(57)【要約】  EGFR及びPD-L1の両方に同時に結合する二重特異性Fabs-In-Tandem免疫グロブリン(FIT-Ig)結合タンパク質が開示される。そのような二重特異性EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、効率的に発現され、EGFRシグナル伝達の遮断、PD-L1シグナル伝達の遮断、及びがんの処置に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
EGFR及びPD-L1に結合し、第1のポリペプチド鎖、第2のポリペプチド鎖、及び第3のポリペプチド鎖を含むFabs-In-Tandem免疫グロブリン(FIT-Ig)結合タンパク質であって、
第1のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシ末端へとVLEGFR-CL-VHPD-L1-CH1-Fcを含み、VLEGFRが、EGFRに結合する第1の親抗体の抗体軽鎖可変ドメインであり、CLが抗体軽鎖定常ドメインであり、VHPD-L1が、PD-L1に結合する第2の親抗体の抗体重鎖可変ドメインであり、CH1が抗体重鎖の第1の定常ドメインであり、Fcが抗体Fcであり、CLが、VHPD-L1に直接的に融合され、可変及び定常ドメインの間に人工リンカーが挿入されておらず、
VLEGFRが、配列番号1のアミノ酸残基1〜107を含み、
VHPD-L1が、配列番号1のアミノ酸残基215〜331を含み、
第2のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシ末端へとVHEGFR-CH1を含み、VHEGFRが、EGFRに結合する前記第1の親抗体の抗体重鎖可変ドメインであり、CH1が抗体重鎖の第1の定常ドメインであり、VHEGFR及びCH1の間に人工リンカーが挿入されておらず、
VHEGFRが、配列番号2のアミノ酸残基1〜119を含み、
第3のポリペプチド鎖が、アミノ末端からカルボキシ末端へとVLPD-L1-CLを含み、VLPD-L1が、PD-L1に結合する前記第2の親抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが抗体軽鎖定常ドメインであり、VLPD-L1及びCLの間に人工リンカーが挿入されておらず、
VLPD-L1が、配列番号3のアミノ酸残基1〜107を含む、
前記FIT-Ig結合タンパク質。
【請求項２】
結合タンパク質が、前記第1のポリペプチド鎖を2つ、前記第2のポリペプチド鎖を2つ、及び前記第3のポリペプチド鎖を2つ含む6ポリペプチド鎖結合タンパク質であり、前記ポリペプチド鎖が会合して4つのFab結合単位を形成し、Fab結合単位のうち2つがEGFRに結合し、Fab結合単位のうち2つがPD-L1に結合する、請求項1に記載のFIT-Ig結合タンパク質。
【請求項３】
前記第1のポリペプチド鎖中及び前記第3のポリペプチド鎖中の前記抗体CLドメインが、ヒトIgG1抗体に由来する、請求項1又は請求項2に記載のFIT-Ig結合タンパク質。
【請求項４】
前記第1のポリペプチド鎖中及び前記第3のポリペプチド鎖中の前記抗体CLドメインが、配列番号1のアミノ酸残基108〜214を含む、請求項1又は請求項2に記載のFIT-Ig結合タンパク質。
【請求項５】
前記第1のポリペプチド鎖中及び前記第2のポリペプチド鎖中に存在する前記抗体CH1ドメインが、ヒトIgG1抗体に由来する、請求項1又は請求項2に記載のFIT-Ig結合タンパク質。
【請求項６】
前記第1のポリペプチド鎖中及び前記第2のポリペプチド鎖中に存在する前記抗体CH1ドメインが、配列番号1のアミノ酸残基332〜434を含む、請求項1又は請求項2に記載のFIT-Ig結合タンパク質。
【請求項７】
前記第1のポリペプチド鎖中に存在する前記抗体Fcが、ヒトIgG1抗体に由来する、請求項1又は請求項2に記載のFIT-Ig結合タンパク質。
【請求項８】
前記第1のポリペプチド鎖中に存在する前記抗体Fcが、配列番号1のアミノ酸残基435〜661を含む、請求項1又は請求項2に記載のFIT-Ig結合タンパク質。
【請求項９】
前記第1のポリペプチド鎖が、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含み、
前記第2のポリペプチド鎖が、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含み、かつ
前記第3のポリペプチド鎖が、配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む、
請求項1又は請求項2に記載のFIT-Ig結合タンパク質。
【請求項１０】
EGFR及びPD-L1に同時に結合する、請求項1に記載のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質。
【請求項１１】
ヒトグリコシル化パターンを有する、請求項1に記載のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質。
【請求項１２】
請求項1に記載のFIT-Ig結合タンパク質を含む組成物であって、0.1%以下のFIT-Ig結合タンパク質凝集物を含む、前記組成物。
【請求項１３】
請求項1に記載のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
1つ以上の付加的な治療活性を有する化合物を更に含む、請求項13に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記1つ以上の付加的な治療活性を有する化合物が、細胞傷害性の金属含有抗がん化合物、細胞傷害性の放射性同位体に基づく抗がん化合物、抗生物質、抗ウイルス化合物、鎮静薬、刺激薬、局所的麻酔薬、抗炎症性ステロイド、鎮痛薬、抗ヒスタミン薬、非ステロイド性抗炎症薬、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗炎症性ステロイドが、天然抗炎症性ステロイド、合成抗炎症性ステロイド、又はこれらの組合せである、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記鎮痛薬が、アセチルサリチル酸、アセトアミノフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、COX-2阻害剤、モルヒネ、オキシコドン、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記非ステロイド性抗炎症薬が、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、COX-2阻害剤、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項15に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の放出のための組成物であって、結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質、賦形剤成分、及び少なくとも1つのポリマー担体を含む、前記組成物。
【請求項２０】
賦形剤成分が、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
ポリマー担体が、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、乳酸・グリコール酸共重合体又はPLGA、ポリ(b-ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン);ポリ(エチレングリコール)、ポリ((ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸/アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン(glycaminoglycan)、硫酸化多糖、その混合物、並びにそのコポリマーからなる群のうち1つ以上から選択されるポリマーである、請求項19に記載の組成物。
【請求項２２】
配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖、
配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖、及び
配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖
のうち1つ以上をコードする、単離された核酸分子。
【請求項２３】
請求項22に記載の1つ以上の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項２４】
前記ベクターが発現ベクターであり、前記1つ以上の単離された核酸が、コードされた1つ以上のポリペプチド鎖の発現を可能にする転写及び翻訳配列に作動可能に連結されている、請求項23に記載のベクター。
【請求項２５】
pcDNA、pcDNA3.1、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO、及びpBJからなる群から選択される、請求項24に記載のベクター。
【請求項２６】
請求項24に記載の1つ以上のベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項２７】
1つ以上の発現ベクターを含む単離された宿主細胞であって、前記1つ以上のベクターが、請求項1に記載のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を形成する3つのポリペプチド鎖をコードする、単離された宿主細胞。
【請求項２８】
単離された原核生物宿主細胞である、請求項27に記載の単離された宿主細胞。
【請求項２９】
単離された真核生物宿主細胞である、請求項27に記載の単離された宿主細胞。
【請求項３０】
単離された哺乳動物宿主細胞である、請求項29に記載の単離された真核生物宿主細胞。
【請求項３１】
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髄腫細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK293)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞、及びMDCK細胞からなる群から選択される、請求項30に記載の単離された哺乳動物宿主細胞。
【請求項３２】
EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を産生する方法であって、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、請求項30に記載の単離された哺乳動物宿主細胞を培養するステップを含む、前記方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物宿主細胞がHEK293細胞である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記FIT-Ig結合タンパク質が、10mg/Lを超えるレベルで発現される、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
請求項32に記載の方法に従って産生されたEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質。
【請求項３６】
細胞におけるEGFRシグナル伝達を阻害する方法であって、EGFRを発現する細胞を請求項1に記載のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項３７】
細胞におけるPD-L1シグナル伝達を阻害する方法であって、PD-L1を発現する細胞を請求項1に記載のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップを含む、前記方法。
【請求項３８】
ヒト対象におけるがんを処置する方法であって、請求項1に記載のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を対象に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項３９】
前記がんが上皮がんである、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記がんが、黒色腫、腎がん、前立腺がん、膵腺癌、乳がん、結腸がん、肺がん、食道がん、頭頸部扁平細胞癌、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸部がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
前記黒色腫が転移性悪性黒色腫である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記腎がんが腎明細胞癌である、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
前記前立腺がんがホルモン不応性前立腺腺癌である、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
前記肺がんが非小細胞肺がんである、請求項40に記載の方法。
【請求項４５】
がんを処置するための医薬の製造における、請求項1に記載のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の使用。
【請求項４６】
前記がんが上皮がんである、請求項45に記載の使用。
【請求項４７】
前記がんが、黒色腫、腎がん、前立腺がん、膵腺癌、乳がん、結腸がん、肺がん、食道がん、頭頸部扁平細胞癌、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸部がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項45に記載の使用。
【請求項４８】
前記黒色腫が転移性悪性黒色腫である、請求項47に記載の使用。
【請求項４９】
前記腎がんが腎明細胞癌である、請求項47に記載の使用。
【請求項５０】
前記前立腺がんがホルモン不応性前立腺腺癌である、請求項47に記載の使用。
【請求項５１】
前記肺がんが非小細胞肺がんである、請求項47に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮増殖因子受容体(EGFR)及びプログラム死リガンド1(PD-L1)を認識する、新たな操作された二重特異性結合タンパク質に関する。二重特異性結合タンパク質は、がんの処置において有用である。
【背景技術】
【０００２】
プログラム死リガンド1(PD-L1)は、約40キロダルトン(kD)のサイズのI型膜貫通糖タンパク質である。ヒトにおいて、PD-L1は、活性化及びアネルギー性/消耗T細胞、ナイーブ及び活性化B細胞、骨髄樹状細胞(DC)、単球、マスト細胞並びに他の抗原提示細胞(APC)を含む多数の免疫細胞種上に発現される。PD-L1は、膵島、肝臓のクッパー細胞、血管内皮、並びに選択的な上皮、例えば、気道上皮及び腎尿細管上皮を含む非免疫細胞上でも発現され、この場合、その発現は、炎症性エピソード中に増強される。PD-L1発現は、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、肺がん、腎がん(腎細胞癌を含む)、胃がん、膀胱がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、肝細胞がん(HCC)、膵がん及び黒色腫を含むがこれらに限定されない多数の悪性腫瘍上でも増加したレベルで見出される。細胞表面上のPD-L1の発現は、IFN-γ(ガンマインターフェロン)刺激により上方調節されることも示された。
【０００３】
PD-L1(CD274、B7-H1)は、CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1及びBTLAを含む受容体のCD28ファミリーのメンバーであるプログラム細胞死タンパク質1(PD-1、CD279)に結合する。PD-1の発現は、免疫細胞、例えば、T細胞、B細胞、単球及びナチュラルキラー(NK)細胞に高頻度で見出される。PD-L1及び同様にPD-L2(CD273、B7-DC)は両者共に、PD-1に対する細胞表面糖タンパク質リガンドである。PD-L1又はPD-L2へのPD-1の結合は、T細胞活性化及びサイトカイン分泌の阻害をシグナル伝達する。T細胞活性化のこのような下方調節は次いで、T細胞増殖、IL-2分泌、IFN-γ分泌並びに他の増殖因子及びサイトカインの分泌の低減をもたらす。Freeman et al., J. Exp. Med., 192: 1027-1034 (2000); Latchman et al., Nat. Immunol., 2: 261-8 (2001); Carter et al., Eur. J. Immunol., 32: 634-43 (2002); Ohigashi et al., Clin. Cancer Res., 11: 2947-53 (2005)。PD-1/PD-L1相互作用を介したシグナル伝達は、T細胞応答を負に調節することにより、免疫系内で決定的で非冗長性な機能を果たすと考えられる。この調節は、胸腺におけるT細胞発達、慢性炎症性応答の調節並びに末梢性寛容及び免疫特権の両方の維持に関与する。これらの機能の決定的な性質は、自己免疫性表現型を示すPD-1欠損マウスにおいて例証される。C57BL/6マウスにおけるPD-1欠損は、慢性進行性ループス様糸球体腎炎及び関節炎をもたらす。Balb/cマウスにおいて、PD-1欠損は、心臓組織特異的自己反応抗体の存在が原因の重度心筋症を生じる。
【０００４】
PD-L1は、抗原特異的T細胞クローンのアポトーシスを増加させることにより、腫瘍免疫において役割を果たすことが示唆された。Dong et al., Nat. Med., 8:793-800 (2002)。PD-L1が、腸管粘膜炎症に関与し得、PD-L1の阻害が、結腸炎に伴う消耗性疾患を抑制することも示唆された。Kanai et al., J. Immunol., 171: 4156-63 (2003)。一般に、PD-L1シグナル伝達の阻害は、がん(例えば、腫瘍免疫)並びに急性及び慢性(例えば、持続性)感染の両方を含む感染の処置のためにT細胞免疫を増強する手段として提唱された。
【０００５】
抗腫瘍免疫応答の抑制を含む免疫応答の下方調節におけるそれらの関与のために、PD-L1、PD-L2及びPD-1は、「免疫チェックポイント」タンパク質として知られている。Pardoll, Nat. Rev. Cancer, 12: 252-264 (2012)。免疫チェックポイント阻害剤、例えば、PD-1、PD-L1又はCTLA-4を標的とする抗体を使用した臨床研究は有望な結果を生じたが、患者のサブセットのみが現在の阻害剤に初期に応答することが観察されており、増加しつつある臨床根拠は、初期応答者の相当な割合が、数ヶ月後又は数年後に致死的な薬物抵抗性疾患を最終的に再発することを示す。Syn et al., The Lancet Oncology, 18(12): e731-e741 (2017)。
【０００６】
上皮増殖因子受容体(EGFR)は、膜貫通糖タンパク質であり、受容体チロシンキナーゼのErbBスーパーファミリーのメンバーである。EGFRは、上皮がんの発達、生存及び転移を促進する複雑なシグナル伝達カスケードにおいて主要な役割を果たすことが示されてきた。EGFRが、そのコグネートリガンド上皮増殖因子(EGF)に結合し、次いで別のEGFR(ホモ二量体形成)又は別の受容体チロシンキナーゼ(ヘテロ二量体形成)のいずれかと二量体を形成すると、EGFRシグナル伝達が誘発される。その後、二量体は、分解又は細胞核における蓄積のために内部移行され、そこでEGFRは、がん形質転換に関与する様々な遺伝子の転写を調節することができる。よって、EGFRは、抗腫瘍療法のための魅力的な治療標的として認識された。EGFRを標的とする承認された抗がん療法は、ヒト-マウスキメラ抗EGFRモノクローナル抗体であるモノクローナル抗体セツキシマブ、及びヒト抗EGFRモノクローナル抗体であるパニツムマブを含む。EGFR及び他の受容体チロシンキナーゼを阻害する多数の小分子チロシンキナーゼ阻害剤が抗がん療法として承認され、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ及びカネルチニブを含む。これらの承認された薬物は、様々ながんを処置するために、単独で又は様々な組合せにおいて使用されてきた。抗がん療法におけるEGFRの標的化に関する概説についてはSeshacharyulu et al., Expert Opin. Ther. Targets, 16(1): 15-31 (2012)を参照。
【０００７】
