(57)【要約】  本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンを調製するプロセスに関し、ここでのプロセスは、炭素対窒素の比が３：１から６：１で、特定のフィード速度での、宿主細胞におけるクローンのフェッドバッチ発酵を含む。本発明はまた、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの精製プロセスにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えレクチンタンパク質を調製する方法であって、該方法は、宿主細胞培養液中で組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質を発現させる工程を含み、細胞の発現が、細胞が１６０分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれる、該方法。
【請求項２】
細胞の発現が、細胞が少なくとも１００分の倍加時間を有するような細胞の条件下で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現が、少なくとも１５℃かつ２２℃以下の温度で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞培養液が少なくとも１０Ｌの容量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、宿主細胞を培養する工程を含み、該培養は、宿主細胞を、タンパク質発現前に増殖させる増殖期及びタンパク質の発現が行なわれる発現期を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
増殖期が、発現期が行なわれる温度よりも高い温度で実施される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
増殖期から発現期までの温度を、少なくとも４時間かつ７時間以下の期間をかけて下げる、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
発現期が、少なくとも０．１mMかつ０．７mM以下の濃度の誘導物質の添加によって誘導される、請求項５〜７のいずれかに請求されているような方法。
【請求項９】
発現期が、培養液の吸光度が少なくとも２５かつ４０以下である場合に、誘導物質の添加によって誘導される、請求項５〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
吸光度が、培養液中の宿主細胞集団の測定であり、６００nmで測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組換えレクチンタンパク質の発現用の宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
誘導物質が、ＩＰＴＧである、請求項８〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
誘導物質が、０．５mM以下の濃度で培養液に添加される、請求項８〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
組換えレクチンタンパク質が、
ａ．配列番号１；
ｂ．配列番号３；
ｃ．配列番号４；又は
ｄ．ａ、ｂ、又はｃに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、さらに、
ａ）場合により、組換えレクチン遺伝子を発現ベクターにクローニングし、該発現ベクターを宿主細胞に挿入すること；
ｂ）適切な培地中で宿主細胞を培養すること、該培養は、２５℃から４０℃の温度で行なわれる増殖期と、組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質が発現される間の発現期とを含み、ここでの発現期間は、１５℃から３０℃の温度で行なわれ、炭素対窒素の比は、発現期中に３：１から６：１に維持される；
ｃ）場合により、（ｂ）で発現される組換えレクチンタンパク質を単離して、粗組換えレクチンタンパク質を得ること；及び
ｄ）場合により、粗組換えレクチンタンパク質を精製し、組換えレクチンタンパク質の単離物を得ること
を含む、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
工程「ａ」の発現ベクターが、図１に示されているとおりである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程「ｂ」の炭素源が、誘導期間中、少なくとも０．５ｇ/Ｌ/ｈの速度かつ２ｇ/Ｌ/ｈ以下の速度で培養液に添加され、炭素源が、グルコース又はグリセロールである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
工程「ｂ」の窒素源が、誘導期間中、少なくとも０．４ｇ/Ｌ/ｈの速度かつ１．５ｇ/Ｌ/ｈ以下の速度で培養液に添加され、窒素源が、トリプトン、ペプトン、又は酵母エキスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
工程「ｃ」の粗組換えレクチンタンパク質の単離が、遠心分離に続いて細胞表面の破壊によって行なわれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
工程「ｄ」の粗組換えレクチンタンパク質の精製が、少なくとも１回のクロマトグラフィー工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１回のクロマトグラフィー工程が、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１回のクロマトグラフィー工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
工程「ｄ」の粗組換えレクチンタンパク質の精製が、ろ過工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
組換えレクチンタンパク質が、
ａ．配列番号１；
ｂ．配列番号３；
ｃ．配列番号４；又は
ｄ．ａ、ｂ、又はｃに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞培養液が、少なくとも１０Ｌの容量を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程；
ｂ）第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程；
ｃ）第二の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第三の精製された溶出物を得る工程；
ｄ）第一、第二、又は第三の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、第四の精製された溶出物を得る工程；及び
ｅ）透析ろ過によって第四の精製された溶出物の緩衝液を交換して、精製された組換えレクチンタンパク質単離物を得る工程
を含む、粗組換えレクチンタンパク質を精製する方法。
【請求項２７】
粗組換えレクチンタンパク質が、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法によって得られる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法によって産生された組換えレクチンタンパク質。
【請求項２９】
２０％未満の、開始メチオニンを有する組換えレクチンを有する組換えレクチンタンパク質を調製するための方法であって、該方法は、以下の条件：
ａ）少なくとも１５℃かつ２２℃以下の発現温度；
ｂ）発現（すなわち誘導）期が少なくとも１０時間かけて行なわれる；
ｃ）炭素源は、０．５〜２ｇ/Ｌ/ｈの速度で培養液に添加される；
ｄ）窒素源は、０．４〜１．５ｇ/Ｌ/ｈの速度で培養液に添加される；
ｅ）少なくとも０．１mMかつ０．５mM以下の誘導物質の濃度；
ｆ）少なくとも１回のクロマトグラフィー工程を使用して粗組換えレクチンタンパク質を精製する工程
の少なくとも１つを含む、該方法。
【請求項３０】
２０％未満の、開始メチオニンを有する組換えレクチンを有する組換えレクチンタンパク質。
【請求項３１】
組換えレクチンが、
ａ．配列番号１；
ｂ．配列番号３；
ｃ．配列番号４；又は
ｄ．ａ、ｂ、又はｃに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択される、請求項２８又は３０に記載の組換えレクチンタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月７日に出願されたインド仮出願番号第２０１８２１００８３８２号、及び２０１９年１月１４日に出願されたインド仮出願番号第２０１９２１００１５５９号の恩典を請求し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、組換えレクチンタンパク質、及び、組換えレクチンタンパク質を調製する方法に関する。本発明はまた、粗組換えレクチンタンパク質を精製する方法にも関する。
【０００３】
発明の背景
レクチンは、糖鎖結合タンパク質であり、これは、他の分子の糖部分に高度に特異的である巨大分子である。レクチンは、細胞レベル及び分子レベルで認識を行ない、細胞、糖鎖、及びタンパク質の関与する生物学的な認識現象において数多くの役割を果たす。それらは、糖タンパク質に結合し沈降させ、赤血球を凝集させる、二価又は多価の糖鎖結合タンパク質である。動物に見られるレクチンは、細胞相互作用を補助することが多いことが判明し、一方、植物レクチンは、潜在的な捕食者又は病原体を防ぐことが知られている。いくつかのレクチンは、癌関連グリカンを検出することができ、それ故、悪性腫瘍のバイオマーカーとしての役目を果たす可能性、及び癌細胞株におけるグリコシル化モチーフの変化の研究を支える可能性を有する。
【０００４】
精製されたレクチンは、血液型判定にも使用されるので、臨床現場において重要である。個人の赤血球上の糖脂質及び糖タンパク質のいくつかは、レクチンによって同定され得る。多くのレクチンが、悪性増殖の早期検出を示すバイオマーカーとして、又はオートファジー誘導物質として使用され、一方、他のレクチンもまた、癌性増殖をアポトーシスを通して抑制する能力を示す。制御不能な細胞増殖に因り、糖鎖部分のいくつかは、癌細胞上の抗原として発現している。レクチンは、癌療法において薬物送達剤として使用される。なぜなら、それらは、悪性腫瘍に特異的に結合するからである。さらに、レクチンはまた、癌関連経路を調節もするので、それらは、癌の診断剤及び治療剤としての可能性も有する。
【０００５】
レクチンが結合し、癌細胞表面上に特徴付けられている、いくつかの抗原が存在する；大半の抗原は特定の種類の癌に対して特異的であり、これらの抗原に対するレクチンの結合により、癌細胞におけるアポトーシスの誘導を通して、癌増殖は抑制され得る。現在、大半の市販されているレクチンは、植物及び他の真核生物に由来する。
【０００６】
白絹病菌（スクレロチウム・ロルフシー）（Sclerotium rolfsii）のレクチン（ＳＲＬ）は、土壌由来の植物病原真菌Ｓ．ロルフシーの菌核体から単離されたレクチンである。ＳＲＬは、トムゼン・フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原及びＴｎ抗原に対する特異性を有する。ＴＦ抗原は、様々なヒト癌細胞の細胞表面上に過剰発現されている、二糖（Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃ−α−Ｓｅｒ/Ｔｈｒ）である。Ｔｎ抗原は、単糖（ＧａｌＮＡｃ−α−）である。ＴＦ抗原及びＴｎ抗原に対するその特異性に因り、ＳＲＬは、ヒト大腸癌、卵巣癌、及び白血病細胞に結合することが示されている。ＳＲＬの結晶構造が決定されている（Leonidas et al., J Mol Biol. 2007 May 11;368(4):1145- 61）。
【０００７】
レクチンは、抗癌ツールとして多くの利点を与えるが、それらは依然として、選択性の欠如、一貫していない品質及び成績、並びに生産が容易にスケールアップできないなどの、多くの制約がある。さらに、植物由来レクチンは、一連の様々なグリカン構造に結合することが報告されることが多く、よって、多くの適用に必要とされる選択性を欠如している。また、植物レクチンを使用した場合に、バッチ毎のばらつきがよく見られる。製品の品質は、植物材料の単離法、及び出発植物材料それ自体の品質に依存する。
【０００８】
天然源からのレクチンの単離は信頼性がない。なぜなら、このようにして得られたレクチンは、所望の特性に関する一貫性が欠如しているからである。天然源からのタンパク質のさらなる単離は、費用がかかる困難なプロセスである。天然レクチンを単離するのに使用される技術は、通常、タンパク質が低い濃度でしか存在しない場合には特に、非常に低い収量をもたらす。また時々、同じレクチンのアイソフォーム間を識別できないことがある。それ故、それらは混合物として得られ、これは多くの不確実性をもたらす。このような意味では、組換えＤＮＡ技術による組換えレクチンの産生は、より良好かつ一貫した収量で、正確な特徴を有する、単一のタンパク質を、劇的により短い時間で提供し、同時に容易にスケールアップ可能であるという利点を有する。ｒＤＮＡ技術を使用することによって、関心対象タンパク質を産生する遺伝子を、適切な宿主に導入することができる。その後、タンパク質を、伝統的な方法と比べて、より短い時間及びより少ない努力で産生及び単離することができる。
