(57)【要約】  新規なヒトＣＤ３抗原結合ポリペプチド、及びそれらの調製、及び種々の疾患の治療及び／または診断におけるそれらの使用が提供され、免疫エフェクター細胞を活性化することができる二重特異性抗体分子、ならびに種々の疾患の診断及び／または治療におけるそれらの使用が提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３に結合する単離されたモノクローナル抗原結合タンパク質であって、ＣＤ３イプシロン（配列番号２３）：Ｋ７３及びＳ８３、ならびにＣＤ３デルタ（配列番号２４）Ｋ８２及びＣ９３から選択される少なくとも１つの残基を含むＣＤ３上のエピトープに結合する、前記単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記ＣＤ３上のエピトープが、Ｋ８２、Ｅ８３、Ｓ８４、Ｔ８５、Ｖ８６、Ｑ８７、Ｖ８８、Ｈ８９、Ｙ９０、Ｒ９１、Ｍ９２、Ｃ９３によって定義されるＣＤ３デルタの領域を含む、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
前記ＣＤ３上のエピトープが、Ｋ７３、Ｎ７４、Ｉ７５、Ｇ７６、Ｓ７７、Ｄ７８、Ｅ７９、Ｄ８０、Ｈ８１、Ｌ８２、Ｓ８３によって定義されるＣＤ３イプシロンの領域を含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記エピトープが、ＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロンの両方の残基を含む立体配座エピトープを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
前記立体配座エピトープが、残基ＣＤ３ε  Ｋ７３及びＳ８３；ＣＤ３δ  Ｋ８２及びＣ９３のそれぞれを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
前記抗体が、カニクイザルＣＤ３タンパク質と交差反応しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
前記抗原結合タンパク質が、Ｔ細胞に結合する際に、Ｆ２Ｂ抗体で観察される最大サイトカイン放出の約２００％以下であるサイトカイン放出を誘導する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
ＣＤ３に対する結合親和性が５０ｎＭ以上である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
前記単離されたモノクローナル抗原結合タンパク質がヒト抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記単離されたモノクローナル抗原結合タンパク質がヒト化抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
軽鎖の可変領域が配列１９中のＣＤＲ配列のセットを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
可変軽鎖ドメインが、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号１〜１８に示されるもの以外のＣＤＲ配列のセットを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
Ｆｃ領域をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
前記Ｆｃ領域が、エフェクター機能を低下させるように操作されている、請求項１４に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記タンパク質が一本鎖である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質が二本鎖またはその倍数である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
前記タンパク質が三本鎖である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
前記タンパク質が三本鎖であり、両方の抗原結合性アームが抗体の重鎖及び軽鎖を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
前記タンパク質が、ＣＤ３以外のタンパク質に特異的な可変重鎖ドメインをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
前記タンパク質が、ＣＤ３以外のタンパク質に特異的な可変重鎖ドメインをさらに含み、
活性化アッセイにおいてＴ細胞と接触させたとき、前記抗原結合タンパク質が、参照抗ＣＤ３抗体と比較して、ＩＬ−２及びＩＬ−６の一方または両方の低下したレベルの放出を誘導し、
腫瘍細胞及びヒトＴ細胞を用いた標準インビトロアッセイにおいて、３０％を超える腫瘍細胞傷害性を誘導する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
ＣＤ３以外のタンパク質に特異的な前記可変重鎖ドメインが重鎖のみのドメインである、請求項２１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
ＣＤ３以外のタンパク質に特異的な前記可変重鎖ドメインが軽鎖可変領域をさらに含む、請求項２１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
前記軽鎖可変領域が、前記ＣＤ３結合領域の軽鎖可変領域と同一である、請求項２１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＣＤ３以外のタンパク質が、腫瘍関連抗原である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
前記ＣＤ３以外のタンパク質が、病原体抗原である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
前記ＣＤ３以外のタンパク質が、免疫調節タンパク質である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項２９】
単位用量製剤中の、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項３０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３３】
前記タンパク質の発現を許容する条件下で、請求項３２に記載の細胞を増殖させることと、前記タンパク質を前記細胞及び／または細胞培養培地から単離することと、を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質の製造方法。
【請求項３４】
有効量の請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、または請求項２８に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、治療方法。
【請求項３５】
疾患の治療のための医薬の調製における、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質の使用。
【請求項３６】
疾患の治療のためにおける使用のための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３７】
前記個体がヒトである、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２０１７年１２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／６１０，７６４号の優先権の権益を主張し、この開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、新規なヒトＣＤ３抗原結合ポリペプチド、及びそれらの調製、ならびに種々の疾患の治療及び／または診断におけるそれらの使用に関し、免疫エフェクター細胞を活性化することができる二重特異性抗体分子、ならびに種々の疾患の診断及び／または治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
身体の免疫システムは、感染、傷害及びがんに対する防御の役割を果たす。２つの別々ではあるが、相互に関連したシステムである、体液性免疫システムと細胞性免疫システムは、身体を保護するために一緒に働く。体液性システムは、抗体と呼ばれる可溶性因子によって媒介され、体内で異物として認識される生成物を中和する。対照的に、細胞性システムは、外来の侵入物を除去し中和するＴ細胞及びマクロファージなどの細胞を含む。
【０００４】
Ｔ細胞の活性化は、免疫反応の刺激にとって重要である。Ｔ細胞は、免疫学的特異性を示し、ほとんどの細胞性免疫反応を導く。Ｔ細胞は、抗体を分泌しないが、Ｂリンパ球による抗体の分泌に必要である。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞受容体複合体及びＣＤ４またはＣＤ８分子のような多数の細胞表面分子の関与を必要とする。抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）は、ジスルフィド結合ヘテロ二量体、鎖を有する膜糖タンパク質、アルファ及びベータ（α及びβ）、またはガンマ及びデルタ（γ及びδ）からなる。ＴｃＲは、ＣＤ３と呼ばれる不変タンパク質の複合体と非共有結合している。
【０００５】
Ｔ細胞は、多数の実験設定において、強力な抗腫瘍効果を発揮することが知られている。腫瘍細胞に対してＴ細胞を効果的に動員できる抗体は、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、ならびにＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びＣＤ２８のようなアゴニスト性Ｔ細胞膜タンパク質に指向する二重特異性抗体として利用可能であった。これらの二重特異性抗体は、そのＴＣＲ特異性にかかわらず、Ｔ細胞を活性化することができ、それぞれのＴＡＡを有する細胞の特異的溶解をもたらす。
【０００６】
しかしながら、抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｔ細胞媒介性溶解を悪性細胞に向け得るが、ＣＤ３ベースのｂＳＡｂによる臨床試験は、患者に高い毒性を示している。ｂＳＡｂ由来の非特異的Ｔ細胞活性化は、Ｆｃ／Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に起因して抗原非依存的に、または抗原が正常細胞及び腫瘍細胞の両方に発現される場合に抗原依存的に生じ得る。両方のメカニズムは、以前の臨床試験で観察された毒性の原因であった可能性がある。例えば、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７７（２）：２５１−６；Ｄｕｒｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１５）；２３  ４，  ６４８−６５５を参照されたい。結果として生じるサイトカイン放出症候群のために、治療目的のためにこれらの抗体の開発に重要なブロックとなっていた。
【０００７】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とそのペプチド−ＭＨＣリガンドとの相互作用が、Ｔ細胞の活性を決定する。この相互作用の結合特性は、非常に詳細に研究されており、Ｔ細胞機能を制御することが示されている。ＴＣＲ−ペプチド／ＭＨＣ相互作用の強度及び性質は、Ｔ細胞がエフェクター機能を発揮するのか、または不活性化され欠失されるのかを決定する。ＣＤ３に対する抗体は、ＣＤ３ε鎖の立体構造を変えることにより、また、Ｔ細胞に対してアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果のいずれかを有し得るエピトープに応じて、Ｔ細胞を活性化する（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：５６３−５６９）。多くのＴ細胞アゴニストの重大な副作用を考慮すると、炎症誘発性サイトカインの放出を減少させながら、強力な抗腫瘍効果を維持することが好ましい場合もある。しかしながら、部分アゴニスト抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３ε鎖を最適以下に変化させて無効なシグナル伝達をもたらし、ほとんどの抗ＣＤ３抗体は、両方の経路に対して完全アゴニストである。これらのエフェクター機能を分離できるかどうかは不明である。多くの既存の抗ＣＤ３抗体（例えば、ＳＰ−３４、ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ３）は、１〜５０ｎＭ  ＫＤの範囲で親和性を有するが、これは、治療的使用には最適ではないかもしれない。
【０００８】
ＣＤ３特異的抗体、及びそれに由来する二重特異性抗体は、本発明によって提供される。
【０００９】
公開
ＣＤ３抗体は、例えば、米国特許第５，５８５，０９７号、５，９２９，２１２号、５，９６８，５０９号、６，７０６，２６５号、６，７５０，３２５号、７，３８１，８０３号、７，７２８，１１４号に開示されている。ＣＤ３結合特異性を有する二重特異性抗体は、例えば、米国特許第７，２６２，２７６号、７，６３５，４７２号、７，８６２，８１３号、及び８，２３６，３０８号に開示され、それぞれは本明細書に参照により具体的に組み込まれる。ＣＤ３結合抗体配列は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる同時係属出願ＰＣＴ  ＵＳ２０１７／０３８３７７に提供されている。
【発明の概要】
【００１０】
概要
その組成物及びその使用方法は、ＣＤ３に結合し、ＣＤ３を介してシグナル伝達を活性化、例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化する抗体のために提供される。抗体は、本明細書ではＦ２Ｂエピトープと呼ばれる場合があるＦ２Ｂ抗体が結合するＣＤ３エピトープへの結合によって特徴付けられ。Ｆ２Ｂ抗体は、配列番号１のＣＤＲ配列のセット、及び配列番号１９の固定軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ｂエピトープに結合する抗体は、配列番号１〜１８に示される配列以外の重鎖可変領域配列を含む。
【００１１】
Ｆ２Ｂエピトープに結合する抗体は、生物学的活性の点で重要な利点を提供する。抗体は有毒なサイトカインの放出を最小限に抑えながら、効果的な腫瘍細胞溶解を維持する。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ｂエピトープへの抗ＣＤ３抗体の結合は、コンピテントＴ細胞に結合する際に、サイトカイン放出、例えば、ＩＬ−２及びＩＦＮγの放出を誘発する傾向の低下を特徴とする。理論に拘束されることなく、Ｆ２Ｂによって認識される特異的なエピトープへの結合は、本明細書に記載の抗体の独特かつ有益な特性を提供すると考えられている。
【００１２】
Ｆ２Ｂエピトープに結合する抗体は、約１０−６〜約１０−１１の範囲のＣＤ３に対する結合親和性親和性に関して選択してもよい。５０ｎＭ以上、１００ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、または１μＭ以上の親和性（ＫＤ）を有する抗ＣＤ３抗体は、ＴＣＲ／ＭＨＣ相互作用をより厳密に模倣し、有効な腫瘍細胞溶解を維持しながら、毒性のあるサイトカインの放出を最小にするために、望ましい可能性がある。Ｆ２Ｂ抗体で観察される最大サイトカイン放出の約２００％以下であり、約１５０％以下、１２５％以下、１００％以下であり得、及び比較アッセイにおいてＦ２Ｂについて観察された最大値よりも小さくあり得るサイトカイン放出を誘導する抗体を選択することができる。
【００１３】
比較インビトロアッセイでにおいて、ＯＫＴ−３またはＴＮＢ−３８３Ｂなどの対照の抗ＣＤ３抗体の最大放出の２０％以下、３０％以下、５０％以下の最大ＩＬ−２及びＩＬ−１０放出を誘発する抗体を選択してもよい。
【００１４】
Ｆ２Ｂエピトープは、ＣＤ３イプシロン（配列番号２３）：Ｋ７３及びＳ８３：ならびにＣＤ３デルタ（配列番号２４）：Ｋ８２及びＣ９３から選択される少なくとも１つの残基への結合によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、エピトープは、Ｋ７３、Ｎ７４、Ｉ７５、Ｇ７６、Ｓ７７、Ｄ７８、Ｅ７９、Ｄ８０、Ｈ８１、Ｌ８２、Ｓ８３によって定義されるＣＤ３イプシロンの領域を含む。いくつかの実施形態において、エピトープは、Ｋ７３及びＳ８３の一方または両方を含む。いくつかの実施形態において、エピトープは、Ｋ８２、Ｅ８３、Ｓ８４、Ｔ８５、Ｖ８６、Ｑ８７、Ｖ８８、Ｈ８９、Ｙ９０、Ｒ９１、Ｍ９２、Ｃ９３によって定義されるＣＤ３デルタの領域を含む。いくつかの実施形態において、エピトープは、Ｋ８２及びＣ９３の一方または両方を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ｂエピトープは、ＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロンの両方の残基を含む立体配座エピトープを含む。いくつかの実施形態において、立体配座エピトープは、残基ＣＤ３  Ｋ７３及びＳ８３；ＣＤ３  Ｋ８２及びＣ９３のそれぞれを含む。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ｂエピトープに結合する抗体は、カニクイザルＣＤ３タンパク質と交差反応しない。
