(57)【要約】本発明は、式IのLNA-ジカルボン酸誘導体またはその塩を含み、式中、R1は核酸塩基または修飾核酸塩基であり、R2はヒドロキシ保護基であり、かつnは1〜5の整数である。式IのLNA-ジカルボン酸誘導体は、式IIIのプリロード固体支持体において、およびオリゴヌクレオチド合成のための適切な出発物質として機能するものとして、使用することができる。2021516673.tif 000023
2021516673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式IのLNA-ジカルボン酸誘導体またはその塩：
2021516673.tif 000018
式中、
R1は核酸塩基または修飾核酸塩基であり、
R2はヒドロキシ保護基であり、かつ
nは1〜5の整数である。
【請求項２】
R1が、
修飾されていてもよくかつ／またはアミノ基が保護されている、アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）
である、請求項1記載のLNA-ジカルボン酸誘導体。
【請求項３】
R1が、アミノ基が保護されているアデニン（A）、アミノ基が保護されているシトシン（C）、アミノ基が保護されている5-メチルシトシン（5-MeC）、アミノ基が保護されているグアニン（G）であるか、またはチミンである、請求項1または2記載のLNA-ジカルボン酸誘導体。
【請求項４】
アミノ保護基が、C1〜6-アルカノイル、ベンゾイル（bz）、またはジメチルホルムアミジン（dmf）から選択される、請求項3記載のLNA-ジカルボン酸誘導体。
【請求項５】
R2が、アルコキシ修飾トリチル基から、好ましくは4,4'-ジメトキシトリチルから選択される酸感受性ヒドロキシル保護基である、請求項1〜4のいずれか一項記載のLNA-ジカルボン酸誘導体。
【請求項６】
nが1である、請求項1〜5のいずれか一項記載のLNA-ジカルボン酸誘導体。
【請求項７】
無機塩基または有機塩基による塩の形態である、請求項1〜6のいずれか一項記載のLNA-ジカルボン酸誘導体。
【請求項８】
有機アミンのアンモニウム塩の形態である、請求項1〜7のいずれか一項記載のLNA-ジカルボン酸誘導体。
【請求項９】
第三級アミン、好ましくはトリ-C1〜4-アルキルアミン、またはピリジンの、より好ましくはトリエチルアミンまたはピリジンの、アンモニウム塩の形態である、請求項8記載のLNA-ジカルボン酸誘導体。
【請求項１０】
遊離酸と、無機塩基または有機塩基による塩との任意の混合物の形態である、請求項1〜9のいずれか一項記載のLNA-ジカルボン酸誘導体。
【請求項１１】
式IのLNA-ジカルボン酸誘導体を形成するための、塩基および有機溶媒の存在下での、式IIのLNAアルコール：
2021516673.tif 000019
（式中、R1およびR2は上記のとおりである）と、C2〜6-ジカルボン酸無水物との反応
を含む、式IのLNA-ジカルボン酸誘導体の調製のための方法。
【請求項１２】
C2〜6-ジカルボン酸無水物が無水コハク酸である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
塩基が、有機アミン、好ましくは第三級アミン、より好ましくはトリ-C1〜4-アルキルアミン、またはピリジン、さらにより好ましくはトリエチルアミンまたはピリジンである、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
有機溶媒がハロゲン化炭化水素である、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
式IIIのプリロード固体支持体：
2021516673.tif 000020
の調製のための、請求項1〜10のいずれか一項記載の式IのLNA-ジカルボン酸誘導体の使用であって、式中、R1、R2、およびnは上記のとおりであり、固体支持体はオリゴヌクレオチド合成に適した固体支持体材料である、使用。
【請求項１６】
式IIIのプリロード固体支持体：
2021516673.tif 000021
式中、R1、R2、およびnは上記のとおりであり、固体支持体はオリゴヌクレオチド合成に適した固体支持体材料である。
【請求項１７】
式IIIのプリロード固体支持体：
2021516673.tif 000022
の使用であって、式中、R1、R2、およびnは上記のとおりであり、固体支持体は、オリゴヌクレオチド合成における出発物質としてオリゴヌクレオチド合成に適した固体支持体材料である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式IのLNA-ジカルボン酸誘導体：
