(57)【要約】  免疫チェックポイント調節因子及び／又は血管新生経路の成分及び／又はＴＧＦ経路の成分に特異的に結合する、抗腫瘍アンタゴニストが開示される。また、上記抗腫瘍アンタゴニストを用いて増殖性障害を治療する方法も開示される。【選択図】図３Ｄ‐３Ｅ
2021532170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン足場；
抗ＰＤ‐１可変ドメイン、抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメイン、抗ＴＩＧＩＴ可変ドメイン、及び抗ＬＡＧ‐３可変ドメインからなる群から選択される１つ以上の免疫グロブリン可変ドメインを含む、第１の標的指向性ドメイン；
ＶＥＧＦに特異的に結合し、ＶＥＧＦＲ由来の１つ以上のペプチドドメインを含む、第２の標的指向性ドメイン；並びに
アンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメイン
を含む、三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２】
前記第２の標的指向性ドメインは、前記ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合され、前記第３の標的指向性ドメインは、前記ＣＨ３ドメイン内に挿入される、請求項１に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項３】
前記第１の標的指向性ドメインは１つ以上の抗ＰＤ‐１可変ドメインを含む、請求項１又は２に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項４】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域であって、
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号４８、５１、５４、５６、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号４９、５２、５７、及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号５０、５３、５５、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域と；
（２）３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域であって、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号６２、６５、６８、６９、７０、及び７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号６３、６６、７１、及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号６４、６７、７２、及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域と
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項５】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）配列番号１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、及び１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；並びに
（２）配列番号１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、及び１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項６】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）配列番号１３７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ；及び
（２）配列番号１３８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＬＣＶＲ
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項７】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）配列番号１３５のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ；及び
（２）配列番号１３６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＬＣＶＲ
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項８】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、ＨＣＶＲであって、
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号５８のアミノ酸配列を有する、ＨＣＶＲと；
（２）３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、ＬＣＶＲであって、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号７０のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号７１のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号７２のアミノ酸配列を有する、ＬＣＶＲと
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項９】
前記第２の標的指向性ドメインは、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１０】
前記第３の標的指向性ドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列の１つのコピーのみを有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１１】
前記第３の標的指向性ドメインは、配列番号１８２のアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１２】
配列番号２０１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、及び／又は配列番号２００若しくは配列番号２０２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１３】
配列番号２３２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、及び／又は配列番号２３１若しくは配列番号２３３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１４】
前記第２の標的指向性ドメインは、ペプチドリンカーを介して、前記免疫グロブリン足場に構造的に結合される、請求項２に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１５】
前記ペプチドリンカーは、配列番号２８４〜２８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１６】
ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン足場；
１つ以上の抗ＰＤ‐１可変ドメイン、又は１つ以上の抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメインを含む、第１の標的指向性ドメイン；
ＶＥＧＦＲの成分を含む、第２の標的指向性ドメイン；並びに
ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメイン
を含む、三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１７】
前記第２の標的指向性ドメインは、前記ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合され、前記第３の標的指向性ドメインは、前記第２の標的指向性ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合される、請求項１６に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１８】
前記第１の標的指向性ドメインは１つ以上の抗ＰＤ‐１可変ドメインを含む、請求項１６又は１７に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項１９】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、免疫グロブリンＨＣＶＲであって、
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号４８、５１、５４、５６、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号４９、５２、５７、及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号５０、５３、５５、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲと；
（２）３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、免疫グロブリンＬＣＶＲであって、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号６２、６５、６８、６９、７０、及び７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号６３、６６、７１、及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号６４、６７、７２、及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲと
を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２０】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）配列番号１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、及び１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに／又は
（２）配列番号１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、及び１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２１】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）配列番号１３７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨＣＶＲ；及び
（２）配列番号１３８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＬＣＶＲ
を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２２】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）配列番号１３５のアミノ酸配列と８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに
（２）配列番号１３６のアミノ酸配列と８０％〜１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
を含む、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２３】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、免疫グロブリンＨＣＶＲであって、
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号５９のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号６０のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号６１のアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに／又は
（２）免疫グロブリンＬＣＶＲであって、前記軽鎖可変領域は、３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号７３のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号７４のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号７５のアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２４】
前記第１の標的指向性ドメインは：
（１）３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、免疫グロブリンＨＣＶＲであって、
前記ＨＣＤＲ１は、配列番号５６のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ２は、配列番号５７のアミノ酸配列を有し、
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号５８のアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＨＣＶＲ；並びに／又は
（２）３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、免疫グロブリンＬＣＶＲのであって、
前記ＬＣＤＲ１は、配列番号７０のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ２は、配列番号７１のアミノ酸配列を有し、
前記ＬＣＤＲ３は、配列番号７２のアミノ酸配列を有する、免疫グロブリンＬＣＶＲ
を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２５】
前記第２の標的指向性ドメインは、配列番号１８５のアミノ酸配列を有する、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２６】
前記第２の標的指向性ドメインは、配列番号２０７のアミノ酸配列を有する、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２７】
前記第３の標的指向性ドメインは、ＴＧＦβ１  ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を有する、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２８】
配列番号１９３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖、並びに／又は
配列番号１９２、２０５、及び２０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖
を含む、請求項１７に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項２９】
前記第１の標的指向性ドメインは、ペプチドリンカーを介して、前記免疫グロブリン足場のアミノ末端に構造的に結合され、
前記ペプチドリンカーは、配列番号２８４〜２８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項３０】
前記第２の標的指向性ドメインは、ペプチドリンカーを介して、前記免疫グロブリン足場のカルボキシル末端に構造的に結合され、
前記ペプチドリンカーは、配列番号２８４〜２８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項３１】
前記第３の標的指向性ドメインは、ペプチドリンカーを介して、前記第２の標的指向性ドメインのカルボキシル末端に構造的に結合され、
前記ペプチドリンカーは、配列番号２８４〜２８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の三重特異性アンタゴニスト。
【請求項３２】
細胞増殖性障害を治療するための方法であって、
有効量の請求項１〜３１の三重特異性アンタゴニストのうちのいずれか１つを、それを必要とする被験者に投与するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年６月２９日出願の米国仮特許出願第６２／６９１，６５８号、及び２０１９年３月２６日出願の米国仮特許出願第６２／８２３，９８９号に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容は、あらゆる目的のために、参照により本出願に明示的に援用される。
【０００２】
本出願は一般に癌治療に関し、特に腫瘍形成、腫瘍免疫、及び血管新生に関連する経路を調節できる、二重特異性及び三重特異性アンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
宿主が癌細胞を排除できないことは、大きな問題であり続けている。様々な癌の治療のためにますます多くの治療用モノクローナル抗体が認可されているが、癌の成長、及び転移への進行の根底に、多数の異なる分子経路が存在することを考慮すると、これらの抗体に対する耐性の出現が頻繁に観察される。免疫系は癌予防の腫瘍な機序であるが、癌細胞は免疫監視に対抗する。従って、改良された治療用結合アンタゴニスト又は抗体、並びにこのような試薬を用いて癌及び慢性ウイルス感染を治療する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本出願のある態様は、三重特異性アンタゴニストに関し、上記三重特異性アンタゴニストは：ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン足場（scaffold）；抗ＰＤ‐１可変ドメイン、抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメイン、抗ＴＩＧＩＴ可変ドメイン、及び抗ＬＡＧ‐３可変ドメインからなる群から選択される１つ以上の可変ドメインを含む、第１の標的指向性ドメイン；ＶＥＧＦに特異的に結合し、ＶＥＧＦＲ由来の１つ以上のペプチドドメインを含む、第２の標的指向性ドメイン；並びにアンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインを含み、上記第２の標的指向性ドメインは、上記ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合され、上記第３の標的指向性ドメインは、上記ＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０００５】
本出願の別の態様は、三重特異性アンタゴニストに関し、上記三重特異性アンタゴニストは：ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン足場；抗ＰＤ‐１可変ドメイン、抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメイン、抗ＴＩＧＩＴ可変ドメイン、及び抗ＬＡＧ‐３可変ドメインからなる群から選択される１つ以上の可変ドメインを含む、第１の標的指向性ドメイン；抗ＰＤ‐１可変ドメイン、抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメイン、抗ＴＩＧＩＴ可変ドメイン、及び抗ＬＡＧ‐３可変ドメインの第２の標的指向性ドメイン；並びにアンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインを含み、上記第２の標的指向性ドメインは、上記ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合され、上記第３の標的指向性ドメインは、上記ＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０００６】
本出願の別の態様は、三重特異性アンタゴニストに関し、上記三重特異性アンタゴニストは：ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン足場；抗ＶＥＧＦ可変ドメインからなる群から選択される１つ以上の可変ドメインを含む、第１の標的指向性ドメイン；ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第２の標的指向性ドメイン；並びにアンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインを含み、上記第２の標的指向性ドメインは、上記ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合され、上記第３の標的指向性ドメインは、上記ＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０００７】
本出願の別の態様は、三重特異性アンタゴニストに関し、上記三重特異性アンタゴニストは：ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン足場；抗ＰＤ‐１可変ドメイン、抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメイン、抗ＴＩＧＩＴ可変ドメイン、及び抗ＬＡＧ‐３可変ドメインからなる群から選択される１つ以上の可変ドメインを含む、第１の標的指向性ドメイン；ＶＥＧＦＲの成分を含む、第２の標的指向性ドメイン；並びにＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインを含み、上記第２の標的指向性ドメインは、上記ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合され、上記第３の標的指向性ドメインは、上記第２の標的指向性ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合される。
【０００８】
本出願の別の態様は、二重特異性アンタゴニストに関し、上記二重特異性アンタゴニストは：ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、免疫グロブリン足場；抗ＰＤ‐１可変ドメイン、抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメイン、抗ＴＩＧＩＴ可変ドメイン、及び抗ＬＡＧ‐３可変ドメインからなる群から選択される１つ以上の可変ドメインを含む、第１の標的指向性ドメイン；並びにＶＥＧＦＲの成分を含む、第２の標的指向性ドメインを含み、上記第３の標的指向性ドメインは、上記第２の標的指向性ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合される。
【０００９】
本出願の別の態様は、細胞増殖性障害を治療するための方法に関する。上記方法は、それを必要とする被験者に、本出願の三重特異性アンタゴニストを有効量投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、特定のチェックポイントアンタゴニスト、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列を示す。
【図２】図２は、トレバナニブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、Ｔｉｅ２、ＶＥＧＦ、及びＴＧＦ‐Ｂアンタゴニストに関する、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ並びに他のドメインの配列を示す。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｈは、８個の三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、ＴＳ‐ＺＰＴ‐１．１、ＴＳ‐ＺＰＴ‐１．２、ＴＳ‐ＺＰＴ‐１．３、ＴＳ‐ＺＰＴ‐２、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３、ＴＳ‐ＺＰＴ‐４、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐６のそれぞれを示し、これらは：（１）抗ＰＤ‐１可変領域（ＶＨ１、ＶＬ１）ドメイン、又は他のチェックポイント抗体可変ドメイン；（２）（ｉ）一方若しくは両方のＩｇＧアームのアミノ末端の（図３Ａ〜３Ｃ、３Ｆ）、（ｉｉ）各アンタゴニストのカルボキシ末端の（図３Ｄ、３Ｅ、３Ｈ）、又は（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端とトレバナニブペプチド（又は他の生物学的ペプチド）との間の（図３Ｇ）、アフリベルセプト融合タンパク質ドメイン；（３）（ｉ）各ＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合した（図３Ａ〜３Ｄ）、（ｉｉ）２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入された（図３Ｅ）、（ｉｉｉ）各ＣＨ１領域のカルボキシ末端に融合した（図３Ｆ）、（ｉｖ）各アフリベルセプト融合タンパク質ドメインのカルボキシ末端に融合した（図３Ｇ）、又は（ｖ）各ＣＬ領域のカルボキシ末端に融合した（図３Ｈ）、トレバナニブペプチド（又は他の生物学的ペプチド）を含む、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４バックボーンを有する。アフリベルセプト融合タンパク質ドメインは、ヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメインからの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）結合部分を含み、その一方でトレバナニブペプチドは、Ａｎｇ１及びＡｎｇ２を標的としてこれらに結合することにより、Ａｎｇ１及び／又はＡｎｇ２とこれらのコグネイトＴｉｅ２受容体との相互作用を防止する。
【図３Ｄ−３Ｅ】同上
【図３Ｆ−３Ｈ】同上
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、３個の異なる三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、ＴＳ‐ＺＰＴ‐７、ＴＳ‐ＺＰＴ‐８、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐９をそれぞれ示し、これらは：（１）各カルボキシ末端のアフリベルセプト融合タンパク質ドメイン；（２）抗ＰＤ‐１又は他のチェックポイントアンタゴニスト抗体可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１）；及び（３）（ｉ）２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入された（図４Ａ）、（ｉｉ）各ＣＨ２領域のカルボキシ末端と、アンタゴニスト中の各ポリペプチド鎖のカルボキシ末端のアフリベルセプト融合タンパク質ドメインとの間に挿入された（図４Ｂ）、又は（ｉｉｉ）各ＩｇＧ１アームのアミノ末端に融合した（図４Ｃ）、トレバナニブペプチド（又は他の生物学的ペプチド）を含む。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜５Ｇは、７個の異なる三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、ＴＳ‐ＬＰＴ‐１、ＴＳ‐ＬＰＴ‐２、ＴＳ‐ＬＰＴ‐３、ＴＳ‐ＬＰＴ‐４、ＴＳ‐ＬＰＴ‐５、ＴＳ‐Ｍ３、及びＴＳ‐Ｍ４をそれぞれ示し、これらは：（１）ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、又は他の抗ＶＥＧＦ可変ドメインに対応する、ＶＨ２及びＶＬ２領域；（２）抗ＰＤ‐１、又は他のチェックポイントアンタゴニスト抗体可変ドメインに対応する、ＶＨ１及びＶＬ１領域；並びに（３）（ｉ）２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入された（図５Ａ）、（ｉｉ）各ＣＬ１領域のカルボキシ末端に融合した（図５Ｂ）、（ｉｉｉ）２つのポリペプチド鎖それぞれのＣＨ１領域のカルボキシ末端に融合した（図５Ｃ）、（ｉｖ）２つのポリペプチド鎖それぞれのＣＬ領域のカルボキシ末端に融合した（図５Ｄ）、（ｖ）２つのポリペプチド鎖それぞれのＣＨ１領域のカルボキシ末端に融合し、かつ２つのポリペプチド鎖それぞれのＣＬ領域のカルボキシ末端に融合した（図５Ｅ）、（ｖｉ及びｖｉｉ）ＣＨ３のカルボキシ末端に融合した（図５Ｆ及び５Ｇ）、トレバナニブペプチド（又は他の生物学的ペプチド）を含む。ラニビズマブ可変ドメインはベバシズマブに由来し、これらはいずれも、ＶＥＧＦＲ１及び２に対するヒトＶＥＧＦ‐Ａの結合を遮断することが知られている。ＴＳ‐ＬＰＴ‐１、ＴＳ‐ＬＰＴ‐２、ＴＳ‐ＬＰＴ‐３、ＴＳ‐ＬＰＴ‐４、ＴＳ‐ＬＰＴ‐５、ＴＳ‐Ｍ３、及びＴＳ‐Ｍ４の例示的な配列は、配列番号２４７〜２６９に示されている。
【図５Ｃ−５Ｅ】同上
【図５Ｆ−５Ｇ】同上
【図６Ａ】図６Ａ及び６Ｂは、図３Ａ〜３Ｅ、３Ｇ、３Ｈ、及び５Ａに示されている、一過性トランスフェクション済みＨＥＫ２９３細胞中に発現される三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの、非還元ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）分析を示す。
【図６Ｂ】同上
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ及び７Ｂは、図３Ａ〜３Ｈに示されている三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの、ヒトＰＤ‐１とヒトＰＤ‐Ｌ１との間の相互作用を遮断する能力を反映した、細胞ベース結合アッセイから計算されたＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ及び８Ｂは、図３Ｄ、３Ｅ、及び３Ｇに示されている三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ‐２との間の相互作用を遮断する能力を反映した、結合アッセイから計算されたＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図９】図９は、図３Ｂ、３Ｄ、３Ｇ、３Ｈ、及び５Ａに示されている三重特異性腫瘍アンタゴニストの、Ａｎｇ２とＴｉｅ２との間の相互作用を遮断する能力を反映した、結合アッセイから計算されたＩＣ５０値（ｎＭ）を、ベバシズマブ‐トレバナニブ融合対照分子と比較して示す。
【図１０】図１０は、ＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって生成された、精製済み三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１７）、並びに抗ＰＤ‐１単一特異性抗体２Ｐ１７の、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析の結果を示す。高分子量（ＨＷＭ％）種、低分子量（ＬＭＷ％）種、及び二量体化分子（Ｄｉｍｅｒ％）のパーセンテージを示す。これらの三重特異性抗腫瘍アンタゴニストのＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのアミノ酸配列は、配列番号２０１〜２０４に示されている。
【図１１】図１１は、ＣＨＯ安定プールによって発現される精製済み三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１７）の、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析の結果を示す。２つのトランスフェクションプールをＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）に関して評価した。高分子量（ＨＷＭ％）種、低分子量（ＬＭＷ％）種、及び二量体化分子（Ｄｉｍｅｒ％）のパーセンテージを示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ及び１２Ｂは、ＣＨＯ安定プールから精製されて４℃で１１２日間保管された精製済み三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の、クロマトグラフィのトレース、及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析の結果を示す。高分子量（ＨＷＭ％）種、低分子量（ＬＭＷ％）種、及び二量体化分子（Ｄｉｍｅｒ％）のパーセンテージを示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａは、トレバナニブ長鎖ペプチドを有する例示的な三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、即ちＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）に関する、重鎖アミノ酸配列（配列番号２０２）及び軽鎖アミノ酸配列（配列番号２０１）を示し、上記三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）別のチェックポイントアンタゴニスト抗体２Ｐ１７可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１）の抗ＰＤ‐１、（２）各アンタゴニストのカルボキシル末端に融合し、かつ３ｘＧ４ＳリンカーでＣＨ３ドメインに接続された、アフリベルセプトＶＥＦＧ結合ドメイン、及び（３）２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入されたトレバナニブペプチド（又は他の生物学的ペプチド）を含む。図１３Ｂは、これらの配列に由来する例示的な分子を示す。
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａは、トレバナニブ短鎖ペプチドを有する例示的な三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、即ちＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）に関する、重鎖アミノ酸配列（配列番号２００）及び軽鎖アミノ酸配列（配列番号２０１）を示し、上記三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）別のチェックポイントアンタゴニスト抗体２Ｐ１７可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１）の抗ＰＤ‐１、（２）各アンタゴニストのカルボキシル末端に融合し、かつ３ｘＧ４ＳリンカーでＣＨ３ドメインに接続された、アフリベルセプトＶＥＦＧ結合ドメイン、及び（３）２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入されたトレバナニブペプチド（又は他の生物学的ペプチド）、（ｉ）トレバナニブ阻害ペプチドの単一のコピーを含む。図１４Ｂは、これらの配列に由来する例示的な分子を示す。
【図１５】図１５は、一過性トランスフェクション済みＨＥＫ２９３細胞によって生成された、図５Ｆ及び５Ｇ、並びに図１３Ａ〜１４Ｂに示されている様々な三重特異性抗腫瘍アンタゴニストのＳＤＳ‐ＰＡＧＥを示す。
【図１６】図１６は、ＨＥＫ２９３細胞から生成されたＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）のサイズ排除クロマトグラフィ分析からの結果を示す。
【図１７】図１７は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）の、４℃で保管した状態での経時的なサイズ排除クロマトグラフィ分析を示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａは、親抗体２Ｐ１７と比較して、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）並びにＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの、ＰＤ‐１とＰＤ‐Ｌ１との間の相互作用を遮断する能力を測定する、細胞ベース結合アッセイの結果を示す。図１８Ｂは、この分析から得られるＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図１９Ａ−１９Ｂ】図１９Ａは、ベンチマーク抗体ベバシズマブ及び非特異的対照抗体と比較して、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）並びにＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ‐２との間の相互作用を遮断する能力を測定する、細胞ベースバイオアッセイの結果を示す。図１９Ｂは、この分析から得られるＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図２０Ａ−２０Ｂ】図２０Ａは、ベンチマーク分子トレバナニブ及び非特異的対照抗体と比較して、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）並びにＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの、Ａｎｇ２とＴｉｅ２との間の相互作用を遮断する能力を測定する、結合アッセイの結果を示す。図２０Ｂは、この分析から得られるＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図２１Ａ−２１Ｃ】図２１Ａ〜２１Ｅは、ベンチマーク抗ＰＤ‐１抗体と比較して、バイオレイヤー干渉法によって決定された、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）並びにＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）三重特異性抗腫瘍アンタゴニストへのＰＤ‐１結合の結果を、得られたこれらの結合親和性定数（図２１Ｆ）と共に示す。
【図２１Ｄ−２１Ｆ】同上
【図２２Ａ−２２Ｃ】図２２Ａ〜２２Ｅは、ベンチマーク抗体ベバシズマブと比較して、バイオレイヤー干渉法によって決定された、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）並びにＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）三重特異性抗腫瘍アンタゴニストへのＶＥＧＦ１６５結合の結果を、得られたこれらの結合親和性定数（図２２Ｆ）と共に示す。
【図２２Ｄ−２２Ｆ】同上
【図２３Ａ−２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｅは、ベンチマーク分子トレバナニブと比較して、バイオレイヤー干渉法によって決定された、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）並びにＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）三重特異性抗腫瘍アンタゴニストへのＡｎｇ２結合の結果を、得られたこれらの結合親和性定数（図２３Ｆ）と共に示す。
【図２３Ｄ−２３Ｆ】同上
【図２４】図２４は、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）並びにＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６及び２Ｐ１７）三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの、その３つの結合パートナーそれぞれに対する順次結合を特性決定するための、バイオレイヤー干渉法の使用を示す。
【図２５】図２５は、４頭の別個のマウスにおけるＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの薬物動態プロファイルを示す。
【図２６Ａ−２６Ｂ】図２６Ａ〜２６Ｂは：（１）ＶＨ１及びＶＬ１領域が、チェックポイント＃１、例えば抗ＰＤ‐１又は抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメインに対応し；（２）ＶＨ２及びＶＬ２領域が、チェックポイント＃２、例えば抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３可変ドメインに対応し；（３）円形の領域が、ＣＨ３ドメイン内に挿入されたトレバナニブ（又は他のいずれの生物学的ペプチド）に対応する、特定の三重特異性抗腫瘍チェックポイントアンタゴニスト構成を示す。
【図２７】図２７は、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐Ａ１ＢＴ‐１を示し、これは：多様体ＩｇＧ１（Ｋ４４７Ａ）足場中のＡｖａｓｔｉｎ／ベバシズマブ由来のＶＨ領域（Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ）の２つのアミノ酸置換を含有する、アミノ末端抗ＶＥＧＦ可変領域（ＶＨ１、ＶＬ１）；ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン内に挿入されたトレバナニブ短鎖ペプチド；及び４ｘＧ４ＳリンカーによってＣＨ３ドメインに接続されたカルボキシ末端ＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ  ＥＣＤを含む。この三重特異性抗腫瘍アンタゴニストのＨＣ及びＬＣのアミノ酸配列は、配列番号２２９及び２３０に列挙されている。
【図２８】図２８は、対照トランスフェクション抗体２Ｐ１７と比較して、ＨＥＫ２９３一過性トランスフェクション済み細胞によって生成されたＴＳ‐Ａ１ＢＴ‐１の非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を示し、これは、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの良好な発現レベルを示している。
【図２９】図２９は、ＴＳ‐ＡＩＢＴ‐１のサイズ排除クロマトグラフィ分析を示す。
【図３０Ａ−３０Ｃ】図３０Ａ〜３０Ｆは、ＴＧＦ‐βＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）：ＴＳ‐ＺＰＢ‐１、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３、ＴＳ‐ＺＰＢ‐４、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐６をそれぞれ含む６個の三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト構成を示す。
【図３０Ｄ−３０Ｆ】同上
【図３１Ａ】図３１Ａは、ＨＥＫ２９３細胞によって一過性発現された三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＬＢ‐１の、精製前及び後の非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を示す。
【図３２Ａ−３２Ｂ】図３２Ａは、ＴＧＦ‐β‐ＲＩＩ‐Ｆｃと比較した、ＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＬＢ‐１の例示的なサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）プロファイルを示す。高分子量種（ＨＷＭ％）、低分子量種（ＬＭＷ％）、及び二量体化された分子（Ｄｉｍｅｒ％）のパーセンテージを図３２Ｂに示す。
【図３３Ａ−３３Ｂ】図３３Ａは、ＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）の、ＰＤ‐１とＰＤ‐Ｌ１との間の相互作用を遮断する能力を測定する、細胞ベース結合アッセイの結果を示す。図３３Ｂは、この分析から得られるＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図３４Ａ−３４Ｂ】図３４Ａは、ベンチマークＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ‐Ｆｃと比較した、ＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＬＢ‐１の、ＴＧＦβ１シグナル伝達を遮断する能力を測定するためのバイオアッセイの結果を示す。図３４Ｂは、この分析から得られるＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図３５Ａ−３５Ｂ】図３５Ａは、ベンチマークベバシズマブと比較した、ＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＬＢ‐１の、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ‐２との間の相互作用を遮断する能力を測定する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。図３５Ｂは、この分析から得られるＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図３６Ａ−３６Ｃ】図３６Ａ〜３６Ｃは、３つの三重特異性アンタゴニスト：ＴＳ‐ＺＰＢ‐５；ＣＨ３ドメインにＫ４４７Ａ変異を有する多様体ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ａ；及びアフリベルセプトＶＥＧＦ結合ドメインのＮ‐結合型グリコシル化を排除するための変異を更に有する多様体ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂを示す。
【図３７】図３７は、一過性トランスフェクション済みＨＥＫ２９３細胞から生成される三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＢ‐５、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ａ、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂの発現レベルを示す。
【図３８】図３８は、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＢ‐５、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ａ、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂの、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ‐２との間の相互作用を遮断する能力を測定する、細胞ベースアッセイの結果を示す。
【図３９】図３９は、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＢ‐５、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ａ、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂの、ＴＧＦβ１シグナル伝達を遮断する能力を測定する、バイオアッセイの結果を示す。
【図４０】図４０は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５Ａ及びＴＳ‐ＺＰＴ‐５Ｂの、それぞれ２頭のマウスにおける薬物動態プロファイルを示す。
【図４１Ａ−４１Ｃ】図４１Ａ〜４１Ｃは、３つの異なる二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト構成Ｂｉ‐ＺＰＬ‐１（又はＢｉ‐ＺＰ‐１）、Ｂｉ‐ＺＰＬ‐２（又はＢｉ‐ＺＰ‐２）、及びＢｉ‐ＺＰＬ‐３（又はＢｉ‐ＺＰ‐３）を示し、これらはそれぞれ：（１）抗ＰＤ‐１又は抗ＰＤ‐Ｌ１可変領域；及び（２）（ｉ）ＶＨ１のアミノ末端に融合した、（ｉｉ）Ｎ‐結合型グリコシル化部位を排除するように変異し、またＶＨ１のアミノ末端に融合した、（ｉｉｉ）Ｎ‐結合型グリコシル化部位を排除するように変異し、また３ｘＧ４ＳリンカーによってＣＨ３のカルボキシ末端に融合した、アフリベルセプトＶＥＧＦ結合ドメインを含む。
【図４２Ａ−４２Ｂ】図４２Ａは、ベンチマーク抗ＰＤ‐１抗体と比較して、Ｂｉ‐ＺＰＬ‐１分子の、ＰＤ‐Ｌ１とＰＤ‐１との間の相互作用を阻害する能力を測定する、細胞ベースアッセイの結果を示す。図４２Ｂは、この分析から得られる結果としてのＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図４３Ａ−４３Ｂ】図４３Ａは、ベンチマーク抗ＰＤ‐１抗体と比較して、Ｂｉ‐ＺＰＬ‐１分子の、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ‐２との間の相互作用を阻害する能力を測定する、バイオアッセイの結果を示す。図４３Ｂは、結果としてのＩＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図４４】図４４は、タンパク質Ａ精製済みＢｉ‐ＺＰ‐２及びＢｉ‐ＺＰＬ‐３のサイズ排除クロマトグラフィ分析の結果を示す。
【図４５】図４５は、Ｂｉ‐ＺＰ‐２及びＢｉ‐ＺＰＬ‐３の、マウスにおける薬物動態評価を示す。
【図４６Ａ】図４６Ａ〜４６Ｃは、例示的なフレームワーク領域の配列を示す。図４６Ａは、抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂの例示的なフレームワーク領域を示す。図４６Ｂは、抗ＰＤ‐１及び抗ＰＤ‐Ｌ１  ｍＡｂの例示的なフレームワーク領域を示す。図４６Ｃは、抗ＬＡＧ３  ｍＡｂの例示的なフレームワーク領域を示す。