【００１５】
いくつかの実施形態において、Ｆ２Ｂエピトープに結合する抗体は、本明細書に開示される抗体と他の抗体との間の競合アッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、抗体は、サイトカイン放出を減少させるＣＤ３の特異的な残基に結合する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、Ｆ２Ｂエピトープに結合する抗体由来の少なくとも重鎖可変領域を含む二重特異性または多重特異性抗体が提供される。二重特異性抗体は、少なくともＣＤ３以外のタンパク質に特異的な抗体の重鎖可変領域を含み、重鎖及び軽鎖可変領域を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、第２の抗体は、腫瘍関連抗原、例えば、インテグリンなどの標的抗原、病原体抗原、チェックポイントタンパク質などに特異的に結合する。限定されるものではないが、一本鎖ポリペプチド、二本鎖ポリペプチド、三本鎖ポリペプチド、四本鎖ポリペプチド、及びそれらの倍数を含む、種々の二重特異性抗体の形態が本発明の範囲内である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明のＦ２Ｂエピトープ結合抗体は、軽鎖と対になって、ＣＤ３結合可変領域を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖は、配列番号１９に記載の可変領域配列、または配列番号１９のＣＤＲ配列のセット及びフレームワーク配列を含む可変領域を含む。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などを含むがこれらに限定されない様々なＦｃ配列が使用される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体の第２のアームは、腫瘍関連抗原に特異的に結合する可変領域を含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体の第２のアームは、ＢＣＭＡに特異的に結合する可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗ＢＣＭＡアームは、例えば、図２Ｂに示すような一本鎖可変領域である。
【００１８】
他の実施形態において、本発明の少なくともＣＤ３結合ＶＨドメイン、本発明の少なくともＣＤ３結合性ＶＨドメインを含む単一特異性、二重特異性などの抗体または抗体様タンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。組成物は、凍結乾燥されてもよく、溶液などに懸濁されてもよく、単位用量製剤で提供されてもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態において、がんの治療のための方法が提供され、方法は、それを必要とする個体に、有効量の単一特異性、二重特異性などの本発明の抗体を投与することを含む。抗体が二重特異性である場合、第２の抗原結合部位は、腫瘍抗原、チェックポイントタンパク質などに特異的に結合し得る。様々な実施形態において、がんは、卵巣癌、乳癌、胃腸管、脳腫瘍、頭頸部癌、前立腺癌、結腸癌、肺癌、白血病、リンパ腫、肉腫、癌腫、神経細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌、胚細胞腫瘍、転移、未分化腫瘍、精上皮腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、混合細胞腫瘍、及び感染性病原体による新生物形成からなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、感染症の治療のための方法が提供され、方法は、それを必要とする個体に、有効量の単一特異性、二重特異性などの本発明の抗体を投与することを含む。抗体が二重特異性である場合、第２の抗原結合部位は、病原体抗原、例えば、細菌、ウイルスまたは寄生虫に特異的に結合し得る。
【００２１】
他の実施形態において、抗体配列、例えば、１つ以上の軽鎖コード配列、１つ以上の重鎖コード配列を単一の宿主細胞に発現することを含む本発明の二重特異性抗体の製造方法が提供される。様々な実施形態において、宿主細胞は、原核細胞または哺乳動物細胞などの真核細胞であってもよい。
【００２２】
本発明の態様は、タンパク質の発現を許容する条件下で宿主細胞を増殖させること、ならびに細胞及び／または細胞培養培地からタンパク質を単離することを含む、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を産生する方法を含む。
【００２３】
本発明の態様は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質または本明細書に記載の医薬組成物の有効用量を個体に投与することを含む治療方法を含む。
【００２４】
本発明の態様は、疾患の治療のための薬剤の調製における、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の使用に関する。
【００２５】
本発明の態様は、疾患の治療に使用するための、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、方法または使用は、ヒト対象（例えば、ヒトである個体）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
本発明は、添付の図面と併せて読むと以下の詳細な説明から最もよく理解される。特許または出願のファイルは、カラーで成される少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）付きのこの特許または特許出願公開の写しは、請求及び必要な手数料の支払いがあった場合に、官庁によって提供される。一般的な慣行によれば、図面の様々な特徴は、同じ縮尺ではないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために、任意に拡大または縮小される。図面には、以下の図が含まれる。
【００２８】
【図１】１Ａ〜１Ｃ。図１Ａは、残基２６〜３３、５１〜５８及び９７〜１１２に対応する、ヒトＣＤ３に特異的に結合する、配列番号１〜１８の抗体ファミリー２のメンバーのＣＤＲ１、２及び３領域のアライメントを示す。図１Ｂは、固定軽鎖のＣＤＲ１、２及び３領域（配列番号１９）、ならびに例示的な抗ＢＣＭＡ配列（配列番号２０及び配列番号２１）を示す。図１Ｃは、参照抗ＣＤ３抗体（配列番号２２）、ＩＤ３０４７０４のＣＤＲ配列を提供する。
【図２】抗ＣＤ３アーム（ＣＤ３＿Ｆ２ＢまたはＩＤ：３１２５５７）及び高親和性抗ＢＣＭＡアームを有する分子ＴＮＢ−３８３Ｂの略図。
【図３】ＴＮＢ−３８３Ｂ及び陽性対照で処理されたＰＢＭＣによるサイトカイン放出の用量反応曲線。前培養されたＰＢＭＣは、増加する濃度の陽性対照（黒い十字）またはＴＮＢ−３８３Ｂ（黒い四角）によって刺激された。この実験の陽性対照は、二重特異性抗ＣＤ３／抗ＢＣＭＡ抗体（ＴＮＢ−３８４Ｂ）であった。この二重特異性抗体の抗ＣＤ３アームは、ヒトＣＤ３の異なるエピトープを高い親和性（ｋＤ＝３０ｎＭ、別名）で認識するが、抗ＢＣＭＡアームはＴＮＢ−３８３Ｂの抗ＢＣＭＡアームと同じである。この陽性対照は、ＯＫＴ３と同様のサイトカイン分泌プロファイルを示した（データ示さず）。
【図４】ＴＮＢ−３８３Ｂ及び陽性対照（ＴＮＢ−３８４Ｂ）で一晩刺激した後のＴ細胞サブセットの活性化プロファイル。陽性対照（１３２ｎｇ／ｍｌ、黒）とＴＮＢ−３８３Ｂ（１３２０ｎｇ／ｍｌ、パターン）のプラトー濃度での応答を示す。実施例１に記載のように、２４時間のインキュベーションステップの後に細胞を分析した。Ｔ細胞サブセットをゲーティングしてＣＤ６９発現が分析された（陽性細胞のパーセンテージ及び陽性細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ））。グラフは、３人のドナーから得られた中央値及び範囲を示す。
【図５】タンパク質分解消化及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析後のＤＥＰＣ標識化ＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロンの組み合わせた配列カバレッジ。影付きの配列は、ＤＥＰＣ修飾を有するペプチドの存在を示す。カバーされていない配列は埋め込まれ、ＤＥＰＣ修飾にアクセスできない。
【図６】ｍＡｂ  Ｆ２Ｂの存在下でＤＥＰＣ標識化が大幅に減少したＥｎｄｏ−ＧｌｕＣ由来ペプチドの数。標識化の程度が少なくとも１５倍異なるペプチドは、それぞれＣＤ３デルタ（Ｄ）及びＣＤ３イプシロン（Ｅ）ＥＣＤの位置にマッピングされる（影付き）。
【図７−１】ＣＤ３イプシロン由来のタンパク質分解ペプチドとそれらのＤＥＰＣ標識化への影響。太字で下線が付いているのは、標識化されていることが判明した残基である。最大の影響は、Ｌｙｓ７３とリジン８５で観察された。
【図７−２】ＣＤ３イプシロン由来のタンパク質分解ペプチドとそれらのＤＥＰＣ標識化への影響。太字で下線が付いているのは、標識化されていることが判明した残基である。最大の影響は、Ｌｙｓ７３とリジン８５で観察された。
【図８】ＤＥＰＣ標識化により同定されたＣＤ３デルタサブユニットのｍＡｂ  Ｆ２Ｂのエピトープ。
【図９】Ｘ線構造のリボン描画により、ＣＤ３デルタ／イプシロン複合体が解明した。ｍＡＢ  Ｆ２Ｂとの相互作用に重要な残基は、スペース重点により強調される。
【図１０】ＤＥＰＣ標識化によって得られたＣＤ３イプシロンエピトープのマッピング。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００３０】
本活性剤及び方法が記載される前に、本発明は、記載される特定の方法論、製品、装置及び因子に限定されず、そのような方法、装置及び製剤は、当然変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定されるものではないことも理解されたい。
【００３１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「薬物候補」への言及は、そのような候補の１つまたは混合物を指し、「該方法」への言及は、当業者に公知の等価な工程及び方法への言及を含む。
【００３２】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているすべての刊行物は、本明細書に記載され、本明細書に記載の発明と関連して使用され得るデバイス、製剤、及び方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に援用される。
【００３３】
ある範囲の値が提供される場合、介在する各値は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、本発明の範囲内に包含されるその記載された範囲において、その範囲の上限及び下限と他の任意の記載された値または介在する値との間で、下限の単位の１０分の１であると理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立してより小さな範囲に含まれてもよく、記載された範囲において、任意の具体的に除外された制限を条件として、本発明内に包含される。記載された範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれかを除外した範囲もまた本発明に含まれる。
【００３４】
以下の説明において、本発明のより完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が示されている。しかしながら、本発明がこれらの特定の詳細が１つ以上ない場合に実施され得ることは当業者には明らかであろう。他の例において、当業者において周知の特徴及び周知の手順は、本発明をあいまいにすることを避けるために記載されていない。
【００３５】
一般に、当業者の技術範囲内のタンパク質合成、組換え細胞培養及びタンパク質単離、ならびに組換えＤＮＡ技術の従来の方法が、本発明に採用される。このような技術は、文献に十分に説明されており、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００１）；Ｈａｒｌｏｗ，  Ｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．Ｉ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）；ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）を参照されたい。
【００３６】
定義
「含む」とは、列挙された要素が組成物／方法／キットにおいて必要とされることを意味するが、他の要素は、請求項の範囲内において組成物／方法／キットなどを形成するために含まれ得る。
【００３７】
「本質的に〜からなる」とは、本発明の基本的かつ新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えない、特定の材料または工程に記載された組成物または方法の範囲の限定を意味する。
【００３８】
「からなる」とは、請求項に特定されていない任意の要素、工程または成分の組成物、方法またはキットからの排除を意味する。
【００３９】
用語「治療」、「治療する」などは、本明細書では、一般に、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、及び／または疾患の部分的または完全な治癒及び／または疾患に起因する有害作用の点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物における疾患の任意の治療を包含し、以下、（ａ）疾患の素因となり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において、疾患が発生するのを防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、または（ｃ）疾患を緩和すること、疾患を退行させること、を含む。治療剤は、疾患または傷害の発症前、発症中または発症後に投与され得る。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または減少させる、進行中の疾患の治療は、特に注目されるものである。このような治療は、罹患した組織における機能の完全な消失に先立って行われることが望ましい。主題の療法は、疾患の症状の段階の間に、場合によっては、疾患の症状の段階の後に投与してもよい。
【００４０】
「治療有効量」は、対象に治療的利益を与えるために、必要な量の活性剤を意図する。例えば、「治療有効量」とは、疾患に関連する病理学的症状、疾患の進行もしくは生理学的状態の改善を誘導、改善、またはそうでなければ引き起こす、または障害に対する耐性を改善する量である。
【００４１】
用語「対象」、「個体」及び「患者」は、本明細書中では交換可能に使用されて、処置のために評価される及び／または治療される哺乳動物のことをいう。１つの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。「対象」、「個体」及び「患者」という用語は、限定されるものではないが、がんを有する個体、自己免疫疾患を有する個体、病原体感染を有する個体などを含む。対象は、ヒトであってもよいが、他の哺乳動物、特に、ヒト疾患の実験モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラットなども含む。
【００４２】
用語「がん」、「新生物」、及び「腫瘍」は、本明細書では互換的に使用され、細胞増殖に対する制御の著しい喪失を特徴とする異常な増殖表現型を示すといった、自律性の調節されない増殖を示す細胞のことをいう。本願における検出、解析または治療の対象となる細胞には、前がん性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性及び非転移性細胞が含まれる。事実上あらゆる組織のがんが知られている。「がん負荷」という語句は、対象のがん細胞またはがん体積の量子のことをいう。したがって、がん負荷を軽減することは、対象のがん細胞数またはがん体積を減少させることをいう。本明細書で使用する用語「がん細胞」は、がん細胞であるか、またはがん細胞に由来する任意の細胞、例えば、がん細胞のクロ−ンのことをいう。がん腫、肉腫、神経膠芽腫、黒色腫、リンパ腫、骨髄腫などの固形腫瘍、及び特に、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病などを含む白血病などの循環癌を含む多くのタイプのがんが当業者に知られている。がんの例には、限定されるものではないが、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、及び脳腫瘍を含む。
