(57)【要約】  本発明は、受託寄託番号ＤＳＭ  ３２５３８を有する、カンジダタス・シュードモナス・メタロソルベンスと呼ばれるシュードモナスＢＲ１１５７１として同定されたシュードモナス属の種に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナスＢＲ１１５７１として同定され、カンジダタス・シュードモナス・メタロソルベンスと呼ばれる、受託寄託番号ＤＳＭ  ３２５３８のシュードモナス属の種。
【請求項２】
前記種がリスクグループ１に属する、請求項１に記載の種。
【請求項３】
前記種のリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）が配列番号１を有する、請求項１または請求項２に記載の種。
【請求項４】
前記種が生体物質を産生することができる、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の種。
【請求項５】
固体材料から貴金属を抽出するための、請求項１に記載のシュードモナスＢＲ１１５７１の使用。
【請求項６】
前記固体材料が二次資源である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記二次資源が、フライアッシュ、廃棄物焼却灰、金属スコリアおよび電子スクラップからなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
貴金属が、金、銀、プラチナ、パラジウム、ロジウム、イリジウム、銅およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５から７の少なくとも１つに記載の使用。
【請求項９】
前記種が、固体材料からの貴金属の可溶化を促進する生体物質を産生する、請求項５■８の少なくとも１項に記載の使用。
【請求項１０】
種がアミノ酸の存在下で生体物質を産生する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
生体物質がシアン化水素酸を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
（ａ）生体物質を放出することによって貴金属の可溶化を促進するのに有効な量の請求項1に記載の種と、
（ｂ）少なくとも１つの固体材料と、
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸と、を含む組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの固体材料（ｂ）が、フライアッシュ、廃棄物焼却灰、金属スコリアおよび電子スクラップからなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記貴金属が、金、銀、プラチナ、パラジウム、ロジウム、イリジウム、銅、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２または請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのアミノ酸（ｃ）が、グリシンである、請求項１２から請求項１４の少なくとも１つに記載の組成物。
【請求項１６】
配列番号２と少なくとも９１％の同一性を有する単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンジダタス・シュードモナス・メタロソルベンス(Candidatus Pseudomonas metallosolvens)と呼ばれるシュードモナス（Pseudomonas）属の新種、固体材料からの貴金属の回収のためのその使用、新種を有する組成物および単離された核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアン化物およびグアニジン（ＬＩＸ ７９５０）またはアミン（ＬＩＸ ７８２０）のような適切な抽出剤による鉱石からの銅の回収は、数十年にわたって知られている（例えば、米国特許第３，４０３，０２０号、１９６８年）。抽出剤によるＣｕ（ＣＮ）４３−およびＣＮ−よりもＣｕ（ＣＮ）３２?の優先抽出のため、遊離シアン化物は水相に残る。シアン化物のレベルが高いと、シアン化銅およびシアン化銀の抽出が抑制される傾向があるが、金、亜鉛、ニッケル、鉄のシアン化物の抽出にはほとんど影響がない。この技術の概要は、例えばXIE ET AL in J. Hazardous Materials, Vol. 169, p 333-338 (2009) によって提供される。
【０００３】
過去において、シアン化カリウムまたはシアン化ナトリウムを使用して銅および貴金属、特に金を回収するプロセスは、有毒物質で汚染された巨大な廃棄物の投棄をもたらしたが、今日のプロセスは閉サイクルで実行され、過去のような環境影響を有さない。それにもかかわらず、特に植物にはシアン化物が豊富な数十万ガロンの抽出剤が含まれているため、閉鎖系でさえシアン化物を扱うことは依然として危険である。
【０００４】
