(57)【要約】持続性が向上したキメラ抗原受容体を開示する。
2021536266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合ドメイン;ヒンジ領域;膜通過ドメイン;補助刺激ドメイン;及び信号伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が含まれたポリペプチドであって、
上記信号伝達ドメインはCD3ζドメインを含むポリペプチド。
【請求項２】
上記補助刺激ドメインと上記CD3ζドメインとの間にIL-7Rαまたはその一部を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
上記補助刺激ドメインと上記CD3ζドメインとの間にIL-2Rβまたはその一部を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項４】
IL-7Rαの一部は配列番号15の配列である、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項５】
IL-2Rβの一部は配列番号17の配列である、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項６】
上記CD3ζドメイン内には3つのITAM(免疫受容体チロシン-基盤活性化モチーフ:immunoreceptor tyrosine-based activation motif)が含まれており、
ここで、3番目に位置したITAM部位の最初のモチーフYxxLがYxxQで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLHMがYxYVTMで置換された、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項７】
上記CD3ζドメイン内には、3つのITAM(免疫受容体チロシン-基盤活性化モチーフ:immunoreceptor tyrosine-based activation motif)が含まれており、
ここで、3番目に位置したITAM部位の最初のモチーフYxxLがYyyLで置換され、2番目のモチーフYxxLがYxxQで置換された、請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項８】
上記CD3ζドメイン内には3つのITAMが含まれており、
ここで、3番目に位置したITAM部位は配列番号31の配列で突然変異されたものである、請求項4に記載のポリペプチド。
【請求項９】
上記CD3ζドメイン内には3つのITAMが含まれており、
ここで、3番目に位置したITAM部位は32の配列で突然変異されたものである、請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
上記CD3ζドメインは配列番号18で表される配列である、請求項4又は5に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
上記3番目に位置したITAM部位は配列番号18で表される配列の91番〜113番の配列である、請求項4又は5に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
上記3番目に位置したITAM部位の最初のモチーフYxxLはYxxQで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLHMがYxYVTMで置換され、ここで、xは任意のアミノ酸である、請求項4に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
上記3番目に位置したITAM部位の最初のモチーフYxxLがYyyLで置換され、2番目のモチーフYxxLはYxxQで置換され、
ここで、x、yは任意のアミノ酸である、請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
さらにサイトカインを含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
上記サイトカインはIL-21である、請求項14に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
上記サイトカインは自己切断型ペプチドによりキメラ抗原受容体と連結されている、請求項15に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
T細胞内で発現された上記サイトカインは、上記キメラ抗原受容体と分離された後、T細胞の外部に分泌されることを特徴とする、請求項14に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
さらにTGF-βR2エキソドメイン及びIL18Rエンドドメインを含み、上記TGF-βR2エキソドメインと上記IL18Rエンドドメインとの間にIL18R膜通過ドメインを含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
上記TGF-βR2エキソドメインは自己切断型ペプチドによりキメラ抗原受容体と連結されている、請求項18に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリペプチド、 
T細胞で発現されるTGF-βR2 エキソドメイン、IL18R膜貫通ドメイン、およびIL18Rエンドドメインがキメラ抗原受容体から分離され、これらの中で、TGF-βR2エキソドメインがT細胞の外側、 ここで、IL18Rエンドドメインは、T細胞の外側に存在するTGF-βがTGF-βR2エキソドメインに結合することによって活性化されます。 
【請求項２１】
さらにサイトカインを含む、請求項18に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
上記サイトカインはIL-21である、請求項21に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
上記サイトカインは自己切断型ペプチドによりIL18Rのエンドドメインと連結されている、請求項21に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
T細胞内で発現された上記サイトカインは、上記IL18Rのエンドドメインと分離された後、T細胞の外部に分泌されることを特徴とする、請求項23に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
上記抗原結合ドメインはIL13Rα2、血管新生作用と関連した抗原、EFGRVIII、EphA2、αVβ3、mesothelin、及びグリピカン(glypican)で構成された群から選択される抗原と結合するものである、請求項2又は3に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
上記補助刺激ドメインは4-1BB及びCD28ドメインで構成された群から選択される1種以上を含むことを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号23〜30及び34〜37のいずれか1つの配列で表されるポリペプチド。
【請求項２８】
固形癌を治療するための、請求項1〜26のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
請求項1〜26のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体含有ポリペプチドが発現されたCAR-T細胞。
【請求項３０】
請求項27に記載のキメラ抗原受容体含有ポリペプチドが発現されたCAR-T細胞。
【請求項３１】
抗原結合ドメイン;ヒンジ領域;膜通過ドメイン;補助刺激ドメイン;及び細胞質信号ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を発現するベクターであって、上記CAR発現ベクターはCARをコードする核酸を含み、
ここで、上記CARコーディング核酸は、上記補助刺激ドメインをコードする核酸及び上記信号伝達ドメインでCD3ζドメインをコードする核酸を含むものの、さらに上記補助刺激ドメインをコードする核酸と上記CD3ζドメインをコードする核酸との間にはIL-7Rαまたはその一部をコードする核酸を含むCAR発現ベクター。
【請求項３２】
抗原結合ドメイン;ヒンジ領域;膜通過ドメイン;補助刺激ドメイン;及び細胞質信号ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を発現するベクターであって、上記CAR発現ベクターはCARをコードする核酸を含み、
ここで、上記CARコーディング核酸は、上記補助刺激ドメインをコードする核酸及び上記信号伝達ドメインでCD3ζドメインをコードする核酸を含むものの、さらに上記補助刺激ドメインをコードする核酸と上記CD3ζドメインをコードする核酸との間にはIL-2Rβまたはその一部をコードする核酸を含むCAR発現ベクター。
【請求項３３】
IL-7Rαの一部は配列番号15の配列である、請求項31に記載のCAR発現ベクター。
【請求項３４】
IL-2Rβの一部は配列番号17の配列である、請求項32に記載のCAR発現ベクター。
【請求項３５】
上記CD3ζドメインをコードする核酸は、CD3ζドメイン内に存在する3つのITAM中、3番目に位置したITAM部位の最初のYxxL及び2番目のYxxLHMが置換されたCD3ζドメインをコードする核酸である、請求項31に記載のCAR発現ベクター。
【請求項３６】
上記CD3ζドメインをコードする核酸は、CD3ζドメイン内に存在する3つのITAM中、3番目に位置したITAM部位の最初のYxxL及び2番目のYxxLが置換されたCD3ζドメインをコードする核酸である、請求項32に記載のCAR発現ベクター。
【請求項３７】
上記CD3ζドメインをコードする核酸は、上記3番目に位置したITAM部位の最初のモチーフYxxLはYxxQで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLHMはYxYVTMで置換されたCD3ζドメインをコードする核酸であり、
ここで、xは任意のアミノ酸である、請求項35に記載のCAR発現ベクター。
【請求項３８】
上記CD3ζドメインをコードする核酸は、上記3番目に位置したITAM部位の最初のモチーフYxxLはYyyLで置換され、2番目のモチーフYxxLがYxxQで置換されたCD3ζドメインをコードする核酸であり、
ここで、x、yは任意のアミノ酸である、請求項36に記載のCAR発現ベクター。
【請求項３９】
さらにサイトカインIL-21をコードする核酸を含む、請求項31〜36のいずれか一項に記載のCAR発現ベクター。
【請求項４０】
上記サイトカインIL-21をコードする核酸は、自己切断型ペプチドをコードする核酸を通じてCARをコードする核酸と連結されている、請求項39に記載のCAR発現ベクター。
【請求項４１】
さらにTGF-βR2エキソドメインをコードする核酸と、IL18Rの膜通過ドメイン及びIL18Rのエンドドメインをコードする核酸を含む、請求項31〜36のいずれか一項に記載のCAR発現ベクター。
【請求項４２】
上記TGF-βR2エキソドメインをコードする核酸は自己切断型ペプチドをコードする核酸によりCARをコードする核酸と連結される、請求項41に記載のCAR発現ベクター。
【請求項４３】
さらにサイトカインIL-21をコードする核酸を含む、請求項41に記載のCAR発現ベクター。
【請求項４４】
上記サイトカインIL-21をコードする核酸は、自己切断型ペプチドをコードする核酸を通じてIL18Rエンドドメインコーディング核酸と連結されている、請求項43に記載のCAR発現ベクター。
【請求項４５】
請求項31〜39のいずれか一項に記載のベクターを導入して製造されたCAR-T細胞。
【請求項４６】
請求項41に記載のベクターを導入して製造されたCAR-T細胞。
【請求項４７】
請求項43に記載のベクターを導入して製造されたCAR-T細胞。
【請求項４８】
請求項45に記載のCAR-T細胞を含有する抗癌剤。
【請求項４９】
上記補助刺激ドメインは4-1BB及びCD28ドメインからなる群より1種以上選択されるものである、請求項37または38に記載のCAR発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液癌または固形癌を効果的に治療するための新規なキメラ抗原受容体(CAR: Chimeric Antigen Receptor)及び特定の癌抗原をターゲットとするキメラ抗原受容体が発現されたCAR-T細胞に関する。また、本発明は、血液癌または固形癌を効果的に治療するための新規なCARを発現するベクターに関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、抗原結合ドメイン(antigen binding domain);ヒンジ領域(hinge region);膜通過ドメイン(transmembrane domain);補助刺激ドメイン(costimulatory domain);及び細胞質信号ドメイン(signaling domain)を含むキメラ抗原受容体において、CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果のために、細胞質信号ドメインであるCD3ζドメイン内に存在するいずれか1つの免疫受容体チロシン-基盤活性化モチーフ(immunoreceptor
tyrosine-based activation motif;以下「ITAM」と記載する)が突然変異されたキメラ抗原受容体及びこれが発現されたCAR-T細胞に関する。
【０００３】
また、癌抗原刺激時に抗原依存的にCAR遺伝子にCD3ζ信号伝達ドメイン及び4-1BB補助刺激ドメインに加えてサイトカイン(cytokine)信号を誘導することができるようにインターロイキン(interleukin)-7 receptor-α (IL7Rα)またはinterleukin-2 receptor-β (IL-2Rβ)の切断された細胞質ドメインを追加してCARトニック信号伝達(tonic signaling)によるCAR-T細胞の分化(differentiation)と疲弊(exhaustion)を減少させてCAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を奏するようにした。
【０００４】
また、本発明においては敵対的腫瘍微細環境の免疫抑制信号をCAR-T細胞内で活性化信号に変えるようにするキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)を導入した。
【０００５】
また、本発明においては先天性免疫に関連する細胞の活性化を助け、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量が増加するようにサイトカインIL-21がCAR-T細胞外に分泌される。
【０００６】
本発明によるキメラ抗原受容体は、敵対的腫瘍微細環境においてCAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を示し、同時に毒性を低下させて患者に副作用が少なく示され、治療効果を高めることができる。また、本発明によるキメラ抗原受容体が装着された同種他家由来のCAR-T治療剤を製作し、本発明の活用範囲を広げることができる。
【背景技術】
【０００７】
キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞(CAR-T細胞)は、癌細胞の表面に特異的に発現される癌細胞表面抗原を認識する受容体をコードする遺伝子をT細胞に導入して癌細胞を死滅させることができるように遺伝子が組み換えられたT細胞を意味する。
【０００８】
イスラエルのWeizmann Institute of Scienceの化学者であるとともに免疫学者であるDr.Zelig Eshharなどが癌細胞で特異的に発現する抗原と結合する受容体を有するT細胞を人為的に作れば、癌細胞のみを標的にして免疫反応を引き起こして癌細胞を殺すことができるという知見を導き出し、キメラ抗原受容体を装着したT細胞を作るのに成功し、1989年にPNASに発表した。
【０００９】
草創期に製造されたCAR-T細胞、即ち、1世代CAR-T細胞は信号伝達ドメインとしてCD3ζのみを用いたが、その治療効果が微少であり、また、持続時間も短いという短所があった。これについて、CAR-T細胞の反応性を向上させるための努力が行われ、補助刺激ドメイン(CD28またはCD137/4-1BB)とCD3ζを結合した2世代CAR-T細胞が製造されたが、1世代CAR-T細胞と比較して体内に残存するCAR-T細胞の数が増加した。
【００１０】
2世代CAR-T細胞は、1つの補助刺激ドメインを用いたが、2つの補助刺激ドメインを用いるCAR-T細胞は3世代CAR-Tと呼ばれる。
【００１１】
CAR-T細胞を用いて癌を治療する方法と関連し、3人の末期慢性リンパ性白血病(CCL, chronic lymphoid leukemia)患者にCD19を認知することができるように変形された細胞毒性T細胞(Cytotoxic T cell)を注射したところ、その中、2人は白血病が完全に治療され、その状態が10カ月程度持続したという報告があり(N. Engl J Med 2011; 365:725-733 August 25, 2011, Sic. Transl. Med 2011 Aug 10; 3(95):95ra73（非特許文献１）)、ここで用いられたCAR-Tは2世代に該当するものであり、補助刺激ドメインとして4-1BBを、信号伝達ドメインとしてCD3ζを用いたものである。上記CAR-T細胞の抗原結合ドメインは、白血病癌細胞の表面で発見されるCD19を抗原として認識する。
【００１２】
また、急性白血病患者にCTLO19を投与して治療したところ、患者30人中、27人が完全寛解を経験し、全体患者の67%が2年間完全寛解、78%が2年間生存したという報告があり、対象患者が再発性あるいは不応性患者であったことを考慮すれば、これは非常に驚くべきことである(N Engl J Med 2014; 371:1507-1517, October 16, 2014（非特許文献２）)。
【００１３】
現在、多様なCAR-T細胞を用いた治療法に対してリンパ腫(1ymphoma)、骨髄種(myeloma)等、多様な血液癌を対象に臨床試験が進行中であり、血液癌を対象に使用可能な医薬品としてのCAR-Tが市場に登場した。
【００１４】
しかし、CAR-T細胞を用いた固形癌の治療には、いくつかの障害物がある。例えば、CAR-T細胞を癌患者に静脈投与した場合にCAR-T細胞が腫瘍部位に移動するのに困難があり,敵対的腫瘍微細環境内でCAR-T細胞が機能的に抑制されると同時に制限された持続性(persistence)及び増殖を示す。
【００１５】
従って、このような問題を克服し、固形癌の治療が可能なCAR-T細胞を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】PCT国際公開公報WO2017/023138号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】N. Engl J Med 2011; 365:725-733 August 25, 2011, Sic. Transl. Med 2011 Aug 10; 3(95):95ra73
【非特許文献２】N Engl J Med 2014; 371:1507-1517, October 16, 2014
【非特許文献３】EmtagePCなど, Clin Cancer Res, 2008,14:8112-8122
【非特許文献４】BL Levine, Cancer Gene Therapy, 2015, 22:79-84
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、従来知られていたCAR-T細胞と比較し、固形癌における治療効果が顕著に優れたCARプラットフォーム、CAR-T細胞及びCAR発現ベクターを提供するためのものである。
【００１９】
固形癌を治療するための本発明のCAR-T細胞治療剤は、(1)CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果のために突然変異されたITAMを細胞質信号ドメインに導入し、及び/又は(2)抗原依存的にCAR遺伝子にCD3ζ信号伝達ドメイン、4-1BB補助刺激ドメインに加えてサイトカイン信号を誘導することができるようにIL-7RαまたはIL-2Rβの切断された細胞質ドメインを追加してCARトニック信号伝達(tonic signaling)を調節し、及び/又は(3)敵対的腫瘍微細環境の免疫抑制信号をCAR-T細胞内で活性化信号に変えるようにキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)を導入し、及び/又は(4)先天性免疫に関連する細胞の活性化を助け、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量が増加するようにするためにサイトカインIL-21がCAR-T細胞外に分泌されるようにした。
【００２０】
CAR-T細胞は、CARトニック信号伝達によりアネルギー(anergy)、分化、消尽、活性化-誘導されたCAR-T細胞の死滅を促進する。CAR-T細胞の固形癌の治療効能を高めるためには、CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果が必須であるため、固形癌の治療戦略においてCARトニック信号体系を調節することが必要である。
【００２１】
CARトニック信号伝達は、CAR-T細胞内信号伝達ドメインの置換により調節され得るため、癌抗原依存的にCAR-T細胞内にサイトカイン信号伝達を追加した。また、CD3ζドメイン内に調節されていない過度なITAM基盤信号により発生し得るCARトニック信号伝達を調節するために、突然変異された1つのITAMを細胞質信号ドメインに導入した。CARトニック信号伝達を調節することにより、CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果がさらに長く持続するようにした。
【００２２】
また、腫瘍微細環境で過発現される免疫抑制サイトカイン(immunosuppressive cytokine)であるTGF-ベータの抑制信号をCAR-T細胞内でサイトカインIL-18の活性化信号に変えるキメラスイッチレセプターを導入した。また、先天性免疫に関連する細胞の活性化を助けて、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量が増加するようにするためにサイトカインIL-21をCAR-T細胞外に分泌することができるように製作した。
【００２３】
本発明のキメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインの癌抗原ターゲットを変更することにより多様な癌腫に対するCAR-T細胞治療剤を製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記課題を解決するために、本発明は、抗原結合ドメイン;ヒンジ領域;膜通過ドメイン;補助刺激ドメイン;及び信号伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が含まれたポリペプチドを提供する。ここで、上記補助刺激ドメインは4-1BBドメインまたはCD28ドメインを含んでもよく、4-1BBドメインとCD28ドメインをいずれも含んでもよく、上記信号伝達ドメインはCD3ζドメインを含む。
【００２５】
本発明において、上記4-1BBドメインと上記CD3ζドメインとの間にはIL-7Rαまたはその一部、またはIL-2Rβまたはその一部を含む。ここで、IL-7Rαの一部は配列番号15の配列であり、IL-2Rβの一部は配列番号17の配列であってもよい。上記IL-7Rαの細胞質ドメインの中の一部(配列番号15)は配列番号14のIL-7Rα全体配列中、266番〜328番の間の配列であり、上記IL-2Rβの細胞質ドメイン中の一部(配列番号17)は、配列番号16のIL-2Rβ全体配列の中、266番〜369番の間の配列である。
【００２６】
例えば、公知のanti-IL13Ra2 CAR-T細胞(配列番号22のYYB-103:PCT国際公開公報WO2017/023138号（特許文献１）を参照)を基盤としてIL-13Ra2に特異的なCARに、切断されたサイトカインIL-7Rα(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメインまたは切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369;配列番号17)の細胞質ドメインを、補助刺激ドメインとして4-1BB(配列番号11)とmutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置が配列番号31または配列番号32で置換される)の間に連結してCARトニック信号伝達を調節することにより、CAR-T細胞の生体内持続性及び腫瘍治療効能を高めた。
【００２７】
本発明において、上記CD3ζドメイン内には、3つのITAM(免疫受容体チロシン-基盤活性化モチーフ:immunoreceptor tyrosine-based activation motif)が含まれているが、このうち、3番目に位置したITAM部位の最初のYxxL及び2番目のYxxLが置換されていることが好ましい(ここで、x、yは任意のアミノ酸を意味する)(図3を参照)。
【００２８】
一般に、CD3ζドメイン内のITAMはロイシン(L)またはイソロイシン(I)からアミノ酸2個配列だけ離れているチロシン(Y)を含有するYxxL(またはI)の形態を2つ含む。上記YxxL/Iの形態は、通常、アミノ酸6〜8個だけ離れて存在するため、ITAMはYxxL/Ix(6-8)YxxL/Iの構造で表示することができる。
【００２９】
本発明において配列番号18で表されるCD3ζドメインには3つのITAM(配列番号18の21番〜35番:60番〜75番;及び91番〜105番の位置)が含まれているが、そのうち、3番目に位置したITAMの最初のモチーフYxxL(配列番号18の91番〜94番の位置)がYxxQで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLHM(配列番号18の102番〜107番の位置)がYxYVTM、または3番目に位置したITAMの最初のモチーフYxxL(配列番号18の91番〜94番の位置)がYyyLで置換され、2番目のモチーフYxxL(配列番号18の102番〜105番の位置)がYxxQで置換されていることが好ましい(ここで、x、yは任意のアミノ酸を意味する)。
【００３０】
例えば、本発明において、CD3ζドメインの3番目に位置したITAMを含む部位は配列番号31または32の配列に突然変異されてもよい。
【００３１】
具体的には、公知のanti-IL13Ra2 CAR-T細胞(YYB-103)の信号伝達ドメインであるCD3ζドメイン(配列番号18を参照)内に存在する3つのITAMモチーフ中の3番目に位置したITAMモチーフ(即ち、配列番号18の91番〜106番)部位の配列を Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R から Y L P Q S T A T K D T Y D Y V
