(57)【要約】１つまたはそれを超える技能要件および訪問滞在時間に関連する項目のデータベースを維持するため；１つまたはそれを超える技能熟練度、場所およびスケジュールに関連する専門家のデータベースを維持するため；データベース内の１つまたはそれを超える項目の専門家による消費者の住所への消費者からの送達の依頼を受け取るため；１つまたはそれを超える項目の技能要件に一致する技能熟練度を有し、かつ１つまたはそれを超える項目の訪問滞在時間の時間枠に利用可能なデータベース内の専門家を特定するため；１人またはそれを超える専門家が識別される時間枠を消費者に提示し消費者が時間枠を選択できるようにするため；および最も短い移動時間に基づくが選択された専門家の利用が所定の利用閾値を超えるという条件で、選択された時間枠において特定された専門家の中から１人の専門家を選択するためのプラットフォーム、システム、媒体および方法が記載される。
2021536235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の表面および前記第１の表面の反対側の第２の表面を有する基材を備えるアレイであって、
前記基材は、基材材料および表面材料を含み、前記表面材料は、前記第１または第２の表面に位置または隣接し、前記基材は、前記第１の表面から前記第２の表面に延びる管腔を定義する複数のポアを含み、前記基材は、
前記複数のポアの各ポアが、５００ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、
前記複数のポアの各ポアが、１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、および
前記表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されること
を特徴とする、
アレイ。
【請求項２】
第１の表面および前記第１の表面の反対側の第２の表面を有する基材を備えるアレイであって、
前記基材は、基材材料および表面材料を含み、前記表面材料は、前記第１または第２の表面に位置または隣接し、前記基材は、前記第１の表面から前記第２の表面に延びる複数のポアを含み、前記基材は、
１平方ミリメートルあたり１００個またはそれを超えるポアというポアの密度、
前記複数のポアの各ポアが、１０を超えるアスペクト比を有すること、および
前記表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されること
を特徴とする、
アレイ。
【請求項３】
前記各ポアが、約０．００８ｍｍ２またはそれ未満の最大断面積を有する、請求項１または２に記載のアレイ。
【請求項４】
前記複数のポアの前記各ポアが、５ミクロン〜１００ミクロンの範囲内のポア直径を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項５】
前記複数のポアの前記各ポアが、１５ミクロン〜５０ミクロンの範囲内のポア直径を有する、請求項４に記載のアレイ。
【請求項６】
前記各ポアが、約１ｍｍ〜約５００ｍｍの範囲から選択される長さを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項７】
前記各ポアが、約１ｍｍ〜約１００ｍｍの範囲から選択される長さを有する、請求項６に記載のアレイ。
【請求項８】
前記各ポアが、約１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲から選択される長さを有する、請求項７に記載のアレイ。
【請求項９】
前記ポアの密度が、１平方ミリメートルあたり１００〜２５００ポアの範囲内である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１０】
前記ポアの密度が、１平方ミリメートルあたり５００〜１５００ポアの範囲内である、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１１】
前記表面材料が、前記基材材料と実質的に類似である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１２】
前記表面材料が、前記基材材料と異なる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１３】
前記基材材料が、ガラスであり、前記表面材料が、ガラスではない、請求項１２に記載のアレイ。
【請求項１４】
前記表面材料が、金属を含む、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１５】
前記表面材料が、０．４ミクロン〜２．５ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１６】
前記表面材料が、入射放射の５０パーセント超を吸収する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１７】
前記表面材料が、０．４ミクロン〜１．５ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の５０パーセント超を吸収する、請求項１６に記載のアレイ。
【請求項１８】
前記アスペクト比が、１０〜１００の範囲内である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１９】
前記アスペクト比が、２０またはそれを超える、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項２０】
前記アスペクト比が、５０またはそれを超える、請求項１９に記載のアレイ。
【請求項２１】
前記アスペクト比が、１００またはそれを超える、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２２】
前記表面材料が、前記第２の表面を覆うかまたは部分的に覆う、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項２３】
前記表面材料が、前記第１の表面を覆うかまたは部分的に覆う、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項２４】
前記表面材料が、前記ポアの前記管腔へのアクセスを遮断しない、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項２５】
前記表面材料が、約２０ｎｍ〜５００ｎｍの平均厚さを有する、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項２６】
前記表面材料が、約１００ｎｍ〜５００ｎｍの平均厚さを有する、請求項２５に記載のアレイ。
【請求項２７】
前記表面材料が、疎水性である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項２８】
前記第１および前記第２の表面が、実質的に平行な面である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項２９】
前記複数のポアが、前記第１の表面から前記第２の表面まで表面法線に対して角度をなして延びている、請求項２８に記載のアレイ。
【請求項３０】
前記角度が、より大きく０〜９０度の範囲内である、請求項２９に記載のアレイ。
【請求項３１】
前記複数のポアが、前記第１の表面から前記第２の表面まで直角に延びている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項３２】
前記複数のポアが、前記第１の表面から前記第２の表面まで間接経路を通っている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項３３】
混合物の構成要素をソーティングするためのシステムであって、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のアレイ、および前記アレイから放出された選ばれた内容物を受け取るように構成された内側表面を備えるハウジングを備える、システム。
【請求項３４】
前記内側表面が、前記基材の前記第２の表面の下に位置する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
選ばれた内容物をアレイのポアから放出する方法であって、前記方法は、
選ばれた内容物を含むアレイのポアを識別する工程であって、前記アレイは、第１の表面および前記第１の表面の反対側の第２の表面を有する基材を備え、前記基材は、基材材料および表面材料を含み、前記表面材料は、前記第１または第２の表面に位置または隣接し、前記基材は、前記第１の表面から前記第２の表面に延びる管腔を定義する複数のポアを含み、前記基材は、（ａ）前記複数のポアの各ポアが、５００ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、（ｂ）前記複数のポアの各ポアが、１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、（ｃ）１平方ミリメートルあたり１００個またはそれを超えるポアというポアの密度、および（ｄ）前記表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの１つまたはそれを超えることを特徴とする、工程、および
前記識別されたポア内のまたは前記識別されたポアに隣接する前記表面材料に向けられた電磁放射によって、前記アレイの前記第１または第２の表面から前記表面材料の一部分を除去し、それにより、前記識別されたポアの前記内容物を放出する工程
を含む、方法。
【請求項３６】
前記電磁放射が、０．２ミクロン〜２．５ミクロンの波長、前記内容物と前記ポアとの間の接着を破壊するのに十分なフルエンスレベル、および１ｎｓ〜１ミリ秒の範囲内のパルス持続時間から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
表面材料を除去する工程が、アブレーションを含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
表面材料を除去する工程が、機械的除去を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
機械的除去が、チッピングを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
表面材料を除去する工程が、光熱除去を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４１】
表面材料を除去する工程が、光化学的除去を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４２】
表面材料を除去する工程が、光音響的除去を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記選ばれた内容物が、水溶液中の細胞を含む、請求項３５〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が、ＩＮＫＴ細胞、Ｔｍｅｍ、Ｔｒｅｇ、ＨＳＰＣおよびそれらの組み合わせから選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記複数のポアの前記各ポアが、約０．００８ｍｍ２またはそれ未満の断面積を有する、請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数のポアの前記各ポアが、５ミクロン〜１００ミクロンの範囲内のポア直径を有する、請求項３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記複数のポアの前記各ポアが、１５ミクロン〜５０ミクロンの範囲内のポア直径を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記各ポアが、約１ｍｍ〜約５００ｍｍの範囲から選択される長さを有する、請求項３５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記各ポアが、約１ｍｍ〜約１００ｍｍの範囲から選択される長さを有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記各ポアが、約１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲から選択される長さを有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポアの密度が、１平方ミリメートルあたり１００〜２５００ポアの範囲内である、請求項３５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポアの密度が、１平方ミリメートルあたり５００〜１５００ポアの範囲内である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アレイが、１０００ポア／ｍｍ２を超えるポアの密度を含む、請求項３５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポアの密度が、５０００ポア／ｍｍ２またはそれを超える、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記アスペクト比が、１０〜１００の範囲内である、請求項３５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポアが、２０またはそれを超えるアスペクト比を有する、請求項３５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポアが、５０またはそれを超えるアスペクト比を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポアが、１００またはそれを超えるアスペクト比を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記表面材料が、約０．４ミクロン〜約２．５ミクロンから選択される波長において１０パーセント超を吸収する、請求項３５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記表面材料が、入射放射の５０パーセント超を吸収する、請求項３５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記表面材料が、約０．４ミクロン〜約２．５ミクロンから選択される波長の入射放射の５０パーセント超を吸収する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記アレイが、（ａ）前記複数のポアの各ポアが、５００ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、（ｂ）前記複数のポアの各ポアが、１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、（ｃ）１平方ミリメートルあたり１００個またはそれを超えるポアというポアの密度、および（ｄ）前記表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの２つまたはそれを超えることを特徴とする、請求項３５〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記表面材料の前記一部分が、前記識別されたポアに隣接する、請求項３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記表面の前記一部分が、前記識別されたポアの管腔表面を含む、請求項３５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記表面の前記一部分が、１００ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去される、請求項３５〜６４のいずれか１項の請求項に記載の方法。