【図４６Ｂ】同上
【図４６Ｃ】同上
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
他の定義がされていない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示の方法及び組成物が属する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書及び添付の請求項中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、そうでないことが文脈によって明確に規定されない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。よって例えば、「あるペプチド（ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」に関する言及は、「１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」ペプチド、又は「複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」のこのようなペプチドを含む。本出願の教示に関して、本出願に記載されているいずれの発行済みの特許又は特許出願公開は、参照により本出願に明示的に援用される。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＰＤ‐１」は、いずれの形態のＰＤ‐１、及びＰＤ‐１の活性の少なくとも一部を保持したその多様体を指す。ヒトＰＤ‐１を指定して言及すること等による別の指示がない限り、ＰＤ‐１は、天然配列ＰＤ‐１の全ての哺乳類種、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシを含む。例示的なヒトＰＤ‐１アミノ酸配列を以下に挙げる：
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL（配列番号１８０）
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「ＰＤ‐Ｌ１」は、いずれの形態のＰＤ‐Ｌ１、及びＰＤ‐Ｌ１の活性の少なくとも一部を保持したその多様体を指す。ヒトＰＤ‐Ｌ１を指定して言及すること等による別の指示がない限り、ＰＤ‐Ｌ１は、天然配列ＰＤ‐Ｌ１の全ての哺乳類種、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシを含む。例示的なヒトＰＤ‐Ｌ１アミノ酸配列を以下に挙げる：
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET（配列番号１８１）
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＴＩＧＩＴ」は、いずれの形態のＴＩＧＩＴ、及びＴＩＧＩＴの活性の少なくとも一部を保持したその多様体を指す。ヒトＴＩＧＩＴを指定して言及すること等による別の指示がない限り、ＴＩＧＩＴは、天然配列ＴＩＧＩＴの全ての哺乳類種、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシを含む。以下は、例示的なヒトＴＩＧＩＴアミノ酸配列である：
MTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIPLLGAMAATLVVICTAVIVVVALTRKKKALRIHSVEGDLRRKSAGQEEWSPSAPSPPGSCVQAEAAPAGLCGEQRGEDCAELHDYFNVLSYRSLGNCSFFTETG（配列番号１７９）
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＬＡＧ‐３」は、いずれの形態のＬＡＧ‐３、及びリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ‐３）の活性の少なくとも一部を保持したその多様体を指す。ヒトＬＡＧ‐３を指定して言及すること等による別の指示がない限り、ＬＡＧ‐３は、天然配列ＬＡＧ‐３の全ての哺乳類種、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシを含む。以下は、例示的なヒトＬＡＧ‐３アミノ酸配列である：
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL（配列番号２９３）
【００１６】
用語「アゴニスト」は、別の分子の生物学的活性又は効果を促進する（即ち誘発する、引き起こす、強化する、又は増大する）物質を指す。用語「アゴニスト」は、受容体に結合する抗体等の物質、及び受容体に結合することなく（例えば関連するタンパク質を活性化することによって）受容体の機能を促進する物質を包含する。
【００１７】
用語「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、受容体又はリガンドといった別の分子の生物学的活性又は効果を妨げる、遮断する、阻害する、中和する、又は低減する物質を指す。アンタゴニストは、単一特異性抗体、二重特異性抗体、又は三重特異性抗体であってよい。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、抗原を特異的に認識して、１つ以上の免疫グロブリン可変領域を通して該抗原に結合する、ポリペプチド又はポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体、抗原結合断片、又はその一本鎖であってよい。用語「抗体」は、生化学的に区別できる多様なクラスのポリペプチドを包含する。重鎖は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミュー（即ちα、δ、ε、γ、及びμ）として分類され、これらの間に多少のサブクラス（例えばγ１〜γ４）が存在することは、当業者には理解されるだろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等は、十分に特性決定されており、機能的な専門性を付与するものであることが分かっている。これらのクラス及びアイソタイプそれぞれを修飾したバージョンは、当業者であれば本開示を参照して容易に識別可能であるため、本開示の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスは本開示の範囲内であり、以下の議論は全体として、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。
【００１９】
本出願の抗体又は抗体アンタゴニストとしては、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多重特異性、二重特異性、三重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、キメラ、及び一本鎖抗体が挙げられる。本明細書で開示される抗体は、鳥類及び哺乳類を含むいずれの動物に由来するものであってよい。好ましくは上記抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、又はニワトリ抗体である。いくつかの実施形態では、可変領域は軟骨魚類に由来する（例えばサメに由来する）ものであってよい。
【００２０】
用語「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成される断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体といった抗体の一部分を指して使用される。その構造にかかわらず、抗体断片は、完全な状態の抗体が認識する抗原と同一の抗原に結合する。用語「抗体断片」は、ＤＡＲＴ及びダイアボディを含む。用語「抗体断片」はまた、特異的抗原に結合して複合体を形成することによって抗体と同様に作用する免疫グロブリン可変領域を含む、いずれの合成又は遺伝子操作タンパク質を含む。「一本鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質を指す。いくつかの態様では、上記領域は、１０〜約２５個のアミノ酸の短鎖リンカーペプチドと接続される。上記リンカーは、柔軟性のためにグリシンを多く含むことができ、また可溶性のためにセリン又はトレオニンを多く含むことができ、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続できるか、又はその逆である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量がおよそ２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、分子量が５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチド鎖とを含む。これら４つの鎖は典型的には、「Ｙ」字型構成で、ジスルフィド結合によって接合され、このジスルフィド結合では、軽鎖が重鎖から張り出して支えられ、この張り出した構造が、「Ｙ」字型の最も開いた部分から始まって、可変領域を通して続く。
【００２１】
軽鎖及び重鎖はいずれも、構造的及び機能的に相同である領域に分割される。用語「定常」及び「可変」は、機能に関して使用される。これに関して軽鎖可変（ＶＬ）及び重鎖可変（ＶＨ）ドメインの部分の両方が、抗原認識及び特異性を決定することが理解されるだろう。対照的に、軽鎖定常（ＣＬ）及び重鎖定常（ＣＨ１、ＣＨ２、又はＣＨ３）ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合等といった重要な生物学的特性を付与する。慣例として、従来の抗体の定常領域ドメインの番号は、抗体の抗原結合部位又はアミノ末端から離れるほど大きくなる。従来の抗体では、Ｎ末端部分は可変領域であり、カルボキシ末端部分には定常領域があり、ＣＨ３及びＣＬドメインは実際には、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。本出願に記載されている例示的なＣＨＩ‐ＣＨ２‐ＣＨ３配列としては：野生型ＩｇＧ１（配列番号２７４）；Ｋ４４７Ａ変異を有するＩｇＧ１（配列番号２７５）；Ｎ２９７Ａ変異を有するＩｇＧ１（配列番号２７６）；野生型ＩｇＧ２（配列番号２７８）；カルボキシ末端リシンが欠失したＩｇＧ２（配列番号２７９）；ヒンジＳ２３１Ｐ変異を有するＩｇＧ４（配列番号２８０）；Ｓ２３Ｐ及びＫ４４７Ａ変異を有するＩｇＧ４（配列番号２８１）；並びにＳ２３１Ｐ変異を有し、かつカルボキシ末端リシンが欠失したＩｇＧ４（配列番号２８２）が挙げられる。例示的なＣＬ配列は配列番号２９２である。
【００２２】
用語「Ｆｃ断片」又は「Ｆｃ」は、抗原結合活性を含まないものの元々は容易に結晶化することが観察されていた（そのため「断片、結晶化可能（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）」からＦｃ断片と呼ばれる）抗体の断片を指して使用される。この断片は、対になったＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインに対応し、エフェクタ分子及び細胞と相互作用する抗体分子の一部である。本明細書に記載のＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４抗体に由来するものであってよく、ヒンジ変異、及びカルボキシ末端リシンの欠失といった修飾を伴う。本出願に記載の例示的なＦｃ配列としては：野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号２１０）；ａ‐グリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号２１１）；ヒンジ変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃ（配列番号２１２）；野生型ＩｇＧ２  Ｆｃ（配列番号２１３）；カルボキシ末端リシンが欠失したＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号２１４）；カルボキシ末端リシンが欠失したａ‐グリコシル化ＩｇＧ１  Ｆｃ（配列番号２１５）；ヒンジ変異を有し、かつカルボキシ末端リシンが欠失したＩｇＧ４  Ｆｃ（配列番号２１６）；及びカルボキシ末端リシンが欠失したＩｇＧ２  Ｆｃ（配列番号２１７）が挙げられる。
【００２３】
上述のように、可変領域により、抗体は、抗原上のエピトープを選択的に認識して、これに特異的に結合できる。即ち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、３次元的な抗原結合部位を画定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙ字型の各腕状部分の端部に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖それぞれの３つのＣＤＲ（即ちＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）によって画定される。いくつかの例では、例えば特定の免疫グロブリン分子、ラクダ種に由来するか、又はラクダ免疫グロブリンをベースとして操作される。あるいは、免疫グロブリン分子は、軽鎖を有さずに重鎖のみから、又は重鎖を有さずに軽鎖のみからなってよい。
【００２４】
自然に発生する抗体では、各抗原結合ドメイン内に存在する６個のＣＤＲは、アミノ酸の短く不連続な配列であり、上記配列は、水性環境下でその３次元構成を取るときにこの抗原結合ドメインを形成するよう、特異的に配置される。抗原結合ドメイン中のアミノ酸の残基は「フレームワーク」領域と呼ばれるが、これは、分子間変動が比較的小さい。フレームワーク領域は主にβシート構造を採用し、ＣＤＲはループを形成し、このループはβシート構造に接続され、場合によってはβシート構造の一部を形成する。よってフレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的な相互作用による、正しい配向でのＣＤＲの配置を提供する、足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補性の表面を画定する。この相補性表面は、抗体とそのコグネイトエピトープとの非共有結合を促進する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域を含むアミノ酸はそれぞれ、既に正確に定義されているため、いずれの所与の重鎖又は軽鎖可変領域に関して当業者が容易に同定できる。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＶＨ１」及び「ＶＨ２」は、２つの異なる結合特異性に対応する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを指す。同様に、用語「ＶＬ１」及び「ＶＬ２」は、２つの異なる結合特異性に対応する軽鎖可変ドメインを指す。これらが共に使用される場合、ＶＨ１領域及びＶＬ１領域は共通の結合特異性を画定すること、並びにＶＨ２ドメイン及びＶＬ２ドメインは第２の結合特異性を画定することを理解されたい。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「フレームワーク領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基を指す。各可変ドメインは典型的には、対応するＣＤＲに隣接する４つのＦＲを有する。例えばＶＨドメインは典型的には、３つのＨＣＤＲにＨＦＲ１‐ＨＣＤＲ１‐ＨＦＲ２‐ＨＣＤＲ２‐ＨＦＲ３‐ＨＣＤＲ３‐ＨＦＲ４という構成で隣接する、４つのＨＦＲ、即ちＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、及びＨＦＲ４を有する。同様に、ＬＨドメインは典型的には、３つのＬＣＤＲにＬＦＲ１‐ＬＣＤＲ１‐ＬＦＲ２‐ＬＣＤＲ２‐ＬＦＲ３‐ＬＣＤＲ３‐ＬＦＲ４という構成で隣接する、４つのＬＦＲ、即ちＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、及びＬＦＲ４を有する。例示的なＦＲを図４６Ａ〜４６Ｃにまとめる。
【００２７】
軽鎖は、カッパ又はラムダ（κ、λ）として分類される。各重鎖クラスは、カッパ又はラムダ軽鎖と結合できる。一般に軽鎖及び重鎖は互いに共有結合し、２つの重鎖の「後端（ｔａｉｌ）」部分は、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、又は遺伝子操作された宿主細胞によって免疫グロブリンが生成された場合に、共有ジスルフィド結合又は非共有結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ字型構成のフォーク状の端部のＮ末端から、各鎖の下部のＣ末端まで連なる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「軽鎖定常領域（ＣＬ）」は、抗体軽鎖ＣＬ由来のアミノ酸配列（配列番号２９２）を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメイン及び定常ラムダドメインのうちの少なくとも一方を含む。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「重鎖定常領域（ＣＨ）」は、免疫グロブリン重鎖由来のアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン（配列番号２９０〜２９１）、ヒンジ（例えば上部、中央、及び／又は下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、並びに多様体又はその断片のうちの少なくとも１つを含む。例えば、本開示で使用するための抗原結合ポリペプチドは：ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインと、少なくともヒンジドメインの一部分と、ＣＨ２ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインと、少なくともヒンジドメインの一部分と、ＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖；又はＣＨ１ドメインと、少なくともヒンジドメインの一部分と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖を含んでよい。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。更に、本開示で使用するための抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えばＣＨ２ドメインの全体又は一部）を含まなくてよい。重鎖定常領域を修飾することにより、そのアミノ酸配列を、自然に発生する免疫グロブリン分子から変化させることができることを理解されたい。
【００３０】
例えば、本開示においてこれ以降で考察されるように、本出願人は、ＣＨ３ドメインが、ＣＨ３ドメインのＦｃループ（例えば図３Ｅを参照）への相当な（例えば１００ａａを超える）挿入に耐えることができる、又はこのような挿入を収容できることを発見した。従って本出願では、本開示のいずれの阻害性ドメインを、トレバナニブ又はＴＧＦβ１  ＲＩＩ  ＥＣＤドメインをＦｃループに挿入するのと同様の方法で、同様にＦｃループに挿入できる。
【００３１】
本明細書で開示されている抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来するものであってよい。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含んでよい。別の例では、重鎖定常領域は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ一部がＩｇＧ３分子に由来する、ヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、かつ一部がＩｇＧ４分子に由来する、キメラヒンジを含むことができる。
【００３２】
「軽鎖‐重鎖対」は、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合によって二量体を形成できる、軽鎖と重鎖との集合を指す。
【００３３】
様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び３次元構成が十分に公知である。本明細書中で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の第１の（ほとんどの場合アミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対するアミノ末端である。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」は、慣用の番号付与スキームを用いた場合に概ね抗体の残基２４４から残基３６０にまでわたる（Ｋａｂａｔ番号付与体系では残基２４４〜３６０、ＥＵ番号付与体系では残基２３１〜３４０）、重鎖分子の一部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接な対を形成しないという点で独特である。そうではなく、２つのＮ結合型分岐炭水化物鎖が完全な状態のネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在する。ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからカルボキシ末端にまでわたりし、およそ１０８個の残基を含む。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接合する、重鎖分子の一部分を含む。このヒンジ領域はおよそ２５個の残基を含み、柔軟であるため、２つのＮ末端抗原結合領域を独立して動かすことができる。ヒンジ領域は：上部、中央、及び下部ヒンジドメインという３つの別個のドメインに細分化できる。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成できる、又は第２のチオール基と架橋できる、チオール基を含む。自然に発生するほとんどのＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＬ領域とはジスルフィド結合によって構造的に結合され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付与体系を用いた２３９及び２４２に対応する位置（ＥＵ番号付与体系の２２６位又は２２９位）において、２つのジスルフィド結合によって構造的に結合される。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、抗体、抗体断片、又は抗体ドメインの「多様体」は：（１）元の抗体、抗体断片、又は抗体ドメインと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し；（２）元の抗体、抗体断片、又は抗体ドメインが特異的に結合する標的と同一の標的に特異的に結合する、抗体、抗体断片、又は抗体ドメインを指す。「少なくともｘ％同一である」又は「少なくともｘ％の同一性」といった句の形式で配列同一性の測定値が提示されている場合、このような実施形態は、この下限以上のあらゆる整数のパーセンテージを含むことを理解されたい。更に、本出願においてアミノ酸配列が提示されている場合、これは、該アミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を追加で開示する、又は包含するものとして解釈されるものとすることを理解されたい。
【００３８】
本明細書中で、例えば「約８０％〜約１００％」といった句で配列相同性の範囲が提示されている場合、このような実施形態は、この範囲内のいずれの整数によって定義されるあらゆる部分範囲を含み、下限の数は８０〜１００のいずれの整数となり得ることを理解されたい。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、句「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体、典型的にはマウスモノクローナル抗体に由来する抗体を指す。あるいはヒト化抗体は、親抗体である非ヒト抗体の抗原結合特性を保持しているか又は略保持しているものの、ヒトへの投与時に親抗体に比べて低い免疫原性を示す、キメラ抗体に由来するものであってよい。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、句「キメラ抗体」は、免疫反応性領域又は部位が第１の種から得られるか又は第１の種に由来し、（完全なものであっても、部分的なものであっても、本開示に従って修飾されたものであってもよい）定常領域が第２の種から得られる、抗体を指す。特定の実施形態では標的結合領域又は部位は、非ヒトソース（例えばマウス又は霊長類）からのものとなり、定常領域はヒトである。
【００４１】
本出願の多重特異性抗体の範囲内に含まれるのは、以下を含む様々な組成物及び方法論である：非対称ＩｇＧ様抗体（例えばトリオマブ／クアドローマ、Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅｓ）抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；Ｃｒｏｓｓ  ｍＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）；静電気適合抗体（ＡＭＧＥＮ）；ＬＵＺ‐Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ストランド・エクスチェンジ・エンジニアード（ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ドメイン（ＳＥＥＤ）ボディ（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ；Ｂｉｏｌｏｎｉｃ、Ｍｅｒｕｓ）；Ｆａｂ交換抗体（Ｇｅｎｍａｂ）；対照ＩｇＧ様抗体（例えば二重標的（ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ＤＴ）‐Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）；トゥ・イン・ワン（ｔｗｏ‐ｉｎ‐ｏｎｅ）抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；架橋ｍＡｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）；ｍＡｂ２（Ｆ‐ｓｔａｒ）；Ｃｏｖ  Ｘ‐ｂｏｄｙ（Ｃｏｖ  Ｘ／Ｐｆｉｚｅｒ）；二重可変ドメイン（ＤＶＤ）‐Ｉｇ融合（Ａｂｂｏｔｔ）；ＩｇＧ様二重特異性抗体（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）；Ｔｓ２Ａｂ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡＺ）；ＢｓＡｂ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）；ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，ＴｖＡｂ、Ｒｏｃｈｅ）；ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合；ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）；二重親和性標的転換技術（Ｆｃ‐ＤＡＲＴ、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；二重（ｓｃＦｖ）２‐Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）；Ｆ（ａｂ）２融合（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）；二重作用又はＢｉｓ‐Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ドック・アンド・ロック（Ｄｏｃｋ‐ａｎｄ‐Ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）；Ｆａｂ‐Ｆｖ（ＵＣＢ‐Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ｓｃＦｖ及びダイアボディベース抗体（例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）；タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ、Ａｆｆｉｍｅｄ）；ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；一本鎖ダイアボディ；ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｏｇｉｃｓ）；ヒト血清アルブミンｓｃＦｖ融合（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）；ＣＯＭＢＯＤＩＥＳ（Ｅｐｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；及びＩｇＧ／非ＩｇＧ融合（例えば免疫サイトカイン（ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ、Ｐｈｉｌｏｇｅｎ、ＩｍｍｕｎＧｅｎｅ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ））。
【００４２】
「特異的に結合する」又は「・・・に対する特異性を有する」は一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してあるエピトープに結合すること、及びこの結合が、抗原結合ドメインと該エピトープとの間のある程度の相補性を伴うことを意味する。この定義に従うと、抗体は、その抗原結合ドメインを介したあるエピトープへの結合が、ランダムで無関係なエピトープへの結合に比べて、より容易である場合に、該エピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は本明細書では、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対親和性を定量化するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は所与のエピトープに対して、抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなされる場合があり、又は抗体「Ａ」は、エピトープ「Ｃ」に、関連するエピトープ「Ｄ」に関してよりも高い特異性で結合すると言われる場合がある。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、又は１０−１０Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する抗原との複合体を形成する場合に、ある抗原「に対して特異性を有する」。
【００４３】
用語「アンタゴニスト抗体」は、標的に結合してこの標的の生物学的効果を阻害又は低減する抗体を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、抗体であって、この抗体が結合する標的、例えばＴＩＧＩＴが生物学的機能を実施するのを阻害する、抗体を指すことができる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「抗ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体」は、ＰＤ‐１の生物学的活性、及び／又はＰＤ‐１によって仲介される１つ以上の下流のイベントを阻害できる抗体を指す。抗ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ‐１の生物学的活性を（「ほとんど」を含む何らかの程度まで）遮断する、拮抗する、抑制する、又は低減する抗体を包含し、上記生物学的活性は、ＰＤ‐１によって仲介される下流のイベント、例えばＰＤ‐１結合及び下流シグナル伝達、Ｔ細胞増殖の阻害、Ｔ細胞活性化の阻害、ＩＦＮ分泌の阻害、ＩＬ‐２分泌の阻害、ＴＮＦ分泌の阻害、ＩＬ‐１０の誘導、及び抗腫瘍免疫応答の阻害を含む。本出願の目的に関して、用語「抗ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体」（相互交換可能な用語として「アンタゴニストＰＤ‐１抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤ‐１抗体」、又は「ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体」が使用される）は、ＰＤ‐１自体、ＰＤ‐１の生物学的活性、又は生物学的活性の結果を、略無化する、低減する、又は何らかの意味のある程度に中和する、これまでに同定されているあらゆる用語、名称、並びに機能的状態及び特性を包含することが、明確に理解されるだろう。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ‐１アンタゴニスト抗体はＰＤ‐１に結合して抗腫瘍免疫応答を上方制御する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「抗ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体」は、ＰＤ‐Ｌ１の生物学的活性、及び／又はＰＤ‐Ｌ１によって仲介される１つ以上の下流のイベントを阻害できる抗体を指す。抗ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体は、ＰＤ‐Ｌ１の生物学的活性を（「ほとんど」を含む何らかの程度まで）遮断する、拮抗する、抑制する、又は低減する抗体を包含し、上記生物学的活性は、ＰＤ‐Ｌ１によって仲介される下流のイベント、例えばＰＤ‐Ｌ１結合及び下流シグナル伝達、Ｔ細胞増殖の阻害、Ｔ細胞活性化の阻害、ＩＦＮ分泌の阻害、ＩＬ‐２分泌の阻害、ＴＮＦ分泌の阻害、ＩＬ‐１０の誘導、及び抗腫瘍免疫応答の阻害を含む。本出願の目的に関して、用語「抗ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体」（相互交換可能な用語として「アンタゴニストＰＤ‐Ｌ１抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤ‐Ｌ１抗体」、又は「ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体」が使用される）は、ＰＤ‐Ｌ１自体、ＰＤ‐Ｌ１の生物学的活性、又は生物学的活性の結果を、略無化する、低減する、又は何らかの意味のある程度に中和する、これまでに同定されているあらゆる用語、名称、並びに機能的状態及び特性を包含することが、明確に理解されるだろう。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニスト抗体はＰＤ‐Ｌ１に結合して抗腫瘍免疫応答を上方制御する。
【００４６】
句「免疫チェックポイント調節因子」は、免疫チェックポイントを通したシグナル伝達を阻害又は刺激する作用剤の機能的クラスを指す。「免疫チェックポイント調節因子」は、一体としてＴ細胞活性化に関連するシグナル伝達経路を阻害又は刺激する手段を提供する、細胞表面受容体及びその関連するリガンドを含む。例示的な免疫チェックポイント調節因子としては、限定するものではないが：ＰＤ‐１並びにそのリガンドであるＰＤ‐Ｌ１及びＰＤ‐Ｌ２；ＴＩＧＩＴ及びそのＣＤ１５５リガンドであるＰＶＲ；ＣＴＬＡ‐４並びにそのリガンドであるＢ７‐１及びＢ７‐２；ＴＩＭ‐３及びそのリガンドであるガレクチン‐９；ＬＡＧ‐３、並びに肝類洞内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）及びガレクチン‐３を含むそのリガンド；ＣＤ１２２及びそのＣＤ１２２Ｒリガンド；ＣＤ７０、Ｂ７Ｈ３、Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）、並びにＶＩＳＴＡが挙げられる。
【００４７】
句「チェックポイント調節因子アンタゴニスト」、「免疫チェックポイント結合アンタゴニスト」、及び「免疫チェックポイントアンタゴニスト」は本明細書において、免疫チェックポイント調節因子の活性に干渉する（又はこれを阻害する）ことによって、チェックポイント調節因子又はそのリガンドへの結合の結果として、チェックポイント調節因子受容体を通したシグナル伝達を遮断又は阻害する作用剤のクラスに関して、相互交換可能なものとして使用される。このシグナル伝達を阻害することによって、免疫抑制を反転させることができ、これにより、癌細胞に対するＴ細胞免疫を再確立又は強化できる。免疫チェックポイント調節因子アンタゴニストとしては、単離された形態の、又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートの一部としての、抗体断片、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチド、及び小分子薬剤が挙げられる。
【００４８】
句「免疫チェックポイント結合アゴニスト」、及び「免疫チェックポイントアゴニスト」は、免疫チェックポイント調節因子の活性を刺激することによって、チェックポイント調節因子又はそのリガンドへの結合の結果として、チェックポイント調節因子受容体を通したシグナル伝達を刺激する作用剤のクラスに関して、相互交換可能なものとして使用される。このシグナル伝達を刺激することによって、癌細胞に対するＴ細胞免疫を再確立又は強化できる。例示的な免疫チェックポイント調節因子アゴニストとしては、限定するものではないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバー、例えばＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、及び４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）、並びにこれらのリガンドが挙げられる。更なるチェックポイント調節因子アゴニストは、ＣＤ２８及びＩＣＯＳを含むＢ７‐ＣＤ２８スーパーファミリーに属する。
【００４９】
句「ドミナントネガティブタンパク質」又は「ドミナントネガティブペプチド」は、野生型タンパク質に由来するタンパク質又はペプチドであって、変異及び／又は欠失によって遺伝子的に修飾されていることによって、修飾済みのタンパク質又はペプチドが、それが由来する内因性野生型タンパク質の機能に干渉する、タンパク質又はペプチドを指す。
【００５０】
句「ＶＥＧＦ結合アンタゴニスト」は、ＶＥＧＦ‐Ａ又はその受容体であるＶＥＧＦＲ‐２に結合することによって、この結合の結果として、ＶＥＧＦ‐ＡによるＶＥＧＦＲ‐２の活性化を遮断又は阻害する、作用剤の機能的クラスを指す。本明細書中で使用される場合、用語「ＶＥＧＦ結合アンタゴニスト」は、単離された形態の、又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートの一部としての、抗体断片、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチド、及び小分子薬剤を含む。
【００５１】
句「Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニスト」は、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、又はそのリガンドのうちの１つに結合することによって、この結合の結果として、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体の、そのリガンド（即ちＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、及びＡｎｇ４）のうちの１つ以上による活性化を遮断又は阻害する、作用剤の機能的クラスを指す。本明細書中で使用される場合、用語「Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体結合アンタゴニスト」は、単離された形態の、又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートの一部としての、抗体断片、ペプチド阻害剤、ドミナントネガティブペプチド、及び小分子薬剤を含む。
【００５２】
句「小分子薬剤」は、医薬活性を有し、かつ分子量が約２ｋＤａ未満、約１ｋＤａ未満、約９００Ｄａ未満、約８００Ｄａ未満、又は約７００Ｄａ未満である、ポリマーでない、多くの場合有機又は有機金属である分子実体を指す。この用語は、タンパク質又は核酸以外の「薬剤」と呼ばれる大半の医薬化合物を包含するが、小さなペプチド又は核酸類似体は小分子薬剤とみなすことができる。例としては、化学療法抗癌剤及び酵素阻害剤が挙げられる。小分子薬剤は、合成によって、半合成によって（即ち自然に発生する前駆体から）、又は生物学的に導出できる。
【００５３】
個々のドメインの間にハイフンを用いてポリペプチドドメインの構成を記述する場合（例えばＣＨ２‐ＣＨ３）、列挙されているドメインの順序は、アミノ末端からカルボキシ末端へのものであることを理解されたい。
【００５４】
用語「免疫複合体」は、共有結合によって阻害性ペプチド又は小分子薬剤に融合する抗体を指す。上記ペプチド又は小分子薬剤は、定常重鎖のＣ末端に、又は可変軽鎖及び／若しくは重鎖のＮ末端に、化学結合できる。
【００５５】
「リンカー」は、メイタンシノイド等のペプチド又は小分子薬剤を抗腫瘍アンタゴニストに安定した共有結合で結合するために使用できる。リンカーは、化合物又は抗体が活性のままとなる条件において、酸誘導型切断、光誘導型切断、ペプチダーゼ誘導型切断、エステラーゼ誘導型切断、及びジスルフィド結合切断に対して、感受性を有してよく、又は実質的な耐性を有してもよい。好適なリンカーは当該技術分野で公知であり、例えばジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基、及びエステラーゼ不安定性基が挙げられる。リンカーは、本明細書に記載され、かつ当該技術分野で公知の、荷電リンカー及びその親水性形態も含む。免疫複合体は更に、抗腫瘍アンタゴニストとペプチド及び／又は小分子薬剤との間に、可撓性３‐１５アミノ酸リンカー、例えばＧＧＧ（配列番号２８３）又はＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）反復ペプチドリンカー（配列番号２８４〜２８９）を含んでよい。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、用語「足場」は、抗体特異性の付加、抗体機能の強化、又は抗体構造及び安定性の支持を含む、アンタゴニストの機能をサポートするために望ましい特性を示すアミノ酸のいずれのポリマーを指す。足場にドナーポリペプチドの結合ドメインを移植することにより、足場にドナーポリペプチドの結合特異性を与えることができる。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、句「多重特異性阻害剤」は、異なる結合特異性を有する少なくとも２つの標的指向性ドメインを含む分子を指す。いくつかの実施形態では、多重特異性阻害剤は、足場と、異なる抗原又はエピトープを標的とする２つ以上の免疫グロブリン抗原結合ドメインとを含む、ポリペプチドである。特定の実施形態では、多重特異性阻害剤は二重特異性抗体又はアンタゴニストである。他の実施形態では、多重特異性阻害剤は三重特異性抗体又はアンタゴニストである。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、句「二重特異性」は、異なる結合特異性を有する少なくとも２つの標的指向性ドメインを含む分子を指す。各標的指向性ドメインは１つの標的分子に特異的に結合でき、該標的分子への結合時に該標的分子の生物学的機能を阻害できる。いくつかの実施形態では、二重特異性チェックポイント調節因子アンタゴニストは、２つ以上のポリペプチドを含むポリマー分子である。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン又はＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性阻害剤は二重特異性抗体である。
【００５９】
用語「二重特異性抗体」、及び「二重特異性アンタゴニスト」は、２つの異なる抗原（又はエピトープ）に特異的に結合できる抗体に関して、相互交換可能なものとして使用される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、その２つの結合アームのうちの一方（１対のＨＣ／ＬＣ）において１つの抗原（又はエピトープ）に結合し、その第２のアーム（異なる１対のＨＣ／ＬＣ）において異なる抗原（又はエピトープ）に結合する、全長抗体である。これらの実施形態では、二重特異性抗体は、（（特異性及びＣＤＲ配列いずれについても）別個のものである２つの抗原結合アームを有し、これが結合する各抗原に対して１価である。
【００６０】
他の実施形態では、二重特異性抗体は、その２つの結合アーム（２対のＨＣ／ＬＣ）それぞれにおいて２つの異なる抗原（又はエピトープ）に結合できる、全長抗体である。これらの実施形態では、二重特異性抗体は、同一の特異性及び同一のＣＤＲ配列を有する２つの同一の抗原結合アームを有し、これが結合する各抗原に対して２価である。
【００６１】
用語「三重特異性抗体」、及び「三重特異性アンタゴニスト」は、３つの異なる結合特異性を有する３つの標的指向性ドメインを含む分子に関して、相互交換可能なものとして使用される。各標的指向性ドメインは１つの標的分子に特異的に結合でき、該標的分子への結合時に該標的分子の生物学的機能を阻害できる。いくつかの実施形態では、三重特異性アンタゴニストは、２つ以上のペプチドを有するポリマー分子である。いくつかの実施形態では、標的指向性ドメインは、抗体の抗原結合ドメイン又はＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、三重特異性アンタゴニストは三重特異性抗体である。
【００６２】
例示的な二重特異性及び三重特異性抗体としては：非対称ＩｇＧ様抗体（例えばトリオマブ／クアドローマ、Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅｓ）抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；Ｃｒｏｓｓ  ｍＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）；静電気適合抗体（ＡＭＧＥＮ）；ＬＵＺ‐Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ストランド・エクスチェンジ・エンジニアード（ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ドメイン（ＳＥＥＤ）ボディ（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ；Ｂｉｏｌｏｎｉｃ、Ｍｅｒｕｓ）；Ｆａｂ交換抗体（Ｇｅｎｍａｂ）；対照ＩｇＧ様抗体（例えば二重標的（ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ＤＴ）‐Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）；  トゥ・イン・ワン（ｔｗｏ‐ｉｎ‐ｏｎｅ）抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；架橋ｍＡｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）；ｍＡｂ２（Ｆ‐ｓｔａｒ）；Ｃｏｖ  Ｘ‐ｂｏｄｙ（Ｃｏｖ  Ｘ／Ｐｆｉｚｅｒ）；二重可変ドメイン（ＤＶＤ）‐Ｉｇ融合（Ａｂｂｏｔｔ）；ＩｇＧ様二重特異性抗体（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）；Ｔｓ２Ａｂ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡＺ）；ＢｓＡｂ（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）；ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，ＴｖＡｂ、Ｒｏｃｈｅ）；ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合；ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）；二重親和性標的転換技術（Ｆｃ‐ＤＡＲＴ、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；二重（ｓｃＦｖ）２‐Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）；Ｆ（ａｂ）２融合（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）；二重作用又はＢｉｓ‐Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ドック・アンド・ロック（Ｄｏｃｋ‐ａｎｄ‐Ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）；Ｆａｂ‐Ｆｖ（ＵＣＢ‐Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ｓｃＦｖ及びダイアボディベース抗体（例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）；タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ、Ａｆｆｉｍｅｄ）；ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）；一本鎖ダイアボディ；ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｏｇｉｃｓ）；ヒト血清アルブミンｓｃＦｖ融合（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）；ＣＯＭＢＯＤＩＥＳ（Ｅｐｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；及びＩｇＧ／非ＩｇＧ融合（例えば免疫サイトカイン（ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ、Ｐｈｉｌｏｇｅｎ、ＩｍｍｕｎＧｅｎｅ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ））が挙げられる。
