(57)【要約】本出願は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む構築物を提供する。これらの構築物を作製及び使用する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物であって、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含み、前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体を含む、前記単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下の：
（１）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（５）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（６）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（７）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（８）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（９）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１０）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１１）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１２）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１３）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１４）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１５）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１６）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１７）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１８）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１９）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２０）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２１）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２２）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２３）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２４）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２５）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２６）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２７）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２８）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２９）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３０）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３１）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３２）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３３）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３４）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３５）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３６）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３７）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３８）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３９）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４０）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４１）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４２）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４３）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４４）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４５）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４６）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４７）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４８）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４９）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（５０）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号３００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
のうちのいずれか１つを含む、請求項１に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項３】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下の：
ａ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ、好ましくは、Ｙ及びＶ、より好ましくは、Ｆ、からなる群より選択される、
ａ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬ、好ましくは、Ｑ及びＧ、より好ましくは、Ｅ、からなる群より選択される、
ａ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｒ、及びＣからなる群より選択される、
ａ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、Ｇ、及びＳからなる群より選択される、ならびに
ａ−５）１０８位のアミノ酸残基がＱである、または
ｂ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ、好ましくは、Ｙ及びＶ、より好ましくは、Ｆ、からなる群より選択される、
ｂ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ、Ｑ、及びＧからなる群より選択される、
ｂ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｒである、
ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、及びＳからなる群より選択される、ならびに
ｂ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ及びＬからなる群より選択される、
のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、アミノ酸の位置が、Ｋａｂａｔナンバリングに従う、請求項１〜２のいずれか１項の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項４】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下の：
ａ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ、好ましくは、Ｙ及びＶ、より好ましくは、Ｆ、からなる群より選択される、
ａ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｇ、Ｅ及びＱからなる群より選択される、
ａ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ及びＲからなる群より選択される、
ａ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｇ、及びＲからなる群より選択され、ならびに
ａ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑである、または
ｂ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶからなる群より選択される、
ｂ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ、Ｇ、及びＱからなる群より選択される、
ｂ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｒである、
ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ及びＧである、
ｂ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑである、
のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔナンバリングに従い、１０８位のＱが任意に、Ｌにヒト化することができる、請求項３に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項５】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下の：
ａ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、及びＶからなる群より選択される、
ａ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｇ、Ｅ及びＱからなる群より選択される、
ａ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ及びＲからなる群より選択される、
ａ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ及びＧである、
ａ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑである、
のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔナンバリングに従い、１０８位のＱが任意に、Ｌにヒト化することができる、請求項４に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項６】
前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または、配列番号３５１〜４００のいずれか１つと、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するその多様体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項７】
前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメイン中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体を含む、請求項６に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項８】
前記ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄが、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項９】
前記ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分が、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１０】
前記単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１１】
ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分が、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合している、請求項９０に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１２】
前記ＨＣＡｂが、単量体または二量体である、請求項９０または１０１に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１３】
ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１４】
前記ＨＣＡｂが、配列番号４０１〜４４０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１５】
前記単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物がさらに、第２の抗原を特異的に認識する第２の抗体部分を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１６】
前記第２の抗体部分が、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、（Ｆａｂ‘）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、ｓｄＡｂ、または抗体模倣物である、請求項１５に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１７】
前記抗ＰＤ−Ｌ１構築物が、単一特異性または多重特異性である、請求項１５または１６に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１８】
前記第２の抗体部分が、ｓｄＡｂである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項１９】
前記第２の抗原が、ＰＤ−Ｌ１である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２０】
前記単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する３つ以上のｓｄＡｂを含む、請求項１９に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２１】
前記第２の抗体が、配列番号３５１〜４００のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１９または２０に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２２】
前記第２の抗原が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２３】
前記第２の抗原が、ＣＴＬＡ−４であり、前記第２の抗体が、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２４】
ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分が、前記第２の抗体部分のアミノ（Ｎ）末端及び／またはカルボキシ（Ｃ）末端である、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２５】
前記第２の抗体部分が、完全長抗体である、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２６】
ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のアミノ（Ｎ）末端が、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのカルボキシ（Ｃ）末端に融合している、請求項２５に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２７】
ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分の前記Ｃ末端が、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのＮ末端に融合している、請求項２５に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２８】
前記完全長抗体が、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３からなる群より選択されるポリペプチドを特異的に認識する、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項２９】
前記ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識される前記ＰＤ−Ｌ１が、配列番号４４１〜４４２のアミノ酸配列を含む、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項３０】
ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分及び前記第２の抗体部分が任意に、ペプチドリンカーで連結されている、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項３１】
前記ペプチドリンカーが、配列番号４４３〜４４５のアミノ酸配列を含む、請求項２８０に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物と競合的にＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第２の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項３３】
前記第２の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が、配列番号５１〜１００のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体を含む、請求項３２に記載の第２の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３５】
ＰＤ−Ｌ１関連疾患を有する個体を治療する方法であって、有効量の請求項３４に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
【請求項３６】
前記ＰＤ−Ｌ１関連疾患が、がんである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記がんが、固形腫瘍である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記がんが、結腸がんである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
さらに、追加のがん療法を前記個体に投与することを含む、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記追加のがん療法が、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＤ−Ｌ１関連疾患が、病原性感染症である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記医薬組成物が、全身的または局所的に投与される、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記医薬組成物が、静脈内投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記医薬組成物が、腫瘍内投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記個体が、ヒトである、請求項３５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する以下の提出内容は、全体が参照として本明細書に取り込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：６８８０９６．９７配列表、記録日：２０１７年１１月１日、サイズ：２７１ｋｂ）。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む構築物、ならびにその作製及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
主に、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞に発現される免疫抑制受容体であるプログラム細胞死受容体１は、プログラム死受容体１（ＰＤ−１）とも呼ばれ、ＣＤ２８及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４（ＣＴＬＡ−４）に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ−１及び類似のファミリーメンバーは、リガンドに結合する細胞外Ｉｇ可変型（Ｖ型）ドメイン及びシグナル伝達分子に結合する細胞質尾部を含むＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＤ−１の細胞質尾部は、２つのチロシンベースのシグナル伝達モチーフ、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベースの抑制モチーフ）及びＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ）を含む。
【０００４】
ＰＤ−１は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）とも呼ばれるプログラム細胞死リガンド１、及び／またはプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）とも呼ばれるプログラム細胞死リガンド２に結合する時、Ｔ細胞応答を軽減する。これらのリガンドのいずれかがＰＤ−１に結合すると、抗原受容体シグナル伝達が負に制御される。ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断すると、腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫が強化され、免疫系による腫瘍細胞のクリアランスが促進される。
【０００５】
結果として、ＰＤ−１、ならびにＰＤ−１との相互作用によりシグナル伝達する他の分子、例えば、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）及びプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）の治療標的化は、極めて興味深い分野である。ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の抑制は、がん（例えば、腫瘍免疫）、ならびに、急性及び慢性（例えば、持続性）の両方の感染症を含む感染症の治療のためにＴ細胞免疫を増強する手段として提案されている。しかし、この経路の標的に向けられた最適な治療薬はいまだ、商品化されていないため、満たされていない重要な医学的ニーズが存在する。抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法は、メラノーマなどの多くのがんに有望である。
【０００６】
単鎖抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体抗体可変ドメインを有することで、従来の４鎖抗体とは異なる。例えば、ラクダ科動物及びサメは、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）と呼ばれる単一ドメイン抗体を産生し、これは、自然に軽鎖を欠いている。ラクダ科動物ＨＣＡｂの各アームの抗原結合フラグメントは、単一の重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）を有し、これは、軽鎖の助けなしに、抗原に対して高い親和性を示し得る。ラクダ科動物ＶＨＨは、およそ１５ｋＤの分子量を有する最小の機能的抗原結合フラグメントとして既知である。
【０００７】
本明細書において言及される全ての公開物、特許、特許出願、及び公開された特許出願の開示は、本明細書をもって参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む構築物、ならびにその作製及び使用方法に関する。
【０００９】
本出願の一態様は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物を提供し、ｓｄＡｂ部分は、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体を含む。
【００１０】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
【００１１】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、以下のうちのいずれか１つを含む：
（１）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（５）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（６）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（７）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（８）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（９）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１０）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１１）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１２）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１３）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１４）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１５）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１６）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１７）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１８）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（１９）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２０）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２１）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２２）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２３）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２４）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２５）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２６）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２７）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２８）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（２９）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３０）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３１）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３２）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３３）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３４）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３５）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３６）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３７）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３８）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（３９）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４０）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４１）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４２）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４３）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４４）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４５）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４６）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４７）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４８）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（４９）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体、
（５０）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号２００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号３００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体。
【００１２】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、以下のアミノ酸残基：ａ−１）Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ、好ましくは、Ｆ、Ｖ、またはＹ、からなる群より選択される３７位のアミノ酸残基；ａ−２）Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬ、好ましくは、Ｇ、Ｅ、またはＱ、からなる群より選択される４４位のアミノ酸残基；ａ−３）Ｌ、Ｒ、及びＣ、好ましくは、例えば、ＬまたはＲ、からなる群より選択される４５位のアミノ酸残基；ａ−４）Ｇ、Ｗ、Ｒ、及びＳ、好ましくは、ＷまたはＲ、より好ましくは、Ｗ、からなる群より選択される１０３位のアミノ酸残基；ならびに、ａ−５）Ｑである１０８位のアミノ酸残基、のうちの１つ以上を含むアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含み、位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。
【００１３】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、以下のアミノ酸残基：ｂ−１）Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ、好ましくは、Ｆ、ＶまたはＹ、からなる群より選択される３７位のアミノ酸残基；ｂ−２）Ｇ、Ｅ、及びＱからなる群より選択される４４位のアミノ酸残基；ｂ−３）ＲまたはＬである４５位のアミノ酸残基；ｂ−４）Ｇ、Ｗ、Ｒ、及びＳ、好ましくは、Ｗ、からなる群より選択される１０３位のアミノ酸残基；ならびにｂ−５）Ｑ及びＬ、好ましくは、Ｑ、からなる群より選択される１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ以上を含むアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含み、位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。
【００１４】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号２８８〜３２８のいずれか１つと、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のいずれか）の配列同一性を有するその多様体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメイン中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【００１５】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合の親和性（ＫＤ、解離定数）は、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。
【００１６】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である。
【００１７】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合している。いくつかの実施形態では、ＨＣＡｂは、単量体または二量体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＣＡｂは、配列番号４０１〜４４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００１８】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物はさらに、第２の抗原を特異的に認識する第２の抗体部分を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、ｓｄＡｂ、または抗体模倣物である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、多重特異性である。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＰＤ−Ｌ１である。いくつかの実施形態では、単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する３つ以上のｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、第２の抗体部分のアミノ（Ｎ）末端及び／またはカルボキシル（Ｃ）末端である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び第２の抗体部分は任意に、ペプチドリンカー（例えば、配列番号４４３、４４４、または４４５）で連結されている。
