(57)【要約】  本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合するＣＡＲ（ＣＡＲ）を提供する。本開示はさらに、当該ＣＡＲを含む操作された免疫細胞、ＣＡＲをコードする核酸、ならびに当該ＣＡＲ、操作された免疫細胞、および核酸を作製する方法に関するものである。本開示はさらに、ＣＤ７０を発現する悪性細胞と関連した状態（例えば、癌）の治療のための、これらＣＡＲ、およびこれらＣＡＲを含む操作された免疫細胞の使用に関する治療方法に関するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外リガンド−結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０（ＣＤ７０）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインは、ＣＤ７０の細胞外ドメインに結合する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含有し、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含有する、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項２】
前記細胞外ドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、または３８１に示される配列を含むＶＨ領域由来の三つのＣＤＲを含む前記重鎖可変（ＶＨ）領域、および配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、または３８０に示されるＶＬ領域由来の三つのＣＤＲを含む前記軽鎖可変（ＶＬ）領域、を含有する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含有する、請求項１に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項３】
前記ＶＨ領域は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９または３８１に示される配列を含有し、および軽鎖可変（ＶＬ）領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８または３８０に示される前記ＶＬ領域由来の三つのＣＤＲ、またはＣＤＲ内ではないアミノ酸に一つまたは複数のアミノ酸置換を伴うそのバリアントを含有する、請求項１に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項４】
前記ＶＨ領域は、配列番号９７、９８または９９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１００または１０１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、軽鎖可変領域（ＶＬ）は以下のＣＤＲ：配列番号２１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２１８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する、請求項１に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項５】
前記ＶＨ領域は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含有し、前記ＶＬ領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６】
前記ＶＨ領域は、配列番号１４５、１４６または１４７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１４８または１４９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、および軽鎖可変領域（ＶＬ）は以下のＣＤＲ：配列番号２４１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２４２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２４３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する、請求項１に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項７】
前記ＶＨ領域は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含有し、前記ＶＬ領域は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項８】
各ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組み合わせ、ＡｂＭ定義、またはＣＤＲの接触定義に従い規定される、請求項２または３に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項９】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１１】
第二の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１２】
前記第二の細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含有する、請求項１１に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１３】
前記細胞外リガンド−結合ドメインと前記第一の膜貫通ドメインの間にストークドメインをさらに含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１４】
前記ストークドメインは、ヒトＣＤ８αのヒンジ、ＩｇＧ１のヒンジ、およびＦｃγＲＩＩＩαのヒンジからなる群から選択される、請求項１３に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１５】
ＣＤ２０エピトープをさらに含有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１６】
前記ＣＤ２０エピトープは、配列番号２９３または配列番号２９４または配列番号６０９に示されるアミノ酸配列を含有する、請求項１５に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１７】
前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、配列番号３１１〜３３４に示されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１８】
前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、配列番号３１９または３２７に示されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項１９】
前記第一の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖膜貫通ドメインを含有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項２０】
ＣＤ７０に特異的ではない別の細胞外リガンド−結合ドメインをさらに含有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項２１】
前記細胞外リガンド−結合ドメイン、前記第一の膜貫通ドメイン、および前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一つのポリペプチド上にある、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項２２】
第二の膜貫通ドメインをさらに含有し、前記第一の膜貫通ドメインおよび前記細胞外リガンド−結合ドメインは、第一のポリペプチド上にあり、および前記第二の膜貫通ドメインおよび前記細胞内シグナル伝達ドメインは、第二のポリペプチド上にあり、前記第一の膜貫通ドメインは、高アフィニティＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖に由来する膜貫通ドメインを含有し、および前記第二の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖に由来する膜貫通ドメインを含有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項２３】
共刺激性分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインに融合された第三の膜貫通ドメインを含有する第三のポリペプチドをさらに含有し、前記第三の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖に由来する膜貫通ドメインを含有する、請求項２２に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３３６または３３７に示される核酸配列を含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２４または２５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２７】
その細胞表面膜に、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する、操作された免疫細胞。
【請求項２８】
ＣＤ７０に特異的ではない別のＣＡＲをさらに含む、請求項２７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項２９】
自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７または２８に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３０】
前記自殺ポリペプチドが、ＲＱＲ８である、請求項２９に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３１】
前記免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球から誘導される、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３２】
一つまたは複数の内因性遺伝子の破壊をさらに含み、前記内因性遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、ＣＤ７０、または例えばｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントタンパク質をコードする、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３３】
ＴＣＲαおよびＣＤ５２、またはＴＣＲα、ＣＤ５２およびＣＤ７０の破壊をさらに含む、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３４】
前記免疫細胞が健常なドナーから取得される、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３５】
前記免疫細胞が患者から取得される、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３６】
医薬品としての使用のための請求項２７〜３５のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３７】
前記医薬品が、癌の治療における使用のためである、請求項３６に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３８】
前記癌が、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項３７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項３９】
請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の細胞の群であって、
ａ）前記細胞群は、幹細胞メモリー細胞およびセントラルメモリー細胞の２０％、３０％または４０％よりも高い割合を構成し、および／または
ｂ）前記細胞群は、実施例４に開示されるアッセイを使用して測定されるときに、６日目で、再帰的ＣＤ７０発現細胞に対し、１０％、２０％、３０％または４０％よりも高いＣＤ７０発現細胞の溶解割合を達成する、細胞群。
【請求項４０】
前記細胞群は、実施例４に開示されるアッセイを使用して測定されるときに、６日目で、再帰的ＣＤ７０発現細胞に対し、２０％よりも高いＣＤ７０発現細胞の溶解割合を達成する、請求項３９に記載の細胞群。
【請求項４１】
免疫細胞を操作する方法であって、
ａ）免疫細胞を提供すること、および
ｂ）請求項１〜２３のいずれか１項に記載の少なくとも一つのＣＤ７０特異的ＣＡＲを、前記細胞の表面に発現させること、を含む、方法。
【請求項４２】
ａ）免疫細胞を提供すること、
ｂ）前記細胞に、前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを導入すること、および
ｃ）前記細胞内で前記ポリヌクレオチドを発現させること、を含む、請求項４１に記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項４３】
ａ）免疫細胞を提供すること、
ｂ）前記細胞に、前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを導入すること、および
ｃ）ＣＤ７０に特異的ではない少なくとも一つの他のＣＡＲを導入すること、を含む、請求項４１に記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項４４】
その必要のある対象を治療する方法であって、
ａ）請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲを、表面に発現する免疫細胞を提供すること、および
ｂ）前記免疫細胞を前記患者に投与すること、を含む、方法。
【請求項４５】
請求項２７〜３９のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項４６】
対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞と関連した状態を治療する方法であって、その必要のある対象に、請求項４５に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項４７】
前記状態が癌である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記癌が、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍の増殖または進行を阻害する方法であって、その必要のある前記対象に、請求項４５に記載の医薬組成物の前記対象に対する有効量を投与することを含む、方法。
【請求項５０】
対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、その必要のある前記対象に、請求項４５に記載の医薬組成物の前記対象に対する有効量を投与することを含む、方法。
【請求項５１】
ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍の退縮を誘導する方法であって、その必要のある前記対象に、請求項４５に記載の医薬組成物の前記対象に対する有効量を投与することを含む、方法。
【請求項５２】
細胞外リガンド−結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０特異的キメラ抗原受容体（ＣＤ７０特異的ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を有するＣＤ７０の細胞外ドメインに結合する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含有し、
ａ）前記ＶＨ領域は、配列番号１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有し、前記ＶＬ領域は、配列番号１７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有し；または
ｂ）前記ＶＨ領域は、配列番号３４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有し、前記ＶＬ領域は、配列番号３３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有する、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項５３】
前記細胞外ドメインは、配列番号３１９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有する、請求項５２に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項５４】
前記細胞外ドメインは、配列番号３２７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有する、請求項５２に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項５５】
ＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、
ａ）配列番号２９７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通し、および配列番号２９８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通する核酸配列を含有するか、または
ｂ）配列番号３０７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通し、および配列番号３０８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通する核酸配列を含有する、ポリヌクレオチド。
【請求項５６】
ＣＤ７０に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記抗原結合分子は、
ａ）配列番号４９〜５１、５５〜５７、６１〜６３、６７〜６９、７３〜７５、７９〜８１、８５〜８７、９１〜９３、９７〜９９、１０３〜１０５、１０９〜１１１、１１５〜１１７、１２１〜１２３、１２７〜１２９、１３３〜１３５、１３９〜１４１、１４５〜１４７、１５１〜１５３、１５７〜１５９、１６３〜１６５、１６９〜１７１、１７５〜１７７、１８１〜１８３、１８７〜１８９、３８２〜３８４、３８８〜３９０、３９４〜３９６、４００〜４０２、４０６〜４０８、４１２〜４１４、４１８〜４２０、４２４〜４２６、４３０〜４３２、４３６〜４３８、４４２〜４４４、４４８〜４５０、４５４〜４５６、４６０〜４６２、４６６〜４６８、４７２〜４７４、４７８〜４８０、４８４〜４８６、４９０〜４９２、４９６〜４９８、５０２〜５０４、および５０８〜５１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ１、
ｂ）配列番号５２、５３、５８、５９、６４、６５、７０、７１、７６、７７、８２、８３、８８、８９、９４、９５、１００、１０１、１０６、１０７、１１２、１１３、１１８、１１９、１２４、１２５、１３０、１３１、１３６、１３７、１４２、１４３、１４８、１４９、１５４、１５５、１６０、１６１、１６６、１６７、１７２、１７３、１７８、１７９、１８４、１８５、１９０、１９１、３８５、３８６、３９１、３９２、３９７、３９８、４０３、４０４、４０９、４１０、４１５、４１６、４２１、４２２、４２７、４２８、４３３、４３４、４３９、４４０、４４５、４４６、４５１、４５２、４５７、４５８、４６３、４６４、４６９、４７０、４７５、４７６、４８１、４８２、４８７、４８８、４９３、４９４、４９９、５００、５０５、５０６、５１１、および５１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ２、
ｃ）配列番号５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、３８７、３９３、３９９、４０５、４１１、４１７、４２３、４２９、４３５、４４１、４４７、４５３、４５９、４６５、４７１、４７７、４８３、４８９、４９５、５０１、５０７、および５１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖ＣＤＲ３、
ｄ）配列番号１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、２６２、５１４、５１７、５２０、５２３、５２６、５２９、５３２、５３５、５３８、５４１、５４４、５４７、５５０、５５３、５５６、５５９、５６２、５６５、５６８、５７１、５７４、および５７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ１、
ｅ）配列番号１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、２６０、２６３、５１５、５１８、５２１、５２４、５２７、５３０、５３３、５３６、５３９、５４２、５４５、５４８、５５１、５５４、５５７、５６０、５６３、５６６、５６９、５７２、５７５、および５７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ２、ならびに
ｆ）配列番号１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６４、５１６、５１９、５２２、５２５、５２８、５３１、５３４、５３７、５４０、５４３、５４６、５４９、５５２、５５５、５５８、５６１、５６４、５６７、５７０、５７３、５７６、および５７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも一つを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項５７】
前記抗原結合分子が、
ａ）それぞれ、配列番号
ｉ）４９〜５１、５２〜５３、５４；
ｉｉ）５５〜５７、５８〜５９、６０；
ｉｉｉ）６１〜６３、６４〜６５、６６；
ｉｖ）６７〜６９、７０〜７１、７２；
ｖ）７３〜７５、７６〜７７、７８；
ｖｉ）７９〜８１、８２〜８３、８４；
ｖｉｉ）８５〜８７、８８〜８９、９０；
ｖｉｉｉ）９１〜９３、９４〜９５、９６；
ｉｘ）９７〜９９、１００〜１０１、１０２；
ｘ）１０３〜１０５、１０６〜１０７、１０８；
ｘｉ）１０９〜１１１、１１２〜１１３、１１４；
ｘｉｉ）１１５〜１１７、１１８〜１１９、１２０；
ｘｉｉｉ）１２１〜１２３、１２４〜１２５、１２６；
ｘｉｖ）１２７〜１２９、１３０〜１３１、１３２；
ｘｖ）１３３〜１３５、１３６〜１３７、１３８；
ｘｖｉ）１３９〜１４１、１４２〜１４３、１４４；
ｘｖｉｉ）１４５〜１４７、１４８〜１４９、１５０；
ｘｖｉｉｉ）１５１〜１５３、１５４〜１５５、１５６；
ｘｉｘ）１５７〜１５９、１６０〜１６１、１６２；
ｘｘ）１６３〜１６５、１６６〜１６７、１６８；
ｘｘｉ）１６９〜１７１、１７２〜１７３、１７４；
ｘｘｉｉ）１７５〜１７７、１７８〜１７９、１８０；
ｘｘｉｉｉ）１８１〜１８３、１８４〜１８５、１８６；
ｘｘｉｖ）１８７〜１８９、１９０〜１９１、１９２；
ｘｘｖ）３８２〜３８４、３８５〜３８６、３８７；
ｘｘｖｉ）３８８〜３９０、３９１〜３９２、３９３；
ｘｘｖｉｉ）３９４〜３９６、３９７〜３９８、３９９；
ｘｘｖｉｉｉ）４００〜４０２、４０３〜４０４、４０５；
ｘｘｉｘ）４０６〜４０８、４０９〜４１０、４１１；
ｘｘｘ）４１２〜４１４、４１５〜４１６、４１７；
ｘｘｘｉ）４１８〜４２０、４２１〜４２２、４２３；
ｘｘｘｉｉ）４２４〜４２６、４２７〜４２８、４２９；
ｘｘｘｉｉｉ）４３０〜４３２、４３３〜４３４、４３５；
ｘｘｘｉｖ）４３６〜４３８、４３９〜４４０、４４１；
ｘｘｘｖ）４４２〜４４４、４４５〜４４６、４４７；
ｘｘｘｖｉ）４４８〜４５０、４５１〜４５２、４５３；
ｘｘｘｖｉｉ）４５４〜４５６、４５７〜４５８、４５９；
ｘｘｘｖｉｉｉ）４６０〜４６２、４６３〜４６４、４６５；
ｘｘｘｉｘ）４６６〜４６８、４６９〜４７０、４７１；
ｘｌ）４７２〜４７４、４７５〜４７６、４７７；
ｘｌｉ）４７８〜４８０、４８１〜４８２、４８３；
ｘｌｉｉ）４８４〜４８６、４８７〜４８８、４８９；
ｘｌｉｉｉ）４９０〜４９２、４９３〜４９４、４９５；
ｘｌｉｖ）４９６〜４９８、４９９〜５００、５０１；
ｘｌｖ）５０２〜５０４、５０５〜５０６、５０７；または
ｘｌｖｉ）５０８〜５１０、５１１〜５１２、５１３、のうちの一つから選択されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン；および
ｂ）それぞれ、配列番号
ｉ）１９３、１９４、１９５；
ｉｉ）１９６、１９７、１９８；
ｉｉｉ）１９９、２００、２０１；
ｉｖ）２０２、２０３、２０４；
ｖ）２０５、２０６、２０７；
ｖｉ）２０８、２０９、２１０；
ｖｉｉ）２１１、２１２、２１３；
ｖｉｉｉ）２１４、２１５、２１６；
ｉｘ）２１７、２１８、２１９；
ｘ）２２０、２２１、２２２；
ｘｉ）２２３、２２４、２２５；
ｘｉｉ）２２６、２２７、２２８；
ｘｉｉｉ）２２９、２３０、２３１；
ｘｉｖ）２３２、２３３、２３４；
ｘｖ）２３５、２３６、２３７；
ｘｖｉ）２３８、２３９、２４０；
ｘｖｉｉ）２４１、２４２、２４３；
ｘｖｉｉｉ）２４４、２４５、２４６；
ｘｉｘ）２４７、２４８、２４９；
ｘｘ）２５０、２５１、２５２；
ｘｘｉ）２５３、２５４、２５５；
ｘｘｉｉ）２５６、２５７、２５８；
ｘｘｉｉｉ）２５９、２６０、２６１；
ｘｘｉｖ）２６２、２６３、２６４；
ｘｘｖ）５１４、５１５、５１６；
ｘｘｖｉ）５１７、５１８、５１９；
ｘｘｖｉｉ）５２０、５２１、５２２；
ｘｘｖｉｉｉ）５２３、５２４、５２５；
ｘｘｉｘ）５２６、５２７、５２８；
ｘｘｘ）５２９、５３０、５３１；
ｘｘｘｉ）５３２、５３３、５３４；
ｘｘｘｉｉ）５３５、５３６、５３７；
ｘｘｘｉｉｉ）５３８、５３９、５４０；
ｘｘｘｉｖ）５４１、５４２、５４３；
ｘｘｘｖ）５４４、５４５、５４６；
ｘｘｘｖｉ）５４７、５４８、５４９；
ｘｘｘｖｉｉ）５５０、５５１、５５２；
ｘｘｘｖｉｉｉ）５５３、５５４、５５５；
ｘｘｘｉｘ）５５６、５５７、５５８；
ｘｌ）５５９、５６０、５６１；
ｘｌｉ）５６２、５６３、５６４；
ｘｌｉｉ）５６５、５６６、５６７；
ｘｌｉｉｉ）５６８、５６９、５７０；
ｘｌｉｖ）５７１、５７２、５７３；
ｘｌｖ）５７４、５７５、５７６；および
ｘｌｖｉ）５７７、５７８、５７９、のうちの一つから選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン、を含む、請求項５６に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項５８】
前記抗原結合分子が、それぞれ、配列番号
ａ）４９〜５１、５２〜５３、５４、１９３、１９４、１９５；
ｂ）５５〜５７、５８〜５９、６０、１９６、１９７、１９８；
ｃ）６１〜６３、６４〜６５、６６、１９９、２００、２０１；
ｄ）６７〜６９、７０〜７１、７２、２０２、２０３、２０４；
ｅ）７３〜７５、７６〜７７、７８、２０５、２０６、２０７；
ｆ）７９〜８１、８２〜８３、８４、２０８、２０９、２１０；
ｇ）８５〜８７、８８〜８９、９０、２１１、２１２、２１３；
ｈ）９１〜９３、９４〜９５、９６、２１４、２１５、２１６；
ｉ）９７〜９９、１００〜１０１、１０２、２１７、２１８、２１９；
ｊ）１０３〜１０５、１０６〜１０７、１０８、２２０、２２１、２２２；
ｋ）１０９〜１１１、１１２〜１１３、１１４、２２３、２２４、２２５；
ｌ）１１５〜１１７、１１８〜１１９、１２０、２２６、２２７、２２８；
ｍ）１２１〜１２３、１２４〜１２５、１２６、２２９、２３０、２３１；
ｎ）１２７〜１２９、１３０〜１３１、１３２、２３２、２３３、２３４；
ｏ）１３３〜１３５、１３６〜１３７、１３８、２３５、２３６、２３７；
ｐ）１３９〜１４１、１４２〜１４３、１４４、２３８、２３９、２４０；
ｑ）１４５〜１４７、１４８〜１４９、１５０、２４１、２４２、２４３；
ｒ）１５１〜１５３、１５４〜１５５、１５６、２４４、２４５、２４６；
ｓ）１５７〜１５９、１６０〜１６１、１６２、２４７、２４８、２４９；
ｔ）１６３〜１６５、１６６〜１６７、１６８、２５０、２５１、２５２；
ｕ）１６９〜１７１、１７２〜１７３、１７４、２５３、２５４、２５５；
ｖ）１７５〜１７７、１７８〜１７９、１８０、２５６、２５７、２５８；
ｗ）１８１〜１８３、１８４〜１８５、１８６、２５９、２６０、２６１；
ｘ）１８７〜１８９、１９０〜１９１、１９２、２６２、２６３、２６４；
ｙ）３８２〜３８４、３８５〜３８６、３８７、５１４、５１５、５１６；
ｚ）３８８〜３９０、３９１〜３９２、３９３、５１７、５１８、５１９；
ａａ）３９４〜３９６、３９７〜３９８、３９９、５２０、５２１、５２２；
ｂｂ）４００〜４０２、４０３〜４０４、４０５、５２３、５２４、５２５；
ｃｃ）４０６〜４０８、４０９〜４１０、４１１、５２６、５２７、５２８；
ｄｄ）４１２〜４１４、４１５〜４１６、４１７、５２９、５３０、５３１；
ｅｅ）４１８〜４２０、４２１〜４２２、４２３、５３２、５３３、５３４；
ｆｆ）４２４〜４２６、４２７〜４２８、４２９、５３５、５３６、５３７；
ｇｇ）４３０〜４３２、４３３〜４３４、４３５、５３８、５３９、５４０；
ｈｈ）４３６〜４３８、４３９〜４４０、４４１、５４１、５４２、５４３；
ｉｉ）４４２〜４４４、４４５〜４４６、４４７、５４４、５４５、５４６；
ｊｊ）４４８〜４５０、４５１〜４５２、４５３、５４７、５４８、５４９；
ｋｋ）４５４〜４５６、４５７〜４５８、４５９、５５０、５５１、５５２；
ｌｌ）４６０〜４６２、４６３〜４６４、４６５、５５３、５５４、５５５；
ｍｍ）４６６〜４６８、４６９〜４７０、４７１、５５６、５５７、５５８；
ｎｎ）４７２〜４７４、４７５〜４７６、４７７、５５９、５６０、５６１；
ｏｏ）４７８〜４８０、４８１〜４８２、４８３、５６２、５６３、５６４；
ｐｐ）４８４〜４８６、４８７〜４８８、４８９、５６５、５６６、５６７；
ｑｑ）４９０〜４９２、４９３〜４９４、４９５、５６８、５６９、５７０；
ｒｒ）４９６〜４９８、４９９〜５００、５０１、５７１、５７２、５７３；
ｓｓ）５０２〜５０４、５０５〜５０６、５０７、５７４、５７５、５７６；および
ｔｔ）５０８〜５１０、５１１〜５１２、５１３、５７７、５７８、５７９、のうちの一つから選択される、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項５９】
前記抗原結合分子が、
ａ）それぞれ、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、および３８０のうちの一つから選択されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン、および
ｂ）それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、および３８１のうちの一つから選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む可変重鎖ドメイン、を含む、請求項５６に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６０】
前記抗原結合分子が、それぞれ、配列番号
ａ）１および２；
ｂ）３および４；
ｃ）５および６；
ｄ）７および８；
ｅ）９および１０；
ｆ）１１および１２；
ｇ）１３および１４；
ｈ）１５および１６；
ｉ）１７および１８；
ｊ）１９および２０；
ｋ）２１および２２；
ｌ）２３および２４；
ｍ）２５および２６；
ｎ）２７および２８；
ｏ）２９および３０；
ｐ）３１および３２；
ｑ）３３および３４；
ｒ）３５および３６；
ｓ）３７および３８；
ｔ）３９および４０；
ｕ）４１および４２；
ｖ）４３および４４；
ｗ）４５および４６；
ｘ）４７および４８；
ｙ）３３８および３３９；
ｚ）３４０および３４１；
ａａ）３４２および３４３；
ｂｂ）３４４および３４５；
ｃｃ）３４６および３４７；
ｄｄ）３４８および３４９；
ｅｅ）３５０および３５１；
ｆｆ）３５２および３５３；
ｇｇ）３５４および３５５；
ｈｈ）３５６および３５７；
ｉｉ）３５８および３５９；
ｊｊ）３６０および３６１；
ｋｋ）３６２および３６３；
ｌｌ）３６４および３６５；
ｍｍ）３６６および３６７；
ｎｎ）３６８および３６９；
ｏｏ）３７０および３７１；
ｐｐ）３７２および３７３；
ｑｑ）３７４および３７５；
ｒｒ）３７６および３７７；
ｓｓ）３７８および３７９；および
ｔｔ）３８０および３８１、のうちの一つから選択される軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６１】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有する、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６２】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含有する、請求項５６〜６１のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６３】
第二の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含有する、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６４】
前記第二の細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含有する、請求項６３に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６５】
前記細胞外リガンド−結合ドメインと前記第一の膜貫通ドメインの間にストークドメインをさらに含有する、請求項５６〜６４のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６６】
前記ストークドメインは、ヒトＣＤ８αのヒンジ、ＩｇＧ１のヒンジ、およびＦｃγＲＩＩＩαのヒンジからなる群から選択される、請求項６５に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６７】
ＣＤ２０エピトープをさらに含有する、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６８】
前記ＣＤ２０エピトープは、配列番号２９３または配列番号２９４または配列番号６０９に示されるアミノ酸配列を含有する、請求項６７に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項６９】
前記第一の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖膜貫通ドメインを含有する、請求項５６〜６８のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項７０】
ＣＤ７０に特異的ではない別の細胞外リガンド−結合ドメインをさらに含有する、請求項５６〜６９のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項７１】
前記細胞外リガンド−結合ドメイン、前記第一の膜貫通ドメイン、および前記細胞内シグナル伝達ドメインは、一つのポリペプチド上にある、請求項５６〜７０のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項７２】
第二の膜貫通ドメインをさらに含有し、前記第一の膜貫通ドメインおよび前記細胞外リガンド−結合ドメインは、第一のポリペプチド上にあり、および前記第二の膜貫通ドメインおよび前記細胞内シグナル伝達ドメインは、第二のポリペプチド上にあり、前記第一の膜貫通ドメインは、高アフィニティＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖に由来する膜貫通ドメインを含有し、および前記第二の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖に由来する膜貫通ドメインを含有する、請求項５６〜７０のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項７３】
共刺激性分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインに融合された第三の膜貫通ドメインを含有する第三のポリペプチドをさらに含有し、前記第三の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖に由来する膜貫通ドメインを含有する、請求項７２に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲ。
【請求項７４】
請求項５６〜７３のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項７５】
請求項７４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項７６】
その細胞表面膜に、請求項５６〜７３のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する、操作された免疫細胞。
【請求項７７】
ＣＤ７０に特異的ではない別のＣＡＲをさらに含む、請求項７６に記載の操作された免疫細胞。
【請求項７８】
自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７６または７７に記載の操作された免疫細胞。
【請求項７９】
前記自殺ポリペプチドが、ＲＱＲ８である、請求項７８に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８０】
前記免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球から誘導される、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８１】
一つまたは複数の内因性遺伝子の破壊をさらに含み、前記内因性遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）、ＣＤ７０、または例えばｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントタンパク質をコードする、請求項７６〜８０のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８２】
ＴＣＲαおよびＣＤ５２、またはＴＣＲα、ＣＤ５２およびＣＤ７０の破壊をさらに含む、請求項７６〜８１のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８３】
前記免疫細胞が健常なドナーから取得される、請求項７６〜８２のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８４】
前記免疫細胞が患者から取得される、請求項７６〜８２のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８５】
医薬品としての使用のための請求項７６〜８４のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８６】
前記医薬品が、癌の治療における使用のためである、請求項８５に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８７】
前記癌が、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項８６に記載の操作された免疫細胞。
【請求項８８】
請求項７６〜８７のいずれか１項に記載の細胞の群であって、
ａ）前記細胞群は、幹細胞メモリー細胞およびセントラルメモリー細胞の２０％、３０％または４０％よりも高い割合を構成し、および／または
ｂ）前記細胞群は、実施例４に開示されるアッセイを使用して測定されるときに、６日目で、再帰的ＣＤ７０発現細胞に対し、１０％、２０％、３０％または４０％よりも高いＣＤ７０発現細胞の溶解割合を達成する、細胞群。
【請求項８９】
前記細胞群は、実施例４に開示されるアッセイを使用して測定されるときに、６日目で、再帰的ＣＤ７０発現細胞に対し、２０％よりも高いＣＤ７０発現細胞の溶解割合を達成する、請求項８８に記載の細胞群。
【請求項９０】
免疫細胞を操作する方法であって、
ａ）免疫細胞を提供すること、および
ｂ）前記細胞に、請求項５６〜７３のいずれか１項に記載の前記ＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを導入すること、を含む、方法。
【請求項９１】
ＣＤ７０に特異的ではない少なくとも一つの他のＣＡＲを導入することをさらに含む、請求項９０に記載の免疫細胞を操作する方法。
【請求項９２】
その必要のある対象を治療する方法であって、
ａ）請求項５６〜７３のいずれか１項に記載のＣＤ７０特異的ＣＡＲを、表面に発現する免疫細胞を提供すること、および
ｂ）前記免疫細胞を前記患者に投与すること、を含む、方法。
【請求項９３】
請求項７６〜８７のいずれか１項に記載の操作された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項９４】
対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞と関連した状態を治療する方法であって、その必要のある対象に、請求項９３に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項９５】
前記状態が癌である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記癌が、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、および非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍の増殖または進行を阻害する方法であって、その必要のある前記対象に、請求項９３に記載の医薬組成物の前記対象に対する有効量を投与することを含む、方法。
【請求項９８】
対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、その必要のある前記対象に、請求項９３に記載の医薬組成物の前記対象に対する有効量を投与することを含む、方法。
【請求項９９】
ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍の退縮を誘導する方法であって、その必要のある前記対象に、請求項９３に記載の医薬組成物の前記対象に対する有効量を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／７７５，２４６号明細書、２０１８年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６４１，８６９号明細書、２０１８年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６４１，８７３号明細書、２０１８年２月１日に出願された米国仮特許出願第６２／６２５，００９号明細書、および２０１８年２月１日に出願された米国仮特許出願第６２／６２５，０１９号明細書の優先権を主張するものであり、当該出願の各々がその全体で参照により本明細書に組み込まれる。
配列表への参照
【０００２】
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に出願され、．ｔｘｔフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルには、約７２５キロバイトのサイズを有する、２０１９年１月２４日に作成された“ＡＬＧＮ＿０１４＿０３ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ”と題された配列表が含まれる。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）に関する。ＣＡＲは、免疫細胞の特異性および反応性を、リガンド−結合ドメインの性質を活用する選択標的に対して再指向化させることができる。特に本開示は、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０に特異的に結合するＣＡＲ（ＣＤ７０特異的ＣＡＲ）に関する。本開示はさらに、ＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、およびその表面にＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する単離細胞に関する。本開示はさらに、その表面にＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する免疫細胞を操作する方法に関する。本開示は特に、リンパ腫、白血病、グリオーマ、または腎細胞癌（ＲＣＣ）などの癌の治療に有用である。本開示はさらに、ＣＤ７０特異的ＣＡＲを含む免疫細胞（ＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞）、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物、およびＣＤ７０を発現する悪性細胞に関連する状態（例えば、癌）を治療するためのＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
悪性腫瘍関連抗原を認識するよう遺伝子改変された免疫細胞の養子免疫伝達は、癌治療の新しいアプローチとしての有望性を示している（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２２（２）：２５１−２５７（２０１０）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，８（４）：２９９−３０８（２００８）を参照のこと）。Ｔ細胞は、抗原認識部分とＴ細胞活性化ドメインから構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されることができる（例えば、Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（２）：７２０−７２４（１９９３），ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２１（２）：２１５−２２３（２００９）を参照のこと）。
【０００５】
Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０（ＣＤ７０、ＣＤ２７ＬＧまたはＴＮＦＳＦ７）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）スーパーファミリーの１種であり、そしてＴＮＦスーパーファミリー受容体であるＣＤ２７のリガンドである。ＣＤ２７とＣＤ７０との間の一時的な相互作用によってＴ細胞の共刺激がもたらされ、この刺激はＣＤ２８による刺激に対して相補的である。ＣＤ７０は、例えば非ホジキンリンパ腫およびホジキン病などの血液の癌、ならびに例えばグリア芽腫および腎細胞癌などの固形腫瘍で発現されており、ｃｃＲＣＣ上でのその発現は、ほぼ均一である（例えば、Ｇｒｅｗａｌ  Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ，１２（３）：３４１−３５１（２００８）を参照のこと）。悪性腫瘍関連抗原を認識するよう遺伝子改変されたＴ細胞の養子免疫伝達は、癌治療の新しいアプローチとしての有望性を示している（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２２（２）：２５１−２５７（２０１０）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，８（４）：２９９−３０８（２００８）を参照のこと）。Ｔ細胞は、抗原認識部分とＴ細胞活性化ドメインから構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されることができる（例えば、Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０（２）：７２０−７２４（１９９３），ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２１（２）：２１５−２２３（２００９）を参照のこと）。正常組織上のＣＤ７０の発現は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および樹状細胞に限定される。しかし活性化Ｔ細胞上のＣＤ７０発現は、製造プロセス中に標的誘導性のＴ細胞の分化、枯渇および同士討ち（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）が発生する可能性があり、ＣＡＲ  Ｔ細胞の製造に懸念が生じ得る。
【０００６】
腎細胞癌（ＲＣＣ：Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、腎皮質を起源とする癌であり、腎臓の癌の約９０％を占めている。組織学的には、ＲＣＣはいくつかのサブタイプに分類されることができる。その中で明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ：Ｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）が最も普遍的であり、最も多くの死者が発生している。毎年、３２万件を超えるＲＣＣが世界で報告されており、おおよそ１４万人が死亡している。ＲＣＣの発生率はこの１０年間で着実に上昇しており、すべての成人の悪性腫瘍の２〜３％を占めている。初期ステージの限局性腫瘍を有する患者は外科的切除を選択することができる。しかし限局性疾患が早期に血行性に播種する場合には、転移が発生する。早期転移の部位としては、肺、リンパ節、肝臓、骨および脳が挙げられ、そして数は少ないが副腎、および対側腎が挙げられる。進行性疾患の患者は高い死亡率を有し、ステージＩＩＩの疾患で５年生存率の中央値は５３％、転移性疾患ではわずか８％である。進行性疾患に対する現在のファーストライン治療選択肢には、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）受容体を標的とする例えばスニチニブおよびパゾパニブなどの低分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ：Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、例えばベバシズマブなどのＶＥＧＦを標的とするモノクローナル抗体、ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）の阻害剤であるテムシロリムス、ならびに高用量ＩＬ−２が含まれる。これらＶＥＧＦを標的とする治療法は全体的な生存率を改善してきたが、長期間の薬剤の耐性により疾患の再発が生じており、進行性疾患に対する治療法はいまだアンメットニーズである（例えば、Ｚａｒｒａｂｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１０：３８（２０１７）を参照のこと）。
【０００７】
