(57)【要約】  新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物において使用するための栄養組成物として舌リパーゼまたは別の前胃エステラーゼを含有する組成物および方法が開示されている。組成物は、独立した飼料として、または乳への添加物、乳または代替物として使用され得る。組成物は、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する任意の年齢の哺乳動物のための微量栄養素、主要栄養素および生物活性を有する食事成分も含み得る。哺乳動物には、反芻動物、ブタ、ウマ、ラクダ類、イヌ、ネコまたはヒトが含まれる。栄養補助剤としての舌リパーゼまたは前胃エステラーゼは、脂肪を効果的に消化できない哺乳動物における脂肪の消化を大幅に改善し得る。舌リパーゼまたはエステラーゼは、好ましくは動物由来である。組成物は、乳脂肪、ミセルカゼイン、乳清、非変性タンパク質およびラクトース源を含有し得る。組成物を用いて脂肪消化不良を処置する方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせ
ｂ．乳脂肪；ならびに
ｃ．プロバイオティクスおよびプレバイオティクス；
の組み合わせを含む栄養組成物。
【請求項２】
ａ．舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせ
ｂ．乳脂肪；ならびに
ｃ．プロバイオティクスおよびプレバイオティクス；
の組み合わせを含む栄養組成物であって、
前記組成物が、好ましくは、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物に投与される、上記栄養組成物。
【請求項３】
ａ．舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせ
ｂ．乳脂肪；ならびに
ｃ．プロバイオティクスおよびプレバイオティクス；
の組み合わせを含む、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物用の栄養組成物。
【請求項４】
前記前十二指腸リパーゼまたはエステラーゼが哺乳動物源に由来する、または生合成的に産生された哺乳動物由来タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記前十二指腸リパーゼまたはエステラーゼがリパーゼ活性のために補因子を必要としない、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物が反芻動物、ブタ、ウマ、ラクダ類、イヌ、ネコまたはヒトである、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項７】
前記哺乳動物が、ウシ、バッファロー、シカ、ヤギおよびヒツジから選択される反芻動物である、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項８】
前記哺乳動物が４８時間齢未満である、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項９】
前記哺乳動物が脂肪を効果的に消化することができないことを患っている、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項１０】
前記哺乳動物が、脂肪を効果的に消化することができないことによる栄養失調を患っている、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、前記哺乳動物と同じ種または哺乳動物の異なる種からの乳をさらに含む、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項１２】
前記組成物が人工乳をさらに含む、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、ケルプ（ｋｅｌｐ）、オメガ−３脂肪酸の１つまたは複数から選択される添加物をさらに含む、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項１４】
哺乳動物の脂肪消化不良の処置のための組成物の製造における、舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせ、乳脂肪、プロバイオティクスおよびプレバイオティクスの使用。
【請求項１５】
ａ．舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせ
ｂ．乳脂肪；
ｃ．プロバイオティクスおよびプレバイオティクス；ならびに
ｄ．ミセルカゼインもしくは非変性乳清タンパク質または両方；
の組み合わせを含む、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物用の栄養組成物。
【請求項１６】
ラクトースをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ビタミンサプリメント、ミネラルサプリメントもしくはオメガ−３脂肪酸サプリメントまたはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１５に記載の組成物を含む、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物用の完全代用乳。
【請求項１９】
前記哺乳動物が新生児である、請求項１、２、３または１５のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２０】
前記哺乳動物が成熟しており、脂肪消化不良を患っている、請求項１、２、３または１５のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２１】
請求項１、２、３または１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物のための液体栄養組成物。
【請求項２２】
請求項１、２、３または１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物のための乳または代用乳に添加される栄養補助剤。
【請求項２３】
請求項１、２、３または１５のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物に給餌することを含む、哺乳動物における脂肪消化不良を処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月２４日に出願された米国特許出願第６２７０２４４２号、および２０１９年３月２１日に出願された米国特許出願第６２８２１６０４号の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、発育不全、脂肪消化不良に関連する医学的状態、栄養的ストレス、早産および術後回復症状を経験している哺乳動物に給餌するための、舌および前胃（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ）エステラーゼを含むリパーゼを含有する組成物および方法に関する。この組成物は、乳房（ｂｒｅａｓｔ）または乳房（ｕｄｄｅｒ）で自然に哺乳されていない新生児（ｎｅｏｎａｔｅ）、および脂肪消化不良を有するより成熟した哺乳動物において特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物による脂肪の消化には、いくつかの種類のリパーゼ酵素のいずれかが必要である。脂肪を消化できないことは栄養失調につながる可能性があり、特定の集団では、これは深刻な問題となり得る。
【０００４】
新生哺乳動物の乳児（新生児）の場合、脂肪の消化は重要であるが、何らかの理由で新生児が母親の乳房（ｂｒｅａｓｔ）または乳房（ｕｄｄｅｒ）で天然乳を授乳しない場合には、生理学的な問題となり得る。すべての哺乳動物の乳児は、出生直後に脂肪の消化を開始する必要があるが、自然な授乳がないと、脂肪の消化に必要とされるリパーゼが十分な量で利用できないことがあり得、脂肪の消化ははるかに非効率である。早期の脂肪消化の不足は、新生児の栄養失調および発育不全を引き起こし得る。脂肪の消化から生じる遊離脂肪酸は、栄養であるとともに、胃の規定要素（ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ）であって、望ましくない生物に対して選択的、保護的および阻害的であり、これによって腸内マイクロバイオームの確立を規定する要素でもある。これは、人間にとって重大な社会的問題であり、家畜にとっても重大な経済的問題となり得る。
