(57)【要約】対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を検出するための方法が本明細書に提示される。一態様では、方法は、対象由来の試料中の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定してシーケンシングパラメータを生成するステップとを含む。方法はまた、シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して予測結果を生成するステップと、予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して調整された結果を生成し、それにより、対象におけるＴＭＢを検出するステップとを含む。他の態様は、対象におけるがんを処置するためのカスタマイズされた療法を選択する方法、および対象におけるがんを処置する方法を対象とする。さらに他の態様は、対象におけるＴＭＢを検出するために使用される、関連するシステムおよびコンピューター可読媒体を含む。
2021531775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｂ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｃ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｄ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、前記対象における前記ＴＭＢを決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料を提供するステップと、
（ｂ）前記試料中の核酸を増幅させて、増幅した核酸を生成するステップと、
（ｃ）前記増幅した核酸のシーケンシングを行って、配列情報を生成するステップと、
（ｄ）前記配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｅ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｆ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｇ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、前記対象における前記ＴＭＢを決定するステップと
を含む方法。
【請求項３】
対象におけるがんを処置するために１つまたは複数のカスタマイズされた療法を選択する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｂ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｃ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｄ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、
（ｅ）前記調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較して、前記対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップと
を含む方法。
【請求項４】
対象におけるがんを処置する方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｂ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｃ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｄ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、
（ｅ）前記調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較して、前記対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップと、
（ｆ）前記調整された結果と前記比較用結果が実質的にマッチする場合に、識別されたカスタマイズされた療法の少なくとも１つを前記対象に施行して、それにより、前記対象におけるがんを処置するステップと
を含む方法。
【請求項５】
対象におけるがんを処置する方法であって、１つまたは複数のカスタマイズされた療法を前記対象に施行し、それにより、前記対象におけるがんを処置することを含み、前記カスタマイズされた療法が、
（ａ）前記対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、
（ｂ）前記核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｃ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｄ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、
（ｅ）前記調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較するステップと、
（ｆ）前記調整された結果と前記比較用結果が実質的にマッチする場合に、前記対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップと
によって識別されたものである、方法。
【請求項６】
前記観測変異カウントおよび／または前記腫瘍割合が、前記核酸において識別される複数の同義変異、複数の非同義変異、および／または複数の非コード変異を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記観測変異カウントおよび／または前記腫瘍割合が、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入または欠失（インデル）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復伸長、およびエピジェネティックバリアントからなる群から選択される複数の変異を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記観測変異カウントおよび／または前記腫瘍割合から、ドライバー変異および／またはクローン性造血由来変異が除外される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記観測変異カウントを決定するために、所与の一塩基バリアント（ＳＮＶ）または所与の挿入もしくは欠失（インデル）に関して検出限界を下回る１つまたは複数の可能性のある変異のプールされたエビデンスを使用することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記予測変異割合を実際の変異カウントの観測割合として使用することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記観測変異カウントおよび／または前記腫瘍割合が、前記核酸において識別される複数の体細胞変異を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記観測変異カウントから１つまたは複数の既知のがんドライバーおよび／またはパッセンジャー変異が除外される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記配列情報を１つまたは複数の参照配列と比較して、前記観測変異カウントを識別することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照配列が、ｈｇ１９および／またはｈｇ３８の少なくとも部分配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍割合が、前記核酸において識別される全ての体細胞変異の最大変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍割合が、前記試料中の全ての核酸の約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、または約５％未満である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記カバレッジを決定するために、前記核酸における所与のヌクレオチド位を含む複数の独特のｃｆＤＮＡ断片を識別することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記カバレッジを決定するために、前記核酸における所与のヌクレオチド位を構成する独特の細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子の数の中央値を識別することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記カバレッジが、前記試料中に存在する前記核酸における所与のヌクレオチド位において１０個から５０，０００個の間のｃｆＤＮＡ断片である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記予測変異割合および／または前記予測変異割合の前記予測分布が、前記変異割合に関して約９５％またはそれよりも大きな信頼区間を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記予測変異割合の９５％信頼区間の上限を使用して、前記観測変異カウントの下限を生成することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
所与の変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）における変異が予測ＭＡＦの分布にわたって識別される確率を算出して、前記予測変異割合を決定することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
予測相対的ＭＡＦの分布に前記腫瘍割合を掛けて、ＭＡＦを生成することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
予測ＭＡＦの前記分布が、以下の二項比率の信頼区間を使用して算出される、請求項２２または２３に記載の方法：
【数５】
2021531775.tif 000015
（式中、ｆは、コールされる変異の予測割合であり、ｎ＿真は、予測される実際の変異であり、これはｆを考慮して観測される変異の数と等しく、ｚは信頼水準である）。
【請求項２５】
ｆが閾値ｆ未満の場合、ＴＭＢは決定されない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｆが閾値ｆを超える場合、ＴＭＢが決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
以下の方程式：
観測された変異の割合＝ΣＭＡＦ（Ｐ（変異のコール｜ＭＡＦ）×Ｐ（ＭＡＦにおける変異））
（式中、Ｐは確率であり、ＭＡＦは変異対立遺伝子割合である）
を使用して前記予測結果を決定することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
相対的ＭＡＦの予測分布が、対照試料データセットの１つまたは複数のデータセットから得られる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記対照試料データセットが、少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１，０００、少なくとも約５，０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１５，０００、少なくとも約２０，０００、少なくとも約２５，０００、少なくとも約３０，０００、またはそれよりも多くの対照試料を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対照試料データセットにおいて観測される最大（ｍａｘ）ＭＡＦが、約０．５％、約１％、約２％、約５％または約１０％を構成する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記相対的ＭＡＦを、以下の方程式：
Ｆ＝１／（１＋（Ｐ＿５０／相対的−ＭＡＦ）ｎ）
（式中、Ｆは、累積分布関数であり、Ｐ＿５０は、相対的ＭＡＦの中央値であり、相対的−ＭＡＦは相対的ＭＡＦであり、ｎは、相対的な分布の形状を当てはめるための指数である）
を使用して曲線に当てはめることを含む、請求項２８から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料における前記観測変異カウントを予測変異割合または前記予測変異割合の信頼区間の上限／下限で割って、前記調整された結果を生成することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記調整された結果が、変異対立遺伝子割合の範囲にわたって前記核酸において検出される複数の変異を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記観測変異カウントを前記予測結果で割って、前記調整された結果を生成することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記調整された結果が、可能性が最も高い実際の変異カウントの予想を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記調整された結果が、可能性が最も低い実際の変異カウントの予想を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記調整された結果が、調整された変異カウントを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記調整された変異カウントが、前記観測変異カウントよりも大きいかまたはそれと等しい、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象由来の前記試料中の前記核酸から前記配列情報を得ることを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記配列情報を、前記核酸の標的とされるセグメントから得る、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
標的とされるセグメントが、約１から約１００，０００の間の異なるおよび／または重複するゲノム領域を含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象由来の前記試料を得ることを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記試料が、組織、血液、血漿、血清、喀痰、尿、精液、膣液、糞便、滑液、脊髄液、および唾液からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料が、組織を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、血液、血漿、および／または血清を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が、哺乳動物対象である、請求項４２から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸が、細胞外遊離核酸を含む、請求項４２から４７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸が、細胞内核酸を含む、請求項４２から４８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸が、循環腫瘍核酸を含む、請求項４２から４９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸を循環腫瘍細胞から得る、請求項４２から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記核酸が、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、請求項４２から５１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記試料中の前記核酸の少なくとも１つのセグメントを増幅させて、少なくとも１つの増幅した核酸を生成することを含む、請求項４２から５２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記増幅した核酸のシーケンシングを行って、前記配列情報を生成することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸の少なくとも約５０，０００、約１００，０００、約１５０，０００、約２００，０００、約２５０，０００、約５００，０００、約７５０，０００、約１，０００，０００、約１，５００，０００、約２，０００，０００ヌクレオチド、またはそれよりも多くのヌクレオチドのシーケンシングを行って、前記配列情報を生成することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記シーケンシングが、標的化シーケンシング、イントロンシーケンシング、エキソームシーケンシング、および全ゲノムシーケンシングからなる群から選択される、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記カスタマイズされた療法が、少なくとも１つの免疫療法を含む、請求項３から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫療法が、少なくとも１つのチェックポイント阻害抗体を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記免疫療法が、ＰＤ−１、ＰＤ−２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０に対する抗体を含む、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫療法が、少なくとも１つの腫瘍型に対する炎症促進性サイトカインの投与を含む、請求項５７から５９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記免疫療法が、少なくとも１つの腫瘍型に対するＴ細胞の投与を含む、請求項５７から６０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記がんが、胆道がん、膀胱がん、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生性癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、直腸がん、結腸直腸癌、結腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道がん、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼内黒色腫、ぶどう膜黒色腫、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝がん、肝癌、ヘパトーマ、肝細胞癌、胆管細胞癌、肝芽腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽細胞腫、中咽頭がん、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵がん、膵管腺癌、偽乳頭状新生物、腺房細胞癌、前立腺がん、前立腺腺癌、皮膚がん、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、小腸癌、胃がん、胃癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮がん、および子宮肉腫からなる群から選択される少なくとも１つの腫瘍型を含む、請求項３から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記配列情報が、核酸シーケンサーによって生成された前記核酸の配列読み取りを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記核酸シーケンサーにより前記核酸に対してパイロシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたはハイブリダイゼーションによるシーケンシングを実施して、シーケンシング読み取りを生成する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
シーケンシングの前にゲノムまたはトランスクリプトームから１つまたは複数の領域を選択的に富化させるステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
選択的に富化された領域をシーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記配列情報を前記核酸の標的とされるセグメントから得て、前記標的とされるセグメントをシーケンシングの前にゲノムまたはトランスクリプトームから１つまたは複数の領域を選択的に富化させることによって得る、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
得られた標的とされるセグメントをシーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
シーケンシングの前に、分子バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを前記核酸に付着させるステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記核酸を一意的にタグ付けする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記核酸を非一意的にタグ付けする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記アダプターが、２から１，０００，０００の間の分子バーコードを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
分子バーコードを含むアダプターを核酸の各末端にランダムに付着させることを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記アダプターを前記核酸に平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーションによって付着させる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記アダプターが、Ｔ尾部を有するおよび／またはＣ尾部を有するアダプターである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
配列読み取りを配列読み取りのファミリーに群分けするステップをさらに含み、各ファミリーが、前記試料中の核酸から生成された配列読み取りを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
前記方法の少なくとも一部が、コンピューターにより実行される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
１つまたは複数のＴＭＢスコアを提示する電子形式の報告書を作成するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記試料をＴＭＢ−Ｈｉｇｈ試料に分類するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記変異カウントを、表２に列挙されている遺伝子を含む遺伝子またはゲノム領域のセットの中で決定する、前記方法請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
がんを有するか、または有する疑いがある対象由来の細胞外遊離核酸分子の試料を特徴付ける方法であって、
前記試料に対してアッセイを実施して、表２に列挙されているものから選択される少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種の遺伝子またはゲノム領域に遺伝的バリエーションが存在するかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【請求項８２】
前記アッセイを１，０００種以下の遺伝子に対して実施する、請求項１３９に記載の方法。
【請求項８３】
アッセイされた遺伝子のうちの少なくとも１種に遺伝的バリエーションの存在が決定された対象にがん処置を施行するステップをさらに含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項８４】
前記試料から核酸分子を単離し、前記少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種の遺伝子に対応する核酸分子を、前記少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種の遺伝子由来のセグメントを含有するプローブを用いて富化させるステップをさらに含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項８５】
がんを有するか、またはがんを有する疑いがある対象由来の細胞外遊離ＤＮＡの試料を解析するための方法であって、
表２に列挙されている遺伝子からなる群から少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種のゲノム領域を選択的に富化させて、富化されたライブラリーを生成するステップと、
前記富化されたライブラリーを増幅させ、シーケンシング反応を実施するステップと、
前記ゲノム領域における遺伝子バリアントの存在について解析するステップと
を含む方法。
【請求項８６】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して新抗原オーファン免疫受容体情報を生成する方法であって、
（ａ）がんと診断された対象から得た血液試料中の核酸から得られた配列情報をコンピューターにより受け取るステップであって、前記配列情報の少なくとも第１の部分が、前記血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）から得られたシーケンシング読み取りを含み、前記配列情報の少なくとも第２の部分が、前記血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸から得られたシーケンシング読み取りを含む、ステップと、
（ｂ）前記配列情報の少なくとも前記第１の部分から前記対象の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）スコアを決定するステップと、
（ｃ）前記配列情報の少なくとも前記第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップと、
（ｄ）前記ＴＭＢスコアと前記１つまたは複数のクローン型を相関させて、前記対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別し、それにより、前記新抗原オーファン免疫受容体情報を生成するステップと
を含む方法。
【請求項８７】
前記新抗原オーファン免疫受容体情報を使用して前記対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記１つまたは複数のカスタマイズされた療法を前記対象に施行するステップをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記配列情報の前記第１の部分における１つまたは複数のバリアントを識別して、前記ＴＭＢスコアを決定することを含み、前記バリアントが、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入または欠失（インデル）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復バリアント、およびエピジェネティックバリアントからなる群から選択される１つまたは複数の変異を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記反復バリアントが、１つまたは複数のマイクロサテライトバリアントを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記配列情報の前記第２の部分における１つまたは複数の他のバリアントを識別して、前記ＴＭＢスコアを決定するステップをさらに含み、前記他のバリアントが、前記血液試料中の前記１つまたは複数の免疫細胞に由来する前記核酸における１つまたは複数の体細胞変異を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
がんと診断された対象由来の血液試料中の多数の解析物を解析する方法であって、
（ａ）前記血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）の第１のセットおよび前記血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞由来の核酸の第２のセットを単離するステップと、
（ｂ）Ｔ細胞受容体のアルファおよび／またはベータサブユニットの少なくとも一部をコードする核酸の前記第２のセットの１つまたは複数の領域を増幅させて、富化された核酸の第２のセットを生成するステップと、
（ｃ）ｃｆＮＡの前記第１のセットの１つまたは複数の領域および前記富化された核酸の第２のセットの１つまたは複数の領域のシーケンシングを行って、配列情報を作製するステップと、
（ｄ）前記配列情報から前記対象の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）スコアを決定するステップと、
（ｅ）前記配列情報から免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップと、
（ｆ）前記ＴＭＢスコアと前記１つまたは複数のクローン型を相関させて、前記対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別し、それにより、がんと診断された前記対象由来の前記血液試料中の前記多数の解析物を解析するステップと
を含む方法。
【請求項９３】
少なくとも部分的にコンピューターを使用して対象由来の血液試料中の核酸を解析する方法であって、
（ａ）前記対象由来の前記血液試料中の前記核酸から得られた配列情報をコンピューターによって受け取るステップであって、前記配列情報の少なくとも第１の部分が、前記血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）から得られたシーケンシング読み取りを含み、前記配列情報の少なくとも第２の部分が、前記血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸から得られたシーケンシング読み取りを含む、ステップと、
（ｂ）前記配列情報の前記第１の部分における１つまたは複数のバリアントおよび前記配列情報の前記第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別し、それにより、前記対象由来の前記血液試料中の前記核酸を解析するステップと
を含む方法。
【請求項９４】
（ｉ）前記配列情報の前記第１の部分における観測変異カウントを決定するステップと、
（ｉｉ）前記配列情報の前記第１の部分における少なくとも前記ｃｆＮＡの腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、
（ｉｉｉ）前記シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または前記予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、
（ｉｖ）前記予測結果を考慮して前記観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、前記対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定するステップと
を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
（ｉ）前記配列情報の前記第１の部分および／または第２の部分に由来する複数の反復性核酸遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、前記複数の反復性核酸遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、前記配列情報が、反復性核酸遺伝子座の集団を含む、ステップと
（ｉｉ）所与の反復性核酸遺伝子座の部位スコアが前記所与の反復性核酸遺伝子座についての部位特異的訓練閾値を超える場合、前記所与の反復性核酸遺伝子座を不安定であるとコールして、前記複数の反復性核酸遺伝子座由来の複数の不安定な反復性核酸遺伝子座を含む反復性核酸不安定性スコアを生成するステップと、
（ｉｉｉ）前記反復性核酸不安定性スコアが前記血液試料中の反復性核酸遺伝子座の集団についての集団訓練閾値を超える場合、前記血液試料の反復性核酸不安定性の状態を不安定であると分類し、それにより、前記血液試料の前記反復性核酸不安定性の状態を決定するステップと
を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
（ｉ）前記配列情報の前記第１の部分および／または第２の部分由来の複数の反復性デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、前記複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、前記配列情報が、反復性ＤＮＡ遺伝子座の集団を含む、ステップと、
（ｉｉ）前記複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座のそれぞれについて、所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座の部位スコアを前記所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座についての部位特異的訓練閾値と比較するステップと、