【００１９】
上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つによるいくつかの実施形態では、単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物はさらに、第２の抗原を特異的に認識する第２の抗体部分を含み、第２の抗体部分は、完全長抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のアミノ（Ｎ）末端は、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのカルボキシ（Ｃ）末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、ＴＩＭ−３を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、ＬＡＧ−３を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び第２の抗体部分は任意に、ペプチドリンカー（配列番号４４３〜４４５）で連結されている。
【００２０】
さらに、上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つと競合的にＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する第２の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が提供される。いくつかの実施形態では、第２の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体を含む。
【００２１】
さらに上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のうちのいずれか１つ、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００２２】
本出願の別の態様は、ＰＤ−Ｌ１関連疾患を有する個体を治療する方法を提供し、方法は、個体に上記の医薬組成物のいずれか１つを有効量投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１関連疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、結腸がんなどの固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、方法はさらに、追加のがん療法、例えば、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせを個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１関連疾患は、病原性感染症である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内（ｉ.ｖ.）など、全身投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腫瘍内など、局所投与される。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
【００２３】
さらに、上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれか１つをコードする単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態では、単離された核酸は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列をコードする。
【００２４】
さらに、上記の単離された核酸のいずれか１つを含むベクターが提供される。
【００２５】
さらに、上記の単離された核酸またはベクターのうちのいずれか１つを含む単離された宿主細胞が提供される。
【００２６】
さらに、上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物、単離された核酸、ベクター、または単離された宿主細胞のうちのいずれか１つを含むキットが提供される。
【００２７】
本出願の別の態様は、上記の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物のうちのいずれか１つを産生する方法を提供し、方法は、コードされた抗ＰＤ−Ｌ１構築物を発現するのに有効な条件下で、上記の単離された核酸またはベクターのうちのいずれか１つを含む宿主細胞を培養すること、または、上記の単離された宿主細胞のうちのいずれか１つを培養すること、及び、該宿主細胞から発現された抗ＰＤ−Ｌ１構築物を得ること、を含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、上記の単離された核酸またはベクターのうちのいずれか１つを含む宿主細胞を生成することを含む。
【００２８】
上述の概要、及び本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読む時、よりよく理解されるであろう。本発明を説明するために、現在好ましい実施形態が図面に示されている。しかし、本発明は、示された正確な配置及び手段に限定されないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】組み換えＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤタンパク質による４回目及び６回目の免疫化後の免疫前血清及び免疫血清の免疫応答評価を示す。
【図２】組み換えＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤタンパク質による６回目の免疫化（最終瀉血）後の重鎖抗体（ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）の免疫応答評価を示し；免疫前血清から分画した重鎖抗体を陰性対照として使用した。
【図３】選択されたｓｄＡｂ（ＡＳ０６６１７（図３Ａ）；ＡＳ０６６１８（図３Ｂ）；ＡＳ０６６２８（図３Ｃ）；ＡＳ０６６８２（図３Ｄ）；ＡＳ０６６８６（図３Ｅ）；ＡＳ０６７０３（図３Ｆ）；ＡＳ０６７３０（図３Ｇ）；ＡＳ０６７５０（図３Ｈ）；ＡＳ０６７７５（図３Ｉ）；ＡＳ０６７７８（図３Ｊ）；ＡＳ０６７９１（図３Ｋ）；ＡＳ１１９４７（図３Ｌ）；ＡＳ１１９４８（図３Ｍ）；及びＡＳ１２００３（図３Ｎ））の親和性決定を示し：ＰＤ−Ｌ１をチップ上に固定し、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂを０．１１、０．３３、１、３、及び９ｎＭの濃度の検体として流した。
【図４】選択されたｓｄＡｂ（ＡＳ０６６１７（図４Ａ）；ＡＳ０６６１８（図４Ｂ）；ＡＳ０６６２８（図４Ｃ）；ＡＳ０６６８２（図４Ｄ）；ＡＳ０６６８６（図４Ｅ）；ＡＳ０６７０３（図４Ｆ）；ＡＳ０６７３０（図４Ｇ）；ＡＳ０６７５０（図４Ｈ）；ＡＳ０６７７５（図４Ｉ）；ＡＳ０６７７８（図４Ｊ）；ＡＳ０６７９１（図４Ｋ）；ＡＳ１１９４７（図４Ｌ）；ＡＳ１１９４８（図４Ｍ）；及びＡＳ１２００３（図４Ｎ））の親和性決定を示し：ＰＤ−Ｌ１をチップ上に固定し、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂを０．１１、０．３３、１、３、及び９ｎＭの濃度の検体として流した。
【図５】ＰＤ−Ｌ１を安定的に発現する細胞株を使用した、選択された抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂベースのＦＡＣＳの相対的結合アッセイを示し：陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照としてＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）を使用した。
【図６】安定した細胞株及びビオチン標識ｈＰＤ−１／Ｆｃタンパク質を発現するＰＤ−Ｌ１を使用することによる、選択された抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂのＦＡＣＳベースのリガンド競合アッセイを示し：陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照としてＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）を使用した。
【図７】ＰＤ−Ｌ１標識遮断アッセイにより精製されたｓｄＡｂ（ＡＳ０６６１７（図７Ａ）；ＡＳ０６６１８（図７Ｂ）；ＡＳ０６６２８（図７Ｃ）；ＡＳ０６６８２（図７Ｄ）；ＡＳ０６６８６（図７Ｅ）；ＡＳ０６７０３（図７Ｆ）；ＡＳ０６７３０（図７Ｇ）；ＡＳ０６７５０（図７Ｈ）；ＡＳ０６７７５（図７Ｉ）；ＡＳ０６７７８（図７Ｊ）；ＡＳ０６７９１（図７Ｋ）；ＡＳ１１９４７（図７Ｌ）；ＡＳ１１９４８（図７Ｍ）；ＡＳ１２００３（図７Ｎ）；及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（図７Ｏ））の機能的活性評価を示し：陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照としてＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）を使用した。
【図８】ＰＤ−Ｌ１標識遮断アッセイで精製された上のＨＣＡｂ（ＡＳ０６６１７（図８Ａ）；ＡＳ０６６１８（図８Ｂ）；ＡＳ０６６２８（図８Ｃ）；ＡＳ０６６８２（図８Ｄ）；ＡＳ０６６８６（図８Ｅ）；ＡＳ０６７０３（図８Ｆ）；ＡＳ０６７３０（図８Ｇ）；ＡＳ０６７５０（図８Ｈ）；ＡＳ０６７７５（図８Ｉ）；ＡＳ０６７７８（図８Ｊ）；ＡＳ０６７９１（図８Ｋ）；ＡＳ１１９４７（図８Ｌ）；ＡＳ１１９４８（図８Ｍ）；ＡＳ１２００３（図８Ｎ）；及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（図８Ｏ））の機能的活性評価を示し：陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照としてＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）を用いた。
【図９】ヒト化後の３つのＷＴ抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ及び上の１〜９クローンのｓｄＡｂ配列アラインメントを示し、ヒトアクセプターに対するフレームワーク領域のアミノ酸の差異（ＷＴ  ｓｄＡｂと最高程度の相同性を共有する最高のヒト生殖系列配列）をダークグレーで網掛けする。図９Ａは、ＡＳ０６７３０（配列番号３６０）のｓｄＡｂ配列アラインメント、ヒト化後の上の９クローン（配列番号３７６〜３８４）、及びコンセンサス配列を示す。図９Ｂは、ＡＳ０６７５０（配列番号３６１）、ヒト化後の上の５クローン（配列番号３８５〜３８９）、及びコンセンサス配列のｓｄＡｂ配列アラインメントを示す。図９Ｃは、ＡＳ１１９４８（配列番号３７２）、ヒト化後の上の９クローン（配列番号３９０〜３９８）、及びコンセンサス配列のｓｄＡｂ配列アラインメントを示す。図９Ｄは、ＡＳ０６６１７（配列番号３５１）、ヒト化後の上の１クローン（配列番号３９９）、及びコンセンサス配列のｓｄＡｂ配列アラインメントを示す。図９Ｅは、ＡＳ０６７７５（配列番号３６５）、ヒト化後の上の１クローン（配列番号４００）、及びコンセンサス配列のｓｄＡｂ配列アラインメントを示す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｔは、親ＨＣＡｂとの選択されたヒト化ＨＣＡｂの親和性決定を示す。図１０Ａ〜１０Ｃは、（ＡＳ０６７３０（図１０Ａ）；ＡＳ０６７３０Ｓ（図１０Ｂ）；ＡＳ０６７３０ＳＶＨ３ａ（図１０Ｃ））：チップ上に固定されているＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓ、及び０．１１、０．３３、１、３、及び９ｎＭの濃度の分析物としての抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂを使用して、親和性決定を行った。図１０Ｄ〜１０Ｆは、（ＡＳ０６７３０ＳＶＨ１２（図１０Ｄ）；ＡＳ０６７３０ＳＶＨ１２Ｍ８（図１０Ｅ）；ＡＳ０６７３０ＳＶＨ１２Ｍ９（図１０Ｆ））：抗ヒトＩｇＧによりチップ上に捕捉されたＨＣＡｂ、及び０．３３、１、３、９、及び２７ｎＭの濃度の分析物としてのＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓを使用して、親和性決定を行った。図１０Ｇ〜１０Ｊは、（ＡＳ０６７５０（図１０Ｇ）；ＡＳ０６７５０ＶＨ２（図１０Ｈ）；ＡＳ０６７５０ＶＨ１１（図１０Ｉ）；ＡＳ０６７５０ＶＨ４（図１０Ｊ））：チップ上に固定されているＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓ、及び０．１１、０．３３、１、３、及び９ｎＭの濃度の分析物としての抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂを使用して、親和性決定を行った。図１０Ｋ〜１０Ｌは、（ＡＳ１１９４８（図１０Ｋ）；ＡＳ１１９４８Ｓ（図１０Ｌ））：チップ上に固定されているＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓ、及び０．１１、０．３３、１、３、及び９ｎＭの濃度の分析物としての抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂを使用して、親和性決定を行った。図１０Ｍ〜１０Ｏは、（ＡＳ１１９４８ＳＶ１２（図１０Ｍ）；ＡＳ１１９４８ＳＶ１２Ｍ８（図１０Ｎ）；ＡＳ１１９４８Ｖ１２Ｍ９（図１０Ｏ））：抗ヒトＩｇＧによりチップ上に捕捉されたＨＣＡｂ、及び０．３３、１、３、９、及び２７ｎＭの濃度の分析物としてのＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓを使用して、親和性決定を行った。図１０Ｐ〜１０Ｑは、（ＡＳ０６６１７（図１０Ｐ）；ＡＳ０６６１７ＶＨ１１（図１０Ｑ））：チップ上に固定されているＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓ、及び０．１１、０．３３、１、３、及び９ｎＭの濃度の分析物としての抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂを使用して、親和性決定を行った。図１０Ｒ〜１０Ｔは、（ＡＳ０６７７５（図１０Ｒ）；ＡＳ０６７７５ＶＨ１１（図１０Ｓ）；ＡＳ０６７７５ＶＨ４（図１０Ｔ））：チップ上に固定されているＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓ、及び０．１１、０．３３、１、３、及び９ｎＭの濃度の分析物としての抗ＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓを使用して、親和性決定を行った。
【図１１】（ＡＳ０６７３０（図１１Ａ）；ＡＳ０６７３０Ｓ（図１１Ｂ）；ＡＳ０６７３０ＳＶＨ３ａ（図１１Ｃ）；ＡＳ０６７３０ＳＶＨ１２（図１１Ｄ）；ＡＳ０６７５０（図１１Ｅ）；ＡＳ０６７５０ＶＨ２（図１１Ｆ）；ＡＳ０６７５０ＶＨ１１（図１１Ｇ）；ＡＳ０６７５０ＶＨ４（図１１Ｈ）；ＡＳ１１９４８（図１１Ｉ）；ＡＳ１１９４８Ｓ（図１１Ｊ）；ＡＳ１１９４８ＳＶＨ１２（図１１Ｋ）；ＡＳ１１９４８ＳＶＨ１２Ｍ８（図１１Ｌ）；ＡＳ０６６１７（図１１Ｍ）；ＡＳ０６６１７ＶＨ１１（図１１Ｎ）；ＡＳ０６７７５（図１１Ｏ）；ＡＳ０６７７５ＶＨ１１（図１１Ｐ）；ＡＳ０６７７５ＶＨ４（図１１Ｑ））は、ＰＤ−Ｌ１ベース遮断アッセイによる、親ＨＣＡｂと共に精製された上のヒト化ＨＣＡｂの機能的活性評価を示す。
【図１２】６つのヒト化ＨＣＡｂ（ＡＳ０６７３０ＱＶＨ１、ＡＳ０６７５０ＶＨ１１、ＡＳ１１９４８ＳＶＨ１２、ＡＳ０６６１７ＶＨ１１、ＡＳ０６６１７ＶＨ１１、ＡＳ１１９４８ＱＶＨ１、及びＡＳ０６７７５ＶＨ１１）のｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、がんなどのＰＤ−Ｌ１関連疾患を治療する新しい方策として、限定されないが、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）などの抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ、または、完全長抗体またはその抗原結合フラグメントに融合している抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂを含むより大きなタンパク質またはポリペプチドを含む、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（以下「抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ」とも呼ばれる）及びその抗体多様体を提供する。
【００３１】
一本鎖抗体（ｓｄＡｂ）は、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一の単量体抗体可変ドメインを有することにより、従来の４鎖抗体とは異なり、これは、軽鎖の助けなしに、抗原に対して高い親和性を示し得る。ラクダ科動物ＶＨＨは、およそ１５ｋＤの分子量を有する最小の機能的抗原結合フラグメントとして既知である。
【００３２】
したがって、本出願の一態様は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物を提供する。単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ（例えば、天然またはヒト化）、一緒に融合している本明細書に記載の複数の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂを含むポリペプチド、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合している本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ、または完全長抗体に融合している抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂを含むＨＣＡｂ、例えば、抗ＰＤ−１抗体、もしくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体、またはその抗原結合フラグメントであり得る。抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、単一特異性または多重特異性、一価または多価であり得る。
【００３３】
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含む構築物を含む組成物（例えば、医薬組成物）、キット、及び製品、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含む構築物の作製方法、ならびに、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含む構築物を使用したＰＤ−Ｌ１関連疾患（例えば、がん）の治療方法も提供する。
【００３４】
Ｉ．定義
「プログラム細胞死１リガンド１」、「ＰＤ−Ｌ１」、「Ｂ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）」、「ＰＤ−Ｌ１抗原」、「ＰＤＣＤ１リガンド１」、及び「ＣＤ２７４」という用語（例えば、Ｃｈｅｍｎｉｔｚ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：９４５−９５４を参照のこと）は、同じ意味で使用され、多様体、アイソフォーム、ヒトＰＤ−Ｌ１の種相同体、及びＰＤ−Ｌ１との少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログを含む（例えば、Ｂｕｔｔｅ（２００８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３５６７−３５７２を参照のこと）。したがって、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、特定の場合、ヒト以外の種由来のＰＤ−Ｌ１、またはヒトＰＤ−Ｌ１に構造的に関連する他のタンパク質（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１ホモログ）と交差反応し得る。他の場合、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、ヒトＰＤ−Ｌ１に完全に特異的であり、種または他のタイプの交差反応性を示さない可能性がある。
【００３５】
「ヒトＰＤ−Ｌ１」という用語は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７を有するヒトＰＤ−Ｌ１の完全なアミノ酸配列などのヒト配列ＰＤ−Ｌ１を指す。ヒトＰＤ−Ｌ１配列は、例えば、保存された変異または非保存領域の変異を有することにより、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のヒトＰＤ−Ｌ１と異なる可能性があり、ＰＤ−Ｌ１は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のヒトＰＤ−Ｌ１と実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１の生物学的機能は、本開示の抗ＰＤ−Ｌ１構築物によって特異的に結合しているＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインにエピトープを有するか、または、ヒトＰＤ−Ｌ１の生物学的機能は、Ｔ細胞活性の調節である。
【００３６】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することが可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面分類からなり、通常特定の三次元構造特徴及び特定の電荷特徴を有する。立体配座及び非立体配座のエピトープは、変性溶媒の存在下で、前者への結合が失われ、後者への結合は失われないという点で区別される。
【００３７】
本明細書で使用される「プログラム細胞死１（ＰＤ−１）」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、Ｔ細胞及び前Ｂ細胞で発現される細胞表面受容体を指すことが意図される。ヒトＢ７−１（ＣＤ８０）のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００９に開示される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む有益または望ましい結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果には、以下のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない：疾患に起因する１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の蔓延（例えば、転移）の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善、疾患の寛解（部分的または全体的）の提供、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬物の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の向上、及び／または生存期間の延長。がんの病理学的帰結の軽減も「治療」に包含される。本発明の方法は、治療のそれらの態様のうちの任意の１つ以上を企図する。
【００３９】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、特定の障害、状態、または疾患を治療するのに、例えば、その症状のうちの１つ以上を改善、緩和、軽減、及び／または遅延させるのに、十分な薬剤または薬剤の組み合わせの量を指す。がんに関して、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こし、及び／または腫瘍の成長速度を減少させる（例えば、腫瘍成長を抑圧する）か、または他の望ましくない細胞増殖を阻止もしくは遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、発症を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、再発を予防または遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。薬剤または組成物の有効量は：（ｉ）がん細胞の数を低減し；（ｉｉ）腫瘍のサイズを縮小させ；（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞の浸潤を、ある程度、抑制、遅延、緩徐化し、好ましくは、停止させ；（ｉｖ）腫瘍の転移を抑制し（すなわち、ある程度遅延させ、好ましくは、停止させ）；（ｖ）腫瘍の成長を抑制し；（ｖｉ）腫瘍の発生及び／もしくは再発を予防または遅延させ；ならびに／または、（ｖｉｉ）がんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減し得る。
【００４０】
「抗体」または「抗体部分」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全長抗体、及びその抗原結合フラグメントを含む種々の抗体構造を包含する。
【００４１】
基本的な４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと共に５つの基本的なヘテロ四量体ユニットからなり、１０つの抗原結合部位を含み、一方、ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と組み合わせて多価集合体を重合し得る２〜５つの基本的な４鎖ユニットを有する。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合し、一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに結合する。各Ｈ鎖及びＬ鎖はまた、一定の間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、α及びγ鎖のそれぞれに３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびに、μ及びεアイソタイプに４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、続いて、他端に定常ドメインを有する。ＶＬは、ＶＨとアラインし、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインする。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメイン間に界面を形成すると考えられている。ＶＨ及びＶＬを共にペアリングすることにより、単一の抗原結合部位が形成される。異なるクラスの抗体の構造及び特性について、例えば、Ｂａｓｉｃａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ  ７１  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照のこと。脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプの１つに割り当てることができる。重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ：がある。γ及びαクラスはさらに、ＣＨ配列及び機能の比較的小さな差異に基づいてサブクラスにさらに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。
【００４２】
「重鎖のみ抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが、通常４鎖抗体に見られる軽鎖を欠く機能性抗体を指す。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、またはアルパカ）はＨＣＡｂを産生することが知られている。
【００４３】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する単一の抗原結合ポリペプチドを指す。ｓｄＡｂ単体は、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドとペアリングしなくても抗原に結合することができる。いくつかの場合、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物のＨＣＡｂから操作され、それらの重鎖可変ドメインは、本明細書では「ＶＨＨ」（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン）と称される。いくつかのＶＨＨは、ナノボディとしても知られ得る。Ｃａｍｅｌｉｄ  ｓｄＡｂは、既知の最小の抗原結合抗体フラグメントのうちの１つである（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３（１９９５）；Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ−Ｇｈａｓｓａｂｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３−２６（２０１３）を参照のこと）。基本的なＶＨＨは、Ｎ末端からＣ末端まで以下の構造を有する：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、相補性決定領域１〜３を指す。
【００４４】
「単離された」抗体（または構築物）は、産生環境の構成成分（例えば、天然または組み換え）から同定、分離、及び／または回収されているものである。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その産生環境に由来する他の全ての構成成分と会合していない。組み換えトランスフェクトされた細胞に由来する構成成分などの、その産生環境の混入構成成分は通常、抗体の研究、診断または治療的使用を妨げる物質であり、これには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドは：（１）例えば、ローリー法で測定された９５重量％超に、いくつかの実施形態では、９９重量％超の抗体に；（２）スピニングカップシーケネーターを使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に；または（３）クーマシーブルー、好ましくは、銀染色を使用する非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて均一となるように精製されるであろう。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないので、単離抗体には、組み換え細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕの抗体が含まれる。しかし、通常、単離されたポリペプチド、抗体、または構築物は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。
【００４５】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称されてもよい。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の高い部分であり（同じクラスの他の抗体と比較して）、抗原結合部位を含む。ラクダ科動物種の重鎖のみ抗体は、「ＶＨＨ」と称される単一の重鎖可変領域を有する。したがって、ＶＨＨは、特別なタイプのＶＨである。
【００４６】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定のセグメントが配列において抗体間で広範囲にわたって異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかし、可変性は、可変ドメインのスパン全体にわたって均等に分布しているわけではない。むしろ、それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方の、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、これらは、主にβシートの立体配置をとり、３つのＣＤＲで連結されており、ループを形成し、βシート構造を連結し、いくつかの場合では、その一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存的な細胞毒性に抗体を関与させるなど、種々のエフェクター機能を示す。
【００４７】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能な自然の変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して高度に特異的である。通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンが混入されていないという点で、有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５），Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及び、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４））を参照のこと）；ヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全てを有する動物におけるヒトまたはヒト様抗体を産生する技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；ならびに、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと）を含む様々な技術で作製され得る。
【００４８】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、または「全抗体」という用語は、抗体フラグメントとは対照的に、実質的にインタクトな形態の抗体を指すために同じ意味で使用される。具体的には、完全長４鎖抗体には、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有する抗体が含まれる。完全長重鎖のみ抗体には、重鎖（例えば、ＶＨＨ）及びＦｃ領域が含まれる。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列多様体であってよい。いくつかの場合では、インタクトな抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。
【００４９】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域及び／または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照のこと）；一本鎖抗体分子；単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、ならびに、抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、容易に結晶化する能力を反映する名称である残留「Ｆｃ」フラグメントを生成させた。Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）と共に完全なＬ鎖からなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、単一の大きなＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成し、これは、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィドで連結されたＦａｂフラグメントにほぼ対応し、依然として抗原を架橋することが可能である。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にごく少ない追加の残基を有することで、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントのペアとして生成された。抗体フラグメントの他の化学的結合もまた既知である。
