(57)【要約】  タンパク質合成効率を高めることができるタンデムＤＮＡエレメントが提供される。特に、核酸構築物は、真核細胞（酵母など）に由来するＩＲＥＳエンハンサー（ＳｃＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＮＣＥ１０２、ＳｃＭＳＮ１、ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＭＳＮ１、Ｋ１ＢＯＩ１など）、Ω配列、および酵母に特異的Kozak配列によってタンデムに形成される。酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系）における核酸構築物の使用は、タンパク質合成効率を有意に改善することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉの核酸配列を含むことを特徴とする核酸構築物。
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５（Ｉ）
（式中、Ｚ１〜Ｚ５は、それぞれ前記酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、ＩＲＥＳエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［オリゴ（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、酵母に由来するKozak配列を構成する。）
【請求項２】
前記ＩＲＥＳエレメントは、ＳｃＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＮＣＥ１０２、ＳｃＭＳＮ１、ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＢＯＩ１、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記核酸構築物の核酸配列は、配列番号２〜１７である請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
５’から３’に下記式ＩＩの構造を含むことを特徴とする核酸構築物。
Ｚ１−Ｚ２ Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６ （ＩＩ）
（式中、Ｚ１〜Ｚ６は、それぞれ前記核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、ＩＲＥＳエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［オリゴ（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、酵母に由来するKozak配列を構成する。）
【請求項５】
前記外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質をコードする請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記外来性タンパク質は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項７】
５’から３’に下記式ＩＩＩの構造を含むことを特徴とする核酸構築物。
Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２ Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６ （ＩＩＩ）
（式中、Ｚ０〜Ｚ６は、それぞれ前記核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０は、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロモーターエレメントであり、
Ｚ１は、ＩＲＥＳエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［オリゴ（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、酵母に由来するKozak配列を構成する。）
【請求項８】
５’から３’に下記式ＩＶの構造を含むことを特徴とする核酸構築物。
Ｚ０’−Ｚ１−Ｚ２ Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＶ）
（式中、Ｚ０’〜Ｚ６は、それぞれ前記核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０’は、ＧＡＡであり、
Ｚ１は、ＩＲＥＳエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［オリゴ（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、酵母に由来するKozak配列を構成する。）
【請求項９】
請求項１〜８に記載の前記核酸構築物を含むことを特徴とするベクターまたはベクターの組合せ。
【請求項１０】
遺伝子組み換え細胞のゲノムが１つ以上の部位で請求項１〜８に記載の前記核酸構築物と一体化される、または、遺伝子組み換え細胞が請求項９に記載の前記ベクターまたは前記ベクターの組み合わせを含むことを特徴とする遺伝子組み換え細胞。
【請求項１１】
試薬を含むキットであって、前記試薬は、
（ａ）請求項１〜８に記載の前記核酸構築物と、
（ｂ）請求項９に記載の前記ベクターまたは前記ベクターの組合せと、
（ｃ）請求項１０に記載の前記遺伝子組み換え細胞と、のうちの１つまたは複数から選択されることを特徴とするキット。
【請求項１２】
ハイスループットのインビトロタンパク質合成に適用可能である、請求項１〜８に記載の構築物、請求項９に記載のベクターまたはベクターの組合せ、請求項１０に記載の遺伝子組み換え細胞、または、請求項１１に記載のキットの使用。
【請求項１３】
外来性タンパク質のためのインビトロハイスループット合成方法であって、前記方法は、
（ｉ）真核生物系のインビトロ生合成系の存在下で、請求項１〜８に記載の前記核酸構築物を提供する工程と、
（ｉｉ）適切な条件下で、前記工程（ｉ）の前記真核生物系のインビトロ生合成系をＴ１の期間インキュベートして、外来性タンパク質を合成する工程と、を含むことを特徴とする外来性タンパク質のためのインビトロハイスループット合成方法。
【請求項１４】
（ｉｉｉ）前記真核生物系のインビトロ生合成系から前記外来性タンパク質を単離する工程、または、前記真核生物系のインビトロ生合成系から前記外来性タンパク質を検出する工程を任意選択でさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記真核生物系のインビトロ生合成系は、酵母系のインビトロ生合成系である請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、タンパク質合成効率を高めることができるタンデムＤＮＡエレメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、細胞における重要な分子であり、細胞のほとんど全ての機能に関与する。タンパク質の配列および構造は、その機能を決定する。細胞において、タンパク質は、酵素類として種々の生化学反応を触媒することができ、シグナル分子として生物体の種々の活動を協調することができ、生物形態をサポートし、エネルギーを蓄積し、分子を輸送し、生物体を動かせることができる。生体医学の分野において、標的薬としての抗体（タンパク質の一種）は、がんや他の病気を治療するための重要な手段である。
【０００３】
細胞では、栄養欠乏などの外界圧力に応答するだけでなく、細胞の発生や分化など様々なプロセスにおいて、タンパク質翻訳の調節が重要な役割を果たしている。タンパク質翻訳の４つのプロセスには、翻訳開始、翻訳伸長、翻訳終結およびリボソームのリサイクリングがある。その中でも、翻訳開始が最も調節されるプロセスである。真核細胞における翻訳開始には２つの方法がある。すなわち、伝統的なキャップ依存的方法およびキャップ非依存的方法（図１に示す）である。
【０００４】
「キャップ構造」依存的な翻訳開始は、いくつかの種類の翻訳開始因子と、リボソームの４０Ｓ小サブユニットとが関与する非常に複雑なプロセスである。「キャップ構造」非依存的な翻訳開始は、主に、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に位置する内部リボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）によって媒介される。ＩＲＥＳは、１９８０年代にウイルス性ｍＲＮＡで初めて発見された。そして、細胞内の内因性ＩＲＥＳも、後に広く報告された。ウイルス性ＩＲＥＳは、通常、複雑な二次および三次構造を有する。宿主細胞内で、ウイルス性ＩＲＥＳは、宿主細胞の翻訳開始因子に依存して、または宿主細胞の翻訳開始因子とは無関係に、タンパク質翻訳を開始するために宿主細胞のリボソームをリクルート（recruit）する。ウイルス性ＩＲＥＳと比較して、細胞内の内因性ＩＲＥＳは、通常、タンパク質翻訳を開始する効率が低いであり、且つまた、共通性を持たない様々な複雑な機構によって調節される。細胞内の異なる内因性ＩＲＥＳは、配列や構造に共通性を有さない。これは、予測が困難である。
【０００５】
細胞内タンパク質合成の上記の理解に加えて、タンパク質合成はまた、細胞外で行われる。インビトロタンパク質合成系は一般に、細菌、真菌、植物細胞または動物細胞に基づく溶解システムを指す。これは、外来性タンパク質の迅速かつ効率的な翻訳を完了するために、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸およびＡＴＰなどの成分を添加する。現在、頻繁に使用される市販のインビトロタンパク質発現系には、大腸菌抽出物（Escherichia coli extract,ＥＣＥ）系、ウサギ網状赤血球溶解物（rabbit reticulocyte lysate,ＲＲＬ）系、コムギ胚芽抽出物（wheat germ extract,ＷＧＥ）系、昆虫細胞抽出物（insect cell extract,ＩＣＥ）系およびヒト供給源系が含まれる。
【０００６】
インビトロで合成されたｍＲＮＡは通常、“キャップ構造”を有さない。“キャップ構造”によるｍＲＮＡの修正は、時間がかかり、高価である。結果として、インビトロタンパク質合成系は一般に、キャップ非依存的な翻訳開始方法を使用して、タンパク質合成が行われる。しかし、ＩＲＥＳまたはオメガ（Ω）配列のみを使用する翻訳開始の効率はかなり低く、インビトロでの迅速、効率的およびハイスループットなタンパク質合成の目的は達成されない。現在のところ、これら２つのタイプの翻訳開始エレメントをタンデムに連結することに関する研究はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＩＲＥＳ配列とΩ配列とをタンデムに連結し、タンパク質合成効率を高めることができる新規な核酸構築物を開発することが、当技術分野において緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの目的は、ＩＲＥＳ配列とオメガ（Ω）配列とをタンデムに連結し、タンパク質翻訳の効率を高めることができる新規な核酸構築物を提供することである。
【０００９】
第１の態様によれば、本発明は、式Ｉの核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５（Ｉ）
式中、Ｚ１〜Ｚ５は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントは、ＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、［オリゴ（Ａ）］ｎで表され、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
【００１０】
別の好ましい実施形態では、Ｚ１は、酵母に由来する。
【００１１】
別の好ましい実施形態において、ＩＲＥＳエレメントの供給源は、原核細胞および真核細胞からなる群より選択される１つ以上のタイプの細胞である。
【００１２】
別の好ましい実施形態において、真核細胞は、高等真核細胞を含む。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、ＩＲＥＳエレメントは、内因性ＩＲＥＳエレメントおよび外因性ＩＲＥＳエレメントを含む。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、ＩＲＥＳエレメントの供給源は、ヒト（human）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Chinese hamster overy cell）、昆虫細胞、コムギ胚芽細胞(Wheat germ cell)およびウサギ網状赤血球(Rabbit reticulocyte)からなる群より選択される１つ以上のタイプの細胞である。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、ＩＲＥＳエレメントは、ＳｃＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＮＣＥ１０２、ＳｃＭＳＮ１、ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＢＯＩ１、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１７】
別の好ましい実施形態において、クルイベロマイセスは、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアナス（Kluyveromyces  marxianus）、クルイベロマイセス・ドブズハンスキ（Kluyveromyces  dobzhanskii）、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、翻訳開始コドンは、ＡＴＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＴＴＧおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、翻訳開始コドンは、ＡＴＧである。
【００２０】
別の好ましい実施形態において、セリンコドンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、セリンコドンは、ＴＣＴである。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、ｎは、６〜１２の範囲であり、好ましくは８〜１０の範囲である。
【００２３】
別の好ましい実施形態では、Ω配列は、直接反復モジュール（ＡＣＡＡＴＴＡＣ）ｍと、（ＣＡＡ）ｐとを含む。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、ｍは、１〜６の範囲であり、好ましくは２〜４の範囲である。
【００２５】
別の好ましい実施形態において、ｐは、６〜１２の範囲であり、好ましくは８〜１０の範囲である。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、（ＣＡＡ）ｐモジュールの数は、１〜５の範囲であり、好ましくは１〜３の範囲である。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、（ＣＡＡ）ｐモジュールは、改善された（ＣＡＡ）ｐモジュールをさらに含む。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、Kozak配列は、配列番号８４に示される。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、核酸構築物の配列は、配列番号２〜１７のいずれか１つである。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、核酸構築物の配列は、配列番号２〜９のいずれか１つである。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、核酸構築物の配列は、配列番号３、４または６である。
【００３２】
第２の態様によれば、本発明は、５’から３’に式ＩＩの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ１−Ｚ２ Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＩ）
式中、Ｚ１〜Ｚ６は、それぞれ核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１はエンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、［オリゴ（Ａ）］ｎで表され、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、原核生物または真核生物に由来する。
【００３４】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、動物、植物または病原体に由来する。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、哺乳動物に由来し、好ましくは、霊長類またはげっ歯類に由来する（ヒト、マウスおよびラットを含む）。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)Ｅ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼおよびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質をコードする。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、外来性タンパク質は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)Ｅ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼおよびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、核酸構築物の配列は、配列番号８５〜８７のいずれか１つである。
【００３９】
第３の態様によれば、本発明は、５’から３’に式ＩＩＩの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２ Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＩＩ）
式中、Ｚ０〜Ｚ６は、それぞれ、核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０は、プロモーターエレメントであり、プロモーターエレメントは、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーターおよびこれらの組合せからなる群から選択され、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、［オリゴ（Ａ）］ｎで表され、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
【００４０】
第４の態様によれば、本発明は、５’から３’に式ＩＶの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ０’−Ｚ１−Ｚ２ Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＶ）