PD-L1及びEGFRは、異なるシグナル伝達経路の調節に関与し、その両方が、ヒトの身体におけるがん細胞の開始、成長、維持及び拡散に寄与することが知られている。しかし、一部のがん細胞において、EGFRの活性化は、PD-L1発現を上方調節することが示されており、2つの経路間のある程度の「クロストーク」を示す(Chen et al., J. Thorac. Oncol., 10(6): 910-923 (2015))。これらのタンパク質の両方を阻害して、これらそれぞれの調節機能を遮断する治療法は、種々のがんの処置に有効なアプローチを提供することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、EGFR及びPD-L1の両方に結合する操作された二重特異性タンパク質を提供することにより、上述のニーズに取り組む。特に、本発明は、ヒトEGFR及びヒトPD-L1に結合する二重特異性多価結合タンパク質を提供する。本発明の好まれる二重特異性結合タンパク質は、EGFR及びPD-L1の両方に結合する「Fabs-In-Tandem(タンデムFab)免疫グロブリン」(FIT-Ig)結合タンパク質である。本明細書に示す通り、本発明に係るそのような「EGFR/PD-L1」FIT-Ig結合タンパク質は、哺乳動物細胞培養物において顕著に高い収率で産生され、有意な凝集物形成を示さない。低い産生収率及び顕著な凝集物形成は、EGFR及びPD-L1に対し以前に作製されたFIT-Ig結合タンパク質を、そのような結合タンパク質を治療用抗がん薬として使用することができるか決定するのに必要とされる前臨床及び臨床ステージ評価を行うには非実用的なものとした問題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ある実施形態では、本発明は、EGFR及びPD-L1に結合し、第1のポリペプチド鎖、第2のポリペプチド鎖及び第3のポリペプチド鎖を含むEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質であって、
第1のポリペプチド鎖(「重鎖」)が、アミノ末端からカルボキシ末端へとVLEGFR-CL-VHPD-L1-CH1-Fcを含み、VLEGFRが、EGFRに結合する第1の親抗体の抗体軽鎖可変ドメインであり、CLが抗体軽鎖定常ドメインであり、VHPD-L1が、PD-L1に結合する第2の親抗体の抗体重鎖可変ドメインであり、CH1が抗体重鎖の第1の定常ドメインであり、Fcが抗体Fc領域(ヒンジ-CH2-CH3を含む)であり、CLが、VHPD-L1に直接的に融合され、可変及び定常ドメインの間に人工リンカーが挿入されておらず、
VLEGFRが、配列番号1のアミノ酸残基1〜107を含み、
VHPD-L1が、配列番号1のアミノ酸残基215〜331を含み、
第2のポリペプチド鎖(「第1の軽鎖」)が、アミノ末端からカルボキシ末端へとVHEGFR-CH1を含み、VHEGFRが、EGFRに結合する前記第1の親抗体の抗体重鎖可変ドメインであり、CH1が抗体重鎖の第1の定常ドメインであり、VHEGFR及びCH1の間に人工リンカーが挿入されておらず、
VHEGFRが、配列番号2のアミノ酸残基1〜119を含み、
第3のポリペプチド鎖(「第2の軽鎖」)が、アミノ末端からカルボキシ末端へとVLPD-L1-CLを含み、VLPD-L1が、PD-L1に結合する前記第2の親抗体の軽鎖可変ドメインであり、CLが抗体軽鎖定常ドメインであり、VLPD-L1及びCLの間に人工リンカーが挿入されておらず、
VLPD-L1が、配列番号3のアミノ酸残基1〜107を含む、
EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を提供する。
【００１０】
好まれる実施形態では、上に記載されているEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、上に記載されている第1のポリペプチド鎖を2つ、上に記載されている第2のポリペプチド鎖を2つ及び上に記載されている第3のポリペプチド鎖を2つ含む6ポリペプチド鎖FIT-Ig結合タンパク質であり、ポリペプチド鎖が会合して4つのFab結合単位を形成し、Fab結合単位のうち2つがEGFRに結合し、Fab結合単位のうち2つがPD-L1に結合する。
【００１１】
好ましくは、本発明のFIT-Ig結合タンパク質の1つ以上のポリペプチド鎖、例えば、上に記載されている第1のポリペプチド鎖及び第3のポリペプチド鎖中に存在するCLドメインは、ヒトCLカッパドメイン(hCκ)である。好ましくは、本発明のFIT-Ig結合タンパク質のCLドメインは、ヒトIgG1(hIgG1)抗体に由来する。本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の1つ以上のポリペプチド鎖中に存在する好まれるhIgG1 CLカッパドメインは、配列番号1のアミノ酸残基108〜214を含む。
【００１２】
好ましくは、本発明のFIT-Ig結合タンパク質の1つ以上のポリペプチド鎖、例えば、上に記載されている第1のポリペプチド鎖及び第2のポリペプチド鎖中に存在するCH1ドメインは、ヒトIgG1抗体に由来する。本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の1つ以上のポリペプチド鎖中に存在する好まれるhIgG1 CH1ドメインは、配列番号1のアミノ酸残基332〜434を含む。
【００１３】
好ましくは、本発明のFIT-Ig結合タンパク質の第1のポリペプチド鎖(又は「重鎖」)、例えば上に記載されているものの中に存在するポリペプチド鎖中のFcは、ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む抗体Fc領域を含む。好ましくは、Fcは、ヒトIgG1抗体に由来する。本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の第1のポリペプチド鎖中に存在する好まれるhIgG1 Fc領域は、配列番号1のアミノ酸残基435〜661を含む。
【００１４】
本発明は、また、EGFR及びPD-L1に結合し、
配列番号1に従ったアミノ酸残基の配列を含む第1のポリペプチド鎖、
配列番号2に従ったアミノ酸残基の配列を含む第2のポリペプチド鎖及び
配列番号3に従ったアミノ酸残基の配列を含む第3のポリペプチド鎖
を含むEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質であって、
EGFR/PD-L1 FIT-Igが、EGFRに対するFab結合単位及びPD-L1に対するFab結合単位を含むEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を提供する。
【００１５】
好まれる実施形態では、上に記載されているEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、配列番号1に従ったアミノ酸残基の配列を含む第1のポリペプチド鎖を2つ、配列番号2に従ったアミノ酸残基の配列を含む第2のポリペプチド鎖を2つ及び配列番号3に従ったアミノ酸残基の配列を含む第3のポリペプチド鎖を2つ含む6ポリペプチド鎖FIT-Ig結合タンパク質であり、ポリペプチド鎖が会合して4つのFab結合単位を形成し、Fab結合単位のうち2つがEGFRに結合し、Fab結合単位のうち2つがPD-L1に結合する。
【００１６】
好ましくは、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR及びPD-L1に同時に結合する。別の実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、2つのEGFRタンパク質及び2つのPD-L1タンパク質に結合する。より好まれる実施形態では、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、2つのEGFRタンパク質及び2つのPD-L1タンパク質に同時に結合する。
【００１７】
ある実施形態では、本発明に係るEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR及びPD-L1に結合し、EGFR及びPD-L1に対する親和性は、FIT-Ig結合タンパク質の個々のEGFR及びPD-L1抗原結合部位が由来するそれぞれの親抗体のEGFR及びPD-L1に対する親和性と実質的に同じ(即ち、それと同じ又はその30%以内)である。
【００１８】
ある実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はEGFRに結合し、バイオレイヤー干渉法によって決定された場合に少なくとも1×105M-1秒-1、より好ましくは少なくとも2×105M-1秒-1である、ヒトEGFRに対するオンレート(on-rate)定数(kon)を有する。更なる実施形態では、本発明に係るEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質の抗EGFR特異性の由来元となった親抗体のヒトEGFRに対するkonよりもおよそ40%低い、ヒトEGFRに対するkonを有する。
【００１９】
ある実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はヒトEGFRに結合し、バイオレイヤー干渉法によって決定された場合に1.1×10-4秒-1未満である、ヒトEGFRに対するオフレート(off-rate)定数(koff)を有する。更なる実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の抗EGFR特異性の由来元となった親抗体のヒトEGFRに対するkoffの値よりもおよそ50%低い、ヒトEGFRに対するkoffを有する。
【００２０】
ある実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はヒトEGFRに結合し、バイオレイヤー干渉法によって決定された場合に1×10-9M未満、好ましくは7×10-10M未満、より好ましくは6×10-10M未満、更により好ましくは5×10-10M以下である、ヒトEGFRに対する解離定数(KD)を有する。更なる実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の抗EGFR特異性の由来元となった親抗体のヒトEGFRに対するKDと実質的に同じ(即ち、それと同一又はその25%以内)である、ヒトEGFRに対するKDを有する。
【００２１】
ある実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はPD-L1に結合し、バイオレイヤー干渉法によって決定された場合に少なくとも5×105M-1秒-1、より好ましくは少なくとも7×105M-1秒-1、更により好ましくは少なくとも8×105M-1秒-1である、ヒトPD-L1に対するオンレート定数(kon)を有する。更なる実施形態では、本発明に係るEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質の抗PD-L1特異性の由来元となった親抗体のヒトPD-L1に対するkonと同じ又はそのおよそ90%以内である、ヒトPD-L1に対するkonを有する。
【００２２】
ある実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はヒトPD-L1に結合し、バイオレイヤー干渉法によって決定された場合に2×10-2秒-1未満、より好ましくは1.5×10-2秒-1未満である、ヒトPD-L1に対するオフレート定数(koff)を有する。更なる実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の抗PD-L1特異性の由来元となった親抗体のヒトPD-L1に対するkoffよりもおよそ20%高い、ヒトPD-L1に対するkoffを有する。
【００２３】
ある実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はヒトPD-L1に結合し、バイオレイヤー干渉法によって決定された場合に2×10-8M未満、より好ましくは1.7×10-8M未満である、PD-L1に対する解離定数(KD)を有する。更なる実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の抗PD-L1特異性の由来元となった親抗体のPD-L1に対するKDと実質的に同じ(即ち、それと同一又はその30%以内)である、PD-L1に対するKDを有する。
【００２４】
ある実施形態では、本発明に係るEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、哺乳動物細胞培養物において10mg/Lを超えるレベルで発現される。
【００２５】
完全にアセンブルした6ポリペプチド鎖EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質「単量体」は、プロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して、細胞培養培地から精製することができる。プロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して精製されたEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の溶液又は懸濁液は、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を使用して、可能な凝集物について更に解析することができ、この場合、タンパク質凝集物は、およそ240,000ダルトンの分子量を有する6鎖EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質単量体の分子量を超える分子量を有する分子種として検出される。ある実施形態では、本発明は、プロテインA親和性クロマトグラフィー(好ましくは、カラム)を使用して精製されており、0.1%以下の(≦0.1%)FIT-Igタンパク質凝集物を有する、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を含む組成物(例えば、溶液又は懸濁液)を提供する。
【００２６】
別の実施形態では、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はグリコシル化される。好ましくは、グリコシル化はヒトグリコシル化パターンである。
【００２７】
ある実施形態では、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFRシグナル伝達又はPD-L1シグナル伝達を阻害又は遮断する。好ましくは、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFRシグナル伝達及びPD-L1シグナル伝達の両方を阻害又は遮断する。
【００２８】
ある実施形態では、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、がん細胞の成長又は生存を阻害する。
【００２９】
本発明は、また、上に記載されているEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質のポリペプチド鎖のうち1つ以上をコードする1つ以上の単離された核酸を提供する。
【００３０】
好まれる実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の第1のポリペプチド鎖(重鎖)、第2のポリペプチド鎖(第1の軽鎖)又は第3のポリペプチド鎖(第2の軽鎖)をコードし、
第1のポリペプチド鎖(重鎖)は、配列番号1に従ったアミノ酸配列を含み、
第2のポリペプチド鎖(第1の軽鎖)は、配列番号2に従ったアミノ酸配列を含み、
第3のポリペプチド鎖(第2の軽鎖)は、配列番号3に従ったアミノ酸配列を含む。
【００３１】
ある実施形態では、本発明は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の1つ以上のポリペプチド鎖をコードする上に記載されている1つ以上の単離された核酸分子を含む発現ベクターであって、1つ以上の単離された核酸分子が、発現ベクターと適合性である宿主細胞におけるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の1つ以上のコードされたポリペプチド鎖の発現に要求される適切な転写及び/又は翻訳配列に作動可能に連結された、発現ベクターを提供する。好ましくは、単一の発現ベクターは、本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質の3つのコンポーネントポリペプチド鎖のうち1つのみをコードする単一の核酸を含み、その結果、本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質が産生されるには、3つの別々の発現ベクター(それぞれが、3つのコンポーネントポリペプチドのうち1つのみをコードし発現する)が宿主細胞中に存在しなければならない。
【００３２】
本明細書に記載される核酸のクローニング及び発現に好まれる発現ベクターは、pcDNA、pcDNA3.1、pTT(Durocher et al, Nucleic Acids Res., 30(2e9): 1-9 (2002))、pTT3(付加的な多重クローニング部位を有するpTT)、pEFBOS(Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Res., 18(17): 5322 (1990))、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO及びpBJを含むがこれらに限定されない。
【００３３】
本発明のベクターは、自律的に複製するベクター又は宿主細胞のゲノムに取り込まれ得るベクターであり得る。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、上に記載されている1つ以上のベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。そのような単離された宿主細胞は、単離された原核細胞又は単離された真核細胞であり得る。
【００３５】
本発明のある実施形態では、本明細書に記載される1つ以上のベクターを含む単離された原核生物宿主細胞は、細菌宿主細胞である。細菌宿主細胞は、グラム陽性、グラム陰性又はグラム不定(Gram variable)細菌細胞であり得る。好ましくは、本明細書に記載される1つ以上のベクターを含む細菌宿主細胞は、グラム陰性細菌である。なおより好ましくは、本明細書に記載される1つ以上のベクターを含む細菌宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)細胞である。
【００３６】
本発明のある実施形態では、本明細書に記載される1つ以上のベクターを含む単離された宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。本明細書に記載される1つ以上のベクターを含むことができる単離された真核生物宿主細胞の例は、哺乳動物宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核生物藻類宿主細胞、線虫宿主細胞、原生動物宿主細胞及び魚類宿主細胞を限定することなく含む。
【００３７】
本明細書に記載される1つ以上のベクターを含むことができる単離された真菌宿主細胞は、コウジカビ属(Aspergillus)、アカパンカビ属(Neurospora)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(Pichia)、ハンゼヌラ、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)及びカンジダ属(Candida)からなる群から選択される。好まれる真菌宿主細胞はサッカロミセス属宿主細胞である。より好ましくは、サッカロミセス属宿主細胞は出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞である。本発明に係る宿主細胞として有用な昆虫細胞は昆虫Sf9細胞である。
【００３８】
好まれる実施形態では、本発明に係る宿主細胞は、本明細書に記載される1つ以上の発現ベクターを含む単離された哺乳動物宿主細胞であり、哺乳動物宿主細胞は、1つ以上の発現ベクターにコードされた3つのポリペプチド鎖を発現し、ポリペプチド鎖が会合して、EGFRに結合する2つのFab結合単位及びPD-L1に結合する2つのFab結合単位を含むFIT-Ig結合タンパク質を形成する。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髄腫細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK293)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞及びMDCK細胞からなる群から選択される哺乳動物宿主細胞が特に好まれる。
【００３９】
より好ましくは、本発明に係る単離された哺乳動物宿主細胞は、3つの発現ベクターを含み、各発現ベクターは、本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質の3つのコンポーネントポリペプチド鎖のうち1つをコードし発現し、3つの発現されたポリペプチド鎖が会合して、EGFRに結合する2つのFab結合単位及びPD-L1に結合する2つのFab結合単位を含むFIT-Ig結合タンパク質を形成する。
【００４０】
本発明は、また、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を産生する方法であって、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、本明細書に記載される1つ以上の発現ベクターを含む単離された宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。
【００４１】
