮ−結合オリゴ糖鎖であるグリカンに関連し得る。
【０１１３】
１つの実施形態において、本発明は、ヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関するものであり、ここで、前記前立腺特異的膜抗原はヒト前立腺特異的膜抗原である。
【０１１４】
本発明のヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体は、モノクローナル抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体であり得る。前記モノクローナル抗体は、好ましくはアイソタイプＩｇＧであり得る。
【０１１５】
本発明のヒト化抗体断片は、可変ドメイン（Ｆｖ）、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ）2断片からなる群から選択することができる。
【０１１６】
本発明のヒト化抗体誘導体は、一本鎖Ｆｖ  （ｓｃＦｖ）であることができる。
【０１１７】
一実施形態では、本発明は、ヒト化抗体、またはその断片もしくは誘導体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関し、本発明は、場合によりリンカー部分を介して、治療薬に結合体化される。
【０１１８】
１つの実施形態において、本発明は、少なくとも薬学的に許容される担体と一緒に、本発明のヒト化抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体を含む、ＰＳＭＡの過剰発現に関連する医学的障害の治療のための医薬製剤に関する。ＰＳＭＡの過剰発現に関連する前記医学的障害は前立腺癌であり得る。本発明の前記医薬製剤は、少なくとも静脈内、筋肉内または皮下投与に適した製剤であり得る。
【０１１９】
１つの実施形態において、本発明は、前立腺癌の治療に使用する本発明のヒト化抗体、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体に関する。
【０１２０】
１つの実施形態において、本発明のヒト化抗体の有効量、またはその抗体断片もしくは抗体誘導体を患者に投与することを含む、前立腺癌に罹患している患者を治療する方法に関する。
【０１２１】
一実施形態では、本発明は、本発明のヒト化抗体その抗体断片もしくは抗体誘導体をコードする核酸に関する。
【０１２２】
１つの実施形態において、本発明は、本発明のヒト化抗体、その抗体断片もしくは抗体誘導体を産生することができる宿主細胞に関する。本発明の前記宿主細胞は哺乳動物細胞であり得る。本発明の前記哺乳動物細胞は、好ましくはＣＨＯ細胞株である。
【０１２３】
本発明の抗体または断片もしくは誘導体は、本発明の抗体のコード配列を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションすることによって産生することができる。発現ベクターまたは組換えプラスミドは、コード化抗体配列を、例えばＣＭＶプロモーターのようなプロモータおよびエンハンサ配列を含む適切な調節性遺伝要素の制御下に置くことによって生産される。重鎖配列および軽鎖配列は、同時トランスフェクトされる個々の発現ベクター、または二重発現ベクターから発現され得る。前記トランスフェクションは、一過性のトランスフェクションまたは安定なトランスフェクションであり得る。トランスフェクトされた細胞は、続いて、トランスフェクトされた抗体構築物を産生するために培養される。安定なトランスフェクションを実施する場合、次に、適切に関連する重鎖および軽鎖を有する抗体を分泌する安定なクローンを、例えば、ＥＬＩＳＡ、サブクローン化、および将来の産生のために増殖するような適切なアッセイによるスクリーニングによって選択する。
【実施例】
【０１２４】
本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、および添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素またはステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組み合わせを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。
【０１２５】
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５’−＞３’で示される。
【０１２６】
実施例１：マウス抗体３Ｆ１１のヒト化と脱免疫化
マウス抗ＰＳＭＡ抗体３／Ｆ１１（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０ａ；  ＥＰ  １８８３６９８  Ｂ２）は、ヒト生殖細胞系のセットから選択されたアクセプターフレームワークへの相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植によりヒト化に供された。
