(57)【要約】  ＲＯＲ１抗原結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体が開示される。さらに、上記キメラ抗原受容体に関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、抗原結合断片、および医薬組成物が開示される。さらに、対象におけるがんの処置または予防方法、およびキメラ抗原受容体Ｔ細胞の作製方法が開示される。
2021502070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号７を含むヌクレオチド配列でコードされるＲＯＲ１抗原結合ドメインを含む少なくとも１つの細胞外の抗原結合ドメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２】
コードされる前記少なくとも１つのＲＯＲ１抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１に結合する抗体の少なくとも１つの一本鎖可変断片を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
コードされる前記少なくとも１つのＲＯＲ１抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
コードされる前記少なくとも１つのＲＯＲ１抗原結合ドメイン、前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方は、リンカーまたはスペーサドメインによって、前記膜貫通ドメインに結合される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
コードされる前記リンカーまたはスペーサドメインは、ＩｇＧ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８の細胞外ドメインに由来し、かつ、膜貫通ドメインに結合している、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
コードされる前記細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメインは、リーダーペプチドをコードするリーダーヌクレオチド配列の後ろに位置する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記リーダーヌクレオチド配列は、配列番号２０のリーダーアミノ酸配列をコードする配列番号１９を含むヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、およびＴＮＦＲＳＦ１９、またはこれらの任意の組み合わせを含むタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１を含むヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、またはこれらとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
コードされる前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
コードされる前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインよりもＮ末端側に位置している、請求項１０に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
コードされる前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
コードされる前記少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの任意の組み合わせの機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１に記載の単離された核酸分子によりコードされるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項１５】
配列番号２または８のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１抗原結合ドメインを含む少なくとも１つの細胞外の抗原結合ドメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、請求項１４に記載のＣＡＲ。
【請求項１６】
前記ＲＯＲ１抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１に結合する抗体の少なくとも１つの一本鎖可変断片を含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
【請求項１７】
前記ＲＯＲ１抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
【請求項１８】
前記膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、およびＴＮＦＲＳＦ１９、またはこれらの任意の組み合わせを含むタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
【請求項１９】
前記ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列との同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のＣＡＲ。
【請求項２０】
前記配列番号２もしくは８のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１抗原結合ドメインを含む少なくとも１つの細胞外の抗原結合ドメイン、および前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方は、リンカーまたはスペーサドメインによって、前記膜貫通ドメインに結合される、請求項１５に記載のＣＡＲ。
【請求項２１】
前記リンカーまたはスペーサドメインは、ＩｇＧ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８の細胞外ドメインに由来し、かつ、膜貫通ドメインに結合している、請求項２０に記載のＣＡＲ。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインを含む、請求項２２に記載のＣＡＲ。
【請求項２４】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２５】
前記ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
プロモーターをさらに含む、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２７】
前記プロモーターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、自殺プロモーター、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２４に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２９】
前記細胞はＴ細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞はＣＤ８＋  Ｔ細胞である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
前記細胞はヒト細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３２】
請求項２４に記載のベクターをＴ細胞に形質導入する工程を含む、細胞作製方法。
【請求項３３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡまたは合成されたＲＮＡを細胞中に導入する工程を含み、前記ＲＮＡは請求項１に記載の核酸分子を含む、ＲＮＡ操作細胞の集団の発生方法。
【請求項３４】
哺乳動物への抗腫瘍免疫の提供方法であって、請求項２８に記載の細胞の有効量を前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項３５】
哺乳動物におけるがんの処置または予防方法であって、前記哺乳動物に、請求項１５に記載のＣＡＲを、前記哺乳動物におけるがんの処置または予防に有効な量にて投与する工程を含む、方法。
【請求項３６】
抗腫瘍有効量のヒトのＴ細胞の集団を含む医薬組成物であって、前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記ＣＡＲは、配列番号２または８のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１抗原結合ドメインを含む少なくとも１つの細胞外の抗原結合ドメイン、少なくとも１つのリンカードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、かつ、前記Ｔ細胞は、がんを有するヒトのＴ細胞である、医薬組成物。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはこれらの任意の組み合わせを含むタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記Ｔ細胞は、血液がんを有するヒトのＴ細胞である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記血液がんは白血病またはリンパ腫である、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記白血病は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはホジキンリンパ腫である、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記血液がんは多発性骨髄腫である、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記ヒトのがんは、口腔（ｃｏｒａｌ）および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管（ｉｎｔｅｒｈｅｐａｔｉｃ  ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ）、胆嚢、膵臓）、呼吸器がん（喉頭、肺、および気管支）、骨および関節がん、軟部組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌）を含む成人癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、神経膠腫）、ならびに、乳房、生殖器系（子宮頸部、子宮体部、卵巣、外陰部、膣、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）、脳および他の神経系のがん、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
腫瘍抗原の発現上昇に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物の処置方法であって、前記方法は、抗腫瘍有効量のＴ細胞の集団を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記ＣＡＲは、配列番号２または８のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１抗原結合ドメインを含む少なくとも１つの細胞外の抗原結合ドメイン、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記Ｔ細胞は、がんを有する前記対象のＴ細胞である、方法。
【請求項４５】
それを必要とする対象におけるがんの処置方法であって、前記方法は、抗腫瘍有効量のＴ細胞の集団を含む医薬組成物を前記対象に投与する工程を含み、前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記ＣＡＲは、配列番号２または８のアミノ酸配列を含むＲＯＲ１抗原結合ドメインを含む少なくとも１つの細胞外の抗原結合ドメイン、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサードメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記Ｔ細胞は、がんを有する前記対象のＴ細胞である、方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはこれらの任意の組み合わせを含むタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
キメラ抗原受容体発現細胞の作製プロセスであって、前記プロセスは、請求項１に記載の単離された核酸を細胞中に導入する工程を含む、プロセス。
【請求項４８】
前記細胞は、Ｔ細胞、またはＴ細胞を含有する細胞集団である、請求項４７に記載のキメラ抗原受容体発現細胞の作製プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本願は、米国特許法第１１９（ｅ）条に準拠して、２０１７年１１月３日付で提出された米国仮特許出願第６２／５８１，２８４号に基づく優先権を主張する。同米国仮特許出願の全記載内容を引用により本明細書に援用する。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ様式にて電子的に提出された配列表を含み、この配列表の全体を引用により本明細書に援用する。このＡＳＣＩＩのコピー（２０１８年１０月２５日作成）のファイル名は「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、サイズは９０．０キロバイトである。
【０００３】
連邦政府の資金援助を受けた研究または開発に関する記述
本発明は、アメリカ国立衛生研究所と米国保健福祉省の一機関との共同研究開発契約（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）の実現によってなされたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
本開示の分野
本願は、がんの分野、特に、ＲＯＲ１抗原結合ドメイン、このＲＯＲ１抗原結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
がんは、人間の健康にとって非常に致死率の高い脅威の１つである。がんは、米国だけで毎年１３０万人近くが新たに罹患し、死亡原因としては心血管疾患に続いて第２位であり、死亡例の４例に１例はがんによるものである。こうした死亡例のほとんどは固形腫瘍が原因である。いくつかの特定のがんの医学的処置は著しく進歩したが、すべてのがんを合わせた５年生存率は、過去２０年間で約１０％しか改善されていない。がんまたは悪性腫瘍の転移および増殖は急速かつ制御不可能であるため、処置が極めて困難である。
【０００６】
固形腫瘍および液性腫瘍の処置においては、非常に多くの治療上の要求事項が満たされていない。ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）は、ＣＬＬ、乳房の癌、神経膠芽細胞腫、肺腺癌、および肉腫（ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、および線維肉腫）を含む多くの型のがんに高発現しているが、正常組織中には一般的には存在しない、胚性タンパク質である（Ｓｕｐｉｎｇ  Ｚｈａｎｇら，２０１２，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏ−Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＲＯＲ１  Ｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｖａｒｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１８１：１９０３−１９１０，Ａｓｈｗｉｎｉ  Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら，２０１７，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＯＲ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅｓ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２３：３０６１−３０７１，Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ，Ｎｉｃｈｏｌａｓら，２０１７，ＲＯＲ１，ａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｃｅｌｌ  ５．７（２０１４）：４９６−５０２）。ＲＯＲ１は、３つのスプライスバリアントを有し、これには、アミノ酸９３７個（シグナルペプチド１〜２９個）からなる１０４ｋＤａ（グリコシル化に依存して上限１２０ｋＤａ）の膜貫通型糖タンパク質と、これより小さい、細胞内形態および分泌形態の２つのバリアントとが含まれる（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＮＰ＿００５００３，Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ，Ｐ．およびＣａｒｒｏｌｌ，Ｒ．Ｄ．，１９９２，Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  Ｄｏｍａｉｎ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３６：２６１８１−２６１９０．）。形質転換された細胞の表面にＲＯＲ１が存在するということは、ＲＯＲ１を標的とすることによって、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）などの多くの液性がんおよびそれら以外の固形腫瘍に対する新規のがん処置の開発が可能となり得ることを示す（Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ，Ｎ．，Ｋｕｓｎｅｒ，Ｄ．ら，２０１４，ＲＯＲ１，ａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｃｅｌｌ，５：４９６−５０２）。
【０００７】
一般的には成人組織中に存在しないが、少なくとも１つの報告によると、副甲状腺、膵島、ならびに食道、胃、および十二指腸の領域におけるＲＯＲ１の発現が見いだされており（Ａｓｈｗｉｎｉ  Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら，２０１７，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＯＲ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅｓ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２３：３０６１−３０７１）、このことは、ＲＯＲ１を標的とする抗がん療法の臨床適用における注意の根拠となる。ＲＯＲ１受容体はサイトゾルプロテインキナーゼドメインを含有し、これは、いくつかの報告によると、ＷｎｔおよびＥＧＦＲのシグナル伝達に関与している（Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ，Ｎ．，Ｋｕｓｎｅｒ，Ｄ．ら，２０１４，ＲＯＲ１，ａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｃｅｌｌ，５：４９６−５０２）。腫瘍において、ＲＯＲ１は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘発し、腫瘍の増殖、侵襲、および転移形成を促進し、アポトーシス耐性に影響を及ぼし得る（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔｏｍｏｙａら，２０１２，“ＮＫＸ２−１／ＴＩＴＦ１／ＴＴＦ−１−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＯＲ１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ｓｕｓｔａｉｎ  ＥＧＦＲ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．”  Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ２１．３：３４８−３６１；Ｂｏｒｃｈｅｒｄｉｎｇ，Ｎ．，Ｋｕｓｎｅｒ，Ｄ．ら，２０１４，ＲＯＲ１，ａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎ＆Ｃｅｌｌ，５：４９６−５０２）。腫瘍表現型への寄与におけるその役割から、これが腫瘍の開始または増悪において重要な機能を果たしている可能性があり、そのため、ドライバタンパク質であることが示される。
【０００８】
がん処置におけるこれまでのアプローチは、手術、放射線療法、化学療法、および、血腫に対する骨髄移植を含む。しかしながら、現行の一次治療は、さらなる改善が必要であることを示す。このような改善は、新規の免疫療法方策にとって必要とされる。現在継続中の、ＲＯＲ１抗原を標的とする前臨床研究および臨床試験研究は、複数のモダリティを使用して構築されている。ＲＯＲ１特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球が、マウスおよび非ヒト霊長類系の両方において試験されている（Ｈｕａｎｇ  Ｘ，Ｐａｒｋ  Ｈ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｊ，Ｐａｏ  Ｊ，Ｍｕｌｖｅｙ  Ｅ，Ｚｈｏｕ  ＳＸら，２０１５，ＩＧＦ１Ｒ−ａｎｄ  ＲＯＲ１−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＡＲ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｒｉｓｋ  Ｓａｒｃｏｍａｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（７）：ｅ０１３３１５２；Ｈｕｄｅｃｅｋ  Ｍ，Ｓｃｈｍｉｔｔ  ＴＭ，Ｂａｓｋａｒ  Ｓ，Ｌｕｐｏ−Ｓｔａｎｇｈｅｌｌｉｎｉ  ＭＴ，Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＴＮ，Ｂｌｅａｋｌｅｙ  Ｍ，Ｔｕｒｔｌｅ  ＣＪ，Ｃｈａｎｇ  ＷＣ，Ｇｒｅｉｓｍａｎ  ＨＡ，Ｗｏｏｄ  Ｂ，Ｍａｌｏｎｅｙ  ＤＧ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＭＣ，Ｒａｄｅｒ  Ｃ，Ｒｉｄｄｅｌｌ  ＳＲ，２０１０，Ｔｈｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＲＯＲ１  ｃａｎ  ｂｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａ  ＲＯＲ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ  １１６：４５３２−４１．）。非ヒト霊長類において毒性がないことから、ヒトにおける研究に着手できるという確信がもたらされる（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．ら，２０１５，Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＲＯＲ１  ｉｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３：２０１６−２１６．）。さらに、未改変のＲＯＲ１抗体および免疫毒素と結合したＲＯＲ１抗体の両方が、治療的使用を目的として提案されている（Ｙａｎｇ，Ｊｉａｈｕｉら，２０１１，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ    ＲＯＲ１  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．”  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６．６：ｅ２１０１８；Ｂａｓｋａｒ，Ｓｉｖａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら，２０１２，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＲＯＲ１．”  ＭＡｂｓ，４：３，３４９−３６１．）。現行のＢ系白血病の標準治療は、高用量の化学療法または放射線療法による寛解導入処置に続いて地固め療法を行なうものであると考えられるが、必要に応じて幹細胞移植およびさらなる化学療法を行なうことを特徴とし得る（ワールドワイドウェブのｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖを参照）。こうした処置は毒性が高く、再発、二次性悪性腫瘍、またはＧＶＨＤなどの合併症のリスクもあるため、これに代わるより良い治療法が探索されている。目下のオープンの臨床試験は、血液悪性腫瘍に対するＲＯＲ１標的Ｔ細胞（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＯＲ１＋  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ，ＮＣＴ０２７０６３９２，資金援助：フレッドハッチンソン癌研究所（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ），ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  アクセス日：２０１７年９月２０日．）、および化学療法の範囲内での乳がんに対するＲＯＲ１特異的抗体（Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｍｔｕｚｕｍａｂ  ａｎｄ  Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｏｒ  Ｌｏｃａｌｌｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ，Ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ，ＮＣＴ０２７７６９１７，資金援助：Ｂａｒｂａｒａ  Ｐａｒｋｅｒ，ＭＤ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  アクセス日：２０１７年９月２０日）を含む。
【０００９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（１）細胞外の抗原結合モチーフ、（２）結合／膜貫通モチーフ、および（３）細胞内のＴ細胞シグナル伝達モチーフという３つの必須ユニットからなる混成分子である（Ｌｏｎｇ  ＡＨ，Ｈａｓｏ  ＷＭ，Ｏｒｅｎｔａｓ  ＲＪ．Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ−ａｃｔｉｖｅ  ＣＤ２２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３；２（４）：ｅ２３６２１）。ＣＡＲの抗原結合モチーフは、一般的に、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の最も小さい結合ドメインである一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ；ＳｃＦｖ）を模して作製される。受容体リガンド（すなわち、腫瘍において発現するＩＬ−１３受容体に結合するようにＩＬ−１３を設計した）などの他の抗原結合モチーフ、完全型免疫受容体、ライブラリ由来のペプチド、および自然免疫系エフェクター分子（たとえば、ＮＫＧ２Ｄ）も、設計によって組み込まれている。ＣＡＲを発現させる他の細胞標的（ＮＫまたはガンマ−デルタＴ細胞など）も開発中である（Ｂｒｏｗｎ  ＣＥら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２；１８（８）：２１９９−２０９；Ｌｅｈｎｅｒ  Ｍら  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（２）：ｅ３１２１０）。ＣＡＲベクターを用いて形質導入するＴ細胞集団のうち活性が最も高いものを明らかにし、最適な培養および増殖技術を見つけ、ＣＡＲタンパク質の構造自体を分子レベルで詳細に解明するには、さらに相当の労力が費やされなければならない。
【００１０】
ＣＡＲの結合モチーフは、ＩｇＧの定常ドメインなどの比較的安定な構造ドメインであってよい、または、長い可動性リンカーとして設計できる。ＩｇＧ定常ドメイン由来構造モチーフなどの構造モチーフを使用して、Ｔ細胞細胞膜表面から遠い位置までＳｃＦｖ結合ドメインを引き延ばすことができる。このことは、結合ドメインが腫瘍細胞表面膜の特に近くにあるいくつかの腫瘍標的（ジシアロガングリオシドＧＤ２など；Ｏｒｅｎｔａｓら、この観察は未公開）にとって重要である可能性がある。これまでＣＡＲにおいて使用されているシグナル伝達モチーフはいずれも、ＣＤ３−ゼータ鎖を含む。というのは、このコアモチーフはＴ細胞活性化にとって重要なシグナルであるためである。最初に報告された第２世代のＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８膜貫通配列を特徴とするものであった。このモチーフは、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達モチーフをさらに含有する第３世代のＣＡＲに使用された（Ｚｈａｏ  Ｙら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８３（９）：５５６３−７４）。新技術が出現したことによって、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体に結合したビーズによるＴ細胞の活性化、ならびにＣＤ２８からの古典的な「シグナル２」の存在を、ＣＡＲ自体がコードする必要はもはやなくなった。ビーズ活性化を用いた第３世代ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて第２世代ベクターを超えるものではないことが分かり、さらに、白血病マウスモデルにおいて第２世代ベクターを明らかに超える利益を提供するものではなかった（Ｈａｓｏ  Ｗ，Ｌｅｅ  ＤＷ，Ｓｈａｈ  ＮＮ，Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｍ，Ｙｕａｎ  ＣＭ，Ｐａｓｔａｎ  ＩＨ，Ｄｉｍｉｔｒｏｖ  ＤＳ，Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ  ＤＪ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ＤＭ，Ｗａｙｎｅ  ＡＳ，Ｍａｃｋａｌｌ  ＣＬ，Ｏｒｅｎｔａｓ  ＲＪ．Ａｎｔｉ−ＣＤ２２−ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（７）：１１６５−７４；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮら  Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１２）：２７０９−２０）。このことは、第２世代のＣＤ２８／ＣＤ３−ゼータ（Ｌｅｅ  ＤＷら  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ；２０１３年１２月７〜１０日）およびＣＤ１３７／ＣＤ３−ゼータシグナル伝達様式（Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬら  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１１；３６５（８）：７２５−３３）におけるＣＤ１９特異的ＣＡＲの臨床での成功によって証明されている。ＣＤ１３７に加えて、ＯＸ４０などの腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの他のメンバーも、ＣＡＲが形質導入されたＴ細胞において重要な持続性シグナルを提供できる（Ｙｖｏｎ  Ｅら  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９；１５（１８）：５８５２−６０）。これと同様に重要なのは、ＣＡＲ  Ｔ細胞集団を培養した培養条件、たとえば、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５を含めることなどであ���（Ｋａｉｓｅｒ  ＡＤら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１５；２２（２）：７２−７８）。
【００１１】
現時点で、ＣＡＲ療法をがんに対してさらに幅広く効果的に適応するにあたっての課題は、有望な標的がほとんど存在しないことに関連する。細胞表面抗原に結合するバインダの作製は現在では容易に達成できるが、腫瘍に特異的でありかつ正常組織に影響を及ぼさない細胞表面抗原の発見は、依然として非常に困難である。ＣＡＲ発現Ｔ細胞に、これまでよりも強い標的細胞特異性を与え得る方法として、複数のＣＡＲアプローチを組み合わせて使用する方法がある。１つの系において、ＣＤ３−ゼータシグナルユニットおよびＣＤ２８シグナルユニットを、同一細胞中に発現させた２つの異なるＣＡＲコンストラクトのそれぞれに分割し、別の系において、２つのＣＡＲを同一Ｔ細胞中に発現させるが、そのうち一方のほうが親和性が低いため、もう一方のＣＡＲを最初に結合させて、後者のＣＡＲの活性を最大限とする必要がある（Ｌａｎｉｔｉｓ  Ｅら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１３；１（１）：４３−５３；Ｋｌｏｓｓ  ＣＣら  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（１）：７１−５）。単一のＳｃＦｖに基づくＣＡＲを免疫療法剤として作製するにあたっての２つめの課題は、腫瘍細胞が均一でないことである。少なくとも１つのグループが、ＣＡＲを用いた神経膠芽細胞腫の治療法を開発しており、この方法は、エフェクター細胞集団が同時に複数種の抗原（ＨＥＲ２、ＩＬ−１３Ｒａ、ＥｐｈＡ２）を標的とするもので、標的抗原を有さない集団の増殖回避を試みたものである（Ｈｅｇｄｅ  Ｍら  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１３；２１（１１）：２０８７−１０１）。
【００１２】
Ｔ細胞に基づく免疫療法は、合成生物学における新たな最先端領域となった。この高効力の細胞を腫瘍微小環境へ誘導する目的で複数のプロモーターおよび遺伝子産物が構想されており、Ｔ細胞は、腫瘍微小環境において、負の制御シグナルを回避して効果的な腫瘍の死滅を仲介し得る。ＡＰ１９０３などの二量体化誘導化学物質を使用した誘導性カスパーゼ９コンストラクトの二量化（薬剤に誘発される二量化）によって不要なＴ細胞を除去する手法は、Ｔ細胞集団を制御できる強力なスイッチを薬理学的に始動させ得る１つの方策を提示するものである（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  Ａら  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１１；３６５（１８）：１６７３−８３）。さらに、おとりの受容体を発現させることにより、形質転換増殖因子βの負の制御作用に反応しないエフェクターＴ細胞集団を作製する手法は、最適な抗腫瘍活性を得るためにエフェクターＴ細胞を操作できる程度を示す（Ｆｏｓｔｅｒ  ＡＥら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８；３１（５）：５００−５）。したがって、ＣＡＲは内因性Ｔ細胞受容体と類似する様式にてＴ細胞活性化をトリガできるようではあるが、現時点では、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ＋  Ｔ細胞の増殖が限られていること、この細胞が輸液後すぐに消失すること、および臨床活動が不調であることが大きな障害となっていて、当該技術の臨床応用は進んでいない。使用されたＣＡＲ配列のいくつかがマウス由来であることに一部起因する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
