(57)【要約】本発明は、細胞のＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）遺伝子のタイプを決定する方法であって、（ａ）前記細胞で発現されたＪ遺伝子のタイプを決定するステップ、および（ｂ）（ａ）から、前記細胞で発現されたＴＲＢＣ遺伝子のタイプを推測するステップを含む、方法に関する。本発明はさらに、Ｔ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプ１に標的化されたＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプ２に標的化されたＣＡＲ  Ｔ細胞の使用に関する。本発明はさらに、薬物処置の方法、および核酸プローブに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）遺伝子のタイプを決定する方法であって、
（ａ）前記細胞で発現されたＪ遺伝子のタイプを決定するステップ、および
（ｂ）（ａ）から、前記細胞で発現されたＴＲＢＣ遺伝子のタイプを推測するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）が、
（ｉ）前記細胞から、核酸を抽出するステップ；
（ｉｉ）前記核酸から、前記Ｊ遺伝子の少なくともセグメントのヌクレオチド配列を決定するステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で決定された前記ヌクレオチド配列を、１つまたは複数のＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列と比較するステップ、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の前記Ｊ遺伝子の参照ヌクレオチド配列に対する、（ｉｉ）の前記Ｊ遺伝子の前記セグメントの前記ヌクレオチド配列の配列同一性から、前記Ｊ遺伝子のタイプを同定するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｊ遺伝子の参照ヌクレオチド配列が、表１の通りである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｊ遺伝子の前記セグメントが、Ｔ細胞受容体遺伝子のＪ領域全体を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｊ遺伝子の前記セグメントが、Ｔ細胞受容体遺伝子のＣＤＲ３に含まれている、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記Ｊ遺伝子の前記セグメントが、
【表７】
2021532792.tif 000020
からなる群より選択される、請求項２から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｉｉ）が、
（１）前記核酸を、前記Ｊ遺伝子の少なくともセグメントの増幅のための試薬と接触させるステップ；
（２）インキュベートして、増幅させるステップ；
（３）前記Ｊ遺伝子の増幅したセグメントのヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む、請求項２から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記増幅のための試薬が、Ｔ細胞受容体遺伝子のＶ領域に配置された少なくとも１つのフォワードプライマーおよびＴ細胞受容体遺伝子のＪ領域に配置された少なくとも１つのリバースプライマーを含むか、または前記増幅のための試薬が、Ｔ細胞受容体遺伝子のＶ領域に配置された少なくとも１つのリバースプライマーおよびＴ細胞受容体遺伝子のＪ領域に配置された少なくとも１つのフォワードプライマーを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１０】
（２ａ）前記Ｊ遺伝子の増幅されたセグメントの電気泳動を行うステップ；
（２ｂ）ヌクレオチドシーケンシングのために、ステップ（２ａ）からの優勢な増幅生成物を選択するステップ
をさらに含む、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）が、前記細胞に対してクローン性の決定またはイムノシーケンスを行って、前記Ｊ遺伝子に関するヌクレオチド配列情報を提供するステップ、および前記ヌクレオチド配列情報から、前記Ｊ遺伝子のタイプを決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列を決定するステップが、ＮＧＳ分析を含む、請求項２から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、細胞の集団内に存在し、ステップ（ａ）が、
（ｉ）前記細胞の集団から核酸を抽出するステップ；
（ｉｉａ）前記核酸から、前記Ｊ遺伝子の少なくともセグメントのヌクレオチド配列を決定して、ヌクレオチド配列の集団を生成するステップ；
（ｉｉｂ）前記ヌクレオチド配列の集団から、ヌクレオチド配列を選択するステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉｂ）で選択された前記ヌクレオチド配列を、１つまたは複数のＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列と比較するステップ、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の前記Ｊ遺伝子の参照ヌクレオチド配列に対する、（ｉｉｂ）の前記Ｊ遺伝子の前記セグメントの前記ヌクレオチド配列の配列同一性によって、前記Ｊ遺伝子のタイプを同定するステップ
を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）を有するかまたは有する疑いのある被験体由来である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）を処置する方法であって、
（ａ）請求項１から１５のいずれかに従って、前記被験体からのＰＴＣＬ細胞のＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプを決定するステップ；および
（ｂ）（ａ）で決定されたＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプに標的化されたＣＡＲ  Ｔ細胞を前記被験体に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）の処置で使用するための、Ｔ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプ１に標的化されたＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプ２に標的化されたＣＡＲ  Ｔ細胞であって、前記処置は、請求項１６に記載の方法を含む、ＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１８】
以下：
【表８】
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からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸プローブ。
【請求項１９】
請求項１８に記載の少なくとも２つの異なる核酸プローブを含む核酸アレイ。
【請求項２０】
コンピューターで実行される場合、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法のステップ（ａ）から（ｂ）を実行するよう、より好適には、請求項２から１５のいずれか一項に記載の方法のステップ（ｉｉ）から（ｉｖ）を実行するように、より好適には、請求項２から１５のいずれか一項に記載の方法のステップ（ｉｉａ）から（ｉｖ）を実行するように、最も好適には、請求項２から１５のいずれか一項に記載の方法のステップ（ｉｉｉ）から（ｉｖ）を実行するように動作可能なコンピュータープログラム製品。
【請求項２１】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品を有するデータキャリアまたは記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、特に、ＰＴＣＬなどの特定の細胞で発現される定常領域の遺伝子のタイプを決定することにおけるＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）使用の分子的評価の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、非ホジキンリンパ腫の１０％から１５％に相当し、２３個の異なる実体で構成される。疾患のうちこのサブセットにおける標準的治療は、変動的であり、患者の６５％は、難治性であるかまたは標準的療法の後に再発する。ＰＴＣＬに特異的な標的の不足が、これらの疾患のための標的化免疫療法の開発を妨げてきた。
【０００３】
αβＴＣＲは、汎Ｔ細胞抗原である。αβＴＣＲは、正常なＴ細胞でのその発現を除けば、ＰＴＣＬを処置するための非常に有望な標的である。
【０００４】
したがって、Ｔ細胞白血病および／またはリンパ腫の処置への１つのアプローチは、Ｔ細胞受容体を抗原として標的化することである。このアプローチは、その抗原を有している細胞の効率的な破壊をもたらすことができ、これは、Ｂ細胞悪性疾患に対して非常に有効であったアプローチである。しかしながら、Ｂ細胞のアブレーションとは対照的に、患者からのＴ細胞集団の除去は、それほど許容されていない。Ｔ細胞区画のアブレーションに関連する重度の毒性は、健康なＴ細胞で発現される抗原の標的化のリスクを増大させる。これは、極めて毒性が高く、患者を危険なほどに感染に曝した状態にする。
【０００５】
ＴＣＲβ鎖組換えの特色は、β鎖定常領域に関連する２つの遺伝子：ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２があることである。各Ｔ細胞（したがって各Ｔ細胞がん）は、不可逆的にＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかを選択して、ＴＣＲに取り込む。
【０００６】
およそ３５％の正常かつウイルス特異的なＴ細胞は、ＴＲＢＣ１を発現し、６５％はＴＲＢＣ２を発現する。ＴＲＢＣ１を発現する腫瘍を標的化することは、腫瘍細胞を枯渇させ、一方で残りのＴ細胞は、放置されて拡大増殖し、Ｔ細胞区画を満たし、感染と戦うはずである。
【０００７】
成熟Ｔ細胞がんを処置するための、ＴＲＢＣ１を標的化するが、ＴＲＢＣ２を標的化しないＣＡＲ  Ｔ細胞が記載されている。この戦略の成功の鍵は、正しいＴＣＲベータ定常領域を発現するリンパ腫を有する患者の選択である。
【０００８】
当該分野では、Ｔ細胞（Ｔ細胞がん）のＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のタイプを決定することが課題となっている。
【０００９】
Ｔ細胞リンパ腫患者の総合診断をカバーし、それにより被験体から単離された腫瘍試料中の全Ｔ細胞のうちのあるパーセンテージが、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２陽性であると確認される戦略が記載されている。抗ＴＲＢＣ１キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を使用する、ＴＲＢＣ１＋Ｔ細胞の標的化された殺滅が記載されている（Maciocia  et  al  2017  Nature  Medicine  volume  23,  pages  1416-1423）。ＴＲＢＣ１／ＴＲＢＣ２を発現する細胞は、ＴＲＢＣ１発現細胞に特異的なＪＯＶＩ−１  ｍＡｂを使用して区別された。これは労力を要し、ＩＨＣ方法は主観的なことがあり、これらは、このアプローチの欠点である。
【００１０】
ＷＯ２０１６０５１２０５Ａ１は、Ｔ細胞の集団の単型（monotypia）を調査する方法であって、Ｔ細胞の集団における、Ｔ細胞受容体ベータ鎖定常領域ＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２、ならびに／またはＴ細胞受容体ガンマ鎖定常領域ＴＲＧＣ１およびＴＲＧＣの発現を検出するステップを含む、方法を開示している。記載された技術は、定常領域のＩＨＣおよび／またはＲＮＡベースの直接検出に焦点を当てている。これらの方法は、信頼できない場合があり（例えばＩＨＣ）、および／またはＲＮＡの保存／抽出を必要とする場合があり（例えば直接検出）、これらのどちらも、これらの方法の欠点である。
【００１１】