【００４３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」は、ナチュラルキラー細胞、好中球及びマクロファージなどのＦｃ受容体を発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応のことをいう。ＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，８２１，３３７号に記載されているものなどの方法を用いて評価され得る。ＡＤＣＰは、抗体依存性細胞媒介性食作用のことをいう。
【００４４】
「エフェクター細胞」は、１つ以上の定常領域受容体を発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。
【００４５】
「サイトカイン」は、１つの細胞によって放出され、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質である。目的のサイトカインには、限定されるものではないが、活性化Ｔ細胞から放出されるサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮγなどが含まれる。
【００４６】
「非免疫原性」は、免疫反応が適応免疫反応及び／または自然免疫反応を含む免疫反応を開始、誘発または増強しない物質のことをいう。
【００４７】
用語「単離された」は、物質がその元の環境（例えば、天然に存在する場合には自然環境）から除去されることを意味する。例えば、生存動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、天然の系において共存する物質のいくつかまたはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが単離される。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、及び／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、また、そのようなベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではないという点で依然として単離され得る。
【００４８】
「薬学的に許容される賦形剤」は、一般に、安全で、毒性がなく、望ましい医薬組成物の調製に有用な賦形剤を意味し、獣医学的使用ならびにヒト医薬用途に許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合にはガス状であり得る。
【００４９】
「薬学的に許容される塩及びエステル」は、薬学的に許容され、所望の薬理学的特性を有する塩及びエステルを意味する。このような塩には、化合物に存在する酸性プロトンが無機塩基または有機塩基と反応することができる場合に形成され得る塩が含まれる。適切な無機塩には、アルカリ金属、例えば、ナトリウム及びカリウム、マグネシウム、カルシウム及びアルミニウムと一緒に形成されたものが含まれる。適切な有機塩には、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎメチルグルカミンなどの有機塩基で形成されたものが含まれる。このような塩はまた、無機酸（例えば、塩酸及び臭化水素酸）ならびに有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、及びメタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸のようなアルカン及びアレーンスルホン酸）と形成された酸付加塩も含まれる。薬学的に許容されるエステルには、化合物に存在するカルボキシ、スルホニルオキシ、及びホスホノキシ基、例えば、Ｃ１−６アルキルエステルから形成されるエステルが含まれる。２つの酸性基が存在する場合、薬学的に許容される塩またはエステルは、モノ酸モノ塩またはエステルまたは二塩またはエステルであり得、同様に２つを超える酸性基が存在する場合、そのような基の一部または全部を塩化またはエステル化され得る。本発明において命名された化合物は、非塩化形態または非エステル化形態で、または塩化形態及び／またはエステル化形態で存在され得、そのような化合物の命名は、元の（非塩化及び非エステル化）化合物ならびにその薬学的に許容される塩及びエステルの両方を含むことを意図している。また、本発明において命名された特定の化合物は、２つ以上の立体異性体形態で存在してもよく、そのような化合物の命名は、そのような立体異性体のすべての単一立体異性体及びすべての混合物（ラセミ体かどうか）を含むことを意図する。
【００５０】
用語「薬学的に許容される」、「生理学的に忍容される」及びそれらの文法的な変形は、それらが組成物、担体、希釈剤及び試薬のことをいうとき、互換的に使用され、物質は、組成物の投与を妨げる程度に、望ましくない生理学的効果を生じることなく、ヒトにまたはヒト上に投与することができることを表す。
【００５１】
２つの配列間の「相同性」は、配列同一性によって決定される。互いに比較される２つの配列の長さが異なる場合、配列同一性は、好ましくは、より長い配列のヌクレオチド残基と同一である短い配列のヌクレオチド残基のパーセンテージに関連する。配列同一性は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（ウィスコンシンシーケンス解析パッケージ、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．  ５３７１１）のようなコンピュータプログラムを使用して、従来通りに決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間で最も高い配列同一性を有するセグメントを見出すために、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２（１９８１），  ４８２−４８９の局所相同性アルゴリズムを利用する。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列と９５％の同一性を有するかどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータは、好ましくは、同一性のパーセンテージが参照配列の全長にわたって計算されるように、また参照配列におけるヌクレオチドの総数の５％までの相同性ギャップが許容されるように調節される。Ｂｅｓｔｆｉｔを使用する場合、いわゆるオプションパラメータは、好ましくは、それらのプリセット（「デフォルト」）値のままである。所与の配列と本発明の上記の配列との比較において現れる偏差は、例えば、付加、欠失、置換、挿入または組換えによって引き起こされ得る。このような配列比較は、好ましくは、プログラム「ｆａｓｔａ２０ｕ６６」（バ−ジョン２．０ｕ６６，１９９８年９月，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３，  ６３−９８、添付の例、及びｈｔｔｐ：／／ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ．ｓｄｓｃ．ｅｄｕ／も参照されたい。）を用いても実施され得る。この目的のために、「デフォルト」パラメータ設定を使用してもよい。
【００５２】
「変異体」とは、天然配列のポリペプチドとはある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことをいう。通常、アミノ酸配列変異体は、少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％の配列相同性を有するであろう。アミノ酸配列変異体は、参照アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有していてもよい。
【００５３】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子のことをいうことを意図している。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループのことをいう。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指向することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または、単に「組換えベクター」）という。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、互換的に使用され得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」（または「組換え宿主細胞」）は、遺伝子改変されたか、または組換えプラスミドもしくはベクターなどの外因性ポリヌクレオチドの導入によって遺伝的に改変され得る細胞のことをいうことを意図する。そのような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫をもいうことを意図することを理解されたい。突然変異または環境の影響のために、ある世代ではある種の改変が起こり得るので、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。
【００５５】
「結合親和性」は、一般に、分子の単一の結合部位（例えば、抗体または他の結合分子）とその結合相手（例えば、抗原または受容体）との間の非共有結合の相互作用の総和の強さのことをいう。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載するものを含む当技術分野で公知の一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は、抗原（または受容体）に弱く結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、抗原（または受容体）をより強固に結合し、より長く結合したままである。
【００５６】
特に断らない限り、本明細書に記載され特許請求される「コンジュゲート」という用語は、１つ以上の抗体断片（複数可）の１つ以上のポリマー分子（複数可）への共有結合によって形成される異種分子として定義され、異種分子は、水溶性であり、すなわち、血液などの生理学的流体に可溶性であり、異種分子は、いかなる構造化凝集体も含まない。目的のコンジュゲートは、ＰＥＧである。前述の定義の文脈において、用語「構造化凝集体」は、（１）異種分子がミセルまたは他のエマルジョン構造ではなく、脂質二重膜、小胞またはリポソームに固定されていないような、スフェロイドまたはスフェロイドシェル構造を有する水溶液中の分子の任意の凝集体、及び（２）クロマトグラフィービーズマトリックスなど、水相と接触しても異種分子を溶液に放出しない、固体または不溶化形態の分子の凝集体のことをいう。したがって、本明細書で定義される用語「コンジュゲート」は、沈殿物、堆積物、生分解性マトリックスまたは固体の水和の際に異種分子を水溶液に放出することができる他の固体において、上記異種分子を包含する。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「標識」は、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートした検出可能な化合物または組成物のことをいう。標識は、それ自体で検出可能であり得（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。
【００５８】
「固相」は、本発明の抗体が付着し得る非水性マトリックスを意味する。本明細書に包含される固相の例には、ガラス（例えば、制御された細孔ガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、及びシリコーンの一部または全部が形成されるものが含まれる。ある特定の実施形態において、状況に応じて、固相は、アッセイプレートのウェルを構成し得、他のものでは、それは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語にはまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されているもののような個別の粒子の不連続固相も含まれる。
【００５９】
免疫グロブリンともいう抗体は、通常、少なくとも１つの重鎖及び１つの軽鎖を含み、重鎖及び軽鎖のアミノ末端ドメインは配列が可変であり、したがって、一般に可変領域ドメイン、または可変重鎖（ＶＨ）ドメインまたは可変軽鎖（ＶＨ）ドメインのことをいう。２つのドメインは、慣習的に会合して特異的結合領域を形成するが、本明細書で考察するように、特異的結合は重鎖のみの可変配列でも得ることができ、抗体の様々な非天然立体配置が知られており、当技術分野で使用されている。
【００６０】
「機能的」または「生物学的に活性な」抗体または抗原結合分子（本明細書において重鎖のみの抗体及び二重特異性三本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む。）は、構造的、規制的、生化学的または生物物理学的な事象において、その天然の活性の１つ以上を発揮することができるものである。例えば、機能的抗体または他の結合分子、例えば、ＴＣＡは、抗原に特異的に結合する能力を有し得、また、結合は、シグナル伝達または酵素活性などの細胞または分子事象を誘発または改変し得る。機能性抗体または他の結合分子、例えば、ＴＣＡはまた、受容体のリガンド活性化をブロックするか、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。その天然の活性の１つ以上を発揮するために、抗体または他の結合分子、例えば、ＴＣＡの能力は、ポリペプチド鎖の適切な折り畳み及び組み立てを含むいくつかの因子に依存する。
【００６１】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単量体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、重鎖のみの抗体、三本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ、ナノボディなどを含み、また、それらが所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を含む（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種の由来であってもよい。
【００６２】
抗体という用語は、全長重鎖、全長軽鎖、インタクトな免疫グロブリン分子、または目的の標的の抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチドを参照し得、そのような標的としては、限定されるものではないが、がん細胞、または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含む。本明細書に開示される免疫グロブリンは、減少または増強されたエフェクター細胞活性を提供する改変されたＦｃ部分を有する操作サブクラスを含む、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。１つの態様において、免疫グロブリンは、大部分がヒト由来である。
【００６３】
用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体間の配列において大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用されるという事実のことをいう。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ベータシート構造を連結するループを形成する、場合によってはベータシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって連結された、ベータシート構造を主に採用する４つのＦＲを含む。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって近接して一緒に保持され、他の鎖由来の超可変領域により、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．を参照されたい）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【００６４】
用語「超可変領域」は、本明細書で使用される場合、抗原結合の関与する抗体のアミノ酸残基のことをいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基、及び／または「超可変ループ」由来のこれらの残基を含んでいてもよい。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６５】
