(57)【要約】  本発明は、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１  ＭＡＰキナーゼ）の阻害剤に関し、特に、脳内の全ＥＲＫシグナル伝達経路を刺激する能力を有するポリペプチド並びに神経保護剤及び／又は認知増強剤としてのその使用に関する。本発明はまた、ＭＡＰＫ３を阻害することができ、全ＥＲＫシグナル伝達経路の刺激を引き起こす関係するポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞及び医薬組成物にも関する。加えて、神経変性障害又は精神神経障害及び認知機能障害の治療における先の阻害剤又は刺激剤の使用も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
ｉ）以下ＲＢ５と呼ぶＱＧＧＧＧＧＥＰＲＲＴＥＧＶＧＰＧＶＰＧＥＶＥＭＶＫＧＱＰＦＤＶ（配列番号１）；又は
ｉｉ）少なくとも７５％の同一性をペプチドｉ）と共有する配列
を含む、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ３（ＭＡＰＫ３）プロテインキナーゼシグナル伝達を阻害するための神経保護ペプチド。
【請求項２】
前記配列部分ｉｉ）が、配列ｉ）と少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％  ９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である、請求項１に記載の神経保護ペプチド。
【請求項３】
膜を横切って前記神経保護ペプチドを輸送するためのペプチド担体と共有結合的もしくは非共有結合的に結合されている又は会合している、請求項１及び２のいずれかに記載の神経保護ペプチド。
【請求項４】
前記膜が生体膜である、請求項３に記載の神経保護ペプチド。
【請求項５】
そのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかにおいて前記ペプチド担体と結合されている、請求項３又は４に記載の神経保護ペプチド。
【請求項６】
前記ペプチド担体が細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項７】
前記ＣＰＰが、
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３）
ＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４）
ＸＲＲＲＲＲＲＲＸ（配列番号５）
ＸＲＲＲＸＲＲＲＲ（配列番号６）
ＲＲＲＸＲＲＲＲＸ（配列番号７）
ＲＲＲＲＲＲＲＸＸ（配列番号８）
ＸＸＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号９）
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）
ＸＲＲＲＲＲＸＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１）
ＲＲＲＲＲＸＲＲＲＲＲＲＲＸ（配列番号１２）
ＧＡＹＤＬＲＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＲＥＲＱＳＲ（配列番号１３）
ＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ（配列番号１４）
ＬＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＥＲＱＳＲ（配列番号１５）
ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ（配列番号１６）
ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳ（配列番号１７）
を含む又はからなる群から選択される、請求項６に記載の神経保護ペプチド。
【請求項８】
配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＧＧＧＧＥＰＲＲＴＥＧＶＧＰＧＶＰＧＥＶＥＭＶＫＧＱＰＦＤＶ（配列番号１８）を含む又はからなる、請求項１〜７のいずれかに記載の神経保護ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド；請求項９に記載の核酸；又は請求項１０に記載のベクター；及び薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１３】
医薬品としての使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項１４】
神経変性障害の治療における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項１５】
神経変性障害を治療する医薬品の製造における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド及び／又は請求項１２に記載の医薬組成物並びに脳の状態を治療するための少なくとも１の他の治療薬を含む、神経変性障害の治療における使用のための組合せ治療薬。
【請求項１７】
神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の認知症；ハンチントン病（ＨＤ）；パーキンソン病（ＰＤ）；変性神経疾患；脳炎；癲癇；遺伝性脳障害；頭部形成異常及び脳形成異常；水頭症；脳卒中；多発性硬化症；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルー・ゲーリック病）；前頭側頭型認知症（ＦＴＰ）；進行性核上麻痺（ＰＳＰ）；本態性振戦症（ＥＴ）；多系統萎縮症（ＭＳＡ）；大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）；脳虚血；リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を含む群から選択される、請求項１４もしくは１５のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド又は請求項１６に記載の組合せ治療薬。
【請求項１８】
有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター又は請求項１２に記載の医薬組成物を治療される患者に投与することを含む、神経変性障害を治療する方法。
【請求項１９】
精神神経障害の治療における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２０】
精神神経障害を治療する医薬品の製造における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド及び／又は請求項１２に記載の医薬組成物並びに脳の状態を治療するための少なくとも１の他の治療薬を含む、精神神経障害の治療における使用のための組合せ治療薬。
【請求項２２】
精神神経障害が、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、知的障害（ＩＤ）、統合失調症（精神病としても既知）、躁病（軽躁病としても、及びうつ病と交互に起こるときは双極性障害としても既知）、大うつ病、不安、外傷後ストレス障害、強迫性障害を含む群から選択される、請求項１９もしくは２０のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド又は請求項２１に記載の組合せ治療薬。
【請求項２３】
有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター又は請求項１２に記載の医薬組成物を治療される患者に投与することを含む、精神神経障害を治療するための方法。
【請求項２４】
認知増強剤としての使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド及び／又は請求項１２に記載の医薬組成物並びに少なくとも１の他の認知増強剤及び／又は鎮痛剤を含む、認知能力の増強における使用のための組合せ治療薬。
【請求項２６】
認知能力を増強するための方法であって、前記改善された認知能力を必要としている又は望んでいる個体に有効量の有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の神経保護ペプチド、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター又は請求項１２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＡＰＫ３（ＥＲＫ１  ＭＡＰキナーゼ）の阻害剤に関し、特に、脳内で全ＥＲＫシグナル伝達経路を刺激する能力を有するポリペプチド並びに神経保護剤及び／又は認知増強剤としてのその使用に関する。本発明はまた、ＭＡＰＫ３を阻害することができ、全ＥＲＫシグナル伝達経路の刺激を引き起こす関係するポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞及び医薬組成物にも関する。加えて、神経変性障害又は精神神経障害及び認知機能障害の治療における先の阻害剤又は刺激剤の使用も開示される。
【背景技術】
【０００２】
細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）カスケードは、細胞の増殖及び生存から分化及び行動可塑性まで様々な細胞プロセスに関与するシグナル伝達経路である。脳内で、このカスケードは、サイトゾル（イオンチャネル及びタンパク質翻訳の制御）及び核現象とのイオンチャネル型受容体、代謝型受容体及びニューロトロフィン受容体の間の結び付きをもたらし、文脈に応じて、遺伝子転写、新規タンパク質合成、並びにシナプスのリモデリング及び可塑性、記憶形成又は神経生存のいずれかにおける変化につながる。ＧＴＰ／ＧＤＰ交換因子によって神経伝達物質受容体により活性化されると、Ｒａｓクラス（ｐ２１  Ｈ−、Ｋ−及びＮ−Ｒａｓ遺伝子産物）に属する低分子量ＧＴＰａｓｅが、Ｒａｆサブファミリー（主にｃ−Ｒａｆ及びＢ−Ｒａｆ、ＭＡＰＫキナーゼキナーゼティア）のセリン／トレオニンキナーゼ、トレオニン／チロシン二重特異性キナーゼＭＥＫ１／２（ＭＡＰＫキナーゼ）及び最後にＥＲＫ１／２タンパク質（ＭＡＰＫ構成要素）からなるプロテインキナーゼのカスケードを順次刺激する。さらに具体的には、ＭＥＫ１／２の活性化は、特異的ドッキングドメインを通じたＥＲＫタンパク質との選択的相互作用につながり、その結果、ＥＲＫ１／２の活性化ループ内でトレオニン及びチロシンの保存認識モチーフ（ＴＥＹドメイン）がリン酸化される。
【０００３】
それぞれＭＡＰＫ３及びＭＡＰＫ１としても既知のＥＲＫ１及びＥＲＫ２は、２の遺伝子、ＭＡＰＫ３及びＭＡＰＫ１により産生された相同なアイソフォームである。ＥＲＫ１及びＥＲＫ２は、８５％近くのアミノ酸同一性を共有するが、コア領域内でより高い同一性を示す。いずれのアイソフォームも実質的に全ての細胞内で発現するが、ＥＲＫ２が脳内及び造血細胞内で優勢なアイソフォームである。活性化されると、脳内の２の主なＭＡＰＫであるＥＲＫ１及びＥＲＫ２は核内に移行することができる。そこで、それらはＣＲＥＢ様のクラスの転写制御因子などの転写因子を直接的に又は間接的に（ＲＳＫファミリーのキナーゼを介して）活性化したり、クロマチンリモデリングを（ＭＳＫファミリーのキナーゼを介して）制御したりすることができる。遺伝子発現及びクロマチン構築を制御するＥＲＫの能力は、正常な認知過程の根底にある神経適応の過程においてだけでなく、いくつかの精神神経障害の発症においても決定的なステップであると考えられる。
【０００４】
記憶の形成及び固定におけるＥＲＫ依存性シグナル伝達の決定的な許容的役割は明らかに十分確立されている。しかし、初期の知見は実質的にＭＥＫキナーゼの化学的阻害剤の使用に基づいてきており、これは、脳内でＥＲＫ１及びＥＲＫ２に間接的に影響を及ぼし、様々な学習課題において記憶欠損を招く。残念ながら、成体脳内のＥＲＫ媒介性遺伝子発現の一般的な活性化及びクロマチンリモデリングが有効に認知増強につながる可能性はまだ証明されておらず、したがって、記憶障害及び神経変性障害の有効な治療の開発を妨げている。同時に、脳内のＥＲＫシグナル伝達の生存促進活性又はアポトーシス促進性の役割のいずれかを支持する相反する証拠が入手できる。
【０００５】
認知低下は、大部分の神経変性障害の主な特徴である。残念ながら、患者において記憶機能を改善することを目指した治療は変性過程を必ずしも遅らせないが、神経保護のアプローチは、健康な個体において観察される行動可塑性を維持又は回復するのに十分ではない場合がある。
【０００６】
