(57)【要約】  本発明において、ヒト肝細胞の核内でＨＢｃに相互作用する因子のプロテオミクス同定は、ｍＲＮＡ代謝に介入する多くのＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）を明らかにし、特に、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子１０（ＳＲＳＦ１０）は、ＨＢｃ複合体において約３０００倍濃縮されて発見された。発明者らは、小分子１Ｃ８（４−ピリジノンベンズイソチアゾールカルボキサミド）を用いたＳＲＳＦ１０のリン酸化の阻害が、ＨＢＶ複製（遺伝子型Ｃ及びＤ）の強い阻害を誘導すること、及びデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）感染状況でＨＢＶのｃｃｃＤＮＡの確立を強く阻害することを証明した。従って、本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染の処置に用いるためのＳＲＳＦ１０阻害剤に関し、該阻害剤はＳＲＳＦ１０の脱リン酸化状態を維持する、又はＳＲＳＦ１０のスプライシング活性を防止又は低減する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染の処置に用いるためのＳＲＳＦ１０活性の阻害剤。
【請求項２】
前記ＨＢＶ感染は、慢性感染である請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
ＳＲＳＦを脱リン酸化状態に維持し、ＳＲＳＦ１０のスプライシング活性を防止又は低減する請求項１又は２に記載の阻害剤。
【請求項４】
感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを低減できる請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項５】
１Ｃ８、Ｅ５、Ｄ３、Ｃ２又はＳＬ３０９化合物からなるリストから選択される有機小分子である請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記有機小分子は、１Ｃ８化合物である請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染の処置に有益な複数の候補化合物をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）前記候補化合物のそれぞれに対して、ＳＲＳＦ１０活性に対するそれらの阻害能力を試験することと、
（ｂ）前記ＳＲＳＦ１０活性を阻害できる候補化合物を積極的に選択することと、からなるステップを含む方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の阻害剤を含み、それを必要とする対象に対してｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染処置をする方法に用いられるための医薬組成物。
【請求項９】
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染の処置に用いるための１Ｃ８化合物（４−ピリジノンベンズイソチアゾールカルボキサミド）又はベンズイソチアゾール誘導体化合物（Ｅ５、Ｄ３、Ｃ２若しくはＳＬ３０９化合物）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＲＳＦ１０（セリン／アルギニンリッチスプライシング因子１０）の生物活性の阻害剤、特に脱リン酸化状態にＳＲＳＦ１０を維持する、及びＳＲＳＦ１０のスプライシング活性を防止又は低減する阻害剤を用いて、Ｂ型肝炎ウィルス感染を処置するための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
予防ワクチンの存在にもかかわらず、慢性的なＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染は、２億５千万人に関与し、原発性肝癌（肝細胞癌、ＨＣＣ）の第一原因であって(Petruzziello, 2018)、世界的に主要な健康問題のままである。現在のＨＢＶ慢性感染に対する臨床的に許容された抗ウィルス治療は、ウィルスＤＮＡからの転写を直接に標的とし且つ宿主の免疫反応を間接に増強するペグ化されたインターフェロンα（ＩＦＮ−α）、及び／又はＨＢＶの逆転写を特異的に阻害するヌクレオシドアナログ（ＮＵＣ）からなる。これらの治療は、通常、患者の血液におけるウィルス血症の低減を一時的に（ＩＦＮ）又は長期的に（ＮＵＣ）引き起こす(Zoulim and Durantel, 2015)。しかしながら、肝臓のウィルス排除は稀に得られるものであり、従って、ＮＵＣが必須の長期治療となる。よって、組み合わせ治療に用いられることができて直接又は間接にＨＢＶの複製を阻害できる抗ウィルス分子の新規のクラスを開発する緊急の必要性がある。
【０００３】
ＨＢＶを高効率で複製する細胞において、ＨＢＶのコアタンパク質（ＨＢｃ）は核に蓄積し、すなわち、ｐｇＲＮＡのカプシド形成及びその後のビリオンゲノムを生成するための逆転写といった周知の役割の他に、ＨＢｃは他の制御機能を有し得る。初期の研究では、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ及び細胞内ＤＮＡに結合することが示されていた(Zlotnick et al., 2015)。これらの発見は、このウィルスタンパク質が、エピジェネティックなモジュレータをリクルートすること及び／又はサイレンシング因子にアクセスすることを防ぐことによりウィルスの微小染色体（ｃｃｃＤＮＡ）の発現を制御し得ることを提示した。しかしながら、より最近の研究では、新たに合成されたＨＢｃは、ＨＢＶの転写自体に必要ではないことを提示している。従って、ＨＢｃの核機能は未だ定義されないままである(Seeger et al. 2015)。
【０００４】
ＨＢｃの核機能を解読するために、発明者らは分化されたヒト肝細胞におけるその核パートナーを同定した。ヒト肝細胞の核内でＨＢｃに相互作用する因子のプロテオミクス同定は、ｍＲＮＡ代謝に介入する多くのＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）を明らかにした。特に、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子１０（ＳＲＳＦ１０）は、ＨＢｃ複合体において約３０００倍濃縮されて発見され、従って、ＨＢｃとこの核ＲＮＡ結合因子との強く優先的な相互作用が際立つ。
【０００５】
ＨＢＶの複製の際のＳＲＳＦ１０の役割をさらに調べるために、発明者らは、ＨＩＶ−１の複製の強い阻害剤として近年同定された(Shkreta et al., 2017)化合物１Ｃ８（４−ピリジノンベンズイソチアゾールカルボキサミド）を用いた。１Ｃ８は、主要なＳＲ因子であるＳＲＳＦ１のスプライシング機能を阻害する薬剤であるＩＤＣ１６の構造的模倣物として最初に同定された(Cheung et al., 2016)。分子解析は、１Ｃ８がＳＲＳＦ１を阻害するのではなく、ＳＲＳＦ１０のリン酸化を防止し、そのスプライシング活性を調節することを示した(Shkreta et al., 2017)。特に、１Ｃ８は、１３３位のセリンにおけるＳＲＳＦ１０のリン酸化を阻害することを示した。この残基のリン酸化は、１３１位のセリンで起こるのと共に、他のスプライシング因子との相互作用を変更することが見られた(Shkreta et al., 2017)。インビトロでの研究は、１Ｃ８が、細胞内遺伝子及び細胞生存にほとんど影響せずに、ＨＩＶの複製を強く阻害することを示した。
【０００６】