T M Q A L P P R (配列番号 31)または公知のanti-IL13Ra2 CAR-T細胞(YYB-103)の信号伝達ドメインであるCD3ζドメイン(配列番号18を参照)内に存在する3つのITAMモチーフ中の3番目に位置したITAMモチーフ(即ち、配列番号18の91番〜105番)部位の配列を Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R から Y L S L S T A T K D T Y L P Q H M Q A L P P R (配列番号32)で突然変異させたキメラ抗原受容体を用いることができる(図3を参照)。
【００３２】
特に、本発明においてCD3ζドメインの3番目に位置したITAMの最初のモチーフYxxL(配列番号18の91番〜94番の位置)はYxxQで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLHM(配列番号18の102番〜106番の位置)がYxYVTM、または本発明においてCD3ζドメインの3番目に位置したITAMの最初のモチーフYxxL(配列番号18の91番〜94番の位置)がYyyLで置換され、2番目のモチーフXxxL(配列番号18の102番〜105番の位置)がYxxQで置換されていることが好ましい(ここで、x、yは任意のアミノ酸を意味する)。
【００３３】
本発明のポリペプチドは追加でサイトカインを含んでもよい。例えば、本発明のポリペプチドは追加されるサイトカインとしてIL-21を含んでもよい。ここで、上記サイトカインは自己切断型ペプチド(self-cleaving peptide)によりキメラ抗原受容体と連結されていることが好ましい。
【００３４】
自己切断型ペプチドは、例えば、公知の配列番号40〜43の2Aペプチドを用いることができる。自己切断型ペプチドは翻訳(translation)後に切断されるようになるが、C末端のプロリン(P)とグリシン(G)との間にあるペプチド結合が分解されることにより切断がなされる。従って、自己切断型ペプチド前後のタンパク質は互いに独立して発現するようになる。
【００３５】
従って、本発明によるポリペプチドはT細胞内で発現時に、上記サイトカインがキメラ抗原受容体(CAR)と分離され、分離されたサイトカインはT細胞の外部に分泌され得る。分離されたサイトカイン(例えば、IL-21)により先天性免疫に関連する細胞を活性化し、分化が十分ではないCAR-T細胞の含有量を増加することができる(図5を参照)。
【００３６】
即ち、IL-21発現によりCAR-T細胞製造工程時に試験管内で分化を防いで、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量を増加させ、CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を高めることができ、また、固形癌周囲の先天性免疫細胞を活性化させて固形癌をさらに効果的に治療可能にした。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、キメラ抗原受容体に加えてさらにTGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインを含んでもよい。ここで、上記TGF-βR2エキソドメイン及びIL18Rエンドドメインの間にはIL18R膜通過ドメインが含まれていることが好ましい(図4を参照)。
【００３８】
本発明において、上記TGF-βR2エキソドメインは自己切断型ペプチドによりキメラ抗原受容体と連結されていることが好ましい。従って、本発明によるポリペプチドはT細胞内で発現時に、上記TGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインを含むポリペプチドがキメラ抗原誘導体(CAR)と分離される。分離されたポリペプチドのTGF-βR2ドメインはT細胞の外部に露出され、IL18R膜通過ドメインはT細胞の細胞膜に位置し、IL18RエンドドメインはT細胞の細胞質内に位置するようになる。
【００３９】
従って、T細胞の外部で免疫抑制サイトカインであるTGF-βが存在する場合、TGF-βが上記TGF-βR2エキソドメインに結合し、これにより上記IL18Rエンドドメインが活性化される。即ち、敵対的腫瘍微細環境の免疫抑制サイトカインであるTGF-βの抑制信号がCAR-T細胞内でサイトカインIL-18の活性化信号に変わるようになる。従って、上記TGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインを含むポリペプチドはキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)となる。
【００４０】
サイトカインIL-18は、T細胞内で免疫抑制物質の発現と調節T細胞の分化を抑制し、癌細胞に対する免疫反応を増進させる。IL-18による進行性固形癌(advanced solid tumors)におけるCAR-T細胞治療剤の効果を確認してみた結果、IL-18によりCD4+T細胞のFoxO1発現が減少し、また、CD8+T細胞ではIL-18によりT-bet発現は増加することを確認した。
【００４１】
結果的に、IL-18は、T-bethigh FoxO1low CAR-T、即ち、CAR-T細胞の持続性(persistence)を通じて進行性固形癌で優れた抗癌効果を奏する。特に、本発明においては固形癌周囲の免疫抑制サイトカイン(immunosuppressive cytokine)であるTGF-βと結合するための受容体であるTGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166;配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541;配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)がCAR-T細胞内で発現されるように製作し、敵対的腫瘍微細環境を逆利用して免疫抑制信号をCAR-T細胞内で活性化信号になるように変えた。
【００４２】
上記のようにキメラ抗原受容体に追加でTGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインが含まれているポリペプチドにも、上記で説明したようなサイトカイン(例えば、IL-21)がさらに含まれ得る。
【００４３】
即ち、キメラ抗原受容体にさらにTGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18R細胞質エンドドメインが含まれているポリペプチドのIL18Rエンドドメインに上記サイトカイン(例えば、IL-21)が自己切断型ペプチドにより連結され得る。
【００４４】
従って、本発明によるポリペプチドはT細胞内で発現時に、上記TGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインを含むポリペプチドがキメラ抗原受容体(CAR)と分離され、また、サイトカインも別途に分離され得る。従って、分離されたサイトカインはT細胞の外部に分泌され、TGF-βR2エキソドメインはT細胞の外部に露出され、IL18R膜通過ドメインはT細胞の細胞膜に位置し、IL18RエンドドメインはT細胞の細胞質内に位置するようになる。
【００４５】
本発明によるポリペプチドは、例えば、配列番号24〜30及び34〜37のいずれか1つの配列で表されるポリペプチドであってもよい。
【００４６】
また、本発明は、上記のようなCAR含有ポリペプチドが発現されたCAR-T細胞に関する。
【００４７】
また、本発明は、抗原結合ドメイン;ヒンジ領域;膜通過ドメイン;補助刺激ドメイン;及び細胞質信号ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を発現するベクターに関する。ここで、上記CAR発現ベクターはCARをコードする核酸を含み、ここで、上記CARコーディング核酸は、上記補助刺激ドメインとして4-1BBドメインをコードする核酸及び上記信号伝達ドメインとしてCD3ζドメインをコードする核酸を含むものの、さらに上記4-1BBドメインをコードする核酸と上記CD3ζドメインをコードする核酸との間にはIL-7Rαまたはその一部、またはIL-2Rβまたはその一部をコードする核酸を含む。ここで、IL-7Rαの一部は、例えば、配列番号15の配列であってもよく、IL-2Rβの一部は、例えば、配列番号17の配列であってもよい。
【００４８】
本発明において、上記CD3ζドメインをコードする核酸は、CD3ζドメイン内に存在する3つのITAM中の3番目に位置したITAM部位の最初のYxxL及び2番目のYxxLが置換されたCD3ζドメインをコードする核酸であってもよい。望ましくは、上記3番目に位置したITAM部位の最初のモチーフYxxLはYxxQで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLHMはYxYVTMまたは最初のモチーフYxxLはYyyLで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLはYxxQで置換されたCD3ζドメインをコードする核酸であってもよい(ここで、x、yは任意のアミノ酸を意味する)。
【００４９】
また、本発明のCAR発現ベクターは、さらにサイトカインIL-21をコードする核酸を含んでもよい。ここで、上記サイトカインIL-21をコードする核酸は自己切断型ペプチドをコードする核酸を通じてCARをコードする核酸と連結される。
【００５０】
また、本発明のCAR発現ベクターは、さらにTGF-βR2エキソドメインをコードする核酸、IL18R膜通過ドメインをコードする核酸及びIL18Rエンドドメインをコードする核酸を含んでもよい。ここで、上記TGF-βR2エキソドメインをコードする核酸は自己切断型ペプチドをコードする核酸によりCARをコードする核酸と連結される。
【００５１】
このように、TGF-βR2エキソドメインをコードする核酸、IL18R膜通過ドメインをコードする核酸及びIL18Rエンドドメインをコードする核酸を含むCAR発現ベクターは、さらにサイトカインIL-21をコードする核酸を含んでもよい。ここで、上記サイトカインIL-21をコードする核酸は自己切断型ペプチドをコードする核酸を通じてIL18Rエンドドメインをコードする核酸と連結される。
【００５２】
本発明は、上記のようなCAR発現ベクターを導入して製造されたCAR-T細胞に関する。
【００５３】
また、本発明は、上記のようなCAR-T細胞を含有する抗癌剤に関する。本発明のCAR-T細胞含有抗癌剤は必要に応じて薬剤学的に許容される添加剤をさらに含み得る。
【００５４】
本発明によるCAR含有ポリペプチドにおいて抗原結合ドメインの癌抗原ターゲットを必要に応じて選択して変更することにより、多様な癌腫に対するCAR-T細胞を製造することができる。例えば、上記抗原結合ドメインはIL13Rα2、血管新生作用と関連した抗原(anti-angiogenesis)、EFGRVIII、EphA2、αVβMesothelin及びグリピカン1(glypican1)などの抗原と結合することにより製造することができる。即ち、 IL-13Ra2, anti-angiogenesis, EGFRvIII, EphA2, aVβglypican1及びmesothelinなどをターゲットとするリガンドまたは抗体(配列番号1〜7及び33を参照)を導入すれば、このターゲットに対する抗癌剤として活用することができる。従って、特定癌腫に対して抗癌効果を奏するCAR-T細胞を製造することができる。
【００５５】
膠芽腫と肺癌などの主要な腫瘍抗原(tumor antigen)であるEGFRvIIIの場合、非特異的結合を通じて示されるCAR-T細胞の副作用を減らすためにEGFRvIIIに対する特異性は維持しながらEGFR wild typeとの結合力を最小化するようにターゲット配列を変更させると同時にCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性(persistence)を最適化させた。
【００５６】
ターゲット配列(配列番号33)は、配列番号3の52番〜57番をSTGGYNからDPENDEに(HEAVY CHAIN CDR2部分)、配列番号3の101番をSからGに(HEAVY CHAIN CDR3部分)、配列番号3の229番をVからGに(LIGHT CHAIN CDR3部分)変更させると同時にCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性をCD8信号配列(signal sequence)を用いて向上させた(配列番号34及び35)。
【００５７】
aVβをターゲットとするCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性を高めるために、Gaussia princeps luciferase signal sequenceまたはCD8 signal sequenceを用いた(配列番号36及び37)。
【発明の効果】
【００５８】
本発明で開示しているCAR-T細胞は発現率及び持続性に優れ、人体内持続性及び抗腫瘍効果を示し、固形癌などに対する向上した治療効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明によるCAR含有ポリペプチドが固形癌を効果的に治療する過程を示したものである。
【図２】本発明によるCAR含有ポリペプチドプラットフォームに使用可能な抗原結合ドメインを説明する図である。
【図３】本発明によるCAR含有ポリペプチドにおいてCARトニックシグナリングの調節のためにCAR-T細胞内にサイトカイン信号伝達ドメインを導入したことを説明するための図である。
【図４】敵対的腫瘍微細環境の免疫抑制信号をCAR-T細胞内で活性化信号に変えるようにキメラスイッチ受容体を導入したことを説明するための図である。
【図５】先天性免疫に関連する細胞の活性化を助けて、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量が増加するようにサイトカインIL-21がCAR-T細胞外に分泌されることを説明するための図である。
【図６】本発明によるCAR含有ポリペプチドの構造を示したものである。
【図７】本発明によるCAR含有ポリペプチドで用いられた自己切断型ペプチドを示したものである。
【図８】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率を示したグラフ及び表である。
【図９】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞のCAR発現率をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて分析した結果である。
【図１０】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞のTGF-βR2とIL-18Rのキメラスイッチ受容体発現率をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて分析した結果である。
【図１１】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞のDay10表現型(phenotype)をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて分析した結果である。
【図１２】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後にLDH assayを通じて細胞毒性(cytotoxicity)を確認したグラフとCAR-T細胞毒性試験に用いられたCAR-T細胞純度及び生存率を示した表である。
【図１３】本発明のCARで形質変形されたCAR-Tの24hまたは96h後に自発的毒性(spontaneous toxicity)を分析した結果である。
【図１４】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後にCAR-T細胞のCAR発現率の変化を、フローサイトメトリー分析機を用いて分析した結果である。
【図１５】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養48h後にCAR-T細胞のCAR発現率の変化を、フローサイトメトリー分析機を用いて分析した結果である。
【図１６】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養96h後にCAR-T細胞のCAR発現率の変化を、フローサイトメトリー分析機を用いて分析した結果である。
【図１７】本発明のキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h(A)後にCAR-T細胞のTGF-Rβ2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現率の変化をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて分析した結果である。
【図１８】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24hと48h後にIFN-γサイトカイン生成を比較したグラフである。
【図１９】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24hと48h後にIL-21サイトカイン生成を比較したグラフである。
【図２０】癌抗原EGFRvIIIターゲットの場合、非特異的結合を通じて示されるCAR-T細胞の副作用を減らすためにEGFRvIIIに対する特異性は維持しながらEGFR wild typeとの結合力を最小化するようにターゲット配列を変更させると同時にCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性を最適化したキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率を示したグラフ及び表である(YYB105、#13、#14)。癌抗原がavβターゲットの場合、CAR-T細胞におけるCAR発現率を最適化したキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率を示したグラフ及び表である(YYB107、#15、#16)。
【図２１】癌抗原EGFRvIIIターゲットの場合、非特異的結合を通じて示されるCAR-T細胞の副作用を減らすためにEGFRvIIIに対する特異性は維持しながらEGFR wild typeとの結合力を最小化するようにターゲット配列を変更させると同時にCAR-T細胞におけるCAR発現率を最適化したキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞におけるCAR発現率を示したグラフである(YYB105、#13、#14)。癌抗原がaVβターゲットの場合、CAR-T細胞におけるCAR発現率を最適化したキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞におけるCAR発現率を示したグラフである(YYB107、#15、#16)。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下、実施例を通じて本発明を具体的に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の思想及び技術的範囲がいかなる意味でも制限されるものではないことに留意すべきである。また、本発明は、参照として引用される図面に示された実施形態の正確な配列及び方法に制限されないものと理解されるべきである。
【００６１】
実施例1:固形癌細胞に過発現されるIL13Rα2に特異的に結合して効果的に治療するための新規なキメラ抗原受容体(CAR)プラットフォーム製造
【００６２】
ヒトIL13(P35225.1)、ヒトCD3(P20963-1)、ヒトCD8A(P01732)、ヒトCD28(P10747)、ヒトCD3ζ(P20963)、ヒト4-1BB(Q07011)、IL7RA(P16871)、IL2RB(P14784)、TGFR2(P37173)、IL18R(Q13478)、IL21(Q9HBE4)、IL2(P60568)、T2A、P2A、及びヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)を科学文献及び公共が利用可能なデータベースを用いて、コドン最適化合成DNA(codon-optimized synthetic DNA)で構成された、キメラ抗原受容体含有ポリペプチド(配列番号23〜30及び34〜37及び図6の#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11、#12を参照)発現ベクターを用いてCAR含有ポリペプチドを製作した(図6及び図7を参照)。
【００６３】
具体的には、合成DNAをXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合し、CAR含有ポリペプチドを発現するベクターを製作し、このベクターをT細胞に形質導入することにより、CAR含有ポリペプチドが発現されたT細胞を製作することができる。
【００６４】
図6のポリペプチド#1の完成した構造体は、kozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K);特許文献１のYYB-103を参照)、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入される3つのグリシン(GGG)(特許文献１のYYB-103を参照)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL-7RΑ(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号31の配列で突然変異される)、T2A、CD8A信号配列(leader sequence)、TGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166:配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541:配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)、P2A、ヒトIL2信号配列(leader sequence)、IL-21(アミノ酸位置23-155;配列番号21)配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#1及び図7を参照)。
【００６５】
図6のCAR含有ポリペプチド#2の完成した構造体は、kozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL-7RΑ(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号31の配列で突然変異される)、T2A,CD8A信号配列、TGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166;配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541;配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#2及び図7を参照)。
【００６６】
図6のCAR含有ポリペプチド#5の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL-7RΑ(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号31の配列で突然変異される)、T2A、ヒトIL2信号配列、IL-21(アミノ酸位置23-155:配列番号21)配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#5及び図7を参照)。
【００６７】
図6のCAR含有ポリペプチド#6の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL-7RΑ(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号31の配列で突然変異される)配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#6及び図7を参照)。
【００６８】
図6のCAR含有ポリペプチド#7の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369;配列番号17)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号32の配列で突然変異される)、T2A、CD8A信号配列、TGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166:配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541;配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体、P2A、ヒトIL2信号配列、IL-21(アミノ酸位置23-155)配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6#7、図7)。
【００６９】
図6のCAR含有ポリペプチド#8の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S6R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369:配列番号19)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号32の配列で突然変異される)、T2A,CD8A信号配列、TGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166;配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541;配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#8及び図7を参照)。
【００７０】
図6のCAR含有ポリペプチド#11の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369:配列番号17)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号32の配列で突然変異される)、T2A、ヒトIL2信号配列、IL-21(アミノ酸位置23-155:配列番号21)配列とXhoI/NotI切断分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#11及び図7を参照)。
【００７１】
図6のCAR含有ポリペプチド#12の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369;配列番号17)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号32の配列で突然変異される)、配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6#12、図7)。
【００７２】
CAR含有ポリペプチド#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11及び#12の全体配列を配列番号23〜30に示した。
【００７３】
最終的に製作されたCAR遺伝子断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(EmtagePCなど, Clin Cancer Res, 2008, 14:8112-8122（非特許文献３）)。本実施例においてキメラ抗原受容体の活性を比較するために、YYB103(配列番号22)をさらに製作した。
