(57)【要約】  本発明は、3-キヌクリジノンをロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）由来のケトレダクターゼ酵素の変異体と反応させることによる、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの酵素還元（スキームI）：2021502798.tif 000005に関する。本発明はまた、酵素的に製造された(R)-3-キヌクリジノールに関し、ここで、酵素の基質負荷量は100g/L以上である。
2021502798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3-キヌクリジノンまたはその塩の、Rhodotorula rubra由来のケトレダクターゼ酵素の変異体を使用する、Bacillus megaterium由来のグルコースデヒドロゲナーゼの補因子再生系変異体の存在下における酵素還元を含み、ここで前記いずれの変異体も細胞溶解液中にある、(R)-3-キヌクリジノールの製造方法。
【請求項２】
前記補因子が、NADまたはNADPから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下記：
a.3-キヌクリジノンを、3-キヌクリジノン還元酵素を含む細胞溶解液と、グルコースデヒドロゲナーゼを含む細胞溶解液の存在下で反応させて、(R)-3-キヌクリジノールを得る工程；
b.工程「a」で得られた(R)-3-キヌクリジノールを抽出して精製する工程；
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
工程「b」の(R)-3-キヌクリジノールの抽出及び精製が、下記：
a.反応混合物を塩基性化／酸性化して、塩基性化／酸性化された反応混合物を得る工程；
b.アセトンを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、溶媒混合物をろ過し、蒸発によってアセトンを除去して、生成物の水性溶液を得る工程；
c.代替的に、セライトを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、20℃から30℃で20分から2時間撹拌し、濾過して生成物の水性溶液を得る工程；
d.生成物を、工程「b」または「c」で得られた水性溶液から、n-ブタノールを用いて抽出し、抽出物を濃縮乾燥させて抽出生成物を得る工程；
e.工程「d」で得られた抽出生成物を80℃から105℃の高温トルエン中に溶解させて可溶化溶液を得る工程；及び
f.工程「e」で得られた可溶化溶液をろ過し、撹拌を継続しつつ濾液を室温まで徐々に冷却し、(R)-3-キヌクリジノールの純粋結晶を得て、ろ過によりこの結晶を回収する工程；
を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
ケトレダクターゼ酵素の前記変異体の基質負荷量が約100g/L以上である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素の基質負荷量が、125g/L以上、好ましくは150g/L以上、より好ましくは175g/L以上である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
細胞溶解液1mLあたりに含まれるケトレダクターゼ酵素が、4単位以上である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
細胞溶解液1mLあたりに含まれるグルコースデヒドロゲナーゼが、250単位以上である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
3-キヌクリジノンまたはその塩の酵素還元を含む、(R)-3-キヌクリジノールの製造方法であって、以下： 
a.3-キヌクリジノンを、Rhodotorula rubra由来の3-キヌクリジノン還元酵素を含む細胞溶解物と、Bacillus megaterium由来のグルコースデヒドロゲナーゼの変異体を含む補因子再生系の存在下で反応させる工程；
b.工程「a」で得られた(R)-3-キヌクリジノールを抽出及び精製する工程；
を含む方法。
【請求項１０】
補因子が、NADまたはNADPから選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
ケトレダクターゼ酵素の前記変異体の基質負荷量が、約100g/L以上である、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素の基質負荷量が、少なくとも125g/L、好ましくは少なくとも150g/L、最も好ましくは少なくとも175g/Lである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