抗体またはＣＡＲ−Ｔ療法のいずれかを受けた患者に対し、反応を持続させるために、続いてＨＳＣＴを受けさせる必要があるか否か、ということは、依然として活発に議論されている領域である。ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ試験において高い反応が報告されているが、少なくとも２０％の患者が短期間で不成功に終わっている（Ｄａｖｉｓ  ＫＬ，Ｍａｃｋａｌｌ  ＣＬ，２０１６，Ｂｌｏｏｄ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  １：２６５−２６８）。ＣＡＲ１９処置の１２か月後の時点で報告された最も良好な結果として、ペンシルベニア大学においてＴ細胞生成物の投与を受け得た患者の５５％がＲＦＳを示し、７９％がＯＳを示した（Ｍａｕｄｅ  ＳＬ，Ｔｅａｃｈｅｙ  ＤＴ，Ｒｈｅｉｎｇｏｌｄ  ＳＲ，Ｓｈａｗ  ＰＡ，Ａｐｌｅｎｃ  Ｒ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ＤＭ，Ｂａｒｋｅｒ  ＣＳ，Ｃａｌｌａｈａｎ  Ｃ，Ｆｒｅｙ  ＮＶ，Ｆａｒｚａｎａ  Ｎ，Ｌａｃｅｙ  ＳＦ，Ｚｈｅｎｇ  Ａ，Ｌｅｖｉｎｅ  Ｂ，Ｍｅｌｅｎｈｏｒｓｔ  ＪＪ，Ｍｏｔｌｅｙ  Ｌ，Ｐｒｔｅｒ  ＤＬ，Ｊｕｎｅ  ＣＨ，Ｇｒｕｐｐ  ＳＡ，２０１６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３４，ｎｏ．１５＿ｓｕｐｐｌ（２０１６年５月）３０１１−３０１１）。予期された長期の反応が５０％以下であったことから、依然として、ＲＯＲ１などの新しいＢ細胞性悪性腫瘍標的が臨床において大いに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、がんならびに他の疾患および／または状態の処置に使用できるＣＡＲ組成物ならびに治療方法を提供することによって、上述される必要性に対処するものである。特に、本明細書中に開示および記載される本発明は、ＲＯＲ１の調節不全発現に関連する疾患、障害、または状態の処置に使用できるＣＡＲを提供し、このＣＡＲは、形質導入Ｔ細胞上での表面発現が高いＲＯＲ１抗原結合ドメインを含有し、ＲＯＲ１発現細胞の細胞溶解の程度が高く、かつ、形質導入Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて増殖および持続する。
【００１５】
概要
新規の抗ＲＯＲ１抗体、またはその抗原結合ドメイン、およびこのようなＲＯＲ１抗原結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および、この受容体を発現する宿主細胞（たとえば、Ｔ細胞）、およびこの受容体をコードする核酸分子が、本明細書中において提供される。このＣＡＲは、形質導入Ｔ細胞上での表面発現が高く、細胞溶解の程度が高く、かつ形質導入Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて増殖および持続する。さらに、たとえば、対象におけるがんを処置するための、開示されるＣＡＲ、宿主細胞、および核酸分子の使用方法が提供される。
【００１６】
したがって、一態様において、配列番号１および７からなる群より選択される核酸配列を含む、ヒト抗ＲＯＲ１抗体またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１７】
一実施形態において、完全ヒト抗ＲＯＲ１抗体またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで、この抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、および一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）からなる群より選択される断片を含む。
【００１８】
一実施形態において、完全ヒト抗ＲＯＲ１抗体またはその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され、ここで、この抗体またはその断片は、配列番号２および８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
一態様において、Ｎ末端からＣ末端に向かって、配列番号１および７からなる群より選択される核酸配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１つのＲＯＲ１抗原結合ドメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離された核酸分子が提供される。
【００２０】
一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１に結合する抗体の少なくとも１つの一本鎖可変断片を含む。
【００２１】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。
【００２２】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるＣＡＲの細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメインは、ＲＯＲ１に結合する、少なくとも１つのリポカリンに基づく抗原結合抗原（アンチカリン）をさらに含む。
【００２３】
一実施形態において、単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメインは、リンカードメインによって、膜貫通ドメインに結合している。
【００２４】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるＲＯＲ１の細胞外の抗原結合ドメインは、リーダーまたはシグナルペプチドをコードする配列の後ろに位置する。
【００２５】
さらに別の一実施形態において、配列番号１および７からなる群より選択される核酸配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１つのＲＯＲ１抗原結合ドメインを含むＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＴＳＬＰＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ、またはこれらの任意の組み合わせを含む（がこれらに限定されない）抗原を標的とする細胞外の抗原結合ドメインをさらにコードする。
【００２６】
特定の実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、さらにコードされる細胞外の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２０  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２２  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗メソテリンＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３３  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３８  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１３８  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ２  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ３  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＦＧＦＲ４  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ｃ−Ｍｅｔ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＰＭＳＡ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＧＤ−２  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、またはこれらとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００２７】
一態様において、本明細書中において提供されるＣＡＲは、リンカーまたはスペーサドメインをさらに含む。
【００２８】
一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、またはその両方は、リンカー（Ｌ）、ヒンジ（Ｈ）、またはスペーサドメインによって、膜貫通ドメインに結合される。
【００２９】
一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるリンカードメインは、ＣＤ８またはＣＤ２８の細胞外ドメインに由来し、かつ、膜貫通ドメインに結合している。
【００３０】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるＣＡＲは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４、またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインをさらに含む。
【００３１】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインをさらに含む。
【００３２】
一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインよりもＮ末端側に位置している。
【００３３】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３４】
さらなる実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの組み合わせの機能的シグナル伝達ドメインを含む。
【００３５】
一実施形態において、リーダー配列またはシグナルペプチドをさらに含有するＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、リーダーまたはシグナルペプチド（ＬＰ）のヌクレオチド配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるリーダー配列は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【００３７】
一態様において、Ｎ末端からＣ末端に向かって、少なくとも１つのＲＯＲ１抗原結合ドメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、本明細書中において提供される。
【００３８】
一実施形態において、ＣＡＲが提供され、ここで、細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメインは、抗原に結合する抗体の少なくとも１つの一本鎖可変断片、または抗原に結合する抗体の少なくとも１つの重鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３９】
別の一実施形態において、ＣＡＲが提供され、ここで、少なくとも１つの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲが提供され、ここで、ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＦＧＦＲ４、ＴＳＬＰＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＴＳＬＰＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ、またはこれらとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む細胞外の抗原結合ドメインをさらにコードする。
【００４１】
一実施形態において、ＣＡＲが提供され、ここで、細胞外の抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２０  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ２２  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗メソテリンＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３３  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ３８  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＣＤ１３８  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ２  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＧＰＣ３  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＦＧＦＲ４  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＴＳＬＰＲ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ｃ−Ｍｅｔ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＰＭＳＡ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗糖脂質Ｆ７７  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＧＤ−２  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、抗ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲ  ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン、またはこれらとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００４２】
別の一実施形態において、ＣＡＲが提供され、ここで、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００４３】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲが提供され、ここで、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメインを含む。
【００４４】
一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号３の核酸配列（ＬＴＧ  １９４１  ＬＰ−ＳｃＦＶ４−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲ核酸配列（図２Ａ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号４のアミノ酸配列（ＬＴＧ  １９４１  ＬＰ−ＳｃＦｖ４−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲアミノ酸配列（図２Ａ））を含むＣＡＲをコードする。
【００４５】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号５の核酸配列（ＬＴＧ  ２５２８  ＬＰ−ＳｃＦｖ４−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲ核酸配列（図２Ｂ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号６のアミノ酸配列（ＬＴＧ  ２５２８  ＬＰ−ＳｃＦｖ４−１−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲアミノ酸配列（図２Ｂ））を含むＣＡＲをコードする。
【００４６】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号９の核酸配列（ＬＴＧ１９４２  ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲヌクレオチド配列（図２Ｃ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号１０のアミノ酸配列（ＬＴＧ１９４２  ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲアミノ酸配列（図２Ｃ））を含むＣＡＲをコードする。
【００４７】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１１の核酸配列（ＬＴＧ２５２９  ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲ核酸配列（図２Ｄ））を含む。一実施形態において、核酸配列は、配列番号１２のアミノ酸配列（ＬＴＧ２５２９  ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８  ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲアミノ酸配列（図２Ｄ））を含むＣＡＲをコードする。
【００４８】
一態様において、本明細書中に開示されるＣＡＲは、がん患者の診断、モニタリング、および／もしくは無増悪生存などの処置転帰の予測において使用するための、またはこのような処置の進捗をモニタリングするための、検出可能なマーカーを発現または含有するように改変される。
【００４９】
一実施形態において、開示されるＣＡＲをコードする核酸分子は、ウイルスベクターなどのベクター中に含有されてよい。ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター、またはこれらの組み合わせである。
【００５０】
特定の実施形態において、ベクターはプロモーターをさらに含み、このプロモーターは、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、自殺プロモーター、またはこれらの任意の組み合わせである。
【００５１】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲを発現するベクターは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現を制御するため、または自殺スイッチによってＣＡＲ−Ｔ細胞を除去するための、１つ以上の作動可能な要素を含むようにさらに改変されてよい。この自殺スイッチは、たとえば、アポトーシス誘発シグナル伝達カスケードまたは細胞死を誘発する薬物を含んでよい。好ましい一実施形態において、ＣＡＲを発現するベクターは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）などの酵素を発現するようさらに改変されてよい。
【００５２】
別の一態様において、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む宿主細胞がさらに提供される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、対象から得られる初代Ｔ細胞などのＴ細胞である。一実施形態において、宿主細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【００５３】
さらに別の一態様において、抗腫瘍有効量のヒトＴ細胞の集団を含む医薬組成物が提供され、ここで、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲは、配列番号２または８のアミノ酸配列を含むヒトＲＯＲ１抗原結合ドメインを含む少なくとも１つの細胞外の抗原結合ドメインと、少なくとも１つのリンカードメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、Ｔ細胞は、がんを有するヒトのＴ細胞である。がんは、とりわけ、白血病（たとえば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫（たとえば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはホジキンリンパ腫）、または多発性骨髄腫、またはこれらの組み合わせなどの血液がんを含む。
【００５４】
一実施形態において、医薬組成物が提供され、ここで、ＣＡＲの少なくとも１つの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含有する。
【００５５】
別の一実施形態において、医薬組成物が提供され、ここで、ヒトのがんは、口腔および咽頭がん（舌、口、咽頭、頭頸部）、消化器がん（食道、胃、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、肝内胆管（ｉｎｔｅｒｈｅｐａｔｉｃ  ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ）、胆嚢、膵臓）、呼吸器がん（喉頭、肺、および気管支）、骨および関節がん、軟部組織がん、皮膚がん（黒色腫、基底細胞癌および扁平上皮癌）を含む成人癌、小児腫瘍（神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫）、中枢神経系の腫瘍（脳、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、神経膠腫）、ならびに、乳房、生殖器系（子宮頸部、子宮体部、卵巣、外陰部、膣、前立腺、精巣、陰茎、子宮内膜）、泌尿器系（膀胱、腎臓および腎盂、尿管）、眼および眼窩、内分泌系（甲状腺）、脳および他の神経系のがん、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００５６】
さらに別の一実施形態において、がんを有するヒトのヒトＴ細胞の集団を抗腫瘍有効量にて含む医薬組成物が提供され、ここで、がんは、１種以上の化学療法剤に反応しない難治性がんである。がんは、造血器がん、骨髄異形成症候群、膵臓がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、ＣＬＬ（慢性リンパ球性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む成人Ｂ細胞性悪性腫瘍、小児Ｂ細胞性悪性腫瘍（Ｂ系ＡＬＬ（急性リンパ球性白血病）を含む）、多発性骨髄腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫、または他の血液がんおよび固形腫瘍、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００５７】
別の一態様において、ＣＡＲ含有Ｔ細胞（以下では「ＣＡＲ−Ｔ細胞」）の作製方法が提供される。この方法は、ＲＯＲ１に特異的に結合するＣＡＲ（開示される）をコードするベクターまたは核酸分子をＴ細胞に形質導入する工程を含み、これによってＣＡＲ−Ｔ細胞を作製する。
【００５８】
さらに別の一態様において、ＲＮＡ操作細胞の集団の発生方法が提供され、これは、開示されるＣＡＲをコードする核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを、対象の細胞中に導入する工程を含み、これによってＣＡＲ発現細胞を発生させる。
【００５９】
さらに別の一態様において、細胞におけるＲＯＲ１の発現に関連する疾患、障害、または状態の診断方法が提供され、これは、ａ）細胞をヒト抗ＲＯＲ１抗体またはその断片に接触させる工程であって、この抗体またはその断片が、配列番号２または８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む工程と、ｂ）ＲＯＲ１の存在を検出する工程であって、ＲＯＲ１が存在する場合に、ＲＯＲ１の発現に関連する疾患、障害、または状態であると診断する工程とを含む。
【００６０】
一実施形態において、ＲＯＲ１の発現に関連する疾患、障害、または状態は、造血器がん、骨髄異形成症候群、膵臓がん、頭頸部がん、皮膚腫瘍、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における微小残存病変（ＭＲＤ）、ＣＬＬ（慢性リンパ球性白血病）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む成人Ｂ細胞性悪性腫瘍、小児Ｂ細胞性悪性腫瘍（Ｂ系ＡＬＬ（急性リンパ球性白血病）を含む）、多発性骨髄腫、肺がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がん、黒色腫、または他の血液がんおよび固形腫瘍、またはこれらの任意の組み合わせを含むがんである。
【００６１】
別の一実施形態において、哺乳動物におけるＲＯＲ１関連疾患について診断または予後診断またはリスク判断する方法が提供され、これは、哺乳動物に由来する試料中におけるＲＯＲ１の発現を検出する工程を含み、この工程は、ａ）試料をヒト抗ＲＯＲ１抗体またはその断片に接触させる工程であって、この抗体またはその断片が、配列番号２または８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、工程と、ｂ）ＲＯＲ１の存在を検出する工程であって、ＲＯＲ１が存在する場合に、哺乳動物においてＲＯＲ１関連疾患であると診断する工程とを含む。
【００６２】
別の一実施形態において、ＲＯＲ１依存性Ｔ細胞阻害の阻害方法が提供され、これは、細胞をヒト抗ＲＯＲ１抗体またはその断片に接触させる工程を含み、この抗体またはその断片は、配列番号２または８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、細胞は、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞、腫瘍関連マクロファージ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００６３】
別の一実施形態において、ＲＯＲ１発現細胞に介在されるＴ細胞阻害を遮断し、かつ、腫瘍微小環境を変化させて哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する方法が提供され、これは、単離された抗ＲＯＲ１抗体またはその断片を含む組成物を、有効量にて、哺乳動物に投与する工程を含み、この抗体またはその断片は、配列番号２および８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、細胞は、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞、腫瘍関連マクロファージ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００６４】
別の一実施形態において、哺乳動物における抗腫瘍性または抗がん性の免疫応答の免疫抑制を阻害、抑制、または予防する方法が提供され、これは、単離された抗ＲＯＲ１抗体またはその断片を含む組成物を、有効量にて、哺乳動物に投与する工程を含み、この抗体またはその断片は、配列番号２および８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、この抗体またはその断片は、第１の細胞とＴ細胞との間の相互作用を阻害し、第１の細胞は、ＲＯＲ１発現腫瘍細胞、腫瘍関連マクロファージ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００６５】
別の一態様において、哺乳動物における抗腫瘍免疫を誘発するための方法が提供され、これは、開示されるＣＡＲをコードするベクターまたは核酸分子が形質導入されたＴ細胞を、治療的有効量にて、哺乳動物に投与する工程を含む。
【００６６】
別の一実施形態において、哺乳動物におけるがんの処置または予防方法が提供され、これは、哺乳動物に、開示されるＣＡＲの１種以上を、哺乳動物におけるがんの処置または予防に有効な量にて投与する工程を含む。上記方法は、対象においてＣＡＲの抗原結合ドメイン、ＲＯＲ１の細胞外ドメイン、および／または上述される抗原のうち１種以上からなる免疫複合体を形成するのに十分な条件下において、ＲＯＲ１および／または上述される抗原のうち１種以上に特異的に結合するＣＡＲ（開示される）を発現する宿主細胞の治療的有効量を、対象に投与する工程を含む。
【００６７】
さらに別の一実施形態において、腫瘍抗原の発現上昇に関連する疾患、障害、または状態を有する哺乳動物を処置するための方法が提供され、上記方法は、抗腫瘍有効量のＴ細胞の集団を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲは、配列番号２および８のアミノ酸配列またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つの細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメイン、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞は、がんを有する対象のＴ細胞である。
【００６８】
さらに別の一実施形態において、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法が提供され、これは、抗腫瘍有効量のＴ細胞の集団を含む医薬組成物を対象に投与する工程を含み、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、ＣＡＲは、配列番号２もしくは８のアミノ酸配列またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのＲＯＲ１抗原結合ドメイン、少なくとも１つのリンカーまたはスペーサドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞は、がんを有する対象のＴ細胞である。上述される方法のいくつかの実施形態において、少なくとも１つの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ１６、ＴＮＦＲＳＦ１９、またはこれらの組み合わせの膜貫通を含む。
【００６９】
さらに別の一実施形態において、がんと診断されたヒトにおいて持続性の遺伝子操作Ｔ細胞の集団を発生させるための方法が提供される。一実施形態において、上記方法は、ＣＡＲを発現するよう遺伝子操作されたＴ細胞をヒトに投与する工程を含み、ＣＡＲは、配列番号２もしくは８のアミノ酸配列またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも１つのＲＯＲ１抗原結合ドメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、持続性の遺伝子操作Ｔ細胞の集団、またはＴ細胞の子孫の集団は、ヒトにおいて、投与後、少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、２年間、または３年間持続する。
【００７０】
一実施形態において、ヒトにおける子孫Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞を含む。別の一実施形態において、Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞である。
【００７１】
本明細書中に記載される方法のすべての態様および実施形態において、上述される、腫瘍抗原の発現上昇に関連するがん、疾患、障害、または状態は、いずれも、本明細書中に開示されるＣＡＲの１種以上を使用して処置または予防または寛解され得る。
【００７２】
さらに別の一態様において、上述されるキメラ抗原受容体Ｔ細胞を作製するための、または、上述される、対象における腫瘍抗原の発現上昇に関連するがん、疾患、障害、もしくは状態のうち任意のものを予防、処置、もしくは寛解するための、キットが提供され、これは、上記に開示される核酸分子、ベクター、宿主細胞、もしくは組成物のうち任意の１種、またはこれらの任意の組み合わせ、または当該キットの使用説明の入った容器を含む。
【００７３】
上述されるＣＡＲ、宿主細胞、核酸、および方法が、本明細書中において詳細に記載される具体的な態様および実施形態の範囲を超えて有用であることが理解される。上述される本開示の特徴および利点は、付属の図面を参照して記載される以下の詳細な説明によって、さらに明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】新規の細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインの配列を有するＣＡＲの一般的なドメイン構造の概略図である。キメラ抗原受容体は、細胞外ＲＯＲ１結合ＳｃＦｖドメインと、（ＩｇＧ４またはＣＤ８に由来する）スペーサーまたはヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ＣＤ１３７共刺激ドメインと、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインとから構成される。
【図２Ａ】図２Ａは、新規のヒト細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインの配列を含有するいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の核酸およびアミノ酸配列を示す。当該ＣＡＲの概略的なスキームは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド（ＳＰまたはＬＰ、リーダーペプチド）、ヒト抗ＲＯＲ１バインダ一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー（またはヒンジ、Ｈ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ  ＬＴＧ１９４１（ＬＰ−ＳｃＦｖ４−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）核酸配列（配列番号３）およびこれにコードされるアミノ酸配列（配列番号４）を発現するレンチウイルスベクターを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、新規のヒト細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインの配列を含有するいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の核酸およびアミノ酸配列を示す。当該ＣＡＲの概略的なスキームは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド（ＳＰまたはＬＰ、リーダーペプチド）、ヒト抗ＲＯＲ１バインダ一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー（またはヒンジ、Ｈ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ  ＬＴＧ２５２８（ＬＰ−ＳｃＦｖ４−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）核酸配列（配列番号５）およびこれにコードされるアミノ酸配列（配列番号６）を発現するレンチウイルスベクターを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、新規のヒト細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインの配列を含有するいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の核酸およびアミノ酸配列を示す。当該ＣＡＲの概略的なスキームは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド（ＳＰまたはＬＰ、リーダーペプチド）、ヒト抗ＲＯＲ１バインダ一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー（またはヒンジ、Ｈ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ  ＬＴＧ１９４２（ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）ヌクレオチド配列（配列番号９）およびこれにコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）を発現するレンチウイルスベクターを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、新規のヒト細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインの配列を含有するいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の核酸およびアミノ酸配列を示す。当該ＣＡＲの概略的なスキームは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド（ＳＰまたはＬＰ、リーダーペプチド）、ヒト抗ＲＯＲ１バインダ一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー（またはヒンジ、Ｈ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ  ＬＴＧ２５２９（ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）核酸配列（配列番号１１）およびこれにコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）を発現するレンチウイルスベクターを示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、新規のヒト細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインの配列を含有するいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の核酸およびアミノ酸配列を示す。当該ＣＡＲの概略的なスキームは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド（ＳＰまたはＬＰ、リーダーペプチド）、ヒト抗ＲＯＲ１バインダ一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー（またはヒンジ、Ｈ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ  ＬＴＧ  １９４３（ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）核酸配列（配列番号１５）およびこれにコードされるアミノ酸配列（配列番号１６）を発現するレンチウイルスベクターを示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、新規のヒト細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインの配列を含有するいくつかのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の核酸およびアミノ酸配列を示す。当該ＣＡＲの概略的なスキームは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド（ＳＰまたはＬＰ、リーダーペプチド）、ヒト抗ＲＯＲ１バインダ一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、細胞外リンカー（またはヒンジ、Ｈ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲ  ＬＴＧ２５２７：（ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）核酸配列（配列番号１７）およびこれにコードされるアミノ酸配列（配列番号１８）を発現するレンチウイルスベクターを示す。