例示的なＣＤＲ指定が本明細書に示されているが、当業者は、Ｋａｂａｔの定義を含むＣＤＲの多くの定義が一般に使用されていることを理解し（“Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ．”  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１０；４７：６９４−７００を参照されたい）、これは配列の可変性に基づいており、最も一般的に用いられている。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づいている（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ．  １９８９；３４２：８７７−８８３）。別の目的のＣＤＲの定義は、限定されるものではないが、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，  “Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ．”  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００１；３０９：６５７−６７０；Ｏｆｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．  “Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ＣＤＲｓ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００８；１８１：６２３０−６２３５；Ａｌｍａｇｒｏ  “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．”  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  ２００４；１７：１３２−１４３；及びＰａｄｌａｎｅｔ  ａｌ．  “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”  Ｆａｓｅｂ  Ｊ．  １９９５；９：１３３−１３９．によって開示されたものを含み、これらのそれぞれは、参照により本明細書に具体的に援用される。
【００６６】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体のことをいい、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成され得るという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特性を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
【００６７】
本明細書の抗体は、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体を含み、鎖（複数可）の残りは、所望の生物学的活性を示す限り、別の種に由来する抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、及びそのような抗体の断片に対応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１−６８５５）。本明細書中の目的のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列、及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
【００６８】
本明細書で使用される「インタクトな抗体鎖」は、完全長可変領域及び完全長定常領域（Ｆｃ）を含むものである。インタクトな「従来の」抗体は、インタクトな軽鎖及びインタクトな重鎖、ならびに分泌ＩｇＧについての軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＩｇＭまたはＩｇＡなどの他のアイソタイプは、異なるＣＨドメインを有していてもよい。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であってもよい。インタクトな抗体は、抗体のＦｃ定常領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を意味する１つ以上の「エフェクター機能」を有してもよい。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、及び細胞表面受容体のダウンレギュレーションが含まれる。定常領域の変異体は、エフェクタープロファイルを変化させるもの、Ｆｃ受容体への結合などを含む。
【００６９】
それらの重鎖のＦｃ（定常ドメイン）のアミノ酸配列に依存して、抗体及び様々な抗原結合タンパク質は、異なる「クラス」として提供され得る。５つの主要なクラスの重鎖Ｆｃ領域：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかはさらに「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に分類され得る。抗体の異なるクラスに対応するＦｃ定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。Ｉｇ形態は、ヒンジ修飾形態またはヒンジレス形態を含む（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１：４０８３−４０９０；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６７：７２４６−７２５６；ＵＳ２００５／００４８５７２；２００４／０２２９３１０）。任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２つの型のうちの１つに割り当てられ得る。
【００７０】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的なエフェクター機能は、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーションなどを含む。このようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域が受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ受容体、及び低親和性ＦｃＲｎ受容体と相互作用することを必要とし、例えば、本明細書の定義に開示されているような種々のアッセイを用いて評価され得る。「死滅した」Ｆｃは、例えば、血清半減期の延長に関して、活性を保持するように変異誘発されているが、高親和性Ｆｃ受容体を活性化しないものである。
【００７１】
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域には、例えば、天然配列のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然配列のヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、天然配列のヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域、及び天然配列のヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ならびに天然に存在するそれらの変異体が含まれる。
【００７２】
「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１個のアミノ酸改変、好ましくは、１個以上のアミノ酸置換（複数可）によって、天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域、または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１個から約１０個のアミノ酸置換、好ましくは、約１個から約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書の変異型Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列のＦｃ領域、及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは、それと少なくとも約９５％の相同性を有する。
【００７３】
変異型Ｆｃ配列は、ＥＵインデックスの２３４位、２３５位、及び２３７位（Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３を参照されたい）におけるＦｃγＲＩ結合を減少させるために、ＣＨ２領域に３個のアミノ酸置換を含み得る。ＥＵインデックス３３０位及び３３１位における補体Ｃ１ｑ結合部位における２個のアミノ酸置換は、補体結合を低下させる（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７８：６６１（１９９３）、及びＣａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７３：１４８３（１９９１）を参照されたい）。２３３〜２３６位のＩｇＧ２残基及び３２７位、３３０位及び３３１位のＩｇＧ４残基のヒトＩｇＧ１への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低下させる（例えば、Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９（８）：２６１３−２４；及びＳｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６（９）：６５９１−６０４を参照されたい）。他のＦｃ変異体も可能であり、限定されるものではないが、ジスルフィド結合を形成することができる領域が欠失しているもの、あるいは、特定のアミノ酸残基が天然のＦｃ形態のＮ末端で除去されているか、またはメチオニン残基がそれに付加されているものを含む。したがって、本発明の１つの実施形態において、ＳｃＦｃ分子の１つ以上のＦｃ部分は、ジスルフィド結合を排除するために、ヒンジ領域に１つ以上の突然変異を含み得る。さらに別の実施形態において、Ｆｃのヒンジ領域は、完全に除去され得る。さらに別の実施形態において、分子は、Ｆｃ変異体を含み得る。
【００７４】
さらに、Ｆｃ変異体は、補体結合またはＦｃ受容体結合を行うために、アミノ酸残基を置換、欠失または付加することによって、エフェクター機能を除去または実質的に減少させるために構築され得る。例えば、限定されるものではないが、Ｃ１ｑ結合部位などの補体結合部位に欠失が生じ得る。免疫グロブリンＦｃ断片のそのような配列誘導体を調製する技術は、国際特許公報ＷＯ９７／３４６３１及びＷＯ９６／３２４７８に開示されている。さらに、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などによって修飾され得る。
【００７５】
Ｆｃは、天然型糖鎖、天然型と比較して増加した糖鎖、または天然型と比較して減少した糖鎖を有する形態であってもよく、または非グリコシル化形態もしくは脱グリコシル化形態であってもよい。糖鎖の増加、減少、除去または他の修飾は、化学的方法、酵素的方法などの当技術分野で一般的な方法によって、または遺伝子操作された産生細胞株においてそれを発現させることによって達成され得る。そのような細胞株は、グリコシル化酵素を天然に発現する、微生物（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及び哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）を含み得る。さらに、微生物または細胞は、グリコシル化酵素を発現するように操作され得るか、またはグリコシル化酵素を発現できないようにし得る（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１３：１４４１（２００６）；Ｋａｎｄａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １３０：３００（２００７）；Ｋｉｔａｇａｗａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６９（２７）：１７８７２（１９９４）；Ｕｊｉｔａ−Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６４  （２３）：１３８４８（１９８９）；Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ，  ｅｔ  ａｌ，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：８４（２００７）；及びＷＯ０７／０５５９１６を参照されたい）。シアリル化活性が変化するように操作された細胞の一例として、アルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１遺伝子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞及びｓｆ９細胞に操作されている。したがって、これらの操作された細胞によって発現される抗体は、外因性遺伝子産物によってシアリル化される。複数の天然分子と比較して、修飾された量の糖残基を有するＦｃ分子を得るためのさらなる方法は、例えば、レクチンアフィニティークロマトグラフィーを用いて、上記複数の分子をグリコシル化及び非グリコシル化画分に分離することを含む（例えば、ＷＯ０７／１１７５０５を参照されたい）。特定のグリコシル化部分の存在は、免疫グロブリンの機能を変化させることが示されている。例えば、Ｆｃ分子からの糖鎖の除去は、第１の補体成分Ｃ１のＣ１ｑ部分に対する結合親和性の急激な低下、及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の減少または喪失をもたらし、それによってインビボで不必要な免疫反応を誘導しない。さらなる重要な修飾としては、シアリル化及びフコシル化が挙げられ、ＩｇＧにおけるシアル酸の存在は、抗炎症活性（例えば、Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：７６０（２００６）を参照されたい）と相関しているが、ＩｇＧからのフコースの除去は、ＡＤＣＣ活性の増強を導く（例えば、Ｓｈｏｊ−Ｈｏｓａｋａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １４０：７７７（２００６）を参照されたい）。
【００７６】
代替的な実施形態において、本発明の抗体は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合能を高め、ＡＤＣＣ活性を高めることによって、エフェクター機能が強化されたＦｃ配列を有し得る。例えば、ＦｃのＡｓｎ−２９７でＮ−結合グリカンに結合したフコースは、ＦｃとＦｃγＲＩＩＩＡとの相互作用を立体的に妨げ、そして糖操作によるフコースの除去は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を増加させることができ、それは、野生型ＩｇＧ１対照と比較して、＞５０倍高いＡＤＣＣ活性と橋渡しされる。タンパク質工学は、ＩｇＧ１のＦｃ部分におけるアミノ酸変異を介して、ＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ結合の親和性を増加させる複数の変異体を生成した。特に、トリプルアラニン変異体Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａは、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＡＤＣＣ機能に対して、２倍の増加した結合を示す。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（２×）及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ（３×）変異体は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合親和性の著しい増加、及びインビトロ及びインビボでのＡＤＣＣ能力の増大を有する。酵母ディスプレイによって同定された他のＦｃ変異体もまた、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する改善された結合、及びマウス異種移植モデルにおける腫瘍細胞殺傷の増強を示した。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＪＢＣ  ２８９（６）：３５７１−９０を参照されたく、本明細書に具体的に参考として援用される。
【００７７】
用語「Ｆｃ領域を含む抗体」は、Ｆｃ領域を含む抗体のことをいう。Ｆｃ領域のＣ末端リシン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の精製の間に、または抗体をコードする核酸の組換え操作によって除去され得る。したがって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を有するかまたは有さない抗体を含み得る。
【００７８】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む、最小限の抗体断片である。本発明のＣＤ３結合抗体は、緊密で非共有結合的に１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体を含むが、追加の抗体、例えば、多重特異的構成での使用のために、ＶＬ配列の非存在下でＶＨを含み得る。親和性は、２つのドメイン結合部位の親和性よりも低いかもしれないが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でも抗原を認識して結合する能力を有する。
