(57)【要約】本明細書では、遺伝子操作されたRNA足場、遺伝子操作されたDNA足場またはDNA-RNAハイブリッド足場の使用を介して、点変異の治療的編集を触媒するために、ADARをリクルートするためのシステムが開示される。該システムは、5'末端または3'末端のいずれかまたは両方において標的RNA及びGluR2 mRNAからADAR2をリクルートするドメインと20〜100bpの相補性を有する遺伝子操作されたADAR2ガイドRNA(adRNA)を含む。
2021536244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むベクターであって、ここで：
(a)前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、ステム-ループを含む二次構造を欠いている、または
(b)前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列様(APOBEC)をリクルートするドメインが、Aluドメインをコードする配列、アポリポタンパク質B mRNA編集触媒ポリペプチドをコードする配列、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの配列と少なくとも約80%の配列同一性を含む、ベクター。
【請求項２】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、前記Aluドメイン配列と少なくとも約80%の配列同一性を含む、請求項1に記載のベクター。
【請求項３】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、前記APOBECをリクルートするドメインをコードする配列と少なくとも約80%の配列同一性を含む、請求項1に記載のベクター。
【請求項４】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項1に記載のベクター。
【請求項５】
前記ベクターが、リポソームである、請求項1に記載のベクター。
【請求項６】
前記ベクターが、ナノ粒子である、請求項1に記載のベクター。
【請求項７】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインが、ADARタンパク質をリクルートするように構成されている、請求項1に記載のベクター。
【請求項８】
前記ADARタンパク質が、ADAR1、ADAR2、またはADAR3タンパク質である、請求項7に記載のベクター。
【請求項９】
前記ADARタンパク質が、ヒトADARタンパク質である、請求項7または8に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ADARタンパク質が、組換えADARタンパク質である、請求項7または8に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ADARタンパク質が、改変されたADARタンパク質である、請求項7または8に記載のベクター。
【請求項１２】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインが、APOBECタンパク質をリクルートするように構成されている、請求項1に記載のベクター。
【請求項１３】
前記APOBECタンパク質が、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、またはAPOBEC4タンパク質である、請求項12に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ADARタンパク質が、ヒトADARタンパク質である、請求項12または13に記載のベクター。
【請求項１５】
前記ADARタンパク質が、組換えADARタンパク質である、請求項12または13に記載のベクター。
【請求項１６】
前記ADARタンパク質が、改変されたADARタンパク質である、請求項12または13に記載のベクター。
【請求項１７】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインが、ステム-ループを含む二次構造を欠いている、請求項1に記載のベクター。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド配列が、少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインをコードする、請求項1に記載のベクター。
【請求項１９】
前記少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインのうちの少なくとも1つが、Aluドメインである、請求項18に記載のベクター。
【請求項２０】
前記Aluドメイン配列が、少なくとも1つのステム-ループを含む二次構造を形成する、請求項19に記載のベクター。
【請求項２１】
前記Aluドメインをコードする配列が、複数のAlu反復を含む、請求項19に記載のベクター。
【請求項２２】
前記Aluドメインをコードする配列が、少なくとも部分的に一本鎖である、請求項19に記載のベクター。
【請求項２３】
前記少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインのうちの少なくとも1つが、APOBECをリクルートするドメインである、請求項18に記載のベクター。
【請求項２４】
前記少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインのうちの少なくとも1つをコードする配列が、GluR2ドメインをコードする配列と少なくとも約80%の配列同一性を含む、請求項18に記載のベクター。
【請求項２５】
前記少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインのうちの少なくとも1つが、GluR2ドメインである、請求項24に記載のベクター。
【請求項２６】
前記少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインのうちの少なくとも1つが、Cas13ドメインである、請求項18に記載のベクター。
【請求項２７】
前記少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインが、前記Aluドメイン及びAPOBECをリクルートするドメインである、請求項19または23に記載のベクター。
【請求項２８】
標的RNAと少なくとも部分的に相補的なRNAをコードする核酸をさらに含む、請求項1〜27のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項２９】
前記標的RNAと少なくとも部分的に相補的なRNAをコードする核酸の長さが、約10個の塩基対(bp)〜約1000 bpである、請求項28に記載のベクター。
【請求項３０】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする核酸、及び前記標的RNAと少なくとも部分的に相補的なRNAをコードする核酸が、長さが少なくとも約200 bpの連続核酸を含む、請求項28に記載のベクター。
【請求項３１】
前記核酸が、化学合成されている、請求項1〜30のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項３２】
前記核酸が、遺伝的にコードされている、請求項1〜30のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項３３】
前記ベクターが、DNAを含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項３４】
前記DNAが、二本鎖である、請求項33に記載のベクター。
【請求項３５】
前記DNAが、一本鎖である、請求項33に記載のベクター。
【請求項３６】
前記ベクターが、RNAを含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項３７】
前記RNAが、塩基修飾を含む、請求項1〜30のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項３８】
前記ベクターが、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターである、請求項1〜37のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項３９】
前記AAVが、組換えAAV(rAAV)である、請求項38に記載のベクター。
【請求項４０】
前記AAVが、AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、それらの誘導体、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、請求項38に記載のベクター。
【請求項４１】
前記AAVが、AAV5血清型またはその誘導体である、請求項38に記載のベクター。
【請求項４２】
前記AAVの誘導体を含む請求項40に記載のベクターであって、ここで、該AAVの誘導体が、改変されたVP1タンパク質を含む、ベクター。
【請求項４３】
前記APOBECをリクルートするドメインが、APOBEC1をリクルートするドメイン、APOBEC2をリクルートするドメイン、APOBEC3Aをリクルートするドメイン、APOBEC3Bをリクルートするドメイン、APOBEC3Cをリクルートするドメイン、APOBEC3Eをリクルートするドメイン、APOBEC3Fをリクルートするドメイン、APOBEC3Gをリクルートするドメイン、APOBEC3Hをリクルートするドメイン、APOBEC4をリクルートするドメイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項3に記載のベクター。
【請求項４４】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインが、少なくとも2つのRNA編集実体をリクルートし、かつ前記RNA編集実体をコードする前記少なくとも2つのポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、APOBECタンパク質をコードする配列と少なくとも約80%の同一性を含む、請求項1〜43のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項４５】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインが、少なくとも2つのRNA編集実体をリクルートし、かつ前記RNA編集実体をコードする前記少なくとも2つのポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、ADARタンパク質をコードする配列と少なくとも約80%の同一性を含む、請求項1〜43のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項４６】
前記核酸にコードされる前記RNAをリクルートするドメインが、少なくとも1つのステムループを含む、請求項1〜45のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項４７】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、実質的に十字型である二次構造を含む、請求項1〜46のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項４８】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、少なくとも2つの実質的に十字型である二次構造を含む、請求項1〜46のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項４９】
前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、少なくとも2つの実質的に十字型である二次構造を形成するポリヌクレオチド配列の間に配置される、請求項48に記載のベクター。
【請求項５０】
前記十字型二次構造が、該十字型二次構造体の少なくとも部分的な相補鎖の少なくとも1つの対において隣接するステム-ループを含む、請求項47〜49のいずれか1項に記載のベクター。
【請求項５１】
前記少なくとも1つのRNA編集をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、実質的にトウホールドである二次構造を含む、請求項1〜46のいずれか1項に記載のベクター
【請求項５２】
実質的に十字型である二次元形状を有するRNAをコードする核酸を含むベクターであって、ここで、前記RNAが、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする配列を含む、ベクター。
【請求項５３】
標的RNA配列と少なくとも部分的に相補的な配列をコードする少なくとも1つの標的化ドメインを有するRNAをコードする核酸をさらに含む、請求項52に記載のベクター。
【請求項５４】
前記標的RNA配列と少なくとも部分的に相補的な少なくとも1つの標的化ドメインを有するRNAをコードする核酸が、実質的に直鎖状の二次元構造をさらに含む、請求項53に記載のベクター。
【請求項５５】
請求項1〜54のいずれか1項に記載のベクターによってコードされた非天然のRNA。
【請求項５６】
実質的に十字型である二次元形状を含む第1ドメイン配列、及び該第1ドメイン配列に接続された実質的に直鎖状の二次元構造を有する第2ドメイン配列を含む非天然のRNAであって、ここで、該第1ドメイン配列が、RNA編集実体をリクルートするドメインをコードし、かつ、該第2ドメイン配列が、標的化ドメインをコードし、ここで、該第2ドメイン配列が、標的RNAと少なくとも部分的に相補的である、非天然のRNA。
【請求項５７】
前記第2ドメイン配列に結合された第3ドメイン配列をさらに含む、請求項56に記載の非天然のRNA。
【請求項５８】
前記第3ドメイン配列が、実質的に十字型である二次元形状を有する二次構造を形成するRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする配列を含む、請求項57に記載の非天然のRNA。
【請求項５９】
前記非天然のRNAの少なくとも1つの塩基が、化学修飾を含む、請求項56〜59のいずれか1項に記載の非天然のRNA。
【請求項６０】
前記非天然のRNAの少なくとも1つの糖が、化学修飾を含む、請求項56〜59のいずれか1項に記載の非天然のRNA。
【請求項６１】
RNA編集実体をリクルートするドメイン及びアンチセンスドメイン配列を含む核酸であって、ここで、該核酸がRNA編集実体と接触する場合、標的核酸のサンガー法配列決定によって測定されたように、前記アンチセンスドメインの少なくとも一部に相補的な標的核酸が、Cas13bタンパク質またはその活性断片と複合体を形成した同等の核酸よりも少なくとも約4倍高い効率で該標的核酸の少なくとも1つの塩基対を修飾する、核酸。
【請求項６２】
RNA編集実体をリクルートするドメイン及びアンチセンスドメイン配列を含む核酸であって、ここで、該核酸がRNA編集実体と接触する場合、標的核酸のサンガー法配列決定によって測定されたように、前記アンチセンスドメインの少なくとも一部に相補的な標的核酸が、GluR2ドメイン及び前記アンチセンスドメインと複合体を形成した同等の核酸よりも少なくとも約4倍高い効率で該標的核酸の少なくとも1つの塩基対を修飾する、核酸。
【請求項６３】
前記核酸が、RNAを含む、請求項61または62に記載の核酸。
【請求項６４】
前記標的核酸が、RNAを含む、請求項51〜63のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項６５】
前記RNAが、mRNAである、請求項64に記載の核酸。
【請求項６６】
前記mRNAが、タンパク質またはその一部をコードする、請求項65に記載の核酸。
【請求項６７】
前記タンパク質またはその一部の機能不全が、疾患または状態に関与している、請求項66に記載の核酸。
【請求項６８】
前記疾患または状態が、神経変性障害、筋肉障害、代謝障害、眼障害、細胞増殖性障害、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項67に記載の核酸。
【請求項６９】
前記RNAが、低分子干渉RNA(siRNA)である、請求項64に記載の核酸。
【請求項７０】
前記RNA編集実体をリクルートするドメインが、GluR2ドメインと少なくとも約80%の同一性を含む、請求項61〜69のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項７１】
前記RNA編集実体をリクルートするドメインが、Aluドメインと少なくとも約80%の同一性を含む、請求項61〜69のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項７２】
前記RNA編集実体をリクルートするドメインが、APOBECをリクルートするドメインと少なくとも約80%の同一性を含む、請求項61〜69のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項７３】
前記RNA編集実体をリクルートするドメインが、ADARタンパク質をリクルートするように構成されている、請求項61〜72のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項７４】
前記ADARタンパク質が、ADAR1、ADAR2、またはADAR3タンパク質である、請求項73に記載の核酸。
【請求項７５】
前記ADARタンパク質が、ヒトADARタンパク質である、請求項73または74に記載の核酸。
【請求項７６】
前記ADARタンパク質が、組換えADARタンパク質である、請求項73または74に記載の核酸。
【請求項７７】
前記ADARタンパク質が、改変されたADARタンパク質である、請求項73または74に記載の核酸。
【請求項７８】
前記RNA編集実体をリクルートするドメインが、APOBECタンパク質をリクルートするように構成されている、請求項61〜72のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項７９】
前記APOBECタンパク質が、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、またはAPOBEC4タンパク質である、請求項78に記載の核酸。
【請求項８０】
前記ADARタンパク質が、ヒトADARタンパク質である、請求項78または79に記載の核酸。
【請求項８１】
前記ADARタンパク質が、組換えADARタンパク質である、請求項78または79に記載の核酸。
【請求項８２】
前記ADARタンパク質が、改変されたADARタンパク質である、請求項78または79に記載の核酸。
【請求項８３】
前記核酸が、化学合成されている、請求項61〜82のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項８４】
前記核酸が、遺伝的にコードされている、請求項61〜82のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項８５】
アンチセンスドメイン、第1ステム-ループを形成する配列、及び第2ステム-ループを形成する配列を含む配列を含む、核酸であって、ここで、前記核酸が、(a)RNA編集実体の第1部分及び前記第1ステム-ループを形成する配列に結合するように構成された第1ポリヌクレオチドと結合するドメインを含む第1ポリペプチド、(b)RNA編集実体の第2部分を含む第2ポリヌクレオチド、及び前記第2ステム-ループを形成する配列に結合するように構成された第2ポリヌクレオチドに結合するドメイン、及び(c)前記アンチセンスドメインと少なくとも部分的に相補な標的核酸と接触された場合、該標的核酸の少なくとも1つの塩基対を修飾する、核酸。
【請求項８６】
前記第1ステム-ループまたは前記第2ステム-ループが、MS2ステムループである、請求項85に記載の核酸。
【請求項８７】
前記第1ステム-ループまたは前記第2ステム-ループが、BoxBステム-ループである、請求項85に記載の核酸。
【請求項８８】
前記第1ステム-ループまたは前記第2ステム-ループが、U1Aステム-ループである、請求項85に記載の核酸。
【請求項８９】
前記RNA編集実体の第1部分または前記RNA編集実体の第2部分が、ADARデアミナーゼドメインをコードする配列のN末端断片を含む、請求項85〜88のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項９０】
前記RNA編集実体の第1部分または前記RNA編集実体の第2部分が、ADARデアミナーゼドメインをコードする配列のC末端断片を含む、請求項85〜88のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項９１】
前記第1ポリヌクレオチドを結合するドメインまたは前記第2ポリヌクレオチドを結合するドメインが、MS2コートタンパク質を含む、請求項85〜90のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項９２】
前記第1ポリヌクレオチドを結合するドメインまたは前記第2ポリヌクレオチドを結合するドメインが、ラムダNペプチドを含む、請求項85〜90のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項９３】
前記第1ポリヌクレオチドを結合するドメインまたは前記第2ポリヌクレオチドを結合するドメインが、ヒト核酸を結合するタンパク質を含む、請求項85〜90のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項９４】
前記ヒト核酸を結合するタンパク質が、UlAタンパク質、TBP6.7タンパク質、ヒトヒストンステム-ループを結合するタンパク質、またはグルココルチコイド受容体のDNAを結合するドメインである、請求項93に記載の核酸。
【請求項９５】
前記RNA編集実体が、前記標的核酸上でアデノシンをイノシンに変異させることができる、請求項85〜94のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項９６】
前記RNA編集実体が、前記標的核酸上でシトシンをチミンに変異させることができる、請求項85〜94のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項９７】
容器中において請求項1〜54のいずれか1項に記載のベクター、容器中において請求項55〜60のいずれか1項に記載の非天然のRNA、または容器中において請求項61〜96のいずれか1項に記載の核酸を含む、キット。
【請求項９８】
シリンジをさらに含む、請求項97に記載のキット。
【請求項９９】
前記容器が、前記シリンジである、請求項98に記載のキット。
【請求項１００】
請求項1〜54のいずれか1項に記載のベクター、請求項55〜60のいずれか1項の非天然のRNA、または請求項61〜69のいずれか1項に記載の核酸を含む、単離された細胞。
【請求項１０１】
単位用量形態の請求項1〜54のいずれか1項に記載のベクター、単位用量形態の請求項55〜60のいずれか1項に記載の非天然のRNA、または単位用量形態の請求項61〜96のいずれか1項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
【請求項１０２】
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含む、請求項101に記載の医薬組成物。
【請求項１０３】
前記医薬組成物が、第2有効成分を含む、請求項101に記載の医薬組成物。
【請求項１０４】
請求項1〜54のいずれか1項に記載のベクター、請求項55〜60のいずれか1項に記載の非天然のRNA、または請求項61〜96のいずれか1項に記載の核酸を被験者に投与することを含む、被験者における疾患または状態を治療する方法。
【請求項１０５】
前記投与が、静脈内注射、筋肉内注射、くも膜下注射、眼窩内注射、皮下注射、またはそれらの任意の組み合わせによるものである、請求項104に記載の方法。
【請求項１０６】
前記被験者に2次治療を提供することをさらに含む、請求項104に記載の方法。
【請求項１０７】
前記疾患または状態が、神経変性障害、筋肉障害、代謝障害、眼障害、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項104に記載の方法。
【請求項１０８】
前記疾患または状態が、アルツハイマー病である、請求項107に記載の方法。
【請求項１０９】
前記疾患または状態が、筋ジストロフィーである、請求項107に記載の方法。
【請求項１１０】
前記疾患または状態が、網膜色素変性症である、請求項107に記載の方法。
【請求項１１１】
前記疾患または状態が、パーキンソン病である、請求項107に記載の方法。
【請求項１１２】
前記疾患または状態が、疼痛である、請求項107に記載の方法。
【請求項１１３】
前記疾患または状態が、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである、請求項107に記載の方法。
【請求項１１４】
前記疾患または状態が、Charcot-Marie-歯科疾患である、請求項107に記載の方法。
【請求項１１５】
前記疾患または状態が、Rett症候群である、請求項107に記載の方法。
【請求項１１６】
前記投与が、投与前に対して遺伝子の発現を減少させるのに十分である、請求項104〜115のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記投与が、前記被験者における少なくとも1つの点変異を編集するのに十分である、請求項104〜115のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記投与が、前記被験者における少なくとも1つの終止コドンを編集し、それによって、該終止コドンのリードスルーを産生するのに十分である、請求項104〜115のいずれか1項に記載。
【請求項１１９】
前記投与が、前記被験者においてエクソンスキップを産生するのに十分である、請求項104-115のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２０】
第2核酸をコードする第1核酸を含むアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、被験者における筋ジストロフィーを治療する方法であって、ここで、前記第2核酸が、(a)筋ジストロフィーに関与するRNA配列と少なくとも部分的に相補的なアンチセンス領域、及び(b)少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインとを含み、ここで、前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインが、ステム-ループを含まず、または、ここで、前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインが、Aluドメイン、アポリポタンパク質B mRNA編集触媒ポリペプチド様(APOBEC)をリクルートするドメイン、及びそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つと少なくとも約80%の配列同一性を含む、方法。
【請求項１２１】
前記医薬組成物が、単位用量形態である、請求項120に記載の方法。
【請求項１２２】
前記投与が、少なくとも週1回である、請求項120または121に記載の方法。
【請求項１２３】
前記投与が、少なくとも月1回である、請求項120または121に記載の方法。
【請求項１２４】
前記投与が、注射によるものである、請求項120〜123のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記注射が、皮下、静脈内、点滴、筋肉内、くも膜下、または腹腔内注射である、請求項124に記載の方法。
【請求項１２６】
前記投与が、経皮、経粘膜、経口、または経肺のものである、請求項120〜123のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記被験者に2次治療を提供することをさらに含む、請求項120〜126のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２８】
核酸の少なくとも1つのコピーを前記ベクターにクローニングすることを含む、ベクターの作製方法であって、ここで、前記核酸が、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードし、かつ前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする配列が、ステム-ループを含む二次構造を形成せず、または、ここで、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする核酸が、Aluドメインをコードする配列、アポリポタンパク質B mRNA編集触媒ポリペプチド様(APOBEC)をリクルートするドメインをコードする配列、及びそれらの任意の組み合わせから選択される配列と少なくとも約80%の配列同一性を含む、作製方法。
【請求項１２９】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項128に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ウイルスベクターが、AAVベクターである、請求項129に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ウイルスベクターが、改変されたVP1タンパク質を含む、請求項129または130に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ベクターが、リポソームである、請求項128に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ベクターが、ナノ粒子である、請求項128に記載の方法。
【請求項１３４】
前記ベクターを単離されたヒト細胞に遺伝子導入または形質導入することをさらに含む、請求項128〜133のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【０００１】
本出願は、2018年9月6日に出願された米国仮出願第62/728,007号、2018年10月17日に出願された米国仮出願第62/766,433号、及び2018年12月15日に出願された米国仮出願第62/780,241号の利益を主張している。これらの全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【政府支援に関する陳述】
【０００２】
本開示は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号CA222826、GM123313、及びHG009285の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
配列リスト
本願は、ASCII形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。2019年10月18日に作成された上記のASCIIコピーは、00015-365WO1_SL.txtという名前で、サイズは163,723バイトである。
【要約】
【０００３】
本開示の1つの態様は、ベクターを提供する。いくつかの場合において、該ベクターは、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むことができ、ここで、(a)該少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、ステム-ループを含む二次構造を形成せず、または(b)該少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、Aluドメインをコードする配列、アポリポタンパク質B mRNA編集触媒ポリペプチド様(APOBEC)をリクルートするドメインをコードする配列、及びそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも1つの配列と少なくとも約80%の配列同一性を含む。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、Aluドメイン配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、APOBECをリクルートするドメインをコードする配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。いくつかの場合において、該ベクターは、リポソームであってもよい。いくつかの場合において、該ベクターは、ナノ粒子であってもよい。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインは、ADARタンパク質をリクルートするように構成されてもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、ADAR1、ADAR2、またはADAR3タンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、ヒトADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、組換えADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、改変されたADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインは、APOBECタンパク質をリクルートするように構成されてもよい。いくつかの場合において、該APOBECタンパク質は、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、またはAPOBEC4タンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、ヒトADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、組換えADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、改変されたADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインは、ステム-ループを含む二次構造を形成しなくてもよい。いくつかの場合において、該ポリヌクレオチド配列は、少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。いくつかの場合において、該少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインのうちの少なくとも1つが、Aluドメインであってもよい。いくつかの場合において、該Aluドメイン配列は、少なくとも1つのステム-ループを含む二次構造を形成することができる。いくつかの場合において、該Aluドメインをコードする配列は、複数のAlu反復を含むことができる。いくつかの場合において、該Aluドメインをコードする��列は、少なくとも部分的に一本鎖であってもよい。いくつかの場合において、該少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインのうちの少なくとも1つが、APOBECをリクルートするドメインであってもよい。いくつかの場合において、該少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインをコードする配列のうちの少なくとも1つが、GluR2ドメインをコードする配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインのうちの少なくとも1つが、GluR2ドメインであってもよい。いくつかの場合において、該少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインのうちの少なくとも1つが、Cas13ドメインであってもよい。いくつかの場合において、該少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインは、前記Aluドメイン及び前記APOBECをリクルートするドメインであってもよい。いくつかの場合において、該ベクターは、標的RNAと少なくとも部分的に相補であってもよいRNAをコードする核酸をさらに含むことができる。いくつかの場合において、該標的RNAと少なくとも部分的に相補であってもよいRNAをコードする核酸は、約10個の塩基対(bp)〜約1000 bpの長さであってもよい。いくつかの場合において、該少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする核酸及び標的RNAの少なくとも一部に相補的であってもよいRNAをコードする核酸は、長さが少なくとも約200 bpの連続核酸を含むことができる。いくつかの場合において、該核酸は、化学的に合成されてもよい。いくつかの場合において、該核酸は、遺伝的にコードされてもよい。いくつかの場合において、該ベクターは、DNAを含むことができる。いくつかの場合において、該DNAは、二本鎖であってもよい。いくつかの場合において、該DNAは、一本鎖であってもよい。いくつかの場合において、該ベクターは、RNAを含むことができる。いくつかの場合において、該RNAは、塩基修飾を含むことができる。いくつかの場合において、該ベクターは、アデノ関連のウイルス(AAV)ベクターであってもよい。いくつかの場合において、該AAVは、組換えAAV(rAAV)であってもよい。いくつかの場合において、該AAVは、AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、これらのいずれかの誘導体、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの場合において、該AAVは、AAV5血清型またはその誘導体であってもよい。いくつかの場合において、該AAVの誘導体は、改変されたVP1タンパク質を含むことができる。いくつかの場合において、該APOBECをリクルートするドメインは、APOBEC1をリクルートするドメイン、APOBEC2をリクルートするドメイン、APOBEC3Aをリクルートするドメイン、APOBEC3Bをリクルートするドメイン、APOBEC3Cをリクルートするドメイン、APOBEC3Eをリクルートするドメイン、APOBEC3Fをリクルートするドメイン、APOBEC3Gをリクルートするドメイン、APOBEC3Hをリクルートするドメイン、APOBEC4をリクルートするドメイン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインは、少なくとも2つのRNA編集実体をリクルートすることができ、ここで、該少なくとも2つのRNA編集実体をコードするポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、APOBECタンパク質をコードする配列と少なくとも約80%の同一性を含む。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインは、該少なくとも2つのRNA編集実体をリクルートすることができ、ここで、該RNA編集実体をコードする少なくとも2つのポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、ADARタンパク質をコードする配列と少なくとも約80%の同一性を含む。いくつかの場合において、該核酸によってコードされるRNAをリクルートするドメインは、少なくとも1つのステムループを含むことができる。いくつかの場合において、該RNA編集をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、実質的に十字型であってもよい二次構造を含むことができる。いくつかの場合において、該RNA編集をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、実質的に十字型である少なくとも2つの二次構造を含むことができる。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、実質的に十字型である少なくとも2つの二次構造を形成するポリヌクレオチド配列の間に配置されてもよい。いくつかの場合において、該十字型二次構造は、該十字型二次構造の少なくとも部分的に相補的な鎖の少なくとも1つの対に隣接するステム-ループを含むことができる。いくつかの場合において、該RNA編集をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、実質的にトウホールドであってもよい二次構造を含むことができる。いくつかの場合において、非天然のRNAは、前記ベクターによってコードされてもよい。いくつかの場合において、キットは、容器内の前記ベクターを含むことができる。いくつかの場合において、該キットは、シリンジをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該容器は、シリンジであってもよい。いくつかの場合において、単離された細胞は、前記ベクターを含むことができる。いくつかの場合において、医薬組成物は、単位用量形態の前記ベクターを含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、第2活性成分を含むことができる。いくつかの場合において、被験者における疾患または状態を治療する方法は、前記ベクターを該被験者に投与することを含む。いくつかの場合において、該投与は、静脈内注射、筋肉内注射、くも膜下注射、眼窩内注射、皮下注射、またはそれらの任意の組み合わせによって行うことができる。いくつかの場合において、該方法は、該被験者に2次治療を提供することをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該疾患または状態は、神経変性障害、筋肉障害、代謝障害、眼障害、細胞増殖性障害(例えば、新生物)、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、アルツハイマー病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、筋ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、網膜色素変性症であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、パーキンソン病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、疼痛であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、シュタルガルト黄斑ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Charcot-Marie歯科疾患であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Rett症候群であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、投与前に対して遺伝子の発現を減少させるのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの点変異を編集するのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの終止コドンを編集し、それによって、該終止コドンのリードスルーを産生するのに十分であってもよく。いくつかの場合において、該投与は、該被験者におけるエクソンスキッピングを産生するのに十分であってもよい。
【０００４】
