(57)【要約】  骨髄容器が本明細書に記載されている。活性化された免疫細胞を他の成分から分離するための分離システムが本明細書に記載されている。免疫細胞を活性化するための方法が本明細書に記載されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む：
特定密度での非イオン性親水性分岐多糖、ここで前記組成物が全血と接触され、そして遠心分離される場合、前記密度は、赤血球を分離することなく、非イオン性親水性分岐多糖を通しての全血の流体移動を可能にするのに十分であり；
２０ｋＤａ以上の分子量を有する非イオン性親水性分岐多糖；及び
ＴＬＲ２リガンド、
組成物を無菌のその内部に含む骨髄容器。
【請求項２】
前記非イオン性親水性分岐多糖が、少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の骨髄容器。
【請求項３】
前記非イオン性親水性分岐多糖が、ポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含む、請求項１又は２に記載の骨髄容器。
【請求項４】
前記非イオン性親水性分岐多糖が、１Ｌ当たり１ｇ未満、例えば1 ｇ/Ｌ、０．９９ ｇ/Ｌ、 ０．９ ｇ/Ｌ、 ０．８ ｇ/Ｌ、 ０．７ ｇ/Ｌ、 ０．６ ｇ/Ｌ、 ０．５ ｇ/Ｌ、 ０.４ ｇ/Ｌ、 ０．３ ｇ/Ｌ、 ０．２ ｇ/Ｌ、 ０．１ ｇ/Ｌ、 ０．０５ ｇ/Ｌ、 １０−２ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−５ ｇ/Ｌ、 ２ｘ １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−７ ｇ/Ｌ、 １０−８ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−９ ｇ/Ｌ、 又は１０−９ ｇ/Ｌ未満、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば１０−９ −１０−６ ｇ/Ｌ、１０− ９−１０−３ ｇ/Ｌ、１０−９−１０−２ｇ/Ｌ、１０−９−０．１ ｇ/Ｌ、１０−９−０．５ｇ/Ｌ、１０−９ −０．９ｇ/Ｌ、 １０−９ −０．０９ｇ/Ｌ、１０−６ −１０−３ ｇ/Ｌ、１０−６−１０−２ ｇ/Ｌ、１０−６−０．１ｇ/Ｌ、１０−６−０．５ｇ/Ｌ、１０−６−０．９ｇ/Ｌ、１０−６−０．０９ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−１０−２ ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−０．１ ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−０．５ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６ −０．９ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６  −０．０９ｇ/Ｌ、１０−３−１０−２ ｇ/Ｌ、１０−３−０．１ｇ/Ｌ、１０−３−０．５ｇ/Ｌ、１０−３ −０．９ｇ/Ｌ、１０−３ −０．０９ｇ/Ｌ、０．００２−０．０１ｇ/Ｌ、０．００２−０．１ｇ/Ｌ、０．００２−０．５ｇ/Ｌ、０．００２ −０．９ｇ/Ｌ、０．００２−０．０９ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、 ０．０１ ｇ/Ｌ−０．９ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．５ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ −０．２ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．１ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ − ０．９ｇ/Ｌ、０．１ ｇ/Ｌ−０．５ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ−０．２ｇ/Ｌ、０．５ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、０．５ｇ/Ｌ−０．９ｇ/Ｌ、又は０．５ｇ/Ｌ−０．７ｇ/Ｌの密度を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨髄容器。
【請求項５】
前記ＴＬＲ２リガンドが、ヒアルロノン、ヒアルロン酸、尿酸一ナトリウム結晶、ビグリカン、エンドプラスミン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒト心臓ミオシン、ザイモサン、リポテイコ酸、血漿由来リポタンパク質、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びＰａｍ２ＣＳＫ４及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含むペプチドグリカンから成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨髄容器。
【請求項６】
前記非イオン性親水性分岐多糖が、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度でポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含み、そして前記ＴＬＲ２リガンドがヒアルロン酸を含む、請求項１に記載の骨髄容器。
【請求項７】
前記容器が、バッグ、バキュテナー及び注射器から成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の骨髄容器。
【請求項８】
一体型送達装置をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の骨髄容器。
【請求項９】
デキストランをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の骨髄容器。
【請求項１０】
前記デキストランが、少なくとも約４％の濃度で存在する、請求項９に記載の骨髄容器。
【請求項１１】
骨髄を受け入れるよう構成された体積をさらに含み、ここで骨髄がその体積中に存在する場合、骨髄及び組成物中のデキストリンの濃度が少なくとも約１％である、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の骨髄容器。
【請求項１２】
前記容器が、分離システムにより受け取られるように構成される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の骨髄容器。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の骨髄容器を受け入れるように構成された空洞を含むシャーシ、前記シャーシはトラックを含み；及び
トラック上に配置されるシャフト、ここで前記シャフトはトラックに沿って移動するように構成され、それにより、骨髄容器がシャーシ内に配置される場合、骨髄容器を圧縮する、を含む分離システム。
【請求項１４】
前記シャフトが、シャーシの内面に対して骨髄容器を押し付けるように構成される、請求項１３に記載の分離システム。
【請求項１５】
前記シャフトが、ローラー及びスライダーから成る群から選択される、請求項１３又は１４に記載の分離システム。
【請求項１６】
前記シャフトが、シャーシ内配置された骨髄容器に対して所定の位置にスナップするように構成され、それにより、骨髄容器の少なくとも２つの部分を規定する、請求項１３又は１４に記載の分離システム。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の骨髄容器、及びルアーロックなどの骨髄吸引針を含むキット。
【請求項１８】
骨髄細胞の直径よりも小さな孔径を有するフィルターをさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記孔径が２００ミクロン未満か又はそれに等しい、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
活性化／沈降溶液をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の分離システムをさらに含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
対象の免疫細胞の活性化方法であって、
免疫細胞を含む骨髄を対象から入手し；
前記骨髄を、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドと共にインキュベートし、
ここで前記骨髄が全血と接触され、そして遠心分離される場合、前記密度は、赤血球を分離することなく、非イオン性親水性分岐多糖を通しての全血の流体移動を可能にするのに十分であり、
前記非イオン性親水性分岐多糖が２０ｋＤａ以上の分子量を有し、そして  
前記インキュベーションが、免疫細胞が活性化されるまで行われ；そして
活性化された免疫細胞を対象に投与することを含む方法。
【請求項２３】
免疫細胞の活性化を必要としている対象を特定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が癌を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記骨髄を、癌細胞抗原と共にインキュベートすることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記非イオン性親水性分岐多糖が、少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記非イオン性親水性分岐多糖が、ポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記非イオン性親水性分岐多糖が、ＩＬ当たり１ｇ未満の密度を有する、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＬＲ２リガンドが、ヒアルロノン、ヒアルロン酸、尿酸一ナトリウム結晶、ビグリカン、エンドプラスミン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒト心臓ミオシン、ザイモサン、リポテイコ酸、血漿由来リポタンパク質、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びＰａｍ２ＣＳＫ４及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含むペプチドグリカンから成る群から選択される、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記非イオン性親水性分岐多糖が、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度でポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含み、そして前記ＴＬＲ２リガンドがヒアルロン酸を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記非イオン性親水性分岐多糖が、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度でポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含み、そして前記ＴＬＲ２リガンドがヒアルロン酸を含む、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記インキュベーションが、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の骨髄容器において行われる、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の分離システムに前記骨髄容器を配置し；
