(57)【要約】  本発明は核酸を単離するための方法及びキットを提供し、これには、核酸の精製及び核酸濃縮、並びにそれらがバイオマーカーとして働くサンプル中の核酸の同定が含まれる。より具体的には、本発明が（ａ）アミン、アミジン又は他のアミン由来カチオンであるカチオン性分子又は（ｂ）固体支持体に結合した副溝核酸結合分子のいずれかである、核酸結合分子に、核酸を結合させる工程、及びポリオキソメタレート又はシュウ酸塩との接触によって結合した核酸を核酸結合分子から解離させる工程を提供する。【選択図】図３【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、第１の核酸含有組成物からの核酸の分離方法：
ａ）第１相に第１の核酸含有組成物を提供すること；
ｂ）第２相に
（ａ）アミン、アミジン又は他のアミン由来のカチオンであるカチオン性分子、又は
（ｂ）副溝核酸結合分子
のいずれかである核酸結合分子を提供すること；
ｃ）前記第１の核酸含有組成物中の核酸が、核酸結合分子に結合するのに十分な時間、前記第１相と第２相との間の接触を維持することを可能にすること；
ｄ）第１相を第２相から分離すること；及び
ｅ）第２相を処理して、ポリオキソメタレート又はシュウ酸塩分子を含む解離組成物と接触させることによって、結合した核酸を前記核酸結合分子から解離させ、第２の核酸含有組成物を生成すること。
【請求項２】
前記カチオン性分子がカチオン性ポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、アミジン含有ポリマー、又はグアニジノポリマーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン性分子が、アミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アミンが、固体支持体に固定化されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアンモニウム（ＱＭＡ）又はジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）基を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸結合分子が、副溝核酸結合分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記副溝核酸結合分子が、ＤＮＡの副溝に結合する、アミジノ基、アミド基、又はグアニジノ基から選択される１つ以上の基を有する分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記副溝核酸結合分子が、アミジノ基を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記副溝核酸結合分子が、抗生物質、抗菌剤、又は抗癌剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記副溝核酸結合分子が、抗生物質又はその誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗生物質が、ストレプトマイシン又はその誘導体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗生物質が、ネトロプシン、ＤＡＰＩ、テトラサイクリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ネオマイシン、又はパルマチン、コラリン又はベルベリンのようなイソキノリンアルカロイドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記副溝核酸結合分子が、標的配列に優先的に結合することができる配列特異的結合剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記解離組成物が、ポリオキソメタレートイオン又はシュウ酸塩を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記解離組成物が、ポリオキソメタレートを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリオキソメタレートが、遷移金属の酸化物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリオキソメタレートが、タングステン、モリブデン、ニオブ、タンタル又はバナジウムの酸化物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリオキソメタレートが、バナジン酸塩である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記バナジン酸塩が、ＮａＶＯ３の重合体である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリオキソメタレートが、アルカリ性溶液中でのポリオキソメタレートの溶解、続いての酸性化によって形成される種の混合物である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記溶液の最終ｐＨが、５〜６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶液中の前記ポリオキソメタレートの濃度が、０．０１ｍＭ〜５００ｍＭである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記解離組成物が、シュウ酸塩を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記シュウ酸塩が、（ＮＨ４）２Ｃ２Ｏ４である、請求項２４に記載の処理。
【請求項２６】
前記シュウ酸塩の濃度が、０．０１〜５０ｍＭである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１相が、液相である、請求項１に記載の方法。
前記第２相から分離した後に、前記第１相を洗浄することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２相が、固相である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸結合分子が、固体支持体に固定化されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２相が、液相である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
解離した核酸をさらに精製するために、溶媒又はアルコールを必要としない、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の核酸含有組成物が、核酸以外の材料を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の核酸含有組成物が、生物学的サンプルに由来する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の核酸含有組成物が、実質的に純粋である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の核酸含有組成物を収集することをさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の核酸含有組成物中に存在する核酸の１つ以上を増幅することをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の核酸含有組成物中に存在する核酸の１つ以上を増幅すること、及び特定の核酸又は一般的な核酸の存在を検出することをさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法で使用するために構成された、前記第１の核酸含有組成物から核酸を分離するための、装置。
【請求項３９】
（ａ）アミン、アミジン又は他のアミン由来カチオンであるカチオン性分子、又は
（ｂ）副溝核酸結合分子のいずれかである、核酸結合分子
を含む、第１の組成物；及び
ポリオキソメタレート又はシュウ酸塩を含む、第２の組成物
を含み、前記第２の組成物を前記核酸結合分子に結合した核酸に添加すると、前記核酸結合分子から核酸が解離する、キット。
【請求項４０】
前記核酸結合分子が、固体支持体上に固定化されている、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
