(57)【要約】  本発明は、コラーゲンペプチドを含有したポリカプロラクトン微粒球フィラーとその製造方法に関し、コラーゲンペプチドをポリカプロラクトン微粒球に封入させることによって、生体に注入する場合、コラーゲン形成効果が速やかに発現しながらも高い組織修復特性を示すだけでなく、長期間前記効果が維持されて頬、胸、鼻、唇およびお尻などの軟組織修復または体積拡大およびシワ改善の特性に優れた整形フィラーを提供することができる。
2021511112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカプロラクトン微粒球にコラーゲンペプチドが含有された微粒球の全体１００重量％を基準として０．０１〜７重量％のコラーゲンペプチドを含み、平均粒度が１０〜１００μｍである、コラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球。
【請求項２】
前記ポリカプロラクトンの固有粘度が０．１６〜１．９０ｄＬ／ｇであることを特徴とする、請求項１に記載のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球。
【請求項３】
前記微粒球のスパン値（Ｓｐａｎ  ｖａｌｕｅ）が１．０以下であることを特徴とする、請求項１に記載のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球。
【請求項４】
前記コラーゲンペプチドはＫＴＴＫＳ、ＧＨＫ、ＡＨＫおよびこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球。
【請求項５】
（ａ）ポリカプロラクトンを第１溶媒に溶解させ、コラーゲンペプチドを第２溶媒に溶解させてそれぞれの溶液を製造した後、前記二つの溶液を均一に混ぜて単一溶液に製造して分散相を製造する工程、
（ｂ）前記分散相を界面活性剤を含有した水溶液（連続相）と混合してエマルションを製造する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）で製造されたエマルション中の分散相から有機溶媒を連続相に抽出および蒸発させて微粒球を形成させる工程、および、
（ｄ）前記工程（ｃ）の連続相から微粒球を回収してポリカプロラクトン微粒球を製造する工程を含む、コラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球の製造方法。
【請求項６】
前記ポリカプロラクトンは、固有粘度が０．１６〜１．９０ｄＬ／ｇであることを特徴とする、請求項５に記載のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球の製造方法。
【請求項７】
前記コラーゲンペプチドはＫＴＴＫＳ、ＧＨＫ、ＡＨＫおよびこれらの誘導体からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項５に記載のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球の製造方法。
【請求項８】
前記（ａ）工程の第１溶媒としてはジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メチルエチルケトンおよびこれらの混合物からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項５に記載のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球の製造方法。
【請求項９】
前記（ａ）工程の第２溶媒としてはメチルアルコール、エチルアルコール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、酢酸およびこれらの混合物からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項５に記載のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球の製造方法。
【請求項１０】
前記工程（ｂ）の界面活性剤としてはメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンひまし油誘導体およびこれらの混合物からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項５に記載のコラーゲンペプチドを含有したポリカプロラクトン微粒球の製造方法。
【請求項１１】
前記工程（ｂ）の界面活性剤は、界面活性剤を含む水溶液の全体体積を基準として０．０１ｗ／ｖ％〜２０ｗ／ｖ％である、請求項５に記載のコラーゲンペプチドを含有したポリカプロラクトン微粒球の製造方法。
【請求項１２】
全体ポリカプロラクトン微粒球フィラー１００重量％に対して、コラーゲンペプチド含有量が０．０１〜７重量％であり、平均粒度が１０〜１００μｍであるコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球２〜５０重量％、溶質０．１〜５重量％、潤滑剤０〜４８重量％、および薬学的に許容可能な水性担体１５〜９７．９重量％、を含む、ポリカプロラクトン微粒球フィラー。
【請求項１３】
前記コラーゲンペプチドがＫＴＴＫＳ、ＧＨＫ、ＡＨＫおよびこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１２に記載のポリカプロラクトン微粒球フィラー。
【請求項１４】
前記溶質がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒアルロン酸、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＰＤＲＮ）、ポリヌクレオチド（ＰＮ）およびこれらの混合物からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１２に記載のポリカプロラクトン微粒球フィラー。
【請求項１５】
前記潤滑剤がグリセリンであることを特徴とする、請求項１２に記載のポリカプロラクトン微粒球フィラー。
【請求項１６】
前記薬学的に許容可能な水性担体が精製水、生理食塩水またはリン酸緩衝液であることを特徴とする、請求項１２に記載のポリカプロラクトン微粒球フィラー。
【請求項１７】
前記フィラーは、シワ改善、軟組織修復または体積拡大、または輪郭較正用である、請求項１２に記載のポリカプロラクトン微粒球フィラー。
【請求項１８】
前記フィラーは注射剤用である、請求項１２に記載のポリカプロラクトン微粒球フィラー。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか一項に記載のポリカプロラクトン微粒球フィラーが充填された、プレフィルドシリンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照]
