(57)【要約】【課題】口腔粘膜炎をポリクローナル抗ＴＮＦアルファ抗体で処置する治療法に関する。【解決手段】本発明は、口腔粘膜炎を処置することにおける使用のための抗体組成物に関し、抗体組成物は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体又はインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体を含む。本発明はまた、これを用いる／含む関連する使用、方法、及び液体組成物に関する。【選択図】図２
2021531301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔粘膜炎を処置することにおける使用のための抗体組成物であって、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体又はインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体を含む抗体組成物。
【請求項２】
口腔粘膜炎を処置するための医薬の製造における抗体の使用であって、前記抗体は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体又はインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体である、使用。
【請求項３】
口腔粘膜炎を処置する方法であって、前記方法は、対象に抗体組成物を投与することを含み、前記抗体組成物は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体又はインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体を含む、方法。
【請求項４】
前記組成物中に存在する総抗体の少なくとも５％がＴＮＦαに結合する、請求項１に記載の使用のための抗体組成物、請求項２に記載の使用、又は請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物中に存在する総抗体の少なくとも１０％がＴＮＦαに結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項６】
前記抗体組成物又は医薬は、液体として、好ましくはマウスウォッシュとして製剤化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項７】
前記抗体は、１〜１００ｇ／Ｌの濃度にて存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項８】
前記抗体は、１〜２５ｇ／Ｌ（好ましくは約５〜１０ｇ／Ｌ）の濃度にて存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項９】
単回用量が、１ｇ以下の前記抗体を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項１０】
単回用量が、０．２５ｇ以下の前記抗体を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項１１】
単回用量が、０．０１〜０．２５ｇの前記抗体を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項１２】
前記抗体組成物は、少なくとも１日２回、対象に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項１３】
前記抗体組成物は、１日４回、対象に投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項１４】
口腔粘膜炎について処置される対象が、化学療法、放射線療法、又はそれらの組合せを受けている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項１５】
本発明の前記組成物は、適切な時間、対象の口腔内に維持されてから排出される（例えば嚥下されない）、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項１６】
本発明の前記組成物は、前記組成物が投与された対象によって消費（例えば嚥下）されない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、又は方法。
【請求項１７】
ａ．ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体又はインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体と；
ｂ．バッファ、タンパク質安定化剤、非イオン性界面活性剤、消毒剤、懸濁化剤、分散剤、結合剤、エマルジョン安定化剤、甘味料、及び香味剤と
を含む、口腔粘膜炎を処置するための液体組成物。
【請求項１８】
前記液体組成物はマウスウォッシュである、請求項１７に記載の液体組成物。
【請求項１９】
前記抗体は、１〜１００ｇ／Ｌの濃度にて存在する、請求項１７又は１８に記載の液体組成物。
【請求項２０】
前記抗体は、１〜２５ｇ／Ｌ（好ましくは約５〜１０ｇ／Ｌ）の濃度にて存在する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項２１】
前記液体組成物は：
ａ．ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体又はインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体と；
ｂ．バッファ、アルギニン、ポリソルベート（例えばポリソルベート20）、ポリビニルピロリドン、ジグルコン酸クロルヘキシジン、サッカリン（例えばサッカリンナトリウム）、及びペパーミント油と
を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項２２】
前記組成物中に存在する総抗体の少なくとも５％がＴＮＦαに結合する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項２３】
前記組成物中に存在する総抗体の少なくとも１０％がＴＮＦαに結合する、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項２４】
前記インタクトな血液由来ポリクローナル抗体は、インタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【請求項２５】
前記インタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体は、インタクトな血漿由来ウマポリクローナル抗体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【請求項２６】
前記抗体又は組成物は、アフィニティ精製されていない、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【請求項２７】
前記抗体又は組成物は、沈殿（及び場合によっては濾過）工程にのみ供されている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【請求項２８】
前記組成物は、沈殿（及び場合によっては濾過）工程にのみ供された血清組成物である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【請求項２９】
前記組成物は、ヒトＴＮＦαに結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体を含むヒツジ血清組成物であって、沈殿（及び場合によっては濾過）工程にのみ供されたヒツジ血清組成物である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【請求項３０】
前記組成物は、沈殿（及び場合によっては濾過）工程にのみ供された血漿組成物である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【請求項３１】
前記組成物は、ヒトＴＮＦαに結合するインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体を含むウマ血漿組成物であって、沈殿（及び場合によっては濾過）工程にのみ供されたウマ血漿組成物である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【請求項３２】
前記沈殿は、カプリル酸沈殿である、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【請求項３３】
前記濾過は、０．２μｍフィルタ、及び場合によっては０．４５μｍフィルタの使用を含む（好ましくは、ガラスマイクロファイバー（０．４５μｍ）及び０．２μｍフィルタの使用からなる）、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物、使用、方法、又は液体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔粘膜炎の処置に用いるのに適した抗体治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、全身性炎症を媒介する主要なサイトカインであり、口腔粘膜炎を含むいくつかの疾患及び障害に関係している。
【０００３】
現在の抗体治療薬は、ＴＮＦαに対するモノクローナル抗体の全身投与に頼っている。そのようなモノクローナル抗体は、典型的には、患者における液性免疫応答の誘導を回避する目的で、キメラであるかヒト化されている。動物起源のポリクローナル抗体の使用は、そのような応答を引き起こすリスクのため、回避されてきた。現在広範囲にわたって用いられている３つのモノクローナル抗体は、キメラマウスのインフリキシマブ、並びに完全にヒト化されたアダリムマブ及びエタネルセプトである。インフリキシマブは静脈内に注入される一方、アダリムマブ及びエタネルセプトは皮下に注入される。
【０００４】
抗体の全身使用は、点滴反応を伴ってきた。そしてそのような処置は、外来患者にとって不都合である。なぜなら、静脈内注入は通常、短い入院を必要とするからである。加えて、全身投与されたＭｃＡｂ（分子量約１５０，０００Ｄａ）が血液から組織液に進んで、次に口腔粘膜に達することとなる効率もまた、疑問の余地がある。さらに、ＴＮＦαは、全身的に患者を感染から保護する重大な炎症誘発性の役割を果たすサイトカインであるから、抗ＴＮＦα抗体の長期的な全身投与は、結核の再活性化、日和見感染、脱髄性疾患、及びリンパ腫の長期間にわたるリスクを含む重大な副作用の出現率の増大を伴う。
【０００５】
口腔粘膜炎は、口腔（及び上部消化管）内に病変を引き起こし、話す、食べる、又は嚥下することができなくなる、非常に痛みを伴う衰弱性の症状である。口腔粘膜炎の現在の処置は、症状の軽減が中心である。前記療法として：口腔を洗浄し、麻痺させ、且つ保護するマウスウォッシュ（例えば、ベンジダミン及びクロルヘキシジン）；鎮痛剤（例えば、パラセタモール、又は重度の口腔粘膜炎の場合にはOramorph（登録商標）若しくは静脈内モルヒネ）；及び口腔の潤いを維持することで、唾液代用物としての機能を果たすスプレー又はジェル（例えばGelclair（登録商標）オーラルジェル）が挙げられる。また、化学療法中のクライオセラピー（例えばアイスチップの吸引）も使用されており、口腔粘膜炎の発病率を下げると考えられている。
【０００６】
従来の口腔粘膜炎治療は、基礎をなす病理を標的としない。ゆえに、対症療法だけではなく、口腔粘膜炎の機構を標的とする治療薬が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記の問題の少なくとも１つを解決する。
【０００８】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の、ＴＮＦαに結合するインタクトな血液由来ヒツジ又はウマ抗体（好ましくは血液由来ヒツジ抗体）が、口腔粘膜炎のための改善された治療薬となることを見出した。
【０００９】
本発明の、ヒツジ血液又はウマ血液（好ましくはヒツジ血液）に由来するポリクローナルＴＮＦα抗体は、驚くべきことに、従来通り製造された抗体（例えば乳由来の抗体）と比較すると、有効性の向上及び特異的力価の向上を示す。この利点は、本発明の抗体が、治療目的に用いることができる前の更なるプロセシング（例えばアフィニティ精製）をほとんど必要としないことであり、それによって、前記抗体の生成に伴うコストを（例えば、モノクローナル抗体と比較して、又は代替源由来のポリクローナル抗体と比較しても）引き下げることである。ゆえに、好ましい実施形態において、本発明のポリクローナル抗体又は本発明のポリクローナル抗体を含む組成物は、広範囲にわたる精製に供されず、より好ましくは、本発明のポリクローナル抗体又は本発明のポリクローナル抗体を含む組成物は、アフィニティ精製（ＴＮＦα、例えばヒトＴＮＦαを用いる）に供されていない。
【００１０】
加えて、又は代わりに、対象に経口的に投与される場合の本発明のポリクローナル抗体によれば、全身投与される従来の抗体（例えばモノクローナル抗体）と比較すると、副作用（例えば液性免疫応答副作用）の誘発がないか、又は大いに引き下げられる。それ故に、本発明の組成物は、全身投与される抗体組成物とは異なり、長期間にわたる治療用途に適している。
【００１１】
更なる利点として、前記ポリクローナル抗体の製造は、従来のモノクローナル抗体よりもかなり廉価である。それ故に、本発明は、スケーラブルな、及び／又は費用効果が優れた治療薬を提供する。
【００１２】
一態様において、本発明は、口腔粘膜炎を処置することにおける使用のための抗体組成物を提供し、当該抗体組成物は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体を含む。
【００１３】
一態様において、本発明は、口腔粘膜炎を処置することにおける使用のための抗体組成物を提供し、当該抗体組成物は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体を含む。
【００１４】
別の態様において、口腔粘膜炎を処置するための医薬の製造における抗体の使用が提供され、当該抗体は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体である。
【００１５】
別の態様において、口腔粘膜炎を処置するための医薬の製造における抗体の使用が提供され、当該抗体は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体である。
【００１６】
関連する態様において、本発明は、口腔粘膜炎を処置する方法を提供し、当該方法は、対象に抗体組成物を投与することを含み、当該抗体組成物は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジポリクローナル抗体を含む。
【００１７】
関連する態様において、本発明は、口腔粘膜炎を処置する方法を提供し、当該方法は、対象に抗体組成物を投与することを含み、当該抗体組成物は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ウマポリクローナル抗体を含む。