本開示の別の態様は、ベクターを提供する。いくつかの場合において、該ベクターは、実質的に十字型であってもよい二次元形状を有するRNAをコードする核酸を含むことができ、ここで、該RNAが、RNA編集実体をリクルートするドメインをコードする少なくとも1つの配列を含む。いくつかの場合において、該ベクターは、標的RNA配列と少なくとも部分的に相補であってもよい少なくとも1つの標的化ドメインをコードする配列を有するRNAをコードする核酸をさらに含むことができる。いくつかの場合において、該標的RNA配列と少なくとも部分的に相補であってもよい少なくとも1つの標的化ドメインを有するRNAをコードする核酸は、実質的に直鎖状の二次元構造を含むことができる。いくつかの場合において、非天然のRNAは、該ベクターによってコードされてもよい。いくつかの場合において、キットは、容器内の該ベクターを含むことができる。いくつかの場合において、該キットは、シリンジをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該容器は、シリンジであってもよい。いくつかの場合において、単離された細胞は、該ベクターを含むことができる。いくつかの場合において、医薬組成物は、単位用量形態の該ベクターを含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、第2活性成分を含むことができる。いくつかの場合において、被験者における疾患または状態を治療する方法は、該ベクターを前記被験者に投与することを含む。いくつかの場合において、該投与は、静脈内注射、筋肉内注射、くも膜下注射、眼窩内注射、皮下注射、またはそれらの任意の組み合わせによって行うことができる。いくつかの場合において、該方法は、前記被験者に2次治療を提供することをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該疾患または状態は、神経変性障害、筋肉障害、代謝障害、眼障害、細胞増殖性障害(例えば、新生物)、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、アルツハイマー病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、筋ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、網膜色素変性症であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、パーキンソン病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、疼痛であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、シュタルガルト黄斑ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Charcot-Marie歯科疾患であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Rett症候群であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、投与前に対して遺伝子の発現を減少させるのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの点変異を編集するのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの終止コドンを編集し、それによって、該終止コドンのリードスルーを産生するのに十分であってもよい。いくつかの���合において、該投与は、該被験者におけるエクソンスキッピングを産生するのに十分であってもよい。
【０００５】
本開示の別の態様は、非天然のRNAを提供する。いくつかの場合において、該非天然のRNAは、実質的に十字型であってもよい二次元形状の第1ドメイン配列、及び該第1ドメイン配列に接続された実質的に直鎖状の二次元構造を有する第2ドメイン配列を含むことができる。ここで、前記第1ドメイン配列は、RNA編集実体をリクルートするドメインをコードし、前記第2ドメイン配列は、標的化ドメインをコードする。また、前記第2ドメイン配列は、標的RNAの少なくとも一部と相補的であってもよい。いくつかの場合において、該非天然のRNAは、前記第2ドメイン配列に結合された第3ドメイン配列をさらに含むことができる。いくつかの場合において、該第3ドメイン配列は、実質的に十字型であってもよい二次元形状の二次構造を形成するRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする配列を含むことができる。いくつかの場合において、該非天然のRNAの少なくとも1つの塩基は、化学修飾を含むことができる。いくつかの場合において、該非天然のRNAの少なくとも1つの糖は、化学修飾を含むことができる。いくつかの場合において、キットは、容器内に該非天然のRNAを含むことができる。いくつかの場合において、該キットは、シリンジをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該容器は、シリンジであってもよい。いくつかの場合において、単離された細胞は、該非天然のRNAを含むことができる。いくつかの場合において、医薬組成物は、単位用量で該非天然のRNAを含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、第2活性成分を含むことができる。いくつかの場合において、被験者における疾患または状態を治療する方法は、該非天然のRNAを該被験者に投与することを含む。いくつかの場合において、該投与は、静脈内注射、筋肉内注射、くも膜下注射、眼窩内注射、皮下注射、またはそれらの任意の組み合わせによって行うことができる。いくつかの場合において、該方法は、該被験者に2次治療を提供することをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該疾患または状態は、神経変性障害、筋肉障害、代謝障害、眼障害、細胞増殖性障害(例えば、新生物)及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、アルツハイマー病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、筋ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、網膜色素変性症であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、パーキンソン病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、疼痛であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、シュタルガルト黄斑ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Charcot-Marie歯科疾患であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Rett症候群であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、投与前に対して遺伝子の発現を減少させるのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの点変異を編集するのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの終止コドンを編集し、それによって、該終止コドンのリードスルーを産生するのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者におけるエクソンスキッピングを産生するのに十分であってもよい。
【０００６】
本開示の別の態様は、核酸を提供する。いくつかの場合において、該核酸は、RNA編集実体をリクルートするドメイン及びアンチセンスドメイン配列を含むことができる。ここで、該核酸がRNA編集実体と接触できる場合、該標的核酸のサンガー法配列決定によって測定されたように、該アンチセンスドメインの少なくとも一部に相補的な標的核酸は、該標的核酸の少なくとも1つの塩基対を、Cas13bタンパク質またはその活性断片と複合体を形成した同等の核酸よりも少なくとも約4倍高い効率で修飾する。
【０００７】
本開示の別の態様は、核酸を提供する。いくつかの場合において、該核酸は、RNA編集実体をリクルートするドメイン及びアンチセンスドメインを含むことができる。ここで、該核酸がRNA編集実体と接触できる場合、該標的核酸のサンガー法配列決定によって測定されたように、該アンチセンスドメインの少なくとも一部に相補的な標的核酸は、該標的核酸の少なくとも1つの塩基対を、GluR2ドメイン及び該アンチセンスドメインと複合体を形成した同等の核酸よりも少なくとも約4倍高い効率で修飾する。いくつかの場合において、該核酸は、RNAを含むことができる。いくつかの場合において、該標的核酸は、RNAを含むことができる。いくつかの場合において、該RNAは、mRNAであってもよい。いくつかの場合において、該mRNAは、タンパク質またはその一部をコードすることができる。いくつかの場合において、該タンパク質またはその一部の機能不全は、疾患または状態に関与することができる。いくつかの場合において、該疾患または状態は、神経変性障害、筋肉障害、代謝障害、眼障害、細胞増殖性障害(例えば、新生物)、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの場合において、該RNAは、低分子干渉RNA(siRNA)であってもよい。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインは、GluR2ドメインと少なくとも約80%の同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインは、Aluドメインと少なくとも約80%の同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインは、APOBECをリクルートするドメインと少なくとも約80%の同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインは、ADARタンパク質をリクルートするように構成されてもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、ADAR1、ADAR2、またはADAR3タンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、ヒトADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、組換えADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、改変されたADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該RNA編集実体をリクルートするドメインは、APOBECタンパク質をリクルートするように構成されてもよい。いくつかの場合において、該APOBECタンパク質は、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、またはAPOBEC4タンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、ヒトADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、組換えADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該ADARタンパク質は、改変されたADARタンパク質であってもよい。いくつかの場合において、該核酸は、化学的に合成されてもよい。いくつかの場合において、該核酸は、遺伝的にコードされてもよい。いくつかの場合において、キットは、容器内の該核酸を含むことができる。いくつかの場合において、該キットは、シリンジをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該容器は、シリンジであってもよい。いくつかの場合において、単離された細胞は、該核酸を含むことができる。いくつかの場合において、医薬組成物は、単位用量形態の該核酸を含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、第2活性成分を含むことができる。いくつかの場合において、被験者における疾患または状態を治療する方法は、該核酸を前記被験者に投与することを含む。いくつかの場合において、該投与は、静脈内注射、筋肉内注射、くも膜下注射、眼窩内注射、皮下注射、またはそれらの任意の組み合わせによって行うことができる。いくつかの場合において、該方法は、前記被験者に2次治療を提供することをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該疾患または状態は、神経変性障害、筋肉障害、代謝障害、眼障害、細胞増殖性障害(例えば、新生物)、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、アルツハイマー病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、筋ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、網膜色素変性症であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、パーキンソン病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、疼痛であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、シュタルガルト黄斑ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Charcot-Marie歯科疾患であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Rett症候群であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、投与前に対して遺伝子の発現を減少させるのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの点変異を編集するのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの終止コドンを編集し、それによって、該終止コドンのリードスルーを産生するのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、被験者におけるエクソンスキッピングを産生するのに十分であってもよい。
【０００８】
本開示の別の態様は、核酸を提供することができる。いくつかの場合において、該核酸は、アンチセンスドメイン、第1ステム-ループを形成する配列、及び第2ステム-ループを形成する配列を含む配列を含むことができる。ここで、該核酸が、(a)RNA編集実体の第1部分及び前記第1ステム-ループを形成する配列に結合するように構成された第1ポリヌクレオチドと結合するドメインを含む第1ポリペプチド、(b)RNA編集実体の第2部分を含む第2ポリヌクレオチド、及び前記第2ステム-ループを形成する配列に結合するように構成された第2ポリヌクレオチドに結合するドメイン、及び(c)前記アンチセンスドメインの少なくとも一部に相補的な標的核酸と接触する場合、該標的核酸の少なくとも1つの塩基対を修飾する。いくつかの場合において、該第1ステム-ループまたは第2ステム-ループは、MS2ステムループであってもよい。いくつかの場合において、該第1ステム-ループまたは第2ステム-ループは、BoxBステム-ループであってもよい。いくつかの場合において、該第1ステム-ループまたは第2ステム-ループは、UlAステム-ループであってもよい。いくつかの場合において、該RNA編集実体の第1部分または該RNA編集実体の第2部分は、ADARデアミナーゼドメインをコードする配列のN末端断片を含むことができる。いくつかの場合において、該RNA編集実体の第1部分または該RNA編集実体の第2部分は、ADARデアミナーゼドメインをコードする配列のC末端断片を含むことができる。いくつかの場合において、前記第1ポリヌクレオチドを結合するドメインまたは前記第2ポリヌクレオチドを結合するドメインは、MS2コートタンパク質を含むことができる。いくつかの場合において、前記第1ポリヌクレオチドを結合するドメインまたは前記第2ポリヌクレオチドを結合するドメインは、ラムダNペプチドを含むことができる。いくつかの場合において、前記第1ポリヌクレオチドを結合するドメインまたは前記第2ポリヌクレオチドを結合するドメインは、ヒト核酸結合タンパク質を含むことができる。いくつかの場合において、該ヒト核酸結合タンパク質は、UlAタンパク質、TBP6.7タンパク質、ヒトヒストンステム-ループ結合タンパク質、またはグルココルチコイド受容体のDNA結合ドメインであってもよい。いくつかの場合において、該RNA編集実体は、前記標的核酸においてアデノシン→イノシン変異を実施することができる。いくつかの場合において、該RNA編集実体は、前記標的核酸においてシトシン→チミン変異を実施することができる。いくつかの場合において、キットは、容器内の該核酸を含むことができる。いくつかの場合において、該キットは、シリンジをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該容器は、シリンジであってもよい。いくつかの場合において、単離された細胞は、該核酸を含むことができる。いくつかの場合において、医薬組成物は、単位用量形態の該核酸を含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体をさらに含むことができる。いくつかの場合において、該医薬組成物は、第2活性成分を含むことができる。いくつかの場合において、被験者における疾患または状態を治療する方法は、該核酸を前記被験者に投与することを含む。いくつかの場合において、���投与は、静脈内注射、筋肉内注射、くも膜下注射、眼窩内注射、皮下注射、またはそれらの任意の組み合わせによって行うことができる。いくつかの場合において、該方法は、前記被験者に2次治療を提供することをさらに含むことができる。いくつかの場合において、該疾患または状態は、神経変性障害、筋肉障害、代謝障害、眼障害、細胞増殖性障害(例えば、新生物)、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、アルツハイマー病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、筋ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、網膜色素変性症であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、パーキンソン病であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、疼痛であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、シュタルガルト黄斑性ジストロフィーであってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Charcot-Marie歯科疾患であってもよい。いくつかの場合において、該疾患または状態は、Rett症候群であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、投与前に対して遺伝子の発現を減少させるのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの点変異を編集するのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者における少なくとも1つの終止コドンを編集し、それによって、該終止コドンのリードスルーを産生するのに十分であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、前記被験者におけるエクソンスキッピングを産生するのに十分であってもよい。
【０００９】
本開示の別の態様は、被験者における筋ジストロフィーの治療方法を提供する。いくつかの場合において、該方法は、前記被験者に第2核酸をコードする第1核酸を含むアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターを含む医薬組成物を投与することを含むことができる。ここで、前記第2核酸が、(a)筋ジストロフィーに関与するRNA配列と少なくとも部分的に相補的なアンチセンス領域、及び(b)少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインを含む。ここで、前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインが、ステム-ループを含有せず、または前記少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインが、Aluドメイン、アポリポタンパク質B mRNA編集触媒ポリペプチド様(APOBEC)をリクルートするドメイン、及びこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つと少なくとも約80%の配列同一性を含む。いくつかの場合において、該医薬組成物は、単位用量形態であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、少なくとも週1回であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、少なくとも月1回であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、注射であってもよい。いくつかの場合において、該注射は、皮下、静脈内、点滴、筋肉内、くも膜下、または腹腔内注射であってもよい。いくつかの場合において、該投与は、経皮、経粘膜、経口、または経肺であってもよい。いくつかの場合において、該方法は、前記被験者に2次治療を提供することをさらに含むことができる。
【００１０】
本開示の別の態様は、ベクターの製作方法を提供することができる。いくつかの場合において、該方法は、核酸の少なくとも1つのコピーを該ベクターにクローニングすることを含むことができる。ここで、前記核酸は、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードし、そして、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする配列は、ステム-ループを含む二次構造を形成せず、または少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする核酸が、Aluドメインをコード配列、アポリポタンパク質B mRNA編集触媒ポリペプチド様(APOBEC)をリクルートするドメインをコードする配列、及びそれらの任意の組み合わせから選択される配列と少なくとも約80%の配列同一性を含む。いくつかの場合において、該ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。いくつかの場合において、該ウイルスベクターは、AAVベクターであってもよい。いくつかの場合において、該ウイルスベクターは、改変されたVP1タンパク質を含むことができる。いくつかの場合において、該ベクターは、リポソームであってもよい。いくつかの場合において、該ベクターは、ナノ粒子であってもよい。いくつかの場合において、該方法は、単離されたヒト細胞に該ベクターを遺伝子導入するまたは形質導入することをさらに含む。
【００１１】
本開示の態様は、遺伝子操作されたADAR1またはADAR2ガイドRNA("adRNA")に関する。これは、遺伝子操作されたADAR2及びGluR2 mRNA由来のADAR2をリクルートするドメインを任意に含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される、標的RNAに相補的な配列を含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。いくつかの実施形態では、該標的RNAに相補的な配列は、約15〜200、または20〜100の塩基対を含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。1つの態様では、該遺伝子操作されたadRNAは、ADARをリクルートするドメインを含まず、または本質的にそれより構成されず、またはさらにそれから構成されない。いくつかの実施形態では、該ADARをリクルートするドメインは、GluR2 mRNA、Alu反復要素、またはADARが結合する他のRNAモチーフ含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。1つの態様では、該遺伝子操作されたadRNAは、約1〜10のADARをリクルートするドメインを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。別の態様では、該ADAR2をリクルートするドメインは、GluR2 mRNAから誘導されてもよく、該遺伝子操作されたadRNAの5'末端または3'末端に配置されてもよい。さらに別の実施形態では、該遺伝子操作されたadRNAは、前記5'末端及び3'末端の両方でGluR2 mRNAを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。さらなる態様では、本開示の遺伝子操作されたadRNAは、標的RNAに相補的な配列に隣接する2つのMS2ヘアピンをさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記標的RNAは、オルニチントランスカルバミラーゼであってもよい。また、本明細書では、高度に厳密な条件下で相補的なポリヌクレオチドにハイブリッド形成されたAdRNAを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される複合体も開示される。1つの態様では、該ポリヌクレオチドは、DNAであってもよい。別の態様では、該ポリヌクレオチドは、RNAであってもよい。
【００１３】
1つの態様では、本開示の遺伝子操作されたadRNAは、編集誘導要素をさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。
【００１４】
さらなる態様は、表1または図2に提供される配列の群から選択された配列によってコードされる遺伝子操作されたADAR2ガイドRNA("adRNA")に関するものである。該adRNAは、薬学的に許容される担体のような担体と組み合わせることができる。本明細書では、その例は提供される。
【００１５】
また、本明細書では、遺伝子操作されたadRNA-snRNA(小核RNA)融合体が開示される。1つの態様では、該遺伝子操作されたadRNAは、N末端ミトコンドリア標的配列(MTS)をさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成され、該遺伝子操作されたadRNAの該ミトコンドリアへの局在化を容易にする。別の態様では、本明細書は、シス作用性ジッパーコードをさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される遺伝子操作された構築物を提供し、該遺伝子操作されたadRNAのペルオキシソーム、エンドソーム及びエクソソームへの局在化を容易にすることができる。
【００１６】
さらに、本明細書では、低分子の調節可能な遺伝子操作されたadRNAが提供される。1つの態様では、本明細書では、遺伝子操作されたadRNA-アプタマー融合体が開示される。該目的に使用できるアプタマーの例として、これらに限定されないが、フラビンモノヌクレオチド、グアニン、他の天然代謝物、または糖に結合するアプタマーが含まれる。また、本明細書では、完全にヒトに由来するU1A-ADAR融合体が開示される。
【００１７】
また、本明細書では、高度に厳密な条件下で相補的なポリヌクレオチドにハイブリッド形成された本開示の遺伝子操作されたadRNAを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される複合体が開示される。
【００１８】
また、本明細書では、本開示の遺伝子操作されたadRNAをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、及び任意に、該単離されたポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列のうちの1つまたは複数を含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成されるベクターが開示される。該ベクターの例としては、これらに限定されないが、プラスミド、またはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターが含まれる。
【００１９】
さらに、本明細書では、上記のベクターをさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される組換え細胞が開示される。ここで、該遺伝子操作されたadRNAは、組換え的に発現されてもよい。
【００２０】
上記化合物及び担体のうちの1つまたは複数を含む組成物が提供される。1つの実施形態では、該組成物は、医薬組成物であってもよく、従って、少なくとも薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。該組成物は、様々な投与方法(例えば、全身(経口)または局所)に応じて製剤化される。
【００２１】
また、本明細書では、タンパク質発現の改変方法が提供される。該方法は、その発現が改変されるべきタンパク質をコードするポリヌクレオチドを本開示の遺伝子操作されたadRNAと接触させることを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。
【００２２】
さらに別の態様は、タンパク質の異常発現に関連する疾患または障害の治療方法に関する。該方法は、タンパク質の異常発現に関連する疾患または障害を治療するため、それを必要とする被験者に、有効量の本明細書に開示された遺伝子操作されたadRNAのうちの任意の1つ以上を投与すること、及び/または有効量の本明細書に開示された遺伝子操作されたadRNAのうちの任意の1つ以上を使用することを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。1つの特定の態様において、本明細書では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法が提供される。該方法は、このような治療を必要とする被験者に、有効量の本開示の遺伝子操作されたadRNAのうちの1つ以上を投与することを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。
【００２３】
本開示は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症のspf-ashマウスモデルにおけるin vivoでのこのアプローチの有効性を実証する。該モデルは、エクソン4の最後のヌクレオチドにG->A点変異を有する。AAVを介してadRNAのみを送達する際に、ADAR酵素の過剰発現が存在しない場合の点変異が誤差1%以下であることが観察された。
【００２４】
追加の態様は、DNAまたはDNAとRNAの組み合わせを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される、同一または類似の構造に関する。さらなる態様は、前記実施形態のうちの任意の1つ以上、及びin vitro及び/またはin vivoで使用するための取扱説明書を含むキットに関する。
【００２５】
本開示の態様は、遺伝子編集のためのADAR及びAPOBECシステムに関することができる。いくつかの態様は、イントロン中のスプライス受容体及び/または分岐点を標的とするadRNA、及び場合によりADAR酵素を含む、エクソンスキッピングのためのADARシステムに関する。いくつかの実施形態では、該ADAR酵素は、ADAR1、ADAR2、またはそれらの変異株または変異体であってもよい。いくつかの実施形態では、該変異株または変異体は、ADAR1(E1008Q)及びADAR2(E488Q)から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、該イントロンは、ジストロフィン、SCN9A、またはオルニチントランスカルバミラーゼから選択された遺伝子に含まれ得る。いくつかの場合において、該adRNAは、配列セット1から選択されてもよい。さらなる態様は、開示されたADARシステムを投与することを含む遺伝子異常発現を特徴とする疾患、障害、または状態を治療する方法に関することができる。いくつかの実施形態では、該疾患、障害、または状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはオルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、該疾患、障害、または状態は、疼痛に関連することがある。
【００２６】
追加の態様は、シトシン→チミン編集のためのAPOBECシステムに関する。これは、アリポタンパク質B mRNA様構造を産生する1対のgRNA、及び任意にAPOBEC酵素を含む。いくつかの実施形態では、該1対のgRNAは、配列セット2に提供される配列対であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ADARの内因性リクルートを示す模式図である。
【００２８】
【図２】(1)改善された効率及び(2)ADARl(配列番号：2〜9)をリクルートする能力について評価されている安定化された足場のリストを示す。
【００２９】
【図３】in vitro及びin vivoでの例示的なadRNAのスクリーニング結果を示す。
【００３０】
【図４】2つのMS2ステム-ループを有するMS2-RNAを介してMCP-APOBEC融合体またはMCP-ACF-APOBEC融合体をリクルートする方法の概略図である。この図に示されたように、目標シトシンを一本鎖に保つことができる。これにより、バルジの生成を介してAPOBECを媒介した編集にアクセスできるようにすることができる。MS2ステム-ループ(青色)間のMS2-RNA中の正確な標的配列(20〜30塩基対)または配列ACATATATGATACAATTTGATCAGTATATT(配列番号：175)のいずれかを、目的のmRNAに結合するMS2ステムループ(緑色)のいずれかの側に相補的な配列(20〜30塩基対)と共に用いて、バルジを作製した。該APOBEC編集が編集する天然由来のアポB基質から、配列ACATATATGATACAATTTGATCAGTATATT(配列番号：176)を採取する。該設計で使用されたMS2ステムループ配列は、aACATGAGGATCACCCATGTc(配列番号：177)である。
【００３１】
【図５】GluR2ドメインを含む構築物による編集と比較して、Aluドメインを含む構築物によるmRNA編集の百分率を示す。
【００３２】
【図６】図5のデータを得るために使用されたAluドメインを含む構築物(配列番号：10)の一例を示す。
【００３３】
【図７】アンチセンスドメインによって連結された2つの十字型を含み、かつAluドメインを含む構築物の一例を示す。例示的な構造(配列番号：11)及び例示的な配列(配列番号：1)の両方が示される。
【００３４】
【図８】図８−１、図８−２および図８−３は、様々な構築物設計(GluR2ドメインを含むものを含む)(配列番号：12〜15、252、および 16〜34)及びそれぞれのmRNA編集の百分率を示す。
【００３５】
【図９】ADAR1及びADAR 2の両方のための、各塩基(例えば、A、C、G、及びT)に対するマッピング酵素の標的選好を示す。
【００３６】
【図１０】ADAR1及びADAR2リクルート潜在性が増強された、次世代adRNAの遺伝子操作を示す。第1シリーズの列は、adRNAを用いない相対活性を示す。第2シリーズの列は、GluR2ドメインを含む構築物を用いた相対活性を示す。第3シリーズの列は、2つの十字型構造に関連するAluドメインを含む構築物を用いる相対活性を示す。図１０は、配列番号：11を開示している。
【００３７】
【図１１Ａ−Ｄ】異なる構築物の設計を示す。図11Aは、2つのGluR2ドメインに連結されたアンチセンスドメインを例示する。図11Bは、アンチセンスドメインのみを例示する。図11Cは、2つの十字型に連結されたアンチセンスドメインを例示する。図11Dは、トウホールドを例示する。
【００３８】
【図１２】異なる構築物設計間の編集収率の百分率を示す。
【００３９】
【図１３】ミスマッチしたバルジを有する短いアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)とヘアピン構造を含むより長い構築物との比較を示す。
【００４０】
【図１４】例示的なadRNA設計(配列番号：250及び251)を示す。
【００４１】
【図１５】パラメータ(d、1、m)を有する例示的なadRNA構造(配列番号：35〜37)を示し、ここで、d=GluR2ドメインの数、1=アンチセンスドメインの長さ、m=ミスマッチの位置。
【００４２】
【図１６】adRNAの存在下で内因性ADARをリクルートすることによるRNA編集の概略図を示す。
【００４３】
【図１７】外因性ADAR2発現の有無にかかわらず標的RNA編集を誘導する能力について評価された0、1、または2つのGluR2ドメインと組み合わせて、アンチセンスドメインの長さが次第に長くなるU6プロモーター転写adRNAを示す。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。長いadRNAは、RNA編集のために内因性ADARをリクルートすることができる。
【００４４】
【図１８】外因性ADAR2発現を有するまたは含まないmRNAのパネルに対して試験された化学的に合成されたadRNAバージョンを示す。化学修飾は、adRNAの供給源と共に同定される。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。
【００４５】
【図１９】処理された成体spfashマウス(後眼窩注射)の肝臓において、正確にスプライスされたOTC mRNAにおけるin vivo RNA補正効率を示す。U6で転写された短いadRNAを注射したマウスにおいて、0.6%のRNA編集レベルが見られる。
【００４６】
【図２０】Alu adRNAの設計を示す。左：Alu要素の構造。中央：標的Aの反対側にCミスマッチを有する遺伝子座特異的アンチセンス配列を含む、本明細書に記載の設計。右：標的へのRNA編集酵素ADARのリクルート。
【００４７】
【図２１】例示的なAluガイド配列(配列番号：38〜41)を示す。
【００４８】
【図２２】分割ADAR2 DDシステムの模式図を示す。
【００４９】
【図２３】分割の可能性のある部位が強調表示された分割ADAR2 DDの例示的な配列(配列番号：42)を示す。
【００５０】
【図２４】ウミホタルルシフェラーゼレポーター(Cluc W85X)を介して試験された断片1〜16の対を示す。
【００５１】
【図２５】Clucレポーターに対して試験された断片9及び10を示す。
【００５２】
【図２６】図２６−１、図２６−２および図２６−３は、例示的な配列(配列番号：43〜55)を示す。
【００５３】
【図２７】U1A(配列番号：56)を介したADARリクルートの概略図を示す。
【００５４】
【図２８】図２８−１〜図２８−６は、いくつかの融合構築物または1つ以上のAPOBECファミリーメンバー(配列番号：57〜68)のための例示的な配列(配列番号：57〜68)を示す。
【００５５】
【図２９】APOBEC3Aをリクルートするように構成された、遺伝子操作されたapRNAの例示的な配列(配列番号：69〜73)を示す。
【００５６】
【図３０】MCP-APOBEC3Aをリクルートするように構成された、遺伝子操作されたMS2-apRNAの例示的な配列(配列番号：74〜78)を示す。
【００５７】
【図３１】ADARリクルート無し及び正常なルシフェラーゼ発現をもたらすリボゾームのリードスルーを可能にするADARリクルートの2つの異なるシナリオを示す。
【００５８】
【図３２Ａ−Ｃ】プログラム可能なRNA編集の遺伝子操作及び特異性プロファイルの特徴付けを示す：(図32A) 全長ADAR2とGluR2転写産物に由来する遺伝子操作されたadRNA、またはADAR1/2デアミナーゼドメイン及び対応するMS2ヘアピンベアリングadRNAへのMS2コートタンパク質（MCP）融合体を利用した構築物を介したRNA編集の概略図。(図32B)サンガー配列決定(サンガーピーク高さ比G/(A+G)として計算される効率)によって定量化された、異なるRNA編集構築物による内因性RAB7A転写物のRNA編集効率の比較。実験は、HEK 293T細胞において行った。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(図32C)対照試料と比較して、少なくとも1つの処理試料が編集収率における有意な変化(フィッシャー直接検定、FDR=1%)が見出された基準部位で観察されたA->G編集収率の分布を表すバイオリンプロット。青色の円は、RAB7A転写物内の標的A部位における編集収率を示す。黒色の点は、中央オフターゲット編集収率を表す。該分布の形状をより良好に可視化するために、y軸に沿ったそれらの最大範囲を全てのプロットにわたって均一化し、60%の収率で切断した。
【００５９】
【図３３Ａ−Ｅ】ヒト疾患のマウスモデルにおけるin vivo RNA編集を示す。(図33A)デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにおけるジストロフィン発現を修復するためのDNA及びRNA標的アプローチの概略図:(i)エクソン23のフレーム切除につながる二重gRNA-CRISPRベースのアプローチ、及び(ii)オーカーコドンのADAR2及びMCP-ADAR1ベースの編集。(図33B)TA筋肉におけるジストロフィンの免疫蛍光染色は、処理された試料における発現の部分的な修復を示す（AAV8-ADAR2、AAV8-ADAR2(E488Q)及びAAV8-CRISPRの筋肉内注射）。処理された試料においてnNOS局在の部分的な修復も見られる(スケールバー：250μm)。(図33C)対応する処理された成体mdxマウスにおけるin vivo TAA->TGG/TAG/TGA RNA編集効率。値は、平均+/-SEM(それぞれn=4、3、7、3、3、10、3、4の単独TA筋肉)を表す。(図33D)エクソン4の最後のヌクレオチドにおけるドナースプライス部位にG->A点変異を有するオルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症のspfashマウスモデルにおけるOTC遺伝子座の概略図、及びADAR2媒介RNA編集による変異OTC mRNAの補正のためのアプローチ。(図33E)処理された成体spfashマウス(AAV8-ADAR2及AAV8-ADAR2(E488Q)の後眼窩注射)の肝臓において、正確にスプライスされたOTC mRNAにおけるin vivo RNA補正効率。値は、平均+/-SEM(それぞれn=4、4、3、3、4、5の単独動物)を表す。
【００６０】
【図３４Ａ−Ｃ】アンチセンスドメインエンジニアリングを示す。(図34A)adRNA足場2を用いたadRNAアンチセンス領域の最適化：ADAR2リクルート領域からの長さ及び距離を系統的に変化させた。値は、平均+/-SEM(n=3)(配列番号：253 および79〜l02)を表す。(図34B)ゼロ、1つ、または2つのGluR2ドメインと組み合わせて、アンチセンスドメインの長さが徐々に長くなるU6プロモーター転写adRNAを、外因性ADAR2発現の有無にかかわらず標的RNA編集を誘導する能力について評価した。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。全ての上記実験は、HEK 293T細胞中で行った。(図34C)HEK 293T及びHeLa細胞株における内因性ADAR1及びADAR2の発現(GAPDHに対する)の実験的確認。観察されたレベルは、ヒトタンパク質図譜に記載されているレベルと類似していた。(world-wide-web(www)におけるproteinatlas.orgを参照)。