したがって癌、特にＣＤ７０の異常発現を含む悪性腫瘍に対する代替治療のニーズが存在する。例えばＣＡＲ  Ｔ療法などの新たな免疫療法は、ＣＤ７０が発現している例えばｍＲＣＣなどの癌を有する患者の転帰を大幅に改善する可能性を有している。したがってＣＤ７０特異的ＣＡＲおよびＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用した癌（例えばｍＲＣＣ）の治療は、有望な治療剤となるであろう。本明細書において、このニーズに対処する方法および組成物が提供される。
【発明の概要】
【０００８】
ＣＤ７０に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ならびに当該受容体を作製する方法および使用する方法が本明細書において提供される。例えばＣＤ７０  ＣＡＲを含むＴ細胞などの免疫細胞も本明細書において提供される。あるＣＤ７０特異的ＣＡＲは、Ｔ細胞で発現されたときに、ＣＤ７０との接触でＴ細胞を活性化するのに有効であることが示されている。有利なことに、本明細書に提供されるＣＤ７０特異的ＣＡＲは、ヒトＣＤ７０に結合する。さらに有利なことには、本明細書に提供されるＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ７０発現細胞との接触で、細胞傷害活性を呈する。ＣＤ７０に結合する抗体、ならびに当該抗体を作製する方法および使用する方法も本明細書において提供される。本明細書に提供されるＣＤ７０特異的抗体は、ヒトＣＤ７０に結合する。
【０００９】
一つの態様において、本開示は、細胞外リガンド−結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０（ＣＤ７０）特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供するものであり、当該細胞外ドメインは、ＣＤ７０の細胞外ドメインに結合する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含有する。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０特異的ＣＡＲを提供するものであり、本明細書に提供されるＣＡＲの細胞外ドメインは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、または３８１に示される配列を含むＶＨ領域由来の三つのＣＤＲを含む重鎖可変（ＶＨ）領域、および配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、または３８０に示されるＶＬ領域由来の三つのＣＤＲを含む軽鎖可変（ＶＬ）領域、を含有する。一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９もしくは３８１に示される配列、またはＣＤＲ内ではない残基に一つまたは複数の保存的アミノ酸置換を伴うそのバリアントを含有し、および／またはＶＬ領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８もしくは３８０に示されるアミノ酸配列、またはＣＤＲ内ではないアミノ酸に一つまたは複数のアミノ酸置換を伴うそのバリアントを含有する。
【００１１】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４９、５０または５１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５２または５３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号１９３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１９４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１９５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００１２】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００１３】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号５５、５６または５７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５８または５９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号１９６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号１９７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号１９８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００１４】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００１５】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６１、６２または６３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号６４または６５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号１９９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２００に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２０１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００１６】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００１７】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号６７、６８または６９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７０または７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号７２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２０２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２０３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２０４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００１８】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００１９】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号７３、７４または７５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７６または７７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２０５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２０６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２０７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００２０】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００２１】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号７９、８０または８１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８２または８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号８４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２０８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２０９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００２２】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００２３】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号８５、８６または８７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号８８または８９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号９０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２１１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２１２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２１３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００２４】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号９１、９２または９３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号９４または９５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号９６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２１４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２１５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２１６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００２５】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００２６】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号９７、９８または９９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１００または１０１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２１８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２１９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００２７】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００２８】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１０３、１０４または１０５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１０６または１０７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１０８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２２０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２２１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２２２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００２９】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００３０】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１０９、１１０または１１１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１２または１１３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１１４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２２３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２２４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２２５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００３１】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００３２】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１１５、１１６または１１７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１８または１１９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１２０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２２６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２２７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２２８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００３３】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００３４】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１２１、１２２または１２３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１２４または１２５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１２６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２２９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２３１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００３５】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００３６】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１２７、１２８または１２９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１３０または１３１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１３２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２３２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２３４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００３７】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００３８】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１３３、１３４または１３５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１３６または１３７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１３８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２３５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２３７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００３９】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００４０】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１３９、１４０または１４１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１４２または１４３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１４４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２３８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２３９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２４０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００４１】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００４２】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１４５、１４６または１４７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１４８または１４９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１５０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２４１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２４２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２４３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００４３】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００４４】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１５１、１５２または１５３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１５４または１５５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２４４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２４５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２４６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００４５】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００４６】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１５７、１５８または１５９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１６０または１６１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１６２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２４７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２４８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２４９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００４７】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００４８】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１６３、１６４または１６５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１６６または１６７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１６８に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２５０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２５１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２５２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００４９】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００５０】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１６９、１７０または１７１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１７２または１７３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１７４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２５３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２５４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２５５に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００５１】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００５２】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１７５、１７６または１７７に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１７８または１７９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１８０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２５６に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２５７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２５８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００５３】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００５４】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１８１、１８２または１８３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１８４または１８５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１８６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２５９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２６０に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２６１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００５５】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００５６】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号１８７、１８８または１８９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１９０または１９１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号１９２に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３を含有し、ＶＬ領域は、配列番号２６２に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２６３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２６４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含有する。
【００５７】
一部の実施形態では、ＶＨ領域は、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含有し、ＶＬ領域は、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００５８】
一部の実施形態では、各ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組み合わせ、ＡｂＭ定義、またはＣＤＲの接触定義に従い規定される。
【００５９】
一部の実施形態では、各ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、拡張定義（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組み合わせ、ＡｂＭ定義、ＣＤＲの接触定義、および／またはＣＤＲのコンフォメーション定義（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）に従い規定される。
【００６０】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有する。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲはさらに、第二の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。一部の実施形態では、第二の細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、第一のＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二の４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。
【００６１】
一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有する。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲはさらに、２個の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲはさらに、３、４、５または６個の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、第一の細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二の細胞内シグナル伝達ドメインを含有し、当該第二の細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。
【００６２】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド−結合ドメインと第一の膜貫通ドメインの間にストーク（ｓｔａｌｋ）ドメインを含有してもよい。一部の実施形態では、ストークドメインは、ヒトＣＤ８αのヒンジ、ＩｇＧ１のヒンジ、およびＦｃγＲＩＩＩαのヒンジからなる群から選択される。一部の実施形態では、ストークドメインは、ヒトＣＤ８αのヒンジ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、またはヒトＦｃγＲＩＩＩαのヒンジである。
【００６３】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２０のエピトープを含有してもよい。一部の実施形態では、ＣＤ２０のエピトープは、配列番号２９３または配列番号２９４または配列番号６０９に示されるアミノ酸配列を含有する。
【００６４】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、表５に列記される配列番号３１１〜３３４に示されるアミノ酸配列を含有してもよい。一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３１９または配列番号３２７に示されるアミノ酸配列を含有してもよい。
【００６５】
一部の実施形態では、第一の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖の膜貫通ドメインを含有する。
【００６６】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ７０に特異的ではない別の細胞外リガンド−結合ドメインを含有してもよい。
【００６７】
一部の実施形態では、細胞外リガンド−結合ドメイン、第一の膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインは、一つのポリペプチド上にある。
【００６８】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、第二の膜貫通ドメインを含有してもよく、当該第一の膜貫通ドメインおよび当該細胞外リガンド−結合ドメインは、第一のポリペプチド上にあり、当該第二の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは、第二のポリペプチド上にあり、当該第一の膜貫通ドメインは、高アフィニティＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）のα鎖に由来する膜貫通ドメインを含有し、第二の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖に由来する膜貫通ドメインを含有する。
【００６９】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激性分子に由来する細胞内シグナル伝達ドメインに融合された第三の膜貫通ドメインを含有する第三のポリペプチドを含有してもよく、当該第三の膜貫通ドメインは、ＦｃεＲＩのγ鎖またはβ鎖に由来する膜貫通ドメインを含有する。
【００７０】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードする核酸配列を含有する単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００７１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを提供する。
【００７２】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲを、その細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞を提供する。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＤ７０に特異的ではない別のＣＡＲを含有してもよい。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してもよい。一部の実施形態では、自殺ポリペプチドは、ＲＱＲ８である。
【００７３】
一部の実施形態では、操作された免疫は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球から誘導される。
【００７４】
一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、一つまたは複数の内因性遺伝子が破壊されていてもよく、当該内因性遺伝子は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ：ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ：ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓａｅ）、ＣＤ７０、または例えばｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントタンパク質をコードする。
【００７５】
一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、健常なドナーから取得される。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、患者から取得される。
【００７６】
別の態様では、本開示は、医薬品としての使用のための、本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲをその細胞表面膜で発現する操作された免疫細胞を提供する。一部の実施形態では、医薬品は、癌治療における使用のための医薬品である。一部の実施形態では、医薬品は、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または非小細胞肺癌の治療のための医薬品である。
【００７７】
別の態様では、本開示は、免疫細胞を操作する方法を提供するものであり、当該方法は、免疫細胞を提供すること、および本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲを少なくとも一つ、当該細胞表面上で発現させること、を含む。一部の実施形態では、当該方法は、免疫細胞を提供すること、当該細胞に、当該ＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを少なくとも一つ導入すること、および当該細胞内で当該ポリヌクレオチドを発現させること、を含む。
【００７８】
一部の実施形態では、当該方法は、免疫細胞を提供すること、当該細胞に、当該ＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを少なくとも一つ導入すること、およびＣＤ７０に特異的ではない他のＣＡＲを少なくとも一つ導入すること、を含む。
【００７９】
別の態様では、本開示は、悪性細胞に関連した状態に罹患する対象を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲを当該表面上で発現する免疫細胞を提供すること、および当該患者に、当該免疫細胞を投与すること、を含む。
【００８０】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される操作された免疫細胞を含有する医薬組成物を提供する。
【００８１】
別の態様では、本開示は、対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞と関連した状態を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、その必要のある対象に、本明細書に記載される操作された免疫細胞を含む医薬組成物の有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、状態は、癌である。一部の実施形態では、癌は、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または非小細胞肺癌である。
【００８２】
別の態様では、本開示は、ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において、腫瘍の増殖または進行を阻害する方法を提供するものであり、当該方法は、その必要のある対象に対し、本明細書に記載される操作された免疫細胞を含む医薬組成物の当該対象に対する有効量を投与することを含む。
【００８３】
別の態様では、本開示は、対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞の転移を阻害する方法を提供するものであり、当該方法は、その必要のある対象に対し、本明細書に記載される操作された免疫細胞を含む医薬組成物の当該対象に対する有効量を投与することを含む。
【００８４】
別の態様では、本開示は、ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において、腫瘍の退縮を誘導する方法を提供するものであり、当該方法は、その必要のある対象に、本明細書に記載される操作された免疫細胞を含む医薬組成物の当該対象に対する有効量を投与することを含む。
【００８５】
一部の実施形態では、上述の方法のいずれかは、例えばモノクローナル抗体および／または化学療法剤などの一つまたは複数の追加の療法を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体など、チェックポイント阻害物質に結合する抗体であってもよい。一部の実施形態では、上記方法のいずれかは、例えばスニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）またはアキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）などの受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ）阻害剤を投与することをさらに含む。
【００８６】
一部の実施形態では、本開示は、細胞外リガンド−結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含有するＣＤ７０特異的ＣＡＲを提供するものであり、当該細胞外ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を有するＣＤ７０の細胞外ドメインに結合する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を含有し、この場合において当該ＶＨ領域は、配列番号１８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有し、および当該ＶＬ領域は、配列番号１７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有し、または当該ＶＨ領域は、配列番号３４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有し、および当該ＶＬ領域は、配列番号３３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有する。
【００８７】
一部の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号３１９と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有する。一部の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号３２７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通するアミノ酸配列を含有する。
【００８８】
一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供するものであり、この場合において当該ポリヌクレオチドは、配列番号２９７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通し、および配列番号２９８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通する核酸配列を含有するか、または配列番号３０７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通し、および配列番号３０８と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％共通する核酸配列を含有する。
【００８９】
一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合する抗原結合分子を含有するＣＡＲを提供するものであり、この場合において当該抗原結合分子は、配列番号４９〜５１、５５〜５７、６１〜６３、６７〜６９、７３〜７５、７９〜８１、８５〜８７、９１〜９３、９７〜９９、１０３〜１０５、１０９〜１１１、１１５〜１１７、１２１〜１２３、１２７〜１２９、１３３〜１３５、１３９〜１４１、１４５〜１４７、１５１〜１５３、１５７〜１５９、１６３〜１６５、１６９〜１７１、１７５〜１７７、１８１〜１８３、１８７〜１８９、３８２〜３８４、３８８〜３９０、３９４〜３９６、４００〜４０２、４０６〜４０８、４１２〜４１４、４１８〜４２０、４２４〜４２６、４３０〜４３２、４３６〜４３８、４４２〜４４４、４４８〜４５０、４５４〜４５６、４６０〜４６２、４６６〜４６８、４７２〜４７４、４７８〜４８０、４８４〜４８６、４９０〜４９２、４９６〜４９８、５０２〜５０４、および５０８〜５１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する可変重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２、５３、５８、５９、６４、６５、７０、７１、７６、７７、８２、８３、８８、８９、９４、９５、１００、１０１、１０６、１０７、１１２、１１３、１１８、１１９、１２４、１２５、１３０、１３１、１３６、１３７、１４２、１４３、１４８、１４９、１５４、１５５、１６０、１６１、１６６、１６７、１７２、１７３、１７８、１７９、１８４、１８５、１９０、１９１、３８５、３８６、３９１、３９２、３９７、３９８、４０３、４０４、４０９、４１０、４１５、４１６、４２１、４２２、４２７、４２８、４３３、４３４、４３９、４４０、４４５、４４６、４５１、４５２、４５７、４５８、４６３、４６４、４６９、４７０、４７５、４７６、４８１、４８２、４８７、４８８、４９３、４９４、４９９、５００、５０５、５０６、５１１、および５１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する可変重鎖ＣＤＲ２、配列番号５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、３８７、３９３、３９９、４０５、４１１、４１７、４２３、４２９、４３５、４４１、４４７、４５３、４５９、４６５、４７１、４７７、４８３、４８９、４９５、５０１、５０７、および５１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する可変重鎖ＣＤＲ３、配列番号１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、２６２、５１４、５１７、５２０、５２３、５２６、５２９、５３２、５３５、５３８、５４１、５４４、５４７、５５０、５５３、５５６、５５９、５６２、５６５、５６８、５７１、５７４、および５７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する可変軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、２６０、２６３、５１５、５１８、５２１、５２４、５２７、５３０、５３３、５３６、５３９、５４２、５４５、５４８、５５１、５５４、５５７、５６０、５６３、５６６、５６９、５７２、５７５、および５７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する可変軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６４、５１６、５１９、５２２、５２５、５２８、５３１、５３４、５３７、５４０、５４３、５４６、５４９、５５２、５５５、５５８、５６１、５６４、５６７、５７０、５７３、５７６、および５７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する可変軽鎖ＣＤＲ３、のうちの少なくとも一つを含有する。
【００９０】
一部の実施形態では、抗原結合分子は、それぞれ配列番号４９〜５１、５２〜５３、５４；５５〜５７、５８〜５９、６０；６１〜６３、６４〜６５、６６；６７〜６９、７０〜７１、７２；７３〜７５、７６〜７７、７８；７９〜８１、８２〜８３、８４；８５〜８７、８８〜８９、９０；９１〜９３、９４〜９５、９６；９７〜９９、１００〜１０１、１０２；１０３〜１０５、１０６〜１０７、１０８；１０９〜１１１、１１２〜１１３、１１４；１１５〜１１７、１１８〜１１９、１２０；１２１〜１２３、１２４〜１２５、１２６；１２７〜１２９、１３０〜１３１、１３２；１３３〜１３５、１３６〜１３７、１３８；１３９〜１４１、１４２〜１４３、１４４；１４５〜１４７、１４８〜１４９、１５０；１５１〜１５３、１５４〜１５５、１５６；１５７〜１５９、１６０〜１６１、１６２；１６３〜１６５、１６６〜１６７、１６８；１６９〜１７１、１７２〜１７３、１７４；１７５〜１７７、１７８〜１７９、１８０；１８１〜１８３、１８４〜１８５、１８６；１８７〜１８９、１９０〜１９１、１９２；３８２〜３８４、３８５〜３８６、３８７；３８８〜３９０、３９１〜３９２、３９３；３９４〜３９６、３９７〜３９８、３９９；４００〜４０２、４０３〜４０４、４０５；４０６〜４０８、４０９〜４１０、４１１；４１２〜４１４、４１５〜４１６、４１７；４１８〜４２０、４２１〜４２２、４２３；４２４〜４２６、４２７〜４２８、４２９；４３０〜４３２、４３３〜４３４、４３５；４３６〜４３８、４３９〜４４０、４４１；４４２〜４４４、４４５〜４４６、４４７；４４８〜４５０、４５１〜４５２、４５３；４５４〜４５６、４５７〜４５８、４５９；４６０〜４６２、４６３〜４６４、４６５；４６６〜４６８、４６９〜４７０、４７１；４７２〜４７４、４７５〜４７６、４７７；４７８〜４８０、４８１〜４８２、４８３；４８４〜４８６、４８７〜４８８、４８９；４９０〜４９２、４９３〜４９４、４９５；４９６〜４９８、４９９〜５００、５０１；５０２〜５０４、５０５〜５０６、５０７；または５０８〜５１０、５１１〜５１２、５１３のうちの一つから選択されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含有する可変重鎖ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号１９３、１９４、１９５；１９６、１９７、１９８；１９９、２００、２０１；２０２、２０３、２０４；２０５、２０６、２０７；２０８、２０９、２１０；２１１、２１２、２１３；２１４、２１５、２１６；２１７、２１８、２１９；２２０、２２１、２２２；２２３、２２４、２２５；２２６、２２７、２２８；２２９、２３０、２３１；２３２、２３３、２３４；２３５、２３６、２３７；２３８、２３９、２４０；２４１、２４２、２４３；２４４、２４５、２４６；２４７、２４８、２４９；２５０、２５１、２５２；２５３、２５４、２５５；２５６、２５７、２５８；２５９、２６０、２６１；２６２、２６３、２６４；５１４、５１５、５１６；５１７、５１８、５１９；５２０、５２１、５２２；５２３、５２４、５２５；５２６、５２７、５２８；５２９、５３０、５３１；５３２、５３３、５３４；５３５、５３６、５３７；５３８、５３９、５４０；５４１、５４２、５４３；５４４、５４５、５４６；５４７、５４８、５４９；５５０、５５１、５５２；５５３、５５４、５５５；５５６、５５７、５５８；５５９、５６０、５６１；５６２、５６３、５６４；５６５、５６６、５６７；５６８、５６９、５７０；５７１、５７２、５７３；５７４、５７５、５７６；および５７７、５７８、５７９のうちの一つから選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含有する可変軽鎖ドメイン、を含有する。
【００９１】
一部の実施形態では、抗原結合分子は、それぞれ配列番号４９〜５１、５２〜５３、５４、１９３、１９４、１９５；５５〜５７、５８〜５９、６０、１９６、１９７、１９８；６１〜６３、６４〜６５、６６、１９９、２００、２０１；６７〜６９、７０〜７１、７２、２０２、２０３、２０４；７３〜７５、７６〜７７、７８、２０５、２０６、２０７；７９〜８１、８２〜８３、８４、２０８、２０９、２１０；８５〜８７、８８〜８９、９０、２１１、２１２、２１３；９１〜９３、９４〜９５、９６、２１４、２１５、２１６；９７〜９９、１００〜１０１、１０２、２１７、２１８、２１９；１０３〜１０５、１０６〜１０７、１０８、２２０、２２１、２２２；１０９〜１１１、１１２〜１１３、１１４、２２３、２２４、２２５；１１５〜１１７、１１８〜１１９、１２０、２２６、２２７、２２８；１２１〜１２３、１２４〜１２５、１２６、２２９、２３０、２３１；１２７〜１２９、１３０〜１３１、１３２、２３２、２３３、２３４；１３３〜１３５、１３６〜１３７、１３８、２３５、２３６、２３７；１３９〜１４１、１４２〜１４３、１４４、２３８、２３９、２４０；１４５〜１４７、１４８〜１４９、１５０、２４１、２４２、２４３；１５１〜１５３、１５４〜１５５、１５６、２４４、２４５、２４６；１５７〜１５９、１６０〜１６１、１６２、２４７、２４８、２４９；１６３〜１６５、１６６〜１６７、１６８、２５０、２５１、２５２；１６９〜１７１、１７２〜１７３、１７４、２５３、２５４、２５５；１７５〜１７７、１７８〜１７９、１８０、２５６、２５７、２５８；１８１〜１８３、１８４〜１８５、１８６、２５９、２６０、２６１；１８７〜１８９、１９０〜１９１、１９２、２６２、２６３、２６４；３８２〜３８４、３８５〜３８６、３８７、５１４、５１５、５１６；３８８〜３９０、３９１〜３９２、３９３、５１７、５１８、５１９；３９４〜３９６、３９７〜３９８、３９９、５２０、５２１、５２２；４００〜４０２、４０３〜４０４、４０５、５２３、５２４、５２５；４０６〜４０８、４０９〜４１０、４１１、５２６、５２７、５２８；４１２〜４１４、４１５〜４１６、４１７、５２９、５３０、５３１；４１８−４２０、４２１〜４２２、４２３、５３２、５３３、５３４；４２４〜４２６、４２７〜４２８、４２９、５３５、５３６、５３７；４３０〜４３２、４３３〜４３４、４３５、５３８、５３９、５４０；４３６〜４３８、４３９〜４４０、４４１、５４１、５４２、５４３；４４２〜４４４、４４５〜４４６、４４７、５４４、５４５、５４６；４４８〜４５０、４５１〜４５２、４５３、５４７、５４８、５４９；４５４〜４５６、４５７〜４５８、４５９、５５０、５５１、５５２；４６０〜４６２、４６３〜４６４、４６５、５５３、５５４、５５５；４６６〜４６８、４６９〜４７０、４７１、５５６、５５７、５５８；４７２〜４７４、４７５〜４７６、４７７、５５９、５６０、５６１；４７８〜４８０、４８１〜４８２、４８３、５６２、５６３、５６４；４８４〜４８６、４８７〜４８８、４８９、５６５、５６６、５６７；４９０〜４９２、４９３〜４９４、４９５、５６８、５６９、５７０；４９６〜４９８、４９９〜５００、５０１、５７１、５７２、５７３；５０２〜５０４、５０５〜５０６、５０７、５７４、５７５、５７６；および５０８〜５１０、５１１〜５１２、５１３、５７７、５７８、５７９のうちの一つから選択されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含有する。
