(57)【要約】  本発明は一般に、ビールを製造するために使用される工程を含む、穀物の発芽および穀物の水性抽出物作製（例えば、マッシングを経由して作製される）に関する。従って、本発明は、穀物の高速発芽および穀物の水性抽出物の作製のための方法を提供する。方法は、穀物ベース飲料の製造のための麦汁を作製する工程を加速し、同時に、低レベルのβ−グルカンを有する前記麦汁を作製する潜在力を維持する。本発明は同様に、他の穀物粒（米、サトウモロコシ、トウモロコシ、アワおよび小麦を含む）の発芽および水性抽出物の作製ならびに補助剤を含む醸造工程にも適用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
飲料を製造するための方法であって、
ｉ．次のステップ：
ａ）穀物の穀粒を用意するステップ；
ｂ）前記穀物粒を４８〜１０８時間にわたる発芽ステップに供しそれにより発芽穀粒を得るステップ；
ｃ）前記発芽穀粒を微粉化し、同時に前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップ；および
ｄ）前記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし前記穀物粒がステップｂ）とｄ）の間のどの時点でも２０％未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ；
を含む方法により水性抽出物を作製し、
それにより前記穀物の水性抽出物を得るステップ、
および
ｉｉ．前記水性抽出物を飲料へと処理するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｉｉ．が、
ｅ）前記水性抽出物を任意選択でホップまたはホップ抽出物の存在下にて加熱するステップ；
ｆ）前記水性抽出物を冷却するステップ；
ｇ）前記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより発酵飲料を製造するステップ、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記飲料が、ビールである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記飲料が、例えばラガービール、ペールエールおよび小麦ビールからなる群より選択される、色の薄いビールである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記発芽ステップが、９６時間を超えない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記発芽ステップが、約９６時間などの、７２〜１０８時間の範囲で実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記発芽穀物粒が、前記穀物粒を微粉砕する時点で、例えば２５％以上、３０％以上など、好ましくは３５％以上、さらにより好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは４５％以上の、少なくとも２０％の含水量を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
発芽穀粒をキルン乾燥するステップを含まない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記微粉化発芽穀物粒をキルン煮沸するステップを含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）で用意される前記穀粒が、抗菌薬で処理されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記発芽穀粒が、１００ｇの発芽穀物粒（乾燥物）当たり、多くても８ｇなど、例えば多くても６ｇ、好ましくは多くても４ｇ（乾燥物）の、多くても１０ｇの細根を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記穀物が、外皮を持つ穀物、例えば皮麦である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
発芽の開始前に前記外皮の少なくとも一部を取り除くステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記穀物が、外皮のない穀物、例えば小麦または裸麦である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記穀物が、穀粒中の低β−グルカンレベルにより特徴づけられる大麦である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記穀粒中のβ−グルカンレベルが、乾燥重量基準で１〜５％の範囲などの、多くても５％ｗ／ｗである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記大麦が、ＣｓｌＦ６をコードする遺伝子中に変異を有することにより特徴づけられる、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
穀物の水性抽出物を製造するための方法であって、
ａ）穀物の穀粒を用意するステップ；
ｂ）前記穀物粒を４８〜１０８時間にわたる発芽ステップに供しそれにより発芽穀粒を得るステップ；
ｃ）前記発芽穀粒を微粉化し、同時に前記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップ；および
ｄ）前記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし前記穀物粒がステップｂ）とｄ）の間のどの時点でも２０％未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ；
を含み、それにより前記穀物の水性抽出物を製造する、方法。
【請求項１９】
ステップａ）、ｂ）、ｃ）および／またはｄ）が、請求項１〜１７のいずれか１項で定義される通りである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップａ）で用意される前記穀粒、および／または前記発芽穀物粒、および／または前記穀物の水性抽出物が、請求項１〜１７のいずれか１項で定義される通りである、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記発芽穀粒をキルン乾燥するステップを含まない、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
煮沸するステップを含まない、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記発芽穀物粒をシュレッディングするステップを含まない、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記穀物が、皮麦などの外皮を持つ穀物であり、発芽の開始前に前記外皮の少なくとも一部を取り除くステップを任意選択で含む、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップａ）で用意される前記穀粒が、抗菌薬で処理されている、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ビールを製造するために使用される工程を含む、穀物の発芽および穀物の水性抽出物作製（例えば、マッシングを経由した作製）に関する。従って、本発明は、穀物の高速発芽および水性抽出物の作製方法ならびに穀物の高速発芽および水性抽出物の作製を含む飲料の製造方法を提供する。方法は、穀物ベース飲料の製造のための麦汁を作製する工程を顕著に加速し、同時に、高レベルの発酵性糖類を有し、好ましくは低レベルのβ−グルカンおよびキシランを有する上記麦汁を作製する潜在力を維持する。本発明は同様に、他の穀物粒（米、サトウモロコシ、トウモロコシ、アワおよび小麦を含む）の発芽および水性抽出物の作製ならびに補助剤を含む醸造工程にも適用できる。
【背景技術】
【０００２】
商業的製麦工程では、大麦粒を、４〜６日間にわたりデンプン性胚乳の貯蔵デンプンおよびタンパク質の部分的流動化を可能にする制御された条件下で、発芽させる、または麦芽にする。製麦工程は通常、乾燥大麦粒を水中に浸漬することにより開始される。この工程は、浸麦として知られ、目的は、穀粒を洗浄するためのみでなく、その含水量を約４０〜４５％（ｗ／ｗ）に上昇させて、次に続く胚乳可動化ステップをより急速に行わせるためでもある。浸麦中に、水を一度抜いて、穀粒の再通気を可能にする。このステップは、エアレスト（ａｉｒ  ｒｅｓｔ）として知られ、主として、浸漬穀粒が約１６時間後に酸素欠乏になるという理由で必要であると考えられる。約８時間の「エアレスト」後に、穀粒は水に再浸漬されて、さらに８時間にわたり、または一連の再浸麦ステップで浸麦処理を完結する。乾燥穀粒の含水量を４０％以上に増加させる２段階浸麦工程は、全体で約３２時間を要する。いくつかの麦芽製造所では、スプレー浸麦技術が使用される。
【０００３】
浸麦穀粒は、発芽のために拡散培養され、その間に、酵素がアリューロンおよび胚盤上皮細胞から分泌され（デンプン性胚乳細胞中に先在する若干量と一緒に）、細胞壁、デンプンおよびタンパク質を分解する。正常な発芽条件下では、植物ホルモンのジベレリン酸（ＧＡ）が結節領域、または胚中のどこかで合成され、そこから水勾配に沿って拡散すると考えられている（Ｆｉｎｃｈｅｒ，２０１１）。
【０００４】
麦芽製造人は通常、穀粒中の可能な限り多くのデンプン分解酵素の合成を、迅速に誘導することを目指している。多くの商業的製麦プログラムでは、アリューロン層からの酵素分泌の工程を加速するために、ＧＡが添加される。デンプン分解酵素（これは、デンプン脱分枝酵素であるαおよびβ−アミラーゼおよびα−グルコシダーゼを含む）は、穀粒の貯蔵澱粉を部分的に単糖、オリゴ糖、およびグルコースに解重合する（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；上記β−アミラーゼに関しては、これらがデンプン性胚乳中に蓄積されることは注目に値する）。デンプンの解重合生成物はその後、炭素源として酵母細胞により使用され、ビールエタノールへと発酵される。糖化力は、一連のデンプン分解酵素の活性レベルを指す製麦品質パラメーターであり、醸造にとっては高い値が望ましい。
【０００５】
大麦粒の他の主要構成成分は、貯蔵タンパク質を含み、これらはデンプン性胚乳死細胞中にも認められ、ホルデインならびに水および塩可溶性タンパク質を含む。これらの解重合もまた、製麦工程で自然に始まるが、醸造業者は、十分なペプチドおよびアミノ酸が放出されて醸造所でのその後の発芽ステップ中に酵母成長を支援するように、これらのタンパク質の分解度を管理し得る。しかし、貯蔵タンパク質の分解が進行しすぎると、放出されたタンパク質が醸造工程で問題を生ずる可能性がある。特に、高レベルの放出された可溶性タンパク質は、析出し、最終的ビール生成物中に望ましくない濁りを形成する、またはビールの貯蔵中のストレッカーアルデヒド形成の可能性を高める可能性がある。製麦品質の規格では、発酵中の酵母成長のために、適切なレベルの遊離アミノ態窒素（ＦＡＮ）が望ましい。コールバッハ指数は、可溶性：総タンパク質比率の尺度であり、適切なコールバッハ指数を生ずる麦芽が通常好ましい。タンパク質分解の程度は従って、麦芽製造業者にとって継続している課題である。過剰な抽出タンパク質に関連し得るビール沈殿の問題に加えて、極めて高いＦＡＮレベルもまた、異臭形成の可能性により、問題に繋がる場合がある。
【０００６】
麦芽製造人はまた、大麦粒中の細胞壁多糖、特に（１，３；１，４）−β−グルカンおよびアラビノキシランを分解する高レベルの酵素を生じさせようと試みている。不完全に分解された（１，３；１，４）−β−グルカンは、醸造業者にとって特に面倒な場合がある。理由は、これらは、可溶型の麦芽から抽出されることがあり、これが高粘稠水溶液を形成し、醸造所における濾過工程を遅らせ、最終ビール中の望ましくない濁りの一因となるためである。従って、低レベルの可溶性（１，３；１，４）−β−グルカンは、重要な製麦品質パラメーターであり、同時に、高レベルの（１，３；１，４）−β−グルカナーゼ酵素は、依然として重要な麦芽品質の尺度のままである。
【０００７】
制御された発芽ステップ後に、湿潤麦芽の含水量を約４０％から４〜５％に乾燥する。この乾燥工程は焙燥工程と呼ばれ、極めてエネルギーを消費する工程であり、この産業の大きなコストを占める。キルン乾燥を含む全体工程は通常、６〜７日を要する。
【０００８】
キルン乾燥は、複数の理由から、長い間、ビール製造の重要部分と考えられてきた。１つの重要な理由は、発芽の間に、細根（稈（ｃｕｌｍ）とも呼ばれる）が形成されることである。細根は、苦味があり、これが、ビールの残味覚に影響を与え、さらに細根は、ビールに望ましくない色を付加し得る（Ｓｈｏｋｕｈｉｎ  Ｓａｎｇｙｏ  Ｓｈｉｍｂｕｎにより刊行されたＢｅｅｒ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）：１８３、ならびに米国特許第９，３２６，５４２号を参照されたい）。緑麦芽がキルン乾燥されると、細根は、例えば、ｄｅｃｕｌｍｅｒを用いて容易に除去できる。一般的教科書であるＤ．Ｅ．Ｂｒｉｇｇｓの「Ｍａｌｔｓ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ（麦芽と製麦）」によれば、「稈は、極めて含水性で、可溶性窒素含有物質に富み、悪い風味を含み、苦味のある物質であり、かつ二酸化硫黄および／またはニトロソアミンに富む場合があるので、除去しなければならない。除稈（Ｄｅｃｕｌｍｉｎｇ）は、麦芽の冷却を促進するために麦芽がキルンから取り出された直ぐ後で、かつ細根が空気から水分を取り込み、緩んで柔軟になり（脆性が小さくなり）、従って破壊および分離がより困難になる前に実施される必要がある」（Ｄ．Ｅ．Ｂｒｉｇｇｓ，Ｍａｌｔｓ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇ；ｐ６９５  Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｉｅ  ＆  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＩＳＢＮ０  ４１２  ２９８００）。
【０００９】
キルン乾燥麦芽は通常、４．５〜５．０％の水分レベルを有する。キルン乾燥麦芽はその後、麦芽製造所から醸造所へ、車、鉄道または船舶により輸送される。これは、製麦および醸造工程が異なる場所で、および、多くの場合、異なる企業体により従来から行われてきたという事実に関連する。
【００１０】
醸造所では、キルン乾燥麦芽を粉砕して穀粒をこじ開け、得られた内容物をマッシング工程として知られる工程で温水により抽出する。上述のように、抽出された物質は、部分的に分解したデンプン、タンパク質および細胞壁分子を含み、これらは、麦芽から抽出された内在性穀物酵素によりさらに分解される。この段階で、いくつかの醸造業者は、追加の、および通常より安価な炭素源（補助剤）を加えて、その後の酵母発酵工程を補助し、麦芽のより高いコストを相殺する。上記補助剤は、大麦、米、小麦またはその他の未発芽穀粒由来の穀粉であってよいが、それらの追加は、加水分解酵素を共に添加する必要がある。理由は、麦芽中には補助剤の成分を分解するのに不十分な内在性酵素しか存在しないためである。添加される酵素は通常、未精製の比較的安価な真菌および／または細菌培養物の抽出物由来である。外来性酵素の添加は、いくつかの国では、特に、ビールを厳密に調節された状況下で製造しなければならない国では合法的ではない。
【００１１】
温水中で抽出されたデンプン、およびその他の胚乳成分のさらなる分解は、糖化と呼ばれる工程で進められる。マッシング工程後に、抽出物は、多くの場合、麦芽汁濾過機中で濾過され、冷却される。抽出物は、ホップまたはホップ抽出物の存在下で煮沸され、冷却時に、放出された糖のエタノールへの発酵のために酵母培養物が添加され得る。そのように製造されたビールは通常、熟成され、濾過後に瓶詰めされる。ビールはまた、瓶詰めの前に炭酸ガスを入れられ得る。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、穀物水性抽出物の発芽および作製のための高速手法を含む穀物の水性抽出物からの飲料製造方法を提供する。方法は、穀物ベース飲料の製造のための麦汁を作製する工程を顕著に加速し、同時に、高レベルの発酵性糖類を有し、好ましくは低レベルのβ−グルカンおよびキシランを有する上記麦汁を作製する潜在力を維持する。特に、上記麦汁から作製された飲料は、低レベルの渋味を特徴とし得る。
【００１３】
本明細書の実施例、特に実施例７からわかるように、本方法により作製された、いくつかの重要な特性の麦汁およびビールは、キルン乾燥を含む従来の方法に比べて、変化しないままである。例えば、キルン乾燥なしで得られたアルコールレベルおよび真性発酵度は、キルン乾燥により得られたビールのレベルに類似する。同様に、色および気泡レベルに顕著な差異は観察されない。従って、発明者らは、キルン乾燥なしで水性穀物抽出物を得ることは可能であり、上記抽出物は、キルン乾燥により得られた飲料の特性と同等の特性を有する飲料へとさらに処理できることを示す。
【００１４】
当業者なら既知であり、上で述べたように、キルン乾燥ステップは、細根除去および異臭の低減を含む複数の理由から、ビール製造の重要な部分と考えられてきた。本発明の前には、キルン乾燥のステップが不要になり得ることは知られていなかった。従って、本明細書記載の方法は、当該技術分野における先入観を克服し、当該技術分野で長期にわたり知られていた問題を解決する。
本発明の一態様は、飲料の製造方法に関し、上記方法は、
ｉ．次のステップ：
ａ）穀物の穀粒を用意するステップ；
ｂ）穀物粒を４８〜１０８時間にわたる発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップ；
ｃ）上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップ；および
ｄ）上記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップｂ）とｄ）の間のどの時点でも２０％未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ；
を含む方法により水性抽出物を作製し、
それにより穀物の水性抽出物を得るステップ、
および
ｉｉ．上記水性抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む。
【００１５】
別の態様では、本発明は、穀物の水性抽出物を製造する方法を提供し、上記方法は、
ａ）穀物の穀粒を用意するステップ；
ｂ）穀物粒を４８〜１０８時間にわたり発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップであって、上記発芽ステップが、上記穀粒が少なくとも３０％の含水量を有するまで水溶液中で上記穀粒をインキュベーションすることを含み、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／（ｋｇ乾燥重量穀物粒）を、上記水溶液中を通過させるステップ；
ｃ）上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップ；および
ｄ）上記粉砕微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップｂ）とｄ）の間のどの時点でも２０％未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ；
のステップを含み、
それにより穀物の水性抽出物を製造する。
【００１６】
上記方法のいくつかの実施形態では、発芽全ステップの期間は、９６時間を超えず、発芽の期間は、発芽の開始から測定される。発芽ステップは、７２〜１０８時間の範囲で、例えば、約９６時間などで実施され得る。あるいは、発芽ステップは、６５〜８０時間の範囲で、例えば、約７２時間などで実施され得る。