シャフトを、骨髄容器に対して所定の位置にスナップし、それにより、骨髄容器の２つの部分を規定し；
前記インキュベーションの後、トラックに沿ってシャフトを動かし、それにより骨髄容器中の内容物を圧縮し、そして骨髄から免疫細胞を押出すことをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記骨髄細胞を、活性化／沈降溶液と共にインキュベートし、それにより、骨髄から赤血球を沈降させることをさらに含む、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記活性化された免疫細胞が、骨髄細胞を含む、請求項２２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記活性化された免疫細胞が、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５４＋顆粒球及び／又はＣＤ６６ｂ＋好中球を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
活性化された免疫細胞を対象に投与する前、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドから活性化された免疫細胞を分離することをさらに含む、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記活性化された免疫細胞が、対象の筋骨格組織に投与される、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
白血球除去療法を含まない、請求項２２〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる、２０１８年６月２９日に出願された米国仮出願第６２／６９１７７５号の利益を主張する、２０１８年１０月１５日に出願された米国国内出願第１６／１６０００６号に対するＰＣＴ規則４．１０に基く優先件を主張する。外国又は国内の優先権主張が本出願と共に提出されたものとして出願データシートで特定されている全ての出願は、３７ＧＦＲ１．５７下で参照により本明細書に組込まれる。
【０００２】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、一般的に、免疫細胞の活性化のための方法、組成物、及び製造に関する。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖類及びＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）リガンドを含む組成物が、骨髄由来の骨髄細胞を活性化するために使用される。
【背景技術】
【０００３】
骨髄は、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び他の再生細胞型、例えば間葉系間質／幹細胞（ＭＳＣ）の容易にアクセスできる源として使用されて来た。骨髄は再生組織であるので、再生医療用途、特に自己細胞が好まれるそれらの用途に再生可能な細胞の有用な源を提供することができる。
【０００４】
従来、骨髄吸引液は、細胞成分を分離することにより処理されて来た。それらの方法は、従来、価値がないものとして見なされ、そして再生医療の用途では有害でさえある可能性がある。赤血球（ＲＢＣ）を分離することにより、骨髄を減量することができる。一般的に、それらの分離方法は、ＨＳＣ及びＭＳＣを含む単核細胞画分において富化するためにＲＢＣの異なる物理的特性を利用して来た。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態によれば、骨髄容器が記載されている。骨髄容器は、特定密度で非イオン性親水性分岐多糖を含む組成物を含むことができ、ここで前記組成物が全血と接触され、そして遠心分離される場合、前記密度は、赤血球を分離することなく、非イオン性親水性分岐多糖を通しての全血の流体移動を可能にするのに十分である。非イオン性親水性分岐多糖は、２０ｋＤａ以上の分子量を有することができる。組成物は、ＴＬＲ２リガンドを含むことができる。組成物は、容器内に含まれ得る。容器は無菌である。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含む。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ＩＬ当たり１ｇ未満の密度を有する。いくつかの実施形態によれば、ＴＬＲ２リガンドは、ヒアルロノン、ヒアルロン酸、尿酸一ナトリウム結晶、ビグリカン、エンドプラスミン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒト心臓ミオシン、ザイモサン、リポテイコ酸、血漿由来リポタンパク質、及びリポ多糖（ＬＰＳ）を含むペプチドグリカンから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ＩＬ当たり１ｇ未満の密度でのポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成り、そしてＴＬＲ２リガンドは、ヒアルロン酸を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、容器は、バッグ、バキュテナー及び注射器から成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は一体型送達装置をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、活性化／沈降溶液をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、デキストラン及び／又はヘスをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、デキストランは、少なくとも約４％の濃度で存在する。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、骨髄を受け入れるよう構成された体積をさらに含み、ここで骨髄がその体積中に存在する場合、骨髄及び組成物中のデキストリンの濃度が少なくとも約１％である。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、本明細書に記載の分離システムにより受け取られるように構成される。
【０００６】
いくつかの実施形態によれば、分離システムが記載されている。分離システムは、本明細書に記載されるような骨髄容器を受け入れるように構成された空洞を含むシャーシを含むことができる。シャーシは、トラックを含むことができる。システムは、本明細書に記載の骨髄容器を受け入れるように構成された空洞を含むシャーシを含むことができる。前記シャーシはトラックを含むことができる。システムは、トラック上に配置されるシャフトを含むことができ、ここで前記シャフトはトラックに沿って移動するように構成され、それにより、骨髄容器がシャーシ内に配置される場合、骨髄容器を圧縮する。いくつかの実施形態によれば、前記シャフトは、シャーシの内面に対して骨髄容器を押し付けるように構成される。いくつかの実施形態によれば、前記シャフトは、ローラー及びスライダーから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、前記シャフトは、シャーシ内配置された骨髄容器に対して所定の位置にスナップするように構成され、それにより、骨髄容器の少なくとも２つの部分を規定する。
【０００７】
いくつかの実施形態によれば、キットが記載されている。キットは、本明細書に記載されるような骨髄容器を含むことができる。キットはさらに、骨髄吸引針、例えばルアーロックを含むことができる。いくつかの実施形態によれば、キットはさらに、フィルターを含む。フィルターは、骨髄細胞の直径よりも小さな孔径を有することができる。いくつかの実施形態によれば、孔径は、２００ミクロン未満か又はそれに等しい。いくつかの実施形態によれば、キットはさらに、活性化／沈降溶液を含む。いくつかの実施形態によれば、キットはさらに、本明細書に記載されるような分離システムを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、対象の免疫細胞の活性化方法が記載される。その方法は、対象の骨髄を入手することを含む。骨髄は、免疫細胞を含むことができる。前記方法は、骨髄を、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドと共にインキュベートすることを含む。非イオン性親水性分岐多糖は、骨髄が全血と接触され、そして遠心分離される場合、前記密度は、赤血球を分離することなく、非イオン性親水性分岐多糖を通しての全血の流体移動を可能にするのに十分であるような密度で存在することができる。非イオン性親水性分岐多糖は、２０ｋＤａ以上の分子量を有することができる。インキュベーションは、免疫細胞が活性化されるまで、行われ得る。例えば、インキュベーションは、列挙された値の任意の２つの間の範囲を含めて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２時間であり得る。方法はさらに、活性化された免疫細胞を対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態によれば、方法はさらに、免疫細胞の活性化を必要としている対象を特定することを含む。いくつかの実施形態によれば、対象は癌を有する。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションはさらに、骨髄を、癌細胞抗原と共にインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含む。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ＩＬ当たり１ｇ未満の密度を有する。いくつかの実施形態によれば、ヒアルロノン、ヒアルロン酸、尿酸一ナトリウム結晶、ビグリカン、エンドプラスミン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒト心臓ミオシン、ザイモサン、リポテイコ酸、血漿由来リポタンパク質、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びＰａｍ２ＣＳＫ４及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含むペプチドグリカン、及び２つ以上の列挙されたアイテムの組合せから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度でポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成り、そして前記ＴＬＲ２リガンドはヒアルロン酸を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度でポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成り、そして前記ＴＬＲ２リガンドはヒアルロン酸を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成り。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは、本明細書に記載されるような骨髄容器において行われる。いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、本明細書に記載の分離システムに前記骨髄容器を配置し、そしてシャフトを、骨髄容器に対して所定の位置にスナップし、それにより、骨髄容器の２つの部分を規定する。