(57)【要約】  本発明は、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）結合抗体およびその使用に関する。 【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）結合抗体であって、前記抗体は、顕著に改善された、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子へのＬＡＧ−３の結合を阻害する作用を有する、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）結合抗体。
【請求項２】
下記のアミノ酸配列：
配列４１、配列４５、配列４９、配列５３、配列５７、配列６１、配列７５または配列７７
を含む重鎖可変領域と、
下記のアミノ酸配列：
配列４３、配列４７、配列５１、配列５５、配列５９または配列６３
を含む軽鎖可変領域と
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
下記の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含む、請求項１または２に記載の抗体：
（１）アミノ酸配列４１と４３；
（２）アミノ酸配列４５と４７；
（３）アミノ酸配列４９と５１；
（４）アミノ酸配列５３と５５；
（５）アミノ酸配列５７と５９；
（６）アミノ酸配列６１と６３；
（７）アミノ酸配列７５と４３；または
（８）アミノ酸配列７７と４３。
【請求項４】
アミノ酸配列４１からなる重鎖可変領域と、アミノ酸配列４３からなる軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
（ａ）配列ＳＹＧＩＳ（配列８８）からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列８９）からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列ＤＧＷＷＥＬＬＲＰＤＤＡＦＤＩ（配列９０）からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）配列ＳＧＤＫＬＧＤＫＹＡＹ（配列９１）からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列ＹＤＳＤＲＰＳ（配列９２）からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列ＱＶＷＤＳＳＳＤＱＶＶ（配列９３）からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域とを含む、単離された抗ＬＡＧ−３抗体。
【請求項６】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
（１）重鎖可変領域はアミノ酸配列４１からなり、軽鎖可変領域はアミノ酸配列４３からなり、
（２）重鎖可変領域はアミノ酸配列７５からなり、軽鎖可変領域はアミノ酸配列４３からなり、および
（３）重鎖可変領域はアミノ酸配列７７からなり、軽鎖可変領域はアミノ酸配列４３からなる、
請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ＬＡＧ−３結合抗体フラグメントである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２フラグメントである、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
完全長抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
ＩｇＧ抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
単一特異性抗体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
多重特異性抗体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記多重特異性抗体は二重特異性抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
前記二重特異性抗体は、第２の生体分子に結合する第２の結合ドメインを含み、前記第２の生体分子は細胞表面抗原である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
前記細胞表面抗原は腫瘍抗原である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体に連結された治療剤を含む免疫複合体。
【請求項１９】
前記治療剤は細胞毒性剤である、請求項１８に記載の免疫複合体。
【請求項２０】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１８または１９に記載の免疫複合体を含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１７または２０に記載の医薬組成物を収容する容器と、前記医薬組成物の使用を説明するプロトコルとを含む、製品。
【請求項２２】
一つ以上のその他の薬剤を収容する一つ以上の容器をさらに含む、請求項２１に記載の製品。
【請求項２３】
前記その他の薬剤は、免疫刺激抗体、化学療法剤、および抗ウイルス薬からなる群より選択される一つ以上である、請求項２２に記載の製品。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２５】
請求項２４に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
前記宿主細胞は哺乳動物細胞である、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を調製する方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞または培地から前記抗体またはＬＡＧ−３結合抗体フラグメントを回収することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、前記Ｔ細胞を請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体と接触させることにより抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激することを含む方法。
【請求項３２】
被験者の免疫反応を刺激する方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を前記被験者に投与することにより前記被験者の免疫反応を刺激することを含む方法。
【請求項３３】
前記被験者は腫瘍を有する被験者であり、しかも前記被験者に投与した請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体は、前記腫瘍に対する免疫反応を刺激した、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験者はウイルス保有者であり、しかも前記被験者に投与した請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体は、前記ウイルスに対する免疫反応を刺激した、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を被験者に投与することを含む、被験者における腫瘍細胞増殖を阻害する方法。
【請求項３６】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を被験者に投与することを含む、被験者におけるウイルス感染を治療する方法。
【請求項３７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体が、一つ以上のその他の薬剤と組み合わせて使用される、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記その他の薬剤は、免疫刺激抗体、抗癌薬、または抗ウイルス薬のうち選択される一つ以上である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫刺激抗体は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、および抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群より選択される一つ以上である、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体の分野に関し、該抗体の使用および調製方法に関する。具体的には、本発明は、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）結合抗体および疾患の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球活性化遺伝子−３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ−３）、すなわち、ＬＡＧ−３は、ＣＤ２２３とも称され、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの一つの膜タンパク質である。その分子量は７０ＫＤａであり、ヒト染色体１２（２０ｐ１３．３）に位置している。該膜タンパク質は、一つのＶ領域と三つのＣ２領域との四つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含む。ＣＤ４分子と比較して、それらが染色体における位置は似ており、しかもそれら二つの分子とも一部の共同アミノ酸（＜２０％）を含む。そのため、それらが同じ遺伝子から進化したと一部の科学者は考えられている［１］。ＬＡＧ−３をコードするＤＮＡは８つのエクソンがある。当該分子の細胞外領域は、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４の四つの部分で構成されている。Ｄ１領域には、３０のアミノ酸からなる環状構造があり、特異性を有する。また、Ｄ１はＶシリーズ免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４はＣ２シリーズ免疫グロブリンスーパーファミリーに属す。Ｄ１とＤ３領域、Ｄ２とＤ４領域には、多くのアミノ酸配列は一致しており、これは、２つのＩｇＳＦ領域遺伝子が複製して４つの領域になったからかもしれない。細胞質領域は、（１）ＣＤ４のプロテインキナーゼのＣサイトに似ている可能性のあるセリンリン酸化サイトＳ４５４；（２）他の既知のタンパク質とは異なる保存的なＫＩＥＥＬＥ配列モチーフ；（３）重複したＥＰ配列の三つの部分からなる［２］。
【０００３】
ＬＡＧ−３のほとんどは、Ｄ１領域に形成された二量体を介して細胞膜に発現される。成熟したＬＡＧ−３は、細胞膜上で切断されて相対分子量が５４０００である可溶性部分ｐ５４（Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３からなる）と、相対分子量が１６０００である膜貫通‐細胞質部分ｐ１６とになることができる［３］。完全なＬＡＧ−３分子切断は、Ｄ４領域と膜貫通領域との間に生じる２０のアミノ酸リンカーペプチドのタンパク質溶解反応である。細胞膜上のＬＡＧ−３分子は可溶性分子に切断され、膜貫通マトリックスメタロプロテイナーゼＡＭＡＤ１０およびＡＭＡＤ１７によって調節され、ＴＣＲシグナル伝達経路はこれら２つの調節モードで重要な役割を果たす［４］。
【０００４】
ＬＡＧ−３分子は主に、活性化されたＮＫ細胞及びＴリンパ球の表面に発現し、高親和性でＨＬＡ−ＩＩに結合し、リンパ球の活性化に寄与する［５，２］。ＬＡＧ−３は、Ｔリンパ球の増殖活性化およびＴ細胞の動的平衡を負に制御し［６］、ＬＡＧ−３の異所性発現もＴ細胞の調節に寄与する。Ｗｏｒｋｍａｎ［７］らの研究によって、ＬＡＧ−３欠損の高齢マウス体内のＴ細胞の数は野生型の２倍であり、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＬＡＧ−３−のＴ細胞はリンパ球の増殖を促進し、安定状態を維持することができ、この機能は、野生型においてＬＡＧ−３の異所性発現によって中止したことは発見された。また、抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体によるインビボ治療では、ＬＡＧ−３欠損細胞と比較してＴ細胞の増殖を有意に高めることができる。Ｗｏｒｋｍａｎ［８］らはリアルタイム蛍光定量ＰＣＲ研究を通して、形質細胞様樹状細胞の表面でのＬＡＧ−３の発現は、制御性Ｔ細胞または活性化エフェクターＴ細胞の表面発現の１０倍であることを発見し、これは、形質細胞様樹状細胞の生物学的機能に重要な役割を果たすことを示している。
【０００５】
Ｔｈ１細胞はＬＡＧ−３を発現するが、Ｔｈ２細胞は発現しないか低発現化する。ＩＬ−１２は、ＬＡＧ−３分子の発現を刺激する最大の可能性を有する［９］。ＬＡＧ−３分子は、Ｔ細胞の増殖を負に調節し、記憶Ｔ細胞プールを制御する［１０］。この負の調節機能は、ＬＡＧ−３：ＭＨＣクラスＩＩ分子との結合と密接に関係し、その細胞質領域の構造のシグナル伝達を介する必要があり、特に高度に保存的なＫＩＥＥＬＥ配列と最も密接に関連している。この調節機能は、ＣＤ４分子と競合してＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することではない。したがって、ＬＡＧ−３は独立した負の調節分子である［２］。
【０００６】
ＬＡＧ−３はＣＤ４＋Ｔ細胞細胞を負に調節し、ＬＡＧ−３：ＭＨＣクラスＩＩ分子の相互作用下で、その細胞内シグナル伝達により、ＣＤ４Ｔｈ１細胞の増殖とサイトカイン分泌（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦなど）を阻害する。しかし、抗ＬＡＧ−３抗体はその機能を回復し、細胞増殖と関連因子の分泌を促進することができる［１１］。
【０００７】
ＬＡＧ−３分子はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性をも負に調節し、マウス実験では、ＬＡＧ−３分子を阻害することでＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を増加させることができ、その細胞毒性活性を増加することもでき、ＩＦＮ−γは有意に増加し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して直接的な調節作用がある。ＬＡＧ−３とＣＤ８＋Ｔ細胞の作用中、ＣＤ４＋Ｔ細胞の寄与は必要ではない［２，１１］。
【０００８】
ＬＡＧ−３分子は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の阻害機能に対して直接的な調節効果を有し［１１，１２］、Ｔｒｅｇ細胞が機能を果たすための必要な分子である。抗ＬＡＧ−３抗体はＴｒｅｇ細胞の機能を有意に阻害することができ、しかも細胞機能の最大化程度と密接に関連している。また、抗ＬＡＧ−３抗体は、Ｔｒｅｇ細胞の機能を阻害することでエフェクターＴ細胞を増殖させることもできるが、Ｔｒｅｇ細胞のアポトーシスを促進することはできない［１３］。同時に、エフェクターＴ細胞はＴｒｅｇ細胞でのＬＡＧ−３分子の発現を用量依存的に増加させることができる。また、ＬＡＧ−３の異所性発現はＴｒｅｇ細胞の調節機能にも関連している。これから見ると、ＬＡＧ−３はリンパ球の内部環境の安定化に対して非常に重要な役割を果たしている［１４］。また、Ｌｉａｎｇら［１５］は、Ｔｒｅｇ細胞の表面のＬＡＧ−３分子と樹状細胞膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子との間の細胞‐細胞接触作用により、Ｔｒｅｇ細胞が細胞質シグナル伝達を介して樹状細胞の成熟を阻害できることを発見した。そして、この効果には、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）経路の介在が必要である。
【０００９】
腫瘍の発展において、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は腫瘍組織内で細胞数が増えるが、その機能は部分的に失われる。抗ＬＡＧ−３抗体の使用またはＬＡＧ−３遺伝子の除去により、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を回復できる。ＣＤ８＋Ｔ細胞の数とその細胞毒性を増加させると、サイトカイン分泌も増加する。また、ＬＡＧ−３の機能をブロックした後、腫瘍組織における細胞毒性Ｔリンパ球の数と機能は明らかに増加し、腫瘍の成長が抑制されたため、ＬＡＧ−３分子の発現を阻害することでリンパ球の免疫機能を回復でき、腫瘍の発展を阻害できると思われる。Ｇａｎｄｈｉら［１３］は、ホジキンリンパ腫患者の腫瘍組織および末梢血において、ＬＡＧ−３がリンパ球で高度に発現していることを発見した。腫瘍組織における特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能は明らかに損なわれ、高度に発現したＬＡＧ−３および／またはＦｏｘＰ３のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数と負の関連がある。ＬＡＧ−３＋Ｔ細胞を除去すると、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍機能が回復し、サイトカイン分泌が増加することが分かる。したがって、ＬＡＧ−３の発現は特異性Ｔ細胞の免疫負調節機能に関連しており、ＬＡＧ−３分子の機能を阻害することで特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍効果を高めることができ、この分子は、潜在的な腫瘍免疫治療の標的である可能性がある。
【００１０】
