(57)【要約】  本発明は、免疫療法用のT細胞増殖のための三次元(3D)バイオリアクターの適用に関する。
2021520782.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖のための表面領域を有する複数の空間を備える3Dバイオリアクターを供給する工程であって、前記複数の空間は、直径Dを有し、前記空間間の複数の孔開口部は、D>dであるような直径dを有し、(a)前記空間の90%以上は、+/-10.0%を超えて変動しない選択された空間体積(V)を有し、(b)前記空間間の前記孔開口部の90%以上は、+/-10.0%を超えて変動しないdの値を有する、工程と、
細胞増殖のための前記バイオリアクター表面領域にポリドーパミンコーティングを施す工程と、
前記ポリドーパミンコーティングと結合した四量体タンパク質を準備する工程と、
前記四量体タンパク質に固定された1つ以上のビオチン化抗体を準備する工程と、
T細胞レセプターを有する前記バイオリアクターを通してT細胞を流す工程であって、前記T細胞レセプターは、前記1つ以上のビオチン化抗体と結合し、活性化される、工程と、
活性化されたT細胞を、シグナル伝達分子を含む灌流培地に曝露して、T細胞増殖を促進する工程と
を含む、T細胞増殖のための方法。
【請求項２】
前記四量体タンパク質は、アビジン又はストレプトアビジンを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ビオチン化抗体は、抗CD3抗体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記ビオチン化抗体は、抗CD3抗体及び抗CD28抗体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記ビオチン化抗体は、抗CD3抗体、抗CD28抗体及び抗CD2抗体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記シグナル伝達分子は、サイトカインシグナル伝達分子を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記空間は、0.4mm超の直径(D)を有し、前記孔は、0.20mm超の直径(d)を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記空間は、0.4mm超から100.0mmの範囲の直径(D)を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記孔は、0.2mmから10.0mmの範囲の直径(d)を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記空間の95.0%以上は、+/-10.0%を超えて変動しない空間体積(V)を示す、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記空間の99.0%から100%は、+/-10.0%を超えて変動しない空間体積(V)を示す、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記空間間の前記孔開口部の95.0%以上は、+/-10.0%を超えて変動しないdの値を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記空間間の前記孔開口部の99.0から100%は、+/-10.0%を超えて変動しないdの値を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
存在する空間の少なくとも90.0%は、1つの空間当たり2個の孔開口部を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
存在する空間の少なくとも90.0%は、1つの空間当たり8から12個の孔開口部を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記空間は、凹状の内面を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記空間は、球状空間を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記球状空間は、3D円筒型スペース中に64.0%を超える充填効率を有する、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記3Dバイオリアクターは、少なくとも0.01GPaの引張弾性率を有する材料から形成される、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記3Dバイオリアクターは、生体適合性の材料から形成される、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
前記3Dバイオリアクターは、加水分解の量が、存在する材料の5.0質量%を上回らないよう、細胞培養中に加水分解感受性ではない材料から形成される、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオリアクターは、直径Φ及び高さHを有し、比Φ:Hは、1:1超から100:1の範囲にある、請求項1に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、免疫療法用のT細胞増殖のための三次元(3D)バイオリアクターの適用に関する。本発明に記載されているバイオリアクターはまた、その他のリンパ球、例えば、B細胞及びナチュラルキラー細胞、又は非接着細胞全般の増殖に使用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
がん免疫療法は、医学におけるバイオテクノロジー革命の最新局面を代表するものであり、がんを処置するために患者自身の免疫システムを使用する。最近の成功例は、キメラ抗原レセプター(CAR)T細胞に基づくがんの処置である。典型的なCAR T細胞療法プロセスでは、患者自身の血液から採取されたTリンパ球に、T細胞ががん細胞を認識及び攻撃することができるように、表面に特別なレセプターCARを産生するよう遺伝子操作が行われる。操作されたCAR T細胞を、検査室で成長させ、数十億の数に増殖させた後、注射して患者に戻し、がん細胞を死滅させる。
【０００３】
CAR T細胞療法の成功に伴い、次の問題は、それをいかにより安全で、費用効率的にするかである。現行のT細胞操作プロセスは、依然として、概してT細胞とともにインキュベートするための磁気ビーズの使用に基づくものである。磁気ビーズの表面は、T細胞を活性化させて、T細胞が増殖できるよう、抗原として働くCD3及びCD28でコーティングされる。T細胞とともに細胞培養培地中に懸濁したマイクロビーズは、T細胞がCD3及びCD28と接触し、一時的に結合した後、活性化するための比較的大きな表面領域を提供する。T細胞を特定の密度まで増殖させた後、T細胞及び磁気ビーズは、刺激及び増殖のプロセスを継続させるためにGE社のWAVEバイオリアクター等の比較的大きなバイオリアクターに移される。比較的多数のT細胞を増殖させるために、このプロセスが複数回繰り返される。回収時、T細胞は、マグネチックセパレーターを使用してビーズから分離されなければならない。したがって、現行のT細胞増殖プロセスは、一般に費用効果的ではない磁気ビーズ、多段階処理、及び手動の相互作用に依存している。更に、これは、容易に汚染物が取り込まれ、好適な製造プロセス(GMP)要件を満たすために相対的により費用がかかる可能性がある開放システムである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Large-Scale Industrialized Cell Expansion: Producing The Critical Raw Material For Biofabrication Processes、A. Kumar及びB. Starly、Biofabrication 7(4):044103(2015年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、臨床用途量要件を実現するために改善されたバイオリアクター設計、費用効果的な製造技術、及び改善されたバイオリアクター操作性能を提供することによって、細胞の増殖、特にT細胞増殖を向上させるための方法及びデバイスが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