満たされていない大きな医学的必要性が、神経変性障害及びその関連する不可逆的な認知低下の治療のための有効な製品のかなりの商業的可能性と共に依然として存在する。そのような障害の例は、パーキンソン病、アルツハイマー病及びハンチントン病であり、これらの障害では、神経細胞集団の進行性の減少により脳機能が損なわれ、学習障害及び記憶欠損につながり、最終的に死に至る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明において、驚くべきことに、ＥＲＫ１のＮ末端ドメインに由来するペプチドが細胞質内のＭＡＰＫ３プロテインキナーゼの阻害を通じて核ＥＲＫシグナル伝達の選択的活性化を実現できることが明らかになった。本発明のペプチドは、ＥＲＫの核移行を特異的に刺激することができ、したがって、脳内でＥＲＫ媒介性遺伝子転写及びクロマチンリモデリングを刺激することができる。これらのペプチドの投与は、グルタミン酸に応答してＥＲＫ依存性核シグナル伝達を促進し；神経細胞死を減少させ、記憶固定を増強し、記憶獲得及び記憶形成を改善する。したがって、これらのペプチドの投与を通じて本発明者らは、ｉ）健康な個体において記憶を改善することができ（認知増強）、ｉｉ）神経変性、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病及びハンチントン病において観察される神経変性を防止することができ、ｉｉｉ）記憶低下、例えば、認知症及びアルツハイマー病の形態で観察されるような記憶低下を遅らせることができることを示した。したがって、本発明のペプチドが、神経細胞生存及び認知の両方に対してプラスの効果を示し、現在有効な治療がないいくつかの主な脳障害の治療法となり、認知欠損を改善し且つ神経変性を阻止することが提案される。さらに、本発明のペプチドは、神経変性なく認知を改善するので、健康な個体における認知増強に適している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様によれば、アミノ酸配列：
ｉ）以下ＲＢ５と呼ぶＱＧＧＧＧＧＥＰＲＲＴＥＧＶＧＰＧＶＰＧＥＶＥＭＶＫＧＱＰＦＤＶ（配列番号１）；又は
ｉｉ）少なくとも７５％の同一性をペプチドｉ）と共有する配列
を含む、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ３（ＭＡＰＫ３）プロテインキナーゼシグナル伝達を阻害するための神経保護ペプチドが提供される。
【０００９】
ＭＡＰＫ３は、ヒトにおいてＭＡＰＫ３遺伝子によってコードされる酵素であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ３（ＭＡＰＫ３）を指す。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーである。細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）としても既知のＭＡＰキナーゼは、様々な細胞外シグナルを受けて増殖、分化及び細胞周期進行などの様々な細胞プロセスを制御するシグナル伝達カスケードにおいて作用する。このキナーゼは、上流キナーゼによって活性化され、その結果、核に移行し、そこで核標的をリン酸化する。異なるタンパク質アイソフォームをコードするスプライス転写変異体が記載されている。ＭＡＰＫ３は、いくつかの異名、すなわちＥＲＫ−１；ＥＲＫ１；ＥＲＴ２；ＨＳ４４ＫＤＡＰ；ＨＵＭＫＥＲ１Ａ；Ｐ４４ＥＲＫ１；Ｐ４４ＭＡＰＫ；ＰＲＫＭ３；ｐ４４−ＥＲＫ１；ｐ４４−ＭＡＰＫを有する。
【００１０】
本発明のペプチドは、核内で全ＥＲＫシグナル伝達の刺激を引き起こす。「全ＥＲＫシグナル伝達」により、この経路に関連するシグナル伝達機構を支配する主なＥＲＫアイソフォームであるＭＡＰＫ１／ＥＲＫ２の活性の増強を意味する。
【００１１】
ペプチドのホモログ、オルソログ又は機能的類似体も本発明の文脈において使用されることを当業者なら理解するであろう。したがって、例えば、１又は複数の付加、欠失、置換などを含むペプチドは本発明により包含される。加えて、１のアミノ酸を同様の「タイプ」の別のアミノ酸で置き換えることができる場合がある。例えば、１の疎水性アミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることは、アミノ酸配列を比較するＣＬＵＳＴＡＬプログラムなどのプログラムを使用することにより実現することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、適宜いずれかの配列にスペースを挿入することにより最適なアラインメントを見つける。最適なアラインメントのためにアミノ酸同一性又は類似性（同一性とは、アミノ酸タイプの維持を意味する。）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、最も長いひと続きの類似配列を整列させ、適合するまで値を割り当てる。したがって、異なるスコアをそれぞれ有するいくつかの類似領域が見られる比較を得ることが可能である。両方のタイプの解析が本発明において企図される。
【００１２】
対立遺伝子変異体は同種のペプチドの変異体を指し、本発明のオーソロガスペプチドは異種の変異体を指す。オーソロガスの例は、マウスＭＡＰＫ３（ＮＰ＿０３６０８２．１）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＭＡＰＫ３（ＮＰ＿０５９０４３．１）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＭＡＰＫ３（ＮＰ＿００１２３８９６４．１）ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）ＭＡＰＫ３（ＮＰ＿９５８９１５．１）タイセイヨウサケ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）ＭＡＰＫ３（ＮＰ＿００１１６７２６７．１）、スマトラオランウータン（Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ）ＭＡＰＫ３アイソフォーム１（ＸＰ＿００２８２６３４３．１）、アヌビスヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ）ＭＡＰＫ３アイソフォーム１（ＸＰ＿００３９１６７９２．１）、バンドウイルカ（Ｔｕｒｓｉｏｐｓ  ｔｒｕｎｃａｔｕｓ）ＭＡＰＫ３アイソフォーム１（ＸＰ＿００４３１６６３４．１）、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００２８０７４６１．１）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）ＭＡＰＫ３アイソフォームＸ１（ＸＰ＿００５２２４９７６．１）、ガーネットガラゴ（Ｏｔｏｌｅｍｕｒ  ｇａｒｎｅｔｔｉｉ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００３７９５８２７．１）、タイヘイヨウセイウチ（Ｏｄｏｂｅｎｕｓ  ｒｏｓｍａｒｕｓ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）ＭＡＰＫ３アイソフォーム１（ＸＰ＿００４３９７２２９．１）、アルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓ）ＭＡＰＫ３アイソフォームＸ１（ＸＰ＿００６２０１３１８．１）、モルモット（Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００３４７８２７５．１）、ハダカデバネズミ（Ｈｅｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｇｌａｂｅｒ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００４８５６３３１．１）、ココノオビアルマジロ（Ｄａｓｙｐｕｓ  ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ）ＭＡＰＫ３様（ＸＰ＿００４４６１５３３．１）、ウェッデルアザラシ（Ｌｅｐｔｏｎｙｃｈｏｔｅｓ  ｗｅｄｄｅｌｌｉｉ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００６７５０２６４．１）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００１９１５５６０．１）、フロリダマナティー（Ｔｒｉｃｈｅｃｈｕｓ  ｍａｎａｔｕｓ  ｌａｔｉｒｏｓｔｒｉｓ）ＭＡＰＫ３アイソフォーム１（ＸＰ＿００４３８６６８１．１）、ミナミシロサイ（Ｃｅｒａｔｏｔｈｅｒｉｕｍ  ｓｉｍｕｍ  ｓｉｍｕｍ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００４４３９５７９．１）、プレーリーハタネズミ（Ｍｉｃｒｏｔｕｓ  ｏｃｈｒｏｇａｓｔｅｒ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００５３５１９９０．１）、フェレット（Ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ）ＭＡＰＫ３、ＸＰ＿００４７７４０９４．１、ＸＰ＿００４８１６９８９．１）、チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ  ｌａｎｉｇｅｒａ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００５４０５４０３．１）、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿５１０９２１．３）、デグー（Ｏｃｔｏｄｏｎ  ｄｅｇｕｓ）ＭＡＰＫ３アイソフォームＸ１（ＸＰ＿００４６２２９９８．１）、ハイイロジネズミオポッサム（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００１３６４３６３．１）、チベットアンテロープ（Ｐａｎｔｈｏｌｏｐｓ  ｈｏｄｇｓｏｎｉｉ）ＭＡＰＫ３（ＸＰ＿００５９６３２５２．１）、スマトラオランウータンＭＡＰＫ３アイソフォーム２（ＸＰ＿００３７７８６４４．１）、アヌビスヒヒＭＡＰＫ３アイソフォーム２（ＸＰ＿００３９１６７９３．１）、バンドウイルカＭＡＰＫ３アイソフォーム２（ＸＰ＿００４３１６６３５．１）、アルパカＭＡＰＫ３アイソフォームＸ２（ＸＰ＿００６２０１３１９．１）、プラティ（Ｘｉｐｈｏｐｈｏｒｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）ＭＡＰＫ１様（ＸＰ＿００５８１３４１０．１）、トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）ＭＡＰＫ１様（ＸＰ＿００３９７５１１８．１）、フロリダマナティーＭＡＰＫ３アイソフォーム２（ＸＰ＿００４３８６６８２．１）、タイヘイヨウセイウチＭＡＰＫ３アイソフォーム２（ＸＰ＿００４３９７２３０．１）、シーラカンス（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ  ｃｈａｌｕｍｎａｅ）ＭＡＰＫ３様（ＸＰ＿００６００５９７５．１）である。
【００１３】
本明細書において使用される「ホモログ／相同」という用語は、ＱＧＧＧＧＧＥＰＲＲＴＥＧＶＧＰＧＶＰＧＥＶＥＭＶＫＧＱＰＦＤＶ（配列番号１）のアミノ酸配列に対する／との少なくとも７５％の相同性又は類似性又は同一性を有する配列を有し、且つＱＧＧＧＧＧＥＰＲＲＴＥＧＶＧＰＧＶＰＧＥＶＥＭＶＫＧＱＰＦＤＶ（配列番号１）の生物学的活性又はＭＡＰＫ３阻害機能を保持するアミノ酸配列を指す。ペプチドがｉ）のペプチド配列との少なくとも７５％の同一性を有することが好ましく、好ましさが高くなる順に、ＱＧＧＧＧＧＥＰＲＲＴＥＧＶＧＰＧＶＰＧＥＶＥＭＶＫＧＱＰＦＤＶ（配列番号１）との少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％  ９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有することが好ましい。
【００１４】
本発明の第１の態様のさらなる別の好ましい実施形態において、前記ペプチドは配列ＱＧＧＧＧＧＥＰＲＲＴＥＧＶＧＰＧＶＰＧＥＶＥＭＶＫＧＱＰＦＤＶ（配列番号１）を含む又はからなる。
【００１５】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、前記神経保護ペプチドは、膜、典型的には、これに限定されないが生体膜を横切って前記選択されたペプチドを輸送する目的のペプチド担体と共有結合的もしくは非共有結合的に結合されている又は会合している。この配置において、有利に、ペプチド担体は、脳血液関門及び／又は神経細胞の形質膜の通過を可能にする。したがって、ペプチドを細胞内に、特に脳の細胞内に送達することができる。
【００１６】
当業者によって理解されるように、前記生体膜は、細胞を取り囲む膜であり得る。これは、以下に限定されないが、単純な形質膜、又は頂端膜、側底膜、シナプス前膜及びシナプス後膜、鞭毛、繊毛、微絨毛、糸状仮足及び葉状仮足の膜、筋細胞の筋鞘、並びにニューロンの特殊なミエリン膜及び樹状突起棘膜を含むさらに特殊な膜構造などの膜を含み得る。追加的又は代替的に、前記膜は、細胞内に位置するオルガネラの膜であり得、ある特定の内部の細胞コンパートメントへのペプチドの送達を可能にする。この細胞コンパートメントは、以下に限定されないが、エンドソーム；滑面小胞体及び粗面小胞体；筋小胞体；ゴルジ装置；リソソーム；ミトコンドリア（内膜及び外膜）；核（内膜及び外膜）；ペルオキシソーム；空胞；細胞質顆粒；細胞小胞（ファゴソーム、オートファゴソーム、クラスリン被覆小胞、ＣＯＰＩ被覆小胞及びＣＯＰＩＩ被覆小胞）及び分泌小胞などのオルガネラを含み得る。
【００１７】
加えて、前記生体膜は、真核生物起源又は原核生物起源の任意の膜への参照を含む。
【００１８】
理想的には、前記神経保護ペプチドは、そのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかにおいて前記ペプチド担体と結合されている。
【００１９】