前記方法はさらに、インキュベーションの後、トラックに沿ってシャフトを動かし、それにより骨髄容器中の内容物を圧縮し、そして骨髄から免疫細胞を押出すことをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、骨髄細胞を、活性化／沈降溶液と共にインキュベートし、それにより、骨髄から赤血球を沈降させることをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、活性化された免疫細胞は、骨髄細胞を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、活性化された免疫細胞は、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５４＋顆粒球及び／又はＣＤ６６ｂ＋好中球を含む。いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、活性化された免疫細胞を対象に投与する前、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドから活性化された免疫細胞を分離することを含む。いくつかの実施形態によれば、活性化された免疫細胞は、対象の筋骨格組織に投与される。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、白血球除去療法を含まない。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、エキスビボで存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ−Ｆは、骨髄吸引液のＦＩＣＯＬＬ試薬及びＴＬＲ２リガンドへの暴露の後の骨髄樹状細胞活性化のフローサイトメトリー分析を示す一連のグラフを示す。図１Ａ及び図１Ｄ（末梢血液サンプル陽性対照、ＰＢ）、図１Ｂ及び図１Ｅ（フィコール及びＴＬＲ２アゴニストへの暴露の前の全骨髄陰性対照）、及び図１Ｃ及び図１Ｆ（フィルコール及びＴＬＲ２アゴニストへの暴露の後の骨髄吸引液単核細胞、ＭＮＣ）。系統陰性、ＣＤ１４陰性、骨髄サイズゲートの古典的樹状細胞（図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃ；白の矢印は領域１、２及び３における樹状細胞を示す）、及びゲートされた樹状細胞が、陽性及び相対蛍光強度の割合によりＨＬＡ−ＤＲ発現について活性化された細胞の割合を測定することにより活性化について分析された（図１Ｄ、図１Ｅ及び図１Ｆ）。
【００１０】
【図２】図２Ａ−Ｉは、前方及び直交光散乱による骨髄サイズ細胞を単離するフローサイトメトリーゲーティングスキーム（図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃ）、生存細胞を死んだ細胞から区別するための色素排除を用いての生存率（図２Ｄ、図２Ｅ及び図２Ｆ）、及び信号幅と信号領域との比率を用いてのダブレット及びデブリからの単一細胞（図２Ｇ、図２Ｈ及び２Ｉ）を示す。
【００１１】
【図３−１】図３Ａは、本明細書のいくつかの実施形態による骨髄容器の図である。
【００１２】
【図３−２】図３Ｂ−Ｃは、本明細書のいくつかの実施形態による、分離システムの図である。分離システムは、本明細書に記載されるような骨髄容器を受け入れるように構成され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
非イオン性親水性分岐多糖、例えばポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を、ＴＬＲ２リガンド（例えば、ヒアルロン酸）と組合して、骨髄における免疫細胞、例えば再生細胞を活性できることが、本明細書において観察される。活性化された免疫細胞は、骨髄系を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。本明細書における実施形態に従って記載されるのは、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含む、骨髄容器、組成物、方法及びキットである。非イオン性親水性分岐多糖は、少なくとも２０ｋＤａの分子量を有することができる。非イオン性親水性分岐多糖は、赤血球を分離することなく、非イオン性親水性分岐多糖を介して全血の流体移動を可能にするのに十分な密度であり得る。対照的に、血液処理における非イオン性親水性分岐多糖の従来の使用は、典型的には、単核画分からの赤血球の密度媒介分離（例えば、遠心分離下で）のために、それらの多糖類を、より高い濃度（１．０ｇ／ｌ以上）で実施する。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２癌度を含む。骨髄吸引液が容器に添加され、そして免疫細胞が、容器中で骨髄吸引液を、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドと共にインキュベートすることにより活性化され得る。いくつかの実施形態によれば、免疫細胞の活性化方法は、骨髄（例えば、骨髄吸引液）を、本明細書に記載の非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドと共にインキュベートすることを含む。
【００１４】
本明細書で使用される場合、免疫細胞を「活性化する」とは、本開示を考慮して、当業者により理解されるようなその通常の慣習的な意味を有する。それは、免疫細胞の増殖、成熟、動員（例えば、移動）、代謝又は異化作用、及び／又は活性（例えば、サイトカイン、成長因子及び／又は酵素分泌）を言及する。
【００１５】
非イオン性親水性分岐多糖：
いくつかの実施形態の骨髄治療容器、キット及び方法は、非イオン性親水性分岐多糖を含む。適切な非イオン性親水性分岐多糖の例は、ＦＩＣＯＬＬ多糖として市販されている、ポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含むが、但しそれらだけには限定されない。本明細書においては、少なくとも２０ｋＤａの分子量を有する大きな分岐多糖が自然免疫系を活性化できることが企画されている。理論に制限されることなく、適切に高い分子量を有する非イオン性親水性分岐多糖は、細菌の細胞壁を模倣する構造を有すると考えられる。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ニ糖以上のモノマー、例えば少なくとも三糖又はそれ以上の糖を含む。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、少なくとも２０ｋＤａ、例えば少なくとも２０ ｋＤａ、３０ ｋＤａ、４０ ｋＤａ、５０ ｋＤａ、６０ ｋＤａ、７０ ｋＤＡ、８０ ｋＤａ、９０ ｋＤａ、１００ ｋＤａ、１５０ ｋＤａ、２００ ｋＤａ又は５００ ｋＤａ、例えば列挙される値の任意の２つの間の範囲、例えば２０−５００ ｋＤａ、２０− ２００ ｋＤａ、２０ −１００ ｋＤａ、２０−８０ ｋＤａ、５０−５００ｋＤａ、５０−２００ｋＤａ、５０−１００ｋＤａ、５０−８０ ｋＤａ、７０−５００ｋＤａ、７０−２００ｋＤａ、７０−１００ｋＤａ、及び７０−８０ｋＤａの分子量を有する。
【００１６】
非イオン性親水性分岐多糖は、従来、血液から赤血球を分離するためには（例えば、遠心分離により）、高い密度を使用して来たが、イオン性親水性分岐多糖ははるかに低い密度で免疫細胞を活性化するのに有用であり得ることが、本明細書において企画されている。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は高い密度で存在し、結果的に、全血と接触され、そして遠心分離される場合、全血は、赤血球を分離しないで、非イオン性親水性分岐多糖を介して流動的に移動することができる。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ＩＬ当たり１ｇ未満の密度で、例えば1 ｇ/Ｌ、０．９９ ｇ/Ｌ、 ０．９ ｇ/Ｌ、 ０．８ ｇ/Ｌ、 ０．７ ｇ/Ｌ、 ０．６ ｇ/Ｌ、 ０．５ ｇ/Ｌ、 ０.４ ｇ/Ｌ、 ０．３ ｇ/Ｌ、 ０．２ ｇ/Ｌ、 ０．１ ｇ/Ｌ、 ０．０５ ｇ/Ｌ、 １０−２ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−５ ｇ/Ｌ、 ２ｘ １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−７ ｇ/Ｌ、 １０−８ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−９ ｇ/Ｌ、 又は１０−９ ｇ/Ｌ未満、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば１０−９ −１０−６ ｇ/Ｌ、１０− ９−１０−３ ｇ/Ｌ、１０−９−１０−２ｇ/Ｌ、１０−９−０．１ ｇ/Ｌ、１０−９−０．５ｇ/Ｌ、１０−９ −０．９ｇ/Ｌ、 １０−９ −０．０９ｇ/Ｌ、１０−６ −１０−３ ｇ/Ｌ、１０−６−１０−２ ｇ/Ｌ、１０−６−０．１ｇ/Ｌ、１０−６−０．５ｇ/Ｌ、１０−６−０．９ｇ/Ｌ、１０−６−０．０９ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−１０−２ ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−０．１ ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−０．５ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６ −０．９ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６  −０．０９ｇ/Ｌ、１０−３−１０−２ ｇ/Ｌ、１０−３−０．１ｇ/Ｌ、１０−３−０．５ｇ/Ｌ、１０−３ −０．９ｇ/Ｌ、１０−３ −０．０９ｇ/Ｌ、０．００２−０．０１ｇ/Ｌ、０．００２−０．１ｇ/Ｌ、０．００２−０．５ｇ/Ｌ、０．００２ −０．９ｇ/Ｌ、０．００２−０．０９ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、 ０．０１ ｇ/Ｌ−０．９ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．５ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ −０．２ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．１ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ − ０．９ｇ/Ｌ、０．１ ｇ/Ｌ−０．５ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ−０．２ｇ/Ｌ、０．５ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、０．５ｇ/Ｌ−０．９ｇ/Ｌ、又は０．５ｇ/Ｌ−０．７ｇ/Ｌの密度で提供される。
【００１７】
ＴＬＲ２リガンド：