細胞溶解液1mLあたりに含まれるケトレダクターゼ酵素が4単位以上である、請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
細胞溶解液1mLあたりに含まれるグルコースデヒドロゲナーゼが250単位以上である、請求項9に記載の方法。
【請求項１５】
酵素的に調製された(R)-3-キヌクリジノールを抽出及び精製する方法であって、以下：
a.反応混合物を塩基性化／酸性化して、塩基性化／酸性化された反応混合物を得る工程；
b.アセトンを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、溶媒混合物をろ過し、蒸発によってアセトンを除去して、生成物の水性溶液を得る工程；
c.代替的に、セライトを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、20℃から30℃で20分から2時間撹拌し、濾過して生成物の水性溶液を得る工程；
d.生成物を、工程「b」または「c」で得られた水性溶液から、n-ブタノールを用いて抽出し、抽出物を濃縮乾燥させて抽出生成物を得る工程；
e.工程「d」で得られた抽出生成物を80℃から105℃の高温トルエン中に溶解させて可溶化溶液を得る工程；及び
f. 工程「e」で得られた可溶化溶液をろ過し、撹拌を継続しつつ濾液を室温まで徐々に冷却し、(R)-3-キヌクリジノールの純粋結晶を得て、ろ過によりこの結晶を回収する工程；
を含む方法。
【請求項１６】
(R)-3-キヌクリジノールの酵素的な製造方法であって、製造された(R)-3-キヌクリジノールが99%以上の純度であり、99.5%超の鏡像体過剰率を有し、前記酵素は細胞溶解液中にある、方法。
【請求項１７】
(R)-3-キヌクリジノンまたはその塩の、Rhodotorula rubra由来のケトレダクターゼ酵素の変異体を使用する、Bacillus megaterium由来のグルコースデヒドロゲナーゼの補因子再生系変異体の存在下における酵素還元を含む方法によって製造され、ここで前記いずれの変異体も細胞溶解液中に存在する、(R)-3-キヌクリジノール。
【請求項１８】
3-キヌクリジノンまたはその塩の酵素還元を含む方法であって、以下： 
a.3-キヌクリジノンを、Rhodotorula rubra由来の3-キヌクリジノン還元酵素を含む細胞溶解物と、Bacillus megaterium由来のグルコースデヒドロゲナーゼの変異体を含む補因子再生系の存在下で反応させる工程；
b.工程「a」で得られた(R)-3-キヌクリジノールを抽出及び精製する工程；
を含む方法によって製造される、(R)-3-キヌクリジノール。
【請求項１９】
工程「b」が、以下：
a.反応混合物を塩基性化／酸性化して、塩基性化／酸性化された反応混合物を得る工程；
b.アセトンを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、溶媒混合物をろ過し、蒸発によってアセトンを除去して、生成物の水性溶液を得る工程；
c.代替的に、セライトを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、20℃から30℃で20分から2時間撹拌し、濾過して生成物の水性溶液を得る工程；
d.生成物を、工程「b」または「c」で得られた水性溶液から、n-ブタノールを用いて抽出し、抽出物を濃縮乾燥させて抽出生成物を得る工程；
e.工程「d」で得られた抽出生成物を80℃から105℃の高温トルエン中に溶解させて可溶化溶液を得る工程；及び
f. 工程「e」で得られた可溶化溶液をろ過し、撹拌を継続しつつ濾液を室温まで徐々に冷却し、(R)-3-キヌクリジノールの純粋結晶を得て、ろ過により前記結晶を回収する工程；
を含む、請求項18に記載の酵素的に調製された(R)-3-キヌクリジノールを抽出及び精製する方法。
【請求項２０】
純度が99％以上であり、99.5％超の鏡像体過剰率を有する、(R)-3-キヌクリジノール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌（E. coli）において可溶形態で発現した組換ケトレダクターゼ（KRED）を用いて、(R)-3-キヌクリジノールを製造するための高効率酵素法に関する。
【背景技術】
【０００２】
式Ｉ：
【化１】
2021502798.tif 000003
の(R)-3-キヌクリジノールは、抗ムスカリン薬、例えば、コハク酸ソリフェナシン、フマル酸タルサクリジン、セビメリンHClなどの製造のための重要な構成要素である。
【０００３】
化学的に、(R)-3-キヌクリジノールは、式IIの3-キヌクリジノンの還元に次ぐ(R)-3-キヌクリジノールの分離と、3-キヌクリジノンまたはその塩の不斉還元とのいずれかによって調製される（スキームI）。
【化２】
2021502798.tif 000004
【０００４】