式中、Ｚ０’〜Ｚ６は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０’は、ＧＡＡであり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントは、ＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、［オリゴ（Ａ）］ｎで表され、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
【００４１】
第５の態様によれば、本発明は、ベクターまたはベクターの組合せを提供する。ベクターまたはベクターの組合せは、本発明の第１の態様〜第４の態様に記載の核酸構築物を含有する。
【００４２】
第６の態様によれば、本発明は、遺伝子組み換えされた細胞を提供する。遺伝子組み換えされた細胞のゲノムは、１つ以上の部位で、本発明の第１の態様から第４の態様による核酸構築物と一体化される。または、遺伝子組み換えされた細胞は、本発明の第５の態様によるベクターまたはベクターの組み合わせを含む。
【００４３】
別の好ましい実施形態において、遺伝子組み換えされた細胞は、原核細胞および真核細胞を含む。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、真核細胞は、高等真核細胞を含む。
【００４５】
別の好ましい実施形態において、遺伝子組み換えされた細胞は、ヒト細胞（例えば、Ｈｅｌａ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞、昆虫細胞、コムギ胚芽細胞、ウサギ網状赤血球、酵母細胞およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、遺伝子組み換えされた細胞は、酵母細胞である。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００４８】
別の好ましい実施形態において、クルイベロマイセスは、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ドブズハンスキ（Kluyveromyces dobzhanskii）、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００４９】
第７の態様によれば、本発明は、キットを提供する。キットに含まれる試薬は、以下の群のうちの１つ以上から選択される。
（ａ）本発明の第１の態様から第４の態様に記載の核酸構築物、
（ｂ）本発明の第５の態様に記載のベクター又はベクターの組合せ、および
（ｃ）本発明の第６の態様による遺伝子組み換え細胞。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、キットは、（ｄ）真核生物系のインビトロ生合成系（例えば、真核生物系のインビトロタンパク質合成系など）をさらに含む。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、真核生物系のインビトロ生合成系は、酵母系のインビトロ生合成系、チャイニーズハムスター卵巣細胞系のインビトロ生合成系、昆虫細胞系のインビトロ生合成系、Ｈｅｌａ細胞系のインビトロ生合成系、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、真核生物系のインビトロ生合成系は、真核生物系のインビトロタンパク質合成系を含む。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、真核生物系のインビトロタンパク質合成系は、酵母系のインビトロタンパク質合成系、チャイニーズハムスター卵巣細胞系のインビトロタンパク質合成系、昆虫細胞系のインビトロタンパク質合成系、Ｈｅｌａ細胞系のインビトロタンパク質合成系、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００５４】
別の好ましい実施形態では、キットは、（ｅ）酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系など）をさらに含む。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系など）は、クルイベロマイセス系のインビトロ生合成系（例えば、クルイベロマイセス系のインビトロタンパク質合成系など）であり、好ましくは、クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ生合成系(例えば、クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロタンパク質合成系ど）である。
【００５６】
第８の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様から第４の態様に係る核酸構築物と、本発明の第５の態様に係るベクターまたはベクターの組合せと、本発明の第６の態様に係る遺伝子組み換えされた細胞または本発明の第７の態様に係るキットの使用を提供する。これは、ハイスループットなインビトロタンパク質合成に適用可能である。
【００５７】
第９の態様によれば、本発明は、以下の工程を含む、外来性タンパク質合成のためのインビトロハイスループット方法を提供する。
（ｉ）真核生物系のインビトロ生合成系の存在下で、本発明の第１の態様から第４の態様による核酸構築物を提供する工程、
（ｉｉ）適切な条件下で、工程（ｉ）の真核生物系のインビトロ生合成系をＴ１の期間インキュベートして、外来性タンパク質を合成する工程。
【００５８】
別の好ましい実施形態において、この方法は、（ｉｉｉ）真核生物系のインビトロ生合成系から外来性タンパク質を任意選択で単離または検出する工程をさらに含む。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、真核生物系のインビトロ生合成系は、酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系など）である。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系など）は、クルイベロマイセス系のインビトロ生合成系（例えば、クルイベロマイセス系のインビトロタンパク質合成系など）であり、好ましくはクルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ生合成系（例えば、クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロタンパク質合成系など）である。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、原核生物または真核生物に由来する。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、動物、植物または病原体に由来する。
【００６３】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、哺乳動物に由来し、好ましくは、霊長類またはげっ歯類に由来する（ヒト、マウスおよびラットを含む）。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質をコードする。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、外来性タンパク質は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）において、反応温度は、２０〜３７℃の範囲であり、好ましくは２２〜３５℃の範囲である。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）において、反応時間は、１〜１０時間の範囲であり、好ましくは２〜８時間の範囲である。
【発明の効果】
【００６８】
本発明の範囲内で、本発明において以下（例えば、実施形態または実施例）で具体的に説明されるそれぞれの技術的特徴および上述のそれぞれの技術的特徴は、互いに組み合わせることができ、それによって、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成することができることを理解されたい。スペースの制約のため、ここでは、これ以上のトートロジーはない。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、生合成においてタンパク質翻訳開始における５’−ＵＴＲ配列の重要な役割を示す。５’−ＵＴＲは主に、細胞内で、タンパク質の翻訳開始を調節し、ｍＲＮＡを安定化させる役割を果たしている。（Ａ）キャップ依存的なタンパク質翻訳開始のプロセスにおいて、５’−ＵＴＲは、翻訳開始因子および４３Ｓ開始前複合体（pre-initiation complex, ＰＩＣ）をリクルート（recruit）するために重要な役割を果たす。そして、それは、４３Ｓ ＰＩＣのスキャニングおよび翻訳開始も調節できる。キャップ非依存的なタンパク質翻訳開始のプロセスでは、（Ｂ）二次構造をもつ５’−ＵＴＲと、（Ｃ）二次構造をもたない５’−ＵＴＲの両方がいくつかのタンパク質因子の助けを必要とし、４３Ｓ ＰＩＣをリクルートするために非常に重要である。
【図２】図２は、インビトロタンパク質合成系において、真核生物内因性ＩＲＥＳがタンパク質合成を開始する効率を示す。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）に由来し、相同性を持つＩＲＥＳから選択された８種のＩＲＥＳは、酵母系のインビトロタンパク合成系で使用された。従来のΩ配列と比較して、６つのＩＲＥＳ（ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２、ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１およびＫｌＮＣＥ１０２）を使用して、その合成を開始した場合のルシフェラーゼの相対発光量（ＲＬＵ）値は、Ω配列を使用した場合よりも高かった。
【００７０】
【図３】図３は、インビトロタンパク質合成系においてタンパク質合成を開始する効率におけるタンデムＤＮＡエレメントの比較を示す。Ω配列の上流または下流のそれぞれに位置する８個のＩＲＥＳを、Ω配列およびクルイベロマイセス・ラクティス−に特異的Kozak配列とタンデムにそれぞれ連結した。１６個のタンデムＤＮＡエレメントを構築した。１６個のタンデムＤＮＡエレメントは、インビトロタンパク質合成系において使用された。合成を開始するためにＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａを使用した場合のルシフェラーゼの相対発光量（ＲＬＵ）値は、Ω配列とKozak配列とを連結するタンデムエレメントΩ−１０Ａを使用した場合の値を超えた。そして、その値は、Ω−１０Ａを使用した場合のＲＬＵ値に対して１．６５倍であった。次に、別の二つのタンデムエレメント、ＳｃＦＬＯ８−Ω−１０ＡとＫｌＭＳＮ１−Ω−１０Ａを用いたときの相対発光量値は、Ω−１０Ａを用いたときのＲＬＵ値に近く、それぞれ、Ω−１０Ａを用いたときのＲＬＵ値の８１．６８％と８５．３５％に達した。
【００７１】
【図４】図４は、本発明におけるＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ配列によるインビトロタンパク質翻訳開始の効率を増大する原理を示す。（Ａ）Ω配列は、４３Ｓ ＰＩＣをリクルートし、タンパク質翻訳を開始するために、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇを組み合わせる必要がある。（Ｂ）ＫｌＮＣＥ１０２は、ポリ（Ａ）結合タンパク質Ｐａｂ１をリクルートすることができるＡリッチ（A-rich）ＲＮＡ配列である。Ｐａｂ１は、ｅＩＦ４Ｇと相互作用することがきる。それによって、４３Ｓ ＰＩＣに対する補充効果を増大させ、翻訳開始の効率を改善する。ＫｌＮＣＥ１０２およびΩ配列は、相乗効果を形成し、翻訳開始効率を高める。
【００７２】
【図５】図５は、Ω−１０Ａ配列およびＧＡＡ配列がＫｌＮＣＥ１０２のインビトロタンパク質翻訳効率を増大したことを示す。ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａタンデムエレメントのインビトロ翻訳効率は、ＫｌＮＣＥ１０２のそれの１．２３倍であった。ＧＡＡ−ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａタンデムエレメントのインビトロ翻訳効率は、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａのそれの１．２８倍、Ω−１０Ａのそれの２．５２倍であった。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
広範かつ詳細な研究の後、多くのスクリーニングおよび探索を通して、インビトロタンパク質翻訳の効率を高めることができる新規な核酸構築物が、初めて予想外に見い出された。本発明の核酸構築物は、真核細胞（例えば、酵母）に由来するＩＲＥＳエンハンサー（例えば、ＳｃＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＮＣＥ１０２、ＳｃＭＳＮ１、ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＢＯＩ１）、Ω配列および酵母（例えば、クルイベロマイセス、好ましくはクルイベロマイセス・ラクティス）に特異的Kozak配列を連結することによって構築される。本発明の核酸構築物を酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系）で使用する場合、合成されたルシフェラーゼの活性を示すための相対発光量（ＲＬＵ）値は、非常に高く、Ω配列およびKozak配列によって連結されたタンデム配列（Ω−１０Ａ）の値の１．６５倍に達する、または、Ω−１０Ａの値とほぼ均等物である。
【００７４】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の核酸構築物の上流にＧＡＡの３残基を配置することがタンパク質合成の効率を増大させ、そしてインビトロ合成を媒介するために本発明の核酸構築物を使用する場合、ルシフェラーゼの相対発光量値が、約０．２８倍（ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａに対してＧＡＡ−ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ）に増大したことを見出した。Ω−１０Ａを用いた場合と比較して、ＧＡＡ−ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａを用いた場合のルシフェラーゼの相対発光量値は、１．５２倍に増大した（すなわち、ＧＡＡ−ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａを用いた場合の相対発光量値は、Ω−１０Ａを用いた場合の値の２．５２倍であった）（図５に示すように）。以上により、本発明者らは、本発明を完成させた。
【００７５】
真核生物系のインビトロ生合成系
【００７６】
真核生物系のインビトロ生合成系は、真核生物細胞に基づく転写−翻訳共役系である。それは、ＤＮＡ鋳型から出発してＲＮＡを合成するか、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として用いてインビトロ（in vitro）でタンパク質合成を完了することができる。真核細胞は、酵母細胞、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽細胞、昆虫細胞、ヒト細胞等を含む。真核生物系のインビトロ生合成系は、複雑な構造を有するＲＮＡまたはタンパク質を合成することができ、タンパク質の翻訳後の修飾ができるなどという利点がある。
【００７７】
本発明において、真核生物系のインビトロ生合成系は、特に限定されない。好ましい真核生物系のインビトロ生合成系は、酵母系のインビトロ生合成系を含み、好ましくは酵母系のインビトロタンパク質合成系を含み、より好ましくはクルイベロマイセス系の発現系（より好ましくは、クルイベロマイセス・ラクティス系の発現系）を含む。
【００７８】
酵母(yeast)は、単純な培養、効率的なタンパク質フォールディングおよび翻訳後の修飾の利点を有する。酵母の中で、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）とピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、複雑な真核タンパク質と膜タンパク質を発現するモデル生物である。酵母はまた、インビトロ翻訳系の調製のための原料として使用される。
【００７９】
クルイベロマイセスは、子嚢胞子形成酵母である。クルイベロマイセスの中で、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces  marxianus）およびクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）は、産業界で広く使用されている酵母である。クルイベロマイセス・ラクティスは、他の酵母と比較して、超分泌能、より良好な大規模発酵特性、食品安全性レベルに適合すること、タンパク質の翻訳後の修飾能などの多くの利点を有する。
【００８０】
本発明において、真核生物系のインビトロ生合成系は、
（ａ）真核細胞抽出物と、
（ｂ）ポリエチレングリコールと、
（ｃ）選択可能にある外来性スクロースと、
（ｄ）水または水性溶媒であり、選択可能にある溶媒と、を含む。
【００８１】
特に一つの好ましい実施形態において、本発明によって提供されるインビトロ生合成系は、真核細胞抽出物、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、アミノ酸混合物、ホスホクレアチン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、クレアチンホスホキナーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ルシフェリン、ルシフェラーゼのＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼを含む。
【００８２】
本発明において、ＲＮＡポリメラーゼは、特に限定されず、１つ以上のＲＮＡポリメラーゼであってもよい。典型的なＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。
【００８３】
本発明において、インビトロ生合成系における真核細胞抽出物の割合は、特に限定されない。通常、インビトロ生合成系における真核細胞抽出物は、２０〜７０％、好ましくは３０〜６０％、より好ましくは４０〜５０％である。
【００８４】
本発明において、真核細胞抽出物は、無傷細胞を含まない。典型的な真核細胞抽出物は、ＲＮＡ合成のための種々のタイプのＲＮＡポリメラーゼと、リボソーム、トランスファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)およびアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを含むタンパク質翻訳のための因子と、開始因子、伸長因子および終止放出因子を含むタンパク質合成に必要な因子とを含む。さらに、真核細胞抽出物はまた、真核細胞の細胞質に由来するいくつかの他のタンパク質、特に、可溶性タンパク質を含む。
【００８５】
本発明において、真核細胞抽出物のタンパク質含量は、２０〜１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍＬである。タンパク質含量の測定法は、クマシーブリリアントブルーアッセイである。
【００８６】