本出願は、２０１８年１月１０日付の韓国特許出願第１０−２０１８−０００３５８５号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
【０００２】
本発明は、ポリカプロラクトン微粒球フィラーとその製造方法に関し、より詳しくは、コラーゲンペプチドを含有してコラーゲンペプチドの生体内安定性の問題を解決しただけでなく、生体への適用時に施術後の効果が速やかに発現しながらも効果の維持時間が長いポリカプロラクトン微粒球フィラーとその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
皮膚用フィラーは、人体に安全な材料を顔の真皮層に注入してシワを改善して美観上ボリュームを取り戻すなど皮膚組織を補充する注射タイプの医療機器であって、ボツリヌストキシン（ボトックス）、自家脂肪移植、スレッドリフト、マイクロニードル、レーザ治療、薄皮術などをはじめとする、いわゆるアンチエイジング施術に使用される。
【０００４】
最初に開発された第１世代皮膚用フィラーは、動物由来のコラーゲンフィラーで施術後効果の持続期間が２〜４ヶ月で短く、施術１ヶ月前に皮膚過敏反応検査をしなければならないという、煩わしさのため最近ではほとんど使われていない。
【０００５】
第２世代皮膚用フィラーは、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）フィラーでコラーゲンフィラーより効果の持続時間が長く、人体の構成成分と類似する多糖質で構成されて皮膚過敏反応などの副作用が顕著に少なくコラーゲンフィラーのように皮膚反応検査を要しない点で現在最も多く使用されるフィラーである。特に、ヒアルロン酸は、施術および除去が容易で、粘弾性（ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）に優れ、皮膚の水分を維持して皮膚のボリュームおよび弾力性を維持して皮膚用フィラーの原料として好適である。最近ではヒアルロン酸の架橋結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ）を誘導して粒子の大きさおよび分子量を増加させることによって持続期間を延長させる研究が活発であるが、維持時間が６〜１２ヶ月で比較的短いので、６〜１２ヶ月ごとに繰り返して施術しなければならない煩わしさがある。
【０００６】
第３世代フィラーは、ポリ乳酸（Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ，ＰＬＡ）またはポリカプロラクトン（Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ，ＰＣＬ）などの合成高分子フィラーで、人体で非常にゆっくりと分解されるので吸水性フィラーであるコラーゲン、ヒアルロン酸フィラーに比べてより長期間にわたる効果を有する目的として使われている。特にポリカプロラクトンは、人体に１００％吸収されて安全な成分であり、皮膚内移植後、ポリ乳酸より吸収される速度が遅く、コラーゲンの生成を促進して異物感のないやわらかい感じの組織で効果が１〜４年間持続する長所がある。しかし、ポリカプロラクトンフィラーは、微粒球形態のフィラーで、カルボキシメチルセルロース（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，ＣＭＣ）などのゲルキャリアに懸濁して投与しなければならないし、皮膚内注入後６〜８週間後に効果が現れるため、施術後効果が即刻に現れるヒアルロン酸フィラーよりは施術の満足度が低下するという短所がある。
【０００７】
一方、ＫＴＴＫＳなどの生理活性ペプチドは、コラーゲン由来物質でコラーゲン加水分解酵素（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）の合成を抑制したり、細胞外基質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）の生産を促進させ、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンとフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）発現を促進させることが知られている。    
【０００８】
しかし、ペプチドの生体内での低い安定性と低い皮膚透過性などによって様々な誘導体を利用してシワ改善、皮膚再生などの目的で化粧品などに限定して使用されているのが実情である。
【０００９】
したがって、従来のポリカプロラクトン微粒球フィラーの特性を活用し、ポリカプロラクトン微粒球でコラーゲンペプチドを封入することによってコラーゲンペプチドの生体内安定性の問題を解決して、より効能が改善された新たなポリカプロラクトン微粒球フィラーの開発が求められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記のような従来のコラーゲンペプチドの生体内安定性の問題を解決し、ポリカプロラクトン微粒球フィラーの効能を改善するために案出されたものであり、生体に適用時、施術後の効果が速やかに発現しながらも効果の維持時間が長いコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球、それを含むフィラーとそれを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するための手段として、
本発明は、微粒球全体重量に対してコラーゲンペプチド含有量が０．０１〜７重量％であり、平均粒度が１０〜１００μｍである、コラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球を提供する。
【００１２】
本発明の他の側面によれば、（ａ）ポリカプロラクトンを第１溶媒に溶解させ、コラーゲンペプチドを第２溶媒に溶解させてそれぞれの溶液を製造した後、前記二つの溶液を均一に混ぜて単一溶液に製造して分散相を製造する工程、（ｂ）前記分散相を界面活性剤を含有した水溶液（連続相）と混合してエマルションを製造する工程、（ｃ）前記製造されたエマルション中の分散相から有機溶媒を連続相に抽出および蒸発させて微粒球を作る工程、および、（ｄ）前記工程（ｃ）の連続相から微粒球を回収する工程を含む、コラーゲンペプチドを含有したポリカプロラクトン微粒球を製造する方法が提供される。
【００１３】