【００５０】
Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドにより一緒に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、特定のタイプの細胞に認められるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識されるＦｃ領域の配列によって測定される。
【００５１】
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含む可変ドメインである免疫グロブリンの他方の部分と比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（一括してＣＨ）ならびに軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含む。
【００５２】
任意の哺乳動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプのうちの１つに割り当てられ得る。
【００５３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。このフラグメントは、非共有結合で緊密に会合した１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。しかし、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。
【００５４】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に連結されているＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはさらに、ＶＨドメイン及びＶＬドメイン間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの概説について、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
【００５５】
本明細書に記載する抗体の「機能的フラグメント」は、一般に、インタクトな抗体の抗原結合領域もしくは可変領域、または修飾されたＦｃＲ結合能力を保持もしくは有する抗体のＦｃ領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例として、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００５６】
「ダイアボディ」という用語は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間ペアリングを達成し、それにより、二価フラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位、を有するフラグメント、が得られるように、ＶＨ及びＶＬドメイン間に短いリンカー（約５〜１０残基）を用いてｓＦｖフラグメント（前段落を参照のこと）を構築することによって調製された小さな抗体フラグメントを指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖフラグメントのヘテロダイマーである。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より詳細に記載される。
【００５７】
本明細書のモノクローナル抗体には特に、所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含むが、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列、及びそのような抗体のフラグメントと同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
【００５８】
非ヒト（例えば、ラマまたはラクダ科動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲ（以下に定義）由来の残基を、所望の特異性、親和性、及び／または能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（「ＦＲ」）残基を、対応する非ヒト残基に置き換える。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに改善するために行うことができる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン配列に対応する、少なくとも１つ、通常は、２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。但し、ＦＲ領域は、結合親和性、異性化、免疫原性などの抗体性能を改善する１つ以上の個々のＦＲ残基置換を含むであろう。ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は通常、Ｈ鎖では６以下、Ｌ鎖では３以下である。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常は、ヒト免疫グロブリンのものを含むであろう。詳細について、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。例えば、Ｖａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号も参照のこと。
【００５９】
「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び／または本明細書に開示するヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製した抗体である。ヒト抗体のこの定義からは、特に、非ヒト抗原結合残基を有するヒト化抗体が除外される。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む、当技術分野で既知の種々の技術を使用して産生することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。さらに、ヒトモノクローナル抗体の調製に、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載の方法が利用可能である。ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）も参照のこと。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫ゼノマウス、に抗原を投与することにより調製することができる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）テクノロジーに関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体に関して、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）も参照のこと。
【００６０】
本明細書で使用される場合の「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変であり、及び／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、単一ドメイン抗体は、３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）：ＨＶＲ１（またはＣＤＲ１）、ＨＶＲ２（またはＣＤＲ２）、及びＨＶＲ３（またはＣＤＲ３）を含む。ＨＶＲ３（またはＣＤＲ３）は、３つのＨＶＲの中で最も多様性を示し、抗体に最適の特異性を与えることにおいて、ユニークな役割を果たすと考えられている。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照のこと。
【００６１】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔシステムによって定義される超可変領域を指すために使用される。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照のこと。
【００６２】
多くのＨＶＲ描写が、使用され、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいており、最も一般に使用される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは代わりに、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ  ＨＶＲ及びＣｈｏｔｈｉａ構造的ループ間の折衷物を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらの各ＨＶＲ由来の残基を、以下の表１に示す。
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【００６３】
ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含んでもよい：ＶＬにおいて、２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびに、ＶＨにおいて２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、または９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについて、上掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．に従って番号付けされる。
【００６４】
単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）のアミノ酸残基は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０００  Ｊｕｎ．２３；２４０（１−２）：１８５−１９５の論文中のラクダ科動物由来のＶＨＨドメインに適用されるように、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．によって与えられたＶＨドメインの一般的なナンバリングに従って番号付けされる（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１）。このナンバリングによると、ＶＨＨのＦＲ１は、１〜３０位にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は、３１〜３５位にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は、３６〜４９位にアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は、５０〜６５位にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は、６６〜９４位にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は、９５〜１０２位にアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４は、１０３〜１１３位にアミノ酸残基を含む。この点では、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに対し当該技術分野で周知のように−ＣＤＲのそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数が変動し得、Ｋａｂａｔナンバリングにより示されるアミノ酸残基の総数に相当しないことがある（つまり、Ｋａｂａｔナンバリングによる１つ以上の位置が、実際の配列で占められないことがあるか、または、実際の配列が、Ｋａｂａｔナンバリングにより許容される数よりも多いアミノ酸残基を含んでもよい）という点に留意すべきである。
【００６５】
「Ｋａｂａｔのような可変ドメイン残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置ナンバリング」という表現及びその変形は、上掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．における抗体の編集物の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用すると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインには、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸インサート（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、ならびに、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）が含まれてもよい。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準の」Ｋａｂａｔにより番号付けられた配列との抗体の配列の相同性領域でのアラインメントによって所与の抗体について決定され得る。
【００６６】
本明細書に別途指示のない限り、免疫グロブリン重鎖中の残基のナンバリングは、上掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．のようなＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。
【００６７】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるようなＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６８】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」または「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来である。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）のようなサブグループである。例としては、ＶＬが含まれ、サブグループは、上掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．のようなサブグループカッパＩ、カッパＩＩ、カッパＩＩＩ、またはカッパＩＶであってよい。さらに、ＶＨの場合、サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．のようなサブグループＩ、サブグループＩＩ、またはサブグループＩＩＩであってよい。あるいは、ヒトコンセンサスフレームワークは、ドナーフレームワーク配列を種々のヒトフレームワーク配列のコレクションと整列させることにより、例えば、ドナーフレームワークとの相同性に基づいて選択される時、上記の特定の残基から由来し得る。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を有してもよく、または既存のアミノ酸配列変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。
【００６９】
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の改変を有し、その結果、それらの改変（複数可）を有さない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が向上したものである。いくつかの実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモルの親和性またはピコモルの親和性さえ有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野で既知の手順によって産生される。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟について記載する。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム変異導入は、例えば：Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、または「に特異的」という用語は、生体分子を含む不均一な分子集団の存在下において標的の存在を決定づける、標的及び抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）間の結合などの測定可能且つ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ等）は、他の標的に結合するよりも高い親和性で、結合力で、より容易に、及び／またはより長い持続時間、この標的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、無関係な標的への抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定された標的への抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）は、≦１０−５Ｍ、≦１０−６Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦１０−９Ｍ、≦１０−１０Ｍ、≦１０−１１Ｍ、または≦１０−１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、異なる種由来のタンパク質から保存されるタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、しかし必須ではない。
【００７１】
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の選択的認識を指す。例えば、天然の抗体は単一特異性である。本明細書で使用される「多重特異性」という用語は、抗原結合タンパク質がポリエピトープ特異性を有することを表す（すなわち、１つの生体分子上の２つ、３つ、もしくはそれ以上の異なるエピトープに特異的結合することができるか、または、２つ、３つ、もしくはそれ以上の異なる生体分子上のエピトープに特異的に結合することができる）。本明細書で使用される「二重特異性」は、抗原結合タンパク質が２つの異なる抗原結合特異性を有することを表す。別途指示のない限り、抗原が記載の二重特異性抗体で結合した順序は任意である。つまり、例えば、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１の両方に特異的に結合する二重特異性抗体を指す「抗−ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１」、「抗−ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１」、「ＰＤ−Ｌ１×ＰＤ−１」、「ＰＤ−１×ＰＤ−Ｌ１」、「ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１」、及び「ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１」という用語は、同じ意味で使用されてもよい。本明細書で使用される「単一特異性」という用語は、１つ以上の結合部位を有する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）を指し、これらのそれぞれは、同じ抗原の同じエピトープに結合する。
【００７２】
本明細書で使用される「価」という用語は、抗原結合タンパク質中の特定数の結合部位の存在を表す。例えば、天然抗体または完全長抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。そのようなものであるから、「三価」、「四価」、「五価」、及び「六価」という用語は、抗原結合タンパク質中に、それぞれ、２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを表す。
【００７３】
「抗体エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列多様体Ｆｃ領域）に帰属する生物活性を指し、抗体のアイソタイプに応じて変動する。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体−依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化。「低減または最小化された」抗体エフェクター機能は、野生型または未修飾抗体から少なくとも５０％（あるいは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）低減されていることを示す。抗体エフェクター機能の決定は、当業者によって容易に決定及び測定可能である。好ましい実施形態では、補体結合、補体依存性細胞傷害性、及び抗体依存性細胞傷害性の抗体エフェクター機能が、影響される。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、グリコシル化を排除した定常領域における変異、例えば、「エフェクターレス変異」を通して排除される。一態様では、エフェクターレス変異は、ＣＨ２領域のＮ２９７ＡまたはＤＡＮＡ変異（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）である。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）６５９１−６６０４（２００１）。あるいは、エフェクター機能の低減または排除をもたらす追加の変異には、Ｋ３２２Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）が含まれる。あるいは、エフェクター機能は、グリコシル化しないまたはエフェクター機能の促進に効果的もしくは効果的でない改変されたグリコシル化パターンをもたらす宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．）での発現などの産生技術を通して低減または排除することができる（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−３４７３（２００３））。
【００７４】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」またはＡＤＣＣは、特定の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）と結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞と特異的に結合して、続いて細胞毒素を用いて標的細胞を死滅させることができるようにする細胞傷害性の形態を指す。抗体は、細胞傷害性細胞で「武装」し、この機序により標的細胞を死滅させるために必要である。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイが実施されてもよい。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価されてもよい。
【００７５】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義して使用され、天然配列のＦｃ領域及び多様性Ｆｃ領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで伸びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによると残基４４７）は、例えば、抗体の産生中もしくは精製中に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することによって、除去されてもよい。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全Ｋ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基を有する抗体及び有しない抗体の混合物を有する抗体集団を含んでもよい。本明細書に記載の抗体での使用に好適な天然配列のＦｃ領域としては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられる。
【００７６】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、これには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体のアレル多様体及び代替的にはスプライス型を含む）が含まれ、ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）が含まれ、これらは、主にそれらの細胞質ドメインが異なる、同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説される。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。
【００７７】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語にはまた、胎児への母体ＩｇＧの移入を担う、新生児型受容体であるＦｃＲｎも含まれる。Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は既知である（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８：（１２）：５９２−８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５（７）：６３７−４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６（２００４）；ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと）。ヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでのＦｃＲｎへの結合及び血清中半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウスもしくはトランスフェクトヒト細胞株において、または多様体Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類においてアッセイすることができる。ＷＯ２００４／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）は、ＦｃＲへの結合を向上または低下させた抗体多様体について記載している。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照のこと。
【００７８】
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）が、同族抗原に結合している（適当なサブクラスの）抗体と結合することにより開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）に記載されるような、ＣＤＣアッセイが実施されてもよい。Ｆｃ領域のアミノ酸配列が改変され、Ｃ１ｑ結合能力が増加または減少した抗体多様体は、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号及びＷＯ９９／５１６４２に記載される。それらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照のこと。
【００７９】
「結合親和性」は一般に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位及びその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有結合性相互作用の合計の強度を指す。別途指示のない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。結合親和性は、Ｋｄ、Ｋｏｆｆ、Ｋｏｎ、またはＫａで示すことができる。本明細書で使用される「Ｋｏｆｆ」という用語は、ｓ−１の単位で表される、動態選択設定から決定される、抗体／抗原複合体からの抗体（または抗原結合ドメイン）の解離のオフ速度定数を指すことが意図される。本明細書で使用される「Ｋｏｎ」という用語は、Ｍ−１ｓ−１の単位で表される、抗体／抗原複合体を形成する抗体（または抗原結合ドメイン）の抗原への会合のオン速度定数を指すことが意図される。本明細書で使用される平衡解離定数「ＫＤ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指し、平衡状態で抗体分子の溶液中に存在する抗体結合ドメインの全部のうちの半分を占めるのに必要な抗原の濃度を表し、Ｍの単位で表されるＫｏｆｆ／Ｋｏｎに等しい。Ｋｄの測定は、全ての結合剤が溶液中にあることを前提とする。例えば、酵母発現系において、抗体が細胞壁に連結している場合に、対応する平衡速度定数は、ＥＣ５０として表され、これは、Ｋｄの良好な近似を与える。親和定数Ｋａは、Ｍ−１の単位で表される解離定数Ｋｄの逆数である。
【００８０】
解離定数（ＫＤまたはＫｄ）は、抗体の抗原に対する親和性を示す指標として使用される。例えば、簡単な分析は、様々なマーカー剤でマークされた抗体を使用するスキャッチャード法、及び、キットに付属のユーザーズマニュアル及び実験操作方法に従って、市販の測定キットまたは類似のキットであるＢｉａｃｏｒｅＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を使用することにより可能である。これらの方法を使用して誘導することができるＫＤ値は、Ｍの単位（Ｍｏｌ）で表される。標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、≦１０−５Ｍ、≦１０−６Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦１０−９Ｍ、≦１０−１０Ｍ、≦１０−１１Ｍ、または≦１０−１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有し得る。
【００８１】
抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当該技術分野で既知の方法により実験的に決定することができる。そのような方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験、ＥＩＡ試験、ＢＩＡｃｏｒｅ試験、及びペプチドスキャンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
半最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、特定の生物学的または生化学的機能の抑制における物質（例えば、抗体）の効果の尺度である。それは、所定の生物学的プロセス（例えば、ＰＤ−Ｌ１及びＢ７−１間の結合、またはプロセスの構成要素、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、または微生物）を半分に抑制するために、特定の薬物または他の物質（抗体などの阻害剤）がどれだけ必要かを示す。値は通常、モル濃度として表される。ＩＣ５０は、アゴニスト薬または他の物質（例えば、抗体）のＥＣ５０に匹敵する。ＥＣ５０は、ｉｎ  ｖｉｖｏで最大の効果の５０％を得るために必要な血漿濃度も表す。本明細書で使用される「ＩＣ５０」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原生物活性（例えば、ＰＤ−Ｌ１生物活性）の５０％を中和するのに必要な抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ）の有効濃度を示すために使用される。ＩＣ５０またはＥＣ５０は、ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の抑制（競合結合アッセイ）、細胞ベースのサイトカイン放出アッセイ、または増幅発光近接均質アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）などのバイオアッセイで測定することができる。
【００８３】
ペプチド、ポリペプチドまたは抗体配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後、保存的置換を配列同一性の一部として考慮しない場合の、特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内の様々な方法で達成することができる。当業者らであれば、比較する配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００８４】
本明細書に記載の構築物、抗体、またはその抗原結合フラグメントをコードする「単離された」核酸分子は、それが産生される環境内で通常関連する少なくとも１つの混入核酸分子から同定及び分離される核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に付随する全ての構成成分と関連していない。本明細書に記載のポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、自然界に見られる形態または設定以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に自然に存在する本明細書に記載のポリペプチド及び抗体をコードする核酸とは区別される。単離された核酸は、通常核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターが含まれる。特定のベクターは、それらが作動可能に結合している核酸の発現を誘導し得る。そのようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【００８６】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。この細胞には、初代対象細胞及びその子孫が含まれる。
【００８７】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、同じ意味で使用され、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を包含する。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではないことがあるが、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異型子孫が、本明細書に含まれる。
【００８８】
「アジュバント設定」は、個体ががんの病歴を有しており、限定されないが、（必ずしもではないが）一般に手術（例えば、切除手術）、放射線療法、及び化学療法を含む療法に応答している臨床設定を指す。しかし、がんの病歴のため、これらの個体は、疾患を発症する危険性があると見なされる。「アジュバント設定」における治療または投与は、その後の治療様式を指す。危険性の程度（例えば、アジュバント設定中の個体が「高リスク」または「低リスク」と見なされる時の）は、いくつかの要因、最も一般的に、最初に治療された時の疾患の程度に依存する。
【００８９】
「ネオアジュバント設定」は、方法が一次／原因療法前に行われる臨床設定を指す。
【００９０】
「医薬組成物」の「医薬製剤」という用語は、有効成分の生物活性を有効にするような形態であり、製剤が投与される対象に対して容認できないほどの毒性を示す追加の構成成分を含まない調製物を指す。そのような製剤は無菌である。「滅菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生存微生物及びそれらの胞子を含まない。
【００９１】
本明細書に記載の本発明の実施形態には、実施形態「からなること」及び／または「から本質的になること」が含まれることが理解される。
【００９２】
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体に関する変形を含む（且つ記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述には、「Ｘ」の記述が含まれる。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「ｎｏｔ」の値またはパラメータへの言及は一般に、値またはパラメータ「以外」を意味し、説明する。例えば、本方法はタイプＸのがんの治療には使用されないことは、本方法がＸ以外のタイプのがんの治療に使用されることを意味する。
【００９４】
本明細書で使用される「約Ｘ〜Ｙ」という用語は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。
【００９５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「または」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象が含まれる。
【００９６】
ＩＩ．抗ＰＤ−Ｌ１構築物