【００６１】
【図３５Ａ−Ｂ】エンジニアリングMS2 adRNAを示す。(図35A)MS2 adRNA(配列番号：103〜110)のアンチセンスRNA標的化ドメインの系統的評価。値は平均+/-SEM(n=3)を表す。(図35B)MCP-ADAR2 DD-NLSによる標的上のRNA編集は、MS2 adRNAの共発現を必要とする。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。全ての実験をHEK 293T細胞中で行った。
【００６２】
【図３６Ａ−Ｃ】標的のパネルにわたるRNA編集収率の分析を示す。(図36A)GluR2 adRNA、MS2 adRNA誘導RNA編集構築物、及びCas13bベースの修復構築物によるOTCレポーター転写物のRNA編集効率の比較。値は、平均+/-SEM(レポーター及びCas13bベース構築物についてn=6、他のすべての構築物についてn=3)を表す。(図36B)化学的に合成されたadRNAバージョンを、外因性ADAR2を有するまたは含まないmRNAのパネルに対して試験した。正確な化学修飾は、adRNAの供給源と共に図に記載されている。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(図36C)発現レベルの範囲をカバーするように選択された内因性標的のスペクトルにわたるRNA編集収率の分析。ゼロまたは2つのGluR2ドメインを有するU6で転写された長いadRNAも、外因性ADAR2発現を有する、または含まない複数の内因性mRNA標的に対して評価された。外因性ADAR2発現が存在しない場合であっても、全てのテストされた遺伝子座において編集が観察される。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。全ての実験をHEK 293T細胞中で行った。
【００６３】
【図３７Ａ−Ｄ】ADAR2変異体及びそれらの編集や特異性に対する影響を示す。(図37A)標的上のRNA編集及びGluR2 adRNA、MS2adRNAガイド付きRNA編集構築物、及びCas13bベースの修復構築物によるRAB7A転写産物の隣接アデノシンの編集との比較。平均(n=3)の編集収率が示されている(配列番号：111)。全ての実験は、HEK 293T細胞中で行った。編集効率は、サンガーピーク高さ比G/(A+G)として算出した。(図37B)ADAR2(E488Q)は、spfash OTCレポーター転写物のin vitro編集におけるADAR2よりも高い効率を示す(p=0.037、独立t検定、両側)。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(図37C)mdx DMDレポーター転写物(p=0.048、p=0.012、独立t検定、両側)；値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(図37D)OTCレポーター転写物(上のパネル)及び内因性RAB7A転写物(下のパネル)のためのADAR2、ADAR2(E488Q)、及びADAR2(Δ1〜138)の編集効率及び特異性プロファイルの比較。ヒートマップは、標的(矢印)の近傍でのA->G編集を示す。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。全ての実験は、HEK 293T細胞中で行った。編集効率は、サンガーピーク高さ比G/(A+G)として算出した。図３７Ｄは、出現順に、それぞれ、配列番号：２５４〜２５５を開示している。
【００６４】
【図３８】RNA編集アプローチ(Cas13b-ADAR修復+/-gRNA)のトランスクリプトームスケール特異性プロファイルを示す。
【００６５】
【図３９】RNA編集アプローチ(ADAR2+/-adRNA)のトランスクリプトームスケール特異性プロファイルを示す。これらの研究に使用されるバージョンは、GluR2 adRNA(1,20,6)である。
【００６６】
【図４０】RNA編集アプローチ(MCP-ADAR1 DD+/-adRNA)のトランスクリプトームスケール特異性プロファイルを示す。
【００６７】
【図４１】RNA編集アプローチ(MCP-ADAR2 DD+/-adRNA)のトランスクリプトームスケール特異性プロファイルを示す。
【００６８】
【図４２−Ｂ】トランスクリプトームのスケール編集特異性の変化を構築物でに示す。(図42A)図中の各点は、図32に列挙されたMCP-ADAR構築物のうちの1つの編集部位の画分に対応する。各構築物の編集部位の画分は、AからGへの編集収率が大幅に変化した参照部位の数（表3を参照）を、検討した参照部位の総数8,729,464で割ることによって計算した。水平軸上に示された構築物をMann-Whitney U検定を用いて比較した。得られたp値は、NLS対NESについては0.16で、ADAR1対ADAR2については0.0070で、-adRNA対+adRNAについては0.72で、またADAR WT対ADAR E>Qについては0.038であった（全ての条件においてn=8）。(図42B)各構築物(y軸)で観察されたトランスクリプトーム全体のA->G編集収率を対照試料(x軸)で観察された該収率との比較を示す2D柱状図。挿入図は、対照試料と比較して、少なくとも1つの処理試料が有意な変化(フィッシャー直接検定、FDR=1%)を有することが見出された参照部位において観察された、A->GGの編集収率の分布を表すバイオリンプロットを示す。青色の円は、RAB7A転写物内の標的A部位における編集収率を示す。分布の形状をより良好に可視化するために、y軸に沿ったそれらの最大範囲を全てのプロットにわたって均一化し、60%の収率で切断した。ここでの試料は、外因性及び/または内因性のADARリクルートを介したRNA編集を可能にするadRNAを含む長いアンチセンスドメインで形質導入された293Tに対応する。
【００６９】
【図４３Ａ−Ｅ】mdxマウスにおけるin vitro及びin vivoでのジストロフィン編集実験の最適化及び評価を示す。(図43A)遺伝子操作されたadRNAまたは逆向きのadRNA(raRNA)と共に全長ADAR2を利用したRNA編集の概略図；(ii)一段階及び二段階におけるアンバーとオーカー終止コドンのRNA編集効率。実験は、HEK 293T細胞中で行った。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(図43B)オーカーコドンのRNA編集は、GFP発現を修復するために、adRNAまたはradRNA(配列番号：112〜116)のアンチセンスRNA標的化ドメインにおける2つのシトシンミスマッチを必要とする。実験は、HEK 293T細胞中で行った。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(図43C)adRNA及びADAR2のin vivo送達のために利用されるAAVベクターの概略図及びAAVベクター(それぞれp=0.0003、p=0.0001、p=0.00l5、独立t検定、両側)を介して送達された、adRNAの1つまたは2つのコピーの存在下でのアンバー及びオーカー終止コドンのRNA編集のin vitro最適化。実験は、HEK 293T細胞中で行った。値は、平均+/-SEM(レポーターについてn=3、全ての他の条件についてn=6)を表す。(図43D)mdx DMDレポーター転写物(NGSによって定量された)(配列番号：117〜118)におけるオーカー終止コドン(TAA->TGG)の編集を示す、代表的なサンガー配列測定プロット。実験は、HEK 293T細胞中で行った(n=3)。(図43E)処理されたmdxマウス(NGSを用いて定量された)(配列番号：119〜130)のin vivo RNA編集解析の代表例。
【００７０】
【図４４Ａ−Ｃ】mdxマウスにおけるin vivoジストロフィンRNA編集実験の免疫蛍光及びウェスタンブロット分析を示す。(図44A)TA筋肉におけるジストロフィンの免疫蛍光染色は、処理された試料(AAV8-ADAR2、AAV8-ADAR2(E488Q)、AAV8-MCP-ADAR1(E1008Q)NLSの筋肉内注射)における発現の部分的な修復を示す。nNOSの部分的な修復は、処理された試料(スケールバー：250μm)においても見られる局在化である。(図44B)編集機の両成分、酵素及びadRNAの注射を受けたmdxマウスのTA筋肉におけるジストロフィン発現の部分修復(1〜2.5%)、及び注射後8週間までの注射されたTA筋肉における安定なADAR2発現を示すウエスタンブロット。(図44C)AAV8-CRISPRを用いたジストロフィン発現の部分修復(10%)を示すウエスタンブロット。
【００７１】
【図４５Ａ−Ｅ】spfashマウスにおけるin vitro及びin vivoでのOTC RNA編集実験の最適化及び評価を示す。(図45A)spfash OTCレポーター転写物(NGSを用いて定量された)(配列番号：131〜132)における点変異の補正を示す、代表的なサンガー配列決定プロット。実験は、HEK 293T細胞中で行った(n=3)。(図45B)正確にスプライスされたOTC mRNA(NGSを用いて定量された)(配列番号：133〜139)における点変異の補正を示す、処理されたspfashマウスのin vivo RNA編集解析の代表例。(図45C)（AAV8-ADAR2及びAAV8-ADAR2(E488Q)を後眼窩注射された)処理された成体spfashマウスの肝臓においてOTCプレmRNAにおけるin vivo RNA補正効率。値は、平均+/-SEM(それぞれn=4、4、3、3、4、5の単独動物)を表す。(図45D)正確に及び不正確にスプライスされたOTC mRNAを示すPCR産物。不正確にスプライスされたmRNAは、48塩基対だけ伸長される。adRNA+ADAR2(E488Q)で処理されたマウスにおいて、不正確にスプライスされたmRNAの画分は、減少する。(図45E)OTCのウエスタンブロットは、処理された成体spfashマウスにおける発現の部分修復(2.5%〜5%)、及び注射3週間後の安定なADAR2(E488Q)発現を示す。
【００７２】
【図４６】in vivo RNA編集実験の毒性分析を示す。
【００７３】
【図４７】スプライス受容体及び/または分岐点変異の生成を介したエクソンスキッピングを示す模式図である。
【００７４】
【図４８】APOBECを介したC→T編集の模式図である。
【００７５】
【図４９Ａ−Ｄ】DNA及びDNA/RNAハイブリッドの両鎖を編集する模式を示す。
【００７６】
【図５０Ａ−Ｄ】オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症のモデルにおける研究の結果を示す。図50Aは、処理（AAV8-ADAR2及びAAV8-ADAR2(E488Qを後眼窩注射)された成体spfashマウスの肝臓におけるin vivo RNA補正効率を示す。各データポイントは、単独動物を表す。スプライスされたOTC mRNAにおいて測定された編集効率。誤差バーは+/-SEMを表す。図50Bは、処理(AAV8-ADAR2及びAAV8-ADAR2(E488Q)を後眼窩注射)された成体spfashマウスの肝臓におけるOTCプレ-mRNAにおけるin vivo RNA補正効率を示す。各データポイントは、単独動物を表す。図50Cは、正確に及び不正確にスプライスされたOTC mRNAを示すPCR産物を示す。不正確にスプライスされたmRNAは、48塩基対だけ伸長される。不正確にスプライスされたmRNAの画分は、adRNA+ADAR2(E488Q)で処理されたマウスにおいて減少する。図50Dは、処理された成体spfashマウスにおける発現の部分修復(2.5%〜5%)を示す、OTCのウェスタンブロットである。
【００７７】
【図５１Ａ−Ｂ】デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルにおける研究の結果を示す。図51Aは、対応する処理された成体mdxマウスにおけるin vivo TAA->TGG/TAG/TGA RNA編集効率を示す。各データポイントは、単独のTA筋肉を表す。誤差バーは+/-SEMを表す。図51Bは、対応する処理された成体mdxマウスにおける発現の部分修復(1〜2.5%)を示すジストロフィンのウェスタンブロットである。
【００７８】
【図５２】潜在的な分岐点位置に関するさらなる情報を提供する。
【詳細な説明】
【００７９】
本開示の態様は、核酸、非天然のRNA、核酸を含むベクター、組成物、及びRNA編集のための医薬組成物を提供する。上記または本明細書に記載のいずれかは、A(アデノシン)→I(イノシン)編集、C(シトシン)→T(チミン)編集、またはそれらの組み合わせのために構成されることができる。いくつかの場合において、A→I編集は、C→U変異として解釈され、または読み取られることができる。いくつかの場合において、A→I編集は、A→G突然変異として解釈され、または読み取られることができる。本明細書に記載の核酸、非天然のRNA、核酸を含むベクター、組成物、及び医薬組成物は、天然系と比べて、増強された編集効率、オフターゲット編集、増強された安定性またはin vivo半減期、またはそれらの任意の組み合わせを提供することができる。
【００８０】
本開示の態様は、ベクターを提供する。該ベクターは、(i)RNA編集実体をリクルートするドメイン、(ii)標的RNAの少なくとも一部に相補的な標的化ドメイン、(iii)２つ以上のいずれかのドメイン、または(iv)これらの任意の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むことができる。いくつかの場合において、該ベクターは、それを必要とする被験者等の被験者に投与してもよい。いくつかの場合において、該ベクターは、それを必要とする被験者等の被験者に医薬組成物の一部として投与してもよい。
【００８１】
本開示の態様は、非天然のRNAを提供する。該非天然のRNAは、(i)RNA編集実体をリクルートするドメイン、(ii)標的RNAの少なくとも一部に相補的な標的化ドメイン、(iii)2つ以上のいずれかのドメイン、または(iv)これらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、該非天然のRNAを、それを必要とする被験者等の被験者に投与してもよい。いくつかの場合において、該非天然のRNAを、それを必要とする被験者等の被験者に医薬組成物の一部として投与してもよい。いくつかの場合において、該非天然のRNAを投与用ベクターに配合してもよい。該ベクターは、ウイルスベクター、リポソーム、ナノ粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、該非天然のRNAは、化学修飾等の修飾を有する少なくとも1つの塩基、少なくとも1つの糖、2つ以上のいずれか、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００８２】
本開示の態様は、核酸を提供する。該核酸は、(i)RNA編集実体をリクルートするドメイン、(ii)標的RNAの少なくとも一部に相補的な標的化ドメイン、(iii)2つ以上のいずれかのドメイン、または(iv)それらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、該核酸は、それを必要とする被験者等の被験者に投与してもよい。いくつかの場合において、該核酸は、それを必要とする被験者等の被験者に医薬組成物の一部として投与してもよい。いくつかの場合において、該核酸を投与用のベクター中に配合してもよい。該ベクターは、ウイルスベクター、リポソーム、ナノ粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。該核酸は、遺伝的にコードされてもよい。該核酸は、化学的に合成されてもよい。
【００８３】
核酸は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のドメインのような1つまたは複数のドメインを含むことができる。いくつかの場合において、核酸は、リクルートドメイン、標的化ドメイン、2つ以上のいずれか、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、核酸は、標的化ドメイン及びリクルートドメインを含むことができる。いくつかの場合において、核酸は、1つの標的化ドメイン及び2つのリクルートドメインを含むことができる。
【００８４】
ドメインは、二次元形状または二次構造を形成することができる。例えば、標的化ドメイン、リクルートドメイン、またはそれらの組合せは、直鎖状の領域、十字型またはその一部、トウホールド、ステムループ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる二次構造を形成することができる。該ドメイン自体は、実質的に直鎖状の二次元構造を形成することができる。該ドメインは、十字型を含むことができる二次構造を形成することができる。該ドメインは、ステムループを含むことができる二次構造を形成することができる。該ドメインは、トウホールドを含むことができる二次構造を形成することができる。
【００８５】
いくつかの場合において、標的化ドメインは、多数のヌクレオチドによって直接隣接または隣接するが分離されている、リクルートドメインに隣接して配置することができる。いくつかの場合において、標的化ドメインは、2つのリクルートドメインによって隣接することができる。いくつかの場合において、2つ以上のリクルートドメインが互いに隣接していてもよい。
【００８６】
本開示の態様は、オフターゲット編集を低減することを含む。本明細書に記載される1つのアプローチは、スプリット再組立アプローチによってADARまたはAPOBECの触媒活性を制限することを含む。このような設計では、第1ドメイン(例えば、リクルートドメイン)は、それ自体によって触媒的に不活性であってもよく、第2ドメインは、それ自体によって触媒的に不活性であってもよいが、2つのドメインを一緒にして、触媒活性を提供して、ADARまたはAPOBECをリクルートするための触媒活性を提供することができる。2つのドメインを含む核酸は、2つのドメイン間の位置のような任意の数の場所で分割することができる。いくつかの場合において、第1ドメインまたは第2ドメインは、MS2ステムループ、BoxBステム-ループ、U1Aステム-ループ、これらのいずれかの改変バージョン、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００８７】
ドメインの二次元形状または二次構造は、異なる二次元形状または二次構造を形成できる核酸と比べて、編集、標的効果、またはそれらの組み合わせの効率に影響を及ぼすことができる。従って、本開示の態様は、二次元形状が編集効率を向上させ、標的効果を減少させるように有利に設計されるような核酸の改変を含む。自然発生のリクルートドメインを含む配列への改変はまた、編集効率を高め、標的効果を減少させることができる。従って、本開示の態様は、配列(例えば、合成配列)が編集効率を向上させ、標的効果を減少させるように有利に設計されるような核酸の改変を含む。改変は、ドメインの長さを変更すること(例えば、長さを延長すること)、二次構造の変化をもたらすネイティブ配列を変更すること、化学修飾を加えること、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。本明細書に記載される核酸は、これらの利点を提供することができる。
【００８８】
いくつかの場合において、本明細書に記載される核酸は、標的核酸の少なくとも1つの塩基対を、天然のリクルートドメイン及び(標的核酸に相補的な)アンチセンスドメインと複合体化された同等の核酸よりも少なくとも約3、4または5倍大きい効率で改変することができる。いくつかの場合において、本明細書に記載される核酸は、標的核酸の少なくとも1つの塩基対を、GluR2ドメイン及び(標的核酸に相補的な)アンチセンスドメインと同等の核酸複合体より少なくとも約3、4、または5倍大きい効率で改変することができる。いくつかの場合において、本明細書に記載される核酸は、標的核酸の少なくとも1つの塩基対を、Cas13bタンパク質またはその活性断片及び(標的核酸に相補的な)アンチセンスドメインと同等の核酸複合体より少なくとも約3、4、または5倍大きい効率で改変することができる。効率の向上は、サンガー法のような配列決定法により測定できる。
【００８９】
本開示の態様は、ベクターを提供する。該ベクターは、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むことができる。いくつかの場合において、該ポリヌクレオチド配列は、ステム-ループを含む二次構造を形成しなくてもよい。いくつかの場合において、該ポリヌクレオチド配列は、1つ以上のステム-ループを形成することができる。いくつかの場合において、該ポリヌクレオチド配列は、十字型を含む二次構造を形成することができる。いくつかの場合において、該ポリヌクレオチド配列は、実質的に直鎖形であってもよい二次構造を形成することができる。いくつかの場合において、該ポリヌクレオチド配列は、Aluドメインコード配列、アポリポタンパク質B mRNA編集触媒ポリペプチド様(APOBEC)をリクルートするドメインをコードする配列、及びそれらの任意の組み合わせを含む1つ以上の配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該核酸は、遺伝的にコードされてもよい。いくつかの場合において、該核酸は、化学的に合成されてもよい。
【００９０】
いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、Aluドメインをコードする配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、Aluドメインをコードする配列と少なくとも約85%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、Aluドメインをコードする配列と少なくとも約90%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、Aluドメインをコードする配列と少なくとも約95%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該Aluドメインをコードする配列は、非天然配列であってもよい。いくつかの場合において、該Aluドメインをコードする配列は、改変された部分を含むことができる。いくつかの場合において、該Aluドメインをコードする配列は、天然に存在するAluドメイン配列の一部を含むことができる。
【００９１】
いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、APOBECドメインをコードする配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、APOBECドメインをコードする配列と少なくとも約85%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、APOBECドメインをコードする配列と少なくとも約90%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、APOBECドメインをコードする配列と少なくとも約95%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該APOBECドメインをコードする配列は、非天然配列であってもよい。いくつかの場合において、該APOBECドメインをコードする配列は、改変された部分を含むことができる。いくつかの場合において、該APOBECドメインをコードする配列は、天然に存在するAPOBECドメイン配列の一部を含むことができる。
【００９２】
いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、GluR2ドメインをコードする配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、GluR2ドメインをコードする配列と少なくとも約85%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、GluR2ドメインをコードする配列と少なくとも約90%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、GluR2ドメインをコードする配列と少なくとも約95%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該GluR2ドメインをコードする配列は、非天然配列であってもよい。いくつかの場合において、該GluR2ドメインをコードする配列は、改変された部分を含むことができる。いくつかの場合において、該GluR2ドメインをコードする配列は、天然に存在するGluR2ドメイン配列の一部を含むことができる。
【００９３】
いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、ADARをリクルートするコード配列と少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、単離され、精製されてもよく、または合成されてもよい。このようなポリヌクレオチド配列は、ADARを標的部位にリクルートするように特異的に構成されてもよい。該リクルートは、外因性のADARリクルート(即ち、同時送達または別々に送達することができる)、内因性のADARリクルート、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、ADARのリクルートを増強するか、または天然に存在するリクルートドメインと比べて、特定部位へのADARリクルートの特異性を増強するように特異的に構成されてもよい。いくつかの場合において、該コード配列は、非天然配列であってもよい。いくつかの場合において、該コード配列は、改変された部分を含むことができる。いくつかの場合において、該コード配列は、天然に存在するADARをリクルートするドメイン配列の一部を含むことができる。ADARをリクルートする天然または合成のいずれかの配列を、該ポリヌクレオチド配列に含めることを想定してもよい。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載の配列例を含むことができる。図2、図6、図7、図8、図14、図15、図21、図26、図28、図29、図30及び表1には、例示的な配列が含まれる。本明細書で提供される配列は、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードできる少なくとも一部を有する配列を含む。
【００９４】
(表1)adRNA配列をコードするDNA。これらの配列から産生されるadRNA配列は、DNA配列と同一であるが、TはUに置換される。
2021536244.tif 000003
2021536244.tif 000004
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【００９５】
RNA編集実体をリクルートするドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、任意のADARタンパク質(例えば、ADAR1、ADAR2、ADAR3またはそれらの任意の組み合わせ)、任意のAPOBECタンパク質(例えば、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、またはそれらの任意の組み合わせ)、またはそれらの組み合わせのリクルートを含むことができる。いくつかの場合において、該リクルートされたADARまたはAPOBECタンパク質は、哺乳動物であってもよい。いくつかの場合において、該リクルートされたADARまたはAPOBECタンパク質は、ヒトであってもよい。いくつかの場合において、該リクルートされたADARまたはAPOBECタンパク質は、組換えられてもよく(例えば、外因的に送達されるADARまたはAPOBEC)、改変されてもよく(例えば、外因的に送達されるADARまたはAPOBEC)、内因性のものであってもよく(例えば、内因性のADARまたはAPOBEC)、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００９６】
いくつかの場合において、該少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインは、ステム-ループを含む二次構造を形成しない。いくつかの場合において、該少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインは、ステム-ループを含む二次構造を形成する。いくつかの場合において、該少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインは、ステム-ループを含まない二次構造を形成する。いくつかの場合において、該少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインは、直鎖状の部分を含む二次構造を形成する。いくつかの場合において、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインは、十字型またはその一部を含む二次構造を形成する。
【００９７】
ポリヌクレオチド配列は、2つ以上のRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、複数のリクルートドメインをコードすることができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド配列は、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上のリクルートドメインをコードすることができる。複数のリクルートドメインは、Aluドメイン、APOBECドメイン、GluR2ドメイン、Cas13ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、該Aluドメイン、APOBECドメイン、Cas13ドメイン、またはGluR2ドメインは、天然のリクルートドメインであってもよい。いくつかの場合において、該Aluドメイン、APOBECドメイン、Cas13ドメイン、またはGluR2ドメインは、非天然のものであってもよく、天然配列から改変されてもよく、または組換えられてもよい。複数のリクルートドメインのうちの少なくとも1つは、一本鎖配列を含むことができる。複数のリクルートドメインのうちの少なくとも1つは、複数のAlu反復を含むことができる。複数のリクルートドメインのうちの少なくとも1つは、ステム-ループを含む二次構造を形成することができる。複数のリクルートドメインのうちの少なくとも1つは、ステム-ループを含まない二次構造を形成することができる。複数のリクルートドメインのうちの少なくとも1つは、十字型またはその一部を含む二次構造を形成することができる。複数のリクルートドメインのうちの少なくとも1つは、トウホールドを含む二次構造を形成することができる。
【００９８】
いくつかの場合において、核酸は、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードすることができる。いくつかの場合において、該核酸は、標的RNAの少なくとも一部に相補的なRNAをコードすることができる。いくつかの場合において、該核酸は、リクルートドメイン及び標的化ドメインをコードすることができる。いくつかの場合において、該核酸は、リクルートドメインをコードすることができ、核酸は、標的化ドメインをコードすることができる。標的RNAの一部は、単一の塩基を含むことができる。標的RNAの一部は、複数の塩基を含むことができる。標的RNAの一部は、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000またはそれ以上の塩基対を含むことができる。いくつかの場合において、該標的RNAは、約1 bps〜約10 bpsを含むことができる。いくつかの場合において、該標的RNA約10 bps〜約100 bpsを含むことができる。いくつかの場合において、該標的RNAは、約10 bps〜約500 bpsを含むことができる。いくつかの場合において、該標的RNAは、約10 bps〜約1000 bpsを含むことができる。標的化ドメイン及びリクルートドメインを含む核酸は、長さが少なくとも約200 bpの連続配列を含むことができる。標的化ドメイン及びリクルートドメインを含む核酸は、長さが少なくとも約150 bpの連続配列を含むことができる。標的化ドメイン及びリクルートドメインを含む核酸は、長さが少なくとも約250 bpの連続配列を含むことができる。標的化ドメイン及びリクルートドメインを含む核酸は、長さが少なくとも約275 bpの連続配列を含むことができる。標的化ドメイン及びリクルートドメインを含む核酸は、長さが少なくとも約300 bpの連続配列を含むことができる。標的化ドメイン及びリクルートドメインを含む核酸は、長さが少なくとも約400 bpの連続配列を含むことができる。標的化ドメイン及びリクルートドメインを含む核酸は、長さが少なくとも約500 bpの連続配列を含むことができる。
【００９９】
ベクターは、核酸を送達するために用いることができる。ベクターは、二本鎖DNAまたは一本鎖DNAのようなDNAを含むことができる。ベクターは、RNAを含むことができる。いくつかの場合において、該RNAは、塩基の改変を含むことができる。該ベクターは、組換えベクターを含むことができる。該ベクターは、天然のベクターから改変されたベクターであってもよい。該ベクターは、非天然のベクターの少なくとも一部を含むことができる。任意のベクターを利用することができる。いくつかの場合において、該ベクターは、ウイルスベクター、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、細胞外小胞、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ関連のウイルスベクター(AAV)、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、これらのいずれかの一部、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、ナノ粒子ベクターは、ポリマーベースのナノ粒子、アミノ脂質ベースのナノ粒子、金属ナノ粒子(例えば、ゴールドベースのナノ粒子)、これらのいずれかの部分、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、ベクターは、AAVベクターを含むことができる。ベクターは、改変されたVP1タンパク質を含むように改変されてもよい(例えば、AAVベクターは、VP1タンパク質を含むように改変される等)。AAVは、AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、それらのいずれかの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせ等の血清型を含むことができる。
【０１００】
別途に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に提供される全てのヌクレオチド配列は、別途に定義されない限り、5'から3'方向に示される。本明細書に記載される方法及び材料と類似または等価な任意の方法及び材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、本明細書において好ましい方法、装置、及び材料を記載する。本明細書に引用された全ての技術文献的及び特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書には、本開示が、従来の開示のためにこのような開示に権利を与えられていないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【０１０１】
別途に示されない限り、本技術の実施は、従来の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び組換えDNAの技術を採用する。例えば、次の文献を参考されたい。GreenとSambrook編、(2012) 分子クローニング：実験マニュアル、第4版；Ausubelら編集のシリーズ、(2015)分子生物学における最新プロトコル；酵素学における方法のシリーズ(Academic Press, Inc., NY)；MacPhersonら、(2015)PCR1：実用的なアプローチ (IRL Press at Oxford University Press)；MacPhersonら、(1995)PCR2：実用的なアプローチ；Macphersonら、(2006)PCR：基礎(Garland Science)；HarlowとLane編、(1999)抗体、実験マニュアル；Greenfield編、(2014)抗体、実験マニュアル；Freshney(2010)動物細胞の培養：基本技術のマニュアル、第6版；Gait編、(1984)オリゴヌクレオチド合成；米国特許第4,683,195号；HamesとHiggins編、(1984)核酸のハイブリッド形成；Anderson(1999)核酸のハイブリッド形成；Herdewijn編、(2005)オリゴヌクレオチド合成：方法と応用；HamesとHiggins編、(1984)転写及び翻訳；BuzdinとLukyanov編、(2007)核酸のハイブリッド形成：最新の応用；固定化細胞及び酵素(IRL Press(1986))；Grandi編、(2007)in vitro転写及び翻訳プロトコル、第2版；Guisan編、(2006)酵素及び細胞の固定；Perbal(1988)分子クローニングの実用ガイド、第2版；MillerとCalos編、(1987)哺乳類細胞用の遺伝子導入ベクター(Cold Spring Harbor Laboratory)；Markrides編、(2003)哺乳動物細胞における遺伝子導入及び発現;MayerとWalker編、(1987)細胞及び分子生物学における免疫化学的方法(Academic Press, London)；LundbladとMacdonald編(2010)生化学及び分子生物学のハンドブック、第4版；Herzenbergら編(1996)ウィアーの実験免疫学ハンドブック、第5版；及び/またはそれらの最新版。
【０１０２】
本明細書の記載において使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本開示を限定することを意図するものではない。
【０１０３】
全ての数値表示、例えば、pH、温度、時間、濃度、及び分子量(範囲を含む)は、近似値である。これらは、1.0または0.1の増減で変動し、適切または代替的には+/-15%、または10%、または5%、または2%変化する。理解されるべきこととして、必ずしも明示的には記載されていないが、全ての数字記載は、先頭に用語"約"が付与される。また理解されるべきこととして、必ずしも明示的に記載されていないが、本明細書に記載の試薬は、単に例示的なものであり、それらと同等なものが当該技術分野において周知されている。
【０１０４】
文脈で示されない限り、本明細書に記載の開示の様々な特徴を任意の組み合わせで使用することができることが特に意図されている。さらに、本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴または特徴の任意の組み合わせを除外または省略することも企図する。具体的には、本明細書は、複合体が成分A、B及びCを含むと記載した場合、具体的には、A、BまたはCのいずれか、またはそれらの組み合わせを単独でまたは任意の組み合わせで省略でき、また免責できることが意図される。
【０１０５】
別途に明記しない限り、全ての具体的な実施形態、特徴、及び用語は、記載された実施形態、特徴、または用語及びそれらの生物学的に同等なものの両方を包含することが意図される。
定義
【０１０６】
明細書及び特許請求の範囲に使用されるように、単数形の"1つ"及び"該"は、文脈中に明記されない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語"1つのポリペプチド"は、その混合物を含む複数のポリペプチドを含む。従って、その逆の場合が示されない限り、本願に記載された数値パラメータは、本開示によって得られることが求められる所望の特性に依存して変動できる近似値である。
【０１０７】
本明細書で使用されるように、用語"約"は、当業者によって測定される特定の値について許容可能な誤差範囲内にあることを意味することができる。このことは、部分的に、値がどのように計測または測定されるか、例えば、測定システムの限界に依存することがある。例えば、"約"は、当業者による一回測定当たりにプラスまたはマイナス10%を意味することができる。あるいは、"約"は、ある値のプラスマイナス20%、プラスマイナス10%、プラスマイナス5%、プラスマイナス1%の範囲を意味することもできる。あるいは、特に生物学的なシステムまたはプロセスに関して、該用語は、ある値の5倍以内、または2倍以内の大きさのオーダーを意味することができる。本願及び特許請求の範囲に具体的な値が記載されている場合、特に断らない限り、その許容可能な誤差範囲内を意味する用語"約"を想定することができる。また、値の範囲及び/またはサブ範囲が示される場合、該範囲及び/またはサブ範囲は、範囲及び/またはサブ範囲の終点を含むことができる。いくつかの場合において、変動は、所定量の20%、10%、5%、1%、0.5%、または0.1%の量または濃度を含むことができる。
【０１０８】
本明細書の数値範囲の説明のために、同じ程度の精度間にある各介在数値が明示的に企図される。例えば、6〜9の範囲では、6及び9に加えて、数値7及び8が企図される。6.0〜7.0の範囲では、数値6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及び7.0が明示的に企図される。
【０１０９】
本明細書で使用されるように、用語"アデニン"、"グアニン"、"シトシン"、"チミン"、"ウラシル"及び"ヒポキサンチン"(イノシン中の核酸塩基)は、そのような核酸塩基を指す。
【０１１０】
用語"アデノシン"、"グアノシン"、"シチジン"、"チミジン"、"ウリジン"及び"イノシン"は、（デオキシ）リボシル糖に結合した核酸塩基を指す。
【０１１１】
本明細書中で使用される"アデノ関連ウイルス"または"AAV"という用語は、この名称に関連し、Parvoviridae科のdependoparvovirus属に属するウイルスのクラスの一員を指す。該ウイルスの複数の血清型は、遺伝子送達に適していることが知られており、全ての既知の血清型は、様々な組織型から細胞を感染させることができる。少なくとも11種は、先行技術において開示されている。本明細書に開示される目的に有用な非限定的な例示的な血清型は、該11種の血清型、例えばAAV2及びAAV8のいずれかを含む。本明細書中で使用される"レンチウイルス"という用語は、この名称に関連し、Retroviridae科のlentivirus属に属するウイルスのクラスの一員を指す。いくつかのレンチウイルスは疾患を引き起こすことが知られているが、他のレンチウイルスは遺伝子送達に適していることが知られている。例えば、Tomasら(2013)生化学、遺伝学及び分子生物学："遺伝子治療-ツール及び潜在的な応用"ISBN 978-953-51-1014-9、DOI：10.5772/52534を参照されたい。
【０１１２】
本明細書中で使用されるように、用語"RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ"または"ADAR"は、RNA配列中のアデノシン(A)をイノシン(I)に変換できるアデノシンデアミナーゼを指すことができる。ADAR 1及びADAR 2は、in vivoでのmRNAの編集に関与するADARの2つの例示的な種である。ADAR1の配列の例は、これらに限定されないが、次の参照番号で見出すことができる：HGNC：225；Entrez Gene：103；Ensembl:ENSG 00000160710；OMIM：146920；UniProtKB：P55265；及びGeneCards：GC01M154554、ならびにそれらの生物学的等価物。ADAR2の配列の例は、これらに限定されないが、次の参照番号で見出すことができる：HGNC：226；Entrez Gene：104；Ensembl：ENG00000197381；OMIM：601218；UniProtKB：P78563；及びGeneCards：GC21P045073、及びそれらの生物学的等価物。さらに、触媒ドメインの非限定的な配列の例が、上記に提供されている。部位特異的ADAR編集に使用される順方向及び逆方向RNAは、それぞれ"adRNA"及び"radRNA"として知られている。ADAR1及びADAR2の触媒ドメインは、本明細書の以下に示す配列に含まれる。