【００７４】
実施例2:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の製造
【００７５】
CARを発現する高力価のPG13クローンは一時的にPhoenix-Ampho及びフェニックス-エコPhoenix-Eco細胞を実施例1で製作されたレトロウイルス発現ベクター感染させ、それ以後、感染したPhoenix-Ampho及びPhoenix-Eco細胞から無細胞Vector stockをPG13細胞に感染させることにより作った。
【００７６】
高力価の単一クローンは、抗-IL-13単一クローン抗体(BD Pharmingen)を用いてPG13/#1、PG13/#2、PG13/#5、PG13/#6、PG13/#7、PG13/#8、PG13/#11、またはPG13/#12細胞を染色した後にフローサイトメトリー分析機により単一クローンを分離した。高い力価のPG13/#1、PG13/#2、PG13/#5、PG13/#6、PG13/#7、PG13/#8、PG13/#11、またはPG13/#12クローンは限界希釈法により2番目のサブクローニングにより作られた。サブクローンは、高いCAR発現を安定的に示し、末梢血液に効率のよい形質導入能力のために選択された。
【００７７】
抗-IL-13単一クローン抗体(BD Pharmingen)を用いて形質導入されたPG13/#1、PG13/#2、PG13/#5、PG13/#6、PG13/#7、PG13/#8、PG13/#11、またはPG13/#12細胞をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて形質導入の程度を分析した。形質導入されたPG13/#1、PG13/#2、PG13/#5、PG13/#6、PG13/#7、PG13/#8、PG13/#11、またはPG13/#12細胞の上層液はレトロウイルスを含み、T細胞の遺伝的変形のために収去した。
【００７８】
末梢血液単核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)は、健康な供与者から得た全血(whole blood)をFicoll Paque(GE Healthcare)に入れて遠心分離を用いて分離した。分離されたPBMCをHuman IL-2(NOVARTIS)100IU/mL条件である状態でanti-CD3単一クローン抗体(eBioscience)100ng/mLを添加して培養することにより、T細胞分画を活性化させた(BL Levine, Cancer Gene Therapy, 2015, 22:79-84（非特許文献４）)。培養2-3日後に、細胞の大部分はT細胞であり、一部のナチュラルキラー細胞(natural killer cell)が0〜2%の比率で含まれていた。活性化段階2〜3日後、T細胞にretroviral上層液を用いて2日にわたって2回の形質導入を行い、洗浄後にフラスコで4〜7日間細胞を増殖した。細胞は12〜28日間、攪拌用プラットフォーム装置(WAVE生物反応器システム)上で培養した。IL-2を100IU/mLに維持した。このような方式で変形されたT細胞は分析実験に用いられた。
【００７９】
実験例1:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率のチェック
【００８０】
実験結果
上記実施例2で製造されたT細胞に対して細胞数を計数してCAR-Tの成長速度(cell growth)及び生存率(viability)を確認し、その結果を図8に示した。
【００８１】
全群(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)の細胞数、成長速度は曜日によって対照群であるYYB103より高く示され、培養12日目から細胞が急速に成長することが分かり、生存率も90%以上で示された(図8を参照)。
【００８２】
実験例2:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞表面のCAR発現率のチェック
【００８３】
実験方法(flow cytometric analysis)
フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的には、PE-conjugated anti-human IL-13 単一クローン抗体(BD Pharmingen)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、形質導入されたT細胞の表面CARの発現率をチェックした。
【００８４】
実験結果
実施例2で製造されたIL13Rα2特異的な8種のCAR含有ポリペプチド(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)がT細胞の表面で発現されるかどうかを確認するために、実施例2によりT細胞培養を28日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。
【００８５】
分析の結果、図9に示されているように、生きているT細胞の表面に発現されたキメラ抗原受容体の発現率は24.5%〜84.2%であり、追加のT細胞活性化や形質導入がなくてもIL13Rα2特異的キメラ抗原受容体の発現は4週間まで安定的に維持された(図9を参照)。
【００８６】
実験例3:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の表面のTGF-βR2とIL-18Rのchimeric switch receptor発現率のチェック
【００８７】
実験方法(flow cytometric analysis)
フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的にはHuman TGF-beta RII Fluorescein-conjugated Antibody(FAB2411F)(BD Pharmingen)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、形質導入されたT細胞の表面のTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現率をチェックした。
【００８８】
実験結果
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)の細胞表面でTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtorが発現されるかどうかを確認するために実施例2によりT細胞培養を14日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。分析結果、生きているT細胞の表面に発現されたTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtorの発現率は〜85%で示された(図10を参照)。
【００８９】
実験例4:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の表面の表現型(phenotype)のチェック
【００９０】
実験方法(flow cytometric analysis)
フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的にはFITC-conjugated CD45RAAb(HI100)(Biolegend)、PE-conjugated CCR7Ab(G043H7)(Biolegend)、PE-Cy7-conjugated CD62L Ab(DREG-56)(Biolegend)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、形質導入されたT細胞の表面の分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量、CCR7+CD45RA+CD62L+phenotypeをチェックした。
【００９１】
実験結果
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)の細胞表面で分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量を確認するために実施例2によりT細胞培養を10日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。分析の結果、生きているT細胞の表面に発現されたCCR7+CD45RA+CD62L+phenotypeは実施例2で製作したCAR-Tの全群(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)の細胞表面で対照群である非形質導入試料(untrasnduced sample)より〜5%以上、形質導入試料CAR-T対照群であるYYB103より〜10%以上CCR7+CD45RA+CD62L+phenotypeを示す分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量を確認した(図11を参照)。
【００９２】
実験例5:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のIL13Rα2が過発現される膠芽腫に対する細胞毒性のチェック
【００９３】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)IL13Rα2特異的なCAR-T細胞の細胞毒性を測定するためにLDH(Promega)キットを用いて細胞毒性分析(cytotoxicity assay)を行った。具体的には、CAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化した後、10日後に用い、CAR発現率が20〜40%であるCAR-T細胞を6-well plateに1:2(effector: target=1 x 106 cells : 2 x 106 cells)の比率で細胞を入れて37℃で24時間反応させた。用いられた標的細胞はIL13Rα2を発現するU87細胞と正常細胞対照群である293FT細胞を用いた。
【００９４】
実験結果
本発明を通じて製作されたIL13Rα2特異的なCAR-T細胞が標的癌細胞(U87)を効果的に死滅させるかを分析した。先に言及した標的癌細胞(U87)と正常細胞(293FT)をそれぞれの活性化したCAR-T細胞と共に培養して細胞毒性を比較分析する方法を用いた。図12で示されているように、本発明により製造された全てのCAR-T細胞は、形質導入されていない活性化したT細胞と比較するとき、50〜70%高い水準に標的癌細胞(U87)の死滅を誘導する結果を示した。特に、本発明のCAR-T#5、#6、#11において細胞毒性が高く示された。また、IL-7Rαを含むCAR-T細胞(#1,2,5,6)が、IL-2Rβを含むCAR-T細胞(#7,8,11,12)より全体的に高い細胞毒性を示した。
【００９５】
標的細胞に関する比較対象にIL13Rα2を発現しない293FT細胞を正常細胞対照群として用いた実験結果では、IL13Rα2に特異的なCAR-T細胞の場合、非常に弱い細胞毒性(2〜4%)を示すことを確認した。これは、本実験に用いられたキメラ抗原受容体がIL13Rα2に特異的に結合するということを示す。
【００９６】
本実験例を通じてIL13Rα2特異的なキメラ抗原受容体T細胞が正常細胞(293FT)には毒性を示さず、IL13Rα2を発現する標的癌細胞(U87)のみを顕著に死滅させることが分かる。
【００９７】
図13は、本発明のキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の標的細胞との共培養なしに24hまたは96h後にLDH assayを通じたspontaneous toxicityを確認した結果である。YYB103 spontaneous toxicityが他の群より高いために、U87共培養では8つの群がYYB103より高い細胞毒性を示すと予想され、本発明のキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)は安全性及び安定性の面で比較優位にあると予想される。
【００９８】
実験例6:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のIL13Rα2が過発現される膠芽腫と共培養時のCAR発現率の変化チェック
【００９９】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)細胞のIL13Rα2が過発現される膠芽腫と共培養時のCAR発現率の変化をチェックするために、CAR発現率が20〜40%のCAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化した後、10日後に用い、6-well plateに1:2(effector: target=1x106 cells : 2x106 cells)の比率で細胞を入れて37℃で24時間、48時間、96時間反応させた。96時間のサンプルは48時間後にtarget 2x106 cellsをadd後、フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的には、PE-conjugated anti-human IL-13単一クローン抗体(BD Pharmingen)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、CAR発現率の変化をチェックした。
【０１００】
実験結果
実施例2で製造されたIL13Rα2特異的な8種のCAR(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)がIL13Rα2が過発現される膠芽腫と共培養時のCAR発現率の変化を確認するために実施例2によりT細胞培養を10日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。分析結果、図14で示されているように、24時間U87との共培養では8種の全群でCAR発現変化がYYB103より少なく示された(図14)。
【０１０１】
48時間U87との共培養では8種の全群でCAR発現変化がYYB103より少なく示された(図15)。
【０１０２】
96時間U87との共培養では#1、#2、#5、#6、#7の5種の群で発現変化がYYB103より少なく示された(図16)。96時間U87との共培養後のYYB103のCAR発現は微々たる水準を示した(図16)。
【０１０３】
IL13Rα2が過発現される膠芽腫に対する共培養時のCAR発現率の変化は、標的細胞との共培養なしに、または正常細胞対照群として用いられた293FT細胞との共培養時にCAR発現率の変化確認により、本発明によるキメラ抗原受容体は敵対的腫瘍微細環境でCAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を示し、同時に毒性を低下させることと期待される。
【０１０４】
実験例7:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のIL13Rα2が過発現される膠芽腫と共培養時のTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現率の変化チェック
【０１０５】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)細胞のIL13Rα2が過発現される膠芽腫と共培養時のTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現率の変化をチェックするために、CAR発現率が20〜40%のCAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化後、10日後に用い、6-well plateに1:2(effector: target=1x106 cells : 2x106 cells)の比率で細胞を入れて37℃で24時間、48時間、96時間反応させた。96時間サンプルは48時間後にtarget 2x106 cellsをadd後、フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的にはHuman TGF-beta RII Fluorescein-conjugated Antibody(FAB2411F)(BD Pharmingen)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、TGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現率の変化をチェックした。
【０１０６】
実験結果
実施例2で製造されたIL13Rα2特異的な8種のCAR(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)がIL13Rα2が過発現される膠芽腫と共培養時のTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現率の変化を確認するために、実施例2によりT細胞培養を10日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。
【０１０７】
分析結果、図17で示されているように、24時間共培養後、4種の群(#1、#2、#7、#8)でTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現がCAR-T cell onlyよりU87共培養群で減少する様相を呈するが、平均30%の発現を示した(図17)。48時間共培養後、4種の群(#1、#2、#7、#8)でTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現がCAR-T cell onlyよりU87共培養の群で減少する様相を呈するが、平均25%の発現を示した。96時間共培養後、4種の群(#1、#2、#7、#8)でTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現がCAR-T cell onlyよりU87共培養の群で減少する様相を呈するが、平均15%の発現を示した。標的細胞との共培養なしに、または正常細胞対照群として用いられた293FT細胞との共培養時よりは発現率の変化が多かったが、IL13Rα2が過発現される膠芽腫に対する共培養時のTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receprtor発現率変化の確認により、本発明によるキメラ抗原受容体は敵対的腫瘍微細環境でCAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を奏すると期待される。
【０１０８】
実験例8:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のtarget細胞に対するサイトカイン(IFN-gamma)生成の確認
【０１０９】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)細胞とIL13Rα2が過発現される膠芽腫U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後と48h後のIFN-γサイトカイン生成を確認するために、CAR発現率が20〜40%であるCAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化した後、10日後に用い、6-well plateに1:2(effector : target=1x106 cells : 2x106 cells)の比率で細胞を入れ、6well culture plateのwell当り培養培地6mLを入れて37℃で24時間培養後に上層液100ulを取り1.5ml tubeに移した後、48時間まで追加培養して上層液100ulを同一に取った。
【０１１０】
ELISA分析機(R&D systems)メーカーの指針に従って下記の通りIFN-gamma分析実験を行った。IFN-gamma standard  bottleに3 ml calibrator diluent RD6-21を入れた後、振盪機(shaker)で15分間混ぜて1.5ml tubeに1mlずつ分注してstandard 1を2つ作った。分注した1mlのstandard 1から500ul取って階段希釈してstandard 7まで作った。Blankを作るために培養培地500ulとcalibrator diluent RD6-21 500ulを混ぜて準備した。
【０１１１】
Sampleを1/20に希釈するために、Sample数だけの新たな1.5ml tubeに190ulのcalibrator diluent RD6-21を入れ、sampleの上層液10ulを取ってtotal volumeが200ulでassay試料を準備した。Wash bufferを作るために500ml storage bottleに蒸溜水500mlと20mlのwash buffer concentrateを十分に混ぜて準備した。
【０１１２】
IFN-gamma microplateにassay diluent RD1-51(Blue dye)をstandard 1〜7とblank、sample wellに100ulずつ入れた。上記で準備したblank、standardとsampleを100ulずつ入れた後、plate sealerを付着して常温で2時間反応させた。反応後に反応液を捨て、準備しておいたwash buffer 400ulを入れてwellを4回washした。IFN-gamma conjugateを各well当り200ul入れてplate sealerを付着して常温で2時間反応させた。反応液を捨てて400ul wash bufferを用いて4回washした。発色試薬(Color reagent)A:Bを1:1の比率で混ぜた後にwell当り200ulずつ入れてplate sealer付着後にホイルで光を遮断させた後、30分間常温で反応した。反応後にstop solution 50ulを各wellに入れて30分間以内に450nmで測定した。
【０１１３】
実験結果
YYB103が相対的に他の試料に比べて多量のIFN-gammaを分泌することが示され、U87cell存在下にCAR-T細胞培養時にIL-7Rα信号伝達ドメインを含むCAR-T(#1,2,5,6)がIL-2Rβ信号伝達ドメインを含むCAR-T(#7,8,11,12)よりIFN-gammaをさらに多く分泌することが示された。24時間と48時間培養後の試料間の結果は類似の様相を示した(図18)。
【０１１４】
図12でのように本発明のキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後にLDH assayを通じた細胞毒性(cytotoxicity)確認した結果、8群の標的細胞の殺傷能力は同様に示されたが、IFN-γの生成が少ないことから推察する時、cytokineによる悪影響(Cytokine release syndrome, CRS)なしに標的細胞を殺傷できるという点で安全性の面で、CAR-T細胞治療剤の効果が副作用が少なく、治療効果は優れると予測される。
【０１１５】
実験例9:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のサイトカイン(IL-21)生成のチェック
【０１１６】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)細胞とIL13Rα2が過発現される膠芽腫U87細胞及び正常細胞の対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後と48h後にサイトカインIL-21生成を確認するため、CAR発現率が20〜40%であるCAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化後、10日後に用い、6-well plateに1:2(effector : target=1x106 cells : 2x106 cells)の比率で細胞を入れ、6well culture plateのwell当り培養培地6mLを入れて37℃で24時間培養後に上層液100ulを取って1.5ml tubeに移した後、48時間まで追加培養して上層液100ulを同一に取った。
【０１１７】
ELISA分析機(Invitrogen)メーカーの指針に従って下記の通りIL-21分析実験を行った。96well ELISA plateにwell当り100ul capture antibodyを入れて4℃でovernight間反応させた。反応後に250ul wash bufferを用いてwellを3回washする。Well当り200ulずつELISA/ELISASPOT diluentを入れて室温で1時間反応させた。反応後に、準備したblank、cytokine IL-21 standardとsampleを100ulずついれた後well当り100ulずつELISA/ELISASPOT diluentを入れてplate sealerを付着して常温で2時間反応させた。反応後、250ul wash bufferを用いてwellを3回washした。Well当り100ulずつdetection antibodyを入れてplate sealerを付着して常温で1時間反応させた。反応後、250ul wash bufferを用いてwellを3回washした。Well当り100ulずつAvidin-HRPを入れてplate sealerを付着して常温で30分間反応させた。反応後、250ul wash bufferを用いてwellを5回washした。Well当り100ulずつ1x TMB solutionを入れてplate sealerを付着して常温で30分間反応させた。反応後にstop solution 50ulを各wellに入れて30分以内に450nmで測定した。
【０１１８】
実験結果
IL-21遺伝子を含んでいる#1、#5、#7、#11 CAR-T細胞でIL-21が分泌されることを確認した。U87 cellと共培養時に、さらに多量のIL-21が分泌され、全体的に24時間と48時間における実験結果の様相が同様に示された点から培養時間による差は見られなかった。48時間における実験結果が24時間における実験結果に比べてIL-21の濃度が高くなったことからIL-21の分泌は継続して進行されると見られた(図19)。
【０１１９】
癌細胞の環境でIL-21の分泌は先天性免疫に関連する細胞の活性化を助けて癌細胞の死滅能力を高めると判断される。
【０１２０】
実施例3:癌抗原EGFRvIIIターゲットCAR及びaVβターゲットCARベクターの製作
【０１２１】
膠芽腫と肺癌などの主要な腫瘍抗原(tumor antigen)であるEGFRvIIIの場合、非特異的結合を通じて示されるCAR-T細胞の副作用を減らすために、EGFRvIIIに対する特異性は維持しながらEGFR wild typeとの結合力を最小化するように配列番号33はまず配列番号3の52番〜57番をSTGGYNからDPENDEに(HEAVY CHAIN CDR2部分)、配列番号3の101番をSからGに(HEAVY CHAIN CDR3部分)、配列番号3の229番をVからGに(LIGHT CHAIN CDR3部分)変更させた。
【０１２２】
ヒトCD3(P20963-1)、ヒトCD8A(P01732)、ヒト4-1BB(Q07011)、ヒトCD3Z(P20963)、Gaussia princeps luciferase、そしてヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)を科学文献及び公共が利用可能なデータベースを用いて最適化し、codon-optimized synthetic DNAで構成されたキメラ抗原受容体含有ポリペプチド(配列番号34〜37の#13、#14、#15、#16)を製作した。