【０００９】
国際公開公報第２０１０/０９５１４３号は、それぞれ、３又は５アミノ酸の置換により、天然ＳＲＬ配列から誘導された、組換えレクチン変異体Ｒｅｃ−２及びＲｅｃ−３を開示する。これらの変異体の結晶構造が報告されている（Peppa et al., Molecules. 2015 Jun 12;20(6):10848-65）。
【００１０】
国際公開公報第２０１４／２０３２６１号は、１２アミノ酸の置換による、天然ＳＲＬ配列から誘導された組換えレクチン変異体を開示する。
【００１１】
インド出願第３５０／ＭＵＭ／２００９号（ＰＣＴ出願の国際公開公報第２０１０／０９５１４３号）は初めて、真菌であるスクレロチウム・ロルフシーに由来する配列番号２（第３５０／ＭＵＭ／２００９号では配列番号１として示される）の天然アミノ酸配列に由来する配列番号１（第３５０／ＭＵＭ／２００９号では配列番号２として示される）のアミノ酸配列を開示する。国際公開公報第２０１０／０９５１４３号は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における組換えレクチンの実験室規模での産生を記載し、ここでの組換えレクチンをコードしている遺伝子は発現ベクターにクローニングされる。しかしながら、該方法は、例えば溶存酸素量及びｐＨなどの培養パラメーターを制御することが困難であること、並びに、タンパク質発現を制御できないことをはじめとする、一部の欠点に苦しむ。さらに、培養液は少ない細胞塊を生じ、よって、全体的に低い収量の精製タンパク質が得られる。さらに、プロセスは工業的にスケールアップできない。
【００１２】
配列番号１のアミノ酸配列を有するレクチンは、真菌のスクレロチウム・ロルフシーに由来する天然レクチンと比較して高い安定性及び溶解度を示し、癌細胞結合特性を示す。レクチンは、研究、医薬、及び生化学技術において様々な用途を有する。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するレクチンは、高い製薬上の可能性を有する。それ故、より高い収量で、より費用対効果の高い、より容易にスケールアップでき、及び/又は、改善された有効性を有する、組換えレクチンを産生するプロセスを考案する必要がある。
【００１３】
本発明は、これらの問題を念頭に置いて考案されている。
【００１４】
発明の目的
本発明の主な目的は、先行技術の対象物の欠点を克服し、配列番号１のアミノ酸配列を調製するための非常に効率的なプロセスを考案することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、高い収量で、費用対効果が高く、容易に入手可能な原材料を使用して行なうことのできる、プロセスを提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、配列番号１のアミノ酸配列を調製するための、容易にスケールアップできるプロセスを提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、非常に純粋な形態の配列番号１のアミノ酸配列を生じるプロセスを提供することである。
【００１８】
発明の要約
本発明の１つの態様では、組換えレクチンタンパク質を調製する方法が提供され、該方法は、宿主細胞培養液中で組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質を発現させる工程を含み、ここでの細胞の発現は、細胞が１６０分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。いくつかの実施態様では、細胞の発現は、細胞が少なくとも１００分間の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。
【００１９】
１つの実施態様では、該方法は、２２℃以下の温度で、宿主細胞培養液中において組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質を発現させる工程を含む。さらなる実施態様では、発現は、少なくとも１５℃かつ２２℃以下の温度で行なわれる。
【００２０】
いくつかの実施態様では、組換えレクチンの発現用の宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施態様では、組換えレクチンタンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又はこれらのいずれかの配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列から選択される。
【００２１】
いくつかの実施態様では、宿主細胞培養液は、少なくとも１０Ｌの容量を有する。
【００２２】
いくつかの実施態様では、前記方法は、宿主細胞を培養する工程を含み、該培養は、増殖期間（その間に、宿主細胞を、タンパク質発現前に増殖させる）及び発現期間（その間にタンパク質の発現が行なわれる）を含む。さらなる実施態様では、増殖期間は、発現期間が行なわれる温度よりも高い温度で行なわれる。さらに他の実施態様では、増殖期間から発現期間までの温度を、少なくとも４時間かつ７時間以下の期間をかけて下げる。
【００２３】
いくつかの実施態様では、発現期間は、少なくとも０．１mMかつ０．７mM以下の濃度の誘導物質の添加によって誘導される。他の実施態様では、誘導物質は、０．５mM以下の濃度で培養液に添加される。さらに他の実施態様では、発現期間は、培養液の吸光度が少なくとも２５かつ４０以下である場合に、誘導物質の添加によって誘導される。
【００２４】
いくつかの実施態様では、前記方法は、培養液の吸光度が少なくとも２５かつ４０以下である場合に、誘導物質の添加によって誘導される発現期間を含み、ここでの誘導物質は、少なくとも０．１mMかつ０．７mM以下の濃度である。
【００２５】
本発明の別の態様では、宿主細胞を培養する方法が提供され、ここでの発現期間は、少なくとも０．１mMかつ０．７mM以下の濃度の誘導物質の添加によって誘導され、ここでの細胞の発現は、細胞が１６０分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。いくつかの実施態様では、誘導物質は、０．５mM以下の濃度で培養液に添加される。
【００２６】
本発明のさらなる態様では、宿主細胞を培養する方法が提供され、ここでの発現期間は、培養液の吸光度が少なくとも２５かつ４０以下である場合に、誘導物質の添加によって誘導され、ここでの細胞の発現は、細胞が１６０分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。
【００２７】
いくつかの実施態様では、組換えレクチンタンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又はこれらのいずれかの配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列から選択される。
【００２８】
特定の実施態様では、吸光度は、培養液中の宿主細胞集団の測定値であり、６００nmで測定される。
【００２９】
いくつかの実施態様では、誘導物質は、ＩＰＴＧである。
【００３０】
本発明はまた、組換えレクチンタンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、宿主細胞培養液中で組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質を発現させる工程を含み、ここでの細胞の発現は、細胞が１６０分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれ、ここでの宿主細胞培養液は、少なくとも１０Ｌの容量を有する。
【００３１】
本発明の別の態様では、組換えレクチンを調製するプロセスが提供され、該プロセスは、
ａ）場合により、組換えレクチン遺伝子を発現ベクターにクローニングし、該発現ベクターを宿主細胞に挿入する工程；
ｂ）適切な培地中で宿主細胞を培養する工程（ここでの該培養は、２５℃から４０℃の温度で行なわれる増殖期間と、組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質が発現される間の発現期間とを含み、ここでの発現期間は、１５℃から３０℃の温度で行なわれ、ここでの炭素対窒素の比は、発現期間中に３：１から６：１に維持される）；
ｃ）場合により、（ｂ）で発現される組換えレクチンタンパク質を単離して、粗組換えレクチンタンパク質を得る工程；及び
ｄ）場合により、粗組換えレクチンタンパク質を精製して、組換えレクチンタンパク質の単離物を得る工程
を含む。
【００３２】
１つの実施態様では、工程ａ）の発現ベクターは図１に示されている通りである。別の実施態様では、工程「ｂ」の炭素源は、誘導期間中、少なくとも０．５ｇ/Ｌ/ｈの速度かつ２ｇ/Ｌ/ｈ以下の速度で培養液に添加され、ここでの炭素源はグルコース又はグリセロールである。あるいは、工程「ｂ」の窒素源は、誘導期間中、少なくとも０．４ｇ/Ｌ/ｈの速度かつ１．５ｇ/Ｌ/ｈ以下の速度で培養液に添加され、ここでの窒素源はトリプトン、ペプトン、又は酵母エキスである。
【００３３】
別の実施態様では、工程「ｃ」の粗組換えレクチンタンパク質の単離は、遠心分離に続いて細胞表面の破壊によって行なわれる。さらなる実施態様では、工程「ｄ」の粗組換えレクチンタンパク質の精製は、少なくとも１回のクロマトグラフィー工程を含む。さらなる実施態様では、少なくとも１回のクロマトグラフィー工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィーを含む。あるいは、少なくとも１回のクロマトグラフィー工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。追加の実施態様では、工程「ｄ」の粗組換えレクチンタンパク質の精製は、ろ過工程を含む。
【００３４】
いくつかの実施態様では、組換えレクチンタンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又はこれらのいずれかの配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列から選択される。いくつかの実施態様では、宿主細胞培養液は少なくとも１０Ｌの容量を有する。
【００３５】
本発明のさらに別の態様では、粗組換えレクチンタンパク質の精製法が提供され、ここでのプロセスは、
ａ）陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程；
ｂ）第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程；
ｃ）第二の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第三の精製された溶出物を得る工程；
ｄ）第二又は第三の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、第四の精製された溶出物を得る工程；及び
ｅ）透析ろ過によって第四の精製された溶出物の緩衝液を交換して、精製された組換えレクチンタンパク質単離物を得る工程
を含む。
【００３６】
いくつかの実施態様では、粗組換えレクチンタンパク質は、上記の方法によって得られる。いくつかの実施態様では、組換えレクチンタンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又はこれらのいずれかの配列に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列から選択される。
【００３７】
いくつかの実施態様では、宿主細胞培養液は、少なくとも１０Ｌの容量を有する。
【００３８】
本発明のさらなる態様では、上記の方法によって産生された組換えレクチンタンパク質が提供される。
【００３９】
本発明の別の態様では、２０％未満の開始メチオニンを有する組換えレクチンを有する組換えレクチンタンパク質を調製するための方法が提供され、該方法は、以下の条件：
ａ）少なくとも１５℃かつ２２℃以下の発現温度；
ｂ）発現（すなわち誘導）期間が少なくとも１０時間かけて行なわれる；
ｃ）炭素源は、０．５〜２ｇ/Ｌ/ｈの速度で培養液に添加される；
ｄ）窒素源は、０．４〜１．５ｇ/Ｌ/ｈの速度で培養液に添加される；
ｅ）少なくとも０．１mMかつ０．５mM以下の誘導物質の濃度；
ｆ）少なくとも１回のクロマトグラフィー工程を使用して粗組換えレクチンタンパク質を精製する工程
の少なくとも１つを含む。
【００４０】
本発明の最終の態様では、２０％未満の開始メチオニンを有する組換えレクチンを有する組換えレクチンタンパク質が提供される。すなわち、組換えレクチンタンパク質ポリマーの２０％未満が開始メチオニンを有する、組換えレクチンタンパク質混合物が提供される。特定の実施態様では、レクチンタンパク質ポリマーは、他の点では、本発明の他の態様に従う。本発明はさらに、本発明の方法によって調製される組換えレクチンタンパク質を提供する。特に、本発明は、２０％未満の開始メチオニンを有する組換えレクチンを有する組換えレクチンタンパク質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】配列番号１のアミノ酸配列をコードしている配列番号５のヌクレオチド配列を有するｐＥＴ２７ｂベクターの注釈の付いた図。
