(57)【要約】本開示は、例えば、誘導性プロモーターと、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡとを組み合わせることによって、低アルカロイドタバコ植物における葉品質を向上させるための方法および組成物を含む。また、ポリアミンレベルが正常な、抑制された、またはそうでなければ変化した、低アルカロイドタバコ植物も提供される。さらに、変化した全アルカロイドおよびニコチンレベルと、商業的に許容される葉グレードとを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介した該タバコ植物の開発、ならびに、該タバコ植物からのタバコ製品の作製が提供される。2021516055.tif 000006
2021516055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡをコードする転写可能なＤＮＡ配列に機能的に連結された誘導性プロモーターを含む、タバコ植物。
【請求項２】
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも２０％以内のレベルの１種類またはそれ以上のポリアミンを含む葉を生成することができる、請求項１に記載のタバコ植物。
【請求項３】
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも２０％以内のクロロフィルレベルを含む葉を生成することができる、請求項１に記載のタバコ植物。
【請求項４】
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも２０％以内の単位葉面積当たりの葉肉細胞数を含む葉を生成することができる、請求項１に記載のタバコ植物。
【請求項５】
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも２０％以内の表皮細胞サイズを含む葉を生成することができる、請求項１に記載のタバコ植物。
【請求項６】
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも２０％以内の葉収率を含む、請求項１に記載のタバコ植物。
【請求項７】
前記オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、３０、３１、３２、３３、および３４からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチド配列をコードする、請求項１に記載のタバコ植物。
【請求項８】
前記ＯＤＣ遺伝子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、２４、２５、２６、２７、および２８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のタバコ植物。
【請求項９】
前記誘導性プロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載のタバコ植物。
【請求項１０】
前記非コーディングＲＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５および３６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のタバコ植物。
【請求項１１】
前記非コーディングＲＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＯＤＣ  ＲＮＡｉ構築物中で提供される、請求項１０に記載のタバコ植物。
【請求項１２】
対照タバコ植物と比べて、
ａ．低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する、第１のゲノム改変と、
ｂ．同等のレベルの１つまたはそれ以上の形質を提供し、該形質が、
ｉ．全葉ポリアミンレベル、
ｉｉ．全根ポリアミンレベル、
ｉｉｉ．全葉クロロフィルレベル、
ｉｖ．単位葉面積当たりの葉肉細胞数、および
ｖ．葉表皮細胞サイズ
からなる群から選択される、第２のゲノム改変と
を含むタバコ植物またはその部分であって、
該対照植物が、該第１のゲノム改変と該第２のゲノム改変を両方とも有さない、該タバコ植物またはその部分。
【請求項１３】
前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の全遊離ポリアミンを葉または根に含む、請求項１２に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項１４】
前記タバコ植物が、前記対照植物に由来する葉の葉グレードと同等の葉グレードを有する葉を生成することができる、請求項１２に記載のタバコ植物またはその部分。
【請求項１５】
請求項１に記載のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
【請求項１６】
請求項１５に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
【請求項１７】
シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、鼻嗅ぎタバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、請求項１６に記載のタバコ製品。
【請求項１８】
請求項１２に記載のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
【請求項１９】
請求項１８に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
【請求項２０】
シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、鼻嗅ぎタバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、請求項１９に記載のタバコ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月５日に出願された米国特許仮出願第６２／６３８，９２８号に対する優先権を主張し、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組込み
８８，０１１バイト（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定）であり２０１９年３月４日に作成された「Ｐ３４５８４ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のＡＳＣＩＩファイルに含有される配列表は、本明細書と共に電子的に提出され、参照することによりその全体が組み込まれる。
【０００３】
分野
本開示は、変化した全アルカロイドおよびニコチンレベルと、商業的に許容される葉グレードとを有するタバコ植物、育種またはトランスジェニックアプローチを介した該タバコ植物の開発、ならびに、該タバコ植物からのタバコ製品の作製を含む。
【背景技術】
【０００４】
背景
タバコは、世界で最も広く栽培されている非食用作物の１つであり、世界生産量が７４０万トンを超え（ＦＡＯＳＴＡＴ，  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎａｔｉｏｎｓ  （ＦＡＯ）（２０１４），  ｆａｏｓｔａｔ．ｆａｏ．ｏｒｇ）、結果として生じるタバコ製品の年間世界市場の大きさが７７００億米ドルである（Ｅｕｒｏｍｏｎｉｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ２０１６）。ニコチンはタバコ葉に蓄積する主要なアルカロイドである。ニコチンおよび他の微量アルカロイドはまた、タバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）の前駆体でもある。低レベルのニコチンを有するタバコ栽培品種の開発への需要が存在する。
【０００５】
商用タバコ栽培品種において、ニコチンは全アルカロイドプールの９０〜９５％を占めるか、または葉の全乾燥重量の２〜５％を占める（Ｓａｉｔｏｈ  Ｆ，  Ｎｏｎａ  Ｍ，  Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｎ  （１９８５）．  Ｔｈｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｏｆ  ｓｉｘｔｙ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｐｅｃｉｅｓ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．  ２４：  ４７７−４８０）。ニコチンは根で合成され（Ｄａｗｓｏｎ  ＲＦ  （１９４２）  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｉｎ  ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｇｒａｆｔｓ  ｏｆ  ｔｏｍａｔｏ  ａｎｄ  ｔｏｂａｃｃｏ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｂｏｔ．  ２９：  ６６−７１）、木部（Ｂａｌｄｗｉｎ  ＩＴ  （１９８８）．  Ｔｈｅ  ａｌｋａｌｏｉｄａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｗｉｌｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｏ  ｒｅａｌ  ａｎｄ  ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｅｒｂｉｖｏｒｙ．  Ｏｅｃｏｌｏｇｉａ  ７７：  ３７８−３８１）を通って植物の気性部分（ａｅｒｉａｌ  ｐａｒｔ）（Ｈｉｌｄｒｅｔｈ  ＳＢ，  Ｇｅｈｍａｎ  ＥＡ，  Ｙａｎｇ  Ｈ，  Ｌｕ  ＲＨ，  Ｒｉｔｅｓｈ  ＫＣ，  Ｈａｒｉｃｈ  ＫＣ，  Ｙｕ  Ｓ，  Ｌｉｎ  Ｊ，  Ｓａｎｄｏｅ  ＪＬ，  Ｏｋｕｍｏｔｏ  Ｓ，  Ｍｕｒｐｈｙｄ，  ＡＳ，  Ｊｅｌｅｓｋｏａｅｔ  ＪＧ  （２０１１）．  Ｔｏｂａｃｃｏ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ  （ＮＵＰ１）  ａｆｆｅｃｔｓ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０８：  １８１７９−１８１８４）に転流され、そこで葉に蓄積し、昆虫食害に応答して突起様構造によってにじみ出される（Ｋｅｓｓｌｅｒ  Ａ，  Ｂａｌｄｗｉｎ  ＩＴ  （２００２）．  Ｐｌａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｉｎｓｅｃｔ  ｈｅｒｂｉｖｏｒｙ：  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ５３：  ２９９−３２８）。ニコチン生合成は遺伝的要因、植物発達、生物ストレスおよび非生物ストレス、植物ホルモンシグナル、ならびに農業管理業務、例えば、摘心および株分けの影響を受ける（Ｗａｎｇ  ＳＳ，  Ｓｈｉ  ＱＭ，  Ｌｉ  ＷＱ，  Ｎｉｕ  ＪＦ，  Ｌｉ  ＣＪ，  Ｚｈａｎｇ  ＦＳ  （２００８）．  Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｅ−ｃｕｒｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ  ａｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｈｏｏｔ  ａｐｅｘ  ａｎｄ  ｌａｔｅｒａｌ  ｂｕｄｓ．  Ｊ．  Ｉｎｔｅｇｒ．  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏ．  ５０：  ９５８−９６４；  Ｓｈｏｊｉ  Ｔ，  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ  （２０１５）．  Ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＮＩＣＯＴＩＮＥ２−ｌｏｃｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．１１３：  ４１−４９）。ニコチン生合成の遺伝子調節は、ニコチンレベルに相乗作用を及ぼす２つの独立した遺伝子座Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２と相関関係があるが、Ｎｉｃ１の効果はＮｉｃ２の効果より約２．４倍強い（Ｌｅｇｇ  ＰＤ，  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＧＢ  （１９７１）．  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｔｏｔａｌ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ＩＩ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  Ｂｕｒｌｅｙ  ２１  ｘ  ＬＡ  Ｂｕｒｌｅｙ  ２１  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｃｙｔｏｌ．  １３：  ２８７−２９１）。両遺伝子座とも、ニコチン生合成経路に関連しない非常に多くの他の遺伝子の発現にも影響を及ぼす（Ｋｉｄｄ  ＳＫ，  Ｍｅｌｉｌｌｏ  ＡＡ，  Ｌｕ  ＲＨ，  Ｒｅｅｄ  ＤＧ，  Ｋｕｎｏ  Ｎ，  Ｕｃｈｉｄａ  Ｋ，  Ｆｕｒｕｙａ  Ｍ，  Ｊｅｌｅｓｋｏ  ＪＧ  （２００６）．  Ｔｈｅ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅｓ，  ｆｅｗ  ｏｆ  ｗｈｉｃｈ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６０：  ６９９−７１６；  Ｓｈｏｊｉ  Ｔ，  Ｋａｊｉｋａｗａ  Ｍ，  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ  （２０１０）  Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２２：  ３３９０−３４０９）。転写分析から、Ｎｉｃ２遺伝子座は、少なくとも７つのエチレン応答転写因子（ＥＲＦ）をコードする遺伝子クラスターであることが分かっている（Ｓｈｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。
【０００６】
一方または両方の遺伝子座のホモ接合性変異を用いて、低減したアルカロイドレベルを有する準同質遺伝子（ｎｅａｒ−ｉｓｏｇｅｎｉｃ）バーレイ（Ｂｕｒｌｅｙ）２１株、すなわち、遺伝子型ｎｉｃ２を有する高中間（ｈｉｇｈ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）（ＨＩ）品種、遺伝子型ｎｉｃ１を有する低中間（ｌｏｗ−ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）（ＬＩ）品種、および遺伝子型ｎｉｃ１ｎｉｃ２を有する低アルカロイド（ＬＡ）品種を作出することができる（Ｌｅｇｇ  ＰＤ，  Ｃｈａｐｌｉｎ  ＪＦ，  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＧＢ  （１９６９）．  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｔｏｔａｌ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  Ｊ．  Ｈｅｒｅｄ．  ６０：  ２１３−２１７；  Ｌｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９７１）。ＬＡバーレイ２１植物は、正常アルカロイド（ＮＡ）野生型品種に見られる全アルカロイドレベルの約５．７％しか含有しない（Ｌｅｇｇ  ＰＤ，  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＧＢ，  Ｌｉｔｔｉｏｎ  ＣＣ  （１９７０）．  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＡ  Ｂｕｒｌｅｙ  ２１  ｔｏｂａｃｃｏ  ｇｅｒｍｐｌａｓｍ．  Ｃｒｏｐ．  Ｓｃｉ．  １０：  ２１２）。ＬＡ植物では、ｎｉｃ１変異およびｎｉｃ２変異の相乗作用は、低収率、成熟および老化の遅延、昆虫食害に対する高い感受性、ならびに乾燥（ｃｕｒｉｎｇ）後の最終製品の低品質を特徴とする好ましくない葉表現型の原因ともなる（Ｃｈａｐｌｉｎ  ＪＦ，  Ｗｅｅｋｓ  ＷＷ  （１９７６）．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｔｏｔａｌ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  ｆｌｕｅ−ｃｕｒｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ．  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．  １６：  ４１６−４１８；  Ｌｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９７０；  Ｃｈａｐｌｉｎ  ＪＦ，  Ｂｕｒｋ  ＬＧ  （１９８３）．  Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ，  ｃｈｅｍｉｃａｌ，  ａｎｄ  ｓｍｏｋｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｆｌｕｅ−ｃｕｒｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｌｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ．  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．  ７５：  １３３−１３６）。
【０００７】
タバコ植物のＬＡ品種において好ましくない葉表現型を回復させる遺伝子を同定すること、ならびにタバコ葉品質を（優れたものとしないにしても）維持しながら変化したニコチンレベル（例えば、低減したニコチン）を含有するタバコ植物および製品を開発することの必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
概要
一局面では、本開示は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡをコードする転写可能なＤＮＡ配列に機能的に連結された誘導性プロモーターを含むタバコ植物を提供する。
【０００９】
別の局面では、本開示は、対照タバコ植物と比べて、低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する第１のゲノム改変と、同等のレベルの１つまたはそれ以上の形質を提供し、該形質が、全葉ポリアミンレベル、全根ポリアミンレベル、全葉クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、および葉表皮細胞サイズからなる群から選択される、第２のゲノム改変とを含み、かつ前記対照植物が前記第１のゲノム改変と前記第２のゲノム改変を両方とも有さない、タバコ植物またはその部分を提供する。
【００１０】
一局面では、本開示は、低減アルカロイドタバコ植物において葉品質を向上させるための方法であって、タバコ植物を生育する工程、該タバコ植物におけるプトレシンレベルを低減する工程、該タバコ植物から葉を収穫する工程を含む、方法を提供する。
【００１１】
別の局面では、本開示は、低減アルカロイドタバコ植物において葉品質を向上させるための方法であって、タバコ植物を生育する工程、該タバコ植物においてオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子の発現または活性を抑制する工程、該タバコ植物から葉を収穫する工程を含む、方法を提供する。
【００１２】
一局面では、トランスジーン抑制、変異誘発、または標的指向性ゲノム編集を介してＭＹＢ８活性が抑制されたタバコ植物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】温室で生育されたＮ．タバカム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）Ｌ．ｃｖ．バーレイ２１正常アルカロイド（ＮＡ）野生型植物および３つの変異品種の表現型特徴決定。図１Ａ：温室で生育された野生型（ＮＡ）高中間（ＨＩ、ｎｉｃ２）、低中間（ＬＩ、ｎｉｃ１）、および低アルカロイド（ＬＡ、ｎｉｃ１ｎｉｃ２）株の全クロロフィル含有量。異なる発達ステージ：開花前（摘心の２．５週間前）、摘心時、摘心してから１週間後（ＷＰＴ）、２．５ＷＰＴ、および収穫時に、１５ｃｍより長い全ての葉のクロロフィルを１枚の葉につき２回測定した。値は４つのバイオロジカルレプリケートの平均である。図１Ｂ：収穫時のＮＡ植物およびＬＡ植物の代表的な写真。図１Ｃ：葉１５における葉肉細胞数の時間経過評価。図１Ｄ：異なる植物発達ステージでのＮＡ植物およびＬＡ植物からの葉１５の葉肉細胞の顕微鏡画像。バー＝１００μｍ。ＡおよびＣの値は６つのバイオロジカルレプリケートの平均である。エラーバーは平均の標準偏差を表す。ＮＡに対する統計学的差異を示した。＊ｐ＜０．０５。
【図２】野外および温室で生育されたＮＡ植物およびＬＡ植物におけるポリアミン分析。図２Ａ：摘心してから１週間後のＮＡ植物およびＬＡ植物の十分に広がった５枚の上葉（ｕｐｐｅｒ  ｌｅａｆ）（野外で生育された３つのバイオロジカルレプリケート）からの遊離（Ｆ）および複合型（Ｃ）プトレシン（Ｐｕｔ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、ならびにスペルミン（Ｓｐｍ）含有量。図２Ｂ：温室で生育されたＮＡ植物およびＬＡ植物における全ポリアミン含有量の時間経過モニタリング。葉試料は同じ発達ステージの葉：開花前（葉１２）、摘心時（葉１９）、および収穫時の葉（２４）から収集した。根試料は摘心時および収穫時から収集した。値は３（Ａ）／４（Ｂ）つのバイオロジカルレプリケートの平均である。エラーバーは平均の標準偏差を表す。ＮＡとの統計学的差異を示した：  ＊ｐ＜０．０５；  ＊＊ｐ＜０．００５．ＰＡ：ポリアミン；ＦＷ：新鮮重量。
【図３】温室で生育されたＮＡ、ＨＩ、ＬＩ、およびＬＡ植物の葉および根におけるポリアミン含有量。開花前（葉６）、摘心時（若い葉２３、根）、および収穫時（成熟した葉２３、根）のＮＡ、ＨＩ、ＬＩ、およびＬＡ植物の葉（図３Ａ）および根（図３Ｂ）における遊離（Ｆ）および複合型（Ｃ）のプトレシン（Ｐｕｔ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、およびスペルミン（Ｓｐｍ）画分を示した。４時間光を当てた後に試料を収集し、液体窒素中ですぐに冷凍し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。値は３つのバイオロジカルレプリケートの平均である。エラーバーは平均の標準偏差を表す。統計学的差異を示した：  ＊ｐ＜０．０５；  ＊＊ｐ＜０．００１。これは、ＬＩ植物およびＬＡ植物が同じ条件下でＮＡ植物とは有意差があるｈを示す。根については摘心および収穫からの試料しか入手できなかった。ＦＷ：新鮮重量。
【図４】ポリアミン生合成酵素の活性。摘心時（若い葉２３、根）および収穫時（成熟した葉２３、根）のＮＡ植物およびＬＡ植物の葉および根におけるアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）（図４Ａ）およびオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）（図４Ｂ）活性の分析。値は３つのバイオロジカルレプリケートの平均である。エラーバーは平均の標準偏差を表す。ＮＡとの統計学的差異を示した：  ＊ｐ＜０．０５；  ＊＊ｐ＜０．００１。
【図５】未処理のＮＡ植物およびＬＡ植物、ならびに収穫時にポリアミン生合成阻害剤および／または植物成長調整物質で処理したＬＡ植物からの葉２３の代表的な写真。Ｄ−アルギニン（５ｍＭ）はＡＤＣの阻害剤である。ＤＦＭＯ（ジフルオロメチルオルニチン，  ２ｍＭ）はＯＤＣの阻害剤である。ＥＴＨ（Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標），  ０．５ｍＭ）は成長調整物質である。
【図６】ポリアミン生合成阻害剤および／またはＥｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）を用いたＬＡ植物の処理。摘心時および収穫時の未処理ＬＡ植物および処理済みＬＡ植物の葉（図６Ａ）および根（図６Ｂ）における比較を用いた全ポリアミン、遊離ポリアミン、および複合型ポリアミン。タバコ植物を、ポリアミン生合成阻害剤および／またはＥｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）（５ｍＭ  Ｄ−アルギニン、２ｍＭ  ＤＦＭＯ、２ｍＭ  ＤＦＭＯ／０．５ｍＭ  Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）、または０．５ｍＭ  Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）単独）の非存在下（ＮＡおよびＬＡ）または存在下（ＬＡ）で温室において生育した。ＤアルギニンおよびＤＦＭＯを開花前から収穫まで６週間にわたって週３回適用した。これに対して、Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）処理は摘心後（２．５週間後）から開始して収穫まで行った。試料は、１つの遺伝子型または１回の処理につき４つのバイオロジカルレプリケートの葉２３または根から、４時間光を当てた後に収集した。未処理ＬＡ植物（灰色のバー）からの平均ポリアミン含有量、またはＤ−アルギニン（黒色のバー）、ＤＦＭＯ（白色のバー）、ＤＦＭＯ／Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）（水平線のあるバー）、およびＥｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）（ディボット（ｄｉｖｏｔ）のバー）で処理した植物からの平均ポリアミン含有量間の変化倍率をプロットした。エラーバーは平均の標準偏差（ｎ＝４）を示す。ＬＡ／ＮＡの平均との統計学的差異を示した：  ＊ｐ＜０．０５。赤色の線はＮＡにおけるポリアミン含有量を表す。
【図７】Ｎ．アテヌアタ（Ｎ．ａｔｔｅｎｕａｔａ）植物における時間および組織スケールで分解したＤＣＳ蓄積。
【図８】Ｎ．アテヌアタ植物におけるクロロゲン酸（ＣＧＡ）およびフラボノイドルチンの時間および組織で分解した蓄積。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
配列の簡単な説明
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１１は、摘心応答性の根特異的発現または根選好性発現のための例示的なプロモーターの配列を示す。
【００１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１〜２１は、摘心応答性の葉特異的発現または葉選好性発現のための例示的なプロモーターの配列を示す。
【００１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を抑制する非コーディングＲＮＡをコードする例示的なＤＮＡ構築物の配列を示す。
【００１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２８は例示的なタバコＯＤＣ遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。
【００１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９〜３４は、例示的なＯＤＣ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【００１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５および３６は、本開示に従ってＯＤＣ遺伝子を標的指向する２つのｍｉＲＮＡ配列を示す。
【００２０】
様々な配列がヌクレオチド配列に「Ｎ」、またはアミノ酸配列に「Ｘ」を含む。「Ｎ」は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃでもよいか、あるいは１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失または挿入でもよい。場合によっては一続きの「Ｎ」が示される。「Ｎ」の数は、その位置にある未決定のヌクレオチドの実際の数と必ず相関するとは限らない。実際のヌクレオチド配列は、「Ｎ」の示されたセグメントよりも長くてもよいかまたは短くてもよい。同様に、「Ｘ」は任意のアミノ酸残基でもよいか、あるいは１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失または挿入でもよい。これもまた、「Ｘ」の数は、その位置にある未決定のアミノ酸の実際の数と必ず相関するとは限らない。実際のアミノ酸配列は、「Ｘ」の示されたセグメントよりも長くてもよいかまたは短くてもよい。配列表でのＳＥＱ  ＩＤの説明にＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃと比較して）が使用されているのにもかかわらず、このＳＥＱ  ＩＤはＳＥＱ  ＩＤが言及されている文脈に応じてＲＮＡ配列も指している場合がある。
【００２１】
詳細な説明
他に定義されなければ、本明細書において使用される科学技術用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、多くの方法を本開示の実施において使用できることを認識する。実際、本開示は、記載される方法および材料に何ら限定されない。本開示の目的のために、以下の用語を以下において定義する。
【００２２】
例えば、全ての特許および刊行物を含む本明細書において参照されるいずれの参考文献も参照することにより全体が組み込まれる。
【００２３】
本明細書において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しなければ、複数への言及を含む。例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含めて、複数の化合物を含んでもよい。
【００２４】
「約」という用語は、おおよそ、大まかに、その辺り、またはその領域内にあることを意味するために本明細書において使用される。「約」という用語が数値範囲と組み合わせて使用される場合、それは、示される数値より上および下に境界を広げることによってその範囲を加減する。少しでも疑いをかけられないようにするために、「約」、「少なくとも」、「少なくとも約」、「最大で」、「未満」、「より多い」、「以内」などの本明細書において使用される用語または句は、パーセントの数値の一連のリストが後に続く場合、このような用語または句は、この一続きのまたはリスト中のパーセントのどの数値も修飾するとみなされる。
【００２５】
本明細書において使用される場合、タバコ植物は、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ニコチアナ・アンプレキシカウリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ）ＰＩ  ２７１９８９；ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）ＰＩ  ５５５４７８；ニコチアナ・ビゲロビー（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ）ＰＩ  ５５５４８５；ニコチアナ・デブネイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｄｅｂｎｅｙｉ）；ニコチアナ・エクセルシオル（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ）ＰＩ  ２２４０６３；ニコチアナ・グルチノーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｌｕｔｉｎｏｓａ）ＰＩ  ５５５５０７；ニコチアナ・グッドスピーデイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ）ＰＩ  ２４１０１２；ニコチアナ・ゴセイ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｏｓｓｅｉ）ＰＩ  ２３０９５３；ニコチアナ・ヘスペリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｈｅｓｐｅｒｉｓ）ＰＩ  ２７１９９１；ニコチアナ・ナイティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ）ＰＩ  ５５５５２７；ニコチアナ・マリティマ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＰＩ  ５５５５３５；ニコチアナ・メガロシフォン（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ）ＰＩ  ５５５５３６；ニコチアナ・ヌディカウリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ）ＰＩ  ５５５５４０；ニコチアナ・パニクラータ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）ＰＩ  ５５５５４５；ニコチアナ・プルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）ＰＩ  ５５５５４８；ニコチアナ・レパンダ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｅｐａｎｄａ）ＰＩ  ５５５５５２；ニコチアナ・ルスティカ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｕｓｔｉｃａ）；ニコチアナ・スアベオレンス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）ＰＩ  ２３０９６０；ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）ＰＩ  ５５５５６９；ニコチアナ・トメントーサ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）ＰＩ  ２６６３７９；ニコチアナ・トメントシフォルミス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ）；およびニコチアナ・トリゴノフィラ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ）ＰＩ  ５５５５７２を含むが、これに限定されないニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属からの任意の植物であり得る。
【００２６】
一局面では、本開示は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡをコードする転写可能なＤＮＡ配列に機能的に連結された誘導性プロモーターを含む、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、タバコ植物は、低減したレベルのニコチンを付与する変異またはトランスジーンを含む。一局面では、タバコ植物は低アルカロイドタバコ植物である。一局面では、本開示のタバコ植物はｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、またはその両方を含む。一局面では、タバコ植物は、同様の生育条件で生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％より少ない、２％より少ない、５％より少ない、８％より少ない、１０％より少ない、１２％より少ない、１５％より少ない、２０％より少ない、２５％より少ない、３０％より少ない、４０％より少ない、５０％より少ない、６０％より少ない、７０％より少ない、または８０％より少ないレベルのニコチンを含み、対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはトランスジーンを除いて、前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。別の局面では、タバコ植物は、同様の生育条件で生育された場合の対照植物のニコチンまたは全アルカロイドレベルの１％より少ない、２％より少ない、５％より少ない、８％より少ない、１０％より少ない、１２％より少ない、１５％より少ない、２０％より少ない、２５％より少ない、３０％より少ない、４０％より少ない、５０％より少ない、６０％より少ない、７０％より少ない、または８０％より少ないレベルのニコチンまたは全アルカロイドを含む。別の局面では、タバコ植物は、同様の生育条件で生育された場合の対照植物のニコチンレベルの３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択される全アルカロイドレベルを含み、対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはトランスジーンを除いて、前記タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。別の局面では、タバコ植物は、同様の生育条件で生育された場合の対照植物のニコチンまたは全アルカロイドレベルの３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンまたは全アルカロイドレベルを含む。
【００２７】
一局面では、タバコ植物は、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノレート（ｑｕｉｎｏｌａｔｅ）ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、Ｓアデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、ｎｉｃ１、ｎｉｃ２、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ）（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする、１種類もしくはそれ以上、２種類もしくはそれ以上、３種類もしくはそれ以上、４種類もしくはそれ以上、５種類もしくはそれ以上、６種類もしくはそれ以上、７種類もしくはそれ以上、８種類もしくはそれ以上、９種類もしくはそれ以上、１０種類もしくはそれ以上、１１種類もしくはそれ以上、１２種類もしくはそれ以上、１３種類もしくはそれ以上、１４種類もしくはそれ以上、１５種類もしくはそれ以上、１６種類もしくはそれ以上、１７種類もしくはそれ以上、１８種類もしくはそれ以上、１９種類もしくはそれ以上、２０種類もしくはそれ以上、または２１種類全ての遺伝子または遺伝子座の発現または活性を直接抑制するトランスジーンまたは変異を含む。Ｄｅｗｅｙ  ａｎｄ  Ｘｉｅ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ，  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９４  （２０１３）  １０−２７を参照されたい。
