(57)【要約】  本発明は、がん細胞上に存在する成分に結合する第２のペプチドリガンドにリンカーを介してコンジュゲートされた、免疫細胞上に存在する成分に結合する第１のペプチドリガンドを含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体に関する。本発明はまた、がんの予防、抑制または治療における前記ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体の使用に関する。
2021520378.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）免疫細胞上に存在する成分に結合する第１のペプチドリガンドであって、
（ｂ）がん細胞上に存在する成分に結合する第２のペプチドリガンドにリンカーを介してコンジュゲートされた、第１のペプチドリガンド
を含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体であって、
前記ペプチドリガンドの各々は、少なくとも２つのループ配列によって分離された、少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチドと、少なくとも２つのポリペプチドループが分子足場上に形成されるように、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子足場とを含む、ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２】
前記免疫細胞が、白血球；リンパ球（例えば、Ｔリンパ球もしくはＴ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞）；ＣＤ８またはＣＤ４；ＣＤ８；樹状細胞、濾胞樹状細胞および顆粒球から選択される、請求項１に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項３】
免疫細胞上に存在する前記成分がＣＤ１３７である、請求項１または２に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項４】
前記第１のペプチドリガンドがＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項５】
前記ＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドが、
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号１）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ａｌａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号３）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａｌａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号４）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＫ［Ｄ−Ａｌａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号５）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ｌｙｓ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号６）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］Ｐ［Ｋ（ＰＹＡ）］［Ｄ−Ａｌａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号７）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ｌｙｓ（ＰＹＡ）］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号８）；
ＣｉＩＥＥ［Ｄ−Ｌｙｓ（ＰＹＡ）］ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号９）；および
［ｄＣｉ］［ｄＩ］［ｄＥ］［ｄＥ］［Ｋ（ＰＹＡ）］［ｄＱ］［ｄＹ］［ｄＣｉｉ］［ｄＦ］［ｄＡ］［ｄＤ］［ｄＰ］［ｄＹ］［ｄＮｌｅ］［ｄＣｉｉｉ］（配列番号１０）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表し、ｔＢｕＡｌａはｔ−ブチル−アラニンを表し、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表す）
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項４に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項６】
前記ＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドが、Ｎ末端修飾およびＣ末端修飾を含み、
Ａｃ−Ａ−（配列番号１）−Ｄａｐ（以下、ＢＣＹ７７３２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−（配列番号１）−Ｄａｐ（ＰＹＡ）（以下、ＢＣＹ７７４１と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号３）−Ｄａｐ（以下、ＢＣＹ９１７２と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号３）−Ｄａｐ（ＰＹＡ）（以下、ＢＣＹ１１０１４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−（配列番号４）−Ｄａｐ（以下、ＢＣＹ８０４５と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号５）−Ａ（以下、ＢＣＹ８９１９と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号６）−Ａ（以下、ＢＣＹ８９２０と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号７）−Ａ（以下、ＢＣＹ８９２７と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号８）−Ａ（以下、ＢＣＹ８９２８と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−（配列番号９）−Ａ（以下、ＢＣＹ７７４４と呼ぶ）；および
Ａｃ−［ｄＡ］−（配列番号１０）−［ｄＡ］−ＮＨ２（以下、ＢＣＹ１１５０６と呼ぶ）；
（式中、Ａｃはアセチル基を表し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を表し、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項５に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項７】
前記がん細胞が、ＨＴ１０８０、ＳＣ−ＯＶ−３、ＰＣ３、Ｈ１３７６、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＬｎＣａｐ、ＭＣ３８およびＲＫＯ腫瘍細胞から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項８】
がん細胞上に存在する前記成分がＥｐｈＡ２である、請求項１から７のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項９】
前記第２のペプチドリガンドがＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求項１から８のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１０】
前記ＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドが、
Ｃｉ［ＨｙＰ］ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ［ｄＤ］Ｗ［ＨＡｒｇ］Ｃｉｉｉ（配列番号２）；および
ＣｉＬＷＤＰＴＰＣｉｉＡＮＬＨＬ［ＨＡｒｇ］Ｃｉｉｉ（配列番号１１）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＨｙＰはヒドロキシプロリンを表し、ｄＤはＤ配置のアスパラギン酸を表し、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表す）
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項９に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１１】
前記ＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドが、Ｎ末端修飾を含み、
Ａ−ＨＡｒｇ−Ｄ−（配列番号２）（以下、ＢＣＹ９５９４と呼ぶ）；
［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−Ａ−［ＨＡｒｇ］−Ｄ−（配列番号２）（以下、ＢＣＹ６０９９と呼ぶ）；
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−Ａ−［ＨＡｒｇ］−Ｄ−（配列番号２）（以下、ＢＣＹ６１６９と呼ぶ）；および
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−ＶＧＰ−（配列番号１１）（以下、ＢＣＹ８９４１と呼ぶ）；
（式中、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表し、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表し、Ｓａｒ１０は１０個のサルコシン単位を表し、Ｂ−Ａｌａはβ−アラニンを表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１０に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１２】
ＢＣＹ９１７３、ＢＣＹ７９８５、ＢＣＹ８９４２、ＢＣＹ８９４３、ＢＣＹ９６４７、ＢＣＹ９６４８、ＢＣＹ９６５５、ＢＣＹ９６５６、ＢＣＹ９６５７、ＢＣＹ９６５８、ＢＣＹ９６５９、ＢＣＹ９７５８、ＢＣＹ１０５６８、ＢＣＹ１０５７０、ＢＣＹ１０５７４、ＢＣＹ１０５７５、ＢＣＹ１０５７６およびＢＣＹ１０５７７から選択されるＣＤ１３７／ＥｐｈＡ２複合体である、請求項９から１１のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１３】
がん細胞上に存在する前記成分がＰＤ−Ｌ１である、請求項１から７のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１４】
前記第２のペプチドリガンドがＰＤ−Ｌ１結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求項１から７および１３のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１５】
前記ＰＤ−Ｌ１結合二環式ペプチドリガンドが、
Ｃｉ［ＨＡｒｇ］ＤＷＣｉｉＨＷＴＦＳＨＧＨＰＣｉｉｉ（配列番号１２）；
ＣｉＳＡＧＷＬＴＭＣｉｉＱＫＬＨＬＣｉｉｉ（配列番号１３）；および
ＣｉＳＡＧＷＬＴＭＣｉｉＱ［Ｋ（ＰＹＡ）］ＬＨＬＣｉｉｉ（配列番号１４）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表し、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表す）
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１４に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１６】
前記ＰＤ−Ｌ１結合二環式ペプチドリガンドが、Ｎ末端修飾および／またはＣ末端修飾を含み、
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−（配列番号１２）（以下、ＢＣＹ８９３８と呼ぶ）；
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−ＳＤＫ−（配列番号１３）（以下、ＢＣＹ１００４３と呼ぶ）；
ＮＨ２−ＳＤＫ−（配列番号１３）−［Ｓａｒ１０］−［Ｋ（ＰＹＡ）］（以下、ＢＣＹ１００４４と呼ぶ）；
ＮＨ２−ＳＤＫ−（配列番号１４）（以下、ＢＣＹ１００４５と呼ぶ）；および
Ａｃ−ＳＤＫ−（配列番号１４）−ＰＳＨ（以下、ＢＣＹ１０８６１と呼ぶ）；
（式中、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表し、Ｂ−Ａｌａはβ−アラニンを表し、Ｓａｒ１０は１０個のサルコシン単位を表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１５に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１７】
ＢＣＹ８９３９、ＢＣＹ１０５８０、ＢＣＹ１０５８１、ＢＣＹ１０５８２、ＢＣＹ１１０１７、ＢＣＹ１１０１８、ＢＣＹ１１０１９、ＢＣＹ１１３７６、ＢＣＹ１１３７７、ＢＣＹ１１３７８、ＢＣＹ１１３７９、ＢＣＹ１１３８０およびＢＣＹ１１３８１から選択されるＣＤ１３７／ＰＤ−Ｌ１複合体である、請求項１４から１６のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１８】
がん細胞上に存在する前記成分がネクチン−４である、請求項１から７のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項１９】
前記第２のペプチドリガンドがネクチン−４結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求項１から７および１８のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２０】
前記ネクチン−４結合二環式ペプチドリガンドが、
ＣｉＰ［１Ｎａｌ］［ｄＤ］ＣｉｉＭ［ＨＡｒｇ］ＤＷＳＴＰ［ＨｙＰ］ＷＣｉｉｉ（配列番号１５；以下、ＢＣＹ８１１６と呼ぶ）；
ＣｉＰ［１Ｎａｌ］［ｄＤ］ＣｉｉＭ［ＨＡｒｇ］Ｄ［ｄＷ］ＳＴＰ［ＨｙＰ］［ｄＷ］Ｃｉｉｉ（配列番号１６；以下、ＢＣＹ１１４１５と呼ぶ）；および
ＣｉＰ［１Ｎａｌ］［ｄＫ］（Ｓａｒ１０−（Ｂ−Ａｌａ））ＣｉｉＭ［ＨＡｒｇ］ＤＷＳＴＰ［ＨｙＰ］ＷＣｉｉｉ（配列番号１７）；
ＣｉＰＦＧＣｉｉＭ［ＨＡｒｇ］ＤＷＳＴＰ［ＨｙＰ］ＷＣｉｉｉ（配列番号１８；以下、ＢＣＹ１１４１４と呼ぶ）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、１Ｎａｌは１−ナフチルアラニンを表し、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表し、ＨｙＰはヒドロキシプロリンを表し、Ｓａｒ１０は１０個のサルコシン単位を表し、Ｂ−Ａｌａはβ−アラニンを表す）
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項１９に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２１】
前記ネクチン−４結合二環式ペプチドリガンドが、場合により、Ｎ末端修飾を含み、
配列番号１５（以下、ＢＣＹ８１１６と呼ぶ）；
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−（配列番号１５）（以下、ＢＣＹ８８４６と呼ぶ）；
配列番号１６（以下、ＢＣＹ１１４１５と呼ぶ）；
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−（配列番号１６）（以下、ＢＣＹ１１９４２と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号１７）（以下、ＢＣＹ８８３１と呼ぶ）；および
配列番号１８（以下、ＢＣＹ１１４１４と呼ぶ）；
（式中、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表し、Ｂ−Ａｌａはβ−アラニンを表し、Ｓａｒ１０は１０個のサルコシン単位を表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項２０に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２２】
ＢＣＹ８８５４、ＢＣＹ９３５０、ＢＣＹ９３５１、ＢＣＹ９３９９、ＢＣＹ９４００、ＢＣＹ９４０１、ＢＣＹ９４０３、ＢＣＹ９４０５、ＢＣＹ９４０６、ＢＣＹ９４０７、ＢＣＹ９４０８、ＢＣＹ９４０９、ＢＣＹ９４１０、ＢＣＹ９４１１、ＢＣＹ９７５９、ＢＣＹ１００００、ＢＣＹ１０５６７、ＢＣＹ１０５６９、ＢＣＹ１０５７１、ＢＣＹ１０５７２、ＢＣＹ１０５７３、ＢＣＹ１０５７８、ＢＣＹ１０９１７、ＢＣＹ１１０２０、ＢＣＹ１１３７３、ＢＣＹ１１３７４、ＢＣＹ１１３７５、ＢＣＹ１１６１６、ＢＣＹ１１６１７、ＢＣＹ１１８５７、ＢＣＹ１１８５８およびＢＣＹ１１８５９から選択されるＣＤ１３７／ネクチン−４複合体である、請求項１９から２１のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２３】
がん細胞上に存在する前記成分がＰＳＭＡである、請求項１から７のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２４】
前記第２のペプチドリガンドがＰＳＭＡ結合二環式ペプチドリガンドを含む、請求項１から７および２３のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２５】
前記リンカーが、−ＣＨ２−、−ＰＥＧ５−、−ＰＥＧ１０−、−ＰＥＧ１２−、−ＰＥＧ２３−、−ＰＥＧ２４−、−ＰＥＧ１５−Ｓａｒ５−、−ＰＥＧ１０−Ｓａｒ１０−、−ＰＥＧ５−Ｓａｒ１５−、−ＰＥＧ５−Ｓａｒ５−、−Ｂ−Ａｌａ−Ｓａｒ２０−、−Ｂ−Ａｌａ−Ｓａｒ１０−ＰＥＧ１０−、−Ｂ−Ａｌａ−Ｓａｒ５−ＰＥＧ１５−およびＢ−Ａｌａ−Ｓａｒ５−ＰＥＧ５−から選択される、請求項１から２４のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２６】
前記分子足場が１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）から選択される、請求項１から２５のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２７】
前記薬学的に許容される塩が、遊離酸またはナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム塩から選択される、請求項１から２６のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【請求項２８】
１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、請求項１から２７のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体を含む医薬組成物。
【請求項２９】
がんの予防、抑制または治療に使用するための、請求項１から２７のいずれか１項に記載のヘテロタンデム二環式ペプチド複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞上に存在する成分に結合する第２のペプチドリガンドにリンカーを介してコンジュゲートされた、免疫細胞上に存在する成分に結合する第１のペプチドリガンドを含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体に関する。本発明はまた、がんの予防、抑制または治療における前記ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ペプチドは、タンパク質に、高い親和性および標的特異性で結合することができ、よって、治療薬の開発にとって魅力的な分子クラスである。実際、いくつかの環状ペプチドが、例えば、抗菌ペプチドバンコマイシン、免疫抑制薬シクロスポリンまたは抗がん薬オクトレオチドとして、診療所で既にうまく使用されている（Ｄｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７（７），６０８−２４）。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間に形成される比較的大きな相互作用表面、ならびに環状構造の構造的柔軟性の減少に起因する。典型的には、大環状分子は、例えば、環状ペプチドＣＸＣＲ４アンタゴニストＣＶＸ１５（４００Å２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３０，１０６６−７１）、インテグリンαＶｂ３に結合するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを有する環状ペプチド（３５５Å２）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６（５５６５），１５１−５）またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウパイン−１（ｕｐａｉｎ−１）（６０３Å２；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １６０（１），１−１０）として、数百平方オングストロームの表面に結合する。
【０００３】
その環状構造のために、ペプチド大環状分子は、直鎖ペプチドよりも柔軟性が低く、標的への結合時にエントロピーの損失が少なく、結合親和性が高くなる。柔軟性の減少はまた、標的−特異的構造のロックをもたらし、直鎖ペプチドと比較して結合特異性を増加させる。この効果は、マトリックスメタロプロテイナーゼ８（ＭＭＰ−８）の強力な選択的阻害剤によって例示され、この阻害剤は開環すると、他のＭＭＰに対するその選択性を失った（Ｃｈｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４１（１１），１７４９−５１）。大環状化を通して達成される好ましい結合特性は、例えば、バンコマイシン、ナイシンおよびアクチノマイシンとして、２つ以上のペプチド環を有する多環式ペプチドでより一層顕著である。
【０００４】
様々な研究チームが、以前、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋いだ（Ｋｅｍｐ  ａｎｄ  ＭｃＮａｍａｒａ（１９８５），Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。Ｍｅｌｏｅｎおよび同僚らは、タンパク質表面の構造的模倣のため、合成足場上での複数のペプチドループの迅速で定量的な環化のためにトリス（ブロモメチル）ベンゼンおよび関連分子を使用した（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）。システイン含有ポリペプチドを、例えば、トリス（ブロモメチル）ベンゼンとしての分子足場に連結することによって生成される候補薬物化合物を生成する方法は、国際公開第２００４／０７７０６２号および国際公開第２００６／０７８１６１号に開示されている。
【０００５】
目的の標的に対する二環式ペプチドの大きなライブラリーを作成およびスクリーニングするためのファージディスプレイに基づくコンビナトリアルアプローチが開発されている（Ｈｅｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ５（７）、５０２−７および国際公開第２００９／０９８４５０号）。手短に言えば、３つのシステイン残基および６つのランダムアミノ酸の２つの領域を含有する直鎖ペプチド（Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ−（Ｘａａ）６−Ｃｙｓ）のコンビナトリアルライブラリーをファージ上にディスプレイし、システイン側鎖を小分子（トリス（ブロモメチル）ベンゼン）に共有結合的に連結することによって環化した。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様によると、
（ａ）免疫細胞上に存在する成分に結合する第１のペプチドリガンドであって、
（ｂ）がん細胞上に存在する成分に結合する第２のペプチドリガンドにリンカーを介してコンジュゲートされた、第１のペプチドリガンド
を含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体であって、
前記ペプチドリガンドの各々は、少なくとも２つのループ配列によって分離された、少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチドと、少なくとも２つのポリペプチドループが分子足場上に形成されるように、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子足場とを含む、ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
【０００７】
本発明のさらなる態様によると、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、本明細書に定義されるヘテロタンデム二環式ペプチド複合体を含む医薬組成物が提供される。
【０００８】
本発明のさらなる態様によると、がんの予防、抑制または治療に使用するための、本明細書に定義されるヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】免疫細胞とがん細胞の両方に結合したＥｐｈＡ２およびＣＤ１３７ペプチドリガンドを含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体の概略図である。
【図２】ＥｐｈＡ２−ＣＤ１３７ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体ＢＣＹ７９８５の構造および組成を示す図である。
【図３】ＥｐｈＡ２発現ＨＴ１０８０細胞の存在下でのＰｒｏｍｅｇａ  ＣＤ１３７ルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＣＳ１９６００８）におけるＥｐｈＡ２−ＣＤ１３７ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体ＢＣＹ７９８５の分析を示す図である。
【図４】ＥｐｈＡ２／ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、ＣＤ１３７レポーターアッセイで活性であり、活性化誘導倍率が、共培養で使用される細胞株上の腫瘍標的発現レベルに依存することを示す図である。
【図５】ＥｐｈＡ２／ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、初代ヒトＴ細胞およびがん細胞共培養アッセイで腫瘍細胞殺傷を誘導することを示す図である。腫瘍細胞殺傷を、経時的に生存Ｎｕｃｌｉｇｈｔ  ｒｅｄ陽性腫瘍細胞を計数することによって評価する。カスパーゼ３／７色素を使用してアポトーシス性腫瘍細胞を特定する。
【図６】ネクチン−４／ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、ＣＤ１３７レポーターアッセイで活性であり、活性化誘導倍率が、共培養で使用される細胞株上の腫瘍標的発現レベル（ＨＴ１３７６：ネクチン−４高およびＮＣＩ−Ｈ２９２：ネクチン−４中）に依存することを示す図である。
【図７】ネクチン−４／ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、ＰＢＭＣ−４Ｔ１共培養アッセイでＩＬ−２およびＩＦＮ−γサイトカイン分泌を誘導することを示す図である。ＢＣＹ９３５０およびＢＣＹ９３５１は、それぞれネクチン−４およびＣＤ１３７の非結合対照である。
【図８】ネクチン−４／ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、初代患者由来肺腫瘍のエキソビボ培養物中で標的依存性サイトカイン放出を誘導することを示す図である。（Ａ）エキソビボ患者由来腫瘍細胞は、培養中４時間以内に３Ｄスフェロイドを形成する、光学顕微鏡下１０倍像。（Ｂ）３人のドナーからの患者由来腫瘍試料中のネクチン−４発現のフロー解析。（Ｃ）表は、３人のドナーの試料中のＣＤ１３７＋Ｔ細胞％およびネクチン−４＋細胞％を示す。（Ｄ）対照／試験化合物による処理に応じた免疫マーカーの変化％（ビヒクルに正規化）を示すヒートマップ。（Ｅ）対照／試験化合物による処理に応じたＣＤ８＋ｋｉ６７＋Ｔ細胞％（ビヒクルを点線で示す）。
【図９】ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、ＰＤ−Ｌ１発現細胞株ＲＫＯの存在下、ＣＤ１３７レポーターアッセイで活性であることを示す図である。
【図１０】ＳＤラットにおけるヘテロタンデムの薬物動態を示す図である：ＢＣＹ１０５７２およびＢＣＹ１００００を２ｍｇ／ｋｇでＩＶ投与した（ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の第１の態様によると、
（ｂ）がん細胞上に存在する成分に結合する第２のペプチドリガンドにリンカーを介してコンジュゲートされた、
（ａ）免疫細胞上に存在する成分に結合する第１のペプチドリガンド
を含むヘテロタンデム二環式ペプチド複合体であって、
前記ペプチドリガンドの各々は、少なくとも２つのループ配列によって分離された、少なくとも３つのシステイン残基を含むポリペプチドと、少なくとも２つのポリペプチドループが分子足場上に形成されるように、ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子足場とを含む、ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
【００１１】
第１のペプチドリガンド
本明細書における「免疫細胞」という用語への言及は、免疫系中の任意の細胞を含む。適切な例としては、リンパ球（例えば、Ｔリンパ球もしくはＴ細胞、Ｂ細胞またはナチュラルキラー細胞）などの白血球が挙げられる。一実施形態では、Ｔ細胞がＣＤ８またはＣＤ４である。さらなる実施形態では、Ｔ細胞がＣＤ８である。免疫細胞の他の例としては、樹状細胞、濾胞樹状細胞および顆粒球が挙げられる。
【００１２】
一実施形態では、免疫細胞上に存在する成分がＣＤ１３７である。
【００１３】
ＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。その代替名は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、４−ＩＢＢおよびリンパ球活性化により誘導された（ＩＬＡ）である。ＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞によって発現され得るが、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＣＤ８＋Ｔ細胞上でより多く発現される。さらに、ＣＤ１３７発現は、樹状細胞、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球および炎症部位の血管壁の細胞に見られる。ＣＤ１３７の１つの特徴付けられた活性は、活性化Ｔ細胞に対するその共刺激活性である。ＣＤ１３７の架橋により、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２分泌、生存および細胞溶解活性が増強される。さらに、これにより、マウスにおいて腫瘍を除去する免疫活性が増強され得る。
【００１４】
ＣＤ１３７は、ＴＣＲ活性化で誘導されるＴ細胞共刺激受容体である（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，５：３５７−３６３（２００５）；Ｗａｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：２３−６８（２００５））。活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上でのその発現に加えて、ＣＤ１３７はまた、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＮＫ−Ｔ細胞、単球、好中球ならびに樹状細胞上でも発現される。その天然リガンド、ＣＤ１３７Ｌは、Ｂ細胞、単球／マクロファージおよび樹状細胞を含む抗原提示細胞で記載されている（Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：２３−６８（２００５））。そのリガンドと相互作用すると、ＣＤ１３７は、増加したＴＣＲ誘導Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、機能的成熟および延長したＣＤ８＋Ｔ細胞生存をもたらす（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，５：３５７−３６３（２００５），Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ｄ−ｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：２３−６８（２００５））。
【００１５】
ＣＤ１３７ＬまたはＣＤ１３７に対するアゴニストモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＣＤ１３７を通したシグナル伝達は、増加したＴＣＲ誘導Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生および機能的成熟、ならびに延長したＣＤ８＋Ｔ細胞生存をもたらす。これらの効果は、（１）ＮＦ−κＢ、ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ／ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）およびｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の活性化、ならびに（２）抗アポトーシスおよび細胞周期関連遺伝子発現の制御に起因する。
【００１６】
ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌの両方が欠損したマウスで実施された実験が、完全コンピテントＴ細胞応答の生成におけるＣＤ１３７共刺激の重要性をさらに実証している。
【００１７】
ＩＬ−２およびＩＬ−１５活性化ＮＫ細胞はＣＤ１３７を発現し、アゴニストｍＡｂによるＣＤ１３７のライゲーションはＮＫ細胞増殖およびＩＦＮ−γ分泌を刺激するが、その細胞溶解活性は刺激しない。
【００１８】
さらに、ＣＤ１３７刺激ＮＫ細胞は、インビトロで活性化Ｔ細胞の拡大を促進する。
【００１９】
その共刺激機能によって、ＣＤ１３７に対するアゴニストｍＡｂは、心臓および皮膚同種移植片の拒絶を促進し、確立された腫瘍を根絶し、一次抗ウイルスＣＤ８＋Ｔ細胞応答を広げ、Ｔ細胞の細胞溶解能力を増加させることが示されている。これらの研究は、ＣＤ１３７シグナル伝達が、腫瘍および感染症に対する免疫を増強し得るＴ細胞機能を促進するという考え方を裏付ける。
【００２０】
一実施形態では、第１のペプチドリガンドがＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドを含む。
【００２１】
ＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用することにより本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第１７１２５８９．９号および同第１８０２９３４．８号に開示されている。
【００２２】
一実施形態では、ＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドが、アミノ酸配列：
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号１）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ａｌａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号３）；
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦ［Ｄ−Ａｌａ］ＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号４）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＫ［Ｄ−Ａｌａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号５）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ｌｙｓ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号６）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］Ｐ［Ｋ（ＰＹＡ）］［Ｄ−Ａｌａ］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号７）；
Ｃｉ［ｔＢｕＡｌａ］ＰＥ［Ｄ−Ｌｙｓ（ＰＹＡ）］ＰＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号８）；
ＣｉＩＥＥ［Ｄ−Ｌｙｓ（ＰＹＡ）］ＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ（Ｎｌｅ）Ｃｉｉｉ（配列番号９）；および
［ｄＣｉ］［ｄＩ］［ｄＥ］［ｄＥ］［Ｋ（ＰＹＡ）］［ｄＱ］［ｄＹ］［ｄＣｉｉ］［ｄＦ］［ｄＡ］［ｄＤ］［ｄＰ］［ｄＹ］［ｄＮｌｅ］［ｄＣｉｉｉ］（配列番号１０）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表し、ｔＢｕＡｌａはｔ−ブチル−アラニンを表し、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００２３】
言及され得る１つの特定の実施形態では、ＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドが、アミノ酸配列：
ＣｉＩＥＥＧＱＹＣｉｉＦＡＤＰＹ［Ｎｌｅ］Ｃｉｉｉ（配列番号１）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、Ｎｌｅはノルロイシンを表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００２４】
さらなる実施形態では、ＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドが、Ｎ末端修飾およびＣ末端修飾を含み、
Ａｃ−Ａ−（配列番号１）−Ｄａｐ（以下、ＢＣＹ７７３２と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−（配列番号１）−Ｄａｐ（ＰＹＡ）（以下、ＢＣＹ７７４１と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号３）−Ｄａｐ（以下、ＢＣＹ９１７２と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号３）−Ｄａｐ（ＰＹＡ）（以下、ＢＣＹ１１０１４と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−（配列番号４）−Ｄａｐ（以下、ＢＣＹ８０４５と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号５）−Ａ（以下、ＢＣＹ８９１９と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号６）−Ａ（以下、ＢＣＹ８９２０と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号７）−Ａ（以下、ＢＣＹ８９２７と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号８）−Ａ（以下、ＢＣＹ８９２８と呼ぶ）；
Ａｃ−Ａ−（配列番号９）−Ａ（以下、ＢＣＹ７７４４と呼ぶ）；および
Ａｃ−［ｄＡ］−（配列番号１０）−［ｄＡ］−ＮＨ２（以下、ＢＣＹ１１５０６と呼ぶ）；
