(57)【要約】  本明細書では、誘導性で条件付きのCRISPR/Cas9とRNAiのためのシステムと方法が提供される。本発明は、動物モデルの作成およびCRISPRベースの標的化の効率から、誘導性かつ可逆的遺伝子サイレンシングを行い、新たな治療法をシミュレートすることを可能にするRNAiモデルを開発することを含む。
2021503968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本発明のファウンダーノックイン株を確立する方法は、以下のものを含む。
a.  プロモーターおよびmiRNAバックボーンを含むヌクレオチド配列を有するファウンダー株を作成する工程；および
b.  ファウンダー株を用いて、産生される次の株のための可変shRNA配列をノックインすること。
【請求項２】
ファウンダー株を作成することは、ゲノム編集システムを使用して、後続の各RNAi株に使用される共通配列を挿入することを含み、前記ファウンダー株を用いて可変shRNA配列をノックインに使用することは、内在性遺伝子を標的とするshRNAを有する次の株を生成することと、胚または細胞への試薬の形質導入によって各株を生成することとを含む、請求項1記載の方法。 
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列がレポーター配列をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子編集システムは、CRISPR/Cas9システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）からなる群から選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子編集システムは、CRISPR/Cas9システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）からなる群から選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
miRNAベースのshRNAのプロモーター駆動発現が、tet誘導性、polllヒトまたはマウスU6およびH1系、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター/エンハンサー、ヒトβアクチンプロモーター、ラットに存在するグルココルチコイド誘導性プロモーター、およびマウス乳癌ウイルス長末端反復（MMTV LTR）、モロニーマウス白血病ウイルス（MuLV LTR）の長末端反復配列、SV40初期または後期領域プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の3'長末端反復に含まれるプロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼプロモーター/エンハンサー、単純ヘルペスウイルスLATプロモーター、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス2など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、およびサルウイルス40（SV40）から成る群から選択される、また、例えば、免疫グロブリンプロモーターなど、異種哺乳動物プロモーターから選択される、ならびに熱ショックプロモーターから選択される、請求項4記載の方法。ただし、そのようなプロモーターが、宿主細胞システム、およびTetプロモーターのような誘導性システムと適合的である限りにおいてである。
【請求項７】
胚または細胞がラット種由来である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
以下のものを含む、RNAiラットを作成するためのシステム。
a.  最初のファウンダー株を作成すること。最初のファウンダー株は、パラメーターとバックボーンmiRNAシステムからなるヌクレオチド配列を含む；および
b.  最初のファウンダー株を使用し、shRNA標的配列を組み込むこと。
【請求項９】
パラメーターがTRE配列である、請求項8記載のシステム。 
【請求項１０】
ヌクレオチド配列はさらにレポーター配列を含む、請求項8記載のシステム。
【請求項１１】
前記レポーター配列は、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびGFPの誘導体、赤色蛍光タンパク質（RFP）およびRFPの誘導体、黄色蛍光レポーター（YFP）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS）、アルカリホスファターゼ（AP）、βガラクトシダーゼ（LacZ）、βグルクロニダーゼ（GUS）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、ルシフェラーゼ（Luc）、ノパリン合成酵素（NOS）、オクトフィンシンターゼ（OCS）、およびそれらの誘導体など、任意の蛍光レポーターから成る群から選択される、請求項10記載のシステム。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンフォス、メトトレキセート、ホスフィノリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに耐性を付与する複数の選択可能なマーカーが利用可能である。
【請求項１２】
miRNAシステム系がUTS配列を含む、請求項8記載のシステム。
【請求項１３】
前記shRNA標的配列が内在性遺伝子を標的とする、請求項8記載のシステム。 
【請求項１４】
前記プロモーターは、PolIIIヒトまたはマウスU6およびH1システム、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター/エンハンサー、ヒトβアクチンプロモーター、ラットおよびマウス哺乳動物腫瘍ウイルス長末端反復（MMTV LTR）中に存在するグルココルチコイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（MuLV LTR）の長末端反復配列、SV40初期または後期領域プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の3'長末端反復に含まれるプロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼプロモーター/エンハンサー、単純ヘルペスウイルスLATプロモーター、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス2など）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよびサルウイルス40（SV40）から成る群から選択される、また、例えば、免疫グロブリンプロモーターなど、異種哺乳動物プロモーターから選択される、ならびに、熱ショックプロモーターから選択される、請求項13記載のシステム。ただし、このようなプロモーターが、宿主細胞システム、およびTetプロモーターなどの誘導性システムと適合的である限りにおいてである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[001]   本発明は、分子生物学および遺伝子工学の分野での遺伝子ターゲティングゲノム編集および一過性遺伝子サイレンシングのための方法およびシステムに関わる。より具体的には、本発明は、薬物治療を模倣するためにRNA干渉に結合されたDNA配列を特異的かつ効率的に編集するためのCRISPR関連ヌクレアーゼの使用について記述する。
【背景技術】
【０００２】
[002]   「RNA干渉」、「転写後遺伝子サイレンシング」、「サイレンシング」。これらの異なる名称は、二本鎖RNA前駆体をコードする導入遺伝子の過剰発現から生じる、または二本鎖RNAの細胞への意図的な導入から生じる同様の効果を意味する。
[003]   動物モデルは、疾患メカニズムを分析するための規範的方法であるが、動物モデルを開発するためのコストと長いリードタイムは、薬剤発見プロセスでの動物モデルの日常的使用を妨げてきた。CRISPR/Cas9ゲノム編集の登場は、RNA干渉技術の大きな前進と相まって、マウスでヒトの疾患を遺伝子操作し、研究することを可能にする。疾患発症を研究することを超えて、誘導性の機能喪失遺伝子ツールは、薬剤の開発に先立って、治療標的候補を探るための強力で拡張可能なシステムを提供する。マウスモデルの有益性にも関わらず、多くの科学者にとって、ラットはそれでもサイズが大きいので外科的操作に向くこと、繰り返し採血が可能であること、ならびに認知的かつ生理学的な特性がマウスよりヒトに似ていることのために、より好まれる齧歯類である。神経生物学、心臓生物学、免疫学および毒物学においては、ラットはまだ研究4-7において優勢な齧歯類モデルです。マウスの胚性幹細胞を操作し、培養する技術は、マウスを遺伝子組換えモデルの標準にしましたが、今やCRISPR/Cas9はラットのゲノムを操作する経路を提供する。現在のアプローチは恒久的な対立遺伝子ノックアウトを誘導することは可能だが、新しい薬剤標的の治療効果と毒性を探査するために必要であることが分かっている一時的な遺伝子調節は可能ではない。RNAiラットモデルは、潜在的な薬物反応のインビボ評価による前臨床検証プロセス、およびインビボ抵抗メカニズムを変形し、より安全でより効率的な薬剤の開発を導く。
[004]   製薬会社は、化合物の毒物学研究の大部分が、フェーズIに先立ち、ラットで行われることをまだ必要とすることがよくある。ラットは創薬において主要な齧歯類モデルとして再び人気を得ることになります。RNAiラットは、恒久的な遺伝子ノックアウトより、小分子阻害のダイナミクスをうまく模倣する。
[005]   本発明は、遺伝子ターゲティングとゲノム編集により問題の追及を企てる。
【発明の概要】
【０００３】
[006]   本明細書では、誘導性で条件付きのCRISPR/Cas9とRNAiのためのシステムと方法が提供される。マウスモデル生成とCRISPRベースのターゲティングの有効性に基づき、本発明は、誘導性で可逆的な遺伝子サイレンシングが新しい治療計画を促進することを可能にするRNAiラットモデルを包含する。
[007]   ファウンダーノックイン株を確立する手法が発表されており、それは一般的に次のものが含まれる。すなわち、プロモーター、レポート配列、miRNAバックボーンから構成されるヌクレオチド配列でファウンダー株を生成すること、ならびにファウンダー株を使用して、後続株が生成されるように、多様なshRNA配列をノックインすることである。