【００２８】
一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される１種類またはそれ以上の、２種類もしくはそれ以上、３種類もしくはそれ以上、４種類もしくはそれ以上、５種類もしくはそれ以上、６種類もしくはそれ以上、７種類もしくはそれ以上、８種類もしくはそれ以上、９種類もしくはそれ以上、または１０種類全ての遺伝子において１つまたはそれ以上の変異をさらに含む。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、またはその両方において１つまたはそれ以上の変異をさらに含む。一局面では、タバコ植物は、ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される１種類またはそれ以上の、２種類もしくはそれ以上、３種類もしくはそれ以上、４種類もしくはそれ以上、５種類もしくはそれ以上、６種類もしくはそれ以上、７種類もしくはそれ以上、８種類もしくはそれ以上、９種類もしくはそれ以上、または１０種類全てのタンパク質をコードする遺伝子を標的指向しかつ抑制する１つまたはそれ以上のトランスジーンをさらに含む。
【００２９】
一局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、類似の条件において生育および乾燥された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはトランスジーンを除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、類似の条件において生育された場合の対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、対照植物は、低ニコチンを付与する変異またはトランスジーンを除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の６５％〜１３０％、７０％〜１３０％、７５％〜１３０％、８０％〜１３０％、８５％〜１３０％、９０％〜１３０％、９５％〜１３０％、１００％〜１３０％、１０５％〜１３０％、１１０％〜１３０％、１１５％〜１３０％、または１２０％〜１３０％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の７０％〜１２５％、７５％〜１２０％、８０％〜１１５％、８５％〜１１０％、または９０％〜１００％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
【００３０】
別の局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。別の局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、５０〜９５、５５〜９５、６０〜９５、６５〜９５、７０〜９５、７５〜９５、８０〜９５、８５〜９５、９０〜９５、５５〜９０、６０〜８５、６５〜８０、７０〜７５、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、および９０〜９５からなる群から選択されるＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の６５％〜１３０％、７０％〜１３０％、７５％〜１３０％、８０％〜１３０％、８５％〜１３０％、９０％〜１３０％、９５％〜１３０％、１００％〜１３０％、１０５％〜１３０％、１１０％〜１３０％、１１５％〜１３０％、または１２０％〜１３０％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、タバコ植物は、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値の７０％〜１２５％、７５％〜１２０％、８０％〜１１５％、８５％〜１１０％、または９０％〜１００％のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
【００３１】
一局面では、本開示はまた、ｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、およびその組合せからなる群から選択される変異を含むタバコ品種、栽培品種、または株であって、タバコ品種、栽培品種、または株が、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ品種、栽培品種、または株の葉グレードと同等の葉グレードを有し、対照タバコ品種が、変異を除いて該タバコ品種、栽培品種、または株と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ品種、栽培品種、または株を提供する。
【００３２】
一局面では、本開示は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンまたは総アルカロイドレベルを含み、非トランスジェニックタバコ植物が、乾燥された場合に、５０またはそれ以上の値、５５またはそれ以上の値、６０またはそれ以上の値、６５またはそれ以上の値、７０またはそれ以上の値、７５またはそれ以上の値、８０またはそれ以上の値、８５またはそれ以上の値、９０またはそれ以上の値、および９５またはそれ以上の値ＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる、非トランスジェニックタバコ植物またはその部分をさらに提供する。別の局面では、そのような非トランスジェニックタバコ植物は、２．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。さらなる局面では、そのような非トランスジェニックタバコ植物は、１．０％未満のニコチンレベルを含み、かつ、乾燥された場合に、７０またはそれ以上のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができる。
【００３３】
一局面では、本開示はまた、非トランスジェニック変異を含み、非トランスジェニック変異が、タバコ植物のニコチンまたは総アルカロイドレベルを、類似の生育条件において生育された場合の対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満まで低減し、タバコ植物が、乾燥された場合に、対照植物のＵＳＤＡグレード指数値と同等のＵＳＤＡグレード指数値を有する葉を生成することができ、かつ、対照植物が、非トランスジェニック変異を除いて該タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する、タバコ植物またはその部分を提供する。
【００３４】
一局面では、本開示は、遺伝子中または遺伝子座中の変異を含み、変異がＬＡバーレイ２１には存在しない、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＬＡバーレイ２１と比較して関心対象の遺伝子座においてより短い染色体移入を含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、関心対象の遺伝子座中の完全な遺伝子の欠失も完全な遺伝子コーディング配列の欠失も含まない。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、関心対象の遺伝子座においてホモ接合である。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、関心対象の遺伝子座においてヘテロ接合である。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、関心対象の遺伝子または遺伝子座における点変異、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群から選択される変異を含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物中の変異は、ランダム変異誘発および標的指向性変異誘発からなる群から選択されるアプローチにより導入される。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物中の変異は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲからなる群から選択される標的指向性変異誘発アプローチにより導入される。
【００３５】
本明細書において使用される場合、変異は、遺伝子によりコードされる産物の発現または活性を変化させるために遺伝子に導入される遺伝性の遺伝子改変を指す。そのような改変は、遺伝子の任意の配列領域中、例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ、エクソン、イントロン、３’ＵＴＲ、またはターミネーター領域中に存在し得る。一局面では、変異は、遺伝子産物の発現または活性を低減、阻害、または除去する。別の局面では、変異は、遺伝子産物の発現または活性を増大させるか、上昇させるか、強化するか、または増やす。一局面では、変異は、特定のタバコ品種または栽培品種中に存在する天然の多型ではない。本明細書において使用される場合、「変異体アレル」は、変異を含む遺伝子座からのアレルを指す。本明細書において使用される場合、「変異誘発性」は、トランスジーンを伴うことも、変異関連のトランスジーンが最終的な変異体中に残留することもなく、変異を生成することを指す。一局面では、変異誘発性はシスジェニックである。別の局面では、変異誘発性は遺伝子またはゲノム編集を介する。さらなる局面では、変異誘発性は、ランダム変異誘発、例えば、化学的（例えば、ＥＭＳ）または物理的（ｒ照射）変異誘発を介する。
【００３６】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２８およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコーディング配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の変異を含む。一局面では、１つまたはそれ以上の変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２８およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するコーディング配列を含む１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
【００３７】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９〜３４およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子内の１つまたはそれ以上の変異を含む。一局面では、１つまたはそれ以上の変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９〜３４およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を低減する。
【００３８】
ＬＡバーレイ２１（ＬＡ  ＢＵ２１としても参照される）は、いくつかの戻し交雑を通じたキューバシガー品種からの低アルカロイド遺伝子のバーレイ２１への組込みにより産生される低い総アルカロイドのタバコ株である（Ｌｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．１９７０）。それは、その親であるバーレイ２１の約３．５％（乾燥重量）と比較して約０．２％の総アルカロイド（乾燥重量）を有する。ＬＡ  ＢＵ２１は、商業的に許容される基準よりかなり低い葉グレードを有する。ＬＡ  ＢＵ２１はまた、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質により特徴付けられる他の不都合な葉の表現型を呈する（ＣｈａｐｌｉｎおよびＷｅｅｋｓ、１９７６；Ｌｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９７０；ＣｈａｐｌｉｎおよびＢｕｒｋ、１９８３）。ＬＡ  ＢＵ２１の葉はさらに、単位葉面積当たりのより高いポリアミン含有量、より高いクロロフィル含有量、およびより多い葉肉細胞などの形質を呈する。
【００３９】
報告によると、植物においてポリアミンは、細胞増殖および分裂、ストレス耐性、維管束の分化、リグニン重合、病原体防御、老化および成熟などの、発達プロセス、生理学的プロセス、および代謝プロセスに関与する（Ｆａｒｉｄｕｄｄｉｎ  Ｑ，  Ｖａｒｓｈｎｅｙ  Ｐ，  Ｙｕｓｕｆ  Ｍ，  Ａｈｍａｄ  Ａ  （２０１３）  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ：  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｅｒａｃ．  ８：  １−１６；  Ｋｕｓａｎｏ  Ｔ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ  （２０１５）．  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｎｅｘｕｓ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ，  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ｔｏｋｙｏ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．）。いくつかの研究からポリアミンと植物細胞老化の調節が結びつけられている（Ｓｏｂｉｅｓｚｃｚｕｋ−Ｎｏｗｉｃｋａ，  Ｅ．，  Ｋｕｂａｌａ，  Ｓ．，  Ｚｍｉｅｎｋｏ，  Ａ．，  Ｍａｌｅｃｋａ，  Ａ．，  Ｌｅｇｏｃｋａ，  Ｊ．  ２０１６．  Ｆｒｏｍ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｄａｒｋ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｂａｒｌｅｙ  ｌｅａｆ  ｃｅｌｌｓ．  Ｆｒｏｎｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ｄｏｉ：  １０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１５．０１１９８）。果実および栄養組織では、ポリアミンは、葉緑体光化学系複合体の崩壊と細胞壁／膜組成物の変化を防ぐ抗老化制御因子および抗成熟制御因子として作用する（Ｌｅｓｔｅｒ  ＧＥ  （２０００）．  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉ−ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｈｏｎｅｙ  ｄｅｗ  ｍｕｓｋ  ｍｅｌｏｎ  ｆｒｕｉｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １６０：  １０５−１１２；  Ｍａｔｔｏｏ  ＡＫ，  Ｈａｎｄａ  ＡＫ  （２００８）．  Ｈｉｇｈｅｒ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ  ｆｒｕｉｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １７４：  ３８６−３９３；  Ｓｅｒａｆｉｎｉ−Ｆｒａｃａｓｓｉｎｉ  Ｄ，  Ｄｉ  Ｓａｎｄｒｏ  Ａ，  Ｄｅｌ  Ｄｕｃａ  Ｓ  （２０１０）．  Ｓｐｅｒｍｉｎｅ  ｄｅｌａｙｓ  ｌｅａｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｃａｙ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４８：  ６０２−６１１）。高レベルのポリアミンはトマトつる植物（ｖｉｎｅ）の寿命を延ばし（Ｍｅｈｔａ  ＲＡ，  Ｃａｓｓｏｌ  Ｔ，  Ｌｉ  Ｎ，  Ａｌｉ  Ｎ，  Ｈａｎｄａ  ＡＫ，  Ｍａｔｔｏｏ  ＡＫ  （２００２）．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｈｙｔｏｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｃｏｎｔｅｎｔ，  ｊｕｉｃｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｖｉｎｅ  ｌｉｆｅ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：  ６１３−６１８）、酵母スペルミジン合成酵素を過剰発現するトランスジェニックトマト植物では成熟および葉老化の遅延が観察された（Ｎａｍｂｅｅｓａｎ  Ｓ，  Ｄａｔｓｅｎｋａ  Ｔ，  Ｆｅｒｒｕｚｚｉ  ＭＧ，  Ｍａｌｌａｄｉ  Ａ，  Ｍａｔｔｏｏ  ＡＫ，  Ｈａｎｄａ  ＡＫ  （２０１０）．  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ，  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅｃａｙ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６３：  ８３６−８４７）。ポリアミンは細胞壁を安定化することによって、またはエチレン、アブシジン酸、サイトカイニン、およびジベレリンなどの植物ホルモンとのクロストークによって直接作用し得る（Ｋｕｓｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ  ２０１５）。
【００４０】
ほとんどの植物において、プトレシンは、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）によってオルニチンから、またはアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）によって開始する３つの酵素段階を介してアルギニンから直接合成することができる（Ｍｉｃｈａｅｌ  ＡＪ，  Ｆｕｒｚｅ  ＪＭ，  Ｒｈｏｄｅｓ  ＭＪ，  Ｂｕｒｔｉｎ  Ｄ  （１９９６）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｎｔ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｃＤＮＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３１４：  ２４１−２４８；  Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉ  Ｍ，  Ｊａｎｏｗｉｔｚ  Ｔ，  Ｋｎｅｉｆｅｌ  Ｈ  （２００３）．  Ｐｌａｎｔ  Ｃ−Ｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｎｔ  Ｎ−ｃａｒｂａｍｏｙｌｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ  ａｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８：  １７０８−１７１２；  Ｉｌｌｉｎｇｗｏｒｔｈ  Ｃ，  Ｍａｙｅｒ  ＭＪ，  Ｅｌｌｉｏｔ  Ｋ，  Ｈａｎｆｒｅｙ  Ｃ，  Ｗａｌｔｏｎ  ＮＪ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  ＡＪ  （２００３）．  Ｔｈｅ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５４９：  ２６−３０）。以前の研究では、プトレシンへのＡＤＣ経路はタバコのアルカロイドプロファイルにほんの少ししか影響を及ぼさず、それに対して、ＯＤＣ経路はニコチン生合成に大きな役割を果たすことが述べられている（Ｃｈｉｎｔａｐａｋｏｒｎ  Ｙ，  Ｈａｍｉｌｌ  ＪＤ  （２００７）．  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＡＤＣ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃａｕｓｅｓ  ｍｉｎｏｒ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈａｉｒｙ  ｒｏｏｔ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｌａｎｔｓ  ｏｆ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．  ６８：  ２４６５−２４７９；  ＤｅＢｏｅｒ  ＫＤ，  Ｄａｌｔｏｎ  ＨＬ，  Ｅｄｗａｒｄ  ＦＪ，  Ｈａｍｉｌｌ  ＪＤ  （２０１１）．  ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  （ＯＤＣ）  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｎａｔａｂｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．  ７２：  ３４４−３５５；  ＤｅＢｏｅｒ  ＫＤ，  Ｄａｌｔｏｎ  ＨＬ，  Ｅｄｗａｒｄ  ＦＪ，  Ｒｙａｎ  ＳＭ，  Ｈａｍｉｌｌ  ＪＤ  （２０１３）．  ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  （ＯＤＣ）  ｉｍｐｅｄｅｓ  ｗｏｕｎｄ−ｓｔｒｅｓｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎａｂａｓｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｌａｕｃａ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．  ８６：  ２１−２８；  Ｄａｌｔｏｎ  ＨＬ，  Ｂｌｏｍｓｔｅｄｔ  ＣＫ，  Ｎｅａｌｅ  ＡＤ，  Ｇｌｅａｄｏｗ  Ｒ，  ＤｅＢｏｅｒ  ＫＤ，  Ｈａｍｉｌｌ  ＪＤ  （２０１６）．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｕｐｏｎ  ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｏｔ．  ６７：  ３３６７−３３８１）。プトレシンは、脱炭酸されたＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に由来するアミノプロピル基が連続して付加されることで、酵素スペルミジン合成酵素によって触媒される反応でスペルミジンに変換され、次いで、スペルミン合成酵素によって触媒される反応でスペルミンに変換される。ＳＡＭはエチレン生合成の基質でもあり（Ｔｉｂｕｒｃｉｏ  ＡＦ，  Ａｌｔａｂｅｌｌａ  Ｔ，  Ｂｉｔｒｉａｎ  Ｍ，  Ａｌｃａｚａｒ  Ｒ  （２０１４）．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ：  ｆｒｏｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｏ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｐｌａｎｔａ  ２４０：  １−１８）、エチレンは老化および果実成熟を調節する（Ｆｌｕｈｒ  Ｒ，  Ｍａｔｔｏｏ  ＡＫ  （１９９６）．  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  −  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ．  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １５：４７９−５２３）。ポリアミン生合成経路とエチレン生合成経路は共通の前駆体ＳＡＭにおいて競合するが、特に、栄養生長から成熟／老化への発達切り換えの間に反対の発達作用を有する（Ｎａｍｂｅｅｓａｎ  Ｓ，  Ｈａｎｄａ  ＡＫ，  Ｍａｔｔｏｏ  ＡＫ  （２００８）．  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．  Ｉｎ：  Ｐａｌｉｙａｔｈ  Ｇ，  Ｍｕｒｒ  ＤＰ，  Ｈａｎｄａ  ＡＫ，  Ｌｕｒｉｅ  Ｓ  （ｅｄｓ）  Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｒｕｉｔｓ，  ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ  ａｎｄ  ｆｌｏｗｅｒｓ．  Ｗｉｌｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌ，  Ａｍｅｓ．  ｐｐ  ３１９−３４０，  Ｈａｒｐａｚ−Ｓａａｄ  Ｓ，  Ｙｏｏｎ  ＧＭ，  Ｍａｔｔｏｏ  ＡＫ，  Ｋｉｅｂｅｒ  ＪＪ  （２０１２）．  Ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＣＣ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｆｏｒ  ＳＡＭ．  Ａｎｎｕ．  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．  ４４：  ５３−８１，  Ｇｕｐｔａ  Ａ，  Ｐａｌ  ＲＫ，  Ｒａｊａｍ  ＭＶ  （２０１３）．  Ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｒｕｉｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｂｙ  ＲＮＡｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｓ  ｏｆ  １−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ．  Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １７０：  ９８７−９９５）。トマト（Ｓａｆｔｎｅｒ  ＲＡ，  Ｂａｌｄｉ  ＢＧ  （１９９０）．  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｔｏｍａｔｏ  ｆｒｕｉｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９２：  ５４７−５５０；  Ｍｏｒｉｌｌａ  Ａ，  Ｇａｒｃｉａ  ＪＭ，  Ａｌｂｉ  ＭＡ  （１９９６）．  Ｆｒｅｅ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｏｍａｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ．  Ｊ．  Ａｇｒｉ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ４４：  ２６０８−２６１１）およびアボカド（Ｋｕｓｈａｄ  ＭＭ，  Ｙｅｌｅｎｏｓｋｙ  Ｇ，  Ｋｎｉｇｈｔ  Ｒ  （１９８８）．  Ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｖｏｃａｄｏ  ｆｒｕｉｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｉｐｅｎｉｎｇ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ８７：４６３−４６７）において果実成熟が開始する間にポリアミンレベルは減少し、エチレンレベルは増大する。これは、ポリアミン生合成に対して相互に拮抗する作用を反映しており、逆もまた同じである（Ｈａｒｐａｚ−Ｓａａｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；  Ａｎｗａｒ  Ｒ，  Ｍａｔｔｏｏ  Ａ，  ＨａｎｄａＡ  （２０１５）．  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｎｔ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ：  ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ａｔ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｋｕｓａｎｏ  Ｔ，  Ｓｕｚｕｋｉ  Ｈ  （ｅｄｓ）．  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｘｕｓ  ｆｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ，  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．  Ｔｏｋｙｏ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．  ｐｐ  ２６７−３０３）。しかしながら、成熟特異的Ｅ８プロモーターの制御下で酵母Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＳＡＭＤＣ）を発現するトランスジェニックトマト植物は果実成熟中に高レベルのエチレンとポリアミンを同時に生成した。このことから、この系にはＳＡＭに対する競合が無いことが分かる（Ｍｅｈｔａ  ＲＡ，  Ｃａｓｓｏｌ  Ｔ，  Ｌｉ  Ｎ，  Ａｌｉ  Ｎ，  Ｈａｎｄａ  ＡＫ，  Ｍａｔｔｏｏ  ＡＫ  （２００２）．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｏｍａｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐｈｙｔｏｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｃｏｎｔｅｎｔ，  ｊｕｉｃｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｖｉｎｅ  ｌｉｆｅ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：  ６１３−６１８）。
【００４１】
いかなる科学理論によっても縛られないが、ＬＡタバコ植物におけるニコチン生合成の抑制はニコチン経路、ポリアミン経路、およびエチレン経路間のクロストークに影響を及ぼし、その結果としてプトレシンが蓄積する。その結果としてエチレン生合成が阻害されると同時に、高次ポリアミン（ｈｉｇｈｅｒ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅ）であるスペルミジンとスペルミンに向かう代謝フラックスが増え、それによって葉の成熟と老化に劇的な効果が生じるであろう。
【００４２】
一局面では、本開示は、低ニコチンまたは低アルカロイドを付与する変異またはトランスジーンを含み、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等のレベルの１種類またはそれ以上のポリアミンを含む葉を生成することができる、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等のレベルの１種類またはそれ以上のポリアミンは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等のレベルの１種類またはそれ以上のポリアミンは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜１％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１１％〜１２％、１２％〜１３％、１３％〜１４％、１４％〜１５％、１５％〜１６％、１６％〜１７％、１７％〜１８％、１８％〜１９％、または１９％〜２０％である。さらなる局面では、同等のレベルの１種類またはそれ以上のポリアミンは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜５％、５％〜１０％、または１０％〜２０％である。
【００４３】
一局面では、本開示は、低ニコチンまたは低アルカロイドを付与する変異またはトランスジーンを含み、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等のクロロフィルレベルを含む葉を生成することができる、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等のクロロフィルレベルとは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等のクロロフィルレベルとは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜１％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１１％〜１２％、１２％〜１３％、１３％〜１４％、１４％〜１５％、１５％〜１６％、１６％〜１７％、１７％〜１８％、１８％〜１９％、または１９％〜２０％である。さらなる局面では、同等のクロロフィルレベルとは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜５％、５％〜１０％、または１０％〜２０％である。
【００４４】
一局面では、本開示は、低ニコチンまたは低アルカロイドを付与する変異またはトランスジーンを含み、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等の単位葉面積当たりの葉肉細胞数を含む葉を生成することができる、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等の単位葉面積当たりの葉肉細胞数は、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等の単位葉面積当たりの葉肉細胞数は、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜１％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１１％〜１２％、１２％〜１３％、１３％〜１４％、１４％〜１５％、１５％〜１６％、１６％〜１７％、１７％〜１８％、１８％〜１９％、または１９％〜２０％である。さらなる局面では、同等の単位葉面積当たりの葉肉細胞数は、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜５％、５％〜１０％、または１０％〜２０％である。
【００４５】
一局面では、本開示は、低ニコチンまたは低アルカロイドを付与する変異またはトランスジーンを含み、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等の表皮細胞サイズを含む葉を生成することができる、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等の表皮細胞サイズとは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等の表皮細胞サイズとは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜１％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１１％〜１２％、１２％〜１３％、１３％〜１４％、１４％〜１５％、１５％〜１６％、１６％〜１７％、１７％〜１８％、１８％〜１９％、または１９％〜２０％である。さらなる局面では、同等の表皮細胞サイズとは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜５％、５％〜１０％、または１０％〜２０％である。
【００４６】
一局面では、本開示は、低ニコチンまたは低アルカロイドを付与する変異またはトランスジーンを含み、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等の葉収率を含む葉を生成することができる、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等の葉収率とは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等の葉収率とは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜１％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１１％〜１２％、１２％〜１３％、１３％〜１４％、１４％〜１５％、１５％〜１６％、１６％〜１７％、１７％〜１８％、１８％〜１９％、または１９％〜２０％である。さらなる局面では、同等の葉収率とは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜５％、５％〜１０％、または１０％〜２０％である。
【００４７】
一局面では、本開示は、低ニコチンまたは低アルカロイドを付与する変異またはトランスジーンを含み、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等の昆虫食害感受性を示す、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、同等の昆虫食害感受性とは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である。一局面では、同等の昆虫食害感受性とは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜１％、１％〜２％、２％〜３％、３％〜４％、４％〜５％、５％〜６％、６％〜７％、７％〜８％、８％〜９％、９％〜１０％、１１％〜１２％、１２％〜１３％、１３％〜１４％、１４％〜１５％、１５％〜１６％、１６％〜１７％、１７％〜１８％、１８％〜１９％、または１９％〜２０％である。さらなる局面では、同等の昆虫食害感受性とは、同じ変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉におけるレベルの０．５％〜５％、５％〜１０％、または１０％〜２０％である。
【００４８】
昆虫食害感受性レベルは、当技術分野において公知の方法、例えば、昆虫摂食アッセイ（ｉｎｓｅｃｔ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）によってアッセイすることができる。手短に言えば、水中０．７％の１／４インチの寒天層を、１００ｍｍペトリ皿に加え、固化させる。ペトリ皿の蓋から葉ディスクを切り取り、プレートの中に入れ、寒天の中にそっと押し入れる。４〜５の葉ステージの植物から葉ディスクを採取する。中肋を除外するようにディスクを葉身から採取する。植物の最も大きな４枚の葉のそれぞれから１枚のディスクを採取して、１つの植物につき４枚のレプリケートを作製する。４つの植物を合計１６回のバイオロジカルレプリケート試験ラインのためにサンプリングする。二齢ステージの１匹の青虫を葉に加え、４８時間、周囲温度で食餌させた。４８時間後に青虫の幼虫を秤量し、幼虫の最終重量を記録する。
【００４９】