【０１２７】
８５のＨＬＡクラスＩＩアロタイプに対する親３／Ｆ１１のＥｐｉｂａｓｅ（登録商標）イムノプロファイリングを行い、ＨＬＡ−ＤＲＢ１アロタイプに焦点を当てて、ＨＬＡアロタイプへの結合を除去または減少させると考えられる置換のためのエピトープまたは隣接エピトープのクラスターを分析した。ＶＨ／ＶＬ鎖間界面を構成するか、またはＣＤＲのカノニカル構造の別個のセットに関与する重要な位置が同定された。ヒト生殖系列配列に対する親抗体配列の配列アラインメントに基づき、最も近いマッチング、アクセプターとしての最適なヒト生殖系列配列が同定され、フレームワーク全体にわたる特に配列同一性、同一または適合する鎖間界面残基、親ＣＤＲカノニカルコンホメーションを有する支持ループ、および発現された抗体中に見出される重および軽鎖生殖系列の組合せを配慮して同定された。３／Ｆ１１は、それぞれ、ＶＫ２軽鎖生殖系列ファミリーＶＫ２およびヒト重鎖生殖系列ファミリーＶＨ１のヒト軽鎖生殖系列ＶＫ２−Ａ１７および重鎖生殖系列ＶＨ１−１−６９に最も適合性があることがわかった。ＣＤＲ移植については、選択されたアクセプターとは異なる親フレームワークのアミノ酸が対応するヒトアミノ酸と置換された。
【０１２８】
治療製品の開発中に問題を引き起こす可能性のある潜在的な翻訳後修飾部位（アスパラギン脱アミド化、アスパラギン酸異性化、Ｃ末端リジンクリッピング、遊離Ｃｙｓチオール基、Ｎ−およびＯ−グリコシル化、Ｎ末端環化、酸化およびピログルタミン酸形成）について配列を分析した。３／Ｆ１１とバリアントのＦV‐領域の構造モデルを、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリングプラットフォームを用いて生成し、完全ＦVだけでなくフレームワークとＣＤＲのための候補構造断片をスコア化し、ランク付けした。
【０１２９】
効果的な方法で考えられる全ての置換の影響を評価するために、適切な場合には置換をグループ分けし、計４匹のヒト化／非免疫化軽鎖と４匹のヒト化／非免疫化重鎖を選択した。表２に遺伝子工学的に改変されたアミノ酸鎖の名称を、修飾の説明とともに列挙する。遺伝子工学的に改変された鎖のアミノ酸配列を表１に示す。ヒト化／非免疫化軽鎖および重鎖のそれぞれの配列アラインメントを、図３および４に示す。
【０１３０】
重鎖可変ドメインバリアント３Ｆ１１−ＶＨ−１は、親マウスＶＨ配列の３つのＣＤＲすべてを含む。バリアント３Ｆ１１−ＶＨ−２では、２つのＣＤＲは親マウスＶＨ配列と同一であるが、ＣＤＲ  Ｈ２は親マウス配列と４つの位置が異なる（ａａ  ６１−６３：  ＮＥＮ  ＞  ＡＱＫ、ａａ  ６５：  Ｋ  ＞  Ｑ）。バリアント３Ｆ１１−ＶＨ−３では、やはり２つのＣＤＲが親マウスＶＨ配列と同一であるが、ＣＤＲ  Ｈ２は親マウス配列とは５つの位置が異なる（ａａ  ５８：  Ｔ  ＞  Ｖ、ａａ  ６１−６３：  ＮＥＮ  ＞  ＡＱＫ、ａａ  ６５：Ｋ  ＞  Ｑ）。バリアント３Ｆ１１−ＶＨ−４では、ここでも２つのＣＤＲが親マウスＶＨ配列と同一であるが、ＣＤＲ  Ｈ２は親マウス配列とは６つの位置が異なる（ａａ  ５６：  Ｇ  ＞  Ｓ、ａａ  ５８：  Ｔ  ＞  Ｖ、ａａ  ６１−６３：  ＮＥＮ  ＞  ＡＱＫ、ａａ  ６５：  Ｋ  ＞  Ｑ）。
【０１３１】
軽鎖可変ドメインバリアント３Ｆ１１−ＶＬ−１は、親マウスＶＬ配列の３つすべてのＣＤＲを含む。バリアント３Ｆ１１−ＶＬ−２において、２つのＣＤＲは親マウスＶＬ配列と同一であるが、ＣＤＲ  Ｌ１はアミノ酸番号３５（Ｎ  ＞  Ｑ）における置換を含む。バリアント３Ｆ１１−ＶＬ−３では、２つのＣＤＲは親マウスＶＬ配列と同一であるが、ＣＤＲ  Ｌ１は親マウス配列と２つの位置が異なる（ａａ  ３３：  Ｎ  ＞  Ｓ、ａａ  ３５：  Ｎ  ＞  Ｑ）。バリアント３Ｆ１１−ＶＬ−４では、ＣＤＲ  Ｌ１は親マウス配列と２つの位置（ａａ  ３３：  Ｎ  ＞  Ｓ、ａａ  ３５：  Ｎ  ＞  Ｑ）が異なり、ＣＤＲ  Ｌ２は１つの位置（ａａ  ６０：  Ｆ  ＞  Ａ）が異なり、ＣＤＲ  Ｌ３は親マウス配列と同一である。
【０１３２】
（表２）
2021532778.tif 000003
【０１３３】
３Ｆ１１−ＶＬ−２は任意に次の変異を有する：  ａａ  ４１：  Ｆ＞Ｙ。３Ｆ１１−ＶＬ−３は任意に次の変異を有する：  ａａ  ４１：  Ｆ＞Ｙ。３Ｆ１１−ＶＬ−４は任意に以下の変異を有する：  ａａ  ４１：  Ｆ＞Ｙ；  ａａ  ４２：  Ｌ＞Ｑ、および／またはａａ  ９０：  Ｖ＞Ｔ。
【０１３４】
置換組合せの影響を評価するために、表３に概要を示したようにバリアント組合せの実験デザインを設定した。４つのヒト化／脱免疫化重鎖および４つのヒト化／脱免疫化軽鎖の組合せにより、１６の異なるヒト化／脱免疫化全長抗体が誘導され、これらは表３に示すように命名された。
【０１３５】