【０１２３】
CAR含有ポリペプチド#13の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence,CD8 signal sequence、配列番号3 EGFRv111と結合する抗原結合ドメイン、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8Aのヒンジ領域、ヒトCD3膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、CD3ζ細胞質ドメイン(配列番号18)配列とXhoI/NotI切断部分を含む。
【０１２４】
最終的に製作されたCAR遺伝子の断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(非特許文献３)。本実施例においてキメラ抗原受容体の活性を比較するために、YYB105(配列番号39:特許文献１を参照)を追加で製作した。
【０１２５】
CAR含有ポリペプチド#14の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、CD8A signal sequence、配列番号32 EGFRv111と結合する抗原結合ドメイン、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に3つのグリシン(GGG)添加、ヒトCD8Aのヒンジ領域、ヒトCD3膜通過ドメイン、細胞質41BBの補助刺激信号ドメイン、CD3ζ細胞質ドメイン(配列番号18)配列とXhoI/NotI切断部分を含む。最終的に製作されたCAR遺伝子の断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(非特許文献３)。
【０１２６】
aVβanti-angiogenicの場合、これらをターゲットとするCAR-T細胞におけるCAR発現率及びpersistenceを最適化させた。aVβの場合、これらをターゲットとするCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性をGaussia princeps luciferase signal sequenceまたはCD8 signal sequenceを用いて向上させた(配列番号36と配列番号37)
【０１２７】
CAR含有ポリペプチド#15の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、Gaussia princeps luciferase signal sequence、配列番号5{αVβと結合する抗原結合ドメイン}、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8Aのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質41BBの補助刺激信号ドメイン、CD3ζ細胞質ドメイン(配列番号18)配列とXhoI/NotI切断部分を含む。最終的に製作されたCAR遺伝子断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(非特許文献３)。本実施例においてキメラ抗原受容体の活性を比較するために、YYB107(配列番号38:特許文献１を参照)を追加で製作した。
【０１２８】
#16完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、CD8A signal sequence、配列番号5{αVβと結合する抗原結合ドメイン}、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に3つのグリシン(GGG)添加、ヒトCD8Aのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質41BBの補助刺激信号ドメイン、CD3ζ細胞質ドメイン(配列番号18)配列とXhoI/NotI切断部分を含む。最終的に製作されたCAR遺伝子の断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(非特許文献３)。
【０１２９】
実施例4:キメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の製造
【０１３０】
CARを発現する高力価のPG13クローンは一時的にPhoenix-Ampho及びPhoenix-Eco細胞を実施例1で製作されたレトロウイルス発現ベクターに感染させ、それ以後に感染したPhoenix-Ampho及びPhoenix-Eco細胞から無細胞Vector stockをPG13細胞に感染させることにより作った。高力価の単一クローンはanti-myc Ab(BD Pharmingen)を用いてPG13/#13、PG13/#14、PG13/#15、PG13/#16細胞を染色した後にフローサイトメトリー分析機により単一クローンを分離した。anti-myc Abを用いて形質導入されたPG13/#13、PG13/#14、PG13/#15、PG13/#16細胞をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて形質導入の程度を分析した。形質導入されたPG13/#13、PG13/#14、PG13/#15、PG13/#16細胞の上層液はレトロウイルスを含み、T細胞の遺伝的変形のために収去した。末梢血液単核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)は健康な供与者から得た全血(whole blood)をFicoll Paque(GE Healthcare)に入れて遠心分離を用いて分離した。分離されたPBMCをHuman IL-2(NOVARTIS)100IU/mLの条件である状態でanti-CD3単一クローン抗体(eBioscience)100ng/mLを添加して培養することによりT細胞の分画を活性化させた(非特許文献４)。培養2-3日後に、細胞の大部分はT細胞であり、一部のナチュラルキラー細胞(natural killer cell)が0〜2%の比率で含まれていた。活性化段階2〜3日後、T細胞にretroviral上層液を用いて2日にわたり2回形質導入を行い、洗浄後にフラスコで14日間細胞を増殖した。IL-2を100IU/mLに維持した。このような方式で変形されたT細胞は分析実験に用いられた。
【０１３１】
実験例1:キメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率のチェック
【０１３２】
実験結果
上記実施例4で製造されたT細胞に対して細胞数を計数してCAR-Tの成長速度及び生存率を確認し、その結果を図20に示した。全群(#13、#14、#15、#16)の細胞の数、成長速度は曜日により対照群であるYYB105または対照群であるYYB107と類似し、生存率(viability)も90%以上で示された(図20)。
【０１３３】
実験例2:キメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞表面のCAR発現率のチェック
【０１３４】
実験方法(flow cytometric analysis)
フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的にはPE-conjugated anti-myc抗体を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、形質導入されたT細胞表面のCARの発現率をチェックした。
【０１３５】
実験結果
実施例3で製造された4種のCAR(#13、#14、#15、#16)がT細胞の表面で発現されるかどうかを確認するために実施例4によりT細胞培養を14日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。
【０１３６】
分析結果、図21で示されているように、生きているT細胞の表面に発現されたキメラ抗原受容体の発現率が対照群YYB105(37.4%)より#13(43.0%)、#14(50.8%)に増加した(図21)。対照群YYB107(24.6%)より#15(45.9%)、#16(40.0%)に増加した(図21)。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明は、癌治療の分野で急速に発展しているCAR-T細胞に関するものであり、本発明によるCAR-T細胞は発現率及び持続性が顕著に優れ、固形癌などに対する向上した治療効果を奏し、カスタマイズ型癌治療の分野で有用に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３８】
配列番号1 {IL13Rα2と結合する抗原結合wild type IL-13ドメインの配列} 
長さ: 112 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
G P V P P S T A L R E L I E E L V N I T Q N Q K A P L C N G S M V W S I N L T A G M Y C A A L E S L I N V S G C S A I E K T Q R M L S G F C P H K V S A G Q F S S L H V R D T K I E V A Q F V K D L L L H L K K L F R E G Q F N 
【０１３９】
配列番号2 {血管新生作用と関連した抗原と結合できる抗原結合ドメイン} 
長さ: 92 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
E V V A A T P T S L L I S W R H P H F P T R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V L Q P P S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V V E R N G R E L N T P P I S I N Y R T H H H H H H 
【０１４０】
配列番号3 {EGFRvlllと結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 252 
タイプ: scFv protein 
生物名: human 
配列: 
Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I S T G G Y N T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y S S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N V P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L 
【０１４１】
配列番号4 {EphA2と結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 141 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
D R H T V F W N S S N P K F R N E D Y T I H V Q L N D Y V D I I C P H Y E D H S V A D A A M E Q Y I L Y L V E H E E Y Q L C Q P Q S K D Q V R W Q C N R P S A K H G P E K L S E K F Q R F T A F A L A K E F K A G H S Y Y Y I S K P I H Q H E D R C L R L K V T V S G E Q K L I S E E D L 
【０１４２】
配列番号5 {αVβと結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 104 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
V S D V P R D L E V V A A T P T S L L I S W D A P A V T V R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V P G S K S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V T P R G D W N E G S K P I S I N Y R T E Q K L I S E E D L 
【０１４３】
配列番号6 {グリピカン1(glypican1)と結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 418 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
T S P C D N F D C Q N G A Q C I V R I N E P I C Q C L P G Y Q G E K C E K L V S V N F I N K E S Y L Q I P S A K V R P Q T N I T L Q I A T D E D S G I L L Y K G D K D H I A V E L Y R G R V R A S Y D T G S H P A S A I Y S V E T I N D G N F H I V E L L A L D Q S L S L S V D G G N P K I I T N L S K Q S T L N F D S P L Y V G G M P G K S N V A S L R Q A P G Q N G T S F H G C I R N L Y I N S E L Q D F Q K V P M Q T G I L P G C E P C H K K V C A H G T C Q P S S Q A G F T C E C Q E G W M G P L C D Q R T N D P C L G N K C V H G T C L P I N A F S Y S C K C L E G H G G V L C D E E E D L F N P C Q A I K C K H G K C R L S G L G Q P Y C E C S S G Y T G D S C D R E I S C R G E R I R D Y Y Q K Q Q G Y A A C Q T T K K V S R L E C R G G C A G G Q C C G P L R S K R R K Y S F E C T D G S S F V D E V E K V V K C G C T R C V S E Q K L I S E E D L 
【０１４４】
配列番号7 {mesothelinと結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 262 
タイプ: scFv protein 
生物名: human 
配列: 
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY CAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSS GSTSGSGKPGSGEGSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDV WGQGTTVTVSSGILGS 
【０１４５】
配列番号8 {ヒンジ領域配列-1} 
長さ: 47 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D 
【０１４６】
配列番号9 {ヒンジ領域配列-2} 
長さ: 45 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A A R P A A G G A V H T R G L D F A 
【０１４７】
配列番号10 {膜通過ドメイン配列-1} 
長さ: 21 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T 
【０１４８】
配列番号11 {膜通過ドメイン配列-2} 
長さ: 23 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
L A Y L L D G I L F I Y G V I L T A L F L R V 
【０１４９】
配列番号12 {4-1BB} 
長さ: 42 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列; 
K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L 
【０１５０】
配列番号13 {Wild type CD28} 
長さ: 41 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
R S K R S R L L H S D Y M N M T P R R P G P T R K H Y Q P Y A P P R D F A A Y R S 
【０１５１】
配列番号14 {IL-7Rα} 
長さ: 459 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MTILGTTFGMVFSLLQVVSGESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNITNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVVYREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMDPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ 
【０１５２】
配列番号15 {IL-7Rαの一部} 
長さ: 64 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTF 
【０１５３】
配列番号16 {IL-2Rβ} 
長さ: 551 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV 
【０１５４】
配列番号17 {IL-2Rβの一部} 
長さ: 104 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHL 
【０１５５】
配列番号18 {CD3ζ} 
長さ: 113 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１５６】
配列番号19 {TGF-βR2エキソドメイン} 
長さ: 137 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD 
【０１５７】
配列番号20 {IL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメイン} 
長さ: 219 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
PGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES 
【０１５８】
配列番号21 {IL-21} 
長さ: 133 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 
【０１５９】
配列番号22 {YYB 103} 
長さ: 359 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M G W S C I I L F L V A T A T G V H S G P V P P S T A L R K L I E E L V N I T Q N Q K A P L C N G S M V W S I N L T A G M Y C A A L E S L I N V S G C S A I E K T Q D M L D G F C P H K V S A G Q F S S L H V R D T K I E V A Q F V K D L L L H L K K L F K E G Q F N G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１６０】
配列番号23 {#1} 
長さ: 998 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSESRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 
【０１６１】
配列番号24 {#2} 
長さ: 818 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES 
【０１６２】
配列番号25 {#5} 
長さ: 594 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 
【０１６３】
配列番号26 {#6} 
長さ: 423 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPR 
【０１６４】
配列番号27 {#7} 
長さ: 1038 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
KMIHQHLSSRTHGSEDS 
【０１６５】
配列番号28 {#8} 
長さ: 858 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLSLSTATKDTYLPQHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES 
【０１６６】
配列番号29 {#11} 
長さ: 634 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLSLSTATKDTYLPQHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 
【０１６７】
配列番号30 {#12} 
長さ: 463 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLSLSTATKDTYLPQHMQALPPR 
【０１６８】
配列番号31 {mutated 3 rd ITAM-1} 
長さ: 23 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
Y L P Q S T A T K D T Y D Y V T M Q A L P P R 
【０１６９】
配列番号32 {mutated 3rd ITAM-2} 
長さ: 23 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
Y L S L S T A T K D T Y L P Q H M Q A L P P R 
【０１７０】
配列番号33 {EGFRvlllと結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 252 
タイプ: scFv protein 
生物名: human 
配列: 
Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I D P E N D E T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y G S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N G P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L 
【０１７１】
配列番号34 {#13} 
長さ: 499 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I S T G G Y N T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y S S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N V P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A A R P A A G G A V H T R G L D F A L A Y L L D G I L F I Y G V I L T A L F L R V K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７２】
配列番号35 {#14} 
長さ: 499 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I D P E N D E T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y G S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N G P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A A R P A A G G A V H T R G L D F A L A Y L L D G I L F I Y G V I L T A L F L R V K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７３】
配列番号36 {#15} 
長さ: 349 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M G V K V L F A L I C I A V A E A V S D V P R D L E V V A A T P T S L L I S W D A P A V T V R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V P G S K S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V T P R G D W N E G S K P I S I N Y R T E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７４】
配列番号37 {#16} 
長さ: 353 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P V S D V P R D L E V V A A T P T S L L I S W D A P A V T V R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V P G S K S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V T P R G D W N E G S K P I S I N Y R T E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７５】
配列番号38 {YYB 107} 
