(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのプロバイオティクス株、およびグルタミン、グルタミン酸もしくはその塩、抱合型グルタミン、または長さ２〜１０アミノ酸単位のオリゴペプチドから選択される少なくとも１つのアミノ酸もしくはその誘導体を含み、前記アミノ酸単位は天然アミノ酸であり、少なくとも１つのアミノ酸単位はグルタミンもしくはグルタミン酸単位である、シンバイオティクス調製物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス株、ならびに
−  グルタミン、グルタミン酸もしくはその塩、抱合型グルタミン、または長さ２〜１０アミノ酸単位のオリゴペプチドから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含み、前記アミノ酸単位は天然アミノ酸であり、少なくとも１つのアミノ酸単位はグルタミンもしくはグルタミン酸単位である、
調製物。
【請求項２】
プロバイオティクス株が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５９２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＤＳＭ３２５３９から選択される、請求項２に記載の調製物。
【請求項３】
オリゴペプチドがさらにアラニンまたはグリシンを含む、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項４】
オリゴペプチドが、グリシン−グルタミン、グリシン−グルタミン酸、アラニン−グルタミン、アラニン−グルタミン酸およびそのアセチル化型から選択されるジペプチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項５】
プロバイオティクス株およびアミノ酸またはオリゴペプチドの総量が、調製物の総重量の少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％、最も好ましくは少なくとも７０重量％である、請求項１から４のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項６】
調製物が腸溶コーティングを含み、腸溶コーティングが以下の、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、セルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ヒプロメロースアセテートスクシネート）、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、メチルメタクリレート−メタクリル酸コポリマー、シェラック、セルロースアセテートトリメリテート、アルギン酸ナトリウム、ゼイン、のうちの１つまたは複数を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項７】
飼料または食品サプリメントとしての、請求項１から６のいずれか一項に記載の調製物の使用。
【請求項８】
飼料または食品中のシンバイオティクス成分としての、請求項１から６のいずれか一項に記載の調製物の使用。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか一項に記載の調製物、ならびに好ましくはタンパク質、炭水化物、脂肪、さらなるプロバイオティクス、プレバイオティクス、酵素、ビタミン、免疫調節物質、代用乳、ミネラル、アミノ酸、抗コクシジウム剤、酸ベースの製品、医薬品、およびそれらの組合せから選択される少なくとも１つのさらなる飼料もしくは食品成分を含む飼料または食料品組成物。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれか一項に記載の調製物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
下痢、便秘、過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、大腸がん、腸がん、心血管疾患、動脈硬化症、脂肪肝疾患、脂質異常症、高コレステロール血症、肥満、脂肪過多症、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、慢性炎症性疾患、およびアレルギー性疾患の予防または治療に使用するための請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス株、ならびにグリシン−グルタミン、グリシン−グルタミン酸、アラニン−グルタミン、アラニン−グルタミン酸およびそのアセチル化型から選択される少なくとも１つのジペプチド、を含むカプセル。
【請求項１３】
１×１０８から２×１０１０ＣＦＵの間のプロバイオティクス株、および５０ｍｇから８００ｍｇの間のジペプチドを含む、請求項１２に記載のカプセル。
【請求項１４】
プロバイオティクス株およびジペプチドの量が、カプセル充填物の総重量の少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％、最も好ましくは少なくとも７０重量％である、請求項１２または１３に記載のカプセル。
【請求項１５】
ビタミンＡ（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノール、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチニルエステル、ならびにａｌｌ−ｔｒａｎｓ−β−カロテンおよび他のプロビタミンＡカロテノイドとして）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸または葉酸塩）、ビタミンＢ１２（コバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロールおよびトコトリエノール）、およびビタミンＫ（キノン）から選択される１つまたは複数のビタミンをさらに含む、請求項１２または１４に記載のカプセル。
【請求項１６】
硫黄、鉄、塩素、カルシウム、クロム、コバルト、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ヨウ素およびセレンから選択される１つまたは複数のミネラルをさらに含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項１７】
イヌリン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、デンプン、ペクチン、β−グルカンおよびキシロオリゴ糖から選択される１つまたは複数のプレバイオティクスをさらに含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項１８】
１つまたは複数の植物抽出物をさらに含み、植物は、好ましくは、ブロッコリー、オリーブ果実、ザクロ、カシス、ブルーベリー、ビルベリー、シーバックソーン、カムカム、ボイセンベリー、ウコン、ショウガ、ニンニク、グレープシード、アサイーベリー、アロニア、クコ、ホースラディッシュ、ボスウェリアセラータ、スピルリナ、チョウセンニンジン、カンナビジオール、ローズヒップ、プーアール、煎茶、エキナセア、および緑茶の葉、から選択される、請求項１２から１７のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項１９】
腸溶コーティングを含み、腸溶コーティングが以下の、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、セルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ヒプロメロースアセテートスクシネート）、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、メチルメタクリレート−メタクリル酸コポリマー、シェラック、セルロースアセテートトリメリテート、アルギン酸ナトリウム、ゼイン、のうちの１つまたは複数を含む、請求項１２から１８のいずれか一項に記載のカプセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのプロバイオティクス株、およびグルタミン、グルタミン酸もしくはその塩、抱合型グルタミン、または長さ２〜１０アミノ酸単位のオリゴペプチドから選択される少なくとも１つのアミノ酸もしくはその誘導体を含み、前記アミノ酸単位は天然アミノ酸であり、少なくとも１つのアミノ酸単位はグルタミンまたはグルタミン酸単位である、シンバイオティクス調製物に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管微生物叢は健康を調節するので、ヒトと動物の健康を改善するための介入の標的として浮上してきた。微生物叢を標的とした戦略には、プレバイオティクス、プロバイオティクスの適用が含まれ、さらには微生物叢の組成と活性を改変する目的での糞便移植が含まれることがある。プロバイオティクスは生きた微生物であり、適切な量を投与した場合に宿主に健康上の利益をもたらす［１］。最も一般的に研究され、市販されているプロバイオティクスは、主にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の種の微生物である。さらに、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、酵母などのいくつかの他のものも使用されている。同属および同種の異なる細菌株は、宿主に対して異なる作用を発揮する場合がある。
【０００３】
定義によれば、プロバイオティクスは、ヒト体内でのその活性を通じて宿主に利益を与えるものであり、提案されている作用機構は、宿主の微生物叢の正常化、病原体の阻害、免疫系との相互作用、およびそれら自身の代謝活性を含む。より具体的には、微生物叢組成に対する正の効果は、両群ともに厳格な極限環境微生物嫌気性菌の群に属する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＩＶ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ群としても知られている）およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩＶａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ群としても知られている）に属する分類群の増加、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩの分類群の減少を含むことができる。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｅｄｅｌｌｉ群は、クラスターＸＩに属し、肺炎、心内膜炎、関節炎、腹膜炎、および筋壊死などを引き起こす。
【０００４】
ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｕｓ属、Ｃｏｐｏｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｄｏｒｅａ属、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ属、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ属、およびＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ属に属する種を含む。ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＩＶは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＡｎａｅｒｏｆｉｌｕｍ属によって構成されている［２］。ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのような病原性種を有する。ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａおよびＩＶは、腸内微生物叢の全細菌のかなりの部分（１０〜４０％）を占めており［３］、防御機構や感染症に対する抵抗力に不可欠な役割を果たしている。
【０００５】
微生物叢の機能性は、有機酸、ジアセチル、短鎖脂肪酸、バイオサーファクタント、ガス、改変胆汁酸、ファイトケミカル、ならびにバクテリオシンおよび過酸化水素のような抗菌物質などの物質産生によって説明される。好ましい短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）としては、特に酢酸とｎ−酪酸が挙げられる。例えば、酢酸は、腸内病原体を阻害することにより健康を改善させる。
【０００６】
食餌へのいくつかの食品成分の追加は、有益な細菌を促進し得る。いわゆるプレバイオティクスは、選択的に発酵させた成分として定義されており、その結果、消化管微生物叢の組成および／または活性の特定の変化をもたらし、それによって、宿主の健康に利益を与えるものである。プレバイオティクスは多くの場合、消化管通過中にマトリックスを捕捉する役割を果たし、さらに腸内において微生物を放出し、発酵性基質として機能する［４］。大部分のプレバイオティクスは植物由来の複雑な炭水化物である。プレバイオティクスおよびプロバイオティクスは、後者の生存と代謝活性を助けるために組み合わせることができ、結果として得られる産物はシンバイオティクスのクラスに属する。シンバイオティクスとは、プロバイオティクスとプレバイオティクスとを相乗効果の形で組み合わせた食品成分または栄養補助食品のことであり、それゆえにシンバイオティクスと呼ばれている［５］。プレバイオティクスという用語の更新された定義は、「健康上の利益をもたらす、宿主微生物によって選択的に利用される基質」［６］であり、このように特定の炭水化物だけでなく、例えばアミノ酸やペプチドも指している。
【０００７】
食品サプリメントとは、通常の食餌を補うことを目的とした、栄養学的または生理学的効果を持つ栄養素または他の物質の濃縮供給源のことである（ｗｗｗ．ｅｆｓａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｅｎ／ｔｏｐｉｃｓ／ｔｏｐｉｃ／ｆｏｏｄ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）。例えば、Ｌ−グルタミンについては、経口補給が体重過多のヒトの腸内微生物叢の組成を変化させ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門とＢａｃｔｅｒｉｏｄｅｔｅｓ門の比率を減少させることが記載されており、これは減量プログラムでも観察されている［７］。微生物叢の活性に有利な効果は、酢酸とｎ−酪酸の産生を増加させ、イソ酪酸やイソ吉草酸などの分岐鎖短鎖脂肪酸の産生を減少させることであり得る。ｎ−酪酸は、いわゆる大腸の燃料として脂質生合成に導入され、腸内ホルモンの産生が行われる。さらに、酪酸は、抗炎症性および抗腫瘍性を有する大腸環境の生理的構成成分であり［８］、非伝染性疾患の形成を予防するためにヒトの体の多くの付加的な機能を支持している［９、１０］。酪酸と吉草酸のアイソフォームが減少することは、腸内でのタンパク質発酵が減少し、有害な発酵産物が減少することを示している。
【０００８】
いくつかのプロバイオティクスは、調査研究で有望な結果を示しているが、ほとんどの健康状態のためにプロバイオティクスの特定の使用を支持する強力な科学的証拠が不足している。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）と欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ）は、これまでのところ、健康問題を予防または治療するためのいかなるプロバイオティクスも承認していない。微生物は消化管内における生存とコロニー形成が貧弱なことが多いので、いくつかのプロバイオティクス戦略は成功していない。制限要因は、胃の低ｐＨだけでなく、胆汁および消化酵素の存在、低酸素含有量、ならびに腸内の他の微生物の存在を含む。さらに、プロバイオティクスの機能性には、菌株の生存率だけでなく、代謝活性の維持も重要である［１１］。
【０００９】
プロバイオティクス治療は、多くの障害と関連しているいくつかのケース、および腸内に常駐する有益な微生物と病原性の微生物の調節の欠如においては、腸内毒素症に十分な影響を与えることができない。さらに、サプリメントとして使用するためのいくつかの有益な微生物（例えば、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉおよびその他の微生物）の入手可能性が不足している。細菌療法としても知られる糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）のような方法は、複雑であり、意図しない有害な結果のリスクを含む。
【００１０】
腸管病原体の減少はしばしばプレバイオティクスの有益な効果に属すると提案されてきたが、これは結論的には実証されていない。他の難消化性炭水化物と同様に、プレバイオティクスは腸内細菌によって発酵され、その結果生じるＳＣＦＡはその健康促進特性で知られている。実際には、ＳＣＦＡの産生は、食物摂取量および腸内微生物叢組成に影響される。これらの分子は、宿主細胞や腸管微生物叢のエネルギー源であるだけでなく、異なる宿主シグナリングメカニズムに関係しているため、腸内環境や大腸の生理を形成することに関与している［１２］。酢酸、プロピオン酸、および酪酸は腸内に豊富に存在するＳＣＦＡである。プロピオン酸は奇数鎖脂肪酸の合成によって糖新生に組み込まれる。ＳＣＦＡ形成の前駆体は乳酸である。
【００１１】
したがって、プレバイオティクス戦略は、主に、発酵性オリゴ糖、二糖類、単糖類、およびポリオール（ＦＯＤＭＡＰ）を含み、これらの代謝物の産生を増加させるとともに、有益な微生物の存在量を増加させることを目的としている。しかし、これらの炭水化物はしばしば望ましくない副作用、例えば下痢、便秘、および鼓腸などを引き起こす。低ＦＯＤＭＡＰ食は、過敏性腸症候群の患者のこれらの症状を効果的に軽減する［１３］。
【００１２】
結論として、宿主の健康に有益な効果をもたらすためには、消化管微生物叢を標的とし、その組成と活性の好ましいシフトを誘導する戦略が必要である。このような概念は、腸内恒常性の維持の主要な担い手であるので、クロストリジウムへの効果に特に焦点を当てるべきである［１４］。これらのＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門の桿状細菌はグラム陽性であり、腸内微生物叢の全細菌のかなりの部分を占めている。これらの細菌は、生後１ヶ月の間に母乳で育てられた乳児の腸にコロニー形成し始め、腸管細胞と密接な関係を保ちながら腸粘膜の特定の領域に生息している。他の常在微生物集団との相互作用によって、また、特定かつ本質的な機能を提供することによっても、この位置は、細菌が全生涯にわたって腸内の生理学的、代謝および免疫プロセスを調節する上で重要な因子として加わることができる。
【００１３】
様々なプロバイオティクス株および飼料および食品添加物としてのそれらの使用は以前に記載されている（例となる参考文献はＷＯ２０１７／２０７３７１Ａ１およびＷＯ２０１７／２０７３７２Ａ１のみである）。しかし、既知のプロバイオティクス株については、腸内微生物叢の組成に対する効果は、特定の細菌株およびそれらの分布に関して、そのように詳細には、これまで記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２０１７／２０７３７１Ａ１
【特許文献２】ＷＯ２０１７／２０７３７２Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の目的は、プロバイオティクス株の組成、特にクロストリジウムに関連した好ましいシフトを誘導し、消化管内の酢酸およびｎ−酪酸のような好ましいＳＣＦＡの産生を促進することにより、消化管微生物叢に正の効果を示す新規なプロバイオティクス株の組合せを提供することである。
【００１６】
したがって、本発明の主題は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス株、ならびにグルタミン、グルタミン酸もしくはその塩、抱合型グルタミン、または長さ２〜１０アミノ酸単位のオリゴペプチドから選択される少なくとも１つのアミノ酸を含み、前記アミノ酸単位は天然アミノ酸であり、前記少なくとも１つのアミノ酸単位はグルタミンもしくはグルタミン酸単位である、シンバイオティクス調製物である。
【００１７】
細菌株とグルタミンまたはグルタミンの誘導体を含むこの新しいシンバイオティクス調製物は、腸内でのｎ−酪酸産生分類群およびｎ−酪酸のレベルの増加を促進する。
【００１８】
特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌がこの効果に適していることが判明した。したがって、本発明の好ましい構成において、プロバイオティクス株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌株を含む。特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ種の細菌株は、腸内のｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩＶａメンバーの割合を効果的に増加させると同時に、腸内のｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩ分類群を減少させる。この効果は、乳酸、酢酸およびｎ−酪酸の増加を伴うが、同時にイソ酪酸およびイソ吉草酸のレベルを減少させる。意外なことに、Ｌ−グルタミンとグルタミン酸およびその誘導体は、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩＶａを強く誘導し、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩ分類群を阻害することがわかった。この微生物叢の効果はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの効果と同様に、酢酸とｎ−酪酸の増加、イソ酪酸とイソ吉草酸の減少と関連していた。酢酸およびｎ−酪酸のレベルの増加は、特定のＣｌｏｓｔｒｉｄｉａによって使用されるグルタミン酸発酵経路によって説明することができる［１５］。さらに、グルタミンまたはその誘導体とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株との組合せは、相乗的に作用し、単一構成成分よりもクロストリジウムクラスターおよび短鎖脂肪酸の産生に対してより強い効果を発揮する。プロバイオティクスおよび／またはシンバイオティクス食品サプリメントとしてのＢａｃｉｌｌｕｓ株の使用は、例えば非胞子形成乳酸菌には不可能な耐熱性および耐酸性胞子の適用が可能であるという付加的な利点を有する。