【００７９】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、少数の残基を付加する点について、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオ−ル基を有するＦａｂ’のための本明細書の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、もともとそれらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００８０】
一本鎖抗体を含む非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体（一本鎖抗体を含む）である。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２４，  ４８７−４９９；Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，（１９９２）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２４：４８７−４９９；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５１，  ２６２３−２６３２；Ｗｅｒｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５７：４９８６−４９９５；及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８５：３７９−３８９を参照されたい。さらなる詳細については、米国特許第５，２２５，５３９号、第６，５４８，６４０号、第６，９８２，３２１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第６，４０７，２１３号、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９を参照されたい。
【００８１】
本明細書で使用される用語「一本鎖抗体」は、抗原のエピトープに結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む単一のポリペプチド鎖を意味し、そのようなドメインは、抗体重鎖または軽鎖の可変領域に由来するか、またはそれと配列同一性を有する。そのような可変領域の一部は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪＨ遺伝子セグメント、またはＪＬ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再編成ＶＨＤＪＨ、ＶＬＤＪＨ、ＶＨＪＬ、又はＶＬＪＬ遺伝子セグメントによってコードされ得る。Ｖ−、Ｄ−、及びＪ−遺伝子セグメントは、ヒト、及び鳥類、魚類、サメ、哺乳動物、げっ歯類、非ヒト霊長類、ラクダ、ラマ、ウサギなどを含む様々な動物に由来し得る。
【００８２】
「競合する」という用語は、同じエピトープについて競合する抗体の文脈で使用されるとき、試験される抗体（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメント）が、共通の抗原（例えば、ＣＤ３またはその断片）への参照抗体（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を防止または阻害する（例えば、減少する）アッセイによって決定されるような抗体間の競合を意味する。多くのタイプの競合結合アッセイ、例えば、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３７：３６１４−３６１９を参照されたい）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ−１２５標識を使用した固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：７−１５を参照されたい）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＲ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２を参照されたい、及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：７７−８２）を使用して、１つの抗体が別の抗体と競合するかどうかを判定できる。
【００８３】
典型的には、そのようなアッセイは、これらのいずれか、非標識試験抗体及び標識参照抗体のいずれかを担持する固体表面または細胞に結合した精製抗原の使用を含む。競合阻害は、試験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗体は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体と、参照抗体が結合するエピトープに対して、立体障害が発生するのに十分近位の隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。競合的結合を決定する方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供されている。通常、競合抗体が過剰に存在するとき、共通の抗原に退位する参照抗体の特異的結合が少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％または７５％以上阻害される（たとえば、減少する）。いくつかの例では、結合は少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、または９７％以上阻害される。
【００８４】
「エピトープ」という用語は、Ｆ２Ｂ抗体などの抗体が結合することができる任意の決定基を含む。エピトープは、その抗原を標的とする抗体が結合する抗原の領域であり、抗原がタンパク質であるとき、抗体に直接接触する特異的なアミノ酸が含まれる。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面の集団を含むことができ、特異的な三次元構造特性及び／または特異的な電荷特性を有することができる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質及び／または高分子の複雑な混合物中の標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
【００８５】
本発明のＣＤ３結合抗体は、限定されるものではないが、二重特異性抗体、三機能性抗体などを含む、多特異的構成において特に有用であることがわかる。多種多様な方法及びタンパク質構成が知られており、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などにおいて使用されている。
【００８６】
第１世代のＢｓＭＡｂは、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなり、１つはそれぞれ２つの異なる抗体由来であった。２つのＦａｂ領域は、２つの抗原に対して指向される。Ｆｃ領域は、２つの重鎖から構成され、免疫細胞上のＦｃ受容体を有する第３の結合部位を形成する（例えば、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  １５５，  ｐ２１９−２２５，  １９９５を参照されたい）。抗体は、同じ種または異なる種に由来するものであってもよい。例えば、ラット及びマウス抗体を発現する細胞株は、優先的に種制限された重鎖及び軽鎖の対形成のために、機能的な二重特異性Ａｂを分泌する。他の実施形態において、Ｆｃ領域は、特定の方法で一緒に適合するようにのみ設計される。
【００８７】
他のタイプの二重特異性抗体は、Ｆａｂ領域のみからなる化学的に連結したＦａｂを含む。２つの化学的に連結したＦａｂまたはＦａｂ２断片は、２つの異なる抗原に結合する人工抗体を形成し、これを二重特異性抗体の一種にする。２つの異なるモノクローナル抗体の抗原結合断片（ＦａｂまたはＦａｂ２）が産生され、チオエ−テルのような化学的手段によって連結される（Ｇｌｅｎｎｉｅ，  Ｍ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３９，  ｐ  ２３６７−７５，  １９８７；Ｐｅｔｅｒ  Ｂｏｒｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  Ｖｏｌ．１００，  Ｎｏ．９，  ｐ３１０１−３１０７，  ２００２を参照されたい）。
【００８８】
多価人工抗体の製造のための種々の他の方法が、２つの抗体の可変ドメインを組換え融合することによって開発されている。一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、１０〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドに連結されている。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンに富み、また、溶解性のためにセリンまたはトレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に結合することができ、またはその逆も可能である。二重特異性一本鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ）は、異なる特異性を有する２つのｓｃＦｖを連結することによって操作され得る。２つのＶＨ及び２つのＶＬ領域を有する単一ペプチド鎖が産生され、二価のｓｃＦｖが得られる。
【００８９】
二重特異性のタンデムなｓｃＦｖは、二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ）としても知られている。二重特異性ｓｃＦｖは、２つの可変領域が一緒に折り畳むには短すぎる（約５個のアミノ酸）、ｓｃＦｖを強制的に二量化させるリンカーペプチドを用いて作製され得る。このタイプは、ダイアボディ−として知られている（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ７７，  ｐ１４０５−１２，  １９９８）。Ｄｕａｌ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅ−Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＡＲＴ）プラットフォ−ム技術（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ）。この融合タンパク質技術は、約５５キロダルトンの単一ペプチド鎖上の異なる抗体の２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を使用する。ＳＣＯＲＰＩＯＮ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，  Ｓｅａｔｔｌｅ，  Ｗａｓｈ．）は、一本鎖タンパク質において、２つの抗原結合ドメインを組み合わせている。免疫グロブリンＦｃ領域に基づいて、１つの結合ドメインは、Ｃ末端にあり、第２の結合ドメインはエフェクタードメインのＮ末端にある。
【００９０】
四価及び二重特異性抗体様タンパク質には、２つのモノクローナル抗体から操作されるＤＶＤ−Ｉｇも含まれる（Ｗｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２５，  ｐ１２９０−１２９７，  ２００７）。ＤＶＤ−Ｉｇ分子を構築するために、２つのｍＡｂのＶドメインを、Ｎ末端の第１抗体軽（ＶＬ）鎖の可変ドメインと、短いリンカー（ＴＶＡＡＰ）によってタンデムに融合させ、続いて、他の抗体ＶＬ及びＣｋが続き、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質軽鎖を形成する。同様に、２つのｍＡｂの重（ＶＨ）鎖の可変領域を、短いリンカー（ＡＳＴＫＧＰ）によって、Ｎ末端の第１の抗体とタンデムに融合させ、続いて、他の抗体及び重鎖定常ドメインを融合させて、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質重鎖（ＶＨ１／ＶＬ１）を形成する。ジスルフィド結合完全ＩｇＧ様分子の形成に重要であるため、ＤＶＤ−Ｉｇ設計では、すべての軽鎖及び重鎖定常ドメインが保存されている。ＤＶＤ−Ｉｇ軽鎖及び重鎖をコードする発現ベクターによる哺乳動物細胞の同時トランスフェクションは、約２００ｋＤａの分子量を有するＩｇＧ様分子の単一種の分泌をもたらす。この分子は、各ｍＡｂから２つの４つの結合部位を有する。
【００９１】
用語「二重特異性三本鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」は、本明細書では、３つのポリペプチドサブユニットを含む、本質的になる、またはそれらからなる抗体様分子のことをいうために使用され、そのうちの２つは、抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含む、モノクローナル抗体の１つの重鎖及び１つの軽鎖、あるいはそのような抗体鎖の機能的抗原結合断片を含む、本質的になる、またはそれらからなる。この重鎖／軽鎖の対は、第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインの非存在下で、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分を含む重鎖のみの抗体と、第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインとを含む、本質的になる、またはそれからなり、そのような結合ドメインは、抗体重鎖または軽鎖の可変領域に由来するか、またはそれと配列同一性を有する。そのような可変領域の一部は、ＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪＨ遺伝子セグメント、またはＪＬ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再編成ＶＨＤＪＨ、ＶＬＤＪＨ、ＶＨＪＬ、又はＶＬＪＬ遺伝子セグメントによってコードされ得る。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「ＴＣＡタンパク質は重鎖のみの抗体を利用する」または「重鎖抗体」または「重鎖ポリペプチド」は、重鎖定常領域ＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメイン及び／またはＣＨ４ドメインを含むがＣＨ１ドメインを含まない一本鎖抗体を意味する。１つの実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、少なくともヒンジ領域の一部及びＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなる。別の実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、少なくともヒンジ領域の一部及びＣＨ２ドメインからなる。さらなる実施形態において、重鎖抗体は、抗原結合ドメイン、少なくともヒンジ領域の一部及びＣＨ３ドメインからなる。ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインが切断されている重鎖抗体も本明細書に含まれる。さらなる実施形態において、重鎖は、抗原結合ドメイン、及び少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４）ドメインからなるが、ヒンジ領域を含まない。重鎖のみの抗体は、２つの重鎖がジスルフィド結合されていてもよく、そうでなければ、互いに共有結合または非共有結合された二量体の形態であってもよい。重鎖抗体は、ＩｇＧサブクラスに属し得るが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体も本明細書に含まれる。特定の実施形態において、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特に、ＩｇＧ１サブタイプである。
【００９３】