本発明において、真核細胞抽出物の調製方法は、限定されない。好ましい調製方法は、以下の工程、
（ｉ）真核細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）洗浄された真核細胞を得るために、真核細胞を洗浄する工程と、
（ｉｉｉ）洗浄された真核細胞を細胞溶解処理で処理し、粗真核細胞抽出物を得る工程と、
(ｉｖ）粗真核生物抽出物を固液分離により処理して、液相（すなわち、真核生物細胞抽出物）を得る工程と、を含む。
【００８７】
本発明において、固液分離の方法は、特に限定されない。好ましい方法は、遠心分離である。
【００８８】
好ましい実施形態では、遠心分離は、液体状態で行われる。
【００８９】
本発明において、遠心分離条件は、特に限定されない。好ましい遠心分離条件は、５０００ｇ〜１０００００ｇの範囲であり、好ましくは８０００ｇ〜３００００ｇの範囲である。
【００９０】
本発明において、遠心分離時間は、特に限定されない。好ましい遠心分離時間は、０．５分〜２時間の範囲であり、好ましくは２０分〜５０分の範囲である。
【００９１】
本発明において、遠心分離の温度は、特に限定されない。好ましくは、遠心分離は、１〜１０℃、好ましくは２〜６℃で行われる。
【００９２】
本発明において、洗浄処理方法は、特に限定されない。好ましい洗浄処理方法は、ｐＨ７〜８（好ましくはｐＨ ７．４）の洗浄液を用いて処理を行うことである。洗浄液は、特に限定されない。典型的な洗浄液は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸カリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００９３】
本発明において、細胞溶解処理の方法は、特に限定されない。細胞溶解処理のための好ましい方法は、高圧溶解および凍結融解（例えば、液体窒素低温での処理）溶解を含む。
【００９４】
インビトロ生合成系におけるヌクレオシド三リン酸の混合物は、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸およびウリジン三リン酸を含む。本発明において、種々の単一ヌクレオチドの濃度は、特に限定されない。各単一ヌクレオチドの濃度は、通常、０．５〜５ｍＭの範囲であり、好ましくは１．０〜２．０ｍＭの範囲である。
【００９５】
インビトロ生合成系におけるアミノ酸混合物は、天然または非天然アミノ酸を含み、そしてＤ型またはＬ型のアミノ酸を含む。代表的なアミノ酸は、特に限定されないが、２０種類の天然アミノ酸を含む。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジン等が挙げられる。各タイプのアミノ酸の濃度は、通常、０．０１〜０．５ｍＭの範囲であり、好ましくは０．０２〜０．２ｍＭの範囲（例えば、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭおよび０．０８ｍＭ）である。
【００９６】
好ましい実施形態において、インビトロ生合成系は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧの類似体をさらに含む。ＰＥＧまたはＰＥＧの類似体の濃度は、特に限定されない。一般に、生合成系の総重量に基づいて、ＰＥＧまたはＰＥＧの類似体の濃度（ｗ／ｖ）は、０．１〜８％の範囲であり、好ましくは０．５〜４％の範囲、より好ましくは１〜２％の範囲である。ＰＥＧの代表的な実施形態としては、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ３３５０が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のシステムはまた、他の種々の分子量のポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ ２００、４００、１５００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００など）を含むことが理解されるべきである。
【００９７】
好ましい実施形態において、インビトロ生合成系は、スクロースをさらに含む。スクロースの濃度は、特に限定されない。一般に、タンパク質合成系の総重量に基づいて、スクロースの濃度は、０．０３〜４０重量％の範囲であり、好ましくは０．０８〜１０重量％の範囲であり、より好ましくは０．１〜５重量％の範囲である。
【００９８】
特に一つの好ましいインビトロ生合成系は、真核細胞抽出物に加えて、以下の成分を含む。例えば、２２ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ｐＨ ７．４）、３０〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、１．０〜５．０ｍＭの酢酸マグネシウム、１．５〜４ｍＭのヌクレオシド三リン酸混合物、０．０８〜０．２４ｍＭのアミノ酸混合物、２５ｍＭのホスホクレアチン、１．７ｍＭのジチオトレイトール、０．２７ｍｇ／ｍＬのクレアチンホスホキナーゼ、１％〜４％のＰＥＧ、０．５％〜２％のスクロース、８〜２０ｎｇ／μＬのホタルルシフェラーゼのＤＮＡおよび０．０２７〜０．０５４ｍｇ／ｍＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどである。
【００９９】
Ω配列
【０１００】
本明細書中で使用される場合、用語「Ω配列」（すなわち、オメガ配列）は、タバコモザイクウイルスゲノムの５’リーダー配列（５’リーディング配列）をいう。そしてそれは、ウイルスの翻訳エンハンサーである。ΩのＤＮＡ配列は、６８塩基対を含み、１〜６（好ましくは２〜４、より好ましくは３）の数（quantities）の８塩基対長の直接反復モジュール（ＡＣＡＡＴＴＡＣ）と、１〜５（好ましくは１〜３、より好ましくは１）の数の（ＣＡＡ）ｐモジュールとを含む。ここで、ｐは、６〜１２の範囲であり、好ましくは８〜１０の範囲である。これらの２つのモジュールは、Ω配列の翻訳増大機能の鍵である。本発明の酵母系のインビトロタンパク質合成系において、Ω配列は、キャップ非依存的なタンパク質翻訳を開始することができる。これは、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇをリクルートすることによって達成される可能性がある。しかしながら、Ω配列によって開始されるタンパク質翻訳の効率は、比較的低い。Ω配列の構造配列は最適化される必要があり、タンパク質翻訳の効率を高めるために、他のＤＮＡエレメントまたはタンパク質と協働する必要がある。
【０１０１】
Kozak配列
【０１０２】
既知の真核生物のｍＲＮＡ分子中の翻訳開始コドン（ＡＵＧ）の上流および下流の配列を解析することは、“Kozak配列”と呼ばれるコンセンサス配列を見つけるのに役立つ。Kozak配列は、ｍＲＮＡの翻訳開始効率を高めることが検証されている。異なる生物種に由来するKozak配列は、しばしば異なる。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia)のKozak配列および哺乳動物細胞のKozak配列は、有意に異なる。
【０１０３】
本発明において使用されるKozak配列は、６〜１２（好ましくは８〜１０）の数のアデニンデオキシヌクレオシドのオリゴマー鎖、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＴＴＧなど、好ましくはＡＴＧ）およびセリンコドン（例えば、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣなど、好ましくはＴＣＴ）を含む。そしてそれは、クルイベロマイセス（好ましくはクルイベロマイセス・ラクティス）に由来する。
【０１０４】
外来性コード配列（外来性ＤＮＡ）
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「外来性コード配列」および「外来性ＤＮＡ」は、互換的に使用され、そして両方とも、ＲＮＡまたはタンパク質の合成を導くために使用される外来性ＤＮＡ分子をいう。通常、ＤＮＡ分子は、線状または環状である。ＤＮＡ分子は、外来性ＲＮＡまたは外来性タンパク質をコードする配列を含む。
【０１０６】
本発明において、外来性コード配列の例としては、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。外来性タンパク質をコードする配列はまた、プロモーター配列、５’非翻訳配列、および／または３’非翻訳配列を含む。
【０１０７】
本発明において、外来性ＤＮＡの選択は、特に限定されない。通常、外来性ＤＮＡは、小さな非コードＲＮＡ(small non-coding RNA, ｓｎｃＲＮＡ)、長い非コードＲＮＡ(long non-coding RNA,ｌｎｃＲＮＡ)、転移ＲＮＡ(ｔransfer RNA,ｔＲＮＡ)、グルコサミン−６−リン酸シンセターゼ（glucosamine-6-phosphate synthase, ｇｌｍＳ）などを含むリボザイム、小さな核ＲＮＡ(small nuclear RNA,ｓｎＲＮＡ)、ＲＮＡとタンパク質の複合体（例えば、スプライソソーム(spliceosome)など）、他の様々な非コードＲＮＡ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１０８】
外来性ＤＮＡはまた、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチンおよび抗体の可変領域をコードする外来性ＤＮＡ、ルシフェラーゼミュータントのＤＮＡ、およびそれらの組合せからなる群から選択されることができる。
【０１０９】
外来性ＤＮＡはまた、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、およびキシラナーゼをコードする外来性ＤＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されることができる。
【０１１０】
好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、緑色蛍光タンパク質（enhanced GFP、ｅＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidaseＬａｃＺ）、ヒトリジン−ｔＲＮＡシンセターゼ(lysine-tRNA synthetase)、ヒトロイシン−ｔＲＮＡシンセターゼ(leucine-tRNA synthetase)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、マウスカタラーゼ(catalase)、およびそれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコードする。
【０１１１】
核酸構築物
【０１１２】
本発明は、式Ｉの核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５ （Ｉ）
【０１１３】
式中、Ｚ１〜Ｚ５は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［oligo（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
【０１１４】
本発明はまた、５’から３’に式ＩＩの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ１−Ｚ２ Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６ （ＩＩ）
【０１１５】
式中、Ｚ１〜Ｚ６は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［oligo（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
【０１１６】
本発明はまた、５’から３’に式ＩＩＩの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２ Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６ （ＩＩＩ）
【０１１７】
式中、Ｚ０〜Ｚ６は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０は、プロモーターエレメントであり、プロモーターエレメントは、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、およびこれらの組合せからなる群から選択され、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［oligo（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
【０１１８】
本発明はまた、５’から３’に式ＩＶの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ０’−Ｚ１−Ｚ２ Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＶ）
【０１１９】
式中、Ｚ０’〜Ｚ６は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０’はＧＡＡであり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［oligo（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
【０１２０】
本発明において、外来性タンパク質のコード配列の選択は、特に限定されない。通常、外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチンおよび抗体の可変領域をコードする外来性ＤＮＡ、ルシフェラーゼ変異体のＤＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１２１】
外来性タンパク質のコード配列はまた、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質をコードすることができる。
【０１２２】
さらに、本発明の核酸構築物は、線状または環状であってもよい。本発明の核酸構築物は、一本鎖または二本鎖であってもよい。本発明の核酸構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。
【０１２３】
好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物の配列は、配列番号２〜１７のいずれか１つである。
【０１２４】
好ましい実施形態において、核酸構築物の配列は、配列番号２〜９のいずれか１つである。
【０１２５】
好ましい実施形態において、核酸構築物の配列は、配列番号３、４または６である。
【０１２６】
好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物の配列は、配列番号８５〜８７のいずれか１つである。
【０１２７】
別の好ましい実施形態において、構築物は、プロモーター、ターミネーター、poly（Ａ）エレメント、輸送エレメント、遺伝子標的化エレメント、選択マーカー遺伝子、エンハンサー、耐性遺伝子、およびトランスポザーゼをコードする遺伝子からなる群より選択されるエレメントまたは組み合わせをさらに含む。
【０１２８】
種々の選択マーカー遺伝子は、本発明において使用されることができる。これは、特に限定されないが、栄養要求性マーカー、耐性マーカー、およびレポーター遺伝子マーカーを含む。選択マーカーの適用は、組換え細胞（レコン）のスクリーニング（篩い分け）において役割を果たす。そこでは、レセプター細胞は、非形質転換細胞と有意に識別することができる。栄養要求性マーカーは、伝達されたマーカー遺伝子の助けを借りて、レセプター細胞の変異遺伝子に相補的である。その結果、レセプター細胞は、野生型増殖を示す。耐性マーカーは、耐性遺伝子がレセプター細胞に移入されることを指す。そして、移入された遺伝子により、レセプター細胞は一定の薬物濃度で薬物耐性を示すことができる。本発明の好ましい様式として、耐性マーカーは、組換え細胞の簡便なスクリーニングを達成するために使用される。
【０１２９】
本発明において、本発明の核酸構築物を本発明の酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のタンパク質生合成系等）に適用することにより、外来性タンパク質翻訳の効率を著しく向上させることができる。具体的には、本発明の核酸構築物を用いて合成されたルシフェラーゼの活性を示す相対発光量値は非常に高い。本発明の核酸構築物（例えば、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ）を用いた場合の相対発光量値は、Ω−１０Ａ配列を用いた場合のそれの１．６５倍であった。
【０１３０】
ベクター、遺伝子組み換え細胞
【０１３１】
本発明はまた、本発明の核酸構築物を含むベクターまたはベクターの組合せを提供する。好ましくは、ベクターは、細菌プラスミド、ファージ（すなわち、バクテリオファージ）、酵母プラスミド、動物細胞ベクター、およびシャトルベクターからなる群より選択される。ベクターは、トランスポゾンベクターである。組換えベクターを調製するための方法は、当業者に周知である。宿主中で複製され、安定である限り、任意のプラスミドまたはベクターを使用することができる。
【０１３２】
当業者は、周知の方法を使用して、本発明のプロモーターおよび／または目的遺伝子配列を含む発現ベクターを構築する。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、インビボ組換え技術などが含まれる。
【０１３３】
本発明はまた、遺伝子組み換え細胞を提供する。遺伝子組み換え細胞は、構築物、ベクターまたはベクターの組合せを含む。または、遺伝子組み換え細胞の染色体は、構築物またはベクターに一体化される。別の好ましい実施形態において、遺伝子組み換え細胞は、トランスポザーゼをコードする遺伝子を含むベクターをさらに含む。または、遺伝子組み換え細胞の染色体は、トランスポザーゼ遺伝子と一体化される。
【０１３４】
好ましくは、遺伝子組み換え細胞は、真核細胞である。
【０１３５】
別の好ましい実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、昆虫細胞、コムギ胚芽細胞、ウサギ網状赤血球および他の高等真核細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１３６】
別の好ましい実施形態において、真核細胞は、酵母細胞（好ましくはクルイベロマイセス細胞、より好ましくはクルイベロマイセス・ラクティス細胞）を含むが、これらに限定されない。
【０１３７】
本発明の構築物またはベクターは、適切な遺伝子組み換え細胞を形質転換するために使用される。遺伝子組み換え細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス、アグロバクテリウムなど）、下等真核細胞（例えば、酵母細胞）、または高等動物細胞（例えば、昆虫細胞など）であってもよい。当業者は、適切なベクターおよび遺伝子組み換え細胞を選択する方法を知っている。遺伝子組み換え細胞の組換えＤＮＡによる形質転換は、当業者に周知の従来の技術を用いて実施されることができる。宿主が原核生物（例えば、大腸菌など）である場合、ＣａＣｌ２法またはエレクトロポレーション法を用いて処理することができる。宿主が真核生物である場合、ＤＮＡトランスフェクション法、リン酸カルシウム共沈法および従来の機械的方法（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージングなど）を選択的に用いることができる。植物細胞の形質転換は、アグロバクテリウム媒介形質転換または遺伝子銃形質転換などの方法、例えば、リーフディスク法、未成熟胚形質転換法、花芽浸漬法などを用いることによって実行されることができる。