2021516673.tif 000003
またはその塩（式中、R1は核酸塩基または修飾核酸塩基であり、R2はヒドロキシ保護基であり、かつnは1〜5の整数である）；その調製のための方法；式IのLNA-ジカルボン酸誘導体を含むLNAプリロード固体支持体の調製のためのその使用；LNAプリロード固体支持体およびオリゴヌクレオチド合成におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドは一般的に固体支持媒体上で調製される。一般的に、第一のシントン（例えば、ヌクレオシドなどの単量体）をまず固体支持媒体に付着させて、次いで、固体支持体に結合したシントンに単量体を順次カップリングさせることによってオリゴヌクレオチドを合成する。最終的にこの反復的伸長によって最終オリゴヌクレオチド化合物が生じ、これは支持体から切断され、必要ならばさらにワークアップが行われて、最終オリゴヌクレオチド化合物が生成される。
【０００３】
特に現在使用されている自動工程合成機において、オリゴヌクレオチド合成をより効率的に行うために、さらなる開発において、固体支持体に付着したリンカー分子が導入された。そのようなリンカー化合物は、例えば国際公開公報第2005/049621号（特許文献1）または国際公開公報第2006/029023号（特許文献2）に開示されている。オリゴヌクレオチドの伸長は、通常、リンカー分子上のO-ジメトキシトリチル（O-DMT）から開始する。
【０００４】
しかしながら、LNAオリゴヌクレオチドの合成においては、リンカー分子における最初のカップリングがある一定の程度で失敗し、それによって最終オリゴヌクレオチドが、かなりの量の(N-1)不純物、すなわち3'末端においてヌクレオシドが1つ欠失しているオリゴヌクレオチドとともに生じることが見出された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開公報第2005/049621号
【特許文献２】国際公開公報第2006/029023号
【発明の概要】
【０００６】
したがって本発明の目的は、3'末端(N-1)不純物の量を大幅に低減させることであった。というのもこのような不純物は、最先端のクロマトグラフィー精製法によってもほとんど除去することができず、それが原因で、例えば分取クロマトグラフィー工程での狭い画分のプーリングおよび／または単離LNAオリゴヌクレオチドにおける満足のいかない不純物プロファイルによって、収率のかなりの損失を引き起すからである。
【０００７】
固体樹脂に付着し（国際公開公報第1992/006103号）かつプリロード樹脂として作用することができる、上に記載した式IのLNA-ジカルボン酸誘導体を用いると、N-1不良物を大幅に低減できることが見出された。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下の定義は、本明細書における本発明の説明のために使用される種々の用語の意味および範囲を例証および定義するために示される。
【０００９】
「C1〜6-アルキル」なる用語は、炭素原子1〜6個の、およびより特定の態様においては炭素原子1〜4個の、一価の直鎖状または分岐状の飽和炭化水素基を表す。典型的な例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、i-ブチル、sec-ブチル、またはt-ブチル、好ましくはメチルまたはエチルが含まれる。
【００１０】
「C1〜6-アルコキシ」なる用語は、酸素原子に結合した、上で定義したC1〜6-アルキル基、より好ましくはC1〜4-アルキル基を表す。典型的な例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、i-ブトキシ、t-ブトキシ、好ましくはメトキシまたはエトキシが含まれる。
【００１１】
「C1〜6-アルカノイル」なる用語は、カルボニル基に結合した、上で定義したC1〜6-アルキル基、より好ましくはC1〜4-アルキル基を表す。典型的な例には、アセチル、エタノイル、プロパノイル、i-プロパノイル、n-ブタノイル、i-ブタノイル、またはt-ブタノイル、好ましくはアセチルが含まれる。
【００１２】