本発明の別の態様は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、本明細書に記載される1つ以上の発現ベクターを含む単離された宿主細胞を培養するステップを含む方法によって産生されたEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質である。
【００４２】
本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、例えば、他のコンジュゲート抗体と同様の様式で、一方又は両方の第1の(重)ポリペプチド鎖のFc領域のCH3ドメインに沿って又はそのカルボキシ末端において、別の化合物にコンジュゲートすることができる。EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質にコンジュゲートされ得るそのような化合物は、造影剤及び治療剤を含むがこれらに限定されない。EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質にコンジュゲートされ得る好まれる造影剤は、放射標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、ビオチン、ストレプトアビジン及びアビジンを限定することなく含む。本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質にコンジュゲートされ得る放射標識は、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、131I、177Lu、166Ho及び153Smを含むがこれらに限定されない。本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質にコンジュゲートされ得る好まれる治療用化合物は、抗生物質、抗ウイルス剤、小分子受容体チロシンキナーゼ阻害剤及びサイトカインを含むがこれらに限定されない。
【００４３】
別の実施形態では、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、非結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質のEGFR及びPD-L1に対する結合親和性を保持する結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質であり得る。そのような結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、個体に投与された場合にEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の無担体制御放出を提供することもできる。本発明の結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、非結晶化形態と比較して、個体に投与された場合により大きいin vivo半減期を示すこともできる。本発明の結晶化結合タンパク質は、当技術分野で知られており、参照により本明細書に組み込む国際公開番号WO02/072636(Shenoy et al.)に開示されている方法に従って産生することができる。
【００４４】
本発明のある実施形態は、結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の放出のための組成物であって、本明細書に記載される結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質、賦形剤成分及び少なくとも1つのポリマー担体を含む組成物を提供する。好ましくは、賦形剤成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される。好ましくは、ポリマー担体は、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、乳酸・グリコール酸共重合体又はPLGA、ポリ(b-ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン(dioxanone));ポリ(エチレングリコール)、ポリ((ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸/アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン(glycaminoglycan)、硫酸化多糖、その混合物、並びにそのコポリマーからなる群のうち1つ以上から選択されるポリマーである。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質、並びに1つ以上の薬学的に許容されるコンポーネント、例えば、薬学的に許容される担体(ビヒクル、バッファー)、薬学的に許容される賦形剤及び/又は他の薬学的に許容される成分を含む。
【００４６】
本発明の医薬組成物において有用な好まれる薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、等張剤を更に含むことができる。本発明の医薬組成物において有用な好まれる等張剤は、糖、多価アルコール(例えば、マンニトール又はソルビトール)、塩化ナトリウム及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【００４８】
本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質を含む医薬組成物は、1つ以上の他の治療活性がある化合物(治療剤)を更に含むことができる。本発明の医薬組成物に取り込まれ得るそのような追加の治療剤の例は、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質とは異なる抗がん剤(例えば、細胞傷害性金属含有抗がん化合物又は細胞傷害性放射性同位体に基づく抗がん化合物及びこれらの組合せ)、抗生物質、抗ウイルス化合物、鎮静薬、刺激薬、局所的麻酔薬、抗炎症性ステロイド(例えば、天然又は合成抗炎症性ステロイド及びこれらの組合せ)、鎮痛薬(例えば、アセチルサリチル酸、アセトアミノフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、COX-2阻害剤、モルヒネ、オキシコドン及びこれらの組合せ)、抗ヒスタミン薬、非ステロイド性抗炎症薬(「NSAID」、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、COX-2阻害剤及びこれらの組合せ)及びこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【００４９】
別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質、薬学的に許容される担体及びアジュバントを含み、アジュバントは、患者の免疫系の全般的な刺激を提供する。
【００５０】
ある実施形態では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５１】
本発明は、また、細胞におけるEGFRシグナル伝達を阻害又は遮断する方法であって、EGFRを発現する細胞を、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、細胞におけるPD-L1シグナル伝達を阻害又は遮断する方法であって、PD-L1を発現する細胞を、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００５３】
ある実施形態では、本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００５４】
別の実施形態では、本発明は、がん患者におけるがんを処置する方法であって、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質が、対象に投与され、がんが、免疫療法に対して典型的に応答性であるがんである、方法を提供する。別の実施形態では、がんは、免疫療法と関連付けられたことがないがんである。別の実施形態では、がんは、不応性又は再発性悪性病変であるがんである。
【００５５】
好ましくは、本発明に係る方法を使用して処置されるがんは、上皮がんである。
【００５６】
別の実施形態では、本発明に係る方法を使用して処置されるがんは、黒色腫(例えば、転移性悪性黒色腫)、腎がん(例えば、淡明細胞型腎細胞癌、「CCRCC」)、前立腺がん(例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌)、膵腺癌、乳がん、結腸がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん)、食道がん、頭頸部扁平細胞癌、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸部がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫及び他の新生物悪性病変からなる群から選択される。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は、EGFR及び/又はPD-L1活性が有害となる疾患を患うヒト対象を処置する方法であって、対象におけるPD-L1/PD1結合及び/又はEGFR/EGF結合によって媒介される活性が低減又は遮断されるように、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を対象に投与するステップを含むそのような方法を提供する。
【００５８】
ある実施形態では、本発明は、試料におけるEGFR及び/又はPD-L1を検出する方法であって、試料が、EGFR若しくはPD-L1又はEGFR若しくはPD-L1を発現する細胞を含有する又はこれを含有すると疑われ、試料が、本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質と接触させられる、方法を提供する。例えば、抗EGFR抗体又は抗PD-L1抗体の代わりにFIT-Ig結合タンパク質が使用された従来のイムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は組織の免疫組織化学的検査において、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を使用して、EGFR若しくはPD-L1又はその両方を検出することができる。本発明は、生体試料におけるEGFR又はPD-L1を検出する方法であって、生体試料を本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップ、及び標的抗原(EGFR又はPD-L1)への結合が起こるか検出し、これにより生体試料における標的の存在又は非存在を検出するステップを含む方法を提供する。FIT-Ig結合タンパク質は、検出可能な物質で直接的に又は間接的に標識して、結合した又は結合していないFIT-Ig結合タンパク質の検出を容易にすることができる。適した検出可能な物質は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料及び放射性材料を含む。適した酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含み;適した補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを含み;適した蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン(dichlorotriazinylamine)フルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンを含み;発光材料の例は、ルミノールを含み;適した放射性材料の例は、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho又は153Smを含む。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】実施例1に記載されるFIT-Ig結合タンパク質の各々の3タイプのポリペプチド鎖を発現させるために使用される3つの発現ベクターを構築するための一般手順を図示す図である。  図1に図示する通り、FIT-Ig結合タンパク質の第1のポリペプチド鎖(「重鎖」)を発現させるために、第1のポリペプチド鎖のVLA-CL-VHBセグメントをコードするDNA分子を合成した(「DNA合成」)。DNA分子は、挿入されるDNA分子が、ベクターの強力なサイトメガロウイルス(CMV)-エンハンサープロモーターの下流で、アミノ末端シグナルペプチド(SP)をコードするDNAセグメントの下流かつそれとインフレームに、天然に連続したヒンジ-CH2-CH3ドメイン(「h-CH2-CH3」と称する)を含む抗体Fc領域に連結される抗体CH1ドメインをコードする挿入されたDNA分子の上流かつそれとインフレームに配置されるように、pcDNA3.1発現ベクターの多重クローニング部位(MCS)に次に挿入した(「挿入」)。  図1に図示する通り、FIT-Ig結合タンパク質の第2のポリペプチド鎖(「軽鎖#1」)を発現させるために、抗体VHAドメインをコードするDNAセグメントを合成し、それは、挿入されるDNA分子が、ベクターの強力なCMV-エンハンサープロモーターの下流で、アミノ末端シグナルペプチド(SP)をコードするDNAセグメントの下流かつそれとインフレームに、抗体CH1ドメインをコードする挿入されたDNA分子の上流かつそれとインフレームに配置されるように、pcDNA3.1発現ベクターの多重クローニング部位(MCS)に次に挿入した。  第3のポリペプチド鎖(「軽鎖#2」)を発現させるために、抗体VLBドメインをコードするDNAセグメントを合成し、それは、挿入されるDNA分子が、ベクターの強力なCMV-エンハンサープロモーターの下流で、アミノ末端シグナルペプチド(SP)をコードするDNAセグメントの下流かつそれとインフレームに、抗体CLドメインをコードする挿入されたDNA分子の上流かつそれとインフレームに配置されるように、pcDNA3.1発現ベクターの多重クローニング部位(MCS)に次に挿入した。  さらなる詳細については実施例1を参照。
【図２】プロテインA親和性クロマトグラフィーによって以前に精製されたFIT-Ig1の試料の、サイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す図である。溶出プロファイルは複雑であり、FIT-Ig1凝集体のかなりの割合を示す。FIT-Ig1の6鎖単量体は、精製されたタンパク質の30%未満を構成した。詳細については実施例1.7を参照。
【図３】プロテインA親和性クロマトグラフィーによって以前に精製されたFIT-Ig2の試料の、サイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す図である。溶出プロファイルは、FIT-Ig2の6鎖単量体の主ピーク及び凝集体を表すいくつかのピークを示す。プロファイル下の表は、いくつかのピークの分析の結果を提供する。FIT-Ig2の6鎖単量体は、精製されたタンパク質の75%未満を構成した。詳細については実施例1.7を参照。
【図４】プロテインA親和性クロマトグラフィーによって以前に精製されたFIT-Ig3の試料の、サイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す図である。溶出プロファイルは複雑であり、凝集体のかなりの割合を示す。FIT-Ig3の6鎖単量体は、精製されたタンパク質の40%未満を構成した。詳細については実施例1.7を参照。
【図５】プロテインA親和性クロマトグラフィーによって以前に精製されたFIT-Ig4の試料の、サイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す図である。溶出プロファイルは、FIT-Ig4の6鎖単量体の主ピーク及び低い割合の凝集体を表すいくつかのピークを示す。プロファイル下の表は、いくつかのピークの分析の結果を提供する。FIT-Ig4の6鎖単量体は、精製されたタンパク質の概ね91%未満を構成した。詳細については実施例1.7を参照。
【図６】プロテインA親和性クロマトグラフィーによって以前に精製されたFIT-Ig5の試料の、サイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す図である。溶出プロファイルは、FIT-Ig5の6鎖単量体の主ピーク及び非常に低い割合の凝集体を表すマイナーピークを示す。プロファイル下の表は、いくつかのピークの分析の結果を提供する。FIT-Ig5の6鎖単量体は、精製されたタンパク質の98%より多くを構成した。詳細については実施例1.7を参照。
【図７】プロテインA親和性クロマトグラフィーによって以前に精製されたFIT-Ig6の試料の、サイズ排除クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す図である。溶出プロファイルは、FIT-Ig6の6鎖単量体の主ピーク、及び、あるとしても例外的に低い凝集体の存在を示し得る、かろうじて検出可能なピークを示す。プロファイル下の表は、いくつかのピークの分析の結果を提供する。FIT-Ig6の6鎖単量体は、驚異的なことに、精製されたタンパク質の99.9%を構成した。詳細については実施例1.7を参照。
【図８】3匹の雄Sprague-DawleyラットにおけるFIT-Ig6の経時的な血清中濃度のグラフを示す図である。FIT-Ig6は、体重1kg当たり5mgの静脈内用量として各ラットに投与した。詳細については実施例3を参照。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
Fabs-In-Tandem免疫グロブリン(「FIT-Ig」)結合タンパク質フォーマットは、異なる標的抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープの多種多様な対に向けられた二重特異性、多価結合性タンパク質を提供することに高度に適応性があることが示されている。例えば、国際公開番号WO2015/103072 A1及びWO2017/136820 A2を参照。好ましいフォーマットでは、FIT-Ig結合タンパク質は4つのFab結合単位(天然のIgG抗体の場合のように2つの代わりに)を含み、ここで、Fab単位のうちの2つの各々は第1の抗原(又は、エピトープ)に結合し、他の2つのFab単位の各々は第2の抗原(又は、エピトープ)に結合する。治療関連の標的抗原の対に結合する二重特異性結合タンパク質の多様な集団を生成するためのFIT-Igフォーマットの使用での成功にもかかわらず、PD-L1及びEGFRに結合するFIT-Ig結合タンパク質は、以前には、候補抗がん治療薬として普通の前臨床ステージ評価を実行するのに適する量及び質で生成されていない。例えば、本明細書に示されるように、PD-L1及びEGFRに結合するいくつかのFIT-Ig結合タンパク質は、標準の哺乳動物細胞培養では、例えば、標準化学、製造及び対照(「CMC」)ステージ評価を含む前臨床評価を支えるのに必要とされるタンパク質の十分な量を提供するのに十分に高いレベル、即ち、10mg/Lを超えるレベルで発現されない。別の問題点は、PD-L1及びEGFRに結合する以前に生成されたFIT-Ig結合タンパク質がかなりの量の凝集体形成を示したということであり、それは、薬物開発のために必要とされる機能的な6ポリペプチド鎖、EGFR及びPD-L1結合タンパク質「単量体」の量をかなり低減させる。プロテインA親和性クロマトグラフィーから溶出したFIT-Ig結合タンパク質の画分で、FIT-Ig凝集体の許容されないレベルが明白になった。コスト分析は、従来のFIT-Ig結合タンパク質構築物のいずれも、前臨床ステージ抗がん評価を可能にするのに十分な量及び質で得られないことを明らかにした。
【００６１】
本発明は、治療的抗がん薬としての、前臨床及び臨床評価を可能にするような、哺乳動物細胞培養で十分に高いレベルで、及び有意なレベルの凝集体形成なしで発現される、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の知見に基づく。
【００６２】
本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質は、2つ以上の抗原結合部位を含み、一般的に四価の(4つの抗原結合部位)タンパク質である。本発明による好ましいFIT-Ig結合タンパク質は、EGFR及びPD-L1の両方に結合し、したがって、二重特異性である。図式的に、FIT-Ig結合タンパク質では、各々一般構造「V-C-V-C-Fc」を有し、ここで「V」は抗体可変ドメインでありCは抗体定常ドメインである2つの第1の(重)ポリペプチド鎖、及び、各々一般構造「V-C」を有する4つの「軽」ポリペプチド鎖は、会合して4つのFab結合単位を提示する六量体を形成する(VL-CLと対合したVH-CH1、VH-CH1::VL-CLと表記される場合もある)。各Fab結合単位は、抗原結合部位につき合計6つのCDRを有する、重鎖可変(VH)ドメイン及び軽鎖可変(VL)ドメインを含む抗原結合部位を含む。したがって、FIT-Ig結合タンパク質の各半分は、ポリペプチド重鎖及び2つのポリペプチド軽鎖を含み、三本鎖のVH-CH1及びVL-CLエレメントの相補的な免疫グロブリン対形成は、タンデムに配置される2つのFab結合単位をもたらす。本発明では、Fab結合単位の免疫グロブリンドメインは、人工ドメイン間リンカーを使用せずに重鎖ポリペプチドに直接的に融合される。即ち、ポリペプチド重鎖の各々のN末端V-Cエレメントは、そのC末端で別のV-CエレメントのN末端に直接的に融合され、それは次にC末端の抗体Fc領域に連結される。二重特異性FIT-Ig結合タンパク質では、タンデムなFab結合単位は、異なる抗原と反応性になる。