【図２】配列番号１のアミノ酸配列を有する精製された組換えレクチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図３】配列番号１のアミノ酸配列を有する精製された組換えレクチンのウェスタンブロット分析。
【００４２】
表１．様々な発酵条件から得られたメチオニンレクチンの比率の分析。表２．様々な発酵条件におけるＥ．ｃｏｌｉの倍加時間。
【００４３】
発明の詳細な説明
本明細書において使用する「倍加時間」という用語は、細胞数が倍加するのに、例えば、１つの細胞が２つの細胞に増えるのに、又は細胞集団の数が倍加するのに、必要とされる期間を指す。当業者は理解しているであろうように、倍加時間は、２の自然対数を増殖率の冪指数で割ることによって計算することができる。
【００４４】
本明細書において使用する「組換え」産物への言及は、遺伝子工学操作された産物を指す。遺伝子工学操作は、自然ではない遺伝子の操作であることが理解されるだろう。したがって、組換え産物は、産物が天然には存在しない宿主細胞などの非天然環境において存在又は合成される産物である。本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。
【００４５】
本発明の文脈において、「増殖期間」という用語は、宿主細胞が所望の集団密度まで増殖する、培養期間を指すと理解されるだろう。
【００４６】
本明細書において使用する「発現期間」という用語は、組換えレクチンが宿主細胞から発現される、培養期間を指すことが理解されるだろう。発現期間は、増殖期間と比べて発現期間において増加した発現によって、増殖期間とは識別され得ることが理解されるだろう。
【００４７】
本明細書において使用する「レクチン」という用語は、糖鎖結合タンパク質を指す。
【００４８】
本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに、天然アミノ酸と類似した機能を有するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸であり、これは、タンパク質原生アミノ酸を含む。天然アミノ酸はまた、細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸も含む。合成アミノ酸は、非正準アミノ酸、例えばセレノシステイン及びピロリジンを含む。典型的には、合成アミノ酸は、タンパク質原生アミノ酸ではない。
【００４９】
本明細書において使用する「相同性」又は「相同な」という用語は、所与の領域又は部分にわたり少なくとも部分的な同一性を共有する、２つ以上の参照された実体を指す。相同性又は同一性の区域、領域、又はドメインは、相同性若しくは同一性を共有するか又は同じである、２つ以上の参照された実体の部分を指す。
【００５０】
したがって、２つの配列が、１つ以上の配列領域にわたり同一である場合、それらはこれらの領域において同一性を共有する。実質的な相同性は、構造的に又は機能的に保存されている分子を指し、よって該分子は、参照分子の、又は該分子が相同性を共有する参照分子の関連する／対応する領域若しくは部分の、１つ以上の構造若しくは機能（例えば生物学的機能又は活性）のうち少なくとも部分的な構造若しくは機能を有するか又は有すると予測される。
【００５１】
本発明の第一の態様によると、組換えレクチンタンパク質を調製する方法が提供され、該方法は、宿主細胞培養液中で組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質を発現させる工程を含み、ここでの細胞の発現は、細胞が１６０分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。
【００５２】
いくつかの実施態様では、組換えレクチン遺伝子は天然遺伝子ではない。組換えレクチンタンパク質は、天然レクチンタンパク質のアミノ酸配列を有していない場合もある。例えば、組換えレクチンタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでいないか又はからならない場合がある。
【００５３】
いくつかの実施態様では、細胞の発現は、細胞が少なくとも１００分間の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。
【００５４】
本発明者らは、宿主細胞の倍加時間を制限する培養条件下で組換えレクチンタンパク質を発現させることによって、より高いレベルの可溶性タンパク質が得られることを発見した。さらに、このような発現条件はまた、組換えレクチンから開始メチオニンの改善された切断をもたらすことも判明し、これにより、開始メチオニンの欠如したより増加した収量のタンパク質が得られる。メチオニンがすでに切除されている増加した量の可溶性タンパク質の産生をもたらすプロセスを提供することによって、これは、タンパク質の下流プロセシングの必要性を低減させ、これは、かなりの割合のタンパク質が、不溶性の封入体として発現した場合には必要であろう。これは、プロセスの複雑さを低減させ、効率を向上させ、プロセスをより経済的に存立させる。
【００５５】
本明細書において使用する「可溶性」という用語は、可溶性の形態で又は少なくとも部分的に可溶性の形態で発現される、修飾されたレクチンタンパク質を指す。１つの実施態様では、修飾されたレクチンタンパク質の溶解度は、修飾されたレクチンタンパク質を発現する宿主細胞の細胞溶解、続いて溶解上清及びペレットのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって決定される。溶解上清中の修飾されたレクチンタンパク質の存在は、それが可溶性であることを示す。溶解上清及びペレット中の修飾されたレクチンタンパク質の存在は、それが部分的に可溶性であることを示す。１つの実施態様では、本明細書において使用する「可溶性」という用語は、封入体を形成していない修飾されたレクチンタンパク質を指す。上記の方法を使用して、ペレット中の修飾されたレクチンタンパク質の存在は、それが封入体として発現されていることを示す。
【００５６】
本明細書において使用する「開始メチオニンの切除」という用語は、アミノ酸配列からのＮ末端の（開始）メチオニンの除去を指す。１つの実施態様では、開始メチオニンの切断は、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）酵素によって触媒される。１つの実施態様では、開始メチオニンの切断は、当業者には公知である質量分析を使用して決定される。
【００５７】
本明細書において使用する「開始メチオニンの改善された切断」という用語は、対照と比べて、開始メチオニンの切断の程度の増加を指す。１つの実施態様では、それは、対照と比べて、開始メチオニンの切断の程度の少なくとも５％、１０％、２５％、又は５０％の増加を指す。１つの実施態様では、対照は、配列番号２のレクチンタンパク質である。いくつかの実施態様では、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％未満の開始メチオニンを有する組換えレクチン（すなわちｍｅｔ−レクチン）を有する、組換えレクチンタンパク質（すなわち、レクチンタンパク質ポリマーの混合物）が提供される。又は、換言すれば、本発明の方法は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％のメチオニンフリーな組換えレクチンタンパク質（すなわち、開始メチオニン残基の欠如したタンパク質）の産生を可能とする。
【００５８】
宿主細胞の倍加時間は、培養温度、培養培地、栄養分のフィード速度、及び宿主細胞の種類などの多くの因子によって影響されるであろうことが理解されるだろう。所望の倍加時間を達成するために、これらの中の１つ以上のパラメーターを変化させることは、当業者の能力の範囲内であろう。
【００５９】
宿主細胞の倍加時間を制御するために使用することのできるパラメーターの１つは、発現が行なわれる温度である。いくつかの実施態様では、組換えレクチンの発現は、３０℃以下、２５℃以下、２２℃以下、２１℃以下、２０℃以下、１９℃以下、又は１８℃以下の温度で行なわれる。
【００６０】
いくつかの実施態様では、組換えレクチンの発現は、少なくとも１５℃、少なくとも１６℃、又は少なくとも１７℃の温度（本明細書においては「発現温度」とも呼ばれる）で行なわれる。いくつかの実施態様では、発現温度は１８℃である。
【００６１】
２５℃より低い温度、例えば１８℃でタンパク質の発現を行なうことは、特に有利であることが判明した。なぜなら、それは、開始メチオニン残基を含む、産生されるタンパク質の量を最小限にすることを助けるからである。これは、宿主細胞が中温菌、例えばＥ．ｃｏｌｉである場合に特に該当する。より低い温度、例えば約１８℃での発現が有益であるという事実は、特に驚くべきことである。なぜなら、それは、Ｅ．ｃｏｌｉのような組換えタンパク質発現のために一般的に使用される宿主細胞の至適増殖温度よりはるかに低いからである。
【００６２】
当技術分野において公知であるように、宿主細胞培養液の温度は、培養液を、例えば、所望の温度を有する環境、例えば水槽又は温度制御室若しくは温度制御チャンバー中の、フラスコ又はバイオリアクターに入れることによって制御され得る。
【００６３】
組換えレクチンタンパク質の発現前に、宿主細胞を培養液中で所望の集団密度となるまで増殖させ得る。したがって、いくつかの実施態様では、該方法は、宿主細胞を培養する工程を含み、該培養は、
−増殖期間（その間に、宿主細胞を、タンパク質発現前に増殖させる）及び
−発現期間（その間にタンパク質の発現が行なわれる）を含む。
【００６４】
増殖期間中に、続く発現期間中のタンパク質産生を最大限とするために、宿主細胞が迅速に増えることを引き起こすことが望ましくあり得る。増殖期間では、宿主細胞の倍加時間は、発現期間の倍加時間よりも短い場合がある（すなわち、細胞は増殖期間の方が速く増える）。例えば、増殖期間における宿主細胞の倍加時間は、１００分間以下であり得る。増殖期間の細胞の倍加時間は、細胞が、増殖のラグ期（この間は倍加時間は比較的長い）、又は指数増殖期間（その間は倍加時間は比較的短い）にあるかどうかに応じて変化するであろうことが理解されるだろう。
【００６５】
いくつかの実施態様では、増殖期間は、発現期間が行なわれる温度よりも高い温度で行なわれる。いくつかの実施態様では、増殖期間、又はその少なくとも一部は、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、又は少なくとも３５℃の温度で行なわれる。いくつかの実施態様では、増殖期間、又はその一部は、４０℃以下、又は３８℃以下の温度で行なわれる。
【００６６】
それ故、いくつかの実施態様では、該方法は、増殖期間から発現期間までに培養液の温度を下げる工程を含むことが理解されるだろう。温度は、数時間の期間をかけて徐々に下げてもよい。例えば、温度は、少なくとも２時間、少なくとも４時間、又は少なくとも６時間の期間をかけて下げてもよい。いくつかの実施態様では、温度は、６又は７時間以下の期間をかけて下げる。
【００６７】
温度は、増殖期間中に下げてもよい。例えば、第一段階の増殖期間は、第一の温度（例えば３０℃）で行なわれ得、増殖期間の第二段階では、温度を発現期間の温度まで下げてもよい（例えば３０℃から１８℃まで低下）。
【００６８】
組換えレクチンタンパク質の発現は、培養液への誘導物質の添加によって開始され得る。したがって、発現期間は、宿主細胞培養液が誘導物質を含む間の段階として定義され得る。この期間はまた、「誘導期間」とも呼ばれ得る。
【００６９】
当技術分野において公知であるように、誘導物質は、遺伝子の発現を調節する分子である。組換えレクチン遺伝子は、オペレーター配列の制御下にあってもよい。誘導物質の非存在下では、遺伝子の発現は、オペレーター配列へのリプレッサーの結合によって、又は代替的には、活性化因子による活性化の欠如によって、妨げられ得る。誘導物質の存在下では、遺伝子発現の抑制は妨げられ得るか、又は遺伝子発現の活性化が可能となり得る。それ故、組換えレクチン遺伝子を、誘導物質により調節されるオペレーター配列の制御下に置くことによって、組換えレクチンタンパク質の発現を、堅固に制御することができ、これにより、「読み飛ばし」発現は回避される。誘導発現系の周知の例としては、ａｒａオペロン及びｌａｃオペロンが挙げられる。ｌａｃオペロン内のｌａｃオペレーターへのリプレッサーの結合は、下流遺伝子の転写を妨げる。タンパク質の発現は、アロラクトース又はその模倣体であるＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を使用することによって開始され得、これはｌａｃリプレッサーに結合し、それをｌａｃオペレーターから遊離させ、これにより、オペロン内の遺伝子の転写が可能となる。他の誘導性オペロンは、当業者には公知であろう。
【００７０】
したがって、いくつかの実施態様では、組換えレクチン遺伝子は、ｌａｃオペレーターの制御下にある。このような実施態様では、誘導物質はＩＰＴＧを含む。
【００７１】
ＩＰＴＧは、少なくとも０．１mM、少なくとも０．２mM、又は少なくとも０．２５mMの濃度で培養液に添加され得る。
【００７２】
いくつかの実施態様では、ＩＰＴＧの濃度は、1mM未満である。ＩＰＴＧの濃度は、０．７mM以下、又は０．５mM以下であり得る。低い発現レベルを維持するためには、より低い濃度のＩＰＴＧの使用が有益であり得、これは、開始メチオニンの効率的な切断を支えると考えらえる。
【００７３】