本発明の第１の態様のさらなる別の好ましい実施形態において、前記選択された神経保護ペプチドは、前記ペプチド担体のアミノ酸残基に又はそのすぐ隣に結合されている。あるいは、前記選択された神経保護ペプチドは、少なくとも１のさらなるアミノ酸残基又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０のアミノ酸残基を含むもしくはからなる群から選択されるいくつかのアミノ酸残基により好ましくは表されるスペーサーの存在のために、前記ペプチド担体のアミノ酸残基から遠位に位置する。当業者によって理解されるように、これは選択された神経保護ペプチドの透過性を改善し得るが、この機能を果たすことができる他のスペーサーが、理想的にはこれに限定されないが等しい効果を伴って、本発明の操作において使用され得る。
【００２０】
より好ましくは、前記ペプチド担体は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。本明細書におけるＣＰＰへの参照は、少なくとも１の選択された分子と共結合されたとき形質膜を移行する能力を持つ短いペプチド配列、典型的には３０未満のアミノ酸を指す。したがって、本発明のペプチドとのＣＰＰの使用は、細胞内又はオルガネラ内への前記ペプチドの送達を容易にする。ＣＰＰは、典型的には、膜の不透過性を克服するために使用される。数百の異なるＣＰＰ配列が今や当技術分野において記載されており、全てが単独で又はカーゴに会合しているとき生体膜を横断又は突破して細胞に入る普遍的な能力を有する。適したＣＰＰは、以下に限定されないが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（商標）、高密度の塩基性（＋）電荷を有するアミノ酸の短い配列（一般にリシン残基又はアルギニン残基の鎖、例えば、オクタアルギニン）又はアンテナペディアペプチドなど、当技術分野において既知である。最も理想的には、前記ペプチド担体は、
ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）；
ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３）；
ＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号４）；
ＸＲＲＲＲＲＲＲＸ（配列番号５）；
ＸＲＲＲＸＲＲＲＲ（配列番号６）；
ＲＲＲＸＲＲＲＲＸ（配列番号７）；
ＲＲＲＲＲＲＲＸＸ（配列番号８）；
ＸＸＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号９）；
ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１０）；
ＸＲＲＲＲＲＸＲＲＲＲＲＲ（配列番号１１）；
ＲＲＲＲＲＸＲＲＲＲＲＲＲＸ（配列番号１２）；
ＧＡＹＤＬＲＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＲＥＲＱＳＲ（配列番号１３）；
ＳＲＲＡＲＲＳＰＲＨＬＧＳＧ（配列番号１４）；
ＬＲＲＥＲＱＳＲＬＲＲＥＲＱＳＲ（配列番号１５）；
ＶＫＲＧＬＫＬＲＨＶＲＰＲＶＴＲＭＤＶ（配列番号１６）及び
ＲＫＫＲＲＲＥＳＲＫＫＲＲＲＥＳ（配列番号１７）
を含む群から選択されるＣＰＰである。
【００２１】
最も好ましくは、前記神経保護ペプチドは、以下ＣＰＰ−ＲＢ５と呼ぶ配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＧＧＧＧＥＰＲＲＴＥＧＶＧＰＧＶＰＧＥＶＥＭＶＫＧＱＰＦＤＶ（配列番号１８）を含む又はからなる。
【００２２】
本発明のさらに第２の態様によれば、本発明によるペプチドをコードする核酸分子が提供される。好ましくは、前記核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡを指し、最も好ましくはＤＮＡを指す。前記ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖であり得る。
【００２３】
本発明の第３の態様によれば、前記核酸分子を含むベクターが提供される。
【００２４】
本明細書において使用されるとき、「ベクター」という用語は発現ベクターを指し、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ、脂質ベースのビヒクル及び細胞ベースのビヒクルの形態であり得る。そのような送達ビヒクルの例には、生分解性ポリマーマイクロスフェア、コロイド金粒子上にコンストラクトを被覆するリポソーム担体などの脂質ベースの製剤、リポ多糖、ポリペプチド、多糖、ウイルスビヒクルのペグ化などが含まれる。さらに、そのようなベクターには、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、泡沫状ウイルス、サイトメガロウイルス、セムリキ森林ウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病、ＲＮＡウイルスベクター及びＤＮＡウイルスベクターも含まれ得る。そのようなウイルスベクターは当技術分野において周知である。さらに本発明には、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組合せに由来するベクターが含まれる。多数の適したベクターが当業者に既知であり、市販されている。以下のベクターを例として記載する。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐｂｓ、ｐＤＩＯ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨｌ［ｂｅｔａ］ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）。真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌ、ｐＳＧ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）。しかし、その他の任意のベクターも宿主内で複製可能且つ生存可能である限り使用することができる。ベクター内のポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を導く（１又は複数の）適切な発現制御配列（プロモーター）に動作可能に結合されている。そのようなプロモーターの代表例として、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期のＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ並びにマウスメタロチオネイン−Ｉなどの原核生物又は真核生物のプロモーターを挙げることができる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ベクターも含む。ベクターは、発現を増幅するための適切な配列も含み得る。
【００２５】
加えて、ベクターは好ましくは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素耐性もしくはネオマイシン耐性など、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性など、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質を提供する１又は複数の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【００２６】
本発明の第４の態様によれば、前記ベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞が提供される。
【００２７】
本明細書において使用されるとき、「宿主細胞」という用語は、ポリヌクレオチドで又は先述のベクターで形質導入、形質転換又は形質移入された宿主細胞に関する。適切な宿主細胞の代表例として、大腸菌、ストレプトミセス、ネズミチフス菌などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、Ｓｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ又はＣＯＳなどの動物細胞、植物細胞などを挙げることができる。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内であるとみなされる。好ましくは、前記宿主細胞は、動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、医薬品としての使用のための、本明細書において定義される神経保護ペプチドが提供される。
【００２９】
本発明のさらなる別の態様によれば、神経変性障害の治療又は防止における使用のための、本明細書において定義される神経保護ペプチドが提供される。
【００３０】
本発明のさらなる別の態様によれば、神経変性障害を治療又は防止する医薬品の製造における使用のための、本明細書において定義される神経保護ペプチドが提供される。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、神経保護ペプチド及び適した担体、軟化剤、希釈剤又はアジュバントを含む医薬組成物が提供される。
【００３２】
本発明のさらなる別の態様によれば、本明細書に記載の神経保護ペプチド及び／又は医薬組成物並びに脳の状態を治療又は防止するための少なくとも１の他の療法を含む、神経変性障害の治療又は防止における使用のための組合せ療法が提供される。
【００３３】
前記追加の療法は、
ａ）認知増強剤（向知性薬）：メチルフェニデート、ラセタム、イソフラボン、ビタミン（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）、コリン、アンフェタミン、キサンチン、アドレナリン作動薬、コリン作動薬、セロトニン作動薬、ドーパミン作動薬、覚醒促進薬（アドラフィニル、アルモダフィニル、モダフィニル）、ＧＡＢＡ遮断薬、アンパカイン、ＰＤＥ４阻害剤及びその他；
ｂ）神経保護剤：グルタミン酸アンタゴニスト、１７β−エストラジオール、ギンセノシドＲｄ、プロゲステロン、スタチン、酸化防止剤、ニコチン、カフェイン、カスパーゼ阻害剤、神経栄養因子、他の抗アポトーシス剤；又は
ｃ）鎮痛剤
を含み得る。
【００３４】
本発明のさらなる別の態様によれば、有効量の本明細書において定義される神経保護ペプチド及び／又は核酸分子及び／又はベクター及び／又は医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、神経変性障害を治療又は防止するための方法が提供される。
【００３５】
本明細書における神経変性障害への参照は、以下に限定されないが、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の認知症；ハンチントン病（ＨＤ）；パーキンソン病（ＰＤ）；変性神経疾患；脳炎；癲癇；遺伝性脳障害；頭部形成異常及び脳形成異常；水頭症；脳卒中；多発性硬化症；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ又はルー・ゲーリック病）；前頭側頭型認知症（ＦＴＰ）；進行性核上麻痺（ＰＳＰ）；本態性振戦症（ＥＴ）；多系統萎縮症（ＭＳＡ）；大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）；脳虚血；リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を含む。好ましくは、神経変性障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の認知症；並びにハンチントン病（ＨＤ）；パーキンソン病（ＰＤ）を含む群から選択される。
【００３６】
本明細書における「有効量」のペプチド又はそれを含む組成物への参照は、所望の生物学的効果、この場合、神経保護及び／又は認知増強を実現するのに十分なものである。有効投与量は、年齢、性別、健康及びレシピエントの体重、併用治療の種類、治療がある場合、治療頻度並びに所望の効果の性質に依存することになるものと理解される。典型的には、有効量は治療を行う者によって決定される。
【００３７】
本発明のさらなる態様によれば、精神神経障害の治療又は防止における使用のための、本明細書において定義される神経保護ペプチドが提供される。
【００３８】
本発明のさらなる態様によれば、精神神経障害を治療又は防止する医薬品の製造における使用のための、本明細書において定義される神経保護ペプチドが提供される。
【００３９】
本発明のさらなる別の態様によれば、本明細書に記載の神経保護ペプチド及び／又は医薬組成物並びに脳の状態を治療するための少なくとも１の他の療法を含む、精神神経障害の治療又は防止における使用のための組合せ療法が提供される。
【００４０】
本発明のさらなる態様によれば、有効量の本明細書において定義される神経保護ペプチド及び／又は核酸分子及び／又はベクター及び／又は医薬組成物を治療される患者に投与することを含む、精神神経障害を治療又は防止するための方法が提供される。
【００４１】
本明細書における精神神経障害への参照は、以下に限定されないが、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、知的障害（ＩＤ）、統合失調症、精神病、躁病（軽躁病としても、及びうつ病と交互に起こるときは双極性障害としても既知）、大うつ病、不安、外傷後ストレス障害、強迫性障害を含む。
【００４２】
本発明のさらなる別の態様によれば、認知増強剤としての使用のための、本明細書において定義される神経保護ペプチドが提供される。
【００４３】
