(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、とりわけ、従来の方法によって調製される液体培地と比較して、ロット間の分析変動が少なく、性能が高く、金属イオン濃度が低い液体細胞培養培地を調製するための方法である。そのような液体培地は、組換え細胞を含むがこれに限定されない細胞を培養するために使用され得る。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地を作製する方法であって、
ｉ）ｐＨ、溶解度、および濃度に基づいて培地成分をグループ化することと、
ｉｉ）製剤中の構成成分に応じて特定のｐＨを標的とするように、アミノ酸の遊離塩基形態／塩形態を変換することと、
ｉｉｉ）前記グループの最適な可溶化を可能にする順序で前記グループの添加を行うことと、を含み、
得られた液体培地は、上記のステップｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）を用いて調製されていない培地と比較して、前記グループを可溶化するためにより少ない酸および／または塩基の添加を必要とする、方法。
【請求項２】
前記得られた液体培地は、前記液体培地の調製に請求項１に記載のステップｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）を用いない別の方法によって調製された液体培地と比較して、
（ａ）前記構成成分を可溶化するためにより少ない酸および／もしくは塩基の添加を必要とし、かつ／または
（ｂ）酸および／もしくは塩基の添加による金属汚染物質を減少させ、かつ／または
（ｃ）金属のロット間のばらつきが少なく、
（ｄ）調製する必要のある溶液が少ないため、より少ない調合時間を必要とする、
請求項１に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項３】
金属の前記ロット間のばらつきは、最大１０％未満である、請求項１または２に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項４】
全金属濃度のロット間のばらつきは、約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．１％未満、約１％未満、約１〜２％未満、約１〜３％未満、約１〜４％未満、約１〜５％未満、約１〜６％未満、約１〜１０％未満、約１〜２０％未満、約１〜３０％未満、約１〜４０％未満、約１〜５０％未満、約１〜６０％未満、約１〜７０％未満、％、約１〜８０％未満、または約１〜９０％未満である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項５】
様々な液体ロット間の任意の金属濃度に関するロット間のばらつきは、約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．１％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約０．００１〜１％未満、約０．００１〜５％未満、約０．００１〜１０％未満、約１〜１０％未満、約１０〜２０％未満、約２０〜３０％未満、約３０〜４０％未満、約４０〜５０％未満、約５０〜１００％未満、約５０〜９０％未満、約５０〜８０％未満、約５０〜７０％未満、約５０〜６０％未満等である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項６】
使用される酸および塩基の体積の減少は、約１０〜４０倍である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項７】
使用される酸および塩基の体積の減少は、約２２倍である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項８】
１２Ｎ濃酸の使用は、前記方法において排除される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項９】
１つ以上の汚染金属の減少は、任意の他の方法によって調製された液体培地と比較して、請求項１に記載の方法によって調製した結果得られた液体において約０．０００１％〜１００％であった、請求項１〜８のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項１０】
１つ以上の汚染金属の減少は、任意の他の方法によって調製された液体培地と比較して、請求項１に記載の方法によって調製した結果得られた液体において約０．０００１％〜０．００１％、約０．０００１％〜０．０１％、約０．０００１％〜０．１％、約０．０００１％〜１％、約０．０００１％〜２％、約０．０００１％〜３％、約０．０００１％〜４％、約０．０００１％〜５％、約０．０００１％〜１０％、約１％〜５％、約１％〜１０％、約１％〜１５％、約１％〜２０％、約１％〜２５％、約１％〜３５％、約１０〜２０％、約１０〜３０％、約１０〜４０％、約１０〜５０％、約１０〜６０％、約１０〜７０％、約１０〜８０％、約１０〜９０％、約１０〜１００％である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項１１】
減少する金属は、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｍｏ、ＡｌおよびＣａからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項１２】
金属汚染％は、任意の他の方法によって調製された液体培地と比較して、Ｃｒで約４０〜１００％、Ｆｅで約０．０１〜２０％、Ｃｕで約０．１〜１５％、Ｍｎで約０．２５〜６０％、Ｎｉで約５〜１００％、Ｚｎで約５％、およびＭｏで約１５％減少する、請求項１１に記載の液体培地を作製する方法。
【請求項１３】
細胞を培養するための方法であって、請求項１に従って調製された液体細胞培養培地中に細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項１４】
前記液体細胞培養培地は無血清である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記液体細胞培養培地はタンパク質不含である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記液体細胞培養培地は、別の方法によって調製された液体培地よりも低い金属レベルを有する、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）、確立された細胞株およびそれらの株、遺伝子組み換え細胞、二倍体細胞、ハイブリオーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３細胞、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血症細胞、デンプシー細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５７３細胞、ＨＥＬ  ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ1細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ3Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ1Ｃ3細胞、ＫＬＮ2Ｏ5細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ-(マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、スイス／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣII細胞、およびＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞またはそれらの誘導体、およびｉＰＳＣ細胞からなる群から選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、組換え産物、タンパク質もしくは組換えタンパク質、融合産物もしくはタンパク質、抗体もしくは抗体断片、融合もしくは修飾抗体、ウイルスまたはウイルス産物もしくはウイルス成分、ＶＬＰ（ウイルス様粒子）、細胞、核酸、脂質、ホルモン、ステロイド、あるいは糖タンパク質を発現する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項３  １３〜１８に従って調製される液体培地において生物学的産物を作製するための方法であって、前記生物学的産物は、組換え産物、タンパク質もしくは組換えタンパク質、融合産物もしくはタンパク質、抗体もしくは抗体断片、融合もしくは修飾抗体、ウイルスまたはウイルス産物もしくはウイルス成分、ＶＬＰ（ウイルス様粒子）、細胞、核酸、脂質、ホルモン、ステロイド、あるいは糖タンパク質である、方法。