【００９２】
一部の実施形態では、抗原結合分子は、それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、および３８０のうちの一つから選択されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含有する可変軽鎖ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、および３８１のうちの一つから選択されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含有する可変重鎖ドメイン、を含有する。
【００９３】
一部の実施形態では、抗原結合分子は、それぞれ配列番号１および２；３および４；５および６；７および８；９および１０；１１および１２；１３および１４；１５および１６；１７および１８；１９および２０；２１および２２；２３および２４；２５および２６；２７および２８；２９および３０；３１および３２；３３および３４；３５および３６；３７および３８；３９および４０；４１および４２；４３および４４；４５および４６；４７および４８；３３８および３３９；３４０および３４１；３４２および３４３；３４４および３４５；３４６および３４７；３４８および３４９；３５０および３５１；３５２および３５３；３５４および３５５；３５６および３５７；３５８および３５９；３６０および３６１；３６２および３６３；３６４および３６５；３６６および３６７；３６８および３６９；３７０および３７１；３７２および３７３；３７４および３７５；３７６および３７７；３７８および３７９；ならびに３８０および３８１のうちの一つから選択される軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含有する。
【００９４】
別の態様では、本開示は、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０（ＣＤ７０）に特異的に結合する抗体を提供するものである。
【００９５】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、６６２、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９もしくは３８１に示されるＶＨ領域、および／または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、６６１、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８もしくは３８０に示されるＶＬ領域を含有する。
【００９６】
一部の実施形態では、抗体は、（ｉ）配列番号４９、５０、５１、５５、５６、５７、６１、６２、６３、６７、６８、６９、７３、７４、７５、７９、８０、８１、８５、８６、８７、９１、９２、９３、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０９、１１０、１１１、１１５、１１６、１１７、１２１、１２２、１２３、１２７、１２８、１２９、１３３、１３４、１３５、１３９、１４０、１４１、１４５、１４６、１４７、１５１、１５２、１５３、１５７、１５８、１５９、１６３、１６４、１６５、１６９、１７０、１７１、１７５、１７６、１７７、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、３８２、３８３、３８４、３８８、３８９、３９０、３９４、３９５、３９６、４００、４０１、４０２、４０６、４０７、４０８、４１２、４１３、４１４、４１８、４１９、４２０、４２４、４２５、４２６、４３０、４３１、４３２、６６３、６６４、６６５、４３６、４３７、４３８、４４２、４４３、４４４、４４８、４４９、４５０、４５４、４５５、４５６、４６０、４６１、４６２、４６６、４６７、４６８、４７２、４７３、４７４、４７８、４７９、４８０、４８４、４８５、４８６、４９０、４９１、４９２、４９６、４９７、４９８、５０２、５０３、５０４、５０８、５０９、または５１０に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号５２、５３、５８、５９、６４、６５、７０、７１、７６、７７、８２、８３、８８、８９、９４、９５、１００、１０１、１０６、１０７、１１２、１１３、１１８、１１９、１２４、１２５、１３０、１３１、１３６、１３７、１４２、１４３、１４８、１４９、１５４、１５５、１６０、１６１、１６６、１６７、１７２、１７３、１７８、１７９、１８４、１８５、１９０、１９１、３８５、３８６、３９１、３９２、３９７、３９８、４０３、４０４、４０９、４１０、４１５、４１６、４２１、４２２、４２７、４２８、４３３、４３４、６６６、６６７、４３９、４４０、４４５、４４６、４５１、４５２、４５７、４５８、４６３、４６４、４６９、４７０、４７５、４７６、４８１、４８２、４８７、４８８、４９３、４９４、４９９、５００、５０５、５０６、５１１、または５１２に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２；およびｉｉｉ）配列番号５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、３８７、３９３、３９９、４０５、４１１、４１７、４２３、４２９、４３５、６６８、４４１、４４７、４５３、４５９、４６５、４７１、４７７、４８３、４８９、４９５、５０１、５０７、または５１３に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、を含む重鎖可変（ＶＨ）領域；ならびに／または（ｉ）配列番号１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、２６２、５１４、５１７、５２０、５２３、５２６、５２９、５３２、５３５、５３８、６６９、５４１、５４４、５４７、５５０、５５３、５５６、５５９、５６２、５６５、５６８、５７１、５７４、または５７７に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、２６０、２６３、５１５、５１８、５２１、５２４、５２７、５３０、５３３、５３６、５３９、６７０、５４２、５４５、５４８、５５１、５５４、５５７、５６０、５６３、５６６、５６９、５７２、５７５、または５７８に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６４、５１６、５１９、５２２、５２５、５２８、５３１、５３４、５３７、５４０、６７１、５４３、５４６、５４９、５５２、５５５、５５８、５６１、５６４、５６７、５７０、５７３、５７６、または５７９に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域、を含有する。
【００９７】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、６６２、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、または３８１に示されるＶＨ配列のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および／または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、６６１、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、または３８０に示されるＶＬ配列のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域、を含有する。
【００９８】
さらなる態様では、本開示は、開示される抗体を用いた核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、作製方法、および状態の治療方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、皮下異種移植片モデルにおける、様々な投与量の４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて治療されたマウスの１腫瘍体積を示す図である。
【０１００】
【図２】図２は、皮下異種移植片モデルにおける、様々な投与量の４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて治療されたマウスの体重を示すプロットである。
【０１０１】
【図３】図３は、ＣＤ７０  ＫＯを伴う、または伴わない、皮下異種移植片モデルにおける、４Ｆ１１およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて治療されたマウスの腫瘍体積を示す図である。
【０１０２】
【図４】図４は、ＣＤ７０  ＫＯを伴う、または伴わない、皮下異種移植片モデルにおける、４Ｆ１１およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて治療されたマウスの体重を示す図である。
【０１０３】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、ＡＣＨＮ肺転移モデルにおける三つのドナーの、対照細胞で治療されたマウス、ＣＤ７０  ＫＯを伴う、または伴わない、およびＴＣＲａ  ＫＯを伴う、または伴わない、ＣＡＲ  ４Ｆ１１を発現する細胞で治療されたマウス、およびＣＤ７０  ＫＯを伴う、または伴わない、およびＴＣＲａ  ＫＯを伴う、または伴わない、ＣＡＲ  Ｐ０８Ｆ０８を発現する細胞で治療されたマウスの腫瘍変動（変動）値を示す一連の図である。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【０１０４】
図５Ａは、対照細胞で取得された結果、ＣＤ７０、ＴＣＲａ、またはＣＤ７０とＴＣＲａの両方のＫＯを伴う４Ｆ１１  ＣＡＲを発現する細胞で取得された結果、およびＴＣＲ  ＫＯを伴うＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲを発現する細胞で取得された結果を示す。細胞は、ドナーＤ４１９から取得された。
【０１０５】
図５Ｂは、対照細胞で取得された結果、ＣＤ７０  ＫＯを伴う、または伴わない４Ｆ１１  ＣＡＲを発現する細胞で取得された結果、およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲを発現する細胞で取得された結果を示す。細胞は、ドナーＤ７１０から取得された。
【０１０６】
図５Ｃは、対照細胞で取得された結果、ＣＤ７０  ＫＯを伴う、または伴わない４Ｆ１１    ＣＡＲを発現する細胞で取得された結果、およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲを発現する細胞で取得された結果を示す。細胞は、ドナーＤ５０３から取得された。
【０１０７】
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、五つの例示的、非限定的なＣＡＲデザインを示す。図６Ａ〜６Ｆのそれぞれにおいて、ＣＤ７０特異的ドメインの抗原結合断片と細胞膜のおよその距離は、二重の矢印により示されており、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインの間のアミノ酸残基の数（ａａ）がラベリングされている。
【０１０８】
図６Ａは、ＣＤ７０に特異的なｓｃＦｖを含む細胞外ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、第一の細胞内ドメイン（４−１ＢＢドメイン）、および第二の細胞内ドメイン（ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）、を含む第二世代ＣＡＲデザインを示す。
【０１０９】
図６Ｂは、ＳＲ２  ＣＡＲフォーマットを示しており、このフォーマットにおいて、自殺スイッチは、ヒンジとｓｃＦｖの間に二つのＲＴＸエピトープ（すなわちＣＤ２０エピトープ）を挿入することによって生成されている。
【０１１０】
図６Ｃは、ＲＳＲＱＲ  ＣＡＲフォーマットを示しており、このフォーマットでは第三のＲＴＸエピトープおよびＣＤ３４エピトープが加えられている。
【０１１１】
図６Ｄは、ＲＳＲフォーマットを示しており、このフォーマットでは、二つのＲＴＸエピトープがｓｃＦｖに隣接している。
【０１１２】
図６Ｅは、ＲＳＲ  ＣＡＲフォーマットの改変型を示しており、このフォーマットでは、ヒンジドメインが短縮されている（ＲＳＲ−短と呼ばれる）。
【０１１３】
図６Ｆは、Ｒ２Ｓ  ＣＡＲフォーマットを示しており、このフォーマットでは、Ｒ２  ＣＡＲフォーマットの二つのＲＴＸエピトープが、ｓｃＦｖのＮ末端に移動している。
【０１１４】
【図７】図７は、四つのフォーマットのＣＤ７０特異的ＣＡＲに暴露された後の標的細胞、または非形質導入（ＮＴＤ：ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）対照細胞の生存能力を示す。
【０１１５】
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した、７８６−０細胞、ＡＣＨＮ細胞またはＲＥＨ細胞の細胞殺傷を示す一連の図であり、この場合においてＣＡＲの細胞外ドメインは、図８Ｄの説明で示されるｓｃＦｖを含有する。
【０１１６】
図８Ａは、７８６−０細胞の細胞殺傷を示しており、この場合においてＣＡＲの細胞外ドメインは、図８Ｄの説明で示されるｓｃＦｖを含有する。
【０１１７】
図８Ｂは、ＡＣＨＮ細胞の細胞殺傷を示しており、この場合においてＣＡＲの細胞外ドメインは、図８Ｄの説明で示されるｓｃＦｖを含有する。
【０１１８】
図８Ｃは、ＲＥＨ細胞の細胞殺傷を示しており、この場合においてＣＡＲの細胞外ドメインは、図８Ｄの説明で示されるｓｃＦｖを含有する。
【０１１９】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｄは、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した、７８６−０細胞、ＡＣＨＮ細胞またはＲＥＨ細胞の一連の殺傷を示す一連の図であり、この場合においてＣＡＲの細胞外ドメインは、図９Ｄの説明で示されるｓｃＦｖを含有する。
【図９−２】同上。
【０１２０】
図９Ａは、ルシフェラーゼ標識された７８６−Ｏ標的細胞に反復暴露されたときのＣＤ７０特異的ＣＡＲの有効性を示す図である（ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２〜３日ごとに新鮮な標的を含有する９６ウェルプレートに移された）。Ｅ：Ｔ比は、３：１であった。ＣＡＲは、ドナーＤ５０３由来の細胞において発現された。
【０１２１】
図９Ｂは、ルシフェラーゼ標識されたＡＣＨＮ標的細胞に反復暴露されたときのＣＤ７０特異的ＣＡＲの有効性を示す図である（ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２〜３日ごとに新鮮な標的を含有する９６ウェルプレートに移された）。Ｅ：Ｔ比は、１０：１であった。ＣＡＲは、ドナーＤ５０３由来の細胞において発現された。
【０１２２】
図９Ｃは、ルシフェラーゼ標識されたＲＥＨ標的細胞に反復暴露されたときのＣＤ７０特異的ＣＡＲの有効性を示す図である（指定される時点で２ｘ１０６個の細胞が添加された）。Ｅ：Ｔ比は、１：５であった。ＣＡＲは、ドナーＤ５０３由来の細胞において発現された。
【０１２３】
【図１０−１】図１０は、ルシフェラーゼ標識されたＲＥＨ標的細胞に反復暴露されたときの、Ｒ２Ｓフォーマット、ＳＲ２フォーマット、またはＲＳＲＱＲフォーマットのいずれかのＣＤ７０特異的ＣＡＲの有効性を示す一連の図である（指定される時点で２ｘ１０６個の細胞が添加された）。Ｅ：Ｔ比は、１：５であった。ＣＡＲは、ドナーＤ７７２由来の細胞において発現された。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１０−４】同上。
【０１２４】
【図１１】図１１は、ＡＣＨＮ肺転移モデルにおいて、対照細胞または様々なＣＡＲ  ｓｃＦｖを発現する細胞で治療されたマウスの腫瘍変動値を示す図である。
【０１２５】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、様々な被験細胞株、または細胞株およびＲＣＣ患者由来細胞に対するＣＤ７０抗体結合能力（ＡＢＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）の観点からのＣＤ７０発現の定量を示す一連の図である。ＲＣＣ患者由来細胞からのデータも示す。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【０１２６】
図１２Ａは、様々な被験細胞株に対するＣＤ７０抗体結合能力（ＡＢＣ）に関するＣＤ７０発現の定量を示す。
【０１２７】
図１２Ｂは、ＲＣＣ患者由来細胞に対するＣＤ７０抗体結合能力（ＡＢＣ）に関するＣＤ７０発現の定量を示す。
【０１２８】
図１２Ｃは、ＲＣＣ患者由来細胞からのデータを示す。
【０１２９】
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｃは、ＲＣＣ患者のＷＤ−５９２７９、患者由来細胞株、またはＡＣＨＮに由来する標的細胞の殺傷を示す一連の図であり、各パネルにおいて抗体結合能力が示されている。
【図１３−２】同上。
【０１３０】
図１３Ａ〜Ｂは、ＲＣＣ患者由来の標的細胞の殺傷および抗体結合能力を示す。
【０１３１】
図１３Ｃは、標的ＡＣＨＮ細胞の殺傷および抗体結合能力を示す。
【０１３２】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＣＤ７０をさまざまなレベルで発現する、さらなる細胞株に関する、および１：１のＥ：ＴでのＱＲ３フォーマットの４Ｆ１１  ＣＡＲによるＣＤ７０受容体数の定量、および血液系（ｈｅｍｅ）腫瘍細胞殺傷を示す一連の棒グラフである。
【図１４Ｂ】同上。
【０１３３】
図１４Ａは、ＣＤ７０をさまざまなレベルで発現する、さらなる細胞株に関する、１：１のＥ：ＴでのＱＲ３フォーマットの４Ｆ１１  ＣＡＲのＣＤ７０受容体数の定量を示す棒グラフである。
【０１３４】
図１４Ｂは、ＣＤ７０をさまざまなレベルで発現する、さらなる細胞株に関する、１：１のＥ：ＴでのＱＲ３フォーマットの４Ｆ１１  ＣＡＲによる血液系腫瘍細胞殺傷を示す棒グラフである。
【０１３５】
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｂは、皮下異種移植片モデルにおける、１０ｘ１０６個の細胞または５×１０６個の細胞の投与量での４Ｆ１１およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔで治療されたマウスの腫瘍体積および体重を示す一連の図である。
【図１５Ｂ】同上。
【０１３６】
図１５Ａは、皮下異種移植片モデルにおける、１０ｘ１０６個の細胞または５×１０６個の細胞の投与量での４Ｆ１１およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔで治療されたマウスの腫瘍体積を示す図である。
【０１３７】
図１５Ｂは、皮下異種移植片モデルにおける、１０ｘ１０６個の細胞または５×１０６個の細胞の投与量での４Ｆ１１およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔで治療されたマウスの体重を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１３８】
本明細書の開示内容は、ＣＤ７０（例えばヒトＣＤ７０）に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびＣＡＲを含有する免疫細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）を提供するものである。本開示はさらに、これらＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、これらＣＡＲ−Ｔ細胞を含有する組成物、ならびにこれらＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ細胞の作製方法および使用方法を提供する。本開示はさらに、例えば癌など、対象において悪性のＣＤ７０発現と関連した状態を治療する方法も提供する。
【０１３９】
一般的技術
本開示の組成物および方法は、別段の指示がない限り、当分野の技術範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来的技術を採用する。こうした技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、ｅｄ．、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ、ｅｄ．、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、ｅｄ．、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ、ｅｄｓ．、１９９３〜１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ、ｅｄｓ．、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、１９８７）；ＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．、ｅｄ．、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ、ｅｄｓ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  ���．Ｄ．Ｃａｐｒａ、ｅｄｓ．、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献で完全に説明されている。
【０１４０】
定義
本明細書において使用される場合、「細胞外リガンド−結合ドメイン」という用語は、リガンドに結合する能力を有するオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。一部の例示的な実施形態では、ドメインは、細胞表面分子と相互作用する能力を有するであろう。例えば、細胞外リガンド−結合ドメインは、特定の疾患状態と関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択されてもよい。
【０１４１】
「ストーク（ｓｔａｌｋ）ドメイン」または「ヒンジドメイン」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用され、ＣＡＲにおいて、膜貫通ドメインと細胞外リガンド−結合ドメインを連結させる機能を果たす任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。特に、ストークドメインは、細胞外リガンド−結合ドメインに対し、高い柔軟性とアクセスし易さを提供するために使用される。
【０１４２】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル伝達機能シグナルを伝え、細胞が専門的機能を実行するよう指示を出すタンパク質の部分を指す。
【０１４３】
本明細書において使用される場合、「共刺激性分子」とは、例えばＴ細胞などの免疫細胞上の同系結合パートナーを指し、共刺激性リガンドに特異的に結合することによって、例えば限定されないが、増殖などの細胞による共刺激性反応を介在する。共刺激性分子としては限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ分子、およびＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられる。共刺激性分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【０１４４】
「共刺激性リガンド」とは、例えばＴ細胞などの免疫細胞上の同系共刺激性シグナル分子に特異的に結合する抗原提示細胞上の分子を指し、ペプチドを搭載したＭＨＣ分子とＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合により生じた一次シグナルに加えて、限定されないが、増殖活性化、分化などを含むＴ細胞反応が介在するシグナルが生じさせる。共刺激性リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｉｇａｎｄ（ＩＣＯＳ−Ｌ）、ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンド、が挙げられるがこれらに限定されない。共刺激性リガンドは、特に例えば限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどのＴ細胞上に存在する共刺激性分子に特異的に結合する抗体も包含する。
【０１４５】
「抗体」は、少なくとも一つの抗原認識部位を介して、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的への特異的結合ができる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、当該用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、その断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体およびドメイン抗体（例えば、サメ抗体およびラクダ科抗体を含む）、ならびに抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の任意の他の改変構造を包含する。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、抗体は任意の特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには五つの主なクラスがある。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、ならびにこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分割されてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造が公知である。
【０１４６】
本明細書において使用される場合、抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」という用語は、特異的に所与の抗原（例えば、ＣＤ７０）に結合する能力を保持するインタクトな抗体の一つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片によって実施され得る。抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含される結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【０１４７】
標的（例えば、ＣＤ７０タンパク質）に「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書において相互交換可能に使用される）抗体、抗原結合断片、抗体結合体、またはポリペプチドは、当分野においてよく理解された用語であり、そうした特異的な結合または優先的な結合を決定するための方法も当分野に公知である。分子は、別の細胞または物質よりも特定の細胞または物質と、より頻繁に、より早く、長い期間および／もしくは高いアフィニティで反応する、または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈すると言われる。他の物質との結合よりも高いアフィニティ、アビディティで、より早く、および／または長い期間、結合する場合、抗体は、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ＣＤ７０エピトープに特異的に、または優先的に結合する抗体は、他のＣＤ７０エピトープまたは非ＣＤ７０エピトープに結合するよりも高いアフィニティ、アビディティで、より早く、および／または長い期間、当該エピトープに結合する抗体である。この定義を読むことで、例えば第一の標的に特異的に、または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第二の標的に特異的に、または優先的に結合しても、または結合しなくてもよいことが理解されるであろう。したがって「特異的結合」または「優先的結合」は必ずしも排他的結合を必須とはしない（が、排他的結合も含み得る）。必ずではないが一般的に、結合に対する参照とは、優先的結合を意味する。
【０１４８】
抗体の「可変領域」とは、抗体軽鎖の可変領域、または抗体重鎖の可変領域を単独で、あるいは組み合わせで指す。当分野で知られるように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された四つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して保持され、そして他の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定する技術は少なくとも二つある：（１）異種間配列多様性に基づく方法（すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ  ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）；および（２）抗原−抗体複合体の結晶研究に基づく方法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８）。本明細書において使用される場合、ＣＤＲとは、いずれか方法により規定されるＣＤＲ、または両方の方法の組み合わせにより規定されるＣＤＲを指す場合がある。
【０１４９】
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の蓄積、ＡｂＭ定義、接触定義、および／もしくはコンフォメーション定義、または当分野において公知のＣＤＲ決定の任意の方法に従って同定される可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらにより最初に規定された超可変領域として規定される場合もある。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃを参照のこと。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａらにより最初に報告された構造的ループ構造として規定される場合もある。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３，１９８９を参照のこと。ＣＤＲ特定の他の方法としては、「ＡｂＭ定義」が挙げられる。この方法は、Ｋａｂａｔ法とＣｈｏｔｈｉａ法の間を取り、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアを使用して導かれる（現在では、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））。または、観察された抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」も挙げられ、この方法は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７３２−７４５，１９９６に記載されている。別の方法は、本明細書においてＣＤＲの「コンフォメーション定義」と呼称されており、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的に貢献する残基として規定され得る。例えば、Ｍａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６−１１６６，２００８を参照のこと。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、厳密には上述の方法の一つに従っていない場合があるが、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部とは重複している。それでも特定の残基または残基群、さらには全ＣＤＲがそれほど抗原結合に影響を与えないという予測、または実験結果を鑑みると、それらは短すぎる、または長すぎる場合がある。本明細書において使用される場合、ＣＤＲとは、方法の組み合わせを含む当分野に公知の任意の方法により規定されるＣＤＲを指す場合がある。本明細書において使用される方法は、これら方法のいずれかに従い規定されたＣＤＲを利用する場合がある。複数のＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態に関し、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ）、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔ（接触）、および／またはコンフォメーション定義のいずれかに従い規定され得る。
【０１５０】
本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体群から取得される抗体を指す。すなわち、当該群を構成する個々の抗体は、わずかに存在し得る可能性がある自然発生的な突然変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に指向する。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向する。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均質な抗体群から取得されたときの抗体の特徴を示すが、任意の特定の方法による抗体の産生が必要とはみなされないものとする。例えば本開示に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５により最初に報告されたハイブリドーマ法により作製されてもよく、または例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組み換えＤＮＡ法により作製されてもよい。モノクローナル抗体は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０に記載される技術を使用して作製されたファージライブラリーから単離されてもよい。
【０１５１】
本明細書において使用される場合、「ヒト化した」抗体とは、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を最小限含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列など）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。一部の例示的実施形態では、ヒト化抗体は、受容体の相補的決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性、および容量を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されるヒトイムノグロブリン（受容体抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基で置換される。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体においても、輸入されるＣＤＲ配列またはフレームワーク配列においても存在しないが、抗体性能のさらなる改善または最適化のために含有される残基を含む場合がある。概してヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的にすべてを含有し、その中で、ＣＤＲ領域のすべて、または実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲのすべて、または実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。さらにヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域または定常ドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含有するのが最適である。例示的実施形態は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されるように改変されたＦｃ領域を有する抗体である。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対し改変された一つまたは複数のＣＤＲ（ＣＤＲ  Ｌ１、ＣＤＲ  Ｌ２、ＣＤＲ  Ｌ３、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２またはＣＤＲ  Ｈ３）を有し、それらは元の抗体の一つまたは複数のＣＤＲから「誘導された」一つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」とは、ヒトによって生成される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、および／または当業者に公知のヒト抗体、もしくは本明細書に開示されたヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも一つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも一つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。そのような例の一つは、マウス軽鎖およびヒト重鎖のポリペプチドを含む抗体である。ヒト抗体は、当分野で知られている様々な技術を使用して生成することができる。一部の実施形態では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、当該ファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０９−３１４，１９９６；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６１５７−６１６２，１９９８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１，１９９１）。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位が内因性座位の代わりにトランスジェニック導入された動物の免疫化によっても作製されることができる。例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的もしくは完全に破壊された、または不活性化されたマウスの免疫化によっても作製されることができる。この方法は、米国特許第  ５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、および第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいはヒト抗体は、標的抗原に対して指向される抗体を生成するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製されてもよい（そうしたＢリンパ球は個体から採取されてもよく、またはｃＤＮＡのシングルセルクローニングから採取されてもよく、またはインビトロで免疫化されてもよい）。例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７，１９８５；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５，１９９１；および米国特許第  ５，７５０，３７３号を参照のこと。
【０１５３】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が一つの種に由来し、定常領域配列は別の種に由来する抗体を指すことが意図され、例えば、可変領域配列はマウス抗体に由来し、定常領域配列はヒト抗体に由来する抗体などである。
【０１５４】
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸鎖を指す。一部の実施形態では、比較的短いアミノ酸鎖（例えば、１０〜１００アミノ酸）を指す。鎖は、直鎖状または分枝状であってもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、および／または非アミノ酸が割り込んでもよい。さらに当該用語は、自然に改変されたアミノ酸鎖、または以下の介入により改変されたアミノ酸を包含する：例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または例えば標識構成要素との結合などの他の任意の操作もしくは改変。この定義にはさらに、例えば一つまたは複数のアミノ酸アナログ（例えば非天然アミノ酸などを含む）ならびに当分野に公知の他の改変を含有するポリペプチドが含有される。ポリペプチドは、一本鎖または関連鎖として生じ得ると理解される。
【０１５５】
「一価抗体」は、一分子当たり、一つの抗原結合部位を含有する（例えば、ＩｇＧまたはＦａｂ）。一部の例では、一価抗体は複数の抗原結合部位を有し得るが、当該結合部位は異なる抗原に由来する。
【０１５６】
「二価抗体」は、一分子当たり、二つの抗原結合部位を含有する（例えば、ＩｇＧ）。一部の例では、当該二つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかし二価抗体は、二特異性である場合もある。
【０１５７】
本開示の抗体は、当分野に公知の技術、例えば組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはそうした技術の組み合わせ、または当分野で容易に知り得る他の技術を使用して作製され得る（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５：１６２８−５０，１９９９  ａｎｄ  Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，３７３（４）：９２４−４０，２００７を参照のこと）。
【０１５８】
当分野において知られるように、本明細書において相互交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは改変塩基、および／またはそれらのアナログ、またはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼにより鎖に組み込まれ得る任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそのアナログなどの改変ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、鎖の組立の前または後に行われる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素により割り込まれてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識構成要素との結合などにより、多量体化後にさらに改変されてもよい。他のタイプの改変としては例えば、アナログを用いた天然ヌクレオチドの一つまたは複数の「キャップ」置換、例えば非荷電結合（例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸塩など）および荷電結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を用いるなどのヌクレオチド間の改変、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）のペンダント部分を含有するもの、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を用いたもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、改変結合を用いたもの（例えば、アルファアノマー核酸など）ならびにポリヌクレオチドの非改変型が挙げられる。さらに糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかを、例えばホスホン酸基、リン酸基などにより置換してもよく、標準的な保護基により保護してもよく、または活性化させて、追加のヌクレオチドへの追加的な結合の準備をしてもよく、または固形支持体へ結合させてもよい。５’末端ＯＨおよび３’末端ＯＨは、リン酸化されてもよく、またはアミン、もしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換されてもよい。他のヒドロキシルは、標準的な保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドはさらに、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、アルファまたはベータ−アノマー糖、例えばアラビノース、キシロースもしくはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ、および例えばメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシドアナログを含む、当分野に一般的に公知のリボース糖またはデオキシリボース糖のアナログ型を含有してもよい。一つまたは複数のホスホジエステル結合が、代替的な結合基により置き換えられてもよい。そうした代替的な結合基としては限定されないが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ））によりリン酸塩が置換される実施形態が挙げられ、この場合、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈ、または置換アルキルもしくは非置換アルキル（１〜２０個のＣ）であり、任意で、エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有する。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
【０１５９】
当分野において知られるように、抗体の「定常領域」とは、抗体軽鎖の定常領域、または抗体重鎖の定常領域を単独で、または組み合わせで指す。
【０１６０】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入物が無い）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である物質を指す。
【０１６１】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチド挿入物の組み込みのためのベクターに対するレシピエントであってもよく、またはレシピエントである個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫物を含み、当該子孫物は、自然の、偶発的な、または意図的な変異により、元の親細胞と完全に同一であるとは限らない場合がある（形態において、またはゲノムＤＮＡの相補体において）。宿主細胞には、本開示のポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」とは、自然免疫応答および／もしくは適応免疫応答の開始ならびに／または実施に機能的に関与する造血系起源の細胞を指す。
【０１６３】
当分野において知られるように、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域またはバリアントのＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基、またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基から、そのカルボキシル末端に及ぶと規定される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号である。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般的に、ＣＨ２とＣＨ３の二つの定常領域を含有する。
【０１６４】
当分野で使用される場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するものである。一部の実施形態では、ＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに一部の実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲ（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これら受容体のアレルバリアントおよび代替的スプライス型を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（活性化受容体）、およびＦｃγＲＩＩＢ（阻害性受容体）が含まれ、それらは類似したアミノ酸配列を有するが、その細胞質ドメインが主に異なっている。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２，１９９１；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５−３４，１９９４；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１，１９９５に概要されている。「ＦｃＲ」はさらに新生児受容体であるＦｃＲｎを含み、これは胎児への母体ＩｇＧの移送に貢献している（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７，１９７６；ａｎｄ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２４９，１９９４）。
【０１６５】
抗体に関して本明細書において使用される場合、「競合する」という用語は、第一の抗体、またはその抗原結合断片（または部分）が、第二の抗体またはその抗原結合部分の結合と充分に類似した様式でエピトープに結合し、それにより、第二の抗体の非存在下での第一の抗体の結合と比較して、第二の抗体の存在下では、その同系エピトープとの第一の抗体の結合の結果が、検出可能に低下することを意味する。第二の抗体のそのエピトープへの結合も、第一の抗体の存在下で検出可能に低下する場合もあり得るが、必ずではない。すなわち第一の抗体は、そのエピトープへの第二の結合を阻害し得るが、第二の抗体による、その各エピトープへの第一の抗体の阻害は伴わない。しかしながら、各抗体がその同系のエピトープまたはリガンドとの他の抗体の結合を同程度に、より強く、またはより弱く検出可能に阻害する場合、当該抗体は、その各エピトープの結合に関し、互いに「交差競合する」といわれる。競合抗体および交差競合抗体の両方が本開示に包含される。そうした競合または交差競合が発生する機序に関わらず（すなわち立体障害、立体構造変化、または共通エピトープもしくはその一部への結合など）、当業者であれば、本明細書に示される教示に基づき、そうした競合抗体および／または交差競合抗体が包含されること、および本明細書に開示される方法に有用であり得ると認識するであろう。