T細胞増殖のための方法は、(a)細胞増殖のための表面領域を有する複数の空間を備える3Dバイオリアクターを供給する工程であって、前記複数の空間は、直径Dを有し、前記空間間の複数の孔開口部は、D>dであるような直径dを有し、(a)前記空間の90%以上は、+/-10.0%を超えて変動しない選択された空間体積(V)を有し、(b)前記空間間の前記孔開口部の90%以上は、+/-10.0%を超えて変動しないdの値を有する、工程と、(b)細胞増殖のための前記バイオリアクター表面領域にポリドーパミンコーティングを施す工程と、(c)前記ポリドーパミンコーティングに結合したアビジン又はストレプトアビジン等の四量体タンパク質を準備する工程と、(d)前記四量体タンパク質に固定された1つ以上のビオチン化抗体を準備する工程と、(e)T細胞表面レセプターを有する前記3Dバイオリアクターを通してT細胞を流す工程であって、前記T細胞レセプターは、前記ビオチン化抗体と結合し、活性化される、工程と、(e)活性化T細胞を、(サイトカイン等の)シグナル伝達分子を含む灌流培地に曝露して、T細胞増殖を促進する工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】3Dバイオリアクター固定床の断面を示す図である。
【図１ａ】隣接球の重複を示すバイオリアクターの単位ネガモデルを示す図である。
【図１ｂ】12個の同一の隣接球によって各球が取り囲まれた単位ネガモデルを示す図である。
【図１ｃ】相互接続した空間システムを示す3Dバイオリアクター固定床の形状を示す図である。
【図１ｄ】断面図として3Dバイオリアクター固定床の形状を示す図である。
【図１ｅ】平面図として3Dバイオリアクターの特定の球状空間、及び球状空間間の相互接続した孔を形成するその重複領域を示す図である。
【図２】流体灌流のための入口及び出口を備えたハウジング中に配置された3Dバイオリアクター固定床を示す図である。
【図３】典型的な3Dバイオリアクター灌流システムを示す図である。
【図４ａ】3Dバイオリアクターを通る流量プロファイルを示す図である。
【図４ｂ】3Dバイオリアクターを通る流量プロファイルを示す図である。
【図４ｃ】3Dバイオリアクターを通る流量プロファイルを示す図である。
【図４ｄ】3Dバイオリアクターを通る流量プロファイルを示す図である。
【図４ｅ】3Dバイオリアクターを通る流量のスケールを示す。
【図５ａ】3Dバイオリアクター中の表面せん断応力の分布を示す図である。
【図５ｂ】3Dバイオリアクター中の表面せん断応力の分布を示す図である。
【図５ｃ】Pa単位のせん断応力のスケールを示す図である。
【図６ａ】円筒型3Dバイオリアクター中の流動方向に沿った圧力低下(勾配)を示す図である。
【図６ｂ】圧力のスケールを示す図である。
【図７ａ】FDM 3D印刷によって形成された3Dバイオリアクター固定床を示す図である。
【図７ｂ】バイオリアクターチャンバーとともに3Dバイオリアクター固定床を示す図である。
【図７ｃ】3Dバイオリアクターの入口及び出口を示す図である。
【図７ｄ】組み立てられた3Dバイオリアクターを示す図である。
【図７ｅ】SLA 3D印刷によって形成された3Dバイオリアクター固定床を示す図である。
【図７ｆ】DLP 3D印刷によって形成された3Dバイオリアクター固定床を示す図である。
【図８】層流に近づくよう3Dバイオリアクターの入口及び出口に配置される2つの流体分配器を示す図である。
【図９】流体分配器を使用した場合の3Dバイオリアクターを通る流量プロファイルを示す図である。
【図１０ａ】代替的なポロゲン浸出法（porogen-leaching method）による3Dバイオリアクターの形成を示す図である。
【図１０ｂ】代替的なポロゲン抽出法による3Dバイオリアクターの形成を示す図である。
【図１１】T細胞の結合及び活性化のために3Dバイオリアクターの球状空間体積への抗体の固定を示す図である。
【図１２】T細胞活性化及び増殖のためのビーズを用いないクローズドループ灌流ベースの3Dバイオリアクターを示す図である。
【図１３】さまざまな濃度のアビジン及びストレプトアビジンコーティングの蛍光強度を示すグラフである。バイオリアクター表面にコーティングされたアビジン及びストレプトアビジンの濃度を示すために蛍光標識アビジン及びストレプトアビジンを使用した。
【図１４】アビジン又はストレプトアビジン上のビオチンコーティングの蛍光強度を示すグラフである。アビジン又はストレプトアビジン上に結合したビオチンの濃度を示すために蛍光標識ビオチンを使用した。
【図１５】抗体コーティング磁気ビーズ及びバイオリアクターマトリックス対抗体コーティングなしのバイオリアクターマトリックスとともにインキュベート(静止)したT細胞増殖(ビーズ活性化後)を示すグラフである。
【図１６】それぞれ、抗体コーティングありのビーズ、バイオリアクターマトリックス及び抗体コーティングなしのバイオリアクターマトリックスとともにインキュベート(静止)したT細胞活性化及び増殖を示すグラフである。
【図１７】連続的な灌流を伴う3Dバイオリアクター中におけるT細胞活性化及び増殖を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示は、免疫療法用のT細胞増殖を実現するための対応する操作性能を有する灌流ベースのスケーラブルなバイオリアクター設計に関する。例えば、遺伝子改変後の患者のT細胞の活性化及び増殖は、患者に注入して戻すことができ、患者の腫瘍細胞を選択的に標的とし、死滅させる様式で患者自身の免疫システムを使用する治療用T細胞生成物をもたらす。
【０００９】
本明細書においてバイオリアクターへの言及は、選択された環境及び操作条件下において生物学的及び/又は生化学的処理を実施することができる本開示の3Dリアクターを指す。これには、以下のものの1つ以上の制御が含まれる:(バイオリアクターの全体的な寸法を決定する)空間の形状/サイズ、空間間の相互接続した孔サイズ及び含まれる空間の総数。更に、表面コーティング、バイオリアクター内の空間を通る流動特性、pH、温度、圧力、酸素、栄養分供給、及び/又は廃棄物除去を選択的に制御することができる。臨床投与量要件とは、109細胞以上の用量を提供する能力を指す。
【００１０】
3Dバイオリアクターの好適な固定床10は、図1に切断図として概して示されており、この図は、好適な密集した球状空間構造及びその球状空間間で相互接続した孔の例を示す。更に具体的には、バイオリアクターは、連続的な相互接続した3D表面領域12を含み、これは、抗体の存在下において細胞が結合する能力を提供し、更にバイオリアクター内に複数の相互接続した非ランダム空間14を画定し、この非ランダム空間14は、示されるとおり、表面積対体積比を最大にするために凹状の内面を有する球状が好ましい。空間は、いくつかの規定された体積の開放スペースと理解される。非ランダムへの言及によって、事実上繰り返しの空間サイズ及び/又は所望の許容誤差の形状をもたらす、3Dバイオリアクター中の空間の目標数又は選択数をここで特定することができることが理解されるべきである。
【００１１】
連続的な表面への言及によって、増殖している細胞が、3Dバイオリアクター内のある表面領域の場所から別の場所に容易に移動することができ、この表面が、表面にあるランダムな切れ目又は0.1mm以上のランダムな隙間等のいかなるランダムな中断も含まないことが理解される。好ましくは、細胞増殖のための3Dバイオリアクター内の表面領域の50%以上が連続的な表面であり、より好ましくは、3Dバイオリアクター内の60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上又は99%以上の表面領域が連続的である。