ＷＯ２０１５／１３２５９８（ＡＵ２０１５２２５９４４に対応）は、Ｔ細胞悪性疾患の処置で使用するためのＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を記載している。しかしながら、悪性疾患のＴＲＢＣ１／ＴＲＢＣ２のタイプを正確に決定することは、当該分野において課題のままである。
本発明は、先行技術に関連する課題を克服しようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０５１２０５号
【特許文献２】国際公開第２０１５／１３２５９８号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Maciocia  et  al  2017  Nature  Medicine  volume  23,  pages  1416-1423
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
ＴＲＢＣ１を発現する腫瘍またはＴＲＢＣ２を発現する腫瘍のみを標的化することは、腫瘍細胞を枯渇させ、一方で残りのＴ細胞は、放置されて拡大増殖し、Ｔ細胞区画を満たし、感染と戦うはずである。
【００１５】
腫瘍がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現する細胞で構成されているかどうかを決定するための、患者の腫瘍の分子診断を可能にする方法が、本明細書に記載される。本方法は、核酸、好ましくはゲノムＤＮＡを得ることができるあらゆる患者試料に対して診断を行うことを可能にするという点で、他の方法より重要な利点を提供する。
【００１６】
したがって、本発明は、患者からの試料のＴＲＢＣタイピングを可能にする診断テストを提供する。この方式で、患者にとって適切な療法（すなわち、ＴＲＢＣ１を発現する細胞を標的化するか、またはＴＲＢＣ２を発現する細胞を標的化するための）を選択することができる。
【００１７】
本発明により教示されるアプローチは、有利には、試料中の細胞のＴＲＢＣタイプを決定するためにゲノムＤＮＡ分析を使用する。本発明者らは、ＴＣＲ遺伝子の、Ｊ領域（接合領域）のＣ領域（定常領域）への驚くほど近い遺伝子連鎖を発見した。本発明者らは、細胞のＴＲＢＣタイプが、Ｊ領域を研究すること、新たに発見されたＪ領域のＣ領域への連鎖を利用すること、および目的のＣ領域のＴＲＢＣタイプを推測することによって読み出すことができるということを見抜いた。
【００１８】
Ｃ領域およびＪ領域が、非常に大量の介在核酸によって分離されていることを考えると、このアプローチの成功は驚くべきことである。この遺伝学的距離の量は、通常、Ｊ領域とＣ領域との間のより一層緩い連鎖をもたらすと予想される。これらの理由のために、このようなＪ領域とＣ領域との間の信頼できる緊密な連鎖が観察され、本発明の診断方法を可能にしていることは非常に驚くべきことである。
【００１９】
この正確な遺伝学的アプローチが、いずれの「目による」免疫組織化学（ＩＨＣ）ベースの方法より優れており、より正確であることは、本発明のさらなる利点である。
【００２０】
先行技術のアプローチは、試料のＴＲＢＣタイプを決定するための抗体の使用を教示している。しかしながら、抗体ベースのアプローチは、そのアウトプットを評価するために、主観的な判断および／またはヒトの介入を必要とする。二値の回答（ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２）が提供されることは、本発明の利点である。
【００２１】
存在するＪ領域遺伝子の決定とＣ領域遺伝子の推測との間の、極めて高い信頼度および極めて低い誤り率（例えば組換え率）は、非常に驚くものである。当業者が、２つの遺伝子が連鎖している可能性を予期していたとしても、それらが本発明により教示されるような信頼できる診断情報を提供するほどに緊密に連鎖しているとは決して予測しなかったであろう。
【００２２】
多くの抗体は、固定された組織ではそれらのエピトープと結合せず、どちらかと言えば新鮮な、または凍結された組織でのみそれらと結合することが当該分野において周知である。当該分野において周知のように、組織の固定は、タンパク質構造に影響を与える可能性があり、それゆえに、抗体が、一方または他の試料タイプに存在しない／利用可能ではないエピトープを認識することがよくある。遺伝学的方法を使用することによって、試験が、固定された、または新鮮な、または凍結した組織に対して等しくよく機能することは、本発明の利点である。したがって本発明は、あらゆる試料タイプに広く適用可能であり、ＩＨＣ分析などの先行技術のアプローチの制限を克服する。
【００２３】
したがって、一態様において、本発明は、細胞のＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）遺伝子のタイプを決定する方法であって、
（ａ）前記細胞で発現されたＪ遺伝子のタイプを決定するステップ、および
（ｂ）（ａ）から、前記細胞で発現されたＴＲＢＣ遺伝子のタイプを推測するステップ
を含む、方法に関する。
【００２４】
「Ｊ遺伝子」は、当該分野におけるその通常の意味を有する。好適には、「Ｊ遺伝子」は、Ｔ細胞受容体遺伝子のジャンクションまたは接合セグメント（Ｊ領域）を指す。
【００２５】
好適には、用語「Ｖ領域」は、当該分野におけるその通常の意味を有し、すなわち、Ｔ細胞受容体遺伝子の可変領域または可変セクション（Ｖ領域）である。
【００２６】
好適には、用語「Ｃ領域」は、当該分野におけるその通常の意味を有し、すなわち、Ｔ細胞受容体遺伝子の定常領域または定常セクション（Ｃ領域）である。
【００２７】
好適には、用語「Ｄ領域」は、当該分野におけるその通常の意味を有し、すなわちＴ細胞受容体遺伝子の多様性領域または多様性セクション（Ｄ領域）である。
【００２８】
さらなる指針が必要な場合、注釈付き参照配列を以下に提供する。
【００２９】
好適には、ステップ（ａ）は、
（ｉ）前記細胞から、核酸を抽出するステップ；
（ｉｉ）前記核酸から、前記Ｊ遺伝子の少なくとも１つのセグメントのヌクレオチド配列を決定するステップ；および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で決定されたヌクレオチド配列を、１つまたは複数のＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列と比較するステップ、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列に対する、（ｉｉ）の前記Ｊ遺伝子のセグメントのヌクレオチド配列の配列同一性から、Ｊ遺伝子のタイプを同定するステップ
を含む。
【００３０】
好適には、前記Ｊ遺伝子の参照ヌクレオチド配列は、表１の通りである。
【００３１】
（ｉｉｉ）のＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列に対する（ｉｉ）の前記Ｊ遺伝子のセグメントのヌクレオチド配列の配列同一性を考慮すると、適切な科学的／統計的な信頼度でＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列を同定するのに（すなわちＪ遺伝子のタイプを同定するのに）十分なレベルの配列同一性が必要である。好適には、Ｊ遺伝子の参照ヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性の一致が必要である。好適には、配列同一性は、Ｊ遺伝子の参照ヌクレオチド配列の長さ全体にわたり評価される。好適には、クエリー配列およびＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列は、配列同一性決定を行う前に、アライメントする必要がある場合がある。配列のアライメントは、目視で行ってもよいし、または以下で論じられるような公知の配列アライメントツールを使用して行ってもよい。
【００３２】
好適には、前記核酸は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む。
【００３３】
好適には、前記Ｊ遺伝子の前記セグメントは、Ｔ細胞受容体遺伝子のＪ領域全体を含む。
【００３４】
好適には、前記Ｊ遺伝子の前記セグメントは、Ｔ細胞受容体遺伝子のＣＤＲ３に含まれている。
【００３５】
好適には、前記Ｊ遺伝子の前記セグメントは、
【表１−１】
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からなる群より選択される。
【００３６】
好適には、ステップ（ｉｉ）は、
（１）前記核酸を、前記Ｊ遺伝子の少なくともセグメントの増幅のための試薬と接触させるステップ；
（２）インキュベートして、増幅させるステップ；
（３）前記Ｊ遺伝子の増幅したセグメントのヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む。
【００３７】
好適には、前記増幅のための試薬は、Ｔ細胞受容体遺伝子のＶ領域に配置された少なくとも１つのフォワードプライマーおよびＴ細胞受容体遺伝子のＪ領域に配置された少なくとも１つのリバースプライマーを含むか、または前記増幅のための試薬は、Ｔ細胞受容体遺伝子のＶ領域に配置された少なくとも１つのリバースプライマーおよびＴ細胞受容体遺伝子のＪ領域に配置された少なくとも１つのフォワードプライマーを含む。
【００３８】
好適には、前記方法は、
（２ａ）前記Ｊ遺伝子の増幅されたセグメントの電気泳動を行うステップ；
（２ｂ）ヌクレオチドシーケンシングのために、ステップ（２ａ）からの優勢な増幅生成物を選択するステップ
をさらに含む。
【００３９】
好適には、ステップ（ａ）は、前記細胞に対してクローン性の決定またはイムノシーケンシングを行って、前記Ｊ遺伝子に関するヌクレオチド配列情報を提供するステップ、および前記ヌクレオチド配列情報から、Ｊ遺伝子のタイプを決定するステップを含む。
【００４０】
好適には、ヌクレオチド配列を決定するステップは、ＮＧＳ分析を含む。
【００４１】
一実施形態において、好適には、前記細胞は、細胞の集団内に存在し、ステップ（ａ）は、
（ｉ）前記細胞の集団から核酸を抽出するステップ；
（ｉｉａ）前記核酸から、前記Ｊ遺伝子の少なくともセグメントのヌクレオチド配列を決定して、ヌクレオチド配列の集団を生成するステップ；
（ｉｉｂ）前記ヌクレオチド配列の集団から、ヌクレオチド配列を選択するステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉｂ）で選択されたヌクレオチド配列を、１つまたは複数のＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列と比較するステップ、および
（ｉｖ）（ｉｉｂ）の前記Ｊ遺伝子のセグメントのヌクレオチド配列の、（ｉｉｉ）のＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列に対する配列同一性によって、Ｊ遺伝子のタイプを同定するステップ
を含む。
【００４２】
ヌクレオチド配列をＮＧＳによって決定する場合、および／または細胞の集団からの核酸についてヌクレオチド配列を決定する場合、配列決定手順の間に、複数のヌクレオチド配列が生成されることに留意されたい。これは、熟練した操作者には周知である。したがって、ＮＧＳ装置によって決定されたら、「生の」ヌクレオチド配列データを評価しなければならない。不適切なデータは、捨てられる。
【００４３】
例えば、試料は、２つまたはそれより多くのクローン再編成を用いて検出することができる。Ｄ／Ｊ再編成などの不完全な再編成からのデータは、好適には、捨てられる。完全なＶ／Ｊ再編成に焦点が当てられる。したがって、２つまたはそれより多くのクローン再編成を示す試料の場合、データの列が、不完全な再編成、例えばＤ／Ｊ再編成または無−Ｊ再編成（ｎｏｎｅ−Ｊ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）または他の不完全な再編成に関する場合、その列は捨てられる。Ｖ／Ｊ再編成配列データが保持される。好適には、ヌクレオチド配列データは、Ｖ／Ｊ再編成された核酸からのものである。
【００４４】
例えば、試料は、クローン性を示していなくてもよい。クローン性を評価するための指針は当該分野において周知であり、以下で説明され、表３に提示される。例えば、トップの総リード％が１．０％未満である場合、データは、非クローン性とみなされる。非クローン性のデータは、好適には、捨てられる。クローン性のデータに焦点が当てられる。好適には、ヌクレオチド配列データは、クローン性核酸からのものである。
【００４５】
例えば、ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  ＮＧＳシステムを使用すれば、最小限のＤＮＡインプット要件は、試料１つ当たり５０ｎｇである。ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  ＮＧＳシステムのＩＦＵ２８０４１０によれば、５０ｎｇ未満の核酸を有する試料は、「評価不可能」とみなされる。評価不可能なデータは、好適には、捨てられる。評価可能なデータに焦点が当てられる。好適には、ヌクレオチド配列データは、評価可能な試料からのものである。好適には、ヌクレオチド配列データは、少なくとも５０ｎｇの核酸を含む試料からのものである。