【００１８】
図面
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して、ほんの一例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】抗血清中の抗ＴＮＦα  ＩｇＧ（●）、及びカプリル酸沈殿によって精製したＩｇＧ（▲）の検出についての直接ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【図２】L929細胞を用いて抗ＴＮＦαフラグメント（■）、インタクトな抗ＴＮＦα（▲）、及びＴＮＦα抗血清（●）の中和活性を試験した免疫細胞障害性アッセイ（ＩＣＴＡ）の結果を示す図である。出発濃度：抗ＴＮＦαフラグメント−５０ｍｇ／ｍｌ；インタクトな抗ＴＮＦα−２１０ｍｇ／ｍｌ；ＴＮＦα抗血清タンパク質濃度−８６ｍｇ／ｍｌ。
【図３】ヒツジ血液由来のインタクトなＰｃＡｂ（抗ヒトＴＮＦα  ＩｇＧ）及びモノクローナル抗体インフリキシマブによるマウスＴＮＦαへの結合を比較するＥＬＩＳＡの結果を示す図である。抗ヒトＴＮＦα  ＩｇＧ（●）、インフリキシマブ（■）、及び陰性対照（ＰＣＢ）（▲）。
【図４】ヒツジ血液由来のインタクトなＰｃＡｂ（抗ヒトＴＮＦα  ＩｇＧ）及びモノクローナル抗体インフリキシマブによるマウスＴＮＦαへの結合を比較する第２のＥＬＩＳＡの結果を示す図である。抗ヒトＴＮＦα  ＩｇＧ（●）、インフリキシマブ（■）、及び陰性対照（ＰＣＢ）（▲）。
【図５】ヒツジ血液由来のインタクトなＰｃＡｂ（抗ヒトＴＮＦα  ＩｇＧ）又はモノクローナル抗体インフリキシマブを投与した場合の、マウスＴＮＦαの５ｎｇ／ｍｌの抗原投与量（challenging dose）の存在下での細胞生存率を比較する免疫細胞障害性アッセイの結果を示す図である。結果を、ヒツジ血液由来インタクトなＰｃＡｂ（「ヒツジＩｇＧ」＝●＋◆）について２×プレートから、そしてインフリキシマブ（「インフリキシマブ」＝■＋中空の円）について２×プレートから得た。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
有利には、ＴＮＦαに対する血液由来ヒツジポリクローナル抗体は、同じヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主の血液から複数回、前記宿主を死滅させることなく得ることができる。これは、制限された回数（例えば１回）しか抗体を生成しない、ウシ初乳等の源を用いる従来の方法と対照的である。
【００２１】
血液由来の抗体は、ヒツジ又はウマから得られ得る場合がある。好ましくは、抗体は、ヒツジポリクローナル抗体（例えばヒツジから得られ得る）である。ゆえに、一実施形態において、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するヒツジインタクトなポリクローナル抗体を含む抗体組成物が提供される。
【００２２】
また、本明細書中で用いられる用語「得られ得る」は、用語「得られた」を包含する。一実施形態において、用語「得られ得る」は、「得られた」を意味する。
【００２３】
本発明の抗体は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合して、これを中和する。抗体は、ヒトＴＮＦαに、非ヒトＴＮＦα又は代わりの抗原に対してよりも高い結合親和性で結合する。一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＴＮＦαに、少なくとも１０−４Ｍ又は少なくとも１０−５Ｍの親和性（解離定数：Ｋｄによって測定される）で結合する。一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＴＮＦαに、少なくとも１０−６Ｍ又は１０−７Ｍの親和性（Ｋｄ）で結合し得る。適切には、本発明の抗体は、ヒトＴＮＦαに、少なくとも１０−８Ｍ又は１０−９Ｍの親和性（Ｋｄ）で結合し得る。
【００２４】
代わりに、又は加えて、抗体結合親和性は、会合定数（Ｋａ）によって測定されてもよい。一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＴＮＦαに、少なくとも１０６Ｍの親和性（会合定数：Ｋａによって測定される）で結合する。適切には、本発明の抗体は、ヒトＴＮＦαに、少なくとも１０７Ｍ（例えば少なくとも１０８Ｍ）の親和性（会合定数：Ｋａによって測定される）で結合する。
【００２５】
抗体結合は、実施例３に記載されるアッセイを用いて試験することができる。中和は、実施例４に記載されるアッセイを用いて試験することができる。より詳細には、抗体組成物をアッセイして、L929マウス線維肉腫細胞株に及ぼすＴＮＦαの細胞毒性作用の中和を試験することができる。L929細胞は、LGC Standards、UK、cat. no. ATCC（登録商標）CCL-1（商標）から商業的に入手可能である。
【００２６】
驚くべきことに、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）から得られ得る血液由来抗体は、代替源（例えば、トリ（例えば卵黄由来）又はウシ源、例えば乳）と比較すると、ヒトＴＮＦαに特異的な、かなり高い濃度の抗体を含有する。場合によっては、前記ヒツジ血液（例えば血清）又はその精製された画分中の特異的抗体の濃度は、１００倍を超える。
【００２７】
一実施形態において、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主から得られ得る血液サンプル中に含まれる総抗体の少なくとも５％（適切には少なくとも１０％）が、ヒトＴＮＦαに結合する。別の実施形態において、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主から得られ得る血液サンプル中に含まれる総抗体の少なくとも１５％が、ヒトＴＮＦαに結合する。別の実施形態において、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主から得られ得る血液サンプル中に含まれる総抗体の少なくとも２０％が、ヒトＴＮＦαに結合する。
【００２８】
また、先で言及した抗体は、好ましくは、前記ヒトＴＮＦαを中和する。
【００２９】
一実施形態において、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたヒツジ宿主から得られ得る血液サンプル中に含まれる総抗体の少なくとも５％（適切には少なくとも１０％）が、ヒトＴＮＦαに結合して、これを中和する。別の実施形態において、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたヒツジ宿主から得られ得る血液サンプル中に含まれる総抗体の少なくとも１５％が、ヒトＴＮＦαに結合して、これを中和する。別の実施形態において、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたヒツジ宿主から得られ得る血液サンプル中に含まれる総抗体の少なくとも２０％が、ヒトＴＮＦαに結合して、これを中和する。
【００３０】
一実施形態において、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたウマ宿主から得られ得る血液サンプル中に含まれる総抗体の少なくとも５％（適切には少なくとも１０％）が、ヒトＴＮＦαに結合して、これを中和する。別の実施形態において、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたウマ宿主から得られ得る血液サンプル中に含まれる総抗体の少なくとも１５％が、ヒトＴＮＦαに結合して、これを中和する。別の実施形態において、ヒトＴＮＦα（又はその精製された画分）で免疫化されたウマ宿主から得られ得る血液サンプル中に含まれる総抗体の少なくとも２０％が、ヒトＴＮＦαに結合して、これを中和する。
【００３１】
一実施形態において、抗体組成物は、インタクトなポリクローナル抗体を、１〜１００ｇ／Ｌ又は１〜５０ｇ／Ｌの濃度で含む。好ましくは、抗体組成物は、インタクトなポリクローナル抗体を、１〜２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２〜１５ｇ／Ｌの濃度で含む。言及される濃度は、全てのインタクトなポリクローナル抗体、適切には全てのインタクトなポリクローナルＩｇＧ（すなわち、ＴＮＦαに結合する抗体及び結合しない抗体を含む）の濃度であってもよい。一実施形態において、前述の実施形態は、ＴＮＦαに結合する（且つ、好ましくはこれを中和する）インタクトなポリクローナル抗体に言及する。
【００３２】
「抗体」は、少なくとも１つ又は２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書中でＶＨＣと省略した）及び少なくとも１つ又は２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書中でＶＬＣと省略した）を含むタンパク質である。ＶＨＣ領域及びＶＬＣ領域はさらに、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域に再分割することができる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991及びChothia, C. et al, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987（参照によって本明細書中に組み込まれる）参照）。好ましくは、ＶＨＣ及びＶＬＣは各々、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００３３】
抗体のＶＨＣ鎖又はＶＬＣ鎖はさらに、重鎖定常領域又は軽鎖定常領域の全部又は一部を含み得る。一実施形態において、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖のテトラマーであり、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖は、例えばジスルフィド結合によって、相互に連結している。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクタ細胞）及び古典的補体系の第１の構成要素（ＣＩｑ）を含む、宿主の組織又は因子への抗体の結合を媒介する。用語「抗体」は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（並びにそれらの亜型）のインタクトな免疫グロブリンを含み、当該免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ型のものであってもラムダ型のものであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、インタクトなＩｇＧである。
【００３４】
用語「インタクトな抗体」は、本明細書中で、本発明の抗体を、抗体フラグメント（例えば、抗体Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、又はＦｃ）から識別するのに用いられる。したがって、「インタクトな抗体」は、ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）から得られ得る全長抗体中に存在する各抗体領域／ドメインを含む（又はからなる）。「インタクトな抗体」のモノマーは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む（又はからなる）。各重鎖は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む（又はからなる）。各軽鎖は、ＣＬドメイン及びＶＬドメインを含む（又はからなる）。
【００３５】
ゆえに、本発明の抗体組成物は、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、又はＦｃフラグメント）を含まない、又は実質的に含まない。この文脈において用いられる用語「実質的に〜ない」は、本発明の組成物中に含まれる抗体の総濃度の５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、又は０．０１％未満が、抗体フラグメントであることを意味する。反対に、一実施形態において、組成物中に含まれる抗体の総濃度の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は１００％（適切には１００％）が、インタクトな抗体である。一実施形態において、ポリクローナル抗体は、混入する抗体フラグメントから精製及び／又は単離されてもよい。
【００３６】
有利には、本発明（血液由来のヒツジ抗体又はウマ抗体）のインタクトな抗体は、ＴＮＦα結合能力（実施例３及び実施例７）及び／又はＴＮＦα中和能力（実施例４及び実施例８）の向上によって実証されるように、抗体フラグメントと比較して、ＴＮＦα結合及び／又はＴＮＦα中和の向上を実証する。さらに、本発明のインタクトな抗体は、更なるプロセシング工程及び／又は精製工程を必要とする抗体フラグメントよりも、生成がかなり廉価である。加えて、ヒツジ抗体又はウマ抗体は、非ヒツジ源又は非ウマ源由来の抗体、例えばインタクトなウシポリクローナル抗体よりも向上したＴＮＦα結合及び／又はＴＮＦα中和を実証すると考えられる。
【００３７】
本明細書中で用いられる用語「血液由来」は、抗体が、前記抗体を生成するのに用いられるヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主の血液から得られることを意味する。血液由来抗体は、ヒトＴＮＦα又はそのフラグメントを、前記ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主に皮下投与、筋肉内投与、腹膜内投与、及び／又は静脈内投与することによって得ることができる。ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主から得られる血液サンプルは、例えば血清又は血漿を得るために、さらに加工処理されてもよい。したがって、抗体は、血清又は血漿から得られ得る場合がある。好ましくは、宿主がヒツジ宿主である場合、抗体は、血清から得られ得る。好ましくは、宿主がウマ宿主である場合、抗体は、血漿から得られ得る。
【００３８】
一実施形態において、血液サンプル（例えば血清）は、ヒトＴＮＦαに結合する（且つ、好ましくはこれを中和する）抗体を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８ｇ／Ｌ、好ましくは、ヒトＴＮＦαに結合する（且つ、好ましくはこれを中和する）抗体を少なくとも３又は少なくとも５ｇ／Ｌ含む。
【００３９】
一実施形態において、血液サンプル（例えば血清）は、ヒトＴＮＦαに結合する（且つ、好ましくはこれを中和する）抗体を約１〜約１２ｇ／Ｌ、例えば、ヒトＴＮＦαに結合する（且つ、好ましくはこれを中和する）抗体を約３〜約９ｇ／Ｌ含む。
【００４０】
一実施形態において、血液サンプルは、ヒトＴＮＦαに、少なくとも１×１０９Ｌ／ｍｏｌ、好ましくは少なくとも１×１０１０Ｌ／ｍｏｌの結合力で結合する抗体を含む。