【００１２】
更に、バイオリアクター固定床10は、空間間として非ランダムな相互接続している孔開口部16を含む。再び、非ランダムへの言及は、選択された孔径の空間に対する孔の目標数又は選択数をここで特定することができ、それが所望の許容誤差の孔径を有する孔の実際の数をもたらすことが理解されるべきである。切断図において示されるバイオリアクターはまた、最終的に非ランダム空間の層(矢印「L」を参照)を定義し、バイオリアクターの複数の層が、その結果、列(矢印「C」を参照)内に複数のそのような非ランダム空間の特定を可能にすることができることが認識されるであろう。
【００１３】
バイオリアクターは、FDM(熱溶解積層法)3D印刷技術に使用されるポリスチレン、ポリカーボネート、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン(ABS)、ポリ乳酸(PLA)、ポリカプロラクトン(PCL)等の生体適合性又は生体不活性高分子材料から作製されてもよい。生体適合性又は生体不活性への言及は、培養細胞に対して無毒性の材料であると理解されるべきである。更に、3Dバイオリアクターのための高分子材料は、加水分解の量が、存在する高分子材料の5.0質量%を上回らない、より好ましくは、2.5質量%を上回らない、最も好ましくは、1.0質量%を上回らないような、細胞培養中に加水分解感受性ではないポリマーから好ましくは選択される。バイオリアクターはまた、SLA(光造形法)及びDLP(デジタル光処理)3D印刷技術に使用される生体適合性材料(例えば、ポリ(メチルメタクリレート)又はPMMA等)から作製されてもよい。
【００１４】
バイオリアクターを作製するために使用される材料は、水性培地中で分解不可能で、細胞増殖中に水性培地の流動に耐える機械的に安定な構造を提供することができることが好ましい。材料及び製造プロセスは、単層細胞増殖のための固体の平滑な相互接続した表面領域をもたらすことができることが好ましい。固体の表面への言及によって、表面が典型的に約20マイクロメートルから100マイクロメートルの直径を有する培養細胞による侵入又は埋め込みを低減する、又は防ぐようなものであることが理解されるべきである。好ましくは、本明細書における3Dバイオリアクターは、ある表面粗度値(Ra)を有する表面を有するものであり、表面粗度値は、評価長さ内で記録された平均線からの輪郭高さの偏差の絶対値の算術平均を指す。したがって、本明細書において、3Dバイオリアクター表面のRaは、20μm以下、より好ましくは、5μm以下の値を有することが想定される。
【００１５】
本明細書における3Dバイオリアクターはまた、少なくとも10、又は10〜95の範囲、より好ましくは、45〜95の範囲のショアD硬さを示す材料から形成されたものが好ましい。そのような点において、本明細書における3Dバイオリアクターが、ヒドロゲル型構造を利用しないものであることにも注目すべきであり、このヒドロゲル型構造は、いくらかの量の架橋を含み、大量の水(例えば、10〜40質量%)を吸収する親水型高分子構造と理解される場合もある。本明細書における3Dバイオリアクターが、好ましくはコラーゲン、アルギナート、フィブリン及び細胞が容易に消化し、再構築を受けるその他のポリマーを利用しないものであることにも注目すべきである。
【００１６】
更に、本明細書における3Dバイオリアクターは、好ましくは少なくとも0.01GPaの引張弾性率を有する材料から作製されるものである。より好ましくは、引張弾性率は、0.01GPa刻みで増加する0.01GPaから20.0GPaの範囲にある値を有する。更により好ましくは、3Dバイオリアクターのための材料に関する引張弾性率は、0.01GPaから10.0GPa又は1.0GPaから10GPaの範囲である。例えば、本明細書における3Dバイオリアクターの製造に適した、前で言及した高分子材料に関して、ポリスチレンは、約3.0GPa、ポリカーボネートは、約2.6GPa、ABSは、約2.3GPa、PLAは、約3.5GPa、PCLは、約1.2GPa、及びPMMAは、約3.0GPaの引張弾性率を示す。
【００１７】
そのような好適な規則的な幾何学特性及び連続的な表面領域を有する本明細書における3Dバイオリアクター設計は、好ましくは、例えば、SolidWorks(商標)コンピュータ支援設計(CAD)プログラムによって入手可能なコンピュータで作成された設計に従ってFDM、選択的レーザー焼結(SLS)、光造形法(SLA)、デジタル光処理(DLP)3D印刷技術等の付加的な製造技術によって作製される。
【００１８】
好適な例として、SolidWorks(商標)を利用して、3Dバイオリアクター設計を作成するプロセスを以下に示す。バイオリアクターネガに関するコンピュータモデルをまず作成する。したがって、更に具体的には、例えば、球間で接続した直径1.0mmの孔を作成するように重複した、充填された直径6.0mmの球を使用して、3Dバイオリアクターネガとして示すことができるものが作成された。当然、その他の可能な寸法が本開示の広い文脈内において想定される。
【００１９】
球は、好ましくは、各球が12個の隣接球によって取り囲まれた効率的に(又はきつく)充填された形状を作成するために六方最密(HCP)格子として構成される。この例となる形状の単位格子を図1aに示す。更に具体的には、図1aには、HCP格子の単位格子があり、ここでは、上の3つの球が半透明として表示されて、隣接球間の6方向の放射状重複領域を示す。孔は、これらの重複領域に形成される。好ましくは、孔の最大数は、充填を最適化するために12個である。最少の孔数は、3Dバイオリアクターの空間を通る培地灌流を可能にするために2個である。したがって、3Dバイオリアクター中に存在する空間の少なくとも90.0%から100%は、1つの空間当たり少なくとも2個の孔開口部を有する。より好ましくは、3Dバイオリアクター中の空間の少なくとも90.0%から100%は、1つの空間当たり8〜12個の孔開口部を有する。特に好適な一実施形態において、3Dバイオリアクター中の空間の少なくとも90.0%から100%は、1つの空間当たり12個の孔開口部を有する。
【００２０】
図1bにおいて、単位のすべての球を示す。バイオリアクターの形状は、その後、好ましくは、ネガモデルを反転させて、図1cに示される相互接続した球状空間システムを含むポジモデルを作成することによって作成される。更に、図1dでは、断面図で再度3Dバイオリアクターを見ることができ、規則的な幾何学特性(上で記載されているのと実質的に同じ空間体積の制御)を有する切断図において14で示される相互接続した空間及び対応する相互接続した孔開口部16の別の実例を提供する。
【００２１】
上記の好ましい規則的な幾何学的3Dバイオリアクターにおいて、空間直径と相互接続した孔の直径との間の関係を特定することができる。図1eに注目する。この好適な形状に関して、球状空間1は、実線の円によって表され、直径はDである(矢印によって示す)。したがって、直径「D」は、空間内面上の任意の2点間の最長距離と理解することができる。球状空間2は、破線の円によって表され、これも直径Dを有するであろう(図示せず)。球状空間2は、球状空間1の12個の隣接空間のうちの1つである。隣接空間間の重複部分のため、球状空間間の相互接続し、一般に同様に水平な矢印によって示される「d」の直径を有する孔が形成される。したがって、直径「d」は、孔開口部における任意の2点間の最長距離と理解することができる。空間の総3D球面積は、SAvoid=4×π×(D/2)2である。Scapと呼ばれるAとBの間の表面積=π×D×h、式中、
【００２２】
【数１】
2021520782.tif 000003
【００２３】
である。3Dバイオリアクター中の所与の空間に対する有用な空間表面は、SAu=SAvoid-[12×Scap]であろう。
【００２４】
空間直径Dが小さい程、規定の3Dスペース(体積)中により多数の空間を詰め込むことができるため、全体的な細胞結合表面がより大きくなる。ただし、灌流を遮断する細胞の凝集を最小限にする、又は防ぐために、孔の最小直径は、この形状に関しては好適なd=0.2mmである。孔の直径dは、0.2mmから10mm、より好ましくは、0.2mmから2.0mmの範囲内にあってもよい。d≧0.5mm及び0.5mmから2.0mmの範囲内にあるのが最も好ましい。