【請求項６６】
前記表面の前記一部分が、５０ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去される、請求項３５〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
選ばれた内容物を含む前記ポアを識別する前記工程の前に、前記選ばれた内容物を含む溶液を前記アレイにロードする工程をさらに含む、請求項３５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
選ばれた内容物を含む前記ポアを識別する工程が、前記アレイの前記ポアから放射された電磁放射を解析する工程を含む、請求項３５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記内容物を放出する工程が、１秒あたり約５，０００〜約１００，０００，０００ポアという速度で前記内容物を放出することを含む、請求項３５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
赤外線吸収コア；および
非赤外線吸収シェルであって、前記非赤外線吸収シェルの外径が、約１０ミクロンに等しいかまたはそれ未満である、非赤外線吸収シェル
を備える、ビーズ。
【請求項７１】
前記非赤外線吸収シェルが、アガロース、デキストランまたはその両方を含む、請求項７０に記載のビーズ。
【請求項７２】
前記赤外線吸収コアが、赤外線吸収色素を含む、請求項７０または７１に記載のビーズ。
【請求項７３】
約２０ミクロンに等しいかまたはそれ未満の直径を有する、請求項７０〜７３のいずれか１項に記載のビーズ。
【請求項７４】
前記表面材料が、赤外線吸収コアおよび非赤外線吸収シェルを含むビーズをさらに備え、前記非赤外線吸収シェルの外径は、約１０ミクロンに等しいかまたはそれ未満である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項７５】
（ａ）複数の、請求項７０〜７３のいずれか１項に記載のビーズ；および
（ｂ）目的の粒子
を含む、溶液。
【請求項７６】
前記目的の粒子が、細胞である、請求項７４に記載の溶液。
【請求項７７】
前記複数のビーズの数と複数の前記細胞の数との比が、約１：１〜１０：１である、請求項７５に記載の溶液。
【請求項７８】
前記表面材料が、細胞生存率に悪影響を及ぼさない材料から選択される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項７９】
前記細胞生存率が、細胞を前記表面材料に曝露する前の細胞生存率と比べて、前記表面材料への曝露の後、同じままであるか、または２０％未満しか低下しない、請求項７８に記載のアレイ。
【請求項８０】
前記表面材料が、電磁放射と接触したとき、細胞傷害または細胞死を引き起こさない材料から選択される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項８１】
前記細胞生存率が、細胞を前記アレイにロードする前の細胞生存率と比べて、前記表面材料を前記電磁放射と接触させた後、同じままであるか、または２０％未満しか低下しない、請求項８０に記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１８年８月３１日出願の米国仮特許出願第６２／７２５３５８号に基づく利益を主張する。この仮出願は、参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞療法は、再生医学および免疫療法の礎石である。この治療に持ち込まれる非治療用細胞の多くは無害であるが、特定の異常な細胞型は、小集団であっても患者において深刻な有害事象の原因となり得る。ゆえに、治療用細胞を患者に移植する前に、それらの細胞を有害な細胞から精製することが極めて重要となり得る。細胞ベースの再生医療技術を臨床に移行するのを加速させるためには、希少な幹細胞および他の免疫細胞型を表面マーカーの差次的発現に基づいて臨床に適用可能な無菌のフォーマットで単離するためのハイスループットかつ高純度の方法が必要であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
本明細書中に開示される実施形態は、細胞をソーティングするためのシステム、方法およびデバイスを提供する。いくつかの場合において、それらの細胞は、レーザー（例えば、レーザー抽出）および／またはマイクロポアアレイの助けによりソーティングされ得る。そのマイクロポアアレイは、目的の細胞の抽出を助けるためにレーザーと相互作用できるコーティングを含み得る。そのコーティングは、場合によっては剥離し、それと同時にマイクロポアアレイ内に保持された液体のメニスカスを破壊できる。有益なことに、本明細書中に記載されるアプローチは、例えば、目的の粒子を保持している液体に対して直接ではなくアレイ表面にレーザーが向けられるので、細胞生存率および抽出効率を高めることができる。
【０００４】
いくつかの態様において、本開示は、第１の表面およびその第１の表面の反対側の第２の表面を有する基材を備えるアレイを提供し、その基材は、基材材料および表面材料を含み、その表面材料は、第１または第２の表面に位置または隣接し、その基材は、第１の表面から第２の表面に伸びる管腔を定義する複数のポアを含み、その基材は、複数のポアの各ポアが、５００ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、複数のポアの各ポアが、１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、および表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されることを特徴とする。
【０００５】
いくつかの態様において、本開示は、第１の表面およびその第１の表面の反対側の第２の表面を有する基材を備えるアレイを提供し、その基材は、基材材料および表面材料を含み、その表面材料は、第１または第２の表面に位置または隣接し、その基材は、第１の表面から第２の表面に延びる複数のポアを含み、その基材は、１平方ミリメートルあたり１００個またはそれを超えるポアというポアの密度、複数のポアの各ポアが、１０を超えるアスペクト比を有すること、および表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されることを特徴とする。
【０００６】
ある特定の実施形態において、各ポアは、約０．００８ｍｍ２またはそれ未満の最大断面積を有する。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、５ミクロン〜１００ミクロンの範囲内のポア直径を有する。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、１５ミクロン〜５０ミクロンの範囲内のポア直径を有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約１ｍｍ〜約５００ｍｍの範囲から選択される長さを有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約１ｍｍ〜約１００ｍｍの範囲から選択される長さを有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲から選択される長さを有する。
【０００７】
ある特定の実施形態において、ポアの密度は、１平方ミリメートルあたり１００〜２５００ポアの範囲内である。ある特定の実施形態において、ポアの密度は、１平方ミリメートルあたり５００〜１５００ポアの範囲内である。ある特定の実施形態において、表面材料は、基材材料と実質的に類似である。ある特定の実施形態において、表面材料は、基材材料と異なる。ある特定の実施形態において、基材材料は、ガラスであり、表面材料は、ガラスではない。ある特定の実施形態において、表面材料は、金属を含む。ある特定の実施形態において、表面材料は、０．４ミクロン〜２．５ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する。ある特定の実施形態において、表面材料は、入射放射の５０パーセント超を吸収する。ある特定の実施形態において、表面材料は、０．４ミクロン〜１．５ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の５０パーセント超を吸収する。
【０００８】
ある特定の実施形態において、アスペクト比は、１０〜１００の範囲内である。ある特定の実施形態において、アスペクト比は、２０またはそれを超える。ある特定の実施形態において、アスペクト比は、５０またはそれを超える。ある特定の実施形態において、アスペクト比は、１００またはそれを超える。ある特定の実施形態において、表面材料は、第２の表面を覆うかまたは部分的に覆う。ある特定の実施形態において、表面材料は、第１の表面を覆うかまたは部分的に覆う。ある特定の実施形態において、表面材料は、ポアの管腔へのアクセスを遮断しない。ある特定の実施形態において、表面材料は、約２０ｎｍ〜５００ｎｍの平均厚さを有する。ある特定の実施形態において、表面材料は、約１００ｎｍ〜５００ｎｍの平均厚さを有する。ある特定の実施形態において、表面材料は、疎水性である。
【０００９】
ある特定の実施形態において、第１の表面と第２の表面は、実質的に平行な面である。ある特定の実施形態において、上記複数のポアは、第１の表面から第２の表面まで表面法線に対して角度をなして延びている。ある特定の実施形態において、その角度は、より大きく０〜９０度の範囲内である。ある特定の実施形態において、上記複数のポアは、第１の表面から第２の表面まで直角に延びている。ある特定の実施形態において、上記複数のポアは、第１の表面から第２の表面まで間接経路を通っている。
【００１０】
いくつかの態様において、本開示は、混合物の構成要素をソーティングするためのシステムシステムを提供し、そのシステムは、本開示の任意の態様のアレイ、およびそのアレイから放出された選ばれた内容物を受け取るように構成された内側表面を備えるハウジングを備える。ある特定の実施形態において、内側表面は、基材の第２の表面の下に位置する。
【００１１】
いくつかの態様において、本開示は、選ばれた内容物をアレイのポアから放出する方法を提供し、その方法は、選ばれた内容物を含むアレイのポアを識別する工程であって、そのアレイは、第１の表面およびその第１の表面の反対側の第２の表面を有する基材を備え、その基材は、基材材料および表面材料を含み、その表面材料は、第１または第２の表面に位置または隣接し、その基材は、第１の表面から第２の表面に延びる管腔を定義する複数のポアを含み、その基材は、（ａ）複数のポアの各ポアが、５００ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、（ｂ）複数のポアの各ポアが、１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、（ｃ）１平方ミリメートルあたり１００個またはそれを超えるポアというポアの密度、および（ｄ）表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの１つまたはそれを超えることを特徴とする、工程、および識別されたポア内のまたは識別されたポアに隣接する表面材料に向けられた電磁放射によって、前記アレイの第１または第２の表面から表面材料の一部分を除去し、それにより、識別されたポアの内容物を放出する工程を含む。
【００１２】
ある特定の実施形態において、電磁放射は、０．２ミクロン〜２．５ミクロンの波長、内容物とポアとの接着を破壊するのに十分なフルエンスレベル、および１ｎｓ〜１ミリ秒の範囲内のパルス持続時間から選択される。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、アブレーションを含む。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、機械的除去を含む。ある特定の実施形態において、機械的除去が、チッピングを含む。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、光熱除去を含む。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、光化学的除去を含む。ある特定の実施形態において、表面材料を除去する工程は、光音響的除去を含む。
【００１３】
ある特定の実施形態において、選ばれた内容物は、水溶液中の細胞を含む。ある特定の実施形態において、その細胞は、ＩＮＫＴ細胞、Ｔｍｅｍ、Ｔｒｅｇ、ＨＳＰＣおよびそれらの組み合わせから選択される。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、約０．００８ｍｍ２またはそれ未満の断面積を有する。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、５ミクロン〜１００ミクロンの範囲内のポア直径を有する。ある特定の実施形態において、複数のポアの各ポアは、１５ミクロン〜５０ミクロンの範囲内のポア直径を有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約１ｍｍ〜約５００ｍｍの範囲から選択される長さを有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約１ｍｍ〜約１００ｍｍの範囲から選択される長さを有する。ある特定の実施形態において、各ポアは、約１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲から選択される長さを有する。
【００１４】