（式中、Ａｃはアセチル基を表し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を表し、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００２５】
言及され得るさらなる実施形態では、ＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドが、Ｎ末端修飾およびＣ末端修飾を含み、
Ａｃ−Ａ−（配列番号１）−Ｄａｐ（以下、ＢＣＹ７７３２と呼ぶ）；
（式中、Ａｃはアセチル基を表し、Ｄａｐはジアミノプロピオン酸を表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００２６】
第２のペプチドリガンド
本明細書における「がん細胞」という用語への言及は、がんに関与することが知られている任意の細胞を含む。がん細胞は、細胞分裂の制御を担う遺伝子が損傷を受けた場合に作り出される。発癌は、増殖と細胞死との間の正常なバランスを狂わせる、正常細胞の遺伝物質の突然変異およびエピ変異（ｅｐｉｍｕｔａｔｉｏｎ）によって引き起こされる。これにより、制御されない細胞分裂および体内での自然選択によるこれらの細胞の進化がもたらされる。細胞の制御されない、通常は急速な増殖は、良性または悪性腫瘍（がん）をもたらし得る。良性腫瘍は、体の他の部分に広がらず、他の組織に侵入もしない。悪性腫瘍は、他の器官に侵入し、遠隔位置に広がり（転移）、生命を脅かし得る。
【００２７】
一実施形態では、がん細胞が、ＨＴ１０８０、ＳＣ−ＯＶ−３、ＰＣ３、Ｈ１３７６、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＬｎＣａｐ、ＭＣ３８、４Ｔ１−Ｄ０２およびＲＫＯ腫瘍細胞から選択される。
【００２８】
一実施形態では、がん細胞上に存在する成分がＥｐｈＡ２である。
【００２９】
Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼ（Ｅｐｈ）は、チロシン残基上でタンパク質をリン酸化するキナーゼである受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の大きなグループに属する。Ｅｐｈおよびその膜結合エフリンリガンド（エフリン）は、細胞位置決めおよび組織編成を制御する（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ７，４６５−８０）。機能的および生化学的Ｅｐｈ応答は、より高いリガンドオリゴマー化状態で起こる（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２，６６７−６７８）。
【００３０】
数あるパターニング機能の中でも、様々なＥｐｈおよびエフリンが、血管の発達において役割を果たすことが示されている。ＥｐｈＢ４およびエフリン−Ｂ２のノックアウトは、毛細血管床を血管に再構築する能力の欠如（Ｐｏｌｉａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、上記）および胚性致死をもたらす。いくつかのＥｐｈ受容体およびエフリンの持続的発現は、新たに形成された成人微小血管でも観察されている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １０，３４３１−４２；Ａｄａｍｓ（２００３）Ｊ  Ａｎａｔ  ２０２，１０５−１２）。
【００３１】
成人におけるいくつかのエフリンおよびその受容体の脱制御された再出現が、腫瘍浸潤、転移および血管新生に寄与することも観察されている（Ｎａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｉｃｒｏｓｃ  Ｒｅｓ  Ｔｅｃｈ  ５９，５８−６７；Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。さらに、いくつかのＥｐｈファミリーメンバーが、様々なヒト腫瘍由来の腫瘍細胞上で過剰発現されることが分かっている（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、上記；Ｍａｒｍｅ（２００２）Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８１  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ６６；Ｂｏｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８，１３６０−１）。
【００３２】
ＥＰＨ受容体Ａ２（エフリンＡ型受容体２）は、ヒトでは、ＥＰＨＡ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【００３３】
Ｅｐｈ２は、通常は疾患進行、転移および予後不良と相関して、ヒトの複数のがん、例えば、乳がん（Ｚｅｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，２３０１−２３０６；Ｚｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０，２９９−３０８；Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，ｅ２４４２６）、肺がん（Ｂｒａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  （Ｐｈｉｌａ）２，１０３９−１０４９；Ｋｉｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９，６１３−６１８；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｏｎｃｏｌ．８，３０１−３０８）、胃がん（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９６，４２−４７；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  ５４，２４１０−２４１７）、膵臓がん（Ｍｕｄａｌｉ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２３，３５７−３６５）、前立腺がん（Ｗａｌｋｅｒ−Ｄａｎｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４１，２７５−２８０）、肝臓がん（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｈｅｐａｔｏｌ  Ｒｅｓ．３９，１１６９−１１７７）および膠芽腫（Ｗｙｋｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３，５４１−５５１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．３１，４７７−４８８）で上方制御される。
【００３４】
がん進行におけるＥｐｈＡ２の完全な役割は依然として定義されていないが、腫瘍細胞成長、生存、浸潤および血管新生を含むがん進行の多数の段階での相互作用についての証拠が存在する。ＥｐｈＡ２発現の下方制御は、腫瘍がん細胞増殖を抑制し（Ｂｉｎｄａ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２，７６５−７８０）、ＥｐｈＡ２遮断は、ＶＥＧＦ誘導細胞遊走（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１，３２５０−３２５５）、出芽および血管新生（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１，２−１１；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  １０９，３３２−４０）ならびに転移進行（Ｂｒａｎｔｌｅｙ−Ｓｉｅｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  （２００５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１９，１８８４−１８８６）を阻害する。
【００３５】
ＥｐｈＡ２との抗体薬物複合体は、ラットおよびマウス異種移植片モデルで腫瘍成長を有意に減少させることが示されており（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６８，９３６７−９３７４）、同様のアプローチがヒトで試みられているが、治療に関連する有害事象のために治療を中断しなければならなかった（Ａｎｎｕｎｚｉａｔａ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  ３１，７７−８４）。
【００３６】
一実施形態では、第２のペプチドリガンドがＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドを含む。
【００３７】
ＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用することにより本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第１７２１２５９．８号および同第１８０４１０２．０号に開示されている。
【００３８】
一実施形態では、ＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドが、アミノ酸配列：
Ｃｉ［ＨｙＰ］ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ［ｄＤ］Ｗ［ＨＡｒｇ］Ｃｉｉｉ（配列番号２）；および
ＣｉＬＷＤＰＴＰＣｉｉＡＮＬＨＬ［ＨＡｒｇ］Ｃｉｉｉ（配列番号１１）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＨｙＰはヒドロキシプロリンを表し、ｄＤはＤ配置のアスパラギン酸を表し、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００３９】
言及され得る一実施形態では、ＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドが、アミノ酸配列：
Ｃｉ［ＨｙＰ］ＬＶＮＰＬＣｉｉＬＨＰ［ｄＤ］Ｗ［ＨＡｒｇ］Ｃｉｉｉ（配列番号２）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＨｙＰはヒドロキシプロリンを表し、ｄＤはＤ配置のアスパラギン酸を表し、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４０】
さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドが、Ｎ末端修飾を含み、
Ａ−ＨＡｒｇ−Ｄ−（配列番号２）（以下、ＢＣＹ９５９４と呼ぶ）；
［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−Ａ−［ＨＡｒｇ］−Ｄ−（配列番号２）（以下、ＢＣＹ６０９９と呼ぶ）；
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−Ａ−［ＨＡｒｇ］−Ｄ−（配列番号２）（以下、ＢＣＹ６１６９と呼ぶ）；および
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−ＶＧＰ−（配列番号１１）（以下、ＢＣＹ８９４１と呼ぶ）；
（式中、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表し、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表し、Ｓａｒ１０は１０個のサルコシン単位を表し、Ｂ−Ａｌａはβ−アラニンを表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４１】
言及され得るさらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドが、Ｎ末端修飾を含み、
Ａ−ＨＡｒｇ−Ｄ−（配列番号２）（以下、ＢＣＹ９５９４と呼ぶ）
（式中、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００４２】
代替実施形態では、がん細胞上に存在する成分がＰＤ−Ｌ１である。
【００４３】
プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、マウス染色体１９およびヒト染色体９上のＣＤ２７４遺伝子によってコードされる２９０アミノ酸Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＰＤ−Ｌ１発現は、慢性感染症、例えば、慢性ウイルス感染症（例えば、中でもＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＴＬＶを含む）、慢性細菌感染症（例えば、中でもヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）を含む）および慢性寄生生物感染症（例えば、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）を含む）に関与する免疫応答の回避に関与する。ＰＤ−Ｌ１発現は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ならびに内皮細胞、肝細胞、筋細胞および胎盤を含む非造血細胞を含むいくつかの組織および細胞型で検出されている。
【００４４】
ＰＤ−Ｌ１発現は、抗腫瘍免疫活性の抑制にも関与している。腫瘍は、宿主Ｔ細胞によって認識され得る抗原を発現するが、腫瘍の免疫学的排除はまれである。この失敗の一部は、腫瘍微小環境による免疫抑制のためである。多くの腫瘍でのＰＤ−Ｌ１発現が、この抑制環境の構成要素であり、他の免疫抑制シグナルと合わせて作用する。ＰＤ−Ｌ１発現は、乳房、肺、結腸、卵巣、黒色腫、膀胱、肝臓、唾液、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺上皮、頭頚部を含む多種多様な固形腫瘍上で、インサイチューで示されている（Ｂｒｏｗｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６；Ｄｏｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００；Ｈａｍａｎｉｓｈｉ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：３３６０−６５；Ｓｔｒｏｍｅ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６５０１−５；Ｉｎｍａｎ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃａｎｃｅｒ  １０９：１４９９−５０５；Ｋｏｎｉｓｈｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：５０９４−１００；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：１１７３−８２；Ｎｏｍｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−５７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１７１７４−７９；Ｗｕ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．１０８：１９−２４）。さらに、ＰＤ−Ｌ１の受容体、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１およびＣＤ２７９としても知られている）の発現が、腫瘍浸潤リンパ球で上方制御されており、これも、腫瘍免疫抑制に寄与している（Ｂｌａｎｋ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：４５７４−８１）。最も重要なことに、腫瘍上のＰＤ−Ｌ１発現を疾患転帰と関連付ける研究は、ＰＤ−Ｌ１発現が、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、胃がんおよび膵臓がんにおいて予後不良と強く相関していることを示している（Ｈａｍａｎｉｓｈｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：３３６０−６５；Ｉｎｍａｎ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃａｎｃｅｒ  １０９：１４９９−５０５；Ｋｏｎｉｓｈｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：５０９４−１００；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：１１７３−８２；Ｎｏｍｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−５７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１７１７４−７９；Ｗｕ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．１０８：１９−２４）。さらに、これらの研究は、腫瘍上のより高レベルのＰＤ−Ｌ１発現が、腫瘍段階の前進およびより深い組織構造への侵入を促進し得ることを示唆している。
【００４５】
ＰＤ−１経路はまた、血液悪性腫瘍においても役割を果たすことができる。ＰＤ−Ｌ１は、多発性骨髄腫細胞上で発現されるが、正常な形質細胞上では発現されない（Ｌｉｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｂｌｏｏｄ  １１０：２９６−３０４）。ＰＤ−Ｌ１は、いくつかの原発性Ｔ細胞リンパ腫、特に未分化大細胞型Ｔリンパ腫上で発現される（Ｂｒｏｗｎ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ，２００３  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６）。ＰＤ−１は、血管免疫芽球性リンパ腫のＴ細胞上で高度に発現され、ＰＤ−Ｌ１は、関連する濾胞樹状細胞ネットワーク上で発現される（Ｄｏｒｆｍａｎ  ＤＭ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．３０：８０２−１０）。結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫では、リンパ球性または組織球性（Ｌ＆Ｈ）細胞に関連するＴ細胞がＰＤ−１を発現する。ＰＤ−１連結によって誘導される遺伝子の読み取りを使用したマイクロアレイ解析は、腫瘍関連Ｔ細胞が、ホジキンリンパ腫で、インサイチューでＰＤ−１シグナルに応答していることを示唆している（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｂｌｏｏｄ  １１０：３２２６−３３）。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１は、ＨＴＬＶ−１媒介成人Ｔ細胞白血病およびリンパ腫においてＣＤ４  Ｔ細胞上で発現される（Ｓｈｉｍａｕｃｈｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２１：２５８５−９０）。これらの腫瘍細胞は、ＴＣＲシグナルに対して低反応性である。
【００４６】
動物モデルでの研究が、腫瘍上のＰＤ−Ｌ１がＴ細胞活性化および腫瘍細胞の溶解を阻害し、ある場合には、腫瘍特異的Ｔ細胞死の増加をもたらすことを実証している（Ｄｏｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００；Ｈｉｒａｎｏ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：１０８９−９６）。腫瘍関連ＡＰＣはまた、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１経路を利用して抗腫瘍Ｔ細胞応答を制御することもできる。腫瘍関連骨髄ＤＣの集団でのＰＤ−Ｌ１発現は、腫瘍環境因子によって上方制御される（Ｃｕｒｉｅｌ  ＴＪ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：５６２−６７）。Ｂ１６黒色腫の腫瘍流入領域リンパ節中の形質細胞様樹状細胞（ＤＣ）は、制御性Ｔ細胞の抑制活性を強力に活性化するＩＤＯを発現する。ＩＤＯで処理された制御性Ｔ細胞の抑制活性には、ＩＤＯ発現ＤＣとの細胞接触が必要であった（Ｓｈａｒｍａ  ＭＤ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：２５７０−８２）。
【００４７】
一実施形態では、第２のペプチドリガンドがＰＤ−Ｌ１結合二環式ペプチドリガンドを含む。
【００４８】
ＰＤ−Ｌ１結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用することにより本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第１８２０９５６．９号および同第１８２０９６９．２号に開示されている。
【００４９】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１二環式ペプチドリガンドが、
Ｃｉ［ＨＡｒｇ］ＤＷＣｉｉＨＷＴＦＳＨＧＨＰＣｉｉｉ（配列番号１２）；
ＣｉＳＡＧＷＬＴＭＣｉｉＱＫＬＨＬＣｉｉｉ（配列番号１３）；および
ＣｉＳＡＧＷＬＴＭＣｉｉＱ［Ｋ（ＰＹＡ）］ＬＨＬＣｉｉｉ（配列番号１４）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表し、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表す）
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００５０】
さらなる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合二環式ペプチドリガンドが、Ｎ末端修飾および／またはＣ末端修飾を含み、
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−（配列番号１２）（以下、ＢＣＹ８９３８と呼ぶ）；
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−ＳＤＫ−（配列番号１３）（以下、ＢＣＹ１００４３と呼ぶ）；
ＮＨ２−ＳＤＫ−（配列番号１３）−［Ｓａｒ１０］−［Ｋ（ＰＹＡ）］（以下、ＢＣＹ１００４４と呼ぶ）；
ＮＨ２−ＳＤＫ−（配列番号１４）（以下、ＢＣＹ１００４５と呼ぶ）；および
Ａｃ−ＳＤＫ−（配列番号１４）−ＰＳＨ（以下、ＢＣＹ１０８６１と呼ぶ）；
（式中、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表し、Ｂ−Ａｌａはβ−アラニンを表し、Ｓａｒ１０は１０個のサルコシン単位を表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００５１】
代替実施形態では、がん細胞上に存在する成分がネクチン−４である。
【００５２】
ネクチン−４は、４つのメンバーを含むタンパク質のネクチンファミリーに属する表面分子である。ネクチンは、発達および成人期中の上皮、内皮、免疫および神経細胞のための極性、増殖、分化および遊走などの様々な生物学的過程において重要な役割を果たす細胞接着分子である。これらは、ヒトにおけるいくつかの病理学的過程に関与する。これらは、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルスおよび麻疹ウイルスの主な受容体である。ネクチン−１（ＰＶＲＬ１）またはネクチン−４（ＰＶＲＬ４）をコードする遺伝子の突然変異は、他の異常に関連する外胚葉性異形成症候群を引き起こす。ネクチン−４は、胎児発生中に発現される。成人組織では、その発現が、ファミリーの他のメンバーの発現よりも制限される。ネクチン−４は、乳癌、卵巣癌および肺癌のそれぞれ５０％、４９％および８６％における腫瘍関連抗原であり、ほとんど予後不良の腫瘍上にある。その発現は、対応する正常組織では検出されない。乳房腫瘍では、ネクチン−４が、主にトリプルネガティブおよびＥＲＢＢ２＋癌で発現される。これらのがんを有する患者の血清では、ネクチン−４の可溶型の検出が、予後不良に関連している。血清ネクチン−４のレベルは、転移進行中に増加し、治療後に減少する。これらの結果は、ネクチン−４が、がんの治療の信頼できる標的となり得ることを示唆している。したがって、いくつかの抗ネクチン−４抗体が先行技術で記載されている。特に、エンホルツマブベドチン（ＡＳＧ−２２ＭＥ）は、ネクチン−４を標的とする抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であり、固形腫瘍を患っている患者の治療について現在臨床的に調査されている。
【００５３】
一実施形態では、第２のペプチドリガンドがネクチン−４結合二環式ペプチドリガンドを含む。
【００５４】
ネクチン−４結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用することにより本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第１８１０２５０．９号、同第１８１５６８４．４号および同第１８１８４９９．４号に開示されている。
【００５５】
一実施形態では、ネクチン−４結合二環式ペプチドリガンドが、
ＣｉＰ［１Ｎａｌ］［ｄＤ］ＣｉｉＭ［ＨＡｒｇ］ＤＷＳＴＰ［ＨｙＰ］ＷＣｉｉｉ（配列番号１５；以下、ＢＣＹ８１１６と呼ぶ）；
ＣｉＰ［１Ｎａｌ］［ｄＤ］ＣｉｉＭ［ＨＡｒｇ］Ｄ［ｄＷ］ＳＴＰ［ＨｙＰ］［ｄＷ］Ｃｉｉｉ（配列番号１６；以下、ＢＣＹ１１４１５と呼ぶ）；および
ＣｉＰ［１Ｎａｌ］［ｄＫ］（Ｓａｒ１０−（Ｂ−Ａｌａ））ＣｉｉＭ［ＨＡｒｇ］ＤＷＳＴＰ［ＨｙＰ］ＷＣｉｉｉ（配列番号１７）；
ＣｉＰＦＧＣｉｉＭ［ＨＡｒｇ］ＤＷＳＴＰ［ＨｙＰ］ＷＣｉｉｉ（配列番号１８；以下、ＢＣＹ１１４１４と呼ぶ）；
（式中、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉはそれぞれ第１、第２および第３のシステイン残基を表し、１Ｎａｌは１−ナフチルアラニンを表し、ＨＡｒｇはホモアルギニンを表し、ＨｙＰはヒドロキシプロリンを表し、Ｓａｒ１０は１０個のサルコシン単位を表し、Ｂ−Ａｌａはβ−アラニンを表す）
から選択されるアミノ酸配列またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００５６】
さらなる実施形態では、ネクチン−４結合二環式ペプチドリガンドが、場合により、Ｎ末端修飾を含み、
配列番号１５（以下、ＢＣＹ８１１６と呼ぶ）；
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−（配列番号１５）（以下、ＢＣＹ８８４６と呼ぶ）；
配列番号１６（以下、ＢＣＹ１１４１５と呼ぶ）；
［ＰＹＡ］−［Ｂ−Ａｌａ］−［Ｓａｒ１０］−（配列番号１６）（以下、ＢＣＹ１１９４２と呼ぶ）；
Ａｃ−（配列番号１７）（以下、ＢＣＹ８８３１と呼ぶ）；および
配列番号１８（以下、ＢＣＹ１１４１４と呼ぶ）；
（式中、ＰＹＡは４−ペンチン酸を表し、Ｂ−Ａｌａはβ−アラニンを表し、Ｓａｒ１０は１０個のサルコシン単位を表す）
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００５７】
代替実施形態では、がん細胞上に存在する成分が前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）である。
【００５８】
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）（グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅＩ）およびＮＡＡＧペプチダーゼとしても知られている）は、ヒトでは、ＦＯＬＨ１（葉酸ヒドロラーゼ１）遺伝子によってコードされる酵素である。ヒトＧＣＰＩＩは、７５０アミノ酸を含み、重さがおよそ８４ｋＤａである。
【００５９】
ヒトＰＳＭＡは、前立腺で高度に、ほとんどの他の組織よりもおよそ１００倍高く発現される。いくつかの前立腺がんでは、ＰＳＭＡが、２番目に多く上方制御される遺伝子産物であり、非がん性前立腺細胞のレベルよりも８〜１２倍増加している。この高い発現のために、ＰＳＭＡは、いくつかのがんの療法および画像化のための潜在的なバイオマーカーとして開発されている。ヒト前立腺がんでは、より高度に発現している腫瘍は、進行までの時間が速く、再発を患う患者の割合が高いことを伴う。
【００６０】
一実施形態では、第２のペプチドリガンドがＰＳＭＡ結合二環式ペプチドリガンドを含む。
【００６１】
ＰＳＭＡ結合二環式ペプチドリガンドの適切な例は、そのペプチドが引用することにより本明細書の一部をなすものとする、英国特許出願第１８１０３１８．４号、同第１８１０３２５．９号および同第１８２０３２５．７号に開示されている。
【００６２】
リンカー
第１のペプチドリガンドを、任意の適切なリンカーを介して第２のペプチドリガンドにコンジュゲートすることができることが理解されるだろう。典型的には、前記リンカーの設計は、２つの二環式ペプチドが、単独で、または両標的受容体に同時に結合している間にそれぞれの標的に邪魔されずに結合することができるように提供されるようなものとなる。さらに、リンカーは、所望の機能的帰結をもたらす標的細胞間の適切な距離を維持しながら、両標的に同時に結合することを許すべきである。リンカーの特性を、所望の機能的帰結を最適化するために、長さ、剛性または可溶性を増加させるよう調節することができる。リンカーを、２つ以上の二環が同じ標的に付着することを許すよう設計することもできる。いずれかの結合ペプチドの結合価を増加させることが、標的細胞に対するヘテロタンデムの親和性を増加させるのに役立ち得る、または標的受容体の一方もしくは両方のオリゴマー化を誘導するのに役立ち得る。
【００６３】
一実施形態では、リンカーが、以下の配列、−ＣＨ２−、−ＰＥＧ５−、−ＰＥＧ１０−、−ＰＥＧ１２−、−ＰＥＧ２３−、−ＰＥＧ２４−、−ＰＥＧ１５−Ｓａｒ５−、−ＰＥＧ１０−Ｓａｒ１０−、−ＰＥＧ５−Ｓａｒ１５−、−ＰＥＧ５−Ｓａｒ５−、−Ｂ−Ａｌａ−Ｓａｒ２０−、−Ｂ−Ａｌａ−Ｓａｒ１０−ＰＥＧ１０−、−Ｂ−Ａｌａ−Ｓａｒ５−ＰＥＧ１５−およびＢ−Ａｌａ−Ｓａｒ５−ＰＥＧ５−から選択される。
【００６４】
適切なリンカーの構造的表現を以下に詳述する。
【００６５】
【化１】
2021520378.tif 000003
【００６６】
【化２】
2021520378.tif 000004
【００６７】
ヘテロタンデム複合体
１つの具体的な実施形態では、第１のペプチドリガンドが、ＴＡＴＡ足場に結合したＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドを含み、第２のペプチドリガンドが、ＴＡＴＡ足場に結合したＥｐｈＡ２結合二環式ペプチドリガンドを含み、前記ヘテロタンデム複合体が
【００６８】
【表１】
2021520378.tif 000005
から選択される。
【００６９】
ヘテロタンデム二環式ペプチド複合体ＢＣＹ７９８５は、ＰＥＧ１２を介してＥｐｈＡ２特異的ペプチドＢＣＹ６１６９のＮ末端ＰＹＡ基に連結されたＣＤ１３７特異的ペプチドＢＣＹ７８５９からなる（図２に絵によって示される）。
【００７０】
ＣＤ１３７はホモ三量体タンパク質であり、天然リガンドＣＤ１３７Ｌは、免疫細胞上で発現されるまたは分泌されるホモ三量体として存在する。ＣＤ１３７の生物学は、免疫細胞でＣＤ１３７活性を誘導するための多量体化に高度に依存する。ＣＤ１３７多量体化をもたらす１つの方法は、別の細胞上に存在する特異的受容体との相互作用を通したＣＤ１３７特異的アゴニストの細胞架橋を通したものである。
【００７１】
ＥｐｈＡ２は、腫瘍細胞上で高度に発現され、エフリン−Ａリガンドによるこの受容体チロシンキナーゼのオリゴマー化が、その活性化を駆動する。理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、１つのＣＤ１３７特異的ペプチドにカップリングした１つのＥｐｈＡ２特異的ペプチドからなるＥｐｈＡ２−ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、ＣＤ１３７を架橋するよう作用すると考えている。どうやらＣＤ１３７が、腫瘍細胞などの細胞上で、ＥｐｈＡ２の存在下で多量体化および活性化されるようである。これにより、局所腫瘍環境でのＣＤ１３７免疫細胞活性化が駆動されるだろう（図１）。
【００７２】
この仮説を、本明細書に記載されるＣＤ１３７細胞活性レポーターアッセイで試験し、結果を図３で本明細書において示すと、ＢＣＹ７９８５が、ＥｐｈＡ２発現ＨＴ１０８０細胞の存在下、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣＤ１３７ルシフェラーゼレポーターアッセイ（ＣＳ１９６００８）でＣＤ１３７細胞活性の強力な誘導を示したことが分かる。
【００７３】
１つの代替の具体的な実施形態では、第１のペプチドリガンドが、ＴＡＴＡ足場に結合したＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドを含み、第２のペプチドリガンドが、ＴＡＴＡ足場に結合したネクチン−４結合二環式ペプチドリガンドを含み、前記ヘテロタンデム複合体が、
【００７４】
【表２−１】
2021520378.tif 000006
【表２−２】
2021520378.tif 000007
から選択される。
【００７５】
理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、１つのＣＤ１３７特異的ペプチドにカップリングした１つのネクチン−４特異的ペプチドからなるネクチン−４−ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、ＥｐｈＡ２について前に記載されるのと同様に、ＣＤ１３７を架橋するよう作用すると考えている。
【００７６】
一実施形態では、ネクチン−４−ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、ＢＣＹ１１８５７、ＢＣＹ１１８５８および／またはＢＣＹ１１８５９のうちのいずれか１つまたは複数以外である。
【００７７】
１つの代替の具体的な実施形態では、第１のペプチドリガンドが、ＴＡＴＡ足場に結合したＣＤ１３７結合二環式ペプチドリガンドを含み、第２のペプチドリガンドが、ＴＡＴＡ足場に結合したＰＤ−Ｌ１結合二環式ペプチドリガンドを含み、前記ヘテロタンデム複合体が、
【００７８】
【表３】
2021520378.tif 000008
から選択される。
【００７９】
理論によって拘束されるものではないが、本発明者らは、１つのＣＤ１３７特異的ペプチドにカップリングした１つのＰＤ−Ｌ１特異的ペプチドからなるＰＤ−Ｌ１−ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、ＥｐｈＡ２について前に記載されるのと同様に、ＣＤ１３７を架橋するよう作用すると考えている。
【００８０】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学の分野などの当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。引用することにより本明細書の一部をなすものとする、標準的な技術が、分子生物学、遺伝子および生化学方法に使用される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照）。
【００８１】
命名法
番号付け
本発明の化合物内のアミノ酸残基位置に言及する場合、システイン残基（Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉ）は不変であるため番号付けから省かれるので、配列番号１内のアミノ酸残基の番号付けは、
Ｃｉ−Ｉ１−Ｅ２−Ｅ３−Ｇ４−Ｑ５−Ｙ６−Ｃｉｉ−Ｆ７−Ａ８−Ｄ９−Ｐ１０−Ｙ１１−［Ｎｌｅ］１２−Ｃｉｉｉ（配列番号１）
と呼ばれる。
【００８２】
本明細書の目的のために、全ての二環式ペプチドは、ＴＢＭＢ（１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン）または１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（1,1',1''-(1,3,5-triazinane-1,3,5-triyl)triprop-2-en-1-one：ＴＡＴＡ）で環化され、三置換構造をもたらすと仮定される。ＴＢＭＢおよびＴＡＴＡによる環化は、Ｃｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉで起こる。
【００８３】
分子フォーマット
二環コア配列へのＮ末端伸長またはＣ末端伸長は、配列の左側または右側に付加され、ハイフンによって分離される。例えば、Ｎ末端βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａｌａ尾部は、
βＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ−（配列番号Ｘ）として表される。
【００８４】
逆ペプチド配列
Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０（３），１３６２−１３７３の開示に照らして、本明細書に開示されるペプチド配列が、そのレトロインベルソ型（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ  ｆｏｒｍ）でも有用性を見出すと想定される。例えば、配列が逆にされ（すなわち、Ｎ末端がＣ末端になる、および逆もまた同様である）、その立体化学も同様に逆にされる（すなわち、Ｄ−アミノ酸がＬ−アミノ酸になる、および逆もまた同様である）。
【００８５】
ペプチドリガンド
本明細書で言及されるペプチドリガンドは、分子足場に共有結合したペプチドを指す。典型的には、このようなペプチドは、足場との共有結合を形成することができる２つ以上の反応性基（すなわち、システイン残基）、およびペプチドが足場に結合している場合に、ループを形成するので、ループ配列と呼ばれる、前記反応性基の間に定められる配列を含む。この場合、ペプチドは、少なくとも３つのシステイン残基（本明細書ではＣｉ、ＣｉｉおよびＣｉｉｉと呼ばれる）を含み、足場上に少なくとも２つのループを形成する。
【００８６】
薬学的に許容される塩
塩形態が本発明の範囲内にあり、ペプチドリガンドへの言及が、前記リガンドの塩形態を含むことが理解されるだろう。
【００８７】
本発明の塩は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．  Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ｓｔａｈｌ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｃａｍｉｌｌｅ  Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｅｄｉｔｏｒ），ＩＳＢＮ：３−９０６３９−０２６−８，Ｈａｒｄｃｏｖｅｒ，３８８ｐａｇｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ２００２に記載される方法などの従来の化学的方法によって塩基性部分または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸形態または遊離塩基形態を、水もしくは有機溶媒または２者の混合物中、適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。
【００８８】
酸付加塩（一塩または二塩）は、無機と有機の両方の、多種多様な酸で形成され得る。酸付加塩の例としては、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、Ｌ−アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、ブタン酸、（＋）樟脳酸、カンファースルホン酸、（＋）−（１Ｓ）−カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイヒ酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−二スルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ−グルコン酸、グルクロン酸（例えば、Ｄ−グルクロン酸）、グルタミン酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸）、α−オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸）、イセチオン酸、乳酸（例えば、（＋）−Ｌ−乳酸、（±）−ＤＬ−乳酸）、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、（−）−Ｌ−リンゴ酸、マロン酸、（±）−ＤＬ−マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、Ｌ−ピログルタミン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）−Ｌ−酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸および吉草酸、ならびにアシル化アミノ酸および陽イオン交換樹脂からなる群から選択される酸で形成される一塩または二塩が挙げられる。