本発明のまた他の側面によれば、本発明のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球、および薬学的に許容可能な水性担体およびポリカプロラクトン微粒球を含むフィラーが提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によるコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球を含むフィラーは、生体に適用時、コラーゲン形成効果が速やかに発現し、高い組織修復特性を示すだけでなく、前記効果が長期間維持されて、頬、胸、鼻、唇およびお尻などの軟組織の修復または体積拡大およびシワ改善特性などのフィラーとしての効果が優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】実施例１−１により製造されたパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ＫＴＴＫＳ）を含むポリカプロラクトン微粒球の形状を電子顕微鏡で撮影した写真である。写真で確認できるように、生成された微粒球は球状の形状を維持しており、製造に使用されたメンブレン直径に応じて粒子サイズが調整可能であることを確認することができた。
【図１ｂ】実施例３−１により製造されたパルミトイル−ＫＴＴＫＳを含むポリカプロラクトン微粒球の形状を電子顕微鏡で撮影した写真である。写真で確認できるように、生成された微粒球は球状の形状を維持しており、製造に使用されたメンブレン直径に応じて粒子サイズが調整可能であることを確認することができた。
【図１ｃ】実施例３−２により製造されたパルミトイル−ＫＴＴＫＳを含むポリカプロラクトン微粒球の形状を電子顕微鏡で撮影した写真である。写真で確認できるように、生成された微粒球は球状の形状を維持しており、製造に使用されたメンブレン直径に応じて粒子サイズが調整可能であることを確認することができた。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１７】
本発明によるコラーゲンペプチドは、生体内でコラーゲン再生促進効果を示すペプチドをいうもので、ＫＴＴＫＳ、ＧＨＫ、ＡＨＫ、およびこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上であり得る。前記コラーゲンペプチド誘導体の非限定的な例としては、パルミトイル−ＫＴＴＫＳ、ＧＨＫ−Ｃｕ、ＡＨＫ−Ｃｕなどが挙げられる。好ましくはＫＴＴＫＳ、パルミトイル−ＫＴＴＫＳ、ＧＨＫ、ＡＨＫおよびこれらの混合物を使用することができる。より好ましくはＫＴＴＫＳ、またはパルミトイル−ＫＴＴＫＳを使用することができる。
【００１８】
本発明によるポリカプロラクトン微粒球内コラーゲンペプチド含有量（封入量）は、微粒球全体重量に対して０．０１〜７重量％、好ましくは０．０５〜６重量％であり得る。このような封入量は、コラーゲンペプチドの生体内安定性を確保しながらもコラーゲンペプチドに特徴的に生理活性が注入部位で上昇的な効果を奏するように最適化したものである。コラーゲンペプチドの封入量が０．０１重量％未満であれば、コラーゲンペプチドによって発現できるコラーゲン生成の上昇的な促進効果が十分に現れず、コラーゲンペプチドの封入量が７重量％を超える場合、コラーゲンペプチドのポリカプロラクトン微粒球内の封入効率が減少するようになって微粒球内部でコラーゲンペプチドが不均一なチャンネルを形成し、形成されたチャンネルでコラーゲンペプチドが拡散を通して急速に放出されるので好ましくない。
【００１９】
本発明のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球は、生分解性高分子であるポリカプロラクトンの固有粘度が０．１６〜１．９０ｄＬ／ｇのポリカプロラクトンを使用して製造する。本発明で使用されるポリカプロラクトンの固有粘度は、ウベローデ（Ｕｂｂｅｌｏｈｄｅ）粘度計を用いて２５℃でクロロホルムで測定されたものをいう。上記したポリカプロラクトン高分子の例としては、エボニック（Ｅｖｏｎｉｋ）社製のＲｅｓｏｍｅｒ  Ｃ２０９、Ｃ２１２およびＣ２１７とコービオン（Ｃｏｒｂｉｏｎ）社製のＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ０２、ＰＣ０４、ＰＣ０８、ＰＣ１２およびＰＣ１７などが挙げられる。使用するポリカプロラクトンの固有粘度が０．１６ｄＬ／ｇより低い場合、低い粘度によってポリカプロラクトン微粒球がうまく生成されなくなるか、または生体内注入時に微粒球が速すぎて分解されてコラーゲンペプチドの初期放出が急激に増加し、１．９０ｄＬ／ｇを超える粘度を有する場合、生体内注入時に微粒球の分解速度が減少することになり、遅くなった高分子分解速度の影響により微粒球内コラーゲンペプチドが生体内に拡散する速度が減少して、十分なコラーゲン生成促進効果を示しにくいという問題がある。
【００２０】
本発明によるコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球は、平均粒度が１０μｍ以上であり、１００μｍ以下、例えば１０〜３０μｍ、１０〜５０μｍ、または１０〜１００μｍ、２０〜５０μｍ、３０〜６０μｍ、または４０〜７０μｍであることが好ましい。本発明で使用される平均粒度とは、粒度分布曲線で体積％の５０％に該当する粒度で、平均粒径（Ｍｅｄｉａｎ  Ｄｉａｍｅｔｅｒ）を意味し、Ｄ５０またはＤ（ｖ、０．５）で表す。
【００２１】
コラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球の平均粒度が１０μｍ未満の場合は、生体内に投与時に大食細胞によって貪食され得、１００μｍより大きい場合には、注射器で注入時に注射能が低下して注射針が厚くなることにより、刺す時の痛みが大きくなって好ましくない。
【００２２】
本発明のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球は、均一な粒子分布を有することが好ましい。均一な粒子分布度を有する微粒球は、不均一な微粒球に比べて注射時に注射器および注射針の内部残留量の偏差も小さく、注射針の目詰まり現象も少ないため、より細い注射針を使用することができる。本発明のポリカプロラクトン微粒球の大きさ分布度またはスパン値（Ｓｐａｎ  ｖａｌｕｅ）が１．０以下であることが好ましい。より好ましくは、大きさ分布度が０．８以下であることが好ましい。本発明で使用される大きさ分布度またはスパン値（Ｓｐａｎ  ｖａｌｕｅ）とは、微粒球の粒子サイズの均一性を示す指標であって、大きさ分布度（Ｓｐａｎ  ｖａｌｕｅ）＝（Ｄｖ０．９−Ｄｖ０．１）／Ｄｖ０．５の数式により求めた値を意味する。ここでＤｖ０．１は微粒球の粒度分布曲線で体積％の１０％に該当する粒度、Ｄｖ０．５は微粒球の粒度分布曲線で体積％の５０％に該当する粒度、Ｄｖ０．９は微粒球の粒度分布曲線で体積％の９０％に該当する粒度を意味する。本発明によるコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球は１０μｍ以上、１００μｍ以下の粒度を示しながらも均一な大きさ分布度を示すので、注射針の目詰まりが減少して注射能が向上することを特徴とする。
【００２３】
