(57)【要約】  腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するため、又は骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制することによって前記腫瘍の微小環境を変化させるための遺伝子改変ＮＫＴ細胞の組成物、方法及び使用が提示される。一部の実施形態では、ナイーブＮＫＴ細胞が腫瘍を有する患者から入手され、キメラタンパク質、Ｔ細胞受容体、内因性Ｔ細胞受容体と置換するハイブリッドＴ細胞受容体又はＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの１つを含むために遺伝子組み換えられる。前記ナイーブ若しくは遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、前記腫瘍に対する免疫応答を誘発及び／又はブーストするために癌患者に投与され得る。
2021520184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片、２）細胞内活性化ドメイン、及び３）前記細胞外一本鎖変異断片を前記細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを有するキメラタンパク質をコードする組換え核酸を含む、遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２】
前記組換え核酸は：
前記腫瘍ネオエピトープ、前記腫瘍関連抗原若しくは前記自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片をコードする第１核酸セグメント；
細胞内活性化ドメインをコードする第２核酸セグメント；
前記細胞外一本鎖変異断片と前記細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３核酸セグメントを含み、及び
前記第１、第２及び第３セグメントは、前記細胞外一本鎖変異断片、前記細胞内活性化ドメイン及び前記リンカーが単一キメラポリペプチドを形成するように配列されている、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項３】
前記細胞外一本鎖変異断片は、前記腫瘍ネオエピトープ、前記腫瘍関連抗原若しくは前記自己脂質に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項４】
前記細胞外一本鎖変異体は、前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとの間のスペーサーを更に含む、請求項３に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項５】
ＣＤ１ｄへ特異的に結合するＴ細胞受容体を更に含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項６】
前記ＮＫＴ細胞は、Ｖα２４−Ｊα１８  Ｔ細胞受容体を含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項７】
前記細胞内活性化ドメインは、前記ＮＫＴ細胞内でＩＴＡＭ媒介性シグナリングを誘発する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項８】
前記細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部分を含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項９】
前記細胞内活性化ドメインは、ＣＤ２８活性化ドメインの一部分を更に含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１０】
前記リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１１】
前記腫瘍エピトープは、患者特異的及び腫瘍特異的である、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１２】
前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１４】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含む、請求項１３に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１５】
Ｔ細胞受容体β遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１６】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含む、請求項１３に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１７】
前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の前記部分の前記少なくとも１つと標的化ゲノム編集ヌクレアーゼによって置換する、請求項１２に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１８】
前記標的化ゲノム編集ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１７に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１９】
α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分を有するタンパク質錯体をコードする組換え核酸であって、前記α鎖Ｔ細胞受容体若しくはβ鎖Ｔ細胞受容体の少なくとも一部分は、患者特異的、腫瘍特異的なネオエピトープ、腫瘍関連抗原又は自己脂質に対して特異的である組換え核酸を含む、遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２０】
前記組換え核酸は：
α鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体をコードする第１核酸セグメントであって、前記α鎖及びβ鎖受容体が第１自己切断型２Ａペプチド配列によって分離されている第１核酸セグメント；
ＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分をコードする第２核酸セグメントであって、ＣＤ３δの前記少なくとも一部分及びＣＤ３γの前記少なくとも一部分が第２自己切断型２Ａペプチド配列によって分離されている第２核酸セグメントを含み；及び
前記α鎖Ｔ細胞受容体及び前記β鎖Ｔ細胞受容体の少なくとも１つは、患者特異的、腫瘍特異的なネオエピトープ又は腫瘍関連抗原又はＣＤ１−脂質抗原錯体へ一緒に特異的に結合する、請求項１９に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２１】
前記第１核酸セグメント及び前記第２核酸セグメントは、第３自己切断型２Ａペプチド配列によって分離されている、請求項１９に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２２】
ＣＤ３γの前記部分又はＣＤ３δの前記部分の少なくとも１つは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項１９に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２３】
ＣＤ１ｄへ特異的に結合するＴ細胞受容体を更に含む、請求項１９に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２４】
前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する、請求項１９に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２５】
Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項２４に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２６】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含む、請求項２５に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２７】
Ｔ細胞受容体β遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項２４に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２８】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含む、請求項２６に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２９】
前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の前記部分の前記少なくとも１つと標的化ゲノム編集ヌクレアーゼによって置換する、請求項２５に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項３０】
前記標的化ゲノム編集ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項２９に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項３１】
腫瘍を有する患者においてＮＫＴ細胞免疫応答を誘導する方法であって、
前記患者から複数のＮＫＴ細胞を含む体液を入手する工程：
前記複数のＮＫＴ細胞に特異的である結合分子を使用して前記ＮＫＴ細胞を濃縮する工程；
前記ＮＫＴ細胞の集団をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させる工程；及び
前記腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するために効果的である用量及びスケジュールで前記増殖したＮＫＴ細胞を前記患者に投与する工程を含む方法。
【請求項３２】
前記結合分子は、Ｖα−２４に対する抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記結合分子は、ＣＤ１ｄの一部分、脂質抗原と結合したＣＤ１ｄの一部分及びペプチド抗原と結合したＣＤ１ｄの一部分から成る群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＣＤ１ｄの一部分及びＶα−２４に対する抗体の少なくとも１つを使用して前記ＮＫＴ細胞を更に濃縮する工程を更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記増殖させる工程は、前記濃縮したＮＫＴ細胞をサイトカインで処置する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１から成る群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍の表面上でＣＤ１ｄを発現する状況を前記腫瘍に提供する工程を更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記状況は、ＣＤ１ｄをコードする第１核酸セグメントを含む核酸組成物を導入する工程を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸組成物は、ｐ９９をコードする第２核酸セグメントを更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記状況は、前記腫瘍へのストレス状況を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記状況は、前記腫瘍内でのＣＤ１ｄ発現を増加させるためにＨＤＡＣの阻害剤を投与する工程を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＮＫＴ細胞は、次の：Ｆａｓリガンド及びＣＤ４０リガンドの少なくとも１つを発現するように遺伝子改変されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍に対する前記ＮＫＴ細胞免疫応答は、前記腫瘍のサイズを低減させることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍に対する前記ＮＫＴ細胞免疫応答は、骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍を有する患者における骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制する方法であって：
骨髄由来サプレッサー細胞の前記活性を抑制するために有効な用量及びスケジュールで複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞を前記患者に投与する工程を含み；及び
前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞がＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つを発現する方法。
【請求項４６】
前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つをコードする組換え核酸を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記腫瘍の表面上でＣＤ１ｄを発現する状況を前記腫瘍に提供する工程を更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記状況は、ＣＤ１ｄをコードする第１核酸セグメントを含む核酸組成物を導入する工程を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸組成物は、ｐ９９をコードする第２核酸セグメントを更に含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記状況は、前記腫瘍へのストレス状況を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記状況は、前記腫瘍内でのＣＤ１ｄ発現を増加させるためにＨＤＡＣの阻害剤を投与する工程を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
腫瘍を有する患者においてＮＫＴ細胞免疫応答を誘導する方法であって：
１）腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片、２）細胞内活性化ドメイン、及び３）前記細胞外一本鎖変異断片を前記細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを有するキメラタンパク質をコードする組換え核酸を含む遺伝子組換えＮＫＴ細胞を提供する工程；及び
前記腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するために効果的である用量及びスケジュールで前記患者に前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程を含む方法。
【請求項５４】
前記組換え核酸は：
前記腫瘍ネオエピトープ、前記腫瘍関連抗原若しくは前記自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片をコードする第１核酸セグメント；
細胞内活性化ドメインをコードする第２核酸セグメント；
前記細胞外一本鎖変異断片と前記細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３核酸セグメントを含み；及び
前記第１、第２及び第３セグメントは、前記細胞外一本鎖変異断片、前記細胞内活性化ドメイン及び前記リンカーが単一キメラポリペプチドを形成するように配列されている、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞外一本鎖変異断片は、前記腫瘍ネオエピトープ、前記腫瘍関連抗原若しくは前記自己脂質に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞外一本鎖変異体は、前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとの間のスペーサーを更に含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄへ特異的に結合するＴ細胞受容体を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＮＫＴ細胞は、Ｖα２４−Ｊα１８  Ｔ細胞受容体を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記細胞内活性化ドメインは、前記ＮＫＴ細胞内でＩＴＡＭ媒介性シグナリングを誘発する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部分を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞内活性化ドメインは、ＣＤ２８活性化ドメインの一部分を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
前記リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６３】
前記腫瘍に対する前記ＮＫＴ細胞免疫応答は、前記腫瘍のサイズを低減させること、又は骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
骨髄由来サプレッサー細胞の前記活性は、骨髄由来サプレッサー細胞の細胞死を誘導することによって抑制される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