【０１６６】
本明細書において使用される場合、「自家」とは、患者の治療に使用される細胞、細胞株、または細胞群が、当該患者を起源とすることを意味する。
【０１６７】
本明細書において使用される場合、「同種」とは、患者の治療に使用される細胞、または細胞群が、当該患者を起源とするのではなく、ドナーに由来することを意味する。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「治療」とは、有益または望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本開示の目的に対し、有益または望ましい臨床結果には、以下のうちの一つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない：腫瘍細胞または癌細胞の増殖の減少（または破壊）、腫瘍細胞の転移の阻害、例えば腎細胞癌（ＲＣＣ）リンパ腫、白血病またはグリオーマなどのＣＤ７０を発現する腫瘍のサイズの縮小または減少、ＣＤ７０関連疾患（例えば、癌）の寛解、ＣＤ７０関連疾患（例えば、癌）から生じる症状の減少、ＣＤ７０関連疾患（例えば、癌）を患う者の生活の質の向上、ＣＤ７０関連疾患（例えば、癌）を治療するために必要な他の薬物の投与量の減少、ＣＤ７０関連疾患（例えば、癌）の進行の遅延、ＣＤ７０関連疾患（例えば、癌）の治癒、および／またはＣＤ７０関連疾患（例えば、癌）を有する患者の生存の延長。
【０１６９】
「改善する」とは、ＣＤ７０特異的ＣＡＲまたはＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与しない場合と比較して、一つまたは複数の症状の軽減または改善を意味する。「改善する」には、症状の持続期間の短縮または減少も含まれる。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、薬剤、化合物、または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、任意の一つ以上の有益または所望の結果を効果するのに十分な量である。予防的使用に関しては、有益な結果または望ましい結果には、疾患、その合併症、およびの疾患の発生中に現れる中間的な病理学的表現型の生化学的、組織学的ならびに／または行動上の症状を含む、疾患のリスクの排除もしくは低下、疾患の重症度の低減、または疾患の発生の遅延が含まれる。治療用途に対し、有益または望ましい結果としては、例えば患者の様々なＣＤ７０関連の疾患もしくは状態（例えば多発性骨髄腫）の一つまたは複数の症状の発生率の低下または改善、当該疾患を治療するために必要とされる他の薬剤の投与量の減少、別の薬剤の効果の強化、および／またはＣＤ７０関連疾患の進行の遅延などの臨床結果が挙げられる。有効な投与量は、１回以上の投与で投与することができる。本開示の目的に対し、薬剤、化合物または医薬組成物の有効用量は、直接または間接的に予防的処置または治療的処置を実現するために充分な量である。臨床状況で理解されるように、薬剤、化合物、または医薬組成物の有効な投与量は、別の薬剤、化合物、または医薬組成物と併せて達成されてもよく、または達成されなくてもよい。したがって、「有効な投与量」は、一つ以上の治療薬を投与する状況で考慮される場合があり、一つ以上の他の薬剤と併せて、望ましい結果が達成される可能性がある場合、または達成される場合、単一剤は有効量で与えられると考えられうる。
【０１７１】
「個体」、「患者」、または「対象」は、哺乳動物であり、一部の実施形態では、ヒトである。哺乳動物としては限定されないが、ヒト、サル、ブタおよび他の家畜動物、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモットを含む齧歯類が挙げられる。対象は哺乳動物であり、本明細書において当該用語は相互交換可能に使用される。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、非ヒト霊長類である。一部の実施形態では、対象は、ヒト、または例えばカニクイザルなどのサルである。
【０１７２】
本明細書において使用される場合、「ベクター」とは、対象の一つもしくは複数の遺伝子または配列を送達することができる、および一部の実施形態では、宿主細胞において対象の一つもしくは複数の遺伝子または配列を発現することができる構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、またはエンハンサーなどのプロモーターであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に操作可能に連結される。
【０１７４】
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容可能な担体」または「医薬受容可能な賦形剤」という用語は、活性成分と組み合わせられたとき、生物活性を保持するための成分を有するとともに、対象の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例としては、限定されないが、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水乳濁液などの乳濁液、および種々のタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体が挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与のための例示的な希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または通常の生理食塩水（０．９％）である。こうした担体を含む組成物は、公知の従来的方法により処方されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５を参照）。
【０１７５】
本明細書において使用される場合、「ｋｏｎ」という用語は、抗原に抗体またはｓｃＦｖまたはＣＡＲが会合する速度定数を指す。
【０１７６】
本明細書において使用される場合、「ｋｏｆｆ」という用語は、抗体／抗原複合体から抗体またはｓｃＦｖまたはＣＡＲが解離する速度定数を指す。
【０１７７】
本明細書において使用される場合、「ＫＤ」という用語は、抗体−抗原またはｓｃＦｖ−抗原またはＣＡＲ−抗原の相互作用の平衡解離定数を指す。
【０１７８】
本明細書の「約」の値またはパラメータは、当該値またはパラメータを本質的に指向する実施形態を含む（および記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。数値範囲は、当該範囲を規定する数を含む。
【０１７９】
用語「含む」を用いて本明細書に記載されているいかなる実施形態においても、「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記載された他の類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
【０１８０】
本発明の態様または実施形態が、マーカッシュ群または他の代替的な群で記載されている場合、本発明は、概して列挙される群全体のみならず、当該個々の群の各メンバー、および当該主要群の可能性のあるすべての亜群の各メンバー、そして当該群メンバーの一つまたは複数を欠いた主要群も包含する。本発明はさらに、請求される本発明の群メンバーのいずれかの一つまたは複数の明白な除外を予期するものである。
【０１８１】
本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、他に定義されない限り、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が制御する。本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの変形は、述べられた整数または整数の群の包含を意味するが、他の任意の整数または群の除外は意味しないことが理解される。文脈によって別途要求されない限り、単数の用語は複数の用語を含むものとし、複数の用語は単数形を含むものとする。
【０１８２】
本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することもできるが、例示的な方法および材料が本明細書に記載される。材料、方法、および例は例示的のみであり、限定することを意図していない。
【０１８３】
ＣＤ７０特異的ＣＡＲ、およびその作製方法
本開示は、ＣＤ７０（例えば、ヒトＣＤ７０（例えば、配列番号３３５））に結合するＣＡＲ、例えばブダペスト条約の規定のもと寄託され、アクセッション番号：Ｐ３２９７０−１を割り当てられたものを提供する。本明細書において提供されるＣＤ７０特異的ＣＡＲは、一本鎖ＣＡＲおよび多鎖ＣＡＲを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合性能を利用することで、非ＭＨＣ拘束性の様式で、Ｔ細胞の特異性および反応性をＣＤ７０へと再指向化させる能力を有している。非ＭＨＣ拘束性の抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原処理に非依存性の抗原認識能力を与え、それによって腫瘍回避の主要機序がバイパスされる。
【０１８４】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、細胞外リガンド−結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。一部の実施形態では、本明細書において提供されるＣＡＲは、「ヒンジ」ドメインまたは「ストーク」ドメインをさらに含有し、それらは細胞外リガンド−結合ドメインと膜貫通ドメインの間に置かれてもよい。一部の実施形態では、細胞外リガンド−結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインは、一つのポリペプチド中にある。すなわち、一本鎖中にある。多鎖のＣＡＲおよびポリペプチドも本明細書において提供される。一部の実施形態では、多鎖ＣＡＲは、膜貫通ドメインと少なくとも一つの細胞外リガンド−結合ドメインを含む第一のポリペプチド、および膜貫通ドメインと少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む第二のポリペプチドを含有し、この場合においてそれらポリペプチドは一緒に組み立てられて多鎖ＣＡＲを形成する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、例えば低分子（例えば、ＡＰ１９０３）またはタンパク質（例えば、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、またはＰＤ−１）などにより誘導される。一部の実施形態では、ＣＤ７０特異的な多鎖ＣＡＲは、ＩｇＥの高アフィニティ受容体（ＦｃεＲＩ）に基づく。肥満細胞および好塩基球上で発現されたＦｃεＲＩは、アレルギー反応を誘発する。ＦｃεＲＩは、一つのαサブユニット、一つのβサブユニット、および二つのジスルフィド結合型γサブユニットから構成される四量体の複合体である。αサブユニットは、ＩｇＥ結合ドメインを含有する。βサブユニットおよびγサブユニットは、シグナル伝達を介在するＩＴＡＭを含有する。一部の実施形態では、ＦｃＲα鎖の細胞外ドメインが削除され、ＣＤ７０特異的細胞外リガンド−結合ドメインで置き換えられる。一部の実施形態では、多鎖ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、ＣＤ７０に特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ、およびＦｃＲβ鎖のＩＴＡＭを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＦｃＲγ鎖を含んでも含まなくてもよい。
【０１８５】
一部の実施形態では、細胞外リガンド−結合ドメインは、標的抗原（すなわちＣＤ７０）特異的なモノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域と重鎖可変（ＶＨ）領域を含有するｓｃＦｖを含有し、それら領域は柔軟なリンカーにより結合されている。一本鎖可変領域断片は、短い結合ペプチドを使用することにより、軽鎖および／または重鎖の可変領域を結合させることにより作製される（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８）。結合ペプチドの例は、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２９６）を有するＧＳリンカーであり、このリンカーは、一つの可変領域のカルボキシ末端と、他方の可変領域のアミノ末端の間でおよそ３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーも設計され、使用される（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８、上記参照）。他の例示的リンカーとしては概して含まれる、他のＧＳリンカーとしては概して、（ＧＧＧＧＳ）ｘが挙げられ、式中、ｘは、１、２、３、４、５である（配列番号６１３）。一部の実施形態では、ｘは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または約２０未満の任意の整数である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号６０２）である。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号６１２）であり、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９３）６（８）：９８９−８９５に記載されている。一般的にリンカーは、短い柔軟なポリペプチドであってもよく、一部の実施形態では、約２０個以下のアミノ酸残基から構成される。リンカーも、例えば薬剤の付加または固形支持体への付加といった追加機能を目的として改変され得る。一本鎖バリアントは、組換えにより、または合成により、作製されてもよい。ｓｃＦｖの合成による作製については、自動化合成装置を使用することができる。ｓｃＦｖの組み換えによる作製については、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適切なプラスミドを、例えば酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞などの真核細胞、または大腸菌などの原核細胞といった適切な宿主細胞に導入することができる。対象のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、例えばポリヌクレオチドのライゲーションといった日常的な操作によって作製されることができる。得られるｓｃＦｖは、当分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離することができる。
【０１８６】
別の態様では、ＣＤ７０に特異的に結合するＣＡＲが提供され、この場合において当該ＣＡＲは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８に示されるＶＨ配列のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および／または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５または４７に示されるＶＬ配列のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域、を含有する細胞外リガンド−結合ドメインを含有する。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、柔軟なリンカーにより互いに結合される。一部の実施形態では、柔軟なリンカーは、配列番号２９６に示されるアミノ酸配列を含有する。
【０１８７】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲは、表１に列記される部分的軽鎖配列のいずれか一つ、および／または表１に列記される部分的重鎖配列のいずれか１つ、を有する細胞外リガンド−結合ドメインを含有する。表１において、下線の配列は、Ｋａｂａｔに従うＣＤＲ配列であり、太字は、Ｃｈｏｔｈｉａに従うＣＤＲ配列である。
【表１】
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【０１８８】
また本明細書において、ＣＤ７０に対するＣＡＲの細胞外リガンド−結合ドメインのＣＤＲ部分（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲおよびＣＤＲ接触領域を含む）も提供される。ＣＤＲ領域の決定は、当分野の技術範囲内にある。一部の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの組み合わせ（「混合ＣＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）であり得ることを理解されたい。一部の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲである。言い換えると、複数のＣＤＲを伴う実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、組み合わせＣＤＲ、またはそれらの組み合わせのいずれかであり得る。表２Ａ〜２Ｂは、本明細書に提供されるＣＤＲ配列の例を提供する。
【表２Ａ】
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【表２Ｂ】
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【０１８９】
本開示は、表１または２Ａ〜２Ｂに示される配列を含むＣＡＲおよびポリペプチドに対する改変を包含しており、その特性に大きな影響を与えない改変を有する機能的に同等のＣＡＲ、ならびに活性および／もしくはアフィニティが強化された、または減少されたバリアントが含まれる。例えばアミノ酸配列は、ＣＤ７０に対し所望の結合アフィニティを有する抗体が得られるように変異されてもよい。ポリペプチドの改変は当分野では日常的に実施されており、本明細書において詳細に記載する必要はない。改変ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を著しく悪化させて変化させない、またはそのリガンドに対するポリペプチドのアフィニティを成熟させる（強化する）アミノ酸の一つもしくは複数の欠失または付加を有するポリペプチド、または化学的アナログが使用されたポリペプチドが挙げられる。
【０１９０】
アミノ酸配列挿入には、１残基から数百以上の残基を含有するポリペプチドの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合を含み、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列間挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合された抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入バリアントとしては、酵素またはポリペプチドの、抗体Ｎ末端または抗体Ｃ末端への融合が挙げられ、それにより血液循環中の抗体の半減期が延長される。
【０１９１】
置換バリアントは、抗体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘導に対し最も大きな関心が持たれる部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲの改変も予期される。保存的置換は、「保存的置換」の見出しで、表３に示されている。そのような置換により生物活性に変化が生じる場合、より大きな置換変化は、表３において「例示的置換」で表示され、またはアミノ酸のクラスに関して以下に詳述されるように、そうした置換変化が導入され、産物はスクリーニングされ得る。
【表３】
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【０１９２】
一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に結合し、本明細書に記載されるＣＡＲとＣＤ７０に対する結合に関して競合する細胞外リガンド−結合ドメインを含有するＣＡＲを提供するものであり、３１Ｈ１、６３Ｂ２、４０Ｅ３、４２Ｃ３、４５Ｆ１１、６４Ｆ９、７２Ｃ２、２Ｆ１０、４Ｆ１１、１０Ｈ１０、１７Ｇ６、６５Ｅ１１、Ｐ０２Ｂ１０、Ｐ０７Ｄ０３、Ｐ０８Ａ０２、Ｐ０８Ｅ０２、Ｐ０８Ｆ０８、Ｐ０８Ｇ０２、Ｐ１２Ｂ０９、Ｐ１２Ｆ０２、Ｐ１２Ｇ０７、Ｐ１３Ｆ０４、Ｐ１５Ｄ０２、Ｐ１６Ｃ０５、１０Ａ１、１０Ｅ２、１１Ａ１、１１Ｃ１、１１Ｄ１、１１Ｅ１、１２Ａ２、１２Ｃ４、１２Ｃ５、１２Ｄ３、１２Ｄ６、１２Ｄ７、１２Ｆ５、１２Ｈ４、８Ｃ８、８Ｆ７、８Ｆ８、９Ｄ８、９Ｅ１０、９Ｅ５、９Ｆ４または９Ｆ８の配列を含むＳｃＦｖを含む細胞外ドメインを含むＣＡＲが含有される。
【０１９３】
一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合するＣＡＲを提供するものであり、当該ＣＡＲは、配列番号２０に示される配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号１９に示される配列を含むＶＬ領域、を含有する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合するＣＡＲを提供するものであり、当該ＣＡＲは、配列番号２２に示される配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号２１に示される配列を含むＶＬ領域、を含有する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合するＣＡＲを提供するものであり、当該ＣＡＲは、配列番号２８に示される配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号２７に示される配列を含むＶＬ領域、を含有する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合するＣＡＲを提供するものであり、当該ＣＡＲは、配列番号３６に示される配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号３５に示される配列を含むＶＬ領域、を含有する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合するＣＡＲを提供するものであり、当該ＣＡＲは、配列番号４６に示される配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号４５に示される配列を含むＶＬ領域、を含有する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合するＣＡＲを提供するものであり、当該ＣＡＲは、配列番号１８に示される配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号１７に示される配列を含むＶＬ領域、を含有する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合するＣＡＲを提供するものであり、当該ＣＡＲは、配列番号３４に示される配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号３３に示される配列を含むＶＬ領域、を含有する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＤＲ接触領域に基づいたＣＤ７０抗体に対する抗体のＣＤＲ部分を含有するＣＡＲも提供する。ＣＤＲ接触領域は、抗原に対する特異性を抗体に与える抗体の領域である。一般的に、ＣＤＲ接触領域は、ＣＤＲ中の残基位置、および特定の抗原に結合する抗体の適切なループ構造を維持するために制約を受けるＶｅｒｎｉｅｒゾーンを含む。例えば、Ｍａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３：１１５６−１１６６，２００７を参照のこと。ＣＤＲ接触領域の決定は、当分野の技術範囲内にある。
【０１９４】
本明細書に記載されるＣＤ７０（例えばヒトＣＤ７０）に対するＣＤ７０特異的ＣＡＲのリガンド結合ドメインの結合アフィニティ（ＫＤ）は、例えば約０．１〜約１０００ｎＭであってもよく、例えば約０．５ｎＭ〜約５００ｎＭ、または例えば約１ｎＭ〜約２５０ｎＭであってもよい。一部の実施形態では、結合アフィニティは、１０００ｎｍ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎｍ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１９ｎＭ、１８ｎＭ、１７ｎＭ、１６ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５．５ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．３ｎＭまたは０．１ｎＭのおよそいずれかである。
【０１９５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲのリガンド結合ドメインのｓｃＦｖのＣＤ７０に対する結合アフィニティ（ＫＤ）は、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１０ｎＭ〜約９０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約８０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約７０ｎＭ、約２５ｎＭ〜約７５ｎＭ、または約４０ｎＭ〜約１１０ｎＭである。一部の実施形態では、本段落に記載されるｓｃＦｖの結合アフィニティは、ヒトＣＤ７０に対する結合アフィニティである。
【０１９６】
一部の実施形態では、結合アフィニティは、１０００ｎｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭのおよそいずれか未満である。
【０１９７】
本開示によるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、標的への細胞外リガンド−結合ドメインの結合の後の細胞内シグナル伝達に関与しており、免疫細胞の活性化および免疫反応を生じさせる。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが発現されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも一つを活性化させる能力を有する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性であってもよく、またはサイトカイン分泌を含むヘルパー活性であってもよい。
【０１９８】
一部の実施形態では、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば限定されないが、協調して作用して抗原受容体会合後のシグナル伝達を開始させるＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれら配列の任意の誘導体またはバリアント、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列であってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、以下の二つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列を含有する：抗原依存性の一次活性化を開始させる配列、および抗原依存性の様式で作用して、二次シグナルまたは共刺激性シグナルを生じさせる配列。一次細胞質シグナル伝達配列は、ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆｓのＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有してもよい。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスのチロシンキナーゼの結合部位としての役割を果たす様々な受容体の細胞質内尾部に存在する、明確に定義されたシグナル伝達モチーフである。本開示で使用されるＩＴＡＭの例としては、非限定的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭが挙げられる。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２７２または６８３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有してもよい。一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激性分子のドメインを含有する。
【０１９９】
一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激性分子の一部を含有する。一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２７１または６８２、および配列番号２７５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を含有するアミノ酸配列を含有する。一部の実施形態では、本開示のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２７１または６８２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性、および／または配列番号２７６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を含有するアミノ酸配列を含有する。
【０２００】
ＣＡＲは、細胞の表面膜上で発現される。ゆえにＣＡＲは、膜貫通ドメインを含有し得る。本明細書に開示されるＣＡＲに対する適切な膜貫通ドメインは、（ａ）一部の実施形態では、例えば限定されないが、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、細胞傷害性Ｔ（ＴＣ）細胞、Ｔ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ球細胞などの免疫細胞である細胞の表面で発現される能力を有し、および／または（ｂ）リガンド−結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用して、所定の標的細胞に対し、免疫細胞の細胞性反応を誘導する能力を有する。膜貫通ドメインは、天然源から、または合成源から誘導されてもよい。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通型タンパク質から誘導されてもよい。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、例えばＣＤ３複合体を構成するα、β、γまたはδポリペプチドなどのＴ細胞受容体の下位配列またはサブユニット、ＩＬ−２受容体ｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）、もしくはＦｃ受容体、特にＦｃγ受容体ＩＩＩのサブユニット鎖であるγ鎖、またはＣＤタンパク質であってもよい。あるいは膜貫通ドメインは、合成であってもよく、例えばロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含有してもよい。一部の実施形態では、当該膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）から誘導される。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド−結合ドメインと当該膜貫通ドメインの間にストーク（ｓｔａｌｋ）ドメインをさらに含有し得る。ストークドメインは、最大で３００アミノ酸を含有してもよく、一部の実施形態では、１０〜１００アミノ酸、または一部の実施形態では、２５〜５０アミノ酸を含有してもよい。ストーク領域は、例えばＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、４−１ＢＢまたはＩｇＧ（特にＩｇＧのヒンジ領域）の細胞外領域のすべて、もしくは一部、または抗体重鎖定常領域のすべてもしくは一部などの天然分子のすべてまたは一部から誘導されてもよい。あるいはストークドメインは、天然ストーク配列に相当する合成配列であってもよく、または全体的に合成的なストーク配列であってもよい。一部の実施形態では、当該ストークドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の特定の実施形態では、当該ヒンジおよび膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖の一部を含み、一部の実施形態では、配列番号２６８および２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲのストークドメインは、ＣＤ８α、ＩｇＧ１、またはＦｃγＲＩＩＩαの下位配列、特にＣＤ８α、ＩｇＧ１、またはＦｃγＲＩＩＩαのいずれかのヒンジ領域を含有する。一部の実施形態では、ストークドメインは、ヒトＣＤ８αのヒンジ、ヒトＩｇＧ１のヒンジ、またはヒトＦｃγＲＩＩＩαのヒンジを含有する。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ＣＤ７０に特異的に結合する細胞外リガンド−結合ドメインを含有し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ｓｃＦｖ、ヒ��ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ならびに４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含有する。
【０２０１】
表４は、本明細書に開示されるＣＡＲに使用され得るドメインの例示的な配列を提示する。
【表４】
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【０２０２】
標的抗原の下方制御または変異は、癌細胞で普遍的に観察されており、抗原消失性の回避バリアントを生じさせる。ゆえに腫瘍回避を相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするために、ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、一つまたは複数の追加的な細胞外リガンド−結合ドメインを含有することで、標的中の異なる要素に同時に結合し、免疫細胞の活性化と機能を増大させ得る。一部の実施形態では、細胞外リガンド−結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上でタンデムに配置され得、および任意で、リンカーによって分離され得る。一部の実施形態では、当該異なる細胞外リガンド−結合ドメインは、ＣＡＲを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に配置され得る。一部の実施形態では、本開示は、ＣＡＲの群に関するものであり、各ＣＡＲは、異なる細胞外リガンド−結合ドメインを含有する。特定の実施形態では、本開示は、免疫細胞を操作する方法に関するものであり、当該方法は、免疫細胞を提供すること、および当該細胞の表面に、ＣＡＲ群を発現させることを含み、各ＣＡＲは異なる細胞外リガンド−結合ドメインを含有する。別の特定の実施形態では、本開示は、免疫細胞を操作する方法に関するものであり、当該方法は、免疫細胞を提供すること、および当該細胞に、ＣＡＲ群を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、各ＣＡＲは異なる細胞外リガンド−結合ドメインを含有する。ＣＡＲ群とは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上のＣＡＲを意味し、各ＣＡＲは、異なる細胞外リガンド−結合ドメインを含有する。本開示による異なる細胞外リガンド−結合ドメインは、一部の実施形態では、標的中の異なる要素に同時に結合することができ、それにより免疫細胞の活性化および機能が増強される。本開示はさらに、ＣＡＲ群を含有する単離免疫細胞にも関連しており、各ＣＡＲは、異なる細胞外リガンド−結合ドメインを含有する。
【０２０３】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＣＡＲおよびポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、当分野に公知の方法により作製および発現され得る。
【０２０４】
別の態様では、本開示は、本開示の細胞のいずれかを含有する組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を含む。さらに他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号２９７および配列番号２９８、配列番号２９９および配列番号３００、配列番号３０１および配列番号３０２、配列番号３０３および配列番号３０４、配列番号３０５および配列番号３０６、配列番号３０７および配列番号３０８、または配列番号３０９および配列番号３１０に示されるポリヌクレオチドのいずれか、または療法を含有する：
４Ｆ１１重鎖可変領域
CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTGACCTGCACCGTCTCTGGGTTCTCACTCAGTAATGCTAGAATGGGTGTGACCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCCTACAGTACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCTCCAAGGACACTTCCAAAACCCAGGTGGTCCTTACCATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACATATTACTGTGCACGGATACGAGATTACTATGACATTAGTAGTTATTATGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAGCGTCTCCTCA (配列番号297)
４Ｆ１１軽鎖可変領域
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTGCCATGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCGCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCGGGGACAGAATTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCTGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCTACAGCTTAATAGTTTCCCGTTCACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAC (配列番号298)
【０２０５】
さらに他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号２９９および配列番号３００に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含有する：
１７Ｇ６重鎖可変領域
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAGCATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCAGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGGTGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGGAGTCAACTGGGGATGGAGACTCTACTGGCACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA (配列番号299)
１７Ｇ６軽鎖可変領域
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTACAACAATAAGAACTACGTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAACCTCCTAACCTACTCATTTTCTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTACTACTGTCAGCAATATTATAGTACGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA (配列番号300)。
【０２０６】
さらに他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３０１および配列番号３０２に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含有する：
１０Ｈ１０重鎖可変領域
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTCAGTAACCATAACATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTTCATACATTAGTCGAAGTAGTAGTACCATATATTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACAATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGACGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCACGCTCAGTGGTACGGTATGGACGTTTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (配列番号301)。
１０Ｈ１０軽鎖可変領域
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCGGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTTTCAGTTTCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA (配列番号302)。
【０２０７】
さらに他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３０３および配列番号３０４に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含有する：
Ｐ０７Ｄ０３重鎖可変領域
GAAGTGCAGCTTGTCCAGAGCGGAGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGAAGATCAGCTGCAAGGGCTCCGGATATCGCTTCACAAGTTACTGGATAGGGTGGGTGCGCCAGATGCCTGGTAAGGGACTGGAATGGATGGGCTCTATATATCCTGATGATTCCGACACACGTTATAGCCCAAGCTTTCAGGGCCAGGTCACAATCAGCGCTGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTTCAGTGGTCGTCTCTGAAGGCCAGCGACACCGCAATGTACTACTGCGCCTCTAGCACAGTTGACTACCCGGGATACAGTTACTTCGACTACTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTCAGCAGC (配列番号303)
Ｐ０７Ｄ０３軽鎖可変領域
GAGCTCCAGAGCGTGCTGACCCAGCCTCCTAGCGCAAGCGGCACCCCTGGACAGCGTGTGACAATTAGCTGTAGCGGAAGTCGTAGCAATATCGGATCAAACTATGTGTATTGGTATCAGCAATTGCCCGGTACAGCACCCAAATTGCTCATATATAGAAATAATCAGAGACCTAGCGGAGTGCCTGATCGTTTTAGCGGTAGCAAAAGCGGCACCAGCGCATCACTGGCAATTTCAGGCCTGCGTAGCGAAGATGAGGCGGATTATTACTGTGCGAGTTGGGATGGTTCGCTGAGTGCTGTTGTGTTCGGCACCGGTACAAAACTGACCGTTCTG (配列番号304)
【０２０８】
さらに他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３０５および配列番号３０６に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含有する：
Ｐ０８Ｇ０２重鎖可変領域
GAAGTGCAGCTTGTCCAGAGCGGAGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGAAGATCAGCTGCAAGGGCTCCGGATACACCTTTCCTTCATCATGGATAGGTTGGGTGCGCCAGATGCCTGGTAAGGGACTGGAATGGATGGGCATCATATACCCTGATACTAGCCATACCCGTTACAGCCCAAGCTTTCAGGGCCAGGTCACAATCAGCGCTGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTTCAGTGGTCGTCTCTGAAGGCCAGCGACACCGCAATGTACTACTGTGCCCGTGCGAGCTATTTCGATCGTGGAACAGGGTATAGTTCTTGGTGGATGGATGTGTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTCAGCAGC (配列番号305)
Ｐ０８Ｇ０２軽鎖可変領域
GAGCTCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCAAGCGTGGGCGATAGAGTGACCATTACCTGTAGGGCCTCACAATCCATATACGACTATTTGCACTGGTATCAGCAGAAACCCGGGAAAGCACCCAAACTGCTGATTTACGATGCTTCCAACCTACAGAGTGGCGTTCCTTCACGTTTTAGCGGTAGCGGTTCAGGCACCGATTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTTCAGCCCGAAGATTTCGCTACGTATTATTGCCAGCAATCATACACCACGCCGTTGTTTACATTCGGCCAGGGTACCAAAGTGGAAATCAAA (配列番号306)
【０２０９】
さらに他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３０７および配列番号３０８に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含有する：
Ｐ０８Ｆ０８重鎖可変領域
GAAGTGCAGCTTGTCCAGAGCGGAGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGAAGATCAGCTGCAAGGGCTCCGGATACGGATTCACAAGTTATTGGATAGGTTGGGTGCGCCAGATGCCTGGTAAGGGACTGGAATGGATGGGTATCATTCATCCCGATGATAGCGACACCAAATACAGCCCAAGCTTTCAGGGCCAGGTCACAATCAGCGCTGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTTCAGTGGTCGTCTCTGAAGGCCAGCGACACCGCAATGTACTACTGTGCCTCTAGCTATTTGCGTGGCTTGTGGGGAGGCTATTTTGACTATTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTCAGCAGC (配列番号307)
Ｐ０８Ｆ０８軽鎖可変領域
GAGCTCCAGAGCGTGCTGACCCAGCCTCCTAGCGCAAGCGGCACCCCTGGACAGCGTGTGACAATTAGCTGTAGCGGATCAAGCTCAAACATTGGCTCAAATTATGTGAATTGGTATCAGCAATTGCCCGGTACAGCACCCAAACTGCTCATTTATGGAGATTATCAACGACCTAGCGGAGTGCCTGATCGTTTTAGCGGTAGCAAAAGCGGCACCAGCGCATCACTGGCAATTTCAGGCCTGCGTAGCGAAGATGAGGCGGATTATTACTGTGCTACCCGCGACGATTCGTTATCTGGGTCTGTCGTTTTTGGCACCGGTACAAAACTGACCGTGCTG (配列番号308)
【０２１０】
さらに他の実施形態では、組成物は、以下の配列番号３０９および配列番号３１０に示されるポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含有する：
Ｐ１５Ｄ０２重鎖可変領域
GAAGTGCAGCTTGTCCAGAGCGGAGCCGAAGTGAAGAAGCCTGGCGAGAGCCTGAAGATCAGCTGCAAGGGCTCCGGATACAGTTTTGCCTCATACTGGATCGGTTGGGTGCGCCAGATGCCTGGTAAGGGACTGGAATGGATGGGCGTAATTTACCCCGGAACTAGCGAGACACGTTACAGCCCAAGCTTTCAGGGCCAGGTCACAATCAGCGCTGACAAGAGCATCAGCACCGCCTACCTTCAGTGGTCGTCTCTGAAGGCCAGCGACACCGCAATGTACTACTGCGCTAAAGGGTTGAGTGCGAGTGCAAGTGGATATTCTTTCCAATATTGGGGCCAAGGTACACTGGTCACCGTCAGCAGC (配列番号309)
P15D032軽鎖可変領域 
GAGCTCGATATTCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCAAGCGTGGGCGATAGAGTGACCATTACCTGTAGGGCCTCACAAAGCATCGACACATATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCCGGGAAAGCACCCAAACTGCTGATTTATTCAGCTAGTAGCCTACACAGTGGCGTTCCTTCACGTTTTAGCGGTAGCGGTTCAGGCACCGATTTCACCCTGACCATTAGCAGCCTTCAGCCCGAAGATTTCGCTACGTATTATTGCCAACAATCATACAGCACAACTGCTTGGACATTCGGCCAGGGTACCAAAGTGGAAATCAAA (配列番号310)
【０２１１】
発現ベクター、およびポリヌクレオチド組成物の投与を、本明細書においてさらに記載する。