ある特定の実施形態において、ポアの密度は、１つのアレイにおいて１平方ミリメートルあたり１００〜２５００ポアの範囲内である。ある特定の実施形態において、ポアの密度は、１つのアレイの１平方ミリメートルあたり５００〜１５００ポアの範囲内である。ある特定の実施形態において、アレイは、１０００ポア／ｍｍ２を超えるポアの密度を含む。ある特定の実施形態において、ポアの密度は、５０００ポア／ｍｍ２またはそれを超える。ある特定の実施形態において、アスペクト比は、１０〜１００の範囲内である。ある特定の実施形態において、ポアは、２０またはそれを超えるアスペクト比を有する。ある特定の実施形態において、ポアは、５０またはそれを超えるアスペクト比を有する。ある特定の実施形態において、ポアは、１００またはそれを超えるアスペクト比を有する。ある特定の実施形態において、表面材料は、約０．４ミクロン〜約２．５ミクロンから選択される波長において１０パーセント超を吸収する。ある特定の実施形態において、表面材料は、入射放射の５０パーセント超を吸収する。ある特定の実施形態において、表面材料は、約０．４ミクロン〜約２．５ミクロンから選択される波長の入射放射の５０パーセント超を吸収する。
【００１５】
ある特定の実施形態において、上記アレイは、（ａ）複数のポアの各ポアが、５００ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、（ｂ）複数のポアの各ポアが、１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、（ｃ）１平方ミリメートルあたり１００個またはそれを超えるポアというポアの密度、および（ｄ）表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの２つまたはそれを超えることを特徴とする。ある特定の実施形態において、表面材料の一部分は、識別されたポアに隣接する。ある特定の実施形態において、表面の一部分は、識別されたポアの管腔表面を含む。ある特定の実施形態において、表面の一部分は、１００ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去される。ある特定の実施形態において、表面の一部分は、５０ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去される。ある特定の実施形態において、上記方法は、選ばれた内容物を含むポアを識別する工程の前に、選ばれた内容物を含む溶液をアレイにロードする工程をさらに含む。ある特定の実施形態において、選ばれた内容物を含むポアを識別する工程は、アレイのポアから放射された電磁放射を解析する工程を含む。ある特定の実施形態において、内容物を放出する工程は、１秒あたり約５，０００〜約１００，０００，０００ポアという速度で内容物を放出することを含む。
【００１６】
いくつかの態様において、本開示は、赤外線吸収コアおよび非赤外線吸収シェルを備えるビーズを提供し、その非赤外線吸収シェルの外径は、約１０ミクロンに等しいかまたはそれ未満である。
【００１７】
ある特定の実施形態において、非赤外線吸収シェルは、アガロース、デキストランまたはその両方を含む。ある特定の実施形態において、赤外線吸収コアは、赤外線吸収色素を含む。ある特定の実施形態において、ビーズは、約２０ミクロンに等しいかまたはそれ未満の直径を有する。
【００１８】
いくつかの態様において、本開示は、複数の、本開示の任意の態様のビーズ；および目的の粒子を含む溶液を提供する。ある特定の実施形態において、目的の粒子は、細胞である。ある特定の実施形態において、複数のビーズの数と複数の細胞の数との比は、約１：１〜１０：１である。
【００１９】
参照による援用
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が明確かつ個別に参照により援用されると示されるのと同程度に、参照により本明細書中で援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の新規特徴は、添付の請求項に詳細に示される。本発明の原理を利用した例証的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点がより理解される。
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、細胞をソーティングするためのアレイの垂直断面図である。
【００２２】
【図１Ｂ】図１Ｂは、粒子をソーティングするためのアレイの上面図である。
【００２３】
【図１Ｃ】図１Ｃは、細胞濃度が異なるアレイの画像例を示している。
【００２４】
【図２Ａ】図２Ａは、粒子をソーティングするためのアレイ例の垂直断面図である。
【００２５】
【図２Ｂ】図２Ｂは、そのアレイ例の基材例の直角図（orthogonal  view）である。
【００２６】
【図３Ａ】図３Ａは、クロムコーティングを備える、粒子をソーティングするためのアレイ例の直角図である。
【００２７】
【図３Ｂ】図３Ｂは、レーザーによって除去されるクロムコーティングをポア付近の場所に備える、粒子をソーティングするためのアレイ例の直角図である。
【００２８】
【図４Ａ】図４Ａは、クロムコーティングを備える第１アレイ例における、ＩＲエネルギー吸収蛍光色素で染色されたＰＢＭＣの直角図である。
【００２９】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＢＭＣ抽出後の、クロムコーティングを備える第１アレイ例の直角図である。
【００３０】
【図５Ａ】図５Ａは、ミクロスフェアを備えるアレイの垂直断面図を示している。
【００３１】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ミクロスフェアおよび水性サンプル溶液を含むアレイの垂直断面図を示している。
【００３２】
【図６Ａ】図６Ａは、ミクロスフェアおよび細胞で満たされたマイクロポアのアレイの明視野像を示している。
【００３３】
【図６Ｂ】図６Ｂは、単一ポアからの細胞の抽出の明視野像を示している。
【００３４】
【図６Ｃ】図６Ｃは、ミクロスフェアおよび１つの細胞で満たされたポアのアレイ像を示している。
【００３５】
【図６Ｄ】図６Ｄは、単一のマイクロポアから細胞を抽出した後のアレイの画像を示している。
【００３６】
【図７Ａ】図７Ａは、抽出された細胞の明視野像の一例を示している。
【００３７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、抽出された細胞の画像例を示している。
【００３８】
【図８】図８は、アガロースおよびデキストランを含むミクロスフェア例の明視野像を示している。
【００３９】
【図９】図９は、アガロースおよびデキストランを含むミクロスフェア例の高倍率の赤外線画像を示している。
【００４０】
【図１０Ａ】図１０Ａは、アガロースおよびＩＲ吸収色素を含むミクロスフェア例の明視野像を示している。
【００４１】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、アガロースおよびＩＲ吸収色素を含むミクロスフェア例の赤外線画像を示している。
【００４２】
【図１１】図１１は、クロムを含むミクロスフェア例の赤外線画像を示している。
【００４３】
【図１２】図１２は、アレイ例におけるクロムを含むミクロスフェア例の赤外線画像を示している。
【００４４】
【図１３】図１３は、マイクロポアの中のクロムを含むクロムミクロスフェア例の高倍率の赤外線画像を示している。
【００４５】
【図１４Ａ】図１４Ａは、アレイ、ハウジングおよび内側表面を備えるシステムの垂直断面図を示している。
【００４６】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、アレイ、ハウジング、内側表面および電磁放射源を備えるシステムの垂直断面図を示している。
【００４７】
【図１５Ａ】図１５Ａは、０時間後におけるシステム例の漏れ試験の初めの直角図である。
【００４８】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、５時間後におけるシステム例の漏れ試験の終わりの直角図である。
【００４９】
【図１６Ａ】図１６Ａは、複数のポアを備えるアレイを提供しているところの垂直断面図を示している。
【００５０】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、アレイ内に水溶液を堆積させているところの垂直断面図を示している。
【００５１】
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、図１のアレイ例をカートリッジに挿入しているところの垂直断面図を示している。
【００５２】
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、第１の細胞および第２の細胞のシグナルのプロットの画像を示している。
【００５３】
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、第２の細胞を抽出しているところの垂直断面図を示している。
【００５４】
【図１６Ｆ】図１６Ｆは、細胞を回収しているところの垂直断面図を示している。
【００５５】
【図１７】図１７は、細胞のアレイの生蛍光像例を示している。
【００５６】
【図１８】図１８は、図１７に表されたアレイの５０万ポアの散布図例を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
発明の詳細な説明
高速かつ無菌の細胞ソーティングシステムを提供する必要がある。したがって、マイクロポアアレイなどのアレイからレーザー抽出によって細胞をソーティングするためのシステム、デバイスおよび方法が、本明細書中に提供される。本明細書中のシステム、デバイスおよび方法が用いるマイクロポアソーティングは、約１０，０００細胞／秒という高ソーティング速度または最先端のものの速度よりも１００〜１０００倍速い速度を求めて形成され得る。さらに、本明細書中に記載される実施形態は、無菌性および操作者のバイオセイフティーを維持し、サンプル間の汚染を低減し、流速の時間的制約を無くしつつ、細胞生存率または細胞機能を損なわずにそのようなソーティング速度を可能にし得る。特に、マイクロポアアレイの表面材料、ならびにそれを使用するシステムおよび方法によって、ポアの内容物に対する熱的影響が無視できる状態でポアの内容物を放出することができる。
【００５８】
アレイ
アレイが本明細書中に提供される。本明細書中に記載されるアレイは、粒子をソーティングするために利用され得る。それらの粒子は、目的の粒子、例えば、治療で使用するために濃縮する必要がある細胞であり得る。そのアレイは、基材を備え得る。その基材は、第１の表面、例えば上面、第１の表面の反対側の第２の表面、例えば底面、および第１の表面から第２の表面に延びる複数のポアを含み得る。それらのポアは、本明細書中に記載されるような様々な形状を有し得る管腔を定義し得る。それらのポアは、マイクロポアまたはマイクロチャネルであり得る。
【００５９】
１つの非限定的な例において、複数のポアを含む基材は、各ポアが５００ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、各ポアが１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、および表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されることを特徴とし得る。さらなるまたは代替の非限定的な例において、複数のポアを含む基材は、１平方ミリメートルあたり１００個またはそれを超えるポアというポアの密度、各ポアが１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、および表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されることを特徴とし得る。
【００６０】
図１〜１３は、粒子をソーティングするためのアレイの非限定的な例を図示している。図１Ａは、いくつかの実施形態に係る、粒子をソーティングするためのアレイの垂直方向のスライスである。図１によると、アレイ１００は、第１の表面１１１および第１の表面１１１の反対側の第２の表面１１２；第１の表面１１１から第２の表面１１２に延びる複数のポア１１３を含む基材１１０を備え得る。それらの複数のポアは、互いに実質的に平行であり得、粒子を液体とともに保持するように形成されている場合がある。例えば、その液体は、表面張力によってポア内に保持され得、場合によってはメニスカスを形成し得る。
【００６１】
基材１１０は、基材材料を含み得る。その基材材料は、ガラス、例えば、ケイ酸塩ガラス、融解石英、溶融石英などであり得る。その基材材料は、プラスチック、例えば、ＰＥＴＧ、ＰＥＥＫなどであり得る。その基材は、金属、例えば、アルミニウム、鋼、クロムなどであり得る。
【００６２】
基材１１０は、複数のポア１１３を含み得る。いくつかの場合において、複数のポア１１３は、約１０万個から約１０００億個のポアを含む。いくつかの場合において、複数のポア１１３は、約１０００個から約１０億個のポアを含む。いくつかの場合において、複数のポア１１３は、約１００万個から約１０００億個のポアを含む。
【００６３】
基材１１０は、ある密度のポアを含み得る。そのポアの密度は、１つのアレイの１平方ミリメートルあたりのポアの数を含み得る。ポアの密度は、第１の表面１１１または第２の表面１１２において計測され得る。必要に応じて、いくつかの実施形態において、第１のアレイ１００は、約６６パーセントまたは約４０パーセント〜約７５パーセントのオープンアレイ割合（充填密度）を有する。いくつかの場合において、ポアの密度は、１平方ミリメートルあたり１００〜２５００ポアの範囲内であり得る。いくつかの場合において、ポアの密度は、１平方ミリメートルあたり５００〜１５００ポアの範囲内であり得る。高ポアの密度を製造する方法は、毛細管などの管を融合することによる方法であり得る。ポアの密度は、管の壁厚および中央の直径を変化させることによって変更され得る。
【００６４】
１つの非限定的な例において、第１のアレイ１１０は、幅および長さがそれぞれ１０×１０インチであり、直径がそれぞれ１５ｕｍの２億４０００万個のポア１１３を含む。
【００６５】
さらに、第１のアレイ１００は、図１Ａによると、第１の表面１１１と第２の表面１１２との間の垂直距離として計測されるアレイ高さ１１０ａを有する。いくつかの実施形態において、アレイ高さ１１０ａは、第１の表面１１１と第２の表面１１２との間の最大または最小の垂直距離として計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ１１０ａは、ポア１１３の標準的な高さとして計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ１１０ａは、ポア１１３の最大または最小の長さとして計測され得る。その長さは、ポア間で一様であり得るか、またはポアは、製造プロセス中の歪みまたは不規則さなどによって、ポアごとに異なり得る。必要に応じて、ポア１１３の各々は、約５０ｍｍと等しいかまたはそれ未満の長さを有する。いくつかの場合において、各ポアは、約１ｍｍ〜約５００ｍｍから選択される長さを有し得る。いくつかの場合において、各ポアは、約１ｍｍ〜約１００ｍｍから選択される長さを有し得る。いくつかの場合において、各ポアは、約１ｍｍ〜約１０ｍｍから選択される長さを有し得る。