以上のような粒径範囲とスパン値は、ポリカプロラクトン微粒球中のコラーゲンペプチドが適切な量で溶出されるようにする封入量を含み得るように最適化したものであり、このような特徴を有する本発明によるコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球は、長期間にわたって有効な容量のコラーゲンペプチドを放出することを特徴とする。具体的には、本発明によるコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球は、好ましくは３０日間、より好ましくは３５〜４２日間、よりさらに好ましくは５６〜６０日間にわたってコラーゲンペプチドを徐々に放出させる。
【００２４】
また、本発明によるコラーゲンペプチドは、生体外で微粒球の累積溶出率を測定する時、溶出後１日目までは０．１〜１０％の累積溶出率を示し、１４日目までは４０〜６５％の累積溶出率を示し、５６日目までは７０〜１００％の累積溶出率を示すことを特徴とする。
【００２５】
本発明によるコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球は、一例として「溶媒抽出および蒸発法」を用いて製造できるが、これに限定されない。
【００２６】
本発明によるコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球の製造方法の具体的な一例として、このような製造方法は、（ａ）ポリカプロラクトンを第１溶媒に溶解させ、コラーゲンペプチドを第２溶媒に溶解させてそれぞれの溶液を製造した後、前記二つの溶液を均一に混ぜて単一溶液に製造して分散相を製造する工程、（ｂ）前記分散相を界面活性剤を含有した水溶液（連続相）と混合してエマルションを製造する工程、（ｃ）前記工程（ｂ）で製造されたエマルション中の分散相から有機溶媒を連続相に抽出および蒸発させて微粒球を形成させる工程、および（ｄ）前記工程（ｃ）の連続相から微粒球を回収してコラーゲンペプチドを含有したポリカプロラクトン微粒球を製造する工程を含む。
前記工程（ａ）でポリカプロラクトンの固有粘度は、０．１６〜１．９０ｄＬ／ｇの範囲が好ましい。
【００２７】
前記工程（ａ）でポリカプロラクトンを溶解させるのに使用される第１溶媒は、水と混和しない性質を有するものが好ましい。有機溶媒の水と混和しない性質を利用することによって、後述する工程（ｂ）で連続相である界面活性剤を含有した水溶液に分散相を均質に混合および分散させてエマルションを形成することができる。このようなポリカプロラクトンを溶解させる溶媒の種類は特に制限されないが、好ましくはジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メチルエチルケトン、およびこれらの混合溶媒からなる群から選択され得、より好ましくはジクロロメタン、酢酸エチルまたはこれらの混合溶媒を使用することができる。
【００２８】
前記工程（ａ）でコラーゲンペプチドを溶解させる第２溶媒としては、メチルアルコール、エチルアルコール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、酢酸およびこれらの混合物からなる群から選択され得、好ましくはメチルアルコール、ジメチルスルホキシドまたはこれらの混合溶媒を使用することができる。
【００２９】
前記工程（ａ）でポリカプロラクトンとコラーゲンペプチド溶液とを混ぜて均一な混合溶液を作って分散相を製造する。コラーゲンペプチドがポリカプロラクトン微粒球内にうまく封入され得るように、ポリカプロラクトンとコラーゲンペプチド混合溶液は均質に溶解することが好ましい。一例として、ポリカプロラクトン溶媒としてジクロロメタンを使用し、コラーゲンペプチド溶媒としてメチルアルコールを使用する場合、メチルアルコールの使用量は、ジクロロメタンの重量に対して２重量％〜５０重量％であることが好ましい。メチルアルコールの量が２重量％未満の場合には、コラーゲンペプチドがジクロロメタンによって溶解度が低下して析出される可能性が高く、５０重量％を超える場合には、ポリカプロラクトンがメチルアルコールによって析出される可能性が高くて好ましくない。
【００３０】
前記工程（ｂ）で分散相と界面活性剤を含有した水溶液を均質に混合する方法は特に制限されないが、好ましくは高速攪拌機、インラインミキサ、メンブレンエマルション法、マイクロフルイディクスエマルション法などを用いて行うことができる。一例として、メンブレンエマルション法を用いて混合する場合、前記工程（ａ）で製造された分散相を均一な大きさの微細孔を有する膜を通過させて界面活性剤を含有した連続相に移動させてエマルションを作る。膜の微細孔は５〜５０μｍであることが好ましい。
【００３１】
前記工程（ｂ）で使用される界面活性剤の種類は特に制限されず、分散相が連続相内で安定した液滴のエマルションを形成できるように助けられるものであれば、いかなるものでも使用することができる。前記界面活性剤としては、好ましくは、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、レシチン、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンひまし油誘導体およびこれらの混合物からなる群から選択されることができ、最も好ましくはポリビニルアルコールを使用することである。
【００３２】
前記工程（ｂ）で、界面活性剤を含む連続相中の界面活性剤の含有量は、界面活性剤を含む連続相の全体体積を基準として、０．０１ｗ／ｖ％〜２０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％であり得る。界面活性剤の含有量が０．０１ｗ／ｖ％未満の場合は、連続相内に液滴形態の分散相またはエマルションが形成されず、界面活性剤の含有量が２０ｗ／ｖ％を超える場合には、過剰の界面活性剤によって連続相内に微粒子が形成された後、界面活性剤を除去するのに困難であり得る。本発明の一実施形態では、１〜５ｗ／ｖ％のポリビニルアルコールを使用してコラーゲンペプチドを含むポリカプロラクトン微粒球を製造した。
【００３３】
前記工程（ｃ）で、液滴形態の分散相および界面活性剤を含有した連続相を含むエマルションを有機溶媒の沸騰点未満の温度、例えば、これらに限定されるものではないが、５〜３９．６℃、好ましくは１０〜３５℃、より好ましくは１５〜３０℃に温度を維持しながら４８時間、好ましくは１〜３６時間、より好ましくは３〜２４時間程度攪拌などを通じて有機溶媒を除去することができる。攪拌速度は特に限定されないが、１０〜３００ｒｐｍであることが好ましい。連続相から抽出された有機溶媒の一部は連続相表面から蒸発され得る。液滴形態の溶液から有機溶媒が除去されることにより、前記液滴形態の分散相は固形化して微粒球が形成され、微粒球を含む懸濁液（微粒球懸濁液）形態が得られる。
【００３４】
前記工程（ｃ）で有機溶媒をさらに効率的に除去するために連続相の温度を一定時間熱を加え得る。
【００３５】
前記工程（ｄ）で、ポリカプロラクトン微粒球を回収する方法は、様々な公知の技術を用いて行うことができ、例えば濾過または遠心分離などの方法を利用することができる。