【００４６】
好適には、前記細胞は、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）を有するかまたは有する疑いのある被験体由来である。
【００４７】
好適には、前記細胞は、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）細胞である。
【００４８】
一態様において、本発明は、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）を処置する方法であって、
（ａ）上述した通りに、前記被験体からのＰＴＣＬ細胞のＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプを決定するステップ；および
（ｂ）（ａ）で決定されたＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプに標的化されたＣＡＲ  Ｔ細胞を前記被験体に投与するステップ
を含む、方法に関する。
【００４９】
一態様において、本発明は、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）の処置で使用するための、Ｔ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプ１に標的化されたＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）のタイプ２に標的化されたＣＡＲ  Ｔ細胞であって、前記処置は、上述した処置する方法を含む、ＣＡＲ  Ｔ細胞に関する。
【００５０】
一態様において、本発明は、
【表１−２】
2021532792.tif 000004
からなる群より選択される、ヌクレオチド配列を含む、またはヌクレオチド配列からなる核酸プローブに関する。
【００５１】
一態様において、本発明は、上述した少なくとも２つの異なる核酸プローブを含む核酸アレイに関する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、棒グラフを示す。
【図２】図２は、図表を示す。
【図３】図３は、図表を示す。
【図４】図４は、ＩＭＧＴアウトプットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
ＴＣＲ多様性は、各ＴＣＲ鎖が、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、接合（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を選択するときに起こる体細胞組換えによって生成される。ＴＣＲ  β鎖のジャンクション領域は、定常ドメインで隔離されている。ＶＤＪ組換えは、ゲノムＤＮＡレベルで起こり、ｍＲＮＡ転写は、あらゆる介在配列をスプライシングで切り出し、ＴＣＲ  Ｃβ鎖の全長タンパク質の翻訳を可能にする。ＤＮＡレベルでのＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２定常領域間の大きい介在領域の存在により、ＴＲＢＪ１−１〜ＴＲＢＪ１−６を選択するＴＣＲは、ＴＲＢＣ１を使用し、ＴＲＢＪ２−１〜ＴＲＢＪ２−７を選択するＴＣＲは、ＴＲＢＣ２を使用することが、本明細書で開示される。したがって、本発明者らは、使用されるＪ領域を同定することによって、ＴＣＲのＣ領域の使用を推測することが可能であることを実証する。
【００５４】
ＴＣＲは、所与のＴ細胞が抗原に曝露されるとき、体細胞超変異に供されない。したがって、一旦再編成が起こったら、所与のＴ細胞クローンの特異性は、変化しないままである。ＴＣＲクローン性試験は、慣例的に、Ｔ細胞リンパ増殖性障害のための診断ツールとして使用される。簡単に言えば、ＶＤＪが組み換えられた可変領域を増幅するのにマルチプレックスプライマーが使用され、優勢なクローンの存在は、電気泳動を介して可視化でき、優勢なＰＣＲ生成物のシーケンシングは、腫瘍のクローン型を解明することができる。ＴＣＲクローン性とＮＧＳシーケンシングの組合せは、ゲノムの数百万ものセグメントを同時に測定することを可能にし、膨大な数の浸潤Ｔ細胞の存在下におけるクローンの同定などの従来のシーケンシングに関連する限界を克服することができる。
【００５５】
Ｔ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）の定常領域に関する２つの遺伝子、すなわちＴＲＢＣ１およびＴＲＢＣ２があることが公知である。これらの２つの遺伝子は、遺伝学的重複によって生じたものと考えられ、機能的に同等とみなされる。２つの遺伝子産物は、４つのアミノ酸が異なるだけである。これらの類似性にもかかわらず、腫瘍がクローン性であるため、この差は有利に利用できる。それゆえに、所与の悪性疾患における細胞のそれぞれは、それから腫瘍が発生する元のＴ細胞と同じＴＲＢＣ遺伝子を有すると予想される。それゆえに、所与の患者において、悪性細胞の全てが、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかであると予想される。
【００５６】
いずれの所与の個体においても、正常なＴ細胞のおよそ３５％が、ＴＲＢＣ１を発現し、残りの６５％が、ＴＲＢＣ２を発現する。これは、全てのＴＲＢＣ１を発現する細胞を選択的に標的化し、同時に、全てのＴＲＢＣ２を発現する細胞を生存したままにする機会（またはその逆）を提供する。この方法で、悪性疾患を標的化でき、同時にこれは、その患者における同じＴＲＢＣタイプの健康なＴ細胞の集団も標的化すると予想され、他のＴＲＢＣタイプを発現する健康なＴ細胞集団の残りを標的化しないと予想される。それゆえに、どちらのＴＲＢＣタイプが標的化されても、健康なＴ細胞集団の残りの部分は患者内に維持されるはずであり、それにより患者は免疫エフェクター機能を維持したままになり、同時に患者の悪性疾患が低減または排除される。この洗練された療法を実施するために、あらゆる所与の患者の悪性細胞で発現されるＴＲＢＣ遺伝子を正確かつ効率的に決定することが極めて重要である。本発明は、この問題の解決法を提供する。
【００５７】
本発明者らは、健康なヒトＴ細胞のＮＧＳ分析を介して、圧倒的多数の場合において、ＴＲＢＪ１がＣ１に連鎖し、ＴＲＢＪ２がＣ２に連鎖していることを実証した。したがって、患者腫瘍におけるＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２発現の診断は、クローン性ベースのアッセイを使用するＪ領域の分析を介して行うことができる。
【００５８】
ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２を発現する腫瘍を同定するのに使用された以前の戦略は、フローサイトメトリーアッセイまたは新鮮な組織でのみ機能する抗体染色方法の使用を前提とする。記載された方法はＤＮＡをゲノムレベルで照会するため、固定された組織は、原材料として使用することができ、これは本発明の利点である。
【００５９】
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫におけるＴＲＢＣ使用の分子的評価に関する。好適には、分子的評価は、核酸ベースの評価である。
【００６０】
好適には、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞である。
【００６１】
本発明は、ＮＧＳ分析を使用して、Ｊ１／Ｃ１およびＪ２／Ｃ２間の連鎖を利用する。
【００６２】
細胞／試料
本発明は、Ｔ細胞受容体β鎖を発現するあらゆる細胞に適用することができる。好適には、細胞は、哺乳動物細胞であり、好適には、細胞は、霊長類細胞であり、好適には、細胞は、ヒト細胞である。好適には、細胞は、Ｔ細胞であるか、またはＴ細胞由来である。
【００６３】
Ｔ細胞由来の細胞は、新生物性細胞、例えばリンパ腫細胞および／または腫瘍細胞を含む。
【００６４】
好適には、細胞は、新生物性細胞であり得る。好適には、細胞は、悪性細胞であり得る。好適には、細胞は、がん細胞であり得る。好適には、細胞は、腫瘍細胞であり得る。
【００６５】
好適には、細胞は、目的の被験体からの試料中に含まれているか、またはその中に存在する。好適には、試料は、被験体における腫瘍または疑いのある腫瘍から採取した試料であり得る。
【００６６】
好適には、試料は、生検材料、例えば腫瘍生検材料であり得る。
【００６７】
好適には、試料は、血液試料であり得る。これは、本発明を使用して微小残存病変（ＭＲＤ）をモニタリングする場合、特に有利である。
【００６８】
試料は、扁桃試料であり得る。
【００６９】
好適には、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である。好適には、試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試料である。好適には、試料は、被験体から予め収集されたものである。好適には、本方法は、ヒトまたは動物の体からの試料の収集を含まない。好適には、本方法は、ヒトまたは動物の体に実施されない。好適には、本方法は、ヒトまたは動物の体の存在を必要としない。
【００７０】
コンピューターでの実施
好適には、本方法は、少なくとも部分的に、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで実行することができる。
【００７１】
上述した本発明の実施形態が、少なくとも部分的に、ソフトウェア制御されたデータ処理装置を使用して実施される限りにおいて、このようなソフトウェアによる制御を提供するコンピュータープログラムおよびこのようなコンピュータープログラムが保存される記憶媒体は、本発明の態様として想定されることが理解されるであろう。
【００７２】
したがって本発明は、前記データ処理装置を操作する方法、本方法を実行するための装置のセットアップ、および／またはコンピュータープログラムそれ自体を提供する。本発明はまた、プログラムを搭載する物理媒体、例えばコンピュータープログラム製品、例えば、プログラムを搭載する、データキャリア、記憶媒体、コンピューター読取り可能な媒体またはシグナルにも関する。
【００７３】
ソフトウェアによって制御された試料取り扱い装置が採用される場合、このようなコンピュータープログラムには明らかに、試料を提供することなどのステップが包含されると予想される。しかしながら、操作者の選択においてこのようなステップが手動で実行される場合、コンピューターによって実施される方法のステップが、本方法のデータを処理するステップを含むかまたはそれからなることが理解されるであろう。
【００７４】
一態様において、本発明は、コンピューターで実行される場合、上述した方法のステップ（ａ）および（ｂ）を実行するように、好適には、上述した方法のステップ（ｉｉ）から（ｉｖ）、より好適には、上述した方法のステップ（ｉｉａ）から（ｉｖ）を実行するように、最も好適には、上述した方法のステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を実行するように動作可能なコンピュータープログラム製品に関する。
【００７５】
一態様において、本発明は、上述したコンピュータープログラム製品を有するデータキャリアまたは記憶媒体に関する。
【００７６】
細胞の集団
本発明は、Ｔ細胞の集団に適用することができる。例えば、本発明は、目的の試料中の、Ｔ細胞の集団、またはＴ細胞由来の細胞に適用することができる。このシナリオでは、その集団内の目的の特定の細胞のＴＲＢＣタイプを決定することが重要であり得る。その集団内の目的の細胞の選択は、例えば、目的の組織からの試料、例えば目的の腫瘍もしくは疑いのある腫瘍からの試料を使用することによって物理的に行ってもよいし、または例えば、分析に供された細胞の集団から決定されたヌクレオチド配列の集団内から特定のクローンを選択することによって、コンピューターで行ってもよい。例えば、優勢なクローン、すなわち、分析された集団内において最大数の「リード」または核酸分子を示すクローンの配列を選択することが望ましい場合がある。代替として、増幅された核酸を、例えば電気泳動によって分離してもよいし、その段階で、シーケンシングのために優勢なクローンを選択してもよい。分析内で個々のクローン（それゆえに個々の細胞）を選び出すために使用される特定の様式は、操作者の選択の範疇である。この方式で、本発明は、細胞の集団に実行される分析内において、特定の１つまたは複数の細胞に有利に適用することができる。
【００７７】
核酸
広範な態様において、核酸は、細胞中に存在するあらゆる核酸であり得る。
【００７８】