【００１９】
抗生物質と比較して、プロバイオティクスの大きな利点は、細菌を無差別に破壊しないこと、および抗生物質に耐性を持つ病原性細菌の菌株を生じさせないことである。通常、それらは特定の有効性を有する抗菌性物質の産生によって病原性細菌と選択的に競合することができ、同時に有益な腸内細菌叢の成長と生存率を高めることができるのが理想的である。さらに、それらは、好ましくは、処置された動物またはヒトにおいて、全身性の免疫応答を刺激することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
好ましい実施形態では、プロバイオティクス株は、以下の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５（ＷＯ２０１７／２０７３７２Ａ１に詳細に記載されている）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５９２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＤＳＭ３２５３９、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４（ＷＯ２０１７／２０７３７１Ａ１に詳細に記載されている）のうちの１つから選択される。
【００２１】
本発明によれば、アミノ酸もしくはその誘導体は、グルタミン、グルタミン酸もしくはその塩、抱合型グルタミン、または長さ２〜１０アミノ酸単位のオリゴペプチドから選択され、前記アミノ酸単位は天然アミノ酸であり、少なくとも１つのアミノ酸単位はグルタミンもしくはグルタミン酸単位である。
【００２２】
グルタミンの正の効果は文献でも知られており、例えば、壊死性腸炎を誘発するメソトレキセートの投与によって処置したモルモットにおいて、グルタミンを経口補給することで死亡率が低下することが示されている［１６］。さらに、術後麻酔をかけた犬の後肢バランス試験では、注入したアラニルグルタミンのアミノ酸は、アラニンとグルタミンの混合物とほぼ同様に骨格筋から抽出されることが示されている［１７］。
【００２３】
本発明の文脈では、「アミノ酸」とは、それぞれのアミノ酸に特異的な側鎖と併せて、アミノ官能基（−ＮＨ２）とカルボン酸官能基（−ＣＯＯＨ）とを含む分子として理解される。本発明の文脈では、α−アミノ酸およびβ−アミノ酸の両方が含まれる。本発明の好ましいアミノ酸は、α−アミノ酸であり、特に以下の２０の「天然アミノ」酸である。
アラニン（Ａｌａ／Ａ）
アルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）
アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）
アスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）
システイン（Ｃｙｓ／Ｃ）
グルタミン酸（Ｇｌｕ／Ｅ）
グルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）
グリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）
ヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）
イソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）
ロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）
リジン（Ｌｙｓ／Ｋ）
メチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）
フェニルアラニン（Ｐｈｅ／Ｆ）
プロリン（Ｐｒｏ／Ｐ）
セリン（Ｓｅｒ／Ｓ）
トレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）
トリプトファン（Ｔｒｐ／Ｗ）
チロシン（Ｔｙｒ／Ｙ）
バリン（Ｖａｌ／Ｖ）
【００２４】
本発明の文脈では、「天然アミノ酸」という表現は、上記の２０個のアミノ酸のＬ型およびＤ型の両方を含むものと理解される。しかし、Ｌ型が好ましい。一実施形態では、「アミノ酸」という用語はまた、それらのアミノ酸のアナログまたは誘導体を含む。
【００２５】
本発明によれば、「遊離アミノ酸」は、そのアミノおよびその（α−）カルボン酸官能基を遊離形態で有する、すなわち、他の分子に共有結合していないアミノ酸、例えば、ペプチド結合を形成していないアミノ酸であると理解される。遊離アミノ酸はまた、塩として、または水和物の形態で存在してもよい。オリゴペプチドの一部として、またはオリゴペプチド中のアミノ酸を指す場合、これは、生化学およびペプチド生合成の既知のメカニズムにしたがって、それぞれのアミノ酸に由来するそれぞれのオリゴペプチド構造のその部分を指すものとして理解されるものとする。
【００２６】
本発明に記載の「オリゴペプチド」は、２〜２０個のアミノ酸からなるペプチド化合物であると理解されるものとする。本発明のより好ましいオリゴペプチドは、２〜１０個のアミノ酸、２〜６個のアミノ酸、２〜５個のアミノ酸、２〜４個のアミノ酸、または２〜３個のアミノ酸からなるオリゴペプチドである。本発明に記載の最も好ましいオリゴペプチドは、ジペプチドである。
【００２７】
より小さいペプチドが好まれることは、若い動物の研究より、ジペプチド輸送が初期の成長期には遊離アミノ酸輸送よりも大きな量的意義が示唆されることを示す初期の文献と一致している［１８、１９］。さらに、ヒトの腸管灌流研究では、ジペプチドおよびトリペプチドの取り込みは、２週間の飢餓後の遊離アミノ酸の取り込みほどには阻害されなかった［２０］。
【００２８】
「ペプチド」とは、ペプチド結合（Ｒ１−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ２）によって互いに共有結合的にカップリングした少なくとも２つのアミノ酸を含む分子であると理解されるものとする。
【００２９】
本発明の代替の実施形態では、オリゴペプチドは、アラニンまたはグリシンをさらに含む。
【００３０】
さらなる代替の実施形態では、オリゴペプチドは、グリシン−グルタミン、グリシン−グルタミン酸、アラニン−グルタミン、アラニン−グルタミン酸およびそのアセチル化型から選択されるジペプチドである。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態によれば、ジペプチドアラニン−グルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）が特に好ましい。
【００３２】
本発明によれば、プロバイオティクス株およびアミノ酸またはオリゴペプチドの総量は、調製物の総重量の少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％、最も好ましくは少なくとも７０重量％である。
【００３３】
調製物が本発明に記載の腸溶コーティングをさらに含む場合、シンバイオティクス組成物を個体の結腸に直接送達することが特に好ましい。腸溶コーティング組成物は、以下の、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、セルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ヒプロメロースアセテートスクシネート）、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、メチルメタクリレート−メタクリル酸コポリマー、シェラック、セルロースアセテートトリメリテート、アルギン酸ナトリウム、ゼイン、のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【００３４】
腸溶コーティングとしては、メチルメタクリレート１０〜３０重量％、メチルアクリレート５０〜７０重量％、およびメタクリル酸５〜１５重量％が重合したポリマーを用いることが好ましい。
【００３５】
開示されたポリマー分散体は、好ましくは、メチルメタクリレート２０〜３０重量％、メチルアクリレート６０〜７０重量％、およびメタクリル酸８〜１２重量％が重合した１５〜５０重量％のポリマーを含んでもよい。ポリマーは、メチルメタクリレート２５重量％、メチルアクリレート６５重量％、およびメタクリル酸１０重量％が重合していることが最も好ましい。
【００３６】
メチルメタクリレート２５重量％、メチルアクリレート６５重量％、およびメタクリル酸１０重量％が重合したポリマーの３０重量％水性分散体は、市販品のＥＵＤＲＡＧＵＡＲＤ（登録商標）バイオティクスに相当する。
【００３７】
モノマーの百分率は合計して１００％になる。機能性ポリマーは、２〜３０ｍｇ／ｃｍ２、好ましくは５〜２０ｍｇ／ｃｍ２の量で塗布する。
【００３８】
本発明の１つの主題は、飼料または食品サプリメントとしての、本発明に記載の調製物の使用である。
【００３９】
本発明のさらなる主題はまた、飼料または食品中のシンバイオティクス成分としての、本発明の調製物の使用である。本発明によれば、「シンバイオティクス」という用語は、プレバイオティクスとプロバイオティクス成分とを含む組成物を指すものとする。さらに、本発明は、「プレバイオティクス」という用語の更新された定義を指し、これは、微生物によって選択的に利用され、健康上の利点をもたらす基質を意味し、アミノ酸およびペプチドも含むものとする。したがって、本発明に記載のシンバイオティクス組成物は、プロバイオティクス株と、プレバイオティクスとしてのアミノ酸またはオリゴペプチドとを含む組成物である。
【００４０】
本発明に記載の好ましい食料品は、乳製品、特にヨーグルト、チーズ、牛乳、バターおよびクワルクである。
【００４１】
本発明の菌株の細胞は、特に本発明の組成物において、胞子（休眠状態にある）として、栄養細胞（成長状態にある）として、遷移状態細胞（成長段階から胞子形成段階に移行している）として、または少なくとも２つの組合せ、特にこれらのタイプの細胞のすべてとして存在してもよい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、主に、または胞子のみを含む。
【００４２】
本発明のさらなる主題は、本発明に記載の調製物、ならびに好ましくはタンパク質、炭水化物、脂肪、さらなるプロバイオティクス、プレバイオティクス、酵素、ビタミン、免疫調節物質、代用乳、ミネラル、アミノ酸、抗コクシジウム剤、酸ベースの製品、医薬品、およびそれらの組合せから選択される少なくとも１つのさらなる飼料もしくは食品成分を含む飼料または食料品組成物である。
【００４３】
本発明に記載の飼料または食料品組成物は、丸剤、カプセル、錠剤または液体の形態の栄養補助食品も含む。
【００４４】
本発明の組成物、特に飼料、食品および医薬組成物は、好ましくは本発明の菌株を含み、約１×１０３〜約２×１０１２ＣＦＵ／ｇの飼料／食品またはｍｌの水の割合で、特に、約１×１０３、または約１×１０４、または約１×１０５、または約１×１０６、または約１×１０７、または約１×１０８、または約１×１０９、または約１×１０１０、または約１×１０１１、または約１×１０１２ＣＦＵ／ｇの飼料／食品またはｍｌの水の割合で、好ましくは、約１×１０４〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの飼料／食品またはｍｌの水の量で、より好ましくは、１×１０４〜１×１０７ＣＦＵ／ｇの飼料／食品またはｍｌの水の量で、動物またはヒトに投与される。