【００６６】
必要に応じて、複数のポア１１３は、第１の表面１１１および第２の表面１１２に対して直角であり得る。いくつかの実施形態において、複数のポア１１３は、互いに実質的に平行であり得る。いくつかの実施形態において、第２の表面の反対側の第１の表面は、実質的に平行な面であり得る。複数のポアは、第１の表面から第２の表面に直角に延びていることがある。それらのポアは、第１の表面から第２の表面に垂直に延びていることがある。あるいは、複数のポアは、表面法線に対する角度で第１の表面から第２の表面に延びていることがある。その角度は、法線から９０度未満であり得る。その角度は、６０度未満、４５度未満、３０度未満またはそれ未満であり得る。その角度は、５〜９０度の範囲内であり得る。
【００６７】
いくつかの実施形態において、複数のポアは、第１の表面から第２の表面まで間接経路を通っていることがある。そのような実施形態において、それらのポアは、入り組んでいるか、つづり合わさっているか、または差し込まれている状態であり得る。それらのポアは、ポアを通るパスが第１の表面から第２の表面への真っ直ぐな経路を基準として実質的に方向を変えるように１つまたは複数の湾曲部を含み得る。
【００６８】
図１Ｂは、粒子をソーティングするためのアレイ１００の上面図である。いくつかの例において、アレイ１００は、複数のポア１１３を有する。それらのポアの各々が、断面を含み得る。その断面は、円形であり得るか、楕円形であり得るか、多面形（例えば、正方形、六角形、八角形、十二角形など）であり得るか、または不規則な形状を有し得る。その形状は、ポア間で一様であり得るか、またはポアは、製造プロセス中の歪みまたは不規則さなどによって、ポアごとに異なり得る。
【００６９】
断面は、最大の断面寸法１１３ｂを含み得る。最大の断面寸法は、アレイの２つの表面のいずれかまたは中間の位置において計測され得る。最大の断面寸法は、単一の断面において計測され得る。追加的または代替的に、最大の断面寸法は、ポアに沿った多くの位置にわたって平均され得る。その寸法は、基準となるものを用いた顕微鏡下での方法、干渉計による方法、流量からの計算による方法などの多くの方法で計測され得る。いくつかの例において、アレイの各ポアは、５ミクロン〜１００ミクロンの範囲内の断面寸法を含み得る。いくつかの例において、各ポアは、１５ミクロン〜５０ミクロンの範囲内の断面寸法を有し得る。
【００７０】
いくつかの場合において、最大の断面寸法は、直径であり得る。直径という用語は、円形、ほぼ円形または楕円形であるポアの端から端までの最大の断面距離を包含すると意図される。いくつかの例において、アレイの各ポアは、５ミクロン〜１００ミクロンの範囲内のポア直径を含み得る。いくつかの例において、各ポアは、１０ミクロン〜５０ミクロンの範囲内の直径を有し得る。
【００７１】
各ポア１１３は、ある断面積を含み得る。その断面積は、単一の断面において計測され得る。追加的または代替的に、その断面積は、ポアに沿った多くの位置にわたって平均され得る。図１Ｂに示されるポア１１３の白色の領域は、ポアの第１の表面における断面積を定義し得る。必要に応じて、マイクロポア１１３の各々が、約１平方ミリメートルに等しいかまたはそれ未満の断面積を有する。いくつかの場合において、複数のポアの各ポアは、約０．００８ｍｍ２またはそれ未満の最大断面積を有し得る。
【００７２】
アレイの各ポア１１３は、あるアスペクト比を含み得る。そのアスペクト比は、ポアの最大の断面寸法に対するポアの長さの割合であり得る。そのアスペクト比は、ポアの直径に対するポアの長さの割合であり得る。いくつかの場合において、アスペクト比は、１０〜１００の範囲内であり得る。いくつかの場合において、アスペクト比は、１０またはそれを超えることがある。いくつかの場合において、アスペクト比は、２０またはそれを超えることがある。いくつかの場合において、アスペクト比は、１００またはそれを超えることがある。
【００７３】
図１Ｃは、細胞濃度が異なるアレイの画像例を示している。各ウェルは、例証の実施形態に示されているように、１つまたは複数の目的の粒子（例えば、細胞）を含み得る。その１つまたは複数の粒子は、１つまたは複数の細胞を含み得る。複数の細胞の数は、約１、約５、約２５またはそれを超える数であり得る。いくつかの例において、複数の細胞の数は、約１００未満または約１０００未満であり得る。
【００７４】
いくつかの実施形態において、水性サンプル溶液は、水性サンプル溶液をアレイ１００上に広げることなどによって、アレイ１００上に堆積され得る。いくつかの実施形態において、アレイ１００の親水性の第１の表面１１１は、水性サンプル溶液をポア１１３に吸い込む。いくつかの実施形態において、アレイ１００の第１の表面１１１は、水性サンプル溶液内の目的の粒子（例えば、細胞）をマイクロポア１１３に分配する。いくつかの実施形態において、アレイ１００の第１の表面１１１は、水性サンプル溶液内の目的の粒子をマイクロポア１１３にランダムに分配する。いくつかの実施形態において、目的の粒子は、各マイクロポア１１３の底に沈み得る。必要に応じて、いくつかの実施形態において、目的の粒子は、水性サンプル溶液の表面張力によって各ポア１１３に留め置かれ得る。
【００７５】
基材材料は、基材材料の一部分または一部分付近に向けられた電磁放射に応答して破壊されるように形成され得る。したがって、目的の粒子が、アレイの特定のマイクロチャネル内に保持されていると識別されると、電磁放射が、基材材料を破壊するように第１の表面に向けられ得、その結果、そのマイクロチャネル内に保持された液体のメニスカスが壊れて、目的の粒子が放出され得る。ある特定の実施形態において、電磁放射は、マイクロアレイにおけるポアの中のまたはポア付近の基材材料の一部分を除去、例えば、切除することにより、ポアのマイクロチャネル内に保持された液体のメニスカスが壊れる。
【００７６】
表面材料
図２〜１７Ｂに示されている、表面材料を含むアレイ１００の非限定的な例が、本明細書中に提供される。表面材料１２０は、コーティングを含み得る。そのコーティングは、第１の表面１１１に結合され得る。いくつかの実施形態において、表面材料は、基材材料の材料と異なる材料を含み得る。１つの例において、コーティングは、遷移金属、例えばクロムなどの金属を含み得る。表面材料またはコーティングは、表面材料の一部分または一部分付近に向けられた電磁放射に応答して第１の表面から破壊されるように形成され得る。したがって、目的の粒子が、アレイの特定のマイクロチャネル内に保持されていると識別されると、電磁放射が、コーティングを破壊および／または剥離するように表面に向けられ得、その結果、そのマイクロチャネル内に保持された液体のメニスカスが壊れて、目的の粒子が放出され得る。
【００７７】
図２Ａは、いくつかの実施形態に係る、粒子をソーティングするためのアレイ例の垂直断面図である。図２Ａに図示されているように、アレイ１００は、基材１１０を備え得る。その基材は、複数のポア１１３を含み得る。基材１１０は、第２の表面１１２および第２の表面１１２の反対側の第１の表面１１１を含み得る。必要に応じて、複数のポア１１３は、第１の表面１１１から第２の表面１１２に延びていることがある。いくつかの実施形態において、コーティング１２０は、第１の表面１１１と作動可能に結合され得る。
【００７８】
いくつかの実施形態において、アレイ１００は、約６６パーセントというオープンアレイ割合（充填密度）を有する。いくつかの実施形態において、ポア１１３の各々は、約１平方ミリメートルに等しいかまたはそれ未満の断面積を有する。いくつかの実施形態において、ポア１１３の各々は、約５０ｕｍ〜約１５０ｕｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、ポア１１３の各々は、約５０ｍｍに等しいかまたはそれ未満の長さを有する。いくつかの実施形態において、複数のポア１１３は、第２の表面１１２および第１の表面１１１に対して直角である。いくつかの実施形態において、複数のポア１１３におけるポア１１３の各々は、互いに実質的に平行であり得る。いくつかの実施形態において、複数のポア１１３は、約１００万〜約１０００億個のポアを含み得る。
【００７９】
さらに、アレイ１００は、図２Ａによると、第２の表面１１２から表面材料１２０までの距離として計測されるアレイ高さ１１０ａを有する。いくつかの実施形態において、アレイ高さ１１０ａは、第１の表面１１１と第２の表面１１２との間の垂直距離として計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ１１０ａは、第１の表面１１１と第２の表面１１２との間の最大または最小の垂直距離として計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ１１０ａは、ポア１１３の標準的な高さとして計測され得る。いくつかの実施形態において、アレイ高さ１１０ａは、ポア１１３の最大または最小の高さとして計測され得る。
【００８０】
図２Ｂは、いくつかの実施形態に係るアレイ例の上面図である。アレイ１００内の複数のポア１１３は、図２Ｂによると、直角のパターン（orthogonal  pattern）で配置されている。いくつかの実施形態において、そのパターンは、線形パターン、三角形パターン、六角形パターン、不規則なパターンまたはそれらの任意の組み合わせを含む。ポア１１３の直交パターンは、図２Ｂによると、第１の隔たり１１３ｂおよび第２の隔たり１１３ｃのうちの少なくとも１つを有し、第１の隔たり１１３ｂおよび第２の隔たりは、連続したポア１５１３の中心点の間で計測される。いくつかの実施形態において、第１の隔たり１１３ｂおよび第２の隔たりのうちの少なくとも１つは、連続したポア１１３の表面上の対向する点の間の垂直距離として計測される。いくつかの実施形態において、第１の隔たり１１３ｂおよび第２の隔たり１１３ｃのうちの少なくとも１つは、約１０ｍｍ〜約４０ｍｍであり得る。
【００８１】
本明細書中に記載されるアレイは、コーティング１２０を含み得る。そのコーティングは、基材と作動可能に結合され得る。そのコーティングは、電磁放射に曝露されたとき、破壊されるように形成され得る。例えば、コーティングの一部分に向けられたレーザーからの電磁放射に応答して、そのコーティングは、チッピングし得るか、または剥離し得る。必要に応じて、そのコーティングは、基材の材料と異なる材料を含み得る。例えば、基材１１０は、第１の材料を含み得、コーティング１２０は、第１の材料と異なる第２の材料を含み得る。
【００８２】
いくつかの場合において、表面材料は、第２の表面を覆い得るかまたは部分的に覆い得る。追加のまたは代替の場合において、表面材料は、第１の表面を覆い得るかまたは部分的に覆い得る。いくつかの場合において、表面材料は、ポアの管腔へのアクセスを実質的に遮断しないことがある。しかしながら、製造中のコーティング厚のばらつきなどに起因して、いくつかのポアの封鎖が生じ得る。表面材料は、約２０ナノメートル（ｎｍ）〜５００ｎｍの平均厚さを有し得る。表面材料は、約１００ｎｍ〜５００ｎｍの平均厚さを有し得る。
【００８３】
いくつかの場合において、表面材料は、基材材料に実質的に類似であり得る。いくつかの場合において、アレイは、均一であり得る。いくつかの実施形態において、均一なアレイは、コーティングを含まない。いくつかの実施形態において、均一なアレイは、一様な集塊または合金材料を含む。１つの例において、アレイは、メタロイド、遷移金属、例えば、クロムまたはその両方を含む。いくつかの実施形態において、基材材料は、ガラス、プラスチック、アルミニウム、鋼、ステンレス鋼またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００８４】
いくつかの場合において、表面材料は、基材材料と実質的に異なり得る。基材材料は、ガラスであり得、表面材料は、ガラス以外の材料であり得る。いくつかの場合において、表面材料は、金属を含み得る。いくつかの場合において、金属としては、クロム、銀、金、アルミニウムなどが挙げられ得る。いくつかの場合において、表面材料は、金属酸化物、例えば、フッ化マグネシウム、フッ化カルシウム、二酸化ケイ素などを含み得る。表面材料は、反射または吸収などの個々に合わせた光学的特性を形成するように、金属および／または金属酸化物の層を含み得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、表面材料は、遷移金属、例えば、クロムを含む。いくつかの実施形態において、第２の材料は、メタロイドを含む。いくつかの実施形態において、第２の材料は、金属酸化物を含む。いくつかの実施形態において、第２の材料としては、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、白金、金、水銀、ニオブ、イリジウム、モリブデン、銀、カドミウム、タンタル、タングステン、アルミニウム、ケイ素、リン（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）、スズ、任意の前述のものの酸化物またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、表面材料は、細胞生存率に悪影響を及ぼさない材料から選択される。例えば、表面材料は、生体適合性であり得る。表面材料は、無毒性であり得る。ある特定の実施形態において、表面材料は、電磁放射と接触したとき、細胞傷害または細胞死を引き起こさない材料から選択される。例えば、表面材料を電磁放射と接触させることによって生成される生成物自体が、細胞傷害または細胞死を引き起こしてはならない。つまり、例えば、表面材料のアブレーションによって生成される生成物は、生体適合性かつ／または細胞に対して無毒性であり得る。ある特定の実施形態において、細胞生存率に対する影響は、細胞を表面材料に曝露する前および後の細胞生存率を計測することによって評価される。ある特定の実施形態において、細胞生存率は、同じままであるか、または４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満もしくは５％未満しか低下しない。ある特定の実施形態において、細胞生存率は、表面材料を電磁放射と接触させる前および後の細胞生存率を計測することによって評価され得る。例えば、細胞生存率は、細胞をアレイにロードする前、および表面材料と電磁放射との接触によってアレイのポアから細胞を放出した後に評価される。いくつかの例において、生存率は、表面材料を電磁放射と接触させた後も、同じままであるか、または４０％未満、３０％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満しか低下しない。
【００８７】
