(57)【要約】  本発明は、グルコサミンの製造方法に関すうるものであり、特にインビトロ酵素触媒によりグルコサミンを製造する方法に関するものであり、グルコサミンの酵素触媒製造分野に属するものである。上記方法は以下を含む：グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ（glucosamine-6-phosphate deaminase，EC 3.5.99.6，GlmD）を触媒として採用し、フルクトース6-リン酸（F6P）及びアンモニウム塩をグルコサミン6-リン酸（GlcN6P）に転換させる；及び、リン酸基脱離可能な酵素を触媒としGlcN6Pのリン酸基を脱離させることでグルコサミン（GlcN）を生成する。
2021531758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ酵素触媒反応によりグルコサミンを製造する方法であり、グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ（glucosamine-6-phosphate deaminase，EC 3.5.99.6，GlmD）を触媒として採用し、フルクトース6-リン酸（F6P）及びアンモニウム塩をグルコサミン6-リン酸（GlcN6P）に変換させ、及び、リン酸基脱離作用をもつ酵素を触媒としGlcN6Pのリン酸基を脱離させることでグルコサミン（GlcN）を生成することを含み、
好ましくは、上記アンモニウム塩は、硫酸アンモニウムと、塩化アンモニウムと、硫酸水素アンモニウムと、硝酸アンモニウムと、炭酸アンモニウムと、炭酸水素アンモニウムと、から選ばれる一種、二種又は多種の任意の混合物であることを特徴とするグルコサミンの製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、上記方法はさらに、グルコース６−リン酸(G6P)をF6Pに転換させる反応工程を含むが、当工程ではホスホグルコースイソメラーゼ（phosphoglucose isomerase，EC 5.3.1.9，PGI）を触媒として採用し、
好ましくは、上記方法はさらに、1-リン酸グルコース（G1P）をG6Pに転換させる反応工程を含むが、当工程ではホスホグルコムターゼ（phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2，PGM）を触媒として採用し、
好ましくは、上記方法はさらに、基質及びリン酸塩をG1Pに転換させる反応工程を含むが、上記基質はD―グルコース単位を含む二糖、多糖またはそれらの任意の混合物であり、当工程では基質及びリン酸塩をG1Pに転換可能な酵素を触媒とし、
好ましくは、上記リン酸塩は、リン酸二水素カリウムと、リン酸水素二カリウムと、リン酸二水素ナトリウムと、リン酸水素二ナトリウムと、から選れる一種、二種又は多種の任意の混合物であり、
好ましくは、上記D―グルコース単位を含む二糖は蔗糖であり、蔗糖ホスホリラーゼ（sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7，SP）を触媒とし其の物及びリン酸塩をG1Pに転換させ；
好ましくは、上記D―グルコース単位を含む多糖は、澱粉と、澱粉誘導体またはそれらの何れの混合物と、から選ばれ、澱粉ホスホリラーゼ（α-glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1、αGP）を触媒とし其の物及びリン酸塩をG1Pに転換させ、
好ましくは、上記Ｄ−グルコース単位を含む多糖はさらに、セルロースと、セルロース誘導体またはそれらの何れの混合物と、から選ばれ、好ましくは、上記セルロース誘導体は、セルロースを酸または酵素で前処理した後の生成物であり、
好ましくは、上記D―グルコース単位を含む多糖がセルロース及び／またはセロ多糖を含む場合、セロ多糖ホスホリラーゼ（cellodextrin phosphorylase，EC 2.4.1.49，CDP）を触媒とし其の物及びリン酸塩をG1Pに転換させ、好ましくは、さらに、セロビオースホスホリラーゼ（cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20，CBP）を触媒としセルロース及び／またはセロ多糖を分解して生成されたセロビオース及びリン酸塩をG1Pに転換させ、
好ましくは、上記D―グルコース単位を含む多糖がセロビオースを含む場合、セロビオースホスホリラーゼ（cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20，CBP）を触媒とし其のもの及びリン酸塩をG1Pに転換させる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法に置いて、上記グルコサミン６−リン酸デアミナーゼの由来は、大腸桿菌（UniProt  番号：P0A759）、枯草菌（UniProt番号：O35000）、ランブル鞭毛虫（UniProt番号：V6TL01）またはThermococcus kodakarensis（UniProt番号：Q5JDU3）などであり、
好ましくは、リン酸基脱離可能な酵素は6-ホスホグルコサミンホスファターゼ（6-phosphate glucosamine phosphatase，GlmP）であり、好ましくは、上記6-ホスホグルコサミンホスファターゼは大腸桿菌（UniProt番号：P77475、P27848、P0AE22など）、バクテロイデス多形体（Bacteroides thetaiotaomicron，UniProt番号：Q8A759）から由来し、
好ましくは、上記リン酸基脱離可能な酵素はヌクレオチドにコードされ、上記ヌクレオチドはSEQ ID NO：1と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%配列の同一性をもつヌクレオチド配列を含み、好ましくは、上記リン酸基脱離可能な酵素はSEQ ID NO：2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%配列の同一性をもつアミノ酸配列を含み、好ましくは、上記リン酸基脱離可能な酵素はThermococcus kodakarensis由来の糖ホスファターゼ（UniProt番号：Q5JJ45）であり、
好ましくは、上記澱粉ホスホリラーぜは大腸桿菌（Uniprot番号：A0A0A0HB49）、テルモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima，Uniprot番号：G4FEH8）、クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，Uniprot番号：A3DCB6）から由来し、
好ましくは、上記蔗糖ホスホリラーゼはビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis，UniProt番号：A0ZZH6）、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum（UniProt番号：D9TT09）から由来し、
好ましくは、上記セロ多糖ホスホリラーゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，UniProt番号：A3DJQ6）、Clostridium stercorarium（UniProt番号：P77846）から由来し、
好ましくは、上記セロビオースホスホリラーゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，UniProt番号：A3DC35）、Thermotoga neapolitana（UniProt番号：B9K7M6）から由来し、
好ましくは、上記ホスホグルコムターゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，Uniprot番号：A3DEW8）、Thermococcus kodakarensis（UniProt番号：Q68BJ6）から由来し、
好ましくは、上記ホスホグルコースイソメラーゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，Uniprot番号：A3DBX9）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus，Uniprot番号：Q5SLL6）から由来することを特徴とする製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れの一項に記載の方法に置いて、触媒反応の温度は30-70℃であり、より好ましくは30-50℃であり、最も好ましくは37℃であり、
好ましくは、触媒反応のpHは5.0-8.0であり、より好ましくは6.0-7.5であり、最も好ましくは7.0であり、