好適には、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。好適には、核酸は、ＤＮＡを含むかまたはそれからなる。好適には、核酸は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含むかまたはそれからなる。
【００７９】
核酸、例えばＤＮＡは、好適には、熟練者に公知のあらゆる技術を使用して、試料中の細胞から抽出される。好適には、核酸は、標準的な商業的に入手可能なＤＮＡ抽出キットを使用して抽出される。最も好適には、核酸は、ＱＩＡＧＥＮ  Ｌｔｄ．、Ｓｋｅｌｔｏｎ  Ｈｏｕｓｅ、Ｌｌｏｙｄ  Ｓｔｒｅｅｔ  Ｎｏｒｔｈ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、Ｍ１５  ６ＳＨ、Ｕ．Ｋ．からのＧｅｎｅＲｅａｄ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥキット（カタログ番号／ＩＤ：１８０１３４）を使用して抽出される。
【００８０】
必要に応じて、本発明の方法は、ステップ（ａ）および（ｂ）で決定された情報から、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）のクローン型を推測する、さらなる必要に応じたステップを含む。
【００８１】
好適には、本発明で分析される核酸は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である。一実施形態において、本発明は、分析される出発材料／核酸としてＲＮＡを使用して実施され得る。しかしながら、ＲＮＡは、生検材料などの試料中にそれを保存するために、ある特定の処置を必要とする。最初の試料または生検材料にこの処置が行われない場合、患者に再生検を行うことを必要とする場合があり、これは、望ましくない２回目の侵襲的手順である。したがって、分析される核酸が好適にはｇＤＮＡであることは、本発明の利点である。ｇＤＮＡは、典型的にはＲＮＡより安定である。
【００８２】
微小残存病変（ＭＲＤ）を分析する場合、ＲＮＡが分析される場合がある。しかしながら、ＭＲＤをモニタリングする段階では、典型的には腫瘍ＶＤＪ領域の配列が決定されている。したがって、患者におけるＭＲＤを追跡する場合、単にその患者からの試料から抽出されたＲＮＡ中の公知の転写物を、例えばその配列のＣＤＲ中のプライマーを使用することによって検出することが、典型的であると予想される。この方式で、申し分のない特異性が、（例えば）ＣＤＲ３をコードする部分などの核酸の好適な部分に向けられたプライマーにより達成される。それゆえに、本発明のＴＲＢＣ１／２のタイピング方法は、ＭＲＤのモニタリングにも適用できる一方で、これは、有利なことに、患者の処置中にすでに決定された腫瘍クローンの特異的な転写物を検出するＲＮＡベースのアプローチと組み合わせることができる。
【００８３】
ＣＤＲ（相補性決定領域）は当該分野において周知である。これらの領域を説明および定義する、例えば（Kabat  et  al.,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  5th  Ed.  Public  Health  Service,  National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  Md.  (1991)）およびそれに続く多数の刊行物を参照されたい。
【００８４】
Ｔ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）遺伝子−参照配列
好適には、本明細書の全ての配列は、ヒトＴＲＢＣを参照して論じられる。
【００８５】
野生型ヒト遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ配列を参照することが有用であり得る。
【００８６】
Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃ領域を含む全体的な遺伝子座／複合遺伝子の構造は、当該分野において公知であり、Ｃ１タイプ、Ｃ２タイプ、Ｊ１タイプおよびＪ２タイプの配列を含む。少なくとも、７つのＪ１バリアントおよび９つのＪ２バリアントがある。さらなる指針が必要な場合、本発明者らは、表１を参照する。
【００８７】
ＧｅｎＢａｎｋは、Benson,  D.  et  al,  Nucleic  Acids  Res.  45(D1):D37-D42  (2017)に記載される配列データベースである。より詳細には、ＧｅｎＢａｎｋは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、国立医学図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、３８Ａ、８Ｎ８０５、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４、ＵＳＡによって管理されている通りのものである。好適には、配列データベースの現在のバージョンに依拠する。代替として、出願日に有効なリリースに依拠する。誤解を避けるために言えば、ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋリリース２２５．０（２０１８年４月１５日）に依拠する。
【００８８】
何らかのさらなる指針が必要な場合において、本発明者らは、以下の参照配列（配列番号３１）：＞３８６７５３０９＿Ｂ９７＃１＿ＴＲＢＣ２を参照する。
【化１】
2021532792.tif 000005
【００８９】
好適には、接合またはＪ領域は、上記の下線で示される配列に対応する配列を含むか、またはより好適にはそれからなる。より好適には、接合またはＪ領域は、上記の下線で示される配列を含むか、またはより好適にはそれからなる。
【００９０】
より詳細には、配列番号３１は、再編成されたベータ鎖のための参照配列である。これは、本発明者らによってシーケンシングされたＮＧＳライブラリーからの例である。
【００９１】
本明細書において特定のヌクレオチドが数字のアドレスを使用して言及される場合、番号付けは、上記で示したような野生型ＴＲＢＣヌクレオチド配列（例えば配列番号３１）を参照しながらなされている。この配列は、目的の特徴／残基の場所を特定するために当該分野においてよく理解されている通りに使用されることとする。これは、必ずしも厳密な数え上げ作業とは限らず、文脈に注意を払う必要がある。例えば、目的の配列がわずかに異なる長さを有する場合、その配列における正しいヌクレオチドの配置は、配列をアライメントし、等価な、または対応するヌクレオチドを選び出すことを必要とする場合がある。これは十分に、熟練した読者の範囲内である。
【００９２】
Ｖ／Ｄ／Ｊ／Ｃ領域の決定
明らかに、個々の患者間に配列のバリエーションがあることが予測される。これは、個々の遺伝学的な変動性／対立遺伝子の差のために、全ての哺乳動物遺伝子に当てはまる。しかしながら、周知の通り、これは、特に、本発明の主題であるＴＲＢＣ遺伝子領域などの高度可変領域に関する場合である。それゆえに、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を検査すること、およびそれがＶ／Ｊ／Ｄ／Ｃ領域であるか、または上記のどれでもないかを決定することにおいて、標準的なアプローチ、例えばソフトウェア（例えばＩＭＧＴ（商標）ソフトウェア）を使用する生物情報科学的なアプローチを採用してもよい。
【００９３】
ＩＭＧＴ（商標）、すなわち国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（商標）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇは、Ｍａｒｉｅ−Ｐａｕｌｅ  Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  ｄｅ  ＭｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒおよびＣＮＲＳ）によって１９８９年に作成された、免疫遺伝学およびイムノインフォマティクスにおける包括的な参照である。ＩＭＧＴ（商標）は、ヒトおよび他の脊椎動物種の、免疫グロブリン（ＩＧ）または抗体、Ｔ細胞受容体（ＴＲ）、主要組織適合性（ＭＨ）において、ならびに、脊椎動物および無脊椎動物の免疫系（ＲＰＩ）の、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）、ＭＨスーパーファミリー（ＭｈＳＦ）および関連タンパク質において特殊化された高品質の総合知識源である。ＩＭＧＴ（商標）は、ＩＭＧＴ−ＯＮＴＯＬＯＧＹおよびＩＭＧＴ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのチャートルールの概念に基づく、配列、ゲノムおよび構造免疫遺伝学データへの共通のアクセスを提供する。
【００９４】
何らかのさらなる情報が必要な場合、本発明者らは、Lefranc  M-P,  Giudicelli  V,  Duroux  P,  Jabado-Michaloud  J,  Folch  G,  Aouinti  S,  Carillon  E,  Duvergey  H,  Houles  A,  Paysan-Lafosse  T,  Hadi-Saljoqi  S,  Sasorith  S,  Lefranc  G,  Kossida  S.  Nucleic  Acids  Res.  2015  Jan;43(Database  issue):D413-22.  "IMGTTM,  the  international  ImMunoGeneTics  information  systemTM  25  years  on.",  Lefranc,  M.-P.,  Front  Immunol.  2014  Feb  05;5:22    "Immunoglobulin  (IG)  and  T  cell  receptor  genes  (TR):  IMGTTM  and  the  birth  and  rise  of  immunoinformatics."を参照する。ＩＭＧＴ（商標）ツールの使用は、十分に熟練者の能力の範囲内であり、完全な詳細は、公開され、１９８９から定期的にアップデートされており、例えば、Lefranc,  M.-P.,  Cold  Spring  Harb  Protoc.  2011  Jun  1;2011(6)  "IMGTTM,  the  International  ImMunoGeneTics  Information  System"である。
【００９５】
起こる可能性が低いがさらなる指針が必要な場合、Ｊ領域を同定するために、当業者は、ＩＭＧＴ／Ｖ−ｑｕｅｓｔなどの公知のアライメントツールを用いて配列をアライメントしてもよい（Nucleic  Acids  Res.,  31,  307-310  (2003)）。ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴは、免疫グロブリン（ＩＧ）およびＴ細胞受容体（ＴＲ）の可変領域およびドメインのヌクレオチド配列のための配列アライメントソフトウェアである。ＩＭＧＴアウトプットは、ジャンクションのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む。
【００９６】
ＶＤＪ再編成の分析は、以下で例示される。
【００９７】
以下に示されるように、ＩＭＧＴは、Ｂ９７＃１  ＴＣＲの配列（配列番号３１）を分析するためのものであった。
ａ）Ｖ領域の翻訳およびアライメント
【化２】
2021532792.tif 000006
注釈：
１）L36092  Homsap  TRBV29-1*01  F  Folch,  G.  and  Lefranc,  M.-P.,  Exp.  Clin.  Immunogenet.,  17,  42-54  (2000))（Ｌ３６０９２−ＧｅｎＢａｎｋ生殖細胞系ベータＴ細胞受容体遺伝子座）
２）３８６７５３０９＿Ｂ９７＃１＿ＴＲＢＣ２（配列番号３１）
ｂ）ジャンクション領域の分析（ＩＭＧＴ）
【化３】
2021532792.tif 000007
注釈：
１）L36092  Homsap  TRBV29-1*01  F  (Folch,  G.  and  Lefranc,  M.-P.,  Exp.  Clin.  Immunogenet.,  17,  42-54  (2000))（Ｌ３６０９２−ＧｅｎＢａｎｋ生殖細胞系ベータＴ細胞受容体遺伝子座）
２）３８６７５３０９＿Ｂ９７＃１＿ＴＲＢＣ２（配列番号３１）
【００９８】