【０２１２】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。
【０２１３】
任意の当該配列に相補的なポリヌクレオチドも本開示に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であってもよく、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、１対１の方式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。追加のコード配列または非コード配列は、必ずではないが、本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、必ずではないが、他の分子および／またはサポート物質に連結されてもよい。
【０２１４】
ポリヌクレオチドは天然配列（すなわち抗体またはその一部分をコードする内因性配列）を含んでもよく、またはそうした配列のバリアントを含んでもよい。ポリヌクレオチドバリアントは、天然免疫反応性分子と比較して、コードされるポリペプチドの免疫反応性が減少しないように一つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、概して本明細書に記載されるように評価されてもよい。バリアントの実施形態は、天然抗体またはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対し、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性を呈する。
【０２１５】
二つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大対応に整列したときに同じである場合、二つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、「同一である」と言われる。二つの配列の間の比較は、典型的には、比較ウィンドウ上の配列を比較して、配列類似性の局所的な領域を特定し、比較することによって実施される。本明細書において使用される場合、「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個の連続する位置、通常は３０〜約７５個、または４０〜約５０個の連続する位置のセグメントを指し、そのセグメントにおいて、二つの配列が最適に整列された後、配列は同数の連続位置の参照配列と比較され得る。
【０２１６】
比較のための最適な配列の整列は、デフォルトパラメータを使用して、バイオインフォマティクスソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州マジソン）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ｓｕｉｔｅのＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施されてもよい。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかの整列スキームを具現化するものである。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，１９７８，Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ。Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（ｅｄ．）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ  Ｊ．，１９９０，Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．，１９７１，Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．，Ｎｅｓ，Ｍ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．，１９７３，Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０２１７】
「配列同一性の百分率」は、最適に並置された二つの配列を、少なくとも２０個の位置の比較ウィンドウ上で比較することにより決定され、この場合において比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、二配列の最適アライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０％以下、通常は５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわちギャップ）を含む場合がある。百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を決定して、合致位置数を出し、その合致位置数を、参照配列中の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛け、配列同一性の百分率を出すことにより算出される。
【０２１８】
バリアントはさらに、またはあるいは、天然遺伝子、またはその一部、またはその相補物に対して実質的に相同であってもよい。そうしたポリヌクレオチドバリアントは、中程度のストリンジェントな条件下で、天然抗体をコードする天然ＤＮＡ配列（または相補配列）にハイブリダイズする能力を有する。
【０２１９】
適切な「中程度のストリンジェントな条件」には、５Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で前洗浄すること；５０℃〜６５℃、５Ｘ  ＳＳＣ、一晩でハイブリダイズすること；次いで６５℃、２０分間で２回、各々０．１％ＳＤＳを含有する２Ｘ、０．５Ｘ、および０．２Ｘ  ＳＳＣを用いて洗浄すること、を含む。
【０２２０】
本明細書において使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄に関し、低イオン強度および高温を採用すること、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムなど；（２）ハイブリダイゼーションの間に、例えばホルムアミドなどの変性剤、例えば０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％  ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドとともに、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを４２℃で採用する；または（３）５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、ソニケート処理された鮭精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストラン、４２℃を採用し、４２℃、０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で洗浄し、および５５℃、５０％ホルムアミドで洗浄し、次いで、５５℃、ＥＤＴＡ含有０．１Ｘ  ＳＳＣからなる高ストリンジェント洗浄を行う。当業者であれば、必要に応じて温度、イオン強度などをどのように調整して、例えばプローブの長さなどの因子に適応させるかを認識するであろう。
【０２２１】
当業者であれば、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は多数存在することを認識するであろう。これらポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対し、最小の相同性を担持する。それにもかかわらずコドン使用頻度の差異により変化するポリヌクレオチドが、本開示により具体的に予期される。さらに本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルも、本開示の範囲内にある。アレルは、例えばヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの一つまたは複数の変異の結果として変化する内因性の遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずではないが、構造が変化または機能が変化する場合がある。アレルは、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を使用して特定されてもよい。
【０２２２】
本開示のポリヌクレオチドは、化学合成、組み換え法、またはＰＣＲを使用して取得することができる。化学的なポリヌクレオチド合成方法は当分野で公知であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者であれば、本明細書に提供される配列、および市販のＤＮＡ合成装置を使用して、所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
【０２２３】
本明細書においてさらに検討されるように、組み換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドが、適切なベクター内に挿入されてもよく、次いで当該ベクターが適切な宿主細胞内に導入され、複製および増幅されてもよい。ポリヌクレオチドは、当分野で公知の任意の手段によって宿主細胞内に挿入され得る。細胞は、直接的な取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ交配、またはエレクトロポレーション法により外来性ポリヌクレオチドを導入することにより形質転換される。導入された時点で、当該外因性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター（例えばプラスミド）として細胞内で維持され、または宿主細胞ゲノム内に統合され得る。そのように増幅されたポリヌクレオチドは、当分野で公知の方法によって宿主細胞から単離され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと。
【０２２４】
あるいは、ＰＣＲによるＤＮＡ配列の再生が可能である。ＰＣＲ技術は当分野で公知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９４に記載されている。
【０２２５】
ＲＮＡは、適切なベクター中で単離ＤＮＡを使用し、適切な宿主細胞内にそれを挿入することによって取得され得る。例えば上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に記載されるように、細胞が複製され、ＤＡＮがＲＮＡに転写される場合、当該ＲＮＡは、当業者に公知の方法を使用して単離され得る。
【０２２６】
標準的な技術に従い適切なクローニングベクターが構築されてもよく、または当分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択されてもよい。選択されたクローニングベクターは、使用が意図される宿主細胞に応じて変化し得るが、有用なクローニングベクターは一般的に自己複製する能力を有するものであり、特定の制限エンドヌクレアーゼに対して単一の標的を保有していてもよく、および／またはベクターを含むクローンの選択に使用することができるマーカーの遺伝子を担持してもよい。適切な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルスが挙げられる。例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびに例えばｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが挙げられる。これらベクター、および他の多くのクローニングベクターは、例えばＢｉｏＲａｄ社、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社などの業者から入手可能である。
【０２２７】
発現ベクターは一般的に、本開示によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡと一体となっている部分として、宿主細胞中で複製可能でなければならないと示唆される。適切な発現ベクターとしては限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２に開示される発現ベクター、またはＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社から入手可能なレンチウイルスｐＬＶＸベクターが挙げられる。ベクターの構成要素としては限定されないが、一般的に、以下の内の一つまたは複数が挙げられる：シグナル配列、複製起源、一つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御因子（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）。発現（すなわち翻訳）に対し、通常は一つまたは複数の翻訳制御因子も必要であり、例えばリボソーム結合部位、翻訳開始部位、および停止コドンなどがある。
【０２２８】
対象のポリヌクレオチドを含有するベクターは、エレクトロポレーション法、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション、マイクロプロジェクタイル照射、リポフェクション、および感染（ベクターが、例えばワクシニアウイルスなどの感染性の実体である場合）をはじめとする多くの適切な手段のいずれかにより宿主細胞内に導入され得る。ベクターまたはポリヌクレオチドの導入に関する選択は多くの場合、宿主細胞の特徴に依存する。
【０２２９】
本明細書に開示されるＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクターにおいて存在してもよい（例えば、細菌宿主細胞内への導入用のプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクション用のバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクション用のプラスミドもしくはレンチウイルスなどのウイルスベクター）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、例えば限定されないが、２Ａペプチドをコードする配列などの、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含有し得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において特定された２Ａペプチドは、一つのコドンから次のコドンへ、当該コドンによりコードされる二つのアミノ酸の間にペプチド結合を形成させることなくリボソームを「スキップ」させる（（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ２００１；Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８）を参照のこと）。「コドン」とは、リボソームによって一つのアミノ酸残基へと翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）の三つのヌクレオチドを意味する。したがって、フレーム中の２Ａオリゴペプチド配列によりポリペプチドが分離されているとき、ｍＲＮＡ内の一つの連続的なオープンリーディングフレームから二つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機構は当分野で公知であり、単一メッセンジャーＲＮＡによりコードされる、いくつかのタンパク質の発現用の数種のベクターに使用されることが知られている。
【０２３０】
宿主細胞の分泌経路に膜貫通ポリペプチドを誘導させるために、一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列中に分泌シグナル配列（リーダー配列、ｐｒｅｐｒｏ配列またはｐｒｅ配列としても知られる）が備えられる。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に操作可能に連結される。すなわち二つの配列は、正しいリーディングフレームで結合され、新たに合成されるポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導するように配置される。分泌シグナル配列は一般的に、対象のポリペプチドをコードする核酸配列に対して５’に配置される。しかし、特定の分泌シグナル配列は、対象の核酸配列中の別の場所に配置されてもよい（例えば、Ｗｅｌｃｈらの米国特許第５，０３７，７４３号、Ｈｏｌｌａｎｄらの米国特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２６６または配列番号２７７に示されるアミノ酸配列を含有する。当業者であれば、遺伝子コードの縮重を考慮すると、これらポリヌクレオチド分子にはかなりの配列バリエーションがあり得ることを認識するであろう。一部の実施形態では、本開示の核酸配列は、哺乳動物細胞での発現に対してコドン最適化され、または一部の実施形態では、ヒト細胞での発現に対してコドン最適化される。コドン最適化とは、所与の種の高度に発現される遺伝子において一般的に稀であるコドンの対象配列を、当該種の高度に発現される遺伝子において一般的に頻繁にあるコドンに交換することを指し、当該コドンは、交換されるコドンと同じアミノ酸をコードしている。
【０２３１】
ＣＤ７０特異的抗体およびその作製方法
本明細書において、ＣＤ７０抗体が提供される。
【０２３２】
一部の実施形態では、本開示のＣＤ７０抗体は、表１に列記される部分的軽鎖配列のいずれか一つ、および／または表１に列記される部分的重鎖配列のいずれか一つを含有する。表１において、下線の配列は、Ｋａｂａｔに従うＣＤＲ配列であり、太字は、Ｃｈｏｔｈｉａに従うＣＤＲ配列である。
【０２３３】
表２Ａ〜２Ｂは、本明細書に提供されるＣＤ７０抗体のＣＤＲ配列の例を提供する。
【０２３４】
一部の実施形態では、本開示は、抗体（例えばＣｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０（ＣＤ７０）に特異的に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含む）を提供するものであり、この場合において当該抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号４９、５０、５１、５５、５６、５７、６１、６２、６３、６７、６８、６９、７３、７４、７５、７９、８０、８１、８５、８６、８７、９１、９２、９３、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０９、１１０、１１１、１１５、１１６、１１７、１２１、１２２、１２３、１２７、１２８、１２９、１３３、１３４、１３５、１３９、１４０、１４１、１４５、１４６、１４７、１５１、１５２、１５３、１５７、１５８、１５９、１６３、１６４、１６５、１６９、１７０、１７１、１７５、１７６、１７７、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、３８２、３８３、３８４、３８８、３８９、３９０、３９４、３９５、３９６、４００、４０１、４０２、４０６、４０７、４０８、４１２、４１３、４１４、４１８、４１９、４２０、４２４、４２５、４２６、４３０、４３１、４３２、６６３、６６４、６６５、４３６、４３７、４３８、４４２、４４３、４４４、４４８、４４９、４５０、４５４、４５５、４５６、４６０、４６１、４６２、４６６、４６７、４６８、４７２、４７３、４７４、４７８、４７９、４８０、４８４、４８５、４８６、４９０、４９１、４９２、４９６、４９７、４９８、５０２、５０３、５０４、５０８、５０９、または５１０に示される配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；（ｉｉ）配列番号５２、５３、５８、５９、６４、６５、７０、７１、７６、７７、８２、８３、８８、８９、９４、９５、１００、１０１、１０６、１０７、１１２、１１３、１１８、１１９、１２４、１２５、１３０、１３１、１３６、１３７、１４２、１４３、１４８、１４９、１５４、１５５、１６０、１６１、１６６、１６７、１７２、１７３、１７８、１７９、１８４、１８５、１９０、１９１、３８５、３８６、３９１、３９２、３９７、３９８、４０３、４０４、４０９、４１０、４１５、４１６、４２１、４２２、４２７、４２８、４３３、４３４、６６６、６６７、４３９、４４０、４４５、４４６、４５１、４５２、４５７、４５８、４６３、４６４、４６９、４７０、４７５、４７６、４８１、４８２、４８７、４８８、４９３、４９４、４９９、５００、５０５、５０６、５１１、または５１２に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２；およびｉｉｉ）配列番号５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、３８７、３９３、３９９、４０５、４１１、４１７、４２３、４２９、４３５、６６８、４４１、４４７、４５３、４５９、４６５、４７１、４７７、４８３、４８９、４９５、５０１、５０７、または５１３に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、を含む重鎖可変（ＶＨ）領域；ならびに／または（ｉ）配列番号１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、��２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、２６２、５１４、５１７、５２０、５２３、５２６、５２９、５３２、５３５、５３８、６６９、５４１、５４４、５４７、５５０、５５３、５５６、５５９、５６２、５６５、５６８、５７１、５７４、または５７７に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１；（ｉｉ）配列番号１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、２６０、２６３、５１５、５１８、５２１、５２４、５２７、５３０、５３３、５３６、５３９、６７０、５４２、５４５、５４８、５５１、５５４、５５７、５６０、５６３、５６６、５６９、５７２、５７５、または５７８に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；および（ｉｉｉ）配列番号１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６４、５１６、５１９、５２２、５２５、５２８、５３１、５３４、５３７、５４０、６７１、５４３、５４６、５４９、５５２、５５５、５５８、５６１、５６４、５６７、５７０、５７３、５７６、または５７９に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域、を含有する。
【０２３５】
一部の実施形態では、本開示は、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０  （ＣＤ７０）に特異的に結合する抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を提供するものであり、この場合において当該抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、６６２、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、または３８１に示されるＶＨ配列のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変（ＶＨ）領域、および／または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、６６１、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、または３８０に示されるＶＬ配列のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域、を含有する。
【０２３６】
一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０に特異的に結合し、前述の抗体のいずれかと競合する単離抗体を提供する。
【０２３７】
一部の実施形態では、本発明は、ＣＤ７０に結合し、３１Ｈ１、６３Ｂ２、４０Ｅ３、４２Ｃ３、４５Ｆ１１、６４Ｆ９、７２Ｃ２、２Ｆ１０、４Ｆ１１、１０Ｈ１０、１７Ｇ６、６５Ｅ１１、Ｐ０２Ｂ１０、Ｐ０７Ｄ０３、Ｐ０８Ａ０２、Ｐ０８Ｅ０２、Ｐ０８Ｆ０８、Ｐ０８Ｇ０２、Ｐ１２Ｂ０９、Ｐ１２Ｆ０２、Ｐ１２Ｇ０７、Ｐ１３Ｆ０４、Ｐ１５Ｄ０２、Ｐ１６Ｃ０５、１０Ａ１、１０Ｅ２、１１Ａ１、１１Ｃ１、１１Ｄ１、１１Ｅ１、１２Ａ２、１２Ｃ４、１２Ｃ５、１２Ｄ３、１２Ｄ６、１２Ｄ７、１２Ｆ５、１２Ｈ４、８Ｃ８、８Ｆ７、８Ｆ８、９Ｄ８、９Ｅ１０、９Ｅ５、９Ｆ４または９Ｆ８を含む、本明細書に記載の抗体と競合する抗体を提供する。
【０２３８】
一部の実施形態では、本発明はさらに、ＣＤＲ接触領域に基づいた、ＣＤ７０抗体に対する抗体のＣＤＲ部分を提供する。ＣＤＲ接触領域は、抗原に対する特異性を抗体に与える抗体の領域である。一般的に、ＣＤＲ接触領域は、ＣＤＲ中の残基位置、および特定の抗原に結合する抗体の適切なループ構造を維持するために制約を受けるＶｅｒｎｉｅｒゾーンを含む。例えば、Ｍａｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３：１１５６−１１６６，２００７を参照のこと。ＣＤＲ接触領域の決定は、当分野の技術範囲内にある。
【０２３９】
ＣＤ７０（例えば、ヒトＣＤ７０（例えば、配列番号３３５））に対する本明細書に記載のＣＤ７０抗体の結合アフィニティ（ＫＤ）は、約０．００１〜約５０００ｎＭであってもよい。一部の実施形態では、結合アフィニティは、およそ５０００ｎＭ、４５００ｎＭ、４０００ｎＭ、３５００ｎＭ、３０００ｎＭ、２５００ｎＭ、２０００ｎＭ、１７８９ｎＭ、１５８３ｎＭ、１５４０ｎＭ、１５００ｎＭ、１４９０ｎＭ、１０６４ｎＭ、１０００ｎＭ、９３３ｎＭ、８９４ｎＭ、７５０ｎＭ、７０５ｎＭ、６７８ｎＭ、５３２ｎＭ、５００ｎＭ、４９４ｎＭ、４００ｎＭ、３４９ｎＭ、３４０ｎＭ、３５３ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２４４ｎＭ、２３１ｎＭ、２２５ｎＭ、２０７ｎＭ、２００ｎＭ、１８６ｎＭ、１７２ｎＭ、１３６ｎＭ、１１３ｎＭ、１０４ｎＭ、１０１ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８３ｎＭ、７９ｎＭ、７４ｎＭ、５４ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４２ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３２ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２４ｎＭ、２２ｎＭ、２０ｎＭ、１９ｎＭ、１８ｎＭ、１７ｎＭ、１６ｎＭ、１５ｎＭ、１２ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５．５ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、または０．００１ｎＭのいずれかである。一部の実施形態では、結合アフィニティは、およそ５０００ｎＭ、４０００ｎＭ、３０００ｎＭ、２０００ｎＭ、１０００ｎＭ、９００ｎＭ、８００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７．５ｎＭ、７ｎＭ、６．５ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４．５ｎＭ、４ｎＭ、３．５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１ｎＭ、または０．５ｎＭのいずれかよりも小さい。
【０２４０】
一部の実施形態では、本開示は、前述の単離抗体のいずれかをコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本開示は、当該核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、本開示は、当該核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０２４１】
本開示はさらに、医薬品としての使用のための前述の抗体の抗体のいずれかを提供する。一部の実施形態では、医薬品は、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または非小細胞肺癌からなる群から選択されるＣＤ７０関連癌の治療における使用のためである。
【０２４２】
一部の実施形態では、本開示は、その必要のある対象を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、前述の抗体のいずれかを提供すること、および当該対象に当該抗体を投与することを含む。
【０２４３】
一部の実施形態では、本開示は、前述の抗体のいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【０２４４】
一部の実施形態では、本開示は、対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞と関連した状態を治療する方法を提供するものであり、当該方法は、その必要のある対象に、前述の抗体のいずれか一つの有効量、または前述の抗体のいずれか一つを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む。一部の実施形態では、状態は、癌である。一部の実施形態では、癌は、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または非小細胞肺癌からなる群から選択されるＣＤ７０関連癌である。
【０２４５】
一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍の増殖または進行を阻害する方法を提供するものであり、当該方法は、その必要のある対象に、本開示の医薬組成物の当該対象に対する有効量を投与することを含む。
【０２４６】
一部の実施形態では、本開示は、対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞の転移を阻害する方法を提供するものであり、当該方法は、その必要のある対象に、本開示の医薬組成物の当該対象に対する有効量を投与することを含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍の退縮を誘導する方法を提供するものであり、当該方法は、その必要のある対象に、本開示の医薬組成物の当該対象に対する有効量を投与することを含む。
【０２４８】
一部の実施形態では、抗体の産生を生じさせる条件下で、本開示の宿主細胞を培養すること、および当該宿主細胞または培養物から当該抗体を単離すること、を含む、抗体。
【０２４９】
本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二特異性抗体、ヘテロ結合抗体、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質（例えば、ドメイン抗体）、ヒト化抗体、および必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変構造物を包含してもよく、抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合改変抗体を含む。抗体は、マウス、ラット、ヒトまたは任意の他の起源（キメラ抗体またはヒト化抗体を含む）であってもよい。
【０２５０】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＤ７０一特異性抗体は、モノクローナル抗体である。例えば、ＣＤ７０一特異性抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。
【０２５１】
本開示はさらに、以下の例示的な実施形態を提供する。
１．Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０（ＣＤ７０）に特異的に結合する単離抗体であって、当該抗体は、
（ａ）（ｉ）配列番号４９、５０、５１、５５、５６、５７、６１、６２、６３、６７、６８、６９、７３、７４、７５、７９、８０、８１、８５、８６、８７、９１、９２、９３、９７、９８、９９、１０３、１０４、１０５、１０９、１１０、１１１、１１５、１１６、１１７、１２１、１２２、１２３、１２７、１２８、１２９、１３３、１３４、１３５、１３９、１４０、１４１、１４５、１４６、１４７、１５１、１５２、１５３、１５７、１５８、１５９、１６３、１６４、１６５、１６９、１７０、１７１、１７５、１７６、１７７、１８１、１８２、１８３、１８７、１８８、１８９、３８２、３８３、３８４、３８８、３８９、３９０、３９４、３９５、３９６、４００、４０１、４０２、４０６、４０７、４０８、４１２、４１３、４１４、４１８、４１９、４２０、４２４、４２５、４２６、４３０、４３１、４３２、６６３、６６４、６６５、４３６、４３７、４３８、４４２、４４３、４４４、４４８、４４９、４５０、４５４、４５５、４５６、４６０、４６１、４６２、４６６、４６７、４６８、４７２、４７３、４７４、４７８、４７９、４８０、４８４、４８５、４８６、４９０、４９１、４９２、４９６、４９７、４９８、５０２、５０３、５０４、５０８、５０９または５１０に示される配列を含むＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、（ｉｉ）配列番号５２、５３、５８、５９、６４、６５、７０、７１、７６、７７、８２、８３、８８、８９、９４、９５、１００、１０１、１０６、１０７、１１２、１１３、１１８、１１９、１２４、１２５、１３０、１３１、１３６、１３７、１４２、１４３、１４８、１４９、１５４、１５５、１６０、１６１、１６６、１６７、１７２、１７３、１７８、１７９、１８４、１８５、１９０、１９１、３８５、３８６、３９１、３９２、３９７、３９８、４０３、４０４、４０９、４１０、４１５、４１６、４２１、４２２、４２７、４２８、４３３、４３４、６６６、６６７、４３９、４４０、４４５、４４６、４５１、４５２、４５７、４５８、４６３、４６４、４６９、４７０、４７５、４７６、４８１、４８２、４８７、４８８、４９３、４９４、４９９、５００、５０５、５０６、５１１または５１２に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、およびｉｉｉ）配列番号５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、９６、１０２、１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、３８７、３９３、３９９、４０５、４１１、４１７、４２３、４２９、４３５、６６８、４４１、４４７、４５３、４５９、４６５、４７１、４７７、４８３、４８９、４９５、５０１、５０７または５１３に示される配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、を含む重鎖可変（ＶＨ）領域；および／または
（ｂ）（ｉ）配列番号１９３、１９６、１９９、２０２、２０５、２０８、２１１、２１４、２１７、２２０、２２３、２２６、２２９、２３２、２３５、２３８、２４１、２４４、２４７、２５０、２５３、２５６、２５９、２６２、５１４、５１７、５２０、５２３、５２６、５２９、５３２、５３５、５３８、６６９、５４１、５４４、５４７、５５０、５５３、５５６、５５９、５６２、５６５、５６８、５７１、５７４または５７７に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、（ｉｉ）配列番号１９４、１９７、２００、２０３、２０６、２０９、２１２、２１５、２１８、２２１、２２４、２２７、２３０、２３３、２３６、２３９、２４２、２４５、２４８、２５１、２５４、２５７、２６０、２６３、５１５、５１８、５２１、５２４、５２７、５３０、５３３、５３６、５３９、６７０、５４２、５４５、５４８、５５１、５５４、５５７、５６０、５６３、５６６、５６９、５７２、５７５または５７８に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および（ｉｉｉ）配列番号１９５、１９８、２０１、２０４、２０７、２１０、２１３、２１６、２１９、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３７、２４０、２４３、２４６、２４９、２５２、２５５、２５８、２６１、２６４、５１６、５１９、５２２、５２５、５２８、５３１、５３４、５３７、５４０、６７１、５４３、５４６、５４９、５５２、５５５、５５８、５６１、５６４、５６７、５７０、５７３、５７６または５７９に示される配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３、を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域、を含む。
２．Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７０（ＣＤ７０）に特異的に結合する単離抗体であって、当該抗体は、
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、６６２、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９または３８１に示されるＶＨ配列のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ領域、および／または
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、６６１、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８または３８０に示されるＶＬ配列のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ領域、を含む。
３．ＣＤ７０に特異的に結合し、実施形態１に記載の抗体と競合する、単離抗体。
４．実施形態１〜３のいずれか一つに記載の抗体をコードする核酸。
５．実施形態４に記載の核酸を含むベクター。
６．実施形態４に記載の核酸を含む宿主細胞。
７．医薬品としての使用のための実施形態１〜３のいずれか一つに記載の抗体。
８．当該医薬品が、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または非小細胞肺癌からなる群から選択されるＣＤ７０関連癌の治療における使用のためである、実施形態７に記載の抗体。
９．その必要のある対象を治療する方法であって、
ａ．実施形態１〜３のいずれか一つに記載の抗体を提供すること、および
ｂ．当該対象に当該抗体を投与すること、を含む、方法。
１０．実施形態１〜３のいずれか一つに記載の抗体を含む医薬組成物。
１１．対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞と関連した状態を治療する方法であって、その必要のある対象に、実施形態１〜３のいずれか一つに記載の抗体の有効量、または実施形態１０に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
１２．当該状態が、癌である、実施形態１１に記載の方法。
１３．当該癌が、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または非小細胞肺癌からなる群から選択されるＣＤ７０関連癌である、実施形態１２に記載の方法。
１４．ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍の増殖または進行を阻害する方法であって、その必要のある当該対象に、実施形態１０に記載の医薬組成物の当該対象に対する有効量を投与することを含む、方法。
１５．対象においてＣＤ７０を発現する悪性細胞の転移を阻害する方法であって、その必要のある当該対象に、実施形態１０に記載の医薬組成物の当該対象に対する有効量を投与することを含む、方法。
１６．ＣＤ７０を発現する悪性細胞を有する対象において腫瘍の退縮を誘導する方法であって、その必要のある当該対象に、実施形態１０に記載の医薬組成物の当該対象に対する有効量を投与することを含む、方法。
１７．抗体を作製する方法であって、当該抗体の産生を生じさせる条件下で、実施形態６に記載の宿主細胞を培養すること、および当該宿主細胞または培養物から当該抗体を単離すること、を含む方法。
【０２５２】
免疫細胞を操作する方法
免疫療法における使用のための免疫細胞を調製する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、本開示によるＣＡＲを免疫細胞に導入すること、および当該細胞を拡張させることを含む。一部の実施形態では、本開示は、免疫細胞を操作する方法に関するものであり、当該方法は、細胞を提供すること、および上述のＣＡＲを少なくとも一つ、当該細胞表面上で発現させること、を含む。免疫細胞を操作する方法は、例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ／２０１４／０３９５２３、ＷＯ／２０１４／１８４７４１、ＷＯ／２０１４／１９１１２８、ＷＯ／２０１４／１８４７４４およびＷＯ／２０１４／１８４１４３に記載されており、それら出願公開はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、方法は、上述のＣＡＲをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすること、および当該細胞において当該ポリヌクレオチドを発現させること、を含む。
【０２５３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞中での安定的発現用のレンチウイルスベクター中に存在する。
【０２５４】
一部の実施形態では、方法は、例えば限定されないが、ＴＣＲの構成要素、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子、ＣＤ７０、および／または例えばＰＤＣＤ１もしくはＣＴＬＡ−４などの免疫チェックポイントタンパク質などを発現する遺伝子を少なくとも一つ破壊する、または不活化することにより、細胞を遺伝子改変する工程をさらに含み得る。遺伝子を破壊または不活化するとは、対象遺伝子が機能的なタンパク質の形態で発現されないことが意図される。一部の実施形態では、破壊される、または不活化される遺伝子は、例えば限定されないが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、ＰＤ−１、ＣＤ７０およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、選択的ＤＮＡ切断によって遺伝子を選択的に不活化することが可能な低頻度切断エンドヌクレアーゼ（ｒａｒｅ−ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を細胞内に導入することにより、一つまたは複数の遺伝子を破壊すること、または不活化することを含む。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、転写活性化因子様エフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連のエンドヌクレアーゼであってもよい。
【０２５５】
一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼとともに追加の触媒ドメインが使用され、標的遺伝子を不活化する能力が強化される。例えば、追加の触媒ドメインは、ＤＮＡ末端処理酵素であってもよい。ＤＮＡ末端処理酵素の非限定的な例としては、５−３’エキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、および鋳型非依存性のＤＮＡポリマーゼが挙げられる。そうした触媒ドメインの非限定的な例は、ｈＥｘｏＩ（ＥＸＯ１＿ＨＵＭＡＮ）、酵母ＥｘｏＩ（ＥＸＯ１＿ＹＥＡＳＴ）、大腸菌ＥｘｏＩ、ヒトＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ１、ヒトＴＲＥＸ１、ウシＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、ＴｄＴ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））ヒトＤＮＡ２、酵母ＤＮＡ２（ＤＮＡ２＿ＹＥＡＳＴ）からなる群から選択されるタンパク質ドメイン、または当該タンパク質ドメインの触媒活性のある誘導体から構成される。一部の実施形態では、追加の触媒ドメインは、３’−５’−エキソヌクレアーゼ活性を有してもよく、一部の実施形態では、当該追加の触媒ドメインは、例えばＴＲＥＸ２触媒ドメイン（ＷＯ２０１２／０５８４５８）などのＴＲＥＸである。一部の実施形態では、当該触媒ドメインは、一本鎖ＴＲＥＸポリペプチドによりコードされる。追加の触媒ドメインは、ヌクレアーゼ融合タンパク質、またはキメラタンパク質に融合されてもよい。一部の実施形態では、追加の触媒ドメインは、例えばペプチドリンカーを使用して融合される。
【０２５６】
一部の実施形態では、方法は、少なくとも標的核酸配列の一部に対して配列相同性のある外因性核酸を細胞に導入する工程をさらに含み、それによって当該標的核酸配列と当該外因性核酸の間に相同組み換えが発生する。一部の実施形態では、当該外因性核酸は、第一の部分と第二の部分を含み、それぞれが標的核酸配列の５’領域および３’領域に相同である。外因性核酸は、当該第一の部分と当該第二の部分の間に配置された第三の部分も含有してもよく、当該部分は、標的核酸配列の５’領域および３’領域との相同性を含まない。標的核酸配列の切断後、標的核酸配列と外因性核酸の間で相同組み換え事象が刺激される。一部の実施形態では、少なくとも約５０ｂｐの相同配列、約１００ｂｐよりも大きい相同配列、または約２００ｂｐよりも大きい相同配列が、ドナーマトリクス内で使用され得る。外因性核酸は、例えば限定されないが、約２００ｂｐ〜約６０００ｂｐ、または約１０００ｂｐ〜約２０００ｂｐであってもよい。共有される核酸相同部は、切断部位の上流および下流に隣接する領域に配置され、導入される核酸配列は当該二つのアームの間に配置される。
【０２５７】
一部の実施形態では、核酸は連続的に、当該切断部位の上流の配列に対する第一の相同領域；ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＣＤ７０、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）および例えばｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される標的遺伝子を不活化する配列；および当該切断部位の下流の配列に対する第二の相同領域、を含有する。ポリヌクレオチド導入工程は、低頻度切断エンドヌクレアーゼの導入もしくは発現と同時、前または後で行われてもよい。切断事象が発生した標的核酸配列の位置に応じて、当該外因性核酸を使用して、例えば外因性核酸が遺伝子のオープンリーディングフレーム内に配置されたときには遺伝子がノックアウトされ、または新たな配列もしくは対象遺伝子が導入される。こうした外因性核酸を使用することによる配列挿入を使用して、遺伝子の修正もしくは置換が行われることにより（非限定的な例としてアレルスワップ）、標的の既存遺伝子が改変され得、または標的遺伝子の発現（非限定的な例としてプロモータースワップ）、標的遺伝子修正もしくは標的遺伝子置換の上方制御もしくは下方制御が行われ得る。一部の実施形態では、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＧＲ、ＤＣＫ、および免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される遺伝子の不活化は、特定のＴＡＬＥ−ヌクレアーゼの標的となる正確なゲノム位置で行われ、この場合において、当該特定のＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、切断を触媒し、およびこの場合において当該外因性核酸は連続的に、少なくとも相同領域、および相同組み換えにより統合されるＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＧＲ、ＤＣＫ、免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される一つの標的遺伝子を不活化する配列、を含有する。一部の実施形態では、いくつかの遺伝子は、一つの規定の遺伝子をそれぞれ、および特異的に標的とするいくつかのＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ、および特定の遺伝子不活化のためのいくつかの特定のポリヌクレオチドを使用して連続的に、もしくは同時に破壊または不活化されてもよい。
【０２５８】
一部の実施形態では、方法は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＧＲ、ＤＣＫ、および免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択される一つまたは複数の追加の遺伝子の不活化を含む。一部の実施形態では、遺伝子の不活化は、少なくとも一つの低頻度切断エンドヌクレアーゼを細胞内に導入し、それにより当該低頻度切断エンドヌクレアーゼが、細胞ゲノムの標的配列において特異的に切断を触媒すること、および任意で、切断の上流の配列に相同な第一の領域、細胞ゲノムに挿入される配列、および切断の下流の配列に相同な第二の領域を連続的に含有する外因性核酸を細胞内に導入することにより実現され得、この場合において当該導入される外因性核酸が遺伝子を不活化し、少なくとも一つの対象の組み換えタンパク質をコードする少なくとも一つの外因性ポリヌクレオチド配列を統合する。一部の実施形態では、外因性ポリヌクレオチド配列は、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＧＲ、ＤＣＫ、および免疫チェックポイントタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子内に統合される。
【０２５９】
別の態様では、細胞を遺伝子改変する工程は、免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも一つの遺伝子を破壊または不活化することによりＴ細胞を改変すること、および細胞を、任意で当該免疫抑制剤の存在下で拡張させること、を含み得る。免疫抑制剤は、いくつかの作用機序のうちの一つにより、免疫機能を抑制する剤である。免疫抑制剤は、免疫応答の範囲および／または貪食を減少させ得る。免疫抑制剤の非限定的な例としては、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシン標的、インターロイキン−２α鎖遮断剤、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、コルチコステロイド、および免疫抑制性の抗代謝剤が挙げられる。一部の細胞障害性の免疫抑制剤は、ＤＮＡ合成を阻害することにより作用する。その他は、Ｔ細胞の活性化を通して作用し、またはヘルパー細胞の活性化を阻害することにより作用する場合がある。本開示による方法は、Ｔ細胞中の免疫抑制剤の標的を破壊または不活化することによって、Ｔ細胞に、免疫療法に対する免疫抑制抵抗性を与え得る。非限定的な例としての免疫抑制剤の標的は、例えば限定されないが、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子のメンバー、およびシクロフィリンファミリー遺伝子のメンバーなどの免疫抑制剤に対する受容体であり得る。