【０１１３】
ADAR1触媒ドメイン：KAERMGFTEVTPVTGASLRRTMLLLSRSPEAQPKTLPLTGSTFHDQIAMLSHRCFNTLTNSFQPSLLGRKILAAIIMKKDSEDMGVVVSLGTGNRCVKGDSLSLKGETVNDCHAEIISRRGFIRFLYSELMKYNSQTAKDSIFEPAKGGEKLQIKKTVSFHLYISTAPCGDGALFDKSCSDRAMESTESRHYPVFENPKQGKLRTKVENGEGTIPVESSDIVPTWDGIRLGERLRTMSCSDKILRWNVLGLQGALLTHFLQPIYLKSVTLGYLFSQGHLTRAICCRVTRDGSAFEDGLRHPFIVNHPKVGRVSIYDSKRQSGKTKETSVNWCLADGYDLEILDGTRGTVDGPRNELSRVSKKNIFLLFKKLCSFRYRRDLLRLSYGEAKKAARDYETAKNYFKKGLKDMGYGNWISKPQEEKNFYLCPV (配列番号：140)
【０１１４】
ADAR2触媒ドメイン：
【０１１５】
QLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLT (配列番号：141)
【０１１６】
ADARの二本鎖RNA結合ドメイン(dsRBD)は、本明細書の以下に示す配列に含まれる。
【０１１７】
ADAR dsRBD：
【０１１８】
MDIEDEENMSSSSTDVKENRNLDNVSPKDGSTPGPGEGSQLSNGGGGGPGRKRPLEEGSNGHSKYRLKKRRKTPGPVLPKNALMQLNEIKPGLQYTLLSQTGPVHAPLFVMSVEVNGQVFEGSGPTKKKAKLHAAEKALRSFVQFPNASEAHLAMGRTLSVNTDFTSDQADFPDTLFNGFETPDKAEPPFYVGSNGDDSFSSSGDLSLSASPVPASLAQPPLPVLPPFPPPSGKNPVMILNELRPGLKYDFLSESGESHAKSFVMSVVVDGQFFEGSGRNKKLAKARAAQSALAAIFN (配列番号：142)
【０１１９】
理解されたいこととして、ADAR及び/またはその種々のドメインの配列に対してさらなる突然変異を行うことができる。例えば、本開示は、ADAR1及びADAR2の両方のE488Q及びE1008Q変異体、ならびにC末端の欠失によるADAR2の"乱交雑な"変異体を提供する。該"乱交雑な"変異体は、A→G変換を示す標的配列の近くに、いくつかのAを有する編集されたリードスルーにおいて乱交雑を示した(2種の異なる遺伝子座にわたって確認された)ため、このように知られている。該変異体の配列を本明細書の以下に示す。
【０１２０】
"乱交雑な"ADAR2変異体
【０１２１】
MLRSFVQFPNASEAHLAMGRTLSVNTDFTSDQADFPDTLFNGFETPDKAEPPFYVGSNGDDSFSSSGDLSLSASPVPASLAQPPLPVLPPFPPPSGKNPVMILNELRPGLKYDFLSESGESHAKSFVMSVVVDGQFFEGSGRNKKLAKARAAQSALAAIFNLHLDQTPSRQPIPSEGLQLHLPQVLADAVSRLVLGKFGDLTDNFSSPHARRKVLAGVVMTTGTDVKDAKVISVSTGTKCINGEYMSDRGLALNDCHAEIISRRSLLRFLYTQLELYLNNKDDQKRSIFQKSERGGFRLKENVQFHLYISTSPCGDARIFSPHEPILEEPADRHPNRKARGQLRTKIESGEGTIPVRSNASIQTWDGVLQGERLLTMSCSDKIARWNVVGIQGSLLSIFVEPIYFSSIILGSLYHGDHLSRAMYQRISNIEDLPPLYTLNKPLLSGISNAEARQPGKAPNFSVNWTVGDSAIEVINATTGKDELGRASRLCKHALYCRWMRVHGKVPSHLLRSKITKPNVYHESKLAAKEYQAAKARLFTAFIKAGLGAWVEKPTEQDQFSLTP*(配列番号：143)
【０１２２】
理論に拘束されないが、ADAR1におけるC末端欠失は、同じまたは類似の効果を生じることができる。
【０１２３】
用語"Aluドメイン"は、Alu転位性要素("Alu要素")から得られた配列を指すことができる。典型的には、該Alu要素の長さは、約300の塩基対である。Alu要素は、典型的には、十字型-ポリA5-TAC-ポリA6-十字型-ポリAテールを含み、ここで、２つの十字型ドメインは、ヌクレオチド配列において類似している。"Aluドメイン"は、該Alu要素の十字型部分を含むことができる。いくつかの実施形態では、十字型構造を含む2つのAluドメインは、標的RNA配列に相補的な配列によって連結される。
【０１２４】
本明細書で使用されるように、用語"APOBEC"は、C→T編集を触媒するmRNA編集に関与する進化的に保存されたシチジンデアミナーゼのファミリーに含まれる任意のタンパク質を指すことができる。これは、C→U変換及びその等価物として解釈することができる。いくつかの態様では、用語APOBECは、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、またはそれらの等価物のいずれかを指すことができる。1つまたは複数のAPOBECドメインを含む融合タンパク質の非限定的な配列例は、ADARドメインに融合され、またはRNA編集システムでの使用に適合するように代替のドメインに融合されて本明細書で提供される。該目的のために、APOBECは、異なる変換によるADAR触媒編集の等価物と考えられる。従って、理論に拘束されないが、では、本明細書で企図される全てのADARベースの編集システム用の実施形態は、APOBECベースのRNA編集システム用に適合できる。いくつかの場合において、APOBECの使用は、特定の改変を含むことができる。例えば、これに限定されないが、特定のガイドRNAまたは"gRNA"を用いて酵素をリクルートする。
【０１２５】
"アプタマー"は、様々な分子を高い親和性と特異性で結合できる短い一本鎖オリゴヌクレオチドを指すことができる。アプタマーの非限定的な例は、Lakhin,A.V.ら(2013).Acta naturae,5(4),34-43 に記載されている。
【０１２６】
本明細書で使用されるように、用語"含む"は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことの意味を意図している。別途に示されない限り、"含有する"、"含有している"、"包含する"、"包含している"等は、"含む"を意味する。組成物及び方法を定義するために使用される場合に、"実質的に構成される"は、意図された用途のための組み合わせに必須の重要な他の要素を除外することを意味する。従って、本明細書で定義されるような要素を本質的に含む組成物は、単離及び精製方法からの微量な汚染物質、及びリン酸塩緩衝生理食塩水、防腐剤等の薬学的に許容される担体を排除しなくてもよい。"構成される"は、他の成分の微量以上の要素、及び本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップの排除を意味することになる。これらの移行用語のいずれによって定義された実施形態は、本開示の範囲内にある。
【０１２７】
"非基準アミノ酸"は、自然にヒト体内で見出される20個のアミノ酸を指す。これらを、3文字の略語、1文字の略語、構造、及び対応するコドンと共に以下の表に示す。
2021536244.tif 000007
2021536244.tif 000008
2021536244.tif 000009
2021536244.tif 000010
【０１２８】
用語"Cas9"は、該名称に参照されるCRISPR関連のエンドヌクレアーゼを指すことができる。Cas9の例には、これらに限定されないが、Staphylococcus aureus Cas9、ヌクレアーゼデッドCas9、それらの相同分子種及び生物学的等価物が含まれる。相同分子種としては、Streptococcus pyogenes Cas9("spCas9")、Streptococcus thermophiles由来のCas9、Legionella pneumophilia、 Neisseria lactamica、Neisseria meningitides、Francisella novicida、及びAcidaminococcus spp.とFrancisella novicida U112を含む様々な細菌種に由来するCpf1（cas9に類似した切断機能を果たす）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、UniProtKB G3ECR1(Cas9_STRTR)、ならびにヌクレアーゼ活性を欠いているデッドCas9またはdCas9(例えば、RuvC及びHNHドメインの両方における突然変異を伴う)を使用することができる。用語"Cas9"は、さらに、それと少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%の同一性を有する、参照されたCas9の等価物を指すことができる。これは、他の大きなCas9タンパク質を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、該Cas9は、Campylobacter jejuniまたは他の長さ1000アミノ酸以下のCas9相同分子種に由来する。
【０１２９】
本明細書で使用されるように、用語"CRISPR"は、クラスター化された規則的に間隔を置いて配置された短いパリンドローム反復経路による配列特異的遺伝子操作技術を指すことができる。CRISPRは、遺伝子編集及び/または遺伝子調節を実行するために、ならびに単に標的タンパク質を特定のゲノム位置に標的化するために使用することができる。"遺伝子編集"は、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が欠失、挿入、一本鎖または二本鎖切断の導入、またはポリヌクレオチド配列への塩基置換を介して変化する遺伝子工学のタイプを指すことができる。いくつかの態様では、CRISPR媒介遺伝子編集は、非相同末端結合(NHEJ)または相同組換えの経路を利用して編集を行う。遺伝子調節は、タンパク質またはRNAのような特定の遺伝子産物の産生を増加または減少させることを指すことができる。
【０１３０】
本明細書で使用されるように、用語"欠乏"は、特定の薬剤の正常(生理学的に許容される)レベルよりも低いことを指すことができる。タンパク質の文脈において、欠乏は、全長タンパク質の正常レベルよりも低いことを指すことができる。
【０１３１】
本明細書で使用されるように、用語"検出可能なマーカー"は、検出可能な信号を直接または間接的に生成できる少なくとも1つのマーカーを指すことができる。該マーカーには、例えば、比色分析、蛍光、発光による検出可能な信号を生成する酵素、例えば、洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ；蛍光、発光染料等の発色団、電子顕微鏡または導電率、電流測定、ボルタンメトリー、インピーダンス等の電気的特性によって検出された電子密度のある官能基、例えば、その分子がそれらの物理的及び/または化学的特性の検出可能な修飾を誘発するのに十分なサイズを有する検出可能な官能基（このような検出は、回折、表面プラズモン共鳴、表面変化等の光学的方法によって達成できる）、接触角の変化または原子間力分光法等の物理的方法、トンネル効果、または32P、35Sまたは125I等の放射性分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書で使用されるように、用語"ドメイン"は、タンパク質またはポリペプチドの特定な、かつ特定の機能に関連する領域を指すことができる。例えば、"RNAヘアピンモチーフと関連するドメイン"は、1つ以上のRNAヘアピンに結合するタンパク質のドメインを指すことができる。該結合は、任意に特定のヘアピンに特異的であってもよい。
【０１３３】
本明細書で使用されるように、用語"ジストロフィン"は、その名称に対応し、かつ遺伝子Dmdにコードされるタンパク質を指す。その非限定的な例は、Uniprotの参照番号：Pl1532(ヒトについて)及びPl1531(マウスについて)に見出される。
【０１３４】
"編集誘導要素"は、RNAを効率的に編集するのに必要な大きな二本鎖RNAの構造を指すことができる。編集誘導要素の非限定的な例は、Daniel,C.ら(2017)Genome Biol.18,195に記載されている。編集誘導要素の更なる非限定的な例は、以下の構造(配列番号：15)により提供される：
2021536244.tif 000011
本開示の実施モデル
【０１３５】
ADARは、アデノシンが加水分解脱アミノ化し、生物化学的にグアノシンと認識されるイノシンに変換することを触媒する天然のRNA編集酵素である。本明細書の上記で説明したように、APOBECは、シトシンからチミンへの変換と類似した機能を果たせる酵素である。
【０１３６】
ポリヌクレオチドに適用される用語"コードする"は、その天然状態において、または当業者に周知の方法で操作された場合、ポリペプチドをコードすると言われるポリヌクレオチドを指すことができる。これは、転写及び/または翻訳され、ポリペプチドのmRNA及び/またはその断片を産生することができる。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、それからコード配列を推定することができる。
【０１３７】
用語"等価物"または"生物学的等価物"は、特定の分子、生物学的または細胞性物質を指すときに交換可能に用いられ、また、所望の構造または機能を維持しながら最低の相同性を有するものを意図する。
【０１３８】
"真核細胞"は、原核生物界を除く全ての生命界を含む。これらは、膜結合核を介して容易に区別することができる。動物、植物、真菌、及び原核生物は、細胞が内部膜及び細胞骨格によって複合構造に組織化された真核生物または生物である。最も特徴的な膜結合構造は核である。特に記載されていない限り、用語"宿主"は、例えば、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む真核生物宿主を包含する。真核細胞または宿主の非限定的な例としては、サル、ウシ、ブタ、ネズミ、ラット、トリ、爬虫類、及びヒトが挙げられる。
【０１３９】
本明細書で使用されるように、"発現"は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写されるプロセス及び/または転写されたmRNAが続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指すことができる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAから誘導される場合、発現は、真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含むことができる。
【０１４０】
本明細書で使用されるように、用語"機能的な"は、任意の分子、生物、または細胞性物質を改変し、特定の効果を達成することを意図するために用いられる。
【０１４１】
本明細書中で使用されるように、用語"Glur2 mRNA"は、アデノシンからイノシンへ(A->I)の編集を受けるmRNAをコードするイオンチャネル型AMPAグルタミン酸塩受容体2（"Glur2"）を指すことができる。該mRNAは、ADARを部位選択的にリクルートする。
【０１４２】
本明細書で使用されるように、用語"gRNA"または"ガイドRNA"は、CRISPR技術を用いた遺伝子編集のための特定のポリヌクレオチド配列を標的とするために用いられるガイドRNA配列を指すことができる。標的特異性のためのgRNA及びドナー治療上のポリヌクレオチドを設計する技術は、当該技術分野において周知されている。例えば、Doench,J.ら、Nature Biotechnology 2014；32(12)：1262-7、Mohr,S.ら(2016)FEBS Journal 283：3232-38、及びGraham,D.ら、Genome Biol.2015；16：260。gRNAは、CRISPR RNA（crRNA）とトランス活性化CRIPSPR RNA（tracrRNA）を含む融合ポリヌクレオチド、またはCRISP RRNA（crRNA）とトランス活性化CRIPSPR RNA（tracrRNA）を含むポリヌクレオチドを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。いくつかの態様では、gRNAは、合成品である(Kelley,M.ら(2016)J of Biotechnology 233(2016)74-83)。
【０１４３】
単独に、または"モチーフ"と共に用いられる用語"ヘアピン"、"ヘアピンループ"、"ステムループ"、及び/または"ループ"は、反対方向に読み取られたときに相補的である一本鎖内の配列が塩基対を形成して、その立体構造がヘアピンまたはループに似ている領域を形成する場合に、一本鎖オリゴヌクレオチドに形成された構造を指すためにオリゴヌクレオチドの文脈で使用される。
【０１４４】
"相同性"または"同一性"または"類似性"は、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性を指すことができる。相同性は、比較のために整列され得る各配列内の位置を比較することで測定できる。比較した配列の位置が同一の塩基またはアミノ酸で占められている場合、該位置で分子が相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致または相同位置の数の関数である。"無関係の"または"非相同の"配列は、本開示の配列の1つと40%未満の同一性、あるいは25%未満の同一性を共有する。
【０１４５】
相同性は、参照配列とa%の配列同一性を指す。実際問題として、特定の配列が、本明細書に記載の任意の配列(これは、本明細書に記載の特定の核酸配列に対応し得る)と少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%または99%同一であろうと、このような特定のポリペプチド配列は、従来公知のコンピュータプログラム、例えばBestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 5711) を用いて測定できる。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを用して特定の配列が参照配列と例えば95%同一であるかどうかを測定する場合、同一性百分率が参照配列の全長にわたって計算され、全参照配列の5%までの相同性のギャップが許容されるようにパラメータを設定することができる。
【０１４６】
例えば、特定の実施形態では、参照配列(問い合わせ配列、即ち、本開示の配列)と、グローバル配列整列とも呼ばれる対象配列との間の同一性は、Brutlagらのアルゴリズム(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))に基づくFASTDBコンピュータプログラムを用いて測定できる。いくつかの場合において、同一性が狭く構築された特定の実施形態のための、FASTDBアミノ酸整列において使用されるパラメータは、スコアリングスキーム=PAM(受け入れた突然変異の百分率)0、k-タプル=2、ミスマッチペナルティ=l、結合ペナルティ=20、ランダム化グループの長さ=0、カットオフスコア=1、ウィンドウサイズ=配列の長さ、ギャップペナルティ=5、ギャップサイズペナルティ=0.05、ウィンドウサイズ=500、またはより短い対象配列の長さを含むことができる。該実施形態によれば、対象配列は、内部欠失ではなく、N-またはC末端の欠失により、問い合わせ配列よりも短いであれば、グローバル百分率同一性を計算するときに、FASTDBプログラムが対象配列のN末端及びC末端の切り捨てを考慮しないという事実を考慮して、結果を手動で補正することができる。N-及びC末端で切断された対象配列に対して、問い合わせ配列に対して、対応する対象残基と一致/整列されていない、対象配列のN-及びC末端に対して横方向である問い合わせ配列の残基の数を、問い合わせ配列の全塩基の百分率として計算することによって、百分率同一性を補正することができる。該FASTDB配列整列の結果により、残基が一致/整列しているか否かの測定を行うことができる。次いで、該百分率は、特定のパラメータを用いてFASTDBプログラムによって計算された百分率同一性から減算され、最終百分率同一性スコアに到達することができる。該最終百分率同一性スコアは、本実施形態の目的に使用することができる。いくつかの場合において、問い合わせ配列と一致/整列されていない対象配列のN-及びC末端への残基のみが、百分率同一性スコアを手動で調節する目的のために考慮される。即ち、この手動補正のために、対象配列の最も遠いN末端残基の外側の問い合わせ残基位置のみが考慮される。例えば、90残基の対象配列を100残基の問い合わせ配列と整列させて、百分率同一性を測定することができる。この欠失は、対象配列のN末端で起こるので、FASTDB整列は、該N末端の最初の10残基の整合/整列を示さない。10個の不対残基は、配列の10％を表す（一致しないN末端とC末端の残基数/クエリ配列の残基の総数）ので、FASTDBプログラムによって計算された百分率同一性スコアから10％が差し引かれる。残りの90残基が完全に一致した場合、最終百分率同一性は90%とすることができる。別の例では、90残基の対象配列は、100残基の問い合わせ配列と比較される。今回は、欠失が内部欠失であるため、該問い合わせ配列と一致/整列されていない対象配列のN-またはC末端に残基が存在しない。この場合、FASTDBにより算出された同一性百分率は手動で補正されない。繰り返すと、問い合わせ配列と整合/整列されていない対象配列のN-及びC末端の外側に位置する残基のみが、FASTDB整列に表示されるように、手動で補正される。
【０１４７】
"ハイブリッド形成"は、1つ以上のポリヌクレオチドが反応し、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指すことができる。該水素結合は、Watson-Crick塩基対やHoogstein結合によって、または他の任意の配列特異的に生じることができる。該複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、多本鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリッド形成鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。ハイブリッド形成反応は、PC反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のような、より広範なプロセスにおいて工程を構成することができる。
【０１４８】
厳密なハイブリッド形成条件の例として、インキュベーションの温度:約25℃〜約37℃、ハイブリッド形成緩衝液の濃度:約6x SSC〜約10x SSC、ホルムアミドの濃度:約0%〜約25%、及び洗浄溶液:約4x SSC〜約8x SSCが含まれる。適度なハイブリッド形成条件の例として、インキュベーションの温度：約40℃〜約50℃、緩衝液の濃度：約9x SSC〜約2x SSC、ホルムアミドの濃度：約30%〜約50%、及び洗浄溶液：約5x SSC〜約2x SSCが含まれる。高度に厳密なハイブリッド形成条件の例には、インキュベーションの温度：約55℃〜約68℃、緩衝液の濃度:約lx SSC〜約0.1x SSC、ホルムアミドの濃度：約55%〜約75%、及び洗浄溶液：約lx SSC〜0.lx SSC、または脱イオン水が含まれる。一般に、ハイブリッド形成のインキュベーション時間は5分間〜24時間であり、1つ、2つまたはそれ以上の洗浄工程が含まれる。また、洗浄のインキュベーション時間は、約1、2または15分間である。SSCは0.15 M NaCl及び15 mMクエン酸塩緩衝液である。理解されたいこととして、他の緩衝系を用いたSSCの等価物を用いることができる。
【０１４９】
本明細書で使用されるように、"阻害する"は、特定の病原体(例えば、感染病原体)または疾患の活性の進行または重症度を実質的に拮抗し、禁止し、阻止し、抑制し、遅延させ、妨害し、変化させ、排除し、停止させ、または反転させる能力を意味する。
【０１５０】
本明細書で使用されるように、用語"インターフェロン"は、免疫応答に関連することが知られている情報伝達タンパク質の群を指すことができる。この用途に関連して、対象となるインターフェロンは、ADARの発現を増強させるものである。インターフェロンαとADAR1との間の相関はよく知られており、従って、本開示は、内因性ADAR1発現を増加させる手段としてインターフェロンαを使用することを意図している。単離されたまたは組換えインターフェロンの商業的供給源として、Sigma-Aldrich、R&D Systems、Abcam、及びThermo Fisher Scientificが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、既知のベクター及び所定のタンパク質配列、例えば、Q6QNB6(ヒトIFNA)を用いてインターフェロンαを産生することができる。
【０１５１】
本明細書で使用されるように、用語"単離された"は、他の物質を実質的に含まない分子または生物学的物質または細胞材料を指すことができる。1つの態様では、用語"単離された"は、DNAまたはRNAのような核酸、またはタンパク質またはポリペプチド(例えば、抗体またはその誘導体)、または他のDNAまたはRNAから分離された細胞または細胞小器官、または組織または器官、または自然源に存在するタンパク質またはポリペプチド、または細胞または細胞小器官、または組織または器官を指すことができる。用語"単離された"はまた、細胞材料、ウイルス物質、または組換えDNA技術によって産生された場合の培地、化学的に合成された場合の化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指すことができる。また、"単離された核酸"は、断片として自然に存在せず、かつ自然な状態では発見できない核酸断片を含むことを意味する。本明細書では、用語"単離された"はまた、他の細胞タンパク質から単離され、精製及び組換えポリペプチドの両方を包含することを意味するポリペプチドを指すために使用される。本明細書では、用語"単離された"はまた、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を意味するために使用され、培養され、及び遺伝子操作された細胞または組織の両方を包含することを意味する。
【０１５２】
"伝達RNA"または"mRNA"は、DNAから転写され、次いで、イントロンとして知られている非コード部分を除去するために処理された核酸分子である。得られたmRNAは、核(またはDNAが存在する別の遺伝子座)から排出され、タンパク質に翻訳される。用語"プレmRNA"は、非コード部分を除去するために処理する前の鎖を指すことができる。
【０１５３】
本明細書で使用されるように、用語"変異"は、当該タンパク質の共通配列に対してタンパク質をコードする核酸配列に対する改変を指すことができる。"ミスセンス"変異は、あるコドンの別のコドンからの置換をもたらす。"ナンセンス"変異は、コドンを特定のアミノ酸をコードするものから終止コドンに変更させる。ナンセンス変異は、しばしば、タンパク質の切断された翻訳をもたらす。"サイレント変異"は、得られた蛋白質に影響を及ぼさないものである。本明細書で使用されるように、用語"点変異"は、遺伝子配列中の1つのヌクレオチドのみに影響を及ぼす変異を指すことができる。"スプライス部位変異"は、イントロンを除去するための処理の前に）プレmRNAに存在する変異であり、誤訳としばしばスプライス部位の不正確な描写からのタンパク質の短縮化とをもたらす。変異は、単一のヌクレオチド変動(SNV)を含むことができる。変異は、配列変異体、配列変動、配列改変、または対立遺伝子変異体を含むことができる。参照DNA配列は、参照データベースから得ることができる。変異は、機能に影響を及ぼすことができる。変異は、機能に影響を与えないことがある。変異は、1つまたは複数のヌクレオチド中のDNAレベルで、1つまたは複数のヌクレオチド中のリボ核酸(RNA)レベルで、1つまたは複数のアミノ酸中のタンパク質レベルで、またはそれらの任意の組み合わせにおいて起きることができる。参照配列は、NCBI参照配列データベース(RefSeq)データベースのようなデータベースから得ることができる。変異を構成できる特定の変化は、置換、欠失、挿入、反転、または1以上のヌクレオチドまたは1つ以上のアミノ酸における変換を含むことができる。変異は、点変異であってもよい。変異は、融合遺伝子であってもよい。融合対または融合遺伝子は、転位置、間質欠失、染色体反転またはそれらの任意の組み合わせのような変異に由来することができる。変異は、3倍、4倍等の反復配列の数の可変性を構成することができる。例えば、変異は、所与の配列に関連するコピー数の増加または減少(即ち、コピー数変動、またはCNV)であってもよい。変異は、異なる対立遺伝子における2つ以上の配列変化、または1つの対立遺伝子における2つ以上の配列変化を含むことができる。変異は、モザイクのような1つの対立遺伝子の1つの位置に2つの異なるヌクレオチドを含むことができる。変異は、キメラのような1つの対立遺伝子の1つの位置における2つの異なるヌクレオチドを含むことができる。変異は、悪性組織に存在することができる。変異の存在または不存在は、疾患または状態を発症するリスクの増加を示すことができる。変異の存在または非存在は、疾患または状態の存在を示すことができる。変異は、良性組織に存在することができる。変異の不存在は、組織または試料が良性であることを示すことができる。代替として、変異の不存在は、組織または試料が良性であることを示さないことがある。本明細書に記載される方法は、試料における変異の存在を同定することを含むことができる。
【０１５４】
用語"非基準アミノ酸"は、典型的には、基準アミノ酸から化学合成または改変によって生成される(例えば、アミノ酸類似体)、この群に属さない合成または改変されたアミノ酸を指すことができる。本開示は、本明細書に開示される方法及びベクターのいくつかにおいて、タンパク質原性の非基準アミノ酸を採用する。非基準アミノ酸の例は、これに限定されないが、ピロリジン(PylまたはO)であり、その化学構造は以下に示す：
2021536244.tif 000012
【０１５５】
イノシン(I)は、非基準アミノ酸の別の例である。これは、tRNAにあり、"ゆらぎ塩基対形成"による適切な翻訳に必須である。イノシンの構造は上記に示されている。
【０１５６】
本明細書中で使用されるように、用語"オルニチントランスカルバミラーゼ"または"OTC"は、その名称に対応し、遺伝子Otcによってコードされるタンパク質を指すことができる。その例は、UniProtの参照番号： P00480(ヒトについて)及びPl1725(マウスについて)で見出される。OTC欠乏は、血液に高濃度のアンモニアをもたらすX関連の遺伝的状態である。いくつかの場合において、OTC欠乏は、プレmRNAのミススプライシングをもたらすエクソン4のドナースプライス部位におけるG->Aスプライス部位変異によって引き起こされる。該変異は、伸長され、または点変異を有するタンパク質の形成をもたらす。OTCタンパク質レベルでの15〜20倍の減少がある。例えば、Hodges,P.E.とRosenberg,L.E.を参考された。spfashマウス：オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子のミスセンス変異も異常なmRNAスプライシングを引き起こす。Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 4142-4146(1989)(産生されたOTCの代替形態を示す)。これらの配列は以下に示す。
2021536244.tif 000013
【０１５７】
上記のように、変異が存在する場合には、正確なスプライス変異体を産生することができるが、そのような産生はミスセンス変異を生じ、OTC欠乏にも寄与することができる。
【０１５８】
用語"タンパク質"、"ペプチド"及び"ポリペプチド"は、交換可能に使用され、それらの最も広い意味では、2つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物の化合物を指す。該サブユニットは、ペプチド結合によって連結することができる。別の実施形態では、該サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結することができる。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含むことができ、タンパク質またはペプチドの配列を含められるアミノ酸の最大数には限界がない。本明細書中で使用されるように、用語"アミノ酸"は、グリシン及びD及びL光学異性体を含む天然及び/または非天然または合成アミノ酸、アミノ酸類似体、ならびにペプチド模倣物のいずれかを指すことができる。本明細書で使用されるように、用語"融合タンパク質"は、1以上の天然に存在するまたは組換え的に産生されたタンパク質からのドメインから構成されるタンパク質を指すことができ、ここで、一般に、各ドメインは、異なる機能を果たす。この点に関して、用語"リンカー"は、これらのドメインを一緒に連結し、融合タンパク質ドメインの立体構造を保存し、及び/またはそれらのそれぞれの機能を妥協する融合タンパク質ドメイン間の好ましくない相互作用を防止するために使用されるタンパク質断片を指すことができる。
【０１５９】
用語"ポリヌクレオチド"及び"オリゴヌクレオチド"は、互換的に使用され、いずれかの長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、任意の既知または未知の機能を実行することができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ)、エキソン、イントロン、伝達RNA(mRNA)、転写RNA、リボソームRNA、RNAi、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたRNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体のような改変されたヌクレオチドを含むことができる。存在する場合には、ポリヌクレオチドの組み立ての前または後に、ヌクレオチド構造への改変を付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって妨害されることができる。さらに、例えば標識成分との結合により、重合後にポリヌクレオチドをさらに改変することができる。該用語は、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指すこともできる。特に明記または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが知られているかまたは予測される2つの相補的な一本鎖形態のいずれかの両方を包含する。
【０１６０】
ポリヌクレオチドは、4つのヌクレオチド塩基の特定の配列からなる：アデニン(A)；シトシン(C)；グアニン(G)；チミン(T)；及びポリヌクレオチドがRNAであるときのチミンのウラシル(U)。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、1つ以上の他のヌクレオチド塩基を含むことができる。例えば、イノシン(I)。これは、ヒポキサンチンがβ-N9-グリコシド結合を介してリボフラノースに結合したときに形成されたヌクレオシドである。その結果、以下の化学構造が得られる：
2021536244.tif 000014
【０１６１】
イノシンは、翻訳機によりグアニン(G)として読み取られる。
【０１６２】
用語"ポリヌクレオチド配列"は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。該アルファベット表現は、中央処理ユニットを有するコンピュータ内のデータベースに入力でき、機能的ゲノミック及び相同性検索のような生体情報学的用途に使用できる。
【０１６３】
本明細書で使用されるように、用語"精製マーカー"は、精製または同定に有用な少なくとも1つのマーカーを指すことができる。該マーカーの非網羅的リストには、His、lacZ、GST、マルトース結合タンパク質、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、チェリー、チオレドキシン、ポリ(NANP)、V5、Snap、HA、キチン結合タンパク質、ソフタグ1、ソフタグ3、Strep、またはS-タンパク質が含まれる。適切な直接的または間接的な蛍光マーカーには、FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、チェリー、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、DNP、AMCA、ビオチン、ジゴキシゲニン、Tamra、テキサスレッド、ローダミン、Alexa fluors、FITC、TRITC、または任意の他の蛍光染料またはハプテンが含まれる。
【０１６４】
本明細書で使用されるように、用語"組換え発現システム"は、遺伝的な構築物または組換えにより形成されたある種の遺伝物質の発現のための構築物を指す。これに関する用語"構築物"は、本明細書で定義される用語"ベクター"と交換可能である。
【０１６５】
本明細書で使用するように、用語"組換えタンパク質"は、組換えDNA技術によって産生されたポリペプチドを指すことができる。ここで、一般に、ポリペプチドをコードするDNAは、適切な発現ベクターに挿入され、その後、異種タンパク質を産生するために宿主細胞の形質転換に用いられる。
【０１６６】
本明細書で使用されるように、タンパク質の発現に関連する"修復"という用語は、変異によって前にタンパク質の発現が切断された完全長タンパク質の発現を確立する能力を指すことができる。"活性を修復する"との文脈において、該用語は、変異が異常な発現(例えば、低すぎ、または高すぎる)を生じた変異が正常な非変異レベルにタンパク質の発現を影響することを包含する。
【０１６７】
本明細書で使用されるように、用語"試料"は、一般に、被験者の任意の試料(例えば、血液試料または組織試料)を指す。試料またはその一部は、幹細胞を含むことができる。試料またはその一部は、幹細胞のために濃縮されてもよい。幹細胞は、試料から単離されてもよい。試料は、組織、細胞、血清、血漿、エクソソーム、体液、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。体液は、尿、血液、血清、血漿、唾液、粘液、脊髄液、涙液、精液、胆汁、羊水、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。試料またはその一部は、被験者から得られた細胞外液を含むことができる。試料またはその一部は、無細胞核酸、DNAまたはRNAを含むことができる。試料またはその一部は、1つ以上の変異が存在するかまたはしないかについて分析されてもよい。試料またはその一部からゲノムデータを得ることができる。試料は、疾患または状態を有すると疑うまたは確認するための試料であってもよい。試料は、非侵襲的な技術、最小限に侵襲的な技術、または侵襲的な技術で被験者から除去された試料であってもよい。試料またはその一部は、組織ブラッシング、スワブ、組織生検、組織切除、微細針吸引、組織洗浄、細胞学的標本、外科的切除、またはそれらの任意の組み合わせによって得ることができる。試料またはその一部は、組織型からの組織または細胞を含むことができる。例えば、試料は、鼻組織、気管組織、肺組織、咽頭組織、喉頭組織、気管支組織、胸膜組織、肺胞組織、乳房組織、膀胱組織、腎臓組織、肝臓組織、結腸組織、甲状腺組織、子宮頸部組織、前立腺組織、心臓組織、筋肉組織、膵臓組織、肛門組織、胆管組織、骨組織、脳組織、脊髄組織、子宮組織、卵巣組織、子宮内膜組織、膣組織、外陰部組織、子宮組織、胃組織、眼組織、洞組織、陰茎組織、唾液腺組織、腸組織、胆嚢組織、胃腸組織、膀胱組織、脳組織、脊髄組織、血液試料、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１６８】
本明細書で使用されるように、用語"配列決定"は、重亜硫酸塩を含まない配列決定、重亜硫酸塩配列決定、TET補助重亜硫酸塩(TAB)配列決定、ACE-配列決定、高処理配列決定、Maxam-Gilbert配列決定、超類似特性配列決定、Polony配列決定、454パイロシークエンシング、サンガー配列決定、照射配列決定、SOLiD配列決定、イオントレント半導体配列決定、DNAナノボール配列決定、単一分子配列決定、単一分子リアルタイム(SMRT)配列決定、ナノポア配列決定、ショットガン配列決定、RNA配列決定、Enigma配列決定、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０１６９】
用語"終止コドン"は、翻訳の終了を信号で知らせる伝達RNA内の3つのヌクレオチド連続配列を意図する。非限定的な例としては、RNA、UAG、UAA、UGA及びin DNA TAG、TAAまたはTGAが含まれる。特記しない限り、該用語は、早期終止コドンを導入し、結果として生じるタンパク質を異常に短縮させるDNAまたはRNA内のナンセンス変異も含む。種々の終止コドンに対応するtRNAは、特定の名称で知られている：アンバー(UAG)、オーカー(UAA)、及びオパール(UGA)。
【０１７０】
"伝達リボ核酸"または"tRNA"は、mRNAのタンパク質への翻訳を手伝う核酸分子である。tRNAは、3つのヘアピンループを含む独特の折り畳み構造を有する。これらのループの1つは、アンチコドンをコードする"ステム"部分を含む。該アンチコドンは、mRNA上の対応するコドンを認識する。各tRNAには、該mRNAコドンに対応するアミノ酸が"荷電"されている。該"荷電"はtRNA合成酵素によって達成される。アンチコドンに対応するコドンがtRNAで認識されると、tRNAは、それが荷電されているアミノ酸を成長中のアミノ酸鎖に転移してポリペプチドまたはタンパク質を形成する。内因性tRNA合成酵素により内因性tRNAを帯電させることができる。従って、内因性tRNAは典型的には基準アミノ酸で荷電される。外部源から誘導された直交tRNAは、対応する直交tRNA合成酵素を必要とする。このような直交tRNAは、基準及び非基準アミノ酸の両方で荷電され得る。いくつかの実施形態では、tRNAが荷電されるアミノ酸は、in vivoでの検出を可能にするために検出可能に標識され得る。標識技術は、当技術分野で公知であり、限定するものではないが、クリックケミストリーを含む。ここでは、非天然アミノ酸を含むアジド/アルキンが、直交tRNA/合成酵素対によって添加され、従って、発蛍光団または他のそのような分子を含むアルキン/アジドを用いて検出され得る。
【０１７１】
本明細書中で使用されるように、用語"処理する"、"処理"等は、所望の薬理学的及び/または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で用いられる。疾患、障害、または状態またはそれらの徴候または症状を完全にまたは部分的に予防するという点で、該効果は予防的であってもよく、及び/または障害及び／または障害に起因する有害作用を部分的または完全に治癒するという点で、該効果は治療的であってもよい。
【０１７２】