【００６３】
FIT-Ig結合タンパク質の設計、発現及び特徴付けの記載は、国際公開番号WO2015/103072に提供されている。本明細書に記載されるそのようなFIT-Ig分子の好ましい例は、ポリペプチド重鎖及び2つの異なるポリペプチド軽鎖を含む。重鎖は、構造式VLA-CL-VHB-CH1-Fcを含み、ここで、CLはVHB又はVHB-CH1-VLA-CL-Fcに直接的に融合され、CH1はVLAに直接的に融合され、ここで、VLAは抗原Aに結合する親抗体に由来する可変軽鎖ドメインであり、VHBは抗原Bに結合する親抗体に由来する可変重鎖ドメインであり、CLは、ヒトIgG1軽鎖カッパ定常ドメインであり、CH1は、第1のヒトIgG1抗体重鎖定常ドメインであり、Fcは、免疫グロブリンFc領域(例えば、ヒトIgG1抗体の重鎖のC末端のヒンジ-CH2-CH3部分)である。FIT-Igの2つのポリペプチド軽鎖は、式VHA-CH1及びVLB-CLをそれぞれ有する。二重特異性FIT-Igの実施形態では、抗原A及び抗原Bは、異なる抗原、又は同じ抗原の異なるエピトープである。本発明では、A及びBの1つはヒトEGFRであり、他方はヒトPD-L1である。最も好ましくは、本発明では、AはヒトEGFRであり、BはヒトPD-L1である。
【００６４】
上記のスキームを使用して、FIT-Ig結合タンパク質の各ポリペプチド鎖の各Vドメインは、その由来元となった抗原結合部位の抗原(又は、エピトープ)特異性で命名することができる。例えば、この「抗原特異性」命名スキームを使用して、実施例1.6及び表6に記載されるFIT-Ig6結合タンパク質の第1のポリペプチド鎖(ポリペプチド鎖#1)の構造は、「VLEGFR-CL-VHPD-L1-CH1-Fc」と命名することができ、ここで、「VLEGFR」は、VLドメインが抗EGFR親抗体のEGFR特異的抗原結合部位に由来することを示し、「VHPD-L1」は、VHドメインが抗PD-L1親抗体のPD-L1特異的抗原結合部位に由来することを示す。FIT-Ig6の第2のポリペプチド鎖(ポリペプチド鎖#2)の構造は、「VHEGFR-CH1」と命名することができ、ここで、VHEGFRは、VHドメインが抗EGFR親抗体のEGFR特異的抗原結合部位に由来することを示す。同様に、FIT-Ig6の第3のポリペプチド鎖(ポリペプチド鎖#3)は、「VLPD-L1-CL」と命名することができ、ここで、「VLPD-L1」は、VLドメインが抗PD-L1親抗体のPD-L1特異的抗原結合部位に由来することを示す。したがって、この抗原特異性命名スキームは、特定の抗原結合特異性が、FIT-Ig結合タンパク質の対応する外側又は内側のFab結合単位に位置するかどうかを示す。
【００６５】
代わりの命名スキームでは、抗原結合部位の個々の可変ドメイン(例えば、VLEGFR、VHEGFR、VLPD-L1、VHPD-L1)の抗原特異性を命名する代わりに、ドメインの供与源としての役目をした親抗体の略名が、親抗体の抗原結合部位のそれぞれのVL及びVHドメインの下付き文字として命名される。例えば、後述の実施例1.6及び表6に記載される本発明のFIT-Ig6結合タンパク質に再び言及すると、第1のポリペプチド鎖(ポリペプチド鎖#1)の構造は、VLpani-CL-VH3G10-CH1-Fcと命名することができ、ここで、「VLpani」は、VLドメインが抗EGFRモノクローナル抗体パニツムマブに由来することを示し、「VH3G10」は、VHドメインが抗PD-L1モノクローナル抗体3G10に由来することを示す。FIT-Ig6の第2のポリペプチド鎖(ポリペプチド鎖#2)の構造は、「VHpani-CH1」と命名することができ、ここで、「VHpani」は、VHドメインがパニツムマブに由来することを示す。同様に、FIT-Ig6の第3のポリペプチド鎖(ポリペプチド鎖#3)は、「VL3G10-CL」と命名することができ、ここで、「VL3G10」は、VLドメインがモノクローナル抗体3G10に由来することを示す。したがって、この代わりの命名スキームは、FIT-Ig結合タンパク質の外側及び内側のFab結合単位の抗原結合特異性の供与源を示す。この供与源命名スキームは、同じ2つの抗原(又は、エピトープ)に結合するが、抗原結合特異性の供与源として使用される一方又は両方の親抗体が異なる、複数のFIT-Ig結合タンパク質の特性を比較しようとするときに特に有用である。後述の実施例を参照。
【００６６】
上記のポリペプチド重鎖及び2つの異なるポリペプチド軽鎖の各々の会合は、各々一般的な抗体VH::VL抗原結合部位を含有する、2つの完全なFab結合単位を形成する。天然のIgG抗体と同様に、重鎖の上のFc領域は別の重鎖上のFc領域と会合してホモダイマーを形成し、それによって、6ポリペプチド鎖及び4つのFab結合単位を含むFIT-Ig結合タンパク質を提供する。FIT-Ig結合タンパク質の各アームは、アミノ末端又は「外側の」Fab結合単位及びカルボキシ近位又は「内側の」Fab結合単位を有する。本明細書で採用されるFIT-Ig命名法では、特定の二重特異性FIT-Ig結合タンパク質は、先ず外側のFab結合単位の抗原特異性、及び次に内側のFab結合単位の抗原特異性を示す接頭辞で命名することができる。したがって、「EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質」は、EGFRに結合する2つの外側のFab結合単位及びPD-L1に結合する2つの内側のFab結合単位を有するFIT-Ig結合タンパク質を指す。
【００６７】
一般に、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、腫瘍学、遺伝学並びに生化学に関連して使用される命名法及び技術は、周知であって当技術分野で一般的に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、別途断りがない限り、当技術分野で周知である従来の方法によって、並びに本明細書全体で引用され、議論される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されている通りに一般的に実行される。当技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように、酵素反応及び精製技術は製造業者の仕様書によって実行される。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学並びに医薬及び製薬化学に関連して使用される命名法、並びにその検査法及び技術は、周知であり、当技術分野で一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、送達及び患者の処置のために、標準の技術が使用される。
【００６８】
本発明をより容易に理解できるように、選び出した用語を下で定義する。
【００６９】
「腫瘍」は、組織の異常な塊である。
【００７０】
「良性」腫瘍は、ゆっくりと増殖し、近くの組織に浸潤し、その元の部位を越えて広がる能力をそれが有しないという点で自己限定的である、組織の異常な塊である。良性腫瘍は、がんでない。
【００７１】
用語「がん」は、医学及び腫瘍学の分野で公知である意味を有し、National Cancer Institute (「NCI」、National Institutes of Health、Bethesda、Maryland、United States of Americaの部門)による定義を含む。したがって、NCIによると、用語「がん」は、異常な細胞が制御されずに分裂し、近くの組織を浸潤して損傷又は破壊し得る疾患のための用語である。がん細胞は、一次腫瘍を脱却して、血液及び/又はリンパ系を通して体の他の部分に広がり(転移し)、「転移性腫瘍」又は「転移がん」とも呼ばれる「二次腫瘍」を確立することもできる。したがって、用語「がん」は、その細胞が制御されずに増殖し、隣接組織に侵入して損傷又は破壊することができ、循環を通して体の離れた部分に転移して新しい腫瘍を形成することができる悪性腫瘍を指す。
【００７２】
「抗がん」化合物又は薬物は、がん細胞の増殖をブロック、阻害又は停止させるものである。好ましい抗がん化合物は、がん細胞に細胞傷害性である。
【００７３】
区別されない限り、用語「静脈内の」(又は、「静脈内に」)及び「全身性の」(又は、「全身的に」)は、本発明の化合物又は組成物をがん患者の循環系に導入するための経路に関して互換的に使用される。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「処置（治療）」及び「処置（治療）すること」は、がんの1つ以上の症状又は徴候を緩和する、がんの進行を阻害する、がんの進行を停止若しくは好転させる、二次(転移)がんの発症を予防する、転移がん細胞のかなりの殺滅を提供する、一次若しくは二次(転移)がん腫瘍のサイズを減少させる、ある期間にわたって1つ以上の二次(転移)腫瘍の寛解を増加させる、一次若しくは二次(転移)腫瘍の進行速度を低下させる、ある期間にわたって二次(転移)腫瘍の数を減少させる、ある期間にわたって新しい二次(転移)腫瘍の数を減少させる、がん患者で器官若しくは組織の機能を増加させる、がん患者の活力を増加させる、患者の寿命を延長する任意のレジメン、又はその組合せを一般的に指す。
【００７５】
「転移」は、腫瘍学又は医学の分野の当業者に知られ、使用されるのと同じ意味を有し、がん細胞が一次腫瘍から患者の体の別の位置に広がる過程を指す。「転移性」がん細胞は、一次腫瘍を脱却したか、さもなければそれから分離し、通常血液又はリンパ液を通して一次腫瘍から患者の体の別の位置に移動する過程にあるか又は既に移動したがん細胞である。この場合には、がん又はその細胞は、「転移した」と言われる。したがって、「転移性」腫瘍は、転移がん細胞が一次腫瘍から患者の体の異なる位置に移動し、そこで、一次腫瘍と同じ種類の腫瘍である別の(「二次」、「転移」)腫瘍をがん細胞が確立した結果として生じた腫瘍である。例えば、肝臓の転移性腸腫瘍は、一次腸腫瘍から転移し、血液を通して肝臓に移動し、そこで、がん細胞が二次(転移)腸腫瘍を次に確立した腸がん細胞によって開始され、構成される。転移性腫瘍は、他の組織及び器官に移動して更なる転移性腫瘍を確立することができる、転移がん細胞の更なる供与源であることができることも理解される。
【００７６】
別途断りがない限り、用語「約」及び「概ね（およそ）」が量、数又は値と一緒に使用される場合、その組合せは、記載される量、数、整数又は値だけを、並びにその量、数又は値の5%をプラス又はマイナスしたその量、数又は値を記載する。例として、語句「約40」及び「概ね40」は、「40」及び「38及び40を含む、38から42」の両方を開示する。
【００７７】
用語「ポリペプチド」は、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。用語「ペプチド」及び「タンパク質」は用語ポリペプチドと互換的に使用され、アミノ酸のポリマー鎖もまた指す。用語「ポリペプチド」は、天然又は人工のタンパク質、タンパク質断片及びタンパク質アミノ酸配列のポリペプチド類似体を包含する。文脈によって否定されない限り、用語「ポリペプチド」は、その断片及び変異体(変異体の断片を含む)を包含する。抗原性ポリペプチドの場合、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの少なくとも1つの連続した又は非線状のエピトープを任意選択で含有する。少なくとも1つのエピトープ断片の正確な境界は、当分野で通常の技術を使用して確認することができる。断片は、少なくとも約5つの連続したアミノ酸、例えば少なくとも約8つの連続したアミノ酸、少なくとも約10の連続したアミノ酸、少なくとも約15の連続したアミノ酸又は少なくとも約20の連続したアミノ酸を含む。
【００７８】
用語「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」は、その導出の起源又は供与源のために、その天然の状態でそれに付随する天然に会合している成分に会合していないか、同じ種に由来する他のタンパク質を実質的に含有しないか、異なる種に由来する細胞によって発現されるか、又は天然に存在しないタンパク質又はポリペプチドである。したがって、化学合成されるか、又はそれが天然に由来する細胞と異なる細胞システムで合成されるポリペプチドは、その天然に会合している成分から「単離されている」。1つ以上のポリペプチド鎖からなるタンパク質は、当技術分野で周知であるタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然に会合している成分を実質的に含有しないようにすることもできる。
【００７９】
用語「回復（回収）する」は、ポリペプチドなどの化学種を、例えば当技術分野で周知であるタンパク質精製技術を使用して、単離によって天然に会合している成分を実質的に含有しないようにするプロセスを指す。
【００８０】
PD-L1又はEGFRの「生物活性」という用語は、それぞれPD-L1又はEGFRの任意の又は全ての固有の生物学的特性を指す。
【００８１】
抗体、結合タンパク質又はペプチドの第2の化学種との相互作用に関する用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、その相互作用が第2の化学種上の特定の構造(例えば、抗原決定基又はエピトープ)の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、タンパク質一般というより特異的タンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、標識された「A」及び抗体を含有する反応でのエピトープA(又は、遊離の非標識のA)を含有する分子の存在は、抗体に結合する標識されたAの量を低減する。本明細書に記載される二重特異性FIT-Ig結合タンパク質は、EGFRに特異的に結合する2つのFab結合単位及びPD-L1に特異的に結合する2つのFab結合単位を含む。
【００８２】
用語「抗体」は、4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖で構成される任意の免疫グロブリン(Ig)分子、又は、Ig分子の必須のエピトープ結合特性を保持するその任意の機能的断片、突然変異体、変異体若しくは誘導体を広く指す。そのような突然変異体、変異体又は誘導体の抗体フォーマットは、当技術分野で公知である。その非限定的な実施形態は、以下で議論される。
【００８３】
完全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書でVHと略す)及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書でVLと略す)及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLで構成される。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存されている領域が間に散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化することができる。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される、3つのCDR及び4つのFRで構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VHドメインの第1、第2及び第3のCDRは、CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3として一般的に列挙される。同様に、VLドメインの第1、第2及び第3のCDRは、CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3として一般的に列挙される。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスであってよい。
【００８４】
一般に、用語「Fc領域」又は単に「Fc」は、抗体重鎖のC末端領域を指し、それはインタクトな抗体のパパイン消化によって生成することができる。Fc領域は、天然配列Fc領域又は変異型Fc領域であってよい。Fc領域は、一般的に2つの定常ドメイン、即ち、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含み、任意選択で、例えばIgM及びIgE抗体のFc領域の場合のように、CH4ドメインを含む。IgG、IgA及びIgD抗体のFc領域は、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。対照的に、IgM及びIgE抗体のFc領域はヒンジ領域が欠如しているが、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びCH4ドメインを含む。抗体エフェクター機能を変化させるためにFc部分にアミノ酸残基の代替物を有する変異型Fc領域は、当技術分野で公知である(例えば、Winterら、米国特許第5,648,260号及び第5,624,821号を参照)。別途断りのない限り、本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質の「Fc領域」は、ヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含み、以下の実施例の表1〜6のいずれかで本明細書に開示されるアミノ酸(配列番号8)を有する、ヒトIgG1抗体に由来するFc領域である。
【００８５】
抗体のFc領域は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、食作用、補体依存性細胞傷害(CDC)並びに抗体及び抗原抗体複合体の半減期/クリアランス速度を媒介する。一部の場合には、これらのエフェクター機能は治療抗体にとって望ましいが、他の場合には、治療目的によって不必要であるか、有害でさえあるかもしれない。ある特定のヒトIgGアイソタイプ、特にIgG1及びIgG3は、それぞれFcガンマ受容体(FcγR)及び補体C1qへの結合を通してADCC及びCDCを媒介する。別途断りのない限り、本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質で使用されるFc領域は、Fc領域がその元のドナー抗体において有していたのと同じ機能特性の少なくとも1つ以上又は全てを保持する。
【００８６】
一実施形態では、抗体の1つ以上のエフェクター機能が変化するように、Fc領域で少なくとも1つのアミノ酸残基が置き換えられる。IgG抗体の場合のように、本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質の2つの同一の重鎖の二量体化は、CH3ドメインの二量体化によって媒介され、FIT-Ig重鎖のCH1又はCLのいずれかをFc定常ドメイン(例えば、CH2及びCH3)に連結するヒンジ領域の中のジスルフィド結合によって安定化される。IgGの抗炎症活性は、IgG Fc断片のN連結グリカンのシアリル化に完全に依存する。抗炎症活性の正確なグリカン必要性は、適当なIgG1 Fc断片を作製することができ、それによって、大いに増強された効力を有する、完全に組換えのシアリル化IgG1 Fcを生成するように決定された(Anthonyら、Science、320:373-376(2008)を参照)。本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質で、そのようなシアリル化Fc領域を使用することができる。
【００８７】