核酸を単離するための緩衝液及び試薬をさらに含み、及び／又は増幅及び／又は検出のための緩衝液及び試薬をさらに含む、請求項３９又は４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
核酸を単離及び／又は増幅及び／又は検出するための装置をさらに含む、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の精製及び核酸濃縮のため、並びにそれらがバイオマーカーとして働く試料中の核酸の同定のためを含む核酸の単離に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における明らかに先に公開された文献の列挙又は議論は、その文献が最新技術の一部であるか、又は一般的な一般知識であることを必ずしも認めるものと解釈されるべきではない。
【０００３】
核酸を単離する最も一般的な方法は、Ｂｏｏｍの方法（ＵＳ５２３４８０９）に由来するシリカ法である。この方法は、シリカと核酸との間の独特の可逆的相互作用に基づく。シリカの表面構造の設計、又はシリカが固体マトリックスにどのように結合されるかに関連する、いくつかのバリエーションが存在する。例えば、シリカの水和状態を変化させて、核酸結合を改善することができる。シリカはシリカ膜及びシリカ被覆磁性粒子を形成するために、様々な基材に結合されている。
【０００４】
Ｂｏｏｍの方法は手順が単純であり、プロセスによって単離された核酸の純度が、ほとんどの下流用途に許容されるため、一般的である。Ｂｏｏｍの方法は、結合、洗浄及び溶出の３つの工程を含む。しかしながら、生物学的サンプルが関係する場合、サンプルの均質化は、通常、第１のステップの前に行われる。核酸は、典型的には細胞膜及び／又は細胞壁、又はウイルスカプセル内で保護されている。核酸はまた、一般に、タンパク質（例えば、ヒストンタンパク質又は核酸を消化し得る酵素を含む酵素）と会合している。従って、生物学的サンプルから核酸を抽出するためには、細胞を溶解しなければならず、そして核酸を修飾又は消化し得る酵素を選択的に不活性化する必要があり得る。また、生成物中にリボ核酸（ＲＮＡ）が不要な場合には、通常、ＲＮＡを消化するための酵素が溶解工程に含まれる。この酵素は、ＲＮＡを個々のヌクレオチドに加水分解し、これは、洗浄工程の間に除去され、そして溶出産物中にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のみを残す。同様に、ＲＮＡが所望の産物である場合、ＤＮＡを消化する酵素を含有させることによって、ＤＮＡを選択的に消化することができる。ＲＮＡが所望の産物である場合、ＲＮＡａｓｅインヒビターはしばしば、ＲＮＡを分解から保護するために使用される。
【０００５】
カオトロピック剤は、しばしば、三次構造を分解し、細胞成分又はウイルスカプセル中からの核酸の溶液中への放出を確実にするために添加される。典型的には、カオトロピック塩、例えば塩化グアニジニウムが追加される。カオトロピック塩は、核酸、特にＤＮＡを修飾又は加水分解する酵素に対する阻害剤としても作用する。塩濃度は、シリカ表面への核酸結合に重要である。シリカは、塩濃度が低い場合には効率的に核酸を捕捉しないので、グアニジニウム塩、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム及び塩化カリウムなどの塩を添加してイオン強度を増加させ、捕捉を容易にする。溶解後及び結合工程前の試料溶液中の塩の濃度は、Ｂｏｏｍの方法では０．５Ｍ〜２Ｍである。核酸は結合工程においてシリカ表面上に捕捉されるが、タンパク質、脂質、及び他の細胞成分は非特異的相互作用によって結合しないか、又は弱くしか結合しない。しかしながら、塩もシリカマトリックス上に捕捉される。次いで、洗浄工程においてシリカマトリックスを高濃度のアルコール（通常約７０％エタノール）で洗浄して、弱く結合した細胞成分及び／又は保持されている任意の塩を除去する。しかしながら、核酸からアルコールを完全に除去することは困難である。
【０００６】
アルコールは下流用途の多くの酵素、例えば、ＰＣＲに使用されるポリメラーゼ、アニーリング反応に使用されるリガーゼ、及び制限酵素消化に使用されるヌクレアーゼに対する強力な阻害剤であることがよく知られている。したがって、下流での適用を妨げないように、マトリックスからのアルコールの除去を確実にするために、追加の工程が必要とされる。使用される方法は、シリカマトリックスを加熱すること、マトリックスを高速で遠心分離すること、又はアルコールを蒸発させるためにマトリックスを空気に曝すことを含む。残留アルコールを除去した後、核酸を、低塩濃度（例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を有する溶液を用いてシリカ表面から溶出する。
【０００７】
イオン交換クロマトグラフィーを用いる核酸単離のための無溶媒方法が開発されている。陰イオン交換クロマトグラフィーは、長い間核酸を精製するために使用されてきた。この方法は、負に荷電した核酸に結合するカチオン性樹脂を使用する。ゲノムＤＮＡ又はプラスミドのような核酸は、その長さに沿って数万の負に荷電したリン酸基を有する。したがって、カチオン性樹脂は、核酸に非常に強く結合する。一方、タンパク質、脂質、及びオリゴ糖は、双性イオン性であるか、正に荷電しているか、又はより少ない負電荷を有するかのいずれかであり、したがって核酸ほど強くカチオン性樹脂に結合しない。核酸と他の細胞成分との間の親和性の違いを利用して、核酸を抽出する。このプロセスでは、対イオン、例えば塩化ナトリウム、塩化グアニジニウム、グアニジンイソチオシアネート、又は塩化カリウムを含有するイオン溶液を樹脂に通し、対イオンの濃度を徐々に増加させる。最も弱く結合する分子は、最低濃度で溶出される。対イオンの濃度が増加することにつれて、より強固に結合した分子が溶出される。典型的にはタンパク質、オリゴ糖及び脂質は０．３Ｍ塩化ナトリウム未満で溶出される。核酸は、０．５Ｍ〜２Ｍ以上の塩化ナトリウムから溶出することができる。しかしながら、核酸が塩溶液で溶出される場合、大量の塩も核酸と共に溶出液中に移動する。塩の濃度は、大部分の下流での適用を阻害するほど高い。従って、核酸溶液から塩を除去するために、さらなる工程が必要とされる。
【０００８】
従って、下流の処理が行われる前にアルコール及び塩のような汚染物質の除去を必要としない、核酸を単離するための方法が必要とされている。本開示は、そのようなプロセスを提供することを目的とする。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、以下の工程を含む、第１の核酸含有組成物からの核酸の分離方法が提供される：
ａ）第１相に第１の核酸含有組成物を提供すること；
ｂ）第２相に、
（ａ）アミン、アミジン又は他のアミン由来のカチオンであるカチオン性分子、又は
（ｂ）副溝核酸結合分子
のいずれかである、核酸結合分子を提供すること；
ｃ）前記第１の核酸含有組成物中の核酸が、前記核酸結合分子に結合するのに十分な時間、前記第１相と前記第２相との間の接触を維持することを可能にすること；
ｄ）第１相を第２相から分離すること；及び
ｅ）第２相を処理して、ポリオキソメタレート又はシュウ酸塩分子を含む解離組成物と接触させることによって、結合した核酸を前記核酸結合分子から解離させ、第２の核酸含有組成物を生成すること。
【００１０】
本発明の第２の態様によれば、第２の核酸含有組成物中に存在する１以上の核酸を増幅することをさらに含む、第１の態様による方法が提供される。
【００１１】
本発明の第３の態様によれば、第１の態様による方法であって、さらに、第２の核酸含有組成物中に存在する１以上の核酸を増幅し、特定の核酸又は一般的な核酸の存在を検出することを含む、方法が提供される。
【００１２】
本発明の第４の態様によれば、第１〜第３の態様のいずれかのプロセスにおいて使用するように構成された、第１の核酸含有組成物から核酸の分離するための装置が提供される。
【００１３】
本発明の第５の態様によれば、（ａ）アミン、アミジン又は他のアミン由来カチオンであるカチオン性分子、又は（ｂ）副溝核酸結合分子のいずれかである核酸結合分子を含む、第１の組成物と；
ポリオキソメタレート又はシュウ酸塩を含む、第２の組成物を含み、
前記核酸結合分子に結合した核酸への前記第２の組成物の添加が、前記核酸結合分子からの核酸の解離をもたらす、キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本開示を容易に理解し、実用的に実施するために、添付の図面を参照して例示される例示的な実施形態を参照する。図面は説明と共に、本発明の実施形態をさらに例示し、様々な原理及び利点を説明するのに役立つ。