【００１７】
発芽のステップに続き、本発明の方法は、発芽した穀物粒を微粉砕するステップを含む。特に興味深い本発明の態様は、本発明の方法が、発芽の直後に発芽した穀物粒の微粉化処理を可能にすることである。従って、方法は一般的に、発芽した穀物粒の乾燥ステップを含まない。特に、方法は、発芽穀物粒のキルン乾燥ステップを含まない。上述のように、キルン乾燥の１つの重要な側面は、細根の容易な除去を可能にすることである。乾燥の前では、細根除去は実現困難である。しかし、本発明の方法により作製された発芽穀物粒は、顕著に低減された細根を有し（通常、１００ｇの発芽大麦（乾燥重量）当たり６ｇ未満）、かつ本発明で示されるように、キルン乾燥のステップは、本発明の方法による発芽穀物に対し必要とされない。従って、好ましい実施形態では、飲料を製造するための方法は、発芽した穀粒のキルン乾燥ステップを必要としない。好ましい実施形態では、水性穀物抽出物を製造するための方法は、発芽した穀粒のキルン乾燥ステップを必要としない。
【００１８】
発芽穀物粒は、例えば、発芽穀物粒を湿式粉砕に供することにより微粉化され得、その後続けて、例えば、所定の温度で、本明細書で下記の「水性抽出物の作製」のセクションに記載のような任意の好適な期間にわたるマッシングによる水性抽出物の作製に供される。放出された糖類、例えば、多糖、およびタンパク質の変換は、デンプン、貯蔵タンパク質および細胞壁多糖の分解を触媒する外来性酵素混合物の添加によりマッシング中に促進され得る。酵素は、大麦それ自体から、麦芽から、または他の原材料から（あるいは、市販品入手源から購入できる真菌および／または細菌性酵素混合物から）部分精製できる。
【００１９】
本発明はそれにより、麦芽の乾燥の省略による大幅な節水、ならびに例えば、キルン乾燥ステップの省略により、大幅な省エネをもたらし得る。加えて、穀物粒から水性抽出物を作製するための総所要時間、および従って、上記水性抽出物の処理後の飲料作製のための所要時間を大きく減らし得る。本発明の高速手法により最大５０％のエネルギーコスト削減を達成でき、これは、この産業の二酸化炭素排出量を大きく減らし得る。製麦および醸造産業の二酸化炭素排出量を削減するために、ほとんどの国における法的および税制上の圧力が世界的に増大しているため、これは重要である。
【００２０】
さらに、持続可能性との関連で、本発明は、全体のビール製造が既に存在している醸造装置で実施されることを可能にするので、ほとんど追加の資本的支出を必要としない。
【００２１】
本発明は、添付特許請求の範囲でさらに定められる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】マイクロ製麦工程例の概略を示す。
【図２】製麦中の大麦変異体および参照穀粒の給水量を示す。
【図３】製麦中の大麦粒の根の成長を示す。根の成長を、通気下で２４時間水に浸漬した後、空気中で２４時間発芽させた（２４＋２４）試料でも測定した。
【図４】変異体および参照成熟大麦粒（０日目）中の、および１、２、３、４、５、６日目の緑麦芽中の、ならびに焙燥されたモルト（７日目）中の加水分解酵素をコードする遺伝子の発現を示す。酵素活性を、２４時間水に浸漬した後、空気中で２４時間発芽させた（２４＋２４）試料でも測定した。
【図５】製麦中に変異体および参照穀粒で測定された、α−アミラーゼ（ａ）、β−アミラーゼ（ｂ）および遊離限界デキストリナーゼ（ｃ）活性を示す。
【図６】変異体および参照成熟大麦粒（０日目）中の、および１、２、３、４、５、６日目の緑麦芽中のならびに焙燥されたモルト（７日目）中の（１−３；１−４）−β−グルカン含量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
本明細書で使用される場合、それが使われる文脈に応じて、「ａ」は、１つ（１種）または１つ（１種）を超えるを意味し得る。
【００２４】
数値に関連して本明細書で使用される場合、用語の「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」および「約（ａｂｏｕｔ）」は、好ましくは±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、用語の「アミノ酸」は、タンパク質を構成するアミノ酸を指す。好ましくは、タンパク質を構成するアミノ酸は、標準的遺伝子コードによりコードされる２０個のアミノ酸の１つである。ＩＵＰＡＣの１文字および３文字コードは、アミノ酸を命名するために使用される。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語の「Ｘに対応するアミノ酸」は、参照ポリペプチド（例えば、配列番号１のＣｓｌＦ６）のアミノ酸との関連で、所与のポリペプチド（例えば、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチド）のアミノ酸について言及する。上記ポリペプチドと参照ポリペプチド間での整列後に、アミノ酸が上記整列中のＸと同じ位置にある場合に、そのアミノ酸は、Ｘに対応する。
【００２７】
指定された核酸に関連して、「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」または「コードする（ｅｎｃｏｄｅｄ）」は、指定されたタンパク質への翻訳のための情報を含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸またはポリヌクレオチドは、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列、例えば、イントロンを含んでよく、または例えば、ｃＤＮＡ中で、このような介在非翻訳配列を欠いていてもよい。それによりタンパク質がコードされる情報は、コドンの使用により指定される。
【００２８】
用語の「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、これは、コード領域に先行するおよびそれに続く領域（プロモーターおよびターミネーター）を含む。さらに、植物遺伝子は通常、イントロンにより割り込まれるエクソンからなる。
【００２９】
キルン乾燥（または焙燥工程）は、製麦工程の一部であり、発芽穀粒を乾燥するステップを指し、上記穀粒は発芽の前に浸麦のステップにも供されている。キルン乾燥は、少なくとも７５℃などの従来の温度、例えば、８０〜８５℃などの８０〜９０℃の範囲の温度で行われ得る。キルン乾燥は通常、高温で実施される。キルン乾燥工程の一例は、次の通りである：６０℃で１２時間；６８℃で３時間；７４℃で４時間；８０℃で３時間。キルン乾燥のステップは、湿潤麦芽の水分または含水量を、約４０％から４〜５％へと低減する。従って、焙燥されたモルトは、約４〜５％の含水量を有する。
【００３０】
「変異」は、遺伝子のコードおよび非コード領域中の、欠失、挿入、置換、塩基転換、および点変異を含む。欠失は、全体遺伝子の欠失でも、または遺伝子の一部分のみの欠失であってもよい。点変異は、１つの塩基対の変化に関し、例えば、未成熟停止コドン、フレームシフト変異、スプライス部位の変異またはアミノ酸置換を生じ得る。変異を含む遺伝子は、「変異体遺伝子」と呼ばれることもある。上記変異体遺伝子が変異を含み、それにより、野生型とは異なる配列を有するポリペプチドをコードする場合、上記ポリペプチドは、「変異体ポリペプチド」と呼ばれることもある。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語の「補助剤」は、ビールの作製中に加えられる炭素リッチ原材料源を指す。補助剤は、非発芽穀物粒であってよく、これは、本発明により作製された発芽穀粒と共に粉砕されてもよい。補助剤はまた、シロップ、糖などであってもよい。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語の「若葉」は、穀物粒の発芽相中に認められる成長している胚芽を指す。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、穀粒の「含水量」という用語は、上記穀粒中のＨ２Ｏのｗ／ｗ％を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語の「発芽穀粒」は、目視可能な若葉、好ましくは、少なくとも２ｍｍなどの少なくとも１ｍｍの若葉、および可視可能茎を発達させた穀粒を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語の「発芽開始」は、１５％未満の含水量の大麦粒が十分な水と接触して発芽を開始する時点を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、別段の指定がない限り、用語の「β−グルカン」は、穀物細胞壁ポリマー「（１，３；１，４）−β−グルカン」を指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語の「（１，３；１，４）−β−グルカンシンターゼ」は、（１，３；１，４）−β−グルカンの合成を触媒し、さらに、任意選択で、グルコピラノシル単量体の重合を触媒する任意の酵素と見なさなければならない。例えば、（１，３；１，４）−β−グルカンシンターゼは、ＣｓｌＦ遺伝子またはその機能的ホモログによりコードされたポリペプチドであり得る。
【００３８】
同様に、本明細書で使用される場合、「キシラン」は、別段の指定がない限り、穀物細胞壁ポリマー「アラビノキシラン」を指す。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語の「キルン乾燥麦芽」および「焙燥されたモルト」は、キルン乾燥により乾燥されている発芽穀物粒を指す。キルン乾燥麦芽は通常、約４〜５％の含水量を有する。キルン乾燥に供されていない麦芽は、「緑麦芽」と表記される。
【００４０】
本明細書で用いられる場合、用語の「浸麦」は、穀物粒の含水量を増大させる工程を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語の「β−グルカナーゼ」は、穀物β−グルカンを解重合する潜在力を有する酵素を指す。従って、別段の指定がない限り、用語の「β−グルカナーゼ」は、（１，３；１，４）−β−および／または（１，４）−β−グルカナーゼ活性を特徴とする細胞内酵素または細胞外酵素またはこれらの混合物を意味する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語の「キシラナーゼ」は、キシランおよびアラビノキシランの主鎖および側鎖を分解する潜在力を有する酵素を指す。従って、別段の指定がない限り、用語の「キシラナーゼ」は、１種または複数の次の酵素クラス：エンド−１，４−キシラナーゼ；エキソ−１，４−キシラナーゼ；アラビノフラノシダーゼ；フェルラ酸エステラーゼにより得られる酵素活性を特徴とする酵素または酵素混合物を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、穀物粒の酵素活性は、特定の穀粒タイプから作製された粉末で測定された活性を指す。例えば、１ｇの穀物粒当たり１０Ｕ／ｇのα−アミラーゼ活性は、上記穀物からの１ｇの粉末（乾燥物）由来の水性抽出物中で測定した上記α−アミラーゼ活性（１０Ｕ）を指す。α−アミラーゼ活性は、Ｋ−ＣＥＲＡ０１／１２により測定される（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。β−アミラーゼ活性は、Ｋ−ＢＥＴＡ３により測定される（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。限界デキストリナーゼ活性は、Ｔ−ＬＤＺ１０００により測定される（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。
【００４４】
本明細書で示すガスの体積は、１気圧、２０℃での上記ガスの体積を指す。
【００４５】
本明細書で示すＯ２の体積は、１気圧、２０℃でのＯ２の体積を指す。本発明の実施形態では、Ｏ２がガスの混合物中に含まれる場合、ガス混合物の総体積が決定され得、Ｏ２の体積は、Ｏ２を含む総体積のパーセンテージとして計算され得る。一例では、大気は２１％Ｏ２を含む。従って、本明細書で使用される大気中のＯ２の体積は、大気の総体積の２１％である。
【００４６】
穀物粒
本発明の方法は、穀物粒の発芽のステップを含む。
穀物粒は、任意の穀物、例えば、大麦、米、サトウモロコシ、トウモロコシ、アワ、ライコムギ、ライ麦、オート麦および小麦からなる群より選択される穀物の穀粒であり得る。本発明の好ましい実施形態では、穀物粒は大麦粒である。上記穀粒は、任意の大麦変種、例えば、本明細書中以下のセクション「大麦」中に記載の大麦品種のいずれかの穀粒であり得る。
【００４７】
穀物粒は、発芽前に比較的低い含水量を有し得る。例えば、穀物粒は、多くても３０％、好ましくは多くても１５％などの２０％、例えば、５〜１５％の範囲の含水量を有し得る。
【００４８】
発芽の前に、穀物粒は抗菌剤処理の１つまたは複数のステップに供されていてよい。上記抗菌剤処理は、任意の有用な抗菌剤処理であり得、この処理は、穀粒の発芽潜在力を損なわない。抗菌剤処理は、例えば、１種または複数の抗菌薬による処理であり得る。上記抗菌薬は、使用される濃度で穀物粒に対し毒性でない任意の抗菌薬であり得る。例えば、抗菌薬は、塩素含有化合物、例えば、次亜塩素酸塩であり得る。抗菌薬はまた、過酸化物、例えば、過酸化水素および／または過酢酸であり得る。有用な商業的抗菌薬の非限定的例としては、Ｐ３−Ｈｙｐｏｃｈｌｏｒａｎ（登録商標）、Ｐ３−ｐｅｒｏｘｙｓａｎ（登録商標）またはＰ３−ｏｘｏｎｉａ  ａｃｔｉｖｅ  １５０（登録商標）が挙げられる。穀物粒は、ｈｙｐｏｃｈｌｏｒａｎを用いて、０．５〜５％の範囲でなどの０．１〜１０％の範囲で、例えば、１％などの約１％の濃度で処理され得る。穀物粒は、上記ｈｙｐｏｃｈｌｏｒａｎを用いて、１〜５時間の範囲でなどの１５分〜１０時間の範囲で、例えば、２〜４時間の範囲にわたり処理され得る。処理後、穀物粒は、１回または数回洗浄され得る。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態では、抗菌剤処理は、抗菌薬を含む水溶液中で穀物粒をインキュベーションすることにより実施され、従って、抗菌剤処理は浸麦ステップの一部として実施され得る。上記インキュベーションの直後に、発芽ステップが開始され得る。従って、このような実施形態では、水溶液を交換する必要はなく、抗菌剤処理および浸麦ステップに対し、同じ水溶液を使用し得る。これは、特に、抗菌薬が過酸化物、例えば、過酸化水素である場合に該当する。
【００５０】
上記穀物粒は本発明による発芽ステップの前に発芽に供されていないことが好ましいかもしれない。従って、穀物粒が前発芽ステップに供されていないことが好ましいかもしれない。
【００５１】
上述のように、穀物粒は、任意の穀物粒であり得る。いくつかの穀物粒は、外皮を含み、一方、他の穀物粒は、外皮がない。外皮を持つ穀物粒は、発芽ステップの前に、少なくとも一部の外皮を除去するように処理され得る。一般に、外皮のない穀物粒が使用される場合には、外皮除去の処理は必要ない。外皮のない穀物としては、例えば、裸麦品種および小麦が挙げられる。
【００５２】
外皮のある穀物粒は、穀物粒を外皮を取り除く物理的処理に供することにより、外皮を取り除くように処理され得る。上記物理的処理は、例えば、研磨、研摩、剥皮および平滑化からなる群より選択され得る。好ましくは、物理的処理は、外皮の減少を生じる。外皮の減少は、全体減量として測定され得る。従って、物理的処理は、好ましくは、穀物粒の総重量の２〜７％などの少なくとも２％の減少、好ましくは、３〜６％の範囲の減少などの少なくとも３％の減少をもたらす。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使われる穀物は、基本的に生物学的プロセスにより得られるとは限らない。技術的プロセスにより得られた植物の子孫は、基本的な生物学的プロセスにより得られるとは限らないと本明細書では見なされる。理由は、親植物が技術的プロセスにより得られるためである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、穀物粒は、１つまたは複数の変異を含む変異導入植物から得られ、上記変異は、化学的および／または物理的因子により誘導されている。
【００５５】
大麦
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法で使用されるべき穀物粒は大麦粒である。
【００５６】
上記穀粒は、任意の大麦植物の穀粒であり得る。しかし、いくつかの実施形態では、大麦植物は、１つまたは複数の特定の特性、例えば、本明細書中以下に記載の１つまたは複数の特性を含み得る。種々の特性が本明細書中以下において個別に考察されるが、本発明の大麦植物は、これらの特性の組み合わせを有し得る。
【００５７】
本発明の一実施形態では、大麦は、裸麦変種（ｖａｒ．）であり得る。大麦が、Ａｄｍｉｒａｌなどの、天然に薄い外皮を有する大麦変種であることも、本発明内に含まれる。例えば、外皮は、穀粒および外皮の合計重量の７％未満を構成し得る。
【００５８】
大麦植物はまた、低レベルのＬＯＸ活性を有する大麦植物であり得る。このような大麦植物は、当技術分野において既知であり、例えば、ＬＯＸ−１をコードする遺伝子中に変異を有する大麦植物を含む。例えば、大麦植物は、国際公開第０２／０５３７２１号、国際公開第２００５／０８７９３４号および国際公開第２００４／０８５６５２号に記載のＬＯＸ−１遺伝子中の任意の変異を有する大麦植物であり得る。
【００５９】
大麦植物はまた、リポキシゲナーゼ１（ＬＯＸ−１）をコードする遺伝子中に、および／またはＬＯＸ−２をコードする遺伝子中に変異を有する大麦植物でもあり得る。例えば、大麦植物は、国際公開第２０１０／０７５８６０号に記載のＬＯＸ−１およびＬＯＸ−２遺伝子中に任意の変異を有する大麦植物であり得る。
【００６０】
大麦植物はまた、低レベルのＭＭＴ活性を有する大麦植物であり得る。このような大麦植物は、当技術分野において既知であり、例えば、ＭＭＴをコードする遺伝子中に変異を有する大麦植物を含む。具体的には、大麦植物は、国際公開第２０１０／０６３２８８号に記載のＭＭＴ遺伝子中に任意の変異を有する大麦植物であり得る。大麦植物はまた、国際公開第２０１１／１５０９３３号に記載のいずれかの大麦植物であり得る。
【００６１】
大麦植物はまた、高められたＧＡシグナル伝達を特徴とする大麦植物であり得る。特に、大麦植物は、ＤＥＬＬＡタンパク質をコードするＳｌｅｎｄｅｒ１遺伝子中に変異を有する大麦植物であり得る。例えば、大麦植物は、Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３の、例えば、その中の表１に記載のいずれかの変異を有する大麦植物であり得る。例えば、大麦植物は、変異体ＤＥＬＬＡタンパク質をコードする変異体Ｓｌｅｎｄｅｒ１遺伝子をもたらすＳｌｅｎｄｅｒ１遺伝子中に変異を有し得、上記変異体ＤＥＬＬＡタンパク質は、アミノ酸番号４６、４９０、２８０、２６８、２７１、２７７、２３１、４８１、２８２、２７７、２２７、４８５または２３７の１つまたは複数に変異、例えば、Ｇ４６Ｅ、Ｓ４９０Ｆ、Ｒ２６８Ｈ、Ｇ２７１Ｄ、Ａ２７７Ｔ、Ｖ２３１Ｍ、Ｒ４８１Ｈ、Ｖ２８２Ｆ、Ａ２７７Ｔ、Ｇ２２７Ｅ、Ｓ４８５ＦおよびＣ２３７Ｙからなる群より選択される変異を有する。アミノ酸ナンバリングは、ジェンバンク受入番号ＡＫ３７２０６４またはＡＦ０３５８２０（２０１３年２月４日時点でのバージョン）により入手できるＤＥＬＬＡタンパク質の配列に対して与えられる。
【００６２】
低レベルのβ−グルカンを有する大麦植物
前述のように、マッシング中に得られる水性抽出物は、マッシュ混合物の良好な濾過性を可能にする十分に低い粘度を有することが好ましい。また、上で詳細に記載したように、可溶性β−グルカンは、水性抽出物の高粘度の一因となり得る。従って、本発明のいくつかの実施形態では、低レベルのβ−グルカンを有する穀類植物−特に大麦植物の使用が好ましい場合がある。