抗体の「抗原結合部分」及び「抗原結合断片」又は「機能的断片」という用語は互換的に使用され、抗原、即ち、その部分又は断片が由来する完全長抗体と同じ抗原(例えば、EGFR、PD-L1)に特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片が発揮することができることがわかっている。そのような抗体の実施形態は、二重特異性（bispecific）、二重特異性（dual specific）、又は2つ以上の異なる抗原に特異的に結合する多重特異的フォーマットであってもよい。抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含される結合断片の例には、(i)Fab断片(Fab結合単位)、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価の断片; (ii)F(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される2つのFab断片を含む二価の断片; (iii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片; (iv)抗体の単一のアームのVL及びVHドメインからなるFv断片、(v)dAb断片(Wardら、Nature、341: 544-546(1989);国際公開番号WO90/05144)、単一の可変ドメインを含む;及び(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、VL及びVH領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする、合成リンカーによって連結することができる(単鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Birdら、Science、242: 423-426(1988);及び、Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85: 5879-5883(1988)を参照)。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語及び上に与えられる同等の用語の中に包含されるものである。単鎖抗体の他の形、例えばダイアボディも包含される。ダイアボディは、VH及びVLドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現される、二価、二重特異性抗体であるが、同じ鎖の上の2つのドメインの間で対形成を可能にするには短か過ぎるリンカーを使用し、それによってドメインを別の鎖の相補的なドメインと対にさせ、2つの抗原結合部位を形成する(例えば、Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90: 6444-6448 (1993)を参照)。そのような抗体結合部分は、当技術分野で公知である(Kontermann及びDubel編、Antibody Engineering (Springer-Verlag、New York、2001)、790ページ(ISBN 3-540-41354-5))。更に、単鎖抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデム型Fvセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む「線状抗体」も含む。(Zapataら、Protein Eng.、8(10): 1057-1062(1995);及び米国特許第5,641,870号)。
【００８８】
別途断りのない限り、用語「ドナー」及び「親」は、本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質を作製するための抗体可変ドメイン、抗体定常ドメイン、Fab結合単位又はFc領域を提供するための供与源である、任意の抗体又は抗原結合断片を指す。非天然の又は操作された抗体も、本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質を作製するためのドナー又は親抗体の役割をすることができる。
【００８９】
抗体(又は、免疫グロブリン)定常(C)ドメインは、抗体の重(CH)又は軽(CL)鎖定常ドメインを指す。マウス及びヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。
【００９０】
用語「モノクローナル抗体」又は「mAb」は、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在するかもしれない可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原決定因子(エピトープ)に向けられている。更に、異なる決定基(エピトープ)に向けられた異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物と対照的に、各mAbは、抗原上の単一の決定基に向けられている。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈するべきでない。
【００９１】
用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を、例えばCDR、特にCDR3に含むことができる(例えば、in vitroでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、又はin vivoでの体細胞突然変異によって導入される突然変異)。しかし、用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含まない。
【００９２】
用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離される全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされる組換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組み換えられた組合せヒト抗体ライブラリーから単離される抗体(Hoogenboom、H.R.、Trends Biotechnol.、15: 62-70 (1997); Azzazy及びHighsmith、Clin. Biochem.、35: 425-445 (2002); Gavilondo及びLarrick、BioTechniques、29: 128-145 (2000); Hoogenboom及びChames、Immunol. Today、21: 371-378 (2000))、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離される抗体(例えば、Taylorら、Nucl. Acids Res.、20: 6287-6295 (1992); Kellermann及びGreen、Curr. Opin. Biotechnol.、13: 593-597 (2002); Littleら、Immunol. Today、21: 364-370 (2000)を参照);又は、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製若しくは単離される抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、in vitro突然変異誘発(又は、ヒトIg配列についてトランスジェニックである動物が使用される場合はin vivo体細胞突然変異誘発)を受け、したがって、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH及びVL配列に由来し、関係があるが、in vivoでヒト抗体生殖系列レパートリーの中に天然に存在することができない配列である。
【００９３】
用語「多価結合タンパク質」は、2つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を表す。多価結合タンパク質は、好ましくは3個以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般に天然に存在する抗体でない。用語「二重特異性結合タンパク質」は、異なる特異性の2つの標的に結合することが可能な結合タンパク質を指す。
【００９４】
用語「活性」には、特性、例えば、標的抗原に特異的に結合する能力、抗体又は結合タンパク質の抗原への親和性、標的抗原の生物活性を中和する能力、標的抗原とその天然の受容体又は天然リガンドとの相互作用を阻害する能力、などが含まれる。本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の活性には、限定されずに、そのコグネート（同族）リガンド(EGF)へのEGFR結合を阻害すること、EGFRシグナル伝達を阻害すること、PD-1へのPD-L1結合を阻害すること、PD-1/PD-L1シグナル伝達を阻害すること、がんへのT細胞応答を上方制御すること、がん細胞を殺滅すること、がん細胞増殖を阻害すること、がん細胞生存を阻害すること、及びがん細胞の拡散を阻害することを含めることができる。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「kon」(同様に「Kon」、「kon」)は、当技術分野で公知であるように、会合体（複合体）、例えば抗体/抗原複合体を形成する、結合タンパク質(例えば、抗体)の抗原への会合のためのオンレート定数を指すものである。本明細書で互換的に使用されるように、「kon」は、用語「会合速度定数」又は「ka」によっても知られる。例えば、この値は、下の式によって示されるように、抗体のその標的抗原への結合速度又は抗体と抗原の間の複合体形成の速度を示すことができる:
抗体(「Ab」)+抗原(「Ag」)→Ab-Ag。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「koff」(同様に「Koff」、「koff」)は、当技術分野で公知であるように、会合体(例えば抗体/抗原複合体)からの結合タンパク質(例えば、抗体)の解離のためのオフレート定数又は「解離速度定数」を指すものである。例えば、この値は、下の式によって示されるように、その標的抗原からの抗体の解離速度又は遊離の抗体及び抗原へのAb-Ag複合体の経時的分離を示すことができる:
Ab+Ag←Ab-Ag。
【００９７】
本明細書で使用される場合、用語「KD」(同様に「Kd」)は「平衡解離定数」を指すものであり、平衡時の滴定測定で、又は会合速度定数(kon)によって解離速度定数(koff)を割ることによって得られる値を指す。会合速度定数(kon)、解離速度定数(koff)及び平衡解離定数(KD)は、抗原への抗体又は結合タンパク質の結合親和性を表すために使用される。会合及び解離速度定数の決定方法は、当技術分野で周知である。蛍光ベースの技術を使用することは、高感度、及び平衡時の生理的緩衝液中で試料を検査する能力を提供する。他の実験手法及び機器、例えばBIAcore(登録商標)(生体分子相互作用分析)アッセイを使用することができる(例えば、BIAcore International AB、GE Healthcare社、Uppsala、Sweden、から入手可能な機器)。例えば、Octet(登録商標) RED96システム(Pall ForteBio LLC)を使用するバイオレイアー干渉法(BLI)は、別の親和性アッセイ技術である。更に、KinExA(登録商標)(動態排除アッセイ)アッセイ(Sapidyne Instruments社、Boise、Idaho、から入手可能)を、使用することもできる。
【００９８】
用語「単離された核酸」は、ヒト介入によって、それが天然に一緒に見出されるポリヌクレオチドの全てとも一部とも結合していないか、天然に連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結されるか、又はより大きな配列の一部として天然に存在しないポリヌクレオチド(例えば、ゲノム、cDNA又は合成起源、又はその一部の組合せの)を意味するものとする。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すものである。1タイプのベクターは「プラスミド」であり、それは、追加のDNAセグメントを連結することができる環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここで、追加のDNAセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞の中で自己複製が可能である(例えば、細菌の複製起点及びエピソーム哺乳動物ベクターを有する細菌ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の後に宿主細胞のゲノムに組み入れることができ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことが可能である。そのようなベクターは、「組換え発現ベクター」(又は、単に「発現ベクター」)と本明細書で呼ばれる。一般に、組換えDNA技術で有用である発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドは最も一般的に使用される形態のベクターであるので、「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に使用することができる。しかし、本発明は、ウイルスベクター(例えば、複製欠陥のあるレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)などの、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクターを含むものである。
【０１００】
用語「作動可能に連結される」は、記載される成分が、それらがそれらの意図された方法で機能することを許す関係にある、並置を指す。コード配列に「作動可能に連結される」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件の下で達成されるような方法で連結される。「作動可能に連結される」配列には、目的の遺伝子に連続している発現制御配列、及び目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は離れて作用する発現制御配列が含まれる。本明細書で使用される場合、用語「発現制御配列」は、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングを実行するのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適当な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列;効率的なRNAプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化シグナル;細胞質mRNAを安定させる配列;翻訳効率を増強する配列(即ち、コザックコンセンサス配列);タンパク質安定性を増強する配列;並びに、必要に応じて、タンパク質分泌を増強する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物では、そのような制御配列は、プロモーター、リボゾーム結合部位及び転写終結配列を一般的に含む。真核生物では、一般的に、そのような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現及びプロセシングのために必須である成分を含むものとし、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含むこともできる。
【０１０１】
用語「組換え宿主細胞」(又は、単に「宿主細胞」)は、外来性DNAが導入された細胞を指すものである。一実施形態では、宿主細胞は、例えば、米国特許第7,262,028号に記載される宿主細胞などの抗体をコードする2つ以上(例えば、複数の)核酸を含む。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代も指すものである。突然変異又は環境の影響のために後の世代においてある特定の改変が起こることがあるので、実際、そのような後代は親細胞と同一でないかもしれないが、本明細書で用いる用語「宿主細胞」の範囲になお含まれる。一実施形態では、宿主細胞には、生物界のいずれかから選択される原核生物及び真核生物の細胞が含まれる。別の実施形態では、真核細胞には、原生生物、真菌、植物及び動物の細胞が含まれる。別の実施形態では、宿主細胞には、限定されずに、原核生物の細胞株大腸菌(Escherichia coli);哺乳動物細胞株CHO、HEK293、COS、NS0、SP2及びPER.C6;昆虫細胞株Sf9;並びに、真菌細胞酵母(Saccharomyces cerevisiae)が含まれる。
【０１０２】
組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、細胞培養、組織培養及び形質転換(例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション)のために、標準の技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書によって、又は当技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実行することができる。前述した技術及び手順は、当技術分野で周知である従来の方法によって、及び本明細書全体で引用及び議論される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されている通りに一般的に実行することができる。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989)を参照。
【０１０３】
用語「アゴニスト」は、本明細書で使用される場合、目的の分子と接触させたときに、アゴニスト非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある特定の活性又は機能の大きさの増加を引き起こすモジュレーター（調節因子）を指す。用語「アンタゴニスト」及び「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、目的の分子と接触させたときに、アンタゴニストの非存在下で観察される活性又は機能の大きさと比較して、分子のある特定の活性又は機能の大きさの低下を引き起こすモジュレーター（調節因子）を指す。本発明の特定のアンタゴニストは、EGFへのEGFR結合をブロック又は阻害する、PD-1へのPD-L1結合をブロック又は阻害する、EGFRシグナル伝達をブロック又は阻害する、PD-L1シグナル伝達をブロック又は阻害する、EGFR依存性シグナル伝達のがん促進活性をブロック又は阻害する、PD-L1依存性シグナル伝達のがん促進活性をブロック又は阻害する、及び、1つ以上のその組合せである、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Igである。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、障害又は1つ以上のその症状の重症度及び/又は持続期間を低減又は改善するのに;障害の進行を予防するのに;障害の退行を引き起こすのに;障害に伴う1つ以上の症状の再発、発達又は進行を予防するのに;障害を検出するのに;又は、別の療法(例えば、予防的又は治療的薬剤)の予防的又は治療的効果を増強又は向上させるのに十分である療法の量を指す。
【０１０５】
本明細書で別途規定されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は明瞭であるべきであるが、何らかの潜在性の曖昧さがある場合は、本明細書で提供される定義はいかなる辞書又は外部の定義に優先する。更に、文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本出願では、「又は」の使用は別途指示されない限り「及び/又は」を意味する。更に、用語「含んでいる(including)」並びに他の形、例えば「含む(includes)」及び「含まれる(included)」の使用は、限定するものでない。同様に、「要素（エレメント）」又は「成分」などの用語は、別途特記されない限り、1つの単位を含む要素及び成分、並びに複数のサブユニットを含む要素及び成分を包含する。
【０１０６】
1つ以上の挙げられた要素又は工程を「含む」と本明細書に記載される組成物又は方法はオープンエンドであり、それは、挙げられた要素又は工程は必須であるが、他の要素又は工程を組成物又は方法の範囲内に加えることができることを意味する。冗長を回避するために、1つ以上の挙げられた要素又は工程を「含んでいる」(又は、「含む」)と本明細書に記載される任意の組成物又は方法は、同じ挙げられた要素又は工程「から本質的になっている」(又は、「から本質的になる」)、対応する、より限定された組成物又は方法を記載すること、即ち、組成物又は方法は挙げられた必須の要素又は工程を含むこと、並びに組成物又は方法の基本的及び新規の特性に実質的に影響しない追加の要素又は工程を含むこともできることを意味することも理解される。1つ以上の挙げられた要素又は工程を「含んでいる」又は「それから本質的になっている」と本明細書に記載される任意の組成物又は方法は、いかなる他の挙げられていない要素も工程も除外して、挙げられた要素又は工程「からなっている」(又は、「からなる」)、対応する、より限定されたクローズエンドの組成物又は方法をも記載することも理解される。本明細書に開示される任意の組成物又は方法では、任意の挙げられた必須の要素又は工程の公知であるか開示された同等物を、その要素又は工程に代えて置換することができる。
【０１０７】
本発明の好ましいEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の特徴
「FIT-Ig6」(又は「EGFR/PD-L1 FIT-Ig6」)と呼ばれる本発明の好ましいEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR及びPD-L1に結合し:
配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む第1のポリペプチド鎖(重鎖);
配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド鎖(第1の軽鎖);
配列番号3に記載のアミノ酸配列を含む第3のポリペプチド鎖(第2の軽鎖)
を含む。
【０１０８】
上記の第1、第2及び第3のポリペプチド鎖の会合は、PD-L1に特異的であるカルボキシ近位又は「内側の」Fab結合とタンデムに連結される、EGFRに特異的であるアミノ末端又は「外側の」Fab結合単位を含む、「半FIT」分子を提供する。天然のIgG1抗体のように、第1のポリペプチド鎖のカルボキシ末端領域のFc(ヒンジ-CH2-CH3)は、別の半 FIT分子のFcと会合して、2つの外側のEGFR特異的Fab結合単位及び2つの内側のPD-L1特異的Fab結合単位を含む、完全に組み立てられた6ポリペプチド鎖FIT-Ig結合タンパク質を形成することができる。