【００８９】
塩の１つの特定の群は、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸（メシル酸）、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸およびラクトビオン酸から形成される塩からなる。１つの特定の塩は塩酸塩である。別の特定の塩は酢酸塩である。
【００９０】
化合物がアニオン性である、またはアニオン性になり得る官能基を有する（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ−になり得る）場合、塩が有機塩基または無機塩基で形成され、適切なカチオンを生成し得る。適切な無機カチオンの例としては、それだけに限らないが、Ｌｉ＋、Ｎａ＋およびＫ＋などのアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋などのアルカリ土類金属カチオン、ならびにＡｌ３＋またはＺｎ＋などの他のカチオンが挙げられる。適切な有機カチオンの例としては、それだけに限らないが、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ４＋）および置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２＋、ＮＨＲ３＋、ＮＲ４＋）が挙げられる。いくつかの適切な置換アンモニウムイオンの例は、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミンおよびトロメタミン、ならびにリジンおよびアルギニンなどのアミノ酸から誘導されるものである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４＋である。
【００９１】
本発明の化合物がアミン官能基を含む場合、これらは、例えば、当業者に周知の方法に従って、アルキル化剤との反応によって、第四級アンモニウム塩を形成し得る。このような第四級アンモニウム化合物は、本発明の範囲内である。
【００９２】
修飾誘導体
本明細書に定義されるペプチドリガンドの修飾誘導体は本発明の範囲内であることが理解されるだろう。このような適切な修飾誘導体の例としては、Ｎ末端修飾および／またはＣ末端修飾；１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置き換え（１つまたは複数の極性アミノ酸残基の１つまたは複数の等価または等電子アミノ酸による置き換え；１つまたは複数の非極性アミノ酸残基の他の非天然等価または等電子アミノ酸による置き換えなど）；スペーサー基の付加；１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基による置き換え；１つまたは複数のアミノ酸残基のアラニンによる置き換え、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置き換え；二環式ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮ−アルキル化；１つまたは複数のペプチド結合の代理結合による置き換え；ペプチド骨格長の修飾；１つまたは複数のアミノ酸残基のα−炭素上の水素の別の化学基による置換、システイン、リジン、グルタミン酸／アスパラギン酸およびチロシンなどのアミノ酸の、前記アミノ酸を官能化するための適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール−反応性試薬による修飾、ならびにそれぞれ、官能化に適した直交性反応基、例えば、アジドを導入するアミノ酸、またはアルキンによる官能化を可能にするアルキン基保有アミノ酸、またアジド保有部分の導入または置き換えから選択される１つまたは複数の修飾が挙げられる。
【００９３】
一実施形態では、修飾誘導体がＮ末端修飾および／またはＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体が、適切なアミノ反応性化学を使用したＮ末端修飾、および／または適切なカルボキシ反応性化学を使用したＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、前記Ｎ末端修飾またはＣ末端修飾が、それだけに限らないが、細胞傷害剤、放射性キレート剤または発色団を含むエフェクター基の付加を含む。
【００９４】
さらなる実施形態では、修飾誘導体がＮ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｎ末端修飾がＮ末端アセチル基を含む。この実施形態では、Ｎ末端システイン基（本明細書でＣｉと呼ばれる基）が、ペプチド合成中に無水酢酸または他の適切な試薬でキャッピングされて、Ｎ末端アセチル化された分子をもたらす。この実施形態は、アミノペプチダーゼにとっての潜在的な認識点を除去するという利点を提供し、二環式ペプチドの分解の可能性を回避する。
【００９５】
代替実施形態では、Ｎ末端修飾が、エフェクター基のコンジュゲーションおよび二環式ペプチドの標的に対する効力の保持を促進する分子スペーサー基の付加を含む。
【００９６】
さらなる実施形態では、修飾誘導体がＣ末端修飾を含む。さらなる実施形態では、Ｃ末端修飾がアミド基を含む。この実施形態では、Ｃ末端システイン基（本明細書でＣｉｉｉと呼ばれる基）が、ペプチド合成中にアミドとして合成されて、Ｃ末端アミド化された分子をもたらす。この実施形態は、カルボキシペプチダーゼにとっての潜在的な認識点を除去するという利点を提供し、二環式ペプチドのタンパク質分解の可能性を減少させる。
【００９７】
一実施形態では、修飾誘導体が、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置き換えを含む。この実施形態では、分解性プロテアーゼによって認識されず、標的効力に対する有害効果も有さない等価／等電子側鎖を有する非天然アミノ酸が選択され得る。
【００９８】
あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質分解性加水分解がコンフォメーション的および立体的に妨げられるように、拘束されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸が使用され得る。特に、これらは、プロリン類似体、嵩高い側鎖、Ｃα−二置換誘導体（例えば、アミノイソ酪酸、Ａｉｂ）およびシクロアミノ酸、アミノシクロプロピルカルボン酸である単純な誘導体に関する。
【００９９】
一実施形態では、修飾誘導体がスペーサー基の付加を含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体が、Ｎ末端システイン（Ｃｉ）および／またはＣ末端システイン（Ｃｉｉｉ）に対するスペーサー基の付加を含む。
【０１００】
一実施形態では、修飾誘導体が、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化耐性アミノ酸残基による置き換えを含む。さらなる実施形態では、修飾誘導体が、トリプトファン残基のナフチルアラニンまたはアラニン残基による置き換えを含む。この実施形態は、結果として生じる二環式ペプチドリガンドの薬学的安定性プロファイルを改善するという利点を提供する。
【０１０１】
一実施形態では、修飾誘導体が、１つまたは複数の荷電アミノ酸残基の１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基による置き換えを含む。代替実施形態では、修飾誘導体が、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の１つまたは複数の荷電アミノ酸残基による置き換えを含む。荷電アミノ酸残基対疎水性アミノ酸残基の正しいバランスが、二環式ペプチドリガンドの重要な特性である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度に影響を及ぼし、よって、血漿中の遊離の利用可能な画分の濃度に影響を及ぼす一方、荷電アミノ酸残基（特に、アルギニン）は、ペプチドと細胞表面上のリン脂質膜の相互作用に影響を及ぼし得る。この２つは組み合わさって、ペプチド薬物の半減期、分布容積および曝露に影響を及ぼし得るので、臨床的エンドポイントに従って調整することができる。さらに、荷電アミノ酸残基対疎水性アミノ酸残基の正しい組み合わせおよび数は、注射部位での刺激を減少させ得る（ペプチド薬物が皮下投与されている場合）。
【０１０２】
一実施形態では、修飾誘導体が、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置き換えを含む。この実施形態は、立体障害およびＤ−アミノ酸がβターンコンフォメーションを安定化する傾向によってタンパク質分解安定性を増加させると考えられる（Ｔｕｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ（２００５）ＰＮＡＳ，１０２（２），４１３−４１８）。
【０１０３】
一実施形態では、修飾誘導体が、任意のアミノ酸残基の除去およびアラニンによる置換を含む。この実施形態は、潜在的なタンパク質分解攻撃部位（複数可）を除去するという利点を提供する。
【０１０４】
上記修飾の各々が、ペプチドの効力または安定性を計画的に改善するのに役立つことに留意すべきである。修飾に基づくさらなる効力改善は、
−  より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を利用し、より低い解離速度をもたらす疎水性部分を組み込むこと；
−  長期のイオン相互作用を利用して、より速い会合速度およびより高い親和性をもたらす荷電基を組み込むこと（例えば、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｒａｐｉｄ，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，４２７−３１参照）；および
−  例えば、標的結合時のエントロピー損失が最小となるように、アミノ酸の側鎖を正しく拘束すること、標的結合時のエントロピー損失が最小となるように、骨格のねじれ角を拘束すること、および同一の理由で追加の環化を分子に導入することによって、追加の拘束をペプチドに組み込むこと
という機構を通して達成され得る（概要については、Ｇｅｎｔｉｌｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ，（２０１０），１６，３１８５−２０３，およびＮｅｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ（２００９），１６，４３９９−４１８参照）。
【０１０５】
同位体変種
本発明は、１つまたは複数の原子が、同じ原子番号を有するが、天然で通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられている、本発明の全ての薬学的に許容される（放射性）同位体標識ペプチドリガンド、および関連する（放射性）同位体を保持することができる金属キレート基が結合している（「エフェクター」と呼ばれる）本発明のペプチドリガンド、および一定の官能基が関連する（放射性）同位体または同位体標識官能基で共有結合的に置き換えられている、本発明のペプチドリガンドを含む。
【０１０６】
本発明のペプチドリガンドに含めるのに適した同位体の例としては、２Ｈ（Ｄ）および３Ｈ（Ｔ）などの水素の同位体、１１Ｃ、１３Ｃおよび１４Ｃなどの炭素の同位体、３６Ｃｌなどの塩素の同位体、１８Ｆなどのフッ素の同位体、１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉなどのヨウ素の同位体、１３Ｎおよび１５Ｎなどの窒素の同位体、１５Ｏ、１７Ｏおよび１８Ｏなどの酸素の同位体、３２Ｐなどのリンの同位体、３５Ｓなどの硫黄の同位体、６４Ｃｕなどの銅の同位体、６７Ｇａまたは６８Ｇａなどのガリウムの同位体、９０Ｙなどのイットリウムの同位体、ならびに１７７Ｌｕなどのルテニウムの同位体、ならびに２１３Ｂｉなどのビスマスの同位体が挙げられる。
【０１０７】
本発明の一定の同位体標識ペプチドリガンド、例えば、放射性同位体を組み込んだものは、薬物および／または基質組織分布研究において、ならびに疾患組織上のネクチン−４標的の存在および／または非存在を臨床的に評価するために有用である。本発明のペプチドリガンドは、標識化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素または受容体との間の複合体の形成を検出または特定するために使用することができるという点で、有用な診断特性をさらに有することができる。検出または特定方法は、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼ）等などの標識剤で標識された化合物を使用することができる。放射性同位体トリチウム、すなわち、３Ｈ（Ｔ）および炭素−１４、すなわち、１４Ｃが、組み込みの容易さおよび迅速な検出手段を考慮して、この目的に特に有用である。
【０１０８】
重水素、すなわち、２Ｈ（Ｄ）などのより重い同位体による置換は、より大きな代謝安定性に起因する一定の治療上の利点、例えば、インビボ半減期の増加または投与量要求の減少を与えることができ、よって、状況によって好まれ得る。
【０１０９】
１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎなどの陽電子放出同位体による置換は、標的占有率を調査するためのポジトロン断層法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＥＴ）で有用となり得る。
【０１１０】
本発明のペプチドリガンドの同位体標識化合物は、一般に、当業者に知られている従来技術によって、または前に使用された非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用して付随する実施例に記載されるのと同様の方法によって調製することができる。
【０１１１】
分子足場
分子足場は、例えば、国際公開第２００９／０９８４５０号およびその中に引用される参考文献、特に国際公開第２００４／０７７０６２号および国際公開第２００６／０７８１６１号に記載される。
【０１１２】
前記文献に言及されるように、分子足場は、小有機分子などの小分子であり得る。
【０１１３】
一実施形態では、分子足場が高分子であり得る。一実施形態では、分子足場が、アミノ酸、ヌクレオチドまたは炭水化物で構成される高分子である。
【０１１４】
一実施形態では、分子足場が、ポリペプチドの官能基（複数可）と反応して、共有結合を形成することができる反応性基を含む。
【０１１５】
分子足場は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルなどの、ペプチドと結合を形成する化学基を含み得る。
【０１１６】
一実施形態では、分子足場が、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、特に１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン（「ＴＡＴＡ」）またはその誘導体を含み得る、またはからなり得る。
【０１１７】
一実施形態では、分子足場が２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。この分子は、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）と類似であるが、ベンゼン環に結合した３つの追加のメチル基を含む。これは、追加のメチル基がポリペプチドとのさらなる接点を形成し、よって、追加の構造上の拘束を加え得るという利点を有する。
【０１１８】
本発明の分子足場は、本発明のコードされるライブラリーのポリペプチドの官能基が、分子足場と共有結合的連結を形成することを可能にする化学基を含む。前記化学基は、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、無水物、スクシンイミド、マレイミド、アジド、ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化アシルを含む広範囲の官能基から選択される。
【０１１９】
システインのチオール基と反応するために分子足場上で使用され得る足場反応性基は、ハロゲン化アルキル（またはハロゲノアルカンもしくはハロアルカンとも呼ばれる）である。
【０１２０】
例としては、ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢによって例示される足場反応性基）またはヨードアセトアミドが挙げられる。化合物をタンパク質中のシステインに選択的にカップリングするために使用される他の足場反応性基は、マレイミド、αβ不飽和カルボニル含有化合物およびα−ハロメチルカルボニル含有化合物である。本発明で分子足場として使用され得るマレイミドの例としては、トリス−（２−マレイミドエチル）アミン、トリス−（２−マレイミドエチル）ベンゼン、トリス−（マレイミド）ベンゼンが挙げられる。αβ不飽和カルボニル含有化合物の例は、１，１’，１’’−（１，３，５−トリアジナン−１，３，５−トリイル）トリプロパ−２−エン−１−オン（ＴＡＴＡ）（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１４），５３（６），１６０２−１６０６）である。α−ハロメチルカルボニル含有化合物の例は、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（ベンゼン−１，３，５−トリイル）トリス（２−ブロモアセトアミド）である。セレノシステインも、システインと同様の反応性を有し、同じ反応に使用することができる天然アミノ酸である。よって、文脈が別のことを示唆しない限り、システインが言及される場合はいつでも、セレノシステインで置換することが典型的に許容される。
【０１２１】
合成
本発明のペプチドは、標準的な技術によって合成的に製造され、引き続いてインビトロで分子足場と反応し得る。これを実施する場合、標準的な化学が使用され得る。これにより、さらなる下流の実験または検証のために可溶性材料の迅速な大規模調製が可能になる。このような方法は、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（上記）に開示されるような従来の化学を使用して達成することができるだろう。
【０１２２】
よって、本発明はまた、本明細書に示される、選択されるポリペプチドまたはコンジュゲートの製造であって、以下で説明される任意のさらなるステップを含む製造に関する。一実施形態では、これらのステップが、化学合成によって調製された最終生成物ポリペプチド／コンジュゲートに行われる。
【０１２３】
コンジュゲートまたは複合体を製造する場合、場合により、目的のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換してもよい。
【０１２４】
ペプチドを伸長して、例えば、別のループを組み込み、よって、複数の特異性を導入することもできる。
【０１２５】
ペプチドを伸長するために、標準的な固相または液相化学を使用して、直交的に保護された（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）リジン（および類似体）を使用して、ペプチドをそのＮ末端もしくはＣ末端で、またはループ内で化学的に簡単に伸長することができる。標準的な（バイオ）コンジュゲーション技術を使用して、活性化もしくは活性化可能なＮ末端またはＣ末端を導入することができる。あるいは、例えば、（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）に記載されるように、フラグメント縮合もしくは天然化学ライゲーションによって、または（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９４  Ｄｅｃ  ２０；９１（２６）：１２５４４−８もしくはＨｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １８，Ｉｓｓｕｅ  ２２，１５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８，Ｐａｇｅｓ  ６０００−６００３）に記載されるサブチリガーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｇａｓｅ）を使用して、酵素によって、付加を行うことができる。
【０１２６】
あるいは、ジスルフィド結合を通したさらなるコンジュゲーションによって、ペプチドを伸長または修飾することができる。これは、第１および第２のペプチドが、細胞の還元環境内で一度に互いに解離することを可能にするという追加の利点を有する。この場合、分子足場（例えば、ＴＢＭＢ）を第１のペプチドの化学合成中に添加して、３つのシステイン基と反応させることができ；次いで、さらなるシステインまたはチオールを第１のペプチドのＮまたはＣ末端に付加して、結果としてこのシステインまたはチオールのみを第２のペプチドの遊離システインまたはチオールと反応させて、ジスルフィド連結二環式ペプチド−ペプチドコンジュゲートを形成することができるだろう。
【０１２７】
同様の技術を２つの二環式および二重特異性高分子の合成／カップリングに等しく適用すると、四重特異性分子が潜在的に作成される。
【０１２８】
さらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で、または側鎖を介してカップリングする適切な化学を使用して、他の官能基またはエフェクター基の付加を同様に達成することができる。一実施形態では、いずれの実態の活性も阻害しないようにカップリングが行われる。
【０１２９】
医薬組成物
本発明のさらなる態様によると、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、本明細書に定義されるペプチドリガンドを含む医薬組成物が提供される。
【０１３０】
一般的に、本ペプチドリガンドは、薬理学的に適切な賦形剤または担体と合わせて、精製された形態で利用される。典型的には、これらの賦形剤または担体には、生理食塩水および／または緩衝化媒体を含む、水性もしくはアルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースならびに塩化ナトリウムおよび乳酸加リンゲル液が含まれる。懸濁液中にポリペプチド複合体を保持するために必要な場合、適切な生理学的に許容されるアジュバントがカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギン酸塩などの増粘剤から選択され得る。
【０１３１】
静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、流体および栄養素補液ならびに電解質補液が含まれる。抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在することができる（Ｍａｃｋ（１９８２）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１３２】
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物として、または他の薬剤と合わせて使用され得る。これらは、抗体、抗体フラグメント、およびシクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチンなどの様々な免疫療法薬、および免疫毒素を含むことができる。医薬組成物は、本発明のタンパク質リガンド、または投与前にプールされているか否かにかかわらず、様々な標的リガンドを使用して選択されるポリペプチドなどの、異なる特異性を有する本発明による選択されるポリペプチドの組み合わせと合わせた、様々な細胞傷害剤または他の薬剤の「カクテル」を含むことができる。
【０１３３】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののいずれかであり得る。療法のために、本発明のペプチドリガンドを、標準的な技術に従って、任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺経路を介して、または適切には、カテーテルによる直接注入によるものを含む任意の適切な様式によることができる。好ましくは、本発明による医薬組成物が吸入によって投与される。投与量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、禁忌薬、ならびに臨床医によって考慮されるべき他のパラメータに依存する。
【０１３４】
本発明のペプチドリガンドを、貯蔵のために凍結乾燥し、使用前に適切な担体で再構成することができる。この技術は有効であることが示されており、当技術分野で既知の凍結乾燥および再構成技術を使用することができる。凍結乾燥および再構成が、様々な程度の活性損失をもたらす可能性があり、そのレベルを上向きに調整して補わなければならない場合があることが当業者によって理解される。
【０１３５】
本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。一定の治療用途では、選択される細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、殺傷またはいくつかの他の測定可能なパラメータを達成するのに十分な量が、「治療上有効用量」として定義される。この投与量を達成するのに必要な量は、疾患の重症度、および患者自身の免疫系の全体的な状態に依存するが、一般的に、体重１キログラム当たり０．００５〜５．０ｍｇの選択されるペプチドリガンドに及び、０．０５〜２．０ｍｇ／ｋｇ／投与の用量がより一般的に使用される。予防的用途では、本ペプチドリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物はまた、同様のまたはわずかに低い投与量で投与され得る。
【０１３６】
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物は、哺乳動物の選択標的細胞集団の変更、不活性化、殺傷または除去を助けるために予防的および治療的設定で利用され得る。さらに、本明細書に記載されるペプチドリガンドは、細胞の不均一集合物から標的細胞集団を殺傷する、枯渇させる、または有効に除去するために体外でまたはインビトロで選択的に使用され得る。標準的な技術に従って、哺乳動物由来の血液を選択されるペプチドリガンドと体外で組み合わせ、それによって不要な細胞を殺傷する、または哺乳動物に戻すために血液から除去することができる。
【０１３７】
治療的使用
本発明のさらなる態様によると、がんを予防、抑制または治療するのに使用するための、本明細書に定義されるヘテロタンデム二環式ペプチド複合体が提供される。
【０１３８】
治療（または阻害）され得るがん（およびその良性対応物）の例としては、それだけに限らないが、上皮由来の腫瘍（腺癌、扁平上皮癌、移行上皮癌および他の癌腫を含む様々な型の腺腫および癌腫）、例えば、膀胱および尿路、乳房、胃腸管（食道、胃（胃の）、小腸、結腸、直腸および肛門を含む）、肝臓（肝細胞癌）、胆嚢および胆道系、膵外分泌部、腎臓、肺（例えば、腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞上皮癌および中皮腫）、頭頚部（例えば、舌、頬側口腔、喉頭、咽頭、上咽頭、扁桃、唾液腺、鼻腔および副鼻腔のがん）、卵巣、輸卵管、腹膜、膣、外陰部、陰茎、子宮頸部、子宮筋層、子宮内膜、甲状腺（例えば、甲状腺濾胞癌）、副腎、前立腺、皮膚および付属器（例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平細胞癌、角化棘細胞腫、異形成母斑）の癌；血液悪性腫瘍（すなわち、白血病、リンパ腫）ならびに血液悪性腫瘍およびリンパ系統の関連する状態（例えば、急性リンパ性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ性白血病［ＣＬＬ］、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫および移植後リンパ増殖性障害）、ならびに血液悪性腫瘍および骨髄系統の関連する状態（例えば、急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、好酸球増加症候群、骨髄増殖性障害、例えば、真性多血症、本態性血小板血症および原発性骨髄線維症、骨髄増殖症候群、骨髄異形成症候群および前骨髄球性白血病）を含む前悪性血液障害および境界領域悪性障害；間葉起源の腫瘍、例えば、軟部組織、骨または軟骨の肉腫、例えば、骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、消化管間質腫瘍、良性および悪性組織球腫、ならびに隆起性皮膚線維肉腫；中枢および末梢神経系の腫瘍（例えば、星細胞腫、神経膠腫および神経膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍およびシュワン腫）；内分泌腫瘍（例えば、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、膵島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍および甲状腺髄様癌）；眼および付属器腫瘍（例えば、網膜芽細胞腫）；生殖細胞および絨毛性腫瘍（例えば、奇形腫、精上皮腫、未分化胚細胞腫、胞状奇胎および絨毛癌）；ならびに小児および胎児性腫瘍（例えば、髄芽腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍および原始神経外胚葉性腫瘍）；あるいは患者を悪性腫瘍に感受性にしておく、先天的なまたはその他の症候群（例えば、色素性乾皮症）が挙げられる。
【０１３９】
さらなる実施形態では、がんが、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂ細胞性およびＴ細胞性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞リンパ腫（ＴＣＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）から選択されるものなどの血液悪性腫瘍から選択される。
【０１４０】
本明細書における「予防」という用語への言及は、疾患の誘導前の保護組成物の投与を伴う。「抑制」は、誘導イベント後であるが、疾患の臨床的出現前の組成物の投与を指す。「治療」は、疾患症状が明らかになった後の保護組成物の投与を伴う。
【０１４１】
疾患に対する保護または疾患の治療におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用することができる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、ヒトおよび動物標的と交差反応して、動物モデルの使用を可能にすることができるポリペプチドリガンドの開発を可能にする本発明によって促進される。
【０１４２】
本発明を、以下の実施例を参照して、以下でさらに説明する。
【実施例】
【０１４３】
［実施例１］
リンカーの合成
ＣＯＭ１２８
【０１４４】
【化３】
2021520378.tif 000009
化合物１（７００．０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）、３−アジドプロパン−１−アミン（１１７．６６ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＥＤＣＩ（２７０．４ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＯＢｔ（１９０．６ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、１．２当量）の混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２０〜２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：６７７．３３、実測ｍ／ｚ：６７８．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。溶媒を蒸発させて、化合物２（６００ｍｇ、粗）を白色固体として得た。
【０１４５】
化合物２（６００．０ｍｇ、８８５．３μｍｏｌ、１．０当量）、Ｎ−エチルエタンアミン（１．２９ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ、１．５０ｍＬ、１７．２当量）の混合物をＤＣＭ（３ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４５５．５１、実測ｍ／ｚ：４５６．３（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。溶媒を蒸発させて、化合物３（４００ｍｇ、粗）を無色の油状物として得た。化合物３（１５０．０ｍｇ、３２９．３μｍｏｌ、１．０当量）、化合物４（３２０．１ｍｇ、３２９．３μｍｏｌ、１．０当量）、ＨＡＴＵ（１２５．２ｍｇ、３２９．３μｍｏ、１．０当量）、ＤＩＥＡ（４２．６ｍｇ、３２９．３μｍｏｌ、５７．４μＬ、１．０当量）の混合物をＤＭＦ（２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で２攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１４０８．７６、実測ｍ／ｚ：７０５．３（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。溶媒を蒸発させて、化合物５（４００ｍｇ、粗）を黄色の油状物として得た。
【０１４６】
化合物５（４００ｍｇ、２８３．７７μｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（４ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、引き続いてピペリジン（８６２．２ｍｇ、１０．１３ｍｍｏｌ、１ｍＬ、３５．７当量）を添加し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１５分間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１１８７．３７、実測ｍ／ｚ：５９４．４（［Ｍ／２＋Ｈ］＋、１１８７．４［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。溶媒を蒸発させて、ＣＯＭ１２８（２５０ｍｇ、粗）を無色の油状物として得た。
【０１４７】
ＣＯＭ１２９
【０１４８】
【化４】
2021520378.tif 000010
化合物１（１．４ｇ、１．４７ｍｍｏｌ、１．０当量）、３−アジドプロパン−１−アミン（１６２．１ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ、１．１当量）、ＥＤＣＩ（３３８．６ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＯＢｔ（２３８．７ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ、１．２当量）の混合物をＤＣＭ（５ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２０〜２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１０３３．１４、実測ｍ／ｚ：１０３３．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を数滴の１Ｍ  ＨＣｌで処理し、有機層を減圧下で蒸発させて、溶媒を除去した。化合物２（１．１ｇ、粗）を黄色の油状物として得た。
【０１４９】
化合物２（１．１ｇ、１．０６ｍｍｏｌ、１当量）、Ｎ−エチルエタンアミン（３．８９ｇ、５３．２４ｍｍｏｌ、５．４８ｍＬ、５０当量）の混合物をＤＣＭ（５ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２０〜２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：８１０．９０、実測ｍ／ｚ：８１０．９（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で蒸発させ、化合物３（８１０ｍｇ、粗）を白色固体として得た。
【０１５０】
化合物３（８１０．０ｍｇ、９９８．９μｍｏｌ、１．０当量）、化合物４（８１０．７ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、１．１当量）、ＨＡＴＵ（４５５．８ｍｇ、１．２０ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＤＩＥＡ（２５８．２ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、３４８．０μＬ、２．０当量）の混合物をＤＭＦ（２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で２攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１５３０．７２、実測ｍ／ｚ：７６５．５（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を数滴の１Ｍ  ＨＣｌで処理し、有機層を回収し、減圧下で蒸発させて、溶媒を除去した。化合物５（１．１ｇ、粗）を黄色固体として得た。
【０１５１】
化合物５（１ｇ、６５３．２９μｍｏｌ、１当量）をＤＣＭ（１０ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、引き続いてピペリジン（２．３９ｇ、３２．６６ｍｍｏｌ、３．３６ｍＬ、５０当量）を添加し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１３０８．４７、実測ｍ／ｚ：１３０８．４（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件：Ａ相：Ｈ２Ｏ中０．０７５％ＴＦＡ、Ｂ相：ＭｅＣＮ、カラム：Ｌｕｎａ  ２００＊２５ｍｍ  １０μｍ、Ｃ１８、１１０ＡおよびＧｅｍｉｎ１５０＊３０ｍｍ、Ｃ１８、５μｍ、１１０Ａ、接続、５０℃）によって精製した。ＣＯＭ１２９（７００ｍｇ、４６３．７２μｍｏｌ、収率７０．９８％）を黄色固体として得た。
【０１５２】
ＣＯＭ１３０
【０１５３】
【化５】
2021520378.tif 000011
化合物１（２９１ｍｇ、２２２．７５μｍｏｌ、１．０当量）、３−アジドプロパン−１−アミン（２４．５３ｍｇ、２４５．０２μｍｏｌ、１．１当量）、ＥＤＣＩ（５１．２４ｍｇ、２６７．３０μｍｏｌ、１．２当量）、ＨＯＢｔ（３６．１２ｍｇ、２６７．３０μｍｏｌ、１．２当量）の混合物をＤＣＭ（３ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２０〜２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１３８８．５３、実測ｍ／ｚ：６９４．７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物２（２００ｍｇ、１４４．０４μｍｏｌ、収率６４．６６％）を白色固体として得た。
【０１５４】
化合物２（２００ｍｇ、１４４．０４μｍｏｌ、１．０当量）、Ｎ−エチルエタンアミン（２１０．７ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ、２９７μＬ、２０．０当量）の混合物をＤＣＭ（３ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２０〜２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１１６６．２９、実測ｍ／ｚ：１１６６．３（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を蒸発させ、化合物３（１５０ｍｇ、粗）を黄色の油状物として得た。
【０１５５】
