(57)【要約】  本発明は、養子細胞療法において有用なバイオマーカーに関する。対象となるバイオマーカーはＣＤ１５０であり、あるいはＳＬＡＭまたはＳＬＡＭＦ１と称される。本明細書において、本発明者らは、腫瘍浸潤リンパ球注入産物でのＣＤ１５０の発現が、そうした患者に見られる奏効率と相関することを実証する。完全奏効を有し続ける患者では高いＣＤ１５０発現が見出され、療法に応答しない患者では低い発現が見出される。本発明は、奏効率を予測するまたは治療のために患者を階層化するためのバイオマーカーの使用に関する。それは、一般的に、効力を増加させる目的での、Ｔ細胞集団における当該受容体の過剰発現、またはＣＤ１５０を発現する細胞の単離を含むがそれらに限定されない、養子細胞療法レジメンにおけるこの受容体の活用も網羅する。【選択図】図１
2021511079.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍反応性Ｔ細胞が富化された細胞集団を獲得するための方法であって、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞が選択され、且つ前記Ｔ細胞が増殖されてもよい、前記方法。
【請求項２】
ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞が、対象に由来する細胞から選択されるＴ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞を選択するステップが、（ｉ）フローサイトメトリー、（ｉｉ）抗体パンニング（panning）、（ｉｉｉ）磁気選択、（ｉｖ）バイオマーカー標的細胞富化のうちの１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ細胞を選択するステップが、細胞集団と抗ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１抗体とを接触させるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞が、以下の選択肢：
抗体もしくは共刺激受容体によって推進されるＴ細胞活性化シグナルおよび共刺激をもたらす、照射フィーダー細胞を用いての増殖、または
ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を通じて推進されるＴ細胞活性化シグナルおよび共刺激シグナルをもたらす、固定化試薬（immobilised reagent）もしくは可溶性試薬を用いての増殖
のうちの一方または両方によって増殖される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞集団が、
ｉ）腫瘍生検、リンパ節、もしくは腹水由来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団、ならびに／または
ｉｉ）ＣＡＲおよび／もしくはＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞の集団
から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法に従って獲得される、細胞の集団。
【請求項８】
Ｔ細胞を含み、且つＴ細胞の＞２５％、＞３０％、または＞４０％がＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現する、細胞の集団。
【請求項９】
細胞がＴＩＬ、好ましくは黒色腫に由来するＴＩＬである、請求項７または８に記載の細胞の集団。
【請求項１０】
ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１をコードする第１の外因性核酸を含む、Ｔ細胞。
【請求項１１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする第２の外因性核酸をさらに含む、請求項１０に記載のＴ細胞。
【請求項１２】
ＴＩＬである、請求項１０または１１に記載のＴ細胞。
【請求項１３】
癌、好ましくは黒色腫の治療において使用するための、請求項６〜９のいずれか１項に記載の細胞の集団、または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＴ細胞。
【請求項１４】
ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を含み、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞がメモリー細胞を含んでもよい、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法、請求項７〜９または請求項１３のいずれか１項に記載の細胞の集団。
【請求項１５】
養子細胞療法の方法であって、請求項７〜９もしくは請求項１３および１４のいずれか１項に記載の細胞の集団、または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＴ細胞を対象に投与するステップを含み、Ｔ細胞は自家（autologous）細胞または同種異系（allogenic）細胞である、前記方法。
【請求項１６】
対象における疾患を治療するための方法であって、請求項７〜９もしくは請求項１３および１４のいずれか１項に記載の細胞集団、または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＴ細胞を対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項１７】
疾患が癌、好ましくは黒色腫である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項７〜９もしくは請求項１３および１４のいずれか１項に記載の細胞の集団、または請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のＴ細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
癌、好ましくは黒色腫の治療において使用するための、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
細胞集団の腫瘍反応性を査定するための方法であって、細胞集団におけるＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現するＴ細胞の比率を定量するステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
細胞集団が、ｉ）患者由来のＴＩＬであり、ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現するＴ細胞が、ＲＥＰ前および／もしくはＲＥＰ後に定量されるか；或いはｉｉ）外因性ＣＡＲおよび／もしくはＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞の集団である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現するＴ細胞の比率が細胞集団の少なくとも２５％であることが、細胞集団が腫瘍反応性であることを示す、請求項２０または２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含めたＴ細胞を用いた治療後の癌の予後の分野に関する。予後は、腫瘍浸潤リンパ球を含めたＴ細胞によって発現される生物学的マーカーの定量に基づく。本発明は、ＴＩＬ療法を含めたＴ細胞療法の治療効力を増強するための生物学的マーカーの活用および／または取り扱いにも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌退縮を媒介する自家Ｔ細胞を使用する養子細胞療法（ＡＣＴ）は、初期臨床試験においてかなり有望であることを示している。エクスビボで増殖させた、天然に存在する腫瘍反応性または腫瘍浸潤性リンパ球／腫瘍関連リンパ球（ＴＩＬ）の使用など、いくつかの一般的手法が取られている。加えて、Ｔ細胞を遺伝子改変して、それらを規定の腫瘍抗原に再標的化させ得る。これは、ペプチド（ｐ）−主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；または、腫瘍特異的一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）とＴ細胞シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）との間の合成融合体、の遺伝子移入により達成され得、後者はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称される。ＴＩＬおよびＴＣＲ移入は、黒色腫を標的にする場合に特に有効であることを証明しており（Rosenberg et al., 2011; Morgan et al., 2006）、一方でＣＡＲ療法は、ある特定のＢ細胞悪性腫瘍の治療においてかなり有望であることを示している（Grupp et al., 2013）。
腫瘍浸潤リンパ球療法は、胃癌（Xu et al., 1995）、腎癌（Figlin et al., 1997; Goedegebuure et al., 1995）、子宮頸癌（Stevanovic et al., 2015）、および結腸直腸癌（Gardini et al., 2004）を含めたいくつかの異なる悪性腫瘍に適用されているが、黒色腫療法において最も広く適用されており、最も大きな進展および有望さを示している。進行性転移性黒色腫における試験は、１５〜２０％の完全奏効（治癒）を有して５０％前後の奏効率を一貫して示している（Rosenberg et al., 2011; Dudley et al., 2010）。加えて、腫瘍関連リンパ球は腹水から獲得され得、ＴＩＬと同じ様式で成長し得る。
【０００３】
ＴＩＬ産生の工程は、遺伝子改変されたＴ細胞と比較して、より低いコストおよび向上した技術革新を付与するが、しかしながら、工程はより労力を要し、成長を最適化するためにより高い程度のユーザー技能を要する。現在の方法論において、腫瘍生検は患者から採取され、研究室環境に移送される。ＴＩＬ産生の２つの選択肢がある：ｉ）腫瘍をおよそ１〜２ｍｍ3の小さなフラグメントに切り、２４ウェル組織培養プレートの個々のウェルに播種する；またはｉｉ）腫瘍を酵素的に消化し、結果として生じた単細胞懸濁液を２４ウェル組織培養プレートにおいて培養する。両方の場合において、次いで、ＴＩＬを＞３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２とともに２〜３週間培養し、その後それらは、照射フィーダー細胞との２週間の増殖を受けて、注入のための概して＞１×１０10個細胞を獲得する。増殖段階の間、患者は、条件付け化学療法（典型的には、シクロホスファミドおよびフルダラビン）を受け、細胞の注入があり次第、ＴＩＬ生着を増強する支持的ＩＬ−２治療を受ける。