本発明のこの態様において、前記神経保護ペプチドは、疾患を防止又は治療するためではなく、理想的には断続的に、しかしおそらくは慢性的に認知能力を改善するために使用されることを当業者なら理解するであろう。したがって、この文脈において、認知能力又は認知増強は疾患とみなされない。したがって、神経保護ペプチドは、栄養補助食品として又はこれに限定されないが健康食品などの食品の一部として処方することができる。
【００４４】
本発明のさらなる別の態様によれば、本明細書に記載のペプチド及び／又は医薬組成物並びに少なくとも１の他の認知増強剤及び／又は鎮痛剤を含む、認知能力の増強における使用のための組合せ療法が提供される。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、前記改善された認知能力を必要としている又は望んでいる個体に有効量の本明細書において定義される神経保護ペプチド及び／又は核酸分子及び／又はベクター及び／又は医薬組成物を投与することを含む、認知能力を増強するための方法が提供される。
【００４６】
本明細書における認知能力への参照は、以下に限定されないが、最も単純な課題から最も複雑な課題まで何らかの課題を実施するのに必要な脳に基づく技能、例えば、記憶すること、注意を払うこと、聞くこと、見ること、集中すること、焦点を合わせること、推論すること、熟考すること、分析すること、感知すること、理解することを含む。それらは、何らかの実知識よりもむしろ、我々が学習し、記憶し、問題解決し、注意を払うメカニズムにより関係がある。
【００４７】
医薬における使用のための化合物は一般に医薬組成物中又は獣医用組成物中に提供されることになり、したがって、本発明のさらなる別の態様によれば、本明細書において定義されるペプチド及び薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
【００４８】
適した医薬賦形剤は当業者に周知である。医薬組成物は、任意の適した経路、例えば、経口、頬側、経鼻又は気管支（吸入）、経皮又は非経口による投与のために処方することができ、薬学の技術分野において周知の任意の方法により調製することができる。
【００４９】
本組成物は、上で定義したペプチドを担体と会合させることにより調製することができる。一般に、製剤は、液体担体もしくは細分された固体担体又はその両方とペプチドを均一且つ密接に会合させ、次いで、必要であれば生成物を成形することにより調製される。本発明は、薬剤的にもしくは獣医学的に許容される担体又はビヒクルと上で定義したペプチドを結合又は会合させることを含む、医薬組成物を調製するための方法に及ぶ。
【００５０】
本発明における経口投与用製剤は、所定量の活性剤をそれぞれ含むカプセル剤、サシェ剤又は錠剤などの別個のユニット；粉末又は顆粒として；水性液中もしくは非水性液中の活性剤の溶液又は懸濁液として；或いは水中油型乳濁液又は油中水型乳濁液として；或いはボーラスとしてなどとして提供され得る。
【００５１】
経口投与用組成物（例えば、錠剤及びカプセル剤）に関して、「許容される担体」という用語は、一般的な賦形剤などのビヒクル、例えば、結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース及びデンプン；充填剤及び担体、例えばコーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、二リン酸カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸；並びに滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム及び他のステアリン酸金属塩、グリセロールステアレート、ステアリン酸、シリコーン液、タルクワックス、油及びコロイド状シリカを含む。香味剤、例えばペパーミント、冬緑油、サクランボ香味料なども使用することができる。剤形を容易に識別できるようにするために着色剤を加えることが望ましいであろう。錠剤は、当技術分野において周知の方法により被覆することもできる。
【００５２】
錠剤は圧縮又は成型により作ることができて、１又は複数の副成分と共に作られてもよい。圧縮錠剤は、バインダー、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存料、界面活性剤又は分散剤と混合されていてもよい、粉末又は顆粒などの自由流動形態のペプチドを適した機械内で圧縮することにより調製することができる。湿製錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適した機械内で成型することにより作ることができる。錠剤は被覆又はスコア化されていてもよく、活性剤の持続放出又は徐放を実現するように処方することができる。
【００５３】
経口投与に適した他の製剤には、フレーバーベース、通常スクロース及びアカシア又はトラガカント中にペプチドを含むロゼンジ；ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシアなどの不活性なベース中にペプチドを含む香錠；並びに適した液体担体中に活性剤を含むマウスウォッシュが含まれる。
【００５４】
皮膚への局所塗布に関して、ペプチドをクリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁液などに作り上げることができる。薬剤に使用することができるクリーム製剤又は軟膏製剤は、当技術分野において周知の従来の製剤であり、例えば、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａなどの薬剤学の標準的な教科書に記載されているような製剤である。
【００５５】
非経口製剤は一般に滅菌されたものになる。
【００５６】
本明細書の説明及び特許請求の範囲全体にわたって、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語及びその変形、例えば「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「以下に限定されないが、〜を含む」を意味し、他の部分、添加剤、構成要素、整数又はステップを排除しない。本明細書の説明及び特許請求の範囲全体にわたって、単数形は、文脈が特に要求していない限り、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されている場合、本明細書は、文脈が特に要求していない限り、単数のみならず複数も企図していると理解されるべきである。
【００５７】
本明細書において引用される任意の特許又は特許出願を含む全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。任意の参考文献が先行技術を構成することは認められない。さらに、先行技術のいずれかが当技術分野における一般常識の一部を構成することは認められない。
【００５８】
本発明のそれぞれの態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかに関連して記載されている通りであってもよい。
【００５９】
本発明の他の特徴は以下の例から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、（添付の特許請求の範囲及び図面を含む）本明細書に開示されている特徴の任意の新規な１又は任意の新規な組合せに及ぶ。したがって、本発明のある特定の態様、実施形態もしくは例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物又は化学的部分は、それと適合しない場合を除き、本明細書に記載のその他の任意の態様、実施形態又は例に適用可能であると理解されるべきである。さらに、特に記載しない限り、本明細書に開示の任意の特徴は、同じ目的又は同様の目的を果たす代替の特徴で置き換えることができる。
【００６０】
ここで、以下の実施例及び以下の図を参照して、本発明を単なる例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＲＢ５が核ＥＲＫシグナル伝達を選択的に刺激することを示す図である。
【００６２】
ａ）ＲＢ５ペプチドがＥＲＫ２の活性化を選択的に促進したことを示す。スクランブル（ＳＣＲ）又はＲＢ５ペプチド（５０μＭ）のいずれかで前処置され、次いで、グルタミン酸（ＧＬＵ）（１００μＭ）で１０分刺激された急性線条体スライス、又はビヒクルは、ウエスタンブロットで分析され（左パネル）、抗ホスホＥＲＫ抗体（ｐ４４ＥＲＫ１及びｐ４２ＥＲＫ２）及び抗ＥＲＫ１／２抗体でプローブされた。ＧＡＰＤＨが負荷対照として使用された。（右パネル）定量化は、ｐＥＲＫ１がＳＣＲ及びＲＢ５処置スライスにおいて等しく増加したことを示す。注目すべきことに、ＥＲＫ２活性化は、ＳＣＲスライスと比較してＲＢ５処置サンプルにおいて有意により高い。総ＥＲＫ１及びＥＲＫ２レベルにおいて変化は検出されなかった。ＧＡＰＤＨが負荷対照として使用された。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として表される。ｂ〜ｃ）ＲＢ５は、ＥＲＫ１  ＫＯ細胞に見られる同じ表現型と類似して、グルタミン酸に応答して核シグナル伝達を選択的に増強した。ｂ）ＣＰＰ−ＳＣＲ又はＣＰＰ−ＲＢ５ペプチド（５０μＭ）で前処置され、グルタミン酸（１００μＭ）で刺激された急性スライス上の抗ホスホ（Ｓｅｒ１０）−アセチル（Ｌｙｓ１４）−ヒストン−Ｈ３（緑色）及び抗ＮｅｕＮ（赤色）免疫蛍光は、ＣＰＰ−ＲＢ５ペプチドに起因する強力な核内ＭＡＰＫ基質活性化を示した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１５）。抗ホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質（Ｔｈｒ２３５／２３６）免疫蛍光（緑色）及び抗ＮｅｕＮ（赤色）は、ＣＰＰ−ＲＢ５ペプチドがサイトゾルＭＡＰＫ基質に影響しないことを示した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１５）。ｃ）グルタミン酸で処置されたＥＲＫ１  ＫＯマウス及びそのＷＴ対照からのスライスを使用して、同じ効果が見られた（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１３）。ｄ〜ｌ）ＣＰＰ−ＲＢ５は、ｉｎ  ｖｉｖｏで単回注射後、核シグナル伝達を活発に促進する。単一用量のＣＰＰ−ＳＣＲペプチド又はＣＰＰ−ＲＢ５ペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を注射されたマウスが１時間後に急速灌流され、脳が解剖され、ＩＨＣ及び免疫蛍光についてさらに分析された。線条体におけるｐＥＲＫ１／２、ｐＭＳＫ、ｐＡｃｈ３、ｐＥＬＫ１及びｃ−Ｆｏｓ発現の代表的な顕微鏡写真。ＲＢ５ペプチドは線条体ＥＲＫリン酸化を増強し（ｄ）、核ＥＲＫ依存性シグナル伝達及び遺伝子転写の選択的活性化を促進した（ｐＭＳＫ、ｐＡｃＨ３、ｐＥＬＫ、ｃ−Ｆｏｓ（ｅ〜ｈ））。対照的に、ＲＢ５は、細胞質マーカーのリン酸化に影響しなかった（ｐＭＥＫ−１、ｐＶＧＫ＋、ｐＳ６）。ｍ〜ｏ）ＲＢ５の単独投与は、ＥＲＫ１  ＷＴマウスにおいてｐＥＲＫ及びｐＡｃＨ３の有意な活性化を誘導したが、この効果はＥＲＫ１  ＫＯマウスでは統計的有意性に達せず、これは、ＲＢ５がＥＲＫ１阻害剤のように作用することを示唆する。追加の対照として本発明者らは、Ｓ６のリン酸化が両方の遺伝子型において同等であることを示し、ＲＢ５が核シグナル伝達を優先的に活性化することを確認した。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較：黒星印１個、ｐ＜０．０５、黒星印２個、ｐ＜０．０１、白星印１個、ｐ＜０．００１。ｐ）ＥＲＫ活性化のためのＲＢ５ペプチドの用量反応曲線。２０���μｍ厚線条体スライスが２カ月齢のマウスから新たに調製され、３２℃の灌流チャンバー内に１時間移された。スライスが異なる用量のＲＢ５又はスクランブル対照で前処置された。１時間後、各用量のスライスがＰＦＡ  ４％中で１５分間固定された。１８μｍ凍結切片が免疫組織化学のために抗ホスホｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼで処置された。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて各スライス内のホスホ−ＥＲＫ陽性細胞の数を計数することにより神経細胞の定量化が実施された。活性化のレベルは、Ｙ軸上に任意単位（ＡＵ）として表される。用量は、Ｘ軸上に対数目盛（Ｌｏｇ１０）で報告される。ＥＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算された。ＲＢ５は、３．４μＭのＥＣ５０を有し、ｐＥＲＫの増強に有効であった。
【図２】時間経過及びＥＲＫ活性化に対するＲＢ５の用量反応調査を示す図である。
【００６３】