表３：３Ｆ１１ヒト化／脱免疫化バリアントＶＨおよびＶＬ鎖の組み合わせは、それぞれ、ヒト化バリアントドメインおよび全長抗体の１６の異なるバリアントを形成する。３Ｆ１１  ｗｔは、マウスのＶＨおよびＶＬ鎖で構成されている。
（表３）
2021532778.tif 000004
【０１３６】
親およびヒト化／脱免疫化配列に対するＨＬＡ  ＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱおよびＤＰの予測される重要なエピトープを表４に示す。表４の親抗体とバリアント抗体の相違は、それぞれの潜在的エピトープの除去を考慮するものである。
【０１３７】
表４：親およびヒト化／脱免疫化配列のＨＬＡ  ＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱおよびＤＰの予測される重要なエピトープ数
（表４）
2021532778.tif 000005
【０１３８】
実施例２：ヒト化抗ＰＳＭＡ抗体バリアントの発現と精製
抗体の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを合成し、ＧＳ  Ｘｃｅｅｄ（登録商標）ベクター（ロンザ）にサブクローニングした。軽鎖可変ドメインコード領域をｐＸＣ−Ｋａｐｐａに、重鎖可変ドメインコード領域をコード化する領域をｐＸＣ−ＩｇＧ１ｚａｄｅｌｔａＫベクターにそれぞれ移入した。
【０１３９】
単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）を、２００ｍｌスケールで参照マウス抗体と一緒にチャイニーズハムスター卵巣ＧＳノックアウト細胞（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ‐ＫＯ）に一時的に同時トランスフェクトした。一過性のトランスフェクションを、最低２週間培養したＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ‐ＫＯ細胞を用いてエレクトロポレーション（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅ  ＸＣｅｌｌ，  ＢｉｏＲａｄ）により行った。細胞はトランスフェクションの２４時間前に継代培養され、細胞生存率はトランスフェクション時に＞９９％であった。トランスフェクション後６日目に、細胞生存率および生存細胞濃度を採取時に測定した。細胞は４．４〜７．５×１０6  生存細胞／ｍｌであり、生存率は８９．０〜９６．１％であった。
【０１４０】
清澄化した上清は、ＡＫＴＡ精製器上にあらかじめ充填した５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲＥカラムを用いて、標準法により、タンパク質Ａクロマトグラフィーにより精製した。１０ｍＭのギ酸ナトリウム、ｐＨ  ３．５で溶出すると、２ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて、速やかにタンパク質を含む画分のｐＨを調整し、１ｘ  ＰＢＳ、５ｍＭギ酸ナトリウム、ｐＨ  ７．４の最終緩衝条件を得た。以下の表５は、３Ｆ１１親マウス抗体および種々のヒト化抗体バリアントについての力価および生成物収率を示す。
【０１４１】
驚くべき影響として、本発明者らは、親マウス３Ｆ１１抗体と比較して、いくつかのヒト化抗ＰＳＭＡ抗体バリアントについて有意に高い発現力価を観察した（表ＡＡ参照）。ヒト化バリアント３Ｆ１１＿ｖａｒ２、３Ｆ１１＿ｖａｒ６、３Ｆ１１＿ｖａｒ９、３Ｆ１１＿ｖａｒ１１、３Ｆ１１＿ｖａｒ１３、３Ｆ１１＿ｖａｒ１５および３Ｆ１１＿ｖａｒ１６を用いて、親マウス３Ｆ１１抗体の３．８８ｍｇ／ｌｉｔｅｒと比較して、９．５〜１３ｍｇ／ｌｉｔｅｒの発現力価が得られた。発現力価が３〜４倍に上昇するため、ヒト化／非免疫化バリアントベースの治療薬の生産コストはかなり削減されることが期待できる。
【０１４２】
表５：ヒト化３Ｆ１１抗体バリアントの特性評価の結果
（表５）
2021532778.tif 000006
【０１４３】
実施例３：ヒト化抗ＰＳＭＡ抗体バリアントの生化学的特性
Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０（９．４ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ２５ｃｍ）カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズシステム上で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびサイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣにより、精製サンプルを分析した。
【０１４４】