【０１３８】
インビトロハイスループットタンパク質合成方法
【０１３９】
本発明は、インビトロハイスループットタンパク質合成方法を提供する。この方法は、以下の工程：
（ｉ）真核生物系のインビトロ生合成系の存在下で、本発明の第１〜第４の態様から選択される核酸構築物を提供する工程と、
（ｉｉ）適切な条件下で、工程（ｉ）の真核生物系のインビトロ生合成系をＴ１の期間インキュベートして、外来性タンパク質を合成する工程と、を含む。
【０１４０】
別の好ましい実施形態において、この方法は、（ｉｉｉ）真核生物系のインビトロ生合成系から外来性タンパク質を任意選択で単離または検出する工程をさらに含む。
【０１４１】
本発明の主な利点は、次の（１）〜（７）を含む。
【０１４２】
（１）初めて、本発明は、プロモーター、酵母由来ＩＲＥＳ、Ω配列、Kozak配列および外来性タンパク質のコード配列を含む核酸構築物が本発明の真核生物系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系）に使用される場合、外来性タンパク質翻訳の効率を有意に向上させることができることを見出した。
【０１４３】
（２）Ω配列およびKozak配列とタンデムに連結された本発明の真核細胞の内因性ＩＲＥＳは、真核生物系のインビトロ生合成系（eukaryote-based in vitro biosynthesis system）におけるタンパク質翻訳開始の効率を高めることができる。翻訳開始の効率を高めることに関して、タンデムＤＮＡエレメントは、後者の２つのみを連結するタンデム配列（Ω−１０Ａ）よりも有利である。クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ生合成系において、合成を開始するためにＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａを使用した場合のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）の相対発光量（ＲＬＵ）値は１．６７×１０９に達した。これは、Ω−１０Ａ配列を使用した場合のそれの１．６５倍であった。
【０１４４】
（３）サッカロマイセス・セレビシエと比較して、クルイベロマイセス・ラクティスは、その安全性と高効率性のため、食品分野および医薬品分野において、タンパク質合成に使用されることができる。その安全性と高効率性、ならびにインビトロ生合成系（in vitro biosynthesis）の利点（例えば、ハイスループットタンパク質合成とスクリーニングに最適、毒性タンパク質を合成する能力、短時間、低コストなど）のため、その結果、クルイリベロマイセス・ラクティス細胞由来のインビトロ生合成系は、タンパク質合成の関連分野で広く利用されることができる。
【０１４５】
（４）本発明によって提供される核酸構築物は、真核生物系のインビトロ生合成系のタンパク質翻訳を開始する効率を高めるだけでなく、より重要なことには、異なるタンパク質の合成のためのクルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ生合成系の可能性を増大させる。
【０１４６】
（５）本発明の核酸構築物は、タンパク質翻訳開始の効率を高めるだけでなく、真核生物系の細胞インビトロ生合成系に使用されるＤＮＡエレメントを設計するための新規なコンセプトおよび新しい方法を提供する。これは、科学的研究および工業生産の分野において、関連システムの適用を大いに高めることができる。
【０１４７】
（６）本発明は、本発明の核酸構築物と強力なプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター）を組み合わせることによっても、非常に高いタンパク質合成効率を達成することができることを初めて見出した。
【０１４８】
（７）本発明は、本発明の核酸構築物の上流にＧＡＡの３つの残基を配置することによって、非常に高いタンパク質合成効率も達成することができることを初めて見出した。
【０１４９】
本発明を、具体的な実施例に関連して以下にさらに記載する。これらの実施例は、本発明を例示するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するためには使用されないことが理解されるべきである。以下の実施例において、特に記載された条件を伴わない実験方法に関して、当業者は、一般に、従来の条件（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）に記載された条件など）に従うか、または、製造業者によって推奨される条件に従う。特に断らない限り、パーセンテージおよび部分は、重量によるパーセンテージおよび部分を指す。
【０１５０】
特に明記しない限り、本発明の実施例で使用される材料および試薬は、すべて市販の製品である。
【０１５１】
実施例１：真核細胞の内因性ＩＲＥＳ、Ω配列およびクルイベロマイセス・ラクティス特異的Kozak配列をタンデムに連結するＤＮＡエレメントのデザイン
【０１５２】
１．１  クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における内因性ＩＲＥＳの測定：
クルイベロマイセス・ラクティスの４つ内因性ＩＲＥＳおよびサッカロマイセス・セレビシエにおけるそれらと相同性を持つタンパク質に対応するＩＲＥＳ（表１に示す）は、インビトロタンパク質合成を開始することができる。Ｆｌｕｃの合成を開始するＩＲＥＳの中で、６つのＩＲＥＳ（ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１およびＳｃＮＣＥ１０２）は、従来のΩ配列よりも高い相対発光量（ＲＬＵ）値を示した。他の２つＩＲＥＳ（ＫｌＢＯＩ１およびＳｃＢＯＩ１）は、Ω配列よりも低いＲＬＵ値を示した（図２に示す）。これらの８つのＩＲＥＳは、Ω配列およびKozak配列とタンデムに連結されることが決定された。
【０１５３】
１．２  １６のタンデムエレメントの決定：
８つの内因性ＩＲＥＳをΩ配列およびクルイベロマイセス・ラクティスに特異的Kozak配列とタンデムに連結し、Ω配列に対してＩＲＥＳの上流または下流の位置を変化させる。その結果、合計１６のタンデムＤＮＡエレメントを設計した（ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２およびＳｃＢＯＩ１−Ω−１０Ａ、ならびに、Ω−ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２およびＳｃＢＯＩ１−１０Ａ）。配列番号２〜１７に示されるタンデムエレメントの配列は、上記のタンデムＤＮＡエレメント（ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２およびＳｃＢＯＩ１−Ω−１０Ａ、ならびに、Ω−ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２およびＳｃＢＯＩ１−１０Ａ）の配列にそれぞれ対応する。
【０１５４】
１．３  タンデムエレメントおよびレポータータンパク質遺伝子（Ｆｌｕｃ）の設計：
上記に設計されたような１６のタンデムエレメントは、Ω−１０Ａに置換するために、既存のΩ−１０Ａ−Ｆｌｕｃプラスミド（カンマ−ヘルスケアコード（シャンハイ）バイオテックカンパニーリミテッドから入手、Ω−１０Ａ配列は配列番号１に示される）に挿入された。そして、１６の新しいプラスミドは、形成された。得られた１６の新しいプラスミドは、それぞれ、ＫｌＦＬＯ８−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＫｌＭＳＮ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＫｌＢＯＩ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＦＬＯ８−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＭＳＮ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＢＯＩ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＫｌＦＬＯ８−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＫｌＭＳＮ１−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＫｌＮＣＥ１０２−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＫｌＢＯＩ１−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＳｃＦＬＯ８−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＳｃＭＳＮ１−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＳｃＮＣＥ１０２−１０Ａ−ＦｌｕｃおよびΩ−ＳｃＢＯＩ１−１０Ａ−Ｆｌｕｃだった。その中で、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＦＬＯ８−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＫｌＭＳＮ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ配列をそれぞれ配列番号８５〜８７に示した。
【０１５５】
表１  サッカロマイセス・セレビシエおよびクルイベロマイセス・ラクティスにおける関連遺伝子
2021503950.tif 000002
【０１５６】
実施例２：インビトロタンパク質合成系のためのタンデムＤＮＡエレメントを含むプラスミドの構築
【０１５７】
２．１  プラスミドの構築：
Ω配列の上流または下流にそれぞれ位置することによって、Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃプラスミドに、それぞれ８個の内因性ＩＲＥＳを挿入する。具体的に使用したプライマーを表２に示す。
【０１５８】
１つのプラスミドの具体的な構築プロセスは、以下の通りである。
【０１５９】
挿入するＩＲＥＳ断片と、Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃベクタープラスミドをそれぞれ２対のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。各ＰＣＲ増幅産物の１０μＬを採取し、混合した。次いで、増幅産物の２０μＬ混合物に１μＬのＤｐｎＩを添加し、続いて、３７℃で６時間インキュベートした。その後、４μＬのＤｐｎＩ処理物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。その後、氷上に３分間置き、ＬＢ液体培地２００μＬを加え、３７℃で４時間振盪培養した。その後、混合物をＡｍｐ抗生物質を含有するＬＢ固体培地上にコーティングし、一晩培養した。増殖培養を実施するために、６つのモノクローナルコロニーを採取した。配列決定により正しいことを確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０１６０】
表２  ＰＣＲ増幅用のプライマー
2021503950.tif 000003
【０１６１】
実施例３：酵母系のインビトロタンパク質合成システムにおけるタンデムＤＮＡエレメントの適用
【０１６２】
３．１  Ｔ７転写開始配列と終止配列との間にある全てのプラスミド中のタンデムＤＮＡエレメントおよびＦｌｕｃを含むフラグメント（断片）は、プライマーとするＴ７＿ｐＥＴ２１ａ＿Ｆ：ＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ（配列番号８２）およびＴ７ｔｅｒ＿ｐＥＴ２１ａ＿Ｒ：ＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧ（配列番号８３）を使用しながら、ＰＣＲ法によって増幅された。
【０１６３】
増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿法を用いて精製し、濃縮した。１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）をＰＣＲ産物に添加し、次いで、２．５〜３倍容量の９５％エタノールを添加した（酢酸ナトリウムの添加後の容量に対して）。続いて、氷上で１５分間インキュベートした。その後、混合物は、室温で１４０００ｇより高速で３０分間遠心分離された。そして、上清を除去した。沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、次いで１５分間遠心分離した。続いて、上清を除去した。この沈殿物を超純水に溶解し、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０１６４】
３．２  使用説明書に従って、精製されたＤＮＡ断片を、自己作製されたクルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロタンパク質合成系に添加した。上記反応系を２５〜３０℃の環境に置き、約２〜６時間混合物をインキュベートした。完了後、同じ容量のＦｌｕｃの基質とするルシフェリン(luciferin)を、９６ウェルまたは３８４ウェルホワイトプレートの上記反応用ウェルに添加した。これを直ちにＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１２０多機能マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）に置いた。吸光度を読み取って、Ｆｌｕｃの活性を検出した。ここで、活性の単位は、図２に示すように、相対発光量（Relative Light Unit,ＲＬＵ）値である。
【０１６５】
３．３  真核細胞の内因性ＩＲＥＳ配列を持たないＤＮＡ断片（Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ）群を対照として使用した。ＤＮＡ鋳型を添加しない反応群を陰性対照（ＮＣ）として使用した。３つの独立したサンプリングを、各群について使用した。
【０１６６】
実験結果
【０１６７】
１．真核細胞の内因性ＩＲＥＳと、Ω配列と、クルイベロマイセス・ラクティスに特異的なKozak配列とを連結するＤＮＡエレメントの設計
【０１６８】
合計１６個のタンデムＤＮＡエレメントを設計した。Ω−１０Ａ配列を置換するために、１６個のエレメントのすべてをΩ−１０Ａ−Ｆｌｕｃプラスミドにそれぞれ挿入した。インビトロタンパク質合成に使用するための１６個のプラスミドを形成した。
【０１６９】
２．インビトロタンパク質合成系のためのタンデムＤＮＡエレメントを含むプラスミドの構築
【０１７０】
多くの試みの後、インビトロタンパク質合成系のための合計１６個のプラスミドが首尾よく構築された。
【０１７１】
３．酵母系のインビトロタンパク質合成系におけるタンデムＤＮＡエレメントの応用
【０１７２】
図３に示すように、選ばれた３つのタンデムＤＮＡエレメントのうち、酵母系のインビトロタンパク質合成系におけるホタルルシフェラーゼ(firely luciferase, Fluc)の相対発光量（ＲＬＵ）値に関して、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０ＡによるＲＬＵ値のみがΩ−１０Ａ配列によるＲＬＵ値を超えた。ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａによる相対発光量値は、Ω−１０Ａ配列によるそれに対して１．６５倍である１．６７×１０９に達した（Ω−１０Ａ配列による相対発光量値は１．０１×１０９であった）。さらに、ＳｃＦＬＯ８−Ω−１０ＡとＫｌＭＳＮ１−Ω−１０Ａによる相対発光量値は、Ω−１０Ａ配列による値に近く、それぞれ、Ω−１０Ａ配列によるＲＬＵ値の８１．６８％および８５．３５％に達した。
【０１７３】
検出器による相対発光量（ＲＬＵ）値と、タンパク質濃度との間の線形関係の範囲内で、最も高い活性を示したＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａによる相対発光量値は、Ω−１０Ａ配列によるものの１．６５倍であったので、タンデムＤＮＡエレメントは、タンパク質合成を約１．６５倍に増強することができることを示している。
【０１７４】
本発明の結果は、真核細胞の内因性ＩＲＥＳと、Ω配列と、クルイベロマイセス・ラクティスに特異的なKozak配列をタンデムに連結することは、タンパク質合成の効率を高めることができることを示す。その２つは、互いに相互作用することができる翻訳開始因子Ｐａｂ１およびｅＩＦ４Ｇをリクルートして、タンパク質合成効率を促進する相乗効果を達成することができる（図４に示す）。そして、酵母系のインビトロタンパク質合成系に適用することができる。それにおいて、タンパク質合成を開始する効率は、Ω配列およびKozak配列を含む一般に使用されるタンデムエレメントΩ−１０Ａのそれを超えることができる、合成がＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａにより開始される合成するタンパク質の量は、Ω−１０Ａ配列によるそれの１．６５倍であった。ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａは、酵母系のインビトロタンパク質合成系のタンパク質翻訳効率を上昇させ、タンパク質合成を開始するためのクルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ合成系用の翻訳エレメントの選択性を増加させ、クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロタンパク質合成系の有用性を大幅に増大した。
【０１７５】
さらに、研究結果によれば、本発明はまた、ＧＡＡの３つの残基をタンデムＤＮＡエレメントの上流に配置すること（転写されたｍＲＮＡの５’末端はＧＡＡである）により、タンパク質合成効率を増大することができることを見出した。インビトロ合成を媒介するために本発明の核酸構築物およびＧＡＡのタンデムを使用した場合のルシフェラーゼの相対発光量値は、本発明の核酸構築物を単独で使用した場合のＲＬＵ値の１．２８倍であった（図５に示す）。
【０１７６】
さらに、研究結果によれば、本発明は、本発明の核酸構築物（例えば、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ）による相対発光量値は、ＫｌＮＣＥ１０２による相対発光量値の１．２３倍である（図５に示す）ことも見出した。
【０１７７】
本発明において言及される全ての文献は、各文献が参照により個々に組み込まれるのと同様に、参照により本出願に組み込まれる。また、当業者であれば、本発明の上記内容を読めば、本発明に様々な変更や修正を加えることができ、これらの均等な形成も本発明の特許請求の範囲に含まれることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月22日(2020.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、タンパク質合成効率を高めることができるタンデムＤＮＡエレメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、細胞における重要な分子であり、細胞のほとんど全ての機能に関与する。タンパク質の配列および構造は、その機能を決定する。細胞において、タンパク質は、酵素類として種々の生化学反応を触媒することができ、シグナル分子として生物体の種々の活動を協調することができ、生物形態をサポートし、エネルギーを蓄積し、分子を輸送し、生物体を動かせることができる。生体医学の分野において、標的薬としての抗体（タンパク質の一種）は、がんや他の病気を治療するための重要な手段である。