ａ）野生型マウス（各群ｎ＝５）にＲＢ５（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）又はスクランブル不活性ペプチド（ＳＣＲ、２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）が注射された。ＲＢ５を注射されたマウスが異なる時点で灌流されたのに対し、スクランブルを注射されたマウスは１時間後に灌流された。免疫組織化学的解析がホスホ−ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）に対して行われた。背側線条体内のホスホ−ＥＲＫ陽性細胞の定量化は、ホスホ−ＥＲＫレベルがＲＢ５の注射後６時間まで有意に増加し、１２時間時間後に基礎レベルに戻ったことを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ  Ｆ５，２９＝９．１３７、ｐ＜０．０００１。ボンフェローニの事後検定、ＳＣＲ対ＲＢ５  １時間：ｐ＜０．００１、ＳＣＲ対ＲＢ５  ６時間：ｐ＜０．００１。データは平均±ＳＥＭとして表される。ｂ）野生型マウス（各群ｎ＝５）に異なる用量のＲＢ５又は２０ｍｇ／ｋｇのスクランブル不活性ペプチド（ＳＣＲ）が全身注射され、１時間後に灌流された。免疫組織化学的解析がホスホ−ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）に対して行われた。背側線条体内のホスホ−ＥＲＫ陽性細胞の定量化は、ＲＢ５がＥＲＫを用量依存的に活性化することを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｆ５，２９＝７．０９７、ｐ＜０．００１。ボンフェローニの事後検定、ＳＣＲ対ＲＢ５  ２０ｍｇ／ｋｇ：ｐ＜０．０５、ＳＣＲ対ＲＢ５  １０ｍｇ／ｋｇ：ｐ＜０．０１。データは平均±ＳＥＭとして表される。ｃ）２０ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｐ．投与後に異なる時間に質量分析法で測定されたＲＢ５脳内レベル。高いレベルのＲＢ５が６時間まで検出された（一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｆ４，１８＝１７．４６９、Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニの事後、ＳＣＲ対ＲＢ５  １時間  Ｐ＜０．０１、ＳＣＲ対ＲＢ５  ３時間  Ｐ＜０．０００１、ＳＣＲ対ＲＢ５  ６時間  Ｐ＜０．０５）。結果は平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。白星印  Ｐ＜０．０００１、Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５。
【図３】胎児線条体培養液においてＲＢ５が神経細胞死を減弱させたことを示す図である。
【００６４】
スクランブル又はＲＢ５ペプチド（２０μＭ又は５０μＭの２の最終濃度）を含む培地に神経細胞の胎児線条体培養液（Ｅ１７）が７日間曝露された。ａ）線条体ニューロンのＴＵＮＥＬ標識を示す代表的な顕微鏡写真。ｂ）濃く染色されたアポトーシス核の定量化は、より高い用量のＲＢ５で処置された培養液においてアポトーシスレベルの有意な減少を示した（ｐ＜０．０１）。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝５として表される。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較  ＊＊ｐ＜０．０１。
【図４】ハンチントン病の薬理学的マウスモデル（３−ニトロプロピオン酸；３−ＮＰ）においてＲＢ５が神経細胞死を減弱させたことを示す図である。
【００６５】
ａ）スクランブルペプチド又はＲＢ５ペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を１日２回及び食塩水又は３−ＮＰ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を１回、連続７日間注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスの線条体からのＴＵＮＥＬ染色。ｂ）ＲＢ５ペプチド及び３−ＮＰで共処置されたマウスは、スクランブルペプチド及び３−ＮＰで共処置されたマウスと比較してアポトーシスレベルの有意な減少を示した。重要なことに、この減少は生理的状態に似ていた（ＲＢ５  ３−ＮＰ対ＲＢ５  食塩水  ｐ＝．８５）。平均±ＳＥＭ、各実験群ｎ＝１０）。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較  ＊＊＊ｐ＜０．００１  ＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｃ）スクランブル又はＲＢ５ペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、１日２回）のいずれか及び食塩水又は３−ＮＰ（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、１日１回）で連続７日間共処置されたマウスの線条体におけるカスパーゼ−３免疫蛍光。ｄ）ＲＢ５ペプチド及び３−ＮＰで共処置されたマウスは、カスパーゼ−３レベルの減少を示した（二元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニの事後、白星印  Ｐ＜０．０００１）。
【図５】ハンチントン病の遺伝的マウスモデル（ＨｄｈＱ１１１）においてＲＢ５が神経保護効果を示すことを示す図である。
【００６６】
ＷＴマウス及びＨｄｈＱ１１１マウスがＣＰＰ−ＲＢ５ペプチド又はスクランブル（ＣＰＰ−ＳＣＲ）ペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で８日間処置された。
【００６７】
ａ）ＷＴマウス及びＨｄｈＱ１１１マウスの背外側線条体におけるＥＲＫ１／２リン酸化の代表的な写真。ｂ）ＲＢ５ペプチドで処置されたＨｄｈＱ１１１マウスは、その同腹仔と比較してＥＲＫ活性化の有意な増強を示した。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較  ＊＊ｐ＜０．０１  ＊＊＊ｐ＜０．００１  ＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｃ）ＷＴマウス及びＨｄｈＱ１１１マウスの背側線条体におけるＴＵＮＥＬ染色の代表的な写真。ｄ）ＲＢ５ペプチドで処置されたＨｄｈＱ１１１マウスは、スクランブル処置マウスと比較してアポトーシス細胞の有意な減少を示した。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較  ＊＊ｐ＜０．０１。ｅ）切断カスパーゼ−３免疫蛍光染色の代表的な写真。ｆ）ＲＢ５で処置されたｈｄｈＱ１１１マウスにおいてプレアポトーシス状態の有意な減少が観察された。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較  ＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図６】パーキンソン病の亜急性ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロプリリジン）マウスモデルにおいてＲＢ５が神経保護効果を示すことを示す図である。
【００６８】
成体マウスがＭＰＴＰ又はビヒクル（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で４日間処置された。ＣＰＰ−ＲＢ５ペプチド又はスクランブル（ＣＰＰ−ＳＣＲ）ペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）がＭＰＴＰ／ビヒクルの１時間前に注射された。ａ）黒質におけるＴＨの代表的な写真。ｂ）ＲＢ５ペプチド及びＭＰＴＰで共処置されたマウスは、スクランブルペプチド処置群と比較してＴＨ減少の有意な減少を示した。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較  ＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１。ｃ）黒質ニューロンにおけるＴＵＮＥＬ染色の代表的な写真。ｄ）ＲＢ５ペプチド及びＭＰＴＰで共処置されたマウスは、スクランブル処置マウスと比較してアポトーシス細胞の有意な減少を示した。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較  ＊ｐ＜０．０５。ｅ）切断カスパーゼ−３免疫蛍光染色の代表的な写真。ｆ）ＲＢ５ペプチドで前処置されたＭＰＴＰマウスにおいてプレアポトーシス状態の有意な減少が観察された。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較  ＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１。
【図７】アルツハイマー病のＴｇ２５７６マウスモデルにおいてＲＢ５ペプチドが神経保護効果を示すことを示す図である。
【００６９】
ＷＴマウス及びＴｇ２５７６マウスがＲＢ５ペプチド又はスクランブルペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で７日間処置された。ａ）ＣＡ１におけるＥＲＫ１／２リン酸化の代表的な写真及びｂ）ＷＴマウス及びＴｇ２５７６マウスの海馬領域の歯状回（ＤＧ）。ｃ〜ｄ）ＲＢ５ペプチドで処置されたＴｇ２５７６マウスにおいて、スクランブル処置マウスと比較してＥＲＫ活性化の有意な増強が観察された。二元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニ事後比較  ＊＊ｐ＜０．０１  ＊＊＊ｐ＜０．００１  白星印  ｐ＜０．０００１  ｅ）切断カスパーゼ−３免疫蛍光染色の代表的な写真。ｆ）ＲＢ５で処置されたＴｇ２５７６マウスにおいてプレアポトーシス状態の有意な減少が観察された。二元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後比較  ＊＊ｐ＜０．０１  ＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】新規物体認識試験（ＮＯＲ）を実施するＷＴマウスにおいてＲＢ５が記憶の形成及び固定を増強することを示す図である。
【００７０】
ａ）１日目の空のアリーナ内の５分の馴化セッションの後、２日目の２の同一物体による訓練セッションの１時間前、マウスにＲＢ５（２０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルが注射され、次いで、後日、その長期記憶が評価された。異なる時点２４、４８、７２及び１２０時間で（ａ）並びに１６８時間まで（ｂ）弁別指数（Ｄ．Ｉ．）が試験された。２４時間で、ＲＢ５群のＤ．Ｉ．はスクランブル群より有意に高かった。後日、ＲＢ５群は高いままだったが、スクランブル群は基礎レベルに戻った。＊ｐ＜０．０１  ＊＊ｐ＜０．０００１。ＲＢ５は、ＮＯＲにおいて５日目まで記憶の形成及び固定を有意に増強した。２４時間で、ＲＢ５群のＤ．Ｉ．は高度に有意であり（独立標本ｔ検定  ｔ２６＝４．４２８  Ｐ＜０．０１、ＳＣＲ（ｎ＝１４）ＲＢ５（＝１４））、４８時間でも同様であった（独立標本ｔ検定  ｔ３８＝４．２１０  Ｐ＜０．０００１、ＳＣＲ（ｎ＝１８）ＲＢ５（＝２２））。４８時間で、スクランブル群のＤ．Ｉ．は偶然水準未満に低下する（１標本ｔ検定  ＳＣＲ  ｔ１７＝０．５６６  Ｐ＝０．５７９）が、ＲＢ５群のＤ．Ｉ．は偶然水準を大きく上回った（１標本ｔ検定  ＲＢ５  ｔ２１＝８．０７７  Ｐ＜０．０００１）。７２時間で、ＲＢ５群のＤ．Ｉ．は高度に有意なまま（独立標本ｔ検定  ｔ１４＝７．８９９  Ｐ＜０．０００１、ＳＣＲ（ｎ＝７）ＲＢ５（＝９））、偶然水準を上回った（１標本ｔ検定  ＲＢ５  ｔ６＝１２．３４１  Ｐ＜０．０００１；ＳＣＲ  ｔ６＝９．０７３  Ｐ＜０．０００１）。１２０時間で、ＲＢ５群のＤ．Ｉ．は依然として高度に有意であり（独立標本ｔ検定  ｔ２３＝４．２９０  Ｐ＜０．０００１、ＳＣＲ（ｎ＝１０）ＲＢ５（＝１５））、偶然水準を上回った（１標本ｔ検定  ＲＢ５  ｔ１４＝９．１４３  Ｐ＜０．０００１；ＳＣＲ  ｔ９＝２．２３０  Ｐ＝０．０５３）。１６８時間で、ＲＢ５群のＤ．Ｉ．は、ＳＣＲ群と区別がつかない基礎レベルまで低下した（独立標本ｔ検定  ｔ１８＝０．７７７  Ｐ＝０．４４７、ＳＣＲ（ｎ＝１０）ＲＢ５（＝１０））。結果は平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１。
【図９】健康な動物においてＲＢ５が文脈的恐怖記憶の獲得を増強することを示す図である。
【００７１】
条件付けの２０分前に覚醒ラットに２ｍｇ／ｍｌスクランブルペプチド（ｎ＝６）又はＲＢ５（ｎ＝５）のいずれかが背側ＣＡ１に向けた留置したスチール製カニューレを介して両側に注入された。ａ）訓練の３時間後及び２日後それぞれの２分の想起試験中に条件付け恐怖行動（すくみ）を測定することによりＳＴＭ及びＬＴＭが評価された。ｂ）ＲＢ５投与は、ラットのすくみ行動に重大な影響を及ぼした（試験×群、Ｆ（２．２６２，２０．３６１）＝９．４３９、ｅ＝０．７５４、Ｐ＝０．０００、反復測定ＡＮＯＶＡ）。これは、恐怖条件付け中のフットショック後（ｐｏｓｔＵＳ）のすくみ行動の増加（Ｆ（１，９）＝２１．５３２、Ｐ＝０．００１、ＰｒｅＵＳ対ｐｏｓｔＵＳ  すくみ行動×注入相互作用、反復測定ＡＮＯＶＡ）並びにＳＴＭ及びＬＴＭの両方の向上（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＦＬＳＤ試験）として現れた。
【図１０】アルツハイマー病のＴｇ２５７６マウスモデルにおいてＲＢ５が文脈的恐怖記憶の獲得を増強することを示す図である。
【００７２】
７カ月齢のＴｇ２５７６マウス及びＷＴマウスが文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ）訓練前にＣＰＰ−ＳＣＲ又はＣＰＰ−ＲＢ５（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）のいずれかで処置され、２４時間後に記憶保持に関して試験された。Ｔｇ２５７６マウスにおける文脈的恐怖（ＣＦ）記憶障害は、ＲＢ５処置により完全に救出される。値は、すくみで費やされた時間の％として報告される。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５  ＊＊ｐ＜０．０１。