ＴＬＲ２リガンドは、骨髄細胞を活性化できる。理論により限定されないが、ＴＬＲリガンドは、それらの治療効果を改善するために骨髄細胞を活性化できると考えられる。従って、いくつかの実施形態の骨髄治療容器、キット、組成物及び方法は、ＴＬＲ２リガンドを含む。本明細書におけるいくつかの実施形態のほう方法、組成物、骨髄容器及びキットのための適切なＴＬＲ２リガンドの例は、以下を含むが、但しそれらだけには源例されない：ヒアルロノン、ヒアルロン酸、尿酸一ナトリウム結晶、ビグリカン、エンドプラスミン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒト心臓ミオシン、ザイモサン、リポテイコ酸、血漿由来リポタンパク質、ＬＰＳ、Ｐａｍ２ＣＳＫ４及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含むペプチドグリカン、及び２つ以上の列挙されたアイテムの組合せ。いくつかの実施形態によれば、ＴＬＲ２リガンドは、ヒアルロン酸を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態の骨髄治療容器、キット、組成物及び方法においては、ＴＬＲ２リガンドは、少なくとも１μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００ 又は ５００μｇ／ｍｌ、又は少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｍｇ／ｍｌ、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば１−１０μｇ/ｍｌ、１−１００ μｇ/ｍｌ、１μｇ/ｍｌ−１ｍｇ/ｍｌ、１μｇ/ｍｌ−１０ ｍｇ/ｍｌ、１０−１００μｇ/ｍｌ、１０ μｇ/ｍｌ−１ｍｇ/ｍｌ、１０μｇ/ｍｌ−１０ ｍｇ/ｍｌ、１００ μｇ/ｍｌ−１ｍｇ/ｍｌ、１００μｇ/ｍｌ−１０ｍｇ/ｍｌ又は１−１０ｍｇ/ｍｌの濃度で存在する。
【００１８】
活性化／沈降溶液：
いくつかの実施形態は、活性化／沈降溶液を含む。活性化／沈降溶液は、骨髄から、赤血球を沈降させることができ、従って、骨髄を減量し、そして活性化された免疫細胞の濃度を高める。デキストラン及び／又はヒドロキシエチルデンプン（ヘス）は、赤血球を沈降させることができる。従って、いくつかの実施形態によれば、活性化／沈降溶液は、デキストラン及び／又はヘスを含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、活性化／沈降溶液は、ヘスを含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、活性化／沈降溶液は、デキストランを含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、デキストラン及び／又はヘスは、骨髄の添加に基づいて、デキストラン及び／又はヘスの濃度が、少なくとも１％、少なくとも１％、２％、３％又は４％、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば１−４％、１−３％、１−２％、２−３％, ２−４％又は３−４％で存在するような濃度である。活性化／沈降溶液は、赤血球を沈降させ、従って活性化された細胞を減量するために、骨髄容器において、骨髄及び組成物（非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含む）と共にインキュベートするために適切であり得る。いくつかの実施形態によれば、デキストラン及び／又はヘスは、高分子量を有する。デキストラン及び／又はヘスは、５１０（ｋ）−互換グレードのものである。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、活性化／沈降溶液は、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含む組成物とは別である。例えば、活性化／沈降溶液は、本明細書に記載されるような骨髄容器とは別である。いくつかの実施形態によれば、活性化／沈降溶液は、本明細書に記載のような非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含む組成物の一部である。
【００２０】
組成物：
いくつかの実施形態によれば、組成物は、本明細書に記載のような非イオン性親水性分岐多糖、及び本明細書に記載のようなＴＬＲ２リガンドを含む。非イオン性親水性分岐多糖は、本明細書に記載のように、少なくとも２０ｋＤａの分子量を有することができる。非イオン性親水性分岐多糖は、本明細書に記載のように、１ｇ／Ｌ以下の密度を有することができる。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、ＴＬＲ２リガンドは、ヒアルロン酸を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、組成物は、溶液（組成物を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成ることができる）、例えば水溶液に含まれる。いくつかの実施形態によれば、組成物は、溶液、例えば水溶液である。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ＩＬ当たり１ｇ未満の密度で、例えば1 ｇ/Ｌ、０．９９ ｇ/Ｌ、 ０．９ ｇ/Ｌ、 ０．８ ｇ/Ｌ、 ０．７ ｇ/Ｌ、 ０．６ ｇ/Ｌ、 ０．５ ｇ/Ｌ、 ０.４ ｇ/Ｌ、 ０．３ ｇ/Ｌ、 ０．２ ｇ/Ｌ、 ０．１ ｇ/Ｌ、 ０．０５ ｇ/Ｌ、 １０−２ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−５ ｇ/Ｌ、 ２ｘ １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−７ ｇ/Ｌ、 １０−８ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−９ ｇ/Ｌ、 又は１０−９ ｇ/Ｌ未満、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば１０−９ −１０−６ ｇ/Ｌ、１０− ９−１０−３ ｇ/Ｌ、１０−９−１０−２ｇ/Ｌ、１０−９−０．１ ｇ/Ｌ、１０−９−０．５ｇ/Ｌ、１０−９ −０．９ｇ/Ｌ、 １０−９ −０．０９ｇ/Ｌ、１０−６ −１０−３ ｇ/Ｌ、１０−６−１０−２ ｇ/Ｌ、１０−６−０．１ｇ/Ｌ、１０−６−０．５ｇ/Ｌ、１０−６−０．９ｇ/Ｌ、１０−６−０．０９ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−１０−２ ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−０．１ ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−０．５ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６ −０．９ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６  −０．０９ｇ/Ｌ、１０−３−１０−２ ｇ/Ｌ、１０−３−０．１ｇ/Ｌ、１０−３−０．５ｇ/Ｌ、１０−３ −０．９ｇ/Ｌ、１０−３ −０．０９ｇ/Ｌ、０．００２−０．０１ｇ/Ｌ、０．００２−０．１ｇ/Ｌ、０．００２−０．５ｇ/Ｌ、０．００２ −０．９ｇ/Ｌ、０．００２−０．０９ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、 ０．０１ ｇ/Ｌ−０．９ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．５ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ −０．２ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．１ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ − ０．９ｇ/Ｌ、０．１ ｇ/Ｌ−０．５ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ−０．２ｇ/Ｌ、０．５ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、０．５ｇ/Ｌ−０．９ｇ/Ｌ、又は０．５ｇ/Ｌ−０．７ｇ/Ｌの密度で提供される。いくつかの実施形態によれば、ＴＬＲ２リガンドは、少なくとも１μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００ 又は ５００μｇ／ｍｌ、又は少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ｍｇ／ｍｌ、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば１−１０μｇ/ｍｌ、１−１００ μｇ/ｍｌ、１μｇ/ｍｌ−１ｍｇ/ｍｌ、１μｇ/ｍｌ−１０ ｍｇ/ｍｌ、１０−１００μｇ/ｍｌ、１０ μｇ/ｍｌ−１ｍｇ/ｍｌ、１０μｇ/ｍｌ−１０ ｍｇ/ｍｌ、１００ μｇ/ｍｌ−１ｍｇ/ｍｌ、１００μｇ/ｍｌ−１０ｍｇ/ｍｌ又は１−１０ｍｇ/ｍｌの濃度で存在する。
【００２１】
理論により限定されないが、非イオン性親水性分岐多糖は、自然免疫応答を活性化することができ、そしてＴＬＲ２リガンドは、骨髄細胞を活性化できると考えられる。いくつかの実施形態によれば、組成物は、天然免疫応答を活性化するのに十分な量の非イオン性親水性分岐多糖を含む。いくつかの実施形態によれば、組成物は、骨髄細胞を活性化するのに十分な量のＴＬＲ２リガンドを含む。いくつかの実施形態によれば、組成物は、骨髄細胞を活性化し、そして天然免疫応答を刺激するのに十分な量の非イオン性親水性分岐多糖及びＹＬＲ２リガンドを含む。いくつかの実施形態によれば、組成物は、ＣＤ６６ｂ＋好中球を活性化するのに十分な量の非イオン性親水性分岐多糖を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、生成物はさらに、本明細書に記載のような活性化／沈降溶液を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、本明細書に記載のような免疫細胞、例えば骨髄系の免疫細胞の活性化への使用のためである。いくつかの実施形態によれば、その使用は、インビトロ使用である。
【００２４】
骨髄容器：
本明細書に記載のような非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含む骨髄容器が骨髄の免疫細胞を活性化できると考えられる。骨髄容器は、免疫応答を必要とする患者の自己骨髄における免疫応答を刺激するために、及び／又は移植前に移植可能なゲル又はパテ（例えば、脱灰骨基質（ＤＢＭ））を水和するために有用であり得る。従って、いくつかの実施形態によれば、骨髄容器が記載されている。骨髄容器は、本明細書に記載のような非イオン性親水性分岐多糖及び本明細書に記載のようなＴＬＲ２リガンドを含む組成物を含むことができる。非イオン性親水性分岐多糖は、組成物が全血と接触され、そして遠心分離される場合、赤血球を分離することなく、非イオン性親水性分岐多糖を通しての全血の流体移動を可能にするのに十分である密度で存在することができる。参照遠心分離パラメーターは、例えば少なくとも５０ｇ、例えば少なくとも１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ又は４００ｇであり得る。非イオン性親水性分岐多糖は、本明細書に記載されるように、２０ｋＤａ以上、例えば少なくとも２０ｋＤａ、例えば少なくとも２０ ｋＤａ、３０ ｋＤａ、４０ ｋＤａ、５０ ｋＤａ、６０ ｋＤａ、７０ ｋＤＡ、８０ ｋＤａ、９０ ｋＤａ、１００ ｋＤａ、１５０ ｋＤａ、２００ ｋＤａ又は５００ ｋＤａ、例えば列挙される値の任意の２つの間の範囲、例えば、２０−５０ｋＤａ、２０−１００ｋＤａ、２０−２００ｋＤａ、２０−５００ｋＤａ、５０−１００ｋＤａ、５０−２００ｋＤａ、５０−５００ｋＤａ、７０−１００ｋＤａ、７０−２００ｋＤａ、７０−５００ｋＤａ、１００−２００ｋＤａ又は１００−５００ｋＤａの分子量を有することができる。組成物は、骨髄容器に含まれ得る。骨髄容器は無菌であり得る。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、本明細書に記載のような分離システムに挿入するように構成される。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度で存在する。