ＳＤＳ−ＰＡＡゲルでは、非還元条件下で、対照抗体（ＩｇＧ1）および親３Ｆ１１に匹敵するすべてのバリアントについて＞９８ｋＤａのシグナルが認められ、全長抗体と一致していた。還元条件下では、対照抗体および親３Ｆ１１に匹敵するすべてのバリアントについて、それぞれ約２８ｋＤａのシグナルおよび約４９ｋＤａの１つのシグナルが認められ、これは抗体軽鎖および重鎖のサイズと一致している。代表的な結果を図５に示す。
【０１４５】
ＳＥ−ＨＰＬＣにおけるヒト化３Ｆ１１バリアントモノマー抗体（７．９６−８．００分）の保持時間は、３Ｆ１１マウス親抗体（７．９６８分）と同等であった。全試料のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラフは、より低い保持時間（約７．２分）でさらなるマイナーなピークを示し、その面積は可溶性凝集体などのより高い分子量の不純物に相当する５．４％までであった。
【０１４６】
実施例４：ヒト化抗ＰＳＭＡ抗体バリアントを用いた細胞結合試験
すべてのヒト化３Ｆ１１抗体バリアントの質および結合活性を、９６−ウェルプレートに基づくアッセイフォーマットおよび細胞に基づくＦＡＣＳ分析において、ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣＡＰ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，  ＤＳＭＺ  ｎｏ．  ＡＣＣ  ２５６）を用いた細胞結合アッセイにおいて評価した。８０〜９０％コンフルエンスでの前コンフルエンスＬＮＣＡＰ細胞を洗浄し、３７℃、５％  ＣＯ2で１時間インキュベートする前にトリプシンで平板から剥離し、細胞表面タンパク質を回復させた。細胞を洗浄し、染色培地（ＲＰＭＩ‐１６４０、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３％  ｈ．ｉ．  ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウム）で１ｘ１０6細胞／ｍｌに調整した。５０〜０．００３２μｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度のモノクローナル抗体試料（マウスｗｔおよび１６ヒト化バリアント）を染色培地で調製し、氷上であらかじめ冷却した９６‐ウェルプレート中で細胞とともに３０分間インキュベートし、ＬＮＣＡＰ細胞表面への抗体結合を可能にした。その後、細胞をＰＢＳで４℃で洗浄して遊離抗体を除去し、結合抗体をＦＩＴＣヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ血清吸着処理済（Ａｂｃａｍ）二次抗体で３０分間氷上で標識した。最後に、細胞を洗浄し、固定し、細胞に結合した抗体に結合したＦＩＴＣ蛍光をフローサイトメトリー（ＧＵＡＶＡ  ８ＨＴサイトメーター）により測定した。Ｉｎｃｙｔｅ  ＧｕａｖａＳｏｆｔ  ２．７ソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてデータを分析した。得られた用量−応答データ（対数変換した用量対応答としてプロット）は、典型的に、可変勾配を有するシグモイド曲線を生じ、これはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて４パラメータロジスティック用量−応答方程式に適合した。最大標的細胞結合の半分を提供する抗体の濃度として定義されるＥＣ50投与量を用いて、様々な抗体バリアントの生物活性を比較した。データポイントは、重複ウェルの平均値と平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。親３Ｆ１１  ｗｔ抗体と１６のヒト化バリアントの結合曲線を図６に示す。
【０１４７】
全く驚くべきことに、細胞ベースの結合アッセイは、１６の３Ｆ１１ヒト化バリアントの全てが、親マウス抗体３Ｆ１１で得られたよりも高い親和性でＰＳＭＡ発現細胞に結合することを明らかにした。ヒト化バリアントの結合活性（ＥＣ50）は０．１７８４〜０．３７３２μｇ／ｍｌの範囲であり、ほとんどの場合、親抗体３Ｆ１１（ＥＣ50＝０．４１８９μｇ／ｍｌ）よりも有意に高かった（９５％信頼区間、ＣＩに基づく）。３Ｆ１１‐ｖａｒ７は最も高い結合活性（ＥＣ50＝０．１７８４μｇ／ｍｌ）を示し、次に３Ｆ１１‐ｖａｒ８と３Ｆ１１‐ｖａｒ６（ＥＣ50＝０．２０４０μｇ／ｍｌとＥＣ50＝０．２１８７μｇ／ｍｌ、表６参照）が密接に続いた。１回の実験から得られた結果を図７に示す。
【０１４８】
表６：ヒト化３Ｆ１１抗体バリアントのＥＣ50結合活性と９５％ＣＩ
（表６）
2021532778.tif 000007
【０１４９】
これらの知見は、ほとんどのヒト化バリアント（重鎖バリアント３Ｆ１１＿ＶＨ＿１を含まないすべてのバリアント）がＣＤＲ間に及ぶフレームワーク領域に復帰変異（ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎ）を必要とせず、とくに、親和性の有意な減少または損失のために抗体のヒト化後に通常必要とされることが知られている親和性成熟を経たバリアントはなかった。驚いたことに、本発明のヒト化バリアントの作製手順およびバリアントでは、このような追加の努力は必要ないことがわかった。