ＨＩＶの複製の阻害は、スプライシングされたウィルスｍＲＮＡの合成における変化及びＨＩＶｍＲＮＡに結合するＳＲＳＦ１０の低減に関連した(Shkreta et al., 2017)。国際公開２０１５／１６４９５６号は、ベンズイソチアゾール誘導体化合物（１Ｃ８が属する）及びＨＩＶ感染の治療のためのそれらの使用について開示する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明において、ＨＢＶの複製のメカニズムを研究している発明者らは、質量分析（ＭＳ）によりヒト肝細胞の核内においてＨＢｃの細胞パートナーを同定することによって、ＨＢｃの制御機能を解読することを試みた。この分析は、２００以上のタンパク質を同定した。機能的アノテーションは、これらの因子の約５０％が、最も関連する機能的区分として互いに強く相互関連するＲＮＡスプライシングに関連する因子に対応するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、特にＳＲタンパク質であることを明らかにした。機能分析は、ＨＢＶの複製を強く且つ差次的に調節できるものとしてＳＲＳＦ１０を同定した。さらに、ＳＲＳＦ１０タンパク質の活性を標的とする小分子化合物１Ｃ８は、ＨＢＶの種々の株（遺伝子型Ｃ及びＤ）でウィルスの複製に対する強い抑制を誘導した。
【０００８】
従って、本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染の治療に用いるためのＳＲＳＦ１０活性の阻害剤に関する。
【０００９】
特定の実施形態において、前記阻害剤はＳＲＳＦ１０を脱リン酸化状態に維持し、ＳＦＲ１０のスプライシング活性を防止又は低減する。
【００１０】
特定の実施形態において、ＳＲＳＦ１０活性の阻害剤は、感染された細胞におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを低減できる。
【００１１】
また、本発明は、（ａ）ＳＲＳＦ１０活性を阻害する能力についてそれぞれの候補化合物を試験することと、（ｂ）前記ＳＲＳＦ１０活性を阻害できる候補化合物を積極的に選択することとからなるステップを含む、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染を治療するのに有益な複数の候補化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は実験の概要である。治療スキーム：（ａ）感染前処置：ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対して１００ｎＭのＰｒｅＳ１ペプチド（ＰｒｅＳ１−ｐｅｐ）若しくは１０μＭの１Ｃ８（−１日目に）で２４時間処理し、又は未処理（ＮＴ）とした。０日目において、細胞に対して、薬剤の存在下でＨＢＶ（ＭＯＩ＝２５０）又はＨＤＶ（ＭＯＩ＝２５）を２４時間接種した。テノホビルコントロール（１０μＭのＴＤＦ）のために、細胞に対して感染後１及び４日目に処理した。上清及び細胞を感染後７日目に回収した。（ｂ）感染後処置：ｄＨｅｐａＲＧ細胞に対してＨＢＶ（ＭＯＩ＝２５０）又はＨＤＶ（ＭＯＩ＝２５）を接種した。感染後４、７及び９日目に、細胞に対して１０μＭのＴＤＦ、１０μＭのラミブジン（３ＴＣ）若しくは１０μＭの１Ｃ８を処理し、又は未処理（ＮＴ）とした。上清及び細胞を感染後１１日目に回収した。
【図２】図２は、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＨＢｃ複合体の精製手順の概要図である。ＨｅｐａＲＧ−ＴＲ−ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＨＢｃ細胞を大量に増殖及び分化させた（１億細胞）。テトラサイクリン誘導の後、細胞の核を回収し、適切なバッファーで溶解した（ＩＢＡプロトコール参照）。核分画に対して、ベンゾナーゼ（すなわち、核酸の架橋を避けるためのＤＮＡ及びＲＮＡの切断）処理し又は未処理とし、その後、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎカラムに通した。溶出分画２をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に掛けた。
【図３】インタラクトーム研究及び一次検証の結果である。
【図４】ＳＴ−ＨＢｃ関連タンパク質の濃縮スコアである。
【図５Ａ−Ｄ】遺伝子型Ｄに持続的に感染されたｄＨｅｐａＲＧ細胞における１Ｃ８の抗ＨＢＶ特性を示す。分化されたＨｅｐａＲＧに、１０μＭの濃度で示された分子を２〜３日毎に２回処理する前に、１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌのＭＯＩでＨＢＶ遺伝子型Ｄ、又は１０ｖｇｅ／ｃｅｌｌのＭＯＩでＨＤＶ遺伝子型１を７日間感染させた。Ａ）細胞から総ＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ、ＨＢＶの総ＲＮＡ又はＨＢＶのプレゲノムＲＮＡを検出するためにｑＰＣＲ及びＲＴｑＰＣＲに掛けた。Ｂ）上清におけるＨＢｓ及びＨＢｅ分泌抗原をＥＬＩＳＡによって定量し、ビリオンに含まれるＨＢＶのＤＮＡを上清からのウィルス核酸抽出後のｑＰＣＲにより定量した。Ｃ）細胞内ＨＤＶのＲＮＡを細胞からの総ＲＮＡ抽出後にＲＴｑＰＣＲにより定量した。Ｄ）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイにより１Ｃ８処理（又はコントロール処理；ピューロマイシンは陽性毒性分子である）細胞の生存度を観察した。結果は、ＨｅｐａＲＧの３つの異なるサンプルで行われたｎ＝３の平均値＋ＳＥＭで示す。統計は両側マン−ホイットニー検定により行われ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。ｎｄは未検である。
【図６Ａ−Ｂ】遺伝子型Ｃに持続的に感染されたｄＨｅｐａＲＧ細胞における１Ｃ８の抗ＨＢＶ特性を示す。分化されたＨｅｐａＲＧに、１０μＭの濃度で示された分子を２〜３日毎に２回処理する前に、１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌのＭＯＩでＨＢＶ遺伝子型Ｃを７日間感染させた。Ａ）細胞から総ＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ、ＨＢＶの総ＲＮＡ又はＨＢＶのプレゲノムＲＮＡを検出するためにｑＰＣＲ及びＲＴｑＰＣＲに掛けた。Ｂ）上清におけるＨＢｓ及びＨＢｅ分泌抗原をＥＬＩＳＡによって定量し、ビリオンに含まれるＨＢＶのＤＮＡを上清からのウィルス核酸抽出後のｑＰＣＲにより定量した。結果は、ＨｅｐａＲＧの３つの異なるサンプルで行われたｎ＝３の平均値＋ＳＥＭで示す。統計は両側マン−ホイットニー検定により行われ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。ｎｄは未検である。
【図７Ａ−Ｃ】ｄＨｅｐａＲＧ（遺伝子型Ｄ）におけるｃｃｃＤＮＡのデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）確立における１Ｃ８の効果を示す。分化されたＨｅｐａＲＧに対して、１０μＭ（１Ｃ８及びＴＤＦ）又は１００ｎＭ（Ｅｎｔｒｙ  Ｉｎｈ．）の示された薬剤を接種前２４時間及び接種の際の２４時間処理し、その後、１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌのＭＯＩでＨＢＶ遺伝子型Ｄ、又は１０ｖｇｅ／ｃｅｌｌのＭＯＩでＨＤＶ遺伝子型１を７日間感染させた。Ａ）細胞から総ＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ、ＨＢＶの総ＲＮＡ又はＨＢＶのプレゲノムＲＮＡを検出するためにｑＰＣＲ及びＲＴｑＰＣＲに掛けた。Ｂ）上清におけるＨＢｓ及びＨＢｅ分泌抗原をＥＬＩＳＡによって定量し、ビリオンに含まれるＨＢＶのＤＮＡを上清からのウィルス核酸抽出後のｑＰＣＲにより定量し、ビリオンに含まれるＨＢＶのＤＮＡを上清からのウィルス核酸抽出後のｑＰＣＲにより定量した。Ｃ）細胞内ＨＤＶのＲＮＡを細胞からの総ＲＮＡ抽出後にＲＴｑＰＣＲにより定量した。結果は、ＨｅｐａＲＧの３つの異なるサンプルで行われたｎ＝３の平均値＋ＳＥＭで示す。統計は両側マン−ホイットニー検定により行われ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。ｎｄは未検である。