（ｉｉｉ）前記所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座の前記部位スコアが前記所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座についての前記部位特異的訓練閾値を超える場合、前記所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座を不安定であるとコールして、前記複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座由来の複数の不安定な反復性ＤＮＡ遺伝子座を含む反復性ＤＮＡ不安定性スコアを生成するステップと、
（ｉｖ）前記反復性ＤＮＡ不安定性スコアが前記血液試料中の反復性ＤＮＡ遺伝子座の集団についての集団訓練閾値を超える場合、前記血液試料の反復性ＤＮＡ不安定性の状態を不安定であると分類し、それにより、前記血液試料の前記反復性ＤＮＡ不安定性の状態を決定するステップと
を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
（ｉ）前記配列情報の前記第１の部分および／または第２の部分由来の複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、前記複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、前記配列情報が、マイクロサテライト遺伝子座の集団を含む、ステップと、
（ｉｉ）前記複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれについて、所与のマイクロサテライト遺伝子座の部位スコアを前記所与のマイクロサテライト遺伝子座についての部位特異的訓練閾値と比較するステップと、
（ｉｉｉ）前記所与のマイクロサテライト遺伝子座の前記部位スコアが前記所与のマイクロサテライト遺伝子座についての前記部位特異的訓練閾値を超える場合、前記所与のマイクロサテライト遺伝子座を不安定であるとコールして、前記複数のマイクロサテライト遺伝子座由来の複数の不安定なマイクロサテライト遺伝子座を含むマイクロサテライト不安定性スコアを生成するステップと、
（ｉｖ）前記マイクロサテライト不安定性スコアが前記血液試料中のマイクロサテライト遺伝子座の前記集団についての集団訓練閾値を超える場合、前記血液試料のマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の状態を不安定であると分類し、それにより、前記血液試料の前記ＭＳＩの状態を決定するステップと
を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
配列可変標的領域セットとエピジェネティック標的領域セットとを含む、細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の標的領域の複数のセットを捕捉することを含み、それにより、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子のセットが生じ、前記配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子よりも高い捕捉収率で前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子のセット内に捕捉される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記ｃｆＮＡが、細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
前記血液試料中の前記１つまたは複数の免疫細胞に由来する前記核酸が、ｍＲＮＡおよび／またはｇＤＮＡを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０１】
前記血液試料中の前記１つまたは複数の免疫細胞に由来する前記核酸が、抗体、Ｂ細胞受容体、およびＴ細胞受容体からなる群から選択される免疫学的ポリペプチドの少なくとも一部をコードする、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ｃｆＮＡを前記血液試料の血漿画分または血清画分から得ることを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０３】
前記血液試料のバフィーコート画分由来の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸を得ることを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０４】
通信ネットワークを通じて対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸からシーケンシング情報を得る通信インターフェースと、
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、少なくとも１つのコンピュータープロセッサと、少なくとも１つのコンピュータープロセッサによって実行されると、
（ｉ）がんと診断された対象から得た血液試料中の核酸から得られた配列情報を受け取るステップであって、前記配列情報の少なくとも第１の部分が、前記血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）から得られたシーケンシング読み取りを含み、前記配列情報の少なくとも第２の部分が、前記血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸から得られたシーケンシング読み取りを含む、ステップと、
（ｉｉ）前記配列情報の少なくとも前記第１の部分から前記対象の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）スコアを決定するステップと、
（ｉｉｉ）前記配列情報の少なくとも前記第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップと、
（ｉｖ）前記ＴＭＢスコアと前記１つまたは複数のクローン型を相関させて、前記対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別するステップと
を含む方法を実行する、機械により実行可能なコードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターと
を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年７月２３日出願の米国仮特許出願第６２／７０２，２８０号、２０１８年１０月５日出願の同第６２／７４１，７７０号、２０１８年１２月２０日出願の同第６２／７８２，８９４号、および２０１９年３月２６日出願の同第６２／８２４，２４６号の利益を主張し、また、その出願日に依拠するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
腫瘍は、細胞の異常な成長である。ＤＮＡは、例えば正常細胞および／またはがん細胞が死滅した際に、細胞外遊離ＤＮＡおよび／または循環腫瘍ＤＮＡとして体液中に放出されることも多い。腫瘍は良性または悪性であり得る。多くの場合、悪性腫瘍はがんと称される。
【０００３】
がんは、世界的に疾患の主要な原因になっている。毎年、世界中で数千万人ががんと診断され、半数よりも多くががんにより最終的に死亡する。多くの国で、がんは心血管疾患に次いで２番目に多い死因として順位付けられる。多くのがんに関して、早期検出が転帰の改善に関連付けられる。
【０００４】
がんは、通常、個体の正常な細胞における変異の蓄積によって引き起こされ、その少なくとも一部により、細胞分裂の不適切な制御が生じる。そのような変異は、一般に、一塩基バリエーション（ＳＮＶ）、遺伝子融合、挿入および欠失（インデル）、塩基転換、転座、ならびに反転を含む。がん内の変異の数は、がんの免疫療法による影響の受けやすさの指標になり得る。
【０００５】
がんは、多くの場合、腫瘍の生検、その後の細胞病理、バイオマーカーまたは細胞から抽出されたＤＮＡの解析によって検出される。しかし、つい最近、血液または尿などの体液中の細胞外遊離核酸（例えば、循環核酸、循環腫瘍核酸、エキソソーム、アポトーシス細胞および／または壊死性細胞由来の核酸）からもがんを検出することができることが提唱された（例えば、Ｓｉｒａｖｅｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １４：  ５３１−５４８  （２０１７）を参照されたい）。そのような試験には、非侵襲的であり、生検およびがんの全部分からの核酸試料採取のために疑わしいがん細胞を識別することなく実施できるという利点がある。しかし、そのような試験は、体液中に放出される核酸の量が少なくて変動しやすく、また、そのような流体からの核酸の解析できる形態での回収率も低く変動しやすいという事実によって複雑なものになる。これらの変動源により、試料の間での腫瘍遺伝子変異量（ｔｕｍｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ）（ＴＭＢ）の比較の適中度が曖昧なものになり得る。
ＴＭＢは、腫瘍ゲノム内の腫瘍細胞が有する変異の測定値である。ＴＭＢは、がんと診断された、またはその徴候を有する疑いがある対象に対してがん免疫療法（Ｉ−Ｏ）による療法などの特定の型のがん療法が有益であるかどうかを評価するために使用することができるバイオマーカーの一種である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｒａｖｅｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １４：  ５３１−５４８  （２０１７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本出願は、患者試料における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）の決定および解析において有用であり、がん処置決定のガイドに役立つ方法、コンピューター可読媒体、およびシステムを開示する。伝統的に、変異率をカウントすることによって得られるＴＭＢは、腫瘍割合（例えば、変異対立遺伝子割合（ｍｕｔａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ＭＡＦ））および／またはカバレッジが小さい場合には、変異をコールするためのアッセイの感度が低下するので、不正確である頻度が高い。したがって、ある特定の態様では、観測ＴＭＢを、アッセイの感度の種々の尺度、例えば、腫瘍割合（所与の試料中の変異のＭＡＦを設定する）、カバレッジ、および／または同様のものなどを考慮して調整する。そのような調整を行わなかった場合、例えば、ＴＭＢ−Ｈｉｇｈであるが腫瘍割合が小さく、かつ／またはカバレッジが小さい試料は、一般には、ＴＭＢ−Ｌｏｗと誤って報告されることになる。そのような転帰は、そのような結果に基づいて処置の決定を行う場合、患者に対して下流で重要な意義を有し得る。したがって、本明細書に開示される調整方法および関連する態様のインプリメンテーション前には、対照試料中の平均変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）は、一般には最大（ｍａｘ）ＭＡＦおよびカバレッジに依存する。これらの方法および関連する態様のインプリメンテーション後には、対照または比較用試料の間の平均変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）は最大（ｍａｘ）ＭＡＦおよびカバレッジのどちらにも基本的に依存しない。
【０００８】
本開示の単に例示的な実施形態が示され、説明されている以下の詳細な説明から本開示の追加的な態様および利点が当業者には容易に明らかになろう。理解される通り、本開示では、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細を、全て本開示から逸脱することなく種々の明白な点で改変することができる。したがって、図および説明は例示的性質のものであるとみなされるべきであり、制限するものとみなされるべきではない。
【０００９】
ある態様では、本開示は、対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定する方法であって、（ａ）対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｎｔ）を決定するステップと、（ｂ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｃ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｄ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、対象におけるＴＭＢを決定するステップとを含む方法を提供する。本明細書に開示される方法および関連するインプリメンテーションの一部の実施形態では、観測変異カウントを、これらのカウントに関連付けられる新抗原の可能性に基づいて調整する。所与の対象のハプロタイプに応じて、例えば、特定の変異または変異のクラスターが、その特定の対象において他の対象よりも新抗原性であり得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、例えば、対象における処置の経過を経時的に評価またはモニタリングするために所与の対象におけるＴＭＢを多数の時点で決定することを含む。
【００１０】
別の態様では、本開示は、対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定する方法であって、（ａ）対象由来の試料を提供するステップと、（ｂ）試料中の核酸を増幅させて、増幅した核酸を生成するステップと、（ｃ）増幅した核酸のシーケンシングを行って、配列情報を生成するステップと、（ｄ）配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、（ｅ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｆ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｇ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、対象におけるＴＭＢを決定するステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本開示は、対象におけるがんを処置するために１つまたは複数のカスタマイズされた療法を選択する方法であって、（ａ）対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、（ｂ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｃ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｄ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、（ｅ）調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較して、対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップとを含む方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法であって、（ａ）対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、（ｂ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｃ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｄ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、（ｅ）調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較して、対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップと、（ｆ）調整された結果と比較用結果が実質的にマッチする場合に、識別されたカスタマイズされた療法の少なくとも１つを対象に施行して、それにより、対象におけるがんを処置するステップとを含む方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本開示は、対象におけるがんを処置する方法であって、１つまたは複数のカスタマイズされた療法を対象に施行し、それにより、対象におけるがんを処置することを含み、カスタマイズされた療法が、（ａ）対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、（ｂ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｃ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｄ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、（ｅ）調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較するステップと、（ｆ）調整された結果と比較用結果が実質的にマッチする場合に、対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップとによって識別されたものである、方法を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合は、核酸において識別される複数の同義変異、複数の非同義変異、および／または複数の非コード変異を含む。一部の実施形態では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合は、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入または欠失（インデル）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復伸長、およびエピジェネティックバリアントからなる群から選択される複数の変異を含む。一部の実施形態では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合からドライバー変異および／または腫瘍に関連しない変異（例えば、クローン性造血由来変異−ＣＨ変異）が除外される。
【００１５】
一部の実施形態では、方法は、観測変異カウントを決定するために、所与の一塩基バリアント（ＳＮＶ）または所与の挿入もしくは欠失（インデル）に関して検出限界を下回る１つまたは複数の可能性のある変異のプールされたエビデンスを使用することを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、方法は、実際の変異カウントの観測割合である予測変異割合を生成することを含む。一部の実施形態では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合は、核酸において識別される複数の体細胞変異を含む。一部の実施形態では、観測変異カウントから１つまたは複数の既知のがんドライバーおよび／またはパッセンジャー変異が除外される。
【００１７】
一部の実施形態では、方法は、配列情報を１つまたは複数の参照配列と比較して、観測変異カウントを識別することを含む。
【００１８】
一部の実施形態では、参照配列は、ｈｇ１９および／またはｈｇ３８の少なくとも部分配列を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、腫瘍割合は、核酸において識別される全ての体細胞変異の最大（ｍａｘｉｍｕｍ）変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）を含む。一部の実施形態では、腫瘍割合は、試料中の全ての核酸の約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、または約５％未満である。
【００２０】
一部の実施形態では、方法は、カバレッジを決定するために、核酸における所与のヌクレオチド位を含む複数の独特のｃｆＤＮＡ断片を識別することを含む。一部の実施形態では、方法は、カバレッジを決定するために、核酸における所与のヌクレオチド位を構成する独特の細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子の数の中央値を識別することを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、カバレッジは、試料中に存在する核酸における所与のヌクレオチド位において１０個から５０，０００個の間のｃｆＤＮＡ断片である。
【００２２】
一部の実施形態では、予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布は、変異割合に関して約９５％またはそれよりも大きな信頼区間を含む。一部の実施形態では、方法は、予測変異割合の９５％信頼区間の上限を使用して、観測変異カウントの下限を生成することを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、方法は、所与の変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）における変異が予測ＭＡＦの分布にわたって識別される確率を算出して、予測変異割合を決定することを含む。一部の実施形態では、方法は、予測相対的ＭＡＦの分布に腫瘍割合を掛けて、ＭＡＦを生成することを含む。本明細書で使用される場合、「ＭＡＦ」という用語は、割合だけに限定されず、ある特定の実施形態では、変異体分子カウントも包含し得る。一部の実施形態では、予測ＭＡＦの分布は、以下の二項比率の信頼区間を使用して算出される：
【００２４】
【数１】
2021531775.tif 000003
および
【００２５】
【数２】
2021531775.tif 000004
（式中、ｆは、コールされる変異の予測割合であり、ｎ＿真は、予測される実際の変異であり、これはｆを考慮して観測される変異の数と等しく、ｚは信頼水準である）。一部の実施形態では、ｆが閾値ｆ未満の場合、ＴＭＢは決定されない。一部の実施形態では、ｆが閾値ｆを超える場合、ＴＭＢが決定される。
【００２６】
一部の実施形態では、方法は、以下の方程式：
【００２７】
観測された変異の割合＝ΣＭＡＦ（Ｐ（変異のコール｜ＭＡＦ）×Ｐ（ＭＡＦにおける変異））
【００２８】
（式中、Ｐは確率であり、ＭＡＦは変異対立遺伝子割合である）
を使用して予測結果を決定することを含む。
【００２９】
一部の実施形態では、相対的ＭＡＦの予測分布は、対照試料データセットの１つまたは複数のデータセットから得られる。一部の実施形態では、対照試料データセットは、少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１，０００、少なくとも約５，０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１５，０００、少なくとも約２０，０００、少なくとも約２５，０００、少なくとも約３０，０００、またはそれよりも多くの対照試料を含む。一部の実施形態では、対照試料データセットに使用される対照試料は、がんの型に特異的なものおよび／または処置に特異的なものであり得る。
【００３０】
一部の実施形態では、対照試料データセットにおいて観測される最大（ｍａｘ）ＭＡＦは、約０．５％、約１％、約２％、約５％または約１０％を構成する。
【００３１】
一部の実施形態では、方法は、相対的ＭＡＦを、以下の方程式：
【００３２】
Ｆ＝１／（１＋（Ｐ＿５０／相対的−ＭＡＦ）ｎ）
【００３３】
（式中、Ｆは、累積分布関数であり、Ｐ＿５０は、相対的ＭＡＦの中央値であり、相対的−ＭＡＦは相対的ＭＡＦであり、ｎは、相対的な分布の形状を当てはめるための指数である）
を使用して曲線に当てはめることを含む。
【００３４】
一部の実施形態では、方法は、試料における観測変異カウントを予測変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）または予測変異割合の信頼区間の上限／下限で割って、調整された結果を生成することを含む。一部の実施形態では、調整された結果は、変異対立遺伝子割合の範囲にわたって核酸において検出される複数の変異を含む。一部の実施形態では、方法は、観測変異カウントを予測結果で割って、調整された結果を生成することを含む。一部の実施形態では、調整された結果は、可能性が最も高い実際の変異カウントの予想を含む。一部の実施形態では、調整された結果は、可能性が最も低い実際の変異カウントの予想を含む。一部の実施形態では、調整された結果は、調整された変異カウントを含む。一部の実施形態では、調整された変異カウントは、観測変異カウントよりも大きいかまたはそれと等しい。一部の実施形態では、調整された変異カウント／調整された結果を解析される標的ゲノム領域のサイズとエキソーム較正因子の積で割って、ＴＭＢスコアを決定する。ある特定の実施形態では、エキソーム較正因子は、少なくとも１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１０、またはそれよりも大きい値であり、他の実施形態では、エキソーム較正因子は、１．０よりも小さい値（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９）を含む。一部の実施形態では、エキソーム較正因子は、がんデータベース（例えば、ＴＣＧＡなど）内の試料のエキソーム変異率から決定される。ある特定の実施形態では、考慮中の所与のがんの型に特異的なエキソーム較正因子およびエキソーム変異率をそのがんの型を有する試料から決定する。
【００３５】
一部の実施形態では、方法は、試料をＴＭＢ−Ｈｉｇｈ試料に分類することをさらに含む。一部の実施形態では、試料のＴＭＢスコアが閾値ＴＭＢスコアよりも大きい場合、試料をＴＭＢ−Ｈｉｇｈ試料に分類する。試料のＴＭＢスコアが閾値ＴＭＢスコアよりも小さい場合、試料をＴＭＢ−Ｌｏｗ試料に分類する。ある特定の実施形態では、例えば、閾値ＴＭＢスコアは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または別の選択された閾値であり得る。
【００３６】
一部の実施形態では、方法は、対象由来の試料中の核酸から配列情報を得ることを含む。一部の実施形態では、配列情報を核酸の標的とされるセグメントから得る。一部の実施形態では、標的とされるセグメントは、約１から約１００，０００の間の異なるおよび／または重複するゲノム領域を含む。
【００３７】
一部の実施形態では、方法は、対象由来の試料を得ることを含む。一部の実施形態では、試料は、組織、血液、血漿、血清、喀痰、尿、精液、膣液、糞便、滑液、脊髄液、および唾液からなる群から選択される。一部の実施形態では、試料は組織を含む。一部の実施形態では、試料は血液、血漿、および／または血清を含む。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物対象である。一部の実施形態では、哺乳動物対象は、ヒト対象である。一部の実施形態では、核酸は、細胞外遊離核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、細胞内核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、循環腫瘍核酸を含む。一部の実施形態では、核酸を循環腫瘍細胞から得る。一部の実施形態では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、方法は、試料中の核酸の少なくとも１つのセグメントを増幅させて、少なくとも１つの増幅した核酸を生成することを含む。一部の実施形態では、方法は、増幅した核酸のシーケンシングを行って、配列情報を生成することを含む。一部の実施形態では、方法は、核酸の少なくとも約５０，０００、約１００，０００、約１５０，０００、約２００，０００、約２５０，０００、約５００，０００、約７５０，０００、約１，０００，０００、約１，５００，０００、約２，０００，０００ヌクレオチド、またはそれよりも多くのヌクレオチドのシーケンシングを行って、配列情報を生成することを含む。一部の実施形態では、シーケンシングは、標的化シーケンシング、イントロンシーケンシング、エキソームシーケンシング、および全ゲノムシーケンシングからなる群から選択される。
【００３９】
一部の実施形態では、カスタマイズされた療法は、少なくとも１つの免疫療法を含む。一部の実施形態では、免疫療法は、少なくとも１つのチェックポイント阻害抗体を含む。一部の実施形態では、免疫療法は、ＰＤ−１、ＰＤ−２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０に対する抗体を含む。一部の実施形態では、免疫療法は、少なくとも１つの腫瘍型に対する炎症促進性サイトカインの投与を含む。一部の実施形態では、免疫療法は、少なくとも１つの腫瘍型に対するＴ細胞の投与を含む。
【００４０】
一部の実施形態では、がんは、胆道がん、膀胱がん、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生性癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、直腸がん、結腸直腸癌、結腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道がん、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼内黒色腫、ぶどう膜黒色腫、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝がん、肝癌、ヘパトーマ、肝細胞癌、胆管細胞癌、肝芽腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽細胞腫、中咽頭がん、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵がん、膵管腺癌、偽乳頭状新生物、腺房細胞癌、前立腺がん、前立腺腺癌、皮膚がん、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、小腸癌、胃がん、胃癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮がん、および子宮肉腫からなる群から選択される少なくとも１つの腫瘍型を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、配列情報は、核酸シーケンサーによって生成された核酸の配列読み取りを含む。一部の実施形態では、核酸シーケンサーにより核酸に対してパイロシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたはハイブリダイゼーションによるシーケンシングを実施して、シーケンシング読み取りを生成する。
【００４２】
一部の実施形態では、方法は、シーケンシングの前にゲノムまたはトランスクリプトームから１つまたは複数の領域を選択的に富化させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、選択的に富化された領域をシーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、配列情報を核酸の標的とされるセグメントから得て、標的とされるセグメントは、シーケンシングの前にゲノムまたはトランスクリプトームから１つまたは複数の領域を選択的に富化させることによって得る。一部の実施形態では、方法は、得られた標的とされるセグメントをシーケンシングの前に増幅させるステップをさらに含む。
【００４３】
一部の実施形態では、方法は、シーケンシングの前に、分子バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを核酸に付着させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、核酸に、一意的にバーコード付けする。一部の実施形態では、核酸に、非一意的にバーコード付けする。一部の実施形態では、アダプターは、２から１，０００，０００の間の分子バーコードを含む。一部の実施形態では、アダプターは、２から１００の間の分子バーコードを含む。一部の実施形態では、アダプターは、２から２００の間の分子バーコードを含む。一部の実施形態では、アダプターは、２から１００の間の分子バーコードを含む。一部の実施形態では、方法は、分子バーコードを含むアダプターを核酸の各末端にランダムに付着させることを含む。一部の実施形態では、アダプターを核酸に平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーションによって付着させる。一部の実施形態では、アダプターは、Ｔ尾部を有するおよび／またはＣ尾部を有するアダプターである。
【００４４】
一部の実施形態では、方法は、配列読み取りを配列読み取りのファミリーに群分けするステップをさらに含み、各ファミリーは、試料中の核酸から生成された配列読み取りを含む。
【００４５】
一部の実施形態では、前記方法の少なくとも一部をコンピューターにより実行する。一部の実施形態では、方法は、１つまたは複数のＴＭＢスコアを提示する電子形式の報告書を作成するステップをさらに含む。
【００４６】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサによって実行されると、少なくとも、（ｉ）対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、（ｉｉ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｉｉｉ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｉｖ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定するステップとを実施する、非一時的なコンピューターで実行可能な命令を含むコンピューター可読媒体を含む、またはそれにアクセスすることができるコントローラを含むシステムを提供する。
【００４７】