R2に関して使用される「ヒドロキシ保護基」なる用語は、ヒドロキシ基を保護することを意図した基を表し、これには、エステル形成基およびエーテル形成基、特に修飾トリチル基、テトラヒドロピラニル、アシル基、カルバモイル、ベンジル、およびシリルエーテル（例えばTBS、TBDPS）基が含まれる。これらの基のさらなる例は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapters 2-3；E. Haslam, 「Protective Groups in Organic Chemistry」, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5、およびT.W. Greene, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, John Wiley and Sons, New York, NY, 1981に見出される。
【００１３】
酸感受性ヒドロキシル基が好ましく、アルコキシ修飾トリチル基がより好ましい。この文脈における修飾とは、1つまたは複数のC1〜6-アルコキシ基による、好ましくはメトキシ基による、1つ、2つまたは3つのフェニル環の置換を意味する。
【００１４】
最も好ましいヒドロキシ保護基は、4,4'-ジメトキシトリチル（DMT）である。
【００１５】
「アミノ保護基」なる用語は、アミノ基を保護することを意図した基を表し、これには、C1〜6-アルカノイル、ベンゾイル、ベンジルオキシカルボニル、カルボベンジルオキシ（CBZまたはZ）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（FMOC）、p-メトキシベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、t-ブトキシカルボニル（BOC）、およびトリフルオロアセチル、ジメチルホルムアミジン（dmf）が含まれる。これらの基のさらなる例は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapter 7；E. Haslam, 「Protective Groups in Organic Chemistry」, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5、およびT.W. Greene, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, John Wiley and Sons, New York, NY, 1981に見出される。
【００１６】
好ましいアミノ保護基は、C1〜6-アルカノイル、ベンゾイル（bz）、またはジメチルホルムアミジン（dmf）から選択される。
【００１７】
R1に関して使用される「核酸塩基」または「修飾核酸塩基」なる用語は、アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、チミン（T）、およびウラシル（U）の5種の核酸塩基、ならびにそれらの修飾されたものを意味する。
【００１８】
本発明の式Iの本発明のLNA-ジカルボン酸誘導体の文脈における「塩」なる用語は、無機塩基または有機塩基による塩を意味する。
【００１９】
無機塩は、典型的には、無機アルカリもしくはアルカリ土類水酸化物塩基による、または有機アルカリもしくはアルカリ土類アルコラートによる、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ塩またはアルカリ土類塩、好ましくはナトリウム塩またはカリウム塩である。
【００２０】
有機塩は、典型的には、有機アミンによるアンモニウム塩、典型的には脂肪族アミンまたは芳香族アミンによるアンモニウム塩、好ましくは第三級アミン、好ましくはトリ-C1〜4-アルキルアミン、またはピリジンによる、より好ましくはトリエチルアミンまたはピリジンによるアンモニウム塩である。
【００２１】
無機塩よりも有機塩が好ましい。
【００２２】
式IのLNA-ジカルボン酸誘導体は、遊離酸と、無機塩基または有機塩基による塩との任意の混合物の形態で存在し得る。
【００２３】
典型的な修飾核酸塩基は、5-メチルシトシン（5-MeC）である。
【００２４】
好ましい態様において、R1は、修飾されていてもよくかつ／またはアミノ基が保護されている、アデニン（A）、シトシン（C）、5-メチルシトシン（5-MeC）、グアニン（G）、またはチミン（T）、好ましくはアミノ基が保護されているアデニン（A）、アミノ基が保護されているシトシン（C）、アミノ基が保護されている5-メチルシトシン（5-MeC）、アミノ基が保護されているグアニン（G）、またはチミン（T）である。
【００２５】