一旦、宿主細胞集団が増殖期間中に所望の密度まで増加したら、誘導物質を添加してもよい。宿主細胞集団は、培養液の吸光度（ＯＤ）を測定することによって決定され得る。いくつかの実施態様では、ＯＤ６００（６００nmにおいて測定された培養液の吸光度）が少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも３８、又は少なくとも４０である場合に、誘導物質が添加される（すなわち発現期間が開始される）。いくつかの実施態様では、誘導物質は、ＯＤ６００が少なくとも２５かつ４０以下である場合に添加される。
【００７４】
当技術分野において一般的に知られているように、バッチ培養の細胞をまず増殖させて所望の細胞塊を得る。この期間中に、焦点は、組換えタンパク質合成ではなくむしろ、細胞増殖の増幅にある。一般的に、誘導の時期は、所望の細胞塊が活発な増殖にある（その間に細胞は、タンパク質合成のための最大数のリボソームを有する）時の期間によって決定される。所望の細胞塊を得た後、組換えタンパク質は、誘導物質の添加後に産生されるだろう。したがって、誘導の時期は、組換えタンパク質の産生力にとって重要である。誘導の時期は、宿主細胞の種類、培養培地の種類、培養条件、及び組換えタンパク質の種類などの、因子に応じて変化するだろう。
【００７５】
いくつかの実施態様では、増殖期間は、発現期間を開始させる誘導物質の添加前に、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、又は少なくとも９時間行なわれる。
【００７６】
発現期間（すなわち、誘導物質の添加後の培養時間）は、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、又は少なくとも３５時間であり得る。いくつかの実施態様では、発現期間は最大４０時間まで行なわれる。
【００７７】
発現をより低い温度で行なう場合には、より長い発現期間が、特に有益である。なぜなら、細胞の増殖速度は遅く、よって、倍加時間はより長いからである。したがって、発現期間に許容される時間は、より多くの細胞増殖を支えかつより低い温度に起因するより低い増殖速度を補うために、延長される。
【００７８】
理論に拘りたくはないが、より長い発現（誘導）期間及び延長された倍加時間が、発現されるタンパク質の量の着実な増加を可能とすると考えられる。宿主細胞内の代謝条件に因り、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）による開始メチオニンの切断のための十分な時間があり、これにより、メチオニンフリーな組換えタンパク質の収量を最大限にすることを助ける。
【００７９】
当業者は、細胞の増殖及びタンパク質の発現を支持するに必要な栄養分を含有している適切な培養培地をはじめとする、所与の宿主細胞に適した培養条件を選択することができるだろうことが理解されるだろう。いくつかの実施態様では、細胞を液体培地中で培養する。微生物細胞を培養するのに適した液体培地としては、溶原／ルリアブロス（ＬＢ）が挙げられる。
【００８０】
培養培地中の炭素対窒素の比は、３：１から６：１のレベルに維持されることが好ましい。この比は、培養液のフィード速度を制御することによって維持され得る。
【００８１】
細胞増殖及びタンパク質の発現に必要とされる栄養分の必要条件は、少なくとも一部には、細胞集団密度、培養温度、誘導物質の量、及び所望のタンパク質発現速度などの、因子によって決定されるだろう。それ故、細胞への栄養分のフィード速度は、増殖速度、よって、タンパク質発現速度を制御するのを補助するために使用され得る。
【００８２】
いくつかの実施態様では、炭素源は、発現期間中に２ｇ/Ｌ/ｈ以下、又は１．５ｇ/Ｌ/ｈ以下の速度で培養液に添加される。炭素源は、発現中に少なくとも０．５ｇ/Ｌ/ｈ、又は少なくとも０．８ｇ/Ｌ/ｈの速度で添加されてもよい。
【００８３】
炭素源は、グリセロールを含み得るか又はからなり得る。追加的に又は代替的に、グルコース又はデキストロースなどの他の炭素源を使用してもよい。
【００８４】
いくつかの実施態様では、窒素源は、発現期間中に１．５ｇ/Ｌ/ｈ以下、又は１ｇ/Ｌ/ｈ以下の速度で培養液に添加される。窒素源は、タンパク質発現中に少なくとも０．４ｇ/Ｌ/ｈ、又は少なくとも０．６ｇ/Ｌ/ｈの速度で添加されてもよい。
【００８５】
炭素及び／又は窒素の供給を、上記に同定されたパラメーター内に制限することによって、細胞増殖及びタンパク質発現の速度は最適化され、これにより、タンパク質は実質的に可溶性の形態で発現され、タンパク質の大半は開始メチオニンを欠如した状態であることが判明した。逆に、未制御なフィードは、タンパク質発現速度の増加及び不完全なメチオニン切断をもたらすことが判明した。
【００８６】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％のメチオニンフリーな組換えレクチンタンパク質（すなわち、開始メチオニン残基を欠失したタンパク質）の産生を可能とする。
【００８７】
いくつかの実施態様では、該方法は、以下の１つ以上又は全ての条件を含む：
−少なくとも１５℃かつ２２℃以下（例えば１８℃）の発現温度；
−発現（すなわち誘導）期間が少なくとも１０時間かけて行なわれる；
−炭素源は、０．５〜２ｇ/Ｌ/ｈの速度で培養液に添加される；
−窒素源は、０．４〜１．５ｇ/Ｌ/ｈの速度で培養液に添加される；
−少なくとも０．１mMかつ０．５mM以下の誘導物質の濃度。
【００８８】
炭素源及び／又は窒素源は、発現期間中に、増殖期間中に、又は発現期間中と増殖期間中に培養液に添加されてもよい。
【００８９】
いくつかの実施態様では、組換えレクチンタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれた、国際公開公報第２０１０/０９５１４３号に記載されているような天然ＳＲＬアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸の１位、１４位、３４位、１１３位及び１２３位の少なくとも１つにおいて変化している。いくつかの実施態様では、組換えレクチンタンパク質は、天然ＳＲＬと比べて、これらの位置の全てにおいて変化している。
【００９０】
組換えレクチンタンパク質は、
（ｉ）配列番号１；
（ｉｉ）配列番号３；
（ｉｉｉ）配列番号４；又は
（ｉｖ）配列番号１、３又は４に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されたアミノ酸配列を含み得るか又はからなり得る。
【００９１】
配列番号１は、Ｓ．ロルフシーのレクチンのアミノ酸配列の変異体を示す（国際公開公報第２０１０/０９５１４３号ではＲｅｃ−２として報告）。
【００９２】
配列番号２は、天然のＳ．ロルフシーのレクチンのアミノ酸配列を示す。
【００９３】
配列番号３は、Ｓ．ロルフシーのレクチンのアミノ酸配列の変異体を示す（国際公開公報第２０１０/０９５１４３号ではＲｅｃ−３として報告）。
【００９４】
配列番号４は、Ｓ．ロルフシーのレクチンのアミノ酸配列の変異体を示す（国際公開公報第２０１４/２０３２６１号に報告）
【００９５】
１つの実施態様では、２つの配列間の「相同性」の比率は、デフォールトパラメーターを用いてＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される（Altschul et al. Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402）。特に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、インターネット上でＵＲＬ：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを使用してアクセスすることができる。代替的な実施態様では、グローバル配列アラインメントでは、２つの配列間の同一性相同性の比率は、デフォールトパラメーターを使用して、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアルゴリズムを使用して決定される。特に、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアルゴリズムは、インターネット上でＵＲＬ：https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needleを使用してアクセスすることができる。
【００９６】
特記されていない限り、「相同性」という用語は、本明細書において「同一性」という用語と同義語として使用される。
【００９７】
組換えレクチン遺伝子は、配列番号５によるヌクレオチド配列を含み得るか又はからなり得る。しかしながら、遺伝子コードの縮重に因り、同じアミノ酸配列を生じ得る、多くの代替的なヌクレオチド配列が存在することが理解されるだろう。
【００９８】
いくつかの実施態様では、組換えレクチン遺伝子は、プラスミド又はベクターなどの発現構築物内に含まれる。発現構築物はさらに、組換えレクチン遺伝子をコードしている構築物を有する、宿主細胞の選択を可能とする、選択マーカーを含んでいてもよい。選択マーカーは、抗生物質、例えばカナマイシンであってもよい。このような実施態様では、培養培地はさらに、抗生物質を含んでいてもよい。
【００９９】
細菌細胞における遺伝子発現に適した人工プラスミドとしては、ｐＥＴベクターが挙げられるが、他の発現ベクターも当業者には公知であろう。いくつかの実施態様では、ベクターは、ｐＥＴ２７ｂである。
【０１００】
いくつかの実施態様では、宿主細胞培養液は、少なくとも１０リットル（Ｌ）、少なくとも２０Ｌ、少なくとも３０Ｌ、少なくとも４０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、又は少なくとも１００Ｌの容量を有する。発現は、工業用発酵槽で行なわれてもよい。
【０１０１】
いくつかの実施態様では、該方法はさらに、組換えレクチン遺伝子（例えば配列番号５の配列を含む遺伝子）を発現ベクターにクローニングする工程を含む。分子クローニング技術は当業者に公知であり、そしてこれはSambroo及びRussellによる「分子クローニング：実験マニュアル」などのテキストに記載されている。
【０１０２】
宿主細胞は、微生物細胞、例えば細菌、古細菌、酵母、又は真菌であり得る。
【０１０３】
いくつかの実施態様では、宿主細胞は、細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉである。特に好ましい株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３Ｇｏｌｄである。
【０１０４】
いくつかの実施態様では、該方法はさらに、発現ベクターを宿主細胞に挿入する工程を含む。これは、当業者には一般的に知られている方法、例えば形質転換法又は電気穿孔法を使用して成し遂げられ得る。
【０１０５】
いくつかの実施態様では、前記方法はさらに、発現された組換えレクチンタンパク質を単離する工程を含む。この単離工程により、粗組換えレクチンタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質）が得られる。単離は遠心分離工程を含み得、例えばここでは宿主細胞を遠心分離にかけることにより細胞ペレットが得られる。単離はさらに、緩衝液中への細胞ペレットの再懸濁を含み得、このために適した緩衝液は、当業者には公知であろう。単離工程は、例えば、ホモジナイザーを使用して細胞膜を破壊することによる、再懸濁された細胞ペレットの溶解を含み得る。細胞溶解は場合により、約１６０００〜２００００プサイの圧力で行なわれる。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、前記方法はさらに、粗組換えレクチンタンパク質の精製を含む。精製により、組換えレクチンタンパク質単離物が産生される。精製は、遠心分離（例えば超遠心分離）、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動法、アフィニティクロマトグラフィー、ろ過（例えば透析ろ過）及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はその組合せなどの任意の適切な技術によって行なわれ得る。
【０１０７】
したがって、いくつかの実施態様では、前記方法は、
ａ）場合により、組換えレクチン遺伝子を発現ベクターにクローニングし、該発現ベクターを宿主細胞に導入する工程；
ｂ）適切な培地中で宿主細胞を培養する工程（ここでの該培養は、２５℃から４０℃の温度で行なわれる増殖期間と、組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質が発現される間の発現期間とを含み、ここでの発現期間は、１５℃から３０℃の温度で行なわれ、ここでの炭素対窒素の比は、発現期間中に３：１から６：１に維持される）；
ｃ）場合により、（ｂ）で発現される組換えレクチンタンパク質を単離して、粗組換えレクチンタンパク質を得る工程；及び
ｄ）場合により、粗組換えレクチンタンパク質を精製して、組換えレクチンタンパク質の単離物を得る工程
を含む。
【０１０８】
いくつかの実施態様では、粗組換えレクチンタンパク質の精製は、少なくとも１回のクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施態様では、少なくとも１回のクロマトグラフィー工程は、イオン効果クロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。
【０１０９】
いくつかの実施態様では、粗組換えレクチンタンパク質の精製は、
ｉ）陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程；