【００６３】
一実施形態では、本発明の方法で使用されるべき大麦植物は、穀粒中に低β−グルカンレベルを有することを特徴とする。一実施形態では、上記穀粒中のβ−グルカンレベルは、乾燥重量基準で、１〜５％ｗ／ｗの範囲などの、多くても５％である。好ましい実施形態では、穀粒中のβ−グルカンレベルは、乾燥重量基準で、１〜３％ｗ／ｗの範囲などの、多くても３％である。
【００６４】
一実施形態では、本発明の方法で使用されるべき大麦植物は、穀粒中に低β−グルカンレベルを有することを特徴とする。一実施形態では、穀粒中の上記β−グルカンレベルは、野生型大麦植物の、例えば、他の類似の野生型大麦植物、例えば、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎの大麦植物の、穀粒中のβ−グルカン含量の多くても５５％などの、多くても６０％、例えば、３０〜６０％の範囲である。
【００６５】
一実施形態では、大麦植物は、β−グルカン不含などの、検出レベル未満のβ−グルカンのレベルを有し得る。
【００６６】
一実施形態では、本発明の方法で使用されるべき大麦植物は、β−グルカンシンターゼをコードするいずれかの遺伝子中に変異を有する。上記遺伝子は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００３０７８４号に記載の配列番号２のポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。例えば、大麦植物は、米国特許出願公開第２０１２／００３０７８４号の配列番号１または配列番号１８に記載のβ−グルカン欠損遺伝子を含む大麦であり得る。
【００６７】
一実施形態では、本発明の方法で使用されるべき大麦植物は、低減した（１，３；１，４）−β−グルカン含量をもたらすＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有し得る。大麦Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ栽培品種Ｓｌｏｏｐ由来の野生型セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６ポリペプチド配列の配列は、配列番号１として本明細書で提供される。大麦Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ栽培品種Ｓｌｏｏｐ由来の野生型セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６（ＣｓｌＦ６）の全コード配列の配列は、配列番号２として本明細書で提供される。配列番号１として提供される配列に加えて、野生型ＣｓｌＦ６ポリペプチドはまた、位置５９０でのアミノ酸がＴｈｒにより置換されている配列番号１の配列も同様に有し得る。従って、Ａ５９０Ｔ多型を有する配列番号１のポリペプチドはまた、野生型ＣｓｌＦ６ポリペプチドとも見なされ得る（Ｔａｋｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２））。
【００６８】
一実施形態では、大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に変異を有する。変異は、ＣｓｌＦ６  ｍＲＮＡおよび／またはＣｓｌＦ６タンパク質の発現レベルに影響を与える変異であり得る。一実施形態では、変異は、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする上記変異導入ＣｓｌＦ６遺伝子をもたらす変異であり得る。ＣｓｌＦ６遺伝子中の変異は、ＣｓｌＦ６遺伝子のいずれかの変異、例えば、欠失、挿入または点変異であり得る。本発明の一実施形態では、変異は、ＣｓｌＦ６遺伝子のコード領域中の点変異である。一実施形態では、変異は、未成熟停止コドンをもたらす。上記変異体ＣｓｌＦ６遺伝子によりコードされる変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、任意の変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドであり得る。特に、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインのいずれか１つ中に１つのアミノ酸の置換を含み得る。変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、好ましくは、膜局在型ドメイン中の１つまたは複数の次の置換を含み得る：
・非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換、すなわち、非極性アミノ酸が荷電アミノ酸により置換され；および
・極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換、すなわち、極性アミノ酸が非極性アミノ酸により置換される。
【００６９】
本発明の一実施形態では、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインのいずれか１つ中に１つのアミノ酸の置換を含み得る。すなわち、膜局在型ドメインのいずれか１つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換され得る。ＣｓｌＦ６の膜局在型ドメインは、本明細書の表１に示される。
【表１】
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【００７０】
例えば、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸８４７の荷電アミノ酸への置換を含む、すなわち、アミノ酸８４７が荷電アミノ酸に置換されること以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり得る。例えば、上記置換は、位置８４７でのグリシン（Ｇ）の負に帯電しているアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐへの置換であり得る；換言すれば、位置８４７でのグリシン（Ｇ）が負に帯電しているアミノ酸、例えば、ＧｌyまたはＡｓｐにより置換され得る。好ましくは変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸８４７の置換を含むこと以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり得、上記置換は、位置８４７でのグリシン（Ｇ）のグルタミン酸（Ｅ）への置換であり、すなわち、位置８４７でのグリシン（G）がグルタミン酸（Ｅ）により置換される。加えて、上記変異体ＣｓｌＦ６は、任意選択で、Ａ５９０Ｔ多型を有してもよい。
【００７１】
例えば、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７４８の荷電アミノ酸への置換を含む、すなわち、アミノ酸７４８が荷電アミノ酸に置換されること以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり得る。例えば、上記置換は、位置７４８でのグリシン（Ｇ）の負に帯電しているアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐへの置換であり得る；換言すれば、位置７４８でのグリシン（Ｇ）が負に帯電しているアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐにより置換され得る。好ましくは変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７４８の置換を含むこと以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり得、上記置換は、位置７４８でのグリシン（Ｇ）のアスパラギン酸（Ｄ）への置換であり、すなわち、位置７４８でのグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）により置換される。加えて、上記変異体ＣｓｌＦ６は、任意選択で、Ａ５９０Ｔ多型を有してもよい。
【００７２】
例えば、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７０９の非極性アミノ酸への置換を含む、すなわち、アミノ酸７０９が非極性アミノ酸により置換されること以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり得る。例えば、上記置換は、位置７０９でのトレオニン（Ｔ）の非極性アミノ酸、例えば、ＬｅｕまたはＩｌｅへの置換であり、すなわち、位置７０９でのトレオニン（Ｔ）が非極性アミノ酸、例えば、ＬｅｕまたはＩｌｅにより置換され得る。加えて、上記変異体ＣｓｌＦ６は、任意選択で、Ａ５９０Ｔ多型を有してもよい。
【００７３】
好ましくは変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６がアミノ酸７０９の置換を含むこと以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり得、上記置換は、位置７０９でのトレオニン（Ｔ）のイソロイシン（Ｉ）への置換であり、すなわち、位置７０９でのトレオニン（Ｔ）がイソロイシン（Ｉ）により置換される。
【００７４】
変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドはまた、完全長ＣｓｌＦ６ポリペプチドのフラグメントであり得る。例えば、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは、変異体ＣｓｌＦ６が未成熟停止コドンを含み、従って短縮ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードすること以外は、配列番号１のＣｓｌＦ６であり得る。好ましくは、変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドは変異体ＣｓｌＦ６遺伝子によりコードされ得、変異体ＣｓｌＦ６遺伝子は、変異体ＣｓｌＦ６遺伝子がコード配列の位置２０２８でヌクレオチドグアニン（Ｇ）のアデニン（Ａ）への置換を含みそれにより停止コドンを形成する；換言すれば、位置２０２８でグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）により置換されること以外は、配列番号２のものである。得られた変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドはそれにより、位置６７６でトレオニン（Ｔ）の停止コドンへの置換（Ｔ６７６Ｓｔｏｐ）を含み、すなわち、位置６７６でトレオニン（Ｔ）。加えて、上記変異体ＣｓｌＦ６は任意選択で、Ａ５９０Ｔ多型を有してもよい。
【００７５】
大麦植物は、ＣｓｌＦ６遺伝子中に任意の変異を有し得る。このような変異は例えば、ＣｓｌＦ６遺伝子のサイレンシングをもたらし、極めて低レベルの（１，３；１，４）−β−グルカンを有する大麦粒をもたらす可能性がある（Ｔａｋｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１により記載のように）。大麦植物はまた、ＣｓｌＦ６遺伝子中に低レベルの（１−３，１−４）β−グルカン（＜１．６％）をもたらす変位を含むｍ３５１変異体（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）により記載のように）でもあり得る。
【００７６】
本特許出願においては、「変異体２」と命名された大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）の種子は、ブダペスト条約に基づいてＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１  ９ＹＡ  Ｓｃｏｔｌａｎｄに寄託されている。変異体２大麦植物は、２０１８年１１月１２日に寄託され、受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３を受け取った。一実施形態では、大麦植物は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３で寄託され、「変異体２」と呼ばれる大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）またはその子孫である。従って、大麦植物は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに寄託された受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３による大麦植物変異体２またはその任意の子孫大麦植物であり得、大麦植物は、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド２２４３のＧ→Ａ変異を有し、および／または上記大麦植物のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子は、配列番号１のアミノ酸７４８のＧｌｙ→Ａｓｐ変異を含む変異体ＨｖＣｓｌＦ６タンパク質をコードする。
【００７７】
穀物粒はまた、変異導入植物などの植物の子孫でもあり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使われる大麦粒は、基本的に生物学的プロセスにより得られるとは限らない大麦植物由来の穀粒である。技術的プロセスにより得られた大麦植物の子孫は、基本的に生物学的プロセスにより得られるとは限らないと本明細書では見なされる。理由は、親植物が技術的プロセスにより得られるためである。
【００７８】
このような植物を得るための方法は、本出願と同じ出願者に譲渡され、同じ出願日を有する「Ｃｅｒｅａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」と題する同時係属出願に記載されている。
【００７９】
大麦植物はまた、調節遺伝子などの、任意の他の遺伝子中にも変位を含み、低レベルのβ−グルカンをもたらし得る。
【００８０】
発芽
水性穀物抽出物の製造にまたはこのような穀物抽出物から作製される飲料の製造に関する本発明の方法は、穀物粒の発芽のステップを含む。
【００８１】
穀物粒は、本明細書中の上記のセクション「穀物粒」、「大麦」および「低レベルのβ−グルカンを有する大麦植物」で記載したいずれかの穀物粒であり得る。
【００８２】
発芽ステップは、上記穀物粒の浸麦の１つまたは複数のステップおよび上記穀物粒発芽の１つまたは複数のステップを含み得る。浸麦および発芽が同時にまたは少なくとも部分的に同時に起こるように、浸麦および発芽ステップは、組み合わされる、または部分的に組み合わされてもよい。
【００８３】
発芽の開始の前に、方法はまた、前の上のセクション「穀物粒」で記載のように、上記穀物粒を剥皮する初期ステップを含み得る。上記剥皮は、穀物粒による水吸収を高めるために、およびその後の発芽誘導のために、ならびに穀物粒の表面上の潜在的微生物の除去のために有益であり得る。加えて、または代わりに、穀物粒上の微生物もまた、前のセクション「穀物粒」で記載のように、穀物粒を１つまたは複数の抗菌剤処理ステップに供することにより、発芽の前に除去され得る。
【００８４】
浸麦は、当業者に既知の任意の従来法により実施され得る。浸麦は、穀粒の含水量を高め、それにより、発芽を開始するために実施される。浸麦は通常、例えば、水溶液中に穀物粒を浸漬することによる、穀物粒の湿潤条件中での１つまたは複数のインキュベーションステップを含む。
【００８５】
１つの非限定例は、乾湿交互条件下での浸麦を含む。浸麦は、任意の有用な温度、例えば、約１５℃などの１０〜２５℃の範囲の温度で実施され得る。
【００８６】
浸麦中に、例えば、穀物粒は、湿潤下、３０分〜１０時間の範囲で、続けて、乾燥下で３０分〜２４時間の範囲でインキュベーションされ、任意選択で、２〜５時間の範囲にて湿潤および／または乾燥下で上記インキュベーションが反復され得る。浸麦後の最終含水量は、例えば、４０〜５０％の範囲であり得る。
【００８７】
別の非限定的例は、穀物粒が湿潤インキュベーションされて約３５％などの３２〜３７％の範囲の含水量を得る、浸麦を含む。このような湿潤インキュベーションは、例えば、５〜１０時間の範囲でなどの５〜１２時間の範囲であり、続けて、乾燥下で１５〜２０時間の範囲でなどの１２〜３０時間の範囲のインキュベーションであり得る。穀物粒は、その後、湿潤インキュベーションされて、約４０％などの３７〜４３％の含水量を得る。これは、３〜７時間の範囲でなどの２〜１０時間の範囲にわたる湿潤インキュベーションにより達成され得る。湿潤インキュベーションに続けて、１５〜２５時間の範囲でなどの１０〜３０時間の範囲にわたる別の乾燥インキュベーションが行われる。最終的に、穀物粒が湿潤インキュベーションされ、約４５％などの４３〜４７％の範囲の含水量を達成し得る。これは、１〜１０時間の範囲で、例えば、１〜５時間の範囲での湿潤インキュベーションにより達成され得る。非限定的浸麦工程の例は、図１に概要が示されている。
【００８８】
一実施形態では、上記浸麦または上記湿潤インキュベーションは、少なくとも部分的に通気下で実施され得る。従って、上記穀物粒は、水溶液中で空気流と共に、例えば、Ｏ２を水溶液中に通過させながら、インキュベーションされ得る。空気流は、例えば、後述のいずれかの空気流であり得る。別の実施形態では、上記浸麦は、通気無しで実施される。
【００８９】
穀粒の発芽は、当業者に既知の任意の従来法によって実施され得る。１つの非限定例は、１〜４日間の範囲にわたり、任意選択で温度を変えながら、１０〜２５℃の範囲の温度で、例えば、１３〜１８℃の範囲での発芽を含む。発芽中に、穀物粒は、所望の含水量、例えば、４０〜４５％の範囲の含水量を維持するために、湿潤条件に供され得る。
【００９０】
加えて、穀物粒は、例えば、以降でより詳細に記載されるように、発芽中に空気流に晒され得る。
【００９１】
発芽の非限定的例を図１に示す。上記湿潤条件は、上記穀物粒上に水溶液を噴霧することにより得られる。湿潤条件はまた、発芽穀物粒を通して湿潤空気流を通過させることにより得られる。
【００９２】
上記空気流は、発芽を支援し得る任意の適切な空気流であり得る。当業者なら、例えば、Ｂｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  ｏｒ  ｏｎ  Ｋｕｎｚｅ，２０１４，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｌｔｉｎｇに基づいて、適切な空気流を決定できるであろう。空気流は、Ｏ２を含む、あるいはＯ２からなる任意のガスの流れであり得る。一実施形態では、空気流は、１時間ごとに、１ｋｇの穀物粒当たり少なくとも２Ｌ、好ましくは少なくとも３Ｌ、より好ましくは少なくとも４Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも６ＬのＯ２であり得る。上記穀物粒の重量は乾燥重量である。例えば、空気流は、１時間ごとに、１ｋｇの穀物粒（乾燥重量）当たり２〜１００Ｌの範囲、例えば、２〜５０Ｌの範囲などの２〜７５Ｌの範囲、例えば、４〜１００Ｌの範囲、例えば、４〜５０Ｌの範囲などの４〜７５Ｌの範囲、例えば、６〜１００Ｌの範囲、例えば、６〜５０Ｌの範囲などの６〜７５Ｌの範囲のＯ２であり得る。
【００９３】
多くの場合、空気流は大気の形態であり得る。従って、空気流は、１時間ごとに、１ｋｇの穀物粒当たり少なくとも１０Ｌ、好ましくは少なくとも１５Ｌ、より好ましくは少なくとも２０Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも２５Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも３０Ｌの大気であり得る。上記穀物粒の重量は乾燥重量である。例えば、空気流は、１時間ごとに、１ｋｇの穀物粒（乾燥重量）当たり１０〜５００Ｌの範囲、例えば、１０〜２５０Ｌの範囲などの、１０〜３７５Ｌの範囲、例えば、２０〜５００Ｌの範囲、例えば、２０〜２５０Ｌの範囲などの２０〜３７５Ｌの範囲、例えば、３０〜５００Ｌの範囲、例えば、３０〜２５０Ｌの範囲などの３０〜３７５Ｌの範囲の大気であり得る。