他のバイオインフォマティクスツールを使用して、Ｖ／Ｄ／Ｊ／Ｃ領域を同定するための類似の分析を実行することができ、その一例は、ＭｉＸＣＲソフトウェアである（Bolotin  et  al  2015  Nature  Methods  Vol  12  No.5  pages  380-381）。Bolotin  et  alは、本開示の配列中のＶ／Ｄ／Ｊ／Ｃ領域の同定において有用な定量化されたクローン型に対する生の配列からの大きいイムノーム（ｉｍｍｕｎｏｍｅ）データを処理するユニバーサルフレームワークを提供するソフトウェアを開示している。Bolotin  et  al  2015は、単にこのような分析方法の教示のために具体的に参照により組み込まれ、それ以外の目的はない。ソフトウェアは、例えばＭｉＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＬＬＣ、５３４  Ｓ．Ａｎｄｒｅｓ  Ｄｒ．、Ｓｏｌａｎａ  Ｂｅａｃｈ、ＣＡ  ９２０７５、ＵＳＡから入手可能である。
【００９９】
変異は、当該分野におけるその通常の意味を有し、１つまたは複数のヌクレオチド、モチーフまたはドメインの置換またはトランケーションまたは欠失または付加を指し得る。
【０１００】
試料
好適には、試料は、生検材料を含んでいてもよい。好適には、試料は、腫瘍生検材料、または疑いのある腫瘍からの生検材料を含んでいてもよい。好適には、試料は、血液を含んでいてもよい。好適には、試料は、Ｔ細胞に富む生検材料、例えばリンパ節生検材料または脾臓生検材料を含んでいてもよい。
【０１０１】
様々な試料タイプ、例えば扁桃生検材料を使用して発明を実証したことに留意すべきである。扁桃は、Ｔ細胞に富む組織である。これは、本発明の有効性を実証することにおいて非常に有用であるが、本発明を患者に適用する場合に、必ずしも例示的な試料タイプではない。したがって、扁桃は本発明にとって好適な試料であるが、より好適には、試料は、腫瘍生検材料、疑いのある腫瘍の生検材料、リンパ節生検材料、脾臓生検材料、または血液を含み、より好適には、試料は、腫瘍生検材料または血液を含む。
【０１０２】
試料が腫瘍からのものである場合、好適には、試料は、あらゆる腫瘍のタイプまたはサブタイプからのものであり得る。好適には、試料は、以下の実施例のセクションで述べられるあらゆる腫瘍のタイプまたはサブタイプからのものであり得る。
【０１０３】
読み出し
原則的に、試料由来の核酸、例えばＰＣＲ増幅された核酸から、配列情報を読み出すあらゆる方法を使用することができる。例えば、ＰＣＲ生成物は、例えばゲル電気泳動を使用することによってサイズで分離されてもよく、優勢な生成物は、切り出され、シーケンシングされてもよい。代替として、ＴＲＢＣ１／２に特異的なプライマーは、最初の増幅ステップの後に、例えば二次ＰＣＲで使用することができ、それによって、試料がＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２であるかどうかの指標が得られる。しかしながら、より好適には、最初の増幅後に、分析されるＪ領域に特異的なＰＣＲプライマーをＰＣＲ反応で使用してもよく、それによって、どのＪ領域が試料中に存在するかが示され、それによって、本発明の方法に従ってＣ領域の正体の推測が可能になる。
【０１０４】
原則的に、核酸プローブのハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ生成物のＪ領域の正体を検出するのに使用してもよいし、または増幅された核酸は、１つまたは複数のプローブ核酸を担持するアレイに適用することもでき、ハイブリダイゼーションを起こすことができ、ＰＣＲ生成物におけるＪ領域の正体は、そのようなプローブ配列に対するハイブリダイゼーションパターンを分析することによって読み出すことができる。
【０１０５】
Ｃ／Ｊ領域
本発明の主要な部分は、ＣからＪへの緊密な連鎖を利用すること、それによって、Ｊタイプから間接的にＴＲＢＣ１／２のステータスを推測することである。
【０１０６】
本発明の利点は、ＲＮＡなどの他の核酸より多くの数の組織タイプおよび貯蔵条件で保存されているｇＤＮＡからの検出（例えば核酸増幅を介した）を可能にすることである。したがって、好適には、本発明によって照合される核酸は、ｇＤＮＡである（すなわち、出発材料または分析される材料は、好適には、ｇＤＮＡである）。
【０１０７】
これは利点である。なぜなら、原材料がｇＤＮＡなどのＤＮＡである場合、Ｊ領域とＣ領域との間のイントロンが、現行のシーケンシング技術を使用してカバーするには大きすぎるからである。それゆえに本発明は、Ｊ領域の分析からＣ領域のタイプを推測することによって、技術的な利点をもたらす。
【０１０８】
−  ＰＣＲ戦略
細胞のＪタイプを決定するために、典型的には、その細胞のＪ領域のヌクレオチド配列情報が必要である。現在のところ、細胞からのｇＤＮＡの直接シーケンシングは、実用的ではない。それゆえに、ヌクレオチド配列情報を得るために、中間増幅ステップ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、ヌクレオチド配列情報を生成するのに十分な核酸を生産するために使用される。
【０１０９】
有利には、２ステップのＰＣＲ戦略を使用することができる。
【０１１０】
例えば、第１のＰＣＲ（「ＰＣＲ１」）は、定性的であり、これは、混合物中で低濃度のいくつかの異なるプライマーを使用してシードコピーを作製するためであり、第２のＰＣＲ（「ＰＣＲ２」）は、定量的であり、これは、これらのシードコピーを、アダプタープライマー（時にはアンカープライマーまたはユニバーサルプライマーと呼ばれる）を使用して増幅して（すなわち、どちらのＶ／Ｊ配列が存在するかは無関係に、同じプライマーを使用して）、ＮＧＳに十分な材料を生産するためである。
【０１１１】
当然ながら、熟練した読者は、１回のＰＣＲで原材料から直接増幅できる可能性が高いことを理解するであろう。それゆえに、２ステップのＰＣＲ戦略が、必須ではないが、有利である。実際には、第２の「ネステッド」ＰＣＲステップを実行することが有利であり、これは、例えばクローン集団の収量および／または検出を増加させる利益を有する。
【０１１２】
マルチプレックスＰＣＲ
好適には、最初のステップとして、一旦ＤＮＡが調製されたら、それはマルチプレックスＰＣＲに供される。これは、Ｖ領域からのいくつかのプライマー、および／またはＤ領域からのいくつかのプライマー、および／またはＪ領域からのいくつかのプライマー、最も好適には、ＶおよびＤおよびＪ領域のそれぞれからのいくつかのプライマーを含有していてもよい。したがって、これらのプライマーは、照合されるヌクレオチド配列にわたり、それらの個々の部位でアニールし、ＰＣＲ反応の後に、増幅生成物を分析して、完全性／信頼度を確実にし、シーケンシングに進行させることができる。好適には、マルチプレックスＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ生成物の本質的にレパートリー全体がシーケンシングされるように、ＮＧＳシーケンシングアプローチで使用される。この時点で、クローン性を決定する、および／または明らかに過剰に存在するクローン（すなわち目的のクローン／目的の腫瘍を表す）を選び出すために、標準的なデータ分析技術が使用される。このクローン性の決定は、当該分野において公知のあらゆる好適な技術によって行うことができ、最も好適には、ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘ  ＴＲＢアッセイ−ＭｉＳｅｑキットのためのＩＦＵ、最も好適には、参照により本明細書に組み込まれるＩＦＵ（使用についての指示）２８０４１０に従うことによって行われる。
【０１１３】
Ｔ細胞クローン性を決定するための代替方法
公知のＴＣＲベースのクローン性アッセイは、ＤＮＡの制限酵素消化、それに続くゲル電気泳動および公知のＴＣＲ遺伝子に関するプローブを使用したサザンブロッティングを採用してきた。この技術は、本発明の実施において有効であり有用であるが、大きな労力を要する可能性があり、完了まで数日かかる可能性があり、泳動するのに相当量の無傷のＤＮＡを必要とする可能性があり、低い感度を有する可能性がある。
【０１１４】
したがって、クローン性を決定するために、ＰＣＲベースの技術を使用することが有利な場合がある。ＰＣＲベースの技術は、クローン性評価に慣例的に使用される。ＰＣＲベースのＴ細胞クローン性アッセイをさらに標準化するために、国際的に容認されたＰＣＲプライマーセットが導入されてきた。ＰＣＲベースのＴＣＲクローン性分析において最も高い頻度で使用されるプライマーは、ＢＩＯＭＥＤプライマーセット（van  Dongen  et  al  2003）と呼ばれる。van  Dongen  et  al  2003  (Leukaemia  2003  volume  17  pages  2257-2317)は、本開示で使用することができるある特定のＰＣＲ方法を開示している。より詳細には、van  Dongen  et  al  2003は、クローン性の決定のための標準的なプライマーのセットを開示しており、具体的には、van  Dongen  2003の図４ｂ、図５ａ、図６ｂ、図７ｂ、図８ｂ、図１０ｂ、図１１ａ、図１２ａおよび図１３ａを参照されたい。したがって、van  Dongen  et  al  2003は、単にこのようなＰＣＲ方法およびＰＣＲプライマーの教示のために具体的に参照により組み込まれ、それ以外の目的はない。
【０１１５】
これらのBIOMED（van  Dongen  2003）プライマーをベースとしたアッセイは、Ｉｇ/ＴＣＲ遺伝子のＰＣＲ生成物を、ヘテロ二重鎖分析またはジーンスキャニング（GeneScanning）によりクローン性に関して分析することを可能にする。このようなアッセイからのＰＣＲ生成物の増幅およびシーケンシングは、Ｊ領域を同定するのに使用でき、したがって本明細書に記載されるＣ領域の推測を可能にする。
【０１１６】
しかしながら、このようなアッセイは、浸潤Ｔ細胞からのアーティファクトを含む場合があり、再編成されたＴＣＲ配列は、生検材料内の非クローン性Ｔ細胞のバックグラウンドで観察されない可能性があることに留意されたい。この状況では、ＮＧＳによって生成物をシーケンシングすることが望ましい。この理由のために、本明細書に記載される好ましい実施形態の場合のようにＮＧＳ技術を使用することが有利である。
【０１１７】
代替として、クローン性は、Ｉｍｍｕｎｏｓｅｑ  ＴＣＲＢアッセイ（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５５１  Ｅａｓｔｌａｋｅ  Ａｖｅ  Ｅ、Ｓｔｅ  ２００、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ  ９８１０２、ＵＳＡ）を使用することによって決定することができる。
【０１１８】
プライマー
標準的なプライマー、例えば、ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ（登録商標）Ｄｘ  ＴＲＢアッセイキット−ＭｉＳｅｑ（Ｉｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ、例えば１０２２２  Ｂａｒｎｅｓ  Ｃａｎｙｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  １、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１、ＵＳＡ）に提供されるものなどが使用できる。
【０１１９】
標準的なプライマー、例えばＢＩＯＭＥＤプライマーセット（van  Dongen  et  al  2003−上記を参照）に提供されるものなどを使用できる。
【０１２０】
読み出し
上述の可能性のあるアプローチ、または当業者公知の核酸配列を読み出す他のあらゆる方法にもかかわらず、最も好適には、ヌクレオチド配列情報は、核酸、例えばＰＣＲで増幅された核酸を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供することによって読み出される（決定される）。これは、定量的情報を提供して、ＮＧＳデータ中の優勢なクローンを容易に同定することを可能にするため、有利である。さらに、これは、単一のステップを意味し、すなわちＰＣＲ増幅された核酸は、「１ステップ」の手順で直接ＮＧＳシーケンシングすることができる。代替の方法、例えば上記のプローブまたはプライマーベースのアプローチは、有効であるが、より時間を要し、および／または高価なステップを実行する必要があると予想されるため、ＮＧＳシーケンシングとの組合せの利点を有さない。したがって、最も好適には、配列情報は、ＮＧＳによって読み出される。
【０１２１】
最も好適には、ヌクレオチド配列情報は、ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘ  ＴＲＢアッセイ−ＭｉＳｅｑアッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ、例えば１０２２２  Ｂａｒｎｅｓ  Ｃａｎｙｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  １、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１、ＵＳＡ）を使用することによって読み出される（決定される）。