【請求項２０】
別の方法を用いて調製された液体培地と比較して、減少した金属汚染物質を含み、かつ／または金属のロット間のばらつきの低減を示し、その構成成分を可溶化するために酸および／または塩基の添加を用いる、液体細胞培養培地。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って調製される、液体細胞培養培地。
【請求項２２】
キットまたは組み合わせであって、（ｉ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って調製された液体細胞培養培地と、（ｉｉ）細胞と、必要に応じて、（ｉｉｉ）細胞培養サプリメントまたは添加剤と、を含む、キットまたは組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
液体細胞培養培地の製造プロセスは、特定の培地成分を可溶化するために大量の酸および塩基を用いる。液体製剤へのそのような添加は、ロット間のばらつきをもたらし、感受性培地成分を経時的に変化させるまたは損傷する可能性があり、また金属イオン濃度の変動をもたらす可能性がある。金属イオン濃度を制御することができ、重金属の導入が低減され、それによって下流の環境問題を軽減する、液体細胞培養培地を作製するための信頼性のある効率的な方法が長い間必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【０００２】
【図１】濃縮液法（左表）および合理化された液体法によって（右表）調製された液体培地の比較を示す。一実施形態において、濃縮液技術は平均７時間の製造時間を要したのに対し、合理化された液体は平均３〜４時間の製造時間を要した。
【図２】濃縮液法は、液体ストック成分の調製中に大量の酸および塩基を使用する。この表は、濃縮技術によって調製された例示的な液体培地において、酸および塩基が最終体積の１．８８％を占めることを示している。ここでは、濃縮技術は１８．８０４ｍＬ／Ｌの酸／塩基を使用した。合理化された液体法は、１２Ｎ濃酸の使用を完全に排除し、５Ｎ酸および５Ｎ塩基の使用を大幅に減少させ、それによって最終製剤への金属汚染物質の導入が低減される。
【図３】酸（５Ｎ  ＨＣｌ）および塩基（５Ｎ  ＮａＯＨ）中で測定された様々な金属濃度（汚染物質）を示す。５Ｎ  ＨＣｌおよび５Ｎ  ＮａＯＨの４つのロットをＩＣＰ−ＭＳにより金属汚染物質について分析した。現在の濃縮液技術は、大量の酸および塩基を使用するため、最終的な液体培地中の金属汚染物質の濃度のばらつきの原因となっている。（Ａ）は、（Ｂ）に示される３０μｇ／Ｌ未満の金属と比較して、より高い濃度で存在する金属の量を示している。合理化された液体法は、１２Ｎ濃酸の使用を排除し、５Ｎ酸および５Ｎ塩基の使用を大幅に減少させ、それによって金属汚染物質に関連する濃度およびばらつきを低減する。
【図４】濃縮液法および合理化された液体法によって調製された培地なかの金属レベルの比較を示す。これらの両方の方法によって調製された培地をＩＣＰ−ＭＳによって分析した。金属濃度は、１００％が「濃縮」法（対照）に存在する金属を表すように正規化された。（Ａ）液体ＣＤＣＨＯ（商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を調製するための合理化された方法では、「濃縮」法（対照）によって調製された場合と比較して、クロム、銅、マンガン、およびニッケルの金属濃度が低下した。（Ｂ）任意の液体２９３培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を調製するための合理化された方法では、「濃縮」法（対照）によって調製された場合と比較して、クロム、鉄、マンガン、およびニッケルの金属濃度が低下した。
【図５】は、（Ａ）ＣＨＯ−Ｓ細胞の生細胞密度（ＶＣＤ）によって測定された細胞増殖の比較を示しており、濃縮液対照と比較して、合理化された液体培地で１４７％の増殖の改善が示された。（Ｂ）２９３細胞は、濃縮液対照と比較した場合、合理化された液体培地で同様の増殖性能（１０５％）を示した。
【図６】は、濃縮液法および合理化された液体法によって調製された液体ＣＤＣＨＯ（商標）培地におけるＩｇＧ力価の性能の比較を示す。「合理化された」方法によって調製された培地では、ＣＨＯ−Ｓ細胞は、従来の「濃縮」対照方法によって調製された液体培地におけるタンパク質の生産性と比較した場合、約１２４％のタンパク質の生産性増加を示した。
【０００３】
本開示は、液体培地を作製する方法であって、
ｉ）ｐＨ、溶解度、および濃度に基づいて培地成分をグループ化することと、
ｉｉ）製剤中の構成成分に応じて特定のｐＨを標的とするように、アミノ酸の遊離塩基形態または塩形態を変換することと、
ｉｉｉ）前記グループの最適な可溶化を可能にする順序でグループの添加を行うことと、を含み、
得られた液体培地は、上記のステップｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）を用いて調製されていない培地と比較して、該グループを可溶化するためにより少ない酸および／または塩基の添加を必要とする、方法を提供する（ステップｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）は、合理化された方法を形成する）。
【０００４】
この方法を用いて得られた液体培地は、液体培地の調製に上記のステップｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）を用いない別の方法によって調製された液体培地と比較して、（ａ）構成成分を可溶化するためにより少ない酸および／もしくは塩基の添加を必要とし、かつ／または（ｂ）酸および／もしくは塩基の添加による金属汚染物質を減少させ、かつ／または（ｃ）金属のロット間のばらつきが少なく、（ｄ）調製する必要のある溶液が少ないため、より少ない調合時間を必要とした。
【０００５】
上述の方法によって調製された液体培地は、いくつかの利点を有していた：例えば、一実施形態において、液体中の金属によるロット間のばらつきが最大１０％未満に低減された。他の実施形態において、全金属濃度のロット間のばらつきは、約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．１％未満、約１％未満、約１〜２％未満、約１〜３％未満、約１〜４％未満、約１〜５％未満、約１〜６％未満、約１〜１０％未満、約１〜２０％未満、約１〜３０％未満、約１〜４０％未満、約１〜５０％未満、約１〜６０％未満、約１〜７０％未満、％未満、約１〜８０％未満、または約１〜９０％に低減された。他の実施形態において、任意の金属濃度に関するロット間のばらつきは、約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．１％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約０．００１〜１％未満、約０．００１〜５％未満、約０．００１〜１０％未満、約１〜１０％未満、約１０〜２０％未満、約２０〜３０％未満、約３０〜４０％未満、約４０〜５０％未満、約５０〜１００％未満、約５０〜９０％未満、約５０〜８０％未満、約５０〜７０％未満、約５０〜６０％未満であった。
【０００６】
合理化された方法を用いることの別の利点は、液体への酸および／または塩基の添加量が減少することである。例えば、いくつかの実施形態において、酸および／または塩基の体積の減少は約１０〜４０倍である。特定の実施形態において、酸および／または塩基の体積の減少は約２２倍である。特定の実施形態において、合理化された方法において、１２Ｎ濃酸の使用が排除される。
【０００７】