化合物３（１５０ｍｇ、１２８．６１μｍｏｌ、１．０当量）、化合物４（７５ｍｇ、１４４．９１μｍｏｌ、１．１３当量）、ＨＡＴＵ（５８．７ｍｇ、１５４．３４μｍｏｌ、１．２当量）およびＤＩＥＡ（３３．２４ｍｇ、２５７．２３μｍｏｌ、４４．８０μＬ、２．０当量）の混合物をＤＭＦ（５ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２０〜２５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１６６５．８４、実測ｍ／ｚ：８３３．２（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。溶媒を減圧下で除去し、化合物５（３００ｍｇ、粗）を黄色の油状物として得た。
【０１５６】
粗化合物５（３００ｍｇ、ＤＭＦ  １０ｍＬに溶解した）に、ピペリジン（２ｍＬ）を添加し、混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣＭＳは、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１４４３．６０  実測ｍ／ｚ：７２２．７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出されることを示した。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。ＣＯＭ１３０（１４０ｍｇ、５８．１９μｍｏｌ、収率３２．３１％、純度６０％）を白色固体として得た。
【０１５７】
ＣＯＭ１３１
【０１５８】
【化６】
2021520378.tif 000012
化合物１（７００．０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）、３−アジドプロパン−１−アミン（１１７．７ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＨＯＢｔ（１９０．６ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＥＤＣＩ（２７０．４ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ、１．２当量）の混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：６７７．７５、実測ｍ／ｚ：６７８．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を数滴の１Ｍ  ＨＣｌで処理し、有機層を回収し、減圧下で蒸発させた。化合物２（６００．０ｍｇ、粗）を白色固体として得た。
【０１５９】
化合物２（６００．０ｍｇ、８８５．２μｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（３ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ピペリジン（１．２９ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ、１．５０ｍＬ、１７．２当量）を添加し、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４５５．５１、実測ｍ／ｚ：４５６．３（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物３（４００．０ｍｇ、８７９．１μｍｏｌ）を無色の油状物として得た。
【０１６０】
化合物３（２５０．０ｍｇ、５４８．８３μｍｏｌ、１．０当量）、化合物４（２８４．１ｍｇ、５４８．８３μｍｏｌ、１当量）、ＨＡＴＵ（２２９．６ｍｇ、６０３．７２μｍｏｌ、１．１当量）、ＤＩＥＡ（１４１．９ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ、１９１．１９μＬ、２．０当量）のＤＣＭ（２０ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）中混合物、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：９５５．０６、実測ｍ／ｚ：９５５．６（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物５（４００．０ｍｇ、４１９．１μｍｏｌ）を白色固体として得た。化合物５（４００．０ｍｇ、４１８．８２μｍｏｌ、１．０当量）の混合物をＤＭＦ（４ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ピペリジン（８６２．２ｍｇ、１０．１３ｍｍｏｌ、１ｍＬ、２４．２当量）を添加し、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：７３２．８３  実測ｍ／ｚ：７３３．３（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＣＯＭ１３１（２００ｍｇ、２７２．９μｍｏｌ）を無色の油状物として得た。
【０１６１】
ＣＯＭ４７０
【０１６２】
【化７】
2021520378.tif 000013
ＣＯＭ１２２（２２８ｍｇ、１４９．８３μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（５１．３１ｍｇ、１６４．８２μｍｏｌ、１．１当量）のＤＭＦ（６ｍＬ）中溶液に、ＨＡＴＵ（８５．４０ｍｇ、２２４．７５μｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＥＡ（１９．３７ｍｇ、１４９．８３μｍｏｌ、２６．１０μＬ、１．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１８１４．９９、実測ｍ／ｚ：９０８．２（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物２（５４ｍｇ、２９．７５μｍｏｌ、収率１９．８６％）を白色固体として得た。
【０１６３】
化合物２（５４ｍｇ、２９．８μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ピペリジン（６１ｍｇ、７１５μｍｏｌ、７１μＬ、２４．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１５９２．７５  実測ｍ／ｚ：７９６．２７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＣＯＭ４７０（４０ｍｇ、２５．１１μｍｏｌ、収率８４．４１％）を白色固体として得た。
【０１６４】
ＣＯＭ４７１
【０１６５】
【化８】
2021520378.tif 000014
化合物１（９００ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、１．０当量）および化合物２（１．０ｇ、３．２１ｍｍｏｌ、２．６当量）の混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、引き続いて（２８４．０ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＯＢｔ（２００．２ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ、１．２０当量）を添加した。混合物を２５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１０２１．４９、実測ｍ／ｚ：１０２２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つのピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去した。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（０．９００ｇ、８８０．５３μｍｏｌ、収率７１．３０％）を白色固体として得た。
【０１６６】
化合物３（５００．０ｍｇ、４８９．１９μｍｏｌ、１．０当量）、化合物４（２５７．６ｍｇ、４８９．１９μｍｏｌ、１．０当量）の混合物をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、引き続いてＨＯＢｔ（１３２．２ｍｇ、９７８．３７μｍｏｌ、２．０当量）、ＥＤＣＩ（１８７．６ｍｇ、９７８．３７μｍｏｌ、２．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１５２９．８０  実測ｍ／ｚ：７６５．９（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物３（４２０ｍｇ、２４６．９４μｍｏｌ、収率５０．４８％）を無色の油状物として得た。
【０１６７】
化合物５（４２０ｍｇ、２７４．３８μｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解し、引き続いてピペリジン（８６５．２ｍｇ、１０．１６ｍｍｏｌ、１ｍＬ、３７当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１３０８．４８、実測ｍ／ｚ：６５４．８（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＣＯＭ４７１（３８６ｍｇ、２６５．５０μｍｏｌ、収率９６．７６％）を無色の油状物として得た。
【０１６８】
ＣＯＭ４７２
【０１６９】
【化９】
2021520378.tif 000015
化合物１（０．５ｇ、８３９．４３μｍｏｌ、１．０当量）、化合物２（６２７．０ｍｇ、８３９．４３μｍｏｌ、１．０当量）およびＤＩＥＡ（２１７．０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、２９２．４μＬ、２．０当量）の混合物をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、次いで、ＨＡＴＵ（３１９．２ｍｇ、８３９．４μｍｏｌ、１．０当量）を混合物に添加した。次いで、混合物を２５℃で３０分間攪拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＣＨ３ＯＨ＝１０：１、Ｒｆ＝０．２４）は、化合物１が完全に消費されており、１つの新たなスポットが形成されたことを示した。溶媒を蒸発させて、化合物３（０．４５ｇ、３３９．７５μｍｏｌ、収率４０．４７％、粗）を無色の油状物として得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
【０１７０】
化合物３（４５０．０ｍｇ、３３９．７５μｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（８ｍＬ）に溶解し、引き続いてピペリジン（２ｍＬ）を添加した。混合物を２５℃で１５分間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望の（計算ＭＷ：１１０２．２７、実測ｍ／ｚ：５５２．１（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（３７０．０ｍｇ、３３５．６７μｍｏｌ、収率９８．８０％）を無色の油状物として得た。
【０１７１】
ＣＯＭ１２６（６０ｍｇ、５４．４５μｍｏｌ、１．０当量）、化合物４（１５．５ｍｇ、８１．６８μｍｏｌ、１．５当量）のＤＭＦ（５ｍＬ）中溶液に、ＨＡＴＵ（３１ｍｇ、８１．６８μｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＥＡ（１０．５ｍｇ、６１．６８μｍｏｌ、１５μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ１２６が完全に消費されていることを示し、所望の１つの主ピークが検出された。混合物を蒸発させて、溶媒を除去し、化合物５（３０ｍｇ、粗）を無色の油状物として得て、これをさらに精製することなく次のステップに使用した。
【０１７２】
化合物５（３０ｍｇ、２３．５７μｍｏｌ、１．０当量）をＤＣＭ（４．５ｍＬ）に溶解し、次いで、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を添加し、混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５が完全に消費されていることを示し、所望の１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＣＯＭ４７２（１０ｍｇ、８．５２μｍｏｌ）を白色固体として得た。
【０１７３】
ＣＯＭ４７３
【０１７４】
【化１０】
2021520378.tif 000016
化合物１（３００ｍｇ、４４９．９６μｍｏｌ、１．０当量）、化合物２（１３８ｍｇ、４４９．９６μｍｏｌ、１．０当量）、ＨＯＢｔ（１２２ｍｇ、８９９．９３μｍｏｌ、２．０当量）、ＥＤＣＩ（１７３ｍｇ、８９９．９３μｍｏｌ、２．０当量）の混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２０〜２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望の（ＭＷ：９５５．０６、実測ｍ／ｚ：９５５．３（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去した。混合物を減圧下で蒸発させ、化合物３（３００ｍｇ、粗）を黄色の油状物として得た。
【０１７５】
化合物３（３００ｍｇ、３１４．１２μｍｏｌ、１．０当量）をＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解し、次いで、ピペリジン（１ｍＬ）を添加し、混合物を２０〜２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：７３２．８３、実測ｍ／ｚ：７３３．２（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。ＣＯＭ４７３（１６０ｍｇ、２１８．３３μｍｏｌ、収率６９．５１％）を無色の油状物として得た。
【０１７６】
［実施例２］
ＥｐｈＡ２／ＣＤ１３７結合ヘテロタンデム二環式ペプチドの合成
ＢＣＹ９１７３
【０１７７】
【化１１】
2021520378.tif 000017
ＢＣＹ９１７２−ＰＥＧ１２−Ｎ３を調製する手順
【０１７８】
【化１２】
2021520378.tif 000018
ＢＣＹ９１７２（５２０ｍｇ、２４８．１６μｍｏｌ、１当量）および化合物１（３７０ｍｇ、４９９．４７μｍｏｌ、２．０１当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（４８．１１ｍｇ、３７２．２４μｍｏｌ、６４．８４μＬ、１．５当量）を添加し、次いで、混合物を３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ９１７２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２７２１．１２、実測ｍ／ｚ：１３６０．９（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（２８４ｍｇ、１０１．１０μｍｏｌ、収率４０．７４％、純度９６．８７％）を白色固体として得た。
【０１７９】
【化１３】
2021520378.tif 000019
ＢＣＹ９１７３を調製する手順
この反応を並行して２つの独立した容器で実施した。１つの容器について、化合物２（１００ｍｇ、３６．７５μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ６１６９（１２０ｍｇ、３６．７８μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）１０ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、９１．９μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（０．４Ｍ、１８３．８μＬ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、９１．９μＬ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５９８３．８５、実測ｍ／ｚ：９９７．６６００（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）および１１９７．２３００（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ９１７３（２１８ｍｇ、３４．９７μｍｏｌ、収率４７．５８％、純度９６％）を白色固体として得た。
【０１８０】
ＢＣＹ７９８５
【０１８１】
【化１４】
2021520378.tif 000020
ＢＣＹ７８５９を調製する一般的な手順
【０１８２】
【化１５】
2021520378.tif 000021
Ｎ３−ＰＥＧ１２−ＣＯＯＨ（２５０ｍｇ、３８８μｍｏｌ）およびＨＯＳｕ（６７．０ｍｇ、５８３μｍｏｌ）のＤＭＡ（４．５ｍＬ）およびＤＣＭ（１．５ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣＩ（８９．３ｍｇ、４６６μｍｏｌ）を添加し、２０℃で１６時間攪拌した。ＢＣＹ７７３２（８５５ｍｇ、３８８μｍｏｌ）のＤＭＡ  ５ｍＬ中混合物を含有する別の５０ｍＬ丸底フラスコに、ＤＩＥＡ（１８６ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、２５０μＬ）を添加し、１０分間攪拌した。次いで、初期反応混合物をフラスコに添加し、２０℃でさらに５時間、さらに攪拌した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ８３９６−３０７−Ｐ１Ｂ１）は、ＢＣＹ７７３２が完全に消費されていることを示し、所望の質量を有する１つの主ピークが検出された。得られた反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製して、化合物ＢＣＹ７８５９（６２１ｍｇ、２００μｍｏｌ、収率５１．６％、ＴＦＡ塩）を白色固体として得た。
【０１８３】
ＢＣＹ６１６９を調製する一般的な手順
【０１８４】
【化１６】
2021520378.tif 000022
ＢＣＹ６０９９（３００ｍｇ、９４．３μｍｏｌ）のＤＭＡ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（３６．６ｍｇ、２８３μｍｏｌ、４９．３μＬ）を添加し、１０分間攪拌した。その後、ＰＹＡ−ＮＨＳ（３６．８ｍｇ、１８９μｍｏｌ）を添加し、２０℃でさらに１５時間、さらに攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ６０９９が完全に消費されていることを示し、所望の質量を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製して、化合物ＢＣＹ６１６９（２９９ｍｇ、８６．２μｍｏｌ、収率９１．５％）を白色固体として得た。
【０１８５】
ＢＣＹ７９８５を調製する一般的な手順
【０１８６】
【化１７】
2021520378.tif 000023
ＢＣＹ７８５９（２２０ｍｇ、７７．８μｍｏｌ）およびＢＣＹ６１６９（２５１ｍｇ、７７．１μｍｏｌ）の窒素によって２時間パージされたＤＭＦ（５ｍＬ）中溶液に、アスコルビン酸水溶液（０．８Ｍ、９６３μＬ）を添加し、引き続いて窒素雰囲気下でＣｕＳＯ４水溶液（０．８Ｍ、２８９μＬ）を添加した。次いで、混合物を２０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ６１６９が完全に消費されていることを示し、所望の質量を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製して、化合物ＢＣＹ７９８５（２８３ｍｇ、４３．４μｍｏｌ、収率５６．３％、ＴＦＡ）を白色固体として得た。
【０１８７】
ＢＣＹ８９４２
【０１８８】
【化１８】
2021520378.tif 000024
ＢＣＹ８９４０を調製する一般的な手順
【０１８９】
【化１９】
2021520378.tif 000025
Ｎ３−ＰＥＧ１２−ＣＯＯＨ（１２０ｍｇ、１８６μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＡ（３ｍＬ）およびＤＣＭ（１ｍＬ）中溶液に、ＨＯＳｕ（３２．２ｍｇ、２８０μｍｏｌ、１．５当量）を添加し、攪拌した。次いで、ＥＤＣＩ（４２．９ｍｇ、２２４μｍｏｌ、１．２当量）を混合物に添加し、２０℃でさらに７時間、さらに攪拌した。ＬＣＭＳは、活性化エステルが完全に形成されていることを示した。ＤＭＡ（３ｍＬ）中ＢＣＹ８０４５（４１０ｍｇ、１８６μｍｏｌ、１．０当量）を含む別のフラスコに、ＤＩＥＡ（１２０ｍｇ、９３２μｍｏｌ、１６２μＬ、５．０当量）を添加し、攪拌し、次いで、活性化エステルを添加し、混合物を２０℃で１８時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚを有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を真空中で濃縮して、ＤＣＭを除去した。得られた混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製して、ＢＣＹ８９４０（１９０ｍｇ、６７．２μｍｏｌ、収率３６．１％）を白色固体として得た。
【０１９０】
ＢＣＹ８９４２を調製する一般的な手順
【０１９１】
【化２０】
2021520378.tif 000026
ＢＣＹ８９４０（２８．６ｍｇ、１０．１μｍｏｌ、１．１当量）およびＢＣＹ６１６９（３０．０ｍｇ、９．１９μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（２．０ｍＬ）中溶液に、（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（１．０Ｍ、９２．０μＬ）およびＣｕＳＯ４（１．０Ｍ、２７．６μＬ）を添加し、窒素雰囲気下、２０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ６１６９が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：６０８９．９１  実測ｍ／ｚ：１２１８．４（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）、１０１６．０（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、８７０．７（［Ｍ／７＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製して、化合物ＢＣＹ８９４２（１５．４ｍｇ、２．４６μｍｏｌ、収率２６．８％、純度９７．３％）を白色固体として得た。
【０１９２】
ＢＣＹ８９４３
【０１９３】
【化２１】
2021520378.tif 000027
ＢＣＹ８９４１を調製する一般的な手順
【０１９４】
【化２２】
2021520378.tif 000028
ＢＣＹ６０１５（ＰＹＡ部分が存在しないことを除いて、ＢＣＹ８９４１と同一のペプチド；１００ｍｇ、３２．９μｍｏｌ）のＤＭＡ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（１２．８ｍｇ、９８．７μｍｏｌ、１７．２μＬ）を添加し、１０分間攪拌した。次いで、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ペンタ−４−イノエート（１２．８ｍｇ、６５．８μｍｏｌ）を混合物に添加し、引き続いて２０℃で１６時間さらに攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：３１１９．６０、実測ｍ／ｚ：１０４０．５（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製して、化合物ＢＣＹ８９４１（９０．０ｍｇ、２８．９μｍｏｌ、収率８７．７％）を白色固体として得た。
【０１９５】
ＢＣＹ８９４３を調製する一般的な手順
【０１９６】
【化２３】
2021520378.tif 000029
ＢＣＹ７８５９（ＢＣＹ７９８５に記載されるように調製され得る；４０．０ｍｇ、１４．２μｍｏｌ）およびＢＣＹ８９４１（４２．０ｍｇ、１３．５μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２ｍＬ、窒素によって１時間予めパージされた）中溶液に、（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（１．０Ｍ、２７０μＬ）およびＣｕＳＯ４（１．０Ｍ、８０．９μＬ）を添加した。混合物を窒素で３回パージし、１５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８９４１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５９４６．７７、実測ｍ／ｚ：１１９０．２（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）、９９１．５（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、８４９．９（［Ｍ／７＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ａ：Ｈ２Ｏ中０．０７５％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ）によって精製して、化合物ＢＣＹ８９４３（１１．５ｍｇ、１．９０μｍｏｌ、収率１４．１％、純度９８．１％）を白色固体として得た。
【０１９７】
ＢＣＹ９６４７
【０１９８】
【化２４】
2021520378.tif 000030
化合物２を調製する手順
【０１９９】
【化２５】
2021520378.tif 000031
ＣＯＭ１３４（３００．０ｍｇ、５７．０μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（１７．２ｍｇ、８５．３μｍｏｌ、１．５当量）のＤＣＭ（０．５ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（８．６５ｍｇ、１１．９μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ１３４が完全に消費されていることを示し、所望の質量（計算ＭＷ：６９１．７２、実測ｍ／ｚ：６９２．３（［Ｍ＋Ｈ］＋）および７０９．３（［Ｍ＋ＮＨ４］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、凍結乾燥して、粗化合物２（３０．５ｍｇ、粗）を白色として得た。
【０２００】
化合物３を調製する手順
【０２０１】
【化２６】
2021520378.tif 000032
化合物２（１０ｍｇ、１．０当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＢＣＹ６０９９（４６ｍｇ、１，０当量）およびＤＩＥＡ（５．６１ｍｇ、７．５５μＬ、３．０当量）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：３７３５．２８  実測ｍ／ｚ：１２４５．９（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）および９３４．５（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（３４ｍｇ、収率６２．９６％、純度１００％）を白色固体として得た。
【０２０２】
ＢＣＹ９６４７を調製する手順
【０２０３】
【化２７】
2021520378.tif 000033
化合物３（３４ｍｇ、９．１０μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（２３ｍｇ、１０．０８μｍｏｌ、１．１１当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１１．４μＬ、０．５当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１１．４μＬ、０．５当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、２２．８μＬ、１当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：６０１６．８２、実測ｍ／ｚ：１２０４．１（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）、１００３．５（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、８６０．３（［Ｍ／７＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９６４７（３１．２ｍｇ、収率５４．６７％、純度９５．９６％）を白色固体として得た。
【０２０４】
ＢＣＹ９６４８
【０２０５】
【化２８】
2021520378.tif 000034
化合物２を調製する手順
【０２０６】
【化２９】
2021520378.tif 000035
ＣＯＭ１３５（３０ｍｇ、２７．２９μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（８．２５ｍｇ、４０．９４μｍｏｌ、１．５当量）のＤＣＭ（０．５ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（４．１４ｍｇ、４０．９４μｍｏｌ、５．７０μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ１３５が完全に消費されていることを示し、所望の質量［計算ＭＷ：１２６４．４１、実測ｍ／ｚ：１２８１．４（［Ｍ＋ＮＨ４］＋）、６４９．８（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製して、化合物２（１８ｍｇ、１４．２μｍｏｌ、収率５２．１４％）を得た。
【０２０７】
化合物３を調製する手順
【０２０８】
【化３０】
2021520378.tif 000036
化合物３（９ｍｇ、７．１２μｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＢＣＹ６０９９（２３ｍｇ、７．２３μｍｏｌ、１．０２当量）およびＤＩＥＡ（２．７６ｍｇ、２１．３５μｍｏｌ、３．７２μＬ、３．０当量）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４３０７．９６  実測ｍ／ｚ：１４３６．９（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）、１０７７．９（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）、８６２．５（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（１４．６ｍｇ、収率４７．６１％、純度１００％）を白色固体として得た。
【０２０９】
ＢＣＹ９６４８を調製する手順
【０２１０】
【化３１】
2021520378.tif 000037
化合物３（１４．６ｍｇ、３．３９μｍｏｌ、１当量）、ＢＣＹ７７４１（８．５ｍｇ、３．７３μｍｏｌ、１．１当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、４．３μＬ、０．５当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（．４Ｍ、４．３μＬ、０．５当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、８．６μＬ、１．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（ＭＷ：６５８９．５０、実測ｍ／ｚ：１０９８．８（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、９４２．１（［Ｍ／７＋Ｈ］＋）、８２４．６（［Ｍ／８＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９６４８（１４．７ｍｇ、収率６３．３４％、純度９６．２２％）を白色固体として得た。
【０２１１】
ＢＣＹ９６５５
【０２１２】
【化３２】
2021520378.tif 000038
化合物２を調製する手順
【０２１３】
【化３３】
2021520378.tif 000039
ＣＯＭ１２８（１２０ｍｇ、１０１．０６μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（２５ｍｇ、１２４．０３μｍｏｌ、１．２５当量）のＤＣＭ（０．５ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（１５．３４ｍｇ、１５１．５９μｍｏｌ、２１．１０μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１３５２．４８、実測ｍ／ｚ：６７６．８（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）、１３６９．３（［Ｍ＋ＮＨ４］＋））を有する１つの新たなピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物２（１４ｍｇ、８．９９μｍｏｌ、収率８．９０％、純度８６．８６％）を無色の油状物として得た。
【０２１４】
化合物３を調製する手順
【０２１５】
【化３４】
2021520378.tif 000040
化合物２（７ｍｇ、５．１８μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ６０９９（１６ｍｇ、５．０３μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（２．０１ｍｇ、１５．５３μｍｏｌ、２．７０μＬ）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４３９６．０２、実測ｍ／ｚ：８７９．８（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）および１０９９．８（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（１１．８ｍｇ、収率４８．２９％、純度９３．１１％）を白色固体として得た。
【０２１６】
ＢＣＹ９６５５を調製する手順
【０２１７】
【化３５】
2021520378.tif 000041
化合物３（１１．８ｍｇ、２．６９μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（７．０ｍｇ、３．０７μｍｏｌ、１．１４当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、６．８μＬ、１当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、６．８μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１３．６μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：６６７７．５７、実測ｍ／ｚ：１１１３．７（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、９５４．７（［Ｍ／７＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９６５５（１．９ｍｇ、０．２６μｍｏｌ、収率９．６５％、純度９１．１５％）を白色固体として得た。
【０２１８】
ＢＣＹ９６５６
【０２１９】
【化３６】
2021520378.tif 000042
化合物２を調製する手順
【０２２０】
【化３７】
2021520378.tif 000043
ＣＯＭ１２９（３０．０ｍｇ、２２．９３μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（６．９ｍｇ、３４．３９μｍｏｌ、１．５当量）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（３．５ｍｇ、３４．３９μｍｏｌ、４．８μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ１２９が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１４７３．５８、実測ｍ／ｚ：７３７．３（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製して、化合物２（１２．３ｍｇ、８．３５μｍｏｌ、収率３６．４１％）を白色固体として得た。
【０２２１】
化合物３を調製する手順
【０２２２】
【化３８】
2021520378.tif 000044
化合物２（９．２６ｍｇ、６．２８μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ６０９９（１０ｍｇ、３．１４μｍｏｌ、０．５当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（０．７ｍｇ、６．９３μｍｏｌ、１μＬ、１．１当量）を添加した。混合物を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４５１７．１２、実測ｍ／ｚ：１１２９．８（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）、９０４．１（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）、７５３．７（［Ｍ／６＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（１２ｍｇ、収率７２．３６％、純度８５．５８％）を白色固体として得た。
【０２２３】
ＢＣＹ９６５６を調製する手順
【０２２４】
【化３９】
2021520378.tif 000045
化合物３（１１ｍｇ、２．４４μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（６．０ｍｇ、２．６３μｍｏｌ、１．０８当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、６．１μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、６．１μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１２．２μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：６７９８．６６、実測ｍ／ｚ：１１３３．８（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、９７１．９（［Ｍ／７＋Ｈ］＋）、８５０．７（［Ｍ／８＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９６５６（６．８ｍｇ、収率３７．３６％、純度９０．９７％）を白色固体として得た。
【０２２５】
ＢＣＹ９６５７
【０２２６】
【化４０】
2021520378.tif 000046
化合物２を調製する手順
【０２２７】
【化４１】
2021520378.tif 000047
ＣＯＭ１３０（３０．０ｍｇ、２０．７８μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（６．３ｍｇ、３１．１７μｍｏｌ、１．５当量）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（３．２ｍｇ、３１．１７μｍｏｌ、４．４μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ１３０が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１６０８．７、実測ｍ／ｚ：８０４．８（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、化合物２（７．９ｍｇ、粗）を白色固体として得た。
【０２２８】
化合物３を調製する手順
【０２２９】
【化４２】
2021520378.tif 000048