【０１２２】
本発明は、定量的情報を得る利点をもたらすため、これは、微小残存病変のモニタリングに適用することができる。例えば、本発明を微小残存病変のモニタリングに適用することにおいて、目的のクローン（すなわちＴ細胞のがん細胞）のパーセンテージは、ＮＧＳデータから得られるが、それに対してその特定の患者の疾患の特徴的な転写物の存在または非存在を単に検出すること（例えばそのＣＤＲ／可変領域に対するプライマーを使用すること）は、質問に対して二値（はい／いいえ）の回答、またはＭＲＤが存在するかどうかのみを与えるであろう。ＭＲＤを検出またはモニタリングするために本発明を使用することによって、ＮＧＳの読み出しとの組合せによって提供される定量的情報は、有用であり、それゆえに有利である。
【０１２３】
Ｊ領域からＣ領域への連鎖が利用されること、すなわち、Ｊ領域の正体を決定することにより、Ｃ領域の正体を推測することは、本発明の主要な部分である。
【０１２４】
Ｊ領域のタイピング
上記から明らかであると予想されるように、目的のＪ領域から配列情報を得るのに使用される特定の試薬／技術は、本発明にとって重要ではない。情報を得るのにＮＧＳを使用することは、論じられたような利点を提供する。
【０１２５】
しかしながら、シーケンシングを行うのに本明細書で開示された具体的なＮＧＳ方法を使用することを必要とする代わりに、１つまたは複数の現存するＮＧＳベースのクローン性の決定方法からの情報は、Ｃ領域の使用を推測するのに使用できる可能性がある。
【０１２６】
例えば当業者は、クローン性の決定を可能にするキットを使用し、その情報をＪ領域をタイピングするのに使用してもよい。次いでこのＪ領域のタイプに関する情報は、本発明者らが本明細書において実証するＣ領域の相関と共に使用して、記載される通りにＴＣＲベータ定常領域の使用を推測することができる。
【０１２７】
したがって、熟練した読者は、本発明は、本明細書において例示された特定のプライマーセットおよび／または設計パラメーターは、一定の利点を提供するが、これらに過度に限定されるべきではないことを理解することができる。そうではなく、熟練者は、配列決定（例えば、クローン性の決定、これは、より一般的には「イムノシーケンシング」と称される）のための「既製の」または商業的に入手可能なキットまたはサービスを使用することができる。
【０１２８】
簡単に言えば、イムノシーケンシングは、Ｔ細胞またはＢ細胞の集団における免疫レパートリーの配列決定を指す。本発明の場合、目的の細胞は、Ｔ細胞である。概要において、このプロセスは、目的の核酸セグメント、例えばＴＣＲの主要なＣＤＲに焦点を当てた第１のＰＣＲ増幅を含む。これに続き、典型的には、異なるプライマーを使用する第２の増幅が行われ、このプライマーは、配列決定を容易にするために便利にタグ付けされる。この第２の増幅の後、次いで核酸生成物は、最も典型的には、同じ元の試料を起源とする数百万もの個々の配列の大規模並列決定を利用するＮＧＳ（次世代シーケンシング）技術を使用してシーケンシングされる。次いでこの配列データは、捕獲され、目的の質問に答えるためにコンピューターにより分析される。本発明の文脈において、イムノシーケンシングからのアウトプットは、Ｊ領域の配列を検査するのに使用されると予想され、それによって、各配列中に存在する特定のＪ遺伝子の決定が可能になる。それゆえに、あらゆる商業的に入手可能なイムノシーケンシング（クローン性試験）キットまたはサービスが本発明で使用可能であるが、このようなキットまたはサービスのいずれもがＪ領域の配列情報を提供することが極めて重要である。
【０１２９】
例えば、必要なデータを得るのに使用することができるキットは、ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ（登録商標）Ｄｘ  ＴＲＢアッセイキット−ＭｉＳｅｑ（Ｉｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ、例えばＩｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ  ＳＡＲＬ、ＺＩ  Ａｔｈｅｌｉａ  ＩＶ−Ｌｅ  Ｆｏｒｕｍ−Ｂａｔ  Ｂ、５１５  Ａｖｅｎｕｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｔｒａｍｏｎｔａｎｅ、１３６００  Ｌａ  Ｃｉｏｔａｔ、Ｆｒａｎｃｅ）および／またはＩｍｍｕｎｏｓｅｑ  ＴＣＲＢアッセイ（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５５１  Ｅａｓｔｌａｋｅ  Ａｖｅ  Ｅ、Ｓｔｅ  ２００、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ  ９８１０２、ＵＳＡ）である。より好適には、必要なデータを得るのに使用することができるキットは、ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ（登録商標）Ｄｘ  ＴＲＢアッセイキット−ＭｉＳｅｑ（Ｉｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅ、例えば１０２２２  Ｂａｒｎｅｓ  Ｃａｎｙｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  １、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１、ＵＳＡ）および／またはｃｌｏｎｏＳＥＱアッセイまたはＩｍｍｕｎｏｓｅｑ  ＴＣＲＢアッセイ（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５５１  Ｅａｓｔｌａｋｅ  Ａｖｅ  Ｅ、Ｓｔｅ  ２００、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ  ９８１０２、ＵＳＡ）である。
【０１３０】
適応性のあるバイオテクノロジーキット／サービス（上記参照）を参照すれば、これは、試料内の個々のクローンのそれぞれに対する「固有な」ＩＤまたはタグとして役立つＣＤＲ３領域に焦点を当てている。このキットにおいて、最初のＰＣＲ反応のためのフォワードプライマーは、Ｖ領域に配置され、最初の増幅のためのリバースプライマーは、Ｊ領域に配置される。したがって、この方式で、Ｊ領域の適切なセグメントが分析され、そのためこのようなキットは、本発明で使用するのに好適である。本発明の状況において、個々のクローンのＪ領域の配列情報は、キット／サービスのアウトプットから採取でき、この情報から、細胞で発現されるＪ遺伝子のタイプを決定でき、そのＪ遺伝子のタイプから、そのクローンで発現されるＴＲＢＣ遺伝子のタイプを本発明に従って推測することができる。
【０１３１】
好適には、核酸抽出プロトコール（行われる場合）は、製造元の指示の通りである。
【０１３２】
核酸シーケンシング
当然ながら、熟練者は、必要なヌクレオチド配列情報を決定する、すなわち本明細書に記載されるＪ領域の１つまたは複数の特徴的なセグメントのヌクレオチド配列を決定するために、彼ら自身のシーケンシングプロトコールを実施することができる。
【０１３３】
実質的に、このようなアプローチは、目的のＴ細胞からのＪ領域のヌクレオチド配列情報にアクセスすることを必要とする。これは、例えば、Ｊ領域の関連セグメントを取り囲む核酸セクションの増幅、それに続いて、例えば標準的なＮＧＳアプローチを使用する配列決定などの標準的なアプローチを使用して行うことができる。当然ながら、他のアプローチは同等に、例えば、電気泳動によって増幅生成物を分離すること、および優勢な生成物をシーケンシングすることによって、またはさらには目的の組換え核酸のクローニングおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの操作によって、または所望される場合、特定のＪタイプに特異的なプライマーを使用する診断ＰＣＲによって採用することができる。
【０１３４】
このような技術は、慣例的であり、本明細書で提供される詳細な開示を考慮して当業者による実施が可能であるとみなされる。何らかのさらなる指針が必要な場合、主要な要素を以下で概説する。
【０１３５】
−  プライマーの設計
プライマーの設計は、当業者により、手作業か、あるいは自由に利用できるツール、例えば、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓのプライマー設計ツール（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ａｎｚｉｎｇｅｒ  Ｓｔｒ．７ａ、８５５６０  Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、または国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、米国立医学図書館（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ、２０８９４  ＵＳＡからのＰｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴサービス、またはＢｉｏＣｏｍｐもしくはＳｅｑＷＥＢスーツ（以前はＡｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧパッケージ／ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ）のＰｒｉｍｅ＋プログラム、または他のあらゆる好適なツールを使用するかのいずれかによって達成することができる。
【０１３６】
代替として、非常に多くの商業的に入手可能なプライマーの設計および生産サービスを使用することができ、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１６８  Ｔｈｉｒｄ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ  ＵＳＡ  ０２４５１）、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（上記を参照）、または他のあらゆる好適なサービスプロバイダーからのものを使用することができる。
【０１３７】
増幅反応においてＰＣＲバイアスを回避することが重要である。これは、正確な定量的情報を確実に得るために重要である。
【０１３８】
ＰＣＲバイアスは、標準的な技術を使用して低減または排除することができる。例えば、概説すると、これは、第１の増幅または予備的な増幅のために、同じ初期濃度で第１の範囲のプライマーを使用することを含む。次いでこの増幅の結果を分析する。典型的には、ＰＣＲバイアスは、得られた増幅された核酸混合物中に、異なるＰＣＲ生成物が異なる濃度で見出される場合に観察される。理論に制限されることは望まないが、その原因は、典型的には最初の混合物中のプライマーの効率または性能が異なることにある。次いでＰＣＲプライマー濃度を調整して、最も良い性能を示すプライマー（すなわち最高濃度の増幅された核酸をもたらすもの）の濃度を低減し、基準を下回る性能のプライマー（すなわち増幅された生成物中に最低濃度の核酸をもたらすもの）の濃度を増加させる。この方式で、ＰＣＲバイアスの作用は、劇的に低減または排除することができ、最終的な増幅された核酸混合物中においてＰＣＲ生成物のより均等な濃度分布をもたらす。このタイプのＰＣＲバイアスを低減または排除するための最適化は、当業者にとって慣例的なことであり、上記で概説したような「トライアンドエラー」分析によって実行することができる。
【０１３９】
加えて、または代替として、ＰＣＲバイアスは、後述されるプールから選択されるプライマーを使用することによって低減または排除することができる。
【０１４０】
−  ネステッド／アンカープライマーの設計
当該分野において一般的に、定性的な最初の増幅に続いて、定性的な増幅に使用される最初のプライマーの５’末端に配置されたユニバーサルプライマーを使用する定量的な増幅を行ってもよい。したがって、二次的な／ユニバーサルの／定量的な増幅をその後行うことができるように、最初の増幅で使用されるプライマーに、「ネスト」または「アンカー」５’テールが取り込まれていてもよい。好適なネストまたはアンカー配列は、当該分野において周知の通りに、操作者によって選択される。
【０１４１】
例示的なネステッドプライマー（プライマー伸長）またはアンカー配列は、以下に提供される。
【０１４２】
データ品質
得られた総シーケンシングリードの数は、データ品質に影響を与える可能性があり、同様に、得られたリードの総数のうちの単一のクローンに起因し得る総シーケンシングリードの比率もデータ品質に影響を与える可能性がある。データが信頼できるかどうかを決定することにおいて、標準的な統計技術が適用され、例えばＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘ  ＴＲＢアッセイ−ＭｉＳｅｑキットの使用についての指示（ＩＦＵ）、最も好適には、ＩＦＵ（使用についての指示）２８０４１０の通りに適用される。