一態様において、液体培地中の１つ以上の汚染金属の減少は、任意の他の方法、例えば、濃縮法によって調製された液体培地と比較して、約０．０００１％〜１００％であった。他の態様において、１つ以上の汚染金属の減少は、任意の他の方法、例えば、液体培地を調製する濃縮法によって調製された液体培地と比較して、約０．０００１％〜０．００１％、約０．０００１％〜０．０１％、約０．０００１％〜０．１％、約０．０００１％〜１％、約０．０００１％〜２％、約０．０００１％〜３％、約０．０００１％〜４％、約０．０００１％〜５％、約０．０００１％〜１０％、約１％〜５％、約１％〜１０％、約１％〜１５％、約１％〜２０％、約１％〜２５％、約１％〜３５％、約１０〜２０％、約１０〜３０％、約１０〜４０％、約１０〜５０％、約１０〜６０％、約１０〜７０％、約１０〜８０％、約１０〜９０％、約１０〜１００％である。
【０００８】
一態様において、液体培地中で減少する汚染金属は、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｍｏ、ＡｌおよびＣａからなる群から選択される。別の態様において、金属汚染％は、任意の他の方法、例えば、濃縮法によって調製された液体培地と比較して、Ｃｒで約４０〜１００％、Ｆｅで約０．０１〜２０％、Ｃｕで約０．１〜１５％、Ｍｎで約０．２５〜６０％、Ｎｉで約５〜１００％、Ｚｎで約５％、およびＭｏで約１５％減少する。特定の態様において、液体細胞培養培地は、別の方法によって調製された液体培地よりも低い汚染金属レベルを有する。
【０００９】
本開示はまた、無血清である液体細胞培養培地、タンパク質不含である液体細胞培養培地、またはその両方を提供する。
【００１０】
本開示はまた、上記の方法を用いて調製された液体細胞培養培地に細胞を接触させることを含む、細胞を培養するための方法を提供する。好ましい実施形態において、細胞は、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）、確立された細胞株およびそれらの株、遺伝子組み換え細胞、二倍体細胞、ハイブリオーマ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３細胞、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血症細胞、デンプシー細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５７３細胞、ＨＥＬ  ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ1細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ3Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ1Ｃ3細胞、ＫＬＮ2Ｏ5細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ-(マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、スイス／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣII細胞、およびＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞またはそれらの誘導体、およびｉＰＳＣ細胞からなる群から選択される。
【００１１】
本開示はさらに、組換え産物、タンパク質もしくは組換えタンパク質、融合産物もしくはタンパク質、抗体もしくは抗体断片、融合もしくは修飾抗体、ウイルスまたはウイルス産物もしくはウイルス成分、ＶＬＰ（ウイルス様粒子）、細胞、核酸、脂質、ホルモン、ステロイド、あるいは糖タンパク質のいずれかを発現することができる細胞をさらに提供する。
【００１２】
本開示は、請求項１３〜１８に従って調製される液体培地において生物学的産物を作製するための方法をさらに提供し、生物学的産物は、組換え産物、タンパク質もしくは組換えタンパク質、融合産物もしくはタンパク質、抗体もしくは抗体断片、融合もしくは修飾抗体、ウイルスまたはウイルス産物もしくはウイルス成分、ＶＬＰ（ウイルス様粒子）、細胞、核酸、脂質、ホルモン、ステロイド、あるいは糖タンパク質である。
【００１３】
本開示は、その構成成分を可溶化するために酸および／または塩基の添加を用いる別の方法を用いて調製された液体培地と比較して、減少した金属汚染物質を含み、かつ／または低減されたロット間のばらつきを示す、液体細胞培養培地を提供する。
【００１４】
本開示はまた、上述の方法（合理化された方法）に従って調製された液体細胞培養培地を提供し、該液体培地は、任意の他の方法、例えば、液体培地を調製する濃縮法によって調製された液体培地と比較して少ない汚染金属を有する。
【００１５】
本開示はまた、（ｉ）請求項１〜１２の方法に従って調製された液体細胞培養培地と、（ｉｉ）細胞と、必要に応じて、（ｉｉｉ）細胞培養サプリメントまたは添加剤と、を含む、キットまたは組み合わせを提供する。
【００１６】
説明
１．細胞細胞培地
細胞培養培地は、いくつかの成分から構成され、これらの成分は培地ごとに異なる。細胞培養培地は、完全な製剤、すなわち、細胞を培養するために補充を必要としない細胞培養培地であってもよいか、あるいは不完全な製剤であってもよく、すなわち、細胞培養培地が、補充を必要とし得るか、もしくは不完全な製剤を補充するためのサプリメントとして使用され得るか、または完全な製剤の場合、細胞培養性能もしくは培養結果（力価）を改善し得る。
【００１７】
一般に、細胞培養培地は、溶媒に溶解した溶質を有し得る。溶質は、浸透力を提供して、細胞膜（または壁）を横切る浸透圧のバランスを保つ。さらに、溶質は細胞に栄養素を提供する。いくつかの栄養素は、細胞の動作のための化学燃料であってもよく、いくつかの栄養素は、同化作用において使用するための細胞の原料であってもよく、いくつかの栄養素は、細胞代謝を促進する酵素もしくは担体等の機構であってもよく、いくつかの栄養素は、細胞使用のための成分と結合してそれを緩衝するか、または有害な細胞産物と結合するもしくはそれを隔離する結合剤であってもよい。
【００１８】
細胞および意図される細胞の用途に応じて、細胞培養培地の成分は、細胞培養性能のバランスを保つ／最適化する濃度で決定され得る。性能は、１つ以上の所望の特徴、例えば、細胞数、細胞量、細胞密度、Ｏ2消費、グルコースまたはヌクレオチド等の培養成分の消費、生体分子の産生、生体分子の分泌、老廃物または副産物、例えば代謝物の形成、インジケータ分子またはシグナル分子に対する活性に従って測定され得る。したがって、各々のまたは選択された成分は、好ましくは、意図される目的のための作用濃度になるよう最適化される。
【００１９】
本発明の培養培地または供給サプリメントは、水等の溶媒の添加のみを必要とする乾燥形態で入手可能であり得る。乾燥形態には、乾燥粉末形態（ＤＰＭ）、凝集（ＡＧＴ（商標））形態、高性能粉末培地（ＡＰＭ）、または他の適切な乾燥形態が含まれるが、これらに限定されず、またこれらは他の特許に記載されている。好ましくは、一旦、水が添加されると、溶解が迅速に起こるべきであり、得られた液体を濾過して、いずれのｐＨ調整もすることなく、細胞に直接添加することができる。再構成された培地または濃縮サプリメントは、さまざまなバルク量で調製されてもよく、特にイオン化または紫外線照射による滅菌に適している。培地（乾燥および液体）は、一般的に以下を含む：
【００２０】
ａ．炭水化物
細胞培養培地成分は、典型的には、炭水化物、アミノ酸、塩、微量元素、およびビタミンを含む。哺乳動物細胞の場合、細胞培養培地に使用される主な炭水化物はグルコースであり、日常的に５〜２５ｎＭ補充される。Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，５１（Ｓａｄｅｔｔｉｎ  Ｏｚｔｕｒｋ  ａｎｄ  Ｗｅｉ−Ｓｈｏｕ  Ｈｕ  ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ２００６）を参照されたい。グルコースに加えて、ガラクトース、フルクトース、もしくはマンノース等の任意のヘキソース、またはこれらの組み合わせも使用され得る。加えて、哺乳動物細胞も主要なエネルギー源としてグルタミンを使用し得る。グルタミンは、他のアミノ酸よりも高い濃度で含まれることが多い（２〜８ｍＭ）。しかしながら、上記のように、グルタミンは自然に分解してアンモニアを形成する可能性があり、特定の細胞株はアンモニアをより迅速に産生するが、それは毒性である。したがって、細胞培養培地中の有毒なアンモニアの蓄積を減少させるために、グルタミン酸およびグルタミンジペプチドが、グルタミンの代替物として使用されてきた。
【００２１】
ｂ．アミノ酸