アレイは、いくつかの場合において、個々に合わせた疎水性を有し得る。１つの例において、第２の表面１１２は、親水性であり得る。必要に応じて、第２の表面１１２は、それ自体が親水性である必要はないが、親水性コーティングに作動可能に結合され得る。いくつかの実施形態において、コーティング１２０の一部分は、第１の表面１１１から破壊されるように形成され得る。いくつかの実施形態において、コーティング１２０の一部分は、コーティングの一部分に向けられた電磁放射に応答して、第１の表面１１１から破壊されるように形成され得る。いくつかの実施形態において、コーティング１２０は、疎水性であり得る。
【００８８】
コーティングは、表面材料の一部分に向けられた電磁放射に応答して破壊されるように形成され得る。したがって、目的の粒子が、アレイの特定のマイクロチャネル内に保持されていると識別されると、電磁放射が、コーティングを破壊および／または剥離するようにコーティングに向けられ得、その結果、マイクロチャネル内に保持された液体のメニスカスが壊れて、目的の粒子が放出され得る。コーティングは、電磁放射源が放射する波長に対応する波長または波長範囲で吸収し得る。
【００８９】
したがって、目的の粒子が、アレイの特定のポア内に保持されていると識別されると、電磁放射が、その特定のポアの近くまたはその特定のポア付近に向けられて、目的の粒子を放出し得る。いくつかの実施形態において、第２の表面の破壊は、アレイ、アレイ上のコーティングまたはその両方の材料の少なくとも一部分を除去することを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、アレイの破壊は、局所的な加熱によって引き起こされ得る。そのようなメカニズムは、パルス持続時間がより長いとき、ピーク出力密度がより低いとき、および／または入射放射の波長が赤外であるとき、起こる可能性があり得る。局所的な加熱は、表面材料またはアレイ材料の昇華を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、基材材料およびコーティングは、異なる熱膨張係数を含み、それにより、チッピングに至り得る。
【００９１】
追加的または代替的に、アレイの破壊は、アブレーションによって引き起こされ得る。そのようなメカニズムは、入射ピーク出力密度がより高いとき、パルス持続時間がより短いとき、放射電力がより高いとき、および／または入射放射が可視であるとき、起こる可能性があり得る。アブレーションは、アレイまたは基材材料の局所的な結合の切断および／または気化を含み得る。
【００９２】
追加的または代替的に、アレイの破壊は、プラズマ発生によって引き起こされ得る。このメカニズムは、入射放射のパルス持続時間が特に短いとき、入射放射の波長が多光子イオン化メカニズムと共鳴関係にあるとき、およびまたは入射放射の波長が非常に短いとき、起こる可能性があり得る。ピコ秒台からフェムト秒台のパルス持続時間によって、基材または表面材料（ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｔｅｒ）の光学エッチングにつながる局所的な加熱よりも速いプラズマ発生がもたらされ得る。
【００９３】
追加的または代替的に、アレイの破壊は、衝撃波発生によって生じ得る。そのようなメカニズムは、ピーク出力密度がより高いとき、フォノンが共鳴しているとき、および／またはパルス持続時間がより短いとき、起こる可能性が高い場合があり得る。衝撃は、表面材料またはアレイ材料の物理的振動、チッピングまたは揺れを引き起こし得る。
【００９４】
ある例において、表面材料は、可視または赤外の範囲の波長を吸収する。いくつかの実施形態において、表面材料は、不透明であり得る。その表面材料は、可視および赤外の範囲内で選択される少なくとも５ナノメートルの帯域を吸収し得る。その表面材料は、０．４〜２．５ミクロンから選択される少なくとも５ナノメートルの帯域内の入射放射の１０パーセント超を吸収し得る。その表面材料は、０．４ミクロン〜２．５ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の１０パーセント超を吸収し得る。いくつかの場合において、その表面材料は、少なくとも５ナノメートルの帯域内の入射放射の５０パーセント超を吸収し得る。その５ナノメートルの帯域は、０．４〜２．５ミクロンの波長の範囲内で選択され得る。その表面材料は、０．４ミクロン〜１．５ミクロンから選択される波長の入射電磁放射の５０パーセント超を吸収し得る。その表面材料は、ドープされたオルトバナジン酸イッテルビウムまたはイッテルビウム・アルミニウム・ガーネット固体レーザーの高調波から選択される波長の入射放射の１０パーセント超を吸収し得る。その表面材料は、１０６４ナノメートルの入射放射の１０パーセント超を吸収し得る。
【００９５】
１つの例において、アレイのコーティング、例えばクロムコーティングは、約５００ｎｍの平均厚さを有し、その平均厚さは、赤外（ＩＲ）レーザーによって約１００ｎｍまたはそれ未満（例えば、約７５ｎｍもしくはそれ未満、または約５０ｎｍもしくはそれ未満）だけ薄くされる。コーティングの厚さは、１００〜５００ｎｍであり得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、電磁放射源は、コーティングの平均厚さを約１ｎｍ〜約５ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍまたは約１ｎｍ〜約１００ｎｍ薄くするように形成され得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、電磁放射源は、約１ｎｍ〜約５ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍまたは約１ｎｍ〜約１００ｎｍの平均深さでアレイの一部分を切除するように形成され得る。
【００９８】
いくつかの実施形態において、電磁放射源は、コーティングまたはアレイの一部分を除去するように形成され得、その一部分は、約１μｍ２〜約３０μｍ２、１μｍ２〜約２０μｍ２、約１μｍ２〜約１０μｍ２または約１μｍ２〜約５μｍ２の表面積を有する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、電磁放射源は、マイクロポアの外周から約１ｎｍ〜約５ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍまたは約１ｎｍ〜約１００ｎｍの平均距離でアレイの一部分を切除するように形成され得る。
【０１００】
図３Ａは、いくつかの実施形態に係る、クロムコーティングを含む粒子をソーティングするためのアレイ例の上面図を示している。図３Ｂは、いくつかの実施形態に係る、レーザーによって除去されるクロムコーティングを含む粒子をソーティングするためのアレイの非限定的な例の上面図を示している。図３Ａ〜Ｂによると、コーティング１２０は電磁エネルギーを吸収し、それにより、それが基材１１０から破壊され、各ポア１１３内の流体のメニスカスを壊し、内部の細胞が排出される。図３Ｂは、電磁エネルギーによって基材１１０から除去されたコーティング１２０の片を示している。図３Ｂに見られるように、レーザーは、単一のポアもしくは単一のポア付近、２つの隣接したポアの間、または３つのポアから等距離の場所に焦点が当てられ得る。いくつかの実施形態において、赤外レーザーを単一ポアの近く、２つの隣接したポアの間または３つのポアから等距離の場所に焦点を当てることにより、それぞれ１つ、２つまたは３つのポア１１３内の流体のメニスカスが壊れて、内部の細胞が排出される。いくつかの実施形態において、レーザーを特定のポアに近づけて焦点を当てることにより、付近のポア内の細胞を意図せず排出してしまう可能性が低下する。いくつかの実施形態において、赤外レーザーの強度および持続時間のうちの少なくとも１つは、１つ、２つまたは３つのポア内の細胞の排出を制御するように設定され得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、表面材料１２０は、１００ｎｍ厚のクロムをガラスアレイ上にスパッタすることによって形成され得る。いくつかの実施形態において、スパッタリングは、真空下で行われ得る。いくつかの実施形態において、真空は、約０．０８〜約０．０２ｍｂａｒであり得る。いくつかの実施形態において、スパッタリングは、約１００Ｖ〜３ｋＶの電圧において行われ得る。いくつかの実施形態において、スパッタリングは、０〜５０ｍＡの電流において行われ得る。必要に応じて、いくつかの実施形態において、クロムは、ガラスアレイの片側のみにスパッタされ得る。いくつかの実施形態において、クロムをコーティングされたアレイは、その後、塩基性溶液、例えば、ＮａＯＨ溶液に浸漬され得る。いくつかの実施形態において、そのＮａＯＨ溶液は、約１Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態において、クロムをコーティングされたアレイは、約１２時間にわたって浸漬され得る。いくつかの実施形態において、クロムをコーティングされたアレイは、その後、１０パーセントの漂白剤に最大１時間浸漬され得、次いで、水の噴霧により、残留漂白剤を除去する。いくつかの実施形態において、クロムをコーティングされたアレイは、その後、細胞をロードする前にブロー乾燥され得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣの抽出は、クロムをコーティングされたアレイ上に界面活性剤および受け取り培地を加えること；組み立てられ得るアレイを、クロムをコーティングされた側を下向きにして受け取り培地に向かってカセットに挿入すること；ＰＢＭＣをアレイ上に滴下すること、およびＰＢＭＣをポア内に静置させることを含む。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、細胞膜の完全性を守り、液体剪断下での頑健さを改善する。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．１パーセントのプルロニック（登録商標）（ｐｌｕｏｒｏｎｉｃ）Ｆ６８を含む。いくつかの実施形態において、受け取り培地には、ＯｐｔｉＰＥＡＫ  Ｔ  Ｃｅｌｌ培地を含む。いくつかの実施形態において、受け取り培地は、ストレプトアビジンをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、約５分間にわたってマイクロポア内に静置される。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、レーザーから放射され、クロムコーティングによって吸収されるＩＲエネルギーは、各マイクロポアの底縁においてコーティングを膨張させ、剥離を起こさせて、各マイクロポアからＰＢＭＣを抽出し得る。各マイクロポアの底縁におけるクロムコーティングの分離により、その中の流体のメニスカスが壊れて、ＰＢＭＣが放出される。
【０１０４】
図４Ａは、いくつかの実施形態に係る、クロムコーティングを備える第１のアレイの非限定的な例におけるＩＲエネルギー吸収蛍光色素で染色されたＰＢＭＣの上面図である。図４Ｂは、いくつかの実施形態に係る、ＰＢＭＣ抽出後の、クロムコーティングを備える第１のアレイ例の上面図である。
【０１０５】
ビーズ
ある特定の実施形態において、アレイのポアは、電磁放射を吸収するビーズであって、ポア内の流体のメニスカス（ｍｉｎｉｓｃｕｓ）の破壊に影響するビーズを含み得る。いくつかの場合において、そのビーズ（ｂｅａｒｄ）は、ポアの管腔表面に結合されていてもよいし、結合されていなくてもよい（液体混合物としてポアに加えられてもよい）。コアおよびシェルを含むビーズが、本明細書中に提供される。本開示のビーズは、「ミクロスフェア」と称され得る。コアは、赤外線（ＩＲ）吸収コアを含み得る。シェルは、非ＩＲ吸収シェルを含み得る。本開示のビーズは、アレイのポアに関連し得、ビーズは、電磁放射を吸収し得る。非ＩＲ吸収シェルは、ＩＲ吸収コアを近くの粒子、例えば、細胞から遮断することにより、ＩＲ吸収放射線によるコアの傷害作用からそれらの粒子を保護し得る。ビーズは、アガロースをさらに含み得る。非ＩＲ吸収シェルは、アガロースを含み得る。ビーズは、デキストランをさらに含み得る。ビーズは、ＩＲ吸収色素で染色され得る。ビーズは、約１μｍ〜約２０μｍまたは約５μｍ〜約２０μｍなどの約２０μｍに等しいかまたはそれ未満の直径を含み得る。ビーズは、約１０ミクロンに等しいかまたはそれ未満であり得る吸収シェルを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるようなアレイの表面材料は、赤外線吸収コアおよび非赤外線吸収シェルを含むビーズを含み得、その非赤外線吸収シェルの外径は、約１０ミクロンに等しいかまたはそれ未満である。
【０１０６】
図５Ａは、中にビーズが配置されたアレイ１００を示している。いくつかの場合において、それらのビーズは、ポアの管腔の内部に配置され得る。いくつかの場合において、それらのビーズは、第１の表面１１１上に配置され得る。いくつかの場合において、それらのビーズは、ポアの管腔内に配置され得る。図５Ｂは、図５Ａのアレイ例内の水性サンプル溶液の垂直断面図を示している。いくつかの実施形態において、水性サンプル溶液５２１をアレイ１００上に堆積させることは、水性サンプル溶液５２１をアレイ１００上に広げることを含む。いくつかの実施形態において、アレイ１００の親水性の第１の表面１１１は、水性サンプル溶液５２１をポア１１３内に吸い込む。いくつかの実施形態において、アレイ１００の親水性の第１の表面１１１は、水性サンプル溶液５２１中の第１の細胞５２２および第２の細胞５２３をポア１１３に均等に分配する。いくつかの実施形態において、アレイ１００の親水性の第１の表面１１１は、水性サンプル溶液５２１中の第１の細胞５２２および第２の細胞５２３をポア１１３にランダムに分配する。いくつかの実施形態において、第１の細胞５２２および第２の細胞５２３は、各ポア１１３の底に沈む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、第１の細胞５２２および第２の細胞５２３は、水性サンプル溶液５２１の表面張力によって各ポア１１３に引き止められる。
【０１０７】
図６Ａは、いくつかの実施形態に係る、ミクロスフェアおよび細胞で満たされたマイクロポアのアレイの明視野像を示している。図６Ａに見られるように、アレイ６００内のマイクロポア６０１の各々は、それぞれの各マイクロポア６０１の中のマイクロビーズおよび細胞によって塞がれ得る。図６Ｂは、いくつかの実施形態に係る、単一のマイクロポアからの細胞抽出の明視野像を示している。図６Ｂに見られるように、アレイ６００内のただ１つのマイクロポア６０１だけしか、細胞によって塞がれることができていないことから、単一のマイクロポア６０１における細胞だけが除去されたことが示唆される。図６Ｃは、いくつかの実施形態に係る、ミクロスフェアおよび細胞で満たされたマイクロポアのアレイ画像を示している。図６Ｃに見られるように、アレイ６００内のただ１つのマイクロポア６０１だけしか、細胞を含まない。図６Ｄは、いくつかの実施形態に係る、単一のマイクロポアからの細胞抽出後のアレイ６００の画像を示している。図６Ｄに見られるように、アレイ６００内のマイクロポア６０１のいずれもが、細胞を含まないことから、単一のマイクロポア６０１における単一の細胞が除去されたことが示唆される。