この理由のために、鉱石および廃棄物の生物学的抽出のための今日の方法、いわゆる「バイオリーチングプロセス」が高い商業的関心を集めていることは驚くべきことではない。通常、これらの目的には、銅が可溶性硫酸塩を形成する硫酸を生成できる独立栄養細菌が使用される。現在、世界の銅生産の約２４％は、３未満の低いｐＨ値で動作し、微生物の唯一の炭素源として二酸化炭素を使用するバイオリーチングプロセスを使用している。これらのプロセスはかなりゆっくり実行されるという事実に加えて、これらの金属は硫酸に不溶であるため、金、銀、プラチナなどの貴金属では通常作用しない。
【０００５】
これに関連して、欧州特許０４３２９３５Ｂ１および欧州公開特許０６９５８０９Ａ１（GEOBIOTICS）では、その鉱石から金を回収および再濃縮するプロセスが開示されている。このプロセスは、シアン化水素酸を生成および放出して金錯体を形成するための適切な微生物として、好ましくは藻類または青緑色のシアノバクテリアを使用するバイオリーチングステップを含む。他のさまざまな微生物の中で、Bacillus megateriumといくつかのPseu-domonas sp.が言及されている。ただし、この先行技術の技術的教示は、鉱石、つまり１０ｐｐｍ以下の微量の貴金属のみを含む天然の一次資源から金を回収することを目的としている。この文献は、鉱業よりもはるかに多量の貴金属を含む産業残渣や廃棄物などの人工鉱物材料からの貴金属の回収に関するいかなる指針も提供していない。
【０００６】
例えば電子スクラップから金を回収するための別の周知の微生物は、クロモバクテリウムビオラセウム（Chromobacterium violaceum）である。残念ながら、浸出プロセスにおけるこの細菌の有効性はかなり低いことがわかっている[CAMPBELL ET AL、J. Industrial Microbiology＆Biotechnology、26、p 134-139（2001）またはFARAMARZI ET AL、J. Biotechnology。 113、321-326（2004）を参照]。さらに、クロモバクテリウムビオラセウムは、ヒトに重度の感染を引き起こす可能性のある病原性微生物であるため、リスクグループ２に分類される。この事実は、経済的に実行可能な工業施設でこの微生物の使用が妥協される。
【０００７】
しかし、産業残渣および廃棄物を使用することの特定の欠点は、特に、有毒金属が高用量で存在する場合、バイオマイニングまたはバイオリーチングが可能なほとんどの微生物が、一般に大量の有毒金属（特に鉛、クロム、カドミウム、ヒ素または銀）にかなり敏感である。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、例えば金、銀、プラチナおよび／またはパラジウムのような貴金属をいわゆる二次資源から回収するための微生物群を提供することである。二次資源は、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）やその他の有機材料で汚染されていることが多い産業廃棄物または廃棄物を意味し、典型的には０．２％まで又はそれ以上の量の標的金属を含む。
【０００９】
本発明の別の目的は、鉛、クロム、カドミウムおよび銀などの有毒金属、典型的にこれらが高用量含まれる産業残渣および廃棄物に耐える一群の微生物を提供することである。
【００１０】
最後に、安全上の理由から、本発明の目的は、リスクグループ１に属する微生物のグループを提供することである。将来的にも、リスクグループ２以上に属する微生物は、政府府の保健当局およびリスク当局から技術的プロセスは承認されないであろう。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の目的は、代表的な実施形態の詳細な説明が以下に開示されるにつれて明らかになるであろう
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
この目的は、受託寄託番号ＤＳＭ  ３２５３８を有するカンジダタス・シュードモナス・メタロソルベンス（以下：シュードモナスＢＲ１１５７１）と呼ばれるシュードモナス属の種に関する本発明の請求項１により解決される。
【００１３】
驚くべきことに、本発明者らは、新種のシュードモナスＢＲ１１５７１が多くの有利な特性を有することを発見した。例えば、
（ａ）産業残渣や廃棄物などの二次資源から貴金属を抽出できること。
（ｂ）貴金属の可溶化を促進する生体物質を生産すること。
（ｃ）リスクグループ１に属していること。
【００１４】
一般に、生体物質は、生命過程によって生成される物質である。本発明において、生体物質は、新種のシュードモナスＢＲ１１５７１によって生産される任意の物質である。本発明の好ましい実施形態では、生体物質はシアン化水素酸を含む。
【００１５】
本発明による一実施形態では、生体物質はアミノ酸の存在下で生産される。本発明による最も好ましい実施形態では、生体物質はグリシンの存在下で生成される。本発明による好ましい実施形態では、シアン化水素酸を含む生体物質は、アミノ酸の存在下で生成される。本発明による最も好ましい実施形態では、シアン化水素酸を含む生体物質はグリシンの存在下で生成される。
【００１６】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも1つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。したがって、例えば、「固体材料」、「固体材料」、または「固体材料」への言及は、複数の固体材料も含む。 「核酸」という用語の使用は、実際問題として、その核酸分子の多くのコピーを任意に含む。