好ましくは、上記工程を同時進行させるが、触媒反応の時間は1-48時間であり、より好ましくは8-36時間であり、さらに好ましくは10-24時間であり、最も好ましくは20時間であり、
好ましくは、上記工程を段階的に進行させるが、各工程の触媒反応の時間は各自独立的に0.5-10時間であり、より好ましくは1-3時間であり、最も好ましくは2時間であり、
好ましくは、基質の濃度は1-200g/Lであり、より好ましくは5-50g/Lであり、さらに好ましくは8-20g/Lであり、最も好ましくは10g/Lであり、
好ましくは、基質をG1Pに変換させる酵素の濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは1-3U/mLであり、最も好ましくは2U/mLであり、
好ましくは、ホスホグルコムターゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは、0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは1-3U/mLであり、最も好ましくは2U/mLであり、
好ましくは、ホスホグルコースイソメラーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは、1-5U/mLであり、最も好ましくは、3U/mLであり、
好ましくは、グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは、0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは、1-3U/mLであり、最も好ましくは2U/mLであり、
好ましくは、リン酸基脱離可能な酵素の濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは1-3U/mLであり、最も好ましくは2U/mLであり、
好ましくは、アンモニウム塩の濃度は50-500mMであり、より好ましくは100-300mMであり、最も好ましくは200mMであり、
好ましくは、リン酸塩の濃度は1-150mMであり、より好ましくは2-50mMであり、さらに好ましくは10-30mMであり、最も好ましくは20mMであり、
好ましくは、反応系内にはさらにマグネシウム塩が含まれ、
好ましくは、上記マグネシウム塩は塩化マグネシウム及び／または硫酸マグネシウムであり、
好ましくは、反応系内のマグネシウム塩の濃度は1-20mMであり、より好ましくは2-15mMであり、最も好ましくは10mMであり、
好ましくは、反応系内にはさらに緩衝液が含まれるし、
好ましくは、上記緩衝液はHEPES緩衝液、Tris-HCl緩衝液、MOPS緩衝液、クエン酸塩緩衝液から選ばれ、
好ましくは、緩衝液はHEPES緩衝液であり、好ましくは、緩衝液の濃度は20〜300mMであり、より好ましくは50〜200mMであり、最も好ましくは100mMである、ことを特徴とする製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れの一項に記載の方法に置いて、上記澱粉、澱粉誘導体またはそれらの任意の混合物内にα-1,6グリコシド結合が含まれる場合、上記方法にはさらに、イソアミラーゼ（isoamylase, EC 3.2.1.68，IA）を用いた基質中のα-1,6-グリコシド結合を加水分解させる反応工程が含まれるし、
好ましくは、上記イソアミラーゼはスルフォロバス（Sulfolobus tokodaii，UniProt番号：Q973H3）、フラボバクテリウム（Flavobacterium sp.，UniProt番号：O32611）から由来し、
好ましくは、反応系内のイソアミラーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.5-2U/mLであり、最も好ましくは1U/mLであり、
好ましくは、イソアミラーゼを用いた基質中のα-1,6-グリコシド結合を加水分解させる反応工程は基質及びリン酸塩をG1Pに転換させる反応工程の前に行い、
好ましくは、反応系内の基質の濃度は1-300g/Lであり、より好ましくは10-200g/Lであり、さらに好ましくは50-150g/Lであり、最も好ましくは100g/Lであり、
好ましくは、イソアミラーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.5-2U/mLであり、最も好ましくは1U/mLであり、
好ましくは、触媒反応のpHは4-8であり、より好ましくは4.5-6.5であり、最も好ましくは5.5であり、
好ましくは、10-99℃で0.5-72時間反応し、より好ましくは30-95℃で1-48時間反応し、さらに好ましくは50-90℃で6-24時間反応し、最も好ましくは85℃で12時間反応し、
好ましくは、反応系内にはさらにマグネシウム塩を含み、好ましくは上記マグネシウム塩は塩化マグネシウム及び／または硫酸マグネシウムであり、好ましくは、反応系内のマグネシウム塩の濃度は0.01-10mMであり、より好ましくは0.1-5mMであり、さらに好ましくは0.2-1mMであり、最も好ましくは0.5mMであり、
好ましくは、反応系内にはさらに緩衝液を含み、好ましくは、上記緩衝液は酢酸ナトリウム緩衝液、HEPES緩衝液、クエン酸塩緩衝液から選ばれ、好ましくは、緩衝液の濃度は1-50mMであり、より好ましくは、2-20mMであり、さらに好ましくは3-10mMであり、最も好ましくは5mMであることを特徴とする製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れの一項に記載の方法に置いて、基質が澱粉、澱粉誘導体またはそれらの任意の混合物である場合、上記方法にはさらに4-α-グルカノトランスフェラーゼ（4-α-glucanotransferase，EC 2.4.1.25，4GT）を採用した触媒反応工程が含まれるし、
好ましくは、4-α-グルカノトランスフェラーゼは好熱性高温球菌（Thermococcus litoralis，UniProt番号：O32462）、枯草菌（Bacillus subtilis，UniProt番号：L8AG91）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum，UniProt番号：Q59266）から由来し、
好ましくは、反応系内の4-α-グルカノトランスフェラーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは0.5-2U/mLであり、最も好ましくは1U/mLであり、
好ましくは、4-α-グルカノトランスフェラーゼで触媒反応する工程は、基質及びリン酸塩をG1Pに転換する反応を一定期間進行させてから行い、好ましくは、基質及びリン酸塩をG1Pに転換する反応を0.5-30時間、より好ましくは5-20時間、最も好ましくは10時間進行した後、反応系内に4-α-グルカノトランスフェラーゼを添加することを特徴とする製造法法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れの一項に記載の方法に置いて、イソアミラーゼで処理した10g/L可溶性澱粉を基質とし、10mM塩化マグネシウムと、20mMリン酸二水素カリウムと、200mM塩化アンモニウムと、100mM HEPES緩衝液（pH7.0）と、2U/mL澱粉ホスホリラーゼと、2U/mLホスホグルコムターゼと、3U/mLホスホグルコースイソメラーゼと、2U/mLグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ、2U/mLリン酸基脱離可能な酵素と、を添加し、反応混合物を37℃で30時間触媒反応することでグルコサミンが得られるが、
好ましくは、リン酸基脱離可能な酵素は6-リン酸グルコサミンホスファターゼであり、
好ましくは、反応を10時間進行させた時点で、反応系内に1U/mL  4-α-グルカノトランスフェラーゼを添加することを特徴とする製造法法。
【請求項８】
グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ及びリン酸基脱離可能な酵素のグルコサミンの製造における活用を提供しており、好ましくはF6Pをグルコサミンに生成するに置ける触媒反応への活用であり、
好ましくは、上記リン酸基脱離可能な酵素は6-リン酸グルコサミンホスファターゼから選ばれることを特徴とする製造法法。
【請求項９】
SEQ ID NOs：1と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%配列の同一性を有するヌクレオチドがコードした配列を含む酵素を、グルコサミンの製造に活用することであり、好ましくはグルコサミン6-リン酸（GlcN6P）をグルコサミン（GlcN）に触媒生成する活用であり、