アミノ酸は、培養される細胞の代謝機能を維持するために細胞培養培地において重要である。細胞培養培地は、典型的には、必須アミノ酸（すなわち、通常、哺乳動物によってインビボでは合成されないアミノ酸）および特定の非必須アミノ酸を含む。非必須アミノ酸は、典型的には、細胞株がアミノ酸を合成できない場合、または細胞株が最大の増殖を支持するのに十分な量のアミノ酸を産生できない場合に、細胞培養培地に含められる。例示的なアミノ酸として、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリンが挙げられる。本開示における方法は、例えば表１に示されるような特性に基づいて、アミノ酸を分類することに関する。そのような分類は周知である。しかしながら、本開示は、濃縮技術を用いる以前に使用されていた方法の細胞培養増殖および力価の性能を損なうことなく、ｐＨおよび濃度でアミノ酸をグループ化してマッチングさせ、酸または塩基の添加を減少させるまたは排除して所望のｐＨを達成するためにそれらの添加をマッチングさせることを目的としている。培地濃縮技術は、例えば、米国特許出願第５４７４９３１号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。アミノ酸の例示的な分類を下の表１に示すが、アミノ酸はそれらの酸性、塩基性、または中性の特性に基づいてグループ化されている。液体培地を調製する一方で、アミノ酸グループの滴定、ならびにｐＨおよび濃度に基づくグループのマッチングにより、５４７４９３１号に記載されるほど多くの酸および／または塩基を添加することなく、また以下の例に示すように、所望のｐＨを達成することができる。
【表１】
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【００２２】
ｃ．塩
塩は、等張状態を維持し、浸透圧の不均衡を防ぐために細胞培養培地に添加される。標準的な哺乳動物細胞培養培地の浸透圧は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであるが、多くの細胞株がこの値の約１０％の変動に耐えることができる。いくつかの昆虫細胞培養物の浸透圧は３００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも高い傾向があり、これは３００ｍＯｓｍ／ｋｇよりも０．５％、１％、２〜５％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％高くてもよい。細胞培養培地に最も一般的に使用される塩は、Ｎａ+、Ｋ+、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｃｌ-、ＳＯ42-、ＰＯ43-、およびＨＣＯ3-（例えば、ＣａＣｌ2、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＨＰＯ4）を含む。したがって、特定の細胞型を培養するための細胞培養培地の所望の浸透圧は、当該技術分野で既知の方法を用いて、当業者によって経験的に決定されてもよい。
【００２３】
ｄ．無機元素
参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０２８７６６６に記載されるように、血清中に微量で存在する他の無機元素が細胞培養培地に含まれてもよい。それらは、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ｖａ、Ｓｅ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｉ、およびＮｉを含む。それほど頻繁ではないが、細胞培養培地に添加されてきた他の無機元素として、Ａｌ、Ａｇ、Ｂａ、Ｂｒ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆ、Ｇｅ、Ｊ、Ｒｂ、およびＺｒが挙げられる。これらの元素の多くは、酵素活性に関与する。それらは、ＣａＣｌ2、Ｆｅ（Ｎ０３）3、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＭｎＣｌ2、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＨＰＯ４、等の塩、ならびにセレン、バナジウム、および亜鉛等の微量元素のイオンの形態で提供され得る。これらの微量元素は、様々な形態で、好ましくはＮａ2ＳｅＯ3，ＮＨ4ＶＯ3等の塩の形態で提供され得る。これらの無機塩および微量元素は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から商業的に入手することができる。
【００２４】
ｅ．ビタミン
ビタミンは、典型的には、補因子として細胞によって使用される。各細胞株のビタミン要件は大きく異なるが、細胞培養培地が血清をほとんどもしくはまったく含まない場合、または細胞を高密度で増殖させる場合、一般的に余分のビタミンが必要とされる。例示的なビタミンとして、ビオチン、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ニコチンアミド、Ｄ−Ｃａ++-パントテン酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ナイアシンアミド、Ａ、Ｂ6、Ｂ12、Ｃ、Ｄ3、Ｅ、Ｋ、およびｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）が挙げられる。
【００２５】
ｆ．オプション：血清または組換え血清タンパク質
凝固した血液の上清である血清は、細胞の増殖および／または生産性を促進する構成成分を提供するために、細胞培養培地に使用され得る。これらの血清成分には、接着因子、微量栄養素（例えば、微量元素）、増殖因子（例えば、ホルモン、プロテアーゼ）、および保護エレメント（例、抗毒素、抗酸化剤、抗プロテアーゼ）が含まれる。血清は、ウシまたはウマを含む様々な動物源から入手可能である。細胞培養培地に含まれる場合、血清は、典型的には５〜１０％の濃度で添加される。特定の細胞培養培地は無血清である。
【００２６】
ｇ．増殖因子
血清の非存在下でまたは血清低減培地中で細胞増殖を促進するために、以下のポリペプチドのうちの１つ以上を細胞培養培地に添加することができる：例えば、酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦを含む線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ならびにＴＧＦαおよびＴＧＦβを含むトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、サイトカイン、例えば、インターロイキン１、２、６、顆粒球刺激因子、白血球抑制因子（ＬＩＦ）。
【００２７】
特定の実施形態において、細胞培養培地は増殖因子を含有しない。タンパク質不含培地において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ９８／０８９３４に記載されるように、インスリンが亜鉛または亜鉛含有化合物で置き換えられてもよい。
【００２８】
ｈ．脂質
１つ以上の脂質を細胞培養培地に添加することもできる。血清は、典型的には、脂肪酸（リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ポリエン酸、および／または各炭素原子が分岐もしくは非分岐である１２、１４、１６、１８、２０、または２４炭素原子の脂肪酸）、リン脂質、レシチン（ホスファチジルコリン）、およびコレステロール等の脂質を含有する。代替的に、これらの脂質のうちの１つ以上がサプリメントとして無血清培地に含まれてもよい。ホスファチジン酸およびリゾホスファチジン酸は、ＭＤＣＫ、マウス上皮、および他の腎細胞株等の特定の足場依存性細胞の増殖を促進する一方で、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルイノシトールは、無血清培地中でヒト線維芽細胞の増殖を促進する。エタノールアミンおよびコレステロールも、特定の細胞株の増殖を促進することが示されている。特定の実施形態において、細胞培養培地は脂質を含有しない。
【００２９】
ｉ．オプション：担体タンパク質