【００２５】
D=0.40mm以下の場合、d=0.2mmのときに算出されるSAuは0未満であり、これは、不可能な構造につながるため、この3Dバイオリアクターの形状に関して、Dは、>0.4mmでなければならない。ただし、Dは、0.4mmから100.0mm、より好ましくは、0.4mmから50.0mmの間、更に0.4mmから25.0mmの範囲内の値を有してもよい。Dの特に好適な値の1つは、2.0mmから10.0mmの範囲内にある。比較的大きなDの値を有する球状空間は、同じバイオリアクター体積内で可能なかぎり細胞培養表面積を増加させる目的を損なう場合もある。したがって、図1eに示される好適な形状に関しては、D>0.4mm(空間の直径)及びd>0.20mm(孔の直径)である。0.4mmから100.0mmの範囲内の空間に関する直径Dの任意の選択値、及び0.2mmから10.0mmの範囲内の孔に関する直径dの任意の選択値に関して、Dの値がdの値よりも大きくなるような値(D>d)であることにも注目すべきである。
【００２６】
ここで、本明細書における3Dバイオリアクターをその非ランダム特性に関して特徴づけることができることが認識可能である。好ましくは、3Dバイオリアクター内のすべての空間は、最も効率的な3Dスペース充填を実現し、対応する最大の連続的な表面領域を供するよう、実質的に同じ体積を有するようにされる。任意の所与の3Dバイオリアクターに存在する相互接続した空間の総数に関して、好ましくは、90.0%以上のそのような空間、また更には95.0%以上のそのような空間、また更には99.0%から100%のそのような空間は、許容誤差が+/-10.0%、又は+/-5.0%、又は+/-2.5%又は+/-1.0%、又は+/-0.5%又は+/-0.1%を超えて変動しないような空間体積(V)を有する。図1の空間は概して球状として示されているが、その他の空間形状も想定されることに留意すべきである。空間の直径は、細胞の凝集を最小限にする、又は回避するよう、更に細胞培養のために有用な最大表面領域をもたらすよう選択される。
【００２７】
本明細書における3Dバイオリアクターの別の非ランダム特性は、空間間の直径dを有する孔開口部である(再度、図1eを参照)。上と同様に、空間間の孔開口部の90.0%以上、又は更には孔開口部の95.0%以上、又は更には孔開口部の99.0%から100%は、許容誤差が+/-10.%、又は+/-5.0%、又は+/-2.5%又は+/-1.0%、又は+/-0.5%又は+/- 0.1%を超えて変化しないdの値を示す。
【００２８】
したがって、ここで、非接着細胞の増殖のための本明細書における3Dバイオリアクターは、細胞結合のための表面領域を含み、複数の空間は、直径D(空間内面上の任意の2点間の最長距離)を有し、前記空間間の複数の孔開口部は、直径d(孔開口部における任意の2点間の最長距離)を有し、ここでは、D>dであることが認識可能である。更に、空間の90%以上は、+/-10.0%を超えて変動しない空間体積(V)を有し、孔開口部の90%以上は、+/-10.0%を超えて変動しないdの値を有する。
【００２９】
更に、T細胞のような非接着細胞の増殖のための本明細書における3Dバイオリアクターは、直径D1を有する第1の複数の空間、前記第1の複数の空間間に直径d1を有する複数の孔開口部を含んでもよく、この場合、D1>d1であり、第1の複数の空間の90%以上は、+/-10.0%を超えて変動しない許容誤差を有する空間体積(V1)を有する。そのような3Dバイオリアクターはまた、直径D2を有する第2の複数の空間、前記第2の複数の空間間に直径d2を有する複数の孔開口部を有してもよく、この場合、D2>d2であり、第2の複数の空間の90%は、+/-10.0%を超えて変動しない許容誤差を有する空間体積(V2)を有する。V1及びV2の値は、異なり、それらの許容誤差変動から外れる。言い換えれば、+/-10.0%の許容誤差を含むV1の値及び+/-10.0%の許容誤差を含むV2の値は、異なる、又は[V1+/-10.0%]≠[V2+/-10.0%]である。
【００３０】
したがって、空間内の表面の曲率半径(Rc)は、好ましくは1/0.5(D)、又は1/0.2mm=5mm-1以下である。好ましくは、Rcは、0.2mm-1から1.0mm-1の値を有してもよく、これは、10.0mmから2.0mmのDの値に対応する。高い曲率(大きなRc)の表面は、細胞表現型の変化を誘発する場合もある典型的な単層2D培養とは著しく異なる環境を提供する。
【００３１】
細胞は、好ましくは、3Dバイオリアクターの相互接続した球状空間表面に結合している。そのような3D構造は、好ましくはスケーラブルであり、比較的小さなフットプリント細胞増殖バイオリアクターにより比較的大規模な細胞増殖のための比較的高い表面積対体積比を提供することができる。表面積対体積比はまた、好ましくは、球状空間の直径によって求められる。直径が小さい程、表面積対体積比が高くなる。好ましくは、空間は、5μmから100μmのサイズを有する細胞のため、更に細胞の凝集も低減又は回避するために比較的「平坦な」表面(すなわち、小さい曲率半径≦1.0mm-1)を提供する。更に、上記に暗示されるとおり、相互接続した孔の直径dを制御することによって、細胞の凝集も低減又は回避され、この直径は、好ましくは、少なくとも500μmであるが、述べたとおり、200μmを超える任意のサイズである。
【００３２】
したがって、バイオリアクター固定床10は、好ましくは、図2に更に示されるとおり使い捨ての3Dバイオリアクターとして働いてもよい。更に具体的には、バイオリアクター10は、ハウジング18中に配置され、その後、流体の流入及び流出が提供されてもよい入口及び出口コンパートメント20に入れられてもよい。好ましくは、バイオリアクター10、ハウジング18、並びに入口及び出口コンパートメント20は、付加的な製造技術を使用して単一の構成要素として作製することができる。図3に示されるとおり、ハウジング18中のバイオリアクター10並びに入口及び出口コンパートメント20は、MSC増殖のための全3Dバイオリアクターシステムの一部になってもよい。更に具体的には、3Dバイオリアクターは、好ましくは、細胞増殖を促進するために3Dバイオリアクターを通して細胞培養培地及び酸素を送達する灌流システム内に配置される。2DのT-フラスコにおいて使用される複数の継代細胞増殖方法はまた、3Dバイオリアクターが数十、数百、又は数千のT-フラスコと同等の細胞培養領域を有することを除いて、3Dバイオリアクターに直接に利用することもできる。
【００３３】
ここで、認識されるであろうとおり、本明細書における3Dバイオリアクターは、相互接続した空間の直径に応じて比較的大きな表面積対体積比を示す。例として、直径5cm及び高さ15cmの円筒と規定する従来のローラーボトルは、236cm2の細胞増殖表面積を提供する。本明細書における3Dバイオリアクターを、相互接続した直径2.0mmの空間で封入するために同じ体積が使用される場合、合計44,968の球状空間をそのスペースに充填することができ、これは、ローラーボトル表面積よりもほぼ24倍大きい約5,648cm2の表面積を有するマトリックスを提供することができる。
【００３４】
ホローファイバー又はマイクロキャリアベースのバイオリアクターと比較して本明細書における3Dバイオリアクターの少なくとも1つの特有の特徴は、断片化される表面の代わりに大きな相互接続した連続的な表面を提供する能力である。したがって、本明細書における3Dバイオリアクター内の連続的な表面は、細胞がある領域から別の領域へより自由に移動することを可能にすることが想定される。図3に示される灌流システムを使用して、バイオリアクターの内側に栄養分又は細胞シグナルの勾配を容易に作成して、細胞移動を誘導することができることが想定される。
【００３５】