好ましくは、上記ヌクレオチドはSEQ ID NO：1と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%配列の同一性をもつヌクレオチド配列を有し、
好ましくは、上記酵素はSEQ ID NO：2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%配列の同一性をもつアミノ酸配列を含み、
好ましくは、上記酵素はSEQ ID NO：2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%同じ配列を有するアミノ酸配列を有すし、
好ましくは、上記酵素はThermococcus kodakarensis由来の糖ホスファターゼ（UniProt番号：Q5JJ45）であることを特徴とする活用。
【請求項１０】
請求項１〜７の何れの一項に記載の方法により製造されたグルコサミン。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願では、2018年7月13日に、中国国家知的財産権局に提出された出願番号が201810772487.3であり、発明の名称が“グルコサミンの酵素法製造”である先行出願の優先権を主張する。当先行出願の全文を引用することで本出願書に編み込む。
［技術分野］
本発明は、グルコサミンの製造方法に関すうるものであり、特にインビトロ酵素触媒によりグルコサミンを製造する方法に関するものであり、グルコサミンの酵素触媒製造分野に属するものである。
［技術背景］
グルコサミンは、D-ブドウ糖分子の2位ヒドロキシ基がアミノ基に置き換わったあとの化合物であり、重要な機能性単糖である。グルコサミンはほぼ全ての有機体内に存在するもので、細菌、酵母、糸状真菌、植物体内並びに動物体内に含まれており、糖タンパク質やプロテオグリカンの主要構成成分であるともに、キトサンやキチンの主要構成成分でもある。
【０００２】
グルコサミン及びその誘導体は幅広く活用されており、医学、食品、化粧品などの分野で重要な使用用途がある。製薬工業では、グルコサミン硫酸塩は軟骨プロテオグリカンの生合成を刺激することができるので、リウマチ性関節炎を治療する原薬として使われている；食品工業では、グルコサミンは体内で生成されるフリーラジカルの吸収、老化防止、ダイエット促進、抗菌、ヒト体内の分泌調節など多くの生理機能を持つため、食品添加剤や健康食品の製造に使われている；化粧品工業では、アセチルグルコサミン（GlcNAc）がヒアルロン酸のモノマーであるため、現在の高級化粧品では欠かせない物質となっている。
【０００３】
眼下、グルコサミンを製造するには主に2つの方法がある。(１)キチンの加水分解法があり、キチンの酸加水分解法と、キチンの酵素加水分解法と、が含まれる。そのうち、キチンの酸加水分解法は最も一般的に使われるグルコサミンの製造方法であり、当方法では、まず、高濃度の塩酸でキチンを加水分解してアセチルグルコサミンを取得し、その後、アセチルグルコサミンを脱アセチル化することでグルコサミンが得られる。当製造方法は原料供給に影響されるし、酸処理で発生する廃水は深刻な環境汚染に繋がるし、そして、エビやカニに対してアレルギー症をもつ人達が当方法で造られたグルコサミンを摂取した場合はアレルギー反応を起こす。キチンの酵素加水分解ではキチンを原料とし、キチナーゼ作用のもと加水分解反応が生じ単量体のグルコサミンが生成される。当方法は環境汚染は少ないが、同じように原料の供給問題や、原料投入対収率が低い問題、アレルギー反応を起こすなどの問題を抱えている。（２）微生物発酵法では、主に人工微生物である大腸桿菌、枯草菌などを利用してブドウ糖などの原料を代謝することで、グルコサミンを製造し得る。この方法は、原料の供給源に制限されないし、発酵時間も短く、環境汚染も少なく、人体安全性などのメリットがあるが、人工微生物の代謝改良の困難や、代謝副産物が生成するなどのデメリットがある。
【０００４】
従って、コストも環境負担も低いグルコサミンの新しい製造方法を開発する必要がある。
［発明の内容］
本発明は、インビトロ酵素法によりグルコサミンを製造する方法に関するものであり、当方法では、インビトロ酵素反応系を利用してグルコサミンを触媒製造するが、当方法は、原料が安い、供給源が豊富、製造コストが低い、環境に優しい、人体への安全性も高い、などのメリットがある。
【０００５】
本発明は次の技術案により実現：
本発明ではインビトロ酵素触媒反応によりグルコサミンを製造する方法を提供している。以下を含む：グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ（glucosamine-6-phosphate deaminase，EC 3.5.99.6，GlmD）を触媒として採用し、フルクトース6-リン酸（F6P）及びアンモニウム塩をグルコサミン6-リン酸（GlcN6P）に変換させる；及び、リン酸基脱離作用をもつ酵素を触媒としGlcN6Pのリン酸基を脱離させることでグルコサミン（GlcN）を生成する。
【０００６】
本発明において、各種のアンモニウム塩を本発明に用いることができる。好ましくは、上記アンモニウム塩は、硫酸アンモニウムと、塩化アンモニウムと、硫酸水素アンモニウムと、硝酸アンモニウムと、炭酸アンモニウムと、炭酸水素アンモニウムと、から選ばれる一種、二種又は多種の任意の混合物である。
【０００７】
本発明において、好ましくは、上記方法はさらに、グルコース６−リン酸(G6P)をF6Pに転換させる反応工程を含むが、当工程ではホスホグルコースイソメラーゼ（phosphoglucose isomerase，EC 5.3.1.9，PGI）を触媒として採用する。
【０００８】
本発明において、好ましくは、上記方法はさらに、1-リン酸グルコース（G1P）をG6Pに転換させる反応工程を含むが、当工程ではホスホグルコムターゼ（phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2，PGM）を触媒として採用する。
【０００９】
本発明において、好ましくは、上記方法はさらに、基質及びリン酸塩をG1Pに転換させる反応工程を含むが、上記基質は、D―グルコース単位を含む二糖、多糖またはそれらの任意の混合物であり、当工程では基質及びリン酸塩をG1Pに転換させる酵素で触媒する。
【００１０】
本発明において、各種リン酸塩を本発明に用いることができる。好ましくは、上記リン酸塩は、リン酸二水素カリウムと、リン酸水素二カリウムと、リン酸二水素ナトリウムと、リン酸水素二ナトリウムと、から選れる一種、二種又は多種の任意の混合物である。より好ましくは、リン酸塩は、リン酸二水素カリウム及び／またはリン酸水素二カリウムから選れる。
【００１１】
本発明において、好ましくは、上記D―グルコース単位を含む二糖は蔗糖であり、蔗糖ホスホリラーゼ（sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7，SP）を触媒とし其の物及びリン酸塩をG1Pに転換させる。
【００１２】
本発明において、好ましくは、上記D―グルコース単位を含む多糖は、澱粉と、澱粉誘導体またはそれらの何れの混合物と、から選ばれ、澱粉ホスホリラーゼ（α-glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1、αGP）を触媒とし其の物及びリン酸塩をG1Pに転換させる。好ましくは、上記澱粉または澱粉誘導体は、可溶性澱粉と、可溶性直鎖澱粉と、可溶性分岐鎖澱粉と、澱粉糊精と、麦芽糊精と、麦芽多糖と、から選ばれる。好ましくは、上記澱粉は可溶性澱粉である。
【００１３】
本発明において、好ましくは、上記Ｄ−グルコース単位を含む多糖はさらに、セルロースと、セルロース誘導体またはそれらの何れの混合物と、から選ばれる。好ましくは、上記セルロース誘導体は、セロ多糖と、セロビオースまたはそれらの何れの混合物と、から選択される。好ましくは、上記セルロース誘導体は、セルロースを酸または酵素で前処理した後の生成物であり、当生成物はセロ多糖、セロビオースまたはそれらの何れの混合物である。好ましくは、上記セルロース誘導体はセロ多糖である。上記D―グルコース単位を含む多糖がセルロース及び／またはセロ多糖を含む場合、例えばセルロース及び／またはセロ多糖である場合は、セロ多糖ホスホリラーゼ（cellodextrin phosphorylase，EC 2.4.1.49，CDP）を触媒とし其の物及びリン酸塩をG1Pに転換させる。好ましくは、さらに、セロビオースホスホリラーゼ（cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20，CBP）を触媒としセルロース及び／またはセロ多糖を分解して生成されたセロビオース及びリン酸塩をG1Pに転換させる。上記D―グルコース単位を含む多糖がセロビオースを含む場合、例えばセロビオースである場合は、セロビオースホスホリラーゼ(cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20，CBP)を触媒とし其のもの及びリン酸塩をG1Pに転換させる。