前記組換え核酸は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つを更にコードする、請求項５３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つをコードする別の組換え核酸を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６７】
前記腫瘍の表面上でＣＤ１ｄを発現する状況を前記腫瘍に提供する工程を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６８】
前記状況は、ＣＤ１ｄをコードする第１核酸セグメントを含む核酸組成物を導入する工程を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記核酸組成物は、ｐ９９をコードする第２核酸セグメントを更に含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記状況は、前記腫瘍へのストレス状況を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記状況は、前記腫瘍内でのＣＤ１ｄ発現を増加させるためにＨＤＡＣの阻害剤を投与する工程を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記患者の体液からＮＫＴ細胞を入手する工程を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＮＫＴ細胞は、Ｖα−２４に対する抗体、ＣＤ１ｄの一部分、脂質抗原と結合したＣＤ１ｄの一部分及びペプチド抗原と結合したＣＤ１ｄの一部分の少なくとも１つを使用して前記体液から入手される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ＣＤ１ｄの一部分又はＶα−２４に対する抗体を使用して前記ＮＫＴ細胞を濃縮する工程を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項７５】
ｅｘ  ｖｉｖｏで前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞の集団を増殖させる工程を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項７６】
前記増殖させる工程は、前記濃縮したＮＫＴ細胞をサイトカインで処置する工程を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１から成る群から選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する、請求項５３に記載の方法。
【請求項７９】
Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
Ｔ細胞受容体β遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８２】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
腫瘍を有する患者においてＮＫＴ細胞免疫応答を誘導する方法であって：
α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分を有するタンパク質錯体をコードする組換え核酸をコードする組換え核酸を含む遺伝子組換えＮＫＴ細胞を提供する工程；及び
前記腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するために効果的である用量及びスケジュールで前記患者に前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程を含む方法。
【請求項８４】
前記第１核酸セグメント及び前記第２核酸セグメントは、自己切断型２Ａペプチドをコードする第３核酸セグメントによって分離されている、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ＣＤ３γの前記部分又はＣＤ３δの前記部分は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
ＣＤ１ｄへ特異的に結合するＴ細胞受容体を更に含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
サイトカイン誘導性キラー細胞を前記遺伝子組換えＮＫＴ細胞と共投与する工程を更に含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記腫瘍に対する前記ＮＫＴ細胞免疫応答は、前記腫瘍のサイズを低減させること、又は骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制することを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
前記組換え核酸は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つをコードする、請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つをコードする別の組換え核酸を更に含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
前記腫瘍の表面上でＣＤ１ｄを発現する状況を前記腫瘍に提供する工程を更に含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項９２】
前記状況は、ＣＤ１ｄをコードする第１核酸セグメントを含む核酸組成物を導入する工程を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記核酸組成物は、ｐ９９をコードする第２核酸セグメントを更に含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記状況は、前記腫瘍へのストレス状況を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記状況は、前記腫瘍内でのＣＤ１ｄ発現を増加させるためにＨＤＡＣの阻害剤を投与する工程を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する、請求項８３に記載の方法。
【請求項９７】
Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
Ｔ細胞受容体β遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の前記部分の前記少なくとも１つと標的化ゲノム編集ヌクレアーゼによって置換する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記標的化ゲノム編集ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分と置換して第１可変ドメインをコードする第１組換え核酸配列及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分と置換して第２可変ドメインをコードする第２組換え核酸配列を含み、前記第１及び第２ドメインが患者特異的、腫瘍特異的なネオエピトープ若しくは腫瘍関連抗原に特異的な結合モチーフを集合的に形成する遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１０４】
Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項１０３に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１０５】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含む、請求項１０４に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１０６】
Ｔ細胞受容体β遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項１０５に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１０７】
Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含む、請求項１０６に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１０８】
前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の前記部分の少なくとも１つと標的化ゲノム編集ヌクレアーゼによって置換する、請求項１０３に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１０９】
腫瘍を有する患者の前記腫瘍を治療するための、請求項１又は１９の何れか一項に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、どちらも本明細書に全体として組み込まれる、２０１７年９月２９日に出願された同時係属の米国仮特許出願第６２／５６５，７７６号明細書及び２０１７年１１月１３日に出願された同時係属の米国仮特許出願第６２／５８５，４９８号明細書に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明の分野は、特に本発明が、癌細胞を特異的に標的とする、又は骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制するナイーブ若しくは遺伝子改変ＮＫＴ細胞を使用する方法に関するので、免疫療法である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景の説明には、本発明を理解する際に有用であり得る情報が含まれる。これは、本明細書に提供した情報の何れかが本明細書で請求する発明の先行技術である、若しくは本発明に関連していること、又は詳細に若しくは黙示的に参照した何れかの刊行物が先行技術であることを承認するものではない。
【０００４】
本明細書の全ての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物若しくは特許出願が参照により組み込まれると特別及び個別に指示されている場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義若しくは使用が本明細書に提供した用語の定義と矛盾する、又は反対である場合は、本明細書に提供した用語の定義が適用され、参考文献における用語の定義は適用されない。
【０００５】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、Ｔ細胞受容体α鎖及びβ鎖を発現するが、それでもＮＫ細胞に関連する数種の分子マーカーを含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（例えば、ＮＫ１．１）の特性を共有する１サブセットのＴ細胞であると考えられる。ＮＫＴ細胞は、抗原提示細胞内のＣＤ１ｄと関連する様々な異種抗原又は自己脂質抗原（若しくは一部のペプチド抗原）を認識する。認識すると、ＮＫＴ細胞は活性化され、様々なタイプのサイトカイン及びケモカインを産生し、それによりＮＫＴ細胞は、特に自己免疫疾患及び感染性疾患において、先天性免疫応答と適応免疫応答との間のニッチの役割を果たす。
【０００６】
より近年は、ＮＫＴ細胞には、癌及び癌細胞に対する免疫応答においてそれらが果たす役割に関して注目が集まってきた。例えば、一部のＮＫＴ細胞は、樹状細胞が様々なサイトカインの放出によってエフェクター細胞を始動させることを促進することによって、及び更に共刺激性分子をアップレギュレートすることにより、強力な抗腫瘍活性を提供できる。更に、一部のＮＫＴ細胞は、発癌促進性細胞（例えば、発癌促進性マクロファージ等）を直接的に殺滅することができる。それでも、癌免疫療法においてＮＫＴ細胞を使用することは、ＮＫＴ細胞の異質性（例えば、Ｉ型及びＩＩ型のＮＫＴ細胞等）並びに活性化された場合に腫瘍に対する免疫応答を促進及び抑制するそれらの役割が明白に矛盾しているために、難題であった。更に、それらの集団が相当に小さいこと（例えば、ヒト末梢血単核球の０．０１〜２％）は、ＮＫＴ細胞を癌免疫療法の標的とするためには別の障害となる。
【０００７】
従って、ＮＫＴ細胞が癌発生及び／又は腫瘍に対する免疫応答において幾つかの役割を果たすことは知られているが、恐らくはそれらの異質性、低い集団密度、抗原認識における制限、癌細胞に対する免疫応答における二重機能及び癌細胞に対する特異性の欠如のために、ＮＫＴ細胞はこれまで癌免疫療法において効果的には使用されてこなかった。従って、癌免疫療法の作用を促進するために、癌細胞を特異的に標的とするため、及び／又は癌の微小環境を変化させるための、ナイーブ若しくは遺伝子改変ＮＫＴ細胞の改良された組成物、方法及びそれらの使用に対する必要が依然としてある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の主題は、ＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するため、及び／又は（例えば、骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制することによって）腫瘍の微小環境を変化させるための、キメラタンパク質若しくはＴ細胞受容体錯体を発現するナイーブＮＫＴ細胞若しくは遺伝子改変ＮＫＴ細胞の様々な組成物、そのための方法及び使用に向けられる。従って、本主題の１つの態様には、キメラタンパク質をコードする組換え核酸を含む、又はＴ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する組換え核酸を含む、並びに組換え核酸がキメラタンパク質をコードする遺伝子組換えＮＫＴ細胞が含まれる。キメラタンパク質は、好ましくは、１）腫瘍（ネオ）エピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片、２）細胞内活性化ドメイン、及び３）細胞外一本鎖変異断片を細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを含む。
【０００９】
好ましくは、組換え核酸は、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片をコードする第１核酸セグメント、細胞内活性化ドメインをコードする第２核酸セグメント、及び細胞外一本鎖変異断片と細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３核酸セグメントを含む。最も典型的には、第１、第２及び第３セグメントは、細胞外一本鎖変異断片、細胞内活性化ドメイン及びリンカーが単一キメラポリペプチドを形成するように配列されている。
【００１０】
好ましい実施形態では、細胞外一本鎖変異断片は、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。そのような実施形態では、細胞外一本鎖変異断片は、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のスペーサーを更に含むことが企図されている。細胞内活性化ドメインは、ＮＫＴ細胞内でＩＴＡＭ媒介性シグナリングを誘発する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。或いは、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部分若しくはＣＤ２８活性化ドメインの一部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。任意選択的に、遺伝子組換えＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ若しくはＶα２４−Ｊα１８  Ｔ細胞受容体へ特異的に結合するＴ細胞受容体を更に含み得る。
【００１１】
一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する組換え核酸が遺伝子組換えＮＫＴ細胞内に含まれる場合は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座のその部分がＴ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含むことが企図されている。そのような実施形態では、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域は、Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含み得る。更に、Ｔ細胞受容体β遺伝子座のその部分がＴ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、及び／又はＴ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域がＴ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含むことも又企図されている。組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座のその部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座のその部分の少なくとも１つと標的化ゲノム編集ヌクレアーゼによって置換し得る。好ましくは、標的化ゲノム編集ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。
【００１２】