【００４１】
ヒツジ抗体は、ヒツジにおいて産生された（raised）抗体である。ヒトＴＮＦαに結合する血液由来抗体用の生成宿主としてヒツジを用いることにはいくつかの利点がある。発明者らは、ヒツジが定期的（例えば２８日毎）に免疫化され続けるならば、ヒツジ血液（例えば血清）中に存在するヒトＴＮＦαに結合する抗体の濃度が、経時的に実質的に一定のままであることを見出した。免疫化を止めると、典型的には、特異的抗体の最大濃度を得てから濃度が半減するまでおよそ６ヵ月かかる。加えて、特異的抗体の実質的に一定の濃度により、高収率の血液由来抗体を一年毎に得ることができる。これに対して、発明者らは、一年毎の抗体収率が、乳（例えば牛乳）、卵、又は初乳を用いると、はるかに低いことを見出した。さらに、高濃度の特異的抗体を、免疫化スケジュールにおいて（一旦最大抗体濃度に到達すれば）実質的にあらゆる時点にて得ることができる。これは、血液中で特異的抗体の濃度が変動することで、抗体濃度を測定すること、及び血液サンプルを特異的抗体濃度が高いときのみ採取することを確実にすることを余儀なくされる他の非ヒト哺乳動物とは対照的である。したがって、生成宿主としてヒツジを用いることで、この追加の工程が取り除かれ、及び／又は製造方法における予測不能性が取り除かれる。
【００４２】
また、本発明者らは、ヒツジ間の特異的血液由来抗体濃度が一貫していることを示した。
【００４３】
さらに、他の非ヒト哺乳動物と比較すると、ヒツジは、先進国世界において豊富であり、且つ扱うのが容易である。
【００４４】
ゆえに、一実施形態において、ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）は、前記ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）に、ヒトＴＮＦα又はそのフラグメントを含む免疫原が投与された後に、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の血中濃度が実質的に一定である。
【００４５】
この文脈において用いられる用語「実質的に一定である」は、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の血中濃度が、前記抗体の最大血中濃度に到達した後６ヵ月以内及び／又は６ヵ月までに（好ましくは６ヵ月以内且つ６ヵ月までに）、前記抗体の最大血中濃度（１００％）の７５％以下（好ましくは、７０％、６５％、又は６０％以下、より好ましくは５５％以下（例えば５０％以下））低下することを意味する。
【００４６】
代わりに、又は加えて、この文脈において用いられる用語「実質的に一定である」は、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の最大血中濃度に到達した（１００％）後６ヵ月以内及び／又は６ヵ月までに（好ましくは６ヵ月以内且つ６ヵ月までに）、前記ポリクローナル抗体の血中濃度が、最大の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、３０％、３５％、又は４０％、より好ましくは少なくとも４５％（例えば約５０％）であることを意味し得る。
【００４７】
一実施形態において、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の最大血中濃度は、免疫化から少なくとも１０週、例えば免疫化から少なくとも１１週にて起こる。好ましくは、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の最大血中濃度は、免疫化から約１２週にて起こる。
【００４８】
ゆえに、本発明は、本発明の組成物に用いられるヒツジ抗体を生成する方法を含み、前記方法は典型的には：
ｉ．ヒトＴＮＦα又はそのフラグメントを含む免疫原をヒツジに投与することと；
ｉｉ．ヒツジにおける抗体の生成に十分な時間を許容することと；
ｉｉｉ．ヒツジから抗体を得ることと
を含む。
【００４９】
本明細書中で用いられる用語「ヒツジ（sheep）」は、用語「ヒツジ（ovine）」と同義である。本明細書中で用いられるヒツジは、ヒツジ（Ovis）属に属するあらゆる種（例えば、アルガリ（Ovis ammon）、オビス・オリエンタリス・アリエス（Ovis orientalis aries）、オビス・オリエンタリス・オリエンタリス（Ovis orientalis arise）、オビス・オリエンタリス・ビグネイ（Ovis orientalis vignei）、オビス・カナデンシス（Ovis Canadensis）、オビス・ダリ（Ovis dalli）、オビス・ニビコラ（Ovis nivicola））を含む。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「ヒツジ抗体」は、ヒツジにおいて産生された抗体に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。好ましくは、本明細書中で用いられる「ヒツジ抗体」は、ヒツジにおいて産生された抗体に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。
【００５１】
一実施形態において、本発明の組成物は、ヒツジ抗体のみを含むので、非ヒツジ源由来の抗体を除外する。
【００５２】
抗体は、典型的には、ヒツジ血清から得られ得る。ゆえに、本明細書中に記載されるヒツジ抗体を生成する方法は、ヒトＴＮＦαに結合することができ、及び／又はこれを中和することができる抗体を含むヒツジ抗血清を生成する。一実施形態において、抗体は、単離及び／又は精製されており、例えば、ヒツジ抗血清から単離及び／又は精製されている。
【００５３】
ウマ抗体は、ウマにおいて産生された抗体である。有利には、生成宿主としてウマを用いることによって、一年毎に、ヒトＴＮＦαに結合する高収率の血液由来抗体（好ましくは血漿由来抗体）を得ることができる。さらに、ウマ血球は、サンプルの収集直後に迅速に沈降することが分かっているので、血漿を得る際に、時間のかかる遠心分離工程を必要としない。製造方法は、血液サンプルから血漿を得ることと、前記サンプル由来の血球を前記ウマに戻すこととを含んでもよい。適切には、血球は、血液サンプルを得た後、２４時間未満、１２時間未満、６時間未満、１時間未満、又は３０分未満で戻されてもよい。有利には、血漿の使用により、ウマ血清の使用とは異なり、ウマの健康を損なわずに短期間の間複数の血液サンプルをとることができる。ゆえに、ウマ血漿を用いることによって、大量の抗体を得ることができる。
【００５４】
好ましくは、血液由来ウマポリクローナル抗体は、血漿由来ウマポリクローナル抗体である。
【００５５】
ゆえに、本発明は、本発明の組成物に用いられるウマ抗体を生成する方法を含み、前記方法は典型的には：
ｉ．ヒトＴＮＦα又はそのフラグメントを含む免疫原をウマに投与することと；
ｉｉ．ウマにおける抗体の生成に十分な時間を許容することと；
ｉｉｉ．ウマから抗体を得ることと
を含む。
【００５６】
本明細書中で用いられる用語「ウマ（horse）」は、用語「ウマ（equine）」と同義である。本明細書中で用いられるウマは、ウマ（Equus）属に属するあらゆる種を含む。好ましくは、ウマは、エクウス・フェルス（Equus ferus）種、例えばウマ（Equus ferus caballus）由来の１種以上である。
【００５７】
本明細書中で用いられる用語「ウマ抗体」は、ウマにおいて産生された抗体に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。好ましくは、本明細書中で用いられる「ウマ抗体」は、ウマにおいて産生された抗体に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。
【００５８】
一実施形態において、本発明の組成物は、ウマ抗体のみを含むので、非ウマ源由来の抗体を除外する。
【００５９】
抗体は典型的には、ウマ血漿から得られ得る。ゆえに、本明細書中に記載されるウマ抗体を生成する方法は、ヒトＴＮＦαに結合することができ、及び／又はこれを中和することができる抗体を含むウマ血漿を生成する。一実施形態において、抗体は、単離及び／又は精製されており、例えば、ウマ血漿から単離及び／又は精製されている。
【００６０】
本発明の抗体を生成するのに用いられる免疫原は、場合によっては精製されている、ヒトＴＮＦαである。本明細書中で用いられる用語「ヒトＴＮＦα」は、全長ヒトＴＮＦα、その変異体、又はそのフラグメントを包含する。好ましくは、用語「ヒトＴＮＦα」は、全長ヒトＴＮＦαを意味する。適切には、ヒトＴＮＦαは、組換えヒトＴＮＦαであってもよい。
【００６１】
免疫原は、配列番号１を含む（又はからなる）ヒトＴＮＦαであってもよい。一実施形態において、免疫原は、配列番号１のフラグメントである。一実施形態において、免疫原は、配列番号１に対して少なくとも７０％（適切には少なくとも８０％）の配列同一性を有するヒトＴＮＦα変異体（又はそのフラグメント）である。適切には、免疫原は、配列番号１に対して少なくとも９０％（適切には少なくとも９５％）の配列同一性を有するヒトＴＮＦα変異体（又はそのフラグメント）である。
【００６２】
免疫原は、配列番号２を含む（又はからなる）ヒトＴＮＦαであってもよい。一実施形態において、免疫原は、配列番号２のフラグメントである。一実施形態において、免疫原は、配列番号２に対して少なくとも７０％（適切には少なくとも８０％）の配列同一性を有するヒトＴＮＦα変異体（又はそのフラグメント）である。適切には、免疫原は、配列番号２に対して少なくとも９０％（適切には少なくとも９５％）の配列同一性を有するヒトＴＮＦα変異体（又はそのフラグメント）である。
【００６３】
一実施形態において、免疫原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、若しくは配列番号１３、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列を含む（又はからなる）。一実施形態において、免疫原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３に対して少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％）の配列同一性を有する配列を含む（又はからなる）。好ましくは、免疫原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３を含む（又はからなる）。一実施形態において、免疫原は、前記配列の１つ以上のフラグメント又は変異体である。
【００６４】
一実施形態において、「変異体」は、ペプチドの模倣体又はペプチドフラグメントであり得、模倣体は、ペプチド又はペプチドフラグメントの少なくとも１つのエピトープを再現する。別の実施形態において、「変異体」は、本明細書中に記載される配列と比較すると、少なくとも１つのアミノ酸突然変異又は修飾を有するペプチド又はペプチドフラグメントであり得る。一実施形態において、変異体は、配列番号１３である。
【００６５】
本明細書中で言及される「フラグメント」は、１から１５６個の任意の数のアミノ酸を有する配列番号１のフラグメントであり得る。代わりに、又は加えて、本明細書中で言及される「フラグメント」は、１から２３２個の任意の数のアミノ酸を有する配列番号２のフラグメントであり得る。フラグメントは、好ましくは、ヒトＴＮＦαの少なくとも１つのエピトープを含む。また、「フラグメント」は、フラグメントが由来するヒトＴＮＦαと共通の抗原交差反応性及び／又は実質的に同じインビボ生物活性を有し得る。例えば、フラグメントに結合することができる抗体は、フラグメントが由来するヒトＴＮＦαにも結合することができるであろう。これ以外にも、フラグメントは、ヒトＴＮＦαの抗原成分に予め曝露されたＴリンパ球の「リコール応答」を誘導する共通の能力を共有し得る。
【００６６】
一実施形態において、フラグメントは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、若しくは配列番号１２、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列を含む（又はからなる）。一実施形態において、フラグメントは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％）の配列同一性を有する配列を含む（又はからなる）。好ましくは、フラグメントは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２を含む（又はからなる）。
【００６７】
一実施形態において、免疫原又はそのフラグメントは、ヒトＴＮＦα（例えば、配列番号１又は配列番号２）のＮ末端又はＮ末端フラグメントを含む（又はからなる）。一実施形態において、Ｎ末端又はＮ末端フラグメントは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号７、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列を含む（又はからなる）。一実施形態において、Ｎ末端又はＮ末端フラグメントは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７に対して少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％）の配列同一性を有する配列を含む（又はからなる）。好ましくは、Ｎ末端又はＮ末端フラグメントは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７を含む（又はからなる）。
【００６８】
本発明のポリクローナル抗体は、マウスＴＮＦαに対する交差反応性及び／又はマウスＴＮＦαの中和を示し得る。これは非常に驚くべきことである。というのも、インフリキシマブのようなモノクローナル抗体等の代替の／従来のＴＮＦα抗体は、マウスＴＮＦαに対して交差反応を起こさず、及び／又はマウスＴＮＦαを中和しないからである。ゆえに、本発明のポリクローナル抗体は、インフリキシマブ等のモノクローナル抗体と比較して、特性の向上を実証する。
【００６９】
有利には、ヒトＴＮＦαのＮ末端フラグメントに結合する抗体は、中和特性の向上を示し得る。
【００７０】
理論により拘束されることを望むものではないが、ヒトＴＮＦαは、複数のエピトープを含む（又はからなる）と考えられる。例えば、ヒトＴＮＦαモノマーは、少なくとも２つ又は３つのエピトープを含み得る。また、ヒトＴＮＦαは、トリマー構造をとると考えられる。ゆえに、ヒトＴＮＦαトリマーは、更なるエピトープを含み得る。理論により拘束されることを望むものではないが、組成物の少なくとも５から１５種の抗体（例えば、１０から１５種の抗体）が、ヒトＴＮＦαトリマーに結合し得ると考えられる。適切には、組成物の約１２種の抗体が、ヒトＴＮＦαトリマーに結合し得る。
【００７１】
本発明の抗体組成物は、ポリクローナル抗体を含み、よって、好ましくは、前記抗体組成物は、抗体の集団を含み、当該集団は、ヒトＴＮＦαの複数のエピトープ（好ましくは全てのエピトープ）に結合することができる。
【００７２】