【００１５】
【図１】図１は、ｐＨに対するバナジン酸塩（Ｖ）のスペシエーションを示すグラフである。種の分布は、バナジウムの濃度及び溶液のｐＨの両方に依存する。より高い濃度では、バナジウムの大部分がｐＨ５でデカマー（ＨＶ１０Ｏ２８）５の形態をとる。
【図２】図２は、ストレプトマイシン樹脂を用いたＤＮＡ分離の結果の画像を示す。（ａ）ｐＢＲ３２２  ＭｓｐＩ消化ＤＮＡの分子量スケールを有するＤＮＡ電気泳動ゲルの写真（ｂ）ＤＮＡの電気泳動ゲルの写真。ここで、ｐＢＲ３２２  ＭｓｐＩ消化ＤＮＡは、ストレプトマイシン結合樹脂を用いて単離された。ゲルは、陽性対照（Ｍ）、フロースルー画分（ＦＴ０）、洗浄画分（Ｗ０）及び回収核酸画分（Ｅ０）のレーンを有する。
【図３】図３は、ＤＥＡＥ樹脂を用いてｐＢＲ３２２  Ｍｓｐ  Ｉ消化ＤＮＡを単離したＤＮＡ電気泳動ゲルの写真を示す。ゲルは、陽性対照（Ｍ５）、フロースルー画分（ＦＴ２）、洗浄画分（Ｗ２）及び回収核酸画分（Ｅ２）のレーンを有する。
【図４】図４は、ストレプトマイシン結合樹脂から２０００コピーのマウスゲノムＤＮＡが溶出された場合の、対数（コピー数）に対するＣＴ値のグラフを示す。
【図５】図５は、種々の核酸サンプルを、ＮａＣｌがストレプトマイシン結合樹脂からＤＮＡを溶出する塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度と対比するグラフを示す。
【図６】図６は、ｐＢＲ３２２  Ｍｓｐ  Ｉ消化ＤＮＡが、バナジン酸ナトリウム（レーン１）、シュウ酸カリウム（レーン２）、酒石酸四水和物（レーン３）、ヘキサクロロ白金酸（ＩＶ）（レーン４）、及び水酸化ナトリウム（レーン５）で溶出されたＤＮＡ電気泳動ゲルの写真を示す。
【図７】図７はＤＮＡ電気泳動ゲルの写真を示し、ここで、ｐＢＲ３２２  Ｍｓｐ  Ｉ消化ＤＮＡは、デカバナジン酸（レーン１Ｅ）、タングステン酸ナトリウム（レーン２Ｅ）又は種々の形態のモリブデン酸ナトリウム（ＭｏＯ４（２−）ｐＨ  ６．１、レーン３Ｅ；  Ｍｏ７Ｏ２４（６−）ｐＨ  ４．１、レーン４Ｅ及びＭｏ８Ｏ２６（４−）ｐＨ  ２．１、レーン５Ｅ）で溶出された。（Ｆ）は収集されたフロースルーを表す。（Ｗ）は溶出前に収集された０．５ＭのＮａＣｌ洗浄を表す。（Ｅ）は収集されたデカバナジン酸、タングステン酸ナトリウム又はモリブデン酸ナトリウム溶出物を表す。（Ｓ）はＤＮＡの溶出後に収集された、２．５ＭのＮａＣｌ洗浄を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［定義］
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。
【００１７】
「第１相」という用語は、本発明の文脈において使用される場合、核酸含有組成物を含む液体又は移動相を指す。
【００１８】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は本明細書では本発明を実施する際に様々な成分、成分、又はステップを共同で使用することができるものと定義され、したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」はより限定的な用語「本質的にからなる」及び「からなる」を包含する。
【００１９】
本発明は、第１の核酸含有組成物からの核酸の単離方法に関する。第１の核酸含有組成物は、アミン、アミジン又は他のアミン由来カチオンであるカチオン性分子、又は副溝核酸結合分子のいずれかである、核酸結合分子と接触させられる。接触は、第１の核酸含有組成物中の核酸が核酸結合分子に結合するのに十分な時間維持される。組成物の他の成分は、結合しないか、又は洗い流される。その後、結合した核酸は、ポリオキソメタレート、シュウ酸塩又は可溶性副溝結合分子を含む解離組成物と接触することによって、核酸結合分子から解離され、第２の核酸含有組成物を生成する。一般に、第１の核酸含有組成物は生物学的試料に由来し、したがって、タンパク質及び脂質などの他の生物学的分子を含有し、第２の核酸含有組成物は、これらの成分を実質的に含まない。
【００２０】
この方法は、下流の酵素反応と適合する。他の溶出方法のように、アルコール又は塩を除去する必要はない。これは、核酸の増幅が、溶出されたＤＮＡ／ＲＮＡが増幅工程において直接的に使用され得るので、単純化されることを意味する。これは、時間がかかり、潜在的にサンプルの汚染を可能にするさらなる処理ステップを行う必要性を回避する。したがって、患者からの試料中の特定の核酸又は一般的な核酸の検出が単純化される。
【００２１】
第１の核酸含有組成物は、生物学的サンプル（例えば、液体、固体、培養細胞、便、毛髪、スワブなど）、又は衣類、壁綿棒（ｗａｌｌ  ｓｗａｂ）、プラスチック、布地、土壌などから採取された法医学的サンプルのような環境から採取されたサンプルであり得る。
【００２２】
生物学的サンプルは、核酸抽出の前に溶解される無傷の細胞を含み得る。当業者によって十分に理解されるように、溶解工程は、機械的、熱的、酵素的、若しくは化学的方法、又はこれらの組み合わせであり得る。適切な機械的方法としては、超音波処理、不活性研磨粒子による破壊、又は剪断力による溶解が挙げられる。熱的方法には、直接加熱又は凍結及び解凍サイクルが含まれる。化学的方法には、カオトロピック塩、溶媒、又は浸透圧ショック誘導塩の添加による溶解が含まれる。酵素的方法には、プロテイナーゼによる加水分解が含まれる。
【００２３】
好ましい実施形態によれば、核酸結合分子は、マトリックス、膜、又は表面であり得る固体支持体に結合される。典型的には、核酸結合分子が第１の核酸含有組成物が導入されるカラムに充填される。固相支持体は固定相と呼ばれる第２相を形成し、一方、第１の核酸含有組成物は、移動相と呼ばれる第１相を形成する。核酸結合分子は、溶液中で利用可能な核酸結合部分で固定相に結合される。抽出の間、核酸結合分子は核酸を捕捉し、それは一時的に固定相の一部となる。当業者によってよく理解されるように、このようなカラムは、第１の核酸含有組成物中の核酸が核酸結合分子に結合するのに十分な時間、接触が維持されるように設計される。第１の核酸含有組成物の他の成分は、結合せずにカラムを通過するか、又は弱く結合され、したがって、核酸が結合したままである間、洗浄工程においてカラムから洗浄され得る。
【００２４】
必ずしも必要ではなく、好ましくはないが、第１の核酸含有組成物は塩を含有してもよい。当業者によって十分に理解されるように、塩の添加は、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水性効果などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨害し、核酸結合分子への非特異的結合を低減又は排除する。塩は、核酸結合分子への非特異的結合を減少又は排除する任意の塩であり得る。一実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ヒスチジン、尿素、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、アルカリ溶液、及び塩化アンモニウムからなる群から選択される。塩は、核酸結合分子への非特異的結合を阻害するために水溶液として添加され得る。より低い濃度、例えば０．１Ｍ、また例えば０．１〜０．５Ｍの範囲では、タンパク質、脂質又は他の非核酸分子が核酸結合分子と会合するのを阻害する。より高い塩濃度では、より大きな核酸のみが選択的に捕捉されるように、より小さな核酸が除去される。
【００２５】