【０００３】
細胞では、栄養欠乏などの外界圧力に応答するだけでなく、細胞の発生や分化など様々なプロセスにおいて、タンパク質翻訳の調節が重要な役割を果たしている。タンパク質翻訳の４つのプロセスには、翻訳開始、翻訳伸長、翻訳終結およびリボソームのリサイクリングがある。その中でも、翻訳開始が最も調節されるプロセスである。真核細胞における翻訳開始には２つの方法がある。すなわち、伝統的なキャップ依存的方法およびキャップ非依存的方法（図１に示す）である。
【０００４】
「キャップ構造」依存的な翻訳開始は、いくつかの種類の翻訳開始因子と、リボソームの４０Ｓ小サブユニットとが関与する非常に複雑なプロセスである。「キャップ構造」非依存的な翻訳開始は、主に、ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に位置する内部リボソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）によって媒介される。ＩＲＥＳは、１９８０年代にウイルス性ｍＲＮＡで初めて発見された。そして、細胞内の内因性ＩＲＥＳも、後に広く報告された。ウイルス性ＩＲＥＳは、通常、複雑な二次および三次構造を有する。宿主細胞内で、ウイルス性ＩＲＥＳは、宿主細胞の翻訳開始因子に依存して、または宿主細胞の翻訳開始因子とは無関係に、タンパク質翻訳を開始するために宿主細胞のリボソームをリクルート（recruit）する。ウイルス性ＩＲＥＳと比較して、細胞内の内因性ＩＲＥＳは、通常、タンパク質翻訳を開始する効率が低いであり、且つまた、共通性を持たない様々な複雑な機構によって調節される。細胞内の異なる内因性ＩＲＥＳは、配列や構造に共通性を有さない。これは、予測が困難である。
【０００５】
細胞内タンパク質合成の上記の理解に加えて、タンパク質合成はまた、細胞外で行われる。インビトロタンパク質合成系は一般に、細菌、真菌、植物細胞または動物細胞に基づく溶解システムを指す。これは、外来性タンパク質の迅速かつ効率的な翻訳を完了するために、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸およびＡＴＰなどの成分を添加する。現在、頻繁に使用される市販のインビトロタンパク質発現系には、大腸菌抽出物（Escherichia coli extract,ＥＣＥ）系、ウサギ網状赤血球溶解物（rabbit reticulocyte lysate,ＲＲＬ）系、コムギ胚芽抽出物（wheat germ extract,ＷＧＥ）系、昆虫細胞抽出物（insect cell extract,ＩＣＥ）系およびヒト供給源系が含まれる。
【０００６】
インビトロで合成されたｍＲＮＡは通常、“キャップ構造”を有さない。“キャップ構造”によるｍＲＮＡの修正は、時間がかかり、高価である。結果として、インビトロタンパク質合成系は一般に、キャップ非依存的な翻訳開始方法を使用して、タンパク質合成が行われる。しかし、ＩＲＥＳまたはオメガ（Ω）配列のみを使用する翻訳開始の効率はかなり低く、インビトロでの迅速、効率的およびハイスループットなタンパク質合成の目的は達成されない。現在のところ、これら２つのタイプの翻訳開始エレメントをタンデムに連結することに関する研究はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＩＲＥＳ配列とΩ配列とをタンデムに連結し、タンパク質合成効率を高めることができる新規な核酸構築物を開発することが、当技術分野において緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの目的は、ＩＲＥＳ配列とオメガ（Ω）配列とをタンデムに連結し、タンパク質翻訳の効率を高めることができる新規な核酸構築物を提供することである。
【０００９】
第１の態様によれば、本発明は、式Ｉの核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５（Ｉ）
式中、Ｚ１〜Ｚ５は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントは、ＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、［オリゴ（Ａ）］ｎで表され、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
【００１０】
別の好ましい実施形態では、Ｚ１は、酵母に由来する。
【００１１】
別の好ましい実施形態において、ＩＲＥＳエレメントの供給源は、原核細胞および真核細胞からなる群より選択される１つ以上のタイプの細胞である。
【００１２】
別の好ましい実施形態において、真核細胞は、高等真核細胞を含む。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、ＩＲＥＳエレメントは、内因性ＩＲＥＳエレメントおよび外因性ＩＲＥＳエレメントを含む。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、ＩＲＥＳエレメントの供給源は、ヒト（human）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Chinese hamster overy cell）、昆虫細胞、コムギ胚芽細胞(Wheat germ cell)およびウサギ網状赤血球(Rabbit reticulocyte)からなる群より選択される１つ以上のタイプの細胞である。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、ＩＲＥＳエレメントは、ＳｃＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＮＣＥ１０２、ＳｃＭＳＮ１、ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＢＯＩ１、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１７】
別の好ましい実施形態において、クルイベロマイセスは、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアナス（Kluyveromycesmarxianus）、クルイベロマイセス・ドブズハンスキ（Kluyveromycesdobzhanskii）、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、翻訳開始コドンは、ＡＴＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＴＴＧおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、翻訳開始コドンは、ＡＴＧである。
【００２０】
別の好ましい実施形態において、セリンコドンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、セリンコドンは、ＴＣＴである。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、ｎは、６〜１２の範囲であり、好ましくは８〜１０の範囲である。
【００２３】
別の好ましい実施形態では、Ω配列は、直接反復モジュール（ＡＣＡＡＴＴＡＣ）ｍと、（ＣＡＡ）ｐとを含む。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、ｍは、１〜６の範囲であり、好ましくは２〜４の範囲である。
【００２５】
別の好ましい実施形態において、ｐは、６〜１２の範囲であり、好ましくは８〜１０の範囲である。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、（ＣＡＡ）ｐモジュールの数は、１〜５の範囲であり、好ましくは１〜３の範囲である。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、（ＣＡＡ）ｐモジュールは、改善された（ＣＡＡ）ｐモジュールをさらに含む。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、Kozak配列は、配列番号８４に示される。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、核酸構築物の配列は、配列番号２〜１７のいずれか１つである。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、核酸構築物の配列は、配列番号２〜９のいずれか１つである。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、核酸構築物の配列は、配列番号３、４または６である。
【００３２】
第２の態様によれば、本発明は、５’から３’に式ＩＩの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＩ）
式中、Ｚ１〜Ｚ６は、それぞれ核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１はエンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、［オリゴ（Ａ）］ｎで表され、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、原核生物または真核生物に由来する。
【００３４】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、動物、植物または病原体に由来する。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、哺乳動物に由来し、好ましくは、霊長類またはげっ歯類に由来する（ヒト、マウスおよびラットを含む）。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)Ｅ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼおよびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質をコードする。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、外来性タンパク質は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)Ｅ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼおよびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、核酸構築物の配列は、配列番号８５〜８７のいずれか１つである。
【００３９】
第３の態様によれば、本発明は、５’から３’に式ＩＩＩの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＩＩ）
式中、Ｚ０〜Ｚ６は、それぞれ、核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０は、プロモーターエレメントであり、プロモーターエレメントは、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーターおよびこれらの組合せからなる群から選択され、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、［オリゴ（Ａ）］ｎで表され、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
【００４０】
第４の態様によれば、本発明は、５’から３’に式ＩＶの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ０’−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＶ）
式中、Ｚ０’〜Ｚ６は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０’は、ＧＡＡであり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントは、ＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列(leading sequence)であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖であり、［オリゴ（Ａ）］ｎで表され、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は、酵母に由来する。
【００４１】
第５の態様によれば、本発明は、ベクターまたはベクターの組合せを提供する。ベクターまたはベクターの組合せは、本発明の第１の態様〜第４の態様に記載の核酸構築物を含有する。
【００４２】
第６の態様によれば、本発明は、遺伝子組み換えされた細胞を提供する。遺伝子組み換えされた細胞のゲノムは、１つ以上の部位で、本発明の第１の態様から第４の態様による核酸構築物と一体化される。または、遺伝子組み換えされた細胞は、本発明の第５の態様によるベクターまたはベクターの組み合わせを含む。
【００４３】
別の好ましい実施形態において、遺伝子組み換えされた細胞は、原核細胞および真核細胞を含む。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、真核細胞は、高等真核細胞を含む。
【００４５】
別の好ましい実施形態において、遺伝子組み換えされた細胞は、ヒト細胞（例えば、Ｈｅｌａ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞、昆虫細胞、コムギ胚芽細胞、ウサギ網状赤血球、酵母細胞およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、遺伝子組み換えされた細胞は、酵母細胞である。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００４８】
別の好ましい実施形態において、クルイベロマイセスは、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromycesmarxianus）、クルイベロマイセス・ドブズハンスキ（Kluyveromycesdobzhanskii）、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００４９】
第７の態様によれば、本発明は、キットを提供する。キットに含まれる試薬は、以下の群のうちの１つ以上から選択される。
（ａ）本発明の第１の態様から第４の態様に記載の核酸構築物、
（ｂ）本発明の第５の態様に記載のベクター又はベクターの組合せ、および
（ｃ）本発明の第６の態様による遺伝子組み換え細胞。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、キットは、（ｄ）真核生物系のインビトロ生合成系（例えば、真核生物系のインビトロタンパク質合成系など）をさらに含む。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、真核生物系のインビトロ生合成系は、酵母系のインビトロ生合成系、チャイニーズハムスター卵巣細胞系のインビトロ生合成系、昆虫細胞系のインビトロ生合成系、Ｈｅｌａ細胞系のインビトロ生合成系、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、真核生物系のインビトロ生合成系は、真核生物系のインビトロタンパク質合成系を含む。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、真核生物系のインビトロタンパク質合成系は、酵母系のインビトロタンパク質合成系、チャイニーズハムスター卵巣細胞系のインビトロタンパク質合成系、昆虫細胞系のインビトロタンパク質合成系、Ｈｅｌａ細胞系のインビトロタンパク質合成系、およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【００５４】
別の好ましい実施形態では、キットは、（ｅ）酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系など）をさらに含む。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系など）は、クルイベロマイセス系のインビトロ生合成系（例えば、クルイベロマイセス系のインビトロタンパク質合成系など）であり、好ましくは、クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ生合成系(例えば、クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロタンパク質合成系ど）である。
【００５６】
第８の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様から第４の態様に係る核酸構築物と、本発明の第５の態様に係るベクターまたはベクターの組合せと、本発明の第６の態様に係る遺伝子組み換えされた細胞または本発明の第７の態様に係るキットの使用を提供する。これは、ハイスループットなインビトロタンパク質合成に適用可能である。
【００５７】
第９の態様によれば、本発明は、以下の工程を含む、外来性タンパク質合成のためのインビトロハイスループット方法を提供する。
（ｉ）真核生物系のインビトロ生合成系の存在下で、本発明の第１の態様から第４の態様による核酸構築物を提供する工程、
（ｉｉ）適切な条件下で、工程（ｉ）の真核生物系のインビトロ生合成系をＴ１の期間インキュベートして、外来性タンパク質を合成する工程。
【００５８】
別の好ましい実施形態において、この方法は、（ｉｉｉ）真核生物系のインビトロ生合成系から外来性タンパク質を任意選択で単離または検出する工程をさらに含む。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、真核生物系のインビトロ生合成系は、酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系など）である。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系など）は、クルイベロマイセス系のインビトロ生合成系（例えば、クルイベロマイセス系のインビトロタンパク質合成系など）であり、好ましくはクルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ生合成系（例えば、クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロタンパク質合成系など）である。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、原核生物または真核生物に由来する。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、動物、植物または病原体に由来する。
【００６３】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、哺乳動物に由来し、好ましくは、霊長類またはげっ歯類に由来する（ヒト、マウスおよびラットを含む）。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質をコードする。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、外来性タンパク質は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）において、反応温度は、２０〜３７℃の範囲であり、好ましくは２２〜３５℃の範囲である。