【０００４】
どの治療的介入を用いても、混合した患者応答があり、治療の改良の一環として、目標は次いで、どの患者が、与えられた治療からの明確な恩恵を示すかを判定することである。免疫治療法は例外ではなく、古典的な例として、治療前平均赤血球ヘモグロビン濃度は、ＴｒｏＶａｘワクチン接種の転帰を予測することが示されており（Harrop et al., 2012）、ＰＤＬ１発現は、抗ＰＤ１療法を用いた治療からのより多くの恩恵を示す患者を規定するために使用されている（Topalian et al. 2012）。黒色腫におけるＴＩＬ療法は５０％前後の奏効率を有することから、特にＴＩＬと並行して使用される作用物質が潜在的に非常に有毒であるとき（ＩＬ−２および条件付け化学療法）、治療から最も恩恵を受けるであろうそうした患者を予測し得るマーカーを見出すことは有益であろう。この目的のために、エフェクターメモリーＴ細胞に富んだＴＩＬ産物は、より良好な患者応答を示すことが示唆されている（Radvanyi et al., 2015）。さらに、ＴＩＬにおけるＢＴＬＡ発現は、ＴＩＬ注入後の良好な予後と相関している（Radvanyi et al., 2012; Haymaker et al., 2015）。
【０００５】
本明細書において提供される本発明は、注入後の治療の成功と相関し、したがって予後のマーカーとして使用され得るであろう細胞表面マーカーに関する。その理由は、このマーカーを発現するＴＩＬ集団は、それらが臨床的奏効率の向上と関連することから腫瘍反応性の増加を示すように思われるためである。
本発明は、どのようにこの受容体を活用して、ＴＩＬ療法、および遺伝子改変されたＴ細胞を利用する療法を含めた他のＴ細胞療法を向上させ得るかも記載する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＴＩＬ製造工程の図である。現在、ＴＩＬ療法は、２つの別個の場に大いに依存している。臨床の場において、腫瘍を切除し、第２の場（製造の場）に送り、そこで腫瘍を解離し、プレートにおいてＩＬ−２を使用してＴ細胞を成長させる。およそ２週間後、細胞を急速増殖プロトコール（ＲＥＰ）に投入して、細胞を数が＞１×１０10個まで成長させる。ＲＥＰの間、患者は条件付け化学療法を受ける。ＲＥＰ後、ＴＩＬ最終産物を、再注入されたＴ細胞を支持する静脈内ＩＬ−２とともに患者に戻す。
【図２】ＳＬＡＭ測定のための例示的なフローサイトメトリー染色ゲートストラテジーである。ＲＥＰ前または後  ＴＩＬを以下の抗体：Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０、αＣＤ４５ＲＯ  ＦＩＴＣ、αＣＤ８  ＰＥ  Ｖｉｏ７７０、αＣＤ４  ＡＰＣ  Ｃｙ７、αＣＤ６２Ｌ  ＡＰＣで染色し、次いでｍＩｇＧ１  ＰＥおよびαＳＬＡＭ  ＰＥのいずれかのペアで対比染色した。細胞をＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー上に取得した。示されるゲートストラテジーを使用し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙソフトウェアを使用して解析を実施した。
【図３ａ】急速増殖プロトコール（ＲＥＰ）前および後のＴＩＬにおけるＳＬＡＭ／ＣＤ１５０の発現のグラフである。ＲＥＰ後  ＴＩＬを以下のもの：Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０、αＣＤ４５ＲＯ  ＦＩＴＣ、αＣＤ８  ＰＥ  Ｖｉｏ７７０、αＣＤ４  ＡＰＣ  Ｃｙ７、αＣＤ６２Ｌ  ＡＰＣで染色し、次いでｍＩｇＧ１  ＰＥまたはαＳＬＡＭ  ＰＥのいずれかで対比染色した。細胞をＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー上に取得した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙソフトウェアを使用して解析を実施した。ＳＬＡＭ+細胞の比率を各ＣＤ４＋またはＣＤ８＋集団において判定し、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してプロットした。３つすべてのグラフに関して、患者は臨床応答（進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、安定（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、および応答者）によって階層化され、表示される奏効率は、固形腫瘍（ＲＥＣＩＳＴｖ１．１）測定における応答評価基準によって判定される、患者によって達成される最良の応答である（Schwartz et al. Eur J Cancer 2016を参照されたい）*Ｐ＜０．０５。示される３つすべてのグラフに関して、平均±ＳＥＭが各細胞および患者サブタイプに対してプロットされている。有意性は、２元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くシダック多重比較検定を使用して判定されている。上のグラフ（最終産物（ＣＤ４＋））に関して、メモリー：ＰＤ対Ｒ、**ｐ＝０．００９。下のグラフ（最終産物）に関して、ＣＤ４：ＰＤ対ＳＤ、*ｐ＝０．０３７；ＰＤ対Ｒ、**ｐ＝０．００４；ＣＤ８：ＰＤ対Ｒ、**ｐ＝０．００８。
【図３ｂ】急速増殖プロトコール（ＲＥＰ）前および後のＴＩＬにおけるＳＬＡＭ／ＣＤ１５０の発現のグラフである。ＲＥＰ後  ＴＩＬを以下のもの：Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０、αＣＤ４５ＲＯ  ＦＩＴＣ、αＣＤ８  ＰＥ  Ｖｉｏ７７０、αＣＤ４  ＡＰＣ  Ｃｙ７、αＣＤ６２Ｌ  ＡＰＣで染色し、次いでｍＩｇＧ１  ＰＥおよびｍＩｇＧ１  ｅＦｌｕｏｒ  ７１０アイソタイプ対照またはαＳＬＡＭ  ＰＥおよびαＧＩＴＲ  ｅＦｌｕｏｒ  ７１０のいずれかのペアで対比染色した。細胞をＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー上に取得した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙソフトウェアを使用して解析を実施した。ＳＬＡＭ＋細胞の比率を各ＣＤ４＋またはＣＤ８＋集団において判定し、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用してプロットした。（Ａ〜Ｃ）すべての黒色腫サブタイプ由来のＲＥＰ前およびＲＥＰ後  ＴＩＬにおけるＳＬＡＭ発現；Ａ）すべてのＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＳＬＡＭ発現；Ｂ）ナイーブ［Ｎ］、メモリー［Ｍ］、およびエフェクター［Ｅ］ＣＤ４＋  ＴＩＬにおけるＳＬＡＭ発現；Ｃ）ナイーブ［Ｎ］、メモリー［Ｍ］、およびエフェクター［Ｅ］ＣＤ８＋  ＴＩＬにおけるＳＬＡＭ発現；（Ｄ〜Ｆ）臨床応答によって階層化された皮膚黒色腫患者由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＴＩＬにおけるＳＬＡＭ発現；Ｄ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＴＩＬでのＳＬＡＭ発現；Ｅ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞サブセットにおけるＳＬＡＭ発現；ならびにＦ）ＣＤ８＋サブセットにおけるＳＬＡＭ発現。黒い丸＝進行、白い三角＝安定、白い四角＝応答者。表示される奏効率は、固形腫瘍（ＲＥＣＩＳＴｖ１．１）測定における応答評価基準によって判定される、患者によって達成される最良の応答である（Schwartz et al. Eur J Cancer 2016を参照されたい）*Ｐ＜０．０５。
【図４】ＳＬＡＭ発現に相関する患者のカプラン−マイヤー生存曲線である。患者の全体的な生存期間が２つの群に関してプロットされている：第１のグラフ（Ａ）において、ＳＬＡＭ高治療（２５％を上回るＳＬＡＭ陽性ＣＤ４  Ｔ細胞を有する患者）、およびＳＬＡＭ低治療（２５％未満のＳＬＡＭ陽性Ｔ細胞を有する患者）；ならびに第２のグラフ（Ｂ）において、ＳＬＡＭ高治療（４０％を上回るＳＬＡＭ陽性ＣＤ４  Ｔ細胞を有する患者）、およびＳＬＡＭ低治療（４０％未満のＳＬＡＭ陽性Ｔ細胞を有する患者）。
【図５Ａ】ＳＬＡＭ選別細胞における生存能およびサイトカイン応答のグラフである。２つのドナー最終産物由来のＴＩＬであるＴＩＬ０３２およびＴＩＬ０５４を、ＳＬＡＭ高およびＳＬＡＭ低集団についてフロー選別した。培養の２４時間後、生存能を査定し（Ａ）、細胞を、それらそれぞれの整合する自家腫瘍細胞株と混合し、サイトカイン応答をフローサイトメトリーを使用して測定した（Ｂ）。
【図５Ｂ】ＳＬＡＭ選別細胞における生存能およびサイトカイン応答のグラフである。２つのドナー最終産物由来のＴＩＬであるＴＩＬ０３２およびＴＩＬ０５４を、ＳＬＡＭ高およびＳＬＡＭ低集団についてフロー選別した。培養の２４時間後、生存能を査定し（Ａ）、細胞を、それらそれぞれの整合する自家腫瘍細胞株と混合し、サイトカイン応答をフローサイトメトリーを使用して測定した（Ｂ）。
【図６Ａ】ＳＬＡＭ  ｓｉＲＮＡのグラフである。ＳＬＡＭＦ１  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）での７６時間の処理後のＲａｊｉ、結腸直腸ＴＩＬ（ＭＲＩＢＢ０１１）、および黒色腫ＴＩＬ（ＴＩＬ０３２）、または未処理細胞（対照）において、ＳＬＡＭＦ１をｑＰＣＲ（Ａ）またはフローサイトメトリー（Ｂ）によって測定した。
【図６Ｂ】ＳＬＡＭ  ｓｉＲＮＡのグラフである。ＳＬＡＭＦ１  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）での７６時間の処理後のＲａｊｉ、結腸直腸ＴＩＬ（ＭＲＩＢＢ０１１）、および黒色腫ＴＩＬ（ＴＩＬ０３２）、または未処理細胞（対照）において、ＳＬＡＭＦ１をｑＰＣＲ（Ａ）またはフローサイトメトリー（Ｂ）によって測定した。
【図７】ＳＬＡＭ過剰発現のグラフである。ＥＦ１αプロモーターの下流に、ヒトＳＬＡＭＦ１配列、２Ａ切断配列、およびヒト細胞質ドメインを切り取ったＣＤ１９配列をクローニングすることによって、ＳＬＡＭ発現カセットを創出した（Ａ）。Ｊｕｒｋａｔ  ＪＲＴ３−Ｔ３．５細胞に、ＳＬＡＭＦ１および切り取られたＣＤ１９遺伝子を含有する滴定濃度のレンチウイルス粒子を形質導入し、発現をフローサイトメトリーによって解析した（Ｂ）。
【発明の概要】
【０００７】
（発明の態様の概要）