【図８Ａ−Ｂ】ｄＨｅｐａＲＧ（遺伝子型Ｃ）におけるｃｃｃＤＮＡのデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）確立における１Ｃ８の効果を示す。分化されたＨｅｐａＲＧに対して、１０μＭ（１Ｃ８及びＴＤＦ）又は１００ｎＭ（Ｅｎｔｒｙ  Ｉｎｈ．）の示された薬剤を接種前２４時間及び接種の際の２４時間処理し、その後、１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌのＭＯＩでＨＢＶ遺伝子型Ｃを７日間感染させた。Ａ）細胞から総ＤＮＡ及びＲＮＡを抽出し、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ、ＨＢＶの総ＲＮＡ又はＨＢＶのプレゲノムＲＮＡを検出するためにｑＰＣＲ及びＲＴｑＰＣＲに掛けた。Ｂ）上清におけるＨＢｓ及びＨＢｅ分泌抗原をＥＬＩＳＡによって定量し、ビリオンに含まれるＨＢＶのＤＮＡを上清からのウィルス核酸抽出後のｑＰＣＲにより定量した。結果は、ＨｅｐａＲＧの３つの異なるサンプルで行われたｎ＝３の平均値＋ＳＥＭで示す。統計は両側マン−ホイットニー検定により行われ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。ｎｄは未検である。
【図９Ａ−Ｅ】持続的に感染された初代ヒト肝細胞における１Ｃ８の効果を示す。２人の異なるドナーからの２つの異なるＰＨＨのバッチをこれらの試験に用いた（バッチ１：図９Ａ、Ｂ及びＣ；バッチ２：図９Ｄ及びＥ）。Ａ）ＰＨＨに、１０μＭの濃度で示された分子を２〜３日毎に２回処理する前に、１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌのＭＯＩでＨＢＶ遺伝子型Ｄを４日間感染させた。Ｂ）細胞から細胞内総ＲＮＡを抽出し、ＨＢＶのｐｇＲＮＡ及びＨＢＶの総ＲＮＡを検出するためにＲＴｑＰＣＲに掛けた。Ｃ）上清におけるＨＢｓ及びＨＢｅ分泌抗原をＥＬＩＳＡによって定量した。Ｄ）ＰＨＨに対して１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌのＭＯＩでＨＢＶ遺伝子型Ｄを感染させた。感染の６日後に、細胞に対して１０μＭの濃度で示された分子で５回処理した。上清を各処理後に回収し、感染後１３日目に細胞を回収した。Ｅ）上清におけるＨＢｓ及びＨＢｅ分泌抗原をＥＬＩＳＡによって定量した。結果は、ｎ＝３（図９Ａ、Ｂ及びＣ）又はｎ＝４（図９Ｄ及びＥ）の平均値＋ＳＤである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本研究において、発明者らは、ＳＲＳＦ１０がＨＢｃ核複合体に存在する主要な因子であり、ＨＢＶのライフサイクルにおいて役割を果たし得ることを証明する。１Ｃ８はＳＲＳＦ１０の脱リン酸化状態を維持することが示されていたので、発明者らは、ＨＩＶの複製を調節することが既に示されていたこの分子がＨＢＶの複製も阻害できるかどうか率直に試験した。発明者らは、１Ｃ８化合物が、細胞内ＨＢＶのＲＮＡ（図５Ａ参照）、並びに細胞培養上清におけるウィルス抗原（ＨＢｓ及びＨＢｅＡｇ）及びＨＢＶビリオン（図５Ｂ参照）の分泌を６０〜７０％低減することによって、持続的に感染された肝細胞においてＨＢＶ（遺伝子型Ｄ及びＣ）の複製を実際に阻害できることを発見した。また、１Ｃ８化合物は、デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）感染下でＨＢＶのｃｃｃＤＮＡの確立を阻害でき、ＨＢＶの接種（遺伝子型Ｃ及びＤ）の前及びの際における肝細胞へのその分子の追加は、ｃｃｃＤＮＡの確立を強く低減し（それぞれ７０％及び５０％）、他のウィルスマーカー（すなわち細胞内ＲＮＡ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ）も１Ｃ８処理条件で低減した（図７Ａ及びＢ並びに図８Ａ及びＢ）。
【００１４】
感染された肝細胞におけるＨＢＶのｃｃｃＤＮＡは、細胞内ヌクレオカプシドのリサイクルを介した新たに合成されるウィルス後代及びｃｃｃＤＮＡプールの補充の両方を保証するために、全てのウィルスサブゲノム転写及びプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の鋳型となり、持続的な慢性感染及び再活性の原因となる。本発明において、ＳＲＳＦ１０活性が、１）慢性的に感染された細胞における細胞内ＨＢＶのＲＮＡ（ＨＢＶの総ＲＮＡ及びＨＢＶのプレゲノムＲＮＡ）の運命、及び２）デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）感染におけるｃｃｃＤＮＡの確立を制御することが初めて示された。この知見は、ＨＢＶ感染された対象におけるデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）ｃｃｃＤＮＡ合成を抑制する機会を提供し、それが、慢性的にＨＢＶ感染された患者の完治のための機会を開く。
【００１５】
要するに、これらの結果は、ＳＲＳＦ１０のリン酸化の阻害が肝細胞におけるＨＢＶ感染の強い阻害を誘導し、魅力的な新規の治療法を示す。
【００１６】
従って、本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染の治療に用いられるためのＳＲＳＦ１０活性の阻害剤に関する。
【００１７】
特定の実施形態において、前記阻害剤は、ＳＲＳＦ１０を脱リン酸化状態に維持し、ＳＦＲ１０のスプライシング活性を防止又は低減する。
【００１８】
特定の実施形態において、ＳＲＳＦ１０活性の阻害剤は、感染された細胞におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを低減できる。
【００１９】
本明細書において用いられる「ＨＢＶ感染」の用語は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）により引き起こされ、肝臓に影響する本技術分野で周知の感染症を意味する。ＨＢＶ感染は、急性又は慢性感染であり得る。感染された人は、初期感染の際に無症状で、嘔吐、黄色皮膚、疲労、暗色尿及び腹痛を伴う病的状態が急速に発症する場合がある（“Hepatitis B Fact sheet N°204”. who.int. July 2014. Retrieved 4 November 2014）。多くの場合、これらの症状は数週間続き、死に至り得る。症状が始まるのに３０〜１８０日かかり得る。出産時近くで感染された人の９０％は慢性Ｂ型肝炎に感染し、１０％未満の人は５歳の後に感染する（“Hepatitis B FAQs for the Public - Transmission” , U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC), retrieved 2011-11-29）。慢性疾患を有するほとんどの人は症状が無いが、肝硬変及び肝癌を最終的に発症し得る（Chang, 2007, Semin Fetal Neonatal Med, 12: 160-167）。 これらの併発は、慢性疾患を有する人の１５〜２５％の死亡を引き起こす（“Hepatitis B Fact sheet N° 204”. who.int. July 2014, retrieved 4 November 2014）。 ここで、「ＨＢＶ感染」の用語は、急性及び慢性Ｂ型肝炎の感染を含む。また、「ＨＢＶ感染」の用語は、ＨＢＶ感染の初期感染の漸近段階、症候段階、漸近的慢性段階を含む。
【００２０】
特定の実施形態において、ＨＢＶ感染は慢性感染である。
【００２１】
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は、エンベロープに包まれた、部分的二本鎖ＤＮＡウィルスである。コンパクトな３．２ｋｂのＨＢＶゲノムは、コア、ポリメラーゼ（Ｐｏｌ）、エンベロープ及びＸタンパク質の４つの重なるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。ＰｏｌのＯＲＦは最も長く、エンベロープのＯＲＦはその中に配置され、Ｘ及びコアのＯＲＦはＰｏｌのＯＲＦと重なる。ＨＢＶのライフサイクルは、１）弛緩型環状（ＲＣ  ＤＮＡ）から閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の生成、及び２）ＲＣ  ＤＮＡの生成のためのプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の逆転写の２つの主要なイベントを有する。