０．１〜１Ｍの濃度を有する塩溶液を使用して、カラムを洗浄して非特異的結合分子を除去し、次いで廃棄することもできる。１〜６回の洗浄工程があってもよいが、通常、１又は２回の洗浄工程のみが必要である。１つ以上の異なる塩を溶液中で混合することができる。洗浄は、必要に応じて、異なる塩溶液を順番に適用して実施され得る。例として、塩化グアニジニウム溶液を第１の洗浄工程で使用し、続いて第２の洗浄工程で水を使用して、残留する塩化グアニジニウムを除去することができる。第１の核酸含有組成物が塩を含有するか、又は塩溶液が洗浄のために使用される場合、一般に、溶出工程の前に、残留塩を除去するために、水での最終洗浄が存在する。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、カチオン性分子はカチオン性ポリマーである。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーがポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、グアニジノポリマー、又はアミジンポリマーである。グアニジノポリマーは、例えば、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンと塩酸グアニジンとの重合と、例えば、エピクロロヒドリンを使用することによるその後の架橋とによって形成される、縮合ポリマーであり得る。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーはポリエチレンイミンである。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、カチオン性分子は、固体支持体に固定化される。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、カチオン性分子はアミンである。例えば、アミンは、第一級アミン、又はジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアンモニウム（ＱＭＡ）、又はジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）基を含み、固体支持体に固定化される。
【００３１】
当業者によって十分に理解されるように、支持体は、カラムを充填することができる任意の固体支持体であり得る。例として、固体支持体は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、セルロース、シリカ酸化物表面、金属酸化物表面、セラミック、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、アガロース、架橋アガロース、コア−シェル粒子、磁性粒子、デキストラン、架橋デキストラン、アクリルアミド、架橋アクリルアミド、又は他のポリマー粒子、例えばポリスチレン、ポリエチレンであってもよい。
【００３２】
別の好ましい実施形態において、核酸結合分子は、副溝核酸結合分子である。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、核酸結合分子は、副溝核酸結合分子が固定化された固体支持体を含む樹脂である。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、副溝核酸結合分子は、ＤＮＡの副溝に結合する、アミジノ基、アミド基、又はグアニジノ基から選択される１つ以上の基を有する分子であり、４−アミノブチルグアニジン、アルギニン又は４−アミノブチルグアニジンに由来するコンジュゲートなどが挙げられる。
【００３５】
別の好ましい実施形態では、副溝核酸結合分子は、アミジノ基を含む。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、副溝核酸結合分子は、抗生物質、抗菌剤、又は抗癌剤である。
【００３７】
別の好ましい実施形態において、副溝核酸結合分子は、抗生物質又はその誘導体である。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、抗生物質はストレプトマイシン又はその誘導体である（例えば、（Ｌｉｕ，  ＹＪ，  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，１３３（２６）：１０１７１−１０１８３（２０１１）（その内容は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、抗生物質は、ネトロプシン、ＤＡＰＩ、テトラサイクリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ネオマイシン、又はイソキノリンアルカロイド（例えば、パルマチン、コラリン又はベルベリン）である。
【００４０】
多くの抗生物質のアミジン又はアミド基は、核酸に結合する能力において重要である。アミジンは、スタッキング効果及びＨ結合を介して核酸と相互作用し得る。［Ｌｉｕ，  ＹＪ，  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，１３３（２６）：１０１７１−１０１８３（２０１１）］．ストレプトマイシンの誘導体が、核酸の結合を研究するために本論文で開発された。また、例えば、ネトロプシン、ＤＡＰＩ、テトラサイクリン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、ＲＮＡのポリＡに結合するネオマイシン［Ｘｉ，  Ｈ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８３：  ２２６９−２２７５  （２００９）］、イソキノリンアルカロイド［Ｇｉｒｉ，  Ｐ．  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｐｌａｎｔ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｐａｌｍａｔｉｎｅ  ｂｉｎｄｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｔｏ  ｐｏｌｙ（Ａ），  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １６：  ２３６４−２３６８（２００６）；  Ｘｉｎｇ，  Ｆ．  Ｃｏｒａｌｙｎｅ  ｂｉｎｄｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｔｏ  ｐｏｌｙ（Ａ），  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５７９：  ５０３５−５０３９  （２００５）；  Ｙａｄａｖ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ，  ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ｐｏｌｙｒｉｂｏａｄｅｎｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｌａｎ  ａｌｋａｌｏｉｄ，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １３：  １６５−１７４  （２００５）］など、他の抗生物質もまた、核酸に結合することが知られている。これらの構造研究は、会合が核酸の小溝で起こることを示す。
【００４１】
他の核酸結合分子（例えば、他の抗生物質薬物又は抗癌薬物）もまた使用され得、これらは、スタッキング相互作用、水素結合、及び静電引力を介して核酸に結合することが公知である。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、副溝核酸結合分子が特定の配列を標的とすることができる。一実施形態では、副溝核酸結合分子は、ＡＴリッチ核酸を選択することができる。一実施形態では、ＡＴリッチ核酸を選択することが特異的に可能な核酸結合剤は、アミジンである。多くのアミジンベースの核酸結合剤は、ランダム又はＧＣリッチ配列よりもはるかに高い親和性でＡＴリッチ配列に結合する。例えば、ビス−アミジノカルバゾールは、ＡＡＴＴ配列の副溝内でアクセス可能な遺伝情報を読み取ることができる平面発色団を有する［Ｔａｎｉｏｕｓ，  Ｆ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６８（１２）：  ３４５５−６４  （２００１）］。カルバゾール誘導体は、対応するジベンゾチオフェン及びジベンゾフランよりもはるかに強く核酸に結合することが示されている。アミジン又はイミダゾリンのいずれかのカチオン性部分が、ＤＮＡ及びＲＮＡへの強力な結合に影響を及ぼすようことが示されている［Ｍａｒｔｉｎｅ  Ｄｅｍｅｕｎｙｎｃｋ，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｂａｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  −  ２００６  −  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＩＳＢＮ：  ９７８−３−５２７−６０５６６−８］。別のジカチオン性ジアミジン誘導体は、配列ＡＡＴＴを含むＤＮＡの副溝に異常に強い結合を有することが示されている。