本明細書で使用されるように、用語"ベクター"は、これらに限定されないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、BAC、YAC等を含む異なる宿主間での伝達のために解砕された核酸構築物を指すことができる。"ウイルスベクター"は、in vivo、ex vivoまたはin vitroのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換えによって産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、市販のベクターから調製することができる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、AAV等から当該技術分野で公知の技術に従って製造することができる。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。感染性タバコモザイクウイルス(TMV)ベースのベクターは、タンパク質の製造に使用でき、また、タバコ葉において、Griffithsinを発現することが報告されている(O'Keefeら、(2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104)。遺伝子治療及び免疫療法での使用のため、Semliki Forestウイルスベースのベクター及びSindbisウイルスベースのベクターのようなアルファウイルスベクターも開発されている。SchlesingerとDubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439及びYingら、(1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照されたい。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様において、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその一部を含むポリヌクレオチド、及び目的の遺伝子を指すことができる。遺伝子導入に使用するためのベクターの最新方法に関するさらなる詳細は、例えば、遺伝子治療のためのKottermanら (2015) 遺伝子療法用のウイルスベクター：医用生体工学の翻訳及び臨床展望年次レビュー17に見出すことができる。プロモーター及びポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るクローニング部位の両方を含むベクターは、当該技術分野において周知である。このようなベクターは、in vitroまたはin vivoでRNAを転写することができ、Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.)及びPromega Biotech (Madison, Wis.)のような供給源から市販されている。1つの態様では、該プロモーターは、pol IIIプロモーターである。
【０１７３】
adRNAを投与するための医薬組成物は、投薬単位形態で便利に提示でき、また、医薬分野で周知されるいずれかの方法で調製できる。該医薬組成物は、例えば、本明細書中に提供される化合物を液体担体、微細に分割された固体担体またはその両方と混合させ、必要に応じて所望の剤形に賦形することで調製できる。該医薬組成物において、本明細書に提供される化合物は、所望の治療効果を得るのに十分な量で含まれる。例えば、前記技術の医薬組成物は、例えば、局所、眼、口腔、頬、全身、鼻、注射、点滴、経皮、直腸、及び膣、または吸入あるいはガス注入による投与に適した形態を含む、実質的にあらゆる形態の投与に適した型をとることができる。
【０１７４】
局所投与のために、当該化合物は、当該技術分野で周知のように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液等として製剤化することができる。
【０１７５】
全身投与用の製剤は、注射(例えば、皮下、静脈内、点滴、筋肉内、くも膜下、または腹腔内注射)による投与に設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、経口、または肺投与用に設計されたものを含む。
【０１７６】
有用な注射可能な製剤には、水性または油性媒体中に提供される化合物の無菌懸濁液、溶液、またはエマルジョンが含まれる。該組成物はまた、懸濁剤、安定剤及び/または分散剤のような配合剤を含有することができる。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプル、または複数回投与用の容器で提示できる。また、添加された防腐剤を含有してもよい。
【０１７７】
代替的に、注射可能な製剤は、使用前に適切な媒体で再構成するための粉末形態で提供することができる。該溶媒として、滅菌パイロジェン不含有水、緩衝液、及びデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。該目的のために、本明細書に提供される化合物を、凍結乾燥等の任意の公知される技術で乾燥させ、使用前に再構成してもよい。
【０１７８】
経粘膜投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。このような浸透剤は、当該技術分野において知られている。
【０１７９】
経口投与のために、該医薬組成物は、結合剤(例えば、プレゼラチン化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸カルシウム)；潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモ澱粉または澱粉グリコール酸ナトリウム)；または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム) のような製薬上許容される賦形剤と共に、汎用の手段で調製されたロゼンジ、錠剤、またはカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当該技術分野で周知の方法でコーティングすることができる。例えば、糖衣、フィルム、または腸溶性コーティング。
【０１８０】
経口使用のための組成物は、当該技術分野で公知される任意の薬学的組成物の製造方法で調製できる。上品で口当たりの良い製剤を提供するため、そのような組成物は、甘味剤、香味剤、着色剤、及び保存剤からなる群から選択される1種以上の薬剤を含むことができる。錠剤は、本明細書中に提供される化合物を、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合して含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤；顆粒化剤及び崩壊剤(例えば、コーンスターチまたはアルギン酸)；結合剤(例えば、澱粉、ゼラチン、またはアカシア)；及び潤滑剤 (例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク)であってもよい。該錠剤は、コーティングされていないままにすることができ、または、既知の技術によってコーティングし、消化管における崩壊及び吸収を遅延させ、それによってより長い期間にわたって持続作用を提供することができる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料を用いることができる。それらは、当業者に周知の技術によってコーティングすることもできる。本技術の医薬組成物は、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。
【０１８１】
経口投与用の液体製剤は、例えば、エリキシル剤、溶液、シロップ剤、または懸濁液の形態をとることができ、または使用前に水または他の適切な媒体で構成するための乾燥した製品として提示することができる。このような液体製剤は、例えば、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪)；乳化剤(例えば、レシチン、またはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、cremophoreTM、または分画された植物油)；及び保存剤(例えば、メチルまたはプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸) 等の薬学的に許容される添加剤を用いて、汎用の手段で調製することできる。該製剤は、適時に緩衝塩、防腐剤、香味剤、着色剤、及び甘味剤を含有してもよい。
【０１８２】
"投与"は、1回の投与量で、治療の過程を通して連続的にまたは断続的に投与することができる。最も有効な投与手段及び用量を決める方法は、当業者に公知であり、治療に用いる組成物、治療目的、治療される標的細胞、及び治療を受ける被験者によって変化し得る。単回または反復投与は、主治医が選択した用量レベルとパターンで実施できる。投与する薬剤の適切な投与製剤及び投与方法は、当該技術分野で公知である。投与経路も決定することができる。また、最も有効な投与経路を決め方法は、当業者には公知であり、治療用の組成物、治療目的、治療を受ける被験者の健康状態または疾患段階、及び標的細胞または組織によって変化し得る。投与経路の非限定的な例には、経口投与、経鼻投与、注射、及び局所投与が含まれる。
【０１８３】
投与は、生物学的作用の所望の部位(例えば、DNA構築物、ウイルスベクター等)への化合物または組成物の送達を可能にするために使用できる方法を指すことができる。これらの方法は、皮膚等の表面の外面における局所投与(例えば、ローション、クリーム、軟膏等)を含むことができる。これらの方法は、非経口投与(静脈内、皮下、髄腔内、腹腔内、筋肉内、血管内または点滴を含む)、経口投与、吸入投与、管内投与、直腸投与を含むことができる。いくつかの例では、被験者は、監視なしに組成物を投与してもよい。いくつかの例では、被験者は医療専門家 (例えば、医師、看護師、医師の助手、ホスピス従事者等) の監督下で組成物を投与してもよい。いくつかの場合において、医療専門家は、組成物を投与してもよい。いくつかの場合において、美容専門家は、組成物を投与してもよい。
【０１８４】
本明細書に開示される組成物の投与または適用は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100日の治療期間で連続または非連続に実施することができる。いくつかの場合において、治療期間は、約1〜約30日、約2〜約30日、約3〜約30日である、約4〜約30日、約5〜約30日、約6〜約30日、約7〜約30日、約8〜約30日、約9〜約30日、約10〜約30日、約11〜約30日、約12〜約30日、約13〜約30日、約14〜約30日、約15〜約30日、約16〜約30日、約17〜約30日、約18〜約30日、約19〜約30日、約20〜約30日、約21〜約30日、約22〜約30日、約23〜約30日、約24〜約30日、約25〜約30日、約26〜約30日、約27〜約30日、約28〜約30日、または約29〜約30日であってもよい。
【０１８５】
本明細書に開示される組成物の投与または適用は、日に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24回実施することができる。いくつかの場合において、本明細書に開示される組成物の投与または適用は、週に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21回実施することができる。いくつかの場合において、本明細書に開示される組成物の投与または適用は、月に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、または90回実施することができる。
【０１８６】
いくつかの場合において、組成物を単回用量または分割用量として投与/適用してもよい。いくつかの場合において、本明細書に記載の組成物を第1時点及び第2時点で投与してもよい。いくつかの場合において、組成物を最初の投与が他の投与の前に、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、16時間、20時間、1日、2日、4日、7日、2週間、4週間、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年間、またはそれ以上の投与時間差で投与してもよい。
【０１８７】
"有効量"という用語は、所望の効果を達成するのに十分な量を指すことができる。治療または予防的な適用の文脈において、有効量は、使用時における状態の種類及び重症度、並びに体調全般、年齢、性別、体重、及び医薬組成物に対する耐性のような個々の被験者の特徴に依存する。免疫療法の組成物の文脈において、いくつかの実施形態では、該有効量は、病原体に対する防御応答をもたらすのに十分な量である。他の実施形態では、免疫療法の組成物の有効量は、抗原に対する抗体の生成をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態では、該有効量は、それを必要とする被験者に受動免疫を付与するのに必要な量である。免疫療法の組成物に関して、いくつかの実施形態において、該有効量は、上記の要素に加えて、意図される用途、特定の抗原性化合物の免疫原性の程度、及び被験者の健康状態/免疫系の応答性に依存し得る。当業者は、これら及び他の要素に応じて適切な量を決めることができる。
【０１８８】
in vitroで使用する場合、いくつかの実施形態では、該有効量は、当該用途のサイズ及び性質に依存することができる。それはまた、in vitro標的及び使用方法の性質及び感度にも依存することができる。当業者は、これら及び他の考慮に基づいて有効量を決めることができる。該有効量は、実施形態によって、組成物の1回以上の投与を含むことができる。
【０１８９】
明示的な記載なしに、及び他に意図されない限り、本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に言及する場合、それらの等価物または生物学的に等価物が、本開示の範囲内で意図される。本明細書で使用されるように、用語"その生物学的等価物"は、参照のタンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸を言及する場合に、"その等価物"と同義であることと意図され、依然として所望の構造または機能を維持しながらも、最小の相同性を有するものを意図する。本明細書に具体的に記載されていない限り、本明細書に言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質もまた、それらの等価物を包含することが意図される。例えば、等価物は、少なくとも約70%の相同性または同一性、または少なくとも80%の相同性または同一性、または少なくとも約85%、または少なくとも約90%、または代替的に少なくとも約95%、または代替的に98%の相同性または同一性を意図し、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と実質的に同等の生物学的活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドを言及する場合、その等価物は、厳密な条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその補体にハイブリッド形成するポリヌクレオチドである。
【０１９０】
本開示は、以下に記載する遺伝子及びタンパク質の編集技術に使用するためのポリペプチド及び/またはポリヌクレオチド配列を提供する。理解されるべきこととして、本明細書に提供される配列が、同じ生物学的性質を有するタンパク質を産生する実質的に同一の配列と同様に発現産物を提供するために使用され得ることは、必ずしも明示的には記載されていない。これらの"生物学的に等価な"または"生物学的に活性な"ポリペプチドは、本明細書に記載されるような等価なポリヌクレオチドによってコードされる。初期状態の条件下で実行される配列同一性法を用いて比較すると、それらは、参照ポリペプチドと少なくとも60%、または代替的に少なくとも65%、または代替的に少なくとも70%、または代替的に少なくとも75%、または代替的に少なくとも80%、または代替的に少なくとも85%、または代替的に少なくとも90%、または代替的に少なくとも95%、または代替的には少なくとも98%同一のアミノ酸一次配列を有することができる。特定のポリペプチド配列は、特定の実施形態の例として提供される。アミノ酸配列への改変は、類似の電荷を有するアミノ酸を変化させる。さらに、等価なポリヌクレオチドは、厳密な条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその補体にハイブリット形成するもの、またはポリペプチドに関して、厳密な条件下で参照コード化ポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリット形成するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。あるいは、等価なポリペプチドまたはタンパク質は、等価なポリヌクレオチドから発現されるものである。
【０１９１】
"医薬組成物"は、典型的には、活性剤（例えば、本開示のadRNA）、化合物または組成物、及び天然または非天然の担体、不活性物質(例えば、検出可能な薬剤または標識)または活性物質(例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバント等)の配合を意図し、また、薬学的に許容される担体を含む。また、担体は、医薬添加物及び添加物タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖等の誘導体化糖、及び多糖または糖ポリマー）を単独でまたは組み合わせて含み、これらを単独でまたは組み合わせて1〜99.99重量％または体積％を含む。例示的なタンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン(HSA)、組換えヒトアルブミン(rHA)、ゼラチン、カゼイン等の血清アルブミンを含む。緩衝能にも機能する代表的なアミノ酸/抗体成分としては、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等が含まれる。糖質賦形剤も本技術の範囲内に意図され、その例として、ルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボース等の単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、澱粉等の多糖類；マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）及びミオイノシトール等のアルジトール類が含むが、これらに限定されない。
【０１９２】
本開示に従って使用される、細胞、処置、治療、薬剤、薬物、及び医薬製剤を含む組成物は、投与の容易さ及び投薬の均一性のための投薬量単位の形態で包装されてもよい。用語"単位用量"または"投薬量"は、被験者での使用に適した物理的に別個のユニットを指すことができる。各ユニットは、該投与（例えば、適切な経路及びレジメン）に関連して所望の応答を生じるために計算された所定量の組成物を含む、投与される量は、治療の回数及び単位用量に応じて、所望の結果及び/または保護に依存する。組成物の正確な量はまた、医師の判断にも依存し、各個人に特有なものである。用量に影響を及ぼす要素には、被験者の物理的及び臨床的状態、投与経路、意図された治療目標（症状の軽減対治癒）、及び特定の組成物の効力、安定性、及び毒性が含まれる。薬剤処方の際に、溶液を、該投与製剤と適合する様式で、そして治療的または予防的に有効な量で投与してもよい。製剤は、本明細書に記載される注射可能な溶液タイプのような様々な投薬形態で容易に投与される。
【０１９３】
本明細書中で使用されるように、用語"発現及び/または機能を低減または排除する"は、mRNAへの前記ポリヌクレオチドの転写を低減または排除すること、または前記mRNAのペプチドへの翻訳を低減または排除すること、または前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の機能を低減または排除することを指すことができる。非限定的な例では、ポリヌクレオチドのmRNAへの転写は、野生型細胞において見出されるその正常レベルの少なくとも半分に低減される。
【０１９４】
語句"第1選択"、または"第2選択"、または"第3選択"は、患者が受ける治療の順序を指すことができる。第1選択療法レジメンは、最初に与える治療である。一方、第2または第3選択療法は、それぞれ第1選択療法または第2選択療法の後に与えられる。国立癌研究所は、第1選択療法を、"疾患または状態のための最初の治療"と定義する。癌患者において、1次治療は、手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの治療の組み合わせであってもよい。第1選択療法は、当業者には、"1次療法及び1次治療"としても呼ばれる。国立癌研究所のウェブサイトcancer.gov.を参照されたい（2017年11月15日付)を参照されたい。典型的には、患者が、第1選択療法に対する陽性の臨床的または副臨床的な応答を示せず、または第1選択療法が中止したため、該患者は、その後の化学療法レジメンを与えられる。
【０１９５】
用語"接触"は、2つ以上の実体間の直接的または間接的な結合または相互作用を意味する。直接な相互作用の特定の例は、結合である。間接的な相互作用の特定の例は、1つの実体が中間分子に作用し、それが次に第2の参照実体に作用する場合である。本明細書で使用されるように、接触は、溶液中、固相中、in vitro、ex vivo、in vivo、細胞中、及びin vivoでの接触を含む。in vivoでの接触は、投与することまたは投与と呼ばれることができる。
【０１９６】
"凍結保護剤"は、当該技術分野において公知であり、限定するものではないが、例えば、スクロース、トレハロース、及びグリセロールを含む。生物系において低い毒性を示す凍結保護剤が一般に使用される。
【０１９７】
本明細書では、ADAR酵素の過剰発現の非存在下での部位特異的なRNA編集のためのadRNAが開示される。さらに、本明細書には、DNAのA->G遺伝子操作編集が提供される。また、本明細書には、RNA及びDNAの部位特異的なC->T編集を可能にするADAR2変異体のスクリーニングが提供される。さらに、本明細書には、ACFと共に発現されたAPOBECの使用を介したRNAのC->T遺伝子操作編集が提供される。
【０１９８】
他のADAR2システムと比較して、本開示は、治療的RNA編集を触媒するための内因性ADARの新規なリクルート方法を提示するため、独特である。また、先行技術のシステムは、C>T遺伝子操作編集のためにADAR酵素を使用するための手段を提供していない。最後に、それらは、プログラム可能な部位特異的RNA編集のためのAPOBECの使用を開示していない。
【０１９９】
本明細書で開示される例示的なadRNAは、標的RNAに相補的なRNA標的化ドメイン、及び1つ以上のADARをリクルートするドメインを含む。その標的に結合すると、adRNAは、ADAR酵素を標的RNAにリクルートすることができる。次いで、該ADAR酵素は、標的アデノシンのイノシンへの変換を触媒することができる。理論に束縛されないが、adRNAを同様に使用して、ADAR2変異体またはAPOBEC1のうちの1つをリクルートし、C->T RNA編集に影響を及ぼすことができると考えられる。
【０２００】
また、本明細書に開示されているように、in vitro及びin vivo両方での実験は、内因性ADAR酵素をリクルートするために、遺伝子操作されたadRNAを使用して実施されてきた。また、ADAR変異体、及びAPOBEC1/ACF構築物のC->T編集の効率を示す実験も開示されている。
【０２０１】
本明細書に記載されるように、ウイルスベクターは、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメインをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの場合において、核酸配列は、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のような2つ以上のRNA編集実体をリクルートするドメインをコードすることができる。RNA編集実体をリクルートするドメインは、Aluドメイン、アポリポプロテインB mRNA編集触媒ポリペプチド様(APOBEC)をリクルートするドメイン、Cas13ドメイン、GluR2ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つと少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。該リクルートドメインは、1つ以上のGluR2ドメイン、1つ以上のAluドメイン、1つ以上のAPOBECドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。該リクルートドメインは、2つ以上のGluR2ドメイン、2つ以上のAluドメイン、2つ以上のAPOBECドメイン、Casl3ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。該リクルートドメインは、Aluドメインを含まなくてもよい。該リクルートドメインは、GluR2ドメインを含まなくてもよい。該リクルートドメインは、APOBECドメインを含まなくてもよい。該リクルートドメインは、Cas13ドメインを含まなくてもよい。
【０２０２】
APOBECをリクルートするドメインは、APOBEC1をリクルートするドメイン、APOBEC2をリクルートするドメイン、APOBEC3Aをリクルートするドメイン、APOBEC3Bをリクルートするドメイン、APOBEC3Cをリクルートするドメイン、APOBEC3Dをリクルートするドメイン、APOBEC3Eをリクルートするドメイン、APOBEC3Fをリクルートするドメイン、APOBEC3Gをリクルートするドメイン、APOBEC3Hをリクルートするドメイン、APOBEC4をリクルートするドメイン、それらのいずれかの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０２０３】
リクルートドメインは、本明細書に記載のAluドメインのうちの任意の1つと少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該リクルートドメインは、本明細書に記載のAluドメインのうちの任意の1つと少なくとも約85%、90%、95%、97%、98%、または99%の配列同一性を含むことができる。
【０２０４】
リクルートドメインは、本明細書に記載のAPOBECドメインのうちの任意の1つと少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該リクルートドメインは、本明細書に記載のAPOBECドメインのうちの任意の1つと少なくとも約85%、90%、95%、97%、98%、または99%の配列同一性を含むことができる。
【０２０５】
リクルートドメインは、本明細書に記載のGluR2ドメインのうちの任意の1つと少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該リクルートドメインは、本明細書に記載のGluR2ドメインのうちの任意の1つと少なくとも約85%、90%、95%、97%、98%、または99%の配列同一性を含むことができる。
【０２０６】
リクルートドメインは、本明細書に記載のCas13ドメインのうちの任意の1つと少なくとも約80%の配列同一性を含むことができる。いくつかの場合において、該リクルートドメインは、本明細書に記載のCas13ドメインのうちの任意の1つと少なくとも約85%、90%、95%、97%、98%、または99%の配列同一性を含むことができる。
【０２０７】
核酸配列は、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つのRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。核酸配列は、少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。ここで、その1つはAluドメインである。核酸配列は、少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。ここで、その1つはAPOBECドメインである。核酸配列は、少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。ここで、その1つはGluR2ドメインである。核酸配列は、少なくとも2つのRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。ここで、その1つはCas13ドメインである。
【０２０８】
リクルートドメインは、1つ以上のステムループ構造を含むことができる。リクルートドメインは、少なくとも2つのステムループ構造を含むことができる。リクルートドメインは、少なくとも3つのステムループ構造を含むことができる。リクルートドメインは、ステムループ構造を含まなくてもよい。少なくとも1つのステムループ構造を含むリクルートドメインは、Aluドメイン、APOBECドメイン、GluR2ドメイン、Cas13ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０２０９】
リクルートドメインの少なくとも一部は、一本鎖であってもよい。いくつかの場合において、Aluドメインは、少なくとも部分的に一本鎖であってもよい。いくつかの場合において、APOBECドメインは、少なくとも部分的に一本鎖であってもよい。いくつかの場合において、GluR2ドメインは、少なくとも部分的に一本鎖であってもよい。いくつかの場合において、Cas13ドメインは、少なくとも部分的に一本鎖であってもよい。
【０２１０】
リクルートドメインは、複数の反復を含むことができる。リクルートドメインは、複数のAlu反復を含むことができる。
【０２１１】
いくつかの場合において、ウイルスベクターは、1つ以上のRNA編集をリクルートするドメインを含むことができる。いくつかの場合において、ウイルスベクターは、2つ以上のRNA編集をリクルートするドメインを含むことができる。いくつかの場合において、ウイルスベクターは、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のRNA編集をリクルートするドメインを含むことができる。核酸配列は、1つ以上のRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。核酸配列は、2つ以上のRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。核酸配列は、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のRNA編集をリクルートするドメインをコードすることができる。核酸配列は、少なくとも1つのAluドメイン及び1つのGluR2ドメインをコードすることができる。核酸配列は、少なくとも1つのAluドメイン及び1つのCas13ドメインをコードすることができる。核酸配列は、少なくとも1つのAluドメイン及び1つのAPOBECドメインをコードすることができる。核酸配列は、少なくとも1つのGluR2ドメイン及び1つのAPOBECドメインをコードすることができる。核酸配列は、少なくとも1つのGluR2ドメイン及び1つのCas13ドメインをコードすることができる。核酸配列は、少なくとも1つのCas13ドメイン及び1つのAPOBECドメインをコードすることができる。
【０２１２】
核酸配列は、標的RNAの少なくとも一部と相補的であってもよい標的RNAをコードすることができる。これは、その標的RNAの少なくとも一部に相補的であってもよい。該相補的であってもよい部分の長さは、約50塩基対(bp)〜約200 bpであってもよい。該相補的であってもよい部分の長さは、約20 bp〜約100 bpであってもよい。該相補的であってもよい部分の長さは、約10 bp〜約50 bpであってもよい。該相補的であってもよい部分の長さは、約50 bp〜約300 bpであってもよい。該相補的である部分の長さを改変することにより、編集の効率を高めることができる。いくつかの場合において、該部分長さがより長い場合は、より短い長さと比べて、編集の効率を高めることができる。
【０２１３】
核酸配列は、少なくとも1つのRNA編集実体をリクルートするドメイン及び標的RNAと少なくとも部分的に相補であり、長さ少なくとも約200 bpの隣接する核酸配列を含むRNAをコードする核酸配列をコードすることができる。該隣接する核酸配列は、約100 bp〜約300 bpの長さを含むことができる。該隣接する核酸配列は、約150 bp〜約400 bpの長さを含むことができる。該隣接する核酸配列は、約200 bp〜約500 bpの長さを含むことができる。該隣接する核酸配列は、約50 bp〜約300 bpの長さを含むことができる。該隣接する核酸配列の長さを改変することにより、編集の効率を高めることができる。いくつかの場合において、隣接する配列の長さがより長い場合は、長さがより短い場合と比べて、編集の効率を高めることができる。
【０２１４】
核酸は、標的化ドメインとリクルートドメインとの間に位置するリンカー配列のようなリンカー配列を含むことができる。いくつかの場合において、核酸は、5'-X-(Y-X')n-L-Z-3'のような配列を含むことができ、ここで、Xは、特定の位置の下流の標的RNA配列に相補的であり、X'は、特定の位置の上流の標的RNA配列に相補的であり、Yは、標的RNA配列に対して相補的でなくてもよい1つ以上のヌクレオチドを含み、nは1〜10の整数であり、Lは、任意の数(ゼロを含む)のヌクレオチドを含むリンカー配列であってもよく、Zは、RNA編集実体によって認識されかつ結合する配列であってもよい。Lは、(オリゴ)ペプチド結合やPEG結合のような異なる化学結合からなることもできる。
【０２１５】
核酸は、20個〜数百個のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの場合において、より長い標的化部分は、編集されるRNA配列の標的部位に対してより高い特異性、より少ない意図しない(オフターゲット)結合によるオフターゲット効果、また、標的部分自体内におけるステム-ループ構造、十字型、トウホールド構造等の二次構造を形成するためのより多くの空間、ミスマッチまたはウォブル-塩基(編集される部位における、またはその近辺において、標的RNA配列中の1つまたはそれ以上の相補的塩基とのミスマッチによる)を提供する。いくつかの場合において、標的部分は、編集されるヌクレオチドとは反対のミスマッチ、及び任意に1つまたは2つのウォブル塩基を除いて、標的部分の全長にわたって標的RNA配列と相補的であってもよい。
【０２１６】
核酸は、種々の化学的方法及び修飾を用いて改変することができる。いくつかの場合において、ヌクレオチド間の規則的なヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合のモノ-またはジ-チオ化によって改変されて、それぞれホスホロチオエートエステルまたはホスホロジチオエートエステルを生成することができる。ヌクレオシド間結合の他の改変は、アミド化またはペプチドリンカーを含むことができる。リボース糖は、2'-O部分を低級アルキル(Cl-4、例えば2'-O-Me)、アルケニル(C2-4)、アルキニル(C2-4)、メトキシエチル(2'-MOE)、または他の置換基で置換することにより改変できる。いくつかの場合において、置換基2'OH基は、メチル、メトキシエチル、または3、3'-ジメチルアリル基を含むことができる。いくつかの場合において、リボース環内において、2'〜4'分子内架橋（例えば、2'酸素と4'炭素との間のメチレン架橋)結合を含むロックされた核酸配列(LNA)を使用することができる。例えば、複素環のアミノ化または脱アミノ化によって、プリン核塩基及び/またはピリミジン核塩基を改変し、それらの特性を変化させることができる。
【０２１７】
ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクターであってもよい。AAVは、組換えAAVであってもよい。AAVは、AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、それらのいずれかの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。AAVは、AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、それらのいずれかの誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。ウイルスベクターは、改変されたウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、タンパク質を含むように改変されてもよい。いくつかの場合において、ウイルスベクターは、改変されたVP1タンパク質を含むことができる。
【０２１８】
RNA編集実体をリクルートするドメイン、標的化ドメイン、またはそれらの組み合わせをコードする核酸配列は、実質的に十字型であってもよい構造(例えば、二次構造)を含むことができる。核酸配列は、実質的に十字型であってもよい少なくとも2つの構造を含むことができる。リクルートドメインは、実質的に十字型であってもよい構造を含むことができる。リクルートドメインは、実質的に十字型であってもよい少なくとも2つの構造を含むことができる。ADARのリクルートまたは結合を増強するために、核酸配列の二次構造(例えば、リクルートドメインをコードする部分)を改変することができる。ADARのリクルートまたは結合を増強するための構造の改変は、十字型構造の形成を含むことができる。
【０２１９】
RNA編集実体をリクルートするドメインは、実質的に十字型であってもよい少なくとも2つの構造の間に配置され得る。標的化ドメインは、実質的に十字型であってもよい少なくとも2つの構造の間に配置され得る。RNA編集実体をリクルートするドメインは、実質的に十字型であってもよい少なくとも1つの構造によって隣接して配置され得る。標的化ドメインは、実質的に十字型であってもよい少なくとも1つの構造によって隣接して配置され得る。
【０２２０】
十字型構造は、十字構造の少なくとも部分的に相補的な鎖の少なくとも1つの対に隣接するステムループを含むことができる。十字型構造は、実質的に十字型であってもよい。十字型構造体は、実質的に1つの十字型、例えば、4本のステムループのうちの3本、または4本のステムループのうちの2本を含むことができる。十字型を形成できる1つまたは複数のステムループは、異なる長さを含むことができる。十字型を形成できる1つまたは複数のステムループは、同じ長さを含むことができる。十字型を形成できる1つまたは複数のステムループは、1つ以上のミスマッチバルジを含むことができる。
【０２２１】
RNA編集実体をリクルートするドメインは、実質的にトウホールドであってもよい構造を含むことができる。RNA編集実体は、1つ以上のミスマッチバルジバルジを含むことができる。RNA編集実体は、ミスマッチバルジを含まなくてもよい。RNA編集実体をリクルートするドメインは、実質的にトウホールドの構造、実質的に十字型の構造、実質的に直鎖状の構造、ステムループの構造、二重ステムループの構造、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２２２】
ウイルスベクターは、二次元形状を有するRNAをコードする核酸配列を含むことができる。該二次元形状は、異なる二次元形状のRNAに、ADARの優れたリクルートまたは結合を伝達することができる。RNAをコードする核酸配列の配列は、該RNAがADARの優れたリクルートまたは結合を伝達する二次元形状を含むように改変することができる。該二次元形状は、実質的に十字型、トウホールド、ステムループ、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。該二次元形状は、実質的に十字型を含むことができる。該二次元形状は、トウホールドを含むことができる。該二次元形状は、ステムループを含むことができる。該二次元形状は、直鎖状であってもよい。
【０２２３】
核酸配列によってコードされるRNAは、第1ドメイン及び第2ドメインを含むことができる。第1ドメインは、十字型を含むことができ、第2ドメインは、直鎖形構造を含むことができる。該第1及び第2ドメインは、直接または間接的に接続されてもよい。該第1ドメインは、リクルートドメインであってもよく、第2ドメインは、標的化ドメインであってもよい。RNAは、第3ドメインを含むことができる。該第3ドメインは、直接的または間接的に前記第1または第2ドメインに接続されてもよい。該第3ドメインは、リクルートドメインであってもよい。該第3ドメインは、十字型構造を含むことができる。
【０２２４】
核酸配列によりコードされるRNAは、非天然のRNAであってもよい。核酸配列によってコードされるRNAは、化学修飾を含む少なくとも1つの塩基または少なくとも1つの糖を含むことができる。RNAは、2つ以上の化学修飾を含むことができる。化学修飾は、in vivoでのRNAの生物活性半減期を有する、RNAの安定性を増加させることができる。
【０２２５】
核酸は、1つ以上のリクルートドメイン及び1つ以上のアンチセンスドメインを含むことができる。該核酸をRNA編集実体、及びアンチセンスドメインの少なくとも一部に相補的な標的核酸と接触させると、配列法(例えば、サンガー法等)により測定されるように、これは、匹敵する、Cas13bタンパク質またはその活性断片と複合体化された核酸より、少なくとも約2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、または6倍の効率で、該標的核酸の少なくとも1つの塩基対を改変することができる。該効率は、少なくとも約3倍高いであってもよい。該効率は、少なくとも約4倍高いであってもよい。該効率は、少なくとも約5倍高いであってもよい。
【０２２６】
核酸は、1つ以上のリクルートドメイン及び1つ以上のアンチセンスドメインを含むことができる。該核酸をRNA編集実体、及びアンチセンスドメインの少なくとも一部に相補的な標的核酸と接触させると、配列法(例えば、サンガー法等)により測定されるように、これは、匹敵する、GluR2タンパク質またはその活性断片と複合体化された核酸より、少なくとも約2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、または6倍の効率で、該標的核酸の少なくとも1つの塩基対を改変することができる。該効率は、少なくとも約3倍高いであってもよい。該効率は、少なくとも約4倍高いであってもよい。該効率は、少なくとも約5倍高いであってもよい。
【０２２７】
本明細書に記載される核酸は、GluR2ドメインのような天然のリクルートドメインの少なくとも一部よりも高い編集効率を提供することができる。核酸は、改変されたGluR2ドメインのような改変されたリクルートドメインの少なくとも一部よりも高い編集効率を提供することができる。
【０２２８】
標的核酸は、RNAを含むことができる。該RNAは、mRNAであってもよい。該RNAは、タンパク質またはその一部をコードすることができる。タンパク質またはその一部の機能不全は、疾患または状態に関連することがある。本明細書に記載される組成物、ベクター、核酸、非天然のRNAの投与は、疾患または状態の1つ以上の症状を治療し、排除し、治癒し、または軽減することができる。
【０２２９】
疾患または状態は、神経変性疾患、筋肉障害、代謝障害、眼障害、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。該疾患または状態は、嚢胞性線維症、白皮症、α-1-アンチトリプシン欠乏症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β-地中海貧血症、カダシル症候群、Charcot-Marie-歯科疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、遠位脊髄性筋萎縮症(DSMA)、Duchenne/Becker型筋ジストロフィー、異栄養性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、V Leiden関連障害、家族性腺腫、ポリープ症、乳糖血症、ゴーシェ病、グルコース-6-リン酸塩脱水素酵素、血友病、遺伝性ヘマトクロマトーシス、Hunter症候群、ハンチントン病、Hurler症候群、炎症性腸疾患(IBD)、遺伝的な多凝集症候群、Leber先天性黒内障、Lesch-Nyhan症候群、Lynch症候群、Marfan症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーI型及びII型、神経線維腫症、Niemann-Pick病A、B及びC型、NY-esol関連癌、Parkinson病、Peutz-Jeghers症候群、フェニルケトン尿症、Pompe病、一次毛様疾患、プロトロンビン変異関連障害(例えば、プロトロンビンG20210A変異)、肺高血圧症、網膜色素変性症、Sandhoff病、重症複合免疫不全症候群(SCID)、鎌状細胞貧血、脊髄性筋萎縮症、Stargardt病、Tay-Sachs病、Usher症候群、X関連の免疫不全、種々の形態の癌(例えば、BRCA1及び2関連の乳癌及び卵巣癌)を含むことができる。該疾患または状態は、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症、網膜色素変性症、乳癌、卵巣癌、アルツハイマー病、疼痛、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、Charcot-Marie-歯科疾患、Rett症候群、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。組成物の投与は、(a)投与前の遺伝子の発現に対して、遺伝子の発現を減少させること、(b)それを必要とする被験者のような、被験者における少なくとも1つの点変異を編集すること、(c)被検体における少なくとも1つの終止コドンを編集し、終止コドンのリードスルーを産生すること、(d)該被験者におけるエクソンスキッピングを産生すること、または(e)それらを任意に組合せたことには十分であることがある。