特に定めのない限り、タバコ植物、品種、栽培品種、または株についての本明細書に記載のアルカロイド、ポリアミン、もしくはニコチンレベル（もしくは別の葉の化学もしくは特性の特徴）の測定値または葉グレード指数値は、例えば、文脈に応じて、単一の植物の複数の葉の平均または単一の品種、栽培品種、もしくは株からのタバコ植物の集団からの平均測定値を含む、平均測定値を指してもよい。一局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心後に葉番号３、４、および５から収集されたプールされた葉試料において摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、ニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミン（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）の最も高いレベルを有する葉において摘心後に測定される。一局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、またはポリアミンレベルは、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０において摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、葉番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される連続する葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、および２６〜３０からなる群から選択される葉番号を有する葉において摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、および２６〜３０からなる群から選択される葉番号を有する２つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、および２６〜３０からなる群から選択される葉番号を有する３つまたはそれ以上の葉のプールにおいて摘心後に測定される。
【００５０】
アルカロイドレベルは、当技術分野において公知の方法によって、例えば、ガス液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合免疫測定法に基づく定量によってアッセイすることができる。
【００５１】
本明細書において使用される場合、葉の番号付けは、タバコの茎上の葉の位置に基づき、葉番号１は摘心後の最も古い葉（最基部）であり、最も大きい葉番号は最も若い葉（先端部）に割り当てられる。
【００５２】
平均測定値（例えば、アルカロイドもしくはニコチンレベルまたは葉のグレード付け）を決定するためのタバコ植物の集団またはタバコ葉の集合物は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０といった任意のサイズであり得る。産業上承認される標準的なプロトコールに従って平均測定値またはグレード（ｇｒａｄ）指数値が決定される。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「摘心」は、タバコ植物が栄養成熟に近くかつ生殖生長の開始時期にある時の、ＳＡＭ、花、および数枚までの隣接する葉を含む、茎の頂部の除去を指す。典型的には、タバコ植物は、つぼみステージ（花が現れ始めた直後）において摘心される。例えば、温室または野外生育のタバコ植物は、５０％の植物が少なくとも１つの開いた花を有する時に摘心され得る。タバコ植物の摘心は、頂芽優勢の喪失を結果としてもたらし、かつアルカロイド産生の増大も誘導する。
【００５４】
典型的には、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約２週間後に測定される。他の時点もまた使用され得る。一局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約１、約２、約３、約４、または約５週間後に測定される。別の局面では、タバコ植物のニコチン、アルカロイド、もしくはポリアミンレベル（または別の葉の化学もしくは特性の特徴）は、摘心してから約３、約５、約７、約１０、約１２、約１４、約１７、約１９、または約２１日後に測定される。
【００５５】
本明細書において使用される場合、「類似の生育条件」は、生育のためおよび２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間の意味のある比較を行うための類似の環境条件および／または耕種学的実施であって、環境条件および耕種学的実施のいずれも、２つまたはそれ以上の植物遺伝子型の間に観察される任意の差異に寄与せず、かつ該差異の説明とならないような、類似の環境条件および／または耕種学的実施を指す。環境条件としては、例えば、光、温度、水（湿度）、ならびに栄養物（例えば、窒素およびリン）が挙げられる。耕種学的実施としては、例えば、種まき、切取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）、切落し（ｕｎｄｅｒｃｕｔｔｉｎｇ）、移植、摘心、および吸枝が挙げられる。Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９９）、ｐｐ  ７０−１０３のＣｈａｐｔｅｒ  ４Ｂおよび４Ｃを参照。
【００５６】
本明細書で使用する「同等の葉」とは、同様のサイズ、形状、齢、および／または葉柄の位置を有する葉を指す。
【００５７】
一局面では、本開示は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡをコードする転写可能なＤＮＡ配列に機能的に連結された誘導性プロモーターを含む、タバコ植物またはその部分を提供する。一局面では、誘導性プロモーターとは摘心誘導性プロモーターである。一局面では、誘導性プロモーターはまた組織特異的プロモーターまたは組織選好性プロモーターでもある。一局面では、組織特異的プロモーターまたは組織選好性プロモーターは、シュート、根、葉、茎、花、吸器、根端、葉肉細胞、表皮細胞、および脈管構造からなる群から選択される１つまたはそれ以上の組織または器官に特異的であるか、または好ましい。さらなる局面では、摘心誘導性プロモーターは、タバコニコチンデメチラーゼ遺伝子、例えば、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、またはＣＹＰ８２Ｅ１０に由来するプロモーター配列を含む。
【００５８】
様々なタイプのプロモーターをここで使用することができる。これらは、プロモーター、例えば、構成的プロモーター、発達プロモーター、組織特異的プロモーター、組織選好性プロモーター、誘導性プロモーターなどに機能的に連結されたコード配列または遺伝子（トランスジーンを含む）の発現パターンに関連する様々な判断基準に従って分類される。植物の全てのまたはほとんどの組織において転写を開始するプロモーターは「構成的」プロモーターと呼ばれる。発達のある特定の期間またはステージに転写を開始するプロモーターは「発達」プロモーターと呼ばれる。他の植物組織と比べて、ある特定の植物組織において発現を増強するプロモーターは「組織増強」または「組織選好性」プロモーターと呼ばれる。従って、「組織選好性」プロモーターは、特異的な植物組織では比較的高い、または優先的な発現を引き起こすが、他の植物組織では低レベルの発現を引き起こす。植物の特異的な組織内で発現し、他の植物組織では発現がわずかであるかまたは発現がない、プロモーターは、「組織特異的」プロモーターと呼ばれる。植物のある特定の細胞タイプにおいて発現するプロモーターは「細胞タイプ特異的」プロモーターと呼ばれる。「誘導性」プロモーターとは、環境刺激、例えば、寒さ、乾燥、熱、もしくは光、または他の刺激、例えば、傷もしくは化学物質の適用に応答して転写を開始するプロモーターである。プロモーターはまた、異種、同種、キメラ、合成などなどの起源の点から分類されることもある。「異種」プロモーターとは、その結合している転写可能な配列、コード配列、または遺伝子（もしくはトランスジーン）と比べて異なる起源を有する、かつ／または形質転換しようとする植物種に天然に存在しない、プロモーター配列である。「異種」という用語は、もっと広範には、２つまたはそれ以上のＤＮＡ分子または配列の組み合わせが天然では通常見出されない場合には、このような組み合わせを含む。例えば、２つまたはそれ以上のＤＮＡ分子または配列が、異なるゲノムに、もしくは同じゲノム内の異なる遺伝子座に通常見出されれば、または天然で全く同じに組み合わされていなければ互いに異種であろう。
【００５９】
一局面では、誘導性プロモーターは根特異的発現または根選好性発現を提供する。一局面では、根特異的または根選好性の誘導性プロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１１からなる群から選択される配列およびその機能的断片を含む。表１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１１によってドライブされる推定の葉特異的発現レベル対根特異的発現レベルの比較を示す。
【００６０】
一局面では、誘導性プロモーターは葉特異的発現または葉選好性発現を提供する。一局面では、葉特異的または葉選好性の誘導性プロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２〜２１からなる群から選択される配列およびその機能的断片を含む。表２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２〜２１によってドライブされる推定の葉特異的発現レベル対根特異的発現レベルの比較を示す。
【００６１】
（表１）摘心応答性の根特異的発現または根選好性発現のための例示的な誘導性プロモーター
2021516055.tif 000003
【００６２】
（表２）摘心応答性の葉特異的発現または葉選好性発現のための例示的な誘導性プロモーター
2021516055.tif 000004
【００６３】
一局面では、誘導性プロモーターは、機能的に連結された転写可能なＤＮＡ配列にとって異種である。一局面では、転写可能なＤＮＡ配列は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作動性ｓｉＲＮＡ（ｔａ−ｓｉＲＮＡ）、およびヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）からなる群から選択される非コーディングＲＮＡをコードする。一局面では、非コーディングＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５および３６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列、およびその任意の部分を含む。一局面では、非コーディングＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に対して少なくとも９９％、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＯＤＣ  ＲＮＡｉ構築物中で提供される。
【００６４】
「アルカロイド」は、植物中に天然に存在する複雑な窒素含有化合物であり、ヒトおよび動物において薬理学的効果を有する。「ニコチン」は、市販のシガレットタバコ中の主要な天然アルカロイドであり、ニコチアナ・タバカム中のアルカロイド含有量の約９０パーセントを占める。タバコ中の他の主要なアルカロイドとしては、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、およびアナタビンが挙げられる。微量のタバコアルカロイドとしては、ニコチン−ｎ−オキシド、Ｎ−メチルアナタビン、Ｎ−メチルアナバシン、シュードオキシニコチン、２，３ジピリジル、およびその他が挙げられる。
【００６５】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合のｎｉｃ１変異および／またはｎｉｃ２変異のいずれも有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルの総アルカロイドまたは個々のアルカロイドを含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ植物と比較して、より低いレベルの、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、およびアナタビンからなる群から選択される１種またはそれ以上のアルカロイドを含む。一局面では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。別の局面では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの約０．５％〜１％、約１％〜２％、約２％〜３％、約３％〜４％、約４％〜５％、約５％〜６％、約６％〜７％、約７％〜８％、約８％〜９％、約９％〜１０％、約１１％〜１２％、約１２％〜１３％、約１３％〜１４％、約１４％〜１５％、約１５％〜１６％、約１６％〜１７％、約１７％〜１８％、約１８％〜１９％、約１９％〜２０％、約２１％〜２２％、約２２％〜２３％、約２３％〜２４％、約２４％〜２５％、約２５％〜２６％、約２６％〜２７％、約２７％〜２８％、約２８％〜２９％、または約２９％〜３０％のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。さらなる局面では、より低いアルカロイドまたはニコチンレベルは、対照タバコ植物のアルカロイドまたはニコチンレベルの約０．５％〜５％、約５％〜１０％、約１０％〜２０％、約２０％〜３０％のアルカロイドまたはニコチンレベルを指す。
【００６６】
アルカロイドレベルは、当技術分野において公知の方法により、例えば、気体−液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合免疫吸着アッセイに基づく定量化により、アッセイされ得る。例えば、ニコチンアルカロイドレベルは、キャピラリーカラムおよびＦＩＤ検出器を備えた気体−液体クロマトグラフィーを使用する方法のためのＣＯＲＥＳＴＡ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｎｏ．７、１９８７およびＩＳＯ規格（ＩＳＯ  ＴＣ  １２６Ｎ  ３９４  Ｅ．；Ｈｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １００：８２６−３５（１９９２）も参照）に基づくＧＣ−ＦＩＤ法により測定され得る。特に定めのない限り、本明細書に記載の全てのアルカロイドレベルは、ＣＯＲＥＳＴＡ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｎｏ  ６２、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  ｉｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  ａｎｄ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００５による方法、ならびにＦｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  Ｖｏｌ．６４、Ｎｏ．５５  Ｍａｒｃｈ  ２３、１９９９において刊行（およびＶｏｌ．７４、Ｎｏ．４、Ｊａｎｕａｒｙ  ７、２００９において補正）されたＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ’ｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｉｃｏｔｉｎｅ，Ｔｏｔａｌ  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐＨ  ｉｎ  Ｓｍｏｋｅｌｅｓｓ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓにおいて定義される方法を使用して測定される。
【００６７】
代替的に、タバコの総アルカロイドは、Ｓｋａｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）により採用されるようなタバコ試料の分析のために開発され、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：７９−８１（１９６９）により記載されているセグメントフロー比色法を使用して測定され得る。簡潔に述べれば、タバコの試料を乾燥し、粉砕し、抽出した後に総アルカロイドおよび還元糖の分析を行う。方法では次に、脱色のために酢酸／メタノール／水抽出および木炭が用いられる。総アルカロイドの決定は、有色複合体を形成するための芳香族アミンの存在下でのニコチンアルカロイドとの塩化シアノゲンの反応に基づき、該複合体は４６０ｎｍにおいて測定される。特に定めのない限り、本明細書に示される総アルカロイドレベルまたはニコチンレベルは、乾燥重量（例えば、総アルカロイドのパーセントまたはニコチンのパーセント）に基づく。
【００６８】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合のｎｉｃ１変異および／またはｎｉｃ２変異のいずれも有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルのニコチンを含む。一局面では、より低いニコチンレベルは、対照タバコ植物の平均ニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満の平均ニコチンレベルを指す。別の局面では、より低いニコチンレベルは、対照タバコ植物の平均ニコチンレベルの約０．５％〜１％、約１％〜２％、約２％〜３％、約３％〜４％、約４％〜５％、約５％〜６％、約６％〜７％、約７％〜８％、約８％〜９％、約９％〜１０％、約１１％〜１２％、約１２％〜１３％、約１３％〜１４％、約１４％〜１５％、約１５％〜１６％、約１６％〜１７％、約１７％〜１８％、約１８％〜１９％、約１９％〜２０％、約２１％〜２２％、約２２％〜２３％、約２３％〜２４％、約２４％〜２５％、約２５％〜２６％、約２６％〜２７％、約２７％〜２８％、約２８％〜２９％、または約２９％〜３０％の平均ニコチンレベルを指す。さらなる局面では、より低いニコチンレベルは、対照タバコ植物の平均ニコチンレベルの約０．５％〜５％、約５％〜１０％、約１０％〜２０％、約２０％〜３０％の平均ニコチンレベルを指す。
【００６９】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、約０．０２％、約０．０５％、約０．７５％、約０．１％、約０．１５％、約０．２％、約０．３％、約０．３５％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、約３％、約３．１％、約３．２％、約３．３％、約３．４％、約３．５％、約３．６％、約３．７％、約３．８％、約３．９％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、および約９％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％〜０．０２％、約０．０２％〜０．０５％、約０．０５％〜０．７５％、約０．７５％〜０．１％、約０．１％〜０．１５％、約０．１５％〜０．２％、約０．２％〜０．３％、約０．３％〜０．３５％、約０．３５％〜０．４％、約０．４％〜０．５％、約０．５％〜０．６％、約０．６％〜０．７％、約０．７％〜０．８％、約０．８％〜０．９％、約０．９％〜１％、約１％〜１．１％、約１．１％〜１．２％、約１．２％〜１．３％、約１．３％〜１．４％、約１．４％〜１．５％、約１．５％〜１．６％、約１．６％〜１．７％、約１．７％〜１．８％、約１．８％〜１．９％、約１．９％〜２％、約２％〜２．１％、約２．１％〜２．２％、約２．２％〜２．３％、約２．３％〜２．４％、約２．４％〜２．５％、約２．５％〜２．６％、約２．６％〜２．７％、約２．７％〜２．８％、約２．８％〜２．９％、約２．９％〜３％、約３％〜３．１％、約３．１％〜３．２％、約３．２％〜３．３％、約３．３％〜３．４％、約３．４％〜３．５％、および約３．５％〜３．６％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、乾燥重量に基づいて約０．０１％〜０．１％、約０．０２％〜０．２％、約０．０３％〜０．３％、約０．０４％〜０．４％、約０．０５％〜０．５％、約０．７５％〜１％、約０．１％〜１．５％、約０．１５％〜２％、約０．２％〜３％、および約０．３％〜３．５％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
【００７０】
本開示はまた、他のタバコ形質、例えば、葉グレード指数値に対して負の影響を有さずに変化したニコチンレベルを有するタバコ植物を提供する。一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、商業的に許容されるグレードの乾燥タバコを提供する。タバコグレードは、葉の茎上の位置、葉のサイズ、葉の色、葉の均一性および完全性、熟度、感触、弾性、光沢（葉の呈色の強度および深さの他に輝きに関する）、吸湿性（周囲の水分を吸収および保持するタバコ葉の能力）、ならびに緑色の特徴または色合いが挙げられるがそれに限定されない要因に基づいて評価される。葉グレードは、例えば、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅにより刊行されたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｅ（７  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§５１１）を使用して決定され得る。例えば、１９９０年１１月５日（５５  Ｆ．Ｒ．４０６４５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｕｒｌｅｙ  Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ  ３１  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｔｙｐｅ  ９３）；１９８９年３月２７日（５４  Ｆ．Ｒ．７９２５）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｅ−Ｃｕｒｅｄ  Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ  １１，１２，１３，１４  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｔｙｐｅ  ９２）；１９６５年１月８日（２９  Ｆ．Ｒ．１６８５４）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｅｅｄｌｅａｆ  Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ  ４１）；１９６３年１２月８日（２８  Ｆ．Ｒ．１１７１９および２８  Ｆ．Ｒ．１１９２６）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｏｈｉｏ  Ｃｉｇａｒ−Ｌｅａｆ  Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ  ４２，４３，ａｎｄ  ４４）；１９６９年１１月２０日（３４  Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｃｉｇａｒ−Ｂｉｎｄｅｒ  Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ  ５４  ａｎｄ  ５５）；１９６９年１１月２０日（３４  Ｆ．Ｒ．１７０６１）に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｃｉｇａｒ−Ｂｉｎｄｅｒ  Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅｓ  ５４  ａｎｄ  ５５）；１９７１年４月に発効されたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｇｒａｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｏｒｇｉａ  ａｎｄ  Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｓｈａｄｅ−Ｇｒｏｗｎ  Ｃｉｇａｒ−Ｗｒａｐｐｅｒ  Ｔｏｂａｃｃｏ（Ｕ．Ｓ．Ｔｙｐｅ  ６２）を参照。ＵＳＤＡグレード指数値は、産業上承認されたグレード指数にしたがって決定され得る。例えば、Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２：３９−４０（１９８８）；Ｌｅｇａｃｙ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｂａｔｅｓ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ＃５２３２６７８２６−５２３２６７８３３、Ｊｕｌｙ  １、１９８８、Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  Ｂｕｒｌｅｙ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｇｒａｄｅ  Ｉｎｄｅｘ）；およびＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎ．、１９２：５５−５７（全ての以上の参考文献は参照することにより全体が組み込まれる）を参照。一局面では、ＵＳＤＡグレード指数は、受領された連邦政府のグレードの０〜１００の数値表現であり、全ての茎上の位置の加重平均である。より高いグレード指数はより高い品質を指し示す。代替的に、葉グレードは、ハイパースペクトルイメージングを介して決定され得る。例えば、ＷＯ２０１１／０２７３１５（公開日２０１１年３月１０日；参照することにより全体が組み込まれる）を参照。同等の葉グレード指数は、同様の葉柄位置からの葉を比較した場合に、適切な対照または比較物の３０％超または３０％未満を超えては変化しない葉グレード指数を示す。一局面では、同等の葉グレード指数は、同様の葉柄位置からの葉を比較した場合に、適切な対照または比較物の２５％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、５％超、４％超、３％超、２％超、もしくは１％超または２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、もしくは１％未満を超えては変化しない。
【００７１】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、類似の生育条件において生育された場合の対照タバコ植物と比較して、類似のレベルの、３−メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される１つまたはそれ以上のタバコ芳香化合物を含む。別の局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、３−メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブダノイド、センブラノイド、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される１つまたはそれ以上のタバコ芳香化合物のレベルに対して影響を有しないｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、またはその組合せを含む。
【００７２】
本明細書において使用される場合、タバコ芳香化合物は、タバコの煙の風味および芳香と関連付けられる化合物である。これらの化合物としては、３−メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、センブラノイドおよびラブダノイドジテルペン、ならびに糖エステルが挙げられるがそれに限定されない。タバコ芳香化合物の濃度は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、核磁気共鳴分光法、液体クロマトグラフィー連結質量分析が挙げられるがそれに限定されない当技術分野における任意の公知の代謝物プロファイリング方法により測定され得る。Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ、ＷｅｃｋｗｅｒｔｈおよびＫａｈｌ編、（Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）（Ｍａｙ  ２８、２０１３）を参照。
【００７３】
本明細書において使用される場合、「還元糖」は、遊離のまたは潜在的に遊離のアルデヒドまたはケトン基を有する任意の糖（単糖または多糖）である。グルコースおよびフルクトースは、煙のｐＨを低減することおよび「遊離」の非プロトン化ニコチンの量を効果的に低減することによりシガレットの煙中のニコチン緩衝剤として作用する。還元糖は、例えば、ニコチンおよび他のタバコアルカロイドの知覚的影響を改変することにより、煙の風味の均衡を取る。糖含有量とアルカロイド含有量との逆の関係性が、タバコ品種にわたり、同じ品種内において、および栽培条件により引き起こされる同じ植物株内において報告されている。還元糖レベルは、Ｓｋａｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）により採用されるようなタバコ試料の分析のために開発され、Ｄａｖｉｓ、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：１３９−１４４（１９７６）により記載されているセグメントフロー比色法を使用して測定され得る。例えば、試料は、炭酸ナトリウム溶液に対して透析される。銅ネオクプロインが試料に添加され、溶液が加熱される。銅ネオクプロインキレートは糖の存在下で還元されて有色複合体を結果としてもたらし、該複合体は４６０ｎｍにおいて測定される。
【００７４】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ｎｉｃ１および／またはｎｉｃ２遺伝子座から１つまたはそれ以上の遺伝子活性を低減または除去するｎｉｃ１および／またはｎｉｃ２遺伝子座における１つまたはそれ以上の天然に存在しない変異体アレルを含む。一局面では、これらの変異体アレルは、より低いニコチンレベルを結果としてもたらす。変異体ｎｉｃ１および／またはｎｉｃ２アレルは、ランダムまたは標的指向性変異誘発アプローチを含む当技術分野において公知の任意の方法により導入され得る。
【００７５】
そのような変異誘発方法としては、エチルメチルスルフェート（ＥＭＳ）（ＨｉｌｄｅｒｉｎｇおよびＶｅｒｋｅｒｋ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ  ｐｒｅｓｓ、ｐｐ  ３１７−３２０、１９６５）またはＵＶ照射、Ｘ線、および高速中性子照射（例えば、Ｖｅｒｋｅｒｋ、Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．１９：１９７−２０３、１９７１；およびＰｏｅｈｌｍａｎ、Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ  Ｃｒｏｐｓ、Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ）、１９８７を参照）、トランスポゾンタグ付加（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４；米国特許第４，７３２，８５６号および米国特許第５，０１３，６５８号）を用いる種子の処理の他に、Ｔ−ＤＮＡ挿入方法論（Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８３；米国特許第５，１４９，６４５号）が挙げられるがそれに限定されない。ＥＭＳ誘導変異誘発は、ゲノムの長さにわたりランダムな点変異を化学的に誘導することからなる。高速中性子変異誘発は、種子を中性子衝撃に曝露することからなり、中性子衝撃は二本鎖ＤＮＡ切断を通じて大きな欠失を引き起こす。トランスポゾンタグ付加は、内因性遺伝子内にトランスポゾンを挿入して遺伝子の発現を低減または除去することを含む。タバコ遺伝子中に存在し得る変異の種類としては、例えば、点変異、欠失、挿入、重複、および逆位が挙げられる。そのような変異は、望ましくは、タバコ遺伝子のコーディング領域中に存在するが、タバコ遺伝子のプロモーター領域、およびイントロン、または非翻訳領域中の変異もまた望ましいことがある。
【００７６】
加えて、変性ＨＰＬＣまたは選択されるＰＣＲ産物の選択的なエンドヌクレアーゼ消化を使用する、化学的に誘導される変異のためのスクリーニングの迅速かつ自動化可能な方法、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）もまた本開示に応用可能である。ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４５５−４５７を参照。遺伝子発現に影響するまたは遺伝子の機能に干渉する変異は、当技術分野において周知の方法を使用して決定され得る。遺伝子エクソン中の挿入変異は、通常、ヌル変異体を結果としてもたらす。保存された残基中の変異は、タンパク質の機能の阻害において特に効果的であり得る。一局面では、タバコ植物は、いずれも参照することにより全体が本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６２／６１６，９５９号および同６２／６２５，８７８号に記載の１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子中のナンセンス（例えば、終止コドン）変異を含む。
【００７７】
一局面では、本開示はまた、商業的に許容される葉品質を維持しながら変化したニコチンレベルを有するタバコ株を提供する。これらの株は、精密なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ−ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１システム、およびその組合せを介してｎｉｃ１および／またはｎｉｃ２遺伝子座における１つまたはそれ以上の遺伝子中に変異を導入することにより産生され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２３３７５６号を参照）。例えば、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１（７）：３９７−４０５（２０１３）を参照。
【００７８】
変異誘発されたタバコ植物のスクリーニングおよび選択は、当業者に公知の任意の方法論を介してもよい。スクリーニングおよび選択の方法論の例としては、サザン解析、ポリヌクレオチドの検出のためのＰＣＲ増幅、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護、プライマー伸長、ＲＮＡ転写物の検出のためのＲＴ−ＰＣＲ増幅、サンガーシークエンシング、次世代シークエンシング技術（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＰａｃＢｉｏ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、４５４）、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性の検出のための酵素アッセイ、ならびにポリペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素結合イムノアッセイが挙げられるがそれに限定されない。インサイチューハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの他の技術もまた、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために使用され得る。参照される全ての技術を行うための方法は公知である。
【００７９】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１ヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼにより変異誘発または編集される。
【００８０】
一局面では、ｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、またはその両方を含む、本明細書において提供されるタバコ植物は、早期老化形質をもたらすトランスジーンまたは変異をさらに含む。一局面では、早期老化形質をもたらす変異はｙｅｌｌｏｗ  ｂｕｒｌｅｙ１（−ｙｂ１）である。一局面では、早期老化形質をもたらす変異はｙｅｌｌｏｗ  ｂｕｒｌｅｙ２（−ｙｂ２）である。一局面では、早期老化形質をもたらす変異はｐａｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ（ＰＹ）である。
【００８１】
一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する第１のゲノム改変と、同等のレベルの１つまたはそれ以上の形質を提供し、該形質が、全葉ポリアミンレベル、全根ポリアミンレベル、全葉クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、および葉表皮細胞サイズからなる群から選択される、第２のゲノム改変とを含み、対照植物は第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有さない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する第１のゲノム改変と、同等のレベルの全葉ポリアミンレベルを提供する第２のゲノム改変とを含み、対照植物は第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有さない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する第１のゲノム改変と、同等のレベルの全根ポリアミンレベルを提供する第２のゲノム改変とを含み、対照植物は第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有さない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する第１のゲノム改変と、同等のレベルの全葉クロロフィルレベルを提供する第２のゲノム改変とを含み、対照植物は第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有さない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する第１のゲノム改変と、同等のレベルの単位葉面積当たりの葉肉細胞数を提供する第２のゲノム改変とを含み、対照植物は第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有さない。一局面では、タバコ植物またはその部分は、対照タバコ植物と比べて、低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する第１のゲノム改変と、同等のレベルの葉表皮細胞サイズを提供する第２のゲノム改変とを含み、対照植物は第１のゲノム改変と第２のゲノム改変を両方とも有さない。
【００８２】
一局面では、第１のゲノム改変、第２のゲノム改変、またはその両方は、トランスジーン、変異、またはその両方を含む。一局面では、ゲノム改変、第２のゲノム改変、またはその両方はトランスジーンを含む。一局面では、第１のゲノム改変、第２のゲノム改変、またはその両方は変異を含む。一局面では、第１のゲノム改変も、第２のゲノム改変も、その両方もトランスジーンに基づいていない。一局面では、第１のゲノム改変も、第２のゲノム改変も、その両方も変異に基づいていない。