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度でポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含み、そしてＴＬＲ２リガンドはヒアルロン酸を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態の例示的な骨髄容器が、図３Ａに示されている。骨髄容器１００は、本明細書に記載されるような非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る組成物１１０を含むことができる。組成物１１０は、骨髄容器１００の内部に配置され得る。骨髄容器の内部は無菌であり得る。骨髄容器１００はさらに、入り口１２０及び出口１３０を含むことができる。入口及び出口は、骨髄容器１００の内部を外部と流体連絡するように配置することができる。いくつかの実施形態によれば、入口１２０は、チャネル及び／又は弁を含む。いくつかの実施形態によれば、入口１２０は、圧力、摩擦又は接着剤により密封可能である。いくつかの実施形態によれば、出口１３０は、チャネル及び／又は弁を含む。いくつかの実施形態によれば、出口１３０は、例えば圧力、摩擦又は接着剤により密封可能である。いくつかの実施形態によれば、入口１２０及び出口１３０は同じ構造である。いくつかの実施形態によれば、入口１２０及び出口１３０は別の構造である。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器１００はさらに、一体型送達装置（示されていない）、例えば静脈内針を含む。一体型送達装置は、出口１３０と流体通信することができ、そして容器からの活性化された免疫細胞を、その必要な対象に投与するように構成され得る。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、バッグ、バキュテナー及び注射器から成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、骨髄が本明細書に記載のように免疫細胞を活性化するために骨髄容器内でインキュベートされた後、活性化された免疫細胞は、それを必要とする対象に投与される。免疫細胞は自己由来であり得る。従って、いくつかの実施形態によれば、骨髄容器はさらに、送達装置、例えば針、例えば静脈内針を含む。いくつかの実施形態によれば、送達装置は、骨髄容器に不可欠である。いくつかの実施形態によれば、送達装置は、骨髄容器に取り付けられ、そして任意には、それから取り外されるように構成される。例えば、送達装置は、骨髄容器の出口と流体連絡して配置されるように構成され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、１回の吸引で２〜４ｍｌ、１回の吸引で約２５ｍｌまでの用量を受け取るように構成される。従って、骨髄容器は、吸引された骨髄、及び非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含む組成物を収容するための容積を有することができる。従って、いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ ｍｌ、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば２−２５ｍｌ、 ２−３０ｍｌ、２−４０ｍｌ、２−５０ｍｌ、２−７０ｍｌ、２−１００ｍｌ、５−２５ｍｌ、５−３０ｍｌ、５−４０ｍｌ、５−５０ｍｌ、５−７０ｍｌ、５−１００ｍｌ、１０−２５ｍｌ、１０−３０ｍｌ、１０−４０ｍｌ、１０−５０ｍｌ、１０−７０ｍｌ、１０−１００ｍｌ、２０−２５ｍｌ、２０−３０ｍｌ、２０−４０ｍｌ、２０−５０ｍｌ、２０−７０ｍｌ、２０−１００ｍｌ、５０−７０ｍｌ又は５０−１００ｍｌの容積を有する。
【００２８】
本明細書に記載の活性化された免疫細胞を含む骨髄から一部の又は全ての赤血球を除去し、例えば骨髄中の活性化された単核免疫細胞の濃度を高めることは好都合である。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器はさらに、赤血球の沈降のために構成される。従って、いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、本明細書に記載のような活性化／沈降溶液を含む。活性化／沈降溶液は、デキストラン及び／又はヘスを含むことができる。いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、骨髄を受け入れるように構成された容量を含み、そして骨髄がその容量に存在する場合、組合わされた骨髄及び活性化／沈降溶液におけるデキストラン及び／又はヘスの濃度は少なくとも約１％である。
【００２９】
いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は、ポイントオブケア装置である。従って、いくつかの実施形態によれば、骨髄容器は携帯可能である。
【００３０】
分離システム：
分離システムは、骨髄が骨髄容器内でインキュベートされた後、濃縮された活性化免疫細胞を調製するために、本明細書に記載のような骨髄容器と組合して有用であり得る。
【００３１】
いくつかの実施形態の例示的な分離システムが、図３Ｂ及び３Ｃに示されている。図３Ｂは、第１の構成（骨髄容器１００内の骨髄の分離の前）の分離システム２００を示す。図３Ｃは、第２の構成（骨髄容器１００内の骨髄の分離の後）の分離システム２００を示す。
【００３２】
図３Ｂを参照すると、分離システム２００は、本明細書に記載のように、骨髄を受け入れるように構成される。分離システム２００は、骨髄容器１００含むように構成された空洞２１０を含むシャーシ２０５を含むことができる。シャーシ２０５はさらに、トラック２２０を含むことができる。トラック２２０は、空洞２１０の軸に沿って配置され得る。シャフト２３０は、トラック上に配置され得る。任意には、シャフト２３０は、ハンドル２３５と機械的に連絡しているので、シャフト２３０はハンドル２３５を介してトラック２２０に沿って移動され得る。従って、シャフト２３０がトラック２２０に沿って移動すると、シャフト２３０は空洞を通過することができる。いくつかの実施形態によれば、シャフト２３０は、ローラー及びスライダーから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、シャフト２３０は、シャーシ２０５内に配置された骨髄容器１００に対して所定の位置にスナップするように構成され、従って、骨髄容器の少なくとも２つの部分を規定する。いくつかの実施形態によれば、シャフト２３０は、シャーシ２０５の内面に対して骨髄容器１００を圧縮するように構成される。いくつかの実施形態によれば、分離システム２００は、本明細書に記載の骨髄容器１００を受け入れるように構成された空洞２１０を含み、シャーシはトラック２２０を含む。分離システムはさらに、トラック２２０上に配置されたシャフト２３０を含み、ここでシャフト２３０はトラック２２０に沿って移動するように構成され、従って、骨髄容器１００がシャーシ２０５に配置される場合、骨髄容器１００を圧縮する。いくつかの実施形態によれば、シャーシ２０５はプラスチックである。
【００３３】
図３Ｃを参照すると、骨髄容器１００が空洞２２０内に配置される場合、入口１２０及び出口１３０はアクセス可能なままであり得る。シャフト２３０がトラック２２０に沿って移動し、そして空洞２１０を通過するにつれて、シャフト２３０は、その中の骨髄容器１００を圧縮することができる。出口１３０に向かってのトラックに沿ってのシャフト２３０の移動は、活性化された免疫細胞を、骨髄容器１００から出口を通して押出すことができる。いくつかの実施形態によれば、活性化／沈降溶液（デキストラン及び／又はヘスを含むか、実質的に成るか、又はそれらから成ることができる）は、入口１２０を通して添加され、そして組成物１１０と共に混合され、そしてインキュベートされ、本明細書に記載のような免疫細胞の活性化、及びまた、他の成分、例えば赤血球の沈降を可能にする。次に、シャフト２３０が、例えば、ハンドルを引くことにより、トラック２２０に沿って移動し、従って、骨髄容器１００を圧縮し、そして出口１３０を通して、活性化された免疫細胞を押出す。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは、少なくとも０．５時間、１時間、１．５時間又は２時間である。
【００３４】
キット：
いくつかの実施形態によれば、キットが記載される。キットは、本明細書に記載のような骨髄容器を含むことができる。骨髄容器は、本明細書に記載のような非イオン性親水性分岐多糖及び本明細書に記載のようなＴＬＲ２リガンドを含む組成物を含むことができる。キットはさらに、骨吸引針、例えばルアーロックを含むことができる。骨吸引針は、骨髄容器の入口を通して骨髄吸引液を投与するのに適切である。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、キットはさらにフィルターを含む。フィルターは、骨髄の他の成分から骨髄細胞を分離するために適切であり得る。従って、いくつかの実施形態によれば、フィルターは骨髄細胞の直径よりも小さな孔径を有する。いくつかの実施形態によれば、フィルターは、２００ミクロン、１５０ミクロン、１００ミクロン又は５０ミクロン以下か又は等しく、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば５０−２００ミクロン、５０−１５０ミクロン、又は１００−２００ミクロンである。いくつかの実施形態によれば、フィルターは、骨髄容器及び骨髄のより小さな成分を処分しながら、骨髄細胞を保持するために使用され得る（例えば、フィルターは、骨髄容器の内部及び出口を含む液体経路に配置され、その結果、骨髄細胞より小さな物質は、骨髄細胞を保持したまま、出口から排出され得る）。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、キットはさらに、活性化／沈降溶液を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化／沈降溶液は、キットの骨髄容器の内部に配置される。いくつかの実施形態によれば、活性化／沈降溶液は、骨髄容器とは別に、例えば別の容器に配置される。活性化／沈降溶液に対する乾燥及び／又は凍結乾燥された前駆体はまた、適切な流体、例えば骨髄の添加に基づいて活性化／沈降溶液として適切に再構成され得る。従って、活性化／沈降「溶液」は、本明細書においては省略形と呼ばれるが、適切な乾燥及び／又は凍結乾燥前駆体もまた企画されることも理解されるであろう。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、キットはさらにプラスミンを含む。プラスミンは、活性化された免疫細胞の凝固及び送達のために有用である。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、キットはさらに、本明細書に記載されるような別のシステムを含む。
【００３９】
免疫細胞の活性化方法：