本発明者らは、細胞表面マーカー：シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＳＬＡＭファミリーメンバー１／ＣＤ１５０／ＣＤｗ１５０／ＩＰＯ−３；ヒトアミノ酸配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３０２８．１を参照されたい）を同定し、それはＴ細胞注入（ＴＩＬ注入）後の治療の成功と相関し、したがって前記マーカーは、Ｔ細胞（ＴＩＬ）が腫瘍反応性である可能性があることを示す。現在のところ、どんなメカニズムによってこの腫瘍反応性の増加が生じるのかは不明であり、例えばそれは、ＳＬＡＭ発現集団における腫瘍細胞殺傷の増強によるものであり得、ならびに／または例えばＳＬＡＭ発現は、腫瘍微小環境における細胞の生存および持続性を向上させ得る。本発明は、どのようにこの受容体を活用して、ＴＩＬ療法、および遺伝子改変されたＴ細胞を利用する療法を含めた、Ｔ細胞を使用する他の癌療法を向上させ得るかに関する。
第１の態様において、腫瘍反応性Ｔ細胞が富化されたＴ細胞集団などの細胞集団を獲得するための方法であって、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞が選択され、任意に増殖される、方法が本明細書において提供される。ゆえに、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現する細胞が、Ｔ細胞集団（例えば、遺伝子改変されたＴ細胞）またはごく一部の他の細胞タイプを含むＴ細胞集団（例えば、ＴＩＬ集団）など、細胞のバルク集団から選択され得る。
【０００８】
ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞は、患者に由来する細胞（例えば、腫瘍生検、リンパ節、腹水由来のＴＩＬ細胞）から選択され得る。実施形態において、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞を選択するステップは、（ｉ）フローサイトメトリー、（ｉｉ）抗体パンニング(panning)、（ｉｉｉ）磁気選択、（ｉｖ）バイオマーカー標的細胞富化のうちの１つまたは複数を含む。選択は、細胞集団と抗ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１抗体とを接触させるステップを含み得る。選択された細胞を、次いで分離しおよび増殖させて、集団に存在するＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１陽性（＋ｖｅ）細胞の数を富化し得る。
【０００９】
本明細書において提供される実施形態において、生物学的マーカーＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴＩＬは、以下の選択肢：
ａ．抗体もしくは共刺激受容体によって推進されるＴ細胞活性化シグナルおよび共刺激を提供する、照射フィーダー細胞との増殖；ならびに／または
ｂ．前記１つもしくは複数の生物学的マーカーを通じて推進されるＴ細胞活性化シグナルおよび共刺激シグナルを提供する、固定化試薬（immobilised reagent）もしくは可溶性試薬との増殖
のうちの一方または両方によって増殖される。
本明細書において提供される実施形態において、細胞集団は、ｉ）腫瘍生検、リンパ節、もしくは腹水由来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団；ならびに／またはｉｉ）遺伝子改変されたＴ細胞、例えばＣＡＲおよび／もしくはＴＣＲおよび／もしくは他の外因性核酸を発現するように操作されたＴ細胞の集団、から選択される。
本発明の別の態様において、本明細書において提供される方法のいずれかに従って獲得された、腫瘍反応性Ｔ細胞が富化された細胞の集団が本明細書において提供される。
そのような集団は、ＴＩＬ集団または遺伝子改変されたＴ細胞の集団から始まり、選択され、任意に、例えば本明細書において提供される方法のいずれかを使用して、その集団におけるＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１陽性（＋ｖｅ）細胞が富化することによって獲得された可能性がある。
【００１０】
腫瘍反応性Ｔ細胞（ＴＩＬまたは遺伝子改変されたＴ細胞など）が富化された細胞の集団であって、Ｔ細胞もしくはＴＩＬの＞２５％は生物学的マーカーＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現する、またはＴ細胞もしくはＴＩＬの＞３０％、＞３５％、もしくは＞４０％は生物学的マーカーＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現する集団も本明細書において提供される。
実施形態において、生物学的マーカーＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１が富化されたＴＩＬの集団が本明細書において提供される。１つの実施形態において、生物学的マーカーＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１が富化されたＴＩＬの集団は、本明細書において記載される方法に従って獲得される。一部の実施形態において、ＴＩＬは黒色腫に由来し得る。
【００１１】
Ｔ細胞（ＴＩＬ集団から獲得されたＴ細胞を含む）は、外因性核酸からＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するまたは過剰発現するように操作され得る。そのような様式でＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するまたは過剰発現することは、操作されたＴ細胞の腫瘍反応性を増加させ得る。１つの実施形態において、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１をコードする第１の外因性核酸を含むＴ細胞が本明細書において提供される。Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／または他のタンパク質をコードする第２の外因性核酸をさらに含み得る。
適切には、Ｔ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞である。一部の実施形態において、Ｔ細胞はメモリー細胞である。
【００１２】
本発明の別の態様において、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴＩＬまたは遺伝子改変されたＴ細胞などのＴ細胞を対象に投与するステップを含む、対象における疾患を治療する方法が本明細書において提供される。ＴＩＬは、対象に由来する細胞の選択および増殖によってＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１が富化されたＴＩＬの集団であり得る、またはＴＩＬは、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するように操作されているＴＩＬもしくは他のＴ細胞であり得る。対象は、典型的にはヒトである。治療する方法は、適切には養子細胞療法であり；Ｔ細胞は自家（autologous）または同種異系（allogenic）であり得る。疾患は、適切には癌、例えば黒色腫、または卵巣癌もしくは子宮頸癌である。
薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤、ならびに任意に１種または複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物と一緒に、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するように操作されたＴ細胞を含めた、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現する腫瘍反応性Ｔ細胞が富化された細胞の集団を含む、静脈内注入に適した医薬組成物も本明細書において提供される。
【００１３】
細胞集団の腫瘍反応性を査定するための方法であって、細胞集団においてＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現しているＴ細胞を定量するステップを含む、方法も、本明細書において提供される。適切には、細胞集団は、ｉ）患者由来のＴＩＬであり得、ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現するＴ細胞は、ＲＥＰ前および／もしくはＲＥＰ後に定量される；またはｉｉ）外因性ＣＡＲおよび／もしくはＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞の集団であり得る。ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０発現レベルを査定する場合、Ｔ細胞／ＴＩＬの集団におけるＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現するＴ細胞の少なくとも２５％は、細胞集団が腫瘍反応性であることを示す。
本発明の態様および実施形態は下でも記載される。
【００１４】
本明細書において記載される本発明は、癌に対する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法を受け得る患者の予後のための、およびより最適なＴＩＬ産物を生成する新規な方法を開発するためのこれら予後マーカーの活用のためのインビトロ方法であって、
ｉ）前記患者由来の腫瘍消化物または製造の間のＴＩＬ産物のサンプルにおいて、ＴＩＬ上の少なくとも１つの生物学的マーカー（ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）を定量するステップであって、定量は、前記生物学的マーカー（ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）を発現する細胞の比率であるステップ；
ｉｉ）前記少なくとも１つの生物学的マーカーに対してステップｉ）で獲得された値と、同じ生物学的マーカーに対する所定の参照値とを比較するステップであって、所定の参照値は、前記癌の進行の特異的予後と相関するステップ；
ｉｉｉ）前記バイオマーカーを発現する細胞の富化に基づいて、製造の前、間、または後に、バルクＴＩＬ集団から細胞を単離するステップ；
ｉｖ）産物の治療効力を向上させる目的で、Ｔ細胞において前記生物学的マーカーを過剰発現させるステップ；
ｖ）ＴＩＬ産物に対する放出試験としての、ＴＩＬ上の前記少なくとも１つの生物学的マーカーの使用；
ｖｉ）化学物質、抗体、他の細胞、タンパク質、脂質、または他の未確定のメカニズムもしくは方法を使用して、前記生物学的マーカーの発現を増加させる、増強する、または誘導する目的で、Ｔ細胞集団を操縦する方法