長さ: 351 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M G W S C I I L F L V A T A T G V H S V S D V P R D L E V V A A T P T S L L I S W D A P A V T V R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V P G S K S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V T P R G D W N E G S K P I S I N Y R T E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７６】
配列番号39 {YYB 105} 
長さ: 497 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M G W S C I I L F L V A T A T G V H S Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I S T G G Y N T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y S S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N V P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A A R P A A G G A V H T R G L D F A L A Y L L D G I L F I Y G V I L T A L F L R V K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７７】
配列番号40 {T2Aペプチド} 
長さ: 21 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
GSG E G R G S L L T C G D V E E N P G P 
【０１７８】
配列番号41 {P2Aペプチド} 
長さ: 22 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
GSG A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P 
【０１７９】
配列番号42 {E2Aペプチド} 
長さ: 23 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
GSG Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P 
【０１８０】
配列番号43 {F2Aペプチド} 
長さ: 25 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
GSG V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P 
【図１】
2021536266.tif 000003
【図２】
2021536266.tif 000004
【図３】
2021536266.tif 000005
【図４】
2021536266.tif 000006
【図５】
2021536266.tif 000007
【図６】
2021536266.tif 000008
【図７】
2021536266.tif 000009
【図８】
2021536266.tif 000010
【図９】
2021536266.tif 000011
【図１０】
2021536266.tif 000012
【図１１−Ａ】
2021536266.tif 000013
【図１１−Ｂ】
2021536266.tif 000014
【図１１−Ｃ】
2021536266.tif 000015
【図１１−Ｄ】
2021536266.tif 000016
【図１２】
2021536266.tif 000017
【図１３】
2021536266.tif 000018
【図１４】
2021536266.tif 000019
【図１５】
2021536266.tif 000020
【図１６】
2021536266.tif 000021
【図１７】
2021536266.tif 000022
【図１８】
2021536266.tif 000023
【図１９】
2021536266.tif 000024
【図２０】
2021536266.tif 000025
【図２１】
2021536266.tif 000026
【配列表】
2021536266000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月7日(2021.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液癌または固形癌を効果的に治療するための新規なキメラ抗原受容体(CAR: Chimeric Antigen Receptor)及び特定の癌抗原をターゲットとするキメラ抗原受容体が発現されたCAR-T細胞に関する。また、本発明は、血液癌または固形癌を効果的に治療するための新規なCARを発現するベクターに関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、抗原結合ドメイン(antigen binding domain);ヒンジ領域(hinge region);膜通過ドメイン(transmembrane domain);補助刺激ドメイン(costimulatory domain);及び細胞質信号ドメイン(signaling domain)を含むキメラ抗原受容体において、CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果のために、細胞質信号ドメインであるCD3ζドメイン内に存在するいずれか1つの免疫受容体チロシン-基盤活性化モチーフ(immunoreceptor
tyrosine-based activation motif;以下「ITAM」と記載する)が突然変異されたキメラ抗原受容体及びこれが発現されたCAR-T細胞に関する。
【０００３】
また、癌抗原刺激時に抗原依存的にCAR遺伝子にCD3ζ信号伝達ドメイン及び4-1BB補助刺激ドメインに加えてサイトカイン(cytokine)信号を誘導することができるようにインターロイキン(interleukin)-7 receptor-α (IL7Rα)またはinterleukin-2 receptor-β (IL-2Rβ)の切断された細胞質ドメインを追加してCARトニック信号伝達(tonic signaling)によるCAR-T細胞の分化(differentiation)と疲弊(exhaustion)を減少させてCAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を奏するようにした。
【０００４】
また、本発明においては敵対的腫瘍微細環境の免疫抑制信号をCAR-T細胞内で活性化信号に変えるようにするキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)を導入した。
【０００５】
また、本発明においては先天性免疫に関連する細胞の活性化を助け、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量が増加するようにサイトカインIL-21がCAR-T細胞外に分泌される。
【０００６】
本発明によるキメラ抗原受容体は、敵対的腫瘍微細環境においてCAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を示し、同時に毒性を低下させて患者に副作用が少なく示され、治療効果を高めることができる。また、本発明によるキメラ抗原受容体が装着された同種他家由来のCAR-T治療剤を製作し、本発明の活用範囲を広げることができる。
【背景技術】
【０００７】
キメラ抗原受容体(CAR)を発現するT細胞(CAR-T細胞)は、癌細胞の表面に特異的に発現される癌細胞表面抗原を認識する受容体をコードする遺伝子をT細胞に導入して癌細胞を死滅させることができるように遺伝子が組み換えられたT細胞を意味する。
【０００８】
イスラエルのWeizmann Institute of Scienceの化学者であるとともに免疫学者であるDr.Zelig Eshharなどが癌細胞で特異的に発現する抗原と結合する受容体を有するT細胞を人為的に作れば、癌細胞のみを標的にして免疫反応を引き起こして癌細胞を殺すことができるという知見を導き出し、キメラ抗原受容体を装着したT細胞を作るのに成功し、1989年にPNASに発表した。
【０００９】
草創期に製造されたCAR-T細胞、即ち、1世代CAR-T細胞は信号伝達ドメインとしてCD3ζのみを用いたが、その治療効果が微少であり、また、持続時間も短いという短所があった。これについて、CAR-T細胞の反応性を向上させるための努力が行われ、補助刺激ドメイン(CD28またはCD137/4-1BB)とCD3ζを結合した2世代CAR-T細胞が製造されたが、1世代CAR-T細胞と比較して体内に残存するCAR-T細胞の数が増加した。
【００１０】
2世代CAR-T細胞は、1つの補助刺激ドメインを用いたが、2つの補助刺激ドメインを用いるCAR-T細胞は3世代CAR-Tと呼ばれる。
【００１１】
CAR-T細胞を用いて癌を治療する方法と関連し、3人の末期慢性リンパ性白血病(CCL, chronic lymphoid leukemia)患者にCD19を認知することができるように変形された細胞毒性T細胞(Cytotoxic T cell)を注射したところ、その中、2人は白血病が完全に治療され、その状態が10カ月程度持続したという報告があり(N. Engl J Med 2011; 365:725-733 August 25, 2011, Sic. Transl. Med 2011 Aug 10; 3(95):95ra73（非特許文献１）)、ここで用いられたCAR-Tは2世代に該当するものであり、補助刺激ドメインとして4-1BBを、信号伝達ドメインとしてCD3ζを用いたものである。上記CAR-T細胞の抗原結合ドメインは、白血病癌細胞の表面で発見されるCD19を抗原として認識する。
【００１２】
また、急性白血病患者にCTLO19を投与して治療したところ、患者30人中、27人が完全寛解を経験し、全体患者の67%が2年間完全寛解、78%が2年間生存したという報告があり、対象患者が再発性あるいは不応性患者であったことを考慮すれば、これは非常に驚くべきことである(N Engl J Med 2014; 371:1507-1517, October 16, 2014（非特許文献２）)。
【００１３】
現在、多様なCAR-T細胞を用いた治療法に対してリンパ腫(1ymphoma)、骨髄種(myeloma)等、多様な血液癌を対象に臨床試験が進行中であり、血液癌を対象に使用可能な医薬品としてのCAR-Tが市場に登場した。
【００１４】
しかし、CAR-T細胞を用いた固形癌の治療には、いくつかの障害物がある。例えば、CAR-T細胞を癌患者に静脈投与した場合にCAR-T細胞が腫瘍部位に移動するのに困難があり,敵対的腫瘍微細環境内でCAR-T細胞が機能的に抑制されると同時に制限された持続性(persistence)及び増殖を示す。
【００１５】
従って、このような問題を克服し、固形癌の治療が可能なCAR-T細胞を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】PCT国際公開公報WO2017/023138号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】N. Engl J Med 2011; 365:725-733 August 25, 2011, Sic. Transl. Med 2011 Aug 10; 3(95):95ra73
【非特許文献２】N Engl J Med 2014; 371:1507-1517, October 16, 2014
【非特許文献３】EmtagePCなど, Clin Cancer Res, 2008,14:8112-8122
【非特許文献４】BL Levine, Cancer Gene Therapy, 2015, 22:79-84
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、従来知られていたCAR-T細胞と比較し、固形癌における治療効果が顕著に優れたCARプラットフォーム、CAR-T細胞及びCAR発現ベクターを提供するためのものである。
【００１９】
固形癌を治療するための本発明のCAR-T細胞治療剤は、(1)CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果のために突然変異されたITAMを細胞質信号ドメインに導入し、及び/又は(2)抗原依存的にCAR遺伝子にCD3ζ信号伝達ドメイン、4-1BB補助刺激ドメインに加えてサイトカイン信号を誘導することができるようにIL-7RαまたはIL-2Rβの切断された細胞質ドメインを追加してCARトニック信号伝達(tonic signaling)を調節し、及び/又は(3)敵対的腫瘍微細環境の免疫抑制信号をCAR-T細胞内で活性化信号に変えるようにキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)を導入し、及び/又は(4)先天性免疫に関連する細胞の活性化を助け、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量が増加するようにするためにサイトカインIL-21がCAR-T細胞外に分泌されるようにした。
【００２０】
CAR-T細胞は、CARトニック信号伝達によりアネルギー(anergy)、分化、消尽、活性化-誘導されたCAR-T細胞の死滅を促進する。CAR-T細胞の固形癌の治療効能を高めるためには、CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果が必須であるため、固形癌の治療戦略においてCARトニック信号体系を調節することが必要である。
【００２１】
CARトニック信号伝達は、CAR-T細胞内信号伝達ドメインの置換により調節され得るため、癌抗原依存的にCAR-T細胞内にサイトカイン信号伝達を追加した。また、CD3ζドメイン内に調節されていない過度なITAM基盤信号により発生し得るCARトニック信号伝達を調節するために、突然変異された1つのITAMを細胞質信号ドメインに導入した。CARトニック信号伝達を調節することにより、CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果がさらに長く持続するようにした。
【００２２】
また、腫瘍微細環境で過発現される免疫抑制サイトカイン(immunosuppressive cytokine)であるTGF-ベータの抑制信号をCAR-T細胞内でサイトカインIL-18の活性化信号に変えるキメラスイッチレセプターを導入した。また、先天性免疫に関連する細胞の活性化を助けて、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量が増加するようにするためにサイトカインIL-21をCAR-T細胞外に分泌することができるように製作した。
【００２３】
本発明のキメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインの癌抗原ターゲットを変更することにより多様な癌腫に対するCAR-T細胞治療剤を製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記課題を解決するために、本発明は、抗原結合ドメイン;ヒンジ領域;膜通過ドメイン;補助刺激ドメイン;及び信号伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体が含まれたポリペプチドを提供する。ここで、上記補助刺激ドメインは4-1BBドメインまたはCD28ドメインを含んでもよく、4-1BBドメインとCD28ドメインをいずれも含んでもよく、上記信号伝達ドメインはCD3ζドメインを含む。
【００２５】
本発明において、上記4-1BBドメインと上記CD3ζドメインとの間にはIL-7Rαまたはその一部、またはIL-2Rβまたはその一部を含む。ここで、IL-7Rαの一部は配列番号15の配列であり、IL-2Rβの一部は配列番号17の配列であってもよい。上記IL-7Rαの細胞質ドメインの中の一部(配列番号15)は配列番号14のIL-7Rα全体配列中、266番〜328番の間の配列であり、上記IL-2Rβの細胞質ドメイン中の一部(配列番号17)は、配列番号16のIL-2Rβ全体配列の中、266番〜369番の間の配列である。
【００２６】
例えば、公知のanti-IL13Ra2 CAR-T細胞(配列番号22のYYB-103:PCT国際公開公報WO2017/023138号（特許文献１）を参照)を基盤としてIL-13Ra2に特異的なCARに、切断されたサイトカインIL-7Rα(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメインまたは切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369;配列番号17)の細胞質ドメインを、補助刺激ドメインとして4-1BB(配列番号11)とmutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置が配列番号31または配列番号32で置換される)の間に連結してCARトニック信号伝達を調節することにより、CAR-T細胞の生体内持続性及び腫瘍治療効能を高めた。
【００２７】
本発明において、上記CD3ζドメイン内には、3つのITAM(免疫受容体チロシン-基盤活性化モチーフ:immunoreceptor tyrosine-based activation motif) が含まれているが、このうち、3番目に位置したITAM部位の最初のYxxL及び2番目のYxxLが置換されていることが好ましい(ここで、x、yは任意のアミノ酸を意味する)(図3を参照)。
【００２８】
一般に、CD3ζドメイン内のITAMはロイシン(L)またはイソロイシン(I)からアミノ酸2個配列だけ離れているチロシン(Y)を含有するYxxL(またはI)の形態を2つ含む。上記YxxL/Iの形態は、通常、アミノ酸6〜8個だけ離れて存在するため、ITAMはYxxL/Ix(6-8)YxxL/Iの構造で表示することができる。
【００２９】
本発明において配列番号18で表されるCD3ζドメインには3つのITAM(配列番号18の21番〜35番:60番〜75番;及び91番〜105番の位置)が含まれているが、そのうち、3番目に位置したITAMの最初のモチーフYxxL(配列番号18の91番〜94番の位置)がYxxQで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLHM(配列番号18の102番〜107番の位置)がYxYVTM、または3番目に位置したITAMの最初のモチーフYxxL(配列番号18の91番〜94番の位置)がYyyLで置換され、2番目のモチーフYxxL(配列番号18の102番〜105番の位置)がYxxQで置換されていることが好ましい(ここで、x、yは任意のアミノ酸を意味する)。
【００３０】
例えば、本発明において、CD3ζドメインの3番目に位置したITAMを含む部位は配列番号31または32の配列に突然変異されてもよい。
【００３１】
具体的には、公知のanti-IL13Ra2 CAR-T細胞(YYB-103)の信号伝達ドメインであるCD3ζドメイン(配列番号18を参照)内に存在する3つのITAMモチーフ中の3番目に位置したITAMモチーフ(即ち、配列番号18の91番〜106番)部位の配列を Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R から Y L P Q S T A T K D T Y D Y V
T M Q A L P P R (配列番号 31)または公知のanti-IL13Ra2 CAR-T細胞(YYB-103)の信号伝達ドメインであるCD3ζドメイン(配列番号18を参照)内に存在する3つのITAMモチーフ中の3番目に位置したITAMモチーフ(即ち、配列番号18の91番〜105番)部位の配列を Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R から Y L S L S T A T K D T Y L P Q H M Q A L P P R (配列番号32)で突然変異させたキメラ抗原受容体を用いることができる(図3を参照)。
【００３２】
特に、本発明においてCD3ζドメインの3番目に位置したITAMの最初のモチーフYxxL(配列番号18の91番〜94番の位置)はYxxQで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLHM(配列番号18の102番〜106番の位置)がYxYVTM、または本発明においてCD3ζドメインの3番目に位置したITAMの最初のモチーフYxxL(配列番号18の91番〜94番の位置)がYyyLで置換され、2番目のモチーフXxxL(配列番号18の102番〜105番の位置)がYxxQで置換されていることが好ましい(ここで、x、yは任意のアミノ酸を意味する)。
【００３３】
本発明のポリペプチドは追加でサイトカインを含んでもよい。例えば、本発明のポリペプチドは追加されるサイトカインとしてIL-21を含んでもよい。ここで、上記サイトカインは自己切断型ペプチド(self-cleaving peptide)によりキメラ抗原受容体と連結されていることが好ましい。
【００３４】
自己切断型ペプチドは、例えば、公知の配列番号40〜43の2Aペプチドを用いることができる。自己切断型ペプチドは翻訳(translation)後に切断されるようになるが、C末端のプロリン(P)とグリシン(G)との間にあるペプチド結合が分解されることにより切断がなされる。従って、自己切断型ペプチド前後のタンパク質は互いに独立して発現するようになる。
【００３５】
従って、本発明によるポリペプチドはT細胞内で発現時に、上記サイトカインがキメラ抗原受容体(CAR)と分離され、分離されたサイトカインはT細胞の外部に分泌され得る。分離されたサイトカイン(例えば、IL-21)により先天性免疫に関連する細胞を活性化し、分化が十分ではないCAR-T細胞の含有量を増加することができる(図5を参照)。
【００３６】
即ち、IL-21発現によりCAR-T細胞製造工程時に試験管内で分化を防いで、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量を増加させ、CAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を高めることができ、また、固形癌周囲の先天性免疫細胞を活性化させて固形癌をさらに効果的に治療可能にした。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、キメラ抗原受容体に加えてさらにTGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインを含んでもよい。ここで、上記TGF-βR2エキソドメイン及びIL18Rエンドドメインの間にはIL18R膜通過ドメインが含まれていることが好ましい(図4を参照)。
【００３８】
本発明において、上記TGF-βR2エキソドメインは自己切断型ペプチドによりキメラ抗原受容体と連結されていることが好ましい。従って、本発明によるポリペプチドはT細胞内で発現時に、上記TGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインを含むポリペプチドがキメラ抗原誘導体(CAR)と分離される。分離されたポリペプチドのTGF-βR2エキソドメインはT細胞の外部に露出され、IL18R膜通過ドメインはT細胞の細胞膜に位置し、IL18RエンドドメインはT細胞の細胞質内に位置するようになる。
【００３９】
従って、T細胞の外部で免疫抑制サイトカインであるTGF-βが存在する場合、TGF-βが上記TGF-βR2エキソドメインに結合し、これにより上記IL18Rエンドドメインが活性化される。即ち、敵対的腫瘍微細環境の免疫抑制サイトカインであるTGF-βの抑制信号がCAR-T細胞内でサイトカインIL-18の活性化信号に変わるようになる。従って、上記TGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインを含むポリペプチドはキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)となる。
【００４０】
サイトカインIL-18は、T細胞内で免疫抑制物質の発現と調節T細胞の分化を抑制し、癌細胞に対する免疫反応を増進させる。IL-18による進行性固形癌(advanced solid tumors)におけるCAR-T細胞治療剤の効果を確認してみた結果、IL-18によりCD4+T細胞のFoxO1発現が減少し、また、CD8+T細胞ではIL-18によりT-bet発現は増加することを確認した。
【００４１】
結果的に、IL-18は、T-bethigh FoxO1low CAR-T、即ち、CAR-T細胞の持続性(persistence)を通じて進行性固形癌で優れた抗癌効果を奏する。特に、本発明においては固形癌周囲の免疫抑制サイトカイン(immunosuppressive cytokine)であるTGF-βと結合するための受容体であるTGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166;配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541;配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)がCAR-T細胞内で発現されるように製作し、敵対的腫瘍微細環境を逆利用して免疫抑制信号をCAR-T細胞内で活性化信号になるように変えた。
【００４２】
上記のようにキメラ抗原受容体に追加でTGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインが含まれているポリペプチドにも、上記で説明したようなサイトカイン(例えば、IL-21)がさらに含まれ得る。
【００４３】
即ち、キメラ抗原受容体にさらにTGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18R細胞質エンドドメインが含まれているポリペプチドのIL18Rエンドドメインに上記サイトカイン(例えば、IL-21)が自己切断型ペプチドにより連結され得る。
【００４４】
従って、本発明によるポリペプチドはT細胞内で発現時に、上記TGF-βR2エキソドメイン、IL18R膜通過ドメイン及びIL18Rエンドドメインを含むポリペプチドがキメラ抗原受容体(CAR)と分離され、また、サイトカインも別途に分離され得る。従って、分離されたサイトカインはT細胞の外部に分泌され、TGF-βR2エキソドメインはT細胞の外部に露出され、IL18R膜通過ドメインはT細胞の細胞膜に位置し、IL18RエンドドメインはT細胞の細胞質内に位置するようになる。
【００４５】
本発明によるポリペプチドは、例えば、配列番号23〜30及び34〜37のいずれか1つの配列で表されるポリペプチドであってもよい。
【００４６】
また、本発明は、上記のようなCAR含有ポリペプチドが発現されたCAR-T細胞に関する。
【００４７】