【０２６０】
一部の実施形態では、当該方法の遺伝子改変は、操作される提供細胞において、一つの低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させ、それにより当該低頻度切断エンドヌクレアーゼが、一つの標的遺伝子において特異的に切断を触媒し、当該標的遺伝子を破壊または不活化することを含む。一部の実施形態では、細胞を操作する方法は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む：例えば細胞培養物由来または血液サンプル由来のＴ細胞を提供する工程、免疫抑制剤の標的を発現するＴ細胞中の遺伝子を選択する工程、当該Ｔ細胞に、当該免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子を、ＤＮＡ切断（一部の実施形態では、二本鎖切断）により選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼを導入する工程、および任意で当該免疫抑制剤の存在下で当該細胞を拡張させる工程。
【０２６１】
一部の実施形態では、当該方法は、以下を含む：例えば細胞培養物由来または血液サンプル由来のＴ細胞を提供する工程、Ｔ細胞中の遺伝子を選択する工程であって、当該遺伝子は、免疫抑制剤の標的を発現する工程、当該Ｔ細胞に、当該免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子を、ＤＮＡ切断（一部の実施形態では、二本鎖切断）により選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸をトランスフェクトし、当該Ｔ細胞内で当該低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させる工程、および任意で当該免疫抑制剤の存在下で当該細胞を拡張させる工程。
【０２６２】
一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＣＤ５２またはＧＲを特異的に標的とする。一部の実施形態では、不活化に選択される遺伝子は、ＣＤ５２をコードし、免疫抑制性治療剤は、ＣＤ５２抗原を標的とするヒト化抗体を含有する。一部の実施形態では、不活化に選択される遺伝子は、ＧＲをコードし、免疫抑制性治療剤は、例えばデキサメタゾンなどのコルチコステロイドを含有する。一部の実施形態では、不活化に選択される遺伝子は、ＦＫＢＰファミリー遺伝子のメンバーまたはそのバリアントであり、免疫抑制性治療剤は、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）またはフジマイシン（ｆｕｊｉｍｙｃｉｎ）としても知られるＦＫ５０６を含有する。一部の実施形態では、ＦＫＢＰファミリー遺伝子のメンバーは、ＦＫＢＰ１２またはそのバリアントである。一部の実施形態では、不活化に選択される遺伝子は、シクロフィリンファミリー遺伝子のメンバーまたはそのバリアントであり、免疫抑制性治療剤は、シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）を含有する。
【０２６３】
一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、転写活性化因子様エフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ）、またはＣＲＩＳＰＲ関連のエンドヌクレアーゼであってもよい。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであり、ガイドＲＮＡは、標的部位に対して少なくとも部分的に相補的または完全に相補的である。
【０２６４】
一般的に、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはその機能的同等物とともに供給される。ｇＲＮＡは、以下の二つの部分から構成される：標的ゲノムＤＮＡ配列に特異的なｃｒｉｓｐｒ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ＤＮＡにＣａｓが結合することを促進するトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、同じＲＮＡオリゴヌクレオチド中に存在する場合があり、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼称される。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、別のＲＮＡオリゴヌクレオチドとして存在する場合もある。本明細書において使用される場合、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、ｓｇＲＮＡとして、またはｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖として存在するｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの組み合わせを指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から誘導され得る（ＳｐＣａｓ９）。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）を含む他の細菌株から誘導され得る。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（ａｌｓｏ  ｋｎｏｗｎ  ａｓ  Ｃｓｎｌ  ａｎｄ  Ｃｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、またはＣｓｆ４を含む群から選択される。
【０２６５】
研究により、未分化状態（すなわちＴＳＣＭまたはＴＣＭ）のサブセットから誘導されたＴ細胞の養子免疫伝達は、インビボで長期的な持続性をもたらすことが提唱されている（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１８（１）：２９４−３０５（２００８）を参照のこと）。したがってＣＡＲ  Ｔ産物におけるＣＤ７０の遺伝子ノックダウンは、Ｔ細胞分化を阻害するための重要な検討事項である。
【０２６６】
一部の実施形態では、当該方法の遺伝子改変は、操作される提供細胞において、一つの低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させ、それにより当該低頻度切断エンドヌクレアーゼが、ＣＤ７０遺伝子において特異的に切断を触媒し、ＣＤ７０遺伝子を破壊または不活化することを含む。一部の実施形態では、細胞を操作する方法は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む：例えば細胞培養物由来または血液サンプル由来のＴ細胞を提供する工程、当該Ｔ細胞に、ＣＤ７０をコードする遺伝子を、ＤＮＡ切断（一部の実施形態では、二本鎖切断）により選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼを導入する工程、および当該細胞を拡張させる工程。
【０２６７】
一部の実施形態では、当該方法は、以下を含む：例えば細胞培養物由来または血液サンプル由来のＴ細胞を提供する工程、当該Ｔ細胞に、ＣＤ７０をコードする遺伝子を、ＤＮＡ切断（一部の実施形態では、二本鎖切断）により選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸をトランスフェクトし、当該Ｔ細胞内で当該低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させる工程、および当該細胞を拡張させる工程。
【０２６８】
一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であってもよい。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼであり、ガイドＲＮＡは、標的部位に対して少なくとも部分的に相補的または完全に相補的である。
【０２６９】
さらに本明細書において、免疫療法に適したＴ細胞を操作する方法が提供され、この場合において当該方法は、少なくとも免疫チェックポイントタンパク質を破壊または不活化することによりＴ細胞を遺伝子改変することを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質は、例えばＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ−４である。一部の実施形態では、細胞を遺伝子改変する方法は、少なくとも一つの免疫チェックポイントタンパク質を破壊または不活化することによりＴ細胞を改変すること、および当該細胞を拡張させること、を含む。免疫チェックポイントタンパク質としては限定されないが、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １（ＰＤ−１、ＰＤＣＤ１またはＣＤ２７９としても知られる、アクセッション番号：ＮＭ−００５０１８）、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４１４１２０．１）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３としても知られる、アクセッション番号：ＮＭ−００２２８６．５）、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＪＸ０４９９７９．１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても知られる、アクセッション番号：ＮＭ−１８１７８０．３）、ＢＹ５５（ＣＤ１６０としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＲ５４１８８８．１）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＴＭ３としても知られる、アクセッション番号：ＮＭ−１７３７９９）、Ｂ７Ｈ５（Ｃ１０ｏｒｆ５４、ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｖｉｓｔａ  ｇｅｎｅとしても知られる、アクセッション番号：ＮＭ−０２２１５３．１）、ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５としても知られる、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＣＲ５４２０５１．１）、ＳＩＧＬＥＣ１０（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号：ＡＹ３５８３３７．１）、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても知られる、アクセッション番号：ＮＭ−００１１６６６６４．１）が挙げられ、直接的に免疫細胞を阻害する。例えばＣＴＬＡ−４は、特定のＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞上に発現される細胞表面タンパク質であり、抗原提示細胞上のそのリガンド（Ｂ７−１およびＢ７−２）と会合したとき、Ｔ細胞の活性化とエフェクター機能が阻害される。
【０２７０】
一部の実施形態では、細胞を操作する当該方法は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む：例えば細胞培養物由来または血液サンプル由来のＴ細胞を提供する工程、当該Ｔ細胞に、免疫チェックポイントタンパク質をコードする一つの遺伝子を、ＤＮＡ切断（一部の実施形態では、二本鎖切断）により選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼを導入する工程、および当該細胞を拡張させる工程。一部の実施形態では、当該方法は、以下を含む：例えば細胞培養物由来または血液サンプル由来のＴ細胞を提供する工程、当該Ｔ細胞に、免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子を、ＤＮＡ切断（一部の実施形態では、二本鎖切断）により選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸をトランスフェクトする工程、当該Ｔ細胞内で当該低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させる工程、および当該細胞を拡張させる工程。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、以下からなる群から選択される遺伝子を特異的に標的とする：ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼであってもよい。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、ガイドＲＮＡは、標的部位に対して少なくとも部分的に相補的または完全に相補的である。
【０２７１】
一部の実施形態では、本開示は、同種免疫療法に特に適している可能性がある。そうした実施形態において、細胞は、以下を含む方法により改変されてもよい：Ｔ細胞中のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素をコードする少なくとも一つの遺伝子を破壊または不活性化すること、および当該Ｔ細胞を拡張させること。一部の実施形態では、当該方法の遺伝子改変は、操作される提供細胞において、一つの低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させ、それにより当該低頻度切断エンドヌクレアーゼが、一つの標的遺伝子において特異的に切断を触媒し、当該標的遺伝子を破壊または不活化することに依存する。一部の実施形態では、細胞を操作する当該方法は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む：例えば細胞培養物由来または血液サンプル由来のＴ細胞を提供する工程、当該Ｔ細胞に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素をコードする少なくとも一つの遺伝子を、ＤＮＡ切断（一部の実施形態では、二本鎖切断）により選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼを導入する工程、および当該細胞を拡張させる工程。
【０２７２】
一部の実施形態では、当該方法は、以下を含む：例えば細胞培養物由来または血液サンプル由来のＴ細胞を提供する工程、当該Ｔ細胞に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素をコードする少なくとも一つの遺伝子を、ＤＮＡ切断（一部の実施形態では、二本鎖切断）により選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸をトランスフェクトする工程、当該Ｔ細胞内で当該低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させる工程、自身の細胞表面上にＴＣＲを発現しない形質転換Ｔ細胞をソーティングする工程、およびおよび当該細胞を拡張させる工程。
【０２７３】
一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥ−ヌクレアーゼであってもよい。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。一部の実施形態では、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、ＴＣＲαまたはＴＣＲβをコードする配列を認識し、切断する。一部の実施形態では、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、配列番号２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０に示されるアミノ酸配列から選択されるポリペプチド配列を含有する。
ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼのポリペプチド配列：
リピート  ＴＲＡＣ＿Ｔ０１−Ｌ
LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号281)。
リピート  ＴＲＡＣ＿Ｔ０１−Ｒ
LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号282)。
リピート  ＴＲＢＣ＿Ｔ０１−Ｌ
LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号283)。
リピート  ＴＲＢＣ＿Ｔ０１−Ｒ
NPQRSTVWYLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号284)。
リピート  ＴＲＢＣ＿Ｔ０２−Ｌ
LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号285)。
リピート  ＴＲＢＣ＿Ｔ０２−Ｒ
LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号286)。
リピート  ＣＤ５２＿Ｔ０２−Ｌ
LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号287)。
リピート  ＣＤ５２＿Ｔ０２−Ｒ
LTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号288)。
リピート  ＣＤ７０−Ｌ
LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号289)
リピート  ＣＤ７０−Ｒ
LTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (配列番号290)
【０２７４】
別の態様では、細胞を遺伝子改変する別の工程は、ＴＣＲα欠損Ｔ細胞を拡張させる方法であってもよく、当該方法は、Ｔ細胞にｐＴα（ｐｒｅＴＣＲαとしても知られる）またはその機能性バリアントを導入すること、および任意でＣＤ３複合体の刺激を介して当該細胞を拡張させることを含む。一部の実施形態では、当該方法は、ａ）細胞に、少なくともｐＴαの断片をコードする核酸をトランスフェクトし、ＣＤ３の表面発現をサポートすること、ｂ）当該細胞内で当該ｐＴαを発現させること、およびｃ）任意でＣＤ３複合体の刺激を介して当該細胞を拡張させること、を含む。
【０２７５】
Ｔ細胞の拡張を行うための当該方法の工程を含む、免疫療法用のＴ細胞を調整する方法も提供される。一部の実施形態では、ｐＴαポリヌクレオチド配列は、無作為に、または相同組み換えにより導入され得る。一部の実施形態では、挿入は、ＴＣＲα遺伝子の不活化と関連し得る。
【０２７６】
ｐＴαの異なる機能性バリアントを使用してもよい。ペプチドの「機能性バリアント」とは、ペプチド全体またはその断片のいずれかと実質的に類似した分子を指す。ｐＴαまたはその機能性バリアントの「断片」とは、任意の分子サブセット、すなわち全長ｐＴαよりも短いペプチドを指す。一部の実施形態では、ｐＴαまたは機能性バリアントは、例えば全長ｐＴαまたはＣ末端切断型ｐＴαであってもよい。Ｃ末端切断ｐＴαは、Ｃ末端の一つまたは複数の残基を欠く。非限定的な例として、Ｃ末端切断型ｐＴαは、タンパク質のＣ末端から１８、４８、６２、７８、９２、１１０または１１４残基を欠く。ペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ペプチドをコードするＤＮＡ中の変異により調製されてもよい。そのような機能性バリアントは、アミノ酸配列内の残基の例えば欠失または挿入または置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行い、最終構築物を得てもよいが、ただし当該最終構築物は、所望の活性、特に機能性ＣＤ３複合体の回復を保有しているものとする。一部の実施形態では、上述のように異なるｐＴα型に、二量体化に影響を及ぼす少なくとも一つの変異が導入される。非限定的な例として、変異残基は、ヒトｐＴαタンパク質の、またはｐＴαファミリーもしくはホモログメンバーにＣＬＵＳＴＡＬＷ法を使用して整列された位置の少なくともＷ４６Ｒ、Ｄ２２Ａ、Ｋ２４Ａ、Ｒ１０２ＡまたはＲ１１７Ａであってもよい。一部の実施形態では、上述のｐＴαまたはそのバリアントは、変異残基Ｗ４６Ｒ、または変異残基Ｄ２２Ａ、Ｋ２４Ａ、Ｒ１０２ＡおよびＲ１１７Ａを含有する。一部の実施形態では、当該ｐＴαまたはバリアントは、非限定的な例としてＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＣＤ８などのシグナル伝達ドメインにも融合される。上述のｐＴαまたはバリアントの細胞外ドメインは、ＴＣＲαタンパク質の断片、特にＴＣＲαの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合されてもよい。ｐＴαバリアントは、ＴＣＲαの細胞内ドメインに融合されてもよい。
【０２７７】
一部の実施形態では、ｐＴα型は、細胞外リガンド−結合ドメインに融合されてもよい。一部の実施形態では、ｐＴαまたはその機能性バリアントは、柔軟なリンカーにより結合された、標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変断片を含有する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）に融合される。
【０２７８】
「ＴＣＲα欠損Ｔ細胞」という用語は、機能性ＴＣＲα鎖の発現を欠く単離Ｔ細胞を指す。そうした細胞は、非限定的な例として、Ｔ細胞が自身の細胞表面上に機能性ＴＣＲαを全く発現しないようにＴ細胞を操作することにより、Ｔ細胞が自身の細胞表面上にほとんど機能性ＴＣＲαを産生しないようにＴ細胞を操作することにより、またはＴ細胞がＴＣＲα鎖の変異型もしくは切断型を発現するように操作することにより、実現されてもよい。ＴＣＲα欠損細胞は、もはやＣＤ３複合体を通しても拡張され得ない。ゆえにこの問題を克服し、ＴＣＲα欠損細胞を増幅させるために、ｐＴαまたはその機能性バリアントが当該細胞内に導入され、機能性ＣＤ３複合体が回復される。一部の実施形態では、当該方法は、当該Ｔ細胞に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一つの構成要素をコードする一つの遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼを導入することを含む。一部の実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼである。
【０２７９】
別の態様では、本明細書に記載される方法によって取得される操作されたＴ細胞は、二特異性抗体と接触してもよい。例えばＴ細胞は、患者への投与前に生体外で二特異性抗体と接触してもよく、または患者への投与後にインビボで二特異性抗体と接触してもよい。二特異性抗体は、異なる抗原特性を有する二つの可変領域を含有し、それにより当該操作された細胞と標的抗原の近接が促進される。非限定的な例として、二特異性抗体は、腫瘍マーカーと、例えば限定されないがＣＤ３などのリンパ球抗原に対して指向してもよく、および任意の循環Ｔ細胞を、腫瘍に対し再指向化させ、活性化する能力を有してもよい。
【０２８０】
一部の実施形態では、本開示によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーション法により直接細胞内に導入されるｍＲＮＡであってもよい。一部の実施形態では、ｃｙｔｏＰｕｌｓｅ法を使用して生細胞を一過性に透過させ、当該細胞内に物質を送達してもよい。パラメータを改変し、最小の失敗率で高いトランスフェクト効率が得られる条件を決定してもよい。
【０２８１】
Ｔ細胞のトランスフェクション法も本明細書に提供される。一部の実施形態では、当該方法は、以下を含む：Ｔ細胞とＲＮＡを接触させ、Ｔ細胞に以下からなるアジャイルパルスシーケンスを適用すること：（ａ）１センチメートル当たり約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲の電気パルス、（ｂ）０．１ミリ秒のパルス幅、（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）の電気パルスの間に約０．２〜１０ミリ秒のパルス間隔、（ｄ）約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲、約１００ミリ秒のパルス幅の電気パルス、および工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の最初の電気パルスの間に約１００ミリ秒のパルス間隔、ならびに（ｅ）約０．２ミリ秒のパルス幅、約３２５Ｖの電圧の４回の電気パルスと、４回の電気パルスのそれぞれの間に２ミリ秒のパルス間隔。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞とＲＮＡを接触させ、Ｔ細胞に以下からなるアジャイルパルスシーケンスを適用することを含む、Ｔ細胞をトランスフェクトさせる方法：（ａ）１センチメートル当たり約２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、または３０００Ｖの電圧の電気パルス、（ｂ）０．１ミリ秒のパルス幅、（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）の電気パルスの間に約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ミリ秒のパルス間隔、（ｄ）２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００Ｖの約２２５０Ｖからの電圧範囲、１００ミリ秒のパルス幅の１回の電気パルス、および工程（ｂ）の電気パルスと工程（ｃ）の最初の電気パルスの間に１００ミリ秒のパルス間隔、ならびに（ｅ）約０．２ミリ秒のパルス幅、約３２５Ｖの電圧の４回の電気パルスと、４回の電気パルスのそれぞれの間に約２ミリ秒のパルス間隔。上述の値の範囲に含まれる値はすべて本出願に開示されている。エレクトロポレーション媒体は、当分野に公知の任意の適切な媒体、例えばＢＴＸ社から入手可能なＢＴＸｐｒｅｓｓ  Ｃｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標）Ｍｅｄｉａ  Ｔ４などであってもよい。一部の実施形態では、エレクトロポレーション媒体は、約０．０１〜約１．０ミリジーメンスに及ぶ範囲の伝導度を有する。
【０２８２】
一部の実施形態では、非限定的な例として、ＲＮＡは、低頻度切断エンドヌクレアーゼの１単量体、例えば半−ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ、ＣＡＲ、多鎖キメラ抗原受容体の少なくとも一つの構成要素、ｐＴαもしくはその機能性バリアント、外因性核酸、および／または追加の触媒ドメインをコードする。
【０２８３】
操作された免疫細胞
本開示はさらに、本明細書に記載されるＣＡＲポリヌクレオチドのいずれかを含む操作された免疫細胞も提供する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞内に導入され得る。一部の実施形態では、プラスミドベクターは例えば、ベクターを受領した細胞の特定および／または選択をもたらす選択マーカーも含有し得る。
【０２８４】
ＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内への導入後に、当該細胞においてｉｎ  ｓｉｔｕで合成されてもよい。あるいはＣＡＲポリペプチドは、細胞の外で産生され、その後に細胞内に導入されてもよい。ポリヌクレオチド構築物を細胞に導入する方法は、当分野で公知である。一部の実施形態では、安定的形質転換法を使用して、細胞ゲノム内にポリヌクレオチド構築物が統合され得る。他の実施形態では、一過性形質転換法を使用して当該ポリヌクレオチド構築物が発現されてもよく、当該ポリヌクレオチド構築物は細胞ゲノム内に統合されない。他の実施形態では、ウイルス媒介法が使用され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、組み換えウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどの任意の適切な手段により細胞内に導入されてもよい。一過性形質転換法としては例えば限定されないがマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法または粒子衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）法が挙げられる。ポリヌクレオチドは、例えばプラスミドベクターまたはウイルスベクターなどのベクター中に含まれてもよい。
【０２８５】
本明細書において、本明細書に提供される上述の細胞操作方法によって取得された単離細胞および細胞株も提供される。一部の実施形態では、単離細胞は、上述のＣＡＲを少なくとも一つ含有する。一部の実施形態では、単離細胞は、ＣＡＲ群を含有し、各ＣＡＲは、異なる細胞外リガンド−結合ドメインを含有する。
【０２８６】
また本明細書において、上述の方法のいずれか一つに従って取得された単離免疫細胞が提供される。異種ＤＮＡを発現する能力を有する任意の免疫細胞を、対象のＣＡＲの発現を目的として使用することができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、例えば限定されないが、幹細胞から誘導され得る。幹細胞は、成人幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、分化全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。単離細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞でもあり得る。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群から誘導され得る。
【０２８７】
一部の実施形態では、自身の細胞表面膜で本開示のＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞は、幹細胞メモリー細胞およびセントラルメモリー細胞の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％超の割合を構成する。一部の実施形態では、自身の細胞表面膜で本開示のＣＤ７０特異的ＣＡＲ発現する操作された免疫細胞は、幹細胞メモリー細胞およびセントラルメモリー細胞の約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約１５％〜約５０％、約１５％〜約４０％、約２０％〜約６０％、または約２０％〜約７０％の割合を構成する。
【０２８８】
一部の実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか一つを発現する炎症性Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか一つを発現する細胞傷害性Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか一つを発現する制御性Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれか一つを発現するヘルパーＴリンパ球である。
【０２８９】
拡張および遺伝子改変の前に、様々な非限定的方法を介して対象から細胞源を取得し得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む多くの非限定的な源から取得され得る。一部の実施形態では、任意の数のＴ細胞株が当業者に利用可能および公知であり、使用してもよい。一部の実施形態では、細胞は、健常なドナーから、癌と診断された患者から、または感染症と診断された患者から誘導され得る。一部の実施形態では、細胞は、異なる表現型を呈する混合細胞集団の一部であり得る。
【０２９０】
また本明細書において、上述の方法のいずれか一つに従って形質転換されたＴ細胞から取得された細胞株も提供される。また本明細書において、免疫抑制性治療に対し抵抗性のある改変細胞も提供される。一部の実施形態では、本開示による単離細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含有する。
【０２９１】
本開示の免疫細胞は、Ｔ細胞の遺伝子改変の前、または後のいずれかに、例えば限定されないが米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開２００６０１２１００５に概説される方法を使用して活性化および拡張され得る。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで拡張され得る。概して、本開示のＴ細胞は、例えばＴ細胞表面上のＣＤ３  ＴＣＲ複合体および共刺激性分子を刺激する剤と接触させ、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを生じさせることにより拡張され得る。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸塩（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）といったマイトージェンレクチンなどの化学物質を使用して、Ｔ細胞に対する活性化シグナルを生じさせ得る。
【０２９２】
一部の実施形態では、Ｔ細胞群は、例えば抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定された抗ＣＤ２抗体と接触させることにより、またはカルシウムイオノフォアと併せてプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えばブリオスタチン）と接触させることにより、インビトロで刺激されてもよい。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激に関しては、当該アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えばＴ細胞群は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触され得る。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、ビーズまたはプレートまたはその他の基盤上に配置され得る。Ｔ細胞培養に適した条件は、血清（例えばウシ胎児血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＧＦｐおよびＴＮＦ、または当業者に公知の細胞増殖用の任意の他の添加物をはじめとする、増殖と活性に必要な因子を含有し得る、適切な培地（例えばＭｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＭｅｄｉａまたはＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０またはＸ−ｖｉｖｏ  ５（Ｌｏｎｚａ社））が含まれる。細胞増殖用の他の添加剤としては限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、および例えばＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられる。培地としては、ＲＰＭＩ  １６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ、それらにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミン類が添加され、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）もしくは所定のホルモンの組み合わせ、および／またはＴ細胞の増殖と拡張に充分な量のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５）が補充される。例えばペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養でのみ含有され、対象への注入用の細胞培養には含有されない。標的細胞は、例えば適切な温度（例えば３７℃）および大気（例えば空気に５％ＣＯ２を加える）など、増殖をサポートするために必要な条件下で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特性を呈する場合がある。
【０２９３】
一部の実施形態では、本開示の細胞は、組織または細胞との共培養により拡張され得る。また細胞は、例えば対象への細胞の投与後の当該対象の血液中でインビボでも拡張され得る。
【０２９４】
一部の実施形態では、本開示による単離細胞は、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＧＲ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ１０、２Ｂ４、ＨＬＡ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβからなる群から選択される、一つの破壊または不活化された遺伝子を含み、ならびに／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲ、および／もしくはｐＴα導入遺伝子を発現する。一部の実施形態では、単離細胞は、多鎖ＣＡＲを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本開示による単離細胞は、以下からなる群から選択される、二つの破壊または不活化された遺伝子を含み：ＣＤ５２およびＧＲ、ＣＤ５２およびＴＣＲα、ＣＤＲ５２およびＴＣＲβ、ＣＤ７０およびＣＤ５２、ＣＤ７０およびＴＣＲα、ＣＤ７０およびＴＣＲβ、ＧＲおよびＴＣＲα、ＧＲおよびＴＣＲβ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ、ＰＤ−１およびＴＣＲα、ＰＤ−１およびＴＣＲβ、ＣＴＬＡ−４およびＴＣＲα、ＣＴＬＡ−４およびＴＣＲβ、ＬＡＧ３およびＴＣＲα、ＬＡＧ３およびＴＣＲβ、Ｔｉｍ３およびＴＣＲα、Ｔｉｍ３およびＴＣＲβ、ＢＴＬＡおよびＴＣＲα、ＢＴＬＡおよびＴＣＲβ、ＢＹ５５およびＴＣＲα、ＢＹ５５およびＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲα、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲα、ＬＡＩＲ１およびＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０およびＴＣＲβ、２Ｂ４およびＴＣＲα、２Ｂ４およびＴＣＲβ、ならびに／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲ、およびｐＴα導入遺伝子を発現する。
【０２９５】
一部の実施形態では、本開示による単離細胞は、ＣＤ５２、ＣＤ７０およびＴＣＲα、またはＣＤ５２、ＣＤ７０およびＴＣＲβから選択される、三つの破壊または不活化された遺伝子を含み、ならびに／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲおよびｐＴα導入遺伝子を発現する。
【０２９６】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、本開示による細胞では、ＴＣＲα遺伝子および／もしくはＴＣＲβ遺伝子の破壊または不活化により、機能性のある状態とはならない。一部の実施形態では、個体から誘導された改変細胞を取得する方法が提供され、この場合において当該細胞は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）シグナル伝達経路とは関係なく増殖することができる。ＭＨＣシグナル伝達経路とは関係なく増殖することができる改変細胞は、本方法による取得に影響を受け、本開示の範囲内に包含される。本明細書に開示される改変細胞は、その必要のある患者における、宿主体移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対する治療に使用することができる。したがって本開示の範囲において、その必要のある患者を宿主体移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して治療する方法は、破壊もしくは不活化されたＴＣＲα遺伝子および／またはＴＣＲβ遺伝子を含む改変細胞の有効量を当該患者に投与することにより、当該患者を治療することを含む。
【０２９７】
一部の実施形態では、免疫細胞は、一つまたは複数の化学療法剤に抵抗性となるように操作される。化学療法薬剤は、例えば、プリンヌクレオチドアナログ（ＰＮＡ）であってもよく、これにより、免疫細胞は、養子免疫療法と化学療法を組み合わせた癌治療に適するようになる。例示的なＰＮＡとしては例えば、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、およびシタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）の単独または併用が挙げられる。ＰＮＡは、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）により、一リン酸ＰＮＡ、二リン酸ＰＮＡ、および三リン酸ＰＮＡに代謝される。それらの三リン酸型は、ＤＮＡ合成に関してＡＴＰと競合し、アポトーシス促進剤として作用する。そしてトリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）の強力な阻害剤である。本明細書において、破壊または不活化されたｄＣＫ遺伝子を含むＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が提供される。一部の実施形態では、ｄＣＫノックアウト細胞は、ｄＣＫ遺伝子に対して指向化された特異的ＴＡＬ−ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを使用して、例えばｍＲＮＡのエレクトロポレーション法などによりＴ細胞にトランスフェクトすることにより作製される。ｄＣＫノックアウトＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えばクロロファラビン（ｃｌｏｒｏｆａｒａｂｉｎｅ）および／またはフルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）をはじめとするＰＮＡに対して抵抗性であり得、ＣＤ７０発現細胞に対するＴ細胞の細胞障害活性を維持している。
【０２９８】
一部の実施形態では、本開示の単離細胞または細胞株は、ｐＴαまたはその機能性バリアントを含有し得る。一部の実施形態では、単離細胞または細胞株は、ＴＣＲα遺伝子を破壊または不活化することによりさらに遺伝子改変され得る。
【０２９９】
モノクローナル抗体特異的エピトープ
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＤ７０特異的ＣＡＲのいずれか一つの細胞外ドメインは、モノクローナル抗体に特異的な（すなわち、モノクローナル抗体により特異的に認識される）エピトープを一つまたは複数含有してもよい。これらのエピトープは、本明細書においてｍＡｂ特異的エピトープとも呼称される。ｍＡｂ特異的エピトープの例は、国際特許出願公開ＷＯ２０１６／１２０１２６に開示されており、当該特許出願公開はその全体で本明細書に組み込まれる。これらの実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ７０に特異的に結合するＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチド、および一つまたは複数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合する一つまたは複数のエピトープを含有する。ｍＡｂ特異的エピトープを含有するＣＡＲは、一本鎖または多鎖であり得る。
【０３００】
本明細書に記載されるＣＡＲの細胞外ドメイン中にモノクローナル抗体に特異的なエピトープが含有されることで、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞のソーティングおよび枯渇が可能となる。一部の実施形態では、この特性により、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞の投与により枯渇された内因性のＣＤ７０発現細胞の回復も促進される。
【０３０１】
したがって一部の実施形態では、本開示は、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲを含む操作された免疫細胞をソーティングおよび／または枯渇させる方法、および例えば骨髄前駆細胞などの内因性のＣＤ７０発現細胞の回復を促進する方法に関する。
【０３０２】
特に非限定的な例として医療用途ですでに承認を受けている例えばＣＤ２０エピトープ／リツキシマブなどのいくつかのエピトープ−モノクローナル抗体の組み合わせを使用して、モノクローナル抗体特異的エピトープを含むＣＡＲを生成することができる。
【０３０３】
本開示はさらに、ｍＡｂ特異的エピトープを発現するＣＤ７０特異的ＣＡＲを含む操作された免疫細胞をソーティングする方法、およびこれらＣＡＲを含む操作された免疫細胞の活性化が、当該ＣＡＲの外部リガンド結合ドメインを標的とする抗体を使用して当該細胞を枯渇させることにより調節される治療方法も包含する。
【表Ａ】
2021511807.tif 000022
【０３０４】
一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、例えばＲＱＲ８などの自殺ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する。例えば、ＷＯ２０１３１５３３９１Ａを参照のこと。当該出願公開はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。当該ポリヌクレオチドを含有するＣＡＲ−Ｔ細胞において、自殺ポリペプチドはＣＡＲ−Ｔ細胞の表面で発現される。一部の実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号２９１に示されるアミノ酸配列を含有する。
CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (配列番号291)。
【０３０５】
自殺ポリペプチドはさらに、例えばＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＡ（配列番号６１１）など、アミノ末端にシグナルペプチドを含有してもよい。一部の実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号６１１のシグナル配列を含む、配列番号２９２に示されるアミノ酸配列を含有する。
MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (配列番号292)。
【０３０６】
一部の実施形態では、自殺ポリペプチドは、配列番号６１１に示されるアミノ酸配列を含有する。
【０３０７】
自殺ポリペプチドがＣＡＲ−Ｔ細胞の表面で発現される場合、当該ポリペプチドのＲエピトープへリツキシマブが結合することにより細胞の溶解が生じる。細胞表面で発現されるポリペプチド一つ当たり、複数分子のリツキシマブが結合する場合がある。ポリペプチドの各Ｒエピトープは、別個のリツキシマブ分子に結合する場合がある。例えばリツキシマブを患者に投与することによって、インビボでＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇が発生する場合がある。移送された細胞を枯渇させる決定は、患者において、当該移送された細胞が原因の望ましくない作用が検出されたとき、例えば受容できないレベルの毒性が検出されたときに行われる場合がある。
【０３０８】
一部の実施形態では、患者へ投与することで、その細胞表面に本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲのいずれか一つを発現する操作された免疫細胞は、当該患者の内因性ＣＤ７０発現細胞を殺傷または溶解し得る。一つの実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲのいずれか一つを発現する操作された免疫細胞による、ＣＤ７０を発現する内因性細胞、もしくはＣＤ７０を発現する細胞株の細胞の減少または溶解の割合は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、またはそれを超える。一つの実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲのいずれか一つを発現する操作された免疫細胞による、ＣＤ７０を発現する内因性細胞、もしくはＣＤ７０を発現する細胞株の細胞の減少または溶解の割合は、約５％〜約９５％、約１０％〜約９５％、約１０％〜約９０％、約１０％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約７０％、約２０％〜約６０％、約２０％〜約５０％、約２５％〜約７５％、または約２５％〜約６０％である。一つの実施形態では、内因性のＣＤ７０発現細胞は、内因性のＣＤ７０発現骨髄細胞である。
【０３０９】
一つの実施形態では、その細胞表面膜で本開示のＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞による、例えばＣＤ７０を発現する細胞株などの標的細胞の減少または溶解の割合は、本明細書に開示されるアッセイを使用して測定することができる。
【０３１０】
ＣＡＲ陽性免疫細胞をソーティングする方法
一つの態様では、免疫細胞群のインビトロソーティングの方法が提供され、この場合において当該免疫細胞群のサブセットは、本明細書に記載されるモノクローナル抗体に特異的なエピトープを含むＣＤ７０特異的ＣＡＲのいずれか一つを発現する操作された免疫細胞を含有する。当該方法は、免疫細胞群と、エピトープに特異的なモノクローナル抗体を接触させること、モノクローナル抗体に結合する免疫細胞を選択して、ＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞が富化された細胞群を取得することを含む。
【０３１１】
一部の実施形態では、当該エピトープに特異的な当該モノクローナル抗体は任意でフルオロフォアに結合される。本実施形態では、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択する工程は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により行うことができる。一部の実施形態では、当該エピトープに特異的な当該モノクローナル抗体は任意で磁気粒子に結合される。本実施形態では、モノクローナル抗体に結合する細胞を選択する工程は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）により行うことができる。
【０３１２】