を含む、インビトロ方法に関する。
方法の一部の実施形態において、ステップｉ）は、フローサイトメトリーによって１つまたは複数の生物学的マーカーを定量することからなる。
方法の他の一部の実施形態において、ステップｉ）は、全腫瘍組織サンプルにおける遺伝子発現解析によって前記生物学的マーカーを定量することからなる。
方法の他の一部の実施形態において、ステップｉ）は、腫瘍組織サンプル全体の免疫組織化学による前記生物学的マーカーの定量からなる。
方法の一部の実施形態において、ステップｉｉｉ）は、フローサイトメトリー選別を使用して、バイオマーカーを発現する細胞を単離することからなる。
【００１５】
方法の他の一部の実施形態において、ステップｉｉｉ）は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ分離、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ磁気分離技術、またはフローサイトメトリー選別を含み得るがそれらに限定されない、物理的分離技法の他の何らかの形態を使用して、バイオマーカーを発現する細胞を単離することからなる。
方法の他の一部の実施形態において、ステップｉｉｉ）は、バイオマーカーを通じて共刺激を誘導するなどのＴ細胞活性化の刺激と組み合わせて、このバイオマーカーに関わる抗体または可溶性受容体タンパク質を使用するなどによって、細胞分裂刺激の過程の何らかの形態を介して、バイオマーカーを発現する細胞を富化することからなる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
細胞
本発明は、Ｔ細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のサンプルに存在するＴ細胞に関する。特に、本発明は、腫瘍反応性Ｔ細胞が富化されたＴＩＬの集団など、Ｔ細胞を含む細胞集団に関する。
腫瘍浸潤リンパ球は、血流から離れかつ腫瘍に移動している白血球である。それらは、可変比率での種々のタイプの細胞の混合（すなわち、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ）である単核免疫細胞であり、Ｔ細胞が圧倒的に最も豊富な細胞である。それらは、間質においておよび腫瘍自体の中にしばしば見出され得る。
ＴＩＬは、腫瘍細胞を特異的に認識し得、溶解し得、および／または殺傷し得る。腫瘍におけるリンパ球の存在は、より良好な臨床転帰としばしば関連する。
【００１７】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の１タイプである。それらは、細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球と区別され得る。下記で要約されるように、様々なタイプのＴ細胞が存在する。
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。ＣＴＬは、それらの表面にＣＤ８分子を発現する。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩと結び付いた抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。ＩＬ−１０、アデノシン、および制御性Ｔ細胞によって分泌される他の分子により、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活性化され得、それは、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を阻止する。
【００１８】
メモリーＴ細胞は、感染が解決した後に長期に存続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると多数のエフェクターＴ細胞に迅速に増殖し、したがって免疫系に過去の感染に対する「メモリー」を提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的に、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
以前は抑制性Ｔ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に不可欠である。それらの主な役割は、免疫反応の終わり頃にＴ細胞媒介性免疫を停止させること、および胸腺における陰性選択の過程を逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応性Ｔｒｅｇ細胞という、２つの主なクラスのＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞が記載されている。
【００１９】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞としても知られる）は、胸腺に生じ、ＴＳＬＰで活性化されている骨髄樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様樹状細胞（ＣＤ１２３＋）の両方を有する成長中のＴ細胞間の相互作用と関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって、他のＴ細胞と区別され得る。
適応性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られる）は、通常の免疫応答の間に発生し得る。
ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、自然免疫系の一部を形成する細胞傷害性細胞の１タイプである。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的様式で、ウイルス感染した細胞からの固有のシグナルに対して迅速な応答を提供する。
ＮＫ細胞（自然リンパ細胞の群に属する）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、ＢおよびＴリンパ球を生成するリンパ系共通前駆細胞と識別される第３の種類の細胞を構成する。
【００２０】
選択および富化
１つの態様において、本明細書において提供される本発明は、細胞のバルク集団からＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞を選択することによって腫瘍反応性Ｔ細胞が富化されている、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）集団に存在するＴ細胞を含めた、Ｔ細胞の集団を獲得することおよび使用することに関する。選択した場合、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１陽性細胞をバルク集団から分離して、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１を発現するＴ細胞が富化された集団を提供し、および任意に、選択された細胞を次いで増殖させて、ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１  ＋ｖｅ（陽性）細胞の数を増加させる。いったんＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１  ＋ｖｅ細胞が選択されると、増殖後にＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１発現が維持される限りにおいて、当技術分野において公知の任意の適切なＴ細胞増殖法が使用され得る。
【００２１】
例えば、以下の選択技法：（ｉ）フローサイトメトリー、（ｉｉ）抗体パンニング、（ｉｉｉ）磁気選択、（ｉｖ）バイオマーカー標的細胞富化のうちの１つまたは複数を使用して、予後的に好ましいレベルの前記生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）を発現する細胞を選択するインビトロ方法が本明細書において記載される。
多くの他のヒト遺伝子のように、ＳＬＡＭＦ１の複数のアイソフォームが存在し、その一部はノンコーディングであるまたは機能的表面タンパク質を生成しない。しかしながら、これらのスプライスバリアントはそれらの細胞質ドメインに差があり、本明細書において記載されるものなどのＳＬＡＭＦ１に対する抗体は、細胞外ドメインに結合し、したがってＳＬＡＭＦ１の種々のアイソフォームに結合する。
【００２２】
前記生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）を発現する選択された細胞は、次いで、例えば以下の選択肢：
ａ）抗体もしくは共刺激受容体によって推進されるＴ細胞活性化シグナルおよび共刺激を提供するような形式での照射フィーダー細胞；ならびに／または
ｂ）前記１つもしくは複数の生物学的マーカーを通じて推進されるＴ細胞活性化シグナルおよび共刺激シグナルを提供する固定化もしくは可溶性試薬
のうちの一方または両方によって増殖され得る。
例えば、一部の実施形態において、抗体を使用したＳＬＡＭ／ＣＤ１５０を通じた共刺激は、それらは文献において共刺激を誘導することが示されているように実現可能であり得る：Aversa G, Chang CC, Carballido JM, Cocks BG, de Vries JE. J Immunol. 1997 May 1;158(9):4036-44を参照されたい。
【００２３】
外因性核酸分子
１つの態様において、本発明は、ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０をコードする外因性核酸分子を含む細胞を提供する。「外因性」という単語は、核酸分子が組み換え手段によって作製され、例えばレンチウイルスベクターなどのベクターによって、細胞内に導入されることを意味する。細胞は、核酸分子を含有しかつＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現する（または過剰発現する）ように操作される。
任意に、細胞は、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする第２の外因性核酸をさらに含み得、そのためＣＡＲまたはＴＣＲも発現し得る。
本明細書において使用するとき、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互いと同義であることを意図される。
数々の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝子コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることは当業者によって理解されるであろう。加えて、当業者であれば、ルーチン技法を使用して、本明細書において記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を作製して、ポリペプチドが発現される対象となる任意の特定の宿主生物のコドン使用法、例えばコドン最適化を反映し得ることが理解されるべきである。