本発明の主題の別の態様では、本発明者らは、腫瘍を有する患者においてＮＫＴ細胞免疫応答を誘導する方法を企図している。方法では、キメラタンパク質をコードする組換え核酸を含む遺伝子組換え核酸ＮＫＴ細胞が提供される。組換えタンパク質は、１）ＣＤ１−脂質抗原錯体、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片、２）細胞内活性化ドメイン、及び３）細胞外一本鎖変異断片を細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを有する。方法には、腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するために効果的である用量及びスケジュールで、患者に遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程が続く。最も典型的には、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程は、静脈内注射又は腫瘍内注射によって実施される。
【００１３】
一部の実施形態では、腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答は、腫瘍のサイズを低減させること、又は骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制することを含む。
【００１４】
好ましくは、本発明の主題における組換え核酸は、１）腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片をコードする第１核酸セグメント、２）細胞内活性化ドメインをコードする第２核酸セグメント、及び３）細胞外一本鎖変異断片と細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３核酸セグメントを含む。最も典型的には、第１、第２及び第３セグメントは、細胞外一本鎖変異断片、細胞内活性化ドメイン及びリンカーが単一キメラポリペプチドを形成するように配列されている。好ましくは、腫瘍エピトープは、患者特異的及び腫瘍特異的である。
【００１５】
一部の実施形態では、細胞外一本鎖変異断片は、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。そのような実施形態では、細胞外一本鎖変異体は、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間のスペーサーを更に含むことが好ましい。他の実施形態では、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄへ特異的に結合するＴ細胞受容体を更に含む。更に他の実施形態では、ＮＫＴ細胞は、Ｖα２４−Ｊα１８  Ｔ細胞受容体を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、細胞内活性化ドメインは、ＮＫＴ細胞内でＩＴＡＭ媒介性シグナリングを誘発する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。他の実施形態では、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部分を含む、及び／又はＣＤ２８活性化ドメインの一部分を更に含む。更に他の実施形態では、リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答は、腫瘍のサイズを低減させることを含む。他の実施形態では、腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答は、骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制することを含む。そのような実施形態では、骨髄由来サプレッサー細胞の活性が骨髄由来サプレッサー細胞の細胞死を誘導することによって抑制されることが好ましい。
【００１８】
一部の実施形態では、組換え核酸は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つを更にコードする。或いは若しくは追加して、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つをコードする別の組換え核酸を含み得る。
【００１９】
更に、方法は、腫瘍の表面上でＣＤ１ｄを発現する状況を腫瘍に提供する工程を更に含み得る。一部の実施形態では、状況は、ＣＤ１ｄをコードする第１核酸セグメントを含む核酸組成物を導入する工程を含む。そのような実施形態では、核酸組成物は、ｐ９９をコードする第２核酸セグメントを更に含む。他の実施形態では、状況は、腫瘍にとってのストレス状況を含む。更に他の実施形態では、状況は、腫瘍内でのＣＤ１ｄ発現を増加させるためにＨＤＡＣの阻害剤を投与する工程を含む。
【００２０】
更に、方法は、患者の体液からＮＫＴ細胞を入手する工程を更に含み得る。そのような実施形態では、ＮＫＴ細胞は、Ｖα−２４に対する抗体を使用して、並びに／又はＣＤ１ｄの一部分及び／若しくは脂質抗原と結合したＣＤ１ｄの一部分及び／若しくはペプチド抗原と結合したＣＤ１ｄの一部分を使用して体液から入手される。
【００２１】
一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１ｄの一部分又はＶα−２４に対する抗体を使用してＮＫＴ細胞を濃縮する工程を更に含み得る。他の実施形態では、方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変ＮＫＴ細胞の集団を増殖させる工程を更に含み得る。そのような実施形態では、増殖させる工程は、濃縮したＮＫＴ細胞をサイトカインで処置する工程を含む。好ましくは、サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１から成る群から選択される。
【００２２】
一部の実施形態では、組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する。そのような実施形態では、Ｔ細胞受容体α遺伝子座のその部分は、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む。更に、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域は、Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含む。更に、そのような実施形態では、Ｔ細胞受容体β遺伝子座のその部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む。Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域は、Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含むのが好ましい。
【００２３】
本主題の更に別の態様には、タンパク質錯体をコードする組換え核酸、又はＴ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する組換え核酸を含む、及びタンパク質錯体をコードする遺伝子組換えＮＫＴ細胞が含まれる。タンパク質錯体には、α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分が含まれる。α鎖Ｔ細胞受容体及び／又はβ鎖Ｔ細胞受容体の少なくとも一部分は、患者特異的、腫瘍特異的なネオエピトープ又は腫瘍関連抗原若しくは自己脂質に対して特異的である。好ましくは、タンパク質錯体の一部分は、その中でα鎖及びβ鎖受容体をコードする部分が第１自己切断２Ａペプチド配列によって分離されているα鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体をコードする第１核酸セグメントによってコードされている。更に、タンパク質錯体の別の部分は、その中でＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分をコードしている部分が第２自己切断型２Ａペプチド配列によって分離されている、ＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分をコードする第２核酸セグメントによってコードされ得る。この実施形態では、第１核酸セグメント及び第２核酸セグメントが第３自己切断型２Ａペプチド配列によって分離されているのが更に好ましい。ＣＤ３γ及び／又はＣＤ３δのその部分は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むことが好ましい。任意選択的に、遺伝子組換えＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄへ特異的に結合するＴ細胞受容体を更に含み得る。
【００２４】
一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する組換え核酸が遺伝子組換えＮＫＴ細胞内に含まれる場合は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座のその部分がＴ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含むことが企図されている。Ｔ細胞受容体β遺伝子座のその部分は、Ｔ細胞α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む、及び／又はＴ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域は、Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含む。更に、Ｔ細胞受容体β遺伝子座のその部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含み得る。更に、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域は、Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含む。
【００２５】
好ましくは、組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座のその部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座のその部分の少なくとも１つと標的化ゲノム編集ヌクレアーゼによって置換する。標的化ゲノム編集ヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼであることが企図されている。
【００２６】
更に別の態様では、本発明の主題は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分と置換して第１可変ドメインをコードする第１組換え核酸配列及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分と置換して第２可変ドメインをコードする第２組換え核酸配列を含む遺伝子組換えＮＫＴ細胞を含む。最も好ましくは、第１及び第２ドメインは、患者特異的、腫瘍特異的なネオエピトープ若しくは腫瘍関連抗原に特異的である結合モチーフを集合的に形成する。
【００２７】
一部の実施形態では、Ｔ細胞受容体α遺伝子座のその部分は、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む。そのような実施形態では、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域が、Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含むことも又企図されている。他の実施形態では、Ｔ細胞受容体β遺伝子座のその部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む。そのような実施形態では、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域は、Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の部分の少なくとも１つと標的化ゲノム編集ヌクレアーゼによって置換する。好ましくは、標的化ゲノム編集ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。
【００２９】
本発明の主題の更に別の態様では、本発明者らは、腫瘍を有する患者においてＮＫＴ細胞免疫応答を誘導する方法を企図している。この方法では、タンパク質錯体を発現する遺伝子組換えＮＫＴ細胞が提供される。タンパク質錯体には、少なくとも１つのα鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分が含まれる。方法には、腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するために効果的である用量及びスケジュールで患者に遺伝子組換えＮＫ細胞を投与する工程が更に続く。最も典型的には、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程は、静脈内注射又は腫瘍内注射によって実施される。一部の実施形態では、腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答は、腫瘍のサイズを低減させることを含む。他の実施形態では、腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答は、骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制することを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、第１核酸セグメント及び第２核酸セグメントは、自己切断型２Ａペプチドをコードする第３核酸セグメントによって分離されている。他の実施形態では、ＣＤ３γの部分は免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、及び／又はＣＤ３δの部分は免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。他の実施形態では、遺伝子組換えＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄへ特異的に結合するＴ細胞受容体を含み得る。
【００３１】
一部の実施形態では、方法は、サイトカイン誘導性キラー細胞を遺伝子組換えＮＫＴ細胞と共投与する工程を更に含み得る。他の実施形態では、方法は、腫瘍の表面上でＣＤ１ｄを発現する状況を腫瘍に提供する工程を更に含み得る。そのような実施形態では、状況は、ＣＤ１ｄをコードする第１核酸セグメントを含む核酸組成物及び／又はｐ９９をコードする第２核酸セグメントを更に含む核酸組成物を導入する工程を含み得る。或いは及び／又は追加して、状況は、腫瘍へのストレス状況、及び／又は腫瘍内のＣＤ１ｄ発現を増加させるためにＨＤＡＣの阻害剤を投与する工程を含み得る。
【００３２】
一部の実施形態では、組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換する。そのような実施形態では、Ｔ細胞受容体α遺伝子座のその部分は、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む。好ましくは、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域は、Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域を含む。更に、そのような実施形態では、Ｔ細胞受容体β遺伝子座のその部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含む。好ましくは、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域は、Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含む。
【００３３】
好ましくは、組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座のその部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座のその部分の少なくとも１つと標的化ゲノム編集ヌクレアーゼによって置換する。そのようなシナリオでは、標的化ゲノム編集ヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼであることが好ましい。
【００３４】
一部の実施形態では、組換え核酸は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つをコードする、及び／又はＮＫＴ細胞は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つをコードする別の組換え核酸を更に含む。
【００３５】
本発明の主題の更に別の態様では、本発明者らは、腫瘍を有する患者において骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制する方法を企図している。この方法では、ＮＫＴ細胞は、好ましくはそれらの細胞表面上で、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つを発現するように遺伝子改変されている。その後、複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制するために有効な用量及びスケジュールで患者に投与される。典型的には、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程は、静脈内注射又は腫瘍内注射によって実施される。
【００３６】
一部の実施形態では、複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞である。一部の実施形態では、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つをコードする組換え核酸を含む。
【００３７】
一部の実施形態では、方法は、腫瘍の表面上でＣＤ１ｄを発現する状況を腫瘍に提供する工程を更に含む。状況は、ＣＤ１ｄをコードする第１核酸セグメントを含む核酸組成物を導入する工程を含み得る。好ましくは、核酸組成物は、ｐ９９をコードする第２核酸セグメントを更に含む。状況は、腫瘍へのストレス状況及び／又は腫瘍内のＣＤ１ｄ発現を増加させるためにＨＤＡＣの阻害剤を投与する工程を含み得る。