抗ＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体部分
本明細書に記載の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、ＰＤ−Ｌ１（または「抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ」）を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む。いくつかの実施形態では、単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂである。
【００９７】
単一ドメイン抗体
例示的なｓｄＡｂとしては、ラクダ科動物の重鎖のみ抗体由来の重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン）、または、軟骨魚のＶＮＡＲ（新サメ抗原受容体の可変ドメイン）、軽鎖を天然に含まない結合分子、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、ヒト化重鎖のみ抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットにより産生されたヒト単一ドメイン抗体、ならびに、抗体由来のもの以外の操作ドメイン及び単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。ｓｄＡｂは、限定されないが、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含む任意の種に由来するものであってもよい。本明細書で企図される単一ドメイン抗体には、ラクダ科動物及びサメ以外の種由来の天然に存在する単一ドメイン抗体分子も含まれる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠く重鎖抗体（本明細書では「重鎖のみ抗体」または「ＨＣＡｂ」とも呼ばれる）として既知の天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子に由来する。そのような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４／０４６７８及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８に記載される。明確にするために、軽鎖を自然に欠く重鎖分子に由来する可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、本明細書ではＶＨＨとして知られる。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科動物種、例えば、ラクダ、ラマ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、アルパカ、及びグアナコで生じた抗体に由来し得る。ラクダ科動物以外の他の種は、軽鎖を自然に欠く重鎖分子を産生し得、そのようなＶＨＨは、本出願の範囲内である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軟骨魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来する。例えば、ｓｄＡｂは、サメの血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。ＮＡＲの可変領域（「ＩｇＮＡＲ」）に由来する単一ドメイン分子を生成する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成（例えば、ファージディスプレイにより選択される）である。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」により改変されてもよい。ラクダ化は、重鎖抗体のＶＨＨドメインの対応する位置（複数可）で発生するアミノ酸残基のうちの１つ以上による、従来の４鎖抗体からの（天然に存在する）ＶＨドメインのアミノ酸配列内の１つ以上のアミノ酸残基の交換または置換を指す。これは、それ自体既知の方法で実行することができ、これらは、例えば本明細書のさらなる説明に基づいて、当業者には明らかであろう。そのような「ラクダ化」置換は、好ましくは、本明細書で定義されるように、ＶＨ−ＶＬ界面を形成する及び／もしくは存在するアミノ酸位置、ならびに／またはいわゆるラクダ科動物ホールマーク残基に挿入される（例えば、ＷＯ９４／０４６７８、Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３９：２８５−２９０，１９９４；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（６）：５３１−５３７，１９９６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：９５７−９６９，１９９６；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５−３８，１９９９を参照のこと）。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現させるトランスジェニックマウスまたはラットによって産生されるヒトｓｄＡｂである。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照のこと。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、親和性成熟している。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、特定の抗原または標的に対する天然に存在するＶＨＨドメインは、ラクダ科動物ＶＨＨ配列の（ナイーブまたは免疫）ライブラリから得ることができる。そのような方法は、それ自体既知の１つ以上のスクリーニング技術を使用して、該抗原または標的、またはその少なくとも一部、フラグメント、抗原決定基もしくはエピトープを使用して、そのようなライブラリをスクリーニングすることを含んでも含まなくてもよい。そのようなライブラリ及び技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０及びＷＯ０３／０３５６９４に記載される。あるいは、例えば、ＷＯ００／４３５０７に記載されるような、ランダム変異導入及び／またはＣＤＲシャッフリングなどの技術によってＶＨＨライブラリから得られた（ナイーブまたは免疫）ＶＨＨライブラリなどのＶＨＨライブラリに由来する改良された合成または半合成ライブラリが使用されてもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、従来の４鎖抗体から生成される。例えば、ＥＰ０  ３６８  ６８４、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  １９８９  Ｏｃｔ．１２；３４１（６２４２）：５４４−６）、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４−４９０；ＷＯ０６／０３０２２０；及びＷＯ０６／００３３８８を参照のこと。
【０１０４】
ｓｄＡｂのユニークな特性故に、単一抗原結合タンパク質として、または抗原結合ドメインとして（すなわち、より大きなタンパク質またはポリペプチドの一部として）ＶＨＨドメインを使用すると、従来のＶＨ及びＶＬ、ｓｃＦｖ、ならびに従来の抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２）に優る多くの重要な利点を提供する。１）単一ドメインのみが、高親和性で抗原に結合するのに必要とされ、従って、２番目のドメインを有する必要がなく、確実にこれら２つのドメインを正しい空間的コンフォメーション及び立体配置で存在させる必要もなく（例えば、折り畳み中の重鎖及び軽鎖をペアリングする必要はなく、例えば、ｓｃＦｖのために、特別に設計されたリンカーを使用する必要はなく）；２）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、単一遺伝子から発現させることができ、翻訳後の折り畳みまたは修飾を必要とせず；３）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、多価及び／または多重特異性フォーマット（本出願に記載されるような）に容易に操作することができ；４）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９８９  Ｏｃｔ  １２；３４１（６２４２）：５４４−６に記載されたマウス由来「のｄＡｂ」と同様に）高度に可溶性であり、凝集する傾向を有せず；５）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、熱、ｐＨ、プロテアーゼ、及び他の変性剤または条件に対して非常に安定であり；６）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、微生物発酵を使用することなどの、（大規模な産生規模であっても）調製するのが容易で比較的安価であり、（例えば、従来の抗体フラグメントの産生に必要とされる）哺乳動物発現システムを使用する必要はなく；７）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、従来の４鎖抗体及びその抗原結合フラグメントと比較して、相対的に小さく（およそ１５ｋＤａ、または従来のＩｇＧの１０分の１より小さく）、したがって、例えば、固形腫瘍及び他の高密度組織のために、組織浸透能力が高く（より高く）；８）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、（従来のＶＨドメインと比較して、ＣＤＲ３ループが長いため）いわゆる「キャビティ結合特性」を示し得、したがって、従来の４鎖抗体及びその抗原結合フラグメントが利用不可能な標的及びエピトープをアクセスし、例えば、ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂが酵素を抑制し得ることが示されている（例えば、ＷＯ１９９７０４９８０５；Ｔｒａｎｓｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９９８  Ｓｅｐ  １；３２（４）：５１５−２２；Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９８  Ｊｕｌ  １；１７（１３）：３５１２−２０を参照のこと）。
【０１０５】
ＰＤ−Ｌ１
関連するＢ７ファミリーメンバーと構造が類似しており、ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、細胞外ＩｇＶ及びＩｇＣドメインならびに短い細胞質領域を含む。ＰＤ−Ｌ１は、ＣＤ２８に類似した細胞内ドメインを有し、これは、固有の触媒活性がなく、ＰＩ３Ｋ、ＰＰ２Ａ、及びＳＨＰ−２に結合可能な１つのＹＶＫＭモチーフ及びＳＨ３含有タンパク質に結合可能な１つのプロリンリッチモチーフを含む。
【０１０６】
ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７に開示される。アミノ酸１〜１８の領域は、リーダーペプチドであり；１９〜２３８は、細胞外ドメインであり；２３９〜２５９は、膜貫通ドメインであり；２６０〜２９０は、細胞質ドメインである。
【０１０７】
特定のヒトＰＤ−Ｌ１配列は一般に、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のヒトＰＤ−Ｌ１と、アミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、マウス）のＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列と比較した時、アミノ酸をヒトであると同定するアミノ酸残基を含むであろう。いくつかの実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１は、アミノ酸配列が、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のＰＤ−Ｌ１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であってよい。いくつかの実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のＰＤ−Ｌ１と１０以下のアミノ酸の差異を示すであろう。いくつかの実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のＰＤ−Ｌ１と、５、４、３、２、または１つのアミノ酸の差異を示し得る。パーセント同一性は、本明細書に記載されるように決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のＰＤ−Ｌ１と１００％のアミノ酸配列同一性を有するＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、配列番号４４１のアミノ酸配列を含むＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを特異的に認識する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ヒト以外の種由来のＰＤ−Ｌ１、またはヒトＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１ホモログ）に構造的に関連する他のタンパク質と交差反応し得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ヒトＰＤ−Ｌ１に完全に特異的であり、種または他のタイプの交差反応性を示さない。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ヒトＰＤ−Ｌ１の可溶性アイソフォームを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ヒトＰＤ−Ｌ１の膜結合アイソフォーム（配列番号４４１）を特異的に認識する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＮ末端部分を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＣ末端部分を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の中央部分を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識されるＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、アミノ酸配列が、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインと、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識されるＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインは、アミノ酸配列が、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７のＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインと１００％同一である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、配列番号４４２のアミノ酸配列を含むＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを特異的に認識する。
【０１１０】
抗体親和性
抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当該技術分野で既知の方法により実験的に決定することができる。そのような方法としては、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験、ＥＩＡ試験、ＢＩＡｃｏｒｅ試験、及びペプチドスキャンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−８Ｍ、または約１０−６Ｍ〜約１０−８Ｍである。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｏｎは、約１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０４Ｍ−１ｓ−１、約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１、約１０６Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０３Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０５Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０３Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１、または約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｏｆｆは、約１ｓ−１〜約１０−２ｓ−１、約１０−２ｓ−１〜約１０−４ｓ−１、約１０−４ｓ−１〜約１０−５ｓ−１、約１０−５ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−２ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−３ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−４ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−２ｓ−１〜約１０−５ｓ−１、または約１０−３ｓ−１〜約１０−５ｓ−１である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分のＩＣ５０は、０．１２ｎＭのＰＤ−１及び０．２ｎＭのＰＤ−Ｌ１を用いる増幅発光近接均質アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）において１０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分のＩＣ５０は、ＦＡＣＳ分析（競合結合アッセイ）によって、リガンド結合の抑制、または細胞ベースのサイトカイン放出アッセイにおいて５００ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分のＩＣ５０は、１ｎＭ未満、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約４００ｎＭ、または約４００ｎＭ〜約５００ｎＭである。
【０１１５】
キメラまたはヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載される。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、ラマなどのラクダ科動物種に由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合フラグメントが含まれる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。通常、非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、及びＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１１７】
ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説され、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフト化について記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」について記載）；ならびに、Ｏｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）ならびにＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「ガイド付き選択」アプローチについて記載）に記載される。
【０１１８】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照のこと）；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導されたフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞が変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照のこと）；ならびに、スクリーニングＦＲライブラリに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、抗原に対するドメインの天然の親和性を低下させることなく、一方で、異種種に対するその免疫原性を低減させるように修飾され、例えば、ヒト化される。例えば、ラマ抗体の抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）のアミノ酸残基を決定することができ、例えば、フレームワーク領域のラクダ科動物のアミノ酸のうちの１つ以上が、代表的な特性を欠失するポリペプチドなしに、ヒトコンセンサス配列に見られるようなヒト対応物で置き換えられており、すなわち、ヒト化は、得られるポリペプチドの抗原結合能力に重大な影響を与えない。ラクダ科動物の単一ドメイン抗体のヒト化は、単一のポリペプチド鎖内の限られた量のアミノ酸の導入及び変異導入を必要とする。これは、２つの鎖（軽鎖及び重鎖）へのアミノ酸変化の導入、ならびに両方の鎖のアセンブリの保存を必要とするｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、及びＩｇＧのヒト化とは対照的である。
【０１２０】
ＶＨＨドメインを含む単一ドメイン抗体は、ヒト様配列を有するようにヒト化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＶＨＨドメインのＦＲ領域は、ヒトＶＨフレームワーク領域と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれか１つのアミノ酸配列相同性を含む。ヒト化ＶＨＨドメインの１つの例示的なクラスは、ＶＨＨが、Ｋａｂａｔナンバリングに従って、４５位に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミンからなる群からのアミノ酸、例えば、Ｌ４５及び１０３位にトリプトファン、を保有することを特徴とする。そのようなものであるから、このクラスに属するポリペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域と高いアミノ酸配列相同性を示し、該ポリペプチドは、それからの望ましくない免疫応答を予期することなく、且つ、さらなるヒト化の負担なしに、ヒトに直接投与されてもよい。
【０１２１】
ヒト化ラクダ科動物単一ドメイン抗体の別の例示的なクラスは、ＷＯ０３／０３５６９４に記載されており、ヒト起源または他の種由来の従来の抗体に通常見られる疎水性ＦＲ２残基を含むが、これは、二本鎖抗体由来のＶＨに存在する保存されたトリプトファン残基を置換する１０３位の荷電アルギニン残基によりこの親水性の損失を補う。そのようなものであるから、これらの２つのクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域と高いアミノ酸配列相同性を示し、該ペプチドは、それからの望ましくない免疫応答を予期することなく、且つ、さらなるヒト化の負担なしに、ヒトに直接投与されてもよい。
【０１２２】
ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で既知の種々の技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載される。完全にヒトの単一ドメイン抗体を産生可能なトランスジェニックマウスまたはラットは、当該技術分野で既知である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照のこと。
【０１２３】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は通常、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を取得するための方法の概説について、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照のこと。（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙについて記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨｕＭＡｂ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙについて記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙについて記載する米国特許第７，０４１，８７０号、及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙについて記載する米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号を参照のこと）。そのような動物により生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに修飾されてもよい。
【０１２４】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照のこと）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体は、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）にも記載される。追加の方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載される）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されるものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載される。
【０１２５】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。次に、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わされてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術は、以下に記載される。
【０１２６】
特定の抗原または標的に対するＶＨＨ配列を得るための１つの技術は、（すなわち、該抗原または標的に対する免疫応答及び／または重鎖抗体を生じさせるために）重鎖抗体を発現可能なトランスジェニック哺乳動物を適切に免疫化すること、該ＶＨＨ配列（例えば、血液サンプル、血清サンプル、またはＢ細胞のサンプル）（をコードする核酸配列）を含む該トランスジェニック哺乳動物から好適な生物学的サンプルを得ること、ならびに、それに続く、それ自体既知の任意の好適な技術（例えば、本明細書に記載の方法のうちのいずれか、またはハイブリドーマ技術）を使用して、該サンプルから出発する該抗原または標的に対するＶＨＨ配列を生成することを含む。例えば、この目的のために、ＷＯ０２／０８５９４５、ＷＯ０４／０４９７９４、及びＷＯ０６／００８５４８、ならびにＪａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６  Ｏｃｔ．１０；１０３（４１）：１５１３０−５に記載の重鎖抗体発現マウスならびにさらなる方法及び技術は使用することができる。例えば、そのような重鎖抗体発現マウスは、天然源由来の（単一）可変ドメイン（例えば、ヒト（単一）可変ドメイン、ラクダ科動物（単一）可変ドメインまたはサメ（単一）可変ドメイン）、及び、例えば、合成または半合成（単一）可変ドメインなどの任意の好適な（単一）可変ドメインを有する重鎖抗体を発現させ得る。
【０１２７】
ライブラリ由来の抗体
本出願の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離されてもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を保有する抗体に関してそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で既知である。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説され、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載される。単一ドメイン抗体ライブラリを構築するための方法が、記載されている。例えば、米国特許第７３７１８４９号を参照のこと。
【０１２８】
特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別個にクローン化され、ファージライブラリ内でランダムに組み換えられ、次に、これは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるような抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは通常、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントのいずれかとして抗体フラグメントをディスプレイする。免疫化供給源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、高親和性抗体を免疫原に提供する。あるいは、ナイーブレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）で記載されるような任意の免疫化なしの広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する単一の抗体源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最終的に、ナイーブライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）で記載されるように、高度に可変ＣＤＲ３領域をコードするために、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再配置を達成するために、幹細胞から未再配列のＶ遺伝子セグメントをクローニングすること、及びランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０１２９】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体フラグメントは、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体フラグメントと見なされる。
【０１３０】
生物活性
本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分の生物活性は、半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を測定することにより決定することができ、これは、特定の生物学的または生化学的機能の抑制（例えば、ＰＤ−Ｌ１及びその受容体ＰＤ−１間の結合の抑制）における抗体の有効性の尺度である。例えば、ここで、ＩＣ５０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤ−Ｌ１生物活性の５０％を中和するために必要な抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂの有効濃度を示すために使用することができる。ＩＣ５０は、アゴニスト薬または他の物質（例えば、抗体）のＥＣ５０に匹敵する。ＥＣ５０は、ｉｎ  ｖｉｖｏで最大の効果の５０％を得るために必要な血漿濃度も表す。ＩＣ５０またはＥＣ５０は、当技術分野で既知のアッセイ、例えば、ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の抑制（競合結合アッセイ）、細胞ベースのサイトカイン放出アッセイ、または増幅発光近接均質アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）などのバイオアッセイで測定することができる。
【０１３１】
例えば、リガンド結合の遮断は、フローサイトメトリーを使用して研究することができる（実施例１も参照のこと）。ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞は、接着培養フラスコから分離し、試験用の様々な濃度の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ、及び一定濃度の標識ＰＤ−１タンパク質（例えば、ビオチン標識ｈＰＤ−１／Ｆｃタンパク質）と混合することができる。Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）などの抗ＰＤ−Ｌ１抗体陽性対照を用いることができる。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％のＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄する。次に、一定濃度の標識ＰＤ−１タンパク質を特異的に認識する抗体（例えば、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体）を添加し、室温で１５分間インキュベートする。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーで分析する。ＩＣ５０を計算するために、非線形回帰を使用して、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）でデータを分析することができる。競合アッセイの結果は、標識ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１間の相互作用の抑制における、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂの能力を実証するであろう。
【０１３２】
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分の生物活性は、サイトカイン放出についてＰＤ−Ｌ１ベースの遮断アッセイによっても試験することができる（実施例１も参照のこと）。ＰＤ−１シグナル伝達は通常、細胞増殖よりもサイトカイン産生に大きな影響を及ぼし、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２産生に重大な影響を及ぼす。ＰＤ−１媒介性抑制シグナル伝達は、ＴＣＲシグナル伝達の強度にも依存し、低レベルのＴＣＲ刺激で、より大きな抑制がもたらされる。この低減は、ＣＤ２８による共刺激（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７−３４（２０００））、またはＩＬ−２の存在（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６３４−４３（２００２））により克服することができる。さらに、いくつかの研究は、ＰＤ−１に依存しないＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の受容体を示す。Ｂ７．１はすでに、ＰＤ−Ｌ１の結合パートナーとして同定されている（Ｂｕｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７：１１１−２２（２００７））。化学架橋研究は、ＰＤ−Ｌ１及びＢ７．１が、ＩｇＶ様ドメインを介して相互作用することができることを示唆する。Ｂ７．１：ＰＤ−Ｌ１相互作用は、Ｔ細胞への抑制シグナルを誘導することができる。その結果、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１、Ｂ７．１、またはその両方と相互作用するのを遮断し、それにより、ＰＤ−Ｌ１がＴ細胞及び他の抗原提示細胞に負の共刺激シグナルを送るのを防ぎ、ＰＤ−Ｌ１を介したシグナル伝達の拮抗作用は、感染症（例えば、急性及び慢性）ならびに腫瘍免疫に応じて免疫を強化する可能性がある。さらに、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の他の構成成分のアンタゴニスト、例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ２抗体と組み合わされてもよい。したがって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−Ｌ１経路の遮断は、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮ−γ放出、またはＩＬ−２分泌を監視する様々なバイオアッセイを使用して研究することができる。