ｉｉ）第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程；
ｉｉｉ）第二の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第三の精製された溶出物を得る工程；
ｉｖ）第二又は第三の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、第四の精製された溶出物を得る工程；及び
ｖ）透析ろ過によって第四の精製された溶出物の緩衝液を交換して、精製された組換えレクチンタンパク質単離物を得る工程
を含む。
【０１１０】
有利には、上記の精製工程は、組換えレクチンタンパク質が、高い純度で（９７〜９９％純粋）、化学的処理又は酵素処理を必要とすることなく得られることを可能とする。
【０１１１】
本発明の第二の態様では、配列番号５のヌクレオチド配列を含む発現構築物が提供される。
【０１１２】
本発明の第三の態様では、本発明の第二の態様の発現構築物を含む宿主細胞が提供される。
【０１１３】
特記されない限り、本明細書に記載の実施態様のいずれかを、任意の方法で、本発明のいずれかの態様と組み合わせることができることが理解されるだろう。
【０１１４】
いくつかの特定の実施態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質などの、組換えレクチンタンパク質を調製するためのプロセスに関し、該プロセスは、
ａ．組換えレクチンタンパク質をコードしているヌクレオチド配列（配列番号５の配列）を、ベクターに包埋されている間に、組換え宿主細胞においてクローニングして、クローンを調製する工程、
ｂ．適切な培地中、約２５℃〜約４０℃の初期温度及び約１５℃〜３０℃の誘導期間温度で、炭素源対窒素源の比が３：１から６：１であるようなフィード速度を有する、組換えレクチンタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）の発現のための工程「ａ」で調製されたクローンのフェッドバッチ発酵により、発酵産物を得る工程；
ｃ．粗組換えレクチンタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）を得るための、工程「ｂ」で得られた発酵産物の単離及び清澄化；及び
ｄ．工程「ｃ」で得られた粗組換えレクチンタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）の精製
を含む。場合により、精製は、
ｉ．陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程；
ｉｉ．工程ｉから得られた第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程；
ｉｉｉ．工程ｉｉから得られた第二の精製された溶出物又は工程ｉから得られた第一の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製して、第三の精製された溶出物を得る工程；
ｉｖ．工程ｉｉｉから得られた第三の精製された溶出物又は工程ｉｉから得られた第二の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、精製された溶出物を得る工程；
ｖ．透析ろ過によって工程ｉｖから得られた精製された溶出物の緩衝液を交換して、組換えレクチンタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）を純粋な産物として得る工程を含む。
【０１１５】
本発明はさらに、適切な培地中での組換え細菌細胞のフェッドバッチ発酵に関し、ここでの発酵産物を得るための、発酵中の炭素源のフィード速度は、０．５〜２ｇ/Ｌ/ｈであり、窒素源のフィード速度は０．４〜１．５ｇ/Ｌ/ｈである。
【０１１６】
本発明はさらに、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質などの、粗組換えレクチンの精製プロセスに関し、ここでのプロセスは：
ａ．陰イオン交換クロマトグラフィーによって粗組換えレクチンタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）を最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程；
ｂ．工程ａから得られた第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程；
ｃ．工程ｂから得られた第二の精製された溶出物又は工程ａから得られた第一の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製して、第三の精製された溶出物を得る工程；
ｄ．工程ｃで得られた第三の精製された溶出物又は工程ｂから得られた第二の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、精製された溶出物を得る工程；
ｅ．透析ろ過によって工程ｄから得られた精製された溶出物の緩衝液を交換して、組換えレクチンタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）を純粋な産物として得る工程を含む。
【０１１７】
本発明はまた、ベクターに包埋されている間に、組換え宿主細胞において、配列番号１のアミノ酸配列をコードしている配列番号５のヌクレオチド配列を含む、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの産生のために使用されるクローンにも関する。
【０１１８】
本発明はさらに、本明細書において開示されているプロセスによって調製されるような、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンに関する。
【０１１９】
有利には、いくつかの実施態様では、本発明のプロセスは、９０％超、９５％超、又は９７％を超える収率で所望の産物を与える。
【０１２０】
組換えレクチンタンパク質産物の純度は、陰イオン交換クロマトグラフィーなどの標準的な方法を使用して測定した場合に、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％であり得る。
【０１２１】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンを調製するプロセスに関し、該プロセスは、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列をコードしている配列番号５のヌクレオチド配列を、ベクターに包埋されている間に、組換え宿主細胞においてクローニングして、クローンを調製する工程、
ｂ．適切な培地中、約２５℃〜約４０℃の初期温度及び約１５℃〜３０℃の誘導期間温度で、炭素源対窒素源の比が３：１から６：１であるようなフィード速度を有する、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの発現のための工程「ａ」で調製されたクローンのフェッドバッチ発酵により、発酵産物を得る工程；
ｃ．配列番号１のアミノ酸配列を有する粗組換えレクチンを得るための、工程「ｂ」で得られた発酵産物の単離及び清澄化；及び
ｄ．工程「ｃ」で得られた配列番号１のアミノ酸配列を有する粗組換えレクチンの精製（この精製は、
ｉ．陰イオン交換クロマトグラフィーによって配列番号１のアミノ酸配列を有する粗組換えレクチンを最初に精製して、第一の精製された溶出物を得る工程；
ｉｉ．工程ｉから得られた第一の精製された溶出物を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって任意選択で精製して、第二の精製された溶出物を得る工程；
ｉｉｉ．工程ｉｉから得られた第二の精製された溶出物又は工程ｉから得られた第一の精製された溶出物を陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製して、第三の精製された溶出物を得る工程；
ｉｖ．工程ｉｉｉで得られた第三の精製された溶出物又は工程ｉｉから得られた第二の精製された溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製して、精製された溶出物を得る工程；
ｖ．透析ろ過によって工程ｉｖから得られた精製された溶出物の緩衝液を交換して、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンを純粋な産物として得る工程を含む）
を含む。
【０１２２】
配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンのクローニング及び発現
本発明の態様によると、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの産生のために使用される宿主細胞は、細菌細胞又は酵母であり得る。好ましい細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉ、特にＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｇｏｌｄ株である。配列番号５のアミノ酸配列を有する組換えレクチンをコードしている配列番号５のヌクレオチド配列は、ベクターに、好ましくはｐＥＴ２７ｂにクローニングされ得る。その後、プラスミドを、宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｇｏｌｄにおいて形質転換及び発現させ得る。
【０１２３】
発酵プロセス
例示的な実施態様では、組換えレクチンタンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列を含有している、プラスミドｐＥＴ２７ｂを含有している、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｇｏｌｄ株を、ルリアＨｉＶｅｇブロス（２０ｇ/ｌ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（７．５ｇ/ｌ）、デキストロース（５ｇ/ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１ｇ/ｌ）、最終濃度が２０μg/mlとなるまでのカナマイシン、及び０．１％（ｖ/ｖ）のＦｅＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＮａＭｏＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４、又はＨ３ＢＯ３の塩酸中の微量金属溶液を含有している、接種培地中で増殖させる。接種材料は、細胞を３０〜４０℃で１２〜１６時間増殖させることによって調製される。組換えＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３ Ｇｏｌｄ株のフェッドバッチ発酵は、酵母エキス（１０ｇ/ｌ）、デキストロース（１２ｇ/ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ/ｌ）、Ｋ２ＨＰＯ４（１２．５ｇ/ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５ｇ/ｌ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ/ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１ｇ/ｌ）、及び０．１％（ｖ/ｖ）のＦｅＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＮａＭｏＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４、又はＨ３ＢＯ３の塩酸中の微量金属溶液を含んでいる産生培地中で行なわれ得る。カナマイシンは、２０μg/mlの最終濃度となるまで添加され得る。フィードは、適切な炭素源、例えばグルコース又はグリセロール、好ましくは５０％（ｗ/ｖ）のグリセロール、及び窒素源、例えばトリプトン、ペプトン、又は酵母エキス、好ましくは４０％（ｗ/ｖ）の酵母エキスを用いて開始され得る。フィードは、所定のフィード速度でｌｏｇ５時間後に開始され得る。Ｃ：Ｎの比を３：１から６：１の範囲内に、好ましくはＣ：Ｎの比を４：１に維持しつつ、発酵中の炭素源のフィード速度は、０．５〜２ｇ/Ｌ/ｈであり、窒素源のフィード速度は、０．４〜１．５ｇ/Ｌ/ｈであり得る。当業者は、それらの適切性に応じて比率及び量を変更してもよい。なぜなら、それらは、特定のバッチサイズのために示されたパラメーターに特異的であるからである。
【０１２４】
初期増殖期間は２５℃から４０℃で、誘導期間中には１５℃から３０℃で行なわれ得、続いて、一連のカラムクロマトグラフィーによる精製が続く。温度は、初期増殖中には約２５℃から４０℃、好ましくは約３７℃で維持され得る。温度は、導入期間においては下げてもよく、約１５℃〜３０℃、好ましくは約２２℃で維持され得る。
【０１２５】
培養液の初期増殖は、１〜２vvmの通気量、５０％〜６０％に維持された溶存酸素、及び水酸化ナトリウムなどのアルカリで６．６〜７．２に維持されたｐＨを用いて行なわれ得る。全培養時間は、２０〜５０時間、又は３０〜４０時間、好ましくは約３６時間であり得る。炭素源及び窒素源のフィードは、培養実行時間の終了まで継続され得る。
【０１２６】