【００１４】
当業者が理解するように、本発明の方法に含まれる上記工程は段階的に実施されてよいものの、例えば、１つのバイオリアクターまたは反応容器内で行うか、または直列配置した複数のバイオリアクターまたは反応容器内で行うことができる。
【００１５】
当業者が理解するように、本発明の方法に含まれる上記工程は同時進行してもよいものの、例えば、１つのバイオリアクターまたは反応容器内で行うことができる。好ましくは、本発明の方法に含まれる上記工程は同時進行させる。
【００１６】
好ましくは、本発明では、インビトロ酵素触媒反応によりグルコサミンを製造する方法を提供するが、以下を含む：D-グルコース単位を含む二糖と、多糖と、またはそれらの何れの混合物と、を基質とし、リン酸塩と、アンモニウム塩と、D-グルコース単位を含む二糖及び多糖またはそれらの何れの混合物並びにリン酸塩をG1Pに転換できる酵素と、ホスホグルコムターゼと、ホスホグルコースイソメラーゼと、6-リン酸グルコサミンデアミナーゼと、リン酸基分離可能な酵素と、を添加して触媒反応させることでグルコサミンを製造し得る。
【００１７】
当業者が理解するように、様々な供給源からのグルコサミン６−リン酸デアミナーゼ全てを本発明に用いることができる。好ましくは、グルコサミン６−リン酸デアミナーゼの由来は、大腸桿菌（UniProt  番号：P0A759）、枯草菌（UniProt番号：O35000）、ランブル鞭毛虫（UniProt番号：V6TL01）またはThermococcus kodakarensis（UniProt番号：Q5JDU3）などである。
【００１８】
当業者が理解するように、様々な供給源からの脱リン酸化可能な酵素を本発明に用いることができる。本発明の一つは、脱リン酸化が可能な酵素は、基質特異性をもつ6-ホスホグルコサミンホスファターゼ（6-phosphate glucosamine phosphatase，GlmP）であるが、好ましくは、6-ホスホグルコサミンホスファターゼは大腸桿菌（UniProt番号：P77475、P27848、P0AE22など）、バクテロイデス多形体（Bacteroides thetaiotaomicron，UniProt番号：Q8A759）などから由来する。
【００１９】
Thermococcus kodakarensis由来である好熱性酵素UniProt番号：Q5JJ45は糖ホスファターゼ（predicted sugar phosphatase，HAD superfamily）と注釈されており、そのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：1が示す通りで、アミノ酸配列はSEQ ID NO：2が示す通りである。本発明ではQ5JJ45の基質特異性が確認され、結果からQ5JJ45はGlcN6Pのリン酸基脱離反応に触媒作用をもつ耐熱性酵素であり、GlcN6Pをグルコサミンに生成させるに当たり触媒作用を持つことを明らかにした。本発明のもう一つは、上記リン酸基脱離可能な酵素はヌクレオチドにコードされ、上記ヌクレオチドはSEQ ID NO：1と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%配列の同一性をもつヌクレオチド配列を含む；好ましくは、上記ヌクレオチドはSEQ ID NO：1と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%配列の同一性をもつヌクレオチド配列を有する。好ましくは、上記リン酸基脱離可能な酵素はSEQ ID NO：2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%配列の同一性をもつアミノ酸配列を含む。好ましくは、上記リン酸基脱離可能な酵素はSEQ ID NO：2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%配列の同一性をもつアミノ酸配列を有する。好ましくは、上記リン酸基脱離可能な酵素はThermococcus kodakarensis由来の糖ホスファターゼ（UniProt番号：Q5JJ45）である。
【００２０】
当業者が理解するように、基質をG1Pに転換できる様々な来源の酵素、ホスホグルコムターゼ、ホスホグルコースイソメラーゼなどは、全て本発明に用いられる。好ましくは、澱粉ホスホリラーぜは大腸桿菌（Uniprot番号：A0A0A0HB49）、テルモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima，Uniprot番号：G4FEH8）、クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，Uniprot番号：A3DCB6）などを来源としてよい；ショ糖ホスホリラーゼはビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（Bifidobacterium adolescentis，UniProt番号：A0ZZH6）、Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum（UniProt番号：D9TT09）などを来源としてよい；セロ多糖ホスホリラーゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，UniProt番号：A3DJQ6）、Clostridium stercorarium（UniProt番号：P77846）などを来源としてよい；セロビオースホスホリラーゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，UniProt番号：A3DC35）、Thermotoga neapolitana（UniProt番号：B9K7M6）などを来源としてよい。ホスホグルコムターゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，Uniprot番号：A3DEW8）、Thermococcus kodakarensis（UniProt番号：Q68BJ6）などを来源としてよい；ホスホグルコースイソメラーゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，Uniprot番号：A3DBX9）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus，Uniprot番号：Q5SLL6）などを来源としてよい。
【００２１】
本発明において、好ましくは、触媒反応の温度は30-70℃であり、より好ましくは30-50℃であり、最も好ましくは37℃である。
【００２２】
本発明において、好ましくは、触媒反応のpHは5.0-8.0であり、より好ましくは6.0-7.5であり、最も好ましくは7.0である。
【００２３】
本発明において、上記工程を同時進行させる場合は、好ましくは、触媒反応の時間は1-48時間であり、より好ましくは8-36時間であり、さらに好ましくは10-24時間であり、最も好ましくは20時間である。
【００２４】
本発明において、上記工程を段階的に進行させる場合は、好ましくは、各工程の触媒反応の時間は各自独立的に0.5-10時間であり、より好ましくは1-3時間であり、最も好ましくは2時間である。
【００２５】
本発明において、好ましくは、反応系内の基質の濃度は1-200g/Lであり、より好ましくは5-50g/Lであり、さらに好ましくは8-20 g/Lであり、最も好ましくは10g/Lである。
【００２６】
本発明において、好ましくは、反応系内の基質をG1Pに変換させる酵素の濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは1-3U/mLであり、最も好ましくは2U/mLである；好ましくは、ホスホグルコムターゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは、0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは、1-3U/mLであり、最も好ましくは、2U/mLである；好ましくは、ホスホグルコースイソメラーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは、1-5U/mLであり、最も好ましくは、3U/mLである；好ましくは、グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは、0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは、1-3U/mLであり、最も好ましくは2U/mLである；好ましくは、リン酸基脱離可能な酵素の濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは1-3U/mLであり、最も好ましくは2U/mLである。