【００１７】
本明細書で使用される「約」という用語は、値が、値を決定するために採用されている方法の誤差の固有の変動、またはその中に存在する変動を含むことを示す。
【００１８】
本明細書で使用される用語「種」、「株」（シュードモナスＢＲ１１５７１に関して）および「シュードモナスＢＲ１１５７１」は、すべての用語がカンジダタスシュードモナスメタロソルベンス（受託寄託番号ＤＳＭ  ３２５３８を有する）に関連するため同義語として使用する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、部分１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて、フィルターｃＢＲ１１５７１(arb-program, Ludwig et al., 2004を用いた大腸菌位置100〜1465)を用いたＪｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒ補正法により、計算された距離マトリックスである。ツリーデンドログラムは、隣接結合法によって生成された。
【図２】図２はハウスキーピング遺伝子ｇｙｒＢ(プログラムarb、フィルターcFN55420 675 nt、Ludwig et al、2004)の部分遺伝子配列（６７５  ｎｔ）の配列類似性（パーセンテージで表される)を示す。
【図３】図３は、ハウスキーピング遺伝子ｒｐｏＢ（プログラムａｒｂ、フィルターSAI_AJ7174 912nt、Ludwig et al、2004）の部分遺伝子配列（９１２ｎｔ）の配列類似性（パーセンテージとして表される）を示す。
【図４】図４は、ハウスキーピング遺伝子ｒｐｏＤの部分遺伝子配列（５６０ｎｔ）の配列類似性（パーセンテージとして表される）を示す(プログラムarb、フィルターcFM25190 560nt Ludwig et al、2004)。
【図５】図５は、製造業者の説明書に従って、ＡＰＩ  ２０  ＮＥ（ＢＩＯＭEＲＩＥＵＸ）である非絶食性非腸溶性グラム陰性桿菌の同定のための標準化された系、およびＢＩＯＬＯＧ  ＰＭ１およびＰＭ２Ａプレート（ＢＩＯＬＯＧ）に基づくカーボン利用試験を用いた、ＢＲ１１５７１の生理学的特性の分析を示す。結果を、関連株の選択された結果と比較した。
【図６】図６は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（ＡＮＩｂ）に基づく平均ヌクレオチド同一性を示す。  ＡＮＩｂ分析（同一性の割合）は、プログラムＰＹＡＮＩを使用して実行された（Pritchard et al.（2016））。
【図７】図７は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１であるシュードモナスＢＲ１１５７１の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を示す。
【００２０】
金属回収：本発明によるシュードモナスＢＲ１１５７１は、鉱石の浸出にも基本的に有用であるが、貴金属、特に金および銀、ならびに白金、パラジウム、ロジウム、イリジウムおよびそれらの混合物を含有する固体材料に焦点が当てられている。微生物は銅の浸出にも適している。これは、典型的には貴金属という用語の中では数えられない。したがって、「貴金属」という用語は、金、銀、白金、パラジウム、ロジウム、イリジウム、銅およびそれらの混合物を含む。
【００２１】
「二次資源」という用語は、PCBおよび他の有機材料で汚染されていることが多い産業上の残渣または廃棄物を意味する。好ましい適切な二次資源は、本発明によれば、フライアッシュ（飛灰）、廃棄物焼却灰、金属線条、電子スクラップなどである。
【００２２】
バイオシアニド(BIOCYANIDE)：シュードモナスＢＲ１１５７１の固体資源から貴金属を抽出する能力は、主にアミノ酸、特にグリシンの存在下でのシアン化水素酸の生成に起因する。しかし、さらに、貴金属の可溶化を促進する他の生体物質が生産される。これは、最新技術から知られている非生物化学プロセスよりも少ない（バイオ）シアン化物が必要であるという本発明に関連する驚くべき効果をもたらす。
【００２３】
シュードモナスＢＲ１１５７１：本発明によれば、シュードモナスＢＲ１１５７１は新しい生物として提供される。この生物は、固体材料から貴金属を抽出するために使用できる。驚くべきことに、この生物は、鉛、クロム、カドミウム、銀などの高レベルの有毒金属を含む材料からも貴金属を抽出できる。これにより、生物は固体材料から貴金属を抽出できるだけでなく、外部条件に対する高い耐性も持っているという結論が得られる。
【００２４】
シュードモナス属への新種の加入は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子解析を実施することにより明らかにされた（図１）。
【００２５】