一部の実施形態では、システムは、コントローラに作動可能に接続された核酸シーケンサーを含み、核酸シーケンサーは、対象由来の試料中の核酸から配列情報をもたらすように構成されている。一部の実施形態では、核酸シーケンサーは、核酸に対してパイロシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたはハイブリダイゼーションによるシーケンシングを実施して、シーケンシング読み取りを生成するように構成されている。一部の実施形態では、核酸シーケンサーまたは別のシステム構成要素は、核酸シーケンサーによって生成された配列読み取りを配列読み取りのファミリーに群分けするように構成されており、各ファミリーは、試料中の核酸から生成された配列読み取りを含む。
【００４８】
一部の実施形態では、システムは、コントローラに作動可能に接続されたデータベースを含み、データベースは、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果を含み、電子プロセッサは、少なくとも（ｖ）調整された結果を１つまたは複数の比較用結果と比較するステップであって、調整された結果と比較用結果が実質的にマッチすることにより、対象に対する療法に対する予想反応が示される、ステップをさらに実施する。
【００４９】
一部の実施形態では、システムは、コントローラに作動可能に接続された試料調製構成要素を含み、試料調製構成要素は、核酸シーケンサーによってシーケンシングされる試料中の核酸を調製するように構成されている。一部の実施形態では、試料調製構成要素は、試料中のゲノムまたはトランスクリプトームから領域を選択的に富化するように構成されている。一部の実施形態では、試料調製構成要素は、分子バーコードを含む１つまたは複数のアダプターを核酸に付着させるように構成されている。
【００５０】
一部の実施形態では、システムは、コントローラに作動可能に接続された核酸増幅構成要素を含み、核酸増幅構成要素は、対象由来の試料中の核酸を増幅するように構成されている。一部の実施形態では、核酸増幅構成要素は、試料中のゲノムまたはトランスクリプトームから選択的に富化された領域を増幅するように構成されている。
【００５１】
一部の実施形態では、システムは、コントローラに作動可能に接続された材料移動構成要素を含み、材料移動構成要素は、１つまたは複数の材料を少なくとも核酸シーケンサーと試料調製構成要素の間を移動させるように構成されている。
【００５２】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサによって実行されると、少なくとも、（ｉ）対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、（ｉｉ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｉｉｉ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｉｖ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定するステップとを実施する、非一時的なコンピューターで実行可能な命令を含むコンピューター可読媒体を提供する。一部の実施形態では、予測変異割合を使用して調整された変異カウントを決定する。
【００５３】
本明細書に開示されるシステムおよびコンピューター可読媒体を使用して実行される方法は、複数の異なる実施形態を含む。一部の実施形態では、例えば、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合は、核酸において識別される複数の同義変異、複数の非同義変異、および／または複数の非コード変異を含む。ある特定の実施形態では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合は、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入または欠失（インデル）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復伸長、およびエピジェネティックバリアントからなる群から選択される複数の変異を含む。他の例示的な実施形態では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合からドライバー変異および／または腫瘍に関連しない変異（例えば、クローン性造血由来変異）が除外される。必要に応じて、所与の一塩基バリアント（ＳＮＶ）または所与の挿入もしくは欠失（インデル）に関して検出限界を下回る１つまたは複数の可能性のある変異のプールされたエビデンスを使用して観測変異カウントを決定する。
【００５４】
一部の実施形態では、予測変異割合を使用して調整された変異カウントを決定する。一般には、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合は、核酸において識別される複数の体細胞変異を含む。これらの実施形態の一部では、観測変異カウントから１つまたは複数の既知のがんドライバーおよび／またはパッセンジャー変異が除外される。ある特定の実施形態では、観測変異カウントを、配列情報と１つまたは複数の参照配列（例えば、ｈｇ１９、ｈｇ３８、および／または同様のものの少なくとも部分配列）を比較することによって決定する。
【００５５】
ある特定の実施形態では、腫瘍割合は、核酸において識別される全ての体細胞変異の最大変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）を含む。一般には、腫瘍割合は、試料中の全ての核酸の約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、または約５％未満である。一部の実施形態では、カバレッジを、核酸における所与のヌクレオチド位を構成する独特の細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子の数の中央値を識別することによって決定する。一部の実施形態では、例えば、カバレッジは、試料中に存在する核酸における所与のヌクレオチド位において１０個から５０，０００個の間のｃｆＤＮＡ断片である。
【００５６】
一部の実施形態では、予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布は、変異割合に関して約９５％またはそれよりも大きな信頼区間を含む。ある特定の実施形態では、予測変異割合の９５％信頼区間の上限を使用して観測変異カウントの下限を生成する。一部の実施形態では、所与の変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）における変異が予測ＭＡＦの分布にわたって識別される確率を算出することにより、予測変異割合を決定する。必要に応じて、相対的ＭＡＦの分布に腫瘍割合を掛けることによってＭＡＦを生成する。一部の実施形態では、予測ＭＡＦの分布は、以下の二項比率の信頼区間を使用して算出される：
【数３】
2021531775.tif 000005
（式中、ｆは、コールされる変異の予測割合であり、ｎ＿真は予測される実際の変異であり、これはｆを考慮して観測される変異の数と等しく、ｚは信頼水準である）。本明細書に開示されるシステムまたはコンピューター可読媒体のある特定のインプリメンテーションは、以下の方程式：
観測された変異の割合＝ΣＭＡＦ（Ｐ（変異のコール｜ＭＡＦ）×Ｐ（ＭＡＦにおける変異））
（式中、Ｐは確率であり、ＭＡＦは変異対立遺伝子割合である）
を使用して予測結果を決定することを含む。
【００５７】
ある特定の実施形態では、ＭＡＦの予測分布は、少なくとも１つの対照試料データセットにおいて観測される相対的ＭＡＦから得られる。一部の実施形態では、比較用結果は、少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１，０００、少なくとも約５，０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１５，０００、少なくとも約２０，０００、少なくとも約２５，０００、少なくとも約３０，０００、またはそれよりも多くの対照試料を含む。ある特定の実施形態では、対照試料データセットにおいて対照試料は、最大ＭＡＦの約０．５％、約１％、約２％、約５％または約１０％を構成する。本明細書に開示されるシステムまたはコンピューター可読媒体の一部のインプリメンテーションは、相対的ＭＡＦを、以下の方程式：
Ｆ＝１／（１＋（Ｐ＿５０／相対的−ＭＡＦ）ｎ）
（式中、Ｆは、累積分布関数であり、Ｐ＿５０は、相対的ＭＡＦの中央値であり、相対的−ＭＡＦは相対的ＭＡＦであり、ｎは、相対的な分布の形状を当てはめるための指数である）を使用して曲線に当てはめることを含む。一部の実施形態では、観測変異カウントを試料中の予測変異割合または予測変異割合の信頼区間の上限／下限で割ることにより、調整された結果を生成する。ある特定の実施形態では、調整された結果は、変異対立遺伝子割合の範囲にわたって核酸において検出される複数の変異を含む。一部の実施形態では、観測変異カウントを予測結果で割ることにより、調整された結果を生成する。ある特定の実施形態では、調整された結果は、可能性が最も高い実際の変異カウントの予想を含む。一部の実施形態では、調整された結果は、可能性が最も低い実際の変異カウントの予想を含む。ある特定の実施形態では、調整された結果は、調整された変異カウントを含む。これらの実施形態の一部では、調整された変異カウントは、観測変異カウントよりも大きいかまたはそれと等しい。一部の実施形態では、調整された変異カウント／調整された結果を解析される標的ゲノム領域のサイズとエキソーム較正因子の積で割って、ＴＭＢスコアを決定する。ある特定の実施形態では、エキソーム較正因子は、少なくとも１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１０、またはそれよりも大きい値であり、他の実施形態では、エキソーム較正因子は、１．０よりも小さい値（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９）を含む。一部の実施形態では、エキソーム較正因子は、がんデータベース（例えば、ＴＣＧＡなど）内の試料のエキソーム変異率から決定される。ある特定の実施形態では、考慮中の所与のがんの型に特異的なエキソーム較正因子およびエキソーム変異率をそのがんの型を有する試料から決定する。一部の実施形態では、所与の試料のＴＭＢスコアが閾値ＴＭＢスコアよりも大きい場合、試料は、一般に、ＴＭＢ−Ｈｉｇｈ試料に分類される。対照的に、試料のＴＭＢスコアが閾値ＴＭＢスコアよりも小さい場合、試料は、一般に、ＴＭＢ−Ｌｏｗ試料に分類される。一部の実施形態では、閾値ＴＭＢスコアは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または別の選択された閾値であり得る。
【００５８】
別の態様では、本開示は、通信ネットワークを通じて対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸からシーケンシング情報を得る通信インターフェースと、通信インターフェースと通信するコンピューターであって、少なくとも１つのコンピュータープロセッサと、少なくとも１つのコンピュータープロセッサによって実行されると、（ｉ）対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、（ｉｉ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｉｉｉ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｉｖ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を検出するステップとを含む方法を実行する、機械により実行可能なコードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターとを含むシステムを提供する。
【００５９】
一部の実施形態では、シーケンシング情報は核酸シーケンサーによってもたらされる。一部の実施形態では、核酸シーケンサーにより核酸に対してパイロシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたはハイブリダイゼーションによるシーケンシングを実施して、シーケンシング読み取りを生成する。一部の実施形態では、核酸シーケンサーは、シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイを使用して、シーケンシング読み取りを生成するものである。一部の実施形態では、核酸シーケンサーは、シーケンシングライブラリーのシーケンシングを行って、シーケンシング読み取りを生成するためのマイクロウェルのアレイを有するチップを含む。
【００６０】
一部の実施形態では、コンピューター可読媒体は、記憶装置、ハードドライブまたはコンピューターサーバーを含む。一部の実施形態では、通信ネットワークは、分散コンピューティングを行うことができる１つまたは複数のコンピューターサーバーを含む。一部の実施形態では、分散コンピューティングは、クラウドコンピューティングである。一部の実施形態では、コンピューターは、核酸シーケンサーから離れた所に位置するコンピューターサーバー上に位置する。
【００６１】
一部の実施形態では、コンピューター可読媒体は、ネットワークを通じてコンピューターと通信する電子ディスプレイをさらに含み、電子ディスプレイは、（ｉ）〜（ｉｖ）が実行された際の結果を表示するためのユーザーインタフェースを含む。一部の実施形態では、ユーザーインタフェースは、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）またはウェブベースユーザーインタフェースである。一部の実施形態では、電子ディスプレイは、パーソナルコンピューター中である。一部の実施形態では、電子ディスプレイは、インターネット接続可能なコンピューター中である。一部の実施形態では、インターネット接続可能なコンピューターはコンピューターから離れた位置にある。一部の実施形態では、コンピューター可読媒体は、記憶装置、ハードドライブまたはコンピューターサーバーを含む。一部の実施形態では、通信ネットワークは、電気通信ネットワーク、インターネット、エクストラネット、またはイントラネットを含む。
【００６２】
一部の実施形態では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合から、最大（ｍａｘ）ＭＡＦが約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満または約３０％未満である体細胞変異が除外される。一部の実施形態では、予測／調整された変異カウントを、エキソーム較正因子を使用して調整する。一部の実施形態では、調整された変異カウントをエキソーム較正因子で割る。
【００６３】
一部の実施形態では、変異カウントを、表２に列挙されている遺伝子を含む遺伝子またはゲノム領域のセットの中で決定する。
【００６４】
別の態様では、本開示は、がんを有するか、または有する疑いがある対象由来の細胞外遊離核酸分子の試料を特徴付ける方法であって、試料に対してアッセイを実施して、表２に列挙されているものから選択される少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種の遺伝子またはゲノム領域に遺伝的バリエーションが存在するかどうかを決定するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法を１，０００種以下の遺伝子に対して実施する。一部の実施形態では、方法は、表２からのアッセイされた遺伝子のうちの少なくとも１種に遺伝的バリエーションの存在が決定された対象にがん処置を施行するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、試料から核酸分子を単離し、少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種の遺伝子に対応する核酸分子を、少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種の遺伝子由来のセグメントを含有するプローブを用いて富化させるステップをさらに含む。
【００６５】
さらに別の態様では、本開示は、がんを有するか、またはがんを有する疑いがある対象由来の細胞外遊離ＤＮＡの試料を解析するための方法であって、表２に列挙されている遺伝子からなる群から少なくとも１００種、２００種、３００種、４００種、または５００種のゲノム領域を選択的に富化させて、富化されたライブラリーを生成するステップと、前記富化されたライブラリーを増幅させ、シーケンシング反応を実施するステップと、前記ゲノム領域における遺伝子バリアントの存在について解析するステップとを含む方法を提供する。
【００６６】
本明細書に開示される方法ならびに関連するシステムおよびコンピューター可読媒体インプリメンテーションは、種々の実施形態を含む。これらの方法および関連する態様は、一般には、試料についてのＴＭＢスコアを生成することを含む。ある特定の適用では、サブクローン性フィルターを利用する。これらの実施形態の一部では、低ＭＡＦの体細胞変異をフィルターで取り除くことにより、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合から体細胞変異を除外する。実施形態のある特定のものでは、例えば、サブクローン性フィルターを使用して、最大（ｍａｘ）ＭＡＦが約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満または約３０％未満である体細胞変異を除外する。一部の実施形態では、体細胞変異を除外する／フィルターで取り除く代わりに、体細胞変異にクローン性に基づいて重み付けを行う（すなわち、低ＭＡＦ変異だけでなく、各変異にいくらかの重みを与える）。他の例示的な実施形態では、予測および／または調整された変異カウントを、エキソーム較正因子を使用して調整する。これらの実施形態の一部では、調整された変異カウントをエキソーム較正因子で割る。ある特定の実施形態では、エキソーム較正因子は、少なくとも１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１０、またはそれよりも大きい値であり、他の実施形態では、エキソーム較正因子は、１．０よりも小さい値（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９）を含む。一部の実施形態では、エキソーム較正因子は、がんデータベース（例えば、ＴＣＧＡなど）内の試料のエキソーム変異率から決定される。ある特定の実施形態では、考慮中の所与のがんの型に特異的なエキソーム較正因子およびエキソーム変異率をそのがんの型を有する試料から決定する。
【００６７】
一部の実施形態では、最大（ｍａｘ）ＭＡＦを使用する以外の代替的なやり方を使用して腫瘍割合を推定する。一部の実施形態では、例えば、ゲノム領域の所定のセットのカバレッジおよび標準の最尤法を使用して腫瘍割合を推定する。ある特定の実施形態では、試料中のゲノム領域の所定のセットとコピー数の変化を有する領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布の差異を使用して腫瘍割合を決定する。必要に応じて、生殖細胞系列および／または体細胞バリアントのＭＡＦを試料において観測されるコピー数の変化に対して調整することによって腫瘍割合を推定する。一般には、決定されたＴＭＢスコアから生殖細胞系列バリアントを除外する。一部の実施形態では、生殖細胞系列／体細胞の状態を、考慮中の候補バリアントの近くに位置する一般的な生殖細胞系列ＳＮＰのＭＡＦの平均値および分散を推定するベータ二項分布モデルを使用して決定する。本明細書に開示される方法および関連する態様を実行することにおける使用のために必要に応じて適合させるベータ二項分布モデルに関連する追加的な詳細は、例えば、参照により組み込まれる［２０１８年９月２０日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５２０８７］にも記載されている。さらに、カバレッジも様々な手法を使用して決定する。一部の実施形態では、カバレッジを所与の試料中の塩基１つ当たりの独特のｃｆＤＮＡ断片の中央値として組み入れる。これらの実施形態のある特定のものでは、例えば、モデルを塩基特異的にすることができ、この方法は、各塩基における感度を、その塩基における独特のｃｆＤＮＡ断片の数を使用して算出することを含む。一般には、カバレッジは、所与の塩基位置におけるｃｆＤＮＡ断片が少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、またはそれよりも多くというものであり得る。
【００６８】
一部の実施形態では、体細胞変異のカウント（観測変異カウント）から、（ｉ）バックグラウンドエキソーム変異率もしくはＴＭＢを表すものではないドライバー変異など、（ｉｉ）考慮中の腫瘍ではなくクローン性造血に由来する可能性が高い変異、および／または（ｉｉｉ）耐性変異を除外する。一部の実施形態では、ある特定の型の体細胞変異に対して、観測変異カウントから除外するまたはフィルターで取り除く代わりに重み付けを行う。ある特定の実施形態では、クローン性造血変異を、（ｉ）文献およびがんデータベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣなど）に基づく、血液関連がんにおいて頻繁に観測される変異のキュレートされた一覧を使用して、（ｉｉ）試料中のそれらの状況（例えば、ＭＡＦ）（例えば、同様のＭＡＦもしくは同様のＭＡＦの範囲における他のクローン性造血バリアントの存在）を使用して、および／もしくは以前に試験された試料のデータベースにおけるクローン性造血変異を解析することによって、ならびに／または（ｉｉｉ）血液に由来する患者試料（例えば、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ））中のＤＮＡのシーケンシングを行うことによって識別する。クローン性造血（例えば、未確定の潜在能をもつクローン性造血（ｃｌｏｎａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」または「ＣＨＩＰ」）変異は、患者の年齢、メチル化の状態、ある特定の集団における変異の富化、本明細書にも開示される腫瘍割合を推定する方法、および／または同様のものなどの他の因子に基づいて識別することもできる。ある特定の実施形態では、耐性変異を、例えば、文献およびがんデータベースに基づく、患者試料において頻繁に観測される変異のキュレートされた一覧を使用して、かつ／または、以前に試験された試料のデータベースを解析することによって識別することができる。耐性機構または任意の他のプロセスにより、多数の遺伝子の変異または遺伝子の変異のクラスターが導入され得る（例えば、結腸直腸がんにおけるＫＲＡＳまたはＰＡＲＰ阻害剤で処置された前立腺がんにおけるＢＲＣＡ１／２復帰変異）。一部の実施形態では、例えば、特定の遺伝子における変異の数が、所与のパネルにおける全体的な試料変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）および遺伝子サイズに基づいてその遺伝子における変異の予測数よりも有意に多い場合、その特定の遺伝子における少なくとも少数の変異が観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）から除外される。ある特定の実施形態では、体細胞変異のカウントは、利用される特定のパネルの一部として報告されていない部位におけるＳＮＶおよびインデルも含む。
【００６９】
ＴＭＢスコアは、一般には、患者が免疫療法による処置に応答するかどうかを予想するために使用される。例えば、解析された遺伝子のセットにわたってある特定の遺伝子における特定の型の変異（例えば、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＰＴＥＮなどの機能喪失）および／または患者の変異シグネチャー（例えば、患者がＣ＞Ｔ転移などを有する）が存在することをＴＭＢスコアと組み合わせて使用して、療法に対する応答の可能性を予想することができる。一般には、遺伝子の機能喪失／ドライバー変異が優先し、その患者は療法に応答しない。すなわち、これだけに限定されないが、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１およびＰＴＥＮなどのある特定の遺伝子の機能喪失が観測される場合、患者はＴＭＢスコアとは関係なく免疫療法に応答しない可能性が高い。
【００７０】
一部の実施形態では、特定の遺伝子（例えば、ＤＮＡ修復系遺伝子−ＭＬＨ１、ＭＬＨ２＆ＭＬＨ３、ＭＳＨ２＆ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１＆ＰＭＳ２；ポリメラーゼＥ）の変異、および、ある特定の領域、特にＤＮＡ修復系遺伝子のプロモーター領域のメチル化の状態などのある特定の因子をＴＭＢスコアと組み合わせて、試料をＴＭＢ−Ｈｉｇｈ試料またはＴＭＢ−Ｌｏｗ試料に分類することに使用することができる。
【００７１】
基本的に任意の療法または療法の組合せを、必要に応じて、所与の患者に、例えばＴＭＢスコア、がんの型および／またはステージ分類などの特定の状況に応じて施行する。そのような療法の例としては、本明細書においてさらに例示されているまたはそうでなければ当業者に公知の多数の他の療法の中でも、免疫療法、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、ワクチン（例えば、一般的なまたは患者新抗原特異的）、オリゴヌクレオチドもしくはベクターに基づく遺伝学的療法、アブスコパル効果介入（例えば、照射療法）、免疫療法による処置／薬物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ）、免疫チェックポイント阻害剤および／もしくは抗体（例えば、抗ＴＩＧＩＴ；ＰＤ−１、ＰＤ−２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０に対する抗体）、ならびに／または併用療法（例えば、免疫療法＋ＰＡＲＰｉ＋化学療法など）が挙げられる。
【００７２】
本明細書に記載のＴＭＢ決定を必要に応じて他の評価または技法とも組み合わせて、さらに処置に関する決定を下すこともできる。これらの一部の例としては、細胞の機構的な欠陥（例えば、所与の療法薬に対する応答の欠如）を評価すること、異数性の増大を評価すること（例えば、ＩＯ療法に対する応答の潜在的な低下を測定するために）、同様に患者の状態の他の非ＴＭＢ特徴（例えば、年齢、ハプロタイプ、民族性、性別など）の決定、ＴＭＢスコアの決定とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）喪失を組み合わせること、ＨＬＡシーケンシング（例えば、新抗原予想のための機構として）、トランスクリプトーム、免疫レパートリーシーケンシング、および／または療法応答の欠如もしくはそのような応答の可能性を予想するための他の解析手法が挙げられる。
【００７３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステムおよび方法の結果を、報告書を作成するための入力として使用する。報告書は、紙形式であっても電子形式であってもよい。例えば、本明細書に開示される方法およびシステムによって得られた調整された結果をそのような報告書に直接表示することができる。その代わりにまたはそれに加えて、調整された結果に基づいた診断情報または療法推奨を報告書に含めることができる。
【００７４】
本明細書に開示される方法の種々のステップ、または本明細書に開示されるシステムによって行われるステップは、同じもしくは違う時間に、同じもしくは異なる地理的位置、例えば、国において、かつ／または同じもしくは異なる人が行うことができる。
【００７５】
別の態様では、本開示は、対象を免疫療法の候補に分類する方法であって、ａ）対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、（ｂ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｃ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｄ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成するステップと、（ｅ）調整された結果を使用してＴＭＢスコアを決定するステップと、（ｆ）ＴＭＢスコアを閾値ＴＭＢスコアと比較して、対象を免疫療法の候補に分類するステップとを含む方法を提供する。
【００７６】
別の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して新抗原オーファン免疫受容体情報を生成する（すなわち、ステップの一部または全部がコンピューターを使用して実施される）方法に関する。方法は、（ａ）がんと診断された対象から得た血液試料中の核酸から得られた配列情報をコンピューターにより受け取るステップであって、配列情報の少なくとも第１の部分が、血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）から得られたシーケンシング読み取りを含み、配列情報の少なくとも第２の部分が、血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸から得られたシーケンシング読み取りを含む、ステップを含む。方法は、（ｂ）配列情報の少なくとも第１の部分から対象の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）スコアを決定するステップと、（ｃ）配列情報の少なくとも第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップとも含む。さらに、方法は、（ｄ）ＴＭＢスコアと１つまたは複数のクローン型を相関させて、対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別し、それにより、新抗原オーファン免疫受容体情報を生成するステップも含む。
【００７７】
一部の実施形態では、方法は、新抗原オーファン免疫受容体情報を使用して対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別するステップをさらに含む。これらの実施形態のある特定のものでは、方法は、１つまたは複数のカスタマイズされた療法を対象に施行するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、配列情報の第１の部分における１つまたは複数のバリアントを識別して、ＴＭＢスコアを決定することを含み、バリアントは、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入または欠失（インデル）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復バリアント、およびエピジェネティックバリアントからなる群から選択される１つまたは複数の変異を含む。これらの実施形態の一部では、反復バリアントは、１つまたは複数のマイクロサテライトバリアントを含む。これらの実施形態のある特定のものでは、方法は、配列情報の第２の部分における１つまたは複数の他のバリアントを識別して、ＴＭＢスコアを決定するステップをさらに含み、他のバリアントは、血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸における１つまたは複数の体細胞変異を含む。
【００７８】
別の態様では、本開示は、がんと診断された対象由来の血液試料中の多数の解析物を解析する方法に関する。方法は、（ａ）血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）の第１のセットおよび血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞由来の核酸の第２のセットを単離するステップと、（ｂ）Ｔ細胞受容体のアルファおよび／またはベータサブユニットの少なくとも一部をコードする核酸の第２のセットの１つまたは複数の領域を増幅させて、富化された核酸の第２のセットを生成するステップとを含む。方法は、（ｃ）ｃｆＮＡの第１のセットの１つまたは複数の領域および富化された核酸の第２のセットの１つまたは複数の領域のシーケンシングを行って、配列情報を作製するステップと、（ｄ）配列情報から対象の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）スコアを決定するステップとも含む。さらに、方法は、（ｅ）配列情報から免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップと、（ｆ）ＴＭＢスコアと１つまたは複数のクローン型を相関させて、対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別し、それにより、がんと診断された対象由来の血液試料中の多数の解析物を解析するステップとも含む。
【００７９】
別の態様では、本開示は、少なくとも部分的にコンピューターを使用して対象由来の血液試料中の核酸を解析する方法に関する。方法は、（ａ）対象由来の血液試料中の核酸から得られた配列情報をコンピューターによって受け取るステップであって、配列情報の少なくとも第１の部分が、血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）から得られたシーケンシング読み取りを含み、配列情報の少なくとも第２の部分が、血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸から得られたシーケンシング読み取りを含む、ステップを含む。方法は、（ｂ）配列情報の第１の部分における１つまたは複数のバリアントおよび配列情報の第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別し、それにより、対象由来の血液試料中の核酸を解析するステップも含む。
【００８０】
一部の実施形態では、方法は、（ｉ）配列情報の第１の部分における観測変異カウントを決定するステップと、（ｉｉ）配列情報の第１の部分における少なくともｃｆＮＡの腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｉｉｉ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｉｖ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を決定するステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法は、（ｉ）配列情報の第１の部分および／または第２の部分に由来する複数の反復性核酸遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、複数の反復性核酸遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、配列情報が、反復性核酸遺伝子座の集団を含む、ステップと、（ｉｉ）所与の反復性核酸遺伝子座の部位スコアが所与の反復性核酸遺伝子座についての部位特異的訓練閾値を超える場合、所与の反復性核酸遺伝子座を不安定であるとコールして、複数の反復性核酸遺伝子座由来の複数の不安定な反復性核酸遺伝子座を含む反復性核酸不安定性スコアを生成するステップと、（ｉｉｉ）反復性核酸不安定性スコアが血液試料中の反復性核酸遺伝子座の集団についての集団訓練閾値を超える場合、血液試料の反復性核酸不安定性の状態を不安定であると分類し、それにより、血液試料の反復性核酸不安定性の状態を決定するステップとを含む。