【００２４】
本発明に従った核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖または二本鎖であり得る。それらは、それらの中に合成のまたは修飾されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもあり得る。オリゴヌクレオチドへのいくつかの異なるタイプの修飾が当技術分野において公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本発明の目的上、ポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解されるべきである。そのような修飾を行って、関心対象のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強させ得る。
ベクター
一態様において、本発明は、本発明の核酸配列または核酸構築物を含むベクターを提供する。
そのようなベクターを使用して、宿主細胞内に核酸配列または核酸構築物を導入し得、それによりそれはＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現する。
【００２５】
ベクターは、例えばプラスミド、またはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾンをベースにしたベクター、または合成ｍＲＮＡであり得る。レンチウイルスなどのレトロウイルスから派生したベクターは、それらは１つまたは複数の導入遺伝子の長期の安定な組み込み、および娘細胞におけるその繁殖を可能にするため、長期の遺伝子移入を達成する適切なツールである。
ベクターは、Ｔリンパ球をトランスフェクトするまたは形質導入する能力があり得る。本発明は、本発明の核酸が挿入されるベクターも提供する。
【００２６】
ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０、および任意にＴＣＲまたはＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、典型的に、ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０およびＴＣＲ／ＣＡＲポリペプチドまたはその一部分をコードする核酸を１つまたは複数のプロモーターに作動的に連結させ、かつ発現ベクター内に構築物を組み入れることによって達成される。ベクターは、真核細胞における複製および組み込みに適切であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにプロモーターを含有する。
ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、例えばSambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されており、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；および米国特許第６，３２６，１９３号も参照されたい。
【００２７】
ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０ポリペプチドまたはその一部分の発現を査定するために、細胞内に導入される対象となる発現ベクターは、選択可能マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはその両方も含有して、ウイルスベクターによりトランスフェクトされるまたは形質導入されることを求められる細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にし得る。例えば、図７Ａに示されるように、マーカー遺伝子はＣＤ１９であり得る。
一部の実施形態において、核酸構築物は図７Ａに示されるとおりである。図７Ａは、ＳＬＡＭＦ１およびＣＤ１９マーカー遺伝子がＥＦ１αプロモーターによって推進される、創出されたレンチウイルス発現構築物を示している。
【００２８】
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤、ならびに任意に１種または複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物と一緒に、本発明の細胞、Ｔ細胞、またはＴＩＬの集団を含有する医薬組成物にも関する。そのような製剤は、例えば静脈内注入に適した形態にあり得る。Ｔ細胞の集団を含む、静脈内注入のための医薬組成物であって、Ｔ細胞の少なくとも２５％、３０％、４０％、または５０％はＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現する医薬組成物が本明細書において提供される。
治療の方法
治療における使用のための、ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現するＴＩＬを含むＴＩＬ産物は、対象に由来する細胞からＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現する細胞が富化することによって、またはＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現するように細胞を操作することによって獲得され得る。
【００２９】
本発明の、ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０を発現する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含めたＴ細胞は、患者自身の末梢血由来（自家）からのエクスビボ、またはドナー末梢血（同種異系）もしくは無縁のドナー由来の末梢血（同種異系）からの造血幹細胞移植の背景におけるエクスビボであり得る。これらの場合、ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０ならびに任意にＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現するＴ細胞は、ウイルスベクターを用いた形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いたトランスフェクションを含めた多くの手段のうちの１つによって、Ｓ  ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０ならびに任意にＣＡＲおよび／またはＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって作出される。
細胞が患者に投与される本発明の方法の目的上、細胞は、患者に対して同種異系または自家であるＴ細胞であり得る。
【００３０】
疾患の治療のための方法は、本発明のベクターまたは細胞の治療的使用に関する。この点において、ベクターまたはＴ細胞を、既存の疾患または病状を有する対象に投与して、疾患と関連した少なくとも１つの症状を軽減し、低下させ、もしくは向上させ得、および／または疾患の進行を減速させ、低下させ、もしくは遮断し得る。本発明の方法は、ＴＩＬ細胞集団の大多数に存在しおよびそれを構成するＴ細胞など、Ｔ細胞の腫瘍反応性を増加させることに関する。抗腫瘍活性の増加は、ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０の増加を有するＴ細胞が、これらの細胞で治療された癌患者における臨床応答の向上と相関することを示す本明細書におけるデータによって実証されている。これらの細胞は、腫瘍反応性Ｔ細胞と見なされ得る。なぜＳＬＡＭ発現の増加が臨床応答の向上（本明細書において腫瘍反応性の増加と称される）と相関するかは不明であり、例えばそれは、ＳＬＡＭが、腫瘍殺傷を増加させることに関与するかもしれない、またはＳＬＡＭが、Ｔ細胞持続性を促進することに関与し得るかもしれない。
本発明の態様および実施形態のさらなる詳細は下記のとおりである。
【００３１】
現在、免疫系は、多くの癌タイプに対して有効な応答を始め得るという反論の余地のない証拠が存在する。これは、いくつかの癌免疫療法の開発につながっている。これらは、細胞をベースにした免疫療法および細胞をベースにしないものに大きく分類され得る。細胞をベースにしない免疫療法は、何らかの刺激的な結果を示している。特に、抗ＰＤ１（ニボルマブ；ペムブロリズマブ）、およびＰＤＬ１（アテゾリズマブ）、または抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ（Ｉｐｉｌｕｍｕｍａｂ））など、チェックポイント遮断抗体の使用は、進行性転移性黒色腫に対する臨床背景において驚くべき結果を有している。癌に対する細胞をベースにした免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍を標的にするＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた初期試験において同じように刺激的な結果を有しており、特に励みになる結果を示している。
ＴＩＬ療法は、それが遺伝子改変を要しないという点において、一般的により簡潔な手法であり、したがって魅力的である。黒色腫では、５０％前後の奏効率が一般的に観察される。子宮頸癌における試験も、３３％の奏効率を示した。卵巣癌を含めた他の癌適応症に対するいくつかの進行中の試験もある。
【００３２】
癌応答は、ＲＥＣＩＳＴガイドライン（２０００年に刊行された第１版）、およびより最近になって更新されたＲＥＣＩＳＴガイドライン１．１（Eisenhauer et al 2009）を使用して測定される。腫瘍負荷の変化についての均一な査定を可能にすることは、癌治療法についての臨床評価の重要な特質であり、腫瘍の縮小または検出可能な疾患がないの両方、すなわち客観的腫瘍縮小効果（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＣＲ＋ＰＲ）、変化なし（安定（ＳＤ））、および疾患進行（ＰＤ）は、治療効力および患者予後を判定する臨床試験における有用な評価項目である。ＲＥＳＩＳＴ１．１の重大な変化は、それにより、腫瘍は縮小前に炎症に起因してサイズを増加させることが可能となり、それは、そうでなければこれらの療法が失敗と称され得る場合に、ＴＩＬなどの治療法を機能させるために重大であるということであった。
【００３３】