【００３８】
本発明の主題の更に別の態様では、本発明者らは、腫瘍を有する患者においてＮＫＴ細胞免疫応答を誘導する方法を企図している。この方法では、患者の複数のＮＫＴ細胞は、患者の体液から入手される。最も典型的には、体液は、血液である。その後、ＮＫＴ細胞は、複数のＮＫＴ細胞に特異的である結合分子を使用して濃縮される。好ましくは、結合分子は、Ｖα−２４に対する抗体、ＣＤ１ｄの一部分又は脂質抗原と結合されたＣＤ１ｄの一部分を含む。濃縮したＮＫＴ細胞の集団は、ｅｘ  ｖｉｖｏで、好ましくは１種以上のサイトカインの存在下で増殖させられる。その後、増殖したＮＫＴ細胞は、腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するために効果的である用量及びスケジュールで患者に投与される。典型的には、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程は、静脈内注射又は腫瘍内注射によって実施される。一部の実施形態では、腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答は、腫瘍のサイズを低減させること及び／又は骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制することを含む。
【００３９】
一部の実施形態では、方法は、腫瘍の表面上でＣＤ１ｄを発現する状況を腫瘍に提供する工程を更に含み得る。状況は、好ましくはｐ９９をコードする第２核酸セグメントと共に、ＣＤ１ｄをコードする第１核酸セグメントを導入する工程を含み得る。状況は、腫瘍内のＣＤ１ｄ発現を増加させるためにＨＤＡＣの阻害剤を患者に投与する工程を更に含み得る。
【００４０】
一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１ｄの一部分及び／又はＶα−２４に対する抗体を使用してＮＫＴ細胞を更に濃縮する工程を更に含み得る。
【００４１】
一部の実施形態では、増殖させる工程は、濃縮したＮＫＴ細胞をサイトカインで処置する工程を含む。そのような実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１から成る群から選択される。
【００４２】
本発明の主題の更に別の態様は、腫瘍を有する患者を治療するための医薬組成物を含むが、ここで医薬組成物は、上述した複数の遺伝子組換え若しくは改変ＮＫＴ細胞を含む。
【００４３】
本発明の主題の更に別の態様は、上述した遺伝子組換え若しくは改変ＮＫＴ細胞又は腫瘍を有する患者の腫瘍を治療するための上述した医薬組成物の使用を含む。
【００４４】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点は、添付の図面と一緒に、好ましい実施形態についての下記の詳細な説明からより明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋Ｖα２４＋）が詳細にはＶα２４抗体を使用して特別に単離され、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）の処置を用いて増殖させられることを示すフローサイトメトリーデータのグラフである
【図２】骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）による阻害されたＴ細胞増殖を示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明者らは今では、ＮＫＴ細胞免疫応答が、腫瘍特異的若しくは腫瘍関連抗原、腫瘍のネオエピトープ及び／又は自己脂質を特異的に認識するようにＮＫＴ細胞を改変することにより、及び／又は腫瘍微小環境を腫瘍に対する免疫応答に対してより感受性に変化させることにより、腫瘍に対して効果的及び特異的に誘導され得ることを見出した。
【００４７】
そのような目的を達成するために、本発明者らは、今では患者からの（均質な）ＮＫＴ細胞集団を入手できる、単離できる、及び増殖させられることを見出した。そのように増殖したＮＫＴ細胞は、次に腫瘍細胞若しくは腫瘍細胞環境に対するＮＫＴ細胞の免疫応答を誘発するために患者に再導入され得る。更に、本発明者らは、ＮＫＴ細胞は、更に腫瘍特異的若しくは腫瘍関連抗原、腫瘍のネオエピトープ及び／又は自己脂質へ特異的に結合し、結果として腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘発する受容体を発現するように遺伝子改変され得ることも見出した。
【００４８】
本明細書で使用する用語「腫瘍」は、ヒトの身体内の１つ以上の解剖学的部位に置かれ得る、又は見出され得る１つ以上の癌細胞、癌組織、悪性腫瘍細胞又は悪性腫瘍組織を意味し、且つそれらと互換的に使用される。本明細書で使用する用語「結合する」は、１０−６Ｍ以下、又は１０−７Ｍ以下のＫＤを備える高親和性を有する２つの分子間の相互作用を意味し、相互作用を「認識する」及び／又は「検出する」という用語と互換的に使用され得る。本明細書で使用する用語「提供する」若しくは「提供する工程」は、製造する、生成する、配置する、使用を可能にする、又は使用を準備する、の何れかの行為を意味し、それらを含む。
【００４９】
ＮＫＴ細胞の単離
ＮＫＴ細胞は、数種の分子マーカー（例えば、Ｖα２４等）及び／又はリガンドに対する反応性（例えば、ＣＤ１ｄ制限、α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）に対するそれらの反応性、等）に基づいて３つのカテゴリーに分類できる異質な細胞集団を表す。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏのＮＫＴ細胞の異質性及び低画分（例えば、０．０１〜２％のヒト末梢血単球）は、患者において腫瘍に対する局所性免疫応答を引き出す際にＮＫＴ細胞を利用する際の障害を表す。従って、本発明の主題の１つの好ましい態様では、本発明者らは、患者のＮＫＴ細胞を入手し、単離し、その後に患者に再導入できるように増殖できることを企図している。ＮＫＴ細胞は、ＮＫＴ細胞が組織内に存在する限り、患者の任意の適切な組織から入手され得る。最も典型的には、適切な組織源には全血が含まれる。組織内に存在すると予想されるＮＫＴ細胞の数は、（例えば、年齢、性別、健康状態、民族等に基づいて）個人間及び組織の型（例えば、全血、脳脊髄液等）間で変動し得ることが企図されている。例えば、腫瘍を有する患者からＮＫＴ細胞を入手するためには、少なくとも２ｍＬ、好ましくは少なくとも５ｍＬ、より好ましくは少なくとも１０ｍＬの全血が患者から入手され得る。
【００５０】
成人の末梢血は、ＮＫＴ細胞を得るために最も入手し易い起源であるが、ＮＫＴ細胞の画分は一般に低く、及び癌患者の末梢血中ではいっそう低い。従って、追加して、及び或いは、患者のＮＫＴは、ＮＫＴ細胞が成人の末梢血よりも高濃度で存在する患者の貯蔵された臍帯血から入手できることも又企図されている。患者の臍帯血からＮＫＴ細胞を入手するためには、貯蔵状況に依存して変動し得るが、少なくとも０．５ｍＬ、好ましくは少なくとも１ｍＬ、より好ましくは少なくとも２ｍＬの臍帯血が患者から入手され得る。
【００５１】
多数の様々なタイプの細胞（例えば、赤血球、血小板、好中球、リンパ球等）を含む患者の体液から、ＮＫＴ細胞は、数種の公知の分子マーカー若しくはそれらの結合分子を使用して単離され得る。１つの実施形態では、典型的にはＶα２４−Ｊα１８型のＴ細胞受容体を発現するヒトＩ型ＮＫＴ細胞の単離は、Ｖα２４に対する抗体又はＶα２４−Ｊα１８に対する抗体を使用して実施することができる。他の実施形態では、典型的にはＣＤ１ｄ制限細胞であるヒトＩ型及びＩＩ型のＮＫＴ細胞の単離は、ＣＤ１ｄ分子の一部分（好ましくはＮＫＴのＴ細胞受容体に対する高親和性に責任を有する部分）、脂質抗原と結合されたＣＤ１ｄ分子の一部分（例えば、ＣＤ１ｄに結合し得る異種生物、栄養物質若しくは患者から生成された自己脂質から生成される任意の脂質抗原等）又はペプチド（例えば、ｐ９９等）と結合したＣＤ１ｄ分子の一部分を使用して実施され得る。細胞を単離するための任意の好適なプルダウン技術は、企図されている。例えば、Ｖα２４に対する抗体若しくはＶα２４−Ｊα１８に対する抗体（若しくは脂質若しくはペプチド抗原を備える、又は備えないＣＤ１ｄ分子）は、ビーズ（例えば、アガロースビーズ、ビオチンコーティングビーズ等）上に固定化し、その後患者の体液と接触させることができる。本発明者らは、抗体（又は脂質若しくはペプチド抗原を備える、又は備えないＣＤ１ｄ分子）を介してビーズに結合した細胞の大多数は、Ｉ型のＮＫＴ細胞であろうことを企図している。従って、このプロセスを使用して、ＮＫＴ細胞、好ましくは特定のタイプのＮＫＴ細胞（例えば、Ｉ型ＮＫＴ細胞）は、他の血液細胞から、及び他のＮＫＴ細胞から単離され得る。
【００５２】
一部の実施形態では、本発明者らは、濃縮するプロセスは、好ましくは２種の別個の及び連続する接触プロセスにおいて、特異性を増加させるために２個以上の結合分子を用いて実施できることを企図している。例えば、体液は、Ｖα２４に対する抗体又はＶα２４−Ｊα１８に対する抗体がコーティングされたビーズと最初に接触させることができる。Ｖα２４に対する抗体若しくはＶα２４−Ｊα１８に対する抗体に結合した細胞は、溶出させて、その後にＣＤ１ｄ分子（脂質若しくはペプチド抗原を備える、又は備えない）がコーティングされたビーズと二番目に接触させることができる。他の例については、体液は、ＣＤ１ｄ分子（脂質若しくはペプチド抗原を備える、又は備えない）がコーティングされたビーズと最初に接触させることができる。その後、ＣＤ１ｄ分子に結合した細胞は、次にＶα２４に対する抗体又はＶα２４−Ｊα１８に対する抗体がコーティングされたビーズと更に接触させることができる。
【００５３】
１つの好ましい実施形態では、抗体（若しくは脂質若しくはペプチド抗原を備える、又は備えないＣＤ１ｄ分子）に結合したＮＫＴ細胞は、元の試料量（例えば、血液量等）よりも少ない量の液体（例えば、細胞培養培地等）中に溶出させることができるので、ＮＫＴ細胞は、単離後に濃縮することができる（例えば、１０ｍＬの血液量中のＮＫＴ細胞は、０．５ｍＬ量の細胞培養培地中に単離することができ、結果として単離後にはＮＫＴ細胞の約２０倍の濃縮が生じる、等）。ＮＫＴ細胞が２回以上の接触させるプロセスによって単離される一部の実施形態では、ＮＫＴ細胞は、第２回の接触させるプロセスにおいて溶出培地（例えば、細胞培養培地等）の量を更に低減させることによって更に濃縮することができる（例えば、１０ｍＬの元の試料量は第１回接触させるプロセスでは２ｍＬの溶出細胞に低減させ、及び第２回接触させるプロセスでは０．５ｍＬの溶出細胞に更に低減させることができる、等）。特に好ましいのは、ＮＫＴ細胞が、元の体液試料の細胞数／量と比較して、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも２０倍濃縮されることである。
【００５４】
他の実施形態では、ＮＫＴ細胞、好ましくは特定のタイプのＮＫＴ細胞（例えば、Ｉ型ＮＫＴ細胞）は、フローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）等）又は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用して患者の体液中の他の細胞から単離され得る。例えば、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、蛍光標識化α−ＣＤ３抗体及びα−Ｖα２４抗体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−α−ＣＤ３抗体及びＣｙ３−α−Ｖα２４抗体等）又は磁気粒子標識化α−ＣＤ３抗体及びα−Ｖα２４抗体を使用して他の細胞から単離され得る。本発明者らは、フローサイトメトリー若しくはＭＡＣＳによって単離されたＣＤ３＋Ｖα２４＋細胞が（脂質若しくはペプチド抗原を備える、若しくは備えない）ＣＤ１ｄ分子でコーティングされたビーズを備えるプルダウンアッセイを使用して更に濃縮され得ることを更に企図している。
【００５５】
遺伝子改変ＮＫＴ細胞
組換えキメラ抗原性受容体（ＣＡＲ）を発現するＮＫＴ細胞：本発明者らは、単離された（及び／又は更に増殖した）ＮＫＴ細胞が、骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制する際に腫瘍細胞を特異的に標的化するため、及び／又はＮＫＴ細胞免疫の作用を増加させるために遺伝子改変され得ることを企図している。本発明の主題の１つの態様では、本発明者らは、ＮＫＴ細胞が、ＮＫＴ細胞に組換えタンパク質を導入することによって、腫瘍特異的抗原若しくは腫瘍関連抗原、ネオエピトープ及び／又は腫瘍細胞によって発現した自己脂質を特異的に認識するように遺伝子改変できることを企図している。
【００５６】
一般に、組換えタンパク質はＣＡＲであり、細胞外一本鎖変異断片、細胞内活性化ドメイン及び細胞外一本鎖変異断片を細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを含む。好ましくは、組換えタンパク質は、単一組換え核酸から翻訳された単一キメラポリペプチドから生成される。しかし、組換えタンパク質の少なくとも一部分がタンパク質−タンパク質相互作用モチーフを介して組換えタンパク質の残りと可逆的に結合され得るように、組換えタンパク質が２つの別個の組換え核酸から個別に翻訳される少なくとも２つのドメインを含むことも又企図されている。
【００５７】
従って、組換えタンパク質が単一組換え核酸によってコードされている１つの好ましい実施形態では、組換え核酸は、少なくとも３つの核酸セグメント：ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは腫瘍細胞表面上で提示された自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片をコードする第１核酸セグメント（配列エレメント）；細胞内活性化ドメインをコードする第２核酸セグメント、及び細胞外一本鎖変異断片と細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３核酸セグメントを含む。
【００５８】
この実施形態では、細胞外一本鎖変異断片をコードする第１核酸セグメントは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）をコードする核酸配列を含む。１つの好ましい実施形態では、重鎖（ＶＨ）の可変領域をコードする核酸配列及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域をコードする核酸配列は、短鎖スペーサーペプチド断片（例えば、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸等）をコードするリンカー配列によって分離されている。最も典型的には、第１核酸セグメントによってコードされた細胞外一本鎖変異断片には、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原又は自己脂質に対する結合親和性及び／又は特異性を決定する１つ以上の核酸配列が含まれる。従って、ＶＨ及びＶＬの核酸配列は、組換えタンパク質が標的とし得る腫瘍エピトープの配列に依存して変動し得る。
【００５９】
腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質に対して特異的なＶＨ及びＶＬの核酸配列を同定するための任意の好適な方法が企図されている。例えば、ＶＨ及びＶＬの核酸配列は、腫瘍エピトープに対する公知の特異性及び結合親和性を用いてモノクローナル抗体配列データベースから同定され得る。或いは、ＶＨ及びＶＬの核酸配列は、候補配列のコンピューター分析によって（例えば、ＩｇＢＬＡＳＴ配列分析ツール等によって）同定することができる。一部の実施形態では、ＶＨ及びＶＬの核酸配列は、任意の好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、ＳＰＲアッセイ、速度論的排除法等）によって腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原又は自己脂質に対する様々な親和性を有するペプチドのマススクリーニングによって同定することができる。腫瘍エピトープの特徴に依存して変動し得るが、ＶＨ及びＶＬの最適な核酸配列が少なくとも１０−６Ｍ以下、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ以下、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ以下のＫＤを備える腫瘍エピトープに対する親和性を有する細胞外一本鎖変異断片をコードするのが好ましい。或いは、腫瘍エピトープへの合成結合剤は、更に又ファージパンニング若しくはＲＮＡディスプレイによって得ることもできる。
【００６０】
第１核酸セグメントが各重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の１つをコードする核酸配列を含むのが好ましいが、更に又一部の実施形態では、第１核酸セグメントは、複数の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）（例えば、二価（若しくは多価さえ）の一本鎖変異断片（例えば、タンデム一本鎖変異断片）を生成するための２本の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ））をコードする核酸配列を含むことも又企図されている。この実施形態では、各重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の１本をコードする配列は、直線的に重複させられ得る（例えば、ＶＨ−リンカー１−ＶＬ−リンカー２−ＶＨ−リンカー３−ＶＬ）。リンカー１、２、３の長さが実質的に類似若しくは同一であることは企図されている。しかし、リンカー２の長さがリンカー１及び／又はリンカー３の長さとは実質的に異なる（例えば、より長い又はより短い）ことも又企図されている。
【００６１】