【００６３】
用語「治療する」及び「治療」は、細胞増殖性障害に関連する１つ以上の症状の改善；細胞増殖性障害の１つ以上の症状の発症の予防若しくは遅延；及び／又は細胞増殖性障害の１つ以上の症状の重篤度若しくは頻度の低減を指す。
【００６４】
句「それを必要とする患者」、「治療を必要とする患者」、又は「治療を必要とする被験者」は、細胞増殖性障害の治療のための本開示の抗腫瘍アンタゴニストの投与から利益を得る、哺乳類被験者等の被験者を含む。
【００６５】
用語「治療有効量」、「薬理学的有効量」、及び「生理学的有効量」は、血流又は標的組織中に閾値レベルの活性アンタゴニスト作用剤を提供するために必要な抗腫瘍アンタゴニストの量を意味するために、相互交換可能なものとして使用される。正確な量は、例えば特定の活性剤、成分、及び成分の物理的特徴、目的とする患者集団、患者の考慮事項等といった多数の因子に左右され、本明細書中で提供される情報、又は関連文献で入手できる情報に基づいて、当業者が容易に決定できる。
【００６６】
本文脈で使用される場合、用語「改善する」、「増大させる」、又は「低減する」は、本明細書に記載の治療を開始する前の同一個体における測定値、又は本明細書に記載の治療を受けない対照個体（若しくは複数の対照個体）における測定値といったベースライン測定値と比較した、値又はパラメータを示す。
【００６７】
「対照個体」は、治療を受ける個体と同一の細胞増殖性障害に苦しむ、（治療を受ける個体と１体以上の対照個体との疾患のステージが同等であることを保証するために）治療を受ける個体と概ね同年齢である、個体である。治療を受ける個体（「患者」又は「被験者」と呼ばれる場合もある）は、細胞増殖性障害を有するヒトの胎児、乳児、小児、青年、又は成人であってよい。
【００６８】
用語「細胞増殖性障害」は、細胞の異常増殖を特徴とする障害を指す。増殖性障害は、細胞成長の速度に関するいかなる制限も含意せず、単に成長及び細胞分裂に影響を及ぼす正常な制御の喪失を示す。従っていくつかの実施形態では、増殖性障害の細胞は、正常細胞と同一の細胞分裂速度を有し得るものの、このような成長を制限するシグナルに応答しない。「細胞増殖性障害」の範囲内には、新生物、癌、又は腫瘍が存在する。
【００６９】
用語「癌」又は「腫瘍」は、周囲の組織に侵入する、及び／又は新たな定着部位に転移する能力を有する、細胞の増殖を特徴とする多様な悪性新生物のいずれの１つを指し、白血病、リンパ腫、癌腫、黒色腫、肉腫、胚細胞腫瘍、及び芽細胞腫を含む。本開示の方法での治療のための例示的な癌としては、脳癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、中皮腫、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、及び子宮癌、白血病、並びに髄芽腫が挙げられる。
【００７０】
用語「白血病」は、造血器官の進行性悪性疾患を指し、一般に、血液及び骨髄中での白血球及びその前駆体の増殖及び発達の異常を特徴とする。例示的な白血病としては例えば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球症性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽球性白血病、血球始原細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ液性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ行性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ球白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血病性白血病、及び未分化細胞性白血病が挙げられる。
【００７１】
用語「癌腫」は、周辺組織に浸潤して転移を引き起こす傾向を有する、上皮細胞の悪性成長を指す。例示的な癌腫としては例えば、腺房癌（ａｃｉｎａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ａｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺腫性癌、副腎皮質の癌腫、肺胞癌、肺胞細胞癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底細胞上皮腫（ｂａｓｏｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛膜癌、膠様腺癌、面皰癌、子宮体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌、円柱腫、円柱細胞癌、乳管癌、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、小葉癌、浸潤性小葉癌、硬癌、胎児性癌、脳様癌、類表皮癌、腺様上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ  ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外向発育癌、潰瘍癌、線維性癌、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血液様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子様癌（ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎様腫、乳児胎児性癌、非浸潤性癌、表皮内癌、上皮内癌、クロンペッカー癌（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチッキー細胞癌（Ｋｕｌｃｈｉｔｚｋｙ‐ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、髄様癌、（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｄｕｌｌａｒｅ、ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、軟性腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌腫（ｍｕｃｉｎｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液分泌性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘表皮癌（ｍｕｃｏｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌（ｍｕｃｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨腫、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、粥状癌腫、腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫性癌、シュナイダー膜癌腫、スキルス癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ状癌（ｓｏｌａｎｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、ひも状癌、血管拡張性癌腫、末梢血管拡張性癌腫、移行上皮癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣贅性癌、及び絨毛癌が挙げられる。
【００７２】
用語「肉腫」は、胚性結合組織様の物質で構成され、一般に線維状の又は均質な物質に埋入された、密に詰まった細胞で構成される、腫瘍を指す。例示的な肉腫としては例えば、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪性肉腫、脂肪肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル芽細胞性肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞の免疫芽球性肉腫、リンパ腫（例えば非ホジキンリンパ腫）、Ｔ細胞の免疫芽球性肉腫、ジェンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、及び毛細血管拡張性肉腫が挙げられる。
【００７３】
用語「黒色腫」は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から発生する腫瘍を指す。黒色腫としては例えば、末端性黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング‐パッセー黒色腫、若年性黒色腫、黒子性悪性黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫、及び表層進展性黒色腫が挙げられる。．
【００７４】
更なる癌としては例えば、ホジキン病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板増加症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵インスラノーマ、悪性カルチノイド、前癌性皮膚病変、精巣癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、泌尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、及び副腎皮質癌が挙げられる。
【００７５】
Ｉ．三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト
本出願のある態様は、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストに関し、上記三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：タンパク質足場；免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する第１の標的指向性ドメイン；ＶＥＧＦに特異的に結合し、ＶＥＧＦＲ由来の１つ以上のペプチドドメインを含む、第２の標的指向性ドメイン；アンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路の阻害剤を含む第３の標的指向性ドメインを含み、上記第１の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のアミノ末端に位置し、上記第２の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のカルボキシ末端に位置する。いくつかの実施形態では、上記第３の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のＦｃループ中のＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【００７６】
組換えＤＮＡ技術によって生成される融合タンパク質（例えばＦｃ‐融合タンパク質）は多くの場合、宿主細胞由来プロテアーゼによる、細胞培養物中での完全な又は部分的な変質（クリッピング）という深刻な問題に直面する。クリッピングは、標的タンパク質の低分子量（ＬＭＷ）種を生成し、不活性ポリペプチドをもたらす。いずれの特定の理論によって束縛されることを望むものではないが、生物学的ペプチドの位置が、得られる融合タンパク質の変質の程度に影響を及ぼすという仮説が立てられている。本出願の発明者らは、ＦｃループのＣＨ３領域に第２の標的指向性ドメインを挿入することによって、得られる三重特異性アンタゴニストのクリッピングが大幅に低減されることを発見した。
【００７７】
本出願の別の態様は、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストに関し、上記三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：タンパク質足場；免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する第１の標的指向性ドメイン；ＶＥＧＦに特異的に結合し、ＶＥＧＦＲ由来の１つ以上のペプチドドメインを含む、第２の標的指向性ドメイン；及びＴＧＦ経路阻害剤を含む第３の標的指向性ドメインを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に位置し、上記第３の標的指向性ドメインは、上記第２の標的指向性ドメインのカルボキシ末端に位置する。いくつかの実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、第１のリンカーを介して、上記タンパク質足場のＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合される。いくつかの実施形態では、上記第３の標的指向性ドメインは、第２のリンカーを介して、上記第２の標的指向性ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合される。いくつかの実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、第１のリンカーを介して、上記タンパク質足場のＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合され、上記第３の標的指向性ドメインは、第２のリンカーを介して、上記第２の標的指向性ドメインのカルボキシ末端に構造的に結合される。本出願の発明者らは、このような構成が、対応するアンタゴニストに改善された薬物動態を与えることを、予想外に発見した。
【００７９】
いくつかの実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、配列番号１８５のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦＲ成分（アフリベルセプト）を含む。更なる実施形態では、上記ＶＥＧＦＲ成分は、アスパラギン酸残基をグルタミン酸残基で置換することによってａ‐グリコシル化される。ａ‐グリコシル化ＶＥＧＦＲ成分の例示的なアミノ酸配列は、配列番号２０７で例示されている。ａ‐グリコシル化ＶＥＧＦＲ成分を有する三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト多様体は、野生型アフリベルセプトに比べて改善された薬物動態を示しながら、ＶＥＧＦＲ生物活性を保持している。
【００８０】
本出願の別の態様は、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストに関し、上記三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：タンパク質足場；免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する第１の標的指向性ドメイン；ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む第２の標的指向性ドメイン；及びアンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む第３の標的指向性ドメインを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、上記第１の標的指向性ドメインは、ベバシズマブ又はその多様体を含み、上記第３の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のＦｃループの２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入される。いくつかの実施形態では、上記第１の標的指向性ドメインは、１つ以上の抗ＰＤ‐１可変ドメインを含み、上記第３の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のＦｃループの２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入される。いくつかの実施形態では、上記第１の標的指向性ドメインは、１つ以上の抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメインを含み、上記第３の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のＦｃループの２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入される。
【００８２】
いくつかの実施形態では、トレバナニブペプチドは、配列：AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE（配列番号１８２）を含む。特段の記載がない限り、「トレバナニブペプチド」及び指定「‐長鎖」又は「‐Ｌ」は、配列番号１８２の配列に対応し、これは、Ａｎｇ‐１／２遮断ペプチド配列QEECEWDPWTCEHM（配列番号１９４）の２つのコピーを含む。特定の実施形態では、本出願の三重特異性アンタゴニストは、指定「‐短鎖」又は「‐Ｓ」を伴う配列番号１９４に対応する配列の単一のコピーを含有する、トレバナニブペプチドの修飾されたバージョンを含む。
【００８３】
ＩＩ．二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト
本出願の別の態様は、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストに関し、上記二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：タンパク質足場；免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する第１の標的指向性ドメイン；及びアンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む第２の標的指向性ドメインを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、上記第１の標的指向性ドメインは、１つ以上の抗ＰＤ‐１又は抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメインを含み、上記第２の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のＦｃループの２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入される。
【００８５】
本出願の別の態様は、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストに関し、上記二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：タンパク質足場；免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する、第１の標的指向性ドメイン；及びＶＥＧＦＲ成分を含む第２の標的指向性ドメインを含む。
【００８６】
図４１Ａ〜４０Ｃは、例示的な二重特異性抗ＰＤ‐１／ＶＥＧＦＲ成分及び抗ＰＤ‐Ｌ１／ＶＥＧＦＲ成分分子である、Ｂｉ‐ＺＰＬ‐１及びＢｉ‐ＺＰＬ‐２、並びにＢｉ‐ＺＰＬ‐３を示し、これらはそれぞれ、Ｎ末端（図４１Ａ）又はカルボキシ末端（図４１Ｂ〜Ｃ）にアフリベルセプトを含有する。一実施形態では、Ｂｉ‐ＺＰＬ‐１は、配列番号２１８に記載の配列を含有する免疫グロブリン重鎖、及び／又は配列番号２１９に記載の配列を含有する免疫グロブリン軽鎖を有する。別の実施形態では、Ｂｉ‐ＺＰ‐１は、配列番号２２０に記載の配列を含有する免疫グロブリン重鎖、及び／又は配列番号２２１に記載の配列を含有する免疫グロブリン軽鎖を有する。
【００８７】
別の実施形態では、Ｂｉ‐ＺＰ‐２は、配列番号２２２に記載の配列を含有する免疫グロブリン重鎖、及び／又は配列番号２２３に記載の配列を含有する免疫グロブリン軽鎖を有する。別の実施形態では、Ｂｉ‐ＺＰＬ‐２は、配列番号２２４に記載の配列を含有する免疫グロブリン重鎖、及び／又は配列番号２２５に記載の配列を含有する免疫グロブリン軽鎖を有する。
【００８８】
別の実施形態では、Ｂｉ‐ＺＰＬ‐３は、配列番号２９６に記載の配列を含有する免疫グロブリン重鎖、及び／又は配列番号２９７に記載の配列を含有する免疫グロブリン軽鎖を有する。
【００８９】
本出願の別の態様は、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストに関し、上記二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：タンパク質足場；ベバシズマブを含む第１の標的指向性ドメイン；アンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む第２の標的指向性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のＦｃループ中のＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【００９０】
本出願の別の態様は、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストに関し、上記二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：Ｆｃ断片を含むタンパク質足場；ＶＥＧＦＲ成分を含む第１の標的指向性ドメイン；アンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む第２の標的指向性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のＦｃループ中のＣＨ３ドメイン内に挿入される。いくつかの実施形態では、上記タンパク質足場の上記Ｆｃ断片は、第２の標的指向性ドメインの挿入前に、配列番号２１０〜２１７からなる群から選択されるアミノ酸を含む。
【００９１】
本出願の別の態様は、二重特異性抗腫瘍アンタゴニストに関し、上記二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：Ｆｃ断片を含むタンパク質足場；ＴＧＦＢＲ２  ＥＣＤを含む第１の標的指向性ドメイン；アンジオポエチン／Ｔｉｅ‐２シグナル伝達経路のペプチド阻害剤を含む第２の標的指向性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、上記タンパク質足場のＦｃループ中のＣＨ３ドメイン内に挿入される。いくつかの実施形態では、上記タンパク質足場の上記Ｆｃ断片は、第２の標的指向性ドメインの挿入前に、配列番号２１０〜２１７からなる群から選択されるアミノ酸を含む。
【００９２】
本出願の二重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＩｇＧバックボーンを用いて構築できる。より具体的には、本出願の二重特異性アンタゴニストのいずれは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４バックボーンを用いて構築できる。ＩｇＧ１バックボーンの使用は癌治療に好ましく、この場合標的は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を仲介できる抗原提示細胞上に存在する。ＩｇＧ４バックボーンを使用すると、抗原結合のみで所望の治療的利益を十分に生成できる場合に、抗原を標的化できる。ＩｇＧ４系アンタゴニストは、例えばＩｇＧ１抗体に関連する、ＦｃγＲ結合及び補体活性化を含む望ましくないエフェクタ機能を排除する。
【００９３】
ＩＩＩ．標的指向性ドメイン
Ａ．免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する標的指向性ドメイン
免疫チェックポイント調節因子に特異的に結合する標的指向性ドメインとしては、限定するものではないが：（１）抗ＰＤ‐１抗体及び抗ＰＤ‐１抗体断片；（２）抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体断片；（３）抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＴＩＧＩＴ抗体断片；並びに（４）抗ＬＡＧ‐３抗体及び抗ＬＡＧ‐３抗体断片が挙げられる。
【００９４】
１．抗ＰＤ‐１抗体及び抗ＰＤ‐１抗体断片
いくつかの実施形態では、チェックポイント調節因子アンタゴニストは、抗ＰＤ‐１抗体又は抗体断片である。ある特定の実施形態では、本出願のＰＤ‐１阻害剤は、抗体又はその抗原結合部分であって：（１）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号４８、５１、５４、５６、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４９、５２、５７、及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号５０、５３、５５、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と；（２）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号６２、６５、６８、６９、７０、及び７３からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号６３、６６、７１、及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号６４、６７、７２、及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、抗体又はその抗原結合部分であり、上記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ‐１に特異的に結合する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本出願のＰＤ‐１阻害剤は：（１）配列番号１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、及び１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と；（２）配列番号１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、及び１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、抗体又はその抗原結合部分であり、上記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ‐１に特異的に結合する。
【００９６】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ‐１抗体又は抗体断片は：（１）配列番号５９のＨＣＤＲ１、配列番号６０のＨＣＤＲ２、及び配列番号６１のＨＣＤＲ３、並びに（２）配列番号３６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ１、配列番号３６０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ２、配列番号３７１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ３、配列番号３５７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ４を含む、重鎖可変領域と；（１）配列番号７３のＬＣＤＲ１、配列番号７４のＬＣＤＲ２、及び配列番号７５のＬＣＤＲ３、並びに（２）配列番号３７２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ１、配列番号３７３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ２、配列番号３７４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ３、配列番号３７５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ４を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域とを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体又は抗体断片は：（１）配列番号５６のＨＣＤＲ１、配列番号５７のＨＣＤＲ２、及び配列番号５８のＨＣＤＲ３、並びに（２）配列番号３６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ１、配列番号３６０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ２、配列番号３６７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ３、配列番号３５７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ４を含む、重鎖可変領域と；（１）配列番号７０のＬＣＤＲ１、配列番号７１のＬＣＤＲ２、及び配列番号７２のＬＣＤＲ３、並びに（２）配列番号３６８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ１、配列番号３６９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ２、配列番号３７０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ３、配列番号３６５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ４を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域とを含む。
【００９８】
用語「２Ｐ１７」又は「ＰＤ‐０６」は：（１）配列番号１３７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び（２）配列番号１３８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、本出願のＰＤ‐１阻害剤を指す。２Ｐ１７（又はＰＤ‐０６）のＣＤＲ及びＦＲ領域は、配列番号５９〜６１、７３〜７５、３５７、３６０、３６６、及び３７１〜３７５として列挙されている。
【００９９】
用語「２Ｐ１６」又は「ＰＤ‐０５」は：（１）配列番号１３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び（２）配列番号１３６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、本出願のＰＤ‐１阻害剤を指す。２Ｐ１６（又はＰＤ‐０５）のＣＤＲ及びＦＲ領域は、配列番号５６〜５８、７０〜７２、３５７、３６０、３６６、及び３６５〜３７０として列挙されている。
【０１００】
２．抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び抗ＰＤ‐Ｌ１抗体断片
一実施形態では、チェックポイント調節因子アンタゴニストは、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体又は抗体断片である。ある特定の実施形態では、本出願のＰＤ‐Ｌ１阻害剤は：（１）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号７６、７９、８５、及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号７７、８０、８２、８４、８６、及び８９からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号７８、８１、８３、８７、及び９０からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と；（２）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号９１、９４、９８、１０１、及び１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号９２、９５、９９、１０２、及び１０５からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号９３、９６、９７、１００、及び１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、抗体又はその抗原結合部分であり、上記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ‐Ｌ１に特異的に結合する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体又は抗体断片は：（１）配列番号７９のＨＣＤＲ１、配列番号８２のＨＣＤＲ２、及び配列番号８３のＨＣＤＲ３、並びに（２）配列番号３６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ１、配列番号３６０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ２、配列番号３８３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ３、配列番号３５７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ４を含む、重鎖可変領域と；（１）配列番号９１のＬＣＤＲ１、配列番号９２のＬＣＤＲ２、及び配列番号９３のＬＣＤＲ３、並びに（２）配列番号３７７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ１、配列番号３７８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ２、配列番号３７９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ３、配列番号３６５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ４を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域とを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本出願のＰＤ‐Ｌ１阻害剤は：（１）配列番号１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、及び１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と；（２）配列番号１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、及び１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、抗体又はその抗原結合部分であり、上記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ‐Ｌ１に特異的に結合する。好ましい実施形態では、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体の重鎖及び軽鎖は配列番号１５３〜１５４からなる。
【０１０３】
用語「ＰＬ‐０８」は：（１）配列番号１５３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び（２）配列番号１５４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、本出願のＰＤ‐Ｌ１阻害剤を指す。ＰＬ‐０８のＣＤＲ及びＦＲ領域は、配列番号７９、８２、８３、９１〜９３、３５７、３６０、３６５、３６６、３７７〜３７９、及び３８３として列挙されている。
【０１０４】
３．抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＴＩＧＩＴ抗体断片
いくつかの実施形態では、チェックポイント調節因子アンタゴニストは、抗ＴＩＧＩＴ抗体又は抗体断片である。ある特定の実施形態では、本出願のＴＩＧＩＴ阻害剤は：（１）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号１、６、１１、１５、１７、２０、及び２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号２、４、７、９、１２、１３、１６、１８、２１、及び２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号３、５、８、１０、１４、１９、２２、及び２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と；（２）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号２６、２９、３１、３３、３５、３９、４２、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号２７、３０、３６、３７、４０、４３、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号２８、３２、３４、３８、４１、４４、及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、抗体又はその抗原結合部分であり、上記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体又は抗体断片は：（１）配列番号２３のＨＣＤＲ１、配列番号２４のＨＣＤＲ２、及び配列番号２５のＨＣＤＲ３、並びに（２）配列番号３４３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ１、配列番号３３０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ２、配列番号３４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ３、配列番号３１９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ４を含む、重鎖可変領域と；（１）配列番号４５のＬＣＤＲ１、配列番号４６のＬＣＤＲ２、及び配列番号４７のＬＣＤＲ３、並びに（２）配列番号３０３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ１、配列番号３１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ２、配列番号３１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ３、配列番号３４５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ４を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域とを含む。
【０１０６】
別の実施形態では、本出願のＴＩＧＩＴ阻害剤は：（１）配列番号１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、及び１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と；（２）配列番号１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、及び１２６からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、抗体又はその抗原結合部分であり、上記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＴＩＧＩＴに特異的に結合する。好ましい実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１２５及び１２６からなる重鎖及び軽鎖の配列を有する。
【０１０７】
用語「Ｂ２１‐３５」又は「Ｔ‐１０」は：（１）配列番号１２５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び（２）配列番号１２６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、本出願のＴＩＧＩＴ阻害剤を指す。Ｂ２１‐３５（又はＴ‐１０）のＣＤＲ及びＦＲ領域は、配列番号２３〜２５、４５〜４７、３０３、３１１、３１７、３１９、３３０、及び３４３〜３４５として列挙されている。
【０１０８】
４．抗ＬＡＧ‐３抗体及び抗ＬＡＧ‐３抗体断片
一実施形態では、チェックポイント調節因子アンタゴニストは、抗ＬＡＧ‐３抗体又は抗体断片である。ある特定の実施形態では、本出願のＬＡＧ‐３阻害剤は：（１）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号１５５〜１５７からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号１５８〜１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号１６１〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と；（２）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号１６４〜１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号１６７及び１６８からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号１６９及び１７０からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、抗体又はその抗原結合部分であり、上記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＬＡＧ‐３に特異的に結合する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ‐３抗体又は抗体断片は：（１）配列番号１５６のＨＣＤＲ１、配列番号１５８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１６１のＨＣＤＲ３、並びに（２）配列番号３９９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ１、配列番号４００のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ２、配列番号４０１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ３、配列番号４０２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＨＦＲ４を含む、重鎖可変領域と；（１）配列番号１６４のＬＣＤＲ１、配列番号１６７のＬＣＤＲ２、及び配列番号１６９のＬＣＤＲ３、並びに（２）配列番号４０３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ１、配列番号４０４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ２、配列番号４０５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ３、配列番号４０６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、又は９０％の同一性を有するＬＦＲ４を含む、免疫グロブリン重鎖可変領域とを含む。
【０１１０】
他の実施形態では、本出願のＬＡＧ‐３阻害剤は：（１）配列番号１７１〜１７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と；（２）配列番号１７５〜１７８からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、抗体又はその抗原結合部分であり、上記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＬＡＧ‐３に特異的に結合する。好ましい実施形態では、抗ＬＡＧ‐３抗体は、配列番号１７１及び１７５からなる重鎖及び軽鎖の配列を有する。
【０１１１】
用語「２Ｌ２Ａ．１」は：（１）配列番号１７１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び（２）配列番号１７５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、本出願のＬＡＧ‐３阻害剤を指す。２Ｌ２Ａ．１のＣＤＲ及びＦＲ領域は、配列番号１５６、１５８、１６１、１６４、１６７、１６９、及び３９９〜４０６として列挙されている。
【０１１２】
Ｂ．血管新生経路成分に特異的に結合する標的指向性ドメイン
血管新生、即ち既に存在する血管からの新たな血管の発達は、腫瘍の成長及び転移のために重要である。血管新生の阻害は、進行（例えば転移）が血管新生に依存する癌等の疾患の治療のための、潜在的に価値のある戦略を提示する。血管新生の阻害は腫瘍細胞の死をもたらし、これにより、腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路に供給できる。
【０１１３】
２つの重要な血管新生経路として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）経路及びＴｉｅ２経路が挙げられる。
【０１１４】
１．ＶＥＧＦ経路アンタゴニスト及び阻害剤
主要なＶＥＧＦ経路は、膜透過性チロシンキナーゼＶＥＧＦ‐Ｒ２によって仲介される。ＶＥＧＦの様々なアイソフォーム、特にＶＥＧＦ‐Ａは、ＶＥＧＦ‐Ｒ１及びＶＥＧＦ‐Ｒ２に結合して、様々な下流のチロシンキナーゼのリン酸化によって、二量体化及び活性化をもたらす。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ経路アンタゴニストは、ＶＥＧＦ‐Ａ、又はその受容体ＶＥＧＦＲ‐１及びＶＥＧＦＲ‐２に結合し、この結合の結果として、ＶＥＧＦ‐ＡによるＶＥＧＦＲ‐１及びＶＥＧＦＲ‐２の活性化が遮断又は阻害される。血管新生阻害剤は、例えば抗体、可変ドメイン断片、又はドミナントネガティブ融合タンパク質断片の形態であってよい。
【０１１６】
例示的なドミナントネガティブ抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストは、ヒトＶＥＧＦ受容体１又は２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対応するタンパク質断片である。ある好ましい実施形態では、ドミナントネガティブ抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストは、アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））であり、これは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４  Ｆｃ断片と融合した、ヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメイン由来のＶＥＧＦ‐Ａ結合部分を含有する、組換え融合タンパク質である。アフリベルセプト等のＶＥＧＦＲ  ＥＣＤは、ＶＥＧＦ‐Ａのための可溶性受容体デコイとして作用する。
【０１１７】
（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標）としても知られる）アフリベルセプトは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ部分と融合したヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメイン由来の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）結合部分からなる、組換えＶＥＧＦ融合タンパク質である。アフリベルセプトは、循環中の可溶性リガンドを含む、ＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦ‐Ｂ、抗胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）‐１及びＰＩＧＦ‐２を含む血管新生に関与する複数のリガンドに結合する。
【０１１８】
ある好ましい実施形態では、本明細書に記載の三重特異性抗腫瘍アンタゴニストのアフリベルセプトドメインは、アスパラギン酸（Ａｓｎ、Ｎ）残基をグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）残基で置換することによって、ａ‐グリコシル化される。Ｎ‐結合型グリコシル化は、タンパク質のＡｓｎ残基の窒素原子（アミド窒素）へのグリカンの付着である。グリコシル化されるＡｓｎ残基は、一次構造の特定のコンセンサス配列（Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｓｅｒ又はＡｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ（ここでＸは、プロリン以外のいずれのアミノ酸を指す）に配置されている必要がある。Ａｓｎ残基をＧｌｕ残基（又は他のいずれのアミノ酸残基）で置換することにより、これらの部位でグリコシル化は発生しない。上述の特定のコンセンサス配列に配置された１つ以上のＡｓｎ残基は置換可能である。
【０１１９】