一実施形態において、本発明の抗体組成物は、ヒトＴＮＦαの第１のエピトープに結合する第１の抗体、及びヒトＴＮＦαの第２のエピトープに結合する第２の抗体を含む。好ましくは、本発明の抗体組成物は、ヒトＴＮＦαの第３のエピトープに結合する第３の抗体を含む。適切には、本発明の抗体組成物は、ヒトＴＮＦαの様々な更なるエピトープに各々結合する更なる抗体を含んでもよい。
【００７３】
本発明の抗体組成物は、適切には、配列番号１及び／又は配列番号２に結合する抗体を含む。適切には、本発明の抗体組成物は、配列番号１３に結合する抗体を含んでもよい。
【００７４】
一実施形態において、抗体組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、若しくは配列番号１３、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列の１つ以上（例えば複数）に結合する抗体を含む。一実施形態において、抗体組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３に対して少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％）の配列同一性を有する１つ以上（例えば複数）の配列に結合する抗体を含む。好ましくは、抗体組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３として示される１つ以上（例えば複数）の配列に結合する抗体を含む。
【００７５】
一実施形態において、抗体組成物は、ヒトＴＮＦα（例えば、配列番号１又は配列番号２）のＮ末端に結合する抗体を含む。一実施形態において、前記抗体は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号７、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（例えば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列の１つ以上（例えば複数）に結合する。一実施形態において、前記抗体は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７に対して少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％）の配列同一性を有する１つ以上（例えば複数）の配列に結合する。好ましくは、前記抗体は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７として示される１つ以上（例えば複数）の配列に結合する。
【００７６】
複数の配列は、少なくとも２つ（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個）の前記配列を意味する。適切には、用語複数の配列は、列挙される配列の全てを意味する。
【００７７】
抗原は、アジュバントと共に製剤化されてもよい。適切なアジュバントとして、ミョウバン(alum)（リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム）、サポニン（及びその精製成分Quil A）、フロイントの完全アジュバント及び不完全アジュバント、RIBBIアジュバント、並びに調査用途及び獣医学的用途に用いられる他のアジュバントが挙げられ得る。
【００７８】
本発明は、多種多様な免疫化スケジュールを意図する。一実施形態において、ヒツジは、０日目に免疫原が投与されてから、間隔を置いて（例えば、２０〜３５日毎、例えば２８日毎に）免疫原を受ける。必要とされる間隔範囲及び投薬量範囲は、とりわけ、免疫原の正確な性質、投与経路、及び製剤の性質に基づいて、当業者によって決定することができる。この投薬量レベルの変動は、実験に基づく標準的な最適化ルーチンを用いて調整することができる。同様に、本発明は、抗体収集のための特定のいかなるスケジュールに限定されることも意図されない。収集時点は典型的には、５６日目以後であり得る。特異的抗体（すなわち、免疫原に結合する）のレベルは、血液、血清、又は血漿１リットルあたり少なくとも２ｇ（例えば、血液、血清、又は血漿１リットルあたり少なくとも３ｇ）に相当し得る。
【００７９】
ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主から得られた抗体は、続いて精製されることで、本明細書中で言及される「精製画分」が提供され得る。一実施形態において、抗体は、沈殿、クロマトグラフィ、濾過、又はそれらの組合せによって精製されてよい。選択される精製方法は、ＩｇＧが溶液中に留まること、アルブミンを同時単離（co-isolate）すること、又はそれらの組合せを可能とするものであってよい。
【００８０】
沈殿は、硫酸ナトリウム沈殿であってもカプリル酸沈殿であってもよい。
【００８１】
最も好ましくは、沈殿は、カプリル酸沈殿である。前記沈殿は、夾雑物を沈殿させる一方、本発明のポリクローナル抗体は、溶液中に留まる。使用されることとなるカプリル酸の量は、実験的に決定することができる。しかしながら、一実施形態において、４〜８ｖ／ｖ％（好ましくは６ｖ／ｖ％）のカプリル酸が使用されてもよい。
【００８２】
本発明の組成物は、濾過してもよいし、濾過されていてもよい。好ましくは、濾過は、ガラスマイクロファイバーフィルタ及び０．２μｍフィルタの使用を含む。好ましくは、濾過は、０．４５μｍフィルタ及び０．２μｍフィルタの使用を含む。組成物は、場合によっては、更なる０．２μｍ濾過工程に供されてもよい。０．４５μｍフィルタは、０．４５μｍの孔サイズを有するガラスマイクロファイバーフィルタであってもよく、例えばMilliporeから市販されているものがある。
【００８３】
一実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも沈殿工程及び濾過に供された組成物である。好ましくは、本発明の組成物は、カプリル酸沈殿工程及び濾過に供された組成物であり、当該濾過は、０．２μｍフィルタの使用（例えば、ガラスマイクロファイバー（好ましくは０．４５μｍフィルタ）及び０．２μｍフィルタの使用）を含む。より好ましくは、本発明の組成物は、カプリル酸沈殿工程及び濾過に供された血漿又は血清であり、当該濾過は、０．２μｍフィルタの使用（例えば、ガラスマイクロファイバー（好ましくは０．４５μｍフィルタ）及び０．２μｍフィルタの使用）を含む。
【００８４】
本発明において、抗体が、多数の精製に供されないことによって、製造に伴うコストが引き下げられることが特に好ましい。
【００８５】
特に好ましい実施形態において、本発明のポリクローナル抗体（又はこれを含む組成物）は、ＴＮＦα（例えばヒトＴＮＦα）を用いてアフィニティ精製されていない。
【００８６】
好ましくは、本発明のポリクローナル抗体を含む血清又は血漿は、ＴＮＦα（例えばヒトＴＮＦα）を用いてアフィニティ精製されていない。
【００８７】
別の実施形態において、本発明のポリクローナル抗体（又はこれを含む組成物）は、精製工程に供されていない。一実施形態において、本発明のポリクローナル抗体を含む血清又は血漿は、精製されていない。
【００８８】
より好ましい実施形態において、本発明のポリクローナル抗体は、１回以上の沈殿工程（及び場合によっては濾過）のみ、例えば１回の沈殿工程及び場合によっては濾過のみに供されている。例えば、本発明のポリクローナル抗体は、カプリル酸沈殿工程、及び０．２μｍフィルタの使用（例えば、ガラスマイクロファイバー（好ましくは０．４５μｍフィルタ）及び０．２μｍフィルタの使用）を含む濾過のみに供されていてもよい。
【００８９】
最も好ましくは、本発明のポリクローナル抗体を含む血清（例えばヒツジ由来）又は血漿（例えばウマ由来）は、１回以上の沈殿工程及び濾過のみ、例えば１回の沈殿工程及び濾過のみに供されている。例えば、本発明のポリクローナル抗体を含む血清又は血漿は、カプリル酸沈殿工程、及び０．２μｍフィルタの使用（例えば、ガラスマイクロファイバー（好ましくは０．４５μｍフィルタ）及び０．２μｍフィルタの使用）を含む濾過のみに供されていてもよい。
【００９０】
一実施形態において、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、ヒトＴＮＦαに、１５ｍｇ／Ｌ以下のＥＣ５０（結合力価）値で結合する。一実施形態において、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、ヒトＴＮＦαに、１０ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、又は２．５ｍｇ／Ｌ以下のＥＣ５０（結合力価）値で結合する。好ましくは、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、ヒトＴＮＦαに、５ｍｇ／Ｌ以下のＥＣ５０（結合力価）値で結合する。より好ましくは、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、ヒトＴＮＦαに、１ｍｇ／Ｌ以下、例えば約０．７７ｍｇ／ＬのＥＣ５０（結合力価）値で結合する。前記ＥＣ５０値は、実施例７に従うＥＬＩＳＡによって求めることができる。この文脈におけるＥＣ５０値は、半値応答を生じさせるのに必要とされる抗体／組成物の濃度を指し得る。
【００９１】
一実施形態において、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、細胞生存アッセイにおいて少なくとも７０％の細胞生存率を達成する。一実施形態において、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、細胞生存アッセイにおいて少なくとも７５％、８０％、又は８５％の細胞生存率を達成する。好ましくは、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、細胞生存アッセイにおいて少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば９９％又は１００％）の細胞生存率を達成する。一実施形態において、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、細胞生存アッセイにおいて、ヒトＴＮＦα細胞毒性を、１５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値で中和する。一実施形態において、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、細胞生存アッセイにおいて、ヒトＴＮＦα細胞毒性を、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下、又は２．５μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０値で中和する。好ましくは、本発明の組成物（好ましくはアフィニティ精製されていない組成物）は、細胞生存アッセイにおいて、ヒトＴＮＦα細胞毒性を、１μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以下（例えば約０．４５５μｇ／ｍｌ）のＥＣ５０値で中和する。前記細胞生存アッセイは、好ましくは実施例８に記載されるように実行される、標準的なインビトロL929アッセイであってもよい。この文脈におけるＥＣ５０値は、細胞単層の５０％をヒトＴＮＦαから保護するのに必要とされる抗体／組成物の濃度を指す。
【００９２】
本発明のインタクトなポリクローナル抗体は、バッファと共に製剤化されてもよい。バッファは、クエン酸ナトリウム等の生理学的塩及び／又はクエン酸を含んでもよい。生理学的塩は、バッファ中に、１〜２００ｍＭの濃度にて存在してもよい。適切には、生理学的塩は、バッファ中に、おおよそ５〜５０ｍＭ（好ましくは約２０ｍＭ）の濃度にて存在してもよい。
【００９３】
抗体組成物（例えば医薬）は、好ましくは、経口投与用に製剤化される。例えば、抗体組成物は、マウスウォッシュ、リンス、ペースト、ジェル、又は他の適切な製剤として製剤化されてもよい。本発明の抗体は、活性抗体と粘膜表面との接触を増大させるように設計された製剤、例えば、口腔内パッチ、口腔内テープ、粘膜付着性フィルム、舌下錠、ロゼンジ、ウエハー、咀嚼錠、即座に若しくは急速に溶解するタブレット、発泡錠、又は口腔内固形製剤若しくは舌下固形製剤を用いて送達されてもよい。
【００９４】
本発明の経口投与される抗体組成物は、以下の予想外の利点の１つ以上を伴うことが見出された：
・静脈内投与、そしてとりわけ皮下投与若しくは筋肉内投与された抗体製剤と比較して、経口投与された場合に、抗体の有効な濃度が、より迅速に所望の領域に到達する；
・かなりのポリクローナル抗体が標的に到達するので、例えば、ほとんどの抗体が血中及び体の細胞外液区内に留まる全身投与と比較して、有意に低い濃度（例えば１０％未満）の投与が可能となる；
・経口投与されるポリクローナル抗体は、３つの主要な利点がある：ｉ．経口投与は、全身性の免疫応答を引き起こさないので、本発明の組成物の投与を、液性免疫応答を引き起こすことなく際限なく継続することができる；ｉｉ．同じ理由から、急性過敏反応若しくは遅延型過敏反応のリスクがない；そしてｉｉｉ．本発明のポリクローナル抗体は、全身に位置するＴＮＦαを中和しないことによって、結核等の感染のリスク、及び悪性腫瘍を含む他の合併症を回避することとなる；
・経口生成物は、規制当局の調査がはるかに少ない。実際に、例えばウマ、ヒツジ、若しくはウシ血漿の、栄養補給飲料としての消費が、経口投与された場合のその安全性に関する更なる証拠を提供する。さらに、一部の経口抗体ベースの製品は、食物として扱われる；
・経口投与用の抗体は、全身的に与えられるものよりも精製及び安全性試験を必要としない；
・製造は、クリーンルーム施設の使用を必要としない；
・治療のコストは、以下を含む理由のために、かなり引き下げられる：本発明のポリクローナル抗体の比較的低い製造コスト；経口投与する場合に必要とされる抗体のより低い濃度；日帰り入院としての病院への入院の必要を回避；及び全身（例えばＩＶ）投与に必要とされる看護師／ヘルスケア専門家の時間の必要を回避；そして／又は
・経口製剤は、患者の利便性を向上させて、対象の自宅での、そして彼／彼女に都合の良い時間での投与を可能にする。また、大部分の対象、とりわけ小児科グループは、全身投与されるものよりも、心地よい風味の経口製品の方が許容可能であることを見出す。
【００９５】
特に好ましい実施形態において、本発明の組成物は、液体として製剤化される。経口投与用の液体剤型として、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシルが挙げられる。抗体に加えて、液体剤型は、当該技術分野において一般的に用いられる不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及び胡麻油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含有してもよい。また、不活性希釈剤の他に、オーラル組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、香味剤、並びに芳香剤を含んでもよい。
【００９６】
好ましくは、液体はマウスウォッシュである。
【００９７】