【００６７】
別の好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）において、反応時間は、１〜１０時間の範囲であり、好ましくは２〜８時間の範囲である。
【発明の効果】
【００６８】
本発明の範囲内で、本発明において以下（例えば、実施形態または実施例）で具体的に説明されるそれぞれの技術的特徴および上述のそれぞれの技術的特徴は、互いに組み合わせることができ、それによって、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成することができることを理解されたい。スペースの制約のため、ここでは、これ以上のトートロジーはない。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、生合成においてタンパク質翻訳開始における５’−ＵＴＲ配列の重要な役割を示す。５’−ＵＴＲは主に、細胞内で、タンパク質の翻訳開始を調節し、ｍＲＮＡを安定化させる役割を果たしている。（Ａ）キャップ依存的なタンパク質翻訳開始のプロセスにおいて、５’−ＵＴＲは、翻訳開始因子および４３Ｓ開始前複合体（pre-initiation complex, ＰＩＣ）をリクルート（recruit）するために重要な役割を果たす。そして、それは、４３ＳＰＩＣのスキャニングおよび翻訳開始も調節できる。キャップ非依存的なタンパク質翻訳開始のプロセスでは、（Ｂ）二次構造をもつ５’−ＵＴＲと、（Ｃ）二次構造をもたない５’−ＵＴＲの両方がいくつかのタンパク質因子の助けを必要とし、４３ＳＰＩＣをリクルートするために非常に重要である。
【図２】図２は、インビトロタンパク質合成系において、真核生物内因性ＩＲＥＳがタンパク質合成を開始する効率を示す。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）に由来し、相同性を持つＩＲＥＳから選択された８種のＩＲＥＳは、酵母系のインビトロタンパク合成系で使用された。従来のΩ配列と比較して、６つのＩＲＥＳ（ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２、ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１およびＫｌＮＣＥ１０２）を使用して、その合成を開始した場合のルシフェラーゼの相対発光量（ＲＬＵ）値は、Ω配列を使用した場合よりも高かった。
【００７０】
【図３】図３は、インビトロタンパク質合成系においてタンパク質合成を開始する効率におけるタンデムＤＮＡエレメントの比較を示す。Ω配列の上流または下流のそれぞれに位置する８個のＩＲＥＳを、Ω配列およびクルイベロマイセス・ラクティス−に特異的Kozak配列とタンデムにそれぞれ連結した。１６個のタンデムＤＮＡエレメントを構築した。１６個のタンデムＤＮＡエレメントは、インビトロタンパク質合成系において使用された。合成を開始するためにＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａを使用した場合のルシフェラーゼの相対発光量（ＲＬＵ）値は、Ω配列とKozak配列とを連結するタンデムエレメントΩ−１０Ａを使用した場合の値を超えた。そして、その値は、Ω−１０Ａを使用した場合のＲＬＵ値に対して１．６５倍であった。次に、別の二つのタンデムエレメント、ＳｃＦＬＯ８−Ω−１０ＡとＫｌＭＳＮ１−Ω−１０Ａを用いたときの相対発光量値は、Ω−１０Ａを用いたときのＲＬＵ値に近く、それぞれ、Ω−１０Ａを用いたときのＲＬＵ値の８１．６８％と８５．３５％に達した。
【００７１】
【図４】図４は、本発明におけるＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ配列によるインビトロタンパク質翻訳開始の効率を増大する原理を示す。（Ａ）Ω配列は、４３ＳＰＩＣをリクルートし、タンパク質翻訳を開始するために、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇを組み合わせる必要がある。（Ｂ）ＫｌＮＣＥ１０２は、ポリ（Ａ）結合タンパク質Ｐａｂ１をリクルートすることができるＡリッチ（A-rich）ＲＮＡ配列である。Ｐａｂ１は、ｅＩＦ４Ｇと相互作用することがきる。それによって、４３ＳＰＩＣに対する補充効果を増大させ、翻訳開始の効率を改善する。ＫｌＮＣＥ１０２およびΩ配列は、相乗効果を形成し、翻訳開始効率を高める。
【００７２】
【図５】図５は、Ω−１０Ａ配列およびＧＡＡ配列がＫｌＮＣＥ１０２のインビトロタンパク質翻訳効率を増大したことを示す。ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａタンデムエレメントのインビトロ翻訳効率は、ＫｌＮＣＥ１０２のそれの１．２３倍であった。ＧＡＡ−ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａタンデムエレメントのインビトロ翻訳効率は、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａのそれの１．２８倍、Ω−１０Ａのそれの２．５２倍であった。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
広範かつ詳細な研究の後、多くのスクリーニングおよび探索を通して、インビトロタンパク質翻訳の効率を高めることができる新規な核酸構築物が、初めて予想外に見い出された。本発明の核酸構築物は、真核細胞（例えば、酵母）に由来するＩＲＥＳエンハンサー（例えば、ＳｃＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＮＣＥ１０２、ＳｃＭＳＮ１、ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＢＯＩ１）、Ω配列および酵母（例えば、クルイベロマイセス、好ましくはクルイベロマイセス・ラクティス）に特異的Kozak配列を連結することによって構築される。本発明の核酸構築物を酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系）で使用する場合、合成されたルシフェラーゼの活性を示すための相対発光量（ＲＬＵ）値は、非常に高く、Ω配列およびKozak配列によって連結されたタンデム配列（Ω−１０Ａ）の値の１．６５倍に達する、または、Ω−１０Ａの値とほぼ均等物である。
【００７４】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の核酸構築物の上流にＧＡＡの３残基を配置することがタンパク質合成の効率を増大させ、そしてインビトロ合成を媒介するために本発明の核酸構築物を使用する場合、ルシフェラーゼの相対発光量値が、約０．２８倍（ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａに対してＧＡＡ−ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ）に増大したことを見出した。Ω−１０Ａを用いた場合と比較して、ＧＡＡ−ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａを用いた場合のルシフェラーゼの相対発光量値は、１．５２倍に増大した（すなわち、ＧＡＡ−ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａを用いた場合の相対発光量値は、Ω−１０Ａを用いた場合の値の２．５２倍であった）（図５に示すように）。以上により、本発明者らは、本発明を完成させた。
【００７５】
真核生物系のインビトロ生合成系
【００７６】
真核生物系のインビトロ生合成系は、真核生物細胞に基づく転写−翻訳共役系である。それは、ＤＮＡ鋳型から出発してＲＮＡを合成するか、ＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型として用いてインビトロ（in vitro）でタンパク質合成を完了することができる。真核細胞は、酵母細胞、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽細胞、昆虫細胞、ヒト細胞等を含む。真核生物系のインビトロ生合成系は、複雑な構造を有するＲＮＡまたはタンパク質を合成することができ、タンパク質の翻訳後の修飾ができるなどという利点がある。
【００７７】
本発明において、真核生物系のインビトロ生合成系は、特に限定されない。好ましい真核生物系のインビトロ生合成系は、酵母系のインビトロ生合成系を含み、好ましくは酵母系のインビトロタンパク質合成系を含み、より好ましくはクルイベロマイセス系の発現系（より好ましくは、クルイベロマイセス・ラクティス系の発現系）を含む。
【００７８】
酵母(yeast)は、単純な培養、効率的なタンパク質フォールディングおよび翻訳後の修飾の利点を有する。酵母の中で、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）とピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、複雑な真核タンパク質と膜タンパク質を発現するモデル生物である。酵母はまた、インビトロ翻訳系の調製のための原料として使用される。
【００７９】
クルイベロマイセスは、子嚢胞子形成酵母である。クルイベロマイセスの中で、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces  marxianus）およびクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）は、産業界で広く使用されている酵母である。クルイベロマイセス・ラクティスは、他の酵母と比較して、超分泌能、より良好な大規模発酵特性、食品安全性レベルに適合すること、タンパク質の翻訳後の修飾能などの多くの利点を有する。
【００８０】
本発明において、真核生物系のインビトロ生合成系は、
（ａ）真核細胞抽出物と、
（ｂ）ポリエチレングリコールと、
（ｃ）選択可能にある外来性スクロースと、
（ｄ）水または水性溶媒であり、選択可能にある溶媒と、を含む。
【００８１】
特に一つの好ましい実施形態において、本発明によって提供されるインビトロ生合成系は、真核細胞抽出物、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、アミノ酸混合物、ホスホクレアチン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、クレアチンホスホキナーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ルシフェリン、ルシフェラーゼのＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼを含む。
【００８２】
本発明において、ＲＮＡポリメラーゼは、特に限定されず、１つ以上のＲＮＡポリメラーゼであってもよい。典型的なＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。
【００８３】
本発明において、インビトロ生合成系における真核細胞抽出物の割合は、特に限定されない。通常、インビトロ生合成系における真核細胞抽出物は、容量で、２０〜７０％、好ましくは３０〜６０％、より好ましくは４０〜５０％である。
【００８４】
本発明において、真核細胞抽出物は、無傷細胞を含まない。典型的な真核細胞抽出物は、ＲＮＡ合成のための種々のタイプのＲＮＡポリメラーゼと、リボソーム、トランスファーＲＮＡ(ｔＲＮＡ)およびアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼを含むタンパク質翻訳のための因子と、開始因子、伸長因子および終止放出因子を含むタンパク質合成に必要な因子とを含む。さらに、真核細胞抽出物はまた、真核細胞の細胞質に由来するいくつかの他のタンパク質、特に、可溶性タンパク質を含む。
【００８５】
本発明において、真核細胞抽出物のタンパク質含量は、２０〜１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍＬである。タンパク質含量の測定法は、クマシーブリリアントブルーアッセイである。
【００８６】
本発明において、真核細胞抽出物の調製方法は、限定されない。好ましい調製方法は、以下の工程、
（ｉ）真核細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）洗浄された真核細胞を得るために、真核細胞を洗浄する工程と、
（ｉｉｉ）洗浄された真核細胞を細胞溶解処理で処理し、粗真核細胞抽出物を得る工程と、
(ｉｖ）粗真核生物抽出物を固液分離により処理して、液相（すなわち、真核生物細胞抽出物）を得る工程と、を含む。
【００８７】
本発明において、固液分離の方法は、特に限定されない。好ましい方法は、遠心分離である。
【００８８】
好ましい実施形態では、遠心分離は、液体状態で行われる。
【００８９】
本発明において、遠心分離条件は、特に限定されない。好ましい遠心分離条件は、５０００ｇ〜１０００００ｇの範囲であり、好ましくは８０００ｇ〜３００００ｇの範囲である。
【００９０】
本発明において、遠心分離時間は、特に限定されない。好ましい遠心分離時間は、０．５分〜２時間の範囲であり、好ましくは２０分〜５０分の範囲である。
【００９１】
本発明において、遠心分離の温度は、特に限定されない。好ましくは、遠心分離は、１〜１０℃、好ましくは２〜６℃で行われる。
【００９２】
本発明において、洗浄処理方法は、特に限定されない。好ましい洗浄処理方法は、ｐＨ７〜８（好ましくはｐＨ ７．４）の洗浄液を用いて処理を行うことである。洗浄液は、特に限定されない。典型的な洗浄液は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸カリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００９３】
本発明において、細胞溶解処理の方法は、特に限定されない。細胞溶解処理のための好ましい方法は、高圧溶解および凍結融解（例えば、液体窒素低温での処理）溶解を含む。
【００９４】
インビトロ生合成系におけるヌクレオシド三リン酸の混合物は、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸およびウリジン三リン酸を含む。本発明において、種々の単一ヌクレオチドの濃度は、特に限定されない。各単一ヌクレオチドの濃度は、通常、０．５〜５ｍＭの範囲であり、好ましくは１．０〜２．０ｍＭの範囲である。
【００９５】
インビトロ生合成系におけるアミノ酸混合物は、天然または非天然アミノ酸を含み、そしてＤ型またはＬ型のアミノ酸を含む。代表的なアミノ酸は、特に限定されないが、２０種類の天然アミノ酸を含む。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジン等が挙げられる。各タイプのアミノ酸の濃度は、通常、０．０１〜０．５ｍＭの範囲であり、好ましくは０．０２〜０．２ｍＭの範囲（例えば、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭおよび０．０８ｍＭ）である。
【００９６】
好ましい実施形態において、インビトロ生合成系は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはＰＥＧの類似体をさらに含む。ＰＥＧまたはＰＥＧの類似体の濃度は、特に限定されない。一般に、生合成系の総重量に基づいて、ＰＥＧまたはＰＥＧの類似体の濃度（ｗ／ｖ）は、０．１〜８％の範囲であり、好ましくは０．５〜４％の範囲、より好ましくは１〜２％の範囲である。ＰＥＧの代表的な実施形態としては、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ３３５０が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のシステムはまた、他の種々の分子量のポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ ２００、４００、１５００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００など）を含むことが理解されるべきである。
【００９７】
好ましい実施形態において、インビトロ生合成系は、スクロースをさらに含む。スクロースの濃度は、特に限定されない。一般に、タンパク質合成系の総重量に基づいて、スクロースの濃度は、０．０３〜４０重量％の範囲であり、好ましくは０．０８〜１０重量％の範囲であり、より好ましくは０．１〜５重量％の範囲である。
【００９８】
特に一つの好ましいインビトロ生合成系は、真核細胞抽出物に加えて、以下の成分を含む。例えば、 ２２ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ｐＨ ７．４）、３０〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、１．０〜５．０ｍＭの酢酸マグネシウム、１．５〜４ｍＭのヌクレオシド三リン酸混合物、０．０８〜０．２４ｍＭのアミノ酸混合物、２５ｍＭのホスホクレアチン、１．７ｍＭのジチオトレイトール、０．２７ｍｇ／ｍＬのクレアチンホスホキナーゼ、１％〜４％のＰＥＧ、０．５％〜２％のスクロース、８〜２０ｎｇ／μＬのホタルルシフェラーゼのＤＮＡおよび０．０２７〜０．０５４ｍｇ／ｍＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどである。
【００９９】
Ω配列
【０１００】
本明細書中で使用される場合、用語「Ω配列」（すなわち、オメガ配列）は、タバコモザイクウイルスゲノムの５’リーダー配列（５’リーディング配列）をいう。そしてそれは、ウイルスの翻訳エンハンサーである。ΩのＤＮＡ配列は、６８塩基対を含み、１〜６（好ましくは２〜４、より好ましくは３）の数（quantities）の８塩基対長の直接反復モジュール（ＡＣＡＡＴＴＡＣ）と、１〜５（好ましくは１〜３、より好ましくは１）の数の（ＣＡＡ）ｐモジュールとを含む。ここで、ｐは、６〜１２の範囲であり、好ましくは８〜１０の範囲である。これらの２つのモジュールは、Ω配列の翻訳増大機能の鍵である。本発明の酵母系のインビトロタンパク質合成系において、Ω配列は、キャップ非依存的なタンパク質翻訳を開始することができる。これは、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇをリクルートすることによって達成される可能性がある。しかしながら、Ω配列によって開始されるタンパク質翻訳の効率は、比較的低い。Ω配列の構造配列は最適化される必要があり、タンパク質翻訳の効率を高めるために、他のＤＮＡエレメントまたはタンパク質と協働する必要がある。
【０１０１】
Kozak配列
【０１０２】
既知の真核生物のｍＲＮＡ分子中の翻訳開始コドン（ＡＵＧ）の上流および下流の配列を解析することは、“Kozak配列”と呼ばれるコンセンサス配列を見つけるのに役立つ。Kozak配列は、ｍＲＮＡの翻訳開始効率を高めることが検証されている。異なる生物種に由来するKozak配列は、しばしば異なる。例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia)のKozak配列および哺乳動物細胞のKozak配列は、有意に異なる。
【０１０３】