シュードモナスＢＲ１１５７１は、シュードモナス属の新規種を表すことが判明した。 シュードモナスＢＲ１１５７１のシュードモナス属の新規種への分類は、表現型（API、BIOLOG）および遺伝子型データ（ハウスキーピング遺伝子rpoB、rpoDおよびgyrBの部分配列の平均系統解析、および足場ゲノムを使用したＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づく平均ヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）の計算）によってサポートされる。足場ゲノムに関して９４％未満のＡＮＩを持つ株は、属の新種と見なされる（例えば、Richter andRossello-Mora、2009）。  ＤＮＡ配列は、カンジダタス・シュードモナス・メタロソルベンス  ＢＲ１１５７１の次の隣が約９１％のＡＮＩの割合を共有していることを示した。
【００２６】
さらに、シュードモナスＢＲ１１５７１の生理学は、API（Biomerieux API 20 NE）およびＢＩＯＬＯＧ（BIOLOG PM1、PM2A）アッセイによって示される限り、既知のシュードモナス種とは異なることがわかった。
【００２７】
ハウスキーピング遺伝子ｒｐｏＤ、ｒｐｏＢおよびｇｙｒＢの部分配列分析および足場ゲノムを使用したＡＮＩ分析によって明らかにされたシュードモナスＢＲ１１５７１の最も近い親類は、P.helmanticensis OHA11（タイプ株）、P. granadensis F-278,770（タイプ株）およびP. koreensis DSM16610（タイプ株）で、すべてリスクグループ１に属する（図２から図６）。さらに、上記の１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび部分配列分析により、シュードモナスＢＲ１１５７１はシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）複合体内のPseudomonas koreensisサブグループに属することが示された（Garrido-Sanz et al.、2016）。 Pseudomonas koreensisサブグループ（Mulet et al.、2010）に属する既知の株は、リスクグループ1に分類されている。したがって、新種シュードモナスＢＲ１１５７１はリスクグループ1に分類できる。
【００２８】
生物学的材料の寄託：分離および同定された種シュードモナスＢＲ１１５７１は、２０１７年６月１３日にLeibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cul-turesのブダペスト条約の規定の下で寄託された。受託番号ＤＳＭ３２５３８に割り当てられている。
【００２９】
本発明による好ましい実施形態において、新しい種はリスクグループ１に属する。用語「リスクグループ」は、微生物の分類のために多くの国で使用される分類システムである。リスクグループへの所属は、たとえば次の要因に依存する。
?生物の病原性
?送信モードとホスト範囲
?効果的な予防措置（例：ワクチン等）の入手可能性
?効果的な治療の利用可能性（例：抗生物質）
リスクグループ1に属するすべての微生物は、健康な成人の疾患とは関係ない（2002年4月のNIH Guidelines in Recombinant DNAを参照）。
【００３０】
本発明による実施形態では、シュードモナスＢＲ１１５７１のリボソームＤＮＡは配列番号１を有する。
【００３１】
上記のように、本発明によるシュードモナスＢＲ１１５７１は、生体物質を産生することができる。シュードモナスＢＲ１１５７１によって生成されるこれらの生体物質は、アミノ酸の存在下で固体材料からの貴金属の可溶化を促進する。本発明の好ましい実施形態では、シュードモナスＢＲ１１５７１によって産生される生体物質はシアン化水素酸である。さらに好ましい実施形態では、アミノ酸はグリシンである。本発明による最も好ましい実施形態では、シアン化水素酸はグリシンの存在下で固体材料からの貴金属の可溶化を促進するシュードモナスＢＲ１１５７１によって生成される。
【００３２】
使用：本発明による一実施形態では、シュードモナスＢＲ１１５７１は、固体材料から貴金属を抽出するために使用される。本発明による好ましい実施形態では、固体材料は二次資源である。本発明によるさらに好ましい実施形態では、固体材料は、フライアッシュ、廃棄物焼却灰、金属線条および電子スクラップからなる群から選択される。
【００３３】
好ましくは、貴金属は、金、銀、プラチナ、パラジウム、ロジウム、イリジウム、銅およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００３４】
組成物：本発明によるさらなる実施形態は、以下を含む組成物に関する。
（ａ）生物由来物質を放出することにより貴金属の可溶化を促進するのに有効な量のシュードモナスＢＲ１１５７１；
（ｂ）少なくとも１つの固体材料；及び
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸。
【００３５】
好ましい実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸はグリシンである。本発明によるさらに好ましい実施形態では、生体物質はヒドロシアン酸を含む。
【００３６】
方法：本発明による一実施形態は、シュードモナスＢＲ１１５７１を用いて固体材料から貴金属を抽出する方法に関する。好ましい実施形態では、この方法で使用される固体材料は二次資源である。より好ましい実施形態では、固体材料は、フライアッシュ、廃棄物焼却灰、金属線条および電子スクラップからなる群から選択される。
【００３７】