【００９４】
一実施形態では、本明細書に記載の水性穀物抽出物を製造する方法またはそれ由来の飲料を製造する方法の全発芽ステップの期間は、１０８時間を超えない。一実施形態では、発芽ステップは、９６時間を超えない。一実施形態では、発芽ステップは、４８〜１０８時間の範囲にわたり実施される。一実施形態では、発芽ステップは、約９６時間などの７２〜１０８時間の範囲で実施される。一実施形態では、発芽ステップは、約７２時間などの６５〜８０時間の範囲で実施される。
【００９５】
発芽期間は、発芽の開始から測定され、例えば、発芽の期間は、発芽の開始から、発芽穀物粒の微粉化の開始まで測定され得ることは、本発明の一態様である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、発芽後に、穀物粒は、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、例えば、４０〜４５％の範囲の含水量を有する。いくつかの実施形態では、穀物粒は、発芽後に、少なくとも３１％などの、少なくとも３２％などの、少なくとも３３％などの、少なくとも３４％などの、少なくとも３５％などの、少なくとも３６％などの、少なくとも３７％などの、少なくとも３８％などの、少なくとも３９％などの、少なくとも４０％などの、少なくとも４５％などの、少なくとも４６％などの、少なくとも４７％などの、少なくとも４８％などの、少なくとも４９％などの、少なくとも５０％などの、少なくとも３０％の含水量を有する。
【００９７】
穀物粒の含水量は、穀物粒の重量を測定し、続いて上記穀物粒を乾燥し、乾燥穀物粒の重量を測定することにより、決定され得る。湿潤および乾燥穀物粒の重量の差異は、水とみなされ、含水量は、水の重量を穀物粒の総重量（湿潤穀物粒）により除算した値として与えられる。含水量はまた、発芽開始前の穀物粒の重量を、発芽中または発芽後の穀物粒の重量と比較することにより決定でき、ここで発芽穀物粒は、全ての表面水を除去するために短時間の遠心分離に供されている。％で与えられる含水量は、従ってｗ／ｗ％である。
【００９８】
穀物粒の発芽は、任意の有用な温度で実施され得る。しかし、穀物粒が少なくとも１０℃の温度で発芽されることが好ましいであろう。特に、穀物粒は、１０〜２５℃の範囲で、好ましくは、１５〜２０℃の範囲などの１２〜２５℃の範囲で発芽され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、発芽ステップ中に１種または複数の外来性の酵素が、例えば、国際公開第２０１６／０７１４６３号に記載のように添加され得る。発芽工程は、任意選択で、発芽を加速できる１種または複数の化合物の添加により、短縮されてもよい。例えば、植物ホルモンのジベレリン酸（ＧＡ）を、開始時から、またはインキュベーション中に加え得る。ＧＡは、その標的細胞、すなわち、大麦粒のアリューロンおよび胚盤上皮中で、デンプン、貯蔵タンパク質および細胞壁多糖の加水分解に必要な内在性酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子の発現を「活性化する」。
【０１００】
穀物粒は好ましくは、発芽の実質的に直後に微粉化される。従って、本発明の方法は好ましくは、穀物粒の発芽と微粉化ステップの間に、乾燥ステップを含まない。本発明の方法は好ましくは、上記発芽穀物粒をキルン乾燥するステップを含まない。
【０１０１】
発芽穀物粒
本発明は、飲料を製造するための方法および穀物の水性抽出物を製造するための方法に関し、上記方法は、発芽穀物粒を製造するステップを含む。
【０１０２】
発芽穀物粒は好ましくは、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、デンプン脱分枝酵素（限界デキストリナーゼなど）、グルコシダーゼおよびプロテアーゼにより提供される、１種または複数の加水分解酵素活性を含む。
【０１０３】
多くの場合、加水分解酵素活性の開始は、時間的に協調して発生し、従って、いくつかの加水分解酵素の活性は、他の加水分解の酵素活性に対するマーカーとして使用され得る。
【０１０４】
従って、発芽穀物粒は適切なレベルの測定可能なα−アミラーゼ活性を有することが好ましい。好ましくは、発芽穀物粒は、少なくとも５０Ｕ／ｇなどの少なくとも３０Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも１００Ｕ／ｇ穀物粒（乾燥重量）の測定可能なα−アミラーゼ活性を有する。α−アミラーゼ活性は好ましくは、標準的な方法により、例えば、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ＩｒｅｌａｎｄのＣｅｒａｌｐｈａ  ｋｉｔ（Ｋ−ＣＥＲＡ）を用いて測定される。特に、α−アミラーゼ活性は、以下の実施例５に記載のように測定し得る。
【０１０５】
発芽穀物粒が適切なレベルの測定可能なβ−アミラーゼ活性を有することもまた好ましいであろう。好ましくは、発芽穀物粒は、少なくとも１０Ｕ／ｇなどの少なくとも５Ｕ／ｇ穀物粒（乾燥重量）の測定可能なβ−アミラーゼ活性を有する。好ましくは、β−アミラーゼ活性は、標準的な方法により、例えば、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ＩｒｅｌａｎｄのＢｅｔａｍｙｌ  ｋｉｔ（Ｋ−ＢＥＴＡ３）を用いて測定される。特に、β−アミラーゼ活性は、以下の実施例５に記載のように測定し得る。
【０１０６】
発芽穀物粒が適切なレベルの限界デキストリナーゼ活性を有することもまた好ましい。好ましくは、発芽穀物粒は、少なくとも５Ｕ／ｇなどの少なくとも２ｍＵ／ｇ、例えば、少なくとも２０Ｕ／ｇなどの、例えば、少なくとも１０Ｕ／ｇ穀物粒（乾燥重量）の限界デキストリナーゼ活性を有する。好ましくは、限界デキストリナーゼ活性は、標準的な方法により、例えば、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，ＩｒｅｌａｎｄのＬｉｍｉｔ  Ｄｅｘｔｒｉｚｙｍｅ  ｋｉｔ  Ｔ−ＬＤＺ１０００を用いて測定される。特に、限界デキストリナーゼ活性は、以下の実施例５に記載のように測定し得る。
【０１０７】
興味深いことに、本発明による発芽穀物粒は、従来の緑麦芽に比べて、顕著に低減された細根を有する。従って、本発明による発芽穀物粒は好ましくは、１００ｇの発芽大麦当たり多くても８ｇなどの１００ｇの発芽大麦当たり多くても１０ｇの細根、好ましくは１００ｇの発芽大麦当たり多くても６ｇの細根、さらにより好ましくは１００ｇの発芽大麦当たり多くても４ｇの細根を含み、ここで細根の質量および発芽大麦の質量の両方は、乾燥重量で与えられる。細根の質量は好ましくは、以下の実施例３で記載のように測定される。
【０１０８】
前述のように、マッシング中に得られる水性抽出物は、マッシュ混合物の良好な濾過性を可能にする十分に低い粘度を有することが好ましい。また、上記で詳細に記載したように、可溶性β−グルカンは、水性抽出物の高粘度の一因となり得る。濾過性は多くの場合、β−グルカンのレベルに依存し得る。従って、発芽穀物粒中のβ−グルカンのレベルは高すぎないことが、好ましいであろう。
【０１０９】
好ましくは、発芽穀物粒は、乾燥重量基準で、５％未満のβ−グルカン含量、例えば、２％ｗ／ｗ未満などの３％ｗ／ｗ未満、例えば、１．５％ｗ／ｗ、好ましくは１．０％ｗ／ｗ未満のβ−グルカン含量を有する。
【０１１０】
発芽穀物粒の微粉化
飲料を製造するための本発明の方法および穀物の水性抽出物を製造するための方法は、発芽穀物粒を微粉化するステップを含む。
【０１１１】
上記穀物粒が微粉化される時点で、それらは好ましくは、まだ高い含水量を有し、好ましくは、上記穀物粒は、少なくとも２０％、例えば、３０％以上などの２５％以上、好ましくは、３５％以上、例えば、４０％以上の含水量を有する。いくつかの実施形態では、穀物粒は、穀物粒の発芽後から微粉化までのどの時点においても、３１％以上などの、３２％以上などの、３３％以上などの、３４％以上などの、３５％以上などの、３６％以上などの、３７％以上などの、３８％以上などの、３９％以上などの、４０％以上などの、４５％以上などの、４６％以上などの、４７％以上などの、４８％以上などの、４９％以上などの、５０％以上などの、３０％以上の含水量を有する。
【０１１２】
例えば、発芽穀物粒は、発芽から穀物粒の微粉化用装置に直接移され得る。従って、発芽穀物粒は、微粉化されている時点では、穀物粒が発芽直後に有するものと同じ含水量、例えば、本明細書のセクション「発芽」で記載の含水量を有し得る。特に、方法は通常、高温に供することによる発芽穀物粒の乾燥ステップを含まない。好ましくは、発芽穀物粒は、上記穀物粒の発芽後および微粉化される前のどの時点においても、２０％未満の含水量をもたず、例えば、３０％以上などの２５％以上、好ましくは、３５％以上、例えば、４０％以上の含水量を有する。従って、方法は好ましくは、発芽穀物粒をキルン乾燥するステップを含まない。
【０１１３】
発芽穀物粒は、２０％を超える、例えば、３０％以上などの２５％以上、好ましくは３５％以上、さらにより好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは４５％以上の含水量を有する穀物粒を微粉化するのに好適な任意の装置を用いて、微粉化され得る。例えば、発芽穀物粒は、粉砕、例えば、湿式粉砕に供され得る。発芽穀物粒の粉砕に有用な粉砕機としては、Ｍｉｌｌｓｔａｒ，ＵＳＡから入手できる粉砕機が挙げられる。発芽穀物粒はまた、磨砕にも供され得る。
【０１１４】
穀物粒は通常、穀物粒の発酵性糖類の水性抽出物が作製されるような程度に微粉化される。従って、穀物粒は、充分に分割され、それにより、１ｋｇの上記微粉化穀物粒の７-Ｌの水性抽出物は少なくとも８プラトー度の比重を有する。
【０１１５】
水性抽出物が発芽穀物粒および１種または複数の補助剤から作製される本発明の実施形態では、上記補助剤も微粉化され得る。特に、これは、上記補助剤が非発芽穀物粒を含む場合に該当し得る。上記補助剤は、微粉化され、例えば、別の手順で粉砕され得る。しかし、補助剤が発芽穀物粒と一緒に微粉化されることも本発明に含まれる。同様に、水性抽出物が発芽穀物粒およびキルン乾燥麦芽から作製される場合、上記キルン乾燥麦芽は微粉化され、例えば、別の手順で粉砕され得る。しかし、キルン乾燥麦芽が発芽穀物粒と一緒に微粉化されることも本発明に含まれる。
【０１１６】
水性抽出物の作製
本発明の方法はまた、微粉化発芽穀物粒の水性抽出物を作製するステップも含む。ステップは、例えば、マッシングのステップであり得る。
【０１１７】
上述の水性抽出物は通常、微粉化穀物粒を水中または水溶液中でインキュベーションすることにより作製され得、本明細書では、「マッシング溶液」とも呼ばれる。マッシング溶液は、任意の水溶液であってよいが、通常それは水道水などの水からなり、これに対し、１種または複数の追加の薬剤が添加され得る。発芽中に添加された追加の薬剤と区別するために、これらの追加の薬剤を、「追加のマッシング剤」と呼ぶ場合もある。従って、マッシング溶液は、水（例えば、水道水）からなり、これに対し、１種または複数の追加のマッシング剤が添加され得る。マッシング剤は、開始時からマッシング溶液中に存在するか、または水性抽出物を作製する工程中に添加され得る。
【０１１８】
上記追加のマッシング剤は酵素であり得る。従って、マッシング溶液は、１種または複数の酵素を含み得る。上記酵素は、開始時からマッシング溶液に加えられか、またはその後、工程中に添加され得る。
【０１１９】
上記酵素は、例えば、１種または複数の加水分解酵素であり得る。好適な酵素としては、リパーゼ、デンプン分解酵素（例えば、アミラーゼ）、グルカナーゼ［好ましくは（１−４）−および／または（１，３；１，４）−β−グルカナーゼ］、および／またはキシラナーゼ（例えば、アラビノキシラナーゼ）、および／またはプロテアーゼ、または１種または複数の上述の酵素を含む酵素混合物、例えば、Ｃｅｒｅｆｌｏ、Ｕｌｔｒａｆｌｏ、またはＯｎｄｅａ  Ｐｒｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ）が挙げられる。例えば、マッシング溶液は、１種または複数の加水分解酵素を含み得、少なくとも１種の加水分解酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、限界デキストリナーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、キシラナーゼ、グルコアミラーゼおよびプロテアーゼからなる群より選択される。
【０１２０】
本発明の一実施形態では、マッシング溶液は、１種または複数の次の酵素を含む：
−β−グルカナーゼ、例えば、エンド−（１，３；１，４）β−グルカナーゼまたはエンド−１，４−β−グルカナーゼ
−キシラナーゼ、例えば、エンド−またはエキソ−１，４−キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼまたはフェルラ酸エステラーゼ
−α−アミラーゼ
−プルラナーゼまたは限界デキストリナーゼ
−グルコアミラーゼ。
【０１２１】
マッシング溶液に酵素を添加するかどうか、およびどの酵素を添加するかの決定は、使われる穀物粒に依存し得る。従って、穀物が低レベルのβ−グルカンを有する大麦植物（例えば、本明細書の上記セクション「大麦」で記載のような）である本発明の実施形態では、マッシング溶液に対してほとんどまたは全くβ−グルカナーゼが添加され得ない。
【０１２２】
一実施形態では、マッシング中に外来性のプロテアーゼが添加されないことが好ましい。プロテアーゼの添加は、プロテアーゼが酵素活性に影響を与え得るので、あまり好ましくないであろう。一実施形態では、マッシング中に外来性のリパーゼが添加されないことが好ましい。
【０１２３】
一実施形態では、１ｇの発芽穀物粒（乾燥物）当たり多くても７００Ｕ、好ましくは多くても３５０Ｕの外来性グルコアミラーゼが水性抽出物の作製中に使用されることが好ましい。
【０１２４】
一実施形態では、１ｋｇの発芽穀物粒（乾燥物）当たり多くても４００ＡＧＵ、好ましくは多くても２００ＡＧＵの外来性グルコアミラーゼが水性抽出物の作製中に使用されることが好ましい。ＡＧＵの測定は、米国特許第７０６０４６８号に記載のように実施され得る。
【０１２５】
別の実施形態では、水性抽出物の作製中に使用される外来性のグルコアミラーゼおよびα−アミラーゼの組み合わせは、１ｇの発芽穀物粒（乾燥物）当たり７００Ｕを超えない、好ましくは３５０Ｕを超えないことが好ましい。グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼ活性の組み合わせは、例えば、Ｋ−ＣＥＲＡ  ０１／１２を用いて測定され得る（プロトコルおよびキットは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄから入手可能）。
【０１２６】
一実施形態では、１ｋｇの発芽穀物粒（乾燥物）当たり多くても２０Ｕの外来性プルラナーゼまたは限界デキストリナーゼが水性抽出物の作製中に使用されることが好ましい。
【０１２７】
一実施形態では、１ｋｇの発芽穀物粒（乾燥物）当たり多くても１００ＰＵＮのプルラナーゼが水性抽出物の作製中に使用されることが好ましい。ＰＵＮの測定は、米国特許第７０６０４６８号に記載のように実施され得る。
【０１２８】
上記追加のマッシング剤はまた、補助剤、例えば、非発芽穀物粒、シロップまたは糖類であり得る。補助剤が添加される場合、これらも、例えば、粉砕または磨砕により、微粉化されていてよい。補助剤が穀物粒、例えば、発芽に供されていない穀物粒である場合、それは通常、微粉化または粉砕され得る。補助剤がシロップ、糖類などの場合には、これらは、通常粉砕されない。糖類またはシロップなどの補助剤は、工程の任意の時点でマッシング溶液に添加され得るが、このような補助剤はまた、水性抽出物に対しても、またはさらに後で下記の飲料作製工程中に、添加され得る。一般に、補助剤は、発芽穀物粒より少ない量で添加される。従って、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、例えば、少なくとも９０％の炭水化物の水性抽出物が、発芽穀物粒から得られ、一方、補助剤は好ましくは、炭水化物のわずかな部分を占めるに過ぎない。補助剤が非発芽穀物粒である場合は、発芽穀物粒が、乾燥重量で測定して総穀物粒の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは７０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも９０％（ｗ／ｗ）を構成することが好ましい。
【０１２９】
追加のマッシング剤はまた、キルン乾燥麦芽であり得る。キルン乾燥麦芽が添加される場合、これも、例えば、粉砕または磨砕により、微粉化されていてよい。一般に、キルン乾燥麦芽は、発芽穀物粒より少ない量で添加される。従って、発芽穀物粒（すなわち、キルン乾燥されていない発芽穀物粒）は、乾燥重量で測定して総穀物粒および麦芽の少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも９５％（ｗ／ｗ）を構成することが好ましい。好ましい実施形態では、キルン乾燥麦芽は添加されない。
【０１３０】
好ましくは食品等級品質の上記追加のマッシング剤は、塩、例えば、ＣａＣｌ２であってもよい。
【０１３１】
上記追加のマッシング剤はまた、酸、好ましくは食品等級酸、例えば、Ｈ３ＰＯ４であり得る。
【０１３２】
水性抽出物は通常、微粉化発芽穀物粒を１種または複数の所定の温度にてマッシング溶液中でインキュベーションすることにより作製される。上記所定の温度は、本明細書では「マッシング温度」とも呼ばれる。上記マッシング温度は、例えば、マッシングに使用される従来の温度であり得る。
【０１３３】
マッシング温度は一般的に、一定に保持される（等温マッシング）か、または徐々に、例えば、逐次的様式で高められる。いずれの場合でも、微粉化発芽穀物粒中の可溶性物質は、上記マッシング溶液中に遊離され、それにより、水性抽出物を形成する。
【０１３４】
マッシング温度は通常、４０〜８５℃の範囲などの３０〜９０℃の範囲の、例えば、５０〜８０℃の範囲の温度である。マッシング温度は、使用される穀物タイプに応じて選択され得る。従って、穀物粒が低レベルのまたは非存在のリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）活性および／またはメチルメチオニントランスフェラーゼ（ＭＭＴ）活性（詳細については、本明細書中以下のセクション「大麦」中の詳細を参照されたい）を有する大麦である、本発明の実施形態では、マッシング温度は、より低く、例えば、３５〜６９℃の範囲であり得る。
【０１３５】
マッシング溶液中でのインキュベーションは、任意の好適な時間にわたり実施され得る。マッシング容器中のマッシング溶液中でのインキュベーション時間は、例えば、６０〜２４０分の範囲などの６０〜３００分の範囲、例えば、９０〜２４０分などの９０〜３００分の範囲、例えば、９０〜２７０分の範囲であり得る。例えば、マッシング溶液中での上記インキュベーション時間は、従来のマッシングで使用されるいずれかの時間であり得る。好適なマッシングの１つの非限定的例は：
（１）約１５分などの１０〜３０分の範囲で、約５５℃などの５０〜６０℃の範囲の温度で仕込み開始。
（２）約６０分などの３０〜９０分の範囲で、６０〜７０℃の範囲、好ましくは、約６２℃などの６０〜６５℃の範囲の温度に加熱。
（３）約１５分などの５〜３０分の範囲で、約７２℃などの７０〜７５℃の範囲の温度に加熱。
（４）約１０分などの５〜１５分の範囲で、７５〜８０℃の範囲、好ましくは、約７８℃などの７５〜７８℃の範囲の温度に加熱。
である。
【０１３６】
マッシング容器での水溶液中のインキュベーションに続いて、マッシング溶液中の微粉化発芽穀物粒は、別の容器、例えば、麦芽汁濾過機に移され、高温で、例えば、７０〜７８℃の範囲で３０〜１２０分の範囲で、インキュベーションされ得る。