【０００５】
関連する問題は、嚢胞性線維症、膵臓リパーゼ不全、非アルコール性脂肪肝、アルコール性脂肪肝または術後状症状などの、他の脂肪消化不良症状を有するヒトまたは哺乳動物である。
【０００６】
新生児哺乳動物の場合、新生児（ヒトまたは動物）が子宮から外界に移行するにつれて、消化管は栄養を与えるために活性化しなければならない。この時点でいくつかのことが起こる。新生児は、子宮内の高炭水化物栄養から、脂肪の形態で消化管を介してその栄養の多くを摂取するように移行する必要がある。新生児は、すべての動物において消化を補助するために極めて重要である消化管細菌を有さず、ほとんどの種で、新生児の消化管は小さく、少なくとも数日間は未成熟である。
【０００７】
出産後に母親によって産生される最初の牛乳が初乳であり、極めて濃縮された少量の形態で栄養素を供給する。ほとんどの種では、初乳は新生児を疾病から保護するための抗体を含有し、ほとんどの種において、通常の乳よりも高いタンパク質含有量を有する。通常の乳と比較した初乳の脂肪含有量は種によって異なり、一部の種ではより高く、他の種ではより低い。
【０００８】
「脂肪」という用語は、トリグリセリドとも呼ばれるトリアシルグリセロールまたはトリグリセリドエステルを主に指し、これは、エステル結合によってグリセロールに結合された３つの脂肪酸を含む。他の脂肪には、リン脂質とコレステロールが含まれる。本発明は、トリアシルグリセロール脂肪のみに関する。
【０００９】
トリアシルグリセロール脂肪の消化には、エステル結合を切断して部分グリセリドと遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を形成するリパーゼまたはエステラーゼ酵素の作用が必要である。これは、脂肪が疎水性であり、腸内で効果的に溶解せず、消化器粘膜を効果的に通過しないために必要である。１トリアシルグリセロール脂肪は、消化器粘膜を通過するためにＦＦＡへと分解されなければならない。腸粘膜中で吸収されると、ＦＦＡは脂肪酸結合タンパク質に結合し、アセチルＣｏＡの助けを借りて再びトリアシルグリセロールへと再エステル化される２。再形成されたトリアシルグリセロールは、小腸の吸収細胞（腸細胞）の小胞体中でカイロミクロンに組み立てられる３。カイロミクロンは、食事中の脂質を腸から体内の他の場所に輸送する。
【００１０】
様々な化学的性質を有するいくつかのリパーゼが消化に関与する。より成熟した哺乳動物における主要なリパーゼは膵臓リパーゼである。新生児に関しては、リパーゼは
乳中に存在し４、前胃リパーゼが授乳中に形成される５。膵臓および乳リパーゼの両方に胆汁酸塩が必要とされる。６
【００１１】
１Ｍａｒｇｉｔ  Ｈａｍｏｓｈ，Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ．Ｆａｔ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｗｂｏｒｎ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｌｉｎｇｕａｌ  Ｌｉｐａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｒｅｄｕｏｄｅｎａｌ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，６１５−６２２（１９７９），ｄｏｉ：１０．１２０３／００００６４５０−１９７９０５０００−００００８
２同著。
３Ｍａｈｍｏｏｄ  Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ  “Ａ  ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎｓ，”  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１４８（１），１−１５（２０００），ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００２１−９１５０（９９）００３９７−４
４Ｌｉｐａｓｅｓ  ｉｎ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍｉｌｋ：Ｃ．Ｖ．Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｏｖｉｎｅ  Ｍｉｌｋ  Ｌｉｐａｓｅ．ＩＩ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ”  Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．１９６８，５１（１２），１８７９−１８８６  ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３１６８／ｊｄｓ．Ｓ００２２−０３０２（６８）８７３０６−０；ｌｉｐａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ：Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｇ  Ｍａｎｓｏｎ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｔ  Ｗｅａｖｅｒ，“Ｆａｔ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｏｎａｔｅ，”  Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ，１９９７，７６，Ｆ２０６−Ｆ２１１；ＰＭＩＤ：９１７５９５５．
５Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ  Ｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｏｒａｌ  Ｌｉｐａｓｅｓ−Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，”  Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．１９７７，６０（３）３２７−３６２，ｄｏｉ：１０．３１６８／ｊｄｓ．Ｓ００２２−０３０２（７７）８３８７３−３
６Ｍａｎｓｏｎ  １９９７，ｎ．４
【００１２】
本発明は、様々な前十二指腸（ｐｒｅｄｕｏｄｅｎａｌ）リパーゼ、特に舌リパーゼ、前胃リパーゼおよび胃リパーゼを主に対象とする。７エステラーゼは、本発明においても有用であり得る密接に関連する酵素である８。
【００１３】
舌リパーゼは、唾液の一部を分泌する口中の漿液腺中で産生され、哺乳動物が食べると産生される。舌リパーゼは、２．０〜６．５の最適ｐＨを有し、胆汁酸塩の不存在下で活性を有する。９舌リパーゼ活性は、食物が飲み込まれた後に胃の中で持続する。１０密接に関連する酵素は、舌リパーゼと類似の形態、配列および活性を有する前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）である。１１ＰＥＧは、舌喉頭蓋（ｇｌｏｓｓｏｅｐｉｇｌｏｔｉｃ）領域中で分泌される。本明細書で使用される場合、舌リパーゼおよび前胃エステラーゼは本質的に同義である。いずれも、他の前十二指腸リパーゼ変異形を含むその他のリパーゼより、新生児および乳児哺乳動物においてはるかに重要な役割を果たすと考えられている。１２
【００１４】