3Dバイオリアクターの作製のための本明細書において示されている好適な3D印刷技術と併せて、計算流体力学(CFD)を使用して、バイオリアクター内における培地の流動をシミュレーションし、三次元の相互接続した内面の任意の場所における流量及びせん断応力を推定し、細胞培養環境を向上させるための最適化を可能にすることができる。更に具体的には、本明細書におけるバイオリアクターの三次元の相互接続した空間を通る流動特性をシミュレーションするため、並びに(1)流動速度、(2)圧力低下、及び(3)壁せん断応力の分布を推定するためにCFDを利用した。後者のパラメーター、せん断応力が細胞増殖に重要であることが認識されるであろう。せん断応力を低下させると、せん断に誘発される細胞分化を低減又は予防することができる。
【００３６】
(コンピュータシミュレーション速度を高めるために)17.5mmの直径、5.83mmの高さ、2mmの空間直径、及び0.5mmの孔径を有する小規模の円筒型3Dバイオリアクターを下で報告するシミュレーションに使用した。この場合、バイオリアクターの直径(Φ=17.5mm)対高さ(H=5.83mm)比は、3:1であり(図1d)、これは、バイオリアクターの入口と出口との間の栄養分及び酸素の勾配を低減するのに好ましい比である。固定床球面に利用可能な細胞密度に基づいて、酸素及び栄養分消費率を推定し、どの程度の頻度で細胞培養培地を交換する必要があるか(すなわち、体積流量)を求めた。このシミュレーションにおいて38.5μm/秒の全線流量が仮定された。3Dバイオリアクターへの投入として38.5μm/秒の速度の層流を使用したCFD結果を図4〜図6に示す。
【００３７】
図4a、図4b、図4c及び図4dは、小規模の円筒型3Dバイオリアクター全体にわたる流動速度プロファイルを示す。図4eは、流量のスケールを示す。更に具体的には、図4aは、バイオリアクターの側から見た流量分布を示す。流動は、流動方向に沿って孔を通って各球状空間を通過する。図中の白/灰色の領域は、流体の流動がない球状空間間の固体領域である。図4eの色付きの速度スケールバーと比較することによって、図4aは、流動方向に沿った孔における流量が200μm/sから240μm/sの最大流量を達成することを示す。対照的に、球面の付近の流量は、0.06μm/sから19.0μm/sの最小まで減少し、これは、球面に存在する細胞への流動が原因となるせん断応力を著しく減少させることになる。
【００３８】
図4bは、バイオリアクターの上部から3D構造の中心断面を通して見た速度プロファイルを示す。再度、画像は、最大速度が、流動方向に沿った球状空間の孔のそれぞれの中心においてであることを示している。この最大速度は、これもまた、200μm/sから240μm/sの範囲内である。球面付近の流量は、これもまた、低く、0.06μm/sから19.0μm/sの値を有する。
【００３９】
図4cは、放射状に相互接続した孔を通過する流動を示す個々の球空間の速度プロファイルを示す。したがって、図4cは、球状空間の内側の流動分布の有用な実例を提供する。高い流量は、細胞のない空間の中心の空のスペースにおいてであり、200μm/sから240μm/sのレベルである。細胞は、流量が低下し、流量がこれもまた0.06μm/sから19.0μm/sのレベルである凹状の空間表面に存在する。したがって、この特有の構造は、比較的高い流動ストレスへの曝露から細胞を保護することができる。これは、例えば、細胞が、細胞培養培地中に懸濁し、細胞に栄養分及び酸素を送達するためにバイオリアクター中で撹拌される凸状の球面を有する直径300μmから400μmのマイクロビーズの外面上で増殖させるマイクロキャリアベースのリアクターを超える、本明細書に記載されている3Dバイオリアクターの別の独特な利点である。そのような凸状の球面に存在する細胞は、0.1Paまでの比較的大きなせん断応力に曝露される可能性があり、これは、細胞の形態、透過性、及び遺伝子発現に影響を及ぼすことが知られている。図4dは、流動方向に沿って側面の孔を通る流動経路を示し、これは、本明細書における3Dバイオリアクターが比較的一定の流動パターンをもたらし、全体にわたって栄養分及び酸素を提供することを示している。
【００４０】
したがって、好適な3Dバイオリアクター内の算出された最大線流量は、流動方向に沿って直径2.0mmの空間間の相互接続した直径0.5mmの孔において生じる200μm/sから240μm/sである。図4a〜図4eに示されるとおり、流動は、優先的には流動に沿って中心方向であるが、球面付近にも依然として流動(約19.0μm/秒)があり、球面に存在する細胞への栄養分の供給を可能にする。したがって、3Dバイオリアクター構造の全体にわたって流動性の対流及び拡散の両方により栄養分が供給可能であるため、細胞は、この構造全体にわたりどこにでも存在することができ、いかなる場所でもよく育つことが想定される。
【００４１】
図5a及び図5bは、上記の円筒型3Dバイオリアクター全体にわたる、並びに単一の球状空間表面における表面せん断応力の分布を示す。図5cは、Pa単位のせん断応力のスケールを示す。最高のせん断応力は、相互接続した孔の縁で確認された。これは、これらの場所におけるより高い流量のためである。しかしながら、バイオリアクター内の有用な球面領域の大部分が、3×10-4Pa未満のせん断応力を示し、これは、バイオリアクターの表面積の90%以上と理解することができる。これは、せん断に誘発される分化を伴わない細胞増殖を提供する。更に、4.0×10-3Paの最大せん断応力でも、ホローファイバーベースのバイオリアクター、ウェーブバイオリアクター、及びマイクロキャリアベースのバイオリアクターにおいて培養される場合に細胞が経験する平均せん断応力よりも低いと考えられる。したがって、本明細書における3Dバイオリアクターは、既存の細胞増殖バイオリアクターと比較して細胞増殖に対して比較的低いせん断応力環境を提供することが想定される。例えば、Large-Scale Industrialized Cell Expansion: Producing The Critical Raw Material For Biofabrication Processes、A. Kumar及びB. Starly、Biofabrication 7(4):044103(2015年)を参照。
【００４２】
図6aは、上記の円筒型3Dバイオリアクターの底部から上部への流動方向に沿った圧力低下を示す。図6bは、圧力の適切なスケールを提供する。図は、バイオリアクターの入口と出口との間の全体的な圧力低下が1.0Pa以下であることを示す。したがって、圧力低下は、0.1Paから1.0Paまでの範囲で低下することもある。言い換えると、バイオリアクターの入口及び出口付近の細胞は、大幅な圧力の差を経験しないことになる。圧力の低い勾配は、そのような設計がまた、バイオリアクターの入口と出口との間で栄養分/代謝産物濃度の小さな勾配(又は差)しかもたらさないことを示唆する。この低い勾配は、直径Φが高さHよりも大きいが、バイオリアクター総体積は同じままであるような、バイオリアクターの設計によるものである。これは、ホローファイバーバイオリアクターよりも優れている。バイオリアクターの入口と出口との間における栄養分/代謝産物の勾配を減少させるΦ>H比を有するホローファイバーバイオリアクターを作製することは難しい。
【００４３】
さまざまな縦横比を有する同じ総体積の円筒型3Dバイオリアクターに関しても比較を行った(すなわち、Φ:H比、Φ:バイオリアクター固定床の全径、H:バイオリアクター固定床の全高)。図1dを参照。Table 1(表1)に示されるとおり、同じ体積流量(体積流量=流動の断面積×線速度)に関しては、低いΦ:H比を有するバイオリアクターで線速度が著しく増加する。線速度の増加は、表面せん断応力、圧力低下、並びに入口と出口との間の栄養分/代謝産物濃度の勾配も増加させ、これは、細胞増殖に好ましくない影響があるであろう。したがって、開示されている固定床3Dバイオリアクターは、好ましくは、あるΦ:H比構造、例えば、1:1超から100:1までの範囲のΦ:H比に設計される。好ましくは、Φ:H比は、1:1超から10:1までである。
【００４４】
【表１】
2021520782.tif 000004
【００４５】