いくつかの実施形態は、対象の免疫細胞を活性化する方法を含む。その方法は、対象の骨髄の入手を含む。骨髄は、免疫細胞を含むことができる。その方法は、骨髄を、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含む組成物、例えば本明細書に記載の非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含む組成物と共にインキュベートすることができる。非イオン性親水性分岐多糖は、２０ｋＤａ以上の分子量を有することができる。非イオン性親水性分岐多糖は、骨髄が全血と接触され、そして遠心分離される場合、赤血球を分離することなく、非イオン性親水性分岐多糖を通しての全血の流体移動を可能にするのに十分であるような密度で存在することができる。インキュベーションは、免疫細胞が活性化されるまで、行われ得る。例えば、インキュベーションは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２時間、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲であり得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、骨髄を、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドと共に一晩インキュベートすることが、免疫細胞を活性化できることが示されている（実施例１を参照のこと）。この方法は、活性化された免疫細胞の対象への投与を含むことができる。従って、いくつかの実施形態の方法は、自己活性化免疫細胞を対象に送達する。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖の密度は、１Ｌ当たり１ｇ以下である。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドは、本明細書に記載のような骨髄容器に配置され、そしてインキュベーションがその骨髄容器において行われる。いくつかの実施形態によれば、活性化された免疫細胞は、骨髄細胞を含むか、実施的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、活性化された免疫細胞は、ＣＤ６６ｂ＋好中球を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、骨髄（及び活性化された免疫細胞）は、対象に対して自己的である。いくつかの実施形態によれば、骨髄（及び活性化された免疫細胞）は、例えば、患者が骨髄及び／又は免疫細胞の産生及び／又は活性を不足している場合、同種異系である。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、方法はさらに、免疫細胞活性化の必要な対象を同定することを含む。いくつかの実施形態によれば、対象は癌を有する。癌患者における免疫細胞の活性化が、癌に対する免疫応答を開始するのに有用である可能性があると考えられる。さらに、癌細胞抗原の存在下での免疫細胞の活性化が、その腫瘍細胞を標的とする免疫応答を活性化できると考えられる。従って、いくつかの実施形態によれば、その方法は、癌を有するものして対象を同定することを含む。この方法はさらに、骨髄を、癌細胞抗原、例えば対象の癌の腫瘍細胞上に存在する癌細胞抗原と共にインキュベートすることを含む。インキュベーションは、本明細書に記載のような骨髄容器内で行われ得る。いくつかの実施形態によれば、癌細胞抗原は、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドをまた含む組成物により構成される。次に、活性化された免疫細胞は、癌を有する対象に投与され得る。いくつかの実施形態によれば、活性化された免疫細胞は、対象の筋骨格組織に投与される。
【００４１】
いくつかの実施形態の方法においては、非イオン性親水性分岐多糖は、少なくとも２０ ｋＤａ、３０ ｋＤａ、４０ ｋＤａ、５０ ｋＤａ、６０ ｋＤａ、７０ ｋＤＡ、８０ ｋＤａ、９０ ｋＤａ、又は１００ ｋＤａ、例えば列挙された値の任意の２の範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、非イオン性親水性分岐多糖は、ＦＩＣＯＬＬ多糖を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態の方法においては、非イオン性親水性分岐多糖は、１Ｌ当たり１ｇ以下、例えば1 ｇ/Ｌ、０．９９ ｇ/Ｌ、 ０．９ ｇ/Ｌ、 ０．８ ｇ/Ｌ、 ０．７ ｇ/Ｌ、 ０．６ ｇ/Ｌ、 ０．５ ｇ/Ｌ、 ０.４ ｇ/Ｌ、 ０．３ ｇ/Ｌ、 ０．２ ｇ/Ｌ、 ０．１ ｇ/Ｌ、 ０．０５ ｇ/Ｌ、 １０−２ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−５ ｇ/Ｌ、 ２ｘ １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−７ ｇ/Ｌ、 １０−８ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−９ ｇ/Ｌ、 又は１０−９ ｇ/Ｌ未満、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば１０−９ −１０−６ ｇ/ｌ、１０−９−１０−３ ｇ/ｌ、１０-９−１０-２ ｇ/ｌ、１０-９−０．１ ｇ/ｌ、１０-９−０．５ ｇ/ｌ、１０-９ −０．９ ｇ/ｌ、１０-９ −０．０９ ｇ/ｌ、１０-６−１０-３ ｇ/ｌ、１０-６−１０-２ ｇ/ｌ、１０-６- ０．１ ｇ/ｌ、１０-６−０．５ ｇ/ｌ、１０-６ −０．９ ｇ/ｌ、１０-６−０．０９ ｇ/ｌ、１０-３−１０-２ ｇ/ｌ、１０-３−０．１ｇ/ｌ、１０-３−０．５ ｇ/ｌ、１０-３−０．９ ｇ/ｌ、１０-３−０．０９ ｇ/ｌ、０．０１ ｇ/ｌ−０．９９ ｇ/ｌ、０．０１ ｇ/ｌ−０．９ ｇ/ｌ、０．０１ ｇ/ｌ−０．５ ｇ/ｌ、０．０１ ｇ/ｌ −０．２ ｇ/ｌ、０．０１ ｇ/ｌ−０．１ ｇ/ｌ、０．１ ｇ/ｌ−０．９９ ｇ/ｌ、０．１ ｇ/ｌ−０．９ ｇ/ｌ、０．１ ｇ/ｌ−０．５ ｇ/ｌ、０．１ ｇ/ｌ−０．２ ｇ/ｌ、０．５ ｇ/ｌ−０．９９ ｇ/ｌ、０．５ ｇ/ｌ−０．９ ｇ/ｌ及び ０．５ ｇ/ｌ−０．７ ｇ/ｌの密度を有する。
【００４２】
いくつかの実施形態の方法においては、ＴＬＲ２リガンドは、ヒアルロノン、ヒアルロン酸、尿酸一ナトリウム結晶、ビグリカン、エンドプラスミン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒト心臓ミオシン、ザイモサン、リポテイコ酸、血漿由来リポタンパク質、ＬＰＳ、及びＰａｍ２ＣＳＫ４及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含むペプチドグリカン、及び２つ以上の列挙されたアイテムの組合せから成る群から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態の方法においては、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドは、ヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態の方法においては、１Ｌ当たり１ｇ以下の密度での非イオン性親水性分岐多糖を含み、そしてＴＬＲリガンドは、ヒアルロン酸を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは、本明細書に記載のような骨髄容器において行われる。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは、少なくとも０．５時間、１時間、１．５時間、２時間又は３時間、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲の時間、例えば０．５−１、０．５−２、０．５−３、１−２、１ − ３、１．５ − ２、１．５−３又は２−３時間である。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば。前記方法はさらに、本明細書に記載のような分離システム中に骨髄容器を配置することを含む。その方法はさらに、骨髄容器に対して所定の位置にシャフトをスナップすることを含み、従って、骨髄容器の２つの部分を規定する。インキュベーションの後、その方法は、トラックに沿ってシャフトを移動し、従って骨髄容器の内容物を圧縮し、そして骨髄から免疫細胞を押出すことを含む。いくつかの実施形態によれば、免疫細胞は、骨髄容器の出口を通して押出される。次に、押出された免疫細胞は、その必要な対象に投与され得る。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、骨髄と活性化／沈降溶液とを接触し、従って、骨髄から赤血球を沈降させることを含む。活性化／沈降溶液は、本明細書に記載のように、デキストラン及び／又はヘスを含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは、本明細書に記載のような骨髄容器において行われ、そして活性化／沈降溶液は、骨髄容器に入れられた時点で骨髄容器に存在している。いくつかの実施形態によれば、インキュベーションは、本明細書に記載のような骨髄容器において行われ、そして活性化／沈降溶液は、骨髄吸引物と同時に、又は骨髄吸引物が容器に入れられた後、骨髄容器に添加される。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、骨髄の活性化された免疫細胞は、骨髄細胞、例えばＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５４＋顆粒球及び／又はＣＤ６６ｂ＋好中球を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、活性化された免疫細胞は、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５４＋顆粒球を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、活性化された免疫細胞は、ＣＤ６６ｂ＋好中球を含むか、自室的に成るか、又はそれらから成る。いくつかの実施形態によれば、活性化された免疫細胞は、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５４＋顆粒球及びＣＤ６６ｂ＋好中球を含むか、実質的に成るか、又はそれらから成る。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、活性化された免疫細胞を対象に投与する前、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドから活性化された免疫細胞を分離することを含む。いくつかの実施形態によれば、分離は濾過を通してである。いくつかの実施形態によれば、分離は、本明細書に記載のような分離システムを通してである。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、白血球除去療法を含まない。
【００５０】
追加の実施形態：
上記項目に加えて、以下のオプションが示される：
１．以下を含む組成物：
特定密度での非イオン性親水性分岐多糖、ここで前記組成物が全血と接触され、そして遠心分離される場合、前記密度は、赤血球を分離することなく、非イオン性親水性分岐多糖を通しての全血の流体移動を可能にするのに十分であり；
２０ｋＤａ以上の分子量を有する非イオン性親水性分岐多糖；及び
ＴＬＲ２リガンド、
を含む組成物を無菌のその内部に含む骨髄容器。
２．前記非イオン性親水性分岐多糖が、少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する、オプション１の骨髄容器。
３．前記非イオン性親水性分岐多糖が、ポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含む、オプション１又は２の骨髄容器。