【００２７】
本発明において、好ましくは、反応系内のアンモニウム塩の濃度は50-500mMであり、より好ましくは100-300mMであり、最も好ましくは200mMである。
【００２８】
本発明において、好ましくは、反応系内のリン酸塩の濃度は1-150mMであり、より好ましくは2-50mMであり、さらに好ましくは10-30mMであり、最も好ましくは20mMである。当業者が理解するように、GlcN6Pがリン酸基脱離されてグルコサミン（GlcN）に生成される過程中に発生するリン酸塩は、D-グルコース単位を含む二糖と、多糖またはそれらの混合物と、をG1Pに変換する工程でのリン源としてよい。
【００２９】
本発明において、好ましくは、上記反応系内にはさらにマグネシウム塩が含まれる。当業者が理解するように、各種のマグネシウム塩は全て本発明に適用して良いものの、例えば塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられるし、好ましくは、マグネシウム塩は塩化マグネシウムである。好ましくは、反応系内のマグネシウム塩の濃度は1-20mMであり、より好ましくは2-15mMであり、最も好ましくは10mMである。
【００３０】
本発明において、好ましくは、上記反応系内にはさらに緩衝液が含まれる。当業者が理解するように、各種の緩衝液は全て本発明に用いられるものの、例えばHEPES緩衝液、Tris-HCl緩衝液、MOPS緩衝液、クエン酸塩緩衝液の例となるクエン酸ナトリウム緩衝液などを挙げられる。好ましくは、緩衝液はHEPES緩衝液である。好ましくは、反応系内の緩衝液の濃度は20〜300mMであり、より好ましくは、50〜200mMであり、最も好ましくは100mMである。
【００３１】
本発明において、上記触媒反応は無ATP、無NAD(H)の環境で行われる。
【００３２】
好ましい実施案において、澱粉、澱粉誘導体またはそれらの任意の混合物内にα-1,6グリコシド結合（例えば、可溶性澱粉、可溶性分岐鎖澱粉、澱粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖）が含まれる場合、本発明方法にはさらに、イソアミラーゼ（isoamylase, EC 3.2.1.68，IA）を用いた基質中のα-1,6-グリコシド結合を加水分解させる反応工程が含まれる。
【００３３】
当業者が理解するように、各種の来源のイソアミラーゼは全て本発明に用いることができる。好ましくは、イソアミラーゼはスルフォロバス（Sulfolobus tokodaii，UniProt番号：Q973H3）、フラボバクテリウム（Flavobacterium sp.，UniProt番号：O32611）などを来源としてよい。
【００３４】
本発明において、好ましくは、反応系内のイソアミラーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.5-2U/mLであり、最も好ましくは1U/mLである。
【００３５】
当業者が理解するように、イソアミラーゼを用いた基質中のα-1,6-グリコシド結合を加水分解させる反応工程は上記反応工程と段階的に進行させて良いものの、例えば１つのバイオリアクターまたは反応容器内で行うか、または直列配置した複数のバイオリアクターまたは反応容器内で行ってもよいし、または上記反応工程と同時進行してもよいものの、例えば、１つのバイオリアクターまたは反応容器内で進行させてもよい。
【００３６】
好ましくは、イソアミラーゼを採用した基質中のα-1,6-グリコシド結合を加水分解させる反応工程は基質及びリン酸塩をG1Pに転換させる反応工程の前に行うものの、即ち、まず、イソアミラーゼを使って基質中のα-1,6-グリコシド結合を加水分解させて、イソアミラーゼ処理を経た基質を得てから、他の反応工程を進行させるが、この時、他の反応工程は段階的に進行してもよいし同時に進行してもよい。この時、好ましくは、反応系内の基質の濃度は1-300g/Lであり、より好ましくは10-200g/Lであり、さらに好ましくは50-150g/Lであり、最も好ましくは100g/Lである；好ましくは、イソアミラーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.5-2U/mLであり、最も好ましくは1U/mLである；好ましくは、触媒反応のpHは4-8であり、より好ましくは4.5-6.5であり、最も好ましくは5.5である；好ましくは10-99℃で0.5-72時間反応し、より好ましくは30-95℃で1-48時間反応し、さらに好ましくは50-90℃で6-24時間反応し、最も好ましくは85℃で12時間反応する。好ましくは、反応系内にはさらにマグネシウム塩と緩衝液とが含まれる。当業者が理解するように、各種のマグネシウム塩は全て本発明に適用して良いものの、例えば塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられるし、好ましくは、マグネシウム塩は塩化マグネシウムである。好ましくは、反応系内のマグネシウム塩の濃度は0.01-10mMであり、より好ましくは0.1-5mMであり、さらに好ましくは0.2-1mMであり、最も好ましくは0.5mMである。当業者が理解するように、各種の緩衝液は全て本発明に適用して良いものの、例えば酢酸ナトリウム緩衝液、HEPES緩衝液、クエン酸塩緩衝液の例となるクエン酸ナトリウム緩衝液などを挙げられるし、好ましくは、緩衝液は酢酸ナトリウム緩衝液である。好ましくは、反応系内の緩衝液の濃度は1-50mMであり、より好ましくは、2-20mMであり、さらに好ましくは3-10mMであり、最も好ましくは5mMである。
【００３７】
好ましい実施案のうち、基質が澱粉、澱粉誘導体またはそれらの任意の混合物（例えば、可溶性澱粉、可溶性直鎖澱粉、可溶性分岐鎖澱粉、澱粉糊精、麦芽澱粉、麦芽多糖）である場合、本発明の方法にはさらに4-α-グルカノトランスフェラーゼ（4-α-glucanotransferase，EC 2.4.1.25，4GT）を採用した触媒反応工程が含まれる。
【００３８】
当業者が理解するように、各種来源の4-α-グルカノトランスフェラーゼは全て本発明に用いることができる。好ましくは、4-α-グルカノトランスフェラーゼは好熱性高温球菌（Thermococcus litoralis，UniProt番号：O32462）、枯草菌（Bacillus subtilis，UniProt番号：L8AG91）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum，UniProt番号：Q59266）などを来源とすることができる。
【００３９】
本発明において、好ましくは、反応系内の4-α-グルカノトランスフェラーゼの濃度は0.1-10U/mLであり、より好ましくは0.2-5U/mLであり、さらに好ましくは0.5-2U/mLであり、最も好ましくは1U/mLである。
【００４０】
当業者が理解するように、4-α-グルカノトランスフェラーゼで触媒する反応工程は上記工程と段階的に進行してよいものの、例えば、１つのバイオリアクターまたは反応容器内で行うか、または直列配置した多数のバイオリアクターまたは反応容器内で進行してよいし、または上記工程と同時進行させてもよいものの、例えば、１つのバイオリアクターまたは反応容器内で行うことができる。
【００４１】
好ましくは、4-α-グルカノトランスフェラーゼで触媒反応させる工程は、基質及びリン酸塩をG1Pに転換する反応を一定期間進行させてから行う。この場合、好ましくは、基質及びリン酸塩をG1Pに転換する反応を0.5-30時間、より好ましくは5-20時間、最も好ましくは10時間進行した後に、反応系内に4-α-グルカノトランスフェラーゼを添加する。
【００４２】
澱粉は、異なる鎖長の直鎖澱粉と、分岐鎖澱粉と、からなる混合物である。直鎖澱粉ブドウ糖単位の間はα-1,4グリコシド結合で繋がり、分岐鎖澱粉はα-1,6グリコシド結合にて澱粉主鎖と繋がり、澱粉ホスホリラーぜはα-1,6グリコシド結合を加水分解することはできず、反応系内に澱粉中のα-1,6グリコシド結合を加水分解できる枝切り酵素-イソアミラーゼを添加することで、G1Pの収率を向上させることができる。そして、澱粉ホスホリラーゼは、澱粉と、澱粉誘導体またはそれらの任意の混合物と、を加水分解し、G1Pを放出した後、最終生成物は麦芽糖および麦芽三糖である。澱粉中のより多くのブドウ糖単位をG1Pに転換させるため、反応系内に4-α-グルカノトランスフェラーゼを添加するが、これは短鎖のオリゴ糖を長鎖のオリゴ糖に重合することができ、長鎖のオリゴ糖はさらに澱粉ホスホリラーゼに再利用されるので、澱粉の利用率が高まる。
【００４３】
一つの好ましい実施案として、本発明の酵素触媒反応は以下の方法を採用：