慢性ウイルス感染症ではＴ細胞衰弱はしばしば発生する。Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ［１６］らは研究により、ＣＤ８＋Ｔ細胞の衰弱が複数の阻害性受容体の共発現によって負に調節されることを発見した。衰弱したＣＤ８＋Ｔ細胞は７つの阻害性受容体を発現することができる。複数の異なる阻害性受容体の共発現は、Ｔ細胞衰弱およびより深刻な感染と密接に関連しており［１７］、Ｔ細胞阻害性受容体ＰＤ−１及びＬＡＧ−３を遮断すると、相乗的にＴ細胞応答を高め、体内のウイルス量を低めることができる。Ｋｏｎｎａｉ［１８］らは、ウシ白血病ウイルスを感染した牛体内の細胞のＬＡＧ−３の発現について分析した結果、ＬＡＧ−３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＬＡＧ−３＋ＣＤ３＋細胞に結合したＭＨＣクラスＩＩ分子が対照群よりも有意に高いことを発見した。対照群および無症候性群牛と比較して、ウイルス感染が持続している牛の末梢血単核細胞上のＬＡＧ−３分子の平均蛍光強度は有意に増加した。そして、ＰＤ−１とＬＡＧ−３の遮断実験により明らかに、ウイルス感染が持続している牛の末梢血単核細胞でＰＤ−１とＬＡＧ−３抗体を増加させるとＩＮＦ−γとＩＬ−２の発現をアップレギュレートすることができる。上記発見により、ウイルスに感染した場合、Ｔ細胞はＬＡＧ−３分子の制限効果およびＭＨＣクラスＩＩシグナル分子の発現を通じてその阻害機能を発揮し、ＬＡＧ−３もウイルス免疫治療の標的である可能性があることは示されている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は下記項に係る。
１．リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）結合抗体であって、前記抗体は、顕著に改善された、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子へのＬＡＧ−３の結合を阻害する作用を有する、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）結合抗体。
２．下記のアミノ酸配列：
配列４１、配列４５、配列４９、配列５３、配列５７、配列６１、配列７５または配列７７
を含む重鎖可変領域と、
下記のアミノ酸配列：
配列４３、配列４７、配列５１、配列５５、配列５９または配列６３
を含む軽鎖可変領域と
を含む、項１に記載の抗体。
３．下記の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含む、項１または２に記載の抗体：
（１）アミノ酸配列４１と４３；
（２）アミノ酸配列４５と４７；
（３）アミノ酸配列４９と５１；
（４）アミノ酸配列５３と５５；
（５）アミノ酸配列５７と５９；
（６）アミノ酸配列６１と６３；
（７）アミノ酸配列７５と４３；または
（８）アミノ酸配列７７と４３。
４．アミノ酸配列４１からなる重鎖可変領域と、アミノ酸配列４３からなる軽鎖可変領域とを含む、項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
５．（ａ）配列ＳＹＧＩＳ（配列８８）からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列８９）からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列ＤＧＷＷＥＬＬＲＰＤＤＡＦＤＩ（配列９０）からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）配列ＳＧＤＫＬＧＤＫＹＡＹ（配列９１）からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列ＹＤＳＤＲＰＳ（配列９２）からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列ＱＶＷＤＳＳＳＤＱＶＶ（配列９３）からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域とを含む、単離された抗ＬＡＧ−３抗体。
６．重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
（１）重鎖可変領域はアミノ酸配列４１からなり、軽鎖可変領域はアミノ酸配列４３からなり、
（２）重鎖可変領域はアミノ酸配列７５からなり、軽鎖可変領域はアミノ酸配列４３からなり、および
（３）重鎖可変領域はアミノ酸配列７７からなり、軽鎖可変領域はアミノ酸配列４３からなる、
項５に記載の抗体。
７．モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
８．ＬＡＧ−３結合抗体フラグメントである、項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
９．前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２フラグメントである、項８に記載の抗体。
１０．完全長抗体である、項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
１１．ＩｇＧ抗体である、項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
１２．単一特異性抗体である、項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
１３．多重特異性抗体である、項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
１４．前記多重特異性抗体は二重特異性抗体である、項１３に記載の抗体。
１５．前記二重特異性抗体は、第２の生体分子に結合する第２の結合ドメインを含み、前記第２の生体分子は細胞表面抗原である、項１４に記載の抗体。
１６．前記細胞表面抗原は腫瘍抗原である、項１５に記載の抗体。
１７．項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
１８．項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体に連結された治療剤を含む免疫複合体。
１９．前記治療剤は細胞毒性剤である、項１８に記載の免疫複合体。
２０．薬学的に許容される担体をさらに含む、項１８または１９に記載の免疫複合体を含む医薬組成物。
２１．項１７または２０に記載の医薬組成物を収容する容器と、前記医薬組成物の使用を説明するプロトコルとを含む、製品。
２２．一つ以上のその他の薬剤を収容する一つ以上の容器をさらに含む、項２１に記載の製品。
２３．前記その他の薬剤は、免疫刺激抗体、化学療法剤、および抗ウイルス薬からなる群より選択される一つ以上である、項２２に記載の製品。
２４．項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
２５．項２４に記載の単離された核酸を含むベクター。
２６．項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
２７．前記宿主細胞は哺乳動物細胞である、項２６に記載の宿主細胞。
２８．前記哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、項２７に記載の宿主細胞。
２９．項２６〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することを含む、項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を調製する方法。
３０．前記宿主細胞または培地から前記抗体またはＬＡＧ−３結合抗体フラグメントを回収することをさらに含む、項２９に記載の方法。
３１．抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、前記Ｔ細胞を項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体と接触させることにより抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激することを含む方法。
３２．被験者の免疫反応を刺激する方法であって、項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を前記被験者に投与することにより前記被験者の免疫反応を刺激することを含む方法。
３３．前記被験者は腫瘍を有する被験者であり、しかも前記被験者に投与した項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体は、前記腫瘍に対する免疫反応を刺激した、項３２に記載の方法。
３４．前記被験者はウイルス保有者であり、しかも前記被験者に投与した項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体は、前記ウイルスに対する免疫反応を刺激した、項３２に記載の方法。
３５．項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を被験者に投与することを含む、被験者にの腫瘍細胞増殖を阻害する方法。
３６．項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体を被験者に投与することを含む、被験者にのウイルス感染を治療する方法。
３７．項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体が、一つ以上のその他の薬剤と組み合わせて使用される、項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．前記その他の薬剤は、免疫刺激抗体、抗癌薬、または抗ウイルス薬からなる群より選択される一つ以上である、項３７に記載の方法。
３９．前記免疫刺激抗体は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、および抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群より選択される一つ以上である、項３８に記載の方法。
４０．抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激するための薬剤の調製における、項１〜１６のいずれか一項に記載抗体の使用。
４１．被験者において免疫反応を刺激するための薬剤の調製における、項１〜１６のいずれか一項に記載抗体の使用。
４２．前記被験者は腫瘍を有する被験者であり、しかも前記被験者に投与した項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体は、前記腫瘍に対する免疫反応を刺激した、項４１に記載の使用。
４３．前記被験者はウイルス保有者であり、しかも前記被験者に投与した項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体は、前記ウイルスに対する免疫反応を刺激した、項４２に記載の使用。
４４．被験者における腫瘍細胞増殖を阻害するための薬剤の調製における、項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体の使用。
４５．被験者におけるウイルス感染を治療するための薬剤の調製における、項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体の使用。
４６．項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体が、一つ以上のその他の薬剤と組み合わせて使用される、項４０〜４５のいずれか一項に記載の使用。
４７．前記その他の薬剤は、免疫刺激抗体、抗癌薬、または抗ウイルス薬からなる群より選択される一つ以上である、項４６に記載の使用。
【発明の詳細】
【００１２】
1．定義
本文の用語の「抗体」は広義に使用され、様々な抗体構造をカバーし、ＬＡＧ−３への結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを含むが、これらに限られていない。
【００１３】
本文で使用される用語の「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の群から得られた抗体のことであり、すなわち、該群を構成する個別の抗体は同一であり、および／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然に存在する突然変異またはモノクローナル抗体の調製中に発生する突然変異を含むような可能な変異抗体を除くと、このような変異体は一般に微量で存在する。異なるエピトープに対する異なる抗体を含む典型的なポリクローナル抗体製剤と比較して、モノクローナル抗体製剤における各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対する。よって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体群から得られることを特徴とする抗体のことであり、いずれかの特定の方法で調製する必要のある抗体と見なすべきではない。例えば、本発明のモノクローナル抗体は複数の技術によって製造することができ、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限られていない。
【００１４】
用語の「完全長抗体」、「完全抗体」は、本文で互いに置き換えて使用でき、天然抗体の構造と基本的に類似した構造を有する抗体を指す。
【００１５】
「ヒト抗体」は、「ヒト抗体」、「完全なヒト抗体」、または「全ヒト抗体」とも呼ばれ、アミノ酸配列が、ヒトまたはヒト細胞により生じるか、ヒト抗体系統（Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｎｅａｇｅ）またはその他のヒト抗体のコード配列を利用した非ヒト由来の抗体に由来するアミノ酸配列に対応する抗体のことである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外している。ヒト抗体は、例えば、下記文献：Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，第７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）などに記載されている、ファージディスプレイライブラリー技術を含む、本分野で既知の様々な技術を使用して調製することができる。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を生じさせるように修飾されているが、その内因性遺伝子座が不活化になっているトランスジェニック動物（例えば、免疫異種マウス）に抗原を投与することにより、調製することができる（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術について、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成したヒト抗体について、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）を参照できる。
【００１６】
用語の「キメラ」抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体をいう。
【００１７】
「ヒト共通フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的にみられるアミノ酸残基を表すフレームワークのことである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般に、配列サブグループは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ  （１９９１）、第１〜３巻のサブグループのようなものである。一実施形態では、ＶＬについて、前記サブグループは、Ｋａｂａｔら（同上）によって記載されているサブグループκIである。一実施形態では、ＶＨについて、前記サブグループは、Ｋａｂａｔら（同上）によって記載されているサブグループＩＩＩである。
【００１８】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基およびヒトＦＲに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施形態では、ヒト化抗体は、実質的にすべての中の少なくとも一つおよび典型的に二つの可変ドメインを含み、すべてまたは実質的にすべてのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）が非ヒト抗体のＨＶＲに対応し、しかもすべてまたは実質的にすべてのＦＲがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化された抗体を指す。
【００１９】
本文で使用される用語の「超可変領域」または「ＨＶＲ」とは、抗体可変ドメインにおいて、高い配列可変性（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる）を有する、および／または確定した構造を有するループ（「超可変ループ」）が形成している、および／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む各領域を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み、ＶＨには３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）があり、ＶＬには３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）がある。本文で例示的なＨＶＲは下記のものを含む：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）に現れる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）に現れるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）および９３−１０１（Ｈ３）に現れる抗原接触点（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））；および
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）および９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組み合わせ。