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはトランスフェリン等の１つ以上の担体タンパク質を、細胞培養培地に添加することもできる。担体タンパク質は、特定の栄養素または微量元素の輸送に役立ち得る。ＢＳＡは、典型的には、水溶液に不溶性であるリノール酸およびオレイン酸等の脂質の担体として用いられる。加えて、ＢＳＡは、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｎｉ等の特定の金属の担体としても機能し得る。タンパク質不含製剤では、シクロデキストリン等の、ＢＳＡの非動物由来代替物が脂質担体として使用され得る。トランスフェリンは、細胞膜を横切る鉄の輸送に関与する。特定の場合において、下流の治療用途のために生成される生成物にとって望ましい細胞の培養（例えば、異種不含（ＸＦ）培養において等）のために、ヒト血清アルブミンが必要であり得る。他の場合において、組換えヒト血清アルブミンは、細胞を培養するために細胞培養培地において使用され得る。特定の場合において、細胞の動物由来成分不含（ＡＯＦ）培養を提供するために、組換えヒト血清アルブミンは、植物、藻類、または真菌供給源、例えば、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、コムギ、さらには酵母等に由来し得る。タンパク質不含製剤では、トランスフェリンを、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ９８／０８９３４に記載されるような第二鉄塩および／もしくは第一鉄塩で、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／０２５４３５８に記載さるようなヒドロキシピリジン誘導体で置き換えることができる。さらに、タンパク質不含製剤では、インスリンを、亜鉛、バナジウム、または他の適切な二価塩で置き換えることができる。
【００３０】
ｊ．オプション：付着タンパク質
足場依存性細胞の基質への付着を促進するのを助けるために、フィブロネクチン、ラミニン、およびプロネクチン等の１つ以上の付着タンパク質を細胞培養培地に添加することもできる。
【００３１】
ｋ．緩衝剤
細胞培養培地は、必要に応じて、１つ以上の緩衝剤を含み得る。好適な緩衝剤には、Ｎ−￥［２−ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ホスフェート、重炭酸、及び細胞培養用途に使用するのに好適な他の緩衝剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な緩衝剤は、培養される細胞に対して実質的な細胞毒性がない緩衝能を提供するものである。好適な緩衝剤の選択は、細胞培養の分野の当業者の範囲内である。
【００３２】
ｌ．ポリアニオンまたはポリカチオン化合物
ポリアニオンまたはポリカチオン化合物は、細胞が凝集するのを防ぎ、懸濁液中の細胞の増殖を促進し得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ９８／０８９３４を参照されたい。例示的なポリアニオン化合物として、ヘパリン、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、多硫酸、プロテオグリカン等のポリスルホン化またはポリ硫酸化化合物が挙げられる。
【００３３】
加えて、細胞培養培地は、本明細書に記載される１つ以上の成分を含み得る。一実施形態において、細胞培養培地は、必要に応じて以下の成分のうちの１つ以上を含んでもよい：エタノールアミン、Ｄ−グルコース、ＨＥＰＥＳ、インスリン、サイトカイン（例えば、ＩＬ−６）、ヘパリン、デキストラン硫酸、リノール酸、リポ酸、フェノールレッド、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、トランスフェリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、ビオチン、塩化コリン、Ｄ−Ｃａ++−パントテン酸、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ12、１つ以上のカルシウム塩、Ｆｅ（ＮＯ3）3、ＫＣｌ、１つ以上のマグネシウム塩、１つ以上のマンガン塩、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＨＰＯ4、Ｎａ2ＳＯ4、１つ以上のセレニウム塩、１つ以上のバナジウム塩、および１つ以上の亜鉛塩。
【００３４】
記載される液体培地は、１×製剤であり得るか、または個々の構成成分の溶解度が許容する場合、１×製剤よりも高い濃度のもの、例えば、２×、５×、１０×、２０×、５０×、５００×、または１０００Ｘ培地製剤として濃縮されてもよい。培地成分が濃縮法により濃縮ストック溶液として調製される場合、１×培地製剤を生成するために、適切な（十分な）量の各濃縮ストックが希釈剤と組み合わせられる。典型的には、使用される希釈剤は水であるが、水性緩衝剤、水性生理食塩水、または他の水溶液を含む他の溶液が使用されてもよい。１×溶液は、合理化された方法によって直接調製され、以下および実施例においてさらに説明される。濃縮ストック溶液を合理化された方法で調製する必要はない。
【００３５】
液体培地を調製するための方法
伝統的な濃縮法
１×液体は、米国特許第５，４７４，９３１号に詳述される「濃縮」技術を用いて調製することができる。この「濃縮」法では、（表２〜５に示すような）構成成分または成分を溶液中で調製して保存することができる。好ましくは、成分は濃縮溶液中でグループ化され、保存される。例えば、グループ化は、表１に示されるアミノ酸成分のグループであり得る。表２の成分の例示的なグループ化は、以下の通りであり得る：ｉ）１つのグループとして酸可溶性アミノ酸、ｉｉ）反応性、濃度、および適合性に基づいて一緒にグループ化された特定のビタミンおよび塩、ｉｉｉ）溶解度特性に従ってグループ化された微量金属、ｉｖ）反応性、濃度、および適合性に基づいて一緒にグループ化されたプルロニック、グルコース、緩衝剤、他のビタミンおよび塩。
【００３６】
グループ化された成分のストック溶液は、濃縮ストックとして作製することができる。例えば、１０×〜１００×の化学的ストック溶液を作製することが可能であり、これは、後に使用するために適切なアリコートサイズで液体としてまたは凍結して保存することができる。
【００３７】
ストック溶液は多くの利点を提供する。例えば、より高い最終濃度の所与の成分を１×培地に使用することができる。加えて、いくつかの成分は、濃縮ストック溶液中に保存されるとより安定である。さらに、濃縮ストック溶液は、１×培地に必要とされるよりも少ない保存体積を必要とする。米国特許第５，４７４，９３１号を参照されたい。「濃縮」法を用いてストック溶液を調製する例示的な方法、または酸可溶物Ｉ、酸可溶物ＩＩ、塩Ｉ、塩ＩＩの例示的なグループ化については、米国特許第，１９８，０８４号（米国特許第８，１９８，０８４号の２５、２６、２７、２８〜２９段目および表２は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００３８】
合理化された方法
一方、「合理化された」技術を用いて調製された液体は以下を行う：
【００３９】
ｉ）グループ化：構成成分は、種類、ｐＨ、濃度、および溶解度によってグループ化され、例えば、アルカリ性アミノ酸の場合、類似のＡｒｇとＬｙｓが一緒にグループ化される；またはアミノ酸は、酸性、塩基性、および中性グループのｐＨに従って複数のサブグループにグループ化され、理論上の溶解度、ｐＨ、およびベンチトップ試験に基づいて添加順序が最適化される。調合タンクへのアミノグループ添加の例示的な順序は、次の通りである：１）酸性、２）塩基性、および３）中性。
【００４０】
ｉｉ）製剤の構成成分に応じて特定のｐＨを標的とするようにアミノ酸の遊離塩基形態または塩形態を変換する；および／または、製剤に適切であるように、チロシンおよびシスチンを遊離塩基から二ナトリウム塩の形態に変換する；および／または、所望の最終標的ｐＨを達成するように、リン酸塩形態を二塩基性リン酸ナトリウムから一塩基性形態と二塩基性形態の組み合わせに変換する。
【００４１】
ｉｉｉ）酸および／または塩基の添加を減少させる：原料からの一貫性のない微量金属汚染物質の最大の源は、ｐＨの調整および構成成分の可溶化のために使用される酸および塩基、例えば、５Ｎ  ＨＣｌおよびＮａＯＨ、１２Ｎ  ＨＣｌ等によってもたらされる。提案される合理化プロセスは、酸および塩基の大量添加の必要性を制限し、多くの場合、その必要性を排除するため、酸および塩基の金属元素濃度の寄与によるロット間の変動が少ない（図３を参照）。
【００４２】