一つの反応系内で、イソアミラーゼ処理をへた可溶性澱粉を基質とし、塩化マグネシウムと、リン酸塩と、アンモニウム塩と、HEPES緩衝液（pH7.0）と、澱粉ホスホリラーゼと、ホスホグルコムターゼと、ホスホグルコースイソメラーゼと、グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼと、リン酸基脱離可能な酵素（好ましくは6-リン酸グルコサミンホスファターゼ）と、を添加して触媒反応を行い、グルコサミンが得られる。好ましくは、反応を一定期間進行させた後に反応系内に4-α-グルカノトランスフェラーゼを添加する。
【００４４】
さらに好ましい実施案では、一つの反応系内で、イソアミラーゼで処理した10g/L可溶性澱粉を基質とし、10mM塩化マグネシウムと、20mMリン酸二水素カリウムと、200mM塩化アンモニウムと、100mM HEPES緩衝液（pH7.0）と、2U/mL澱粉ホスホリラーゼと、2U/mLホスホグルコムターゼと、3U/mLホスホグルコースイソメラーゼと、2U/mLグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ、2U/mLリン酸基脱離可能な酵素（好ましくは6-リン酸グルコサミンホスファターゼ）と、を添加し、反応混合物を37℃で30時間触媒反応することでグルコサミンが得られる。好ましくは、反応を10時間進行させた時点で、反応系内に1U/mL  4-α-グルカノトランスフェラーゼを添加する。
【００４５】
本発明はさらに、グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ及びリン酸基脱離可能な酵素（好ましくは6-リン酸グルコサミンホスファターゼ）のグルコサミンの製造における活用を提供しており、好ましくはF6Pをグルコサミンに生成するに置ける触媒反応を活用する。
【００４６】
本発明はさらに、SEQ ID NOs：1と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%同じ配列を有するヌクレオチドがコードした配列を含む酵素を、グルコサミンの製造に活用することを提供し、好ましくはグルコサミン6-リン酸（GlcN6P）からグルコサミン（GlcN）を触媒生成することに活用する；好ましくは上記ヌクレオチドはSEQ ID NO：1と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%同じ配列のヌクレオチド配列を有する。好ましくは、上記酵素はSEQ ID NO：2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%同じ配列を有するアミノ酸配列を含む；好ましくは、上記酵素はSEQ ID NO：2と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%または100%同じ配列を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、上記酵素はThermococcus kodakarensisを来源とする糖ホスファターゼ（UniProt番号：Q5JJ45）である。
【００４７】
本発明はさらに、上記の方法にて製造されたグルコサミンを提供する。
【００４８】
本発明は初めてインビトロ酵素触媒反応にてグルコサミンを製造し、特に初めてグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ及びリン酸基脱離可能な酵素でF6Pをグルコサミンに触媒生成する。本発明の方法はよりよい変換率で目標生成物を獲得するだけでなく、得られた生成物は人体安全性をもつなどのメリットがある。その他に、本発明の方法は、様々な原料を使用することができるものの、例えば、Ｄ−グルコース単位を含む二糖と、多糖またはそれらの任意の混合物と、が使える。従って、本発明の方法は、原料の安価、供給源の豊富、製造コストの低い、環境に優しい、人体安全性などのメリットを持つため、普及に適している。この他、発明人はさらに、澱粉、澱粉誘導体またはそれらの任意の混合物を基質としグルコサミンを触媒生成する場合、イソアミラーゼ及び4-α-グルカノトランスフェラーゼを添加することで、目標生成物の収率が大幅に向上されることを見出した。
［添付図］
図1は、澱粉を基質としグルコサミンを製造するにおけるインビトロ酵素触媒経路の概略図である。その内、αGPは澱粉ホスホリラーぜであり、PGMはホスホグルコムターゼであり、PGIはホスホグルコースイソメラーゼであり、GlmDはグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ、GlmPは6-リン酸グルコサミンホスファターゼである。
【００４９】
図2は、澱粉を基質としグルコサミンを製造するにおけるインビトロ酵素触媒経路中の中間体間反応でのギブスの自由エネルギー変化である。
【００５０】
図3は、澱粉を基質としグルコサミンを製造するにおける主要な酵素をSDS-PAGE検出したものである。M：マーカー。
【００５１】
図4は、グルコサミンをHPLC分析した。その内、4Aは基準となるグルコサミン製品のHPLCピーク図である；その内、4Bはグルコサミンの濃度をHPLCで定量分析したものであり、グルコサミンピークの強さによって得られたグルコサミンの濃度を、定量化することができる。
【００５２】
図5は、HPLCにて分析したグルコサミン6-リン酸デアミナーゼがインビトロ酵素系の可溶性澱粉からグルコサミンへの触媒合成に参与したものである。その内、図5Aは、インビトロ酵素触媒による可溶性澱粉から生成されたグルコサミンのHPLC分析結果である。その内、5Bはインビトロ酵素が可溶性澱粉をグルコサミンに触媒合成させる反応過程を示すグラフである。
【００５３】
図6は、IA処理された可溶性澱粉からグルコサミンをインビトロ酵素触媒合成する反応過程を示すグラフである。
【００５４】
図7は、酵素濃度を適化したあとに、IA処理された可溶性澱粉からグルコサミンをインビトロ酵素触媒合成する反応過程を示すグラフである。
【００５５】
図8は、蔗糖をグルコサミンに転換させるインビトロ酵素触媒反応の過程を示すグラフである。
【００５６】
図9は、セロ多糖をグルコサミンに転換させるインビトロ酵素触媒反応の過程を示すグラフである。
［実施方法］
以下、具体的な実施例をもって本発明の技術的解決案に対して、さらに詳しく説明する。理解すべきなことは、以下の実施例は本発明を例示的に説明解釈するものであり、本発明の保護範囲を限定するものと解釈されてはない。本発明の記載内容を基盤として実現された凡ゆる技術は、本発明が目指す保護範囲内に含まれる。
【００５７】
特に説明がない限り、以下の実施例で使れる原料および試薬はすべて市販品であるか、または既知の方法で造ることができる。
【００５８】
本発明の実施例で使れる一部の原料の情報は下記通り：
可溶性澱粉：ACROS社製造、製品番号：424490020；
pET20b担持体：Novagen，Madison，WI；
大腸桿菌発現菌BL21(DE3)：Invitrogen，Carlsbad，CA。
［実施例１］
グルコサミンの酵素法合成経路における酵素活性への測定
インビトロ酵素触媒系にて澱粉をグルコサミンに転換させる触媒経路を図1で示し、その内、リン酸基脱離可能な酵素は6-リン酸グルコサミンホスファターゼを例とした。図2は、澱粉をグルコサミンに転換させるにおける触媒経路の中間体間の反応でのギブスの自由エネルギー変化を示す。本実施例において、（1）澱粉ホスホリラーぜは大腸桿菌（Uniprot番号：A0A0A0HB49）由来である；（2）ホスホグルコムターゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，Uniprot番号：A3DEW8）由来である；（3）ホスホグルコースイソメラーゼはクロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum，Uniprot番号：A3DBX9）由来である；（4）グルコサミン-6-リン酸デアミナーゼは枯草菌（Uniprot番号：O35000）由来である；（5）リン酸基脱離可能な酵素は多形バクテリオイデスBacteroides thetaiotaomicronの6-リン酸グルコサミンホスファターゼ（Uniprot番号：Q8A759）由来である。上記ゲノムDNAは全てATCCの公式サイト（www.atcc.org）から入手できる。Simple Cloning（You C, Zhang XZ, Zhang Y-HP. 2012. Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 78(5):1593-5.）の方法を通じて、上記遺伝子をpET20b担持体(Novagen, Madison, WI)にクローンさせおることで、それぞれの発現担持体であるpET20b-EcαGP、pET20b-CtPGM、pET20b-CtPGI、pET20b-BsGlmD、pET20b-BtGlmPが得られる。組換えタンパク質は大腸桿菌BL21(DE3)内で発現されるともに純化されており、タンパク質純化の結果は図3の示す通り。