【００２０】
別途説明する場合を除き、ＨＶＲ残基および可変ドメイン内のその他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本文においてＫａｂａｔら（同上）に従って番号付けられる。
【００２１】
用語の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関連する抗体重鎖または軽鎖ドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖（それぞれＶＨとＶＬである）の可変ドメインは一般に類似した構造を持ち、各ドメインには４つの保存的フレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）が含まれる（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版参照）。単一のＶＨまたはＶＬドメインでは抗原結合特異性を付与するには十分である。また、特定の抗原に結合する抗体に由来するＶＨまたはＶＬドメインを使用してその抗原に結合する抗体を単離して、相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングすることができる（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）参照）。
【００２２】
「抗体フラグメント」とは、完全な抗体の他に、完全な抗体中の、当該完全な抗体が結合する抗原の一部に結合する分子を指す。抗体フラグメントの実例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二機能性抗体；直鎖状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限られていない。
【００２３】
本文で使用される用語の「細胞毒性剤」とは、細胞機能を阻害または防止し、および／または細胞死亡または破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性剤は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕ放射性同位体）；化学療法剤または薬剤（例えば、メトトレキサート、アデリミシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）；成長阻害剤；リボ分解酵素のような酵素およびそのフラグメント；抗生物質；そのフラグメントおよび／または変異体を含む、細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒性のような毒素；本分野で既知の様々な抗腫瘍薬または抗癌剤を含むが、これらに限られていない。
【００２４】
「免疫複合体」は、抗体が一つ以上の異種分子（細胞毒性剤を含むが、これに限られていない）である複合体である。
【００２５】
「被験者」または「個体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウス、ラット）を含むが、これらに限られていない。ある実施形態では、前記被験者または個体はヒトである。
【００２６】
用語の「プロトコル」とは、通常治療製品の商業包装に含まれる説明書を指し、適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症および／またはこのような治療製品の使用に関する警告などの情報が含まれている。
【００２７】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合サイトとその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途説明する場合を除き、本文で使用されるように、「結合親和性」とは、結合パートナーメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本文で説明するそれらの方法を含む、本分野で既知の常用方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的および例示的な実施形態は後文で説明する。
【００２８】
参照ポリペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、候補配列を参照ポリペプチド配列にアライメントして必要に応じてギャップを導入することで最大の配列同一性パーセンテージを実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じのアミノ酸残基のパーセンテージである。アミノ酸配列の同一性パーセンテージを確定することは、本分野の複数種類の手段によって実現でき、例えば、公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧｈまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、該パラメータは、アライメントされる配列のフルサイズに対して最大のアライメントを実現するための如何なるアルゴリズムを含む。
【００２９】
例えば、ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのアミノ酸配列同一性％は以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
ここで、Ｘは、ＡおよびＢのプログラムアライメントを実行する時に、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２において同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なることを理解されたい。別途説明する場合と除き、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性％は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【００３０】
２．抗体、調製方法、組成物、および製品
１）抗体
本発明は抗ＬＡＧ−３抗体に係る。一部の実施形態では、本発明は、（ａ）配列８８のアミノ酸配列、または該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列８９のアミノ酸配列、または該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列９０のアミノ酸配列、または該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列９１のアミノ酸配列、または該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列９２のアミノ酸配列、または該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列９３のアミノ酸配列、または該配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群より選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの超可変領域（ＨＶＲ）またはいわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む結合ドメインを含む抗ＬＡＧ−３抗体を提供する。場合によって、抗ＬＡＧ−３抗体が有する重鎖可変（ＶＨ）ドメイン（領域）は、配列４１、７５、または７７と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、または配列４１、７５または７７のアミノ酸配列を含んでもよく、および／またはその軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（領域）は、配列４３と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有するアミノ酸配列、または配列４３のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
一部の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、下記のアミノ酸配列：
配列４１、配列４５、配列４９、配列５３、配列５７、配列６１、配列７５または配列７７を含む重鎖可変領域と、
下記のアミノ酸配列：
配列４３、配列４７、配列５１、配列５５、配列５９または配列６３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は下記の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせを含む：
（１）アミノ酸配列４１と４３；
（２）アミノ酸配列４５と４７；
（３）アミノ酸配列４９と５１；
（４）アミノ酸配列５３と５５；
（５）アミノ酸配列５７と５９；
（６）アミノ酸配列６１と６３；
（７）アミノ酸配列７５と４３；または
（８）アミノ酸配列７７と４３。
【００３３】
一部の実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体は、アミノ酸配列４１、配列７５、または配列７７を含む重鎖可変領域と、アミノ酸配列４３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３４】
２）抗体フラグメント
一部の実施形態では、本文で提供される抗体は抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、（Ｆａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖ断片、および後文で説明するその他の断片を含むが、これらに限られていない。一部の抗体フラグメントに関する説明について、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片に関する説明について、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、第２６９−３１５頁（１９９４）；ＷＯ９３／１６１８５、および米国特許第５，５７１，８９４号及び第５，５８７，４５８号を参照できる。
【００３５】
二機能性抗体は、二つの抗原結合サイトを有する抗体フラグメントであり、それは二価または二重特異性でっあってもよい。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照できる。三機能性抗体および四機能性抗体は、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）にも記載されている。
【００３６】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてまたは一部、または軽鎖可変ドメインのすべてまたは一部を含む抗体フラグメントである。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号参照）。
【００３７】
抗体フラグメントは、様々な技術によって生じることができ、それらの技術は完全な抗体のタンパク質加水分解消化および本文に記載の組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）を含むが、これらに限られていない。
【００３８】
３）キメラ抗体およびヒト化抗体
一部の実施形態では、本文で提供される抗体はキメラ抗体である。一部のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）に記載されている。
【００３９】
一部の実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体はヒト化によってヒトに対する免疫原性を低下させるとともに、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持している。一般的に、ヒト化抗体は一つ以上の可変ドメインを含み、その中で、ＣＤＲのようなＨＶＲ（またはその一部）は非ヒト抗体に由来し、且つＦＲ（またはその一部）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部も含んでもよい。一部の実施形態では、ヒト化抗体における一部のＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を修復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基を取得する抗体）からの対応する残基で置換される。
【００４０】
ヒト化抗体およびその製造方法について、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に記載されており、さらに、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号及び第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植が記載されている）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面改質」が記載されている）；Ｄａｌｌ  ａｎｄ  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲ組み換え」が記載されている）；およびＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲ組み換えに対する「ガイド選択」方法が記載されている）に記載されている。
【００４１】
４）ヒト抗体
一部の実施形態では、本文で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、本分野で既知の様々な技術によって生じることができる。
【００４２】
ヒト抗体は、修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与し、抗原でチャレンジして完全なヒト抗体またはヒト可変領域を有する完全な抗体を調製することができる。このような動物は典型的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、染色体外に存在するか、動物染色体にランダムに組み込まれている、すべてまたは一部のヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む。このようなトランスジェニックマウスには、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に不活性化されている。トランスジェニッ動物からヒト抗体を得る方法について、例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術が記載されている）；米国特許第５，７７０，４２９号；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ技術が記載されている）；および米国出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号を参照できる。このような動物により生成した完全な抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに修飾されることができる。
【００４３】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づいた方法によって製造してもよい。ヒトモノクローナル抗体の生成に用いられるヒト骨髄腫およびマウス‐ヒトハイブリッド骨髄腫細胞株が記載されている。例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，第５１−６３頁；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照できる。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成したヒト抗体は、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）にも記載されている。その他の方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からモノクローナルヒトＩｇＭ抗体が生成することは記載されている）およびＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト‐ヒトハイブリドーマが記載されている）に記載の方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（Ｔｒｉｏｍａ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐｈａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）、およびＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）にも記載されている。
【００４４】
ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより調製してもよい。次いで、このような可変ドメイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。本発明の実施例部分は、ファージディスプレイライブラリーを介してヒト抗体をスクリーニングするプロセスを説明している。
【００４５】
具体的には、ＬＡＧ−３結合活性を有する抗体によってコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより、高い親和性を有する本発明の抗体を単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特徴を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法は本分野で知られている。このような方法について、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）を参照でき、しかも、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；およびＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載されている。