【０１５０】
実施例５：抗ＰＳＭＡ  ｓｃＦｖ構築物による細胞結合研究
３Ｆ１１−ＶＨ−１および３Ｆ１１−ＶＬ−１鎖（３Ｆ１１−ｖａｒ１）、ならびに３Ｆ１１−ＶＨ−４および３Ｆ１１−ＶＬ−４鎖（３Ｆ１１−ｖａｒ１６）の組合せも一本鎖Ｆｖ  （ｓｃＦｖ）構築物の作製に用いた。両方の構築物について、それぞれの可変ドメイン配列を、ＶＬ−ＶＨ組成物において発現ベクターｐＨＯＧ２１へクローン化し、細菌細胞において発現させた。親和性精製後、両ｓｃＦｖ構築物のＬＮＣＡＰサブ細胞株Ｃ４−２のＰＳＭＡ発現細胞への結合およびＰＳＭＡ陰性ＤＵ１４５前立腺癌細胞への結合を試験した。両ｓｃＦｖコンストラクトはＣ４‐２細胞に強い結合を示したが、陰性対照ＤＵ１４５細胞には結合しなかった。
【０１５１】
参考文献：
2021532778.tif 000008
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2021532778.tif 000010
【０１５２】
配列
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ  ＳＴ  ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。
ｈ／ｄ：ヒト化／脱免疫化、ＣＤＲ：相補性決定領域、ＦＲ：フレームワーク領域、ＣＲ：定常領域
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月29日(2020.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のＣＤＲ  Ｈ１配列、
配列番号２、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１に記載の配列のいずれかから選択されるＣＤＲ  Ｈ２配列、および
配列番号３に記載のＣＤＲ  Ｈ３配列
を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン、ならびに
配列番号４、配列番号８および配列番号１０に記載の配列のいずれかから選択されるＣＤＲ  Ｌ１配列、
配列番号５および配列番号１２に記載の配列のいずれかから選択されるＣＤＲ  Ｌ２配列、および
配列番号６に記載のＣＤＲ  Ｌ３配列
を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含むが、
配列番号１に記載のＣＤＲ  Ｈ１配列、配列番号２に記載のＣＤＲ  Ｈ２配列、配列番号３に記載のＣＤＲ  Ｈ３配列、配列番号４に記載のＣＤＲ  Ｌ１配列、配列番号５に記載のＣＤＲ  Ｌ２配列、および配列番号６に記載のＣＤＲ  Ｌ３配列の組合せを含まず、
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の細胞外ドメインに結合する、ヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項２】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１９に記載のいずれかの配列から選択される配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％の配列相同性を有するＶＨドメインを含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項３】
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１９に記載のいずれかの配列から選択されるＶＨドメイン配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項４】
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択される配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは９５％の配列相同性を有するＶＬドメインを含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項５】
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項６】
配列番号１３に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列、または
配列番号１５に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列、または