別の研究では、ネトロプシン−オキサゾロピリドカルバゾールのアミジン基が、ポリＧＣ配列よりもポリＡＴ配列に対して強い親和性を示した。［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−Ｔｈｉｒｄ  Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｈｅｌｄ  ｉｎ  Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，  Ｉｓｒａｅｌ，  Ｍａｙ  １４−１７，  （１９９０）  Ｅｄｓ．  Ｂ．  Ｐｕｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊｏｒｔｎｅｒ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＋  Ｂｕｓｉｎｅｓ  Ｍｅｄｉａ，  Ｂ．Ｖ．；  ＩＳＢＮ  ９７８−９４−０１０−５６５７−１］。さらに別の刊行物において、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８のヘキサ環式アミジン類似体は、ＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣの配列に対して強い選択的親和性を示した［Ｂｏｓｔｏｃｋ−Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ０：  １２１−１２２  （１９９７）］。したがって、副溝結合剤は、第１の核酸含有組成物中の他の核酸に優先して、選択されたクラスの分子又は特定の配列さえも濃縮／抽出するために使用され得る。一実施形態では、ＧＣリッチ又はランダム配列への結合を達成することができるが、試料中の塩濃度などのパラメータを調整する。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、核酸結合分子は、配列特異的結合剤が結合される樹脂である。配列特異的結合剤が使用される場合、配列特異的結合剤に結合する標的配列を有する核酸の濃縮が可能である。標的配列は、バイオマーカーであり得る。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、核酸結合分子は、核酸試料が存在する第２の液相と可溶性又は混和性でない第１の液相中に存在することができる。２つの液相は、水性／水性又は有機溶媒／水性であり得る。例としては、クロロホルム／水、油／水及びＰＥＧ溶液／水系が挙げられる。核酸結合分子は、第１の液相のみに存在し、第２相には存在しない。核酸結合分子は、第１の液相中のマトリックスの一部であってもよく、又は第１の液相中の可溶性成分であってもよい。核酸への結合は、第１の液相及び第２の液相の境界で起こり得る。一実施形態では、液相の一方が他方の液相中の微小液滴である。洗浄及び溶出は、第２の液相を洗浄溶液で置き換え、次いで溶出溶液で置き換えることによって達成することができた。
【００４５】
水を使用して、残留塩を除去し、非特異的に結合した分子を除去するために、核酸結合分子が起こった後の第２相をすすぎ、洗浄することができる。この方法ではアルコールは必要とされない。したがって、固体表面を乾燥させたり、表面からアルコールを除去したりする必要がない。
【００４６】
核酸結合分子からの結合核酸の解離は、解離組成物との接触によって起こる。クロマトグラフィープロセスにおいて使用される場合、解離組成物は、溶出緩衝液と呼ばれる。このような工程において、溶出緩衝液は、ポリオキソメタレートイオン、シュウ酸塩若しくは可溶性の副溝結合分子、又はこれらの化合物のいずれかの混合物を含み得る。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、解離組成物はポリオキソメタレートを含む。水溶液中では、これらの金属酸化物はｐＨ依存性の縮合又は解離を受け、種々の化学種として存在する。この現象をスペシエーションと呼ぶ。溶液中の種の組成は、溶液のｐＨ及び酸化物の濃度に依存する。酸化物溶液を調製するために、固体酸化物をアルカリ性溶液に溶解することができる。アルカリ性条件下では、酸化物が単一の別個の単位として存在することができる。ｐＨが低下することにつれて、溶液中の酸化物は多原子イオンを形成する。通常、複数の種が存在して平衡混合物を与え、その正確な性質は図１に示されるように、酸化物のｐＨ及び濃度に依存する［Ａｌａｎ  Ｓ．  Ｔｒａｃｅｙ，  Ｇａｉｌ  Ｒ．  Ｗｉｌｌｓｋｙ，  ａｎｄ  Ｅｓｔｈｅｒ  Ｓ．  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ｖａｎａｄｉｕｍ：  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ＩＳＢＮ：  １−４２００−４６１３−６  ，  Ｐａｇｅ  ２１  （２００７）による］。理論に束縛されることを望まないが、多原子アニオンはアミン化合物と錯体を形成すると考えられている；したがって、溶出緩衝液中のポリオキソメタレートは、核酸結合分子に首尾よく結合することによって核酸を溶出すると考えられる。例えば、多原子アニオンはアミジン基（例えば、ストレプトマイシン）及び第三級アミン基（例えば、ＤＥＡＥ）に結合した核酸を置換する。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、ポリオキソメタレートは、遷移金属の酸化物である。タングステン、モリブデン、ニオブ、タンタル、及びバナジウムなどの遷移金属の酸化物は、溶液中で重合アニオン（ポリオキソメタレート）を形成することができる。一般に、ポリオキソメタレートはアルカリ性溶液中にポリオキソメタレートを溶解し、続いて酸性化により形成される種の混合物である。種の性質はｐＨ依存性である。一実施形態では、溶液の最終ｐＨは４〜８である。一実施形態では、溶液の最終ｐＨは５〜６である。種の性質も濃度依存性である。一実施形態では、溶液中のポリオキソメタレートの濃度は、１０ｍＭ〜５００ｍＭである。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、ポリオキソメタレートがタングステン、モリブデン、ニオブ、タンタル又はバナジウムの酸化物である。
【００５０】
別の好ましい態様において、ポリオキソメタレートは、バナジン酸塩、典型的にはＮａＶＯ３である。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、解離組成物は、シュウ酸塩、典型的には（ＮＨ４）２Ｃ２Ｏ４を含む。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、解離組成物は、可溶性の副溝結合分子を含む。一実施形態では、可溶性副溝結合分子には、ビス−アミジンカルバゾール、アミジノカルバゾール、イミダゾールカルバゾール、ストレプトマイシン、２，７−ジアミジノカルバゾール、ペンタミジン、ネトロプシン、ＤＡＰＩ、Ｂｅｒｅｎｉｌ及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、又はその混合物が含まれる。
【００５３】
第２の核酸含有組成物は下流での適用の前に、溶媒又はアルコールなどを用いたさらなる精製を必要としない。核酸を溶出するためには、比較的低濃度のポリオキソメタレート、シュウ酸塩又は可溶性の副溝結合分子が必要である。一実施形態では、濃度が０．０１〜５００ｍＭの範囲から選択することができる。典型的な濃度は１０〜５００ｍＭである。核酸をできるだけ少量で回収することが望ましい場合がある。溶出液の体積は、より高い濃度のポリオキソメタレート、シュウ酸塩、又は可溶性の副溝結合分子を有する、より少量の溶出液を使用することによって減らすことができる。
【００５４】
この方法は、非常に高い回収率を有する。非常に希釈された試料を捕捉することができ、回収率は５０％〜９０％（１ｍＬの血液中に１０００コピー）である。この方法は、幅広いサイズ範囲内で、そして種々の型の核酸で、一本鎖及び二本鎖の両方で機能する。このプロセスを用いて、２０ヌクレオチドほどの小ささであるがこれに限定されない一本鎖ＤＮＡ、又は１８塩基対ほどの小ささであるがこれに限定されない二本鎖ＤＮＡを回収することができる。
【００５５】
本発明はまた、本発明の方法で使用するように構成された第１の核酸含有組成物からの核酸の単離のための装置に関する。装置はサンプル間の相互汚染を最小限にするために、使い捨ての一体型カートリッジの形態をとることができる。本発明はまた、抽出工程が、単離された核酸を増幅し、及び／又は目的の核酸を検出する装置内のモジュールである、検出のための統合装置を提供する。