化合物２（７．９ｍｇ、４．９１μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ６０９９（１６ｍｇ、５．０３μｍｏｌ、１．０２当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（１．９ｍｇ、１４．７３μｍｏｌ、２．６μＬ、３．０当量）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４６５２．２５、実測ｍ／ｚ：１５５１．３（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）、１１６３．６（［Ｍ／４］＋）、９３１．１（［Ｍ／５＋Ｈ］＋、７７６．１（［Ｍ／６＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（１３．３ｍｇ、２．８６μｍｏｌ、収率５３．２２％、純度９１．４２％）を白色固体として得た。
【０２３０】
ＢＣＹ９６５７を調製する手順
【０２３１】
【化４３】
2021520378.tif 000049
化合物３（１３．３ｍｇ、２．８６μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（７．０ｍｇ、３．０７μｍｏｌ、１．０３当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、７．５μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、７．５μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１５μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：６９３３．７８、実測ｍ／ｚ：１１５６．７（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、９９１．４（［Ｍ／７＋Ｈ］＋）、８６７．４（［Ｍ／８＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９６５７（８．４ｍｇ、収率４０．２１％、純度９４．９％）を白色固体として得た。
【０２３２】
ＢＣＹ９６５８
【０２３３】
【化４４】
2021520378.tif 000050
化合物２を調製する手順
【０２３４】
【化４５】
2021520378.tif 000051
ＣＯＭ１３１（１６７．０ｍｇ、２２７．８９μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（５５．０ｍｇ、２７２．８７μｍｏｌ、１．２当量）のＤＣＭ（５ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（３６．４ｍｇ、３５９．２３μｍｏｌ、５０．０μＬ、１．６当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：８９７．９３  実測９２０．３（［Ｍ＋Ｎａ＋］）を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（３５ｍｇ、３３．７４μｍｏｌ、収率１４．８１％、純度８６．５６％）を無色の油状物として得た。
【０２３５】
化合物３を調製する手順
【０２３６】
【化４６】
2021520378.tif 000052
化合物２（１５ｍｇ、１６．７１μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ６０９９（５３ｍｇ、１６．６５μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（６．４８ｍｇ、６５．０５μｍｏｌ、５０．１μＬ、４．０当量）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：３９４１．４７  実測ｍ／ｚ：９８６．０（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。［ＢＣＹ６０９９］−［ＣＯＭ１３１］（５ｍｇ、収率５０．４８％、純度９４．９６％）を白色固体として得た。
【０２３７】
ＢＣＹ９６５８を調製する手順
【０２３８】
【化４７】
2021520378.tif 000053
化合物３（３５ｍｇ、８．８８μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（２１ｍｇ、９．２０μｍｏｌ、１．０３当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、２２．２μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、２２．２μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、４４．４μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：６２２３．０１  実測ｍ／ｚ：１０３８．０（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）および８８９．８（［Ｍ／８＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９６５８（１３．２ｍｇ、収率２１．５４％、純度９０．１６％）を白色固体として得た。
【０２３９】
ＢＣＹ９６５９
【０２４０】
【化４８】
2021520378.tif 000054
化合物２を調製する手順
【０２４１】
【化４９】
2021520378.tif 000055
ＣＯＭ１３２（２０．０ｍｇ、６５．２８μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（１５．８ｍｇ、７８．３４μｍｏｌ、１．２当量）のＤＣＭ（５ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（３６．４ｍｇ、３５９．２３μｍｏｌ、５０μＬ、５．５当量）を添加した。混合物を２５℃で１時間攪拌した。所望のｍ／ｚ（ＭＷ：４７１．４６、実測ｍ／ｚ：４８９．２（［Ｍ＋ＮＨ４］＋））を有するＬＣ−ＭＳの１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、化合物２（２６ｍｇ、粗）の無色の油状物を得た。
【０２４２】
化合物３を調製する手順
【０２４３】
【化５０】
2021520378.tif 000056
化合物２（１５．０ｍｇ、４．７１μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ６０９９（３．３３ｍｇ、７．０７μｍｏｌ、１．５当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（０．７ｍｇ、６．９３μｍｏｌ、１μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：３５１５．０１、実測ｍ／ｚ：１１７２．１（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）  ８７９．５（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（１２．７ｍｇ、３．２６μｍｏｌ、収率６９．２３％、純度９０．３％）を白色固体として得た。
【０２４４】
ＢＣＹ９６５９を調製する手順
【０２４５】
【化５１】
2021520378.tif 000057
化合物３（１２．７ｍｇ、２．８９μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（６．８０ｍｇ、２．９８μｍｏｌ、１．０３当量）およびＴＨＰＴＡ（１．３ｍｇ、２．９９μｍｏｌ、１．０３当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、７．３μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１４．６μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：５７９６．５４  実測ｍ／ｚ：１１５９．８（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）  ９６６．７（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９６５９（６．２ｍｇ、１．０６μｍｏｌ、収率３６．５８％、純度９８．８６％）を白色固体として得た。
【０２４６】
ＢＣＹ９７５８
【０２４７】
【化５２】
2021520378.tif 000058
化合物２を調製する手順
【０２４８】
【化５３】
2021520378.tif 000059
化合物１（５．０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ６０９９（１１．３ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（０．９ｍｇ、７．０７μｍｏｌ、１．２μＬ、２．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２０分間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：４４８１．１１、実測ｍ／ｚ：１１０１．３（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つのピークが検出されることを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、化合物２（１５ｍｇ、粗）を白色固体として得た。
【０２４９】
ＢＣＹ９７５８を調製する手順
【０２５０】
【化５４】
2021520378.tif 000060
化合物２（１５ｍｇ、３．３５μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ７７３２（１４．７４ｍｇ、６．６９μｍｏｌ、２．０当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（０．９ｍｇ、７．０７μｍｏｌ、１．２μＬ、２．１当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：６５６７．４８、実測ｍ／ｚ：１０９５．１（［Ｍ／６＋Ｈ］）、９３８．８（［Ｍ／７＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＣＹ９７５８（５．８ｍｇ、収率２４．２６％、純度９１．９７％）を白色固体として得た。
【０２５１】
ＢＣＹ１０５６８
【０２５２】
【化５５】
2021520378.tif 000061
ＢＣＹ８９１９−ＰＥＧ１２−Ｎ３を調製する手順
【０２５３】
【化５６】
2021520378.tif 000062
ＢＣＹ８９１９（８０．０ｍｇ、３８．４７μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（２９．６ｍｇ、４０．０１μｍｏｌ、１．０４当量）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、溶液にＤＩＰＥＡ（７．４６ｍｇ、５５．７１μｍｏｌ、１０．０μｌ、１．５当量）を添加し、次いで、混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８９１９の大部分が消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２７０５．１６、実測ｍ／ｚ：１３５３．１（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（１８．６ｍｇ、６．８６μｍｏｌ、収率１７．８３％、純度９９．７６％）を白色固体として得た。
【０２５４】
ＢＣＹ１０５６８を調製する手順
【０２５５】
【化５７】
2021520378.tif 000063
化合物２（９．０ｍｇ、３．３３μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ６１６９（１１．０ｍｇ、３．３６μｍｏｌ、１．０１当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、８．３μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（１．４ｍｇ、７．０６μｍｏｌ、２．１当量）およびＴＨＰＴＡ（１．４ｍｇ、３．２２μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。最後に、０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５９６７．９０、実測ｍ／ｚ：９９５．００（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）および１１９４．７０（［Ｍ／６＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１０５６８（１３．４ｍｇ、２．１６μｍｏｌ、収率６９．４４％、純度９６．３％）を白色固体として得た。
【０２５６】
ＢＣＹ１０５７０
【０２５７】
【化５８】
2021520378.tif 000064
ＢＣＹ８９２０−ＰＥＧ１２−Ｎ３を調製する手順
【０２５８】
【化５９】
2021520378.tif 000065
ＢＣＹ８９２０（３７ｍｇ、１７．３１μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（１５ｍｇ、２０．２５μｍｏｌ、１．２当量）のＤＭＳＯ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（３．３６ｍｇ、２５．９６μｍｏｌ、４．５μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８９２０が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２７６３．２、実測ｍ／ｚ：６８９．０７（［Ｍ／４−Ｈ＋］））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得た。次いで、残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物２（２２．８ｍｇ、８．１５μｍｏｌ、収率４７．０９％、純度９８．７８％）を白色固体として得た。
【０２５９】
ＢＣＹ１０５７０を調製する手順
【０２６０】
【化６０】
2021520378.tif 000066
化合物２（６ｍｇ、２．１７μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ６１６９（７．０８ｍｇ、２．１７μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．４μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（０．４Ｍ、１０．８μＬ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、５．４μＬ、１．０当量）を添加した。最後に、０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で４時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＳ：６０２５．９３、実測ｍ／ｚ：１００４．５６（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）および８６１．４８（［Ｍ／７＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＣＹ１０５７０（７．２ｍｇ、１．１７μｍｏｌ、収率５３．９０％、純度９７．９５％）を白色固体として得た。
【０２６１】
ＢＣＹ１０５７４
【０２６２】
【化６１】
2021520378.tif 000067
化合物２を調製する手順
【０２６３】
【化６２】
2021520378.tif 000068
ＢＣＹ９５９４（６５ｍｇ、２７．０７μｍｏｌ、１当量）、化合物１（１２．００ｍｇ、２７．７５μｍｏｌ、１．０２当量）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（５．２５ｍｇ、４０．６１μｍｏｌ、７．０７μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ９５９４が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２７１８．１３、実測ｍ／ｚ：９０６．０４（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）、１３５９．０７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（４２．６ｍｇ、１５．６７μｍｏｌ、収率５７．８９％、純度１００％）を白色固体として得た。
【０２６４】
ＢＣＹ１０５７４を調製する手順
【０２６５】
【化６３】
2021520378.tif 000069
化合物２（２０ｍｇ、７．３６μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ８９２７（１７ｍｇ、７．８７μｍｏｌ、１．０７当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１８．４μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１８．４μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、３６．８μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４８７７．６８、実測ｍ／ｚ：１２１９．４２（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）および９７５．５４（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ１０５７４（１７．６ｍｇ、３．４１μｍｏｌ、収率４６．２９％、純度９４．４０％）を白色固体として得た。
【０２６６】
ＢＣＹ１０５７５
【０２６７】
【化６４】
2021520378.tif 000070
化合物２を調製する手順
【０２６８】
【化６５】
2021520378.tif 000071
ＢＣＹ９５９４（６５ｍｇ、２７．０７μｍｏｌ、１当量）、化合物１（１２．０ｍｇ、２７．７５μｍｏｌ、１．０２当量）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（５．２５ｍｇ、４０．６１μｍｏｌ、７．０７μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［計算ＭＷ：２７１８．１３  実測ｍ／ｚ：９０６．０４（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）および１３５９．０７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（４２．６ｍｇ、１５．６７μｍｏｌ、収率５７．８９％、純度１００％）を白色固体として得た。
【０２６９】
ＢＣＹ１０５７５を調製する手順
【０２７０】
【化６６】
2021520378.tif 000072
化合物２（２０ｍｇ、７．３６μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ８９２８（１７ｍｇ、７．６７μｍｏｌ、１．０４当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１８．４μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１８．４μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、３６．８μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［計算ＭＷ：４９３５．７１、実測ｍ／ｚ：１２３４．５９（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）および９８７．７１（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ１０５７５（１２ｍｇ、２．３７μｍｏｌ、収率３２．２７％、純度９７．６７％）を白色固体として得た。
【０２７１】
ＢＣＹ１０５７６
【０２７２】
【化６７】
2021520378.tif 000073
化合物２を調製する手順
【０２７３】
【化６８】
2021520378.tif 000074
ＢＣＹ９５９４（３０．０ｍｇ、１２．５０μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（５．５４ｍｇ、１２．８１μｍｏｌ、１．０２当量）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（２．４２ｍｇ、１８．７４μｍｏｌ、３．３μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［計算ＭＷ：２７１８．１３、実測ｍ／ｚ：９０６．４５（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）および１３５９．５０（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（１６ｍｇ、５．８０μｍｏｌ、収率４６．４２％、純度９８．５４％）を白色固体として得た。
【０２７４】
ＢＣＹ１０５７６を調製する手順
【０２７５】
【化６９】
2021520378.tif 000075
化合物２（１７．０ｍｇ、６．２５μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ１１０１４（１３．６ｍｇ、６．２５μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１．８μＬ、２．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１５．６μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１．８４μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２の大部分が消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［計算ＭＷ：４８９３．６３、実測ｍ／ｚ：１２２４．７（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）および９８０．０１（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ１０５７６（２０．５ｍｇ、４．１３μｍｏｌ、収率６６．０２％、純度９８．５７％）を白色固体として得た。
【０２７６】
ＢＣＹ１０５７７
【０２７７】
【化７０】
2021520378.tif 000076
化合物２を調製する手順
【０２７８】
【化７１】
2021520378.tif 000077
化合物１（５．０ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣＩ（８．５ｍｇ、５４．８μｍｏｌ、１．１当量）およびＨＯＳｕ（５．７ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で３０分間攪拌した。ＴＬＣは、化合物１が完全に消費されており、１つの新たなスポットが形成されたことを示した。次いで、ＢＣＹ９１７２（５３ｍｇ、２５．２９μｍｏｌ、０．４７当量）およびＤＩＥＡ（３．２７ｍｇ、２５．２９μｍｏｌ、４．４μＬ、０．４７当量）を反応混合物に添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ９１７２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：２１７８．４６、実測ｍ／ｚ：１０８９．５７００（［（Ｍ／２＋Ｈ＋］））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得た。次いで、残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物２（３０ｍｇ、１３．７７μｍｏｌ、収率５４．４５％、純度１００％）を白色固体として得た。
【０２７９】
ＢＣＹ１０５７７を調製する手順
【０２８０】
【化７２】
2021520378.tif 000078
化合物２（２０ｍｇ、９．１８μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ６１６９（３２．９５ｍｇ、１０．１０μｍｏｌ、１．１当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、２３μＬ、１当量）、ＶｃＮａ（０．４Ｍ、４６μＬ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、２３μＬ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で４時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＳ：５４４１．２０、実測ｍ／ｚ：１３６１．８（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＣＹ１０５７７（１６．２ｍｇ、２．９８μｍｏｌ、収率３２．４３％）を白色固体として得た。
【０２８１】
［実施例３］
ネクチン−４／ＣＤ１３７結合ヘテロタンデム二環式ペプチドの合成
ＢＣＹ８８５４
【０２８２】
【化７３】
2021520378.tif 000079
ＢＣＹ８８４６を調製する一般的な手順
【０２８３】
【化７４】
2021520378.tif 000080
ＢＣＹ８２３４（ＰＹＡ部分が存在しないことを除いて、ＢＣＹ８８４６と同一のペプチド；３００ｍｇ、１０２μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＡ（３ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（５２．５ｍｇ、４０６μｍｏｌ、７０．８μＬ、４．０当量）を添加し、１０分間攪拌した。次いで、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ペンタ−４−イノエート（２５．８ｍｇ、１３２μｍｏｌ、１．３当量）をここに添加し、混合物を２０℃でさらに１６時間、さらに攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８２３４が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：３０３４．４３、実測ｍ／ｚ：１０１１．８（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）、１５１７．０（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製して、化合物ＢＣＹ８８４６（２９０ｍｇ、９５．６μｍｏｌ、収率９４．１％）を白色固体として得た。
【０２８４】
ＢＣＹ８８５４を調製する一般的な手順
【０２８５】
【化７５】
2021520378.tif 000081
ＢＣＹ８８４６（２３４ｍｇ、７７．１μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（５ｍＬ）中溶液に、ＢＣＹ７８５９（ＢＣＹ７９８５に記載されるように調製され得る；２２０ｍｇ、７７．８μｍｏｌ、１．０当量）を添加し、引き続いて（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．８０Ｍ、９６３μＬ、１．０当量）およびＣｕＳＯ４（０．８０Ｍ、２８９μＬ、０．３当量）を添加した。混合物を２０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８８４６が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５８６１．５９、実測ｍ／ｚ：８３７．９（［Ｍ／７＋Ｈ］＋）、９７７．６（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、１１７３．３（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ａ：Ｈ２Ｏ中０．０７５％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ）によって精製して、化合物ＢＣＹ８８５４（２９２ｍｇ、４６．８μｍｏｌ、収率６０．８％、純度９５．９％、ＴＦＡ）を白色固体として得た。
【０２８６】
ＢＣＹ９３５０
【０２８７】
【化７６】
2021520378.tif 000082
ＢＣＹ８７８２−ＰＹＡを調製する一般的な手順
【０２８８】
【化７７】
2021520378.tif 000083
ＢＣＹ８７８２（ＰＹＡ部分が存在しないことを除いて、ＢＣＹ１１９４２と同一のペプチド；２０．０ｍｇ、６．７７μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＡ（１ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（４．３７ｍｇ、３３．９μｍｏｌ、５．９０μＬ、５．０当量）および（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ペンタ−４−イノエート（２．６４ｍｇ、１３．５μｍｏｌ、２．０当量）を添加し、２５℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８７８２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：３０３４．４３、実測ｍ／ｚ：１０１２．１［Ｍ／３＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製して、ＢＣＹ１１９４２（２０．０ｍｇ、６．００μｍｏｌ、収率８８．６％、純度９１．０％）を白色固体として得た。
【０２８９】
ＢＣＹ９３５０を調製する一般的な手順
【０２９０】
【化７８】
2021520378.tif 000084
ＢＣＹ１１９４２（２０ｍｇ、６．５９μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ７８５９（ＢＣＹ７９８５に記載されるように調製され得る；２０．５ｍｇ、７．２５μｍｏｌ、１．１当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシ−２Ｈ−フラン−５−オン（０．４Ｍ、３３０μＬ、２０．０当量）を添加し、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、９８．９μＬ、６．０当量）を混合物に添加した。混合物を２５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８７８２−ＰＹＡが完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５８６１．５９、実測ｍ／ｚ：１１７３．３［Ｍ／５＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ａ：Ｈ２Ｏ中０．０７５％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ）によって精製して、ＢＣＹ９３５０（１４．５ｍｇ、２．４０μｍｏｌ、収率３６．５％、純度９７．２％）を白色固体として得た。
【０２９１】
ＢＣＹ９３５１
【０２９２】
【化７９】
2021520378.tif 000085
ＢＣＹ９３５１を調製する一般的な手順
【０２９３】
【化８０】
2021520378.tif 000086
ＢＣＹ８９４０（ＢＣＹ８９４２に記載されるように調製され得る；９．４ｍｇ、３．３３μｍｏｌ、１．０１当量）およびＢＣＹ８８４６（１０．０ｍｇ、３．３０μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、窒素雰囲気下で、Ｖｃ（０．４Ｍ、１６５μＬ、２０．０当量）およびＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、４９．４μＬ、６．０当量）を添加した。混合物を２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８９４０が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５８６１．５９、実測ｍ／ｚ：９７５．４［Ｍ／６＋Ｈ］＋、１１７２．３［Ｍ／５＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ａ：Ｈ２Ｏ中０．０７５％ＴＦＡ、Ｂ：ＡＣＮ）によって精製して、ＢＣＹ９３５１（５．３０ｍｇ、０．９０４μｍｏｌ、収率２６．３％、純度９６．０％）を白色固体として得た。
【０２９４】
ＢＣＹ９３９９
【０２９５】
【化８１】
2021520378.tif 000087
化合物２を調製する手順
【０２９６】
【化８２】
2021520378.tif 000088
ＣＯＭ１３４（３０ｍｇ、５６．９７μｍｏｌ）、化合物１（１７．２２ｍｇ、８５．４５μｍｏｌ）のＤＣＭ（０．５ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（８．６５ｍｇ、８５．４５μｍｏｌ、１１．９μＬ）を添加した。混合物を２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ１３４が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：６９１．７２、実測ｍ／ｚ：６９２．３（［Ｍ＋Ｈ］＋）および７０９．３（［Ｍ＋ＮＨ４］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物２（３０．５ｍｇ）を無色の油状物として得た。
【０２９７】
化合物３を調製する手順
【０２９８】
【化８３】
2021520378.tif 000089
化合物２（１５ｍｇ、２１．６８μｍｏｌ）およびＢＣＹ８１１６（４７ｍｇ、２１．６８μｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（８．４１ｍｇ、６５．０５μｍｏｌ、１１．３３μＬ）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：２７２５．１  実測ｍ／ｚ：１３６２．７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）、９０９．０（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（２０ｍｇ、収率３３．４１％、純度９８．７１％）を白色固体として得た。
【０２９９】
ＢＣＹ９３９９を調製する手順
【０３００】
【化８４】
2021520378.tif 000090
化合物３（２０．０ｍｇ、５．３５μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（１３．０ｍｇ、５．７０μｍｏｌ、１．０１当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１３．４μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１３．４μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、２６．８μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：５００６．６４  実測ｍ／ｚ：８３４．９（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、１００２．３（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）、１２５２．４（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９３９９（９．１ｍｇ、収率２７．２０％、純度９６．２９％）を白色固体として得た。
【０３０１】
ＢＣＹ９４００
【０３０２】
【化８５】
2021520378.tif 000091
化合物２を調製する手順
【０３０３】
【化８６】
2021520378.tif 000092
ＣＯＭ１３５（ＢＣＹ９６４８に記載されるように調製され得る；３０．０ｍｇ、２７．２９μｍｏｌ）、化合物１（８．３ｍｇ、４０．９４μｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（４．１４ｍｇ、４０．９４μｍｏｌ、５．７μＬ）を添加した。次いで、反応混合物を２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ１３５が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１２６４．４０、実測ｍ／ｚ：１２８１．４（［Ｍ＋ＮＨ４］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製して、化合物２（１８ｍｇ）を白色固体として得た。
【０３０４】
化合物を調製する手順
【０３０５】
【化８７】
2021520378.tif 000093
化合物２（１５．５ｍｇ、７．１２μｍｏｌ）およびＢＣＹ８１１６（９ｍｇ、７．１２μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（１．４ｍｇ、１０．６８μｍｏｌ、１．９μＬ）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：３２９７．７８、実測ｍ／ｚ：１０９９．７（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（１９．５ｍｇ、５．９１μｍｏｌ、収率３３．４１％、純度８３．０７％）を白色固体として得た。
【０３０６】
ＢＣＹ９４００を調製する手順
【０３０７】
【化８８】
2021520378.tif 000094
化合物３（１９．５ｍｇ、５．９１μｍｏｌ）、ＢＣＹ７７４１（１４ｍｇ、６．１４μｍｏｌ、１．０１当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１５μＬ、１当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１５μＬ、１当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、３０μＬ、２当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：５５７９．３１  実測ｍ／ｚ：９３０．５（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）、１１１６．６（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４００（１３．９ｍｇ、２．３３μｍｏｌ、収率２７．２０％、純度９３．５６％）を白色固体として得た。
【０３０８】
ＢＣＹ９４０１
【０３０９】
【化８９】
2021520378.tif 000095
化合物３を調製する手順
【０３１０】
【化９０】
2021520378.tif 000096
化合物１（５０．０ｍｇ、３１．３９μｍｏｌ、１当量）、化合物２（６．６ｍｇ、３２．９６μｍｏｌ、１．０５当量）のＤＣＭ（２ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（４．８ｍｇ、４７．０９μｍｏｌ、６．６μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１７５７．８６  実測ｍ／ｚ：８７９．１０（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（０．０２ｇ、６．５６μｍｏｌ、収率２０．９１％、純度５７．７％）を白色固体として得た。
【０３１１】
化合物４を調製する手順
【０３１２】
【化９１】
2021520378.tif 000097
化合物３（２０ｍｇ、１１．３８μｍｏｌ、１当量）、ＢＣＹ８１１６（２５ｍｇ、１１．５１μｍｏｌ、１．０１当量）のＤＭＦ（４ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（２．２ｍｇ、１７．０７μｍｏｌ、２．９７μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：３７９１．２３、実測ｍ／ｚ：１２６３．２（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって直接精製した。化合物４（１０ｍｇ、２．４３μｍｏｌ、収率２１．３３％、純度９２％）を無色の油状物として得た。
【０３１３】
ＢＣＹ９４０１を調製する手順
【０３１４】
【化９２】