【００８１】
ある特定の実施形態では、方法は、（ｉ）配列情報の第１の部分および／または第２の部分由来の複数の反復性デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、配列情報が、反復性ＤＮＡ遺伝子座の集団を含む、ステップと、（ｉｉ）複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座のそれぞれについて、所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座の部位スコアを所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座についての部位特異的訓練閾値と比較するステップと、（ｉｉｉ）所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座の部位スコアが所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座についての部位特異的訓練閾値を超える場合、所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座を不安定であるとコールして、複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座由来の複数の不安定な反復性ＤＮＡ遺伝子座を含む反復性ＤＮＡ不安定性スコアを生成するステップと、（ｉｖ）反復性ＤＮＡ不安定性スコアが血液試料中の反復性ＤＮＡ遺伝子座の集団についての集団訓練閾値を超える場合、血液試料の反復性ＤＮＡ不安定性の状態を不安定であると分類し、それにより、血液試料の反復性ＤＮＡ不安定性の状態を決定するステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、（ｉ）配列情報の第１の部分および／または第２の部分由来の複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、配列情報が、マイクロサテライト遺伝子座の集団を含む、ステップと、（ｉｉ）所与の反復性核酸遺伝子座の部位スコアが所与の反復性核酸遺伝子座についての部位特異的訓練閾値を超える場合、所与の反復性核酸遺伝子座を不安定であるとコールして、複数の反復性核酸遺伝子座由来の複数の不安定な反復性核酸遺伝子座を含む反復性核酸不安定性スコアを生成するステップと、（ｉｉｉ）反復性核酸不安定性スコアが血液試料中の反復性核酸遺伝子座の集団についての集団訓練閾値を超える場合、血液試料の反復性核酸不安定性の状態を不安定であると分類し、それにより、血液試料の反復性核酸不安定性の状態を決定するステップとを含む。
【００８２】
一部の実施形態では、方法は、（ｉ）配列情報の第１の部分および／または第２の部分由来の複数の反復性デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、配列情報が、反復性ＤＮＡ遺伝子座の集団を含む、ステップと、（ｉｉ）複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座のそれぞれについて、所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座の部位スコアを所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座についての部位特異的訓練閾値と比較するステップと、（ｉｉｉ）所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座の部位スコアが所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座についての部位特異的訓練閾値を超える場合、所与の反復性ＤＮＡ遺伝子座を不安定であるとコールして、複数の反復性ＤＮＡ遺伝子座由来の複数の不安定な反復性ＤＮＡ遺伝子座を含む反復性ＤＮＡ不安定性スコアを生成するステップと、（ｉｖ）反復性ＤＮＡ不安定性スコアが血液試料中の反復性ＤＮＡ遺伝子座の集団についての集団訓練閾値を超える場合、血液試料の反復性ＤＮＡ不安定性の状態を不安定であると分類し、それにより、血液試料の反復性ＤＮＡ不安定性の状態を決定するステップとを含む。別の実施形態では、方法は、（ｉ）配列情報の第１の部分および／または第２の部分由来の複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれに存在する複数の異なる反復長を定量して、複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれについての部位スコアを生成するステップであって、配列情報が、マイクロサテライト遺伝子座の集団を含む、ステップと、（ｉｉ）複数のマイクロサテライト遺伝子座のそれぞれについて、所与のマイクロサテライト遺伝子座の部位スコアを所与のマイクロサテライト遺伝子座についての部位特異的訓練閾値と比較するステップと、（ｉｉｉ）所与のマイクロサテライト遺伝子座の部位スコアが所与のマイクロサテライト遺伝子座についての部位特異的訓練閾値を超える場合、所与のマイクロサテライト遺伝子座を不安定であるとコールして、複数のマイクロサテライト遺伝子座由来の複数の不安定なマイクロサテライト遺伝子座を含むマイクロサテライト不安定性スコアを生成するステップと、（ｉｖ）マイクロサテライト不安定性スコアが血液試料中のマイクロサテライト遺伝子座の集団についての集団訓練閾値を超える場合、血液試料のマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の状態を不安定であると分類し、それにより、血液試料のＭＳＩの状態を決定するステップとを含む。
【００８３】
一部の実施形態では、方法は、配列可変標的領域セットとエピジェネティック標的領域セットとを含む、細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の標的領域の複数のセットを捕捉することを含み、それにより、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子のセットが生じ、配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子が、エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子よりも高い捕捉収率で捕捉されたｃｆＤＮＡ分子のセット内に捕捉される。ある特定の実施形態では、ｃｆＮＡは、細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸は、ｍＲＮＡおよび／またはｇＤＮＡを含む。一部の実施形態では、血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸は、抗体、Ｂ細胞受容体、およびＴ細胞受容体からなる群から選択される免疫学的ポリペプチドの少なくとも一部をコードする。一部の実施形態では、方法は、ｃｆＮＡを血液試料の血漿画分または血清画分から得ることを含む。ある特定の実施形態では、方法は、血液試料のバフィーコート画分由来の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸を得ることを含む。
【００８４】
別の態様では、本開示は、通信ネットワークを通じて対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸からシーケンシング情報を得る通信インターフェースを含むシステムに関する。システムは、通信インターフェースと通信するコンピューターであって、少なくとも１つのコンピュータープロセッサと、少なくとも１つのコンピュータープロセッサによって実行されると、（ｉ）がんと診断された対象から得た血液試料中の核酸から得られた配列情報を受け取るステップであって、配列情報の少なくとも第１の部分が、血液試料中の細胞外遊離核酸（ｃｆＮＡ）から得られたシーケンシング読み取りを含み、配列情報の少なくとも第２の部分が、血液試料中の１つまたは複数の免疫細胞に由来する核酸から得られたシーケンシング読み取りを含む、ステップと、（ｉｉ）配列情報の少なくとも第１の部分から対象の腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）スコアを決定するステップと、（ｉｉｉ）配列情報の少なくとも第２の部分における免疫レパートリーの１つまたは複数のクローン型を識別するステップと、（ｉｖ）ＴＭＢスコアと１つまたは複数のクローン型を相関させて、対象における１つまたは複数の新抗原オーファン免疫受容体を識別するステップとを含む方法を実行する、機械により実行可能なコードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターも含む。
【００８５】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する付属図は、ある特定の実施形態を例示するものであり、明細書と共に、本明細書に開示される方法、コンピューター可読媒体、およびシステムのある特定の原理を説明する機能を果たす。本明細書に提示される説明は、例として含まれ、限定するものではない付属図と併せて読むとよりよく理解される。図全体を通して、文脈からそうでないことが示されない限り、同様の参照数字により同様の構成要素が識別されることが理解されよう。図面の一部または全部は、例示のために略図であり得、必ずしも示されている要素の実際の相対的なサイズまたは位置を示すものではないことも理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、本発明の一部の実施形態に従ってＴＭＢを調整する例示的な方法のステップを概略的に示すフローチャートである。
【００８７】
【図２】図２は、本発明のある特定の実施形態での使用に適した例示的なシステムの概略図である。
【００８８】
【図３】図３は、本開示の一実施形態に従った、同じ試験試料由来の細胞外遊離ＤＮＡ解析と免疫レパートリーのシーケンシングのための複合ワークフローを示すフローチャートである。免疫レパートリーのプロファイリングとＴＭＢ解析の集合的な結果から、免疫療法に対する応答スコアの増強がもたらされる。
【００８９】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、本開示の一実施形態に従ったＴＣＲ  ｇＤＮＡアッセイ（図４Ａ）および免疫受容体ＲＮＡアッセイ（図４Ｂ）のための試料調製方法を示す概略図である。
【００９０】
【図５】図５は、本開示の一実施形態に従った、同じ試験試料由来の細胞外遊離ＤＮＡ解析と免疫レパートリーのシーケンシングのための複合ワークフローを示すフローチャートである。
【００９１】
【図６】図６は、本明細書に開示されるＴＭＢ補正または調整方法を適用した（ｏ）および適用していない（Δ）、腫瘍割合が小さく、かつカバレッジが小さい試料のＴＭＢスコアプロットである。
【００９２】
【図７】図７は、本発明の一部の実施形態に従った例示的なＴＭＢワークフローを概略的に示すフローチャートである。
【００９３】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、非同義コード一塩基バリアント（ＳＮＶ）と相関する変異型を示すプロットである。具体的には、図８Ａは、非同義ＳＮＶと相関する同義ＳＮＶを示すプロットである（ピアソンのｒ＝０．９０；非同義ＳＮＶの数（ｘ軸）；同義ＳＮＶの数（ｙ軸））。図８Ｂは、非同義ＳＮＶと相関するインデルを示すプロットである（ピアソンのｒ＝０．７１；非同義ＳＮＶの数（ｘ軸）；インデルの数（ｙ軸））。図８Ｃは、イントロンＳＮＶの率とエクソンＳＮＶの率が相関することを示すプロットである（ピアソンのｒ＝０．８９；イントロンＳＮＶの率（ｘ軸）；エクソンＳＮＶの率（ｙ軸））。
【００９４】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、大パネルアッセイの腫瘍シェディング補正により、変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）の（図９Ａ（最大（ｍａｘ）ＭＡＦビン（％）（ｘ軸）；変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）（ｙ軸）））腫瘍シェディングおよび（図９Ｂ（分子カバレッジ（×１０００）（ｘ軸）；変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）（ｙ軸）））入力ｃｆＤＮＡへの依存が取り除かれ、その結果、これらの入力メトリクスにほとんど依存しないｐＴＭＢがもたらされる（図９Ｃ（最大（ｍａｘ）ＭＡＦビン（％）（ｘ軸）；ＴＭＢ（ｍｕｔ／Ｍｂ）（ｙ軸））および９Ｄ（分子カバレッジ（×１０００）（ｘ軸）；ＴＭＢ（ｍｕｔ／Ｍｂ）（ｙ軸）））ことを示すバイオリンプロットである。
【００９５】
【図１０】図１０Ａ（ＴＭＢ（ｍｕｔ／Ｍｂ）（ｘ軸）；試料の割合（％）（ｙ軸））および１０Ｂ（ＴＭＢ（ｍｕｔ／Ｍｂ）（ｘ軸）；腫瘍型（ｙ軸））は、それぞれ、コホートにわたる、および腫瘍型間のＴＭＢ分布を示すプロットである。
【００９６】
【図１１】図１１Ａ（主成分（ＰＣ）１（ｘ軸）；ＰＣ２（ｙ軸））および１１Ｂ（ＴＭＢ（ｍｕｔ／Ｍｂ）（ｘ軸）；民族性（ｙ軸））は、それぞれ主成分解析（ＰＣＡ）クラスタリングおよびＴＭＢスコアを示すプロットである。
【００９７】
【図１２】図１２は、ＴＭＢと発がん性変異の相関を示すプロットである（ＴＭＢ（ｍｕｔ／Ｍｂ）（ｘ軸）；ドライバー変異（ｙ軸））。
【００９８】
【図１３】図１３Ａは、体細胞変異のクローン性および染色体不安定性がＴＭＢランドスケープにわたって高度に変動することを示すプロットである。図１３Ｂは、ＴＭＢ−Ｈｉｇｈ試料のサブセットにおいて高スコアのマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈｉｇｈ）が検出されたことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
定義
本開示をより容易に理解するために、まずある特定の用語を以下に定義する。以下の用語および他の用語についての追加的な定義が本明細書を通して記載されている場合がある。下記の用語の定義が参照により組み込まれる出願または特許における定義と相反する場合には、本出願に記載の定義がその用語の意味を理解するために使用されるべきである。
【０１００】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「１つの（ａ）方法」への言及は、１つまたは複数の方法、ならびに／または本明細書に記載の型のおよび／もしくは本開示を読めば当業者には明らかになるステップなどを含む。
【０１０１】
本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定的なものではないことも理解される。さらに、別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本開示が関係する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。方法、コンピューター可読媒体、およびシステムを記載し、特許請求する際に、以下の用語法、およびそれらの文法上の変形は下記の定義に従って使用される。
【０１０２】
約：本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」は、目的の１つまたは複数の値または要素に適用される場合、規定された参照値または要素と同様の値または要素を指す。ある特定の実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、別段の指定のない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り、規定された参照値または要素の、いずれかの方向（より大きい方またはより小さい方）に、２５％以内、２０％以内、１９％以内、１８％以内、１７％以内、１６％以内、１５％以内、１４％以内、１３％以内、１２％以内、１１％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、またはそれ未満の％以内に入る値または要素の範囲を指す（そのような数が可能性のある値または要素の１００％を超える場合を除く）。
【０１０３】
調整された腫瘍遺伝子変異量：本明細書で使用される場合、「調整された腫瘍遺伝子変異量」、「調整された腫瘍遺伝子変異量（ｔｕｍｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ）」、または「調整された結果」は、観測変異カウントを腫瘍割合、カバレッジ、および／または別のシーケンシングパラメータが説明されるように補正したものを指す。
【０１０４】
投与する：本明細書で使用される場合、治療剤（例えば、免疫学的治療剤）を対象に「投与する」または「投与すること」とは、組成物を対象に与える、適用するまたは接触させることを意味する。投与は、例えば、局部、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内および皮内を含めた複数の経路のいずれかによって実現することができる。
【０１０５】
アダプター：本明細書で使用される場合、「アダプター」は、一般には少なくとも部分的に二本鎖であり、所与の試料核酸分子の一方または両方の末端との連結のために使用される、短い核酸（例えば、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満の長さ）を指す。アダプターは、両末端にアダプターが隣接する核酸分子の増幅を可能にするための核酸プライマー結合性部位、および／または、種々の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）適用などのシーケンシングに適用するためのプライマー結合性部位を含めたシーケンシングプライマー結合性部位を含み得る。アダプターは、例えばフローセル支持体に付着させたオリゴヌクレオチドなどの捕捉用プローブの結合性部位も含み得る。アダプターは、本明細書に記載の核酸タグも含み得る。核酸タグは、一般には、増幅プライマーおよびシーケンシングプライマー結合性部位に対して、核酸タグが所与の核酸分子のアンプリコンおよび配列読み取りに含まれるように位置付けられる。核酸分子のそれぞれの末端に同じまたは異なるアダプターを連結することができる。一部の実施形態では、核酸分子のそれぞれの末端に、核酸タグが異なる以外は同じアダプターを連結する。一部の実施形態では、アダプターは、一方の末端が、核酸分子との接合のために本明細書に記載の通り平滑末端化されたかまたは尾部付加されたＹ形アダプターであり、核酸分子も同様に１つまたは複数の相補的なヌクレオチドで平滑末端化されたかまたは尾部付加されている。さらに他の実施形態例では、アダプターは、解析される核酸分子との接合のための平滑または尾部付加末端を含む鐘形アダプターである。アダプターの他の例としては、Ｔ尾部を有するアダプターおよびＣ尾部を有するアダプターが挙げられる。
【０１０６】
増幅させる：本明細書で使用される場合、「増幅させる」または「増幅」は、核酸に関しては、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部の多数のコピーを、一般には少量のポリヌクレオチド（例えば、単一のポリヌクレオチド分子）から出発して産生させることを指し、増幅産物またはアンプリコンが一般に検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、種々の化学的および酵素的プロセスを包含する。
【０１０７】
バーコード：本明細書で使用される場合、「バーコード」または「分子バーコード」は、核酸に関しては、分子識別子としての機能を果し得る配列を含む核酸分子を指す。例えば、一般には、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリー調製の間に個々の「バーコード」配列を各ＤＮＡ断片に付加し、したがって、最終的なデータ解析前に各読み取りを識別し、選別することができる。
【０１０８】
がんの型：本明細書で使用される場合、「がんの型」とは、例えば病理組織検査によって定義されるがんの型または亜型を指す。がんの型は、任意の従来の基準よって、例えば、所与の組織における発生に基づいて（例えば、血液がん、中枢神経系（ＣＮＳ）、脳がん、肺がん（小細胞および非小細胞）、皮膚がん、鼻のがん、咽頭がん、肝がん、骨がん、リンパ腫、膵がん、腸がん（ｂｏｗｅｌ  ｃａｎｃｅｒ）、直腸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎がん、口腔がん、胃がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、軟部組織がん、神経内分泌がん、胃食道のがん、頭頸部がん、婦人科のがん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、固形状態のがん、異種がん、同種がん）、原発不明などに基づいて、ならびに／または同じ細胞系列のものに基づいて（例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、胆管細胞癌、白血病、中皮腫、黒色腫、または神経膠芽腫）、ならびに／または、Ｈｅｒ２、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ホルモン受容体およびＮＭＰ−２２などのがんマーカーを示すがんに基づいて定義することができる。がんは、ステージ（例えば、ステージ１、２、３、または４）および原発性であるか続発性であるかによって分類することもできる。
【０１０９】
細胞外遊離核酸：本明細書で使用される場合、「細胞外遊離核酸」とは、細胞内に含有されないもしくは他のやり方で細胞に結合していない核酸、または一部の実施形態では、インタクトな細胞の除去後に試料中に残っている核酸を指す。細胞外遊離核酸は、例えば、対象由来の体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）など）を供給源とする封入されていない核酸全てを含み得る。細胞外遊離核酸はゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、循環ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、高分子非コードＲＮＡ（高分子ｎｃＲＮＡ）、および／またはこれらのいずれかの断片を含めた、ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、およびそれらのハイブリッドを含む。細胞外遊離核酸は、二本鎖、一本鎖、またはそれらのハイブリッドであり得る。細胞外遊離核酸は、分泌または細胞死プロセス、例えば、細胞壊死、アポトーシスなどを通じて体液中に放出され得る。一部の細胞外遊離核酸は、がん細胞から体液中に放出される、例えば循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）である。他の細胞外遊離核酸は健康な細胞から放出される。ＣｔＤＮＡは、封入されていない腫瘍由来断片化ＤＮＡであり得る。細胞外遊離核酸は、１つまたは複数のエピジェネティック修飾を有し得、例えば、細胞外遊離核酸は、アセチル化、５−メチル化、ユビキチン化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、リボシル化、および／またはシトルリン化されたものであり得る。
【０１１０】
細胞内核酸：本明細書で使用される場合、「細胞内核酸」とは、後で所与の解析プロセスの一部として除去されたとしても（例えば、細胞溶解によって）、少なくとも対象から試料を取得または採取した時点で１つまたは複数の細胞内に配置されている核酸を意味する。
【０１１１】
クローン性造血由来変異：本明細書で使用される場合、「クローン性造血由来変異」は、クローン性増大を導く造血幹細胞および／または前駆細胞におけるゲノム変異の体細胞性の獲得を指す。
【０１１２】
クローン型：本明細書で使用される場合、「クローン型」は、免疫細胞受容体に関しては、その受容体をコードするヌクレオチド配列の変異プロセスまたは遺伝子再構成プロセスに起因する独特のヌクレオチド配列（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ポリペプチド鎖のＣＤＲ３配列をコードする独特のヌクレオチド配列）を指す。
【０１１３】
比較用結果：本明細書で使用される場合、「比較用結果」とは、所与の試験試料または試験結果の１つまたは複数の可能性のある特性、ならびに／あるいは、試験試料を取得したまたは他のやり方で導き出した対象に関する１つもしくは複数の可能性のある予後転帰および／または１つもしくは複数のカスタマイズされた療法を識別するために、当該試験試料または結果の比較対象とすることができる結果または結果のセットを意味する。比較用結果は、一般には、参照試料のセット（例えば、試験対象と同じがんの型を有する対象および／または試験対象と同じ療法を受けているもしくは受けたことがある対象に由来するもの）から得られる。ある特定の実施形態では、例えば、調整されたＴＭＢスコアを比較用結果と比較して、試験試料に対して決定された調整されたＴＭＢスコアと参照試料のセットに対して決定されたＴＭＢスコアの実質的なマッチを識別する。一般には、参照試料のセットに対して決定されたＴＭＢスコアにより、１つまたは複数のカスタマイズされた療法が指し示される。したがって、実質的なマッチが識別されたら、それにより、対応するカスタマイズされた療法も試験試料を取得した対象に対する潜在的な療法経路として識別される。
【０１１４】
信頼区間：本明細書で使用される場合、「信頼区間」とは、値の範囲であって、その値の範囲内に所与のパラメータの値が既定の確率で入ると定義される値の範囲を意味する。
【０１１５】
対照試料：本明細書で使用される場合、「対照試料」とは、分析手順の正確度を評価するために、試験試料と一緒に分析されるかまたは試験試料と比較される、組成が既知であり、かつ／または既知の特性および／もしくは既知のパラメータ（例えば、既知の腫瘍割合、既知のカバレッジ、既知のＴＭＢ、および／または同様のもの）を有する試料を指す。一部の実施形態では、対照試料データセットに使用される対照試料は、がんの型に特異的なものおよび／または処置に特異的なものであり得る。
【０１１６】
対照試料データセット：本明細書で使用される場合、「対照試料データセット」とは、所定の閾値腫瘍割合よりも大きい腫瘍割合を有する対照試料のデータセットを指す。
【０１１７】
コピー数バリアント：本明細書で使用される場合、「コピー数バリアント」、「ＣＮＶ」、または「コピー数バリエーション」とは、ゲノムの切片が反復され、ゲノム内の反復の数が考慮中の集団内の個体間で変動し、また、ある個体の２つの条件または状態の間で変動する現象を指す（例えば、ＣＮＶは、ある個体において療法を受ける前と受けた後で変動し得る）。
【０１１８】
カバレッジ：本明細書で使用される場合、「カバレッジ」とは、特定の塩基位置を表す核酸分子の数を指す。
【０１１９】
カスタマイズされた療法：本明細書で使用される場合、「カスタマイズされた療法」とは、所与のＴＭＢスコアを有するまたは定義されたＴＭＢスコアの範囲内に入る対象または対象の集団に関する所望の療法転帰を伴う療法を指す。
【０１２０】
デオキシリボ核酸またはリボ核酸：本明細書で使用される場合、「デオキシリボ核酸」または「ＤＮＡ」とは、糖部分の２’位に水素基を有する天然のまたは改変されたヌクレオチドを指す。ＤＮＡは、一般には、４つの型のヌクレオチド塩基；アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）で構成されるヌクレオチドの鎖を含む。本明細書で使用される場合、「リボ核酸」または「ＲＮＡ」とは、糖部分の２’位にヒドロキシル基を有する天然のまたは改変されたヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、一般には、４つの型のヌクレオチド；Ａ、ウラシル（Ｕ）、Ｇ、およびＣで構成されるヌクレオチドの鎖を含む。本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、天然のヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドを指す。ある特定のヌクレオチドの対は、互いに相補的に特異的に結合する（相補的塩基対合と称される）。ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。第１の核酸鎖が、第１の鎖のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドで構成される第２の核酸鎖と結合する場合、これらの２つの鎖は結合して二本鎖を形成する。本明細書で使用される場合、「核酸シーケンシングデータ」、「核酸シーケンシング情報」、「配列情報」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ゲノム配列」、「遺伝子配列」、または「断片配列」、または「核酸シーケンシング読み取り」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の分子（例えば、全ゲノム、全トランスクリプトーム、エキソーム、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または断片）内のヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンまたはウラシル）の順序および同一性を示す任意の情報またはデータを示す。本教示では、これだけに限定されないが、キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ、ライゲーションに基づくシステム、ポリメラーゼに基づくシステム、ハイブリダイゼーションに基づくシステム、直接または間接ヌクレオチド識別システム、パイロシーケンシング、イオンまたはｐＨに基づく検出システム、および電子シグネチャーに基づくシステムを含めた全ての利用可能な種々の技法、プラットフォームまたは技術を使用して得られた配列情報が意図されることが理解されるべきである。
【０１２１】
ドライバー変異：本明細書で使用される場合、「ドライバー変異」とは、がんの増悪を駆動する変異を意味する。
【０１２２】
予測変異割合の予測分布：本明細書で使用される場合、「予測変異割合の予測分布」とは、統計学的分布モデル、例えば二項分布などによって決定された予測変異割合の範囲を指す。
【０１２３】
予測変異カウント：本明細書で使用される場合、「予測変異カウント（ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｎｔ）」または「予測変異カウント（ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）」または「調整された変異カウント（ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）」または「調整された変異カウント（ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｎｔ）」とは、調整された観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）を指す。
【０１２４】
予測変異割合（ｆ）：本明細書で使用される場合、「予測変異割合」とは、試料においてコールされる実際の体細胞変異の割合を指し、これは、バイオインフォマティクス解析の感度、および、対照試料データセットにおいてバイオインフォマティクス解析によって決定された全ての変異の相対的ＭＡＦのデータベースから導き出される相対的ＭＡＦの分布から導き出される。
【０１２５】
予測結果：本明細書で使用される場合、「予測結果」とは、推定される、可能性が高い、または予想される結果を意味する。
【０１２６】
免疫レパートリー：本明細書で使用される場合、「免疫レパートリー」とは、対象の適応免疫系を構成するＴ細胞受容体およびＢ細胞受容体（すなわち、免疫グロブリン）の合計を指す。
【０１２７】
免疫療法：本明細書で使用される場合、「免疫療法」とは、がん細胞を死滅させるかまたは少なくともその成長を阻害し、好ましくはがんのさらなる成長を低減し、がんのサイズを縮小させ、かつ／またはがんを排除するように免疫系を刺激するように作用する１つまたは複数の薬剤を用いた処置を指す。そのような薬剤の中には、がん細胞に存在する標的に結合するものもあり、免疫細胞に存在し、がん細胞には存在しない標的に結合するものもあり、がん細胞と免疫細胞の両方に存在する標的に結合するものもある。そのような薬剤としては、これだけに限定されないが、チェックポイント阻害剤および／または抗体が挙げられる。チェックポイント阻害剤は、自己寛容を維持し、末梢組織における生理的免疫応答の持続時間および振幅を、副次的な組織損傷が最小限になるようにモジュレートする免疫系の経路の阻害剤である（例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２，  ２５２−２６４  （２０１２）を参照されたい）。例示的な薬剤としては、ＰＤ−１、ＰＤ−２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０のいずれかに対する抗体が挙げられる。他の例示的な薬剤としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αなどの炎症促進サイトカインが挙げられる。他の例示的な薬剤は、Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原を標的とするキメラ抗原の発現によって活性化されるＴ細胞などの、腫瘍に対して活性化されるＴ細胞である。
【０１２８】
インデル：本明細書で使用される場合、「インデル」とは、対象のゲノム内のヌクレオチドの挿入または欠失を伴う変異を指す。
【０１２９】
指し示す：本明細書で使用される場合、「指し示す」とは、第１の要素（例えば、ＴＭＢスコア）が第２の要素（例えば、所与の療法）に関連付けられることを指す。
【０１３０】
最大（ｍａｘｉｍｕｍ）ＭＡＦ：本明細書で使用される場合、「最大（ｍａｘｉｍｕｍ）ＭＡＦ」または「最大（ｍａｘ）ＭＡＦ」とは、試料中の全ての体細胞バリアントの最大ＭＡＦを指す。
【０１３１】