【図３】初代ヒトＴ細胞における抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ表面発現を示す。ＳｃＦｖドメインを使用してＲＯＲ１腫瘍抗原に再指向させたＣＡＲ  Ｔ細胞を、レンチウイルスを用いたＣＡＲ発現コンストラクトの形質導入によって発生させた。ＣＡＲ  Ｔの検出はフローサイトメトリーによって行なった。Ｔ細胞を冷ＰＢＳ−ＥＤＴＡバッファー中で２回洗浄し、ＲＯＲ１−Ｆｃペプチド、続いて蛍光標識抗ヒト−ＦｃポリクローナルＦ（ａｂ）’２断片を用いて染色した。細胞を、前方散乱および側方散乱、１重項識別、ならびに７ＡＡＤ陰性に基づいてゲーティングし、これによって、生細胞のみを分析できるようにした。データを、ＡＰＣチャネルにおいてＭＡＣＳＱｕａｎｔ  １０  フローサイトメーターを使用して取得した。分析した試料が左軸上に列記されている：ＵＴＤ、非形質導入ネガティブコントロール細胞、ＧＦＰ−ＬＶコントロール形質導入、ＬＴＧ１９４１（ＳｃＦｖ４）、ＬＴＧ１９４２（ＳｃＦｖ９）、およびＬＴＧ１９４３（コントロール−ＳｃＦｖ）。垂直の点線により、ＣＡＲ発現のゲートが明示され、各集団におけるＣＡＲ発現の割合が列記される、ＣＡＲ％ＭＦＩ。
【図４】ＳｃＦｖバインダ（ＬＴＧ１９４１、ＬＴＧ１９４２、およびＬＴＧ１９４３）を組み込んだ抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲＯＲ１陽性腫瘍の細胞溶解への介在を示す。抗ＲＯＲ１コンストラクトを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を、ホタルルシフェラーゼを安定的に形質導入したＲＯＲ１陽性細胞株（Ｊｅｋｏ−ＬｕｃおよびＡ４３１−Ｌｕｃ）またはＲＯＲ１陰性株（Ｒｅｈ−ｌｕｃ）と共に、ｘ軸上に記載されるエフェクター標的比（Ｅ：Ｔ）にて、一晩インキュベートした。ＣＡＲ  Ｔ細胞傷害活性を、ルシフェラーゼ活性測定によって、材料および方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）に記載されるとおりに評価した。ＵＴＤ−形質導入されていないＴ細胞ネガティブコントロール、１５３８−ＬＴＧ１５３８  ＦＭＣ６３  マウス抗ＣＤ１９  ＣＡＲポジティブコントロール。
【図５】ＲＯＲ１陽性白血病株（Ｊｅｋｏ、灰色、またはＡ４３２、薄い灰色）と共培養した場合の、または、Ｔ細胞を非発現株（Ｒｅｈ）と共に、もしくは単独（灰色、最後の列）でインキュベートした場合の、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞による高レベルのサイトカイン産生を示す。このアッセイは、Ｅ：Ｔ比１０：１にて一晩実施し、次いで、上清のサイトカイン濃度をＥＬＩＳＡによって分析した。Ｎ＝２  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ  ＋／−ＳＤ。ネガティブコントロール：ＵＴ−非形質導入Ｔ細胞、ＬＴＧ１９４１、ＬＴＧ１９４２、ＬＴＧ１９４３、抗ＲＯＲ１形質導入Ｔ細胞。ＬＴＧ１３９８、ＧＦＰ−ＬＶ形質導入コントロールＴ細胞が、ｘ軸に明記される。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
詳細な説明
定義
本明細書中において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかな矛盾がない限り、単数形と複数形の両方を指す。たとえば、用語「ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ（抗原）」は、１つまたは複数の抗原を含み、「少なくとも１つの抗原」という言葉と同等であるとみなし得る。本明細書中において使用される場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」を意味する。したがって、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ」は、他の要素を除外しない「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ」を意味する。「および／または」という言葉は、「および」または「または」を意味する。さらに、特に記載がない限り、核酸またはポリペプチドに与えられる任意のおよびすべての塩基の大きさまたはアミノ酸の大きさならびにすべての分子量または分子質量の値は、近似値であり、説明目的で提供されることが理解される。本明細書中に記載されるものと類似または同等の多くの方法および材料を使用できるが、特に好適な方法および材料が以下に記載される。万一矛盾がある場合には、本明細書（用語の説明を含む）が支配する。これに加えて、材料、方法、および例示は、例証することのみを目的とし、限定を意図しない。多様な実施形態の確認を容易にするために、以下に用語の説明が提供される。
【００７６】
用語「約」は、量および持続期間などの測定可能な可能な値を指す場合、明示される値から±２０％、または場合によっては±１０％、または場合によっては±５％、または場合によっては±１％、または場合によっては±０．１％の変量を含むことを意味する。というのは、こうした変量が、開示される方法の実施に適切であるためである。
【００７７】
特に記載がない限り、本明細書中の科学用語は、従来の用法で使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ、オックスフォード大学出版局より出版、１９９９年；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社より出版、１９９４年；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社より出版、１９９５年；および他の類似する参考資料において見つけ得る。
【００７８】
本開示は、ＲＯＲ１抗体またはその断片、およびこのようなＲＯＲ１抗原結合ドメインを有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ＣＡＲの機能活性を向上させることは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の機能活性の向上に直接関連する。こうした改変の１つ以上がなされた結果として、ＣＡＲは、サイトカイン誘発性の細胞溶解と、形質導入Ｔ細胞における細胞表面発現との両方を、高レベルで呈し、かつ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の増殖および形質導入したＣＡＲ発現Ｔ細胞の持続が高レベルとなる。
【００７９】
異なるタンパク質ドメインに由来する機能的部位を組み合わせることができるユニークな能力は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の有する革新的な特徴である。こうしたタンパク質ドメインのいずれを選択するかということは、これらが特異的に結合する様式と同じように、重要な設計上の特徴である。個々の設計ドメインは、リンパ球の機能を操作する目的で、あらゆる異種のＣＡＲプラットフォームにおいて使用できる、必須の構成要素である。たとえば、細胞外結合ドメインの選択によって、そのままでは有効でないＣＡＲを有効とすることができる。
【００８０】
ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインの作製に使用される免疫グロブリン由来タンパク質の配列の非可変フレームワーク構成要素は、完全に中立的なものであってもよいし、または、自己結合し、Ｔ細胞を代謝性消耗状態にすることにより、このＣＡＲを発現する治療用Ｔ細胞の有効性を大幅に減ずるようなものであってもよい。この現象は、このＣＡＲドメインの抗原結合機能とは独立して生じる。さらに、細胞内シグナル伝達ドメインの選択によって、免疫療法に使用される治療用リンパ球集団の活性および耐久性を支配することもできる。ここで、標的抗原を結合する能力、ならびに、上述される細胞外および細胞内ドメインのそれぞれを経て活性化シグナルをＴ細胞に伝達する能力は、重要なＣＡＲ設計態様であるが、このことと共に明白になったのは、細胞外抗原結合断片の供給源の選択がＣＡＲの効力に著しい作用を及ぼす可能性があり、したがって、ＣＡＲの機能および臨床有用性において決定的な役割を有する可能性があるということである。
【００８１】
驚くべきことに、かつ予期しないことに、マウス由来抗原結合断片（宿主において抗マウス免疫応答およびＣＡＲ  Ｔ除去を誘発する傾向がある）（参照：ペンシルベニア大学の資金援助によるマウス由来のＳＳ１  ＳｃＦｖ配列を使用した臨床試験、ＮＣＴ０２１５９７１６）ではなく、完全ヒト抗原結合ドメインを、ＣＡＲにおいて使用することが、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の機能活性を決定し得ることが見いだされた。
【００８２】
この発見に照らして、ヒトｓｃＦｖ発現ライブラリからの複数のＲＯＲ１バインダが開発された。これらの完全ヒトＲＯＲ１  ＣＡＲは、マウス由来ではなくなっているため、患者によるアレルギーまたは拒絶反応を誘発しにくい（Ｍａｕｓ  ＭＶ，Ｈａａｓ  ＡＲ，Ｂｅａｔｔｙ  ＧＬ，Ａｌｂｅｄａ  ＳＭ，Ｌｅｖｉｎｅ  ＢＬ，Ｌｉｕ  Ｘ，Ｚｈａｏ  Ｙ，Ｋａｌｏｓ  Ｍ，Ｊｕｎｅ  ＣＨ，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１：２６−３１を参照）。その結果、これらの「完全ヒト」ＣＡＲをＴ細胞において発現させた後で患者に注入すると、治療的有効性がより高くなる可能性がある。こうしたヒト配列由来ＣＡＲバインダを、ヒトにおけるＲＯＲ１抗原を発現するがん、白血病、およびリンパ腫（Ｂ−ＣＬＬ、卵巣がん、トリプルネガティブ乳がん、肺腺癌、および神経膠芽細胞腫を含むがこれらに限定されない）の処置に使用し得る（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．ら，２０１６，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２３：３０６１−３０７１；および  Ｂａｓｋａｒ，Ｓ．ら，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：３９６−４０４；および  Ｊｕｎｇ，Ｅ．Ｈ．ら，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｆｕｎｃｔ，３４：１４９−１５７）。
【００８３】
本明細書中に開示されるＣＡＲは、細胞中で高レベルで発現する。このＣＡＲを発現する細胞はｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖率が高く、大量のサイトカインを産生し、かつ、ＣＡＲが結合するＲＯＲ１抗原を表面に有する細胞に対する傷害活性が高い。ヒト細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインを使用した結果、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける機能が改善されたＣＡＲが作製され、同時に、宿主における免疫応答における抗ＣＡＲ免疫の誘発とＣＡＲ  Ｔ細胞集団の死滅とが回避される。完全ヒト細胞外ＲＯＲ１  ＳｃＦｖ抗原結合ドメインを発現するＣＡＲは、優れた活性および／または特性を呈し、これには、ｉ）ＣＡＲ  Ｔの不良な持続性および不良な機能（マウス由来の結合配列でみられる）の防止と、ｉｉ）効力発揮のための特定領域（すなわち、胸膜内）へのＣＡＲの運搬の欠如と、ｉｉｉ）ＲＯＲ１親和性の高いバインダと低いバインダの両方に基づいたＣＡＲ  Ｔ細胞の設計を可能とする能力とが含まれる。後者の特性があることによって、研究者は、ＣＡＲ  Ｔ生成物の効力対毒性および／または組織特異性をより良好に調節することができる。というのは、ＲＯＲ１が正常組織よりも腫瘍において高発現しているために、親和性が低い方のバインダが正常組織よりも腫瘍に対して高い特異性を有する可能性があり、これにより、ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｏｆｆ  ｔｕｍｏｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙおよびバイスタンダー細胞死（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）を防止できるためである。
【００８４】
次に、本発明のＣＡＲについて詳細に説明する。この説明には、その細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインについての説明と、ＣＡＲ、抗体、およびその抗原結合断片、結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、ヌクレオチド、発現、ベクター、および宿主細胞、開示されるＣＡＲを使用する処置方法、組成物、およびキットについてのさらなる説明が含まれる。
【００８５】
Ａ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書中に開示されるＣＡＲは、ＲＯＲ１に結合できる少なくとも１つのＲＯＲ１抗原結合ドメインと、少なくとも１つの膜貫通ドメインと、少なくとも１つの細胞内ドメインとを含む。
【００８６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、膜貫通ドメインを介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに結合した抗体の抗原結合ドメイン（たとえば、一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＣＡＲの特徴として、ＭＨＣに制限されない様式で、Ｔ細胞の特異性および反応性を、選択された標的に再指向させ、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用する能力を含む。ＭＨＣに制限されずに抗原を認識できるため、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、抗原プロセシングから独立して抗原を認識でき、その結果として腫瘍エスケープの主要な機序を回避できる能力を有する。また、ＣＡＲは、Ｔ細胞において発現すると、有利にも、内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよびベータ鎖と二量体化しない。
【００８７】
本明細書中に開示されるとおり、ＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、たとえば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方を含んでよい。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインは、たとえばＣＤ３ゼータ  タンパク質の細胞内部分など（これに限定されない）のＴ細胞受容体の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指し、これは、リンパ球が抗原に対して効率よく反応するために必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。
【００８８】
１．細胞外ドメイン
一実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメインまたは部位とも称される標的特異的結合要素を含む。ドメインの選択は、標的細胞の表面を定めるリガンドの種類および数に依存する。たとえば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上において細胞表面マーカーとして働くリガンドを認識するように選択されてよい。したがって、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインのリガンドとして働き得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス感染、細菌感染、および寄生虫感染、自己免疫疾患、およびがん細胞に関連するものを含む。
【００８９】
一実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを設計することによって、目的の腫瘍抗原を標的とするように設計できる。腫瘍抗原は、腫瘍細胞によって産生され、免疫応答、特にＴ細胞介在性の免疫応答を顕在化させるタンパク質である。抗原結合ドメインの選択は、処置するがんの具体的な種類に依存し得る。腫瘍抗原は、たとえば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、およびＣＤ１９を含む。本明細書中に開示される腫瘍抗原は、単に例示として含まれる。その列記は限定を意図するものではなく、これら以外の例が当業者には容易に認識されるであろう。
【００９０】
一実施形態において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍に関連する１つ以上の抗原がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として働き得る複数のタンパク質を発現する。こうした分子は、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ、およびＧＰ１００、ならびに前立腺がんにおける前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの組織特異抗原を含むが、これらに限定されない。これら以外の標的分子として、がん遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子の群に属するものがある。さらに別の標的抗原の群として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などのがん胎児性の抗原がある。Ｂ細胞リンパ腫においては、腫瘍特異的なイディオタイプの免疫グロブリンが、個々の腫瘍に固有である真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原に該当する。ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１、およびＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原もまた、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原の候補である。こうした抗原（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）のうちいくつかは、モノクローナル抗体を使用する受動免疫療法の標的として使用されているが、十分な成功は収めていない。
【００９１】
好ましい一実施形態において、腫瘍抗原はＲＯＲ１であり、ＲＯＲ１の発現に関連する腫瘍は、細胞外タンパク質ＲＯＲ１を高レベルで発現する肺中皮腫、卵巣および膵臓がん、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００９２】
腫瘍抗原の種類は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であってもよい。ＴＳＡは腫瘍細胞に固有であり、身体の他の細胞上には生じない。ＴＡＡは、腫瘍細胞に固有ではなく、その代わり、この抗原に対する免疫寛容状態が誘発されない条件下おいて、正常細胞上にも発現する。腫瘍におけるこの抗原の発現は、この抗原に対する免疫系の応答を可能とする条件下において生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が成熟しておらず抗原に応答できない胎児発生の間に正常細胞上に発現する抗原であり得る、または、ＴＡＡは、通常から正常細胞上に極めて低レベルで存在しているが腫瘍細胞上ではこれより大幅に高いレベルで発現する抗原であり得る。
【００９３】
ＴＳＡまたはＴＡＡの例は、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２などの分化抗原、およびＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５などの腫瘍特異的多系譜抗原；ＣＥＡなどの過剰発現胚抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなどの過剰発現がん遺伝子および突然変異腫瘍抑制遺伝子；染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなど；ならびに、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７などのウイルス抗原を含むが、これらに限定されない。これら以外の、タンパク質に基づく大きな抗原は、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータ−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ  １５、ｐ  １６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ−フェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ  １２５、ＣＡ  １５−３／ＣＡ  ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ  １９５、ＣＡ  ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０／Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳを含む。
【００９４】
一実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン部分は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＦＧＦＲ４、ＴＳＬＰＲ、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、およびＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲなどを含むがこれらに限定されない抗原を標的とする。
【００９５】
好ましい一実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン部分は、細胞外ＲＯＲ１抗原を標的とする。
【００９６】
好ましい一実施形態において、細胞外ＲＯＲ１結合ドメインｓｃＦｖ４をコードする単離された核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列、またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含む。一実施形態において、単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメインｓｃＦｖ４は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列との同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列を含む。
【００９７】
好ましい一実施形態において、細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインＳｃＶ９をコードする単離された核酸分子は、配列番号７のヌクレオチド配列、またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含む。一実施形態において、単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外のＲＯＲ１抗原結合ドメインＳｃＦｖ９は、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８のアミノ酸配列との同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列を含む。
【００９８】
好ましい一実施形態において、細胞外ＲＯＲ１コントロールＳｃＦｖ抗原結合ドメインをコードする単離された核酸分子は、配列番号１３のヌクレオチド配列、またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含む。一実施形態において、単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされる細胞外のＲＯＲ１コントロールＳｃＦｖ抗原結合ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列、または配列番号１４のアミノ酸配列との同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％であるアミノ酸配列を含む。
【００９９】
本明細書中に開示されるＲＯＲ１特異的ＣＡＲの多様な実施形態において、概略的なスキームは図１中に記載され、これは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルまたはリーダーペプチド、抗ＲＯＲ１  ＳｃＦｖ、細胞外リンカーまたはヒンジ（Ｈ）ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、４−１ＢＢ、ＣＤ３ゼータを含み、太字の文字は、リンカードメイン（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）のクローニングサイトを表す。
【０１００】
一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号３の核酸配列を含み、かつ、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ１９４１  ＬＰ−ＳｃＦｖ４−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ａに示される）］。
【０１０１】
一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号３の核酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含み、かつ、配列番号４のアミノ酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ１９４１  ＬＰ−ＳｃＦｖ４−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ａに示される）］。
【０１０２】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号５の核酸配列を含み、かつ、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ２５２８  ＬＰ−ＳｃＦｖ４−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ｂに示される）］。
【０１０３】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号５の核酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含み、かつ、配列番号６のアミノ酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ２５２８  ＬＰ−ＳｃＦｖ４−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ｂに示される）］。
【０１０４】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号９の核酸配列を含み、かつ、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ１９４２  ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲアミノ酸配列（図２Ｃに示される）］。
【０１０５】
別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号９の核酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含み、かつ、配列番号１０のアミノ酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ１９４２  ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  ＣＡＲアミノ酸配列（図２Ｃに示される）］。
【０１０６】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１１の核酸配列を含み、かつ、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ２５２９  ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ｄに示される）］。
【０１０７】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１１の核酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含み、かつ、配列番号１２のアミノ酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ２５２９  ＬＰ−ＳｃＦｖ９−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ｄに示される）］。
【０１０８】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１５の核酸配列を含み、かつ、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ１９４３  ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ｅに示される）］。
【０１０９】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１５の核酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含み、かつ、配列番号１６のアミノ酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ１９４３  ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ｅに示される）］。
【０１１０】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１７の核酸配列を含み、かつ、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ２５２７  ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ｆに示される）］。
【０１１１】
さらに別の一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列は、配列番号１７の核酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含み、かつ、配列番号１８のアミノ酸配列またはこれとの同一性が８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である配列を含むＣＡＲをコードする［ＬＴＧ２５２７  ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ  アミノ酸配列（図２Ｆに示される）］。
【０１１２】
ＲＯＲ１抗原に反応する一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）配列を組み込んだ抗ＲＯＲ１  ＣＡＲの表面発現が下記の実施例２中に示され、その概要が表２中に示される。各ＳｃＦｖ含有ＣＡＲの発現レベルを、組換えＲＯＲ１−Ｆｃペプチド、続いて、ＡＦ６４７に結合させた抗ヒトＦｃ  Ｆ（ａｂ’）２断片を使用した、健康なドナーからのＬＶ形質導入Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析によって求め、ＡＰＣチャネルにおいて検出した（図３を参照）。ＳｃＦｖに基づく抗ＲＯＲ１  ＣＡＲコンストラクトＬＴＧ１９４１、ＬＴＧ１９４２〜ＬＴＧ１９４３は、非形質導入Ｔ細胞コントロール（ゲーティングしていない細胞集団）と比較して、ヒト初代Ｔ細胞において高発現していた（ゲーティングした集団により示される）。ドナー１人からの代表的な結果が示される。
【０１１３】
実施例２ならびに図４において示されるように、以下のＣＡＲを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ）を作製して抗白血病活性について試験したところ、ＲＯＲ１  ＣＡＲの高い細胞溶解活性が示された。実験に用いたＣＡＲはいずれも、記載された４−１ＢＢ／ＣＤ３ゼータ鎖シグナル伝達モチーフおよび特異的抗ＲＯＲ１結合モチーフ／ドメインを含有する。ＲＯＲ１表面発現を有する白血病標的株を使用した：ＪｅｋｏおよびＡ４３１；ならびにＲＯＲ１陰性Ｒｅｈ。ＳｃＦｖに基づく抗ＲＯＲ１  ＣＡＲコンストラクトＬＴＧ１９４１、ＬＴＧ１９４２、およびＬＴＧ１９４３は、Ａ４３１を効率よく溶解できたが、これらは、Ｒｅｈに対する特異的な溶解活性を有さなかった（図４を参照）。抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ  ＬＴＧ１９４１およびＬＴＧ１９４２の有するＪｅｋｏ溶解能力は異なっており、これより、生物学的活性も異なることが示される。こうした結果から、作製したＣＡＲコンストラクトの効率および特異性が示される。
【０１１４】
次いで、抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン分泌能力を評価した。腫瘍細胞を、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはコントロールＴ細胞と共に、エフェクター標的比１０：１にて、一晩インキュベートし、培養上清をＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ、およびＩＬ−２について分析した（図５を参照）。注目すべきことに、ＣＡＲ  Ｔ発現細胞ＬＴＧ１９４２およびＬＴＧ１９４３は高レベルのＩＦＮガンマを産生し、ＬＴＧ１９４１は、Ｊｅｋｏには応答してＩＦＮ−ガンマを中程度の量で産生したが、Ａ４３１白血病細胞株の場合には産生しなかった。類似する結果がＩＬ−２およびＴＮＦ−アルファの発現についてもみられた。ネガティブコントロール（非形質導入Ｔ細胞、ＵＮ、または、コントロールＬＴＧ１３９８  ＬＶで形質導入したＴ細胞）は、測定できるサイトカイン誘発を示さなかった。重要なことに、細胞溶解性およびサイトカイン機能においてみられた結果が明らかに示すのは、ＬＴＧ１９４２は、コントロールのＳｃＦｖを有するＣＡＲであるＬＴＧ１９４３に類似する能力を有するが、ＬＴＧ１９４１のサイトカイン産生はこれより大幅に低く、Ｊｅｋｏ白血病細胞株の溶解能力も大幅に低いということである。とはいうものの、ＬＴＧ１９４１のＡ４３１溶解能力が示すのは、もしＣＡＲ−Ｔの臨床研究においてＬＴＧ１９４２の活性または高い毒性が明らかとなった場合には、好まれ得る別の選択肢があるということである。