【０２３０】
医薬組成物は、第1有効成分を含むことができる。該第1有効成分は、本明細書に記載のウイルスベクター、本明細書に記載の非天然のRNA、または本明細書に記載の核酸を含むことができる。該医薬組成物は、単位用量の形態で製剤化されてもよい。該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含むことができる。該医薬組成物は、第2、第3または第4の有効成分を含むことができる。
【０２３１】
本明細書に記載の組成物は、賦形剤を含むことができる。賦形剤は、幹細胞に添加されてもよく、またはその源から幹細胞と共単離されてもよい。賦形剤は、低温保存剤を含むことができ、例えば、DMSO、グリセロール、ポリビニルピロリドン(PVP)、またはそれらの任意の組み合わせである。賦形剤は、低温保存剤を含むことができ、例えば、スクロース、トレハロース、澱粉、これらのいずれかの塩、これらのいずれかの誘導体、またはこれらの任意の組み合わせであるる。賦形剤は、(該組成物の成分の酸化または分解を最小にするための)pH剤、(該組成物の成分の変性または分解を防止するための)安定化剤、(温度安定性を向上させるための)緩衝剤、(タンパク質溶解度を増加させるための)可溶化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。賦形剤は、界面活性剤、糖、アミノ酸、酸化防止剤、塩、非イオン性界面活性剤、可溶化剤、中性脂肪、アルコール、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。賦形剤は、炭酸ナトリウム、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ポリ-エチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン(HSA)、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ポリソルベート80、リン酸ナトリウム、スクロース、リン酸二ナトリウム、マンニトール、ポリソルベート20、ヒスチジン、クエン酸塩、アルブミン、水酸化ナトリウム、グリシン、クエン酸ナトリウム、トレハロース、アルギニン、酢酸ナトリウム、酢酸エステル、HC1、エデト酸ナトリウム、レシチン、グリセリン、キサンタンガム、大豆イソフラボン、ポリソルベート80、エチルアルコール、水、テプレノン、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。賦形剤は、医薬賦形剤ハンドブック、アメリカ製薬協会(1986)に記載されている賦形剤であってもよい。
【０２３２】
適切な賦形剤の非限定的な例は、緩衝剤、防腐剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、潤滑剤、キレート剤、分散増強剤、崩壊剤、香味剤、甘味料、着色剤が含むことができる。
【０２３３】
いくつかの場合において、賦形剤は緩衝剤であってもよい。適切な緩衝剤の非限定的な例は、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、及び炭酸カルシウムを含むことができる。緩衝剤としては、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、グルコンネート、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウムが挙げられる。ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、及びその他のカルシウム塩またはそれらの組み合わせを医薬製剤に用いることができる。
【０２３４】
いくつかの場合において、賦形剤は、防腐剤を含むことができる。非限定的な適切な防腐剤の例は、α-トコフェロール及びアスコルビン酸塩のような酸化防止剤、及びパラベン、クロロブタノール、及びフェノールのような抗菌剤を含むことができる。酸化防止剤は、さらにEDTA、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、亜硫酸ナトリウム、p-アミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノール及びN-アセチルシステインを含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの例では、防腐剤は、バリダマイシンA、TL-3、オルトバナジン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、N-a-トシル-Phe-クロロメチルケトン、N-a-トシル-Lys-クロロメチルケトン、アプロチニン、フェニルメチルスルホニルフルオリド、ジイソプロピルフルオロリン酸塩、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、グランザイム阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞分裂阻害剤、細胞周期阻害剤、脂質シグナル伝達阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、アルキル化剤、抗菌剤、酸化酵素阻害剤、またはその他の阻害剤を含むことができる。
【０２３５】
いくつかの場合において、医薬製剤は、賦形剤として結合剤を含むことができる。非限定的な適切な結合剤の例は、澱粉、α化澱粉、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキサゾリドン、ポリビニルアルコール、C12〜C18脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖類、及びそれらの組み合わせを含むことができる。
【０２３６】
医薬製剤に使用できる結合剤は、ジャガイモ澱粉、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉等の澱粉；スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、マルトデキストリン等の糖類；天然及び合成ガム；ゼラチン；微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルピロリドン(ポビドン)；ポリエチレングリコール(PEG)；ワックス；炭酸カルシウム；リン酸カルシウム；ソルビトール、キシリトール、マンニトール等のアルコール類及び水またはそれらの組み合わせから選択することができる。
【０２３７】
いくつかの場合において、医薬製剤は、賦形剤として潤滑剤を含むことができる。非限定的な好適な潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、水素化植物油、ステロイドテックス、ポリオキシエチレンモノステアリン酸塩、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、及び軽質鉱油を含むことができる。医薬製剤に使用できる潤滑剤は、金属ステアリン酸塩(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム)、脂肪酸エステル(例えば、フマル酸ステアリルナトリウム)、脂肪酸(例えば、ステアリン酸)、脂肪アルコール、グリセリルベヘネート、鉱油、パラフィン、水素化植物油、ロイシン、ポリエチレングリコール(PEG)、金属ラウリル硫酸塩(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム)、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及びタルクまたはこれらの組み合わせから選択することができる。
【０２３８】
いくつかの場合において、医薬製剤は、賦形剤としての分散増強剤を含むことができる。非限定的な好適な分散剤の例は、澱粉、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、澱粉グリコール酸ナトリウム、イソアモルファスケイ酸塩、及び高HLB乳化剤界面活性剤としての微結晶セルロースを含むことができる。
【０２３９】
いくつかの場合において、医薬製剤は、賦形剤として崩壊剤を含むことができる。いくつかの場合において、崩壊剤は、非発泡性崩壊剤であってもよい。非限定的な適切な非発泡性崩壊剤の例は、澱粉、例えば、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、それらのアルファ化及び変性澱粉、甘味料、粘土、例えば、ベントナイト、微結晶セルロース、アルギン酸塩、澱粉グリコール酸ナトリウム、ガム、例えば、寒天、ガウア、ローカストビーンズ、カラヤ、ペクチン、及びトラガカントを含むことができる。いくつかの場合において、崩壊剤は、発泡性崩壊剤であってもよい。非限定的な適切な発泡性崩壊剤の例は、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウム、及び酒石酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムを含むことができる。
【０２４０】
いくつかの場合において、賦形剤は、香味剤を含むことができる。外層に組み込まれた香味剤は、合成香味油及び香味芳香族、天然油、植物、葉、花、及び果実からの抽出物、及びそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの場合において、香味剤は、シナモン油、ウィンググリーンの油、ペパーミント油、クローバー油、干し草油、アニス油、ユーカリ、バニラ、レモン油、オレンジ油、ブドウ及びグレープフルーツ油のような柑橘類油、ならびにリンゴ、桃、梨、イチゴ、ラズベリー、チェリー、プラム、パイナップル、及びアプリコットを含む果実エキスからなる群から選択することができる。
【０２４１】
いくつかの場合において、賦形剤は、甘味料を含むことができる。非限定的な適切な甘味料の例は、グルコース(トウモロコシシロップ)、デキストロース、インバート糖、フルクトース、及びそれらの混合物(担体として使用されない場合)；サッカリン及びその種々の塩、例えば、ナトリウム塩、アスパルテーム等のジペプチド甘味料；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリチン；Stevia Rebaudiana(ステビオシド)；スクラロース等のショ糖クロロ誘導体；及びソルビトール、マンニトール、シリトール等の糖アルコールを含むことができる。
【０２４２】
1つの態様では、本開示では、adRNAは、内因性ADAR酵素を標的mRNAにリクルートし、部位特異的なA→G編集を助ける。これは、単一のadRNAの送達は、G-→A点変異を潜在的に修正できる遺伝子治療に潜在的な可能性を有する。これは、また、ADAR2のようなRNA編集酵素を過剰発現させることなく、標的RNAの編集を可能にする。本開示は、in vitro及びin vivoの両方において、該技術の適用性を示す。本開示はまた、長い二本鎖RNAを産生することにより、ADARをリクルートするドメインが存在しない場合であっても、内因性ADARをリクルートすることが可能であることを示す。また、これらの遺伝子操作されたadRNAを用いて、標的領域のmRNA中に複数のA→G編集を産生することが可能である。1つの態様では、該システムは、U6プロモーター(polIII)で転写されたadRNAならびに化学的に合成されたadRNAを使用し、効率的なRNA編集であることが示された。従って、1つの態様では、該構築物は、adRNAを転写するために、polIIIプロモーターのようなプロモーターをさらに含む。polIIIプロモーターのようなプロモーターからの転写は、標的RNAの編集の効率を向上させることができる。polIIIプロモーターからのAlu転写物は、優先的に編集される。また、本明細書では、内因性ADARの標的であるAlu反復の構造からの遺伝子操作されたadRNAが提供される。
【０２４３】
本開示の構築物は、特定の細胞区画にadRNAを局在化するために使用することができる。例えば、核局在化のために、adRNA-snRNA融合体を使用することができる。同様に、N末端ミトコンドリア標的配列(MTS)を添加することにより、adRNAをミトコンドリアに局在化させることが可能である。従って、1つの態様では、該構築物は、N末端ミトコンドリア標的配列(MTS)をさらに含む。適切なシス作用性ジッパーコードを添加することにより、adRNAをペルオキシソーム、エンドソーム及びエクソソームに局在化させることが可能である。従って、さらなる態様では、該構築物は、adRNAをペルオキシソーム、エンドソーム及びエクソソームに局在化させるための適切なシス作用性ジッパーコードをさらに含む。adRNAのエンドソームへの局在化は、ニューロンの場合において長距離にわたってそれらの輸送させる可能性がある。エクソソームにおける局在化は、隣接する細胞へのadRNAの伝播を潜在的に促進する可能性がある。コレステロールからadRNAへのような繋留部分は、細胞取り込みを助けることができる。従って、1つの態様では、該構築物は、コレステロールのような標的部分をさらに含む。
【０２４４】
1つの態様では、本開示に示されるように、小分子調節可能なadRNAを産生するため、1つの態様では、フラビンモノヌクレオチド、グアニン及び他の天然代謝産物を結合するアプタマー等のadRNA-アプタマーが用いられ、RNA編集の時間的制御を可能にする。該目的のため、糖を結合するアプタマーも使用することができる。
【０２４５】
1つの態様では、UlA-ADAR融合体の産生は、完全にヒト起源である。スプライスソーマルU1Aタンパク質のモチーフのN末端RNA認識は、63 nmの解離定数でその同族UlヘアピンIIRNAに結合する。
【０２４６】
本開示はまた、トウホールドをさらに含む構築物を提供する。
【０２４７】
本開示の該構築物は、1つの態様では、ADAR酵素の過剰発現の不存在下で使用することができる。
【０２４８】
従って、特定の態様では、本開示のadRNAは、特定な成分を有する：長さが約15〜約200塩基対であり(及びその間の範囲)、標的RNAに相補的なRNA標的化ドメイン、GluR2 mRNA、Alu反復要素またはADARが結合する他のRNAモチーフから由来し得る0〜10個のADARをリクルートするドメイン、及び標的化ドメイン内のどこに存在してもよい標的アデノシンにADARを誘導するために必要とされるシトシンミスマッチ。該adRNAがその標的RNAに結合すると、これは、ADAR酵素を標的RNAにリクルートする。該ADAR酵素は、次に標的アデノシンのイノシンへの変換を触媒することができる。50塩基対を超える長さのadRNAについては、HEK293T及びHelaにおいて発現される場合、該adRNA細胞は、ADARをリクルートするドメインが存在しない場合であっても、ADARをリクルートすることができ、有意なレベルの標的RNA編集を可能にする。単一のadRNAを用いて、標的mRNAにおける複数のA→G編集を産生することもできる。また、複数のadRNAを利用することにより、同一細胞内で複数の異なるadRNAを編集することができる。例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルでは、ジストロフィンの変異を修正するだけでなく、ナンセンス媒介崩壊に関与するタンパク質をコードする遺伝子のmRNA配列を破壊することも可能である。別の用途では、該技術を使用し、機能を損失し、機能また優性の負の変異を取得する。1つの態様では、癌スクリーン、腫瘍進行ならびに免疫編集研究のために該技術を使用することができる。
遺伝子操作されたadRNA
【０２４９】
本明細書で提供されるのは、遺伝子操作されたADAR1またはADAR2ガイドRNA("adRNA")である。これは、標的RNAに相補的な配列を含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。1つの特定の態様において、本開示の遺伝子操作されたadRNAは、さらに、オルニチントランスカルバミラーゼに相補的な配列を含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。
【０２５０】
1つの態様では、本開示の遺伝子操作されたadRNAは、GluR2 mRNA由来のADAR2をリクルートするドメインをさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。別の態様では、本開示の遺伝子操作されたadRNAは、Alu反復由来のADAR1をリクルートするドメインをさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。さらなる態様では、本開示の遺伝子操作されたadRNAは、標的RNAに相補的な配列に隣接する2つのMS2ヘアピンをさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作されたadRNAにおける標的RNAに相補的な配列は、約15〜30個の塩基対、または約30〜45個の塩基対、または約45〜60個の塩基対、または約60〜75個の塩基対、または約75〜90個の塩基対、または約90〜105個の塩基対、または約105〜120個の塩基対、または約120〜135個の塩基対、または約135〜150個の塩基対、または約150〜165個の塩基対、または約165〜180個の塩基対、または約180〜200個の塩基対を含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。さらなる態様では、それは、約40〜約200、または約50〜約200、または約60〜約200、または約70〜約200、または約80〜約200、または約90〜約200、または約100〜約200個の塩基対である。
【０２５１】
本明細書では、ADARをリクルートするドメインを含まなく、または約1〜2個のADARをリクルートするドメイン、または約2〜3個のADARをリクルートするドメイン、または約3〜4個のADARをリクルートするドメイン、または約4〜5個のADARをリクルートするドメイン、または約5〜6個のADARをリクルートするドメイン、または約6〜7個のADARをリクルートするドメイン、または約7〜8個のADARをリクルートするドメイン、または約8〜9個のADARをリクルートするドメイン、または約9〜10個のADARをリクルートするドメインを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される、遺伝子操作されたadRNAが開示される。または約9〜10個のADARをリクルートするドメインを含む。いくつかの実施形態では、該ADARをリクルートするドメインは、GluR2 mRNA、Alu反復要素、またはADARが結合する他のRNAモチーフを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。また、本明細書には、GluR2 mRNA由来の遺伝子操作されたadRNAのADAR2をリクルートするドメインが、該遺伝子操作されたadRNAの5'末端または3'末端に位置する遺伝子操作されたadRNAが提供される。いくつかの実施形態では、該GluR2 mRNAは、該遺伝子操作されたadRNAの5'末端及び3'末端の両方に位置する。
【０２５２】
1つの態様では、本開示の遺伝子操作されたadRNAは、さらに、本質的に、またはそれに代えて、編集誘導要素をさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。"編集誘導要素"は、効率的なRNA編集に必要な大きな二本鎖RNAの構造を指すことができる。非限定的な編集誘導要素の例は、Daniel,C.ら(2017)Genome Biol.18,195に記載されている。
【０２５３】
1つの特定の態様では、本開示の遺伝子操作されたadRNAは、表1または図2に示されている配列の群から選択されたポリヌクレオチド配列またはその等価物によってコードされる。
【０２５４】
また、高度に厳密な条件下で相補的なポリヌクレオチドとハイブリッド形成される本開示の遺伝子操作されたadRNAを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される複合体もまた、本明細書に開示される。
【０２５５】
本開示はまた、以下に記載する遺伝子及びタンパク質の編集技術に使用するためのポリペプチド及び/またはポリヌクレオチドの配列を提供する。理解されるべきこととして、必ずしも明示的には記載されていないが、本明細書に提供される配列が、発現産物、ならびに同じ生物学的性質を有するタンパク質を産生する実質的に同一の配列の提供に使用できる。これらの"生物学的に等価な"または"生物学的に活性な"ポリペプチドは、本明細書に記載されるように、等価なポリヌクレオチドによってコードされる。それらは、初期状態の条件下で実行される配列同一性法を用いて比較した場合に、参照ポリペプチドに対し、少なくとも60%、または代替的に少なくとも65%、または代替的に少なくとも70%、または代替的に少なくとも75%、または代替的に少なくとも80%、または代替的に少なくとも85%、または代替的に少なくとも90%、または代替的に少なくとも95%、または代替的に少なくとも98%同一の一次アミノ酸配列を有することができる。特定のポリペプチド配列は、特定の実施形態の例として提供される。アミノ酸配列への改変は、類似の電荷を有する代替アミノ酸を用いる。また、等価なポリヌクレオチドは、厳密な条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその補体にハイブリッド形成するもの、または、ポリペプチドに関して、厳密な条件下で参照をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖にハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。あるいは、等価なポリペプチドまたはタンパク質は、等価なポリヌクレオチドから発現されるものである。
【０２５６】
また、本明細書には、遺伝子操作されたadRNA-snRNA(小核RNA)融合体が開示される。1つの態様では、該遺伝子操作されたadRNAは、N末端ミトコンドリア標的配列(MTS)をさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成され、ミトコンドリアへの遺伝子操作されたadRNAの局在化を容易にする。別の態様では、本明細書には、遺伝子操作されたadRNAのペルオキシソーム、エンドソーム及びエクソソームへの局在化を促進するために、シス作用性ZIPコードをさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される、遺伝子操作された構築物が提供される。エンドソームへのadRNAの局在化は、ニューロンの場合に長い距離にわたってそれらの輸送を潜在的に可能にすることができる。エクソソームにおける局在化は、隣接する細胞へのadRNAの伝播を潜在的に助けることができる。adRNAへのコレステロールのような繋留部分は、細胞取り込みを助けることができる。
【０２５７】
さらに、本明細書では、小分子調節可能な遺伝子操作されたadRNAが提供される。1つの態様では、本明細書には、遺伝子操作されたadRNA-アプタマー融合体が開示される。該目的に使用できるアプタマーの非限定的なの例には、フラビンモノヌクレオチド、グアニン、他の天然代謝物、または糖に結合するアプタマーが含まれる。"アプタマー"は、高い親和性及び特異性で種々の分子を結合できる短い一本鎖オリゴヌクレオチドを指すことができる。非限定的なアプタマーの例は、Lakhin,A.V.ら(2013), Acta、naturae, 5(4), 34-43に記載されている。
【０２５８】
また、本明細書には、完全にヒト由来のUlA-ADAR融合体が開示されている。スプライスソームU1Aタンパク質のモチーフのN末端RNA認識は、63 nMの解離定数でその同族のUlヘアピンII RNAに結合する。
遺伝子操作されたadRNAを発現するベクター及び組換え細胞
【０２５９】
本明細書では、本開示の遺伝子操作されたadRNAをコードする1つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド配列、及び任意選択で、該単離されたポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成されるベクターが提供される。非限定的なベクターの例には、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターが含まれる。該ベクターは、当技術分野で知られているように、標的配列、ZIPコード、またはトウホールドをさらに含むことができる。
【０２６０】
1つの態様では、該調節配列は、プロモーター、転写促進因子及び/またはレポーターを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。いくつかの実施形態では、該プロモーターは、ヒトU6、マウスU6プロモーター、CMVプロモーター、またはpolIIIプロモーター、またはpolIIプロモーターである。1つの態様では、該ベクターは、さらに、検出可能なマーカーまたは精製マーカーを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。
【０２６１】
さらに、本明細書には、上記ベクターを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される、組換え細胞が開示される。ここで、前記遺伝子操作されたadRNAが、組換え的に発現される。
遺伝子操作されたadRNAの組成物
【０２６２】
本明細書には、担体及び本開示の遺伝子操作されたadRNAの1つまたは複数、本開示の遺伝子操作されたadRNAをコードする単離されたポリヌクレオチド、本開示の遺伝子操作されたadRNAを発現するベクター、または本開示の遺伝子操作されたadRNAを発現する組換え細胞を含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される組成物が開示される。1つの態様では、該担体は、薬学的に許容される担体または固体支持体である。さらなる態様では、該組成物は、化学療法剤または薬剤をさらに含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。
遺伝子操作されたadRNAの使用方法
【０２６３】
本明細書では、タンパク質発現を改変方法が提供される。該方法は、発現が改変されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、本開示の遺伝子操作されたadRNAと接触させることを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。
【０２６４】
また、本明細書には、有効量の、本開示の遺伝子操作されたadRNAのうちの1種以上を、このような治療を必要とする被験者に投与することを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される、タンパク質異常発現に関連する疾患または障害の治療方法が提供される。1つの特定の態様において、本明細書には、有効量の、本開示の遺伝子操作されたadRNAのうちの1種以上を、このような治療を必要とする被験者に投与することを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成されるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療方法が提供される。
【０２６５】
in vitro適用の場合、いくつかの実施形態では、該有効量は、該適用のサイズ及び性質に依存することができる。それはまた、in vitro標的及び使用方法の性質及び感度にも依存することができる。当業者は、これら及び他の考慮に基づいて該有効量を決めることができる。該有効量は、本実施形態による組成物の1種以上の投与を含むことができる。
【０２６６】
用語"被験者"、"宿主"、"個体"、及び"患者"は、本明細書中で互換的に使用され、動物、典型的には哺乳動物を指す。本明細書に記載の方法、細胞または組成物で任意の適切な哺乳動物を治療することができる。非限定的な哺乳動物の例には、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等)、家畜(例えば、イヌ及びネコ)、畜産動物(例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ)及び実験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)が含まれる。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発育段階(例えば、成人、ティーンエージャー、子供、幼児、または子宮内の哺乳動物)であってもよい。哺乳動物は、雄型または雌型であってもよい。哺乳動物は、妊娠中の雌であってもよい。いくつかの実施形態では、被験者は、ヒトである。いくつかの実施形態では、被験者は、癌または新生物障害を有するかまたは疑われる。他の実施形態では、被験者は、タンパク質異常発現に関連する疾患または障害を有するかまたは疑われる。
【０２６７】
図13を参照すると、短いssRNA(長さ約35 nt等)を含むことができるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)設計(図13の左側)とは対照的に、本開示の例示的な構築物(図13の右側)は、約60 bp〜約100 bpの長さを有し、優れた標的特異性及び約150 nt〜約250 ntの全長を有する長いssRNAであってもよい。本明細書に記載される構築物は、AON設計のために、図13の左側に示されるように、ヘアピン様RNAバルジを産生するために添加され得るミスマッチされた塩基とは対照的に、最適化及び真のヘアピン構造を含むことができる。該構築物の真のヘアピン設計の利点には、最適で優れたADARリクルート効率が含まれ、AON構築物と比べて、標的編集収率が高くなる。ヘアピン設計は、mRNA標的配列から完全に独立していてもよく、任意の新しいmRNA標的に対して容易に展開可能であってもよい。脱アミノ化のための標的部位は、独特で、正確であり、望ましくない化学修飾を必要とせず、他の部位での望ましくない脱アミノ化の危険性がない。対照的に、ミスマッチヘアピン様RNAバルジ(例えば、図13の左側に示されるように)を利用したAON設計は、(a)ADAR(真のヘアピンではなく、構造が短すぎる)のリクルートに、効力が制限され、(b)配列及びバルジの再使用を防止し、(新たな標的mRNAごとに独特の設計を必要とする)、(c)ミスマッチによる細胞mRNA標的部位への特異性が低下し(標的損傷の危険性の増加)、(d)ADAR脱アミノ化活性から他のアデニリンを保護するために、バルジにおける2’OMe修飾が必要とされる(誤ったリボヌクレオチドに望ましくない変異を引き起こすことがある)。
【０２６８】
長鎖アンチセンス-adRNAを介した外因性及び内因性ADARのリクルート
【０２６９】
CRISPR/Cas9系は研究に広く使用されているが、in vivoでの適用に関する懸念がある。2つの主な懸念は、ゲノム上に形成される永久的な編集、及び細菌性由来の系を導入することから生じる可能性のある免疫応答である。その結果、両方の課題を解決するための潜在的な解決策として、RNA編集が注目されている。最初の課題は、RNA編集の適用によって容易に克服でき、遺伝子から転写されたRNAは一過性であり得、そして編集は細胞を永久的に変化させないであろう。しかし、このことは、多くのRNAが編集され、表現型効果を達成できるので、編集効率が低下する形で新たな問題を生じることがある。また、免疫応答の第2課題は必ずしも克服されないかもしれない。RNAを編集する酵素のADARファミリーは、ヒト由来である。特に、ADAR1は、多くの細胞型においてほぼ一様に発現され；RNA A→I(A→G)編集のためのその自然の優先性を利用することによって、多くの潜在的な治療用途があり得る。この方法はまた、小さなガイドRNAが大きなかさばった酵素よりも輸送し易いので、送達の大きなハードルが克服される。従って、本明細書に記載される方法及び組成物の目的は、内因性ADARをリクルートするためのガイド(adRNAと呼ばれる)を遺伝子操作することを含むことができる。ADARは、二本鎖RNAの領域、特に二次構造を有する近い配列を編集することを好むことがある。これにより、アンチセンス領域の長さが長くなる遺伝子操作ガイドを有利にすることができる。adRNAは、3つの成分を有することができる：(1)標的RNAに相補的であってもよいRNA標的化ドメイン(例えば、長さが約15個の塩基対〜約200個の塩基対)；(2)ADARが結合する、約0個〜約10個のADARをリクルートするドメイン(GluR2 mRNA、Alu反復要素または他のRNAモチーフから由来してもよい)、及び(3)標的化ドメイン内のどこにも存在し得る標的アデノシンにADARを誘導するのに必要とされ得るシトシンミスマッチ。
【０２７０】
このadRNAがその標的RNAに結合すると、ADAR酵素を該標的RNAにリクルートすることができる。該ADAR酵素は、標的アデノシンのイノシンへの変換を触媒することができる。興味深いことに、HEK 293T及びHeLa細胞において発現される場合、長さが50個の塩基対を超える長いadRNAは、ADARをリクルートするドメインが存在しなくてもADARをリクルートすることができ、有意なレベルでの標的RNA編集を可能にすることができる。単一のadRNAを使用して、標的mRNAにおける複数のA→G編集を産生することもできる。また、複数のadRNAを利用することにより、同一細胞内で複数の異なるmRNAを編集することができる。例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルでは、ジストロフィンの変異を修正するだけでなく、ナンセンス媒介崩壊に関与するタンパク質をコードする遺伝子のmRNA配列を破壊することができる。他の用途としては、該技術を用いて、機能の損失、機能の取得、支配的な負の突然変異、またはそれらの任意の組み合わせを産生することができる。これは、癌スクリーン-腫瘍の進行、ならびに免疫編集研究において非常に重要である。
【０２７１】
図16を参照すると、adRNAの存在下で内因性ADARのリクルートによるRNA編集の模式が示されている。これらのadRNAは、化学的に修飾されたRNAまたはU6で転写されたRNAのいずれかとして送達することができる。図17を参照すると、漸進的に長いアンチセンスドメイン長を有するU6プロモーター転写されたadRNAは、0個、1個または2個のGluR2ドメインと組み合わせて、外因性ADAR2発現を伴うかまたは伴わない標的RNA編集を誘導する能力について評価される。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。長いadRNAは、RNA編集のために内因性ADARをリクルートすることができる。図18を参照すると、化学的に合成されたadRNAのバージョンは、外因性ADAR2発現を含むまたは含まないmRNAのパネルに対して試験される。正確な化学修飾は、adRNAの供給源と共に図に記載されている。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。図19を参照すると、処理された成体spfashマウス(後眼窩注射)の肝臓における正確にスプライスされたOTC mRNAにおけるin vivo RNA補正効率。U6で転写された短いadRNAを注射されたマウスには、RNA編集レベルが0.6%であった。
【０２７２】
Alu-adRNAを介した外因性及び内因性ADARのリクルート
【０２７３】
Alu遺伝子は、ゲノム中の転位性要素であり、ADARによるRNA編集の自然な標的である。内在的にリクルートされたADARによる編集を可能にするために、adRNAをAlu要素構造に基づいて設計することができる。本来の配列が標的に相補的なアンチセンス配列と置換され得る場合に、Alu要素構造上の様々な位置を試験してもよい。図20に示すように、一本鎖リンカー領域を選択することができる。アンチセンスガイドの長さを最適化することができる。これにより、約20個の〜約100個の塩基の長さを変化させ、RAB7A遺伝子座を標的とする。各ガイドは、1つまたは複数のミスマッチを含むように設計することができる。アンチセンスのシトシンと編集される標的アデノシン塩基との間にミスマッチを配置することができる。該ミスマッチは、各アンチセンス長の中間に配置することができる。編集効率は、ADAR1とADAR2の両方をリクルートできる100〜50アンチセンスガイドと、ADAR2のみをリクルートできるGluR2 20-6ガイドとを比較することができる。
【０２７４】
図20を参照すると、Alu adRNAの設計が示されている。左：Alu要素の構造。中央：標的Aの反対側にCミスマッチがある遺伝子座特異的アンチセンス配列を組み込んだ設計。右：該標的へのRNA編集酵素ADARのリクルート。
【０２７５】
これらのガイドは、293FT細胞においてリポフェクタミンを用いる遺伝子導入により試験される。各ガイドは、ADARlpl10、ADARlpl50、ADAR2のいずれかを過剰発現しているか、または酵素過剰発現を全く発現しない細胞において、内因性ADARをリクルートするadRNAの能力について試験される。遺伝子導入の48時間後に、細胞を採取し、RNAを抽出し、cDNAに変換し、サンガー配列決定のためにRAB7A遺伝子座を増幅する。編集効率は、ピーク高さの比として計算される。図5は、Aluガイド長実験の結果を示す。
【０２７６】
図5を参照すると、長いAlu-v2-l00-50ガイドは、ADAR酵素が過剰発現されない細胞における改良された編集を示す。ADARlpl50の過剰発現は、編集速度が直鎖形100-50ガイドに類似している一方、Alu構築物に対して有意に高い編集速度をもたらす。ADARlpl50は、短いアイソフォームであるADAR1p110に欠けているよりも、余分なds-RNA結合ドメインがあるため、Z-RNAに優先的に結合でき。GC含量が高い該Alu要素は、Z-DNA及びZ-RNAを形成することが知られており、ADARlpl50のリクルートを助ける。
【０２７７】
分割-ADAR2デアミナーゼドメイン(DD)
【０２７８】
ADARの過剰発現は、いくつかのトランスクリプトーム幅オフターゲット編集をもたらすことができる。標的mRNAのみにADAR2ddの触媒活性を制限する能力は、オフターゲットの数を減少させることができる。分割-ADAR2 DDの産生は、オフターゲットの数を減らすための1つの潜在的なアプローチになりうる。分割タンパク質再組立またはタンパク質断片相補性は、タンパク質-タンパク質相互作用の研究に広く用いられるアプローチになりうる。ADAR2 DDを分割することは、分割-ADAR2 DDの各断片がそれ自体で触媒的に不活性であるように設計することができる。しかし、分割された半分は、adRNAの存在下で、二量体化し、意図されたmRNA標的において触媒的に活性な酵素を形成することができる。
【０２７９】
タンパク質を分割するための領域は、その天然に存在する基質との複合体におけるADAR2 DDの結晶構造を研究すること、予測ソフトウェアを用いて溶媒接触性スコアを調べる理解すること、またはそれらの任意の組合せで同定することができる。MS2-MCPシステム及び (効率的にADARをリクルートできる) boxB-lambda Nシステムを単独でまたは組み合わせて利用して、分割ADAR2 DDのN及びC末端をそれぞれリクルートすることができる。adRNAは、1つのMS2ステムループ、及び該標的に相補的なアンチセンスドメインと共に1つのboxBヘアピンを含むことができる。これにより、分割ADAR2 DDのN及びC末端を標的にリクルートすることができ、これにより、触媒的に活性なDDを構成することができる。
【０２８０】
図22及び図23を参照すると、分割-ADAR2 DDシステムの概略図が示され、該ADAR2 DDの配列例には、分割部位が強調表示されている。
【０２８１】
図24を参照すると、一対の断片1〜16を、ウミホタルルシフェラーゼレポーター(cluc W85X)を介してアッセイすることができる。断片9及び10は、最高活性を示す。図23において、断片9及び10に対応する分割位置は、青色のサークルで示されている。
【０２８２】
図25を参照すると、Clucレポーターに対して試験された 断片9及び10が示されている。さらに、A→G編集について、NES-MCP-AD2-C-U変異体を試験することもできる。N：N末端断片、C：C末端断片、M-M：MS2-MS2 adRNA、M-B：MS2-BoxB adRNA、B-B：BoxB-boxB adRNA
【０２８３】
(a)U1a、または(b)その既知の内因性ヒトヘアピン標的を有さない進化変異体TBP6.7、または(c)ヒトヒストンステムループ結合タンパク質(SLBP)、または(d)グルココルチコイド受容体のDNA結合ドメイン、または(e)これらの任意の組み合わせを利用することにより、これらの構築物のさらなる完全なヒト化バージョンを作製することができる。これらのタンパク質は、ADAR2のN及びC末端断片に融合し、完全にヒト及び必要な特異性でアデノウイルスを編集できるプログラム可能なRNA編集ツールセットを産生することができる。さらに、2つの対応するRNAヘアピンを有するキメラRNAを利用して、ADAR2断片をリクルートすることができる。該RNAヘアピンの配列は、本明細書で提供される。
【０２８４】
ADAR2デアミナーゼドメインにおける1つまたは複数の変異(例えば、16の変異)を作製することによって、C→U RNA編集酵素を産生することができる。1つ以上の変異であっても、該編集酵素は、依然としていくつかのトランスクリプトーム幅A→G及びC→Uオフターゲットを示すことができる。該酵素の特異性を向上させるために、ある残基(例えば、前のスクリーンで同定された残基のようなもの)で分割することができ、従って、C→U編集のための分割ADARシステムを産生することができる。
【０２８５】
C→U編集のための外因性及び内因性のAPOBECのリクルート
【０２８６】
APOBEC(アポリポタンパク質B mRNA編集酵素、触媒ポリペプチド様)は、シチジンをウラシルに変換し、mRNAレベルで多様性を作り出すRNA編集酵素である。これらの実体は、遺伝子操作されたAPOBECリクルート誘導RNA(apRNA)のようなガイドRNAによるRNAのC→U編集のためにリクルートすることができる。いくつかの場合において、1つまたは複数のAPOBECファミリーメンバーを含むことにより、融合構築物を産生することができる。例えば、融合構築物は、MCP(MS2コートタンパク質)へ、ADAT1(アデノシンデアミナーゼTRNA特異1)及びAID(活性化誘導型シチジンデアミナーゼ)を含むことができる。遺伝子操作されたMS2-apRNAを利用して、1つ以上のMCP融合体をリクルートすることができる。該構築物のタンパク質配列、ならびにMS2-apRNA配列が、図28〜図30に示されている。融合構築物のタンパク質配列、または本明細書に記載される方法のいずれかに利用された配列は、図28の配列のいずれかの少なくとも一部と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を含むことができる。
【０２８７】