本発明は、患者における腫瘍浸潤リンパ球療法を用いた治療の転帰の予後のための方法を提供し、その新規な方法は、例えば、腫瘍における、ＴＩＬ製造工程の間の産物における、または注入前のＴＩＬ産物における、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球上の１つまたは複数の生物学的マーカーの検出および／または定量に基づく。
ＴＩＬ産物のフローサイトメトリー解析によって、本出願者らは、注入され次第の患者に見られる応答と相関する、ＴＩＬ産物内のＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞上に発現した細胞分子マーカーを見出した。
患者応答と相関することが本発明者らによって示された本明細書において記載されるマーカーは、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）である。
細胞表面マーカーの発現とＴＩＬを用いた治療の転帰との間に相関があることが、本発明に従って見出された。
【００３４】
同定された受容体は、ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０）である。ＳＬＡＭは、受容体のＳＬＡＭファミリーの特定のメンバーに与えられた名前であり、具体的にはＳＬＡＭファミリー受容体１（ＳＬＡＭＦ１）を指す。ＳＬＡＭファミリーは、ＳＬＡＭＦ３（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４）、およびＳＬＡＭＦ７（ＣＲＡＣＣ／ＣＤ３１９）を含めたいくつかの他のメンバーを含有する。これら受容体のほとんどは自己リガンドであり、つまりそれらは、造血細胞を越えて互いに結合する。ＳＬＡＭファミリー受容体の細胞質ドメインは、ＳＡＰ（Ｔ細胞における）またはＥＡＴ−２（ＮＫ細胞における）タンパク質アダプターと関連する免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフを含有する。ＳＬＡＭファミリー受容体の役割は、若干解決されないままである。それらは、問題となっているＳＬＡＭファミリー受容体およびそれが発現している細胞に応じて、活性化の役割または阻害の役割において免疫応答を支援し得る。ＣＤ１５０自体は、共刺激機能を証明している。ＳＬＡＭ関与は、ＩＦＮγによって支配されるサイトカインのＴＨ１表現型を誘導し、したがって、ＳＬＡＭの操縦は、ＴＨ２偏向疾患に有益であり得ることが示唆されている（Quiroga et al 2004）。さらに、ＳＬＡＭは、ＴＨ２細胞と比較してＴＨ１細胞においてより高い程度に発現されることが指摘されており（Hamalainen et al 2000）、そのことは、なぜそれがＴＨ１様サイトカインを誘導するのかに関する観察結果を部分的に説明し得る。ＣＤ１５０に関して述べる最後の興味深い主張は、それが、麻疹ウイルスに対する主要なウイルス受容体であることである（Erlenhoefer et al 2001）。これは、レンチウイルスをＴ細胞へより特異的に標的化するために、麻疹ウイルスエンベロープを有して偽型化されているレンチウイルスを使用することによって、細胞療法目的で活用されている（Frecha et al. 2011）。
【００３５】
ゆえに、本発明の第１の目的は、癌に対する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法を受け得る患者の予後のためのインビトロ方法であって、
ｉ）前記患者由来の腫瘍消化物、製造工程の間のＴＩＬ材料、またはＴＩＬ産物のサンプルにおいて、ＴＩＬ上の少なくとも１つの生物学的マーカーを定量するステップ；および
ｉｉ）前記少なくとも１つの生物学的マーカーに対してステップｉ）で獲得された値と、同じ生物学的マーカーに対する所定の参照値とを比較するステップであって、所定の参照値は、前記癌の進行の特異的予後と相関するステップ
を含む、インビトロ方法からなる。
【００３６】
臨床効力と相関するように見えるＴＩＬ上の分子マーカーの以前の例があるものの（例えば、ＢＴＬＡ）、誰もＳＬＡＭを記載していない。Radvanyi et al. 2015は、良好な臨床転帰と関連するものとしてＴＩＬ内のＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率を記載している。これは、ＢＴＬＡがＴ細胞活性の負の調節因子として作用し得るという観察結果によって混乱している（Watanabe et al. 2003）。
ＣＤ８＋細胞が富化されたＴＩＬ産物は、混合したＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞に勝る生存利点を付与しない（Dudley et al., 2010）。これは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の存在が、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存および生着を支援するためであると大いに推測される。さらに、ＣＤ４＋細胞は、腫瘍細胞の直接認識および殺傷を支援し得るという証拠がある（Tran et al., 2014）。
【００３７】
Radvanyi et al. (2015)も、臨床的有益性と好ましい関連を有するとしてＢＴＬＡの発現を記載した。ＢＴＬＡの発現は、増強した生存特性を有する低分化Ｔ細胞と関連付けられている（Haymaker et al., 2015）。しかしながら、逆説的に、ＴＩＬ注入産物内のより分化したエフェクターメモリーＴ細胞の存在が好ましい転帰と関連することも示されている。エフェクターメモリーＴ細胞は、通常、ＣＤ４５ＲＯまたはＣＤ４５ＲＡと組み合わせたＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ７の共発現によって印付けられ、それによりエフェクターメモリー細胞は、以下の表現型：ＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＯ＋、またはＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−を有し得る。
【００３８】
臨床転帰に関する、インビボでのＴＩＬ上の様々な細胞表面マーカーとの関連を記載したいくつかの刊行物および先行研究もあるが、これは、ＴＩＬ製造ではなくむしろ腫瘍生検の解析と関連する。例には、特許の米国特許出願公開第２００９０２１５０５３号−Ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ａ  Ｐａｔｉｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ  Ｓａｉｄ  Ｍｅｔｈｏｄが含まれる。
【００３９】
本明細書において意図されるように、腫瘍浸潤リンパ球は、ａ）物理的または酵素的分解による、癌を有する患者の腫瘍サンプルから直接単離されたＣＤ４５＋細胞、ｂ）前記患者由来のリンパ節から単離されたＣＤ４５＋細胞、ｃ）腹水から単離されたＣＤ４５＋細胞（そうでなければ腫瘍関連リンパ球と称される）である。ＴＩＬは、それらがわずかに異なる表現型を獲得する傾向を有して、ＴＩＬ製造工程を通じてそれ自体としてのままであって、それらはＣＤ４５＋のままであるが、ＣＤ３＋細胞の比率は、細胞がＩＬ−２において培養され、照射フィーダー細胞または代替的ＴＩＬ増殖システムを用いて活性化されるにつれて増加する。これらＣＤ４５＋／ＣＤ３＋細胞は、Ｔ細胞またはＴリンパ球と称される。そのため、「ＴＩＬ」という用語は、手術の時点から、同じ患者への戻し注入の時点までの任意のＣＤ４５＋細胞を包含する。
前記マーカー（ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０）の解析は、いくつかのメカニズムの１つによって実施され得る。第１の例において、フローサイトメトリーが実施され得る。この例では、細胞をＳＬＡＭに対する抗体で染色して、その存在または非存在を判定し得る。さらに、他の抗体を染色パネルに組み入れて、ＴＩＬ内の細胞の規定集団に注目し得る。例えば、細胞を、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４、および／またはＣＤ８に対する抗体で対比染色し得る。
【００４０】
前記マーカー（ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１／ＣＤ１５０）は、最終産物の効力を向上させる目的で、前記マーカーを発現する細胞を富化するような形式で別様に活用され得る。例えば、フローサイトメトリーの利点を生かして、フルオロフォアまたは他の直接的もしくは間接的な選択可能マーカーにコンジュゲートした特異的抗体（抗ＳＬＡＭ）または組み換え（ｒ）タンパク質（例えば、ｒ−ＳＬＡＭ）を使用することによって、前記マーカーを発現する細胞を単離し得る。
あるいは、細胞を単離するための他の技術が実施され得る。例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳ磁気技術、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ技術、またはＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＥａｓｙＳｅｐ技術を使用して、前記マーカーを発現する細胞を単離し得る。
【００４１】
さらにあるいは、プレート、ビーズ、もしくは他の固体マトリックスに固定化された、または人工抗原提示細胞プラットフォーム上に発現した、抗体（またはその抗体フラグメント）または組み換えタンパク質を使用して、前記マーカーを発現する細胞を富化し得る。そのような例において、抗体または組み換えタンパク質は、単独で、またはＴ細胞に対する一次活性化シグナルを誘導する抗体もしくは他の活性化プラットフォームとの組み合わせで見出され得る（例には、フィトヘマグルチニン、抗ＣＤ３抗体、ペプチド−主要組織適合性（ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ）抗原複合体、ホルボールミリステートアセテートが含まれるが、それらに限定されるわけではない）。
次いで、上記のすべての目標は、前記マーカーの発現に基づいて患者を階層化すること、ならびに可能である場合には、上で記載される１つまたは複数の方法により治療用細胞を単離するおよび／または富化することである。
【００４２】