本発明の方法によるさらに好ましい実施形態では、貴金属は、金、銀、プラチナ、パラジウム、ロジウム、イリジウム、銅およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００３８】
本発明の方法による実施形態では、シュードモナスＢＲ１１５７１は、固体材料からの貴金属の可溶化を促進するアミノ酸の存在下で生体物質を生成する。本発明の方法による好ましい実施形態では、シュードモナスＢＲ１１５７１によって放出される生体物質はシアン化水素酸を含む。本発明の方法によるさらに好ましい実施形態では、アミノ酸はグリシンである。
【００３９】
単離された核酸：本発明のさらなる実施形態は、配列番号２と少なくとも９１％の同一性を有する単離された核酸に関する。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、単離された核酸は、配列番号２に対して少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する。本発明による別の好ましい実施形態では、単離された核酸は配列番号２と１００％の同一性を有する。言い換えると、単離された核酸は配列番号２である。
【００４１】
本発明による最も好ましい実施形態では、単離された核酸は、配列番号２と少なくとも９４％の同一性を有する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「同一性」は、核酸に関して使用される場合、２つ以上のヌクレオチド配列間の類似性の程度を説明する。２つの配列間の「配列同一性」の割合は、比較ウィンドウで２つの最適に配列された配列を比較することで決定できる。そのため、比較ウィンドウ内の配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントのため、参照配列（追加または削除を含まない）と比較して追加または削除（ギャップ）を含むことができる。割合は、一致する位置の数を得るために両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割ることによって計算される。その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を求める。参照配列と比較してすべての位置で同一の配列は、参照配列と同一であると言われ、逆もまた同様である。任意の適切なコンピュータープログラムを使用して、２つ以上の配列のアラインメントを実行してもよい。例えば、配列アラインメントを実行するために広く使用され、受け入れられているコンピュータープログラムは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ  ｖ１．６（Thompson、et al.（1994）Nucl.Acids Res.,22：4673-4680）である。
【００４３】
配列番号２は、人工配列を表す。この人工配列は、シュードモナスＢＲ１１５７１の足場ゲノム配列である。本明細書で使用される「足場」という用語は、ゲノム内のコンティグの相対的な位置および方向に関する追加情報を使用してコンティグを連鎖させることにより作成される一種の配列決定である。「コンティグ」とは、ギャップの無いＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴ塩基のみを含む連続したストレッチである。足場のコンティグは、「Ｎ」文字の可変数で指定されるギャップで区切られる。
【実施例】
【００４４】
実施例１：シュードモナスＢＲ１１５７１の単離および同定
シュードモナスＢＲ１１５７１は、次の手順に従って分離した。４ｍＭ  ＫＣＮおよび１００μｇ／ｍｌナイスタチンを添加した０．５ｘＨＤ栄養寒天プレートに０．８５％ＮａＣｌの土壌懸濁液をプレーティングする。出現した微生物コロニーは、新鮮な寒天プレート上の「クリーンストリーク」によって移動および精製され、その後シアン化水素酸の生産および二次資源からの貴金属の溶出効率について分析された。性能基準を満たす微生物は、系統学的に１６Ｓ ｒＤＮＡ分析によって特徴付けられた。シュードモナス属へのＢＲ１１５７１株の所属は、プログラムａｒｂ（Ludwig et al.,2004）を使用して、部分的な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子解析（図１）を実行することによって示された。
この株をＬＢ培地[Bacto Tryptone #211705(BD)1%(w/v)、Bacto Yeast Extract #212750(BD)0.5%(w/v)、NaCl #141659.1221(Applichem)0.5%(w/v)]およびＭ９などの無機培地[Harwood、CR、およびSM Cutting.1990に準拠。化学的に定義された成長培地およびサプリメント、p.548. In CR Harwood and SM Cut-ting（ed.）、Molecular Bacillus．Wiley、Chichester、United Kingdomの生物学的手法] で培養した。ＬＢ培地及び無機培地にはカサミノ酸（０．２５％／ｗ／ｖ）とグリシン（０．５％（ｗ／ｖ））が追加される。適切なインキュベーション温度は、好ましくは２８〜３０℃の範囲である。シュードモナスＢＲ１１５７１の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を図７および配列番号１に示す。単離および同定された株は、２０１７年６月１３日にライプニッツ研究所DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Culturesに提出された。受託番号はＤＳＭ  ３２５３８である。