或いは、本発明者らは、細胞外一本鎖変異断片（ＶＨ及び／又はＶＬ鎖）がＴ細胞受容体の細胞外ドメインと置換され得ることも企図している。例えば、一部の実施形態では、細胞外一本鎖変異断片は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、γ鎖又はδ鎖の一部分と置換され得る。他の実施形態では、細胞外一本鎖変異断片は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、γ鎖又はδ鎖の一部分（例えば、α鎖及びβ鎖のハイブリッド、γ鎖及びδ鎖のハイブリッド等）の少なくとも２本の組み合わせと置換され得る。この実施形態では、Ｔ細胞受容体の細胞外一本鎖変異断片の核酸配列、特にα、β、γ及び／又はδ鎖の超可変領域は、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原又は自己脂質に対する測定、推定若しくは予想された親和性に基づいて選択することができる。腫瘍エピトープに対するＴ細胞受容体の細胞外ドメインの親和性は、少なくとも１０−６Ｍ以下、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ以下、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ以下のＫＤを備えるのが特に好ましい。
【００６２】
組換え核酸は、組換えタンパク質の細胞内活性化ドメインをコードする第２核酸セグメント（配列エレメント）を更に含む。最も典型的には、細胞内活性化ドメインは、これらのモチーフを発現する細胞内でのシグナリングカスケードを誘発する、１つ以上のＩＴＡＭ活性化モチーフ（免疫受容体チロシン活性化モチーフ、ＹｘｘＬ／Ｉ−Ｘ６〜８−ＹＸＸＬ／Ｉ）を含む。１つ以上のＩＴＡＭ活性化モチーフを含む任意の好適な核酸配列は、企図されている。例えば、活性化ドメインの配列は、１つ以上のＩＴＡＭ活性化モチーフ（例えば、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）の細胞内尾部ドメイン（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６等））を含むＮＫ受容体に由来し得る。別の実施例では、活性化ドメインの配列は、ＮＫＴ  Ｔ細胞抗原受容体（例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８等）の尾部部分に由来し得る。一部の実施形態では、細胞内活性化ドメインの核酸配列は、組換えタンパク質を発現する細胞の細胞傷害性を調節するために１つ以上のＩＴＡＭ活性化モチーフを添加／除去するように改変され得る。
【００６３】
第１及び第２核酸セグメントは、典型的には、組換えタンパク質のリンカー部分をコードする第３核酸セグメントによって結合されている。好ましくは、組換えタンパク質のリンカー部分は、少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む。更に、本発明者らは、組換えタンパク質のリンカー部分が膜貫通ドメインと細胞外一本鎖変異断片との間で短鎖ペプチド断片（例えば、１〜５アミノ酸の間又は３〜１０アミノ酸の間、又は８〜２０アミノ酸の間、又は１０〜２２アミノ酸の間のサイズを備えるスペーサー）及び／又は膜貫通ドメインと細胞内活性化ドメインとの間の別の短鎖ペプチド断片を更に含むことを企図している。一部の実施形態では、膜貫通ドメインの核酸配列及び／又は１つ若しくは２つの短鎖ペプチド断片は、それから細胞内活性化ドメインの配列が入手される同一若しくは異なる分子に由来し得る。
【００６４】
例えば、細胞内活性化ドメインがＣＤ３ζの一部分である場合は、（膜貫通ドメイン及び短鎖ペプチド断片の両方をコードする）全第３核酸セグメントは、ＣＤ３ζ（同一分子）又はＣＤ２８（異なる分子）に由来し得る。他の実施形態では、第３核酸セグメントは、その中でセグメントの少なくとも一部分がセグメントの残りとは異なる分子に由来するハイブリッド配列である。別の例では、細胞内活性化ドメインがＣＤ３ζの一部分である場合、膜貫通ドメインの配列は、ＣＤ３ζ及び膜貫通ドメインを結合させる短鎖断片に由来してよく、細胞外一本鎖変異断片は、ＣＤ２８若しくはＣＤ８に由来してよい。
【００６５】
他の企図された実施形態では、組換え核酸は、細胞表面に組換えタンパク質を方向付けるシグナリングペプチドをコードする核酸セグメントを含む。任意の好適及び／又は公知のシグナリングペプチド（例えば、ロイシンリッチモチーフ等）が企図されている。好ましくは、細胞外一本鎖変異断片をコードする核酸セグメントは、シグナル配列が組換えタンパク質のＮ末端に局在し得るように、細胞外一本鎖変異断片をコードする第１核酸セグメントの上流に局在する。しかし、シグナリングペプチドは組換えタンパク質のＣ末端又は組換えタンパク質の中央部に局在し得ることも又企図されている。
【００６６】
更に、組換え核酸は、組換えタンパク質の発現を制御する配列エレメントを含むことができ、及び全ての制御方法は、本明細書で使用するために好適であると思われる。例えば、組換え核酸がＲＮＡである場合は、発現制御は、好適な翻訳開始部位（例えば、好適なキャップ構造、開始因子結合部位、内部リボソーム侵入部位等）及び（例えば、長さが安定性及び／又は代謝回転を制御する場合は）ポリＡ尾部によって発揮され得るが、組換えＤＮＡ発現は、構成的に活性なプロモーター、組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターによって制御され得る。
【００６７】
組換えＴ細胞受容体錯体を発現するＮＫＴ細胞：更に、又は代わりに本発明者らは、ＮＫＴ細胞が更にＮＫＴ細胞へタンパク質錯体をコードする組換え核酸組成物を導入する工程によって遺伝子改変され得ることを企図している。最も典型的には、タンパク質錯体は、Ｔ細胞受容体の細胞外ドメインを有する少なくとも１つ以上の別個のペプチド、及びＴ細胞共受容体の細胞内ドメインの少なくとも１つ以上の別個のペプチドを含む。例えば、１つの好ましいタンパク質錯体には、Ｔ細胞受容体のα鎖、Ｔ細胞受容体のβ鎖、ＣＤ３δの少なくとも一部分（好ましくは細胞質ドメイン）及びＣＤ３γの少なくとも一部分（好ましくは、細胞質ドメイン）が含まれる。別の例では、タンパク質錯体は、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖の代わりにγ鎖Ｔ細胞受容体及びδ鎖Ｔ細胞受容体を含み得る。更に、タンパク質錯体は、ＣＤ３δのその部分又はＣＤ３γのその部分と置換する１本以上のζ鎖を含み得る。
【００６８】
タンパク質錯体をコードするためには組換え核酸組成物の任意の好適な形態を使用することができるが、本発明者らは、それらの各々が、タンパク質錯体が別個のペプチドをコードする複数のセグメントを含む単一核酸によってコードされ得ることを企図している。従って、１つの好ましい実施形態では、核酸組成物は、２つの別個のペプチド：α鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体（又は代わりに、γ鎖Ｔ細胞受容体及びδ鎖Ｔ細胞受容体）をコードする第１核酸セグメント並びに２つのペプチド：Ｔ細胞共受容体の１つのタイプの少なくとも一部分（例えば、ＣＤ３δ）及びＴ細胞共受容体の別のタイプの少なくとも一部分（例えば、ＣＤ３γ）又は代わりにＣＤ３δのその部分若しくはＣＤ３γのその部分と置換する１つ以上のζ鎖をコードする第２核酸セグメントを含み得る。第１及び第２核酸セグメントによってコードされた各別個のペプチドは、全長タンパク質（例えば、全長α鎖及びβ鎖Ｔ細胞受容体及び共受容体）であることが企図されている。それでも、第１及び第２核酸セグメントによってコードされた少なくとも１つ以上の別個のペプチドは、短縮タンパク質又は全長タンパク質の一部分であってよいことも又企図されている。
【００６９】
好ましくは、第１及び第２核酸セグメントは、それらの各々がＴ細胞受容体（例えば、サブセグメントＡはα鎖Ｔ細胞受容体のｍＲＮＡであり、サブセグメントＢはβ鎖Ｔ細胞受容体のｍＲＮＡである等）をコードし、その後にポリＡ尾部によってコードされるｍＲＮＡの２つのサブセグメントを含むｍＲＮＡである。更に、ｍＲＮＡの２つのサブセグメントは、１つのタイプの２Ａ自己切断型ペプチド（２Ａ）をコードする核酸配列によって分離されることが好ましい。本明細書で使用する２Ａ自己切断型ペプチド（２Ａ）は、同一ｍＲＮＡ断片内の２つのサブセグメントが２つの個別及び別個のペプチド内に翻訳され得るように、「ストップゴー」若しくは「ストップキャリー」として公知の翻訳作用を提供できる任意のペプチド配列を意味する。ブタテスコウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、トセア・アシグナ（ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎ウイルス２Ａ（Ｅ２Ａ）、手足口病ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）、細胞質多核体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ  ２Ａ）及びフラシェリー病ウイルス（ＢｍＩＦＶ  ２Ａ）を含む任意の好適なタイプの２Ａペプチド配列が企図されている。一部の実施形態では、同一のタイプの２Ａ配列は、第１及び第２核酸セグメント両方の２つのサブセグメント（例えば、第１核酸セグメント：α鎖受容体のｍＲＮＡ−Ｔ２Ａ−β鎖受容体のｍＲＮＡ；第２核酸セグメント：α鎖受容体ｍＲＮＡの−Ｔ２Ａ−β鎖受容体のｍＲＮＡ）間で使用することができる。他の実施形態では、異なるタイプの２Ａ配列は、第１及び第２核酸セグメント両方の２つのサブセグメント（例えば、第１核酸セグメント：α鎖受容体のｍＲＮＡ−Ｔ２Ａ−β鎖受容体のｍＲＮＡ；第２核酸セグメント：α鎖受容体のｍＲＮＡ−Ｐ２Ａ−β鎖受容体のｍＲＮＡ）間で使用することができる。
【００７０】
更に、本発明者らは、第１及び第２核酸セグメントが更に、例えば２Ａ配列によって結合された単一核酸（ｍＲＮＡ）中にも存在し得ることを企図している。この実施形態では、第１及び第２核酸セグメントのサブセグメントは、同一若しくは異なる２Ａ配列の任意の公的な組み合わせ（例えば、α鎖−Ｔ２Ａ−β鎖−Ｐ２Ａ−ＣＤ３γ−Ｆ２Ａ−ＣＤ３δ、β鎖−Ｐ２Ａ−ＣＤ３γ−Ｔ２Ａ−α鎖−Ｆ２Ａ−ＣＤ３δ等）、その後に単一ｍＲＮＡの３’にあるポリＡ尾部が続く任意の好適な順序（例えば、α鎖−β鎖−ＣＤ３γ−ＣＤ３δ、β鎖−ＣＤ３γ−α鎖−ＣＤ３δ等）で配列することができる。
【００７１】
第１及び第２核酸セグメントのｍＲＮＡ配列に関して、ｍＲＮＡ配列は、腫瘍ネオエピトープの配列、腫瘍関連抗原又はタンパク質錯体が標的とする自己脂質に基づいて選択されるのが好ましい。例えば、第１核酸セグメントによってコードされるペプチドが、少なくとも１０−６Ｍ以下、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ以下、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ以下のＫＤで腫瘍エピトープに対する実際若しくは予想親和性を有することが好ましい。腫瘍エピトープに対する高い結合親和性を有する第１核酸セグメント配列を同定するための任意の好適な方法は、企図されている。例えば、核酸セグメントの核酸配列は、任意の好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、ＳＰＲアッセイ、速度論的排除法等）によって腫瘍エピトープに対する様々な親和性を有するペプチドのマススクリーニングによって同定することができる。
【００７２】
認識された抗原に関して、ＣＤ１ｄに結合する全ての抗原が本明細書で使用するために好適と見なされると留意すべきである。結果として、企図された抗原には、詳細には、１つ以上の腫瘍関連抗原、自己脂質及び特に腫瘍ネオエピトープが含まれる。典型的には、腫瘍関連抗原及びネオエピトープ（典型的には、患者特異的及び腫瘍特異的である）は、患者の癌組織又は（患者若しくは健常個人の）正常組織から入手されるオミクスデータから同定され得る。オミクスデータには、典型的には、ゲノミクス、トランスクリプトミクス及び／又はプロテオミクスに関連する情報が含まれる。本明細書で使用する、癌細胞又は正常細胞（若しくは組織）は、単一若しくは複数の異なる組織若しくは解剖学的領域由来の細胞、単一若しくは複数の異なる宿主由来の細胞並びに任意の順列の組み合わせを含み得る。
【００７３】
癌細胞及び／又は正常細胞のオミクスデータは、好ましくはゲノム配列情報を含むゲノムデータセットを含む。最も典型的には、ゲノム配列情報は、（例えば、腫瘍生検によって）患者から、最も好ましくは癌組織（罹患組織）及び患者若しくは健常個人の適合健常組織から得られているＤＮＡ配列情報を含む。例えば、ＤＮＡ配列情報は、患者の膵臓（及び／又は転移細胞についての隣接領域）内の膵臓癌細胞、及び患者の正常膵臓組織（非癌性細胞）又は患者以外の健常個人由来の正常膵臓細胞から入手され得る。
【００７４】
本発明の主題の１つの特に好ましい態様では、ＤＮＡ分析は、腫瘍及び適合正常試料両方の（典型的には、少なくとも１０倍、より典型的には少なくとも２０倍の標的領域深さでの）全ゲノムシーケンシング及び／又はエクソームシーケンシングによって実施される。或いは、ＤＮＡデータは、先行配列決定からの既に確立された配列記録（例えば、ＳＡＭ、ＢＡＭ、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＱ若しくはＶＣＦファイル）から提供され得る。このため、データセットは、未処理又は処理済みデータセット、並びにＢＡＭフォーマット、ＳＡＭフォーマット、ＦＡＳＴＱフォーマット若しくはＦＡＳＴＡフォーマットを有するデータを含む典型的なデータセットを含み得る。しかし、データセットがＢＡＭフォーマット中で、又はＢＡＭＢＡＭ  ｄｉｆｆオブジェクトとして提供されることが特に好ましい（例えば、米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／００６６００１Ａ１号明細書を参照されたい）。更に、これらのデータセットが患者及び腫瘍特異的情報を得るための同一患者の腫瘍及び適合正常試料を反映していること留意すべきである。従って、腫瘍を発生させない遺伝的生殖細胞系の変化（例えば、サイレント突然変異、ＳＮＰ等）を排除することができる。当然ながら、腫瘍試料は、初期腫瘍由来、治療開始後の腫瘍由来、再発性腫瘍若しくは転移性部位由来であってよいことを認識すべきである。大多数の症例では、患者の適合正常試料は、血液、又は腫瘍と同一組織タイプ由来の非疾患組織であってよい。
【００７５】
同様に、配列データのコンピューター分析は、数多くの方法で実施され得る。しかし最も好ましい方法では、分析はコンピューター内で、例えば、ＢＡＭファイル及びＢＡＭサーバーを使用して米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／００６６００１Ａ１号明細書に開示されているように、腫瘍及び正常試料の位置誘導性同期アラインメントによって実施される。そのような分析は、有益にも擬陽性ネオエピトープを低減させ、メモリ及び計算資源に関する要求を有意に低減させる。
【００７６】
このようにして得られたネオエピトープは、事前に規定された構造パラメーター及び発現パラメーター並びに細胞内局在パラメーターを使用して更に詳細な分析及びフィルタリングを受けさせることができる。例えば、ネオエピトープ配列は、それらが事前に規定された発現閾値（例えば、正常と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上の高い発現）を満たすであろうことを前提にのみ保持され、膜関連局在（例えば、細胞の細胞膜の外側に局在する）を有すると同定されると理解すべきである。更なる企図された分析は、ネオエピトープ又は腫瘍関連抗原若しくは自己脂質が溶媒に曝露させられるか否かにかかわらず、構造的に安定性のエピトープ等を提示する構造的計算を含むであろう。
【００７７】
結果として、エピトープは、患者及び腫瘍のタイプにとって固有である潜在的エピトープを最終的に予測する排他的なコンピューター環境でのみ同定され得ることを認識すべきである。そのように同定されたエピトープ配列は、次に対応するペプチドを生成するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される。従って、概念的には、その後に高親和性抗体を見出すため、又は生成するために更にｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験され得る特異的癌を有する特定患者の（ネオ）エピトープの全合理的設計コレクションを組み立てることが可能である。本発明の主題の１つの態様では、１つ以上のペプチド（ネオ）エピトープ（例えば、９マー）は、固体担体（例えば、磁気ビーズ若しくはカラーコード・ビーズ）上に固定化し、表面提示抗体断片若しくは抗体に結合させるためのベイト（ｂａｉｔ）として使用され得る。最も典型的には、そのような表面提示抗体断片若しくは抗体には、Ｍ１３ファージ（例えば、タンパク質ＩＩＩ、ＶＩＩＩ等）が関連しており、抗体断片についての多数のライブラリーは当分野において公知であり、本明細書に提示した教示と結び付けると好適である。所望である場合は、より小さなライブラリーも又使用することができ、当分野において周知の方法を使用して結合親和性及び／又は結合動態を改善するために親和性成熟を受けさせることができる（例えば、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｖｏｌ  １．Ｎｏ２．１８９−２０３．Ｊｕｌｙ  ２００２を参照されたい）。更に、抗体ライブラリーは一般に好ましいが、他のスカフォールドも又好適であると思われ、βバレル、リボソームディスプレイ、細胞表面ディスプレイ等を含むことに留意すべきである（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００６  Ｊａｎ；１５（１）：１４−２７を参照されたい）。更に、既に上記で考察したように、患者及び腫瘍特異的ネオエピトープだけではなく、全ての公知の腫瘍関連抗原（ＣＥＡＣＡＭ、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２等）並びに様々な自己脂質も又好適であると思われることを理解すべきである。
【００７８】