【０１０８】
図７Ａは、いくつかの実施形態に係る、抽出された細胞の明視野像の一例を示している。図７Ｂは、いくつかの実施形態に係る、抽出された細胞の画像例を示している。
【０１０９】
図８〜１３によると、ビーズまたはミクロスフェアの例が本明細書中に提供される。図８は、アガロースおよびデキストランミクロスフェアの一例の明視野像を示している。いくつかの実施形態において、アガロースおよびデキストランミクロスフェア８００は、赤外光を吸収するように形成されている。いくつかの実施形態において、アガロースおよびデキストランミクロスフェア８００は、不透明、黒色またはその両方である。いくつかの実施形態において、アガロースおよびデキストランミクロスフェア８００は、ポリマーシェル酸化鉄ミクロスフェア８００を含む。いくつかの実施形態において、アガロースおよびデキストランミクロスフェア８００は、約６ｕｍ〜約２０ｕｍの直径を有する。
【０１１０】
図９は、アガロースおよびデキストランミクロスフェアの一例の高倍率の赤外線画像を示している。図９に見られるように、アガロースおよびデキストランミクロスフェア８００は、赤外線（ＩＲ）吸収コア９１０および非ＩＲ吸収シェル９２０を含む。いくつかの実施形態において、ＩＲ吸収コア９１０は、ＩＲ吸収色素を含む。いくつかの実施形態において、ＩＲ吸収色素は、Ｅｐｏｌｉｇｈｔ１１７８を含む。いくつかの実施形態において、非ＩＲ吸収シェル９２０は、アガロースおよびデキストランを含む。
【０１１１】
ＩＲコア着色粒子を使用することは、効率的な細胞抽出にとって有益であり得る。第１に、アガロースコアの分子構造に組み込まれた色素は、色素コーティングよりもＩＲ吸収を増加させ得る。さらに、非ＩＲ吸収ソフトシェルは、任意の潜在的な熱吸収、体積膨張および／またはマイクロバブル形成に関連する応力および熱衝撃から細胞を守るための緩衝層として働き得る。その両方が、抽出効率の増大（成功した抽出事象の回数の増加）および細胞生存率の上昇を可能にし得る。
【０１１２】
図１０Ａは、アガロースおよびＩＲ色素ミクロスフェアの一例の明視野像を示している。図１０Ｂは、アガロースおよびＩＲ色素ミクロスフェアの一例の赤外線画像を示している。図１０Ｂに見られるように、アガロースおよびＩＲ色素ミクロスフェア１０００は、赤外線（ＩＲ）を吸収するものであり得る。いくつかの実施形態において、アガロースおよびＩＲ色素ミクロスフェア１０００は、アガロースを含む。いくつかの実施形態において、アガロースおよびＩＲ色素ミクロスフェア１０００は、ＩＲ吸収色素を含む。いくつかの実施形態において、ＩＲ吸収色素は、Ｅｐｏｌｉｇｈｔ１１７８を含む。いくつかの実施形態において、その色素は、緑色蛍光タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、その色素は、赤色蛍光タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、その色素は、シアニン色素、アクリジン色素、フルオロン（ｆｌｏｕｒｏｎｅ）色素、オキサジン色素、ローダミン（ｒｈｏｄｏｍｉｎｅ）色素、クマリン色素、フェナントリジン（ｐｈｅａｎｔｈｒｉｄｉｎｅ）色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、ＡＬＥＸＡ色素、ペリレン色素、アントラセン色素、ナフタリン色素などを含む。いくつかの実施形態において、アガロースおよびＩＲ色素ミクロスフェア１０００は、約２μｍ〜約１６μｍの直径を有する。
【０１１３】
図１１は、クロムを含むミクロスフェア例の赤外線画像を示している。図１２は、アレイ例におけるクロムを含むミクロスフェア例の赤外線画像を示している。図１３は、マイクロポアの中のクロムを含むミクロスフェア例の高倍率の赤外線画像を示している。いくつかの実施形態において、ミクロスフェア１１００は、遷移金属、例えば、クロムを含む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、ミクロスフェア１１００は、クロムコーティングを含む。
【０１１４】
赤外線吸収ビーズを形成する方法が、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、その方法は、アガロースビーズを洗浄する工程；アガロースビーズを着色する工程；およびアガロースビーズのコアを形成する工程を含む。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを洗浄する工程は、アガロースビーズを第１の溶媒に懸濁し、アガロースビーズおよび第１の溶媒を遠心分離することを含む。いくつかの実施形態において、第１の溶媒は、有機溶媒、例えばアセトン、または水性溶媒、例えば水、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、遠心は、約１，０００ｒｐｍ〜約４，０００ｒｐｍの速度で行われ得る。いくつかの実施形態において、遠心は、約２，０００ｒｐｍの速度で行われ得る。いくつかの実施形態において、１ｍＬの第１の溶媒が、５０ｍｇのアガロースビーズごとに使用され得る。いくつかの実施形態において、アガロースビーズは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘビーズを含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、着色液を形成すること、その着色液を遠心分離すること、および着色液をアガロースビーズに加えることを含む。着色液は、Ｅｐｏｌｉｎ１１７８および第２の溶媒を含み得る。いくつかの実施形態において、第２の溶媒は、アセトン、水、脱イオン水またはそれらの任意の組み合わせを含む。遠心は、約２，０００ｒｐｍ〜約１０，０００ｒｐｍ、例えば、約５，０００ｒｐｍの速度で行われ得る。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、アガロースビーズおよび着色液をインキュベートすることをさらに含む。インキュベーションは、約１５分間〜約１時間、例えば、約３０分間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、室温で行われ得る。インキュベーションは、絶えず混合しながら行われ得る。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、インキュベーション後に、例えば、約７５０ｒｐｍ〜約３，０００ｒｐｍの速度で、アガロースビーズを遠心分離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、色の濃いビーズを色の薄いビーズから分離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、アガロースビーズを着色する工程は、アガロースビーズを０．２パーセントのＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁することをさらに含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、アガロースビーズのコアを形成する工程は、アガロースビーズを第３の溶媒に懸濁すること、およびアガロースビーズおよび第３の溶媒を遠心分離することを含む。いくつかの実施形態において、第３の溶媒は、１：１のアセトン−水混合物を含む。いくつかの実施形態において、遠心は、約５００ｒｐｍ〜約２，０００ｒｐｍの速度で行われ得る。いくつかの実施形態において、遠心は、約１０秒間〜約６０秒間行われ得る。
【０１１７】
あるいは、いくつかの実施形態において、アガロースビーズのコアを形成する工程は、ビーズを緩衝液中でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、緩衝液は、ＢＳＡ−ＰＢＳを含む。いくつかの実施形態において、緩衝液は、約０．２パーセントの濃度を有する。いくつかの実施形態において、ビーズを緩衝液中でインキュベートすることは、約４℃の温度で行われ得る。いくつかの実施形態において、ビーズを緩衝液中でインキュベートすることは、少なくとも約５日間にわたって行われ得る。アガロースビーズのコアを形成する工程は、緩衝液を毎日交換することをさらに含み得る。
【０１１８】
本明細書中に記載されるような複数のビーズおよび本明細書中に記載されるような目的の粒子を含む溶液が、本明細書中に提供される。いくつかの場合において、目的の粒子は、細胞である。いくつかの場合において、その溶液は、約１：１〜１０：１である、複数のビーズの数と複数の細胞の数との比を含む。目的の粒子を含む溶液は、本明細書中に記載されるようなアレイの１つまたは複数のポアに挿入され得る。溶液の例は、実施例５および６に関してさらに記載される。
【０１１９】
システム
本明細書中に提供される別の態様は、粒子をソーティングするためのシステムである。混合物の構成要素をソーティングするためのシステムが、本明細書中に提供される。そのシステムは、本明細書中に記載されるようなアレイの任意の実施形態、バリエーションまたは例を含み得る。
【０１２０】
図１４Ａは、アレイ１００、ハウジング１４３１および内側表面１４３２を備えるシステムを示している。粒子をソーティングするためのシステムは、第１の表面１１１；第１の表面１１１の反対側の第２の表面１１２；および第１の表面１１１から第２の表面１１２に延びる複数のポア１１３を含む基材１１０を備えるアレイ１００を備え得、ポア１１３の各々は、約１平方ミリメートルに等しいかまたはそれ未満の断面積および約１０ｍｍに等しいかまたはそれ未満の長さを含み、基材１１０は、第１の材料；および第２の表面１１２に作動可能に結合されたコーティング１２０（ここで、コーティング１２０は、第１の材料と異なる第２の材料を含み、コーティング１２０の一部分は、そのコーティング１２０の一部分に向けられた電磁放射に応答して第２の表面１１２から破壊されるように形成され得る）；およびアレイ１００の複数のポア１１３内の流体（ここで、複数のポア１１３内の流体のメニスカスは、コーティング１２０に実質的に隣接している）を備える。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、第１の表面１１１は、親水性であり得る。いくつかの実施形態において、第１の表面１１１は、親水性のコーティング１２０に作動可能に結合され得る。いくつかの実施形態において、コーティング１２０は、疎水性であり得る。いくつかの実施形態において、コーティング１２０は、１時間と等しいかまたはそれを超える時間にわたってポアからの漏れを防ぐことが可能であり得る。いくつかの実施形態において、コーティング１２０は、その全体が第２の表面１１２を覆っている。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、第２の材料は、クロムであり得る。いくつかの実施形態において、第２の材料は、銀、金、アルミニウム、チタン、銅、白金、ニッケルまたはコバルトを含む。いくつかの実施形態において、第１の材料は、ガラスであり得る。いくつかの実施形態において、断面積は、約０．０３ｍｍ２に等しいかまたはそれ未満であり得る。いくつかの実施形態において、長さは、約１．５ｍｍに等しいかまたはそれ未満であり得る。いくつかの実施形態において、コーティング１２０は、約２００ｎｍに等しいかまたはそれ未満の厚さを含む。いくつかの実施形態において、基材１１０は、約０．５ｍ−１という表面積対体積比を含む。いくつかの実施形態において、コーティング１２０の一部分は、電磁放射を吸収するように、かつコーティング１２０の一部分に向けられた電磁放射に応答して第２の表面１１２から剥がれるように、形成され得る。いくつかの実施形態において、複数のマイクロポア１１３は、第１の表面１１１および第２の表面１１２に対して直角である。いくつかの実施形態において、複数のマイクロポア１１３は、互いに実質的に平行である。いくつかの実施形態において、複数のマイクロポア１１３は、約１００万〜約１０００億個のマイクロポア１１３である。いくつかの実施形態において、第２の材料は、不透明である。第２の材料は、赤外（ＩＲ）エネルギーを吸収するように形成され得る。基材１１０とコーティング１２０とは、異なる熱膨張係数を含み得る。
【０１２３】
必要に応じて、上記システムは、アレイから放出された選ばれた内容物を受け取るように構成された内側表面１４３２を含むハウジング１４３１をさらに備え得る。上記システムは、本明細書中に記載されるようなアレイの任意の実施形態、バリエーションまたは例、および内側表面を含むハウジングを備え得る。その内側表面は、基材の第２の表面の下に位置し得る。上記システムは、セルソーターをさらに備え得る。アレイは、セルソーター上にマウントされ得る。
【０１２４】
必要に応じて、粒子をソーティングするためのシステムは、電磁放射源を備え得る。
【０１２５】
図１４Ｂは、アレイ１００、電磁放射源１４５１を備える、粒子をソーティングするためのシステムを示している。そのアレイは、第１または第２の表面の一部分に向けられた電磁放射に応答して第１の表面または第２の表面において破壊されるように形成され得る。いくつかの場合において、例えば、目的の粒子が細胞であるとき、細胞生存率の上昇を助けるために、目的の粒子を保持しているコンパートメントにレーザーまたは他のエネルギー源を直接向けることなくアレイの特定のコンパートメント内に保持された粒子をソーティングシステムが放出できることが有益であり得る。アレイのポアの内部ではなく、アレイの表面にレーザーエネルギーの焦点を合わせることにより、熱衝撃、熱膨張、マイクロバブル発生および局所的な剪断応力（ｓｈｅｅｒ  ｓｔｒｅｓｓ）からポア内容物が傷害を受ける可能性が回避または低減され得る。
【０１２６】
電磁放射の発生源は、レーザーを含み得る。レーザーは、ドープされた固体レーザーであり得る。レーザーは、ファイバーレーザーであり得る。レーザーは、半導体ダイオードレーザーであり得る。レーザーは、ガスレーザー、例えば、ＨｅＮｅレーザーまたはエキシマ（ｅｘｉｍｅｒ）レーザーであり得る。レーザーは、ある範囲内の波長の電磁放射を放射し得る。いくつかの実施形態において、その電磁放射は、可視光線および／または赤外線として放射され得る。その電磁放射は、５ナノメートルの帯域内で放射され得、次いで、可視光線または赤外線として放射され得る。その電磁放射は、ドープされた固体レーザーの高調波（例えば、ドープされたオルトバナジン酸イッテルビウムまたはイッテルビウム・アルミニウム・ガーネット）で放射され得る。その電磁放射は、１０６４ｎｍの放射線を含み得る。
【０１２７】
上記電磁放射は、入射エネルギーを含み得る。その入射エネルギーは、１パルスあたり０．１マイクロジュール超であり得る。その入射エネルギーは、１パルスあたり１ミリジュール未満であり得る。その入射エネルギーは、１パルスあたり１ピコジュール〜１ジュールの範囲内であり得る。平均出力は、１０ワット未満であり得る。平均電力は、１００ミリワット未満であり得る。平均出力は、１マイクロワット超であり得る。
【０１２８】