【図１１】ハンチントン病のｚＱ１７５マウスモデルにおいてＲＢ５が認識能力を改善することを示す図である。
【００７３】
ＷＴマウス及びｚＱ１７５マウスが毎日２０分、連続１０日間（１〜１０日目）、単純な定率強化（ＦＲ１）スケジュールでノーズポーク訓練を受けた。１１日目からの開始で、マウスはＲＢ５（２０ｍｇ／ｋｇ．ｉ．ｐ．）の１回投与をノーズポーク訓練の１時間前に受けた。ＲＢ５は、ｚＱ１７５雌マウスのノーズポーク反応を有意に改善した（遺伝子型×性間Ｆ１，５７＝４．３８３  Ｐ＝．０４１及び処置×性間Ｆ１，５７＝２８．１２０  Ｐ＜０．０００１の二元配置相互作用は有意であった）。平均ノーズポークスコアは、雌ｚＱ１７５において雄ｚＱ１７５より高く、平均差は２１．８９３  Ｐ＝０．００１であった。ａ）ＲＢ５処置は、ＷＴ及びｚＱ１７５雌マウスの両方の能力を改善し（二元配置ＡＮＯＶＡ、時間×処置相互作用Ｆ１８，６４８＝２３．３１４、Ｐ＜０．００１）、雌ＷＴにおいて雌ｚＱ１７５より高いスコアとなった（４６．１７５の平均差  Ｐ＝０．００１）。ｂ）訓練中（Ｗｅｌｃｈ  ＡＮＯＶＡ、Ｇａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌの事後、ｚＱ１７５対ＷＴ  Ｐ＜．０５）及びＲＢ５処置中（Ｗｅｌｃｈ  ＡＮＯＶＡ、Ｇａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌの事後、Ｐ＜０．０００１）に測定されたノーズポークの曲線下面積（ＡＵＣ）の解析。結果は平均±ｓ．ｅ．ｍを示す。白星印  Ｐ＜０．０００１。
【００７４】
方法及び材料
ペプチドの調製
ＥＲＫ経路並びにスクランブル対照（無効）に対する細胞透過性ペプチドはＧＥＮＥＣＵＳＴ  ＥＵＲＯＰＥ（Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ）によりカスタム合成される。試験ペプチド（ＣＰＰ−ＲＢ５）及びそのスクランブルバージョン（ＣＰＰ−ＳＣＲ）の配列は以下の通りである：
ＣＰＰ−ＲＢ５：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＧＧＧＧＥＰＲＲＴＥＧＶＧＰＧＶＰＧＥＶＥＭＶＫＧＱＰＦＤＶ（配列番号１８）
ＣＰＰ−ＳＣＲ：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＶＧＰＧＶＰＥＧＶＧＶＡＶＦＧＶＫＥＰＧＱＴＧＤＶＧＰＶＧＥ（配列番号１９）
全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験について、Ｄ型のＣ末端アミノ酸（最後）及びアセチル化Ｎ末端（最初）アミノ酸を含む高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により高度に精製（≧９５％）された２００ｍｇのバッチを使用した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験については、ペプチドを１倍ＰＢＳに溶解し、示した用量で注射した。
【００７５】
薬理学的処置
Ｌ−グルタミン酸（Ｇ−６９０４、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を滅菌水に溶解し、１０分の刺激の間、１００μＭの最終濃度で使用した。
【００７６】
３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ、Ｎ５６３６、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を５０ｍｇ／ｍｌの濃度まで蒸留水に溶解し、ｐＨを７．４に調整し、０．２μｍフィルターに通し、使用するまで−８０℃に保った。
【００７７】
動物
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫ブロット及び免疫蛍光の両方を実施するための線条体初代培養液及びｅｘ−ｖｉｖｏ急性スライスの源として使用した。マウスには、３−ＮＰ及びペプチドによる共処置時の行動調査並びに免疫組織化学的調査も実施した。
【００７８】
ＣＰＰ−ＲＢ５及びＣＰＰ−ＳＣＲの急性効果を試験するために、且つ物体認識試験とその後の免疫蛍光及びＩＨＣ分析のためにＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したＣＤ１マウスを使用した。
【００７９】
ＨｄｈＱ１１１ヘテロ接合体マウス（Ｊａｘ（登録商標）、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｍａｉｎｅ、米国）、１８０から１９５の間のＣＡＧリピートを持つｚＱ１７５ノックインヘテロ接合体（異性混合）（ＣＨＤＩ−８１００３００３、Ｐｓｙｃｈｏｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）及びＴｇ２５７６トランスジェニック雄マウス（Ｃ５７ＢＬ６及びＳＬＪ混合バックグラウンド、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をＩＨＣ、ＩＦ及び行動試験に使用した。
【００８０】
ＥＲＫ１雄ＫＯ及び同腹仔対照を先述の通り作成し、ｅｘ  ｖｉｖｏ解析に使用した。
【００８１】
Ｌｉｓｔｅｒ  ＨｏｏｄｅｄラットをＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、文脈的恐怖条件付け試験に使用した。
【００８２】
急性脳スライス上のｅｘ−ｖｉｖｏ系
成体マウスを麻酔し、断頭した。頭蓋から脳を速やかに切除し、氷冷したスクロース系解剖溶液（８７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、７５ｍＭスクロース、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭキヌレン酸）で満たされた冷却ガラス板上に置き、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で酸素化し、続いてビブラトームステージ（Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ、ＶＴ１０００Ｓ−Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にマウントした。２００μｍ厚スライスを切り、脳スライスチャンバー（Ｂｒａｉｎ  ｓｌｉｃｅ  ｃｈａｍｂｅｒ−ＢＳＣ１−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、カナダ）内に移し、スクランブル又はＲＢ５ペプチド（５０μＭ）の存在下、カルボキシ化人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）の一定の灌流により３２℃で１時間回復させた。１００μＭグルタミン酸を用いてチャンバー内で１０分間、脳スライス刺激を実施した。４％ＰＦＡ中、室温で１５分間速やかに固定した後、スライスをすすぎ、スクロース溶液中、４℃で一晩凍結保護した。翌日、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１８５０）を使用してスライスを１８μｍのより薄いスライスにさらに切り、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に集めた。
【００８３】
薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏ投与
薬剤処置後の示した時間に、動物を麻酔し、氷冷した緩衝４％ＰＦＡで経心灌流した。脳を摘出し、一晩後固定し、３０％緩衝スクロースに２４時間移した。冠状切片を凍結ミクロトーム上で３５μｍ厚に切り、免疫組織化学又は免疫蛍光のために処理するまで−２０℃の凍結保護溶液中で保管した。
【００８４】
液体クロマトグラフィー及びタンデム質量分析法（ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
２０ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｐ．投与後に異なる時間間隔（１、３、６、１２時間）でマウス脳におけるＲＢ５のバイオアベイラビリティを決定した。次いで、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用してマウス脳においてＲＢ５を定量化した。ホモジナイザーｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘを用いて脳サンプルを１：４ｗ／ｖの５０％アセトニトリル、水中の５％ＴＦＡとホモジナイズし、次いで、１３０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離した。上澄みを回収し、１３０００ｒｐｍで４℃で２分間遠心分離した。次いで、上澄みを氷中に回収し、Ｓｅｐ−ＰａｋカートリッジＣ１８を使用して抽出し、凍結乾燥し、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで４℃に保った。分析直前にサンプルをオートサンプラーバイアル内の水中の０．１％ＨＣＯＯＨ／８％アセトニトリル１００μＬ中に懸濁させた。
【００８５】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４１０  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄｒｕｐｌｅ質量分析計と連結したＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣシステムからなるシステムを使用してＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。データ収集及び処理のためにＭａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ｖ．Ｂ．０１．０３ソフトウェアを使用した（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）。０．１から４ｎｇ／μｌの範囲のペプチド濃度の内部標準曲線を使用してＲＢ５ペプチド及びスクランブルペプチドのマウス脳レベルの定量化を行った。Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４  ３００  Ａ分析カラム、２ｘ１５０ｍｍ、粒径５μｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ）上に１０μＬの抽出サンプルを注入することにより、ＲＢ５ペプチド及びスクランブルペプチド並びに内部標準を室温で分離した。クロマトグラフ分離のために、溶媒Ａとして水中の０．１％ギ酸を、溶媒Ｂとしてアセトニトリルを２００μｌ／分の流量で使用する勾配溶離を使用した。溶離は９２％の溶離液Ａ及び８％の溶離液Ｂで開始して１分間保持し、その後、７５％の溶離液Ｂまで４分の直線勾配、９９％の溶離液Ｂまで１分の直線勾配、２分の定組成溶離及び８％の溶離液Ｂまで０．５分の直線勾配が続き、これを９．５分間保持してカラムを平衡化させた。サンプルをオートサンプラー内で４℃で保持した。
【００８６】
次いで、以下のパラメータを使用してＡｇｉｌｅｎｔ  ６４１０  ＱＱＱ質量分析計でペプチドを検出した：陽イオンモード、キャピラリー電圧  ５ｋＶ、コーン電圧  ５００Ｖ、ガス流量  ３５０℃で８Ｌ／分、ネブライザーガス圧  ３５０℃で４０ＰＳＩ、ウェルタイム  ７５ミリ秒並びにユニット分解能に設定したＱ１及びＱ３。
【００８７】
免疫蛍光
スライドを加湿チャンバー内に置き、５％正常ヤギ血清及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液中でブロッキングして１時間後、スライドを以下の一次抗体のうちの１：抗ホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）（１：２００  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、抗ホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２４０／２４４）（１：２００  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、抗ホスホ（Ｓｅｒ１０）−アセチル化（Ｌｙｓ１４）ヒストンＨ３（１：１０００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）又は切断カスパーゼ３（１：２００  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）及び抗ＮｅｕＮ（１：１０００  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）と、続いて適切な二次抗体と４℃で一晩インキュベートした。対応するレーザー及び蛍光色素間のクロストークを回避する適切なフィルターセットを備えたレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２）を使用して一重標識画像及び二重標識画像を得た。４０倍対物レンズを用いて線条体の背側領域全体にわたって細胞をサンプリングした。各スライド内のＮｅｕＮ陽性ニューロンのうちホスホ−Ｓ６免疫反応性ニューロン又はｐＨ３ニューロンをＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて計数することにより神経細胞の定量化が実施される（各実験群につきｎ＝１０）。総ＮｅｕＮ陽性ニューロン間のホスホ−Ｓ６又はホスホ−Ｈ３陽性細胞の比より、スライドを通じて取得された各視野のホスホ−Ｓ６又はホスホ−Ｈ３陽性ニューロンの百分率を得た（ｎ＝４）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアにおいて二元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニ検定による事後解析を使用して異なる処置群間の比較を実施した。