【００４６】
一部のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子系統がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単独にクローン化され、ファージライブラリーにランダムに組み換えられ、その後、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載のように、抗原‐結合ファージに対してスクリーニングすることができる。ファージは典型的に、抗体フラグメントを単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントとして示す。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築せずに免疫原に対する高い親和性を有する抗体を提供する。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許公開は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号及び米国特許公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号、および第２００９／０００２３６０号を含む。
【００４７】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体フラグメントは、本文においてヒト抗体またはヒト抗体フラグメントと見なされる。
【００４８】
５）多重特異性抗体
上記の形態のいずれかにおいて、本文で提供される抗ＬＡＧ−３抗体は、二重特異性抗体などの多重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるサイトに結合特異性を有するモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、一つの結合特異性はＬＡＧ−３に対するものであり、もう一つの結合特異性はいずれかその他の抗原（例えば、第２の生体分子、細胞表面抗原、腫瘍抗原）に対するものである。それ相応に、二重特異性抗ＬＡＧ−３抗体は、ＬＡＧ−３、および、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＦｃＲＨ５、ＨＥＲ２、ＬＹＰＤ１、ＬＹ６Ｇ６Ｄ、ＰＭＥＬ１７、ＬＹ６Ｅ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＥＤＡＲ、ＧＦＲＡ１、ＭＲＰ４、ＲＥＴ、Ｓｔｅａｐ１またはＴｅｎＢ２などの腫瘍抗原に対して結合特異性を有し得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することもできる。
【００４９】
多重特異性抗体を製造するための技術は、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖‐軽鎖ペアの組み換え共発現を含むが、これらに限られていない（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）；ＷＯ９３／０８８２９；およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１））ＷＯ２００９／０８０２５３；Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１１１８７−１１１９２（２０１１））、ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１など参照）。
【００５０】
６）抗体変異体
本発明の抗体は、本発明の抗ＬＡＧ−３抗体のアミノ酸配列変異体を包含する。例えば、抗体の結合親和性および／またはその他の生物学的特性をさらに改善するために調製される抗体変異体が必要になる場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、その抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、またはペプチド合成により調製できる。このような修飾は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換を含む。欠失、挿入、および置換を任意に組み合わせて最終構築体を得ることができ、その条件として、最終構築体が所望の特徴、例えば抗原結合、を備える必要がある。
【００５１】
ａ．変異体の置換、挿入、および欠失
一部の実施形態では、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型突然変異誘発の関連サイトはＨＶＲとＦＲを含む。保存的な置換は、下記の「好ましい置換」という見出しの下に表示される。より実質的な変化は、下記の「例示的置換」という見出しの下で提供され、且つ後文でアミノ酸側鎖のタイプを参照しながらさらに説明される。アミノ酸置換を関連抗体に導入し、所望の活性（例えば、抗原結合の保持／改善、またはＡＤＣＣまたはＣＤＣの改善）について生成物をスクリーニングすることができる。
【００５２】
アミノ酸の例示的な置換およびアミノ酸の好ましい置換
共有の側鎖特性に従ってアミノ酸を群分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）アルカリ性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換には、これらのタイプのいずれかのメンバーを別のタイプと交換することが必ず伴われる。
【００５３】
一つのタイプの置換型変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の一つ以上の超可変領域残基の置換に係る。一般的には、更なる研究のために選択された取得した変異体は、ある生物学的特性（例えば、親和性の増加）において親抗体と比較して修飾（例えば、改善）され、および／または実質的に親抗体のある生物学的特性が保持される。例示的な置換型変異体は親和性成熟抗体であり、これは、例えば、ファージディスプレイの親和性成熟技術（本文に記載のようなもの）に基づいて便利に生じることができる。一言でいうと、一つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させて変異抗体をファージ上に提示され、しかも特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【００５４】
一部の実施形態では、そのような変化が実質的にＬＡＧ−３への抗体の結合能力を損なわない限り、一つ以上のＨＶＲ（ＣＤＲ）内で置換、挿入または欠失は起こってもよい。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変化（例えば、本文で提供される保存的置換）をＨＶＲにおいて行うことができる。例えば、そのような変化は、ＨＶＲ中の抗原接触残基以外のところにあることができる。上記で提供されたＶＨおよびＶＬ配列を変異させる一部の実施形態では、各ＨＶＲは変化しないか、１、２または３個以下のアミノ酸置換を含む。
【００５５】
Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されているように、突然変異誘発を行うために標的とすることができる抗体残基または領域を識別するために適用する方法は、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。
【００５６】
７）組み換え方法
本発明の抗ＬＡＧ−３抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組み換え方法で調製することができる。一実施形態では、本文に記載の抗ＬＡＧ−３抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、該抗体（例えば、該抗体の軽鎖および／または重鎖）のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはそのＶＨを含むアミノ酸配列をコードすることができる。別の一実施形態では、このような核酸を含む1つ以上のベクター（例：発現ベクター）が提供される。別の一実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施形態では、宿主細胞は、（１）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸のベクター；または、（２）該抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、および該抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、改質転換によってそれを有する）。一実施形態では、該宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ球様細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの真核細胞である。一実施形態では、抗ＬＡＧ−３抗体を製造する方法が提供され、該方法は、該抗体の発現に適した条件下で前文で提供された該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および該宿主細胞（または宿主細胞の培地）から該抗体を回収してもよいことを含む。
【００５７】
抗ＬＡＧ−３抗体を組み替えて生成するために、抗体をコードする核酸を単離し（例えば、上記のように）、且つ宿主細胞においてさらにクローニングおよび／または発現するために一つ以上のベクターを挿入する。このような核酸は、通常の手順（例えば、該抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）を使用して容易に単離して配列決定できる。
【００５８】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、本文に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、特にグリコシル化とＦｃエフェクター機能が必要ではない場合に、細菌内に抗体を生成させてもよい。細菌において抗体フラグメントとポリペプチドを発現することについて、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、および第５，８４０，５２３号を参照できる。発現後、可溶性部分中の抗体を細菌の細胞質から分離し、さらに精製することができる。
【００５９】
原核生物の他に、糸状菌や酵母などの真核微生物も、抗体をコードするベクターの適切なクローニングまたは発現宿主であり、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンを生成するためにグリコシル化経路がすでに「ヒト化」された抗体の真菌および酵母菌株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）；およびＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照できる。
【００６０】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞も多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の実例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞に結合するために使用可能な多くの、特にスポドプテラ・フルギぺルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのための、バキュロウイルス株が特定されている。
【００６１】
植物細胞培養物も宿主として使用できる。米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、および第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術が記載されている）を参照できる。
【００６２】
脊椎動物細胞も宿主とすることができる。例えば、懸濁液中での増殖に適した哺乳動物細胞株は適している場合がある。哺乳動物宿主細胞株が適用されるその他の実例として、ＳＶ４０形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎細胞株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されている２９３または２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載のＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞が挙げられる。その他の適用される哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；およびＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０のような骨髄腫細胞株を含む。抗体の生成に適する一部の哺乳動物宿主細胞株に関する説明について、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）、第２５５−２６８頁（２００３）を参照できる。
【００６３】
８）免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤または化学療法薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素活性毒素またはそのフラグメント）または放射性同位体などの一つ以上の細胞毒性剤に本文の抗ＬＡＧ−３抗体が結合した免疫複合体を提供する。
【００６４】
一実施形態では、免疫複合体は抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）であり、抗体は、メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１参照）；モノメチルオルリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）などのオルリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号、第５，７８０，５８８号、および第７，４９８，２９８号参照）；ドラスチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号および第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３）；およびＬｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２５−２９２８（１９９８））、メトトレキサート；ビンクリスチン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル（ｌａｒｏｔａｘｅｌ）、テセタキセル（ｔｅｓｅｔａｘｅｌ）、およびオルタタキセル（оｒｔａｔａｘｅｌ）などのタキサン；トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）；およびＣＣ１０６５を含むが、これらに限られていない一つ以上の薬剤に結合する。
【００６５】
別の一実施形態では、免疫複合体は、本文に記載の抗ＬＡＧ−３抗体と酵素活性毒素またはそのフラグメントとの複合体を含み、該酵素活性毒素は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖およびトリコテセン-マイコトキシンなどを含むが、これらに限られていない。
【００６６】
別の一実施形態では、免疫複合体は、本文に記載の抗ＬＡＧ−３抗体と放射性原子とが結合して形成する放射性複合体を含む。複数の放射性同位体は、放射性複合体に用いることができる。その実例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体を含む。
【００６７】
抗体と細胞毒性剤との複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−ホルメート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジピン酸ジメチル塩酸塩など）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミドなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビサジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、および二重活性化フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの複数の二官能性タンパク質カップリング剤を使用して製造することができる。
【００６８】
９）薬物製剤
本発明の抗ＬＡＧ−３抗体の薬物製剤は、所望の純度を有する抗体を一つ以上の選択されてもよい薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））と混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して調製される。薬学的に許容される担体は、使用される用量および濃度下において一般的に被験者に対して毒性がなく、且つ、リン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸やメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼト二ウム；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのｐ−ヒドロキシ安息香酸アルキルエステル；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個より少ない残基を有する）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク錯体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン界面活性剤を含むが、これらに限られていない。