マイナー対立遺伝子頻度：本明細書で使用される場合、「マイナー対立遺伝子頻度」とは、対象から得た試料などの所与の核酸の集団における主要でない対立遺伝子（例えば、最も一般的なものではない対立遺伝子）の存在頻度を指す。一般には、マイナー対立遺伝子頻度が低い遺伝子バリアントは試料中に存在する頻度が比較的低い。
【０１３２】
変異対立遺伝子割合：本明細書で使用される場合、「変異対立遺伝子割合」、「変異量」、または「ＭＡＦ」とは、所与の試料中の所与のゲノム内の位置に対立遺伝子の変更または変異を有する核酸分子の割合を指す。ＭＡＦは、一般に、割合またはパーセンテージとして表される。例えば、ＭＡＦは、一般には、所与の遺伝子座に存在する全ての体細胞バリアントまたは対立遺伝子の約０．５未満、約０．１未満、約０．０５未満、または約０．０１未満（すなわち、約５０％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満）である。
【０１３３】
変異：本明細書で使用される場合、「変異」とは、既知の参照配列からのバリエーションを指し、例えば、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、コピー数バリアントまたはバリエーション（ＣＮＶ）／異常、挿入または欠失（インデル）、遺伝子融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復伸長、およびエピジェネティックバリアントなどの変異を含む。変異は、生殖細胞系列または体細胞変異であり得る。一部の実施形態では、比較を行うための参照配列は、試験試料を提供する対象の種の野生型ゲノム配列、一般にはヒトゲノムである。
【０１３４】
変異コール器：本明細書で使用される場合、「変異コール器」とは、試験試料データ（例えば、対象から得た配列情報）における変異を識別するために使用されるアルゴリズム（一般には、ソフトウェアに組み入れられるか、または他のやり方でコンピューターにより実行される）を意味する。
【０１３５】
変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）：本明細書で使用される場合、「変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）」または「変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｎｔ）」とは、核酸試料の全ゲノムまたはエキソームまたは標的化領域における体細胞変異の数を指す。
【０１３６】
新抗原オーファン免疫受容体情報：本明細書で使用される場合、「新抗原オーファン免疫受容体情報」とは、以前は所与の対象の免疫系によって認識されていなかった抗原に関連する情報を指す。一般には、新抗原オーファン免疫受容体情報は、１つまたは複数の腫瘍関連変異の結果として形成される変更されたポリペプチド、またはコードするポリヌクレオチドから得られる。ある特定の実施形態では、新抗原オーファン免疫受容体情報は、これらの変更されたポリペプチドまたはコードするポリヌクレオチドに関連する配列情報から導き出される。
【０１３７】
新生物：本明細書で使用される場合、「新生物」および「腫瘍」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、対象における細胞の異常な成長を指す。新生物または腫瘍は、良性、潜在的に悪性、または悪性であり得る。悪性腫瘍は、がんまたはがん性腫瘍と称される。
【０１３８】
次世代シーケンシング：本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」とは、従来のサンガー法に基づく手法およびキャピラリー電気泳動に基づく手法と比較して増大したスループットを有し、例えば、何十万もの比較的小さな配列読み取りを一度に生成する能力を有するシーケンシング技術を指す。次世代シーケンシング技法の一部の例としては、これだけに限定されないが、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、およびハイブリダイゼーションによるシーケンシングが挙げられる。
【０１３９】
非同義変異：本明細書で使用される場合、「非同義変異」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更させる変異を意味する。
【０１４０】
核酸タグ：本明細書で使用される場合、「核酸タグ」とは、核酸を、型が異なる、または異なる処理に供された異なる試料と区別するために（例えば、試料インデックスを表す）、または同じ試料中の異なる核酸分子と区別するために（例えば、分子バーコードを表す）使用される短い核酸（例えば、約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、または約１０ヌクレオチド未満の長さ）を指す。核酸タグは、所定の、固定された、ランダムでない、ランダムなまたはセミランダムなオリゴヌクレオチド配列を含む。そのような核酸タグを使用して、異なる核酸分子または異なる核酸試料もしくは副試料を標識することができる。核酸タグは、一本鎖、二本鎖、または少なくとも部分的に二本鎖であり得る。核酸タグは、必要に応じて同じ長さまたは変動する長さを有する。核酸タグは、１つもしくは複数の平滑末端を有する二本鎖分子、５’もしくは３’一本鎖領域（例えば、突出）を含む二本鎖分子を含んでいてもよいし、および／または所与の分子内の他の位置における１つもしくは複数の他の一本鎖領域を含んでいてもよい。核酸タグは、他の核酸（例えば、増幅および／またはシーケンシングされる試料核酸）の一方の末端に付着させることもでき、両方の末端に付着させることもできる。核酸タグを復号して、所与の核酸の起源試料、形態、または処理などの情報を明らかにすることができる。例えば、核酸タグを使用して、異なる分子バーコードおよび／または試料インデックスを有する核酸を含む多数の試料のプールおよび／または並行処理を可能にすることもでき、この場合、その後、核酸タグを検出すること（例えば、読み取り）によって核酸をデコンボリューションする。核酸タグは、識別子（例えば分子識別子、試料識別子）と称することもできる。それに加えて、またはその代わりに、核酸タグを分子識別子として使用することができる（例えば、同じ試料または副試料中の異なる分子または親分子が異なるアンプリコンを区別するために）。これは、例えば、所与の試料中の異なる核酸分子に一意的にタグ付けすること、またはそのような分子に非一意的にタグ付けすることを含む。非一意的にタグ付けする適用の場合では、限られた数のタグ（すなわち、分子バーコード）を使用して各核酸分子にタグ付けすることができ、したがって、異なる分子をそれらの内因性配列情報（例えば、選択された参照ゲノムにそれらがマッピングされる開始および／もしくは停止位置、配列の一方もしくは両方の末端の部分配列、ならびに／または配列の長さ）と少なくとも１つの分子バーコードの組合せに基づいて区別することができる。一般には、任意の２つの分子が同じ内因性配列情報（例えば、開始および／もしくは停止位置、配列の一方もしくは両方の末端部分配列、ならびに／または長さ）を有し、同じ分子バーコードも有し得る確率が低くなるように（例えば、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満の見込み）、十分な数の異なる分子バーコードを使用する。
【０１４１】
観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）：本明細書で使用される場合、「観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）」または「観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｎｔ）」とは、本明細書に記載のバイオインフォマティクス解析によって決定された体細胞変異の数を指す。
【０１４２】
パッセンジャー変異：本明細書で使用される場合、「パッセンジャー変異」とは、適応度の変更はもたらさないが、同時にまたは後にドライバー変異を獲得する細胞に生じる変異を意味する。
【０１４３】
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシド間連結によって接合したヌクレオシドの直鎖状ポリマー（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはその類似体を含む）を指す。一般には、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドのサイズ範囲は、多くの場合、少数の単量体単位、例えば、３〜４から、数百単量体単位までである。ポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列で表されるときはいつでも、特に断りのない限り、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順序であること、およびＤＮＡの場合では、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はデオキシチミジンを示すことが理解されよう。文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、当技術分野における標準と同様に、塩基自体、ヌクレオシド、または塩基を含むヌクレオチドを示すために使用され得る。
【０１４４】
処理すること：本明細書で使用される場合、「処理すること」、「算出すること」、および「比較すること」という用語は、互換的に使用され得る。ある特定の適用では、この用語は、差異、例えば、数または配列の差異を決定することを指す。例えば、遺伝子発現、コピー数バリエーション（ＣＮＶ）、インデル、および／または一塩基バリアント（ＳＮＶ）値または配列を処理することができる。
【０１４５】
相対的ＭＡＦ：本明細書で使用される場合、「相対的ＭＡＦ」とは、試料中の最大（ｍａｘ）ＭＡＦと比較した特定のバリアントのＭＡＦの推定値を指す。
【０１４６】
参照配列：本明細書で使用される場合、「参照配列」とは、実験により決定された配列との比較のために使用される既知配列を指す。例えば、既知配列は、ゲノム全体、染色体、またはその任意のセグメントであり得る。参照は、一般には、少なくとも約２０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約１０００、またはそれよりも多くのヌクレオチドを含む。参照配列は、ゲノムもしくは染色体の単一の連続した配列とアラインメントすることができるものである、またはゲノムもしくは染色体の種々の領域とアラインメントされる連続していないセグメントを含み得る。例示的な参照配列としては、例えば、ｈＧ１９およびｈＧ３８などのヒトゲノムが挙げられる。
【０１４７】
試料：本明細書で使用される場合、「試料」とは、本明細書に開示される方法および／またはシステムによって分析することができる何かを意味する。
【０１４８】
検出限界（ＬｏＤ）：本明細書で使用される場合、「検出限界」とは、所与のアッセイまたは解析手法によって測定することができる試料中の物質（例えば、核酸）の最小量を意味する。
【０１４９】
感度：本明細書で使用される場合、「感度」とは、所与のＭＡＦおよびカバレッジにおける変異の存在が検出される確率を意味する。
【０１５０】
シーケンシング：本明細書で使用される場合、「シーケンシング」とは、生体分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の配列（例えば、単量体単位の同一性および順序）を決定するために使用される複数の技術のいずれかを指す。例示的なシーケンシング方法としては、これだけに限定されないが、標的化シーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、エクソンまたはエキソームシーケンシング、イントロンシーケンシング、電子顕微鏡に基づくシーケンシング、パネルシーケンシング、トランジスタ媒介性シーケンシング、ダイレクトシーケンシング、ランダムショットガンシーケンシング、サンガージデオキシ終結シーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、パイロシーケンシング、キャピラリー電気泳動、二重鎖シーケンシング、サイクルシーケンシング、一塩基伸長シーケンシング、固相シーケンシング、ハイスループットシーケンシング、大規模並列処理シグネチャーシーケンシング、エマルジョンＰＣＲ、低変性温度での共増幅−ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）、多重ＰＣＲ、可逆的ダイターミネーターによるシーケンシング、ペアエンドシーケンシング、短期シーケンシング、エキソヌクレアーゼシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ショートリードシーケンシング、単一分子シーケンシング、合成によるシーケンシング、リアルタイムシーケンシング、リバースターミネーターシーケンシング、ナノポアシーケンシング、４５４シーケンシング、Ｓｏｌｅｘａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンシング、ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシング、ＭＳ−ＰＥＴシーケンシング、およびこれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、シーケンシングは、例えば、他の多くのものの中でも、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている遺伝子解析機器などの遺伝子解析機器によって実施することができる。
【０１５１】
配列情報：本明細書で使用される場合、「配列情報」とは、核酸ポリマーに関しては、そのポリマー内の単量体単位（例えば、ヌクレオチドなど）の順序および同一性を意味する。
【０１５２】
一塩基バリアント：本明細書で使用される場合、「一塩基バリアント」または「ＳＮＶ」とは、ゲノム内の特定の位置に生じる一塩基の変異またはバリエーションを意味する。
【０１５３】
体細胞変異：本明細書で使用される場合、「体細胞変異」とは、受胎後に生じるゲノム内の変異を意味する。体細胞変異は、生殖細胞以外の体の任意の細胞において生じ得、したがって、後代には受け渡されない。
【０１５４】
実質的なマッチ：本明細書で使用される場合、「実質的なマッチ」とは、少なくとも第１の値または要素が少なくとも第２の値または要素と少なくともほぼ等しいことを意味する。ある特定の実施形態では、例えば、調整された結果（例えば、調整されたＴＭＢスコア）と比較用結果（例えば、１つまたは複数の対照または参照試料から決定されたＴＭＢスコア）が少なくとも実質的にまたはほぼマッチした場合に、カスタマイズされた療法が識別される。
【０１５５】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」とは、哺乳動物種（例えば、ヒト）もしくはトリ（例えば、鳥類）種などの動物、または植物などの他の生物体を指す。より詳細には、対象は、脊椎動物、例えば、マウス、霊長類、サルまたはヒトなどの哺乳動物であり得る。動物は、農場動物（例えば、肉用牛、乳牛、家禽、ウマ、ブタなど）、競技動物、および伴侶動物（例えば、愛玩動物または支援動物）を含む。対象は、健康な個体、疾患もしくは疾患に対する素因を有するもしくはそれを有する疑いがある個体、または療法を必要とするもしくは療法を必要とする疑いがある個体であり得る。「個体」または「患者」という用語は、「対象」と交換できることが意図されている。
【０１５６】
例えば、対象は、がんを有するという診断を受けた個体、がん療法を受ける予定の個体、および／または少なくとも１つのがん療法を受けた個体であり得る。対象は、がんが寛解した状態であり得る。別の例として、対象は、自己免疫疾患を有するという診断を受けた個体であり得る。別の例として、対象は、疾患、例えば、がん、自己免疫疾患を有するという診断を受けた可能性があるかまたは有する疑いがあり得る妊娠中または妊娠する計画がある女性個体であり得る。
【０１５７】
同義変異：本明細書で使用される場合、「同義変異」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変更されない変異を意味する。
【０１５８】
閾値：本明細書で使用される場合、「閾値」とは、異なる試料に関して実験により決定された同じパラメータの値を閾値との関係に応じて特徴付けるために使用される所定の値を指す。
【０１５９】
閾値最大（ｍａｘ）ＭＡＦ：本明細書で使用される場合、「閾値最大（ｍａｘ）ＭＡＦ」とは、異なる試料に関して実験により決定された最大（ｍａｘ）ＭＡＦの値を特徴付けるために使用される最大（ｍａｘ）ＭＡＦの所定の値を指す。一部の実施形態では、例えば、閾値最大（ｍａｘ）ＭＡＦは、約０．５％、１％、２％、５％、１０％または別の選択された閾値であり得る。
【０１６０】
閾値ＴＭＢスコア：本明細書で使用される場合、「閾値ＴＭＢスコア」とは、異なる試料に関して実験により決定されたＴＭＢスコアの値を特徴付けるために使用されるＴＭＢスコアの所定の値を指す。ある特定の実施形態では、例えば、閾値ＴＭＢスコアは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または別の選択された閾値であり得る。
【０１６１】
閾値腫瘍割合：本明細書で使用される場合、「閾値腫瘍割合」とは、異なる試料に関して実験により決定された腫瘍割合の値を特徴付けるために使用される腫瘍割合の所定の値を指す。ある特定の実施形態では、例えば、閾値腫瘍割合は、約１％、２％、３％、４％、５％または別の選択された閾値であり得る。
【０１６２】
閾値ｆ：本明細書で使用される場合、「閾値ｆ」とは、異なる試料に関して実験により決定された予測変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）の値を特徴付けるために使用される予測変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ｆ）の所定の値を指す。一部の実施形態では、例えば、閾値ｆは、約０．０５よりも大きい、約０．１よりも大きい、約０．２よりも大きい、約０．３よりも大きい、約０．４よりも大きい、約０．５よりも大きい、約０．６よりも大きい、約０．７よりも大きい、約０．８よりも大きい、約０．９よりも大きい、または別の選択された閾値であり得る。
【０１６３】
腫瘍割合：本明細書で使用される場合、「腫瘍割合」とは、所与の試料中の腫瘍に由来する核酸分子の割合の推定値を指す。例えば、試料の腫瘍割合は、試料の最大（ｍａｘ）ＭＡＦまたは試料のシーケンシングカバレッジのパターンまたは試料中のｃｆＤＮＡ断片の長さまたは任意の他の選択された試料の特色から導き出される尺度であり得る。一部の例では、試料の腫瘍割合は、試料の最大（ｍａｘ）ＭＡＦと等しい。
【０１６４】
腫瘍遺伝子変異量：本明細書で使用される場合、「腫瘍遺伝子変異量（ｔｕｍｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ）（ＴＭＢ）」、「腫瘍遺伝子変異量（ｔｕｍｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｕｒｄｅｎ）（ＴＭＢ）」または「がん遺伝子変異量（ｃａｎｃｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ）」または「変異負荷量（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌｏａｄ）」または「変異負荷量（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｌｏａｄ）」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、腫瘍ゲノムのシーケンシングされた部分に存在する変異、例えば体細胞変異の総数を指す。ＴＭＢは、調査される腫瘍ゲノムまたはエキソームまたはゲノムの標的化領域の１メガベース当たりのコーディング、塩基置換、インデル、または他の変異の数を指し得る。これらは、がん治療剤もしくは薬物、例えば、免疫チェックポイント阻害剤、抗体などに対する感度および／または耐性を、検出する、評価する、算出する、または予想することを示し得る。高レベルのＴＭＢを有する腫瘍は、がん特異的抗原の一種である新抗原をより多く発現する可能性があり、より頑強な免疫応答を可能にし得、したがって、免疫療法に対するより長続きする応答を可能にし得る。免疫系は、適正に応答するために、十分な数の新抗原に依拠するので、体細胞変異の数は、腫瘍における新抗原の数を決定するための代理として作用し得る。ＴＭＢを使用して、対象における薬物処置に対する免疫応答の頑強性および薬物処置の有効性を推定することができる。生殖細胞系列バリアントと体細胞バリアントをバイオインフォマティクスにより区別して、抗原性体細胞バリアントを識別することができる。
【０１６５】
バリアント：本明細書で使用される場合、「バリアント」は、対立遺伝子と称することができる。バリアントは、通常、対立遺伝子がヘテロ接合性であるかホモ接合性であるかに応じて５０％（０．５）または１００％（１）の頻度で存在する。例えば、生殖細胞系列バリアントは遺伝性であり、通常は０．５または１の頻度を有する。しかし、体細胞バリアントは後天性バリアントであり、通常は＜０．５の頻度を有する。遺伝子座の主要な対立遺伝子および主要でない対立遺伝子とは、それぞれ、参照配列のヌクレオチドによって占有された遺伝子座、および参照配列とは異なるバリアントヌクレオチドによって占有された遺伝子座を有する核酸を指す。遺伝子座における測定値は、試料中で対立遺伝子が観測される頻度を測定する対立遺伝子割合（ＡＦ）の形態をとり得る。
詳細な説明
【０１６６】
緒言
【０１６７】
がんは、異常な細胞成長、および体内の細胞の起源部位を越えて転移する潜在性という共通の特徴を有する遺伝子疾患の大きな群を包含する。これらの疾患の基礎をなす分子基盤は、細胞表現型の変容を導く変異および／またはエピジェネティック変化であり、これらの有害な変化が遺伝によって獲得されたものであるか体細胞を基礎とするものであるかは関係ない。厄介なことに、これらの分子変化は、一般には、同じ型のがんを有する患者の中だけでなく、所与の患者自身の腫瘍の中でさえも変動する。
【０１６８】
大多数のがんにおいて観測される変異性の変動性を考慮すると、がんケアに関する難題の１つは、患者の個別化されたがんの型を考慮して患者が応答する可能性が最も高い療法を識別することである。がん患者にがん免疫療法を含めた適正な処置をマッチさせるために種々のバイオマーカーが使用される。応答に関するバイオマーカーの１つは腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）であり、これは、所与のがんゲノムのコード領域１つ当たりの変異の総数の定量的尺度である。現在まで、この応答バイオマーカーの適用は、一部において、ＴＭＢを測定し、解析する手段によって限定されている。
【０１６９】
本開示は、患者試料中のＴＭＢを決定し、解析することにおいて有用であり、がん処置決定のガイドに役立つ方法、コンピューター可読媒体、およびシステムを提供する。伝統的に、腫瘍割合（例えば、変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ））および／またはカバレッジが小さい場合には、変異をコールするためのアッセイの感度が低下するので、変異率をカウントすることによって得られるＴＭＢは不正確である頻度が高い。したがって、ある特定の態様では、観測ＴＭＢを、アッセイの感度の種々の尺度、例えば、腫瘍割合（所与の試料中の変異のＭＡＦを設定する）、カバレッジ、および／または同様のものなどを考慮して調整する。そのような調整を行わなかった場合、例えば、実際にはＴＭＢ−Ｈｉｇｈであるが腫瘍割合が小さく、かつ／またはカバレッジが小さい試料は、ＴＭＢ−Ｌｏｗと誤って報告される頻度が高くなる。そのような転帰は、そのような結果に基づいて処置の決定を行う場合、患者に対して下流で重要な意義を有し得る。
【０１７０】
腫瘍遺伝子変異量調整方法
【０１７１】
本出願は、所与のアッセイにおける腫瘍割合および／またはカバレッジの変動性を説明するためにＴＭＢを調整する様々な方法を開示し、変動性は、そうでなければ不正確なＴＭＢ報告を導き得る。ある特定の実施形態では、方法は、未加工の体細胞変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）（例えば、所与のバイオインフォマティクスパイプラインまたはワークフローによってコールされたＳＮＶおよびインデル）を、特定のバイオインフォマティクスパイプラインによってコールされる考慮中のパネルにおける試料の実際の変異の割合のモデルによる予想によって調整することを含む。ある特定の実施形態では、モデルは、バイオインフォマティクス変異（例えば、ＳＮＶ、インデル、および／または同様のもの）コール器および二項サンプリングソリューションの論理を使用して、試料カバレッジの設定における、および／またはその試料中のＭＡＦの予測分布にわたる変異コール器の感度を算出する。一部の実施形態では、試料中のＭＡＦの予測分布は、対照試料データセットの対照試料においてコールされた全ての変異の相対的ＭＡＦによって導き出される。これらの実施形態の一部では、モデルにより、観測された変異の予測割合、および当該割合の確率分布が算出され、これを、例えば、当該割合に関する９５％信頼区間として要約することができる。これを使用して、予測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）の高感度（例えば、可能性が最も高い実際の変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ））および／または高特異度（例えば、可能性が最も低い実際の変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ））の算出を出力することができる。これらの実施形態のある特定のものでは、次いで、予測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）を、解析されるゲノム領域のサイズで割って、変異率（すなわち、ＴＭＢまたはＴＭＢスコア）を得る。例えば腫瘍由来の組織試料の全エキソームシーケンシングから算出されるＴＭＢまたは試料の腫瘍割合が高い場合に算出されるＴＭＢの「ゴールドスタンダード」と比較して、本明細書に記載の調整を実行することによって算出されるＴＭＢはこれらの調整を行わずに測定されるＴＭＢよりも正確なものになる。
【０１７２】
さらなる例示のために、図１は、本発明の一部の実施形態に従ってＴＭＢを調整する例示的な方法のステップを概略的に示すフローチャートを提供する。示されている通り、方法１００は、ステップ１１０において、対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定することを含む。方法１００は、ステップ１１２において、核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成すること、ならびにステップ１１４において、シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成することも含む。さらに、方法１００は、ステップ１１６において、予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、対象におけるＴＭＢを決定することも含む。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、方法１００は、追加的な上流および／または下流のステップを含む。一部の実施形態では、例えば、方法１００は、ステップ１０２で開始され、ステップ１０４において対象由来の試料を提供する（例えば、対象から取得した血液試料を提供する）。これらの実施形態では、方法１００のワークフローは、一般には、ステップ１０６において、試料中の核酸を増幅させて、増幅した核酸を生成すること、およびステップ１０８において、増幅した核酸のシーケンシングを行って、配列情報を生成した後、ステップ１１０において、配列情報から観測変異カウントを決定することも含む。核酸増幅（関連する試料調製を含む）、核酸シーケンシング、および関連するデータ解析は本明細書にさらに記載されている。
【０１７４】
一部の実施形態では、方法１００は、ステップ１１６において生成された調整された結果から下流の種々のステップを含む。これらの一部の例は、ステップ１１８において、調整された結果を、１つまたは複数の療法を指し示す１つまたは複数の比較用結果と比較して、対象に対する１つまたは複数のカスタマイズされた療法を識別することを含む。一部の実施形態では、方法１００は、結果を対象または医師に報告することを含む。他の例示的な実施形態では、方法１００は、ステップ１２０において、調整された結果と比較用結果が実質的にマッチする場合に、識別されたカスタマイズされた療法の少なくとも１つを対象に施行し（例えば、対象のがんまたは別の疾患もしくは状態を処置するために）、その後、ステップ１２２において終了することも含む。
【０１７５】
さらなる例示のために、任意の所与の試料に関して、腫瘍割合（例えば、体細胞変異の最大ＭＡＦ（「主要でないＡＦ」）または腫瘍割合の別の推定値）および／またはカバレッジのいくつかの指標（例えば、塩基１つ当たりの独特の分子の中央値）をモデルに入力する。モデルは、これらの条件でコールされることが予測されるパネル空間内の変異の割合、および認められることが予測される変異の割合の分布（例えば、認められることが予測される変異の割合の範囲の９５％信頼区間を用いて要約することができる）を出力するために利用される変異（例えば、ＳＮＶ、インデル、および／または同様のもの）コールアルゴリズムに基づく算出を使用する。一部の実施形態では、バイオインフォマティクス解析によってコールされる所与のパネルにおける実際の変異の予測割合は、予測ＭＡＦの範囲にわたる所与のＭＡＦにおける変異がコールされる確率（すなわち、感度）を評価することによって算出される（すなわち、相対的ＭＡＦの分布を、試料腫瘍割合を掛けることによってＭＡＦに変換する）。
【０１７６】
一般には、変異コール器の感度を所与のＭＡＦにおける変異がコールされる確率およびカバレッジから本明細書に記載のバイオインフォマティクス解析のアルゴリズムを使用して推定する。一部の実施形態では、以前のデータに基づく経験的な分布を使用して確率を算出することができる（すなわち、「経験的な」変異コール感度をもたらす、試料が種々のカバレッジで種々のＭＡＦにおける既知の変異を有し、変異がどのくらいの頻度で検出されるかを試験する実験を実行する）。一部の実施形態では、二項分布を使用して確率を算出することができる。一部の実施形態では、変異コールのための多数の要件に基づく多成分分布を使用して確率を算出することができる（例えば、変異に関する以前の予測のいくつかの他の考慮事項と共に、変異を支持する分子の数；変異コール感度を、変異ががんホットスポット領域に存在するか否かと共に使用する−これらの成分の全てに基づく組合せを使用することができる）。一部の実施形態では、変異コール器の感度を、バリアントの型（例えば、ＳＮＶ、短いインデルまたは長いインデル）、ゲノムの状況（例えば、ホットスポット領域、骨格領域、局所的なＧＣ含量など）、または試料の状況（例えば、ＧＣ、ＭＡＰＤ、カバレッジプロファイルなどのシーケンシングメトリクス；または腫瘍型の試料メトリクス）などの特定の基本要件に基づいて推定することができる。
【０１７７】
一部の実施形態では、方法は、特定の試料中のＭＡＦの予測分布を定義することを含む。これらの実施形態のある特定のものでは、相対的ＭＡＦの分布を、対照試料データセットにおける対照試料全てにわたって曲線に経験的に当てはめる。経験的に当てはめる曲線は、以下の方程式：
Ｆ＝１／（１＋（Ｐ＿５０／相対的−ＭＡＦ）ｎ）
（式中、Ｆは、累積分布関数であり、Ｐ＿５０は、相対的ＭＡＦの中央値であり、相対的−ＭＡＦは相対的ＭＡＦであり、ｎは、相対的な分布の形状を当てはめるための指数である）によって記載される。ある特定の実施形態では、予測変異割合の予測分布を、少なくとも１つの対照試料データセットにおいて観測される相対的な変異対立遺伝子割合（ＭＡＦ）の１つまたは複数のデータセットから得る。対照試料データセットは、一般には、少なくとも約２５から少なくとも約３０，０００またはそれよりも多くまでの対照試料を含む。一部の実施形態では、対照試料データセットは、約５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、１００，０００、１，０００，０００、またはそれよりも多くの対照試料を含む。一部の実施形態では、対照試料において観測される最大（ｍａｘ）ＭＡＦは、約０．５％、約１％、約２％、約５％、約１０％またはそれよりも多くを構成する。一部の実施形態では、最大ＭＡＦの閾値（すなわち、閾値最大（ｍａｘ）ＭＡＦ）を使用する。これらの実施形態では、閾値腫瘍割合は、一般には、約１％、２％、３％、４％、５％または別の選択された閾値である。
【０１７８】
一部の実施形態では、予測結果を、以下の方程式：
観測された変異の割合（ｆ）＝ΣＭＡＦ（Ｐ（変異のコール｜ＭＡＦ）×Ｐ（ＭＡＦにおける変異））
（式中、Ｐは確率であり、ＭＡＦは変異対立遺伝子割合であり、Ｐ（変異のコール｜ＭＡＦ）は特定のＭＡＦにおける変異がコールされる確率であり、これは、試料の特定のＭＡＦおよびカバレッジにおける変異コール器の感度を表し、Ｐ（ＭＡＦにおける変異）は、ＭＡＦにおける変異の確率であり、これは、試料のＭＡＦの予測分布を表す）
を使用して決定する。
【０１７９】
この割合は基本的に二項サンプリング確率であるので、この割合における分布の上限および下限（および信頼区間）は、二項比率の信頼区間を使用して概算される：
【数４】
2021531775.tif 000006
（式中、ｆは、コールされる変異の予測割合であり、ｎ＿真は、予測される実際の変異カウントであり、これはｆを考慮して観測される変異の数と等しく、ｚは信頼水準である（例えば、９５％信頼区間に対して１．９６））。予測される実際の変異カウントの算出は、方程式：ｎ＿真＝ｎ＿観測／ｆによって得られる。したがって、例えば、６つの変異が観測され（すなわち、ｎ＿観測＝６）、変異の６０％が観測された（すなわち、ｆ＝６０％）場合、予測される実際の変異カウントは、１０（すなわち、ｎ＿真＝１０）である。ある特定の実施形態では、ｆが閾値ｆ未満の場合、ＴＭＢは決定されず、他の実施形態では、ｆが閾値ｆを超える場合、ＴＭＢが決定される。一部の実施形態では、例えば、閾値ｆは、約０．０５よりも大きい、約０．１よりも大きい、約０．２よりも大きい、約０．３よりも大きい、約０．４よりも大きい、約０．５よりも大きい、約０．６よりも大きい、約０．７よりも大きい、約０．８よりも大きい、約０．９よりも大きい、または別の選択された閾値であり得る。ある特定の実施形態では、予測変異割合（ｆ）および／または予測変異割合の予測分布は、変異割合に関して約９５％またはそれよりも大きな信頼区間を含む。一部の実施形態では、方法は、予測変異割合の９５％信頼区間の上限（ｆ上限）を使用して調整された変異カウントの下限を生成することを含む。