４．前記非イオン性親水性分岐多糖が、１Ｌ当たり１ｇ未満、例えば1 ｇ/Ｌ、０．９９ ｇ/Ｌ、 ０．９ ｇ/Ｌ、 ０．８ ｇ/Ｌ、 ０．７ ｇ/Ｌ、 ０．６ ｇ/Ｌ、 ０．５ ｇ/Ｌ、 ０.４ ｇ/Ｌ、 ０．３ ｇ/Ｌ、 ０．２ ｇ/Ｌ、 ０．１ ｇ/Ｌ、 ０．０５ ｇ/Ｌ、 １０−２ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−３ ｇ/Ｌ、 １０−５ ｇ/Ｌ、 ２ｘ １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−６ ｇ/Ｌ、 １０−７ ｇ/Ｌ、 １０−８ ｇ/Ｌ、 ２ ｘ １０−９ ｇ/Ｌ、 又は１０−９ ｇ/Ｌ未満、例えば列挙された値の任意の２つの間の範囲、例えば１０−９ −１０−６ ｇ/Ｌ、１０− ９−１０−３ ｇ/Ｌ、１０−９−１０−２ｇ/Ｌ、１０−９−０．１ ｇ/Ｌ、１０−９−０．５ｇ/Ｌ、１０−９ −０．９ｇ/Ｌ、 １０−９ −０．０９ｇ/Ｌ、１０−６ −１０−３ ｇ/Ｌ、１０−６−１０−２ ｇ/Ｌ、１０−６−０．１ｇ/Ｌ、１０−６−０．５ｇ/Ｌ、１０−６−０．９ｇ/Ｌ、１０−６−０．０９ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−１０−２ ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−０．１ ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６−０．５ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６ −０．９ｇ/Ｌ、２ｘ１０−６  −０．０９ｇ/Ｌ、１０−３−１０−２ ｇ/Ｌ、１０−３−０．１ｇ/Ｌ、１０−３−０．５ｇ/Ｌ、１０−３ −０．９ｇ/Ｌ、１０−３ −０．０９ｇ/Ｌ、０．００２−０．０１ｇ/Ｌ、０．００２−０．１ｇ/Ｌ、０．００２−０．５ｇ/Ｌ、０．００２ −０．９ｇ/Ｌ、０．００２−０．０９ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、 ０．０１ ｇ/Ｌ−０．９ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．５ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ −０．２ｇ/Ｌ、０．０１ｇ/Ｌ−０．１ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ − ０．９ｇ/Ｌ、０．１ ｇ/Ｌ−０．５ｇ/Ｌ、０．１ｇ/Ｌ−０．２ｇ/Ｌ、０．５ｇ/Ｌ−０．９９ｇ/Ｌ、０．５ｇ/Ｌ−０．９ｇ/Ｌ、又は０．５ｇ/Ｌ−０．７ｇ/Ｌの密度を有する、オプション１〜３のいずれかの骨髄容器。
５．前記ＴＬＲ２リガンドが、ヒアルロノン、ヒアルロン酸、尿酸一ナトリウム結晶、ビグリカン、エンドプラスミン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒト心臓ミオシン、ザイモサン、リポテイコ酸、血漿由来リポタンパク質、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びＰａｍ２ＣＳＫ４及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含むペプチドグリカンから成る群から選択される、オプション１〜４のいずれかの骨髄容器。
６．前記非イオン性親水性分岐多糖が、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度でポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含み、そして前記ＴＬＲ２リガンドがヒアルロン酸を含む、オプション１の骨髄容器。
７．前記容器が、バッグ、バキュテナー及び注射器から成る群から選択される、オプション１〜６のいずれかの骨髄容器。
８．一体型送達装置をさらに含む、オプション１〜７のいずれかの骨髄容器。
９．デキストランをさらに含む、オプション１〜８のいずれかの骨髄容器。
１０．前記デキストランが、少なくとも約４％の濃度で存在する、オプション９の骨髄容器。
１１．骨髄を受け入れるよう構成された体積をさらに含み、ここで骨髄がその体積中に存在する場合、骨髄及び組成物中のデキストリンの濃度が少なくとも約１％である、オプション９〜１０のいずれかの骨髄容器。
１２．前記容器が、分離システムにより受け取られるように構成される、オプション９〜１１のいずれかの骨髄容器。
１３．オプション１〜１２のいずれかの骨髄容器を受け入れるように構成された空洞を含むシャーシ、前記シャーシはトラックを含み；及び
トラック上に配置されるシャフト、ここで前記シャフトはトラックに沿って移動するように構成され、それにより、骨髄容器がシャーシ内に配置される場合、骨髄容器を圧縮する、を含む分離システム。
１４．前記シャフトが、シャーシの内面に対して骨髄容器を押し付けるように構成される、オプション１３の分離システム。
１５．前記シャフトが、ローラー及びスライダーから成る群から選択される、オプション１３又は１４の分離システム。
１６．前記シャフトが、シャーシ内配置された骨髄容器に対して所定の位置にスナップするように構成され、それにより、骨髄容器の少なくとも２つの部分を規定する、オプション１３又は１４の分離システム。
１７．オプション１〜１２のいずれかの骨髄容器、及びルアーロックなどの骨髄吸引針を含むキット。
１８．骨髄細胞の直径よりも小さな孔径を有するフィルターをさらに含む、オプション１７のキット。
１９．前記孔径が２００ミクロン未満か又はそれに等しい、オプション１８のキット。
２０．活性化／沈降溶液をさらに含む、オプション１７〜１９のいずれかのキット。
２１．オプション１３〜１６のいずれかの分離システムをさらに含む、オプション１７〜２０のいずれかのキット。
２２．対象の免疫細胞の活性化方法であって、
免疫細胞を含む骨髄を対象から入手し；
前記骨髄を、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドと共にインキュベートし、
ここで前記骨髄が全血と接触され、そして遠心分離される場合、前記密度は、赤血球を分離することなく、非イオン性親水性分岐多糖を通しての全血の流体移動を可能にするのに十分であり、
前記非イオン性親水性分岐多糖が２０ｋＤａ以上の分子量を有し、そして  
前記インキュベーションが、免疫細胞が活性化されるまで行われ；そして
活性化された免疫細胞を対象に投与することを含む方法。
２３．免疫細胞の活性化を必要としている対象を特定することをさらに含む、オプション２２の方法。
２４．前記対象が癌を有する、オプション２３の方法。
２５．前記骨髄を、癌細胞抗原と共にインキュベートすることをさらに含む、オプション２４の方法。
２６．前記非イオン性親水性分岐多糖が、少なくとも７０ｋＤａの分子量を有する、オプション２２〜２５のいずれかの方法。
２７．前記非イオン性親水性分岐多糖が、ポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含む、オプション２２〜２６のいずれかの方法。
２８．前記非イオン性親水性分岐多糖が、ＩＬ当たり１ｇ未満の密度を有する、オプション２２〜２７のいずれかの方法。
２９．前記ＴＬＲ２リガンドが、ヒアルロノン、ヒアルロン酸、尿酸一ナトリウム結晶、ビグリカン、エンドプラスミン、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒト心臓ミオシン、ザイモサン、リポテイコ酸、血漿由来リポタンパク質、リポ多糖（ＬＰＳ）、及びＰａｍ２ＣＳＫ４及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含むペプチドグリカンから成る群から選択される、オプション２２〜２８のいずれかの方法。
３０．前記非イオン性親水性分岐多糖が、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度でポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含み、そして前記ＴＬＲ２リガンドがヒアルロン酸を含む、オプション２２の方法。
３１．前記非イオン性親水性分岐多糖が、１Ｌ当たり１ｇ未満の密度でポリ（ショ糖−ｃｏ−エピクロロヒドリン）を含み、そして前記ＴＬＲ２リガンドがヒアルロン酸を含む、オプション２２〜２８のいずれかの方法。
３２．前記インキュベーションが、オプション１〜１６のいずれかの骨髄容器において行われる、オプション２２〜３１のいずれかの方法。
３３．オプション１７〜２１のいずれかの分離システムに前記骨髄容器を配置し；
シャフトを、骨髄容器に対して所定の位置にスナップし、それにより、骨髄容器の２つの部分を規定し；
前記インキュベーションの後、トラックに沿ってシャフトを動かし、それにより骨髄容器中の内容物を圧縮し、そして骨髄から免疫細胞を押出すことをさらに含む、オプション３２の方法。
３４．前記骨髄細胞を、活性化／沈降溶液と共にインキュベートし、それにより、骨髄から赤血球を沈降させることをさらに含む、オプション２２〜３３のいずれかの方法。
３５．前記活性化された免疫細胞が、骨髄細胞を含む、オプション２２〜３４のいずれかの方法。
３６．前記活性化された免疫細胞が、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ５４＋顆粒球及び／又はＣＤ６６ｂ＋好中球を含む、オプション３５の方法。
３７．活性化された免疫細胞を対象に投与する前、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドから活性化された免疫細胞を分離することをさらに含む、オプション２２〜３６のいずれかの方法。
３８．前記活性化された免疫細胞が、対象の筋骨格組織に投与される、オプション２２〜３７のいずれかの方法。
３９．白血球除去療法を含まない、オプション２２〜３８のいずれかの方法。
４０．前記方法がエクスビボである、オプション２２〜３９のいずれかの方法。
【００５１】
一般的に、従来の分離方法は、ＨＳＣ及びＭＳＣを含む単核細胞画分において富化するためにＲＢＣの異なる物理的特性を利用した。密度介在分離は従来、ＦＩＣＯＬＬ−ＨＩＰＡＱＵＥ多糖類を、１．０以上の密度で使用し、そして物理的分離を行うために遠心力を適用した。これは、ＲＢＣ及び顆粒球の除去により骨髄が減量されるので、再生細胞をより小さく、且つより有用な量で含む単核細胞画分の使用を可能にした。
【００５２】
理論により限定されるものではないが、いくつかの実施形態の非イオン性親水性分岐多糖は、ヒト免疫系の先天性アームを活性化できる細菌細胞壁多糖に類似する機構を用いて骨髄中の再生細胞を活性化できることが企画される。理論により限定されるものではないが、いくつかの実施形態のＴＬＲ２リガンドは、骨髄細胞を活性化することができ、骨髄細胞の活性化はそれらの治療効果を増強できることが企画される。従って、本明細書に記載のような組成物、骨髄容器、キット及び方法に従って非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを用いての免疫細胞の活性化は、自己骨髄細胞による患者の治療の有効性を高めることができると考えられる。
【実施例】
【００５３】
実施例１：
骨髄吸引物のＲＩＣＯＬＬ多糖、及び次のＴＬＲ２リガンド：血漿由来のリポタンパク質、合成ＰＡＭ−３ＣＳＲ４及びリポ多糖（ＬＰＳ）への暴露の後の骨髄樹状細胞活性化のフローサイトメトリー分析。末梢血液（ＰＢ）及び骨髄（ＢＭ）のサンプルを、単一のドナーから入手し、そして全てのサンプルを、高張塩溶液（ＦＡＣＳ溶解溶液、Becton Dickinson）により処理し、赤血球を除去し、その後、無洗浄を用いて染色した。次に、適切な蛍光色素結合モノクローナル抗体を、２％ウシ血清アルブミンと共にＰＢＳ中で、製造先の指示に従って、氷上で３０分間インキュベートし、そしてデータを、５０，０００以上のイベントで即座に収集した。ゲートを、アイソタイプが一致する対照を用いて設定した。ＰＢ対照は、比較的希な成熟樹状細胞に対して陽性対照を提供することに注意して下さい。樹状細胞を、ＴＬＲリガンド及び１／１００（ｖ／ｖ）に希釈されたフィコールへの暴露の後、陰性対照の骨髄細胞と一致した骨髄細胞との間で比較した。
【００５４】
図１Ａ及び図１Ｄ（末梢血液サンプル陽性対照、ＰＢ）、図１Ｂ及び図１Ｅ（ＦＩＣＯＬＬ多糖及びＴＬＲ２アゴニストへの暴露の前の全骨髄陰性対照）、及び図１Ｃ及び図１Ｆ（フィコール及びＴＬＲ２アゴニストへの暴露後の骨髄吸引物単核細胞（ＭＮＣ）。系統陰性、ＣＤ１４陰性、骨髄サイズゲートの古典的樹状細胞（図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃ；白の矢印１、２及び３は、領域１、２及び３における樹状細胞を示す）、及びゲート樹状細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ（成熟のマーカー）発現について活性化された細胞の割合を、陽性及び相対的な蛍光強度の割合により測定することにより活性化について分析した（図１Ｄ、図１Ｅ及び図１Ｆ）。