重鎖抗体は、ラクダ科動物、例えば、ラクダ及びラマによって産生されるＩｇＧ抗体の約４分の１を構成する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３６３，  ４４６−４４８（１９９３））。これらの抗体は、２つの重鎖によって形成されるが、軽鎖が欠如している。結果として、可変抗原結合部分はＶＨＨドメインといい、それは長さが約１２０個のアミノ酸のみである最小の天然に存在するインタクトな抗原結合部位を表す（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２６２８５−２６２９０（２００１））。高い特異性及び親和性を有する重鎖抗体は、免疫化により種々の抗原に対して生成され得（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ，  Ｒ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １４３１，  ３７−４６（１９９９））、ＶＨＨ部分は、容易にクロ−ン化され、酵母で発現され得る（Ｆｒｅｎｋｅｎ，  Ｌ．Ｇ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７８，  １１−２１（２０００））。それらの発現レベル、溶解性及び安定性は、古典的なＦ（ａｂ）またはＦｖ断片のレベルよりも著しく高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４１４，  ５２１−５２６（１９９７））。サメは、ＶＮＡＲという抗体において、単一のＶＨ様ドメインを有することも示されている（Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２７０，  ３５４３−３５５４（２００３）；Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５５，  １８７−１９７（２００４）；Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，  ２５−３３（２００３））。
【００９４】
本明細書における重鎖のみの抗体及び二重特異性三本鎖抗体様分子（ＴＣＡ）を含む抗体または抗原結合分子は、目的の抗原に「結合する」が、十分な親和性で抗原に結合するものであり、そのような抗体または結合分子は、抗原を標的とする際の診断薬及び／または治療薬として有用であり、他のタンパク質と著しく交差反応しない。このような実施形態において、抗体または他の結合分子の非標的抗原への結合の程度は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析または放射免疫沈降（ＲＩＡ）によって決定されるように１０％以下である。
【００９５】
タンパク質
本発明は、ＣＤ３に結合し、ＣＤ３を介してシグナル伝達を活性化（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化）する密接に関連する抗体のファミリーを提供する。ファミリー内の抗体は、本明細書で定義されるＣＤＲ配列のセットを含み、配列番号１〜１８の提供されるＶＨ配列によって例示される。抗体のファミリーは、臨床的治療剤（複数可）としての有用性に寄与する多くの利益を提供する。ファミリー内の抗体は、ある範囲の結合親和性を有するメンバーを含み、所望の親和性を有する特定の配列の選択を可能にする。親和性を微調整する能力は、治療される個体におけるＣＤ３活性化のレベルを管理し、それによって、毒性を低減することが特に重要である。例えば、小さく豊富な腫瘍抗原（細胞当たり１０，０００分子未満）が標的化される場合、高い親和性のＣＤ３結合剤（＜３０ｎＭ）が好ましいと予測される。非常に豊富な腫瘍抗原（細胞あたり５０，０００分子以上）が標的化される場合、低い親和性（＞５０ｎＭ）を有するＣＤ３結合体が好ましい。親和性とは別に評価されるのは、Ｔ細胞に結合した場合には、サイトカインの放出、例えば、サイトカインの放出の減少が望ましい場合には、ＩＬ−２、ＩＦＮγなどの放出を誘導する抗体の傾向であり得る。
【００９６】
別の態様において、ＣＤ３への特異的結合について、本明細書に記載のエピトープに結合する例示的な抗体または機能的フラグメントの１つと競合する抗体が提供される。そのような抗体は、本明細書に例示された抗体の１つと同じエピトープ、または重複するエピトープにも結合することもできる。例示された抗体と同じエピトープと競合または結合する抗体及びフラグメントは、類似の機能特性を示すことが期待される。例示された抗体及びフラグメントは、図１に示される重鎖及び軽鎖、可変領域ドメイン及びＣＤＲを有するものを含む、上記のものを含む。
【００９７】
そのような競合する抗体は、Ｆ２Ｂエピトープに結合し得るが、配列番号１〜１８に示されるもの以外のＣＤＲ配列のセットを含む。重鎖のＣＤＲ配列は、配列番号１〜１８に示されるＣＤＲ配列と実質的に類似しているが同一でなくてもよく、例えば、ＣＤＲ配列における１つのアミノ酸置換、１つのアミノ酸置換、３つのアミノ酸置換、またはそれ以上を含み得、ここで、変化は、１つのＣＤＲ配列、２つのＣＤＲ配列、または３つのＣＤＲ配列において見出され得る。軽鎖配列は、配列番号１９に示されるＣＤＲ配列のセットを含んでもよく、または、異なるセットのＣＤＲ配列を含んでもよい。
【００９８】
エピトープへの結合に直接関与している、または抗体で覆われている残基は、スキャン結果から同定できる。したがって、これらの残基は、抗体が結合する結合領域（複数可）を含むＣＤ３のドメインまたは領域の指標を提供することができる。
【００９９】
Ｆ２Ｂエピトープは、ＣＤ３イプシロン（配列番号２３）：Ｋ７３及びＳ８３、ならびにＣＤ３デルタ（配列番号２４）Ｋ８２及びＣ９３から選択される少なくとも１つの残基への結合によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、エピトープは、Ｋ７３、Ｎ７４、Ｉ７５、Ｇ７６、Ｓ７７、Ｄ７８、Ｅ７９、Ｄ８０、Ｈ８１、Ｌ８２、Ｓ８３によって定義されるＣＤ３イプシロンの領域を含む。いくつかの実施形態において、エピトープは、Ｋ７３及びＳ８３の一方または両方を含む。いくつかの実施形態において、エピトープは、Ｋ８２、Ｅ８３、Ｓ８４、Ｔ８５、Ｖ８６、Ｑ８７、Ｖ８８、Ｈ８９、Ｙ９０、Ｒ９１、Ｍ９２、Ｃ９３によって定義されるＣＤ３デルタの領域を含む。いくつかの実施形態において、エピトープは、Ｋ８２及びＣ９３の一方または両方を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ｂエピトープは、ＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロンの両方の残基を含む立体配座エピトープを含む。いくつかの実施形態において、立体配座エピトープは残基ＣＤ３ε  Ｋ７３及びＳ８３；ＣＤ３δ  Ｋ８２及びＣ９３のそれぞれを含む。いくつかの実施形態において、Ｆ２Ｂエピトープに結合する抗体は、カニクイザルＣＤ３タンパク質と交差反応しない。適切な抗体は、限定されるものではないが、二重特異性抗体としての使用を含み、開発及び使用のために、本明細書に提供されているものから選択され得る。候補タンパク質に対する親和性の決定は、当該分野で公知の方法、例えば、ビアコア測定などを用いて実施され得る。抗体ファミリーのメンバーは、約１０−６〜約１０−１１のＫｄでＣＤ３に対する親和性を有し得、限定されるものではないが、約１０−６〜約１０−１０、約１０−６〜約１０−９、約１０−６〜約１０−８、約１０−８〜約１０−１１、約１０−８〜約１０−１０、約１０−８〜約１０−９、約１０−９〜約１０−１１、約１０−９〜約１０−１０、またはこれらの範囲内の任意の値を含む。親和性の選択は、例えば、インビトロまたは前臨床モデルにおけるＴ細胞の活性化、及び潜在的な毒性の評価に対する生物学的評価を用いて確認され得る。サイトカイン放出の決定は、これらに限定されるものではないが、実施例に記載されているアッセイを含む、任意の便利な方法を用いて評価され得る。
【０１００】
ＭＨペプチド複合体または抗ＴＣＲ／ＣＤ３抗体を結合させることによるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の係合は、Ｔ細胞の活性化を開始する。Ｔ細胞を活性化する抗ＴＣＲ／ＣＤ３抗体の例は、ＯＫＴ３及びＵＣＨＴ１である。これらの抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞上のＣＤ３への結合について交差競合し、Ｔ細胞の活性化アッセイにおいて日常的に使用される。本発明の抗ＣＤ３抗体は、ヒトＣＤ３への結合に対して、ＯＫＴ３と交差競合する。ＣＤ３及びＣＤ３上のエピトープに対する結合親和性に依存して、抗ＣＤ３抗体は、異なる機能的な結果を伴ってＴ細胞を活性化した。低い親和性の抗ＣＤ３抗体を用いたヒトＴ細胞のインビトロのインキュベ−ションは、Ｔ細胞の不完全な活性化、低いＩＬ−２及びＩＬ−１０の産生をもたらした。対照的に、高い親和性のＣＤ３結合剤は、著しく多くのＩＬ−２及び他のサイトカインを産生するように、Ｔ細胞を活性化した。低い親和性の抗ＣＤ３抗体は、いくつかのエフェクター機能、強力な腫瘍の殺傷及びＣＤ６９のアップレギュレーションを選択的に誘導する一方で、ＩＬ−２及びＩＬ−１０の産生のような他のものを誘導しない部分アゴニストと考えられる。ＣＤ３と、認識されたエピトープとの相互作用の強さは、Ｔ細胞の質的に異なる活性化をもたらした。低い親和性の抗ＣＤ３抗体によって活性化されたＴ細胞の最大サイトカインの産生は、高い親和性の抗ＣＤ３抗体による最大活性化よりも低かった。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、同じアッセイにおいて参照抗ＣＤ３抗体と比較した場合、活性化アッセイにおいてＴ細胞と組み合わせた場合に、ＩＬ−２及びＩＬ−１０の一方または両方のより低い放出をもたらし、参照抗体は、ＩＤ３０４７０３（配列番号２２）、または同等の親和性の抗体であり得る。ＩＬ−２及び／またはＩＬ−１０の最大放出は、参照抗体による放出の約７５％未満であり得、参照抗体による放出の約５０％未満であり得、参照抗体による放出の約２５％未満であり得て、参照抗体による放出の約１０％未満であってもよい。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態において、二重特異性抗体または多重特異性抗体が提供され、これは、本明細書中で議論される任意の構成を有し得、限定されるものではないが、三本鎖二重特異性を含む。二重特異性抗体は、少なくともＣＤ３以外のタンパク質に特異的な抗体の重鎖可変領域を含み、重鎖及び軽鎖の可変領域を含んでいてもよい。いくつかのこのような実施形態において、第２の抗体特異性は、腫瘍関連抗原、例えば、インテグリンなどの標的抗原、病原体抗原、チェックポイントのタンパク質などと結合する。限定されるものではないが、一本鎖ポリペプチド、二本鎖ポリペプチド、三本鎖ポリペプチド、四本鎖ポリペプチド、及びそれらの倍数を含む、二重特異性抗体の種々の形態は、本発明の範囲内である。
【０１０２】
ＣＤ３特異的抗体のファミリーは、ヒトＶＨフレームワークにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むＶＨドメインを含む。ＣＤＲ配列は、一例として、配列番号１〜１８に記載の提供される例示的な可変領域配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３について、それぞれ、およそアミノ酸残基２６〜３３、５１〜５８及び９７〜１１２の領域に位置し得る。異なるフレームワーク配列が選択される場合、ＣＤＲ配列は異なる位置にあり得るが、一般に配列の順序は同じままであると当業者によって理解される。
【０１０３】
ファミリー２の抗体のＣＤＲ配列は、以下の配列式を有し得る。Ｘは、可変アミノ酸を示し、以下に示すように特定のアミノ酸であってもよい。
2021508479.tif 000003
ここで、Ｘ５は、任意のアミノ酸であってもよく、いくつかの実施形態において、Ｘ５は、Ｄ、ＡまたはＨであり、いくつかの実施形態において、Ｘ５は、Ｄである。Ｘ６は、任意のアミノ酸であってもよく、いくつかの実施形態において、Ｘ６は、ＤまたはＮであり、いくつかの実施形態において、Ｄ６は、Ｄである。いくつかの実施形態において、ファミリー２の抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ１配列は、配列番号１〜１８、残基２６〜３３のいずれかに記載の配列を含む。
【０１０４】
2021508479.tif 000004
いくつかの実施形態において、ファミリー２の抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ２配列は、配列番号１〜１８、残基５１〜５８のいずれかに記載の配列を含む。
【０１０５】
2021508479.tif 000005
ここで、
Ｘ９’は、任意のアミノ酸であってもよく、いくつかの実施形態において、Ｘ９’は、ＤまたはＳであり、いくつかの実施形態において、Ｘ９’は、Ｄであり、
Ｘ１１’は、任意のアミノ酸であってもよく、いくつかの実施形態において、Ｘ１１’は、ＲまたはＳであり、
Ｘ１２’は、任意のアミノ酸であってもよく、いくつかの実施形態において、Ｘ１２’は、ＬまたはＲである。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ファミリー２の抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ３配列は、式：
2021508479.tif 000006
を有し、Ｘ１１’及びＸ１２’は、上記で定義されている。いくつかの実施形態において、ファミリー２の抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ３配列は、配列番号１〜１８、残基９７〜１１２のいずれかに記載の配列を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ＶＨドメインは、軽鎖可変領域ドメインと対になる。このようないくつかの実施形態において、軽鎖は、固定された軽鎖である。いくつかの実施形態において、軽鎖は、ヒトＶＬフレームワークにおいて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有するＶＬドメインを含む。ＣＤＲ配列は、配列番号１９に含まれるものであってもよい。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ１配列は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３について、それぞれ、アミノ酸残基２７〜３２、５０〜５２、８９〜９７を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ファミリー２の抗体のＣＤＲ配列は、配列番号１〜１８のいずれか１つに記載のＣＤＲ配列またはＣＤＲ配列のセットに対して、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９９％の同一性を有する配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のＣＤＲ配列は、配列番号１〜１８のいずれか１つのＣＤＲ配列またはＣＤＲ配列のセットに対して、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換（複数可）は、上記の式に対して、ＣＤＲ１の５位または１０位、ＣＤＲ２の２位、６位または７位、ＣＤＲ３の１位、８位、９位または１０位の１つ以上である。
【０１０９】
本発明のタンパク質が二重特異性抗体である場合、一方の結合部分、すなわち、ＶＨ／ＶＬの組合せまたはＶＨのみがヒトＣＤ３に特異的であるが、他方のアームは、卵巣癌、乳癌、胃腸管、脳腫瘍、頭頸部癌、前立腺癌、結腸癌、及び肺癌などの細胞のようながん細胞を含む標的細胞、ならびに、白血病、リンパ腫、肉腫、癌腫、神経細胞腫瘍、扁平上皮細胞癌、胚細胞腫瘍、転移、未分化腫瘍、精上皮腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、混合細胞腫瘍、及び感染性因子による新生物形成、及び他の悪性腫瘍を含むＢ細胞腫瘍のような血液腫瘍、病原体に感染した細胞、炎症及び／または自己免疫を引き起こす自己反応性細胞に対して特異的であり得る。非ＣＤ３部分はまた、本明細書に記載されるように、免疫調節タンパク質に特異的であり得る。
【０１１０】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞に比較的限定されているが、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）は、腫瘍細胞に対して独特である。ＴＳＡ及びＴＡＡは、典型的には、主要組織適合複合体の一部として、細胞表面上に発現される細胞内分子の部分である。
【０１１１】
組織特異的な分化抗原は、腫瘍細胞及びその正常細胞の対応物上に存在する分子である。治療用のｍＡｂによって認識されることが知られている腫瘍関連抗原は、いくつかの異なるカテゴリ−に分類される。造血分化抗原は、通常、分化（ＣＤ）分類群に関連する糖タンパク質であり、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３及びＣＤ５２を含む。細胞表面の分化抗原は、正常及び腫瘍細胞の両方の表面に見出される、糖タンパク質及び炭水化物の多様な群である。増殖及び分化シグナル伝達に関与する抗原は、しばしば増殖因子及び成長因子受容体である。がん患者における抗体の標的である成長因子には、ＣＥＡ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ１としても知られている）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２としても知られている。）、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ（ＨＧＦＲとしても知られている。）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、エフリン受容体Ａ３（ＥＰＨＡ３）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａとしても知られている。）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂとしても知られている）及び核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦＳＦ１１としても知られている。）が含まれる。血管新生に関与する抗原は、通常、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３及びインテグリンα５β１を含む、新しい微小血管系の形成を支持するタンパク質または成長因子である。腫瘍間質及び細胞外マトリックスは、腫瘍にとって不可欠な支持構造である。治療標的である間質及び細胞外マトリックス抗原には、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びテネイシンが含まれる。