ハイブリッドＴ細胞受容体錯体を発現するＮＫＴ細胞：更に、又は代わりに、本発明者らは、ＮＫＴ細胞が、更にハイブリッドＴ細胞受容体錯体を形成するために２つの別個及び個別のペプチドをコードする組換え核酸配列を導入する工程によって遺伝子改変され得ることも又企図している。好ましくは、ペプチドは、内因性Ｔ細胞α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域（ヒトにおける１４番染色体内）及び内因性Ｔ細胞β鎖のＶβ１１領域（ヒトにおける７番染色体内）と置換する。より好ましくは、ペプチドは、内因性Ｔ細胞α鎖及びＴ細胞β鎖のＣＤＲ１α−ＣＤＲ３α（例えば、ＣＤＲ１α−ＣＤＲ３α、ＣＤＲ２α−ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１α−ＣＤＲ２α等）の少なくとも２つ及び／又はＣＤＲ１β−ＣＤＲ３β（例えば、ＣＤＲ１β−ＣＤＲ３β、ＣＤＲ２β−ＣＤＲ３β、ＣＤＲ１β−ＣＤＲ２β等）の少なくとも２つと置換する。従って、２つの別個、個別のペプチドと共に形成されたハイブリッドＴ細胞受容体錯体は、ＣＤ１ｄへの特異性（若しくは制限）を失う可能性が高く、２つの別個及び個別のペプチドの配列に依存して他のＭＨＣ抗原（若しくはネオエピトープ）錯体への特異性を獲得する可能性がある。
【００７９】
最も好ましくは、ＮＫＴ細胞の内因性Ｔ細胞α鎖及びＴ細胞β鎖の部分上でペプチドがグラフト化及び置換された場合は、ＮＫＴ細胞の内因性Ｔ細胞受容体はＭＨＣ分子（例えば、ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ）と結合した癌抗原若しくはネオエピトープへ特異的に結合するＴ細胞受容体に形質転換され得るように、２つのペプチドが選択されることが企図されている。従って、１つの実施形態では、２つのペプチドは各々、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの少なくとも一部分及びＴ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの少なくとも一部分である。好ましくは、Ｔ細胞受容体α鎖及びβ鎖の細胞外ドメインのそれらの部分は、一緒に又は個別に、抗原提示細胞（例えば、癌細胞）上に提示された癌抗原若しくはネオエピトープ（癌特異的、患者特異的）に少なくとも１０−６Ｍ以下、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ以下、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ以下のＫＤの親和性で結合し得る。他の実施形態では、２つのペプチドの少なくとも１つは、少なくとも１本以上の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又は全抗体分子の断片を少なくとも１０−６Ｍ以下、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ以下、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ以下のＫＤの親和性で（癌特異的、患者特異的）癌抗原若しくはネオエピトープに結合し得る。これらの実施形態では、全抗体の断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｖ並びにＶＨセグメント及び／又はＶＬセグメント何れかを含む任意の断片を含み得るがそれらに限定されない。抗体が免疫グロブリンである場合は、免疫グロブリンが様々なタイプの免疫グロブリンを構成するために任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）並びに任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の重鎖若しくは定常ドメインを含むことは、企図されている。更に、「抗体」は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含み得るが、それらに限定されない。
【００８０】
任意の特定の理論によって拘束されることを望まなくても、本発明者らは、癌（ネオ）エピトープを特異的に認識する組換えタンパク質（ＣＡＲ）若しくはタンパク質錯体（Ｔ細胞受容体錯体）の何れかを発現する遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、腫瘍特異的標的化によって腫瘍に対してＮＫＴ細胞免疫応答（例えば、腫瘍細胞に対する細胞傷害性）を増加させることを企図している。更に、ＮＫＴ細胞からＣＤ１ｄ制限を除去することによって、本発明者らは、より多くのＮＫＴ細胞が腫瘍の近くで動員され、ＮＫＴ細胞がそれらの免疫サーベイランス機能によって（例えば、局所的に遊離するサイトカイン等によって）腫瘍の微小環境を変化させると予期されるので、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を更に使用され得ることを企図している。
【００８１】
Ｆａｓリガンド及び／又はＣＤ４０リガンドを発現するＮＫＴ細胞：多数の腫瘍では、腫瘍細胞に対する免疫細胞応答は、免疫抑制調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の蓄積を含むことが多い、変化した腫瘍微小環境によって抑制される。図２に示したように、ＭＤＳＣによる免疫抑制機序の１つは、Ｔ細胞増殖を抑制することによる。従って、別の本発明の主題では、本発明者らは、腫瘍微小環境を低免疫抑制性に変化させられるようにＮＫＴ細胞がＴｒｅｇ若しくはＭＤＳＣの細胞死を誘導するように遺伝子改変されることを企図している。例えば、１つの好ましい実施形態では、ＮＫＴ細胞は、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンド又はその両方の少なくとも１つを発現するように遺伝子改変される。
【００８２】
Ｆａｓリガンド及び／又はＣＤ４０リガンドをコードする任意の好適な形態の組換え核酸組成物を使用することができるが、本発明者らは、一部の実施形態では、Ｆａｓリガンド及びＣＤ４０リガンドが、それらの各々が別個のペプチドをコードする複数のセグメントを含む単一核酸によってコードされ得ることを企図している。従って、１つの好ましい実施形態では、核酸組成物は、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＣＤ９５Ｌ）をコードする第１核酸セグメント及びＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ若しくはＣＤ１５４）をコードする第２核酸セグメントを含む。好ましくは、第１及び第２核酸セグメントは、１つのタイプの２Ａ自己切断型ペプチド（２Ａ）をコードする核酸配列によって分離されているｍＲＮＡである。本明細書で使用する２Ａ自己切断型ペプチド（２Ａ）は、同一ｍＲＮＡ断片内の２つのサブセグメントが２つの個別及び別個のペプチド内に翻訳され得るように、「ストップゴー」若しくは「ストップキャリー」として公知の翻訳作用を提供できる任意のペプチド配列を意味する。ブタテスコウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、トセア・アシグナ（ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎ウイルス２Ａ（Ｅ２Ａ）、手足口病ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）、細胞質多核体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ  ２Ａ）及びフラシェリー病ウイルス（ＢｍＩＦＶ  ２Ａ）を含む任意の好適なタイプの２Ａペプチド配列は、企図されている。
【００８３】
何らかの特定の理論に拘束されなくても、Ｆａｓリガンド及び／又はＣＤ４０リガンドを発現するＮＫＴ細胞は、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ若しくはＭＤＳＣの蓄積が防止される、又は腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ若しくはＭＤＳＣの数が低減されるように、Ｔｒｅｇ若しくはＭＤＳＣのＦａｓ依存性細胞死を誘発することが企図されている。更に、Ｆａｓリガンド及び／又はＣＤ４０リガンドを発現するＮＫＴ細胞は、Ｔｒｅｇ若しくはＭＤＳＣの近くで細胞死誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）を遊離させることによってＴｒｅｇ若しくはＭＤＳＣの細胞死を更に促進させ得る。従って、本発明者らは、１つの好ましい実施形態では、Ｔｒｅｇ若しくはＭＤＳＣの細胞死を促進する１種以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）は、Ｆａｓリガンド及び／又はＣＤ４０リガンドを発現する遺伝子改変ＮＫＴ細胞の投与後に腫瘍微小環境に同時に投与できる、又は腫瘍微小環境において発現させ得ることも又更に企図している。Ｔｒｅｇ若しくはＭＤＳＣのＦａｓ依存性細胞死の誘導は、腫瘍細胞がその後の免疫療法又はナイーブ若しくは遺伝子改変ＮＫＴ細胞を用いた更なる治療により感受性であり得るように、腫瘍微小環境から低免疫抑制性への変化を更に誘発し得ることが予測されている。
【００８４】
組換え核酸のＮＫＴ細胞への導入
（上述した組換えタンパク質、タンパク質錯体若しくはＦａｓＬ／ＣＤ４０Ｌの何れかをコードする）組換え核酸は、任意の好適な手段によってＮＫＴ細胞に導入することができる。好ましくは、組換え核酸は、それがトランスフェクト細胞内で安定性若しくは一過性染色体外単位として（例えば、複製能力を有する可能性があるプラスミド、酵母人工染色体等として）存在し得るように導入される。好適なベクターには、細胞に組換え核酸を導入する方法論に依存して、任意の哺乳類細胞発現ベクター及びウイルスベクターが含まれるがそれらに限定されない。或いは、組換え核酸がＲＮＡである場合、核酸は細胞内にトランスフェクトされ得る。更に、組換え発現の方法は、改変細胞が構成的若しくは誘導性方法においてキメラタンパク質を生成できる限り、特定の技術には限定されないことも又認識すべきである。このため、細胞は、キメラタンパク質等をコードする配列エレメントを抱いている線状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、線状ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスを用いてトランスフェクトされ得る。様々な視野から眺めると、トランスフェクションは、バリスティック法、ウイルス媒介法、エレクトロポレーション、レーザーポレーション、リポフェクション、ゲノム編集、リポソーム若しくはポリマー媒介性トランスフェクション、組換え核酸を運ぶ小胞との融合等によって実施され得る。
【００８５】
従って、組換え核酸が、（ゲノム編集若しくはレトロウイルストランスフェクションによって）ゲノム内に統合され得る、又は（複製能力を有する可能性がある）安定性若しくは一過性染色体外単位として存在し得ることも又理解すべきである。例えば、細胞傷害性細胞をトランスフェクトするために使用される組換え核酸は、ウイルス核酸として構成することができ、細胞をトランスフェクトするための好適なウイルスには、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ関連性ウイルス、パルボウイルス、トガウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス等が含まれる。或いは、組換え核酸は、染色体外単位として（例えば、プラスミド、酵母人工染色体等として）、又はゲノム編集のために好適（例えば、ＣＲｉＰＲ／Ｃａｓ９、Ｔａｌｅｎ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介性統合のために好適）な構築体として、又は単純トランスフェクション（例えば、ＲＮＡ、（合成又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される）ＤＮＡ、ＰＮＡ等）のために構成され得る。このため、細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされ得ることにも留意されたい。
【００８６】
著者らは、組換えキメラ抗原性受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体錯体若しくはハイブリッドＴ細胞受容体錯体を発現する遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＮＫＴ細胞がＣＤ１ｄ−（脂質）抗原錯体に対する特異性（若しくは制限）を損失し得る、及び他のＭＨＣ抗原（若しくはネオエピトープ）錯体に対する特異性を２種の別個及び個別のペプチドの配列に依存して獲得できるように、内因性ＮＫＴ細胞Ｔ細胞受容体の置換においてそれらの分子を発現することを企図している。そのような実施形態では、ＮＫＴ細胞内のＴ細胞受容体のα鎖及びβ鎖をコードする遺伝子は、ノックアウト（例えば、欠失等）することができ、組換えキメラ抗原性受容体（ＣＡＲ）若しくはＴ細胞受容体錯体をコードする核酸は、導入された異種キメラ抗原性受容体（ＣＡＲ）若しくはＴ細胞受容体錯体がノックアウトされた内因性Ｔ細胞受容体の代わりにＮＫＴ細胞内で発現させ得るように、（例えば、ウイルスベクター等を使用して）ＮＫＴ細胞に導入することができる。
【００８７】
ＣＡＲ若しくはＴ細胞受容体錯体をコードする核酸は、標的化遺伝子座でノックインすることができ、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の内因性Ｔ細胞受容体α鎖若しくはβ鎖又はそれらの部分と置換するので、内因性Ｔ細胞受容体の発現は、実質的に（例えば、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満）無効にできる、及び／又は導入されたタンパク質（ＣＡＲ若しくはＴ細胞受容体錯体）と競合し得る内因性Ｔ細胞受容体の任意の機能的若しくは非機能的断片は発現できないことが好ましい。
【００８８】
本発明者らは、任意の好適な数の組換え核酸及びノックイン遺伝子座を使用すると組換え核酸をノックインできることを更に企図している。例えば、遺伝子改変ＮＫＴ細胞がＣＡＲを発現する場合は、ＣＡＲは、ＮＫＴ細胞ゲノムの１つ以上の遺伝子座内に統合されるべき１つ以上のベクター内に更に挿入され得る単一核酸によってコードされ得る。従って、この例では、ＣＡＲをコードする組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α鎖（１４番染色体）若しくはＴ細胞受容体β鎖（７番染色体）又はその両方をコードする遺伝子座の１つに統合することができる。他の例については、遺伝子改変ＮＫＴ細胞が組換えＴ細胞受容体錯体を発現する場合は、組換えＴ細胞受容体錯体は、ＮＫＴ細胞ゲノムの１つ以上の遺伝子座内に統合されるべき１つ以上のベクター内に更に挿入され得る、単一核酸によって（上述した複数の核酸セグメントと共に）コードされ得る。従って、この例では、組換えＴ細胞受容体錯体をコードする組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α鎖（１４番染色体）若しくはＴ細胞受容体β鎖（７番染色体）又はその両方をコードする遺伝子座の１つに統合することができる。更に又他の例については、遺伝子改変ＮＫＴ細胞が組換えＴ細胞受容体錯体を発現する場合は、組換えＴ細胞受容体錯体は、その各々がＮＫＴ細胞ゲノムの１つ以上の遺伝子座内に統合されるべき１つ以上のベクター内に更に挿入され得る複数の核酸によってコードされ得る。従って、この例ではそれぞれ、組換えＴ細胞受容体のα鎖をコードする組換え核酸は、内因性Ｔ細胞受容体α鎖をコードする遺伝子座内に統合することができ、組換えＴ細胞受容体のβ鎖をコードする組換え核酸は、内因性Ｔ細胞受容体β鎖をコードする遺伝子座内にそれぞれ統合することができる。
【００８９】
更に他の例については、遺伝子改変ＮＫＴ細胞がハイブリッドＴ細胞受容体を発現する場合は、ハイブリッドＴ細胞受容体の２つの別個のペプチドは、１つ以上のベクター内に局在する２つの別個の核酸セグメントによってコードされ得る。好ましくは、第１ペプチドをコードする組換え核酸は、内因性α鎖及びβ鎖の両方が腫瘍抗原／新抗原に対する特異性を獲得し、ＣＤ１ｄ提示脂質抗原に対する特異性（若しくは制限）を消失させる（又は低減させる）ためにハイブリッドα鎖及びβ鎖と置換され得るように、Ｔ細胞受容体α鎖をコードする遺伝子座（１４番染色体）を標的とするカセット内に封入され、第２ペプチドをコードする組換え核酸はＴ細胞受容体β鎖をコードする遺伝子座（７番染色体）を標的とするカセット内に封入されている。
【００９０】
本発明者らは、上述した組換え核酸を用いて遺伝子改変されるべきＮＫＴ細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで増殖したＮＫＴ細胞であってよいこと、又は腫瘍細胞若しくは腫瘍微小環境に対する所望の免疫応答に依存して、特異的糖脂質アゴニスト（例えば、α−ＧｌｃＣｅｒ、β−ＭａｎＣｅｒ、ＧＤ３等）を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させられる特定のタイプのＮＫＴ細胞であってよいことを更に企図している。例えば、β−ＭａｎＣｅｒを用いて活性化されたＮＫＴ細胞は、ＮＯＳ（例えば、マクロファージ活性等を包含する）に依存するＮＫＴ細胞媒介性免疫応答を誘導するために上述したように遺伝子改変され得る。他の例については、α−ＧｌｃＣｅｒを用いて活性化されたＮＫＴ細胞は、ＮＯＳに依存するＮＫＴ細胞媒介性免疫応答（例えば、ＭＤＳＣ媒介性免疫抑制の抑制等）を誘導するために上述したように遺伝子改変され得る。免疫療法の別個の目的のためには２を超えるタイプの細胞を個別に使用できるが、両方のタイプのＮＫＴ細胞は、免疫療法における相乗作用を提供するために同一若しくは異なる核酸構築体を用いて遺伝子改変され得ることも又企図されている。
【００９１】
ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖及び活性化