典型的なアミノ保護基は上で定義したが、アデニン（A）、シトシン（C）、および5-メチルシトシン（5-MeC）のための好ましいアミノ保護基はベンゾイルであり、グアニン（G）のための好ましいアミノ保護基はイソブタノイル（イソブチリル）またはジメチルホルムアミジン（dmf）である。
【００２６】
好ましい態様において、本発明のLNA-ジカルボン酸誘導体は、式I：
2021516673.tif 000004
を有するか、または有機アミンによるそのアンモニウム塩を有し、
式中、
R1は、修飾されていてもよくかつ／またはアミノ基が保護されている、アデニン（A）、シトシン（C）、5-メチルシトシン（5-MeC）、グアニン（G）、またはチミン（T）、好ましくはアミノ基が保護されているアデニン、アミノ基が保護されているシトシン（C）、アミノ基が保護されている5-メチルシトシン（5-MeC）、アミノ基が保護されているグアニン（G）、またはチミン（T）であり；
R2は、アルコキシ修飾トリチル基から選択される酸感受性ヒドロキシ保護基であり；
nは1〜5の整数である。
【００２７】
さらなる好ましい態様において、本発明のLNA-ジカルボン酸誘導体は、式Iを有するか、またはトリ-C1〜4-アルキルアミンから選択される第三級アミン、より好ましくはトリエチルアミンによる、もしくはピリジンによるそのアンモニウム塩を有し、
式中、
R1はベンゾイルで保護されているアデニン（A）、ベンゾイルで保護されているシトシン（C）、ベンゾイルで保護されている5-メチルシトシン（5-MeC）、イソブタノイルもしくはジメチルホルムアミジンで保護されているグアニン（G）、またはチミン（T）であり；
R2は、4,4'-ジメトキシトリチル（DMT）であり；
nは1である。
【００２８】
本発明の最も好ましいLNA-ジカルボン酸誘導体は式Iを有し、かつ以下の定義により特徴づけられる：
●R1＝ベンゾイルで保護されているアデニン（A）；R2＝4,4'-ジメトキシトリチル（DMT）；n＝1；トリエチルアンモニウム塩またはピリジニウム塩の形態である
●R1＝ベンゾイルで保護されているシトシン（C）；R2＝4,4'-ジメトキシトリチル（DMT）；n＝1；トリエチルアンモニウム塩またはピリジニウム塩の形態である
●R1＝ベンゾイルで保護されている5-メチルシトシン（5-MeC）；R2＝4,4'-ジメトキシトリチル（DMT）；n＝1；トリエチルアンモニウム塩またはピリジニウム塩の形態である
●R1＝イソブタノイルで保護されているグアニン（G）；R2＝4,4'-ジメトキシトリチル（DMT）；n＝1；トリエチルアンモニウム塩またはピリジニウム塩の形態である
●R1＝ジメチルホルムアミジンで保護されているグアニン（G）；R2＝4,4'-ジメトキシトリチル（DMT）；n＝1；トリエチルアンモニウム塩またはピリジニウム塩の形態である
●R1＝チミン（T）；R2＝4,4'-ジメトキシトリチル（DMT）；n＝1、トリエチルアンモニウム塩またはピリジニウム塩の形態である。
【００２９】
上で概説した本発明の好ましいLNA-ジカルボン酸誘導体は、遊離酸として、もしくは上に記載したアンモニウム塩の形態で存在し得るか、またはアンモニウム塩と遊離酸との任意の混合物としても存在し得る。
【００３０】
式IのLNA-ジカルボン酸誘導体の調製のための方法は、式IのLNA-ジカルボン酸誘導体を形成するための、塩基および有機溶媒の存在下での、式IIのLNAアルコール：
2021516673.tif 000005
（式中、R1およびR2は上記のとおりである）と、C2〜6-ジカルボン酸無水物との反応を含む。
【００３１】
式IIのLNAアルコールは基本的に市販されており、またはWengel et al. Tetrahedron 54 (1998) 3607-3630に従って調製することができる。
【００３２】
同様に、C2〜6-ジカルボン酸無水物は市販の化合物である。典型的なC2〜6-ジカルボン酸無水物は無水コハク酸である。
【００３３】
通常、最初の工程において、トルエンなどの適切な有機溶媒を用いて共沸条件下で出発物質から残留水が除去される。
【００３４】
適切な塩基は上に記載したが、好ましくは有機アミンが使用される。
【００３５】
典型的に適用される塩基は、好ましくは第三級アミン、より好ましくはトリ-C1〜4-アルキルアミン、またはピリジン、さらにより好ましくはトリエチルアミンまたはピリジンである。
【００３６】
適切な有機溶媒は、ジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素である。
【００３７】
反応は、10℃〜40℃の反応温度で不活性ガス雰囲気下にて好都合に行われる。
【００３８】