【００４５】
実施例２：シュードモナスＢＲ１１５７１の系統解析およびシュードモナス属の新しい群の定義
部分的な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１６Ｓ  ｒＲＮＡ分析により、シュードモナスＢＲ１１５７１はシュードモナス属に属することが明らかになった（図１）。ハウスキーピング遺伝子ｇｙｒＢ、ｒｐｏＢおよびｒｐｏＤの部分遺伝子配列を分析して、シュードモナスＢＲ１１５７１の系統発生的関係をさらに調査した（図２−４）。これらの４つのコア「ハウスキーピング」遺伝子は、通常、シュードモナス系統発生の分析に使用される（例：Mulet et al.,2010）。これらのハウスキーピング遺伝子を使用した約９７％の配列類似性の閾値は、シュードモナス属内の種分化のために提案されている（Mulet et al.,2010; Gomila et al.,2015）。図２、図３、および図４に示すように、最も近い関連タイプの株との最大類似値は約９７％である。これらのデータは、シュードモナスＢＲ１１５７１が新しい種であることを示唆している。シュードモナスＢＲ１１５７１の生理学的特性を分析するために、ＡＰＩ  ２０  ＮＥ（BIOMERIEUX）である非絶食性非腸溶性グラム陰性桿菌の同定のための標準化された系、およびＢＩＯＬＯＧ  ＰＭ１およびＰＭ２Ａプレート（ＢＩＯＬＯＧ）に基づくカーボン利用試験を用いた。結果は、関連株の生理学的試験の文献から選択された結果と比較された。関連株を、上記の系統発生配列分析結果に基づいて選択した（図５）。分析の結果、シュードモナスＢＲ１１５７１の生理機能は、ＡＰＩおよびＢＩＯＬＯＧアッセイで示されているように、これまで知られているシュードモナス種とは異なることが明らかになった（図５）。これらのデータは、シュードモナスＢＲ１１５７１がカンジダタス・シュードモナス・メタロソルベンスと呼ばれるシュードモナス属の新規種として分類できることをさらに強調する。
ＡＮＩ分析を適用して、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを置き換えた（例：Richter andRossel-lo-Mora、2009）。提案された種レベル境界は、約９４％のＡＮＩに設定された（例：Richter and Rossello-Mora、2009）。図６に示すように、ＡＮＩｂ類似値は９１％未満である。これらの結果は、シュードモナスＢＲ１１５７１がシュードモナス属の新規種であることをさらに強調している。シュードモナス  ＢＲ１１５７１の足場ゲノムに対して少なくとも９４％のＡＮＩを共有するシュードモナス株は、シュードモナスの新しいグループの一部と見なされる（Goris et al.,2007）
【００４６】
実施例３：シュードモナスＢＲ１１５７１を使用した貴金属の回収
電子スクラップ、つまりプリントカードボード（ＰＣＢ）は、以下を使用してバイオリーチングが行われた。
（ａ）シュードモナスＢＲ１１５７１（本発明による）
（b）Chromobacterium violaceum、DSMZ 30191（比較用）
比較用は、シアン化水素酸を生成および放出できる従属栄養微生物である。
金属に関する廃棄物は、主に銅（６％ｂ．ｗ．）、鉄（６％ｂ．ｗ．）、アルミニウム（４％ｂ．ｗ．）および亜鉛（２％ｂ．ｗ．）で構成されていた。また、かなりの量の貴金属、特に銀、金、パラジウムも含まれていた。
サンプル材料をインパクトミルで細かく粉砕した。得られた微細画分（１ｍｍ以下）を浸出実験に使用した。この材料１  ｇを容量０．３  Ｌの浸出容器に加えた。容器は、微生物または（ｂ）をそれぞれ約１ｇ／ｌ湿重量の量で含む０．１ｌの水溶液で満たされた。この水溶液は、微生物の栄養素として機能するのに適した量のミネラルと炭水化物も含む。０．５  ｇの量のグリシンを添加して、シアン化水素酸の生成を維持した。混合物を約３０℃に加熱し、約１８０ｒｐｍで１２０時間にわたって攪拌した。その後、スラリーを遠心分離によって収集し、ＩＣＰ−ＭＳ分析によって遊離した貴金属及び銅の量について液相を分析した。実験は３回繰り返して実施した。結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
2021502053.tif 000003
【００４８】
シュードモナスＢＲ１１５７１は、Chromobacterium violaceumよりも銀の浸出効率が５倍高く、金の浸出が３０％良好であることを示している。さらに、シュードモナスＢＲ１１５７１はリスクグループ1に属し、Chromobacterium violaceumはリスクグループ2に属し、経済的に実行可能な工業環境で後者の微生物の使用を危うくする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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