【００４５】
それに対応して、本発明の飼料または食品組成物中の本発明の調製物の好ましい量は、好ましくは０．１重量％〜１０重量％、より好ましくは０．２重量％〜５重量％、特に０．３重量％〜３重量％の範囲である。
【００４６】
本発明のさらなる主題は、本発明に記載の調製物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【００４７】
本発明に記載の調製物は、動物またはヒトに投与される場合、好ましくは、動物またはヒトの健康状態、特に腸の健康、心血管の健康、健康的な体重管理または免疫の健康を改善する。
【００４８】
本発明のさらなる主題は、したがって、下痢、便秘、過敏性腸症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、大腸がん、腸がん、心血管疾患、動脈硬化症、脂肪肝疾患、脂質異常症、高コレステロール血症、肥満、脂肪過多症、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、慢性炎症性疾患、およびアレルギー性疾患の予防または治療に使用するための本発明に記載の組成物である。
【００４９】
本発明に記載の有利な構成は、次の、
−  腸内マイクロバイオームにおけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩＶａの細菌の総量を増加させること、
−  腸内マイクロバイオームにおけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩの細菌の総量を減少させること、
−  短鎖脂肪酸、好ましくはｎ−酪酸、プロピオン酸、酢酸および乳酸の産生を増加させること、ならびに
−  分岐鎖短鎖脂肪酸、好ましくはイソ酪酸およびイソ吉草酸の形成を阻害すること、
の１つまたは複数によって動物またはヒトの腸の健康状態を改善するための組成物である。
【００５０】
本発明のさらなる主題は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓから選択される少なくとも１つのプロバイオティクス株、ならびにグリシン−グルタミン、グリシン−グルタミン酸、アラニン−グルタミン、アラニン−グルタミン酸およびそのアセチル化型から選択される少なくとも１つのジペプチド、を含むカプセルである。
【００５１】
好ましい実施形態では、プロバイオティクス株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓであり、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５９２である。
【００５２】
カプセルは、好ましくは、１×１０８から２×１０１０ＣＦＵの間のプロバイオティクス株、および５０ｍｇから８００ｍｇの間のジペプチドを含む。
【００５３】
また、プロバイオティクス株およびジペプチドの量が、カプセル充填物の総重量の少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも５０重量％、より好ましくは少なくとも６０重量％、最も好ましくは少なくとも７０重量％である場合が好ましい。
【００５４】
カプセルは、さらに追加のビタミンまたはミネラルを含んでもよい。好ましくは、ビタミンは、ビタミンＡ（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノール、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチニルエステル、ならびにａｌｌ−ｔｒａｎｓ−β−カロテンおよび他のプロビタミンＡカロテノイドとして）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸または葉酸塩）、ビタミンＢ１２（コバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロールおよびトコトリエノール）、およびビタミンＫ（キノン）から選択される。
【００５５】
好ましくは、ミネラルは、硫黄、鉄、塩素、カルシウム、クロム、コバルト、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ヨウ素およびセレンから選択される。
【００５６】
カプセルは、好ましくは、イヌリン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、デンプン、ペクチン、β−グルカンおよびキシロオリゴ糖から選択される１つまたは複数のプレバイオティクス成分をさらに含んでもよい。
【００５７】
カプセルは、好ましくは、１つまたは複数の植物抽出物をさらに含んでもよく、植物は、好ましくは、ブロッコリー、オリーブ果実、ザクロ、カシス、ブルーベリー、ビルベリー、シーバックソーン、カムカム、ボイセンベリー、ウコン、ショウガ、ニンニク、グレープシード、アサイーベリー、アロニア、クコ、ホースラディッシュ、ボスウェリアセラータ、スピルリナ、チョウセンニンジン、カンナビジオール、ローズヒップ、プーアール、煎茶、エキナセア、および緑茶の葉、から選択される。
【００５８】
好ましい構成では、カプセルは、腸溶コーティングを含み、腸溶コーティングが以下の、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、セルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ヒプロメロースアセテートスクシネート）、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、メチルメタクリレート−メタクリル酸コポリマー、シェラック、セルロースアセテートトリメリテート、アルギン酸ナトリウム、ゼイン、のうちの１つまたは複数を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】１６Ｓ  ｒＲＮＡコード領域遺伝子のＶ４高頻度可変領域のＭｉＳｅｑ配列決定に基づくｉ−ｓｃｒｅｅｎ発酵サンプルの属レベルを示す円グラフである。検出された属とそれらの相対的存在量を陰影部分で示す。何も添加せずに０時間インキュベーション。
【図１Ｂ】何も添加せずに２４時間インキュベーション後。
【図１Ｃ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５栄養細胞添加後０時間。
【図１Ｄ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５栄養細胞添加後２４時間。
【図１Ｅ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０栄養細胞添加後０時間。
【図１Ｆ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０栄養細胞添加後２４時間。
【図１Ｇ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４栄養細胞添加後０時間。
【図１Ｈ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４栄養細胞添加後２４時間。
【図１Ｉ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０栄養細胞添加後０時間。
【図１Ｊ】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０栄養細胞添加後２４時間。
【図２】ＳＩＥＭ中で２４時間インキュベーション後、ＳＩＥＭ中で、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０をそれぞれ含む結腸微生物叢の存在下で測定した乳酸濃度をｍｇ／ｍｌで示した図である。乳酸の検出限界は０．０２ｍｇ／ｍｌであった。
【図３】ＳＩＥＭ中で２４時間インキュベーション後、ＳＩＥＭ中で、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０をそれぞれ含む結腸微生物叢の存在下で測定した酢酸濃度をｍＭで示した図である。
【図４】ＳＩＥＭ中で２４時間インキュベーション後、ＳＩＥＭ中で、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０をそれぞれ含む結腸微生物叢の存在下で測定したプロピオン酸濃度をｍＭで示した図である。
【図５】ＳＩＥＭ中で２４時間インキュベーション後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０をそれぞれ含む結腸微生物叢の存在下で測定したｎ−酪酸濃度をｍＭで示した図である。
【図６】ＳＩＥＭ中で２４時間インキュベーション後、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０をそれぞれ含む結腸微生物叢の存在下で測定したイソ酪酸、およびイソ吉草酸の濃度をｍＭで示した図である。
【図７】１６Ｓ  ｒＲＮＡコード領域遺伝子のＶ４高頻度可変領域のＭｉＳｅｑ配列決定に基づくｉ−ｓｃｒｅｅｎ発酵サンプルの属レベルを示す棒グラフである。斜線の棒は、検出されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩＶａ属とその相対的存在量を表している。
【図８】１６Ｓ  ｒＲＮＡコード領域遺伝子のＶ４高頻度可変領域のＭｉＳｅｑ配列決定に基づくｉ−ｓｃｒｅｅｎ発酵サンプルの属レベルを示す棒グラフである。斜線の棒は、検出されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩＶａ属とその相対的存在量を表している。
【図９】ヒト微生物叢と共にＳＩＥＭ中で２４時間インキュベーション後、異なるアミノ酸またはジペプチドを含む結腸微生物叢の存在下で、それぞれＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５細胞の組合せの有無で測定したｎ−酪酸濃度をｍＭで示した図である。
【図１０】ヒト微生物叢と共にＳＩＥＭ中で２４時間インキュベーション後、異なるアミノ酸またはジペプチドを含む結腸微生物叢の存在下で、それぞれＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ３２３１４）細胞またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＣＥＣＴ  ５９４０）細胞の組合せの有無で測定したｎ−酪酸濃度をｍＭで示した図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００６０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４株、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０株は、結腸ヒト微生物叢内で生存し続けることができる
腸管スクリーニングモデル