[008]   その手法とシステムは、一部は、以下のような記述で規定され、また一部は記述から明らかになるか、手法とシステムの実践から学習することが可能である。この方法とシステムの利点は、添付のクレームで特に指摘される要素とコンビネーションにより理解され、達成される。上記の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものであり、特許請求される方法およびシステムを限定するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
[009]   添付図に、類似する要素は、本発明の複数の好ましい実施形態の中の類似する参照番号で特定される。
【図１Ａ】[010] 図1Aは、3日間ドキシサイクリンで処理されたバイトランスジェニックshMkk4/CAG-rtTA3から摘出された組織内のGFP発現の顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】図1Bは顕微鏡写真であり、GFPのタンパク質発現であり、孤立した肝細胞のMkk4発現である。
【図１Ｃ】図1AはRNAiマウスのトランスジェニック対立遺伝子の模式図である。
【図２Ａ】[011] 図2Aは、CRISPR/Cas9を使用するRNAiモデル生成の2ステップアプローチの図である。そこでは、ファウンダー動物は、第1にドナーカセットのノックインで生成され、第2のターゲティングイベントで、ssODNのCRISPRが介在するHDRを使用して、ユニークなshRNA配列の挿入を容易にする。図2Bは、一実施形態に従って生成されるファウンダー株の模式図である。
【図３】[012] 図3は、発明の他の実施形態の図である。
【図４】[013] 図4は、UTSへのshRNAの統合の評価の図である。そこでは、1つの細胞胚がTRE-GFP-UTS/CAG-rtTA3クロスから摘出される。CRISPR試薬＋ssODNドナーDNAの顕微注射が実行される。胚は4-5日間培養されて胚盤胞ステージになり、PCR増幅用のDNAのために準備されて、その後T7エンドヌクレアーゼI処理が施される。陽性クローンは、直接DNA配列によりさらに分析される。
【図５ＡＢ】[014] 図5A-5Bは、5' ColA1 #261-284のPCRの結果を表示する図である。
【図５ＣＤ】図5C-5Dは、5' COLA1 #285-300のPCRの結果を表示する図である。
【図６ＡＢ】[015] 図6A-6Bは、3' ColA1 #261-284のPCRの結果を表示する図である。
【図６ＣＤ】図6C-6Dは、3' ColA1 #258-300のPCRの結果を表示する図である。
【図７ＡＢ】[016] 図7A-7Bは、5' ColA1 #701-724のPCRの結果を表示する図である。
【図７ＣＤ】図7C-7Dは、5' ColA1 #725-748のPCRの結果を表示する図である。
【図７ＥＦ】図7E-7Gは、5' ColA1 #749-773のPCRの結果を表示する図である。
【図７Ｇ８Ａ】図7E-7Gは、5' ColA1 #749-773のPCRの結果を表示する図である。図8A-8Fは、3' ColA1 #701-773のPCRの結果を表示する図である。
【図８ＢＣ】[017] 図8A-8Fは、3' ColA1 #701-773のPCRの結果を表示する図である。
【図８ＤＥ】図8A-8Fは、3' ColA1 #701-773のPCRの結果を表示する図である。
【図８Ｆ】図8A-8Fは、3' ColA1 #701-773のPCRの結果を表示する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
[018]   本発明の先述および他の特長と利点は、以下の標準的な実施形態の詳細な記述から明らかである。添付図面と関連させて読むべきである。詳細な説明と図面は制限的なものではなくて本発明の単なる実証例であり、本発明の範囲は添付のクレームとそれに等しいものにより規定される。
[019]   本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書で特に示されない限り、範囲内にある各個別の値に個々に言及する簡潔な方法として役立つことを意図しており、各別個の値は、本明細書中に個別に記載されているかのように、明細書に組み込まれる。数値に付随する場合、「約」という語は、述べられている数値から最大10％までの偏差を指すものと解釈されるものとする。本明細書内で使用されるすべての例、または標準的な言語（「例えば」または「など」）の使用は、単に本発明をより明確にすることを意図しているだけであり、別段主張される場合を除き、本発明の範囲を限定することはない。明細書の文言は、本発明の実用に不可欠な要素だけでなく、クレームされていない要素を指示するように解釈されてはならない。
[020]   「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらはあらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。それらはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれの相似形のいずれかである。ポリヌクレオチドは3次元の構造を持っていてもよい、または、知られているか、知られていないかを問わず、何らかの機能を行ってもよい。以下のものは、ポリヌクレオチドの実例だが、これらに制限されない。遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、リンケージ分析から定義された遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA)、トランスファーRNA、リボゾームRNA、短い干渉RNA（siRNA)、短ヘアピンRNA（shRNA)、マイクロRNA（miRNA)、リボゾーム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何らかの配列の分離されたDNA、何らかの配列の分離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドには、メチル化ヌクレオチドとヌクレオチドアナログなど、1つ以上の修飾ヌクレオチドが含まれていてもよい。存在する場合、ポリマーの組立ての前後に、ヌクレオチド構造への改変は与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ラベリング成分との共役などにより、重合のあと、ポリヌクレオチドはさらに修飾されてもよい。
[021]   本発明の態様において、「キメラRNA」、「キメラガイドRNA」、「ガイドRNA」、「単一ガイドRNA」および「合成ガイドRNA」という用語は互換的に使用され、それらはガイド配列、tracr配列およびtracrメイト配列が含まれるポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」とは、標的部位を特定する誘導RNA内の約20 bp配列を指し、また、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用され得る。また、tracrメイト配列という用語は、「ダイレクトリピート」という用語と互換的に使用してもよい。標準的なCRISPR-Casシステムは以下に指示される。
[022]   「ワイルドタイプ」という用語は、本明細書で使用される場合、熟練者により理解される専門用語であり、異形または変異型とは区別される、自然界で発生する生物、株、遺伝子または特性の典型的な形態を意味する。
[023]   本明細書で使用される場合、「異型」という用語は、自然界で発生するものからは逸脱しているパターンを有する質の表示を意味するもとと理解するものとする。
[024]   「自然発生しない」または「操作された」という用語は互換的に使用され、人間の手の関与を示す。それらの用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、核酸分子またはポリペプチドが、自然界ではそれらが通常結合している、または自然界では一緒に見つかる相互の成分と、少なくとも実質上分離していることを意味する。
[025]   「相補性」は、従来型のワトソン・クリック型またはその他の非従来型により、別の核酸配列と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、2番目の核酸配列との（ワトソン・クリック塩基対合など）水素結合を形成する核酸分子の残基のパーセンテージを指す（10のうちの5、6、7、8、9、10が50%、60%、70%、80%、90%および100%相補性であるなど）。「完全に相補的」は、核酸配列のすべての隣接した残基が、2番目の核酸配列内における同じ数の隣接する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的である」とは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、またはそれ以上のヌクレオチドの領域で、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%である相補性の程度を指すか、または厳格な条件の下でハイブリダイズする2個の核酸を指す。
[026]   本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションの「厳格な条件」とは、標的配列に対する相補性を有する核酸が標的配列と優越的にハイブリダイズし、非標的配列とは実際上ハイブリダイズしないことを指す。厳格な条件は通常配列依存的であり、数多くのファクターに依存して変化する。一般的に、配列が長いほど、配列が特異的に標的配列にハイブリダイズする温度が高くなる。厳格な条件の非限定的な例は、Tijssen（1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probesの第1部第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”（「ハイブリダイゼーションの原理と核酸プローブアッセイのストラテジーの概説」）、Elsevier, N.Y.に詳細に記述されている。
[027]   「ハイブリダイゼーション」は、1つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基ベース間の水素結合を介して安定化した複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的な手法で生じさせることができる。複合体には、二重構造を形成する2つの鎖、多重鎖複合体を形成する3つ以上の鎖、単一の自己17ハイブリダイズ鎖、またはそれらの任意の組み合わせが含まれてもよい。ハイブリダイゼーション反応は、PCRの開始または酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より広範なプロセスで1つのステップを構成してもよい。任意の配列とのハイブリダイズが可能な配列は、任意の配列の「補体」と称される。