図7aは、相互接続した直径6mmの空間及び相互接続した1mmの孔を有する、FDM 3D印刷によって形成された3Dバイオリアクター固定床部分を示す。この3Dバイオリアクターは、ABSフィラメントを用いて印刷した。この特定の3Dバイオリアクターの直径(Φ)及び高さ(H)は、それぞれ4.28cm及び1.43cmである。したがって、Φ:H比は、3:1である。約134個の相互接続した開放空間が固定床に含まれる。細胞培養のための相互接続した連続的な球面の総面積SAuは、約152cm2である。入口及び出口壁並びに入口及び出口にある流体分配器22(図8)は、細胞培養のための追加の88cm2の表面積をもたらす。言い換えると、3Dバイオリアクター中に約240cm2の細胞接着のために有用な総表面積がある。流体分配器は、バイオリアクターを通る層流を向上させることができる。レノルズ数が<2100又は0超から最大2100未満までの範囲内である場合、流体分配器は任意選択である。
【００４６】
図7bは、3Dバイオリアクターの固定床がバイオリアクターチャンバー中に結合した溶媒であったことを示す。これは、固定床とチャンバー壁との間の隙間をシールすることになり、これが、灌流細胞培養培地を、そうした隙間ではなく相互接続した孔を通過させることになる。好ましくは、固定床及びチャンバーは、製造効率を高めるために一体型パーツとして一緒に印刷される。図7cは、バイオリアクターの入口及び出口を示す。これらは、固定床を通る層流を促進するよう幾何学的に設計される。バイオリアクターの入口は、任意に組み込み式回転歯車を含み、これは、一定の細胞播種のためにバイオリアクターの回転を制御するステッピングモーターに結合されてもよい(以下参照)。図7dに統合型バイオリアクターが示され、これは、流体の流動を導くために1/8インチ管に接続することができる。或いは、入口及び出口を反復使用用に作製することができ、この場合、内側のバイオリアクター固定床のみが使い捨てである。DLA 3D印刷によって作製された、3.0mmの空間及び0.5mmの孔を有する比較的小さなサイズの3Dバイオリアクター固定床も図7eに示されている。図7fは、DLP 3D印刷を使用した、同じ直径3.0mmの空間及び0.5mmの孔を有する比較的大きいサイズの3Dバイオリアクター固定床である。バイオリアクターをスケールアップする場合、バイオリアクターの内部構造は、維持される。したがって、灌流体積流量は、局所的な線流量を同じに維持しながら比例してスケールアップすることができる。このように、スケールアップ過程において最低限のプロセス変更しか必要とされず、これによりプロセス開発費を低減することができる。
【００４７】
次に、流体分配器22(図8)は、好ましくは、3Dバイオリアクターを通る流動均一性を向上させることになるようにされることに留意すべきである。入口、出口、及び流体分配器の設計は、好ましくは、以下のものも考慮に入れる:(1)3Dバイオリアクターを通る流動均一性を向上させる、(2)バイオリアクターの全体的なプライミングボリュームを減少させるために入口及び出口のデッドボリューム24の最小化、及び(3)バイオリアクター内の気泡堆積（bubble collection）を防ぐこと。図9は、流体分配器を使用することによるCFDシミュレーションに基づく3Dバイオリアクター全体にわたる流動速度プロファイルを示す。流体分配器の使用(図8)は、流動の均一性を向上させた。最大流量(およそ30μm/s)及び最低流量(およそ10μm/s)は、互いに比較的近く、一定の層流(すなわち、比較的平行する層の流体の流動)を促進するのに役立つ。バイオリアクターのいずれの場所においても流量が比較的一定であることは、バイオリアクターのさまざまな場所に存在する細胞に対するせん断応力の差もより小さくすることになる。
【００４８】
3Dバイオリアクターは、選択的レーザー焼結(SLS)、光造形法(SLA)、デジタル光処理(DLP)等のその他の付加的な製造技術によって作製することができる。図7e、図7f。
【００４９】
付加的な製造又は3D印刷により本明細書における3Dバイオリアクターを作製することに加えて、3Dバイオリアクターが、相互接続した細胞培養表面を得るために従来のポロゲン抽出法によって作製されてもよいことが想定される。図10a及び図10bは、ポロゲン抽出法を利用した3Dバイオリアクターを示す。これは、型中でポロゲン及びポリマーを組み合わせた後、続いてポロゲンを浸出して孔を形成することを指す。図10aの3Dバイオリアクターは、ビーズ同士が接触するようビーズを振盪し、軽くたたき、加圧することによって円筒型のステンレス型に(ポロゲンとして)4.0mmの水溶性の球状糖ビーズをきつく充填する工程から開始する。ビーズ間の隙間は、5.0質量%の脱イオン水を含むアセトンで満たす。これに、真空チャンバーにおけるアセトン及び水の一晩の蒸発が続く。その後、ビーズ間の隙間を、ベンゾイル又はtert-ブチルペルオキシベンゾアート等の重合開始剤とともにスチレン等の低粘度の重合性ビニルモノマーで満たす。スチレンモノマーは、その後、重合して、ポリスチレンを形成することになる。サンプルは、90℃で8〜12時間そのままにした後、115℃で更に3時間加熱され、オーブンから取り出されて図10aに示されるものを得る。その後、糖ビーズを超音波水浴に沈めながら浸出して、相互接続した空間を有するポリスチレン3Dバイオリアクター固定床を残す。図10bを参照。その後、3Dバイオリアクターを、メタノールで3日間抽出して、あらゆる残存スチレンモノマーを除去する。しかしながら、ポロゲン抽出法は、複雑な製造プロセスを有するだけでなく、ポロゲンビーズの充填がランダムなプロセスであるため、厳密な再現性のある構造を実現するのも難しい。
【００５０】
ABS又はPMMAを使用した3D印刷したバイオリアクター(図7d)に関して、バイオリアクターの疎水性内面は、好ましくは、細胞付着を可能にさせるよう改変される。他のタンパク質がポリドーパミンコーティングによりバイオリアクター表面に容易に付着することができるよう、ポリドーパミンを、バイオリアクター表面へのプライマーコーティングとして使用した。10mMのトリスバッファー(25℃においてpH=8.5)中に溶解した0.25mg/mLのドーパミン中におけるバイオリアクター表面の約18時間のインキュベーションは、それに続くタンパク質コーティングのための効果的なポリドーパミン層をもたらした。バイオリアクター表面にポリドーパミンが堆積させられた後、他のタンパク質は、マイケル付加及び/又はシッフ塩基反応により機能的なリガンドと結合することができる。したがって、リガンド分子としては、アミン及びチオール官能基等の求核性官能基が挙げられる。
【００５１】
ここで、本明細書中で開示されている3Dバイオリアクターの付加的な特徴の1つは、特定の幾何学的及び空間体積要件、並びに対応する利用可能な表面積要件を有し、比較的最小限の変動でそのような目標を(すなわち、作製又は製造中に)実現することができる3Dバイオリアクターを設計することができることが上記のすべてから認識されるべきである。例えば、1つ以上の内部空間が目標の空間体積「Vt」を有し、3Dバイオリアクター自体が細胞培養のための目標の総表面積「SAt」を有する、3Dバイオリアクターの設計要件を特定することができる。したがって、ここで、1つ以上の内部空間がVtの+/-10.0%、又はより好ましくは、Vtの+/-5.0%以内である実際の空間体積「Va」を有するような3Dバイオリアクターを形成することができる。同様に、細胞培養のための実際の表面積SAaは、SAtの+/-10.0%、又はより好ましくは、SAtの+/-5.0%以内である。更に、目標の空間内の内面に関して、目標の曲率半径「Rct」等の製造のための目標の形状も特定することができ、その後、製造において、Rctの+/-5%以内の空間内面の実際の曲率半径「Rca」を実現することができる。
【００５２】