【００８３】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比較して低レベルのニコチンを提供する第１のゲノム改変を含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、またはその両方を含む第１のゲノム改変を含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、Ｎｉｃ１遺伝子座を標的指向するトランスジーン、Ｎｉｃ２遺伝子座を標的指向するトランスジーン、またはその両方を含む。
【００８４】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮメチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１、Ｎｉｃ２、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子中または遺伝子座中に変異を含む第１のゲノム改変を含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１、Ｎｉｃ２、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子座を標的指向しかつ抑制するトランスジーンを含む第１のゲノム改変を含む。
【００８５】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子中または遺伝子座中に変異を含む第１のゲノム改変を含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子座を標的指向しかつ抑制するトランスジーンを含む第１のゲノム改変を含む。
【００８６】
一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ３５からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に１つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、１つまたはそれ以上の変異は１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１３、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＮＣＧ２１、ＮＣＧ２２、ＮＣＧ２４、ＮＣＧ２６、ＮＣＧ２９、ＮＣＧ３０、およびＮＣＧ３５からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に１つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、１つまたはそれ以上の変異は、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ２１からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に１つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、１つまたはそれ以上の変異は、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に１つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、１つまたはそれ以上の変異は、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に１つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、１つまたはそれ以上の変異は、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に１つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、１つまたはそれ以上の変異は、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮＣＧ変異を有する編集または変異されたタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に１つまたはそれ以上の変異をさらに含み、１つまたはそれ以上の変異は、１つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。
【００８７】
一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ３５からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に２つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、２つまたはそれ以上の変異は、２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１３、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＮＣＧ２１、ＮＣＧ２２、ＮＣＧ２４、ＮＣＧ２６、ＮＣＧ２９、ＮＣＧ３０、およびＮＣＧ３５からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に２つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、２つまたはそれ以上の変異は、２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ２１からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に２つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、２つまたはそれ以上の変異は、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に２つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、２つまたはそれ以上の変異は、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に２つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、２つまたはそれ以上の変異は、２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に２つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、２つまたはそれ以上の変異は、２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、２つまたはそれ以上のＮＣＧ変異を有する編集または変異されたタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に２つまたはそれ以上の変異をさらに含み、２つまたはそれ以上の変異は、２つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。
【００８８】
一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ３５からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に３つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、３つまたはそれ以上の変異は、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１３、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＮＣＧ２１、ＮＣＧ２２、ＮＣＧ２４、ＮＣＧ２６、ＮＣＧ２９、ＮＣＧ３０、およびＮＣＧ３５からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に３つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、３つまたはそれ以上の変異は、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ２１からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に３つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、３つまたはそれ以上の変異は、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に３つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、３つまたはそれ以上の変異は、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に３つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、３つまたはそれ以上の変異は、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に３つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、３つまたはそれ以上の変異は、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、３つまたはそれ以上のＮＣＧ変異を有する編集または変異されたタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に３つまたはそれ以上の変異をさらに含み、３つまたはそれ以上の変異は、３つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。
【００８９】
一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ３５からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に４つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、４つまたはそれ以上の変異は、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１３、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＮＣＧ２１、ＮＣＧ２２、ＮＣＧ２４、ＮＣＧ２６、ＮＣＧ２９、ＮＣＧ３０、およびＮＣＧ３５からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に４つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、４つまたはそれ以上の変異は、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ２１からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に４つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、４つまたはそれ以上の変異は、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に４つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、４つまたはそれ以上の変異は、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に４つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、４つまたはそれ以上の変異は、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子に４つまたはそれ以上の変異を有するように変異または編集されており、４つまたはそれ以上の変異は、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、４つまたはそれ以上のＮＣＧ変異を有する編集または変異されたタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に４つまたはそれ以上の変異をさらに含み、４つまたはそれ以上の変異は、４つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。
【００９０】
一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ３５からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する１つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、１つまたはそれ以上のトランスジーンは、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１３、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＮＣＧ２１、ＮＣＧ２２、ＮＣＧ２４、ＮＣＧ２６、ＮＣＧ２９、ＮＣＧ３０、およびＮＣＧ３５からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する１つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、１つまたはそれ以上のトランスジーンは、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ２１からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する１つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、１つまたはそれ以上のトランスジーンは、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する１つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、１つまたはそれ以上のトランスジーンは、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する１つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、１つまたはそれ以上のトランスジーンは、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する１つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、１つまたはそれ以上のトランスジーンは、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮＣＧを標的指向するトランスジーンを有するタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に１つまたはそれ以上の変異をさらに含み、１つまたはそれ以上の変異は、１つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＮＣＧを標的指向するトランスジーンを有するタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、４つもしくはそれ以上、または５つもしくはそれ以上のＥＲＦ遺伝子を標的指向する１つまたはそれ以上のトランスジーンをさらに含み、１つまたはそれ以上のＥＲＦを標的指向するトランスジーンは、１つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。
【００９１】
一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ３５からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する２つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、２つまたはそれ以上のトランスジーンは、２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１３、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＮＣＧ２１、ＮＣＧ２２、ＮＣＧ２４、ＮＣＧ２６、ＮＣＧ２９、ＮＣＧ３０、およびＮＣＧ３５からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する２つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、２つまたはそれ以上のトランスジーンは、２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ２１からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する２つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、２つまたはそれ以上のトランスジーンは、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する２つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、２つまたはそれ以上のトランスジーンは、１つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する２つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、２つまたはそれ以上のトランスジーンは、２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する２つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、２つまたはそれ以上のトランスジーンは、２つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、２つまたはそれ以上のＮＣＧを標的指向するトランスジーンを有するタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に２つまたはそれ以上の変異をさらに含み、２つまたはそれ以上の変異は、２つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、２つまたはそれ以上のＮＣＧを標的指向するトランスジーンを有するタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子を標的指向する２つまたはそれ以上のトランスジーンをさらに含み、２つまたはそれ以上のＥＲＦを標的指向するトランスジーンは、２つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。
【００９２】
一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ３５からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する３つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、３つまたはそれ以上のトランスジーンは、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１３、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＮＣＧ２１、ＮＣＧ２２、ＮＣＧ２４、ＮＣＧ２６、ＮＣＧ２９、ＮＣＧ３０、およびＮＣＧ３５からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する３つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、３つまたはそれ以上のトランスジーンは、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ２１からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する３つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、３つまたはそれ以上のトランスジーンは、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する３つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、３つまたはそれ以上のトランスジーンは、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する３つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、３つまたはそれ以上のトランスジーンは、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する３つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、３つまたはそれ以上のトランスジーンは、３つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、３つまたはそれ以上のＮＣＧを標的指向するトランスジーンを有するタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に３つまたはそれ以上の変異をさらに含み、３つまたはそれ以上の変異は、３つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、３つまたはそれ以上のＮＣＧを標的指向するトランスジーンを有するタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される３つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子を標的指向する３つまたはそれ以上のトランスジーンをさらに含み、３つまたはそれ以上のＥＲＦを標的指向するトランスジーンは、３つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。
【００９３】
一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ３５からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する４つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、４つまたはそれ以上のトランスジーンは、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１３、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、ＮＣＧ１７、ＮＣＧ２１、ＮＣＧ２２、ＮＣＧ２４、ＮＣＧ２６、ＮＣＧ２９、ＮＣＧ３０、およびＮＣＧ３５からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する４つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、４つまたはそれ以上のトランスジーンは、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１〜ＮＣＧ２１からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する４つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、４つまたはそれ以上のトランスジーンは、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１１、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する４つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、４つまたはそれ以上のトランスジーンは、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ２、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する４つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、４つまたはそれ以上のトランスジーンは、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。一局面では、提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、ＮＣＧ１２、ＮＣＧ１５、ＮＣＧ１６、およびＮＣＧ１７からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子を標的指向する４つまたはそれ以上のトランスジーンを含み、４つまたはそれ以上のトランスジーンは、４つまたはそれ以上のＮＣＧ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、４つまたはそれ以上のＮＣＧを標的指向するトランスジーンを有するタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子に４つまたはそれ以上の変異をさらに含み、４つまたはそれ以上の変異は、４つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。別の局面では、４つまたはそれ以上のＮＣＧを標的指向するトランスジーンを有するタバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される４つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子を標的指向する４つまたはそれ以上のトランスジーンをさらに含み、４つまたはそれ以上のＥＲＦを標的指向するトランスジーンは、４つまたはそれ以上のＥＲＦ遺伝子の活性または発現を低減または除去する。
【００９４】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡをコードする転写可能なＤＮＡ配列に機能的に連結された誘導性プロモーターを含む第２のゲノム改変を含む。別の局面では、トランスジーン抑制、変異誘発、または標的指向性ゲノム編集を介してＭＹＢ８活性が抑制されたタバコ植物が提供される。簡単にするために、ＯＤＣ抑制（例えば、任意の特定のタイプのプロモーターに機能的に連結される）について言及した、ここでの全ての事例はＭＹＢ８抑制に等しく適用される。
【００９５】
一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の全複合型ポリアミンを葉に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の全複合型ポリアミンを根に含む。ここで使用される、複合型ポリアミンには、１つまたはそれ以上のフェニルプロパノイド、例えば、フェルラ酸、コーヒー酸、およびクマル酸（ｃｏｕｒｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ）と結合体化した、可溶性複合型ポリアミン、例えば、遊離ポリアミン（例えば、プトレシン、スペルミン、および／またはスペルミジン）からなるバックボーンを含有するフェノールアミドが含まれるが、これに限定されない。複合型ポリアミンには、リグニンなどの構造ポリマーに組み込まれた不溶性複合型ポリアミンも含まれるが、これに限定されない。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の全遊離ポリアミン（例えば、プトレシン、スペルミン、およびスペルミジン）を葉に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の全複合型ポリアミンを根に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１種類またはそれ以上のポリアミンの全複合型を葉に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１種類またはそれ以上のポリアミンの全複合型を根に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１種類またはそれ以上のポリアミンの全遊離型を葉に含む。一局面では、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比べて低減した量の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１種類またはそれ以上のポリアミンの全複合型を根に含む。
【００９６】
一局面では、ここで説明したタバコ植物の特徴または形質は、開花直前、摘心時、摘心してから１週間後（ＷＰＴ）、２ＷＰＴ、３ＷＰＴ、４ＷＰＴ、５ＷＰＴ、６ＷＰＴ、７ＷＰＴ、８ＷＰＴ、および収穫時からなる群から選択される時期に測定される。一局面では、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変とを含む、本明細書において提供されるタバコ植物は、対照植物に由来する葉の葉グレードと同等の葉グレードを有する葉を生成することができる。一局面では、第１のゲノム改変と第２のゲノム改変とを含む、本明細書において提供されるタバコ植物は対照植物と同等の全葉収率を有する。
【００９７】
本明細書において使用される場合、「編集」または「ゲノム編集」は、内因性の植物ゲノム核酸配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０ヌクレオチドの標的指向性変異誘発、または内因性の植物ゲノム核酸配列の除去もしくは置換を指す。一局面では、提供される編集された核酸配列は、内因性核酸配列と少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。一局面では、提供される編集された核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２８およびその断片と少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。別の局面では、提供される編集された核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９〜３４からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。
【００９８】
メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、ゲノム配列の標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、それは次に、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然のプロセスにより修復される。次に、切断された部位において配列改変が行われ、それは、ＮＨＥＪの場合に遺伝子破壊を結果としてもたらす欠失もしくは挿入、またはＨＲによるドナー核酸配列の組込みを含み得る。一局面では、提供される方法は、提供されるヌクレアーゼを用いて植物ゲノムを編集して、ドナーポリヌクレオチドを用いるＨＲを介して植物ゲノム中の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド超を変異させる工程を含む。一局面では、提供される変異は、ヌクレアーゼを使用するゲノム編集により引き起こされる。別の局面では、提供される変異は、非相同末端結合または相同組換えにより引き起こされる。
【００９９】
一局面では、本明細書において提供される変異は、１つまたはそれ以上の酸化防止剤について、関心対象の遺伝子、例えば、生合成酵素、調節性転写因子、トランスポーター、異化酵素、またはその組合せからなる群から選択される遺伝子の発現または活性を活性化させる優性変異体を提供する。
【０１００】
一般的に微生物において同定されるメガヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの部位特異的な消化を結果としてもたらす高い活性および長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有する特有の酵素である。天然に存在するメガヌクレアーゼの操作型は、典型的には、伸長されたＤＮＡ認識配列（例えば、１４〜４０ｂｐ）を有する。メガヌクレアーゼの操作は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの操作より困難であり得、その理由は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ認識と切断機能が単一ドメインにおいて絡み合っているからである。特有の配列を認識しかつ向上したヌクレアーゼ活性を有する新規のメガヌクレアーゼバリアントを作製するために変異誘発およびハイスループットスクリーニングの特別の方法が使用されている。
【０１０１】
ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合した操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる合成タンパク質である。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの改変のために二本鎖ＤＮＡの任意の長さと言ってよい長さのストレッチを切断するように設計され得る。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列に結合するように操作されたジンクフィンガーアレイに融合したＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの非特異的なＤＮＡ切断ドメインから構成される単量体から二量体を形成する。
【０１０２】
ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３〜４個のジンクフィンガーアレイから構成される。標的ＤＮＡへの部位特異的な結合に寄与するジンクフィンガー∞−ヘリックスの開始に対して−１、＋２、＋３、および＋６の位置のアミノ酸を変更およびカスタマイズして、特定の標的配列に適合させることができる。他のアミノ酸はコンセンサス骨格を形成して、異なる配列特異性を有するＺＦＮを生成する。ＺＦＮ用の標的配列を選択するための規則は当技術分野において公知である。
【０１０３】
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡを切断するために二量体化を必要とし、したがって、Ｃ末端領域を有する２つのＺＦＮは切断部位の対向するＤＮＡ鎖（５〜７ｂｐだけ分離されている）に結合することが必要とされる。２−ＺＦ−結合部位がパリンドロームの場合、ＺＦＮ単量体は標的部位を切断することができる。ＺＦＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＺＦＮからの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＺＦＮを含む。ＺＦＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働くように操作された一対のＺＦＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
【０１０４】
いかなる科学理論によっても限定されないが、ジンクフィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は様々な方法の１つを使用して原理的に再操作され得るので、カスタマイズされたＺＦＮは理論的に、ほぼすべての遺伝子配列を標的指向するように構築され得る。ジンクフィンガードメインを操作するための公開されている方法としては、Ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）、Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ  Ｐｏｏｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＯＰＥＮ）、およびＭｏｄｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙが挙げられる。
【０１０５】
ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合させることにより生成される人工的な制限酵素である。ＴＡＬＥＮペアの各メンバーが標的部位に隣接するＤＮＡ部位に結合する場合、ＦｏｋＩ単量体は二量体化して標的部位において二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。ＴＡＬＥＮという用語は、本明細書において使用される場合、広義のものであり、別のＴＡＬＥＮの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断できる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位においてＤＮＡを切断するために一緒に働く一対のＴＡＬＥＮの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
【０１０６】
転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際的に任意のＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。ＴＡＬＥタンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の様々な植物細菌性病原体に由来するＤＮＡ結合ドメインである。キサントモナス病原体は、感染の間に宿主植物細胞中にＴＡＬＥを分泌する。ＴＡＬＥは核に移動し、そこで宿主ゲノム中の特定の遺伝子のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列のプロモーター領域中の特定のＤＮＡ配列を認識してそれに結合する。ＴＡＬＥは、３３〜３４アミノ酸の１３〜２８個のリピートモノマーから構成される中心のＤＮＡ結合ドメインを有する。各単量体のアミノ酸は、位置１２および１３における超可変アミノ酸残基を除いて高度に保存されている。２つの可変アミノ酸は反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＲＶＤのアミノ酸ペアＮＩ、ＮＧ、ＨＤ、およびＮＮはそれぞれ、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニン／アデニンを優先的に認識し、ＲＶＤのモジュレーションは、連続するＤＮＡ塩基を認識することができる。アミノ酸配列とＤＮＡ認識とのこの単純な関係性は、適切なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組合せを選択することによる特定のＤＮＡ結合ドメインの操作を可能とした。
【０１０７】