【００６９】
例示的な凍結乾燥された抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載されているものを含み、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸塩バッファーを含む。
【００７０】
本文の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な複数の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する活性成分を含んでもよい。例えば、追加の治療剤（例えば、化学療法剤、細胞毒性剤、成長阻害剤および／または抗ホルモン剤）をさらに提供する必要がある場合がある。このような活性成分は、組み合わせた形で予定の目的に有効な量で存在することに適している。
【００７１】
１０）製品
本発明のもう一態様において、本発明の抗体または医薬組成物を含む製品が提供される。該製品は、容器と、その容器上にあるまたはその容器に関連付けられたラベルまたはプロトコルを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグなどを含む。このような容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から作られることができる。該容器は、本発明の組成物自体または該組成物と別の組成物との組み合わせを収納し、しかも無菌の入口を有してもよい（例えば、該容器は静脈内溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能な栓を含むバイアルであってもよい）。該組成物中の少なくとも一種類の活性化剤は本発明の抗体である。前記ラベルまたはプロトコルは、選択された腫瘍またはウイルス感染の治療に前記組成物を使用することを説明する。また、前記製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を含有する第１の容器と、（ｂ）別の細胞毒性剤またはその他の治療剤を含む組成物を含有する第２の容器とを含んでもよい。本発明のこの実施形態における製品は、このような組成物を腫瘍またはウイルス感染の治療に使用可能であることを説明するためのプロトコルをさらに含んでもよい。選択されてもよいが、若しくはまた、該製品はさらに第２（または第３）の容器を含んでもよく、その容器は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む。さらには、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、針および注射器を含む、商業および使用者の角度から見ると必要とされるその他の材料を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、６つのＩｇＧ４モノクローナル抗体とヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質のインビトロ結合活性の検出結果を示す図である。
【図２】図２は、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓの一過性トランスフェクションにより発現かつ精製されたＭＶ７０５−３モノクローナル抗体のＳＥＣ−ＨＰＬＣ検出純度を示す図である。
【図３】図３は、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体とヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質の結合のＥＬＩＳＡ測定結果を示す図である。
【図４】図４は、ヒトＬＡＧ−３−ｍＦｃ組み換え融合タンパク質とＭＨＣクラスＩＩ分子との結合に対する抗ヒトＬＡＧ−３完全ヒトモノクローナル抗体のブロッキング効果を示す図である。
【図５】図５は、抗ヒトＬＡＧ−３完全ヒトモノクローナル抗体とマカクＬＡＧ−３＊６Ｈｉｓタグ融合タンパク質抗原との交差結合活性を示す図である。
【図６】図６は、抗ヒトＬＡＧ−３完全ヒトモノクローナル抗体とマウスＬＡＧ−３抗原との交差活性を示す図である。
【図７】図７は、抗ヒトＬＡＧ−３完全ヒトモノクローナル抗体と活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞との結合活性を示す図である。
【図８】図８は、抗ヒトＬＡＧ−３完全ヒトモノクローナル抗体のインビトロ生物学的機能分析を示す図である。
【図９】図９は、ＭＶ７０５−３およびＢＭＳ対照モノクローナル抗体（ＢＭＳ−２５Ｆ７およびＢＭＳ−９８６０１６）の結合エピトープ分析実験設計を示す図である。
【図１０ａ】図１０ａ〜図１０ｄは、ＭＶ７０５−３およびＢＭＳ対照モノクローナル抗体（ＢＭＳ−２５Ｆ７およびＢＭＳ−９８６０１６）の結合エピトープの分析結果を示す図である。
【図１０ｂ】図１０ａ〜図１０ｄは、ＭＶ７０５−３およびＢＭＳ対照モノクローナル抗体（ＢＭＳ−２５Ｆ７およびＢＭＳ−９８６０１６）の結合エピトープの分析結果を示す図である。
【図１０ｃ】図１０ａ〜図１０ｄは、ＭＶ７０５−３およびＢＭＳ対照モノクローナル抗体（ＢＭＳ−２５Ｆ７およびＢＭＳ−９８６０１６）の結合エピトープの分析結果を示す図である。
【図１０ｄ】図１０ａ〜図１０ｄは、ＭＶ７０５−３およびＢＭＳ対照モノクローナル抗体（ＢＭＳ−２５Ｆ７およびＢＭＳ−９８６０１６）の結合エピトープの分析結果を示す図である。
【図１１】図１１は、クローン１１４５２、クローン１３３８０およびクローン１３３８１の重鎖可変領域、軽鎖可変領域のアミノ酸配列およびＣＤＲ配列を示す図である。
【図１２】図１２は、ＬＡＧ−３ヒト化マウスＭＣ３８担癌モデルにおいてインビボで１３３８１変異体の抗腫瘍効果を検証したことを示す図である。平均腫瘍体積±ＳＥＭが図示されている。＊は、有意水準が０．０５であることを表し、＊＊は、有意水準が０．０１であることを表す。
【実施例１】
【００７３】
抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の調製
１．１  ヒトＬＡＧ−３組み換え融合タンパク質に高親和性で結合する単鎖抗体のパニング
本実施例は、完全なヒト単鎖ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーからヒトＬＡＧ−３組み換え融合タンパク質に高い親和性で結合する単鎖抗体をパニングする方法について説明する。この方法は、後述の完全ヒト単鎖ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーの使用に係り、市販のヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓ組み換え融合タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｃａｔ＃ＣＪ９１）、大腸菌ＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ｃａｔ＃６０５０２−１）、およびＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃１８３１１０１９）の使用に係る。本実施例に係る全ヒト単鎖ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーは、ｐＢＲ３．２２プロモーターとＭ１３ファージｐＩＩＩタンパク質ディスプレイシステムを含むファージミドベクターｐＣＬＳ１．０（配列１）から構築され、そのＣ末端にはＭｙｃ−Ｈｉｓタグが含まれている。ライブラリーの構築時に大腸菌ＴＧ１が使用された。当該全ヒト単鎖ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーは、文献でよく知られている通常の方法によって構築され、下記のように簡単に説明する。すなわち、ＲＮＡ抽出キット（ＴａＫａＲａ、ｃａｔ＃９７６７）を利用して市販の健康人ＰＢＭＣｓ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ、ｃａｔ＃ＰＢ−００３Ｆ−Ｓ、５０サンプル）からＲＮＡを獲得し、各全ヒトｓｃＦｖ単鎖ファージディスプレイサブライブラリーは、５または１０のサンプルのＲＮＡを混合して構築された。逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ｃａｔ＃４３６８８１４）を使用してＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡの第一鎖を合成し、ヒト抗体可変領域遺伝子を増幅するための特異性プライマーを文献（ＣａｉＸＨ，ＧａｒｅｎＡ．ＰＮＡＳ，１９９５．９２（１４）：６５３７−６５４１）およびＶ−ｂａｓｅデータベースに従って設計して合成した。ｃＤＮＡ第一鎖をテンプレートとして、ヒト抗体重鎖可変領域と軽鎖可変領域をそれぞれＰＣＲで増幅した。分子クローニング技術を利用してヒト抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域遺伝子フラグメントをファージミドベクターｐＣＬＳ１．０にクローニングした。具体的には、ヒト抗体軽鎖可変領域をＮｈｅ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ二重消化によってベクターｐＣＬＳ１．０にクローニングし、大腸菌ＴＧ１にエレクトロポレーションにより形質転換して、ファージ軽鎖サブライブラリーを得てベクターｐＣＬＳ１．０−ＶＬを得た。続いてＳｆｉ  Ｉ／Ｘｈо  Ｉ二重消化を利用してヒト抗体重鎖可変領域をベクターｐＣＬＳ１．０−ＶＬにクローニングした。同じ方法を使用して重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせを備えた全ヒトｓｃＦｖファージディスプレイサブライブラリーを得た。各サブライブラリーの合計ストレージ容量は９×１０９である。
パニング実験におけるヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質はいずれもバイオチンラベリングキット（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ，ｃａｔ＃ＬＫ０３））を使用してバイオチンを標識した。パニング実験を以下のように簡単に説明する。すなわち、大腸菌ＴＧ１を使用してＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを調製し、測定力価は約１．０×１０１３であり、それをＯＤ６００値が０．５〜０．６である上記全ヒトｓｃＦｖ単鎖ファージディスプレイライブラリーに感染させて一回目の入力（ｉｎｐｕｔ）ファージを取得した。液相パニングストラテジーを利用し、事前にＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ，ｃａｔ＃１１２０６Ｄ）とプレインキュベーションしたビオチン化ヒトＬＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質によりヒトＬＡＧ−３のｓｃＦｖ単鎖抗体に結合するファージを濃縮した。濃縮された前記単鎖抗体ファージをｐＨ２．２、０．１Ｍグリシン‐塩酸溶液で溶出し、一回目の出力（оｕｔｐｕｔ）ファージを取得した。一回目の出力ファージをＯＤ６００値が０．５〜０．６であるＴＧ１大腸菌に感染させて二回目の入力ファージを取得し、続いて上記生物学的パニング方法を使用してヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質に結合する二回目の出力ファージを得た。二回目の生物学的パニング方法を繰り返して三回目または四回目のパニングを行い、三回目または四回目のパニングを経て濃縮された出力ファージを大腸菌ＴＧ１に感染させてモノクローンを得て、ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質と高い親和性を有するモノクローナル大腸菌をファージＥＬＩＳＡにより同定、選択して配列決定の分析をし、１９個の単一ヌクレオチド配列を得た。具体的な配列を表１に示す。
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１．２  フローサイトメトリーによりＬＡＧ−３タンパク質に結合する単鎖抗体を選択してＩｇＧ転換を行った
単一ヌクレオチド配列を持つ１９個のモノクローナルｓｃＦｖ単鎖抗体が細胞表面ＬＡＧ−３タンパク質に対する結合能力をテストするために、これらのｓｃＦｖ単鎖抗体を持つ大腸菌モノクローンをＩＰＴＧで誘導して可溶性ｓｃＦｖ単鎖抗体タンパク質を発現させ、ろ過された上清と活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を取って結合活性を検出した。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、ｃａｔ＃１９０５２）を使用してヒト末梢血ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。そして、単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１１１３１Ｄ）と共インキュベーションし、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で４８時間活性化した。前記ＩＰＴＧにより誘導発現された１９個の可溶性ｓｃＦｖ単鎖抗体タンパク質、２ＹＴ培地（Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．、ｃａｔ＃ＳＤ７０１９）およびブランク対照ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ｃａｔ＃ＳＨ３０２５６．０１）をそれぞれ活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞と４℃で１時間共インキュベーションした。次いで、細胞を冷１×ＰＢＳバッファーで二回洗浄した。１：５０希釈のａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ＰＥタグ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ｃａｔ＃１３０−０９２−６９１）を入れて混合物を４℃で３０分間インキュベーションした後、冷１×ＰＢＳバッファーで二回洗浄し、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ＨＴフローサイトメーター（ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）により、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する前記誘導発現されたｓｃＦｖ単鎖抗体の結合活性を分析した。フローサイトメトリー中にＬＡＧ−３を発現するＣＤ４陽性Ｔ細胞はゲーティングにより選択された。結果は表２に示されるように、モノクローンにより誘導発現された１９個の可溶性ｓｃＦｖ単鎖抗体タンパク質のうち６個の抗体タンパク質（１１４４６、１１４５２、１１４５４、１１４５５、１１４７１、１１４８７）は、活性化されたヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する最高の結合活性を有する。
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１１４４６、１１４５２、１１４５４、１１４５５、１１４７１、１１４８７の６つのｓｃＦｖ単鎖抗体遺伝子を選択して分子クローニングし、ＩｇＧ４に転換した。一般的には、リーダーペプチド、Ｎｈｅ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ消化サイト、重鎖遺伝子定常領域およびヒトＩｇＧ４−Ｆｃを含む配列をｐＣＤＮＡ３．３＋にクローニングして構築し、ベクターｐＣＤＮＡ３．３−ＩｇＧ４が得られた。同様に、リーダーペプチド、Ｎｈｅ  Ｉ／ＢｓｉＷ  Ｉ消化サイト、軽鎖Ｋａｐｐａ遺伝子定常領域を含む配列をｐＣＤＮＡ３．３＋にクローニングして構築し、ベクターｐＣＤＮＡ３．３−ＶＫａｐｐａが得られ、または、リーダーペプチド、ＢａｍＨ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ消化サイト、軽鎖ｌａｍｂｄａ遺伝子定常領域を含む配列をｐＣＤＮＡ３．３＋にクローニングして構築し、ベクターｐＣＤＮＡ３．３−ＶＬａｍｂｄａが得られた。前記ｓｃＦｖ単鎖抗体の重鎖可変領域遺伝子ヌクレオチド配列の両端にＮｈｅ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉサイトを加えてｐＣＤＮＡ３．３−ＩｇＧ４プラスミドの対応するサイトに挿入し、前記ｓｃＦｖ単鎖抗体の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列の両端にＮｈｅ  Ｉ／ＢｓｉＷ  Ｉサイトを加えてｐＣＤＮＡ３．３−Ｖｋａｐｐａプラスミドの対応するサイトに挿入し、またはＢａｍＨ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ消化サイトを利用してｓｃＦｖ単鎖抗体の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列をｐＣＤＮＡ３．３−ＶＬａｍｂｄａベクターに挿入した。前記モノクローナル抗体を発現する組み換えプラスミドを取得した。表３に示されるように、その中で、すべての重鎖はＩｇＧ４である（Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４  Ｆｅｂ；３１（３）：１６９−２１７．  Ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）。
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１．３  ＩｇＧ４モノクローナル抗体の発現、精製、同定および結合活性