【０１０９】
FIT-Ig結合タンパク質のFab結合単位の特異性は、特異抗原結合部位を形成する抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメイン(VH、VL)の供与源として使用される親抗体に由来する。
【０１１０】
本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR及びPD-L1に同時に結合する。更なる実施形態では、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、2つのEGFRタンパク質及び2つのPD-L1タンパク質に同時に結合する。
【０１１１】
本発明によるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR及びPD-L1特異性が由来する個々の親抗体の各々のものに類似している親和性でEGFR及びPD-L1に結合する。
【０１１２】
本発明によるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質のEGFR及びPD-L1への親和性は、バイオレイアー干渉法(例えば、Octet(登録商標) RED96システム、Pall ForteBio LLC、を使用する)、表面プラズモン共鳴(例えば、BIAcore(登録商標)(生体分子相互作用分析)アッセイシステム、BIAcore International AB、GE Healthcare company、Uppsala、Sweden、を使用する)、又は動態排除アッセイ(例えば、KinExA(登録商標)アッセイシステム、Sapidyne Instruments、Boise、Idaho、を使用する)を含む、様々なシステムのうちのいずれかを使用して測定することができる。
【０１１３】
本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はEGFRに結合し、バイオレイアー干渉法によって決定された場合に、少なくとも1×105M-1s-1、より好ましくは少なくとも2×105M-1s-1のヒトEGFRに対するオンレート定数(kon)を有する。更なる実施形態では、本発明によるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質の抗EGFR特異性の由来元となった親抗体のヒトEGFRに対するkonより概ね40%低いヒトEGFRに対するkonを有する。
【０１１４】
本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はヒトEGFRに結合し、バイオレイアー干渉法によって決定された場合に、1.1×10-4sec-1未満のヒトEGFRに対するオフレート定数(koff)を有する。更なる実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の抗EGFR特異性の由来元となった親抗体のヒトEGFRに対するkoffの値より概ね50%低いヒトEGFRに対するkoffを有する。
【０１１５】
本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はヒトEGFRに結合し、バイオレイアー干渉法によって決定された場合に、1×10-9M未満、好ましくは7×10-10M未満、より好ましくは6×10-10M未満、更により好ましくは5×10-10M以下のヒトEGFRに対する解離定数(KD)を有する。更なる実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の抗EGFR特異性の由来元となった親抗体のヒトEGFRに対するKDと実質的に同じ(即ち、同一の又はその25%以内の)ヒトEGFRに対するKDを有する。
【０１１６】
本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はPD-L1に結合し、バイオレイアー干渉法によって決定された場合に、少なくとも5×105M-1s-1、より好ましくは少なくとも7×105M-1s-1、更により好ましくは少なくとも8×105M-1s-1のヒトPD-L1に対するオンレート定数(kon)を有する。更なる実施形態では、本発明によるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の抗PD-L1特異性の由来元となった親抗体のヒトPD-L1に対するkonと同じか又はその概ね90%以内のヒトPD-L1に対するkonを有する。
【０１１７】
本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はヒトPD-L1に結合し、バイオレイアー干渉法によって決定された場合に、2×10-2sec-1未満、より好ましくは1.5×10-2sec-1未満のヒトPD-L1に対するオフレート定数(koff)を有する。更なる実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の抗PD-L1特異性の由来元となった親抗体のヒトPD-L1に対するkoffより概ね20%高いヒトPD-L1に対するkoffを有する。
【０１１８】
一実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はヒトPD-L1に結合し、バイオレイアー干渉法によって決定された場合に、2×10-8M未満、より好ましくは1.7×10-8M未満のPD-L1に対する解離定数(KD)を有する。更なる実施形態では、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の抗PD-L1特異性の由来元となった親抗体のPD-L1に対するkDと実質的に同じ(即ち、同一の又はその30%以内の)PD-L1に対するKDを有する。
【０１１９】
本発明の好ましいEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、プロテインA親和性クロマトグラフィーを使用した細胞培地からの一段階精製の後に、有意な凝集体形成を示さない。本明細書に示されるように、プロテインA親和性クロマトグラフィーでの精製の後に、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を含有するカラム溶出液は、サイズ排除クロマトグラフィー(例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィー)を使用して凝集体の存在について分析することができる。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、サイズに基づいて分子を分離し、したがって、完全に組み立てられた、6鎖「単量体」とも呼ばれる6ポリペプチド鎖EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質で予想される分子量を有する分子を、より高いかより低い分子量を有する他の種から分離する。6鎖単量体は、概ね240,000ダルトンの分子量を有する。プロテインA親和性クロマトグラフィーを使用して培地から精製された本発明の好ましいEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、0.1%以下の凝集体を有する。即ち、哺乳動物の細胞培養で生成される本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の99.9%は、完全に組み立てられた6鎖単量体として存在する。0.1%以下(≦0.1%)のレベルのタンパク質凝集体は、抗がん薬としてのEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の効率的な前臨床及び臨床評価を阻止しない非有意な量と考えられる。対照的に、本明細書に示されるように、他の以前に生成されたEGFR/PD-L1及びPD-1/EGFR FIT-Ig結合タンパク質で見出された凝集体の量は、1.2%から最大で70%を超えた。したがって、凝集体形成に関して、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質はより安定し、EGFR及びPD-L1に結合する以前に生成されたFIT-Ig結合タンパク質より有意に低い(例えば、10分の1以下)百分率の凝集体を有する。下の実施例1.7の表7を参照。
【０１２０】
本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の産生
本発明は、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を産生する方法であって、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の3つのポリペプチド鎖をコードする1つ以上のベクターを含む単離された宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。所望のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、2つの外側EGFR特異的Fab結合単位及び2つの内側PD-L1特異的Fab結合単位を含む6ポリペプチド鎖FIT-Ig結合タンパク質として発現される。
【０１２１】
発現ベクター及び適合性原核生物又は真核生物宿主細胞を含む種々の発現系は、組換え異種タンパク質の発現に利用できる。組換えタンパク質の発現に使用されることが多い原核生物宿主細胞の例は、大腸菌細胞である。組換えタンパク質の発現に使用することができる真核生物宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、藻類宿主細胞、線虫宿主細胞、原生動物宿主細胞及び魚類宿主細胞を限定することなく含む。組換えタンパク質の発現に使用することができる真菌宿主細胞は、コウジカビ属（Aspergillus）、アカパンカビ属（Neurospora）、サッカロミセス属（Sccharomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、クルリベロミセス属（Kluyveromyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）及びカンジダ属（Candida）を含むがこれらに限定されない。組換えタンパク質の発現に好まれるサッカロミセス属宿主細胞は、出芽酵母細胞である。本発明に係る宿主細胞として有用な昆虫細胞は、昆虫Sf9細胞である。
【０１２２】
FIT-Ig結合タンパク質は好ましくは、哺乳動物細胞発現系を使用して産生される。FIT-Ig結合タンパク質の構築及び発現は、国際公開番号WO2015/103072 A1及びWO2017/136820 A2に以前に記載された。本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、同様の材料及び方法を使用して産生することができる。そのような方法は一般的に、選択された宿主細胞における組換え抗体及び操作された結合タンパク質の発現に用いられる。
【０１２３】
典型的には、FIT-Ig結合タンパク質の各ポリペプチド鎖は、新生ポリペプチド鎖を分泌のために小胞体(ER)の内腔に、次いでゴルジ体に方向付けるアミノ末端シグナル配列(シグナルペプチド)と共に、単離された核酸分子にコードされる。本明細書に記載されるFIT-Ig結合タンパク質のポリペプチド鎖をコードする個々の核酸分子は、化学的DNA合成方法を使用して、組換えDNA方法を使用して、又は両方の方法論の組合せを使用して作製することができる。
【０１２４】
次に、FIT-Ig結合タンパク質のポリペプチド鎖の1つをコードする各核酸分子は、別々の発現ベクターに挿入され、これにより、発現ベクターと適合性である宿主細胞におけるポリペプチド鎖の発現を可能にする適切な転写及び/又は翻訳配列に作動可能に連結される。
【０１２５】
発現ベクターは、自律的に複製するベクター又はベクター中に存在する単離された核酸を宿主細胞ゲノムに取り込ませるベクターであり得る。本明細書に記載される核酸の発現に好まれるベクターは、pcDNA、pTT(Durocher et al, Nucleic Acids Res., 30(2e9): 1-9 (2002))、pTT3(追加的な多重クローニング部位を有するpTT)、pEFBOS(Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Res., 18(17): 5322 (1990))、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、pEF6 TOPO、pBJ、及び特定の宿主細胞における本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の発現に要求されるその改変を含むがこれらに限定されない。
【０１２６】
FIT-Ig結合タンパク質の産生に好まれるプロトコールにおいて、FIT-Ig結合タンパク質は、3つの発現ベクターをトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞において発現され、各発現ベクターは、FIT-Ig結合タンパク質の3つのコンポーネントポリペプチド鎖の1つをコードする核酸を含む。
【０１２７】
好ましくは、本明細書に記載されるベクターを含む単離された哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、Vero細胞、SP2/0細胞、NS/0骨髄腫細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK293)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、HeLa細胞、ヒトB細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、PerC6細胞及びMDCK細胞からなる群から選択される。
【０１２８】
トランスフェクトされたHEK293細胞は、例えば、トランスフェクション4〜10日後に操作された抗体及び結合タンパク質を含む組換えタンパク質の短期産生を提供することができる、一過的トランスフェクション系としてルーチンに使用される。トランスフェクトされたHEK293細胞は、組換えタンパク質の初期研究室クローニング、産生及び解析にルーチンに用いられ、これにより、安定してトランスフェクトされた産生細胞株、例えば、安定したトランスフェクトされたCHO細胞株の単離に要求される時間及び労働を回避する。操作された抗体及び結合タンパク質の産生に詳しい実務者にとって、一過的にトランスフェクトされた細胞の培養物における10mg/L未満の発現のレベルは、適切な量の結合タンパク質が、初期前臨床評価、例えば、動物モデルにおける生物活性研究、予備的安定性研究、薬物動態(PK)研究及び有効性を行うために利用できると予想するには低すぎる。加えて、本分野の実務者であれば、一過的にトランスフェクトされたHEK293細胞の培養物における10mg/L未満の発現のレベルは、高い発現(例えば、1g/Lを超える)を有する安定してトランスフェクトされたCHO細胞の単離が、時間及び労働の大規模な投資をもってしても成功する可能性が低いことを示すことも認識する。対照的に、一過的にトランスフェクトされたHEK293細胞の培養物における10 mg/Lを超えるFIT-Ig結合タンパク質の発現レベルは、安定してトランスフェクトされたCHO細胞の生成に先立ち初期発見ステージ評価を行う結合タンパク質の量を提供するのに十分に高いと考慮され、また、後期前臨床ステージ及び臨床ステージ評価の両方に要求されるはるかにより多い量の産生に要求される、安定してトランスフェクトされたCHO細胞の単離に成功する可能性を示す。
【０１２９】
本明細書に示す通り、本発明に係るEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、トランスフェクトされたHEK293細胞の培養物において、1リットルの細胞培養物当たり10mgのEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を超えるレベルで(>10mg/L)発現させることができる。以前に産生されたEGFR/PD-L1及びPD-1/EGFR FIT-Ig結合タンパク質が、約1mg/L〜約8mg/Lに及ぶレベルでしか発現されなかったという事実を考慮すると、このレベルの発現は予想外であった。加えて、他のFIT-Ig結合タンパク質のものと比較して漸進的増強を超えるレベルの産生により、トランスフェクトされたHEK293細胞の培養物における本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の発現のレベルは、結合タンパク質が、新たな抗がん療法薬として前臨床ステージ及び臨床ステージ評価の両方を受けるのに十分な量で利用できることを確実にする。
【０１３０】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質、並びに1つ以上の薬学的に許容されるコンポーネント、例えば、薬学的に許容される担体(ビヒクル、バッファー)、賦形剤及び/又は他の成分を含む。「薬学的に許容される」とは、組成物の担体、化合物、コンポーネント又は他の成分が、ヒト対象の生理学と適合性であり、また、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の所望の結合特異性にとって、又はヒト対象に投与されるべき組成物中に存在し得るいずれか他のコンポーネントのいずれか他の所望の特性若しくは活性にとって有害でないことを意味する。本発明の医薬組成物において使用することができる薬学的に許容される担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール及びその他並びにこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。一部の場合では、糖;多価アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール;塩化ナトリウム;及びこれらの組合せを含むがこれらに限定されない等張剤を含むことが好ましい場合がある。
【０１３１】
本発明の薬学的に許容される組成物は、医薬組成物の有効期間又は有効性を増強するために、1つ以上の賦形剤、少量の補助的物質、例えば、湿潤若しくは乳化剤、フィラー、保存料又はバッファーを更に含み得る。賦形剤は一般に、主な治療用化合物又は活性以外の有益な特性又は特色を医薬組成物に提供するいずれかの化合物又は化合物の組合せである。本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質(主な治療用化合物)を含む医薬組成物に関して、賦形剤は、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の所望の結合特異性又はEGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質による抗がん活性以外の所望の有益な特色を提供する。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質、薬学的に許容される担体及びアジュバントを含み、アジュバントは、ヒト免疫系の全般的な刺激を提供する。
【０１３３】
pHは、必要に応じて医薬組成物において調整して、例えば、コンポーネント成分の溶解性を促進若しくは維持する、製剤中の1つ以上のコンポーネント成分の安定性を維持する、及び/又は組成物に潜在的に導入され得る微生物の望まれない成長を阻止することができる。
【０１３４】
本発明のEGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質を含む医薬組成物は、結合タンパク質の持続又は時間遅延された放出を提供するように調製することができる。そのような制御放出又は時間遅延用組成物の調製のための種々の方法は、当業者に知られており、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達システムを含むがこれらに限定されない。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸及びこれらの組合せを使用して、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を含む制御放出又は時間遅延用組成物を調製することもできる。
【０１３５】
本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質を含む医薬組成物は、1つ以上の追加的な治療活性がある化合物(治療剤)を更に含むことができる。本発明の医薬組成物に取り込まれ得るそのような追加的な治療剤の例は、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質とは異なる抗がん剤(例えば、細胞傷害性金属含有抗がん化合物又は細胞傷害性放射性同位体に基づく抗がん化合物及びこれらの組合せ)、抗生物質、抗ウイルス化合物、鎮静薬、刺激薬、局所的麻酔薬、抗炎症性ステロイド(例えば、天然又は合成抗炎症性ステロイド及びこれらの組合せ)、鎮痛薬(例えば、アセチルサリチル酸、アセトアミノフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、COX-2阻害剤、モルヒネ、オキシコドン及びこれらの組合せ)、抗ヒスタミン薬、非ステロイド性抗炎症薬(「NSAID」、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、COX-2阻害剤及びこれらの組合せ)及びこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０１３６】