７Ｈａｍｏｓｈ，Ｍ；ａｎｄ  Ｈａｍｏｓｈ，Ｐ；“Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｌｉｐａｓｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｅｄｕｏｄｅｎａｌ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｌｉｐａｓｅｓ”  ｉｎ  “Ｅｓｔｅｒａｓｅｓ，Ｌｉｐａｓｅｓ，ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２６６  ｏｆ  Ｎａｔｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ａ”  Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｍ．Ｉ．Ｍａｃｋｎｅｓｓ，Ｍ．Ｃｌｅｒｃ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  １９９４，ｐｐ．１３９−１４８．ＩＳＢＮ  １４８９９０９９３１，９７８１４８９９０９９３０；Ｈｅｒｎｅｌｌ，Ｏ；Ｂｌａｃｋｂｅｒｇ  Ｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆａｔ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｗｂｏｒｎ，”  Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｐｐｌ  １９９４，４０５，６５−９；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１６５１−２２２７．１９９４．ｔｂ１３４０１．ｘ；Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ａｌａｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｌｉｐａｓｅ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｐａｓｅ，Ｔｗｏ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４（２４），１６９９５−１７００２；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｊｂｃ．２７４．２４．１６９９５
８Ｆｏｊａｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｗｈａｔ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ａｎ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌｉｐａｓｅ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，”  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，２０００，８２（１１）１０３３−１０４１，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０３００−９０８４（００）０１１８８−３
９Ｔａｂｌｅ  ３  ｉｎ  Ｈａｍｏｓｈ  １９９４，ｓｅｅ  ａｌｓｏ  Ｍａｎｓｏｎ  １９９７，ｎ．４
１０Ｓｗｅｅｔ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｃａｌｆ，”  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８４，２３４，１４４−１５０，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０００３−９８６１（８４）９０３３５−７；ｓｅｅ  ａｌｓｏ  Ｍａｎｓｏｎ  １９９７，ｎ．４も参照。
１１Ｔａｂｌｅ  ３  ｉｎ  Ｈａｍｏｓｈ  １９９４，ｎ．７
１２同著。
【００１５】
舌リパーゼ／前胃エステラーゼは、食物が十二指腸を通過した後に消化管に送達される他のリパーゼ、主に膵臓リパーゼとは区別される。生合成（微生物、真菌および植物）由来のリパーゼは、本明細書に記載されているいくつかの実施形態において利用され得る哺乳動物由来の舌リパーゼの実施可能な代替物であり得る。
【００１６】
新生児が自然に授乳できない場合には、脂肪消化不良のために、乳児の栄養失調が重大な問題になり得る。自然に得られた初乳を人工的に与えられた新生児でさえ、しばしば成長が不良であり、乳児の罹患率と死亡率に寄与する。この問題は、母乳の哺乳または母親への自然な授乳が起こらないあらゆる哺乳動物にとって課題である。多くの人間の母親は新生児に母乳を与えないことを選択する（またはできない）ので、これには、経済的に重要な家畜のみならず、ヒトも含まれる。この問題は、母親が出産後すぐに仔ウシから離されることがある酪農業においても重大である。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「自然に授乳する」とは、ウシおよびヤギの乳房またはヒトの乳房を含む、母親の乳腺からの授乳を意味する。「人工授乳」または哺乳とは、瓶、人工乳首によってまたはチューブを介して給餌される乳児、または早期に、つまり通常の離乳年齢より前に固形食を与えられる乳児を意味する。
【００１８】
舌リパーゼの不存在下では、初乳、乳または代用乳中の脂肪は乳児では適切に消化されないことが示唆されている１３。本発明者らは、人工的に給餌された乳児では、乳の品質に関わらず、前胃エステラーゼ（舌リパーゼを含む）が産生されないこと、および舌または前胃エステラーゼリパーゼの欠如は、脂肪酸への脂肪の効率的な分解を妨げるので、人工的に給餌された新生児は脂肪を十分に消化していないことを推測する。
【００１９】
乳児哺乳動物における口内への舌リパーゼの放出は、通常、授乳行動の直接の結果である１４。乳児は、人工哺乳と自然哺乳のいずれにおいても授乳行為を行い得るので、いくつかの事例では、舌リパーゼの産生が不良である理由は不明である。考えられる説明の１つは、瓶の乳または乳首の温度が不適切であることである。もう１つの説明は、乳児は通常、少なくとも最初の数日間は母親とともにかなりの時間を過ごし、１日に最大１０回授乳するというものである。これは哺乳瓶で育てられた乳児よりも頻繁であり（ウシでは、仔ウシは通常、２週間１日２回、その後離乳まで１日１回哺乳瓶で育てられる）、乳児が授乳するたびに、一部のリパーゼまたは前胃エステラーゼが放出されるので、自然に授乳される乳児は、自然に産生された舌リパーゼまたは前胃エステラーゼをより大量に得る可能性がある。別の考えられる説明は、自然に授乳する乳児は、母乳の分泌を刺激するために、乳房（ｂｒｅａｓｔ）または乳房（ｕｄｄｅｒ）を吸い、刺激しなければならないということである。そのため、自然に授乳している乳児は、母乳がその口内に到達する前に、リパーゼまたは前胃エステラーゼが直ちに利用可能となるであろう。
【００２０】
１３Ｈａｍｏｓｈ  Ｍ，Ｓｃａｎｌｏｎ  ＪＷ，Ｇａｎｏｔ  Ｄ，Ｌｉｋｅｌ  Ｍ，Ｓｃａｎｌｏｎ  ＫＢ，Ｈａｍｏｓｈ  Ｐ．“Ｆａｔ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｗｂｏｒｎ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐａｓｅ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｓｐｉｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｅｒｍ  ｉｎｆａｎｔｓ，”  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １９８１，６７（３）：８３８−８４６，ｄｏｉ：１０．１１７２％２ＦＪＣＩ１１０１０１
１４Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｊ．，Ｋａｍｉｎｓｋｙ，Ｓ．ａｎｄ  Ｄ’ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｗ．“Ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆａｔ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｇｕａｌ  Ｌｉｐａｓｅ，”  Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，１９８６，７５  ９１３−９１８．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１６５１−２２２７．１９８６．ｔｂ１０３１６．ｘ
【００２１】
他の人々は、例えば、植物または真菌源に由来するリパーゼの使用を開示する米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５９号（米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５９、［００４５］）において、動物飼料中のリパーゼ添加物を提案している。米国特許出願公開第２０１７３４８１９８Ａ１号および米国特許出願公開第２０１３／０２８０２２８号も参照されたい。しかし、動物飼料中のリパーゼ添加物は、測定可能な利益を与える上で効果がないという報告が現れた。例えば、ＤｉｅｒｉｃｋとＤｅｃｕｙｐｅｒｅは、ブタの飼料中の微生物リパーゼは脂肪消化性の改善を示さなかったと報告した１５。別の報告では、仔ブタに外因性リパーゼを使用した場合の体重増加、飼料効率およびエネルギー消化率の増加を検出できなかった１６。