ｉｖ）より少ない側溶液の調製：溶液（または側溶液とも称されるストック溶液）および事前可溶化ステップの数を最小限に抑えることは、合理化された手法の一環である。したがって、「濃縮技術」におけるストック溶液の調製とは異なり、乾燥／湿潤成分が「溶液として調製」されるのではなく、直接使用され得る。したがって、溶液中に調製された酸可溶物グループＩおよびＩＩ、塩ＩおよびＩＩ等の大量に存在する構成成分は、代わりにそれらの天然の形態で、合理化された手法の調合タンクに直接添加される（すなわち、原料が乾燥粉末の場合、乾燥粉末が製剤調製タンクに直接添加されるか、または、原料が液体の場合、液体が直接添加される）。
【００４３】
ｖ）微量溶液のプール：従来は「濃縮」法において、複数の微量元素溶液がストック溶液として調製されていた。代わりに、合理化では、複数の微量元素溶液が１つの完全な「微量元素溶液」にまとめられ、最大８回添加する代わりにメインタンクで１回添加されるようになる。典型的には、アミノ酸および塩等の高濃度の構成成分が最初に添加されてから、より濃度が低く、より感受性の高い構成成分が添加される。構成成分を添加するための一般的な順序は、図１の右側にある「合理化された液体の表」に示す通りであり得、一実施形態において、成分は、表の上から下に示される順序で添加される。
【００４４】
したがって、合理化された方法によって調製される液体は、前記濃縮法によって調製された液体培地と比較して、
（ａ）構成成分を可溶化するためにより少ない酸および／もしくは塩基の添加を必要とし、かつ／または
（ｂ）酸および／もしくは塩基の添加による金属汚染物質を減少させ、かつ／または、
（ｃ）金属のロット間のばらつきが少なく、
（ｄ）調製する必要のある（側）溶液が少ないため、かつ構成成分の最適化されたグループ化に起因して、より少ない調合時間を必要とする。濃縮法の広範なｐＨおよび溶解度を有する構成成分を十分に可溶化するためには、さらなる時間が必要である。
【００４５】
一般に、構成成分の可溶化のための酸および／または塩基の添加に起因して、少なくとも金属イオン濃度にはロット間のばらつきがある。酸および塩基の添加量の減少と、合理化された方法によりプロトコル内の１２Ｎ濃酸が完全に排除されるという事実とに起因して、合理化された酸／塩基の添加における倍率減少は、製剤に応じて、約１〜１０倍、１〜２０倍、１〜３０倍、または１〜４０倍である。一実施形態において、酸／塩基の体積の減少は約２２倍であった。
【００４６】
金属のロット間のばらつきは、限定されないが、ＩＣＰ−ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ等を含む様々な分析方法によって測定することができる。適切な分析方法を用いて、全金属イオン濃度または特定の金属イオン濃度のいずれかを測定することができ、金属イオンの違いをロット間で比較する。特定の実施形態において、合理化された方法における全金属濃度のロット間のばらつきは、最大１０％低減された。他の実施形態において、全金属のロット間のばらつきは、約０．００１％、約０．０１％、約０．１％、約１％、約１〜２％、約１〜３％、約１〜４％、約１〜５％、約１〜６％、約１〜１０％、約１〜２０％、約１〜３０％、約１〜４０％、約１〜５０％、約１〜６０％、約１〜７０％、％、約１〜８０％、または約１〜９０％低減された。
【００４７】
他の実施形態において、様々な液体ロット間で個々の金属濃度を測定することができる。測定される金属は、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｍｏ、Ａｌ、およびＣａからなる群から選択される。合理化された培地のロット間には以下のような任意の金属の減少が存在し得る：約０．００１％未満、約０．０１％未満、約０．１％未満、約１％未満、約２％未満、約３未満％、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約０．００１〜１％未満、約０．００１〜５％未満、約０．００１〜１０％未満、約１〜１０％未満、約１０〜２０％未満、約２０未満〜３０％、約３０〜４０％未満、約４０〜５０％未満、約５０〜１００％未満、約５０〜９０％未満、約５０〜８０％未満、約５０〜７０未満％、約５０〜６０％未満。１つ以上の汚染金属の減少は、任意の他の方法、例えば、液体培地を調製する濃縮法によって調製された液体培地と比較することができる。特定の実施形態において、減少は約０．０００１％〜１００％であった。または、１つ以上の汚染金属の減少は、任意の他の方法、例えば、濃縮法によって調製された液体培地と比較して、合理化された方法によって調製した結果得られた液体において、約０．０００１％〜０．００１％、約０．０００１％〜０．０１％、約０．０００１％〜０．１％、約０．０００１％〜１％、約０．０００１％〜２％、約０．０００１％〜３％、約０．０００１％〜４％、約０．０００１％〜５％、約０．０００１％〜１０％、約１％〜５％、約１％〜１０％、約１％〜１５％、約１％〜２０％、約１％〜２５％、約１％〜３５％、約１０〜２０％、約１０〜３０％、約１０〜４０％、約１０〜５０％、約１０〜６０％、約１０〜７０％、約１０〜８０％、約１０〜９０％、約１０〜１００％である。
【００４８】
特定の実施形態において、個々の金属汚染％は、任意の他の方法、例えば、濃縮法によって調製された液体培地と比較して、Ｃｒで約４０〜１００％、Ｆｅで約０．０１〜２０％、Ｃｕで約０．１〜１５％、Ｍｎで約０．２５〜６０％、Ｎｉで約５〜１００％、Ｚｎで約５％、およびＭｏで約１５％減少する。
【００４９】
合理化された方法によって調製された液体培地は、無血清もしくはタンパク質不含またはその両方、低血清、低タンパク質、あるいはそれらの組み合わせであり得る。液体培地は、細胞を培養するために使用され得る。
【００５０】
２．無血清培地
バッチ間の変動、高タンパク質含有量、汚染物質（例えば、ウイルス、マイコプラズマ、プリオン）のリスク、限られた入手可能性、および高コストを含む血清に関連する潜在的な問題が、無血清培地の生産を推進してきた。さらに、血清を補充した培地で増殖した細胞に見られる発現レベルと比較して、無血清培地で増殖した細胞からは、改善されたレベルの組換えタンパク質発現を得ることができる（Ｂａｔｔｉｓｔａ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌａｂ．ｓ１２：６４−６８（１９９４））。
【００５１】
これらの無血清培地において、血清は、定義されたホルモンで、またはヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、および亜セレン酸塩を含有するＨＩＴＥＳまたはＩＴＥＳ等のホルモンカクテルで置き換えることができる。代替的に、無血清培地は、上皮細胞増殖因子または線維芽細胞増殖因子等の、内分泌腺からの増殖因子抽出物を含有し得る。無血清培地はまた、血清の代替物として、精製タンパク質（動物性または組換え）、ペプトン、アミノ酸、無機塩、および動物性または植物性の加水分解物（またはその画分）を含む他の構成成分を含有することもできる。
【００５２】
無血清培地は、化学的に定義されていても、または定義されていなくてもよい。化学的に定義された培地では、構成成分の同一性およびその量が既知であるのに対し、化学的に定義されていない培地の場合はその逆である。したがって、化学的に定義された培地は、一部には、汚染物質のリスクを低減し、バッチ間の変動を低減するように設計される。細胞培養培地に追加され得る化学的に定義されたサプリメントは、増殖因子、ホルモン、担体タンパク質、および／または付着因子を含む。好ましい実施形態において、小ペプチドを含む培地または供給物とともに用いられる基礎培地は、化学的に定義された培地である。別の好ましい実施形態において、小ペプチドを含む本発明の濃縮細胞培養培地または濃縮供給物もまた、化学的に定義された組成物である。さらに別の好ましい実施形態において、システインおよびチロシンを含む小ペプチドを含む本発明の濃縮供給物または培地は、単一部分供給物であり、また化学的に定義されている。別の態様において、システインおよびチロシンを含む小ペプチドを含む上記全ての組成物は、自動的にｐＨのバランスおよび浸透圧のバランスが保たれる。さらに別の態様において、システインおよびチロシンを含む小ペプチドを含む上記全ての組成物は、化学量論的にバランスが保たれる。
【００５３】
３．タンパク質不含培地
無血清培地は、血清を含有する細胞培養培地と比較して少量のタンパク質を含有する。しかしながら、無血清培地は、アルブミン、フェチュイン、様々なホルモン、および他のタンパク質を含む、様々な動物由来成分の１つ以上をなおも含有し得る。タンパク質の存在により、組換えタンパク質の精製が困難になり、時間がかかり、かつ高価になり、生成物の収量および／または純度の低下ももたらされ得る。したがって、一実施形態において、細胞培養培地はタンパク質を含まない。