更に、単離且つ濃縮したＮＫＴ細胞の集団は、ハイブリッドＴ細胞受容体を形成するためにＣＡＲ、組換えＴ細胞受容体錯体又はペプチドをコードする組換え核酸が導入される前及び／又は導入された後にＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖によって更に増加させられ得る。ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖は、ＮＫＴ細胞を７〜２１日間で少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍増殖させられる任意の好適な材料を用いて任意の好適な方法で実施することができる。例えば、単離且つ濃縮したＮＫＴ細胞は、１つ以上の活性化状況を含む細胞培養培地（例えば、ＡＩＭＶ（登録商標）培地、ＲＰＭＩ１６４０（登録商標）等）に配置することができる。活性化状況は、ＮＫＴ増殖を刺激し得る、ＮＫＴの細胞分割を誘導し得る、及び／又はＮＫＴ細胞を更に増殖させ得るＮＫＴからのサイトカイン遊離を刺激し得る任意の分子の添加を含むことができる。活性化状況がｅｘ  ｖｉｖｏ増殖及び活性化の時期に依存して変動し得ることは企図されている。例えば、ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖及び活性化は、内因性ＮＫＴ  Ｔ細胞が組換え核酸のノックインによって除去される前に、内因性ＮＫＴ  Ｔ細胞受容体の成分に対する内因性ＮＫＴ  Ｔ細胞受容体若しくは抗体の活性化因子を使用して実施することができる。しかし、内因性ＮＫＴ  Ｔ細胞が組換え核酸のノックインによって除去された後に、内因性ＮＫＴ  Ｔ細胞受容体又は内因性ＮＫＴ  Ｔ細胞受容体の成分に対する抗体の活性化因子を効果的なｅｘ  ｖｉｖｏ増殖及び活性化のために使用できないことは企図されている。
【００９２】
従って、活性化分子は、組換え核酸がＮＫＴ細胞内に導入される前にｅｘ  ｖｉｖｏ増殖及び活性化が実施された場合は、Ｔ細胞受容体抗体（例えば、好ましくはビーズ上に固定化された抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、α−ＴＣＲ−Ｖα２４＋抗体等）、糖脂質（例えば、α−ＧｌｃＣｅｒ、β−ＭａｎＣｅｒ、ＧＤ３等）、ＣＤ１（例えば、ＣＤ１ｄ等）と結合した糖脂質を含むことができる。組換え核酸がＮＫＴ細胞内に導入された後、活性化分子は、１種以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１、好ましくはヒト組換えＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１等）を任意の所望の濃度（例えば、少なくとも１０Ｕ／ｍＬ、少なくとも５０Ｕ／ｍＬ、少なくとも１００Ｕ／ｍＬ）等で含み得る。一部の実施形態では、活性化状況は、単離且つ濃縮したＮＫＴ細胞を自家若しくは自己末梢血単核球（ＰＢＭＣ）フィーダー細胞と共に培養する工程を含み得る。
【００９３】
更に、本発明者らは、ＮＫＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖が、ＮＫＴ細胞がサイトカイン遊離の様々なプロファイルを有するように誘発し得る様々なタイプの糖脂質（例えば、α−ＧｌｃＣｅｒ、β−ＭａｎＣｅｒ、ＧＤ３等）を用いてＮＫＴ細胞を処置する工程によって、特定のタイプのＮＫＴ細胞の増殖に向け得ることも又企図している。例えば、ＮＫＴ細胞は、増殖したＮＫＴ細胞を特定の型：ＩＦＮ−γ産生ＮＫＴ細胞に誘導するために細胞外α−ＧｌｃＣｅｒをｅｘ  ｖｉｖｏで処置することができる。他の例については、ＮＫＴ細胞は、他の特定の型：ＴＮＦ−α、ｉＮＯＳ依存性抗腫瘍活性を備えるＮＫＴ細胞へ増殖したＮＫＴ細胞を誘導するために細胞外β−ＭａｎＣｅｒをｅｘ  ｖｉｖｏで処置することができる。
【００９４】
活性化状況に関して、活性化状況を提供する用量及びスケジュールがＮＫＴ細胞の初期数及びＮＫＴ細胞の状況に依存して変動し得ることは、企図されている。一部の実施形態では、単回用量のサイトカイン（例えば、１００Ｕ／ｍＬ）を少なくとも３日間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間に渡り使用することができる。他の実施形態では、サイトカインの用量は、増殖期間中に増量又は減量することができる（例えば、最初の３日間を２００Ｕ／ｍＬ及び次の１４日間を１００Ｕ／ｍＬ、又は最初の３日間を１００Ｕ／ｍＬ及び次の１４日間を２００Ｕ／ｍＬ等）。更に、様々なタイプのサイトカインは、ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖中に組み合わせて、又は個別に使用できること（例えば、最初の３日間をＩＬ−１５及び次の３日間をＩＬ−１８、又は１４日間に渡りＩＬ−１５及びＩＬ−１８の組み合わせ等）も又企図されている。
【００９５】
任意選択的に、増殖したＮＫＴ細胞は、更に細胞傷害性を増加させるであろう状況下で活性化され得る。細胞傷害性を増加させる状況には、増殖したＮＫＴ細胞をＴ細胞受容体抗体（例えば、好ましくはビーズ上に固定された抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、α−ＴＣＲ−Ｖα２４＋抗体等）、糖脂質（例えば、α−ＧｌｃＣｅｒ、β−ＭａｎＣｅｒ、ＧＤ３等）又はＣＤ１と結合した糖脂質（例えば、ＣＤ１ｄ等）と所望の期間（例えば、少なくとも１時間、少なくとも６時間、少なくとも２４時間、少なくとも３日間、少なくとも７日間等）に渡り接触させる工程が含まれる。増殖且つ活性化されたＮＫＴ細胞の細胞傷害性は、ＮＫＴ細胞からのサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−α等）遊離の量を測定することによって決定することができる。
【００９６】
腫瘍を有する患者へのＮＫＴ細胞の投与
本発明者らは、ｅｘ  ｖｉｖｏ増殖した及び任意選択的に活性されたＮＫＴ細胞は、腫瘍を有する（又は自己免疫疾患に罹患している、若しくは微生物による局所感染症を有する等）患者に投与できることも企図している。ナイーブＮＫＴ細胞（例えば、単離、単離且つｅｘ  ｖｉｖｏ増殖、遺伝子改変等）及び／又は遺伝子組換えＮＫＴ細胞は、任意の（例えば、無菌注射用組成物としての）医薬上許容される担体中で少なくとも１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好ましくは少なくとも１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ及び用量単位当たり少なくとも１ｍＬ、好ましくは少なくとも５ｍＬ、より好ましくは及び少なくとも２０ｍＬの細胞力価で調製され得ることが企図されている。しかし、別の調製物も又本明細書で使用するために好適と思われ、本明細書では全ての公知の経路及び投与様式が企図されている。本明細書で使用する、遺伝的にナイーブなＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞を「投与する工程」という用語は、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物の直接的及び間接的両方の投与を意味するが、ここでナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子組換えＮＫＴ細胞の直接的投与は、典型的にはヘルスケア専門家（例えば、医師、看護師等）によって実施され、間接的投与は、ヘルスケア専門家が（例えば、注射等によって）直接的投与するためのナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物を提供する、又は彼らが利用可能にする工程を含む。
【００９７】
本組成物はナイーブＮＫＴ細胞、１つのタイプの遺伝子改変ＮＫＴ細胞（例えば、ＣＡＲを発現する遺伝子改変ＮＫＴ細胞、組換えＴ細胞受容体錯体を発現する遺伝子改変ＮＫＴ細胞、ハイブリッドＴ細胞受容体を発現する遺伝子改変ＮＫＴ細胞）だけを含む可能性はあるが、本組成物がナイーブＮＫＴ細胞及び遺伝子改変ＮＫＴ細胞の混合物又は異なるタイプの遺伝子改変ＮＫＴ細胞の混合物を含み得ることも又企図されている。本組成物では、ナイーブＮＫＴ細胞対遺伝子改変ＮＫＴ細胞の比率、又は様々なタイプの遺伝子改変ＮＫＴ細胞間の比率は、癌のタイプ、患者の年齢、性別若しくは健康状態、腫瘍のサイズ又は患者の血液中のＮＫＴ細胞数に依存して変動し得る。一部の実施形態では、ナイーブＮＫＴ細胞対遺伝子改変ＮＫＴ細胞の比率、又は２種の異なる遺伝子改変ＮＫＴ細胞間の比率は、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも５：１、又は少なくとも１：２、少なくとも１：３、若しくは少なくとも１：５であり、及び３種の異なる遺伝子組換えＮＫＴ細胞間の比率は、少なくとも１：１：１、１：２：１、１：１：２等であり得る。更に、ナイーブＮＫＴ細胞又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞に対する組成物の細胞傷害性を増強するために複数のサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞）を含むことができる、又はＣＩＫ細胞と共投与することができる。
【００９８】
一部の実施形態では、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物は、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）注射又は静脈内注射を含む全身性注射によって投与される。全身性注射が（例えば、脳腫瘍等のために）効率的ではない他の実施形態では、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物は、腫瘍内注射によって投与されることが企図されている。
【００９９】
ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物の投与の用量に関して、用量は、疾患の状態、症状、腫瘍のタイプ、サイズ、局在位置、患者の健康状態（例えば、年齢、性別等を含む）及び任意の他の関連状況に依存して変動し得ることが企図されている。変動する可能性があるが、用量及びスケジュールは、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞が宿主正常細胞に任意の有意な傷害性作用をもたらさないが、それでも腫瘍のサイズが低減する（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％等）、腫瘍細胞の数が低減する、腫瘍の表現型が変化する（例えば、形状、遺伝子発現の変化、タンパク質発現の変化、タンパク質の翻訳後修飾の変化等）、ＭＤＳＣ及び／又はＴｒｅｇの蓄積が防止される（又は、停止される、低減させられる等）ように、腫瘍及び／又は腫瘍微小環境に対する細胞傷害性作用及び／又は免疫調節作用を誘導するのに効果的であるために十分であるように選択及び調節することができる。
【０１００】
投与のスケジュールに関して、スケジュールも又、疾患の状態、症状、腫瘍のタイプ、サイズ、局在位置、患者の健康状態（例えば、年齢、性別等を含む）及び任意の他の関連状況に依存して変動し得ることが企図されている。一部の実施形態では、単回用量のナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物は、少なくとも１日間、少なくとも３日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１カ月間、又は任意の他の所望のスケジュールに渡り、少なくとも１日１回若しくは１日２回（投与１回当たり半量）投与することができる。他の実施形態では、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物の用量は、スケジュール中に徐々に増量され得る、又はスケジュール中に徐々に減量され得る。更に他の実施形態では、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物の複数回の一連の投与は、間隔を空けて分けることができる（例えば、連続３日間に１回の投与及び７日間の間隔を空けて別の連続する３日間に１回の投与等）。
【０１０１】
一部の実施形態では、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物の投与は、２つ以上の異なる段階：プライミング投与及びブースト投与で行うことができる。プライミング投与の用量は、後に続くブースト投与よりも（例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％）多いことが企図されている。それでも、プライミング投与のための用量が後に続くブースト投与よりも少ないことも又企図されている。更に、複数のブースト投与が行われる場合、各ブースト投与は、異なる用量（例えば、増加する用量、低減する用量等）を有する。
【０１０２】
一部の実施形態では、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物の投与の用量及びスケジュールは、感染細胞又は癌細胞の細胞変化によって微調整且つ通知され得る。例えば、癌患者に１以上の用量のナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物が投与された後に、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子組換えＮＫＴ細胞調製物との相互作用の結果として生じた何らかの変化（例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドのアップレギュレーション、アポトーシス率等）を評価するために、癌組織の微小生検が入手される。細胞変化の評価は、免疫組織学的方法（例えば、蛍光標識化、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等）、生化学的方法（例えば、タンパク質の定量、翻訳後修飾の同定等）又はオミクス分析を含む任意の好適なタイプのテクノロジーによって実施することができる。評価の結果に基づき、ナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞調製物の用量及び／又はスケジュールは、修飾することができる（例えば、過剰な細胞傷害性が観察された場合は低用量にする等）。
【０１０３】
ＮＫＴ細胞免疫応答の有効性を増加させるための腫瘍の前処置
遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、複数のサイトカイン及びケモカイン（例えばＩＬ−２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１７、インターロイキン−２１及びＴＮＦ−α）を遊離することによって抗原提示細胞に対する免疫応答を引き出すために、抗原提示細胞上のＭＨＣ錯体を用いて提示された腫瘍関連抗原／ネオエピトープであるＣＤ１ｄ抗原錯体が認識されると活性化されることが企図されている。従って、患者に、好ましくは腫瘍若しくは腫瘍微小環境にナイーブＮＫＴ細胞及び／又は遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程に加えて、腫瘍が投与されたＮＫＴ細胞に対してより感受性である状況を促進するための腫瘍を前状態調節する工程は、特に企図されている。
【０１０４】
例えば、一部の実施形態では、腫瘍細胞は、ＮＫＴ細胞感受性（若しくは応答性）状況に前状態調節することができ、その後にはナイーブＮＫＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖が続く可能性がある。そのような実施形態では、患者のナイーブＮＫＴ細胞は、任意の所望の濃度（例えば、少なくとも１０Ｕ／ｍＬ、少なくとも５０Ｕ／ｍＬ、少なくとも１００Ｕ／ｍＬ）でサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１、好ましくはヒト組換えＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２１等）を含むがそれらに限定されない活性化分子、Ｔ細胞受容体抗体（例えば、好ましくはビーズ上に固定化された抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、α−ＴＣＲ−Ｖα２４＋抗体等）、糖脂質（例えば、α−ＧｌｃＣｅｒ等）、ＣＤ１（例えば、ＣＤ１ｄ等）と結合した糖脂質を適用する（好ましくは腫瘍の近くに局所的に適用する）工程によって増殖させることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖ＮＫＴ細胞の量は、生検組織由来又は局所的に収集した体液由来のＮＫＴ細胞を計数することによって決定することができる。
【０１０５】
ＮＫＴ細胞に対する癌細胞の感受性若しくは応答性を増加させることのできる任意の好適な状況が企図されているが、最も好ましいのは、腫瘍細胞がＣＤ１ｄ又は細胞表面上でペプチド若しくは脂質抗原と結合したＣＤ１ｄを発現させる状況で処置されることである。一部の実施形態では、（野生型若しくは改変）ＣＤ１ｄをコードする組換え核酸は、ＣＤ１ｄ分子が腫瘍内で過剰発現するように癌細胞に導入することができる。好ましくは、ＣＤ１ｄをコードする組換え核酸は、ウイルスゲノム内に挿入され、癌細胞に導入される。ＣＤ１ｄをコードする組換え核酸を運ぶ任意の好適なウイルスが企図されている。好適なウイルスには、腫瘍崩壊性ウイルス、好ましくは宿主に低免疫原性を提示する遺伝子改変腫瘍崩壊性ウイルスが含まれる。例えば、好ましい腫瘍崩壊性ウイルスには、その初期１（Ｅ１）遺伝子、初期２ｂ（Ｅ２ｂ）遺伝子若しくは初期３（Ｅ３）遺伝子において１つ以上の欠失を備える遺伝子改変アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）（例えば、Ｅ１及びＥ３遺伝子欠失Ａｄ５（Ａｄ５［Ｅ１］）、Ｅ２ｂ遺伝子欠失Ａｄ５（Ａｄ５［Ｅ１、Ｅ２ｂ］等）が含まれる。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームを有する１つの好ましいウイルス菌株では、それに対して細胞媒介性免疫が発生するウイルスタンパク質をコードする初期１（Ｅ１）遺伝子、初期２ｂ（Ｅ２ｂ）遺伝子及び初期３（Ｅ３）遺伝子領域は、免疫原性を低減させるために欠失している。更に、この菌株では、Ｅ２ｂ領域内のＡｄ５ポリメラーゼ（ｐｏｌ）及び終端直前タンパク質（ｐＴＰ）の欠失は、高度に免疫原性及び潜在的傷害性のタンパク質をコードするＡｄ５後期遺伝子を含むＡｄ５下流遺伝子発現を低減させる。様々な観点から、及び他の好適なウイルス間で考えると、特に好ましい腫瘍崩壊性ウイルスには、非複製性若しくは複製欠損性アデノウイルスが含まれる。