【００２２】
本明細書で用いられるｃｃｃＤＮＡ（共有結合性閉環状ＤＮＡ）の用語は、細胞核におけるいくつかのＤＮＡウィルスの増殖の際に生じる特別なＤＮＡ構造である。また、ｃｃｃＤＮＡは、エピソーマルＤＮＡとして又は時々微小染色体として知られている。ｃｃｃＤＮＡは、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を含むヘパドナウィルス科の代表例である。ＨＢＶゲノムは、肝細胞の核内で、共有結合性閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）である安定な微小染色体を形成する。ｃｃｃＤＮＡは、カプシド会合弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）の変換により形成される。ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡ形成は、細胞ＤＮＡの修復機構に必要とする複数のステップのプロセスに関連し、ｒｃＤＮＡにおけるプラス鎖ＤＮＡの完成に寄与する別の細胞成分との特異的相互作用に依拠する（Alweiss et al. 2017, Viruses, 9 (6): 156）。
【００２３】
本明細書で用いられる「処置」及び「治療」等の用語は、所望の薬理及び／又は生理効果を得ることを意味する。その効果は、その疾患若しくは症状を完全に若しくは部分的に防止する点で予防的であってもよく、並びに／又は疾患及び／若しくはその疾患に起因する悪影響を部分的に若しくは完全に治癒する点で治療的であってもよい。本明細書で用いられる「処置」は、対象の疾患へのいずれの処置もカバーし、（ａ）生存期間の延長、（ｂ）疾患による死亡リスクの低減、（ｃ）疾患に罹りやすくなっているかもしれないが疾患に罹っていると未だ診断されていない対象における疾患の発生の予防、（ｄ）疾患の抑制、すなわちその発症の阻止（例えば疾患の進行度の抑制）、及び（ｅ）疾患の緩和、すなわち疾患の退行を含む。
【００２４】
本明細書で用いられる「処置」又は「治療」の用語は、予防的又は防止的処置、及び治療的又は疾患改変処置の両方を意味し、それは、疾患に罹患するリスクのある対象又は疾患に罹患したと疑われる対象、及び病気である対象又は病気若しくは疾患を患うと診断された対象に対する処置を含み、また、臨床的再発の抑制を含む。処置は、障害若しくは障害の再発の発症の防止、治療、遅延、それらの重症度の低減、若しくはそれらの１つ以上の症状の改善のために、又はそれらのような治療の不存在下で予想される対象の生存時間を延長するために、医的障害を有する又は最終的に障害を受け得る対象に投与され得る。「治療レジメン」は、病気の処置のパターン、例えば治療の際に用いられる用量のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含み得る。「導入レジメン」の用語又は「導入時期」の用語は、疾病の初期処置に用いられる治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を意味する。導入レジメンの一般目的は、治療レジメンの初期に対象に対して高レベルの薬剤を与えることである。導入レジメンは、維持レジメンの際に医師が採用する用量よりも大きい用量を投与すること、維持レジメンの際に医師が薬剤を投与するよりも頻繁に薬剤を投与すること、又はその両方を含み得る「負荷レジメン」を（部分的に又は全体的に）採用し得る。「維持レジメン」又は「維持時期」の用語は、病気の処置の際における対象の維持、例えば長期間（数か月又は数年）にわたって対象の寛解状態を維持するのに用いられる治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を意味する。維持レジメンは、連続的治療（例えば毎週、毎月、毎年等の規則的な間隔で薬剤を投与する）又は断続的治療（例えば断続的処置、間歇的処置、再発に対する処置、又は特定の所定基準（例えば疾患症状等）の達成の上での処置）を採用し得る。
【００２５】
従って、本明細書での「ＨＢＶ感染の治療」は、対象に生じるＨＢＶ感染の治療及び防止、並びにＨＢＶ感染の症状の発症の治療及び防止を含む。本発明において、特に、ＨＢＶ感染された母親から生まれた子供のＨＢＶ感染の防止が考えられる。また、慢性ＨＢＶ感染のへの急性ＨＢＶ感染の変換の防止も考えられる。
【００２６】
本明細書において互換的に用いられる「対象」及び「患者」の用語は、哺乳動物、特に突発性肺線維症等の間質性肺線維症と過去に診断された、又は突発性肺線維症を有する又は発症するリスクがあるヒトを意味する。一般に、突発性肺線維症の診断は、肺生検の後に、又は高分解コンピュータ断層撮影（ＨＲＣＴ）によってなされ得る。
【００２７】
本明細書で用いられる「セリン／アルギニンリッチスプライシング因子１０」又は「ＳＲＳＦ１０」の用語は、本技術分野におけるその一般的な意味を有する。ＳＲＳＦ１０（ＮＳＳＲ、ＴＡＳＲ、ＳＲｐ３８、ＴＡＳＲ１、ＴＡＳＲ２、ＦＵＳＩＰ１、ＦＵＳＩＰ２、ＳＦＲＳ１３、ＳＲｒｐ４０、ＳＦＲＳ１３Ａ、ＰＰＰ１Ｒ１４９とも知られている）は、プレｍＲＮＡスプライシングに関わるＲＢＰ（ＲＮＡ結合タンパク質）のグループであるＳＲ（セリン／アルギニン）タンパク質のファミリーに属する。それは、ヒトにおいて、染色体１の１ｐ３６．１１位に位置する遺伝子（ＩＤ：１０７７２）によってコードされている。ＳＲＳＦ１０は、有糸分裂の際、及び熱ショックに応じたその脱リン酸化に基づく一般的なスプライシング抑制因子として最初に同定された(Shin et al., 2004; Shin et al., 2005)。これに対して、リン酸化ＳＲＳＦ１０は、スプライシングを活性でき、そのリン酸化状態は、ｈｎＲＮＰ（ｈｎＲＮＰＫ、Ｆ及びＨ）並びにＴＲＡ２Ｂ等の種々のＲＢＰとの相互作用を決定する(Shkreta et al., 2017; Shkreta et al., 2016)。重要なことに、リン酸化された際、ＳＲＳＦ１０は、ストレス、ＤＮＡ損傷、アポトーシス及び発癌の経路に関連する代わりのいくつかの細胞転写物のスプライシングを活性する(Shkreta et al., 2016; Zhou et al., 2014a; Zhou et al., 2014b)。最後に、ＳＲＳＦ１０は、ウィルスのプレｍＲＮＡ、特にＨＩＶ−１転写物のスプライシングにおいても役割を果たす(Shkreta et al., 2017)。
【００２８】
ＳＲＳＦ１０活性の阻害剤
「ＳＲＳＦ１０活性の阻害剤」は、本技術分野における一般的な意味を有し、ＳＲＳＦ１０の生物活性を低減又は抑制できる能力を有する化合物（天然又は非天然）を意味する。本願において、前記化合物は、脱リン酸化状態にＳＲＳＦ１０を維持し、ＳＦＲ１０のスプライシング活性を防止又は低減する。例えば、その化合物は、ＳＲＳＦ１０がウィルス及び細胞ＲＮＡのスプライシングを活性できない、並びに種々のＲＢＰと結合できない方法で脱リン酸化状態にＳＲＳＦ１０を維持又はブロックし(Shkreta et al., 2017; Shkreta et al., 2016を参照)、それは、感染された細胞においてｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡを低減することを引き起こす。一般に、前記阻害剤は、有機小分子又は生物分子（例えばペプチド、脂質、アプタマー、抗体等）である。
【００２９】
リン酸化ＳＲＳＦ１０の「生物活性は」、感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡの確立に関連するＨＢＶ感染された細胞においてそのスプライシング活性を誘導することを意味する。
【００３０】