【０１８０】
これらの実施形態の一部では、次いで、試料の腫瘍割合が大きく、かつ／またはカバレッジが大きい場合、未加工の体細胞変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）（観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ））をモデルによるこの出力で割って、パネルにおいてコールされたと予測変異の数を得る。割合の推定値を実際の／予測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）の最良の推定値として使用することができる。必要に応じて、割合に関する９５％信頼区間の上限（ｆ上限）を使用して、実際の変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）の下限を得ることができ（すなわち、実際の変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）がその変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）と少なくとも等しい見込みが９５％である）、これは、特異度が高い出力である（ＴＭＢ−Ｈｉｇｈの報告に関して特異度が高い）。これらの実施形態のある特定のものでは、次いで、予測／調整された変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｕｎｔ）を解析されるゲノム領域のサイズで割って、試料のＴＭＢスコアを得る。一部の実施形態では、試料のＴＭＢスコアが閾値ＴＭＢスコアよりも大きい場合、試料をＴＭＢ−Ｈｉｇｈ試料に分類する。試料のＴＭＢスコアが閾値ＴＭＢスコアよりも小さい場合、試料をＴＭＢ−Ｌｏｗ試料に分類する。ある特定の実施形態では、例えば、閾値ＴＭＢスコアは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または別の選択された閾値であり得る。
【０１８１】
一般には、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合は、核酸において識別される複数の体細胞変異を含む。これらの実施形態の一部では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合から１つまたは複数の既知のがんドライバーおよび／またはパッセンジャー変異が除外される。ある特定の実施形態では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合は、核酸において識別される複数の同義変異、複数の非同義変異、および／または複数の非コード変異を含む。必要に応じて、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合は、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、挿入もしくは欠失（インデル）、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、融合、塩基転換、転座、フレームシフト、重複、反復伸長、エピジェネティックバリアント、および／または同様のものを含む複数の変異を含む。ある特定の実施形態では、観測変異カウントおよび／または腫瘍割合からクローン性造血由来変異が除外される。必要に応じて、予測変異割合を実際の変異カウントの観測割合として使用する。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、腫瘍割合を組み入れるために、例えば、全ての体細胞変異（例えば、ＳＮＶおよびインデルデータから導き出される）の最大変異対立遺伝子割合（最大（ｍａｘ）ＭＡＦ）を使用すること以外の代替法を利用する。いくつかの例示的な代替としては、カバレッジに基づいた腫瘍割合を使用すること、ｃｆＤＮＡ断片の長さに基づいた腫瘍割合を使用すること、生殖細胞系列および／もしくは体細胞バリアントに基づいた腫瘍割合を使用すること、またはこれらの手法のいずれかの組合せが挙げられる。一部の実施形態では、ゲノム領域の所定のセットのシーケンシングカバレッジのパターンおよび標準の最尤法を使用して腫瘍割合を推定することができる。一部の実施形態では、試料中のゲノム領域の所定のセットとコピー数の変化を有する領域のｃｆＤＮＡ断片サイズ分布の差異から腫瘍割合を推定することができる。一部の実施形態では、生殖細胞系列および／または体細胞バリアントのＭＡＦを試料において観測されるコピー数の変化に対して調整することによって腫瘍割合を推定することができる。一部の実施形態では、標的ゲノム領域のｃｆＤＮＡ分子のセットを捕捉するために使用されるプローブのシーケンシングカバレッジを使用して、腫瘍割合（すなわち、体細胞割合）を推定することができる。一部の実施形態では、試料中のｃｆＤＮＡ分子のメチル化の状態に基づいて腫瘍割合を推定することができる。一部の実施形態では、最大（ｍａｘ）ＭＡＦを使用して腫瘍割合を推定することができるが、その特定のゲノム内の位置におけるコピー数に関して調整を行うことができる。一部の実施形態では、試料中の体細胞ＭＡＦを腫瘍割合の推定値と組み合わせることができる。一部の実施形態では、メチル化を、メチル化パターンを使用して腫瘍に由来する分子を識別することに基づいて腫瘍割合を推定するために使用することができ、したがって、腫瘍分子の割合を識別して、腫瘍割合を推定するために使用することができる。一部の例では、上記の実施形態の全ての組合せまたは上記の実施形態の少なくともサブセットの組合せをモデルにおいて使用して、腫瘍割合を推定することができる。
【０１８３】
一部の実施形態では、所与の試料の腫瘍割合は、全核酸の約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．２％未満、約０．５％未満、１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満であり得る。
【０１８４】
一部の実施形態では、生殖細胞系列バリアントをＴＭＢスコアの決定から除外する。一部の実施形態では、バリアントの生殖細胞系列／体細胞の状態は、ベータ二項分布モデルを使用して決定することができる。ベータ二項分布を使用して、候補バリアントの近くに位置する共通生殖細胞系列一塩基多型（ＳＮＰ）の変異対立遺伝子カウントの平均値および分散をモデル化する。候補バリアントがこれらの局所的生殖細胞系列ＳＮＰの分布から逸脱する場合には、バリアントは「体細胞バリアント」とコールされ、そうでなければ、バリアントは、「生殖細胞系列バリアント」とコールされる。ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５２０８７ならびに米国特許仮出願第６２／７２６，１８２号、同第６２／８２３，５７８号および同第６２／８５７，０４８号に記載されている方法およびシステムが参照により組み込まれる。
【０１８５】
カバレッジをまた必要に応じて種々のやり方でモデルに組み入れる。一部の実施形態では、カバレッジを塩基１つ当たりの独特のｃｆＤＮＡ断片の中央値として組み入れることができる。一部の実施形態では、モデルを塩基特異的にすることができ、方法は、各塩基における感度を、その塩基における独特のｃｆＤＮＡ断片の数を使用して算出することを含む。ある特定の実施形態では、方法は、核酸における所与のヌクレオチド位を含む複数の独特のシーケンシング読み取りを識別して、カバレッジを決定することを含む。さらに他の例示的な実施形態では、方法は、核酸における所与のヌクレオチド位を構成する独特の細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子の数の中央値を識別して、カバレッジを決定することを含む。カバレッジは、ある塩基位置におけるｃｆＤＮＡ断片が少なくとも１０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個、１０，０００個、２０，０００個または５０，０００個というものである。
【０１８６】
本出願に開示される方法は、一般に、対象から取得した試料中の核酸から配列情報を得ることを含む。ある特定の実施形態では、配列情報を核酸の標的とされるセグメントから得る。基本的にあらゆる数のゲノム領域を必要に応じて標的とする。標的とされるセグメントは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも５０，０００または少なくとも１００，０００（例えば、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１５，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００または１００，０００）の異なるおよび／または重複するゲノム領域を含み得る。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、方法は、観測変異カウントを予測結果で割って、調整された結果を生成することを含む。一般には、調整された結果は、変異対立遺伝子割合の範囲にわたって核酸において検出される複数の変異を含む。調整された結果は、一般に、可能性が最も高い実際の変異カウントの予想および／または可能性が最も低い実際の変異カウントの予想を含む。ある特定の実施形態では、予測結果は、予測変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を含む。ある特定の実施形態では、調整された結果は、調整された変異カウントを含む。一般には、調整された変異カウントは、観測変異カウントよりも大きいかまたはそれと等しい。
【０１８８】
他の例示的な実施形態では、体細胞変異（例えば、ＳＮＶ、インデルなど）のカウントからバックグラウンドエキソーム変異率またはＴＭＢを表さないドライバー変異などが除外される。一部の実施形態では、考慮中の腫瘍ではなく、クローン性造血に由来する可能性が高い変異は体細胞変異のカウントから除外される。クローン性造血に由来する変異は、文献およびがんデータベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣ）に基づく、血液関連がんにおいて頻繁に観測される変異のキュレートされた一覧を使用して識別することができる。一部の実施形態では、クローン性造血変異を、試料中のそれらの状況（例えば、ＭＡＦ）（例えば、同様のＭＡＦまたは同様のＭＡＦの範囲における他のクローン性造血バリアントの存在）を使用して、または以前に試験された試料のデータベース内のクローン性造血変異を解析することによって識別することができる。一部の実施形態では、クローン性造血変異を、血液に由来する患者試料（例えば、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ））中のＤＮＡのシーケンシングを行うことによって識別することができる。ある特定の実施形態では、体細胞変異のカウントは、利用される特定のパネルの一部として報告されていない部位におけるＳＮＶおよびインデルも含む。例えば、そのような変異は、所与の適用において変異が「報告されていない」領域（例えば、イントロン）内にあり得る。これは、例えば、体細胞変異をカウントするためのパネルがより大きく、したがって、試料採取エラーがより小さく、変異率のシグナルがより高いことを意味する。一部の実施形態では、クローン性造血由来変異を、これらのパラメータ−患者の年齢、腫瘍型、その位置におけるメチル化の状態、その試料中のその変異および任意の他の変異を支持する分子の断片サイズの少なくともいくつかを入力として利用する確率／尤度モデルを使用することによって識別することができる。一部の実施形態では、これらの入力パラメータを使用して、各変異がクローン性造血由来変異であるかどうかのモデルまたは優先を構築することができる。一部の実施形態では、ロジスティック回帰、ランダムフォレストなどのような機械学習アルゴリズムを適用して、クローン性造血由来変異を識別することができる。ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３５２１４に記載されている方法およびシステムも使用することができ、これらは参照により組み込まれる。
【０１８９】
他の例示的な実施形態では、方法は、任意の特定のＳＮＶ、インデル、および／または他の型の変異について検出限界（ＬＯＤ）を下回るが、他の大多数の塩基よりもその塩基における変異の可能性が高いことが示された変異のプールされたエビデンスを使用することを含む。これらの実施形態では、ＴＭＢ−Ｈｉｇｈ試料は、一般には、ＴＭＢ−Ｌｏｗ試料よりもこのエビデンスを多く有する。一部の実施形態は、所与のパネルにおける、ＴＭＢを相関する変異を有する部位の数を増大させること、および／または、腫瘍割合の推定をさらに改善することを含む。ある特定の実施形態では、フラグメントミクスに関して潜在的に高度に情報価値のある部位を含めることにより、腫瘍割合の推定または決定もさらに改善される。
【０１９０】
一部の実施形態では、低ＭＡＦの体細胞変異をフィルターで取り除くことにより、観測変異カウントからサブクローン性変異を除外する。一部の実施形態では、観測変異カウントから、最大（ｍａｘ）ＭＡＦの約１％未満、約２％未満、約３％未満、約４％未満、約５％未満、約６％未満、約７％未満、約８％未満、約９％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満または約３０％未満である体細胞変異を除外する。
【０１９１】
一部の実施形態では、予測／調整された変異カウントを、エキソーム較正因子を使用して調整し、エキソーム較正因子は、解析されるパネルの変異率のエキソーム変異率に対する比である。一部の実施形態では、予測／調整された変異カウントをエキソーム較正因子で割る。一部の実施形態では、エキソーム較正因子は、１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９または少なくとも１．１０である。一部の実施形態では、エキソーム較正因子をがんデータベース、例えば、ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）内の試料のエキソーム変異率から決定する。一部の実施形態では、エキソーム較正因子は、がんの型に特異的であり得、エキソーム変異率を特定のがんの型を有する試料（データベース内の）から決定することができる。
【０１９２】
一部の実施形態では、観測変異カウントから耐性変異を除外する。いくつかの実施形態では、耐性変異を、文献およびがんデータベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣ、ＴＣＧＡ）に基づく、患者試料において頻繁に観測される変異のキュレートされた一覧を使用して識別することができる。一部の実施形態では、以前に試験された試料のデータベースを解析することによって耐性変異を識別することができる。
【０１９３】
一部の実施形態では、耐性機構または任意の他のプロセスにより、遺伝子に多数の変異が導入される可能性があり（例えば、ＣＲＣにおけるＫＲＡＳまたはＰＡＲＰ阻害剤で処置された前立腺がんにおけるＢＲＣＡ１／２復帰変異）、観測変異カウントにおけるこれらの変異全てをカウントすることでは、全エキソーム変異率は反映されない可能性がある。そのような実施形態では、特定の遺伝子におけるわずかな変異は、その特定の遺伝子における変異の数がパネルにおける全体的な試料変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）および遺伝子サイズに基づいて予測されるその遺伝子における変異の数よりも有意に多い場合、観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）から除外される。「有意に多い」という用語は、統計学的サンプリングモデルに基づいて評価することができる。例えば、試料の変異率が１Ｍｂ当たり１０個の変異（がん関連遺伝子のパネルを解析することによって観測される）であり、そのうち５個の変異がＫＲＡＳ遺伝子（パネル内）に存在する場合、ＫＲＡＳ内の変異率は、試料変異率に基づいて予測されるものよりもはるかに高くなる。観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）にカウントされるＫＲＡＳ由来の変異の数は、試料変異率に基づいて予測率に近づくように抑えられる。
【０１９４】
一部の実施形態では、ＴＭＢスコアを使用して、患者が免疫療法による処置に応答するかどうかを予想することができる。ある特定の実施形態では、解析された遺伝子のセットにわたるある特定の遺伝子における特定の型の変異（例えば、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＰＴＥＮなどの機能喪失）および／または患者の変異シグネチャー（例えば、患者がＣ＞Ｔ転移を有する）が存在することをＴＭＢスコアと組み合わせて使用して、患者が免疫療法による処置に応答するかどうかを予想することができる。ある特定の実施形態では、患者が、これだけに限定されないが、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１およびＰＴＥＮなどのある特定の遺伝子の機能喪失を有する場合には、患者は、ＴＭＢスコアとは関係なく免疫療法に応答しない。例えば、患者が、（ｉ）高ＴＭＢスコアおよび（ｉｉ）ＳＴＫ１１機能喪失を有する場合には、機能喪失／ドライバー変異が優先し、患者は療法に応答しない。
【０１９５】
一部の実施形態では、本明細書に開示される調整方法は、対象（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物対象）から試料を得ることを含む。必要に応じて利用される例示的な試料型は本明細書にさらに記載されている。基本的にあらゆる型の核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を本出願に開示される方法に従って評価することができる。一部の例としては、細胞外遊離核酸（例えば、腫瘍起源のｃｆＤＮＡおよび／または同様のもの）、循環腫瘍細胞を含めた細胞内核酸（例えば、試料中のインタクトな細胞を溶解させることによって得られる）、循環腫瘍核酸が挙げられる。
【０１９６】
一部の実施形態では、特定のカットオフ未満の腫瘍シェディングを示し、かつ／または特定のカットオフ未満のカバレッジを有する腫瘍割合またはいずれかのパラメータを有し、その結果、変異の予測割合が非常に低くなる試料にはＴＭＢ補正モデルを適用することができない。一部の実施形態では、正確なＴＭＢ推定に干渉するＣＨＩＰ変異を優勢に含有する試料にはＴＭＢ補正モデルを適用することができない。ＴＭＢ補正モデルを試料に適用することができるかどうかを確認するための基準は、試料がＣＨＩＰ変異を優勢に含有するかどうかを算出するために使用される方法を含む。そのような方法は、例えば、（ａ）ＣＨＩＰであることが分かっている変異の大きな割合（キュレートされたデータベース、またはＣＨＩＰを識別する他の方法、例えば、バフィーシーケンシング、フラグメントミクスなどを使用して）；（ｂ）固形腫瘍のエビデンス、例えば、試料の腫瘍型の既知のドライバー変異の非存在；（ｃ）上記の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、低腫瘍シェディングまたはＣＨＩＰ優勢を含有する試料にはＴＭＢ補正モデルを適用することができない。
【０１９７】
これらの実施形態では、方法は、一般には、核酸をシーケンシングのために調製するための種々の試料またはライブラリー調製ステップも含む。多くの異なる試料調製技法が当業者に周知である。それらの技法の基本的に任意のものが本明細書に記載の方法の実施に使用する、または使用するために適合させる。例えば、核酸をシーケンシングのために調製するための典型的なステップは、所与の試料中の他の構成成分から核酸を単離するための種々の精製ステップに加えて、核酸に分子バーコードをタグ付けすること、アダプター（例えば、分子バーコードを含み得る）を付加すること、核酸を１回または複数回増幅させること、核酸の標的とされるセグメントを富化すること（例えば、種々の標的捕捉戦略などを使用して）、および／または同様のものを含む。例示的なライブラリー調製プロセスは本明細書にさらに記載されている。核酸試料／ライブラリー調製に関する追加的な詳細は、例えば、それぞれの全体が参照により組み込まれるｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：  Ｔｏｎｅ  ｄｏｗｎ  ｔｈｅ  ｂｉａｓ，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３２２（１）：  １２−２０  （２０１４），  Ｍｉｃｉｃ  （Ｅｄ．），  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ，  Ｐｌａｎｔ，  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓａｍｐｌｅｓ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ），  １ｓｔ  Ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  （２０１６）、およびＣｈｉｕ，  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｂｅｎｔｈａｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （２０１８）にも記載されている。
【０１９８】
本明細書に開示される方法によって決定される調整されたＴＭＢは、必要に応じて、対象における疾患もしくは状態、特にがんの存在を診断するため、そのような疾患もしくは状態を特徴付けるため（例えば、所与のがんのステージ分類を行うため、がんの不均一性を決定するためなど）、処置に対する応答をモニタリングするため、所与の疾患もしくは状態が発生する潜在的なリスクを評価するため、および／または、疾患もしくは状態の予後を評価するために使用される。調整された腫瘍遺伝子変異量（ｔｕｍｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ）はまた、必要に応じて、がんの特定の形態を特徴付けるためにも使用される。がんは、多くの場合、組成およびステージ分類のどちらも不均一であるので、ＴＭＢデータから、がんの特定の亜型を特徴付け、それにより、診断および処置の選択を補助することが可能になり得る。この情報はまた、対象または健康管理実践者に特定の型のがんの予後に関する手がかりを提供し、対象および／または健康管理実践者が疾患の進行にしたがって処置選択肢を適合させることを可能にするものであり得る。一部のがんは、進行するにつれて侵攻性が大きくなり、遺伝学的に不安定になる。他の腫瘍は良性、不活性または休止状態のままである。
【０１９９】
調整されたＴＭＢはまた、疾患増悪の決定および／または再発のモニタリングに有用であり得る。ある特定の場合では、例えば、上首尾の処置により、最初に、がん細胞死の数が増加し、核酸が排出（シェディング）されるので、調整されたＴＭＢが増加し得る。これらの場合、一般には、次いで、療法が進行するに従い、腫瘍のサイズが縮小し続けるので、調整されたＴＭＢが減少する。他の場合では、上首尾の処置により、腫瘍遺伝子変異量の最初の増加を伴わずに同じくＴＭＢおよび／または主要でない対立遺伝子割合が減少し得る。さらに、処置後にがんが寛解の状態であることが認められた場合、調整されたＴＭＢを使用して、患者における残留する疾患または疾患の再発をモニタリングすることができる。
【０２００】
試料
【０２０１】
試料は、対象から単離された任意の生体試料であってよい。試料は、体組織、全血、血小板、血清、血漿、便、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）、内皮細胞、組織生検材料（例えば、既知のまたは疑わしい固形腫瘍由来の生検材料）、脳脊髄液、滑液、リンパ液、腹水、間質液または細胞外液（例えば、細胞間隙からの滲出液）、歯肉滲出液、歯肉溝滲出液、骨髄、胸水、脳脊髄液、唾液、粘液、喀痰、精液、汗、尿を含み得る。試料は、体液、特に血液およびその割合、ならびに尿であることが好ましい。そのような試料は、腫瘍から排出された核酸を含む。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み得、また、二本鎖形態および一本鎖形態であり得る。試料は、対象から元々単離された形態であってもよく、細胞などの構成成分を除去もしくは付加するため、１つの構成成分を別の構成成分に対して富化するため、または１つの形態の核酸を別の形態の核酸に変換する、例えば、ＲＮＡをＤＮＡに変換する、もしくは一本鎖核酸を二本鎖に変換するために、さらなる処理に供されたものであってもよい。したがって、例えば、分析用の体液は、細胞外遊離核酸、例えば、細胞外遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含有する血漿または血清である。
【０２０２】
一部の実施形態では、対象から取得した体液の試料体積は、シーケンシングされる領域に対する所望の読み取りの深さに依存する。例示的な体積は、約０．４〜４０ｍｌ、約５〜２０ｍｌ、約１０〜２０ｍｌである。例えば、体積は、約０．５ｍｌ、約１ｍｌ、約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約２０ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌ、またはそれよりも大きなミリリットル数であり得る。試料採取された血漿の体積は、一般には、約５ｍｌから約２０ｍｌの間である。
【０２０３】
試料は、種々の量の核酸を含み得る。一般には、所与の試料中の核酸の量は、多数のゲノム等価物と等しい。例えば、約３０ｎｇのＤＮＡの試料は、約１０，０００（１０４）個の一倍体ヒトゲノム等価物、およびｃｆＤＮＡの場合では、約２０００億（２×１０１１）個の個々のポリヌクレオチド分子を含有し得る。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡの試料は、約３０，０００個の一倍体ヒトゲノム等価物、およびｃｆＤＮＡの場合では、約６０００億個の個々の分子を含有し得る。
【０２０４】
一部の実施形態では、試料は、異なる供給源に由来する核酸、例えば、細胞由来の核酸および細胞外遊離供給源（例えば、血液試料など）由来の核酸を含む。一般には、試料は、変異を有する核酸を含む。例えば、試料は、必要に応じて、生殖細胞系列変異および／または体細胞変異を有するＤＮＡを含む。一般には、試料は、がん関連変異（例えば、がん関連体細胞変異）を有するＤＮＡを含む。
【０２０５】
増幅前の試料中の細胞外遊離核酸の例示的な量は、一般には、約１フェムトグラム（ｆｇ）〜約１マイクログラム（μｇ）、例えば、約１ピコグラム（ｐｇ）〜約２００ナノグラム（ｎｇ）、約１ｎｇ〜約１００ｎｇ、約１０ｎｇ〜約１０００ｎｇにわたる。一部の実施形態では、試料は、最大約６００ｎｇ、最大約５００ｎｇ、最大約４００ｎｇ、最大約３００ｎｇ、最大約２００ｎｇ、最大約１００ｎｇ、最大約５０ｎｇ、または最大約２０ｎｇの細胞外遊離核酸分子を含む。必要に応じて、量は、少なくとも約１ｆｇ、少なくとも約１０ｆｇ、少なくとも約１００ｆｇ、少なくとも約１ｐｇ、少なくとも約１０ｐｇ、少なくとも約１００ｐｇ、少なくとも約１ｎｇ、少なくとも約１０ｎｇ、少なくとも約１００ｎｇ、少なくとも約１５０ｎｇ、または少なくとも約２００ｎｇの細胞外遊離核酸分子である。ある特定の実施形態では、量は、最大約１ｆｇ、約１０ｆｇ、約１００ｆｇ、約１ｐｇ、約１０ｐｇ、約１００ｐｇ、約１ｎｇ、約１０ｎｇ、約１００ｎｇ、約１５０ｎｇ、または約２００ｎｇの細胞外遊離核酸分子である。一部の実施形態では、方法は、試料から約１ｆｇから約２００ｎｇの間の細胞外遊離核酸分子を得ることを含む。
【０２０６】
細胞外遊離核酸は、一般には、約１００ヌクレオチド長から約５００ヌクレオチド長の間のサイズ分布を有し、約１１０ヌクレオチド長〜約２３０ヌクレオチド長の分子が試料中の分子の約９０％に相当し、最頻値は約１６８ヌクレオチド長であり、第２の副次的なピークが約２４０ヌクレオチド長から約４４０ヌクレオチド長の間にわたる。ある特定の実施形態では、細胞外遊離核酸は、約１６０ヌクレオチド長から約１８０ヌクレオチド長まで、または約３２０ヌクレオチド長から約３６０ヌクレオチド長まで、または約４４０ヌクレオチド長から約４８０ヌクレオチド長までである。
【０２０７】
一部の実施形態では、溶液中に見出される細胞外遊離核酸をインタクトな細胞および体液の他の不溶性構成成分から分離する分割ステップを通じて、細胞外遊離核酸を体液から単離する。これらの実施形態の一部では、分割は、遠心分離または濾過などの技法を含む。あるいは、体液中の細胞を溶解させ、細胞外遊離核酸と細胞内核酸を一緒に処理する。一般に、緩衝剤の添加および洗浄ステップ後、細胞外遊離核酸を、例えばアルコールを用いて沈殿させる。ある特定の実施形態では、夾雑物または塩を除去するためのシリカに基づくカラムなどの追加的な清澄化ステップを使用する。収率などの、例示的な手順のある特定の態様を最適化するために反応全体を通して、例えば非特異的バルクキャリア核酸を必要に応じて添加する。そのような処理後、試料は、一般には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび／または一本鎖ＲＮＡを含めた様々な形態の核酸を含む。必要に応じて、一本鎖ＤＮＡおよび／または一本鎖ＲＮＡを二本鎖形態に変換し、したがって、二本鎖形態がその後の処理および解析ステップに含まれる。
【０２０８】
核酸タグ
【０２０９】
一部の実施形態では、核酸分子（ポリヌクレオチドの試料由来）に、試料インデックスおよび／または分子バーコード（一般に「タグ」と称される）をタグ付けすることができる。タグは、他の方法の中でも、化学合成、ライゲーション（例えば、平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーション）、またはオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってアダプターに組み入れるまたは他のやり方で接合させることができる。そのようなアダプターを標的核酸分子に最終的に接合させることができる。他の実施形態では、一般に、従来の核酸増幅方法を使用して試料インデックスを核酸分子に導入するために、１つまたは複数のラウンドの増幅サイクル（例えば、ＰＣＲ増幅）を適用する。増幅は、１つまたは複数の反応混合物（例えば、アレイ内の複数のマイクロウェル）中で行うことができる。分子バーコードおよび／または試料インデックスは、同時に導入することもでき、任意の逐次的順序で導入することもできる。一部の実施形態では、分子バーコードおよび／または試料インデックスを、配列捕捉ステップを実施する前および／または実施した後に導入する。一部の実施形態では、分子バーコードのみをプローブによる捕捉前に導入し、試料インデックスを配列捕捉ステップの実施後に導入する。一部の実施形態では、分子バーコードおよび試料インデックスの両方をプローブに基づく捕捉ステップの実施前に導入する。一部の実施形態では、試料インデックスを配列捕捉ステップの実施後に導入する。一部の実施形態では、分子バーコードを試料中の核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ分子）にアダプターを通じて、ライゲーション（例えば、平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーション）によって組み入れる。一部の実施形態では、試料インデックスを試料中の核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ分子）にオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて組み入れる。一般には、配列捕捉プロトコールは、標的とされる核酸配列、例えば、ゲノム領域のコード配列に相補的な一本鎖核酸分子を導入することを伴い、そのような領域の変異ががんの型に関連付けられる。
【０２１０】
一部の実施形態では、タグを試料核酸分子の一方の末端または両方の末端に位置付けることができる。一部の実施形態では、タグは、所定のまたはランダムもしくはセミランダムな配列のオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、タグは、約５００ヌクレオチド未満、約２００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、約２０ヌクレオチド未満、約１０ヌクレオチド未満、約９ヌクレオチド未満、約８ヌクレオチド未満、約７ヌクレオチド未満、約６ヌクレオチド未満、約５ヌクレオチド未満、約４ヌクレオチド未満、約３ヌクレオチド未満、約２ヌクレオチド未満、または約１ヌクレオチド未満の長さであり得る。タグは、試料核酸にランダムに連結することもでき、非ランダムに連結することもできる。
【０２１１】
一部の実施形態では、各試料を、試料インデックスまたは試料インデックスの組合せを用いて一意的にタグ付けする。一部の実施形態では、試料または副試料の各核酸分子を、分子バーコードまたは分子バーコードの組合せを用いて一意的にタグ付けする。他の実施形態では、複数の分子バーコードを、分子バーコードが必ずしも複数内で互いに一意的にならないように使用することができる（例えば、非一意的分子バーコード）。これらの実施形態では、一般に、分子バーコードを個々の分子に、分子バーコードとそれを付着させることができる配列の組合せにより、個別に追跡することができる一意的な配列が創出されるように付着させる（例えば、ライゲーションによって）。非一意的にタグ付けされた分子バーコードと内因性配列情報（例えば、試料中の元の核酸分子の配列に対応する最初の（開始）および／もしくは最後の（終止）部分、一方の末端もしくは両方の末端における配列読み取りの部分配列、配列読み取りの長さ、および／または試料中の元の核酸分子の長さ）の組合せの検出により、一般には、一意的な同一性を特定の分子に割り当てることが可能になる。個々の配列読み取りの長さまたは塩基対の数も一意的な同一性を所与の分子に割り当てるために必要に応じて使用することができる。本明細書に記載の通り、核酸の一本鎖由来の断片に一意的な同一性が割り当てられていることにより、その後、親鎖および／または相補鎖から当該断片を識別することが可能になり得る。
【０２１２】
一部の実施形態では、分子バーコードを、識別子のセット（例えば、一意的または非一意的分子バーコードの組合せ）と試料中の分子の予測比率で導入する。フォーマットの１つの例では、約２種から約１，０００，０００種までの異なる分子バーコード、または約５種から約１５０種までの異なる分子バーコード、または約２０種から約５０種までの異なる分子バーコードを標的分子の両末端にライゲーションさせて使用する。あるいは、約２５種から約１，０００，０００種までの異なる分子バーコードを使用することができる。例えば、２０〜５０×２０〜５０種の分子バーコードを使用することができる。このような識別子の数は、一般には、同じ開始点および終止点を有する異なる分子が異なる識別子の組合せを得る確率を高くする（例えば、少なくとも９４％、９９．５％、９９．９９％、または９９．９９９％）ために十分なものである。一部の実施形態では、分子の約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％が分子バーコードの同じ組合せを有する。