【０１１２】
二重特異性立体配置で有用な治療用抗体の例としては、限定されるものではないが、リツキシマブ、イブリツモマブ、チウキセタン、トシツモマブ、ブレンツキシマブ、ベドチン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、アレムツズマブ、ＩＧＮ１０１、アデカツムマブ、ラベツズマブ、ｈｕＡ３３、ペムツモマブ、オレゴボマブ、ＣＣ４９（ミンレツモマブ）、ｃＧ２５０、Ｊ５９１、ＭＯｖ１８、ＭＯＲＡｂ−００３（ファレツズマブ）、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ＩｇＮ３１１、ベバシズマブ、ＩＭ−２Ｃ６、ＣＤＰ７９１、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、８０６、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＭＭ−１２１、ＡＭＧ１０２、ＭＥＴＭＡＢ、ＳＣＨ９００１０５、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ  ７５１８７１、ＫＢ００４、ＩＩＩＡ４、マパツムマブ（ＨＧＳ−ＥＴＲ１）、ＨＧＳ−ＥＴＲ２、ＣＳ−１００８、デノスマブ、シブロツズマブ、Ｆ１９、及び８１Ｃ６が挙げられる。
【０１１３】
臨床的がん免疫療法、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られている）及びプログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても知られている）の状況において最も活発に研究されている免疫チェックポイント受容体は、両方とも阻害性受容体である。これらの受容体のいずれかを遮断する抗体の臨床活性は、抗腫瘍免疫が複数のレベルで増強され得、コンビナトリアルストラテジ−が機械論的考察及び前臨床モデルによって指導的に設計され得ることを意味する。
【０１１４】
ＰＤ１の２つのリガンドは、ＰＤ１リガンド１（ＰＤＬ１、Ｂ７−Ｈ１及びＣＤ２７４としても知られている）及びＰＤＬ２（Ｂ７−ＤＣ及びＣＤ２７３としても知られている）である。ＰＤＬ１は、がん細胞上で発現され、Ｔ細胞上のその受容体ＰＤ１に結合することにより、Ｔ細胞活性化／機能を阻害する。
【０１１５】
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３、ＣＤ２２３としても知られている）、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても知られている）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ、ＣＤ２７２としても知られている）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３、ＨＡＶｃｒ２としても知られている）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、及びキラー阻害性受容体のファミリーは、それぞれ、リンパ球活性の阻害、及び場合によってはリンパ球アネルギーの誘導に関連している。これらの受容体の抗体の標的化は、本発明の方法において使用され得る。
【０１１６】
免疫共刺激分子を作動させる薬剤も、本発明の方法において有用である。そのような薬剤には、アゴニストまたはＣＤ４０及びＯＸ４０が含まれる。ＣＤ４０は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に見出される共刺激タンパク質であり、それらの活性化に必要とされる。これらのＡＰＣには、食細胞（マクロファージ及び樹状細胞）ならびにＢ細胞が含まれる。ＣＤ４０は、ＴＮＦ受容体ファミリーの一部である。ＣＤ４０に対する主要な活性化シグナル伝達分子は、ＩＦＮγ及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）である。ＣＤ４０による刺激は、マクロファージを活性化する。
【０１１７】
目的の抗ＣＣＲ４（ＣＤ１９４）抗体は、潜在的な抗炎症活性及び抗腫瘍活性を有するＣ−Ｃケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に対するヒト化モノクローナル抗体を含む。ＣＣＲ２は、炎症性マクロファージ上に発現され、これは様々な炎症状態、例えば、リウマチ性関節炎において見出され得、また、腫瘍促進マクロファージで発現していると同定されている。ＣＣＲ２は、調節性Ｔ細胞でも発現され、ＣＣＲ２リガンドであるＣＣＬ２は、調節性Ｔ細胞の腫瘍への動員を媒介する。調節性Ｔ細胞は、抗腫瘍Ｔ細胞の応答を抑制し、したがって、それらの阻害または欠乏が望まれる。
【０１１８】
本発明のタンパク質の産生
抗体は、化学合成によって調製され得るが、典型的には、例えば、単一の組み換え宿主細胞においてタンパク質を構成するすべての鎖の共発現、または重鎖ポリペプチド及び抗体（例えば、ヒト抗体）の共発現などの組換えＤＮＡ技術の方法によって産生される。さらに、抗体の重鎖及び軽鎖は、単一のポリシストロニック発現ベクターを用いて、発現させることもできる。個々のポリペプチドの精製は、親和性（プロテインＡ）クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び／または疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの標準的なタンパク質精製技術を用いて達成される。二重特異性物質はサイズ及び疎水性において十分に異なり、精製は標準的な手順を用いて実施され得る。
【０１１９】
単一の宿主細胞において産生される抗体及び重鎖ポリペプチドの量は、例えば、自己相補的な相互作用を導入することによって、ホモ二量体化がヘテロ二量体化よりも有利であるように、抗体及び重鎖の定常領域の操作を通じて、最小限に抑えられ得る（例えば、「腔内への突出」戦略など（ＷＯ９６／２７０１１を参照されたい）の可能性については、ＷＯ９８／５０４３１を参照されたい）。したがって、本発明の別の態様は、組換え宿主細胞において、二重特異性物質を産生する方法を提供することであって、方法は、組換え宿主細胞において、少なくとも２つの重鎖ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させるステップを含み、重鎖ポリペプチドは、ホモ二量体形成を減少または防止するが、二重特異性形成を増加させるのに十分にそれらの定常領域において異なる。
【０１２０】
タンパク質が３つの鎖（例えば、ＦｌｉｃＡｂ）を含む場合、これらは、単一の組換え宿主細胞において分子を構成する３つの鎖（２つの重鎖及び１つの軽鎖）の共発現によって産生され得る。
【０１２１】
本明細書のタンパク質の組換え産生のために、すべての鎖をコードする１つ以上の核酸、例えば、２、３、４などが単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。多くのベクターは、利用可能である。ベクター成分は、限定されるものではないが、一般的に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含む。
【０１２２】
好ましい実施形態において、本発明の方法による宿主細胞は、上記宿主細胞において一本鎖をコードする核酸分子の増幅を必要としないで、高レベルのヒト免疫グロブリン、すなわち、少なくとも１ｐｇ／細胞／日、好ましくは、少なくとも１０ｐｇ／細胞／日、より好ましくは、少なくとも２０ｐｇ／細胞／日、またはそれ以上の発現が可能である。
【０１２３】
薬学的組成物
本発明の別の態様は、適切な薬学的に許容される担体と混合した本発明の１つ以上のタンパク質を含む医薬組成物を提供することである。本明細書で使用される薬学的に許容される担体は、限定されるものではないが、アジュバント、固体担体、水、緩衝液、もしくは治療成分を保持するために当該技術分野で使用される他の担体、またはそれらの組み合わせを例示する。
【０１２４】
本発明に従って使用されるタンパク質の治療用製剤は、所望の純度を有するタンパク質を、例えば、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって保存用に調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．（１９８０）を参照されたい）。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコ−ス、マンノ−スまたはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレ−ト剤、スクロ−ス、マンニト−ル、トレハロ−スまたはソルビト−ルのような糖類、ナトリウムのような塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２５】
抗ＣＤ３抗体製剤は、例えば、米国特許公開第２００７００６５４３７号に開示されており、その全体の開示は、本明細書に具体的に参考として援用される。同様の製剤は、本発明のタンパク質に使用され得る。そのような製剤の主成分は、３．０〜６．２の範囲で有効なＰＨ緩衝剤、塩、界面活性剤、及び抗ＣＤ３特異性を有する有効量の二重特異性物質である。
【０１２６】
使用方法
特に、抗原結合性組成物が治療される状態に適した多重特異性抗体である場合、例えば、関連するがん細胞の治療のために、１つの結合部分（関連する感染症の治療のために、目的の病原体に対する特異的な結合部分など）が腫瘍関連抗原に特異的に結合する場合、標的細胞を本発明の抗原結合性組成物と接触させることを含むレジメンにおいて、限定されるものではないが、感染症、自己免疫疾患、原発性または転移性がんなどを含む疾患を治療または軽減するための方法が提供される。そのような方法は、治療有効量または本発明の有効量の薬剤を、治療を必要とする対象に投与することを含み、限定されるものではないが、試薬と化学療法剤、放射線療法、または手術との組合せを含む。
【０１２７】
疾患の治療のための本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトなのか動物なのかどうか、他の薬が投与されているのかどうか、また、治療が予防的なのか治療的なのかどうか、を含む多くの異なる要因によって異なる。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳動物（例えば、犬、猫、馬などのコンパニオン動物、ウサギ、マウス、ラットなどの実験哺乳動物など）にも治療され得る。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために漸増され得る。
【０１２８】
投与レベルは、通常の技能を有する臨床医によって容易に決定され得、必要に応じて、例えば、治療に対する対象の応答を修正するために必要に応じて変更され得る。単一剤形を製造するために、担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主、及び特定の投与方法に応じて変わる。投薬単位形態は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、薬剤の治療用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な治療レジメンは、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明の治療物質は、通常、複数の機会に投与される。単回投与間の間隔は、毎週、毎月、または毎年であり得る。間隔は、患者の治療物質の血中濃度を測定することによって示されるように、不規則であってもよい。あるいは、本発明の治療物質は、徐放性処方物として投与され得、この場合、より少ない投与回数が必要とされる。投薬量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に依存して変化する。
【０１３０】
予防的な用途において、比較的低用量が、比較的まれな間隔で長期間にわたって投与され得る。一部の患者は、残りの生活のために治療を受け続けている。他の治療的な用途において、疾患の進行が減少または終息するまで、また、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされることがある。その後、患者は、予防的な管理体制で投与され得る。
【０１３１】
さらに他の実施形態において、本発明の方法は、癌腫、白血病及びリンパ腫などの血液癌、黒色腫、肉腫、神経膠腫などのがんの腫瘍増殖、腫瘍転移または腫瘍浸潤の治療、軽減または予防を含む。予防的な用途のために、医薬組成物または医薬は、疾患（疾患の進行中に現れるその合併症及び中間の病理学的表現型）の生化学的症状、組織学的症状、及び／または行動症状を含む、疾患のリスクを排除または低減し、疾患の重症度を軽減し、または疾患の発症を遅らせるのに十分な量において、疾患のリスクを冒しやすいまたはそうでなければ疾患のリスクがある患者に投与される。
【０１３２】
病気の治療のための組成物は、非経口、局所、静脈内、腫瘍内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内の手段によって投与され得る。典型的な投与経路は、静脈内または腫瘍内であるが、他の経路も同等に有効であり得る。
【０１３３】
典型的には、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され、注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適した固体形態もまた調製され得る。調製物は、上記のように、増強されたアジュバント効果のために、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはコポリマーのようなリポソ−ムまたはミクロ粒子に乳化またはカプセル化され得る（Ｌａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７，  １９９０、及びＨａｎｅｓ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７−１１９，  １９９７）。本発明の薬剤は、活性成分の持続放出またはパルス放出を可能にするような様式で製剤化され得る、デポー注射またはインプラント調製の形態で投与され得る。医薬組成物は、一般に、無菌で、実質的に等張性で、米国食品医薬品局のすべての医薬品製造管理及び品質管理基準（ＧＭＰ）規則に完全に適合して製剤化される。
【０１３４】
本明細書に記載のタンパク質の毒性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に致命的な用量）を決定することによって、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するために、毒性でない用量範囲を製剤化する際に使用され得る。本明細書に記載のタンパク質の用量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形態及び利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。正確な製剤、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る。
【０１３５】
医薬組成物は、投与方法に依存して、種々の単位剤形で投与され得る。例えば、経口投与に適した単位剤形は、限定されるものではないが、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、及びロゼンジを含む。本発明の組成物は、経口投与された場合、消化から保護されるべきであると認識される。これは、典型的には、分子を組成物と複合させて、それらを酸性及び酵素的加水分解に耐性にすることにより、または分子をリポソ−ムまたは保護バリアなどの適切に耐性のある担体にパッケージすることによって達成される。消化から薬剤を保護する手段は、当該技術分野において周知である。
【０１３６】