ＳＲＳＦ１０活性の阻害剤となる化合物の能力を測定するための試験は、当業者に周知である。好ましい実施形態において、その阻害剤は、ＳＲＳＦ１０の生物活性を阻害する十分な方法でＳＲＳＦ１０を脱リン酸化状態に特異的に維持する。ＳＲＳＦ１０の脱リン酸化状態の維持及びＳＲＳＦ１０の生物活性の阻害は、本技術分野に周知のアッセイによって測定され得る。例えば、そのアッセイは、ＳＲＳＦ１０のリン酸化状態を変更するための因子の能力を測定することからなり得る。タンパク質のリン酸化を直接に測定する古典的な方法は、全体細胞の放射標識された３２Ｐ−オルトリン酸塩とのインキュベーション、細胞抽出物の生成、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分離、及びフィルムへの撮影を含む。他の伝統的な方法は、リン酸化がタンパク質の移動性及び等電点を変更し得ることを想定した技術である二次元ゲル電気泳動を含む。例えばShkreta et al 2016及びShkreta et al 2017において、ＳＲＳＦ１０のリン酸化状態のためのアッセイは、リン酸化状態と比較してＳＲＳＦ１０の脱リン酸化状態のゲル条件下における速い移動性に基づいて説明されている。また、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）も、ＳＲＳＦ１０のリン酸化状態を評価するための便利なツールである。また、Shkreta et al 2017も、ＩＣ８がＳＲＳＦ１０のセリン１３３位の脱リン酸化を促進することを測定するためにこのアッセイを使用している。
【００３１】
そして、競合アッセイは、ＳＲＳＦ１０の生物活性を阻害するための因子の能力を測定することを解決し得る。機能的アッセイは、そのような感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡの確立に関連するＨＢＶ感染細胞におけるスプライシング活性を誘導又は阻害する能力を評価することが把握され得る（例えば１Ｃ８化合物及び図７〜８を参照）。
【００３２】
当業者は、ＳＲＳＦ１０活性の阻害剤が、ＳＲＳＦ１０の生物活性を中和する、ブロックする、阻害する、抑止する、低減する又は妨げるかどうかを容易に決定できる。ＳＲＳＦ１０活性の阻害剤がＳＲＳＦ１０のリン酸化状態を変更する、並びに／又はＳＦＲ１０のスプライシング活性を阻害する、並びに／又はＨＢＶ感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡ及び／若しくはｐｇＲＮＡを阻害するかどうかを確認するために、同じ方法で、最初に特徴付けられた１Ｃ８化合物がそれぞれの阻害剤と共に行われ得る。例えば、肝細胞におけるＨＢＶ感染は、ｃｃｃＤＮＡの定量及び／又はｐｇＲＮＡの定量等のウィルスパラメータの分析により測定され得る。ｃｃｃＤＮＡの定量のために、総ＤＮＡは、Ｔ５エキソヌクレアーゼ(New England Biolabs)により切断された後、Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ(Life Technologies)を用いたｑＰＣＲに掛けられる。ｐｇＲＮＡの定量のために、ＲＴ−ｑＰＣＲがＴａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ(Life Technologies)を用いて行われ得る。ｐｇＲＮＡレベルは、市販のプローブプライマーミックス(Life Technologies #Hs99999908_m1)を用いてＧＵＳＢで正規化される。
【００３３】
ＨＢＶ感染は、Ｅｌｉｓａ（化学発光免疫アッセイキット（Autobio））により分泌ＨＢｅ及びＨＢｓ抗原の定量（分泌ＨＢｅ及びＨＢｓ抗原のレベルは肝細胞のＨＢＶ感染の標準分泌マーカーである）、並びに／又は実施例の項等で説明されるような特定のＨＢＶプライマーを用いたｑＰＣＲ若しくはＲＴ−ｑＰＣＲによる感染細胞から抽出された細胞内総ＨＢＶＤＮＡ若しくはＲＮＡの評価等のウィルスパラメータの分析により測定され得る。
【００３４】
ＳＲＳＦ１０を阻害する小分子は、ＨＩＶにおけるＳＲＳＦ１０の役割に関連して同定されてきており、そのようなＳＲＳＦ１０阻害剤は、ＨＢＶを治療する本発明において有益と考えられる。特に、コンジュゲート又は製剤化等を介してそのような小分子化合物を肝臓に標的化することは、例えば、ＨＢＶの処置において有益となり得る。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明に係る活性阻害剤は、化合物１Ｃ８（又はＣ８）：４−ピリジノンベンズイソチアゾールカルボキサミド（Shkreta et al 2016及びShkreta et al 2017 WO2015/164956）、又は１Ｃ８に属するベンズイソチアゾール誘導体化合物（WO2015/164956を参照）等の有機小分子である。WO2015/164956に開示されたすべての活性化合物は、参照により本明細書内に組み込まれる。特に、以下の化合物である。
2021520407.tif 000002
【００３６】
これら全ての化合物は、抗ＨＩＶ活性を示し、特に最も活性な１Ｃ８化合物はＳＲＳＦ１０の１３３位の残基のリン酸化を阻害し、そのスプライシング活性を調節する。
【００３７】
一実施形態において、本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染の処置に用いるためのベンズイソチアゾール誘導体化合物にも関する。
【００３８】
ベンズイソチアゾール誘導体化合物は、WO2015/164956に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態において、前記化合物は、１Ｃ８、Ｅ５、Ｄ３、Ｃ２又はＳＬ３０９化合物からなるリストから選択される。
【００３９】
特定の実施形態において、本発明は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染の処置に用いるための１Ｃ８（４−ピリジノンベンズイソチアゾールカルボキサミド）又はベンズイソチアゾール誘導体化合物（Ｅ５、Ｄ３、Ｃ２又はＳＬ３０９化合物）にも関する。
【００４０】
医薬組成物
ＳＲＳＦ１０の阻害剤は、治療組成物の形成のために、医薬的に許容可能な賦形剤、及び生分解性ポリマー等の任意に徐放性マトリクスと組み合わせられ得る。
【００４１】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、吸入又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、有効成分は、動物及びヒトに、従来の医薬担体との混合物としてユニット投与の形態で単独で又は他の有効成分と組み合わせて投与され得る。適切なユニット投与形態は、タブレット、ゲルカプセル、粉末、顆粒及び経口懸濁液又は溶液等の経口形態、舌下及び口腔内投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、皮下、脊髄内及び鼻腔内投与形態、並びに直腸投与形態を含む。
【００４２】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤化のために医薬的に許容可能なビヒクルを含む。これらは、特に、等張、無菌、生理食塩水（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウム等、又はそれらの塩の混合物）、又は場合によって滅菌水又は生理食塩水の追加で注射溶液の構成を許容する乾燥、特に凍結乾燥組成物であってもよい。
【００４３】
注射用途に適する医薬形態は、無菌の水溶液、又はごま油、ピーナッツ油若しくは水性プロピレングリコールを含む形態の分散液、及び無菌注射溶液若しくは分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は、無菌でなければならず、注射針の通過が容易な程度の流体でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び菌類等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【００４４】