野生型ＦｏｋＩ切断ドメインの他に、変異を有するＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントが、切断特異性および切断活性を向上させるために設計されている。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向および空間的配置を有する標的ゲノム中の部位のための特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基数の両方は、高レベルの活性を達成するためのパラメータである。
【０１０８】
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との関係性は、設計可能なタンパク質を可能とする。ＤＮＡ  Ｗｏｒｋｓなどのソフトウェアプログラムを使用してＴＡＬＥ構築物を設計することができる。ＴＡＬＥ構築物を設計する他の方法は当業者に公知である。Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）４０：Ｗ１１７−１２２．；Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）．３９：ｅ８２；およびｔａｌｅ−ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔを参照。
【０１０９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＦｏｋＩベースの方法のＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの代替である。ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位におけるＤＮＡ配列を認識するために相補的塩基対形成を使用するＲＮＡガイド操作型ヌクレアーゼに基づく。
【０１１０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細菌および古細菌の適応免疫系の部分であり、配列依存的な方式で外来ＤＮＡを切断することによりウイルスなどの侵入性核酸からそれらを保護する。免疫は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位末端における２つの隣接リピートの間のスペーサーとして公知の侵入性ＤＮＡの短い断片の組込みにより獲得される。スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイは、侵入性ＤＮＡとのその後の遭遇の間に転写され、約４０ｎｔの長さの低分子干渉ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされ、ｃｒＲＮＡはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と合わさってＣａｓ９ヌクレアーゼを活性化およびガイドする。これは侵入性ＤＮＡ中のプロトスペーサーとして公知の相同的二本鎖ＤＮＡ配列を切断する。切断のための必要条件は、標的ＤＮＡの下流の保存されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在であり、これは通常、配列５−ＮＧＧ−３、より低い頻度でＮＡＧを有する。特異性は、ＰＡＭの約１２塩基上流のいわゆる「シード配列」により提供され、これはＲＮＡと標的ＤＮＡとの間でマッチしなければならない。Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はＣａｓ９と類似の方式で作用するが、Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１はｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする。
【０１１１】
さらに別の局面では、提供されるタバコ植物は、ニコチンデメチラーゼをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子座中の１つまたはそれ以上の変異を欠いた対照植物と比較して、低減した量のノルニコチンを付与するニコチンデメチラーゼをコードする１つまたはそれ以上の遺伝子座中の１つまたはそれ以上の変異（例えば、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、ＣＹＰ８２Ｅ１０）をさらに含む（米国特許第８，３１９，０１１号、同第８，１２４，８５１号、同第９，１８７，７５９号、同第９，２２８，１９４号、同第９，２２８，１９５号、同第９，２４７，７０６号を参照）。一局面では、記載される改変タバコ植物は、同等の条件下で生育および乾燥された場合の対照植物と比較して低減したニコチンデメチラーゼ活性をさらに含む。さらなる局面では、提供されるタバコ植物は、高レベルの１種類またはそれ以上の種類の酸化防止剤をもたらす１つまたはそれ以上の変異またはトランスジーンをさらに含む（米国特許出願第１５／７２７，５２３号およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５５６１８を参照されたい）。別の局面では、提供されるタバコ植物は、低減したレベルの１つまたはそれ以上のＴＳＮＡ（例えば、Ｎ’−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、４−メチルニトロソアミノ−ｌ−（３−ピリジル）−ｌ−ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ’−ニトロソアナタビン（ＮＡＴ）Ｎ’−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ））をもたらす１つまたはそれ以上の変異またはトランスジーンをさらに含む。
【０１１２】
本開示はまた、植物において、特に、様々な商用品種のタバコ植物を含むニコチアナ属の植物において、ポリアミン生合成またはその調節に関与する１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または機能を阻害するための組成物および方法も提供する。
【０１１３】
一局面では、本開示は、ＯＤＣ阻害配列を含む異種発現カセットを含む、タバコ植物またはその部分を提供する。別の局面では、タバコ植物またはその部分は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２８からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む遺伝子の阻害配列、およびその断片を含む異種発現カセットを含み、阻害配列は、植物細胞において機能するプロモーターに機能的に連結され、阻害配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２８からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列、およびその断片の少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、または少なくとも８０ヌクレオチドの断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、「阻害する」、「阻害」、および「阻害すること」という用語は、関心対象の遺伝子産物（例えば、標的遺伝子産物）の発現または機能を減少させる当技術分野において公知のまたは本明細書に記載の任意の方法として定義される。「阻害」は、２つの植物、例えば、遺伝学的に変化した植物と野生型植物との比較の文脈におけるものであり得る。代替的に、標的遺伝子産物の発現または機能の阻害は、同じ植物内のまたは異なる植物間の植物細胞、細胞小器官、器官、組織、もしくは植物部分の間での比較の文脈におけるものであり得、同じ植物内もしくは植物部分内のまたは植物間もしくは植物部分間の発達ステージもしくは時間的ステージの間での比較が挙げられる。「阻害」は、関心対象の遺伝子産物の機能または産生の完全な除去を含めて該完全な除去までの、その遺伝子産物の機能または産生の任意の相対的な減少を含む。「阻害」という用語は、標的遺伝子産物の翻訳および／もしくは転写または標的遺伝子産物の機能的活性を下方調節する任意の方法または組成物を包含する。一局面では、改変植物中の１つまたはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルは、変異体ではない植物中またはその遺伝子の発現を阻害するように遺伝子改変されていない植物中の同じ遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満である。
【０１１５】
「阻害配列」という用語は、植物中のＮｉｃ１ｂ遺伝子座からのニコチン生合成調節に関与する遺伝子の発現または機能を阻害することができる任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を包含し、例えば、全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、切断型ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の断片、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のバリアント、センス方向のヌクレオチド配列、アンチセンス方向のヌクレオチド配列、センスまたはアンチセンス方向のヌクレオチド配列の相補体、ヌクレオチド配列の逆位領域、ヌクレオチド配列のヘアピン、二本鎖ヌクレオチド配列、一本鎖ヌクレオチド配列、およびその組合せなどである。「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学修飾核酸、核酸アナログ、およびその組合せなどの配列を含む。
【０１１６】
阻害配列は、標的遺伝子産物の名称により指し示される。したがって、「ＯＤＣ阻害配列」は、例えば、転写および／もしくは翻訳のレベルにおいて、植物中のポリアミン生合成調節に関与するＯＤＣ遺伝子の発現を阻害することができる、または遺伝子産物の機能を阻害することができる阻害配列を指す。「阻害することができる」という語句がポリヌクレオチド阻害配列の文脈において使用される場合、それは、阻害配列自体が阻害効果を発揮すること；または、阻害配列が阻害性ヌクレオチド分子（例えば、ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド）をコードするか、もしくは阻害性ポリペプチド（例えば、標的遺伝子産物の発現もしくは機能を阻害するポリペプチド）をコードする場合、その転写（例えば、ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは二本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする阻害配列の場合）もしくはその転写および翻訳（阻害性ポリペプチドをコードする阻害配列の場合）後に、それぞれ転写もしくは翻訳された産物が標的遺伝子産物に対する阻害効果を発揮する（例えば、標的遺伝子産物の発現もしくは機能を阻害する）ことを意味するように意図される。
【０１１７】
開示されるＯＤＣ阻害配列は、センス抑制／共抑制、アンチセンス抑制、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ干渉およびイントロン含有ヘアピンＲＮＡ干渉、アンプリコン媒介性干渉、リボザイム、小干渉性ＲＮＡ、人工または合成マイクロＲＮＡ、および人工トランス作用性ｓｉＲＮＡが挙げられるがそれに限定されない当技術分野において公知の任意のサイレンシング経路または機構を介して遺伝子サイレンシングを誘発する配列であり得る。ＯＤＣ阻害配列は、所望のアウトカムに依存して、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約４００ヌクレオチドから本開示のタンパク質をコードする全長ポリヌクレオチドまでの範囲内であってもよい。一局面では、ＯＤＣ阻害配列は、約５０〜約４００ヌクレオチド、約７０〜約３５０ヌクレオチド、約９０〜約３２５ヌクレオチド、約９０〜約３００ヌクレオチド、約９０〜約２７５ヌクレオチド、約１００〜約４００ヌクレオチド、約１００〜約３５０ヌクレオチド、約１００〜約３２５ヌクレオチド、約１００〜約３００ヌクレオチド、約１２５〜約３００ヌクレオチド、または約１２５〜約２７５ヌクレオチドの長さの断片であり得る。
【０１１８】
「ポリヌクレオチド」という用語の使用は、ＤＮＡを構成するポリヌクレオチドに本開示を限定することを意図しない。当業者は、ポリヌクレオチドはリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオシドとの組合せを含み得ることを認識する。そのようなデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオチドとしては、天然に存在する分子および合成アナログの両方が挙げられる。本開示のポリヌクレオチドはまた、一本鎖形態、二本鎖形態、ヘアピン、およびステム−アンド−ループ構造などが挙げられるがそれに限定されない全ての形態の配列を包含する。
【０１１９】
一局面では、本開示は、タバコ細胞中で機能し、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２８およびその断片からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＲＮＡに結合することができるＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された、プロモーターを含み、かつ、ＲＮＡ分子がポリペプチドの発現を抑制する、組換えＤＮＡ構築物を提供する。一局面では、ＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびトランス作用性ｓｉＲＮＡからなる群から選択される。別の局面では、組換えＤＮＡ構築物は二本鎖ＲＮＡをコードする。これらの組換えＤＮＡ構築物を含むトランスジェニックタバコ植物もしくはその部分、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品もまた提供される。一局面では、これらのトランスジェニック植物、乾燥タバコ材料、またはタバコ製品は、組換えＤＮＡ構築物を有しない対照タバコ植物と比較してより低いレベルのニコチンを含む。タバコ植物のニコチンレベルを低減する方法であって、これらの組換えＤＮＡ構築物のいずれかを用いてタバコ植物を形質転換する工程を含む、方法がさらに提供される。
【０１２０】
本明細書において使用される場合、「機能的に連結された」は、２つまたはそれ以上の要素の間の機能しうる連結を指す。例えば、関心対象のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との機能的な連結は、関心対象のポリヌクレオチドの発現を可能とする機能しうる連結である。機能的に連結された要素は、連続または非連続であってもよい。
【０１２１】
本明細書において使用され、かつ配列に関して使用される場合、「異種」は、外来種を起源とするか、または、同じ種からの場合、意図的なヒトの介入により組成物および／もしくはゲノム位置においてその天然の形態から実質的に改変されている配列を指す。この用語はまた、本明細書において「ポリヌクレオチド構築物」または「ヌクレオチド構築物」と称されることもある核酸構築物にあてはまる。このようにして、「異種」核酸構築物は、外来種を起源とするか、または、同じ種からの場合、意図的なヒトの介入により組成物および／もしくは位置においてその天然の形態から実質的に改変されている構築物を意味することが意図される。異種核酸構築物としては、例えば、形質転換方法、または関心対象の別の植物を用いるトランスジェニック植物のその後の育種を介して、植物またはその植物部分に導入された組換えヌクレオチド構築物が挙げられるがそれに限定されない。一局面では、使用されるプロモーターは、プロモーターによりドライブされる配列にとって異種である。別の局面では、使用されるプロモーターは、タバコにとって異種である。さらなる局面では、使用されるプロモーターは、タバコにとって天然である。
【０１２２】
一局面では、記載される改変タバコ植物はシスジェニック植物である。本明細書において使用される場合、「シスジェネシス」または「シスジェニック」は、全ての成分（例えば、プロモーター、ドナー核酸、選択遺伝子）が植物のみを起源とする（すなわち、非植物起源の成分は使用されない）植物、植物細胞、または植物ゲノムの遺伝子改変を指す。一局面では、提供される改変植物、植物細胞、または植物ゲノムはシスジェニックである。提供されるシスジェニック植物、植物細胞、および植物ゲノムは、使用準備済みのタバコ株に繋がり得る。別の局面では、提供される改変タバコ植物は、非タバコの遺伝材料および配列のいずれも含まない。
【０１２３】
本明細書において使用される場合、「遺伝子発現」は、遺伝子産物の転写および／または翻訳を含む、遺伝子産物の生合成または産生を指す。
【０１２４】
一局面では、組換えＤＮＡ構築物または発現カセットはまた、トランスジェニック細胞の選択のための選択マーカー遺伝子を含み得る。選択マーカー遺伝子としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子などの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子の他に、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）などの除草性化合物に対して抵抗性を付与する遺伝子が挙げられるがそれに限定されない。追加の選択マーカーとしては、β−ガラクトシダーゼなどの表現型マーカーおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質が挙げられる。
【０１２５】
一局面では、組換えＤＮＡ構築物または発現カセットは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および組織選好性プロモーター（例えば、葉特異的または根特異的プロモーター）からなる群から選択されるプロモーターを含む。例示的な構成的プロモーターとしては、Ｒｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよび米国特許第６，０７２，０５０号に開示される他の構成的プロモーター；コアＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ  ３：２７２３−２７３０）；ならびにＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などが挙げられる。例示的な化学物質誘導性プロモーターとしては、サリチル酸により活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターが挙げられる。他の関心対象の化学物質誘導性プロモーターとしては、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０４２１−１０４２５およびＭｃＮｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４（２）：２４７−２５７におけるグルココルチコイド誘導性プロモーターを参照）ならびにテトラサイクリン誘導性プロモーター（例えば、Ｇａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７、および米国特許第５，８１４，６１８号および同第５，７８９，１５６号を参照）が挙げられる。使用され得る追加の例示的なプロモーターは、熱調節性遺伝子発現、光調節性遺伝子発現（例えば、エンドウマメｒｂｃＳ−３Ａ；トウモロコシｒｂｃＳプロモーター；エンドウマメにおいて見出されるクロロフィルａｌｂ結合性タンパク質遺伝子；またはＡｒａｂｓｓｕプロモーター）、ホルモン調節性遺伝子発現（例えば、コムギのＥｍ遺伝子からのアブシジン酸（ＡＢＡ）応答性配列；オオムギおよびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＡＢＡ誘導性のＨＶＡ１およびＨＶＡ２２、およびｒｄ２９Ａプロモーター；ならびに創傷誘導性遺伝子発現（例えば、ｗｕｎｌ）、器官特異的遺伝子発現（例えば、塊茎特異的貯蔵タンパク質遺伝子；により記載されるトウモロコシからの２３ｋＤａのゼイン遺伝子；またはインゲンマメ（β−ファセオリン遺伝子）、または病原体誘導性プロモーター（例えば、ＰＲ−１、ｐｒｐ−１、または（β−１，３グルカナーゼプロモーター、コムギの真菌誘導性のｗｉｒｌａプロモーター、および線虫誘導性プロモーター、それぞれタバコ乾燥パセリのＴｏｂＲＢ７−５ＡおよびＨｍｇ−１）に関与するものである。
【０１２６】
一局面では、提供されるタバコ植物は、ニコチン生合成または輸送に関与する遺伝子の活性の発現の増大または低減をさらに含む。ニコチン生合成に関与する遺伝子としては、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ−アデノシル−メチオニンシンセターゼ（ＳＡＭＳ）が挙げられるがそれに限定されない。ニコチン酸誘導体とメチルピロリニウム陽イオンとの縮合段階を触媒するニコチンシンターゼは解明されていないが、２つの候補遺伝子（Ａ６２２およびＮＢＢ１）が提唱されている。ＵＳ２００７／０２４０７２８Ａ１およびＵＳ２００８／０１２０７３７Ａ１を参照。Ａ６２２はイソフラボンレダクターゼ様タンパク質をコードする。加えて、いくつかのトランスポーターがニコチンの移行に関与し得る。ＭＡＴＥと命名されたトランスポーター遺伝子がクローニングおよび特徴決定されている（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  １０６：２４４７−５２（２００９））。
【０１２７】
一局面では、提供されるタバコ植物は、対照タバコ植物と比較して、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の増大または低減したレベルのｍＲＮＡ、タンパク質、または両方をさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を直接的に抑制するトランスジーンをさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子の発現または活性を抑制するトランスジーンまたは変異をさらに含む。別の局面では、提供されるタバコ植物は、ＰＭＴ、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子を過剰発現するトランスジーンをさらに含む。
【０１２８】
当技術分野において公知の任意の好適な形質転換方法を使用する記載される組換え構築物または発現カセットを用いるタバコ植物の形質転換もまた開示される。ポリヌクレオチド配列をタバコ植物に導入するための方法は当技術分野において公知であり、安定な形質転換方法、一過性形質転換方法、およびウイルス媒介性の方法が挙げられるがそれに限定されない。「安定な形質転換」は、植物に導入された関心対象のヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれ、その子孫に遺伝することができる形質転換を指す。「一過性形質転換」は、配列が植物に導入され、かつ、一時的にのみ発現されるかまたは一過性にのみ植物中に存在することを意味することが意図される。
【０１２９】
ポリヌクレオチドを本開示の植物細胞に導入する好適な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：３２０−３３４）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３１３−３３６；Ｒｉｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：５６０２−５６０６）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性の形質転換（米国特許第５，１０４，３１０号、同第５，１４９，６４５号、同第５，１７７，０１０号、同第５，２３１，０１９号、同第５，４６３，１７４号、同第５，４６４，７６３号、同第５，４６９，９７６号、同第４，７６２，７８５号、同第５，００４，８６３号、同第５，１５９，１３５号、同第５，５６３，０５５号、および同第５，９８１，８４０号）、直接的な遺伝子移入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２）、および衝撃粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）（例えば、米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１４１，１３１号、同第５，８８６，２４４号、同第５，８７９，９１８号、および同第５，９３２，７８２号；Ｔｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、ＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ）；ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６を参照）が挙げられる。Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１−６７４（ダイズ）；ＭｃＣａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６（ダイズ）；ＦｉｎｅｒおよびＭｃＭｕｌｌｅｎ（１９９１）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７Ｐ：１７５−１８２（ダイズ）；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９６：３１９−３２４（ダイズ）；Ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）、Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅｓ、Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．編（Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｎ．Ｙ．）、ｐｐ．１９７−２０９（花粉）；Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８およびＫａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８４：５６０−５６６（ウィスカー媒介性形質転換）；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ４：１４９５−１５０５（エレクトロポレーション）も参照。
【０１３０】
別の局面では、組換え構築物または発現カセットは、植物をウイルスまたはウイルス核酸と接触させることにより植物に導入されてもよい。概しては、そのような方法は、本開示の発現カセットをウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に組み込む工程を含む。発現カセットにおいて使用するためのプロモーターはまた、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによる転写のために用いられるプロモーターを包含することが認識される。ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ分子を伴う、ポリヌクレオチドを植物に導入し、かつ、それにコードされるタンパク質を発現させるための方法は当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，８８９，１９１号、同第５，８８９，１９０号、同第５，８６６，７８５号、同第５，５８９，３６７号、同第５，３１６，９３１号、およびＰｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：２０９−２２１を参照。
【０１３１】
器官発生によるものであれ胚発生によるものであれ、クローン法を使用してその後に繁殖され得る任意の植物組織は、組換え構築物または発現カセットを用いて形質転換されてもよい。「器官発生」により、シュートおよび根が成長点の中心から逐次的に発達するプロセスが意図される。「胚発生」により、シュートおよび根が、体細胞からであれ配偶子からであれ、協調した様式（逐次的ではない）において一緒に発達するプロセスが意図される。記載される様々な形質転換プロトコールのために好適な例示的な組織としては、カルス組織、既存の分裂性組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根端分裂組織）ならびに誘導性分裂組織（例えば、子葉分裂組織および胚軸分裂組織）、胚軸、子葉、葉盤、花粉、ならびに胚などが挙げられるがそれに限定されない。
【０１３２】
一局面では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色空気乾燥タバコ、暗色火力乾燥タバコ、ガルパオ（Ｇａｌｐａｏ）タバコ、およびオリエンタル（Ｏｒｉｅｎｔａｌ）タバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。別の局面では、提供されるタバコ植物は、バーレイタバコ、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）タバコ、およびダークタバコからなる群から選択されるタバコ種からのものである。
【０１３３】
一局面では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコのバックグラウンドであるか、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の熱風乾燥タバコの特徴を呈する。熱風乾燥タバコ（バージニア（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）またはブライトタバコとも呼ばれる）は、世界のタバコ産生の約４０％の量を占める。熱風乾燥タバコは、乾燥の間に達するゴールデンイエローからディープオレンジの色のため、多くの場合に「ブライトタバコ」とも称される。熱風乾燥タバコは、軽い、鮮烈な芳香および味を有する。熱風乾燥タバコは、概して、糖分が高くかつ油分が低い。主要な熱風乾燥タバコ生育国は、アルゼンチン、ブラジル、中国、インド、タンザニアおよび米国である。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、ＣＣ  １３、ＣＣ  ２７、ＣＣ  ３３、ＣＣ  ３７、ＣＣ  ６５、ＣＣ  ６７、ＣＣ  ７００、ＧＦ  ３１８、ＧＬ  ３３８、ＧＬ  ３６８、ＧＬ  ９３９、Ｋ  ３４６、Ｋ  ３９９、Ｋ３２６、ＮＣ  １０２、ＮＣ  １９６、ＮＣ  ２９１、ＮＣ  ２９７、ＮＣ  ２９９、ＮＣ  ４７１、ＮＣ  ５５、ＮＣ  ６０６、ＮＣ  ７１、ＮＣ  ７２、ＮＣ  ９２、ＰＶＨ  １１１８、ＰＶＨ  １４５２、ＰＶＨ  ２１１０、スペイト（ＳＰＥＩＧＨＴ）１６８、スペイト  ２２０、スペイト  ２２５、スペイト  ２２７、スペイト  ２３６、および以上の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される熱風乾燥タバコのバックグラウンドである。別の局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、コッカー（Ｃｏｋｅｒ）４８、コッカー  １７６、コッカー３７１ゴールド（Ｃｏｋｅｒ  ３７１−Ｇｏｌｄ）、コッカー  ３１９、コッカー  ３４７、ＧＬ  ９３９、Ｋ  １４９、Ｋ３２６、Ｋ  ３４０、Ｋ  ３４６、Ｋ  ３５８、Ｋ  ３９４、Ｋ  ３９９、Ｋ  ７３０、ＮＣ  ２７ＮＦ、ＮＣ  ３７ＮＦ、ＮＣ  ５５、ＮＣ  ６０、ＮＣ  ７１、ＮＣ  ７２、ＮＣ  ８２、ＮＣ  ９５、ＮＣ  ２９７、ＮＣ  ６０６、ＮＣ  ７２９、ＮＣ  ２３２６、マクネア（ＭｃＮａｉｒ）３７３、マクネア９４４、Ｏｘ  ２０７、Ｏｘ  ４１４  ＮＦ、レームズ（Ｒｅａｍｓ）１２６、レームズ７１３、レームズ７４４、ＲＧ  ８、ＲＧ  １１、ＲＧ  １３、ＲＧ  １７、ＲＧ  ２２、ＲＧ  ８１、ＲＧ  Ｈ４、ＲＧ  Ｈ５１、スペイトＨ−２０、スペイトＧ−２８、スペイトＧ−５８、スペイトＧ−７０、スペイトＧ−１０８、スペイトＧ−ｌ１１、スペイトＧ−ｌ１７、スペイト１６８、スペイト１７９、スペイトＮＦ−３、Ｖａ  １１６、Ｖａ  １８２、および以上の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される熱風乾燥タバコのバックグラウンドである。ＷＯ２００４／０４１００６Ａ１を参照。さらなる局面では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、Ｋ３２６、Ｋ３４６、およびＮＣ１９６からなる群から選択される任意の熱風乾燥のバックグラウンドである。
【０１３４】
一局面では、提供されるタバコ植物は、空気乾燥タバコのバックグラウンドであるか、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の空気乾燥タバコの特徴を呈する。空気乾燥タバコとしては、バーレイ、メリーランド、およびダークタバコが挙げられる。共通の因子は、乾燥が主に、熱および湿度の人工的な供給源なしであるということである。バーレイタバコは、ライトブラウンからダークブラウンの色であり、油分が高く、かつ糖分が低い。バーレイタバコは、納屋中で空気乾燥される。主要なバーレイ生育国は、アルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウイ、および米国である。メリーランドタバコは極めてふっくらしており、良好な燃焼特性、低いニコチン、および中立的な芳香を有する。主要なメリーランド生育国としては、米国およびイタリアが挙げられる。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｃｌａｙ  ４０２、Ｃｌａｙ  ４０３、Ｃｌａｙ  ５０２、Ｋｙ  １４、Ｋｙ  ９０７、Ｋｙ  ９１０、Ｋｙ  ８９５９、ＮＣ  ２、ＮＣ  ３、ＮＣ  ４、ＮＣ  ５、ＮＣ  ２０００、ＴＮ  ８６、ＴＮ  ９０、ＴＮ  ９７、Ｒ  ６１０、Ｒ  ６３０、Ｒ  ７１１、Ｒ  ７１２、ＮＣＢＨ  １２９、Ｂｕ  ２１×Ｋｙ  １０、ＨＢ０４Ｐ、Ｋｙ  １４×Ｌ  ８、Ｋｔ  ２００、Ｎｅｗｔｏｎ  ９８、Ｐｅｄｉｇｏ  ５６１、Ｐｆ５６１、およびＶａ  ５０９からなる群から選択されるバーレイタバコのバックグラウンドである。さらなる局面では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、ＴＮ  ９０、ＫＴ  ２０９、ＫＴ  ２０６、ＫＴ２１２、およびＨＢ  ４４８８からなる群から選択される任意のバーレイのバックグラウンドである。別の局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｍｄ  １０、Ｍｄ  ４０、Ｍｄ  ２０１、Ｍｄ  ６０９、Ｍｄ  ８７２およびＭｄ  ３４１からなる群から選択されるメリーランドタバコのバックグラウンドである。
【０１３５】
一局面では、提供されるタバコ植物は、暗色空気乾燥タバコのバックグラウンドであるか、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の暗色空気乾燥タバコの特徴を呈する。暗色空気乾燥タバコは主に、暗色空気乾燥タバコにミディアムブラウンからダークブラウンの色および独特の芳香を与えるその乾燥プロセスにより他の種類から区別される。暗色空気乾燥タバコは主に、噛みタバコおよび嗅ぎタバコの産生において使用される。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、スマトラ（Ｓｕｍａｔｒａ）、ジャティム（Ｊａｔｉｍ）、ドミニカン・キュバノ（Ｄｏｍｉｎｉｃａｎ  Ｃｕｂａｎｏ）、ビスキ（Ｂｅｓｕｋｉ）、ワンサッカー（Ｏｎｅ  ｓｕｃｋｅｒ）、グリーンリバー（Ｇｒｅｅｎ  Ｒｉｖｅｒ）、バージニア太陽乾燥種（Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ｓｕｎ−ｃｕｒｅｄ）、およびパラグアン・パサッド（Ｐａｒａｇｕａｎ  Ｐａｓｓａｄｏ）からなる群から選択される暗色空気乾燥タバコのバックグラウンドである。
【０１３６】
一局面では、提供されるタバコ植物は、暗色火力乾燥タバコのバックグラウンドであるか、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上の暗色火力乾燥タバコの特徴を呈する。暗色火力乾燥タバコは、概して、閉鎖乾燥納屋の床上で低燃木の火を用いて乾燥される。それらの葉は、低い糖含有量であるが高いニコチン含有量を有する。暗色火力乾燥タバコは、パイプブレンド物、シガレット、噛みタバコ、嗅ぎタバコおよび強い味のシガーを作製するために使用される。暗色火力乾燥タバコの主要な生育領域は、米国のテネシー、ケンタッキー、およびバージニアである。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、ナロー・リーフ・マドーレ（Ｎａｒｒｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｍａｄｏｌｅ）、改良マドーレ、トム・ロッソン・マドーレ（Ｔｏｍ  Ｒｏｓｓｏｎ  Ｍａｄｏｌｅ）、Ｎｅｗｔｏｎ’ｓ  ＶＨマドーレ、リトル・クリテンデン（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ）、グリーン・ウッド（Ｇｒｅｅｎ  Ｗｏｏｄ）、リトル・ウッド（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｗｏｏｄ）、スモール・ストーク・ブラック・マンモス（Ｓｍａｌｌ  Ｓｔａｌｋ  Ｂｌａｃｋ  Ｍａｍｍｏｔｈ）、ＤＴ  ５０８、ＤＴ  ５１８、ＤＴ  ５９２、ＫＹ  １７１、ＤＦ  ９１１、ＤＦ  ４８５、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＶＡ  ３０９、およびＶＡ  ３５９からなる群から選択される暗色火力乾燥タバコのバックグラウンドである。
【０１３７】
一局面では、提供されるタバコ植物は、オリエンタルタバコのバックグラウンドであるか、または本明細書に記載の１つもしくはそれ以上のオリエンタルタバコの特徴を呈する。オリエンタルタバコは、トルコ、ギリシャ、ブルガリア、マケドニア、シリア、レバノン、イタリア、およびルーマニアなどの東地中海地域において典型的に生育されるという事実に起因してギリシャ、アロマ、およびトルコタバコとも称される。今日のオリエンタル品種に固有の小さい植物および葉のサイズの他に、その特有の芳香特性は、過去何世紀にもわたり植物が発達する乏しい土壌および苛酷な気候の条件への植物の適合の結果である。一局面では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、イズミール（Ｉｚｍｉｒ）、カテリニ（Ｋａｔｅｒｉｎｉ）、サムスン（Ｓａｍｓｕｎ）、バスマ（Ｂａｓｍａ）およびクルモブラグド（Ｋｒｕｍｏｖｇｒａｄ）、トラブゾン（Ｔｒａｂｚｏｎ）、テサリアン（Ｔｈｅｓａｌｉａｎ）、タソバ（Ｔａｓｏｖａ）、シノップ（Ｓｉｎｏｐ）、イズミット（Ｉｚｍｉｔ）、ヘンデク（Ｈｅｎｄｅｋ）、エディルネ（Ｅｄｉｒｎｅ）、セムディンリ（Ｓｅｍｄｉｎｌｉ）、アジヤンマン（Ａｄｉｙａｎｍａｎ）、ヤイラダグ（Ｙａｙｌａｄａｇ）、イスケンデルン（Ｉｓｋｅｎｄｅｒｕｎ）、デュズジェ（Ｄｕｚｃｅ）、マセドニアン（Ｍａｃｅｄｏｎｉａｎ）、マヴァラ（Ｍａｖｒａ）、プリレップ（Ｐｒｉｌｅｐ）、バフラ（Ｂａｆｒａ）、バルサ（Ｂｕｒｓａ）、バカク（Ｂｕｃａｋ）、ビトリス（Ｂｉｔｌｉｓ）、バリケシル（Ｂａｌｉｋｅｓｉｒ）、ならびに以上の品種のいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択されるオリエンタルタバコのバックグラウンドである。