【０１１５】
いかなる特定の作用機序に限定されることも意図しないが、本発明に係る例示的なＣＡＲに関連して治療的機能が向上した理由には、たとえば、ａ）細胞膜中における横方向の動きが改善されたためにシグナル伝達がより高効率となった、ｂ）細胞膜マイクロドメイン中における位置が優れていたために（脂質ラフトなど）、Ｔ細胞活性化に関連する膜貫通型シグナル伝達カスケードとの相互作用能力が向上した、ｃ）低減性もしくは下方調節性の相互作用から離れる優先的な動きがあったために、細胞膜中における位置が優れていた、たとえば、ＣＤ４５などのホスファターゼからの距離が比較的遠かったもしくは当該ホスファターゼとの相互作用が比較的少なかった、ならびに、ｄ）Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体（すなわち、免疫シナプス）へのアセンブリが優れていた、またはこれらの任意の組み合わせが含まれると考えられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
ここまで、例示的な細胞外のＲＯＲ１  ＳｃＦｖ抗原結合ドメインを用いて本開示が例証されてきたが、ＲＯＲ１可変ＳｃＦｖ抗原結合ドメイン中の他のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸バリアントも、これを使用して重鎖単独結合ドメインまたはそのサブセットを誘導することができるため、本明細書中に記載されるＣＡＲにおいて使用するためのＲＯＲ１抗原結合ドメインを含んでよい。
【０１１７】
標的とする所望の抗原に依存して、ＣＡＲは、所望の抗原標的に特異的な適切な抗原結合ドメインを含むようにさらに操作されてもよい。たとえば、ＲＯＲ１が、標的とする所望の抗原である場合には、ＲＯＲ１に対する抗体を、ＣＡＲに組み込む抗原結合ドメインとして使用してよい。
【０１１８】
例示的な一実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン部分は、さらにＣＤ３３を標的とする。好ましくは、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、抗ＣＤ３３  ＳｃＦｖであり、ここで、抗ＣＤ３３  ＳｃＦｖの核酸配列は、配列番号３４の配列を含む。一実施形態において、抗ＣＤ３３  ＳｃＦｖは、配列番号３５のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＡＲの抗ＣＤ３３  ＳｃＦｖ部分は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
例示的な一実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン部分は、さらにメソテリンを標的とする。好ましくは、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、抗メソテリンＳｃＦｖであり、ここで、抗メソテリンＳｃＦｖの核酸配列は、配列番号３６の配列を含む。一実施形態において、抗メソテリンＳｃＦｖは、配列番号３７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＡＲの抗メソテリンＳｃＦｖ部分は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
例示的な一実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメイン部分は、さらにＣＤ１９を標的とする。好ましくは、ＣＡＲにおける抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖであり、ここで、抗メソテリンＳｃＦｖの核酸配列は、配列番号３２の配列を含む。一実施形態において、抗メソテリンＳｃＦｖは、配列番号３３のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＡＲの抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖ部分は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
本発明の一態様において、たとえば、レトロウイルス科（たとえば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−ＬＰなどのヒト免疫不全ウイルス）、ピコルナウイルス科（たとえば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、およびエコーウイルス）、風疹ウイルス、コロナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科（たとえば、１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ならびにヘルペスウイルス）、ポックスウイルス科（たとえば、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、およびポックスウイルス）、またはＣ型肝炎ウイルス、またはこれらの任意の組み合わせに由来する抗原（これらに限定されない）を含む、ＴＳＡ以外またはＴＡＡ以外に結合できるＣＡＲが提供される。
【０１２２】
本発明の別の一態様において、ブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌、シュードモナス、またはサルモネラ菌といった菌種に由来する抗原に結合できるＣＡＲが提供される。特に、たとえば、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、マイコバクテリア種（たとえば、結核菌、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、またはＭ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎｅａ））、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、リステリア菌、化膿連鎖球菌、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌（ストレプトコッカス・アガラクチア）、肺炎連鎖球菌、もしくは破傷風菌といった菌種またはこれらの組み合わせなどの感染性細菌に由来する抗原に結合できるＣＡＲが提供される。
【０１２３】
２．膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、当該ＣＡＲの細胞外ＲＯＲ１抗原結合ドメインに融合した１つ以上の膜貫通ドメインを含む。
【０１２４】
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれに由来するものであってよい。供給源が天然のものである場合、このドメインは、任意の膜結合型または膜貫通型タンパク質に由来するものであってよい。
【０１２５】
本明細書中に記載されるＣＡＲにおいて特に有用な膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＴＮＦＲＳＦ１６、またはＴＮＦＲＳＦ１９に由来する（すなわち、その膜貫通領域を少なくとも含む）ものであってよい。代替的には、膜貫通ドメインは、合成されたものであってよく、この場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主として含んでよい。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端にみられてよい。任意に、好ましくはアミノ酸２〜１０個の長さの、短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成していてよい。グリシンとセリンとのダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
【０１２６】
一実施形態において、ＣＡＲにおけるドメインの１つに元々関連している膜貫通ドメインが、上述される膜貫通ドメインに加えて使用される。
【０１２７】
いくつかの例において、膜貫通ドメインは、当該ドメインと他の受容体複合体構成要素との相互作用を最小限とするために、当該ドメインが、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避するように選択またはアミノ酸置換できる。
【０１２８】
一実施形態において、本発明に係るＣＡＲにおける膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２１の核酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
一実施形態において、コードされる膜貫通ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列、または配列番号２２のアミノ酸配列との同一性が９５〜９９％である配列に改変（たとえば、置換）を少なくとも１、２、もしくは３つ加えたものであって、ただし改変（たとえば、置換）が２０、１０、もしくは５つ以下であるアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
いくつかの例において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８アルファヒンジドメインを含む。一実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２３の核酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列またはこれとの同一性が９５〜９９％である配列を含む。
【０１３１】
一実施形態において、単離された核酸分子が提供され、ここで、コードされるリンカードメインは、ＣＤ８の細胞外ドメインに由来し、膜貫通ＣＤ８ドメイン、膜貫通ＣＤ２８ドメイン、またはこれらの組み合わせに結合している。
【０１３２】
３．スペーサー（ヒンジ、Ｈ）ドメイン
ＣＡＲにおいて、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサドメインが配置されていてよい。スペーサドメインとは、膜貫通ドメインを細胞外ドメインと、および／または膜貫通ドメインを細胞内ドメインと結合させるように働く、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサドメインは、アミノ酸上限３００個まで、好ましくはアミノ酸１０〜１００個、最も好ましくはアミノ酸２５〜５０個を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、リンカーはスペーサ要素を含んでよく、スペーサ要素が存在する場合、スペーサ要素によってリンカーが大きくなり、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合断片との間の距離が増大する。スペーサの具体例は当業者に周知されており、米国特許第７，９６４，５６６号、第７，４９８，２９８号、第６，８８４，８６９号、第６，３２３，３１５号、第６，２３９，１０４号、第６，０３４，０６５号、第５，７８０，５８８号、第５，６６５，８６０号、第５，６６３，１４９号、第５，６３５，４８３号、第５，５９９，９０２号、第５，５５４，７２５号、第５，５３０，０９７号、第５，５２１，２８４号、第５，５０４，１９１号、第５，４１０，０２４号、第５，１３８，０３６号、第５，０７６，９７３号、第４，９８６，９８８号、第４，９７８，７４４号、第４，８７９，２７８号、第４，８１６，４４４号、および第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許公開第２０１１０２１２０８８号および第２０１１００７０２４８号中に列記されるものを含む（これらの全体を引用により本明細書に援用する）。
【０１３４】
スペーサドメインは、好ましくは、ＣＡＲと抗原との結合を促進し細胞中へのシグナル伝達を増大させる配列を有する。結合を促進すると予期されるアミノ酸の例は、システイン、荷電アミノ酸、ならびにグリコシル化の可能性のある部位におけるセリンおよびトレオニンを含み、これらのアミノ酸を、スペーサドメインを構成するアミノ酸として使用できる。
【０１３５】
このスペーサドメインとして、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７５９．３）のヒンジ領域のアミノ酸番号１３７〜２０６（配列番号２５）、ＣＤ８ベータ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５〜１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５〜３９６、またはＣＤ２８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１３７〜１５２の、全体または一部を使用できる。また、このスペーサドメインとして、抗体のＨ鎖またはＬ鎖の定常領域の一部も使用できる。さらに、このスペーサドメインは、人工的に合成された配列であってもよい。
【０１３６】
また、スペーサードメインは、ＩｇＧ４に由来するものなどの、免疫グロブリンタンパク質を含む免疫グロブリンドメインを結合する配列を含む、免疫グロブリン（Ｉｇ）定常ドメインの要素からなっていてもよい。スペーサーまたはヒンジドメインは、ｓｃＦｖ  ＲＯＲ１結合ドメインのＣ末端に存在し、ＣＡＲ膜貫通ドメインに延びている。一実施形態において、ＩｇＧ４ヒンジ（Ｈ）ドメインは、配列番号３８の核酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＤ８ヒンジドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列、またはこれと９５〜９９％同一である配列を含む。
【０１３７】
いくつかの例において、ＩｇＧ４定常領域はヒンジ（Ｈ）として働き、ＣＤ８の膜貫通ドメインに結合している。一実施形態において、ＩｇＧ４Ｈドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインに結合しており、これと一緒になって、配列番号４０の核酸配列を含む。一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインに結合したＩｇＧ４Ｈドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の一実施形態において、ＣＤ８膜貫通ドメインに結合したＩｇＧ４Ｈは、配列番号４１のアミノ酸配列、またはこれと９５〜９９％同一である配列を含む。
【０１３８】
さらに、ＣＡＲにおいて、Ｎ末端にシグナルペプチド配列が結合していてよい。このシグナルペプチド配列は、多くの分泌タンパク質および膜タンパク質のＮ末端に存在し、アミノ酸１５〜３０個の長さを有する。細胞内ドメインとして上述されるタンパク質分子の多くがシグナルペプチド配列を有するため、このシグナルペプチドを、ＣＡＲのためのシグナルペプチドとして使用できる。一実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
４．細胞内ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊機能を指す。たとえば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。よって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し細胞が特殊機能を果たすように仕向ける、タンパク質部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体を使用できるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインを切断した一部が使用される場合、この切断部分がエフェクター機能シグナルを伝達できる限りは、これを完全な鎖の代わりに使用してよい。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」の意味には、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分が含まれる。
【０１４０】
ＣＡＲにおいて使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原と受容体との結合後にシグナル伝達を開始するよう協同作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の派生物またはバリアント、ならびに同じ機能的能力を有する任意の合成配列を含む。
【０１４１】
ＴＣＲのみを通って発されたシグナルはＴ細胞を十分に活性化するには不十分であること、および第２のまたは共刺激シグナルがさらに必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化には、抗原依存性の第１の活性化をＴＣＲを経て開始するもの（第１の細胞質シグナル伝達配列）と、抗原とは独立した様式で働いて第２のまたは共刺激シグナルを提供するもの（第２の細胞質シグナル伝達配列）との、２つの別個の種類の細胞質シグナル伝達配列が介在するといえる。
【０１４２】
第１の細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の第１の活性化を、刺激的様式または阻害的様式のいずれかで調節する。刺激的様式で働く第１の細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有してよい。
【０１４３】
本明細書中に開示されるＣＡＲにおいて特に有用な第１の細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例は、ＴＣＲゼータ（ＣＤ３ゼータ）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものを含む。ＩＴＡＭの具体例は、ＣＤ３ゼータ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１〜１６４、ＦｃイプシロンＲＩガンマ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５〜８６、ＦｃイプシロンＲＩベータ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１〜２４４、ＣＤ３ガンマ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９〜１８２、ＣＤ３デルタ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８〜１７１、ＣＤ３イプシロン（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３〜２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２〜４９５、００２２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７〜８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６〜２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２〜２２９、およびＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７〜２５２の配列を有するペプチド、ならびに、これらのペプチドと同じ機能を有するバリアントを含むが、これらに限定されない。本明細書中に記載されるＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）の全長に基づいて番号付けされたものである。一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含む。
【０１４４】
好ましい一実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、それ自体がＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含むように設計されてよい、または、ＣＡＲとの関連で有用である任意の他の望ましい細胞質ドメインと組み合わせてよい。たとえば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含んでよい。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、リンパ球が抗原に対して効率よく反応するために必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような共刺激分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、および特異的にＣＤ８３と結合するリガンドなどを含む。このような共刺激分子の具体例は、ＣＤ２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６〜３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１〜４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２〜４９５、ＣＤ８アルファ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７〜２３５、ＣＤ８３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６〜２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１〜２２０、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４〜２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１〜２７７、およびＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６〜１９９の配列を有するペプチド、ならびに、これらのペプチドと同じ機能を有するバリアントを含むが、これらに限定されない。このように、本開示は、ここまで、共刺激シグナル伝達要素として主に４−１ＢＢを用いて例示されてきたが、他の共刺激要素も本開示の範囲内である。
【０１４５】
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分における細胞質シグナル伝達配列は、無作為のまたは特定の順序で、互いに結合していてよい。任意に、好ましくはアミノ酸２〜１０個の長さの、短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、この結合を形成していてよい。グリシンとセリンとのダブレットは、特に好適なリンカーを提供する。
【０１４６】
一実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の一実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の一実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ２８および４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
【０１４７】
一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号２６の核酸配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは配列番号２８の核酸配列および配列番号３０のバリアント核酸配列を含む。一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号２６の核酸配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは配列番号２８の核酸配列および配列番号３０のバリアント核酸配列を含む。
【０１４８】
一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列をコードする核酸配列および配列番号３１のアミノ酸配列をコードするバリアント核酸を含む。
【０１４９】
一実施形態において、ＣＡＲにおける細胞内ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインを含むように設計され、ここで、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは配列番号２７のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは配列番号２９のアミノ酸配列および配列番号３１のバリアントアミノ酸配列を含む。
【０１５０】
５．ＣＡＲについてのさらなる説明
本明細書中に開示されるＣＡＲの機能的部分もまた、本発明の範囲内に明白に含まれる。用語「機能的部分」は、ＣＡＲに言及して使用される場合、本明細書中に開示されるＣＡＲの１種以上の任意の部分または断片を指し、この部分または断片は、当該ＣＡＲ（親ＣＡＲ）の生物学的活性を保持する。機能的部分は、たとえば、親ＣＡＲと類似する程度に、親ＣＡＲと同程度に、または親ＣＡＲよりも高程度に、標的細胞の認識、または疾患の検出、処置、もしくは予防を行なう能力を保持する、ＣＡＲ部分を包含する。親ＣＡＲに関して、機能的部分は、たとえば、親ＣＡＲの約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上を含み得る。
【０１５１】
機能的部分は、当該部分のアミノ末端またはカルボキシ末端または両末端に、親ＣＡＲのアミノ酸配列にはみられないさらなるアミノ酸を含んでよい。望ましくは、これらのさらなるアミノ酸は、たとえば、標的細胞の認識、がんの検出、がんの処置または予防などの、機能的部分の生物学的機能を妨げない。より望ましくは、これらのさらなるアミノ酸は、こうした生物学的活性を、親ＣＡＲの生物学的活性よりも向上させる。
【０１５２】
本明細書中に開示されるＣＡＲの機能的バリアントが、本開示の範囲内に含まれる。用語「機能的バリアント」は、本明細書中において使用される場合、親ＣＡＲとの配列同一性または類似性が相当程度または顕著であるＣＡＲ、ポリペプチド、またはタンパク質を指し、この機能的バリアントは、当該バリアントの派生元であるＣＡＲの生物学的活性を保持する。機能的バリアントは、たとえば、本明細書中に記載されるＣＡＲ（親ＣＡＲ）のバリアントであって、親ＣＡＲと類似する程度に、親ＣＡＲと同程度に、または親ＣＡＲよりも高程度に、標的細胞を認識する能力を保持するものを包含する。親ＣＡＲに関して、機能的バリアントは、たとえば、親ＣＡＲとのアミノ酸配列同一性が、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％、またはそれ以上であってよい。
【０１５３】
機能的バリアントは、たとえば、親ＣＡＲのアミノ酸配列に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を加えたものを含んでよい。代替的には、または追加的には、機能的バリアントは、親ＣＡＲのアミノ酸配列に少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を加えたものを含んでよい。この場合、この非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を妨害または阻害しないことが好ましい。この非保存的アミノ酸置換は、機能的バリアントの生物学的活性を向上させて、その結果、機能的バリアントの生物学的活性が親ＣＡＲよりも優れるようにするものであってよい。
【０１５４】
ＣＡＲのアミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は当技術分野において周知されており、特定の物理的および／または化学的特性を有する１つのアミノ酸が、同じまたは類似する化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸と交換されるようなアミノ酸置換を含む。たとえば、保存的アミノ酸置換は、酸性／負荷電極性アミノ酸（たとえば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）を別の酸性／負荷電極性アミノ酸で置換すること、非極性側鎖含有アミノ酸（たとえば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）を別の非極性側鎖含有アミノ酸で置換すること、塩基性／正荷電極性アミノ酸（たとえば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）を別の塩基性／正荷電極性アミノ酸で置換すること、極性側鎖含有非荷電アミノ酸（たとえば、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）を別の極性側鎖含有非荷電アミノ酸で置換すること、ベータ分枝側鎖含有アミノ酸（たとえば、Ｈｅ、Ｔｈｒ、およびＶａｌ）を別のベータ分枝側鎖含有アミノ酸で置換すること、芳香族側鎖含有アミノ酸（たとえば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）を別の芳香族側鎖含有アミノ酸で置換することなどであってよい。
【０１５５】
ＣＡＲは、本質的に、本明細書中に記載される１つまたは複数の指定のアミノ酸配列からなるものであってよく、その結果、他の構成要素（たとえば、他のアミノ酸）によって機能的バリアントの生物学的活性が実質的に変化しない。
【０１５６】
ＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、ＣＡＲ（またはその機能的部分または機能的バリアント）が、たとえば、抗原への特異的結合能力、哺乳動物における疾患細胞検出能力、または哺乳動物における疾患の処置もしくは予防能力などの、生物学的活性を保持する限り、任意の長さであってよい、すなわち任意の数のアミノ酸を含むものであってよい。たとえば、ＣＡＲは、アミノ酸約５０〜約５０００個の長さ、たとえば、アミノ酸５０個、７０個、７５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、またはそれ以上の長さであってよい。
【０１５７】
ＣＡＲ（本発明に係る機能的部分および機能的バリアントを含む）は、１つ以上の天然アミノ酸に替えて、合成アミノ酸を含んでよい。このような合成アミノ酸は当技術分野において周知であり、たとえば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、−アミノ  ｎ−デカン酸（−ａｍｉｎｏ  ｎ−ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、ｔｒａｎｓ−３−およびｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン  β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、ａ−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リシン、Ν’，Ν’−ジベンジル−リシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、−アミノシクロペンタンカルボン酸（−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ａ−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ａ−アミノシクロヘプタンカルボン酸、ａ−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、γ−ジアミノ酪酸、β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびａ−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。
【０１５８】
ＣＡＲ（機能的部分および機能的バリアントを含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化（たとえば、ジスルフィド架橋により）、または酸付加塩に変換、および／または任意に二量体化もしくは重合もしくは共役されていてよい。
【０１５９】
ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）は、当技術分野において周知の方法によって得ることができる。ＣＡＲは、任意の好適なポリペプチドまたはタンパク質作製方法によって作製されてよい。ポリペプチドおよびタンパク質を新たに合成する好適な方法が、Ｃｈａｎら，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００；Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００；Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ，ｅｄ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄら，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００１；および米国特許第５，４４９，７５２号などの先行技術文献中に記載される。また、ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書中に記載される核酸を使用し、標準的な組換え方法を使用して、組換えにより産生されてもよい。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１；および、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照。さらに、ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のいくつかは、植物、細菌、昆虫、哺乳動物（たとえば、ラット、ヒトなど）などの供給源から単離および／または精製されてよい。単離および精製方法は当技術分野において周知されている。代替的には、本明細書中に記載されるＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）は、企業により商業的に合成されたものであってもよい。この点に関し、ＣＡＲは、合成、組換え、単離、および／または精製されたものであってよい。
【０１６０】
Ｂ．抗体および抗原結合断片
一実施形態は、本明細書中に開示される抗原の１つ以上に特異的に結合する、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合ドメインもしくは一部分をさらに提供する。本明細書中において使用される場合、「ＣＡＲを発現するＴ細胞」または「ＣＡＲ  Ｔ細胞」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を意味し、たとえばＣＡＲの抗体由来標的ドメインによって決定される、抗原特異性を有する。
【０１６１】
本明細書中において使用される場合、「抗原結合ドメイン」は、抗体およびその抗原結合断片を含んでよい。用語「抗体」は、本明細書中において、その最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を呈するものであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）、およびその抗原結合断片を含む（がこれらに限定されない）多様な抗体構造を包含する。抗体の例は、たとえば、抗原に対する結合親和性を保持する当技術分野において周知の完全型免疫グロブリンならびにそのバリアントおよび断片を含むが、これらに限定されない。
【０１６２】
「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体である。すなわち、この集団を構成する個々の抗体は、ごく微量で存在し得る天然の突然変異を有し得ることを除いて、同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原エピトープに対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から当該抗体が得られるという特性を示すものであって、当該抗体が何らかの特定の方法によって作製される必要があると解釈されるべきではない。いくつかの例において、モノクローナル抗体は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、または、単一の抗体（またはその抗原結合断片）についてその抗体の軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸がトランスフェクションされた細胞もしくはその子孫によって、産生された抗体である。いくつかの例において、モノクローナル抗体は、対象から単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響しない保存的アミノ酸置換を有してよい。例示的なモノクローナル抗体作製方法は周知されており、たとえば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１３）を参照。
【０１６３】