プロバイオティクス株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０の成人の結腸微生物叢に対する効果を決定するために、腸管スクリーニングモデルを使用した（ｉ−ｓｃｒｅｅｎ、ＴＮＯ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。したがって、ｉ−ｓｃｒｅｅｎモデルに、６人の健康な成人ボランティア（白人、ヨーロッパ人のライフスタイルと栄養）由来のプールされた糞便提供からなる標準的なヒト成人糞便微生物叢材料を接種した。この糞便材料を混合し、フェッドバッチ発酵槽で４０時間培養して、先に記載されているような標準化された微生物叢を作成した［２１］。これらの標準成人腸内微生物叢セットを、−８０℃で１２％グリセロール中に保存した。
【００６１】
腸管微生物叢を、改変標準回腸排出培地（ＳＩＥＭ）中でインビトロ培養し、その組成を［２２］に記載し、以下のように改変した。０．０４７ｇ／ｌペクチン、０．０４７ｇ／ｌキシラン、０．０４７ｇ／ｌアラビノガラクタン、０．０４７ｇ／ｌアミロペクチン、０．３９２ｇ／ｌデンプン、２４．０ｇ／ｌカゼイン、２４．０Ｂａｃｔｏペプトン、０．４牛胆汁、および０．２ｇ／ｌシステイン。すべての構成成分は、Ｔｒｉｔｉｔｉｕｍ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｅｌｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により供給した。培地のｐＨは５．８に調整した。
【００６２】
ｉ−ｓｃｒｅｅｎ発酵については、前培養した標準化糞便接種材料を１３５０μｌの改変ＳＩＥＭで５０倍に希釈した。すべての実験は、３連で行った。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＤＳＭ３２３１５）株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４株、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０株を５０ｍｌのＬＢＫｅｌｌｙ培地［２３］中で約１６時間、別々に前培養した。インキュベーションは、振盪フラスコ中、３７℃、好気的条件下で行った。インキュベーション後、６００ｎｍでの吸光度測定により細菌密度を測定した。１ｍｌの緩衝液（０．１ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６）中に、１×１０１０細胞／ｍｌの最終ストック溶液を調製した。各菌株の懸濁液を、それぞれ約１０９細胞／ｍｌの最終レベルになるようにｉ−ｓｃｒｅｅｎに導入した。
【００６３】
ｉ−ｓｃｒｅｅｎのインキュベーションは、０．２％Ｏ２、０．２％ＣＯ２、１０％Ｈ２、８９．６％Ｎ２、のガス条件下で行った。
【００６４】
ＤＮＡ単離
１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の配列決定のためのＤＮＡ抽出は、Ｌａｄｉｒａｔら（２０１３）に記載されているように、いくつかの若干の変更を加えて行った。ウェルあたり３００μｌの溶解緩衝液（Ｍａｇ  Ｍｉｎｉ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＬＧＣｌｔｄ、ＵＫ）、５００μｌのジルコニウムビーズ（０．１ｍｍ；ＢｉｏＳｐｅｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ、ＵＳＡ）、および５００μｌのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０；Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧＭＢＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で飽和させたフェノールを含む９６ウェルプレートのウェルに、約１００μｌの培養物を添加した。９６ウェルプレートを、Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄＢｅａｔｅｒ−９６（ＢｉｏＳｐｅｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ、ＵＳＡ）に２１００振動／分で２分間置いた。続いて、製造業者の推奨にしたがって、Ａｇｏｗａ  Ｍａｇ  Ｍｉｎｉ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてＤＮＡを精製した。抽出されたＤＮＡを、最終容量６０μｌの緩衝液で溶出した。
【００６５】
Ｖ４  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定
微生物叢組成を、Ｖ４高頻度可変領域の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコン配列決定により解析した。これは、一連のステップによって達成された。
【００６６】
ｉ−ｓｃｒｅｅｎＤＮＡサンプル中の細菌ＤＮＡ量は、細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマー、フォワードプライマー：ＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡ、リバースプライマー：ＧＴＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧ、プローブ：６ＦＡＭ−ＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡ−ＭＧＢを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により測定した。
【００６７】
その後、Ｆ５１５／Ｒ８０６プライマー［２５］を用いて、［２４］（２０１３）に記載された、５００ｐｇのＤＮＡを増幅することにより、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４高頻度可変領域のＰＣＲアンプリコンを個々のサンプルについて生成した。プライマーには、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターおよび固有の８ｎｔサンプルインデックス配列キーが含まれていた［２４］。技術的な品質管理のためにモックコントロールが含まれていた。サンプルあたりの増幅されたＤＮＡの量は、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）上のｄｓＤＮＡ  ９１０  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを用いて定量した。アンプリコンライブラリーを等モル量でプールし、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて１．２％アガロースゲルから精製した。ライブラリーは、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。アンプリコンのペアエンド配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて実施した。
【００６８】
配列データは、ｍｏｔｈｕｒ  ＭｉＳｅｑ  ＳＯＰ［２４］に沿ってＭｏｔｈｕｒ  ｖ．１．３６．１［２６］で処理した。リードペアを結合する前に、Ｂｔｒｉｍ［２７］を用いて、スライディングウィンドウサイズを５ｎｔ、および平均品質スコアを２５で、低品質領域をトリミングした。結合後、配列を長さでフィルタリングしたが、曖昧な塩基は許容しなかった。固有の配列を、細菌のＳＩＬＶＡ  ＳＥＥＤリファレンスアライメントリリース１０２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｔｈｕｒ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｓｉｌｖａ＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｆｉｌｅｓで入手可能）にアラインメントし、短すぎる配列はｓｃｒｅｅｎ．ｓｅｑｓを用いて、パラメーター「ｏｐｔｉｍｉｚｅ＝ｓｔａｒｔ−ｅｎｄ，  ｃｒｉｔｅｒｉａ＝９０」で除去した。キメラ配列は、ｄｅ  ｎｏｖｏモードでＵＣＨＩＭＥ［２８］を用いてサンプルごとに同定し、除去した。次に、データセット全体で１０回未満出現する配列を除去した。リボソームデータベースプロジェクト（ＲＤＰ）の単純ベイズ分類器を用いて、信頼度閾値６０％および１０００回反復［２９］およびＲＤＰトレーニングセットｖ．９（ｔｒａｉｎｓｅｔ９＿０３２０１２）のｍｏｔｈｕｒフォーマット版を用いて、すべての配列に分類学的名称を割り当てた。
【００６９】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンを敏感にクラスタリングする最小エントロピー分解（ＭＥＤ）アルゴリズムを用いて配列をグループ化した［３０］。ノイズをフィルタリングするために、「最小実質的存在量」フィルターを２００に設定した。
【００７０】
また、ｉ−ｓｃｒｅｅｎの結腸ヒト微生物叢には、各プロバイオティクス株の生育可能なＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．栄養細胞を補充した。
【００７１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡコード遺伝子のＶ４高頻度可変領域のＭｉＳｅｑ配列決定に基づいて、個々の菌株に関連する微生物叢組成に特異的な影響を可視化することができた。
【００７２】
配列のリード数に基づいて、ｉ−ｓｃｒｅｅｎ実験開始時に桿菌の存在量が高く（約１０９ｃｆｕ／ｍｌ）、したがって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５は、ｔ＝０時間で、全細菌集団の約９１％に寄与し（図１Ｃ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０はｔ＝０時間で全細菌集団の約８７％に寄与し（図１Ｅ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４はｔ＝０時間で全細菌集団の約９４％に寄与し（図１Ｇ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０はｔ＝０時間で全細菌集団の約８８％に寄与した（図１Ｉ）。
【００７３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．株を添加していないコントロールは、０時間（図１Ａ）と２４時間インキュベーション後（図１Ｂ）の時点で示されている。２４時間インキュベーションでは、糞便微生物叢は桿菌の相対的な存在を犠牲にして回復することができた。ＤＳＭ３２３１５細胞は、２４時間インキュベーション後のｉ−ｓｃｒｅｅｎに４１％のレベルで存在が持続しているように見え（図１Ｄ）、ＤＳＭ３２５４０細胞は、２４時間インキュベーション後のｉ−ｓｃｒｅｅｎに１９％のレベルで存在が持続しているように見え（図１Ｆ）、ＤＳＭ３２３１４細胞は２４時間インキュベーション後のｉ−ｓｃｒｅｅｎに４％のレベルで存在が持続しているように見え（図１Ｈ）、ＣＥＣＴ５９４０細胞は２４時間インキュベーション後のｉ−ｓｃｒｅｅｎに７％のレベルで存在が持続しているように見えた（図１Ｊ）。
【実施例２】
【００７４】
プロバイオティクス株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０は、有意なレベルの乳酸を産生する