【００２２】
前述の議論は、乳児または新生児哺乳動物に限定されない。リパーゼ欠乏症の原理は、リパーゼ欠乏症または脂肪消化不良障害を有する任意の年齢の動物に対して適用可能である。１７
【００２３】
ウシ由来の舌リパーゼおよびその他の前胃リパーゼは、チーズの製造において産業的に使用されている１８。本開示は、脂肪消化不良に対処するために、哺乳動物の給餌用のユニークな生物学的活性成分と組み合わせた、任意の源からのリパーゼの組み合わせを提供する。
【００２４】
１５Ｄｉｅｒｉｃｋ  Ｎ．Ａ．；Ｄｅｃｕｙｐｅｒｅ，Ｊ．Ａ．，“Ｉｎｆｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｐａｓｅ  ａｎｄ／ｏｒ  ｅｍｕｌｓｉｅｒ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｌｅａｌ  ａｎｄ  ｆａｅｃａｌ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｐｉｇｓ  ｆｅｄ  ｄｉｅｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ４％  ａｎｉｍａｌ  ｆａｔ，”  Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ．Ａｇｒｉｃ．，２００４，８４（１２）１４４３−１４５０，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｓｆａ．１７９４
１６Ｏｆｆｉｃｅｒ，Ｄ．Ｉ．，“Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｅｎｚｙｍｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｉｇｌｅｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｅ−ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｗｅａｎｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄｓ，”  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ，１９９５，５６（１−２），５５−６５，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／０３７７−８４０１（９５）００８２５−８
１７Ｓｅｅ  ｅ．ｇ．，Ｓａｍｓ  Ｌ．，Ｐａｕｍｅ，Ｊ．；Ｇｉａｌｌｏ，Ｊ．；Ｃａｒｒｉｅｒｅ，Ｆ．“Ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｐＨ  ａｎｄ  ｌｉｐａｓｅ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，”  Ｆｏｏｄ  Ｆｕｎｃｔ．２０１６，７，３０−４５，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ５ｆｏ００９３０ｈ．
１８ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｇ．ｃｈｅｅｓｅｍａｋｉｎｇ．ｃｏｍ／ａｂｏｕｔ−ｌｉｐａｓｅ／（ｄｏｗｎｌｏａｄｅｄ  ７／３／２０１８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
人工的に哺乳された乳児哺乳動物における脂肪の不適切な消化の問題に対処するために、自然に授乳していない新生児哺乳動物用の栄養組成物が提供される。一実施形態では、組成物は、舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせと、乳脂肪と、プロバイオティクスと、プレバイオティクスとを含む。本発明の前十二指腸リパーゼおよびエステラーゼは、リパーゼ活性のために補因子を必要としない。一実施形態では、前十二指腸リパーゼは、哺乳動物源に由来するか、または生合成的に産生された哺乳動物由来タンパク質である。一実施形態では、組成物は、乳児と同じ種からの乳を使用する。一実施形態では、組成物は、別の種からの乳を使用する。
【００２６】
一実施形態では、組成物は、脂肪を適切に消化することができない消化不良障害を有する任意の年齢の哺乳動物において使用される。
【００２７】
哺乳動物は、ヒト、または反芻動物、ブタ、ウマ、ラクダ類、イヌ、ネコ、または乳児に授乳する任意の哺乳動物であり得る。反芻動物には、ウシ、バッファロー、シカ、ヤギおよびヒツジが含まれる。
【００２８】
一実施形態では、舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせと、乳脂肪と、ミセルカゼインと、プロバイオティクスと、プレバイオティクスとの組み合わせを含む、自然に授乳していない新生児哺乳動物のための栄養組成物が提供される。
【００２９】
一実施形態では、舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせと、乳脂肪と、ミセルカゼインと、非変性乳清タンパク質と、プロバイオティクスと、プレバイオティクスとの組み合わせを含む、自然に授乳していない新生児哺乳動物のための栄養組成物が提供される。
【００３０】
一実施形態では、栄養組成物は、哺乳動物乳または乳児もしくは高齢哺乳動物用の飼料として意図された人工乳または代用乳に基づくことができ、リパーゼおよび／または脂肪ならびに他の栄養素または栄養因子が組成物の成分である。
【００３１】
一実施形態では、任意の供給源からのリパーゼを栄養補助剤（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）として使用して、乳児哺乳動物、ストレスを受けた哺乳動物、発育不全哺乳動物、未熟児、術後哺乳動物、および脂肪消化不良の哺乳動物の消化を改善するための方法が提供される。一実施形態では、この方法は、微量栄養素、乳固形分、単離された大豆タンパク質、ミセルカゼイン、炭水化物、プレバイオティクス、プロバイオティクス、非変性乳清タンパク質などの主要栄養素、オメガ３脂肪酸、カフェイン、植物の抗炎症成分などの生物活性を有する食事成分、または乳児およびより高齢の哺乳動物のために調合される他の酵素などの消化補助剤を含む任意の担体／食品と組み合わされたリパーゼの栄養補助剤を含む。
【００３２】
一実施形態では、乳中の栄養補助剤、新生児用調合乳（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｆｏｒｍｕｌａ）または栄養補助剤として、動物の供給源からの舌リパーゼ、または植物からのリパーゼ、または生合成供給源を含む、哺乳動物新生児または高齢哺乳動物において、インビボでのトリアシルグリセロール脂肪の消化を改善するための方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、新生児哺乳動物、特に乳房（ｂｒｅａｓｔ）または乳房（ｕｄｄｅｒ）（ウシの場合）で自然に哺乳されていない新生児哺乳動物、発育不全を有する哺乳動物、脂肪消化不良障害を有する、未熟な、栄養的ストレスを受けた、およびより成熟した哺乳動物における栄養失調の問題に取り組む。新生児に関して、本発明者らは、自然に授乳されていない新生児における加水分解酵素活性の欠如のために栄養失調が起こり得ると仮定している。したがって、本発明は、これらの問題に対処し得る、哺乳動物源からのリパーゼまたはエステラーゼを含有する組成物および方法を提供する。本発明は、栄養不足が最初に出現し得る産後最初の４８時間の乳児に特に適用可能である。しかしながら、本発明の組成物および方法は、脂肪消化不良障害を患う、より年長の乳児またはより成熟した哺乳動物においても有益であり得る。
【００３４】
脂肪消化不良障害は、脂肪が正常に消化されない任意の状態である。食事性脂肪の吸収は健康な成体では極めて効率的であり、摂取された脂肪のわずか４〜５％が排泄される１９。これに対して、この過程は、新生児、特に未熟児でははるかに効率が低く、（糞便中の脂肪によって）わずか６５％の吸収であることが測定されている、２０すなわち、食事性脂肪の少なくとも３５％は吸収されない。嚢胞性線維症患者における脂肪のわずか７９％が吸収されるに過ぎないことも報告されている２１。これらはすべて、哺乳動物が脂肪を効果的に消化できない脂肪消化不良状態を表している。それが栄養失調をもたらす場合、問題は特に深刻である。