遊離塩基又は医薬的に許容可能な塩のように本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合された水で調製され得る。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合液、並びに油で調製され得る。保存及び使用の通常の条件下において、これらの製剤は微生物の増殖を防止する保存料を含む。
【００４５】
本発明のＳＲＳＦ１０活性の阻害剤は、中性又は塩形態で組成物に製剤化され得る。医薬的に許容可能な塩は、（タンパク質の遊離アミノ基で形成された）酸付加塩を含み、それは例えば塩酸又はリン酸糖の無機酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸及びマンデル酸等の有機酸で形成される。また、遊離カルボキシル基で形成された塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来し得る。
【００４６】
キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合液、及び植物油を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティングを用いることにより、分散液の場合では必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸及びチメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤によりもたらされ得る。多くの場合、それは、例えば砂糖又は塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが好ましいであろう。注射組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった吸収を遅延する薬剤を組成物に用いることによりもたらされ得る。
【００４７】
無菌注射溶液は、適切な溶媒に、上記列挙した種々の他の成分と共に必要量の活性化合物を組み入れ、必要に応じてその後にろ過滅菌されることにより調製される。一般に、分散液は、基本的な分散媒及び上記列挙されたもののうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに種々の無菌活性成分を組み入れることにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合において、調製の好ましい方法は、予めろ過滅菌された活性成分及び追加の所望の成分の溶液から、それらの成分の粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【００４８】
製剤において、溶液は、投与形態と相性が良い方法で、また、治療効果がある量で投与されるであろう。製剤は、上記注射溶液の型等の種々の投与形態で容易に投与されるが、薬剤徐放性カプセル等も採用され得る。
【００４９】
水溶液の非経口投与のために、例えば必要であれば溶液は適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、まず十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に適切である。これに関連して、採用され得る無菌水性媒体は、本開示を考慮して当業者に周知であろう。例えば、一回量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下注入液に加えられ得る又は注入の候補部位に注射され得る。投与量の変更は、治療される対象の状態に依存して必然的に生じるであろう。投与の責任者は、いずれのイベントにおいても、個々の対象に適切な用量を決定するであろう。
【００５０】
本発明のＳＲＳＦ１０活性又は発現の阻害剤は、１用量当たり約０．０００１〜１．０ｍｇ、又は約０．００１〜０．１ｍｇ、又は約０．１〜１．０ｍｇ又は約１０ｍｇ等を含むように治療混合物内で製剤化され得る。複数回投与もなされ得る。
【００５１】
静脈内又は筋肉内注射等の非経口投与用に製剤化された本発明の化合物に加えて、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与用のタブレット又は他の固体、リポソーム製剤、徐放性カプセル及び現在用いられている他の形態を含む。
【００５２】
スクリーニング方法
本発明は、（ａ）候補化合物のそれぞれのＳＲＳＦ１０活性を阻害する能力を試験することと、（ｂ）前記ＳＲＳＦ１０活性を阻害できる候補化合物を積極的に選択することとからなるステップを含む、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）感染の治療に有益な複数の候補化合物のスクリーニング方法にも関する。
【００５３】
一般に、候補化合物は、有機小分子、ペプチド、ポリペプチド又はオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００５４】
候補化合物がＳＲＳＦ１０活性を阻害できるかどうか試験することは、本技術分野に周知のレポーターアッセイを用いて又はルーチン的に変更して決定され得る。
【００５５】
例えば、その方法は、ＳＲＳＦ１０を発現する細胞を候補化合物に接触することと、ＳＲＳＦ１０のリン酸化状態（例えばＳＲＳＦ１０のスプライシング活性の活性化又は抑制）を測定することと、その細胞応答を基準細胞応答と比較することとを含み得る。一般に、基準細胞応答は、候補化合物の非存在下で測定される。基準に対して減少した細胞応答は、候補化合物がＳＲＳＦ１０の阻害剤であることを示す。
【００５６】
積極的に選択された候補化合物は、ＨＢＶ感染を罹患する対象から単離された肝細胞（又はＨＢＶに感染されたｄＨｅｐａｒＲＧ細胞、Grippon et al 2002を参照）におけるその特性をさらに試験することを考慮した更なる選択ステップに掛けられ得る。例えば、上記のようにスクリーニング方法により積極的に選択された候補化合物は、ＨＢＶ感染細胞においてＳＲＳＦ１０のスプライシング活性を阻害する、又はＨＢＶ感染細胞においてｃｃｃＤＮＡ及び／若しくはｐｇＲＮＡを低減するそれらの能力でさらに選択され得る。一般に、そのスクリーニング方法は、ｉ）ＨＢＶ感染された患者からの肝細胞と積極的に選択された候補化合物と接触させることと、ｉｉ）前記ＨＢＶ感染細胞におけるｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡの量を決定することと、ｉｉｉ）ステップｉｉ）で測定されたｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡの量を、ステップｉ）が積極的に選択された化合物の非存在下で行われた場合に測定されたｃｃｃＤＮＡ及び／又はｐｇＲＮＡの量を比較することとのステップをさらに含み得る。上記のようなステップｉ）は、肝細胞の培養培地に試験されるための候補化合物の量を加えることにより行われ得る。通常、複数の培養サンプルは、別の培養サンプルで試験されるための増加された候補化合物の量を加えるために調製される。一般に、候補化合物が無い少なくとも１つの培養サンプルも、更なる比較のための陰性対照として調製される。
【００５７】
最後に、積極的に選択された候補化合物は、ＨＢＶ感染のための動物モデルにおいてその特性をさらに試験することを考慮した更なる選択ステップに掛けられ得る。一般に、積極的に選択された候補化合物は、動物モデルで投与されてもよく、ＨＢＶ感染の進行が決定され、また、候補化合物が投与されていない動物モデルのＨＢＶ感染の進行と比較される。
【００５８】
本発明は、下記実施例及び図面によりさらに説明される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するように決して解釈されるべきでない。
【実施例】
【００５９】
［実施例１］
＜材料及び方法＞
野生型ＨｅｐａＲＧ、操作型ＨｅｐａＲＧ細胞の培養及びＨＢＶ感染の条件