アシアロ糖タンパク質受容体１及び２（ＡＳＧＲ１及びＡＳＧＲ２）は、露出した末端ガラクトース又はＮ‐アセチルガラクトサミン残基を有する糖タンパク質のエンドサイトーシス及びリソソーム分解を仲介することによって、血清糖タンパク質ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす、膜透過性タンパク質である。場合によっては、タンパク質のグリコシル化は、ＡＳＧＲ１及びＡＳＧＲ２によるクリアランスの上昇をもたらす可能性がある。ＶＥＧＦＲ成分ドメインを有する三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの薬物動態を改善する（即ち、より長い半減期を達成する）ために、本出願の発明者らは、ＡＳＧＲ１及びＡＳＧＲ２によるタンパク質のクリアランスを制限するための、ＶＥＧＦＲ成分のａ‐グリコシル化多様体を生成した。ａ‐グリコシル化ＶＥＧＦＲ成分を有する三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト多様体は、ＶＥＧＦＲ生物活性を保持しながら、薬物動態のアルファ相をグリコシル化ＶＥＧＦＲ成分に比べて約５倍改善する。図３７を参照されたい。アフリベルセプトＶＥＧＦ結合ドメインの例示的なアミノ酸配列は、配列番号１８５、即ちSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKに示されており、ａ‐グリコシル化アフリベルセプトＶＥＧＦ結合ドメインの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２０７、即ちSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPEITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISEATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLECTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKESTFVRVHEKに示されている。置換部位には下線が付されている。
【０１２０】
例示的なＶＥＧＦ抗体アンタゴニストは、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））というヒト化抗体である。ベバシズマブは、変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域（ＦＲ）と、ＶＥＧＦＲ‐２に対するヒトＶＥＧＦ‐Ａの結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域とを含む。ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％（フレームワーク領域の大半を含む）は、ヒトＩｇＧ１由来であり、上記配列の約７％はマウス抗体Ａ４．６．１由来である。ベバシズマブは、約１４９，０００ダルトンの分子質量を有し、グリコシル化されている。特定の実施形態では、米国特許第７，５７５，８９３号に記載されているように、ベバシズマブ／Ａｖａｓｔｉｎ抗体にアミノ酸置換が含まれていてよい（配列番号２２６〜２２７）。例示的なアミノ酸置換としては、限定するものではないが、Ｅ１Ｑ、Ｅ６Ｑ、Ｌ１１Ｖ、Ｑ１３Ｋ、Ｌ１８Ｖ、Ｒ１９Ｋ、Ａ２３Ｋ、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２１】
更なる抗ＶＥＧＦ抗体としては：ベバシズマブと同一の親マウス抗体に由来するモノクローナル抗体断片である、ラニビズマブ（商品名：Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））（配列番号２９４〜２９５）；米国公開特許第２００６／０２８０７４７号、米国公開特許第２００７／０１４１０６５号、及び／又は米国公開特許第２００７／００２０２６７号に記載されているＧ６又はＢ２０シリーズ抗体（例えばＧ６‐２３、Ｇ６‐３１、Ｂ２０‐４．１）；並びに米国特許第７，２９７，３３４号、米国特許第７，０６０，２６９号、米国特許第６，８８４，８７９号、米国特許第６，５８２，９５９号、米国特許第６，７０３，０２０号、米国特許第６，０５４，２９７号、米国特許出願公開第２００７／０５９３１２号、米国特許出願公開第２００６／００９３６０号、米国特許出願公開第２００５／０１８６２０８号、米国特許出願公開第２００３／０２０６８９９号、米国特許出願公開第２００３／０１９０３１７号、及び米国特許出願公開第２００３／０２０３４０９号に記載の抗体が挙げられる。
【０１２２】
例示的な抗ＶＥＧＦＲ‐２抗体アンタゴニストは、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるラムシルマブであり、これは、ＶＥＧＦＲ‐２の細胞外ドメインに結合することによって、ＶＥＧＦＲ‐２とＶＥＧＦ‐Ａとの相互作用を遮断する。更なる抗ＶＥＧＦＲ‐２抗体は、米国特許第７，４９８，４１４号、米国特許第６，４４８，０７７号、及び米国特許第６，３６５，１５７号に記載されている。
【０１２３】
ＶＥＧＦ経路の例示的な小分子アンタゴニストとしては、スニチニブ、ソラフェニブ、セディナニブ、パゾパニブ、及びニンテダニブを含む、ＶＥＧＦＲ‐２のマルチキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０１２４】
２．Ｔｉｅ２経路アンタゴニスト及び阻害剤
Ｔｉｅ２経路は、そのための治療用抗体及び小分子薬剤が開発されている、別の血管新生経路である。Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体は、そのアンジオポエチン（Ａｎｇ）リガンド（即ちＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３（マウス）、及びＡｎｇ４）による結合に応答して、血管新生を活性化する。Ｔｉｅ２経路アンタゴニストは、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体又はそのアンジオポエチン（Ａｎｇ）リガンド（即ちＡｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、及びＡｎｇ‐４）のうちの１つに結合し、その結合の結果として、そのリガンドのうちの１つ以上によるＴｉｅ２受容体の活性化を遮断又は阻害する。
【０１２５】
一実施形態では、Ｔｉｅ２受容体結合アンタゴニストは阻害性ペプチドである。別の実施形態では、上記阻害性ペプチドは、配列番号１８２のアミノ酸配列、即ちAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLEを含む。別の実施形態では、Ｔｉｅ２受容体結合アンタゴニストは、Ｆｃ断片のＣ末端に融合した配列番号１８２のペプチド、即ちDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE（配列番号１８３）を含む。別の実施形態では、上記阻害性ペプチドは、アミノ酸配列QEECEWDPWTCEHM（配列番号１９４）の単一のコピーを含む。
【０１２６】
別の実施形態では、上記阻害性ペプチドは、Ｆｃループ中の２つのＣＨ３領域それぞれに組み込まれる。このループ領域は、αヘリックス又はβシートでないタンパク質中の不規則な二次構造であるが、βシートをβシートに、βシートをαヘリックスに、又はαヘリックスをαヘリックスに接続する。上記阻害性ペプチドは、挿入によって（即ち既存のＦｃループ中のアミノ酸の間に）、又は既存のＦｃループ中のアミノ酸の置換によって（即ち既存のＦｃループ中のアミノ酸を除去してペプチドアミノ酸を付加することによって）、付加できる。
【０１２７】
例示的なＦｃ断片は、配列番号２０８のアミノ酸配列、即ちDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKを含む。上述のループ領域は太字になっている。太字で示されている部位は全て、阻害性ペプチド配列による完全な若しくは部分的な置換、又は阻害性ペプチド配列の挿入に好適であり得る。特に好ましい置換及び挿入部位には下線が付されている。
【０１２８】
別の実施形態では、阻害性ペプチドは、配列番号２０９、即ちSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLEGGTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKに示されているように、Ｆｃ残基であるＭｅｔとＬｙｓとの間の、配列ＥＥＭＴＫとして画定されるＦｃ領域に挿入され、２つのＧｌｙ残基を、挿入されるペプチドの両側に隣接するリンカーとして含む。Ｇｌｙリンカーは斜字体になっており、阻害性ペプチドの挿入には下線が付されている。挿入部位は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３の図１３Ａ〜１４Ｂにも示されている。重鎖中で、第１の下線セクションは抗ＰＤ‐１可変ドメインに対応し、第２の下線セクションはＦｃループに挿入されたトレバナニブペプチドに対応し、第３の下線セクションはカルボキシ末端に融合したアフリベルセプトドメインに対応する。
【０１２９】
Ｔｉｅ２活性化の他のペプチド阻害剤（Ａｎｇ‐２阻害剤を含む）としては：アミノ酸配列ETFLSTNKLENQ（配列番号１８４）を含むＡ‐１１（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）；アミノ酸配列NSLSNASEFRAPY（配列番号１９５）を有するペプチド；アミノ酸配列NLLMAAS（配列番号１９６）を有するペプチド；ＣＶＸ‐０６０ペプチド（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＶＸ‐０３７ペプチド（Ｐｆｉｚｅｒ）；及びＣＧＥＮ‐２５０１７（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）が挙げられる。Ｔｉｅ２活性化の更なるペプチド阻害剤は、米国特許第７，１３８，３７０号に記載されている。アンジオポエチン‐１又はアンジオポエチン‐２の例示的なペプチド阻害剤は、米国特許第７，１３８，３７０号、米国特許第７，５２１，０５３号、米国特許第７，６５８，９２４号、及び米国特許第８，０３０，０２５号に記載されている。
【０１３０】
Ｔｉｅ２活性化（及び／又はアンジオポエチン‐２）の抗体阻害剤としては：ＡＭＧ‐７８０（Ａｍｇｅｎ）；ＭＥＤＩ‐３６１７（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＤＸ‐２２４０（Ｄｙａｘ／Ｓａｎｏｆｉ‐Ａｖｅｎｔｉｓ）；ＲＥＧＮ‐９１０（Ｓａｎｏｆｉ／Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；ＲＧ７５９４（Ｒｏｃｈｅ）；ＬＣ０６（Ｒｏｃｈｅ）；ＴＡｖｉ６（Ｒｏｃｈｅ）；ＡＴ‐００６（Ｒｏｃｈｅ／Ａｆｆｉｔｅｃｈ）が挙げられる。更なるＴｉｅ２受容体結合抗体アンタゴニスト、及びこれに由来する抗体結合配列は、米国特許第６，３７６，６５３号、米国特許第７，５２１，０５３号、米国特許第７，６５８，９２４号、米国特許第８，０３０，０２５号、並びに米国特許出願公開第２０１３／００７８２４８号、米国特許出願公開第２０１３／０２５９８５９号、及び米国特許出願公開第２０１５／０１９７５７８号に記載されている。
【０１３１】
Ｔｉｅ２結合アンタゴニストとしては、小分子分子阻害剤であるＣＧＩ‐１８４２（ＣＧＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＬＰ‐５９０（Ｌｏｃｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＡＣＴＢ‐１００３（Ａｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）、ＣＥＰ‐１１９８１（Ｃｅｐｈａｌｏｎ／Ｔｅｖａ）、ＭＧＣＤ２６５（Ｍｅｔｈｙｌｇｅｎｅ）、レゴラフェニブ（Ｂａｙｅｒ）、カボザンチニブ／ＸＬ‐１８４／ＢＭＳ‐９０７３５１（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、フォレチニブ（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＭＧＣＤ‐２６５（ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ  Ｉｎｃ．）も挙げられる。
【０１３２】
Ｃ．ＴＧＦ経路阻害剤
ＴＧＦ‐βは、細胞増殖及び分化、遊走及び接着、腫瘍間質及び免疫抑制を含む細胞外マトリックス修飾、血管新生及び線維形成、アポトーシス、並びに他の機能を多数の細胞タイプにおいて制御する、ペプチドの多機能セットを含む。ＴＧＦ‐βは血管新生の強力な誘導因子であり、これは固形腫瘍の重要なサポートシステム、及び腫瘍細胞の播種の機序を提供する。多くの細胞がＴＧＦ‐βを合成し、これらのうちのほとんど全てが、これらのペプチドに対する特異的受容体を有する。ＴＧＦ‐β１、ＴＧＦ‐β２、及びＴＧＦ‐β３は全て、同一の受容体シグナル伝達系を介して機能する。ＴＧＦ‐βの活性形態は、セリンスレオニン１型及び２型受容体、それぞれＴＧＦ‐β  ＲＩ及びＴＧＦβ  ＲＩＩで構成される膜結合ヘテロ四量体の形成を介してシグナルを送る二量体である。
【０１３３】
近年、ＴＧＦ‐β経路阻害剤が、ＴＧＦ‐β１又はＴＧＦ‐β１  ＲＩＩに対する抗体又は結合断片、例えばＴＧＦ‐β１  ＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含有するドミナントネガティブ融合タンパク質断片の形態で、開発されている。本明細書中で更に説明されるように、ＴＧＦβ１  ＲＩＩ  ＥＣＤは、腫瘍成長及び播種の中心である更なるチェックポイント調節因子経路又は血管新生経路を標的とする、更なる結合剤と組み合わされている。例示的なヒトＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ  ＥＣＤ（野生型）は、配列番号１８６に記載のアミノ酸配列を有する。
【０１３４】
ＴＧＦ‐β経路阻害剤は例えば：ＴＧＦ‐β１若しくはＴＧＦ‐β１  ＲＩＩに対する抗体若しくは可変ドメイン断片；ＴＧＦ結合ペプチド；又はＴＧＦ‐β１  ＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）等のドミナントネガティブ融合タンパク質断片の形態であってよい。特定の実施形態では、二重特異性又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ  ＥＣＤを含む。特定の実施形態では、二重特異性又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ  ＥＣＤを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ  ＥＣＤは、例えば図３０Ａ及び３０Ｅに示すように、二重特異性又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト中のＩｇＧのカルボキシ末端に融合する。他の実施形態では、ＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ  ＥＣＤは、例えば図３０Ｂ及び３０Ｄに示すように、二重特異性又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト中のＩｇＧのアミノ末端に融合する。更に他の実施形態では、ＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ  ＥＣＤは、例えば図３０Ｃ及び３０Ｆに示すように、二重特異性又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト中のＩｇＧのＩｇＧ  Ｆｃ断片（即ちＣＨ２又はＣＨ３領域）内に挿入される。
【０１３５】
例示的な抗ＴＧＦ‐β１抗体は、米国特許第７，０６７，６３７号、米国特許第７，４９４，６５１号、米国特許第７，５２７，７９１号、及び米国特許第７，６１９，０６９号に記載されている。例示的な抗ＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ抗体は、米国特許第７，５７９，１８６に記載されている。ＴＧＦ‐β１の例示的なペプチド阻害剤は、KRIWFIPRSSWYERA（配列番号１９７）である。
【０１３６】
Ｄ．標的指向性ドメインの全体的な構成
抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ、抗アンジオポエチン‐１／２、及び／又は抗Ｔｉｅ２受容体アンタゴニストのうちのいずれの１つは、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦｖ、又は二重特異性及び三重特異性アンタゴニスト等の多重特異性アンタゴニストの形態とすることができる。更に、本明細書に記載のアンタゴニストのいずれは、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ‐３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、アンジオポエチン、及び／又はＴｉｅ２受容体を標的とする多重結合特異性を有することができる。更に、抗体アンタゴニストのいずれは、所与の標的中の複数のエピトープを標的とするように操作されていてよい。更に、いくつかの実施形態では、チェックポイントアンタゴニスト及び／又は血管新生特異性が、対応する受容体に由来する細胞外ドメイン（ＥＣＤ）等のドミナントネガティブ融合タンパク質の形態で含まれていてよい。
【０１３７】
本明細書に記載のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、自然に発生するＣＨ１‐ＣＨ２‐ＣＨ３領域、あるいは自然に発生しない若しくは変異したＦｃ（ＣＨ２‐ＣＨ３）領域、例えばエフェクタ機能を有しない若しくはほとんど有しないＦｃ（例えばヒトＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４）、又は腫瘍環境下でのＴｒｅｇ枯渇を強化するために１つ以上の活性化Ｆｃ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ若しくはＦｃγＲＩＩＩａ）への結合が強化されたＦｃに対して、構造的に結合され得る。従って特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ  ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、典型的には血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害性といった抗体の１つ以上の機能的特性を変化させるために、１つ以上の修飾を含むＣＨ１‐ＣＨ２‐ＣＨ３に構造的に結合され得る。更に、本明細書に記載の抗体は、抗体の１つ以上の機能的特性を変化させるために、化学的に修飾されていてよく（例えば１つ以上の化学的部分を抗体に付着させることができ）、又はそのグリコシル化を変化させるように修飾されていてよい。より具体的には、特定の実施形態では、本出願の抗体は、Ｆｃ領域に修飾を含んでよく、これにより、親Ｆｃと比較して、（ａ）抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が上昇若しくは低下し、（ｂ）補体介在性細胞傷害性（ＣＤＣ）が上昇若しくは低下し、（ｃ）Ｃ１ｑに対する親和性が上昇若しくは低下し、及び／又は（ｄ）Ｆｃ受容体に対する親和性が上昇若しくは低下した、Ｆｃ多様体が生成される。このようなＦｃ領域多様体は一般に、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含むことになる。複数のアミノ酸修飾を組み合わせることは、特に望ましいものと考えられる。例えば多様体Ｆｃ領域はその中に、例えば本明細書中で同定されている特定のＦｃ領域の位置の、２つ、３つ、４つ、５つ等の置換を含んでよい。
【０１３８】
エフェクタ機能が完全に回避されるべき用途、例えば所望の治療的利益の生成には抗原結合だけで十分であり、エフェクタ機能が望ましくない副作用をもたらす（又はそのリスクを上昇させる）だけである場合に関しては、ＩｇＧ４抗体を使用してよく、又はＦｃ領域若しくはその実質的な部分を欠いた抗体若しくは断片を考えることができ、又はＦｃを変異させてグリコシル化（例えばＮ２９７Ａ）を完全に排除してよい。あるいは、エフェクタ機能を欠き、ＦｃγＲ（ＩｇＧ２等）に結合して補体（ＩｇＧ４等）を活性化する能力を欠いた、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域）とヒトＩｇＧ４（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）とのハイブリッド構築物を生成してよい。ＩｇＧ４定常ドメインを使用する場合、置換Ｓ２２８Ｐを含むことが好ましい場合が多く、これは、ＩｇＧ１のヒンジ配列を模倣することによってＩｇＧ４分子を安定させ、治療用抗体と、治療を受ける患者の内因性ＩｇＧ４との間での、Ｆａｂアームの交換を減少させる。
【０１３９】
特定の実施形態では、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ、抗アンジオポエチン、及び抗Ｔｉｅ２Ｒ抗体、又はこれらの断片を修飾することによって、その生物学的半減期を増大させてよい。例えばＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を上昇させるアプローチを含む、様々なアプローチを採用できる。一実施形態では、米国特許第５，８６９，０４６号、及び米国特許第６，１２１，０２２号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、抗体をＣＨ１又はＣＬ領域内で変化させる。Ｆｃ領域内の残基の番号付与は、ＥＵインデックスのものである。本明細書で開示される配列多様体は、残基番号と、これに続く、自然に発生するアミノ酸の代わりとなるアミノ酸とを参照して提供され、必要に応じて、その位置の自然に発生する残基がその前に記載される。所与の位置に複数のアミノ酸が存在し得る場合、例えば配列が自然に発生する複数のアイソタイプ間で異なる場合、又は複数の変異がその位置において置換され得る場合、これらはスラッシュで区切られる（例えば「Ｘ／Ｙ／Ｚ」）。
【０１４０】
ＦｃＲｎへの結合を増大させる、及び／又は薬物動態特性を改善する、例示的なＦｃ多様体は、２５９、３０８、及び４３４位の置換を含み、これらは例えば、２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、及び４３４Ｍを含む。ＦｃＲｎへのＦｃの結合を増大させる他の多様体としては：２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９（８）：６２１３‐６２１６、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７６：３４６‐３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１  ＩＡ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６（９）：６５９１‐６６０４）、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６９：５１７１‐５１８０，  Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８１：２３５１４‐２３５２４、及び米国特許第８，３６７，８０５号）が挙げられる。
【０１４１】
Ｎ４３４Ａ多様体（Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８２：７６６３）等の、ＩｇＧ  Ｆｃ中の特定の保存された残基の修飾（１２５３、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｈ４３３、Ｎ４３４）が、ＦｃＲｎ親和性を上昇させることによって循環中の抗体の半減期を増大させる方法として提案されている（国際公開特許第９８／０２３２８９号）。Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを含む複合Ｆｃ多様体は、ＦｃＲｎ結合を増大させ、半減期を最大５倍まで増大させることが示されている（Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２８：１５７）。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、及びＮ４３４Ａ修飾を含む複合Ｆｃ多様体もまた、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長する（Ｐｅｔｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８：１７５９）。更に、Ｍ２５２Ｙ‐Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｍ、及びＭ４２８Ｌ‐Ｎ４３４Ｓ多様体を含む複合Ｆｃ多様体もまた、半減期を延長することが示されている（米国公開特許第２００６／１７３１７０号）。更に、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅを含む複合Ｆｃ多様体は、半減期を４倍近く増大させることが報告されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８１：２３５１４）。
【０１４２】
ＩＶ．三重特異性アンタゴニストの好ましい実施形態
一実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、及び１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、及び１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）本明細書中で更に説明されるように、１つ以上の抗ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は１つ以上の抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）本明細書中で更に説明されるように、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、Ａｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、又はＡｎｇ‐４に特異的に結合する生物学的ペプチドを含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１４３】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）本明細書中で更に説明されるように、１つ以上の抗ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は１つ以上の抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）本明細書中で更に説明されるように、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、Ａｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、又はＡｎｇ‐４に特異的に結合する生物学的ペプチドを含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１４４】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）本明細書中で更に説明されるように、１つ以上の抗ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は１つ以上の抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）本明細書中で更に説明されるように、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、Ａｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、又はＡｎｇ‐４に特異的に結合する生物学的ペプチドを含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１４５】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号４８、５１、５４、５６、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４９、５２、５７、及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号５０、５３、５５、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号６２、６５、６８、６９、７０、及び７３からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号６３、６６、７１、及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号６４、６７、７２、及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）本明細書中で更に説明されるように、１つ以上の抗ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は１つ以上の抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）本明細書中で更に説明されるように、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、Ａｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、又はＡｎｇ‐４に特異的に結合する生物学的ペプチドを含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。ある好ましい実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１４６】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号５９のアミノ酸配列と約８０％又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号６０のアミノ酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号６１のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号７３のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号７４のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号７５のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）本明細書中で更に説明されるように、１つ以上の抗ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は１つ以上の抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）本明細書中で更に説明されるように、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、Ａｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、又はＡｎｇ‐４に特異的に結合する生物学的ペプチドを含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１４７】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号５６のアミノ酸配列と約８０％又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号５７のアミノ酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号５８のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号７０のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号７１のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号７２のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）本明細書中で更に説明されるように、１つ以上の抗ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は１つ以上の抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）本明細書中で更に説明されるように、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、Ａｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、又はＡｎｇ‐４に特異的に結合する生物学的ペプチドを含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１４８】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）１つ以上の抗ＰＤ‐１可変ドメイン又は１つ以上の抗ＰＤ‐Ｌ１可変ドメインを含む１つ以上の可変領域によって与えられる、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（又はＺａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）本明細書中で更に説明されるように、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、Ａｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、又はＡｎｇ‐４に特異的に結合する生物学的ペプチドを含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１４９】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）本明細書中で更に説明されるように、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、Ａｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、又はＡｎｇ‐４に特異的に結合する生物学的ペプチドを含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１５０】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）本明細書中で更に説明されるように、Ｔｉｅ２チロシンキナーゼ受容体、Ａｎｇ‐１、Ａｎｇ‐２、Ａｎｇ‐３、又はＡｎｇ‐４に特異的に結合する生物学的ペプチドを含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１５１】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）配列番号１９４のアミノ酸配列を１つだけ含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１５２】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）配列番号１９４のアミノ酸配列を１つだけ含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１５３】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１５４】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはＣＨ３ドメイン内に挿入される。
【０１５５】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号１９８、２００、２０２、２０３、及び２０４からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖と；配列番号１９９及び２０１からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖とを含む。
【０１５６】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号１９８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖と；配列番号１９９のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖とを含む。
【０１５７】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号２００のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖と；配列番号２０１のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖とを含む。
【０１５８】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号２０２のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖と；配列番号２０１のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖とを含む。
【０１５９】
図３Ａ〜図４Ｃは、様々な異なる三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを示し、ここで：（１）ＶＨ１及びＶＬ１領域は、抗ＰＤ‐１可変ドメイン又は他のチェックポイント抗体に対応し；（２）二重の卵型はアフリベルセプト融合タンパク質ドメインに対応し；（３）円はトレバナニブペプチドに対応する。図５Ａ〜５Ｅは、様々な異なる三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを示し、ここで：（１）ＶＨ１及びＶＬ１領域は、抗ＰＤ‐１可変ドメイン又は別のチェックポイント抗体に対応し；（２）ベバシズマブ又は別の抗ＶＥＧＦ‐Ａ抗体のＶＨ及びＶＬ；（３）円はトレバナニブペプチドに対応する。これらの図に示されているように、これらの成分は、複数の構成に再配置できる。例えばトレバナニブペプチドは、以下の位置：（ｉ）各ＩｇＧ４  ＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合した位置（図３Ａ〜３Ｄ）；（ｉｉ）２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入された位置（図３Ｅ、図４Ａ、及び図５Ａ）；（ｉｉｉ）各ＣＨ１領域のカルボキシ末端に融合した位置（図３Ｆ、図４Ｃ、図５Ｃ〜５Ｅ）；（ｉｖ）各アフリベルセプト融合タンパク質ドメインのカルボキシ末端に融合した位置（図３Ｇ）；（ｖ）各ＣＬ領域のカルボキシ末端に融合した位置（図３Ｈ、図５Ｂ）；又はＣＨ２ドメインのアミノ末端に融合した位置（図４Ｂ）に配置される。
【０１６０】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、及び１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、及び１３８からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）抗ＶＥＧＦアンタゴニスト、又は抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストを含む、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。一実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインは、カルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１６１】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）抗ＶＥＧＦアンタゴニスト、又は抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストを含む、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインは、カルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１６２】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）抗ＶＥＧＦアンタゴニスト、又は抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストを含む、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインは、カルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１６３】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号４８、５１、５４、５６、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号４９、５２、５７、及び６０からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号５０、５３、５５、５８、及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号６２、６５、６８、６９、７０、及び７３からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号６３、６６、７１、及び７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号６４、６７、７２、及び７５からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）抗ＶＥＧＦアンタゴニスト、又は抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストを含む、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインは、カルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１６４】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号５９のアミノ酸配列と約８０％又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号６０のアミノ酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号６１のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号７３のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号７４のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号７５のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）本明細書中で更に説明されるように、１つ以上の抗ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は１つ以上の抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインは、カルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１６５】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）重鎖可変領域であって、上記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は、配列番号５６のアミノ酸配列と約８０％又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号５７のアミノ酸配列と約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号５８のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）軽鎖可変領域であって、上記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号７０のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号７１のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号７２のアミノ酸配列と約８０％、約９０％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）本明細書中で更に説明されるように、１つ以上の抗ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は１つ以上の抗ＶＥＧＦＲアンタゴニストによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインは、カルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１６６】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第１の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはカルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１６７】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第1の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはカルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１６８】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第1の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するａ‐グリコシル化アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはカルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１６９】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第1の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するａ‐グリコシル化アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）ＴＧＦ‐β経路阻害剤を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはカルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１７０】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第1の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）配列番号１８６のアミノ酸配列を有するＴＧＦβ１  ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはカルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１７１】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第1の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するアフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）配列番号１８６のアミノ酸配列を有するＴＧＦβ１  ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはカルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１７２】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第1の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３８のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するａ‐グリコシル化アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）配列番号１８６のアミノ酸配列を有するＴＧＦβ１  ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはカルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１７３】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：（１）第1の標的指向性ドメインであって、（ａ）配列番号１３５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖可変領域と、（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖可変領域とを含む、第１の標的指向性ドメインと；（２）配列番号１８５のアミノ酸配列を有するａ‐グリコシル化アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ（登録商標））ドメインによって与えられる、第２の標的指向性ドメインと；（３）配列番号１８６のアミノ酸配列を有するＴＧＦβ１  ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、第３の標的指向性ドメインとを含む。別の実施形態では、上記第２の標的指向性ドメインは、アンタゴニストのカルボキシ末端のＣＨ３ドメインの下流に挿入され、上記第３の標的指向性ドメインはカルボキシ末端の第２の標的指向性ドメインの下流に挿入される。