【００３５】
１９Ｍａｒｇｉｔ  Ｈａｍｏｓｈ，ｎ．１。
２０同著。
２１Ｍｉｎｉ  Ｋａｌｉｖｉａｎａｋｉｓ，ｅｔ  ａｌ．“Ｆａｔ  ｍａｌａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ”，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１９９９  ６９（１）１２７−１３４，ｄｏｉ：１０．１０９３／ａｊｃｎ／６９．１．１２７
【００３６】
工業化された農業モデル、特に酪農で生まれた乳児期のウシは、通常、ほぼ出生直後に、母親および出産環境から離される。不適切な育児、仔ウシ−雌ウシの拒絶および有害な環境または衛生状態は、仔ウシを雌ウシのところに残すことがしばしば効果的でないまたは望ましくないことを意味する。雌ウシは搾乳群に加わる。仔ウシは、母乳または代用乳を使用して、母親とは別に育てられる。これらの乳児はしばしば発育が不良である、つまり、体重増加、エネルギーレベルおよび全体的な健康状態が、自然に飼育されている仔ウシよりも劣ることがある。
【００３７】
本発明者らは、初乳を含む生乳、または粉乳から再構成される乳を含む代用乳は、ウシの新生児に与えられると、しばしば仔ウシを病気にし、発育不全をもたらすことを観察した。この発育不全は重大な経済問題となり得る。対照的に、母親から自然に授乳することによって育てられている仔ウシは、母親から離され、他のより自然でないシステムを使用して飼育されている動物の乳児と比較して健康に育つ。現代の酪農では、出生後間もなく母親から引き離された新生仔ウシに、哺乳瓶およびチューブが使用されている。これら後者の動物はしばしば発育が不全である。
【００３８】
したがって、本発明者らは、何らかの理由で乳房（ｕｄｄｅｒ）または乳房（ｂｒｅａｓｔ）（すなわち、母親の乳腺）で自然に授乳しない乳児は、出生後最初の数日で脂肪消化不良障害にかかりやすく、栄養失調、下痢、脱水症、不要な死亡を患うことがあり得ると仮定する。上記の議論はウシについて述べているが、ヒトを含む他の種の乳児も同じ問題を経験し得る。
【００３９】
人工的に与えられた乳（つまり、母親の乳房ではない）とともに舌リパーゼを与えられた仔ウシは、乳をより効率的に消化できるので、病気が少なく、より活動的で、光沢のある毛、甘い香りの良い便（より良い消化を示す）を持ち、成長が速く、一定の時間における体重増加がより大きく、母親から自然に哺乳されていない仔ウシより多くの乳も消費する。
【００４０】
舌上の舌腺の刺激の欠如は、分泌されたリパーゼとの接触によって乳中の乳脂肪を即座に修飾するために必要なリパーゼを乳児に与えないことがあり得る。さらに、豊富な遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の存在は、望ましい植細菌叢に対して有益であり、望ましくない細菌叢に対しては有益でない環境を作出する、すなわち、マイクロバイオームの健康を改善する。
【００４１】
哺乳瓶またはその他の人工乳首から乳を飲み得るとしても、哺乳瓶から哺乳される仔ウシには、舌リパーゼまたは前胃エステラーゼの欠如が存在することが提案されている。これらの器具は、天然の乳首よりもはるかに効率的に乳を供給できるので、授乳時間がはるかに短くなり、これが舌リパーゼの欠如を説明し得る。さらに、多くの仔ウシはうまく乳を飲まない。危険にさらされた仔ウシ（寒冷、早産、難産、不適切な育児、育児放棄など）は、一時的な神経学的課題を抱えていることが多く、これによって授乳反射とメカニズムが損なわれ、したがって、自然な舌リパーゼの刺激が低下し得る。もう１つの問題は、酪農業では、一部の仔ウシは初日からバケツで乳が与えられるので、全く乳を吸わないということである。さらに別の要因は、哺乳瓶給餌システムの生産者および普及事業が、費用および労力の節約として、ならびに仔ウシが満腹になるまで授乳された時に通常発生する栄養性下痢（下痢）を軽減するために、乳の量を制限することを推奨し得ることである。下痢および不十分な栄養は脱水症と死につながることがある。この助言は、仔ウシの消化器系が健康な場合に仔ウシが消費できる乳の量を過小に見積もっている可能性がある。もう１つの要因は、人工システムは通常、様々な臭い、味、触覚（例えば、母親が仔ウシをなめる）など、仔ウシにある程度のストレスを与える環境を有することである。これにより、正常な授乳効果と自然なリパーゼ産生が低下し得る。
【００４２】
別の問題は、脂肪消化不良が栄養素の吸収不良を引き起こすことである。この問題は、本発明の製剤において、主要栄養素および微量栄養素の両方の様々な形態の栄養素ならびに生物活性栄養素成分の添加によって対処され得る。例えば、主要栄養素は、ミセルカゼインまたは単離された大豆タンパク質またはオメガ３脂肪酸またはラクトースもしくはブドウ糖などの炭水化物、または酵素を含む消化補助剤であり得る。例えば、生物活性栄養成分は、カフェイン、イソフラボン、成長因子、抗炎症成分、または抗酸化植物色素であり得る。
【００４３】
リパーゼおよびエステラーゼ
本発明者らは、自然に給餌されていない乳児における前胃エステラーゼまたはリパーゼ（ＰＧＥ）などの必須な前十二指腸リパーゼの欠如が、乳児から正しい栄養を奪うと仮定している。生乳、低温殺菌乳または代替乳の処方にＰＧＥが存在しないと、消化が不十分なために乳児の発育不良または病気をもたらし得る。これは、新生児哺乳動物での膵臓および腸のリパーゼの既知の低活性が原因であり得る。２２したがって、ＰＧＥが存在しない場合、乳中の乳脂肪中のトリグリセリド脂肪を分解するには、消化管のさらに下方のリパーゼ活性が不十分であり得る。この同じ原理は、嚢胞性線維症、膵臓リパーゼ不全、非アルコール性脂肪肝、アルコール性脂肪肝または術後症状など、新生児または乳児を含まない他の脂肪消化不良症状にも当てはまり得る。これらの状況では、リパーゼは脂肪の消化を助けるための栄養補助剤の成分として有用であり得る。嚢胞性線維症の患者はしばしば膵臓の機能不全を患っており、脂肪消化不良を引き起こし得る十分な膵臓リパーゼを産生することができない。
【００４４】
２２Ｎｏｔｅ  １，ａｔ  ６１５，ｃｏｌ．２，ｔｈｉｒｄ  ｐａｒａ．
【００４５】
本発明者らは、自然に授乳していない乳児のための乳児用調合乳へのいくつかのエステラーゼまたはリパーゼのいずれかの添加が乳児の発育因子を有意に改善し、これはおそらく脂肪の消化の改善および機能的な消化マイクロバイオームの発達の結果であることを見出した。
【００４６】
さらに、本発明者らは、仔ウシに人工的に与えられた乳に舌リパーゼを添加すると、生存率が向上し、乳児死亡率が低下することを発見した。しかしながら、潜在的に重要であり得る要素は、異なる種は異なるリパーゼを有することであり、本発明者らは、リパーゼは種に一致しなければならないと考えている。好ましくは、使用されるリパーゼは当該種から得られたものであり、例えば、仔ウシの飼料には、ウシの舌リパーゼが添加される。同様に、ヒトの舌リパーゼはヒトにおいてよりよく機能する。逆に、微生物または植物のリパーゼは、インサイチュで働く必要がある場合には、例えば仔ウシまたはヒトに与えられた場合、有意な食事上の利益を与える可能性は低い。
【００４７】
舌リパーゼは、アスパラギン酸、ヒスチジンおよびセリンの触媒三残基を使用して、中鎖および長鎖トリグリセリドを部分グリセリドと遊離脂肪酸に加水分解する、トリアシルグリセロールリパーゼ、ＥＣ  ３．１．１．３と呼ばれる消化酵素ファミリーのメンバーである。唾液とともに口の中に放出される酵素は、食事性脂質の消化における最初の反応を触媒し、ジグリセリドが主要な反応生成物である。舌リパーゼは、ｐＨ４．５〜５．４の最適ｐＨを有し、胆汁酸塩の不存在下で、エステルの加水分解を触媒する。脂肪分解活性は食物を飲み込んだ後も胃の中で継続し、舌リパーゼが存在しないと、新生児では一般に脂肪が適切に消化されない可能性があると提案されている２３。酵素放出は摂取後に自律神経系によって指示され、この時、舌の表面上にある有郭および葉状舌乳頭下の漿液腺は有郭および葉状乳頭の溝に舌リパーゼを分泌する。
【００４８】
膵臓リパーゼ、乳中に存在するリパーゼ、植物または真菌／生合成源からのリパーゼなどの他のリパーゼは、通例、リパーゼ活性のために補因子、特に胆汁酸塩を必要とする。舌リパーゼを含む動物由来のＰＧＥには補因子は必要とされない２４。これは、本発明のリパーゼにとって潜在的に重要な特徴である。
【００４９】
２３Ｎｏｔｅ  １
２４Ｎｏｔｅ  １  ａｔ  １４３，ｂｏｔｔｏｍ．