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２９４または６０１〜６１０のうちの一つまたは複数のｍＡｂ特異的エピトープを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号６０９のｍＡｂ特異的エピトープを含有する。一部の実施形態ではＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２９５のｍＡｂ特異的エピトープを含有する。一部の実施形態ではＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号６０９のｍＡｂ特異的エピトープを含有し、免疫細胞群と接触させるために使用される抗体は、ＱＢＥＮＤ−１０である。一部の実施形態ではＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２９５のｍＡｂ特異的エピトープを含有し、免疫細胞群と接触させるために使用される抗体は、ＱＢＥＮＤ−１０である。
【０３１３】
一部の実施形態ではＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２９４のｍＡｂ特異的エピトープを含有する。一部の実施形態ではＣＡＲの細胞外結合ドメインは、配列番号２９４のｍＡｂ特異的エピトープを含有し、免疫細胞群と接触させるために使用される抗体は、リツキシマブである。
【０３１４】
一部の実施形態では、上述の免疫細胞のインビトロソーティング法を使用したときに取得されるＣＡＲ発現免疫細胞群は、ＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含有する。一部の実施形態では、上述のＣＡＲ発現免疫細胞のインビトロソーティング法を使用したときに取得されるＣＤ７０  ＣＡＲ発現免疫細胞群は、ＣＡＲ発現免疫細胞を少なくとも８５％含有する。
【０３１５】
本開示によると、レシピエントへ投与される細胞は、源となる群からインビトロで富化されてもよい。源となる群を拡張させる方法は当分野に公知であり、例えばＣＤ３４抗原などの抗原を発現する細胞を、当業者に公知の密度遠心分離法、免疫−磁気ビーズ精製、アフィニティクロマトグラフィーおよび蛍光活性化細胞ソーティングの組み合わせを使用して選択することを含んでもよい。
【０３１６】
フローサイトメトリー法は当分野で広く使用されており、当業者に公知の方法であり、そして細胞群内の特定の細胞型をソーティングおよび定量する。概してフローサイトメトリー法は、主に光学的手段によって細胞の構成要素または構造特性を定量する方法である。構造特性を定量することにより異なる細胞型を識別することができるため、フローサイトメトリー法および細胞ソーティング法を使用して、混合物中の異なる表現型の細胞を計数およびソーティングすることができる。
【０３１７】
フローサイトメトリー分析には、以下の二つの基礎的な工程が含まれる：１）選択された細胞型を、一つまたは複数の標識マーカーで標識する工程、および２）群中の細胞総数と比較した標識細胞の数を決定する工程。
【０３１８】
細胞型を標識する主な方法は、標識抗体を、特定の細胞型により発現されているマーカーに結合する方法である。抗体は、蛍光化合物で直接標識され、または例えば一次抗体を認識する蛍光標識された二次抗体を使用して間接的に標識される。
【０３１９】
一部の実施形態ではＣＡＲを発現する免疫細胞のソーティングに使用される方法は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）である。磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）は、超常磁性のナノ粒子とカラムを使用し、その表面抗原（ＣＤ分子）に応じて様々な細胞群を分離する方法である。いくつかのシンプルな工程で、純粋な細胞群が得られる。単一細胞懸濁液中の細胞は、マイクロビーズで磁気的に標識される。サンプルは、強磁性球から構成されるカラムに通される。カラムは細胞親和的なコーティングで覆われており、迅速で穏やかな細胞の分離が可能である。標識されていない細胞は通過し、一方で磁気標識された細胞はカラム内に留まる。流出液を非標識細胞分画として集めることもできる。短い洗浄工程の後、分離器からカラムが取り除かれ、磁気標識された細胞はカラムから溶出される。
【０３２０】
一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する免疫細胞をソーティングする方法で使用されるｍＡｂは、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、イブリツモマブチウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、ムロモナブ−ＣＤ３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）セルトリズマブペゴール（ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、ダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、エクリズマブ（ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、パリビズマブ（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＱＢＥＮＤ−１０、および／またはウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）から選択される。一部の実施形態では、当該ｍＡｂは、リツキシマブである。別の実施形態では、当該ｍＡｂは、ＱＢＥＮＤ−１０である。
【０３２１】
一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖ内に選択エピトープを含有し、特定の抗体により認識される特異性を有する。例えば、ＷＯ２０１６／１２０２１６を参照のこと。当該出願公開は、参照によりその全体が本明細書に援用される。そうしたエピトープによりＣＡＲ−Ｔ細胞のソーティングが促進され、および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇が促進される。エピトープは、当分野で公知の任意の数のエピトープから選択することができる。一部の実施形態では、エピトープは、例えば限定されないが、リツキシマブにより認識されるＣＤ２０エピトープなど、医療用途で承認を受けたモノクローナル抗体の標的であってもよい。一部の実施形態では、エピトープは、ＣＰＹＳＮＰＳＬＣ（配列番号２９３）のアミノ酸配列を含有する。
【０３２２】
一部の実施形態では、エピトープは、ＣＡＲ内に配置される。例えば限定されないが、エピトープは、ｓｃＦｖと、ＣＡＲのヒンジの間に配置され得る。一部の実施形態では、リンカーにより分離される２例の同一エピトープがＣＡＲで使用されてもよい。例えば、配列番号２９４または配列番号６０９または配列番号２９５に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドが、ＣＡＲ内で使用され、軽鎖可変領域とヒンジの間に配置され得る。
GSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGS (配列番号294)
ELPTQGTFSNVSTNVS (配列番号609)
ELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTA (配列番号295)
【０３２３】
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、以下の配列を含有する。
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−；
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−；
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２；
エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ−；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ２；または
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ；
式中、
Ｖ１はＶＬであり、Ｖ２はＶＨであり、またはＶ１はＶＨであり、Ｖ２はＶＬである；
Ｌ１は、ＶＨ鎖をＶＬ鎖に結合させることに適したリンカーである；
Ｌは、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであり、細胞外結合ドメイン中のＬの各存在は、同じ細胞外結合ドメイン中の他のＬの存在と同一であっても異なってもよく、複数の実施形態では、ＳＧＧＧＧ（配列番号６１４）、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１５）またはＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１６）を含有するか、またはこれらであり、および
ｘは０または１または２であり、ｘの各存在はその他から独立して選択され、および
エピトープ１、エピトープ２、エピトープ３およびエピトープ４は、ｍＡｂ特異的エピトープであり、同一であっても異なってもよく、ＶＨは、重鎖可変断片であり、ＶＬは、軽鎖可変断片である。一部の実施形態では、エピトープ１、エピトープ２およびエピトープ４は、配列番号２９３のアミノ酸配列を有するｍＡｂ特異的エピトープであり、エピトープ３は、配列番号２９５のアミノ酸配列を有するｍＡｂ特異的エピトープである。
【０３２４】
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、以下の配列を含有する。
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−；
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−；
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２；
エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ−；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ；
Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ；
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ２；または
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ；
式中、
Ｖ１はＶＬであり、Ｖ２はＶＨであり、またはＶ１はＶＨであり、Ｖ２はＶＬである；
Ｌ１は、ＶＨ鎖をＶＬ鎖に結合させることに適したリンカーである；
Ｌは、グリシン残基およびセリン残基を含むリンカーであり、細胞外結合ドメイン中のＬの各存在は、同じ細胞外結合ドメイン中の他のＬの存在と同一であっても異なってもよく、複数の実施形態では、ＳＧＧＧＧ（配列番号６１４）、ＧＧＧＧＳ（配列番号６１５）またはＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１６）を含有するか、またはこれらであり、および
ｘは０または１または２であり、ｘの各存在はその他から独立して選択され、および
エピトープ１、エピトープ２、エピトープ３およびエピトープ４は、ｍＡｂ特異的エピトープであり、同一であっても異なってもよく、ＶＨは、重鎖可変断片であり、ＶＬは、軽鎖可変断片である。一部の実施形態では、エピトープ１、エピトープ２およびエピトープ４は、配列番号２９３のアミノ酸配列を有するｍＡｂ特異的エピトープであり、エピトープ３は、配列番号６０９のアミノ酸配列を有するｍＡｂ特異的エピトープである。
【０３２５】
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、以下の配列を含有する。
Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−；または
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ−であって、式中、Ｖ１、Ｖ２、Ｌ１、Ｌ、ｘならびにエピトープ１、エピトープ２、エピトープ３およびエピトープ４は、上記に規定されるとおりである。
【０３２６】
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、以下の配列を含有する。
（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘ−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４−（Ｌ）ｘ−であって、式中、Ｖ１、Ｖ２、Ｌ１、Ｌ、ｘは、上記に規定されるとおりであり、式中、（Ｌ）ｘ−エピトープ１−（Ｌ）ｘは、ＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６１７）であり、
（Ｌ）ｘ−エピトープ２−（Ｌ）ｘ−エピトープ３−（Ｌ）ｘ−エピトープ４は、ＧＳＧＧＧＧＳＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳＧＧＧＧＳＥＬＰＴＱＧＴＦＳＮＶＳＴＮＶＳＰＡＫＰＴＴＴＡＣＰＹＳＮＰＳＬＣ（配列番号６１８）であり、ならびに
Ｖ１、Ｖ２、Ｌ１、Ｌ、ｘは、上記に規定されるとおりである。
【０３２７】
一部の実施形態では、エピトープ特異的抗体は、細胞傷害剤と結合されてもよい。さらに、補体系の構成要素を移植された、操作された抗体を使用することによりＣＤＣ細胞傷害を促進することも可能である。一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化は、エピトープを認識する抗体を使用して細胞を枯渇させることにより調節されることができる。
【０３２８】
治療応用
上述の方法により取得された単離細胞、またはそうした単離細胞から誘導された細胞株を、医薬品として使用することができる。一部の実施形態では、かかる医薬品は、癌の治療に使用され得る。一部の実施形態では、癌は、腎細胞癌、グリア芽腫、例えば低グレードグリオーマなどのグリオーマ、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病（ＨＤ）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型リンパ腫、濾胞性リンパ腫、または非小細胞肺癌である。
【０３２９】
一部の実施形態では、癌は、例えばリンパ腫または白血病などの造血系が起源の癌である。一部の実施形態では、癌は、多発性骨髄腫、悪性形質細胞新生物、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーラー病および骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞型リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（下肢型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、炎症関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病で発生する大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫とバーキットリンパ腫の中間の性質を伴う未分類型Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と古典的ホジキンリンパ腫の中間の性質を伴う未分類型Ｂ細胞リンパ腫、およびその他の造血細胞関連癌、例えばＡＬＬまたはＡＭＬからなる群から選択される。
【０３３０】
一部の実施形態では、本開示による単離細胞、または当該単離細胞から誘導された細胞株は、その必要のある患者における癌の治療用の医薬品の製造に使用することができる。
【０３３１】
患者の治療方法も本明細書に提供される。一部の実施形態では、方法は、本開示の免疫細胞をその必要のある患者に提供することを含む。一部の実施形態では、方法は、本開示の形質転換免疫細胞をその必要のある患者に投与する工程を含む。
【０３３２】
一部の実施形態では、本開示のＴ細胞は、安定的なインビボＴ細胞拡張を行うことができ、および長期間、持続することができる。
【０３３３】
本開示の治療方法は、改善、治癒または予防することができる。本開示方法は、自己免疫療法治療の一部、または同種免疫療法治療の一部のいずれであってもよい。本開示は特に、同種免疫療法に適している。ドナーのＴ細胞を、標準的なプロトコールを使用して非同種反応性細胞へと形質転換してもよく、必要に応じて再生成させ、それにより１人または複数人の患者に投与され得るＣＡＲ−Ｔ細胞が生成される。当該ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、「在庫のある（ｏｆｆ  ｔｈｅ  ｓｈｅｌｆ）」治療用生成物として利用可能となる。
【０３３４】
本開示方法とともに使用できる細胞は、上記の項において記載されている。治療は、例えば癌と診断された患者を治療するために使用することができる。治療され得る癌としては例えば限定されないが、上記に列記される癌のいずれかを含む、Ｂリンパ球を含む癌が挙げられる。本開示のＣＡＲおよびＣＡＲ−Ｔ細胞で治療される癌のタイプとしては限定されないが、特定の白血病またはリンパ性悪性疾患が挙げられる。成人の腫瘍／癌、および小児の腫瘍／癌も含まれる。一部の実施形態では、治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子治療、ホルモン療法、レーザ光治療および放射線療法の群から選択される、癌に対する一つまたは複数の治療と併用されることができる。
【０３３５】
一部の実施形態では、治療は、免疫抑制性の治療を受けている患者に投与され得る。実際に本開示方法は、一部の実施形態では、当該免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化によって、少なくとも一つの免疫抑制剤に対し抵抗性となった細胞または細胞群に依存する。この態様において、免疫抑制性の治療は、本開示による患者内のＴ細胞の選択および拡張を補助するものとする。本開示による細胞または細胞群の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、点滴、輸液、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎまたはｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）をはじめとする任意の簡便な方法で実行されてもよい。本明細書に記載される組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内もしくはリンパ管内の注射または点滴、または腹腔内に投与されてもよい。一部の実施形態では、本開示の細胞組成物は、静脈内の注射または点滴により投与される。
【０３３６】
一部の実施形態では、細胞または細胞群の投与は、例えば体重１ｋｇあたり約１０４〜約１０９個の細胞の投与を含んでもよく、当該範囲内にある細胞数のすべての整数値を含む。一部の実施形態では、細胞または細胞群の投与は、体重１ｋｇあたり約１０５〜約１０６個の細胞の投与を含んでもよく、当該範囲内にある細胞数のすべての整数値を含む。細胞または細胞群は、１回または複数回の投与で投与することができる。一部の実施形態では、当該細胞の有効量は、単回投与として投与することができる。一部の実施形態では、当該細胞の有効量は、ある期間にわたる複数回の投与として投与することができる。投与のタイミングは、担当医師の判断内にあり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞群は、例えば患者、血液バンク、またはドナーなどの任意の供給源から取得されてもよい。個々のニーズは変化する一方で、特定の疾患または状態に対する所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当業者の技術範囲内にある。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、もしあれば併用治療の種類、治療頻度、および望ましい効果の性質に依存する。一部の実施形態では、細胞の有効量または当該細胞を含む組成物の有効量は、非経口投与される。一部の実施形態では、投与は、静脈内投与であってもよい。一部の実施形態では、投与は、腫瘍内注射により直接行われてもよい。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）疾患を有する対象に対し、第一の用量の同種ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与することを含む。一部の実施形態では、第一の投与量は、約１×１０４細胞、約５×１０４細胞、約１×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞、約５×１０６細胞、約６×１０６細胞、約１×１０７細胞、約６×１０７細胞、約１×１０８、約１．８×１０８細胞、または約４．８×１０８細胞を含有する。いくつかの実施形態では、方法は、（ｂ）（ａ）における投与の開始後少なくとも約５週間、または約５週間超、および（ａ）における投与の開始後約２４週間未満の時点で、ＣＡＲ−Ｔ細胞の後続用量を対象に投与することをさらに含む。
【０３３８】
一部の実施形態では、再発性／難治性の疾患（例えば、再発性／難治性のＲＣＣ）を有する対象に、同種ＣＡＲ−Ｔ細胞の第一の用量および後続用量が投与され、各用量は６×１０６個の細胞を含有し、（ｂ）におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の後続用量は、（ａ）の投与開始から約９９日後に投与される。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、方法は、第一および複数の後続用量が、例えば、第一および後続用量に対して指定された投与量とタイミングスケジュールとに従って、投与されるように、追加的な後続用量、または後続用量を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、一つ以上の後続用量のうち第一の用量は、後続用量の投与開始から少なくとも５週間後、または５週間超後の時点で投与される。一部の実施形態では、第一、後続、さらに後続の用量の投与は、５週間以内、または約５週間以内に当該用量を少なくとも３回投与することを含む。いくつかの実施形態では、第一の用量の投与開始後約１６週で投与され、追加的な後続容量または後続用量は、第一の用量の投与開始後１７週目で投与される。いくつかの実施形態では、追加的な後続用量は、第一の用量の投与開始後の１７週目および／または第３４週で投与される。
【０３４０】
一部の態様では、後続用量を投与するときは、対象が免疫応答を呈さない、例えば、ＣＡＲ−Ｔの当該第一の（または以前の）投与に対して特異的で検出可能な適応宿主免疫応答を呈さない、その後のときである。
【０３４１】
一部の実施形態では、第一の用量（初回用量）の投与、例えば第一のまたは以前の用量の投与開始と、後続用量の投与開始（例えば、後続用量の投与開始）との間の時間は、約４週間超、例えば、約５、６、７、８、または９日超、例えば、約２０週間超、例えば、約９週間〜約３５週間の間、約１４週間〜約２８週間の間、１５週間〜２７週間の間、または１６週間〜約１８週間の間、および／または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７週間、あるいは約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７週間である。いくつかの実施形態では、後続用量の投与（例えば、その開始など）は、第一または以前の用量の投与（例えば、その開始など）後、約５週間超で約２４週間未満である。いくつかの実施形態では、後続用量の投与は、第一の用量の開始から１７週間後に開始される。いくつかの実施形態では、第一の用量と後続用量（例えば、その開始など）との投与の間隔、または以前の用量と次の後続用量との投与の間隔は、約５週間超、および約２４週間未満、例えば１０週間〜２４週間の間、例えば約１７週間などである。いくつかの実施形態では、第一の用量の投与と後続用量の投与（例えば、その開始など）との間の時間は、約１７週間である。
【０３４２】
本開示の一部の実施形態では、細胞は、限定されないが、例えばＭＳ患者に対するモノクローナル抗体療法、ＣＣＲ２アンタゴニスト（例えば、ＩＮＣ−８７６１）、抗ウイルス療法、シドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）およびインターロイキン２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても知られる）またはナタリジイマブ（ｎａｔａｌｉｚｉｉｍａｂ）治療、または乾癬患者に対するエファリズチマブ（ｅｆａｌｉｚｔｉｍａｂ）治療、またはＰＭＬ患者に対する他の治療をはじめとする、任意の数の関連治療モダリティと併用して（例えば、前に、同時に、または後に）、患者に投与される。一部の実施形態では、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、以下のうちの一つまたは複数と併用されて患者に投与される：抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはＰＦ−０６８０１５９１）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブまたはデュルバルマブ）、抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＰＦ−０４５１８６００）、抗４−１ＢＢ抗体（例えば、ＰＦ−０５０８２５６６）、抗ＭＣＳＦ抗体（例えば、ＰＤ−０３６０３２４）、抗ＧＩＴＲ抗体、および／または抗ＴＩＧＩＴ抗体。一部の実施形態では、配列番号３１９または３２７に示されるアミノ酸配列を含むＣＤ７０特異的ＣＡＲは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のアベルマブと併用されて患者に投与される。さらなる実施形態では、本開示のＴ細胞は、化学療法、放射線療法、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、すなわち例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法などの他の免疫消耗剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダリビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および／または放射線療法と併用して使用されてもよい。これらの薬剤は、カルシウム依存性のホスファターゼカルシニューリンを阻害し（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または増殖因子誘導型シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９９１；Ｌｉｕ，Ａｌｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９２；Ｂｉｅｒｅｒ，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。さらなる実施形態では、本開示のＴ細胞は、例えばミドスタウリン（Ｍｉｄｏｓｔａｕｒｉｎ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）およびアキシタニブ（ａｘｉｔａｎｉｂ）などの受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ）阻害剤、例えばラパマシン（Ｒａｐａｍａｃｙｎ）およびエベロリムス（Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）などのｍＴＯＲ阻害剤、例えばボルモスタット（Ｖｏｒｍｏｓｔａｔ）などのエピジェネティック調節剤、例えばボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）などのプロテアソーム阻害剤、例えばレナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）などの免疫調節剤、例えばエリスモデジブ（Ｅｒｉｓｍｏｄｅｇｉｂ）およびＰＦ−０４４４９９１３などのヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）阻害剤、または例えばＡＧ−１２０およびＡＧ−２２１などのイソクエン酸脱水素酵素（ＩＤＨ）阻害剤と併用されて使用されてもよい。さらなる実施形態では、本開示の細胞組成物は、骨髄移植、例えばフルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、外照射療法（ＸＲＴ：ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｂｅａｍ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、または例えばＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用したＴ細胞消耗治療（ａｂｌａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）と併用されて（例えば、前に、同時に、または後に）患者に投与される。一部の実施形態では、本開示の細胞組成物は、例えばリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）などのＣＤ２０と反応する剤などのＢ細胞消耗療法の後に投与される。例えば一部の実施形態では、対象は、高用量の化学療法を用いた標準的な治療を受け、その後に末梢血幹細胞移植を受けてもよい。特定の実施形態では、移植後、対象は本開示の拡張免疫細胞の点滴を受ける。一部の実施形態では、手術の前または後に拡張細胞が投与される。
【０３４３】
一部の実施形態では、ＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞を、当該細胞を投与された対象から枯渇させる方法が提供される。枯渇は、阻害または除去によるものであってもよい。
【０３４４】
一つの態様において、モノクローナル抗体に特異的なエピトープを含む、ＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞を枯渇させる方法は、当該操作された免疫細胞と、当該エピトープに特異的なモノクローナル抗体とを接触させることを含む。
【０３４５】
一部の実施形態において、モノクローナル抗体に特異的なエピトープを含む、ＣＤ７０特異的ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞を投与された対象から枯渇させる方法は、当該エピトープに特異的なモノクローナル抗体を当該対象に投与することを含む。これらの実施形態では、ＣＡＲの細胞外ドメインに存在するエピトープに特異的なモノクローナル抗体を対象に投与することで、対象から、操作されたＣＡＲ発現免疫細胞が除去され、またはその活性が阻害される。一つの態様では、操作されたＣＡＲ発現免疫細胞の枯渇は、ＣＤ７０発現細胞の内因性集団の回復を可能にする。
【０３４６】
一部の態様において、本開示は、モノクローナル抗体に特異的なエピトープを含む、ＣＤ７０特異的ＣＡＲを細胞表面に発現する操作された免疫細胞を投与された対象において、内因性ＣＤ７０発現細胞の回復を促進させる方法に関するものであり、当該方法は、当該エピトープに特異的なモノクローナル抗体を当該対象に投与することを含む。一部の実施形態では、内因性のＣＤ７０発現細胞は、内因性のＣＤ７０発現骨髄細胞である。一つの態様では、「回復」という用語は、内因性ＣＤ７０発現細胞の数の増加を指す。内因性ＣＤ７０発現細胞の数は、内因性ＣＤ７０発現細胞の増殖における増加によって、および／またはＣＡＲを発現する操作された免疫細胞による内因性ＣＤ７０発現細胞の除去における減少によって、増加してもよい。一部の実施形態では、対象へモノクローナル抗体を投与することによって、当該対象において、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞が枯渇し、例えば内因性ＣＤ７０発現骨髄前駆細胞などの内因性ＣＤ７０発現細胞の数が増加する。一つの実施形態では、対象へモノクローナル抗体を投与することによって、当該モノクローナル抗体の投与前の内因性ＣＤ７０発現発現細胞の数と比較して、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、内因性ＣＤ７０発現細胞の数が増加する。
【０３４７】
一つの態様では、対象におけるＣＤ７０介在性の状態を治療する方法が提供され、当該方法は、（ａ）当該対象に、一つまたは複数のモノクローナル抗体に特異的な一つまたは複数のエピトープを含む、ＣＤ７０特異的ＣＡＲを細胞表面に発現する操作された免疫細胞を投与すること、および（ｂ）その後、当該対象に、当該エピトープに特異的な一つまたは複数のモノクローナル抗体を投与することにより、当該対象から、当該操作された免疫細胞を枯渇させること、を含む。
【０３４８】
一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する操作された免疫細胞を枯渇させる方法において使用されるｍＡｂは、アレムツズマブ（ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、イブリツモマブチウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、ムロモナブ−ＣＤ３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、アブシキシマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）セルトリズマブペゴール（ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、ダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、エクリズマブ（ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、パリビズマブ（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ（ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、カナキヌマブ（ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、デノスマブ（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、ゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＱＢＥＮＤ−１０、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）およびそれらの組み合わせから選択される。
【０３４９】
一部の実施形態では、モノクローナル抗体に特異的な当該エピトープ（ｍＡｂ特異的エピトープ）は、例えば配列番号６０９、配列番号２９４または配列番号２９５などのＣＤ２０のエピトープまたはミモトープであり、エピトープに特異的なｍＡｂは、リツキシマブである。
【０３５０】
一部の実施形態では、対象にモノクローナル抗体を投与する工程は、当該対象に当該モノクローナル抗体を点滴する工程を含む。一部の実施形態では、対象に投与されるエピトープ特異的ｍＡｂの量は、当該対象においてＣＡＲ発現免疫細胞の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を除去するのに充分な量である。
【０３５１】
一部の実施形態では、対象にモノクローナル抗体を投与する工程は、当該対象に週に１回または数回、３７５ｍｇ／ｍ２のリツキシマブを点滴する工程を含む。
【０３５２】
一部の実施形態では、ｍＡｂ特異的エピトープを含むＣＡＲを発現する免疫細胞（ＣＡＲ発現免疫細胞）は、エピトープ特異的ｍＡｂを使用したＣＤＣアッセイにおいて枯渇され、活性のあるＣＡＲ発現免疫細胞の量は、例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、減少する。
【０３５３】
一部の実施形態では、細胞障害性薬剤がエピトープ特異的ｍＡｂに結合され、これを使用して、ＣＡＲ発現免疫細胞が枯渇される。モノクローナル抗体の標的化能力と、細胞傷害性薬剤の細胞殺傷能力を組み合わせることで、抗体−薬剤結合体（ＡＤＣ）は、当該薬剤を単独で使用した時と比較して、健康な組織と、罹患組織を高感度に識別することが可能となる。いくつかのＡＤＣが、販売承認を受けている；特にリンカーに関する作製方法は、以下の先行技術において豊富に存在する（Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２；Ｔｒａｉｌ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７；Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９７５，２７８）。
【０３５４】
一部の実施形態では、点滴されるエピトープ特異的ｍＡｂは、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を促進する能力を有する分子と前もって結合される。ゆえに補体系は、抗体が生物体から病原体を排除する能力を補助または補完する。いくつかの因子の内の一つにより刺激されたとき、細胞殺傷性の細胞膜傷害複合体の反応および活性化の大幅な増幅として、活性化カスケードが誘発される。例えばグリカンなどの異なる分子を使用して、ｍＡｂを結合させてもよい（Ｃｏｕｒｔｏｉｓ，Ａ，Ｇａｃ−Ｂｒｅｔｏｎ，Ｓ．，Ｂｅｒｔｈｏｕ，Ｃ，Ｇｕｅｚｅｎｎｅｃ，Ｊ．，Ｂｏｒｄｒｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｏｉｓｓｅｔ，Ｃ．（２０１２），Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｓ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｇｌｙｃａｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩＳＳＮ：０７１７−３４５８；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｊｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｉｎｆｏ  ＤＯＩ：１０．２２２５／ｖｏｌｌ５−ｉｓｓｕｅ５）。
【０３５５】
キット
本開示はさらに、本方法における使用のためのキットを提供する。本開示のキットは、本明細書に記載されるＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、またはＣＤ７０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む操作された免疫細胞、および本明細書に記載の開示方法のいずれかに従う使用に関する説明書を含む一つまたは複数の容器を含有する。概してこれらの説明書は、上述の治療的処置に関する操作された免疫細胞の投与に関する説明を含む。キットは、リンパ枯渇のための一つまたは複数の剤を含んでもよい（例えば、アレムツズマブ、シトキサン、フルダラビン、シクロホスファミド、またはテモゾロミド）。
【０３５６】
本明細書に記載の操作された免疫細胞の使用に関する説明書は概して、意図される処置に対する用量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。容器は、単位投与量、バルクパッケージ（例えば複数投与量のパッケージ）またはサブ単位投与量であってもよい。本開示のキット中に供給される説明書は多くの場合、ラベルまたは添付文書（例えばキットに含まれる紙シート）上の書面の説明書であるが、機械読み取り可能な説明書（例えば、磁気記憶ディスクまたは光学式記憶ディスク上で実行される説明書）も受容可能である。一部の実施形態では、容器は、（例えばラベルにより、バーコードにより、または無線周波数識別（ＲＦＩＤ：ｒａｄｉｏ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により）識別可能であり、追跡可能であり、または機械読み取り可能な容器の識別子が印刷されている。
【０３５７】
本開示のキットは適切な梱包材料中にある。適切な梱包材料としては限定されないが、バイアル、ボトル、瓶、柔軟性のある梱包材料（例えば、密閉Ｍｙｌａｒバッグまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。一部の実施形態では、容器（例えば、プラスチックバッグ）は、静脈内点滴に適している。さらに例えば吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザー）、または例えばミニポンプなどの輸液用器具などの特定のデバイスと組み合わせた使用のための梱包材料も予期される。キットは、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。容器も、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は、ＣＤ７０特異的ＣＡＲである。容器はさらに、第二の薬学的に活性な剤を含んでもよい。
【０３５８】
キットは任意で、例えば緩衝液および説明情報などの追加的な構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器と、当該容器上にある、もしくは当該容器と関連づけられたラベルまたは添付文書を含む。
【０３５９】
以下の実施例は、説明目的に対してのみ提供されており、本開示の範囲を限定する意図は全くない。実際に、本明細書に示される、および本明細書に記載されるものに加えて、本開示の様々な改変が前述の説明から当業者には明白であり、添付の請求の範囲内に含まれる。
【０３６０】
特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブタベスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定のもと、寄託が行われた。これにより、寄託日から３０年間、当該寄託物の生育可能な培養物の維持が確保される。寄託物はブダペスト条約の条項のもとＡＴＣＣにより利用可能であり、ファイザー社とＡＴＣＣの間に契約が締結される。これにより、適切な米国特許発行の際、または任意の米国特許出願もしくは外国特許出願の公衆への公開の際のいずれか早い方に、当該寄託物の培養物の子孫物の永続的で制限のない公衆の利用が確保される。そして米国特許法第１２２項および準じる長官規則（特に８８６  ＯＧ  ６３８に関する米国特許法施行規則１．１４を含む）に従い、米国特許庁長官により決定される、権利付与されるものに対する子孫物の利用が確保される。
【０３６１】
本出願の譲受人は、寄託に関する物質の培養物が適切な条件下で培養されたときに死亡した場合、失われた場合、または破壊された場合、通知により当該物質を速やかに同一の別のものと交換するものとする。寄託物質の利用は、任意の政府当局のもと、その特許法に従い与えられる権利に反して本開示を実施するライセンスとは解釈されないものとする。
【実施例】
【０３６２】
実施例１．ＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の作製
以下の表５に列記される以下のコドン最適化されたＣＤ７０  ＣＡＲ配列が合成され、ＸｍａＩ（５’）およびＭｌｕＩ（３’）の制限酵素部位を使用して以下のレンチウイルスベクターｐＬＶＸ−ＥＦ１ａ−ＴｕｒｂｏＧＦＰ−Ｐ２Ａ−ＣＤ７０  ＣＡＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）またはｐＣＬＳ−ＥＦ１ａ−ＢＦＰ−Ｐ２Ａ−ＣＤ７０  ＣＡＲ（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社）にサブクローニングされた（つまりＣＡＲはＰ２Ａ部位の後にクローニングされた）。
【表５】
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【０３６３】
１０Ａ１、１０Ｅ２、１１Ａ１、１１Ｃ１、１１Ｄ１、１１Ｅ１、１２Ａ２、１２Ｃ４、１２Ｃ５、１２Ｄ３、１２Ｄ６、１２Ｄ７、１２Ｆ５、１２Ｈ４、８Ｃ８、８Ｆ７、８Ｆ８、９Ｄ８、９Ｅ１０、９Ｅ５、９Ｆ４または９Ｆ８配列に基づくＳｃＦｖを含むＣＡＲも調製され、当該ＣＡＲは、配列番号５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００および６０１に示される配列を含む。
【０３６４】
実施例２：抗ＣＤ７０  ＣＡＲのインビトロ特徴解析のためのＪｕｒｋａｔスクリーニング
Ｊｕｒｋａｔ細胞は不死化ヒトＴ細胞株であり、初代Ｔ細胞に非常によく似ており、活性化または形質導入によりＣＤ７０を発現する。そこでこれらの細胞をＣＤ７０  ＣＡＲの形質導入に選択し、その活性化プロファイルが調べられた。ＣＤ７０をノックアウトするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して改変されたＪｕｒｋａｔ細胞（ＫＯ  Ｊｕｒｋａｔ）、または親Ｊｕｒｋａｔ（ＷＴ  Ｊｕｒｋａｔ）に、ＣＤ７０  ＣＡＲが形質導入された。その自己活性化プロファイルは、ＷＴ  Ｊｕｒｋａｔ上のＣＤ６９発現の割合（形質導入でＷＴ  Ｊｕｒｋａｔは標的、すなわちＣＤ７０を発現するため、自己活性化し、および標的依存性に活性化する）と、ＫＯ  Ｊｕｒｋａｔ上のＣＤ６９発現の割合（標的、すなわちＣＤ７０の非存在下での自己活性化のみ）を比較することにより決定された。次いで標的特異的活性化と、最小限の自己活性化を示したクローンが、「活性化比率」（当該用語の定義に関する以下を参照のこと）に基づき選択された。自己活性化は、標的依存性のクラスター化およびＣＡＲの活性化を記載するために使用される用語である。ＣＡＲの自己活性化は、最小／無しから、高までの範囲であり得、凝集およびクラスター形成するｓｃＦｖの固有の特性または傾向であると考えられている。自己活性化により慢性的なシグナル伝達が生じ、Ｔ細胞分化、消耗および細胞溶解性の低下がもたらされ得る。高度に自己活性化するＣＡＲのスクリーニングおよび排除は、最適なＣＡＲの識別において重要な工程である。理想的なＣＡＲは、最小限の自己活性化を有するＣＡＲである。
【０３６５】
組み換え抗原へのＣＡＲの結合は、ＣＡＲを特徴解析し、固有の群へと分類するための一つの方法である。強力な結合は、ＣＡＲが細胞表面上に高度に発現され、その標的抗原に対し中程度〜高いアフィニティを有することの指標であり得る。低い結合または最小限の結合は、低発現および／または弱いアフィニティを示し得る。最適なアフィニティおよび細胞表面発現は未知であるため、高い結合および低い結合を有するＣＡＲをさらに特徴解析するものとする。
材料および方法
Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ７０のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウト
【０３６６】
Ｊｕｒｋａｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して、ＤＮＡ２．０から取得されたＣａｓ９およびＧＦＰを含有するＣＤ７０標的化ガイドＲＮＡベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、蛍光活性化シングルセルソーティングを実施して、ＧＦＰ＋ＣＤ７０−細胞を選択した。次いで個々のクローンを拡張させ、粗細胞溶解物によるＰＣＲのためにゲノムＤＮＡを取得した。ＰＣＲ産物を配列解析して、ＣＤ７０ノックアウトを示すｉｎｄｅｌｓまたはフレームシフトを伴うクローンを特定した。
【０３６７】
ＣＤ７０  ＣＡＲを用いたＪｕｒｋａｔ細胞の形質導入
０日目に、６ウェルプレートの１ウェル当たり１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社またはＪＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）の２ｍＬにおいて、１ｍＬ当たり５０万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。１日目に、６ウェルプレートの１ウェル当たり２５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）において、レンチウイルスパッケージングベクター  １．５ｕｇ  ｐｓＰＡＸ２、０．５ｕｇ  ｐＭＤ２Ｇ、およびＧＦＰタグを含有する２ｕｇの適切なトランスファーＣＡＲベクターを混合することによりレンチウイルスを調製した（ＤＮＡミックス）。２５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて、１０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を室温で５分間インキュベートし、次いで当該ＤＮＡミックスに添加した。ウイルスを室温で２０分間インキュベートし、５００ｕＬの総量を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含有するウェルの側面にゆっくりと添加した。２日目に、６ウェルプレートの各ウェルからの培地を、１ウェル当たり２ｍＬのＪｕｒｋａｔ細胞培地、すなわち１０％  ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社）と入れ替えた。３日目に、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＫＯまたはＷＴ）を、６ウェルプレートの１ウェル当たり、１０％  ＦＢＳを補充した２ｍＬのＲＰＭＩ中、１ｍＬ当たり５０万個で再懸濁した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のレンチウイルスの上清を採取し、０．４５ミクロンのフィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通して細胞残渣を除去して、その後、Ｊｕｒｋａｔ細胞に添加した。６日目に、フローサイトメトリーを介してＧＦＰシグナルを検出することにより、形質導入効率が決定された。１０％  ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩを使用して、必要に応じて細胞をさらに大きなフラスコ内で拡張させた。
【０３６８】
活性化プロファイルおよびＣＤ７０タンパク質に結合する能力
５日目に、形質導入細胞を、ＰＥ−Ｃｙ７が結合したヒト抗ＣＤ６９抗体で染色し、フローサイトメーター上で取得して、各ＣＡＲに対するＣＤ６９＋群の割合を得た。細胞を、組み換えビオチニル化ヒトＣＤ７０タンパク質とともにさらにインキュベートし、ＰＥ結合ストレプトアビジンで染色して、フローサイトメーター上で取得してタンパク質結合を決定した。活性化比率（ＷＴ活性化／ＫＯ活性化）およびタンパク質結合を使用して、ＣＡＲをランク付けした。
【表６】
2021511807.tif 000029
【０３６９】
ハイブリドーマＣＡＲの活性化比率およびタンパク質結合は、Ｊｕｒｋａｔスクリーニングで決定され、ＣＡＲのインビトロ特徴解析に使用された。ＣＤ７０  ＣＡＲ（ＫＯ）を形質導入されたＣＤ７０ノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞上でのＣＤ６９発現の割合に対する、ＣＤ７０  ＣＡＲ（ＷＴ）を形質導入されたＷＴ  Ｊｕｒｋａｔ細胞上でのＣＤ６９発現の割合の比率を算出することにより、活性化比率が決定された。活性化比率が高ければ、標的依存性の活性化であることを示唆する。タンパク質結合は、組み換えビオチニル化ｈＣＤ７０タンパク質への結合によって決定され、フローサイトメトリーを介してフィコエリトリン（ＰＥ）色素に結合したストレプトアビジンを使用して検出された。タンパク質結合の値は、ヒトＣＤ７０タンパク質に結合するＣＤ３＋ＣＡＲ  Ｔ細胞の割合を示している。