開始時のＳＩＥＭでは、約０．０４ｍｇ／ｍｌの低レベルの乳酸が検出され、これは２４時間後に＜０．０２ｍｇ／ｍｌの乳酸含有量を有する微生物叢の存在下で完全に消失した（図２）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ株は、２４時間後に結腸群落のないＳＩＥＭにおいて有意なレベルの乳酸を産生した。ＤＳＭ３２３１５の細胞は０．３５ｍｇ／ｍｌを産生し、ＤＳＭ３２５４０の細胞は０．３１ｍｇ／ｍｌを産生し、ＤＳＭ３２３１４の細胞は０．１９ｍｇ／ｍｌを産生し、ＣＥＣＴ５９４０の細胞は０．１１ｍｇ／ｍｌを産生した。
【００７５】
ヒト腸内微生物叢との２４時間インキュベーション後も、乳酸の量は、ＤＳＭ３２３１５またはＤＳＭ３２５４０細胞の存在下では０．１２ｍｇ／ｍｌに、ＤＳＭ３２３１４の存在下では０．１５ｇ／ｍｌに、それぞれ有意に増加した。
【００７６】
したがって、これらのプロバイオティクス株は、ヒト腸内微生物叢による有意な乳酸の形成を生じさせる。乳酸は健康を促進するＳＣＦＡに変換することができるので、これは、有益な効果として解釈することができる。
【実施例３】
【００７７】
プロバイオティクス株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０は、それぞれヒト微生物叢群落による酢酸産生を支持している
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＤＳＭ３２３１５株、ＤＳＭ３２３１４株およびＣＥＣＴ５９４０株は、腸内微生物叢の酢酸産生の実質的な増加を引き起こす。図３は、プロバイオティクス株を添加せずに２４時間曝露した後のｉ−ｓｃｒｅｅｎでは約４４ｍＭの平均酢酸レベルを示すが、酢酸はＳＩＥＭではほとんど検出できない３．４ｍＭであることを示している。
【００７８】
２４時間インキュベーション後、ＤＳＭ３２３１５株、ＤＳＭ３２３１４株、およびＣＥＣＴ５９４０株の存在下で、酢酸濃度がそれぞれ１０．４ｍＭ、４３．７ｍＭ、および３．３ｍＭ増加することが観察された（図３）。
【００７９】
すべてのデータのｐ値は０．０５未満であり、これは統計的に有意であることを意味する。したがって、プロバイオティクス株ＤＳＭ３２３１５、ＤＳＭ３２３１４、およびＣＥＣＴ５９４０は、ヒトの腸に有益な効果がある酢酸産生を支持している。
【実施例４】
【００８０】
プロバイオティクス株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０は、それぞれヒト微生物叢によるプロピオン酸の産生を支持している
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＤＳＭ３２３１５株、ＤＳＭ３２５４０株、ＤＳＭ３２３１４株およびＣＥＣＴ５９４０株は、ＳＩＥＭ中ではプロピオン酸を産生しないが、ヒト微生物叢によるプロピオン酸の産生を有意に（ｐ値＜０．０５）促進する（図４）。これらの菌株は、コントロールと比較して、腸内微生物叢によるプロピオン酸の産生を有意に支持している。図４は、プロバイオティクス株を添加せずに２４時間曝露した後のｉ−ｓｃｒｅｅｎでは約１１．５ｍＭの平均プロピオン酸レベルを示すが、プロピオン酸はＳＩＥＭではほとんど検出できない２．７ｍＭであることを示している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５栄養細胞の存在下では、プロピオン酸の量は２４時間後のコントロールよりも１５．１ｍＭ高かった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０栄養細胞の存在下では、プロピオン酸の量は１２．２ｍＭ高かった。ＤＳＭ３２３１４の存在下では、プロピオン酸の量は１３．４ｍＭ高く、ＣＥＣＴ５９４０の存在下ではプロピオン酸の量は７．１ｍＭ高かった。
【００８１】
プロピオン酸は、糖新生に組み込むことができるため、ヒトの腸の健康状態に有益である。
【実施例５】
【００８２】
プロバイオティクス株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０は、それぞれヒト微生物叢組成におけるｎ−酪酸の産生を支持している
プロバイオティクス株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０は、ＳＩＥＭ中で２４時間曝露した後に検出可能なレベルのｎ−酪酸を産生しないが、ヒト微生物叢によるｎ−酪酸産生のレベルに有意な正の影響（ｐ値＜０．０５）を及ぼす（図５）。図５は、プロバイオティクス株を添加せずに２４時間曝露した後のｉ−ｓｃｒｅｅｎでは約５．４ｍＭの平均ｎ−酪酸レベルを示すが、プロピオン酸はＳＩＥＭではほとんど検出できない０．３ｍＭであることを示している。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５栄養細胞の存在下では、ｎ−酪酸の量は２４時間後のコントロールよりも２．０ｍＭ高かった。ＤＳＭ３２３１４栄養細胞の存在下では、ｎ−酪酸の量は１．０ｍＭ高く、ＣＥＣＴ５９４０栄養細胞の存在下ではｎ−酪酸の量は４．８ｍＭ高かった。より高いｎ−酪酸の量の生成は、脂質生合成、例えば腸内ホルモンの産生に有益である。
【実施例６】
【００８３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５株およびＤＳＭ３２５４０株は、ヒト微生物叢組成中のイソ酪酸およびイソ吉草酸の形成をそれぞれ減少させる
図６は、プロバイオティクス株を添加せずに２４時間曝露した後のｉ−ｓｃｒｅｅｎでは約０．７３ｍＭの平均イソ酪酸レベルおよび約２．２ｍＭの平均イソ吉草酸レベルを示すが、ＳＩＥＭではイソ酪酸は検出されず、イソ吉草酸の含有量は０．２４ｍＭであったことを示している。
【００８４】
特に、ＤＳＭ３２３１５株およびＤＳＭ３２５４０株は、ヒト腸内微生物叢によるイソ酪酸およびイソ吉草酸産生を有意に減少させる（ｐ値＜０．０５）。２４時間インキュベーション後、コントロールと比較して、イソ酪酸含有量は、それぞれＤＳＭ３２３１５の細胞の存在下では０．５ｍＭ低く、ＤＳＭ３２５４０の細胞の存在下では０．４ｍＭ低かった。
【００８５】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＤＳＭ３２３１５株および  ＤＳＭ３２５４０株もまた、ヒト微生物叢に添加した場合、イソ吉草酸産生のレベルに負の影響を及ぼす。コントロールと比較して、ｉ−ｓｃｒｅｅｎでは、それぞれ０．７ｍＭおよび０．８ｍＭの値で有意に（ｐ値＜０．０５）濃度が低下している。
【００８６】
ｉ−ｓｃｒｅｅｎの腸内微生物叢にＢａｃｉｌｌｕｓ  ＤＳＭ３２３１５株を導入すると、細胞はｎ−酪酸の産生を支持し、イソ酪酸およびイソ吉草酸の形成を阻害する。これは、腸内のタンパク質発酵プロセスが低下していることを示しており、有害な副産物の産生が減少していることも示していると考えられる。
【実施例７】
【００８７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２３１５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＤＳＭ３２５４０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ３２３１４、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＣＥＣＴ５９４０の存在は、それぞれＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩクラスターの存在量を減少させる。ＤＳＭ３２３１５株、ＤＳＭ３２３１４株およびＣＥＣＴ５９４０株は、それぞれＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩＶａクラスターの存在量を増加させる。
開始時点０時間（図１）におけるコントロールと、２４時間後の微生物叢の発達を比較すると、ＤＳＭ３２３１５株、ＤＳＭ３２５４０株、ＤＳＭ３２３１４株、およびＣＥＣＴ５９４０株の存在は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩクラスターを６％から、全微生物群落の３％未満の値にまで減少させる（図７）。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩＶａクラスターは、２４時間後に、コントロールの５％からプロバイオティクス細胞の存在下では、それぞれ、全群落の少なくとも８％まで増加した。ｉ−ｓｃｒｅｅｎのインキュベーションは、０．２％Ｏ２、０．２％ＣＯ２、１０％Ｈ２、８９．６％Ｎ２、のガス条件下で行った。
【００８８】
したがって、これらのプロバイオティクス株の存在下では、ヒト微生物叢組成は、より健康的な群落にシフトされる。
【実施例８】
【００８９】
グルタミンまたはその誘導体の添加は、ヒトの微生物群落を著しく変化させる
グルタミンまたはグルタミン酸含有ジペプチドの存在は、除菌されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩおよび増加したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ群ＸＩＶａへのシフトによって微生物群落に影響を及ぼす（図８）。単一アミノ酸を３．５ｍＭの濃度まで、ジペプチドを７ｍＭの濃度まで添加した。ｉ−ｓｃｒｅｅｎの曝露は、０％Ｏ２、０．２％ＣＯ２、１０％Ｈ２、９０％Ｎ２、のガス条件下で、実施例１に記載したように行った。さらに、Ａｌａ−ＧｌｎおよびＧｌｙ−ＧｌｕはＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ＸＩ群をほぼ完全に減少させ、これは腸の健康に対する強力な有益な効果と関連している。コントロールとして、いかなるグルタミンまたはグルタミン酸も含まないジペプチドＧｌｙ−Ｔｙｒ、ならびに単一アミノ酸グルタミン（Ｇｌｎ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）をテストしたが、微生物群落に正の効果はなかった。
【実施例９】
【００９０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＤＳＭ３２３１５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ３２３１４）またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＣＥＣＴ５９４０）とグルタミンまたはその誘導体との組み合わせた添加は、単一成分よりも微生物群落の変化およびその短鎖酸産生に相乗効果を示す
いくつかのグルタミンおよびグルタミン酸含有ペプチドと一緒に、異なるプロバイオティクス株を組み合わせた効果を、実施例７に記載の方法で詳細に分析した。コントロールとして、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、および非Ｇｌｕ／非Ｇｌｎジペプチドであるグリシン−チロシン（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ）の単独およびプロバイオティクス株との組合せの効果を分析した。単一アミノ酸を３．５ｍＭの濃度まで、ジペプチドを７ｍＭの濃度まで添加した。
【００９１】