ヒト肝臓前駆細胞であるＨｅｐａＲＧ細胞を、１０％ＦＢＳ(Perbio)、ペニシリン／ストレプトマイシン(500 U/mL)、グルタミン(2mM)、ヒドロコルチゾンＵｐｊｏｈｎ(2.5 mg/L; Serb laboratory)、インスリン(5mg/L; Sigma Aldrich)が転化されたウィリアムス培地(ThermoFisher)で培養した。分化されたＨｅｐａＲＧ細胞（ｄＨｅｐａＲＧ）を、以前に説明された通りに(Gripon et al., 2002)、ＨｅｐＧ２．２．１５若しくはＨｅｐＡＤ３８細胞から調製されたＨＢＶ遺伝子型Ｄ接種材料、又は直線状ｐｃＤＮＡ３−ＨＢＶ−１．３５ゲノムユニットプラスミドで安定的に形質導入され、Ｇ４１８耐性で選択されたＨｅｐＧ２から調製されたＨＢＶ遺伝子型Ｃ(GenBank: KP017269.1)で感染させた。感染の多重度（ＭＯＩ；１細胞当たりのウィルスゲノム当量として表される）は、図面の説明で示されたが、明確でない場合１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌとした。
【００６０】
ＨｅｐａＲＧ−ＴＲ−ＳｔｅｐＴａｇ−ＨＢｃ細胞株を、ブラストサイジンに耐性可能な発現カセットに導入されたテトラサイクリンリプレッサ（ＴＲ）を有し、ゼオシンに耐性可能な発現カセットに導入されたＮ末端にＳｔｒｅｐＴａｇを含むＨＢＶのコア／カプシドタンパク質をコードするＳｔｒｅｐＴａｇ−ＨＢｃ遺伝子を有するレンチウィルスによる二重形質導入によって生成した。ＨｅｐａＲ−ＴＲ−ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＨＢｃ細胞を、１００μｇ／ｍＬのゼオシン及び１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンを含む同一のウィリアムス培地で培養した。また、テトラサイクリンも、導入遺伝子、すなわちＳｔｅｐＴａｇ−ＨＢｃの発現を得るために上記培地に加えた（１μｇ／ｍＬ）。
【００６１】
ＳｔｅｐＴａｇ精製
Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ親和性カラム樹脂を特色とするＩＢＡからのＳｔｒｅｐＴａｇシステムは、タンパク質の精製、検出及び固定化のための最も広く用いられる親和性クロマトグラフィーシステムの１つであり、（タンパク質：タンパク質相互作用に好ましいバッファー条件下での）生理的精製プロセスの後に単離された複合体の高純度を含む多くの利点を提供する。精製に用いられる手順は、製造者により推薦される手順であり、www.ibalifesciences.com/strep-tactin-system-technology.htmlで見られ得る。
【００６２】
化学試薬
ＩＣ８はBenoit Chabot博士より提供された。ＨＢＶの侵入を阻害するために用いられるＰｒｅＳ１ペプチド（ＨＢＶのＰｒｅＳ１のアミノ酸配列２〜４８、TNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFRANSNNPDWDFNPNKDHWPEANKVG（配列番号１）は、Ｎ末端をミリストイル化部分で修飾され、標準塩酸に再懸濁された）Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（香港）により合成された。ヌクレオシドアナログであるラミブジン及びテノホビルは、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓより提供された。これらの分子の抗ＨＢＶ活性を決定するために用いられた２つの実験スキームは、図１に示される。
【００６３】
細胞毒性アッセイ
細胞毒性を、プロメガの「CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay」を用いて製造者の説明書に従って、図１に示す実験スキーム薬剤等で処理されたＨｅｐａＲＧ細胞で測定した。
【００６４】
ウィルスパラメータの分析
細胞培養上清から、製造者の説明書に従って化学発光免疫アッセイキット(Autobio, 中国)を用いて、分泌型ＨＢｅ及びＨＢｓ抗原をＥＬＩＳＡにより定量した。細胞外ウィルスＤＮＡを、製造者のプロトコールに従ってＭａｇＭＡｘキット(Thermo scientific)及びＭａｇＮＡＰｕｒｅ(Roche)のそれぞれを用いて細胞培養上清から抽出し、ＤＮＡｓｅ‐Ｉ又はＲＮＡｓｅ‐Ａで処理した。細胞内総ＨＢＶＤＮＡ又はＲＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ９６  Ｔｉｓｓｕｅ又はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ９６  ＲＮＡキット(Macherey-Nagel)のそれぞれを用いて感染細胞から抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素(Invitrogen)を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。細胞内総ＨＢＶＤＮＡ及びＲＮＡからのｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０(Roche)を用いて行い、ハウスキーピング遺伝子であるＰＲＰで正規化し、以下のプライマーを用いた：5’- GCTGACGCAACCCCCACT-3’ (ＨＢＶ−センス:配列番号２)及び 5’-AGGAGTTCCGCAGTATGG-3’ (ＨＢＶ−アンチセンス:配列番号３), 5’-TGCTGGGAAGTGCCATGAG-3’(ＰＲＰ−センス : 配列番号４)及び5’-CGGTGCATGTTTTCACGATAGTA-3’(ＰＲＰ−アンチセンス :配列番号５)。
【００６５】
ＨＢＶ標品を細胞外ウィルスＤＮＡ及びＲＮＡの定量のために用いた。ｃｃｃＤＮＡの定量のために、総ＤＮＡをＴ５エキソヌクレアーゼ(New England Biolabs)の３７℃で６時間処理により切断し、その後、Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ(Life Technologies)を用いてｑＰＣＲを行った。ｃｃｃＤＮＡをβグロビン定量で正規化した。ｐｇＲＮＡ定量のために、自家製プローブプライマーミックスを用いたＴａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ(Life Technologies)を用いてｑＰＣＲを行った。ｐｇＲＮＡレベルを市販のプローブプライマーミックス(Life Technologies #Hs99999908_m1)を用いてＧＵＳＢで正規化した。
【００６６】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア６．０を用いたノンパラメトリックなマン‐ホイットニー試験を用いて統計分析を行った。有意性は以下の通りである：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【００６７】
＜結果＞
ＳＲＳＦ１０はＨＢＶのコア／カプシドタンパク質の主要な相互作用物である
ＨＢＶのコア／カプシドタンパク質（ＨＢｃ）は、細胞質区画内でのＨＢＶのプレゲノムＲＮＡのカプシド形成において役割を果たす構造タンパク質である。このカプシド形成後に、ｐｇＲＮＡは、ビリオンに見られるＨＢＶのゲノム型である弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）に逆転写される。この構造的機能以外に、ＨＢｃは、それが増殖している肝細胞で蓄積する特に感染細胞の核内において潜在的に他の非構造的な制御機能を有する。ＨＢｃの核での機能の見識を得るために、我々は、テトラサイクリン誘導性ＨｅｐａＲＧ−ＴＲ−ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＨＢｃ細胞の核内のタンパク質複合体に関連するＳｔｅｐＴａｇ−ＨＢｃの質量分析を行った。手順の概要を図２に示す。
【００６８】
分析の統計力を増大するために、３つの独立した試験を行った。それぞれ、ベンゾナーゼ（−）及びベンゾナーゼ（＋）条件で、４４及び５８種のＨＢｃ相互作用タンパク質を見出した（ｐ値＜０．００５、濃縮係数＞４）。３７種のタンパク質は、２つのセットの条件間で共通するものであった。これらのタンパク質のリストを図３に示す。