一実施形態において、本発明の組成物（例えばマウスウォッシュ）は、以下を含む（又はからなる）：
【００９８】
【表１】
2021531301.tif 000003
【００９９】
インタクトなポリクローナル抗体は、１〜１００ｇ／Ｌの濃度にて存在してもよい。一実施形態において、インタクトなポリクローナル抗体は、１〜５０ｇ／Ｌ、例えば１〜２５ｇ／Ｌの濃度にて存在する。好ましくは、ポリクローナル抗体は、約５〜１０ｇ／Ｌの濃度にて存在してもよい。言及される濃度は、全てのインタクトなポリクローナル抗体、適切には全てのインタクトなポリクローナルＩｇＧ（すなわち、ＴＮＦαに結合する抗体及び結合しない抗体を含む）の濃度であってもよく、例えば、前記抗体の少なくとも１０％が、ＴＮＦαに結合して、これを中和してもよい。一実施形態において、前述の実施形態は、ＴＮＦαに結合する（且つ、好ましくはこれを中和する）インタクトなポリクローナル抗体に言及する。
【０１００】
インタクトなポリクローナル抗体は、バッファ中に存在してもよく、前記バッファの濃度は、１〜１００ｍＭ、例えば１０〜３０ｍＭである。適切なバッファは、クエン酸（例えばクエン酸ナトリウム生理食塩水）バッファであってもよい。
【０１０１】
組成物はさらに、タンパク質安定化剤、非イオン性界面活性剤、消毒剤、懸濁化剤、分散剤、結合剤、エマルジョン安定化剤、甘味料、及び香味剤の１つ以上を含んでもよい。
【０１０２】
一態様において、本発明は、以下を含む（好ましくはからなる）、口腔粘膜炎を処置するための液体組成物を提供する：
ａ．ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）ポリクローナル抗体；並びに
ｂ．バッファ、タンパク質安定化剤、非イオン性界面活性剤、消毒剤、懸濁化剤、分散剤、結合剤、エマルジョン安定化剤、甘味料、及び香味剤。
【０１０３】
液体組成物は、本明細書中に記載される処置のあらゆる使用又は方法に利用されてもよい。
【０１０４】
タンパク質安定化剤は、５〜１００ｇ／Ｌ、例えば１０〜３５ｇ／Ｌの濃度にて存在してもよい。好ましくは、前記タンパク質安定化剤は、アミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジン、又はグリシンであってもよい。
【０１０５】
組成物は、非イオン性界面活性剤を、０．５〜２．０ｇ／Ｌ、例えば０．７５〜１．５ｇ／Ｌの濃度で含んでもよい。好ましくは、前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（例えばポリソルベート20）である。
【０１０６】
組成物は、経口消毒剤を、０．１〜１ｗ／ｖ％、例えば０．１〜０．５ｗ／ｖ％の濃度で含んでもよい。消毒剤は、クロルヘキシジン消毒剤、例えばジグルコン酸クロルヘキシジンであってもよい。
【０１０７】
組成物は、ポリマーを、０．５４〜２０ｗ／ｖ％、例えば０．７５〜１５ｗ／ｖ％の濃度で含んでもよい。ポリマーは、結合剤、懸濁化剤、分散剤、エマルジョン安定化剤、又はそれらの組合せとして作用してもよい。好ましくは、ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である
【０１０８】
組成物は、甘味料を、０．１〜２．０ｇ／Ｌ、例えば０．５〜１．５ｇ／Ｌの濃度で含んでもよい。甘味料は、好ましくはサッカリン、例えばサッカリンナトリウムである。
【０１０９】
組成物は、香味剤（例えばペパーミント油）を、０．１〜０．５ｇ／Ｌ、例えば０．１５〜０．３ｇ／Ｌの濃度で含んでもよい。
【０１１０】
本発明の組成物は、先に記載される構成要素のあらゆる組合せを含んでもよい。（先で、そして以下で）示される濃度は、液体組成物中に存在する場合の構成要素の最終濃度であってもよい。当業者であれば、乾燥粉末として製剤化される場合、濃度はかなり高くなってもよいが、構成要素間の濃度比は、（好ましくは）同程度であり得ることを認識するであろう。
【０１１１】
ゆえに、一実施形態において、本発明の組成物は、以下を含む（又はからなる）：
【０１１２】
【表２】
2021531301.tif 000004
【０１１３】
特に好ましい実施形態において、本発明の組成物は、以下を含む（又はからなる）：
【０１１４】
【表３】
2021531301.tif 000005
【０１１５】
経口投与に適した組成物は、使用前に適切なビヒクル中に溶解又は懸濁する、溶液、懸濁液、又は乾燥粉末の形態であってもよい。
【０１１６】
組成物を調製する際に、抗体は、ビヒクル中に溶解させて、例えば、無菌的技術を用いて滅菌フィルタによる濾過によって滅菌してから、適切な滅菌バイアル又はアンプル中に充填してシールされてもよい。有利には、添加物、例えば、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤若しくは殺菌剤、懸濁化剤、及び／又は局所麻酔剤を、ビヒクル中に溶解させてもよい。
【０１１７】
使用前に適切なビヒクル中に溶解又は懸濁させる乾燥粉末は、滅菌領域において無菌的技術を用いて、プレ滅菌された成分を滅菌コンテナ中に充填することによって調製されてもよい。これ以外にも、成分は、滅菌領域において無菌的技術を用いて、適切なコンテナ中に溶解させてもよい。コンテナは典型的には、無菌的にシールされる。
【０１１８】
本発明に用いられるビヒクルは、あらゆるタイプの１つ以上の非毒性の、不活性の固体、半固体、又は液体のフィラー、希釈剤、カプセル化材料、又は調合助剤を包含してもよい。薬学的に許容されるキャリアとして機能することができる材料の一部の例として、糖、例えば、ラクトース、グルコース、及びスクロース；デンプン、例えば、コーンスターチ及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース；粉末トラガカントゴム；麦芽；タルク；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、胡麻油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；アガー；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール及びリン酸バッファ溶液、並びに他の非毒性の相溶性の潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味剤、及び芳香剤、防腐剤及び抗酸化剤があり、製剤化する人の判断に従って、組成物中に存在してもよい。
【０１１９】
好ましくは、本発明の抗体は、消化管移動中に抗体を保護する手段と共に製剤化されない。言い換えると、抗体を保護する外部手段（すなわち、例えば、既に血清又は血漿組成物の一部ではない）は、好ましくは加えられない。好ましくは、抗体は、消化管移動中に抗体を保護する手段と共に（同時にせよ、順次にせよ）投与されない。そのような手段として、以下の１つ以上が含まれ得る：プロテアーゼインヒビタ、制酸剤、抗体の翻訳後修飾（例えば、ペグ化及び／又はグリコシル化）、安定化アミノ酸修飾、レクチン、卵（例えば卵白）又はその成分、コーティング成分（例えば、コーティングマトリックス及び／又は腸溶コーティング）、微生物的に制御される送達系、ポリアクリラート、抗体のカプセル化又は捕捉のための手段（例えば、マイクロカプセル化及び／又はマイクロスフェア、例えばアルブミン−キトサン混合マトリックスマイクロスフェア）、モノメトキシポリ（エチレン）グリコール（例えば、モノメトキシポリ（エチレン）グリコールは、塩化シアン、スクシンイミジルスクシナート、及びトレシルクロリドによって活性化される）、エマルジョン、コロイダルポリマー、及びリポソーム。消化管移動中に抗体を保護する手段は、国際公開第２０１８／１３８５２４  Ａ１号に記載されている１つ以上であってよく、この出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
好ましくは、本発明の抗体は、カプセル化されていない。
【０１２１】
本明細書中で用いられる用語「障害」は、「疾患」も包含する。一実施形態において、障害は疾患である。
【０１２２】
本明細書中で用いられる用語「口腔粘膜炎」は、好ましくは、口腔及び／又は喉の粘膜内層(lining)の炎症を指す。より好ましくは、本明細書中で用いられる用語「口腔粘膜炎」は、口腔の粘膜内層の炎症を指す。
【０１２３】
一実施形態において、口腔粘膜炎は、化学療法及び／又は放射線療法によって誘導される口腔粘膜炎である。
【０１２４】
本明細書中で用いられる用語「対象」は、哺乳動物、例えばヒト又は他の動物を指す。好ましくは、「対象」は、ヒト対象を意味する。
【０１２５】
モノクローナル抗体療法は、口腔粘膜炎の処置について、（例えば、モノクローナル抗体の生成と関連する高いコストに起因して）現実的でない。有利には、本発明のポリクローナル抗体組成物は、前記障害を処置する問題の解決策を提供する。前記ポリクローナル抗体組成物は、製造費用が比較的廉価であるため、現実的な治療薬を提供する。
【０１２６】
適切な治療薬は、ヒトＴＮＦαに対して高い特異性を示すことが必要とされる。有利には、血液由来ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）ポリクローナル抗体（製造の方法による）は、非血液由来ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）抗体／非ヒツジ抗体若しくは非ウマ抗体及び／又はモノクローナル抗体と比較して、ヒトＴＮＦαに対する高い特異性を実証する。さらに、定義によれば、モノクローナル抗体を含む組成物は、単一エピトープにのみ結合するが、ポリクローナル抗体を含む組成物は、いくつかに結合することによって、ヒトＴＮＦαが中和される有効性を増大させることとなる。
【０１２７】
本明細書中で用いられる用語「処置する」又は「処置」は、（例えば、疾患の発症を予防するための）予防的処置、及び矯正的処置（既に疾患に罹患している対象の処置）を包含する。好ましくは、本明細書中で用いられる「処置する」又は「処置」は、矯正的処置を意味する。
【０１２８】
本明細書中で用いられる用語「処置する」又は「処置」は、障害及び／又はその病徴に言及する。
【０１２９】
したがって、本発明の組成物は、対象に、治療的に有効な量又は予防的に有効な量で投与されてよい。
【０１３０】
「治療的に有効な量」は、口腔粘膜炎（又はその病徴）を処置するために対象に単独で、又は組み合わせて投与された場合に、障害又はその病徴のそのような処置を達成するのに十分な、抗体のあらゆる量である。
【０１３１】
「予防的に有効な量」は、対象に単独で、又は組み合わせて投与された場合に、口腔粘膜炎（又はその病徴）の発症又は再発を阻害又は遅延する抗体のあらゆる量である。一部の実施形態において、予防的に有効な量は、口腔粘膜炎の発症又は再発を完全に予防する。発症の「阻害」は、口腔粘膜炎（又はその病徴）の発症の尤度を小さくする、又は発症を完全に予防することを意味する。
【０１３２】
適切な投薬量範囲は、所望の治療的効果をもたらすものである（例えば、抗体／組成物は、治療的に、又は予防的に有効な量で投薬される）。典型的な投薬量レジメンは、本発明の組成物を１週あたり少なくとも４回投与することを含んでもよい。好ましくは、本発明の組成物は、毎日投与される。
【０１３３】
本発明の組成物は、１日あたり少なくとも１回、２回、３回、又は４回投与されてもよい。好ましくは、組成物は、１日あたり４回投与される。
【０１３４】
特に好ましい実施形態において、組成物は、１日あたり４回、１週あたり７日（すなわち毎日）投与される。投与は典型的には、口腔粘膜炎若しくはその病徴がもはや存在しなくなるまで、及び／又は対象の化学療法レジメン及び／又は放射線療法レジメンが完了するまで実行される。
【０１３５】
ゆえに、一実施形態において、本発明の処置の対象は、化学療法及び／又は放射線療法を受けている。
【０１３６】
適切な単回用量は、１ｇ以下のポリクローナル抗体であってもよい。一実施形態において、単回用量は、０．５ｇ以下、例えば０．２５ｇ以下のポリクローナル抗体である。好ましくは、用量は、０．１５ｇ以下のポリクローナル抗体である。
【０１３７】
一実施形態において、単回用量は、少なくとも０．００１ｇのポリクローナル抗体である。一実施形態において、単回用量は、少なくとも０．０１ｇのポリクローナル抗体、好ましくは少なくとも０．０５ｇのポリクローナル抗体である。
【０１３８】
一実施形態において、単回用量は、０．００１ｇから１ｇのポリクローナル抗体である。一実施形態において、単回用量は、０．００１ｇから０．５ｇのポリクローナル抗体、例えば０．００１ｇから０．２５ｇのポリクローナル抗体である。好ましくは、単回用量は、０．０５ｇから０．１０ｇのポリクローナル抗体である。
【０１３９】
前述の単回用量は、１日あたり少なくとも１回、２回、３回、又は４回投与されてもよい。好ましくは、組成物は、１日あたり４回投与される。
【０１４０】
特に好ましい実施形態において、０．０５ｇから０．１０ｇのポリクローナル抗体の単回用量が、１日４回投与される（好ましくは、一日用量は、０．２ｇから０．４ｇであってもよい）。
【０１４１】
適切には、先の用量は、本発明の組成物中に含まれるインタクトなポリクローナル抗体の総量、適切には全てのインタクトなポリクローナルＩｇＧ（すなわち、ＴＮＦαに結合する抗体及びＴＮＦαに結合しない抗体を含む）に言及してもよい。インタクトなポリクローナル抗体は、血液サンプル（例えば抗血清）又はその精製された画分から直接得られ得る。好ましくは、インタクトなポリクローナル抗体は、血液サンプル、例えば抗血清から精製されたものである。例えば、サンプルは、沈殿（好ましくは硫酸ナトリウム沈殿又はカプリル酸沈殿、最も好ましくはカプリル酸沈殿）及び濾過に供されていてもよい。適切には、組成物中に含まれる全てのインタクトなポリクローナル抗体の少なくとも５％（例えば少なくとも１０％）が、ＴＮＦαに結合する。より好ましくは、組成物中に含まれる全てのインタクトなポリクローナル抗体の少なくとも１５％又は少なくとも２０％が、ＴＮＦαに結合する。
【０１４２】
驚くべきことに、治療的／予防的効果が、そのような低い用量のインタクトな総血液由来ポリクローナル抗体にて観察され、且つ、非血液由来非ヒツジ又は非ウマ（好ましくは非ヒツジ）源、例えば牛乳と比較した場合に、高濃度の特異的抗体（すなわちＴＮＦαに結合する）の生成が明確に示される。さらに驚くべきことに、治療的／予防的効果が、そのような低い用量のインタクトな総ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）ポリクローナル抗体にて観察され、且つ、ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主を用いての、高濃度の特異的抗体（すなわちＴＮＦαに結合する）の生成が明確に示される。
【０１４３】
液体組成物（例えばマウスウォッシュ）として製剤化される場合、組成物の単回用量は、１〜５０ｍｌであってもよい。一実施形態において、単回用量は、１〜２０ｍｌである。好ましくは、単回用量は、５〜１５ｍｌ（例えば約１０ｍｌ）である。
【０１４４】
（例えばマウスウォッシュとして）投与される場合、本発明の組成物は好ましくは、消費されない（例えば嚥下されない）。一実施形態において、組成物は、適切な時間（例えば、少なくとも１、２、３、又は４分間）、対象の口腔内に（例えば渦巻かせながら（swirling））維持されてから排出される（例えば吐き出される）。好ましくは、対象の口腔内部は、組成物で洗浄される（例えば渦巻かれる）。