従って、マッシング溶液中でのインキュベーションは、上述のステップに加えて、次のステップ（５）も含む：
（５）約６０分などの３０〜１２０分の範囲で、７０〜７８℃の範囲、好ましくは、約７８℃などの７５〜７８℃の範囲の温度に加熱。
【０１３７】
非限定的例は、醸造文献、例えば、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら（前出）およびＨｏｕｇｈら（前出）で見つけることができる。
【０１３８】
マッシングステップは、微粉化穀物粒の煮沸を含まないことが好ましい。換言すれば、水中または水溶液中抽出物中の微粉化穀物抽出物のインキュベーション中、温度は常に、沸点未満に保持される。しかし、水性抽出物のビール粕からの分離後に、水性抽出物は煮沸され得る。通常、微粉化発芽穀物粒の水性抽出物を作製するステップは、煮沸温度より十分に低い温度で、通常、８５℃未満などの９０℃未満の温度で、例えば、８０℃未満の温度で実施される。
【０１３９】
マッシング溶液中でのインキュベーション後に、水性抽出物は通常、例えば、濾過により水性抽出物と残留非溶解固体粒子とに分離され得、後者は「ビール粕」とも表記される。濾過は、例えば、麦芽汁濾過機中で実施され得る。あるいは、濾過は、マッシュフィルターを用いた濾過であり得る。こうして得られた水性抽出物は、「第一麦汁」とも表記される。
【０１４０】
スパージングとも表記される工程中に、水などの追加の液体をビール粕に加え得る。スパージングおよび濾過の後で、「第二麦汁」が得られ得る。さらなる麦汁は、この手順の反復により作製され得る。
【０１４１】
従って、水性抽出物は、麦汁、例えば、第一麦汁、第二麦汁、さらなる麦汁またはこれらの組み合わせであり得る。
【０１４２】
水性抽出物
本発明の方法により作製された水性抽出物は、限定されないが、このセクションで記載の特性を含む、多くの有用な特性を有し得る。本方法により作製された水性抽出物は、本明細書に記載のように、飲料中でさらに処理され得る。
【０１４３】
前述のように、水性抽出物は、濾過のステップに供され得る。従って、麦汁が良好な濾過性を有することが好ましい。例えば、高粘性液体を濾過するのは、技術的に困難であり得る。これが、水性抽出物が低粘度を有することが好ましい理由である。
【０１４４】
濾過性は、様々な方法で測定され得る。一実施形態では、濾過性は、濾紙を備えた濾過用漏斗を１時間にわたり通す濾過後に得られる液体の量として測定される。一実施形態では、水性抽出物は、１００ｇの微粉化穀物粒を含む４００ｍＬのマッシング溶液が上記濾過用漏斗に添加された場合、少なくとも２５０ｍＬの濾過性を有し得る。濾過性はまた、上述のように６０分の濾過後に得られた液体の体積の、上記漏斗に添加された水性抽出物の液体の体積に対するパーセンテージとしても測定され得る。従って、一実施形態では、濾過性は、例えば、少なくとも６０％などの少なくとも約５０％（ｖ／ｖ）であり得る。特に、濾過性は、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６５４９８号の実施例３に記載のように、測定され得る。
【０１４５】
濾過性は、多くの場合、β−グルカンのレベルに依存し得る。従って、β−グルカンのレベルは高すぎないことが好ましいであろう。例えば、一実施形態では、水性抽出物は、多くても２００ｍｇ／Ｌ、好ましくは多くても１５０ｍｇ／Ｌのβ−グルカンを含み得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、穀物の水性抽出物は、メラノイジンを含まない。
【０１４７】
穀物粒の水性抽出物を製造するための方法
一実施形態では、本発明は、穀物の水性抽出物を製造するための方法に関し、上記方法は、次のステップを含む：
ａ）穀物の穀粒を用意するステップ；
ｂ）穀物粒を４８〜１０８時間にわたり発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップであって、上記発芽ステップが、上記穀粒が少なくとも３０％の含水量を有するまで水溶液中で上記穀粒をインキュベーションすることを含み、１時間当たり、少なくとも２ＬのＯ２／（ｋｇ乾燥重量穀物粒）を、上記水溶液中を通過させる、ステップ；および
ｃ）上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップ；および
ｄ）上記粉砕により微粉化した発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップｂ）とｄ）の間のどの時点でも２０％未満の含水量を有しないことが前提であり；それにより穀物の水性抽出物を製造する、ステップ。
【０１４８】
一実施形態では、発芽のステップは、１つまたは複数の浸麦のステップを含み得る。発芽の全ステップの期間は、１０８時間を超えず、例えば、９６時間を超えないことが好ましい場合がある。一実施形態では、発芽のステップは、約９６時間などの７２〜１０８時間の範囲で実施される。一実施形態では、発芽のステップは、約７２時間などの６５〜８０時間の範囲で実施される。
【０１４９】
発芽の期間が、発芽の開始から測定されることは本発明の一態様である。
【０１５０】
一実施形態では、発芽の終了が、発芽穀粒の微粉化の開始であり得る。
【０１５１】
用語の「上記穀物粒がステップｂ）とｄ）の間のどの時点でも２０％未満の含水量をもたない」は、例えば、上記穀物粒がステップｂ）の完了からステップｄ）の開始のどの時点でも２０％を超える含水量を有し得ることを含む。
【０１５２】
穀物の水性抽出物を作製するための本方法は、上記ステップｂ）とｄ）の間のどの時点でもキルン乾燥のステップを含まない。いくつかの実施形態では、方法は、上記ステップ（ｂ）と（ｃ）の間のどの時点でも、キルン乾燥のステップを含まない。他の実施形態では、方法は、上記ステップ（ｃ）と（ｄ）の間のどの時点でも、キルン乾燥のステップを含まない。上記で説明したように、これは、本発明者らが驚くべきことに、キルン乾燥のステップを免除でき、および水性穀物抽出物、特に、飲料の製造に好適な抽出物を発芽穀粒のキルン乾燥なしで得ることができることを見だしたことが理由である。実施例３で認められるように、本方法により発芽された大麦粒の根の成長は驚くべきことに、顕著に低減され、従って、キルン乾燥のステップを免除できる。
【０１５３】
穀物粒は、本明細書中で上記したいずれかの穀物粒であり得る。一実施形態では、大麦植物は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３で寄託され、「変異体２」と呼ばれる大麦植物（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）またはその子孫である。従って、大麦植物は、２０１８年１１月１２日にＮＣＩＭＢに寄託された受入番号ＮＣＩＭＢ４３２７３による大麦植物変異体２またはその任意の子孫大麦植物であり得、大麦植物は、ＨｖＣｓｌＦ６遺伝子（配列番号２）のコード配列のヌクレオチド２２４３のＧ→Ａ変異を有し、および／または上記大麦植物のＨｖＣｓｌＦ６遺伝子は、配列番号１のアミノ酸７４８のＧｌｙ→Ａｓｐ変異を含む変異体ＨｖＣｓｌＦ６タンパク質をコードする。
【０１５４】
穀物粒はまた、変異導入植物などの植物の子孫でもあり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使われる大麦粒は、基本的に生物学的プロセスにより得られるとは限らない大麦植物由来の穀粒である。技術的プロセスにより得られた大麦植物の子孫は、基本的に生物学的プロセスにより得られるとは限らないと本明細書では見なされる。理由は、親植物が技術的プロセスにより得られるためである。
【０１５５】
このような植物を得るための方法は、本出願と同じ出願者に譲渡され、同じ出願日を有する「Ｃｅｒｅａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」と題する同時係属出願に記載されている。
【０１５６】
重要なことに、本方法は、発芽の後のどの時点でもキルン乾燥のステップを必要としない、すなわち、発芽後に、発芽穀粒の粉砕または微粉化後に、または水性抽出物の作成後に、キルン乾燥が実施されない。従って、好ましい実施形態では、本方法は、例えば、醸造による、飲料の作製に使用できる穀物の水性抽出物を得るまでどの時点でもキルン乾燥のステップを含まない。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本方法により作製される、麦汁などの水性穀物抽出物中に含まれるアミノ酸のレベルは、キルン乾燥ステップを含む従来の方法により作製された、麦汁などの水性穀物抽出物中に含まれるアミノ酸のレベルと同等である。いくつかの実施形態では、本方法により作製された麦汁などの水性穀物抽出物中のアミノ酸のレベルは、６００〜２９００ｍｇ／Ｌなどの、７００〜２８００ｍｇ／Ｌなどの、８００〜２７００ｍｇ／Ｌなどの、９００〜２６００ｍｇ／Ｌなどの、１０００〜２５００ｍｇ／Ｌなどの、１１００〜２４００ｍｇ／Ｌなどの、１２００〜２２００ｍｇ／Ｌなどの、１３００〜２１００ｍｇ／Ｌなどの、１４００〜２０００ｍｇ／Ｌなどの、５００〜３０００ｍｇ／Ｌの範囲である。いくつかの実施形態では、本方法により作製された麦汁などの水性穀物抽出物中のアミノ酸のレベルは、少なくとも６００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも７００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも８００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも９００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも１０００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも１２５０ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも１５００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも１６００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも１７００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも１８００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも１９００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも２０００ｍｇ／Ｌなどの、少なくとも５００ｍｇ／Ｌである。アミノ酸のレベルは、麦汁などの水性穀物抽出物中の、例えば、本明細書で上記した発芽の２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後または１０８時間後に測定される、好ましくは発芽の４８時間〜１０８時間後に測定される総アミノ酸のレベルである。アミノ酸のレベルの測定方法は、当業者に既知である。
【０１５８】
本方法により作製された麦汁などの水性穀物抽出物中に存在する発酵性炭水化物のレベルは、キルン乾燥ステップを含む従来の方法により作製された、麦汁などの水性穀物抽出物中に存在する発酵性炭水化物のレベルに比べて不変であることが好ましい。いくつかの実施形態では、発酵性炭水化物のレベル（すなわち、全ての発酵性炭水化物の合計）は、６〜１９ｍｇ／１００ｍＬなどの、７〜１８ｍｇ／１００ｍＬなどの、８〜１７ｍｇ／１００ｍＬなどの、９〜１６ｍｇ／１００ｍＬなどの、１０〜１５ｍｇ／１００ｍＬなどの、１０〜１４ｍｇ／１００ｍＬなどの、１１〜１３ｍｇ／１００ｍＬなどの、約１２ｍｇ／１００ｍＬなどの、５〜２０ｍｇ／１００ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、本方法により作製された麦汁の発酵性炭水化物のレベルは、少なくとも６ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも７ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも８ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも９ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも１０ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも１１ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも１２ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも５ｍｇ／１００ｍＬである、またはそれを超える。発酵性炭水化物のレベルは、麦汁などの水性穀物抽出物中の、例えば、本明細書で上記した発芽の２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後または１０８時間後に測定される、好ましくは発芽の４８時間〜１０８時間後に測定される総発酵性炭水化物のレベルである。発酵性炭水化物のレベルの測定方法は、当業者に既知である。
【０１５９】
本方法により得られた麦汁などの水性穀物抽出物中の転化糖のレベルは、キルン乾燥ステップを含む従来の方法により得られた、麦汁などの水性穀物抽出物中のレベルに比べて不変であることが好ましい。いくつかの実施形態では、本方法により得られた麦汁などの水性穀物抽出物中の転化糖のレベルは、１．５〜４ｇ／１００ｍＬなどの、１．７５〜３．２５ｇ／１００ｍＬなどの、２〜３ｇ／１００ｍＬなどの、２．１〜２．９ｇ／１００ｍＬなどの、２．３〜２．８ｇ／１００ｍＬなどの、２．４〜２．７ｇ／１００ｍＬなどの、２．５〜２．６ｍｇ／１００ｍＬなどの、１〜５ｇ／１００ｍＬの範囲である。いくつかの実施形態では、転化糖のレベルは、少なくとも１．５ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも１．６ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも１．７ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも１．８ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも１．９ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも２．０ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも２．１ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも２．２ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも２．３ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも２．４ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも２．５ｍｇ／１００ｍＬなどの、少なくとも１ｍｇ／１００ｍＬである。転化糖のレベルは、麦汁などの水性穀物抽出物中の、例えば、本明細書で上記した発芽の２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後または１０８時間後に測定される、好ましくは発芽の４８時間〜１０８時間後に測定される総転化糖のレベルである。転化糖のレベルの測定方法は、当業者に既知である。
【０１６０】
飲料の作製
いくつかの実施形態では、本発明の方法はまた、本発明の上記方法により作製された水性抽出物を飲料へと処理するステップも含む。
【０１６１】
従って、一態様では、飲料を製造するための方法が提供され、上記方法は、
ｉ．次のステップ：
ａ）穀物の穀粒を用意するステップ；
ｂ）穀物粒を４８〜１０８時間にわたる発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップ；
ｃ）上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップ；および
ｄ）上記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップｂ）とｄ）の間のどの時点でも２０％未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ；
を含む方法により水性抽出物を作製し、それにより穀物の水性抽出物を得るステップ、
および
ｉｉ．上記水性抽出物を飲料へと処理するステップ、
を含む。
【０１６２】
水性抽出物は、ホップの含有または非含有下で煮沸され得、これはその後、煮沸麦汁と呼ばれることもある。
【０１６３】
第一、第二およびさらなる麦汁を混合し、その後、加熱または煮沸に供し得る。水性抽出物は、任意の好適な時間、例えば、６０分〜１２０分の範囲で加熱または煮沸され得る。加熱または煮沸中に、水性抽出物の体積は、蒸発のために低減され得る。水性抽出物の体積が８％未満、好ましくは５％未満だけ低減されることが好ましいであろう。これは、エネルギー消費を大きく低減し得る。
【０１６４】
飲料は、水性抽出物の発酵により、例えば、麦汁の発酵により作製され得る。従って、飲料は、酵母による水性抽出物の発酵により作製され得る。
【０１６５】
一実施形態では、飲料は、ビールなどのアルコール性飲料であり得る。他の実施形態では、飲料は、発芽穀物粒をベースにした非アルコール性飲料であり得る。非アルコール性飲料は、例えば、非アルコール性ビールまたはマルチナなどの他の種類の非アルコール性飲料であり得る。好ましくは、飲料は、クバス麦汁ではない。
【０１６６】
好ましい一実施形態では、飲料はビールである。従って、ビールは、例えば、アルトビール、アンバーエール、バーレイワイン、ベルリーナー・ヴァイセ、ビエールドギャルド、ビター、ブロンドエール、ボック、ブラウン・エール、カリフォルニアコモン、クリーム・エール、ドルトムンダー エクスポート、ドッペルボック、デュンケル、デュンケルバイツェン、アイスボック、フルーツランビック、ゴールデンエール、ゴーゼ、グーズ、ヘーフェヴァイツェン、ヘレス、インディア・ペールエール、ケルシュ、ランビック、ライトエール、マイボック、モルト・リカー、マイルド、メルツェンビア、オールドエール、オード・ブライン、ペールエール、ピルスナー、ポーター、レッドエール、ロッゲンビア 、セゾン、スコッチエール、スチームビール、スタウト、シュヴァルツビール、ラガー、ウィットビア、ヴァイスビアおよびヴァイツェンボックからなる群より選択され得る。本発明の好ましい実施形態では、ビールは、ラガービール、ペールエールまたはヴァイスビールなどの色の薄いビールである。本発明による水性抽出物は、キルン乾燥に供されていない発芽穀物粒から作製される。キルン乾燥されていない発芽穀物粒は通常、より色が薄く、従って、本発明の方法は、より薄い色のビールの作製に、特にラガービールの作製に特に有用である。黒っぽいビールはまた、例えば、「飲料の作製」のセクションに記載のようにマッシング中に１種または複数のキルン乾燥麦芽を加えることにより、本発明の方法により作製され得る。
【０１６７】
本発明はまた、下記ステップを含む飲料の製造方法にも関する：
−本発明の方法により水性抽出物を作製するステップ；
−上記抽出物を飲料へと処理するステップ。
【０１６８】
アルコール性飲料（ビールなど）は、本発明の方法に従って、発芽穀物粒から製造され得る。発芽穀物粒は、ホップおよび酵母に加え、ビールの風味および色に寄与する。
【０１６９】