【０１３３】
例えば、ＰＤ−１エフェクター細胞（ヒトＰＤ−１タンパク質及びＮＦＡＴルシフェラーゼで安定にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞）ならびにＣＨＯ−Ｋ１／ヒトＣＤ２７４（ヒトＣＤ８０を安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１）は、ウェル内で混合される。抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂは、異なる濃度で各ウェルに添加される。バックグラウンド対照として、抗体を使用することができない。陰性対照（例えば、ヒトＩｇＧ１）及び陽性対照（例えば、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））を用いることができる。３７℃／５％のＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートした後、培地は、ＩＬ−２分泌測定用の各試験ウェルから採取される（Ｃｉｓｂｉｏ）。各試験抗体のＥＣ５０値が測定され、これは、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１間の相互作用の遮断、それによる、Ｔ細胞ＩＬ−２産生の抑制において、試験抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂの能力を反映するであろう。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ＰＤ−Ｌ１リガンドにより形質導入されるシグナルを遮断または拮抗する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１と相互作用するのを抑制するように、ＰＤ−Ｌ１上のエピトープに結合し得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、抗体結合部位対ＰＤ−Ｌ１リガンド結合部位の比率が１：１を超え、且つ、抗体の濃度が１０−８Ｍを超える条件で、ＰＤ−Ｌ１のその受容体ＰＤ−１への結合を、少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％のいずれかで低減させ得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２にある。
【０１３７】
したがって、いくつかの実施形態では、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３９】
本明細書に記載のＣＤＲの配列は、表１５に提供される。
【０１４０】
ＣＤＲは、多数の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を生成するために、種々の一対の組み合わせで組み合わせることができる。
【０１４１】
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ＦＲ配列のうちの１つ以上に、１つ以上の「ホールマーク残基」を含んでもよい。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、以下の：ａ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶからなる群より選択される（例えば、Ｙ、または、例えば、Ｆ）；ａ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬからなる群より選択される（例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）；ａ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｒ、及びＣからなる群より選択される（例えば、ＬまたはＲ）；ａ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｇ、Ｗ、Ｒ、及びＳからなる群より選択される（例えば、ＷもしくはＲ、または、例えば、Ｗ）；ａ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑである；あるいは、ｂ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶからなる群より選択される（例えば、Ｙ、または、例えば、Ｆ）；ｂ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ及びＱからなる群より選択される；ｂ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｒである；ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｇ、Ｗ、Ｒ、及びＳからなる群より選択される（例えば、Ｗ）；ならびに、ｂ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ及びＬからなる群より選択され（例えば、Ｑ）；のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含んでもよく、アミノ酸の位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従う。Ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置３７、４４、４５、１０３、及び１０８のこれらの「ホールマーク残基」は、天然ＶＨＨ配列の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分に適用され、ヒト化中に置換することができるという点に留意すべきである。例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによるアミノ酸位置１０８のＱは、任意にＬにヒト化することができる。他のヒト化置換は、当業者らには明らかであろう。例えば、潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨのＦＲ配列を１つ以上の密接に関連するヒトＶＨの対応するＦＲ配列と比較することにより決定して、（さらに本明細書で記載されるような）当該技術分野で既知の方法を使用して、そのような潜在的に有用なヒト化置換のうちの１つ以上を該ＶＨＨに導入することができる。得られるヒト化ＶＨＨ配列は、ＰＤ−Ｌ１結合親和性、安定性、発現の容易さ及びレベル、ならびに／または他の望ましい特性について試験することができる。可能な残基置換はさらに、ＶＨ／ＶＬ界面が１つ以上の高度に荷電したアミノ酸残基を含む抗体ＶＨドメインに由来し得る。本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、部分的または完全にヒト化することができる。好ましくは、得られるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂは、本明細書に記載のＫｄ、Ｋｏｎ、ＫｏｆｆでＰＤ−Ｌ１に結合する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または、配列番号３５１〜４００のいずれか１つと、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその多様体を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメイン中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその多様体を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３などのＣＤＲ中にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその多様体を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのＦＲ１及び／またはＦＲ２及び／またはＦＲ３及び／またはＦＲ４などのＦＲにある。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分のうちのいずれか１つと競合的にＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分（以下、「競合する抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分」または「競合する抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ」と称される）が提供される。いくつかの実施形態では、競合結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分と競合的にＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分が提供される。別の例として、いくつかの実施形態では、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分と競合的にＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分が提供される。いくつかの実施形態では、競合する抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、競合する抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１４４】
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含む構築物
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、任意の可能な形式のものであり得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物はさらに、追加のポリペプチド配列、例えば、１つ以上の抗体部分、または免疫グロブリンのＦｃフラグメントを含んでもよい。そのような追加のポリペプチド配列は、ｓｄＡｂの（生物学的）特性を変化させても、または他の点で影響してもしなくてもよく、本明細書に記載のｓｄＡｂにさらなる機能を追加してもしなくてもよい。いくつかの実施形態では、追加のポリペプチド配列は、本発明のｓｄＡｂに１つ以上の所望の特性または機能性を付与する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、本明細書に記載の１つ以上の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含む細胞外抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、追加のポリペプチド配列は、第２の抗原を特異的に認識する第２の抗体部分（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、完全長抗体）であってよい。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＰＤ−Ｌ１ではない。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂと同じＰＤ−Ｌ１上のエピトープを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂと、ＰＤ−Ｌ１上の異なるエピトープを特異的に認識する。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、追加のポリペプチド配列は、それ自体が本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂと比較して、抗体構築物の半減期、溶解度、もしくは吸収を増加させ、免疫原性もしくは毒性を低下させ、望ましくない副作用を排除もしくは軽減し、ならびに／または他の有利な特性を付与し、及び／もしくは本発明の抗ＰＤ−Ｌ１構築物の好ましくない特性を低減させ得る。そのような追加のポリペプチド配列のいくつかの非限定例は、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質（例えば、ＷＯ００／２７４３５を参照のこと）またはハプテン分子（例えば、循環抗体によって認識されるハプテン、例えば、ＷＯ９８／２２１４１を参照のこと）である。血清アルブミンまたはそのフラグメントへの免疫グロブリンのフラグメント（例えば、ＶＨドメイン）の連結が抗体の半減期を延長させ得ることが示された（例えば、ＷＯ００／２７４３５及びＷＯ０１／０７７１３７を参照のこと）。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、任意に好適なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して、血清アルブミン（またはその好適なフラグメント）に連結している本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、少なくとも血清アルブミンドメインＩＩＩを含む血清アルブミンのフラグメントに連結することができる。（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００２８１７を参照のこと）。
【０１４８】
重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させるために、任意にリンカー配列を介して、１つ以上の（好ましくは、ヒト）ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインに連結することができる。
【０１４９】
したがって、いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、免疫グロブリンのＦｃフラグメント、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、に融合している本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含むＨＣＡｂ（以下、「抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ」と称される）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１ＨＣＡｂは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれかなどのＩｇＧのＦｃ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒトＦｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂは、単量体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂは、二量体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＦｃフラグメントは任意に、ペプチドリンカーで連結されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、変異したヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号４４５）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号４４３のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号４４４のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む。
【０１５０】
したがって、いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂが提供され、ｓｄＡｂ部分は、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体を含み、ｓｄＡｂ部分は、免疫グロブリンのＦｃフラグメントに融合している。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂが提供され、ｓｄＡｂ部分は、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域中に最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体を含み、ｓｄＡｂ部分は、免疫グロブリンのＦｃフラグメントに融合している。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２にある。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂが提供され、ｓｄＡｂ部分は、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、ｓｄＡｂ部分は、免疫グロブリンのＦｃフラグメントに融合している。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、以下の：ａ−１）４４位のアミノ酸残基が、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬからなる群より選択される（例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）；ａ−２）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｒ、及びＣからなる群より選択される（例えば、ＬまたはＲ）；ａ−３）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、及びＳからなる群より選択される（例えば、ＷもしくはＲ、または、例えば、Ｗ）；ａ−４）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑである；ｂ−１）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ及びＱからなる群より選択される；ｂ−２）４５位のアミノ酸残基が、Ｒである；ｂ−３）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、及びＳからなる群より選択される（例えば、Ｗ）；ならびに、ｂ−４）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ及びＬからなる群より選択され（例えば、Ｑ）；のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングに従い、１０８位は、１０８位がＱである時に、任意にＬにヒト化することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂは、単量体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂは、二量体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＦｃフラグメントは任意に、ペプチドリンカーで連結されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号４４３、配列番号４４４、または配列番号４４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、配列番号４０１〜４４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂが提供される。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂのうちのいずれか１つと競合的にＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ（以下、「競合する抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ」と称される）も提供される。競合的結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号４０１〜４４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂと競合的にＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂが提供される。別の例として、いくつかの実施形態では、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸を含むＣＤＲ１；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂと競合的にＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂが提供される。いくつかの実施形態では、競合する抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、競合する抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂは、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１５３】
多価及び／または多重特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、１つ以上の他の抗体部分（例えば、別の抗原を特異的に認識する抗体部分）に融合している本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含む。１つ以上の他の抗体部分は、任意の抗体または抗体フラグメントフォーマット、例えば、多重特異性ｓｄＡｂ（例えば、二重特異性ｓｄＡｂ）、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、またはｓｄＡｂ、のものであり得る。特定の抗体フラグメントの概説について、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖフラグメントの概説について、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；を参照のこと；ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が延長したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察について、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。多重特異性抗体の概説について、Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１０（１）：１−１８，２０１３；Ｇｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３（２）：６５−７９，２０１５；Ｓｔａｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１（２）：１７２−１９８，２０１２を参照のこと。ダイアボディは、二価であっても、二重特異性であってもよい、２つの抗原結合部位を有する抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディは、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）にも記載される。抗体フラグメントは本明細書に記載するような様々な技術によって作製することができる。技術には、インタクトな抗体分解及び組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ  ｃｏｌｉまたはファージ）による産生があるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１つ以上の他の抗体部分は、抗体模倣体であり、これは、抗体のような抗原結合ドメインを含む小さな操作タンパク質である（Ｇｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３（２）：６５−７９，２０１５）。これらの分子は、既存のヒト足場タンパク質に由来し、単一のポリペプチドを含む。本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１構築物内に含むことができる例示的な抗体模倣物は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ；Ｎ末端及びＣ末端Ｃａｐドメインに隣接する３〜５つの完全合成アンキリンリピートを含む）、アビディティー多量体（アビマー；複数のＡドメインを含む高親和性タンパク質、標的に対する低親和性を有する各ドメイン）、またはアンチカリン（４つの利用可能なループを有するリポカリンの足場に基づいて、それぞれの配列は、ランダム化することができる）であり得るが、これらに限定されない。
【０１５４】
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組み換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照のこと）、ならびに「ノブインホール」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電誘導効果を設計すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つ以上の抗体またはフラグメントの架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））を参照のこと）；二重特異性抗体を産生するロイシンジッパーの使用（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと）；及び例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるような三重特異性抗体の調製；ならびにタンデム単一ドメイン抗体を含むポリペプチドの作成（例えば、米国特許出願第号２０１１００２８６９５；及び、Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１；２７６（１０）：７３４６−５０）によって作製されてもよい。「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もまた、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照のこと）。
【０１５５】
ペプチドリンカー
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物内の２つ以上の抗体部分は任意に、ペプチドリンカーで連結することができる。抗ＰＤ−Ｌ１構築物に使用されるペプチドリンカー（複数可）の長さ、可撓度、及び／または他の特性は、１つ以上の特定の抗原またはエピトープに対する、限定されないが、親和性、特異性、または結合力を含む特性に何らかの影響を及ぼし得る。例えば、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないように、より長いペプチドリンカーが選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、可撓性残基（例えば、グリシン及びセリン）を含むため、隣接ドメインは互いに対して自由に移動する。例えば、グリシン−セリンダブレットは、好適なペプチドリンカーであり得る。
【０１５６】
ペプチドリンカーは、任意の適切な長さにすることができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、またはそれ以上のアミノ酸長のいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、またはそれ以下のアミノ酸長のいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約１アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１アミノ酸〜約２０アミノ酸、約１アミノ酸〜約３０アミノ酸、約５アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１０アミノ酸〜約２５アミノ酸、約５アミノ酸〜約３０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸長、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１００アミノ酸、または約１アミノ酸〜約１００アミノ酸のいずれかである。
【０１５７】
ペプチドリンカーは、天然の配列、または非天然の配列を有し得る。例えば、重鎖のみ抗体のヒンジ領域に由来する配列は、リンカーとして使用されてもよい。例えば、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照のこと。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、変異したヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号４４５）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは可撓性リンカーである。例示的な可撓性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎが含まれ、ｎは、１以上の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野で既知の他のフレキシブルなリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーはＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号４４３）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号４４４のアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号４４５のアミノ酸配列（ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ）を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及び１つ以上の他の抗体部分を含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及び１つ以上の他の抗体部分を含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、多重特異性（例えば、二重特異性）である。多重特異性分子は、少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープに対して結合特異性を有する分子である（例えば、二重特異性抗体は、２つの抗原またはエピトープに対して結合特異性を有する）。３つ以上の原子価及び／または特異性を有する多重特異性分子も企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。当業者は、互いに組み合わせて本発明の多重特異性抗ＰＤ−Ｌ１分子を形成するために、本明細書に記載の個々の多重特異性分子の適切な特徴を選択することができることを理解すべきである。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、多価であるが、単一特異性であり、すなわち、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分、及び抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分と同じＰＤ−Ｌ１エピトープを特異的に認識する少なくとも第２の抗体部分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分と同じＰＤ−Ｌ１エピトープを特異的に認識する１つ以上の抗体部分は、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分と同じＣＤＲ及び／または同じＶＨＨアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、本明細書に記載の２つ以上の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含んでもよく、２つ以上の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は任意に、ペプチドリンカー（複数可）で連結されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号４４３〜４４５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、多価及び多重特異性であり、すなわち、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１以外の第２抗原または抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分によって認識されるものとは異なるＰＤ−Ｌ１エピトープを特異的に認識する少なくとも第２の抗体部分を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、第２の抗体部分に対してＮ末端またはＣ末端である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、三価で二重特異性である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、本明細書に記載の２つの抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ及び第２の抗体部分（例えば、抗ＨＳＡ  ｓｄＡｂ）を含み、第２の抗体部分は、２つの抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂの間にある。いくつかの実施形態では、抗体部分は任意に、ペプチドリンカー（複数可）で連結されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号４４３〜４４５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０１６１】
ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を２つ以上含む単一特異性または多重特異性抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、単一の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分と比較して結合活性の増加を有し得る。
【０１６２】
完全長抗体に融合しているｓｄＡｂを含む二重特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、第２の抗体部分に融合している本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含み、第２の抗体部分は、完全長抗体（例えば、抗ＴＩＧＩＴ完全長抗体）である。ＰＤ−Ｌ１及びＴＩＧＩＴに対する二重特異性を含む構築物は以下、「抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ抗体」、「抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ構築物」、または「ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ抗体」と称されるであろう。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、第２の抗体部分に融合している本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含み、第２の抗体部分は、完全長抗体（例えば、抗ＴＩＭ−３完全長抗体）である。ＰＤ−Ｌ１及びＴＩＭ−３に対する二重特異性を含む構築物は以下、「抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＭ−３抗体」、「抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＭ−３構築物」、または「ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＭ−３抗体」と称されるであろう。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、第２の抗体部分に融合している本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含み、第２の抗体部分は、完全長抗体（例えば、抗ＬＡＧ−３完全長抗体）である。ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＧ−３に対する二重特異性を含む構築物は以下、「抗ＰＤ−Ｌ１／ＬＡＧ−３抗体」、「抗ＰＤ−Ｌ１／ＬＡＧ−３構築物」、または「ＰＤ−Ｌ１×ＬＡＧ−３抗体」と称されるであろう。