【０１４５】
一部の実施形態において、本発明の抗体組成物は、対象に、１つ以上の更なる治療薬と組み合わせて投与されてもよい。一実施形態において、抗体組成物が投与される一方、対象は化学療法を受けている。１つ以上の更なる治療薬は、順次投与されてもよいし、本発明の抗体組成物と同時に投与されてもよい。
【０１４６】
一実施形態において、抗体組成物は、口腔粘膜炎を処置する治療薬と組み合わせて投与される。一実施形態において、治療薬は、アミノサリチラート（５−ＡＳＡ）、コルチコステロイド又は抗生物質であってもよい。抗体組成物は、マウスウォッシュ（例えば、ベンジダミン及び／又はクロルヘキシジンマウスウォッシュ）、鎮痛剤（例えば、パラセタモール、Oramorph（登録商標）、及び／又は静脈内モルヒネ）、唾液代用物（例えば、Gelcaliar（登録商標）オーラルジェル）、又はそれらの組合せと組み合わせて投与されてもよい。
【０１４７】
ヒツジ抗体に関して本明細書中に記載される全ての実施形態は、ウマ抗体の態様に等しく当てはまり、そして逆もまた同じである。同様に、本発明に用いられる種々の抗体組成物に関連する実施形態が、使用、方法、又は液体組成物に等しく当てはまり、そして逆もまた同じであることが意図される。
【０１４８】
配列比較
配列比較について、典型的には、一配列が、試験配列を比較し得る基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば、以降のコーディネートを指定し、そして配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムにより、指定したプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
【０１４９】
比較に最適な配列アライメントは、例えば、Smith and Waterman [Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)]の局所相同性アライメントアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch [J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]のアルゴリズムによって、Pearson & Lipman [Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実施（GAP, BESTFIT,FASTA, and TFASTA - Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）によって、又は視覚による精査［Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausbel et al, eds, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, In. And John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubel参照］によって行うことができる。
【０１５０】
配列類似性パーセントを求めるのに適したアルゴリズムの例として、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズム［Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: pp. 403-410、及びNational Center for Biotechnology Information の“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/”参照］がある。
【０１５１】
ある相同性比較において、同一性は、少なくとも１０、２０、３０、４０、又は５０アミノ酸残基長の配列の領域にわたって存在する。別の相同性比較において、同一性は、少なくとも６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸残基長の配列の領域にわたって存在する。
【０１５２】
種々の配列アライメント法のいずれを用いても、同一性パーセントを求めることができ、限定されないが、グローバル法、ローカル法、及びハイブリッド法、例えば、セグメントアプローチ法が挙げられる。同一性パーセントを求めるプロトコルは、当業者の範囲内のルーチン手順である。グローバル法では、配列を、分子の最初から最後までアラインして、個々の残基対のスコアを合計することによって、そしてギャップペナルティを課すことによって、最も良いアライメントを決定する。非限定の方法として、例えば、CLUSTAL W（例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)参照）、及び反復的リファインメント（例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)参照）が挙げられる。ローカル法では、入力配列の全てが共有する１つ以上の保存モチーフを同定することによって配列をアラインする。非限定の方法として、例えば、Match-Box（例えば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992)参照）；Gibbsサンプリング（例えば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)参照）；Align-M（例えば、Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)参照）が挙げられる。
【０１５３】
ゆえに、配列同一性パーセントは、従来の方法によって求められる。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992参照。手短に言うと、２つのアミノ酸配列をアラインして、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ１、及び以下に示すHenikoff and Henikoffの「blosum 62」スコアリングマトリックス(ibid.)（アミノ酸を、標準的な１文字コードによって示す）を用いてアライメントスコアを最適化する。
【数１】
2021531301.tif 000006
【０１５４】
次に、同一性パーセントを、以下のように算出する：
【数２】
2021531301.tif 000007
【０１５５】
実質的に相同なポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有するものとして特徴付けられる。これらの変化は、好ましくは、重要でない性質のもの、すなわち、保存的アミノ酸置換（以下参照）、及びポリペプチドの折畳み若しくは活性に大きな影響を及ぼさない他の置換；小さな、典型的には１から約３０個のアミノ酸の欠失；並びに小さなアミノ末端伸長又はカルボキシル末端伸長（例えば、アミノ末端メチオニン残基、最大約２０〜２５残基の小リンカーペプチド、又はアフィニティータグ）である。
【０１５６】
保存的アミノ酸置換として、以下が挙げられ得る：
塩基性：アルギニン
リシン
ヒスチジン
酸性：グルタミン酸
アスパラギン酸
極性：グルタミン
アスパラギン
疎水性：ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香性：フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小：グリシン
アラニン
セリン
トレオニン
メチオニン
【０１５７】
２０種の標準的なアミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα−メチルセリン）が、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換されていてもよい。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによってコードされていないアミノ酸、及び非天然のアミノ酸が、ポリペプチドアミノ酸残基と置換されていてもよい。また、本発明のポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸残基を含んでもよい。
【０１５８】
天然に存在しないアミノ酸として、限定されないが、ｔｒａｎｓ−３−メチルプロリン、２，４−メタノ−プロリン、ｃｉｓ−４−ヒドロキシプロリン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−プロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチル−トレオニン、ヒドロキシ−エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ−システイン、ニトロ−グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニル−アラニン、４−アザフェニル−アラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に組み込むいくつかの方法が、当該技術分野において知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサｔＲＮＡを用いてナンセンス突然変異を抑制するインビトロ系を利用してもよい。アミノ酸を合成してｔＲＮＡをアミノアシル化する方法が、当該技術分野において知られている。ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写及び翻訳が、大腸菌（E. coli）S30抽出物、並びに市販の酵素及び他の試薬を含む細胞フリー系において実行される。タンパク質が、クロマトグラフィによって精製される。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991；Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991；Chung et al., Science 259:806-9, 1993；及びChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993)参照。第２の方法において、翻訳が、突然変異ｍＲＮＡ及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサｔＲＮＡのマイクロインジェクションによって、ツメガエル（Xenopus）属卵母細胞内で実行される（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996）。第３の方法では、置換されることとなる天然アミノ酸（例えばフェニルアラニン）の不在下で、且つ所望の、天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で、大腸菌（E. coli）細胞が培養される。天然に存在しないアミノ酸は、その天然の対応物の代わりにポリペプチド中に組み込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994参照。天然に存在するアミノ酸残基を、インビトロ化学修飾によって、天然に存在しない種に変換することができる。置換の範囲をさらに拡大させるために、化学修飾を部位特異的突然変異誘発と組み合わせてもよい（Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993）。
【０１５９】
限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによってコードされていないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び非天然アミノ酸が、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基と置換されていてもよい。
【０１６０】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、当該技術分野において既知の手順、例えば、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発に従って同定することができる（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989）。また、生物学的相互作用部位を、推定の接触部位アミノ酸の突然変異と併用した、核磁気共鳴、結晶解析、電子回折、又は光親和性標識等の技術によって決定される、構造の物理的分析によって決定することができる。例えば、de Vos et al., Science 255:306-12, 1992；Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBSLett. 309:59-64, 1992参照。また、必須アミノ酸の同定は、本発明のポリペプチドの関連構成要素（例えば、転座又はプロテアーゼ構成要素）との相同性の分析から推測することができる。
【０１６１】
Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)によって開示されるもの等の、既知の突然変異誘発及びスクリーニング方法を用いて、複数のアミノ酸置換を行って試験することができる。手短に言うと、これらの著者らは、ポリペプチド内の２つ以上の位置を同時にランダム化して、機能的ポリペプチドを選択してから、突然変異を起こしたポリペプチドを配列決定することで、各位置にて許容可能な置換の範囲を決定する方法を開示している。使用することができる他の方法として、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991；Ladner et al.の米国特許第５，２２３，４０９号、Huseの国際公開第９２／０６２０４号）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986；Ner et al., DNA 7:127, 1988）が挙げられる。
【０１６２】
Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)によって開示されるもの等の、既知の突然変異誘発及びスクリーニング方法を用いて、複数のアミノ酸置換を行って試験することができる。手短に言うと、これらの著者らは、ポリペプチド内の２つ以上の位置を同時にランダム化して、機能的ポリペプチドを選択してから、突然変異を起こしたポリペプチドを配列決定することで、各位置にて許容可能な置換の範囲を決定する方法を開示している。使用することができる他の方法として、ファージディスプレイ（例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991；Ladner et al.の米国特許第５，２２３，４０９号、Huseの国際公開第９２/０６２０４号）及び領域特異的突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986；Ner et al., DNA 7:127, 1988）が挙げられる。