式IIの3-キヌクリジノンの還元に次ぐ(R)-3-キヌクリジノールの分離という2段階のプロセスは、単調で時間がかかり、特定のエナンチオマーを分離する際の再現性に欠け、収率が低い。不斉化学触媒を用いた一段階変換は、費用がかかり、さらに再現性が低い。
【０００５】
補因子依存性ケトレダクターゼ（KRED）酵素を補因子の再生に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)酵素と共に用いる、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの変換のための生体触媒の使用については、いくつかの報告がある。基質-酵素特異性のため、生体触媒反応は再現性があり、不要なエナンチオマーは微量も産生せずに高収率である。
【０００６】
Uzuraら（Appl. Microbial Biotech (2009) 83:617-626）には、99%のe.e.（鏡像体過剰率での(R)-3-キヌクリジノールの製造のための方法が開示されている。この方法には、E. coli株で、NAD/NADP（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド／ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）依存性ケトレダクターゼと、補因子再生酵素である、2種類の異なるプラスミドでクローニングされたグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）とを共発現させ、光学活性(R)-3-キヌクリジノールを産生することが記載されている。ケトレダクターゼ遺伝子はロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）JCM3782から単離されたものであり、GDH遺伝子の供給源は巨大菌（Bacillus megaterium）IAM1030であった。反応時間は21hであった。さらにまた、この方法には、宿主E. coli BL21（DE3）（pEQG）、E. coli BL21（DE3）（pEGQ）、E. coli W3110（pTrcQG）、及びE. coli JM109（pWKQ、pAG）における酵素の共発現が記載されている。この文献は、上記全ての宿主系の中でE. coli BL21（DE3）（pEQG）及びE. coli BL21（DE3）（pEGQ）の活性が最も低く、生成物の収率も低いことに言及している。宿主E. coli W3l10 (pWKLQ, pAG)の場合には、3-キヌクリジノン(618ミリモル、mM)から(R)-3-キヌクリジノールへの立体選択的な生物変換は、98.6%(モル収率)及び99.9%のe.e.である。この条件下では反応は遅い(21h)。また、基質負荷の量は少ない（618mM、〜63mg/ml）。このように、この方法はより長い時間がかかり、生成物の量はより少なく、単調且つ非効率であり、商業的にも不経済となっている。
【０００７】
Isotaniら[Int. J. Mol Sci. (2012) 13, 13542-13553]には、ミクロバクテリウム・ルテオーラム（Microbacterium luteolum）由来の3-キヌクリジノン還元酵素とレイフソニア（Leifsonia）種のアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子を持つ組換えE. coli細胞を用いた(R)-3-キヌクリジノールの生産のための還元系が記載されている。この方法は、150mg/mlで実施され、高いエナンチオ選択性を示した。この方法には、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの変換のための固定化酵素と、反応混合物中の有機溶媒との使用が記載されている。この方法は、生成物を有機溶媒から分離する、追加の煩雑な工程のためにより長くなる。固定化酵素の使用により、当該方法の費用が増大する。
【０００８】
欧州特許出願第2796548号公報には、GDH及びNADP依存性キヌクリジノン還元酵素アミノ酸配列を含むキメラ融合タンパク質をコードし、宿主E. coli細胞において前記タンパク質を発現させる、ポリヌクレオチド配列を調製するための方法が記載されている。この方法には、キメラ酵素を含む粗製抽出物及び全細胞の、リン酸緩衝液の存在下における、適切なpH、温度、及び反応時間での変換のための使用が記載されている。この方法は、2〜16g/Lの基質負荷を使用し、30℃にて48〜96時間に亘る変換を要して、95％超の転化率及び99％のe.e.を達成する。
【０００９】
Rhodotorula rubra(Rr)以外の微生物由来のケトレダクターゼを用いて3-キヌクリジノンから(R)-3-キヌクリジノールを調製する方法は他にもいくつかある。米国特許出願第20140147896号では、酵素はSaccharomyces cerevisiae由来のものである。欧州特許第2423320号では、細菌Burkholderiaspsに由来するポリペプチド、またはそのポリペプチドを産生可能な組換生物を使用している。米国特許第5888804号は、Nakazawaea属, Candida属、及びProteus属の微生物由来の酵素を用いて、キヌクリジノンから光学活性(R)-3-キヌクリジノールを製造するための方法を開示する。