【０１６５】
ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３は、ＰＤ−Ｌ１と同様に、抑制性免疫チェックポイント分子である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、ならびに、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、及び抗ＬＡＧ−３抗体からなる群より選択される完全長抗体を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が提供され、単離された抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び完全長抗体は任意に、ペプチドリンカーで連結されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号４４３〜４４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、ならびに、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、及び抗ＬＡＧ−３抗体からなる群より選択される完全長抗体を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が提供され、ｓｄＡｂは、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または、配列番号３５１〜４００のいずれか１つと、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のいずれか）の配列同一性を有するその多様体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、ならびに、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、及び抗ＬＡＧ−３抗体からなる群より選択される完全長抗体を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が提供され、ｓｄＡｂは、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または、ＶＨＨドメインに最大約３つ（例えば、約１、２、もしくは３つのうちのいずれか）のアミノ酸置換を含むその多様体を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその多様体を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２及び／またはＣＤＲ３などのＣＤＲ中にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその多様体を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのＦＲ１及び／またはＦＲ２及び／またはＦＲ３及び／またはＦＲ４などのＦＲにある。いくつかの実施形態では、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインまたはその多様体を含む抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分、ならびに、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、及び抗ＬＡＧ−３抗体からなる群より選択される完全長抗体を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が提供され、ｓｄＡｂ部分は、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのＮ末端に融合している。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び完全長抗体は任意に、ペプチドリンカーで連結されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号４４３〜４４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１���−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ構築物、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＭ−３構築物、または抗ＰＤ−Ｌ１／ＬＡＧ−３構築物のいずれか１つと競合的にＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するｓｄＡｂ部分を含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物（以下、「競合する抗ＰＤ−Ｌ１構築物」と称される）も提供される。
【０１６９】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体多様体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列多様体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列多様体は、抗体をコードする核酸配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製されてもよい。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基からの欠失、及び／または残基への挿入、及び／または残基の置換が挙げられる。最終構築物に到達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができる。但し、最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合、を保有する。
【０１７０】
ａ）置換、挿入、削除、及び多様体
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体多様体が提供される。置換変異導入のための目的の部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、「好ましい置換」の表題の下の表２に示される。より実質的な変更は、「例示的置換」の表題の下の表２に、アミノ酸側鎖クラスを参照して、さらに以下に記載されるように提供される。アミノ酸置換が目的の抗体に導入され、生成物が、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣまたはＣＤＣの改善についてスクリーニングされてもよい。
表２．アミノ酸置換
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【０１７１】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類されてもよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１７２】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。
【０１７３】
置換多様体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を含む。一般に、さらなる研究のために選択された得られる多様体（複数可）は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有することになり、及び／または親抗体の特定の生物学的特性を実施的に保持しているであろう。例示的な置換多様体は、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して、都合よく生成され得る親和性成熟抗体である。要約すると、１つ以上のＨＶＲ残基が変異し、多様体抗体は、ファージ上にディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０１７４】
例えば、抗体親和性を向上させるために、ＨＶＲの改変（例えば、置換）が行われてもよい。そのような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基、及び／または、得られる多様体ＶＨまたはＶＬが結合親和性について試験されるＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行われてもよい（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照のこと）。二次ライブラリからの構築及び再選択による親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性が、様々な方法のうちのいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド特異的変異導入）。次に、二次ライブラリを作成する。次に、ライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体多様体を同定する。多様性を導入する別の方法には、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）がランダム化されるＨＶＲ指向のアプローチが含まれる。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異導入またはモデリングを使用して、特異的に同定されてもよい。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は多くの場合、標的とされる。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的改変（例えば、本明細書で提供される保存的置換）は、ＨＶＲで行われてもよい。そのような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」またはＣＤＲの外側であってもよい。上で提供された多様性ＶＨＨ配列のいくつかの実施形態では、各ＨＶＲは、未改変か、または１つ、２つ、もしくは３つ未満のアミノ酸置換を含む。
【０１７６】
変異導入の標的とされ得る抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されるように、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）は、抗体との抗原の相互作用が影響を受けるかどうかを判定するために、同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置換される。初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換が導入されてもよい。あるいは、または加えて、抗体及び抗原間の接触点を同定する抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接する残基は、置換の候補として標的とされてもよく、または排除されてもよい。多様体は、それらが所望の特性を有するかどうかを決定するために、スクリーニングされてもよい。
【０１７７】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入多様体には、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）または抗体の血清半減期を延長するポリペプチドが含まれる。
【０１７８】
ｂ）グリコシル化多様体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、構築物がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され得る。
【０１７９】
抗ＰＤ−Ｌ１構築物がＦｃ領域を含む場合、それに結合している炭水化物が改変されてもよい。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は通常、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖には、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合しているフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、特定の改善された特性を有する抗体多様体を作成するために、本願の抗ＰＤ−Ｌ１構築物中のオリゴ糖の修飾が行われてもよい。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体多様体が提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であってよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定された、Ａｓｎ２９７に結合している全ての糖鎖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計と比べた、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置するアスパラギン残基を指すが；Ａｓｎ２９７はまた、抗体におけるわずかな配列の変動に起因して、２９７位から約±３アミノ酸の上流または下流、すなわち、２９４〜３００位に位置してもよい。そのようなフコシル化多様体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体多様体に関する刊行物の例としては：ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損しているＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（特に、実施例１１のＲｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ならびに、ノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照のこと）が挙げられる。
【０１８１】
抗ＰＤ−Ｌ１構築物多様体はさらに、例えば、抗体のＦｃ領域に結合している二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されるバイセクト型オリゴ糖が提供される。そのような抗体多様体は、低減されたフコシル化機能を有しても、及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有してもよい。そのような抗体多様体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）；及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載される。Ｆｃ領域に付着しているオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を含む抗体多様体も提供される。そのような抗体多様体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体多様体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されされる。
【０１８２】
ｃ）Ｆｃ領域多様体
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、本明細書で提供される抗ＰＤ−Ｌ１構築物のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域多様体が生成されてもよい。Ｆｃ領域多様体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含んでもよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、本出願は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有する抗ＰＤ−Ｌ１構築物多様体を企図し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ＰＤ−Ｌ１構築物の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）は、不要または有害である。ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認するために実施することができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでの非限定例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照のこと）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照のこと）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、カリフォルニア州マウンテンビュー）を参照のこと）；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価されてもよい。Ｃ１ｑ結合アッセイは、抗体がＣ１ｑに結合することができずに、ＣＤＣ活性を欠くことを確認するために実行されてもよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイは、実施されてもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野で既知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照のこと）。
【０１８４】
エフェクター機能が低減した抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９（米国特許第６，７３７，０５６号）のうちの１つ以上が置換されているものが含まれる。そのようなＦｃ変異体としては、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１８５】
ＦｃＲへの結合が改善または低減されたある特定の抗体多様体が記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照のこと）。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物多様体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位での置換（残基のＥＵナンバリング）を有するＦｃ領域を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の変化（すなわち、向上または低下）をもたらすＦｃ領域に改変が行われる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、半減期を延長し、及び／または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を改善する１つ以上のアミノ酸置換を含む多様性Ｆｃ領域を含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、ＨＣＡｂ）多様体が提供される。胎児への母系ＩｇＧの移動（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））に関与する、半減期が延長され且つ新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載される。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する、１つ以上の置換を内部に有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ多様体としては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上で置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換、を有するものが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０１８９】
Ｆｃ領域多様体の他の例に関するＤｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ９４／２９３５１も参照のこと。
【０１９０】
本明細書に記載のＦｃ多様体のいずれか、またはその組み合わせを含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、ＨＣＡｂまたは完全長抗体に融合している抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ）が企図される。
【０１９１】
ｄ）システイン操作抗体多様体
いくつかの実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗ＰＤ−Ｌ１構築物、例えば、「チオＭＡｂ」を作成することが望ましいことがある。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を他の部分（薬物部分またはリンカー−薬物部分など）に抱合して、本明細書にさらに記載される免疫抱合体を作製することができる。いくつかの実施形態では、以下の残基のうちの任意の１つ以上は、システインで置換されてもよい。重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成されてもよい。
【０１９２】
ｅ）抗体誘導体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−Ｌ１構築物はさらに、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、いずれの分子量のものであってもよく、分岐状であっても非分岐状であってもよい。抗体に結合したポリマーの数は異なってもよく、２つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子であっても、異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／またはタイプは、限定されないが、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下で、療法に使用されるかどうかなどを含む考慮すべき事項に基づいて決定することができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、放射線への曝露により選択的に加熱され得る抗ＰＤ−Ｌ１構築物及び非タンパク質性部分の抱合体が提供される。いくつかの実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、いずれの波長のものであってもよく、これには、限定するものではないが、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に近接する細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長が挙げられる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＴＬＡ−４ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＭ−３二重特異性抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１／ＬＡＧ−３二重特異性抗体）はさらに、１つ以上の生物活性なタンパク質、ポリペプチド、またはそのフラグメントを含むように修飾されてもよい。本明細書で使用される「生物活性の」または「生物的に活性な」は、特定の機能を実行するために体内で生物活性を示すことを意味する。例えば、それは、タンパク質、ＤＮＡなどの特定の生体分子との組み合わせ、その後の、そのような生体分子の活性の促進または抑制を意味し得る。いくつかの実施形態では、生物活性タンパク質またはそのフラグメントは、免疫刺激／免疫調節、膜輸送、または酵素活性を有する。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１構築物と融合することができる生物活性タンパク質またはそのフラグメントは、特定の細胞受容体と相互作用するリンホカイン及び細胞因子などのリガンドである。リンホカインは、抗原またはレクチンがＴ細胞の成長を刺激する時、Ｔ細胞によって分泌される低分子量タンパク質である。リンホカインの例としては、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（例えば、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、またはＧＭ−ＣＳＦ）、ケモタキシン、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、マクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、ＮＫ細胞活性化因子、Ｔ細胞置換因子、白血球抑制因子（ＬＩＦ）、リンホトキシン、破骨細胞活性化因子（ＯＡＦ）、可溶性免疫応答抑制因子（ＳＩＲＳ）、成長刺激因子、単球成長因子などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質に組み込まれ得る細胞因子には、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロン（ＩＦＮ）、及び神経成長因子（ＮＧＦ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９６】
ＩＩＩ．医薬組成物
本明細書に記載のＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂを含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＴＬＡ−４ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＭ−３二重特異性抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１／ＬＡＧ−３二重特異性抗体）のうちのいずれか１つを含む医薬組成物、及び、任意に薬学的に許容される担体が本出願によりさらに提供される。医薬組成物は、所望の純度を有する本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１構築物を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。
【０１９７】
医薬組成物は、好ましくは、安定であるべきであり、そこでは、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂを含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物は、保存時にその物理的及び化学的安定性及び完全性を本質的に保持する。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技術が、当該技術分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）及びＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０（１９９３）で概説される。安定性は、選択された温度で選択された期間にわたって測定され得る。迅速なスクリーニングのために、製剤は、４０℃で２週間〜１ヶ月間保存されてもよく、その時点で、安定性が測定される。製剤を２〜８℃で保存すべき場合、一般に、製剤は、３０℃または４０℃で少なくとも１か月間、及び／または、２〜８℃で少なくとも２年間安定していなければならない。製剤を３０℃で保存すべき場合、一般に、製剤は、３０℃で少なくとも２年間、及び／または、４０℃で少なくとも６か月間安定していなければならない。例えば、保管中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１構築物の安定製剤は、製剤中に凝集体として存在する抗ＰＤ−Ｌ１構築物の約１０％未満（好ましくは、約５％未満）を含み得る。
【０１９８】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度で、レシピエントに無毒であり、緩衝液、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウム；防腐剤、等張剤（例えば、塩化ナトリウム）、安定化剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ＥＤＴＡなどのキレート剤、及び／または非イオン性界面活性剤を含む。
【０１９９】
生理学的に許容される担体の例としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または、ＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２００】
特に安定性がｐＨ依存性である場合、治療効果を最適化する範囲でｐＨを制御するために緩衝液を使用する。緩衝液は、好ましくは約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本出願での使用に好適な緩衝剤には、有機酸及び無機酸の両方、ならびにそれらの塩が含まれる。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。さらに、緩衝液は、ヒスチジン及びトリスなどのトリメチルアミン塩を含むことがある。
【０２０１】
防腐剤は、微生物の成長を遅延させるために添加され、通常、０．２％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。防腐剤の添加は、例えば、複数回使用（複数回用量）製剤の製造を容易にし得る。本出願での使用に好適な防腐剤としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。
【０２０２】
「安定剤」として知られる等張化剤は多くの場合、組成物中の液体の張度を調整または維持するように存在する。タンパク質や抗体などの大きな荷電生体分子と併用すると、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより、分子間及び分子内相互作用の可能性を低くすることができるため、それらは多くの場合「安定剤」と呼ばれる。等張化剤は、他の構成成分の相対量を考慮して、０．１重量％〜２５重量％、好ましくは、１％〜５％、の任意の量で存在することができる。好ましい等張化剤として、多価糖アルコール、好ましくは、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの三価以上の糖アルコールが挙げられる。
【０２０３】
追加の賦形剤には、以下のうちの１つ以上として機能することができる薬剤が含まれる：（１）充填剤、（２）溶解度向上剤、（３）安定剤、及び（４）変性または容器の壁への付着を防止する薬剤。そのような賦形剤には、以下のものが含まれる：多価糖アルコール（上記に列挙される）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイノシトール、ミオイノシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖または糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノースなどの三糖；及びデキストリンまたはデキストランなどの多糖。
【０２０４】
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療薬の可溶化を補助するために、及び撹拌により誘発される凝集から治療用タンパク質を保護するために存在し、それはまた、活性な治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こさずに、製剤をせん断表面応力にさらすこともできる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在する。
【０２０５】
好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアレート、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油１０、５０、及び６０、グリセロールモノステアレート、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用できる陰イオン性洗浄剤として、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、及びジオクチルスルホン酸ナトリウムが挙げられる。陽イオン性洗浄剤として、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
【０２０６】
医薬組成物をｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用されるためには、それらは、無菌でなければならない。医薬組成物は、滅菌濾過膜を通した濾過により滅菌されてもよい。本明細書の医薬組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０２０７】
投与経路は、好適な方法での長期間にわたる単回または複数回のボーラスまたは注入などによる既知の及び容認された方法、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内もしくは関節内経路、局所投与、吸入、または徐放性もしくは持続放出手段による注射または注入、に従う。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腫瘍内など、局所投与される。
【０２０８】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適例としては、アンタゴニストを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態をとる。持続放出性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２０９】
本明細書の医薬組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な複数な活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。あるいは、またはさらに、組成物は、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、または成長阻害剤を含んでもよい。そのような分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０２１０】
活性成分はまた、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）またはマクロ乳濁液中の、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル、に取り込まれてもよい。そのような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに開示される。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、使い捨て密封バイアルなどの使い捨てバイアルに含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、多目的バイアルに含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、容器内のバルクに含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結保存される。
【０２１２】
ＩＶ．ＰＤ−Ｌ１関連疾患の治療方法
本明細書に記載のＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂを含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＴＬＡ−４ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＭ−３二重特異性抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１／ＬＡＧ−３二重特異性抗体）、及びその組成物（例えば、医薬組成物）は、診断、分子アッセイ、及び療法などの様々な用途に有用である。