本発明は、免疫療法のために利用されるT細胞増殖を提供するための、本明細書の上で言及した3Dバイオリアクターの使用を更に提示する。T細胞の結合及び活性化のためのバイオリアクターの球状空間体積表面への抗体の固定を示す図11を参照する。更に具体的には、3Dバイオリアクターに関して、ビオチン・アビジン/ストレプトアビジン結合メカニズムによりバイオリアクター表面に抗CD3及び抗CD28抗体等の抗体(ビオチンコンジュゲート球状タンパク質)を固定することができる。アビジン又はストレプトアビジンは、上記のとおり最初のポリドーパミンコーティングによりバイオリアクター表面にプレコートされる。更に具体的には、本明細書における3Dバイオリアクターの表面にポリドーパミンコーティングが塗布された後、ビオチンに対して親和性を有するアビジン又はストレプトアビジン等の四量体タンパク質(4つのサブユニットの4次構造を有するタンパク質)を結合させることができる。したがって、4次構造を有するタンパク質(アビジン又はストレプトアビジン)に頼り、ビオチン化抗体、例えば、抗CD3抗体をバイオリアクター表面に固定することができる。ビオチン化抗体は、ビオチンの抗体との共有結合を指す。T細胞がバイオリアクターを流れるとき、T細胞は、T細胞表面レセプター、例えば、CD3により、CD3・抗CD3抗体結合により結合し、活性化することになる。これに続いて、活性化T細胞を、シグナル伝達分子を含む灌流培地に曝露して、T細胞増殖をもたらす。シグナル伝達分子としては、好ましくは、インターロイキン-2(IL-2)等のサイトカインシグナル伝達分子を挙げることができる。ただし、本発明の広い文脈において、ポリドーパミンコーティングの使用の必要性を排除し、抗体(例えば、抗CD3抗体)を直接3Dリアクターの表面に、ビオチン化抗体を結合させるためにアビジン/ストレプトアビジンを直接にバイオリアクター表面に固定することができることが想定されることに留意すべきである。
【００５３】
本明細書における3Dバイオリアクターを使用した、図12に示されるT細胞増殖のためのクローズドループ灌流ベースのシステムがここで可能である。更に具体的には、図12は、T細胞活性化及び増殖のためのビーズを用いないクローズドループ灌流ベースの3Dバイオリアクターを示す。灌流システムは、好ましくは、細胞に安全な蠕動ポンプ及び培地/細胞リザーバーを含み、これは、増殖プロセス中に培地を添加して、より効果的な細胞増殖のために細胞密度を薄めるか、又は培地を交換して、栄養素濃度を維持することができる。培地リザーバーはまた、気体注入並びに栄養分及び酸素を混合するための撹拌又は振盪メカニズムを備えた酸素供給器として働くこともできる。3Dバイオリアクターを通して灌流される培地に懸濁したT細胞は、球面上のCD3及びCD28抗体と接触する機会が多くあり、それにより活性化される。大きな表面に固定されたCD3及びCD28は、現行のT細胞増殖システムに使用される磁気ビーズと同等の刺激をT細胞に与えることが予想される。ビーズを用いないこのプロセスは、著しく簡素化されることになる。更に、このクローズドループシステムは、自動化及び費用効果的なcGMP細胞製造を容易にする。
【００５４】
Table 1(表2)は、3つの異なるサイズのバイオリアクターの寸法、培養表面積、同等の総表面積を有する磁気ビーズの数、予想される培地体積等を列記する。FDAに認可された移植可能な生体適合性材料であるPMMAを使用し、DLP 3Dプリンターを使用してバイオリアクターを作製した。Table 1(表2)はまた、特定された3Dバイオリアクターを構築するための概算の材料費も列記する。
【００５５】
【表２】
2021520782.tif 000005
【００５６】
バイオリアクター表面へのアビジン(又はストレプトアビジン)のコーティング
Miltenyi MACSiBeadシステムを模倣するために、アビジン(ストレプトアビジン)及びビオチン結合メカニズムを利用して、抗CD2、CD3及びCD28抗体をバイオリアクター表面に固定した。まず、さまざまな濃度の蛍光標識アビジン及びストレプトアビジンを試験し(図13)、100μg/mLのアビジン又は30μg/mLのストレプトアビジンがバイオリアクター表面への比較的高いアビジン又はストレプトアビジンコーティング密度を実現することがわかった。図13は、さまざまな濃度のアビジン及びストレプトアビジンコーティングの蛍光強度を示す。蛍光標識アビジン/ストレプトアビジンを使用して、ポリドーパミンプライマーコーティングに結合可能なアビジン又はストレプトアビジンの濃度を試験した。アビジン/ストレプトアビジンコーティングの好適な手順を、以下のとおり記載する。アビジン又はストレプトアビジンのコーティング濃度は、更に最適化することができる。
1)バイオリアクター表面を、まず本明細書のポリドーパミンによってコーティングする。
2)トリスバッファー(pH8.5)にアビジン又はストレプトアビジンを溶解させ、それぞれ100μg/mL又は30μg/mLのアビジン又はストレプトアビジン濃度でコーティング溶液を調製する。穏やかに振盪、及び光への曝露から保護した状態で、バイオリアクターをコーティング溶液に12時間浸す。
3)足場をリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)で完全に洗浄する。その後、ビオチン化抗体によるコーティングの準備ができた足場をPBS中に置いておく。
【００５７】
その後、アビジン又はストレプトアビジン基層と結合する第2層コーティングとしてさまざまな濃度の蛍光標識ビオチンに関して比較を行い(図14)、1.0μg/mLのビオチンが固定されたアビジン又はストレプトアビジンと首尾よく結合すると特定した。アビジン又はストレプトアビジン上のビオチンコーティングの蛍光強度(ビオチン濃度に比例する)を特定している図14を参照。ビオチンがアビジン又はストレプトアビジンでコーティングされたバイオリアクター表面に首尾よく結合することができることを確認した後、ビオチン化抗CD2、CD3、及びCD28抗体をT細胞活性化及び増殖のためのバイオリアクターに利用した。
【００５８】
好ましくは、直径2.1cmの足場に抗体コーティングを塗布するために(すなわち、約7.5×107ビーズの合計表面に相当する):
1)バイオリアクター足場をBPSから取り出す
2)可能なかぎり足場からPBSを除去するが、足場を乾燥したままにはしない。
3)200μLの100μg/mL CD2-ビオチン、200μLの100μg/mL CD3-ビオチン、及び200μLの100μg/mL CD28-ビオチンを15mLチューブ中で組み合わせ、1.4mLの抗体標識バッファー(0.5%熱失活ウシ胎仔血清及び2mM EDTAを加えたCa2+及びMg2+を含まないPBS、pH=7.2)を添加し、十分に混合して、各抗体のそれぞれの濃度が10μg/mLである合計2mLのビオチン化抗体を生成する。
4)2mLの混合抗体を添加して、12ウェルプレート中のバイオリアクターマトリックス(入口及び出口を伴わない、図7e)を覆い、上下にピペッティングして、混合する。
5)冷蔵庫中の暗所でマトリックス中において、穏やかな振盪下で2時間インキュベートする。
6)PBSで、足場から結合していない抗体を完全に洗い流す。
【００５９】
ポリドーパミン、アビジン/ストレプトアビジン、及びビオチン化抗体のコーティング手順は、完全なバイオリアクター(すなわち、バイオリアクターマトリックス、プラス入口及び出口)の内面をコーティングすることにまで拡大することができる。
【００６０】
T細胞増殖のための抗体コーティングバイオリアクターマトリックス及び磁気ビーズとともにインキュベートしたT細胞の比較
抗体コーティングマトリックス(入口及び出口を伴わない)をMiltenyi MACSiBead(商標)システムと比較した。コーティング手順と同様である製造業者の手順に従って、磁気ビーズ(既にストレプトアビジン結合済み)をビオチン化抗CD2、CD3、及びCD28抗体でコーティングした。Table 1(表1)に列挙されている比較的小さい直径2.1cm×高さ0.7cmのバイオリアクター(図7e)を使用した。バイオリアクターマトリックスは、12ウェルプレートのウェルに合うため、ビーズ及びマトリックスの性能を容易に比較することができる。3つのバイオリアクターマトリックスを、上記の好適な手順を使用して、まずアビジン又はストレプトアビジンでコーティングした後、ビオチン化CD2、CD3、CD28抗体でコーティングした。同じ濃度の抗体でバイオリアクターマトリックス及びMACSiBeadをコーティングした。ストレプトアビジンコーティングを有する1つのバイオリアクターマトリックスは、陰性対照として使用した抗体で更にコーティングしなかった。