上記電磁放射は、ある入射ピーク出力密度を含み得る。そのピーク出力密度は、１平方センチメートルあたり１０テラワット未満であり得る。そのピーク出力は、１平方センチメートルあたり１０ギガワット未満であり得る。
【０１２９】
上記電磁放射は、ある入射スポット径を含み得る。そのスポット径は、細胞の内容物が有意に照射されることなく、ポアに隣接する範囲が照射され得るように十分に小さいことがある。そのスポット径は、ポアのサイズおよびポアの間隔に基づいて調整され得る。そのスポット径は、管腔の内部の細胞などのポアの内容物が有意に照射されることなく、ポア管腔の内壁が照射され得るように十分に小さいことがある。そのスポット径は、１０ミリメートル（ｍｍ）未満、１ｍｍ未満、１００ミクロン（μｍ）未満、１０μｍ未満またはそれ未満であり得る。
【０１３０】
上記電磁放射は、ある入射パルス持続時間を含み得る。そのパルス持続時間は、約５フェムト秒超であり得る。そのパルス持続時間は、約１００フェムト秒超であり得る。そのパルス持続時間は、約１ナノ秒超またはそれを超えることがある。そのパルス持続時間は、約１マイクロ秒未満であり得る。
【０１３１】
電磁放射源の一例は、出力が０．１ｍＪであり、出力密度が１０８〜１０９Ｗ／ｍｍ２である１０６４ｎｍのイッテルビウムファイバーレーザーを含み、それにより、最大レーザー出力の１０パーセント〜３０パーセントにおいて４ｎｓのパルス持続時間で２０μｍのスポット径が、アレイに３０〜９０Ｊ／ｃｍ２を提供することができる。
【０１３２】
上記システムは、電磁放射源の焦点を合わせるための１つまたは複数のレンズをさらに備え得る。その１つまたは複数のレンズは、顕微鏡の対物レンズを含み得る。その顕微鏡の対物レンズは、アレイの特定の一部分を標的化するために、アレイの表面の端から端までラスタースキャンされ得る。上記システムは、アレイの表面に対する対物レンズの位置を制御し得る１つまたはそれを超える移動ステージを備え得る。
【０１３３】
上記システムは、１つまたはそれを超えるビームスプリッター、フィルターまたは干渉フィルターを備え得る。そのシステムの１つまたはそれを超えるビームスプリッター、フィルターまたは干渉フィルターは、ユーザーが、電磁放射源をアレイの表面と一直線に並べるかまたは電磁放射源をアレイの表面に向けながら、アレイの表面をモニターできるようにし得る。その位置調整は、アレイを破壊し得る出力よりも低い出力または同じ出力の電磁放射で行われ得る。上記システムは、電磁放射源の位置調整をモニターするために、１つまたはそれを超える位置敏感型光学検出器（例えば、ＣＣＤ）を備え得る。
【０１３４】
上記システムは、第２の電磁放射源を備え得る。第２の電磁放射源は、位置調整のために使用され得る。第２の電磁放射源は、フルオロフォアなどの吸収体を励起させるために使用され得る。第２の電磁放射源は、干渉性であってもよいし、非干渉性であってもよい。第２の電磁放射源は、広帯域であってもよいし、狭帯域であってもよい。第２の電磁放射源は、電磁放射源に関する本明細書中に記載される任意の特性（例えば、力、パルス持続時間、波長など）を含み得る。
【０１３５】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、アレイおよびハウジングを備えるシステム例１４００を示している。図１５Ａは、０時間後における漏れ試験の初めの上面図である。図１８Ｂは、５時間後におけるアレイ例の漏れ試験の初めの上面図である。図１５Ａ〜図１５Ｂによると、フレーム１５１０におけるアレイ例１００の漏れ試験を、脱イオン水を用いて約５時間にわたって行った。アレイのマイクロポアを通じた脱イオン水の漏れは無かった。いくつかの実施形態において、アレイ例１００のコーティングは、約１時間と等しいかまたはそれを超える時間にわたってポアからの漏れを防ぐことが可能であり得る。いくつかの実施形態において、アレイ例１００のコーティングは、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間または１０時間と等しいかまたはそれを超える時間にわたってポアからの漏れを防ぐことが可能であり得る。
【０１３６】
方法
本明細書中に記載されるアレイの実施形態、例およびバリエーションは、そのアレイのポアから粒子を放出するための方法において利用され得る。本明細書中に記載されるシステムの実施形態、例およびバリエーションは、アレイのポアから粒子を放出するための方法において利用され得る。アレイのポアから粒子を放出する方法が本明細書中に提供され、その方法は、ポアを満たす工程、溶液の一部をポアの中に保持する工程、電磁放射をアレイの一部分に向ける工程、アレイの一部分を破壊する工程、および目的の粒子を含む溶液の一部を放出する工程を含む。ポアは、ある溶液の少なくとも一部で満たされ得る。その溶液は、目的の粒子を含み得る。その溶液の一部は、表面張力によってポアの中に保持され得る。アレイの一部分を破壊する工程は、ポアの中に保持された溶液の一部の表面張力を破壊し得る。
【０１３７】
本明細書では、選ばれた内容物をアレイのポアから放出する方法を提供し、その方法は、選ばれた内容物を含むアレイのポアを識別する工程であって、そのアレイは、第１の表面およびその第１の表面の反対側の第２の表面を有する基材を備え、その基材は、基材材料および表面材料を含み、その表面材料は、第１または第２の表面に位置または隣接し、その基材は、第１の表面から第２の表面に延びる管腔を定義する複数のポアを含み、その基材は、（ａ）複数のポアの各ポアが、５００ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、（ｂ）複数のポアの各ポアが、１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、（ｃ）１平方ミリメートルあたり１００個またはそれを超えるポアというポアの密度、および（ｄ）表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの１つまたはそれを超えることを特徴とする、工程、および識別されたポア内のまたは識別されたポアに隣接する表面材料に向けられた電磁放射によって、前記アレイの第１または第２の表面から表面材料の一部分を除去し、それにより、識別されたポアの内容物を放出する工程を含む。
【０１３８】
いくつかの例において、上記アレイは、（ａ）複数のポアの各ポアが、５００ミクロンまたはそれ未満の最大直径を有すること、（ｂ）複数のポアの各ポアが、１０またはそれを超えるアスペクト比を有すること、（ｃ）１平方ミリメートルあたり１００個またはそれを超えるポアというポアの密度、および（ｄ）表面材料が、入射電磁放射の１０パーセント超を吸収する材料から選択されること、のうちの２つまたはそれを超えることを特徴とし得る。
【０１３９】
図１６Ａ〜Ｅは、本明細書中に記載されるように、図１のアレイ例を用いて細胞をソーティングする方法の一例の垂直断面図を示している。図１６Ａ〜Ｅによると、第１アレイ例１００を用いて細胞をソーティングする方法例１６００は、複数のポア１１３を備えるアレイ１００を提供する工程１６１０を含む。いくつかの実施形態において、操作１６１０は、図５Ａによると、ミクロスフェアを含むアレイ１００の第１の表面１１１に最も近いポア１１３の一部分を覆う工程をさらに含み得る。方法１６００の操作１６２０は、水溶液１６２１をアレイ内に堆積させる工程を含み得る。いくつかの場合において、そのアレイは、図１６Ｂによると、第１の細胞１６２２および第２の細胞１６２３を第１のアレイ１００上に堆積させることを含み得る。方法１６００の操作１６３０は、図１６Ｃによると、アレイ１００をハウジング１６３１に挿入することを含み得る。いくつかの場合において、ハウジングは、カートリッジを備え得る。ハウジングは、内側表面１６３２を備え得る。方法１００の操作１６４０は、選ばれた粒子のシグナルのプロットを捕捉する工程を含み得る。その選ばれた粒子は、図１６Ｄによると、第１の細胞１６２２および第２の細胞１６２３を含み得る。図１６Ｅによると、方法１６００は、第１の細胞および第２の細胞１６２３のシグナルのプロット内の第１の細胞１６２２のシグナルのプロットの位置を突き止める工程１６４０をさらに含み得る。図１６Ｆによると、方法１６００は、第２の細胞１６２３をアレイ１００から抽出する工程１６４０；および第２の細胞１６２３を回収する工程１６５０をさらに含み得る。細胞をアレイから抽出する工程は、アレイ１００の表面上または表面近くのコーティングを破壊する工程を含み得る。破壊する工程は、電磁放射をアレイの表面の選択された位置に提供する工程を含み得る。図１６Ａは、その方法例に従って、コーティングを含む複数のポアを備えるアレイを提供しているところの垂直断面図を示している。
【０１４０】
図１６Ｂは、図１のアレイ例の中に水性サンプル溶液を堆積させているところの垂直断面図を示している。いくつかの実施形態において、水性サンプル溶液１６２１をアレイ１００上に堆積させる工程１６２０は、水性サンプル溶液１６２１をアレイ１００上に広げる工程を含む。いくつかの実施形態において、アレイ１００の親水性の第１の表面１１１は、水性サンプル溶液１６２１をポア１１３に吸い込む。いくつかの実施形態において、アレイ１００の親水性の第１の表面１１１は、水性サンプル溶液１６２１内の第１の細胞１６２２および第２の細胞１６２３をポア１１３に均等に分配する。いくつかの実施形態において、アレイ１００の親水性の第１の表面１１１は、水性サンプル溶液１６２１内の第１の細胞１６２２および第２の細胞１６２３をポア１１３にランダムに分配する。いくつかの実施形態において、第１の細胞１６２２および第２の細胞１６２３は、各ポア１１３の底に沈む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、第１の細胞１６２２および第２の細胞１６２３は、水性サンプル溶液１６２１の表面張力によって各ポア１１３に引き止められる。いくつかの例において、それらの細胞は、ＩＮＫＴ細胞、Ｔｍｅｍ、Ｔｒｅｇ、ＨＳＰＣおよびそれらの組み合わせから選択される。
【０１４１】
図１６Ｃは、いくつかの実施形態に係る、図１のアレイ例を閉鎖カートリッジまたはハウジングに挿入しているところの垂直断面図を示している。図１６Ｃによると、カートリッジ１６３１は、アレイ１００の上部に加湿膜１６３３を備え、第２の細胞１６２３を回収するための回収トレイ１６３２も備える。必要に応じて、いくつかの実施形態において、カートリッジ１６３１は、閉鎖カートリッジ１６３１を含む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、カートリッジ１６３１は、湿度が制御されたカートリッジ１６３１を含む。必要に応じて、いくつかの実施形態において、加湿膜１６３３は、ポア１１３からの蒸発を減少させる。必要に応じて、いくつかの実施形態において、回収トレイ１６３２は、カートリッジ１６３１内のアレイ１００の下に配置され得る。必要に応じて、いくつかの実施形態において、回収トレイ１６３２は、透明の回収トレイ１６３２を含む。
【０１４２】
図１６Ｄは、いくつかの実施形態に係る、第１の細胞および第２の細胞のシグナルのプロットの画像を示している。図１６Ｄによると、第２の細胞のシグナルのプロット１６４１が測定され得る。いくつかの実施形態において、第１の細胞１６４２のシグナルのプロットが測定され得る。いくつかの実施形態において、それらのプロットは、自動蛍光走査システムによって撮影された画像を定量化することによって捕捉され得る。第１の細胞は、第１の波長において蛍光性であり得、第２の細胞は、第２の波長において蛍光性であり得る。いくつかの実施形態において、合わせた画像が測定され得る。図１７は、細胞のアレイの生の蛍光像の非限定的な例を示している。図１８は、図１７に表された５０万個のマイクロポアのアレイの散布図の非限定的な例を示している。
【０１４３】
図１６Ｅは、いくつかの実施形態に係る、第２の細胞を抽出しているところの垂直断面図を示している。図１６Ｅによると、図１６Ｄにおける第２の細胞１６２３のシグナルのプロットに従って、第２の細胞１６２３を含むポア１１３をレーザー１６５１によるパルスに曝露することによって、第２の細胞１６２３がアレイ１００から抽出される。レーザーは、特定のポア１１３内にミクロスフェアを含み得るコーティングを励起させる。必要に応じて、いくつかの実施形態において、レーザー１６５１は、ナノ秒レーザー１６５１を含む。
【０１４４】
図１６Ｆは、いくつかの実施形態に係る、細胞を回収しているところの垂直断面図を示している。図１６Ｆによると、レーザー１６５１によってアレイ１００から抽出された第２の細胞１６２３は、回収トレイ１６６１に回収され得る。
【０１４５】
本明細書中に提供される別の態様は、アレイのポアから粒子を放出する方法であり、その方法は、ある溶液の少なくとも一部でポアを満たす工程（ここで、その溶液の少なくとも一部は、目的の粒子を含む）；ポアの中の溶液の一部を表面張力によって保持する工程；電磁放射をアレイの一部分に向ける工程；アレイの一部分を破壊し、それによって、ポアの中に保持された溶液の一部の表面張力を破壊する工程；および目的の粒子を含む溶液の一部を放出する工程を含む。いくつかの実施形態において、そのアレイは、基材、およびその基材に作動可能に結合されたコーティングを備える。いくつかの実施形態において、その基材は、第１の表面、第１の表面の反対側の第２の表面、およびポアを備え、そのポアは、第１の表面から第２の表面に延びている。いくつかの実施形態において、第１の表面は親水性であり、コーティングは疎水性である。いくつかの実施形態において、アレイの一部分は、アレイのコーティングである。いくつかの実施形態において、アレイの一部分は、ポアに近接したアレイのコーティングである。いくつかの実施形態において、コーティングは、クロムを含む。いくつかの実施形態において、アレイは、複数のポアを含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、複数のポアを溶液で満たす工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、複数のポアのサブセットの中に保持された溶液を放出する工程をさらに含み、その複数のポアのサブセットは、目的の粒子を含む溶液を保持している。上記方法は、各粒子に対する複数の蛍光シグネチャを解析する工程をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、その解析に基づいて、目的の粒子を含む溶液の一部を保持しているポアを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、それらの粒子は、１秒あたり約５，０００〜約１００，０００，０００個の目的の粒子という速度で放出される。いくつかの実施形態において、目的の粒子は、細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、６０パーセントと等しいかまたはそれを超える生存率で放出される。いくつかの実施形態において、上記方法は、目的の粒子をハウジングにおいて受け取る工程をさらに含み、そのハウジングは、目的の粒子を受け取るための内側表面を備える。いくつかの実施形態において、内側表面は、受け取り培地を保持している。いくつかの実施形態において、受け取り培地は、プルロニック（登録商標）Ｆ６８を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、上記方法は、識別されたポア内のまたは識別されたポアに隣接する表面材料に向けられた電磁放射によって、アレイの第１または第２の表面から表面材料の一部分を除去し、それにより、識別されたポアの内容物を放出する工程をさらに含む。いくつかの例において、表面材料の一部分は、識別されたポアに隣接し得る。表面の一部分は、識別されたポアの管腔表面を含み得る。表面の一部分は、１００ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去され得る。表面の一部分は、５０ミクロンまたはそれ未満の深さまで除去され得る。