前記工程（ｃ）および工程（ｄ）の間に、濾過および洗浄により残留する界面活性剤を除去し、再び濾過させて微粒球を回収することができる。
【００３６】
残存する界面活性剤を除去するための洗浄工程は、通常、水を用いて行うことができ、前記洗浄工程は数回にわたって繰り返すことができる。
【００３７】
また、上記したように、前記工程（ｂ）で高速攪拌機、インラインミキサを利用してエマルションを形成した場合、前記工程（ｃ）および工程（ｄ）の間に、篩過工程を追加的に使用することで均一な微粒球を得ることができる。公知の技術を用いて篩過工程を行うことができ、大きさが互いに異なるふるい膜を利用して小さい粒子と大きい粒子の微粒球を濾して均一な大きさの微粒球を得ることができる。
【００３８】
本発明の他の側面によれば、前記本発明のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球、および薬学的に許容可能な水性担体、を含むコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球を含むフィラーが提供される。
【００３９】
前記薬学的に許容可能な水性担体としては、例えば、精製水、生理食塩水、またはリン酸緩衝液などの注射用水溶液を使用することができる。また、前記フィラーは、コラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球および薬学的に許容可能な水性担体のほかに必要に応じてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）などのセルロース誘導体、ヒアルロン酸、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＰＤＲＮ）、ポリヌクレオチド（ＰＮ）などの溶質、グリセリンなどの潤滑剤を一つ以上さらに含み得るが、これらに限定されない。溶質としては、好ましくはカルボキシメチルセルロースまたはヒアルロン酸である。
【００４０】
一実施形態で、本発明のコラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球のフィラーに含まれる各成分の含有量は、フィラー剤型の合計１００重量％を基準として、前記コラーゲンペプチド含有ポリカプロラクトン微粒球２〜５０重量％（ポリカプロラクトン微粒球内コラーゲンペプチド含有量は０．０１〜７重量％）、薬学的に許容可能な水性担体１５〜９７．９重量％、溶質０．１〜５重量％、潤滑剤０〜４８重量％であり得るが、これらに限定されない。ヒアルロン酸を溶質として追加する場合には、架橋率が０〜５％のヒアルロン酸を使用することができる。
【００４１】
このような本発明によるコラーゲンペプチドを含有したポリカプロラクトン微粒球を含むフィラーは、施術直後から施術部位でコラーゲン形成効果が速やかに発現し、自然かつ理想的なボリューム感を有する組織修復特性を示すだけでなく、コラーゲンペプチドの生体内の安定性が維持され、注射投与能も良好で維持期間も長い卓越した特性を示すため、美容または治療目的で非常に有用に使用することができる。
【００４２】
具体的な例示として、このようなポリカプロラクトン微粒球を含むフィラーは、生物学的組織のフィリング（ｆｉｌｌｉｎｇ）、シワのフィリング（ｆｉｌｌｉｎｇ  ｗｒｉｎｋｌｅ）によるシワ改善、顔面のリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｅ）または唇、鼻、お尻、頬または胸などの軟組織容積（ｖｏｌｕｍｅ）の修復または増加などに使用することができる。前記ポリカプロラクトン微粒球を含むフィラーは、このような用途に適切な投与形態で投与することができ、好ましくは注射剤であり得る。
【００４３】
また他の様態として、本発明は、前記ポリカプロラクトン微粒球を含むフィラーが充填されたプレフィルドシリンジを提供する。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９９ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０１ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．９６ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）２．０２ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、２ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相４０００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍ速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００４６】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００４７】
実施例１−１：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．９２ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）２．５２ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、２ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相４０００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００４８】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００４９】
実施例１−２：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．１ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．６ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）４．０ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、２ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相５０００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００５０】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００５１】