【０１７４】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号１８７、１８９、１９０、１９２、２０５、及び２０６からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖と；配列番号１８８、１９１、及び１９３からなる群から選択されるアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖とを含む。
【０１７５】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号１９２のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖と；配列番号１９３のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖とを含む。
【０１７６】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号２０５のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖と；配列番号１９３のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖とを含む。
【０１７７】
他の実施形態では、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは：配列番号２０６のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、重鎖と；配列番号１９３のアミノ酸配列と約８０％〜約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、軽鎖とを含む。
【０１７８】
本出願の三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、ＩｇＧバックボーンを用いて構築できる。より具体的には、本出願のいずれの三重特異性アンタゴニストは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４バックボーンを用いて構築できる。ＩｇＧ１バックボーンの使用は癌治療に好ましく、この場合標的は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を仲介できる抗原提示細胞上に存在する。ＩｇＧ４バックボーンを使用すると、抗原結合のみで所望の治療的利益を十分に生成できる場合に、抗原を標的化できる。ＩｇＧ４系アンタゴニストは、例えばＩｇＧ１抗体に関連する、ＦｃγＲ結合及び補体活性化を含む望ましくないエフェクタ機能を排除する。
【０１７９】
Ｖ．抗腫瘍アンタゴニストの使用方法
抗ＰＤ‐１アンタゴニスト、抗ＰＤ‐１抗体断片、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体断片、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体断片、抗ＬＡＧ‐３抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体断片、血管新生経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、並びにＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ‐３、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ、ＴＧＦβ／ＴＧＦβ受容体に特異的に結合する二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト及び三重特異性抗腫瘍アンタゴニストといった、本出願の抗腫瘍アンタゴニストは、例えば免疫応答の強化、及び癌、感染症、又は自己免疫疾患の治療を含む、多数の試験管内及び生体内利用法を有する。
【０１８０】
Ａ．抗腫瘍療法
いくつかの実施形態では、本出願の抗腫瘍アンタゴニストを、培養中、試験管内、若しくは生体外の細胞に、又はヒト被験者、例えば生体内に投与して、多様な疾患における免疫を強化する。従って、本明細書で提供されるのは、被験者における免疫応答を改変する方法であって、上記方法は、上記被験者に、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片を投与することにより、上記被験者の免疫応答を強化する、刺激する、又は上方制御するステップを含む。好ましい被験者としては、免疫応答の強化が望まれるヒト患者が挙げられる。上記方法は特に、免疫応答（例えばＴ細胞仲介型免疫応答）の増強によって治療できる障害を有するヒト患者の治療に好適である。上記方法は特に、生体内の癌又は慢性感染の治療に公的である。例えば、抗原特異的免疫を強化するために、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、若しくは抗ＬＡＧ‐３組成物を、関心対象の抗原と共に投与してよく、又は上記抗原が、治療対象の被験者（例えば担腫瘍若しくは担ウイルス被験者）の体内に既に存在していてもよい。抗ＴＩＧＩＴ抗体を別の作用剤と共に投与する場合、これら２つを別個に投与しても、同時に投与してもよい。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、上述の方法で使用されるチェックポイント調節因子アンタゴニストは、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、これらの断片、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、チェックポイント調節因子アンタゴニストは、本出願の二重特異性又は三重特異性抗体である。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、チェックポイント調節因子アンタゴニスト、又は抗腫瘍アンタゴニストは、抗体又は抗体断片の形態である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。
【０１８３】
また、サンプル中のヒトＰＤ‐１、ヒトＰＤ‐Ｌ１、ヒトＴＩＧＩＴ、又はヒトＬＡＧ‐３の存在を検出及び／又は測定するための方法も包含され、上記方法は、上記サンプル及び対照サンプルを、ヒトＰＤ‐１、ヒトＰＤ‐Ｌ１、ヒトＴＩＧＩＴ、又はヒトＬＡＧ‐３に特異的に結合するそのヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合断片と、上記抗体又はその断片とヒトＰＤ‐１、ヒトＰＤ‐Ｌ１、ヒトＴＩＧＩＴ、又はヒトＬＡＧ‐３との間での複合体の形成が可能な条件下で接触させるステップを含む。続いて複合体の形成が検出され、ここでサンプルと対照サンプルとの間での複合体形成の差は、サンプル中のヒトＰＤ‐１、ヒトＰＤ‐Ｌ１、ヒトＴＩＧＩＴ、又はヒトＬＡＧ‐３抗原の存在の指標となる。
【０１８４】
抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、及び抗ＬＡＧ‐３抗体の、Ｔ細胞応答の阻害又は同時阻害を遮断する能力を考えると、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の抗体を用いて抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば抗腫瘍Ｔ細胞応答を刺激する、強化する、又は上方制御する、試験管内及び生体内方法である。特定の実施形態では、（膜ＣＤ３を発現する細胞との同時インキュベーションによって）ＣＤ３刺激も提供され、この刺激は、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、又は抗ＬＡＧ‐３抗体による治療と同時に、該治療の前に、又は該治療の後に提供できる。例えば本明細書で提供されるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答を強化する方法であり、上記方法は、上記Ｔ細胞を本明細書に記載の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、又は抗ＬＡＧ‐３抗体、及び任意にＣＤ３と接触させて、例えばＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、又はＬＡＧ‐３仲介型阻害効果を除去することによって、抗原特異的Ｔ細胞応答を強化するステップを含む。抗原特異的Ｔ細胞応答のいずれの好適なインジケータを用いて、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定できる。このような好適なインジケータの非限定的な例としては、抗体の存在下でのＴ細胞増殖の増大、及び／又は抗体の存在下でのサイトカイン産生の増大が挙げられる。ある好ましい実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン‐２及び／又はインターフェロン‐ガンマ産生が強化される。
【０１８５】
更に包含されるのは、被験者の免疫応答（例えば抗原特異的Ｔ細胞応答）を強化する方法であって、上記方法は、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、又は二重特異性若しくは三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを被験者に投与することによって、該被験者の免疫応答（例えば抗原特異的Ｔ細胞応答）を強化するステップを含む。ある好ましい実施形態では、被験者は担腫瘍被験者であり、腫瘍に対する免疫応答が強化される。腫瘍は固形腫瘍であっても、液体腫瘍、例えば血液学的悪性腫瘍であってもよい。特定の実施形態では、腫瘍は免疫原性腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は非免疫原性である。特定の実施形態では、腫瘍はＰＤ‐Ｌ１陽性である。他の実施形態では、腫瘍はＰＤ‐Ｌ１陰性である。被験者は担ウイルス被験者であってもよくこの被験者の体内では、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの投与の結果として、ウイルスに対する免疫応答が強化される。
【０１８６】
一実施形態では、被験者の体内での腫瘍の成長を阻害するための方法は、上記被験者に、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与することによって、上記被験者の体内で腫瘍の成長を阻害するステップを含む。また、被験者の慢性ウイルス感染を治療する方法も提供され、上記方法は、上記被験者に、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与することによって、上記被験者の体内で慢性ウイルス感染を治療するステップを含む。
【０１８７】
また本明細書には、腫瘍、例えば癌性腫瘍を有する被験者の腫瘍微小環境から、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させるための方法も包含され、上記方法は、上記被験者に、腫瘍微小環境中でのＴｒｅｇ細胞の枯渇を刺激するＦｃを含む、治療有効量の、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与するステップを含む。Ｆｃは例えば、エフェクタ機能又は強化されたエフェクタ機能を有する、例えば１つ以上の活性化Ｆｃ受容体に結合するか又はこのような結合が強化されている、Ｆｃであってよい。
【０１８８】
ある好ましい実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇は、腫瘍微小環境におけるＴｅｆｆの大幅な枯渇又は阻害を伴わず、また腫瘍微小環境の外でのＴｅｆｆ細胞及びＴｒｅｇ細胞の大幅な枯渇又は阻害を伴わずに、発生する。特定の実施形態では、被験者は、例えば腫瘍微小環境中において、Ｔｅｆｆ細胞に比べてＴｒｅｇ細胞において高いレベルのＴＩＧＩＴを有する。特定の実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はアンタゴニストは、腫瘍中のＴｒｅｇ、及び／又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）中のＴｒｅｇを枯渇させることができる。例えばＣＴ２６腫瘍モデルでは、（エフェクタ機能を示す）マウスＩｇＧ２ａとしてフォーマットされた抗マウスＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔｒｅｇ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を部分的に枯渇させたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇させなかった。これに対応する、マウスＩｇＧ１  Ｄ２６５Ａとしてフォーマットされたエフェクタ機能を有しない抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔ細胞を枯渇させなかった。
【０１８９】
Ｆｃエフェクタ機能又はエフェクタ機能を有しない抗ＴＩＧＩＴ抗体を採用するかどうかを考える際、抗腫瘍免疫応答を強化できるＴｒｅｇの枯渇と、腫瘍細胞を実際に殺滅するために必要な細胞の一部を排除するＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇との間でのトレードオフを十分に考慮しなければならない。Ｔｒｅｇの枯渇は抗腫瘍活性を強化すると予想されるかもしれないが、最近の研究で、ＴＩＧＩＴ＋ＴｒｅｇへのＴＩＧＩＴのライゲーションが、Ｔｅｆｆ細胞増殖のＴｒｅｇ細胞仲介型抑制を促進することが示されており（Ｊｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４０：５６９）、これは、（例えば本発明のアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体を用いて）ＴＩＧＩＴシグナル伝達を遮断することによっても、抗腫瘍活性が強化され得ることを示唆している。従って、エフェクタ機能を欠いたアンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の使用が最も有効となり得、これは：ｉ）ＴｒｅｇにおけるＴＩＧＩＴシグナル伝達を遮断することによって、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を低減し；ｉｉ）ＴＩＧＩＴの阻害作用を遮断することによって抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化すると同時に、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクタ機能によって仲介される枯渇を回避し；ｉｉｉ）ＴＩＧＩＴが結合するはずだったＤＮＡＭをＰＶＲ（ＣＤ１５５、ＴＩＧＩＴリガンド）に結合させることによって（及びＴＩＧＩＴ‐ＤＮＡＭ間の直接の相互作用を低減することによって）ＤＮＡＭ仲介型活性を強化する（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２６：９２３）。これと同じことが、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの使用にも当てはまる。
【０１９０】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、補助療法として被験者に投与される。本出願による抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを用いた癌患者の治療は、現在の標準的な治療と比較して長期間持続する反応、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、１０年、又はそれ以上の長期生存、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、若しくは１０年、又はそれ以上の無再発生存をもたらすことができる。特定の実施形態では、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを用いた癌患者の治療は、癌の再発を防止するか、又は癌の再発を例えば１年、２年、３年、４年、５年、１０年、若しくはそれ以上遅延させる。抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、及び／又は抗ＬＡＧ‐３治療は、一次治療又は二次治療として使用できる。
【０１９１】
特定の好ましい実施形態では、被験者は、細胞増殖性疾患又は癌を有する。抗ＴＩＧＩＴ抗体によって、ＴＩＧＩＴを介したＰＶＲ／ネクチン‐２シグナル伝達を遮断することにより患者の体内の癌性細胞に対する免疫応答を強化できる。同様に、本明細書で提供されるのは、癌を有する被験者を治療するための方法であって、上記方法は、上記被験者に、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与することによって、上記被験者を治療する、例えば癌性腫瘍の成長を阻害若しくは低減する、及び／又は癌を退縮させるステップを含む。本明細書に記載の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、単独で使用して癌性腫瘍の成長を阻害できる。あるいは、これらの抗腫瘍アンタゴニストのうちのいずれを、別の作用剤、例えばこれ以降に記載される他の抗癌標的、免疫原性剤、標準的な癌治療、又は他の抗体と組み合わせて使用できる。
【０１９２】
従って、本明細書で提供されるのは、例えば腫瘍細胞の成長を阻害することによって、被験者の体内の癌を治療する方法であり、上記方法は、上記被験者に、本明細書に記載の治療有効量の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを投与するステップを含む。好ましくは、上記抗体は、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、若しくは抗ＬＡＧ‐３のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む、ヒト抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、若しくは抗ＬＡＧ‐３抗体であるか、又は上記抗体は、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、若しくは抗ＬＡＧ‐３抗体のうちの少なくとも１つと、結合に関して競合する、若しくは同一のエピトープに結合する、キメラ若しくはヒト化非ヒト抗ｈｕ  ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ｈｕ  ＴＩＧＩＴ、若しくは抗ＬＡＧ‐３抗体、例えばキメラ若しくはヒト化抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、若しくは抗ＬＡＧ‐３抗体であってよい。
【０１９３】
本出願の抗体を用いて成長を阻害できる癌としては、免疫療法に典型的な応答を示す癌が挙げられる。治療対象の癌の非限定的な例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、胃腸癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）（例えば淡明細胞癌）、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）（例えば腎細胞癌（ＲＣＣ））、前立腺癌（例えばホルモン不応性前立腺腺癌）、甲状腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、膠芽腫（多形膠芽腫）、子宮頸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、大腸癌、及び頭頸部癌（又は癌腫）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫（例えば転移性悪性黒色腫、例えば皮膚又は眼内悪性黒色腫）、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門領域の癌、精巣癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、小児期の固形腫瘍、尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、中枢神経系原発リンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎軸腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮嚢癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されるものを含む環境誘発型癌、ウイルス関連癌（例えばヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連腫瘍）、並びに２つの主要な血球系統のいずれか、即ち（顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、及び肥満細胞を産生する）骨髄細胞株又は（Ｂ、Ｔ、ＮＫ、及び形質細胞を産生する）リンパ系細胞株に由来する血液悪性腫瘍、例えばあらゆるタイプの白血病、リンパ腫、及び骨髄腫、例えば急性、慢性、リンパ性及び／又は骨髄性白血病、例えば急性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、未分化ＡＭＬ（ＭＯ）、骨髄芽球性白血病（Ｍ１）、骨髄芽球性白血病（Ｍ２；細胞成熟を伴う）、前骨髄球性白血病（Ｍ３、又はＭ３多様体［Ｍ３Ｖ］）、骨髄単球性白血病（Ｍ４、又は好酸球増加症を伴うＭ４多様体［Ｍ４Ｅ］）、単球性白血病（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）、巨核芽球性白血病（Ｍ７）、限局顆粒球性肉腫、及び緑色腫；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＥＩＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、未分化（例えばＫｉ１＋）大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸管Ｔ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；及びリンパ腫／白血病（Ｔ‐Ｌｂｌｙ／Ｔ‐ＡＬＬ）、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、臓器移植後リンパ増殖性疾患、真の組織球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫（ＬＢＬ）、リンパ系の造血器腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキッ���リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性組織球性リンパ腫（ＤＨＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＬＣ）（菌状息肉症又はセザリー症候群とも呼ばれる）、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）；骨髄腫、例えばＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫（無症候性骨髄腫とも呼ばれる）、孤立性形質細胞腫、及び多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞リンパ腫；骨髄系の造血器腫瘍、間葉系起源の腫瘍（線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む）；精上皮腫、奇形癌腫、中枢及び末梢神経の腫瘍（星状細胞腫、神経鞘腫を含む）；間葉系起源の腫瘍（線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む）；並びに他の腫瘍（黒色腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、及び奇形癌腫を含む）、リンパ系の造血器腫瘍、例えばＴ細胞及びＢ細胞腫瘍（限定するものではないが、小細胞及び大脳様細胞型のものを含むＴ前リンパ球性白血病（Ｔ‐ＰＬＬ）等のＴ細胞障害を含む）；好ましくはＴ細胞型の、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；ａ／ｄ  Ｔ‐ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢性／成熟Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性サブタイプ）；血管中心性（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；頭頸部の癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、直腸癌、甲状腺の癌；急性骨髄性リンパ腫、並びに以上の癌のいずれの組み合わせが挙げられる。本明細書に記載の方法は、転移性癌、難治性癌（例えば、例えば遮断ＣＴＬＡ‐４又はＰＤ‐１抗体を用いた過去の免疫療法に対して、抵抗性を有する癌）、及び再発癌の治療にも使用してよい。
【０１９４】
抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、単独で、別の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて、又は別の抗腫瘍アンタゴニストと同時に投与できる。抗ＰＤ‐１抗体、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストもまた、免疫原性剤、例えば癌性細胞、腫瘍ワクチン、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、及び炭水化物分子を含む）、癌ワクチン戦略において免疫刺激性サイトカインをエンコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：４９１９‐２８）、又は腫瘍溶解性ウイルスと、組み合わせて又は同時に投与できる。
【０１９５】
腫瘍に対するワクチン接種のための多数の実験的戦略が考案されている。これらの戦略のうちの１つでは、ワクチンは、自家腫瘍又は同種異系腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞ワクチンのいくつかは、腫瘍細胞がＧＭ‐ＣＳＦを発現するように形質導入される場合に、最も効果的であることが示されている。ＧＭ‐ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力な活性化因子であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：  ３５３９‐４３）。前臨床モデルにおいて、癌ワクチンは、腫瘍内へのエフェクタＴ細胞浸潤を強化することが示されている。癌ワクチンの主要なタイプとしては、ペプチドワクチン、ベクターベースの抗原特異的ワクチン、全細胞ワクチン、及び樹状細胞ワクチンが挙げられる。全てのワクチンベースの療法は、単一又は複数の抗原性エピトープ又は抗原を、全細胞から患者に送達して、腫瘍特異的エフェクタＴ細胞を誘導するように設計されている。よって、ワクチンベースの療法は、腫瘍へのＴ細胞浸潤を誘発するための最も効率的な方法である可能性がある。
【０１９６】
様々な腫瘍における遺伝子発現及び大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義がもたらされた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ  Ａ  （１９９９）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：  ２８１‐７）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍中、及び腫瘍が発生する細胞中で発現される分化抗原であり、例えばメラニン細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、及びＴｒｐ‐２である。更に重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主の体内に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的となることを示すことができる。
【０１９７】
ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＡＧ‐３阻害を、腫瘍中で発現される一連の組換えタンパク質及び／又はペプチドと組み合わせて使用して、これらのタンパク質に対する免疫応答を生成できる。このようなタンパク質は、免疫系によって自己抗原とみなされる可能性があり、従って免疫系に対して耐性を有する。腫瘍抗原はタンパク質テロメラーゼを含むことができ、これは、染色体のテロメアの合成に必要であり、ヒトの癌の８５％超、及びごく限られた数の体細胞組織において発現される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：  ２０１１‐２０１３）。腫瘍抗原は、タンパク質配列を変化させるか又は２つの無関係な配列の間で融合タンパク質（即ちフィラデルフィア染色体中のｂｃｒ‐ａｂｌ）を生成する体細胞変異によって癌細胞中で発現される「ネオ抗原」、あるいはＢ細胞腫瘍からのイディオタイプであってもよい。
【０１９８】
腫瘍ワクチンの非限定的な例としては、転移性前立腺癌のためのＦＤＡ認可済み腫瘍ワクチンであるシプリューセル‐Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））；顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）を発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞、例えば全細胞ＧＭ‐ＣＳＦ分泌性被照射同種異系膵臓癌ワクチン（ＧＶＡＸ；  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ）；乳癌抗原、ｎｅｕ、レグマイン、及びβ‐カテニンに由来する免疫原性ペプチドからなるマルチペプチドワクチン（これを抗ＰＤ‐１抗体と組み合わせて投与すると、担乳がんマウスの、ワクチンによって誘発される無進行生存が延長された（Ｋａｒｙａｍｐｕｄｉ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７４：２９７４‐２９８５）；黒色腫抗原のペプチド、例えばｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ‐２、ＭＡＲＴＩ及び／又はチロシナーゼのペプチドが挙げられる。他の腫瘍ワクチンとしては、ヒトの癌に関与するウイルスからのタンパク質が挙げられ、上記ウイルスは例えば：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（例えばＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）、Ｇａｒｄａｓｉｌ  ９（登録商標）、及びＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）；Ｂ型肝炎ウイルス（例えばＥｎｇｅｒｉｘ‐Ｂ及びＲｅｃｏｍｂｉｖａｘ  ＨＢ）；Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）；カポジ肉腫関連ヘルペス肉腫ウイルス（ＫＳＨＶ）である。ＴＩＧＩＴ阻害と組み合わせて使用できる別の形態の腫瘍特異的抗原は、腫瘍組織自体から単離された精製済み熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含有し、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を誘発するための抗原提示細胞への送達において非常に効率的である。タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ‐ＶＥＣ、又はＩｍｌｙｇｉｃ（登録商標））は、手術で除去できない転移性黒色腫を有する一部の患者の治療のための、ＦＤＡ認可済みの腫瘍溶解性ウイルスである。
【０１９９】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答のプライミングに使用できる、強力な抗原提示細胞である。ＤＣを生体外で生成して、様々なタンパク質及びペプチド抗原、並びに腫瘍細胞抽出物を担持させることができる（Ｎｅｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：  ３２８‐３３２）。また、ＤＣを、これらの腫瘍抗原を発現するように、遺伝的手段で形質導入することもできる。またＤＣは、免疫化を目的として、腫瘍細胞に直接融合されている（Ｋｕｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３３２‐３３６）。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化をＴＩＧＩＴ遮断と効果的に組み合わせることにより、より強力な抗腫瘍応答を活性化する（引き出す）ことができる。
【０２００】
ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＡＧ‐３阻害は、標準的な癌治療（例えば手術、放射線、及び化学療法）と組み合わせることもできる。特にＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＡＧ‐３阻害は、化学療法レジメンと効果的に組み合わせることができる。これらの例では、投与される化学療法試薬の用量を削減できる可能性がある（Ｍｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：  ５３０１‐５３０４）。このような組み合わせの例は、黒色腫の治療のための抗腫瘍アンタゴニストとダカルバジンとの組み合わせである。このような組み合わせの別の例は、黒色腫の治療のためのチェックポイント調節因子アンタゴニスト又は抗腫瘍アンタゴニストとインターロイキン‐２（ＩＬ‐２）との組み合わせである。例えば、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＡＧ‐３阻害と化学療法とを組み合わせて使用することで細胞死が促進される科学的根拠は、大半の化学療法用化合物の細胞傷害作用の結果が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルを上昇させるはずであるということである。細胞死によるＴＩＧＩＴ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＬＡＧ‐３阻害との相乗効果をもたらすことができる他の併用療法は、放射線、手術、及びホルモン抑制である。これらのプロトコルはそれぞれ、宿主の腫瘍抗原のソースを生成する。血管新生阻害剤もまた、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＬＡＧ‐３阻害と組み合わせることができる。血管新生の阻害は腫瘍細胞の死につながり、これは腫瘍抗原を宿主の抗原提示経路に供給し得る。
【０２０１】
本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、及び三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、Ｆｃα又はＦｃγ受容体発現性エフェクタ細胞を腫瘍細胞に対して標的化する二重特異性抗体と組み合わせて使用してもよい（例えば米国特許第５，９２２，８４５号、及び米国特許第５，８３７，２４３号を参照）。二重特異性抗体は、２つの別個の抗原を標的とするために使用できる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えばＨｅｒ‐２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを腫瘍の複数の部位に対して標的化するために使用されている。この標的化により、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化できる。これらの応答のＴ細胞アームは、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＬＡＧ‐３の阻害によって増強されることになる。あるいは、腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体と、樹状細胞特異的細胞表面マーカーとを使用することによって、抗原をＤＣに直接送達できる。
【０２０２】
腫瘍は、多様な機序によって宿主の免疫監視を回避する。これらの機序の多くは、腫瘍が発現する免疫抑制タンパク質の不活性化によって克服される可能性がある。これらには特に、ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐１０、及びＦａｓリガンドが含まれる。これらの実体それぞれに対する抗体を、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用することにより、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を促進できる。
【０２０３】
宿主の免疫応答性を活性化する他の抗体を、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用できる。これらには、ＤＣ機能及び抗原提示を活性化する、樹状細胞の表面上の分子が含まれる。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代替でき（Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：  ４７４‐４７８）、抗ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせて使用できる。ＯＸ‐４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：  ２１６０‐２１６９）、ＣＤ１３７／４‐１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：  ６８２‐６８５  （１９９７）、及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：  ２６２‐２６６）といったＴ細胞共刺激分子に対する活性化抗体も、Ｔ細胞活性化のレベルの上昇を提供できる。更に、これ以降で更に説明されるように、他の免疫チェックポイント調節因子の阻害剤も、本明細書に記載の他の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用してよい。
【０２０４】
骨髄移植は現在、造血器起源の多様な腫瘍の治療に使用されている。移植片対宿主病はこの治療の結果であるが、ＴＩＧＩＴ阻害を用いて、移植片対腫瘍応答を低減することにより、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の効力を増大させることができる。
【０２０５】
抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下で癌及びウイルス感染に対して抗原特異的Ｔ細胞を刺激するための、抗原特異的Ｔ細胞の生体外活性化及び増殖、並びにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入により、養子移入されたＴ細胞の頻度及び活性を上昇させることができる。
【０２０６】
腫瘍に対して抗原特異的Ｔ細胞を刺激するための、抗原特異的Ｔ細胞の生体外活性化及び増殖、並びにこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を伴う、複数の実験的治療プロトコルも存在する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＆  Ｒｉｄｄｅｌｌ  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：  ５４６‐５１）。これらの方法を用いて、ＣＭＶ等の感染性病原体に対するＴ細胞応答を活性化することもできる。抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下での生体外活性化により、養子移入されたＴ細胞の頻度及び活性を上昇させることができる。
【０２０７】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストを、感染性疾患、特に慢性感染を有する被験者に投与してよい。この場合、癌への応用と同様に、抗体仲介型ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、及び／又はＬＡＧ‐３阻害を単独で、又はアジュバントとしてワクチンと組み合わせて使用して、病原体、毒素、及び自己抗原に対する免疫応答性を強化できる。この治療アプローチを適用できる例示的な病原体としては、限定するものではないが、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、及びＣ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、及び緑膿菌が挙げられる。ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、及び／又はＬＡＧ‐３阻害は、感染の経過にわたって新規の又は変化した抗原を提示するＨＩＶ等の病原体による、確立された感染に対して、特に有用である。抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、及び三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの投与により、これらの抗原を外来性として認識させることで、適切なＴ細胞応答を誘発できる。
【０２０８】
本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす他の病原性ウイルスとしては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、又はＣ）、ヘルペスウイルス感染症（例えばＶＺＶ、ＨＳＶ‐１、ＨＡＶ‐６、ＨＳＶ‐ＩＩ、及びＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、並びにアデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ロタウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス性脳炎ウイルス、又はこれらの組み合わせによって引き起こされる感染症が挙げられる。
【０２０９】
本明細書に記載の方法によって治療可能であり得る、例示的な病原性細菌又はそれらによって引き起こされる疾患としては、クラミジア、リケッチア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ菌、ジフテリア菌、サルモネラ菌、桿菌菌、コレラ菌、レプトスピラ症、破傷風、ボツリヌス中毒、炭疽、ペスト、及びライム病が挙げられる。
【０２１０】
本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす例示的な病原性真菌としては、カンジダ属（例えばカンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルーセイ、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス等）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス属（例えばアスペルギルス・フミガーツス、クロコウジカビ等）、ケカビの一種（例えばケカビ、ユミケカビ、クモノスカビ）、スポロスリックス・シェンキィ、ブラストミセス・デルマチチジス、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス、コクシジオイデス・イミチス、及びヒストプラズマ・カプスラーツムが挙げられる。
【０２１１】
本明細書に記載の方法によって治療可能な感染症を引き起こす例示的な病原性寄生虫としては、赤痢アメーバ、大腸バランジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバの一種、ザンビアジアルジア、クリプトスポリジウムの一種、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、バベシア・ミクロチ、ブルーストリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、トキソプラズマ・ゴンジ、及びニッポストロンギルス・ブラジリエンシスが挙げられる。
【０２１２】
上述の方法の全てにおいて、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、及び／又はＬＡＧ‐３阻害を、サイトカイン治療（例えばインターフェロン、ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐２）、又は２つの異なる結合特異性を用いる二重特異性抗体療法といった、他の形態の免疫療法と組み合わせることにより、腫瘍抗原の提示の強化を提供できる。
【０２１３】
本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、及び三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、これらの抗体のうちのいずれか１つ以上と、関心対象の抗原（例えばワクチン）との同時投与によって、抗原特異的免疫応答を強化するために使用できる。従って、本明細書で提供されるのは、被験者の体内での抗原に対する免疫応答を強化する方法であって、上記方法は、上記被験者に：（ｉ）上記抗原；及び（ｉｉ）抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又はこれらの組み合わせを投与することによって、上記被験者の体内での上記抗原に対する免疫応答を強化するステップを含む。上記抗原は例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、又は病原体由来の抗原とすることができる。このような抗原の非限定的な例としては、上述のセクションに記載したもの、例えば上述の腫瘍抗原（若しくは腫瘍ワクチン）、又は上述のウイルス、細菌、若しくは他の病原体由来の抗原が挙げられる。
【０２１４】
特定の実施形態では、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストが結合するエピトープを含むペプチド又は融合タンパク質を、１つ以上の抗腫瘍アンタゴニストの代わりに、又は１つ以上の抗腫瘍アンタゴニストに加えて、ワクチンとして使用してよい。
【０２１５】
上述の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性抗体又はアンタゴニスト、及び免疫複合体）を生体内及び試験管内で投与する好適な経路は、当該技術分野において公知であり、当業者が選択できる。例えば抗体組成物は、注射（例えば静脈内又は皮下）によって投与できる。使用される分子の好適な投薬量は、被験者の年齢及び体重、並びに抗体組成物の濃度及び／又は処方に左右される。
【０２１６】
Ｂ．医薬組成物及び治療方法
本出願の別の態様は、癌、慢性感染症、又は易感染性疾患状態といった細胞増殖性障害を治療するための、医薬組成物及び方法に関する。一実施形態では、上記医薬組成物は、本出願の１つ以上の抗腫瘍アンタゴニストを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の上記抗腫瘍アンタゴニストは：１つ以上のチェックポイント調節因子アンタゴニスト、例えばＰＤ‐１阻害剤、ＰＤ‐Ｌ１阻害剤、抗ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＧ‐３阻害剤；１つ以上の血管新生阻害剤、例えばＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦＲ２阻害剤、アンジオポエチン‐１／２阻害剤、及びＴｉｅ２Ｒ阻害剤；１つ以上の抗腫瘍阻害剤、例えばＴＧＦ‐β１阻害剤及びＴＧＦ‐β１  ＲＩＩ阻害剤；又は二重特異性及び三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを含む。１つ以上の上記アンタゴニストは、薬学的に許容可能な担体と共に処方される。本出願の医薬組成物は、本明細書に記載されるように、１つ以上の異なる抗体、１つ以上の多重特異性抗体、１つ以上の免疫複合体、又はこれらの組み合わせを含んでよい。
【０２１７】
上述のように、本明細書に記載の医薬組成物を使用するための方法は、それを必要とする被験者に、有効量の本開示による医薬組成物を投与するステップを含む。
【０２１８】
患者に治療有効量又は予防有効量の抗体又はアンタゴニストを提供するために、いずれの好適な投与経路又はモードを採用できる。例示的な投与経路又はモードとしては、非経口（例えば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内）、経口、局所（経鼻、経皮、皮内、又は眼内）、粘膜（例えば鼻腔、舌下、頬内、直腸、膣内）、吸入、リンパ管内、脊髄内、頭蓋内、腹腔内、気管内、膀胱内、髄腔内、経腸、肺内、リンパ管内、腔内、眼窩内、被膜内、及び経尿道、並びにカテーテル又はステントによる局所送達が挙げられる。