[028]   本明細書において、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがDNA鋳型から（例えばmRNAまたは別のRNA転写物に）転写されるプロセス、および／または転写されたmRNAがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子生成物」と称されてよい。ポリヌクレオチドがゲノムDNAから誘導される場合、発現には、真核細胞におけるmRNAのスプライシングが含まれてよい。
[029]   「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書においては、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すものとして、互換的に使用される。ポリマーは線形でも分岐していてもよい。修飾アミノ酸が含まれていてもよい。また、非アミノ酸により中断されてもよい。また、当該用語は、修飾されているアミノ酸ポリマーを含む。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはラベル付きコンポーネントとの複合など、任意の他の操作。本明細書では、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびDまたはL光学異性体の両方を含む自然および/または非自然のアミノ酸もしくは合成アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣薬を含む。
[030]   本明細書では、「被験体」、「個体」および「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指すものとして、互換的に使用される。哺乳類には、マウス、類人猿、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペットが含まれるが、それらに限定されない。インビボで得られた、またはインビトロで培養された生物学的存在の組織、細胞およびそれらの所産も含まれる。
[031]   「治療薬」、「治療能力のある薬剤」または「治療薬剤」は互換的に使用され、投与時に、被験体に何らかの有益な効果を与える分子または化合物を指す。有益な効果には、診断確定の能力、疾患、症状、機能障害、または病態の改善、疾患、症状、機能障害、または病態の低減または防止、ならびに疾患、症状、機能障害、または病態に対する一般的な対抗が含まれる。
[032]   本明細書では、「種」は脊椎動物、好ましくは哺乳類を指すものとして、互換的に使用される。哺乳類には、マウス、類人猿、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペットが含まれるが、それらに限定されない。
[033]   本明細書においては、「治療」または「治療すること」もしくは「緩和すること」または「改善すること」は互換的に使用される。これらの用語は、治療効果および/または予防効果を含むが、それに限定されない有効なまたは望む結果を得るためのアプローチを指す。治療効果という用語は、治療下での、1つ以上の疾患、状態、または症状に対する任意の治療に関連する改善または効果を意味する。予防の効用のためには、特定の疾患、病状、もしくは症状を発生させるリスクがある被験体に対しては、または疾患の1つ以上の症状を報告している被験者に対しては、それらの疾患、病状、または症状がまだ現れていないとしても、構成を行ってよい。
[034]   「有効量」または「治療有効量」は、有益な結果または望む結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療上有効な量は、以下の1つ以上の事情次第で変えてもよい。すなわち、被験体と病状が治療されていること、被験者の体重と年齢、病状の重さ、当業者により決定されていることがありうる施薬の仕方など。当該用語は、本明細書に記述されるイメージング法の任意の1つにより検知される画像を提供する投与量に適用される。特定の投与量は、選択した特定の薬剤、続いて実施する投与計画、それが他の化合物と組み合わせて投与するかどうか、投与のタイミング、撮像するべき組織、およびそれが搬送される物理的な送達システムのうちの1つまたは複数に応じて変化し得る。
[035]   「組換え」という用語は、2つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。この公開の目的に関しては、「相同組換え（HR)」は、例えば、細胞内での二本鎖切断の修理中に生じる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、（二本鎖切断を経験した分子など）「標的」分子の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、遺伝情報をドナーから標的に移転させることになるため、「非交差遺伝子変換」または「短管遺伝子変換」など様々な名称で知られている。任意の特定の理論による拘束があることもあるが、当該転移は、切断された標的とドナー間で形成されるヘテロ二本鎖DNAのミスマッチ修復、および/または、標的の一部になる遺伝情報を再合成するために、ドナーが使用される「合成依存鎖アニーリング」、および/または関連プロセスを含むことは可能である。当該特殊なHRは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるなど、標的分子の配列の変質を生じさせることがよくある。
[036]   「切断」は、DNA分子の共有結合のバックボーンの破壊を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含むがそれらに限定されない様々な手法で開始できる。一本鎖切断と二本鎖切断は両方とも可能であり、また二本鎖切断は、2つの別々の一本鎖切断の結果として生じることがある。DNA切断により、鈍端または付着端が作られることがある。特定の実施形態では、融合ポリペプチドが標的二本鎖DNA切断に使用される。
[037]   「切断ドメイン」には、DNA切断用の触媒活性を有する1つ以上のポリペプチド配列が含まれる。切断ドメインは単一のポリペプチド鎖に含まれることがある。あるいは、切断活性は2つ（またはそれ以上）のポリペプチドの関連から生じることがある。
[038]   用語「調節要素」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（IRES)、および他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリU配列などの転写終結シグナル）を含むことを意図している。そのような調節要素は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.（1990)に記述されているIRESをP2Aの代わりにしてもよい。  調節要素は、多くのタイプの宿主細胞内のヌクレオチド配列の構成発現を誘導する要素、およびある宿主細胞でのみヌクレオチド配列（例えば組織特異的調節配列）の発現を誘導する要素を含む。組織特異的プロモーターは、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特異な器官（肝臓、膵臓など）、または特異な細胞型（リンパ球など）など、主に関心の対象である望む組織内で発現を誘導してもよい。調節要素は、細胞周期依存的手法または発達的ステージ依存的方法（組織特異的または細胞型特異的であってもなくてもよい）など、時間依存的方法で発現を誘導してもよい。一部の実施形態では、1つのベクターには、1つ以上のpol IIIプロモーター（例えば1、2、3、4、5、またはそれ以上のpol III プロモーター）、1つ以上のpol IIプロモーター（例えば1、2、3、4、5、またはそれ以上のpol IIプロモーター）、1つ以上のpol Iプロモーター（例えば1、2、3、4、5、またはそれ以上のpol Iプロモーター）、またはそれらの組み合わせが含まれる。pol IIIプロモーターの例としては、U6およびH1プロモーターが挙げられるがそれらに限定されない。pol IIプロモーターの例は、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター（オプションとしてRSVエンハンサー付き）、サイトメガロウイルス(CMV）プロモーター（オプションとしてCMVエンハンサー付き）を含むがそれらに限定されない。[例えばBoshart et al, Cell, 41:521-530（1985)], the SV40 promoter, the dihydrofolate reductase promoter, the β-actin promoter, the phosphoglycerol kinase（PGK）promoter, and the EF1α promoterを参照。用語「調節要素」により、WPRE；CMVエンハンサー；R-U5′セグメントHTLV-IのLTR中のR-U5′ セグメント(Mol. Cell. Biol., Vol. 8（1), p. 466-472, 1988)； SV40 enhancer; and the intron sequence between exons 2 and 3 of rabbit β-globin（SV40エンハンサー；ラビットβグロビンエクソン2と3の間のイントロン配列）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78（3), p. 1527-31, 1981)など、エンハンサー要素も包含される。発現ベクターの設計が、変換される宿主細胞の選択、望む発現のレベルなどのファクターに依存することがあることは、熟練当業者により評価される。ベクターは、本明細書で記述されるように、宿主細胞に導入されて、融合タンパク質またはペプチドを含む、転写物、タンパク質、またはペプチドを産生し、それらは核酸によりコードされる（例えば、規則的に集束し、散在するショートパリンドロームが、（CRISPR）転写物、タンパク質、酵素、それらの変異型、それらの融合タンパク質などを繰り返す）。