本発明において使用されるKozak配列は、６〜１２（好ましくは８〜１０）の数のアデニンデオキシヌクレオシドのオリゴマー鎖、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ、ＡＴＡ、ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＴＴＧなど、好ましくはＡＴＧ）およびセリンコドン（例えば、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣなど、好ましくはＴＣＴ）を含む。そしてそれは、クルイベロマイセス（好ましくはクルイベロマイセス・ラクティス）に由来する。
【０１０４】
外来性コード配列（外来性ＤＮＡ）
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、用語「外来性コード配列」および「外来性ＤＮＡ」は、互換的に使用され、そして両方とも、ＲＮＡまたはタンパク質の合成を導くために使用される外来性ＤＮＡ分子をいう。通常、ＤＮＡ分子は、線状または環状である。ＤＮＡ分子は、外来性ＲＮＡまたは外来性タンパク質をコードする配列を含む。
【０１０６】
本発明において、外来性コード配列の例としては、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。外来性タンパク質をコードする配列はまた、プロモーター配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１０７】
本発明において、外来性ＤＮＡの選択は、特に限定されない。通常、外来性ＤＮＡは、小さな非コードＲＮＡ(small non-coding RNA, ｓｎｃＲＮＡ)、長い非コードＲＮＡ(long non-coding RNA,ｌｎｃＲＮＡ)、転移ＲＮＡ(ｔransfer RNA,ｔＲＮＡ)、グルコサミン−６−リン酸シンセターゼ（glucosamine-6-phosphate synthase, ｇｌｍＳ）などを含むリボザイム、小さな核ＲＮＡ(small nuclear RNA,ｓｎＲＮＡ)、ＲＮＡとタンパク質の複合体（例えば、スプライソソーム(spliceosome)など）、他の様々な非コードＲＮＡ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１０８】
外来性ＤＮＡはまた、ルシフェリン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼなど）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチンおよび抗体の可変領域をコードする外来性ＤＮＡ、ルシフェラーゼミュータントのＤＮＡ、およびそれらの組合せからなる群から選択されることができる。
【０１０９】
外来性ＤＮＡはまた、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、およびキシラナーゼをコードする外来性ＤＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されることができる。
【０１１０】
好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、緑色蛍光タンパク質（enhanced GFP、ｅＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidaseＬａｃＺ）、ヒトリジン−ｔＲＮＡシンセターゼ(lysine-tRNA synthetase)、ヒトロイシン−ｔＲＮＡシンセターゼ(leucine-tRNA synthetase)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、マウスカタラーゼ(catalase)、およびそれらの組合せからなる群より選択されるタンパク質をコードする。
【０１１１】
核酸構築物
【０１１２】
本発明は、式Ｉの核酸配列を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５ （Ｉ）
【０１１３】
式中、Ｚ１〜Ｚ５は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［oligo（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
【０１１４】
本発明はまた、５’から３’に式ＩＩの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６ （ＩＩ）
【０１１５】
式中、Ｚ１〜Ｚ６は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［oligo（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
【０１１６】
本発明はまた、５’から３’に式ＩＩＩの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６ （ＩＩＩ）
【０１１７】
式中、Ｚ０〜Ｚ６は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０は、プロモーターエレメントであり、プロモーターエレメントは、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、およびこれらの組合せからなる群から選択され、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［oligo（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
【０１１８】
本発明はまた、５’から３’に式ＩＶの構造を含む核酸構築物を提供する。
Ｚ０’−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＶ）
【０１１９】
式中、Ｚ０’〜Ｚ６は、それぞれ、構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０’はＧＡＡであり、
Ｚ１は、エンハンサーエレメントであり、エンハンサーエレメントはＩＲＥＳエレメントを含み、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）であり、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［oligo（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、Kozak配列を構成し、Kozak配列は酵母に由来する。
【０１２０】
本発明において、外来性タンパク質のコード配列の選択は、特に限定されない。通常、外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチンおよび抗体の可変領域をコードする外来性ＤＮＡ、ルシフェラーゼ変異体のＤＮＡ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１２１】
外来性タンパク質のコード配列はまた、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質をコードすることができる。
【０１２２】
さらに、本発明の核酸構築物は、線状または環状であってもよい。本発明の核酸構築物は、一本鎖または二本鎖であってもよい。本発明の核酸構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。
【０１２３】
好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物の配列は、配列番号２〜１７のいずれか１つである。
【０１２４】
好ましい実施形態において、核酸構築物の配列は、配列番号２〜９のいずれか１つである。
【０１２５】
好ましい実施形態において、核酸構築物の配列は、配列番号３、４または６である。
【０１２６】
好ましい実施形態において、本発明の核酸構築物の配列は、配列番号８５〜８７のいずれか１つである。
【０１２７】
別の好ましい実施形態において、構築物は、プロモーター、ターミネーター、poly（Ａ）エレメント、輸送エレメント、遺伝子標的化エレメント、選択マーカー遺伝子、エンハンサー、耐性遺伝子、およびトランスポザーゼをコードする遺伝子からなる群より選択されるエレメントまたは組み合わせをさらに含む。
【０１２８】
種々の選択マーカー遺伝子は、本発明において使用されることができる。これは、特に限定されないが、栄養要求性マーカー、耐性マーカー、およびレポーター遺伝子マーカーを含む。選択マーカーの適用は、組換え細胞（レコン）のスクリーニング（篩い分け）において役割を果たす。そこでは、レセプター細胞は、非形質転換細胞と有意に識別することができる。栄養要求性マーカーは、伝達されたマーカー遺伝子の助けを借りて、レセプター細胞の変異遺伝子に相補的である。その結果、レセプター細胞は、野生型増殖を示す。耐性マーカーは、耐性遺伝子がレセプター細胞に移入されることを指す。そして、移入された遺伝子により、レセプター細胞は一定の薬物濃度で薬物耐性を示すことができる。本発明の好ましい様式として、耐性マーカーは、組換え細胞の簡便なスクリーニングを達成するために使用される。
【０１２９】
本発明において、本発明の核酸構築物を本発明の酵母系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のタンパク質生合成系等）に適用することにより、外来性タンパク質翻訳の効率を著しく向上させることができる。具体的には、本発明の核酸構築物を用いて合成されたルシフェラーゼの活性を示す相対発光量値は非常に高い。本発明の核酸構築物（例えば、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ）を用いた場合の相対発光量値は、Ω−１０Ａ配列を用いた場合のそれの１．６５倍であった。
【０１３０】
ベクター、遺伝子組み換え細胞
【０１３１】
本発明はまた、本発明の核酸構築物を含むベクターまたはベクターの組合せを提供する。好ましくは、ベクターは、細菌プラスミド、ファージ（すなわち、バクテリオファージ）、酵母プラスミド、動物細胞ベクター、およびシャトルベクターからなる群より選択される。ベクターは、トランスポゾンベクターである。組換えベクターを調製するための方法は、当業者に周知である。宿主中で複製され、安定である限り、任意のプラスミドまたはベクターを使用することができる。
【０１３２】
当業者は、周知の方法を使用して、本発明のプロモーターおよび／または目的遺伝子配列を含む発現ベクターを構築する。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、インビボ組換え技術などが含まれる。
【０１３３】
本発明はまた、遺伝子組み換え細胞を提供する。遺伝子組み換え細胞は、構築物、ベクターまたはベクターの組合せを含む。または、遺伝子組み換え細胞の染色体は、構築物またはベクターに一体化される。別の好ましい実施形態において、遺伝子組み換え細胞は、トランスポザーゼをコードする遺伝子を含むベクターをさらに含む。または、遺伝子組み換え細胞の染色体は、トランスポザーゼ遺伝子と一体化される。
【０１３４】
好ましくは、遺伝子組み換え細胞は、真核細胞である。
【０１３５】
別の好ましい実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、昆虫細胞、コムギ胚芽細胞、ウサギ網状赤血球および他の高等真核細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１３６】
別の好ましい実施形態において、真核細胞は、酵母細胞（好ましくはクルイベロマイセス細胞、より好ましくはクルイベロマイセス・ラクティス細胞）を含むが、これらに限定されない。
【０１３７】
本発明の構築物またはベクターは、適切な遺伝子組み換え細胞を形質転換するために使用される。遺伝子組み換え細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス、アグロバクテリウムなど）、下等真核細胞（例えば、酵母細胞）、または高等動物細胞（例えば、昆虫細胞など）であってもよい。当業者は、適切なベクターおよび遺伝子組み換え細胞を選択する方法を知っている。遺伝子組み換え細胞の組換えＤＮＡによる形質転換は、当業者に周知の従来の技術を用いて実施されることができる。宿主が原核生物（例えば、大腸菌など）である場合、ＣａＣｌ２法またはエレクトロポレーション法を用いて処理することができる。宿主が真核生物である場合、ＤＮＡトランスフェクション法、リン酸カルシウム共沈法および従来の機械的方法（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージングなど）を選択的に用いることができる。植物細胞の形質転換は、アグロバクテリウム媒介形質転換または遺伝子銃形質転換などの方法、例えば、リーフディスク法、未成熟胚形質転換法、花芽浸漬法などを用いることによって実行されることができる。
【０１３８】
インビトロハイスループットタンパク質合成方法
【０１３９】
本発明は、インビトロハイスループットタンパク質合成方法を提供する。この方法は、以下の工程：
（ｉ）真核生物系のインビトロ生合成系の存在下で、本発明の第１〜第４の態様から選択される核酸構築物を提供する工程と、
（ｉｉ）適切な条件下で、工程（ｉ）の真核生物系のインビトロ生合成系をＴ１の期間インキュベートして、外来性タンパク質を合成する工程と、を含む。
【０１４０】
別の好ましい実施形態において、この方法は、（ｉｉｉ）真核生物系のインビトロ生合成系から外来性タンパク質を任意選択で単離または検出する工程をさらに含む。
【０１４１】
本発明の主な利点は、次の（１）〜（７）を含む。
【０１４２】
（１）初めて、本発明は、プロモーター、酵母由来ＩＲＥＳ、Ω配列、Kozak配列および外来性タンパク質のコード配列を含む核酸構築物が本発明の真核生物系のインビトロ生合成系（例えば、酵母系のインビトロタンパク質合成系）に使用される場合、外来性タンパク質翻訳の効率を有意に向上させることができることを見出した。
【０１４３】
（２）Ω配列およびKozak配列とタンデムに連結された本発明の真核細胞の内因性ＩＲＥＳは、真核生物系のインビトロ生合成系（eukaryote-based in vitro biosynthesis system）におけるタンパク質翻訳開始の効率を高めることができる。翻訳開始の効率を高めることに関して、タンデムＤＮＡエレメントは、後者の２つのみを連結するタンデム配列（Ω−１０Ａ）よりも有利である。クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ生合成系において、合成を開始するためにＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａを使用した場合のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）の相対発光量（ＲＬＵ）値は１．６７×１０９に達した。これは、Ω−１０Ａ配列を使用した場合のそれの１．６５倍であった。
【０１４４】
（３）サッカロマイセス・セレビシエと比較して、クルイベロマイセス・ラクティスは、その安全性と高効率性のため、食品分野および医薬品分野において、タンパク質合成に使用されることができる。その安全性と高効率性、ならびにインビトロ生合成系（in vitro biosynthesis）の利点（例えば、ハイスループットタンパク質合成とスクリーニングに最適、毒性タンパク質を合成する能力、短時間、低コストなど）のため、その結果、クルイリベロマイセス・ラクティス細胞由来のインビトロ生合成系は、タンパク質合成の関連分野で広く利用されることができる。
【０１４５】
（４）本発明によって提供される核酸構築物は、真核生物系のインビトロ生合成系のタンパク質翻訳を開始する効率を高めるだけでなく、より重要なことには、異なるタンパク質の合成のためのクルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ生合成系の可能性を増大させる。
【０１４６】
（５）本発明の核酸構築物は、タンパク質翻訳開始の効率を高めるだけでなく、真核生物系の細胞インビトロ生合成系に使用されるＤＮＡエレメントを設計するための新規なコンセプトおよび新しい方法を提供する。これは、科学的研究および工業生産の分野において、関連システムの適用を大いに高めることができる。
【０１４７】
（６）本発明は、本発明の核酸構築物と強力なプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター）を組み合わせることによっても、非常に高いタンパク質合成効率を達成することができることを初めて見出した。
【０１４８】
（７）本発明は、本発明の核酸構築物の上流にＧＡＡの３つの残基を配置することによって、非常に高いタンパク質合成効率も達成することができることを初めて見出した。
【０１４９】
本発明を、具体的な実施例に関連して以下にさらに記載する。これらの実施例は、本発明を例示するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するためには使用されないことが理解されるべきである。以下の実施例において、特に記載された条件を伴わない実験方法に関して、当業者は、一般に、従来の条件（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）に記載された条件など）に従うか、または、製造業者によって推奨される条件に従う。特に断らない限り、パーセンテージおよび部分は、重量によるパーセンテージおよび部分を指す。
【０１５０】
特に明記しない限り、本発明の実施例で使用される材料および試薬は、すべて市販の製品である。
【０１５１】
実施例１：真核細胞の内因性ＩＲＥＳ、Ω配列およびクルイベロマイセス・ラクティス特異的Kozak配列をタンデムに連結するＤＮＡエレメントのデザイン
【０１５２】
１．１  クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)およびサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における内因性ＩＲＥＳの測定：
クルイベロマイセス・ラクティスの４つ内因性ＩＲＥＳおよびサッカロマイセス・セレビシエにおけるそれらと相同性を持つタンパク質に対応するＩＲＥＳ（表１に示す）は、インビトロタンパク質合成を開始することができる。Ｆｌｕｃの合成を開始するＩＲＥＳの中で、６つのＩＲＥＳ（ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１およびＳｃＮＣＥ１０２）は、従来のΩ配列よりも高い相対発光量（ＲＬＵ）値を示した。他の２つＩＲＥＳ（ＫｌＢＯＩ１およびＳｃＢＯＩ１）は、Ω配列よりも低いＲＬＵ値を示した（図２に示す）。これらの８つのＩＲＥＳは、Ω配列およびKozak配列とタンデムに連結されることが決定された。
【０１５３】
１．２  １６のタンデムエレメントの決定：
８つの内因性ＩＲＥＳをΩ配列およびクルイベロマイセス・ラクティスに特異的Kozak配列とタンデムに連結し、Ω配列に対してＩＲＥＳの上流または下流の位置を変化させる。その結果、合計１６のタンデムＤＮＡエレメントを設計した（ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２およびＳｃＢＯＩ１−Ω−１０Ａ、ならびに、Ω−ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２およびＳｃＢＯＩ１−１０Ａ）。配列番号２〜１７に示されるタンデムエレメントの配列は、上記のタンデムＤＮＡエレメント（ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２およびＳｃＢＯＩ１−Ω−１０Ａ、ならびに、Ω−ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＭＳＮ１、ＳｃＮＣＥ１０２およびＳｃＢＯＩ１−１０Ａ）の配列にそれぞれ対応する。
【０１５４】