【０２１９】
本開示による抗体又はアンタゴニストを含む医薬組成物は、いずれの１つ以上の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤中で処方してよい。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的適合性を有するありとあらゆる溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。医薬組成物は、好適な固体又はゲル相の担体又は賦形剤を含んでよい。例示的な担体又は賦形剤としては、限定するものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコール等のポリマーが挙げられる。薬学的に許容可能な例示的な担体としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びこれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを、組成物中に含めることが好ましい。薬学的に許容可能な担体は更に、微量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤を含んでよく、これらは治療剤の貯蔵期間又は効力を強化する。
【０２２０】
抗腫瘍アンタゴニストは、非経口投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。好適な緩衝剤としては、限定するものではないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、又はリン酸カリウムが挙げられる。塩化ナトリウムは、溶液の毒性を改変するために、０〜３００ｍＭ（最適には液体剤形に関して１５０ｍＭ）の濃度で使用できる。凍結乾燥剤形には凍結防止剤、主に０〜１０％のスクロース（最適には０．５〜１．０％）を含めることができる。他の好適な凍結防止剤としては、トレハロース及びラクトースが挙げられる。凍結乾燥剤形には増量剤、主に１〜１０％のマンニトール（最適には２〜４％）を含めることができる。安定剤は、液体剤形及び凍結乾燥剤形の両方で使用でき、主に１〜５０ｍＭのＬ‐メチオニン（任意に５〜１０ｍＭ）である。他の好適な増量剤としては、グリシン、アルギニンが挙げられ、これらは０〜０．０５％のポリソルベート‐８０（最適には０．００５〜０．０１％）として含めることができる。更なる界面活性剤としては、限定するものではないが、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。
【０２２１】
治療用抗腫瘍アンタゴニスト調製物を凍結乾燥し、滅菌粉体として好ましくは真空下で保存でき、その後、（例えばベンジルアルコール防腐剤を含有する）静菌水又は滅菌水中で再構築してから注射できる。医薬組成物は、注射、例えばボーラス注射又は持続注入による非経口投与のために処方できる。
【０２２２】
医薬組成物中の治療剤は、「治療有効量」又は「予防有効量」で処方してよい。「治療有効量」は、複数回の投薬量で、必要な期間にわたって、所望の治療効果を達成するために有効な量を指す。組換えベクターの治療有効量は、治療対象の状態；状態の重篤度及び経過；投与のモード；抗体又は作用剤を予防目的で投与するか治療目的で投与するか；１つ以上の特定の作用剤のバイオアベイラビリティ；抗腫瘍アンタゴニストが個体内で所望の応答を誘発する能力；過去の療法；患者の年齢、体重、及び性別；患者の臨床履歴及び抗体に対する応答；使用される抗腫瘍アンタゴニストのタイプ；主治医の裁量等に応じて変化し得る。治療有効量はまた、組換ベクターのいずれの毒性の又は有害な影響を治療上有益な効果が上回る、量でもある。「予防有効量」は、複数回の投薬量で、必要な期間にわたって、所望の予防的結果を達成するために有効な量を指す。
【０２２３】
好ましくは、抗腫瘍アンタゴニスト中のポリペプチドドメインは、これらが投与される宿主と同一の宿主に由来するものであり、これにより、投与された治療剤に対する炎症反応が低減される。
【０２２４】
抗腫瘍アンタゴニストは、患者に１回で又は複数回の一連の治療にわたって好適に投与され、診断以降のいずれの時点に患者に投与してよい。抗腫瘍アンタゴニストは、単独の治療として、又は問題となっている状態の治療に有用な他の薬剤もしくは療法と組み合わせて、投与してよい。
【０２２５】
一般的な案として、治療有効量又は予防有効量の抗腫瘍アンタゴニストは、１回又は複数回の投与で、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内で投与されることになる。ある特定の実施形態では、各抗腫瘍アンタゴニストは、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日〜約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内で投与される。
【０２２６】
他の実施形態では、抗腫瘍アンタゴニストは、３日毎に５００μｇ〜２０ｇ、又は３日毎に２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。
【０２２７】
他の実施形態では、各抗腫瘍アンタゴニストは、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１００ｎｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１μｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１０μｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１００μｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１０ｎｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１０ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１μｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１０μｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１００μｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１００ｎｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１００ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１０μｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１００μｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１μｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１μｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１００μｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１０μｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１０μｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１００μｇ〜約１ｍｇ、投与１回あたり約１００μｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１００μｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１００μｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１００μｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、投与１回あたり約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、投与１回あたり約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、注射１回あたり約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１０ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、注射１回あたり約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、投与１回あたり約１００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇ、及び投与１回あたり約１０００ｍｇ〜約１０，０００ｍｇの範囲内で投与される。抗腫瘍アンタゴニストは毎日、２、３、４、５、６若しくは７日毎、又は１、２、３、若しくは４週間毎に投与される。
【０２２８】
他の特定の実施形態では、抗腫瘍アンタゴニストは、約０．０００６ｍｇ／日、０．００１ｍｇ／日、０．００３ｍｇ／日、０．００６ｍｇ／日、０．０１ｍｇ／日、０．０３ｍｇ／日、０．０６ｍｇ／日、０．１ｍｇ／日、０．３ｍｇ／日、０．６ｍｇ／日、１ｍｇ／日、３ｍｇ／日、６ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、６０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、２０００ｍｇ／日、５０００ｍｇ／日、又は１０，０００ｍｇ／日の用量で投与してよい。予想されるように、投薬量は、患者の状態、サイズ、年齢に左右されることになる。
【０２２９】
特定の実施形態では、抗腫瘍アンタゴニストのコード配列を、細胞増殖性障害を有する患者の体内で有効量の抗腫瘍アンタゴニストを発現するために、好適な発現ベクター（例えばウイルス又は非ウイルスベクター）に組み込む。例えば１つ以上の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスの投与を含む特定の実施形態では、医薬組成物は、１ｋｇあたり少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、又は少なくとも１０１４個のゲノムコピー（ＧＣ）又は組換えウイルス粒子を含む量、又はそのいずれの範囲の量の、ｒＡＡＶを含んでよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、少なくとも１０１２、少なくとも１０１３、少なくとも１０１４、少なくとも１０１５個のゲノムコピー又は組換えウイルス粒子を含む量、又はそのいずれの範囲の量の、有効量のｒＡＡＶ等の組換えウイルスを含む。
【０２３０】
投薬量は、いずれの特定の細胞増殖性障害に好適な、いくつかの当該技術分野で許容された動物モデルで試験できる。
【０２３１】
送達方法としては、殺滅されたウイルスに結合した又はしていないポリカチオン性凝縮ＤＮＡの使用、リガンド結合ＤＮＡの使用、リポソームの使用、真核細胞送達ビヒクル細胞の使用、光重合性ヒドロゲル材料の堆積、ハンドヘルド遺伝子導入パーティクルガンの使用、電離放射線の使用、核酸電荷中和、又は細胞膜との融合、粒子仲介型遺伝子導入等を挙げることもできる。
【０２３２】
Ｃ．併用療法
別の態様では、本出願は、被験者の体内での抗原特異的Ｔ細胞応答を強化するための併用療法を提供する。一実施形態では、上記方法は、Ｔ細胞を、抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、これらの抗体断片、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストと、第２の抗体、抗体断片、アンタゴニスト、又は薬剤との組み合わせと接触させることによって、抗原特異的Ｔ細胞応答又はアポトーシス経路を強化するステップを含む。
【０２３３】
関連する態様では、それを必要とする被験者の腫瘍中の調節性Ｔ細胞を減少させる又は枯渇させる方法は、有効量の抗体又は抗体断片と、第２の抗体、抗体断片、アンタゴニスト、又は薬剤との組み合わせを投与することによって、上記被験者の体内の調節性Ｔ細胞の数を減少させるステップを含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、上記被験者は、本明細書に記載の細胞増殖性疾患又は癌を有する。
【０２３５】
他の実施形態では、本明細書に記載の上記被験者は、慢性ウイルス感染症、炎症性疾患、又は自己免疫疾患を有する。
【０２３６】
Ｔ細胞に２つの別個のシグナルを提供することは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による休止Ｔ細胞リンパ球のリンパ球活性化に関する、広く受け入れられているモデルである。このモデルは更に、自己と非自己との識別、及び免疫寛容を提供する。一次シグナル、即ち抗原特異的シグナルは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との関連で提示される外来抗原ペプチドの認識に続いて、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して伝達される。第２のシグナル、即ち共刺激シグナルは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される共刺激分子によって、Ｔ細胞に送達される。これによりＴ細胞が、クローン増殖、サイトカイン分泌、及びエフェクタ機能を促進するように誘導される。共刺激がない場合、Ｔ細胞は抗原刺激に対して不応性となる可能性があり、その結果、外来又は内因性抗原に対する寛容原性応答が生じる。
【０２３７】
この２シグナルモデルでは、Ｔ細胞は、正の共刺激シグナル及び負の共阻害シグナルの両方を受け取る。このような正及び負のシグナルの調節は、免疫寛容を維持し、かつ自己免疫を防止しながら、宿主の防御免疫応答を最大化するために、重要である。負のシグナルは、Ｔ細胞寛容の誘導に必要と思われ、正のシグナルはＴ細胞活性化を促進する。共刺激シグナル及び共阻害シグナルの両方が、抗原に曝露されたＴ細胞に供給され、共刺激シグナルと共阻害シグナルとの間の相互作用は、免疫応答の大きさを制御するために不可欠である。更に、Ｔ細胞に供給されるシグナルは、感染又は免疫誘発が解消される、悪化する、又は持続するに従って変化し、これらの変化は、応答するＴ細胞に強力に影響を及ぼして、免疫応答を再形成する。
【０２３８】
共刺激の機序は治療上の関心の対象となる。というのは、共刺激シグナルの操作は、細胞ベースの免疫応答を強化する又は終了させるための手段を提供することが示されているためである。近年、Ｔ細胞の機能不全又はエネルギが、免疫チェックポイント調節因子、例えばＰＤ‐１並びにそのリガンドＰＤ‐Ｌ１及びＰＤ‐Ｌ２の、誘導された持続的な発現と、同時に発生し得る可能性があることが発見された。ＰＤ‐Ｌ１は多くの癌で過剰発現し、多くの場合、予後不良と関連している（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｒ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６，６６（７）：３３８１）。更に、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球の大半は、主にＰＤ‐１を発現するが、これは、腫瘍応答性Ｔ細胞上のＰＤ‐１の上方制御が抗腫瘍免疫応答の障害に寄与する可能性があることを示す、正常組織中のＴリンパ球及び末梢血Ｔリンパ球とは対照的である（Ｂｌｏｏｄ  ２００９  １１４（８）：１５３７）。これは、ＰＤ‐１発現性Ｔ細胞と相互作用するＰＤ‐Ｌ１発現性腫瘍細胞が仲介するＰＤ‐Ｌ１シグナル伝達を利用して、Ｔ細胞活性化の減衰及び免疫監視の回避をもたらすことによるものである可能性がある。ＰＤ‐Ｌ１／ＰＤ‐１相互作用の阻害は、ＣＤ８＋Ｔ細胞仲介型の癌細胞及び腫瘍の殺滅を含む、Ｔ細胞免疫の強化のための手段を提供する。同様のＴ細胞免疫の強化は、ＰＤ‐Ｌ１の、結合パートナーＢ７‐１への結合を阻害することによって観察されている。従って、ＰＤ‐１及び他の免疫チェックポイント調節因子の治療的標的化は、極めて高い関心が持たれている分野である。
【０２３９】
ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＡＧ‐３シグナル伝達の阻害を、腫瘍細胞において調節解除された他のシグナル伝達経路と組み合わせることにより、治療の効力を強化する手段を提供できる。近年、受容体及びそのリガンドの形態の多数の免疫チェックポイント調節因子が同定されている。共刺激又は共阻害受容体に結合する膜結合型リガンドの１つの重要なファミリーは、Ｂ７ファミリーであり、これは：ＣＴＬＡ‐４並びにそのリガンドであるＢ７‐１及びＢ７‐２；ＰＤ‐１並びにそのリガンドであるＰＤ‐Ｌ１（Ｂ７‐Ｈ１）及びＰＤ‐Ｌ２（Ｂ７‐ＤＣ）；Ｂ７‐Ｈ２（ＩＣＯＳ‐Ｌ）；Ｂ７‐Ｈ３；Ｂ７‐Ｈ４；Ｂ７‐Ｈ５（ＶＩＳＴＡ）；並びにＢ７‐Ｈ６を含む。更なる免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、限定するものではないが：ＴＩＭ‐３及びそのリガンドであるガレクチン‐９；ＬＡＧ‐３、並びに肝類洞内皮細胞レクチン（ＬＳＥＣｔｉｎ）及びガレクチン‐３を含むそのリガンド；ＣＤ１２２及びそのＣＤ１２２Ｒリガンド；ＣＤ７０；Ｂ７Ｈ３；Ｂ及びＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ）；並びにＶＩＳＴＡが挙げられる（Ｌｅ  Ｍｅｒｃｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｆｒｏｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  （６），  Ａｒｔｉｃｌｅ  ４１８）。更に、多数のチェックポイント調節因子アンタゴニストが同定されており、様々な臨床及び前臨床モデルで試験され、並びに／又はＦＤＡによって認可されている（Ｋｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８８：３６８‐３７６  （２０１４））。免疫チェックポイント遮断薬としても知られる阻害性受容体遮断薬のコンセプトは、転移性黒色腫に関するＰＤ‐１阻害剤ニボルマブ及びペンブロリズマブ並びに抗ＣＴＬＡ‐４抗体イピリムマブのＦＤＡ認可によって検証されている。
【０２４０】
免疫チェックポイントアンタゴニストは、免疫チェックポイント調節因子の活性を調節する、又は上記活性に干渉し、チェックポイント調節因子又はそのリガンドへの結合の結果として、チェックポイント調節因子受容体を通したシグナル伝達を遮断又は阻害する。このシグナル伝達を阻害することにより、免疫抑制を反転させることができ、従って、癌細胞に対するＴ細胞免疫を再確立又は強化できる。対照的に、（例えば共刺激分子の）免疫チェックポイントアゴニストは、免疫チェックポイント調節因子の活性を刺激し、チェックポイント調節因子又はそのリガンドへの結合の結果として、チェックポイント調節因子受容体を通したシグナル伝達を刺激する。このシグナル伝達を刺激することによって、癌細胞に対するＴ細胞免疫を再確立又は強化できる。
【０２４１】
従って一実施形態では、被験者の体内での免疫応答を刺激する方法は、上記被験者に、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、これらの１つ以上の抗体断片（例えば抗ＴＩＧＩＴ  ＨＣＶＲ及び／若しくはＬＣＶＲ）、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを、本明細書中で上述されている別の免疫チェックポイント調節因子と組み合わせて投与することによって、上記被験者の体内において免疫応答を刺激して、例えば腫瘍成長を阻害するか、又は抗ウイルス応答を刺激する、ステップを含む。
【０２４２】
一実施形態では、本出願による抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、これらの１つ以上の抗体断片、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、別の免疫チェックポイント調節因子と、別個の抗体として、又は複数の産物に対する結合特異性を備えた多重特異性抗体中で、組み合わせて投与される。一般に、本明細書に記載の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ‐３抗体、二重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストは、免疫応答を刺激するために：（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するＩｇＳＦファミリータンパク質、Ｂ７ファミリー、若しくはＴＮＦファミリーのアンタゴニスト、若しくはＴ細胞の活性化を阻害するサイトカイン（例えばＩＬ‐６、ＩＬ‐１０、ＴＧＦ‐β、ＶＥＧＦ、若しくは他の免疫抑制性サイトカイン）のアンタゴニスト；及び／又は（ｉｉ）免疫応答を刺激するために、Ｔ細胞活性化を刺激するための、ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリー、若しくはＴＮＦファミリー、若しくはサイトカインの刺激性受容体のアゴニストと組み合わせることができる。
【０２４３】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント調節因子のリガンドの高発現を示す癌を有する被験者のみが、本出願の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、及び／若しくは抗ＬＡＧ‐３抗体、これらの断片、又は二重特異性若しくは三重特異性アンタゴニストのいずれかとの併用療法のために選択される。例えば一実施形態では、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）及び／若しくはネクチン‐２（ＣＤ１１２）の高発現、並びに／又はＰＤ‐Ｌ１の低発現を示す癌を有する被験者は、本出願の抗ＴＩＧＩＴ抗体、その断片、若しくはＴＩＧＩＴアンタゴニストを用いた単剤療法、又はＰＤ‐１アンタゴニスト若しくは他の免疫チェックポイント調節因子を用いた併用療法のために選択できる。
【０２４４】
抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、第２の抗体、抗体断片、若しくはアンタゴニストとは別個に投与してよく、又はＴＩＧＩＴに対する少なくとも１つの結合特異性と、他の標的産物に対する第２の結合特異性とを備える、多重特異性抗体若しくはアンタゴニストを投与してよい。更に、本出願による抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ、又は二重特異性若しくは三重特異性アンタゴニストは、免疫応答及び／又はアポトーシスを刺激するのに有効な１つ以上の量の、１つ以上の更なる作用剤、例えば抗体、アンタゴニスト、又は薬剤と、同時投与してよく、これにより、被験者の体内での免疫応答及び／又はアポトーシスが更に強化される、刺激される、又は上方制御される。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、若しくは抗ＬＡＧ‐３抗体、又はこれらの１つ以上の断片は、異なる抗腫瘍アンタゴニストを用いた治療の後に投与される。例えば一実施形態では、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、又は抗ＬＡＧ‐３抗体は、ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１アンタゴニストを用いた治療が失敗した後；治療応答が不完全となった後；又は腫瘍の再発若しくは再燃があった（即ち「ＰＤ‐１失敗」となった）後でのみ、投与され得る。いくつかの実施形態では、このような失敗を示す癌を、例えばＰＶＲ及び／又はネクチン‐２の発現に関してスクリーニングし、高レベルの発現を有するものだけを、本出願の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、若しくは抗ＬＡＧ‐３抗体、断片、又はアンタゴニストを用いて治療する。
【０２４６】
他の抗ＰＤ‐１抗体としては、限定するものではないが、ニボルマブ（ＢＭＳ‐９３６５５８、ＭＤＸ‐１１０６、ＯＰＤＩＶＯ（商標））、ヒト化免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）  ｍＡｂ（Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；ペンブロリズマブ（ＭＫ‐３４７５、ランブロリズマブ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（商標））（Ｍｅｒｃｋ）；ピジリズマブ（ＣＴ‐０１１）（Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）；及びＡＭＰ‐２２４（Ｍｅｒｃｋ）が挙げられる。抗ＰＤ‐１抗体は例えば、ＡＢＣＡＭ（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１‐１４）、及びＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。
【０２４７】
他の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体としては、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、完全ヒトＩｇＧ４  ｍＡｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）；ＢＭＳ‐９３６５５９（ＭＤＸ‐１１０５）、完全ヒト化ＩｇＧ４  ｍＡｂ（Ｂｒｉｓｔｏｌ‐Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；ＭＥＤＩ４７３６、ヒト化ＩｇＧ抗体（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体（Ｍｅｒｃｋ、ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）が挙げられる。
【０２４８】
本発明の方法に従って使用するための例示的な抗ＣＴＬＡ‐４抗体としては、イピリムマブ、トレビリズマブ、及びトレメリムマブが挙げられる。
【０２４９】
特定の実施形態では、抗腫瘍アンタゴニストは、免疫チェックポイント調節因子のドミナントネガティブタンパク質である。特定の実施形態では、ドミナントネガティブタンパク質は、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＰＤ‐１、Ｂ７‐１、Ｂ７‐２、Ｂ７Ｈ３、ＣＴＬＡ‐４、ＬＡＧ‐３、ＴＩＭ‐３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ７０、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーに由来する、細胞外ドメインを含む。特定の実施形態では、これらの細胞外ドメインは、本明細書に記載の抗体の免疫グロブリン定常領域又はＦｃ受容体に融合する。このような変異体は、内因性受容体に結合でき、これにより、シグナル伝達が不足した複合体が形成される。特定の実施形態では、細胞外ドメインは、免疫グロブリン定常領域若しくはＦｃ断片、又はオリゴマータンパク質複合体中のモノマーに融合する。
【０２５０】
特定の実施形態では、ドミナントネガティブＰＤ‐Ｌ１アンタゴニストは、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、又はＰＤ‐１の細胞外ドメインを含む。別の実施形態では、ドミナントネガティブＰＤ‐１アンタゴニストが採用され、これは変異を有するため、ＰＤ‐Ｌ１には結合できない。例示的なドミナントネガティブタンパク質はＡＭＰ‐２２４（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ及びＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅが共同開発）であり、これは、ＰＤ‐Ｌ２の細胞外ドメイン及びヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む組換え融合タンパク質である。
【０２５１】
例示的な免疫チェックポイント調節因子アゴニストとしては、限定するものではないが、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバー、例えばＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及び４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）、並びにこれらのリガンド、又はＣＤ２８及びＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）を含むＢ７‐ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーが挙げられる。更なるチェックポイント調節因子アゴニストとしては、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ‐１、ＬＦＡ‐１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＤ８３リガンドが挙げられる。免疫チェックポイントアンタゴニストとしては、１つ以上の共刺激ドメインを含む抗体又は可溶性融合タンパク質アゴニストが挙げられる。アゴニスト抗体としては、限定するものではないが：抗ＣＤ４０  ｍＡｂ、例えばＣＰ‐８７０、８９３、ルカツムマブ、及びダセツズマブ；抗ＣＤ１３７  ｍＡｂ、例えばＢＭＳ‐６６３５１３ウレルマブ、及びＰＦ‐０５０８２５６６；抗ＯＸ４０  ｍＡｂ；抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ、例えばＴＲＸ５１８；抗ＣＤ２７  ｍＡｂ、例えばＣＤＸ‐１１２７；並びに抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂが挙げられる。
【０２５２】
例示的なＧＩＴＲアゴニストとしては例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質及び抗ＧＩＴＲ抗体（例えば２価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば米国特許第６，１１１，０９０号、及び米国特許第８，５８６，０２３号；欧州特許第０９０５０５Ｂ１号、国際公開特許第２０１０／００３１１８号、及び国際公開特許第２０１１／０９０７５４号に記載されているＧＩＴＲ融合タンパク質が挙げられる。抗ＧＩＴＲ抗体は例えば、米国特許第７，０２５，９６２号、米国特許第７，６１８，６３２号、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７号、及び米国特許第８，５９１，８８６号；欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号、及び欧州特許第１８６６３３９号；国際公開特許第２０１１／０２８６８３号、国際公開特許第２０１３／０３９９５４号、国際公開特許第２００５／００７１９０号、国際公開特許第２００７／１３３８２２号、国際公開特許第２００５／０５５８０８号、国際公開特許第９９／４０１９６号、国際公開特許第２００１／０３７２０号、国際公開特許第９９／２０７５８号、国際公開特許第２００６／０８３２８９号、国際公開特許第２００５／１１５４５１号、国際公開特許第２０１１／０５１７２６号に記載されている。例示的な抗ＧＩＴＲ抗体は、ＴＲＸ５１８である。
【０２５３】
共刺激又は共阻害性受容体に結合する別の膜結合型リガンドのファミリーは、コグネイトＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合する分子のＴＮＦファミリーであり、これは、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ、ＯＸ‐４０、ＯＸ‐４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４‐１ＢＢＬ、ＣＤ１３７／４‐１ＢＢ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２‐Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンフォトキシンα／ＴＮＦ  γ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンフォトキシンα１（３２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲ（例えばＴａｎｓｅｙ，  Ｍ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，  １４（２３‐２４）：１０８２‐１０８８を参照）を含む。
【０２５４】
免疫チェックポイントアゴニスト、又は共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な、抗原受容体以外の細胞表面分子又はそのリガンドを含み、限定するものではないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ‐１、ＬＦＡ‐１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７‐Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ‐１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ‐６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ‐１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ‐１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ‐Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ‐３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ‐７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む。
【０２５５】
一態様では、Ｔ細胞応答は、本出願の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、又は抗ＬＡＧ‐３  ｍＡｂと、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質のアンタゴニスト（例えば免疫チェックポイント阻害剤）、例えばＣＴＬＡ‐４、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＰＤ‐Ｌ２、ＬＡＧ‐３、ＴＩＭ‐３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ‐１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン‐１、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ‐１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ‐１、ＣＤ９６、及びＴＩＭ‐４、並びに（ｉｉ）Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト、例えばＢ７‐１、Ｂ７‐２、ＣＤ２８、４‐１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４‐１ＢＢＬ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ‐Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３、及びＣＤ２８Ｈのうちの１つ以上との組み合わせによって、刺激できる。
【０２５６】
癌治療のために本出願の抗ＰＤ‐１抗体、抗ＰＤ‐Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体及び／又は抗ＬＡＧ‐３抗体と組み合わせることができる、上述のタンパク質のうちの１つを調節する例示的な作用剤としては、（ＣＴＬＡ‐４に対する）ＹＥＲＶＯＹ（商標）／イピリムマブ又はトレメリムマブ、（Ｂ７．１に対する）ガリキシマブ、（ＰＤ‐１に対する）ＯＰＤＩＶＯ（商標）／ニボルマブ／ＢＭＳ‐９３６５５８、（ＰＤ‐１に対する）ピジリズマブ／ＣＴ‐０１１、（ＰＤ‐１に対する）ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）／ペンブロリズマブ／ＭＫ‐３４７５、（Ｂ７‐ＤＣ／ＰＤ‐Ｌ２に対する）ＡＭＰ２２４、（Ｂ７‐Ｈ１に対する）ＢＭＳ‐９３６５５９、（Ｂ７‐Ｈ１に対する）ＭＰＤＬ３２８０Ａ、（ＩＣＯＳに対する）ＭＥＤＩ‐５７０、（Ｂ７Ｈ２に対する）ＡＭＧ５５７、（Ｂ７Ｈ３に対する）ＭＧＡ２７１、（ＬＡＧ‐３に対する）ＩＭＰ３２１、（ＣＤ１３７／４‐１ＢＢに対する）ウレルマブマブ／ＢＭＳ‐６６３５１３及びＰＦ‐０５０８２５６６、（ＣＤ２７に対する）ＣＤＸ‐１１２７、（ＯＸ４０に対する）ＭＥＤＩ‐６３８３及びＭＥＤＩ‐６４６９、（ＯＸ４０Ｌに対する）ＲＧ‐７８８８、（ＴＡＣＩに対する）アタシセプト、（ＣＤ４０に対する）ＣＰ‐８７０８９３、（ＣＤ４０に対する）ルカツムマブ、（ＣＤ４０に対する）ダセツズマブ、（ＣＤ３に対する）ムロモナブ‐ＣＤ３が挙げられる。
【０２５７】
癌の治療のために本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせることができる他の分子としては、ＮＫ細胞の阻害性受容体のアンタゴニスト、又はＮＫ細胞の活性化受容体のアゴニストが挙げられる。例えば、アンタゴニスト抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１及び／又は抗ＴＩＧＩＴ抗体を、ＫＩＲのアンタゴニスト（例えばリリルマブ）、ＲＧ７１５５等のＣＳＦ‐１Ｒアンタゴニストと組み合わせることができる。
【０２５８】
腫瘍は、多様な機序によって宿主の免疫監視を回避する。これらの機序の多くは、腫瘍が発現する免疫抑制タンパク質の不活性化によって克服される可能性がある。これらには特に、ＴＧＦ‐β、ＩＬ‐１０、及びＦａｓリガンドが含まれる。これらの実体それぞれに対する抗体を、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用することにより、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を促進できる。
【０２５９】
宿主の免疫応答性を活性化する他の抗体を、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用できる。これらには、ＤＣ機能及び抗原提示を活性化する、樹状細胞の表面上の分子が含まれる。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代替でき、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストと組み合わせて使用できる。ＯＸ‐４０、ＣＤ１３７／４‐１ＢＢ、及びＩＣＯＳといったＴ細胞共刺激分子に対する活性化抗体も、Ｔ細胞活性化のレベルの上昇を提供できる。
【０２６０】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、１つ以上の他の治療剤、例えば抗癌剤、放射性毒性剤、又は免疫抑制剤と同時投与できる。このような同時投与により、薬剤に対する耐性の発生、腫瘍細胞の抗体に対する反応性を低下させる抗原性の変化、及び（１つ以上の薬剤を低用量で投与することによる）毒性による問題を解決できる。
【０２６１】
本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、（免疫複合体として）作用剤に化学的に結合でき、又は作用剤とは別個に投与できる。後者の場合（別個に投与する場合）、抗体は、作用剤の前、後、若しくは作用剤と同時に投与でき、又は他の公知の療法、例えば抗癌療法、例えば放射線と同時投与できる。本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、１つ以上の抗癌剤と同時投与してよく、これにより、異なる機序で相乗的に作用する２つの抗癌剤を提供することで、ヒト癌細胞において細胞傷害効果が得られる。
【０２６２】
本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、抗癌剤、例えば：アルキル化剤；アントラサイクリン抗生物質；代謝拮抗剤；解毒剤；インターフェロン；ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体；ＥＧＦＲ阻害剤；ＨＥＲ２阻害剤；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；ホルモン；有糸分裂阻害剤；ホスファチジルイノシトール‐３‐キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤；Ａｋｔ阻害剤；哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤；プロテアソーム阻害剤；ポリ（ＡＤＰ‐リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤；Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路阻害剤；中心体クラスター分離剤；マルチキナーゼ阻害剤；セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤；タキサン若しくはタキサン誘導体、アロマターゼ阻害剤、アントラサイクリン、微小管標的化剤、トポイソメラーゼ毒型薬剤、分子標的若しくは酵素（例えばキナーゼ若しくはタンパク質メチルトランスフェラーゼ）の阻害剤、シチジン類似体、又はこれらの組み合わせと組み合わせることができる。
【０２６３】
例示的なアルキル化剤としては、限定するものではないが：シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ；Ｎｅｏｓａｒ）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）；メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ）；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ）；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ）；ロムスチン（ＣｅｅＮＵ）；ダカルバジン（ＤＴＩＣ‐Ｄｏｍｅ）；オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）；カルムスチン（Ｇｌｉａｄｅｌ）；イホスファミド（Ｉｆｅｘ）；メクロレタミン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）；ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ）；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）；シスプラチン（ＣＤＤＰ；Ｐｌａｔｉｎｏｌ）；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ）；チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ）；又はストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ）が挙げられる。
【０２６４】
例示的なアントラサイクリン抗生物質としては、限定するものではないが：ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）；ドキソルビシンリポソーム（Ｄｏｘｉｌ）；ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）；ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）；ダウノルビシンリポソーム（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ）；ダクチノマイシン（Ｃｏｓｍｅｇｅｎ）；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ）；プリカマイシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）；マイトマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）；ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ）；又はバルルビシン（Ｖａｌｓｔａｒ）が挙げられる。
【０２６５】
例示的な代謝拮抗剤としては、限定するものではないが：フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ）；カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）；ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ）；メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）；ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ）；フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ）；ネララビン（Ａｒｒａｎｏｎ）；クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ  Ｎｏｖａｐｌｕｓ）；クロファラビン（Ｃｌｏｌａｒ）；シタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ‐Ｕ）；デシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ）；シタラビンリポソーム（ＤｅｐｏＣｙｔ）；ヒドロキシ尿素（Ｄｒｏｘｉａ）；プララトレキサート（Ｆｏｌｏｔｙｎ）；フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）；ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）；クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）；フルダラビン（Ｏｆｏｒｔａ）；メトトレキサート（ＭＴＸ；Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）；メトトレキサート（Ｔｒｅｘａｌｌ）；チオグアニン（Ｔａｂｌｏｉｄ）；ＴＳ‐１又はシタラビン（Ｔａｒａｂｉｎｅ  ＰＦＳ）が挙げられる。
【０２６６】
例示的な解毒剤としては、限定するものではないが、アミホスチン（Ｅｔｈｙｏｌ）又はメスナ（Ｍｅｓｎｅｘ）が挙げられる。
【０２６７】
例示的なインターフェロンとしては、限定するものではないが、インターフェロンアルファ‐２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ）又はインターフェロンアルファ‐２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ‐Ａ）が挙げられる。
【０２６８】
例示的なポリクローナル又はモノクローナル抗体としては、限定するものではないが：トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）；オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）；トシツモマブ／ヨウ素１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）；アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）；イブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ；Ｉｎ‐１１１；Ｙ‐９０  Ｚｅｖａｌｉｎ）；ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）；エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ）；又はデノスマブが挙げられる。
【０２６９】
例示的なＥＧＦＲ阻害剤としては、限定するものではないが：ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）；エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）；ＰＫＩ‐１６６；カネルチニブ（ＣＩ‐１０３３）；マツズマブ（Ｅｍｄ７２００）；又はＥＫＢ‐５６９が挙げられる。
【０２７０】
例示的なＨＥＲ２阻害剤としては、限定するものではないが、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）；又はＡＣ‐４８０が挙げられる。
【０２７１】
例示的なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としては、限定するものではないが、ボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ）、バルプロ酸、ロミデプシン、エンチノスタット、アベキシノスタット、ギビノスタット、及びモセチノスタットが挙げられる。
【０２７２】