【００５４】
タンパク質不含培地は、例えば、無血清培地からあらゆる残存タンパク質を除去することにより、当該技術分野で既知の方法によって得ることができる。細胞培養培地からのそのようなタンパク質の除去は、細胞増殖を支持する培地の能力を損なう可能性があるが、培地からタンパク質を除去することの影響を軽減するために、他の構成成分が培地に添加されてもよい。例えば、上記のように、シクロデキストリンはＢＳＡに取って代わることができ、鉄塩またはヒドロキシピリジン誘導体はトランスフェリンに取って代わることができる。他の場合には、動物組織または植物加水分解物（またはその画分）がタンパク質不含培地を補充するために使用されている。
【００５５】
４．流加培養
細胞の流加培養は、典型的には、高い製品濃度および容積生産性を目指して、細胞濃度を増加させるためおよび培養寿命を延長するために、タンパク質等の生体分子の工業的生産に用いられる。流加培養は、基礎培地へのグルコース、アミノ酸等の、細胞によって迅速に利用される栄養素を含み得る供給物の形態の、１つ以上の栄養素の制御された添加を伴う。栄養素（複数可）は、栄養素の枯渇および副産物の蓄積を妨げようとすることによって、ｐＨ、浸透圧、およびＣＯ2濃度等の重要なパラメータを、最適な産物の発現のために細胞増殖を促進するかまたは細胞死を最小限に抑えるレベル内に制御するのに役立つ。Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，３４９−３８６（Ｓａｄｅｔｔｉｎ  Ｏｚｔｕｒｋ  ａｎｄ  Ｗｅｉ−Ｓｈｏｕ  Ｈｕ  ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ２００６）を参照されたい。その場合にも、流加培養は、最終的には細胞生存率と適合しない、高濃度の阻害性代謝物および高い浸透圧をもたらすことが多い。流加培養では、典型的には、基礎培地を使用してバッチ様式で特定の時点まで細胞を増殖させる。その後、量の増加または培養物の希釈を最小限に抑えながら、栄養素を提供するために単一または複数の栄養素の濃縮溶液を含む培地サプリメント（濃縮供給物）が添加される。培地サプリメントが基礎培地に追加されると、例えば、より迅速な細胞増殖、倍加時間の短縮、より高い達成可能な細胞密度、またはタンパク質、例えば、抗体もしくは治療的な関心対象である他のタンパク質等の生体分子のより高い生産量もしくは収量によって示されるように、細胞培養が改善される。
【００５６】
５．基礎培地
基礎培地は、典型的には、細胞培養の維持のために使用され、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩、糖、ならびに他の構成成分を含む多くの成分を含むことができ、各成分は、インビトロで細胞培養を支持する量で存在する。細菌および古細菌培養を含む原核細胞培養、ウイルス培養、植物細胞培養、昆虫細胞培養、哺乳動物細胞培養に有用な基礎培地は、小ペプチドとともに使用することができる。基礎培地の例には、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、グラスゴー改変イーグル培地（ＧＭＥＭ）、ジョクリック改変イーグル培地、α改変イーグル培地、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地、フィッシャー培地、ライボビッツＬ−１５培地、トロウェルＴ−８培地、ウィリアムズ培地Ｅ、Ｂｉｇｇｅｒｓ培地、コンノート医学研究所（ＣＭＲＬ）１０６６培地、ＨａｍのＦ１０培地、ＨａｍのＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ  １０４、ＭＣＤＢ  １１０、ＭＣＤＢ  １５３、ミディアム１９９、ＮＣＴＣ  １３５ミディアム、およびウェイマスのミディアムＭＢ  ７５２／１が含まれる。ＣＨＯ細胞の場合、好ましい基本培地には、ＣＤＣＨＯ（商標）、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）、およびＤｙｎａｍｉｓ（商標）培地（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が含まれる。ＣＨＯ細胞のための好ましい濃縮供給サプリメントとして、ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ａ＋ＡＧＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ２５０２３）、ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ｂ＋ＡＧＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号２５０３０）、Ｆｅｅｄ（商標）Ｋｉｔ  Ａ＋、Ｂ＋、Ｃ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ３３１５８０１）、ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ｃ＋ＡＧＴ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ２５０３１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
６．培養細胞
本開示は、合理化された方法に従って調製される液体培地中で細胞を培養するための方法を対象とし、細胞は、一次上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頚部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、および網膜上皮細胞）、ならびに樹立細胞系およびそれらの株（例えば、ＣＨＯ細胞、２９３胚性腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＲＣ−５、２ＢＳおよび他を含むワクチン産生のための二倍体細胞、ハイブリドーマ、ＨｅＬａ子宮頚部上皮細胞、およびＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞、ＨｅＬａ  ２２９細胞、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ  ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８  ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ2細胞、クローンＭ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ−１細胞、Ｙ−１細胞、ＬＬＣ−ＰＫ1細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ1細胞、ＧＨ3細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ  ２５６細胞、ＭＨ1Ｃ1細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、およびＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞、またはそれらの誘導体）、任意の組織もしくは器官（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃、扁桃腺、骨髄、および血液）、脾臓を含むが、これらに限定されない）に由来する線維芽細胞、ならびに線維芽細胞および繊維芽細胞様細胞系（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５７３細胞、ＨＥＬ  ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ1細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ3Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ1Ｃ3細胞、ＫＬＮ2Ｏ5細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ-（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣII細胞、ならびにＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞、またはこれらの誘導体）、幹細胞、ｉＰＳＣ細胞等を含む。上記細胞のいずれも、組換え産物、タンパク質もしくは組換えタンパク質、融合産物もしくはタンパク質、抗体もしくは抗体断片、融合もしくは修飾抗体、ウイルスまたはウイルス産物もしくはウイルス成分、ＶＬＰ（ウイルス様粒子）、細胞、核酸、脂質、ホルモン、ステロイド、あるいは糖タンパク質を発現するように遺伝子操作することができる。