【０１６３】
特に定義されない限り、本明細書で用いられる科学用語及び技術用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)及びHale & Marham, THEHARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)が、本開示で用いられている多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【０１６４】
本開示は、本明細書中に開示される例示的な方法及び材料によって限定されず、本明細書中に記載されるものと類似の、又は等価なあらゆる方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験に用いることができる。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。特に示されない限り、核酸配列はいずれも、左側から右側へ、５’から３’の向きに、アミノ酸配列は、左側から右側へ、アミノからカルボキシの向きに、それぞれ書かれている。本明細書中に記載される見出しは、本開示の種々の態様又は実施形態の限定ではない。アミノ酸は、本明細書中で、アミノ酸の名称、三文字略号、又は一文字略号を用いて言及する。用語「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。本明細書で用いられる用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。ある場合には、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。ある場合には、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義である。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書中で互換的に用いられる。本開示及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基について従来の一文字コード及び三文字コードを用いる場合がある。アミノ酸の三文字コードは、IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（ＪＣＢＮ）に準拠して定義される。また、ポリペプチドは、遺伝コードの縮重に起因して、２種以上のヌクレオチド配列によってコードされ得ると理解される。
【０１６５】
用語の他の定義が、本明細書の全体にわたって現れる場合もある。本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、変化し得ることを理解すべきである。また、本明細書中で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明することだけを目的としたものに過ぎず、限定することを意図していないことも理解すべきである。というのも、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ規定されることとなるからである。
【０１６６】
値の範囲が与えられる場合、当該範囲の上限と下限との間の各介在値は、文脈上明らかに異なる記載がない限り、下限の単位の１０分の１まで具体的に開示されているものと理解される。指定範囲内の任意の指定値又は介在値と、当該指定範囲内の任意の他の指定値又は介在値との間のより小さい各範囲が、本開示内に包含される。より小さい当該範囲の上限及び下限は、独立して、当該範囲内に含まれても除外されてもよく、そしてまた、限界値が、より小さい範囲内で一方だけ含まれる、どちらも含まれない、又は双方とも含まれる各範囲が、本開示内に包含されるが、指定範囲内の具体的に除外される任意の限界値次第である。指定範囲が限界値を一方だけ、又は双方とも含む場合、それらの含まれる一方又は双方の限界値を除外した範囲もまた、本開示に含まれる。本明細書中で、そして添付の特許請求の範囲において用いられる場合、文脈上明らかに異なる場合を除いて、単数形の「a」、「an」、及び「the」は、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。ゆえに、例えば、「抗体（an antibody）」への言及は、複数のそのような候補物質を含み、「抗体（the antibody）」への言及は、１つ以上の抗体及び当業者に知られているその等価物への言及を含む等々である。本明細書で考察される刊行物は、単に本出願の出願日前の開示について提供されているに過ぎない。本明細書の記載内容は、そのような出版物が、本明細書に添付されている特許請求の範囲に対する先行技術を構成することを容認するものとみなされるべきでない。
【０１６７】
次に、本発明を、単なる例として、以下の図面及び実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０１６８】
実施例
実施例１
ヒトＴＮＦαに対するヒツジ抗血清の調製
成熟ヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）（UniProtKB登録番号：P01375）を、R&D Systems, Boehringerから得た。アミノ酸配列を、配列番号１として示す。
【０１６９】
メリノ去勢ヒツジの一次免疫化用の免疫原は、フロイント完全アジュバント、及びヒツジ１頭あたり１００μｇのｈＴＮＦαを含んだ。腋窩、鼠径部、及び前肩甲骨（prescapular）のドレナージリンパ腺付近に選択した６つの注射部位中に、タンパク質：アジュバント混合液を等しく皮下注射した。動物保護のための州及び国の厳しい倫理ガイドラインに準拠する、Turretfield Research Centre (Rosedale, South Australia, Australia)の処理施設にて、各ヒツジを、１００μｇのｈＴＮＦα及びフロイント不完全アジュバントにより２８日間隔で再免疫化して、血液サンプルを１４日後に、およそ４週間隔で収集した。動物は最終的に出血（bled）していなかった。動物を傷つけずに外頸静脈から合計１０ｍＬの血液／体重ｋｇを収集することができる。
【０１７０】
続いて、ヒツジ抗血清を−２０℃にて貯蔵した。
【０１７１】
実施例２
ヒトＴＮＦαに対するポリクローナルヒツジ抗体（インタクトな抗ＴＮＦα）の精製
ヒツジポリクローナル抗体（ＰｃＡｂ）を精製する２つの異なる方法を使用した。アルブミンを沈殿させて、ＩｇＧを溶液中に維持するカプリル酸沈殿、又はＩｇＧを沈殿させる硫酸ナトリウム沈殿のいずれかを用いた。精製されたＩｇＧを濾過して、経口投与のために、又は更なる特徴付けのために、提供された製剤内に含めて準備を整えて、−２０℃にて貯蔵した。
【０１７２】
実施例３
抗体結合を特徴付けるための酵素結合免疫吸着アッセイ
産生された特異的抗体は、組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）の表面上の複数のエピトープに結合したが、組換え齧歯類ＴＮＦαには結合しなかった。結合力は極めて高かった。
【０１７３】
ヒツジ抗血清中の、そしてこの抗血清由来のＩｇＧの精製画分（カプリル酸沈殿によって精製した）（インタクトな抗ＴＮＦα）中の抗ＴＮＦα  ＩｇＧの検出用に、直接ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。Immulon 4HBxマイクロタイタープレートを、１μｇ／ｍＬ  ｈＴＮＦαでコーティングした。０．１％Tween 20を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳＴ）を３回交換してプレートを洗浄し、ブロッキングバッファ（ＰＢＳ中に希釈した２．５％ウシ胎仔血清）で３７℃にて１時間ブロックした。プレートを洗浄して、抗血清（１：１０００の初期希釈度に続いて１：２の段階希釈度）と共に３７℃にて１時間インキュベートして；ＰＢＳＴで洗浄して；ロバ抗ヒツジＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートと共に３７℃にて１時間インキュベートした。さらなる洗浄の後に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）液体基質溶液を加えて、反応を、１．０Ｍ  ＨＣＬの添加によっておよそ１０分後に止めてから、４５０ｎｍでの光学濃度を読んだ。
【０１７４】
免疫前ヒツジ血清を用いて試験する、開発したアッセイは、非常に低いバックグラウンドを示した（図１）。
【０１７５】
実施例４
抗体中和を特徴付けるための免疫細胞傷害性アッセイ
L929マウス線維肉腫細胞株（Sigma-Aldrich, The Old Brickyard, New Road, Gillingham, Dorset, SP8 4XT, UKから市販されている）を用いて、ＴＮＦαの細胞傷害作用、及びＴＮＦαに対する抗体の中和能力を試験した。したがって、抗血清中のヒツジＰｃＡｂによる、抗血清から精製したＩｇＧ（インタクトな抗ＴＮＦα）による、そしてそのフラグメント（抗ＴＮＦαフラグメント）によるｒｈＴＮＦαの細胞傷害作用の中和を試験するためのアッセイを開発した。
【０１７６】
実施例１のヒツジ抗血清のストックの一部をパパイン消化にかけることによって、抗ＴＮＦαフラグメントを調製した。Ｆａｂは、１０ｇ／Ｌの濃度にて存在し、そして総Ｆａｂの約１０％が、ＴＮＦαに特異的であった。その製造にアフィニティクロマトグラフィ工程を含めなかった。過剰のＦａｂの存在下で、約１２分子のＦａｂが、各ＴＮＦαトリマーに付着している。
【０１７７】
抗原投与量として、細胞傷害性アッセイから決定した１３ｎｇ／ｍｌのＩＣ９０  ｈＴＮＦα濃度（データ示さず）を用いた。手短に言うと、ＤＭＥＭ中に必要な抗原投与量の２倍を含有するL929細胞を、等しい容量の種々の希釈度のｈＴＮＦα抗血清、抗ＴＮＦαフラグメント、又はインタクトな抗ＴＮＦαと、２４時間共インキュベートした。陽性対照（最大死滅）として、２．５μｇ／ｍｌ  ｈＴＮＦαを用いた。ニュートラルレッドによる細胞染色に基づく比色アッセイによって、抗体毒素中和力価を推定した。
【０１７８】
ニュートラルレッドによる細胞染色に基づく比色アッセイによって、抗体毒素中和力価を推定した（代表的な曲線を図２に示す）。有利には、インタクトな抗ＴＮＦαは、抗ＴＮＦαフラグメントと比較して、中和能力の有意な向上を示した。
【０１７９】
特異的抗体濃度を、以下のように算出した：
特異的Ａｂ濃度［ｇ／Ｌ］＝［ＣＣＤ（μｇ／Ｌ）−ＬＣ５０（μｇ／Ｌ）］×［ＭＷ  Ａｂ／（ＭＷ  Ａｇ×ＢＳ）］×ＥＣ５０×１０−６
−  ＣＣＤ（μｇ／Ｌ）−抗原投与量＝１３μｇ／Ｌ（L929細胞に及ぼすＴＮＦα細胞傷害性から求めたＬＣ９０）
−  ＬＣ５０（μｇ／Ｌ）＝０．３μｇ／Ｌ（L929細胞に及ぼすＴＮＦα細胞傷害性から求めた）
−  ＢＳ−結合部位＝２（総ＩｇＧについて）
−  ＭＷ  Ａｂ＝１６００００Ｄａ
−  ＭＷ  Ａｇ（ＴＮＦα）＝５１０００Ｄａ
【０１８０】
以上を考慮に入れて、抗血清中の特異的ＰｃＡｂ濃度を、２．９ｇ／Ｌと算出した。
【０１８１】
比較例５
ヒツジ血清及び鶏卵からの特異的抗体力価の比較分析
鶏卵から得られた特異的ＩｇＹの濃度及び結合活性を、ヒツジ抗血清からの特異的抗体濃度と比較して評価する研究を行った。
【０１８２】
１０羽のニワトリ及び５頭のヒツジの群を、ヒトインターロイキン−６（ＴＮＦαのような炎症誘発性サイトカインｈＩＬ−６）で免疫化して、結果として生じた特異的ＰｃＡｂの力価及び結合力を比較した。平均結合力定数は、ニワトリＩｇＹについて１．３×１０１０Ｌ／ｍｏｌ、ヒツジ抗体について３．１×１０１０Ｌ／ｍｏｌであった。しかしながら、ヒツジにおいて達成された特異的ＰｃＡｂのレベル（平均力価が≧１：２００，０００）は、卵黄において見出された力価（≦１：２０，０００）の１０倍超であった。特異的ＰｃＡｂの濃度におけるこの１０倍以上の差は、ヒツジ及び雌鶏をいくつかの他の免疫原で免疫化した場合にも明らかとなった。
【０１８３】
以上の実験は、ヒツジの血液に由来する抗体の利点を示す。
【０１８４】
実施例６
ヒツジ血清及び牛乳から供給された特異的抗体力価の比較分析
適切に免疫化されたウシ由来の初乳及び乳のＰｃＡｂ源としての潜在性を評価する研究を行った。
【０１８５】
ウシをヒトＴＮＦαで免疫化して、結果として生じた特異的ＰｃＡｂヒツジ血液の力価を、最初に初乳において、次に乳の逐次サンプルにおいて求めた。初乳において得られた最大力価は１：２７５，０００であり（ヒツジ抗血清における１：８００，０００と比較）、そして最初の搾乳の後に、レベルはおよそ１：２７，５００に急速に低下した。
【０１８６】
ゆえに、血液由来源は、乳／初乳由来源と比較して、ヒトＴＮＦαに結合する抗体をより高濃度で一貫して生成することが示された。
【０１８７】
実施例７
ヒツジ血液由来ポリクローナル抗体の、ヒトＴＮＦαへの結合
ヒツジ血液由来ポリクローナル抗ＴＮＦα抗体（インタクトな抗ＴＮＦα）の力価を、間接ＥＬＩＳＡによって求めた。コーティングバッファ（８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４を含有するリン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて、Immulon（登録商標）4HBX平底マイクロフィルタプレート（Thermo Scientific）を、ヒト組換えＴＮＦαで、１μｇ／ｍＬ（１００μｌ／ウェル）の濃度にてコーティングして、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、０．１％Tween 20を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄して、ＰＢＳ中２．５％ウシ胎仔血清（１５０μｌ／ウェル）で３７℃にて２時間ブロックした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄して、抗ＴＮＦαポリクローナル抗体組成物（カプリル酸６ｖ／ｖ％を用いて精製して、ガラスマイクロファイバー及び０．２μｍフィルタを用いて濾過した血清）（１００μｌ／ウェル）と共に適切な希釈度にてインキュベートした。PolyCAb B（クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）毒素に結合する）を、陰性対照として用いた。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄して、１００μｌの希釈した（１：１０，０００）ロバ抗ヒツジ抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Sigma）に結合させている）を加えて、３７℃にて１時間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄して、室温に達するようにおよそ４時間放置した１００ｍｌの基質溶液３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加えた。プレートを、室温にて５分間静置した。反応を、５０ｍｌ／ウェルの１Ｍ  ＨＣｌを加えることによって止めて、プレートを、PolarStarプレートリーダーで４５０ｎｍ及び６９０ｎｍにて読んだ。全サンプルを、二反復又は三反復で試験した。５０％の結合力価を、Graph Pad Prism 7を用いて推定した。