例示的なホルモンとしては、限定するものではないが：タモキシフェン（Ｓｏｌｔａｍｏｘ；Ｎｏｌｖａｄｅｘ）；ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ）；メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ）；リュープロリド（Ｌｕｐｒｏｎ；Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ；Ｅｌｉｇａｒｄ；Ｖｉａｄｕｒ）；フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）；レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ）；トリプトレリン（Ｔｒｅｌｓｔａｒ  ＬＡ；Ｔｒｅｌｓｔａｒ  Ｄｅｐｏｔ）；エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ）；ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ）；ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ）；アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）；フルオキシメステロン（Ａｎｄｒｏｘｙ；Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ）；メドロキシプロゲステロン（Ｐｒｏｖｅｒａ；Ｄｅｐｏ‐Ｐｒｏｖｅｒａ）；エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ）；フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ）；トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；デガレリックス（Ｆｉｒｍａｇｏｎ）；ニルタミド（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ）；アバレリクス（Ｐｌｅｎａｘｉｓ）；又はテストラクトン（Ｔｅｓｌａｃ）が挙げられる。
【０２７３】
例示的な有糸分裂阻害剤としては、限定するものではないが：パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ；Ｏｎｘｏｌ；Ａｂｒａｘａｎｅ）；ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）；ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ；Ｖｉｎｃａｓａｒ  ＰＦＳ）；ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）；エトポシド（Ｔｏｐｏｓａｒ；Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ；ＶｅＰｅｓｉｄ）；テニポシド（Ｖｕｍｏｎ）；イクサべピロン（Ｉｘｅｍｐｒａ）；ノコダゾール；エポチロン；ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；カンプトテシン（ＣＰＴ）；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）；トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）；アムサクリン；又はラメラリンＤ（ＬＡＭ‐Ｄ）が挙げられる。
【０２７４】
例示的なホスファチジルイノシトール‐３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤としては、ウォルトマンニン（ＰＩ３Ｋの非可逆的阻害剤）、デメトキシビリジン（ウォルトマンニンの誘導体）、ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋの可逆的阻害剤）；ＢＫＭ１２０（ブパリシブ）；イデラリシブ（ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤）；デュベリシブ（ＩＰＩ‐１４５（ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマの阻害剤））；アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）（アルファ特異性ＰＩ３Ｋ阻害剤）；ＴＧＲ１２０２（かつてはＲＰ５２６４として公知）（経口ＰＩ３Ｋデルタ阻害剤）；並びにコパンリシブ（ＢＡＹ８０‐６９４６）（主にＰＩ３Ｋα、δアイソフォームの阻害剤）が挙げられる。
【０２７５】
例示的なＡｋｔ阻害剤としては、限定するものではないが、ミルテフォシン、ＡＺＤ５３６３、ＧＤＣ‐００６８、ＭＫ２２０６、ペリフォシン、ＲＸ‐０２０１、ＰＢＩ‐０５２０４、ＧＳＫ２１４１７９５、及びＳＲ１３６６８が挙げられる。
【０２７６】
例示的なＭＴＯＲ阻害剤としては、限定するものではないが：エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）又はテムシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）；シロリムス（ｒａｐａｍｕｎｅ）；リダフォロリムス又はデフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＯＳＩ‐０２７（ＯＳＩ）、ＩＮＫ‐１２８、ＢＥＺ２３５、ＰＩ‐１０３、Ｔｏｒｉｎ１、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｋｕ‐００６３７９４、ＷＡＹ‐６００、ＷＹＥ‐６８７、ＷＹＥ‐３５４、及びＣＣ‐２２３が挙げられる。
【０２７７】
例示的なプロテアソーム阻害剤としては、限定するものではないが、ボルテゾミブ（ＰＳ‐３４１）、イキサゾミブ（ＭＬＮ２２３８）、ＭＬＮ９７０８、デランゾミブ（ＣＥＰ‐１８７７０）、カルフィルゾミブ（ＰＲ‐１７１）、ＹＵ１０１、オプロゾミブ（ＯＮＸ‐０９１２）、マリゾミブ（ＮＰＩ‐００５２）、及びジスフィラムが挙げられる。
【０２７８】
例示的なＰＡＲＰ阻害剤としては、限定するものではないが、オラパリブ、イニパリブ、ベラパリブ、ＢＭＮ‐６７３、ＢＳＩ‐２０１、ＡＧ０１４６９９、ＡＢＴ‐８８８、ＧＰＩ２１０１６、ＭＫ４８２７、ＩＮＯ‐１００１、ＣＥＰ‐９７２２、ＰＪ‐３４、Ｔｉｑ‐Ａ、Ｐｈｅｎ、ＰＦ‐０１３６７３３８、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０２７９】
例示的なＲａｓ／ＭＡＰＫ経路阻害剤としては、限定するものではないが、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、ＣＩ‐１０４０、ＰＤ０３２５９０１、ＡＳ７０３０２６、ＲＯ４９８７６５５、ＲＯ５０６８７６０、ＡＺＤ６２４４、ＧＳＫ１１２０２１２、ＴＡＫ‐７３３、Ｕ０１２６、ＭＥＫ１６２、及びＧＤＣ‐０９７３が挙げられる。
【０２８０】
例示的な中心体クラスター分離剤としては、限定するものではないが：グリセオフルビン；ノスカピン、ノスカピン誘導体、例えば臭素化ノスカピン（例えば９‐ブロモノスカピン）、還元型ブロモノスカピン（ＲＢＮ）、Ｎ‐（３‐ブロモベンジル）ノスカピン、アミノノスカピン、及びこれらの水溶性誘導体；ＣＷ０６９；フェナントリジン由来ポリ（ＡＤＰ‐リボース）ポリメラーゼ阻害剤、ＰＪ‐３４；Ｎ２‐（３‐ピリジルメチル）‐５‐ニトロ‐２‐フラミド、Ｎ２‐（２‐チエニルメチル）‐５‐ニトロ‐２‐フラミド、並びにＮ２‐ベンジル‐５‐ニトロ‐２‐フラミドが挙げられる。
【０２８１】
例示的なマルチキナーゼ阻害剤としては、限定するものではないが：レゴラフェニブ；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）；スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）；ＢＩＢＷ２９９２；Ｅ７０８０；Ｚｄ６４７４；ＰＫＣ‐４１２；モテサニブ；又はＡＰ２４５３４が挙げられる。
【０２８２】
例示的なセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤としては、限定するものではないが：ルボキシスタウリン；塩酸エリル／イースジル；フラボピリドール；セリシクリブ（ＣＹＣ２０２；Ｒｏｓｃｏｖｉｔｒｉｎｅ）；ＳＮＳ‐０３２（ＢＭＳ‐３８７０３２）；Ｐｋｃ４１２；ブリオスタチン；ＫＡＩ‐９８０３；ＳＦ１１２６；ＶＸ‐６８０；Ａｚｄ１１５２；Ａｒｒｙ‐１４２８８６（ＡＺＤ‐６２４４）；ＳＣＩＯ‐４６９；ＧＷ６８１３２３；ＣＣ‐４０１；ＣＥＰ‐１３４７；又はＰＤ３３２９９１が挙げられる。
【０２８３】
例示的なチロシンキナーゼ阻害剤としては、限定するものではないが：エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）；イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）；スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）；トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）；ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）；リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）；パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ）；アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）；ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）；テニシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）；パゾバニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）；ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）；ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）；バタラニブ（Ｐｔｋ７８７；ＺＫ２２２５８４）；ＣＥＰ‐７０１；ＳＵ５６１４；ＭＬＮ５１８；ＸＬ９９９；ＶＸ‐３２２；Ａｚｄ０５３０；ＢＭＳ‐３５４８２５；ＳＫＩ‐６０６ＣＰ‐６９０；ＡＧ‐４９０；ＷＨＩ‐Ｐ１５４；ＷＨＩ‐Ｐ１３１；ＡＣ‐２２０；又はＡＭＧ８８８が挙げられる。
【０２８４】
例示的なＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤としては、限定するものではないが：ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）；スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）；ラニビズマブ；ペガプタニブ；又はバンデタニブが挙げられる。
【０２８５】
例示的な微小管標的化剤としては、限定するものではないが、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、及びナベルビンが挙げられる。
【０２８６】
例示的なトポイソメラーゼ毒型薬剤としては、限定するものではないが、テニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシン、及びイダルビシンが挙げられる。
【０２８７】
例示的なタキサン又はタキサン誘導体としては、限定するものではないが、パクリタキセル及びドセタキソールが挙げられる。
【０２８８】
例示的な一般的化学療法剤、抗新生物剤、抗増殖剤としては、限定するものではないが、アルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ）；イソトレチノイン（Ａｃｃｕｔａｎｅ；Ａｍｎｅｓｔｅｅｍ；Ｃｌａｒａｖｉｓ；Ｓｏｔｒｅｔ）；トレチノイン（Ｖｅｓａｎｏｉｄ）；アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ）；ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）；アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ）；レバミソール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）；ミトタン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ）；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）；ペガスパルガーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ）；デニロイキンディフチトクス（Ｏｎｔａｋ）；ポルフィマー（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）；アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）；レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）；ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）；サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）；テニシロリムス（Ｔｏｒｉｓｅｌ）；三酸化ヒ素（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ）；ベルテポルフィン（Ｖｉｓｕｄｙｎｅ）；ミモシン（Ｌｅｕｃｅｎｏｌ）；（１Ｍ  テガフール‐０．４Ｍ  ５‐クロロ‐２，４‐ジヒドロキシピリミジン‐１Ｍ  カリウムオキソネート）、又はロバスタチンが挙げられる。
【０２８９】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗腫瘍アンタゴニストは、治療用量未満で投与され、別の抗免疫チェックポイント調節因子抗体又はアンタゴニストは、治療用量未満で投与され、血管新生アンタゴニストは、治療用量未満で投与され、あるいは、アンタゴニストの組み合わせの中のいずれのアンタゴニストはそれぞれ、治療用量未満で投与される。
【０２９０】
特定の実施形態では、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＡＧ‐３阻害は、標準的な癌治療（例えば手術、放射線、及び化学療法）と組み合わされる。ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＡＧ‐３阻害は、化学療法レジメンと効果的に組み合わせることができる。これらの例では、投与される化学療法試薬の用量を削減できる可能性がある。このような組み合わせの例は、黒色腫の治療のための抗ＴＩＧＩＴ、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、又は抗ＬＡＧ‐３抗体と、ダカルバジンとの組み合わせである。このような組み合わせの別の例は、黒色腫の治療のための抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、又は抗ＬＡＧ‐３抗体と、インターロイキン‐２（ＩＬ‐２）との組み合わせである。ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ及び／又はＬＡＧ‐３阻害と化学療法とを組み合わせて使用することで、アポトーシスを強化でき、また細胞傷害性免疫のための腫瘍抗原提示を増大させることができると考えられる。他の相乗的併用療法としては、放射線、手術、又はホルモン抑制と組み合わせて使用した場合の、細胞死によるＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、及び／又はＬＡＧ‐３阻害が挙げられる。これらのプロトコルはそれぞれ、宿主の腫瘍抗原のソースを生成する。
【０２９１】
特定の実施形態では、本明細書に記載のチェックポイント調節因子アンタゴニストは、多重特異性アンタゴニスト中で、又はＦｃα若しくはＦｃγ受容体発現性エフェクタ細胞を腫瘍細胞に対して標的化する二重特異性抗体と組み合わせて、使用できる（例えば米国特許第５，９２２，８４５号、及び米国特許第５，８３７，２４３号を参照）。二重特異性抗体は、２つの別個の抗原を標的とするために使用できる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えばＨｅｒ‐２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、マクロファージを複数の癌細胞又は腫瘍に対して標的化するために使用されている。この標的化により、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化できる。これらの応答のＴ細胞アームは、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１及び／又はＬＡＧ‐３の阻害によって増強されることになる。あるいは、腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体と、樹状細胞特異的細胞表面マーカーとを使用することによって、抗原をＤＣに直接送達できる。
【０２９２】
ＶＩ．抗腫瘍アンタゴニストの作製方法
Ａ．アンタゴニストを発現するための核酸及び宿主
一態様では、本出願は、本出願の抗腫瘍アンタゴニストをコードする核酸、及びこのような核酸を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載の実施形態による抗体若しくは断片のＨＣＶＲ及び／若しくはＬＣＶＲ断片、又は本明細書に記載の他の抗体及び抗体断片のうちのいずれかをコードする。
【０２９３】
モノクローナル抗体の抗原結合部位をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）、ハイブリドーマ細胞から単離して配列決定できる。あるいは、関心対象の免疫グロブリンからのアミノ酸配列を、タンパク質の直接の配列決定によって決定でき、好適なコードヌクレオチド配列は、普遍的なコドン表に従って設計できる。他の場合においては、定常領域、ヒンジ領域等を含む、抗原結合部位のヌクレオチド及びアミノ酸配列、又は他の免疫グロブリン配列は、当業者に公知の、公開されているソースから得ることができる。
【０２９４】
特定の単一特異性、二重特異性、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストをコードする発現ベクターを用いて、本開示の抗腫瘍アンタゴニストを、試験管内の培養細胞中で合成してよく、あるいは上記発現ベクターを患者に直接投与して、生体内又は生体外で抗腫瘍アンタゴニストを発現させてよい。本明細書中で使用される場合、「発現ベクター」は、本開示の単一特異性、二重特異性、又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストに対応する１つ以上のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、ウイルス又は非ウイルスベクターであって、抗体の調製を目的として、又は治療剤としての直接投与のために、宿主細胞中で１つ以上の上記ポリヌクレオチドから発現させるのに好適な形態の、ウイルス又は非ウイルスベクターを指す。
【０２９５】
ある核酸配列は、別の核酸配列とある機能的な関係に配置されたときに、上記別の核酸配列に対して「作動可能に結合」される。例えば、プレ配列又はシグナルペプチドのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、上記ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に結合され；プロモータ又はエンハンサは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、このコード配列に作動可能に結合され；あるいはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に結合されている。一般に、「作動可能に結合される」は、結合される複数のＤＮＡ配列が連続していること、及びシグナルペプチドの場合は連続しておりかつ読み取り段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは必ずしも連続していなくてよい。結合は、便利な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーを、従来の慣行に従って使用してよい。
【０２９６】
抗腫瘍アンタゴニストを発現するための核酸配列は典型的には、アミノ末端シグナルペプチド配列を含み、これは成熟タンパク質から除去される。シグナルペプチド配列は発現のレベルに影響を及ぼし得るため、ポリヌクレオチドは、多様な異なるＮ末端シグナルペプチド配列のいずれをコードしてよい。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等といった因子に左右され得ることは、当業者には理解されるであろう。
【０２９７】
上述の「調節性配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つ以上の宿主生物の体内における、作動可能に結合されたコード配列の発現に必要な、ＤＮＡ配列を指す。用語「調節性配列」は、プロモータ、エンハンサ、及び他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図したものである。調節性配列は多数のタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、又は特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば組織特異性調節性配列）を含む。発現ベクターは一般に、転写終結のための配列を含有し、更に、ｍＲＮＡの安定性にプラスの影響を及ぼす１つ以上の要素を含有し得る。
【０２９８】
発現ベクターは、抗腫瘍アンタゴニストの発現を指示するための、プロモータ及び／又はエンハンサを含む１つ以上の転写調節性要素を含有する。プロモータは、転写開始部位に関して比較的固定された位置から転写を開始させるように機能する、ＤＮＡ配列を含む。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要なコア要素を含有し、他の上流の要素及び応答要素と連動して作動し得る。
【０２９９】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモータ」は、その最も広い文脈において解釈されるべきであり、ゲノム遺伝子由来の転写調節性要素（ＴＲＥ）、又はそれ由来のキメラＴＲＥを含み、これは、正確な転写開始のためのＴＡＴＡボックス又はイニシエータ要素を含み、またこれは、発達刺激及び／又は外部刺激に応答してそれに作動可能に結合される遺伝子の活性化又は抑制を調節する更なるＴＲＥ（即ち上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサ、及びサイレンサ）、並びにトランス作用性調節性タンパク質又は核酸を、伴っても伴わなくてもよい。プロモータは、ゲノム断片を含有してよく、又は組み合わされる１つ以上のＴＲＥのキメラを含有してよい。
【０３００】
好ましいプロモータは、関心対象の標的細胞中での高レベルの発現を指示できるプロモータである。プロモータとしては、構成的プロモータ（例えばＨＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子‐１α（ＥＦ‐１α））、又は関心対象の特定の細胞タイプにおいて優先的な発現を示すプロモータが挙げられる。エンハンサは一般に、転写開始部位から離れて機能する、転写ユニットに対して５’又は３’となることができるＤＮＡ配列を指す。更にエンハンサは、イントロン内及びコード配列内に存在してよい。これらの長さは通常１０〜３００ｂｐであり、シスで機能する。エンハンサは、近隣のプロモータからの転写を増大させる、及び／又は調節するように機能する。好ましいエンハンサは、抗体産生細胞中での高レベルの発現を指示するものである。細胞又は組織特異的転写調節性要素（ＴＲＥ）は、発現ベクターに組み込むことによって、発現を所望の細胞タイプに制限できる。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータ（Ｈ１又はＵ６）は、ｓｉＲＮＡが発現されるｓｈＲＮＡの発現に特に有用である。発現ベクターは、１つ以上の細胞タイプでの抗腫瘍アンタゴニストの発現を促進するように設計できる。
【０３０１】
特定の実施形態では、１つ以上の発現ベクターを操作して、抗腫瘍アンタゴニストと、Ｔｉｅ２経路、ＶＥＧＦ経路、又は免疫チェックポイント調節因子を標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡとの両方を発現させることができる。
【０３０２】
ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導するように操作できる、二本鎖ＲＮＡである。合成によって産生されたｓｉＲＮＡは、酵素Ｄｉｃｅｒによって細胞内で通常処理されるタイプのｓｉＲＮＡを構造的に模倣する。発現ベクターから発現される場合、この発現ベクターは、処理される短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を、細胞内の標的化ｓｉＲＮＡへと転写するように、操作される。合成ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、公知のアルゴリズムを用いて設計でき、また従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザを用いて合成できる。
【０３０３】
抗腫瘍アンタゴニストの個々の鎖を共発現させるために、好適なスプライスドナー及びスプライスアクセプタ配列を組み込んで、両方の産物を発現させることができる。あるいは、内部リボソーム結合配列（ＩＲＥＳ）又は２Ａペプチド配列を採用して、１つのプロモータから複数の産物を発現させることができる。ＩＲＥＳは、リボソームが結合できる構造を提供し、上記リボソームは必ずしもｍＲＮＡの５’末端にある必要はない。従って、ｍＲＮＡ内の第２の開始コドンにおいて翻訳を開始するようリボソームに指示でき、これにより、単一のｍＲＮＡから２つ以上のポリペプチドを産生できる。２Ａペプチドは、２Ａ部位の上流及び下流でペプチドの同時翻訳自己切断を仲介する短い配列を含有し、これにより、２つの異なるタンパク質を、１回の転写から同一のモル量で産生できる。ＣＨＹＳＥＬが２Ａペプチドの非限定的な例であり、これは、翻訳中の真核生物リボソームに、ｍＲＮＡから解離することなく合成されている成長中のポリペプチド鎖を放出させる。このリボソームは翻訳を続け、第２のポリペプチドを産生する。
【０３０４】
発現ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含んでよい。ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス（ＨＩＶ‐１及びＨＩＶ‐２等のレンチウイルスを含む）、シンドビス及び他のＲＮＡウイルス、アルファウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス等に由来するものであってよい。非ウイルスベクターは単に、ウイルス由来成分（例えばカプシド及び／又はエンベロープ）でパッケージされていない「裸の」発現ベクターである。
【０３０５】
特定のケースにおいて、これらのベクターは、これらのウイルスベクターが生来有する、又は操作によってウイルスベクターに与えられた、標的化特性を用いて、特定の疾患又は細胞集団を標的とするように操作できる。特定の細胞を、ポリヌクレオチドの送達及び発現のために「標的化」してよい。従って用語「標的化」はこの場合：カプシド、エンベロープタンパク質、特定の細胞への送達のための抗体の形態での、内因性又は異種結合剤の使用；発現を細胞の１つ以上の特定のサブセットに制限するための組織特異的調節性要素の使用；あるいはこれら両方に基づくものとすることができる。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、抗体鎖の発現は、組織特異的又は遍在性プロモータといった調節性要素の制御下にある。いくつかの実施形態では、ＣＭＶプロモータ、ＣＭＶ‐ニワトリベータアクチンハイブリッド（ＣＡＧ）プロモータといった遍在性プロモータ、又は特定の抗体の重鎖若しくは軽鎖若しくは一本鎖誘導体の発現を制御するための組織特異的若しくは腫瘍特異的プロモータを用いてよい。
【０３０７】
非ウイルス発現ベクターは、裸のＤＮＡの直接注入によって、又は抗腫瘍アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドをリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、ウイルス様粒子、若しくは赤血球ゴーストでカプセル化することによって、非ウイルス遺伝子の導入に利用できる。このような組成物は、標的指向性ドメインへの化学的コンジュゲーションによって更に結合されて、関心対象の所望の細胞への核酸の標的化された送達及び／又は移入を促進できる。更に、プラスミドベクターを、ポリリジン、プロタミン、及びアルブミンのような高分子ＤＮＡ結合カチオン等の合成遺伝子導入分子と共にインキュベートし、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトース、又はトランスフェリンといった細胞標的化リガンドに化学的に結合させることができる。
【０３０８】
あるいは、裸のＤＮＡを採用してもよい。裸のＤＮＡの取り込み効率は、圧縮によって、又は生分解性ラテックスビーズの使用によって、改善できる。このような送達は、ビーズを処理して疎水性を向上させて、エンドソームの破壊及び細胞質へのＤＮＡの放出を促進することによって、更に改善できる。
【０３０９】
Ｂ．単一特異性又は多重特異性抗体の製造方法
一態様では、本出願は宿主細胞であって、本出願の二重特異性及び／又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストをコードする核酸若しくは発現ベクター又は核酸／発現ベクターをコードする、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、及び／又は抗ＬＡＧ‐３のＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲで形質転換された、宿主細胞を提供する。宿主細胞は、核酸若しくは発現ベクター、又は本明細書に記載の他の同時投与される抗体若しくはアンタゴニストのうちのいずれかをコードする、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ及び／又は抗ＬＡＧ‐３のＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲを発現できるいずれの細菌又は真核細胞とすることができる。
【０３１０】
別の態様では、抗腫瘍アンタゴニストの製造方法は、抗体又は断片の産生が可能な条件下で、核酸又は発現ベクターをコードする、１つ以上の抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＴＩＧＩＴ、及び／又は抗ＬＡＧ‐３のＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲで形質転換された、宿主細胞を培養するステップと、上記抗体を上記細胞から精製するステップとを含む。
【０３１１】
更なる態様では、本出願は、抗体の製造方法を提供し、上記方法は：上記抗体中の１つ以上のポリペプチド鎖をコードする１つ以上の構築物を一時的又は安定的に発現する細胞を培養するステップ；及び培養した上記細胞から上記抗体を精製するステップを含む。機能的な抗体を産生できるいずれの細胞を使用してよい。好ましい実施形態では、抗体発現細胞は、真核生物又は哺乳類由来であり、好ましくはヒト細胞である。様々な組織細胞タイプ由来の細胞を用いて、抗体を発現させることができる。他の実施形態では、細胞は酵母細胞、昆虫細胞、又は細菌細胞である。好ましくは、抗体産生細胞は、上記抗体を発現するベクターで安定的に形質転換される。
【０３１２】
抗体重鎖又は軽鎖を発現する１つ以上の発現ベクターを、Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡ技法、カチオン性脂質仲介型トランスフェクション、ポリマー仲介型トランスフェクション、ペプチド仲介型トランスフェクション、ウイルス仲介型感染、物理的又は化学的な作用剤又は処理、電気穿孔法等といったいずれの従来の方法で、細胞内に導入できる。更に、細胞は、抗体を発現する安定的に形質転換されたクローンの選択を促進する選択可能なマーカーと共に、抗体を発現するための、１つ以上の発現ベクターでトランスフェクトしてよい。このような細胞によって産生された抗体は、遠心分離、クロマトグラフィ等といった当該技術分野で公知の技法に従って、回収及び／又は精製できる。
【０３１３】
哺乳類細胞に対して好適な、選択可能なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びピューロマイシンが挙げられる。このような選択可能なマーカーを哺乳類宿主細胞内に良好に移入すると、形質転換された哺乳類宿主細胞は、選択された圧力下に置かれた場合に生き残ることができる。選択方式については、２つの広く使用されている別個のカテゴリが存在する。第１のカテゴリは、細胞の代謝と、補充培地から独立して成長する能力を欠いた変異細胞株の使用とに基づくものである。その２つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンといった栄養素を追加せずに成長する能力に欠けている。これらの細胞が、完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているため、これらの細胞は、不足しているヌクレオチドが補充培地で提供されない限り、生き残ることができない。培地の補充に代わる選択肢は、無傷のＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を、これらの各遺伝子を欠いている細胞に導入することによって、成長要件を変更することである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、補充されていない培地中では生き残ることができない。
【０３１４】
第２のカテゴリは、いずれの細胞タイプにおいて使用される選択スキームを指す優生選択であり、変異細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは典型的には、宿主細胞の成長の阻止のために薬剤を使用する。新規の遺伝子を有する細胞は、薬剤耐性を伝達するタンパク質を発現し、上記選択を生き残ることになる。このような優生選択の例は、ネオマイシン、ミコフェノール酸、又はハイグロマイシンといった薬剤を使用する。これら３つの例は、真核細胞の制御下にある細菌遺伝子を採用して、適切な薬剤Ｇ４１８、即ちネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、又はハイグロマイシンそれぞれに対する耐性を伝達する。他には、ネオマイシン類似体Ｇ４１８及びピューロマイシンが挙げられる。
【０３１５】
例示的な抗体発現性細胞としては、ヒトＪｕｒｋａｔ、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＷＥＨＩ線維肉腫細胞、及びリーシュマニア・タレントラエ等の単細胞原生動物種が挙げられる。更に、安定的に形質転換された抗体産生細胞株は、ｃ‐ｍｙｃ又は他の不死化剤で不死化された一次細胞を用いて産生できる。
【０３１６】
一実施形態では、上記細胞株は、安定的に形質転換されたリーシュマニア・タレントラエ等のリーシュマニア細胞株を含む。リーシュマニアは、哺乳類タイプのグリコシル化パターンを示す真核細胞タンパク質の高レベルの発現のための、ロバストで迅速に成長する単細胞宿主を提供することが知られている。市販のリーシュマニア真核細胞発現キットが入手可能である（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、イエナ（ドイツ））。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、上記細胞株は、培養物１リットルあたり、少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、少なくとも５ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも１００ｍｇ、少なくとも２００ｍｇ、少なくとも３００ｍｇ、少なくとも４００ｍｇ、又は少なくとも５００ｍｇの抗体を発現する。
【０３１８】
本出願の抗体は、いずれの適切な培養培地、例えばＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、及びＡＩＭ  Ｖ（登録商標）中での培養及び保持の後、抗体発現細胞から単離できる。抗体は、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ免疫アフィニティ精製を含む従来のタンパク質精製方法（例えばアフィニティ精製、クロマトグラフィ等）を用いて精製できる。いくつかの実施形態では、抗体を、培養物上清からの単離のために培養物上清に分泌されるように操作する。
【０３１９】
限定として解釈されるべきではない以下の実施例によって、本出願を更に説明する。本出願全体を通して引用されている全ての参考文献、特許、及び公開特許出願の内容、並びに図面及び表は、参照により本出願に援用される。
【０３２０】
Ｃ．ホモ二量体及びヘテロ二量体
二重特異性及び三重特異性抗体調製物を効率的に製造するための課題の１つは、結合特異性が異なる鎖が同時発現される際の、重鎖及び軽鎖の誤った対合に関する。表１は、結合特異性が異なる重鎖間の誤った対合を克服するための、複数のアミノ酸置換選択肢を示し、これは、所望の重鎖間での正しい会合を「強制する」、又は優先的に促進する。重鎖間の誤った対合を防止又は低減するためのいずれのアプローチを用いて、本開示による二重特異性及び三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを作製してよい。
【０３２１】
「ノブ・イントゥ・ホール」（ＫｉＨ）アプローチは、ほとんどの相互作用が発生する２つのＣＨ３ドメイン間の境界の修飾に依存する。典型的には、嵩高い残基を一方の抗体重鎖のＣＨ３ドメインに導入し、これは鍵のように機能する。他方の重鎖には「ホール」が形成され、これは上述の嵩高い残基を収容でき、錠を模倣する。得られるヘテロ二量体Ｆｃ部分は、人工的なジスルフィド架橋によって更に安定化できる。
【０３２２】
別のアプローチは、イオン相互作用又は立体的相補性を有する荷電残基に基づくものである。これは、ＣＨ３境界の電荷の極性を変更するステップを含み、これにより、静電気的に一致したＦｃドメインの同時発現が、疎水性コアを保持しながら、好ましい牽引性の相互作用及びヘテロ二量体形成をサポートし、その一方で、好ましくない反発性の電荷の相互作用がホモ二量体化を抑制する。表１を参照。表１のアミノ酸の番号付与は、Ｋａｂａｔ番号付与スキームに従っており、本明細書に記載の抗体の重鎖アミノ酸配列に適用できる。
【０３２３】
更なるアプローチでは、ロイシンジッパー（ＬＺ）ドメインをタンパク質足場に組み込んでよい。ロイシンジッパーは、典型的には様々な転写因子中のＤＮＡ結合ドメインの一部としての、タンパク質中の一般的な３次元構造モチーフである。単一のＬＺは、典型的には４〜５個のロイシン残基をおよそ７残基の間隔で含有し、これは、片側に沿って疎水性領域が延在する両親媒性アルファヘリックスを形成する。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質足場は、ｃ‐ｆｏｓ転写因子からのＬＺに関連するｃ‐ｊｕｎ転写因子からのＬＺを含む。ｃ‐ｊｕｎは、ｊｕｎ‐ｊｕｎホモ二量体を形成することが知られており、ｃ‐ｆｏｓはヘテロ二量体を形成しないが、ｊｕｎ‐ｆｏｓホモ二量体の形成はｊｕｎ‐ｊｕｎヘテロ二量体よりもはるかに好ましい。
【０３２４】
ロイシンジッパードメインは、タンパク質足場中にＣＨ２‐ＣＨ３配列の代わりに組み込むことができ、又は二重特異性若しくは三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの２つの重鎖のカルボキシ末端に配置できる。後者の場合、フリン切断部位をＣＨ３のカルボキシ末端とロイシンジッパーのアミノ末端との間に導入してよい。これにより、適切な哺乳類細胞発現系において二重特異性又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの重鎖及び軽鎖が同時発現されたときに、ヘテロ二量体化ステップの後に、ロイシンジッパーのフリン仲介型切断を促進できる。（Ｗｒａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ，  ２８７（５）：４３３３１‐４３３３９，  ２０１２を参照）。
【表１】
2021532170.tif 000003
【０３２５】
表１のアミノ酸の番号付与は、Ｋａｂａｔ番号付与スキームに従っており、本明細書に記載の抗体の重鎖アミノ酸配列に適用できる。表１に記載の変異は、いずれの免疫グロブリンＩｇＧ１重鎖、並びに本明細書中の他の免疫グロブリンクラス及びサブクラス（又はアイソタイプ）の配列（公開されているもの又はそうではないもの）に適用され得る。
【０３２６】
二重特異性又は三重特異性抗体の重鎖及び軽鎖の同時発現時、ある結合特異性の軽鎖が、異なる結合特異性の重鎖と誤って対合される場合もある。従って特定の実施形態では、重鎖、軽鎖、又はこれら両方の部分を、これらが由来する「野生型」抗体鎖に比べて修飾することによって、両方の重鎖定常領域の互いに対する誤った対合、及び軽鎖定常領域の、対応する重鎖に対する誤った対合を、防止又は低減できる。
【０３２７】
軽鎖の誤った対合の問題には、複数の方法で対処できる。いくつかの実施形態では、立体的相補性変異及び／又はジスルフィド架橋を２つのＶＬ／ＶＨ境界に組み込むことができる。他の実施形態では、変異を、イオン性又は静電気的相互作用に基づいて組み込むことができる。いくつかの実施形態では、軽鎖の誤った対合は、重鎖のＣＨ１ドメインのＳ１８３Ｅ変異と、軽鎖のＣＬドメインのＳ１７６Ｋ変異とを伴う第１のアームを採用することによって、防止又は低減できる。第２のアームは、重鎖のＣＨ１ドメインのＳ１８３Ｋ変異と、軽鎖のＣＬドメインのＳ１７６Ｅ変異とを含んでよい。他の実施形態では、「ＣｒｏｓｓＭａｂ」アプローチが採用され、ここでは、二重特異性又は三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト中の一方のアーム（例えばＦａｂ）は触られないままであるが、他の結合特異性を有する他方のアームでは、軽鎖の１つ以上のドメインが、重鎖：軽鎖の境界において、重鎖の１つ以上のドメインと交換される。
【０３２８】
上で開示されている重鎖及び軽鎖の誤った対合を防止するための方法、特異的変異を含む免疫グロブリンドメイン配列は、米国特許出願公開第２０１４／０２４３５０５号、米国特許出願公開第２０１３／００２２６０１号に更に記載されている。
【０３２９】
Ｄ．コンジュゲート
特定の実施形態では、本出願の抗腫瘍アンタゴニストは、１つ以上のペプチド及び／又は小分子薬剤に化学的にコンジュゲートされる。上記ペプチド又は小分子薬剤は、同一であっても異なっていてもよい。上記ペプチド又は小分子薬剤は例えば、還元されたＳＨ基及び／又は炭水化物側鎖に付着させることができる。ペプチド又は小分子薬剤と抗体との共有又は非共有結合を作製する方法は当該技術分野において公知であり、いずれのこのような公知の方法を利用してよい。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、ペプチド又は小分子薬剤は、ジスルフィド結合の形成によって、還元された抗体成分のヒンジ領域に付着させられる。あるいは、このような作用剤は、Ｎ‐スクシニル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）等のヘテロ二官能性架橋剤を用いて付着させることができる。このようなコンジュゲーションのための一般的な技法は、当該技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、ペプチド又は小分子薬剤は、抗体のＦｃ領域の炭水化物部分を介してコンジュゲートされる。炭水化物基は、チオール基に結合する同一の作用剤の負荷を増大させるために使用でき、又は炭水化物部分は、異なる治療剤若しくは診断剤に結合するために使用できる。抗体の炭水化物部分を介してペプチド阻害剤又は小分子薬剤を抗体にコンジュゲートする方法は、当業者には公知である。例えば一実施形態では、上記方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有する担体ポリマーと反応させるステップを伴う。この反応により、最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これを還元して２級アミンとすることによって安定化させて、最終的なコンジュゲートを形成できる。小分子薬剤及びペプチドを抗体にコンジュゲートする例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１４／０３５６３８５号に記載されている。
【０３３１】
好ましくは、本開示の抗腫瘍アンタゴニストは、試験管内及び生体内安定性（例えば長い半減期及び貯蔵寿命安定性）、所望の標的細胞への効率的な送達、結合パートナーに対する親和性の向上、所望の抗体依存性細胞介在性細胞傷害性及び補体依存性細胞傷害性、並びに腎クリアランス又は排泄の低減を含む、抗体の特定の所望の特徴及び薬物動態特性を保持している。従って、抗腫瘍アンタゴニストの設計において、サイズへの十分な配慮、及び特定の定常領域のエフェクタ機能の必要性を、考慮できる。
【０３３２】
抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、及び抗ＴＩＧＩＴ阻害剤（これらに由来する単一特異性、二重特異性、及び三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを含む）のサイズは、５０ｋＤ〜３００ｋＤ、５０ｋＤ〜２５０ｋＤ、６０ｋＤ〜２５０ｋＤ、８０ｋＤ〜２５０ｋＤ、１００ｋＤ〜２５０ｋＤ、１２５ｋＤ〜２５０ｋＤ、１５０ｋＤ〜２５０ｋＤ、６０ｋＤ〜２２５ｋＤ、７５ｋＤ〜２２５ｋＤ、１００ｋＤ〜２２５ｋＤ、１２５ｋＤ〜２２５ｋＤ、１５０ｋＤ〜２２５ｋＤ、６０ｋＤ〜２００ｋＤ、７５ｋＤ〜２００ｋＤ、１００ｋＤ〜２００ｋＤ、１２５ｋＤ〜２００ｋＤ、１５０ｋＤ〜２００ｋＤ、６０ｋＤ〜１５０ｋＤ、７５ｋＤ〜１５０ｋＤ、１００ｋＤ〜１５０ｋＤ、６０ｋＤ〜１２５ｋＤ、７５ｋＤ〜１２５ｋＤ、７５ｋＤ〜１００ｋＤ、又は上述の範囲内で挙げられている整数のいずれの組み合わせによって包含されるいずれの範囲、又は上述の範囲のうちのいずれかの間の整数のいずれの組み合わせによって指定されるいずれの範囲内であってよい。
【実施例】
【０３３３】
実施例１：モノクローナル抗体の生成
本出願のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当該技術分野で公知の技法を用いて生成及びスクリーニングされる。例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。抗原特異的ハイブリドーマＭａｂは、当該技術分野で公知の技法を用いてクローニング、配列決定、及び操作される。例えばＬｏ．  Ｂ．Ｋ．Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｔｒａｄｅｍａｒｋ）．  Ｖｏｌｕｍｅ  ２４８  ２００４．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを参照。
【０３３４】
実施例２：ＰＤ‐１標的指向性ドメイン及び複数の血管新生標的化部分を有する、三重特異性アンタゴニスト
図１は、抗ＰＤ‐１、抗ＰＤ‐Ｌ１、抗ＬＡＧ‐３、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｍＡｂのＶＨ及びＶＬ配列を示す。図２は：ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びＶＨの変異多様体のＶＨ及びＶＬ；アフリベルセプト、トレバナニブ‐短鎖ペプチド、及びトレバナニブ‐長鎖ペプチドのＶＥＧＦ結合ドメイン；並びにＴＧＦβ  Ｒ‐ＩＩの細胞外ドメイン（ＴＧＦβ  Ｒ‐ＩＩ  ＥＣＤ）を含む、他の機能性ドメインを示す。
【０３３５】
アフリベルセプト融合タンパク質ドメインは、ヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメインに由来する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含み、ＶＥＧＦ‐Ａ、ＶＥＧＦ‐Ｂ、及びＰＬＧＦの、これらの受容体であるＶＥＧＦＲ‐１及びＶＥＧＦＲ‐２への結合を防止する。トレバナニブペプチドは、Ａｎｇ１及びＡｎｇ２を標的としてこれらに結合することにより、Ａｎｇ１及び／又はＡｎｇ２と、これらのコグネイトＴｉｅ２受容体との相互作用を防止する。抗腫瘍アンタゴニストは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１ａｇｌｙ、又はＩｇＧ４バックボーンで構築できる。
【０３３６】
それぞれが以下を含む、多様な三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを構築した：
（１）１つ以上の抗ＰＤ‐１、又は他のチェックポイント抗体可変領域ドメイン；アフリベルセプトペプチド；及びトレバナニブペプチド又はそのペプチド配列。図３Ａ〜３Ｈは、８個の異なる三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、ＴＳ‐ＺＰＴ‐１．１、‐１．２、‐１．３、及び‐２〜‐６をそれぞれ示す。
（１）抗ＰＤ‐１可変領域（ＶＨ１、ＶＬ１）（図３Ａ〜３Ｈ）；