水性抽出物が作製されると、それは、従来の醸造方法を含む任意の方法により、ビールへと処理され得る。好適な醸造方法の例の非限定的記載は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓら（１９８１）およびＨｏｕｇｈら（１９８２）による刊行物中で見つけることができる。多くの定期的に更新される大麦ビールおよびビール製品の分析方法は、例えば、限定されないが、米国穀物化学者学会（１９９５）、米国醸造化学者学会（１９９２）、欧州醸造学会（１９９８）、および英国醸造協会（１９９７）から入手できる。多くの特定の手順が特定の醸造所に採用され、現地の消費者の好みにより最も大きく変化することが認識されている。いずれかのこのようなビール製造方法を本発明で用い得る。
【０１７０】
水性抽出物からのビール製造の第１のステップは好ましくは、本明細書で上記したように上記水性抽出物を加熱すること、その後続いて、冷却および任意選択でワールプールレストを含む。１種または複数の追加の化合物、例えば、下記セクション「追加の化合物」に記載の１種または複数の追加の化合物、を水性抽出物に加えてもよい。冷却後に、水性抽出物を、酵母、例えば、ビール酵母または出芽酵母などの醸造酵母を含む発酵タンクに移し得る。水性抽出物は、任意の好適な期間、一般的には、１〜１０日間などの、１〜２０日間にわたり発酵され得る。発酵は、任意の有用な温度、例えば、１０〜２０℃の範囲の温度で実施される。方法はまた、１種または複数の酵素の追加を含み得、例えば、１種または複数の酵素が、発酵の前に、または発酵中に麦汁に添加され得る。特に、上記酵素は、プロリン特異的エンドプロテアーゼであり得る。プロリン−特異的エンドプロテアーゼの非限定的例は、ＤＳＭから入手可能な「Ｂｒｅｗｅｒ’ｓ  Ｃｌａｒｅｘ」である。他の実施形態では、方法中に外来性の酵素は添加されない。
【０１７１】
数日間の長さの発酵工程中に、糖はアルコールおよびＣＯ２に同時に転換され、いくつかの香味物質が発生する。任意の望ましい時間に、例えば、％Ｐのさらなる低下が観察されなくなると、発酵を終了させ得る。
【０１７２】
その後、ビールは、さらに処理され、例えば、冷却され得る。それはまた、濾過されおよび／またはラガーにするため貯蔵され得る−−この工程で、酵母様香味の少ない、心地よい香りが発生する。添加物をさらに添加してもよい。さらに、ＣＯ２を添加し得る。最終的に、ビールは、低温殺菌および／または濾過された後に、包装され得る（例えば、容器またはビア樽に移される、瓶詰、または缶詰にされる）。ビールはまた、標準的な方法で低温殺菌され得る。
【０１７３】
本発明の方法で製造されたビールは通常、口当たりのよい味を有し、渋みがないか、またはわずかな渋みのみを有する。味は、例えば、専門家によるビール試飲パネルにより分析され得る。
【０１７４】
飲料
本発明の方法による水性抽出物を処理することにより飲料へと作製された飲料は、限定されないが、このセクションで記載の特性を含む、多くの有用な特性を有し得る。
【０１７５】
本発明による飲料は可能な限り少ないジアセチルを含むことが通常望ましい。従って、飲料はジアセチルをラガービール中の異臭と考えられる閾値未満のレベルで含むことが好ましいであろう。好ましくは、飲料は、多くても３０ｐｐｂのジアセチル、より好ましくは多くても２５ｐｐｂのジアセチル、さらにより好ましくは多くても２０ｂｂｐのジアセチルを含む。これは、特に、飲料がビール、例えば、ラガービールである場合に該当する。
【０１７６】
本発明による飲料は、例えば、任意選択で発酵させた、本明細書に記載の水性抽出物であり得る。従って、飲料は、上記水性抽出物または発酵水性抽出物、および任意選択で、１種または複数の追加の化合物を含むかまたはこれらからなる。上記追加の化合物は、例えば、本明細書の下記セクション「追加の化合物」に記載のいずれかの追加の化合物であり得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本方法により得られるビールなどの飲料の特性は、キルン乾燥のステップを含む従来の方法により得られるビールなどの飲料の特性と基本的に類似している。飲料は、フレッシュビールであり、すなわち、特性が製造直後に決定されるビール、または所与の期間貯蔵されているビールであり得る。このような特性は、アルコールレベル、真性発酵度（ＲＤＦ）、ｐＨ、発泡、所望の化合物のレベルおよび／または望ましくない化合物（例えば、アセトアルデヒド、酢酸エチル、酢酸イソブチル、プロパノール、酢酸イソアミ、イソアミルアルコール、トランス−２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）、ストレッカーアルデヒド、２−メチルプロパノール、２−メチルブタノール、３−メチルブタノール、フェニルアセトアルデヒド、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ））のレベルのいずれか１つまたは複数であり得る。特性は、例えば、本明細書で上記した発芽の２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後または１０８時間後に測定される、好ましくは発芽の４８時間〜１０８時間後に測定される特性であり得る。
【０１７８】
特に、本方法により得られるビールなどの飲料中の貯蔵前および／または貯蔵後のＴ２Ｎのレベルは、キルン乾燥を含む従来の方法により得られるビールなどの飲料中のＴ２Ｎのレベルと類似している。特に、Ｔ２Ｎのレベルは、０．０５ｍｇ／ｌである、感覚閾値未満である。従って、本方法により作製されるビール中の貯蔵前および／または貯蔵後のＴ２Ｎのレベルは、例えば、３７℃、２週間の貯蔵後で、０．０９ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０８ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０７ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０６ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０５ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０４ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０３ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０２ｍｇ／Ｌ未満などの、約０．０１ｍｇ／Ｌ以下などの、１ｍｇ／Ｌ未満である。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、本方法により得られるビールなどの飲料中のストレッカーアルデヒドのレベルは、貯蔵前および／またはその後で、キルン乾燥を含む従来の方法により得られるビールなどの飲料中のストレッカーアルデヒドのレベルと類似している。いくつかの実施形態では、ストレッカーアルデヒドのレベルは、６〜２４ｍｇ／Ｌなどの、７〜２３ｍｇ／Ｌなどの、８〜２２ｍｇ／Ｌなどの、９〜２１ｍｇ／Ｌなどの、１０〜２０ｍｇ／Ｌなどの、５〜２５ｍｇ／Ｌである。好ましくは、ストレッカーアルデヒドのレベルは、２４ｍｇ／Ｌ未満などの、２３ｍｇ／Ｌ未満などの、２２ｍｇ／Ｌ未満などの、２１ｍｇ／Ｌ未満などの、２０ｍｇ／Ｌ未満などの、２５ｍｇ／Ｌ未満である。
【０１８０】
追加の化合物
本発明の方法は、１種または複数の追加の化合物を加えるステップを含み得る。上記追加の化合物は、例えば、風味化合物、保存剤、機能性成分、染料、甘味剤、ｐＨ調整剤または塩であり得る。ｐＨ調整剤は、例えば、緩衝剤またはリン酸などの酸であり得る。
【０１８１】
機能性成分は、所与の機能を得るために添加される任意の成分であり得る。好ましくは、機能性成分は、飲料をより健康によいものにする。機能性成分の非限定例としては、ビタミンまたはミネラルが挙げられる。
【０１８２】
保存剤は、任意の食品等級保存剤であり得、例えば、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸塩（例えば、ソルビン酸カリウム）、亜硫酸塩および／またはその塩であり得る。
【０１８３】
追加の化合物はまた、ＣＯ２であり得る。特に、ＣＯ２は炭酸飲料を得るために添加され得る。
【０１８４】
本発明で使用される香味化合物は、任意の有用な香味化合物であり得る。香味化合物は、例えば、芳香剤、植物抽出物、植物濃縮物、植物部分およびハーブ浸剤からなる群より選択され得る。特に、風味化合物はホップであり得る。
【０１８５】
配列
＞配列番号１、セルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６配列（ジェンバンク番号ＮＣＢＩ：ＥＵ２６７１８１．１に基づく）
ＭＡＰＡＶＡＧＧＧＲＶＲＳＮＥＰＶＡＡＡＡＡＡＰＡＡＳＧＫＰＣＶＣＧＦＱＶＣＡＣＴＧＳＡＡＶＡＳＡＡＳＳＬＤＭＤＩＶＡＭＧＱＩＧＡＶＮＤＥＳＷＶＧＶＥＬＧＥＤＧＥＴＤＥＳＧＡＡＶＤＤＲＰＶＦＲＴＥＫＩＫＧＶＬＬＨＰＹＲＶＬＩＦＶＲＬＩＡＦＴＬＦＶＩＷＲＩＳＨＫＮＰＤＡＭＷＬＷＶＴＳＩＣＧＥＦＷＦＧＦＳＷＬＬＤＱＬＰＫＬＮＰＩＮＲＶＰＤＬＡＶＬＲＱＲＦＤＲＰＤＧＴＳＴＬＰＧＬＤＩＦＶＴＴＡＤＰＩＫＥＰＩＬＳＴＡＮＳＶＬＳＩＬＡＡＤＹＰＶＤＲＮＴＣＹＶＳＤＤＳＧＭＬＬＴＹＥＡＬＡＥＳＳＫＦＡＴＬＷＶＰＦＣＲＫＨＧＩＥＰＲＧＰＥＳＹＦＥＬＫＳＨＰＹＭＧＲＡＱＤＥＦＶＮＤＲＲＲＶＲＫＥＹＤＥＦＫＡＲＩＮＳＬＥＨＤＩＫＱＲＮＤＧＹＮＡＡＩＡＨＳＱＧＶＰＲＰＴＷＭＡＤＧＴＱＷＥＧＴＷＶＤＡＳＥＮＨＲＲＧＤＨＡＧＩＶＬＶＬＬＮＨＰＳＨＲＲＱＴＧＰＰＡＳＡＤＮＰＬＤＬＳＧＶＤＶＲＬＰＭＬＶＹＶＳＲＥＫＲＰＧＨＤＨＱＫＫＡＧＡＭＮＡＬＴＲＡＳＡＬＬＳＮＳＰＦＩＬＮＬＤＣＤＨＹＩＮＮＳＱＡＬＲＡＧＩＣＦＭＶＧＲＤＳＤＴＶＡＦＶＱＦＰＱＲＦＥＧＶＤＰＴＤＬＹＡＮＨＮＲＩＦＦＤＧＴＬＲＡＬＤＧＭＱＧＰＩＹＶＧＴＧＣＬＦＲＲＩＴＶＹＧＦＤＰＰＲＩＮＶＧＧＰＣＦＰＲＬＡＧＬＦＡＫＴＫＹＥＫＰＧＬＥＭＴＴＡＫＡＫＡＡＰＶＰＡＫＧＫＨＧＦＬＰＬＰＫＫＴＹＧＫＳＤＡＦＶＤＴＩＰＲＡＳＨＰＳＰＹＡＡＡＡＥＧＩＶＡＤＥＡＴＩＶＥＡＶＮＶＴＡＡＡＦＥＫＫＴＧＷＧＫＥＩＧＷＶＹＤＴＶＴＥＤＶＶＴＧＹＲＭＨＩＫＧＷＲＳＲＹＣＳＩＹＰＨＡＦＩＧＴＡＰＩＮＬＴＥＲＬＦＱＶＬＲＷＳＴＧＳＬＥＩＦＦＳＫＮＮＰＬＦＧＳＴＹＬＨＰＬＱＲＶＡＹＩＮＩＴＴＹＰＦＴＡＩＦＬＩＦＹＴＴＶＰＡＬＳＦＶＴＧＨＦＩＶＱＲＰＴＴＭＦＹＶＹＬＧＩＶＬＳＴＬＬＶＩＡＶＬＥＶＫＷＡＧＶＴＶＦＥＷＦＲＮＧＱＦＷＭＴＡＳＣＳＡＹＬＡＡＶＣＱＶＬＴＫＶＩＦＲＲＤＩＳＦＫＬＴＳＫＬＰＳＧＤＥＫＫＤＰＹＡＤＬＹＶＶＲＷＴＰＬＭＩＴＰＩＩＩＩＦＶＮＩＩＧＳＡＶＡＦＡＫＶＬＤＧＥＷＴＨＷＬＫＶＡＧＧＶＦＦＮＦＷＶＬＦＨＬＹＰＦＡＫＧＩＬＧＫＨＧＫＴＰＶＶＶＬＶＷＷＡＦＴＦＶＩＴＡＶＬＹＩＮＩＰＨＭＨＴＳＧＧＫＨＴＴＶＨＧＨＨＧＫＫＬＶＤＴＧＬＹＧＷＬＨ
＞配列番号２：Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅセルロースシンターゼ様ＣｓｌＦ６（ＣｓｌＦ６）、全コード領域（ジェンバンク番号ＮＣＢＩ：ＥＵ２６７１８１．１に基づく）
ＡＴＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＧＣＣＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＧＣＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＴＴＧＣＧＣＣＴＧＣＡＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＴＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＡＴＣＧＧＣＧＣＣＧＴＣＡＡＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＣＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＡＧＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＴＴＧＡＣＧＡＣＣＧＣＣＣＣＧＴＡＴＴＣＣＧＣＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＡＣＣＧＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＴＣＴＧＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＴＴＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＣＧＴＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＣＧＣＧＡＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＧＧＴＴＴＣＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＡＧＡＴＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＧＣＧＴＧＣＣＧＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＴＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＣＣＣＧＴＧＧＡＣＣＧＣＡＡＣＡＣＡＴＧＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＧＡＣＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＣＡＣＣＴＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＡＧＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＧＣＣＡＣＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＡＧＣＴＡＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＴＡＣＡＴＧＧＧＧＡＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＣＧＡＧＴＴＣＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＴＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＣＧＡＣＧＧＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＡＴＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＣＧＴＧＣＣＣＣＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＧＡＧＧＧＣＡＣＡＴＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＡＣＣＡＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＧＣＴＧＡＣＡＡＣＣＣＡＣＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＴＧＴＧＣＧＴＣＴＣＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＣＣＣＧＴＧＡＧＡＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＡＣＧＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＣＧＧＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＧＣＧＣＴＴＡＣＣＣＧＣＧＣＣＴＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＣＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＡＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＴＣＧＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＡＣＧＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＧＧＴＴＧＣＣＴＴＣＧＴＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＣＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＧＧＣＡＴＧＣＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧＣＣＧＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＴＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＣＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＴＣＡＡＣＧＴＣＧＧＣＧＧＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＣＧＣＣＧＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＧＣＣＣＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＡＧＧＧＴＡＡＧＣＡＣＧＧＣＴＴＣＴＴＧＣＣＡＣＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＴＡＣＧＧＣＡＡＧＴＣＧＧＡＣＧＣＣＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＧＣＧＣＧＣＧＴＣＧＣＡＣＣＣＧＴＣＧＣＣＣＴＡＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＡＧＧＧＧＡＴＣＧＴＧＧＣＣＧＡＣＧＡＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＧＴＣＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＧＧＣＴＧＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＧＧＡＴＧＣＡＴＡＴＣＡＡＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＣＡＣＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＴＡＣＣＣＡＣＡＣＧＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＣＧＣＴＧＧＴＣＣＡＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＣＣＣＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＣＧＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＡＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧＧＣＧＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＴＣＡＣＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＧＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＴＡＣＧＴＣＴＡＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＧＴＧＣＴＡＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＧＡＧＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＴＣＣＧＧＣＧＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＧＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＣＴＣＴＡＣＧＴＧＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＧＴＴＣＴＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴＧＧＡＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＡＡＧＧＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＴＡＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＧＧＡＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＣＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＴＡＣＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＡＣＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＧＴＣＧＡＣＡＣＡＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡ
【表２】
2021508481.tif 000003
【０１８６】
項目
本発明は、下記の項目によりさらに記載され得る：
１．穀物の水性抽出物を製造するための方法であって、上記方法は、
ａ）穀物の穀粒を用意するステップ；
ｂ）穀物粒を４８〜１０８時間にわたる発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップ；
ｃ）上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップｂ）とｃ）の間のどの時点でも２０％未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ；および
ｄ）上記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップ
を含み、
それにより穀物の水性抽出物を製造する。
２．穀物の水性抽出物を製造するための方法であって、上記方法は、
ａ）穀物の穀粒を用意するステップ；
ｂ）穀物粒を４８〜１０８時間にわたる発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップ；
ｃ）上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも２０％の含水量を有するステップ；および
ｄ）上記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップｂ）とｄ）の間のどの時点でも２０％未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ；
を含み、それにより穀物の水性抽出物を製造する。
３．項目１または２に記載の方法であって、発芽の全ステップが９６時間を超えない、方法。
４．項目１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、発芽のステップが、約９６時間などの７２〜１０８時間の範囲で実施される、方法。
５．項目１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、発芽のステップが、約７２時間などの６５〜８０時間の範囲で実施される、方法。
６．項目１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、発芽の期間が発芽の開始から測定される、方法。
７．項目１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、発芽がステップｃの開始により終結される、方法。
８．項目１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、発芽が、１０〜３０℃、例えば、１０〜２５℃の範囲の温度で実施される、方法。
９．項目１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、発芽が、最後の浸麦ステップ後に穀物粒が少なくとも３５％などの少なくとも３０％、例えば、少なくとも４５％などの少なくとも４０％の含水量を有するまで実施される１つまたは複数の浸麦ステップを含む、方法。
１０．項目１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、発芽穀物粒が、上記穀物粒を微粉砕する時点で、少なくとも２０％、例えば、３０％以上などの２５％以上、好ましくは３５％以上、さらにより好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは４５％以上の含水量を有する、方法。
１１．項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、発芽穀物粒が、発芽ステップの完了と上記穀物粒を微粉砕する時点の間のどの時点でも、２０％未満の含水量をもたず、例えば、３０％以上などの２５％以上、好ましくは３５％以上、さらにより好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは４５％以上の含水量を有する、方法。
１２．項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、発芽のステップが少なくとも部分的に通気下で実施される、方法。
１３．項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、発芽のステップが湿潤条件下で穀物粒をインキュベーションすることにより穀物粒を浸麦するステップを含む、方法。
１４．項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、発芽のステップが通気下で水溶液中に穀物粒を浸漬するステップを含まない、方法。
１５．項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、ステップａ）で用意される穀粒が抗菌薬で処理されている、方法。
１６．項目１５に記載の方法であって、抗菌薬が過酸化水素などの過酸化物である、方法。
１７．項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、発芽穀粒が、１００ｇの発芽穀物粒（乾燥物）当たり多くても８ｇなどの多くても１０ｇ、例えば、多くても６ｇ、好ましくは多くても４ｇ（乾燥物）の細根を含む、方法。
１８．項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、発芽穀粒が、１００ｇの発芽穀物粒（乾燥物）当たり、多くても６ｇ（乾燥物）の細根を含む、方法。
１９．項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、細根除去のステップを含まない、方法。
２０．項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、穀物が外皮を持つ穀物、例えば、皮麦である、方法。
２１．項目２０に記載の方法であって、発芽の開始前に、少なくとも一部の上記外皮を取り除くステップを含む、方法。
２２．項目２１に記載の方法であって、上記外皮の除去が、穀物粒の合計重量の少なくとも２％の減少などの少なくとも１％の減少、例えば、３〜６％の範囲などの２〜７％の範囲の減少をもたらす、方法。
２３．項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、穀物が外皮のない穀物、例えば、小麦または裸麦である、方法。
２４．項目１〜２３のいずれか１項に記載の方法であって、穀物が大麦である、方法。
２５．項目２４に記載の方法であって、大麦が裸麦または薄い外皮を有する大麦変種である、方法。
２６．項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法であって、穀物が、穀粒中の低β−グルカンレベルを特徴とする大麦である、方法。
２７．項目２６に記載の方法であって、穀粒中のβ−グルカンレベルが、乾燥重量基準で、１〜５％の範囲などの多くても５％ｗ／ｗである、方法。
２８．項目２６に記載の方法であって、穀粒中のβ−グルカンレベルが、乾燥重量基準で、１〜３％の範囲などの多くても３％ｗ／ｗである、方法。
２９．項目２４〜２８のいずれか１項に記載の方法であって、大麦が、β−グルカンシンターゼをコードする遺伝子中に変異を有することを特徴とする、方法。
３０．項目２４〜２８のいずれか１項に記載の方法であって、大麦が、ＣｓｌＦ６をコードする遺伝子中に変異を有することを特徴とする、方法。
３１．項目３０に記載の方法であって、上記大麦植物の穀粒が、野生型ＣｓｌＦ６遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物のβ−グルカンの含量の、少なくとも３０％で最大で６０％などの多くても６０％、例えば、少なくとも４０％で最大で６０％のβ−グルカン含量を有する、方法。
３２．項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法であって、穀物が、以下の：
Ａ．ＬＯＸ−１をコードする遺伝子中に変異を有すること；
Ｂ．ＬＯＸ−２をコードする遺伝子中に変異を有すること；
Ｃ．ＭＭＴをコードする遺伝子中に変異を有すること；および／または
Ｄ．発芽中に増大したα−アミラーゼ活性をもたらす変異、例えば、ＤＥＬＬＡをコードする遺伝子中に変異を有すること、
の１つまたは複数を特徴とする大麦である、方法。
３３．項目１〜３２のいずれか１項に記載の方法であって、発芽穀粒が、乾燥重量基準で少なくとも５０Ｕ／ｇなどの少なくとも３０Ｕ／ｇ、好ましくは、例えば、少なくとも１００Ｕ／ｇ穀物粒のα−アミラーゼ活性を有する、方法。
３４．項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法であって、発芽穀粒が、乾燥重量基準で少なくとも５Ｕ／ｇ、好ましくは、少なくとも１０Ｕ／ｇ穀物粒のβ−アミラーゼ活性を有する、方法。
３５．項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法であって、発芽穀粒が、乾燥重量基準で少なくとも１０ｍＵ／ｇなどの少なくとも２ｍＵ／ｇ、好ましくは少なくとも２０ｍＵ／ｇの穀物粒の限界デキストリナーゼ活性を有する、方法。
３６．項目１〜３５のいずれか１項に記載の方法であって、発芽穀粒が、乾燥重量基準で、５％未満、例えば、２％ｗ／ｗ未満などの３％ｗ／ｗ未満、例えば、１．５％ｗ／ｗ、好ましくは１．０％ｗ／ｗ未満のβ−グルカン含量を有する、方法。
３７．項目１〜３６のいずれか１項に記載の方法であって、ステップＣが、上記微粉化穀粒をマッシング溶液と共に、５０〜８０℃の範囲でマッシングするステップを含む、方法。
３８．項目３７に記載の方法であって、上記マッシングが１種または複数の添加された加水分解酵素の存在下で実施される、方法。
３９．項目３８に記載の方法であって、少なくとも１種の加水分解酵素が、限定されないが、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、限界デキストリナーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、キシラナーゼ、グルコアミラーゼおよびプロテアーゼを含む、細胞壁およびデンプン分解酵素からなる群より選択される、方法。
４０．項目３７〜３９のいずれか１項に記載の方法であって、上記マッシングが少なくとも１種のβ−グルカナーゼおよび少なくとも１種のキシラナーゼの存在下で実施される、方法。
４１．項目３７〜４０のいずれか１項に記載の方法であって、１ｇの発芽穀物粒（乾燥重量）当たり、多くても７００Ｕ、好ましくは、多くても３５０Ｕの外来性のグルコアミラーゼおよび／またはα−アミラーゼが上記マッシング中に加えられる、方法。
４２．項目３７〜４１のいずれか１項に記載の方法であって、１ｇの発芽穀物粒（乾燥重量）当たり、多くても１００ＰＵＮの外来性プルラナーゼが上記マッシング中に加えられる、方法。
４３．項目３７〜４２のいずれか１項に記載の方法であって、穀物が穀粒中の低β−グルカンレベルを特徴とし、マッシング中にβ−グルカナーゼが添加されない、方法。
４４．項目１〜４３のいずれか１項に記載の方法であって、上記水性抽出物を濾過するステップをさらに含む、方法。
４５．項目１〜４４のいずれか１項に記載の方法であって、水性抽出物が、６００〜２９００ｍｇ／Ｌなどの、７００〜２８００ｍｇ／Ｌなどの、８００〜２７００ｍｇ／Ｌなどの、９００〜２６００ｍｇ／Ｌなどの、１０００〜２５００ｍｇ／Ｌなどの、１１００〜２４００ｍｇ／Ｌなどの、１２００〜２２００ｍｇ／Ｌなどの、１３００〜２１００ｍｇ／Ｌなどの、１４００〜２０００ｍｇ／Ｌなどの、５００〜３０００ｍｇ／Ｌの範囲のアミノ酸のレベルを有する、方法。
４６．項目１〜４５のいずれか１項に記載の方法であって、水性抽出物が、６〜１９ｍｇ／１００ｍＬなどの、７〜１８ｍｇ／１００ｍＬなどの、８〜１７ｍｇ／１００ｍＬなどの、９〜１６ｍｇ／１００ｍＬなどの、１０〜１５ｍｇ／１００ｍＬなどの、１０〜１４ｍｇ／１００ｍＬなどの、１１〜１３ｍｇ／１００ｍＬなどの、約１２ｍｇ／１００ｍＬなどの、５〜２０ｍｇ／１００ｍＬの範囲の発酵性炭水化物のレベルを有する、方法。
４７．項目１〜４６のいずれか１項に記載の方法であって、水性抽出物が、１．５〜４ｇ／１００ｍＬなどの、１．７５〜３．２５ｇ／１００ｍＬなどの、２〜３ｇ／１００ｍＬなどの、２．１〜２．９ｇ／１００ｍＬなどの、２．３〜２．８ｇ／１００ｍＬなどの、２．４〜２．７ｇ／１００ｍＬなどの、２．５〜２．６ｇ／１００ｍＬなどの、１〜５ｇ／１００ｍＬの範囲の転化糖のレベルを有する、方法。
４８．項目１〜４７のいずれか１項に記載の方法であって、キルン乾燥のステップを含まない、好ましくは、ステップＤの前のどの時点でもキルン乾燥のステップを含まない、方法。
４９．項目１〜４８のいずれか１項に記載の方法であって、穀物粒をシュレッディングするステップを含まず、シュレッディングされた発芽穀物粒からペレットを形成するステップを含む、方法。
５０．飲料を製造するための方法であって、
ｉ．項目１〜４９のいずれか１項に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ；
ｉｉ．上記抽出物を飲料へと処理するステップ、
を含む方法。
５１．項目５０に記載の方法であって、ステップｉｉ．が、
ｅ）上記水性抽出物を、任意選択で、ホップまたはホップ抽出物の存在下で加熱するステップ；
ｆ）水性抽出物を冷却するステップ；
ｇ）上記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより発酵飲料を製造するステップ、を含む、方法。
５２．項目５０に記載の方法であって、ステップｅ）またはステップｆ）後に実施される沈殿のステップをさらに含む、方法。
５３．項目５０〜５２のいずれか１項に記載の方法であって、飲料がビールである、方法。
５４．項目５０〜５３のいずれか１項に記載の方法であって、飲料が、例えば、ラガービール、ペールエールおよび小麦ビールからなる群より選択される、色の薄いビールである、方法。
５５．項目５０〜５４のいずれか１項に記載の方法であって、飲料がラガービールである、方法。
５６．項目５０〜５５のいずれか１項に記載の方法であって、飲料が、０．０９ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０８ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０７ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０６ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０５ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０４ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０３ｍｇ／Ｌ未満などの、０．０２ｍｇ／Ｌ未満などの、約０．０１ｍｇ／Ｌ以下などの、１ｍｇ／Ｌ未満のＴ２Ｎのレベルを有する、方法。
５７．項目５０〜５６のいずれか１項に記載の方法であって、飲料が、６〜２４ｍｇ／Ｌなどの、７〜２３ｍｇ／Ｌなどの、８〜２２ｍｇ／Ｌなどの、９〜２１ｍｇ／Ｌなどの、１０〜２０ｍｇ／Ｌなどの、５〜２５ｍｇ／Ｌのストレッカーアルデヒドのレベルを有する、方法。
５８．項目５０〜５７のいずれか１項に記載の方法であって、ステップｉ．がキルン乾燥のステップを含まない、方法。
【０１８７】
実施例
実施例１：マイクロ製麦
各５０ｇの大麦試料を３回繰り返して処理した。ステンレス鋼ビーカー中に置いた試料を、図１に示したスキームに従って、強制的浸漬として最初の日に約７時間、２日目に３時間および３日目に１時間１５℃の淡水中で浸漬させ、各浸漬の終わりに、それぞれ、３５％、４０％および４５％の含水量に達するようにした。各浸麦後に、試料を含むステンレス鋼ビーカーを１５℃の発芽ボックスに移動し、工程の次のステップまでそこに保持した。浸麦水の最後の廃液時に、試料を発芽ボックス中で１２０時間（３〜７日間）保持し、４５％の水に平衡化し、呼吸水の減少を克服するために、噴霧した。発芽工程の終わりに（７日目）、試料をＴｅｒｍａｋｓインキュベーター中のステンレス鋼ボックスで２１日間、次の昇温プログラムを用いてキルン乾燥した：
２５℃〜５５℃（２℃／時間）
５５℃〜８５℃（４℃／時間）
８５℃で１．５時間。
【０１８８】
発芽およびキルン乾燥のステップを、８０％の新鮮な空気による再循環空気流を用いて実施した。
【０１８９】
それぞれのマイクロ製麦日の終わりに、試料を３回の反復分析用に収集し、４８時間凍結乾燥した。
【０１９０】
２種の大麦系統、１つは通常の大麦系統栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎ（参照）および１つは低いβ−グルカン含量を有する大麦系統（変異体）、をこの発芽工程を用いて試験した。 低β−グルカン含量を有する大麦系統は、栽培品種Ｐａｕｓｔｉａｎの大麦植物であり、これは、位置７４８でＧｌｙ→Ａｓｐ変異を有する変異体ＣｓｌＦ６ポリペプチドをコードする変異体ＣｓｌＦ６遺伝子をもたらす、ＣｓｌＦ６遺伝子中の変異を有する。大麦ＣｓｌＦ６ポリペプチドの野生型配列（配列番号１）は、ジェンバンクデータベースのＮＣＢＩ受入番号ＥＵ２６７１８１．１により入手可能である。
【０１９１】
実施例２：水吸収
発芽の最初の６時間中の水吸収速度を、表面水を除くためのビーカーの急速遠心分離後に出発重量に比べた穀物粒の正確な重量差異を測定することにより決定した。
【０１９２】
結果：
最初の６時間の浸漬中の変異体の水吸収は、参照よりわずかに速いように見えた（図２）。
【０１９３】
実施例３：根の成長
発芽大麦の試料を、実施例１に記載のように、各発芽日後に凍結乾燥した。凍結乾燥試料を秤量し、形成された細根を手で取り除き、発芽大麦を再度秤量した。根の成長を、処理前後の重量％として計算した。
【０１９４】
結果：
変異体および参照の根の成長は、製麦期間を通して同様であったが、焙燥されたモルトに比べて、４日目に顕著に低かった。
【０１９５】