実施例１−３：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．５ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．５ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３８．０ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）６．１９ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、３ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相５４００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００５２】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００５３】
実施例１−４：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）１ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３６．０ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）１０．７７ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、３ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相４８００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００５４】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００５５】
実施例２：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０２（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）２４．９５ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）１．５７ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、２ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相２５００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００５６】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００５７】
実施例２−１：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  １２（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）５５．４４ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）３．５ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、２ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相６７００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００５８】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００５９】
実施例２−２：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  １７（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）８３．１６ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）５．２５ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、２ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相１２５００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００６０】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００６１】
実施例３：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．９２ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）２．５２ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、２ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相４０００ｍＬを直径５μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００６２】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００６３】
実施例３−１：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．９２ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）２．５２ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、２ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相４０００ｍＬを直径３０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００６４】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００６５】
実施例３−２：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．９２ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）２．５２ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、２ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相４０００ｍＬを直径４０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００６６】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００６７】
実施例４：高速攪拌機を利用したコラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．９２ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）２．５２ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、調製容器に連続相４０００ｍＬを入れ、装置された高速ミキサーを４５００ｒｐｍの速度で攪拌しながら、分散相を分当たり７ｍＬの流速で注入した。微粒球懸濁液は１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００６８】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し、２５μｍおよび１５０μｍのふるい目を有するメッシュを同時に使用して微粒球をふるい分けた後、凍結乾燥した。
【００６９】
実施例５：ＧＨＫ−Ｃｕが封入されたポリカプロラクトン微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよび生理活性物質としてＧＨＫ−Ｃｕ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．９２ｇとリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）６０μＬに完全に溶かした後、二つの溶液をボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）して準備した。連続相は、１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相４８００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００７０】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００７１】
実施例５−１：ＡＨＫ−Ｃｕが封入されたポリカプロラクトン微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよび生理活性物質としてＡＨＫ−Ｃｕ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．９２ｇとリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）７０μＬに完全に溶かした後、二つの溶液をボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）して準備した。連続相は、１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相４８００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００７２】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００７３】
実施例６：カルボキシメチルセルロースを溶質として使用したポリカプロラクトン微粒球フィラーの製造
ポリカプロラクトン微粒球フィラーは、微粒球の懸濁のための溶液を製造した後、微粒球を混合して製造した。具体的には、カルボキシメチルセルロース（製造会社：Ａｓｈｌａｎｄ社、米国）２ｇを７５℃リン酸緩衝液に入れ、３時間、１００ｒｐｍで攪拌しながら溶かして冷却させた。溶液温度が２５℃になるとグリセリン１８ｇを入れ、最終的に実施例１−２によるコラーゲンペプチドが封入されたポリカプロラクトン微粒球を３０％（ｗ／ｗ）で混ぜてポリカプロラクトン微粒球フィラーを完成した。
【００７４】
実施例６−１：ヒアルロン酸を溶質として使用したポリカプロラクトン微粒球フィラーの製造
ポリカプロラクトン微粒球フィラーは、微粒球の懸濁のための溶液を製造した後、微粒球を混合して製造した。ヒアルロン酸（製造会社：Ｂｌｏｏｍａｇｅ  Ｆｒｅｄａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ社、中国）１ｇを５５℃リン酸緩衝液に入れて溶かして冷却させた。溶液温度が２５℃になるとグリセリン１８ｇを入れ、最終的に実施例１−２によるコラーゲンペプチドが封入されたポリカプロラクトン微粒球をポリカプロラクトン微粒球フィラー全体重量に対して３０％（ｗ／ｗ）で混ぜてポリカプロラクトン微粒球フィラーを完成した。
【００７５】
比較例１：コラーゲンペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３２．０ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）１５．３５ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、３ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、連続相４８００ｍＬを直径１０μｍの多孔性メンブレンを装着した乳化装置に供給すると同時に、準備された分散相を注入して微粒球を製造した。製造された微粒球懸濁液は調製容器に入れて１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、メンブレン乳化装置および調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００７６】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し収得して微粒球を凍結乾燥した。
【００７７】
比較例２：高速攪拌機を利用した生理活性ペプチドが封入された微粒球の製造
分散相は、生体適合性高分子であるＰｕｒａｓｏｒｂ  ＰＣ  ０４（製造会社：Ｃｏｒｂｉｏｎ社、オランダ）９．９８ｇおよびパルミトイル−ＫＴＴＫＳ（製造会社：Ｉｎｃｏｓｐｈａｒｍ社、韓国）０．０２ｇをそれぞれジクロロメタン（製造会社：Ｊ．Ｔ  Ｂａｋｅｒ社、米国）３９．９２ｇとメチルアルコール（製造会社：シグマアルドリッチ社、米国）２．５２ｍＬに完全に溶かした後、二つの溶液を混合して準備した。連続相は、１ｗ／ｖ％ポリビニルアルコール（粘度：４．８〜５．８ｍＰａ・ｓ）水溶液を使用し、調製容器に連続相４０００ｍＬを入れ、装置された高速ミキサーを４５００ｒｐｍの速度で攪拌しながら、分散相を分当たり７ｍＬの流速で注入した。微粒球懸濁液は１５０ｒｐｍの速度で攪拌し、調製容器の温度は２５℃を維持した。
【００７８】
分散相注入が完了すると微粒球懸濁液を１２時間、２５℃で１５０ｒｐｍの速度で攪拌して有機溶媒を除去した。有機溶媒の除去が完了すると微粒球懸濁液を３次蒸留水で数回繰り返し洗浄して残余ポリビニルアルコールを除去し、微粒球は凍結乾燥した。
【００７９】
実験例１：光学顕微鏡を活用した形態学的分析