（２）（ｉ）一方若しくは両方のＩｇＧアームのアミノ末端（図３Ａ〜３Ｃ、３Ｆ）；（ｉｉ）各アンタゴニストのカルボキシ末端（図３Ｄ、３Ｅ、３Ｈ）；又は（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端とトレバナニブペプチド（若しくは他の生物学的ペプチド）との間（図３Ｇ）の、アフリベルセプト融合タンパク質ドメイン；
（３）（ｉ）各ＩｇＧ４  ＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合した（図３Ａ〜３Ｄ）；（ｉｉ）２つのＣＨ３領域それぞれの中に挿入された（図３Ｅ）；（ｉｉｉ）各ＣＨ１領域のカルボキシ末端に融合した（図３Ｆ）；（ｉｖ）各アフリベルセプト融合タンパク質ドメインのカルボキシ末端に融合した（図３Ｇ）；又は（ｖ）各ＣＬ領域のカルボキシ末端に融合した（図３Ｈ）、トレバナニブペプチド（又は他の生物学的ペプチド）。
【０３３７】
図４Ａ〜４Ｃは、３つの異なる三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、ＴＳ‐ＺＰＴ‐７、ＴＳ‐ＺＰＴ‐８、ＴＳ‐ＺＰＴ‐９をそれぞれ示し、これらは：（１）ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に融合した、抗ＰＤ‐１又は他のチェックポイント抗体Ｆａｂドメイン（ＶＨ１‐ＣＨ１、ＶＬ１‐ＣＬ１）；（２）ＣＨ２ドメインのアミノ末端に融合したＣＨ２ドメインのアミノ末端のアフリベルセプト融合タンパク質ドメイン；（３）（ｉ）２つのＣＨ３ドメインそれぞれの中に挿入された（図４Ａ）；（ｉｉ）ＣＨ２ドメインのアミノ末端に融合した（図４Ｂ）；又は（ｉｉｉ）ＣＨＩドメインのカルボキシ末端に融合した（図４Ｃ）、トレバナニブペプチド（又は他の生物学的ペプチド）を含む。
【０３３８】
図５Ａ〜５Ｇは、７個の異なる三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、ＴＳ‐ＬＰＴ‐１、ＴＳ‐ＬＰＴ‐２、ＴＳ‐ＬＰＴ‐３、ＴＳ‐ＬＰＴ‐４、ＴＳ‐ＬＰＴ‐５、ＴＳ‐Ｍ３、ＴＳ‐Ｍ４をそれぞれ示し、これらは：（１）（ｉ）ＣＨ１及びＣＬ１のアミノ末端にそれぞれ融合した（図５Ｆ）；又は（ｉｉ）ＶＨ１及びＶＬ１のアミノ末端にそれぞれ融合した（図５Ｇ）、抗ＰＤ‐１、又は他のチェックポイント抗体可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１）；（２）（ｉ）ＶＨ１及びＶＬ１のアミノ末端にそれぞれ融合し、ＣＨ１及びＣＬ１のアミノ末端にそれぞれ融合した（図５Ｆ）；（ｉｉ）ＣＨ１及びＣＬ１のアミノ末端にそれぞれ融合した（図５Ｇ）；又は（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端、並びにＣＨ１及びＣＬ１ドメインのアミノ末端にそれぞれ融合した、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ、ベバシズマブ、又は他の抗ＶＥＧＦ抗体可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１）；（３）（ｉ）２つのＣＨ３ドメインそれぞれの中に挿入された（図５Ａ）；（ｉｉ）ＣＬ１ドメインのカルボキシ末端に融合した（図５Ｂ）；（ｉｉｉ）ＣＨＩドメインのカルボキシ末端のうちの１つ若しくは２つに融合した（図５Ｃ〜５Ｅ）；又は（ｉｖ）ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に融合した（図５Ｆ〜５Ｇ）、トレバナニブペプチド（又は他の生物学的ペプチド）を含む。
【０３３９】
配列番号２００及び２０１（ＬＣ）に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓの例示的な配列を示す。配列番号２０１及び２０２に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌの例示的な配列を示す。配列番号１８７及び１８８に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＬＰＴ‐１の例示的な配列を示す。配列番号２０１及び２０３に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐２の例示的な配列を示す。配列番号２０１及び２０４に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５の例示的な配列を示す。配列番号２３４及び２３５に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐６の例示的な配列を示す。
【０３４０】
実施例３：抗ＰＤ‐１抗体２Ｐ１６を用いて作製された三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの特性決定
図３Ａ〜３Ｈに示されている三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの複数のバージョンは、２Ｐ１６抗ＰＤ‐１抗体、トレバナニブ‐長鎖ペプチド、及びアフリベルセプトのＶＥＧＦ結合ドメインを利用して作製された。ＴＳ‐ＺＰＴ‐１．１（配列番号２３６〜２３７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐１．２（配列番号２３８〜２３９）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐１．３（配列番号２４０〜２４１）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐２（配列番号２４２〜２４３）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３（配列番号２０１〜２０２）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５（配列番号２４４及び２９８）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐６を構築して、ＴＳ‐ＬＰＴ‐１（配列番号２３４〜２３５）、即ち２Ｐ１６抗体、トレバナニブ、及びＬｕｃｅｎｔｉｓのＦａｂ部分を利用した三重特異性抗腫瘍アンタゴニストと比較した。
【０３４１】
図６Ａ及び６Ｂは、一過性トランスフェクション済みＨＥＫ２９３細胞によって発現された三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの、非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を示す。分子の精製の前後にサンプルを評価した。結果は、全ての分子が発現され、かつ精製可能であったこと、並びにＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１６）が、ＴＳ‐ＺＰＴ‐６（２Ｐ１６）、及びＴＳ‐ＬＰＴ‐１（２Ｐ１６）よりも良好に発現されたことを示す。
【０３４２】
遮断アッセイを実施して、選択された三重特異性分子のＩＣ５０を計算した。簡潔に述べると、抗ヒトＰＤ‐１  ｍＡｂの２又は３倍段階希釈物を調製した。ヒトＰＤ‐１トランスフェクト済みＣＨＯ‐Ｋ１細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄し、１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＦＩＴＣ標識ヒトＰＤ‐Ｌ１‐Ｆｃタンパク質を、ヒトＰＤ‐１トランスフェクト済みＣＨＯ‐Ｋ１細胞に、最終濃度７μｇ／ｍｌで加え、よく混合した。インキュベーションせずに、２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中の２，０００個のこれらのＣＨＯ‐Ｋ１細胞（ＰＤ‐Ｌ１タンパク質を含む）を、９６ウェル丸底プレートに即座に加え、２０μｌの、又は２若しくは３倍に段階希釈した、三重特異性分子を、上記細胞に即座に加えて、４℃で３０分間インキュベーションした。続いて細胞を洗浄し、３０μｌの７ＡＡＤ溶液中で再懸濁し；続いて３５μｌの１０％中性緩衝ホルマリン溶液を加えて１５分間インキュベーションした後、ｉＱｕｅ  ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔシステムを用いて分析した。
【０３４３】
図７Ａ〜Ｂは、例示的な三重特異性抗腫瘍アンタゴニストであるＴＳ‐ＺＰＴ‐１．１（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐１．２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐１．３（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐６（２Ｐ１６）と、抗ＰＤ‐１  ｍＡｂ及び陽性対照又はベンチマーク（「ＢＭ」）抗体（ニボルマブ）との、ＩＣ５０を示す。ＩＣ５０は、この相互作用を遮断する点で、ベンチマーク抗体と同等であった。
【０３４４】
三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐６（２Ｐ１６）の、ＶＥＧＦとその受容体であるＶＥＧＦＲ２との間の相互作用を遮断する能力を、判定した。簡潔に述べると、９６ウェルアッセイプレートを、炭酸塩‐重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中の０．５μｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦ  １６５（Ｒ＆Ｄ）で、４℃で一晩にわたってコーティングした後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。続いて、段階希釈された抗体をプレートに加え、室温で３０分間インキュベーションした。組換えヒトＶＥＧＦＲ‐２を加え、室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ‐２０）で洗浄した後、抗ＶＥＧＦＲ‐２抗体と共に室温で１時間インキュベーションした。その後、洗浄緩衝液で洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＨＲＰをプレートに加え、室温で１時間にわたってインキュベーションした。ＴＭＢをプレートに加えた後で６５０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ＶＥＧＦＲ‐２結合の量を検出した。ＩＣ５０値を、活性曲線の中点として決定した。
【０３４５】
図８Ａ及び８Ｂは、三重特異性アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐１．２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐６（２Ｐ１６）、及びＴＳ‐ＬＰＴ‐１（２Ｐ１６）用いたＶＥＧＦ‐ＶＥＧＦＲ２遮断アッセイから計算した、ＩＣ５０値を示し、これらをアフリベルセプトペプチド及びベバシズマブ抗体に対応する陽性対照と比較した。これらの分析の結果は、三重特異性アンタゴニストが、対応する対照と同等又はそれ以下の（即ちより良好な）ＩＣ５０値を示したことを示した。
【０３４６】
三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐１．２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐６（２Ｐ１６）、及びＴＳ‐ＬＰＴ‐１の、Ａｎｇ‐２とその受容体であるＴｉｅ２との間の相互作用を遮断する能力を、判定した。簡潔に述べると、９６ウェルアッセイプレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの組換えヒトＡｎｇ２（Ｒ＆Ｄ）で、３７℃で１時間にわたってコーティングした後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて室温で１時間遮断した。続いて、段階希釈された抗体及び組換えヒトＴｉｅ２混合物をプレートに加え、室温で２時間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ‐２０）で洗浄した後、抗Ｔｉｅ２抗体と共に室温で１時間インキュベーションした。洗浄緩衝液で洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＨＲＰをプレートに加え、室温で１時間にわたってインキュベーションした。ＴＭＢをプレートに加えた後で６５０ｎｍでの吸光度を測定することにより、Ｔｉｅ２結合を検出した。ＩＣ５０値を、活性曲線の中点として決定した。
【０３４７】
図９は、三重特異性アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐１．２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐６（２Ｐ１６）、及びＴＳ‐ＬＰＴ‐１（２Ｐ１６）用いたＴｉｅ２‐Ａｎｇ２遮断アッセイ試験から計算した、ＩＣ５０値を示し、これらをアンタゴニストであるベバシズマブトレバナニブに対応する陽性対照と比較した。この分析の結果は、三重特異性アンタゴニストが、対応する対照と同等又はそれ以下の（即ちより良好な）ＩＣ５０値を示したことを示した。
【０３４８】
実施例４：抗ＰＤ‐１抗体２Ｐ１７を用いて構築した、ＴＳ‐ＺＰＴ‐２、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐５分子の特性決定
ＴＳ‐ＺＰＴ‐２、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐５三重特異性抗腫瘍アンタゴニストを、抗ＰＤ‐１抗体２Ｐ１７を用いて作製し（それぞれ配列番号２０３及び２０１、２３３及び２０１、２０４及び２０１）、タンパク質Ａクロマトグラフィで精製した後で、サイズ排除クロマトグラフィによって、均質性及び安定性に関して特性決定した。ＳＥＣクロマトグラフィは、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  ＵＰ‐Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用いて実施した。移動相系は１００ｍＭのリン酸ナトリウム、４００ｍＭの塩酸ナトリウム、６％のイソプロピルアルコール、ｐＨ６．８、０．２ｍＬ／分であった。検出は、相対面積積分のために２１４ｎｍで実施した。
【０３４９】
図１０は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１７）、並びにＨＥＫ２９３一過性トランスフェクション済み細胞によって産生された親２Ｐ１７抗体の、サイズ排除クロマトグラフィ分析の結果を示す。二量体化分子（Ｄｉｍｅｒ）と比較した高分子量（ＨＷＭ）種及び低分子量（ＬＭＷ）種のパーセンテージは、これら３つの三重特異性アンタゴニストのうちＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）が、最低パーセンテージのＬＭＷ種及び最高パーセンテージの二量体を有していたことを示す。
【０３５０】
図１１は、３つの三重特異性アンタゴニスト：ＴＳ‐ＺＰＴ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）（２つのプールから精製）、及び安定したＣＨＯ細胞プールから産生されたＴＳ‐ＺＰＴ‐５（２Ｐ１７）の、二量体と比較したＨＷＭ及びＬＭＷ種の相対量を示す。結果は、これら３つの三重特異性アンタゴニストのうちＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）が、最低パーセンテージのＬＭＷ種及び最高パーセンテージの二量体を有していたことを示す。
【０３５１】
従って、一過性細胞株及び安定した細胞株の両方において、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）は最低量のクリッピングを示し、これは、ＣＨ３領域へのトレバナニブペプチドの挿入が、アフリベルセプト融合タンパク質を保護し、クリッピングを低減することを示している。
【０３５２】
図１２Ａ及び１２Ｂは、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）のＤｉｍｅｒ、ＨＭＷ、及びＬＭＷ種が、４℃で少なくとも１１２日間の良好な安定性を示すことを示している。
【０３５３】
実施例５：ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの発現及び精製
ＴＳ‐ＺＰＴ‐３の複数のバージョンを、全長トレバナニブペプチドＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌと、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓの単一コピー（即ちトレバナニブ‐短鎖）ペプチドとの両方を伴う、抗ＰＤ‐１抗体２Ｐ１６及び２Ｐ１７を用いて作製した。これら４つの分子を、ベバシズマブのＶＨ及びＶＬを利用した三重特異性分子であるＴＳ‐Ｍ３及びＴＳ‐Ｍ４（図５Ｆ及び５Ｇに図示）、並びに可変ドメイン配列が図１に配列番号２４７〜２５４の配列で示されている抗ＰＤ‐１抗体ニボルマブを利用した三重特異性分子である２Ｐ１６及び２Ｐ１７（その可変ドメイン配列は図１に配列番号２４７〜２５４の配列で示されている）と比較した。
【０３５４】
図１３Ａは、トレバナニブペプチドを含む例示的な三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、即ちＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を示す。図１３Ｂは、これらの配列に由来する例示的な分子を示す。
【０３５５】
図１４Ａは、トレバナニブ短鎖ペプチドを含む例示的な三重特異性抗腫瘍アンタゴニスト、即ちＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）の、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を示す。図１４Ｂは、これらの配列に由来する例示的な分子を示す。
【０３５６】
図１５は、一過性トランスフェクション済みＨＥＫ２９３細胞による産生後の三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）、ＴＳ‐Ｍ３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐Ｍ４（２Ｐ１７）、ＴＳ‐Ｍ３（２Ｐ１６）、及びＴＳ‐Ｍ３（ニボルマブ）の、クマシー染色非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を示す。結果は、アフリベルセプト融合タンパク質ドメインを含有する三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）が、抗ＶＥＧＦ可変ドメインを含有する三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐Ｍ３（ニボルマブ）、ＴＳ‐Ｍ４（ニボルマブ）、ＴＳ‐Ｍ３（２Ｐ１７）及びＴＳ‐Ｍ３（２Ｐ１６）よりも高い発現レベルを示したことを示す。
【０３５７】
図１６は、タンパク質Ａクロマトグラフィによる精製後の、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＬ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）のサイズ排除クロマトグラフィ分析からの結果を示す。二量体分子（Ｄｉｍｅｒ）と比較した、高分子量（ＨＷＭ）種及び低分子量（ＬＭＷ）種のパーセンテージは、２Ｐ１７抗体を含む分子が、好ましい二量体種を比較的高いレベルで有することを示している。
【０３５８】
図１７は、４℃で４８日間保管されたＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）のサイズ排除クロマトグラフィ分析を示し、これは、これら両方の分子が保管時に安定していることを示す。
【０３５９】
実施例６：三重特異性アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＴ‐３の機能的特性決定
実施例５のＰＤ‐１‐ＰＤＬ１細胞ベースの遮断アッセイを用いて、三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの４つのバリエーションであるＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の、ＰＤ‐１とそのリガンドであるＰＤ‐Ｌ１との間の相互作用を遮断する能力を評価した。その結果を用いて、対応するＩＣ５０を、２Ｐ１７及びベンチマーク抗体（ニボルマブ）と共に計算した。図１８Ａ〜１８Ｂは、ＩＣ５０が、この相互作用の遮断において、ベンチマーク抗体と同等であったことを示す。
【０３６０】
ＶＥＧＦ‐ＶＥＧＦＲ‐２バイオアッセイを用いて、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の、ＶＥＧＦとその受容体であるＶＥＧＦＲ‐２との間の相互作用を遮断する能力を評価し、対応するＩＣ５０を、ベンチマーク抗体（ベバシズマブ）と共に計算した。簡潔に述べると、ＶＥＧＦＲ２／ＮＦＡＴレポータ‐ＨＥＫ２９３組換え細胞株（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃：７９３８７）を、３０ｋ細胞／ウェルの密度で、白色で底が透明の９６ウェルマイクロプレートに播種した。２４時間後、指示されている分子の段階希釈物及びヒトＶＥＧＦ１６５をウェルに加えた。４時間のインキュベーションの後、１００μｌのＯＮＥ‐Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼ試薬を加え、室温で１５分間振盪し、プレートの発光シグナルを読み取った。図１９Ａ〜１９Ｂは、ＩＣ５０が、この相互作用の遮断において、ベンチマーク抗体と同等であったことを示す。
【０３６１】
実施例５のＡｎｇ２‐Ｔｉｅ２遮断アッセイを用いて、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の、Ｔｉｅ２とそのリガンドであるＡｎｇ‐２との間の相互作用を遮断する能力を評価し、対応するＩＣ５０を、ベンチマーク抗体（トレバナニブ）と共に計算した。図２０Ａ〜２０Ｂは、２つのＡｎｇ‐２遮断ペプチドを含むＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）のＩＣ５０がベンチマークと同等であったものの、１つのＡｎｇ‐２遮断ペプチドしか含まないＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）のＩＣ５０がベンチマークより高いことを示す。
【０３６２】
実施例９のバイオレイヤー干渉法アッセイを用いて、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の、ＰＤ‐１タンパク質に対する結合親和性を評価した。図２１Ａ〜２１Ｆは、結合及び結果として生じる結合親和性定数を示す。結果は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）が、ベンチマーク（ニボルマブ）より高い親和性を示したことを示す。
【０３６３】
同様のバイオレイヤー干渉法アッセイを用いて、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の、ＶＥＧＦ１６５に対する結合親和性を評価した。図２２Ａ〜２２Ｆは、結合及び結果として生じる結合親和性定数を示す。結果は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）が、ベンチマーク（ベバシズマブ）より高い親和性を示したことを示す。
【０３６４】
同様のバイオレイヤー干渉法アッセイを用いて、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の、Ａｎｇ‐２に対する結合親和性を評価した。図２３Ａ〜２３Ｆは、結合及び結果として生じる結合親和性定数を示す。結果は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）が、ベンチマーク（トレバナニブ）と同等の親和性を示したことを示す。
【０３６５】
図２４は、概ね上述の実施例１１で説明したように、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６  Ｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の、その３つの結合パートナーそれぞれに対する順次結合を特性決定するための、バイオレイヤー干渉法の使用を示す。簡潔に述べると、２０ｎＭのＴＳ‐ＺＰＴ‐３三重特異性抗体を、抗ヒトＩｇＧ捕捉バイオセンサに装入した。上記３つの抗原の、上記４つのＴＳ‐ＺＰＴ‐３分子に対する順次結合を監視するために、バイオセンサを、飽和濃度の各抗原（２４０ｎＭのＨｉｓタグ付きヒトＰＤ‐Ｉ、１２０ｎＭのヒトＶＥＧＦ１６５、４０ｎＭのＨｉｓタグ付きヒトアンジオポエチン‐２）を内包したウェル内に５分間配置した後、１分間解離させた。３つの異なる順次結合の組み合わせを観察した。これらの結果は、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１６）、ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｓ（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）が、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ‐２、及びＰＤ‐１に同時に結合できることを示す。
【０３６６】
ＴＳ‐ＺＰＴ‐３Ｌ（２Ｐ１７）の生体内薬物動態特性を評価するために、薬物動態プロファイルを生成した。簡潔に述べると、１０ｍｇ／ｋｇのアンタゴニストを、４頭の６〜１０週齢のメスのＣＤ１マウスの尾部静脈に静脈内注射した（ｎ＝マウス２頭／分子）。注射の３分後、３時間後、１日後、３日後、７日後、及び１０日後に血清を回収した。血清中の抗体を検出するために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片でコーティングした後、ＰＢＳ中で５％のミルクでブロッキングした。５％のミルク中の、段階希釈されたマウス血清、並びに標準として段階希釈及び精製されたタンパク質分子を、プレートに加えた。ペルオキシダーゼコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧとのインキュベーション、及び更なる洗浄に続いて、ＴＭＢ‐ＥＬＩＳＡ基質とのインキュベーションの後にＴＳ‐ＺＰ１７Ｔ‐３を検出した。この分析の結果は、ＴＳ‐ＺＰ１７Ｔ‐３の半減期（Ｔ１／２）が約２日であることを示した（図２５）。
【０３６７】
従って、トレバナニブ又はその多様体の挿入により、安定した強力な三重特異性治療用分子を生成できる。
【０３６８】
図２６Ａ〜２６Ｂは、２つのチェックポイント抗体と、ＣＨ３ドメインに挿入されたトレバナニブペプチドとを利用した、２つの更なる三重特異性分子を示す。これらの分子は：（１）第１のチェックポイント抗体、例えば抗ＰＤ‐１又は抗ＰＤ‐Ｌ１からのＶＨ及びＶＬと；（２）ＣＨ３に挿入されたトレバナニブと；（３）第２のチェックポイント阻害剤、例えば抗ＴＩＧＩＴ又は抗ＬＡＧ３からの３‐６ｘＧ４Ｓリンカーを含むＶＨ及びＶＬとを含む、図１に示されている配列を含む。
【０３６９】
図２７は：（１）ベバシズマブ、又は別の抗ＶＥＧＦ抗体をコードする、ＶＨ及びＶＬドメインと；（２）ＣＨ３ドメインに挿入されたトレバナニブペプチドと；（３）ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に融合したＴＧＦＢＲ‐ＩＩ  ＥＣＤとを含む、更なる三重特異性分子ＴＳ‐Ａ１ＢＴ‐１（配列番号２２９〜２３０）を示す。この分子は、一過性トランスフェクション済みＨＥＫ２９３細胞によって産生される。図２８では、ＨＥＫ２９３細胞からの未精製の上清の非還元ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析は、上記分子が良好に発現することを示している。図２９は、タンパク質Ａクロマトグラフィで精製されたＴＳ‐Ａ１ＢＴ‐１の、サイズ排除クロマトグラフィ分析を示す。
【０３７０】
実施例７：ＴＧＦ‐β  ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＴＧＦ‐β‐ＲＩＩ  ＥＣＤ）を含む三重特異性抗腫瘍アンタゴニストの設計
図３０Ａ〜３０Ｆは、６つの三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＢ‐１、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３、ＴＳ‐ＺＰＢ‐４、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐６それぞれを示す。これらのアンタゴニストは：（１）抗ＰＤ‐１、又は別のチェックポイント抗体可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１）（図３０Ａ〜３０Ｆ）；（２）（ｉ）各重鎖ＶＨ１領域のアミノ末端に融合した（図３０Ａ、３０Ｄ、３０Ｆ）、又は（ｉｉ）各重鎖ＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合した（図３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｅ）、アフリベルセプト融合タンパク質ドメイン；及び（３）（ｉ）各重鎖ＣＨ３領域のカルボキシ末端に融合した（図３０Ａ）、（ｉｉ）各重鎖ＶＨ１領域のアミノ末端に融合した（図３０Ｂ）、（ｉｉｉ）各重鎖ＣＨ３領域のＦｃループに挿入された（図３０Ｃ、３０Ｆ）、（ｉｖ）アフリベルセプト融合タンパク質ドメインの上流で、各重鎖のアミノ末端に融合した（図３０Ｄ）、又は（ｖ）アフリベルセプト融合タンパク質ドメインの下流で、各重鎖のカルボキシル末端に融合した（図３０Ｅ）、ＴＧＦ‐β  ＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。
【０３７１】
配列番号１８７及び１８８に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＬＢ‐１の例示的な配列を示す。配列番号２７０及び２７１に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＢ‐１に関する例示的な配列を示す。配列番号２７２及び２７３に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２に関する例示的な配列を示す。配列番号１８８及び１８９に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＬＢ‐３に関する例示的な配列を示す。配列番号１９０及び１９１に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３に関する例示的な配列を示す。配列番号１９２及び１９３に示されているアミノ酸配列は、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５に関する例示的な配列を示す。
【０３７２】
実施例８：ＴＳ‐ＺＰＢ及びＴＳ‐ＺＰＬＢ分子の一過性発現
ＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＬＢ分子を、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞中で一過性発現させ、これらを７日間培養した。Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＯＲＯＳ  Ａ  ２０μｍカラム、２．１×３０ｍｍ、０．１ｍＬを用いて、力価を定量した。波長２８０ｎｍにおいて、精製済みの組換えＴＩＧＩＴ  ｍＡｂを用いて、標準曲線を生成した。サンプルを、３０μＬの上清でＨＰＬＣに丁寧に注入した。移動相ＡはｐＨ７．３のＰＢＳであり、移動相ＢはｐＨ２．２のＰＢＳであった。開始から０．２分を１００％Ａとし、続いて０．２２〜１．２２分を１００％Ｂとし、１．２３〜２．３０分を１００％Ａに戻し、２．３２〜３．３２分を１００％Ｂとし、３．４〜４．００分を１００％Ａとして終了する、多段階の勾配を構成した。使用した流量は１ｍＬ／分であり、１回の実行につき合計４分とした。
【０３７３】
図３１Ａに示すように、ＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＬＢのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析を、一過性トランスフェクション済みＨＥＫ２９３細胞によって実施した。この分析の結果、全ての分子が良好に発現していた（図３１Ｂ）。
【０３７４】
図３２Ａは、２１４ｎｍで検出を行うＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  ＵＰ‐Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを用いたＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＬＢの例示的なサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）プロファイルを示す。結果は、ＴＳ‐ＺＰＬＢ‐１及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）が他のＴＳ‐ＺＰＢ分子に比べて最も多くの二量体を保持していることを示している。
【０３７５】
実施例９：対照と比較したＴＳ‐ＺＰＢ三重特異性アンタゴニストの機能的特性決定
図３３Ａは、ＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）の、ＰＤ‐１とＰＤ‐Ｌ１との間の相互作用を遮断する能力を測定する、細胞ベースアッセイの結果を示す。この実験では、ＴＳ‐ＺＰＢ分子の３倍段階希釈物（図示されている通り；最高Ａｂ濃度：３００ｎＭ；各ｍＡｂについて３回）を調製し；ヒトＰＤ‐１トランスフェクト済みＣＨＯＫ１細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄し、１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁し；ＦＩＴＣ標識ヒトＰＤ‐Ｌ１‐Ｆｃタンパク質を、７μｇ／ｍｌの最終濃度でヒトＰＤ‐１トランスフェクト済みＣＨＯＫ１細胞に加え；十分に混合し；インキュベーションを行うことなく、２０ｘ１０３個の（ＰＤ‐Ｌ１タンパク質を含む）トランスフェクト済みＣＨＯＫ１細胞を、９６ウェル丸底プレート中の２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に即座に加え；続いて２０μｌのＴＳ‐ＺＰＢ分子の３倍段階希釈物を上記細胞に即座に加えて、４℃で３０分間インキュベーションし；次に細胞を洗浄し、３０μｌの７ＡＡＤ溶液中で再懸濁し、３５μｌの１０％中性緩衝ホルマリン溶液を加えた。１５分間インキュベーションした後、ｉＱｕｅ  ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔシステムを用いて分析した。図３３Ｂは、この分析から得られたＩＣ５０値（ｎＭ）が、全ての分子がＰＤ‐１とＰＤ‐Ｌ１との相互作用を阻害できることを示していることを示している。
【０３７６】
図３４Ａは、ＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＬＢ、並びにベンチマークであるＴＧＦβ１  ＲＩＩ‐Ｆｃの、ＴＧＦβ１シグナル伝達を遮断する能力を測定するための、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤシグナル伝達経路ＳＢＥレポータ‐ＨＥＫ２９３細胞株（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｃａｔａｌｏｇ＃：  ６０６５３）を用いた細胞ベースアッセイの結果を示す。簡潔に述べると、ＳＢＥレポータ‐ＨＥＫ２９３細胞を、〜３５，０００細胞／ウェルの密度で、白色で底が透明の９６ウェルマイクロプレート内の、１００μｌの成長培地中に播種した。播種の２４時間後、細胞を、９０μｌのアッセイ培地中のＴＳ‐ＺＰＢ分子の５倍段階希釈物で処理した。次に、１０μｌの希釈ヒトＴＧＦβ１を、刺激したウェルに加え（最終ＴＧＦβ１濃度＝１０ｎｇ／ｍｌ）；１０μｌのアッセイ培地を未刺激の対照ウェルに加え（基礎活性を決定するため）、その一方で、１００μｌのアッセイ培地を、細胞を含まない対照ウェルに加えた（バックグラウンドの発光を決定するため）。続いてこれらのプレートを、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で一晩（〜１８時間）インキュベーションした。一晩のインキュベーションの後、ＯＮＥ‐Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（ＢＰＳ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．）を用いて、提供されているプロトコルに従ってルシフェラーゼアッセイを実施した（即ち１００μｌのＯＮＥ‐Ｓｔｅｐ（商標）ルシフェラーゼ試薬を加え、室温で〜１５〜３０分間振盪した後で発光シグナルを読み取った）。図３４Ｂは、この分析から得られたＩＣ５０値（ｎｍ）を示し、これは、上記分子がＴＧＦβ‐１の生体活性を遮断できることを示している。
【０３７７】
図３５Ａは、ＴＳ‐ＺＰＢ‐１（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐２（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐３（２Ｐ１７）、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５（２Ｐ１７）、及びＴＳ‐ＺＰＬＢの、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ‐２との間の相互作用を遮断する能力を、ベンチマーク抗体ベバシズマブと比較して測定する、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。簡潔に述べると、炭酸塩‐重炭酸塩緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌの組換えヒトＶＥＧＦ‐１６５（Ｒ＆Ｄ  ＃２９３−ＶＥ−０５０／ＣＦ）で、９６ウェルアッセイ中のウェルをコーティングし、４℃で一晩にわたってインキュベーションした。その後これらのウェルを、ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、５０μｌの５倍段階希釈抗体をプレートのウェルに加え、室温で３０分間インキュベーションした。続いて５０μｌの０．６μｇ／ｍｌ組換えヒトＶＥＧＦＲ‐２‐ｈｕ  ＩｇＧ１‐Ｈｉｓタグ（Ｒ＆Ｄ  ＃３５７‐ＫＤ‐０５０）をウェル内の抗体に加え、室温で１時間インキュベーションした後、洗浄緩衝液で３回洗浄した。その後、１００μｌの抗ＨｉｓタグＨＲＰ（１：１０，０００）を加え、これらのプレートを室温で４０分間インキュベーションし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。３，３’，５，５’‐テトラメチルベンジジンをプレートの各ウェルに加えた後、６５０ｎｍでの吸光度を測定することによって、ＶＥＧＦＲ‐２結合（Ｈｉｓ‐タグ）を検出した。図３５Ｂは、この分析から得られたＩＣ５０値（ｎＭ）を示し、これは、全ての分子がＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ‐２との結合を阻害できることを示している。
【０３７８】
実施例１０：ａ‐グリコシル化ＶＥＧＦＲ（アフリベルセプト）を含むＴＳ‐ＺＰＴ‐５多様体の機能的特性決定
ＴＳ‐ＺＰＢ‐５の薬物動態を改善するために、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５の２つの多様体を製造した。ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ａの重鎖（配列番号２０５）を、ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端のリシンのコドンにおいて変異させて、血中に存在するプロテアーゼによる潜在的なタンパク質分解活性を低減した。ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂの重鎖（配列番号２０６）は更に、ＡＳＧＲＩ及びＡＳＧＲＩＩによるクリアランスを低減するために、アフリベルセプトのグリコシル化部位を排除する変異を有する。
【０３７９】
図３６Ａ〜３６Ｃは、３つの三重特異性抗腫瘍アンタゴニストＴＳ‐ＺＰＢ‐５、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ａ、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂを示す。
【０３８０】
図３７は、ＴＳ‐ＴＰＢ‐５、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ａ、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂの一過性ＨＥＫ２９３細胞発現レベルが親２Ｐ１７抗体と同様であることを示している。
【０３８１】
実施例１０のＶＥＧＦ‐ＶＥＧＦＲ‐２遮断アッセイを用いて、ＴＳ‐ＴＰＢ‐５、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ａ、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂの、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ‐２との間の相互作用を遮断する能力を評価した（図３８）。結果は、ＶＥＧＦＲ成分の結合及び生体活性が、アフリベルセプトのグリコシル化部位がＡｓｎからＧｌｕに変異した後でも保持されることを示している。実施例１０に記載のＴＧＦＢシグナル伝達アッセイを用いて、ＴＳ‐ＴＰＢ‐５、ＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ａ、及びＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂの、ＴＧＦβシグナル伝達を遮断する能力を評価した（図３９）。結果は、ＴＧＦβＲ‐ＩＩの結合及び生体活性が、アフリベルセプトのグリコシル化部位がＡｓｎからＧｌｕに変異した後でも保持されることを示している。
【０３８２】
ａ‐グリコシル化ＶＥＧＦＲを含むＴＳ‐ＺＰＴ‐５Ｂ多様体の生体内薬物動態特性を、グリコシル化バージョンであるＴＳ‐ＺＰＴ‐５Ａと、実施例７に記載されているように比較した。
【０３８３】
図３９は、アフリベルセプトグリコシル化部位のＡｓｎからＧｌｕへの変異を有するＴＳ‐ＺＰＢ‐５Ｂ多様体が、薬物動態をおよそ５倍改善したことを示す。
【０３８４】
実施例１１：ＰＤ‐１／ＰＤ‐Ｌ１及びＶＥＧＦの二重特異性阻害剤の製造及び特性決定
図４１Ａ〜４１Ｃは、二重特異性分子ＴＳ‐ＺＰＬ‐１（又はＴＳ‐ＺＰ‐１）、ＴＳ‐ＺＰＬ‐２（又はＴＳ‐ＺＰ‐２）、及びＴＳ‐ＺＰＬ‐３（又はＴＳ‐ＺＰ‐３）を示し、これらは：（１）ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、又は他のチェックポイント抗体可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）；（２）アフリベルセプトであって、（ｉ）ＶＨドメインのアミノ末端（図４０Ａ及び４０Ｂ）；（ｉｉ）ＣＨ３ドメインのカルボキシ末端（図４０Ｃ）に融合した、アフリベルセプトを含む。これらの分子の例示的な配列は、配列番号２１８〜２２５である。
【０３８５】
図４２Ａは、Ｂｉ‐ＺＰＬ‐１分子の、ＰＤ‐Ｌ１とＰＤ‐１との間の相互作用を遮断する能力を測定した、細胞ベース結合アッセイの結果を示す。簡潔に述べると、抗ヒトＰＤ‐Ｌ１  ｍＡｂ又は二重特異性Ａｂの２又は３倍の段階希釈物（最高Ａｂ濃度：１２８ｎＭ；各ｍＡｂについて３回）を調製した。ヒトＰＤ‐Ｌ１をトランスフェクトしたＣＨＯＫ１細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で洗浄し、１０＾６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁した。７μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ヒトＰＤ‐１‐Ｆｃタンパク質を細胞に加え、２０μｌの混合物を、抗ヒトＰＤ‐Ｌ１  ｍＡｂ又は二重特異性Ａｂの２又は３倍段階希釈物に加えた。４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、３０μｌの７ＡＡＤ中で細胞を再懸濁し、３５μｌの１０％中性緩衝ホルマリン溶液を加えた。１５分後、ウェルをｉＱｕｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔシステムで分析した。この分析の結果得られたＩＣ５０値（ｎＭ）が図４２Ｂに示されており、これは、Ｂｉ‐ＺＰＬ‐１がＰＤ‐１‐ＰＤ‐Ｌ１結合を阻害する能力を保持していることを示している。
【０３８６】
図４３Ａは、Ｂｉ‐ＺＰ‐２及びＢｉ‐ＺＰＬ‐３の、ＶＥＧＦＲ‐２発現性細胞上のＶＥＧＦ１６５の生体活性を遮断する能力を試験する、実施例１０のバイオアッセイを示す。表形式の結果が図４３Ｂに示されており、これは、上記分子が、ベンチマーク抗体ベバシズマブと比較して生体活性を保持していることを示している。
【０３８７】
Ｂｉ‐ＺＰ‐２及びＢｉ‐ＺＰＬ‐３の両方をサイズ排除クロマトグラフィで評価したが、これらは図４４に示すように、同等のパーセンテージのＨＭＷ、Ｄｉｍｅｒ、及びＬＭＷ種を有していた。
【０３８８】
図４５は、Ｂｉ‐ＺＰ‐２及びＢｉ‐ＺＰＬ‐３の、それぞれ２頭のマウスにおける薬物動態を示す。Ｂｉ‐ＺＰ‐２はＢｉ‐ＺＰＬ‐３よりも長い生体内半減期を示す。
【０３８９】
以上の説明は、当業者に本発明の実施方法を教示することを目的としており、この説明を読めば当業者には明らかになるであろう本発明の明白な修正形態及び変形形態の全てを詳述することを意図したものではない。しかしながら、全てのこのような明白な修正形態及び変形形態は、以下の請求項によって定義される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。請求項は、文脈によってそうでないことが明確に示されていない限り、請求対象である構成要素及びステップを、意図されている目的を達成するために有効ないずれの順序で、包含することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図３Ｄ−３Ｅ】
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【図３Ｆ−３Ｈ】
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【図４Ａ−４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ−５Ｅ】
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【図５Ｆ−５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１９Ａ−１９Ｂ】
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【図２０Ａ−２０Ｂ】
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【図２１Ａ−２１Ｃ】
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【図２１Ｄ−２１Ｆ】
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【図２２Ａ−２２Ｃ】
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【図２２Ｄ−２２Ｆ】
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【図２３Ａ−２３Ｃ】
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【図２３Ｄ−２３Ｆ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ−２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ−３０Ｃ】
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【図３０Ｄ−３０Ｆ】
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【図３１Ａ】
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【図３２Ａ−３２Ｂ】
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【図３３Ａ−３３Ｂ】
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【図３４Ａ−３４Ｂ】
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【図３５Ａ−３５Ｂ】
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【図３６Ａ−３６Ｃ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ−４１Ｃ】
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【図４２Ａ−４２Ｂ】
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【図４３Ａ−４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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