配列番号１７に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列、または
配列番号１９に記載のＶＨドメイン配列および配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に記載のいずれかの配列から選択されるＶＬドメイン配列を含む、
請求項１に記載のヒト化抗体または抗原結合断片もしくはその抗原結合部分。
【請求項７】
重鎖が配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、または配列番号２７のいずれかの配列を含む、請求項３に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項８】
軽鎖が配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８のいずれかの配列を含む、請求項５に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項９】
配列番号２１、２３、２５または２７のいずれかの配列を含む少なくとも１つの重鎖、および配列番号２２、２４、２６または２８のいずれかの配列を含む少なくとも１つの軽鎖を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項１０】
配列番号２７を含む少なくとも１つの重鎖、および配列番号２８を含む少なくとも１つの軽鎖を含む、ヒト化抗体またはその抗原結合断片または抗原結合部分。
【請求項１１】
ＥＣ50＜０．４μｇ／ｍｌの親和性でＰＳＭＡの細胞外ドメインに結合する、前記請求項のいずれかに記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項１２】
抗体がグリコシル化されている、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項１３】
グリカンが、重鎖のアスパラギン２９７におけるＮ−結合オリゴ糖鎖である、請求項１２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項１４】
前記前立腺特異的膜抗原がヒト前立腺特異的膜抗原である、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項１５】
抗体がアイソタイプＩｇＧである、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分。
【請求項１６】
抗体断片が可変ドメイン（Ｆｖ）、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ）2断片からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗原結合断片。
【請求項１７】
抗原結合部分が一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のヒト化抗原結合部分。
【請求項１８】
治療薬に、場合によりリンカー部分を介して結合された、前記請求項のいずれかに記載のヒト化抗体またはその断片もしくは誘導体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項１９】
少なくとも薬学的に許容される担体とともに、前記請求項のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分を含む、ＰＳＭＡの過剰発現に関連する医学的障害の治療のための医薬製剤。
【請求項２０】
前記製剤が、少なくとも静脈内、筋肉内または皮下投与に適している、請求項１９に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
前立腺癌の治療に使用するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分、または請求項１９もしくは２０に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合部分の有効量を患者に投与することを含む、前立腺癌に罹患している患者の治療方法。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のヒト化抗体、その抗原結合断片もしくは抗原結合部分をコードする核酸。
【請求項２４】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のヒト化抗体、その抗原結合断片もしくは抗原結合部分を産生することができる宿主細胞。
【請求項２５】
宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞株である、請求項２５に記載の宿主細胞。
【国際調査報告】
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