【０２１３】
一部の実施形態では、反応における一意的または非一意的分子バーコードの割り当てを、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００１００５３５１９号、同第２００３０１５２４９０号、および同第２０１１０１６００７８号、ならびに米国特許第６，５８２，９０８号、同第７，５３７，８９８号、同第９，５９８，７３１号、および同第９，９０２，９９２号に記載されている方法およびシステムを使用して実施する。あるいは、一部の実施形態では、内因性配列情報（例えば、開始および／もしくは終止位置、配列の一方もしくは両方の末端部分配列、ならびに／または長さ）だけを使用して試料の異なる核酸分子を識別することができる。
【０２１４】
核酸増幅
【０２１５】
アダプターに挟まれた試料核酸を、一般には、増幅されるＤＮＡ分子を挟むアダプター内のプライマー結合性部位に結合する核酸プライマーを使用してＰＣＲおよび他の増幅方法によって増幅させる。一部の実施形態では、増幅方法は伸長、変性およびアニーリングのサイクルを伴い、これは、サーモサイクリングによるもの、または、例えば転写増幅法におけるものと同様に等温性であり得る。必要に応じて利用する他の典型的な増幅方法としては、他の手法の中でも、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、および自家持続配列に基づく複製が挙げられる。
【０２１６】
一般に、従来の核酸増幅方法を使用して分子バーコードおよび／または試料インデックスを核酸分子に導入するために、１つまたは複数のラウンドの増幅サイクルが適用される。増幅は、一般には、１つまたは複数の反応混合物中で行われる。分子バーコードおよび試料インデックスを必要に応じて同時にまたは任意の逐次的順序で導入する。一部の実施形態では、分子バーコードおよび試料インデックスを、配列捕捉ステップを実施する前におよび／または実施した後に導入する。一部の実施形態では、分子バーコードのみをプローブによる捕捉前に導入し、試料インデックスを配列捕捉ステップの実施後に導入する。ある特定の実施形態では、分子バーコードおよび試料インデックスの両方をプローブに基づく捕捉ステップの実施前に導入する。一部の実施形態では、試料インデックスを配列捕捉ステップの実施後に導入する。一般には、配列捕捉プロトコールは、標的とされる核酸配列、例えば、ゲノム領域のコード配列に相補的な一本鎖核酸分子を導入することを伴い、そのような領域の変異ががんの型に関連付けられる。一般には、増幅反応により、約２００ヌクレオチド（ｎｔ）〜約７００ｎｔ、２５０ｎｔ〜約３５０ｎｔ、または約３２０ｎｔ〜約５５０ｎｔにわたるサイズの分子バーコードおよび試料インデックスで非一意的にまたは一意的にタグ付けされた核酸アンプリコンが複数生成される。一部の実施形態では、アンプリコンのサイズは、約３００ｎｔである。一部の実施形態では、アンプリコンのサイズは、約５００ｎｔである。
【０２１７】
核酸富化
【０２１８】
一部の実施形態では、核酸のシーケンシングを行う前に、配列を富化する。富化は、必要に応じて特異的な標的領域に対してまたは非特異的に（「標的配列」）実施する。一部の実施形態では、標的とされる目的の領域を、１つまたは複数のベイトセットパネルについて選択された核酸捕捉用プローブ（「ベイト」）を用い、示差的タイリングおよび捕捉スキームを使用して富化する。示差的タイリングおよび捕捉スキームでは、一般に、ベイトが結び付くゲノム領域にわたって示差的にタイリングするために（例えば、異なる「分解能」で）種々の相対的濃度のベイトセットを使用し、一連の制約（例えば、シーケンシング負荷、各ベイトの有用性などのシーケンサー制約）に供し、標的とされる核酸を下流のシーケンシングのために所望のレベルで捕捉する。これらの標的とされる目的のゲノム領域は、必要に応じて核酸構築物の天然または合成ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の目的の領域に対するプローブを伴うビオチン標識ビーズを使用して、標的配列を捕捉することができ、必要に応じて、その後、これらの領域を増幅させて、目的の領域を富化させる。
【０２１９】
配列捕捉は、一般には、標的核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を伴う。ある特定の実施形態では、プローブセット戦略は、目的の領域にわたってプローブをタイリングすることを伴う。そのようなプローブは、例えば、約６０ヌクレオチド長から約１２０ヌクレオチド長までであり得る。セットの深さは、約２×、３×、４×、５×、６×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、５０×またはそれよりも深いものであり得る。配列捕捉の効果は、一般に、一部において、プローブの配列と相補的な（またはほぼ相補的な）標的分子の配列の長さに依存する。
【０２２０】
核酸シーケンシング
【０２２１】
必要に応じてアダプターに挟まれ、予め増幅させたまたはさせていない試料核酸を、一般に、シーケンシングに供する。必要に応じて利用するシーケンシング方法または市販のフォーマットとしては、例えば、サンガーシーケンシング、ハイスループットシーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアに基づくシーケンシング、半導体シーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、単一分子合成によるシーケンシング（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列シーケンシング、Ｃｌｏｎａｌ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガンシーケンシング、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｎｉａ、Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、またはＮａｎｏｐｏｒｅプラットフォームを使用したシーケンシングが挙げられる。シーケンシング反応は、多数の試料セットを実質的に同時に処理する多数のレーン、多数のチャネル、多数のウェル、または他の手段を含み得る種々の試料処理装置で実施することができる。試料処理装置は、多数の動作を同時に処理することを可能にするために多数の試料チャンバーも含み得る。
【０２２２】
シーケンシング反応は、がんまたは他の疾患のマーカーを含有することが分かっている１つまたは複数の核酸断片型または領域に対して実施することができる。シーケンシング反応はまた、試料中に存在するあらゆる核酸断片に対して実施することもできる。シーケンシング反応は、ゲノムの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％または１００％に対して実施することができる。他の場合では、シーケンシング反応をゲノムの約５％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約６０％未満、約７０％未満、約８０％未満、約９０％未満、約９５％未満、約９９％未満、約９９．９％未満または約１００％未満に対して実施することができる。
【０２２３】
同時シーケンシング反応を、マルチプレックスシーケンシング技法を使用して実施することができる。一部の実施形態では、細胞外遊離ポリヌクレオチドのシーケンシングを、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、または１００，０００シーケンシング反応で行う。他の実施形態では、細胞外遊離ポリヌクレオチドのシーケンシングを、約１０００未満、約２０００未満、約３０００未満、約４０００未満、約５０００未満、約６０００未満、約７０００未満、約８０００未満、約９０００未満、約１００００未満、約５００００未満、または約１００，０００未満のシーケンシング反応で行う。シーケンシング反応は、一般には、逐次的にまたは同時に実施される。その後のデータ解析を、一般に、シーケンシング反応の全部または一部に対して実施する。一部の実施形態では、データ解析を少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、または１００，０００のシーケンシング反応に対して実施する。他の実施形態では、データ解析を約１０００未満、約２０００未満、約３０００未満、約４０００未満、約５０００未満、約６０００未満、約７０００未満、約８０００未満、約９０００未満、約１００００未満、約５００００未満、または約１００，０００未満のシーケンシング反応に対して実施することができる。例示的な読み取りの深さは、遺伝子座（塩基位置）１つ当たり約１０００読み取りから約５００００読み取りまでである。
【０２２４】
一部の実施形態では、核酸集団を、一方の末端または両方の末端に一本鎖突出を有する二本鎖核酸に平滑末端を酵素的に形成させることにより、シーケンシングのために調製する。これらの実施形態では、集団を、一般には、５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用い、ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴまたはＵ）の存在下で処理する。必要に応じて使用される例示的な酵素またはその触媒断片としては、クレノウ大断片およびＴ４ポリメラーゼが挙げられる。５’突出では、当該酵素により、一般には、反対の鎖上の陥凹３’末端が５’末端と揃うまで伸長して、平滑末端が生じる。３’突出では、当該酵素により、一般に、３’末端が反対の鎖の５’末端まで、および時にはそれを越えて消化される。この消化が反対の鎖の５’末端を越えて進行する場合、５’突出に対して使用される、同じポリメラーゼ活性を有する酵素によってギャップを埋めることができる。二本鎖核酸における平滑末端の形成により、例えば、アダプターの付着およびその後の増幅が容易になる。
【０２２５】
一部の実施形態では、核酸集団を、一本鎖核酸から二本鎖への変換および／またはＲＮＡからＤＮＡへの変換などの追加的な処理に供する。これらの形態の核酸も必要に応じてアダプターと連結し、増幅させる。
【０２２６】
核酸を、予め増幅させてまたは増幅させずに上記の平滑末端を形成するプロセスに供し、必要に応じて、試料中の他の核酸のシーケンシングを行って、シーケンシングされた核酸を生じさせることができる。シーケンシングされた核酸とは、核酸の配列（すなわち、配列情報）または配列が決定された核酸のいずれも指し得る。シーケンシングは、試料中の個々の核酸分子の配列データが直接、または試料中の個々の核酸分子の増幅産物のコンセンサス配列から間接的にもたらされるように実施することができる。
【０２２７】
一部の実施形態では、平滑末端形成後の試料中の一本鎖突出を有する二本鎖核酸の両末端を、分子バーコードを含むアダプターと連結し、シーケンシングにより、核酸配列ならびにアダプターによって導入された分子バーコードを決定する。平滑末端ＤＮＡ分子を必要に応じて少なくとも部分的に二本鎖のアダプター（例えば、Ｙ形または鐘形アダプター）の平滑末端とライゲーションする。あるいは、ライゲーションを容易にするために（例えば、粘着末端ライゲーションに関して）、試料核酸およびアダプターの平滑末端に、相補的なヌクレオチドを用いて尾部付加することができる。
【０２２８】
一般には、同じ核酸の任意の２つのコピーが、両末端に連結したアダプター由来のアダプターバーコード（すなわち、分子バーコード）の同じ組合せを受ける確率が低くなる（例えば、＜１または０．１％）ように、核酸試料を十分な数のアダプターと接触させる。アダプターをこのように使用することにより、参照核酸における開始点および終止点が同じであり、同じ分子バーコードの組合せと連結した核酸配列のファミリーを識別することが可能になる。そのようなファミリーは、増幅前の試料中の核酸の増幅産物の配列を表す。平滑末端形成およびアダプター付着によって改変されるにしたがって、ファミリーメンバーの配列をコンパイルして、元の試料中の核酸分子に対するコンセンサスヌクレオチド（複数可）または完全なコンセンサス配列を導き出すことができる。言い換えれば、試料中の核酸の既定の位置を占有するヌクレオチドを、ファミリーメンバー配列のその対応する位置を占有するヌクレオチドのコンセンサスであると決定する。ファミリーは、二本鎖核酸の一方または両方の鎖の配列を含み得る。ファミリーのメンバーが二本鎖核酸の両方の鎖の配列を含む場合、全ての配列をコンパイルして、コンセンサスヌクレオチド（複数可）または配列を導き出す目的で、一方の鎖の配列をそれらの相補物に変換する。一部のファミリーは、単一のメンバー配列のみを含む。この場合、この配列を、増幅前の試料中の核酸の配列とみなすことができる。あるいは、単一のメンバー配列のみを伴うファミリーをその後の解析から除外することができる。
【０２２９】
シーケンシングされた核酸のヌクレオチドバリエーションは、シーケンシングされた核酸を参照配列と比較することによって決定することができる。参照配列は、多くの場合、既知配列、例えば、対象由来の既知の全ゲノム配列または部分的なゲノム配列（例えば、ヒト対象の全ゲノム配列）である。参照配列は、例えば、ｈＧ１９またはｈＧ３８であり得る。シーケンシングされた核酸は、上記の通り、試料中の核酸について直接決定された配列、またはそのような核酸の増幅産物の配列のコンセンサスを表し得る。比較は、参照配列の１つまたは複数の指定位置で実施することができる。それぞれの配列を最大限にアラインメントした場合に、参照配列の指定位置に対応する位置を含むシーケンシングされた核酸のサブセットを識別することができる。そのようなサブセット内では、もしあれば、どのシーケンシングされた核酸が指定位置にヌクレオチドバリエーションを含むか、および必要に応じて、もしあれば、どれが参照ヌクレオチドを含むか（すなわち、参照配列と同じであるか）を決定することができる。ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内のシーケンシングされた核酸の数が選択された閾値を超える場合には、その指定位置においてバリアントヌクレオチドをコールすることができる。閾値は、他の可能性の中でも、ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内のシーケンシングされた核酸が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、９、もしくは１０などの単純な数であり得る、または、ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内のシーケンシングされた核酸に対して少なくとも０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、もしくは２０などの比であり得る。参照配列内の目的の任意の指定位置について比較を繰り返すことができる。時には、参照配列の少なくとも約２０、１００、２００、または３００の連続した位置、例えば、約２０〜５００、または約５０〜３００の連続した位置を占有する指定位置について比較を実施することができる。
【０２３０】
本明細書に記載のフォーマットおよび適用を含めた核酸シーケンシングに関する追加的な詳細は、例えば、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １７：  ９５−１１５  （２０１６）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１２，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２５１３６４：  １−１１  （２０１２）、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，  ５５：  ６４１−６５８  （２００９）、ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ７：  ２８７−２９６  （２００９）、Ａｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，  １２８  （５）：  １７０５−１０  （２００６）、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，２５８，５６８号、米国特許第６，８３３，２４６号、米国特許第７，１１５，４００号、米国特許第６，９６９，４８８号、米国特許第５，９１２，１４８号、米国特許第６，１３０，０７３号、米国特許第７，１６９，５６０号、米国特許第７，２８２，３３７号、米国特許第７，４８２，１２０号、米国特許第７，５０１，２４５号、米国特許第６，８１８，３９５号、米国特許第６，９１１，３４５号、米国特許第７，５０１，２４５号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，１７０，０５０号、米国特許第７，３０２，１４６号、米国特許第７，３１３，３０８号、および米国特許第７，４７６，５０３号にも提供されており、これらはそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
比較用結果
【０２３２】
本出願に開示される方法に従って決定された所与の対象の調整された腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を、一般には、参照集団由来の比較用結果（例えば、ＴＭＢ）のデータベースと比較して、その対象に対するカスタマイズされたまたは標的化療法を識別する。一部の実施形態では、試験対象のＴＭＢおよび比較用ＴＭＢを、例えば、ゲノム全体またはエキソーム全体にわたって測定し、一方、他の実施形態では、例えば、ゲノムまたはエキソームのサブセットまたは標的化領域に基づいてそれらのＴＭＢを測定し、それらを必要に応じて推定して、全ゲノムまたは全エキソームについてのＴＭＢを決定する。一般には、参照集団は、試験対象と同じがんの型を有する患者、および／または試験対象と同じ療法を受けている、もしくは受けた患者を含む。一部の実施形態では、試験対象のＴＭＢおよび比較用ＴＭＢを、所定のまたは選択された遺伝子またはゲノム領域のセットにおける変異カウントまたは負荷量を決定することによって測定する。基本的にあらゆる遺伝子（例えば、癌遺伝子）がそのような解析のために必要に応じて選択される。これらの実施形態のある特定のものでは、選択された遺伝子またはゲノム領域は、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１，５００、２，０００またはそれよりも多くの選択された遺伝子またはゲノム領域を含む。これらの実施形態の一部では、選択された遺伝子またはゲノム領域は、必要に応じて、表１に列挙されている１つまたは複数の遺伝子を含む。
【表１】
2021531775.tif 000007
【０２３３】
ある特定の実施形態では、選択された遺伝子またはゲノム領域は、必要に応じて、表２に列挙されている１つまたは複数の遺伝子を含む。
【表２−１】
2021531775.tif 000008
【表２−２】
2021531775.tif 000009
【０２３４】
がん
【０２３５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法およびシステムを使用して、患者における所与の疾患または状態を処置するためのカスタマイズされた療法を識別する。一般には、考慮中の疾患は、がんの一種である。そのようながんの非限定的な例としては、胆道がん、膀胱がん、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生性癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、直腸がん、結腸直腸癌、結腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道がん、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼内黒色腫、ぶどう膜黒色腫、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝がん、肝癌、ヘパトーマ、肝細胞癌、胆管細胞癌、肝芽腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽細胞腫、中咽頭がん、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵がん、膵管腺癌、偽乳頭状新生物、腺房細胞癌、前立腺がん、前立腺腺癌、皮膚がん、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、小腸癌、胃がん、胃癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮がん、または子宮肉腫が挙げられる。
【０２３６】
カスタマイズされた療法および関連する施行
【０２３７】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、所与の調整されたＴＭＢを有する患者に対するカスタマイズされた療法を識別し、施行することに関する。基本的にあらゆるがん療法（例えば、外科療法、放射線療法、化学療法、および／または同様のもの）がこれらの方法の一部として含まれる。一般には、カスタマイズされた療法は、少なくとも１つの免疫療法（または免疫治療剤）を含む。免疫療法とは、一般に、所与のがんの型に対する免疫応答を増強する方法を指す。ある特定の実施形態では、免疫療法とは、腫瘍またはがんに対するＴ細胞応答を増強する方法を指す。
【０２３８】
一部の実施形態では、免疫療法または免疫治療剤は、免疫チェックポイント分子を標的とする。ある特定の腫瘍は、免疫チェックポイント経路を選ぶことにより、免疫系から逃れることができる。したがって、免疫チェックポイントの標的化は、免疫系を逃れる腫瘍の能力を阻止し、ある特定のがんに対する抗腫瘍免疫を活性化するために有効な手法として登場した。Ｐａｒｄｏｌｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２０１２，  １２：  ２５２−２６４。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、抗原に対するＴ細胞応答に関与するシグナルを低減する阻害性分子である。例えば、ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞上に発現され、抗原提示細胞上のＣＤ８０（Ｂ７．１としても公知）またはＣＤ８６（Ｂ７．２としても公知）に結合することにより、Ｔ細胞活性化の下方制御において役割を果たす。ＰＤ−１は、Ｔ細胞上に発現される別の阻害性チェックポイント分子である。ＰＤ−１は、炎症反応中の末梢組織におけるＴ細胞の活性を限定する。さらに、ＰＤ−１のリガンド（ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）は、一般に、多くの異なる腫瘍の表面上で上方制御され、その結果、腫瘍微小環境の抗腫瘍免疫応答が下方制御される。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１である。他の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２などのＰＤ−１のリガンドである。他の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６などのＣＴＬＡ４のリガンドである。他の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ガレクチン９（ＧＡＬ９）、またはアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）である。
【０２４０】
これらの免疫チェックポイント分子を標的とするアンタゴニストを使用して、ある特定のがんに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することができる。したがって、ある特定の実施形態では、免疫療法または免疫治療剤は、阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１である。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−Ｌ１である。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストは、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。ある特定の実施形態では、抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ２抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、抗ＣＴＬＡ４抗体と抗ＰＤ−１抗体の組合せ、抗ＣＴＬＡ４抗体と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組合せ、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体と抗ＰＤ−１抗体の組合せである。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））またはニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））のうちの１つまたは複数である。ある特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、またはデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））のうちの１つまたは複数である。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、免疫療法または免疫治療剤は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＴＩＧＩＴまたはＡ２ａＲに対するアンタゴニスト（例えば、抗体）である。他の実施形態では、アンタゴニストは、阻害性免疫チェックポイント分子の細胞外ドメインと抗体のＦｃドメインとを含む可溶性融合タンパク質などの、阻害性免疫チェックポイント分子の可溶性バージョンである。ある特定の実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、またはＡ２ａＲの細胞外ドメインを含む。一実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ２またはＬＡＧ３の細胞外ドメインを含む。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、抗原に対するＴ細胞応答に関与するシグナルを増幅させる共刺激分子である。例えば、ＣＤ２８は、Ｔ細胞上に発現される共刺激受容体である。Ｔ細胞がＴ細胞受容体を通じて抗原に結合すると、ＣＤ２８が抗原提示細胞上のＣＤ８０（Ｂ７．１としても公知）またはＣＤ８６（Ｂ７．２としても公知）に結合して、Ｔ細胞受容体シグナル伝達が増幅し、Ｔ細胞活性化が促進される。ＣＤ２８はＣＴＬＡ４と同じリガンド（ＣＤ８０およびＣＤ８６）に結合するので、ＣＴＬＡ４により、ＣＤ２８によって媒介される共刺激シグナル伝達を打ち消すまたは制御することができる。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＣＤ２８、誘導性Ｔ細胞共刺激物質（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、またはＣＤ２７から選択される共刺激分子である。他の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、またはＣＤ７０を含めた共刺激分子のリガンドである。
【０２４３】
これらの共刺激チェックポイント分子を標的とするアゴニストを使用して、ある特定のがんに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することができる。したがって、ある特定の実施形態では、免疫療法または免疫治療剤は、共刺激チェックポイント分子のアゴニストである。ある特定の実施形態では、共刺激チェックポイント分子のアゴニストはアゴニスト抗体であり、モノクローナル抗体であることが好ましい。ある特定の実施形態では、アゴニスト抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＣＤ２８抗体である。他の実施形態では、アゴニスト抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、または抗ＣＤ２７抗体である。他の実施形態では、アゴニスト抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗Ｂ７ＲＰ１抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗ＣＤ１３７Ｌ抗体、抗ＯＸ４０Ｌ抗体、または抗ＣＤ７０抗体である。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のカスタマイズされた療法は、一般には非経口的に投与される（例えば、静脈内にまたは皮下に）。免疫治療剤を含有する医薬組成物は、一般には静脈内に投与される。ある特定の治療剤は経口投与される。しかし、カスタマイズされた療法（例えば、免疫治療剤など）は、例えば、頬側、舌下、直腸、膣、尿道内、局部、眼内、鼻腔内、および／または耳介内を含めた当技術分野で公知の任意の方法によって投与することもでき、これらの投与は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、水性懸濁剤、ゲル剤、噴霧剤、坐剤、膏薬、軟膏剤などを含み得る。
【０２４５】
システムおよびコンピューター可読媒体
【０２４６】
本開示は、種々のシステムおよびコンピュータープログラム製品または機械可読媒体も提供する。一部の実施形態では、例えば、本明細書に記載の方法は、少なくとも一部において、システム、分散コンピューティングハードウェアおよびアプリケーション（例えば、クラウドコンピューティングサービス）、電子通信ネットワーク、通信インターフェース、コンピュータープログラム製品、機械可読媒体、電子記憶媒体、ソフトウェア（例えば、機械により実行可能なコードまたは論理命令）ならびに／または同様のものを使用して必要に応じて実施されるまたは促進される。例示のために、図２に、少なくとも本出願に開示される方法の態様の実行での使用に適した例示的なシステムの概略図を提示する。示されている通り、システム２００は、少なくとも１つのコントローラまたはコンピューター、例えば、プロセッサ２０４および記憶装置、ストレージデバイス、または記憶装置構成要素２０６を含むサーバー２０２（例えば、検索エンジンサーバー）、ならびに、遠隔サーバー２０２から離れた所に配置され、遠隔サーバー２０２とインターネットまたは他のインターネットワークなどの電子通信ネットワーク２１２を通じて通信する１つまたは複数の他の通信デバイス２１４および２１６（例えば、クライアントサイドコンピューターターミナル、電話機、タブレット、ラップトップ、他のモバイルデバイスなど）を含む。通信デバイス２１４および２１６は、一般には、例えば、サーバー２０２コンピューターとネットワーク２１２を通じて通信する電子ディスプレイ（例えば、インターネット接続可能なコンピューターなど）を含み、電子ディスプレイは、本明細書に記載の方法が実行された際に結果を表示するためのユーザーインタフェース（例えば、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）、ウェブベースユーザーインタフェース、および／または同様のもの）を含む。ある特定の実施形態では、通信ネットワークは、例えば、ハードドライブ、サムドライブ、または他のデータ記憶機構を使用した１つの場所から別の場所へのデータの物理的転送も包含する。システム２００は、１つまたは複数の他の通信デバイス、例えば２１４（デスクトップまたはパーソナルコンピューターとして概略的に示されている）および２１６（タブレットコンピューターとして概略的に示されている）による、例えば、ガイドされた検索アプリケーションまたは他の実行可能なものを容易にするために、コンピューター、または、例えば、サーバー２０２によって可読のサーバー２０２の記憶装置２０６などの種々の型の記憶装置の１つまたは複数などの機械可読媒体に記憶されたプログラム製品２０８も含む。一部の実施形態では、システム２００は、必要に応じて、例えば、直接または検索エンジンサーバー２０２を通じてのいずれかで検索可能なデータが記憶されたオンラインウェブサイトに関連付けられるサーバー２１０（例えば、カスタマイズされた療法を指し示す対照試料または比較用結果データなど）などの少なくとも１つのデータベースサーバーも含む。システム２００は、必要に応じて、サーバー２０２から離れた所に配置された１つまたは複数の他のサーバーも含み、そのそれぞれが、必要に応じて、他のサーバーのそれぞれから離れた所に位置するまたはそれらに対してローカルである１つまたは複数のデータベースサーバー２１０と関連付けられる。他のサーバーにより、地理的に離れたユーザーにサービスを有益に提供し、地理的に分散した操作を増強することができる。
【０２４７】
当業者には理解される通り、サーバー２０２の記憶装置２０６は、必要に応じて、例えば、とりわけ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、および磁気または光ディスクを含めた揮発性および／または不揮発性記憶装置を含む。単一のサーバーを例示しているが、例示されているサーバー２０２の構成は単に例として示したものであり、種々の他の方法体系またはアーキテクチャに従って構成された他の型のサーバーまたはコンピューターも使用することができることも当業者には理解される。図２に概略的に示されているサーバー２０２は、サーバーまたはサーバークラスターまたはサーバーファームを表し、いかなる個々の物理的サーバーにも限定されない。サーバーサイトは、サーバーホスティング提供者によって管理されるサーバーファームまたはサーバークラスターとして配置することができる。サーバーならびにそれらのアーキテクチャおよび構成の数をシステム２００に対する使用、要求および容量の要件に基づいて増加させることができる。同じく当業者には理解される通り、これらの実施形態では、他のユーザー通信デバイス２１４および２１６は、例えば、ラップトップ、デスクトップ、タブレット、携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、サーバー、または他の型のコンピューターであってよい。当業者には公知であり、理解される通り、ネットワーク２１２は、１つまたは複数の他のコンピューターと、通信ネットワークおよび／またはローカルもしくは他のエリアネットワークの一部を通じて通信する複数のコンピューター／サーバーのインターネット、イントラネット、電気通信ネットワーク、エクストラネット、またはワールドワイドウェブを含み得る。