【０１４７】
いくつかの場合において、選ばれた内容物を含むポアを識別する前に、選ばれた内容物を含む溶液をアレイにロードする工程。いくつかの場合において、選ばれた内容物を含むポアを識別する工程は、アレイのポアから放射された電磁放射を解析する工程を含む。いくつかの場合において、内容物を放出する工程は、１秒あたり約５，０００〜約１００，０００，０００ポアという速度で内容物を放出することを含む。
【０１４８】
電磁放射の発生源は、レーザーを含み得る。レーザーは、ドープされた固体レーザーであり得る。レーザーは、ファイバーレーザーであり得る。レーザーは、半導体ダイオードレーザーであり得る。レーザーは、ガスレーザー、例えば、ＨｅＮｅレーザーまたはエキシマレーザーであり得る。レーザーは、ある範囲内の波長の電磁放射を放射し得る。いくつかの実施形態において、その電磁放射は、可視光線および／または赤外線で放射され得る。その電磁放射は、５ナノメートルの帯域内で放射され得、次いで、可視光線または赤外線として放射され得る。その電磁放射は、ドープされた固体レーザーの高調波（例えば、ドープされたオルトバナジン酸イッテルビウムまたはイッテルビウム・アルミニウム・ガーネット）で放射され得る。その電磁放射は、１０６４ｎｍの放射線を含み得る。
【０１４９】
電磁放射は、０．２ミクロン〜２．５ミクロンの波長、および内容物とポアとの接着を破壊するのに十分なフルエンスレベル、および１ｎｓ〜１ミリ秒の範囲内のパルス持続時間から選択され得る。
【０１５０】
したがって、目的の粒子が、アレイの特定のポア内に保持されていると識別されると、電磁放射が、その特定のポアの近くまたは特定のポアに隣接したところに向けられて、目的の粒子を放出し得る。いくつかの実施形態において、第２の表面の破壊は、アレイの材料の少なくとも一部分、アレイ上のコーティングまたはその両方を除去することを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、表面材料の一部分を除去する工程は、局所的な加熱によって引き起こされ得る。そのようなメカニズムは、パルス持続時間がより長いとき、ピーク出力密度がより低いとき、および／または入射放射の波長が赤外であるとき、起こる可能性があり得る。局所的な加熱は、表面材料またはアレイ材料の昇華を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、基材材料とコーティングとは、異なる熱膨張係数を含み、それにより、チッピングに至り得る。
【０１５２】
いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、アブレーションによって引き起こされ得る。そのようなメカニズムは、入射ピーク出力密度がより高いとき、パルス持続時間がより短いとき、放射電力がより高いとき、および／または入射放射が可視であるとき、起こる可能性があり得る。アブレーションは、アレイまたは基材材料の局所的な結合の切断および／または気化を含み得る。
【０１５３】
いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、プラズマ発生によって引き起こされ得る。このメカニズムは、入射放射のパルス持続時間が特に短いとき、入射放射の波長が多光子イオン化メカニズムと共鳴関係にあるとき、およびまたは入射放射の波長が非常に短いとき、起こる可能性があり得る。ピコ秒台からフェムト秒台のパルス持続時間により、基材または表面材料の光学エッチングにつながる局所的な加熱よりも速いプラズマ発生がもたらされ得る。
【０１５４】
いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、衝撃波発生によって生じ得る。そのようなメカニズムは、ピーク出力密度がより高いとき、フォノンが共鳴しているとき、および／またはパルス持続時間がより短いとき、起こる可能性が高い場合がある。衝撃は、表面材料またはアレイ材料の物理的振動、チッピングまたは揺れを引き起こし得る。
【０１５５】
いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、光イオン化などの光化学的除去である。いくつかの場合において、表面材料の一部分を除去する工程は、衝撃波の光学的発生などによる光音響的除去を含む。
【０１５６】
用語および定義
別段定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。
【０１５７】
本明細書中で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書中の「または」に対する任意の言及は、別段述べられない限り、「および／または」を包含すると意図されている。
【０１５８】
本明細書中で使用されるとき、用語「約」とは、その中の増分を含めて、述べた量に１０パーセント、５パーセントまたは１パーセント近い量のことを指す。
【０１５９】
本明細書中で使用されるとき、用語「ＰＢＭＣ」とは、末梢血単核球のことを指す。
【０１６０】
本明細書中で使用されるとき、用語「直角」とは、垂直の配置または関係性のことを指す。
【実施例】
【０１６１】
以下の説明的な例は、本明細書中に記載されるソフトウェアアプリケーション、システムおよび方法の実施形態の代表であって、決して限定であることを意味しない。
【０１６２】
実施例１−クロムコーティングされたマイクロポアアレイの調製：
Ｉｎｃｏｍｅ  Ｉｎｃ．から購入したガラスマイクロポアアレイ（Ｃ００１１３，３００５７２２，２０μｍポア，６０パーセントのポアカバー率）をＬＧＡ薄膜において１００ｎｍ厚のクロムでスパッタした（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，真空：８ｘｌ０−２〜２ｘｌ０−２ｍｂａｒ、スパッタリング電圧：１００Ｖ〜３ｋＶ、電流：０〜５０ｍＡ）。そのクロムは、ポアプレートの片側だけにスパッタされた。その後、クロムコーティングされたマイクロポアアレイを、まず１Ｍ  ＮａＯＨ溶液に１２時間、１０パーセント漂白剤に最大１時間浸漬し、次いで、水を噴霧して残留漂白剤を除去し、細胞をロードする前にブロー乾燥した。
【０１６３】
実施例２−カセットアセンブリ：
カセットは、（上から下に向かって）カセットの上部に封着されたガラス；マイクロポアプレートを保持するためのアルミニウム合金フレーム；マイクロポアプレートから一定または不定の距離の間隔をあけた受け取りガラスプレートを含む。（カセットのサイズに応じて）異なる体積の０．１パーセントのプルロニック（登録商標）Ｆ６８（Ｃａｔ．２４０４００３２，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を含む受け取り培地（ＯｐｔｉＰＥＡＫ  Ｔ  Ｃｅｌｌ培地，ＩｎＶｉｔｒｉａ，Ｊｕｎｃｔｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＫＳ）を受け取りプレートに加えた。クロムコーティングされたマイクロポアアレイを、クロムコーティングされた側を下向きにして（受け取り培地に面して）カセットに組み立てた。受け取り培地にプルロニック（登録商標）Ｆ６８を加えることによって、ポアから抽出される細胞の生存率を０パーセントの生存率から＞７５パーセントの生存率へ大幅に高めることができる。
【０１６４】
実施例３−クロムコーティングされたマイクロポアアレイによる細胞ソーティング：
ＯｐｔｉＰＥＡＫ  Ｔ  Ｃｅｌｌ培地中に２００万／ｍＬという密度を有するＰＢＭＣをマイクロポアアレイの上部に滴下し、５分間静置させて、表面張力によって単一細胞がマイクロポアの底に捕捉されるようにした。その後、カセットをセルソーターにマウントした。１０〜１００パーセントのレーザー出力を用いることにより、マイクロポアから細胞を抽出することができる。マイクロポアの底の縁のクロムコーティングがＩＲレーザーエネルギーを吸収し、クロムの薄層が除去された。メニスカスを壊し、所望のマイクロポアから細胞を放出した。
【０１６５】
実施例４−ＩＲ吸収コアを有するアガロースビーズの製造：
この手順では、透明のシェルおよびＩＲ吸収コアを有するアガロースビーズの調製を説明する。
【０１６６】
工程１．５０ｍｇのＳｕｐｅｒｄｅｘビーズ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １００／３００  ＧＬ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１ｍＬのアセトンに懸濁する。２０００ｒｐｍで遠心して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘビーズを回収する。アセトンを廃棄する。アセトン中に１ｍＬのＩＲ吸収色素（Ｅｐｏｌｉｇｈｔ１１７８，Ｅｐｏｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）飽和溶液を作製する。５０００ｒｐｍで遠心して、溶解していないＩＲ色素を除去する。ＩＲ色素溶液をＳｕｐｅｒｄｅｘビーズに加える。絶えず混合しながら室温で３０分間インキュベートする。その混合物を１５００ｒｐｍで遠心分離する。上部の液体を廃棄する。底に色の濃いペレットだけを残す。アセトンでさらに洗浄せずに、得られた色の濃いペレットを０．２パーセントＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁する。これにより、均一にＩＲ色素が組み込まれたＳｕｐｅｒｄｅｘビーズが得られる。
【０１６７】
工程２．ビーズの外側部分から色素を除去するために、ピペッティングによってビーズを１：１アセトン−水混合物で１５秒未満、リンスする。その直後に、その混合物を１０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上部の液体を廃棄する。これにより、ＩＲコア構造が得られる。
【０１６８】
あるいは、ＩＲ吸収コアは、工程１から得られたビーズを４度の０．２パーセントＢＳＡ−ＰＢＳ中で＞５日間インキュベートすることによって作製することもできる。緩衝液を１日１回交換する。これにより、分子拡散のみによってＩＲ色素がＳｕｐｅｒｄｅｘビーズからゆっくり溶ける。
【０１６９】
ＩＲ色素ミクロスフェアの有効性を下記の表１に示す。
【表１】
2021536235.tif 000003
【０１７０】
クロムミクロスフェアの有効性を下記の表２に示す。
【表２】
2021536235.tif 000004
【０１７１】
実施例５−培地サプリメントとしてプルロニック（登録商標）Ｆ６８を用いたときの単一ＰＢＭＣの生存率：
この手順では、細胞ソーティング中の細胞生存率を高めるための培地サプリメントを説明する。細胞のロードおよび収集に向けて、０．１パーセントのプルロニック（登録商標）Ｆ６８および１×ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＯｐｔｉＰＥＡＫ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｅｄｉａ（７７７ＯＰＴ０６９）に細胞を懸濁し、収集した。この実施例では、２０μｍのマイクロポアサイズを有するアレイ例の場合、３つの各サンプルに対するパーセント生存率が、それぞれ８１パーセント、７４パーセントおよび６５パーセントと計測された。
【０１７２】
実施例６−ＰＢＭＣ抽出：
この手順では、目的の粒子およびビーズを含む溶液を説明する。
【０１７３】
ヒトＰＢＭＣ細胞を含む溶液をマイクロポアアレイの上部に滴下した。１０分後、単一のＰＢＭＣがマイクロポアにロードしているところだった。その後、コントロールビーズ（ＩＲ色素でコーティングされたＴｉＯ２ビーズ）、またはアガロースおよびデキストランビーズ、またはアガロースおよびＩＲ色素ミクロスフェアのいずれかを含む溶液を、マイクロポアアレイの上部にロードした。１５〜３０分後、ビーズが重力によってマイクロポア内にロードされた。細胞およびビーズを含むポアアレイを、細胞培養液を含む受け取りレザバーの上部にマウントした。ビーズがロードされたポアの底を標的化するようにＩＲパルスレーザーを向け、細胞を細胞培養液中に抽出した。抽出後、抽出された細胞を含む細胞培養液を生存率アッセイに向けて収集した。
【０１７４】
実施例７−細胞生存率：
この手順では、細胞生存率の測定を説明する。
【０１７５】
定量的サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ（ヒトＩＦＮ−ガンマＥＬＩＳｐｏｔ  Ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｏ．ＥＬ２８５）によって、細胞生存率を測定した。このアッセイは、ＰＶＤＦが塗布されたマイクロプレート上にプレコーティングされたヒトサイトカインインターフェロンγ（ＩＦＮ−ガンマ）に特異的な捕捉抗体を使用する。収集された細胞をウェルに直接、ピペットで移すと、分泌細胞のすぐ近傍の固定化された抗体が、分泌されたヒトＩＦＮ−ガンマに結合する。洗浄工程およびビオチン化検出抗体とのインキュベーションの後、ストレプトアビジンに結合体化されたアルカリホスファターゼを加えた。その後、洗浄によって未結合の酵素を除去し、基質溶液を加えた。青色の沈殿物が、サイトカインの部位に現れ得、スポットとして出現し得る。各個別のスポットが、個々のヒトＩＦＮ−ガンマ分泌細胞に相当する。それらのスポットを数えた。生細胞数が既知である段階希釈の標準細胞サンプルも、収集された細胞サンプルと同じようにプレーティングした。各ウェル内の青色のスポットを数えることによって、検量線をプロットした。収集されたサンプル中の生細胞数を検量線によって決定した。
【０１７６】
本発明の好ましい実施形態を本明細書中に示し、説明してきたが、そのような実施形態が例示のためだけに提供されていることは、当業者には明らかであろう。当業者は、数多くのバリエーション、変更および置換を本発明から逸脱することなく考え付くだろう。本明細書中に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明の実施において使用され得ることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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