【００５６】
循環核酸は、診断及び予後目的、並びに多くの分野における処置の管理のためのバイオマーカーとして使用される。これらには、癌のスクリーニングと治療、母体液からの胎児遺伝子検査、母体血からのトリソミー検出、糖尿病管理などがある。ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はマイクロＲＮＡなどの核酸は、唾液、脳脊髄液、気管支洗浄液、母乳、涙、便、尿、及び精液を含む様々な体液中に見出すことができる。他の生物において、循環する核酸は動物だけでなく植物においても見出され得る（Ｇａｈａｎ，  Ｐ．Ｂ．，  ２００３，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｆｕｎｃｔ  ２１：  ２０７−２０９）。臨床応用において、外傷、敗血症、又は腫瘍の治療の際に、血液中のＤＮＡレベルが増加することが見出されている。腫瘍学の場合、循環核酸は、既存の腫瘍を有する患者の状態のモニタリング並びにより早期の癌の検出のために使用されている［Ｐｈａｌｌｅｎ，  Ｊ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：  ｅａａｎ２４１５  （２０１７）］。初期段階での腫瘍の検出は、腫瘍組織から放出される核酸の量が限られているために困難であった。癌患者由来の循環ＤＮＡ断片の大部分は１００ｂｐ未満である［Ｍｏｕｌｉｅｒｅ，  Ｆ，  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６（９）：  ｅ２３４１８  （２０１１）］。マイクロＲＮＡの場合、血液試料中のそれらの存在量は非常に低く、それらのサイズは非常に小さい（＜２５ヌクレオチド、一本鎖）。利用可能な市販の製品には、ＱｉａｇｅｎからのｍｉＲＮＡｅａｓｙ  ｓｅｒｕｍ／ｐｌａｓｍａ、ＥｘｉｑｏｎのｍｉＲＣＵＲＹ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、又はＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒのｍｉｒＶＡＮＡ  ＰＡＲＩＳが含まれる。これらの製品はサンプルを処理し、樹脂を洗浄するためにエタノール又はイソプロパノールを使用する。非常に小さい核酸の回収率に関する情報はほとんど得られていない。
【００５７】
本発明は、２０ヌクレオチドである小型の一本鎖ＤＮＡ又は１８塩基対である二本鎖ＤＮＡを回収する能力を有する。抽出及び回収は、溶媒又はアルコールなしで行われる。これにより、核酸フラグメントの量が非常に少ない体液から、一本鎖又は二本鎖の短い核酸フラグメントを濃縮するためのアプリケーションが可能になる。
【００５８】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットに関する。
【００５９】
好ましい実施形態では、このようなキットは、（ａ）アミン、アミジン又は他のアミン由来カチオンであるカチオン性分子、又は（ｂ）副溝核酸結合分子のいずれかである核酸結合分子を含む第１の組成物；及びポリオキソメタレート又はシュウ酸塩を含む第２の組成物を含む。前述のように、核酸結合分子は一般に、固体支持体上に固定化され、この形態でキット中に存在する。別法は、固体支持体及び固体支持体への核酸結合分子の付着のための試薬を提供することであろう。キットは、核酸を単離するための緩衝液及び試薬、並びに／又は核酸の増幅及び／若しくは検出のための緩衝液及び試薬をさらに含み得る。さらに、それは、核酸を単離及び／又は増幅及び／又は検出するための装置を含み得る。
【００６０】
使用に際して、キットに含まれる第１の組成物は、第１相に含まれる核酸を第１相の他の成分から分離するための分離プロセスにおいて第２相を形成する。一般に、第２相は固定相であり、次いで核酸結合分子は固体支持体に固定化される。第２の組成物は、例えば、そこから溶出することによって、固定相から核酸を解離させるために使用される。したがって、核酸結合分子に結合した核酸への第２の組成物の添加は、核酸結合分子からの核酸の解離をもたらすことが理解される。
【００６１】
次に、本発明の特定の態様を具体化する非限定的な例を説明する。
【実施例】
【００６２】
当技術分野で公知であり、特に記載されていない標準的な分子生物学技術は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）に記載に従った。
【００６３】
［例１．バナジン酸塩溶液の調製］
２５ミリモルのＮａＶＯ３を２５ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。ｐＨをｐＨ５〜ｐＨ６に徐々に調整し、放置した。静置後、溶液を水で約５００ｍＭに、次いで２５ｍＭに希釈した。
【００６４】
［例２．核酸副溝分子結合表面の結合：ストレプトマイシン及びバナジン酸塩溶液による溶出］
試薬：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＧｌｙｃｏｌｉｎｋキット、ストレプトマイシン粉末、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｘ−ｓｐｉｎ  ｆｉｌｔｅｒカラム、様々なサイズの核酸（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂの０．０２μｇ／μｌ  ｐＢＲ３２２  Ｍｓｐ  Ｉ消化ＤＮＡ）、２５ｍＭバナジン酸ナトリウム溶液、ｐＨ６。
【００６５】
ストレプトマイシン結合表面の合成及び溶出は、以下のように行った：
（１）ストレプトマイシン１３ｍｇを樹脂のユーザーマニュアルで規定された方法でＧｌｙｃｏｌｉｎｋ樹脂３００μｌ（５０％  ｗ／ｖ）にコンジュゲートした。
（２）ストレプトマイシン結合樹脂の２０μｌ分をフィルターカラムに充填した。カラムを１０，０００ｒｐｍで１分間回転させて、貯蔵液体を除去した。
（３）２０μｌのｐＢＲ３２２  ＭｓｐＩ消化ＤＮＡをカラム中の樹脂に添加し、１０，０００ｒｐｍで１分間回転させて、フロースルー（ＦＴ０）を収集した。
（４）カラムを２５μｌの水で洗浄し、回転させて洗浄液（Ｗ０）を回収した
（５）核酸を２０μｌのバナジン酸塩溶液（Ｅ０）で溶出した
（６）ＤＮＡ電気泳動を、工程３で使用したのと同じ量のｐＢＲ３２２  ＭｓｐＩ消化ＤＮＡを有する陽性対照（Ｍ）を用いてフロースルーで行った。
【００６６】
図２に示される写真に示されるように、核酸は、フロースルー（ＦＴ０）及び洗浄（Ｗ０）中に存在しない。カラム（Ｅ０）から回収された核酸は、その中に含まれるＤＮＡ分子に関して入力（Ｍ）に近い。全ての小フラグメント（６７、７６、９０、１１０、１２３  ｂｐｓ）が回収される。
【００６７】
［例３．カチオン交換表面及びバナジン酸塩を使用する核酸精製：ＤＥＡＥ樹脂］
試薬：Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐのＤＥＡＥ樹脂、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｘ−ｓｐｉｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃｏｌｕｍｎ、様々なサイズの核酸（０．０２μｇ／μＬ  ｐＢＲ３２２  ＭｓｐＩ消化ＤＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ））、２５ｍＭバナジン酸ナトリウムｐＨ６。
【００６８】
ＤＥＡＥカラムの調製及び溶出は、以下のように行った：
（１）２５μｌのＤＥＡＥ樹脂をスピンカラムに充填し、ＱｉａｇｅｎキットのＱＢＴ緩衝液で洗浄した。
（２）０．５μｇのｐＢＲ３２２  ＭｓｐＩ消化ＤＮＡを、マニュアルに従って、ＤＥＡＥ樹脂に添加した。
（３）サンプルを回転させ、フロースルー（ＦＴ２）を収集した。
（４）カラムを２５μｌのＱＣ緩衝液で洗浄し、洗浄液（Ｗ２）を回収した。
（５）核酸を２５μｌのバナジン酸塩溶液で溶出し、回収した（Ｅ２）。
（６）ＤＮＡ電気泳動を、陽性対照（Ｍ５）と一緒に収集した画分について行った。
【００６９】
図３に再現された写真に示されるように、核酸はフロースルー（ＦＴ２）又は洗浄（Ｗ２）には存在しない。核酸は、高濃度の塩を使用せずにバナジン酸塩によって溶出される。
【００７０】
［例４．ストレプトマイシン表面からバナジン酸塩溶出核酸のｑＰＣＲ結果］