いくつかの場合において、方法は、APOBEC3A等のようなAPOBECをリクルートするために構成された構築物を含むことができる。リクルートは、内因性リクルートであってもよい。APOBECをリクルートするために構成された構築物は、一次配列、二次構造またはそれらの組み合わせの好みを標的とすることによって設計することができる。1つ以上のapRNAの設計は、図29に示されるような配列またはその一部を含むことができる。いくつかの場合において、APOBEC3A等のようなAPOBECをリクルートできる配列、または本明細書に記載の方法のいずれかに利用された配列は、図29の配列のいずれかの少なくとも一部と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を含むことができる。
【０２８８】
MCP-APOBEC3Aをリクルートするために、MS2-apRNAを設計することができ、それらの配列は、図30の配列の任意の1つ以上を含むことができる。いくつかの場合において、MCP-APOBEC3Aをリクルートできる配列、または本明細書に記載の方法のいずれかに利用された配列は、図30の配列のいずれかの少なくとも一部と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、またはそれ以上の配列同一性を含むことができる。
【０２８９】
ルシフェラーゼアッセイ
【０２９０】
ADARが、TAG中の標的AをIに変換すると(Gと読まれる)、リボソームは、図31に示されるようなタンパク質を完全に翻訳することができる。細胞は、遺伝子導入され、48時間後にルシフェラーゼレポーターアッセイで可視化されることができる。該細胞からの光の読み出しは、ルシフェラーゼ活性の修復を示すことができる。
【０２９１】
図31を参照すると、最初のシナリオは、リボソームがルシフェラーゼ遺伝子において未熟のTAG終止コドンに達し、翻訳を停止させることができ、切断された非機能性ルシフェラーゼ酵素が生じる例を示す。第2のシナリオでは、
adRNAによってADARは、リボソームのリードスルーを可能にするトリプトファンにTAG終止コドンをTGGコドンへ編集することができる部位にリクルートすることができ、正常なルシフェラーゼ発現をもたらすことができる。このようなシステムは、adRNAによる適切なADARリクルートの評価を可能にすることができる。ルシフェラーゼ発現が検出される場合には、adRNAによるADARリクルートは発生した可能性がある。ルシフェラーゼ発現が検出されない場合には、ADARリクルートが発生していない可能性がある。
キット
【０２９２】
また、本明細書では、本開示の遺伝子操作されたadRNA、本開示の遺伝子操作されたadRNAをコードする単離されたポリヌクレオチド、本開示の遺伝子操作されたadRNAを発現するベクター、本開示の遺伝子操作されたadRNAを発現する組換え細胞、または本明細書に開示された組成物、または使用するための取扱説明書を含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成されるキットが開示される。1つの態様では、該取扱説明書は、本明細書に開示された遺伝子操作されたadRNAの使用方法を説明する。
【０２９３】
キットは、ベクターを含むことができる。該ベクターは、容器内に包装されてもよい。該キットは、非天然のRNAを含むことができる。該非天然のRNAは、容器内に包装されてもよい。該キットは、シリンジを含むことができる。シリンジは、ベクター、核酸、または非天然のRNAが包装される容器であってもよい。該キットは、本明細書に記載の医薬組成物を含むことができる。ウイルスベクター、非天然のRNA、本明細書に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験者へ投与するため、該キットは、取扱説明書を含むことができる。
実施例
【０２９４】
以下の実施例は、本開示を効果的に実施する際に様々な場合で使用できる手順の非限定的かつ例示的なものである。また、本明細書に開示される全ての参考文献は、参考としてその全体が組み込まれる。
実施例1
【０２９５】
理論に拘束されないが、哺乳動物において見出され得るADARは、点変異の治療的編集を触媒するためにリクルートすることができると考えられる。ADAR1またはADAR2は、遺伝子操作されたRNA足場、遺伝子操作されたDNA足場またはDNA-RNAハイブリッド足場の使用を介して、標的RNAまたは潜在的にDNAにリクルートされ得る。このアプローチを使用して潜在的に標的化され得る組織には、中枢及び末梢神経系、肺、肝臓、胃腸管、膵臓、心筋、腎臓及び皮膚が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９６】
本明細書で提案される例示的な実施形態は、標的RNAと20〜100 bpの相補性を有する遺伝子操作されたADAR2ガイドRNA(adRNA)である。該遺伝子操作されたadRNAはまた、5'末端または3'末端のいずれか、またはその両端でのGluR2 mRNAからのADAR2をリクルートするドメインを含む。
【０２９７】
このことを、オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症のspfashマウスモデルにおいてin vivoで試験した。該モデルは、エクソン4の最後のヌクレオチドにG->A点変異を有している。AAVを介してadRNAのみを送達すると、ADAR酵素の過剰発現がない場合の点変異が誤差1%以下で観察された。本開示はまた、ADARを発現することが知られているHeLa細胞においてin vitroでの該有効性を示す。adRNAのみが送達されると、これらの細胞においてRNA編集が観察された。
【０２９８】
また、該効率は、他のリクルートドメインにも適用することができる。従って、さらなる態様は、遺伝子操作された一本鎖ADAR2ガイドDNA(adDNA)ならびにadRNAよりも高い安定性を有するadDNA-RNAハイブリッドに関する。本明細書に開示されるこれらの酵素の使用方法がさらに提供される。
【０２９９】
理論に拘束されないが、酵素のADARファミリーは、アデノシンのイノシンへの加水分解脱アミノ化を触媒するので、これらの酵素は、標的アデノシンと相互作用するADAR2-V351、E396及びC451の3つの特定の残基を変異させることによって、シトシンのチミンへの加水分解脱アミノ化を触媒するために使用することができると考えられる。このように、該触媒ポテンシャルを提供する方法は、これらの部位の変異によって提供される。
【０３００】
言及した3つの残基における全ての可能なアミノ酸置換が生成され、仮説を試験するためにスクリーニングされている。
【０３０１】
また、UAG編集部位のためのADAR固有の好みの排除を可能にするかもしれないS486のような他のアミノ酸の役割を探索するため、実験が行われている。
【０３０２】
C->T編集を遺伝子操作するために、hAPOBECl及びrAPOBEClの役割を、Apobecl相補因子(ACF)の過剰発現と共に測定する。また、本明細書では、MCP-(h/r)APOBECl-ACF融合タンパク質はさらに提供される。
【０３０３】
また、本明細書では、Cas9（またはCpf1）-ADARデアミナーゼドメイン融合体（ADAR1、ADAR2及びそれらの触媒活性変異体E1008Q及びE488Q）に対する現在のアデニン塩基編集アプローチに対し、現在の塩基編集者によるssDNA置換鎖を標的とする組成物がさらに提供される。これを達成するために、理想的にはgRNAの5'末端に近い最初のl0 bpにおいてA-Cバルジを有するgRNA結合鎖が標的化される。
【０３０４】
他の実施形態は、添付文献に例示され、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例2
【０３０５】
図6を参照すると、Alu要素は、内因性ADARベースのRNA編集の主要な標的であってもよい。従って、プログラム可能なRNA編集のために、この目的は、内在性ADARの効率的なリクルートを潜在的に可能にすることができるので、Alu要素に基づくADARリクルートRNA(adRNA)を設計することである。Alu-adRNAは、ヒトU6プロモーターから発現され、Alu反復の間のリンカー配列は、RAB7A転写物を標的とする種々の長さのアンチセンスドメインによって置換される。各アンチセンスドメインは、アンチセンス領域の中間にミスマッチしたヌクレオチド、及び標的アデノシンからのシトシンを有する。
【０３０６】
Alu-adRNAは、ADARlpl10、ADARlpl50、ADAR2と共に、または過剰発現酵素を含まずに、293FT細胞の遺伝子導入によりin vitroで試験され、内因性ADARのリクルートを実証する。遺伝子導入から48時間後に細胞を回収し、RNAを抽出し、ランダムヘキサマーまたはオリゴ-dTプライマーのいずれかを用いてcDNAに変換する。次いで、RAB7A遺伝子座を増殖し、サンガー配列決定に供する。編集効率は、サンガーピーク高さG/(A+G)の比として算出される。
実施例3
【０３０７】
ベクター設計及び構築
【０３０８】
ヒトU6及びマウスU6プロモーターを、FPまたは完全長のヒトADAR2酵素またはその高活性変異体ADAR2（E488Q）の発現を駆動するCMVプロモーターと共に含むAAVベクターに、ゼロ、1、または2つのGluR2 adRNAのコピーをクローニングした。同様に、MCP-ADAR1またはMCP-ADAR2デアミナーゼドメイン融合体及びそれらの高活性変異体を有するAAVベクターに、1つまたは2つのMS2 adRNAのコピーをクローニングした。GFPレポーター-GFP-アンバー、GFP-オーカー及びGFP-オパールを構築するために、野生型GFPのY39残基をそれぞれ"TAG"、"TAA"、"TGA"で置き換え、3つの遺伝子ブロックを合成し、CAGプロモーターの下流にクローニングした。OTC及びDMDレポーターを構築するために、編集する標的アデノシンを含むspfashOTC及びmdxDMD転写産物の200 bp断片を、CAGプロモーターの下流にクローニングした。
【０３０９】
哺乳動物細胞の培養及び遺伝子導入
【０３１０】
10%FBS及び1%抗生物質-抗真菌剤(Thermo Fisher)を補充したDulbecco’s Modified Eagle培地で、37℃及び5%C02雰囲気下でのインキュベーター中に、全てのHEK 293T細胞を増殖させた。全てのin vitro遺伝子導入実験は、市販の遺伝子導入試薬リポフェクタミン2000(Thermo Fisher)を用いて、HEK 293T細胞中で実施した。レポーターを含むin vitro RNA編集実験の全ては、400ngのレポータープラスミド及び800ngのadRNA+酵素プラスミドを用いて、24ウェルプレート中で実施した。内因性転写物を標的とするin vitro RNA編集実験は全て、800ngのadRNA/酵素プラスミドを用いて、24ウェルプレートで実施した。dCasl3b-ADAR2DDE488QベースのRNA編集実験は、800 ngの酵素プラスミド(Addgene#103864)及び800 ngのgRNAプラスミドを使用して実施した。細胞に、25〜30%のコンフルエンスで遺伝子導入し、遺伝子導入の60時間後に、編集定量のため採取した。リポフェクタミン3000(Thermo Fisher)を用いて、20 pmol/ウェルの量で、化学的に合成された(IDTまたはSynthegoを介して合成)adRNAに遺伝子導入した。
【０３１１】
AAVベクターの産生
【０３１２】
3重遺伝子導入法でHEK 293T細胞を用いてAAV8粒子を産生し、イオジキサノールグラジェントを介して精製した。遺伝子導入時のコンフルエントは、約80%であった。遺伝子導入の2時間前に、10%FBSを補充したDMEMをHEK 293T細胞に添加した。各ウイルスを、5×15 cmのプレートで産生した。ここで、各プレートは、7.5μgのpXR-8、7.5μgの組換え転写ベクター、PEI(lxDPBS pH4.5中1μg/μL直鎖形PEI、HC1使用)を4：1のPEI：DNA質量比で使用した7.5μgのpHelperベクターで遺伝子導入した。該混合物を室温で10分間インキュベートし、次いで細胞培地の上に滴下した。72時間後に該ウイルスを採取し、イオジキサノール密度グラジェント超遠心分離法を用いて精製した。次いで、50 mm NaCl及び0.0001%のプルロニックF68(Thermo Fisher)を補充した1×PBS(pH7.2)で、50 kDAフィルター(Millipore)を用いて該ウイルスを、約lmLの最終容量まで透析し、qPCRにより、ITR領域に特異的なプライマーを使用して標準(ATCC VR-1616)に対して定量した。
【０３１３】
AAV-ITR-F：5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'(配列番号：149)、及び
【０３１４】
AAV-ITR-R：5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3'(配列番号：150)
実施例4−RNA誘導アデノシンデアミナーゼを介した点変異のin vivo RNA編集
【０３１５】
ADARガイドRNA(adRNA)に関連するRNA(ADAR)酵素に作用するアデノシンデアミナーゼを介した配列特異的RNA塩基編集システムを設計した。該システムは、ADARを利用するように系統的に遺伝子操作され、ヒト疾患の2つのマウスモデルを介してin vitro及びin vivoにおけるその特異性及び活性を総合的に評価された。いくつかの場合において、該プラットフォームは、多様な用途のための調節可能な及び可逆的なRNAの遺伝子操作を可能にすることができる。
【０３１６】
イノシン→イノシンRNAの編集、転写後のRNA修飾は、RNA(ADAR)酵素に作用するアデノシンデアミナーゼによって触媒される。イノシンは、グアニンとして生物化学的に認識されるアデノシンの脱アミノ化形態である。最近、複数の研究がADAR媒介した標的RNA編集を実証した。これらの上に、2つの直交ツールセットを、in vitro及びin vivoでの配列特異的なプログラム可能なRNAベースの編集のために遺伝子操作した。具体的には、関連するADARガイドRNA(adRNA)を有するADAR1/2を介した標的RNA編集システムが利用された(図32A)。該adRNAは、該標的RNA配列と相補的なプログラム可能なアンチセンス領域を、標的アデノシンとは反対のミスマッチしたシチジンで部分的に含む。また、それらは、1つのバージョンには、天然に存在するADAR基質GluR2プレ-mRNA(ここでは、GluR2 adRNAと称する)から遺伝子操作されたゼロ、1つ、または2つのADARをリクルートするドメイン、及び第2フォーマットには、アンチセンス領域(ここでは、MS2 adRNAと称する)に隣接する2つのMS2ヘアピンを有する。G-C対A-Uペアリングに基づく突然変異誘発足場含む複数の足場変異体の評価、編集誘導要素の追加、アンチセンスドメイン長及びミスマッチ位置の改変によって、該GluR2 adRNAは、系統的に最適化され、外因性及び/または内因性ADARのリクルートを増強する(図8、図34A〜C)。次に、後者のMS2 adRNAバージョンを最適化し、デアミナーゼドメインのハイパー活性バージョン及び核局在化(NLS)対輸出(NES)信号を有するバージョン(図32B、図35A、図41B)の使用と共に、系統的アンチセンスドメイン長及びミスマッチ位置改変を介して、MS2コートタンパク質(MCP)に融合されたADAR1またはADAR2のデアミナーゼドメイン(DD)を含む合成タンパク質を利用した。
【０３１７】
上記2つのシステムの活性を総合的に評価し、Cas13bに基づく最近開発されたRNA編集システムでベンチマークした。これらのin vitro実験から次のことが明らかになった：(1)遺伝子操作された構築物が、Cas13bに基づくシステムに匹敵する収率で、標的RNA編集に対する影響力において活性であった(図32B、図36A、表2、3)、また、U6で転写されたadRNA及び化学的に合成されたadRNAは両方とも有効なフォーマットであった(図36B)；(2)長アンチセンスドメインを有するadRNAは、GluR2ドメインを有してもと有していなくても、外因的に発現されたADARをリクルートするのに十分であり、効率的なRNA編集を可能にするためには内因性ADARの程度に十分である(図32B、図34B、図40C、図42C)；(3)MS2 adRNA及び対応するMCP-ADAR1/2融合体に基づく構築物は、異なる発現レベルのスペクトルにわたって選択された内因性遺伝子の大きなパネルにわたって最も高い及び最も強い活性を示した(図32B、図36C)；(4)MCP-ADAR1/2融合体中のNES及び/またはハイパー活性デアミナーゼドメインの使用は、一貫して標的アデノシンでより高いRNA編集収率をもたらしたが、側面の配列中の標的にされないアデノシンにおける編集をもたらす傾向がより高い(図32B、図37A)。これをさらに検証にするために、ADAR2(Δ1-138)におけるネイティブNLSドメインの欠失から同様の乱交雑が続いた(図37B〜図37D)、及び(5)これら2つのツールセットは、動作的に直交しており、具体的には、共発現されたMS2 adRNAまたはGluR2 adRNAとのMCP-ADAR2デアミナーゼドメイン融合体の編集効率を評価し、前者を介してのみターゲット編集で表示した。逆に、全長ADAR2は、MS2 adRNAではなく、GluR2 adRNAによってリクルートされることが観察された(図35B)。
【０３１８】
このツールセットの強い活性を示したが、該システムによって実施されるトランスクリプトームワイドオフターゲットA->G編集分析で、その特異性プロファイルを調べた(図32C)。該目的のために、HEK 293T細胞を各構築物で遺伝子導入し、RNA-seqによって分析した。遺伝子導入されていない細胞は対照として含まれた。各試料から、約40万個の一意に整列した配列決定リードを収集した。フィッシャー直接検定を用いて、十分なリード範囲を有する各基準アデノシン部位において、遺伝子導入されていない細胞に対し、A->Gの編集収率の有意な変化を定量した。いずれかの試料において検出された少なくとも1つのA->G編集イベントを有する部位の数を計算した。これらのうち、統計的に有意なA->G編集を有する部位の数は、偽発見率(FDR)が1%であり、かつ、倍率変化が少なくとも1.1であり、広く変動し、MCP-ADAR2 DD-NLS構築物について最も低く、MCP-ADAR1 DD(E1008Q)-NESについて最も高いことが見出された(図38〜図41、表4、5)。編集収率の分布を調査するために、少なくとも1つの試料において編集収率が有意に変化するA部位を考慮して、バオリンプロットを産生した(図32)。まとめると、RNA-seq実験から、トランスクリプトームの広いオフターゲット編集が、(1) NESを有する構築物よりもNLSを有するMCP-ADAR構築物において一般的ではなく；(2)MCP-ADAR1構築物よりもMCP-ADAR2構築物においてより一般的であり；(3)E>Q高活性変異体よりも野生型MCP-ADAR構築物において優勢であり(図42A、表5)；また(4)オフターゲットは、主としてADAR過剰発現によるものであり、adRNAのみの使用は、少なくとも数のオフターゲット(図42B)をもたらしたことが明らかになった。
【０３１９】
(表2)adRNA及びgRNAアンチセンスの配列表
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【０３２０】
(表3)次世代配列(NGS)分析のためのプライマー表
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【０３２１】
(表4)高処理配列決定実験からのRNA-seq解読の集計。与えられたカウントは、対の末端配列決定からのリードペアーではなく、リードメイトを表す。項目は次の通りである：sn、試料名；nt、デマルチプレクス後の生のリードの総数；nu、基準ゲノムに一意に配列された対におけるリードの数；nd、複製された対におけるリードの数；nr、残りのリードの数；df、ダウンサンプリング画分。同一対照ライブラリーから、"293T"、"293T L2"、"293T L8"、及び"293T L4"と名付け試料を採取したが、イルミナ機器の異なるレーン上で配列決定した。
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【０３２２】
(表5)整列されたRNA-seqリードからのA->G編集収率の定量結果。項目は次の通りである：試料名、総部位、処理された試料と対照試料との間の少なくとも1つの比較において、A->Gの編集収率の有意な変化を伴う参照部位の総数；変更された部位、表4の第1試料である対照試料との処理された試料を比較すると、A->Gの編集収率の有意な変化を有することが見出された基準A部位の数；オンターゲット編集収率、RAB7AmRNA内の意図された標的A部位で観察される編集収率、編集収率の中央値、標的部位を除いて考えられる全ての部位における収率の中央値。
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【０３２３】
これらのin vitro研究に続いて、一貫して最高のin vitroRNA編集収率を可能にしたものと同様に、adRNA兼外因性ADAR発現構築物バージョンを利用し、該システムを、遺伝子治療応用でのin vivo RNA標的化について評価した。ジストロフィン遺伝子のエクソン23にオーカー停止部位を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)のmdxマウスモデルをまず評価した。該選択は、ナンセンス変異は、一般に、遺伝性のヒト疾患を引き起こす記載された遺伝子病変のほぼ11％、また、遺伝子のコード領域に影響を与える疾患関連の一塩基置換のほぼ20％の原因である可能性があるという事実でさらに動機づけられた。従って、ここでのRNA編集方法の有効性は、広い治療用途を有することができる。これに向かって、終止コドンのRNA編集を最初にin vitroで最適化した(図43)。注目すべきことに、adRNAの第2コピーの添加は、標的効率を有意に改善したことが観察された(図43C)。従って、in vivoでの研究において、二重のadRNA送達アプローチが利用された。次いで、該構築物をAAV8にパッケージし、mdxマウスの前脛骨筋(TA)または腓腹筋に2E+12ベクターゲノム(vg)を注射した。該アプローチをさらに評価するために、該mdxマウスをエクソン23のCRISPR-Cas9ベースの切除(図33A)を介して同時に標的化した。注射後4週間または8週間後に、mdxマウス、野生型マウス、adRNA標的化及び非標的化対照で処理したマウス、及びCRISPR-Cas9から(TA)及び腓腹筋を採取した。免疫蛍光染色から、標的RNA編集を介したジストロフィン発現の明確な修復が明らかになった(図33B、図44A)。また、筋細胞膜においてnNOS活性も修復した(図33B、図44A)。処理されたマウスにおいて、RNA編集 (TAA->TGG/TAG/TGA)の収率が3.6%以下で、TAA->TGGの収率が2.4%であることが観察された(図33C、図43E)。処理された筋肉のウエスタンブロットは、免疫蛍光の観察を確認し、1〜2.5%のタンパク質修復を示した(図44B)。評価基準として、CRISPR-Cas9を有するベクターで注入された筋肉も、期待されたように、筋細胞のサブセットにおいてジストロフィン発現の修復に至った(図33B)。処理された筋肉のウエスタンブロットにより、最大10％のタンパク質の修復が確認された(図44C)。
【０３２４】
次に、該アプローチの効力をさらに確認するために、ADAR媒介RNA編集を、ヒト疾患の単独マウスモデル、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC) 欠乏症の雄疎毛皮灰(spfash)マウスモデルで評価した。該spfashマウスは、OTC遺伝子の4番目のエクソンの最後のヌクレオチドに、OTC mRNA欠損及び変異タンパク質の産生を導くG->A点変異を有している。最近の研究では、新生マウスにおける該変異の左右されない補正のためのCRISPR-Cas9及び相同組換えに基づく方法の使用が実証されている。SpfashOTC mRNAにおける点変異を編集する際のシステムの有効性を試験(図33D)するため、該構築物をin vitroで評価した(図45A)。該構築物を、高い肝臓指向性を有するAAV8にパッケージし、5E+12vgを10〜12週齢のspfashマウスに注射した。注射後3〜4週間後、spfashマウス、野生型同腹仔、ADAR2標的化ベクター及び非標的化ベクターで処理されたspfashマウスから肝臓試料を採取し、NGSを介して対応する編集効率を評価した。特に、adRNAとADAR2を送達すると、正確にスプライスされたOTC mRNAの中で、0.8〜4.7%の編集されたmRNAが観察され、興味深いことに、adRNAのみが、低いが有意なRNA編集収率をもたらした(図33E)。また、ハイパー活性ADAR2変異体(E488Q)の送達時には、正確にスプライスされたOTC mRNAにおいて、高い編集画分(4.6〜33.8%)が観察され(図33E、図45B)、OTCプレmRNAにおいて4.6〜8.2%が観察され(図45C)、不正確にスプライスされた産物の減少が確認された(図45D)。処理された肝臓試料のウェスタンブロットにより、OTCタンパク質の部分的な修復(2.5〜5%)が確認された(図45E)。
【０３２５】
めとめると、該結果は、点変異のin vivo RNA編集のためのRNA誘導ADARの有用性を確立する。いくつかの場合において、ADAR酵素、RNAフォールディング、内因性半減期、局在化、翻訳機、及び常駐RNA結合タンパク質の配列選択は、潜在的に、RNA中の標的部位の接触性及び編集性に影響を与え、有効な標的化を可能にするための考慮すべき重要な設計パラメータでもなりうる。例えば、mdxモデルでは、ADARに基づくRNA編集アプローチは、変異性ジストロフィンmRNAのナンセンスを媒介した崩壊、及び非理想的な隣接ヌクレオチドの文脈で2つのA->I置換を実施して、未熟な終止コドン及びRNAの安定性や機能に対する潜在的な影響を排除する要求と競合することができる。さらに、spfashモデルでは、一過性OTCプレmRNAを標的化する必要性は、迅速な標的係合及び編集をもたらす可能性がある。内因性酵素-RNA結合によって誘導されるオフターゲット等のシステムの重要な制限、処理能力、乱交雑、内因性ADAR発現の増加につながる送達様式自体（脂質、ナノ粒子、ウイルス等）によるインターフェロン応答の刺激、RNAiを誘導するadRNAの可能性、また、潜在的に有害な影響を与える可能性のあるadRNAのアンチセンスドメインのオフターゲットハイブ形成に対処するため、さらなる進歩も必要とされる。この点に関して、本研究は、高活性ADAR変異体で全身的に注入されたマウスにおける毒性を明らかにした(図46)。これらの研究は、このアプローチの特異性及び安全性の系統的な改善を助けるために重要になる可能性がある。遺伝子治療のためのRNA標的化、特に非積分ベクターの使用を介して考える際に、別の重要な考慮は、編集されたmRNA及びエフェクターの半減期が制限されているため、エフェクター構築物の定期的な再投与の必要性であろう。この点に関して、CRISPRに基づくRNA編集アプローチと比べて、該RNAガイドADAR方法は、同様のバージョンがエフェクターRNA及びヒトタンパク質を単独で利用するように、直接にヒト治療薬に関連するであろう。また、ADARは広く発現される。例えば、ADAR1がヒト組織の大部分で発現され、ADAR2が特に肺及び脳においてで発現される。長アンチセンスドメイン(図32、図33E、図34、及び図36に示されるように)を有するadRNAを介したものの内因性リクルートは、有効なRNA編集のための非常に魅力的な方法を示す。漸進的に改良された該ツールセットは、多様な基本科学及び治療用途のため、広い意味を有することができる。
【０３２６】
図32：プログラム可能なRNA編集の遺伝子操作と特異性プロファイルの特性づけ(A)全長ADAR2及びGluR2転写産物に由来する操作されたadRNA、またはADAR1/2デアミナーゼドメインへのMS2コートタンパク質（MCP）融合体及び対応するMS2ヘアピンベアリングadRNAを利用した構築物を介したRNA編集の概略図。(B)サンガー配列決定(サンガーピーク高さG/(A+G)の比として算出される効率)によって定量化された、異なるRNA編集構築物による内因性RAB7A転写物のRNA編集効率の比較。HEK 293T細胞において実験を行った。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(C)対照試料と比較して、少なくとも1つの処理試料が有意な編集収率の変化(フィッシャー直接検定、FDR=1%)を有することが見出された参照部位で観察されるA->Gの編集収率の分布を表すバイオリンプロット。青色の円は、RAB7A転写物内の標的A部位における編集収率を示す。黒色点は、中央値のオフターゲット編集収率を表す。分布の形状をより良好に可視化するために、y軸に沿ったそれらの最大範囲をプロットにわたって均一化し、60%の収率で切断した。
【０３２７】
図33：ヒト疾患のマウスモデルにおけるin vivo RNA編集：(A)デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにおけるジストロフィン発現を修復するためのDNA及びRNA標的アプローチの概略図(i)エクソン23のフレーム切除につながる二重gRNA-CRISPRベースのアプローチ、及び(ii)オーカーコドンのADAR2及びMCP-ADAR1ベースの編集。(B)前記TA筋肉におけるジストロフィンの免疫蛍光染色は、処理された試料 (AAV8-ADAR2、AAV8-ADAR2(E488Q)、及びAAV8-CRISPRの筋肉内注射)における発現の部分的な修復を示す。nNOS局在の部分的な修復もまた、処理された試料において見られる(スケールバー：250μm)。(C)対応する処理された成体mdxマウスにおけるin vivo でのTAA->TGG/TAG/TGA RNA編集効率。値は、平均+/-SEM(それぞれ、n=4、3、7、3、3、10、3、4の単独TA筋肉)を表す。(D)エクソン4の最後のヌクレオチドにおけるドナースプライス部位にG->A点変異を有するオルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症のspfashマウスモデルにおけるOTC遺伝子座の模式図、及びADAR2媒介RNA編集を介して変異OTC mRNAの補正のためのアプローチ。(E)処理された成体spfashマウス（AAV8-ADAR2及びAAV8-ADAR2(E488Qの後眼窩注射)の肝臓における正確にスプライスされたOTC mRNAにおけるin vivo でのRNA補正効率。値は平均+/-SEM(それぞれ、n=4、4、3、3、4、5の単独動物)を表す。
【０３２８】
ベクター設計及び構築
【０３２９】
ヒトU6、マウスU6プロモーター、及び酵素の発現を駆動するCMVプロモーターを含むAAVベクターに、adRNAの1つまたは2つのコピーをクローニングした。GFPレポーター-GFP-アンバー、GFP-オーカー及びGFP-オパールを構築するために、野生型GFPのY39残基をそれぞれ置換する"TAG"及び"TAA"及び"TGA"で、3つの遺伝子ブロックを合成し、CAGプロモーターの下流にクローニングした。OTC及びDMDレポーターを構築するために、編集しようとする標的アデノシンを担持したspfash OTC及びmdx DMD転写物の200 bp断片をCAGプロモーターの下流にクローニングした。
【０３３０】
哺乳動物細胞培養及び遺伝子導入
【０３３１】
全てのHEK 293T細胞を10%FBS及び1%抗生物質-抗真菌剤(Thermo Fisher)を補充したDulbecco’s Modified Eagle培地で、37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベーターの中で増殖させた。全てのin vitro遺伝子導入実験は、市販の遺伝子導入試薬リポフェクタミン2000(Thermo Fisher)を用いてHEK 293T細胞中で実施した。全てのレポーターを含むin vitroでのRNA編集実験は、400 ngのレポータープラスミド及び800 ngのadRNA+酵素プラスミドを用いて24ウェルプレート中で実施した。全ての内因性転写物を標的とするin vitroでのRNA編集実験は、800 ngのadRNA/酵素プラスミドを用いて24ウェルプレート中で実施した。dCas13b-ADAR2DDE488Qに基づくRNA編集実験は、800 ngの酵素プラスミド(Addgene #103864)及び800ngのgRNAプラスミドを用いて行った。細胞を25〜30%のコンフルエンスで遺伝子導入し、遺伝子導入の60時間後に、編集定量のため採取した。化学的に合成されたadRNA(IDTまたはSynthegoを介して合成)を、リポフェクタミン3000(Thermo Fisher)を20 pmol/ウェルの量で用いて、遺伝子導入した。
【０３３２】
AAVベクターの産生
【０３３３】
AAV8粒子は、HEK 293T細胞を用いて3重遺伝子導入法で製造し、イオジキサノールグラジェントで精製した。遺伝子導入時のコンフルエントは約80%であった。遺伝子導入の2時間前に、10%FBSを補充したDMEMをHEK 293T細胞に添加した。各ウイルスは、5×15 cmのプレートの中で産生された。各プレートは、PEI（1xDPBSにおけるlμg/μL 直鎖形PEI、pH4.5、HC1使用）を用いて、PEI:DNA質量比4：1で使用して、7.5μgのpXR-8、7.5μg組換え転移ベクター、7.5μgのpHelperベクターで遺伝子導入された。該混合物を室温で10分間インキュベートし、次いで細胞媒体上に滴下した。72時間後にウイルスを採取し、イオジキサノール密度グラジェント超遠心分離法を用いて精製した。次いで、50kDAフィルター(Millipore)で、該ウイルスを、50 mMのNaCl及び0.0001%プルロニックF68(Thermo Fisher)を補充した1×PBS(pH7.2)で、最終容積約1 ｍLに透析し、標準(ATCC VR-1616)に対して、ITR領域に特異的なプライマーを用いてqPCRにより定量した。
【０３３４】
AAV-ITR-F：5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'(配列番号：149)、及び
【０３３５】
AAV-ITR-R：5-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3'(配列番号：150)
【０３３６】
RNA単離及び次世代配列決定ライブラリーの構築
【０３３７】
RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen)を用い、メーカーのプロトコルに従って、動物組織からのRNAを抽出した。細胞からのRNAを、RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出した。Protoscript II第1鎖cDNA合成キット(NEB)を用いて、500ng RNAからcDNAを合成した。次世代の配列決定ライブラリーを以下のように構築した。簡単に言うと、関心部位を囲む約150bpを増幅するプライマーを用いてPCRにより、上記で調製したcDNAのlulを、KAPA Hifi HotSart PCR Mix(Kapa Biosystems)を用いて増幅した。PCR産物を精製(Qiagen PCR精製キット/ゲル抽出キット)し、副生成物を除去した。イルミナキット(NEB)用のNEBNextマルチプレックスオリゴを用いてライブラリーを構築した。10ngの入力DNAを指標プライマーで増幅した。次いで、試料をプールし、Illumina Miseq(l50 bpシングルエンドラン)またはHiseq(100 bpペアードエンドラン)上にロードした。CRISPResso(Pinello、L.ら、2016)を用いてデータ解析を行った。全てのin vivo実験について、最小100、000回のリードを解析した。NEBNextポリ(A)mRNA磁気分離モジュール及びイルミナ用のNEBNext Ultra RNAライブラリー構築キットを用いて、300 ngのRNAからRNA-配列ライブラリーを構築した。試料をプールし、Illumina Miseq(100 bpペアードエンドラン)上にロードした。
【０３３８】
spfashマウスにおけるOTC mRNAの編集収率の定量
【０３３９】
spfashマウスは、3つのOTC RNA形態を有する：プレmRNA、正確にスプライスされたmRNA、及び陰性のスプライシ部位48塩基対をイントロン4に使用することによって形成された不正確にスプライスされ、伸長されたmRNA。これにより、正確にスプライスされたmRNAの総数はXとなり、不正確にスプライスされた変異体はYとなり、プレmRNAはZとなる。Xe、Ye、及びZeは3つの形態のA->Gの編集されたmRNAを示す。mRNAの編集収率は、理想的には(Xe+Ye+Ze)/(X+Y+Z)として算出することができる。しかし、同じプライマーを用いてスプライスされた、及びmRNA変異体を増幅させることができないため、図34Eは、正確にスプライスされたmRNA(Xe/X)における編集された転写物の画分を示す。これは次に翻訳されてOTCタンパク質を産生する。また、図48Cは、プレmRNA(Ze/Z)における編集された転写物の画分を示す。この画分は、正しいスプライシングの際に、OTCタンパク質の形成に寄与する。最後に、不正確にスプライスされたmRNAは、選択的に分解される16個のアミノ酸によって伸長されたタンパク質の産生をもたらす。図48Dでは、X及びYに対応するバンドが示されている。
【０３４０】
動物実験
【０３４１】
すべての動物実験は、カリフォルニア大学(Sandiego)の研究用動物ケア及び使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従って実施した。Jackson Labs.からマウスを入手した。2E+12vg/筋肉で、mdxマウス(C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)の腹筋またはTA筋にAAVを注射した。2.5E+12vg/マウスで、後眼窩注射を介して、AAVをspfashマウス(B6EiC3Sn a/A-Octspf-ash/J)に注射した。ヘアコートが荒く見え、動きが緩慢で、またわずかに空腹にしたマウスを傷病マウスと呼び、安楽死させた。
【０３４２】
免疫蛍光
【０３４３】
収穫した腹筋またはTA筋を、OCT化合物(VWR)を含有する鋳型に入れ、液体窒素中でフラッシュ凍結させた。10μmセクションを、前処理した組織学的スライド上に切断した。4%パラホルムアルデヒドを用いてスライドを固定した。ジストロフィン及びnNOSは、それぞれ、ジストロフィンのC末端ドメイン(1：200、Abcam 15277)及びnNOSのN末端ドメイン(1：100、Immunostar 24431)に対するウサギポリクローナル抗体、続いて、ロバ抗ウサギAlexa 546二次抗体(1：400、Thermo Fisher)で検出された。
【０３４４】
ウエスタンブロット
【０３４５】
mdxマウスからの筋肉生検及びspfashマウスからの肝臓生検を、RIPA緩衝液(Sigma)中、プロテイナーゼ阻害剤カクテル(Roche)で断片化し、間欠的なボルテックスし、氷上で1時間インキュベートした。試料を4℃、l5500xgで30分間遠心分離し、そして上清を単離し、Pierce Coomassie Plus(Bradford)アッセイキット(Thermo Fisher)で定量した。タンパク質単離物を、4x Laemmliローディング緩衝液(Biorad)及び2-メルカプトエタノール(Biorad)と混合し、100℃で10分沸騰させた。トリス-グリシン-SDS緩衝液(Biorad)を用いて、筋肉生検から100μg、または肝臓生検から60μgの総タンパク質を4〜15% Mini Protean TGXゲル(Biorad)の各ウェルにローディングし、100 Vで60分間電気泳動した。筋肉生検からのタンパク質をニトロセルロース膜に移し、34Vで終夜した。一方、肝臓生検からのタンパク質を65Vで移し、10%メタノール及び0.1%SDSを含む1Xトリス-グリシン導入緩衝液中で1時間30分した。5% milk-TBST中で1時間該ブロットをブロックした。ブロットをウサギ抗ジストロフィン(1：200、Abcam 15277)、ウサギ抗GAPDH(1：4000、Cell Signaling 2118S)、ウサギ抗OTC(1：800、Abcam 203859)及びマウス抗ADAR2(1：150、Santa Cruz Biotechnology 73409)で、5% milk-TBST中、4℃で終夜プローブした。ブロットをTBSTで洗浄し、次いで抗ウサギまたは抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体(Cell Signaling)と共に5% milk-TBST中で1時間インキュベートした。TBSTで洗浄した後、SuperSigneal West Femto Chemiluminescent Substyeild (Thermo Fisher)及びX線フィルムを用いてブロットを可視化した。
【０３４６】
統計及び再現性
【０３４７】
in vitro実験：in vitro実験は、最小3回の単独繰り返しで1回実施した。in vivo実験：mdxマウスモデルについて、ADAR2、及びMCP-ADAR1(E1008Q)NLSに基づく実験は2回行った。両ラウンドの実験は、ウェスタンブロットによって見られるように、一貫したRNA編集効率、ジストロフィン免疫蛍光及びジストロフィン修復をもたらした。ADAR2(E488Q)及びCRISPR-Cas9に基づく実験は1回行った。spfashマウスモデルについて、マウスの入手可能性のため、2回実験を行った。OTC転写物のRNA編集効率、スプライスされたmRNA及びプレmRNAの両方は、両ラウンドの実験において一致した。実験セット1の動物についてRT-PCR及びウェスタンブロットを行った。
【０３４８】
1.RNA A->G編集の定量
【０３４９】
(a)RNA-seqリード配向
【０３５０】
リードメイト当たりに100塩基を有するRNA-seqリード対を、スター露光装置バージョン2.6.0c(Dobin Aら、2013)を用いてGRCh38参照ゲノムに整列させた。該ゲノムインデックスを、GENCODEリリース28(GRCh38.pl2)からの一次アセンブリ注釈を用いて構築した。次の関連する設定を除いて、初期パラメータを使用してスターを実行した。readMapNumber=-1, alignSJoverhangMin=5, alignSJDBoverhangMin=1, alignEndsType=EndToEnd, outFilterMismatchNmax =10, outFilterMultimapNmax=1, outSAMunmapped=None, outSAMmultNmax=1。得られた一意的に整列した対のリードを、samtools sort(Li H.ら、2009)を用いてゲノム座標によって分類した。複製されたリード対を、samtool markdupを用いてマークし、その後の分析から除外した。各試料について、集計され、整列され、複製され、及び残りのリード(対)は、表4に示されている。
【０３５１】
(b)編集収率を定量するための参照部位の選択
【０３５２】
A→G編集収率の有意な変化を有する部位の評価(下記を参照)は、各試料に対して利用可能な一意的に整列されたリードの数に敏感である。有意に編集された部位に関して異なる試料を比較するときの潜在的なバイアスを最小にするために、各HEK293T試料についての一意に整列されたリードを、表4に報告されたオプション-及びダウンサンプリング画分と共に、samtoolsビューを用いてダウンサンプリングした。試料間で一意に整列された試料の最小数を、試料がダウンサンプリングされるために利用可能な一意に整列されたリードの数で除算し、これらの画分を計算した。対照試料のリードについて、ダウンサンプリングは行われなかった（表4の最初）。ダウンサンプリングされたリードを、samtools mpileupを用いて次いで処理した。このツールの出力を解析し、GRCh38参照ゲノム配列中の各A部位及びT-部位における整列されたリードに見出される各塩基のカウントを抽出した。挿入及び欠失を無視した。リード範囲が10未満の参照部位を下流の分析から省略した。表4に列挙された試料にわたって、少なくとも10のリードコーティング量を有する残りの参照A-及びT-部位の数は、約15%で変動した。ダウンサンプリングなしに、この数は、約50%変動すると見られた。リード範囲が少なくとも10を有する参照A部位及びT部位から、すべての試料に共通であり、少なくとも1つの試料の整列されたリードで参照A部位またはT部位でそれぞれ少なくとも1つのGまたはCが観察された部位を選択することによって、総部位(A部位及びT部位)の最終リストを選択した。他の部位は、全ての試料に共通ではなく、または全ての試料において観測された編集事象がゼロのものを廃棄した。