上記表３に記載されている重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む組み換えプラスミドを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ＃Ａ２９１２９）リポソーム法を使用して懸濁培養されたＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ＃Ａ２９１２７）を一過性トランスフェクションした。
３０ｍｌ  ＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ＃Ａ２９１００−０１）において、３７℃、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍの条件下で前記取得したトランスフェクションされたＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞を培養した。
１０〜１４日間培養されたトランスフェクション細胞を二次遠心分離処理（一次遠心分離の条件は、２０分間、４００ｇである；二次遠心分離の条件は、２０分間、１００００ｇである）し、細胞と細胞破片を除去して上清を得た。清澄化された上清をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ｃａｔ＃ＧＥ−１７−５４３８−０４）に載せ、三段階で溶出（溶出バッファーは順に、１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ、ｐＨ５．０のリン酸塩バッファー；２０ｍＭクエン酸ナトリウム‐１Ｍ  塩化ナトリウムｐＨ５．０；２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０の溶出バッファーである）して不純物を除去した後、ｐＨ３．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液により目標の抗体を分離して捕獲した。最後に、限外ろ過濃縮ステップにより、目標の抗体をｐＨ７．４の１×ＰＢＳバッファーに置き換えた。
精製された６つのＩｇＧ抗体（１１４４６、１１４５２、１１４５４、１１４５５、１１４７１、１１４８７）について、ＥＬＩＳＡ法によりヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質抗原に対するインビトロ結合活性を検出した。このテストは、市販のヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｃａｔ＃ＣＪ９１）に係る。具体的には、ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質をコーティングバッファー（炭酸塩バッファー）で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、４℃で９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ｃａｔ＃９０１８）に一晩コーティングした。ｐＨ７．４の１×ＰＢＳバッファーで三回洗浄した後、５％スキムミルクで２時間ブロックした。精製された６つのＩｇＧ抗体をｐＨ７．４の１×ＰＢＳバッファーにより１００μｇ／ｍｌから３倍勾配で希釈し、コーティング抗体とともに２５℃で２時間共インキュベーションした。そして、抗‐ｈＩｇＧタグが付けられているＨＲＰ検出抗体を使用してヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質抗原に対する前記抗体の結合を検出した。図１と表４に示すように、１１４５２クローンは、ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質抗原に対する最高の親和性を有し、該クローン１１４５２はＭＶ７０５−３と命名され、その重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列はＳＹＧＩＳ（配列８８）であり、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列はＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列８９）であり、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列はＤＧＷＷＥＬＬＲＰＤＤＡＦＤＩ（配列９０）であり、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列はＳＧＤＫＬＧＤＫＹＡＹ（配列９１）であり、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列はＹＤＳＤＲＰＳ（配列９２）であり、軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列はＱＶＷＤＳＳＳＤＱＶＶ（配列９３）である。
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【実施例２】
【００７４】
トランスフェクションされたＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞からのＭＶ７０５−３  ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の調製
好ましいクローンＭＶ７０５−３の重鎖および軽鎖遺伝子を含む組み換えプラスミドを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＣＨＯ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ＃Ａ２９１２９）リポソーム法を使用して大規模（２００〜６００ｍｌ）懸濁培養されたＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ＃Ａ２９１２７）を一過性トランスフェクションし、実施例１．３に記載のトランスフェクション、培養、精製方法を用いて目標の抗体を調製した。最後に、後続の各インビトロおよびインビボ活性検出および生物学的分析実験のために、限外ろ過濃縮ステップにより、目標の抗体をｐＨ７．４の１×ＰＢＳバッファーに置き換えた。
【実施例３】
【００７５】
一過性発現、精製されたＭＶ７０５−３抗体の純度分析
３．１  実施例２で得られたＬＡＧ−３モノクローナル抗体ＭＶ７０５−３の純度をキャピラリー電気泳動（ＣＥ−ＳＤＳ）で分析した
ＳＤＳ−ＭＷ  Ａｎａｌｙｓｉｓキット（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｉｏｓｍａｒｔ  Ｔｅｃｈ．  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｃａｔ＃ＢＳＹＫ０１８）を使用して下記の方法に従ってモノクローナル抗体ＭＶ７０５−３サンプルに対して還元および非還元処理を行った。
非還元：１００μｇの抗ヒトＬＡＧ−３全ヒトモノクローナルＭＶ７０５−３抗体サンプルを７５μｌの１％濃度のＳＤＳバッファーに入れて、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで容量を９５μｌにメスアップし、５μｌのヨードアセトアミドを加え、均一にボルテックスした後、７０℃で５分間インキュベーションし、８℃で１分間６０００ｇ遠心分離した。
還元：１００μｇの抗ヒトＬＡＧ−３全ヒトモノクローナルＭＶ７０５−３抗体サンプルを７５μｌの１％濃度のＳＤＳバッファーに入れて、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで容量を９５μｌにメスアップし、５μｌのβ−メルカプトエタノールを加え、均一にボルテックスした後、７０℃で５分間インキュベーションし、８℃で１分間６０００ｇ遠心分離した。
そして、キャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ、型番：ＰＡ８００ｐｌｕｓ）を用いて純度分析をした。その結果、還元（Ｒ−ＣＥ−ＳＤＳ）と非還元（ＮＲ−ＣＥ−ＳＤＳ）条件下で、本発明の、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓの一過性トランスフェクションにより発現精製された抗ヒトＬＡＧ−３全ヒトモノクローナルＭＶ７０５−３抗体サンプルは、重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）、およびメインピークのピーク純度のパーセンテージ（％）は表５に示される。
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３．２  実施例２で得られたＬＡＧ−３モノクローナル抗体ＭＶ７０５−３の純度をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により分析した
２０μｇの抗ヒトＬＡＧ−３全ヒトモノクローナルＭＶ７０５−３抗体（濃度を１ｍｇ／ｍｌに調整した）をＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のカラム（ＴＯＳＯＨ、型番：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ）に入れた。移動相は５０ｍＭリン酸塩バッファーと３００ｍＭ  ＮａＣｌであり、ｐＨ７．０であり、流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎであり、検出波長は２８０ｎｍである。その結果は図２に示される。ピークの計算は、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析し、本発明の抗ヒトＬＡＧ−３全ヒトモノクローナルＭＶ７０５−３抗体のメインピークの割合（％）は９９．２％を超え、多量体ピークの割合（％）は１％未満である。
【実施例４】
【００７６】
ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の結合
４．１  ＥＬＩＳＡ法によりヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の親和性を検出した
本実施例は、ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質抗原に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の結合力をインビトロ活性実験で検出することに係る。このテストは、市販のヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｃａｔ＃ＣＪ９１）および陽性対照抗体を使用した。その陽性対照抗体は、抗体２５Ｆ７（ＵＳ２０１１／０１５０８９２Ａ１、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３４０５）であり、その重鎖ヌクレオチド配列、重鎖アミノ酸配列、軽鎖ヌクレオチド配列、軽鎖アミノ酸配列はそれぞれ、配列６４、配列６５、配列６６、配列６７である。そのＩｇＧ４  ｋａｐｐａベクターの構築方法について、実施例１．２を参照することができ、しかも実施例１．３に記載の方法でＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞をトランスフェクションして発現し精製し、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳバッファーに保存した。抗ヒトＬＡＧ−３全ヒトモノクローナル抗体ＭＶ７０５−３、陽性対照抗体をそれぞれコーティングバッファー（炭酸塩バッファー）で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、４℃で９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ｃａｔ＃９０１８）に一晩コーティングした。ｐＨ７．４の１×ＰＢＳバッファーで三回洗浄した後、５％スキムミルクで２時間ブロックした。ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質をｐＨ７．４の１×ＰＢＳバッファーにより２０μｇ／ｍｌから３倍勾配で希釈し、コーティング抗体とともに２５℃で２時間共インキュベーションした。そして、抗‐Ｈｉｓタグが付けられているＨＲＰ検出抗体を使用してヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質抗原に対する前記抗体の結合を検出した。一回のＥＬＩＳＡ実験結果は図３に示されるように、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体はヒトＬＡＧ−３組み換え融合タンパク質に対して高い親和性を有し、ＥＬＩＳＡで検出された親和性ＥＣ５０値は４０  ｎｇ／ｍｌである。表６は、三回の独立ＥＬＩＳＡ実験における、ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の結合のＥＣ５０値の範囲（４０−１００  ｎｇ／ｍｌ）＿をまとめている。
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４．２  ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の親和平衡解離定数（ＫＤ）の検出
ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の結合能力を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６生体分子間相互作用システム（Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して検出した。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（ＡＨＣ）動力学的バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、＃１８−５０６３）をｐＨ１．７のグリシンで前処理してから検出用ＰＢＳバッファーに浸した。ＭＶ７０５−３を１０μｇ／ｍｌの濃度でＡＨＣバイオセンサーに固定した。次に、ＭＶ７０５−３がロードされたＡＨＣバイオセンサーを異なる濃度のヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓ抗原とバッファーに浸した。検体カラムの最終希釈点は、バッファーとロードされたバイオセンサー間の非特異的な結合をテストするように検出用バッファーのみを含む。０〜３００秒で抗原と抗体との結合が検出され、そして３００〜９００秒で解離が発生した。検出用バッファーで６０秒のベースラインが確定された。抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の親和性曲線は、１：１の結合の動力学センシング一価結合モデルでフィッティングさせられた。結合動力学分析は表７に示す。
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４．３  ＢＩＡｃоｒｅによるＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の親和平衡解離定数ＫＤの測定
本実施例は、ＢＩＡｃоｒｅ  ＳＰＲ技術を用いて、ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体または上記陽性対照抗体の結合を検証した。モノクローナル抗体ＭＶ７０５−３（１．１μｇ／ｍｌ）または陽性対照抗体（１２．９μｇ／ｍｌ）を５００ＲＵレベルに設定し、製造元が推奨した標準的固定化操作手順に基づいてそれをＣＭ５チップ（ＧＥ、ロット番号：ＢＲ１００５３０）にコーティングした。異なる濃度（０．３５２〜４５ｎＭ）のヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質を３０μｌ／ｍｉｎの流速で、抗体にカップリングされたチップの表面にそれぞれ１２０秒注射・分析し、抗原を１０分間解離させた。抗原結合の解離が完了した後、ｐＨ２．１のＧｌｙ−ＨＣｌ再生溶液を用いて３０μｌ／ｍｉｎの流速でチップの表面を３０秒再生し、さらにＰＢＳバッファーでチップを６０秒洗浄してチップの状態を安定させた。ＢＩＡｃоｒｅ制御ソフトウェア（バージョン２．０．１）を使用し、ＢＩＡｃоｒｅ  Ｔ２００（Ｎｏ．１６０２８３１）表面プラズモン共振器ですべての実験を行った。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェアを使用してデータ分析をした。結合動力学分析は表８に示すように、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体は、陽性対照抗体２５Ｆ７よりも、ヒトＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質に結合するＫＤが高い。
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【実施例５】
【００７７】
ヒトＬＡＧ−３−ｍＦｃ組み換え融合タンパク質とＭＨＣクラスＩＩ分子との結合に対するＭＶ７０５−３のブロッキング効果
本実施例は、ヒトＬＡＧ−３−ｍＦｃ組み換え融合タンパク質とＭＨＣクラスＩＩ分子との結合に対して抗ヒトＬＡＧ−３完全ヒトモノクローナル抗体ＭＶ７０５−３がブロッキング効果を有することを証明できるインビトロ結合活性テストを行った。このテストは、ヒトＬＡＧ−３−ｍＦｃ組み換え融合タンパク質と、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子を表面に発現するＤａｕｄｉ細胞とを使用した。ヒトＬＡＧ−３−ｍＦｃ融合タンパク質（ｈＬＡＧ−３−ｍＦｃ）は、ヒトＬＡＧ−３細胞外ドメインとマウスＦｃとを融合してなるものであり、そのヌクレオチド配列は配列６８であり、アミノ酸配列は配列６９である。ＬＡＧ−３−ｍＦｃ融合タンパク質を発現するヌクレオチド配列を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３にクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ＃Ａ１４５２７）にトランスフェクションし、実施例１．３に類似した方法で精製して上記ｈＬＡＧ−３−ｍＦｃ組み換え融合タンパク質を得た。配列＃１０１６１を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３に構築し、Ｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションし、発現精製によりイソタイプ対照タンパク質を得た。このテストは、陽性対照抗体２５Ｆ７（実施例４に記載の通り）とこのアイソタイプ対照タンパク質の両方に係る。