[039]   インビボでshRNAコンストラクトの発現を制御するのに使用されてもよいプロモーター/エンハンサーは、限定されるものではないが，PolIIIヒトまたはマウスU6およびH1システム、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター/エンハンサー、ヒトβアクチンプロモーター、ラットおよびマウスの乳腺腫瘍ウイルスのロングターミナルリピート（MMTV LTR）にあるグルチコルチコイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（MuLV LTR）のロングターミナルリピート配列、SV40初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の3′ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）のチミジンキナーゼプロモーター/エンハンサー、ならびに単純ヘルペスウイルスLATプロモーターが挙げられる。例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘、アデノウイルス（例えばアデノウイルス2）、ウシ乳頭腫、トリ肉腫、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよび猿ウイルス40（SV40）など、ウイルスのゲノムから得られたプロモーター、免疫グロブリンプロモーターなどの非相同哺乳類プロモーター、および熱ショックプロモーターにより、そのようなプロモーターが宿主細胞システムと適合している場合に限り、哺乳類宿主細胞のベクターからの転写物が制御される。Tetプロモーターなどの誘導系が使用されてもよい。さらに、望む回数のshRNAコンストラクトの切除を可能にするように、Cre/loxなど、リコンビナーゼシステムを使用してもよい。Creは、（転写後または転写前に）タモキシフェンなどの外部シグナルに反応する
[040]   「遺伝子発現の阻害」は、標的遺伝子からのタンパク質および/またはmRNAプロダクトのレベルの不在または観察できる減少を指す。「特異性」は、細胞のその他の遺伝子への明らかな効果なしで、標的遺伝子を阻害する能力を指す。阻害の結果は、（これらの例に関して以下に記載されているような）細胞や生物の外側の特性の検査により、ならびにRNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイ付き遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素とリンクした免疫吸着剤アッセイ（ELISA)、ウェスタンブロッティング、放射線免疫アッセイ（RIA)、他の免疫アッセイ、および蛍光発色細胞分析（FACS）などの手法により確証することができる。細胞株または生物全体のRNA介在阻害については、遺伝子発現は、そのタンパク質産物が容易に検査できるレポーター遺伝子または薬剤抵抗遺伝子の使用により従来的な検査される当該レポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS)、アルカリホスファターゼ（AP)、β-ガラクトシターゼ（LacZ)、β-グルクロニダーゼ（GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT)、緑色蛍光タンパク質（GFP)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)、ルシフェラーゼ（Luc)、ノパリンシンターゼ（NOS)、オクトピンシンターゼ（OCS)、およびそれらの誘導体が含まれる。次のものに耐性を提供する複数の選択マーカーが使用可能である。すなわちアンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンである。
[041]   本発明の実施は、別途言及がない限り、従来の手法の範囲内にある免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学、および組換えDNAという従来の手法を使用する。以下の論文を参照する。Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition（1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（F. M. Ausubel, et al. eds.,（1987)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY（Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH（M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds.（1995)), Harlow and Lane, eds.（1988）ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE（R. I. Freshney, ed.（1987))。
[042]   「リコンビナーゼ介在カセット交換」（RMCE)は、部位特異的組換えプロセス（SSRs）の特性に基づいている。当該手順は、標的を狙った組み込みにより、高次の真核生物のゲノムのシステマティックで繰り返される修飾を可能にする。RMCEでは、これは既存の遺伝子カセットを「目的の遺伝子」（GOI）を保有する相似のカセットとクリーンに交換することにより達成される。遺伝子カセットの交換（「フリップ」ステップ）が、イーストのリコンビナーゼ（「Flp」)により可能になる。パートBは、自然に生じる48 bp FRT部位（F）の変異体を示す。遺伝子カセットの両端にこれらの部位（例えばFとFn）のセットがある場合、遺伝子カセットは、二重相互組換えにより、交換プラスミドの一部である第2のカセットと場所を交換することがある。モデル実験はパートCに示される。当該実験では、「空」細胞が標準的なトランスフェクションアプローチまたはRMCEにより修飾される。最初の例では、複数のゲノムサイトが当てられ、それぞれは異なる発現レベルに上昇することが重要である。予め定義された遺伝子アドレスを使用して、同じ遺伝子レポーターを導入する場合、その各イベントから誘導される各クローンは、類似の発現特性を示す。
[043]   「リコンビナーゼ」は遺伝組み込み酵素である。DNAリコンビナーゼは、ゲノムの構造を操作し、遺伝子発現を制御するのに、多細胞生物で広く使用されている。バクテリアと菌類に由来するこれらの酵素は、各リコンビナーゼに特異な短い（30-40ヌクレオチド）標的部位の間で、方向に敏感なDNA交換反応を触媒作用を及ぼす。当該反応は4つの基本的な機能モジュール、すなわち切除/挿入、逆位、転座およびカセット交換を可能にする。それらの反応は、遺伝子発現を制御するために幅広い立体配置内で個別にまたは組み合わされて使用される。
[044]   「tet誘導系」は、抗生作用のあるテトラサイクリンまたはその誘導体の1つ（例えばドキシサイクリン）が存在する場合に、転写が可逆的にONまたはOFFになる誘導性遺伝子発現の方法である。自然界では、Ptetプロモーターは、TetR、リプレッサー、およびTetA、細胞からテトラサイクリン抗生物質を排出するタンパク質を発現する。  Tet-OnおよびTet-Offの違いは、名前が示唆するように、トランス活性化因子が遺伝子をONまたはOFFにすることではなく、両方のタンパク質が発現を活性化させることである。違いは、ドキシサイクリン（Dox、より安定したテトラサイクリン類似体）に対するそれらそれぞれの反応に関係する。Tet-OffはDoxの非存在下で発現を活性化し、Tet-OnはDoxの存在下で発現を活性化する。Tet-On Advancedトランス活性化因子（rtTA2S-M2とも呼ばれる）は、低減した基礎発現を示すTet-Onの代替バージョンであり、Tet-Offより10倍低いDox濃度で機能する。さらに、その発現は、最適されたヒトのコドンであり、3つの最小の転写活性化ドメインを使用するために、真核生物の細胞においてより安定している考えられる。Tet-On 3G（rtTA-V16[Clontech Laboratories, Inc.]としても知られている）は、Tet-On Advancedに類似しているが、rtTA2S-M2ではなく、rtTA2S-S2から誘導されたのである。それは最適化されたヒトのコドンであり、3つの最小VP16活性化ドメインが含まれる。しかし、Tet-On 3Gタンパク質が、Tet-On Advancedと比べて、Doxへの感度をさらに上昇させるように見える、5つのアミノ酸の違いを有する。Tet-On 3Gは、100分の1のDoxに対して感度があり、元来のTet-Onより7倍アクティブである。ライフテクノロジーによるT-Rexシステムなどの他のシステムは、異なる仕方で機能する。目的の遺伝子は、両端に上流CMVプロモーターと2つのTetO2部位を有している。目的の遺伝子の発現は、テトラサイクリンの非存在下で、TetRホモ二量体の各TetO2配列への高い親和性結合により抑制される。テトラサイクリンの導入により、1つのテトラサイクリンが各TetRホモ二量体に結合し、次いで、TetO2がTetRホモ二量体により解放される。TetRホモ二量体とTetO2の分離から、目的の遺伝子の活性化が生じる。
[045]   「外来DNA物質の形質導入」は、DNAやsiRNAなど、遺伝物質がウイルスにより細胞に挿入されるプロセスである。分子生物学の一般的な手法は、ウイルスベクター（バクテリアファージなど）、電気穿孔法、細胞浸透性を高める化学試薬の使用である。トランスフェクションと形質変換も、DNAと細胞に挿入する一般的な手段である。
[046]   「胚盤胞注入」はキメララット、すなわちES細胞由来の組織と宿主胚盤胞由来の組織の混合を算出する。目標は、生殖系列を含む、ES細胞由来の組織の高い寄与率のキメラである。注入用のES細胞は準備可能である。（129由来ES細胞用にはC57BL/6株からの；C57BL/6由来ES細胞用にはアルビノC57BL/6の）胚盤胞に遺伝子組換えES細胞を注入し、当該胚盤胞をレシピエントダムに移植してもよい。キメラオスは実験に使用してもよい。
[047]   他のソース（商業的供給源または細胞銀行）から分離されたまたは取得された多様な細胞を、当該発明と調和するように使用することが可能である。当該細胞は、限定されるものではないが、以下の体細胞が挙げられる。すなわち、免疫細胞（T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞）、血液細胞（赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、ニューロン細胞（中枢神経系、末梢神経系から）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋または心筋のミオサイトおよび筋芽細胞を含む）、結合組織細胞（例えば線維芽細胞、脂肪細胞、細胞質、軟骨芽細胞、骨細胞および骨芽細胞）、ならびに他の間質細胞（例えばマクロファージ、樹状細胞、胸腺ナース細胞、シュワン細胞など）である。原種、前駆体および、上記体細胞と生殖細胞を発生させる幹細胞が当該発明に基づいて使用できるのと同じく、真核生物生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）もまた当該発明に基づいて使用できる。これらの細胞、組織および器官は正常の場合もあり、疾患の場合もある。そのような疾患には、限定されるものではないが，遺伝病または生化学病（例えば、嚢胞線維症、血友病、アルツハイマー病、統合失調症、筋萎縮症、多発性硬化症など）における、または癌の発生および癌関連プロセスにおける、免疫関連疾病、慢性炎症、自己免疫反応、感染性疾患（バクテリア、菌類またはイースト、ウイルス（HIVなど）または寄生虫により発生する）が挙げられる。胚細胞、精原幹細胞、胚性幹細胞など、ラット多能細胞およびiPS細胞が考えられる。ラット体細胞も考えられる。