組換えレクチンタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）の発現は、宿主細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）培養ブロスを、ラクトース又はイソプロピルチオ−ガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）、好ましくは約５０μMから１５００μM、好ましくは約１０００μMの濃度のＩＰＴＧなどの誘導物質を用いて誘導することによって行なわれ得る。培養は、約６００nmにおいて少なくとも約２０〜５０、好ましくは約３０〜５０と測定される細胞密度において誘導され得る。
【０１２７】
組換えレクチンタンパク質の発現は、全細胞溶解液及び溶解上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって実証され得る。組換えタンパク質の発現は、全タンパク質の約５０％から６０％であり得、可溶性形で細胞質内に発現され得る。組換えレクチンタンパク質の収量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、少なくとも約５〜９ｇ/Ｌ（発酵ブロス）であり得る。
【０１２８】
可溶性組換えレクチンタンパク質の単離は、細胞を遠心分離によって収集して細胞ペレットを得、そして細胞を、約６℃〜１０℃の温度まで予め冷やしておいていてもよい、適切な緩衝液中に再懸濁することによって行なわれ得る。細胞の破壊は、場合により約１６０００〜２００００プサイの高圧下、ホモジナイザー（MiniDebee）で行なわれ得る。このようにして得られた細胞溶解液を、例えば様々なクロマトグラフィー工程を使用することによって、可溶性組換えレクチンタンパク質の精製のためにさらに処理することができる。
【０１２９】
組換えレクチンタンパク質の精製
発酵プロセスから得られた細胞溶解液から得られた組換えレクチンタンパク質の精製プロセスは、以下の工程を含み得る：
ａ  カラム１：陰イオン交換クロマトグラフィー、
ｂ  カラム２：疎水性相互作用クロマトグラフィー、
ｃ  カラム３：陽イオン交換クロマトグラフィー、
ｄ  カラム４：陰イオン交換クロマトグラフィー。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、細胞溶解後に得られた全細胞溶解液を、約０．１μmのタンジェンシャルフローろ過システムを使用して清澄化することにより、透明な溶液が得られる。
【０１３１】
いくつかの実施態様では、清澄化された細胞溶解液を、セルファインＭａｘ Ｑ−ｒ、ソース３０Ｑ、ソース１５Ｑ、及びＤＥＡＥセファロースなどの樹脂を使用した陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかける。カラムを、適切な緩衝液、例えば、約１０〜３０mMのトリス、約０．５〜２mMのＥＤＴＡ及びｐＨ約７．５〜９．０を有する緩衝液を用いて平衡化し得る。ローディング後、カラムを、約４〜８mS/cmの範囲内の伝導率を有する緩衝液を使用して洗浄し得る。溶出は、約１０〜３０mMのトリス、約０．５〜２mMのＥＤＴＡ、及び約１５〜２０mS/cmの伝導率を有する塩化ナトリウムを含有している緩衝液を用いて行なわれ得る。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、陰イオン交換カラムから得られたタンパク質は場合により、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーにかけられる。使用される樹脂は、セルファインＭａｘブチル、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどであり得る。カラムは、約０．５〜２Ｍの硫酸アンモニウム、約０．５〜２mMのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ約４〜５である、約２０〜３０mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて平衡化され得る。溶出は、約０．５〜２mMのＥＤＴＡ、約１０〜２０ｇ/ｌの硫酸アンモニウムを有し、約４〜５の範囲内のｐＨ及び約２〜１００ms/cmの範囲内の伝導率を有する、約２０〜３０mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて行なわれ得る。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー後に又は陰イオン交換カラムから得られた溶出液を、その後、ＳＰセファロース、ＣＭセファロース、セルファインＭａｘ Ｓ−ｈなどの樹脂を使用した陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ得る。カラムを、約０．５〜２．０mMのＥＤＴＡを含有し、ｐＨは約４〜５の範囲内である、約２０〜３０mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて平衡化し得る。溶出緩衝液は、約２０〜３０mMの酢酸ナトリウム、約０．５〜２mMのＥＤＴＡ、約０．３〜１Ｍの塩化ナトリウムを含有し得、約４〜５の範囲内のｐＨである。溶出前に、約１５〜２５％の範囲内の段階的な勾配が与えられてもよい。溶出は、約５０〜８０％の範囲内の段階的勾配を用いて行なわれ得る。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶出液を、注射用水（ＷＦＩ）又は精製水（ＰＷ）を用いて約１：２から１：５の比で希釈する。タンパク質溶液のｐＨは、その後、水酸化ナトリウム、トリス緩衝液、又はグリシン緩衝液（ｐＨ１１．０）を用いて約７．５〜８．５に調整し得、続いて、伝導率が約１〜５mS/cmの範囲内に減少するまでタンジェンシャルフローろ過システムを使用して、緩衝液をトリス緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）と交換した。その後、タンパク質溶液を、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ得る。セルファインＭａｘ Ｑ−ｒ、ソースＱ１５、ソースＱ３０、又はＤＥＡＥセファロースなどの樹脂を使用することができる。カラムを約７．５〜８．５の範囲内のｐＨを有する、約２０〜３０mMのトリス緩衝液を用いて平衡化し得る。溶出は、約２０〜３０mMのトリス、約０．３〜１Ｍの塩化ナトリウムを含有し、約７．５〜８．５の範囲内のｐＨである、緩衝液を用いて行なわれ得る。溶出のために、３〜２０のカラム容量の最大約１５％までの線形勾配が与えられ得る。このようにして得られた溶出液を、３、５又は１０ｋＤａのカットオフ膜を使用した透析ろ過によって、トリス緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水、酢酸緩衝液などの適切な緩衝液と緩衝液を交換し得る。
【０１３４】
緩衝液の交換されたタンパク質を約２〜８℃で保存することによって、生物学的活性を維持することができる。あるいは、２回目の陰イオン交換クロマトグラフィー後に得られた溶出液を、注射用水に対して緩衝液を交換し得、続いて、凍結乾燥することにより粉末形のタンパク質を得ることができる。
【０１３５】
組換えレクチンタンパク質の純度は、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによって確認することができる。一連のクロマトグラフィーによる分離後にこのようにして得られた配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンタンパク質は、９７％から９９％純粋であることが判明した。プロセシングされていない開始メチオニンを有する、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンタンパク質の比率は、約１０〜１５％であることが判明した（メチオニンフリーなレクチンに関する量と比較）。
【０１３６】
よって、本発明は、タンパク質の発現に対して堅固な調節、及び宿主細胞におけるその可溶性発現を有する、ベクターにおいて、配列番号１などの、組換えレクチンタンパク質を発現する方法を提供する。本発明のプロセスは、制御可能かつスケールアップ可能であり、以前のプロセスの欠点を克服する。よって、本発明は、グラム量の組換えレクチンを産生するための、工業的にスケールアップ可能なプロセスを記載する。
【０１３７】
よって、本発明の主な目的、すなわち、先行技術の対象物の欠点を克服し、配列番号１のアミノ酸配列を調製するための非常に効率的なプロセスを考案することが達成される。
【０１３８】
配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの収量は、１．５〜３．０ｇ/Ｌ（発酵ブロス）であり得る。したがって、本発明の別の目的、すなわち、非常に収量が多く、かつ費用対効果が高く、容易に入手可能な原材料を使用して行なうことのできる、プロセスを提供することも達成される。本発明のプロセスは、費用対効果が高い。なぜなら、配列番号１のアミノ酸配列を有する多量の組換えレクチンを調製するために必要とされる原材料は、かなり少ないからである。また、プロセスの実施に、非常に高い温度若しくは低い温度、又はコストのかかる装置を必要としない。それ故、プロセスは、費用対効果が高くなり、容易にスケールアップできる。
【０１３９】
本発明はさらに、適切な培地中における組換え細菌細胞のフェッドバッチ発酵に関し、ここでの、発酵産物を得るための、発酵中の炭素源のフィード速度は、約０．５〜２ｇ/Ｌ/ｈであり、窒素源のフィード速度は約０．４〜１．５ｇ/Ｌ/ｈである。
【０１４０】
初期発酵期間／増殖期間は、約２５℃から４０℃で行なわれ得、その後、温度は、誘導期間中に約１５℃から３０℃に下げられ、その後、一連のカラムクロマトグラフィーによる精製が続く。
【０１４１】
いくつかの実施態様では、培養液の初期増殖は、約１〜２vvmの通気量、約５０〜６０％に維持された溶存酸素、及び水酸化ナトリウムなどのアルカリで約６．６〜７．２に維持されたｐＨを用いて行なわれ得る。いくつかの実施態様では、初期増殖中に維持された温度は、約２５℃〜４０℃であった。誘導期間中の温度は下げてもよく、約１５℃〜３０℃に維持されてもよい。発酵の実行時間は少なくとも約２０〜５０時間であり得る。炭素源及び窒素源のフィードは、発酵実行時間の終了まで継続され得る。
【０１４２】
いくつかの実施態様では、清澄化された細胞溶解液を、セルファインＭａｘ Ｑ−ｒ、ソース３０Ｑ、ソース１５Ｑ、及びＤＥＡＥセファロースなどの樹脂を使用した陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかける。カラムを、約１０〜３０mMのトリス緩衝液、約０．５〜２mMのＥＤＴＡ、及びｐＨ約７．５〜９．０を有する緩衝液を用いて平衡化し得る。ローディング後、カラムを、約４〜８mS/cmの範囲内の伝導率を有する緩衝液で洗浄し得る。溶出は、１０〜３０mMのトリス、約０．５〜２mMのＥＤＴＡ、及び約１５〜２０mS/cmの伝導率を有する塩化ナトリウムを含有している緩衝液を用いて行なわれ得る。
【０１４３】
いくつかの実施態様では、陰イオン交換カラムから得られたタンパク質を場合により、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーにかける。使用される樹脂は、セルファインＭａｘブチル、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどであり得る。カラムを、約０．５〜２Ｍの硫酸アンモニウム、約０．５〜２mMのＥＤＴＡを含有し、ｐＨが約４．０〜５．０である、２０〜３０mMの酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化し得る。溶出は、約０．５〜２mMのＥＤＴＡ、約１０〜２０ｇ/Ｌの硫酸アンモニウム、約４〜５の範囲内のｐＨ、及び約２〜１００ms/cmの範囲内の伝導率を有する、約２０〜３０mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて行なわれ得る。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー後に又は陰イオン交換カラムから得られた溶出液を、その後、ＳＰセファロース、ＣＭセファロース、セルファインＭａｘ Ｓ−ｈなどの樹脂を使用した陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ得る。カラムを、約０．５〜２．０mMのＥＤＴＡを含有し、ｐＨが約４〜５の範囲内である、約２０〜３０mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて平衡化し得る。溶出緩衝液は、約２０〜３０mMの酢酸ナトリウム、約０．５〜２mMのＥＤＴＡ、約０．３〜１Ｍの塩化ナトリウムを含有し得、ｐＨは約４〜５の範囲内であり得る。溶出前に、約１５〜２５％の範囲内の段階的勾配が与えられてもよい。溶出は、約５０〜８０％の範囲内の段階的勾配を用いてなされてもよい。
【０１４４】
陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶出液を、注射用水又は精製水を用いて約１：２から１：５の比に希釈し得る。タンパク質溶液のｐＨを、その後、ＮａＯＨ、トリス緩衝液、又はグリシン緩衝液（ｐＨ１１．０）を用いて約８に調整し得る。この後に、伝導率が約１〜５mS/cmの範囲内に低下するまで、タンジェンシャルフローろ過システムを使用した、トリス緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）を用いた緩衝液の交換が続き得る。その後、タンパク質溶液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにかけ得る。セルファインＭａｘ Ｑ−ｒ、ソースＱ１５、ソースＱ３０、又はＤＥＡＥセファロースなどの樹脂を使用してもよい。カラムを、約７．５〜８．５の範囲内のｐＨを有する、約２０〜３０mMのトリス緩衝液を用いて平衡化し得る。溶出は、約２０〜３０mMのトリス、約０．３〜１Ｍの塩化ナトリウムを含有し、ｐＨが約７．５〜８．５の範囲内である、緩衝液を用いて行なわれ得る。溶出では、３〜２０カラム容量の、最大約１５％までの線形勾配が与えられ得る。このようにして得られた溶出液は、３、５、又は１０ＫＤａのカットオフ膜を使用した透析ろ過によって、トリス緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水、酢酸緩衝液などの適切な緩衝液を用いて緩衝液が交換され得る。緩衝液の交換されたタンパク質は、２〜８℃で保存されることにより、生物学的活性を維持することができる。あるいは、２回目の陰イオン交換クロマトグラフィー後に得られた溶出液を、注射用水に対して緩衝液を交換してもよく、続いて、凍結乾燥することにより、粉末形のタンパク質を得ることができる。配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの純度は、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによって確認し得る。このシリーズのクロマトグラフィーによる分離後にこのようにして得られた、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンは、９７％から９９％純粋である。プロセシングされていない開始メチオニンを有する、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの比率は、１０〜１５％であった（Ｍｅｔフリーレクチンに関する量と比較）。
【０１４５】
本発明は、ベクターに包埋されている間の組換え宿主細胞における、配列番号１のアミノ酸配列をコードしている、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの産生に使用されるクローンに関する。
【０１４６】
実施例
実施例は、本発明を実施する最善のモードを実証するために示され、いずれにしても本発明の範囲を制限するものではない。
【０１４７】
実施例１：ｐＥＴ２７ｂベクターにおけるレクチン配列番号５のクローニング、及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３における発現
ｐＥＴ２０ｂベクター（特許番号ＷＯ２０１０/０９５１４３Ａ２号に開示されているような）に事前にクローニングされた配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンをコードしているヌクレオチド配列（配列番号５）を、ｐＥＴ２７ｂベクターにサブクローニングした。ｐＥＴ２０ｂにクローニングされた配列番号５を有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３細胞を、ルリアＨｉｖｅｇブロス（Himedia社、ムンバイ、インド）中で増殖させた。プラスミドは、ＧｅｎｅＪＥＴプラスミドミニプレップキット（サーモサイエンティフィック社）を使用して、製造業者の説明書に従って細胞から単離された。プラスミドｐＥＴ２０ｂを、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ニューイングランドバイオラボ社）で消化した。消化されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動上で泳動させ、分離した挿入断片を、ＧｅｎｅＪＥＴゲル抽出キット（サーモサイエンティフィック社）を使用して、ゲルから溶出させた。類似のベクターｐＥＴ２７ｂを単離し、同じ制限酵素（ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ）で消化した。ｐＥＴ２０ｂから分離した挿入断片（配列番号５）を、ｐＥＴ２７ｂベクター（ｐＥＴ２７ｂ−Ｌｅｃ）にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ＤＥ３（Ｇｏｌｄ）に形質転換した。クローンを、コロニーＰＣＲによってスクリーニングし、陽性クローンをさらに、発現分析のために使用した。陽性クローンを、Ｈｉｖｅｇルリアブロス中で３７℃で増殖させ、１〜１．２細胞密度（ＯＤ６００nm）において０．２５mMのＩＰＴＧを用いて誘導し、４時間さらに増殖させた。配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認された。ベクターｐＥＴ２７ｂにおける挿入断片の配列は、単離されたプラスミドのＤＮＡシークエンスによって確認された。陽性クローンのグリセロールストックを調製し、−８０℃に維持した。
【０１４８】
実施例２：発酵プロセス
グリセロールストックからの培養液を、２％Ｈｉｖｅｇルリアブロス、０．７５％のＮａ２ＨＰＯ４、０．５％のデキストロース、及びカナマイシン（２０μg/ml）を含有している培地に接種した。培養液を３０±２℃及び１１０rpmで１６時間増殖させた。約３００mlの培養液を、１％の酵母エキス（ｗ/ｖ）、１．２％デキストロース（ｗ/ｖ）、０．３％のＫＨ２ＰＯ４（ｗ/ｖ）、１．２５％のＫ２ＨＰＯ４（ｗ/ｖ）、０．５％の（ＮＨ４）２ＳＯ４（ｗ/ｖ）、０．０５％のＮａＣｌ（ｗ/ｖ）、０．１％のＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（ｗ/ｖ）、０．１％（ｖ/ｖ）の微量金属溶液、カナマイシン（２０μg/ml）を含有している、２．３Ｌの産生培地に接種した。発酵は、１〜２vvmの通気量で、５Ｌの発酵槽（バイオスタットＢ、ザルトリウムステディム社）中で行なわれ、溶存酸素は５０〜６０％に維持され、ｐＨはアルカリを用いて６．６〜７．０に維持された。初期増殖は、３７℃の温度で行なわれた。温度を徐々に下げ、誘導期間中は２２℃に維持した。炭素源（グリセロール）及び窒素源（酵母エキス）のフィードは、Ｃ：Ｎ比を４：１の範囲内に維持しながら、予め決められたフィード速度で５ｌｏｇ時間後に開始された。培養液は、約４５（ＯＤ６００）の細胞密度において１mMのＩＰＴＧを用いて誘導された。発酵は２４時間まで続けられ、培養ブロスは、９０００rpmで１５分間の遠心分離によって収集された。発酵ブロスから得られた細胞塊の湿潤重量は、３７２ｇであった。
【０１４９】
実施例３：配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの細胞からの単離
細胞ペレットを、溶解緩衝液（２５mMのトリス、１mMのＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）に１：１０（ｗ/ｖ）の比で懸濁し、オーバーヘッドスターラーで少なくとも２時間撹拌し、均一な懸濁液を形成した。懸濁液を、約１８，０００プサイでの高圧ホモジナイゼーションによって溶解した。細胞溶解液を、１５℃で９，０００rpmで１５分間の遠心分離にかけた。結果として得られた上清を保持し、配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの精製のためにさらに処理した。
【０１５０】
実施例４：核酸不純物の除去、及び精密ろ過によるタンパク質溶液の清澄化
上清を、少なくとも０．０２５％のポリエチレンイミンを用いて１５〜３０分間撹拌することによって処理した。ポリエチレンイミンによる処理後に得られた全細胞溶解液を、１mMのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ８．０±０．５である、２５mMのトリス緩衝液を用いて予め平衡化された、３６００cm２の面積の０．１μmの中空繊維を使用して清澄化した。５〜１０プサイの膜間差圧を、清澄化プロセス全体を通して維持した。残留物を上記の平衡緩衝液を用いて段階的モードで透析ろ過して、ろ過透過液中の配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンを回収した。配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンについて、９０％を超える回収率が、ろ過透過液中に得られた。２８０nmにおける吸光度によって測定したところ８４．４ｇの全タンパク質が、ろ過透過液中に回収された。関心対象のタンパク質の純度は、ＨＰＬＣによって測定したところ４９．４％であった。
【０１５１】
実施例５：イオン交換クロマトグラフィー（カラム１）によるタンパク質の精製
清澄化されたタンパク質溶液を、１mMのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ８．０±０．５である、２５mMのトリス緩衝液で予め平衡化された、セルファインＭａｘ Ｑ−ｒ樹脂にローディングした。ローディング後、平衡緩衝液による洗浄を行ない、続いて、１〜３ｇ/ＬのＮａＣｌを含有している平衡緩衝液で洗浄した。タンパク質を、１mMのＥＤＴＡ、１１〜１５ｇ/ＬのＮａＣｌを含有し、ｐＨ８±０．５である、２５mMのトリス緩衝液を用いて溶出した。このカラムで回収された全タンパク質は、４１．６ｇで７７．４％の純度の活性タンパク質であった。
【０１５２】
実施例６：タンパク質の沈降、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ−カラム２）による精製
カラム１の溶出液のｐＨを、酢酸を用いて４．５に調整し、続いて、硫酸アンモニウムにより沈降させた。その後、溶液を遠心分離にかけ、透明な上清を疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂（セルファインＭａｘブチル）上でさらなる精製のために処理した。カラムを、１mMのＥＤＴＡ、０．５〜２Ｍの硫酸アンモニウムを含有し、ｐＨ４．５である、２５mMの酢酸ナトリウムを用いて平衡化させ、その後、タンパク質溶液をローディングした。ローディング後、平衡緩衝液による洗浄を行ない、続いて、２５mMの酢酸ナトリウム、１mMのＥＤＴＡ、１５ｇ/Ｌの硫酸アンモニウムを含有し、ｐＨ４．５である、溶出緩衝液を用いて溶出した。９０．３％の純度を有する、２７．５ｇの全タンパク質がカラム２から溶出された。
【０１５３】
実施例７：陽イオン交換クロマトグラフィー（カラム３）によるタンパク質の精製
カラム２から得られたタンパク質を、精製水を用いて約２０mS/cmの伝導率となるまで希釈し、１mMのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ４．５である、２５mMの酢酸ナトリウム緩衝液を用いて予め平衡化されたＳＰセファロースＦＦ樹脂にローディングした。ローディング後に、平衡緩衝液によりカラムを洗浄し、続いて、２５mMの酢酸ナトリウム、１mMのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＣｌを含有し、ｐＨ４．５である、２０％の段階的勾配の溶出緩衝液を流した。溶出は、５０〜７０％の溶出緩衝液の段階的勾配を流すことによって行なわれた。９３．０％の純度を有する計２４．６ｇのタンパク質がカラムから回収された。カラム３の溶出液の緩衝液の交換を、３ＫＤａの膜上で行ない、２５mMのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中にタンパク質を得た。
【０１５４】
実施例８：陰イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の精製
緩衝液の交換後、２０．９ｇのタンパク質が、ソース３０Ｑ樹脂上で得られ処理された。カラムを、２５mMのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて平衡化し、続いて、タンパク質溶液をローディングした。ローディング後、カラムを平衡緩衝液で洗浄した。その後、溶出は、２５mMのトリス、０．５ＭのＮａＣｌを含有し、ｐＨ８．０、１５カラム容量である、線形勾配の溶出緩衝液を流すことによって行なわれた。一本のピークが得られ、これはＨＰＬＣによって分析したところ、９９．０％を超える純度を示した。２８０nmにおける１ＯＤが１mgに等価であると考えて、２８０nmにおける吸光度によって測定したところ、計９．０ｇが得られた。最終溶出液を、ＴＢＳ緩衝液に対して緩衝液を交換した（５０mMのトリス緩衝液、１５０mMのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）。
【０１５５】
実施例９：配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの物理化学的特徴
配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ分析によって決定された。ＨＰＬＣ分析による配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンの純度は、９７〜９９％であった。配列番号１のアミノ酸配列を有する組換えレクチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、約１６ＫＤａの分子量で一本のバンドを示した。タンパク質の同一性は、ウェスタンブロットによって確認され、生物学的活性は、赤血球凝集アッセイ、及び様々な癌細胞株を使用したンビトロでの細胞ベースアッセイによって確認された。配列番号１のアミノ酸配列を有する精製された組換えレクチンの分子量は、１６０４４ダルトンであった。