【０２１３】
本発明の一態様は、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１構築物を含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む、それを必要とする個体のＰＤ−Ｌ１関連疾患または状態を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１関連疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１関連疾患は、ウイルス感染症などの病原性感染症である。
【０２１４】
本発明は、部分的に、タンパク質構築物（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＴＬＡ−４ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＭ−３二重特異性抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１／ＬＡＧ−３二重特異性抗体）、それをコードする核酸分子及び／またはベクター、それをコードする核酸分子及び／またはベクターを含む宿主細胞を、単独または別の療法と組み合わせて、少なくともいくつかの態様では、薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、投与することができることを企図する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１構築物の投与の前に、それらは、当該技術分野で周知の好適な薬学的担体及び賦形剤と組み合わされてもよい。本開示に従って調製された組成物は、がんの治療または悪化の遅延に使用することができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＴＬＡ−４ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＭ−３二重特異性抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１／ＬＡＧ−３二重特異性抗体）を含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含むがんを治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍（例えば、結腸がん）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身（例えば、静脈内）投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所（例えば、腫瘍内）投与される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、追加のがん療法（例えば、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせ）を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。いくつかの実施形態では、がんを治療する方法は、以下の生物活性のうちの１つ以上を有する：（１）がん細胞の死滅（バイスタンダー死滅を含む）；（２）がん細胞の増殖の抑制；（３）腫瘍の免疫応答の誘導；（４）腫瘍サイズの低減；（５）がんを有する個体の１つ以上の症状の緩和；（６）腫瘍転移の抑制；（７）生存期間の延長；（８）がんの進行までの時間の延長；及び（９）がんの再発の可能性の予防、抑制、または低減。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介されるがん細胞を死滅させる方法は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの腫瘍細胞死滅率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介されるがん細胞を死滅させる方法は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかのバイスタンダー腫瘍細胞（腫瘍溶解性ＶＶに感染していない）の死滅率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介される腫瘍サイズを低減する方法は、腫瘍サイズの少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれかを含む）低減させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介される腫瘍転移を抑制する方法は、転移の少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれかを含む）抑制し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介される個体（ヒトなど）の生存期間を延長する方法は、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、または２４か月のうちのいずれかによって個体の生存期間を延長させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介されるがん進行までの時間を延長する方法は、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間のいずれかによって、がん進行までの��間を延長することができる。
【０２１６】
本明細書に記載の方法は、固形がん及び液体がんの両方を含む様々ながんの治療に適する。方法は、早期がん、非転移がん、原発性がん、進行がん、局所進行がん、転移性がん、または寛解期のがんを含む全ての病期のがんに適用可能である。本明細書に記載の方法は、アジュバント設定またはネオアジュバント設定中の、第１の療法、第２の療法、第３の療法、または当該技術分野で既知の他のタイプのがん療法、例えば、化学療法、手術、ホルモン療法、放射線、遺伝子療法、免疫療法（例えば、Ｔ細胞療法）、骨髄移植、幹細胞移植、標的療法、凍結療法、超音波療法、光線力学療法、高周波アブレーションなど、との併用療法として使用されてもよい（すなわち、方法は、一次／決定的療法の前に実施されてもよい）。いくつかの実施形態では、方法は、以前に治療されている個体を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、がんは、以前の療法に対して難治性であった。いくつかの実施形態では、方法は、以前に治療されていない個体を治療するために使用される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、方法は、異常なＰＤ−Ｌ１発現、活性、及び／またはシグナル伝達を伴うがんの治療に適し、非限定例として、黒色腫、前立腺がん、肺がん、大腸がん、胃がん、卵巣がん、乳がん、及び膠芽腫が挙げられる。
【０２１８】
したがって、いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／抗ＣＴＬＡ−４ＨＣＡｂ、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＭ−３二重特異性抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１／ＬＡＧ−３二重特異性抗体）を含む有効量の医薬組成物個体に投与することを含む、免疫療法応答性固形腫瘍（例えば、がんまたは腺がん、例えば、異常なＰＤ−Ｌ１発現、活性、及び／またはシグナル伝達を伴うがん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍（例えば、結腸がん）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身（例えば、静脈内）投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所（例えば、腫瘍内）投与される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、追加のがん療法（例えば、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせ）を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、がんを治療する方法は、以下の生物活性のうちの１つ以上を有する：（１）がん細胞の死滅（バイスタンダー死滅を含む）；（２）がん細胞の増殖の抑制；（３）腫瘍の免疫応答の誘導；（４）腫瘍サイズの低減；（５）がんを有する個体の１つ以上の症状の緩和；（６）腫瘍転移の抑制；（７）生存期間の延長；（８）がんの進行までの時間の延長；及び（９）がんの再発の可能性の予防、抑制、または低減。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介されるがん細胞を死滅させる方法は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの腫瘍細胞死滅率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介されるがん細胞を死滅させる方法は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかのバイスタンダー腫瘍細胞（腫瘍溶解性ＶＶに感染していない）の死滅率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介される腫瘍サイズを低減する方法は、腫瘍サイズの少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれかを含む）低減させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介される腫瘍転移を抑制する方法は、転移の少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちのいずれかを含む）抑制し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介される個体（ヒトなど）の生存期間を延長する方法は、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、または２４か月のうちのいずれかによって個体の生存期間を延長させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって媒介されるがん進行までの時間を延長する方法��、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間のいずれかによって、がん進行までの時間を延長することができる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、この方法は、異常なＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２発現、活性、及び／またはシグナル伝達を伴うがんの治療に適しており、非限定例として、血液がん及び／または固形腫瘍が挙げられる。本発明の抗体を使用して成長が抑制され得るいくつかのがんには、免疫療法に通常応答するがんが含まれる。治療のための他のがんの非限定例には、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺がん）、乳がん、結腸がん、及び肺がん（例えば、非−小細胞肺がん）が含まれる。さらに、本発明には、本発明の抗体を使用して成長が抑制され得る難治性または再発性の悪性腫瘍が含まれる。本発明の抗体を使用して治療され得る他のがんの例としては、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部分のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管のがん、子宮内膜のがん、子宮頸部のがん、膣のがん、外陰部のがん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮細胞がん、Ｔ−細胞性リンパ腫、アスベストによって誘導されたものを含む環境誘導性がん、及び該がんの組み合わせが挙げられる。本発明はまた、転移がん、特に、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移がん、の治療に有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３−１４４）。
【０２２０】
したがって、いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３完全長抗体に融合しているＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物を含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む免疫療法応答性固形腫瘍（例えば、がん腫または腺がん、例えば、異常なＰＤ−Ｌ１発現、活性、及び／またはシグナル伝達、ならびに／または異常なＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３発現、活性、及び／またはシグナル伝達を伴うがん）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ−３完全長抗体に融合しているＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物を含む有効量の医薬組成物を個体に投与することを含む免疫療法応答性固形腫瘍（例えば、がん腫または腺がん、例えば、異常なＰＤ−Ｌ１発現、活性、及び／またはシグナル伝達、ならびに／または異常なＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３発現、活性、及び／またはシグナル伝達を伴うがん）を治療する方法が提供される。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、結腸直腸、例えば、腺がん、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、黒色腫、または扁平上皮細胞がん、を治療することに適する。
【０２２２】
本発明の医薬組成物の投薬量及び所望の薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて変動し得る。適切な投薬量または投与経路の決定は、十分に通常の技術の範囲内である。動物実験は、ヒトの療法に対する有効用量を決定するための信頼できる指針を提供する。有効用量の種間スケーリングは、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，”Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−４６により定められた原理に従って実施することができる。
【０２２３】
本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＰＤ−Ｌ１構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ投与が使用される時、通常の投薬量は、投与経路に応じて、１日当たり哺乳動物の体重１ｋｇ当たり約１０ｎｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上まで、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約１〜３ｍｇ／ｋｇ／日、約２〜４ｍｇ／ｋｇ／日、約３〜５ｍｇ／ｋｇ／日、約４〜６ｍｇ／ｋｇ／日、約５〜７ｍｇ／ｋｇ／日、約６〜８ｍｇ／ｋｇ／日、約６〜６．５ｍｇ／ｋｇ／日、約６．５〜７ｍｇ／ｋｇ／日、約７〜９ｍｇ／ｋｇ／日、または約８〜１０ｍｇ／ｋｇ／日で変動し得る。異なる製剤が異なる治療及び異なる障害に効果的であること、ならびに特定の器官または組織の治療を目的とする投与が、別の器官または組織に対する投与とは異なる方式での送達を必要とする可能性があることは、本出願の範囲内である。さらに、投薬量は、１回以上の別々の投与によって、または持続注入によって投与されてもよい。数日以上の繰り返し投与の場合、病態に応じて、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで治療を持続させる。しかし、他の投薬レジメンが有用なことがある。この療法の進行は、従来の技術及び解析によって容易に監視される。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回（例えば、ボーラス注射）投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上の回数のいずれか）投与される。複数回投与する場合、それらは、同じまたは異なる経路で実施されてもよく、同じ部位または別の部位で行われてもよい。医薬組成物は、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、毎日、連続的に毎日、週に１回、連続的に毎週、２週間に１回、３週間に１回、月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、７ヶ月に１回、８ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１０ヶ月に１回、１１ヶ月に１回、または年に１回投与されてもよい。投与間隔は、約２４時間〜４８時間、２日間〜３日間、３日間〜５日間、５日間〜１週間、１週間〜２週間、２週間〜１ヶ月、１ヶ月〜２ヶ月、２か月〜３か月、３か月〜６か月、または６か月〜１年のうちのいずれか１つであり得る。間隔は、（例えば、腫瘍の進行に従って）不規則であり得る。いくつかの実施形態では、投与スケジュールに中断はない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、４日ごとに４回投与される。特定の患者に対する最適な投薬量及び治療レジメンは、疾患の徴候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することにより、医学の当業者が容易に決定することができる。
【０２２５】
限定されないが、再構成及び液体製剤を含むこれらに本出願の医薬組成物は、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、静脈内（ｉ．ｖ．）、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路による、ボーラスとしての、またはある期間にわたって連続注入による静脈内投与などの既知の方法に従って、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１構築物を用いる治療を必要とする個体、好ましくは、ヒト、に投与される。構成製剤は、タンパク質が全体に分散されるように、本明細書に記載の凍結乾燥抗ＰＤ−Ｌ１構築物を希釈剤に溶解させることにより調製することができる。本出願での使用に適する例示的な薬学的に許容可能な（ヒトへの投与に安全且つ非毒性）希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸塩−緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液もしくはデキストロース溶液、または塩の水溶液及び／もしくは緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下（すなわち、皮膚の下に）投与によって個体に投与される。そのような目的のために、医薬組成物は、注射器を使用して注射されてもよい。しかし、注射装置；インジェクターペン；自動注射装置、無針装置；及び皮下パッチ送達システムなどの、医薬組成物の投与のための他の装置が利用可能である。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体に静脈内投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物を、静脈内注入などの注入によって個体に投与する。免疫療法のための注入技術は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）を参照のこと）。
【０２２８】
Ｖ．調製方法
本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１単一ドメイン抗体）は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、または本明細書に記載されるように調製されてもよい。実施例１〜２も参照のこと。
【０２２９】
単一ドメイン抗体の調製方法が記載されている。例えば、Ｅｌｓ  Ｐａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，２０１４；９（３）：６７４を参照のこと。単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）は、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、ラクダ科動物種（例えば、ラクダまたはラマ）を免疫化して、そこからハイブリドーマを得ることにより、または、当該技術分野で既知の分子生物学技術及びその後の非選択ライブラリの個々のクローンを用いたＥＬＩＳＡによる選択を使用して単一ドメイン抗体のライブラリをクローニングすることにより、もしくはファージディスプレイを使用することにより、得られてもよい。
【０２３０】
単一ドメイン抗体の組み換え産生のために、単一ドメイン抗体をコードする核酸は、単離され、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。単一ドメイン抗体をコードするＤＮＡは、従来の手技を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定される。多くのベクターは、利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物起源または真核生物（一般に、哺乳類）起源のいずれかのものである。
【０２３１】
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態も提供する。
【０２３２】
実施形態１は、ｓｄＡｂ部分が、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体を含む、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２３３】
実施形態２は、ｓｄＡｂ部分が、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体を含む、実施形態１の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２３４】
実施形態３は、ｓｄＡｂ部分が、以下の：
（１）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（５）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（６）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（７）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（８）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（９）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１０）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１１）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１２）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１３）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１４）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１５）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１６）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１７）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１８）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（１９）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２０）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２１）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２２）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２３）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２４）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２５）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２６）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２７）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２８）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（２９）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３０）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３１）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３２）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３３）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３４）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３５）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３６）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３７）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３８）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（３９）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４０）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体；ならびに
（４１）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４２）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４３）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４４）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４５）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４６）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４７）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４８）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（４９）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号２９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
（５０）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号２００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び、配列番号３００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または、ＣＤＲ領域中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体、
のうちのいずれか１つを含む、実施形態１〜２のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２３５】
実施形態４は、ｓｄＡｂ部分が、
ａ−１）Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ、好ましくは、Ｙ及びＶ、より好ましくは、Ｆ、からなる群より選択される３７位のアミノ酸残基、
ａ−２）Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬ、好ましくは、Ｑ及びＧ、より好ましくは、Ｅ、からなる群より選択される４４位のアミノ酸残基、
ａ−３）Ｌ、Ｒ、及びＣからなる群より選択される４５位のアミノ酸残基、
ａ−４）Ｗ、Ｒ、Ｇ、及びＳからなる群より選択される１０３位のアミノ酸残基、ならびに
ａ−５）Ｑである１０８位のアミノ酸残基、
を含むアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含み、、アミノ酸位置のそれぞれが、Ｋａｂａｔのナンバリングに従う、実施形態１〜３のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２３６】
実施形態５は、ｓｄＡｂ部分が、
ａ−１）Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ、好ましくは、Ｙ及びＶ、より好ましくは、Ｆ、からなる群より選択される３７位のアミノ酸残基、
ａ−２）Ｇ、Ｅ、及びＱからなる群より選択される４４位のアミノ酸残基、
ａ−３）Ｌ及びＲからなる群より選択される４５位のアミノ酸残基、
ａ−４）Ｗ、Ｇ、及びＲからなる群より選択される１０３位のアミノ酸残基、ならびに
ａ−５）Ｑである１０８位のアミノ酸残基、
を含むアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、実施形態４の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２３７】
実施形態６は、ｓｄＡｂ部分が、
ａ−１）Ｆ、Ｙ、及びＶからなる群より選択される３７位のアミノ酸残基、
ａ−２）Ｇ、Ｅ、及びＱからなる群より選択される４４位のアミノ酸残基、
ａ−３）Ｌ及びＲからなる群より選択される４５位のアミノ酸残基、
ａ−４）ＷまたはＧである１０３位のアミノ酸残基；ならびに
ａ−５）任意にＬにヒト化されるＱである１０８位のアミノ酸残基、
を含むアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、実施形態５の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２３８】
実施形態７は、ｓｄＡｂ部分が、
ｂ−１）Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ、好ましくは、Ｙ及びＶ、より好ましくは、Ｆ、からなる群より選択される３７位のアミノ酸残基、
ｂ−２）Ｅ、Ｑ、及びＧからなる群より選択される４４位のアミノ酸残基、
ｂ−３）Ｒである４５位のアミノ酸残基、
ｂ−４）Ｗ、Ｒ、及びＳからなる群より選択される１０３位のアミノ酸残基、ならびに
ｂ−５）Ｑ及びＬからなる群より選択される１０８位のアミノ酸残基、
を含むアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含み、各アミノ酸位置のそれぞれが、Ｋａｂａｔナンバリングに従う、実施形態１〜３のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２３９】
実施形態８は、ｓｄＡｂ部分が、
ｂ−１）Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶからなる群より選択される３７位のアミノ酸残基、
ｂ−２）Ｅ、Ｇ、及びＱからなる群より選択される４４位のアミノ酸残基、
ｂ−３）Ｒである４５位のアミノ酸残基、
ｂ−４）ＷまたはＧである１０３位のアミノ酸残基、ならびに
ｂ−５）任意にＬにヒト化されるＱである１０８位のアミノ酸残基、
を含むアミノ酸配列を有するＶＨＨドメインを含む、実施形態７の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４０】
実施形態９は、ｓｄＡｂ部分が、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または、配列番号３５１〜４００のいずれか１つと、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するその多様体を含む、実施形態１〜８のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４１】
実施形態１０は、ｓｄＡｂ部分が、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメイン中に最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体を含む、実施形態９の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４２】
実施形態１１は、ｓｄＡｂ部分及びＰＤ−Ｌ１間の結合のＫＤが、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍである、実施形態１〜１０のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４３】
実施形態１２は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分が、ラクダ科動物、キメラ、ヒト、部分的ヒト化、または完全ヒト化である、実施形態１〜１１のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４４】
実施形態１３は、単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）である、実施形態１〜１２のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４５】
実施形態１４は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分が、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合している、実施形態１３の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４６】
実施形態１５は、ＨＣＡｂが、単量体または二量体である、実施形態１３または１４の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４７】
実施形態１６は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分が、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１３〜１５のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４８】
実施形態１７は、ＨＣＡｂが、配列番号４０１〜４４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１３〜１５のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２４９】
実施形態１８は、単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物がさらに、第２の抗原を特異的に認識する第２の抗体部分を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５０】