【００８８】
ウエスタンブロット法
断頭によりマウスを屠殺し、脳スライスを上述のｅｘ−ｖｉｖｏ系プロトコールに従って新たに調製し、灌流チャンバー内でペプチドとインキュベートした。グルタミン酸又は食塩水で刺激した後、次いで、スライスをホモジナイズし、ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用するタンパク質定量に使用した。各サンプルに対して等量のタンパク質（標的タンパク質に応じて５又は１０μｇ）を１２％ポリアクリルアミドゲル上に負荷した。タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥ上に分離し、ニトロセルロース膜に移した。ブロッキング溶液（１倍ＴＢＳ、０，１％Ｔｗｅｅｎ）中で１時間インキュベーション後、膜を抗ＥＲＫ２（Ｋ−２３）：ｓｃ−１５３（１：１０００  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ）、ホスホ−ｐ４２−４４  Ｍａｐキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（１：１０００  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）及び抗ＧＡＰＤＨ（ＦＬ−３３５）：ｓｃ−２５７７８（１：１０００  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ）と一晩インキュベートした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて免疫ブロットを分析し、バンドの光学密度を測定した。各タンパク質のレベルをＧＡＰＤＨ負荷対照に対して規格化した。
【００８９】
神経細胞の胎児培養液
胎児培養液（Ｅ１６）をＷＴマウスの線条体から調製し、ポリ−Ｌ−リシンをコートしたガラス上に播種し、先述の培養培地で１０日間保存した（Ｆａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙ  ２００９）。２の異なる濃度（２０μＭ及び５０μＭ）のＣＰＰ−ＲＢ５ペプチド及びＣＰＰ−ＳＣＲペプチドを３日目までに培養培地に加え、毎日交換した。１１日目に、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ  ｐＨ７．４を１０分間用いて細胞を固定した。
【００９０】
免疫組織化学
１時間後、ＣＰＰ−ＲＢ５／ＣＰＰ−ＳＣＲ（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）マウスを麻酔し、氷冷した４％ＰＦＡの心臓内注入により灌流した。脳を速やかに摘出し、一晩後固定し、２５％緩衝スクロースに２４時間移した。冠状切片を凍結ミクロトーム上で３０μｍ厚に切り、免疫組織化学のために処理するまで−２０℃の凍結保護溶液中で保管した。浮遊切片を抗ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、抗ホスホ−Ｅｌｋ−１（Ｓｅｒ３８３）、抗ホスホ−Ｋｖ４．２（Ｔｈｒ６０７）−Ｒ、抗ホスホ−ＭＳＫ−１、抗ホスホ−ＭＥＫ−１、ｃ−Ｆｏｓ及びチロシンヒドロキシラーゼに対する一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）と２時間インキュベートした。標準的なペルオキシダーゼに基づく方法（ＡＢＣ−ｋｉｔ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）、続いてＤＡＢ及びＨ２Ｏ２溶液を使用して結合抗体の検出を行った。両側でマウスあたり２〜３切片中の線条体から陽性ニューロンの定量化を計数した。盲検評価者によりＬｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＢ顕微鏡の２０倍対物レンズ下でサンプル領域を状態に対して視覚化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して領域あたりの計数を切片にわたって平均した。
【００９１】
ＴＵＮＥＬ染色
ＤｅａｄＥｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、改変ＴＵＮＥＬアッセイを使用してアポトーシス細胞の断片化ＤＮＡを標識しながら培養細胞中のアポトーシス細胞を検出した。ＴＵＮＥＬ染色は、ジアミノベンジド（ＤＡＢ）とその後の製造のプロトコールを用いて実現させた。２０倍対物レンズを使用したＺｅｉｓｓ顕微鏡に接続されたビデオカメラ（Ｎｉｃｏｎ）によりサンプル領域をデジタル化した。４の領域を計数し、各プレートについて平均した。
【００９２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの３−ニトロプロピオン酸投与
使用前に、ＣＣＰ−ＳＣＲ及びＣＰＰ−ＲＢ５を１倍ＰＢＳ中に希釈し、１２時間の間隔で１日２回注射した（２０ｍｇ／ｋｇ）。ペプチドの１時間後、３−ＮＰを１日１回、連続７日間、雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに注射した（５０ｍｇ／ｋｇ）。全ての薬剤を１０ｍｌ／ｋｇの量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。マウスを最後のペプチド注射の１時間後に安楽死させ、緩衝４％ＰＦＡで経心灌流し、免疫組織化学のために処理した。ＤｅａｄＥｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、３５ｍｍ厚の組織切片上のアポトーシス細胞を検出した。各動物について、３の連続する冠状切片を採取し、ガラススライド上にマウントし、推奨手順に従って免疫組織化学的解析のために処理した。定量化のために、両半球の線条体の背外側領域にわたって各切片中の陽性ニューロンの数を計数し、平均値を計算した。
【００９３】
物体認識課題（ＮＯＲ）
薄明かりの静かな部屋に置いた開いた四角い箱（４５×４５×４５ｃｍ）内で試験を実施した。使用した物体は、水で満たされた金属及びガラスバイアル内の平行六面体であった。マウスにとってそれらに自然的意義はなく、それらが以前に強化に関連することはなかった。プロトコールには３日を要し、以下の通り実施した：
１日目：アリーナに慣れさせ、マウスの不安（走触性試行）を測定するために、マウスを空のアリーナ内に個別に５分間置いた。走触性の百分率は、アリーナ内で費やされた総時間（３００秒）のうち辺縁部で費やされた時間として計算される。９０％超の走触性を示す動物は不安について偏りがあるとみなされるためサンプルから除かれる。
【００９４】
２日目：訓練の１時間前にマウスに２０ｍｇ／ｍｌ  ＣＰＰ−ＳＣＲ又はＣＰＰ−ＲＢ５のいずれかを注射し、次いで、マウスをアリーナ内に１０分間置き、そこでマウスに２の同一物体を探索させた（訓練試行）。したがって、左の物体及び右の物体に対する２の異なる測定値（秒単位）を得た。１０分内に少なくとも８秒の総物体探索が行われた訓練が成功とみなされ、動物がこの閾値に達しなかった場合、実験から除外した。次いで、各物体の探索の百分率を総探索時間（ＲＯ＋ＬＯ）のうちＬＯ又はＲＯの探索に費やされた時間として計算した。この百分率に従って、実験者が試験試行の新規物体を配置する場所を決定した。
【００９５】
３日目：２の同一物体（平行六面体）のうちの１を新しい物体（バイアル）と交換し、マウスに物体を１０分間探索させた（試験試行）。
【００９６】
既存物体（ＦＯ）及び新規物体（ＮＯ）の探索時間を訓練試行と同じ手順で個別に記録した。６秒のカットオフも考慮した。認識記憶を裏付けるために、弁別指数（Ｄ．Ｉ．）を（ＮＯの総探索時間−ＦＯの総探索時間）／（ＦＯ＋ＮＯ）の総探索時間として計算した。Ｄ．Ｉ．指数は−１から＋１の間に含まれる。Ｄ．Ｉ．が１のとき、ＦＯの記憶保持が完全であることを意味するであろう。逆に、動物がＦＯの探索に長い時間を費やすほどＤ．Ｉ．値は低くなり、ＦＯの記憶保持が劣ることを意味する。ＳＭＡＲＴソフトウェア（Ｐａｎｌａｂ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）を使用して実験を行った。
【００９７】
外科手術及び背側海馬への微量注入
対象は、体重２８０〜３５０ｇの成体雄Ｌｉｓｔｅｒ  ｈｏｏｄｅｄラットであった。ラットを２１℃に維持した逆転光サイクル（１２時間明／暗；午後１０：００に点灯）の待機部屋に対で収容した。全ての実験をラットの暗期に実施した。飼料及び水は実験全体にわたって自由に摂取できた。行動訓練及び微量注入の少なくとも１週間前に背側海馬（ブレグマに対してＡＰ−３．５０）に向けたスチール製ダブルガイドカニューレを麻酔下で外科的に移植した。ポリエチレンチューブで注射器（２８ゲージ、ガイドカニューレから１ｍｍ突出）に接続されたシリンジポンプを使用して、条件付けの２０分前に慢性留置カニューレを介した２ｍｇ／ｍｌ  ＣＰＰ−ＳＣＲ又はＣＰＰ−ＲＢ５のいずれかの両側注入（ｐＨ７．０、片側１．０ｍｌ、速度＝０．５ｍｌ／分）を覚醒ラットにおいて実施した。
【００９８】
文脈的恐怖条件付け
２の異なる文脈のうちの１で条件付けを実施した。これらの文脈は、サイズ、空間的位置、匂い及び照明を含むいくつかの特徴的な特性が異なるように設計された。
【００９９】
ラットプロトコール：３分の条件付け訓練試行の間、ラットは条件付け文脈のうちの１（ＣｔｘＡ）に置かれた２分後に１回のスクランブルフットショック（０．５ｍＡ、２秒間）を受けた。全てのラットが条件付け後にホームケージに戻った。想起の３時間後（想起後短期記憶、ＳＴＭ）又は２日後（長期記憶、ＬＴＭ）の想起試験は再び、ラットを条件付け文脈に２分間曝露することからからなっていた。
【０１００】
マウスプロトコール：１２０秒の探索後、格子床を通じて与えられた５回のフットショック（０．７ｍＡ、２秒間、６０秒間隔で分離）をマウスは受けた。マウスを条件付けチャンバーに５分間戻し、フットショックを与えないことにより、文脈恐怖記憶を２４時間後に評価した。
【０１０１】
全てのプロトコールについて、すくみ行動が行動手順の条件付け試験中及び想起試験中の文脈に対する条件付け恐怖の尺度となった。これを録画し、実験群を知らない観察者によって定量化した。１０秒毎にサンプリングした１秒内に呼吸に必要な動き以外の連続した動きがないことを１単位のすくみと定義した。
【０１０２】
９穴オペラント箱
オペラント試験を１６の９穴オペラント箱内で実施した。各オペラント箱は、９の穴の水平配列及び各穴の前面に限局するノーズポークを検出するための赤外線ビームを含む。ペリスタルティックポンプにより液体強化（イチゴミルク）が箱の前面にあるマガジン内に送られる。
【０１０３】
訓練開始の１週間前に、マウスは水が１８時間／日に制限され、実験手順全体にわたってこのレジメン下に保たれる。マウスは単純な定率強化（ＦＲ１）スケジュールでノーズポークをするよう教えられる：報酬を得るために、マウスは１回のノーズポークにより中央の穴の中の光刺激に反応する必要がある。マウスは１０日間、２０分のセッションの間このプログラムの訓練を毎日受ける（訓練段階）。訓練したら、動物を４群に細分し、他の９日間、ＦＲ１スケジュールで試験される１時間前にＲＢ５ペプチド又はスクランブル（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）ペプチドを動物に注射した。
【０１０４】
結果
ＥＲＫ１  ＭＡＰキナーゼの特有のＮ末端部分上に小さいポリペプチドを設計した。このポリペプチドは、キナーゼＥＲＫ１と結合されたとき、核と往来するＥＲＫ１及びＥＲＫ２の能力を著しく低下させることにより全ＥＲＫ依存性シグナル伝達に対して阻害効果を与え、これは、核膜の成分に結合することによる可能性が最も高い。重要なことに、ペプチド配列は機能ドメインであるように見受けられ、その理由は、ＥＲＫ１から除去されたとき、このキナーゼはＥＲＫ２のように挙動し、一方、ＥＲＫ２と結合されたとき、このキナーゼはＥＲＫ１のように挙動し始めるからである。
【０１０５】
しかし、そのような分離したペプチドは、ＥＲＫ１と結合されずに発現したとき、特に細胞透過性ペプチド配列に融合されたとき、以下の詳細の通り、ＭＡＰＫ３／ＥＲＫ１阻害剤として作用する予想外の薬理特性を示す。本発明において、ＥＲＫ１のＮ末端部分、特に配列番号１のペプチド配列、とりわけＲＢ５ペプチド配列の周辺で設計されたこのＭＡＰＫ３／ＥＲＫ１阻害剤は、細胞内に又は生きている動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで投与されたとき、主なＥＲＫアイソフォームであるＥＲＫ２の核移行を容易にすることにより核内の全ＥＲＫシグナル伝達を増強することが明らかになった。
【０１０６】
ＲＢ５ペプチドによるＥＲＫ活性の増強