【００６１】
ヒト末梢血CD3+ Pan T細胞(ReachBio Research Labs社)を、まず製造業者の手順に従ってMACSiBeadを使用して活性化及び増殖させ(7日)、その後、磁性粒子からビーズを分離した。その後、4.5×106のT細胞を、それぞれ12ウェルプレートの4つのウェルに添加した。それぞれが3mLの培養培地(10%ウシ胎仔血清及び20IU/mLのヒトIL2を加えたRPMI1640)で満たされた4ウェルは、それぞれ、1)7.5×106の抗体コーティング磁気ビーズ、2)抗体コーティングストレプトアビジンマトリックス、3)抗体コーティングアビジン・マトリックス、及び4)抗体コーティングなしのストレプトアビジン・マトリックスを含む。追加の培地を3日目にウェルに添加した。5日目に、その細胞を、追加のビーズ及びマトリックスを含む2つのウェルに分けた。3、5及び7日目に磁気ビーズ又はマトリックスから分離された後の各ウェル中のT細胞の数をカウントした。
【００６２】
図15は、抗体コーティング磁気ビーズ及びマトリックス対抗体コーティングなしのマトリックスとともにインキュベートしたT細胞増殖(活性化後)を示す。抗体コーティングマトリックスにおけるT細胞増殖の傾向は、抗体コーティングビーズのものと同様である。しかしながら、抗体なしのマトリックスとともにインキュベートしたT細胞は、おそらく、継続する刺激がないため増殖しなかった。この実験では、マトリックスを静止状態のウェルに入れた。したがって、この結果は、灌流ベースのバイオリアクターとは異なることが予想される。この実験は、抗体が首尾よくバイオリアクターのマトリックス表面にコーティングされ、T細胞増殖に影響を及ぼしたことを明らかに示している。
【００６３】
抗体コーティングバイオリアクターマトリックス及び磁気ビーズとともにインキュベートした末梢血単核細胞(PBMC)のT細胞活性化及び増殖の両方に関する比較
上記と同様の調査を、単離T細胞に代わりにPBMCを用いて実施した。典型的には、T細胞及びその他の単核細胞、例えば、B細胞、NK細胞、単球等を含むPBMCを、患者から採取し、T細胞の単離をせずに細胞増殖に直接に使用した。これは、非T細胞がCD2、CD3、及びCD28によって活性化されず、活性化なしでは、数日後に自然に排除されるためである。この実験の図15の実験との別の違いは、抗体コーティングマトリックスを使用した場合の活性化工程の組み込みである。簡単に言えば、2.5×106細胞/mLの密度でPBMCを含む2mLの培養培地を、12ウェルプレートの3つのウェルに添加した。この3つのウェルは、それぞれ、1)7.5×106の抗体コーティング磁気ビーズ、2)抗体コーティングストレプトアビジン・マトリックス、及び3)抗体コーティングなしのストレプトアビジン・マトリックスを含む。最後の2つの実験でストレプトアビジンは、アビジンよりも優れていることを示したため、この実験にはアビジンコーティングマトリックスは使用しなかった。活性化のために2日間各ウェル中でPBMCをインキュベートした。その後、増殖段階を開始させるために培地が20IU/mLのヒトIL2を有するよう、IL2サイトカインを含む追加の培地をウェルに添加した。5日間の培養の間の総細胞数の変化を図16に示す。これは、抗体コーティングマトリックスを用いて増殖させたT細胞が、抗体コーティング磁気ビーズを用いたものよりも多くのT細胞をもたらすことを裏付けている。これは、抗体コーティングマトリックスが同等又は更に良好なT細胞活性化及び増殖をもたらすことができることも裏付けている。
【００６４】
動的灌流ベースのT細胞増殖
灌流ベースの3Dバイオリアクターを、本明細書に記載されるとおりに作製した。ポリドーパミンによる12時間のコーティングによって3Dバイオリアクターの内面を準備した。その後、バイオリアクター内面を、ストレプトアビジンで12時間コーティングした。次に、バイオリアクターを滅菌のために70%エタノールとともにインキュベートした。滅菌後、内面をPBSで洗浄し、CD2、CD3、及びCD28-ビオチンコンジュゲートの等量の混合物(各抗体に関して10μg/mLの濃度)でコーティングして、上記の手順を使用して抗体をバイオリアクターの内面に固定した。
【００６５】
図12に示したとおりに灌流回路を組み立てた。生細胞及びせん断感応性流体を送り込むために設計されたCytoflowポンプヘッド(Cole-Parmer社)を備えたMasterflex L/Sを灌流システムに使用した。本出願は、比較的小さいバイオリアクターを使用し、灌流速度が比較的遅いことが予想されるため、酸素供給器の代わりに、培地への気体拡散による特製の酸素注入ユニット及び培地液滴を利用した。
【００６６】
約20×106のPBMCを、予め準備したバイオリアクター灌流システムに播種した。2mL/分で15分間循環させることによって細胞を均等に分布させた。活性化段階、すなわち、サイトカインIL2を含まない灌流培地である間、1日目に0.1mL/分及び2日目に0.14mL/分の速度でT細胞を灌流させた。活性化の2日後、細胞密度を確認し、合計IL-2濃度が20IU/mLであるよう、ヒトIL-2を含む培地をシステムに添加した。T細胞増殖段階を0.2mL/分の灌流速度で3日間行った。細胞密度を5日目に決定し、その結果を図17に示す。図15及び図16に示される静止実験と同様に、T細胞は活性化後3倍の増殖を達成した。
【符号の説明】
【００６７】
10  固定床
12 3D  表面領域
14  非ランダム空間
16  孔開口部
18  ハウジング
20  入口及び出口コンパートメント
22  流体分配器
24  デッドボリューム
【図１】
2021520782.tif 000006
【図１ａ】
2021520782.tif 000007
【図１ｂ】
2021520782.tif 000008
【図１ｃ】
2021520782.tif 000009
【図１ｄ】
2021520782.tif 000010
【図１ｅ】
2021520782.tif 000011
【図２】
2021520782.tif 000012
【図３】
2021520782.tif 000013
【図４ａ】
2021520782.tif 000014
【図４ｂ】
2021520782.tif 000015
【図４ｃ】
2021520782.tif 000016
【図４ｄ】
2021520782.tif 000017
【図４ｅ】
2021520782.tif 000018
【図５ａ】
2021520782.tif 000019
【図５ｂ】
2021520782.tif 000020
【図５ｃ】
2021520782.tif 000021
【図６ａ】
2021520782.tif 000022
【図６ｂ】
2021520782.tif 000023
【図７ａ】
2021520782.tif 000024
【図７ｂ】
2021520782.tif 000025
【図７ｃ】
2021520782.tif 000026
【図７ｄ】
2021520782.tif 000027
【図７ｅ】
2021520782.tif 000028
【図７ｆ】
2021520782.tif 000029
【図８】
2021520782.tif 000030
【図９】
2021520782.tif 000031
【図１０ａ】
2021520782.tif 000032
【図１０ｂ】
2021520782.tif 000033
【図１１】
2021520782.tif 000034
【図１２】
2021520782.tif 000035
【図１３】
2021520782.tif 000036
【図１４】
2021520782.tif 000037
【図１５】
2021520782.tif 000038
【図１６】
2021520782.tif 000039
【図１７】
2021520782.tif 000040
【国際調査報告】
2021520782.tif 000041