２４時間インキュベーション後の微生物叢組成を分析した。アミノ酸またはジペプチド、およびプロバイオティクス細胞の単独添加と比較して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩＶａ群の百分率のより大きな増加およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ＸＩ群のより大きな減少によって明らかにされるように、微生物群落組成に対する、いくつかの組合せの相乗的な正の効果が観察された。この相乗効果は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＤＳＭ３２３１５）にはＡｌａ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、およびＧｌｙ−Ｇｌｎを、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ３２３１４）にはＡｌａ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、およびＧｌｙ−Ｇｌｎを、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＣＥＣＴ５９４０）にはＡｌａ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、およびＧｌｙ−Ｇｌｎを組み合わせた場合に観察された（表１）。
【００９２】
したがって、グルタミンまたはグルタミン酸含有ジペプチドと組み合わせたこれらのプロバイオティクス株の存在下では、ヒト微生物叢組成は、より健康的な群落にシフトされる。
【００９３】
【表１】
2021520197.tif 000002
【実施例１０】
【００９４】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＤＳＭ３２３１５）、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ３２３１４）またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＣＥＣＴ５９４０）とグルタミン、またはグルタミンもしくはグルタミン酸含有ジペプチドとの組み合わせた添加は、微生物群落のｎ−酪酸産生に対して相乗効果を示す
グルタミン、またはグルタミンもしくはグルタミン酸含有ジペプチドを含有するペプチドと一緒に、異なるプロバイオティクス株を組み合わせたことの、微生物群落のｎ−酪酸産生に対する効果を、実施例１および５に記載のように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＤＳＭ３２３１５）株について分析した。単一アミノ酸を３．５ｍＭの濃度まで、ジペプチドを７ｍＭの濃度まで添加した。
【００９５】
２４時間インキュベーション後のｎ−酪酸含有量を分析した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＤＳＭ３２３１５）とＧｌｎ、Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、Ａｌａ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、またはＧｌｙ−Ｇｌｕとの組合せについて、ｎ−酪酸濃度に対する相乗的な正の効果が観察された（図９）。これは、このプロバイオティクス株がグルタミン、またはグルタミン酸、またはグルタミン含有ペプチドとの組合せで、微生物群落の有益なｎ−酪酸産生を促進する効果を有することを示している。ネガティブコントロールとして、いかなるグルタミンまたはグルタミン酸も含まないジペプチドＧｌｙ−Ｔｙｒをテストしたが、ｎ−酪酸産生に正の効果はなかった。
【実施例１１】
【００９６】
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ３２３１４）細胞またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＣＥＣＴ５９４０）細胞とグルタミン、グルタミンまたはグルタミン酸含有ジペプチドとの組み合わせた添加は、微生物群落のｎ−酪酸産生に対して相乗効果を示す
グルタミン、またはグルタミンもしくはグルタミン酸含有ジペプチドを含有するペプチドと一緒に、異なるプロバイオティクス株を組み合わせたことの、微生物群落のｎ−酪酸産生に対する効果を、実施例１、５、および１０に記載のように、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ３２３１４）およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＣＥＣＴ５９４０）株について分析した。単一アミノ酸を３．５ｍＭの濃度まで、ジペプチドを７ｍＭの濃度まで添加した。
【００９７】
２４時間インキュベーション後のｎ−酪酸含有量を分析した。Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ＤＳＭ３２３１４）とＧｌｙ−Ｇｌｎ、Ａｌａ−Ｇｌｎ、およびＧｌｙ−Ｇｌｕとの組合せについて、ｎ−酪酸濃度に対する相乗的な正の効果が観察された（図１０）。また、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＣＥＣＴ５９４０）とＧｌｎ、およびＧｌｙ−Ｇｌｎとの組合せについても同様であった。
【００９８】
これは、このプロバイオティクス株がグルタミン、またはグルタミン酸、またはグルタミン含有ペプチドとの組合せで、微生物群落の有益なｎ−酪酸産生を促進する効果を有することを示している。ネガティブコントロールとして、いかなるグルタミンまたはグルタミン酸も含まないジペプチドＧｌｙ−Ｔｙｒをテストしたが、ｎ−酪酸産生に正の効果はなかった。
【実施例１２】
【００９９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびプレバイオティクスとしてのジペプチドを含むカプセル
以下の構成成分をＨＰＭＣカプセル（サイズ３）に充填した。
【０１００】
【表２】
2021520197.tif 000003
【０１０１】
カプセルは、さらにイヌリン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、デンプン、ペクチン、β−グルカンおよびキシロオリゴ糖から選択されるプレバイオティクス成分をさらに含んでもよい。
【０１０２】
カプセルは、ブロッコリー、オリーブ果実、ザクロ、カシス、ブルーベリー、ビルベリー、シーバックソーン、カムカム、ボイセンベリー、ウコン、ショウガ、ニンニク、グレープシード、アサイーベリー、アロニア、クコ、ホースラディッシュ、ボスウェリアセラータ、スピルリナ、チョウセンニンジン、カンナビジオール、ローズヒップ、プーアール、煎茶、エキナセア、緑茶の葉、から選択される、１つまたは複数の植物抽出物をさらに含んでもよい。
【０１０３】
カプセルは、ビタミンＡ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ９（葉酸または葉酸塩）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（カルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロールおよびトコトリエノール）、およびビタミンＫ（キノン）から選択されるビタミン、または硫黄、鉄、塩素、カルシウム、クロム、コバルト、銅、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ヨウ素、およびセレンから選択されるミネラル、をさらに含んでもよい。
【実施例１３】
【０１０４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびプレバイオティクスとしてのジペプチドおよび腸溶コーティングを含むカプセル
実施例１２で調製したカプセルを腸溶コーティング組成物でコーティングした。
【０１０５】
【表３】
2021520197.tif 000004
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１０．Ｖｉｔａｌ  Ｍ，  Ｋａｒｃｈ  Ａ，  Ｐｉｅｐｅｒ  ＤＨ：  Ｃｏｌｏｎｉｃ  Ｂｕｔｙｒａｔｅ−Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ：  ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  Ｕｓｉｎｇ  Ｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａ．  ｍＳｙｓｔｅｍｓ  ２０１７，  ２（６）．
１１．Ｇｕｅｉｍｏｎｄｅ  Ｍ，  Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｂ：  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｅｃｏｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓ  ２０１２，  ２３．
１２．Ｒｉｏｓ−Ｃｏｖｉａｎ  Ｄ，  Ｒｕａｓ−Ｍａｄｉｅｄｏ  Ｐ，  Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ  Ａ，  Ｇｕｅｉｍｏｎｄｅ  Ｍ，  ｄｅ  Ｌｏｓ  Ｒｅｙｅｓ−Ｇａｖｉｌａｎ  ＣＧ，  Ｓａｌａｚａｒ  Ｎ：  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｈａｉｎ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｌｉｎｋ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｅｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅａｌｔｈ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０１６，  ７：１８５．
１３．Ｈａｌｍｏｓ  Ｔ，  Ｓｕｂａ  Ｉ：  ［Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｙｓｂａｃｔｅｒｉｏｓｉｓ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ，  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ］．  Ｏｒｖ  Ｈｅｔｉｌ  ２０１６，  １５７（１）：１３−２２．
１４．Ｌｏｐｅｔｕｓｏ  ＬＲ，  Ｃｈｏｗｄｈｒｙ  Ｓ，  Ｐｉｚａｒｒｏ  ＴＴ：  Ｏｐｐｏｓｉｎｇ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓｉｃ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  ＩＬ−１  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｕｔ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３，  ４：１８１．
１５．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  Ｈ：  Ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ．  Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ  １９９２．