【００６９】
多くのＨＢｃ相互作用タンパク質は、ＲＮＡ代謝（プレＲＮＡの成熟、スプライシング、ＲＮＡ輸送）に関連するＲＮＡ結合タンパク質であることが見出された。これらのタンパク質のうち、我々は、ベンゾナーゼの存在下であっても最も濃縮されたＳｔｒｅｐＴａｇ−ＨＢｃ関連因子のうちの１つであったＳＲＳＦ１０に興味を得た（図４）。導入の項で示した通り、このタンパク質は、ＨＩＶ複製に重要であることも見出された。また、興味深いことに、阻害特性を有するいくつかの小分子は、以前に説明されており、それらに１Ｃ８が含まれる。
【００７０】
ＨＢＶ複製するｄＨｅｐａＲＧ細胞における１Ｃ８の抗ＨＢＶ特性
我々は、２つの異なる実験スキームを用いて１Ｃ８の潜在的抗ＨＢＶ特性を分析した（図１）。持続的に感染された（ＨＢＶ遺伝子型Ｄを使用、ＭＯＩは１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌ）ｄＨｅｐａＲＧにおいて、１００μＭの１Ｃ８又はコントロール分子で２〜３日毎に３回処理し、我々は、１Ｃ８が単独で細胞内ＨＢＶＲＮＡの蓄積を６０〜７０％低減する能力がある一方で、ＦＤＡ承認ヌクレオシドアナログ（ＮＵＣ；ラミブジン（３ＴＣ）及びテノホビル（ＴＤＦ））がこのウィルスパラメータに影響することができないことを見出した（図５Ａ）。それらの分子は、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡを低減する能力がなかった。１Ｃ８は、細胞培養上清におけるウィルス抗原（ＨＢｓ及びＨｂｅＡｇ）及びＨＢＶビリオン（図５Ｂにおいて分泌型ＨＢＶＤＮＡとして測定）を６０〜７０％低減でき、このとき、ＨＢＶビリオン生成の期待された強い阻害がＮＵＣでも見出された。１Ｃ８は、同一の細胞におけるＤ型肝炎ウィルスの複製を阻害できなかった（図５Ｃ）。１Ｃ８は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いた試験で４０μＭまででは細胞に毒性を与えず（図５Ｄ）、従って、ＨＢＶの複製に対する抗ウィルス作用の特異性を証明した。
【００７１】
ＨＢＶには、種々の遺伝子型が存在する。１Ｃ８等の宿主標的剤（ＨＴＡ、すなわちウィルス複製に重要な細胞機能を阻害し、従って抗ウィルス作用を引き起こす分子）を評価する場合、ＨＴＡの抗ウィルス特性が遺伝子型の中で保存されていることを確認することが重要である。従って、我々は、アジアで主に循環する遺伝子型Ｃウィルスの複製における１Ｃ８の効果を評価した。我々は、１Ｃ８がこの系統に対してわずかに効果が低減するものの、抗ウィルス特性を維持することを見出した（図６）。
【００７２】
１Ｃ８は、ナイーブｄＨｅｐａＲＧにおけるＨＢＶ感染の確立も障害する
第２の実験アプローチにおいて、我々は、１Ｃ８が侵入阻害剤(Li and Urban, 2016)又はコアアセンブリモジュレータ（ＣＡＭ）(Berke et al., 2017)のように、ｄＨｅｐａＲＧ細胞においてＨＢＶ感染の確立を障害できるかどうかを決定することを試みた。ＰｒｅＳ１ペプチド（例えばMyrcludex）等の侵入阻害剤は、ＨＢＶビリオンとその細胞受容体であるヒトタウロコール酸ナトリウム共輸送ペプチド（ｈＮＴＣＰ）との相互作用を防止することにより肝細胞内へのＨＢＶの侵入を阻害する。カプシド形成プロセスを阻害するために主に開発されたＣＡＭは、侵入後レベルで作用することによりｃｃｃＤＮＡの確立を防止することも示し、なぜか新たな感染肝細胞の核へのヌクレオカプシドの侵入後輸送を妨げる。対して、臨床的に用いられるＮＵＣは、ＨＢＶ感染の確立に干渉しない。１Ｃ８の抗ＨＢＶ阻害のメカニズムが知られていないので、我々は、それがｃｃｃＤＮＡプールの確立及びその後の他のウィルス成分の合成／生成を防止できるかどうかを決定するために、ＨＢＶ接種の前及び際にその分子で細胞を処理した。我々は、１Ｃ８が１０μＭで、ＨＢＶ遺伝子型ＤのｃｃｃＤＮＡの確立を５０％阻害でき（図８Ａ）、ＨＢＶ遺伝子型ＣのｃｃｃＤＮＡの確立を７０％阻害できる（図８Ａ）ことを見出した。
【００７３】
この１Ｃ８誘導性阻害は、侵入阻害剤で得られるものよりも低いが、ＮＵＣ（テノホビル、ＴＤＦ）で得られるよりも高かった。ｃｃｃＤＮＡの確立の阻害の後、他のウィルスマーカー（すなわち、細胞内ＲＮＡ、ＨｂｅＡｇ、ＨＢｓＡｇ）も、１Ｃ８処置条件で低減された（図７Ａ及びＢ、図８Ａ及びＢ）。その間に、同一の実験条件を用いて（すなわち接種前及び接種の際の２４時間処理）、１Ｃ８が（コントロールのＥｎｔｒｙ  Ｉｎｈにより阻害された）ＨＤＶ感染の確立をブロックできなかったので、ＨＢＶにおける１Ｃ８の作用の特異性を再度提案する（図７Ｃ及び図８Ｃ）。
【００７４】
［実施例２］
＜材料及び方法＞
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）の培養及びＨＢＶ感染の条件
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、以前に説明されたように(Leycluse and Alexandre, 2010)、フランス政府承認のCentre Leon Berard (Lyon)から得られたヒト肝臓摘出から新たに調製した。それらを、５％ＦＢＳ(Perbio)、ペニシリン／ストレプトマイシン(500 U/mL)、グルタミン(2mM)、ヒドロコルチゾンＵｐｊｏｈｎ(2.5mg/L; Serb Laboratory)及びインスリン(5mg/L; Sigma Aldrich)が添加されたウィリアムス培地(Thermofisher)で培養した。ＰＨＨを、以前に説明されたように(Gripon et al., 2002)、ＨｅｐＡＤ３８細胞(GenBank : KP017269.1)から調製されたＨＢＶ遺伝子型Ｄ接種によって、１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌで感染させた。感染の１６時間後、細胞を洗浄した。感染の６日後、細胞に対してテノホビル（ＴＤＦ）、ラミブジン（３ＴＣ）又は１Ｃ８を１０μＭの濃度で処理した。上清を各処理の後に回収し、細胞を感染の１３日後に回収した。
【００７５】
ウィルスパラメータの分析
分泌型ＨＢｅ及びＨＢｓ抗原、並びに細胞内ＨＢＶＲＮＡを実施例１に説明するように分析した。
【００７６】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア６．０を用いたノンパラメトリックなマン‐ホイットニー試験を用いて統計分析を行った。有意性は以下の通りである：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【００７７】
＜結果＞
１Ｃ８が初代ヒト肝細胞でＨＢＶ複製を阻害する
１Ｃ８の阻害効果について、持続的に感染されたＰＨＨにおいて同様に試験した。このため、２人の異なるドナーから得られたＰＨＨの２つの異なるバッチをＨＢＶに感染させ（ＨＢＶ遺伝子型Ｄ、１００ｖｇｅ／ｃｅｌｌのＭＯＩ）、その後、２つの異なるプロトコールで１０μＭの１Ｃ８又はコントロール分子により処理した（図９Ａ及びＤ）。分泌型ウィルス抗原、ＨＢｅ及びＨＢｓの分析は、１Ｃ８による処理がウィルス複製の強い低減（６０％以上の低減）を引き起こすことを示した（図９Ｂ及びＤ）。予想通り、これらのパラメータは、ＨＢＶのｐｇＲＮＡの逆転写を標的とするヌクレオシドアナログである３ＴＣによって影響しなかった。細胞内ウィルスＲＮＡ（総ＲＮＡ及びｐｇＲＮＡ）の定量は、先にＨｅｐａＲＧ細胞で観察されたように（図６Ａ）、ＨＢＶ感染ＰＨＨへの１Ｃ８の添加がウィルスＲＮＡの量の顕著な低減を引き起こすことをさらに示した（図９Ｃ）。
【００７８】
このアプローチを通して、本発明が属する最先端技術について種々の参考文献が説明する。これらの参考文献の開示は、本開示の中に参照として組み込まれる。
【００７９】
＜参考文献＞
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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