【００５０】
本発明のリパーゼは、哺乳動物源から入手することができる。例えば、チーズの製造に使用される舌リパーゼは、仔ウシ、仔ヤギ、仔ヒツジの舌から得られる。ウシおよび他の哺乳動物の舌リパーゼは市販されている。
【００５１】
一実施形態では、本発明のリパーゼまたはエステラーゼは、例えば、適切なＤＮＡ配列を発現系中に挿入し、生物を培養して酵素を産生することにより、合成的に産生された哺乳動物酵素であり得る。例示的な発現系には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌、ならびにサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母が含まれる。異種ペプチドを作製するための他の多くの発現系が当技術分野において周知である２５。
【００５２】
ヒトおよび動物の舌リパーゼおよび前胃エステラーゼの候補のアミノ酸配列が知られている２６。
【００５３】
２５例えば、Ｊｏａｎ  Ｌｉｎ  Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ  Ｊａｍｅｓ  Ｍ．Ｃｒｅｇｇ，“Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，”  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２４，Ｉｓｓｕｅ  １，１  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００，Ｐａｇｅｓ  ４５−６６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１５７４−６９７６．２０００．ｔｂ００５３２．ｘ参照。
２６例えば、“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ａｃｉｄ  ｌｉｐａｓｅ／ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ．Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｔｏ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｌｉｎｇｕａｌ  ｌｉｐａｓｅｓ”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３３），２２４７９−２２４８４（１９９１）．Ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｉｓ  ａｌｓｏ  ｋｎｏｗｎ，（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ，Ｍ．Ｙ．，Ｔｅｕｃｈｙ，Ｈ．ａｎｄ  Ｋｕｐｅｒｓ，Ｌ．Ｐ．，Ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ  ｅｓｔｅｒａｓｅ，Ｇｅｎｅ  １４７（２），２５９−２６２（１９９４）；ＮＣＢＩ  ＮＰ＿７７６５２８。
【００５４】
本発明において有用なリパーゼおよびエステラーゼは、種特異的であり得るが、必ずしも種特異的であるわけではない。つまり、ある種、例えばウシのリパーゼは、例えばブタでは役に立たないか、または効率が低下する可能性がある。いずれ、本発明者らは、以前には補助飼料として提案されていた、植物または細菌などの非哺乳動物源からのリパーゼは、インサイチュで機能する必要がある場合には、ヒトまたは経済的に重要な動物に対して著しい利益を与える可能性は低いと考えている。
【００５５】
天然乳の成分
一実施形態では、本発明は、新生児または乳児および高齢の哺乳動物で使用するための、活性化のために胆汁酸を必要としない哺乳動物源からの舌リパーゼおよび／または他のリパーゼまたはエステラーゼを含有する飼料または栄養補助剤製品を開示する。一実施形態では、飼料製品は、天然もしくは人工乳または栄養補助剤である。本明細書で使用される場合、「天然乳」は、新生児と同じ種からの乳または初乳である。本明細書で使用される「配合天然乳」は、同じ種の授乳中の母親から得られない乳（例えば、ヒトの乳児に与えられる牛乳）である。「人工乳」には、乳（例えば、牛乳）を基礎とし得るが、著しい追加成分を有する任意の液体飼料製品もしくは人工調合乳（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａ）または全く乳を基礎としていない人工調合乳が含まれる。一実施形態では、本発明は、新生児哺乳動物に人工的に与えられる天然または人工乳中の栄養補助剤として、哺乳動物源からの１つまたは複数の舌リパーゼを開示する。
【００５６】
カゼインは牛乳中の主要なタンパク質である。牛乳中のタンパク質の約８０％、ヒト乳汁中のタンパク質の２０％〜４５％はカゼインである。カゼインは比較的疎水性であるため、水にわずかに溶ける。カゼインは、カゼインミセル（本明細書では「ミセルカゼイン」とも呼ばれる）と称される粒子の懸濁液として乳中に本来存在するが、親水性部分がミセルの表面に存在し、カゼインミセルは球形であるという意味において、カゼインミセルは界面活性剤型のミセルとは限られた類似性を示す。ただし、界面活性剤ミセルとは対照的に、カゼインミセルの内部は高度に水和されている。ミセル内のカゼインは、カルシウムイオンと疎水性相互作用によってまとまっている。いくつかの分子モデルのいずれかが、ミセル内でのカゼインの特別な立体構造を説明することが可能であろう。カゼインは、市販され、多くの食品の添加物として使用されている乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）の主成分である。
【００５７】
消化の間に、カゼインは、カッパカゼインを切断してミセルを不安定化するキモシンの作用により真に不溶性となり、修飾されたミセルが負電荷と正電荷の両方を有することを可能にする。ミセルが回転し、修飾されたミセルの負に帯電した領域に正が付着することを可能にし、胃の中にゲルが形成される。
【００５８】
乳清タンパク質は、強力な栄養価を持つ乳由来のもう１つの主要栄養素である。好ましくは、非変性乳清が使用される。乳清／イムノグロブリン（抗体運搬）化合物は、非変性形態のＭＰＣの成分であるか、または、例えば、スイートホエイパウダー（非変性であるが、低温殺菌され得る）として本発明の製剤に添加され得る。
【００５９】
一実施形態では、本発明の飼料製品は、天然の哺乳動物の乳中の糖であるラクトースも含む。本発明の飼料製品は、理想的には、約２重量％〜７重量％のラクトースを含有するであろう。ラクトースは、ラクトース粉末として本発明の製剤に直接添加されてもよく、またはスイートホエイまたはスイートクリームなどの成分を使用してもよく、これらはいずれもラクトースを含有する。
【００６０】
追加の材料
本発明の組成物および方法は、補助的なビタミン、ミネラルまたはその他の栄養素を含み得る。補助栄養素には、例えば、ケルプ（ｋｅｌｐ）（ビタミン源）、追加のビタミンまたはミネラル（「微量栄養素」とも呼ばれる）、タンパク質、炭水化物および脂肪などの主要栄養素が含まれ得る。本発明の組成物および方法のための主要栄養素としては、単離された大豆タンパク質、オメガ−３脂肪酸、例えば、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）もしくはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、またはこれらの組み合わせ、ラクトース、プレバイオティクスおよびプロバイオティクスが挙げられる。
【００６１】
新生児の潜在的な問題は、新生児動物の消化管中に細菌が存在しないことであり、これは消化不良を引き起こす可能性がある。初乳を母親から機械的に収集した後、瓶または哺乳管によって、喉から直接胃の中へ、人工的に仔ウシに与えることは可能である。しかし、腸内に適切な細菌叢が存在しない場合、初乳は適切に消化されない可能性がある。この問題は、プレバイオティクスを加えたまたは加えないプロバイオティクスの添加により、本発明の製剤において対処され得る。
【００６２】
プロバイオティクスは、栄養のためにさらに必要である有益な消化細菌を追加する。プレバイオティクスは、腸内の有益な微生物の成長または活動を誘発する食品成分である２７。プレバイオティクスは、腸内マイクロバイオーム中の生物の組成を変化させることができる。プレバイオティクスとプロバイオティクスを追加すると、消化に必要とされる適切な細菌を腸に生息させることができる。
【００６３】