ヒトＬＡＧ−３−ｍＦｃ組み換え融合タンパク質とＭＨＣクラスＩＩ分子との結合に対する前記抗体のブロッキング効果をテストするために、ＭＶ７０５−３、陽性対照抗体２５Ｆ７およびアイソタイプ対照タンパク質を４℃に予め冷却したの１×ＰＢＳバッファーで１００μｇ／ｍｌから３倍勾配希釈し、それと同時に各勾配希釈液に１０μｇ／ｍｌのｈＬＡＧ−３−ｍＦｃ組み換え融合タンパク質溶液を加えた。該混合液を４℃で３０分間インキュベーションしてから、４℃に予め冷却したの１×ＰＢＳバッファーにより洗浄された２×１０５個のＤａｕｄｉ細胞を加え、４℃で１時間インキュベーションした。その後、予め冷却した４℃の１×ＰＢＳバッファーで一回洗浄し、ウサギ抗マウスＩｇＧのＰＥタグ抗体（Ａｂｃａｍ，ｃａｔ＃ａｂ７０００）と、洗浄されたＤａｕｄｉ細胞とを１時間インキュベーションし、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ＨＴフローサイトメーター（ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）でｈＬＡＧ−３−ｍＦｃ組み換えタンパク質とＤａｕｄｉ細胞との結合を分析した。
図４と表９に示す結果のように、モノクローナル抗体ＭＶ７０５−３は、ヒトＬＡＧ−３−ｍＦｃ組み換え融合タンパク質とＤａｕｄｉ細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子との結合を効果的にブロッキングすることができ、そのブロッキングＩＣ５０値は２．８μｇ／ｍｌである。これは、ヒトＬＡＧ−３−ｍＦｃとＤａｕｄｉ細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子との結合に対する陽性対照抗体２５Ｆ７のブロッキング能力に相当し、陽性対照抗体２５Ｆ７のブロッキングＩＣ５０値は３．３μｇ／ｍｌである。
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【実施例６】
【００７８】
アカゲザルＬＡＧ−３抗原およびマウスＬＡＧ−３抗原に対するＭＶ７０５−３の結合活性
本実施例は、前記抗体が、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＬＡＧ−３抗原およびマウスＬＡＧ−３抗原と交差反応を有するか否かを説明するためのインビトロ結合活性テストを行った。このテストは、市販の組み換えアカゲザルＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｃａｔ＃Ｃ９９８）、および構築発現された組み換えマウスＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質に係る。マウスＬＡＧ−３遺伝子完全長ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｃａｔ＃ＭＧ５３０６９−Ｇ）を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３にクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクションし、上記組み換えマウスＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質（ヌクレオチド配列は配列７０であり、アミノ酸配列は配列７１である）を得た。
前記抗体とアカゲザルＬＡＧ−３抗原との交差反応をテストするために、抗ヒトＬＡＧ−３全ヒトモノクローナル抗体ＭＶ７０５−３と陽性対照抗体２５Ｆ７をそれぞれコーティングバッファー（炭酸塩バッファー）で１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、４℃で９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、ｃａｔ＃９０１８）に一晩コーティングした。１×ＰＢＳバッファーで三回洗浄した後、５％スキムミルクで２時間ブロックした。アカゲザルＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質を１×ＰＢＳバッファーにより２０μｇ／ｍｌから３倍勾配で希釈し、コーティング抗体とともに２５℃で２時間共インキュベーションした。そして、抗‐ｈｉｓタグが付けられているＨＲＰ検出抗体を使用してアカゲザルＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質抗原に対する前記抗体の結合を検出した。
図５と表１０に示すように、モノクローナル抗体ＭＶ７０５−３は、アカゲザルＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質と良好な交差反応活性を有し、そのＥＣ５０値は０．１１μｇ／ｍｌである。前記陽性対照抗体２５Ｆ７は、アカゲザルＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質との交差反応が弱く、対応するＥＣ５０値は７．０μｇ／ｍｌである。
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前記抗体とマウスＬＡＧ−３抗原との交差反応をテストするために、上記方法を使用してマウスＬＡＧ−３−６＊Ｈｉｓタグ融合タンパク質抗原に対する前記抗体ＭＶ７０５−３の結合活性を検出した。その結果は図６と表１１に示すように、マウスＬＡＧ−３抗原に対して、前記抗体ＭＶ７０５−３と陽性対照抗体２５Ｆ７のいずれも弱い交差反応の活性を有する。
2021516989.tif 000012
【実施例７】
【００７９】
活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＭＶ７０５−３の結合活性
本実施例は、活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する前記抗体の結合活性をテストするためのインビトロ結合活性テストを行い、活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の表面に天然ヒトＬＡＧ−３が発現される。実施例１．２に記載の方法を使用してＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化した。そして、抗体ＭＶ７０５−３、陽性対照抗体２５Ｆ７、上記陰性対照、すなわちアイソタイプ対照を、冷１×ＰＢＳバッファー（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ｃａｔ＃ＳＨ３０２５６．０１）で１０μｇ／ｍｌから３倍または４倍勾配希釈した。結合活性検出について、１：２００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥタグ抗体（Ａｂｃａｍ，ｃａｔ＃ａｂ９８５９６）を使用してＣＤ４＋Ｔ細胞に対する前記抗体の結合を検出し、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ＨＴフローサイトメーター（ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）により、細胞に対する前記抗体の結合活性を分析した。フローサイトメトリー中にＬＡＧ−３を発現するＣＤ４陽性Ｔ細胞はゲーティングにより選択された。その結果は図７と表１２に示すように、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体は、ＬＡＧ−３のＣＤ４陽性Ｔ細胞を高い親和性で結合・発現することができ、その結合ＥＣ５０値は１．９ｎｇ／ｍｌである。
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【実施例８】
【００８０】
ＭＶ７０５−３のインビトロ生物学的機能分析
本実施例はインビトロ生物学的機能分析を実行し、市販の、ヒトＬＡＧ−３を安定的に発現する細胞株ＬＡＧ３／ＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ−Ｊｕｒｋａｔ  （ＢＰＳ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃａｔ＃７１２７８）、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ，ｃａｔ＃ＣＣＬ−８６）、スーパー抗原試薬（Ｔｏｘｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ＥＴ４０４）、ｂｉо−ｇｌоルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ＃Ｇ７９４０）をテストに利用した。
前記抗体のインビトロＴ細胞の活性化生物学的機能をテストするために、前記抗体ＭＶ７０５−３および陽性対照抗体２５Ｆ７をＲＰＩＭ１６４０（Ｇｂｉｃｏ，ｃａｔ＃１１８７５０９３）を１５０μｇ／ｍｌ（最終濃度の５倍）から３倍勾配希釈し、濃度ごとにウェルを三つ重複し、一つの抗体のブランク濃度のブランク対照を設置した。各希釈勾配の抗体をそれぞれ４×１０４の細胞／ウェルのＬＡＧ３／ＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ−Ｊｕｒｋａｔ細胞と混合し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３０分間プレインキュベーションした。そして、順に３×１０４の細胞／ウェルＲａｊｉ細胞及び１０μｌの濃度０．０８ｎｇ／ｍｌ（最終濃度の１０倍）のスーパー抗原試薬を加えた。混合物を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５〜６時間共インキュベーションした。１００μｌのｂｉо−ｇｌоルシフェラーゼ検出試薬をすばやく加えて５〜１０分間インキュベーションし、ＴＥＣＡＮ蛍光検出装置（ＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００  ＰＲＯ）を使用して生体蛍光のシグナルを測定して前記抗体のインビトロＴ細胞の活性化機能を分析した。誘導倍数は、各濃度勾配の生体蛍光シグナル値とブランク対照生体蛍光シグナル値との比であり、実験結果はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにより非線形回帰分析された。
その結果は図８および表１３に示すように、前記抗体ＭＶ７０５−３の濃度の増加につれて、生体蛍光のシグナル強度は勾配依存的に上昇した。これは、前記抗体ＭＶ７０５−３がＮＦＡＴレポーター遺伝子の発現を増加させることができることを説明し、そのＥＣ５０値は０．０４μｇ／ｍｌである。前記抗体ＭＶ７０５−３は、陽性対照抗体２５Ｆ７よりも有意に優れたインビトロＴ細胞活性化生物学的機能を示し、陽性対照抗体２５Ｆ７のＥＣ５０値は０．６４μｇ／ｍｌである。
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【実施例９】
【００８１】
ＭＶ７０５−３、ＢＭＳ−２５Ｆ７抗体、およびＢＭＳ−９８６０１６抗体の結合エピトープの分析
本実施例の目的は、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体が、ＢＭＳ−２５Ｆ７抗体（ＵＳ２０１１／０１５０８９２Ａ１及びＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３４０５のような文献に開示されており、ここで言及して本出願に組み込まれる）またはＢＭＳ−９８６０１６抗体（ＢＭＳ−９８６０１６は、ＷＯ２０１５１１６５３９に記載のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と２に示される重鎖および軽鎖を含み、ＷＯ２０１４／００８２１８にも記載されており、ここで言及して本出願に組み込まれる）と同じ結合エピトープを有するか否かを分析することである。実験は、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６生体分子間相互作用システム（Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して表した。実験設計は図９に示され、以下のように簡単に説明する。すなわち、ビオチンで標識されたｈＬＡＧ−３−６＊ｈｉｓタグ組み換えタンパク質を１０μｇ／ｍｌの濃度でＳＡバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、ロット番号１８−５０２０）に固定し、３００秒平衡した後にＰＢＳバッファーに浸漬し、ｈＬＡＧ−３−６＊ｈｉｓタグ組み換えタンパク質をロードしたＳＡバイオセンサーを下記各グループのサンプルに浸漬した：（１）１００μｇ／ｍｌのＢＭＳ対照モノクローナル抗体（ＢＭＳ−２５Ｆ７またはＢＭＳ−９８６０１６）；（２）１００μｇ／ｍｌのＭＶ７０５−３モノクローナル抗体；（３）１００μｇ／ｍｌのＭＶ７０５−３モノクローナル抗体と１００μｇ／ｍｌのＢＭＳ対照モノクローナル抗体ＢＭＳ−２５Ｆ７またはＢＭＳ−９８６０１６の混合物；（４）５０μｇ／ｍｌのＭＶ７０５−３モノクローナル抗体と５０μｇ／ｍｌのＢＭＳ対照モノクローナル抗体ＢＭＳ−２５Ｆ７またはＢＭＳ−９８６０１６の混合物。ＰＢＳバッファーで６０秒のベースラインが確定された。０〜３００秒で抗原と抗体との結合が検出され、そして３００〜９００秒で解離が発生した。抗ＬＡＧ−３モノクローナル抗体の親和性曲線は、１：２の結合の動力学センシング一価結合モデルでフィッティングさせられた。結合動力学分析は図１０ａ〜ｄに示すように、飽和濃度下（１００μｇ／ｍｌ）で、ｈＬＡＧ−３−ｈｉｓタグ組み換えタンパク質に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の結合およびＢＭＳ対照モノクローナル抗体の結合はいずれも最高値（Ｒｍａｘ）に達したが、両方の抗体の混合物は１００μｇ／ｍｌ＋１００μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ＋５０μｇ／ｍｌの濃度下でいずれもｈＬＡＧ−３−ｈｉｓタグ組み換えタンパク質に対する結合シグナル値を増加させることができる。これは、ｈＬＡＧ−３抗原に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の結合エピトープは、それに対するＢＭＳの対照抗体の結合エピトープとは異なることを示している。
【実施例１０】
【００８２】
ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の変異体の設計、構築発現及び活性試験
１０．１  ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の変異体の設計及び構築発現
ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体のアミノ酸配列の潜在的な分解サイトを分析して調べた結果、その抗体の重鎖中に二つのサイトが「ＤＤ」アミノ酸配列を含み、アスパラギン異性化の可能性のある潜在的な識別サイトであり、それぞれ配列４１の第８９、９０サイト、及び１０８、１０９サイトに位置することは発見された。Ｑ５（登録商標）  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ部位特異的変異誘発キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ロット番号Ｅ０５５２Ｓ）を使用し、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体のＶＨ領域の第８９、９０サイト及び１０８、１０９サイトに対する部位特異的変異誘発を実施し、それらをＤＥまたはＥＤに変更した。誘発が成功したＭＶ７０５−３モノクローナル抗体変異体ＶＨ領域を、ヒトＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ定常領域を含むＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の元ベクターにサブクローニングした（得られたクローン番号を表１４に示す；得られたクローン重鎖ＶＨヌクレオチド配列とアミノ酸配列番号について表１５参照）。ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の各変異体の重鎖を発現するベクターをそれぞれ、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の軽鎖を発現するベクターと一緒にＥｘｐｉ−ＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクションした。
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下記の各分析方法により、得られた上記８つのＭＶ７０５−３モノクローナル抗体変異体とＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の活性を検出した：（ａ）ヒトＬＡＧ−３組み換えタンパク質に結合するＥＬＩＳＡ；（ｂ）ヒトＬＡＧ−３タンパク質を発現する細胞に結合する実験；（ｃ）市販の、ヒトＬＡＧ−３を安定的に発現する細胞株ＬＡＧ３／ＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ−Ｊｕｒｋａｔを利用したインビトロ生物学的機能分析。
１０．２  ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体変異体の活性試験