また、本発明は、抗原結合ドメイン;ヒンジ領域;膜通過ドメイン;補助刺激ドメイン;及び細胞質信号ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を発現するベクターに関する。ここで、上記CAR発現ベクターはCARをコードする核酸を含み、ここで、上記CARコーディング核酸は、上記補助刺激ドメインとして4-1BBドメインをコードする核酸及び上記信号伝達ドメインとしてCD3ζドメインをコードする核酸を含むものの、さらに上記4-1BBドメインをコードする核酸と上記CD3ζドメインをコードする核酸との間にはIL-7Rαまたはその一部、またはIL-2Rβまたはその一部をコードする核酸を含む。ここで、IL-7Rαの一部は、例えば、配列番号15の配列であってもよく、IL-2Rβの一部は、例えば、配列番号17の配列であってもよい。
【００４８】
本発明において、上記CD3ζドメインをコードする核酸は、CD3ζドメイン内に存在する3つのITAM中の3番目に位置したITAM部位の最初のYxxL及び2番目のYxxLが置換されたCD3ζドメインをコードする核酸であってもよい。望ましくは、上記3番目に位置したITAM部位の最初のモチーフYxxLはYxxQで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLHMはYxYVTMまたは最初のモチーフYxxLはYyyLで置換され、2番目のモチーフ部位YxxLはYxxQで置換されたCD3ζドメインをコードする核酸であってもよい(ここで、x、yは任意のアミノ酸を意味する)。
【００４９】
また、本発明のCAR発現ベクターは、さらにサイトカインIL-21をコードする核酸を含んでもよい。ここで、上記サイトカインIL-21をコードする核酸は自己切断型ペプチドをコードする核酸を通じてCARをコードする核酸と連結される。
【００５０】
また、本発明のCAR発現ベクターは、さらにTGF-βR2エキソドメインをコードする核酸、IL18R膜通過ドメインをコードする核酸及びIL18Rエンドドメインをコードする核酸を含んでもよい。ここで、上記TGF-βR2エキソドメインをコードする核酸は自己切断型ペプチドをコードする核酸によりCARをコードする核酸と連結される。
【００５１】
このように、TGF-βR2エキソドメインをコードする核酸、IL18R膜通過ドメインをコードする核酸及びIL18Rエンドドメインをコードする核酸を含むCAR発現ベクターは、さらにサイトカインIL-21をコードする核酸を含んでもよい。ここで、上記サイトカインIL-21をコードする核酸は自己切断型ペプチドをコードする核酸を通じてIL18Rエンドドメインをコードする核酸と連結される。
【００５２】
本発明は、上記のようなCAR発現ベクターを導入して製造されたCAR-T細胞に関する。
【００５３】
また、本発明は、上記のようなCAR-T細胞を含有する抗癌剤に関する。本発明のCAR-T細胞含有抗癌剤は必要に応じて薬剤学的に許容される添加剤をさらに含み得る。
【００５４】
本発明によるCAR含有ポリペプチドにおいて抗原結合ドメインの癌抗原ターゲットを必要に応じて選択して変更することにより、多様な癌腫に対するCAR-T細胞を製造することができる。例えば、上記抗原結合ドメインはIL13Rα2、血管新生作用と関連した抗原(anti-angiogenesis)、EFGRVIII、EphA2、αVβMesothelin及びグリピカン1(glypican1)などの抗原と結合することにより製造することができる。即ち、 IL-13Ra2, anti-angiogenesis, EGFRvIII, EphA2, aVβ3、glypican1及びmesothelinなどをターゲットとするリガンドまたは抗体(配列番号1〜7及び33を参照)を導入すれば、このターゲットに対する抗癌剤として活用することができる。従って、特定癌腫に対して抗癌効果を奏するCAR-T細胞を製造することができる。
【００５５】
膠芽腫と肺癌などの主要な腫瘍抗原(tumor antigen)であるEGFRvIIIの場合、非特異的結合を通じて示されるCAR-T細胞の副作用を減らすためにEGFRvIIIに対する特異性は維持しながらEGFR wild typeとの結合力を最小化するようにターゲット配列を変更させると同時にCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性(persistence)を最適化させた。
【００５６】
ターゲット配列(配列番号33)は、配列番号3の52番〜57番をSTGGYNからDPENDEに(HEAVY CHAIN CDR2部分)、配列番号3の101番をSからGに(HEAVY CHAIN CDR3部分)、配列番号3の229番をVからGに(LIGHT CHAIN CDR3部分)変更させると同時にCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性をCD8信号配列(signal sequence)を用いて向上させた(配列番号34及び35)。
【００５７】
aVβ3をターゲットとするCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性を高めるために、Gaussia princeps luciferase signal sequenceまたはCD8 signal sequenceを用いた(配列番号36及び37)。
【発明の効果】
【００５８】
本発明で開示しているCAR-T細胞は発現率及び持続性に優れ、人体内持続性及び抗腫瘍効果を示し、固形癌などに対する向上した治療効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明によるCAR含有ポリペプチドが固形癌を効果的に治療する過程を示したものである。
【図２】本発明によるCAR含有ポリペプチドプラットフォームに使用可能な抗原結合ドメインを説明する図である。
【図３】本発明によるCAR含有ポリペプチドにおいてCARトニックシグナリングの調節のためにCAR-T細胞内にサイトカイン信号伝達ドメインを導入したことを説明するための図である。
【図４】敵対的腫瘍微細環境の免疫抑制信号をCAR-T細胞内で活性化信号に変えるようにキメラスイッチ受容体を導入したことを説明するための図である。
【図５】先天性免疫に関連する細胞の活性化を助けて、分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量が増加するようにサイトカインIL-21がCAR-T細胞外に分泌されることを説明するための図である。
【図６】本発明によるCAR含有ポリペプチドの構造を示したものである。
【図７】本発明によるCAR含有ポリペプチドで用いられた自己切断型ペプチドを示したものである。
【図８】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率を示したグラフ及び表である。
【図９】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞のCAR発現率をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて分析した結果である。
【図１０】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞のTGF-βR2とIL-18Rのキメラスイッチ受容体発現率をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて分析した結果である。
【図１１】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞のDay10表現型(phenotype)をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて分析した結果である。
【図１２】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後にLDH assayを通じて細胞毒性(cytotoxicity)を確認したグラフとCAR-T細胞毒性試験に用いられたCAR-T細胞純度及び生存率を示した表である。
【図１３】本発明のCARで形質変形されたCAR-Tの24hまたは96h後に自発的毒性(spontaneous toxicity)を分析した結果である。
【図１４】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後にCAR-T細胞のCAR発現率の変化を、フローサイトメトリー分析機を用いて分析した結果である。
【図１５】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養48h後にCAR-T細胞のCAR発現率の変化を、フローサイトメトリー分析機を用いて分析した結果である。
【図１６】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養96h後にCAR-T細胞のCAR発現率の変化を、フローサイトメトリー分析機を用いて分析した結果である。
【図１７】本発明のキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h(A)後にCAR-T細胞のTGF-Rβ2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receprtor発現率の変化をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて分析した結果である。
【図１８】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24hと48h後にIFN-γサイトカイン生成を比較したグラフである。
【図１９】本発明のCARで形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24hと48h後にIL-21サイトカイン生成を比較したグラフである。
【図２０】癌抗原EGFRvIIIターゲットの場合、非特異的結合を通じて示されるCAR-T細胞の副作用を減らすためにEGFRvIIIに対する特異性は維持しながらEGFR wild typeとの結合力を最小化するようにターゲット配列を変更させると同時にCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性を最適化したキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率を示したグラフ及び表である(YYB105、#13、#14)(配列番号39、34、35参照)。癌抗原がavβ3ターゲットの場合、CAR-T細胞におけるCAR発現率を最適化したキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率を示したグラフ及び表である(YYB107、#15、#16)(配列番号38、36、37参照)。
【図２１】癌抗原EGFRvIIIターゲットの場合、非特異的結合を通じて示されるCAR-T細胞の副作用を減らすためにEGFRvIIIに対する特異性は維持しながらEGFR wild typeとの結合力を最小化するようにターゲット配列を変更させると同時にCAR-T細胞におけるCAR発現率を最適化したキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞におけるCAR発現率を示したグラフである(YYB105、#13、#14)(配列番号39、34、35参照)。癌抗原がaVβ3ターゲットの場合、CAR-T細胞におけるCAR発現率を最適化したキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞におけるCAR発現率を示したグラフである(YYB107、#15、#16)(配列番号38、36、37参照)。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下、実施例を通じて本発明を具体的に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の思想及び技術的範囲がいかなる意味でも制限されるものではないことに留意すべきである。また、本発明は、参照として引用される図面に示された実施形態の正確な配列及び方法に制限されないものと理解されるべきである。
【００６１】
実施例1:固形癌細胞に過発現されるIL13Rα2に特異的に結合して効果的に治療するための新規なキメラ抗原受容体(CAR)プラットフォーム製造
【００６２】
ヒトIL13(P35225.1)、ヒトCD3(P20963-1)、ヒトCD8A(P01732)、ヒトCD28(P10747)、ヒトCD3ζ(P20963)、ヒト4-1BB(Q07011)、IL7RA(P16871)、IL2RB(P14784)、TGFR2(P37173)、IL18R(Q13478)、IL21(Q9HBE4)、IL2(P60568)、T2A、P2A、及びヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)を科学文献及び公共が利用可能なデータベースを用いて、コドン最適化合成DNA(codon-optimized synthetic DNA)で構成された、キメラ抗原受容体含有ポリペプチド(配列番号23〜30及び34〜37及び図6の#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11、#12を参照)発現ベクターを用いてCAR含有ポリペプチドを製作した(図6及び図7を参照)。
【００６３】
具体的には、合成DNAをXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合し、CAR含有ポリペプチドを発現するベクターを製作し、このベクターをT細胞に形質導入することにより、CAR含有ポリペプチドが発現されたT細胞を製作することができる。
【００６４】
図6のポリペプチド#1の完成した構造体は、kozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K);特許文献１のYYB-103を参照)、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入される3つのグリシン(GGG)(特許文献１のYYB-103を参照)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL-7RΑ(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号31の配列で突然変異される)、T2A、CD8A信号配列(leader sequence)、TGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166:配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541:配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体(chimeric switch receptor)、P2A、ヒトIL2信号配列(leader sequence)、IL-21(アミノ酸位置23-155;配列番号21)配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#1及び図7を参照)。
【００６５】
図6のCAR含有ポリペプチド#2の完成した構造体は、kozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL-7RΑ(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号31の配列で突然変異される)、T2A,CD8A信号配列、TGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166;配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541;配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#2及び図7を参照)。
【００６６】
図6のCAR含有ポリペプチド#5の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL-7RΑ(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号31の配列で突然変異される)、T2A、ヒトIL2信号配列、IL-21(アミノ酸位置23-155:配列番号21)配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#5及び図7を参照)。
【００６７】
図6のCAR含有ポリペプチド#6の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL-7RΑ(アミノ酸位置265-328;配列番号15)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号31の配列で突然変異される)配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#6及び図7を参照)。
【００６８】
図6のCAR含有ポリペプチド#7の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369;配列番号17)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号32の配列で突然変異される)、T2A、CD8A信号配列、TGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166:配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541;配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体、P2A、ヒトIL2信号配列、IL-21(アミノ酸位置23-155)配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6#7、図7)。
【００６９】
図6のCAR含有ポリペプチド#8の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S6R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369:配列番号19)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号32の配列で突然変異される)、T2A,CD8A信号配列、TGF-βR2エキソドメイン(アミノ酸位置23-166;配列番号19)とサイトカイン受容体であるIL-18R(アミノ酸位置323-541;配列番号20)の膜通過ドメイン及びエンドドメインを含むキメラスイッチ受容体配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#8及び図7を参照)。
【００７０】
図6のCAR含有ポリペプチド#11の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369:配列番号17)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号32の配列で突然変異される)、T2A、ヒトIL2信号配列、IL-21(アミノ酸位置23-155:配列番号21)配列とXhoI/NotI切断分を含む(図6のCAR含有ポリペプチド#11及び図7を参照)。
【００７１】
図6のCAR含有ポリペプチド#12の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、ヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)、ヒトIL13.E11K.R64D.S67D.R107K成熟タンパク質配列(human IL13(E11K.R64D.S67D.R107K))、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8αのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、切断されたサイトカインIL2Rβ(アミノ酸位置266-369;配列番号17)の細胞質ドメイン、mutant CD3ζ(配列番号18の91番〜113番の位置は配列番号32の配列で突然変異される)、配列とXhoI/NotI切断部分を含む(図6#12、図7)。
【００７２】
CAR含有ポリペプチド#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11及び#12の全体配列を配列番号23〜30に示した。
【００７３】
最終的に製作されたCAR遺伝子断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(EmtagePCなど, Clin Cancer Res, 2008, 14:8112-8122（非特許文献３）)。本実施例においてキメラ抗原受容体の活性を比較するために、YYB103(配列番号22)をさらに製作した。
【００７４】
実施例2:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の製造
【００７５】
CARを発現する高力価のPG13クローンは一時的にPhoenix-Ampho及びフェニックス-エコPhoenix-Eco細胞を実施例1で製作されたレトロウイルス発現ベクター感染させ、それ以後、感染したPhoenix-Ampho及びPhoenix-Eco細胞から無細胞Vector stockをPG13細胞に感染させることにより作った。
【００７６】
高力価の単一クローンは、抗-IL-13単一クローン抗体(BD Pharmingen)を用いてPG13/#1、PG13/#2、PG13/#5、PG13/#6、PG13/#7、PG13/#8、PG13/#11、またはPG13/#12細胞を染色した後にフローサイトメトリー分析機により単一クローンを分離した。高い力価のPG13/#1、PG13/#2、PG13/#5、PG13/#6、PG13/#7、PG13/#8、PG13/#11、またはPG13/#12クローンは限界希釈法により2番目のサブクローニングにより作られた。サブクローンは、高いCAR発現を安定的に示し、末梢血液に効率のよい形質導入能力のために選択された。
【００７７】
抗-IL-13単一クローン抗体(BD Pharmingen)を用いて形質導入されたPG13/#1、PG13/#2、PG13/#5、PG13/#6、PG13/#7、PG13/#8、PG13/#11、またはPG13/#12細胞をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて形質導入の程度を分析した。形質導入されたPG13/#1、PG13/#2、PG13/#5、PG13/#6、PG13/#7、PG13/#8、PG13/#11、またはPG13/#12細胞の上層液はレトロウイルスを含み、T細胞の遺伝的変形のために収去した。
【００７８】
末梢血液単核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)は、健康な供与者から得た全血(whole blood)をFicoll Paque(GE Healthcare)に入れて遠心分離を用いて分離した。分離されたPBMCをHuman IL-2(NOVARTIS)100IU/mL条件である状態でanti-CD3単一クローン抗体(eBioscience)100ng/mLを添加して培養することにより、T細胞分画を活性化させた(BL Levine, Cancer Gene Therapy, 2015, 22:79-84（非特許文献４）)。培養2-3日後に、細胞の大部分はT細胞であり、一部のナチュラルキラー細胞(natural killer cell)が0〜2%の比率で含まれていた。活性化段階2〜3日後、T細胞にretroviral上層液を用いて2日にわたって2回の形質導入を行い、洗浄後にフラスコで4〜7日間細胞を増殖した。細胞は12〜28日間、攪拌用プラットフォーム装置(WAVE生物反応器システム)上で培養した。IL-2を100IU/mLに維持した。このような方式で変形されたT細胞は分析実験に用いられた。
【００７９】
実験例1:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率のチェック
【００８０】
実験結果
上記実施例2で製造されたT細胞に対して細胞数を計数してCAR-Tの成長速度(cell growth)及び生存率(viability)を確認し、その結果を図8に示した。
【００８１】
全群(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)の細胞数、成長速度は曜日によって対照群であるYYB103より高く示され、培養12日目から細胞が急速に成長することが分かり、生存率も90%以上で示された(図8を参照)。
【００８２】
実験例2:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞表面のCAR発現率のチェック
【００８３】
実験方法(flow cytometric analysis)
フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的には、PE-conjugated anti-human IL-13 単一クローン抗体(BD Pharmingen)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、形質導入されたT細胞の表面CARの発現率をチェックした。
【００８４】
実験結果
実施例2で製造されたIL13Rα2特異的な8種のCAR含有ポリペプチド(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)がT細胞の表面で発現されるかどうかを確認するために、実施例2によりT細胞培養を28日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。
【００８５】
分析の結果、図9に示されているように、生きているT細胞の表面に発現されたキメラ抗原受容体の発現率は24.5%〜84.2%であり、追加のT細胞活性化や形質導入がなくてもIL13Rα2特異的キメラ抗原受容体の発現は4週間まで安定的に維持された(図9を参照)。
【００８６】
実験例3:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の表面のTGF-βR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receptor発現率のチェック
【００８７】
実験方法(flow cytometric analysis)
フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的にはHuman TGF-beta RII Fluorescein-conjugated Antibody(FAB2411F)(BD Pharmingen)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、形質導入されたT細胞の表面のTGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receprtor発現率をチェックした。
【００８８】
実験結果
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)の細胞表面でTGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receprtorが発現されるかどうかを確認するために実施例2によりT細胞培養を14日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。分析結果、生きているT細胞表面のTGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receprtorの発現率は〜85%で示された(図10を参照)。