プレバイオティクスは、細菌に対する基質として作用することにより、大腸にコロニーを形成する有利な細菌の増殖または活動を刺激する。一実施形態では、プレバイオティクスは、イヌリン、フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧａｌＯＳ）、ラクツロース、またはペクチンの組成物であり得る２８。イヌリンは、主にフルクトース単位（フルクタン）から構成される多糖であり、典型的には末端グルコースを有する。イヌリンは、β（２，１）結合によって連結された、鎖末端グルコシル部分と反復するフルクトシル部分からなる。β（２，１）結合のため、イヌリンは、デンプンを消化するように適合されたヒト酵素であるプチアリンとアミラーゼによって消化されない。その結果、イヌリンはそのまま上部消化管を通過する。細菌が結腸中でのみイヌリンを代謝し、その機能的特性：カロリー値の低下、食物繊維およびプレバイオティクス効果に寄与する。色および臭いがなく、イヌリンは、食品の感覚特性にはほとんど影響を与えない。大腸に到達した後、イヌリンは、結腸細菌によって、腸内細菌叢に非常に栄養を与えるプレバイオティクスゲルへと変換される。イヌリンの供給源には、バナナ、チコリの根、エルサレムアーティチョーク（北米原産の塊茎野菜）が含まれる。
【００６４】
２７Ｈｕｔｋｉｎｓ  ＲＷ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ：ｗｈｙ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  ｍａｔｔｅｒ”  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６  Ｆｅｂ；３７：１−７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｏｐｂｉｏ．２０１５．０９．００１．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｓｅｐ  ２９．
２８Ｂｅｌｅｎ  Ｇｏｍｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｃｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｅｅｌ  Ｗａｓｔｅｓ，”  Ｊ．Ａｇ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１４  ６２（４０），９７６９−９７８２  ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊｆ５０３４７５ｂ
【００６５】
重要なことに、上記の酵素、プチアリンとアミラーゼは、おそらくヒトに限定されない。特に、ウシまたはヤギなどの未熟な反芻動物は、実際には、出生時に多室胃を持った反芻動物ではない。ウシおよびヤギは生後６〜１２週齢まで単胃消化管を有しており、イヌリンなどのプレバイオティクスは若い反芻動物の消化管を通過して大腸に留まり、これらの幼若動物が真の反芻上部消化管を発達させる前に、プレバイオティック効果を発揮すると考えられている。
【００６６】
組成物
一実施形態では、本発明の方法および組成物は、リパーゼまたはエステラーゼを含み、牛乳（乾燥または新鮮）、ケルプ（ｋｅｌｐ）、追加のビタミンまたはミネラル、ミセルまたは天然（ｎａｔｉｖｅ）カゼイン、単離された大豆タンパク質、オメガ−３脂肪酸、ラクトースを含む炭水化物、プレバイオティクスおよびプロバイオティクスなどの主要栄養素の１つまたは複数などの栄養素を含み得る。一実施形態では、例えば、乳は担体であり、ケルプ（ｋｅｌｐ）は新生児に有益なミネラルおよびビタミン源である。
【００６７】
飼料サプリメント中のリパーゼの量は、当該種の天然乳中の脂肪の量、または当該哺乳動物種にとって適切な食事もしくは栄養補助剤中の脂肪の量に基づいて調整することができる。例えば、国産牛乳は約４〜５％の乳脂肪を有し、バッファロー乳は天然乳中に７〜９％の乳脂肪を有し、国産ブタ乳は約７〜８％の脂肪を有し、ヒト乳は約４．５％の脂肪を有する。例えば、バッファローのような高脂肪含有量の天然乳には、さらなるリパーゼが追加される。脂肪消化不良、発育不全、栄養的ストレスおよび術後症状を有する哺乳動物の食事は、それぞれの種に対する推奨栄養プロトコル、年齢、状態およびサイズの変動によって異なる。したがって、リパーゼおよび追加の成分ならびにそれぞれの量は変動する。
【００６８】
一実施形態では、本発明の飼料製品は、添加された乳脂肪を含み得る。乳脂肪は、新生児、特にウシにとって優れた脂肪の形態であり得る。通常、この実施形態の乳脂肪は全乳からのものであり、乳脂肪は天然乳中に存在する天然脂肪（クリーム）である。
【００６９】
本発明の組成物および方法は、その他の経済的に重要な農場動物または家畜、例えばバッファロー、シカ、ヤギ、ヒツジ、ブタ（成体ブタ（ｈｏｇ））、ウマ、ラクダ類（ラクダ、ラマまたはアルパカ）などのその他の反芻動物およびイヌまたはネコなどの家庭用ペットなど、ウシ以外の他の哺乳動物に対しても等しく有効であると予想される。例えば、多数の同腹仔を産むブタなどの種では、１〜２匹の乳児が排除され、自然に放置死させられることがある。本発明は、これらの潜在的に価値のある動物を救助し、成熟させることを可能にする。
【００７０】
本発明は、動物園または自然保護区で飼育されている動物などの珍しい絶滅危惧動物に対しても有用であり得る。新生児は、生存の見込みを高めるために、これらの環境では、出生時または出生直後に、母親から離されることがよくある。
【００７１】
本発明の本組成物および方法は、ヒトにとっても有用であり得、ヒト乳児用調合乳および脂肪消化不良を有するヒトにおいて使用され得る。現行のガイドラインは、ヒトは生後６か月間専ら乳房で栄養を与えられるべきであると示唆しているが、２９多くの母親はそれができないか、またはそれを望んでいない。明らかな栄養失調が存在しない場合さえ、乳児用調合乳または天然ヒト乳汁にリパーゼを追加することは、新生児における消化および乳児の健康を改善し得る。栄養素と生物活性栄養成分が配合されたリパーゼ含有栄養補助剤を、ヒトにおける特定の栄養不良症状用の食事に添加することは、健康を改善し得る。
【００７２】
２９Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，“Ｉｎｆａｎｔ  ａｎｄ  ｙｏｕｎｇ  ｃｈｉｌｄ  ｆｅｅｄｉｎｇ”  Ｆａｃｔ  ｓｈｅｅｔ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｎ／ｎｅｗｓ−ｒｏｏｍ／ｆａｃｔ−ｓｈｅｅｔｓ／ｄｅｔａｉｌ／ｉｎｆａｎｔ−ａｎｄ−ｙｏｕｎｇ−ｃｈｉｌｄ−ｆｅｅｄｉｎｇ（ｄｏｗｎｌｏａｄｅｄ  Ｊｕｌｙ  ４，２０１８）
【００７３】
実施形態
本発明の飼料は、天然乳もしくは代用乳に添加されるまたは非乳栄養補助剤中に配合される栄養補助剤を提供する。一実施形態では、補助剤は、種、体重、年齢または健康状態に応じて、広範な成分を含み得る。仔ウシに対する例は、
リパーゼパウダー  ．００１〜１０グラム
プレバイオティクス  ．００１〜１０グラム
プロバイオティクス  ．００１〜１０グラム
乾燥された粉末化ケルプ（ｋｅｌｐ）  ．００１〜１０グラム
ミネラルミックス  ．００１〜３グラム
粉末化された脱脂粉乳  １．０〜２０グラム
であり得る。
【００７４】
これらの成分は、４リットル（約１米ガロン）中に約５ｇのこの補助剤が存在するように、十分な天然乳または代用乳中に混合される。
【００７５】
仔ウシ飼料の別の実施形態では、成分は、
リパーゼパウダー  ．００１〜１０グラム
プレバイオティクス  ．００１〜１０グラム
プロバイオティクス  ．００１〜１０グラム
乾燥された粉末化ケルプ（ｋｅｌｐ）  ．００１〜１０グラム
ミネラルミックス  ．００１〜３グラム
であり得る。
【００７６】
これは、４リットルの乳または代用乳中に約４〜５ｇの固形分になるように希釈される。
【００７７】
仔ウシに対するより具体的な実施形態では、以下の材料が使用され得る。
リパーゼパウダー  １．０グラム
プレバイオティクス  ３．０グラム
プロバイオティクス  ４．５グラム
乾燥された粉末化ケルプ（ｋｅｌｐ）  ３．０グラム
ミネラルミックス  ３．０グラム
粉末化された脱脂粉乳  １．０グラム
【００７８】
この混合物は、１６リットルの天然乳または代用乳中に希釈される。
【００７９】
例
例１
以下の成分を用いて、仔ウシ用の補助剤を調製した。
リパーゼパウダー  １．０グラム
プレバイオティクス  ３．０グラム
プロバイオティクス  ４．５グラム
乾燥された粉末化ケルプ（ｋｅｌｐ）  ３．０グラム