ＥＲＫ活性に対するＲＢ５ペプチドの機能を生化学的に調査するために、本発明者らは最近確立されたｅｘ  ｖｉｖｏ系を使用した。この系では、脳スライスを成体マウスから新たに調製し、灌流チャンバー内でペプチドとインキュベートし、適切なアゴニスト及びアンタゴニストで刺激することができる。図１ａに示す通り、あらかじめ５０μＭ  ＣＰＰ−ＲＢ５ペプチド又はＣＰＰ−ＳＣＲペプチドと１時間インキュベートした脳スライスに１００μＭグルタミン酸を負荷し、ウエスタンブロットで分析した。ホスホ−ＥＲＫ１はＣＰＰ−ＳＣＲ及びＣＰＰ−ＲＢ５前処置スライスにおいて等しく増加したが、ＥＲＫ２のリン酸化はＣＰＰ−ＲＢ５前処置スライスにおいてのみ選択的に増強され、これは、この細胞透過性ペプチドがＥＲＫ２媒介性シグナル伝達の促進において非常に有効であることを示す。興味深いことに、ＥＲＫ１タンパク質及びＥＲＫ２タンパク質の基礎レベルの変化は検出されなかった。
【０１０７】
さらに、このｅｘ  ｖｉｖｏ系を用いて、ヒストンＨ３リン酸化（ｐＨ３）又はリボソームタンパク質Ｓ６（ｐＳ６）のいずれかに対するホスホ−特異抗体を使用してＥＲＫシグナル伝達の誘導を単細胞レベルで監視した。ＲＢ５は、グルタミン酸適用に応答してＥＲＫ依存性核シグナル伝達（ＥＲＫ１／２移行及びヒストンＨ３リン酸化の誘導）を促進する（図１ｂ、左パネル）。同時に、細胞質シグナル伝達は（リボソームＳ６リン酸化により測定される通り）活性化されない（図１ｂ、右パネル）。この表現型は、ＥＲＫ１  ＫＯ細胞に見られるものと等しく、これは、ＲＢ５が、ＥＲＫ１活性が減弱され、したがってＥＲＫ２が増強され得る薬理学的モデルであることを示唆する（図１ｃ）。
【０１０８】
これらの結果に基づいて、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を用いて核シグナル伝達におけるＲＢ５の主な関与を調べた。単一用量のＣＰＰ−ＲＢ５又はＣＰＰ−ＳＣＲ（２０ｍｇ／ｋｇ）で前処置されたマウスを１時間後に灌流し、核マーカー及び細胞質マーカー用に脳スライスを処理した。図１に示す通り、ＥＲＫ依存性核シグナル伝達と同様にＥＲＫ誘導が有意に増強されることが明らかになった（パネルｄ）。実際、ＣＰＰ−ＲＢ５を投与するとｐ−ＭＳＫ−１、ｐ−ＡｃＨ３、ｐ−ＥＬＫ−１、ｃ−Ｆｏｓのような核分子が有意に増加することが明らかになった（パネルｅ〜ｈ）。一方、リボソームＳ６リン酸化により測定された細胞質シグナル伝達は、ＣＰＰ−ＲＢ５処置マウスにおける低下の程度はより小さいことが明らかになったが、電位依存性カリウムチャネル（ｐＫｖ４．２）及びＭＥＫ−１のリン酸化は、２の処置間で同等であった（パネルｉ〜ｌ）。最後に、スライスにおいて観察される通り、ＲＢ５  ｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、ＥＲＫ１  ＫＯマウスにおいてｐＥＲＫ（パネルｍ）、ｐＡｃＨ３（パネルｎ）又はｐＳ６（パネルｏ）のいずれも変えず、ＲＢ５標的がＥＲＫ１／ＭＡＰＫ３であることが確認された。
【０１０９】
脳内のＲＢ５ペプチドの薬物動態学的特性
図２において、ＥＲＫシグナル伝達をｉｎ  ｖｉｖｏで増強するＲＢ５の能力を評価した。第一に、ＲＢ５活性は注射後６時間まで高いままだった（パネルａ）が、１２時間で基礎レベルまで低下し、推定半減期は９時間となった。第二に、注射後１時間における用量反応曲線を決定し、２０及び１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）用量のいずれもｐＥＲＫを増加させることができることを確認した（パネルｂ）。第三に、本発明者らは、２０ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｐ．投与後に異なる時間に質量分析法でＲＢ５脳内レベルを測定した。高いレベルのＲＢ５が６時間まで検出された（パネルｃ）。
【０１１０】
ＲＢ５ペプチドによって媒介される初代線条体培養液における神経細胞死の減少
神経生存に対するＲＢ５の効果を分析するため、本発明者らは、胎児線条体から初代神経細胞培養液を調製した。細胞を２０μＭ又は５０μＭの２の最終濃度のＣＰＰ−ＳＣＲペプチド又はＣＰＰ−ＲＢ５ペプチドを含む培地に連続７日間曝露した。
【０１１１】
ＤｅａｄＥｎｄ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍを２４時間後に適用して、核ＤＮＡ断片化を測定することによりアポトーシス細胞死を分析した。図３に示す通り、より高い濃度（５０μＭ）のＣＰＰ−ＲＢ５は、ＣＰＰ−ＳＣＲ値と比較してアポトーシスを３２％減少させた。
【０１１２】
ハンチントン病の薬理学的マウスモデルにおける細胞死の防止
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで及びｅｘ−ｖｉｖｏ急性スライス系においてＥＲＫ活性を増強するＲＢ５ペプチドの有効な能力を検証した後、本発明者らは、ハンチントン病の薬理学的マウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでの神経保護効果を試験した。３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰ）がハンチントン病に見られるものと同様の線条体病変を選択的に形成するということは周知である。
【０１１３】
本発明者らは、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＰＰ−ＳＣＲペプチド又はＣＰＰ−ＲＢ５ペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を１日２回（１２時間毎）、７日間注射し、ペプチド注射の１時間後、３−ＮＰ（５０ｍｇ／ｋｇ）の１回注射を与えたプロトコールを設定した。処置の最後に、免疫組織化学と同様に動物を灌流し、脳を調製した。図４に示す通り、ＣＰＰ−ＲＢ５は、アポトーシスを対照レベルまで減少させながら、ｉｎ  ｖｉｖｏでの３−ＮＰ誘導細胞死を防止することができ（パネルａ〜ｂ）、プレアポトーシスレベルのカスパーゼ３マーカーを対照レベルまで減少させることができた（パネルｃ〜ｄ）。
【０１１４】
ハンチントン病の遺伝的マウスモデルにおける細胞死の防止
本発明者らは、ハンチントン病の遅発性遺伝モデルであるｈｄｈＱ１１１トランスジェニックマウスにおけるＲＢ５の潜在的な神経保護効果も評価した。ｈｄｈＱ１１１マウスを７日間処置した（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、１日２回）（図５）。ＲＢ５がＷＴ及びミュータント線条体においてｐＥＲＫを増加させただけでなく（パネルａ、ｂ）、ｈｄｈＱ１１１ミュータントにおいて変性を防止する（パネルｃ〜ｆ）ことが明らかになった。
【０１１５】
パーキンソン病の薬理学的マウスモデルにおける細胞死の防止
本発明者らは、パーキンソン病のＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）神経毒モデルにおけるＲＢ５の神経保護効果を評価した（図６）。マウスをＭＰＴＰ又はビヒクル（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）で４日間処置した。ＭＰＴＰ／ビヒクルの１時間前にＲＢ５又はスクランブルペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）を注射した。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）染色（パネルａ、ｂ）、ＴＵＮＥＬ（パネルｃ、ｄ）及び切断カスパーゼ３（パネルｅ、ｆ）により評価された通り神経変性は防止され、強い神経保護効果が確認された。
【０１１６】
アルツハイマー病の遺伝的マウスモデル（Ｔｇ２５７６）における細胞死の防止
アルツハイマー病の遺伝モデルＴｇ２５７６及びそのＷＴ対照をＲＢ５／スクランブルペプチド（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ）で７日間処置した。図７に示したＡ、ＲＢ５はＴｇ２５７６ミュータントにおいてｐＥＲＫを増加させ（パネルａ〜ｄ）、同時に切断カスパーゼ−３染色のレベルを減少させ（パネルｅ〜ｆ）、強い神経保護効果が確認された。
【０１１７】
物体認識試験における記憶固定の増強
ＲＢ５ペプチドは、ニューロンにおいてＥＲＫシグナル伝達を上方制御すると考えられる。これは、経路の活性化を増強し、したがって、タンパク質合成を増強するであろう。遺伝子転写は記憶固定の根底にある生物学的機構であるため、記憶改善は予想される行動結果である。したがって、本発明者らは、げっ歯類において顕在記憶を研究するために一般に使用される試験である物体認識課題（ＯＲＴ）を実施した。
【０１１８】
この試験の様々な変種が存在し、選ばれた試験により、特有の事象に関する記憶の調査、すなわち、新規物体と既存物体との間の遅延弁別が必要な一試行物体認識試験が可能になる。試験開始の１時間前にマウスはＣＰＰ−ＳＣＲペプチド又はＣＰＰ−ＲＢ５ペプチドの腹腔内注射を受け、次いで、異なる時点（２４、４８、７２及び１２０時間）の後に調べられた。図８に示す通り、ＣＰＰ−ＲＢ５処置マウスは、そのＣＰＰ−ＳＣＲ動物と比較したとき、２４、４８、７２時間後及び驚くべきことに１２０時間後のいずれにおいても物体を記憶するより高い能力を有していた（パネルａ）。最後に、１６８時間で、ＲＢ５群の能力はＳＣＲ群と区別がつかない基礎レベルまで低下した（パネルｂ）。これは、ＲＢ５がマウスの記憶固定を改善し、マウスが記憶試験日に新しい物体により長い時間を費やせるようになったことを意味する。
【０１１９】
ＣＦＣにおける情動記憶形成の改善
本発明者らは、げっ歯類が文脈などの非侵害性条件刺激（ＣＳ）をフットショックなどの侵害性無条件刺激（ＵＳ）と関連付けることを学習する文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ）の獲得及び発現に対するＲＢ５の効果も試験した。ＣＦＣは連合学習機能及び記憶機能を評価するための行動パラダイムとして広く使用されてきた。チャンバー箱内の条件付け（文脈）の２０分前に覚醒ラットに２ｍｇ／ｍｌ  ＣＰＰ−ＳＣＲ又はＣＰＰ−ＲＢ５のいずれかを海馬の両側に注入した。訓練の３時間後及び２日後に実施した試験中にすくみ行動を測定することにより短期記憶（ＳＴＭ）及び長期記憶（ＬＴＭ）を評価した。図９に示す通り、ＣＦＣ前の背側海馬へのＣＰＰ−ＲＢ５注入は、文脈的恐怖記憶の獲得を増強し、より強い長期恐怖記憶が生じた。
【０１２０】
アルツハイマー病のマウスモデル（Ｔｇ２５７６）における記憶喪失の防止
さらに、本発明者らは、ＲＢ５ペプチドによるＥＲＫ活性の増強がアルツハイマー病において認知機能障害を調節することができるか調査した。ＡＤのトランスジェニックモデル（Ｔｇ２５７６−ＡＰＰｓｗｅマウス）を後期症状期中に使用して認知機能障害を停止する可能性を試験した。老化Ｔｇ２５７６マウス及びＷＴマウスを文脈的恐怖条件付け（ＣＦＣ）訓練前にＣＰＰ−ＳＣＲ又はＣＰＰ−ＲＢ５（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）のいずれかで処置し、２４時間後に記憶保持に関して試験した。図１０に示す通り、ＣＰＰ−ＲＢ５ペプチドは、老化Ｔｇ２５７６マウスに既に存在する記憶障害をＷＴレベルまで戻して救出した。
【０１２１】
ハンチントン病のｚＱ１７５マウスモデルにおける認識能力の増強。
【０１２２】
本発明者らは、認知欠損の早期発症を伴うＨＤのモデルであるｚＱ１７５トランスジェニックマウスにおいて「ノーズポーキング」などの手続き学習課題の獲得に対するＲＢ５の効果も評価した。ノーズポーク訓練を９穴オペラント箱内で実施した。この課題において、マウスは、液体報酬を得るために１回のノーズポークにより中央の穴の中の光刺激に反応する必要があった。１０日の訓練後、ｚＱ１７５マウスは、この課題の学習において明確な機能障害を示した。しかし、ＲＢ５を投与すると、全ての動物が明確な性差を伴って経時的にその能力を有意に変化させた（図１１ａ〜ｂ）。特に、野生型（ＷＴ）及びｚＱ１７５雌マウスの両方が、ＲＢ５処置の９日にわたって反応の有意な増強を示した。
【０１２３】
全体として、この証拠は、神経変性障害によって影響された患者のための及び正常な個体において認知を改善するための有効な神経保護及び認知増強治療としてのＲＢ５及び類似体又はホモログの使用を支持する。
【０１２４】
結論
本発明者らは、ＥＲＫ１  ＭＡＰキナーゼ（ヒト及びマウスの両方）のＮ末端に由来する短いペプチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで神経細胞アポトーシスを防止することを示した。本発明のペプチドは、ＥＲＫの核移行を特異的に刺激する能力を有し、したがって、脳内でＥＲＫ媒介性遺伝子転写及びクロマチンリモデリングを刺激する能力を有する。ペプチドの脳送達は、細胞透過性ペプチド配列による特異的タギングによって有利に達成される。次いで、ペプチドは、血液脳関門及び神経細胞の形質膜を通過することができる。そのようなペプチドは、いくつかの神経変性疾患又は障害の治療に有用であり得る神経保護剤として作用する。さらに、本発明のペプチドは、神経細胞生存及び認知の両方に対してプラスの効果を示し、現在有効な治療がないいくつかの主な致命的な脳障害の治療法となり、認知欠損を改善し且つ神経変性を阻止する。さらに、本発明のペプチドは、神経変性なく認知も改善するので、健康な個体における認知増強に適している。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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