【００８９】
実験例4:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の表面の表現型(phenotype)のチェック
【００９０】
実験方法(flow cytometric analysis)
フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的にはFITC-conjugated CD45RAAb(HI100)(Biolegend)、PE-conjugated CCR7Ab(G043H7)(Biolegend)、PE-Cy7-conjugated CD62L Ab(DREG-56)(Biolegend)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、形質導入されたT細胞の表面の分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量、CCR7+CD45RA+CD62L+phenotypeをチェックした。
【００９１】
実験結果
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)の細胞表面で分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量を確認するために実施例2によりT細胞培養を10日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。分析の結果、生きているT細胞の表面に発現されたCCR7+CD45RA+CD62L+phenotypeは実施例2で製作したCAR-Tの全群(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)の細胞表面で対照群である非形質導入試料(untrasnduced sample)より〜5%以上、形質導入試料CAR-T対照群であるYYB103より〜10%以上CCR7+CD45RA+CD62L+phenotypeを示す分化が十分ではない記憶CAR-T細胞の含有量を確認した(図11を参照)。
【００９２】
実験例5:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のIL13Rα2が過発現される膠芽腫に対する細胞毒性のチェック
【００９３】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)IL13Rα2特異的なCAR-T細胞の細胞毒性を測定するためにLDH(Promega)キットを用いて細胞毒性分析(cytotoxicity assay)を行った。具体的には、CAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化した後、10日後に用い、CAR発現率が20〜40%であるCAR-T細胞を6-well plateに1:2(effector: target=1 x 106 cells : 2 x 106 cells)の比率で細胞を入れて37℃で24時間反応させた。用いられた標的細胞はIL13Rα2を発現するヒト脳癌細胞株U87細胞と正常細胞対照群である293FT細胞を用いた。
【００９４】
実験結果
本発明を通じて製作されたIL13Rα2特異的なCAR-T細胞が標的癌細胞(IL13Rα2を発現するU87)を効果的に死滅させるかを分析した。先に言及した標的癌細胞(IL13Rα2を発現するU87)と正常細胞(293FT)をそれぞれの活性化したCAR-T細胞と共に培養して細胞毒性を比較分析する方法を用いた。図12で示されているように、本発明により製造された全てのCAR-T細胞は、形質導入されていない活性化したT細胞と比較するとき、50〜70%高い水準に標的癌細胞(U87)の死滅を誘導する結果を示した。特に、本発明のCAR-T#5、#6、#11において細胞毒性が高く示された。また、IL-7Rαを含むCAR-T細胞(#1,2,5,6)が、IL-2Rβを含むCAR-T細胞(#7,8,11,12)より全体的に高い細胞毒性を示した。
【００９５】
標的細胞に関する比較対象にIL13Rα2を発現しない293FT細胞を正常細胞対照群として用いた実験結果では、IL13Rα2に特異的なCAR-T細胞の場合、非常に弱い細胞毒性(2〜4%)を示すことを確認した。これは、本実験に用いられたキメラ抗原受容体がIL13Rα2に特異的に結合するということを示す。
【００９６】
本実験例を通じてIL13Rα2特異的なキメラ抗原受容体T細胞が正常細胞(293FT)には毒性を示さず、IL13Rα2を発現する標的癌細胞(U87)のみを顕著に死滅させることが分かる。
【００９７】
図13は、本発明のキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の標的細胞との共培養なしに24hまたは96h後にLDH assayを通じたspontaneous toxicityを確認した結果である。YYB103 spontaneous toxicityが他の群より高いために、U87共培養では8つの群がYYB103より高い細胞毒性を示すと予想され、本発明のキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)は安全性及び安定性の面で比較優位にあると予想される。
【００９８】
実験例6:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のIL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫と共培養時のCAR発現率の変化チェック
【００９９】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)細胞のIL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫と共培養時のCAR発現率の変化をチェックするために、CAR発現率が20〜40%のCAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化した後、10日後に用い、6-well plateに1:2(effector: target=1x106 cells : 2x106 cells)の比率で細胞を入れて37℃で24時間、48時間、96時間反応させた。96時間のサンプルは48時間後にtarget 2x106 cellsをadd後、フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的には、PE-conjugated anti-human IL-13単一クローン抗体(BD Pharmingen)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、CAR発現率の変化をチェックした。
【０１００】
実験結果
実施例2で製造されたIL13Rα2特異的な8種のCAR(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)がIL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫と共培養時のCAR発現率の変化を確認するために実施例2によりT細胞培養を10日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。分析結果、図14で示されているように、24時間U87(ヒト膠芽腫)との共培養では8種の全群でCAR発現変化がYYB103より少なく示された(図14)。
【０１０１】
48時間U87(ヒト膠芽腫)との共培養では8種の全群でCAR発現変化がYYB103より少なく示された(図15)。
【０１０２】
96時間U87(ヒト膠芽腫)との共培養では#1、#2、#5、#6、#7の5種の群で発現変化がYYB103より少なく示された(図16)。96時間U87(ヒト膠芽腫)との共培養後のYYB103のCAR発現は微々たる水準を示した(図16)。
【０１０３】
IL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫に対する共培養時のCAR発現率の変化は、標的細胞との共培養なしに、または正常細胞対照群として用いられた293FT細胞との共培養時にCAR発現率の変化確認により、本発明によるキメラ抗原受容体は敵対的腫瘍微細環境でCAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を示し、同時に毒性を低下させることと期待される。
【０１０４】
実験例7:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のIL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫と共培養時のTGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receprtor発現率の変化チェック
【０１０５】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)細胞のIL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫と共培養時のTGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receprtor発現率の変化をチェックするために、CAR発現率が20〜40%のCAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化後、10日後に用い、6-well plateに1:2(effector: target=1x106 cells : 2x106 cells)の比率で細胞を入れて37℃で24時間、48時間、96時間反応させた。96時間サンプルは48時間後にtarget 2x106 cellsをadd後、フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的にはHuman TGF-beta RII Fluorescein-conjugated Antibody(FAB2411F)(BD Pharmingen)を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、TGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receptor発現率の変化をチェックした。
【０１０６】
実験結果
実施例2で製造されたIL13Rα2特異的な8種のCAR(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)がIL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫と共培養時のTGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receptor発現率の変化を確認するために、実施例2によりT細胞培養を10日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。
【０１０７】
分析結果、図17で示されているように、24時間共培養後、4種の群(#1、#2、#7、#8)でTGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receptor発現がCAR-T cell onlyよりヒト膠芽腫U87共培養群で減少する様相を呈するが、平均30%の発現を示した(図17)。48時間共培養後、4種の群(#1、#2、#7、#8)でTGFβR2とIL-18Rのchimeric switch receptor発現がCAR-T cell onlyよりヒト膠芽腫U87共培養の群で減少する様相を呈するが、平均25%の発現を示した。96時間共培養後、4種の群(#1、#2、#7、#8)でTGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receptor発現がCAR-T cell onlyよりU87共培養の群で減少する様相を呈するが、平均15%の発現を示した。標的細胞との共培養なしに、または正常細胞対照群として用いられた293FT細胞との共培養時よりは発現率の変化が多かったが、IL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫に対する共培養時のTGFβR2エキソドメインとIL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメインのchimeric switch receptor発現率変化の確認により、本発明によるキメラ抗原受容体は敵対的腫瘍微細環境でCAR-T細胞の優れた生体内持続性及び抗腫瘍効果を奏すると期待される。
【０１０８】
実験例8:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のtarget細胞に対するサイトカイン(IFN-gamma)生成の確認
【０１０９】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)細胞とIL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後と48h後のIFN-γサイトカイン生成を確認するために、CAR発現率が20〜40%であるCAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化した後、10日後に用い、6-well plateに1:2(effector : target=1x106 cells : 2x106 cells)の比率で細胞を入れ、6well culture plateのwell当り培養培地6mLを入れて37℃で24時間培養後に上層液100ulを取り1.5ml tubeに移した後、48時間まで追加培養して上層液100ulを同一に取った。
【０１１０】
ELISA分析機(R&D systems)メーカーの指針に従って下記の通りIFN-gamma分析実験を行った。IFN-gamma standard  bottleに3 ml calibrator diluent RD6-21を入れた後、振盪機(shaker)で15分間混ぜて1.5ml tubeに1mlずつ分注してstandard 1を2つ作った。分注した1mlのstandard 1から500ul取って階段希釈してstandard 7まで作った。Blankを作るために培養培地500ulとcalibrator diluent RD6-21 500ulを混ぜて準備した。
【０１１１】
Sampleを1/20に希釈するために、Sample数だけの新たな1.5ml tubeに190ulのcalibrator diluent RD6-21を入れ、sampleの上層液10ulを取ってtotal volumeが200ulでassay試料を準備した。Wash bufferを作るために500ml storage bottleに蒸溜水500mlと20mlのwash buffer concentrateを十分に混ぜて準備した。
【０１１２】
IFN-gamma microplateにassay diluent RD1-51(Blue dye)をstandard 1〜7とblank、sample wellに100ulずつ入れた。上記で準備したblank、standardとsampleを100ulずつ入れた後、plate sealerを付着して常温で2時間反応させた。反応後に反応液を捨て、準備しておいたwash buffer 400ulを入れてwellを4回washした。IFN-gamma conjugateを各well当り200ul入れてplate sealerを付着して常温で2時間反応させた。反応液を捨てて400ul wash bufferを用いて4回washした。発色試薬(Color reagent)A:Bを1:1の比率で混ぜた後にwell当り200ulずつ入れてplate sealer付着後にホイルで光を遮断させた後、30分間常温で反応した。反応後にstop solution 50ulを各wellに入れて30分間以内に450nmで測定した。
【０１１３】
実験結果
YYB103が相対的に他の試料に比べて多量のIFN-gammaを分泌することが示され、ヒト膠芽腫U87cell存在下にCAR-T細胞培養時にIL-7Rα信号伝達ドメインを含むCAR-T(#1,2,5,6)がIL-2Rβ信号伝達ドメインを含むCAR-T(#7,8,11,12)よりIFN-gammaをさらに多く分泌することが示された。24時間と48時間培養後の試料間の結果は類似の様相を示した(図18)。
【０１１４】
図12でのように本発明のキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞とヒト脳癌細胞株U87細胞及び正常細胞対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後にLDH assayを通じた細胞毒性(cytotoxicity)確認した結果、8群の標的細胞の殺傷能力は同様に示されたが、IFN-γの生成が少ないことから推察する時、cytokineによる悪影響(Cytokine release syndrome, CRS)なしに標的細胞を殺傷できるという点で安全性の面で、CAR-T細胞治療剤の効果が副作用が少なく、治療効果は優れると予測される。
【０１１５】
実験例9:新規なキメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞のサイトカイン(IL-21)生成のチェック
【０１１６】
実験方法
実施例2で製造されたCAR-T(#1、#2、#5、#6、#7、#8、#11または#12)細胞とIL13Rα2が過発現されるヒト膠芽腫U87細胞及び正常細胞の対照群として用いられた293FT標的細胞との共培養24h後と48h後にサイトカインIL-21生成を確認するため、CAR発現率が20〜40%であるCAR-T細胞(effector細胞)はanti-CD3 Abで細胞活性化後、10日後に用い、6-well plateに1:2(effector : target=1x106 cells : 2x106 cells)の比率で細胞を入れ、6well culture plateのwell当り培養培地6mLを入れて37℃で24時間培養後に上層液100ulを取って1.5ml tubeに移した後、48時間まで追加培養して上層液100ulを同一に取った。
【０１１７】
ELISA分析機(Invitrogen)メーカーの指針に従って下記の通りIL-21分析実験を行った。96well ELISA plateにwell当り100ul capture antibodyを入れて4℃でovernight間反応させた。反応後に250ul wash bufferを用いてwellを3回washする。Well当り200ulずつELISA/ELISASPOT diluentを入れて室温で1時間反応させた。反応後に、準備したblank、cytokine IL-21 standardとsampleを100ulずついれた後well当り100ulずつELISA/ELISASPOT diluentを入れてplate sealerを付着して常温で2時間反応させた。反応後、250ul wash bufferを用いてwellを3回washした。Well当り100ulずつdetection antibodyを入れてplate sealerを付着して常温で1時間反応させた。反応後、250ul wash bufferを用いてwellを3回washした。Well当り100ulずつAvidin-HRPを入れてplate sealerを付着して常温で30分間反応させた。反応後、250ul wash bufferを用いてwellを5回washした。Well当り100ulずつ1x TMB solutionを入れてplate sealerを付着して常温で30分間反応させた。反応後にstop solution 50ulを各wellに入れて30分以内に450nmで測定した。
【０１１８】
実験結果
IL-21遺伝子を含んでいる#1、#5、#7、#11 CAR-T細胞でIL-21が分泌されることを確認した。ヒト膠芽腫U87 cellと共培養時に、さらに多量のIL-21が分泌され、全体的に24時間と48時間における実験結果の様相が同様に示された点から培養時間による差は見られなかった。48時間における実験結果が24時間における実験結果に比べてIL-21の濃度が高くなったことからIL-21の分泌は継続して進行されると見られた(図19)。
【０１１９】
癌細胞の環境でIL-21の分泌は先天性免疫に関連する細胞の活性化を助けて癌細胞の死滅能力を高めると判断される。
【０１２０】
実施例3:癌抗原EGFRvIIIターゲットCAR及びaVβ3ターゲットCARベクターの製作
【０１２１】
膠芽腫と肺癌などの主要な腫瘍抗原(tumor antigen)であるEGFRvIIIの場合、非特異的結合を通じて示されるCAR-T細胞の副作用を減らすために、EGFRvIIIに対する特異性は維持しながらEGFR wild typeとの結合力を最小化するように配列番号33はまず配列番号3の52番〜57番をSTGGYNからDPENDEに(HEAVY CHAIN CDR2部分)、配列番号3の101番をSからGに(HEAVY CHAIN CDR3部分)、配列番号3の229番をVからGに(LIGHT CHAIN CDR3部分)変更させた。
【０１２２】
ヒトCD3(P20963-1)、ヒトCD8A(P01732)、ヒト4-1BB(Q07011)、ヒトCD3Z(P20963)、Gaussia princeps luciferase、そしてヒトカッパ軽鎖信号配列(HuVHCAMP)を科学文献及び公共が利用可能なデータベースを用いて最適化し、codon-optimized synthetic DNAで構成されたキメラ抗原受容体含有ポリペプチド(配列番号34〜37の#13、#14、#15、#16)を製作した。
【０１２３】
CAR含有ポリペプチド#13の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence,CD8 signal sequence、配列番号3 EGFRv111と結合する抗原結合ドメイン、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8Aのヒンジ領域、ヒトCD3膜通過ドメイン、細胞質4-1BBの補助刺激信号ドメイン、CD3ζ細胞質ドメイン(配列番号18)配列とXhoI/NotI切断部分を含む。
【０１２４】
最終的に製作されたCAR遺伝子の断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(非特許文献３)。本実施例においてキメラ抗原受容体の活性を比較するために、YYB105(配列番号39:特許文献１を参照)を追加で製作した。
【０１２５】
CAR含有ポリペプチド#14の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、CD8A signal sequence、配列番号33 EGFRv111と結合する抗原結合ドメイン、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に3つのグリシン(GGG)添加、ヒトCD8Aのヒンジ領域、ヒトCD3膜通過ドメイン、細胞質41BBの補助刺激信号ドメイン、CD3ζ細胞質ドメイン(配列番号18)配列とXhoI/NotI切断部分を含む。最終的に製作されたCAR遺伝子の断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(非特許文献３)。
【０１２６】
aVβ3anti-angiogenicの場合、これらをターゲットとするCAR-T細胞におけるCAR発現率及びpersistenceを最適化させた。aVβ3の場合、これらをターゲットとするCAR-T細胞におけるCAR発現率及び持続性をGaussia princeps luciferase signal sequenceまたはCD8 signal sequenceを用いて向上させた(配列番号36と配列番号37)
【０１２７】
CAR含有ポリペプチド#15の完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、Gaussia princeps luciferase signal sequence、配列番号5{αVβ3と結合する抗原結合ドメイン}、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に導入された3つのグリシン(GGG)、ヒトCD8Aのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質41BBの補助刺激信号ドメイン、CD3ζ細胞質ドメイン(配列番号18)配列とXhoI/NotI切断部分を含む。最終的に製作されたCAR遺伝子断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(非特許文献３)。本実施例においてキメラ抗原受容体の活性を比較するために、YYB107(配列番号38:特許文献１を参照)を追加で製作した。
【０１２８】
#16完成した構造体はkozak consensus ribosome-binding sequence、CD8A signal sequence、配列番号5{αVβ3と結合する抗原結合ドメイン}、CARタンパク質の溶解度を高めてキメラ抗原受容体の発現を増加させるために抗原結合ドメインとヒンジとの間に3つのグリシン(GGG)添加、ヒトCD8Aのヒンジ領域、ヒトCD8膜通過ドメイン、細胞質41BBの補助刺激信号ドメイン、CD3ζ細胞質ドメイン(配列番号18)配列とXhoI/NotI切断部分を含む。最終的に製作されたCAR遺伝子の断片をXhoI/NotIで切断されたMFGレトロウイルス発現ベクターに接合させた(非特許文献３)。
【０１２９】
実施例4:キメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の製造
【０１３０】
CARを発現する高力価のPG13クローンは一時的にPhoenix-Ampho及びPhoenix-Eco細胞を実施例1で製作されたレトロウイルス発現ベクターに感染させ、それ以後に感染したPhoenix-Ampho及びPhoenix-Eco細胞から無細胞Vector stockをPG13細胞に感染させることにより作った。高力価の単一クローンはanti-myc Ab(BD Pharmingen)を用いてPG13/#13、PG13/#14、PG13/#15、PG13/#16細胞を染色した後にフローサイトメトリー分析機により単一クローンを分離した。anti-myc Abを用いて形質導入されたPG13/#13、PG13/#14、PG13/#15、PG13/#16細胞をフローサイトメトリー分析機(Flow cytometry analysis)を用いて形質導入の程度を分析した。形質導入されたPG13/#13、PG13/#14、PG13/#15、PG13/#16細胞の上層液はレトロウイルスを含み、T細胞の遺伝的変形のために収去した。末梢血液単核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)は健康な供与者から得た全血(whole blood)をFicoll Paque(GE Healthcare)に入れて遠心分離を用いて分離した。分離されたPBMCをHuman IL-2(NOVARTIS)100IU/mLの条件である状態でanti-CD3単一クローン抗体(eBioscience)100ng/mLを添加して培養することによりT細胞の分画を活性化させた(非特許文献４)。培養2-3日後に、細胞の大部分はT細胞であり、一部のナチュラルキラー細胞(natural killer cell)が0〜2%の比率で含まれていた。活性化段階2〜3日後、T細胞にretroviral上層液を用いて2日にわたり2回形質導入を行い、洗浄後にフラスコで14日間細胞を増殖した。IL-2を100IU/mLに維持した。このような方式で変形されたT細胞は分析実験に用いられた。