【０３５３】
(c)A→G編集収率における有意な変化の評価
【０３５４】
A→G編集収率の有意な変化を明らかにするために、いくつかの対照試料のペアー及び処理試料のペアーを考慮した。各ペアーについて、対照試料は、表4に記載された最初の試料であって、処理試料は、図32に示された試料のうちの1つであった。比較試料の各ペアー、及び上記のように選択された各基準A部位について、以下に定義したエントリーを有する2x2 不連続性マトリックスCを用いてフィッシャー直接検定を実施した。C1.1=対照試料において観察されるG以外の塩基のカウント、C2.1=対照試料において観察されるG塩基のカウント、C1.2=試験試料において観察されるG以外の塩基のカウント、C2.2=試験試料中で観察されるG塩基のカウント。上記定義においてGをCと置換した以外は、選択された各参照T-部位に類似の不連続性マトリックスを使用した。複数の試験のために、選択された全ての参照部位について算出されたp値と、試料の所与の比較のために計算されたp値を、Benjamini-Hochberg法を用いて調節した。調節されたp値が偽発見率(FDR)1%より低く、かつ編集収率が少なくとも1.1倍の変化を有するA部位及びT部位は、それぞれ正逆転写物におけるA→G編集収率の有意な変化を有すると考えられた。試料の各比較のためのこれらの部位のカウントは、図38〜図42にNsigとして示されており、表5の"変更された部位"の欄に示されている。A→G編集収率の有意な変化を伴う参照部位の総数を計算した。これらの部位における編集収率を用いて、図32に示す分布を構築した。各試料について、図32及び図38〜図42中の青色円として示されたオンターゲットA→G編集収率を、RAB7A転写物中の意図された標的A部位で観察されたカウントを用いて、C2.2/(C1.2+C2.2)として推定した。これらの値は、表5に"編集収率"の欄に示されている。参照組立体hg38を選択した後、以下の配列をBLATに提出し、意図された標的A部位の1塩基ゲノム座標は、chr3：128814202であることが見いだされた。
AGCGGCAGTATTCTGTACAGTAGACACAAGAATTATGTACGCCTTTTATCA(配列番号：15l)
【０３５５】
図8-GluR2 adRNAの遺伝子操作：足場ドメインの遺伝子操作。adRNA足場の配列情報：ADARをリクルートするドメイン、アンチセンスRNA標的化ドメイン、及び強調されたシトシンミスマッチ。安定化された足場を作り出すために変異された塩基対は、番号付けされ、赤色で強調表示され、また、編集誘導要素モチーフは緑色に示されている。サンガー配列決定により定量されたOTCレポーター転写物のための産生された足場の編集効率の定量が示されている。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。HEK 293T細胞において実験を行った。
【０３５６】
図34-GluR2 adRNAの遺伝子操作：アンチセンスドメイン遺伝子操作(a)adRNA足場2を用いたadRNAアンチセンス領域の最適化：長さ及びADAR2リクルート領域からの距離を系統的に変化させた。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(b)漸進的に長いアンチセンスドメイン長を有するU6プロモーターに転写されたadRNAを、0、1つまたは2つのGluR2ドメインと組み合わせて、外因性ADAR2発現を含む、または含まない標的RNA編集を誘導する能力について評価した。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。該データの一部を図1Bに再利用する。HEK 293T細胞中で上記の全ての実験を行った。(c)HEK 293T細胞及びHeLa細胞株における内因性ADAR1及びADAR2(GAPDHに対する)の発現の実験的確認。観察されたレベルは、ヒトタンパク質atlasに記載されているレベルと類似していた(world-wide-webのproteinatlas.orgを参照されたい)。
【０３５７】
図35-MS2 adRNAの遺伝子操作(a)MS2 adRNAのアンチセンスRNA標的化ドメインの系統的評価。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(b)MCP-ADAR2 DD-NLSによるオンターゲットRNA編集は、MS2 adRNAの共発現を必要とする。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。HEK 293T細胞において実験を行った。
【０３５８】
図36-標的パネルにわたるRNA編集収率の分析。(A)GluR2 adRNA及びMS2 adRNA誘導RNA編集構築物とCas13bベースの修復構築物によるOTCレポーター転写物のRNA編集効率の比較。値は、平均+/-SEM(レポーター及びCas13bベース構築物の場合n=6、他の構築物の場合n=3)を表す。(B)外因性ADAR2発現を含むまたは含まないmRNAパネルに対して、化学的に合成されたadRNAバージョンを試験した。正確な化学修飾は、adRNAの供給源と共に図に記載されている。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(C)発現レベルの範囲をカバーするように選択された内因性標的のスペクトルにわたるRNA編集収率の分析。0または2つのGluR2ドメインを有するU6で転写された長いadRNAも、外因性ADAR2発現を含む、または含まない複数の内因性mRNA標的に対して評価された。外因性ADAR2発現がない場合であっても、試験された遺伝子座部位での編集が観察される。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。HEK 293T細胞において実験を行った。
【０３５９】
図37-ADAR2変異体及び編集及び特異性に対するそれらの影響。(A)オンターゲットRNA編集、及びGluR2 adRNA及びMS2 adRNA誘導RNA編集構築物及びCas13bベースの修復構築物によるRAB7A転写物の隣接するアデノウイルスにおける編集の比較。平均(n=3)の編集収率が示されている。実験は、HEK 293T細胞において行い、編集効率は、サンガーピーク高さの比G/(A+G)として算出した。(B)ADAR2(E488Q)は、spfashOTCレポーター転写物(p=0.37、不対t検定、両側)のin vitro編集において、ADAR2よりも高い効率を示す。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(C)mdx DMDレポーター転写物(それぞれp=0.048、r=0.012、不対t検定、両側);値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(D)OTCレポーター転写物(上のパネル)及び内因性RAB7A転写物(下のパネル)のためのADAR2、ADAR2(E488Q)及びADAR2(Δ1〜138)の編集効率及び特異性プロファイルの比較。ヒートマップは、標的(赤色矢印)の近傍におけるA->G編集を示す。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。実験は、HEK 293T細胞で行い、編集効率は、サンガーピーク高さの比G/(A+G)として算出した。
【０３６０】
図38-RNA編集アプローチのトランスクリプトームスケール特異性プロファイル(Cas13b-ADAR修復+/-gRNA)。各Cas13b-ADAR2構築物で観察したトランスクリプトーム-ワイドA->G編集収率(y軸)と対照試料で観察した収率(x軸)と比較する2Dヒストグラム。各ヒストグラムは、リード範囲が少なくとも10であって、かつ少なくとも1つの推定編集イベントが少なくとも1つの試料に検出された8,729,464の参照部位の同じセットを表す。赤色で強調されたビンは、処理試料を対照試料と比較すると、A->Gの編集収率の有意な変化を有する部位を含む。各プロットにおける赤色のクロスは、最小の調節されたp値を有する100個の部位を示す。青色の円は、RAB7A転写物内の意図された標的A部位を示す。左下隅付近のビンの大きなカウントは、試験及び対照試料の両方における低い編集収率のみならず、配列誤差及び整列誤差にも対応する可能性が高い。各プロットの右上角付近のビンにおける大きなカウントは、ホモ接合性の単一ヌクレオチド多型(SNP)、ならびに参照ゲノムと実験に使用されるHEK 293T細胞株のゲノムとの間の他の差異に対応する可能性が高い。
【０３６１】
図39-RNA編集アプローチ(ADAR2+/-adRNA)のトランスクリプトームスケール特異性プロファイル。これらの研究に使用されるバージョンは、GluR2 adRNA（l.20,6）である。各ADAR構築物で観察されたトランスクリプトーム-ワイドA->G編集収率(y軸)と対照試料で観察された収率(x軸)と比較する2Dヒストグラム。より詳細は、図38に提供される。
【０３６２】
図40-RNA編集アプローチ(MCP-ADAR1 DD+/-adRNA)のトランスクリプトームスケール特異性プロファイル。各ADAR構築物で観察されたトランスクリプトーム-ワイドA->G編集収率(y軸)と対照試料で観察された収率(x軸)と比較する2Dヒストグラム。より詳細は、図38に提供される。
【０３６３】
図41-RNA編集アプローチ(MCP-ADAR2 DD+/-adRNA)のトランスクリプトームスケール特異性プロファイルを示す。各ADAR構築物で観察されたトランスクリプトーム-ワイドA->G編集収率(y軸)と対照試料で観察された収率(x軸)と比較する2Dヒストグラム。より詳細は、図38に提供される。
【０３６４】
図42-構築物の特徴に伴うトランスクリプトームスケール編集特異性の変化。(A)ボックスプロット内の各点は、図32に列挙されたMCP-ADAR構築物のうちの1つについての編集された部位の画分に対応する。各構築物についての編集された部位の画分は、A→G編集収率の有意な変化を有する参照部位の数(表3を参照)を考慮された参照部位の合計数8,729,464で割ることによって計算された。水平軸上に示された構築物の特徴を、Mann-Whitney U試験を用いて比較した。得られたp値が、NLS対NESの場合は0.16であり、ADAR1対ADAR2の場合は0.0070であり、"-adRNA"対"+adRNAの場合0.72であり、また"ADAR WT"対"ADAR E>Q"の場合、0.038である。(全ての条件についてn=8)(B)各構築物で観察したトランスクリプトーム-ワイドA->G編集収率(y軸)を対照試料で観察した収率(x軸)と比較する2Dヒストグラム。より詳細は、図38に提供される。挿入図は、対照試料と比較して、少なくとも1つの処置試料が有意な変化(フィッシャー直接検定、FDR=1%)を有することが見出された参照部位において観察された、A->Gの編集収率の分布を表すバイオリンプロットを示す。青色の円は、RAB7A転写物内の標的A部位における編集収率を示す。分布の形状をよりよく可視化するために、y軸に沿ったそれらの最大範囲をプロットにわたって均一化し、60%の収率で切断した。ここで、試料は、外因性及び/または内因性ADARリクルートによるRNA編集を可能にすることができるadRNAを有する長いアンチセンスドメインで遺伝子導入された293Tsに対応する。
【０３６５】
図43-は、mdxマウスにおいてin vitro及びin vivoでのジストロフィンRNA編集実験の最適化及び評価。(A)遺伝子操作されたadRNAまたは逆向きのadRNA(raRNA)と共に全長ADAR2を利用したRNA編集の概略；(ii)一段階及び二段階において、アンバー及びオーカー終止コドンのRNA編集効率。HEK 293T細胞中で実験を行った。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(B)オーカーコドンのRNA編集は、GFP発現を修復するために、adRNAまたはradRNAのアンチセンスRNA標的化ドメインにおける2つのシトシンミスマッチを必要とする。HEK 293T細胞中で実験を行った。値は、平均+/-SEM(n=3)を表す。(C)adRNA及びADAR2のin vivo送達のために利用されるAAVベクターの概略、ならびに、AAVベクター(それぞれp=0.0003、r=0.0001、p=0.00l5、t検定、両側)を介して送達される、adRNAの1つまたは2つのコピーの存在下でのアンバー及びオーカー終止コドンのRNA編集のin vitro最適化。HEK 293T細胞中で実験を行った。値は、平均+/-SEM(レポーターについてn=3、他の条件についてn=6)を表す。(D)mdx DMDレポーター転写物(NGSによって定量化)中のオーカー終止コドン(TAA->TGG)の編集を示す代表的なサンガー配列決定プロット。HEK 293T細胞(n=3)中で実験を行った。(E)処理されたmdxマウス(NGSを用いて定量化)のin vivo RNA編集解析の代表例。
【０３６６】
図44-mdxマウスにおけるin vivoジストロフィンRNA編集実験の免疫蛍光及びウェスタンブロット分析。(A)TA筋肉におけるジストロフィンの免疫蛍光染色は、処理された試料(AAV8-ADAR2、AAV8-ADAR2(E488Q)、AAV8-MCP-ADAR1(E1008Q)NLSの筋肉内注射)における発現の部分的な修復を示す。nNOSの部分的な修復は、局在的で、処理された試料においても見られる(スケールバー：250μm)。(B)編集機の両方の成分、酵素及びadRNAが注入されたmdxマウスのTA筋肉におけるジストロフィン発現の部分的な修復(1〜2.5%)、及び注射後8週間までの注射されたTA筋肉における安定なADAR2発現を示すウェスタンブロット。(C)AAV8-CRISPRを用いたジストロフィン発現の部分的な修復(10%)を示すウェスタンブロット。
【０３６７】
図45-spfashマウスにおいてin vitro及びin vivoでのOTC RNA編集実験の最適化及び評価。(A)spfashOTCレポーター転写物(NGSを用いて定量化)における点変異の補正を示す代表的なサンガー配列プロット。HEK 293T細胞(n=3)中で実験を行った。(B)正確にスプライスされたOTC mRNA(NGSを用いて定量)における点変異の補正を示す、処理されたspfashマウスのin vivo RNA編集解析の代表例。(C)処理された成体spfashマウス（AAV8-ADAR2及びAAV8-ADAR2(E488Qの後眼窩注射)の肝臓におけるOTCプレmRNAにおけるin vivo RNA補正効率。値は、平均+/-SEM(それぞれn=4、4、3、3、4、5の単独動物)を表す。(D)正確、及び不正確にスプライスされたOTC mRNAを示すPCR産物。不正確にスプライスされたmRNAは、48塩基対だけ伸長される。adRNA+ADAR2(E488Q)で処理したマウスにおいて、不正確にスプライスされたmRNAの画分が減少する。(E)OTCのウエスタンブロットは、処理された成体spfashマウスにおける発現の部分的な修復(2.5%〜5%)、及び注射3週間後の安定なADAR2(E488Q)発現を示す。
【０３６８】
図46-in vivo RNA編集実験の毒性分析。AAV投与の経路、送達された構築物、及び注射後3週間の注射されたマウスの健康状態をまとめた動物実験の要約。
実施例5
【０３６９】
本明細書では、ADAR1(MCP-ADAR1(E100Q)に含まれる)のE100Q変異体を用いたデュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにおける実験の結果が開示される。いくつかの場合において、該変異体は、ADAR2及びADAR2のE488Q変異体と比較して、in vivoでの編集収率を改善することができる。さらに、本明細書では、イントロン中のスプライス受容体部位または分岐点を編集することによってスプライシングパターンを変化させ、それによってエクソンスキッピングをもたらすような方法でのADARシステムを適用が開示される。また、APOBECを使用する方法が企図され、例示される。本明細書では、ACF-APOBEC複合体が目的のmRNAにおいて結合するアリポタンパク質B mRNAの局所構造の生成がC→T RNA編集を可能にする例が示されている。さらに、本明細書では、RNA及びDNAの両方のプログラム可能な編集のためのADAR酵素を利用する方法が開示される。
【０３７０】
ADAR編集システムを、外因性ADAR1またはADAR2を含むまたは含まないで利用してadRNAを生成することができる。実施例は、与えられた標的に目的の特定のadRNAを提供した。さらに、本明細書では、第1及び最後の3、6、9、または12ヌクレオチドにおける2'-O-メチル3'ホスホチオレート修飾を有する化学合成されたadRNAの例が提供され、及び/またはGalNc、またはコレステロール、または細胞浸透ペプチドのような標的化部分と結合する、ミスマッチ部位(下に下線を付した)を中心とする3ヌクレオチドを除くアンチセンス領域全体にわたる2'-O-メチル修飾は、細胞またはin vivo(特に、肝臓、肺及び脳において)における外因性ADAR1/2過剰発現を伴うまたは伴わない標的RNA編集の遺伝子操作に使用することができる。
一般設計：
【０３７１】
adRNA22:  GTGGAAgAGgAgAACAATATGCTAAATGTTGTTcTcGTcTCCCACNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNN (配列番号：152)
【０３７２】
adRNA32: GGTGTCGAGAAgAGgAgAACAATATGCTAAATGTTGTTcTcGTcTCCTCGACACCNNNNNNCNNNNNNNNNNNNNN (配列番号：153)
【０３７３】
具体例：
【０３７４】
adRNA22_RAB7A: GTGGAAgAGgAgAACAATATGCTAAATGTTGTTcTcGTcTCCCACTGCCGCCAGCTGGATTTCCC (配列番号：154)
【０３７５】
adRNA32_RAB7A: GGTGTCGAGAAgAGgAgAACAATATGCTAAATGTTGTTcTcGTcTCCTCGACACCTGCCGCCAGCTGGATTTCCC (配列番号：155)
【０３７６】
adRNA22_CKDN2A: GTGGAAgAGgAgAACAATATGCTAAATGTTGTTcTcGTcTCCCACCTCCTCCACCCGACCCCGGG (配列番号：156)
【０３７７】
adRNA32_CKDN2A: GGTGTCGAGAAgAGgAgAACAATATGCTAAATGTTGTTcTcGTcTCCTCGACACCCTCCTCCACCCGACCCCGGG (配列番号：157)
【０３７８】
以下に提供される実施例は、本明細書に開示された実施形態をさらに明確にすることで行われる多数の工程を記載する。例えば、
(1)mdxマウスのジストロフィン転写物中の未熟な終止コドンを標的とするMS2-adRNAを用いてMCP-ADAR構築物を送達する；
(2)ADAR2/ADAR2(E488Q)と共に送達されたadRNA、またはMCP-ADAR1/ADAR(E1008Q)と共に送達されたMS-adRNA、またはスプライス部位でA→G置換の産生に用いられる、MCP-ADAR2/ADAR2(E488Q)と共に送達されたms-adRNAを用いて、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにおける点変異の産生を介してエクソンスキッピングを試験する；
(3)spc-ashマウスのOTC転写物におけるスプライス部位変異の編集を試験する；
(4)オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症のspf-ashマウスモデルにおけるスプライシングパターンを変更するための変異スプライス部位の編集を試験する；
(5)スプライス部位にA→G置換を産生して、SCN9A転写物をノックダウンさせることにより、マウスSCN9A転写物を標的化し、疼痛に対する感受性を遺伝子操作する；
(6)APOBEC gRNAを遺伝子操作し、目的の標的mRNAにおいて、アリポタンパク質B mRNAの局所的な構造を産生する；及び、
(7)RNA、DNA、及びRNA-DNAハイブリッドを利用してRNA及びDNAを編集する際のADARを試験し、ADARをリクルートする。
【０３７９】
これらの例では、MS2-adRNA及びMCP-ADAR1(E1008Q)を使用して、mdxマウスのジストロフィン転写物中の未熟な終止コドンを編集しながら、増強されたRNA収率及びタンパク質発現が達成されたことが観察された。ADAR2(E488Q)をadRNAで送達すると、spf-ashマウスモデルにおける不正確にスプライスされたOTC mRNAの減少も確認された。
【０３８０】
従って、本開示は、RNAの部位特異的A->G編集を可能にすることができるシステムを記載する。このようなアプローチは、スプライス受容部位及び分岐点を編集してスプライシングを変更するために使用することができる。これは、エクソンスキッピングを可能にすることもできる。さらなる実施形態は、DNAのA->G編集の使用を意図している。また、本開示では、ACF1と共に発現されるAPOBEC1の使用を介して、RNAにおけるC->T編集の可能性が提供される。
【０３８１】
本開示は、in vivoでの第1部位特異的RNA編集を記載する。実際、MCP-ADAR1(E1008Q)の利用は、筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにおける従来の構築物よりも高い編集効率を示す。さらなる試験は、in vitro及びin vivoの両方において、(1)スプライシングを変更するためのRNA編集、ならびに(2)ACF及び(3)DNAを編集するためのADARの過剰発現と共にAPOBECを介したC->T編集の有効性を検討する。
【０３８２】
他のADAR2システム(例えば、Stafforst、Zhang、及びRosenthal labs)及びスプライシングのCasl3dに基づく阻害と比べると、本ADARシステムが独特である。
【０３８３】
本明細書に記載されるように、該ADARシステムは、標的RNAに相補的なRNA標的化ドメイン、及びADARのリクルートを可能にする1つまたは複数のADARをリクルートするドメインを含むか、または本質的にそれより構成されるか、またはさらにそれから構成される。これらの成分を導入する際に、ADAR酵素は、標的アデノシンのイノシンへの変換を触媒することができ、それにより、点変異を修復する。本開示は、ADAR2またはMCP-ADAR1/2-NLSまたはそれらの高活性変異体を使用して、スプライス受容部位及び/またはイントロンでの分岐点でA->G編集を産生して、エクソンスキッピングを遺伝子操作することを記載している。対称エキソンをスキップすることにより、切断されたタンパク質が形成される。この方法は、該エキソン中の未熟な終止コドンを有するDMDのmdxマウスモデルのジストロフィン転写物中のエクソン23をスキップするために使用することができる。エクソン23をスキップすることにより、機能的な切断されたジストロフィンタンパク質の翻訳がもたらされる。また、非対称エキソンをスキップすることは、フレームシフト突然変異を導く。このように、必須エキソンまたは非対称エキソンをスキップすることにより、遺伝子ノックダウンを遺伝子操作することが可能である。また、開始コドンATG及びKozak/Shine-Dalgarno配列の編集はまた、翻訳効率を変化させるのを助け、遺伝子のノックダウンをもたらすることができる。エクソンスキッピング法を用いて、SCN9A転写物を標的化して、疼痛に対する感受性を遺伝子操作することができる。ACF-APOBEC複合体が結合するアポリポタンパク質BmRNAの局所構造は、目的のmRNA標的で、編集するCをアポリポタンパク質B mRNAの天然部位に類似した位置に注意深く配置するために産生できる。これは、1対のadRNAの過剰発現により達成され、MCP-ACF1及びAPOBEC1の過剰発現によって編集され得るアポリポタンパク質B mRNA様構造を産生する。
実施例6-スプライス受容体及び/または分岐点変異の産生を介したエクソンスキッピング
【０３８４】
本開示は、ADAR2またはMCP-ADAR1/2-NLSまたはそれらの高活性変異体を使用して、イントロンにおけるスプライス受容部位及び/または分岐点でA->G編集を産生して、エクソンスキッピングを遺伝子操作することを実証する。対称エキソンをスキップすることにより、切断されたタンパク質が形成される。本実施例では、この方法は、該エキソン中の未熟な終止コドンを有するDMDのmdxマウスモデルのジストロフィン転写物中のエクソン23をスキップするために使用することができる。エクソン23をスキップすることにより、機能的な切断されたジストロフィンタンパク質の翻訳がもたらされる。また、非対称エキソンをスキップすることは、フレームシフト突然変異を導く。このように、必須のエキソンまたは非対称エキソンをスキップすることにより、遺伝子ノックダウンを遺伝子操作することが可能である。また、開始コドンATG及びKozak/Shine-Dalgarno配列の編集は、翻訳効率を変化させるのを助け、遺伝子のノックダウンをもたらす。この方法を用いて、SCN9A転写物を標的化して、疼痛に対する感受性を遺伝子操作することができる。
【０３８５】
この目的を達成するための例示的な配列を以下に示す。
【０３８６】
配列セット1：例示的なadRNA配列
【０３８７】
mdxマウスにおいてジストロフィン転写物におけるエクソン23スキッピングのためのadRNA配列(配列番号：158〜159)。
2021536244.tif 000019
【０３８８】
mdxマウスにおいてジストロフィン転写物におけるエクソン23スキッピングのためのMS2-adRNA配列(配列番号:160〜161)
2021536244.tif 000020
【０３８９】
mdxマウスにおける未成熟な終止コドンを編集するためのMS2-adRNA配列（配列番号：162)
2021536244.tif 000021
【０３９０】
マウスにおいてSCN9A転写産物におけるエクソンスキッピングのためのadRNA配列(配列番号:163〜167)
2021536244.tif 000022
【０３９１】
マウスにおいてSCN9A転写産物におけるエクソンスキッピングのためのMS2-adRNA配列(配列番号:168〜172)
2021536244.tif 000023
2021536244.tif 000024
実施例7-APOBECを介したC→T編集
【０３９２】
ACF-APOBEC複合体が結合するアポリポタンパク質B mRNAの局所構造は、目的のmRNA標的において、編集するCをアポリポタンパク質BmRNAの天然に存在する部位に類似した位置に注意深く配置するために産生できる。これは、1対のgRNAの過剰発現によって達成され、以下の組み合わせのうちの1つまたは複数の過剰発現によって編集され得るアポリポタンパク質B mRNA様構造を産生する：
1. MCP-ACF1及びAPOBEC1
2. MCP-ACF1及びMCP-APOBEC1
3. MCP-リンカー-ACF-リンカー-APOBEC1
4. MCP-APOBEC1及びACF1
【０３９３】
配列セット2：例示的なC→T編集配列
【０３９４】
C→T編集のためのMS2-adRNA配列(配列番号：173〜174)
2021536244.tif 000025
実施例8-癌に関連する点変異の産生
【０３９５】
癌経路に関与するいくつかの遺伝子は、単一のアミノ酸置換を有する。優性のネガティブ変異体、構成的に活性な変異体及び触媒的に不活性な変異体の生成は、これらの遺伝子のmRNA配列においてA->G置換を産生することによって可能である。これらの遺伝子のいくつかは、KRAS、HRAS、JAK2、GSK3β、β-カテニン、SmoM2、capa3、Caspase 8、TGF-β、p53を含む。
実施例9-DNA/RNAハイブリッドのDNA及び両鎖を編集する。 
【０３９６】
ADARは、二本鎖RNAならびにDNA-RNAハイブリッドの両方の鎖を編集することが示されているので、一本鎖DNAまたはDNA-RNAハイブリッドを介してADARをリクルートし、DNA及びRNAの両方を編集することが可能である。これを用いて、Cas9（またはCpf1）-ADAR-デアミナーゼドメイン融合体（ADAR1、ADAR2及びそれらの触媒活性変異体（E1008Q）及びE488Q）に対する現在のアデニン塩基編集アプローチを改変でき、また、現在の塩基編集者がssDNA置換鎖を標的にする代わりに、A-Cバルジを持つgRNA結合鎖を、理想的にはgRNAの5'末端に近い最初の10bpで標的にすることができる。
実施例10-オルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症
【０３９７】
spfashマウスにおいて、ADAR2(E488Q)はadRNAと共に送達された。正確にスプライスされたmRNAに加えて、spfashマウスは、不正確にスプライスされ、伸長されたmRNA変異体を有し、これは、クリプトススプライス部位、48塩基対のエクソン4への使用により形成される。ADAR2(E488Q)をadRNAで送達すると、不正確にスプライスされた産物の減少が確認された。スプライスされたmRNAにおいて33.9%までの高効率のRNA編集収率も観察された。最大8%のプレmRNA収率が観察された。注射後3週間以内に、2.5〜5%のタンパク質修復も観察された。これは、スプライス部位突然変異の修正及びスプライシングパターンの変更におけるRNA編集の有用性を実証している。(図50A〜D)
実施例11-デュシェンヌ型筋ジストロフィー
【０３９８】
mdxマウスにおいてMCP-ADARl(E008Q)をMS2-adRNAで試験した。増強されたRNA編集収率及びADAR2及びADAR2（E488Q）酵素を介したジストロフィン発現の修復が観察された(図51A〜B)。
同等物
【０３９９】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この技術が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【０４００】
本明細書に例示的に説明される技術は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の要素、制限の有無にかかわらず適切に実施することができる。このように、例えば、"から成る"、"含む"、"含有する"等の用語は、広範かつ制限なく読むものとする。また、本明細書で使用される用語及び表現は、説明の用語として使用されており、限定ではない。また、そのような用語や表現を用いて、表示及び説明されている機能またはその一部に相当するものを除外する意図はない。しかし、主張された技術の範囲内で様々な改変が可能であることが認識されている。
【０４０１】
従って、本明細書で提供される材料、方法、及び実施例は、好ましい態様を表すものであり、例示的なものであり、本技術の範囲に限定されるものではないことを理解されたい。
【０４０２】
本明細書では、本技術が広く一般的に記載されている。一般的な開示に含まれるより狭い種及び亜一般的な群のそれぞれもまた、本技術の一部を形成する。これには、切り取った材料が本明細書に具体的に記載されているかどうかに関係なく、属から主題を削除するという但し書きまたは否定的な制限を伴う技術の一般的な説明が含まれる。
【０４０３】
また、本技術の特徴または態様がMarkushグループに関して記載されている場合、当業者は、本技術が、Markushグループのメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。
【０４０４】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それぞれが参照により個々に組み込まれている場合と同じ程度に、その全体が明示的に組み込まれている。矛盾が生じる場合には、定義を含む本明細書に準じるものとする。
具体的な実施形態
【０４０５】
本明細書には、多数の組成物、方法及びシステムが開示されている。これらの組成物、方法及びシステムの具体的な実施形態の例を以下に開示する。
【０４０６】
第1部
【０４０７】
実施形態1.標的RNAに相補的な配列を含む、遺伝子操作されたADAR1またはADAR2ガイドRNA("adRNA")。
【０４０８】
実施形態2.GluR2 mRNAに由来するADAR2をリクルートするドメインをさらに含む、実施形態1の遺伝子操作されたadRNA
【０４０９】
実施形態3.標的RNAに相補的な配列に隣接する2つのMS2ヘアピンをさらに含む、実施形態1の遺伝子操作されたadRNA。
【０４１０】
実施形態4.標的RNAに相補的な配列が、約20〜100個の塩基対を含む、実施形態1〜3のいずれか1つの遺伝子操作されたadRNA。
【０４１１】
実施形態5.GluR2 mRNA由来のADAR2をリクルートするドメインが、遺伝子操作されたadRNAの5'末端または3'末端に配置されている、実施形態2または4の遺伝子操作されたadRNA。
【０４１２】
実施形態6.遺伝子操作されたadRNAの5'末端及び3'末端の両方にGluR2 mRNAを含む、実施形態5の遺伝子操作されたadRNA。
【０４１３】
実施形態7.編集誘導要素をさらに含む、実施形態5または6の遺伝子操作されたadRNA。
【０４１４】
実施形態8.前記標的RNAが、オルニチントランスカルバミラーゼである、前記実施形態のいずれかの遺伝子操作されたadRNA。
【０４１５】
実施形態9.表1または図2に示される配列の群から選択されるポリヌクレオチド配列、またはその等価物によってコードされる、遺伝子操作されたADAR2ガイドRNA("adRNA")。
【０４１６】
実施形態10.実施形態1〜9のいずれか1つの遺伝子操作されたadRNAをコードする、単離されたポリヌクレオチド、またはそのいずれかの等価物。
【０４１７】
実施形態11.1つまたは複数の実施形態10の単離されたポリヌクレオチド、または実施形態9の遺伝子操作されたadRNAをコードするポリヌクレオチド配列、及び任意に、単離されたポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含む、ベクター。
【０４１８】
実施形態12.前記調節配列が、プロモーター、促進要素及び/またはレポーターを含む、実施形態11のベクター。
【０４１９】
実施形態13.前記プロモーターが、ヒトU6、マウスU6プロモーターまたはCMVプロモーターである、実施形態12のベクター。
【０４２０】
実施形態14.検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む、実施形態11〜13のいずれか1つのベクター。
【０４２１】
実施形態15.前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、実施形態14のベクター。
【０４２２】
実施形態16.前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ関連ウイルスベクターからなる群から選択される、実施形態15のベクター。
【０４２３】
実施形態17. 前記遺伝子操作されたadRNAが、組換えで発現される、実施形態11〜16のいずれか1つのベクターをさらに含む、組換え細胞。
【０４２４】
実施形態18.担体、及び実施形態1〜9のいずれか1つの遺伝子操作されたadRNAの1つまたは複数を含む組成物、実施形態10の単離されたポリヌクレオチド、実施形態11〜16のいずれか1つのベクター、または実施形態17の組換え細胞。
【０４２５】
実施形態19.化学療法剤または薬剤をさらに含む、実施形態18の組成物。
【０４２６】
実施形態20.前記担体が、薬学的に許容される担体または固体支持体である、実施形態18または19の組成物。
【０４２７】
実施形態21.タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、実施形態1〜9のいずれか1つの遺伝子操作されたadRNAと接触させることを含む、タンパク質発現を改変する方法。
【０４２８】
実施形態22.前記接触が、in vitroまたはin vivoでの接触ある、実施形態21に記載の方法。
【０４２９】
実施形態23.そのような処置を必要とする被験者に、有効量の、1つまたはそれ以上の実施形態1〜9のいずれかの遺伝子操作されたadRNAを投与することを含む、異常なタンパク質発現に関連する疾患または障害を治療する方法。
【０４３０】
実施形態24.前記疾患または障害が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、実施形態23に記載の方法。
【０４３１】
実施形態25.前記被験者が、動物である、実施形態23または24の方法。
【０４３２】
実施形態26.前記動物が、哺乳動物である、実施形態23または24の方法。
【０４３３】
実施形態27.異常なタンパク質発現に関連する疾患または障害を治療するための、有効量の、1つまたはそれ以上の実施形態1〜9のいずれかの遺伝子操作されたadRNAの使用。
【０４３４】
実施形態28.前記疾患または障害が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、実施形態27の使用。
【０４３５】
実施形態29.実施形態1〜9のいずれか1つの遺伝子操作されたadRNA、実施形態10の単離されたポリヌクレオチド、実施形態11〜16のいずれか1つのベクター、実施形態17の組換え細胞、または実施形態18〜20のいずれか1つの組成物、及び使用のための取扱説明書を含むキット。
【０４３６】
実施形態30.前記取扱説明書が、実施形態21〜26のいずれか1つの方法を説明する、実施形態19のキット。
【０４３７】
実施形態31.高度に厳密な条件下で相補的なポリヌクレオチドにハイブリッド形成される、実施形態1〜9のいずれか1つのadRNAを含む複合体。
【０４３８】
第2部
【０４３９】
実施形態1.標的RNAに相補的な配列、及びGluR2 mRNAに由来のADAR2をリクルートするドメインを含む、遺伝子操作されたADAR2ガイドRNA("adRNA")。
【０４４０】
実施形態2.前記標的RNAに相補的な配列が、約20〜100個の塩基対を含む、実施形態1の遺伝子操作されたadRNA。
【０４４１】
実施形態3.前記GluR 2mRNAに由来のADAR2をリクルートするドメインが、遺伝子操作されたadRNAの5'末端または3'末端に配置されている、実施形態1または実施形態2の遺伝子操作されたadRNA。
【０４４２】
実施形態4.遺伝子操作されたadRNAの5'末端及び3'末端の両方にGluR2 mRNAを含む、実施形態3の遺伝子操作されたadRNA。
【０４４３】
実施形態5.前記標的RNAが、オルニチントランスカルバミラーゼである、上記実施形態のいずれかの遺伝子操作されたadRNA。
【０４４４】
実施形態6.表1または図2に示される配列の群から選択される配列によってコードされる遺伝子操作されたADAR2ガイドRNA("adRNA")。
【０４４５】
実施形態7.タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、実施形態1〜6のいずれか1つの遺伝子操作されたadRNAと接触させることを含む、タンパク質発現を改変する方法。
【０４４６】
実施形態8.前記接触が、in vitroまたはin vivoでの接触である、実施形態7の方法。
【０４４７】
実施形態9.そのような処置を必要とする被験者に、有効量の、実施形態1〜6のいずれか1つの遺伝子操作されたadRNAを投与することを含む、異常なタンパク質発現に関連する疾患または障害を治療する方法。
【０４４８】
実施形態10.前記被験者が、動物である、実施形態9の方法。
【０４４９】
実施形態11.前記動物が、哺乳動物である、実施形態9の方法。
【０４５０】
実施形態12.異常なタンパク質発現に関連する疾患または障害を治療するための、有効量の、実施形態1〜6のいずれか1つの遺伝子操作されたadRNAの使用。
【０４５１】
実施形態13.実施形態1〜6のいずれか1つの遺伝子操作されたadRNA、及び使用のための取扱説明書を含む、キット。
【０４５２】
実施形態14.前記取扱説明書が、実施形態7または実施形態9の方法を説明する、実施形態13のキット。
【０４５３】
実施形態15.実施形態1〜6のいずれかのadRNA及び担体を含む、組成物。
【０４５４】
実施形態16.前記担体が、薬学的に許容される担体である、実施形態15の組成物。
【０４５５】
実施形態17.高度に厳密な条件下で相補的なポリヌクレオチドにハイブリッド形成される、実施形態1〜6のいずれか1つのadRNAを含む、複合体。
【０４５６】
第3部
【０４５７】
実施形態1.adRNAを標的とするスプライス受容体、及び/またはイントロン中の分岐点、及び任意にADAR酵素を含む、エクソンスキッピングのためのADARシステム。
【０４５８】
実施形態2.前記ADAR酵素が、ADAR1、ADAR2、またはそれらの変異株または変異体である、実施形態1のADARシステム。
【０４５９】
実施形態3.前記変異株または変異体が、ADAR1(E1008Q)及びADAR2(E488Q)から選択される、実施形態2のADARシステム。
【０４６０】
実施形態4.前記イントロンが、ジストロフィン、SCN9A、またはオルニチントランスカルバミラーゼから選択される遺伝子に含まれる、実施形態1〜3のいずれか1項のADARシステム。
【０４６１】
実施形態5.前記adRNAが、配列セット1から選択される、実施形態1〜4のいずれか1項のADARシステム。
【０４６２】
実施形態6.実施形態1〜5のいずれか1項のADARシステムを投与することを含む、異常な遺伝子発現を特徴とする疾患、障害、または状態を治療する方法。
【０４６３】
実施形態7.前記疾患、障害、または状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはオルニチントランスカルバミラーゼ欠乏症から選択される、実施形態6の方法。
【０４６４】
実施形態8.前記疾患、障害、または状態が、疼痛に関連する、実施形態6または実施形態7の方法。
【０４６５】
実施形態9.アリポタンパク質B mRNA様構造、及び任意にAPOBEC酵素を産生する1対のgRNAを含む、シトシン→チミン編集のためのAPOBECシステム。
【０４６６】
実施形態10.前記1対のgRNAが、配列セット2に示された配列対である、実施形態9のAPOBECシステム。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２８−４】
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【図２８−５】
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【図２８−６】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ−Ｃ】
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【図３７Ａ−Ｄ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
2021536244.tif 000084
【図４２Ａ−Ｂ】
2021536244.tif 000085
【図４３Ａ−Ｅ】
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【図４４Ａ−Ｃ】
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【図４５Ａ−Ｅ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
2021536244.tif 000093
【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図５０Ａ−Ｄ】
2021536244.tif 000096
【図５１Ａ−Ｂ】
2021536244.tif 000097
【図５２】
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【配列表】
2021536244000001.app
【国際調査報告】
2021536244.tif 000099
2021536244.tif 000100
2021536244.tif 000101
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