本発明に係る医薬組成物は、当技術分野で知られている種々の経路のいずれかによる投与のために製剤化される。そのような経路は、非経口、静脈内(全身性)、皮下、筋肉内、経口(即ち、胃腸管)、舌下、口腔、鼻腔内(例えば、吸入)、経皮(例えば、外用)、腫瘍内、経粘膜、関節内、気管支内、嚢内、軟骨内(intracartilaginous)、腔内、子宮頸部内(intracervical)、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内(intraprostatic)、肺内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑膜内(intrasynovial)、胸腔内、子宮内、膀胱内、腟及び直腸を含むがこれらに限定されない。
【０１３７】
好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、がんを有するヒト対象への静脈内投与のために製剤化される。EGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質を含む医薬組成物の静脈内投与は、循環器系全体に、よって循環血によって到達される組織及び臓器へとEGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質を提供する。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性水性バッファー中の溶液である。必要であれば、組成物は、注射部位における疼痛を緩和するために、可溶化剤及び局所的麻酔薬、例えば、リグノカムン(lignocamne)を含み得る。
【０１３８】
本発明の医薬組成物の皮下投与は、EGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質をリンパ系に提供することができる経路である。したがって、本発明のEGFR/PD-L1 FTI-Ig結合タンパク質を含む医薬組成物は、皮下投与のために製剤化することができる。
【０１３９】
本発明の医薬組成物は、注射(例えば、ボーラス注射又は継続的注入)による非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤は、保存料を加えた単位剤形(例えば、アンプル又は複数用量容器)において提示することができる。組成物は、油性又は水性ビヒクルにおける懸濁液又は溶液又はエマルション等の形態をとることができ、処方集の薬剤、例えば、懸濁剤、安定化剤及び/又は分散剤を含有することができる。或いは、活性成分(即ち、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質)は、使用前の適したビヒクル(例えば、滅菌パイロジェンフリー水)による復元のための粉末形態(例えば、凍結乾燥形態)であり得る。
【０１４０】
本発明の医薬組成物は、ある種の長時間作用性製剤としてのデポー調製物としての送達のために製剤化することができる。そのような長時間作用性製剤は、植え込み(例えば、皮下又は筋肉内)又は筋肉内注射によって投与することができる。よって、例えば、医薬組成物は、適したポリマー若しくは疎水性材料(例えば、許容される油におけるエマルションとして)又はイオン交換樹脂と共に又は難溶性誘導体(例えば、難溶性塩として)として製剤化することができる。
【０１４１】
別の実施形態では、本明細書に記載されるEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、非結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質が結合するEGFR及びPD-L1に対する結合活性を保持する結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質であり得る。そのような結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、個体に投与された場合にEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の無担体制御放出を提供することもできる。本発明の結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は、非結晶化形態と比較して、個体に投与された場合により大きいin vivo半減期を示すこともできる。本発明の結晶化結合タンパク質は、当技術分野で知られており、参照により本明細書に組み込む国際公開番号WO02/072636(Shenoy et al.)に開示されている方法に従って産生することができる。
【０１４２】
結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の放出のための医薬組成物であって、本明細書に記載される結晶化EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質、賦形剤成分及び少なくとも1つのポリマー担体を含む医薬組成物。好ましくは、賦形剤成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される。好ましくは、ポリマー担体は、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)（poly(anhydrides)）、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、乳酸・グリコール酸共重合体（ポリ(乳酸-co-グリコール酸)）又はPLGA、ポリ(b-ヒドロキシブチレート(hydroxybutryate))、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン);ポリ(エチレングリコール)、ポリ((ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸/アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオール、アルブミン、アルギン酸（alginate）、セルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリコサミノグリカン(glycaminoglycan)、硫酸化多糖、その混合物、並びにそのコポリマーからなる群のうち1つ以上から選択されるポリマーである。
【０１４３】
本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の方法及び使用
EGFR及びPD-L1の両方に結合するEGFR/PD-1 FIT-Ig結合タンパク質の能力は、抗がん療法の提供において主要な関心事項となる。おそらく、EGFR及びPD-L1へのEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質の結合は、EGFR及びPD-L1が、これらそれぞれのリガンド(例えば、EGFR及びPD-1)に結合するのを阻害又は遮断し、これは次いで、発癌、がん細胞成長及びがん細胞の拡散(転移)に関与するそれぞれの別々のシグナル伝達経路(即ち、EGFR/EGFシグナル伝達及びPD-L1/PD-1シグナル伝達)を阻害又は遮断する。本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質は好ましくは、in vitro及びin vivoの両方でヒトEGFR又はヒトPD-L1シグナル伝達活性を遮断することができる。したがって、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を使用して、ヒトEGFR及び/又はヒトPD-L1シグナル伝達を、ヒト対象において、又はおそらく本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質が交差反応するEGFR及びPD-L1を有する他の哺乳動物対象において阻害又は遮断することができる。
【０１４４】
細胞におけるEGFRシグナル伝達を阻害又は遮断する方法は、EGFRを発現する細胞を本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップを含む。
【０１４５】
細胞におけるPD-L1シグナル伝達を阻害又は遮断する方法は、PD-L1を発現する細胞をEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップを含む。
【０１４６】
EGFRシグナル伝達及びPD-L1シグナル伝達を阻害又は遮断する方法は、EGFRを発現する細胞及びPD-L1を発現する細胞を含む細胞集団を、本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップを含む。
【０１４７】
上に記載されている方法において有用なFIT-Ig結合タンパク質は、配列番号1に従ったアミノ酸配列を含む第1の(重)ポリペプチド鎖;配列番号2に従ったアミノ酸配列を含む第2の(第1の軽)ポリペプチド鎖;及び配列番号3に従ったアミノ酸配列を含む第3の(第2の軽)ポリペプチド鎖を含むEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質である。
【０１４８】
本発明は、また、その処置を必要とするヒト対象におけるがんを処置する方法であって、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質又はEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、EGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質が、配列番号1に従ったアミノ酸配列を含む第1の(重)ポリペプチド鎖;配列番号2に従ったアミノ酸配列を含む第2の(第1の軽)ポリペプチド鎖;及び配列番号3に従ったアミノ酸配列を含む第3の(第2の軽)ポリペプチド鎖を含む、方法を提供する。
【０１４９】
本発明に係るヒト対象におけるがんを処置する方法において、がんは上皮がんであり得る。
【０１５０】
別の実施形態では、本発明の方法において処置されるがんは、黒色腫(例えば、転移性悪性黒色腫)、腎がん(例えば、明細胞癌)、前立腺がん(例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌)、膵腺癌、乳がん、結腸がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん)、食道がん、頭頸部扁平細胞癌、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸部がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫及び他の新生物悪性病変からなる群から選択される。
【０１５１】
ある実施形態では、本発明は、また、活性化T細胞の活性を回復させる(抑制を反転する)方法であって、PD-L1/PD-1開始T細胞抑制が阻害されるように、ヒトPD-L1発現細胞を本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、EGFR/EGF結合によって誘導される発癌を阻害する方法であって、EGFR/EGF媒介性シグナル伝達が阻害又は遮断されるように、ヒトEGFR発現細胞を本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップを含む方法を提供する。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明は、EGFR及び/又はPD-L1活性が有害となる疾患を患うヒト対象を処置する方法であって、対象におけるPD-L1/PD1結合及び/又はEGFR/EGF結合によって媒介される活性が低減されるように、本発明のEGFR/PD-L1結合タンパク質を対象に投与するステップを含むそのような方法を提供する。
【０１５３】
上に記載されている方法において有用なFIT-Ig結合タンパク質は、配列番号1に従ったアミノ酸配列を含む第1の(重)ポリペプチド鎖;配列番号2に従ったアミノ酸配列を含む第2の(第1の軽)ポリペプチド鎖;及び配列番号3に従ったアミノ酸配列を含む第3の(第2の軽)ポリペプチド鎖を含むEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質である。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、用語「EGFR及び/又はPD-L1活性が有害となる疾患」は、障害を患う対象におけるEGFRとそのリガンド(EGR)との相互作用又はPD-L1とそのリガンド(PD-1)との相互作用が、障害の病態生理学の原因となる、又は疾患の悪化に寄与する因子となる疾患を含むことを意図する。したがって、EGFR及び/又はPD-L1活性が有害となる疾患は、EGFR及び/又はPD-L1活性の阻害が、疾患の症状及び/又は進行を軽減することが予想される疾患である。
【０１５５】
本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質が、ヒトEGFR及びPD-L1に結合することを考慮すると、EGFR/PD-L1結合タンパク質を使用して、EGFR若しくはPD-L1又はその両方を例えば、これら標的抗原の一方又は両方を発現する細胞を含有する生体試料において検出することもできる。例えば、本発明のEGFR/PD-L1結合タンパク質は、従来のイムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は組織の免疫組織化学的検査において使用することができる。本発明は、生体試料におけるEGFR又はPD-L1を検出する方法であって、生体試料を本発明のEGFR/PD-L1 FIT-Ig結合タンパク質と接触させるステップ、及び標的抗原(EGFR又はPD-L1)への結合が起こるか検出し、これにより生体試料における標的の存在又は非存在を検出するステップを含む方法を提供する。結合タンパク質は、検出可能な物質で直接的に又は間接的に標識して、結合した又は結合していない抗体/断片/結合タンパク質の検出を容易にすることができる。適した検出可能な物質は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料及び放射性材料を含む。適した酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含み;適した補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを含み;適した蛍光材料の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンを含み;発光材料の例は、ルミノールを含み;適した放射性材料の例は、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho又は153Smを含む。
【０１５６】
ここで本発明について詳細に記載してきたが、本発明は、単なる説明目的で含まれ本発明の限定を意図しない次の例を参照することにより、より明確に理解されるであろう。
【実施例】
【０１５７】
[実施例1] EGFR及びPD-L1に結合するFIT-Ig結合タンパク質の生成。
ヒトEGFR及びヒトPD-L1の両方を認識する6つの二重特異性Fabs-In-Tandem免疫グロブリン(FIT-Ig)結合タンパク質を、抗PD-L1及び抗EGFR親抗体に由来する結合部位を使用して構築した。
【０１５８】
抗PD-L1モノクローナル抗体(mAb) 1B12、10A5及び3G10は、以前に記載した。例えば、米国特許第7,943,743 B2号を参照。
【０１５９】
FIT-Ig結合タンパク質を作製するための抗EGFR mAbパニツムマブの特定のアミノ酸配列の使用は、以前に記載されている。例えば、国際公開番号WO2017/136820 A2を参照。
【０１６０】
[実施例1.1] FIT-Ig1。
「FIT-Ig1」(「PD-L1/EGFR FIT-Ig1」とも呼ばれる)と称されるPD-L1/EGFR FIT-Igは、親抗体mAb 1B12及びパニツムマブに由来する免疫グロブリンドメインのコード配列を利用して構築した。FIT-Ig1は、以下の3つの成分ポリペプチド鎖で構成される六量体である:
ポリペプチド鎖#1は、ドメイン式:ヒンジ-CH2-CH3(ヒトIgG1 Fc領域)に直接的に融合されるVHpani-CH1に直接的に融合されるVL1B12-CLを有する;
ポリペプチド鎖#2は、ドメイン式: VH1B12-CH1を有する;
ポリペプチド鎖#3は、ドメイン式: VLpani-CLを有する。
【０１６１】
N末端シグナル配列を含む3つの発現されるFIT-Ig1ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、下の表1に示す:
【０１６２】
【表１】
2021531821.tif 000003
2021531821.tif 000004
【０１６３】
[実施例1.2] FIT-Ig2
「FIT-Ig2」(「EGFR/PD-L1 FIT-Ig2」とも呼ばれる)と称されるEGFR/PD-L1 FIT-Igは、親抗体パニツムマブ及びmAb 1B12に由来する免疫グロブリンドメインのコード配列を利用して構築した。FIT-Ig2は、以下の3つの成分ポリペプチド鎖で構成される六量体である:
ポリペプチド鎖#1は、ドメイン式:ヒンジ-CH2-CH3(ヒトIgG1 Fc領域)に直接的に融合されるVH1B12-CH1に直接的に融合されるVLpani-CLを有する;
ポリペプチド鎖#2は、ドメイン式: VHpani-CH1を有する;
ポリペプチド鎖#3は、ドメイン式: VL1B12-CLを有する。
【０１６４】
N末端シグナル配列を含む3つの発現されるFIT-Ig2ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、下の表2に示す:
【０１６５】
【表２】
2021531821.tif 000005
2021531821.tif 000006
2021531821.tif 000007
【０１６６】
[実施例1.3] FIT-Ig3
「FIT-Ig3」(「PD-L1/EGFR FIT-Ig3」とも呼ばれる)と称されるPD-L1/EGFR FIT-Igは、親抗体10A5及びパニツムマブに由来する免疫グロブリンドメインのコード配列を利用して構築した。FIT-Ig3は、以下の3つの成分ポリペプチド鎖で構成される六量体である:
ポリペプチド鎖#1は、ドメイン式:ヒンジ-CH2-CH3(ヒトIgG1 Fc領域)に直接的に融合されるVHpani-CH1に直接的に融合されるVL10A5-CLを有する;
ポリペプチド鎖#2は、ドメイン式: VH10A5-CH1を有する;
ポリペプチド鎖#3は、ドメイン式: VLpani-CLを有する;。
【０１６７】
N末端シグナル配列を含む3つの発現されるFIT-Ig3ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、下の表3に示す:
【０１６８】
【表３】
2021531821.tif 000008
2021531821.tif 000009
【０１６９】
[実施例1.4] FIT-Ig4
「FIT-Ig4」(「EGFR/PD-L1 FIT-Ig4」とも呼ばれる)と称されるEGFR/PD-L1 FIT-Igは、親抗体パニツムマブ及びmAb 10A5に由来する免疫グロブリンドメインのコード配列を利用して構築した。FIT-Ig4は、以下の3つの成分ポリペプチド鎖で構成される六量体である:
ポリペプチド鎖#1は、ドメイン式:ヒンジ-CH2-CH3(ヒトIgG1 Fc領域)に直接的に融合されるVH10A5-CH1に直接的に融合されるVLpani-CLを有する;
ポリペプチド鎖#2は、ドメイン式: VHpani-CH1を有する;
ポリペプチド鎖#3は、ドメイン式:VL10A5-CLを有する。
【０１７０】
N末端シグナル配列を含む3つの発現されるFIT-Ig4ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、下の表4に示す:
【０１７１】
【表４】
2021531821.tif 000010
2021531821.tif 000011
【０１７２】
[実施例1.5] FIT-Ig5
「FIT-Ig5」(「PD-L1/EGFR FIT-Ig5」とも呼ばれる)と称されるPD-L1/EGFR FIT-Igは、親抗体mAb 3G10及びパニツムマブに由来する免疫グロブリンドメインのコード配列を利用して構築した。FIT-Ig5は、以下の3つの成分ポリペプチド鎖で構成される六量体である:
ポリペプチド鎖#1は、ドメイン式:ヒンジ-CH2-CH3(ヒトIgG1 Fc領域)に直接的に融合されるVHpani-CH1に直接的に融合されるVL3G10-CLを有する;
ポリペプチド鎖#2は、ドメイン式: VH3G10-CH1を有する;
ポリペプチド鎖#3は、ドメイン式: VLpani-CLを有する。
【０１７３】