【表７】
2021511807.tif 000030
【０３７０】
表７：ファージＣＡＲの活性化比率およびタンパク質結合が、Ｊｕｒｋａｔスクリーニングにおいて決定された。活性化比率は、ＣＡＲのインビトロ特徴解析に使用された。ＣＤ７０  ＣＡＲ（ＫＯ）を形質導入されたＣＤ７０ノックアウトＪｕｒｋａｔ細胞上でのＣＤ６９発現の割合に対する、ＣＤ７０  ＣＡＲ（ＷＴ）を形質導入されたＷＴ  Ｊｕｒｋａｔ細胞上でのＣＤ６９発現の割合の比率を算出することにより、活性化比率が決定された。活性化比率が高ければ、標的依存性の活性化であることを示唆する。タンパク質結合は、組み換えビオチニル化ｈＣＤ７０タンパク質への結合によって決定され、フローサイトメトリーを介してフィコエリトリン（ＰＥ）色素に結合したストレプトアビジンを使用して検出された。タンパク質結合の値は、ヒトＣＤ７０タンパク質に結合するＣＤ３＋ＣＡＲ  Ｔ細胞の割合を示している。
【０３７１】
最小の自己活性化を示したＣＡＲ、すなわちＣＤ７０  ＫＯ  Ｊｕｒｋａｔにおいて形質導入されたときにＣＤ６９発現が最小であったＣＡＲを、標的の非存在下であっても高度に活性化され、消耗性が高いＣＡＲ表現型となり得るＣＡＲと比較して、より望ましいＣＡＲであるとみなした。同様に、より高いヒトＣＤ７０タンパク質結合を伴うＣＡＲは、表面上でのＣＡＲの適切な発現とフォールディングを示唆しているとして、より望ましいとみなされた。
【０３７２】
実施例３：ファージＣＡＲおよびハイブリドーマＣＡＲのインビトロ特徴解析のための初代Ｔ細胞のスクリーニング
初代ヒトＴ細胞に、ＣＤ７０  ＣＡＲを形質導入して、形質導入効率、培養中のＴ細胞上のＣＤ７０発現、およびＴ細胞サブセットを決定した。次いで形質導入されたＣＡＲ  Ｔ細胞を凍結し、機能性アッセイに使用した。
【０３７３】
ＣＡＲ構築物の形質導入効率は、異なるクローン間で大きく変化し得る。形質導入効率が高いと、ＣＡＲ  Ｔ細胞の数が増え、より効率的な製造プロセスがもたらされる。一方で、形質導入効率が低いＣＡＲは、大規模製造には適さない場合がある。形質導入効率が高いことは、一部の実施形態では、有益である。
【０３７４】
Ｔ細胞は、分化状態および抗原暴露の指標である、広範な表現型またはサブセットを有している。細胞表面のマーカーは、Ｔ細胞サブセットの識別に役立ち、ＣＤ６２Ｌマーカーは一般的に、ナイーブな幹細胞メモリーＴ細胞および中心メモリーＴ細胞上に存在する。これらの細胞は、例えばエフェクターメモリーＴ細胞およびエフェクターＴ細胞などの他のサブセットと比較して分化しておらず、そのため、ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の割合が高いＣＡＲ  Ｔ細胞群は、一部の実施形態では、有益である。
【０３７５】
ＣＤ７０の表面発現も、異なる形質導入ＣＡＲの間で変化し、一部のＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｔ細胞の活性化および形質導入によって２０〜４０％がＣＤ７０を発現し、その他のＴ細胞は発現しない。
【０３７６】
材料および方法
初代Ｔ細胞の単離
Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ勾配密度培地（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ社／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用し、スタンフォード大学から得たバフィーコートサンプルから精製された。ＰＢＭＣ層を回収し、市販のＴ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用してＴ細胞を精製した。
【０３７７】
ＣＤ７０  ＣＡＲを用いたＴ細胞の形質導入
０日目に、６ウェルプレートの１ウェル当たり１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社またはＪＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）の２ｍＬにおいて、１ｍＬ当たり５０万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。１日目に、６ウェルプレートの１ウェル当たり２５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）において、レンチウイルスパッケージングベクター  １．５ｕｇ  ｐｓＰＡＸ２、０．５ｕｇ  ｐＭＤ２Ｇ、およびＧＦＰタグを含有する２ｕｇの適切なトランスファーＣＡＲベクターを混合することによりレンチウイルスを調製した（ＤＮＡミックス）。２５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭにおいて、１０ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を室温で５分間インキュベートし、次いで当該ＤＮＡミックスに添加した。ウイルスを室温で２０分間インキュベートし、５００ｕＬの総量を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含有するウェルの側面にゆっくりと添加した。精製されたＴ細胞は、１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社またはＪＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、およびビーズと細胞の比率が１：２のヒトＴ活性化ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を補充されたＸ−Ｖｉｖｏ−１５  ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ社）中で活性化された。２日目に、６ウェルプレートの各ウェルからの培地を、１ウェル当たり２ｍＬのＴ細胞形質導入培地、すなわち１０％  ＦＢＳが補充されたＸ−Ｖｉｖｏ−１５と入れ替えた。３日目に、Ｔ細胞を、６ウェルプレートの１ウェル当たり２ｍＬのＴ細胞形質導入培地中、１ｍＬ当たり５０万個で再懸濁させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのレンチウイルスの上清を採取し、０．４５ミクロンのフィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を通し、細胞残渣を除去して、その後、１００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ−２とともにＴ細胞に添加した。６日目に、フローサイトメトリーを介してＧＦＰシグナルを検出することにより、形質導入効率が決定された。細胞は、必要に応じてより大きなフラスコ中で、またはＧ−Ｒｅｘ容器（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）中で、Ｔ細胞拡張培地、すなわち５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ社）を補充されたＸ−Ｖｉｖｏ−１５を使用して拡張された。
【０３７８】
ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ７０発現およびＴ細胞サブセット
活性化後１３日目に、形質導入されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＰＥが結合した抗ヒトＣＤ７０抗体およびＢＶ６０５が結合した抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体で染色し、フローサイトメーター上で取得して、各ＣＡＲに対するＣＤ７０＋およびＣＤ６２Ｌ＋群の割合を得た。次いで拡張されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するＦＢＳ中で凍結させ、その後に機能性アッセイにおいて使用した。
【表８】
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【０３７９】
表８：活性化後１３日目に、ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型を、ファージＣＡＲおよびハイブリドーマＣＡＲのインビトロ特徴解析に使用した。ＣＡＲ＋群は、ＣＤ３＋細胞をゲーティングすることにより決定された。ＣＤ７０発現群は、生きたＣＤ３＋細胞をゲーティングすることにより決定された。ＣＤ６２Ｌ発現群は、生きたＣＤ３＋  ＣＡＲ＋  ＣＤ８＋細胞をゲーティングすることにより決定された。
【０３８０】
検証されたＣＡＲ構築物は、様々なレベルの形質導入効率を示した。形質導入効率が低いクローンは、大規模製造にはあまり適さないために、有望性が低いとみなされた。ＣＡＲ  Ｔ細胞の産物も、異なる表現型（ＣＤ６２Ｌ発現により測定）を示し、表面上に様々なレベルのＣＤ７０発現を示した。概して、高レベルのＣＤ６２Ｌを発現したＣＡＲ  Ｔ細胞は、分化の程度が低い可能性があるとして、有望性が高いとみなされた。
【０３８１】
実施例４：ファージＣＡＲを用いたストレステスト
前述の実施例で記載されるようにファージライブラリーからの１２個の異なるｓｃＦｖからＣＡＲ  Ｔ細胞が作製され、凍結された。次いでこれらのＣＡＲ  Ｔ細胞を溶解させ、ＣＤ７０を発現することが知られているＲａｊｉ標的細胞と、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、１０％ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ中で混合した。その後、２日毎にＲａｊｉ細胞をＣＡＲ  Ｔ細胞に加え、その後、１：１のＥ：Ｔ比が維持された。標的細胞の溶解割合、およびエフェクターＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張倍数が、各時点で決定された。
【０３８２】
ストレステストはスクリーニングアッセイであり、ＣＡＲを増幅させ、特定の場合には分化させ、および枯渇させる標的へのＣＡＲ  Ｔ細胞の反復暴露が含まれる。ストレステストを使用して、標的細胞への数回の暴露ラウンド後に高い標的細胞溶解と増幅能力を有する最適クローンを選択した。
【０３８３】
材料および方法
０日目に、ファージライブラリーからの１２個の異なるｓｃＦｖから誘導されたＣＡＲ  Ｔ細胞を溶解させ、１：１のＥ：Ｔ比でＲａｊｉ細胞と混合させた。２日目に、アッセイからの２００ｕＬの細胞を、５０ｕＬの細胞カウントビーズ（ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と混合し、フローサイトメーター上で取得された。カウントビーズを使用して、各ＣＡＲ処置に対する、ＧＦＰ＋ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ３＋でゲーティングされた）およびＲａｊｉ細胞（ＣＤ３−でゲーティングされた）の総数が決定された。総ＣＡＲ  Ｔ細胞カウントに基づき、１：１のＥ：Ｔ比の維持に必要なＲａｊｉ細胞の数が算出され、アッセイの各ウェルに添加された。このプロセスは５日目および７日目に繰り返された。各ＣＡＲ処置に対する生Ｒａｊｉ細胞の割合を算出し、非形質導入対照に対して正規化することにより、標的細胞の溶解割合が各時点で算出された。０日目に播種されたＣＡＲ  Ｔ細胞の数に対する、ＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張倍数が各時点で算出された。
【０３８４】
最適なクローンは、７日目のアッセイの終了時に、最も高い標的細胞溶解と、最も優れた拡張倍数を有するクローンであり、例えばＰ０８Ｆ０８などであった。
【表９】
2021511807.tif 000032
【０３８５】
表９：ストレステストにおける標的細胞溶解とＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張倍数を、ファージＣＡＲのインビトロ特徴解析に使用した。活性化後１３日目でＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型を決定し、次いで１４日目に細胞を凍結させた。溶解させたＣＡＲ  Ｔ細胞と標的Ｒａｊｉ細胞を１：１のＥ：Ｔ比で使用してストレステストを実施した。標的細胞溶解は、ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養の２日、５日および７日後、ＣＤ３−標的細胞をゲーティングすることによりフローサイトメトリーを介して決定された。ＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張倍数は、細胞カウントビーズを使用し、アッセイの開始時に添加された細胞数と比較した２日目、５日目および７日目の細胞数を算出することにより決定された。太字で強調されたＣＡＲは、高い標的細胞溶解と拡張倍数を示すＣＡＲである。
【０３８６】
実施例５：第二のドナーから作製された最適ＣＡＲを用いたストレステストの反復
実施例３に記載される、ファージライブラリーからの４個のｓｃＦｖ（Ｐ０７Ｄ０３、Ｐ０８Ｆ０８、Ｐ０８Ｇ０２、Ｐ１５Ｄ０２）、およびハイブリドーマライブラリーからの２個のｓｃＦｖ（４Ｆ１１、１７Ｇ６）から、ＣＡＲ  Ｔ細胞が作製され、凍結された。次いでこれらのＣＡＲ  Ｔ細胞を溶解させ、ＣＤ７０を発現することが知られているＲａｊｉ標的細胞と、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、１０％ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ中で混合した。その後、２日毎にＲａｊｉ細胞をＣＡＲ  Ｔ細胞に加え、その後、１：１のＥ：Ｔ比が維持された。標的細胞の溶解割合、およびエフェクターＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張倍数が、各時点で決定された。
【０３８７】
標的細胞の溶解に関してはすべてのクローンが良好な成績であった。拡張倍数に基づく良好なクローンは、Ｐ０８Ｆ０８および４Ｆ１１であった。
【表１０】
2021511807.tif 000033
【０３８８】
表１０：ストレステストにおける標的細胞溶解とＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張倍数を、最適ＣＡＲのインビトロ特徴解析に使用した。活性化後１４日目でＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型を決定し、次いで同日に細胞を凍結させた。溶解させたＣＡＲ  Ｔ細胞と標的Ｒａｊｉ細胞を１：１のＥ：Ｔ比で使用してストレステストを実施した。標的細胞溶解は、ＣＡＲ  Ｔ細胞との共培養の２日、５日および７日後、ＣＤ３−標的細胞をゲーティングすることによりフローサイトメトリーを介して決定された。ＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張倍数は、細胞カウントビーズを使用し、アッセイの開始時に添加された細胞数と比較した２日目、５日目および７日目の細胞数を算出することにより決定された。太字で強調されたＣＡＲは、高い標的細胞溶解と拡張倍数を示すＣＡＲである。
【０３８９】
実施例６：ＲＣＣ  Ｓ．Ｃ．腫瘍モデルにおける、用量依存性のＣＡＲ  Ｔのインビボ有効性
実施例３に記載されるように４Ｆ１１  ｓｃＦｖからＣＡＲ  Ｔ細胞が作製された。ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスに、７８６−Ｏ腫瘍を皮下移植し、腫瘍体積が２００ｍｍ３に達したときに、マウスを、尾静脈注射を介して様々な静脈内投与量の４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて治療し、最適なＣＡＲ  Ｔ投与量を決定した。７８６−Ｏ細胞は、ＡＴＣＣ（登録商標）からＣＲＬ−１９３２（商標）として入手可能である。４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔはインビボでの有効性が高く、５ｘ１０６個のＣＡＲ  Ｔ投与量で完全な腫瘍の退縮をもたらした。
【０３９０】
材料および方法
５０匹のＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスの毛を剃って準備して、右脇腹上に腫瘍を皮下移植した。ＣＤ７０を発現することが知られている７８６−Ｏ腫瘍細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で拡張させた。０日目に、７８６−Ｏ細胞を無血清ＲＰＭＩ中に必要濃度で再懸濁し、動物１匹当たり５００万個の細胞を注射した。腫瘍細胞は、動物１匹当たり、１００ｕＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）と混合した１００ｕＬの無血清ＲＰＭＩ中で皮下注射された。腫瘍移植後、ただちにすべての動物に対し、０日目の基準体重が記録された。腫瘍は、Ｄｉｇｉｍａｔｉｃ  Ｃａｌｉｐｅｒｓ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社）を使用して９日目に始まり週に２回測定され、体重が記録された。１４日目、腫瘍が２００ｍｍ３に達したとき（標準誤差８．３９）、４０匹の腫瘍担持マウスを各群当たり１０匹の４群に無作為化した。１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ中で４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を溶解させ、必要濃度で無血清ＲＰＭＩ中に再懸濁させて、動物１匹当たり１００万、３００万または５００万個のＣＡＲ＋Ｔ細胞が注射された（４Ｆ１１の形質導入効率５７．２％に基づき算出された）。各群において、等しい数の総Ｔ細胞を維持するために必要な非形質導入Ｔ細胞（ＮＴＤ）の数が算出され、各サンプルに加えられた。ＣＡＲ  Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞対照は、尾静脈を介して、動物１匹当たり２００ｕＬの無血清ＲＰＭＩ中で静脈内注射された。ＮＴＤ群が試験エンドポイント（１５００ｍｍ３の腫瘍体積）に達した４３日目まで、週に２回、腫瘍が測定され、体重が記録された。
【０３９１】
腫瘍体積（平均および誤差ＳＥＭ）をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ上にプロットし、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して反復測定結果を用いて統計が算出された（図１および２を参照のこと）。５００万個のＣＡＲ＋投与量で腫瘍は完全に排除された。一方で、１００万個のＣＡＲ＋投与量は、ＮＴＤ群と比較し、有効性を示さなかった。従って、３００万個のＣＡＲ＋の投与量を、将来的なインビボ試験に対する最適投与量として選択した。
【０３９２】
実施例７：７８６−Ｏ細胞における、ＣＤ７０  ＴＡＬＥＮノックアウトを伴う、または伴わないＣＤ７０  ＣＡＲのインビボ比較
４Ｆ１１  ＣＡＴ  Ｔ細胞およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＴ  Ｔ細胞を、実施例１に記載されるように、活性化後６日目にＣＤ７０  ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡエレクトロポレーションを伴い、または伴わずに作製した。ＮＳＧマウスに、７８６−Ｏ腫瘍を皮下移植し、腫瘍体積が２００ｍｍ３に達したときに、マウスを、尾静脈注射を介してＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて治療し、最適な有効性を有するＣＡＲおよび条件を決定した。Ｐ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞はインビボでの有効性が高く、ＣＤ７０ノックアウト（ＫＯ）にもかかわらず、３ｘ１０６個のＣＡＲ  Ｔ投与量で完全な腫瘍の退縮をもたらした。４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ７０がノックアウトされたときには良好な有効性を示したが、ＣＤ７０ノックアウトがない場合には単に腫瘍増殖を制御しただけであった。これらの結果から、ＣＤ７０ノックアウトが、ＣＤ７０  ＣＡＲの活性を改善し得ることが示唆される。
【０３９３】
材料および方法
７５匹のＮＳＧマウスの毛を剃って準備して、右脇腹上に腫瘍を皮下移植した。ＣＤ７０を発現することが知られている７８６−Ｏ腫瘍細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中で拡張させた。０日目に、７８６−Ｏ細胞を無血清ＲＰＭＩ中に必要濃度で再懸濁し、動物１匹当たり５００万個の細胞を注射した。腫瘍細胞は、動物１匹当たり、１００ｕＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）と混合した１００ｕＬの無血清ＲＰＭＩ中で皮下注射された。腫瘍移植後、ただちにすべての動物に対し、０日目の基準体重が記録された。腫瘍は、Ｄｉｇｉｍａｔｉｃ  Ｃａｌｉｐｅｒｓ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ社）を使用して７日目に始まり週に２回測定され、体重が記録された。２０日目、腫瘍が２００ｍｍ３に達したとき（標準誤差９．６９）、６０匹の腫瘍担持マウスを各群当たり１０匹の６群に無作為化した。２１日目に、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ中でＣＡＲ  Ｔ細胞を溶解させ、動物１匹当たり３００万個のＣＡＲ＋Ｔ細胞で、無血清ＲＰＭＩ中に再懸濁させた（個々の形質導入効率に基づき算出された）。各群において、等しい割合のＣＡＲ＋Ｔ細胞ならびに等しい数の総Ｔ細胞を維持するために必要なＮＴＤ細胞の数が算出され、各サンプルに加えられた。ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＴＤ対照は、尾静脈を介して、動物１匹当たり２００ｕＬの無血清ＲＰＭＩ中で静脈内注射された。ＮＴＤ群が試験エンドポイント（１５００ｍｍ３の腫瘍体積）に達した５６日目まで、週に２回、腫瘍が測定され、体重が記録された（図３および４を参照のこと）。
【０３９４】
腫瘍体積（平均および誤差ＳＥＭ）をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ上にプロットし、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して反復測定結果を用いて統計が算出された。ＣＤ７０ノックアウトを伴う、または伴わないＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔ群の両方が、３００万個のＣＡＲ＋投与量で完全な腫瘍退縮をもたらした。ＣＤ７０ノックアウトを伴う４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔ群も、３００万個のＣＡＲ＋投与量で完全な腫瘍退縮をもたらした。しかしＣＤ７０ノックアウトを伴わない４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔ群は、完全退縮をもたらさなかった。
【０３９５】
図３および４において、対応するＮＴＤ対照に対する統計的有意性は、説明の右側に示されている（例えば、ＣＤ７０  ＫＯを伴うＮＴＤに対する、ＣＤ７０  ＫＯを伴うＰ０８Ｆ０８）。ＣＤ７０  ＫＯを伴わない対応するＣＡＲ群に対するＣＤ７０  ＫＯを伴う各ＣＡＲ群の統計的有意性は、説明の左側に示されている。統計は、ダネットの事後検定を用いたＲＭ一元配置ＡＮＯＶＡを表している（ｎｓ  ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１）。
【０３９６】
実施例８：ＡＣＨＮ転移モデルにおける、ＣＤ７０  ＴＡＬＥＮノックアウトを伴う、または伴わないＣＤ７０  ＣＡＲのインビボ比較
実施例７の４Ｆ１１およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、腎細胞癌（ＲＣＣ）由来の細胞株であるＡＣＨＮ細胞においてさらに検証した。ＡＣＨＮ細胞は、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５２：８２７−８４１，８３４（２０１５）に記載されている。ＮＳＧマウスのそれぞれに、１００万個のＡＣＨＮ腫瘍細胞を静脈内移植し、腫瘍細胞注射の１５日後、マウスを、尾静脈注射を介してＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて治療し、最適な有効性を有するＣＡＲおよび条件を決定した。動物１匹当たり３００万個のＣＡＲ＋細胞で投与された４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ７０のノックアウト（ＫＯ）に関わらず、検証された三つすべてのドナーにわたり有効であった。Ｐ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、有効性がわずかであるか、または有効性を示さず、ＣＤ７０ノックアウトが無い場合でのみ検証された。
【０３９７】
材料および方法
４５匹のＮＳＧマウスを、尾静脈を介した静脈内腫瘍注射のために準備した。ＣＤ７０を発現することが知られているＡＣＨＮ腫瘍細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭ中で拡張させた。０日目に、ＡＣＨＮ腫瘍細胞を無血清ＭＥＭ中に必要濃度で再懸濁し、動物１匹当たり１００万個の細胞を注射した。ＡＣＨＮ腫瘍細胞を、２００ｕＬの無血清ＭＥＭ中で静脈内注射した。すべての動物に対し、４日目の基準体重が記録された。腫瘍変動は生体発光（ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（商標）、１２０秒の最大露出時間で自動露出）を使用し、７日目に開始して週に２回測定され、体重が記録された。２０日目、腫瘍が２００ｍｍ３に達したとき（標準誤差９．６９）、２０匹の腫瘍担持マウスを各群当たり５匹の４群に無作為化した。１５日目に、１０％ＦＢＳが補充されたＭＥＭ中でＣＡＲ  Ｔ細胞を溶解させ、動物１匹当たり３００万個のＣＡＲ＋Ｔ細胞で、無血清ＭＥＭ中に再懸濁させた（個々の形質導入効率に基づき算出された）。各群において、等しい割合のＣＡＲ＋Ｔ細胞ならびに等しい数の総Ｔ細胞を維持するために必要なＮＴＤ細胞の数が算出され、各サンプルに加えられた。ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＴＤ対照は、尾静脈を介して、動物１匹当たり２００ｕＬの無血清ＭＥＭ中で静脈内注射された。ＮＴＤ群が試験エンドポイント（２０％を超える体重減少）に達する３５〜４９日目まで、週に２回、腫瘍変動が測定され、体重が記録された（図５ａ、５ｂおよび５ｃを参照のこと）。
【０３９８】
生体発光（平均および誤差  ＳＥＭ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ上にプロットし、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して反復測定結果を用いて統計が算出された。ＣＤ７０ノックアウトを伴う、または伴わない両方の４Ｆ１１  ＣＡＲ  Ｔ群が、３００万個のＣＡＲ＋投与量で抗腫瘍の有効性を示した。ＣＤ７０ノックアウトを伴わないＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲ  Ｔ群は、３００万個のＣＡＲ＋投与量ではほとんど有効性を示さないか、または全く示さなかった。
【０３９９】
実施例９：ＣＤ２０エピトープを発現するＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性
パートＡ：インビトロ活性
ＣＤ２０エピトープを発現するＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞殺傷アッセイにおいて、７８６−０標的細胞に対し、効果がある。
【０４００】
六つのＣＤ７０特異的ＣＡＲのフォーマットが設計された（図６Ａ〜６Ｆ）。構築されたＣＡＲの配列は、表１１Ａ〜１１Ｆに示されるとおりである。
【表１１Ａ】
2021511807.tif 000034
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【表１１Ｂ】
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【表１１Ｃ】
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【表１１Ｄ】
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【表１１Ｅ】
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2021511807.tif 000048
【０４０１】
以下に対し、試験を実施した：ＮＴＤ対照、４Ｆ１１  ＣＡＲのＲＳＲＱＲフォーマット（上述、および図６Ｃに概略が示される）、Ｐ０８Ｆ０８  ＣＡＲのＳＲ２フォーマット（上述、および図６Ｂに概略が示される）、Ｐ０８Ｆ０８  ＣＡＲのＲ２Ｓフォーマット（上述、および図６Ｆに概略が示される）、およびＰ０８Ｆ０８  ＣＡＲのＲＳＲ−短フォーマット（上述、および図６Ｅに概略が示される）。
【０４０２】
各ＣＡＲフォーマットを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞が作製された。次いでこれらのＣＡＲ  Ｔ細胞を溶解させ、ＣＤ７０を発現することが知られている７８６−０標的細胞と、３：１、１：１、１：３または１：９（または０対照）のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、１０％ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ中で混合した。標的細胞の溶解割合、およびエフェクターＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張倍数が決定された（図７）。
【０４０３】
各ＣＡＲ処置に対する生７８６−Ｏ細胞の割合を算出し、次いで非処置対照に対して正規化することにより、標的細胞の溶解割合が各時点で算出された。０日目に播種されたＣＡＲ  Ｔ細胞の数に対する、ＣＡＲ  Ｔ細胞の拡張倍数が各時点で算出された。
【０４０４】
これらの結果から、ＣＤ２０エピトープを発現するＣＤ７０特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が、３：１、１：１、１：３、および１：９のＥ：Ｔ比率、およびその間の比率、ならびに潜在的に本実験で検証されていない３：１〜９：１の範囲の外にある比率で、標的細胞を効率的に殺傷し得ることが示される。
【０４０５】
パートＢ：インビボでのリツキシマブに対する感受性
リツキシマブ投与後のＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇により、ＮＳＧマウスにおいて、ＣＤ７０発現リンパ球の回復が可能となる。
【０４０６】
抗ＣＤ２０抗体のリツキシマブが、ＣＤ２０エピトープを発現するＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇を介在し、リンパ球の回復を促進する能力について、マウスで検証する。この実験において、マウスは、リンパ球表面上のマウスＣＤ７０タンパク質に結合することができ、リツキシマブにより認識されるＣＤ２０エピトープを含有するＣＤ７０特異的ＣＡＲ（α−マウスＣＤ７０  ＣＡＲ  Ｔｓ）、またはマウスＦＬＴ３タンパク質に僅かに結合する対照ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞で処置される。リンパ球のフローサイトメトリー解析を使用して、ＣＤ７０を発現するリンパ球に対する、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。この活性は、対照ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与されたマウス、または非処置マウスと比較した場合のリンパ球の減少として認められる。ＣＡＲ  Ｔ細胞の殺傷活性の確認を行った後、マウスに連続４日間、リツキシマブを与え、循環残留ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１３日目にフローサイトメトリーにより計数される。これらマウスの血液中のＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、リツキシマブを与えられていない対照群と比較して枯渇される。最後に、リンパ球のフローサイトメトリー解析により、リツキシマブを投与された（２０日目）マウスのみが、リンパ球の回復を示すことが示される。
【０４０７】
この実験により、ＣＤ２０エピトープを発現するＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を、リツキシマブ依存性に枯渇させることで、ＣＤ７０発現組織へのダメージが軽減され、急速なリンパ球の回復が可能となる。
【０４０８】
実施例１０：ＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性
実施例９のパートＡに記載されるものと同じアッセイ、および類似の実験パラメータを使用して、標的細胞の殺傷を評価した。検証された細胞株は、７８６−０、ＡＣＨＮ、およびＲＥＨ（ヒト急性リンパ球性白血病の細胞株）であった。ＲＥＨ細胞株は、最も優れたＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の分化を示す。そこでこの株を使用して、将来的なすべての実験において、ｓｃＦｖをランク付けする。図８Ａ〜８Ｄは、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用した、７８６−０細胞（図８Ａ）、ＡＣＨＮ細胞（図８Ｂ）またはＲＥＨ細胞（図８Ｃ）の細胞殺傷を示す。この場合においてＣＡＲの細胞外ドメインは、説明（図８Ｄ）で示されるｓｃＦｖを含有する。すべての実験に対し、ネイキッドＣＡＲフォーマットが使用された。
【０４０９】
表１２は、図８Ａ〜８Ｄの根底にあるデータを提供するものであり、追加的に、蛍光標識された抗ＣＤ７０抗体、ＣＤ２５および４−１ＢＢ（活性化マーカー）が陽性の細胞の測定割合；細胞障害アッセイを行う前の幹メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の割合、ＢＦＰの割合（ＣＡＲ＋）も提供する。
【表１２】
2021511807.tif 000049
【０４１０】
図９Ａは、ルシフェラーゼ標識された７８６−Ｏ標的細胞に反復暴露されたときのＣＤ７０特異的ＣＡＲの有効性を示す（ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２〜３日ごとに新鮮な標的を含有する９６ウェルプレートに移された）。Ｅ：Ｔ比は、３：１であった。ＣＡＲは、ドナーＤ５０３由来の細胞において発現された。実施例４に記載される結果と同じように、ストレステストでの標的細胞の溶解は、ＣＡＲ  ｓｃＦｖのインビボ特徴解析に使用された。
【０４１１】
図９Ｂは、ルシフェラーゼ標識されたＡＣＨＮ標的細胞に反復暴露されたときのＣＤ７０特異的ＣＡＲの有効性を示す（ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２〜３日ごとに新鮮な標的を含有する９６ウェルプレートに移された）。Ｅ：Ｔ比は、１０：１であった。ＣＡＲは、ドナーＤ５０３由来の細胞において発現された。実施例４に記載される結果と同じように、ストレステストでの標的細胞の溶解は、ＣＡＲ  ｓｃＦｖのインビボ特徴解析に使用された。
【０４１２】
図９Ｃは、ルシフェラーゼ標識されたＲＥＨ標的細胞に反復暴露されたときのＣＤ７０特異的ＣＡＲの有効性を示す（指定される時点で２ｘ１０６個の細胞が添加された）。Ｅ：Ｔ比は、１：５であった。ＣＡＲは、ドナーＤ５０３由来の細胞において発現された。実施例４に記載される結果と同じように、ストレステストでの標的細胞の溶解は、ＣＡＲ  ｓｃＦｖのインビボ特徴解析に使用された。
【０４１３】
図１０は、ルシフェラーゼ標識されたＲＥＨ標的細胞に反復暴露されたときの様々なフォーマット（実施例９、パートＡに言及される）でのＣＤ７０特異的ＣＡＲの有効性を示す（指定される時点で２ｘ１０６個の細胞が添加された）。Ｅ：Ｔ比は、１：５であった。実施例４に記載される結果と同じように、ストレステストでの標的細胞の溶解は、ＣＡＲ  ｓｃＦｖのインビボ特徴解析に使用された。
【０４１４】
実施例１１：ＡＣＨＮ転移モデルにおける、ＣＤ７０  ＣＡＲのインビボ比較
異なるＣＤ７０  ｓｃＦｖを含有するＣＡＲ  Ｔ細胞が作製され、腎細胞癌（ＲＣＣ）由来の細胞株であるＡＣＨＮ細胞において検証された。ＡＣＨＮ細胞は、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５２：８２７−８４１，８３４（２０１５）に記載されている。ＮＳＧマウスのそれぞれに、１００万個のＡＣＨＮ腫瘍細胞を静脈内移植し、腫瘍細胞注射の１５日後、マウスを、尾静脈注射を介してＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて治療し、最適な有効性を有するＣＡＲおよび条件を決定した。マウス１匹当たり３００万個のＣＡＲ＋細胞で投与された１２Ｃ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、最も優れた有効性を示した。
【０４１５】
材料および方法
４５匹のＮＳＧマウスを、尾静脈を介した静脈内腫瘍注射のために準備した。ＣＤ７０を発現することが知られているＡＣＨＮ腫瘍細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭ中で拡張させた。０日目に、ＡＣＨＮ腫瘍細胞を無血清ＭＥＭ中に必要濃度で再懸濁し、動物１匹当たり１００万個の細胞を注射した。ＡＣＨＮ腫瘍細胞を、２００ｕＬの無血清ＭＥＭ中で静脈内注射した。すべての動物に対し、４日目の基準体重が記録された。腫瘍変動は生体発光（ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｅｒ（商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（商標）、１２０秒の最大露出時間で自動露出）を使用し、７日目に開始して週に２回測定され、体重が記録された。２０日目、腫瘍が２００ｍｍ３に達したとき（標準誤差９．６９）、３５匹の腫瘍担持マウスを各群当たり５匹の７群に無作為化した。１５日目に、１０％ＦＢＳが補充されたＭＥＭ中でＣＡＲ  Ｔ細胞を溶解させ、動物１匹当たり３００万個のＣＡＲ＋Ｔ細胞で、無血清ＭＥＭ中に再懸濁させた（個々の形質導入効率に基づき算出された）。各群において、等しい割合のＣＡＲ＋Ｔ細胞ならびに等しい数の総Ｔ細胞を維持するために必要なＮＴＤ細胞の数が算出され、各サンプルに加えられた。ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＮＴＤ対照は、尾静脈を介して、動物１匹当たり２００ｕＬの無血清ＭＥＭ中で静脈内注射された。ＮＴＤ群が試験エンドポイント（２０％を超える体重減少）に達する３２日目まで、週に２回、腫瘍変動が測定され、体重が記録された（図１１を参照のこと）。
【０４１６】
生体発光（平均および誤差  ＳＥＭ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ上にプロットし、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して反復測定結果を用いて統計が算出された。３００万個のＣＡＲ＋投与量で、１２Ｃ５  ＣＡＲ  Ｔ群は、抗腫瘍の有効性を示した。
【０４１７】
実施例１２：患者由来のＲＣＣサンプル上でのＣＤ７０の発現レベル、およびＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞による患者由来ＲＣＣサンプルの溶解
初代ＲＣＣ患者サンプルは、Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ  Ｂｉｏ（凍結された解離腫瘍細胞）またはＣＨＴＮ  Ｗｅｓｔｅｒｎ／ＮＤＲＩ（新鮮な腫瘍断片であり、その後に本発明者らにより、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｋｉｔおよびＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳを使用して解離された）から取得された。初代腫瘍細胞は、２０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ中で維持された。関連ＲＣＣ細胞株と共にこれら細胞におけるＣＤ７０タンパク質の細胞表面発現を決定するために、本発明者らはフィコエリトリンが１：１の比率で結合した抗ＣＤ７０抗体を使用してフローサイトメトリーを実施し、受容体の定量を行った。細胞表面受容体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ  ｂｅａｄｓを使用して算出され、抗体の結合能力（ＡＢＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）はメーカーの推奨に従い算出された。ＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、上述のように作製され、初代ＲＣＣ細胞およびＡＣＨＮ  ＲＣＣ細胞株に対する細胞傷害性は、実施例９、パートＡに記載されるアッセイと同じアッセイ、類似した実験パラメータを使用して評価された。
【０４１８】
結果
初代ＲＣＣ細胞は、一つの細胞当たり約２，０００個のＣＤ７０受容体（受容体／細胞）〜約２５，０００個の受容体／細胞の範囲のＡＢＣ値でＣＤ７０を発現し（図１２Ｂ）、ＲＣＣ細胞株上の発現は、約２５，０００受容体／細胞〜約４００，０００受容体／細胞の範囲であった（図１２Ａ）ことが確認された。さらに本発明者らは、一つの細胞当たり７，０００個のＣＤ７０受容体（受容体／細胞）（図１３Ｂ）、２４，０００個の受容体／細胞（図１３Ａ）、または４０，０００個の受容体／細胞（図１３Ｃ）を発現する細胞が、ＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞により効率的に殺傷されること、この場合において当該ＣＡＲは、４Ｆ１１またはＰ０８Ｆ０８のいずれかｓｃＦｖから作製されていることを確認した。
【０４１９】
実施例１３：様々な血液系腫瘍細胞株上でのＣＤ７０の発現レベル、およびＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞によるこれら細胞の溶解
リンパ腫、白血病、および骨髄腫を含む、様々な血液系腫瘍でＣＤ７０を標的とすることの可能性が解析された。特徴解析には、複数の悪性腫瘍におけるＣＤ７０のＲＮＡと細胞表面タンパク質の両方の発現解析、次いで細胞株に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性が含まれた。
【０４２０】
結果
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、および多発性骨髄腫（ＮＭ細胞）の株に対するＲＮＡ発現の解析は、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）を使用し、ＣＤ７０発現が、４種すべての癌タイプで観察され得ることが示された。このことから、これら癌を、ＣＤ７０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて標的化することの潜在的な有用性が示唆される。これら癌におけるＣＤ７０タンパク質の細胞表面発現を決定するために、本発明者らは、選択された腫瘍タイプを起源とする細胞株のパネルに対し、フローサイトメトリーおよび受容体定量を実施した。細胞表面タンパク質の発現パターンは、ＲＮＡ解析の発現パターンと類似しており、このことから、ＣＤ７０発現は、すべての腫瘍タイプの細胞株において広く観察されたことが確認された（図１４Ａ）。次に、本発明者らはＣＤ７０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製し、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて同細胞株に対する有効性を検証した。ＣＤ７０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ７０抗原を発現する標的細胞に対し、安定的な特異的活性を呈した（図１４Ｂ）。ＣＤ７０特異的ＣＡＲが、様々な細胞株を殺傷し得ることから（図１４Ｂ）、ＣＤ７０特異的ＣＡＲは、低レベルでＣＤ７０を発現する細胞でさえも殺傷し得ることが示唆される。これにより、ＣＤ７０特異的ＣＡＲの活性が、特定の細胞型に限定されないことが示される。最後に本発明者らは、実施例７のように実施されたインビボアッセイにおいて、これらＣＡＲがＭＭ１Ｓ細胞株に対して有効であることを示した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。ＭＭ１Ｓは、細胞一つ当たり中程度の数のＣＤ７０受容体を発現する多発性骨髄腫の細胞株である（図１４Ａ）。結論として、様々な血液系悪性腫瘍にわたって、ＣＤ７０が広範な発現プロファイルを有することが観察された。ＣＤ７０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を単独で、または他の血液系標的と併用して使用することで、様々な血液系悪性腫瘍において腫瘍抗原回避を標的とする、または阻害する機会がもたらされる。
実施例１４：３７℃でのヒトＣＤ７０／ＣＤ７０抗体の相互作用の動態およびアフィニティの決定
【０４２１】
本実施例は、ヒトＣＤ７０に対する様々な抗ＣＤ７０抗体の結合動態および／またはアフィニティを決定する。ＳｃＦｖは、抗ＣＤ７０抗体の可変領域をクローニングし、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー（配列番号６０２）、次いで改変ヒトＩｇＧ２配列のヒンジ部分およびＦｃに隣接させ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合物を生成することで作製された。これをＥｘｐｉ２９３を使用して発現させ、次いでプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。組み換えヒトＣＤ７０は、ポリヒスチジンタグであるＡｖｉＴａｇ（商標）とニワトリテネイシンの三量体化ドメインを、ヒトＣＤ７０細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＮ末端に融合させることで作製され、これをＥｘｐｉ２９３を使用して発現させ、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製して、次いで必要に応じてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。
【０４２２】
抗体の結合動態は、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）により、３７℃で、ＨＢＳ−Ｔ＋（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中で決定された。ＨＢＳ−Ｔ＋で希釈された組換えヒトＣＤ７０は、抗ＡｖｉＴａｇ（商標）抗体が固定化されたＣ１チップ上で捕捉された。精製された抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合物は、ＨＢＳ−Ｔ＋中で連続希釈され、２〜４分間、３０ｕＬ／分で注入され、１０分間、解離がモニタリングされた後、注入の間に７５ｍＭリン酸で表面が再生された。緩衝液サイクルは、二重参照目的（Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２，２７９−２８４（１９９９）に記載される二重参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ））で、各抗ＣＤ７０  ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合物に対して集められた。動的な会合速度（Ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、８Ｋ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）を使用して、二重参照されたセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を、物質移動モデル（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｍｏｄｅｌ）を用いた１：１のＬａｎｇｍｕｉｒに広く適合させることにより同時に取得され、次いでこれらを使用して、動的速度定数（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から平衡解離定数（ＫＤ）が算出された。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して１：１の定常状態アフィニティモデルに適合され、必要に応じて定常状態の平衡解離定数（ＳＳ  ＫＤ）が決定された。
【０４２３】
検証された抗ＣＤ７０抗体の結合動態およびアフィニティのパラメータを、表１３に示す。表１３に示す抗体は、表５および表１１において示される、同じ名称を有するＣＡＲと同じｓｃＦｖ配列を共有している。
【表１３】
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【０４２４】
開示された教示は、様々な用途、方法、キットおよび組成物を参照して説明されてきたが、本明細書の教示および以下の特許請求される発明から逸脱することなく、様々な変更および修正を行うことができることが理解されよう。前述の実施例は、開示された教示をより良く図示するために提供されており、本明細書に提示される教示の範囲を制限することを意図していない。本教示はこれらの例示的実施形態の観点から説明されてきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数の変形および修正が、過度の実験を伴わずに可能であることを容易に理解するであろう。こうした変形および修正はすべて、現在の教示の範囲内である。
【０４２５】
本明細書に引用されたすべての参照文献であって、特許、特許出願、論文、教科書などを含む参照文献、およびそこに引用される参照文献は、それらがまだ参照されていない範囲で、その全体が参照により本明細書に援用される。組み込まれた文献および類似の資料のうちの一つ以上が、本出願とは異なるものであるか、またはこれに矛盾する場合、定義された用語、用語使用、記載された技術、またはこれに類するものを含むがこれに限定されないが、本出願が制御する。
【０４２６】
前述の説明および実施例は、本開示のある特定の実施形態を詳細に説明し、発明者によって意図されるベストモードを記述する。しかしながら、本文中の前述がどれだけ詳細に記載されようとも、本発明は多くの方法で実施されてもよく、本発明は添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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