本明細書において意図されるように、（ａ）フローサイトメトリーにおいて一般に使用されるものなどの検出され得るレポーターシステムにコンジュゲートしたバイオマーカー結合抗体など、バイオマーカー結合部分が単一もしくは複数のステップ工程で二次レポート部分に結合している直接的な方法。顕微鏡法もしくはプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）ゲルクロマトグラフィー；または（ｂ）定量ＰＣＲなど、バイオマーカーをコードする核酸が定量される間接的な方法、のいずれかを使用して、バイオマーカーの存在を査定する複数の方法が当技術分野において利用可能である。選定される方法が、単細胞および集団をベースにした方法で細胞を解析することである場合、細胞は規定の表面マーカーに対する抗体を搭載しており、それはフルオロフォアに直接的または間接的に共役され得、それはフローサイトメーター機器の構成要素によって検出され得る規定の波長における光を放つ。本明細書において、フローサイトメトリーという用語は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメトリー機器の商標である、ＦＡＣＳというより一般的に使用されるが不正確な用語よりも好まれる。そのため、本方法の目的上、任意のフローサイトメーターが解析に使用され得るが（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ［ＢＤ］、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｃｅａ等）、他の方法が採用されてもよい。
好ましくは、ステップａ）が１つまたは複数の遺伝子、すなわち１つまたは複数の関連する生物学的マーカーの発現解析からなる場合には、前記１つまたは複数の遺伝子の発現の定量は、全腫瘍組織サンプルから実施される。
本発明の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示を考慮して当業者に明白であろう。
本明細書において言及されるすべての文書は、参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられる。
【００４３】
「および／または」は、本明細書において使用する場合、他方の有無にかかわらない２つの指定の特質または構成要素のそれぞれについての具体的な開示として捉えられるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、ちょうどあたかもそれぞれが本明細書において個々に提示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれについての具体的な開示として捉えられるべきである。
文脈上別様に述べられていない限り、上で提示される特質についての説明および定義は、本発明の任意の特定の態様または実施形態に限定されるわけではなく、記載されるすべての態様および実施形態に同じように適用される。
実施例によって、ならびに上で記載される図および下で記載される表を参照して、本発明のある特定の態様および実施形態がここで例示される。
【実施例】
【００４４】
（実施例１）
腫瘍浸潤リンパ球におけるＳＬＡＭ／ＣＤ１５０の発現の解析
転移性黒色腫腫瘍生検を患者から採取し、研究室に持ち込み、そこでまずそれらを外科用メスを使用して細かく切り刻み、次いでコラゲナーゼおよびＤＮａｓｅの混合物を使用して単細胞懸濁液に消化した。
細胞懸濁液を、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の添加とともに、完全培地中２４ウェルプレートのウェルあたりおよそ１×１０6個のＣＤ３＋生存細胞で播種した。培養物を細胞成長についてモニターし、必要に応じて分割して、健康的な培養を維持した。
【００４５】
ＴＩＬを最高で２１日間、またはＣＤ３＋細胞数が３０×１０6個を上回るまで成長させ、その後、細胞を洗浄し、凍結した。凍結する前に、フローサイトメトリー解析のためにサンプルを採取した。この時点で、サンプルはＲＥＰ前と称される。細胞が注入の準備ができる前に、それらは１×１０10個を超えた数まで増殖される必要がある。これを達成するために、ＴＩＬは、急速増殖プロトコールを受ける（Dudley et al., 2003）。簡潔には、ＴＩＬ細胞を増殖の１〜３日前に解凍した。次いで、１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３の添加とともに、ＴＩＬと照射自家／同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞とを１：５０〜１：１０００の比で混合する。次いで、ＴＩＬを２週間の期間増殖し、その後、それらはＲＥＰ後  ＴＩＬと称される。治療用ＴＩＬ産物（すなわち、ＲＥＰ後  ＴＩＬ）の注入前に、患者は、フルダラビンおよびシクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈａｓｐｈａｍｉｄｅ）からなる条件付け化学療法を受けた。ＲＥＰ後  ＴＩＬを患者に出し、ＩＬ−２の複数回の投薬前に単回注入として与える。
ＲＥＰ前およびＲＥＰ後の時点で、ＴＩＬ細胞をフローサイトメトリーによって解析した。簡潔には、１〜２×１０5個細胞の３つのサンプルをＰＢＳ中で洗浄し、次いで５０μｌの１：４００希釈のＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ  ４５０とともに暗所で室温にて５分間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＰＢＳで２回洗浄し、次いで、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％ウシ胎仔血清を補給した５０μｌの冷ＰＢＳ（ＰＥＦ）中に再懸濁した。各サンプルに、下記の表に示されるように抗体を４℃で３０分間添加した。
【００４６】
【表１】
2021511079.tif 000003
【００４７】
インキュベーション後、細胞を１５０μｌの冷ＰＥＦで２回洗浄し、最後に２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。細胞をＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー上に取得し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔｉｆｙソフトウェアを使用してデータを解析した（図１）。ＲＥＰ前およびＲＥＰ後にＴＩＬを比較した場合、本発明者らは、ＲＥＰ後ステージと比較して、ＲＥＰ前ステージのＣＤ４＋およびＣＤ８＋  ＴＩＬにおいてＳＬＡＭの発現の増強を見出した。特に、本発明者らは、ＣＤ４＋  ＲＥＰ後  ＴＩＬにおけるＳＬＡＭ発現の２つの別個の集団を観察し、ＳＬＡＭ−高およびＳＬＡＭ−低である患者の群を示唆した。特に、ＳＬＡＭ発現は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団におけるメモリー細胞集団に大きく制限される傾向があり、ナイーブおよびエフェクター集団においてより低い発現を有した。ナイーブおよびエフェクター集団は、ＴＩＬ産物全体のごく一部を形成する。
【００４８】
本発明者らが、皮膚黒色腫における患者応答に関してＳＬＡＭ＋細胞の比率を解析した場合、本発明者らは、進行を有する人（「進行者」）と比較して、安定（ｐ＝０．０２５２）または応答者（ｐ＝０．０１１３）を有する患者においてＳＬＡＭ＋であるＣＤ４＋  Ｔ細胞の有意に増加した比率を見出した。ＣＤ８＋集団において、観察された有意差は、治療への応答を有するそうした患者と進行を有する人との間であった（ｐ＝０．０２４８）。有意差は、メモリー細胞集団に見られる差に主に制限された。ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、メモリー細胞集団は、安定を有する患者と進行者との間（ｐ＝０．０３８４）、および進行と応答者との間（ｐ＝０．０２２１）で有意差を有した。ＣＤ８＋メモリーＴ細胞において、本発明者らは、進行を有する患者と安定を有する患者との間（ｐ＝０．０３４８）、および進行を有する人と応答者との間（ｐ＝０．０１６９）に有意差を見た。
【００４９】
治療後、患者を評価して、固形腫瘍（ＲＥＣＩＳＴｖ１．１）測定における応答評価基準に従って、腫瘍サイズを測定した。最良の応答を、最新のＲＥＣＩＳＴ１．１ガイドライン（Schwartz et al. 2016）に従って、各患者に対して判定した。本発明者らは、応答の継続期間に対して患者の全体的な生存率をプロットした（図４）。本発明者らは、ＳＬＡＭ−高およびＳＬＡＭ−低に対して２つのカットオフ：最終産物における全ＣＤ４＋  ＴＩＬのそれぞれ２５％および４０％を使用した。本発明者らは、＞２５％のＳＬＡＭ＋細胞を有する患者が、＜２５％のＳＬＡＭ＋細胞を有する人と比較して、増強した生存率を有することを見出した（それぞれ２１．３ヶ月対２．４ヶ月の中央値、ウィルコクソン検定によるｐ＝０．００９の有意差を有する、および４４％のプラトー）（図４Ａ）。同じように、本発明者らは、＞４０％のＳＬＡＭ＋細胞を有する患者が、＜４０％のＳＬＡＭ＋細胞を有する人と比較して、増強した生存率を有することを見出した（それぞれ未到達対４ヶ月の中央値、ウィルコクソン検定によるｐ＝０．０２７の有意差を有する、および５５％のプラトー）（図４Ａ）。
【００５０】
（実施例２）
Ｔ細胞およびＴＩＬにおけるＳＬＡＭ発現の変調
本発明者らは、まず、整合する腫瘍へのＴＩＬの生存能および機能的応答に対する、ＴＩＬにおけるＳＬＡＭ発現の影響を査定した（ＴＩＬ０３２およびＴＩＬ０５４）。この目的のために、本発明者らは、２つのＴＩＬ注入産物を選び、抗ＳＬＡＭ抗体およびフローソーターを使用してＳＬＡＭ−高および−低集団を選別した。一晩の休息期間の後、細胞をそれらの自家腫瘍株とともに共培養し、または刺激されないウェルに１６時間放置し、次いで、生存能をＤＲＡＱ７を使用して判定し（図５Ａ）、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαを産生する細胞の比率をフローサイトメトリーを使用して判定した（図５Ｂ）。本発明者らは、ＴＩＬ０３２およびＴＩＬ０５４  ＳＬＡＭ−高細胞が、ＳＬＡＭ−低または非選別細胞と比較して、増加した生存能を有することを見出した（図５Ａ）。それらの腫瘍と混合した場合、効果はあまり明らかでなかったが、ＴＩＬ０５４においては明白であった。本発明者らがサイトカイン産生を査定した場合、本発明者らは、ＴＩＬをそれらの整合する腫瘍とともに培養した場合にサイトカイン応答の上昇を見出した。これは、ＴＮＦαの産生に注目した場合に最も明らかであった。しかしながら、本発明者らは、ＳＬＡＭ−高選別集団からのＴＮＦα応答が、ＴＩＬ０５４における腫瘍へのＣＤ８＋応答を除いて、全体としてＳＬＡＭ−低選別細胞からのものよりも大きいことを見出した。
【００５１】