【０１４３】
Ｊ領域の決定
好適には、ＮＧＳを使用して、試料由来の／試料から増幅した核酸の配列情報が提供される。
【０１４４】
次いで、この配列情報を照合して、どのＪ領域が標的配列中に存在するかを決定する。
【０１４５】
配列の比較は目視を含むあらゆる手段によって行うことができるが、典型的には、特定のＪ領域の公知の配列特徴をＮＧＳ分析からの配列情報と比較するためのコンピューターアルゴリズムが使用される。クエリー配列（公知のＪ領域配列）と標的配列（患者試料からの核酸のＮＧＳ分析からの配列）との間の一致は、その対応するＪ領域の存在を示す。
【０１４６】
存在する特定のＪ領域の正体の診断に役立つかまたはそれを示すＪ領域配列の要約は、以下の通りである。
【表１−３】
2021532792.tif 000008
【０１４７】
熟練者は、場合によって、表１における配列の一部が、依然として、それらが存在する特定のＪ領域の正体の診断に役立つかまたはそれを示すままであることを常に条件として、それらを例えば約３０ｂｐに短くすることがある。
【０１４８】
Ｊ１の異なるサブタイプ（例えばＪ１−１、Ｊ１−２、Ｊ１−３など）があることが上記の表から見ることができる。また同様にＪ２の異なるサブタイプ（Ｊ２−１、Ｊ２−２、Ｊ２−２Ｐなど）があることも見ることができる。
【０１４９】
用語「Ｊ遺伝子のタイプ」は、本明細書で使用される場合、Ｊ領域の正体を意味し、すなわちＪ領域がＪ１であるかまたはＪ２であるかを意味する。したがって、試料中に存在するＪ１またはＪ２領域を同定するためのプロセスは、典型的には以下の通りである：
・目的のＪ領域からの（すなわち目的の細胞／試料からの）配列データを参照Ｊ領域配列と比較する。
・配列比較から、細胞／試料中に存在するＪ遺伝子のタイプ（すなわちＪ１またはＪ２遺伝子）を決定する。
【０１５０】
以下の表２に、Ｊ領域においてアニールできるプライマーの例を提供する。
【表２−１】
2021532792.tif 000009
【０１５１】
フォワードプライマーは、熟練した操作者によって設計することができる。
【０１５２】
Ｊ１またはＪ２の決定がなされたら、最終ステップは、Ｊ領域の知見からＣ領域の正体を推測することである。
【０１５３】
用語「Ｃ遺伝子のタイプ」または「ＴＲＢＣ遺伝子のタイプ」は、本明細書で使用される場合、Ｃ領域の正体、すなわちＣ領域がＣ１であるかまたはＣ２であるかを意味する。
【０１５４】
したがって、好適には、最終的なステップは、以下の通りである：
・Ｊ１遺伝子の存在が決定される場合、Ｃ１遺伝子の存在が推測され、Ｊ２遺伝子の存在が決定される場合、Ｃ２遺伝子の存在が推測される。
【０１５５】
特徴的なＪ領域配列（参照配列）を、標的配列（目的の細胞／試料からのヌクレオチド配列）と比較する場合、好適には１００％の一致が必要である。
【０１５６】
不完全な組換え体
場合によっては、細胞が、不完全なＶ／Ｄ鎖再編成を受けていることが予想される。これらの状況において、Ｄ−Ｊ接合（Ｖ−Ｊ接合よりむしろ）を観察することが可能である場合がある。典型的には、Ｄ−Ｊ接合で収集されたあらゆる情報が無視され、Ｖ−Ｊ接合が選択される。
【０１５７】
臨床上の検討事項
この文書で提供される例示的なデータから、転写物のおよそ０．１１１５％がＪ２−Ｃ１またはＪ１−Ｃ２であり得る（０．１０２７％のＪ１−Ｃ２＋０．００８８％のＪ２−Ｃ１＝０．１１１５％）ことがわかり得る。連鎖が転写物レベルであることに留意しなければならない。それゆえに、この０．１１１５％は、誤診のリスクではなく、これは、細胞表面上のＴＣＲが、細胞内の核酸レベルで生産される代替の転写物に起因する予測されるもの「以外」であり得る率である。言い換えれば、本発明の方法は、Ｊ領域から推測される通りのＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のいずれかである細胞中の単一の再編成されたＴＣＲ  β遺伝子をロバストに同定するが、その細胞内において、場合によってはそれでもなお非常に低レベルの代替の転写物が生産されている可能性がある。したがって、実際面で、これは、細胞は、予測される組合せの９９．８８８５％を提示すると予想されるが、この一定の転写のバリエーションのために０．１１１５％の予想外の組合せを提示する可能性があることを意味する。あらゆる実際面で、これは、本発明の方法の患者／処置／診断への使用に対して、最小かまたはゼロの作用を有する。これは、決して０．１１１５％の誤り率／誤診ではない。
【０１５８】
より詳細に言えば、０．１１５％の誤り率は、細胞上に提示されるＴＣＲに関するものであり、患者を診断するという意味におけるいかなる種類の誤り率も指していないことに留意しなければならない。それゆえに、細胞内の天然プロセスの転写の変動性に起因して、場合によっては（例えば）Ｊ１−Ｃ２またはＪ２−Ｃ１である生産されたＴＣＲが存在するとしても、あらゆる実際的な意味において、その患者における圧倒的多数のＴ細胞は、それでもなお本発明の方法によって決定された特定のＪ／Ｃの組合せを正確に提示すると予想される。それゆえに、本発明の方法によって提供される情報に基づく処置は、それでもなお有効であると予想され、個々の細胞で生産された転写物におけるあらゆる天然の変動性は、本発明の診断の価値に負の影響を与えないことが、本発明の利点である。
【０１５９】
本発明者らは、本方法は、「予想外の」組合せ（例えばＪ１−Ｃ２またはＪ２−Ｃ１）がケースの１％未満で観察されるという意味で、少なくとも９９％正確であることを主張する。言い換えれば、本発明者らは、ケースの少なくとも９９％が、本発明のベースとなるＪ遺伝子とＣ遺伝子との注目すべきかつ驚くべきほど近い連鎖を反映していることを主張する。
【０１６０】
さらなる実施形態
【０１６１】
一態様において、本発明は、
（ａ）細胞で発現されるＪ遺伝子のタイプを決定するステップ、および
（ｂ）（ａ）から、前記細胞で発現されるＴ細胞受容体β鎖（ＴＲＢＣ）遺伝子のタイプを推測するステップ
を含む方法に関する。
【０１６２】
一態様において、本発明は、ステップ（ａ）が、
（ａｉ）前記細胞からの前記Ｊ遺伝子の少なくともセグメントのヌクレオチド配列を決定するステップ；および
（ａｉｉ）（ａｉ）で決定されたヌクレオチド配列を、１つまたは複数のＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列と比較するステップ、および
（ａｉｉｉ）（ａｉｉ）のＪ遺伝子の参照ヌクレオチド配列に対する、（ａｉ）の前記Ｊ遺伝子のセグメントのヌクレオチド配列の配列同一性から、Ｊ遺伝子のタイプを同定するステップ
を含む、上述した方法に関する。
【０１６３】
さらなる利点
先行技術の方法、例えばＩＨＣは、凍結した組織の使用を必要とする場合があるが（例えばＪＯＶＩ−１の分析のために）、これは、労力を要し、必ずしも利用可能であるとは限らない。加えて、ＩＨＣ方法の定性的な性質は、誤診に至る可能性があり、および／または診断病理学者によってなされる解釈の誤りを起こしやすい可能性がある。したがって、ＩＨＣは、主観的な場合があり、および／または操作者の誤りを起こしやすい可能性があり、これらは、当該分野において問題である。抽出プロトコールおよびシーケンシングが慣例的であり、自動化が可能であるため、ゲノムアッセイにおける操作者の誤りを減らすことは、本発明の利点である。
【０１６４】
本発明のさらなる利点は、分子診断は、疾患に関与するクローンが同定されたら、高い精度での血液中の微小残存病変（ＭＲＤ）の追跡を可能にすることである。
【０１６５】
特許出願ＷＯ２０１６／０５１２０５は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ方法を記載している。しかしながら、ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイは、プローブがＲＮＡを検出する点で限界があり、これは、プローブ結合を可能にするのに十分な長さと完全性を有することを必要とする。ＲＮＡｓｃｏｐｅは固定された組織からの材料の検出を可能にするはずだが、ゲノム評価は、ＤＮＡから決定することができ、したがって、アッセイのためにより安定な原材料を提供し、これは、本発明の利点である。さらに、最近の刊行物によれば、第３の転写物があることが示されている（ＴＲＢＣＸとして公知。Lethe  et  al  2017  (Immunity,  Inflammation  and  Disease  2017;  5(3):  346-354)を参照）。これは、プローブ設計を介したＴＲＢＣ１／２  ＲＮＡ転写物間の区別を不可能にすると予想され、したがってＲＮＡｓｃｏｐｅは、本出願のためのアッセイとして好適ではない可能性があると予想され、この問題は、有利なことに本発明によって解決される。
【０１６６】
例えば定性的なアッセイまたはＩＨＣなどの「目視による」方法などの先行技術の方法と比較して、より高いレベルの精度が提供されることは、本発明のさらなる利点である。
【０１６７】
先行技術の実施者が、Ｖ／Ｄ鎖ジャンクション（すなわちＪ領域）を、特定のＣ領域の正体と関連付けていなかったことは、本発明の利点である。ＴＲＢＣ遺伝子内におけるＪタイプとＣタイプとの間の非常に驚くほど近い連鎖を含むこの有用な知見は、本発明のベースとなる驚くべき進歩である。
【０１６８】
さらなる特定の好ましい態様は、添付の独立請求項および従属請求項で述べられる。従属請求項の特色は、必要に応じて、さらに、請求項で明示的に述べられたもの以外の組合せで、独立請求項の特色と組み合わせることができる。
【０１６９】
装置の機構が、機能を提供するように動作可能であると記載される場合、これは、その機能を提供する装置の機構、またはその機能を提供するように適合もしくは構成されている装置の機構を含むことが理解されるであろう。
【実施例】
【０１７０】
ここで本発明を一例として記載するが、これは、限定ではなく、特許請求の範囲に記載される本発明の実施形態を例示することを意図する。
【０１７１】
（実施例１）
接合領域と定常領域との相関
５’ＲＡＣＥを使用して、４つの正常なヒト扁桃試料からＴＲＢＣ転写物を増幅した。４×１０６個の固有なＴ細胞転写物のＮＧＳ分析を示す図２を参照されたい。
【０１７２】
長さ約５３０〜６２０ｂｐのＰＣＲ生成物をプールし、Ｍｉｓｅｑ  ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを使用してシーケンシングした。２×３００ｂｐのペアエンドリードを獲得した。
【０１７３】
図１に結果を示す。
【０１７４】
（実施例２）
ＤＮＡへの適用
本発明者らは、図３を参照する。
好適には、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。
【０１７５】
（実施例３）
配列の読み出し
本発明者らは、図４を参照する。
ＩＭＧＴアウトプットが示される。
【０１７６】
（実施例４）
この研究において、様々なＴＲＢＣ１／２を発現する細胞株を試験した（表４）。
【０１７７】
様々なＴ細胞リンパ腫試料からのデータも提示する（表５）。
【０１７８】
本発明者らはまた、例示的な核酸抽出プロトコールおよび例示的なＮＧＳプロトコールも提供する。
【０１７９】
この実施例において、データは、ＩｎｖｉｖｏｓｃｒｉｂｅからのＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ（登録商標）Ｄｘ  ＴＲＢアッセイを使用して得られる。
【０１８０】
方法
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞株（Ｊｕｒｋａｔ、ＭＪ、Ｈ９、ＨＰＢおよびＲａｊｉ）およびＦＦＰＥ  Ｔ細胞リンパ腫試料を、ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘ  ＴＲＢアッセイ−ＭｉＳｅｑアッセイを用いて分析した。本明細書において別段の記述がない限り、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｅｎｅＲｅａｄ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥキットを製造元からの指示に従って使用して、各細胞株およびＴ細胞リンパ腫試料からのＤＮＡを、１０〜１５個の５μＭのＦＦＰＥ切片から抽出した。
【０１８１】
Ｑｕｂｉｔ  ３．０を使用してＤＮＡ濃度を定量化した。ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘ  ＴＲＢアッセイ−ＭｉＳｅｑにより、アッセイのＩＦＵ（２８０４１０）に従ってＤＮＡを個別に試験した。ＭｉＳｅｑ試行からのＦＡＳＴＱファイルを、ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘソフトウェア−ＭｉＳｅｑ  ｖ２．４．３により、ソフトウェアのＩＦＵ（２８０３４４）に従って分析した。