（ａ）ヒトＬＡＧ−３組み換えタンパク質にＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の変異体が結合するＥＬＩＳＡ方法は、実施例４に記載の通りであり、その結果は表１６に示すように、２つの変異体タンパク質１３３８０（ＤＥ＋ＤＤ）、１３３８１（ＥＤ＋ＤＤ）が、ヒトＬＡＧ−３−ｈｉｓタグ組み換え融合タンパク質に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の結合能力と類似した結合能力を有し、その他の変異体の結合能力は異なる程度で低下した。
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（ｂ）ヒトＬＡＧ−３を発現する細胞に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の結合の実験方法を下記のように簡単に説明する：
被験抗体ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体とその変異体、陽性対照抗体ＢＭＳ−２５Ｆ７及びＢＭＳ−９８６０１６抗体を冷１×ＰＢＳバッファー（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ｃａｔ＃ＳＨ３０２５６．０１）で１０μｇ／ｍｌから３倍または４倍勾配希釈した。結合活性検出について、１：２００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ標識した抗体（Ａｂｃａｍ，ｃａｔ＃ａｂ９８５９６）を使用してヒトＬＡＧ−３を発現する細胞に対する前記抗体の結合を検出し、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ＨＴフローサイトメーター（ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）により、細胞に対する前記抗体の結合活性を分析した。フローサイトメトリー中にＬＡＧ−３を発現する陽性細胞はゲーティングにより選択された。その結果は表１７に示される。ＥＬＩＳＡ結果と類似し、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体は、ＬＡＧ−３の細胞を高い親和性で結合・発現することができ、その２つの変異体タンパク質１３３８０（ＤＥ＋ＤＤ）、１３３８１（ＥＤ＋ＤＤ）が、ヒトＬＡＧ−３を発現する細胞に対するＭＶ７０５−３モノクローナル抗体タンパク質の結合能力と類似した結合能力を有し、その他の変異体の結合能力は異なる程度で低下した。
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（ｃ）市販の、ヒトＬＡＧ−３を安定的に発現する細胞株ＬＡＧ３／ＮＦＡＴ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ−Ｊｕｒｋａｔを利用したインビトロ生物学的機能分析は、実施例８に記載の通りである。ＬＡＧ−３に対するＭＶ７０５−３変異体クローン１３３６５（ＤＤ＋ＤＥ）、１３５６５（ＤＥ＋ＤＥ）及び１３５６４（ＥＤ＋ＤＥ）の結合能力は大幅に低下していることはすでに分かった。そのため、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体及び、１３３８０（ＤＥ＋ＤＤ）、１３３８１（ＥＤ＋ＤＤ）、１３３８６（ＤＤ＋ＥＤ）、１３５６３（ＤＥ＋ＥＤ）、及び１３６１６（ＥＤ＋ＥＤ）の５つの変異体のみをテストした。その結果は表１８に示すように、変異体タンパク質１３３８０（ＤＥ＋ＤＤ）及び１３３８１（ＥＤ＋ＤＤ）は、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体と類似した、インビトロでＴ細胞を活性化する能力を持っている。
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【実施例１１】
【００８３】
インビボでの腫瘍細胞増殖の阻害における１３３８１変異体の有効性
インビボでの腫瘍細胞増殖の阻害におけるＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の１３３８１変異体の有効性をテストするために、ヒト化ＬＡＧ−３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３）マウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ  ＭＯＤＥＬ  ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ  ＣＯ．，  ＬＴＤ．から購入、完全な株名：Ｂ６．１２９−Ｌａｇ３ｔｍ（ｈＬＡＧ３）／Ｓｍоｃ；カタログ番号ＮＭ−ＫＩ−０００４９）を使用した。相同組み換え法を使用してマウス内因性Ｌａｇ３遺伝子のすべての細胞外領域配列をヒトＬＡＧ３配列に置き換え、これによってマウスにヒトキメラＬＡＧ３タンパク質を発現させた。マウスＭＣ３８結腸癌細胞株をマウスに接種して腫瘍移植モデルを調製した。
上記ヒト化ＬＡＧ−３マウス（Ｂ６．１２９−Ｌａｇ３ｔｍ（ｈＬＡＧ３）／Ｓｍоｃ）にそれぞれ０日目に１×１０６のＭＣ３８細胞を移植し、腫瘍が平均約１２３（ｍｍ３）に増殖した時に群分けして投薬し始め、３週間連続して週に２回投与し（ＢＩＷｘ３）、投与開始から３〜４週間連続して観察して平均腫瘍体積を測定した。動物を、（１）ＰＢＳ溶媒対照、ＢＩＷｘ３、ｉｐ；（２）ｍＰＤ−１抗体（ＢＥ０１４６、ＢｉｏＣｅｌｌ）、１ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＷｘ３、ｉｐ；（３）ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の１３３８１変異体、１０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＷｘ３、ｉｐ；（４）ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の１３３８１変異体、１０ｍｇ／ｋｇ、及びｍＰＤ−１抗体（ＢＥ０１４６、ＢｉｏＣｅｌｌ）、１ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＷｘ３、ｉｐの四つの群に分けた（ｎ＝８）。
その結果は表１９及び図１２に示すように、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の１３３８１変異体は単独で腫瘍増殖を効果的に阻害でき、平均腫瘍増殖阻害率は３５．１１％であり（
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）、ＴｉまたはＶｉは、特定の時点での治療群または対照群の平均腫瘍体積を表し、Ｔ０またはＶ０は、群分けの後、投与前の治療群または対照群の平均腫瘍体積を表す。それに対して、抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体は腫瘍増殖に対して阻害の効果が無く、ＭＶ７０５−３モノクローナル抗体の１３３８１変異体は、抗マウスＰＤ−１モノクローナル抗体と組み合わせて投与する場合、腫瘍増殖に対する阻害効果が最も強く、平均腫瘍増殖阻害率は４６．０７％である。
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参考文献：
1. Triebel F, Jitsukawa S, Baixeras E, et al. LAG-3, a novel lymphocyte activation gene closely related to CD4 [J]. J Exp Med, 1990, 171(5):1393-1405.
2. Workman C J, Dugger K J, Viganli DA, et al. Cutting edge: molecular analysis of the negative regulatory function of lymphocyte activation gene-3 [J]. J Immunol, 2002, 169(10):5392 -5395.
3. Li N, Workman C J, Martin SM, et al. Biochemical analysis of the regulatory T cell protein lymphocyte activation gene-3 (LAG-3 ; CD223) [J]. J Immunol, 2004, 173(11):6806-6812.
4. Li N, Wang Y, Forbes K, et al. Metalloproteases regulate T cell proliferation and effect or function via LAG-3 [J]. EMBO J, 2007, 26(2):494-504.
5. Workman C J, Rice DS, Dugger KJ, et al. Phenotypic analysis of the murine CD4-related glycoprotein, CD223 (LAG-3) [J]. Eur J Immunol, 2002,32(8): 2255-2263.
6. Blackburn SD, Shin H, Haining WN, et al. Coregulation of CD8+T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection[J]. Nat Immunol,2009,10(1): 29-37.
7. Workman CJ, Vignali DA. Negative regulation of T cell homeostasis by lymphocyte activation gene-3 (CD223) [J]. J Immunol, 2005,174(2): 688-695.
8. Workman CJ, Wang Y, El Kasmi KC. LAG-3 regulates plasmacytoid dendritic cell homeostasis [J]. J Immunol, 2009,182(4): 1885-1891.
9. An nunziato F, Manetti R, Tomasevic I, et al. Expression and release of LAG-3-encoded protein by human CD4 T cells are associated with IFN-gama production [J]. F ASEB J, 1996, 10 (7):769 -775.
10. Workman C J, Cauley LS, Kim IJ, et al. Lymphocyte activation gene-3 (CD223) regulates the size of the expanding T cell population following antigen activation in vivo [J]. J Immunol, 2004, 172(9):5450-5455.
11. Macon-Lemaitre L, TriebelF. The negative regulatory function of the lymphocyte-activation gene-3 co-receptor (CD223) on human T cells [J]. Immunol, 2005, 115(2):170-178.
12. Huang C T, Workman C J , Flies D, et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells [J]. Immun, 2004, 21(4):503-513.
13. Gandhi MK, Lambley E, Duraiswamy J, et al. Expression of LAG-3 by tumor infiltrating lymphocytes is coincident with the suppression of latent membrane antigen specific CD8+ T cell function in Hodgkin-lymphoma patients [J]. Blood, 2006,108(7):2280-2289.
14. Andreae S, Biosson S, Triebel F, et al. MHC class II signal transduction in human dendritic cells induced by a natural ligand, the LAG-3 protein (CD223) [J]. Blood, 2003, 102(6):2130-2137.
15. Liang B, Workman C J , Lee J, et al. Regulatory T cells inhibit dendritic cells by lymphocyte activation gene-3 engagement of MHC class II [J]. J Immunol, 2008, 180(9):5916-5926.
16. Blackburn SD, Shin H, Nicholas Haining W. Coregulation of CD8+T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection [J]. Nat Immunol, 2009,10(1):29-37.
17. Kassu A, Marcus RA. Receptors during Chronic HIV Infection Function by Multiple Costimulatory Regulation of Virus-Specific CD4+T Cell [J]. J Immunol, 2010,185(5): 3007-3018.
18. Konnai S, Suzuki S, Shirai T. Enhanced expression of LAG-3 on lymphocyte subpopulations from persistently lymphocytotic cattle infected with bovine leukemia virus [J]. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2013,36(1): 63-69.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
2021516989.tif 000032
【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月19日(2020.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列ＳＹＧＩＳ（配列８８）からなる重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ（配列８９）からなる重鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｃ）配列ＤＧＷＷＥＬＬＲＰＤＤＡＦＤＩ（配列９０）からなる重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
（ｄ）配列ＳＧＤＫＬＧＤＫＹＡＹ（配列９１）からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列ＹＤＳＤＲＰＳ（配列９２）からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列ＱＶＷＤＳＳＳＤＱＶＶ（配列９３）からなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域とを含む、単離された抗ＬＡＧ−３抗体。
【請求項２】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
（１）重鎖可変領域はアミノ酸配列４１からなり、軽鎖可変領域はアミノ酸配列４３からなり、
（２）重鎖可変領域はアミノ酸配列７５からなり、軽鎖可変領域はアミノ酸配列４３からなり、および
（３）重鎖可変領域はアミノ酸配列７７からなり、軽鎖可変領域はアミノ酸配列４３からなる、
請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ＬＡＧ−３結合抗体フラグメントである、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２フラグメントである、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
完全長抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ＩｇＧ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
単一特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
多重特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記多重特異性抗体は二重特異性抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記二重特異性抗体は、第２の生体分子に結合する第２の結合ドメインを含み、前記第２の生体分子は細胞表面抗原である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記細胞表面抗原は腫瘍抗原である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体に連結された治療剤を含む免疫複合体。
【請求項１５】
前記治療剤は細胞毒性剤である、請求項１４に記載の免疫複合体。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１７】
当該抗体はＬＡＧ−３結合抗体フラグメントである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２フラグメントである、請求項１７に記載の核酸。
【国際調査報告】
2021516989.tif 000037
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