投与のための組成物は、通常、薬学的に許容される担体、好ましくは、水性担体に溶解された抗体または他のアブレーション剤を含む。種々の水性担体、例えば、緩衝食塩水などが使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般的に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌してもよい。組成物は、ＰＨ調節剤及び緩衝剤、毒性調整剤などの、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのような生理学的条件に近似するのに必要な薬学的に許容される補助物質を含み得る。これらの製剤における活性剤の濃度は、広く変動し得、また、選択された特定の投与様式、及び患者の必要性にしたがって、主に体液量、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，  １９８０）、及びＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｌｍａｎ，  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９６））。
【０１３７】
本発明の範囲内には、本発明の活性剤及びその製剤を含むキット、ならびに使用説明書もある。キットは、少なくとも１つのさらなる試薬、例えば、化学療法薬などをさらに含み得る。キットには、典型的には、キットの内容物の意図された使用を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キットの上またはキットと共に供給されるか、そうでなければキットに付随する任意の記述物または記録された資料を含む。
【０１３８】
組成物は、治療的処置のために投与され得る。組成物は、上記のように、標的細胞を実質的に切除するのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに十分な量は、全体的な生存率の改善をもたらし得る「治療上有効な用量」として定義される。組成物の単回投与または複数回投与は、患者によって必要とされ、かつ許容される投与量及び頻度に依存して投与され得る。治療に必要な特定の用量は、哺乳動物の病状及び病歴、ならびに年齢、体重、性別、投与経路、効率などの他の要因に依存する。
【０１３９】
本発明を十分に説明したが、本発明の精神または範囲を逸脱することなく、様々な変更及び修正を加えることができることは当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１４０】
実施例１：重鎖のみの抗体を発現する遺伝子操作されたラット
ヒトＩｇＨ遺伝子座を、ヒトＶＨ６−Ｄ−ＪＨ領域の下流に連結したラットＣ領域遺伝子の改変及び連結を含むいくつかの部分で構築し、組み立てた。次いで、ヒトＶＨ遺伝子の別々のクラスターを有する２つのＢＡＣを、組み立てられた（ヒトＶＨ６−Ｄ−ＪＨ−ラットＣ）断片をコードするＢＡＣと同時に注入した。
【０１４１】
人工重鎖免疫グロブリン遺伝子座を再配置されていない状態で保有するトランスジェニックラットを作製した。含まれる定常領域の遺伝子は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及び３’エンハンサーをコードする。トランスジェニックラットのＲＴ−ＰＣＲ及び血清解析（ＥＬＩＳＡ）は、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座の生産的再編成、及び血清における種々のアイソタイプの重鎖のみの抗体の発現を明らかにした。トランスジェニックラットを、米国特許公開第２００９／００９８１３４  Ａ１号に以前に記載されている突然変異した内因性重鎖及び軽鎖の遺伝子座を有するラットと交配させた。そのような動物の解析は、ラット免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の発現の不活性化、ならびにヒトＶ、Ｄ及びＪ遺伝子によってコードされる可変領域を有する重鎖抗体の高レベルの発現を示した。トランスジェニックラットの免疫化は、抗原特異的な重鎖抗体の高力価の血清反応の産生をもたらした。ヒトＶＤＪ領域を有する重鎖抗体を発現するこれらのトランスジェニックラットは、ＵｎｉＲａｔｓと呼ばれた。
【０１４２】
実施例２：固定された軽鎖抗体を発現する遺伝子操作されたラット
トランスジェニックヒト抗体レパートリーは、固有のＬ鎖と組み合わせて、多様な（ＶＨ−Ｄ−ＪＨ）ｎ再編成を有するＨ鎖から生成された。このために、再編成したＬ鎖ヒトＶｋ−Ｊｋ１−ＣｋをＤＮＡマイクロインジェクションによりラット生殖系列に組み込み、得られたトランスジェニック動物を、ヒトＨ鎖レパートリーを天然に発現する以前に記載されたラット株で飼育した（Ｏｓｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。この新しいラット株は、ＯｍｎｉＦｌｉｃと命名された。
【０１４３】
多くの異なる抗原を用いたＯｍｎｉＦｌｉｃラットの免疫は、同じＩｇＨ遺伝子座を有する他のトランスジェニックラットと同様の、高レベルの抗原特異的ＩｇＧを産生した。ＲＴ−ＰＣＲによるレパートリー解析は、高い転写物及びタンパク質レベルで、非常に可変性の高いＶＨ遺伝子再編成を同定した。さらに、高レベルでも発現しているＬ鎖生成物は１つだけ同定された。
【０１４４】
ＯｍｎｉＦｌｉｃ由来の抗原特異的結合剤は、ＮＧＳ及びｃＤＮＡライブラリー（酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、ファージ）からの選択によって得られ、配列決定の際に、多様なＨ鎖の転写物が同定された。哺乳動物細胞における発現のために、超変異型Ｈ鎖構築物を元のトランスジェニックＩｇｋ配列と組み合わせてトランスフェクトした。この再編成されたＶｋ−Ｊｋ１−Ｃｋでは、突然変異の変化は認められず、モノクローナルヒトＩｇＧを生成するために、常に同じＬ鎖が種々のＨ鎖生成物と共に発現された。
【０１４５】
実施例３：トランスジェニックラットにおける抗原特異的抗体の生成
ラットにおける抗原特異的重鎖抗体の生成のために、遺伝子操作されたラットを２つの方法で免疫化した。
【０１４６】
ＰＤ−Ｌ１及びＢＣＭＡの組換え細胞外ドメインを用いた免疫化。ＰＤ−Ｌ１及びＢＣＭＡの組換え細胞外ドメインをＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、滅菌生理食塩水で希釈し、アジュバントと組み合わせた。免疫原は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、またはＴｉｔｅｒｍａｘ及びＲｉｂｉアジュバントのいずれかと組み合わせたものであった。ＣＦＡまたはＴｉｔｅｒｍａｘにおける免疫原を用いた最初の免疫（プライミング）を左右の脚に投与した。ＣＦＡにおける免疫原を用いた最初の免疫の後、ＩＦＡで２回以上の免疫（追加免疫）、またはＲｉｂｉで４回以上の免疫、及びＴｉｔｅｒｍａｘでもう１回の免疫を各脚に投与した。この一連の免疫は、高い親和性の抗体を産生するＢ細胞の発生をもたらす。免疫原の濃度は、１脚あたり１０マイクログラムであった。血清力価を決定するために、最終採血時にラットから血清を採取した。
【０１４７】
抗ヒトＣＤ３δε抗体の生成のために、遺伝子操作されたラットを、ＤＮＡベースの免疫化プロトコールを用いて免疫化した。ＯｍｎｉＦｌｉｃラットを、ＧＥＮＯＶＡＣ抗体技術を用いて、Ａｌｄｅｖｒｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆａｒｇｏ、ＮＤ）でヒト及びカニクイザルのＣＤ３−イプシロン／デルタ構築物で免疫化した。最終的な追加免疫及びＲＮＡ単離後に、流入領域リンパ節を採取した。ｃＤＮＡの合成後、ＩｇＨ重鎖抗体のレパートリーは、次世代シークエンシング及び独自のソフトウェアによって特徴付けられた。抗原特異的な陽性選択の証拠を示す候補抗原特異的なＶＨ配列を選択した。ＦｌｉｃＡｂＳをコードする数百のＶＨ配列を遺伝子組換えのために選択し、発現ベクターにクローニングした。続いて、フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡによる解析のために、完全ヒトヒトＦｌｉｃＡｂ  ＩｇＧ１抗体をＨＥＫ細胞において発現させた。フローサイトメトリーにより、初代ヒトＴ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞への結合について、ヒトＦｌｉｃＡｂを試験した。さらに、ＥＬＩＳＡにおいて、組換えＣＤ３δεタンパク質を用いて、ヒトＦｌｉｃＡｂを試験した。ヒトＴ細胞に対する陽性結合を有するすべてのＦｌｉｃＡｂを図１に列挙する。Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、選択された配列をさらに特徴化した。
【０１４８】
実施例４：Ｔｒｅｇ細胞の活性化の分析
ＣＤ６９は、刺激によりアップレギュレートされるＴ細胞の細胞表面マーカーである。この実験では、Ｂｉｏｃｏｌ（１．０７７ｇ／ｍｌ密度）と標準的な方法を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をバフィーコートから単離した。単離したＰＢＭＣを完全培地中で４８時間、２×１０７細胞／ｍｌで前培養し、洗浄し、完全培地中で１０６細胞／ｍｌに再懸濁した。これらの細胞を、組換えＢＣＭＡタンパク質でコーティングされたＦＡＣＳチューブ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で２４時間インキュベートした。チューブは、組換えＢＣＭＡタンパク質を１０マイクログラム／ｍｌで一晩プレコートした。
【０１４９】
細胞を洗浄し、Ｔ細胞の異なるサブセット、すなわち：（１）ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔ４−抗ｈｕＣＤ４−ＥＣＤ）、（２）ＣＤ８陽性Ｔ細胞（抗ｈｕＣＤ８−ＡＦ７００）、及び（３）ＣＤ４、ＣＤ２５、及び細胞内マーカーＦｏｘ−ｐ３に対する陽性によって定義されるＴｒｅｇ細胞（抗ｈｕＣＤ２５−ＰＥＣｙ７、抗Ｆｏｘｐ３−ＡＦ６４７、抗ｈｕＣＤ２５−ＰＥＣｙ７、全ての抗体はＢｅｃｋｍａｎから入手した）、に対する特異的な抗体で染色した。適切なテンプレートを使用して、Ｃｙｔｏｆｌｅｘフローサイトメーターで細胞を分析した。現在利用可能な抗ＣＤ３二重特異性分子とは対照的に、ＴＮＢ−３８３ＢはＴｒｅｇ細胞よりもＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に活性化する。免疫抑制細胞タイプであるＴｒｅｇ細胞の活性化を防ぐことで、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能を強化し、腫瘍標的の免疫破壊を増加させることができる。データを図３及び４に示す。
【０１５０】
実施例５：ＣＤ３デルタ／イプシロン  Ｆｃ融合タンパク質の発現及び精製
図５に示される組換え抗原ＣＤ３イプシロン（配列番号２３、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）残基２２〜１０５）及びＣＤ３デルタ（配列番号２４、ＥＣＤ残基２３〜１２６）は、マウスＩｇＧ１  Ｆｃとインフレームでクローン化され、一過性に共発現され、ＣＨＯ細胞培養培地から精製された。ＣＤ３イプシロンサブユニットに追加されたＣ末端Ｈｉｓタグは、標準プロトコールを使用したＩＭＡＣによるＣＤ３デルタ／イプシロン複合体のアフィニティーキャプチャーとイミダゾールによる溶出に使用された。配列ＥＰＥＡ（Ｃタグ）を含む第２の精製アフィニティータグをＣＤ３デルタサブユニットのＣ末端に付加した。
【０１５１】
実施例６：ｍＡｂ  ＣＤ３  Ｆ２Ｂのエピトープマッピング
表面残基の標識化
エピトープマッピングは、アミノ酸ヒスチジン、リジン、チロシン、システイン、セリン、トレオニン、及び遊離のＮ末端アミノ基のアクセス可能な側鎖と共有結合的に反応するジエチルピロカーボネートＤＥＰＣ（参照）で標識した表面残基によって達成された。複合体形成を促進するために、３０：１の抗体：抗原のモル比でＤＥＰＣ標識を行った。ＤＥＰＣ標識抗体−抗原複合体をＣａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｃ−ｔａｇアフィニティーマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でキャプチャーし、過剰な抗体を徹底的に洗浄して除去した。親和性樹脂結合ＣＤ３デルタ／イプシロンは、トリプシン、キモトリプシン、及びエンドペプチダーゼＧｌｕ−Ｃで消化する前に、標準的な還元法及びアルキル化法にかけられた。放出されたペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ＣＤ３抗体Ｆ２Ｂの非存在下で同じＤＥＰＣ標識化実験を行い、続いてアフィニティキャチャー、還元／アルキル化、プロテアーゼ消化を行った。各消化は三重に行われた。ｍＡｂ  ＣＤ３  Ｆ２Ｂの非存在下での質量分析に由来する配列カバレッジは高く、図６に示されている。
【０１５２】
ＣＤ３デルタ／イプシロンのＤＥＰＣ標識は、ｍＡｂ  ＣＤ３  Ｆ２Ｂ（配列番号１の重鎖と配列番号１９の軽鎖）の結合によって影響を受ける。標識化中にｍＡｂ  ＣＤ３Ｆ２Ｂが存在するため大幅に削減されるＤＥＰＣ修飾残基について、３つのタンパク質分解消化物から得られたペプチドを分析した。図７は、代表例としてエンドペプチダーゼＧｌｕ−Ｃによる消化から得られた影響を受けたペプチドを示す。
【０１５３】
アミノ酸残基の標識への影響は、ａ）ＤＥＰＣ取り込みの減少が１５倍を超え、ｂ）３つの消化物のうち少なくとも２つで検出された場合、重要であるとみなされる。影響を受けたＣＤ３イプシロンペプチドを図７に示す。キモトリプシン及びＧｌｕ−Ｃペプチドの両方で、Ｌｙｓ７３に一貫した重要な標識化の影響が観察された。さらに、Ｇｌｕ−ＣペプチドＩ５７〜Ｅ８６及びＤ８０〜Ｅ８６は、ｍＡｂ  Ｆ２Ｂのエピトープがイプシロン鎖内の少なくともリジン８５にまで及ぶというさらなる証拠を提供する。
【０１５４】
影響を受けたＣＤ３デルタペプチドも見出された。１つの標識の影響を受けた配列ストレッチは、３つ消化セットのそれぞれに共通であった。これらのデータは、リジン８２からシステイン９３へのｍＡｂ  Ｆ２Ｂのエピトープを示唆する。図８は、ＣＤ３デルタタンパク質で同定されたエピトープを示す（影付き）。図９は、それぞれのＣＤ３サブユニットの影響を受けた残基をスペース充填モードで示しているＣＤ３デルタ／イプシロン（ＰＤＢ  ＩＤコード１ＸＩＷ、Ａｒｎｅｔｔ  Ｋ．  ｅｔ．ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００４；１０１（４６）：１６２６８−１６２７３）の結晶構造を示す。
【０１５５】
実施例７：ＣＤ３ファミリー２抗体は、ＯＫＴ３及びＳＰ３４とは異なるエピトープを認識する
同じエピトープマッピングアプローチを使用して、治療用抗体ＯＫＴ３とＣＤ３デルタ／イプシロンの間の既知の相互作用（Ｓａｌｍｅｒｏｎ，  Ａ．，  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ，  Ｆ．，  Ｕｒｓａ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｆｒｅｓｎｏ，  Ｍ．  ＆  Ａｌａｒｃｏｎ，  Ｂ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７，  ３０４７−３０５２）を確認した。交差反応性抗体ＳＰ−３４も特徴付けられている（米国特許第８，２３６，３０８号、２０１２年）。この抗体は、ＣＤ３イプシロンの拡張Ｅ−Ｆループ内のエピトープを認識し、結合にＣＤ３デルタを必要としない。
【０１５６】
出願者らのデータセットは、ＣＤ３抗体Ｆ２ＢがＯＫＴ３及びＳＰ−３４と比較して、異なるエピトープに結合することを確認する。図１０は、ヒト及びカニクイザルのＥＣＤのアライメントを示す。本明細書で提供されるＣＤ３  ｍＡｂは、カニクイザルのホモログにはないループに結する。これにより、これらの抗体がＣＤ３複合体に対してサルの交差反応性を示さない理由がさらに説明される。さらに、ＯＫＴ３もＳＰ−３４もＣＤ３デルタと直接結合しない。
【０１５７】
実施例は、当業者に本発明の製造方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示され、また、本発明者らがそれらの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が全部または唯一実施される実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。特記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、また、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１５８】
本発明をその特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の真の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更を加えたり等価物を代替したりすることができることは当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップまたは複数のステップを本発明の目的、精神及び範囲に適合させるために、多くの修正を加えてもよい。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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