典型的には、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により互いに結合した重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。軽鎖にはラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２種類がある。主要な重鎖には５つのクラス（またはアイソタイプ）があり、これらが抗体分子の機能活性を決定する（ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）。
【０１６４】
重鎖および軽鎖はそれぞれ、定常領域（または定常ドメイン）および可変領域（または可変ドメイン）を含有する（たとえば、Ｋｉｎｄｔら  Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，９１ページ（２００７）を参照）。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖可変領域が組み合わさって、抗原に特異的に結合する。追加的な実施形態において、重鎖可変領域のみが必要とされる。たとえば、重鎖のみからなる天然のラクダ類抗体は、軽鎖がなくても機能的かつ安定である（たとえば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４４６−４４８，１９９３；Ｓｈｅｒｉｆｆら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：７３３−７３６，１９９６を参照）。「ＶＨ」への言及、または「ＶＨ」は、抗原結合断片の可変領域を含む、抗体重鎖の可変領域、たとえばＦｖ、ＳｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂなどを指す。「ＶＬ」への言及、または「ＶＬ」は、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂのものを含む抗体軽鎖の可変ドメインを指す。
【０１６５】
軽鎖および重鎖の可変領域は、「フレームワーク」領域と、これを中断する３つの超可変領域（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」ともよばれる）とを含有する（たとえば、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ），１９９１を参照）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、同種間で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成軽鎖および構成重鎖のフレームワーク領域が一緒になって、三次元空間においてＣＤＲを位置決めおよび整列させている。
【０１６６】
ＣＤＲは、主に、抗原エピトープへの結合を担う。所与のＣＤＲのアミノ酸配列の境界は、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”  第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１；“Ｋａｂａｔ”  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８，１９９７；“Ｃｈｏｔｈｉａ”  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）、およびＬｅｆｒａｎｃら（“ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ，”  Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５−７７，２００３；“ＩＭＧＴ”  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ）により記載されるスキームを含む複数の周知のスキームのうち任意のものを使用して容易に判断できる。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（Ｎ末端からＣ末端に向かって）と称され、さらに、典型的には、そのＣＤＲが位置する鎖によって特定される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３は、これを含む抗体の重鎖の可変ドメインからのＣＤＲ３であり、ＶＬ  ＣＤＲ１は、これを含む抗体の軽鎖の可変ドメインからのＣＤＲ１である。軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と称される場合がある。重鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３と称される場合がある。
【０１６７】
「抗原結合断片」は、同族の抗原を特異的に認識する能力を保持する、全長抗体の一部分、およびこのような部分の多様な組み合わせである。抗原結合断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；一本鎖抗体分子（たとえば、ＳｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。抗体断片は、抗体全体の改変によって作製された、または、組換えＤＮＡ方法論を使用して新たに合成された、抗原結合断片を含む（たとえば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（Ｅｄ），Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．１−２，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０を参照）。
【０１６８】
一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）は、１つ以上の抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとを好適なポリペプチドリンカーによって結合して遺伝子融合一本鎖分子としたものを含有する、遺伝子操作された分子である（たとえば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３  ４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：５８７９  ５８８３，１９８８；Ａｈｍａｄら，Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０；Ｍａｒｂｒｙ，ＩＤｒｕｇｓ，１３：５４３−５４９，２０１０を参照）。ＳｃＦｖ内におけるＶＨドメインおよびＶＬドメインの分子内配向は、典型的には、ＳｃＦｖを決定づけるものではない。したがって、起こり得る編成（ＶＨドメイン−リンカードメイン−ＶＬドメイン；ＶＬドメイン−リンカードメイン−ＶＨドメイン）の両方を有するＳｃＦｖを使用してよい。
【０１６９】
ｄｓＦｖにおいて、重鎖および軽鎖の可変鎖は、突然変異によりジスルフィド結合を導入して、両鎖の結合を安定化させたものである。また、ダイアボディも含まれ、これは２価の二重特異性抗体であって、ＶＨドメインとＶＬドメインとが１本のポリペプチド鎖上に発現しているが、２つのドメインを繋いで１本の鎖にするには短すぎるリンカーを使用しているため、２つのドメインを別の鎖の相補的ドメインと繋いでおり、２つの抗原結合部位が形成されている（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：６４４４  ６４４８，１９９３；Ｐｏｌｊａｋら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：１１２１  １１２３，１９９４を参照）。
【０１７０】
抗体は、さらに、キメラ抗体（ヒト化マウス抗体など）およびヘテロ結合抗体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（二重特異性抗体など）などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照。
【０１７１】
天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築できる、または、組換えによって作製できる、または、たとえば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）（引用により本明細書に援用する）により記載される可変重鎖および可変軽鎖からなるコンビナトリアルライブラリのスクリーニングによって得ることができる。これらの方法、ならびに、たとえばキメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト、一本鎖、および二機能性抗体を作製するための、他の方法は、当業者に周知されている（Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，上述，１９８８；Ｈｉｌｙａｒｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；これらの各々を引用により本明細書に援用する）。
【０１７２】
参照抗体としての「同じエピトープに結合する抗体」は、拮抗アッセイにおいて参照抗体とその抗原との結合を５０％以上妨げる抗体を指し、逆に、参照抗体は、拮抗アッセイにおいてこの抗体とその抗原との結合を５０％以上妨げる。抗体拮抗アッセイは周知されており、例示的な拮抗アッセイが本明細書中において提供される。
【０１７３】
「ヒト化」抗体または抗原結合断片は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（マウス、ラット、または合成など）抗体または抗原結合断片からの１つ以上のＣＤＲとを含む。このＣＤＲを与える非ヒト抗体または抗原結合断片は「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを与えるヒト抗体または抗原結合断片は「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態において、すべてのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリンにおけるドナー免疫グロブリンからのものである。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一であってよく、たとえば少なくとも約８５〜９０％（約９５％以上など）同一であってよい。よって、ヒト化抗体または抗原結合断片のすべての部分（恐らくはＣＤＲを除く）が、天然ヒト抗体配列の対応部分と実質的に同一である。
【０１７４】
「キメラ抗体」は、２つの異なる抗体（典型的には種が異なる）に由来する配列を含む抗体である。いくつかの例において、キメラ抗体は、１つのヒト抗体からの１つ以上のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域と、別のヒト抗体からのＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域とを含む。
【０１７５】
「完全ヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノムからの（または、これに由来する）配列を含み、別の種からの配列を含まない抗体である。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、ヒトゲノムからの（または、これに由来する）ＣＤＲ、フレームワーク領域、および（存在する場合には）Ｆｃ領域を含む。ヒト抗体は、たとえばファージディスプレイまたは遺伝子組換え動物の使用により、ヒトゲノム由来配列に基づく抗体作製技術を使用することによって、同定および単離できる（たとえば、Ｂａｒｂａｓら  Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ．第１版  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００４．Ｐｒｉｎｔ．；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２３：１１１７−１１２５，２００５；Ｌｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０：４５０−４５９，２００８を参照）。
【０１７６】
抗体は、１つ以上の結合部位を有してよい。結合部位が１を超える場合には、これらの結合部位は、互いに同じであってよい、または異なってもよい。たとえば、天然の免疫グロブリンは２つの同じ結合部位を有し、一本鎖抗体またはＦａｂ断片は１つの結合部位を有し、二重特異性または二機能性抗体は２つの異なる結合部位を有する。
【０１７７】
ＣＡＲの任意の機能的部分に結合できる抗体能力を試験する方法は当技術分野において周知であり、たとえば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、および競合阻害アッセイなどの、任意の抗体抗原結合アッセイを含む（たとえば、下記のＪａｎｅｗａｙら、米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６  Ａｌ号、および米国特許第７，３３８，９２９号を参照）。
【０１７８】
また、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分は、たとえば、放射性同位体、フルオロフォア（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（たとえば、金粒子）などの、検出可能な標識を含むように改変されていてよい。
【０１７９】
Ｃ．結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）
本明細書中に開示される抗原の１つ以上に対して特異的な、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、またはモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、当業者に周知の多くの手段のうち任意の手段を使用して、エフェクター分子または検出可能なマーカーなどの剤に結合されていてよい。共有結合による手段および非共有結合による手段のいずれを使用してもよい。結合体は、本明細書中に開示される抗原の１つ以上に対して特異的に結合する抗体または抗原結合断片と、エフェクター分子または検出可能なマーカーとが共有結合している分子を含むが、これらに限定されない。当技術分野における当業者には、化学療法剤、抗血管新生剤、毒素、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ、および３５Ｓなどの放射性剤、ならびに、他の標識、標的部位、およびリガンドなどを含む（がこれらに限定されない）多様なエフェクター分子および検出可能なマーカーを使用できるということが理解される。
【０１８０】
具体的なエフェクター分子または検出可能なマーカーの選択は、具体的な標的分子または細胞、および所望される生物学的作用に依存する。したがって、たとえば、エフェクター分子は、特定の標的細胞（腫瘍細胞など）の死を引き起こすために使用される細胞毒であってもよい。
【０１８１】
エフェクター分子または検出可能なマーカーを抗体または抗原結合断片に付着させる手順は、エフェクターの化学構造によって異なる。ポリペプチドは、典型的には、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）、またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基などの多様な官能基を含有しており、これらを抗体上の好適な官能基との反応に利用でき、その結果として、エフェクター分子または検出可能なマーカーの結合が得られる。代替的には、抗体または抗原結合断片を誘導体化して、さらなる反応性官能基を露出または付着させる。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手できるものなどの複数の周知のリンカー分子のうち任意のものの付着に関連してよい。リンカーは、抗体または抗原結合断片をエフェクター分子または検出可能なマーカーと結合させるために使用される任意の分子であってよい。リンカーは、抗体または抗原結合断片とエフェクター分子または検出可能なマーカーとの両方に共有結合を形成できる。好適なリンカーは当業者に周知されており、直鎖もしくは分枝鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含むが、これらに限定されない。抗体または抗原結合断片およびエフェクター分子または検出可能なマーカーがポリペプチドである場合、リンカーは、その側鎖を介して構成アミノ酸に（たとえば、ジスルフィド結合を介してシステインに）、または末端アミノ酸のアルファ炭素のアミノ基およびカルボキシ基に結合していてよい。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、リンカーはスペーサ要素を含んでよく、スペーサ要素が存在する場合、スペーサ要素によってリンカーが大きくなり、エフェクター分子または検出可能なマーカーと抗体または抗原結合断片との間の距離が増大する。スペーサの具体例は当業者に周知されており、米国特許第号７，９６４，５６６号、第７，４９８，２９８号、第６，８８４，８６９号、第６，３２３，３１５号、第６，２３９，１０４号、第６，０３４，０６５号、第５，７８０，５８８号、第５，６６５，８６０号、第５，６６３，１４９号、第５，６３５，４８３号、第５，５９９，９０２号、第５，５５４，７２５号、第５，５３０，０９７号、第５，５２１，２８４号、第５，５０４，１９１号、第５，４１０，０２４号、第５，１３８，０３６号、第５，０７６，９７３号、第４，９８６，９８８号、第４，９７８，７４４号、第４，８７９，２７８号、第４，８１６，４４４号、および第４，４８６，４１４号、ならびに米国特許公開第２０１１０２１２０８８号および第２０１１００７０２４８号中に列記されるものを含む（これらの各々の全体を引用により本明細書に援用する）。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内という条件下において開裂可能であり、リンカーの開裂によって、細胞内環境において、抗体または抗原結合断片からエフェクター分子または検出可能なマーカーが解放される。さらに別の実施形態において、リンカーは開裂可能ではなく、エフェクター分子または検出可能なマーカーは、たとえば抗体の分解によって、解放される。いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内環境内（たとえば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ（ｃａｖｅｏｌｅａ）内）に存在する開裂剤によって開裂可能である。リンカーは、たとえば、細胞内のペプチダーゼ、またはリソソームプロテアーゼもしくはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されないプロテアーゼ酵素によって開裂したペプチドリンカーであってよい。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくともアミノ酸２個の長さ、または少なくともアミノ酸３個の長さである。しかしながら、リンカーは、アミノ酸４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の長さ、たとえばアミノ酸１〜２個、１〜３個、２〜５個、３〜１０個、３〜１５個、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個の長さであってよい。プロテアーゼは、カテプシンＢおよびＤ、ならびにプラスミンを含んでよく、これらはすべて、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞中において活性薬物を放出することが知られている（たとえば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３を参照）。たとえば、チオール依存性プロテアーゼ  カテプシン−Ｂによって開裂可能なペプチドリンカーを使用できる（たとえば、フェニルアラニン−ロイシンまたはグリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシンリンカー）。このようなリンカーの他の例が、たとえば米国特許第６，２１４，３４５号中に記載され、これを引用により本明細書に援用する。具体的な一実施形態において、細胞内プロテアーゼによって開裂可能なペプチドリンカーは、バリン−シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）リンカーまたはフェニルアラニン−リシンリンカーである（たとえば、米国特許第６，２１４，３４５号を参照。この文献はドキソルビシンとバリン−シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ）リンカーとの合成を記載している）。
【０１８４】
別の実施形態において、開裂可能なリンカーは、ｐＨ感受性である、すなわち、特定のｐＨ値において加水分解に感受性を有する。典型的には、こうしたｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下において加水分解する。たとえば、リソソーム内で加水分解し得る酸不安定リンカー（たとえば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｉｃ  ａｍｉｄｅ）、オルトエステル、アセタール、またはケタールなど）を使用できる。（たとえば、米国特許第５，１２２，３６８号、第５，８２４，８０５号、第５，６２２，９２９号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅら，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１を参照）。こうしたリンカーは、中性ｐＨ条件下（血液中など）においては比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。特定の実施形態において、加水分解性リンカーは、チオエーテルリンカーである（たとえば、アシルヒドラゾン結合を介して当該治療剤に結合したチオエーテルなど（たとえば、米国特許第５，６２２，９２９号などを参照））。
【０１８５】
別の実施形態において、リンカーは、還元条件下において開裂可能である（たとえば、ジスルフィドリンカー）。多様なジスルフィドリンカーが当技術分野において周知されており、たとえば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）、およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）−、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成できるものを含む。（たとえば、Ｔｈｏｒｐｅら，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら，Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：９２８０９２９０，２００８を参照）。また、米国特許第４，８８０，９３５号も参照される。
【０１８６】
さらに別の具体的な実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕら，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０１８７】
さらに別の実施形態において、リンカーは開裂可能ではなく、エフェクター分子または検出可能なマーカーは抗体の分解によって解放される（米国公報第２００５／０２３８６４９号を参照、この全体を引用により本明細書に援用する）。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞外環境において、開裂に対して抵抗性を有する。たとえば、結合体が細胞外環境内（たとえば、血漿中）に存在する際には、結合体の試料中において、リンカーの約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約３％以下、または約１％以下が開裂している。細胞外環境内においてリンカーが開裂に対して抵抗性を有するか否かは、たとえば、目的とするリンカーを含有する結合体を血漿と共に、あらかじめ定められた時間（たとえば、２、４、８、１６、または２４時間）かけてインキュベートし、次いで、血漿中に遊離しているエフェクター分子または検出可能なマーカーの量を定量することによって、判断できる。結合体中において使用できる多様な例示的なリンカーが、ＷＯ２００４−０１０９５７号、米国公報第２００６／００７４００８号、米国公報第２００５０２３８６４９号、および米国公報第２００６／００２４３１７号中に記載され、これらの各々の全体を引用により本明細書に援用する。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分と、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテセン、およびＣＣ１０６５などの１つ以上の小分子毒素、ならびにこれらの毒素の誘導体で毒素活性を有するものとの結合体が提供される。
【０１９０】
メイタンシノイド毒素部位としての使用に好適なメイタンシン化合物が当技術分野において周知されており、周知の方法にしたがって天然の供給源から単離でき、遺伝子操作技術を使用して作製できる（Ｙｕら（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：７９６８−７９７３を参照）、または、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体を周知の方法にしたがって合成により調製できる。メイタンシノイドは、チューブリン重合の阻害によって作用する有糸分裂阻害剤（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）である。メイタンシンは、東アフリカ産の灌木であるＭａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。続いて、さらに、特定の微生物が、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールならびにその誘導体および類似体が、たとえば、米国特許第４，１３７，２３０号、第４，２４８，８７０号、第４，２５６，７４６号、第４，２６０，６０８号、第４，２６５，８１４号、第４，２９４，７５７号、第４，３０７，０１６号、第４，３０８，２６８号、第４，３０８，２６９号、第４，３０９，４２８号、第４，３１３，９４６号、第４，３１５，９２９号、第４，３１７，８２１号、第４，３２２，３４８号、第４，３３１，５９８号、第４，３６１，６５０号、第４，３６４，８６６号、第４，４２４，２１９号、第４，４５０，２５４号、第４，３６２，６６３号、および第４，３７１，５３３中に開示され、これらの各々を引用により本明細書に援用する。メイタンシノイドを含有する結合体、その作製方法、およびその治療的使用が、たとえば、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、第６，４４１，１６３号、および欧州特許第ＥＰ０４２５２３５  Ｂ１号中に開示され、その開示内容を引用により本明細書に明白に援用する。
【０１９１】
さらなる毒素を、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分と共に使用できる。毒素の例は、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、リボトキシン（ｒｉｂｏｔｏｘｉｎ）、リボヌクレアーゼ、サポリン、およびカリケアマイシン、ならびにボツリヌストキシンＡ〜Ｆを含む。こうした毒素は当技術分野において周知されており、その多くを商業的供給元（たとえば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から容易に入手できる。意図される毒素は、こうした毒素のバリアントをも含む（たとえば、米国特許第５，０７９，１６３号および第４，６８９，４０１号を参照）。
【０１９２】
サポリンは、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓに由来する毒素であり、リボソーム複合体の６０Ｓ部分の不活性化によってタンパク質合成を妨げる（Ｓｔｉｒｐｅら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４０５−４１２，１９９２）。しかしながら、この毒素は、細胞内に特異的に浸入するための機構を有さず、そのため、細胞内に効率よく入るには、内在している細胞表面タンパク質を認識する抗体または抗原結合断片に結合する必要がある。
【０１９３】
ジフテリア毒素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅから単離される。典型的には、免疫毒素中において使用するためのジフテリア毒素は、突然変異により、非特異的毒性が低減または除去されている。ＣＲＭ１０７として知られる突然変異体は、十分な酵素活性を有するが非特異的毒性が著しく低減されたものであり、１９７０年代から周知され（Ｌａｉｒｄ  ａｎｄ  Ｇｒｏｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：２２０，１９７６）、ヒト臨床試験において使用されている。米国特許第５，７９２，４５８号および米国特許第５，２０８，０２１号を参照。
【０１９４】
リシンは、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ（Ｃａｓｔｏｒ  ｂｅａｎ））から得られるレクチンＲＣＡ６０である。リシンの例は、米国特許第５，０７９，１６３号および米国特許第４，６８９，４０１号を参照。Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ凝集素（ＲＣＡ）には２つの形態があり、これらの分子量がそれぞれ約６５ｋＤおよび約１２０ｋＤであることからＲＣＡ６０およびＲＣＡ１２０と称される（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ＆Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２６６：５４３，１９７２）。Ａ鎖はタンパク質合成の不活性化と細胞の死滅とを担う。Ｂ鎖は、細胞表面ガラクトース残基にリシンを結合させて、サイトゾル中へのＡ鎖の輸送を促進する（Ｏｌｓｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ２４９：６２７−６３１，１９７４および米国特許第３，０６０，１６５号）。
【０１９５】
リボヌクレアーゼもまた、標的分子に結合させることによって免疫毒素として使用されている（Ｓｕｚｕｋｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２６５−７０，１９９９を参照）。α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびレストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）などの例示的なリボトキシンが、たとえば、Ｒａｔｈｏｒｅら，Ｇｅｎｅ  １９０：３１−５，１９９７、およびＧｏｙａｌ  ａｎｄ  Ｂａｔｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４５  Ｐｔ  ２：２４７−５４，２０００中に記載されている。カリケアマイシンは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａから最初に単離されたものであり、ＤＮＡ二本鎖の切断を引き起こしてアポトーシスを導くエンジイン抗腫瘍抗生物質ファミリーのメンバーである（たとえば、Ｌｅｅら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４２：１０７０−８７，１９８９を参照）。この薬物は、臨床試験において、免疫毒素の毒性部位である（たとえば、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１：７３５−４１，２０００を参照）。
【０１９６】
アブリンは、Ａｂｒｕｓ  ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓから得られる毒性レクチンを含む。その毒性成分であるアブリンａ、ｂ、ｃ、およびｄは、分子量が約６３〜６７ｋＤであり、２つのポリペプチド鎖ＡおよびＢがジスルフィド結合したものから構成される。Ａ鎖はタンパク質合成を阻害し、Ｂ鎖（アブリン−ｂ）はＤ−ガラクトース残基に結合する（Ｆｕｎａｔｓｕら，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２：１０９５，１９８８；および、Ｏｌｓｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０：３３０−３３５，１９７８を参照）。
【０１９７】
本明細書中に開示される抗原の１つ以上に対して特異的な、ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、モノクローナル抗体、その抗原結合断片は、検出可能なマーカー、たとえば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡法、または画像診断技術（コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、コンピュータ体軸断層撮影（ＣＡＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲＩ）、磁気共鳴断層撮影（ＭＴＲ）、超音波診断、光ファイバー検査、および腹腔鏡下検査など）によって検出できる検出可能なマーカーとも結合していてよい。検出可能なマーカーの具体例は、フルオロフォア、化学発光剤、酵素による結合、放射性アイソタイプ、および重金属または化合物（たとえば、ＭＲＩによる検出を目的とした超常磁性酸化鉄ナノ結晶）を含むが、これらに限定されない。たとえば、有用である検出可能なマーカーは、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（５−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−１−ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、フィコエリトリン、およびランタニド発光体などを含む蛍光性化合物を含む。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーも有用である。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分はまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼなどの、検出にとって有用な酵素と結合していてもよい。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分が、検出可能な酵素と結合している場合、当該酵素に使用されると識別可能な反応生成物を生成するようなさらなる試薬を添加することによって検出できる。たとえば、剤である西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加によって着色反応生成物が得られ、これを目視によって検出できる。ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分はまた、ビオチンと結合していてもよく、アビジンまたはストレプトアビジンの結合を間接的に測定することによって検出されてもよい。注目すべきことに、アビジン自体が酵素または蛍光標識と結合していてもよい。
【０１９８】
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分は、ガドリニウムなどの常磁性剤と結合していてもよい。超常磁性酸化鉄などの常磁性剤も、標識として有用である。抗体はまた、ランタニド（ユーロピウムおよびジスプロシウムなど）およびマンガンと結合していてもよい。抗体または抗原結合断片はまた、第２のレポーター（ロイシンジッパーの配列対、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）によって認識されるあらかじめ定められたポリペプチドエピトープで標識されていてもよい。
【０１９９】
ＣＡＲ、ＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、またはその抗原結合部分はまた、放射性標識アミノ酸と結合していてもよい。放射性標識は、診断目的および治療目的の両方に使用してよい。たとえば、放射性標識は、本明細書中に開示される抗原の１つ以上および抗原発現細胞をＸ線、発光スペクトル、または他の診断技術によって検出するために使用してよい。さらに、放射性標識は、治療において、対象における腫瘍を処置するための、たとえば神経芽細胞腫を処置するための、毒素として使用してよい。ポリペプチドのための標識の例は、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉなどの放射性同位体または放射性ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【０２００】