2021520378.tif 000098
化合物４（１０ｍｇ、２．４３μｍｏｌ、０．９当量）、ＢＣＹ７７４１（６．３２ｍｇ、２．７７μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、６．７μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、６．７μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１３．４μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物４が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：ＭＷ：６０７２．７７、実測ｍ／ｚ：１０１２．００（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４０１（８．４ｍｇ、１．５６μｍｏｌ、収率５９．３１％、純度９５．５２％）を白色固体として得た。
【０３１５】
ＢＣＹ９４０３
【０３１６】
【化９３】
2021520378.tif 000099
化合物２を調製する手順
【０３１７】
【化９４】
2021520378.tif 000100
ＣＯＭ４７１（１００．０ｍｇ、７６．４２μｍｏｌ、１．０当量）、４−ニトロフェニルクロロホルメート（１６．２ｍｇ、８０．２５μｍｏｌ、１．０５当量）のＤＣＭ（１０ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（１１．６ｍｇ、１１４．６４μｍｏｌ、１６．０μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ４７１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１４７３．５８、実測ｍ／ｚ：７３６．８３（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（６２．８ｍｇ、４２．６７μｍｏｌ、収率５５．８４％、純度４８．３７％）を白色の油状物として得た。
【０３１８】
化合物３を調製する手順
【０３１９】
【化９５】
2021520378.tif 000101
化合物２（４４ｍｇ、２９．４６μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ８１１６（６３ｍｇ、２９．１８μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（５．６６ｍｇ、４３．７７μｍｏｌ、７．６２μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を４０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：３５０６．９５、実測ｍ／ｚ：１１６８．５８（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（２０ｍｇ、５．４２μｍｏｌ、収率１８．５７％、純度９５．０４％）を白色固体として得た。
【０３２０】
ＢＣＹ９４０３を調製する手順
【０３２１】
【化９６】
2021520378.tif 000102
化合物３（１０．０ｍｇ、２．７１μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（６．８３ｍｇ、２．９９μｍｏｌ、１．１当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、７μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、７μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１４μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：５７８８．４９、実測ｍ／ｚ：１１５７．００（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）および９６４．６０（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４０３（２．１ｍｇ、０．３４μｍｏｌ、収率１１．９３％、純度９３．８０％）を白色固体として得た。
【０３２２】
ＢＣＹ９４０５
【０３２３】
【化９７】
2021520378.tif 000103
化合物２を調製する手順
【０３２４】
【化９８】
2021520378.tif 000104
ＣＯＭ４７２（４４．７ｍｇ、３８．１μｍｏｌ）、化合物１（９．２ｍｇ、４５．７２μｍｏｌ）のＤＣＭ（４ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（５．８ｍｇ、５７．１４μｍｏｌ、８μＬ）を添加した。混合物を２５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ４７２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１３３８．４５、実測ｍ／ｚ：６８６．２３（［Ｍ／２＋ＮＨ４＋］））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物２（２０ｍｇ、１４．９４μｍｏｌ、収率３９．２％）を無色の油状物として得た。
【０３２５】
化合物３を調製する手順
【０３２６】
【化９９】
2021520378.tif 000105
化合物２（２０ｍｇ、１４．９４μｍｏｌ）およびＢＣＹ８１１６（３８．９６ｍｇ、１７．９３μｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（１．９ｍｇ、１４．９４μｍｏｌ、２．６μＬ）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：３３７１．８２、実測ｍ／ｚ：１１２３．９４（［Ｍ／３＋Ｈ＋］））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（１０ｍｇ、収率９９．０７％、純度１９．６６％）を白色固体として得た。
【０３２７】
ＢＣＹ９４０５を調製する手順
【０３２８】
【化１００】
2021520378.tif 000106
化合物３（１０．０ｍｇ、２．９７μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（７．４ｍｇ、３．２６μｍｏｌ、１．１当量）およびＴＨＰＴＡ（１．３ｍｇ、２．９７μｍｏｌ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、７．５μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１５１μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：５６５３．３６、実測ｍ／ｚ：１１３０．４７（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４０５（７．８ｍｇ、収率４６．０８％、純度９７．８％）を白色固体として得た。
【０３２９】
ＢＣＹ９４０６
【０３３０】
【化１０１】
2021520378.tif 000107
化合物２を調製する手順
【０３３１】
【化１０２】
2021520378.tif 000108
ＣＯＭ４７３（１３０．０ｍｇ、１７７．４０μｍｏｌ、１．０当量）、（４−ニトロフェニル）カルボノクロリダート（３６．４ｍｇ、１８０．５９μｍｏｌ、１．０２当量）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（２７．０ｍｇ、２６６．０９μｍｏｌ、３７μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ４７３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：８９７．９３、実測ｍ／ｚ：８９７．６５（［Ｍ＋Ｈ］＋）、９１４．６０（［Ｍ＋ＮＨ４］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（９０ｍｇ、９５．８７μｍｏｌ、収率５４．０４％、純度９５．６５％）を無色の油状物として得た。
【０３３２】
化合物３を調製する手順
【０３３３】
【化１０３】
2021520378.tif 000109
化合物２（１０ｍｇ、１１．１４μｍｏｌ、１当量）、ＢＣＹ８１１６（２５ｍｇ、１１．５１μｍｏｌ、１．０３当量）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（２．１６ｍｇ、１６．７１μｍｏｌ、２．９１μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：２９３１．３０、実測ｍ／ｚ：９７７．００（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＦＴＡ条件）によって精製した。化合物３（１５ｍｇ、５．１２μｍｏｌ、収率４５．７９％、純度９９．６６％）を白色固体として得た。
【０３３４】
ＢＣＹ９４０６を調製する手順
【０３３５】
【化１０４】
2021520378.tif 000110
化合物３（１５ｍｇ、５．１２μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（１２ｍｇ、５．２６μｍｏｌ、１．０３当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１２．８μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１２．８μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、２５．６μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：５２１２．８４  実測ｍ／ｚ：１０４２．７４（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４０６（１４．４ｍｇ、２．５７μｍｏｌ、収率５０．２１％、純度９３．０１％）を白色固体として得た。
【０３３６】
ＢＣＹ９４０７
【０３３７】
【化１０５】
2021520378.tif 000111
化合物２を調製する手順
【０３３８】
【化１０６】
2021520378.tif 000112
ＣＯＭ１２８（６０ｍｇ、５０．５３μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（１３ｍｇ、６４．５０μｍｏｌ、１．２８当量）、ＤＩＥＡ（９．８０ｍｇ、７５．８０μｍｏｌ、１３．２０μＬ、１．５当量）のＤＣＭ（５ｍＬ）中溶液を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ１２８が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：１３５２．４８、実測ｍ／ｚ：６７６．７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（１２ｍｇ、８．８７μｍｏｌ、収率１７．５６％）を無色の油状物として得た。
【０３３９】
［ＢＣＹ８１１６］−［ＣＯＭ１２８］を調製する手順
【０３４０】
【化１０７】
2021520378.tif 000113
化合物２（７ｍｇ、５．１８μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ８１１６（１１ｍｇ、５．０６μｍｏｌ、１．０当量）、ＤＩＥＡ（２．０１ｍｇ、１５．５３μｍｏｌ、２．７０μＬ、３．０当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：３３８５．８５、実測ｍ／ｚ：１１２９．３（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。［ＢＣＹ８１１６］−［ＣＯＭ１２８］（１５．６ｍｇ、４．４６μｍｏｌ、収率８６．１３％、純度９６．７５％）を白色固体として得た。
【０３４１】
ＢＣＹ９４０７を調製する手順
【０３４２】
【化１０８】
2021520378.tif 000114
［ＢＣＹ８１１６］−［ＣＯＭ１２８］（１５．６ｍｇ、４．６１μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（１１ｍｇ、４．８２μｍｏｌ、１．０５当量）およびＴＨＰＴＡ（０．８Ｍ、５．８μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１１．６μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、２３．２μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５６６７．３９、実測ｍ／ｚ：９４５．６（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）および１１３４．２（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つのピークが検出されることを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４０７（１．３ｍｇ、０．２３μｍｏｌ、収率４．３３％、純度８６．９０％）を白色固体として得た。
【０３４３】
ＢＣＹ９４０８
【０３４４】
【化１０９】
2021520378.tif 000115
化合物２を調製する手順
【０３４５】
【化１１０】
2021520378.tif 000116
ＣＯＭ１２９（４５．０ｍｇ、３４．３９μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（１５．０ｍｇ、７４．４２μｍｏｌ、２．１当量）のＤＣＭ（５ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（５．５ｍｇ、５３．８８μｍｏｌ、７．５μＬ、１．５当量）を添加し、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＣＯＭ１２９が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１４７３．５８、実測ｍ／ｚ：７３７．３（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（９ｍｇ、６．１１μｍｏｌ、収率１７．０１％、純度９５．７６％）を白色固体として得た。
【０３４６】
化合物３を調製する手順
【０３４７】
【化１１１】
2021520378.tif 000117
化合物２（９．０ｍｇ、６．１１μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ８１１６（１３．３ｍｇ、６．１１μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（２．４ｍｇ、１８．３２μｍｏｌ、３．２μＬ、３．０当量）を添加した。全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージし、次いで、混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：３５０６．９５、実測ｍ／ｚ：８７７．４（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）およびｍ／ｚ：１１６９．６（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（７．２ｍｇ、２．０５μｍｏｌ、収率３１．９３％、純度９５％）を白色固体として得た。
【０３４８】
ＢＣＹ９４０８を調製する手順
【０３４９】
【化１１２】
2021520378.tif 000118
化合物３（７．２ｍｇ、２．０５μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（５．０ｍｇ、２．１９μｍｏｌ、１．０３当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、５．１μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．１μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、１０．２μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：５７８８．４９  実測ｍ／ｚ：９６８．９（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）および１１５８．０（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４０８（３．１ｍｇ、４．９７ｅ−１μｍｏｌ、収率２４．２３％、純度９２．８７％）を白色固体として得た。
【０３５０】
ＢＣＹ９４０９
【０３５１】
【化１１３】
2021520378.tif 000119
化合物２を調製する手順
【０３５２】
【化１１４】
2021520378.tif 000120
化合物１（３０ｍｇ、２０．７８μｍｏｌ）、ＣＯＭ１３０（６．２８ｍｇ、３１．１７μｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（３．１５ｍｇ、３１．１７μｍｏｌ、４．３４μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：１６０８．７０  実測ｍ／ｚ：８０４．８（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いで、凍結乾燥して、化合物２（１０．２ｍｇ、粗）を白色固体として得た。
【０３５３】
化合物３を調製する手順
【０３５４】
【化１１５】
2021520378.tif 000121
化合物２（１０．２ｍｇ、６．３４μｍｏｌ）およびＢＣＹ８１１６（１３．５０ｍｇ、６．２２μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（０．８ｍｇ、６．２２μｍｏｌ、１．１μＬ、１．０当量）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：３６４２．０８、実測ｍ／ｚ：１２１４．４（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）を検出した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（１５．０ｍｇ、４．１２μｍｏｌ、収率６２．９４％、純度９５％）を白色固体として得た。
【０３５５】
ＢＣＹ９４０９を調製する手順
【０３５６】
【化１１６】
2021520378.tif 000122
化合物３（１５ｍｇ、４．１２μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（１０ｍｇ、４．３８μｍｏｌ、１．０３当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１０．３μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１０．３μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、２０．６μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：５９２３．６１、実測ｍ／ｚ：９８８．２（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４０９（３．１ｍｇ、０．５２μｍｏｌ、収率１２．６２％、純度９０．８９％）を白色固体として得た。
【０３５７】
ＢＣＹ９４１０
【０３５８】
【化１１７】
2021520378.tif 000123
化合物２を調製する手順
【０３５９】
【化１１８】
2021520378.tif 000124
ＣＯＭ１３１（１６７．０ｍｇ、２２７．８９μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（５５．０ｍｇ、２７２．８７μｍｏｌ、１．２当量）のＤＣＭ（５ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（３６．４ｍｇ、３５９．２３μｍｏｌ、５０．０μＬ、１．６当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：８９７．９３  実測９２０．３（［Ｍ＋Ｎａ＋］）を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（３５ｍｇ、３３．７４μｍｏｌ、収率１４．８１％、純度８６．５６％）を無色の油状物として得た。
【０３６０】
化合物３を調製する手順
【０３６１】
【化１１９】
2021520378.tif 000125
化合物２（２０ｍｇ、２２．２７μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ８１１６（４８ｍｇ、２２．０９μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（８．６４ｍｇ、６６．８２μｍｏｌ、１１．６４μＬ、３．０当量）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：２９３１．３２、実測ｍ／ｚ：９７７．７（［Ｍ＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（４０ｍｇ、１３．０８μｍｏｌ、収率５８．７％、純度９５．８２％）を白色固体として得た。
【０３６２】
ＢＣＹ９４１０を調製する手順
【０３６３】
【化１２０】
2021520378.tif 000126
化合物３（４０ｍｇ、１３．０８μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（３５ｍｇ、１５．３４μｍｏｌ、１．１７当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、３４μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、３４μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、６８μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：５２１２．８５、実測ｍ／ｚ：１０４３．２（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４１０（３８．６ｍｇ、６．７８μｍｏｌ、収率４９．７１％、純度９１．６％）を白色固体として得た。
【０３６４】
ＢＣＹ９４１１
【０３６５】
【化１２１】
2021520378.tif 000127
化合物２を調製する手順
【０３６６】
【化１２２】
2021520378.tif 000128
ＣＯＭ１３２（５ｍｇ、１６．３２μｍｏｌ、１当量）、化合物１（４ｍｇ、１９．８５μｍｏｌ、１．２２当量）のＤＣＭ（５ｍＬ）中溶液に、ＴＥＡ（２．８ｍｇ、２４．４８μｍｏｌ、３．４μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５℃で１時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４７１．４６、実測ｍ／ｚ：４８９．２（［Ｍ＋ＮＨ４］＋））を有する１つのピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、次いで、凍結乾燥して、化合物２（８ｍｇ、粗）を白色固体として得た。
【０３６７】
化合物３を調製する手順
【０３６８】
【化１２３】
2021520378.tif 000129
化合物２（３．３ｍｇ、６．９μｍｏｌ、１．５当量）およびＢＣＹ８１１６（１０．０ｍｇ、４．６μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（５ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（０．７ｍｇ、６．９０μｍｏｌ、１μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２５０４．８３、実測ｍ／ｚ：１２５２．３（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（４．２ｍｇ、１．５１μｍｏｌ、収率３２．７８％、純度９０％）を白色固体として得た。
【０３６９】
ＢＣＹ９４１１を調製する手順
【０３７０】
【化１２４】
2021520378.tif 000130
化合物３（４．２ｍｇ、１．６８μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４１（４．０ｍｇ、１．７５μｍｏｌ、１．０５当量）およびＴＨＰＴＡ（０．０４Ｍ、８４μＬ、２．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．０４Ｍ、８４μＬ、２．０当量）およびＶｃＮａ（０．０４Ｍ、１６８μＬ、４．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：４７８６．３７、実測ｍ／ｚ：１５９６．２（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）、１１９６．９（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ９４１１（４．１ｍｇ、０．８６μｍｏｌ、収率５０．２０％、純度９８．２６％）を白色固体として得た。
【０３７１】
ＢＣＹ９７５９
【０３７２】
【化１２５】
2021520378.tif 000131
化合物２を調製する手順
【０３７３】
【化１２６】
2021520378.tif 000132
化合物１（５．０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ８１１６（７．７ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（０．９ｍｇ、７．０７μｍｏｌ、１．２μＬ、２．０当量）を添加した。混合物を０℃で２０分間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＮＨＳ基が脱落している化合物２に対応する質量（計算ＭＷ：３４７０．９５、加水分解ＭＷ：３３７３．８１、実測ｍ／ｚ：１１２５．０（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）を検出した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、化合物２（１５ｍｇ、粗）を白色固体として得た。
【０３７４】
ＢＣＹ９７５９を調製する手順
【０３７５】
【化１２７】
2021520378.tif 000133
化合物２（２０ｍｇ、５．７６μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ７７３２（１２．７ｍｇ、５．７６μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（１．５ｍｇ、１１．５２μｍｏｌ、２．０μＬ、２．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：５５５７．３、実測ｍ／ｚ：９２７．０（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）および１１１２．２（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＣＹ９７５９（２．３ｍｇ、収率６．９２％、純度９６．２９％）を白色固体として得た。
【０３７６】
ＢＣＹ１００００
【０３７７】
【化１２８】
2021520378.tif 000134
ＢＣＹ９１７２−ＰＥＧ１２−Ｎ３を調製する手順
【０３７８】
【化１２９】
2021520378.tif 000135
ＢＣＹ９１７２（５２０ｍｇ、２４８．１６μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（３７０ｍｇ、４９９．４７μｍｏｌ、２．０１当量）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、次いで、混合物にＤＩＥＡ（４８．１１ｍｇ、３７２．２４μｍｏｌ、６４．８４μＬ、１．５当量）を添加し、３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ９１７２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２７２１．１２、実測ｍ／ｚ：１３６０．９（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（２８４ｍｇ、１０１．１０μｍｏｌ、収率４０．７４％、純度９６．８７％）を白色固体として得た。
【０３７９】
ＢＣＹ１００００を調製する手順
【０３８０】
【化１３０】
2021520378.tif 000136
この反応を並行して２つの独立した容器で実施した。１つの容器について、化合物２（１４２ｍｇ、５２．１８μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ８８４６（１５７ｍｇ、５１．７４μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）１０ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１３０．５μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（０．４Ｍ、２６１．０μＬ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１３０．５μＬ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５７５５．５４、実測ｍ／ｚ：９５９．６０（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）および１１５１．５５（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１００００（３１４．９ｍｇ、５１．９９μｍｏｌ、収率４９．８２％、純度９５．０３％）を白色固体として得た。
【０３８１】
ＢＣＹ１０５６７
【０３８２】
【化１３１】
2021520378.tif 000137
ＢＣＹ８９１９−ＰＥＧ１２−Ｎ３を調製する手順
【０３８３】
【化１３２】
2021520378.tif 000138
ＢＣＹ８９１９（６０．０ｍｇ、２８．８５μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（２２．２ｍｇ、３０．０１μｍｏｌ、１．０４当量）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解した。溶液にＤＩＰＥＡ（５．６ｍｇ、４３．２８μｍｏｌ、７．６μｌ、１．５当量）を添加し、次いで、混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８９１９が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２７０５．１６、実測ｍ／ｚ：１３５３．１５（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（ＢＣＹ８９１９−ＰＥＧ１２−Ｎ３、１８．５ｍｇ、６．７７μｍｏｌ、収率２３．４７％、純度９９．０４％）を白色固体として得た。
【０３８４】
ＢＣＹ１０５６７を調製する手順
【０３８５】
【化１３３】
2021520378.tif 000139
注：この反応を２回実施し、最初の反応を以下に記載する。
化合物２（９．０ｍｇ、３．３３μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ８８４６（１０．１ｍｇ、３．３３μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、８．３μＬ、１．０当量）、ＶｃＮ（１．３ｍｇ、６．５６μｍｏｌ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（１．４ｍｇ、３．２２μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。最後に、０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＳ：５７３９．５８、実測ｍ／ｚ：９５６．７５（［Ｍ／６＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１０５６７（６．８５ｍｇ、１．１８μｍｏｌ、収率３５．４８％、純度９８．９１％）を白色固体として得た。
【０３８６】
ＢＣＹ１０５６９
【０３８７】
【化１３４】
2021520378.tif 000140
化合物３を調製する手順
【０３８８】
【化１３５】
2021520378.tif 000141
化合物ＢＣＹ８９２０（４０．０ｍｇ、１８．７１μｍｏｌ、１．０当量）、化合物２（１６．０ｍｇ、２１．６μｍｏｌ、１．１５当量）およびＤＩＥＡ（５．０μＬ、２８．０μｍｏｌ、１．５当量）の混合物をＤＭＦに溶解した。ＬＣ−ＭＳが、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２７６３．２、実測ｍ／ｚ：９１２．１７（［（Ｍ−２８）／２＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出されることを示すまで、反応混合物を４０℃で１時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得て、引き続いて分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（２３．４ｍｇ、８．４７μｍｏｌ、収率４５．２５％、純度９９．０％）を白色固体として得た。
【０３８９】
ＢＣＹ１０５６９を調製する手順
【０３９０】
【化１３６】
2021520378.tif 000142
化合物３（５．０ｍｇ、１．８１μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ８８４６（５．８ｍｇ、１．９μｍｏｌ、１．０５当量）およびＴＨＰＴＡ（１．０ｍｇ、２．３μｍｏｌ、１．３当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．０μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、５．０μＬ、１．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５７９７．６２、実測ｍ／ｚ：１１６０．７（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１０５６９（５．７ｍｇ、１．１８μｍｏｌ、収率５２．２５％、純度９６．１６％）を白色固体として得た。
【０３９１】
ＢＣＹ１０５７１
【０３９２】
【化１３７】
2021520378.tif 000143
ＢＣＹ８１１６−ＰＥＧ５−Ｎ３を調製する手順
【０３９３】
【化１３８】
2021520378.tif 000144
ＢＣＹ８１１６（６０ｍｇ、２７．６２μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（１２．０ｍｇ、２７．７５μｍｏｌ、１．０当量）を最初にＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、次いで、混合物にＤＩＥＡ（５．４ｍｇ、４１．４３μｍｏｌ、７．２２μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：２４８９．８２、実測ｍ／ｚ：１２４５．１７００（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（４８ｍｇ、１９．２８μｍｏｌ、収率６９．８０％、純度１００％）を白色固体として得た。
【０３９４】
ＢＣＹ１０５７１を調製する手順
【０３９５】
【化１３９】
2021520378.tif 000145
この反応を並行して２つの独立した容器で実施した。１つの容器について、化合物２（１０ｍｇ、４．０２μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ８９２７（９ｍｇ、４．１７μｍｏｌ、１．０４当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１０．０μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（０．４Ｍ、２０．１μＬ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１０．０μＬ、１当量）を添加した。最後に、０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で４時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：４６４９．３６、実測ｍ／ｚ：１１６２．５７（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）、１５４９．６９（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＣＹ１０５７１（１３ｍｇ、２．７９μｍｏｌ、収率３４．８８％、純度９６．４８％）を白色固体として得た。
【０３９６】
ＢＣＹ１０５７２
【０３９７】
【化１４０】
2021520378.tif 000146
ＢＣＹ８１１６−ＰＥＧ５−Ｎ３を調製する手順
【０３９８】
【化１４１】
2021520378.tif 000147
ＢＣＹ８１１６（６０ｍｇ、２７．６２μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（１２．０ｍｇ、２７．７５μｍｏｌ、１．０当量）を最初にＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、次いで、混合物にＤＩＥＡ（５．４ｍｇ、４１．４３μｍｏｌ、７．２２μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：２４８９．８２、実測ｍ／ｚ：１２４５．１７００（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（４８ｍｇ、１９．２８μｍｏｌ、収率６９．８０％、純度１００％）を白色固体として得た。
【０３９９】
ＢＣＹ１０５７２を調製する手順
【０４００】
【化１４２】
2021520378.tif 000148
この反応を並行して２つの独立した容器で実施した。１つの容器について、化合物２（１０ｍｇ、４．０２μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ８９２８（９ｍｇ、４．０６μｍｏｌ、１．０１当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１０．１μＬ、１当量）、ＶｃＮａ（０．４Ｍ、２０．２μＬ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１０．１μＬ、１．０当量）を添加した。最後に、０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で４時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：４７０７．４０、実測ｍ／ｚ：１５６８．２９（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）および１１７６．８３（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＣＹ１０５７２（２１ｍｇ、４．４６μｍｏｌ、収率５５．７％、純度９７．５１％）を白色固体として得た。
【０４０１】
ＢＣＹ１０５７３
【０４０２】
【化１４３】
2021520378.tif 000149
化合物２を調製する手順
【０４０３】
【化１４４】
2021520378.tif 000150