１６．Ｆｏｘ  ＡＤ，  Ｋｒｉｐｋｅ  ＳＡ，  Ｄｅ  Ｐａｕｌａ  Ｊ，  Ｂｅｒｍａｎ  ＪＭ，  Ｓｅｔｔｌｅ  ＲＧ，  Ｒｏｍｂｅａｕ  ＪＬ：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｅｎｔｅｒａｌ  ｄｉｅｔ  ｏｎ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ．  ＪＰＥＮ  Ｊ  Ｐａｒｅｎｔｅｒ  Ｅｎｔｅｒａｌ  Ｎｕｔｒ  １９８８，  １２（４）：３２５−３３１．
１７．Ｒｏｔｈ  Ｅ，  Ｋａｒｎｅｒ  Ｊ，  Ｏｌｌｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｇ，  Ｋａｒｎｅｒ  Ｊ，  Ｓｉｍｍｅｌ  Ａ，  Ｆｕｒｓｔ  Ｐ，  Ｆｕｎｏｖｉｃｓ  Ｊ：  Ａｌａｎｙｌｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｍｕｓｃｌｅ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ａｌａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｚｅｄ  ｄｏｇｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ  （Ｌｏｎｄ）  １９８８，  ７５（６）：６４１−６４８．
１８．Ｇｕａｎｄａｌｉｎｉ  Ｓ，  Ｒｕｂｉｎｏ  Ａ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔｓ．  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  １９８２，  １６（２）：９９−１０３．
１９．Ｍｉｌｌｅｒ  ＰＭ，  Ｂｕｒｓｔｏｎ  Ｄ，  Ｂｒｕｅｔｏｎ  ＭＪ，  Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＤＭ：  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｉｎｔｏ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｌｎｏｕｒｉｓｈｅｄ  ｙｏｕｎｇ  ｒａｔ  ｊｅｊｕｎｕｍ．  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  １９８４，  １８（６）：５０４−５０８．
２０．Ｖａｚｑｕｅｚ  ＪＡ，  Ｍｏｒｓｅ  ＥＬ，  Ａｄｉｂｉ  ＳＡ：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９８５，  ２４９（５  Ｐｔ  １）：Ｇ５６３−５６６．
２１．Ｌａｄｉｒａｔ  ＳＥ，  Ｓｃｈｏｌｓ  ＨＡ，  Ｎａｕｔａ  Ａ，  Ｓｃｈｏｔｅｒｍａｎ  ＭＨ，  Ｋｅｉｊｓｅｒ  ＢＪ，  Ｍｏｎｔｉｊｎ  ＲＣ，  Ｇｒｕｐｐｅｎ  Ｈ，  Ｓｃｈｕｒｅｎ  ＦＨ：  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３，  ９２（３）：３８７−３９７．
２２．Ｍｉｎｅｋｕｓ  Ｍ，  Ｓｍｅｅｔｓ−Ｐｅｅｔｅｒｓ  Ｍ，  Ｂｅｒｎａｌｉｅｒ  Ａ，  Ｍａｒｏｌ−Ｂｏｎｎｉｎ  Ｓ，  Ｈａｖｅｎａａｒ  Ｒ，  Ｍａｒｔｅａｕ  Ｐ，  Ａｌｒｉｃ  Ｍ，  Ｆｏｎｔｙ  Ｇ，  Ｈｕｉｓ  ｉｎ'ｔ  Ｖｅｌｄ  ＪＨ：  Ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｓｉｍｕｌａｔｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｍｉｘｉｎｇ，  ｗａｔｅｒ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９９，  ５３（１）：１０８−１１４．
２３．Ｓｃｈｏｌｚ  Ｒ，  Ｍｏｌｏｈｏｎ  ＫＪ，  Ｎａｃｈｔｉｇａｌｌ  Ｊ，  Ｖａｔｅｒ  Ｊ，  Ｍａｒｋｌｅｙ  ＡＬ，  Ｓｕｓｓｍｕｔｈ  ＲＤ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ＤＡ，  Ｂｏｒｒｉｓｓ  Ｒ：  Ｐｌａｎｔａｚｏｌｉｃｉｎ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｃｒｏｃｉｎ  Ｂ１７／ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｓ−ｌｉｋｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２０１１，  １９３（１）：２１５−２２４．
２４．Ｋｏｚｉｃｈ  ＪＪ，  Ｗｅｓｔｃｏｔｔ  ＳＬ，  Ｂａｘｔｅｒ  ＮＴ，  Ｈｉｇｈｌａｎｄｅｒ  ＳＫ，  Ｓｃｈｌｏｓｓ  ＰＤ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｄｕａｌ−ｉｎｄｅｘ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ａｎｄ  ｃｕｒａｔｉｏｎ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＭｉＳｅｑ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０１３，  ７９（１７）：５１１２−５１２０．
２５．Ｃａｐｏｒａｓｏ  ＪＧ，  Ｌａｕｂｅｒ  ＣＬ，  Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ＥＫ，  Ｂｅｒｇ−Ｌｙｏｎｓ  Ｄ，  Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ａ，  Ｓｔｏｍｂａｕｇｈ  Ｊ，  Ｋｎｉｇｈｔｓ  Ｄ，  Ｇａｊｅｒ  Ｐ，  Ｒａｖｅｌ  Ｊ，  Ｆｉｅｒｅｒ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ：  Ｍｏｖｉｎｇ  ｐｉｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ２０１１，  １２（５）：Ｒ５０．
２６．Ｓｃｈｌｏｓｓ  ＰＤ，  Ｗｅｓｔｃｏｔｔ  ＳＬ，  Ｒｙａｂｉｎ  Ｔ，  Ｈａｌｌ  ＪＲ，  Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｍ，  Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ  ＥＢ，  Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉ  ＲＡ，  Ｏａｋｌｅｙ  ＢＢ，  Ｐａｒｋｓ  ＤＨ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ：  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｏｔｈｕｒ：  ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ，  ｐｌａｔｆｏｒｍ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００９，  ７５（２３）：７５３７−７５４１．
２７．Ｋｏｎｇ  Ｙ：  Ｂｔｒｉｍ：  ａ  ｆａｓｔ，  ｌｉｇｈｔｗｅｉｇｈｔ  ａｄａｐｔｅｒ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｔｒｉｍｍｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１１，  ９８（２）：１５２−１５３．
２８．Ｅｄｇａｒ  ＲＣ，  Ｈａａｓ  ＢＪ，  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ  ＪＣ，  Ｑｕｉｎｃｅ  Ｃ，  Ｋｎｉｇｈｔ  Ｒ：  ＵＣＨＩＭＥ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｅｄ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１１，  ２７（１６）：２１９４−２２００．
２９．Ｗａｎｇ  Ｑ，  Ｇａｒｒｉｔｙ  ＧＭ，  Ｔｉｅｄｊｅ  ＪＭ，  Ｃｏｌｅ  ＪＲ：  Ｎａｉｖｅ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｙ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００７，  ７３（１６）：５２６１−５２６７．
３０．Ｅｒｅｎ  ＡＭ，  Ｍａｉｇｎｉｅｎ  Ｌ，  Ｓｕｌ  ＷＪ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＬＧ，  Ｇｒｉｍ  ＳＬ，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＨＧ，  Ｓｏｇｉｎ  ＭＬ：  Ｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ：  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔａｘａ  ｕｓｉｎｇ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｄａｔａ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｃｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２０１３，  ４（１２）．
【図１Ａ】
2021520197.tif 000005
【図１Ｂ】
2021520197.tif 000006
【図１Ｃ】
2021520197.tif 000007
【図１Ｄ】
2021520197.tif 000008
【図１Ｅ】
2021520197.tif 000009
【図１Ｆ】
2021520197.tif 000010
【図１Ｇ】
2021520197.tif 000011
【図１Ｈ】
2021520197.tif 000012
【図１Ｉ】
2021520197.tif 000013
【図１Ｊ】
2021520197.tif 000014
【図２】
2021520197.tif 000015
【図３】
2021520197.tif 000016
【図４】
2021520197.tif 000017
【図５】
2021520197.tif 000018
【図６】
2021520197.tif 000019
【図７】
2021520197.tif 000020
【図８】
2021520197.tif 000021
【図９】
2021520197.tif 000022
【図１０】
2021520197.tif 000023
【配列表】
2021520197000001.app
【国際調査報告】
2021520197.tif 000024
2021520197.tif 000025
2021520197.tif 000026