【０１８８】
ヒツジ血液由来ポリクローナル抗体は、ヒトＴＮＦαに、０．７７ｍｇ／ＬのＥＣ５０値で結合することが見出された。
【０１８９】
実施例８
細胞生存率アッセイ（ヒトＴＮＦα）
血液由来ヒツジポリクローナル抗体（インタクトな抗ＴＮＦα−カプリル酸６ｖ／ｖ％を用いて精製して、ガラスマイクロファイバー及び０．２μｍフィルタを用いて濾過した血清）及びインフリキシマブ（Schering-Plough Ltd）の中和能力を評価して、ニュートラルレッド吸収（ＮＲＵ）ベースのアッセイを用いて定量化した。ＴＮＦαに曝されると細胞死を経験することが知られているL929細胞を用いた。L929細胞を７．５×１０３／ウェル（１００μＬ）にて播種して、５％ＣＯ２加湿雰囲気内で３７℃にておおよそ２４時間増殖させたインジケータプレートを用いて、アッセイを実行した。
【０１９０】
１０％熱不活化ウシ胎仔血清（Sigma）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Sigma）、及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma）を用いて、L929細胞を維持した。３０ｍＬの培地中２×１０５の密度にて毎週播種した細胞を、７５ｃｍ２のフラスコ内で維持した。細胞は、ルーチン的に維持した。
【０１９１】
抗体サンプル毎に、２倍の連続希釈を、９６ウェル希釈プレートにおいてＤＭＥＭを用いて実行してから、ＴＮＦαを含有する培地の等量を加えた。ＴＮＦαの固定濃度を用いて（抗原投与量＝１２ｎｇ／ｍｌ）、ＬＣ９８（９８％の細胞死が起きる致死濃度）に基づいた。この濃度は、細胞球状化（cell rounding）を１００％近く引き起こすのに十分であることが示された。ＴＮＦα細胞障害性曲線を、アッセイ間変動についての対照としてプレート毎に含めて、抗原安定性及び再現性を監視した。
【０１９２】
ＤＭＥＭ中の抗体は、陰性対照としての機能を果たし、そしてＴＮＦα抗原投与量は、陽性対照としての機能を果たした。希釈プレートを、室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、希釈プレート由来の１００μＬのサンプルを、１００μｌの培地を含有するインジケータプレート内の対応するウェルに移した。こうして、総容量を２００μｌとした。続いて、インジケータプレートを、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ内に戻した。４８時間後、プレートをリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄してから、１００μｌの脱色溶液（５０％エタノール及び１％酢酸）を加えて、プレートロッカー上に１５分間置いた。プレートを、５４０ｎｍ（試験測定）及び６９０ｎｍ（バックグラウンド測定）の波長にて、PolarStarプレートリーダーで読んだ。バックグラウンド測定値を試験測定値から減算することによって、ウェル毎の吸光度を算出した。細胞死パーセンテージを、以下のように算出した：
【数３】
2021531301.tif 000008
【０１９３】
結果を、別々の３日に二反復（ｎ＝２）で実行した合計６プレートから得た。ヒツジポリクローナル抗体は、アッセイにおいて、生存率が７０％であるインフリキシマブと比較して、用いた最も高い濃度にて１００％の細胞生存率を与えた。具体的には、平均２６．３６％（範囲：１５．４５〜３９．５％）の差異が、インフリキシマブとヒツジポリクローナル抗体で処理したL929細胞の最適生存率の間で観察された。これは、インフリキシマブがｈｒＴＮＦαを完全に中和できないことを意味する。
【０１９４】
細胞単層の５０％を保護するのに必要とされるヒツジポリクローナル抗体の希釈を、GraphPad Prism 7を用いて推定して、０．４５５μｇ／ｍｌの平均ＥＣ５０値が与えられた。これは驚くべきことであった。というのも、ウシ初乳由来ポリクローナル抗体の類似の調製物が、ヒトＴＮＦαを約１６μｇ／ｍｌのＥＣ５０値で中和することが報告されているからである。ゆえに、ウシポリクローナル抗体と比較すると、ヒツジ血液由来ポリクローナル抗体は、かなり向上している。
【０１９５】
実施例９
血液由来ポリクローナル抗体の、モノクローナル抗体との比較
ヒトＴＮＦαに結合する血液由来ヒツジポリクローナル抗体、及びヒトＴＮＦαに結合するインフリキシマブ（Schering-Plough Ltd）、モノクローナル抗体を用いて、比較抗原結合アッセイを実行した。
【０１９６】
図３は、モノクローナル抗体インフリキシマブが、マウスＴＮＦαに結合しないが、ヒトＴＮＦαに対して産生されたヒツジ由来ポリクローナル抗体がこれに結合することを示している。
【０１９７】
本発明の血液由来ヒツジポリクローナル抗体は、ヒトＴＮＦαを中和するのに必要とされるよりもおよそ１００倍高い濃度であるとはいえ、マウスＴＮＦαに結合してこれを中和することが示された。マウスＴＮＦαの中和は、インフリキシマブでは観測されなかったことから、中和能力が、本発明の抗体と比較して全体的に低いことが示される。
【０１９８】
実施例１０
ヒツジ血液由来ポリクローナル抗体の、マウスＴＮＦαへの結合
インフリキシマブ及び血液由来ヒツジポリクローナル抗体（インタクトな抗ＴＮＦα）の力価を、間接ＥＬＩＳＡによって求めた。コーティングバッファ（８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４を含有するリン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて、Immulon（登録商標）4HBX平底マイクロフィルタプレート（Thermo Scientific）を、マウス組換えＴＮＦαで、１μｇ／ｍＬ（１００μｌ／ウェル）の濃度にてコーティングして、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを、０．１％Tween 20を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄して、ＰＢＳ中２．５％ウシ胎仔血清（１５０μｌ／ウェル）で３７℃にて２時間ブロックした。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄して、抗ＴＮＦαポリクローナル抗体組成物（カプリル酸６ｖ／ｖ％を用いて精製して、ガラスマイクロファイバー及び０．２μｍフィルタを用いて濾過した血清）又はインフリキシマブ（１００μｌ／ウェル）と共に適切な希釈度にてインキュベートした。PolyCAb Bを、陰性対照として用いた。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄して、１００μｌの希釈した（１：１０，０００）ロバ抗ヒツジ抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Sigma）に結合させている）を加えて、３７℃にて１時間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄して、室温に達するようにおよそ４時間放置した１００ｍｌの基質溶液３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加えた。プレートを、室温にて５分間静置した。反応を、５０ｍｌ／ウェルの１Ｍ  ＨＣｌを加えることによって止めて、プレートを、PolarStarプレートリーダーで４５０ｎｍ及び６９０ｎｍにて読んだ。全サンプルを、二反復又は三反復で試験した。５０％の結合力価を、Graph Pad Prism 7を用いて推定した。
【０１９９】
図４は、モノクローナル抗体インフリキシマブが、マウスＴＮＦαに結合しないが、ヒトＴＮＦαに対して産生されたヒツジ由来ポリクローナル抗体が、１１．３５ｍｇ／Ｌ（ＣＶ＝５．５％）の平均ＥＣ５０でこれに結合することを示している。合計２プレートを、三反復（ｎ＝３）で実行した。
【０２００】
実施例１１
細胞生存率アッセイ（マウスＴＮＦα）
血液由来ヒツジポリクローナル抗体（インタクトな抗ＴＮＦα−カプリル酸６ｖ／ｖ％を用いて精製して、ガラスマイクロファイバー及び０．２μｍフィルタを用いて濾過した血清）及びインフリキシマブ（Schering-Plough Ltd）の中和能力を評価して、ニュートラルレッド吸収（ＮＲＵ）ベースのアッセイを用いて定量化した。ＴＮＦαに曝されると細胞死を経験することが知られているL929細胞を用いた。L929細胞を７．５×１０３／ウェル（１００μＬ）にて播種して、５％ＣＯ２加湿雰囲気内で３７℃にておおよそ２４時間増殖させたインジケータプレートを用いて、アッセイを実行した。
【０２０１】
１０％熱不活化ウシ胎仔血清（Sigma）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Sigma）、及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Sigma）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma）を用いて、L929細胞を維持した。３０ｍＬの培地中２×１０５の密度にて毎週播種した細胞を、７５ｃｍ２のフラスコ内で維持した。細胞は、ルーチン的に維持した。
【０２０２】
抗体サンプル毎に、２倍の連続希釈を、９６ウェル希釈プレートにおいてＤＭＥＭを用いて実行してから、ＴＮＦαを含有する培地の等量を加えた。マウスＴＮＦαの固定濃度を用いて（抗原投与量＝５ｎｇ／ｍｌ）、ＬＣ９８（９８％の細胞死が起きる致死濃度）に基づいた。この濃度は、細胞球状化を１００％近く引き起こすのに十分であることが示された。ＴＮＦα細胞障害性曲線を、アッセイ間変動についての対照としてプレート毎に含めて、抗原安定性及び再現性を監視した。
【０２０３】
ＤＭＥＭ中の抗体は、陰性対照としての機能を果たし、そしてＴＮＦα抗原投与量は、陽性対照としての機能を果たした。希釈プレートを、室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、希釈プレート由来の１００μＬのサンプルを、１００μｌの培地を含有するインジケータプレート内の対応するウェルに移した。こうして、総容量を２００μｌとした。続いて、インジケータプレートを、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ内に戻した。４８時間後、プレートをリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄してから、１００μｌの脱色溶液（５０％エタノール及び１％酢酸）を加えて、プレートロッカー上に１５分間置いた。プレートを、５４０ｎｍ（試験測定）及び６９０ｎｍ（バックグラウンド測定）の波長にて、PolarStarプレートリーダーで読んだ。バックグラウンド測定値を試験測定値から減算することによって、ウェル毎の吸光度を算出した。細胞死パーセンテージを、以下のように算出した：
【数４】
2021531301.tif 000009
【０２０４】
細胞単層の５０％を保護するのに必要とされる希釈を、GraphPad Prism 7を用いて推定した。
【０２０５】
図５は、インフリキシマブが、マウスＴＮＦαに曝された細胞に保護を付与しないことを示している。これに対して、ヒツジポリクローナル抗体について、９５．１５μｇ／ｍｌ（ＣＶ＝２５．６％）の平均ＥＣ５０が観察され、そして約１００％の生存率が、より高い用量にて観察された。合計５プレートを、別々の３日に二反復（ｎ＝２）で実行した。
【０２０６】
実施例１２
口腔粘膜炎を処置するための組成物の製剤化
本発明の血液由来ヒツジポリクローナル抗体を、以下のように、経口投与用のマウスウォッシュとして製剤化する：
【０２０７】
【表４】
2021531301.tif 000010
【０２０８】
実施例１３
ケーススタディ（処置）
５０歳の男性が、口腔粘膜炎と診断されている。対象は、実施例１２の１０ｍｌのマウスウォッシュを１日４回使用するように、彼の医師によって指図されている。マウスウォッシュを、口腔周りに２〜３分間渦巻かせてから吐き出す。口腔粘膜炎（又はその病徴）がもはや存在しなくなるまで、処置が継続される。
【０２０９】
実施例１４
ケーススタディ（予防）
乳癌のためのフルオロウラシル処置を受けている３２歳の女性が、彼女の医師によって、口腔粘膜炎のリスクが高いと考えられている。対象は、実施例１２の１０ｍｌのマウスウォッシュを１日４回使用するように、彼女の医師によって指図されている。マウスウォッシュを、口腔周りに２〜３分間渦巻かせてから吐き出す。処置を、対象の化学療法レジメンの期間継続し、その後、医師による評価により、口腔粘膜炎（又はその病徴）が検出されない（すなわち、本発明によって予防された）ことが明らかにされる。
【０２１０】
配列
配列番号１
【化１】
2021531301.tif 000011
配列番号２
【化２】
2021531301.tif 000012
配列番号３
【化３】
2021531301.tif 000013
配列番号４
【化４】
2021531301.tif 000014
配列番号５
ＶＲＳＳＳＲＴＰ
配列番号６
ＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲ
配列番号７
ＮＧＶＥＬＲ
配列番号８
ＶＰＳＥＧ
配列番号９
ＣＰＳＴＨＶＬ
配列番号１０
ＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫ
配列番号１１
ＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫ
配列番号１２
ＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡ
配列番号１３（変異ヒトＴＮＦα  Ｐ８４Ｌ）
【化５】
2021531301.tif 000015
【０２１１】
上の明細書において述べた全ての刊行物は、参照によって本明細書中で組み込まれる。本発明の記載される方法及びシステムの種々の改変及び変形が、本発明の範囲及び精神から逸脱しない範囲で当業者に明らかであろう。特定の好ましい実施形態との関連で本発明を説明してきたが、特許請求される本発明が、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に自明である、本発明を実行するための記載される態様の種々の改変が、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
2021531301.tif 000016
【図２】
2021531301.tif 000017
【図３】
2021531301.tif 000018
【図４】
2021531301.tif 000019
【図５】
2021531301.tif 000020
【配列表】
2021531301000001.app
【国際調査報告】
2021531301.tif 000021
2021531301.tif 000022
2021531301.tif 000023
2021531301.tif 000024