【００５９】
クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）由来のホスホグルコムターゼの酵素活性測定は、10mM塩化マグネシウムを含む100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）内で行う。10mMグルコース1-リン酸を基質とし、37℃で10分反応させて、生成されたグルコース6-リン酸（G6P）の量を測定する。G6P量の測定方法は以下の通り：40μlのG6Pを含むサンプル溶液を計量してから、2mM塩化マグネシウムと、0.15mM NAD+と、0.5U/mLグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ（glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）と、を含む100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）を200ul添加し、37℃で30分反応させ、340nm点での吸光度を測定し、生成されたNADHの量を算出する。実験結果はクロストリジウム・テルモセルム由来のホスホグルコムターゼの37℃での比活性は20U/mgであることを示している。
【００６０】
大腸桿菌（E. coli）由来の澱粉ホスホリラーゼの酵素活性測定は、10mM塩化マグネシウムと、1U/mLホスホグルコムターゼと、を含む100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）内で行う。5g/L可溶性澱粉を基質とし、37℃で10分間反応させ、生成されたグルコース6-リン酸の量を測定する。実験結果は大腸桿菌由来の澱粉ホスホリラーゼの37℃での比活性は5.6U/mgであることを示している。
【００６１】
クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）由来のホスホグルコースイソメラーゼの酵素活性測定は、10mM塩化マグネシウムを含む100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）内で行う。10mM フルクトース-6-リン酸を基質とし、37℃で10分間反応させ、生成されたグルコース6-リン酸の量を測定する。実験結果はクロストリジウム・テルモセルム由来のホスホグルコースイソメラーゼの37℃での比活性は396U/mgであることを示している。
【００６２】
枯草菌（B. subtilis）由来のグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼの酵素活性測定は、10mM塩化マグネシウムを含む100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）内で行う。10mM フルクトース-6-リン酸及び100mM塩化アンモニウムを気質とし、37℃で10分間反応させ、生成されたグルコサミン6-リン酸（GlcN6P）の量を測定する。GlcN6P量の測定方法は下記通り：GlcN6Pを含むサンプルを50μl計量し、100μlアセチルアセトン試薬（1.5mLアセチルアセトンを計量して、50mLの1.25mol/L炭酸ナトリウム溶液内に溶解させることで調合）を添加し、20分沸騰させてから、室温に冷却させ、96%(v/v)エタノールを1mLゆっくり添加してから、P-ジメチルアミノベンズアルデヒド（DMAB）試薬（1.6gのDMABを計量して30mL濃塩酸及び30mL 96%エタノールに溶解させることで調合）を100μl添加し、均等に混合し、室温で30分放置してから、530nm点での吸光度を測定し、基準グラフを根拠にGlcN6P含有量を計算する。実験結果は枯草菌由来のグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼの37℃での比活性は10U/mgであることを示している。
【００６３】
当反応経路において、GlcN6Pに対して特異的に脱リン酸化活性を有するリン酸基脱離可能な酵素は本発明のキーポイントの一つである。10mM塩化マグネシウムを含む100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）内で、上記リン酸基脱離可能な酵素のG1P、G6P、F6P、GlcN6Pに対する脱リン酸化活性を測定した。実験結果は表1が示す通り。多形バクテリオイデス菌（Bacteroides thetaiotaomicron）由来の6-リン酸グルコサミンホスファターゼはGlcN6Pに対して比較的高い比活性をもつともに、特異的なGlcN6P脱リン酸化活性を表した。Thermococcus kodakarensis由来の糖ホスファターゼ（predicted sugar phosphatase，HAD superfamily）の70℃でのGlcN6P基質に対する脱リン酸化活性は0.011U/mgである。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
［実施例２］
インビトロ酵素触媒により可溶性澱粉をグルコサミンに触媒合成
本実施例では、酵素のインビトロ触媒により可溶性澱粉をグルコサミンに合成することを採用した。まず、5つの酵素を組み換え発現させた：大腸桿菌由来のαGP；クロストリジウム・テルモセルム由来のPGM；クロストリジウム・テルモセルム由来のPGI；枯草菌由来のGlmD；多形バクテリオイデス菌由来のGlmP（表2）。
【００６６】
【表２】
2021531758.tif 000004
【００６７】
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）でグルコサミンを定量化分析した。使われたクロマトグラフィーカラムはアミノカラムで、移動相は80％アセトニトリル水溶液、流速は1mL/min、カラム温度は40℃、使われた検出器は示差屈折検出器である。基準サンプルの検出は図4Aが示す通りで、グルコサミンの保持時間は約9.6分である。グルコサミンの濃度はグルコサミンのHPLC特性ピークの応答強度に正比例しており、標準グラフは図4Bに示し通りである。
【００６８】
10g/L可溶性澱粉と、10mM塩化マグネシウムと、20mMリン酸二水素カリウムと、200mM塩化アンモニウムと、100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）と、1U/mL αGPと、1U/mL PGMと、1U/mL PGIと、1U/mL GlmDと、1U/mL GlmPと、を含む0.5mLの反応混合物を、37℃で30h反応させる。反応終了後、反応系内に等体積のアセトニトリルを加え反応を終了させ、12000rpmで10分間遠心分離し、上澄みを取り、高速液体クロマトグラフィーにて反応溶液中のグルコサミンの濃度を測定する（図5A）。反応を20h進行した時、グルコサミンの濃度は2.4g/Lであり、転換率は24%である（図5B）。
【００６９】
生成物への転換率の計算式は下記通り：
【００７０】
【数１】
2021531758.tif 000005
【００７１】
［実施例３］
インビトロ酵素触媒によりIA処理した可溶性澱粉をグルコサミンに触媒合成
澱粉はα-1,4及びα-1,6で混合結合された多糖であり、澱粉ホスホリラーゼに完全加水分解されない。イソアミラーゼ（IA，EC 3.2.1.68）は澱粉中のα-1,6グリコシド結合を加水分解することができるため、澱粉ホスホリラーゼが基質を加リン酸分解することを手助けし、グルコサミンの収率を高める。
【００７２】
本実施例では、イソアミラーゼはスルフォロバス（Sulfolobus tokodaii，UniProt番号：Q973H3）由来である。文献（Cheng, K. et al. Doubling Power Output of Starch Biobattery Treated by the Most Thermostable Isoamylase from an Archaeon Sulfolobus tokodaii. Sci. Rep. 5:13184）が報道した発現担持体pET20b-StIAを、大腸桿菌BL21(DE3)に取り込み、タンパク質の発現及び純化を行う。
【００７３】
100g/L可溶性澱粉を含む5mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）内に、0.5mM塩化マグネシウム及び1U/mLイソアミラーゼを添加し、85℃で12時間処理する。
【００７４】