【００５８】
したがって、本開示はまた、合理化された方法に従って調製された液体培地で生物学的産物を作製するための方法を対象とし、生物学的産物は、組換え産物、タンパク質もしくは組換えタンパク質、融合産物もしくはタンパク質、抗体もしくは抗体断片、融合もしくは修飾抗体、ウイルスまたはウイルス産物もしくはウイルス成分、ＶＬＰ（ウイルス様粒子）、細胞、核酸、脂質、ホルモン、ステロイド、あるいは糖タンパク質である。
【００５９】
実施例１：最小限の酸／塩基を添加して液体培地を作製する
現在の一般的な液体製造プロセスは、アミノ酸等の分類上のグループの構成成分を可溶化するために大量の酸および塩基を用いる。このプロセスにはいくつかの欠点がある。酸および塩基の過剰な使用は、金属汚染物質、および培地成分に対する潜在的な変更または損傷に起因するロット間のばらつきと関連している。バイオプロダクション産業は、細胞培養培地中の金属濃度の一貫性および制御の欠如、ならびに金属による潜在的な細胞毒性について懸念を表明している。加えて、規制当局は、より良好な廃棄および環境問題のために、より低いレベルの重金属が製品に含まれることを要求している。
【００６０】
このばらつきを低減するために、アミノ酸等の構成成分のグループ化、構成成分形態の最適化、および添加の順序の最適化に依存して、培地成分を可溶化するために以前に用いられていた酸および塩基の量を大幅に減少する新規製造手法が開発された。一例において、培養培地ＣＤＣＨＯ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、後述の表２を参照）の液体製造プロセスは、最も可溶性の高い形態の構成成分を組み込み、１）ｐＨ、２）濃度、および３）構成成分の感受性または反応性に基づいて、構成成分のグループ化および添加の順序を最適化することによって変更された。新しいプロセスにより、５Ｎの酸および塩基の使用量が２２倍減少しただけでなく、１２Ｎ濃酸が完全に排除された。この手法は、酸／塩基に関連する汚染金属が減少し、最終製剤に対してクロムが３倍減少し、ニッケルが２倍減少したことを証明した。
【００６１】
また、新しい方法は、側溶液の数、ｐＨ調整、および調合プロセス時間を削減することにより、製造プロセスを合理化および簡素化し、大幅な製造コストの削減と安全性の向上をもたらした。特に、ＣＤＣＨＯ（商標）では、側溶液の数が２７％減少し、酸／塩基の添加およびｐＨ調整の数が３３％減少した：全体として、調合時間が４３％短縮された。この方法はまた、ロット間の金属イオン濃度のより高い一貫性も実現し、性能におけるより少ないばらつきに貢献し得る。実際に、図６に見られるように、濃縮技術によって調製されたＣＤＣＨＯ（商標）培地に比べて、合理化された方法によって調製されたＣＤＣＨＯ（商標）における性能の改善が観察された。
【００６２】
方法
最初に、所望のｐＨでの最適な溶解度について構成成分を評価した。次いで、構成成分を、構成成分カテゴリ、例えば、アミノ酸、ビタミン、塩、糖、微量金属、緩衝剤、および感受性または反応性の構成成分を含むグループにグループ化した。感受性または反応性グループにはこれらの構成成分が含まれるが、これらのみには限定されない：すなわち、ポリアミン、反応性塩化マグネシウム、塩化コリン、吸湿性グルコース、およびプルロニック。これらの構成成分のいくつかは、長い混合時間のために、不良な可溶性またはｐＨドリフトを呈する場合がある。
【００６３】
最終ｇ／Ｌ濃度（現在１ｍｇ／Ｌ）での計量可能性について構成成分を評価した。閾値を下回る構成成分には、新たに調製された濃縮側溶液が必要であった。
【００６４】
メルクインデックスに基づいて、または文献で既知の一般的な知識に基づいて、または当該技術分野における日常的な方法を用いて内部標準化し、溶解度の上限について構成成分を評価した。限界を超える構成成分は、メインタンクでの添加前に、最小限の酸または塩基で可溶化する必要があった。
【００６５】
化学反応を必要とする構成成分（たとえば、鉄キレート）は、反応要件を管理するため（例えば、ｐＨ、プロセス、タイムラインを管理するため）に、別個に新たに調製する必要がある。
【００６６】
各グループの構成成分を再検討して、最適なｐＨグループを決定し、類似のｐＨを有する構成成分を酸性、塩基性、および中性のサブグループに分けた。これはアミノ酸の場合に特に重要である。アミノ酸の例示的な分類を表２に示す。最終製剤を調製する前に、ベンチトップでグループ化を確認することが強く奨励される。
【００６７】
最終調合タンクへの構成成分の添加の順序は、１）ｐＨおよび２）濃度および３）構成成分の感受性または反応性に基づいていた。これらは、２０リットルの最小スケールでベンチトップパイロットを実行し、１００リットルで追加の試験を行うことにより標準化／確認した。
【００６８】
実施例１で使用したＣＤ培地成分を表２に示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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【００６９】
合理化された方法を用いて液体培地を作製するための例示的な方法：上記の表２および後述の表３〜５に示される任意の例示的な液体製剤は、合理化された方法において使用することができる。
１）製剤中の構成成分に応じて特定のｐＨを標的とするように、アミノ酸の遊離塩基形態／塩形態を変更および変換する。
２）アミノ酸グループを、酸性、塩基性、および中性グループのｐＨに従って複数のサブグループに変更し、理論上の溶解度、ｐＨ、およびベンチトップ試験に基づいて添加順序を最適化する。調合タンクへのアミノグループ添加の例示的な順序は、次の通りに決定された：１）酸性、２）塩基性、および３）中性。
３）所望の最終標的ｐＨを達成するように、等モルのリン酸塩形態を全ての二塩基性リン酸ナトリウムから一塩基性形態と二塩基性形態の組み合わせに変換する。
４）必要に応じて、等モルのスペルミン形態を塩酸スペルミンに変換する。
５）不要な側溶液を取り出し、メイン調合タンクへの直接添加として組み込む（すなわち、溶液の代わりに、構成成分がそれらの天然の形態で直接添加された）。
６）１つの完全な微量元素溶液（微量元素溶液の組み合わせ）を作製および添加することにより、現在の複数回の微量元側溶液のメイン調合タンクへの添加を変更する。
７）葉酸の可溶化プロセス（溶解限界を超える）を、新たに調製されたｐＨ溶液から最小限の水酸化ナトリウム可溶化側溶液に変更する。
８）鉄およびＥＤＴＡの濃度に基づいて酸の添加を標的とする、新しい、新たに調製された鉄キレート化溶液の最良実施例を組み入れた。
９）塩化コリン（吸湿性）を取り出して別のグループに入れるようにビタミングループを変更する。
１０）グルコースを独自の新しいグループに入れるよう変更する（潜在的な反応性および最も頻繁なカスタム変更）。
１１）最終的な理論上の塩化ナトリウムの約８５％を含む、より高い濃度の塩グループを作成した。（以前は浸透圧調整のためのみに添加されていた。）
１２）約７．５％のプルロニック側溶液を作製して、タンク内での発泡を最小限に抑え、可溶化するための混合時間を短縮する。（以前は最後に直接添加されていた）。
【００７０】
以下の表３〜５に列挙される成分を上記の方法に従って一緒に混合し、合理化された方法によって調製される完全な液体培養培地を形成することができる。これらの完全培地は、様々な哺乳動物細胞、例えば、２９３細胞の培養に使用するのに適している。２９３細胞は、ＨＥＫ２９３細胞とも称される。表３〜５に提示される情報、および当業者が有する知識に基づいて、過度の実験を行うことなく、有効な合理化された液体培地製剤を得ることができる。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【００７１】
本発明を、発明を実施するための形態と併せて記載している一方で、前述の記載は、例示を意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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