【００１０】
本明細書中で言及されるいずれの方法も、工業的規模で実施することは困難である。これらの方法は、長い反応時間、低い基質負荷、低い収率、及び高価であるために煩わしい。全ての方法が、ケトレダクターゼ酵素の純粋形態を使用する。酵素のさらなる精製は、疑わしい収率、より長い生産時間、及びひいては高価となる、面倒なものである。
【００１１】
したがって、本発明は、優れた収率、処理時間の短縮、及びひいては費用効率が良く、商業的に実施可能とするケトレダクターゼを使用する。然るに、本発明者らは、(R)-3-キヌクリジノールを調製するための工業的に実施可能であり、且つ商業的に利用可能な方法を提供するという、長らく充足されていない需要に対処した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】欧州特許出願第2796548号公報
【特許文献２】米国特許出願第20140147896号明細書
【特許文献３】米国特許第5888804号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Uzura et. al. Appl. Microbial Biotech (2009) 83:617-626）
【非特許文献２】Isotani et al. [Int. J. Mol Sci. (2012) 13, 13542-13553]
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の主な目的は、(R)-3-キヌクリジノールを製造するための、再現性があり、経済的で、工業的に実施可能で、且つ効率的な酵素法を提供することである。
本発明の別の目的は、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの酵素変換の反応時間を短縮することである。
本発明のさらに別の目的は、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの酵素変換のためのケトレダクターゼ酵素を用いる反応における、基質負荷を増加させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、3-キヌクリジノンとRhodotorula rubra由来のケトレダクターゼ酵素の変異体を適切な補因子再生系の存在下で反応させることによる、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの酵素還元に関し、前記変異体は細胞溶解液中に存在する。
【００１６】
本発明はまた、(R)-3-キヌクリジノールの、約99%以上の純度及び約99.5%超のe.e.での酵素的製造に関し、ここで、前記酵素の基質負荷量は約100g/L以上である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明においては、前記方法は、より高い収率及び生物変換の時間短縮をもたらす酵素の基質負荷量の増加により、高度に有効であるとされている。
【００１８】
「ケトレダクターゼ酵素」、「3-キヌクリジノン還元酵素」、「変異体」は、すべて互換的に使用され、いずれもRhodotorula rubraのアミノ酸配列に由来する酵素を指し、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの酵素還元において使用される。
【００１９】
本発明で使用される基質は、3-キヌクリジノンまたはその塩である。
【００２０】
v/vもしくはV/Vは体積／体積を意味し、w/vもしくはW/Vは質量／体積を意味し、w/wもしくはW/Wは質量／質量を表す。
時間（単数もしくは複数）は、hまたはhrまたはhrsと表される。e.e.なる語は鏡像体過剰率の略語であり、他方と比較した一方の鏡像体のパーセンテージを示す。
【００２１】
グルコースデヒドロゲナーゼなる語及びGDHは互換的に使用され、Bacillus megaterium（Bm）のアミノ酸配列に由来する酵素を指し、ここでGDHは、グルコースを基質として使用してNADもしくはNADPのような補因子を再生する能力を有する。
【００２２】
本発明の主要な実施態様は、Bacillus megaterium由来のグルコースデヒドロゲナーゼの変異体及び補因子NADまたはNADPからなる、適切な補因子再生系の存在下で、3-キヌクリジノンとRhodotorula rubra由来のケトレダクターゼ酵素の変異体と反応させることによる、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの酵素還元に関し、ここで、いずれの変異体も細胞溶解液中に存在する