【００５５】
図１Ｄ（ＰＢ陽性対照）図１Ｅ（ＢＭ陰性対照）白の矢印番号５は、全骨髄陰性対照についての骨髄細胞活性化の対照レベルを示しているが、図１Ｆ矢印６は、１．０ｇ／Ｌ以下でのＴＬＲ−２リガンド及びフィコールへの一晩暴露の後、細胞陽性（１．９対１５．９％）及び相対的平均蛍光強度の割合におけるＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションを示す。図１Ｄの白の矢印４は、ＰＢ対照についての骨髄細胞活性化の対照レベルを示す。
【００５６】
従って、本明細書におけるいくつかの実施形態によれば、免疫細胞が、本明細書におけるいくつかの実施形態による、ＦＩＣＯＬＬ多糖及びＴＬＲリガンドと共に骨髄をインキュベートすることにより活性化されたことが結論付けられ得る。さらに、骨髄前駆細胞からの樹状細胞の成熟は、活性化により高められる。
【００５７】
実施例２：
活性化された骨髄細胞（実施例１のＦＩＣＯＬＬ多糖及びＴＬＲリガンドにより活性化された）のさらなる分析を行った。ゲーティングスキームが、図２Ａ−Ｉに示されている。細胞を、サイズ（図２Ａ−Ｃ）、生存率（シトックスブルー染色）（図２Ｄ−Ｆ）及びシングレット（図２Ｇ−Ｉ）についてゲート制御した。
【００５８】
細胞の表現型の特徴は、活性化された免疫細胞の集団が、未成熟（ＣＤ３３−低、ＣＤ１１ｂ−低）骨髄細胞を含むことを示した（図４Ａ−Ｉ）。ＣＤ６６ｂは好中球により発現され、これは新規のＤＣ集団を示してしる（図４Ａ、４Ｄ、４Ｇを参照のこと）。従って、未熟骨髄細胞、例えば好中球は、本明細書におけるいくつかの実施形態によれば、活性化されたと結論付けられ得る。
【００５９】
実施例３：
患者を吸引し、そして約２５ｍｌの全骨髄を、Terumo BCT SmartPrep骨髄吸引濃縮物（ＢＭＡＣ）、又はBiomet Marrow刺激システムのいずれかにより、それらの製造業者の指示に従って処理する（ただし、本明細書においては、いくつかの実施形態によれば、骨髄処理及び減量のために現在市販されている装置を使用することができる）。次に、得られた骨髄濃縮物を、１００倍濃度の十分な量のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ及びヒアルロン酸を含む無菌の骨髄容器中に注入し、フローサイトメトリー又は遺伝子発現分析によりＣＤ１１ｂ発現を高め、次に、ポイントオブケアで周囲濃度で、少なくとも１０分〜８時間以内、インキュベートする。次に、細胞を、細胞が保持されるよう濾過し、そして活性化部分の濃度を低め、そして次に、活性化された細胞を患者に送達する。同種異系の生物学的組織、人工骨充填剤、脊椎に関連するハードウェア、及び筋骨格組織の再生をサポートするために使用されるステンレス鋼、チタン、ＰＥＥＫ装置などの他の手術を含む医療装置を移植する外科的手順が、本明細書における実施形態の開示された組成物及び方法を用いて処理されていない骨髄濃縮物に比較して、改善され、そして結果が向上される。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、方法、使用又は組成物は、単一の工程又は特徴（複数の工程又は特徴とは対照的に）として存在する種々の工程又は特徴を含む。例えば、いくつかの実施形態によれば、前記方法は、骨髄と、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドとの単一のインキュベーションを含む。非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲリガンドは、免疫細胞、例えば骨髄細胞を活性化するために効果的な量で存在することができる。方法、骨髄容器又はキットは、本明細書に記載のような免疫細胞を活性化するために効果的な単一量の非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含むことができる。複数の特徴又は成分が、代替の実施形態において提供される。
【００６１】
種々の側面及び実施形態が本明細書に開示されているが、他の側面及び実施形態は当業者に明らかであろう。本明細書に開示される種々の側面及び実施形態は、例示を目的とするものであり、そして限定を意図するものではなく、真の範囲及び精神は以下の特許請求の範囲により示される。本明細書に記載される各方法に関しては、その方法に使用するための関連の組成分が明確に企画され、その方法への組成物の使用、及び該当する場合、その方法に使用するための薬剤の製造方法もまた、明確に企画される。例えば、本明細書に記載される免疫細胞を活性化するための方法に関しては、その対応する方法への使用のための、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドを含む組成物（及び骨髄容器）もまた企画される。さらに、患者の治療を含むインビトロ方法、例えば、骨髄吸引物を受け取り、そしてその骨髄吸引物を、非イオン性親水性分岐多糖及びＴＬＲ２リガンドと共にインキュベートし、従って免疫細胞をインビトロで活性化する方法が企画される。当業者は、本明細書に開示されているこの工程及び他の工程、及び方法に関して、その工程及び方法で実行される機能は、異なる順序で実施され得ることを理解するであろう。さらに、概説された工程及び操作は例としてのみ提供され、そしてそれらの工程及び操作のいくつかは任意であり、より少ない工程及び操作に組合されるか、又は開示された実施形態の本質を損なわないで、追加工程及び操作に拡張され得る。
【００６２】
本明細書における実質的に任意の複数形及び／又は単数形の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は用途に適切であるように、複数形から単数形へ、及び／又は単数形から複数形へと翻訳することができる。種々の単数形／複数形の順列を、明確にするために、本明細書に明確に示すことができる。
【００６３】
一般的に、本明細書において、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文で）で使用される用語は、一般的に、「オープン」用語として意図されている（例えば、用語「含む（including）」とは、「含むが、但しそれには限定されていない」、用語「有する」とは「少なくとも有する」、用語「含む（include）」とは、「含むが、但しそれには限定されない」と解釈されるべきであることを当業者により理解されるであろう。特定数の導入されたクレームの記載が意図される場合、そのような意図は、請求項に明確に記載され、そしてそのような記載がない場合、そのよう意図は存在しないことが当業者によりさらに理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の請求項は、請求項の記載を導入するために、導入句「少なくとも１つ」及び「１又は２以上」の使用を含むことができる。しかしながら、そのような句の使用は、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項の記載の導入が、そのような導入された請求項の記載を含む特定の請求項を、そのような記載を１つのみ含む実施形態に制限することを意味すると解釈されるべきではなく、さらに、同じ請求項が導入句「１つ又は２以上」又は「少なくとも１つ」、及び不定冠詞、例えば「ａ」又は「ａｎ」（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」又は「１又は２以上」を意味すると解釈されるべきである）を含む場合でさえ、同様であり；同じことが、請求項の記載を導入するために使用される定冠詞の使用にも当てはまる。さらに、特定数の導入された請求項の記載が明確に記載されている場合でさえ、当業者は、そのような記載が少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであると認識するであろう（例えば、他の修飾子なしの「１つの記載」の裸の記載は、少なくとも２つの記載、又は２つの記載を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ及びＣなどの少なくとも１つ」に類似する規則が使用される場合、一般的に、そのような構成は、当業者が規則を理解すると意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つを有するシステム」とは、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、及び／又はＡ、Ｂ及びＣを一緒に有するシステムに限定されない。「Ａ、Ｂ及びＣなどの少なくとも１つ」に類似する規則が使用される場合、一般的に、そのような構成は、当業者が規則を理解すると意味で意図されている（例えば、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つを有するシステム」とは、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、及び／又はＡ、Ｂ及びＣを一緒に有するシステムに限定されない。２つ以上の代替用語を提示する事実上すべての選言的な単語及び／又は句、本明細書の記載、特許請求の範囲、及び図面のいずれにおいても、用語１つ、用語のいずれか、又は両用語を含む可能性を企画することが理解されるべきであることが、当業者によりさらに理解されるであろう。例えば、句「Ａ又はＢ」とは、「Ａ」、又は「Ｂ」、又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むことが理解されるであろう。
【００６４】
さらに、開示の特徴又は側面がマルクーシュグループに関して記載される場合、当業者は、それにより、開示が、マルクーシュグループの個々のメンバーもサブグループに関しても記載されることを理解するであろう。
【００６５】
当業者により理解されるように、任意の及び全ての目的に関して、例えば書面による記載を提供することに関して、本明細書に開示される全ての範囲はまた、任意の及び全ての可能な副範囲、及びその副範囲の組合せを包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい半分、１／３、１／４、１／５、１／１０などに分割できるように十分に記載しているとして容易に理解され得る。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下１／３、中１／３及び上１／３などに容易に分割され得る。当業者によりまた理解されるように、全ての言語、例えば「まで」、「少なくとも」などは、列挙された数を含み、そして上記のように後で副範囲に分割され得る範囲を指す。例えば、「約５」は、数５を含むであろう。最終的に、当業者により理解されるように、範囲は、個々のメンバーを含む。従って、例えば、１〜３個の細胞を有するグループは、１、２又は３個の細胞を有するグループを指す。用語に、１〜５個の細胞を有するグループは、１、２、３、４又は５個の細胞を有するグループを指す。本明細書で使用されるような「およそ」、「約」及び「実施的に」などの用語が前に付く数字は、列挙された数字（例えば、約１０％＝１０％）を含み、そしてまた、まだ、所望の機能を実行し、所望の結果を達成する、記載された量に近い量を表す。用語「おおよそ」、「約」及び「実質的に」とは、言及された量の１０％未満、５％未満、１％未満及び０．０１％未満内である量を指す。
【００６６】
前述から、本開示の種々の実施形態が例示の目的で本明細書に記載されており、本開示の範囲及び精神から逸脱することなく種々の修正を行うことができることが理解されるであろう。従って、本明細書に開示される種々の実施形態は、限定することを意図するものではなく、真の範囲及び精神は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【国際調査報告】
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