N末端シグナル配列を含む3つの発現されるFIT-Ig5ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、下の表5に示す:
【０１７４】
【表５】
2021531821.tif 000012
2021531821.tif 000013
【０１７５】
[実施例1.6] FIT-Ig6
「FIT-Ig6」(「EGFR/PD-L1 FIT-Ig6」とも呼ばれる)と称されるEGFR/PD-L1 FIT-Igは、親抗体パニツムマブ及びmAb 3G10に由来する免疫グロブリンドメインのコード配列を利用して構築した。FIT-Ig6は、以下の3つの成分ポリペプチド鎖で構成される六量体である:
ポリペプチド鎖#1は、ドメイン式:ヒンジ-CH2-CH3(ヒトIgG1 Fc領域)に直接的に融合されるVH3G10-CH1に直接的に融合されるVLpani-CLを有する;
ポリペプチド鎖#2は、ドメイン式: VHpani-CH1を有する;
ポリペプチド鎖#3は、ドメイン式: VL3G10-CLを有する。
【０１７６】
N末端シグナル配列を含む3つの発現されるFIT-Ig6ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、下の表6に示す:
【０１７７】
【表６】
2021531821.tif 000014
2021531821.tif 000015
【０１７８】
[実施例1.7] FIT-Ig結合タンパク質の発現
6つのFIT-Ig構築物FIT-Ig1、FIT-Ig2、FIT-Ig3、FIT-Ig4、FIT-Ig5、FIT-Ig6は、WO2015/103072及びWO2017/136820に一般的に記載される、無リンカーFabs-In-Tandem免疫グロブリン(又は、無リンカーFIT-Ig)として知られるタイプの二重特異性多価結合タンパク質である。結合タンパク質は、全ての3つの鎖のための発現ベクターでトランスフェクトされた哺乳動物の宿主細胞において、3つの成分ポリペプチド鎖の同時発現によって生成された。結合タンパク質の設計は、機能的タンデムFab部分を形成するために、第2のポリペプチド鎖(又は、「第1の軽鎖」)、及び第3のポリペプチド鎖(又は、「第2の軽鎖」)と対合する第1のポリペプチド鎖(又は、「重鎖」)を要求し、更に、4つの無傷のFab結合部位を提示する6鎖結合タンパク質が形成されるように、重鎖はFc領域(ヒンジ-CH2-CH3)を通して二量体化するように設計される。免疫グロブリンドメインを連結するために合成アミノ酸リンカーペプチドは使用されず、したがって「無リンカーFIT-Ig」と命名される。そのような結合タンパク質は、組換えで生成されたモノクローナル抗体と同様に宿主細胞でよく発現されることが見出され、リンカーの不在は、可能性のある免疫原性部位の導入を阻止し、それは、リンカーを特徴として有するFIT-Igのより急速なクリアランスにおそらくつながる。無リンカーFIT-Igは、VH-CH1及びVL-CLが基づく親抗体と同等である、それらの標的抗原への結合特性を示すことも見出され、驚くべきことに、タンデムに配置された抗原結合部位を有する以前の操作された抗体の「内側」及び「外側」結合部位の間で見出された立体障害を回避した。しかし、本明細書に示されるように、無リンカーFIT-Igモデルを使用したにもかかわらず、PD-L1及びEGFRに結合するFIT-Igタンパク質の以前の構築物、例えばFIT-Ig 1〜5は、治療的抗がん薬として評価するために必要とされる通常の前臨床及び臨床アッセイで効率的に使用するには異例に低いレベルの発現及び/又は望ましくなく高い百分率の凝集体を示した。
【０１７９】
結合タンパク質FIT-Ig1、FIT-Ig3及びFit-Ig5では、N末端又は「外側」Fab結合部位はPD-L1に結合し、隣接した「内側」Fab結合部位はEGFRに結合する。外側Fab断片(抗PD-L1 mAb 1B12、10A5又は3G10の)は、免疫グロブリンドメインを連結するリンカーを使用せずに、VH-CH1(抗EGFRパニツムマブの)のN末端への、そのC末端でのVL-CL(抗PD-L1 mAb 1B12、10A5又は3G10の)の直接的な融合によって、重鎖を通してだけ内側Fab断片(抗EGFRパニツムマブの)に連結される。
【０１８０】
結合タンパク質FIT-Ig2、FIT-Ig4及びFit-Ig6では、N末端又は「外側」Fab結合部位はEGFRに結合し、隣接した「内側」Fab結合部位はPD-L1に結合する。外側Fab断片(抗EGFRパニツムマブの)は、免疫グロブリンドメインを連結するリンカーを使用せずに、VH-CH1(抗PD-L1 mAb 1B12、10A5又は3G10の)のN末端への、そのC末端でのVL-CL(抗EGFRパニツムマブの)の直接的な融合によって、重鎖を通してだけ内側Fab断片(抗PD-L1 mAb 1B12、10A5又は3G10の)に連結される。
【０１８１】
FIT-Igの各々は、トランスフェクトされたヒト胚腎臓293E(HEK293)細胞を使用して、一過的に発現された。HEK293E細胞株は、EBNA-1を発現し、ベクターによってコードされる組換えタンパク質の増強されたレベルの発現を提供する、HEK293の派生物である。
【０１８２】
発現ベクターは、任意のFIT-Ig結合タンパク質の3つのポリペプチド鎖の各々の発現を可能にし、ここで、第1の(重)ポリペプチド鎖は構造式:VLA-CL-VHB-CH1-Fcを有し、第2の(第1の軽)ポリペプチド鎖は構造式:VHA-CH1を有し、第3の(第2の軽)ポリペプチド鎖は構造式:VLB-CLを有し、式中、VLA及びVHAは第1の親抗体の抗原結合部位の可変ドメインであり、VLB及びVHBは第2の親抗体の抗原結合部位の可変ドメインである。
【０１８３】
図1に図示する通り、FIT-Ig結合タンパク質の第1のポリペプチド鎖(「重鎖」)を発現させるために、第1のポリペプチド鎖のVLA-CL-VHBセグメントをコードするDNA分子を合成した(「DNA合成」)。大腸菌の細胞において相同組換えを使用して、pcDNA3.1発現ベクターの多重クローニング部位(MCS)にDNA分子を次に挿入した。この相同組換え方法は、リコンビナーゼ陽性大腸菌細胞が相同配列を高率の特異性及び速度で組み換えることができるという原理に依存する。目的のコード配列を含む線状DNA断片は、線状化ベクター上の末端配列に相同的である配列を5'及び3'末端に含むようにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成される。PCR生成物及び線状ベクターを混合してコンピテント大腸菌細胞に形質転換させた場合、内因性の細菌リコンビナーゼ活性は2つのDNA断片を連結して環状プラスミドをもたらすことができる。その後、挿入されたDNA分子は、アミノ末端シグナルペプチド(SP)をコードするDNAセグメントの下流かつそれとインフレームで、ヒンジ領域-CH2-CH3ドメイン(図1で「h-CH2-CH3」と命名される)を含む抗体Fc領域に連結される抗体CH1ドメインをコードする挿入されたDNA分子の上流かつそれとインフレームで、ベクターの強力なサイトメガロウイルス(CMV)-エンハンサープロモーターの下流に配置した。
【０１８４】
同様に図1に図示されるように、FIT-Ig結合タンパク質の第2のポリペプチド鎖(軽鎖#1)を発現させるために、抗体VHAドメインをコードしたDNAセグメントを合成し、それは、挿入されたDNA分子が、アミノ末端シグナルペプチド(SP)をコードするDNAセグメントの下流かつそれとインフレームで、抗体CH1ドメインをコードする挿入されたDNA分子の上流かつそれとインフレームで、ベクターの強力なCMV-エンハンサープロモーターの下流に配置されるように、pcDNA3.1発現ベクターの多重クローニング部位(MCS)に次に挿入した。
【０１８５】
図1に図示されるように、FIT-Ig結合タンパク質の第3のポリペプチド鎖(軽鎖#3)を発現させるために、抗体VLBドメインをコードするDNAセグメントを合成し、それは、挿入されたDNA分子が、アミノ末端シグナルペプチド(SP)をコードするDNAセグメントの下流かつそれとインフレームで、抗体CLドメインをコードする挿入されたDNA分子の上流かつそれとインフレームで、ベクターの強力なCMV-エンハンサープロモーターの下流に配置されるように、pcDNA3.1発現ベクターの多重クローニング部位(MCS)に次に挿入した。
【０１８６】
生じた発現ベクターの配列は、DNA配列決定によって確認した。
【０１８７】
FIT-Igの各々の3つの成分ポリペプチド鎖をコードする生じた発現ベクターを、1:3:3の重鎖:軽鎖#1:軽鎖#2のモル比を使用して、HEK293E細胞にトランスフェクトした。これは、重鎖に対して比例してより多くの軽鎖#1及び#2が発現されるように設計され、それは次に、対応する軽鎖と対を形成しなかったので機能的Fab断片を形成することができないであろう、重鎖上のVL-CL及びVH-CH1セグメントの存在を減少させる。WO2015/103072を参照。トランスフェクション剤としてポリエチレンイミン(PEI)を使用して、HEK293E細胞を発現ベクターでトランスフェクトした。このトランスフェクションプロトコールでは、FreeStyle (商標) 293 Expression Medium中の発現ベクターを1:2のDNAとPEIとの比の最終濃度でPEIと混合し、室温で15〜20分間インキュベートし、その後60μg DNA/120ml培養液でHEK293E細胞に加えた(1.0〜1.2×106/ml、細胞生存率>95%)。振盪機での6〜24時間の培養の後、37℃、8% CO2において125rpm/分で振盪させながら、ペプトンを5%の最終濃度でトランスフェクション細胞に加えた。第6〜7日目に、上清を遠心分離及び濾過によって収集し、製造業者の使用説明書に従ってプロテインAクロマトグラフィー(GE healthcare、US)を使用してFIT-Igタンパク質を精製した。タンパク質をSDS-PAGEによって分析し、それらの濃度は280nmでのUV吸光度及びビシンコニン酸タンパク質アッセイ(BCA)(Pierce BCA Protein Assay Kit、Thermo Fisher Scientific)によって決定した。
【０１８８】
FIT-Igタンパク質発現生成物は、プロテインAクロマトグラフィーによって精製した。精製されたFIT-Igの組成及び純度を、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって次に分析した。PBS中の精製されたFIT-Igを、TSKgel SuperSW3000、300×4.6mmカラム(TOSOH社)上に加えた。SECのために、280nm及び214nmでのUV検出を使用して、HPLC機器、モデルU3000(DIONEX)を使用した。より大きな(より高い分子量)凝集体及びFIT-Ig6単量体の断片を含むより小さい種を含む、6ポリペプチド鎖FIT-Ig6単量体(240,000ダルトンの分子量)以外のSECによって検出された種は、不純物である。
【０１８９】
FIT-Ig1からFIT-Ig6の各々のSEC溶出プロファイルは、それぞれ、図2〜7に示す。
【０１９０】
図2に示すFIT-Ig1のSEC溶出プロファイルは、タンパク質凝集体の複数の重複するピークを明らかにした。プロファイルは、個々のピーク種の詳細な分析を可能とするには複雑過ぎた。
【０１９１】
図3に示すFIT-Ig2のSEC溶出プロファイルは、タンパク質凝集体の少なくとも2つの追加のピークの後に、6ポリペプチドFIT-Ig2単量体の予想された位置で主ピークを明らかにした。
【０１９２】
図4に示すFIT-Ig3のSEC溶出プロファイルは、タンパク質凝集体の複数の重複するピークを明らかにした。プロファイルは、個々のピーク種の詳細な分析を可能とするには複雑過ぎた。
【０１９３】
図5に示すFIT-Ig4のSEC溶出プロファイルは、タンパク質凝集体のマイナーピークの後に、及び未知の種(おそらく分解生成物)の別のマイナーピークの前に、6ポリペプチドFIT-Ig4単量体の予想された位置で主ピークを明らかにした。
【０１９４】
図6に示すFIT-Ig5のSEC溶出プロファイルは、図2〜5の以前のプロファイルで見出されたいかなるものより有意に小さかったタンパク質凝集体のマイナーピークの後に、6ポリペプチドFIT-Ig5単量体の予想された位置で主ピークを明らかにした。
【０１９５】
図7に示すFIT-Ig6のSEC溶出プロファイルは、タンパク質凝集体の領域内のかろうじて検出可能なピークの後に、6ポリペプチドFIT-Ig6単量体の予想された位置で主ピークを明らかにした。FIT-Ig6結合タンパク質は、凝集体の有意な形成なしで、プロテインA親和性クロマトグラフィーを使用した一段階精製の後に、実質的に完全に均一な生成物として明らかに得られた。凝集体の百分率は、0.1%以下(≦0.1%)と推定される。FIT-Ig6は、有意な百分率の凝集体を有しないことで、全ての他のFIT-Igを明らかに凌いだ。
【０１９６】
FIT-Ig 1〜6の発現及びSECデータは、下の表7に示す。
【０１９７】
【表７】
2021531821.tif 000016
【０１９８】
上のデータは、以下を示す:
・FIT-Ig 1、2及び3は、トランスフェクトされたHEK293細胞の培養で、例外的に高い凝集体百分率及び容認できないほど低いレベルの発現を示し、したがって、治療薬としての更なる前臨床評価のために必要とされるタンパク質の品質(無であるか又は非有意に低い百分率の凝集体)及び量を提供することができない
・FIT-Ig4はFIT-Ig 1、2及び3より低い凝集体百分率を有するが、レベルは薬物開発のために無視できない。更に、FIT-Ig4は、容認できないほど低い発現レベルを示す。したがって、FIT-Ig4は、治療薬としての更なる前臨床評価のために必要とされるタンパク質の量及び質を同様に提供することができない
・FIT-Ig5は、ほとんど許容されるレベルの凝集体及び発現を有するが、10mg/ml未満の発現レベルは、前臨床及び臨床評価のための量を得るために安定してトランスフェクトされたCHO細胞株を単離するために必要とされる努力は、成功しないか又は費用効果が高くないと予測する
・FIT-Ig6は、驚くべきことに、トランスフェクトされたHEK293細胞の培養で高い発現レベル及び非有意な量の凝集体形成(≦0.1%)の両方を示す。したがって、凝集体形成に関してFIT-Ig6はより安定し、プロテインA親和性クロマトグラフィーを使用した一段階精製の後にFIT-Ig5の10分の1以下の百分率の凝集体を有する。哺乳動物の細胞培養で発現されるFIT-Ig6の発現レベル及び例外的に低いレベルの凝集により、この結合タンパク質は、抗がん治療薬としての前臨床及び臨床評価のための候補としての使用に適格である
・FIT-Ig6の例外的な特性は、以下の結果である:
1.  FIT-Ig6のPD-L1特異的Fab結合単位の各々においてPD-L1特異的抗原結合部位を形成するVH及びVLドメインの供与源として抗PD-L1 mAb 3G10を使用すること、
2.  FIT-Ig6のEGFR特異的Fab結合単位の各々においてEGFR特異的抗原結合部位を形成するVH及びVLドメインの供与源としてパニツムマブ抗EGFR mAbを使用すること、
3.  FIT-Ig6の外側Fab結合単位としてEGFR特異的Fab結合単位を配置すること、及び
4.  FIT-Ig6の内側Fab結合単位としてPD-L1特異的Fab結合単位を配置すること。
【０１９９】
[実施例2] FIT-Ig5及びFIT-Ig6の結合親和性。
親の抗EGFRパニツムマブ、親の抗PD-L1 mAb 3G10、FIT-Ig5及びFIT-Ig6の結合親和性は、バイオレイアー干渉法によって決定した。簡潔には、各親のmAb及びFIT-Igを、Octet(登録商標) RED96バイオレイアー干渉法(Pall ForteBio LLC)によって親和性及び結合動態について特徴付けた。各親のmAb及びFIT-Igは、100nMの濃度で30秒間、抗ヒトIgG Fc捕捉(AHC)バイオセンサー(Pall)によって捕捉した。ベースラインを検査するために、次に流動緩衝液(1×、pH7.2、PBS、0.05% Tween20、0.1% BSA)の中にセンサーを60秒間浸した。両方とも1nMから200nMの範囲内の単一濃度の組換えヒトPD-L1(Novoprotein)又は組換えヒトEGFR(Sino Biological Inc)の中にセンサーを浸すことによって、結合を測定した。解離の後に、センサーを流動緩衝液に1200秒間浸した。ForteBio DataAnalysisソフトウェア(Pall)を使用して、会合及び解離曲線を1:1のLangmuir結合モデルにあてはめた。結果は、表8に示す。
【０２００】
【表８】
2021531821.tif 000017
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【０２０１】
結果は、FIT-Ig5及びFIT-Ig6が、EGFR及びPD-L1標的抗原に対してそれぞれ親のパニツムマブ及び親のmAb 3G10のそれらに類似している結合親和性を有することを示す。特に、EGFRに対するFIT-Ig6のKDは、親のパニツムマブのそれより概ね25%低く、PD-L1に対するFIT-Ig6のKDは、親のmAb 3G10のそれより概ね30%高かった。FIT-Ig6のKD値及び親のmAbのそれらにおける差のこれらのレベルは、おそらくアッセイの変動によるものであった。したがって、FIT-Ig6は、EGFR及びPD-L1に対してそれぞれの特異性が由来する親の抗体の各々と実質的に同じ(即ち、同じか又はその30%以内の)親和性を有する。
【０２０２】
したがって、これらのデータは、FIT-Ig6結合タンパク質が親のmAbの結合親和性を保持したことを示す。更に、FIT-Ig6結合タンパク質の結合親和性は、抗がん薬としてのFIT-Ig6の前臨床及び臨床評価の継続を許容するものである。
【０２０３】
[実施例3] 雄Sprague-DawleyラットにおけるFIT-Ig6の薬物動態試験。
FIT-Ig6の薬物動態学的特性を、雄Sprague-Dawley(SD)ラットで調査した。FIT-Igタンパク質は、5mg/kgの単一の静脈内用量で雄SDラットに投与した。血清試料は、28日間にわたって異なる時点で収集し、試料は、尾静脈を通した0分、5分、15分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、24時間、2日、4日、7日、10日、14日、21日及び28日後の連続放血で採取し、一般的なELISAによって分析した。簡潔には、ヤギ抗ヒトIgG Fc抗体(Rockland、Cat#: 609-101-017)の125ng/ウェルでELISAプレートを4℃で終夜コーティングし、1×PBS/1% BSA/0.05% Tween-20/0.05% ProClin(商標)300でブロックした。全ての血清試料は、先ずブロッキング緩衝液で20倍に希釈した。5%のプールされたラット血清で追加の希釈溶液を作製し、37℃で60分間、プレート上でインキュベートした。抗ヒトIgG(Fab断片)ペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma;カタログno. A0293)で検出を実行し、4パラメーターロジスティックフィットを使用した標準曲線で濃度を決定した。薬物動態パラメーターの値は、WinNonlinソフトウェア(Pharsight Corporation、Mountain View、Calif.)を使用した非コンパートメントモデルによって決定した。
【０２０４】
3匹のSDラットにおける時間に対するFIT-Ig6の血清中濃度のグラフを、図8に示す。
【０２０５】
動物のうちの2匹(ラット#1及びラット#3)のための図8に示す結果の分析は、下の表9に示すPKパラメーターを与えた。(最初の2つのデータポイントに関連した未解決の問題のために、ラット#2のデータの完全なセットは、ラット#1及びラット#3のそれと一緒に分析できず、それはソフトウェアによる分析を妨げたが、残りの時点は正常範囲にあった。)
【０２０６】
【表９】
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【０２０７】
上のPKデータは、FIT-Ig6がSDラットで安定し、従来のmAbの類似のPKパラメーターを有したことを示す。
【０２０８】
重要なことに、FIT-Ig6の比較的長い排出半減期(ベータt1/2=10.9日)及び低いクリアランス(CL=6.77mL/日/kg)は、治療用mAbと同様により低頻度の投薬で慢性症状のためのその治療的有用性を可能にする。
【０２０９】
本出願全体を通して引用されている(文献の参考文献、特許、特許出願及びウェブサイト)を含む全ての参考文献の内容は、本明細書に参照により完全に明示的に組み込まれる。本発明の実施は、別途断りのない限り、当技術分野で周知である免疫学、分子生物学及び細胞生物学の従来の技術を用いる。
【０２１０】
本発明は、上記の本発明の必須の特徴を逸脱しない範囲で、他の特異的な形態で具体化することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載される発明を限定ではなく例示する全ての観点で考えるべきである。したがって、本発明の範囲は前述の記載よりは添付の特許請求の範囲によって示され、したがって、特許請求の範囲の同等性の意味及び範囲内の全ての変更は本明細書に包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021531821.tif 000029
2021531821.tif 000030
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