【０１８２】
ＦＦＰＥ組織ブロックの切片作製
１．パラフィン包埋組織ブロックを、切片作製の前に氷上で冷やす。コールドワックスにより、組織検体内のより硬い要素のための支持体を提供することにより、より薄い切片を得ることが可能になる。融解する氷からブロックに透過する少量の水分が、組織をより簡単に切断しやすくすると予想される。
【０１８３】
２．水槽を超純水で満たし、４０〜４５℃に加熱する。
【０１８４】
３．ホルダー中にブレードを置き、それを確実に固定し、すきま角を設ける。すきま角は、ナイフのファセットとブロックの面との接触を防止する。すきま角を設ける際の指針については、マイクロトーム製造元の指示に従う。Ｌｅｉｃａブレードの場合、これは通常、１°から５°の間である（図１）。
【０１８５】
４．パラフィンブロックを挿入し、ブレードがブロックを真っすぐに切断するような方向に配置する。
【０１８６】
５．慎重にブレードをブロックに近づけ、数枚の薄い切片に切断して、位置決めが正しいことを確実にする。必要に応じて調整する。
【０１８７】
６．代表的な切片を切断できる水平面に組織表面が露出するようにブロックをトリミングする。トリミングは通常、１０〜３０μｍの厚さでなされる。
【０１８８】
７．切片を約４〜５μｍの厚さで切断する（最初の数枚の切片は、トリミングによって生じた穴を含有する可能性が高いため、恐らくそれらを捨てなければならないだろう）。
【０１８９】
８．ピンセットを使用して、切片のリボンをピックアップし、オートクレーブした、またはＤＮアーゼ非含有のマイクロチューブ（１．５ｍＬ）に移す。
【０１９０】
９．Ｑｉａｇｅｎ  ＧｅｎｅＲｅａｄ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥキットを製造元からの指示に従って使用して、ＤＮＡ単離を進める。
【０１９１】
核酸抽出手順
使用することができる数々のＤＮＡ抽出キットがある。この実施例では、ＤＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＧｅｎｅＲｅａｄ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥキットを使用して抽出される。
【０１９２】
ＧｅｎｅＲｅａｄ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ手順は、パラフィンを除去し、それをＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに結合させる前にＤＮＡ試料からのホルマリン架橋を元に戻す。加熱して架橋を除去した後、ＤＮＡは、酵素ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）による脱アミノ化シトシン残基の特異的な除去に利用できるようになる。最適化された反応混合物は、ＵＮＧが、ＦＦＰＥ試料から得られたＤＮＡから、人工的に誘導されたウラシルを特異的に除去できる条件をもたらす。ＤＮＡのスピンカラムへの結合の後、塩などの残留した汚染物質を、緩衝液ＡＷ１およびＡＷ２、ならびにエタノールによって洗い落とす。エタノールは、それに続く酵素反応に干渉する可能性があるため、全ての残留したエタノールを追加の遠心分離ステップによって除去する。ＤＮＡを溶出させ、この段階で、ＤＮＡは次世代シーケンシングのワークフローにすぐ使用できる。
【０１９３】
配列決定手順
この実施例において、配列は、ＮＧＳプロトコール−ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘ  ＴＲＢアッセイ−ＭｉＳｅｑアッセイを使用して決定される：
【０１９４】
１．手袋をはめた手を使用して、冷凍庫からマスターミックスを取り出す。チューブを融解させ、穏やかにボルテックスして混合する。
【０１９５】
２．封じ込めのフードまたはデッドエアーボックス中で、ＰＣＲプレートの個々のウェルに４５ｕｌのマスターミックスをピペットで入れる。マスターミックスのそれぞれにつき１つのウェルとし、試料、陽性、陰性または鋳型なしの対照１つ当たり１つのマスターミックスとする。
【０１９６】
３．マスターミックスのそれぞれに、０．２ｕｌのＥａｇｌｅＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥａｇｌｅＴａｑ、５Ｕ／ｕＬで）を添加する。
【０１９７】
４．それぞれのマスターミックス反応物を含有するウェルに、５ｕｌの試料ＤＮＡ（１０ｎｇ／ｕＬの最低濃度で）および５ｕＬの対照試料を添加し、ピペットで５〜１０回吸引排出して混合する。
【０１９８】
５．鋳型なしの対照のためのそれぞれのマスターミックスを含有するウェルに、５ｕＬの分子生物学的グレードの水を添加し、ピペットを５〜１０回吸引排出して混合する。
【０１９９】
６．以下のサーマルサイクラープログラムを使用して標的ＤＮＡを増幅する：
【表２−２】
2021532792.tif 000010
【０２００】
７．サーマルサイクラーから増幅プレートを取り出す。
【０２０１】
８．Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ＰＣＲ精製システムを使用して、ＰＣＲ生成物を精製する。各５０ｕｌの反応物に３５ｕｌの粒子を添加し、２５ｕｌの溶出液でＤＮＡを溶出させる。
【０２０２】
９．ＫＡＰＡライブラリー定量化キットをキットの指示に従って使用して、アンプリコンを定量化する。ｑＰＣＲに進める前に、アンプリコンを１：４，０００に希釈する。
【０２０３】
１０．試料（鋳型なしの対照を含まない）からの等量のアンプリコンをプールし、１：１，０００に希釈し、ＫＡＰＡライブラリー定量化キットを使用してライブラリーを定量化する。
【０２０４】
１１．ライブラリーを変性させ、ＭｉＳｅｑ試薬キットｖ２の場合は１２ｐＭに、ＭｉＳｅｑ  ｅ＝試薬キットｖ３（ＭＣＳ  ｖ２．６）の場合は１２〜２０ｐＭに希釈する。
【０２０５】
１２．６００ｕｌの変性および希釈したライブラリーをＭｉＳｅｑ試薬カートリッジにローディングする。
【０２０６】
１３．Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｍａｎａｇｅｒ（ｖ１．４〜ｖ１．１３）を使用して、ＭｉＳｅｑ試料シートをセットアップする。
【０２０７】
１４．ＭｉＳｅｑ試行を開始させる。
【０２０８】
１５．付随のＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘソフトウェア−ＭｉＳｅｑパッケージを使用して、獲得したデータを分析し、可視化する。
【０２０９】
ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘソフトウェア−ＭｉＳｅｑパッケージの解釈および報告
表３に列挙した基準を使用して、クローン性の決定の前に、トップの統合されたリード配列およびそれらの頻度を同定するために統合されたリードの要約の報告を使用すべきである。
【表３−１】
2021532792.tif 000011
【表３−２】
2021532792.tif 000012
【表３−３】
2021532792.tif 000013
【０２１０】
結果
Ｔ細胞リンパ腫試料の診断および組織学データは、表６に見出すことができる。
【０２１１】
以下の表を参照すれば、「総数」は、ＮＧＳ装置から得られたリードの総数を意味する。「長さ」は、得られたリードの長さを意味する。「Ｖ遺伝子」は、検出されたＶ遺伝子のタイプを指す。「Ｊ遺伝子」は、検出されたＪ遺伝子のタイプを指す。「総リードパーセンテージ」は、決定された通りのこの特異的な遺伝子配列と一致したリードの総数のうちのパーセンテージである。
【０２１２】
表中のある特定の列は、単一の試料からの１つより多くのＶ遺伝子またはＪ遺伝子のタイプを示すことが観察されることになるが、これは、Ｄ−Ｊ接合が、Ｖ−Ｊ接合と同様に検出される場合起こり得る。この文書の他所で説明されるように、検出されたいずれのＤ−Ｊ接合も、それらは不完全な組換え事象を表すために捨てられる。好適には、決定されたＪ遺伝子のタイプは、Ｖ−Ｊ接合したＪ遺伝子（Ｊ領域）に由来する。
【０２１３】
細胞株
表４に、細胞株についての、ＤＮＡ濃度、アンプリコン濃度ならびにトップ１および／または２のクローン再編成を要約する：
【表４−１】
2021532792.tif 000014
【０２１４】
１つの細胞株試料（ＭＪ）において、２つのクローン再編成が検出された。Ｄ／Ｊ再編成は、不完全な再編成であり、Ｖ−Ｊ−Ｃの組合せでスプライシングで切り出されると予想される。Ｄ／Ｊ再編成などの不完全な再編成からのデータは、好適には、捨てられる。完全なＶ／Ｊ再編成に焦点が当てられる。したがって、「ＭＪ」の場合、「Ｄｂ１」データの列は、不完全な再編成であるために捨てられる。Ｖｂ２８データの列は、保持される。
【０２１５】
１つの細胞株試料（Ｒａｊｉ）において、１．０％未満のトップの％総リードが検出されたが、これは非クローン性である。非クローン性であるデータは、好適には、捨てられる。クローン性のデータに焦点が当てられる。
【０２１６】
上記で説明したように捨てられたデータに従って、表４Ａが作成される。
【表４−２】
2021532792.tif 000015
Ｊ１−Ｃ１およびＪ２−Ｃ２の相関に基づいて、ＭＪは、Ｃ１である。
【０２１７】
３つの細胞株試料（Ｊｕｒｋａｔ、ＨＰＢ−ＡＬＬおよびＨ９）において、１つのＶ−Ｊ再編成が検出された。Ｊ１−Ｃ１およびＪ２−Ｃ２の相関に基づいて、ＪｕｒｋａｔおよびＨ９細胞は、Ｃ１であり、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞は、Ｃ２である。
【０２１８】
全ての細胞株データは、報告された文献と一致する。
【０２１９】
試料
表５に、Ｔ細胞リンパ腫試料のＤＮＡ濃度、アンプリコン濃度ならびにトップ１および／または２のクローン再編成を要約する。
【０２２０】
４つのＴ細胞リンパ腫試料（Ｆ１９５４２．１ａ、Ｆ１９５３９．１ｃ、Ｆ１９５３８．Ａ１ｂおよびＴＳ１８−１５１２Ａ）において、２つのクローン再編成が検出される。Ｄ／Ｊ再編成などの不完全な再編成からのデータは、好適には、捨てられる。完全なＶ／Ｊ再編成に焦点が当てられる。したがって、これらの試料の場合、データの「Ｄｂ１」または「Ｄｂ２」の列は、不完全な再編成であるために捨てられる。Ｖｂ１３、Ｖｂ２９−１、Ｖｂ１２−４およびＶｂ６−４データの列は、保持される。
【０２２１】
２つの試料（ＴＳ１８−１５０８ＡおよびＴＳ１８−１４９９Ａ）において、無−Ｊ再編成もしくはＤ−Ｊ再編成のいずれか、および／または１．０％未満のトップの％総リードが検出され、非クローン性とみなされる。ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋキットのＩＦＵ２８０４１０に従って、より好適には上記の表３に従って、非クローン性または評価不可能と決定された残りの試料からのデータは、捨てられる。非クローン性のデータは、好適には、捨てられる。クローン性のデータに焦点が当てられる。
【０２２２】
上記で説明したように捨てられたデータに従って、表５Ａが作成される。
【表５−１】
2021532792.tif 000016
【表５−２】
2021532792.tif 000017
【表５−３】
2021532792.tif 000018
【表６】
2021532792.tif 000019
【０２２３】
Ｊ１−Ｃ１およびＪ２−Ｃ２の相関（表５Ａ）に基づいて、Ｆ１９５４２．１ａは、Ｃ１であり、Ｆ１９５３９．１ｃおよびＴＳ１８−１５１２Ａは、Ｃ２である。
【０２２４】
１つの試料（Ｆ４５０３８．ｂ）において、１つのＶ−Ｊ再編成（Ｖｂ１２−４／Ｊｂ１−６）が検出される。Ｊ１−Ｃ１およびＪ２−Ｃ２の相関に基づいて、この試料は、Ｃ１である。
【０２２５】
まとめると、ＬｙｍｐｈｏＴｒａｃｋ  Ｄｘ  ＴＲＢアッセイ−ＭｉＳｅｑによって試料がクローン性であると決定される場合、その試料は、ＴＲＢＣ１（Ｃ１）またはＴＲＢＣ２（Ｃ２）陽性であるとして同定され、その場合、Ｊ１配列の存在は、Ｃ１陽性を決定し、またはＪ２配列の存在は、Ｃ２陽性を決定する。
【０２２６】
本発明の例示的な実施形態を、添付の図面を参照しながら本明細書において詳細に開示したが、本発明は、示された正確な実施形態に限定されないこと、ならびに当業者によって、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲およびそれらの均等物から逸脱することなく、それらに様々な変更および改変を実行することができることが理解されるであろう。
【０２２７】
上記の明細書中で述べられた全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021532792.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021532792.tif 000027
2021532792.tif 000028