【０２４８】
当業者にはさらに理解される通り、例示的なプログラム製品または機械可読媒体２０８は、必要に応じて、ハードウェアの機能を制御し、その操作を指揮する順序付けられた操作の１つまたは複数のセットを提供するマイクロコード、プログラム、クラウドコンピューティングフォーマット、ルーチン、および／または記号言語の形態である。例示的な実施形態によるプログラム製品２０８はまた、その全体が揮発性記憶装置内に存在する必要はなく、必要に応じて、当業者には公知であり、理解される種々の方法体系に従って選択的にローディングすることができる。
【０２４９】
当業者にはさらに理解される通り、「コンピューター可読媒体」または「機械可読媒体」という用語は、プロセッサへの実行の命令の提示に関与する任意の媒体を指す。例示のために、「コンピューター可読媒体」または「機械可読媒体」という用語は、例えば、コンピューターによる読み取りのために、本開示の種々の実施形態の機能性またはプロセスを実行するプログラム製品６０８を記憶させることができる分散媒体、クラウドコンピューティングフォーマット、中間記憶媒体、コンピューターの実行記憶装置、および任意の他の媒体またはデバイスを包含する。「コンピューター可読媒体」または「機械可読媒体」は、これだけに限定されないが、非揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体を含めた多くの形態をとり得る。非揮発性媒体としては、例えば、光学ディスクまたは磁気ディスクが挙げられる。揮発性媒体としては、所与のシステムのメインメモリなどのダイナミックメモリが挙げられる。伝送媒体としては、バスを含むワイヤーを含めた、同軸ケーブル、銅線および光ファイバーが挙げられる。伝送媒体は、とりわけ、電波および赤外データ通信の間に生成されるものなどの音波または光波の形態もとり得る。コンピューター可読媒体の例示的な形態としては、フロッピー（登録商標）ディスク、フレシキブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、フラッシュドライブ、もしくは任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、ホール、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭのパターンを有する任意の他の物理的な媒体、ＦＬＡＳＨ（登録商標）−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、搬送波、またはコンピューターが読み取りを行うことができる任意の他の媒体が挙げられる。
【０２５０】
プログラム製品２０８は、必要に応じて、コンピューター可読媒体からハードディスクまたは同様の中間記憶媒体にコピーされる。プログラム製品２０８またはその一部が実施される際、コンピューター（複数可）が種々の実施形態の機能性または方法に一致して作動するように構成されたそれらの分散媒体、それらの中間記憶媒体などから、１つまたは複数のコンピューターの実行記憶装置に必要に応じてローディングされる。そのような操作は全て、例えば、コンピューターシステムの当業者に周知である。
【０２５１】
さらなる例示のために、ある特定の実施形態では、本出願は、１つまたは複数のプロセッサ、およびプロセッサと通信する１つまたは複数の記憶装置構成要素を含むシステムを提供する。記憶装置構成要素は、一般には、実行されると、プロセッサに、少なくとも１つの変異カウント、調整された結果／ＴＭＢ、比較用結果、カスタマイズされた療法、および／もしくは同様のものの表示を引き起こす情報を提供させる（例えば、通信デバイス２１４、２１６などを介して）、ならびに／または他のシステム構成要素および／もしくはシステムユーザーから情報を受信させる（例えば、通信デバイス２１４、２１６などを介して）１つまたは複数の命令を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、プログラム製品２０８は、電子プロセッサ２０４によって実行されると、少なくとも、（ｉ）対象由来の試料中の１つまたは複数の核酸から得られた配列情報から観測変異カウントを決定するステップと、（ｉｉ）核酸の腫瘍割合および／またはカバレッジを決定して、シーケンシングパラメータを生成するステップと、（ｉｉｉ）シーケンシングパラメータを考慮して予測変異割合および／または予測変異割合の予測分布を決定して、予測結果を生成するステップと、（ｉｖ）予測結果を考慮して観測変異カウントを調整して、調整された結果を生成し、それにより、対象における腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）を検出するステップと、必要に応じて、（ｖ）調整された結果を１つまたは複数の比較用結果と比較するステップであって、調整された結果と比較用結果が実質的にマッチすることにより、対象に対する療法に対する予想応答が示される、ステップとを実施する非一時的なコンピューターで実行可能な命令を含む。
【０２５３】
システム２００は、一般には、本明細書に記載の方法の種々の態様を実施するように構成された追加的なシステム構成要素も含む。これらの実施形態の一部では、これらの追加的なシステム構成要素の１つまたは複数は、遠隔サーバー２０２から離れた所に配置され、電子通信ネットワーク２１２を通じて遠隔サーバー２０２と通信し、一方、他の実施形態では、これらの追加的なシステム構成要素の１つまたは複数は、ローカルに配置され、サーバー２０２と通信する（すなわち、電子通信ネットワーク２１２の非存在下で）か、または、例えばデスクトップコンピューター２１４と直接通信する。
【０２５４】
一部の実施形態では、例えば、追加的なシステム構成要素は、コントローラ２０２に作動可能に接続された（直接または間接的に（例えば、電子通信ネットワーク２１２を介して））試料調製構成要素２１８を含む。試料調製構成要素２１８は、核酸増幅構成要素（例えば、サーマルサイクラーなど）および／または核酸シーケンサーによって増幅および／またはシーケンシングしようとする試料中の核酸を調製する（例えば、核酸のライブラリーを調製する）ように構成されている。これらの実施形態のある特定のものでは、試料調製構成要素２１８は、試料中の核酸を他の構成要素から単離するように、本明細書に記載の通り分子バーコードを含む１つもしくは複数のアダプターを核酸に付着させるように、シーケンシングの前にゲノムもしくはトランスクリプトームから１つもしくは複数の領域を選択的に富化するように、および／または同様のことを行うように構成されている。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、システム２００は、コントローラ２０２に作動可能に接続された（直接または間接的に（例えば、電子通信ネットワーク２１２を介して））核酸増幅構成要素２２０（例えば、サーマルサイクラーなど）も含む。核酸増幅構成要素２２０は、対象由来の試料中の核酸を増幅させるように構成されている。例えば、核酸増幅構成要素２２０は、必要に応じて、本明細書に記載の通り試料中のゲノムまたはトランスクリプトームから選択的に富化された領域を増幅するように構成されている。
【０２５６】
システム２００は、一般には、コントローラ２０２に作動可能に接続された（直接または間接的に（例えば、電子通信ネットワーク２１２を介して））少なくとも１つの核酸シーケンサー２２２も含む。核酸シーケンサー２２２は、対象由来の試料中の核酸（例えば、増幅した核酸）から配列情報をもたらすように構成されている。基本的にあらゆる型の核酸シーケンサーをこれらのシステムにおける使用に適合させることができる。例えば、核酸シーケンサー２２２は、必要に応じて、パイロシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、または他の技法を核酸に対して実施して、シーケンシング読み取りを生成するように構成されている。必要に応じて、核酸シーケンサー２２２は、配列読み取りを配列読み取りのファミリーに群分けするように構成されており、各ファミリーは、所与の試料中の核酸から生成された配列読み取りを含む。一部の実施形態では、核酸シーケンサー２２２では、シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイを使用して、シーケンシング読み取りを生成する。ある特定の実施形態では、核酸シーケンサー２２２は、シーケンシングライブラリーのシーケンシングを行って、シーケンシング読み取りを生成するためのマイクロウェルのアレイを有する少なくとも１つのチップを含む。
【０２５７】
完全なまたは部分的なシステム自動化を容易にするために、システム２００は、一般には、コントローラ２０２に作動可能に接続された（直接または間接的に（例えば、電子通信ネットワーク２１２を介して））材料移動構成要素２２４も含む。材料移動構成要素２２４は、１つまたは複数の材料（例えば、核酸試料、アンプリコン、試薬、および／または同様のもの）を核酸シーケンサー２２２、試料調製構成要素２１８、および核酸増幅構成要素２２０に、ならびに／または核酸シーケンサー２２２、試料調製構成要素２１８、および核酸増幅構成要素２２０から移動させるように構成されている。コンピューターシステムおよびネットワーク、データベース、およびコンピュータープログラム製品に関する追加的な詳細は、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ：  Ａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  （２０１１）、Ｋｕｒｏｓｅ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇ：  Ａ  Ｔｏｐ−Ｄｏｗｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｐｅａｒｓｏｎ，  ７ｔｈ  Ｅｄ．  （２０１６）、Ｅｌｍａｓｒｉ，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ，  ６ｔｈ  Ｅｄ．  （２０１０）、Ｃｏｒｏｎｅｌ，  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  ＆  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  Ｃｅｎｇａｇｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，  １１ｔｈ  Ｅｄ．  （２０１４）、Ｔｕｃｋｅｒ，  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｌａｎｇｕａｇｅｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｍａｔｈ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  （２００６）、およびＲｈｏｔｏｎ，  Ｃｌｏｕｄ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｅｄ：  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｐｒｅｓｓ  （２０１１）でも提供されており、これらはそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５８】
免疫レパートリーのシーケンシング
【０２５９】
本明細書に記載のＴＭＢ解析に加えて、本出願は、免疫レパートリーのシーケンシングを対象とする方法をさらに提供する。免疫受容体（Ｔ細胞に関してはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞に関しては免疫グロブリン（Ｉｇ））は、これらのリンパ球の一意的な「バーコード」である（健康なヒトでは受容体の種類が１０６種を超える）。免疫系は、病原体（すなわち、ワクチン、病原体、およびがん変異由来の新抗原）を認識すると、抗原特異的Ｔ細胞のクローンへの増大を可能にする免疫応答を誘発する。ＴＣＲなどの免疫受容体の一意性のシーケンシングを行うことにより、患者試料において免疫応答を追跡することが可能になる。ある特定の実施形態では、免疫レパートリーのプロファイリングにより、ＴＭＢ解析と相補的な解析が可能になる。高ＴＭＢスコアは、免疫療法（抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ４など）に対する患者の応答と相関する可能性が高く、一方、免疫レパートリーの測定は、がんに存在する新抗原の高出現に応答した実際の機能的転帰である。さらに、いくつかの、例えば白血病細胞および他のがん細胞は別個の受容体クローンシグネチャーを有し得るので、免疫レパートリーのシーケンシングにより、血液がんの識別が可能になる。これはまた、元のがん細胞の受容体を追跡することによる血液がんに関する微小残存病変（ＭＲＤ）研究にも拡張することができる。
【０２６０】
さらなる例示のために、図３は、本開示の一部の実施形態に従って、細胞外遊離核酸のシーケンシング（ＴＭＢ解析を用いて）を同じ試料由来の免疫レパートリーのシーケンシングと組み合わせて実施する例示的な方法のステップを概略的に示すフローチャートを提示する。示されている通り、方法３００は、試験試料（例えば、血液試料）を対象から得るステップを含む。試験試料を単離または抽出ステップに供して、細胞外遊離核酸を含む血漿画分およびリンパ球を含むバフィーコート画分を作製する。示されている実施形態では、血漿試料部分中のｃｔＤＮＡを、ｃｔＤＮＡにおける変異またはバリアントを識別するプロセスの一部として、ＰｒｏＫに基づく抽出ステップに供する。必要に応じて、方法は、標的化パネルおよびメチル結合性ドメイン（ＭＢＤ）分割ステップを含む。本明細書に開示される方法の実施における使用のために必要に応じて適合させるエピジェネティック修飾の解析に関する追加的な詳細は、例えば、参照により組み込まれる２０１７年１２月２２日出願のＷＯ２０１８／１１９４５２に記載されている。示されている通り、ｃｔＤＮＡ解析は、種々のライブラリー調製（末端修復、ライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅など）および富化ステップも含む。方法３００は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）抽出ステップ、ライブラリー調製ステップ（例えば、ＴＣＲバーコーディング、清浄化、マルチプレックスネステッドＰＣＲ、ならびにさらなる清浄化および定量ステップ）を含むＴＣＲクローン型決定アッセイを含む。同じく示されている通り、例示的な方法３００は、ＴＣＲクローン型決定アッセイに必要に応じて追加してまたはその代わりに、ＲＮＡ抽出、逆転写および鋳型切り換え、ならびに清浄化ステップを種々のＰＣＲおよび清浄化ステップと一緒に含む免疫受容体発見アッセイ／血液がん検出および微小残存病変（ＭＲＤ）アッセイを含む。方法３００の様々なアッセイの産物をプールし、シーケンシングを行い、本明細書に記載のバイオインフォマティクスパイプライン（ＢＩＰ）によってさらに解析する。ＰＣＲステップを含めた試料調製方法のさらなる描写を、図４Ａおよび４Ｂに、それぞれＴＣＲクローン型決定アッセイおよび免疫受容体発見アッセイについて示す。
【０２６１】
さらなる例証のために、図５に、血液試料のバフィーコートおよび血漿部分の分析を含む方法５００を概略的に示す。示されている通り、バフィーコート分析は、免疫レパートリーおよび他の免疫遺伝子をクローン性造血（例えば、未確定の潜在能をもつクローン性造血（ｃｌｏｎａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）」または「ＣＨＩＰ」）変異に関して評価することを含み、これは、本明細書に記載のバイオインフォマティクスパイプラインによってさらに評価される。アッセイは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＢ細胞受容体（ＢＣＲ）のクローン型を評価すること、ならびにクローン性増大または新抗原受容体の評価を含む。試料の血漿部分に関しては、ｃｔＤＮＡライブラリーを、試料のバフィーコート試料割合から得られたＣＨＩＰ関連情報を含む本明細書に記載のバイオインフォマティクスパイプラインを使用して評価する。血漿試料割合の評価の一部として、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）、および融合を評価して、ＴＭＢスコアを生成する。同じく示されている通り、新抗原オーファン受容体を識別するために、２つの示されているアッセイ経路間で収集したデータを使用して、変異を相関させることができる。同じく示されている通り、２つの示されているアッセイ経路の結果を使用して、可能性のある免疫療法に対する応答を識別するための改善されたスコアを生成することもできる。
【０２６２】
一部の実施形態では、例えば、バフィーコートを、標準のキット（例えば、Ｑｉａｇｅｎまたは他の供給者から市販されているもの）を使用したゲノムＤＮＡ単離、その後、２回のネステッドＰＣＲに供して、ＣＤＲ３などの高度可変領域の外側のＴＣＲアルファおよびベータサブユニットを標的とするアンプリコンを富化させる。２回のＰＣＲの２回目は、ＴＣＲ  ｇＤＮＡを増幅させるだけでなく、シーケンシング用の部分的なアダプター（例えば、ＳＰ５およびＳＰ７アダプター）を付加するプライマーを必要とする。これらの部分的なアダプターは、この例示的な実施形態の最終的な第３の「インデックス」ＰＣＲにおいて、所望のＴＣＲアンプリコンに全長Ｐ５およびＰ７オリゴを付加し、それにより、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーでシーケンシングを行うことができるライブラリーを作製するために利用する。
【実施例】
【０２６３】
（実施例１）
腫瘍割合が小さく、かつカバレッジが小さい試料におけるＴＭＢスコアの調整
【０２６４】
既知の腫瘍割合が大きく、かつカバレッジが大きい患者試料の一定分量を、非腫瘍ｃｆＤＮＡ（すなわち、正常なｃｆＤＮＡ）で３〜４倍希釈して、腫瘍割合が小さく、かつカバレッジが小さい試料を実現した。希釈試料を、Ｇｕａｒｄａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって開発された血液に基づくＤＮＡアッセイを使用して処理し、分析した。バイオインフォマティクス解析によって変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）を推定し、ＴＭＢ補正モデルを適用して、補正ＴＭＢスコアを決定した。希釈試料の観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）、最大（ｍａｘ）ＭＡＦおよびカバレッジを入力パラメータとして提供した。このモデルにより、予測変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ｆ）、予測変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）の９５％信頼水準の上限（ｆ上限）、調整された変異カウントおよびＴＭＢスコアを推定した。表３に示されている通り、モデルから報告された希釈試料のＴＭＢスコア（１メガベースＭｂ当たり２３．５の変異（ｍｕｔ））は、元の腫瘍割合が大きい試料のＴＭＢスコア（１Ｍｂ当たり２３．２の変異）と非常に近い。図６に、ＴＭＢ補正モデルを適用した（ｏ）および適用していない（Δ）希釈試料のＴＭＢスコアプロットを示す。
【表３】
2021531775.tif 000010
【０２６５】
（実施例２）
６種の固形腫瘍型にわたるｃｔＤＮＡに基づく腫瘍遺伝子変異量のランドスケープおよびゲノム相関
【０２６６】
緒言
【０２６７】
腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）は、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）による療法に対する応答の予想バイオマーカーである。現行のパネルに基づくＴＭＢアルゴリズムでは、ある特定の型の体細胞バリアント由来のシグナル（例えば、非同義コードＳＮＶ）を集める。多くのＴＭＢ−Ｈｉｇｈ患者はＩＣＩに応答しないので、追加的なバリアント型および他のゲノム相関によりＴＭＢ算出を精密化することができるかどうかを調査した。さらに、血漿ＴＭＢでは、組織と比べて報告可能なＴＭＢ結果の収量が改善されるが、低腫瘍ＤＮＡ排出者（ｓｈｅｄｄｅｒ）におけるＴＭＢが実際よりも小さく推定される。この実施例では、高感度５００遺伝子ｃｆＤＮＡシーケンシングプラットフォーム（大パネルアッセイ）での実施を利用して多数のがんの型の試料を数千試験することにより、追加的なゲノムの特色および低ＤＮＡ排出についての調整を使用して、ＴＭＢアルゴリズムを改善する。
【０２６８】
方法
【０２６９】
変動する腫瘍シェディングレベルに対して頑強なｃｆＤＮＡに基づくＴＭＢアルゴリズムを開発した。肺、結腸直腸、および前立腺を含めた６種の固形腫瘍型にわたる１，０００を超える血漿試料においてｃｆＤＮＡに基づくＴＭＢを評価した。サイレントＳＮＶおよびインデルのＴＭＢスコアに対する寄与を調査した。ＴＭＢ腫瘍型、患者民族性、および肺腫瘍分子亜型の間の相関を調査した。最後に、ＴＭＢのランドスケープならびに追加的なゲノムの特色：サブクローン性、染色体不安定性、およびマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）も調査した。大パネルアッセイに関する追加的な詳細を表４に提示する。さらに、本実施例において使用したＴＭＢワークフローを図７に概略的に示す。
【表４】
2021531775.tif 000011
【０２７０】
結果
【０２７１】
１．大パネルアッセイの性能
【０２７２】
表５に、３０ｎｇのｃｆＤＮＡ入力に基づく大パネルアッセイの解析的検証性能および明細の要約を提示する。
【表５】
2021531775.tif 000012
【０２７３】
体細胞／生殖細胞系列状態を、局所的生殖細胞系列変異対立遺伝子割合からの偏差のベータ二項統計学モデルを使用して決定した。これは、例えば、参照により組み込まれるＮａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１８）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｖｓ．  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂｅｔａｂｉｎｏｍｉａｌ  ｍｏｄｅｌ．  ＡＡＣＲ，  Ｐｏｓｔｅｒ  ４２７２にさらに記載されている。この方法は、共通生殖細胞系列変異（例えば、ｄｂＳＮＰ）のデータベースに依拠するものではなかった。
【０２７４】
２．パネルに基づくＴＭＢの構成物
【０２７５】
図８Ａ、ＢおよびＣは、非同義コードＳＮＶと相関した変異型：コホートにわたって、非同義コードＳＮＶと相関する（図８Ａ）同義ＳＮＶ、（図８Ｂ）インデル、および（図８Ｃ）イントロンＳＮＶ（ピアソンのｒ＝０．９０、０．７１、０．８９）を示すプロットである。変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）の変動性（箱ひげ図）は、試料特異的変異率に基づく予測と一致した（黒い線：太い：中央値、細い：ＩＱＲ）。
【０２７６】
３．調整された血漿ＴＭＢは入力にほとんど依存しない
【０２７７】
図９Ａ〜９Ｄは、大パネルアッセイ腫瘍シェディング補正により、変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）の（図９Ａ）腫瘍シェディングおよび（図９Ｂ）入力ｃｆＤＮＡへの依存が取り除かれ、その結果、これらの入力メトリクスにほとんど依存しない血漿腫瘍遺伝子変異量（ｐＴＭＢ）がもたらされた（図９Ｃおよび９Ｄ）ことを示すプロットである。図９Ａおよび９Ｂは、腫瘍シェディングのビンにわたる変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）分布（最大体細胞ＭＡＦ（最大（ｍａｘ）ＭＡＦ）によって概算される）または入力体積（分子カバレッジをもたらす）を示す。図９Ｃおよび９Ｄは、補正後の同じビンにわたるＴＭＢスコアを示す。バイオリンプロットは中央値および四分位範囲（ＩＱＲ）を示す。黒い線は、中央値のトレンドを示す。
【０２７８】
４．腫瘍型にわたるＴＭＢ
【０２７９】
図１０Ａおよび１０Ｂは、コホートにわたる、および腫瘍型間のＴＭＢ分布を示すプロットである：（図１０Ａ）コホートにわたって、ＴＭＢスコアは尾の長い分布を有し、これは、組織に基づくＴＭＢおよび血漿に基づくＴＭＢにおける以前の観察と一致し、腫瘍型にわたる中央値は１０ｍｕｔ／Ｍｂであり、上位三分位数は１４ｍｕｔ／Ｍｂであった（黒い線）。図１０Ｂは、ＴＭＢ中央値が、以前の組織に基づく観察と一致する傾向で結腸直腸がん試料、肺がん試料、および前立腺がん試料の間で変動したことを示す。
【０２８０】
５．ＴＭＢは民族性に依存しない
【０２８１】
図１１Ａおよび１１Ｂは、ＴＭＢ中央値が民族性の間で変動しないことを示すプロットである。共通生殖細胞系列変異の主成分解析（ＰＣＡ）を使用して試料をクラスター化して、人種に基づくクラスターを定義した。人種が分かっている試料のセットを使用してクラスターにラベルを付ける（アジア人／太平洋諸島の住民：Ａ；黒人／アフリカ系アメリカ人：Ｂ、白人：Ｗ）。人種に基づくクラスターのそれぞれについて、腫瘍型を釣り合わせた試料２３例をランダムに選択した。図１１ＡはＰＣＡクラスタリングを示し、図１１ＢはＴＭＢスコアを示す。いくつかの組織ＴＭＢパイプラインに反して、ＴＭＢ中央値はクラスターにわたって一定であった（中央値のノンパラメトリックなサンプリングに基づく比較を使用して、Ａ対Ｗ：ｐ＝０．７８、Ｂ対Ｗ：０．７７、Ａ対Ｂ：０．９９）。
【０２８２】
６．ＴＭＢと発がん性変異の相関
【０２８３】
図１２は、肺試料におけるＴＭＢ（すなわち、血漿に基づくＴＭＢ（ｐＴＭＢ））がドライバーの状態によって異なることを示すプロットである。肺試料の中で、ＴＭＢ中央値は、全肺腫瘍（１２ｍｕｔ／Ｍｂ）と比較して、ＥＧＦＲにより駆動された肺腫瘍およびＡＬＫにより駆動された肺腫瘍において低く（中央値８ｍｕｔ／Ｍｂ、中央値の同等性についてｐ＜０．０１）、ＫＲＡＳまたはＰＩＫ３ＣＡホットスポット変異を有する腫瘍では高かった（１４ｍｕｔ／Ｍｂ、ｐ＝０．０４）。ＢＲＡＦドライバーを有する肺腫瘍は、全肺腫瘍と同様のＴＭＢ中央値を有する（１１ｍｕｔ／Ｍｂ、ｐ＝０．２５）。ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、またはＰＴＥＮの機能喪失（ＬＯＦ）変異は、ＩＣＩ応答に関する推定上の負の予測因子である。ＴＭＢ中央値はこれらの変異を有する腫瘍において全肺腫瘍よりもわずかに高く（１５ｍｕｔ／Ｍｂ、ｐ＜０．０１）、これにより、これらの後者の事象がＴＭＢとは独立した臨床的バイオマーカーであり得ることが示唆される。
【０２８４】
７．ＴＭＢランドスケープは変動するクローン構造、染色体不安定性、およびＭＳＩの状態を有する
【０２８５】
図１３Ａは、体細胞変異のクローン性および染色体不安定性がＴＭＢランドスケープにわたって高度に変動したことを示すプロットである：コホートにおいて認められたＴＭＢスコアの範囲にわたって、様々なサブクローン性変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）が存在した。これは、ＴＭＢスコアによって順序付けられた、腫瘍型にわたってランダムに選択された試料１００例によって例示され、黒色がクローン性変異（ＭＡＦは試料の最大（ｍａｘ）ＭＡＦの≧１０％である）であり、薄い灰色がサブクローン性変異（試料の最大（ｍａｘ）ＭＡＦのＭＡＦ＜１０％と定義される）である。サブクローン性であった全変異の割合が下の棒に示されている（黒色＝高度にクローン性；薄い灰色＝高度にサブクローン性）。サブクローン性割合はＴＭＢスコアと相関しなかった。同様に、増幅が検出された遺伝子の数（＃ＣＮＶ：サブクローン性割合の下に示されている）または二倍体であるパネル空間の割合（二倍体割合：（＃ＣＮＶ）の下に示されている）のいずれかによって測定される染色体不安定性もＴＭＢスコアと相関しない。図１３Ｂは、ＴＭＢ−Ｈｉｇｈ試料のサブセットにおいてＭＳＩ−Ｈｉｇｈが検出されたことを示す図である。
【０２８６】
結論
【０２８７】
パネルに基づくＴＭＢスコアは、エキソーム全体にわたる変異負荷量のシグナルが強化されるように、同義および非コード変異に影響を及ぼし得る。より多くの患者転帰データが利用可能になるので、ＴＭＢアルゴリズムおよび腫瘍ゲノム免疫原性の別個の（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）バイオマーカーは、患者の免疫療法に対する応答に関するガイダンスの改善のためにさらに進化する。大きなパネル空間を介してＴＭＢに対して高感度でパネルのシーケンシングを行うこと、ならびにコピー数バリエーションおよびＭＳＩの状態を検出できることがバイオマーカーの開発および臨床的適用に重要になる。
【０２８８】
（実施例３）
ＴＭＢ補正モデルを使用した、腫瘍割合が小さく、かつカバレッジが小さい試料におけるＴＭＢスコアの調整
【０２８９】
患者試料を、Ｇｕａｒｄａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により開発された血液に基づくＤＮＡアッセイを使用して処理し、分析した。バイオインフォマティクス解析により、この試料において１３種の体細胞変異が識別された。この実施形態では、ＳＮＶおよびインデルのみ体細胞変異の考慮に入れた。この実施形態では、１３種の体細胞変異のうち、３種を観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）から除外し、これは、これらの３種変異のうち２種は腫瘍に関連しない変異（例えば、クローン性造血変異）であり、他の変異はドライバー変異であったからである。試料の観測変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）、最大（ｍａｘ）ＭＡＦおよびカバレッジをＴＭＢ補正モデルへの入力パラメータとして提供した。このモデルにより、予測変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ｆ）、予測変異割合（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）の９５％信頼水準の上限（ｆ上限）、調整された変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）、およびＴＭＢスコアを推定した。ここで、調整された変異カウント（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔ）をエキソーム較正因子と解析されるゲノム領域のサイズ（本実施例では約１Ｍｂ）の積で割って、ＴＭＢスコアを決定した。表６は、ＴＭＢ補正モデルから報告されたＴＭＢスコアを示す。
【表６】
2021531775.tif 000013
【０２９０】
（実施例４）
ＴＭＢ補正モデルを使用した評価を受けていない試料（腫瘍割合が小さい）
【０２９１】
患者試料を、Ｇｕａｒｄａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）により開発された血液に基づくＤＮＡアッセイを使用して処理し、分析した。バイオインフォマティクス解析により、この試料において１種の体細胞変異が識別された。この実施形態では、ＳＮＶおよびインデルのみ体細胞変異の考慮に入れた。また、この試料の最大（ｍａｘ）ＭＡＦは０．１％であることが決定された。この実施形態では、最大（ｍａｘ）ＭＡＦを腫瘍割合とみなした。この試料の腫瘍割合は腫瘍割合カットオフを下回った。したがって、この試料に対してはＴＭＢ補正モデルを使用した評価を行わなかった。この実施例に関するデータを表７にさらに要約する。
【表７】
2021531775.tif 000014
【０２９２】
前述の開示は、明瞭さおよび理解のために実例としておよび例として一部の詳細が記載されているが、本開示を読めば、形態および詳細の種々の変化を本開示の真の範囲から逸脱することなく行うことができ、また、添付の特許請求の範囲内で実施することができることが当業者には明らかになろう。例えば、方法、システム、コンピューター可読媒体、および／または構成要素の特色、ステップ、要素、またはそれらの他の態様は全て種々の組合せで使用することができる。
【０２９３】
本明細書において引用されている特許、特許出願、ウェブサイト、他の刊行物または文書、受託番号などは全て、各個別の項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたものと同じく、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。異なるバージョンの配列が違う時間に受託番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日に受託番号に関連付けられたバージョンが意図される。有効な出願日とは、実際の出願日よりも前または該当する場合には受託番号を参照する優先出願の出願日を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日のごく最近に公開されたバージョンが意図される。
【図１】
2021531775.tif 000016
【図２】
2021531775.tif 000017
【図３】
2021531775.tif 000018
【図４】
2021531775.tif 000019
【図５】
2021531775.tif 000020
【図６】
2021531775.tif 000021
【図７】
2021531775.tif 000022
【図８】
2021531775.tif 000023
【図９】
2021531775.tif 000024
【図１０】
2021531775.tif 000025
【図１１】
2021531775.tif 000026
【図１２】
2021531775.tif 000027
【図１３】
2021531775.tif 000028
【国際調査報告】
2021531775.tif 000029
2021531775.tif 000030
2021531775.tif 000031
2021531775.tif 000032
2021531775.tif 000033
2021531775.tif 000034
2021531775.tif 000035