反応完了時、典型的には約2時間後に、反応に使用される溶媒を適切に適用する抽出プロセスを介してアンモニウム塩を得ることができる。
【００３９】
合わせた有機相からの溶媒の除去、およびクロマトグラフィーによる任意のさらなる精製により、式IのLNA-ジカルボン酸誘導体のそれぞれのアンモニウム塩が、収率94〜99.9％およびHPLC純度97〜99.5面積％（残留トルエンを除く）で提供され得る。
【００４０】
式IのLNA-ジカルボン酸誘導体は遊離酸の形態で得ることもできる。これは、本発明による式IのLNA-ジカルボン酸誘導体の塩を、ジクロロメタンまたは酢酸エチルなどの適切な有機溶媒中で、塩酸を用いてまたはクエン酸などの有機酸を用いて変換することによって、達成することができる。
【００４１】
本発明のさらなる態様において、式IのLNA-ジカルボン酸誘導体は、式IIIのプリロード固体支持体：
2021516673.tif 000006
の調製のために使用することができ、式中、R1、R2、およびnは上記のとおりであり、固体支持体は、オリゴヌクレオチド合成に適した固体支持体材料である。
【００４２】
適切な固体支持体材料は、例えばGuzaev, A. P. Solid-phase supports for oligonucleotide synthesis. In: Current protocols in nucleic acid chemistry. (John Wiley & Sons, Inc.) (2013), Chapter 3, Unit 3.1., pp. 3.1.1-3.1.60に十分に記載されている。典型的な市販の固体支持体は、GE HealthcareのPrimer Support 5Gシリーズまたは日東電工のNittoPhase（登録商標）HL固体支持体である。
【００４３】
R1、R2、およびnに関して上で提供した定義および選択は、式IIIのプリロード固体支持体にも同様に当てはまる。
【００４４】
別の態様において、本発明は式IIIのプリロード固体支持体：
2021516673.tif 000007
に関し、式中、R1、R2、n、および固体支持体は上で定義したとおりである。R1、R2、n、および固体支持体に関して上で提供した選択は、式IIIのプリロード固体支持体にも同様に当てはまる。
【００４５】
本発明のさらに別の態様において、式IIIのプリロード固体支持体：
2021516673.tif 000008
（式中、R1、R2、n、および固体支持体は上記のとおりである）は、オリゴヌクレオチド合成のための出発物質として使用することができる。R1、R2、n、および固体支持体に関して上で提供した定義および選択は、式IIIのプリロード固体支持体にも同様に当てはまる。
【００４６】
式IのLNA-ジカルボン酸誘導体は、当業者に公知の方法および例えば国際公開公報第1992/006103号に記載の方法によって、固体支持体に連結することができる。
【００４７】
オリゴヌクレオチド合成の原理は当技術分野において周知であり、文献およびWikipediaのような公開フォーラムに十分に記載されている（例えば、2016年3月15日のOligonucleotide synthesis; Wikipedia, the free encyclopedia; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide_synthesisを参照されたい）。
【００４８】
現在、より大規模なオリゴヌクレオチド合成は、コンピュータ制御された合成機を使用して自動で行われている。
【００４９】
一般に、オリゴヌクレオチド合成は固相合成であり、アセンブルされるオリゴヌクレオチドは、その3'末端ヒドロキシ基を介して固体支持体材料に共有結合しており、鎖アセンブリの全過程にわたって固体支持体材料に付着したままである。適切な固体支持体は上に記載されている。
【００５０】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよいDNAヌクレオシド単量体もしくはLNAヌクレオシド単量体またはそれらの組み合わせからなり、かつ10〜25ヌクレオチド長である。
【００５１】
式IIIのプリロード固体支持体がLNAヌクレオシドを含むという事実を踏まえると、生成されるオリゴヌクレオチド鎖の3'末端ヌクレオシドは常にLNAヌクレオシドである。
【００５２】
オリゴヌクレオチド合成は、原理的には、所望の配列がアセンブルされるまで行われる、伸長鎖の5'末端へのヌクレオチド残基の段階的付加である。
【００５３】
一般に、それぞれの付加は合成サイクルと称され、原理的には以下の化学反応からなる：