次に、本発明者らは、ＳＬＡＭ発現を変調する手法として、細胞株およびＴ細胞におけるＳＬＡＭの発現に対するＳＬＡＭＦ１  ｓｉＲＮＡの影響を査定した。本発明者らは、ＳＬＡＭ＋細胞株Ｒａｊｉおよび２つのＴＩＬサンプル（ＭＲＩＢＢ０１１結腸直腸腫瘍ＴＩＬサンプル、およびＴＩＬ０３２由来のＴＩＬ０３２注入産物）を選んだ。細胞を、最少培地（ＲＰＭＩ＋１％ＦＣＳ＋ＩＴＳ、およびＴＩＬに関しては１０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を補給された）中、１０μＭの自己送達ｓｉＲＮＡ（Ａｃｃｅｌｌ  Ｈｕｍａｎ  ＳＬＡＭＦ１  ｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ、５ｎｍｏｌ−［Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡ］）を有する９６ウェルに播いた（ウェルあたり１×１０5個）。対照を、同じ条件であるがｓｉＲＮＡなしで成長させた。７６時間後、各条件からの２×１０5個細胞（２×ウェル）をプールし、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（商標）１−Ｓｔｅｐ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【００５２】
簡潔には、細胞をスピンダウンし、ＰＢＳ（Ｒ／Ｔ）で洗浄し、再度ペレットにした。上清を除去し、４９μｌのＬｙｓｉｓ溶液＋１μｌのＤＮＡｓｅを添加した。それらをＲ／Ｔで５分間インキュベートし、５μｌのＳＴＯＰ溶液を添加した。サンプルをＲＴで２分間放置し、次いで、使用するまで氷上に置いた。上記のすべての試薬は、キットに提供されている。溶解物は、−８０で最高５ヶ月間安定である。
【００５３】
ＳＬＡＭＦ１（アッセイＩＤ：Ｈｓ００２３４１４９＿ｍ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＧＡＰＤＨ（アッセイＩＤ：Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対するＴａｑＭａｎ反応を三つ組で設定し、反応容量を、キットによって提案される２０μｌから１０μｌに縮小した。１μｌのｌｙｓｉｓを各反応に添加した。細胞溶解物に存在する考え得るＰＣＲ阻害性作用物質を説明するために、未処理のＲａｊｉ細胞からすでに抽出されたＲＮＡを用いた陽性対照反応も用意した。
【００５４】
本発明者らは、Ｒａｊｉ細胞におけるＳＬＡＭ転写産物のほぼ完全なノックダウン（＞９９％）を観察した（図６Ａ）。ＭＲＩＢＢ０１１において、本発明者らはＳＬＡＭ転写産物の３１％の低下を見た；ＴＩＬ０３２において、本発明者らはＳＬＡＭ転写産物の５７％の増加を見た。タンパク質発現は、種々の程度に変わった（図６Ｂ）。Ｒａｊｉ細胞において、同じ時間経過にわたる前記タンパク質の表面発現は５．３％、ＭＲＩＢＢ０１１  ＴＩＬにおいて３０．８％、およびＴＩＬ０３２において９．６％減少した。ゆえに、発現における最適なノックダウンを観察するために、試験される各細胞株に対して最適化が要されるものの、ＳＬＡＭ  ｓｉＲＮＡは、ＳＬＡＭ発現を変調する適切な手段である。
【００５５】
次に、本発明者らは、Ｔ細胞におけるＳＬＡＭ発現の増強が、ｓｉＲＮＡによって達成されるノックダウンによるよりもむしろ、ＳＬＡＭ発現の影響を定量することに代わる手法を提供し得るかどうかを判定した。この目的のために、ＳＬＡＭＦ１およびＣＤ１９マーカー遺伝子がＥＦ１αプロモーターによって推進されるレンチウイルス発現構築物を創出した（図７Ａ）。レンチウイルス粒子を一過性のトランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞において作出し、次いで結果として生じた粒子を、ＳＬＡＭ陰性Ｊｕｒｋａｔ  ＪＲＴ３−Ｔ３．５細胞に対して滴定した（図７Ｂ）。ＳＬＡＭおよびＣＤ１９の共発現をＪｕｒｋａｔ細胞において実証した。
本発明の態様および実施形態は、以下の項においても提示される。
【００５６】
１．腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法を受けた患者の予後のためのインビトロ方法であって、
ａ．患者由来のＴＩＬのサンプルにおいて、適応免疫応答の状態を示す生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）を定量するステップ；および
ｂ．前記生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）は癌応答を示すステップ；および
ｃ．前記少なくとも１つの生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）に対してステップａ）で獲得された値と、同じ生物学的マーカーに対する所定の参照値とを比較するステップであって、それに関して、前記癌の特異的予後または進行と相関する所定の参照値が存在するステップ
を含む、インビトロ方法。
２．前記腫瘍組織サンプルが、（ｉ）原発性腫瘍、（ｉｉ）転移性腫瘍病変、（ｉｉｉ）前記患者由来の腫瘍病変の１つに最も近接して位置するリンパ節、からなる群に由来する、項１に記載のインビトロ方法。
３．ステップａ）が、フローサイトメトリーを使用して実施される、項１に記載のインビトロ方法。
【００５７】
４．ステップａ）が、前記生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）の値を査定する代替的な直接的または間接的方法を使用して実施され、前記少なくとも１つの生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）に対してステップａ）で獲得された値を比較する前記方法が、同じ生物学的マーカーに対する所定の参照値の決定を可能にし、それに関して、前記癌の特異的予後または進行と相関する所定の参照値が存在する、項１に記載のインビトロ方法。
５．前記生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）がリンパ球によって発現される、項１に記載のインビトロ方法。
【００５８】
６．前記患者の癌に対する前記患者の適応免疫応答の状態を示す前記生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）が、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ４＋細胞、および／またはＣＤ８＋細胞からなる群より選択される免疫系由来の細胞によって発現される少なくとも１つの生物学的マーカーからなる、項１に記載のインビトロ方法。
７．前記生物学的マーカーがＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）である、項１に記載のインビトロ方法。
【００５９】
８．前記生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）が、以下のサンプル：（ｉ）腫瘍の単細胞懸濁液、（ｉｉ）腫瘍浸潤リンパ球の培養の間の任意の時点で腫瘍の単細胞懸濁液から獲得された材料のサンプル、（ｉｉｉ）前記患者への注入に出される対象となる最終産物、のうちの１つにおいて定量される、項１に記載のインビトロ方法。
９．以下の選択技法：（ｉ）フローサイトメトリー、（ｉｉ）抗体パンニング、（ｉｉｉ）磁気選択、（ｉｖ）バイオマーカー標的細胞富化のうちの１つまたは複数を使用して、予後的に好ましいレベルの生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）を発現する細胞を選択するインビトロ方法。
【００６０】
１０．前記生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）を発現する細胞が、以下の選択肢：
ａ）抗体または共刺激受容体によって推進されるＴ細胞活性化シグナルおよび共刺激を提供するような形式での照射フィーダー細胞；ならびに
ｂ）前記１つまたは複数の生物学的マーカーを通じて推進されるＴ細胞活性化シグナルおよび共刺激シグナルを提供する固定化または可溶性試薬
のうちの一方または両方によって増殖される、項９に記載のインビトロ方法。
１１．１種または複数のリンパ球において生物学的マーカー（ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ／ＳＬＡＭＦ１）を発現させるインビトロ方法。
１２．項１１に記載の核酸配列を含む、ベクター。
１３．項１１に記載のポリペプチドを発現する、細胞。
１４．項１１に記載の細胞を作製するための方法であって、細胞に項１２に記載のベクターを形質導入するまたはトランスフェクトするステップを含む、方法。
１５．関心対象の導入遺伝子が、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、または養子細胞療法に対する免疫療法的使用の別の受容体もコードし、それにより、ベクターを使用して標的細胞に形質導入する場合、標的細胞は、項１３に記載のポリペプチドと、キメラ抗原受容体、Ｔ細胞受容体、または免疫療法上の関心対象の別の受容体とを共発現し、明確性のために、この付加的なポリペプチドコードタンパク質は関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）と称される、項１２に記載のベクター。
【００６１】
１６．ＰＯＩを発現する細胞を選択するための方法であって、
Ｉ．項１５に記載のベクターをトランスフェクトされたまたは形質導入された細胞の表面でのＰＯＩエピトープの発現を検出するステップ；および
ＩＩ．ＰＯＩエピトープを発現すると同定されている細胞が富化するステップ
を含む、方法。
１７．項１６に記載の方法を使用して、細胞の集団からＰＯＩを発現する細胞を選択するステップを含む、ＰＯＩを発現する細胞が富化された、細胞の精製集団を調製するための方法。
１８．項１に記載のポリペプチドを発現する細胞が富化されている、したがってＰＯＩを発現する細胞が富化されている、細胞集団。
１９．細胞表面での項１に記載のポリペプチドの発現の検出のステップを含む、形質導入された細胞をインビボで追跡するための方法。
２０．対象における疾患を治療するための方法であって、項１２〜１４のいずれか１つに記載の細胞、または項１８に記載の細胞集団を対象に投与するステップを含む、方法。
【００６２】
（参考文献）
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2021511079.tif 000007
【図１】
2021511079.tif 000008
【図２】
2021511079.tif 000009
【図３ａ】
2021511079.tif 000010
【図３ｂ】
2021511079.tif 000011
【図４】
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【図５Ａ】
2021511079.tif 000013
【図５Ｂ】
2021511079.tif 000014
【図６Ａ】
2021511079.tif 000015
【図６Ｂ】
2021511079.tif 000016
【図７】
2021511079.tif 000017
【国際調査報告】
2021511079.tif 000018
2021511079.tif 000019
2021511079.tif 000020