【０１３８】
一局面では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、ＢＵ  ６４、ＣＣ  １０１、ＣＣ  ２００、ＣＣ  ２７、ＣＣ  ３０１、ＣＣ  ４００、ＣＣ  ５００、ＣＣ  ６００、ＣＣ  ７００、ＣＣ  ８００、ＣＣ  ９００、コッカー１７６、コッカー３１９、コッカー３７１ゴールド、コッカー４８、ＣＵ  ２６３、ＤＦ９１１、ガルパオタバコ、ＧＬ  ２６Ｈ、ＧＬ  ３５０、ＧＬ  ６００、ＧＬ  ７３７、ＧＬ  ９３９、ＧＬ  ９７３、ＨＢ  ０４Ｐ、Ｋ  １４９、Ｋ  ３２６、Ｋ  ３４６、Ｋ  ３５８、Ｋ３９４、Ｋ  ３９９、Ｋ  ７３０、ＫＤＨ  ９５９、ＫＴ  ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ  １０、ＫＹ  １４、ＫＹ  １６０、ＫＹ  １７、ＫＹ  １７１、ＫＹ  ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４×Ｌ８  ＬＣ、リトル・クリテンデン（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ）、マクネア３７３、マクネア（９４４、ｍｓＫＹ  １４ｘＬ８、ナロー・リーフ・マドーレ、ＮＣ  １００、ＮＣ  １０２、ＮＣ  ２０００、ＮＣ  ２９１、ＮＣ  ２９７、ＮＣ  ２９９、ＮＣ  ３、ＮＣ  ４、ＮＣ  ５、ＮＣ  ６、ＮＣ７、ＮＣ  ６０６、ＮＣ  ７１、ＮＣ  ７２、ＮＣ  ８１０、ＮＣ  ＢＨ  １２９、ＮＣ  ２００２、ニール・スミス・マドール（Ｎｅａｌ  Ｓｍｉｔｈ  Ｍａｄｏｌｅ）、ＯＸＦＯＲＤ  ２０７、「ペリック」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ  ６１０、Ｒ  ６３０、Ｒ  ７−１１、Ｒ  ７−１２、ＲＧ  １７、ＲＧ  ８１、ＲＧ  Ｈ５１、ＲＧＨ  ４、ＲＧＨ  ５１、ＲＳ  １４１０、スペイト１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ−２８、スペイトＧ−７０、スペイトＨ−６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、ＴＩ  １４０６、ＴＩ  １２６９、ＴＮ  ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ  ９０、ＴＮ  ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ  Ｄ９４、ＴＮ  Ｄ９５０、ＴＲ（トム・ロッソン）マドーレ、ＶＡ  ３０９、またはＶＡ３５９、メリーランド６０９、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ＨＢ４４８８ＰＬＣ、ＫＴ２０６ＬＣ、ＫＴ２０９ＬＣ、ＫＴ２１０ＬＣ、ＫＴ２１２ＬＣ、Ｒ６１０ＬＣ、ＰＶＨ２３１０、ＮＣ１９６、ＫＴＤ１４ＬＣ、ＫＴＤ６ＬＣ、ＫＴＤ８ＬＣ、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０５ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１８ＬＣ、ＰＤ７３１９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ、シャーレイ（Ｓｈｉｒｅｙ）ＬＣ、または当技術分野において公知の標準的なタバコ育種技術による任意の商用のタバコ品種に本質的に由来するか、またはその遺伝的背景である。
【０１３９】
暗色空気乾燥、バーレイ、メリーランド、暗色火力乾燥、またはオリエンタル種の全ての上記の特定の品種は、例示的な目的のためにのみ列記されている。任意の追加の暗色空気乾燥、バーレイ、メリーランド、暗色火力乾燥、オリエンタル品種もまた本出願において想定される。
【０１４０】
記載されるタバコ植物の集団もまた提供される。一局面では、タバコ植物の集団は、１エーカー当たり約５，０００〜約８０００、約５，０００〜約７，６００、約５，０００〜約７，２００、約５，０００〜約６，８００、約５，０００〜約６，４００、約５，０００〜約６，０００、約５，０００〜約５，６００、約５，０００〜約５，２００、約５，２００〜約８，０００、約５，６００〜約８，０００、約６，０００〜約８，０００、約６，４００〜約８，０００、約６，８００〜約８，０００、約７，２００〜約８，０００、または約７，６００〜約８，０００個の植物の栽植密度を有する。別の局面では、タバコ植物の集団は、低い〜中程度の肥沃度を有する土壌型
中に存在する。
【０１４１】
記載されるタバコ植物からの種子の容器もまた提供される。本開示のタバコ種子の容器は、任意の数、重量、または体積の種子を含有してもよい。例えば、容器は、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１５００、少なくとも約２０００、少なくとも約２５００、少なくとも約３０００、少なくとも約３５００、少なくとも約４０００、もしくはそれ以上、または約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００個、もしくはそれ以上より多い種子を含有し得る。代替的に、容器は、少なくとも約１オンス、少なくとも約５オンス、少なくとも約１０オンス、少なくとも約１ポンド、少なくとも約２ポンド、少なくとも約３ポンド、少なくとも約４ポンド、少なくとも約５ポンド、もしくはそれ以上、または約１オンス、約５オンス、約１０オンス、約１ポンド、約２ポンド、約３ポンド、約４ポンド、約５ポンド、もしくはそれ以上より多い種子を含有し得る。タバコ種子の容器は、当技術分野において利用可能な任意の容器であってもよい。非限定的な例として、容器は、箱、バッグ、小包、ポーチ、テープロール、チューブ、またはボトルであってもよい。
【０１４２】
記載される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料もまた提供される。より高いレベルの総アルカロイドまたはニコチンを有する記載されるタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料がさらに提供される。
【０１４３】
「乾燥」は、水分を低減し、かつ、タバコ葉に黄金色を与えかつそれによりデンプンが糖に変換されるクロロフィルの分解をもたらす熟成プロセスである。乾燥タバコは、したがって、収穫された緑色の葉と比較してより高い還元糖含有量およびより低いデンプン含有量を有する。一局面では、提供される緑色の葉のタバコは、従来の手段、例えば、熱風乾燥、納屋乾燥、火力乾燥、空気乾燥、または太陽乾燥を使用して乾燥され得る。例えば、異なる種類の乾燥方法の説明のためにＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥タバコは、通常、１０％〜約２５％の範囲内の水分含有量において数年（例えば、２〜５年）にわたり圧縮条件において木製ドラム（例えば、大だる）または段ボール箱中で熟成される。米国特許第４，５１６，５９０号および同第５，３７２，１４９号を参照。乾燥および熟成されたタバコは次にさらに加工され得る。さらなる加工としては、様々な温度での蒸気の導入ありまたはなしでの真空下でのタバコのコンディショニング、低温殺菌、および発酵が挙げられる。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０〜２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、同第５，３７２，１４９号；米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号；およびＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥、熟成、および発酵されたタバコはさらに加工（例えば、切断、細断、膨化、またはブレンド）され得る。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、および同第４，９８７，９０７号を参照。一局面では、本開示の乾燥タバコ材料は太陽乾燥されている。別の局面では、本開示の乾燥タバコ材料は、熱風乾燥、空気乾燥、または火力乾燥されている。
【０１４４】
本開示のタバコ株、品種またはハイブリッドから得られるタバコ材料は、タバコ製品を作製するために使用され得る。本明細書において使用される場合、「タバコ製品」は、ヒトでの使用または消費が意図されるタバコから作製または派生された任意の製品として定義される。
【０１４５】
提供されるタバコ製品としては、シガレット製品（例えば、シガレットおよびビディシガレット）、シガー製品（例えば、葉巻タバコ（ｃｉｇａｒ  ｗｒａｐｐｉｎｇ  ｔｏｂａｃｃｏ）およびシガリロ）、パイプタバコ製品、タバコに由来する製品、タバコ由来ニコチン製品、無煙タバコ製品（例えば、湿潤嗅ぎタバコ、乾燥嗅ぎタバコ、および噛みタバコ）、フィルム、チュワブル、タブ、成形部分、ゲル、消費可能単位、不溶性マトリックス、中空形状、再構成タバコ、ならびに膨化タバコなどが挙げられるがそれに限定されない。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００６／０１９１５４８号を参照。
【０１４６】
本明細書において使用される場合、「シガレット」は、「ロッド」および「フィラー」を有するタバコ製品を指す。シガレット「ロッド」は、シガレットペーパー、フィルター、プラグラップ（フィルター材料を含有するために使用される）、シガレットペーパー（フィラーを含む）をフィルターに保持するティッピングペーパー（ｔｉｐｐｉｎｇ  ｐａｐｅｒ）、およびこれらの成分を一緒に保持する全ての接着剤を含む。「フィラー」としては、（１）再構成タバコおよび膨化タバコが挙げられるがそれに限定されない全てのタバコ、（２）非タバコ代用品（シガレットペーパー内に巻かれたタバコを伴ってもよいハーブ、非タバコ植物材料および他のスパイスが挙げられるがそれに限定されない）、（３）ケーシング、（４）風味物質、ならびに（５）全ての他の添加物（タバコおよび代用品に混合され、シガレット中に巻かれる）が挙げられる。
【０１４７】
本明細書において使用される場合、「再構成タバコ」は、シート形態に加工され、かつタバコに似せるように細片に切断された、タバコ塵および他のタバコ屑材料から作製されたタバコフィラーの部分を指す。コストの節約に加えて、再構成タバコは、アンモニアと糖との反応を使用する風味発生の加工からシガレットの味に対するその寄与のために非常に重要である。
【０１４８】
本明細書において使用される場合、「膨化タバコ」は、タバコが「膨らむ」ように好適な気体の膨張を通じて加工されて、低減された密度およびより大きい充填能力を結果としてもたらすタバコフィラーの部分を指す。それは、シガレットにおいて使用されるタバコの重量を低減する。
【０１４９】
本開示の植物に由来するタバコ製品としてはまた、シガレットと、特にフィルター要素を含む、他の喫煙物品とが挙げられ、喫煙可能材料のロッドがタバコブレンド物内に乾燥タバコを含む。一局面では、本開示のタバコ製品は、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群から選択される。別の局面では、本開示のタバコ製品は無煙タバコ製品である。無煙タバコ製品は燃焼されず、噛みタバコ、湿潤無煙タバコ、スヌース、および乾燥嗅ぎタバコが挙げられるがそれに限定されない。噛みタバコは、典型的には大きいパウチ様パッケージ中に包装されてプラグまたはツイストにおいて使用される粗く分割されたタバコ葉である。湿潤無煙タバコは、ルース（ｌｏｏｓｅ）形態またはパウチ形態において提供される湿潤の、より微細に分割されたタバコであり、典型的には、丸缶中に包装され、成人タバコ消費者の頬と歯肉との間に置かれるピンチとしてまたはパウチ中で使用される。スヌースは、熱処理される無煙タバコである。乾燥嗅ぎタバコは、口の中に置かれるまたは経鼻的に使用される微細に粉砕されたタバコである。さらなる局面では、本開示のタバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される。さらに別の局面では、本開示のタバコ製品は、電子加熱シガレット、ｅ−シガレット、電子的気化デバイスからなる群から選択される。
【０１５０】
一局面では、本開示のタバコ製品は、ブレンドされたタバコ製品であり得る。一局面では、ブレンドされたタバコ製品は乾燥タバコ材料を含む。一局面では、乾燥タバコ材料は、重量でタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する。一局面では、乾燥タバコ材料は、体積でタバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する。
【０１５１】
一局面では、本開示のタバコ製品はブレンドタバコ製品であり得る。別の局面では、本開示のタバコ製品は低ニコチンタバコ製品であり得る。さらなる局面では、本開示のタバコ製品は、約３ｍｇ／ｇ未満のレベルのノルニコチンを含んでもよい。例えば、そのような製品中のノルニコチン含有量は、約３．０ｍｇ／ｇ、約２．５ｍｇ／ｇ、約２．０ｍｇ／ｇ、約１．５ｍｇ／ｇ、約１．０ｍｇ／ｇ、約７５０μｇ／ｇ、約５００ｐｇ／ｇ、約２５０ｐｇ／ｇ、約１００ｐｇ／ｇ、約７５ｐｇ／ｇ、約５０ｐｇ／ｇ、約２５ｐｇ／ｇ、約１０ｐｇ／ｇ、約７．０ｐｇ／ｇ、約５．０ｐｇ／ｇ、約４．０ｐｇ／ｇ、約２．０ｐｇ／ｇ、約１．０ｐｇ／ｇ、約０．５ｐｇ／ｇ、約０．４ｐｇ／ｇ、約０．２ｐｇ／ｇ、約０．１ｐｇ／ｇ、約０．０５ｐｇ／ｇ、約０．０１ｐｇ／ｇ、または検出不可能であり得る。
【０１５２】
一局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％、約０．０２％、約０．０５％、約０．７５％、約０．１％、約０．１５％、約０．２％、約０．３％、約０．３５％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、約３％、約３．１％、約３．２％、約３．３％、約３．４％、約３．５％、約３．６％、約３．７％、約３．８％、約３．９％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、および約９％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。別の局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％〜０．０２％、約０．０２％〜０．０５％、約０．０５％〜０．７５％、約０．７５％〜０．１％、約０．１％〜０．１５％、約０．１５％〜０．２％、約０．２％〜０．３％、約０．３％〜０．３５％、約０．３５％〜０．４％、約０．４％〜０．５％、約０．５％〜０．６％、約０．６％〜０．７％、約０．７％〜０．８％、約０．８％〜０．９％、約０．９％〜１％、約１％〜１．１％、約１．１％〜１．２％、約１．２％〜１．３％、約１．３％〜１．４％、約１．４％〜１．５％、約１．５％〜１．６％、約１．６％〜１．７％、約１．７％〜１．８％、約１．８％〜１．９％、約１．９％〜２％、約２％〜２．１％、約２．１％〜２．２％、約２．２％〜２．３％、約２．３％〜２．４％、約２．４％〜２．５％、約２．５％〜２．６％、約２．６％〜２．７％、約２．７％〜２．８％、約２．８％〜２．９％、約２．９％〜３％、約３％〜３．１％、約３．１％〜３．２％、約３．２％〜３．３％、約３．３％〜３．４％、約３．４％〜３．５％、および約３．５％〜３．６％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる局面では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量に基づいて約０．０１％〜０．１％、約０．０２％〜０．２％、約０．０３％〜０．３％、約０．０４％〜０．４％、約０．０５％〜０．５％、約０．７５％〜１％、約０．１％〜１．５％、約０．１５％〜２％、約０．２％〜３％、および約０．３％〜３．５％からなる群から選択される平均ニコチンまたは総アルカロイドレベルを含む。
【０１５３】
本開示はまた、望ましいレベルの総アルカロイドまたはニコチン、例えば、低ニコチンまたはニコチン非含有を含むタバコ株、栽培品種、または品種を育種するための方法を提供する。育種は、任意の公知の手法を介して実行され得る。ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰマッピング、ハプロタイプマッピング、または類似の技術は、望ましい形質またはアレルをタバコ植物に移入または育種するためにマーカー補助選択（ＭＡＳ）育種プログラムにおいて使用されてもよい。例えば、育種家は、Ｆ１ハイブリッド植物を使用してまたはＦ１ハイブリッド植物を耕種学的に望ましい遺伝子型を有する他のドナー植物とさらに交雑してＦ２または戻し交雑世代において分離集団を作製することができる。Ｆ２または戻し交雑世代における植物は、当技術分野において公知のまたは本明細書において列記される技術の１つを使用して所望の耕種学的形質または望ましい化学的プロファイルについてスクリーニングされ得る。期待される遺伝パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に依存して、所望の個々の植物の同定を補助するために戻し交雑の各サイクルの前に選択された植物の自家受粉が行われ得る。戻し交雑または他の育種手法は、反復親（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｐａｒｅｎｔ）の所望の表現型が回収されるまで反復され得る。本開示における反復親は、熱風乾燥品種、バーレイ品種、暗色空気乾燥品種、暗色火力乾燥品種、またはオリエンタル品種であり得る。他の育種技術は、例えば、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ  Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ  ６６９−６９８  Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（参照することにより全体が本明細書に組み込まれる）において見出され得る。
【０１５４】
記載されるタバコ植物を使用する植物育種プログラムの結果としては、本開示の有用な株、栽培品種、品種、子孫、近交系、およびハイブリッドが挙げられる。本明細書において使用される場合、「品種」という用語は、同じ種の他の植物からそれらを分離する一定の特徴を共有する植物の集団を指す。品種は、常にではないが多くの場合に、商業的に販売される。１つまたはそれ以上の特徴的な形質を有するが、品種は、その品種内の個体間の非常に小さい全体的なバリエーションによりさらに特徴付けられる。「純粋株」品種は、組織または細胞培養技術を使用して単一の親からの自家受粉および選択、または栄養繁殖のいくつかの世代により作製されてもよい。品種は、別の株または品種に本質的に由来し得る。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ（１９６１年１２月２日；１９７２年１１月１０日、１９７８年１０月２３日、および１９９１年３月１９日にＧｅｎｅｖａにおいて改訂）により定義されるように、品種は、ａ）主に初期品種、または初期品種の遺伝子型もしくは遺伝子型の組合せの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現を保持しながら主に初期品種に由来する品種に由来し、ｂ）初期品種から明確に区別可能であり、かつｃ）誘導という行為の結果としてもたらされる差異を除いて、初期品種の遺伝子型または遺伝子型の組合せの結果としてもたらされる本質的な特徴の発現において初期品種と合致する場合に、初期品種に「本質的に由来する」。本質的に由来する品種は、例えば、天然のもしくは誘導された変異体、体細胞繁殖系バリアント、初期品種の植物からのバリアント個体の選択、戻し交雑、または形質転換により得られ得る。第１のタバコ品種および第１の品種が本質的に由来する第２のタバコ品種は、本質的に同一の遺伝的背景を有すると考えられる。品種から区別されるような「株」は、最も多くの場合に、非商業的に、例えば植物研究において使用される植物の群を表す。株は、典型的には、１つまたはそれ以上の関心対象の形質について個体間の全体的なバリエーションをほとんど示さないが、他の形質について個体間で何らかのバリエーションがあってもよい。
【０１５５】
本明細書において使用される場合、「遺伝子座」は、多型核酸、形質決定因子、遺伝子、またはマーカーが位置する染色体領域である。本開示の遺伝子座は集団中に１つまたはそれ以上の多型を含み、例えば、代替的なアレルが一部の個体中に存在する。本明細書において使用される場合、「アレル」は、特定の遺伝子座における代替的な核酸配列を指す。アレルの長さは、１ヌクレオチド塩基もの短さであり得るが、典型的にはより長い。例えば、ヘテロ接合個体の異なる染色体について、または集団中の異なるホモ接合もしくはヘテロ接合個体の間で存在するように、例えば、第１のアレルが１つの染色体上で存在し得ると共に、第２のアレルが第２の相同染色体上で存在する。本明細書において使用される場合、「染色体間隔」という用語は、単一の染色体上にあるゲノムＤＮＡの連続する線形スパンを示す。
【０１５６】
本明細書において使用される場合、「移入」または「移入する」は、１つの遺伝的背景から別の遺伝的背景への遺伝子座の所望のアレルの伝達を指す。
【０１５７】
本明細書において使用される場合、「交雑される」または「交雑」は、受精（例えば、細胞、種子、または植物）を介して子孫を産生することを意味し、植物の間の交雑（有性）および自家受精（自殖）を含む。
【０１５８】
本明細書において使用される場合、「戻し交雑」および「戻し交雑する」は、子孫植物がその親の１つに戻して繰り返して交雑される方法を指す。戻し交雑スキームにおいて、「ドナー」親は、移入される所望の遺伝子または遺伝子座を有する親植物を指す。「レシピエント」親（１回もしくは複数回使用される）または「反復」親（２回もしくはそれ以上の回数使用される）は、遺伝子または遺伝子座が移入されている親植物を指す。初期交雑はＦ１世代を生じさせる。「ＢＣ１」という用語は反復親の２回目の使用を指し、「ＢＣ２」は反復親の３回目の使用を指す、などである。一局面では、戻し交雑は繰り返して行われ、連続する戻し交雑世代それぞれの子孫個体は、それ自体が同じ親遺伝子型に対して戻し交雑される。
【０１５９】
本明細書において使用される場合、「単一遺伝子変換される」または「単一遺伝子変換」は、戻し交雑として公知の植物育種技術を使用して、または遺伝子操作を介して開発される植物を指し、ここで、戻し交雑技術を介してまたは遺伝子操作を介して品種に移入される単一遺伝子に加えて、品種の所望の形態学的および生理学的特徴の本質的に全てが元通りとされる。
【０１６０】
本明細書において使用される場合、「エリート品種」は、優れた耕種学的性能のための育種および選択の結果としてもたらされた任意の品種を意味する。
【０１６１】
本明細書において使用される場合、マーカー補助選択または育種の文脈における「選択する」または「選択」は、ある特定の予め決定された基準に基づく、通常は集団からの所望の個体の採集または選出の行為を指す。
【０１６２】
本明細書において使用される場合、「形質」という用語は、遺伝子型により影響され得る細胞または生物の１つまたはそれ以上の検出可能な特徴を指す。表現型は、肉眼で、または当技術分野において公知の評価の任意の他の手段により観察可能であり得、該手段は、例えば、顕微鏡法、生化学的分析、ゲノム解析、特定の耐病性についてのアッセイなどである。一部の場合には、表現型は、単一の遺伝子または遺伝子座、例えば、「単一の遺伝子形質」により直接的に制御される。他の場合には、表現型はいくつかの遺伝子の結果である。
【０１６３】
本開示の任意のタバコ植物は、例えば、当技術分野において公知の技術を使用する遺伝子構築物またはトランスジーンを用いる形質転換により、追加の耕種学的に望ましい形質をさらに含み得ることが理解される。非限定的に、所望の形質の例は、除草剤抵抗性、有害生物抵抗性、耐病性；高い収率；高いグレード指数値；治癒可能性；乾燥品質；機械的収穫可能性；保持能力；葉品質；高さ、植物成熟度（例えば、早期成熟、早期成熟から中程度成熟、中程度成熟、中程度成熟から後期成熟、もしくは後期成熟）；茎サイズ（例えば、小さい、中程度、もしくは大きい茎）；または植物１つ当たりの葉数（例えば、少ない（例えば、５〜１０枚の葉）、中程度（例えば、１１〜１５枚の葉）、または多数（例えば、１６〜２１枚）の葉）、または任意の組合せである。一局面では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物または種子は、１つまたはそれ以上の殺虫タンパク質、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の結晶タンパク質またはバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からの栄養殺虫タンパク質、例えば、ＶＩＰ３などを発現する１つまたはそれ以上のトランスジーンを含む（例えば、Ｅｓｔｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１３７を参照）。別の局面では、タバコ植物は、落葉病への抵抗性（米国特許第５，６８９，０３５号）またはシスト線虫への抵抗性（米国特許第５，４９１，０８１号）を付与する移入された形質をさらに含む。
【０１６４】
本開示はまた、変化したニコチンまたは総アルカロイドレベルを含むがそのようなニコチンレベルの変化を有しない対応する初期タバコ植物の収率と同等の収率を有するタバコ植物を提供する。一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、約１２００〜３５００、約１３００〜３４００、約１４００〜３３００、約１５００〜３２００、約１６００〜３１００、約１７００〜３０００、約１８００〜２９００、約１９００〜２８００、約２０００〜２７００、約２１００〜２６００、約２２００〜２５００、および約２３００〜２４００ｌｂ／エーカーからなる群から選択される収率を提供する。別の局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、約１２００〜３５００、約１３００〜３５００、約１４００〜３５００、約１５００〜３５００、約１６００〜３５００、約１７００〜３５００、約１８００〜３５００、約１９００〜３５００、約２０００〜３５００、約２１００〜３５００、約２２００〜３５００、約２３００〜３５００、約２４００〜３５００、約２５００〜３５００、約２６００〜３５００、約２７００〜３５００、約２８００〜３５００、約２９００〜３５００、約３０００〜３５００、および約３１００〜３５００ｌｂ／エーカーからなる群から選択される収率を提供する。さらなる局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物は、ｎｉｃ１ｂ変異、ｎｉｃ２変異、Ｎｉｃ１ｂトランスジーン、Ｎｉｃ２トランスジーン、またはその組合せを除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の６５％〜１３０％、７０％〜１３０％、７５％〜１３０％、８０％〜１３０％、８５％〜１３０％、９０％〜１３０％、９５％〜１３０％、１００％〜１３０％、１０５％〜１３０％、１１０％〜１３０％、１１５％〜１３０％、または１２０％〜１３０％の収率を提供する。さらなる局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ植物は、ｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、Ｎｉｃ１トランスジーン、Ｎｉｃ２トランスジーン、またはその組合せを除いて本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収率の７０％〜１２５％、７５％〜１２０％、８０％〜１１５％、８５％〜１１０％、または９０％〜１００％の収率を提供する。
【０１６５】
一局面では、タバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ  ＢＵ２１形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈しない。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ  ＢＵ２１形質の２つまたはそれ以上を呈しない。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ  ＢＵ２１形質の３つまたはそれ以上を呈しない。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ  ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ  ＫＹ１７１と比較してより低いレベルにおいて、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ  ＢＵ２１形質の１つもしくはそれ以上、２つもしくはそれ以上、３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ  ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ  ＫＹ１７１と比較してより低いレベルにおいて、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ  ＢＵ２１形質の２つまたはそれ以上を呈する。一局面では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、ＬＡ  ＢＵ２１、ＬＡＦＣ５３、またはＬＮ  ＫＹ１７１と比較してより低いレベルにおいて、より低い収率、成熟および老化の遅延、昆虫の草食に対するより高い感受性、摘心後のポリアミン含有量の増加、より高いクロロフィル、単位葉面積当たりのより多い葉肉細胞、ならびに乾燥後の不良な最終製品の品質からなる群から選択されるＬＡ  ＢＵ２１形質の３つもしくはそれ以上、または全てを呈する。
【０１６６】
一局面では、改変タバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイドのタバコ品種）は、収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群から選択される形質に実質的に影響することなく所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含む。
【０１６７】
一局面では、改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物と実質的に同等の形質をさらに含み、該形質は、収率、成熟および老化、昆虫の草食に対する感受性、摘心後のポリアミン含有量、クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、ならびに乾燥後の最終製品の品質からなる群から選択される。
【０１６８】
一局面では、改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い収率をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて７０％〜１４０％、７５％〜１３５％、８０％〜１３０％、８５％〜１２５％、９０％〜１２０％、９５％〜１１５％、または１００％〜１１０％の収率をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の収率と比べて７０％〜８０％、７５％〜８５％、８０％〜９０％、８５％〜９５％、９０％〜１００％、９５％〜１０５％、１０５％〜１１５％、１１０％〜１２０％、１１５％〜１２５％、１２０％〜１３０％、１２５〜１３５％、または１３０％〜１４０％の収率をさらに含む。
【０１６９】
一局面では、改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の摘心後のポリアミン含有量と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い摘心後のポリアミン含有量をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の摘心後のポリアミン含有量と比べて７０％〜１４０％、７５％〜１３５％、８０％〜１３０％、８５％〜１２５％、９０％〜１２０％、９５％〜１１５％、または１００％〜１１０％の摘心後のポリアミン含有量をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の摘心後のポリアミン含有量と比べて７０％〜８０％、７５％〜８５％、８０％〜９０％、８５％〜９５％、９０％〜１００％、９５％〜１０５％、１０５％〜１１５％、１１０％〜１２０％、１１５％〜１２５％、１２０％〜１３０％、１２５〜１３５％、または１３０％〜１４０％の摘心後のポリアミン含有量をさらに含む。
【０１７０】
一局面では、改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物のクロロフィルレベルと比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高いクロロフィルレベルをさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物のクロロフィルレベルと比べて７０％〜１４０％、７５％〜１３５％、８０％〜１３０％、８５％〜１２５％、９０％〜１２０％、９５％〜１１５％、または１００％〜１１０％のクロロフィルレベルをさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物のクロロフィルレベルと比べて７０％〜８０％、７５％〜８５％、８０％〜９０％、８５％〜９５％、９０％〜１００％、９５％〜１０５％、１０５％〜１１５％、１１０％〜１２０％、１１５％〜１２５％、１２０％〜１３０％、１２５〜１３５％、または１３０％〜１４０％のクロロフィルレベルをさらに含む。
【０１７１】
一局面では、改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の単位葉面積当たりの葉肉細胞数と比べて８０％より高い、８５％より高い、９０％より高い、９５％より高い、１００％より高い、１０５％より高い、１１０％より高い、１１５％より高い、１２０％より高い、１２５％より高い、１３０％より高い、１３５％より高い、または１４０％より高い単位葉面積当たりの葉肉細胞数をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の単位葉面積当たりの葉肉細胞数と比べて７０％〜１４０％、７５％〜１３５％、８０％〜１３０％、８５％〜１２５％、９０％〜１２０％、９５％〜１１５％、または１００％〜１１０％の単位葉面積当たりの葉肉細胞数をさらに含む。一局面では、開示される改変タバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチン非含有、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、かつ非改変の対照植物の単位葉面積当たりの葉肉細胞数と比べて７０％〜８０％、７５％〜８５％、８０％〜９０％、８５％〜９５％、９０％〜１００％、９５％〜１０５％、１０５％〜１１５％、１１０％〜１２０％、１１５％〜１２５％、１２０％〜１３０％、１２５〜１３５％、または１３０％〜１４０％の単位葉面積当たりの葉肉細胞数をさらに含む。
【０１７２】
一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、機械収穫のために適合されている。別の局面では、開示される低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は、機械で収穫される。
【０１７３】
一局面では、低減アルカロイドタバコ植物において葉品質を向上させるための方法であって、タバコ植物を生育する工程；タバコ植物においてプトレシンレベルを低減する工程、およびタバコ植物から葉を収穫する工程を含む、方法が提供される。
【０１７４】
一局面では、低減アルカロイドタバコ植物において葉品質を向上させるための方法であって、タバコ植物を生育する工程；タバコ植物においてオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子の発現または活性を抑制する工程、およびタバコ植物から葉を収穫する工程を含む、方法が提供される。一局面では、抑制する工程は２ＷＰＴ以内、４ＷＰＴ以内、６ＷＰＴ以内、または８ＷＰＴ以内である。一局面では、抑制する工程は、タバコ植物を摘心する前と後の両方でＯＤＣ遺伝子を抑制する工程を含む。一局面では、抑制する工程は化学阻害剤の使用を含まない。一局面では、抑制する工程は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡの発現を誘導することによって成し遂げられる。一局面では、抑制する工程は、ＯＤＣ阻害剤をタバコ植物に適用する工程を含む。一局面では、抑制する工程は、ＯＤＣ阻害剤をタバコ植物に適用することによって成し遂げられる。一局面では、ＯＤＣ阻害剤はＤＦＭＯである。
【０１７５】
一局面では、提供されるタバコ植物はハイブリッド植物である。ハイブリッドは、第１の品種の雌性親植物（例えば、種子親）の自家受粉を予防して、第２の品種の雄性親植物からの花粉が雌性親植物に授精することを可能とし、Ｆ１ハイブリッド種子が雌性植物において形成されることを可能とすることにより産生され得る。雌性植物の自家受粉は、早期の花発達ステージにおいて花を除雄することにより予防され得る。代替的に、花粉形成は、雄性不稔性の形態を使用して雌性親植物において予防され得る。例えば、雄性不稔性は、トランスジーンが小胞子形成および／もしくは花粉形成を阻害する雄性不稔性（ＭＳ）、もしくはトランスジェニック雄性不稔性、または自家不和合性により生じ得る。ＭＳを含有する雌性親植物は特に有用である。雌性親植物がＭＳである局面では、花粉が雄性稔性植物から収穫され、ＭＳ雌性親植物の柱頭に手動で適用されてもよく、結果として生じたＦ１種子が収穫される。
【０１７６】
植物は、単交雑タバコＦ１ハイブリッドを形成するために使用され得る。雄性親植物からの花粉は、Ｆ１種子を形成するために、除雄された雌性親植物または雄性不稔性の雌性親植物に手動で移動される。代替的に、単交雑Ｆ１ハイブリッドが雌性親として使用されて異なる雄性親と交雑される三系交雑が実行され得る。別の代替として、２つの異なる単交雑のＦ１子孫がそれら自体で交雑される二重交雑ハイブリッドが作製され得る。二重交雑ハイブリッドを形成する場合の雌性親の自家受粉を予防するための特定の利点のために自家不和合性が使用され得る。
【０１７７】
一局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は雄性不稔性である。別の局面では、低ニコチンまたはニコチン非含有のタバコ品種は細胞質雄性不稔性である。雄性不稔性のタバコ植物は、当技術分野において公知の任意の方法により産生されてもよい。雄性不稔性のタバコを産生する方法は、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．およびＲｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７．Ｃｈａｐｔｅｒ  Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ  ６６９−６９８  Ｉｎ：Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（編）、ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．７６１  ｐｐに記載されている。
【０１７８】