試薬：ストレプトマイシン結合樹脂、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｘ−ｓｐｉｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃｏｌｕｍｎ、マウスゲノムＤＮＡ、ｑＰＣＲ  ２ｘ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、加水分解プローブアッセイミックス（Ｍｍ．ＰＴ．５８．７１６１１２３．ｇ）（ＩＤＴ  ＤＮＡ  ｓｅｒｖｉｃｅ）。２５ｍＭバナジン酸ナトリウム溶液、ｐＨ６。ヒト血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００７１】
ストレプトマイシン結合カラムを調製し、以下のように使用した：
（１）２５μｌストレプトマイシン結合樹脂をスピンカラムに充填した。
（２）２０００コピーのマウスゲノムＤＮＡをスピンカラムに添加し、回転させた。
（３）カラムを５００μｌの水で２回洗浄した。
（４）核酸を２５μｌのバナジン酸塩溶液で溶出した。
（５）１μｌの溶出ＤＮＡを、０．５μｌのアッセイミックス、５μｌのマスターミックス、及び３．５μｌの水と混合した。ｑＰＣＲアッセイをＡＢＩ  ７５００Ｆａｓｔで行った。
【００７２】
図４が示すように、溶出液は下流のｑＰＣＲ反応に適用できる。回収収率はほぼ完全である。
【００７３】
［例５．ストレプトマイシン結合樹脂は核酸に強固に結合する］
対象試薬：０．１％ウシ血清アルブミン、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの等量）、１８塩基対二本鎖ＤＮＡ、２０ヌクレオチドＤＮＡオリゴ、７３塩基対二本鎖ＤＮＡ、７３ヌクレオチドＤＮＡオリゴ、１００ヌクレオチドＤＮＡオリゴ、１５０ヌクレオチドＤＮＡオリゴ、ＭｓｐＩ消化ｐＢＲ３２２プラスミド、Ｅ．ＣｏｌｉリボソームＲＮＡ。
【００７４】
樹脂及び溶出試薬：例１で調製したストレプトマイシン結合樹脂、及び塩化ナトリウム溶液。
【００７５】
（１）０．４μｇの各標的の試薬を別々に２５μｌの樹脂に添加した。
（２）サンプルを回転させ、フロースルー画分を収集した。
（３）樹脂を２５μｌの水で洗浄し、洗浄画分を集めた。
（４）０．２Ｍ〜２．４Ｍの塩化ナトリウム勾配での溶出を行った。
（５）各勾配からの画分を集めた。
（６）全ての画分を、ゲル電気泳動を用いてアガロースゲル上で泳動した。
【００７６】
図５のグラフが示すように、副溝結合分子共役樹脂（ストレプトマイシン）は、核酸、ＤＮＡ及びＲＮＡに対して特異的かつ強固な結合を有する。より小さな核酸は、０．８Ｍの高塩分によって溶出することができた。より大きな核酸は、樹脂から溶出されるのに最大２．２Ｍを必要とする。
【００７７】
［例６．シュウ酸塩による核酸の溶出］
試薬：例２のように調製したストレプトマイシン結合樹脂（２５％ｗ／ｖ）、ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ、バナジン酸ナトリウム、シュウ酸カリウム、１００ｂｐ  ＤＮＡラダー（ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂ）。
【００７８】
手順：
（１）溶出溶液１（５０ｍＭバナジン酸ナトリウム）、溶出溶液２（５０ｍＭシュウ酸カリウム）、溶出溶液３（酒石酸四水和物）、溶出溶液４（ヘキサクロロ白金（ＩＶ））及び溶出溶液５（１Ｍ  ＮａＯＨ）は、それぞれの名前の試薬を水に溶解することによって調製した。
（２）５本のチューブを準備し、それぞれの溶出溶液で１本ずつ溶出した。５μｌのストレプトマイシン結合樹脂及び５μｌの０．１μｇ／μｌのｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（未消化）を各チューブに添加した。
（３）成分を十分に混合した。
（４）混合後、溶出溶液１〜５をそれぞれチューブ１〜５に添加した。
（５）樹脂混合物をｘ−スピンカラムに移し、１０，０００ｒｐｍで１分間回転させた。
（６）溶出した溶液をＤＮＡゲル電気泳動で調べた。ＤＮＡラダーマーカーは１００ｂｐラダーである。
【００７９】
ゲル写真（図６）は、ｐＢＲ３２２がバナジン酸ナトリウム及びシュウ酸カリウムによって、並びに水酸化ナトリウムを使用してｐＨを上昇させ、脱プロトン化を引き起こすことによって溶出され得ることを示した。
【００８０】
［例７．タングステン酸塩及びモリブデン酸塩による核酸の溶出］
試薬：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＧｌｙｃｏｌｉｎｋキット、ストレプトマイシン粉末、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｘ−ｓｐｉｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃｏｌｕｍｎ、種々のサイズの核酸（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂのｐＢＲ３２２  Ｍｓｐ  Ｉ消化ＤＮＡ  ０．１５μｇ）、５０ｍＭタングステン酸ナトリウム、５０ｍＭモリブデン酸ナトリウム。
【００８１】
手順：
（１）例２に記載のようにストレプトマイシン結合樹脂を調製した。
（２）１５μｌのストレプトマイシン結合樹脂をフィルターカラムに分注した。スピンして貯蔵液を除去した。
（３）過剰の核酸を添加して、核酸結合部位の飽和を達成した。１５μｌのｐＢＲ３２２  ＭｓｐＩ消化ＤＮＡを０．５Ｍ塩化ナトリウム中でカラム中の樹脂に添加し、遠心分離してフロースルー（Ｆ）を収集した。０．５Ｍ塩化ナトリウムは、核酸の非特異的相互作用を防止する。
（４）カラムを１５μｌの０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、スピンして洗浄液（Ｗ）を回収した。
（５）表１に示されるように、１５μｌの溶出緩衝液（バナジン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、又はモリブデン酸ナトリウム）（Ｅ）によって核酸を溶出する。
（６）高濃度塩を用いて樹脂を洗浄した。１５μｌの２．５Ｍ  ＮａＣｌを各樹脂に添加し、遠心分離（Ｓ）後に溶液を収集した。高濃度の塩では、それは非共有結合相互作用の大部分を破壊した。
（７）分子ラダーとしてｐＢＲ３２２  Ｍｓｐ  Ｉ消化ＤＮＡを用いて、フロースルーでＤＮＡ電気泳動を行う。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
ゲル写真（図７）及び表２は、ｐＢＲ３２２がバナジン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及びモリブデン酸ナトリウムによって溶出され得ることを示す。
【００８４】
【表２】
2021502831.tif 000003
【００８５】
モリブデン酸塩の溶出能力はｐＨ値に依存する。ｐＨ６．１では、モリブデン酸塩は溶出画分（３Ｅ）中に目に見えるバンドを生成しなかった。
【００８６】
［例８．タングステン酸によって溶出された核酸を用いる直接ｑＰＣＲ反応］
試薬：ｐＢＲ３２２プラスミド、Ｂｉｏｌｉｎｅ  ＳｅｎｓｉＦａｓｔ  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲマスターミックス、ｑＰＣＲプライマーセット、加水分解プローブ（ＩＤＴにより合成されたもの）、タングステン酸塩溶出緩衝液、及びバナジン酸塩溶出溶液。
【００８７】
手順：
（１）各スピンカラム中に２５μｌのストレプトマイシン結合樹脂を調製した。
（２）保存緩衝液を除去し、２５μｌの水で洗浄した。
（３）樹脂を０．５Ｍ塩化ナトリウム中で１０００コピーのｐＢＲ３２２と混合した。
（４）樹脂を２５μｌの水で洗浄する。
（５）１２．５μｌの１００ｍＭバナジン酸塩又は１２．５μｌの１００ｍＭタングステン酸塩溶出緩衝液を使用して核酸を溶出する。
（６）溶出した核酸を、１５μｌの２Ｘ  ｓｅｎｓｉＦａｓｔ  Ｐｒｏｂｅ  ｑＰＣＲマスターミックス、プライマー、プローブ、及び水と混合した。
（７）ＡＢＩ  ７５００Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ装置を用いてｑＰＣＲを行った。
【００８８】
【表３】
2021502831.tif 000004
【００８９】
結果は、タングステン酸塩及びバナジン酸塩によって溶出された核酸は、さらなる精製なしにｑＰＣＲ反応において直接使用され得ることを示す。
【００９０】
［参考文献］
以下の内容は参照により本明細書に組み込まれる；