a1）式IIIのプリロード固体支持体上の保護されているヒドロキシル基を非ブロック化する工程、
a2）第一のヌクレオシドを活性化ホスホロアミダイトとして、固体支持体上の遊離ヒドロキシル基とカップリングさせる工程、
a3）それぞれのP結合ヌクレオシドを酸化または硫化して、それぞれのホスホトリエステル（P=O）またはそれぞれのホスホロチオエート（P=S）を形成する工程；
a4）任意で、固体支持体上の任意の未反応ヒドロキシル基をキャッピングする工程；
a5）固体支持体に付着した第二のヌクレオシドの5'ヒドロキシル基を非ブロック化する工程；
a6）第三のヌクレオシドを活性化ホスホロアミダイトとしてカップリングさせて、それぞれのP結合三量体を形成する工程；
a7）それぞれのP結合ジヌクレオシドを酸化または硫化して、それぞれのホスホトリエステル（P=O）またはそれぞれのホスホロチオエート（P=S）を形成する工程；
a8）任意で、任意の未反応5'ヒドロキシル基をキャッピングする工程；
a9）所望の配列がアセンブルされるまで、前述の工程a5〜a8を繰り返す工程；
a10）典型的なオリゴヌクレオチド精製技術によって、例えばクロマトグラフィーおよび／または限外ろ過および／または凍結乾燥を用いてさらに精製することができる粗オリゴヌクレオチドを得るための、包括的脱保護。
【００５４】
以下の実施例は、本発明を限定することなく例証するものである。
【実施例】
【００５５】
略語：
EtOAc＝酢酸エチル
MeCN＝アセトニトリル
MeOH＝メタノール
DCM＝ジクロロメタン
DMAP＝4-ジメチルアミノピリジン
TEA＝トリエチルアミン
THF＝テトラヒドロフラン
TLC＝薄層クロマトグラフィー
rt＝室温
eq＝当量
【００５６】
プロセススキーム
2021516673.tif 000009
【００５７】
一般手順
ヌクレオシド2（1eq）および無水コハク酸（1.5eq）を丸底フラスコに入れた。残留水の共沸除去のために、混合物をrtで無水トルエン（1gの2につき20mL）中に懸濁した。次に揮発性物質を真空中で除去した。この手順を1回繰り返し、次いでトルエンを除去し、固体であるが完全には乾燥していない残渣を得た。この後の操作はすべてアルゴン雰囲気下で行った。上記の形成された固体に無水DCM（1gの2につき18mL）を加えた。次いでTEA（2aに関しては3.0eq、2bに関しては5.0eq）を一度に加えて、混合物をrtで撹拌し、それによって30分後に透明な反応混合物を得た。TLCまたはLC-MSによって変換を確認した（1a.TEAに関しては実施例1の表1を、1b.TEAに関しては実施例2の表2を参照されたい）。
【００５８】
通常、変換は2時間後に完了したが、すべての場合において混合物をrtでさらに1時間、追加で撹拌した。次いで反応混合物をリン酸トリエチルアンモニウム緩衝溶液（1gの2につき緩衝液15mL。緩衝溶液の調製：85％ H3PO4水溶液（8.5mL、1eq）、TEA（26mL、1.5eq）、および水（465.5mL）を混合する。）に注いだ。形成された層を分離し、水層をDCM（1gの2につき2×10mL）でさらに抽出した。合わせた有機層を無水Na2SO4のパッドに通してろ過し、真空下で濃縮した。白色泡状物として得られた粗生成物を、シリカカラムに通すろ過によってさらに精製した（1gの粗生成物につきシリカ20g；溶離液：DCM中EtOH 2.5％〜10％、混合物にさらに3 vol％のTEAを追加する）。目的の画分を濃縮して乾燥させ、直ちに無水トルエン中に懸濁し、真空中で同時蒸発させた。同時蒸発をもう1回繰り返した。
【００５９】
実施例1：1a.TEAの調製
8.6gの2aを、一般手順に記載したとおりに1a.TEAへと変換し、11.3gの1a.TEAを収率96％および純度99.1 HPLC面積％（残留トルエン0.67mol eqを除く）で得た（カラム：Apollo C-18（10μm）（4.6×250mm）10.65分；移動相：勾配40％のMeCN＋60％の0.1％ H3PO4水溶液；流速1.0mL/分；カラム温度40℃；検出：210nm、254nm；試料濃度：MeCN中1mg/mL；注入量：0.002mL）。
2021516673.tif 000010
【００６０】
【表１】
2021516673.tif 000011
【００６１】
実施例2：1b.TEAの調製