[048]   誘導性CRISPR/Cas9とRNAi法
[049]   PCT出願番号PCT/US2016/051992に記載されている誘導性CRISPR/Cas9およびRNAi 100（その全部が参照のために本明細書に含まれている）は、（CRISPR/Cas9、ジンクフィンガー、TALENなどにより）特異遺伝子編集イベントの新規の組み合わせであり、RNA干渉は、連続的におよび/または組み合わせて、同じ生物学的システム（または生物または動物モデル）に使用される。最初の手法はCRISPR/Cas9ゲノム編集ツールであり、正確に遺伝子位置でDNA切断を開始し、2つのメカニズムのうちの1つによりDNA修復を誘導する。NHEJ（非相同末端結合）またはHDR（相同組換え修復）。NHEJの場合、これらの遺伝子編集イベントは、ランダム挿入により、または生物学的システムまたは動物モデルに望む病因もしくは望む表現型の発現の素因を与える望むゲノム領域のヌクレオチド（INDELS）の除去により、遺伝子変異を発生させるのに使用される。HDRの場合、相同領域および望む変異を含むドナー鋳型もまた送致されて、相同組換えイベントとドナー鋳型のゲノムへの組み込みを誘導する。ドナー鋳型は、限定されるものではないが， cDNA、ポイント変異配列、レポーター、miRNAなどを含む、ゲノムDNAを変える導入遺伝子カセットをいくつ含んでいてもよい。Cas9媒介DNA切断は、TRE（tet反応要素）プロモーターなど、誘導性プロモーターからCas9を発現させることにより、正確なタイミングで誘導させることが可能である。このコンフィギュレーションは、ドキシサイクリン（テトラサイクリンアナログの一種）を動物のシステムまたは食物もしくは飲料水に添加することにより、Cas9発現を促進する（Dow, L.E., Fisher, J., O'Rourke, K.P., Muley, A., Kastenhuber, E.R., Livshits, G., Tschaharganeh, D.F., Socci, N.D., and Lowe, S.W.（2015). Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol 33, 390-394)。対照的に、（PCT出願番号PCT/US2016/051992記載の図1に示されるように）tGFP-shRNAコンストラクトは反対方向を向いていて、プロモーターとともにはない。それゆえ、発現は、ドキシサイクリン処理後すぐには誘導されない。適用される2番目の手法は、CRE/LoxまたはFLP/FRTもしくはDRE/Roxなどの組換えシステムであり、それらにより逆方向反復がCas9-CREERT2コンストラクトの両端に付く（PCT出願番号PCT/US2016/051992記載の図1に示される）。タモキシフェン（またはエストロゲンアナログ）添加後、当該方法は、正確な組換えが生じるのを可能にする（Siegel, R.W., Jain, R., and Bradbury, A.（2001). インビボファージミドシステムを使用して、非互換loxP配列。FEBS Lett 499, 147-153.)。逆方向反復または組換え配列の数多くのコンフィギュレーションを、使用してもよい。loxP配列の位置と配向次第で、特異組換えイベントが生じる。（PCT出願番号PCT/US2016/051992の図1-4に示される）（Matsuda, T., and Cepko, C.L.（2007). Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.（インビボ電気穿孔法により導入された導入遺伝子の制御された発現。）Proc Natl Acad Sci U S A 104, 1027-1032.; Siegel, R.W., Jain, R., and Bradbury, A.（2001). Using an in vivo phagemid system to identify non-compatible loxP sequences. （非互換loxP配列を特定するための、インビボファージミドシステムの使用。）FEBS Lett 499, 147-153)。PCT出願番号PCT/US2016/051992記載の図2に示すように、CREによるloxP部位の組換えはDNAコンストラクトの切除および/または反転を生じさせ、tGFP-shRNAコンストラクトは適切な5’から3’の方向��向いていて、3番目の手法、誘導性RNA干渉の機能を可能にする。付加的逆方向反復および組換えシステム（すなわちFlp/FRT、PhiC31/attP/Bシステム/Dre/Rox）の代わりにloxPおよび lox2272を使用してもよい。選択された組換え次第では、他のエストロゲンまたはホルモン分子をタモキシフェンと交換してもよい。  任意のレポーターまたはDNA配列の代わりにtGFPを使用して、遺伝子発現の阻害をモニターしてもよい。  最終的に、反転が生じたあと、ドキシサイクリンによる処理は、目的の特異遺伝子のRNAi媒介遺伝子サイレンシングを誘導するGFP融合のshRNAコンストラクトの発現を活性化させる（Dickins, R.A., McJunkin, K., Hernando, E., Premsrirut, P.K., Krizhanovsky, V., Burgess, D.J., Kim, S.Y., Cordon-Cardo, C., Zender, L., Hannon, G.J., et al.（2007).Tissue-specific and reversible RNA interference in transgenic mice（トランスジェニックマウスの特異組織的および可逆的RNA干渉）.Nat Genet 39, 914-921; Premsrirut, P.K., Dow, L.E., Kim, S.Y., Camiolo, M., Malone, C.D., Miething, C., Scuoppo, C., Zuber, J., Dickins, R.A., Kogan, S.C., et al.（2011).A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference.（条件付きのRNA干渉を使用するマウスの遺伝子機能を研究するために迅速で拡張可能なシステム。）Cell 145, 145-158.)。
[050]   誘導性CRISPR/CasおよびRNAi 100法は、単一のDNAコンストラクトを生命システムに送達するのを可能にし、効果的なCRISPR/Cas9媒介遺伝子編集および組換えにおけるRNAi干渉媒介遺伝子サイレンシングを容易にします。そのようなシステムは、例えば、生命システムまたは動物モデルの特異な疾患または表現型の誘導を可能にする。オールインワンデザインの単純さにより、システムの活性化に2つの遺伝子が必要なだけの疾患の動物モデルの迅速な発生が可能になる。（1）オールインワンFLExシステム（PCT出願番号PCT/US2016/051992記載の図1）、および（2）tetトランス活性化因子（Tet-off；tTAまたはTet-on；rtTAのいずれか）。
[051]   誘導性CRISPR/Cas9およびRNAi法は、誘導性CRISPR/Cas9と誘導性RNAiの両方が同一のTREプロモーターから発現する同一のシステムで使用されるという点で類を見ない。SparQTM cumateスイッチ（System Biosciences, Inc.）またはRheoSwitch誘導性発現システム（New England BioLabs）などのように、2つの独特の誘導性発現システムを組み合わせることで、誘導性CRISPR/Cas9と誘導性RNAiの組み合わせが達成できることは理解できる。しかし、これらのシステムはインビボ動物モデルで入念にはテストされていない上に、Tet誘導性システムとして普通に利用されておらず（Abe, T., and Branzei, D.（2014).High levels of BRC4 induced by a Tet-On 3G system suppress DNA repair and impair cell proliferation in vertebrate cells.（Tet-On 3Gシステムにより誘導された高レベルのBRC4は、DNA修復を抑制し、脊椎動物細胞の細胞増殖を損なう。）DNA Repair（Amst）22, 153-164; Gossen and Bujard, 1992; Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., and Gossen, M.（2010).最小化された背景発現を有する改良されたTet反応プロモーター。BMC Biotechnol 10, 81.)、インビボでのそれらの発現パターンの特性はまだ確定されていない。さらに、2つの独立した誘導性発現システムが組み合わされて、オールインワン発現ベクターになるか否かは分かっていない。と言うのも、プロモーター干渉がこの可能性を妨げることもあるからである。誘導性CRISPR/Cas9およびRNAi法は、Cas9とshRNA発現を使用して、同時にではなく、順次誘導されるようにする。これの目的は、変異変異誘発が最初に生じ、病因または表現型出現のあとに、shRNA発現の誘導を反転させることです。