ＢＣＹ８１１６（３５ｍｇ、１６．１１μｍｏｌ、１当量）、化合物１（７．００ｍｇ、１６．１９μｍｏｌ、１当量）のＤＭＳＯ（１ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（３．１２ｍｇ、２４．１７μｍｏｌ、４．２１μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８１１６の大部分が消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２４８９．８２、実測ｍ／ｚ：１２４５．３７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）および８３０．２５（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（２６．８ｍｇ、１０．７６μｍｏｌ、収率６６．８１％、純度１００％）を白色固体として得た。
【０４０４】
ＢＣＹ１０５７３を調製する手順
【０４０５】
【化１４５】
2021520378.tif 000151
化合物２（１５ｍｇ、６．０２μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ１１０１４（１３．５０ｍｇ、６．２１μｍｏｌ、１．０３当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１５．１μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１５．１μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、３０．２μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［ＭＷ：４６６５．３２、実測ｍ／ｚ：１１６７．５０（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）］を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ１０５７３（１１．５ｍｇ、２．４２μｍｏｌ、収率４０．１４％、純度９８．１１％）を白色固体として得た。
【０４０６】
ＢＣＹ１０５７８
【０４０７】
【化１４６】
2021520378.tif 000152
化合物２を調製する手順
【０４０８】
【化１４７】
2021520378.tif 000153
化合物１（５．０ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）を最初にＥＤＣＩ（８．５ｍｇ、５４．８μｍｏｌ、１．１当量）およびＨＯＳｕ（５．７ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）と混合することによって活性化した。混合物を２５〜３０℃で３０分間攪拌した。ＴＬＣは、化合物１が完全に消費されており、１つの新たなスポットが形成されたことを示した。次いで、化合物ＢＣＹ９１７２（８０．０ｍｇ、３８．１８μｍｏｌ、０．８当量）およびＤＩＥＡ（６．３ｍｇ、８．５μＬ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）をこの混合物に添加し、ＬＣ−ＭＳが、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２１７８．４６、実測ｍ／ｚ：１０８９．４４（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出されることを示すまで、４０℃で１時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（１５ｍｇ、６．８８μｍｏｌ、収率１８．６６％、純度７３．３％）を白色固体として得た。
【０４０９】
ＢＣＹ１０５７８を調製する手順
【０４１０】
【化１４８】
2021520378.tif 000154
化合物２（９．８ｍｇ、４．５μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ８８４６（１４．０ｍｇ、４．６μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＰＴＡ（２．０ｍｇ、４．６μｍｏｌ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１２μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、２４μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５２１２．８８、実測ｍ／ｚ：１３０４．２（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１０５７８（１３．７８ｍｇ、２．６４μｍｏｌ、収率５８．６６％、純度９６．２３％）を白色固体として得た。
【０４１１】
ＢＣＹ１０９１７
【０４１２】
【化１４９】
2021520378.tif 000155
ＢＣＹ８８３１−ＰＥＧ１２−Ｎ３を調製する手順
【０４１３】
【化１５０】
2021520378.tif 000156
ＢＣＹ８８３１（４０．０ｍｇ、１３．２９μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（１０．５ｍｇ、１４．１７μｍｏｌ、１．０７当量）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。溶液にＤＩＰＥＡ（２．６ｍｇ、２０．０９μｍｏｌ、３．５μｌ、１．５当量）を添加し、次いで、混合物を３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８８３１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：３６３５．１６  実測ｍ／ｚ：１２１２．０（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（２２．０ｍｇ、５．８３μｍｏｌ、収率４３．８５％、純度９６．３９％）を白色固体として得た。
【０４１４】
ＢＣＹ１０９１７を調製する手順
【０４１５】
【化１５１】
2021520378.tif 000157
注：２つのバッチを作り、最初のものを最終報告のために記載した。
化合物２（１０．０ｍｇ、２．７５μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ１１０１４（５．９８ｍｇ、２．７５μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１３．７μＬ、２．０当量）、ＶｃＮａ（１．１ｍｇ、５．５５μｍｏｌ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（１．２ｍｇ、２．７６μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５８１０．６６  実測ｍ／ｚ：１１６３．０（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１０９１７（６．４ｍｇ、１．０７μｍｏｌ、収率３９．０３％、純度９７．４９％）を白色固体として得た。
【０４１６】
ＢＣＹ１１０２０
【０４１７】
【化１５２】
2021520378.tif 000158
ＢＣＹ８８３１−ＰＥＧ５−Ｎ３を調製する手順
【０４１８】
【化１５３】
2021520378.tif 000159
ＢＣＹ８８３１（２５．０ｍｇ、８．３１μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（３．９ｍｇ、９．０２μｍｏｌ、１．０９当量）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。溶液にＤＩＰＥＡ（１．６ｍｇ、１２．４６μｍｏｌ、２．２μｌ、１．５当量）を添加し、次いで、混合物を３５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８８３１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：３３２６．７９  実測ｍ／ｚ：１１０９．６６（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（７．３ｍｇ、２．０９μｍｏｌ、収率２５．２０％、純度９５．４１％）を白色固体として得た。
【０４１９】
ＢＣＹ１１０２０を調製する手順
【０４２０】
【化１５４】
2021520378.tif 000160
化合物２（７．３ｍｇ、２．１９μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ１１０１４（４．８ｍｇ、２．１９μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．５μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（１．０ｍｇ、５．０５μｍｏｌ、２．３当量）およびＴＨＰＴＡ（１．０ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５５０２．２９、実測ｍ／ｚ：１１０１．７４（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１０２０（３．３ｍｇ、０．５７７μｍｏｌ、収率２６．３０％、純度９６．２４％）を白色固体として得た。
【０４２１】
ＢＣＹ１１３７３
【０４２２】
【化１５５】
2021520378.tif 000161
化合物２を調製する手順
【０４２３】
【化１５６】
2021520378.tif 000162
化合物１（５．０ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣＩ（８．５ｍｇ、５４．８μｍｏｌ、１．１当量）およびＨＯＳｕ（５．７ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で３０分間攪拌した。ＴＬＣは、化合物１が完全に消費されており、１つの新たなスポットが形成されたことを示した。次いで、この混合物０．３ｍＬにＢＣＹ８１１６（３０．０ｍｇ、１３．８１μｍｏｌ、０．２８当量）およびＤＩＥＡ（２．４μＬ、１３．８１μｍｏｌ、０．２８当量）を添加し、２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８１１６が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２２５５．５３、実測ｍ／ｚ：１１２８．３４（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（２１ｍｇ、８．９μｍｏｌ、収率６４．４３％、純度９５．５６％）を白色固体として得た。
【０４２４】
ＢＣＹ１１３７３を調製する手順
【０４２５】
【化１５７】
2021520378.tif 000163
化合物２（５ｍｇ、２．２２μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ８９２８（４．７９ｍｇ、２．２２μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＰＴＡ（１．０ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．６μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、５．６μＬ、１．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４４１５．０７、実測ｍ／ｚ：１４７１．５（［Ｍ／３＋Ｈ］＋および１１０３．８（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１３７３（４．９ｍｇ、１．０３μｍｏｌ、収率４６．２６％、純度９２．４％）を白色固体として得た。
【０４２６】
ＢＣＹ１１３７４
【０４２７】
【化１５８】
2021520378.tif 000164
ＢＣＹ１１３７４を調製する手順
【０４２８】
【化１５９】
2021520378.tif 000165
化合物２（ＢＣＹ１１３７３を調製する手順に記載されるように調製され得る；５ｍｇ、２．２２μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ８９２８（４．９ｍｇ、２．２２μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＰＴＡ（１．０ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．６μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、５．６μＬ、１．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４４７３．１１、実測ｍ／ｚ：１４９１．５（［Ｍ／３＋Ｈ］＋および１１１８．５（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１３７４（４．１ｍｇ、１．２７μｍｏｌ、収率３８．０４％、純度９２．０％）を白色固体として得た。
【０４２９】
ＢＣＹ１１３７５
【０４３０】
【化１６０】
2021520378.tif 000166
ＢＣＹ１１３７５を調製する手順
【０４３１】
【化１６１】
2021520378.tif 000167
化合物２（ＢＣＹ１１３７３に記載されるように調製され得る；５ｍｇ、２．２２μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ１１０１４（４．８ｍｇ、２．２２μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．５ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．６μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、５．６μＬ、１．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、いくつかの所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４４３１．０３、実測ｍ／ｚ：１１０７．５９（［Ｍ／４＋Ｈ］＋および１４７７．９０（［Ｍ／３＋Ｈ］＋）を検出した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１３７５（６ｍｇ、１．３１μｍｏｌ、収率５９．１３％、純度９６．８％）を白色固体として得た。
【０４３２】
ＢＣＹ１１６１６
【０４３３】
【化１６２】
2021520378.tif 000168
化合物３を調製する手順
【０４３４】
【化１６３】
2021520378.tif 000169
化合物ＢＣＹ８１１６（３０．０ｍｇ、１３．８１μｍｏｌ、１．０当量）、化合物２（６．０ｍｇ、１３．８８μｍｏｌ、１．０当量）およびＤＩＥＡ（２．４μＬ、１３．８２μｍｏｌ、１．０当量）の混合物をＤＭＦに溶解した。ＬＣ−ＭＳが、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２４８９．８２、実測ｍ／ｚ：１２４５．４（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出されるまで、反応混合物を４０℃で１時間攪拌した。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物３（２７ｍｇ、１０．２９μｍｏｌ、収率７４．５２％、純度９４．９％）を白色固体として得た。
【０４３５】
ＢＣＹ１１６１６を調製する手順
【０４３６】
【化１６４】
2021520378.tif 000170
化合物３（５ｍｇ、２．０１μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ７７４４（５．２ｍｇ、２．２１μｍｏｌ、１．１当量）およびＴＨＰＴＡ（１．０ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．０μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、５．０μＬ、１．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４８２７．４６、実測ｍ／ｚ：１２０７．１２（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１６１６（４．７ｍｇ、１．０μｍｏｌ、収率４８．４８％、純度９４．７％）を白色固体として得た。
【０４３７】
ＢＣＹ１１６１７
【０４３８】
【化１６５】
2021520378.tif 000171
ＢＣＹ１１６１７を調製する手順
【０４３９】
【化１６６】
2021520378.tif 000172
化合物３（ＢＣＹ１１６１６を調製する手順に記載されるように調製され得る；５ｍｇ、２．０１μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ１１５０６（５．２ｍｇ、２．２１μｍｏｌ、１．１当量）およびＴＨＰＴＡ（１．０ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．１当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．０μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、５．０μＬ、１．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４８２８．４５、実測ｍ／ｚ：１２０６．９７（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）および９６５．９１（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１６１７（３．２ｍｇ、０．６３μｍｏｌ、収率３１．３７％、純度９５．０５％）を白色固体として得た。
【０４４０】
ＢＣＹ１１８５７
【０４４１】
【化１６７】
2021520378.tif 000173
ＢＣＹ１１４１４−ＰＥＧ５−Ｎ３を調製する手順
【０４４２】
【化１６８】
2021520378.tif 000174
ＢＣＹ１１４１４（６０．０ｍｇ、２９．０６μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（１３．０ｍｇ、３０．０６μｍｏｌ、１．０３当量）をＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解した。ＮａＨＣＯ３（０．４Ｍ）でｐＨを８に調整し、次いで、混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２３８１．７２、実測ｍ／ｚ：１１９１．０７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（３８．０ｍｇ、１５．９μｍｏｌ、収率５４．７１％、純度９７．３５％）を白色固体として得た。
【０４４３】
ＢＣＹ１１８５７を調製する手順
【０４４４】
【化１６９】
2021520378.tif 000175
化合物２（１０．０ｍｇ、４．２０μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ７７４４（１１．５ｍｇ、４．９２μｍｏｌ、１．２当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１１．０μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（２．０ｍｇ、１０μｍｏｌ、２．４当量）およびＴＨＰＴＡ（２．０ｍｇ、４．６μｍｏｌ、１．１当量）を添加した。最後に、０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４７１９．３７、実測ｍ／ｚ：１１８０．２４（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１８５７（１０．３ｍｇ、２．１８μｍｏｌ、収率５１．９０％、純度９６．０２％）を白色固体として得た。
【０４４５】
ＢＣＹ１１８５８
【０４４６】
【化１７０】
2021520378.tif 000176
ＢＣＹ１１４１４−ＰＥＧ５−Ｎ３を調製する手順
【０４４７】
【化１７１】
2021520378.tif 000177
ＢＣＹ１１４１４（６０．０ｍｇ、２９．０６μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（１３．０ｍｇ、３０．０６μｍｏｌ、１．０３当量）をＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解した。ＮａＨＣＯ３（０．４Ｍ）でｐＨを８に調整し、次いで、混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２３８１．７２、実測ｍ／ｚ：１１９１．０７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（３８．０ｍｇ、１５．９μｍｏｌ、収率５４．７１％、純度９７．３５％）を白色固体として得た。
【０４４８】
ＢＣＹ１１８５８を調製する手順
【０４４９】
【化１７２】
2021520378.tif 000178
化合物２（２０．０ｍｇ、８．４０μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ８９２８（２２．０ｍｇ、９．９２μｍｏｌ、１．１当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、２１．０μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（４．０ｍｇ、２０．１９μｍｏｌ、２．４当量）およびＴＨＰＴＡ（４．０ｍｇ、９．２０μｍｏｌ、１．１当量）を添加した。最後に、０．４Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４５９９．３０、実測ｍ／ｚ：９２０．３８（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）、１１５０．７９（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）、１５３３．３５（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１８５８（１６．９ｍｇ、３．６７μｍｏｌ、収率４３．４３％、純度９９．２５％）を白色固体として得た。
【０４５０】
ＢＣＹ１１８５９
【０４５１】
【化１７３】
2021520378.tif 000179
ＢＣＹ１１４１５−ＰＥＧ５−Ｎ３を調製する手順
【０４５２】
【化１７４】
2021520378.tif 000180
ＢＣＹ１１４１５（３０．０ｍｇ、１３．８１μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（６．０ｍｇ、３０．０６μｍｏｌ、１．０当量）をＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解した。ＮａＨＣＯ３（０．４Ｍ）でｐＨを８に調整し、次いで、混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２４８９．８２、実測ｍ／ｚ：１２４５．１８（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（２４．０ｍｇ、９．６３μｍｏｌ、収率６９．７％、純度９９．２８％）を白色固体として得た。
【０４５３】
ＢＣＹ１１８５９を調製する手順
【０４５４】
【化１７５】
2021520378.tif 000181
化合物２（２０．０ｍｇ、８．０３μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ８９２８（２１．０ｍｇ、９．４７μｍｏｌ、１．１当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、２１．０μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（４．０ｍｇ、２．５当量）およびＴＨＰＴＡ（４．０ｍｇ、１．１当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４７０７．４０、実測ｍ／ｚ：９４１．７（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）、１１７６．９（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）、１５６９．６（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１８５９（１９．２ｍｇ、４．０１μｍｏｌ、収率４９．８７％、純度９８．２２％）を白色固体として得た。
【０４５５】
［実施例４］
ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１３７結合ヘテロタンデム二環式ペプチドの合成
ＢＣＹ８９３９
【０４５６】
【化１７６】
2021520378.tif 000182
ＢＣＹ８９３９を調製する一般的な手順
【０４５７】
【化１７７】
2021520378.tif 000183
Ｎ３−ＰＥＧ１２−ＣＯＯＨ（２５０ｍｇ、３８８μｍｏｌ）およびＨＯＳｕ（６７．０ｍｇ、５８３μｍｏｌ）のＤＭＡ（４．５ｍＬ）およびＤＣＭ（１．５ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣＩ（８９．３ｍｇ、４６６μｍｏｌ）を添加し、２０℃で１６時間攪拌した。ＬＣＭＳは、所望の中間体が完全に形成されていることを示した。ＢＣＹ７７３２（８５４．９７ｍｇ、３８８．３７μｍｏｌ、１当量）およびＤＩＥＡ（１８６ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、２５０μＬ）を混合物に添加し、２０℃でさらに５時間、さらに攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ７７３２が完全に消費されていることを示し、所望の質量を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製して、化合物ＢＣＹ７８５９（６２１ｍｇ、２００．５８μｍｏｌ、収率５１．６５％、純度９５％、ＴＦＡ）を白色固体として得た。計算ＭＷ：２８１７．１６、実測ｍ／ｚ：９４２．７［Ｍ／３＋Ｈ］＋。
【０４５８】
ＢＣＹ８９３９を調製する一般的な手順
【０４５９】
【化１７８】
2021520378.tif 000184
ＢＣＹ７８５９（３１．１ｍｇ、１１．０μｍｏｌ）およびＢＣＹ８９３８（３０．０ｍｇ、１０．０μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液に、（２Ｒ）−２−［（１Ｓ）−１，２−ジヒドロキシエチル］−３，４−ジヒドロキシル−２Ｈ−フラン−５−オン（１Ｍ、１００μＬ）およびＣｕＳＯ４（１Ｍ、３０．０μＬ）を添加し、窒素雰囲気下、２０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ７８５９が完全に消費されていることを示し、所望の質量を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製して、化合物ＢＣＹ８９３９（１６．１ｍｇ、２．７２μｍｏｌ、収率２７．１％、純度９８．３％）を白色固体として得た。計算ＭＷ：５８２３．４９、実測ｍ／ｚ：１１６５．４［Ｍ／５＋Ｈ］＋、９７１．０［Ｍ／６＋Ｈ］＋、８３２．９［Ｍ／７＋Ｈ］＋
【０４６０】
ＢＣＹ１０５８０
【０４６１】
【化１７９】
2021520378.tif 000185
ＢＣＹ９１７２−ＰＥＧ１２−Ｎ３を調製する手順
【０４６２】
【化１８０】
2021520378.tif 000186
ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中ＢＣＹ９１７２（１００．０ｍｇ、４７．７２μｍｏｌ、１当量）および化合物１（４０．０ｍｇ、５４．００μｍｏｌ、１．１３当量）に、ＤＩＥＡ（９．２５ｍｇ、７１．５８μｍｏｌ、１２．４７μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ９１７２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：２７２１．１２、実測ｍ／ｚ：１３６１．０７（［（Ｍ／２＋Ｈ＋］））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得た。次いで、残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物２（４８ｍｇ、１７．４４μｍｏｌ、収率４５．６８％、純度９８．８７％）を白色固体として得た。
【０４６３】
ＢＣＹ１０５８０を調製する手順
【０４６４】
【化１８１】
2021520378.tif 000187
化合物２（２０ｍｇ、７．３５μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ１００４３（２３．１ｍｇ、７．３５μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１８．４μＬ、１．０当量）、ＶｃＮａ（０．４Ｍ、３６．８μＬ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１８．４μＬ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で４時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：５８５５．７４  実測ｍ／ｚ：９７６．４０（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）および１１７１．６７（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＣＹ１０５８０（２９ｍｇ、４．８５μｍｏｌ、収率６５．９５％、純度９７．８７９％）を白色固体として得た。
【０４６５】
ＢＣＹ１０５８１
【０４６６】
【化１８２】
2021520378.tif 000188
ＢＣＹ９１７２−ＰＥＧ１２−Ｎ３を調製する手順
【０４６７】
【化１８３】
2021520378.tif 000189
ＤＭＳＯ（２ｍＬ）中ＢＣＹ９１７２（１００ｍｇ、４７．７２μｍｏｌ、１当量）および化合物１（４０．００ｍｇ、５４．００μｍｏｌ、１．１３当量）に、ＤＩＥＡ（９．２５ｍｇ、７１．５８μｍｏｌ、１２．４７μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ９１７２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：２７２１．１２、実測ｍ／ｚ：１３６１．０７（［（Ｍ／２＋Ｈ＋］））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得た。次いで、残留物を分取ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物２（４８ｍｇ、１７．４４μｍｏｌ、収率４５．６８％、純度９８．８７％）を白色固体として得た。
【０４６８】
ＢＣＹ１０５８１を調製する手順
【０４６９】
【化１８４】
2021520378.tif 000190
化合物２（１２ｍｇ、４．４１μｍｏｌ、１当量）およびＢＣＹ１００４４（１４．０８ｍｇ、４．４１μｍｏｌ、１当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１１．０２μＬ、１当量）、ＶｃＮａ（０．４Ｍ、２２．０５μＬ、２当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１０．０４μＬ、１当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３０℃で４時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（ＭＷ：５９１２．８４、実測ｍ／ｚ：９８５．９０（［Ｍ／６＋Ｈ］＋）および１１８３．２８（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＣＹ１０５８１（９．３ｍｇ、１．４７μｍｏｌ、収率３３．３６％、純度９３．５４１％）を白色固体として得た。
【０４７０】
ＢＣＹ１０５８２
【０４７１】
【化１８５】
2021520378.tif 000191
化合物２を調製する手順
【０４７２】
【化１８６】
2021520378.tif 000192
ＢＣＹ９１７２（１００．０ｍｇ、４７．７μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１（４０．０ｍｇ、５４．０μｍｏｌ、１．１３当量）のＤＭＳＯ（２ｍＬ）中溶液に、ＤＩＥＡ（９．２ｍｇ、７１．６μｍｏｌ、１２．５μＬ、１．５当量）を添加した。混合物を３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ９１７２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２７２１．１２、実測ｍ／ｚ：１３６１．０７（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去して、残留物を得た。残留物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（３７ｍｇ、１３．６０μｍｏｌ、収率２８．４９％）を白色固体として得た。
【０４７３】
ＢＣＹ１０５８２を調製する手順
【０４７４】
【化１８７】
2021520378.tif 000193
化合物２（１６．０ｍｇ、５．９μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ１００４５（１４．０ｍｇ、６．０μｍｏｌ、１．０１当量）およびＴＨＰＴＡ（０．４Ｍ、１４．７μＬ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、２ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１４．７μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、２９．４μＬ、２．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ［計算ＭＷ：５０７３．８９、実測ｍ／ｚ：１０１５．２４（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）および１２６８．９７（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＣＹ１０５８２（１０ｍｇ、１．９２μｍｏｌ、収率３２．５８％、純度９７．２１％）を白色固体として得た。
【０４７５】
ＢＣＹ１１０１７
【０４７６】
【化１８８】
2021520378.tif 000194
ＢＣＹ１１０１７を調製する手順
【０４７７】
【化１８９】
2021520378.tif 000195
化合物２（ＢＣＹ１０５６７を調製する手順に記載されるように調製され得る；７．０ｍｇ、２．５９μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ１０８６１（７．０３ｍｇ、２．５９μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１３．０μＬ、２．０当量）、ＶｃＮａ（１．０ｍｇ、５．０３μｍｏｌ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（１．１ｍｇ、２．５３μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３５℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５４２１．３０、実測ｍ／ｚ：１０８４．７（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１０１７（６．６ｍｇ、１．１７μｍｏｌ、収率４５．２４％、純度９６．１６％）を白色固体として得た。
【０４７８】
ＢＣＹ１１０１８
【０４７９】
【化１９０】
2021520378.tif 000196
ＢＣＹ１１０１８を調製する手順
【０４８０】
【化１９１】
2021520378.tif 000197
化合物２（ＢＣＹ１０５７０を調製する手順に記載されるように調製され得る；６．０ｍｇ、２．１７μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ１０８６１（５．９ｍｇ、２．１７μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１１．０μＬ、２．０当量）、ＶｃＮａ（１．０ｍｇ、２．３当量）およびＴＨＰＴＡ（１．１ｍｇ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３５℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５４７９．３４、実測ｍ／ｚ：１０９６．４０（［Ｍ／５＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１０１８（２．３ｍｇ、０．４０μｍｏｌ、収率１８．３１％、純度９４．７３％）を白色固体として得た。
【０４８１】
ＢＣＹ１１０１９
【０４８２】
【化１９２】
2021520378.tif 000198
ＢＣＹ１１０１９を調製する手順
【０４８３】
【化１９３】
2021520378.tif 000199
化合物２（ＢＣＹ１０５８１を調製する手順に記載されるように調製され得る；８．０ｍｇ、２．９４μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ１０８６１（８．０ｍｇ、２．９５μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、１４．７μＬ、２．０当量）、ＶｃＮａ（１．２ｍｇ、６．０５μｍｏｌ、２．０当量）およびＴＨＰＴＡ（１．３ｍｇ、２．９９μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、３５℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５４３７．２６、実測ｍ／ｚ：１０８８．０９（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）および１３６０．１９（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１０１９（７．６ｍｇ、１．３６μｍｏｌ、収率４６．０９％、純度９６．９５％）を白色固体として得た。
【０４８４】
ＢＣＹ１１３７６
【０４８５】
【化１９４】
2021520378.tif 000200
化合物２を調製する手順
【０４８６】
【化１９５】
2021520378.tif 000201
化合物１（５．０ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣＩ（８．５ｍｇ、５４．８μｍｏｌ、１．１当量）およびＨＯＳｕ（５．７ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で３０分間攪拌した。ＴＬＣは、化合物１が完全に消費されており、１つの新たなスポットが形成されたことを示した。次いで、この混合物０．２ｍＬにＢＣＹ８９１９（２０．０ｍｇ、９．６２μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．７μＬ、９．６２μｍｏｌ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８９１９が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２１６２．５１、実測ｍ／ｚ：１０８１．８（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（１２ｍｇ、５．５５μｍｏｌ、収率５６．２８％、純度９７．５４％）を白色固体として得た。
【０４８７】
ＢＣＹ１１３７６を調製する手順
【０４８８】
【化１９６】
2021520378.tif 000202
化合物２（３ｍｇ、１．３９μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ１０８６１（３．８ｍｇ、１．４０μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＰＴＡ（１．２ｍｇ、２．７６μｍｏｌ、２．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、３．５μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、３．５μＬ、１．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ１０８６１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４８７８．６４、実測ｍ／ｚ：１２２０．８（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１３７６（１．９ｍｇ、１．０μｍｏｌ、収率２７．０１％、純度９６．２％）を白色固体として得た。