このような検出可能なマーカーの検出手段は、当業者に周知されている。したがって、たとえば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンタを使用して検出されてよく、蛍光性マーカーは、光検出器を使用して放射光を検出することによって検出されてよい。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を与えて、基質に対する酵素の作用により生成した反応生成物を検出することによって検出され、比色標識は、単純に、着色した標識を可視化することによって検出される。
【０２０１】
Ｄ．ヌクレオチド、発現、ベクター、および宿主細胞
本発明の一実施形態によって、本明細書中に記載されるＣＡＲ、抗体、またはその抗原結合部分（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のうち任意のものをコードするヌクレオチド配列を含む核酸がさらに提供される。本発明に係る核酸は、本明細書中に記載されるリーダー配列、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および／または細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのうち任意のものをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、コドンが改変されたものであってよい。いかなる理論にも拘束されないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化によってｍＲＮＡ転写物の翻訳効率が増大すると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、天然コドンを、同じアミノ酸をコードするが細胞内での利用がより容易なｔＲＮＡによって翻訳され得る別のコドンに置換することを伴ってよく、したがって、翻訳効率が増大し得る。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳を妨害し得る二次ｍＲＮＡ構造を低減し得るものであってよく、したがって、翻訳効率が増大し得る。
【０２０３】
本発明の一実施形態において、核酸は、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインをコードするコドン改変ヌクレオチド配列を含んでよい。本発明の別の一実施形態において、核酸は、本明細書中に記載されるＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）のうち任意のものをコードするコドン改変ヌクレオチド配列を含んでよい。
【０２０４】
本明細書中において使用される「核酸」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸分子」を含むものであり、一般的には、一本鎖または二本鎖であってよく、合成または天然の供給源から（たとえば、単離および／または精製により）得られてよく、天然、非天然、または変化したヌクレオチドを含有してよく、天然、非天然、または変化したヌクレオチド間結合（無改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステルに代えて、ホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合など）を含有してよい、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味する。いくつかの実施形態において、核酸は、挿入、欠失、反転、および／または置換を全く含まない。しかしながら、本明細書中において記載されるとおり、いくつかの例においては、核酸が１つ以上の挿入、欠失、反転、および／または置換を含むことが好適であってよい。
【０２０５】
組換え核酸は、天然には存在しない配列を有するもの、または、配列中では離れた２つの領域を人工的に組み合わせた配列を有するものであってよい。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または、より一般的には、離れた核酸領域を、たとえば、上述されるＳａｍｂｒｏｏｋらの文献中に記載されるものなどの、遺伝子操作技術により、人工的に操作して、実現されることが多い。核酸は、当技術分野において周知される手順を使用した化学合成および／または酵素による結合反応に基づいて構築されてもよい。たとえば、上述されるＳａｍｂｒｏｏｋらの文献および上述されるＡｕｓｕｂｅｌらの文献を参照。たとえば、核酸は、天然のヌクレオチドを使用して、または、当該分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるように設計された、多様な様式で改変されたヌクレオチド（たとえば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して、化学的に合成されてもよい。核酸生成に使用できる改変ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンを含むが、これらに限定されない。代替的には、本発明に係る核酸の１つ以上を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、米国）などの企業から購入してもよい。
【０２０６】
核酸は、上述されるＣＡＲのうち任意のものまたはその機能的部分もしくは機能的バリアントをコードする任意の単離または精製されたヌクレオチド配列を含んでよい。代替的には、ヌクレオチド配列は、上述される配列のうち任意のものに縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）されたヌクレオチド配列または縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）配列の組み合わせを含んでよい。
【０２０７】
一実施形態は、本明細書中に記載される核酸のうち任意のもののヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、または本明細書中に記載される核酸のうち任意のもののヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離または精製された核酸をさらに提供する。
【０２０８】
ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズしてよい。「高度にストリンジェントな条件」とは、ヌクレオチド配列が標的配列（本明細書中に記載される核酸のうち任意のもののヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズし、その量が、非特異的なハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に多いことを意味する。高度にストリンジェントな条件は、厳密に相補的な配列を有するポリヌクレオチドまたはミスマッチが２〜３個散在するのみであるものを、当該ヌクレオチド配列に一致する小領域（たとえば、３〜１０塩基）を偶然にも２〜３個有する無作為の配列から区別できるような条件を含む。こうした小さな相補性領域は、塩基１４〜１７個またはそれ以上の長さの全長相補性領域よりも容易に融解され、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションによってこれらを容易に区別できる。比較的高度にストリンジェントな条件は、たとえば、約０．０２〜０．１Ｍ  ＮａＣｌまたはこれと同等で温度約５０〜７０℃などのような低塩および／または高温条件を含み得る。このように高度にストリンジェントな条件は、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間のミスマッチを、万一許容するとしても、その程度は非常に低く、本発明のＣＡＲのうち任意のものの発現を検出するために特に好適である。一般的に、ホルムアミドの添加量を増加することによって条件をさらにストリンジェントにすることができると理解される。
【０２０９】
また、本明細書中に記載される核酸のうち任意のものとの同一性が少なくとも約７０％またはそれ以上、たとえば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％であるヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。
【０２１０】
一実施形態において、核酸は、組換え発現ベクター中に組み込まれてよい。この点において、一実施形態は、上述される核酸のうち任意のものを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書中に記載される目的において、用語「組換え発現ベクター」は、遺伝子改変オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドコンストラクトを意味し、このコンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、当該ベクターと宿主細胞とを、宿主細胞中において当該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが発現するのに十分な条件下において接触させた場合に、宿主細胞が当該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現できるものである。こうしたベクターは、総じて、天然には存在しない。
【０２１１】
しかしながら、こうしたベクターの一部は天然に存在し得る。この組換え発現ベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意の種類のヌクレオチドを含んでよく、これらは、一本鎖または二本鎖であってよく、合成または一部は天然の供給源から得られてよく、天然、非天然、または変化したヌクレオチドを含有してよい。組換え発現ベクターは、天然または非天然のヌクレオチド間結合、または両方の型の結合を含んでよい。好ましくは、非天然または変化したヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合は、当該ベクターの転写または複製を妨げない。
【０２１２】
一実施形態において、組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであってよく、任意の好適な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするために使用できる。好適なベクターは、繁殖および増殖を目的として、または発現を目的として、またはその両方の目的で設計されたもの（プラスミドおよびウイルスなど）を含む。ベクターは、ｐＵＣ系（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）、およびｐＥＸ系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群より選択されてよい。
【０２１３】
λυΤΙΟ、λυΤΙ  １、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＭＢＬ４、およびλΝΜΙ  １４９などのバクテリオファージベクターも使用できる。植物発現ベクターの例は、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＨＯｌ．３、ｐＢＩ１２１、およびｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。動物発現ベクターの例は、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、およびｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、たとえば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってよい。レンチウイルスベクターは、特に、Ｍｉｌｏｎｅら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３−１４６４（２００９）中において提供されるような自己不活型レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部分に由来するベクターである。診療所において使用され得るレンチウイルスベクターの他の例は、たとえば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ  ｐｌｃからのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子導入技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎなどからのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系を含むが、これらに限定されない。臨床用の型ではないレンチウイルスベクターも入手可能であり、当業者に周知され得る。
【０２１４】
複数のトランスフェクション技術が当技術分野において一般的に周知されている（たとえば、Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上述；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）；および、Ｃｈｕら，Ｇｅｎｅ，１３：９７（１９８１）を参照）。
【０２１５】
トランスフェクション方法は、リン酸カルシウム共沈（たとえば、上述されるＧｒａｈａｍらを参照）、培養細胞中への直接マイクロインジェクション（たとえば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，２２：４７９−４８８（１９８０）を参照）、エレクトロポレーション（たとえば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：７４２−７５１（１９８８）を参照）、リポソーム介在性遺伝子導入（たとえば、Ｍａｎｎｉｎｏら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２−６９０（１９８８）を参照）、脂質介在性形質導入（たとえば、Ｆｅｉｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７）を参照）、および高速微粒子銃を使用した核酸導入（たとえば、Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３（１９８７）を参照）を含む。
【０２１６】
一実施形態において、組換え発現ベクターは、たとえば上述されるＳａｍｂｒｏｏｋら、および上述されるＡｕｓｕｂｅｌら中に記載される、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製されてよい。発現ベクターの環状または線状コンストラクトは、原核または真核生物の宿主細胞において機能する複製機構を含有するように調製されてよい。複製機構は、たとえば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、およびウシパピローマウイルスなどに由来するものであってよい。
【０２１７】
組換え発現ベクターは、ベクター導入先の宿主細胞（たとえば、細菌、真菌、植物、または動物）の種類に対して適宜特異的であり、かつ、ベクターがＤＮＡまたはＲＮＡのいずれに基づくかが考慮された、転写コドンおよび翻訳開始コドンおよび停止コドンなどの調節配列を含んでよい。組換え発現ベクターは、クローニングを促進するための制限部位を含んでよい。
【０２１８】
組換え発現ベクターは、形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞の選択を可能とする１つ以上のマーカー遺伝子を含んでよい。マーカー遺伝子は、たとえば抗生物質、重金属などに対する耐性といった、殺生物剤耐性、および、原栄養性とするための栄養要求性宿主における補完などを含む。本発明の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子は、たとえば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【０２１９】
組換え発現ベクターは、ＣＡＲ（その機能的部分および機能的バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列、またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列に相補的なもしくはこれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に結合した、天然または非天然のプロモーターを含んでよい。プロモーターの選択（たとえば、強い、弱い、誘導性、組織特異的、および発生特異的（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）など）は、当業者の通常の知識の範囲内である。同様にヌクレオチド配列とプロモーターとの結合も、当業者の通常の知識の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、たとえば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列中にみられるプロモーターであってよい。
【０２２０】
組換え発現ベクターは、一過性の発現、または安定的な発現、またはその両方のうちのいずれかを目的として設計されてよい。また、組換え発現ベクターは、恒常的発現または誘導性発現を目的として作製されてよい。
【０２２１】
さらに、組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製されてよい。本明細書中において使用される場合、用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現している細胞の死を引き起こす遺伝子を指す。自殺遺伝子は、当該遺伝子が発現している細胞に、たとえば薬物などの剤に対する感受性を与えて、当該細胞がこの剤に接触または曝露されると当該細胞の死を引き起こす遺伝子であってよい。自殺遺伝子は当技術分野において周知されており（たとえば、Ｓｕｉｃｉｄｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｊ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４を参照）、かつ、たとえば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびニトロレダクターゼを含む。
【０２２２】
一実施形態は、本明細書中に記載される組換え発現ベクターのうち任意のものを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書中において使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明に係る組換え発現ベクターを含有し得る任意の型の細胞を指す。宿主細胞は、たとえば植物、動物、真菌、もしくは藻類などの、真核細胞であってもよいし、または、たとえば細菌もしくは原生動物などの、原核細胞であってもよい。宿主細胞は、培養細胞、または、初代細胞（すなわち、たとえばヒトなどの、生物から直接単離されたもの）であってよい。宿主細胞は、接着細胞、または、懸濁細胞（すなわち、懸濁液中で増殖する細胞）であってよい。好適な宿主細胞は当技術分野において周知されており、たとえば、ＤＨ５ａ大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＨＥＫ２９３細胞などを含む。組換え発現ベクターの増幅または複製が目的である場合には、宿主細胞は、原核細胞、たとえばＤＨ５ａ細胞であってよい。組換えＣＡＲの作製が目的である場合には、宿主細胞は哺乳動物細胞であってよい。宿主細胞はヒト細胞であってよい。宿主細胞は任意の細胞型であってよく、任意の種類の組織に由来してよく、任意の発生段階であってよいが、宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってよい。宿主細胞はＴ細胞であってよい。
【０２２３】
本明細書中に記載される目的において、Ｔ細胞は任意のＴ細胞であってよく、培養Ｔ細胞（たとえば初代Ｔ細胞など）、または培養Ｔ細胞株（たとえば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど）からのＴ細胞、または哺乳動物から得られるＴ細胞であってよい。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液を含むがこれらに限定されない、非常に多様な供給源から得られてよい。Ｔ細胞は、強化または精製されていてもよい。Ｔ細胞はヒトＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞であってよく、任意の発生段階であってよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、たとえばＴｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞（たとえば、細胞毒性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、メモリーＴ細胞、メモリー幹細胞、すなわちＴｓｃｍ、およびナイーブ型Ｔ細胞などを含むがこれらに限定されない。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＤ４＋  Ｔ細胞であってよい。
【０２２４】
一実施形態において、本明細書中に記載されるＣＡＲは、Ｔ細胞ではない好適な細胞において使用できる。このような細胞は、たとえば、ＮＫ細胞および多能性幹細胞から発生させたＴ様細胞などの、免疫エフェクター機能を有するものである。
【０２２５】
また、一実施形態は、本明細書中に記載される少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団も提供する。この細胞の集団は、記載される組換え発現ベクターのうち任意のものを含む宿主細胞に加えて、少なくとも１種の他の細胞、たとえば、組換え発現ベクターのうち任意のものを含まない宿主細胞（たとえば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、たとえば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などを含む、不均質な集団であってよい。代替的には、細胞の集団は、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（たとえば、本質的にこれからなる）、実質的に均質な集団であってよい。また、集団は、当該集団の全細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、したがって当該集団の全細胞がこの組換え発現ベクターを含むような、クローン細胞集団であってもよい。本発明の一実施形態において、細胞の集団は、本明細書中に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【０２２６】
ＣＡＲ（その機能的部分およびバリアントを含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、および抗体（その抗原結合部分を含む）は、単離および／または精製されてよい。たとえば、精製された（または単離された）宿主細胞の調製物中では、宿主細胞の純度が、体内の自然環境中における純度よりも高い。このような宿主細胞は、たとえば標準的な精製技術によって作製されてよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞の調製物は、この調製物の総細胞含有量の少なくとも約５０％、たとえば少なくとも約７０％を宿主細胞が占めるように精製される。たとえば、この純度は、少なくとも約５０％であってよい、または約６０％、約７０％、もしくは約８０％を超えてよい、または約１００％であってよい。
【０２２７】
Ｅ．処置方法
本明細書中に開示されるＣＡＲを哺乳動物における疾患の処置または予防方法において使用してよいことが意図される。この点において、一実施形態は、哺乳動物におけるがんの処置または予防方法を提供し、これは、哺乳動物に、ＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体および／またはその抗原結合部分、および／または医薬組成物を、哺乳動物におけるがんの処置または予防に有効な量にて投与する工程を含む。
【０２２８】
一実施形態は、さらに、本明細書中に開示されるＣＡＲを投与するより前に、哺乳動物をリンパ球枯渇させる工程を含む。リンパ球枯渇の例は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法、骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法、全身照射などを含むが、これらに限定されなくてよい。
【０２２９】
宿主細胞または細胞の集団が投与される本方法の目的において、この細胞は、当該哺乳動物の同種異系由来の細胞、またはこれの自己由来細胞であってよい。好ましくは、この細胞は、当該哺乳動物の自己由来細胞であってよい。本明細書中において使用される場合、同種異系由来とは、任意の材料であって、当該材料を導入した個体と同種であるが別個体である動物に由来することを意味する。２つ以上の個体について、１つ以上の座における遺伝子が同一でない場合に、これらの個体は互いに同種異系由来であるといわれる。いくつかの態様において、同種の個体からの同種異系由来の材料は、抗原性的に相互に作用できるほど十分に遺伝学的に異なっていてよい。本明細書中において使用される場合、「自己由来」は、任意の材料であって、この材料を後に再び導入することになる個体と同じ個体に由来する材料を意味する。
【０２３０】
本明細書中において言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であってよい。本明細書中において使用される場合、用語「哺乳動物」は、マウスおよびハムスターなどの齧歯目哺乳動物およびウサギなどのウサギ目（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）哺乳動物を含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目のものであってよい。哺乳動物は、ウシ亜科（ウシ）およびブタ類（ブタ）を含む偶蹄目、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）のものであってよい。哺乳動物は、霊長目、セボイド類（Ｃｅｂｏｉｄｓ）、もしくはシモイド類（Ｓｉｍｏｉｄｓ）（サル（ｍｏｎｋｅｙｓ））、または類人猿類（ヒトおよびサル（ａｐｅｓ））であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２３１】
上述される方法に関して、がんは、急性ンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣型横紋筋肉腫、膀胱がん（たとえば、膀胱癌）、骨がん、脳がん（たとえば、髄芽細胞腫）、乳がん、肛門、肛門管、または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頚部、胆嚢、または胸膜のがん、鼻、鼻腔、または中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頚がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、頭頸部がん（たとえば、頭頸部扁平上皮癌）、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液性腫瘍、肝臓がん、肺がん（たとえば、非小細胞肺癌および肺腺癌）、リンパ腫、中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、Ｂ−慢性リンパ球性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）およびＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、網、および腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、固形腫瘍、滑膜肉腫、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、ならびに尿管がんのうち任意のものを含む、任意のがんであってよい。
【０２３２】
用語「処置」および「予防」ならびにこれらの派生語は、本明細書中において使用される場合、必ずしも１００％のまたは完全な処置または予防を示唆するものではない。そうではなく、むしろ、当技術分野において通常の知識を有する者が利益または治療効果の可能性を認識する処置または予防には、多様な程度のものがある。この点に関し、本方法は、哺乳動物における任意の量または任意のレベルのがん処置または予防を提供できる。
【０２３３】
さらに、本方法によって提供される処置または予防は、処置または予防されている疾患（たとえば、がん）の１つ以上の状態または症状の処置または予防を含んでよい。また、本明細書中に記載される目的において、「予防」は、疾患またはその症状もしくは状態の発症の遅延を包含してもよい。
【０２３４】
別の一実施形態は、哺乳動物におけるがんの存在の検出方法を提供し、これは、（ａ）哺乳動物からの１つ以上の細胞を含む試料をＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体、および／またはその抗原結合部分、または医薬組成物に接触させることによって、複合体を形成する工程と、（ｂ）この複合体を検出する工程とを含み、複合体が検出された場合、哺乳動物においてがんが存在することが示唆される。
【０２３５】
この試料は、たとえば生検または剖検などの、任意の好適な方法によって得られてよい。生検は、個体から組織および／または細胞を除去することである。こうした除去は、除去された組織および／または細胞を実験法に供するために、個体から組織および／または細胞を採取するものであってよい。この実験法は、この個体が特定の状態もしくは疾患状態を有するか否かおよび／またはこれに罹患しているか否かを判断するための実験を含んでよい。この状態または疾患は、たとえば、がんであってよい。
【０２３６】
哺乳動物における増殖性障害、たとえばがん、の存在の検出方法の一実施形態に関して、哺乳動物の細胞を含む試料は、全細胞、その溶解物、または全細胞溶解物画分、たとえば、核もしくは細胞質画分、総タンパク質画分、または核酸画分、を含む試料であってよい。試料が全細胞を含む場合、この細胞は、哺乳動物の任意の細胞、たとえば、任意の臓器または組織の細胞（血液細胞または内皮細胞を含む）であってよい。
【０２３７】
上述される接触は、哺乳動物について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生じてよい。好ましくは、当該接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生じる。
【０２３８】
また、複合体の検出は、当技術分野において周知される複数の方法のうち任意のものによって行なってよい。たとえば、本明細書中に開示されるＣＡＲ、本明細書中に記載されるポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、または抗体、またはその抗原結合部分は、たとえば、上記に開示されるとおり、放射性同位体、フルオロフォア（たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（たとえば、金粒子）などの、検出可能な標識で標識されてよい。
【０２３９】
ＣＡＲの標的細胞認識能力および抗原特異性を試験する方法は、当技術分野において周知されている。たとえば、Ｃｌａｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６３：５０７−５１３（１９９９）は、サイトカイン（たとえば、インターフェロン−γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−ａ）、またはインターロイキン２（ＩＬ−２））の放出の測定方法を教示する。それに加えて、ＣＡＲの機能を、Ｚｈａｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：４４１５−４４２３（２００５）中に記載されるとおり、細胞の細胞毒性の測定によって評価してよい。
【０２４０】
別の一実施形態は、哺乳動物における増殖性障害、たとえばがん、を処置または予防するための、本発明に係るＣＡＲ、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、抗体、またはその抗原結合部分、および／または医薬組成物の使用を提供する。このがんは、本明細書中に記載されるがんのうち任意のものであってよい。
【０２４１】
局所および全身投与を含む任意の投与方法を、開示される治療剤に対して使用してよい。たとえば、外用的、経口、静脈内などの血管内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、くも膜下腔内、および皮下への投与を使用してよい。具体的な投与様式および投薬レジメンは、担当臨床医によって、当該症例の詳細（たとえば、対象、疾患、関連する疾患状態、および処置が予防的であるか否か）を考慮の上で選択されてよい。１種を超える剤または組成物が投与される場合、１種以上の投与経路が使用されてよく、たとえば、化学療法剤は経口的に投与されてよいし、抗体または抗原結合断片または結合体または組成物は静脈内に投与されてよい。投与方法は注射を含み、この注射において、ＣＡＲ、ＣＡＲ  Ｔ細胞、結合体、抗体、抗原結合断片、または組成物は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、５％ヒト血清アルブミン、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソームなどの、非毒性でありかつ製薬学的に許容される担体中に提供される。いくつかの実施形態において、開示される化合物の局所投与は、たとえば、抗体または抗原結合断片を、腫瘍除去後の組織領域、または腫瘍発生傾向が疑われる領域に適用することによって使用されてよい。いくつかの実施形態において、治療的有効量の抗体または抗原結合断片を含む医薬調製物の持続的な腫瘍内（または腫瘍近傍）への放出が有益である可能性がある。他の例において、結合体は、点眼剤として、外用的に角膜に、または眼の硝子体内に適用される。
【０２４２】
開示される治療剤は、正確な投薬量を１回１回投与するのに好適な単位投薬形態で製剤化されてよい。それに加えて、開示される治療剤は、単回投与または複数回投与のスケジュールで投与されてよい。複数回投与のスケジュールは、最初の一連の処置では１回を超える投与（たとえば１〜１０回の投与）が１回１回別個に行なわれてよく、続いてその後、必要に応じて、組成物の作用を維持または増大させるために、残りの投与が時間間隔をあけて行なわれてよいというものである。処置は、化合物を１日１回または１日複数回（ｍｕｌｔｉ−ｄａｉｌｙ  ｄｏｓｅｓ）、２〜３日間から数か月間、またはさらには数年間の期間にわたって投与することを伴ってよい。したがって、投薬レジメンは、処置する対象の具体的な要求事項にも少なくとも一部基づいて決定されてよく、投与担当医の判断に依存してよい。
【０２４３】
抗体または結合体の典型的な投薬量は、約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、たとえば約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。
【０２４４】
具体的な例において、対象は、結合体、抗体、組成物、ＣＡＲ、ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはさらなる剤のうち１種以上を含む治療用組成物を、少なくとも連続２日間および連続１０日間などの複数日投与スケジュール（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄａｉｌｙ  ｄｏｓｉｎｇ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ）にて、たとえば数週間、数か月間、または数年間の期間にわたって投与される。一例において、対象は、結合体、抗体、組成物、またはさらなる剤を、少なくとも３０日間の期間にわたって、たとえば少なくとも２か月間、少なくとも４か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも２４か月間、または少なくとも３６か月間の期間にわたって投与される。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、開示される方法は、開示される抗体、抗原結合断片、結合体、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞と組み合わせて（たとえば、逐次的に、実質的に同時に、または同時に）、手術、放射線療法、および／または化学療法を、対象に提供することを含む。このような剤および処置についての方法および治療的投薬量は当業者に周知されており、熟練した臨床医によって判断されてよい。さらなる剤についての調製物および投与スケジュールは、製造元の説明書にしたがって、または熟練した医師の経験に基づく判断にしたがって使用されてよい。また、このような化学療法の調製物および投与スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，（１９９２）Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ中に記載される。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、併用療法は、さらなるがん阻害剤の治療的有効量を対象に投与することを含んでよい。併用療法と共に使用できるさらなる治療剤の例は、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよびＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子制御剤、ならびに血管新生阻害剤を含むが、これらに限定されない。これらの剤（治療的有効量にて投与される）および処置は、単独で、または組み合わせで使用されてよい。たとえば、任意の好適な抗がんまたは抗血管新生剤が、本明細書中に開示されるＣＡＲ、ＣＡＲ−Ｔ細胞、抗体、抗原結合断片、または結合体との組み合わせで投与されてよい。このような剤についての方法および治療的投薬量は当業者に周知されており、熟練した臨床医によって決定され得る。