【００２３】
この実施形態によれば、補因子再生系は、グルコースデヒドロゲナーゼの変異体及び補因子NADまたはNADPを含む。
【００２４】
この実施態様の一面により、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの酵素還元は、下記：
a.3-キヌクリジノンを、グルコースデヒドロゲナーゼを含む細胞溶解液の存在下で、3-キヌクリジノン還元酵素を含む細胞溶解液と反応させて、(R)-3-キヌクリジノールを得る工程；
b.工程「a」で得られた(R)-3-キヌクリジノールを抽出して精製する工程；
を含む方法を用いて実施された。
【００２５】
本発明のこの実施態様によれば、3-キヌクリジノンを、グルコースデヒドロゲナーゼを含む細胞溶解液の存在下で、3-キヌクリジノン還元酵素を含む細胞溶解液と反応させて、(R)-3-キヌクリジノールが得られ、ここで、反応混合物は以下：
a)基質としての3-キヌクリジノン；
b)補因子NADまたはNADP；
c)基質濃度の1から2倍のグルコース；
d)酵素3-キヌクリジノン還元酵素を含む細胞溶解液
e)酵素グルコースデヒドロゲナーゼを含む細胞溶解液；
f)リン酸カリウム緩衝液；
を含む。
【００２６】
本実施態様の別の側面は、(R)-3-キヌクリジノールの抽出及び精製のための方法である。この方法は、以下：
a)反応混合物を塩基性化／酸性化して、塩基性化／酸性化された反応混合物を得る工程；
b)アセトンを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、溶媒混合物をろ過し、蒸発によってアセトンを除去して、生成物の水性溶液を得る工程；
c)代替的に、セライトを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、約20℃から30℃で約20分から2時間撹拌し、濾過して生成物の水性溶液を得る工程；
d)生成物を、工程「b」または「c」で得られた水性溶液から、n-ブタノールを用いて抽出し、抽出物を濃縮乾燥させて生成物を得る工程；
e)工程「d」で得られた生成物を高温トルエン中に溶解させる工程；
f)工程「e」で得られた溶液をろ過し、撹拌を継続しつつ濾液を室温まで徐々に冷却し、(R)-3-キヌクリジノールの純粋結晶を得て、ろ過によりこの結晶を回収する工程；
を含む。
【００２７】
本発明のさらに別の実施態様は、約99%以上の純度及び約99.5%超のe.e.の(R)-3-キヌクリジノールの酵素的に製造することであり、ここで、前記酵素の基質負荷量は約100g/L以上である。
【００２８】
この実施形態によれば、酵素の基質負荷量は、少なくとも125g/L、好ましくは少なくとも150g/L、最も好ましくは少なくとも175g/Lである。
従って、(R)-3-キヌクリジノールは、適切な補因子再生系の存在下で、Rhodotorula rubraに由来するケトレダクターゼ酵素の変異体を用い、3-キヌクリジノンの還元によって製造された。
【００２９】
補因子再生系は、グルコースデヒドロゲナーゼの変異体及び補因子NADまたはNADPを含む。
【００３０】
3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの酵素還元は、以下：
a)3-キヌクリジノンを、細胞溶解液1mlあたり少なくとも4単位の3-キヌクリジノン還元酵素と、溶解液1mlあたり250単位以上のグルコースデヒドロゲナーゼ酵素を含む細胞溶解液の存在下で存在させ、ここで、当該反応中の3-キヌクリジノン負荷されたが100g/L以上である工程；
b)工程「a」で得られた(R)-3-キヌクリジノールを抽出し、精製する工程；
を含む方法を用いて実施した。
【００３１】
この実施態様によれば、3-キヌクリジノンを、細胞溶解液1mlあたり少なくとも4単位の3-キヌクリジノン還元酵素を使用し、少なくとも250単位以上のグルコースデヒドロゲナーゼを含む細胞溶解液の存在下で還元して、生成物である(R)-3-キヌクリジノールが得られ、ここで、反応混合物は、以下：
a)基質としての3-キヌクリジノン、反応混合物の約100g/L以上；
b)補因子NADまたはNADP；
c)グルコース、基質濃度の1から2倍；
d)酵素3-キヌクリジノン還元酵素を含む細胞溶解液；
e)酵素グルコースデヒドロゲナーゼを含む細胞溶解液；
f)リン酸カリウム緩衝液；
を含む。
【００３２】
この実施態様の別の側面は、(R)-3-キヌクリジノールを抽出及び精製するための方法である。
この方法は、以下：
a.反応混合物を塩基性化／酸性化して、塩基性化／酸性化された反応混合物を得る工程；
b.アセトンを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、溶媒混合物をろ過し、蒸発によってアセトンを除去して、生成物の水性溶液を得る工程；