実施形態１９は、第２の抗体部分が、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、ｓｄＡｂ、または抗体模倣物である、実施形態１８の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５１】
実施形態２０は、抗ＰＤ−Ｌ１構築物が、単一特異性または多重特異性である、実施形態１８または１９の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５２】
実施形態２１は、第２の抗体部分が、ｓｄＡｂである、実施形態１８〜２０のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５３】
実施形態２２は、第２の抗原が、ＰＤ−Ｌ１である、実施形態１８〜２１のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５４】
実施形態２３は、単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する３つ以上のｓｄＡｂを含む、実施形態２２の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５５】
実施形態２４は、第２の抗体が、配列番号３５１〜４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態２２または２３の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５６】
実施形態２５は、第２の抗原が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、実施形態１８〜２１のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５７】
実施形態２６は、第２の抗原が、ＣＴＬＡ−４であり、第２の抗体が、抗ＣＴＬＡ−４  ｓｄＡｂである、実施形態１８〜２１のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５８】
実施形態２７は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分が、第２の抗体部分のアミノ（Ｎ）末端及び／またはカルボキシ（Ｃ）末端である、実施形態１８〜２６のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２５９】
実施形態２８は、第２の抗体部分が、完全長抗体である、実施形態１８〜２１のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２６０】
実施形態２９は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のアミノ（Ｎ）末端が、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのカルボキシ（Ｃ）末端に融合している、実施形態２８の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２６１】
実施形態３０は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端が、完全長抗体の重鎖のうちの少なくとも１つのＮ末端に融合している、実施形態２８の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２６２】
実施形態３１は、完全長抗体が、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、及びＬＡＧ−３からなる群より選択されるポリペプチドを特異的に認識する、実施形態２８〜３０のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２６３】
実施形態３２は、ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識されるＰＤ−Ｌ１が、配列番号４４１または配列番号４４２のアミノ酸配列を含む、実施形態２８〜３０のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２６４】
実施形態３３は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び第２の抗体部分が任意に、ペプチドリンカーで連結されており、実施形態２８〜３０のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２６５】
実施形態３４は、ペプチドリンカーが、配列番号４４３〜４４５のアミノ酸配列を含む、実施形態３３の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２６６】
実施形態３５は、実施形態１〜３４のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物と競合的にＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、第２の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物である。
【０２６７】
実施形態３６は、実施形態３５の第２の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物であり、第２の単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物が、配列番号５１〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体；配列番号１５１〜２００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体；及び、配列番号２５１〜３００のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大約３つのアミノ酸置換を含むその多様体を含む。
【０２６８】
実施形態３７は、実施形態１〜３６のいずれか１つの単離された抗ＰＤ−Ｌ１構築物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【０２６９】
実施形態３８は、有効量の実施形態３７の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を必要とする対象において、ＰＤ−Ｌ１関連疾患を有する個体を治療する方法である。
【０２７０】
実施形態３９は、ＰＤ−Ｌ１関連疾患が、がんである、実施形態３８の方法である。
【０２７１】
実施形態４０は、がんが、固形腫瘍である、実施形態３９の方法である。
【０２７２】
実施形態４１は、がんが、結腸がんである、実施形態３９または４０の方法である。
【０２７３】
実施形態４２は、さらに、追加のがん療法を個体に投与することを含む、実施形態３９〜４１のいずれか１つの方法である。
【０２７４】
実施形態４３は、追加のがん療法が、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせである、実施形態４２の方法である。
【０２７５】
実施形態４４は、ＰＤ−Ｌ１関連疾患が、病原性感染症である、実施形態３８の方法である。
【０２７６】
実施形態４５は、医薬組成物が、全身的または局所的に投与される、実施形態３８〜４４のいずれか１つの方法である。
【０２７７】
実施形態４６は、医薬組成物が、静脈内投与される、実施形態４５の方法である。
【０２７８】
実施形態４７は、医薬組成物が、腫瘍内投与される、実施形態４５の方法である。
【０２７９】
実施形態４８は、個体が、ヒトである、実施形態３８〜４７のいずれか１つの方法である。
【実施例】
【０２８０】
以下の実施例は、単に本発明の例示となるよう意図されており、したがって、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例と詳細な説明は、例示として提供するものであり、制限するものではない。
【０２８１】
実施例１：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂｓの生成
免疫
現在の全ての動物福祉規制の下で、２つのラマを組み換えＰＤ−Ｌ１ＥＣＤタンパク質で免疫化した。免疫化のために、ＣＦＡ（一次免疫）またはＩＦＡ（追加免疫）を含むエマルジョンとして、抗原を製剤化した。抗原を頸部筋肉内にダブルスポット注射で投与した。各動物は、注射を週間隔で、１００μｇのＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤを含むエマルジョンの２回の注射、及び後続の５０μｇの抗原を含有する４回の注射を受けた。免疫化中の異なる時点で、１０ｍｌの血液サンプルを動物から収集し、血清を調製した。固定されたＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤタンパク質を用いたＥＬＩＳＡベースの実験で血清サンプルを使用して、抗原特異的体液性免疫応答の誘導を確認した（図１及び２）。最後の免疫化の５日後、３００ｍｌの血液サンプルを収集した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅグラジエント（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ラマ重鎖免疫グロブリン（ＨＣＡｂ）の遺伝源としての末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、３００ｍｌの血液サンプルから単離し、１×１０９のＰＢＬを得た。抗体の最大の多様性は、サンプリングされたＢリンパ球の数に等しいと予想され、これは、ＰＢＬの数の約１０％（１×１０８）である。ラマの重鎖抗体の割合は、Ｂリンパ球の数の最大２０％である。それ故、３００ｍｌの血液サンプルにおけるＨＣＡｂの最大多様性は、２×１０７の異なる分子として計算される。
【０２８２】
ライブラリ作成
ＰＢＬ及びリンパ節から抽出されたＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲの出発材料として使用して、ｓｄＡｂコード遺伝子フラグメントを増幅した。これらのフラグメントを、社内のファージミドベクターにクローン化した。ｓｄＡｂコード配列のフレーム内で、ベクターはＣ末端（Ｈｉｓ）６タグをコードした。ライブラリのサイズは、１×１０９以上である。ライブラリファージを標準プロトコルに従って調製し、さらに使用するために４℃で滅菌濾過した後に保存した。
【０２８３】
選択及びハイスループットスクリーニング
固相パニング及び細胞ベースパニングを使用して、選択を上記のライブラリで実行した。単一ラウンドを両方の条件に対し実施した。濃縮因子（＃対照に対して溶出液中に存在するファージ）、多様性、及びＰＤ−Ｌ１陽性クローン（ＥＬＩＳＡ）の割合について、各選択アウトプットを分析した。これらのパラメータに基づいて、さらなる分析のための最良の選択を選んだ。この目的のために、ハイスループットスクリーニングのためのプールとして、各選択からのアウトプットを可溶性発現ベクターに再クローン化した。ｓｄＡｂコード配列のフレーム内で、ベクターはＣ末端（Ｈｉｓ）６タグをコードした。コロニーを採取し、９６ディープウェルプレート（１ｍｌ体積）で成長させ、上清中のｓｄＡｂ発現のためにＩＰＴＧ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎを添加することにより誘導した。
【０２８４】
ＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤタンパク質（ＥＬＩＳＡによる）及びＰＤ−Ｌ１安定細胞株（ＦＡＣＳによる）に結合する能力について、上清を分析した。陽性バインダーを配列決定し、さらなる特徴づけのためにユニークなクローンを選択した。
【０２８５】
ユニークなクローンを２ＸＹＴ培地で成長させ、ＩＰＴＧにより、上清中のｓｄＡｂ発現を誘導した。ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１相互作用を抑制する能力について、ユニークなバインダーの上清を分析した。この目的のために、上清をＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤタンパク質と共にインキュベートし、次に、結合評価のために複合体をＰＤ−１安定細胞株に添加した。ＰＤ−１細胞株に負のシグナルを有するｓｄＡｂは、ＰＤ−Ｌ１阻害剤とみなされる。
【０２８６】
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、オフレート分析のために、全ての潜在的な阻害剤を選択した。解離フェーズを使用して、個々のｓｄＡｂに対するｋｏｆｆ値を計算した。
【０２８７】
ｓｄＡｂ産生
Ｈｉｓ６タグ付きｓｄＡｂを、ＡＫＴＡによってペリプラズム抽出物から精製した。ＮＴＡ樹脂を製造者の使用説明書に従って処理した。調製されたペリプラズム抽出物を、回転装置上で樹脂と共に室温で３０分間インキュベートした。樹脂をＰＢＳで洗浄し、カラムに移した。充填された樹脂を、１５ｍＭのイミダゾールで洗浄した。１５０ｍＭのイミダゾールを使用して、ｓｄＡｂｓをカラムから溶出させた。溶出した画分を、Ｈｙｂｏｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅにスポットすることにより分析し、Ｐｏｎｃｅａｕで視覚化した。タンパク質を含む画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。透析されたタンパク質を収集し、滅菌濾過し、濃度測定し、−２０℃で保存した。
【０２８８】
純度を決定するために、タンパク質サンプルを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。１０μｌのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を１０μｌ（２μｇ）の精製タンパク質に添加し、次に、サンプルを９５℃で１０分間加熱し、冷却し、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一般的な手順に従ってゲルを処理し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。
【０２８９】
ＨＣＡｂ産生
ヒトＦｃ領域とのｓｄＡｂｓの融合によって、ＨＣＡｂ構築物を生成した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性発現及び精製のために、ＨＣＡｂ構築物のマキシプレップを調製した。プロテインＡアガロース樹脂を含むカラム、続いて、サイズ排除カラムを介したクロマトグラフィーにより、発現されたＨＣＡｂを精製した。
【０２９０】
純度を決定するために、タンパク質サンプルを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。１０μｌのＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を１０μｌ（２μｇ）の精製タンパク質に添加し、次に、サンプルを９５℃で１０分間加熱し、冷却し、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一般的な手順に従ってゲルを処理し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。精製されたＨＣＡｂの純度は、８５％を超える。データを表２０にまとめた。
表２０．ＨＣＡｂ精製の概要
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【０２９１】
ｓｄＡｂ親和性決定及びＨＣＡｂ親和性決定
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、各ｓｄＡｂ及びＨＣＡｂの親和定数（Ｋｄ）を決定した。要約すると、ＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓは、１００ＲＵ以下の密度でＣＭ５センサーチップにアミン結合させた。０．３３〜２７ｎＭの５つの異なる濃度で、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂまたは抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂを注射した。流量は、全ての実験で３０μｌ／分であった。会合期及び解離期は、それぞれ５分及び１０分であった。グリシン／ＨＣｌ  ｐＨ１．５を使用して、チップを再生した。異なる濃度のｓｄＡｂ及びＨＣＡｂの結合曲線を使用して、動力学的パラメータｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫＤを計算した（図３Ａ〜３Ｎ及び図４Ａ〜４Ｎ）。動力学的データを表３及び表４にまとめた。
表３  ＰＤ−Ｌ１に対するｓｄＡｂの親和性決定
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表４  ＰＤ−Ｌ１に対するＨＣＡｂの親和性決定
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＊ｋｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で測定することができる範囲外である。
【０２９２】
標的結合アッセイ
表面プラズモン共鳴法（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））、酵素結合免疫吸着アッセイ、蛍光支援細胞選別法（ＦＡＣＳ）、またはそれらの組み合わせを使用して、精製された抗原結合タンパク質がＰＤ−Ｌ１に結合する能力を決定する。分析は、ＰＤ−Ｌ１トランスフェクト細胞で実施することができる。
【０２９３】
ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を接着培養フラスコから分離し、様々な濃度の抗体及び一定濃度の抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂまたはＨＣＡｂ（９６ウェルプレート中）と混合した。Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体陽性対照として使用した。抗体及び細胞のインキュベーションを室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％のＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体を添加し、室温で１５分間インキュベートした。細胞を再度ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。非線形回帰を使用して、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）でデータを分析し、ＥＣ５０値を計算した（図５Ａ及び５Ｂ）。
【０２９４】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の抑制
フローサイトメトリーを使用して、リガンド結合の遮断を研究した。抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ評価のために、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を、接着培養フラスコから分離し、様々な濃度の抗体及び一定濃度のビオチン標識ｈＰＤ−１／Ｆｃタンパク質と混合した（両方とも、９６−ウェルプレート中で）。Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体陽性対照として使用した。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％のＢＳＡを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体を添加し、室温で１５分間インキュベートした。細胞を再度ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。非線形回帰を使用して、データをＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）で分析し、ＩＣ５０値を計算した。図６Ａ及び６Ｂからわかるように、競合アッセイは、低濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）のＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１相互作用の効率的抑制における大部分の抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂの能力を示し、大部分のＨＣＡｂのＩＣ５０は、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）に匹敵する。
【０２９５】
ＰＤ−Ｌ１ベースの遮断アッセイ
抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ及びＨＣＡｂ評価のためのＰＤ−１遮断を評価するために、ＣＨＯ−Ｋ１の安定発現ＰＤ−Ｌ１細胞及びＪｕｒｋａｔエフェクター細胞を使用する。エフェクター細胞は、ＰＤ−Ｌ１細胞がＰＤ−１を発現するエフェクター細胞と混合される時など、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１受容体−リガンド相互作用の破壊時に誘導されるルシフェラーゼ構築物を含む。したがって、抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ及びＨＣＡｂによるＣＨＯ−Ｋ１安定細胞上のＰＤ−Ｌ１の抑制の有効性は、ルシフェラーゼレポーター活性を測定することにより評価することができる。アッセイを次のように実施する。
【０２９６】
１日目に、ＰＤ−Ｌ１細胞を、細胞がちょうど解凍されるまで（約３〜４分）、３７℃の水浴で解凍し、０．５ｍＬの解凍された細胞を、１４．５ｍＬの細胞回収培地（１０％のＦＢＳ／Ｆ−１２）に移す。チューブを１〜２回静かに反転させることにより、細胞懸濁液をよく混合する。次に、細胞懸濁液を、滅菌試薬リザーバーに移し、ウェルあたり２５μＬの細胞懸濁液と共にアッセイプレートに分注する。ウェルあたり１００μＬのアッセイ培地を、ブランク対照として添加する。ウェルあたり１００μＬの細胞回収培地を、ブランク対照として機能するウェル用に添加する。次に、プレートに蓋をし、３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩インキュベートする。
【０２９７】
アッセイ当日に、新鮮なアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ  １６４０＋１％のＦＢＳ）を調製する。対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、ｓｄＡｂ、またはＨＣＡｂのそれぞれについて、アッセイ緩衝液中で、８点連続希釈を実施する。完全な用量反応曲線を達成するために、開始濃度及び希釈スキームを最適化する。ＰＤ−Ｌ１細胞を含むアッセイプレートを、ＣＯ２インキュベーターから回収する。全てのウェルから、ウェルあたり９５μｌの培地を除去する。ＰＤ−Ｌ１細胞を含むウェルに、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体または抗原結合タンパク質の連続希釈液を、ウェルあたり４０μＬを添加する。各プレートのブランク対照ウェルに、ウェルあたり８０μＬのアッセイ緩衝液を添加する。
【０２９８】
次に、細胞がちょうど解凍されるまで（約３〜４分）、ＰＤ−１エフェクター細胞を、３７℃の水浴で解凍する。上下にピペッティングすることにより、細胞懸濁液をバイアル中で穏やかに混合し、０．５ｍＬの細胞を５．９ｍＬのアッセイ緩衝液に添加する。チューブを１〜２回静かに反転させることにより、細胞懸濁液をよく混合する。次に、細胞懸濁液を、滅菌試薬リザーバーに移し、ＰＤ−１細胞及び対照抗体または二重特異性抗原結合タンパク質を含む各ウェルに、４０μＬの細胞懸濁液を分注する。プレートに蓋をして、ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で６時間インキュベートする。
【０２９９】
基質を含むボトルに１本の緩衝液を移すことにより、ルシフェラーゼアッセイシステムを再構成する。システムを室温で保管し、同日使用のために遮光する。６時間の誘導後に、アッセイプレートを、ＣＯ２インキュベーターから取り出し、周囲温度で５〜１０分間平衡化する。８０μＬの試薬を各ウェルに添加する。プレートを周囲温度で５〜１０分間インキュベートする。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）またはグロータイプの発光読み取り機能を備えたプレートリーダーで、発光を測定する。
【０３００】
発光は、相対光単位（ＲＬＵ）で表される。希釈された抗体または二重特異性抗原結合タンパク質を有するウェルのＲＬＵ値を、抗体または二重特異性抗原結合タンパク質を含まない対照のＲＬＵに正規化して、ルシフェラーゼ誘導の倍を得る。データを、ＲＬＵ対、抗体または二重特異性抗原結合タンパク質の濃度のＬｏｇ１０、及び、誘導のフォールド対、抗体または二重特異性抗原結合タンパク質の濃度のＬｏｇ１０としてグラフ化する。データを曲線にフィッティングさせ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍなどのカーブフィッティングソフトウェアを使用して、各二重特異性抗原結合タンパク質及び対照抗ＰＤ−１抗体のＥＣ５０を決定する（図７Ａ〜７Ｏ及び図８Ａ〜８Ｏ、表５及び６）。
表５  ｓｄＡｂのＰＤ−Ｌ１ベースの遮断アッセイのＥＣ５０
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表６  ＨＣＡｂのＰＤ−Ｌ１ベースの遮断アッセイのＥＣ５０
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【０３０１】
例２：抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂのヒト化
５つの抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｄＡｂ（ＡＳ０６７３０、ＡＳ０６７５０、ＡＳ１１９４８、ＡＳ０６６１７、及びＡＳ０６６７５）を、ヒト化のために選択した。最高程度の相同性を共有する５つの最も近いヒト生殖系列配列と、野生型ラクダ科動物ｓｄＡｂのタンパク質配列をアラインした。最良のヒト生殖系列配列を、ヒト受容体として選択した。ホモロジーモデルを作製した。モデル分析データに従って、抗原結合または抗体足場形成に潜在的に重要な残基をそのまま残したが、残りをヒト対応物への変換について選択した。最初に、４つの配列最適化された多様体のパネルを生成した（ステージ１）。これらの多様体を多数のパラメータについて分析し、得られた結果を使用して、ｓｄＡｂの２番目のセットを設計した（ステージ２）。各野生型ｓｄＡｂに対して、結合、安定性、及び機能評価のために、１〜９つのヒト化ｓｄＡｂを設計し、それらの配列アラインメントを図９Ａ〜９Ｅに示す。
【０３０２】
ヒト化ＨＣＡｂ産生
ヒトＦｃ領域とのｓｄＡｂｓの融合によって、ＨＣＡｂ構築物を生成した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性発現及び精製のために、ＨＣＡｂ構築物のマキシプレップを調製した。プロテインＡアガロース樹脂を含むカラム、続いて、サイズ排除カラムを介したクロマトグラフィーにより、発現されたＨＣＡｂを精製した。
【０３０３】
ヒト化ＨＣＡｂの親和性ランキング
ＣＭ５（Ｂｉａｃｏｒｅ）センサーチップにコーティングされた組み換えヒトＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓタンパク質（Ｒ＆Ｄシステム）を使用して、ＰＤ−Ｌ１への各ヒト化ＨＣＡｂの結合動態を決定する。表面プラズモン共鳴を使用して、各抗原結合タンパク質を、抗原コーティングされたチップ上に流す。あるいは、各抗原結合タンパク質をＣＭ５センサーチップに捕捉し、その上に、ヒトＰＤ−１−Ｈｉｓタンパク質を適用する。親ＨＣＡｂの結合親和性に匹敵するヒト化クローンの結合親和性を、さらなる特徴について選択した（表７〜１１）。
表７  ヒト化ｓｄＡｂの親和性ランキング（ＡＳ０６７３０）
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表８  ヒト化ｓｄＡｂの親和性ランキング（ＡＳ０６７５０）
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表９  ヒト化ｓｄＡｂの親和性ランキング（ＡＳ１１９４８）
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表１０  ヒト化ｓｄＡｂの親和性ランキング（ＡＳ０６６１７）
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表１１  ヒト化ｓｄＡｂの親和性ランキング（ＡＳ０６７７５）
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【０３０４】
親和性決定
ＡＳ０６７３０Ｓ、ＡＳ０６７３０ＳＶＨ３ａ、ＡＳ０６７３０ＳＶＨ１２、ＡＳ０６７３０ＡＶＨ１２Ｍ８、ＡＳ０６７３０ＳＶＨ１２Ｍ９、ＡＳ０６７５０ＶＨ２、ＡＳ０６７５０ＶＨ１１、ＡＳ０６７５０ＶＨ４、ＡＳ１１９４８Ｓ、ＡＳ１１９４８ＳＶＨ１２、ＡＳ１１９４８ＳＶ１２Ｍ８、ＡＳ１１９４８ＳＶ１２Ｍ９、ＡＳ０６６１７ＶＨ１１、ＡＳ０６７７５ＶＨ１１、及びＡＳ０６７７５ＶＨ４を、親和性決定のために選択した。各ＨＣＡｂの親和定数（Ｋｄ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で決定した。要約すると、ＨＣＡｂ親和性決定のほとんどについて、ＰＤ−Ｌ１  Ｈｉｓを、１００ＲＵ以下の密度で、ＣＭ５センサーチップにアミン結合させた。０．１１ｎＭ〜２７ｎＭの５つの異なる濃度の抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂを注入した。流量は、全ての実験で３０μｌ／分であった。会合期及び解離期は、それぞれ５分及び１０分であった。グリシン／ＨＣｌ  ｐＨ１．５を使用して、チップを再生した。ＡＳ０６７３０ＳＶＨ１２、ＡＳ０６７３０ＳＶＨ１２Ｍ８、ＡＳ０６７３０ＶＨ１２Ｍ９、ＡＳ１１９４８ＳＶ１２、ＡＳ１１９４８ＳＶ１２Ｍ８、及びＡＳ１１９４８ＳＶ１２Ｍ９ＨＣＡｂｓの親和性の測定では、抗ヒトＩｇＧ抗体によって、１００ＲＵ以下の密度でＣＭ５センサーチップに抗ＰＤ−Ｌ１ＨＣＡｂを捕捉させた。０．３３〜２７ｎＭの５つの異なる濃度で、抗ＰＤ−Ｌ１Ｈｉｓを注入した。流量は、全ての実験で３０μｌ／分であった。会合及び解離段階は、５分であった。異なる濃度のＨＣＡｂでの結合曲線を使用して、動態パラメータｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを計算した（図１０Ａ〜１０Ｔ）。動力学的データを表１２及び表１３にまとめた。
表１２．ヒト化ＨＣＡｂの親和性パラメータ
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表１３．ヒト化ＨＣＡｂの親和性パラメータ
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ＰＤ−Ｌ１ベースの遮断アッセイ
実施例１に記載されるように、ＰＤ−Ｌ１ベースの遮断アッセイを実施した。図１１Ａ〜１１Ｑからわかるように、選択された全てのヒト化抗ＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂは、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−１間の結合を抑制する点でＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）に匹敵する。ＥＣ５０データを、表１４にまとめた。
表１４  ＨＣＡｂのＰＤ−Ｌ１ベースの遮断アッセイのＥＣ５０
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【０３０５】
ヒト化ＨＣＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
ここで提示される研究では、マウス腫瘍モデルに対するＰＤ−Ｌ１  ＨＣＡｂ遮断の有効性を調査した。ＰＤ−Ｌ１相互作用の抑制は、抗腫瘍ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を回復することによって治療効果を発揮することが提案され、それにより、前臨床有効性試験を、宿主の免疫系が完全にインタクトである同系マウス腫瘍モデルで行った。ヒトＰＤ−１トランスジェニックマウスを使用した。
この研究では、マウスの右脇腹に１×１０６のヒトＰＤ−Ｌ１過剰発現ＭＣ３８結腸がん細胞を皮下接種した。腫瘍が約１００ｍｍ３の平均体積に達した時、マウスを治療グループに分類した（ｎ＝５）（研究日０として定義される）。この研究で試験された６つのヒト化ＨＣＡｂは：ＡＳ０６７３０ＱＶＨ１、ＡＳ０６７５０ＶＨ１１、ＡＳ１１９４８ＳＶＨ１２、ＡＳ０６６１７ＶＨ１１、ＡＳ０６６１７ＶＨ１１、ＡＳ１１９４８ＱＶＨ１及びＡＳ０６７７５ＶＨ１１であった。グループに、０、２、５、７、９、及び１２日目に、ベンチマーク抗体ＭＥＤＩ４７３６（１０ｍｇ／ｋｇ）またはヒト化ＨＣＡｂ（５．３３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。対照グループを、１０ｍｌ／ｋｇのＰＢＳで治療した。研究期間中、腫瘍を週に２回測定した。全ての治療群は、対照群と比較した時、有意な有効性（Ｐ＜０．０５０）を示した（図１２）。これらの観察結果は、抗腫瘍ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を引き起こすための効果的な戦略としての抗ＰＤ−Ｌ１療法を支持する。
表１５：単離されたｓｄＡｂのＣＤＲ
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ＩＤ：配列番号
表１６：フレームワーク領域１及び２
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ＩＤ：配列番号；ＦＲ：フレームワーク領域
表１７：フレームワーク領域３及び４
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ＩＤ：配列番号；ＦＲ：フレームワーク領域
表１８：ｓｄＡｂ
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ＩＤ：配列番号
表１９：ＨＣＡｂ
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図７Ｎ】
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【図７Ｏ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図８Ｎ】
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【図８Ｏ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１０Ｐ】
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【図１０Ｑ】
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【図１０Ｒ】
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【図１０Ｓ】
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【図１０Ｔ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
2021503455.tif 000155
【図１１Ｌ】
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【図１１Ｍ】
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【図１１Ｎ】
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【図１１Ｏ】
2021503455.tif 000159
【図１１Ｐ】
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【図１１Ｑ】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021503455.tif 000163
2021503455.tif 000164
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