【０２４７】
さらなる化学療法剤は、ナイトロジェンマスタード（たとえば、クロラムブチル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン）、ニトロソウレア（たとえば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、白金化合物（たとえば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、およびウラムスチンなどのアルキル化剤；葉酸（たとえば、メトトレキサート、ペメトレキセド、およびラルチトレキセド）、プリン（たとえば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、およびチオグアニン）、ピリミジン（たとえば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、およびゲムシタビンなどの代謝拮抗剤；ポドフィルム（たとえば、エトポシドおよびテニポシド）、タキサン（たとえば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（たとえば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）などの植物アルカロイド；アントラサイクリンファミリーのメンバー（たとえば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン）、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシ尿素、およびマイトマイシンなどの細胞毒性／抗腫瘍性抗生物質；トポテカンおよびイリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤；アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、およびトラスツズマブなどのモノクローナル抗体；アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、およびベルテポルフィンなどの光増感剤；ならびに、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペガスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｉｎｉｂ）、バンデタニブ、およびトレチノインなどの他の剤を含むが、これらに限定されない。このような剤の選択および治療的投薬量は当業者に周知されており、熟練した臨床医によって決定され得る。
【０２４８】
併用療法は、相乗作用を生じ得るものであり、かつ、相乗的であることが立証され得る、すなわち、複数の活性成分を一緒に使用した際に達成される作用が、同じ化合物を別個に使用した際に得られる作用を合わせたものより大きい。相乗効果は、複数の活性成分が、（１）一緒に製剤化されて、これらを合わせた単位投薬用調製物として同時に投与もしくは送達された場合、（２）別個の調製物として、交互にもしくは平行して送達された場合、または（３）何らかの他のレジメンが使用された場合に生じ得る。交互に送達された場合には、たとえば別個のシリンジで別々に注射されることによって、当該化合物が逐次的に投与または送達された際に、相乗効果が生じ得る。一般的に、交互の場合には、各活性成分の有効投薬量が逐次的に、すなわち連続的に投与され、一方、併用療法では、２種以上の活性成分の有効投薬量が一緒に投与される。
【０２４９】
一実施形態において、本明細書中に開示される抗原の１つ以上に特異的に結合する抗体もしくは抗原結合断片またはその結合体の有効量が、腫瘍を有する対象に、抗がん処置後に投与される。十分な時間が経過して、投与された抗体または抗原結合断片または結合体が、それぞれのがん細胞上に発現した抗原と免疫複合体を形成した後、この免疫複合体が検出される。免疫複合体が存在すること（または存在しないこと）が、上記処置の有効性を示す。たとえば、上記処置よりも前に得たコントロールと比較して免疫複合体が増加していれば、上記処置が有効でないことが示され、上記処置よりも前に得たコントロールと比較して免疫複合体が減少していれば、上記処置が有効であることが示される。
【０２５０】
Ｆ．バイオ医薬組成物
本明細書中に開示される１つ以上の抗原に特異的に結合する、開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、結合体、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１種以上を、担体（製薬学的に許容される担体など）中に含む、バイオ医薬組成物または生物組成物（以下、「組成物」）が、本明細書中において、遺伝子療法、免疫療法、および／または細胞療法における使用を目的として提供される。この組成物は、対象への投与のために単位投薬形態にて調製されてよい。投与の量およびタイミングは、所望される転帰を達成するために、処置担当臨床医によって判断される。この組成物は、全身（静脈内など）または局所（腫瘍内など）への投与を目的として配合されてよい。一例において、開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、結合体は、静脈内投与などの非経口投与を目的として配合される。本明細書中に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、結合体、抗体、または抗原結合断片を含む組成物は、たとえば、腫瘍（たとえば、神経芽細胞腫であるが、これに限定されない）の処置および検出に有用である。いくつかの例において、この組成物は、癌の処置または検出に有用である。本明細書中に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、結合体、抗体、または抗原結合断片を含む組成物は、たとえば病理学的血管新生の検出にも有用である。
【０２５１】
この投与用組成物は、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、結合体、抗体、または抗原結合断片を、水性担体などの製薬学的に許容される担体中に溶解した、溶液を含んでよい。たとえば緩衝生理食塩水などの、多様な水性担体が使用されてよい。こうした溶液は、滅菌されており、一般的に、望ましくない物質を含まない。この組成物は、従来から周知される滅菌技術によって滅菌されていてよい。この組成物は、生理的条件に近づけるために、必要に応じて、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムなどの、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤、および補助剤といった製薬学的に許容される補助的な物質を含有してよい。当該調製物中におけるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、または抗原結合断片、または結合体の濃度は、広範囲で変動してよく、主に流体の体積、粘度、および体重などに基づいて、選択された特定の投与様式および対象の要求事項に応じて選択されてよい。遺伝子療法、免疫療法、および／または細胞療法において使用するためのこのような投薬形態の実際の調製方法は、周知されている、または当業者には明らかであろう。
【０２５２】
静脈内投与用の典型的な組成物は、対象１人につき１日当たり約０．０１〜約３０ｍｇ／ｋｇの、抗体または抗原結合断片または結合体（または、対応する投与量のＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体もしくは抗原結合断片を含む結合体）を含む。投与用組成物の実際の調製方法は、当業者に周知または明白であってよく、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１９版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）などの出版物中に、より詳細に記載される。
【０２５３】
ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、抗原結合断片、または結合体は、凍結乾燥形態で提供されてよく、滅菌水で戻して投与されてよいが、周知の濃度の滅菌溶液中に溶解した形態でも提供される。ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、または抗原結合断片、または結合体の溶液は、次いで、０．９％塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を入れた注入バッグに充填され、場合によっては、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与される。抗体または抗原結合断片および結合体の薬物の投与にあたっては、当技術分野において相当量の経験を見いだすことができ、たとえば、抗体薬が、１９９７年のリツキサン（登録商標）の承認以来、米国市場に出回っている。ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、その抗原結合断片および結合体は、静脈内プッシュ（ｐｕｓｈ）またはボーラスではなく、低速の注入によって投与されてよい。一例において、より高負荷の投与量が投与され、続いて、これより低い程度にて維持投与量が投与される。たとえば、抗体または抗原結合断片が初期負荷投与量４ｍｇ／ｋｇ（または、抗体もしくは抗原結合断片を含む結合体の、これに対応する投与量）が約９０分間にわたって注入され、この初期投与量が良好に許容されれば、続いて、週１回の維持投与量２ｍｇ／ｋｇが、一回につき３０分間、４〜８週間にわたって注入されてよい。
【０２５４】
制御放出非経口調製物は、移植片、油性注射、または粒子系として調製されてよい。タンパク質送達系の広範囲の全体像は、Ｂａｎｇａ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，（１９９５）を参照。粒子系は、微小球体、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノ球体、およびナノ粒子を含む。マイクロカプセルは、細胞毒または薬物などの治療用タンパク質を中心核として含有する。微小球体中、粒子の全体に治療薬が分散している。約１μｍ未満の粒子、微小球体、およびマイクロカプセルは、一般的に、それぞれ、ナノ粒子、ナノ球体、およびナノカプセルと称される。毛細血管は直径約５μｍであるため、ナノ粒子のみが静脈内に投与される。微粒子は、典型的には直径約１００μｍであり、皮下または筋肉内に投与される。たとえば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．２１９−３４２（１９９４）；および、Ｔｉｃｅ＆Ｔａｂｉｂｉ，Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３１５−３３９，（１９９２）を参照。
【０２５５】
ポリマーを、本明細書中に開示されるＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞、抗体、または抗原結合断片、または結合体の組成物のイオン制御（ｉｏｎ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）放出に使用してよい。制御薬物送達において使用するための多様な分解性および非分解性ポリマーマトリックスが当技術分野において周知されている（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７−５４２，１９９３）。たとえば、ブロックコポリマーであるポロキサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）４０７は、低温では粘性を有する可動性の液体として存在するが、体温においては半固体のゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの調製物および持続送達にとって有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４２５−４３４，１９９２；および、Ｐｅｃら，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４（２）：５８−６５，１９９０）。代替的には、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御放出用のマイクロ担体として使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５−２２４，１９９４）。さらに別の一態様において、リポソームが、脂質カプセル化薬物の制御放出および薬物標的のために使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ（１９９３））。これら以外にも、治療用タンパク質の制御送達のための非常に多くの系が周知されている（米国特許第５，０５５，３０３号、米国特許第５，１８８，８３７号、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号、米国特許第４，８３７，０２８号、米国特許第４，９５７，７３５号、米国特許第５，０１９，３６９号、米国特許第５，０５５，３０３号、米国特許第５，５１４，６７０号、米国特許第５，４１３，７９７号、米国特許第５，２６８，１６４号、米国特許第５，００４，６９７号、米国特許第４，９０２，５０５号、米国特許第５，５０６，２０６号、米国特許第５，２７１，９６１号、米国特許第５，２５４，３４２号、および米国特許第５，５３４，４９６号）。
【０２５６】
Ｇ．キット
一態様において、本明細書中に開示されるＣＡＲを使用するキットがさらに提供される。たとえば、対象における腫瘍を処置するための、または本明細書中に開示されるＣＡＲの１種以上を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を作製するためのキットである。こうしたキットは、典型的には、本明細書中に開示される抗体、抗原結合断片、結合体、核酸分子、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞を含んでよい。開示される抗体、抗原結合断片、結合体、核酸分子、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１種を超えるものが、キット中に含まれてよい。
【０２５７】
キットは、容器と、容器に付けられたまたは容器に付随するラベルまたは添付文書とを含んでよい。好適な容器は、たとえば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。容器には、典型的には、開示される抗体、抗原結合断片、結合体、核酸分子、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞のうち１種以上を含む組成物が入っている。いくつかの実施形態において、容器は、滅菌アクセス口を有してよい（たとえば、容器は、皮下注射針で穿孔可能な栓を有する静脈内投与用液剤バッグまたはバイアルであってよい）。ラベルまたは添付文書は、組成物を特定の状態の処置に使用するということを示すものである。
【０２５８】
ラベルまたは添付文書は、典型的には、たとえば、腫瘍の処置もしくは予防方法、またはＣＡＲ  Ｔ細胞の作製方法における、開示される抗体、抗原結合断片、結合体、核酸分子、ＣＡＲ、またはＣＡＲを発現するＴ細胞の使用についての説明をさらに含んでよい。添付文書は、典型的には、治療用製品の市販パッケージ中に慣習的に入っている説明書を含んでおり、この説明書は、当該治療用製品の使用に関連する適応、用法、投薬量、投与、禁忌、および／または警告についての情報を含む。説明書の内容は、電子形式（フロッピーディスクまたはコンパクトディスクなど）または視覚形式（ビデオファイルなど）で記述されていてよい。キットは、さらに、キット設計目的である特定の用途を推進するためのさらなる構成要素を含んでよい。したがって、たとえば、キットには、さらに、標識検出手段（たとえば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識検出のためのフィルターセット、または、二次抗体などの適切な二次標識など）が入っていてよい。キットには、さらに、特定の方法の実施において慣例的に使用されるバッファーおよび他の試薬が入っていてよい。このようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知されている。
【０２５９】
実施例
本発明が、以下の実施例によってさらに例証されるが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。逆に、様々な他の実施形態、改変、および等価物に頼らなければならず、こうした他の実施形態、改変、および等価物は、本発明の精神および／または付属の請求項の範囲から逸脱することなく、本明細書の記載を読んだ後、当業者の念頭に浮かび得るということが明瞭に理解される。
【実施例１】
【０２６０】
ファージディスプレイおよび酵母ディスプレイされた完全ヒトＳｃＦｖライブラリからのＲＯＲ１特異的バインダの単離
材料および方法：
ａ）ヒトＲＯＲ１に対する完全ヒトＳｃＦｃ（分析のためのＦｃドメインを有するＳｃＦｖ）バインダの作製
健康なドナー５０人の末梢血Ｂ細胞から構築されたナイーブヒトＳｃＦｖ（免疫グロブリンの組換え一本鎖可変断片）ファージディスプレイライブラリ（およその多様性として、ユニークな特異性が１０１０）（Ｚ．Ｙ．ＺｈｕおよびＤ．Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ、データは未発表）を使用して、組換えヒトＲＯＲ１タンパク質のためのＳｃＦｖを選択した。ファージディスプレイさせた１０１２個のＳｃＦｖの増幅ライブラリを、５μｇ、３μｇ、および１μｇにて被覆したＲＯＲ１と共に、体積５×１００μｌ（９６ウェルプレートの５つのウェル中に等しく分配）にて、１回目、２回目、および３回目のバイオパニングの間、各回につき２時間ずつ、室温でインキュベートした。各回のインキュベーションの後、１回目の後には５回、以降の回の後には１０回、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）含有リン酸緩衝生理食塩水でウェルを洗浄して、非特異的に結合したファージを除去し、結合したファージは３７℃において１時間かけてＴＧ１コンピテントセルと混合し、感染した細胞から当該ファージを増幅して次の回のバイオパニングにおいて使用した。３回目のバイオパニングの実施後、感染したＴＧ１細胞から３８０個のクローンを無作為に選び、その１つ１つを、９６ウェルプレート中の１００μｇ／ｍｌ  カルベニシリンおよび０．２％グルコースを含有する２ＹＴ培地１５０μｌ中に接種した。この細菌培養物の６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）が０．５に達した後、感染多重度（ＭＯＩ）が１０のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７および５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）のカナマイシンを培地に添加し、プレートを３０℃においてさらに一晩、２５０ｒｐｍの振とう器中にてインキュベートした。ファージ上清を３％脱脂乳（ＰＢＳ中）と体積比４：１にて混合して、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）に使用し、ＲＯＲ１結合親和性の高いＳｃＦｖを提示するファージのクローンを特定した。９６ウェルプレートの各ウェルに５０ｎｇずつ被覆した組換えヒトＲＯＲ１と共に、上清を室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで５回洗浄した（４℃において一晩インキュベートした後、３％脱脂乳（ＰＢＳ中）でブロッキングし、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した）。ＲＯＲ１結合ファージを、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗Ｍ１３抗体を使用して検出した。この標的抗体と共にインキュベートした後、ウェルを洗浄することによって、非特異的に結合した抗体を除去し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、溶液の吸光度を４５０ｎｍにおいて測定した（Ａ４５０）。Ａ４５０が１．０を超えたＲＯＲ１結合クローンを選択して、さらなる特徴づけに供した。
【０２６１】
ｂ）選択した可溶性ＳｃＦｖの発現および精製
選択したクローンのＶＨおよびＶＬのＤＮＡ配列を決定し、クローンによってコードされる、固有の配列を有するＳｃＦｖを、以下に記載される通りに発現させ、精製した。当該クローンから抽出したプラスミドを使用して、ＨＢ２１５１細胞を形質転換した。新たに形質転換させた細胞の入ったプレートから単一コロニーを選び、これを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．２％グルコースを含有する２ＹＴ培地２００ｍｌ中に接種して、２５０ｒｐｍにて振とうしながら３７℃においてインキュベートした。この培養物の６００ｎｍにおけるＯＤが０．９０に達したときに、イソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度０．５ｍＭとなるように添加して、培養物を３０℃においてさらに一晩インキュベートした。８，０００×ｇにおいて２０分間遠心分離して細菌ペレットを採取し、これを、０．５ｍＵ  ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＰＢＳバッファー中に再懸濁した。５０ｒｐｍにて回転させながら室温において３０分間インキュベートした後、再懸濁したペレットを２５，０００×ｇで４℃において２５分間遠心分離し、上清を使用して、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて、業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）のとおりに、ＳｃＦｖを精製した。
【０２６２】
ｃ）ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
ＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌにて希釈した組換えヒトＲＯＲ１  ５０μｌを、４℃において一晩かけて９６ウェルプレートに被覆した。ＨｉｓタグおよびＦｌａｇタグを有する精製ＳｃＦｖを段階希釈して、標的タンパク質で被覆したウェル中に添加した。洗浄後、１：３０００にて希釈したＨＲＰ標識抗Ｆｌａｇ抗体を、１時間かけて室温において添加した。洗浄後、３，３，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加し、室温において１０分間インキュベートした後、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍでのＯ．Ｄ．を読み取って、ＳｃＦｖの相対的なＲＯＲ１結合能力を定量した。
【０２６３】
結果：
組換えヒトＲＯＲ１に対して特異的な２つのＳｃＦｖクローンを特定して、ヒト抗ＲＯＲ１  ＳｃＦｖバインダ  ＳｃＦｖ４およびＳｃＦｖ９として分類した。結合結果が極めて少ないということは、当該２つのバインダが、ＣＡＲおよび免疫グロブリン治療用コンストラクトに組み入れることのできる、完全にユニークでありかつ重要な、新しいＲＯＲ１結合部位であることを示す。ＬＴＧ１９４１、ＬＴＧ１９４２、ＬＴＧ２５２８、およびＬＴＧ２５２９  ヒト抗ＲＯＲ１バインダを発現するキメラ抗原受容体の作製が、下記の実施例２中に概説される。
【実施例２】
【０２６４】
抗ＲＯＲ１完全ヒト結合配列を発現するＣＡＲ。
ホモ・サピエンスＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）は、よく研究されているがん胚細胞表面糖タンパク質であり、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および、肉腫の一部、癌、または肺の腺癌などの様々な固形腫瘍において発現している。再発または抵抗性の慢性リンパ球性白血病に対する抗ＲＯＲ１抗体ＵＣ−９６１（シルムツズマブ（Ｃｉｒｔｕｚｕｍａｂ））の第１相研究が、現在進行中である（資金援助、Ｔｈｏｍａｓ  Ｋｉｐｐｓ、ＮＣＴ０２２２２６８８）。この第１級の研究の結果が待たれる。ＲＯＲ１に特異的なＣＡＲ−Ｔを用いた第１相臨床試験も初期段階である（資金援助、フレッドハッチンソン癌研究所、ＮＣＴ０２７０６３９２）。本出願人らは、我々の研究を一定基準に基づいて評価するため、かつ我々のコンストラクトの活性を実証するために、発表されたＲＯＲ１バインダを我々のコントロール（ＬＴＧ１９４３、ＬＴＧ２５２７）として含めた（Ｈｕｄｅｃｅｋら，２０１３，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：３１５３−３１６４を参照）。最近では抗ＣＤ１９  ＣＡＲが市販されていることを含めて、Ｔ細胞に基づく療法の現時点での進歩を考慮すると、ＲＯＲ１を発現するＣＬＬおよび他の悪性腫瘍に対しての、本明細書中に提示されるＣＡＲコンストラクトを特徴とする、細胞に基づく免疫療法の開発は、ヒト配列に由来する結合部位を使用してヒトの疾患を処置するための革新的で新規のアプローチである。
【０２６５】
本明細書中に記載される新規の抗ＲＯＲ１  ＣＡＲ−Ｔコンストラクトは、初代ヒトＴ細胞における細胞表面発現と、ＲＯＲ１陽性腫瘍細胞に対する特異性および潜在細胞毒性およびサイトカイン機能とが、高レベルである。実施例１でのように、ファージディスプレイによって特定したＳｃＦｖ候補に由来するＲＯＲ１結合配列を使用して、ＲＯＲ１  ＣＡＲを設計し、特徴づけのために、選択された構造ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含有するレンチウイルス発現ベクター中に、ＥＦ１ａプロモーターの制御下においてクローニングし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、形質導入効率、死滅機能、およびサイトカイン産生について、モデル細胞株および初代ヒトＴ細胞の両方において試験した。表１は、使用される学術用語の概要を示す。ＣＡＲコンストラクトＬＴＧ１９４３は妥当な比較である、というのは、この配列が臨床使用において提案されているためである（ＫＴＥ−Ｃ１９、Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ、およびＣＴＬ０１９、Ｎｏｖａｒｔｉｓを参照）。
【０２６６】
【表１】
2021502070.tif 000003
【０２６７】
材料および方法
（ａ）細胞株
すべての細胞株および試薬は、特記しない限り、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓｓ、ＶＡ）から購入したものである。急性リンパ球性白血病細胞株ＲＥＨおよびマントル細胞リンパ腫株Ｊｅｋｏ−１（ＡＣＣ−５５３  ＤＳＭＺ、Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｉｅｇ、ドイツ）、ならびに慢性骨髄性白血病株Ｋ５６２は、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）および２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。
【０２６８】
（ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現ベクターの作製
ＲＯＲ１  ＣＡＲコンストラクトを、フレーム中の各ｓｃＦｖをＣＤ８のヒンジドメインおよび膜貫通ドメイン（ａａ  １４１１８２〜１９１、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０１７３２）のいずれか、またはＩｇＧ４ヒンジドメイン（ａａ  ９９〜１１０、ＵｎｉＰｒｏｔ配列番号Ｐ０１８６１）と結合させ、続いて、ＣＤ８膜貫通ドメイン（ａａ  １８３〜２０３、ＵｎｉＰｒｏｔ配列番号Ｐ０１７３２）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ａａ  ２１４〜２５５、ＵｎｉＰｒｏｔ配列番号Ｑ０７０１１）トランス活性化ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７、ａａ  ５２〜１６３、参照配列番号：ＮＰ＿０００７２５．１．）と結合させることによって、作製した。Ｔ細胞膜へのＣＡＲの輸送を促進するために、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体アルファサブユニットからのリーダー配列を、すべてのコンストラクトに含めた。ＣＡＲコンストラクトの配列は、コドン最適化して、第３世代レンチウイルスプラスミドバックボーン中にクローニングした（Ｌｅｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。
【０２６９】
初代Ｔ細胞の精製および形質導入
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の免疫磁気ビーズ選択を製造元のプロトコールのとおりに使用して（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）、健康な志願者からのヒト初代Ｔ細胞を全血またはバフィーコート（民間供給元から購入、ドナーの同意を書面で得てある）から精製した。２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地中において、Ｔ細胞を密度０．３〜２×１０６個／ｍｌにて培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８  ＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ  Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて活性化して、２日目に、ＣＡＲコンストラクトをコードするレンチウイルスベクターを用いて、１０μｇ／ｍｌプロタミン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下において一晩かけて形質導入し、３日目に培地を交換した。２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地中において培養物を繁殖させてから、８〜１２日目に回収した。
【０２７０】
（ｄ）免疫性エフェクターアッセイ（ＣＴＬおよびサイトカイン）
細胞介在性の細胞毒性を調べるために（ＣＴＬアッセイ）、ホタルルシフェラーゼを安定的に形質導入した標的細胞５，０００個を、多様なエフェクター標的比（Ｅ：Ｔ）にてＣＡＲ  Ｔ細胞と組み合わせて、一晩インキュベートした。ＳｔｅａｄｙＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を各ウェルに添加し、得られた発光を、ＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で分析し、１秒あたりのカウントとして記録した（試料ＣＰＳ）。標的のみのウェル（最大ＣＰＳ）と、標的のみのウェルに１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したもの（最小ＣＰＳ）とを使用して、アッセイ範囲を決定した。特異的溶解の割合を、（１−（試料ＣＰＳ−最小ＣＰＳ）／（最大ＣＰＳ−最小ＣＰＳ））として計算した。Ｅ：Ｔ比１０にてエフェクターおよび腫瘍細胞株を同時インキュベーションした後で回収した上清に対して、サイトカイン放出アッセイを行なった。サイトカインＩＦＮｇ、続いてＩＬ−２を、ＥＬＩＳＡによって３通りで測定した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）。
【０２７１】
フローサイトメトリー分析
細胞の染色にあたり、ＣＡＲ  Ｔを形質導入した細胞５０万個を培養物から回収して、０．５％ウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を添加した冷ＡｕｔｏＭＡＣＳバッファー中において２回洗浄し、ＲＯＲ１−Ｆｃペプチド（Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、続いて抗Ｆｃ−ＡＦ６４７結合体で染色することによって、ＣＡＲ表面発現を検出した（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）。非形質導入細胞をネガティブコントロールとして使用した。すべての研究において、７ＡＡＤ染色によって死細胞を除外した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。細胞を２回洗浄し、２００μｌの染色バッファー中に再懸濁した後、フローサイトメトリーによって定量分析した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）１０  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してフローサイトメトリー分析を行ない、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用してデータプロットを生成した。
【０２７２】
結果：
ＧＭＣＳＦＲに由来するリーダーペプチド、抗ヒトＲＯＲ１  ＳｃＦｖ、ＣＤ８またはＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｒｙ）ドメイン、およびＣＤ３ｚ活性化ドメインの配列をフレーム中で組み合わせることによって、ＲＯＲ１腫瘍抗原を標的とする完全ヒトＣＡＲ  Ｔコンストラクトを設計した。このＣＡＲ  Ｔコンストラクトの概略図、ならびに設計したコンストラクトおよび各ＳｃＦｖ標的ドメインのリストが提供される（図１および表１）。同一条件下において増殖させた非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、コントロールとして含めた。
【０２７３】
すべての試験ＣＡＲコンストラクトおよびコントロールＣＡＲコンストラクトを、ヒトＥｆ１−アルファプロモーターの制御下においてＬＶバックボーン発現ベクター中にクローニングし、これを使用して、標準的な４プラスミド系を用いての２９３細胞中へのトランスフェクションによって、レンチウイルスベクター粒子を作製した。活性化させたヒト初代Ｔ細胞を、ＣＡＲ試験コンストラクトまたはコントロールをコードするＬＶ上清で形質導入し、培養８〜１０日目まで増殖させた。フローサイトメトリー分析において、組換えのＲＯＲ１−Ｆｃ融合タンパク質、続いて抗Ｆｃ  ＡＰＣを使用して、すべての試験ＣＡＲコンストラクトが、形質導入したヒトＴ細胞における表面発現を示した（図３）。
【０２７４】
【表２】
2021502070.tif 000004
【０２７５】
抗ＲＯＲ１キメラ抗原受容体を形質導入したＴ細胞は、サイトカイン発現および細胞溶解活性を示す。
【０２７６】
ＣＡＲ  Ｔの細胞毒性機能を評価するために、培養８〜１０日目に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＲＯＲ１＋マントル細胞リンパ腫Ｊｅｋｏ−１、ＲＯＲ１＋類表皮癌Ａ４３１、またはＲＯＲ１−  Ｒｅｈ白血病細胞と、Ｅ：Ｔ比４０：１、２０：１、または１０：１にて組み合わせた（図３）。抗ＲＯＲ１  ｓｃＦｖ  Ｒ１２（参照  ９）に基づくポジティブコントロールＣＡＲコンストラクトＬＴＧ１９４３、および、ＧＦＰ（１３９８）をコードするレンチウイルスベクターが形質導入されたネガティブコントロールＴ細胞または非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を、比較のために含めた。示されたすべてのコンストラクト（ＬＴＧ１９４１〜１９４３）が、用量依存性のＲＯＲ１特異的腫瘍死滅を示した。ＲＯＲ１＋腫瘍株に対する最大の細胞毒性（Ｊｅｋｏ−１  ＲＯＲ１＋細胞においてＥ：Ｔ比４０：１にて８０％）は、ＣＡＲコンストラクトＬＴＧ１９４２によって示され、その腫瘍死滅程度は、Ｒ１２  抗ＲＯＲ１  ｓｃＦｖ（参照  ９）に基づく、コントロールＣＡＲコンストラクトＬＴＧ１９４３と同等であった。ＣＡＲコンストラクトＬＴＧ１９４１も、ＲＯＲ１＋腫瘍株に対して、比較的小さくはあるが細胞毒性を示し、Ｊｅｋｏ−１細胞に対して、Ｅ：Ｔ比４０：１における特異的溶解が最大の４０％であった。ＣＡＲ  Ｔ介在性溶解に対する感受性が比較的低いＡ４３１株において、ＣＡＲ  ＬＴＧ１９４１は有効ではなかったが、ＣＡＲ  ＬＴＧ１９４２はポジティブコントロールＣＡＲ  ＬＴＧ１９４３と同等またはこれよりも有効であった。