さらなる局面では、提供されるタバコ部分としては、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、さや、胚、内乳、外植片、カルス、組織培養物、シュート、細胞、およびプロトプラストが挙げられるがそれに限定されない。一局面では、提供されるタバコ部分は種子を含まない。一局面では、本開示は、生殖材料ではなく、かつ植物の天然の生殖を媒介しないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示はまた、生殖材料であり、かつ植物の天然の生殖を媒介するタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示は、光合成を介して維持され得ないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の局面では、本開示は、体細胞性タバコ植物細胞を提供する。体細胞は、生殖細胞系列細胞とは異なり、植物生殖を媒介しない。
【０１７９】
提供される細胞、組織、および器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、分裂組織、胚、内乳、根、シュート、茎、さや、花、花序、茎、小花柄、花柱、柱頭、花托、花弁、がく、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、師部、管束組織からのものであってもよい。別の局面では、本開示は、タバコ植物葉緑体を提供する。さらなる局面では、本開示は、表皮細胞、気孔細胞、葉毛もしくは根毛、貯蔵根、または塊茎を提供する。別の局面では、本開示は、タバコプロトプラストを提供する。
【０１８０】
タバコ植物は、無性生殖または栄養繁殖を介してではなく、種子を介して天然に生殖することを当業者は理解する。一局面では、本開示は、タバコ内乳を提供する。別の局面では、本開示は、タバコ内乳細胞を提供する。さらなる局面では、本開示は、ヒトの介入なしでは生殖できない雄性または雌性不稔性タバコ植物を提供する。
【０１８１】
一局面では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２８およびその断片からなる群から選択される配列に対して少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の同一性を含む核酸分子を提供する。一局面では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９〜３４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の同一性を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。別の局面では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９〜３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性バリアントを提供する。本開示のタンパク質の生物学的活性バリアントは、わずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１０、わずか９、わずか８、わずか７、わずか６、わずか５、わずか４、わずか３、わずか２、またはわずか１アミノ酸残基だけそのタンパク質から異なるものであってもよい。ＯＤＣ経路からの遺伝子またはタンパク質のオルソログ遺伝子またはタンパク質もまた提供される。「オルソログ」は、共通の祖先遺伝子に由来し、かつ種分化の結果として異なる種において見出される遺伝子である。オルソログは、ヌクレオチド配列および／またはタンパク質配列のレベルにおいて少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性または類似性を共有してもよい。オルソログの機能は、多くの場合に種間で高度に保存されている。
【０１８２】
本明細書において使用される場合、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定される比較ウインドウにわたる最大の一致のためにアライメントされた場合に同じである２つの配列中の残基を参照する。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は多くの場合に保存的アミノ酸置換により異なり、その場合、アミノ酸残基は類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって分子の機能的特性を変化させないことが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質について補正するために上方に調整されてもよい。そのような保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有するとみなされる。
【０１８３】
提供される核酸分子、ポリペプチド、またはタンパク質は、単離または実質的に精製され得る。「単離された」または「精製された」核酸分子、ポリペプチド、タンパク質、またはその生物活性部分は、その天然に存在する環境において見出されるようなそのポリヌクレオチドまたはタンパク質と通常一緒にあるまたは相互作用する成分を実質的または本質的に含まない。例えば、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術により産生される場合に他の細胞材料、もしくは培養培地を実質的に含まず、かつ、化学合成される場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
【０１８４】
本開示は、開示されるタバコ植物からのタバコ材料を含むタバコ製品を産生する方法をさらに提供する。一局面では、方法は、タバコ植物から作製された熟成されたタバコ材料をコンディショニングして約１２．５％〜約１３．５％から約２１％までその水分含有量を増加させ、コンディショニングされたタバコ材料をブレンドして望ましいブレンド物を産生する工程を含む。一局面では、タバコ製品を産生する方法は、ブレンド物をケーシングまたは風味付けする工程をさらに含む。概して、ケーシングプロセスの間に、ケーシングまたはソース材料をブレンド物に加えて、化学組成の均衡を取ることによりそれらの品質を増強し、かつある特定の所望の風味の特徴を発生させる。ケーシング加工についてのさらなる詳細は、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌ．ＤａｖｉｓおよびＭ．Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９において見出され得る。
【０１８５】
提供されるタバコ材料はまた、熱処理（例えば、クッキング、トースティング）、風味付け、酵素処理、膨張、および／または乾燥が挙げられるがそれに限定されない方法を使用して加工され得る。発酵タバコおよび非発酵タバコの両方がこれらの技術を使用して加工され得る。好適な加工タバコの例としては、暗色空気乾燥、暗色火力乾燥、バーレイ、熱風乾燥、およびシガーフィラーまたはラッパーの他に、葉全体から茎を取り除く操作（ｗｈｏｌｅ  ｌｅａｆ  ｓｔｅｍｍｉｎｇ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）からの製品が挙げられる。一局面では、タバコ繊維は、新鮮重を基準にして最大７０％のダークタバコを含む。例えば、タバコは、米国特許出願公開第２００４／０１１８４２２号または同第２００５／０１７８３９８号に記載されるような加熱、蒸しおよび／または低温殺菌段階によりコンディショニングされ得る。
【０１８６】
提供されるタバコ材料は、発酵に供され得る。発酵は、典型的には、高い初期水分含有量、熱生成、および乾燥重量の１０〜２０％の損失により特徴付けられる。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、および同第５，３７２，１４９号を参照。葉の芳香の改良に加えて、発酵は、葉の色および感触のいずれかまたは両方を変化させ得る。また、発酵プロセスの間に、発生ガスが産生され得、酸素が取り込まれ得、ｐＨが変更され得、かつ保持される水の量が変更され得る。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号およびＴｓｏ（１９９９、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｏｘｆｏｒｄ）を参照。乾燥、または乾燥および発酵タバコは、口腔製品への組込みの前にさらに加工（例えば、切断、膨化、ブレンド、ミーリング加工、または粉砕）され得る。タバコは、一部の場合には、コポリマーとの混合ならびに任意選択的に香料および他の添加物の前に４８〜５０重量パーセントのオーブン揮発分含有量（ｏｖｅｎ  ｖｏｌａｔｉｌｅｓ  ｃｏｎｔｅｎｔ）を有するロングカットの発酵乾燥湿潤タバコである。
【０１８７】
一局面では、提供されるタバコ材料は、所望のサイズに加工され得る。一局面では、タバコ繊維は、２００マイクロメートル未満の平均繊維サイズを有するように加工され得る。一局面では、タバコ繊維は７５〜１２５マイクロメートルである。別の局面では、タバコ繊維は、７５マイクロメートルまたはそれ未満のサイズを有するように加工される。一局面では、タバコ繊維は、ロングカットのタバコを含み、該タバコは、約１０カット／インチから約１１０カット／インチまでの幅および約０．１インチから約１インチまでの長さにカットまたは細断され得る。ダブルカットタバコ繊維は、ダブルカットタバコ繊維の約７０％が−２０メッシュ〜８０メッシュの間のメッシュサイズを落ちるような粒子サイズの範囲を有し得る。
【０１８８】
提供されるタバコ材料は、約１０重量％もしくはそれ以上、約２０重量％もしくはそれ以上、約４０重量％もしくはそれ以上、約１５重量％〜約２５重量％、約２０重量％〜約３０重量％、約３０重量％〜約５０重量％、約４５重量％〜約６５重量％、または約５０重量％〜約６０重量％の総オーブン揮発分含有量を有するように加工され得る。「湿潤」タバコは、典型的には、約４０重量％〜約６０重量％（例えば、約４５重量％〜約５５重量％、または約５０重量％）のオーブン揮発分含有量を有するタバコを指すことを当業者は理解する。本明細書において使用される場合、「オーブン揮発分」は、１１０℃に予め温めた強制送風オーブン中で３．２５時間にわたり試料を乾燥した後の試料の重量損失のパーセンテージを算出することにより決定される。口腔製品は、口腔製品を作製するために使用されるタバコ繊維のオーブン揮発分含有量とは異なる全体的なオーブン揮発分含有量を有し得る。記載される加工段階は、オーブン揮発分含有量を低減または増加させ得る。
【０１８９】
本開示が大まかに説明されたが、定めのない限り、例示として提供され、本開示を限定することを目的としない以下の実施例を参照することによって同じことがもっと容易に理解される。
【０１９０】
以下は本開示の例示的な態様である。
態様１．オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡをコードする転写可能なＤＮＡ配列に機能的に連結された誘導性プロモーターを含む、タバコ植物。
態様２．低減したレベルのニコチンを付与する変異またはトランスジーンを含む、態様１記載のタバコ植物。
態様３．低アルカロイドタバコ植物である、態様１または２記載のタバコ植物。
態様４．ｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、またはその両方を含む、態様１〜３のいずれかに記載のタバコ植物。
態様５．アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、Ｓ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１、Ｎｉｃ２、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子中または遺伝子座中に変異を含む、態様１〜４のいずれかに記載のタバコ植物。
態様６．ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子中または遺伝子座中に変異を含む、態様１〜５のいずれかに記載のタバコ植物。
態様７．アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、Ｓ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１、Ｎｉｃ２、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を標的指向しかつ抑制するトランスジーンを含む、態様１〜６のいずれかに記載のタバコ植物。
態様８．ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を標的指向しかつ抑制するトランスジーンを含む、態様１〜７のいずれかに記載のタバコ植物。
態様９．前記変異も前記トランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等のレベルの１種類またはそれ以上のポリアミンを含む葉を生成することができる、態様１〜８のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１０．前記同等のレベルが、前記対照におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、態様１〜９のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１１．前記変異も前記トランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等のクロロフィルレベルを含む葉を生成することができる、請求項態様１〜１０のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１２．前記同等のクロロフィルレベルが、前記対照におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、態様１〜１１のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１３．前記変異も前記トランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等の単位葉面積当たりの葉肉細胞数を含む葉を生成することができる、態様１〜１２のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１４．同等の単位葉面積当たりの前記葉肉細胞が、前記対照におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、態様１〜１３のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１５．前記変異も前記トランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等の表皮細胞サイズを含む葉を生成することができる、態様１〜１４のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１６．前記同等の表皮細胞サイズが、前記対照におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、態様１〜１５のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１７．前記変異も前記トランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等の葉収率を含む、態様１〜１６のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１８．前記同等の葉収率が、前記対照におけるレベルの２０％以内、１７．５％以内、１５％以内、１２．５％以内、１０％以内、７．５％以内、５％以内、２．５％以内、または１％以内である、態様１〜１７のいずれかに記載のタバコ植物。
態様１９．前記変異も前記トランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて同等の昆虫食害感受性を示す、態様１〜１８のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２０．前記オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９〜３４からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列をコードする、態様１〜１９のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２１．前記ＯＤＣ遺伝子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜２８からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様１〜２０のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２２．前記誘導性プロモーターが摘心誘導性プロモーターである、態様１〜２１のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２３．前記誘導性プロモーターが組織特異的プロモーターまたは組織選好性プロモーターでもある、態様１〜２２のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２４．前記組織特異的プロモーターまたは前記組織選好性プロモーターが、シュート、根、葉、茎、花、吸器、根端、葉肉細胞、表皮細胞、および脈管構造からなる群から選択される１つまたはそれ以上の組織または器官に特異的であるかまたは好ましい、態様１〜２３のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２５．前記誘導性プロモーターが、根特異的発現または根選好性発現を調節する、態様１〜２４のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２６．前記誘導性プロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１１からなる群から選択される配列を含む、態様１〜２５のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２７．前記誘導性プロモーターが、葉特異的発現または葉選好性発現を調節する、態様１〜２６のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２８．前記誘導性プロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２〜２１からなる群から選択される配列を含む、態様１〜２７のいずれかに記載のタバコ植物。
態様２９．前記誘導性プロモーターが前記転写可能なＤＮＡ配列にとって異種である、態様１〜２８のいずれかに記載のタバコ植物。
態様３０．前記非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、トランス作動性ｓｉＲＮＡ（ｔａ−ｓｉＲＮＡ）、およびヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）からなる群から選択される、態様１〜２９のいずれかに記載のタバコ植物。
態様３１．前記非コーディングＲＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５および３６からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様１〜３０のいずれかに記載のタバコ植物。
態様３２．前記非コーディングＲＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＯＤＣ  ＲＮＡｉ構築物中で提供される、態様１〜３１のいずれかに記載のタバコ植物。
態様３３．ｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、またはその両方を含み、早期老化形質をもたらすトランスジーンまたは変異をさらに含む、タバコ植物またはその部分。
態様３４．早期老化形質をもたらす前記変異がｙｅｌｌｏｗ  ｂｕｒｌｅｙ１（−ｙｂ１）である、態様３３記載のタバコ植物。
態様３５．早期老化形質をもたらす前記変異がｙｅｌｌｏｗ  ｂｕｒｌｅｙ２（−ｙｂ２）である、態様３３または３４記載のタバコ植物。
態様３６．早期老化形質をもたらす前記変異がｐａｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ（ＰＹ）である、態様３３〜３５のいずれかに記載のタバコ植物。
態様３７．対照タバコ植物と比べて、
ａ．低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する、第１のゲノム改変と、
ｂ．同等のレベルの１つまたはそれ以上の形質を提供し、該形質が、
ｉ．全葉ポリアミンレベル、
ｉｉ．全根ポリアミンレベル、
ｉｉｉ．全葉クロロフィルレベル、
ｉｖ．単位葉面積当たりの葉肉細胞数、および
ｖ．葉表皮細胞サイズ
からなる群から選択される、第２のゲノム改変と
を含むタバコ植物またはその部分であって、
該対照植物が、該第１のゲノム改変と該第２のゲノム改変を両方とも有さない、該タバコ植物またはその部分。
態様３８．対照タバコ植物と比べて、
ａ．低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する、第１のゲノム改変と、
ｂ．同等のレベルの全葉ポリアミンレベルを提供する、第２のゲノム改変と
を含むタバコ植物またはその部分であって、
該対照植物が、該第１のゲノム改変と該第２のゲノム改変を両方とも有さない、該タバコ植物またはその部分。
態様３９．対照タバコ植物と比べて、
ａ．低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する、第１のゲノム改変と、
ｂ．同等のレベルの全根ポリアミンレベルを提供する、第２のゲノム改変と
を含むタバコ植物またはその部分であって、
該対照植物が、該第１のゲノム改変と該第２のゲノム改変を両方とも有さない、該タバコ植物またはその部分。
態様４０．対照タバコ植物と比べて、
ａ．低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する、第１のゲノム改変と、
ｂ．同等のレベルの全葉クロロフィルレベルを提供する、第２のゲノム改変と
を含むタバコ植物またはその部分であって、
該対照植物が、該第１のゲノム改変と該第２のゲノム改変を両方とも有さない、該タバコ植物またはその部分。
態様４１．対照タバコ植物と比べて、
ａ．低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する、第１のゲノム改変と、
ｂ．同等のレベルの単位葉面積当たりの葉肉細胞数を提供する、第２のゲノム改変と
を含むタバコ植物またはその部分であって、
該対照植物が、該第１のゲノム改変と該第２のゲノム改変を両方とも有さない、該タバコ植物またはその部分。
態様４２．対照タバコ植物と比べて、
ａ．低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する、第１のゲノム改変と、
ｂ．同等のレベルの葉表皮細胞サイズを提供する、第２のゲノム改変と
を含むタバコ植物またはその部分であって、
該対照植物が、該第１のゲノム改変と該第２のゲノム改変を両方とも有さない、該タバコ植物またはその部分。
態様４３．前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の全複合型ポリアミンを葉に含む、態様３７〜４２のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様４４．前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の全複合型ポリアミンを根に含む、態様３７〜４３のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様４５．前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の全遊離ポリアミンを葉に含む、態様３７〜４４のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様４６．前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の全複合型ポリアミンを根に含む、態様３７〜４５のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様４７．前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１種類またはそれ以上のポリアミンの全複合型を葉に含む、態様３７〜４６のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様４８．前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１種類またはそれ以上のポリアミンの全複合型を根に含む、態様３７〜４７のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様４９．前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１種類またはそれ以上のポリアミンの全遊離型を葉に含む、態様３７〜４８のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５０．前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の、プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンからなる群から選択される１種類またはそれ以上のポリアミンの全複合型を根に含む、態様３７〜４９のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５１．前記第１のゲノム改変が、前記対照タバコ植物と比較して低レベルのニコチンを提供する、態様３７〜５０のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５２．前記第１のゲノム改変、前記第２のゲノム改変、またはその両方がトランスジーン、変異、またはその両方を含む、態様３７〜５１のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５３．前記第１のゲノム改変、前記第２のゲノム改変、またはその両方がトランスジーンを含む、態様３７〜５２のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５４．前記第１のゲノム改変、前記第２のゲノム改変、またはその両方が変異を含む、態様３７〜５３のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５５．前記第１のゲノム改変も前記第２のゲノム改変もその両方もトランスジーンに基づいていない、態様３７〜５４のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５６．前記第１のゲノム改変も前記第２のゲノム改変もその両方も変異に基づいていない、態様３７〜５５のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５７．前記第１のゲノム改変がｎｉｃ１変異、ｎｉｃ２変異、またはその両方を含む、態様３７〜５６のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５８．前記第１のゲノム改変が、Ｎｉｃ１遺伝子座を標的指向するトランスジーン、Ｎｉｃ２遺伝子座を標的指向するトランスジーン、またはその両方を含む、態様３７〜５７のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様５９．前記第２のゲノム改変が、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子、ＭＹＢ８遺伝子、またはその両方を抑制するための非コーディングＲＮＡをコードする転写可能なＤＮＡ配列を含む、態様３７〜５８のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６０．前記転写可能なＤＮＡ配列が、構成的プロモーター、発達プロモーター、組織特異的プロモーター、組織選好性プロモーター、誘導性プロモーター、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される異種プロモーターに機能的に連結されている、態様３７〜５９のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６１．前記第２のゲノム改変が、ジアミンオキシダーゼの過剰発現、アルギニンデカルボキシラーゼの抑制、またはその両方を含む、態様３７〜６０のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６２．前記第１のゲノム改変が、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１、Ｎｉｃ２、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子中または遺伝子座中に変異を含む、態様３７〜６１のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６３．前記第１のゲノム改変が、ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子中または遺伝子座中に変異を含む、態様３７〜６２のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６４．前記第１のゲノム改変が、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ−アデノシル−メチオニン合成酵素（ＳＡＭＳ）、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＢＢＬ、ＭＹＣ２、Ｎｉｃ１、Ｎｉｃ２、エチレン応答因子（ＥＲＦ）転写因子、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子座を標的指向しかつ抑制するトランスジーンを含む、態様３７〜６３のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６５．前記第１のゲノム改変が、ＥＲＦ３２、ＥＲＦ３４、ＥＲＦ３９、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子座を標的指向しかつ抑制するトランスジーンを含む、態様３７〜６４のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６６．前記低レベルが、開花直前、摘心時、摘心してから１週間後（ＷＰＴ）、２ＷＰＴ、３ＷＰＴ、４ＷＰＴ、５ＷＰＴ、６ＷＰＴ、７ＷＰＴ、８ＷＰＴ、および収穫時からなる群から選択される時期に測定される、態様３７〜６５のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６７．前記同等のレベルが、開花直前、摘心時、摘心してから１週間後（ＷＰＴ）、２ＷＰＴ、３ＷＰＴ、４ＷＰＴ、５ＷＰＴ、６ＷＰＴ、７ＷＰＴ、８ＷＰＴ、および収穫時からなる群から選択される時期に測定される、態様３７〜６６のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６８．前記タバコ植物が、前記対照植物に由来する葉の葉グレードと同等の葉グレードを有する葉を生成することができる、態様３７〜６７のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様６９．前記タバコ植物が、前記対照植物と同等の全葉収率を有する、態様３７〜６８のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様７０．前記タバコ植物が、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、および０．０５％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含む、前記態様のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様７１．前記タバコ植物が、同等の生育条件で生育された場合の前記対照植物のニコチンレベルの１％より少ない、２％より少ない、５％より少ない、８％より少ない、１０％より少ない、１２％より少ない、１５％より少ない、２０％より少ない、２５％より少ない、３０％より少ない、４０％より少ない、５０％より少ない、６０％より少ない、７０％より少ない、または８０％より少ないレベルのニコチンを含む、態様３７〜７０のいずれかに記載のタバコ植物またはその部分。
態様７２．前記態様のいずれかに記載のタバコ植物の集団。
態様７３．前記態様のいずれかに記載のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
態様７４．熱風乾燥、空気乾燥、火力乾燥、および太陽乾燥からなる群から選択される乾燥プロセスによって作製される、態様７３記載の乾燥タバコ材料。
態様７５．態様７３または７４記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド物。
態様７６．前記乾燥タバコ材料が、重量で前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様７３〜７５のいずれかに記載のタバコブレンド物。
態様７７．前記乾燥タバコ材料が、体積で前記タバコブレンド物中の乾燥タバコのおおよそ少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する、態様７３〜７６のいずれかに記載のタバコブレンド物。
態様７８．態様７３〜７７のいずれかに記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
態様７９．シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、態様７８記載のタバコ製品。
態様８０．ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコからなる群から選択される、態様７８または７９記載のタバコ製品。
態様８１．低減アルカロイドタバコ植物において葉品質を向上させるための方法であって、
ａ．タバコ植物を生育する工程；
ｂ．該タバコ植物においてプトレシンレベルを低減する工程；
ｃ．該タバコ植物から葉を収穫する工程
を含む、該方法。
態様８２．低減アルカロイドタバコ植物において葉品質を向上させるための方法であって、
ａ．タバコ植物を生育する工程；
ｂ．該タバコ植物においてオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子の発現または活性を抑制する工程；
ｃ．該タバコ植物から葉を収穫する工程
を含む、該方法。
態様８３．前記抑制する工程が２ＷＰＴ以内、４ＷＰＴ以内、６ＷＰＴ以内、または８ＷＰＴ以内である、態様８１または８２に記載の方法。
態様８４．前記抑制する工程が、タバコ植物を摘心する前または摘心した後に前記ＯＤＣ遺伝子を抑制する工程を含む、態様８１〜８３のいずれかに記載の方法。
態様８５．前記抑制する工程が化学阻害剤の使用を含まない、態様８２〜８４のいずれかに記載の方法。
態様８６．前記抑制する工程が、ＯＤＣ阻害剤を前記タバコ植物に適用する工程を含む、態様８２〜８５のいずれかに記載の方法。
態様８７．前記抑制する工程が、ＯＤＣ阻害剤を前記タバコ植物に適用することによる、態様８２〜８６のいずれかに記載の方法。
態様８８．前記ＯＤＣ阻害剤がＤＦＭＯである、態様８２〜８７のいずれかに記載の方法。
態様８９．前記抑制する工程が、前記オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡの発現を誘導することによる、態様８２〜８８のいずれかに記載の方法。
態様９０．窒素施肥を低減するかまたはニトレートを低減する工程をさらに含む、態様８２〜８９のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【０１９１】
実施例１：植物材料および一般的な生育条件
ニコチアナ・タバカムＬ．ｃｖ．バーレイ２１野生型  ＮＡならびに  ＨＩ  （ｎｉｃ２）、ＬＩ  （ｎｉｃ１）、および  ＬＡ  （ｎｉｃ１ｎｉｃ２）準同質遺伝子品種の種子はノースカロライナ州立大学  のＵＳ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、全ての温室実験において使用した。種子を、２７／２３℃昼／夜温度、１６時間明期（約２００ｍｍｏｌｓ−１ｍ−２；  λ＝４００〜７００ｎｍ）、７０％相対湿度の温室条件下で植木鉢の中で発芽させた。５週齢タバコ小植物を、標準的な基質（Ｅｉｎｈｅｉｔｓｅｒｄｅ，  Ｆｒｏｎｄｅｎｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）のある１３Ｌ植木鉢に移した。植物を、４時間ごとに約５分間動作する連続点滴灌漑システムに取り付け、０．７％（ｗ／ｖ）Ｆｅｒｔｙ  ２  Ｍｅｇａ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １６％  ｎｉｔｒｏｇｅｎ，（Ｐｌａｎｔａ  Ｄｕｎｇｅｍｉｔｔｅｌ，  Ｒｅｇｅｎｓｔａｕｆ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって１６時間明期の間、１時間につき５分間灌漑し、さらに４週間生育させた。植物の５０％に少なくとも１つの開いた花がある時に温室植物の先端を切り取った。摘心後、摘心してから３０日後の収穫まで、さらに４〜７週間間、植物を成育させた。ポリアミン分析に使用するタバコ葉を、温室で生育された植物から３つの時点：開花前（６．５週齢植物）、摘心、すなわち、花茎頂（ｆｌｏｒａｌ  ａｐｅｘ）切除の直前（９週齢植物）、および収穫時（１３週齢植物、摘心してから４週間後）で収集した。根試料は摘心時および収穫時に収集した。ＬＡおよびＮＡタバコ植物を野外で１エーカーにつき１３５単位の窒素で生育させ、ポリアミン分析のために摘心してから１週間後にサンプリングした。
【０１９２】
ポリアミン生合成阻害剤で処理するために、点滴灌漑システムの代わりに、５ｍＭ  Ｄ−アルギニン（ＡＫｏｓ，  Ｓｔｅｉｎｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、２ｍＭ  ＤＦＭＯ（Ｓｙｎｃｈｅｍ  Ｕｇ  ＆  Ｃｏ．  ＫＧ，  Ｆｅｌｓｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）単独もしくは０．５ｍＭ  Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）との組み合わせ、または０．５ｍＭ  Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）単独（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を、毎日の灌漑に使用した等量の水で希釈し、週３回、４時間ごとに９ａｍ、１２ａｍ、３ｐｍ、および６ｐｍにＬＡ植物に適用した。Ｄ−アルギニンおよびＤＦＭＯによる処理は開花前（植物がまだ栄養生長ステージにある、摘心の約２．５週間前）から開始し、収穫まで６週間にわたった。それに対して、Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）は、ＬＡ植物での早期老化を回避するために摘心から収穫（全体で４週間）まで適用された。１種類の阻害剤につき１２の植物を処理した。ＮＡ植物を対照として使用し、ＬＡ植物と同じように処理した。実験手法およびデータのさらなる説明は、Ｎｏｌｋｅ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｄｅｌａｙ  ｌｅａｆ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｏｗ‐ａｌｋａｌｏｉｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｖａｒｉｅｔｉｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ．  ２０１８；２：１−１２に記載されている。