実施例４：製麦中の加水分解酵素をコードする遺伝子の発現
ＲＮＡ単離：
各試料に対し、２個の金属ボールを含む２ｍＬのエッペンドルフチューブを作製した。約８０ｍｇの凍結乾燥粉末を、金属ボール含有エッペンドルフチューブ中に秤取した。試料を１００μＬのＲＮアーゼ不含水で予め濡らし、続いて、１ｍＬのＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔを加えた。その後、試料を強く震盪させた。室温での５分のインキュベーション後に、試料を１２，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を２ｍＬのフェーズロックチューブ（遠心沈降３０秒、Ｑｉａｇｅｎ＃１２９０５６）中にデカントし、０．２ｍＬのクロロホルムを加えた。チューブを手で１０〜１５秒間強く浸透させて、クロロホルムおよびＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔを混合した。試料を室温で５〜１５分間インキュベーションした後、１２，０００ｘｇ、４℃で５分間遠心分離した。試料の水相を新しいエッペンドルフチューブ中にデカントし、５００μＬの２−プロパノールを加えた。ＲＮＡを冷凍庫中で一晩沈殿させた。試料を１２，０００ｘｇ、４℃で５分間インキュベーションし、イソプロパノールの上清を除去した。ＲＮＡの浄化のために、ペレットを、Ａｕｒｕｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡミニキット（ＢｉｏＲａｄ  ＃７３２６８２０）の３５０μＬのリシスバッファー中に直接再懸濁させた。３５０μＬの７０％エタノールを加えて、ＲＮＡを再沈殿させた。溶液を２ｍＬのキャップレス洗浄剤チューブ中（キット中に提供される）に置かれたＲＮＡ結合カラムに移し、３０秒間遠心分離した。ＲＮＡ結合カラムを取り出し、濾液を廃棄した。７００μＬの低厳密性洗浄溶液をＲＮＡ結合カラムに加え、３０秒間遠心分離した。低厳密性洗浄溶液をチューブから廃棄し、結合カラムを同じ洗浄チューブ中に再度置いた。
【０１９６】
オンカラムＤＮアーゼ処理：
提供された凍結乾燥したＤＮアーゼＩを、提供されたマニュアル（Ｂｉｏｒａｄ  Ａｕｒｕｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡミニキット＃７３２６８２０）に従い２５０μＬの１０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．５をバイアルに加えピペッティングによる下層での吸引と上層での吐出により混合することにより再構成した。８０μＬの希釈したＤＮアーゼＩを各カラムの底部にある膜スタックに加え、室温で１５分間消化させた。７００μＬの高厳密性洗浄溶液をＲＮＡ結合カラムに加え、３０秒間遠心分離した。濾液を廃棄し、カラムを同じ洗浄チューブ中に再度置いた。７００μＬの低厳密性洗浄溶液をＲＮＡ結合カラムに加え、３０秒間遠心分離した。濾液を廃棄し、カラムを同じ洗浄チューブ中に再度置いた。洗浄チューブおよびカラムを追加の２分間遠心分離して、残留物洗浄溶液を除去した。ＲＮＡ結合カラムを１．５ｍＬのキャップ付き微量遠心機チューブに移し、８０μＬの溶出緩衝液をＲＮＡ結合カラムの底部の膜スタックに加えた。溶液で膜を１分間飽和させた後、２分間遠心分離して総ＲＮＡを溶出させた。最後に、ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により定量した。
【０１９７】
ｃＤＮＡ合成およびｄｄＰＣＲの準備：
ｃＤＮＡを、ＢｉｏＲａｄのｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（＃１７０８８９１）を用いて合成した。ｃＤＮＡ合成に先立ち、総ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で推定し、ＲＮアーゼ不含水で５０ｎｇ／μＬに正規化した。ｃＤＮＡ合成では、２００ｎｇのＲＮＡを次のプロトコルに従い用いた：
【表３】
2021508481.tif 000004
【０１９８】
ＮｏＲＴ対照試料では、逆転写酵素（ＲＴ）の代わりに水を加えた。全て揃った反応混合物を次のプロトコルによりサーマルサイクラー中でインキュベーションした：
【表４】
2021508481.tif 000005
【０１９９】
ｄｄＰＣＲ分析では、各試料を、目的の遺伝子ならびに１つの参照遺伝子について分析した。ｄｄＰＣＲを、ＢｉｏＲａｄのＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  ＧｅｎｅｒａｔｏｒおよびＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒを用いて製造業者の説明書に従い実施した。ここでは、発芽中に安定に発現される、細胞質ゾルのピルビン酸キナーゼファミリータンパク質のＨＯＲＶＵ５Ｈｒ１Ｇ０４１１２０を参照遺伝子として用いた。セクション「配列」中の上表２は、プライマーおよびプローブの詳細を提供する。
分析の前に、ｃＤＮＡを水中で２０倍に希釈し、各反応混合物を次のプロトコルに従い準備した：
【表５】
2021508481.tif 000006
【０２００】
試料を９６ウェルプレート中でよく混合し、４０００ｒｐｍで１分間遠心分離した後、ドロップレットを発生させた（ＢｉｏＲａｄ  ＱＸ２００（商標）Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）。ドロップレットプレートを、次のプログラムに従いサーマルサイクラーでインキュベーションした。
【表６】
2021508481.tif 000007
【０２０１】
ＦＡＭおよびＨＥＸ陽性ドロップレットの存在を、ＢｉｏＲａｄ  ＱＸ２００（商標）ドロップレットリーダーで検出し、ＢｉｏＲａｄのＱｕａｎｔａｓｏｆｔソフトウエアを用いて解析した。２Ｄプロットで閾値を手動で設定し、濃度値をその後、エクセルに送り選択した参照遺伝子に対し正規化した。
【０２０２】
結果：
選択遺伝子の発現；アミラーゼ（ＡＭＹ１）、（１−３；１−４）−β−グルカン（ＢＧＬ２）、高ｐＩのα−グルコシダーゼ（ＡＧＬ９７）およびお限界デキストリナーゼ（ＬＤ）を、ｄｄＰＣＲを用いて分析した。ＡＧＬ９７は、２日目で既に最高レベルで発現したが、他の３種の遺伝子は４日目に最大発現を示した（図４）。変異体および参照大麦系統の両方は、選択遺伝子の類似の発現パターンを示し、（１−３；１−４）−β−グルカン分解酵素をコードする遺伝子の低（１−３；１−４）−β−グルカン変異体中での最適発現を立証している。
【０２０３】
実施例５：麦芽試料中の加水分解酵素活性
酵素活性分析の前に、発芽試料をタングステンカーバイド粉砕リング（Ｆｏｓｓ１０００４４６３）、ニッケルメッキインペラ（Ｆｏｓｓ１０００２６６６）および１ｍｍの出口スクリーン（Ｆｏｓｓ１０００１９８９）を備えた標準的Ｆｏｓｓ  Ｃｙｃｌｏｔｅｃｈミルを用いて粉砕した。大麦麦芽の酵素活性の全ての測定は、乾燥試料の粉砕後４８時間以内に行われた。α−アミラーゼ活性アッセイは、標準的実験装置を用いてＭｅｇａｚｙｍｅのＣｅｒａｌｐｈａ  ｋｉｔ（Ｋ−ＣＥＲＡ）を使用して測定した。アミラーゼアッセイは、製造業者のプロトコル（Ｋ−ＣＥＲＡ  ０１／１２）に従って実施した。アミラーゼ活性の計算は、Ｍｅｇａｚｙｍｅプロトコル（Ｋ−ＣＥＲＡ  ０１／１２）中の式に基づいた。β−アミラーゼ活性アッセイは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ標準的実験装置を用いるＭｅｇａｚｙｍｅのＢｅｔａｍｙｌ  ｋｉｔ（Ｋ−ＢＥＴＡ３）を使用して測定した。アミラーゼアッセイは、製造業者のプロトコル（Ｋ−ＢＥＴＡ３  １０／１０）に従って実施した。β−アミラーゼ活性の計算は、Ｍｅｇａｚｙｍｅプロトコル（Ｋ−ＢＥＴＡ３  １０／１０）中の式に基づいた。限界デキストリナーゼ活性アッセイは、標準的実験装置を用いるＭｅｇａｚｙｍｅのプルラナーゼ／限界デキストリナーゼＡｓｓａｙ（ＰｕｌｌＧ６  法）ｋｉｔ（Ｋ−ＰｕｌｌＧ６）を使用して測定した。限界デキストリナーゼアッセイは、製造業者のプロトコル（Ｋ−ＰｕｌｌＧ６  ０５／１７）に従って実施した。限界デキストリナーゼ活性の計算は、Ｍｅｇａｚｙｍｅプロトコル（Ｋ−ＰｕｌｌＧ６  ０５／１７）中の式に基づいた。
【０２０４】
結果：
α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよび遊離限界デキストリナーゼについて測定した総酵素活性は、変異体および参照大麦系統での同じパターンに従う（図５）。驚くべきことに、限界デキストリナーゼ活性は、早くも３日目に始まり変異体中でわずかに高いように見えるが、限界デキストリナーゼ遺伝子発現はわずかに低かった（図４）。
【０２０５】
実施例６：（１−３；１−４）−β−グルカン含量
発芽穀粒を総（１，３；１，４）−β−グルカン含量について分析した。１０ｍＬの大麦粒をＲｅｔｃｈ  ｃｙｃｌｏｎｅミルで粉砕した。全ての試料を３回繰り返して分析した。２０ｍｇの粉末を２ｍｌのエッペンドルフチューブに秤取し、オーブン中にて１００℃で２時間加熱し、続けて室温に冷却した。全体で５００μＬの５０％水性メタノールを加え、試料を１４００ｒｐｍで１時間震盪した。１６０００ｘｇで１０分間遠心分離後に、上清を廃棄し、試料を一晩乾燥した。次に、１０ｍｇの粉末当たり、１Ｕ／ｍＬのリケナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を含有する４００μＬの２０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．５）を加え、５０℃で２．５時間インキュベーションした。試料を１６０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、放出されたＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ３）およびＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ４）をアンペロメトリック電気化学検出を備えたオリゴマーを高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）により定量した。Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ３）およびＧｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞４）−Ｇｌｃ−β−（１−＞３）−Ｇｌｃ（ＤＰ４）オリゴマーを、２ｘ２５０ｍｍ寸法およびプレカラムを有する４μｍのＳＡ−１０カラムを備えたＤｉｏｎｅｘ  ＩＣＳ５０００＋ＤＣシステムを用いてＨＰＡＥＣ−ＰＡＤで定量した。実施条件は、０．４ｍＬ／分、カラム温度４０℃、無勾配の１００ｍＭ  ＮａＯＨ溶出液で１５分間であった。定量化のための標準を、ＤＰ３とＤＰ４の間の等モルＰＡＤ応答比率を仮定して、２０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ６．５）中の既知の量の中間的粘度の（１，３；１，４）−β−グルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）の、１Ｕ／ｍＬのリケナーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｅｌａｎｄ）消化により生成した。総（１，３；１，４）−β−グルカン含量を、ＤＰ３およびＤＰ４オリゴマーの含量の合計として計算した。
【０２０６】
結果：
変異体および参照の（１−３；１−４）−β−グルカン含量を、大麦中および緑麦芽中で製麦工程（図１）の１、２、３、４、５、６日目に、ならびに焙燥されたモルト中（図１の７日目）で監視した。全製麦工程中で、変異体の（１−３；１−４）−β−グルカン含量は、参照の５０％に過ぎず、５日目では、変異体（１−３；１−４）−β−グルカン含量は、参照焙燥されたモルトと同様であった。
【０２０７】
実施例７：緑麦芽試験品、麦汁およびビールの分析
本方法、すなわち、焙燥工程なし、または焙燥工程あり（表３〜８の「パイロット」焙燥工程）により１、２、３、４または５日間発芽させた大麦、ならびに５日間発芽させ、後の段階で焙燥工程（表３〜８の「工業的」焙燥工程）に供した大麦から作製した麦汁およびビールの特性を、表３および４に示す。発芽の前に、約３６時間の浸麦を実施した。実験を、緑麦芽での直接醸造および焙燥工程により製造された麦芽での醸造を、毎日比較するように設計した。焙燥されたモルトでの醸造（表中の「工業的」）を、後の段階で実施した。大麦栽培品種Ｃｏｎｇｏを用いた。
【０２０８】
麦汁糖類を、電気化学検出を備えたＨＰＬＣにより測定した。ストレッカーアルデヒドを、基本的にＧｒｏｅｎｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９３による記載のようにして、Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロジルアミンを用いたカルボニルの誘導体化後にＧＣ−ＭＳにより測定した。ビール中の低沸点エステルおよび高級アルコールを、ＦＩＤ検出を備えたＨｅａｄ−Ｓｐａｃｅ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙにより測定した。高沸点エステルおよび高級アルコールおよび脂肪酸を、ＣＳ２によりビールから抽出し、ＦＩＤ検出を備えたガスクロマトグラフィー（液体注入）により分析した。麦汁およびビールのアミノ酸含量を、基本的に供給業者による記載に従い、欧州特許第ＥＰ３２３７６０１号に記載のようにして、ホトダイオードアレー検出器を備えたＵＰＬＣを用い、ＷａｔｅｒｓのＡｃｃＱ−Ｔａｇ  Ｕｌｔｒａ誘導体化キットを使い、欧州特許第ＥＰ３２３７６０１号に記載のように測定した。ビール中のＴ２Ｎを、基本的にＧｒｏｅｎｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ，１９９３による記載のように、Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）−ヒドロジルアミンを用いたカルボニルの誘導体化後にＧＣ−ＭＳにより測定した。真性発酵度（ＲＤＦ）、アルコール、抽出物および色を、供給業者による記載のようにＡｎｔｏｎ  ＰａａｒのＡｌｃｏｌｙｚｅｒ  Ｂｅｅｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。気泡を、供給業者による記載のようにＦＴ−００３  Ｆｏａｍ  Ｔｅｓｔｅｒ（Ｌｇ−ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ａｐｓ，Ｕｎｄａｌｓｖｅｊ  ６，３３００  Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｖｅｒｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて測定した。
【０２０９】
表３で分かるように、麦汁ｐＨもアミノ酸も、キルン乾燥がないことにより顕著な影響を受けない。３、４または５日間の発芽後に得られた麦汁β−グルカンの差異は、顕著であるとは考えられない。従って、本方法により作製された麦汁は驚くべきことに、キルン乾燥ステップがないにも関わらず、さらに後の発酵における酵母のための栄養素源として機能するのに十分なアミノ酸を含む。表４は、キルン乾燥ステップの非存在が、発酵性炭水化物の濃度を大きく変化させないことを示す。
【表７】
2021508481.tif 000008
【表８】
2021508481.tif 000009
【０２１０】
発芽の１、２、３、４または５日後に、本発明の方法、すなわち、焙燥工程なしで得られた水性穀物抽出物から作製されたビールを、従来の方法、すなわち、焙燥工程を含む方法により得られた水性穀物抽出物から作製されたビールと比較した。ビールの特性を表５〜８に示す。
【０２１１】
表５は、キルン乾燥なしで作製されたビール中のアルコールの体積％が、キルン乾燥を用いて作製されたビールで得られたものと同様であることを示す。同様に、真性発酵度（ＲＤＦ）または発泡においても顕著な差は存在しない。特に、高い発泡を得ることが望ましい。表６は、アセトアルデヒド（発芽の２日目から）、酢酸エチル、酢酸イソブチル、プロパノール、酢酸イソアミおよびイソアミルアルコールの濃度は、キルン乾燥がないことにより大きく影響されないことを示す。
【表９】
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【表１０】
2021508481.tif 000011
【０２１２】
いくつかの異臭化合物の濃度を、フレッシュビール（表７）および３７℃で２週間貯蔵したビール（表８）において分析した。フレッシュビール（表７）では、ビール中の熟成風味の重要な成分であると考えられる、アルデヒド、２−メチルプロパナール、２−メチルブタナール、３−メチルブタナール、フェニルアセトアルデヒド総ストレッカーアルデヒドについて顕著な差は観察されなかった。これに対して、低減した異臭化合物の傾向が、いくつかの事例で観察された。麦芽のキルン乾燥は、Ｔ２Ｎの形成を開始するリポキシゲナーゼ酵素の不活化によるいくつかの異臭のレベル、例えば、トランス−２−ノネナール（Ｔ２Ｎ）のレベルの低減に重要であると考えられている。Ｔ２Ｎのレベルは、キルン乾燥しないビールで幾分高いが、しかし、測定されたレベルはそれでも、０．０５ｍｇ／Ｌの感覚閾値未満であり、従って、Ｔ２Ｎから生じる異臭は、キルン乾燥をしないで作製されたビールで変化しないことが予測される。
【０２１３】
同様に、キルン乾燥しないで作製され３７℃で２週間貯蔵されたビールの異臭化合物の濃度（表８）は、キルン乾燥で作製され、同一条件下で貯蔵されたビールで観察された濃度とほんのわずかな差異を示すにすぎない。
【表１１】
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【表１２】
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【０２１４】
全体としては、上記データは、本発明の方法に従って作製した麦汁およびフレッシュまたは貯蔵ビールの特性は驚くべきことに、キルン乾燥ステップのないことによる影響をほとんど受けないことを示す。
【０２１５】
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Ｓｍｉｔｈ  ＡＭ，Ｚｅｅｍａｎ  Ｓ．Ｃ，Ｓｍｉｔｈ  ＳＭ（２００５）Ｓｔａｒｃｈ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５６：７３−９８．
Ｔａｋｅｔａ  Ｓ，Ｙｕｏ  Ｔ，Ｔｏｎｏｏｋａ  Ｔ，Ｔｓｕｍｕｒａｙａ  Ｙ，Ｉｎａｇａｋｉ  Ｙ，Ｈａｒｕｙａｍａ  Ｎ，Ｌａｒｒｏｑｕｅ  Ｏ  ａｎｄ  Ｊｏｂｌｉｎｇ  ＳＡ（２０１２）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｒｌｅｙ  ｂｅｔａｇｌｕｃａｎｌｅｓｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＣｓｌＦ６  ｉｎ（１，３；１，４）−β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ．６３（１）：３８１−９２．
【図１】
2021508481.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月12日(2020.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021508481000001.app
【国際調査報告】
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2021508481.tif 000021
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