【０１３１】
実験例1:キメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞の成長速度及び生存率のチェック
【０１３２】
実験結果
上記実施例4で製造されたT細胞に対して細胞数を計数してCAR-Tの成長速度及び生存率を確認し、その結果を図20に示した。全群(#13、#14、#15、#16)の細胞の数、成長速度は曜日により対照群であるYYB105または対照群であるYYB107と類似し、生存率(viability)も90%以上で示された(図20)。
【０１３３】
実験例2:キメラ抗原受容体で形質変形されたCAR-T細胞表面のCAR発現率のチェック
【０１３４】
実験方法(flow cytometric analysis)
フローサイトメトリー分析(>30,000 events)のためにBD LSRII装備(Becton Dickinson)とBD FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いた。具体的にはPE-conjugated anti-myc抗体を添加する前の細胞を2% bovine serum albuminを含有したPBSに1回洗浄を行った。洗浄後に光が遮断された状態で4℃で30分間それぞれの抗体と反応した後、細胞を1回洗浄し、形質導入されたT細胞表面のCARの発現率をチェックした。
【０１３５】
実験結果
実施例3で製造された4種のCAR(#13、#14、#15、#16)がT細胞の表面で発現されるかどうかを確認するために実施例4によりT細胞培養を14日間進行した後、実験方法によりフローサイトメトリー分析(flow cytometric analysis)を行った。
【０１３６】
分析結果、図21で示されているように、生きているT細胞の表面に発現されたキメラ抗原受容体の発現率が対照群YYB105(37.4%)より#13(43.0%)、#14(50.8%)に増加した(図21)。対照群YYB107(24.6%)より#15(45.9%)、#16(40.0%)に増加した(図21)。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明は、癌治療の分野で急速に発展しているCAR-T細胞に関するものであり、本発明によるCAR-T細胞は発現率及び持続性が顕著に優れ、固形癌などに対する向上した治療効果を奏し、カスタマイズ型癌治療の分野で有用に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【０１３８】
配列番号1 {IL13Rα2と結合する抗原結合wild type IL-13ドメインの配列} 
長さ: 112 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
G P V P P S T A L R E L I E E L V N I T Q N Q K A P L C N G S M V W S I N L T A G M Y C A A L E S L I N V S G C S A I E K T Q R M L S G F C P H K V S A G Q F S S L H V R D T K I E V A Q F V K D L L L H L K K L F R E G Q F N 
【０１３９】
配列番号2 {血管新生作用と関連した抗原と結合できる抗原結合ドメイン} 
長さ: 92 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
E V V A A T P T S L L I S W R H P H F P T R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V L Q P P S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V V E R N G R E L N T P P I S I N Y R T H H H H H H 
【０１４０】
配列番号3 {EGFRvlllと結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 252 
タイプ: scFv protein 
生物名: human 
配列: 
Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I S T G G Y N T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y S S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N V P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L 
【０１４１】
配列番号4 {EphA2と結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 141 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
D R H T V F W N S S N P K F R N E D Y T I H V Q L N D Y V D I I C P H Y E D H S V A D A A M E Q Y I L Y L V E H E E Y Q L C Q P Q S K D Q V R W Q C N R P S A K H G P E K L S E K F Q R F T A F A L A K E F K A G H S Y Y Y I S K P I H Q H E D R C L R L K V T V S G E Q K L I S E E D L 
【０１４２】
配列番号5 {αVβ3と結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 104 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
V S D V P R D L E V V A A T P T S L L I S W D A P A V T V R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V P G S K S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V T P R G D W N E G S K P I S I N Y R T E Q K L I S E E D L 
【０１４３】
配列番号6 {グリピカン1(glypican1)と結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 418 
タイプ: ligand protein 
生物名: human 
配列: 
T S P C D N F D C Q N G A Q C I V R I N E P I C Q C L P G Y Q G E K C E K L V S V N F I N K E S Y L Q I P S A K V R P Q T N I T L Q I A T D E D S G I L L Y K G D K D H I A V E L Y R G R V R A S Y D T G S H P A S A I Y S V E T I N D G N F H I V E L L A L D Q S L S L S V D G G N P K I I T N L S K Q S T L N F D S P L Y V G G M P G K S N V A S L R Q A P G Q N G T S F H G C I R N L Y I N S E L Q D F Q K V P M Q T G I L P G C E P C H K K V C A H G T C Q P S S Q A G F T C E C Q E G W M G P L C D Q R T N D P C L G N K C V H G T C L P I N A F S Y S C K C L E G H G G V L C D E E E D L F N P C Q A I K C K H G K C R L S G L G Q P Y C E C S S G Y T G D S C D R E I S C R G E R I R D Y Y Q K Q Q G Y A A C Q T T K K V S R L E C R G G C A G G Q C C G P L R S K R R K Y S F E C T D G S S F V D E V E K V V K C G C T R C V S E Q K L I S E E D L 
【０１４４】
配列番号7 {mesothelinと結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 262 
タイプ: scFv protein 
生物名: human 
配列: 
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY CAREGKNGAFDIWGQGTMVTVSS GSTSGSGKPGSGEGSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDV WGQGTTVTVSSGILGS 
【０１４５】
配列番号8 {ヒンジ領域配列-1} 
長さ: 47 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D 
【０１４６】
配列番号9 {ヒンジ領域配列-2} 
長さ: 45 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A A R P A A G G A V H T R G L D F A 
【０１４７】
配列番号10 {膜通過ドメイン配列-1} 
長さ: 21 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T 
【０１４８】
配列番号11 {膜通過ドメイン配列-2} 
長さ: 23 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
L A Y L L D G I L F I Y G V I L T A L F L R V 
【０１４９】
配列番号12 {4-1BB} 
長さ: 42 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列; 
K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L 
【０１５０】
配列番号13 {Wild type CD28} 
長さ: 41 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
R S K R S R L L H S D Y M N M T P R R P G P T R K H Y Q P Y A P P R D F A A Y R S 
【０１５１】
配列番号14 {IL-7Rα} 
長さ: 459 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MTILGTTFGMVFSLLQVVSGESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNITNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVVYREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMDPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ 
【０１５２】
配列番号15 {IL-7Rαの一部} 
長さ: 64 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTF 
【０１５３】
配列番号16 {IL-2Rβ} 
長さ: 551 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MAAPALSWRLPLLILLLPLATSWASAAVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRWNQTCELLPVSQASWACNLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRLMAPISLQVVHVETHRCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWICLETLTPDTQYEFQVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV 
【０１５４】
配列番号17 {IL-2Rβの一部} 
長さ: 104 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHL 
【０１５５】
配列番号18 {CD3ζ} 
長さ: 113 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１５６】
配列番号19 {TGF-βR2エキソドメイン} 
長さ: 137 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
TIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD 
【０１５７】
配列番号20 {IL-18Rの膜通過ドメイン及びエンドドメイン} 
長さ: 219 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
PGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES 
【０１５８】
配列番号21 {IL-21} 
長さ: 133 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 
【０１５９】
配列番号22 {YYB 103} 
長さ: 359 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M G W S C I I L F L V A T A T G V H S G P V P P S T A L R K L I E E L V N I T Q N Q K A P L C N G S M V W S I N L T A G M Y C A A L E S L I N V S G C S A I E K T Q D M L D G F C P H K V S A G Q F S S L H V R D T K I E V A Q F V K D L L L H L K K L F K E G Q F N G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１６０】
配列番号23 {#1} 
長さ: 998 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSESRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 
【０１６１】
配列番号24 {#2} 
長さ: 818 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES 
【０１６２】
配列番号25 {#5} 
長さ: 594 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 
【０１６３】
配列番号26 {#6} 
長さ: 423 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLPQSTATKDTYDYVTMQALPPR 
【０１６４】
配列番号27 {#7} 
長さ: 1038 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLSLSTATKDTYLPQHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSESRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
【０１６５】
配列番号28 {#8} 
長さ: 858 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLSLSTATKDTYLPQHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDPGHVFTRGMIIAVLILVAVVCLVTVCVIYRVDLVLFYRHLTRRDETLTDGKTYDAFVSYLKECRPENGEEHTFAVEILPRVLEKHFGYKLCIFERDVVPGGAVVDEIHSLIEKSRRLIIVLSKSYMSNEVRYELESGLHEALVERKIKIILIEFTPVTDFTFLPQSLKLLKSHRVLKWKADKSLSYNSRFWKNLLYLMPAKTVKPGRDEPEVLPVLSES 
【０１６６】
配列番号29 {#11} 
長さ: 634 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLSLSTATKDTYLPQHMQALPPREGRGSLLTCGDVEENPGPMYRMQLLSCIALSLALVTNSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 
【０１６７】
配列番号30 {#12} 
長さ: 463 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
MGWSCIILFLVATATGVHSGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFNGGGPRKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELNCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYLSLSTATKDTYLPQHMQALPPR 
【０１６８】
配列番号31 {mutated 3 rd ITAM-1} 
長さ: 23 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
Y L P Q S T A T K D T Y D Y V T M Q A L P P R 
【０１６９】
配列番号32 {mutated 3rd ITAM-2} 
長さ: 23 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
Y L S L S T A T K D T Y L P Q H M Q A L P P R 
【０１７０】
配列番号33 {EGFRvlllと結合する抗原結合ドメイン} 
長さ: 252 
タイプ: scFv protein 
生物名: human 
配列: 
Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I D P E N D E T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y G S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N G P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L 
【０１７１】
配列番号34 {#13} 
長さ: 499 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I S T G G Y N T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y S S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N V P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A A R P A A G G A V H T R G L D F A L A Y L L D G I L F I Y G V I L T A L F L R V K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７２】
配列番号35 {#14} 
長さ: 499 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I D P E N D E T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y G S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N G P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A A R P A A G G A V H T R G L D F A L A Y L L D G I L F I Y G V I L T A L F L R V K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７３】
配列番号36 {#15} 
長さ: 349 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M G V K V L F A L I C I A V A E A V S D V P R D L E V V A A T P T S L L I S W D A P A V T V R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V P G S K S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V T P R G D W N E G S K P I S I N Y R T E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７４】
配列番号37 {#16} 
長さ: 353 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P V S D V P R D L E V V A A T P T S L L I S W D A P A V T V R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V P G S K S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V T P R G D W N E G S K P I S I N Y R T E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７５】
配列番号38 {YYB 107} 
長さ: 351 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M G W S C I I L F L V A T A T G V H S V S D V P R D L E V V A A T P T S L L I S W D A P A V T V R Y Y R I T Y G E T G G N S P V Q E F T V P G S K S T A T I S G L K P G V D Y T I T V Y A V T P R G D W N E G S K P I S I N Y R T E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７６】
配列番号39 {YYB 105} 
長さ: 497 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
M G W S C I I L F L V A T A T G V H S Q V Q L Q E S G G G L V K P G G S L K L S C A A S G F T F S K F G M S W V R Q T P D K R L E W V A S I S T G G Y N T F Y S D N V K G R F T I S R D N A K N T L Y L Q M S S L K S E D T A M Y Y C A R G Y S S T S F A M D Y W G Q G T M V T V S S G S T S G S G K P G S G E G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C M T S T D I D D D M N W Y Q Q K P G K T P K L L I Y E G N T L R P G V P S R F S G S G S G T D F I F T I S S L Q P E D I A T Y Y C L Q S F N V P L T F G G G T K V E I K E Q K L I S E E D L G G G P R K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A A R P A A G G A V H T R G L D F A L A Y L L D G I L F I Y G V I L T A L F L R V K R G R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P Q R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R 
【０１７７】
配列番号40 {T2Aペプチド} 
長さ: 21 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
GSG E G R G S L L T C G D V E E N P G P 
【０１７８】
配列番号41 {P2Aペプチド} 
長さ: 22 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
GSG A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P 
【０１７９】
配列番号42 {E2Aペプチド} 
長さ: 23 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
GSG Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P 
【０１８０】
配列番号43 {F2Aペプチド} 
長さ: 25 
タイプ: protein 
生物名: human 
配列: 
GSG V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P 
【国際調査報告】
2021536266.tif 000027
2021536266.tif 000028
2021536266.tif 000029
2021536266.tif 000030
2021536266.tif 000031
2021536266.tif 000032
2021536266.tif 000033
2021536266.tif 000034