[052]   誘導性CRISPR/Cas9およびRNAiシステムも、TREプロモーターからの高レベルのCas9発現を妨げるために、新規のshRNA標的Cas9（shCas9）を含んでいてよい（図1）。高レベルのおよび/または持続的なレベルのCas9が細胞に有害であることは示されている。このため、その発現を制限するために、誘導性CRISPR/Cas9およびRNAi法はCas9発現カセットの3’ UTRのshRNAを含んでいてもよい。TREプロモーターからの豊富な過剰発現を制御することに加えて、shCas9は、（Tet-Onシステムにおいて）ドキシサイクリンの非存在の場合にTREプロモーター自体からのリーキーな発現を制御するのにも役立つ（McJunkin, K., Mazurek, A., Premsrirut, P.K., Zuber, J., Dow, L.E., Simon, J., Stillman, B., and Lowe, S.W.（2011). Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference.（トランスジェニックRNA干渉を使用する成獣のマウスの必須遺伝子の可逆的な抑制。）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 7113-7118)。ドキシサイクリンの非存在の場合、最小限の発現が生じないように、数多くの例で、オリジナルのTREプロモーターがリーキーであることを明らかにされた。このため、複数の新しい世代のプロモーター（TREtightとTRE3G）が開発された（Abe and Branzei, 2014; Loew et al., 2010)。不運にして、これらのプロモーターは漏れやすさを制御するのには役立つものの、発現が動物モデルの特異的組織に制限されるという点で、一部の事例では、当該プロモーターの調節が難しいことがある（McJunkin et al., 2011)。それにも関わらず、TREは、より新しいTREtightとTRE3Gプロモーターを含む、任意のプロモーターと交換することができる。
[053]   誘導性CRISPR/Cas9およびRNAiシステムも、非常に適応性が高いと言う点で比類がない。数多くのバージョンが使用できるが、システムは記載されているものだけに限らない。例えば、数多くのU6-gRNAカセットはTREプロモーターの上流で発現する。U6-gRNA-gRNA−U6-gRNA-gRNA−U6-gRNA-gRNAなど、U6-RNAsは並んでクローンされる。上述したように、U6は他のpol IIIプロモーターまたは調節要素と交換できる。gRNAは複数の遺伝子に向けてもよい。（Dow, L.E., Fisher, J., O'Rourke, K.P., Muley, A., Kastenhuber, E.R., Livshits, G., Tschaharganeh, D.F., Socci, N.D., and Lowe, S.W.（2015). Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. （CRISPR/Cas9による誘導性インビボゲノム編集。）Nat Biotechnol 33, 390-394).PCT出願番号PCT/US2016/051992に記載されている図5-6に示すように、TREプロモーターをTREtight（Clontech Laboratories, Mountain View, CA）またはTRE3G（Clontech Laboratories, Mountain View, CA）プロモーターと交換してもよい。または究極的にはテストされ、特徴付けられた別の誘導性プロモーターと交換してもよい。TREプロモーターは、組織特異的プロモーターまたは偏在的プロモーターもしくは調節要素と交換してもよい。豊富な過剰発現および/または漏れやすさが問題であろうとなかろうと、プロモーター次第では、shCas9は存在してもしなくてもよい。一部の事例では、CREまたはCREERT2は、例えば、CREを含むアデノウイルスまたはレンチウイルスの形態で、異所的に送達されてもよい。正常細胞では、CreERT2は細胞質であり、不活性であるが、タモキシフェンを追加すると、融合タンパク質のリコンビナーゼの活性が活性化する。
[054]   テトラサイクリン（tet）調節システムは、テトラサイクリン反応プロモーター（TRE）のRNAiの発現を制御する（Dickins, R. A., Hemann, M. T., Zilfou, J. T., Simpson, D. R., Ibarra, I., Hannon, G. J., & Lowe, S. W. 安定した調節的合成マイクロRNA前駆体を使用する腫瘍表現型の探索。Nature Genetics. 37（2005）1289-95)。簡潔に言うと、tetベースシステムは、tetトランス活性化因子タンパク質の付加的発現を必要とする（Furth, P. A., St. Onge, L., Boger, H., Gruss, P., Gossen, M., Kistner, A., Bujard, H. & Hennighausen, L. テトラサイクリン反応プロモーターによるトランスジェニックマウスの遺伝子発現の一時的な制御。Proc. Natl. Acad. Sci. 27（1994）9302-9306)。tTA（tet-off）の存在下では、TRE駆動発現は有効であるが、ドキシサイクリン（テトラサイクリン誘導体）が投与されると、活動停止する。rtTA（tet-on）に関しては、逆が真である。その場合、ドキシサイクリンの存在下においてのみ、転写は有効である。マウスでは、tTAまたはrtTAの発現は、組織特異的プロモーターの使用により制限することが可能で、特定の組織のノックダウンを制限することが可能になる。
[055]   適用させうる他の特徴は、組換えシステムである。CRE/loxPシステムとFlp/FRTシステムは両方とも入念に記述され、インビトロとインビボの両方でテストされてきて（Boniface, E.J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., and Chen, W.（2009).FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.（生きたゼブラフィッシュにおけるCreおよびFlpの活性の可視化のためのFlExベーストランスジェニックレポーターライン。） Genesis 47, 484-491; Branda, C.S., and Dymecki, S.M. （2004).革命について話す：マウスの遺伝子分析に関する部位特異的組換えの衝撃。Dev Cell 6, 7-28)、相互に代替することができる。付加的な高効率組換えシステム（KD、R、B2、B3またはDREリコンビナーゼ）は、近い将来発見される可能性があり、CRE/loxPの代わりに使用される可能性がある（Nern, A., Pfeiffer, B.D., Svoboda, K., and Rubin, G.M.（2011).動物ゲノムを操作するのに使用するための複数の新しい部位特異的リコンビナーゼ。Proc Natl Acad Sci U SA 108, 14198-14203)。IRES配列もP2A（Kim, J.H., Lee, S.R., Li, L.H., Park, H.J., Park, J.H., Lee, K.Y., Kim, M.K., Shin, B.A., and Choi, S.Y.（2011). High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.（ヒト細胞株、ゼブラフィッシュおよびマウスにおける、豚のテッショウウイルス1由来の2Aペプチドの高い切断効率。）PLoS One 6, e18556）または任意のリボゾームエントリー配列と交換可能である。記述されているターボGFP（tGFP）は、抗生物質耐性カセット、蛍光レポーターなど、または別のcDNAであってさえも、任意の他のレポーターの代わりに使用してもよい。実際、それは、プロモーターとshRNA間にスペーサー要素を提供し、RNAi効率の上昇を誘導する限りで、ランダムなDNA配列と交換してもよい（Premsrirut et al., 2011)。
[056]   RNAiモデルのCRISPR/Cas9媒介エンジニアリング
[057]   本発明は、CRISPR/Cas9ゲノムエンジニアリング、特定された落とし穴および開発された新しい手法ならびに標準化されたプロトコルを組み込んでおり、ほとんど任意の望むモデルの生成を促進する。本発明は、CRISPR/Cas9-RNAiラットの生成のための変形可能なプラットフォームテクノロジーを開発する。そのテクノロジーにより、CRISPRはヒト腫瘍に発見される複雑な変異パターンを迅速に誘導し、RNAiは同一の動物の新規な標的を評価する。RNAiラットパイプラインは変形し、固有のshRNAだけを内部に持つ小型ドナー鋳型のCas9媒介挿入を使用する（図2A）。そうすることにより、従来型のESCターゲティングプラットフォームを代替し、胚への直接注入を実行し、そのようにして、生産の時間とコストを劇的に減少させる。本発明はRNAiラット生産用のCRISPR/Cas9法を含み、可逆的な遺伝子サイレンシングテクノロジーがラットシステムに適用される。そうすることによって、ラットが望ましい齧歯類モデルのエリア内の調査が一変する。モデル臨床的障害を改善し、より適切なモデル生物内の遺伝刺激および環境刺激を評価する能力は、ヒトの薬剤応答を予測するための動物モデルの信頼性を増加させる。
[058]   1. CRISPR
[059]   モデル生成のCRISPR/Cas9およびRNAiのツールボックスの効果を相乗させること
[060]   本発明は、CRISPR干渉（CRISPRi)32,33、CRISPR活性化因子（CRISPRa)34、およびクロマチン35のモジュレーションを可能にする他のCas9融合など、新しいCRISPR/Cas9ツールを使用してもよい。本発明は、確立され、最適化されたRNAiツールにより、勃興しつつあるCRISPRテクノロジーの効果を相乗させ、各システムの強さを制御し、強さを同時に適用し、遺伝子標的評価のための新しい強力なCRISPR-RNAiマウスモデルを生成する。CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集を使用する100以上の新しいモデルが本発明により生み出された。本発明は、一部の事例で、大規模な挿入（>10kb)、様々な遺伝子座にある複数のレポーターまたはloxP部位の導入、ならびに特異点変異および調節可能なshRNAカセットの直接生成など、洗練された対立遺伝子のエンジニアリングを包含する。本発明は、マウスを超えたモデル生成、および、限定されるものではないが、ラットなど他の種のモデル生成を包含する。本発明は、CRISPR/Cas9遺伝子エンジニアリング、分子生物学、RNAiテクノロジー、胚の操作および動物モデル生成を包含する。ラットモデルのための要件が確立されて、迅速なRNAiラットモデル生成のためのパイプライン。本発明は、shRNAを検証し、系統的に挿入するように設計され、前処理されたラット胚に容易に挿入できるラット遺伝子を標的とする強力なshRNAを選択し、マウスモデルシステムを反映することを包含する（図2A）。本発明は、薬剤発明研究のための新規なラットモデルの生成を加速するだけでなく、より広い病状において遺伝子機能を研究する新しい手段を提供する、新しいパラダイムを定義する。