１．３  レポータータンパク質遺伝子（Ｆｌｕｃ）を有するタンデムエレメントの設計：
上記に設計されたような１６のタンデムエレメントは、Ω−１０Ａに置換するために、既存のΩ−１０Ａ−Ｆｌｕｃプラスミド（カンマ−ヘルスケアコード（シャンハイ）バイオテックカンパニーリミテッドから入手、Ω−１０Ａ配列は配列番号１に示される）に挿入された。そして、１６の新しいプラスミドは、形成された。得られた１６の新しいプラスミドは、それぞれ、ＫｌＦＬＯ８−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＫｌＭＳＮ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＫｌＢＯＩ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＦＬＯ８−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＭＳＮ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＢＯＩ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＫｌＦＬＯ８−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＫｌＭＳＮ１−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＫｌＮＣＥ１０２−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＫｌＢＯＩ１−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＳｃＦＬＯ８−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＳｃＭＳＮ１−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、Ω−ＳｃＮＣＥ１０２−１０Ａ−ＦｌｕｃおよびΩ−ＳｃＢＯＩ１−１０Ａ−Ｆｌｕｃだった。その中で、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＳｃＦＬＯ８−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ、ＫｌＭＳＮ１−Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ配列をそれぞれ配列番号８５〜８７に示した。
【０１５５】
表１  サッカロマイセス・セレビシエおよびクルイベロマイセス・ラクティスにおける関連遺伝子
2021503950.tif 000009
【０１５６】
実施例２：インビトロタンパク質合成系のためのタンデムＤＮＡエレメントを含むプラスミドの構築
【０１５７】
２．１  プラスミドの構築：
Ω配列の上流または下流にそれぞれ位置することによって、Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃプラスミドに、それぞれ８個の内因性ＩＲＥＳを挿入する。具体的に使用したプライマーを表２に示す。
【０１５８】
１つのプラスミドの具体的な構築プロセスは、以下の通りである。
【０１５９】
挿入するＩＲＥＳ断片と、Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃベクタープラスミドをそれぞれ２対のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。各ＰＣＲ増幅産物の１０μＬを採取し、混合した。次いで、増幅産物の２０μＬ混合物に１μＬのＤｐｎＩを添加し、続いて、３７℃で６時間インキュベートした。その後、４μＬのＤｐｎＩ処理物を５０μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。その後、氷上に３分間置き、ＬＢ液体培地２００μＬを加え、３７℃で４時間振盪培養した。その後、混合物をＡｍｐ抗生物質を含有するＬＢ固体培地上にコーティングし、一晩培養した。増殖培養を実施するために、６つのモノクローナルコロニーを採取した。配列決定により正しいことを確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０１６０】
表２  ＰＣＲ増幅用のプライマー
2021503950.tif 000010
【０１６１】
実施例３：酵母系のインビトロタンパク質合成システムにおけるタンデムＤＮＡエレメントの適用
【０１６２】
３．１  Ｔ７転写開始配列と終止配列との間にある全てのプラスミド中のタンデムＤＮＡエレメントおよびＦｌｕｃを含むフラグメント（断片）は、プライマーとするＴ７＿ｐＥＴ２１ａ＿Ｆ：ＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ（配列番号８２）およびＴ７ｔｅｒ＿ｐＥＴ２１ａ＿Ｒ：ＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧ（配列番号８３）を使用しながら、ＰＣＲ法によって増幅された。
【０１６３】
増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿法を用いて精製し、濃縮した。１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）をＰＣＲ産物に添加し、次いで、２．５〜３倍容量の９５％エタノールを添加した（酢酸ナトリウムの添加後の容量に対して）。続いて、氷上で１５分間インキュベートした。その後、混合物は、室温で１４０００ｇより高速で３０分間遠心分離された。そして、上清を除去した。沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、次いで１５分間遠心分離した。続いて、上清を除去した。この沈殿物を超純水に溶解し、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０１６４】
３．２  使用説明書に従って、精製されたＤＮＡ断片を、自己作製されたクルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロタンパク質合成系に添加した。上記反応系を２５〜３０℃の環境に置き、約２〜６時間混合物をインキュベートした。完了後、同じ容量のＦｌｕｃの基質とするルシフェリン(luciferin)を、９６ウェルまたは３８４ウェルホワイトプレートの上記反応用ウェルに添加した。これを直ちにＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１２０多機能マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）に置いた。吸光度を読み取って、Ｆｌｕｃの活性を検出した。ここで、活性の単位は、図２に示すように、相対発光量（Relative Light Unit,ＲＬＵ）値である。
【０１６５】
３．３  真核細胞の内因性ＩＲＥＳ配列を持たないＤＮＡ断片（Ω−１０Ａ−Ｆｌｕｃ）群を対照として使用した。ＤＮＡ鋳型を添加しない反応群を陰性対照（ＮＣ）として使用した。３つの独立したサンプリングを、各群について使用した。
【０１６６】
実験結果
【０１６７】
１．真核細胞の内因性ＩＲＥＳと、Ω配列と、クルイベロマイセス・ラクティスに特異的なKozak配列とを連結するＤＮＡエレメントの設計
【０１６８】
合計１６個のタンデムＤＮＡエレメントを設計した。Ω−１０Ａ配列を置換するために、１６個のエレメントのすべてをΩ−１０Ａ−Ｆｌｕｃプラスミドにそれぞれ挿入した。インビトロタンパク質合成に使用するための１６個のプラスミドを形成した。
【０１６９】
２．インビトロタンパク質合成系のためのタンデムＤＮＡエレメントを含むプラスミドの構築
【０１７０】
多くの試みの後、インビトロタンパク質合成系のための合計１６個のプラスミドが首尾よく構築された。
【０１７１】
３．酵母系のインビトロタンパク質合成系におけるタンデムＤＮＡエレメントの応用
【０１７２】
図３に示すように、選ばれた３つのタンデムＤＮＡエレメントのうち、酵母系のインビトロタンパク質合成系におけるホタルルシフェラーゼ(firely luciferase, Fluc)の相対発光量（ＲＬＵ）値に関して、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０ＡによるＲＬＵ値のみがΩ−１０Ａ配列によるＲＬＵ値を超えた。ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａによる相対発光量値は、Ω−１０Ａ配列によるそれに対して１．６５倍である１．６７×１０９に達した（Ω−１０Ａ配列による相対発光量値は１．０１×１０９であった）。さらに、ＳｃＦＬＯ８−Ω−１０ＡとＫｌＭＳＮ１−Ω−１０Ａによる相対発光量値は、Ω−１０Ａ配列による値に近く、それぞれ、Ω−１０Ａ配列によるＲＬＵ値の８１．６８％および８５．３５％に達した。
【０１７３】
検出器による相対発光量（ＲＬＵ）値と、タンパク質濃度との間の線形関係の範囲内で、最も高い活性を示したＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａによる相対発光量値は、Ω−１０Ａ配列によるものの１．６５倍であったので、タンデムＤＮＡエレメントは、タンパク質合成を約１．６５倍に増強することができることを示している。
【０１７４】
本発明の結果は、真核細胞の内因性ＩＲＥＳと、Ω配列と、クルイベロマイセス・ラクティスに特異的なKozak配列をタンデムに連結することは、タンパク質合成の効率を高めることができることを示す。その２つは、互いに相互作用することができる翻訳開始因子Ｐａｂ１およびｅＩＦ４Ｇをリクルートして、タンパク質合成効率を促進する相乗効果を達成することができる（図４に示す）。そして、酵母系のインビトロタンパク質合成系に適用することができる。それにおいて、タンパク質合成を開始する効率は、Ω配列およびKozak配列を含む一般に使用されるタンデムエレメントΩ−１０Ａのそれを超えることができる、合成がＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａにより開始される合成するタンパク質の量は、Ω−１０Ａ配列によるそれの１．６５倍であった。ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａは、酵母系のインビトロタンパク質合成系のタンパク質翻訳効率を上昇させ、タンパク質合成を開始するためのクルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロ合成系用の翻訳エレメントの選択性を増加させ、クルイベロマイセス・ラクティス系のインビトロタンパク質合成系の有用性を大幅に増大した。
【０１７５】
さらに、研究結果によれば、本発明はまた、ＧＡＡの３つの残基をタンデムＤＮＡエレメントの上流に配置すること（転写されたｍＲＮＡの５’末端はＧＡＡである）により、タンパク質合成効率を増大することができることを見出した。インビトロ合成を媒介するために本発明の核酸構築物およびＧＡＡのタンデムを使用した場合のルシフェラーゼの相対発光量値は、本発明の核酸構築物を単独で使用した場合のＲＬＵ値の１．２８倍であった（図５に示す）。
【０１７６】
さらに、研究結果によれば、本発明は、本発明の核酸構築物（例えば、ＫｌＮＣＥ１０２−Ω−１０Ａ）による相対発光量値は、ＫｌＮＣＥ１０２による相対発光量値の１．２３倍である（図５に示す）ことも見出した。
【０１７７】
本発明において言及される全ての文献は、各文献が参照により個々に組み込まれるのと同様に、参照により本出願に組み込まれる。また、当業者であれば、本発明の上記内容を読めば、本発明に様々な変更や修正を加えることができ、これらの均等な形成も本発明の特許請求の範囲に含まれることを理解されたい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉの核酸配列を含むことを特徴とする核酸構築物。
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５（Ｉ）
（式中、Ｚ１〜Ｚ５は、それぞれ前記酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、ＩＲＥＳエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［オリゴ（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、酵母に由来するKozak配列を構成する。）
【請求項２】
前記ＩＲＥＳエレメントは、ＳｃＢＯＩ１、ＳｃＦＬＯ８、ＳｃＮＣＥ１０２、ＳｃＭＳＮ１、ＫｌＦＬＯ８、ＫｌＮＣＥ１０２、ＫｌＭＳＮ１、ＫｌＢＯＩ１、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記核酸構築物の核酸配列は、配列番号２〜１７のいずれか１つである請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
５’から３’に下記式ＩＩの構造を含むことを特徴とする核酸構築物。
Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６ （ＩＩ）
（式中、Ｚ１〜Ｚ６は、それぞれ前記核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ１は、ＩＲＥＳエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［オリゴ（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、酵母に由来するKozak配列を構成する。）
【請求項５】
前記外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質をコードする、好ましくは、前記外来性タンパク質のコード配列は、ホタルルシフェラーゼをコードする請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記外来性タンパク質は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、好ましくは、前記外来性タンパク質は、ホタルルシフェラーゼである請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項７】
５’から３’に下記式ＩＩＩの構造を含むことを特徴とする核酸構築物。
Ｚ０−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６ （ＩＩＩ）
（式中、Ｚ０〜Ｚ６は、それぞれ前記核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０は、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、およびこれらの組合せからなる群から選択されるプロモーターエレメントであり、
Ｚ１は、ＩＲＥＳエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［オリゴ（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、好ましくは、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質のコード配列であり、より好ましくは、ホタルルシフェラーゼのコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、酵母に由来するKozak配列を構成する。）
【請求項８】
５’から３’に下記式ＩＶの構造を含むことを特徴とする核酸構築物。
Ｚ０’−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６（ＩＶ）
（式中、Ｚ０’〜Ｚ６は、それぞれ前記核酸構築物の一部としてのエレメントであり、
各「−」は、独立して、結合またはヌクレオチド連結配列であり、
Ｚ０’は、ＧＡＡであり、
Ｚ１は、ＩＲＥＳエレメントを含むエンハンサーエレメントであり、
Ｚ２は、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（leading sequence）、つまりΩ配列であり、
Ｚ３は、アデニンデオキシヌクレオチドのオリゴマー鎖［オリゴ（Ａ）］ｎであり、
Ｚ４は、翻訳開始コドンであり、
Ｚ５は、セリンコドンであり、
Ｚ６は、外来性タンパク質のコード配列であり、好ましくは、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される外来性タンパク質のコード配列であり、より好ましくは、ホタルルシフェラーゼのコード配列であり、
Ｚ３、Ｚ４およびＺ５は、酵母に由来するKozak配列を構成する。）
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を含むことを特徴とするベクターまたはベクターの組合せ。
【請求項１０】
遺伝子組み換え細胞のゲノムが１つ以上の部位で請求項１〜８のいずれか一項に記載の前記核酸構築物と一体化される、または、遺伝子組み換え細胞が請求項９に記載の前記ベクターまたは前記ベクターの組み合わせを含むことを特徴とする遺伝子組み換え細胞。
【請求項１１】
試薬を含むキットであって、前記試薬は、
グループ（ａ）請求項１〜８のいずれか一項に記載の前記核酸構築物と、
グループ（ｂ）請求項９に記載の前記ベクターまたは前記ベクターの組合せと、
グループ（ｃ）請求項１０に記載の前記遺伝子組み換え細胞と、のうちの１つまたは複数から選択されることを特徴とするキット。
【請求項１２】
ハイスループットのインビトロタンパク質合成に適用可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項９に記載のベクターまたはベクターの組合せ、請求項１０に記載の遺伝子組み換え細胞、または、請求項１１に記載のキットの使用。
【請求項１３】
外来性タンパク質のためのインビトロハイスループット合成方法であって、前記方法は、
ステップ（ｉ）真核生物系のインビトロ生合成系の存在下で、請求項１〜８のいずれか一項に記載の前記核酸構築物を提供する工程と、
ステップ（ｉｉ）適切な条件下で、前記工程（ｉ）の前記真核生物系のインビトロ生合成系をＴ１の期間インキュベートして、外来性タンパク質を合成する工程と、を含むことを特徴とする外来性タンパク質のためのインビトロハイスループット合成方法。
【請求項１４】
（ｉｉｉ）前記真核生物系のインビトロ生合成系から前記外来性タンパク質を単離する工程、
前記真核生物系のインビトロ生合成系から前記外来性タンパク質を検出する工程、または、
それらの組み合わせをさらに含む請求項１３に記載のインビトロハイスループット合成方法。
【請求項１５】
前記真核生物系のインビトロ生合成系は、酵母系のインビトロ生合成系である請求項１３に記載のインビトロハイスループット合成方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2021503950.tif 000011
【図２】
2021503950.tif 000012
【図３】
2021503950.tif 000013
【図４】
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【図５】
2021503950.tif 000015
【国際調査報告】
2021503950.tif 000016
2021503950.tif 000017
2021503950.tif 000018
2021503950.tif 000019
2021503950.tif 000020
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