【０４８９】
ＢＣＹ１１３７７
【０４９０】
【化１９７】
2021520378.tif 000203
化合物２を調製する手順
【０４９１】
【化１９８】
2021520378.tif 000204
化合物１（５．０ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣＩ（８．５ｍｇ、５４．８μｍｏｌ、１．１当量）およびＨＯＳｕ（５．７ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で３０分間攪拌した。ＴＬＣは、化合物１が完全に消費されており、１つの新たなスポットが形成されたことを示した。次いで、この混合物０．２ｍＬにＢＣＹ８９２０（２０．０ｍｇ、９．３６μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．２ｍｇ、９．３６μｍｏｌ）を添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８９２０が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２２２０．５４、実測ｍ／ｚ：１１１０．９０（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（１２ｍｇ、５．１５μｍｏｌ、収率５６．２８％、純度９５．３％）を白色固体として得た。
【０４９２】
ＢＣＹ１１３７７を調製する手順
【０４９３】
【化１９９】
2021520378.tif 000205
化合物２（３ｍｇ、１．３５μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ１０８６１（３．８ｍｇ、１．３５μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＰＴＡ（０．６ｍｇ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、３．４μＬ、１当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、３．４μＬ、１当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４９３６．６８、実測ｍ／ｚ：１２３４．９（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出されることを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１３７７（３．５ｍｇ、０．６６μｍｏｌ、収率４８．８６％、純度９３．１％）を白色固体として得た。
【０４９４】
ＢＣＹ１１３７８
【０４９５】
【化２００】
2021520378.tif 000206
化合物２を調製する手順
【０４９６】
【化２０１】
2021520378.tif 000207
化合物１（５．０ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）のＤＭＦ（１ｍＬ）中溶液に、ＥＤＣＩ（８．５ｍｇ、５４．８μｍｏｌ、１．１当量）およびＨＯＳｕ（５．７ｍｇ、４９．５μｍｏｌ、１．０当量）を添加した。混合物を２５〜３０℃で３０分間攪拌した。ＴＬＣは、化合物１が完全に消費されており、１つの新たなスポットが形成されたことを示した。次いで、この混合物０．２ｍＬをＢＣＹ９１７２（２０．０ｍｇ、９．５４μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１．７μＬ、９．６２μｍｏｌ）に添加した。混合物を２５〜３０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物１が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２１７６．４９、実測ｍ／ｚ：１０９０．０（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。次いで、反応混合物を減圧下で濃縮して、溶媒を除去し、残留物を得て、引き続いて分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物２（２０．２ｍｇ、７．４８μｍｏｌ、収率７８．３４％、純度８０．５７％）を白色固体として得た。
【０４９７】
ＢＣＹ１１３７８を調製する手順
【０４９８】
【化２０２】
2021520378.tif 000208
化合物２（５ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．０当量）、ＢＣＹ１０８６１（６．２４ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．０当量）およびＴＨＰＴＡ（１．０ｍｇ、１．０当量）の混合物をｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、１ｍＬ、予め脱気し、Ｎ２で３回パージした）に溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、５．８μＬ、１．０当量）およびＶｃＮａ（０．４Ｍ、５．８μＬ、１．０当量）をＮ２下で添加した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３（１：１  ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中）を滴加することによって、この溶液のｐＨを８に調整すると、溶液が淡黄色になった。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、４０℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：４８９４．６１、実測ｍ／ｚ：１２２４．３（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残留物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１３７８（１．２ｍｇ、０．３４μｍｏｌ、収率１０．０７％、純度９４．３％）を白色固体として得た。
【０４９９】
ＢＣＹ１１３７９
【０５００】
【化２０３】
2021520378.tif 000209
ＢＣＹ８９１９−ＰＥＧ５−Ｎ３を調製する手順
【０５０１】
【化２０４】
2021520378.tif 000210
ＢＣＹ８９１９（３０．０ｍｇ、１４．４３μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（６．３ｍｇ、１４．５７μｍｏｌ、１．０１当量）を、ＭｅＣＮ（１ｍＬ）とＨ２Ｏ（１ｍＬ）の混合物に溶解した。溶液に１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整し、次いで、混合物を３５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８９１９が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２３９６．７９、実測ｍ／ｚ：１１９８．７４（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）および７９９．５０（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（２０ｍｇ、８．０７μｍｏｌ、収率５５．９２％、純度９６．６８％）を白色固体として得た。
【０５０２】
ＢＣＹ１１３７９を調製する手順
【０５０３】
【化２０５】
2021520378.tif 000211
化合物２（３．０ｍｇ、１．２５μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ１０８６１（３．４ｍｇ、１．２５μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、７μＬ、２．２４当量）、ＶｃＮａ（１ｍｇ、５．０４μｍｏｌ、４．０３当量）およびＴＨＰＴＡ（１ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．８４当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５１１２．９３  実測ｍ／ｚ：１０２２．９６（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）および１２７８．７４（［Ｍ／４＋Ｈ］＋）を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１３７９（３．４ｍｇ、０．６１５μｍｏｌ、収率５２．００％、純度９７．８８％）を白色固体として得た。
【０５０４】
ＢＣＹ１１３８０
【０５０５】
【化２０６】
2021520378.tif 000212
ＢＣＹ８９２０−ＰＥＧ５−Ｎ３を調製する手順
【０５０６】
【化２０７】
2021520378.tif 000213
ＢＣＹ８９２０（３０．０ｍｇ、１４．０４μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（６．１ｍｇ、１４．１１μｍｏｌ、１．０１当量）を、ＭｅＣＮ（１ｍＬ）とＨ２Ｏ（１ｍＬ）の混合物に溶解した。溶液に１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整し、次いで、混合物を３５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ８９２０が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２４５４．８３、実測ｍ／ｚ：１２２７．６３（［Ｍ／２＋Ｈ］＋）および８１８．６６（［Ｍ／３＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（２０ｍｇ、８．０３μｍｏｌ、収率５７．２１％、純度９８．５６％）を白色固体として得た。
【０５０７】
ＢＣＹ１１３８０を調製する手順
【０５０８】
【化２０８】
2021520378.tif 000214
化合物２（３．５ｍｇ、１．４３μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ１０８６１（３．９ｍｇ、１．４４μｍｏｌ、１．０当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、８μＬ、２．２４当量）、ＶｃＮａ（１ｍｇ、５．０４μｍｏｌ、３．５２当量）およびＴＨＰＴＡ（１ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．６１当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２の大部分が消費されていること、および所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５１７０．９７、実測ｍ／ｚ：１０３４．２８（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）および１２９３．１０（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１３８０（１．６ｍｇ、０．２９６μｍｏｌ、収率２０．７７％、純度９６．７７％）を白色固体として得た。
【０５０９】
ＢＣＹ１１３８１
【０５１０】
【化２０９】
2021520378.tif 000215
ＢＣＹ８９２０−ＰＥＧ５−Ｎ３を調製する手順
【０５１１】
【化２１０】
2021520378.tif 000216
ＢＣＹ９１７２（３０．０ｍｇ、１４．３２μｍｏｌ、１．０当量）および化合物１（６．２ｍｇ、１４．３４μｍｏｌ、１．０当量）を、ＭｅＣＮ（１ｍＬ）とＨ２Ｏ（１ｍＬ）の混合物に溶解した。溶液に１Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整し、次いで、混合物を３５℃で２時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、ＢＣＹ９１７２が完全に消費されていることを示し、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：２４１２．７５、実測ｍ／ｚ：１２０６．７２（［Ｍ／２＋Ｈ］＋））を有する１つの主ピークが検出された。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、化合物２（１５ｍｇ、６．１４μｍｏｌ、収率４２．８７％、純度９８．７５％）を白色固体として得た。
【０５１２】
ＢＣＹ１１３８１を調製する手順
【０５１３】
【化２１１】
2021520378.tif 000217
化合物２（３．０ｍｇ、１．２４μｍｏｌ、１．０当量）およびＢＣＹ１０８６１（３．４ｍｇ、１．２５μｍｏｌ、１．０１当量）を最初にｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）２ｍＬに溶解し、次いで、ＣｕＳＯ４（０．４Ｍ、７μＬ、２．２５当量）、ＶｃＮａ（１ｍｇ、５．０４μｍｏｌ、４．０６当量）およびＴＨＰＴＡ（１ｍｇ、２．３０μｍｏｌ、１．８５当量）を添加した。最後に、１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を添加して、ｐＨを８に調整した。ここでは全ての溶媒を脱気し、Ｎ２で３回パージした。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下、２５〜３０℃で１６時間攪拌した。ＬＣ−ＭＳは、所望のｍ／ｚ（計算ＭＷ：５１２８．８９、実測ｍ／ｚ：１０２６．０５（［Ｍ／５＋Ｈ］＋）および１２８２．５０（［Ｍ／４＋Ｈ］＋））を有する１つのピークを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製し、ＢＣＹ１１３８１（１．６ｍｇ、０．２９５μｍｏｌ、収率２３．７３％、純度９４．５９％）を白色固体として得た。
【０５１４】
［実施例５］
ＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストの作製
本明細書に提示される実験でＣＤ１３７他量体と比較するために使用したＣＤ１３７モノクローナル抗体アゴニストの配列は、米国特許第７２８８６３８号に開示された。ＩｇＧ４アイソタイプ抗体を、ＤＮＡ発現構築物の一過的トランスフェクション後にＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して発現させた。抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中で製剤化した。ＨＰＬＣ−ＳＥＣ（カラムＧＦ−２５０、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した純度分析は、ＣＤ１３７モノクローナル抗体の単量体割合がおよそ９５％であることを示した。結合活性分析は、１μｇ／ｍｌ超の濃度を有するＣＤ１３７モノクローナル抗体が、ＣＤ１３７を発現するＣＨＯ細胞に結合することができることを示した。ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を使用したエンドトキシン分析は、ＣＤ１３７モノクローナル抗体調製物が、７ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンを含有していることを示した。
【０５１５】
生物学的データ
１．ＣＤ１３７  Ｂｉａｃｏｒｅ実験説明
Ｂｉａｃｏｒｅ実験を実施して、ヒトＣＤ１３７タンパク質に結合するヘテロタンデムペプチドのｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ（ｓ−１）、ＫＤ（ｎＭ）値を決定した。組換えヒトＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳに再懸濁し、製造業者の提案されるプロトコルによって、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してビオチン化した。タンパク質を脱塩して、スピンカラムを使用してカップリングしていないビオチンをＰＢＳに除去した。
【０５１６】
ペプチド結合を分析するために、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００またはＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器をＸａｎＴｅｃ  ＣＭＤ５００Ｄチップと共に使用した。ストレプトアビジンを、泳動緩衝液としてＨＢＳ−Ｎ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、２５℃で標準的なアミンカップリング化学を使用して、チップに固定した。手短に言えば、カルボキシメチルデキストラン表面を、１０μｌ／分の流速で、１：１比の０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を７分注入することによって活性化した。ストレプトアビジンを捕捉するために、タンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、１２０μｌを注入することによって活性化チップ表面上に捕捉させた。残留活性化基を、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を７分間注入してブロッキングし、ビオチン化ＣＤ１３７を２７０〜１５００ＲＵのレベルまで捕捉した。緩衝液をＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０に変更し、ペプチドの希釈系列を、最終ＤＭＳＯ濃度０．５％で、この緩衝液中で調製した。上位ペプチド濃度は５００ｎＭであり、６回さらに２倍または３倍希釈した。ＳＰＲ分析を、６０秒結合および９００秒解離で、９０μｌ／分の流速で、２５℃で行った。各サイクル後に、再生ステップ（１０ｍＭグリシンｐＨ２  １０μｌ）を使用した。必要に応じて、ＤＭＳＯを除いた体積効果についてデータを補正した。全てのデータを、標準的な処理手順を使用して、ブランク注入および参照表面について二重参照し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア、バージョン２．０ｃ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、データプロセッシングおよびキネティックフィッティングを実施した。該当する場合、物質移動効果を可能にする単純な１：１結合モデルを使用して、データをフィッティングした。
【０５１７】
一定のヘテロタンデムペプチドをこのアッセイで試験し、結果を以下の表１に示す。
【０５１８】
【表４】
2021520378.tif 000218
【０５１９】
２．ネクチン−４  Ｂｉａｃｏｒｅ実験説明
Ｂｉａｃｏｒｅ実験を実施して、ヒトネクチン−４タンパク質（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手）に結合するヘテロタンデムペプチドのｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ（ｓ−１）、ＫＤ（ｎＭ）値を決定した。ｇｐ６７シグナル配列およびＣ末端ＦＬＡＧタグを有するヒトネクチン−４（残基Ｇｌｙ３２−Ｓｅｒ３４９；ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１２１７８．２）を、ｐＦａｓｔｂａｃ−１にクローニングし、標準的なＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（商標）プロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してバキュロウイルスを作製した。２７℃でＥｘｃｅｌｌ−４２０培地（Ｓｉｇｍａ）中１×１０６個ｍｌ−１のＳｆ２１細胞を、Ｐ１ウイルスストックで、ＭＯＩ２で感染させ、上清を７２時間で収穫した。上清を、ＰＢＳで洗浄した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティーアガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ）で、４℃で１時間バッチ結合し、その後、樹脂をカラムに移し、ＰＢＳで広範囲に洗浄した。タンパク質を１００μｇ／ｍｌ  ＦＬＡＧペプチドで溶出した。溶出したタンパク質を２ｍｌに濃縮し、１ｍｌ／分で、ＰＢＳ中Ｓ２００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。２ｍｌ画分を回収し、ネクチン−４タンパク質を含有する画分を１６ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
タンパク質を、製造業者の提案されるプロトコルによって、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＰＢＳ中でランダムにビオチン化した。タンパク質を広範囲に脱塩して、スピンカラムを使用してカップリングしていないビオチンをＰＢＳに除去した。
ペプチド結合を分析するために、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００機器をＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に使用した。ストレプトアビジンを、泳動緩衝液としてＨＢＳ−Ｎ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、２５℃で標準的なアミンカップリング化学を使用して、チップに固定した。手短に言えば、カルボキシメチルデキストラン表面を、１０μｌ／分の流速で、１：１比の０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を７分注入することによって活性化した。ストレプトアビジンを捕捉するために、タンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、ストレプトアビジン１２０μｌを注入することによって活性化チップ表面上に捕捉させた。残留活性化基を、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を７分間注入してブロッキングし、ビオチン化ネクチン−４を１２００〜１８００ＲＵのレベルまで捕捉した。緩衝液をＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０に変更し、ペプチドの希釈系列を、最終ＤＭＳＯ濃度０．５％で、この緩衝液中で調製した。上位ペプチド濃度は１００ｎＭであり、６回さらに２倍希釈した。ＳＰＲ分析を、個々のペプチドに応じて、６０秒結合および４００〜１２００秒解離で、５０μｌ／分の流速で、２５℃で行った。ＤＭＳＯを除いた体積効果についてデータを補正した。全てのデータを、標準的な処理手順を使用して、ブランク注入および参照表面について二重参照し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア、バージョン２．０ｃ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、データプロセッシングおよびキネティックフィッティングを実施した。該当する場合、物質移動効果を可能にする単純な１：１結合モデルを使用して、データをフィッティングした。
【０５２０】
本発明の一定のヘテロタンデムペプチドを上記のネクチン−４結合アッセイで試験し、結果を以下の表２に示す。
【０５２１】
【表５】
2021520378.tif 000219
【０５２２】
３．ＥｐｈＡ２  Ｂｉａｃｏｒｅ実験説明
Ｂｉａｃｏｒｅ実験を実施して、ヒトＥｐｈＡ２タンパク質に結合するヘテロタンデムペプチドのｋａ（Ｍ−１ｓ−１）、ｋｄ（ｓ−１）、ＫＤ（ｎＭ）値を決定した。
ＥｐｈＡ２を、タンパク質に対して３倍モル過剰のビオチンを用いて、４ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．４中で、１時間、ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを使用してビオチン化した。反応混合物のＰＢＳへの透析後、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、標識化の程度を決定した。ペプチド結合を分析するために、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を、ＸａｎＴｅｃ  ＣＭＤ５００Ｄチップと共に使用した。ストレプトアビジンを、泳動緩衝液としてＨＢＳ−Ｎ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、２５℃で標準的なアミンカップリング化学を使用して、チップに固定した。手短に言えば、カルボキシメチルデキストラン表面を、１０μｌ／分の流速で、１：１比の０．４Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／０．１Ｍ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を７分注入することによって活性化した。ストレプトアビジンを捕捉するために、タンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、１２０μｌを注入することによって活性化チップ表面上に捕捉させた。残留活性化基を、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）：ＨＢＳ−Ｎ（１：１）を７分間注入してブロッキングした。緩衝液をＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０に変更し、緩衝液中０．２μＭまでのタンパク質の希釈を使用して、ビオチン化ＥｐｈＡ２を５００〜１５００ＲＵのレベルまで捕捉した。ペプチドの希釈系列を、最終ＤＭＳＯ濃度０．５％で、この緩衝液中で調製し、上位ペプチド濃度は５０または１００ｎＭであり、６回さらに２倍希釈した。ＳＰＲ分析を、６０秒結合および９００〜１２００秒解離で、９０μｌ／分の流速で、２５℃で行った。ＤＭＳＯを除いた体積効果についてデータを補正した。全てのデータを、標準的な処理手順を使用して、ブランク注入および参照表面について二重参照し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒソフトウェア、バージョン２．０ｃ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、データプロセッシングおよびキネティックフィッティングを実施した。該当する場合、物質移動効果を可能にする単純な１：１結合モデルを使用して、データをフィッティングした。
【０５２３】
本発明の一定のヘテロタンデムペプチドをＥｐｈＡ２結合アッセイで試験し、結果を以下の表３に示す。
【０５２４】
【表６】
2021520378.tif 000220
【０５２５】
４．腫瘍細胞とのＣＤ１３７レポーターアッセイ共培養
１％ＦＢＳをＲＰＭＩ−１６４０（ＰｒｏｍｅｇａキットＣＳ１９６００５の成分）に添加することによって、Ｒ１培地と呼ばれる培養培地を調製する。Ｒ１中の試験物の系列希釈を滅菌９６ウェルプレートで調製する。白色細胞培養プレートの指定されたウェルに対して、１ウェル当たり２５μｌの試験物またはＲ１（バックグラウンド対照として）を使用する。腫瘍細胞＊を収穫し、Ｒ１培地に４０００００個細胞／ｍＬの濃度で再懸濁する。２５（２５）μＬ／ウェルの腫瘍細胞を白色細胞培養プレートで使用する。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＰｒｏｍｅｇａキットＣＳ１９６００５、０．５ｍＬ）を水浴中で解凍し、次いで、５ｍｌ予熱Ｒ１培地に添加する。２５（２５）μＬ／ウェルのＪｕｒｋａｔ細胞を白色細胞培養プレートで使用する。細胞および試験物を３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートする。６時間の終わりに、７５μｌ／ウェルのＢｉｏ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、１０分間インキュベートした後、プレートリーダー（Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ、ＢＭＧ）で発光を読み取る。細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞＋共培養で使用した細胞株）に対する変化倍率を計算し、対数（アゴニスト）対応答としてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍでプロットして、ＥＣ５０（ｎＭ）およびバックグラウンドに対する誘導倍率（最大）を決定する。
【０５２６】
共培養に使用した腫瘍細胞型は、以下の表４に示されるように、ヘテロタンデムに特異的な腫瘍標的に依存する。
【０５２７】
【表７】
2021520378.tif 000221
【０５２８】
ＥｐｈＡ２−ＣＤ１３７ヘテロタンデムＢＣＹ７９８５が、ＥｐｈＡ２発現ＨＴ１０８０細胞の存在下、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣＤ１３７ルシフェラーゼレポーターアッセイでＣＤ１３７細胞活性の強力な誘導を示したことを示すデータが図３に示される。ＨＴ１０８０細胞の非存在下では、ヘテロタンデムによるＣＤ１３７誘導はない。
【０５２９】
ＥｐｈＡ２／ＣＤ１３７ヘテロタンデムがＣＤ１３７レポーターアッセイで強力なＣＤ１３７活性化を誘導し、活性化の誘導倍率が、共培養に使用した細胞株（Ａ５４９およびＳＣ−ＯＶ−３：ＥｐｈＡ２高およびＬＮＣａＰ：ＥｐｈＡ２低）上の腫瘍標的発現レベルに依存することを示すデータが図４に示される。
【０５３０】
ネクチン−４／ＣＤ１３７ヘテロタンデムがＣＤ１３７レポーターアッセイで強力なＣＤ１３７活性化を誘導し、活性化の誘導倍率が、共培養に使用した細胞株（ＨＴ１３７６：ネクチン−４高およびＮＣＩ−Ｈ２９２：ネクチン−４中）上の腫瘍標的発現レベルに依存することを示すデータが図６に示される。
【０５３１】
ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、ＰＤ−Ｌ１発現細胞株の存在下、ＣＤ１３７レポーターアッセイでＣＤ１３７の強力な活性化を誘導することを示すデータが図９に示される。様々な細胞株との共培養においてＣＤ１３７レポーターアッセイでヘテロタンデムペプチドによって誘導されるＥＣ５０（ｎＭ）および誘導倍率の概要を以下の表５に報告する。
【０５３２】
【表８−１】
2021520378.tif 000222
【表８−２】
2021520378.tif 000223
【表８−３】
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【０５３３】
５．初代ヒトＴ細胞−Ａ５４９共培養（腫瘍細胞殺傷）
３人の健康なドナーからＰＢＭＣを単離し、２つの濃度で、抗ＣＤ３刺激の存在下、２つの規定比で、Ｎｕｃｌｉｇｈｔ  Ｒｅｄ標識腫瘍標的細胞（ヒト肺癌細胞Ａ５４９（登録商標）、ＡＴＣＣ  ＣＬＬ−１８５（商標））に添加した。腫瘍細胞：ＰＢＭＣ共培養物を３つの濃度で、リード二環と共にインキュベートした。直接的な腫瘍細胞への細胞傷害性を検出するために、全ての試験条件を、刺激されたＰＢＭＣの非存在下で、腫瘍細胞に蒔いた。経時的に生存Ｎｕｃｅｌｉｇｈｔ  ｒｅｄ陽性腫瘍細胞を計数することによって、腫瘍殺傷を評価した。さらに、カスパーゼ３／７色素を使用して、アポトーシス性腫瘍細胞を特定した。リアルタイム生細胞蛍光イメージングを可能にするＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３機械を使用して、培養物を分析した。共培養物を７２時間画像化した。各条件を３連で確立した。
【０５３４】
ＥｐｈＡ２／ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、初代ヒトＴ細胞およびがん細胞共培養アッセイで腫瘍細胞への細胞殺傷を誘導することを実証するデータが図５に示される。抗ＣＤ１３７  ｍＡｂアゴニストを対照として使用する。
【０５３５】
６．ヒトＰＢＭＣ−４Ｔ１共培養（サイトカイン放出）アッセイ
マウス乳腺腫瘍細胞株４Ｔ１−１（４Ｔ１−親）およびマウスネクチン−４過剰発現４Ｔ１（４Ｔ１−Ｄ０２）を、１０％熱失活ウシ胎児血清、１００Ｉ．Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００Ｉ．Ｕ／ストレプトマイシン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１×非必須アミノ酸および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ作業培地）で培養した。健康なヒトドナー由来の凍結ＰＢＭＣを解凍し、室温ＰＢＳ中で１回洗浄し、次いで、ＲＰＭＩ作業培地に再懸濁した。腫瘍細胞およびＰＢＭＣ共培養物について、１００００個ＰＢＭＣおよび２０００個腫瘍細胞（５：１）を混合し、３８４ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。ヒトＰＢＭＣを刺激するために、１２５ｎｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３  ｍＡｂ（クローンＯＫＴ３）を０日目に培養物に添加した。試験化合物、対照化合物またはビヒクル対照をそれぞれのウェルに添加し、１ウェル当たりの最終体積を１００μｌにした。プレートを５％ＣＯ２で、３７℃細胞培養インキュベーターで最大３日間インキュベートした。上清を刺激４８時間後に回収し、ＨＴＲＦアッセイを使用して、ヒトＩＬ−２およびＩＦＮγを検出した。ＥｘｃｅｌまたはＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して生データを分析して、標準曲線を作成して、タンパク質濃度を内挿した。データは、２連で、実験で試験した３人の異なるドナーのＰＢＭＣを使用した１つの試験を表す。
【０５３６】
図７に示されるデータは、ネクチン−４／ＣＤ１３７ヘテロタンデムがＰＢＭＣ−４Ｔ１共培養アッセイで堅牢なＩＬ−２およびＩＦＮ−γサイトカイン分泌を誘導することを実証している。ＢＣＹ９３５０およびＢＣＹ９３５１は、それぞれネクチン−４およびＣＤ１３７についての非結合対照である。
【０５３７】
ヒトＰＢＭＣ−４Ｔ１共培養（サイトカイン放出）アッセイで選択されたネクチン−４／ＣＤ１３７ヘテロタンデムペプチドによって誘導されるＥＣ５０（ｎＭ）および最大ＩＦＮ−γサイトカイン分泌（ｐｇ／ｍｌ）の概要を以下の表６に報告する。
【０５３８】
【表９】
2021520378.tif 000225
【０５３９】
７．エキソビボ培養プロトコル
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＤＬＳ）製の初代患者由来腫瘍細胞を、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを新たに添加した１０ｍＬ予熱洗浄培地中で穏やかに解凍する。Ｇｒｅｉｎｅｒ製の３Ｄスフェロイドキット（カタログ番号６５５８４０）を使用して、培養中の細胞を２日間維持する。手短に言えば、腫瘍細胞を、血球計数器を使用してトリパンブルーで計数する。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して洗浄し、ペレットを、１×１０６個細胞当たり１００μＬのＮ３Ｄナノシャトルに再懸濁する。これらを磁性にするために、細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心沈殿し、再懸濁する；このプロセスを合計４回繰り返す。最後の遠心後、細胞を適量の新鮮な肺ＤＴＣ培地（ＤＬＳ）に再懸濁して、１００μＬ／ウェルで１ウェル当たり５００００〜１０００００個の細胞を得る。Ｇｒｅｉｎｅｒ製のセルリペレント（ｃｅｌｌ−ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ）９６ウェルプレート（カタログ番号６５５９７６）をこの実験に使用する。目に見える細胞塊または細胞片が存在する場合、試料を蒔く前に７０〜１００μｍフィルターに適用する。１試料当たり少なくとも５００００個の細胞を０日目のフローサイトメトリーパネルのために取っておき、これらの細胞を染色し、固定し、後のフロー分析のために４℃で保管する。対照／試験化合物希釈物を、肺ＤＴＣ培地中２倍で別々のプレートに調製し、１００μＬ／ウェルのこれらの２×薬物溶液をプレートマップによって記載されるようにウェルに添加する。次いで、アッセイプレートを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿チャンバー中、９６ウェル磁気スフェロイドドライブに置く。２４時間で、磁気スフェロイドドライブを除去する。４８時間で、培地をサイトカイン分析のために回収し、細胞を２日目のフローサイトメトリーパネルのために回収する。Ｌｕｍｉｎｅｘリーダーで、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製のカスタムビルドサイトカイン／ケモカインパネル（ＩＰ−１０、グランザイムＢ、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０、ＭＩＧ）を使用して、サイトカインを定量化する。フローパネル：０日目＝生／死、ＣＤ４５、ＥｐＣＡＭ、ネクチン４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３７；２日目＝生／死、ＣＤ４５、ＥｐＣＡＭ、ネクチン４、ＣＤ３、ＣＤ８、Ｋｉ６７、および計数ビーズ。フローデータをＦｌｏｗｊｏソフトウェアで分析する。
【０５４０】
図８に示されるデータは、ネクチン−４／ＣＤ１３７ヘテロタンデムが、初代患者由来肺腫瘍のエキソビボ培養物中で標的依存性サイトカイン放出を誘導することを実証している。ＢＣＹ１０５７２の処理によって、患者由来試料において、いくつかの免疫マーカー（ビヒクルに対して正規化）およびＣＤ８＋ｋｉ６７＋Ｔ細胞％のネクチン−４依存性変化が誘導された。
【０５４１】
８．ＳＤラットにおけるＣＤ１３７二重特異性の薬物動態
雄ＳＤラットに、２５ｍＭヒスチジンＨＣｌ、１０％スクロース  ｐＨ７に製剤化された２ｍｇ／ｋｇの各二環多量体を投与した。各時点で、顎下または伏在静脈を介して、連続出血（約８０μＬ血液／時点）を実施した。全ての血液試料を直ちに抗凝固剤として２μＬ  Ｋ２−ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）を含有する予冷マイクロ遠心チューブに移し、湿潤氷上に置いた。血液試料を、およそ４℃、３０００ｇでの遠心分離によって、血漿のために直ちに処理した。内部標準を含む沈殿剤を直ちに血漿に添加し、十分混合し、１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を予め標識したポリプロピレンマイクロ遠心チューブに移し、次いで、ドライアイス上で急速凍結した。試料を分析まで必要に応じて７０℃以下で保管した。上清試料７．５μＬを、正イオンモードでＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅを使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために直接注入して、二環多量体の濃度を決定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ６．３ソフトウェアプログラムを使用して、非コンパートメントアプローチによって時間に対する血漿濃度データを分析した。Ｃ０、Ｃｌ、Ｖｄｓｓ、Ｔ１／２、ＡＵＣ（０−ｌａｓｔ）、ＡＵＣ（０−ｉｎｆ）、ＭＲＴ（０−ｌａｓｔ）、ＭＲＴ（０−ｉｎｆ）および時間に対する血漿濃度プロファイルのグラフを報告した。
【０５４２】
図１０は、ＳＤラット（ｎ＝３）における２ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ投与からのＢＣＹ１０５７２およびＢＣＹ１００００の時間に対する血漿濃度の曲線を示す。実験からの薬物動態パラメータは、表７に示される通りである。
【０５４３】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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