[061]   ごく最近、clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）関連ヌクレアーゼシステムに基づく微生物と哺乳類のシステムに関して、新しい遺伝子ターゲティングツールが開発された。CRISPR関連ヌクレアーゼは、バクテリアとアーキアの適応免疫の一部である。Cas9エンドヌクレアーゼすなわち連鎖球菌膿形成タイプII CRISPR/Casシステムのコンポーネントは、CRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性crRNA（transcrRNA）を持つ、2つの短いRNA分子を持つコンプレックスを形成する。それらは、ヌクレアーゼをガイドし、特異部位の両鎖にある非自己DNAを切断する。crRNA-transcrRNA heteroduplexは、1つのキメラRNA（いわゆるガイドRNA（gRNA)）と交換できる。これは、次に、標的特異部位へとプログラムされうる。gRNA-Cas9をプログラムする最小限の制約は、処理された5′-RNAと標的DNA間に、不適合塩基対なしに、少なくとも15塩基対があることであり、NGGモチーフ（いわゆるプロトスペーサー隣接モチーフすなわちPAM）が標的DNA配列内の塩基対形成領域のあとに来ることである。一般的に、Cas9ヌクレアーゼが特異部位にあるDSBを産生するように仕向けるために、gRNA領域の5′末端内の15-22 ntを使用する。CRISPR/Casシステムが、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、イーストおよびバクテリアのゲノム編集に関して実証された。
[062]   当該手法には、1つ以上の遺伝子産物および以下に記載する1つ以上のベクターを含む、操作され、自然には生じないベクターシステムをコードするDNA分子を遺伝子編集し、発現させることが含まれる。a）第1調節要素は、1つ以上の遺伝子産物をコードするDNA分子の遺伝子座の標的配列とハイブリダイズする、1つ以上のClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）関連（Cas）システムガイドRNAに操作できるようにリンクしている。b）第2調節要素は、タイプII Cas9タンパク質と操作できるようにリンクしている。当該タンパク質において、コンポーネント（a)と（b)はそのシステムの同じまたは異なるベクター上に位置している。それにより、ガイドRNAは、1つ以上の遺伝子産物をコードするDNA分子の遺伝子座を標的にし、Cas9タンパク質は1つ以上の遺伝子産物をコードするDNA分子の遺伝子座を切断する。このことにより、1つ以上の遺伝子産物の発現が変容し、Cas9タンパク質およびガイドRNAは当然一緒には生じない。
[063]   CRISPR/Cas様列は、CRISPR/CasタイプI、タイプII、またはタイプIIIシステムから引き出すことができる。以下のものはCRISPR/Casタンパク質の実例だが、これらに限定されない。Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e（またはCasD）、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1（またはCasA）、Cse2（またはCasB）、Cse3（またはCasE）、Cse4（またはCasC）、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、およびCu1966。
[064]   特定の実施形態では、融合タンパク質のCRISPR/Cas様タンパク質が、タイプIICRISPR/Casシステムに誘導される。標準的な実施形態で、融合タンパク質のCRISPR/Cas類似タンパク質はCas9タンパク質から誘導される。Cas9タンパク質は以下の生物から得られる。すなわち、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus sp）、ノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトスポランギウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バチルス・シュードマイコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・セレニティレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エキシグオバクテリウム・シビリクム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ミクロシラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホリデリアレス・バクテリウム（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニイ（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス属（Cyanothece sp.）、ミクロシスティス・アエルギノサ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス属（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラビティカム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェツクス・デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルディセルロシルプター・ベシイ（Caldicelulosiruptor becscii）、カンディダトゥス・デスルフォルドゥス（Candidatus Desulforudis）、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトラナエロビウス・サーモフィラス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum the rmopropionicum）、アシディチオバチルス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワトソニ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクテル・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック属（Nostoc sp.）、アースロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アースロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アースロスピラ属（Arthrospira sp.）、リングビア属（Lyngbya sp.）、ミクロコレス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オスキラトリア属（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、またはアカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）である。
[065]   一般的に、CRISPR/Casタンパク質には、少なくとも1つのRNA認識および/またはRNA結合ドメインが含まれる。RNA認識および/またはRNA結合ドメインはガイドRNAと相互作用する。CRISPR/Casには、ヌクレアーゼドメイン（すなわちDNaseまたはRNaseドメイン）、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、RNaseドメイン、タンパク質-タンパク質相互作用ドメイン、二量体ドメイン、および他のドメインが含まれることもある。
[066]   CRISPR/Cas様タンパク質は、野生型CRISPR/Casタンパク質、修飾されたCRISPR/Casタンパク質、または野生型または修飾されたCRISPR/Casタンパク質の断片であることもある。CRISPR/Casタンパク質を修飾することで、核酸結合親和性および/または特異性を増加させ、酵素活性を変容させる、および/またはタンパク質の別の特性を変えることができる。例えば、CRISPR/Casタンパク質のヌクレアーゼ（すなわちDNase、RNase）ドメインは、修飾し、削除し、不活化することができる。あるいは、CRISPR/Casタンパク質を切断して、融合タンパク質の機能にとって不可欠でないドメインを除去することができる。CRISPR/Casタンパク質を切断または修飾することで、融合タンパク質のエフェクタードメインの活性を最適化することができる。
[067]   一部の実施形態では、融合タンパク質のCRISPR/Cas様タンパク質は、野生型Cas9タンパク質またはそれの断片から誘導することができる。他の実施形態では、融合タンパク質のCRISPR/Cas様タンパク質は、修飾されたCas9タンパク質から誘導することができる。例えば、Cas9タンパク質のアミノ酸配列を修飾して、当該タンパク質の1つ以上の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性など）を変容させることができる。あるいは、RNAガイド切断に含まれていないCas9タンパク質のドメインを当該タンパク質から削除して、修飾されたCas9タンパク質が野生型Cas9タンパク質より小さくするようにすることができる。
[068]   一般に、Cas9タンパク質には、少なくとも2つのヌクレアーゼ（すなわちDNase）ドメインが含まれる。例えば、Cas9タンパク質には、RuvC様ヌクレアーゼドメインとHNH様ヌクレアーゼドメインが含まれる。RuvCおよびHNHドメインは一緒に機能して、一本鎖を切断して、DNAの二本鎖切断をする。（Jinek et al., Science, 337: 816-821). 一部の実施形態では、Cas9由来タンパク質を修飾して、1つの機能するヌクレアーゼドメイン（RuvC様またはHNH様ヌクレアーゼドメインのいずれか）だけを含ませることができる。例えば、Cas9由来タンパク質を修飾して、ヌクレアーゼドメインの1つを消去することができ、また、Cas9由来タンパク質を変異させて、それが機能しない（すなわちヌクレアーゼ活性がない）ようにすることができる。ヌクレアーゼドメインの1つが不活性な一部の実施形態では、Cas9由来タンパク質は二本鎖核酸（当該タンパク質の末端はニッカーゼである）に導入することができる二本鎖DNAを切断することはできない。例えば、RuvC様ドメインでのアスパラギン酸塩のアラニン（D10A）への変換は、Cas9由来タンパク質をニッカーゼに変換する。HNHドメインでのヒスチジンのアラニン（H840A）への変換は、Cas9由来タンパク質をニッカーゼに変換する。