【０１９３】
実施例２：クロロフィル測定
クロロフィル含有量は、ＳＰＡＤ−５０２  Ｐｌｕｓ装置（Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｃａｍｅｒａ  Ｃｏ．，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を用いて赤色領域および赤外領域での葉吸光度を測定することによって求めた。クロロフィルは、各株から無作為に選択した６つの植物に由来する、異なる位置にある完全に広がった（長さ＞１５ｃｍ）全ての葉（葉６−２６）において、５つの生育ステージ：開花前（６．５週齢の植物および摘心の２．５週間前）、摘心時、１ＷＰＴおよび２．５ＷＰＴ、ならびに収穫時（摘心してから３０日後）開花前に同日に２回測定した。全クロロフィル含有量は、葉位置の影響を最小限にするために植物１つ当たりの全ての葉クロロフィル測定値の平均として計算した。
【０１９４】
実施例３：葉細胞顕微鏡観察
異なる発達ステージ（開花前、摘心時、１ＷＰＴ、および収穫時）にある６つのバイオロジカルレプリケートの葉１５から切った４枚の葉ディスク（１ｃｍ２）をスライドの上にのせ、１０×空気対物レンズ（ａｉｒ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）が付いたＬｅｉｃａ  ＤＭ  Ｒ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，  Ｗｅｔｚｌａｒ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて画像化した。画像をＩｍａｇｅＪおよびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ５．１ソフトウェアにインポートし、単位面積当たりの細胞を、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ５のＣｏｕｎｔ  Ｔｏｏｌを用いて計数した。全ての画像にわたって３回、細胞を計数するのに使用するために標準的な領域を指定し、どの細胞も２回計数しないように気をつけた。
【０１９５】
実施例４：ＯＤＣ活性およびＡＤＣ活性の確認
酵素活性を測定するために、３つのバイオロジカルレプリケートの葉２３から収集した５００ｍｇのタバコ葉組織を１ｍｌ  ＨＥＰＥＳ  抽出緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で粉砕し、粉砕している間に１００ｍｇのポリビニルピロリドンを添加した。遠心分離（１３，０００ｇ、１０分、４℃）後に、同位体法を用いてＣａｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）に記載のように１４ＣＯ２の放出を測定することによって酵素活性を測定した。Ｌ−［１−１４Ｃ］ＡｒｇおよびＬ−［１−１４Ｃ］Ｏｒｎを放射性基質として使用した。
【０１９６】
実施例５：ポリアミン抽出および分析
ポリアミン分析のために、１５０μｇの葉または根材料を、温室で生育された植物から、異なる発達ステージ：開花前（根元から番号を付けた、葉６および１２）、摘心時（葉１９および２３ならびに根）、ならびに収穫時（葉２３および２４ならびに根）に採取した。３つのバイオロジカルレプリケートから、４時間光を当てた後に試料を収集し、液体窒素中で急速冷凍した。野外で生育された植物については、３つのバイオロジカルレプリケートの十分に広がった５枚の上葉から葉材料を収集した。植物材料を１．６ｍｌの予め冷却した１０％（ｖ／ｖ）過塩素酸中で粉砕し、４℃で１時間インキュベートした。抽出物を１０秒間ボルテックスし、遠心分離（１６，０００  ｇ，  １５分，  ４℃）した後に８００μｌの上清を１００μｌの１ｍＭヘキサメチレンジアミンと混合した。次いで、１０μｌの透明な上清を新鮮な２ｍｌチューブに移し、遊離ポリアミンのダンシル化（ｄａｎｓｉｌａｔｉｏｎ）のためにポリアミンを２００μｌのシクロヘキサンで抽出した。複合型ポリアミンを抽出するために、ペレットを１６００μｌの１Ｍ  ＮａＯＨおよび２００μｌの１ｍＭヘキサメチレンジアミンに再懸濁し、上記のように遠心分離した。透明な上清（２００μｌ）を、１２Ｍ  ＨＣｌを含有する２ｍｌガラスアンプルに移し、混合し、複合型ポリアミンを加水分解するために１１０℃で１６時間、一晩インキュベートした。遊離ポリアミンおよび複合型ポリアミンのダンシル化は、Ｆｌｏｒｅｓ  ａｎｄ  Ｇａｌｓｔｏｎ  （１９８２）に記載のように塩化ダンシルを用いて行った。
【０１９７】
ダンシル化ポリアミンをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。全実験を、ＨＰＬＣ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００システム（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）とつながった３２００  ＱＴＲＡＰ（商標）質量分析計（Ｓｃｉｅｘ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行った。質量分析計にはエレクトロスプレーイオン化源が備わっていた。試料を、対応するガードカラムが付いた孔径８０Å、粒径４μｍ、および寸法５０ｍｍ×２．０ｍｍ内径の逆相Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｆｕｓｉｏｎ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）によって流速８００μｌ／分で分離した。カラムオーブンを３０℃まで加熱した。溶出のために、溶媒Ａは９４．９％（ｖ／ｖ）水、５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含み、溶媒Ｂは９４．９％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、５％（ｖ／ｖ）水、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含んだ。以下の溶出プロファイルを使用した：１分、６０％溶媒Ａ／４０％溶媒Ｂで維持する；３分、１００％溶媒Ｂまで直線的に増やす、３分１００％溶媒Ｂで維持する；０．１分で６０％溶媒Ａ／４０％溶媒Ｂまで迅速に直線的に減らす；１分間維持する。全操作時間は８分であり、各操作で注入する試料体積は１０μｌであった。
【０１９８】
質量分析計をＱ１およびＱ３においてユニット分解能に設定した。全測定を多重反応モニタリングモードで捕捉した。化合物最適化のために、標準物質をダンシル化プロトコールに従って調製し、５０：５０（ｖ／ｖ）メタノール／水で希釈し、イオン源に直接接続したシリンジポンプを用いて１０μｌ／分の流速で注入した。全化合物のデクラスタリング電位（ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、衝突エネルギー、コリジョンセルエントランス電位（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｅｎｔｒａｎｃｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、コリジョンセルエグジット電位（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｅｘｉｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、およびエントランス電位（ｅｎｔｒａｎｃｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を、自動化合物最適化を用いて最適化した（表３）。イオン源パラメータをキャピラリー電圧＝５．５ｋＶ、ヒーターガス温度＝５００℃、カーテンガス（ｃｕｒｔａｉｎ  ｇａｓ）＝３０ｐｓｉ、噴霧ガス（ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ  ｇａｓ）＝７０ｐｓｉ、乾燥ガス（ｄｒｙｉｎｇ  ｇａｓ）＝７０ｐｓｉ、およびコリジョンガス＝中程度に設定した。それぞれの分析物について、ある遷移を定量に使用し、別の遷移をクォリファイアー（ｑｕａｌｉｆｉｅｒ）に使用した。取得したデータをＡｎａｌｙｓｔ  ｖ１．６（Ｓｃｉｅｘ）を用いて処理した。３２００  ＱＴＲＡＰのマスキャリブレーションを、ポリプロピレングリコール標準物質（Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ／Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ＰＰＧｓ，  Ｓｃｉｅｘ）を用いて製造業者の説明書に従って行った。
【０１９９】
（表３）ポリアミン定量のための化合物パラメータ。ＤＰ＝デクラスタリング電位、ＣＥ＝衝突エネルギー、ＣＥＰ＝コリジョンセルエントランス電位、ＣＸＰ＝コリジョンセルエグジット電位、ＥＰ＝エントランス電位
2021516055.tif 000005
【０２００】
実施例６：統計解析
遺伝子型間の差異は、Ｅｘｃｅｌソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，  Ｒｅｄｍｏｎｄ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＵＳＡ）を用いて一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後に事後ボンフェローニ検定（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔｅｓｔ）を適用することによって判定した。両側ｔ検定を適用した。ｐ値＜０．０５が統計的に有意だとみなされた。
【０２０１】
実施例７：葉成熟中の４品種間の生化学的および形態学的な差異
バーレイ２１  ＮＡ、ＨＩ、ＬＩ、およびＬＡ株における老化の進行は、葉にあるクロロフィルａおよびｂの減少を測定することによってモニタリングした。摘心してから１週間後（ＷＰＴ）に全ての遺伝子型においてクロロフィルレベルは有意に低下した（ｐ＜０．０１）（図１Ａ）。しかしながら、ＬＩ植物およびＬＡ植物の葉は２．５ＷＰＴ（両遺伝子型で２２％多い）ならびに収穫時（ＬＩ葉およびＬＡ葉でそれぞれ３６％および４４％多い）でＮＡ対照よりも有意に（ｐ＜０．００１）高いレベルのクロロフィルを含んだ。このことは、ＮＡ対照と比較してクロロフィル分解がゆっくりであることを示している。クロロフィル減少はＮＡ植物の葉の形態学的変化と相関関係にあった。すなわち、ＮＡ植物の葉はしわが多く、革のようであり、黄色の斑点があった。それに対して、ＬＡ葉は滑らかで、つやがあり、緑色のままであった（図１Ｂ）。
【０２０２】
ＬＡ株およびＮＡ株の葉形態が異なることを考えて、葉肉細胞のサイズと形状を異なる時点で調べた。開花前に、ＮＡ植物と比較してＬＡ植物の葉１５（根元から番号を付けた）の葉肉細胞の方が小さくかつ豊富にあった（単位葉面積当たりの細胞が多かった）（図１Ｃ／Ｄ）。その時点から収穫まで、ＮＡ株およびＬＡ株の両方で単位面積当たりの葉の葉肉細胞数がほぼ同じ速度で減少したが、成熟の間ずっとＬＡ植物の葉肉細胞数の方が有意に（ｐ＜０．０５）多いままであった。単位面積当たりの葉肉細胞数の最も大きな差（ＮＡ対照と比較してＬＡ植物の方は細胞が５４％多い）が初期の葉発達ステージ（開花前）で観察された。ＬＩ植物もＮＡ植物より多くの葉肉細胞を含んだが、ＬＡ植物で観察される程度ではなく、ＨＩ株とＮＡ株との間には葉肉細胞数に有意差はなかった（データ示さず）。
【０２０３】
実施例８：ＬＡ植物はＮＡ植物より高レベルのポリアミンを蓄積する
ポリアミン生合成に及ぼすｎｉｃ１ｎｉｃ２二重変異の影響を調べるために、ＮＡ植物およびＬＡ植物における遊離および複合型のプトレシン、スペルミジン、およびスペルミンのレベルを液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって比較した。最初に、野外で生育された植物の葉１６〜１８のポリアミン含有量を分析した。１ＷＰＴでは、全ポリアミン含有量はＮＡ植物と比較してＬＡ植物の方が有意に多かった（１．９倍、ｐ＜０．００１）（図２Ａ）。組成分析から、ＬＡ植物の葉には有意に高いレベルの遊離プトレシン（１．４倍、ｐ＜０．０５）、複合型プトレシン（２．３倍、ｐ＜０．００５）、および複合型スペルミジン（１．９倍、（ｐ＜０．００５）レベルがあることが明らかになった。このことは、ポリアミン生合成経路がｎｉｃ１ｎｉｃ２二重変異体によって強力に誘導されるか、または基質がニコチンにこれ以上処理できないために、これらの材料が蓄積することを示している。対照的に、ＬＡ植物における遊離スペルミジンレベルはＮＡ植物より少なかったが、この差は統計的に有意でなかった（ｐ＞０．０５）。
【０２０４】
ポリアミン生合成に及ぼす変化に富んだ環境要因の影響を最小限にするために、温度、光、および湿度の点で標準的な野外条件を模倣する管理された温室条件下で、さらなる実験を行った（データ示さず）。収穫時（摘心してから３０日後）の温室におけるＮＡ植物およびＬＡ植物の表現型は、植物の高さ、葉の数、および葉形態の点で、野外で生育された対応物と同様であった（データ示さず）。それぞれの葉／根試料を１つの植物および１つの時点につき１回だけ収集するように実験を設計することによって、ポリアミン生合成に及ぼす傷の影響を最小限にした。同じ発達ステージでの葉、すなわち、葉１２開花前、葉１９摘心時、および葉２４収穫時での葉における全ポリアミン含有量の時間経過モニタリングから、ＮＡ対照と比較してＬＡ植物では開花前（１．５倍）および収穫時（２．１倍）に有意に（ｐ＜０．０５）高いレベルのポリアミンがあることが明らかになった（図２Ｂ）。ＬＡ植物はまた、ＮＡ対照と比較して、摘心時（２．４倍）および収穫時（１．４倍）に根に有意に（ｐ＜０．０５）高いレベルの全ポリアミンも有意に蓄積した（図２Ｂ）。
【０２０５】
実施例９：ポリアミン生合成に及ぼすｎｉｃ１ｎｉｃ２二重変異の影響
４品種の選択された葉（葉６開花前、若い葉２３摘心時、および成熟した葉２３収穫時）におけるポリアミン組成物の比較分析から、開花前に、株ＬＩおよびＬＡはＮＡ対照よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いレベルの遊離プトレシン（それぞれ１．６倍および４．２倍）を含有し、さらに高レベルの複合型プトレシン（それぞれ２．１倍および５倍）を含有することが明らかになった（図３Ａ）。複合型プトレシンおよびスペルミジン画分は４品種全てにおいて成熟中に連続して増大したが、ＮＡ対照と比較してＬＩ植物およびＬＡ植物では有意に高いままであった（図３Ａ）。ポリアミン含有量の最大の差は収穫時のＬＡ葉において観察され、ＮＡ対照と比較して、遊離プトレシンが１．８倍増加、複合型プトレシンが２．９倍増加、複合型スペルミジンが２．９倍増加したことを含めて全ポリアミンレベルが２．１倍増加した。しかしながら、ＮＡ品種とＨＩ品種との間には有意差は無かった。このことから、ポリアミン蓄積に及ぼすｎｉｃ２単一変異の影響が小さかったことが分かる。
【０２０６】
摘心時に、ＬＡ植物の根はＮＡ植物よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いレベルの遊離プトレシン、複合型プトレシン、および複合型スペルミジンを含有し（それぞれ、２．６倍、２．９倍、および２．５倍の増加）、このような差異は収穫時にも観察された（それぞれ、１．６倍、１．４倍、および２．５倍の増加）（図３Ｂ）。
【０２０７】
実施例１０：ポリアミン生合成経路はＬＡ植物においてより活発である
プトレシン生合成へのＡＤＣおよびＯＤＣの相対的寄与を、摘心時および収穫時のＮＡ植物およびＬＡ植物の葉（葉２３）および根における各酵素の活性を測定することによって評価した。両株ともＡＤＣ活性およびＯＤＣ活性は器官特異的および発達ステージ特異的に変化した（図４）。ＡＤＣ活性は両株の葉で高いが根では最小であるのに対して、ＯＤＣ活性は若い葉と根で高い。このことから、ＯＤＣは主に根でのプトレシン生合成を担っていることが分かる。ＡＤＣ活性は摘心時および収穫時にＮＡ対照と比較してＬＡ植物の葉において有意に高かった（１．４倍、ｐ＜０．０５）（図４Ａ）。同様に、ＯＤＣ活性は、ＮＡ対照と比較してＬＡ植物の摘心時の根（１．８倍）および収穫時の根（１．７倍）、ならびに摘心時の若い葉（１．５倍）において有意に（ｐ＜０．０５）高かった（図４Ｂ）。
【０２０８】
実施例１１：ＬＡ品種におけるポリアミン生合成の阻害
ＬＡ品種における高次ポリアミンレベルと望ましくない葉形態との間には相関関係があると仮定して、ＡＤＣおよびＯＤＣを阻害する化学物質によって植物を処理する効果を評価した。予備実験によって、適切な阻害剤濃度、適用時間、処理強度、および期間が定められた（データ示さず）。遊離プトレシンおよび複合型プトレシンのレベルは開花前および収穫時にはＮＡ対照よりもＬＡ植物の方が有意に高かった（図３）。そのため、ＡＤＣ阻害剤Ｄ−アルギニンとＯＤＣ阻害剤ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）を摘心の２．５週間前から適用し、収穫まで処理を続けた。さらに、エチレン遊離を介して成熟を加速するために、植物成長調整物質Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）を単独で、またはＤＦＭＯと組み合わせて使用した。老化の早期誘導を回避するために、Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）を摘心から収穫まで適用した。
【０２０９】
ＤＦＭＯおよびＤＦＭＯ／Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）処理によって、ＬＡ植物の葉がＮＡ葉の特徴のいくつか（しわ、クロロフィル分解）を獲得するように形態学的表現型が部分的に改善した。それに対して、Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）単独での処理によってクロロフィル含有量が低減したが、葉形態は影響を受けなかった（図５）。開花前にＤＦＭＯ処理を開始すると生育が止まり、これは、摘心時に処理を開始した際には観察されなかった（データ示さず）。Ｄ−アルギニン処理はＬＡ植物のクロロフィルレベルにも形態にも影響を及ぼさなかった。
【０２１０】
ポリアミンレベルの分析から、摘心の２．５週間前にＤＦＭＯ処理すると、ＬＡ葉における全ポリアミンレベルが２．１倍増加することが明らかになった。このことは、主に、高レベルの複合型プトレシンと複合型スペルミジンを反映している（図６Ａ）。この高い割合の複合型ポリアミンは、ＤＦＭＯおよびＤＦＭＯ／Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）で処理した植物では収穫まで残存した。対照的に、Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）単独で処理すると、収穫時の全ポリアミンレベルは有意に低減した。このことは、主に、遊離プトレシンと複合型プトレシンの低減を反映している。根では、ＤＦＭＯ処理することで、ＬＡ植物の全ポリアミン含有量が、摘心時（１．５倍）および収穫時（１．４倍）に有意に低減した（ｐ＜０．０５）。これは、主に、遊離プトレシンおよび複合型プトレシンならびに複合型スペルミジンの低減によるものである（図６Ｂ）。この減少はＥｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）を添加しても逆転しなかった。葉での効果とは対照的にＥｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）単独適用は根のポリアミン含有量に影響を及ぼさなかった。Ｄ−アルギニン処理はＬＡ植物のポリアミン含有量に影響を及ぼさなかった。従って、根でのポリアミン減少は、根でのプトレシン生合成を担う主な酵素であるＯＤＣ活性の阻害を反映している可能性がある。
【０２１１】
実施例１２：遺伝子操作によるポリアミンレベルの変化
ｎｉｃ１ｎｉｃ２変異バックグラウンドでＯＤＣ活性を抑制する目的で改変タバコ植物を作製する。ＯＤＣ  ＲＮＡｉカセット（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）をドライブして１つまたはそれ以上のＯＤＣ遺伝子（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３〜３４に示したコード配列またはタンパク質配列）を抑制するために、摘心応答性プロモーター（例えば、ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２１）を使用する。トランスジェニック植物を作製し、例えば、全葉ポリアミンレベル、全根ポリアミンレベル、全葉クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、葉表皮細胞サイズ、および乾燥葉グレードを含む葉表現型について評価する。
【０２１２】
ｎｉｃ１ｎｉｃ２変異バーレイバックグラウンドでＭＹＢ８遺伝子の発現および活性を調整する目的でも改変タバコ植物を作製する。ＭＹＢ８は、ニコチアナ・アテヌアタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ａｔｔｅｎｕａｔａ）において３種類のヒドロキシシンナモイル−コエンザイムＡ：ポリアミントランスフェラーゼを活性化することによって誘導性フェノールアミドレベルを制御すると報告された。Ｏｎｋｏｋｅｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １５８  （１）  ３８９−４０７  （２０１２）を参照されたい。ＭＹＢ８  ＲＮＡｉカセットまたはＭＹＢ８  ｃＤＮＡ配列をドライブして、それぞれ抑制または過剰発現するために、構成的プロモーターまたは摘心応答性プロモーター（例えば、ＳＥＤ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２１）を使用する。トランスジェニック植物を作製し、例えば、全葉ポリアミンレベル、全根ポリアミンレベル、全葉クロロフィルレベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、葉表皮細胞サイズ、および乾燥葉グレードを含む葉表現型について評価する。
【０２１３】
実施例１３：育種集団
低アルカロイドのタバコハイブリッド、品種、または株は、バーレイ種、ダーク種、熱風乾燥種、メリーランド種、もしくはオリエンタル種のタバコとして作製することができ、またはＢＵ６４、ＣＣ１０１、ＣＣ２００、ＣＣ２７、ＣＣ３０１、ＣＣ４００、ＣＣ５００、ＣＣ６００、ＣＣ７００、ＣＣ８００、ＣＣ９００、コッカー１７６、コッカー３１９、コッカー３７１ゴールド、コッカー４８、ＣＵ２６３、ＤＦ９１１、Ｇａｌｐａｏタバコ、ＧＬ２６Ｈ、ＧＬ３５０、ＧＬ６００、ＧＬ７３７、ＧＬ９３９、ＧＬ９７３、ＨＢ０４Ｐ、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４６、Ｋ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＫＤＨ９５９、ＫＴ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ１６０、ＫＹ１７、ＫＹ１７１、ＫＹ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４ｘＬ８ＬＣ、リトル・クリテンデン、マクネア３７３、マクネア９４４、ｍｓＫＹ１４ｘＬ８、ナロー・リーフ・マドーレ、ＮＣ１００、ＮＣ１０２、ＮＣ２０００、ＮＣ２９１、ＮＣ２９７、ＮＣ２９９、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ６、ＮＣ７、ＮＣ６０６、ＮＣ７１、ＮＣ７２、ＮＣ８１０、ＮＣＢＨ１２９、ＮＣ２００２、ニール・スミス・マドール、ＯＸＦＯＲＤ２０７、「ペリック」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７−１１、Ｒ７−１２、ＲＧ１７、ＲＧ８１、ＲＧＨ５１、ＲＧＨ４、ＲＧＨ５１、ＲＳ１４１０、スペイト１６８、スペイト１７２、スペイト１７９、スペイト２１０、スペイト２２０、スペイト２２５、スペイト２２７、スペイト２３４、スペイトＧ−２８、スペイトＧ−７０、スペイトＨ−６、スペイトＨ２０、スペイトＮＦ３、ＴＩ１４０６、ＴＩ１２６９、ＴＮ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ９０、ＴＮ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮＤ９４、ＴＮＤ９５０、ＴＲ（トム・ロッソン）マドーレ、ＶＡ３０９、もしくはＶＡ３５９、メリーランド６０９、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ＨＢ４４８８ＰＬＣ、ＫＴ２０６ＬＣ、ＫＴ２０９ＬＣ、ＫＴ２１０ＬＣ、ＫＴ２１２ＬＣ、Ｒ６１０ＬＣ、ＰＶＨ２３１０、ＮＣ１９６、ＫＴＤ１４ＬＣ、ＫＴＤ６ＬＣ、ＫＴＤ８ＬＣ、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０５ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１８ＬＣ、ＰＤ７３１９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ、シャーレイＬＣ、または当技術分野において公知の標準的なタバコ育種技術による任意の商用のタバコ品種に本質的に由来し得る。
【図１】
2021516055.tif 000007
【図２】
2021516055.tif 000008
【図３】
2021516055.tif 000009
【図４】
2021516055.tif 000010
【図５】
2021516055.tif 000011
【図６】
2021516055.tif 000012
【配列表】
2021516055000001.app
【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年1月12日(2021.1.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
（表１）摘心応答性の根特異的発現または根選好性発現のための例示的な誘導性プロモーター
2021516055.tif 000013
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６２】
（表２）摘心応答性の葉特異的発現または葉選好性発現のための例示的な誘導性プロモーター
2021516055.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月13日(2020.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【図１】温室で生育されたＮ．タバカム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）Ｌ．ｃｖ．バーレイ２１正常アルカロイド（ＮＡ）野生型植物および３つの変異品種の表現型特徴決定。図１Ａ：温室で生育された野生型（ＮＡ）高中間（ＨＩ、ｎｉｃ２）、低中間（ＬＩ、ｎｉｃ１）、および低アルカロイド（ＬＡ、ｎｉｃ１ｎｉｃ２）株の全クロロフィル含有量。異なる発達ステージ：開花前（摘心の２．５週間前）、摘心時、摘心してから１週間後（ＷＰＴ）、２．５ＷＰＴ、および収穫時に、１５ｃｍより長い全ての葉のクロロフィルを１枚の葉につき２回測定した。値は４つのバイオロジカルレプリケートの平均である。図１Ｂ：収穫時のＮＡ植物およびＬＡ植物の代表的な写真。図１Ｃ：葉１５における葉肉細胞数の時間経過評価。図１Ｄ：異なる植物発達ステージでのＮＡ植物およびＬＡ植物からの葉１５の葉肉細胞の顕微鏡画像。バー＝１００μｍ。ＡおよびＣの値は６つのバイオロジカルレプリケートの平均である。エラーバーは平均の標準偏差を表す。ＮＡに対する統計学的差異を示した。＊ｐ＜０．０５。
【図２】野外および温室で生育されたＮＡ植物およびＬＡ植物におけるポリアミン分析。図２Ａ：摘心してから１週間後のＮＡ植物およびＬＡ植物の十分に広がった５枚の上葉（ｕｐｐｅｒ  ｌｅａｆ）（野外で生育された３つのバイオロジカルレプリケート）からの遊離（Ｆ）および複合型（Ｃ）プトレシン（Ｐｕｔ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、ならびにスペルミン（Ｓｐｍ）含有量。図２Ｂ：温室で生育されたＮＡ植物およびＬＡ植物における全ポリアミン含有量の時間経過モニタリング。葉試料は同じ発達ステージの葉：開花前（葉１２）、摘心時（葉１９）、および収穫時の葉（２４）から収集した。根試料は摘心時および収穫時から収集した。値は３（Ａ）／４（Ｂ）つのバイオロジカルレプリケートの平均である。エラーバーは平均の標準偏差を表す。ＮＡとの統計学的差異を示した：  ＊ｐ＜０．０５；  ＊＊ｐ＜０．００５．ＰＡ：ポリアミン；ＦＷ：新鮮重量。
【図３】温室で生育されたＮＡ、ＨＩ、ＬＩ、およびＬＡ植物の葉および根におけるポリアミン含有量。開花前（葉６）、摘心時（若い葉２３、根）、および収穫時（成熟した葉２３、根）のＮＡ、ＨＩ、ＬＩ、およびＬＡ植物の葉（図３Ａ）および根（図３Ｂ）における遊離（Ｆ）および複合型（Ｃ）のプトレシン（Ｐｕｔ）、スペルミジン（Ｓｐｄ）、およびスペルミン（Ｓｐｍ）画分を示した。４時間光を当てた後に試料を収集し、液体窒素中ですぐに冷凍し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。値は３つのバイオロジカルレプリケートの平均である。エラーバーは平均の標準偏差を表す。統計学的差異を示した：  ＊ｐ＜０．０５；  ＊＊ｐ＜０．００１。これは、ＬＩ植物およびＬＡ植物が同じ条件下でＮＡ植物とは有意差があるｈを示す。根については摘心および収穫からの試料しか入手できなかった。ＦＷ：新鮮重量。
【図４】ポリアミン生合成酵素の活性。摘心時（若い葉２３、根）および収穫時（成熟した葉２３、根）のＮＡ植物およびＬＡ植物の葉および根におけるアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）（図４Ａ）およびオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）（図４Ｂ）活性の分析。値は３つのバイオロジカルレプリケートの平均である。エラーバーは平均の標準偏差を表す。ＮＡとの統計学的差異を示した：  ＊ｐ＜０．０５；  ＊＊ｐ＜０．００１。
【図５】未処理のＮＡ植物およびＬＡ植物、ならびに収穫時にポリアミン生合成阻害剤および／または植物成長調整物質で処理したＬＡ植物からの葉２３の代表的な写真。Ｄ−アルギニン（５ｍＭ）はＡＤＣの阻害剤である。ＤＦＭＯ（ジフルオロメチルオルニチン，  ２ｍＭ）はＯＤＣの阻害剤である。ＥＴＨ（Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標），  ０．５ｍＭ）は成長調整物質である。
【図６】ポリアミン生合成阻害剤および／またはＥｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）を用いたＬＡ植物の処理。摘心時および収穫時の未処理ＬＡ植物および処理済みＬＡ植物の葉（図６Ａ）および根（図６Ｂ）における比較を用いた全ポリアミン、遊離ポリアミン、および複合型ポリアミン。タバコ植物を、ポリアミン生合成阻害剤および／またはＥｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）（５ｍＭ  Ｄ−アルギニン、２ｍＭ  ＤＦＭＯ、２ｍＭ  ＤＦＭＯ／０．５ｍＭ  Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）、または０．５ｍＭ  Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）単独）の非存在下（ＮＡおよびＬＡ）または存在下（ＬＡ）で温室において生育した。ＤアルギニンおよびＤＦＭＯを開花前から収穫まで６週間にわたって週３回適用した。これに対して、Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）処理は摘心後（２．５週間後）から開始して収穫まで行った。試料は、１つの遺伝子型または１回の処理につき４つのバイオロジカルレプリケートの葉２３または根から、４時間光を当てた後に収集した。未処理ＬＡ植物（灰色のバー）からの平均ポリアミン含有量、またはＤ−アルギニン（黒色のバー）、ＤＦＭＯ（白色のバー）、ＤＦＭＯ／Ｅｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）（水平線のあるバー）、およびＥｔｈｅｐｈｏｎ（登録商標）（ディボット（ｄｉｖｏｔ）のバー）で処理した植物からの平均ポリアミン含有量間の変化倍率をプロットした。エラーバーは平均の標準偏差（ｎ＝４）を示す。ＬＡ／ＮＡの平均との統計学的差異を示した：  ＊ｐ＜０．０５。赤色の線はＮＡにおけるポリアミン含有量を表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
一局面では、トランスジーン抑制、変異誘発、または標的指向性ゲノム編集を介してＭＹＢ８活性が抑制されたタバコ植物が提供される。
[本発明1001]
オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子を抑制するための非コーディングＲＮＡをコードする転写可能なＤＮＡ配列に機能的に連結された誘導性プロモーターを含む、タバコ植物。
[本発明1002]
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも20％以内のレベルの1種類またはそれ以上のポリアミンを含む葉を生成することができる、本発明1001のタバコ植物。
[本発明1003]
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも20％以内のクロロフィルレベルを含む葉を生成することができる、本発明1001のタバコ植物。
[本発明1004]
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも20％以内の単位葉面積当たりの葉肉細胞数を含む葉を生成することができる、本発明1001のタバコ植物。
[本発明1005]
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも20％以内の表皮細胞サイズを含む葉を生成することができる、本発明1001のタバコ植物。
[本発明1006]
変異もトランスジーンも含まない対照植物の同等の葉と比べて少なくとも20％以内の葉収率を含む、本発明1001のタバコ植物。
[本発明1007]
前記オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）遺伝子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：29、30、31、32、33、および34からなる群から選択される配列に対して少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列をコードする、本発明1001のタバコ植物。
[本発明1008]
前記ＯＤＣ遺伝子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：23、24、25、26、27、および28からなる群から選択される配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、本発明1007のタバコ植物。
[本発明1009]
前記誘導性プロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、および21からなる群から選択される配列を含む、本発明1001のタバコ植物。
[本発明1010]
前記非コーディングＲＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：35および36からなる群から選択される配列に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、本発明1001のタバコ植物。
[本発明1011]
前記非コーディングＲＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：22に対して少なくとも90％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むＯＤＣ  ＲＮＡｉ構築物中で提供される、本発明1010のタバコ植物。
[本発明1012]
対照タバコ植物と比べて、
ａ．低レベルのニコチンまたは全アルカロイドを提供する、第1のゲノム改変と、
ｂ．同等のレベルの1つまたはそれ以上の形質を提供し、該形質が、
ｉ．全葉ポリアミンレベル、
ｉｉ．全根ポリアミンレベル、
ｉｉｉ．全葉クロロフィルレベル、
ｉｖ．単位葉面積当たりの葉肉細胞数、および
ｖ．葉表皮細胞サイズ
からなる群から選択される、第2のゲノム改変と
を含むタバコ植物またはその部分であって、
該対照植物が、該第1のゲノム改変と該第2のゲノム改変を両方とも有さない、該タバコ植物またはその部分。
[本発明1013]
前記タバコ植物が、前記対照タバコ植物と比べて低減した量の全遊離ポリアミンを葉または根に含む、本発明1012のタバコ植物またはその部分。
[本発明1014]
前記タバコ植物が、前記対照植物に由来する葉の葉グレードと同等の葉グレードを有する葉を生成することができる、本発明1012のタバコ植物またはその部分。
[本発明1015]
本発明1001のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
[本発明1016]
本発明1015の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
[本発明1017]
シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、鼻嗅ぎタバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、本発明1016のタバコ製品。
[本発明1018]
本発明1012のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
[本発明1019]
本発明1018の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
[本発明1020]
シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット、通気式リセスフィルターシガレット、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、細断タバコ、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、鼻嗅ぎタバコ、およびカットタバコからなる群から選択される、本発明1019のタバコ製品。
【国際調査報告】
2021516055.tif 000015
2021516055.tif 000016
2021516055.tif 000017
2021516055.tif 000018
2021516055.tif 000019