本実験は、製造された微粒球の形態学的特性を電子顕微鏡を用いて分析した。実験手続は以下の通りである。実施例１−１、３−１および３−２で製造された微粒球５ｍｇをカーボンテープ付きアルミニウムスタブに載せてＩＯＮ−ＣＯＡＴＥＲ（ＣＯＸＥＭ社製、韓国）を利用して白金コーティングした。アルミニウムスタブを走査電子顕微鏡（ＣＯＸＥＭ社製、ＥＭ−３０、韓国）に装着し、加速電圧１５ｋＶで微粒球の形態学的特性を観察し、その結果を図１ａ（実施例１−１）、図１ｂ（実施例３−１）および図１ｃ（実施例３−２）に示す。
【００８０】
図１ａ、図１ｂおよび図１ｃに示すように、微粒球は球状の形状を維持しており、製造に使用されたメンブレン直径に応じて粒子サイズが調整可能であることを確認することができた。
【００８１】
実験例２：レーザ回折法を用いた微粒球粒度分析
本実験は、微粒球の平均粒度および分布度を定量的に測定して粒子の均一性を確認するために実施した。実験手順は以下の通りである。
【００８２】
微粒球５０ｍｇを１ｍＬ３次蒸留水と混合して２０秒間ボルテックスミキサーで混合した後、１分間超音波発生器に入れて分散させた。微粒球分散液を粒度分析装置（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ  Ｂｌｕｅｗａｖｅ、Ｊａｐａｎ）に入れて２０秒間測定した。粒度大きさの均一性の指標を示すスパン値は以下の数式１から求めた。
【００８３】
［数１］
スパン値（Ｓｐａｎ  Ｖａｌｕｅ）＝（Ｄｖ、０．９-Ｄｖ、０．１）／Ｄｖ、０．５
【００８４】
【表１】
2021511112.tif 000003
【００８５】
上記の表１のように粒度分析装置で測定されたＤｖ、０．５とスパン値（Ｓｐａｎ  Ｖａｌｕｅ）により実施例１、実施例１−１、実施例１−２、実施例１−３、実施例１−４および比較例１は類似の平均粒度を有することを確認することができた。実施例１−１、実施例３、実施例３−１および実施例３−２は、それぞれ直径が異なるメンブレンを使用して製造した微粒球で、約１０〜１００μｍの平均粒度を有していた。この時、すべての微粒球は、スパン値（Ｓｐａｎ  Ｖａｌｕｅ）が１．０以下に均一な粒子分布を有していた。これにより、スパン値（Ｓｐａｎ  Ｖａｌｕｅ）が１．０以下に均一で、かつ平均粒度が１０〜１００μｍの微粒球を製造することができることを確認した。
【００８６】
実施例２、実施例２−１および実施例２−１の場合、分散相製造に使用される高分子の種類は異なるが、製造された分散相および微粒球の製造装置であるメンブレンの大きさ調節により類似の平均粒度に調節可能であることを確認することができた。
【００８７】
実施例１−１、実施例４および比較例２の場合、分散相を界面活性剤が含まれている水溶液に混合する方法に差異があり、該方法によって製造された微粒球は異なる平均粒度およびスパン値を示した。特に、高速撹拌機を用いた実施例４および比較例２の場合微粒球の選別過程である篩過によりスパン値を１．０以下に調節可能であり、別途の篩過過程のない比較例２の場合スパン値が１．３８で、相対的に広い粒度分布を有する。
【００８８】
実験例３：コラーゲンペプチド含有量分析
本実験では微粒球内に封入されたコラーゲンペプチドを定量分析するために実施し、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を活用して定量分析した。実験手続は以下の通りである。
【００８９】
微粒球１００ｍｇをジメチルスルホキシドとメチルアルコール混合溶液に完全に溶解させた後、移動相で希釈した。分析に用いた移動相は、酢酸アンモニウム溶液とアセトニトリルを３０：７０の比率（ｖ／ｖ）で混合して使用し、０．０５％酢酸が含まれるように製造した。本測定ではＣ８カラム（２．０ｘ１００ｍｍ、５μｍ）を使用した。測定された封入量は表２に示す。
【００９０】
【表２】
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【００９１】
上記表２に示すように、封入量（含有量）は分散相製造に使用されるコラーゲンペプチドの量に比例して増加し、コラーゲンペプチドの使用量に反比例して封入効率は減少した。実施例１−１、実施例３、実施例３−１および実施例３−２のコラーゲンペプチドの含有量は同様であり、これによって粒子サイズが封入率に影響を与えないことを確認した。
【００９２】
実験例４：コラーゲンペプチドの生体外放出動き
本実験は、ポリカプロラクトン微粒球に封入されたコラーゲンペプチドの薬物放出性能を確認するために実施し、実験手続は以下の通りである。
【００９３】
実施例１−１、１−２、１−４、２および２−２、そして比較例１で製造された微粒球１００ｍｇを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＬが入った２５０ｍＬの広口びんに入れ、予め定めた時間間隔ごとに広口びんから溶液１ｍＬを取り、同量の新たなＨＥＰＥＳ緩衝液をさらに入れた。採取した溶液は１．５ｍＬチューブに入れ、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、コラーゲンペプチド含有量分析法と同様に、液体クロマトグラフィー質量分析法により溶出率を確認した。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
上記表３に示すように、本発明による実施例１、実施例１−２および実施例１−４の累積溶出率によりポリカプロラクトン微粒球に封入されたコラーゲンペプチドの放出が５６日間にわたって徐々に放出される傾向を確認した。
【００９６】
より詳しくは、微粒球内封入されたコラーゲンペプチドの量が多いほど初期放出が高く、放出速度が速くなる傾向を確認することができた。これに対し、比較例１によって製造された微粒球の場合、溶出初期から高い溶出率を示して、４日間封入されたコラーゲンペプチドの約６９％を急激に放出する動きを示し、１４日目にはほとんどコラーゲンペプチドの溶出が完了して持続時間が長くないことを確認することができた。これは、分散相製造に使用したコラーゲンペプチドおよび溶媒の量が実施例１、実施例１−２および実施例１−４の場合より過度に多く、封入効率も減少することから微粒球内部にコラーゲンペプチドが不均一なチャンネルを形成し、形成されたチャンネルでコラーゲンペプチドが拡散を通して急速に放出されることが予測された。
【００９７】
実施例１−１、実施例２および実施例２−２の累積溶出率の結果により、分散相製造に使用された高分子の粘度が増加すると封入されたコラーゲンペプチドの放出速度が減少することが確認された。これは、高分子分子量の増加により微粒球の分解速度が減少するだけでなく、遅くなった高分子分解速度の影響で微粒球内コラーゲンペプチドの溶出液内への拡散速度の減少によるものと予測された。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【国際調査報告】
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