Ｗｉｌｌｅｍ  Ｒ．  Ｂｏｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （１９９１），  ＵＳ  ｐａｔｅｎｔ  ５２３４８０９．
Ｃｌａｒｅ  Ｅ．  Ｂｏｓｔｏｃｋ−Ｓｍｉｔｈ，  Ｋｅｖｉｎ  Ｊ．  Ｅｍｂｒｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｒｋ  Ｓ．  Ｓｅａｒｌｅ，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｈｅｘａｃｙｃｌｉｃ  ａｍｉｄｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｏｆ  ＤＮＡ：  １Ｈ  ＮＭＲ  ａｎｄ  ＵＶ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｄｅｃａｍｅｒ  ｄｕｐｌｅｘ  ｄ（ＧＧＴＡＡＴＴＡＣＣ）２，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ０：  １２１−１２２  （１９９７）．
Ｍａｒｔｉｎｅ  Ｄｅｍｅｕｎｙｎｃｋ，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｂａｉｌｌｙ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ
Ｂｉｎｄｅｒｓ：  Ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｏ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，  （２００６），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＩＳＢＮ：  ９７８−３−５２７−６０５６６−８．
Ｐｒａｂａｌ  Ｇｉｒｉ，  Ｍａｉｄｕｌ  Ｈｏｓｓａｉｎ  ａｎｄ  Ｇｏｐｉｎａｔｈａ  Ｓｕｒｅｓｈ  Ｋｕｍａｒ，  ＲＮＡ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｐｌａｎｔ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｐａｌｍａｔｉｎｅ  ｂｉｎｄｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｔｏ  ｐｏｌｙ（Ａ）  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １６：  ２３６４−２３６８  （２００６）．
Ｙａｎｇ  Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗａｔｅｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ａｇｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  Ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  １３３（２６）：  １０１７１−１０１８３  （２０１１）．
Ｆｌｏｒｅｎｔ  Ｍｏｕｌｉｅｒｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｉｇｈ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ  Ｔｕｍｏｕｒ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ，  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６（９）：  ｅ２３４１８  （２０１１）．
Ｊｉｌｌｉａｎ  Ｐｈａｌｌｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｒｌｙ−Ｓｔａｇｅ  Ｃａｎｃｅｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９：  ｅａａｎ２４１５  （２０１７）．
Ｆａｒｉａｌ  Ａ．  Ｔａｎｉｏｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｓ−ａｍｉｄｉｎｅ  ｃａｒｂａｚｏｌｅ  ｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６８（１２）：  ３４５５−６４  （２００１）．
Ａｌａｎ  Ｓ．  Ｔｒａｃｅｙ，  Ｇａｉｌ  Ｒ．  Ｗｉｌｌｓｋｙ，  ａｎｄ  Ｅｓｔｈｅｒ  Ｓ．  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ｖａｎａｄｉｕｍ：  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （２００７），  ＩＳＢＮ：  １−４２００−４６１３−６，  Ｐａｇｅ  ２１．
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−Ｔｈｉｒｄ  Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｈｅｌｄ  ｉｎ  Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，  Ｉｓｒａｅｌ，  Ｍａｙ  １４−１７，  （１９９０）  Ｅｄｓ．  Ｂ．  Ｐｕｌｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊｏｒｔｎｅｒ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＋  Ｂｕｓｉｎｅｓ  Ｍｅｄｉａ，  Ｂ．Ｖ．  ＩＳＢＮ  ９７８−９４−０１０−５６５７−１．
Ｈｏｎｇｊｕａｎ  Ｘｉ，  Ｄａｖｉｄ  Ｇｒａｙ，  Ｓｕｎｉｌ  Ｋｕｍａｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  Ｐ．  Ａｒｙａ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：  Ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｏｌｙ（Ａ），  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８３：  ２２６９−２２７５  （２００９）．
Ｆｅｉｆｅｉ  Ｘｉｎｇ，  Ｇｕａｎｇｔａｏ  Ｓｏｎｇ  ａｎｄ  Ｊｉｎｓｏｎｇ  Ｒｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：  Ｃｏｒａｌｙｎｅ  ｂｉｎｄｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｔｏ  ｐｏｌｙ（Ａ）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５７９：  ５０３５−５０３９  （２００５）．
Ｒａｍ  Ｃｈａｎｄｒａ  Ｙａｄａｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ，  ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ｐｏｌｙｒｉｂｏａｄｅｎｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｌａｎｔ  ａｌｋａｌｏｉｄ：  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ，  ｖｉｓｃｏｍｅｔｒｉｃ，  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １３：  １６５−１７４  （２００５）．
【図１】
2021502831.tif 000005
【図２】
2021502831.tif 000006
【図３】
2021502831.tif 000007
【図４】
2021502831.tif 000008
【図５】
2021502831.tif 000009
【図６】
2021502831.tif 000010
【図７】
2021502831.tif 000011
【国際調査報告】
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2021502831.tif 000013
2021502831.tif 000014