【０２７７】
次いで、ＲＯＲ１陽性およびＲＯＲ１陰性腫瘍細胞株によって誘発した際に、ＲＯＲ１  ＣＡＲコンストラクトが形質導入されたＣＡＲ  Ｔ細胞により分泌された炎症性サイトカインＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、およびＩＬ−２の濃度を測定した（図４）。サイトカイン産生の基礎レベルを調べる目的で、各コンストラクトにＣＡＲ  Ｔ細胞単独を含めた。ＧＦＰ（ＬＴＧ１３９８）が形質導入されたＴ細胞をネガティブコントロールとして含めた。ＲＯＲ１＋  Ｊｅｋｏ−１、またはＡ４３１株によって誘発した際に、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、およびＩＬ−２のレベルがＣＡＲ  Ｔ細胞コンストラクトＬＴＧ１９４２およびポジティブコントロールＬＴＧ１４９３によって強く誘発され、これよりも低い程度でＣＡＲ  ＬＴＧ１４９１によっても誘発されたが、ＲＯＲ１−  Ｒｅｈコントロール株の場合には誘発されなかった。ネガティブコントロールのＧＦＰまたはＵＴＤ群ではサイトカインの誘発はみられなかった。とりわけ、ＬＴＧ１９４１のサイトカイン産生レベルは非常に低く、このことは、このベクターを発現するＴ細胞を活性化する能力が異なっていることを示す。このことは、ＬＴＧ１９４１とＬＴＧ１９４２との比較において、Ｊｅｋｏ細胞株に対する細胞溶解レベルがより低いが、Ａ４３１に対してはそうではないことに対応した。このことは、まず第１に、バインダを特定するだけでは、このバインダを配列中に含むＣＡＲの真の活性を調べるのに十分でないことを示す。重要なことに、こうした差異は非常に重要である可能性があり、所望の標的抗原密度に応じてＣＡＲの活性を調節できる可能性がある。腫瘍標的を溶解できる能力は、Ｔ細胞表面におけるＣＡＲ発現レベルと、標的腫瘍細胞表面上における腫瘍抗原の標的発現レベルとの両方に、複雑に関与している（Ｗａｌｋｅｒ，Ａ．ら，２０１７，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２５：２１８９−２２０１）。したがって、たとえばＬＴＧ１４９２によって、正常Ｔ細胞上におけるＲＯＲ１の発現がＣＡＲ−Ｔ活性を誘発するのであれば、正常組織上における低い発現レベルに対して、がんを識別して標的とするために、ＬＴＧ１９４１のようなコンストラクトを使用できる可能性がある。さらに、いずれのコンストラクトも、腫瘍細胞標的の非存在下において、ベースラインを超えるサイトカイン産生を示さなかった。このことは、いくつかのＣＡＲコンストラクトについて以前に報告されたような自動活性化というものは存在しないということの重要な実証である（Ｌｏｎｇ，Ａ．Ｈ．ら，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２０：５８１−５９０）。以上より、ＣＡＲ  ＴコンストラクトＬＴＧ１９４１、ＬＴＧ１９４２、およびＬＴＧ１９４３は、モデル腫瘍細胞株において発現させたＲＯＲ１腫瘍抗原に対して特異的であった。
【０２７８】
総合すると、ＣＡＲ  ＬＴＧ１９４２およびＬＴＧ１９４１は、腫瘍溶解活性、および、ＲＯＲ１＋腫瘍に応答したサイトカイン合成として現れる、機能的特異性を示した。したがって、本願中に記載されるコンストラクトは、臨床用途において有望な候補である。
【０２７９】
本文中に引用された各出願および特許、ならびに各出願および特許中に引用された各文献または先行技術文献（訴訟中の各発行済特許「出願引用文献」を含む）、ならびに当該出願および特許のいずれかに対応するおよび／またはその優先権を主張する各ＰＣＴ出願または特許および外国出願または特許、ならびに各出願引用文献中に引用または参照された各文献を、引用により明白に本明細書に援用し、これらは本発明の実施において使用されてよい。より一般的には、文献または先行技術文献は本文中、請求項の前の先行技術文献一覧、または本文自体のいずれかにおいて引用され、当該文献または先行技術文献の各々（「本明細書中引用先行技術文献」）、および各本明細書中引用先行技術文献中に引用された各文献または先行技術文献（製造元の規格、説明書などを含む）を、引用により明白に本明細書に援用する。
【０２８０】
いくつかの具体的な実施形態についての上述される記載は、他者が最新の知識の適用により、一般的概念から逸脱することなく、多様な用途のために当該具体的な実施形態を容易に変更または適合させるのに十分な情報を提供するものであり、したがって、このような適合および変更は、当該開示される実施形態の等価物の意味および範囲内であると理解されるべきである。本明細書中において使用される語句または専門用語は説明目的であって限定目的でないことが理解される。図面および記載中、例示的な実施形態が開示されており、特定の用語が使用されている可能性があるが、これらは、特記しない限り、一般的かつ説明目的のみで使用されており、限定を目的するものではないため、これによって請求項の範囲が限定されるものではない。また、当業者には、本明細書中に開示される方法の特定の工程を別の順序で実施してよいこと、または工程を組み合わせてよいことが理解される。したがって、本明細書中に開示される具体的な実施形態に付属の請求項が限定されないことが意図される。当業者には、本明細書中に記載される本発明に係る実施形態の多くの等価物が認識され得る、または常套的な実験法のみを使用して把握できる。かかる等価物は、下記請求項に包含される。
【０２８１】
本開示に係る配列
以下に列記される核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で規定されるように、ヌクレオチド塩基の標準的な文字省略およびアミノ酸の３文字コードを使用して示される。各核酸配列について一方の鎖のみが示されるが、示された鎖に言及する場合にはその相補鎖が含まれることが理解される。付属の配列表において：
配列番号１  抗ＲＯＲ１バインダ：ＳｃＦＶ４  のヌクレオチド配列
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＧＡＧＴＡＴＣＴＡＴＴＡＴＡＧＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＡＣＣＣＧＴＡＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＧＡＡＣＡＡＣＡＴＴＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＧＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＴＡＧＣＡＧＣＡＡＴＣＣＣＧＴＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＴＴＡ
配列番号２  抗ＲＯＲ１バインダ：ＳｃＦＶ４  のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＰＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＬＧＧＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＦＣＱＳＹＤＳＳＮＰＶＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬ
配列番号３  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＬＴＧ１９４１（ＬＰ−ＳｃＦＶ４−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
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配列番号４  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＡＡ  ＳＥＱ  ＬＴＧ１９４１（ＬＰ−ＳｃＦＶ４−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＰＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＬＧＧＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＦＣＱＳＹＤＳＳＮＰＶＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬＡＡＡＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号５  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＬＴＧ２５２８（ＬＰ−ＳｃＦＶ４−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＡＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＴＡＣＣＧＴＡＴＣＡＧＧＡＧＧＧＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣＣＴＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣＣＡＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＧＧＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴＡＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＡＣＡＴＡＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧＴＣＡＴＴＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＡＣＧＡＴＴＣＣＧＧＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＡＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＡＣＣＴＣＧＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＴＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＴＴＧＣＣＣＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＧＣＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＧＧＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＴＧＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＴＡＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＴＡＧＣＡＡＴＴＣＡＧＧＧＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＴＡＴＴＡＧＣＧＧＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＴＴＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＡＧＴＡＡＣＣＣＡＧＴＣＧＴＧＴＴＣＧＧＧＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＡＧＴＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧ
配列番号６  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＡＡ  ＳＥＱ  ＬＴＧ２５２８（ＬＰ−ＳｃＦＶ４−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳＳＳＳＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＹＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＰＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＬＧＧＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＦＣＱＳＹＤＳＳＮＰＶＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬＡＡＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号７  抗ＲＯＲ１バインダ：ＳｃＦＶ９  のヌクレオチド配列
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配列番号８  抗ＲＯＲ１バインダ：ＳｃＦＶ９  のアミノ酸配列
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配列番号９  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＬＴＧ１９４２（ＬＰ−ＳｃＦＶ９−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＴＴＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＣＣＡＴＣＧＣＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＴＡＣＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧ
配列番号１０  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＡＡ  ＳＥＱ  ＬＴＧ１９４２（ＬＰ−ＳｃＦＶ９−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
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配列番号１１  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＤＮＡ  ＳＥＱ  ＬＴＧ２５２９（ＬＰ−ＳｃＦＶ９−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＴＴＡＴＡＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＴＧＧＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧ
配列番号１２  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＡＡ  ＳＥＱ  ＬＴＧ２５２９（ＬＰ−ＳｃＦＶ９−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＱＡＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＲＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＳＹＮＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＦＭＬＴＱＰＨＳＶＳＥＳＰＧＫＴＶＴＩＳＣＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱＷＹＱＱＲＰＧＳＡＰＴＩＶＩＹＥＤＤＱＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＩＤＴＳＳＮＳＡＳＬＴＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＥＰＧＮＧＶＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＡＡＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号１３  コントロール抗ＲＯＲ１バインダのヌクレオチド配列：
ＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＴＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＴＣＡＧＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＧＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＡＣＴＡＴＡＴＡＣＣＣＧＴＣＡＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＴＡＣＴＡＣＧＣＧＡＣＴＴＧＧＧＴＡＡＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＴＡＣＧＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＴＡＣＧＣＴＧＡＴＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＡＣＧＣＴＣＧＴＡＡＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＧＴＡＡＧＣＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＧＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＡＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＣＴＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＧＣＧＧＣＡＣＴＣＡＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＡＧＧＧ
配列番号１４  コントロール抗ＲＯＲ１バインダのアミノ酸配列：
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配列番号１５  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＤＮＡ  ＳＥＱ  コントロールＬＴＧ１９４３（ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＴＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＴＣＡＧＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＧＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＡＣＴＡＴＡＴＡＣＣＣＧＴＣＡＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＴＡＣＴＡＣＧＣＧＡＣＴＴＧＧＧＴＡＡＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＴＡＣＧＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＴＡＣＧＣＴＧＡＴＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＡＣＧＣＴＣＧＴＡＡＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＧＴＡＡＧＣＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＧＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＡＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＣＴＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＧＣＧＧＣＡＣＴＣＡＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＣＣＡＴＣＧＣＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＴＡＣＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧ
配列番号１６  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＡＡ  ＳＥＱ  コントロールＬＴＧ１９４３（ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＣＤ８Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＱＥＱＬＶＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＧＳＬＴＬＳＣＫＡＳＧＦＤＦＳＡＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＴＩＹＰＳＳＧＫＴＹＹＡＴＷＶＮＧＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＴＡＡＤＲＡＴＹＦＣＡＲＤＳＹＡＤＤＧＡＬＦＮＩＷＧＰＧＴＬＶＴＩＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＬＶＬＴＱＳＰＳＶＳＡＡＬＧＳＰＡＫＩＴＣＴＬＳＳＡＨＫＴＤＴＩＤＷＹＱＱＬＱＧＥＡＰＲＹＬＭＱＶＱＳＤＧＳＹＴＫＲＰＧＶＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＡＤＲＹＬＩＩＰＳＶＱＡＤＤＥＡＤＹＹＣＧＡＤＹＩＧＧＹＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＴＧＡＡＡＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号１７  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＤＮＡ  ＳＥＱ  コントロールＬＴＧ２５２７（ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＧＡＧＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＣＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＴＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＧＧＴＴＣＧＡＴＴＴＣＡＧＴＧＣＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＧＧＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＡＣＴＡＴＡＴＡＣＣＣＧＴＣＡＴＣＣＧＧＣＡＡＧＡＣＴＴＡＣＴＡＣＧＣＧＡＣＴＴＧＧＧＴＡＡＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＴＡＣＧＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＴＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＴＣＴＴＡＣＧＣＴＧＡＴＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＡＴＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＡＣＧＣＴＣＧＴＡＡＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＴＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＧＴＡＡＧＣＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＧＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＣＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＡＧＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＡＴＡＴＣＴＣＡＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＧＡＧＴＴＡＴＡＣＴＡＡＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＣＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＡＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＴＡＧＧＴＧＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＧＧＧＣＧＧＣＡＣＴＣＡＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＡＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧ
配列番号１８  ＲＯＲ１−ＣＡＲ  ＡＡ  ＳＥＱ  コントロールＬＴＧ２５２７（ＬＰ−コントロールＳｃＦｖ−ＩｇＧ４Ｈ／ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−ＣＤ３ゼータ）
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＱＥＱＬＶＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＧＳＬＴＬＳＣＫＡＳＧＦＤＦＳＡＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＴＩＹＰＳＳＧＫＴＹＹＡＴＷＶＮＧＲＦＴＩＳＳＤＮＡＱＮＴＶＤＬＱＭＮＳＬＴＡＡＤＲＡＴＹＦＣＡＲＤＳＹＡＤＤＧＡＬＦＮＩＷＧＰＧＴＬＶＴＩＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＬＶＬＴＱＳＰＳＶＳＡＡＬＧＳＰＡＫＩＴＣＴＬＳＳＡＨＫＴＤＴＩＤＷＹＱＱＬＱＧＥＡＰＲＹＬＭＱＶＱＳＤＧＳＹＴＫＲＰＧＶＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＡＤＲＹＬＩＩＰＳＶＱＡＤＤＥＡＤＹＹＣＧＡＤＹＩＧＧＹＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＴＧＡＡＡＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号１９  リーダー／シグナルペプチド配列（ＬＰ）のヌクレオチド配列
ＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＡＡＣＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＣＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＧ
配列番号２０  リーダー／シグナルペプチド配列（ＬＰ）のアミノ酸配列
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ
配列番号２１  ＤＮＡ  ＣＤ８膜貫通ドメインのヌクレオチド配列
ＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣ
配列番号２２  ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列
ＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
配列番号２３  ＤＮＡ  ＣＤ８ヒンジドメインのヌクレオチド配列
ＡＣＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＣＣＡＴＣＧＣＡＡＧＣＣＡＡＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＧＴＧＣＡＴＡＣＣＣＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＴＡＣ
配列番号２４  ＣＤ８ヒンジドメインのアミノ酸配列
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹ
配列番号２５  ＣＤ８アルファのアミノ酸番号１３７〜２０６のヒンジおよび膜貫通領域のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿＿００１７５９．３）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
配列番号２６  ４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列
ＡＡＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＡＴＧＣＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＧＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＡＴＧＣＧＡＡＣＴＧ
配列番号２７  ４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
配列番号２８  ＣＤ３−ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列
ＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧ
配列番号２９  ＣＤ３−ゼータのアミノ酸配列
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号３０  ＣＤ３−ゼータの細胞内シグナル伝達ドメイン、バリアント、のヌクレオチド配列
ＣＧＣＧＴＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＡＴＡＴＡＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧ
配列番号３１  ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン、バリアント、のアミノ酸配列
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号３２  ＳｃＦＶ  ＣＤ１９（ＦＭＣ６３）のヌクレオチド配列
ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＣＣＡＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＣＣＧＣＧＴＣＡＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＧＴＧＴＣＧＣＧＣＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＡＣＧＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＧＧＧＡＡＣＣＧＡＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＡＴＣＡＣＴＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＴＣＧＧＧＡＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＣＡＴＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＣＴＣＧＡＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＣＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＡＧＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＴＴＣＧＧＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＡＡＧＣ
配列番号３３  ＳｃＦＶ  ＣＤ１９（ＦＭＣ６３）のアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号３４  抗ＣＤ３３  ＳｃＦＶ（ＬＴＧ１９３６）のヌクレオチド配列
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＡＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＣＴＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＴＡＣＧＧＧＧＧＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＡＣＣＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＡＡ
配列番号３５  抗ＣＤ３３  ＳｃＦＶ（ＬＴＧ１９３６）のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＲＩＳＣＫＧＳＧＦＳＦＰＴＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＬＶＧＤＧＹＮＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＨＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＫＴＹＬＹＷＹＬＱＫＰＧＱＰＰＱＬＬＩＹＧＡＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＳＩＱＬＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
配列番号３６  抗メソテリンＳｃＦＶ（ＬＴＧ１９０４）のヌクレオチド配列
ＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＴＴＧＧＡＡＴＡＧＴＧＧＴＡＧＣＡＴＡＧＧＣＴＡＴＧＣＧＧＡＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴＣＧＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＣＣＴＴＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＡＡＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＡＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＣＴＧＧＴＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＣＧＧＴ
配列番号３７  抗メソテリンＳｃＦＶ（ＬＴＧ１９０４）のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＳＷＮＳＧＳＩＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＬＹＹＣＡＫＤＬＳＳＶＡＧＰＦＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＧＫＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲＤＳＳＧＮＨＬＶＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬＧ
配列番号３８  ＩｇＧ４Ｈ（ヒンジ）のヌクレオチド配列
ＧＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧ
配列番号３９  ＩｇＧ４Ｈ（ヒンジ）のアミノ酸配列
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号４０  ＣＤ８  ＴＭ（膜貫通）に結合したＩｇＧ４Ｈのヒンジドメインのヌクレオチド配列
ＧＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣ
配列番号４１  ＣＤ８  ＴＭ（膜貫通）に結合したＩｇＧ４Ｈのヒンジドメインのアミノ酸配列
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
【図１】
2021502070.tif 000005
【図２Ａ】
2021502070.tif 000006
【図２Ｂ】
2021502070.tif 000007
【図２Ｃ】
2021502070.tif 000008
【図２Ｄ】
2021502070.tif 000009
【図２Ｅ】
2021502070.tif 000010
【図２Ｆ】
2021502070.tif 000011
【図３】
2021502070.tif 000012
【図４】
2021502070.tif 000013
【図５】
2021502070.tif 000014
【配列表】
2021502070000001.app
【国際調査報告】
2021502070.tif 000015
2021502070.tif 000016