ミネラルミックス  ３．０グラム
粉末化された脱脂粉乳  １．０グラム
すべての成分は米国内で市販されている。
【００８０】
４米ガロン（１５．１リットル）の天然牛乳中に、この混合物を混合した。
【００８１】
有効性の証拠
約８５０頭の乳牛がいるミズーリ州の酪農場が、仔ウシの飼育作業の一環として、この舌リパーゼ補助剤を使用した。３０か月にわたって、４００頭を超える雄の仔ウシとともに１，６００頭を超える未経産仔ウシに、補充された乳を与えた。最長５週間、または保持された雄の仔ウシの場合には１〜４週齢で販売されるまで、舌リパーゼ補助剤の添加を継続した。動物は、与えられた牛乳を摂取した後４〜５分間授乳が継続したことなど、人工の「カルフェタリア（ｃａｌｆｅｔａｒｉａ）」乳首で活発に授乳することができた。リパーゼを含めた後に、仔ウシの生育状態は向上した。仔ウシの飼育システム、管理ならびに給餌および哺乳システムは、舌リパーゼ補助剤なしの前年と同一であった。測定または観察された変化には、以下のものが含まれた。
・便の状態および硬さから明らかなように、消化が改善された；
・栄養性下痢はなし；
・改善された活力、移動性および群本能（ｈｅｒｄ  ｉｎｓｔｉｎｃｔｓ）によって明らかとされた知能の向上；
・より強い食欲；
・免疫力の向上；
・成長率の改善と加速；
・若年個体および成体としてのパフォーマンスの向上；
・死亡率の低下；
・難産、母親による放棄、極度の寒さまたは暑さストレスなどの要因によって損なわれる仔ウシの生存率の増加。
【００８２】
舌リパーゼを含めることによって可能になった一生の始まりの改善は、加速された成長と活力につながり、これらの仔ウシが健康に育ち、離乳時体重までずっと、より良い体重増加を示すことを可能にした。
例２
毎年春に８０〜９０頭の雌シカが産まれるミズーリ州の商業シカ農場は、母を失ったまたは母が育児をしない子シカに与えられる乳または代用乳中に、例１と同じリパーゼ補充剤を追加した。これらの子シカの死亡率は、過去四シーズンの平均５０％以上から、リパーゼが添加された２年については、５％未満に低下した。その間、他の要因は変化しなかった。
【００８３】
例３
これは、全乳も摂取している動物の補助飼料に対する補助処方（ａｄｊｕｎｃｔ  ｆｏｒｍｕｌａ）である。この処方には、脂肪は存在しない。
【表１】
2021531019.tif 000002
ＮＦＤＭ＝脱脂粉乳。
仔ウシの場合、リパーゼはウシ由来であり、市販されている。
【００８４】
使用するために、１３．３３ｇのこの処方を２６ガロン（９８Ｌ）の乳（天然または人工）に加える。
【００８５】
例４
これは完全な代用乳の処方である。
【表２】
2021531019.tif 000003
ＭＰＣ＝乳タンパク質濃縮物７０％（市販）
仔ウシの場合、リパーゼはウシ由来であり、市販されている。この実験におけるスイートホエイは変性していなかった。
【００８６】
この処方は、１００ｇを９００ｍＬの水に加えて、１Ｌの処方を作製することによって再構成される。
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月25日(2020.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される、活性のために補因子を必要としない前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせであり、前記前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼが哺乳動物源に由来する、または生合成的に産生された哺乳動物由来タンパク質である；
ｂ．乳脂肪；ならびに
ｃ．プロバイオティクスおよびプレバイオティクス；
の組み合わせを含む、哺乳動物用の栄養組成物。
【請求項２】
ａ．舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される、活性のために補因子を必要としない前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせであり、前記前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼが哺乳動物源に由来する、または生合成的に産生された哺乳動物由来タンパク質である；
ｂ．乳脂肪；ならびに
ｃ．プロバイオティクスおよびプレバイオティクス；
の組み合わせを含む栄養組成物であって、
前記組成物が、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物に投与される、上記栄養組成物。
【請求項３】
前記哺乳動物が反芻動物、ブタ、ウマ、ラクダ類、イヌ、ネコまたはヒトである、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物が、ウシ、バッファロー、シカ、ヤギおよびヒツジから選択される反芻動物である、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項５】
前記哺乳動物が４８時間齢未満である、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物が脂肪を効果的に消化することができないことを患っている、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項７】
前記哺乳動物が、脂肪を効果的に消化することができないことによる栄養失調を患っている、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項８】
前記組成物が、前記哺乳動物と同じ種または哺乳動物の異なる種からの乳をさらに含む、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項９】
前記組成物が人工乳をさらに含む、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、ケルプ（ｋｅｌｐ）、オメガ−３脂肪酸の１つまたは複数から選択される添加物をさらに含む、請求項１に記載の栄養組成物。
【請求項１１】
哺乳動物の脂肪消化不良の処置のための液体組成物の製造における、舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される、活性のために補因子を必要としない前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせであり、前記前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼが哺乳動物源に由来する、または生合成的に産生された哺乳動物由来タンパク質である、および乳脂肪、プロバイオティクスおよびプレバイオティクスの使用。
【請求項１２】
ａ．舌リパーゼ、前胃リパーゼ、胃リパーゼおよび前胃エステラーゼから選択される、活性のために補因子を必要としない前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼまたはこれらの組み合わせであり、前記前十二指腸リパーゼもしくはエステラーゼが哺乳動物源に由来する、または生合成的に産生された哺乳動物由来タンパク質である；
ｂ．乳脂肪；
ｃ．プロバイオティクスおよびプレバイオティクス；ならびに
ｄ．ミセルカゼインもしくは非変性乳清タンパク質または両方；
の組み合わせを含む、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物用の栄養組成物。
【請求項１３】
ラクトースをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ビタミンサプリメント、ミネラルサプリメントもしくはオメガ−３脂肪酸サプリメントまたはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１２に記載の組成物を含む、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物用の完全代用乳。
【請求項１６】
請求項１、２または１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物のための液体栄養組成物。
【請求項１７】
請求項１、２または１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、新生児哺乳動物または脂肪消化不良を有する哺乳動物のための乳または代用乳に添加される栄養補助剤。
【国際調査報告】
2021531019.tif 000004