イソアミラーゼ処理をへた10g/L可溶性澱粉と、10mM塩化マグネシウムと、20mMリン酸二水素カリウムと、200mM塩化アンモニウムと、100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）と、1U/mL αGPと、1U/mL PGMと、1U/mL PGIと、1U/mL GlmDと、1U/mL GlmPと、を含む0.5mLの反応混合物を、37℃で20h時間インキュベートする。タイミング別にサンプリングし、等体積のアセトニトリルを添加して反応を終了させ、12000回転数で10分間遠心分離し、上澄みをとり、高速液体クロマトグラフィーにてグルコサミンの濃度を測定する。反応を10時間進行した時点で、グルコサミンの濃度は3.5g/Lであり、転換率は35%である（図6）。
［実施例４］
酵素濃度適合化後にインビトロ酵素触媒によりIA処理した可溶性澱粉をグルコサミンに合成
イソアミラーゼ処理をへた10g/L可溶性澱粉と、10mM塩化マグネシウムと、20mMリン酸二水素カリウムと、200mM塩化アンモニウムと、100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）と、2U/mL αGPと、2U/mL PGMと、3U/mL PGIと、2U/mL GlmDと、2U/mL GlmPと、を含む0.5mLの反応混合物を37℃で30時間インキュベートする。タイミング別にサンプリングし、等体積のアセトニトリルを添加して反応を終了させ、12000回転数で10分間遠心分離し、上澄みをとり、高速液体クロマトグラフィーにてグルコサミンの濃度を測定する。反応を20時間進行した時点で、グルコサミンの濃度は7.12g/Lであり、転換率は71.2%である（図7、実線が示す通り）
［実施例５］
4-α-グルカノトランスフェラーゼを添加することでグルコサミンの収率を向上
澱粉ホスホリラーゼはイソアミラーゼ処理した可溶性澱粉を加リン酸分解し、最終的に残る基質は麦芽三糖及び麦芽糖である。4-α-グルカノトランスフェラーゼ（4GT，EC 2.4.1.25）は短鎖麦芽オリゴ糖の糖鎖を延長させ、さらに澱粉ホスホリラーゼに利用させるため、グルコサミンへの転換が進み生成物の収率が向上される。
【００７５】
本実施例では、4-α-グルカノトランスフェラーゼは好熱性高温球菌Thermococcus litoralis由来であり、そのUniProt番号はO32462である。プライマー  F2：TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATA ATGGAAAGAATAAACTTCATATTTG，R2：CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCを利用し、Simple Cloning方法にてpET20b担持体にクローンし、それぞれの発現担持体pET20b-St4GTを獲得する。大腸桿菌BL21(DE3)にてタンパク質の発現および純化を行う。
【００７６】
イソアミラーゼ処理した10g/L可溶性澱粉と、10mM塩化マグネシウムと、20mMリン酸二水素カリウムと、200mM塩化アンモニウムと、100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）と、2U/mL αGPと、2U/mL PGMと、3U/mL PGIと、2U/mL GlmDと、2U/mL GlmPと、を含む0.5mLの反応混合物を、37℃で10hインキュベートする。その後、最終濃度1U/mLの4GTを添加し、37℃で引き続き30hまで反応させる。タイミング別にサンプリングし、等体積のアセトニトリルを添加して反応を終了させ、12000回転数で10分間遠心分離し、上澄みをとり、高速液体クロマトグラフィーにて反応液内のグルコサミンの濃度を測定する。反応を20時間進行した時点で、グルコサミンの濃度は7.93g/Lであり、転換率は79.3 %である（図7、点線が示す通り）
［実施例６］
インビトロ酵素触媒により蔗糖をグルコサミンに転換
10g/L蔗糖と、10mM塩化マグネシウムと、20mMリン酸二水素カリウムと、200mM塩化アンモニウムと、100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）と、2U/mL SPと、2U/mL PGMと、3U/mL PGIと、2U/mL GlmDと、2U/mL GlmPと、を含む0.5mLの反応混合物を、37℃で20時間インキュベートする。タイミング別にサンプリングし、等体積のアセトニトリルを添加して反応を終了させ、12000回転数で10分間遠心分離し、上澄みをとり、高速液体クロマトグラフィーにて反応液内のグルコサミンの濃度を測定する。反応を10時間進行した時点で、グルコサミンの濃度は4.1g/Lであり、転換率は41%である（図8）。
［実施例７］
インビトロ酵素触媒によりセロ多糖をグルコサミンに転換
10g/Lセロ多糖（平均重合度は4.4）と、10mM塩化マグネシウムと、20mMリン酸二水素カリウムと、200mM塩化アンモニウムと、100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）と、1U/mL CDPと、1U/mL CBPと、2U/mL PGMと、3U/mL PGIと、3U/mL GlmDと、2U/mL GlmPと、を含む0.5mLの反応混合物を、37℃で20時間インキュベートする。タイミング別にサンプリングし、等体積のアセトニトリルを添加して反応を終了させ、12000回転数で10分間遠心分離し、上澄みをとり、高速液体クロマトグラフィーにて反応液内のグルコサミンの濃度を測定する。反応を10時間進行した時点で、グルコサミンの濃度は3.44g/Lであり、転換率は34.4%である（図9）。
［実施例８］
インビトロ酵素触媒によりフルクトース-6-リン酸をグルコサミンに転換
50mMフルクトース-6-リン酸と、10mM塩化マグネシウムと、200mM塩化アンモニウムと、100mM HEPES緩衝液（pH 7.0）と、1U/mL GlmDと、1U/mL GlmPと、を含む0.5mLの反応混合物を、37℃で10時間インキュベートする。タイミング別にサンプリングし、等体積のアセトニトリルを添加して反応を終了させ、12000回転数で10分間遠心分離し、上澄みをとり、高速液体クロマトグラフィーにて反応液内のグルコサミンの濃度を測定する。反応を4時間進行した時点で、グルコサミンの濃度は43.9mMであり、転換率は87.8%である。
【００７７】
以上、本発明の実施方法に対して説明をした。但し、本発明は、上記実施方法に限らない。本発明の精神および原則内で行われる凡ゆる修正、同等の置き換え、改良などは、全て本発明の保護範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図1は、澱粉を基質としグルコサミンを製造するにおけるインビトロ酵素触媒経路の概略図である。その内、αGPは澱粉ホスホリラーぜであり、PGMはホスホグルコムターゼであり、PGIはホスホグルコースイソメラーゼであり、GlmDはグルコサミン-6-リン酸デアミナーゼ、GlmPは6-リン酸グルコサミンホスファターゼである。
【図２】図2は、澱粉を基質としグルコサミンを製造するにおけるインビトロ酵素触媒経路中の中間体間反応でのギブスの自由エネルギー変化である。
【図３】図3は、澱粉を基質としグルコサミンを製造するにおける主要な酵素をSDS-PAGE検出したものである。M：マーカー。
【図４】図4は、グルコサミンをHPLC分析した。その内、4Aは基準となるグルコサミン製品のHPLCピーク図である；その内、4Bはグルコサミンの濃度をHPLCで定量分析したものであり、グルコサミンピークの強さによって得られたグルコサミンの濃度を、定量化することができる。
【図５】図5は、HPLCにて分析したグルコサミン6-リン酸デアミナーゼがインビトロ酵素系の可溶性澱粉からグルコサミンへの触媒合成に参与したものである。その内、図5Aは、インビトロ酵素触媒による可溶性澱粉から生成されたグルコサミンのHPLC分析結果である。その内、5Bはインビトロ酵素が可溶性澱粉をグルコサミンに触媒合成させる反応過程を示すグラフである。
【図６】図6は、IA処理された可溶性澱粉からグルコサミンをインビトロ酵素触媒合成する反応過程を示すグラフである。
【図７】図7は、酵素濃度を適化したあとに、IA処理された可溶性澱粉からグルコサミンをインビトロ酵素触媒合成する反応過程を示すグラフである。
【図８】図8は、蔗糖をグルコサミンに転換させるインビトロ酵素触媒反応の過程を示すグラフである。
【図９】図9は、セロ多糖をグルコサミンに転換させるインビトロ酵素触媒反応の過程を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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