【０１０６】
好ましくは、ＣＤ１ｄをコードする組換え核酸には、ＣＤ１ｄを細胞表面に方向付けるシグナリングペプチドをコードする核酸セグメントが含まれる。任意の好適及び／又は公知のシグナリングペプチド（例えば、ロイシンリッチモチーフ等）は、企図されている。好ましくは、ＣＤ１ｄをコードする核酸セグメントは、シグナル配列がＣＤ１ｄのＣ末端に局在し得るように、シグナリングペプチドをコードする核酸セグメントの上流に局在する。しかし、シグナリングペプチドがＣＤ１ｄのＮ末端又はＣＤ１ｄタンパク質の中央部に局在し得ることも又企図されている。
【０１０７】
更に、ＣＤ１ｄをコードする組換え核酸は、ＣＤ１ｄのペプチドリガンド（例えば、疎水性短鎖ペプチド）、例えばｐ９９をコードする核酸セグメントを含み得る。この実施形態では、組換え核酸は、ＣＤ１ｄをコードする第１核酸セグメント及びｐ９９をコードする第２核酸セグメントを含むことができ、第１及び第２核酸セグメントは、ＣＤ１ｄ及びｐ９９が２つの個別及び別個のペプチドに翻訳され得るが、それでも２つのペプチドの発現が同一プロモーター下で調節され得るように、１つのタイプの２Ａ自己切断型ペプチド（２Ａ）をコードする核酸配列によって分離されている。本発明者らは、共発現したＣＤ１ｄ及びｐ９９が細胞内で結合され、腫瘍細胞表面に一緒にトラフィッキングされ、ＮＫＴ細胞がＣＤ１ｄ−ＣＤ１ｄ受容体相互作用又はＭＨＣ−エピトープ−Ｔ細胞受容体（若しくはＣＡＲ）相互作用によって腫瘍細胞を認識した場合は、ＮＫＴ細胞活性化を誘発することを企図している。少なくとも一部の例では、ｐ９９は、従来型のＴ細胞認識を崩壊させ得る例外的方法でＣＤ１ｄに結合し得ることに留意されたい。しかし、ｐ９９は生理学的シグナリング能力を備える強力なリガンドであると思われるので、本明細書では（Ｔ細胞又は他の免疫担当細胞との）他の相互作用も又企図されている。
【０１０８】
或いは、ＣＤ１ｄ分子をコードする組換え核酸（例えば、腫瘍崩壊性ウイルス等）を用いて前処置された腫瘍細胞は、α−ＧａｌＣｅｒ、β−マンノシルセラミド（β−ＭａｎＣｅｒ）若しくはＧＤ３（黒色腫由来ガングリオシド）を含むがそれらに限定されない１種以上のＮＫＴ細胞アゴニストを用いて更に処置することができる。この実施形態では、α−ＧａｌＣｅｒ、β−ＭａｎＣｅｒ、ＧＤ３又はそれらの任意の組み合わせは、ＣＤ１ｄをコードする組換え核酸が腫瘍細胞に導入された後（例えば、少なくとも１日後、少なくとも３日後、少なくとも７日後等）に局所的に適用（例えば、腫瘍内注射等）され得る。本発明者らは、表面発現したＣＤ１ｄは、細胞外α−ＧａｌＣｅｒ、β−ＭａｎＣｅｒ若しくはＧＤ３に結合し、ＮＫＴ細胞が腫瘍細胞をＣＤ１ｄ−ＣＤ１ｄ受容体相互作用若しくはＭＨＣ−（ネオ）エピトープ−Ｔ細胞受容体（若しくはＣＡＲ）相互作用によって認識すると、ＣＤ１ｄ−α−ＧａｌＣｅｒ錯体、ＣＤ１ｄ−β−ＭａｎＣｅｒ錯体若しくはＣＤ１ｄ−ＧＤ３錯体を形成し、及びＮＫＴ細胞活性化を誘発することを企図している。複数のタイプの細胞外ＮＫＴ細胞アゴニストが腫瘍細胞へ処置される１つの実施形態では、細胞外ＮＫＴ細胞アゴニストが連続的に処置され得ることが企図されている（例えば、第１日におけるα−ＧａｌＣｅｒ、第３日におけるβ−ＭａｎＣｅｒ及び第５日におけるＧＤ３等）。それでも、複数の細胞外ＮＫＴ細胞アゴニストが、単回処置又は複数回処置のために腫瘍細胞へのカクテルとして処置され得ることも又企図されている。
【０１０９】
他の実施形態では、腫瘍細胞は、ＣＤ１ｄ及び／又は自己脂質分子と結合したＣＤ１ｄの発現を増加させるために腫瘍細胞を抑制できる状況にかけることができる、又は任意の組成物で前処置することができる。例えば、局所的熱ショック処置（例えば、４２℃で１分間、３分間、５分間等）、低酸素症、化学療法、毒素への曝露及び／又は機械的損傷（例えば、癌組織の部分的外科的切除等）を使用すると、ＣＤ１ｄ及び／又は自己脂質分子と結合したＣＤ１ｄの発現を増加させることができる。
【０１１０】
更に他の実施形態では、腫瘍細胞は、腫瘍細胞上でのＣＤ１ｄの表面発現を促進できる薬物を用いて前処置することができる。例えば、ＣＤ１ｄの表面発現を誘発できるＨＤＡＣの阻害剤には、ヒドロキサム酸（例えば、トリコスタチンＡ）、環状テトラペプチド（例えば、トラポキシンＢ等）、ベンズアミド、求電子性ケトン及び脂肪酸（例えば、フェニルブチレート、バルプロ酸等）が含まれるがそれらに限定されない。この実施形態では、ＨＤＡＣの阻害剤は、ナイーブ若しくは遺伝子改変ＮＫＴ細胞が投与される前（例えば、少なくとも６時間前、少なくとも２４時間前、少なくとも３日前等）に、又はナイーブ若しくは遺伝子改変ＮＫＴ細胞の投与と同時に、局所的（例えば、腫瘍内注射等）又は全身性で投与（例えば、経口投与、静脈内注射等）することができる。
【０１１１】
更に別の態様では、免疫化レジメンの一部として、腫瘍近傍において内因性若しくは養子移入されたＮＫＴ細胞を活性化するために、ｉｎ  ｖｉｖｏで様々な腫瘍標的化ビヒクルと共に使用するための、１種以上の天然型若しくは合成ＣＤ１ｄリガンド（例えば、α−ＧａｌＣｅｒ）を含む様々な組成物及び化合物の使用が企図されている。例えば、及び天然型若しくは合成ＣＤ１ｄリガンドに関しては、上述と同一の考察が適用される。そのようなリガンドは、次に腫瘍標的化部分に結合させることができ、腫瘍を特異的若しくは優先的に標的化し得る全ての公知の部分は、本明細書で使用するために好適であると思われる。このため、標的化の機序は、腫瘍エピトープ特異的、又は腫瘍若しくは腫瘍微小環境の１つ以上の生理学的特性に対して特異的であり得ることを認識すべきである。
【０１１２】
例えば、標的化の機序が腫瘍エピトープ特異的である場合は、中間担体を用いて、又は用いずに様々なｓｃＦｖ若しくは抗体ベースの組成物を使用することができる。数ある品目の中で、ｓｃＦｖ若しくは抗体は、キメラポリペプチドであってよい、又はＣＤ１ｄリガンドは、合成リンカーによってｓｃＦｖ若しくは抗体に共有結合され得る。他の例では、標的化は、腫瘍新血管構造におけるトランスサイトーシス及びＣＤ１ｄリガンドの担体としてのアルブミンをそのようなものとして使用することができる。或いは、若しくは追加して、新血管構造は、ｇｐ６０媒介性輸送によって更に標的化することができ、そのようなものとして少なくとも１つのＦｃ部分を含むことができる。そのような使用の更に別の態様では、ＣＤ１ｄリガンドは、例えばエクソソーム、リポソーム等（更にｓｃＦｖ若しくは抗体等の標的化実体も含み得る）の膜担体に結合させることができる。
【０１１３】
特定の成分及び結合方法とは無関係に、そのようなハイブリッド分子が少なくとも優先的に、及びより典型的には腫瘍微小環境内及び／又は標的化部分に起因する腫瘍細胞中で選択的に濃縮するであろうことが企図されている。腫瘍細胞若しくは腫瘍塊と共局在すると、内因性若しくは養子移入ＮＫＴ細胞は次に腫瘍で活性化され、免疫抑制を反転させる、又は少なくとも（典型的にはＭＤＳＣとの相互作用によって）低減させる免疫調節機能を提供するであろう。上述した主題に該当するより多くの関連データ及び提案されたモデルは、本明細書の付属書Ａに添付されている。
【０１１４】
当業者には、本明細書に記載の本発明の概念から逸脱せずに、既に上述した他に多数のより多くの改変が可能であることは明白なはずである。このため、本発明の主題は、添付の特許請求項の範囲を除いて制限されることはない。更に、本発明の明細書及び特許請求項の両方を解釈する際には、全ての用語は本発明の状況と一致する最も広範囲の可能な方法で解釈すべきである。特に、用語「含む」及び「含んでいる」は、本明細書で言及した要素、成分若しくは工程が明示的には言及されていない他の要素、成分若しくは工程と共に存在し得る、利用できる、又は組み合わせられることを示している、非排他的方法における要素、成分若しくは工程を意味すると解釈すべきである。本明細書の説明及び添付の特許請求の範囲において使用するように、単数形「１つの」及び「その」は、状況が明白に他のことを指示していない限り、複数形を含む。更に、本明細書の説明で使用するように、「中で」の意味は、状況が明白に他のことを指示しない限り、「中」及び「上」の意味を含む。本明細書の特許請求項がＡ、Ｂ、Ｃ．．．及びＮから成る群から選択される何かの少なくとも１つを意味する場合、その文は、Ａ＋Ｎ又はＢ＋Ｎ等ではなく、その群からの唯一の要素だけを必要とすると解釈すべきである。
【図１】
2021520184.tif 000003
【図２】
2021520184.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月30日(2020.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片、２）細胞内活性化ドメイン、及び３）前記細胞外一本鎖変異断片を前記細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを有するキメラタンパク質をコードする組換え核酸を含む、遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項２】
前記組換え核酸は：
前記腫瘍ネオエピトープ、前記腫瘍関連抗原若しくは前記自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片をコードする第１核酸セグメント；
細胞内活性化ドメインをコードする第２核酸セグメント；
前記細胞外一本鎖変異断片と前記細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３核酸セグメントを含み、かつ
前記第１、第２及び第３セグメントは、前記細胞外一本鎖変異断片、前記細胞内活性化ドメイン及び前記リンカーが単一キメラポリペプチドを形成するように配列されている、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項３】
前記細胞外一本鎖変異断片は、前記腫瘍ネオエピトープ、前記腫瘍関連抗原若しくは前記自己脂質に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、任意選択的に前記細胞外一本鎖変異体は、前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとの間のスペーサーを更に含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項４】
ＣＤ１ｄへ特異的に結合するＴ細胞受容体、またはＶα２４−Ｊα１８  Ｔ細胞受容体を更に含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項５】
前記細胞内活性化ドメインは、前記ＮＫＴ細胞内でＩＴＡＭ媒介性シグナリングを誘発する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはＣＤ３ζの一部分、またはＣＤ２８活性化ドメインの一部分を含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項６】
前記リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項７】
前記腫瘍エピトープは、患者特異的及び腫瘍特異的である、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項８】
前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の一部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の一部分の少なくとも１つと置換し、
任意選択的にＴ細胞受容体α遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含み、好ましくはＴ細胞受容体α鎖の細胞外ドメインの前記可変領域は、前記Ｔ細胞受容体α鎖のＶα２４−Ｊα１８領域または前記Ｔ細胞受容体β鎖のＶα１１領域を含み、
任意選択的にＴ細胞受容体β遺伝子座の前記部分は、Ｔ細胞受容体β鎖の細胞外ドメインの可変領域をコードする核酸配列を含み、
更に任意選択的に前記組換え核酸は、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記部分及びＴ細胞受容体β遺伝子座の前記部分の前記少なくとも１つと標的化ゲノム編集ヌクレアーゼによって置換し、好ましくは前記標的化ゲノム編集ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項９】
α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分を有するタンパク質錯体をコードする組換え核酸であって、前記α鎖Ｔ細胞受容体若しくはβ鎖Ｔ細胞受容体の少なくとも一部分は、患者特異的、腫瘍特異的なネオエピトープ、腫瘍関連抗原又は自己脂質に対して特異的である組換え核酸を含む、遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１０】
前記組換え核酸は：
α鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体をコードする第１核酸セグメントであって、前記α鎖及びβ鎖受容体が第１自己切断型２Ａペプチド配列によって分離されている第１核酸セグメント；
ＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分をコードする第２核酸セグメントであって、ＣＤ３δの前記少なくとも一部分及びＣＤ３γの前記少なくとも一部分が第２自己切断型２Ａペプチド配列によって分離されている第２核酸セグメントを含み；かつ
前記α鎖Ｔ細胞受容体及び前記β鎖Ｔ細胞受容体の少なくとも１つは、患者特異的、腫瘍特異的なネオエピトープ又は腫瘍関連抗原又はＣＤ１−脂質抗原錯体へ一緒に特異的に結合する、請求項９に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１１】
ＣＤ３γの前記部分又はＣＤ３δの前記部分の少なくとも１つは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項９に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞。
【請求項１２】
腫瘍を有する患者においてＮＫＴ細胞免疫応答を誘導する方法であって、
前記患者から複数のＮＫＴ細胞を含む体液を入手する工程：
前記複数のＮＫＴ細胞に特異的である結合分子を使用して前記ＮＫＴ細胞を濃縮する工程；
前記ＮＫＴ細胞の集団をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させる工程；及び
前記腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するために効果的である用量及びスケジュールで前記増殖したＮＫＴ細胞を前記患者に投与する工程を含み、
好ましくは前記結合分子は、Ｖα−２４に対する抗体であり、より好ましくは前記結合分子は、ＣＤ１ｄの一部分、脂質抗原と結合したＣＤ１ｄの一部分及びペプチド抗原と結合したＣＤ１ｄの一部分から成る群から選択される、方法。
【請求項１３】
腫瘍を有する患者における骨髄由来サプレッサー細胞の活性を抑制する方法であって：
骨髄由来サプレッサー細胞の前記活性を抑制するために有効な用量及びスケジュールで複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞を前記患者に投与する工程を含み；かつ 
前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞がＣＤ４０Ｌ及びＦａｓ−Ｌの少なくとも１つを発現し、
好ましくは前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞である、方法。
【請求項１４】
腫瘍を有する患者においてＮＫＴ細胞免疫応答を誘導する方法であって：
１）腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくは自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片、２）細胞内活性化ドメイン、及び３）前記細胞外一本鎖変異断片を前記細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを有するキメラタンパク質をコードする組換え核酸を含む遺伝子組換えＮＫＴ細胞を提供する工程；及び
前記腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するために効果的である用量及びスケジュールで前記患者に前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程を含み、
好ましくは前記組換え核酸は：
前記腫瘍ネオエピトープ、前記腫瘍関連抗原若しくは前記自己脂質へ特異的に結合する細胞外一本鎖変異断片をコードする第１核酸セグメント；
細胞内活性化ドメインをコードする第２核酸セグメント；
前記細胞外一本鎖変異断片と前記細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３核酸セグメントを含み；かつ 
前記第１、第２及び第３セグメントは、前記細胞外一本鎖変異断片、前記細胞内活性化ドメイン及び前記リンカーが単一キメラポリペプチドを形成するように配列されている、方法。
【請求項１５】
腫瘍を有する患者においてＮＫＴ細胞免疫応答を誘導する方法であって：
α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部分及びＣＤ３γの少なくとも一部分を有するタンパク質錯体をコードする組換え核酸をコードする組換え核酸を含む遺伝子組換えＮＫＴ細胞を提供する工程；及び
前記腫瘍に対するＮＫＴ細胞免疫応答を誘導するために効果的である用量及びスケジュールで前記患者に前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞を投与する工程を含む方法。
【請求項１６】
腫瘍を有する患者の前記腫瘍を治療するための、請求項１又は９の何れか一項に記載の遺伝子組換えＮＫＴ細胞の使用。
【国際調査報告】
2021520184.tif 000005
2021520184.tif 000006
2021520184.tif 000007