【０１５６】
実施例１０：発酵プロセス条件
以前の実施例に記載のグリセロールストックの培養液を、２％Ｈｉｖｅｇルリアブロス、０．７５％のＮａ２ＨＰＯ４、０．５％のデキストロース及びカナマイシン（２０μg/ml）を含有している培地に接種した。バッチ１〜３についての培養液を３７℃及び１１０rpmで１６時間増殖させた。
【０１５７】
バッチ４及び５については、以前の実施例に記載のグリセロールストックの培養液を、培養液を３０℃及び１１０rpmで１９時間増殖させた以外は、上記の通りに培地に接種した。
【０１５８】
その後、約３００mlの培養液を、２．３Ｌの産生培地に接種した。
【０１５９】
産生培地は、各バッチの以下の差以外は、実施例２に記載の通りであった（及び表１に示されている通りであった）。
【０１６０】
【表１】
2021536253.tif 000002
【０１６１】
バッチ１〜３：産生培地は、実施例２に従って、１２ｇ/Ｌのデキストロースを含有していた。
【０１６２】
バッチ４〜５：産生培地は、実施例２に記載されているような１．２％のデキストロースの代わりに１０ｇ/Ｌのデキストロースを含有していた。
【０１６３】
各バッチについて、発酵は、１〜２vvmの通気量で、５Ｌの発酵槽（バイオスタットＢ、ザルトリウムステディム社）中で行なわれ、溶存酸素は５０〜６０％に維持され、ｐＨは、アルカリを用いて６．６〜７．０に維持された。
【０１６４】
産生培地の温度は当初、以下の条件を用いて、３７℃に保持された。
【０１６５】
バッチ１〜２−温度はｌｏｇ４時間毎に２２℃まで徐々に下げた。この温度は、誘導期間中維持され、誘導期間は１mMのＩＰＴＧを用いて開始された。バッチ実行時間の総計は２５時間であった。
【０１６６】
炭素源（グリセロール）及び窒素源（酵母エキス）のフィードは、４ｌｏｇ時間後に開始された。バッチ１にフィードされたグリセロールの総量は１０２ｇ/Ｌであり、バッチ２へは７５ｇ/Ｌであった。
【０１６７】
バッチ３−温度は５時間目までに１８℃まで徐々に下げた。この温度は、誘導期間中維持され、誘導期間は１mMのＩＰＴＧを用いて開始された。バッチ実行時間の総計は２５時間であった。
【０１６８】
誘導期間中にバッチ３にフィードされたグリセロールの総量は、７０ｇ/Ｌであった。
【０１６９】
バッチ１〜３では、誘導物質は、接種から４〜６時間後に産生培地中に添加された。誘導物質の添加は、誘導（発現）期間を開始した。
【０１７０】
バッチ４〜５−産生培地への接種後、温度は６時間目までに１８℃まで徐々に下げた。この温度は、誘導（発現）期間中に維持され、誘導（発現）期間は、接種から９時間後に０．２５mMのＩＰＴＧを用いて開始された。バッチ実行時間の総計は３３時間（バッチ８）又は４８時間（バッチ９）のいずれかであった。
【０１７１】
誘導期間中にバッチ４にフィードされたグリセロールの総量は３５ｇ/Ｌであり、一方、誘導期間中にバッチ５にフィードされたグリセロールの総量は４０ｇ/Ｌであった。
【０１７２】
培養ブロスは、９０００pmで１５分間の遠心分離によって収集され、組換えレクチンは本発明に従って単離及び精製された。単離されたレクチン中のメチオニンレクチンの比率をその後、分析した。
【０１７３】
バッチ１で単離されたレクチンの５０％超が、メチオニン−レクチンであった。これは、バッチ２では２６％に、バッチ３では１６％に、バッチ４では１３％に、バッチ５では１２％に減少した。
【０１７４】
実施例１１：倍加時間
Ｅ．ｃｏｌｉの倍加時間は、試料発酵プロセス中の、すなわち産生培地への接種後の、様々な時点及び温度で決定された。結果は表２に示される。この実施例では、誘導物質、この実施態様ではＩＰＴＧを接種から９時間後に加えた。したがって、この実施例では、増殖期間は、９時間より前の時点であると理解され、発現期間は、誘導物質の添加時及び添加後の時点であると理解されるだろう。
【０１７５】
【表２】
2021536253.tif 000003
【０１７６】
実施例１２：組換えレクチンの精製
この実施例では、組換えレクチンは、実施例１０において産生されたものなどの培養ブロスから単離及び精製される。
【０１７７】
培養ブロスを、９０００rpmで１５分間１５℃で遠心分離にかける。得られたペレットを、溶解緩衝液（２５mMのトリス、１mMのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁する。細胞を、１８０００プサイでの高圧ホモジナイズによって溶解する。溶解液を、溶解緩衝液で予め平衡化した０．１μmの中空繊維を使用して清澄化する。清澄化されたタンパク質溶液を、一連のクロマトグラフィー工程にかけて、組換えレクチンを精製する。
【０１７８】
陰イオン交換クロマトグラフィー：清澄化されたタンパク質溶液を、２５mMのトリス、１mMのＥＤＴＡ、及びｐＨ８．０で平衡化されたセルファインＭａｘ Ｑ−ｒカラムに、６０〜８０mg/mlの結合強度でローディングする。ローディング後、カラムを２〜３カラム容量の平衡緩衝液で洗浄する。さらに、カラムを、約５mS/cmの伝導率を有する塩化ナトリウムを含有している平衡緩衝液で洗浄する。結合したタンパク質の溶出は、１８〜２０mS/cmの伝導率を有する塩化ナトリウムを含有している、２５mMのトリス緩衝液、１mMのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を用いて行なわれる。全ピークは、単一の画分として回収され、これはいくつかの他の不純物と共に関心対象のタンパク質を含有している。
【０１７９】
陽イオン交換クロマトグラフィー：陰イオン交換クロマトグラフィーからの溶出液を、ＳＰセファロースＦＦカラムを使用した陽イオン交換クロマトグラフィーにかける。溶出液のｐＨを、酢酸を用いて４．５に調整する。その後、タンパク質を、１mMのＥＤＴＡを含有し、ｐＨ４．５である２５mMの酢酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ａ）で平衡化されたＳＰセファロースＦＦカラム上に、樹脂上への４０〜５０mg/mlの結合度でローディングする。ローディング後、カラムを２〜３カラム容量の平衡緩衝液で洗浄する。その後、カラムを２０％の緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋０．５ＭのＮａＣｌ）を用いた段階的勾配で洗浄する。溶出は、７０％の緩衝液Ｂの段階的勾配を用いて行なう。その後、溶出液を直ちに、１：１の比で水で希釈することにより、タンパク質の凝集を防ぐ。溶出されたタンパク質は、３ＫＤａの膜を使用して、２５mMのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて緩衝液の交換をする。
【０１８０】
陰イオン交換クロマトグラフィー：緩衝液を交換した後、タンパク質をソース３０Ｑ樹脂にローディングし、カラムを、２５mMのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて平衡化し、続いて、タンパク質溶液をローディングする。ローディング後、カラムを、平衡緩衝液で洗浄する。その後、溶出は、２５mMのトリス、０．５ＭのＮａＣｌを含有し、ｐＨ８．０、１５カラム容量である溶出緩衝液の線形勾配を流すことによって行なわれる。その後、最終溶出液を、ＴＢＳ緩衝液（５０mMのトリス緩衝液、１５０mMのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）に対して緩衝液の交換を行なう。溶出されたタンパク質を、純度及び濃度についてＨＰＬＣによって分析する。
【０１８１】
配列の要約
【化１】
2021536253.tif 000004
【０１８２】
本発明の態様は以下である：
１．組換えレクチンタンパク質を調製する方法であって、該方法は、宿主細胞培養液中で組換えレクチン遺伝子によってコードされる組換えレクチンタンパク質を発現させる工程を含み、ここでの細胞の発現は、細胞が１６０分間以下の倍加時間を有するような条件下で行なわれる。
【０１８３】
２．細胞の発現は、細胞が少なくとも１００分間の倍加時間を有するような条件下で行なわれる、１に記載の方法。
【０１８４】
３．発現は、２２℃以下の温度で行なわれる、１又は２に記載の方法。
【０１８５】
４．発現は、少なくとも１５℃の温度で行なわれる、１〜３いずれか一項に記載の方法。
【０１８６】
５．前記方法は、宿主細胞を培養する工程を含み、該培養は、増殖期間（その間に、宿主細胞を、タンパク質発現前に増殖させる）；及び発現期間（その間にタンパク質の発現が行なわれる）を含み、増殖期間は、発現期間が行なわれる温度よりも高い温度で実施される、１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１８７】
６．増殖期間は、少なくとも２５℃かつ４０℃以下の温度で行なわれる、５に記載の方法。
【０１８８】
７．増殖期間から発現期間までの温度は、少なくとも４時間かつ７時間以下の期間にわたり下げる、５又は６に記載の方法。
【０１８９】
８．組換えレクチンタンパク質の発現は、培養液への誘導物質の添加によって開始される、１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【０１９０】
９．誘導物質は、少なくとも０．１mMかつ０．５mM以下の濃度で培養液に添加される、８の方法。
【０１９１】
１０．誘導物質はＩＰＴＧを含む、８又は９に記載の方法。
【０１９２】
１１．発現は少なくとも１０時間行なわれる、１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【０１９３】
１２．炭素源は、培養液に、２ｇ/Ｌ/ｈ以下の速度で添加され、及び／又は窒素源は、培養液に１．５ｇ/Ｌ/ｈ以下の速度で添加される、１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【０１９４】
１３．炭素源は、培養液に少なくとも０．５ｇ/Ｌ/ｈの速度で添加される、１２の方法。
【０１９５】
１４．窒素源は、培養液に少なくとも０．４ｇ/Ｌ/ｈの速度で添加される、１２又は１３の方法。
【０１９６】
１５．炭素源は、グリセロールを含むか又はからなる、１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【０１９７】
１６．組換えレクチンタンパク質は、
ｉ）配列番号１；
ｉｉ）配列番号３；
ｉｉｉ）配列番号４；又は
ｉｖ）ｉ）、ｉｉ）、又はｉｉｉ）に対して少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【０１９８】
１７．ｉｖ）のアミノ酸配列は、ｉ）、ｉｉ）、又はｉｉｉ）に対して少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の相同性を有する、アミノ酸配列である、１６に記載の方法。
【０１９９】
１８．該方法はさらに、組換えレクチンタンパク質を発現させる工程の後に、粗組換えレクチンタンパク質を単離する工程を含む、１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【０２００】
１９．該方法はさらに、粗組換えレクチンタンパク質を精製する工程を含む、１８に記載の方法。
【０２０１】
２０．粗タンパク質の精製は、少なくとも１回のクロマトグラフィー工程を含む、１９に記載の方法。
【０２０２】
２１．少なくとも１回のクロマトグラフィー工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、２０に記載の方法。
【０２０３】
２２．少なくとも１回のクロマトグラフィー工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、２０又は２１に記載の方法。
【０２０４】
２３．粗組換えレクチンタンパク質の精製は、ろ過工程を含む、１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【０２０５】
２４．宿主細胞は、エシェリヒア・コリである、１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【０２０６】
２５．宿主細胞は、組換えレクチン遺伝子を含む発現構築物を含む、１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【０２０７】
２６．宿主細胞は、少なくとも１０Ｌの容量を有する、１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【０２０８】
２７．発現は、工業用発酵槽で行なわれる、２６に記載の方法。
【図１】
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【図２】
2021536253.tif 000006
【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021536253.tif 000009
2021536253.tif 000010
2021536253.tif 000011
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