c.代替的に、セライトを、工程「a」で塩基性化／酸性化された反応混合物に添加し、約20℃から30℃で約20分から2時間撹拌し、濾過して生成物の水性溶液を得る工程；
d.生成物を、工程「b」または「c」で得られた水性溶液から、n-ブタノールを用いて抽出し、抽出物を濃縮乾燥させて生成物を得る工程；
e.工程「d」で得られた生成物を約80℃から105℃の高温トルエン中に溶解させて溶液を得る工程；
f. 工程「e」で得られた溶液をろ過し、濾液を室温まで徐々に冷却し、(R)-3-キヌクリジノールの純粋結晶を得て、ろ過によりこの結晶を回収する工程；
を含む。
【００３３】
本発明の方法によって得られた(R)-3-キヌクリジノールの結晶は、約99%超の純度及び約99.5%超の鏡像体過剰率を示す。
【００３４】
本発明の方法は、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの変換に関与する酵素の負荷濃度を増加させ、その結果、生成物の収率の増加、より短期間でのより高い生産による生産効率の増大、より高い収率及びより高い純度をもたらす。
【００３５】
このように、本発明者らは、(R)-3-キヌクリジノールを製造するための、再現性があり、経済的で、工業的に実行可能且つ効率的な酵素方法を設計した。
また、本発明者らは、3-キヌクリジノンの(R)-3-キヌクリジノールへの酵素変換の反応時間の短縮に成功した。
【００３６】
然るに、本発明は、全ての問題点を克服し、本発明の全ての目的を達成する。
【実施例】
【００３７】
本発明の以下の実施例は、本発明を実施するための最良の態様を示す。これらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものではなく、純粋に例示的なものとみなされるべきである。
【００３８】
実施例１：全細胞を用いた(R)-3-キヌクリジノールの製造
1gの3-キヌクリジノンの生物変換のために、4gの細胞量を、10mgのNADP、6gのグルコース、10mgのグルコースデヒドロゲナーゼを含む反応混合物中に使用して最終体積を40mlとした。反応液を、150rpmの回転式シェーカーで、25℃±l℃にて、3〜4時間に亘って混合した。20％のNaOH溶液を用いてpHを即座に〜6.5から7.5に調節した。反応の完了を、シリカゲル薄層クロマトグラフィー(TLC)でモニターした。
【００３９】
実施例２：細胞溶解液を用いた(R)-3-ギヌクリジノールの製造
反応混合物は、1ミリリットルあたり少なくとも4単位のケトレダクターゼを含む100mlの細胞溶解液と、1ミリリットルあたり250単位以上のグルコースデヒドロゲナーゼ酵素を含む50mlの細胞溶解液とを、30mgのNADP及び1.4gのグルコース、10gの3-キヌクリジノンと共に含んでいた。反応混合物の最終体積は150mlであった。反応液を、150rpmの回転式シェーカーで、25℃±l℃にて、3〜4時間に亘って混合した。pHを、20％のNaOH溶液を用いて常に〜6.5から7.5に調節した。4時間の時点で、混合物から試料を採り、基質3-キヌクリジノンの変換を分析し、生成物(R)-3-キヌクリジノールの鏡像体純度を決定した。
【００４０】
実施例３：反応における基質負荷を増加させた細胞溶解液を用いた(R)-3-ギヌクリジノールの製造
1ミリリットル当たり少なくとも4単位のケトレダクターゼ酵素を含む細胞溶解液を最高で60mL、1ミリリットル当たり250単位以上のグルコースデヒドロゲナーゼ酵素を含む細胞溶解液を最高で30mL、及び30mgのNADPを含む反応液を使用した。3-キヌクリジノンは100mLまでの反応液中で10.0g、12.5g、15.0g、17.5g、及び20.0gと変化させた。反応液を、150rpmの回転式シェーカーで、25℃±l℃にて、3〜4時間に亘って撹拌した。pHを、20％のNaOH溶液を用いて常に〜6.5から7.5に調節した。10時間後に、混合物から試料を採り、基質3-キヌクリジノンの変換をTLCで分析した。全ての反応において変換の完了が観察された。
【００４１】
実施例４：セライトを用いた(R)-3-キヌクリジノールの精製
反応混合物(100mL)を20%のNaOH溶液でpH12にアルカリ化させ、5gのセライトを前記アルカリ化された反応混合物に加え、25℃にて1時間撹拌した。反応混合物をろ過して、生成物の水性溶液を得た。200mLのn-ブタノールを水性の濾液に加え、激しく混合した。水層と有機層とを分離し、水層を200mLのn-ブタノールで再度抽出した。n-ブタノール抽出物をプールし、濃縮乾燥させて、90℃から100℃のトルエンに溶解させた。高温トルエン溶液を濾過し、撹拌を継続しつつ濾液を徐々に室温まで冷却した。(R)-3-キヌクリジノール結晶を濾過し、真空下、50℃から60℃で乾燥させた。白色から乳白色の結晶が得られ、純度は99%超、e.e.は99.9%超であった。
【国際調査報告】
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