8.9gの2bを、一般手順に記載したとおりに1b.TEAへと変換し、11.0gの1b.TEAを収率94％および純度97.2 HPLC面積％（残留トルエン0.75mol eqを除く）で得た（カラム：Apollo C-18（10μm）（4.6×250mm）9.18分；移動相：勾配40％のMeCN＋60％の0.1％ H3PO4水溶液；流速1.0mL/分；カラム温度40℃；検出：210nm、254nm；試料濃度：MeCN中1mg/mL；注入量：0.002mL）。
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【００６２】
【表２】
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【００６３】
実施例3：1c.TEAの調製
10gの2cを、一般手順に記載したとおりに1c.TEAへと変換し、13.6gの1c.TEAを収率98％および純度98.6 HPLC面積％（残留トルエン1.20mol eqを除く）で得た（カラム：Apollo C-18（10μm）（4.6×250mm）11.00分；移動相：勾配40％のMeCN＋60％の0.1％ H3PO4水溶液；流速1.0mL/分；カラム温度40℃；検出：210nm、254nm；試料濃度：MeCN中1mg/mL；注入量：0.002mL）。
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【００６４】
実施例4：1d.TEAの調製
10gの2dを、一般手順に記載したとおりに1d.TEAへと変換し、14.0gの1d.TEAを収率99％超および純度99 HPLC面積％（残留トルエン0.50mol eqを除く）で得た（カラム：Apollo C-18（10μm）（4.6×250mm）12.89分；移動相：勾配40％のMeCN＋60％の0.1％ H3PO4水溶液；流速1.0mL/分；カラム温度40℃；検出：210nm、254nm；試料濃度：MeCN中1mg/mL；注入量：0.002mL）。
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【００６５】
実施例5：1e.TEAの調製
10gの2cを、一般手順に記載したとおりに1c.TEAへと変換し、14.2gの1c.TEAを収率99％超および純度99.2 HPLC面積％（残留トルエン1.00mol eqを除く）で得た（カラム：Apollo C-18（10μm）（4.6×250mm）5.17分；移動相：勾配40％のMeCN＋60％の0.1％ H3PO4水溶液；流速1.0mL/分；カラム温度40℃；検出：210nm、254nm；試料濃度：MeCN中1mg/mL；注入量：0.002mL）。
LC-MS ESI (m/z): 786.5 [M-TEA+H]+
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【００６６】
実施例6：1e.TEAおよび1e（酸形態）の調製
化合物2e（6.71g、9.80mmol）を乾燥THF（70mL）中に溶解し、真空下で35℃にて濃縮した。次いで固体を真空下で4時間、周囲温度にてさらに乾燥させ、乾燥EtOAc（50mL）中に溶解し、TEA（1.60mL、11.7mmol）、DMAP（0.30g、2.4mmol）、および無水コハク酸（1.37g、13.7mmol）を順次、ヌクレオシド溶液に加えた。次いで反応混合物を50℃で16時間加熱した。反応混合物をEtOAc（100mL）およびヘキサン（5mL）で希釈し、10％クエン酸溶液（3×50mL）で抽出した。有機相を5％ NaHCO3溶液（4×50mL）で抽出し、EtOAc（150mL）で希釈し、10％クエン酸溶液（2×75mL）および水（2×75mL）でさらに抽出した。合わせたクエン酸画分および水画分をEtOAc（2×50mL）で逆抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（Na2SO4）、減圧下で濃縮し、スクシネート1e（酸形態）を白色泡状物として得た。
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【００６７】
前記固体をMeCN（70mL）中に再溶解し、TEA（6.8mL、49mmol）を加えた。10分間撹拌した後、混合物を真空下で35℃にて10分間濃縮し、残留物を真空下で周囲温度にて終夜乾燥させ、1e.TEA塩（7.45gのスクシネート x 0.6 TEA、収率90％、HPLC純度98％超）を得た。
【００６８】
1e.TEAについての分析データは、実施例5において報告されたものと一致していた。
【国際調査報告】
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