[069]   他の実施形態では、RuvC様ヌクレアーゼドメインとHNH類似ヌクレアーゼドメインの両方とも、修飾または削除することができ、Cas9由来タンパク質は二本鎖核酸に切れ目を入れる、または切断することはできない。さらに別の実施形態では、Cas9由来タンパク質のすべてのヌクレアーゼがすべてのヌクレアーゼ活性を欠いている。
[070]   上記の実施形態のいずれにおいても、部位特異的変異誘発、PCR媒介変異原性、および全面的遺伝子合成などの周知の手法、ならびに当業者に知られている他の方法を使用して、1つ以上の欠失変異、挿入変異、および/または置換変異により、すべてのヌクレアーゼドメインは不活化させることができる。1つの標準的な実施形態では、融合タンパク質のCRISPR/Cas様のタンパク質は、すべてのヌクレアーゼドメインが不活化または欠失しているCas9タンパク質から誘導される。
[071]   CRISPR/Casシステムを生成し、使用する組成と手法は、U.S. Pat. No. 8,697,359, 題名“CRISPR-CAS SYSTEMS AND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OF GENE PRODUCTS”（「CRISPR/Casシステムと遺伝子産物の発現を変化させる方法」）に記載されている。
[072]   最近、動物および植物システムの遺伝子標的またはゲノム編集の効率を高める配列特異的ヌクレアーゼが開発された。それらの中で、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）が、2つの最も一般的に使用されている配列特異的キメラタンパク質である。ZFNまたはTALENコンストラクトが細胞に導入され、発現すれば、プログラム可能DNA結合ドメインが特異的に対応する配列に結合し、キメラヌクレアーゼ（例えばFokIヌクレアーゼ）を誘導し、特異的DNA鎖切断を行う。1対のZFNまたはTALENが導入されると、二本鎖切断が発生し、その結果、DNA修復システムが活性化し、非相同末端結合（NHEJ）と相同組換え（HR）の頻度が著しく高まる。
[073]   一般的に、単一のジンクフィンガーモチーフは3 bpを特異的に認識し、タンデム反復を持つ操作されたジンクフィンガーは9-36 bpまで認識できる。ただし、望むZFNをスクリーニングし、特定するのは、きわめて長々しく、時間がかかる。この欠点にも関わらず、特異的ゲノムサイトでの小型の変異、遺伝子欠失、または外来DNA組込み（遺伝子交換/ノックイン）を導入するために、ZFNは植物に使用されてきた。ジンクフィンガータンパク質とは対照的に、TALEは植物病原菌キサントモナスから誘導され、12と13の位置にある反復可変2残基（RVD）がDNA結合特異性を決定する34個のアミノ酸タンデムリピートを含む。その結果、16-24タンデムリピート付きのTALENは、ゲノム配列により特異的に16-24を認識し、キメラヌクレアーゼは特異的ゲノムサイトでDSBを産生する。TALEN媒介ゲノム編集は、イースト、動物および植物など、多くの生物ですでに実証されている。
[074]   操作されたメガヌクレアーゼは、遺伝子編集システムとして使用してもよい。改変されたメガヌクレアーゼは、DNA配列（14〜40塩基対）を認識し、切断する能力で特性づけられる酵素である。最も広まっていてよく知られているメガヌクレアーゼはLAGLIDADGファミリーのタンパク質である。それらは、保存されているアミノ酸配列に基づいてそれぞれの名前を持つ。
[075]   2.組換えシステム
[076]   この例は、ラットゲノムの規定された位置に望む向きで組み込まれた単一のRNAi発現カセットを、安定的に反転させるために、Cre媒介組換えを使用して、遺伝的に規定されたRNAiを生成するためのシステムを記述する。この手法は、他の研究に見られるランダム組込みイベントにより、クローンの変異を最小化し、RNAiコンストラクトの「エピ対立遺伝子の」シリーズの効率的な生成および誘導性RNAiシステムを可能にすることになる。出願者は、マウスの染色体エンジニアリングのために開発されたシステムを、ラットES細胞の単一のショートヘアピンRNA（shRNA）発現カセットの組込みを媒介することに適応させた。出願者は、マウスの染色体エンジニアリングのために開発されたシステムを、ラットES細胞の単一の短ヘアピンRNA（shRNA）発現カセットの組込みを媒介することに適応させた。
[077]   ERT2-CRE-ERT2は存在しても、しなくてもよい。ERT2-CRE-ERT2が存在しない場合、タモキシフェンをCREに代わりに使用してもよい。TREを任意のプロモーターまたは誘導性プロモーターの代わりに使用してもよい。
[078]   loxPとlox2272を、付加的逆方向反復および組換えシステム（すなわちFlp/FRT、PhiC31/attP/B、Dre/Roxシステム）の代わりに使用してもよい。非EFT2システムを使用するとき、代わりにタモキシフェンを使用してもよい。
[079]   3. RNAi
[080]   今日のRNAiは昨日のRNAiではない
[081]   本発明者は、インビボでのRNAiの力を実証し続けて、特異的遺伝子標的の小型分子阻害をモデル化し、遺伝子サイレンシング13、15-18と関連する潜在的な毒性を正確に特定する能力を提示する。数十年のイノベーションと漸進的な改良から、本発明者はこれまでにRNAiをその最高点にまで高め、今や新しいSplashRNAアルゴリズム26、検証方法27、および最適化されたmiREバックボーン28を自由に使用できる。本発明者は、最も強力なshRNA配列を特定し、任意の遺伝子を標的として、それらの遺伝子をRNAi媒介遺伝子サイレンシングのための最も効果的な足場に組み込むことができる。注目すべきことだが、本発明者のmiRE設計の優越性は、Genentechによる最近のテクニカルレポートで確認されている。そのレポートは、複数のRNAiプラットフォーム間の性能の違い、および一般に使用されているRNAi試薬29の、いくつかの主要な設計上の欠点を明らかにした。最近、本発明者は、新しいタンデムshRNAアプローチを開発して、それをmultEmiRと名付けた。当該アプローチは、複数の標的をインビボで同時に強力に阻害することを可能にし、単一の酵素ではなくタンパク質ファミリーを阻害する薬剤を模倣する。この目的のために、MultEmiRマウスは、複数の標的の阻害治療または併用治療の不可欠な発症前評価の手段を提供する。本発明者および他の人々は、薬物療法との組み合わせでRNAiを使用して、併用療法の証拠を提供し、および/または潜在的で総合的な致命的相互作用18を特定するのに成功した。
[082]   ある態様では、本発明は、RNA干渉を使用して、細胞内の1つ以上の標的遺伝子の発現を、安定的に、条件付き（例えば、空間的、時間的および/または可逆的に制御可能な）で、かつ特異的に標的として、低減させるシステムを提供する。最近の研究で、外的に与えられたdsRNAのRNA干渉の効果が、安定した「ヘアピン」構造に折り込まれている単一のRNA分子の発現により、哺乳動物細胞で再現されることが示された。(Paddison, P. J., A. A. Caudy, and G. J. Hannon, Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells（哺乳動物細胞のRNAiによる遺伝子発現の安定した抑制）. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(3): p. 1443-8)小型「ヘアピン」RNA（shRNA）をコードするプラスミドの一過性トランスフェクションにより、細胞内の特異的タンパク質のレベルのほぼ完全な低減が達成することが可能である。今や出願者は、shRNAを（望ましくは部位特異的方法で）哺乳類の細胞に安定的に導入すること、生きている生物に導入すること、ならびにRNA干渉効果の大幅な喪失なしに増殖させることが可能であることを実証した。さらに、安定的に組み込まれたRNAiコンストラクトが、条件付きで発現してもよい（例えば、発現が組織特異的な仕方または可逆的な仕方でOnまたはOffになるのでもよい）。本発見を実証する多様な実験が、以下の実例で具体的に提示されている。
[083]   本発明の多くの実施形態では、RNAに自己ハイブリダイズを生じさせ、ヘアピン構造を形成させる、逆方向反復領域を含む一本鎖RNA分子を使用する。このタイプのshRNA分子は、RNAまたはDNAベクター内でコードされてもよい。用語「コードされた」は、ベクターが、RNAポリメラーゼなど、適切な酵素により作用されて、望むshRNA分子を生じさせることを指すのに使用される（ただし、付加的なプロセシング酵素がコードされたshRNA分子を産生するときに関与していてもよい）。本明細書に記載されているように、1つ以上のコードされたshRNAを含むベクターが、エクスビボで細胞に導入されて、当該細胞が哺乳類に導入されてもよい。shRNAの発現は、望むやり方で恒常的または調節的であるのでもよい。インビボでのRNA干渉を達成するための他のテクノロジーは信頼性が低い。あるコンストラクトは幹細胞では発現したが、分化細胞では発現しなかった。また、その逆もある。本明細書に記載されているテクノロジーにより、細胞型のスペクトラムを横断する、インビボでのshRNAの恒常的または高度に調節的な発現を達成し、それによりインビボの標的遺伝子の厳密に制御された調節を可能にすることが、可能になる。
[084]   単一の自己補足的RNA鎖により、shRNAの二本鎖構造が形成される。RNA二本鎖形成が開始されるのは、細胞内でも細胞外でもよい。阻害は、RNAの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝子阻害を標的としているという点で、配列特異的である。コード配列であれ、非コード配列であれ、標的遺伝子の一部に同一のヌクレオチド配列を含むshRNAコンストラクトが阻害に好ましい。標的配列に関連する挿入、欠失、および単一点変異を持つRNA配列が、阻害に効果的であることも発見された。本発明を実施するのに、RNAと標的遺伝子間の100％配列同一性は必要ないため、本発明は、遺伝子変異、株多型、または進化的分岐による予期される配列の多様性に耐えられるという利点を有する。当業者に知られている配列比較およびアライメントアルゴリズム（Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991,および本明細書に記載の参照文献を参照）により、ならびに、例えば、デフォルトパラメーターを使用するBESTFITソフトウェアプログラム（例えば、University of Wisconsin Genetic Computing Group）に実装されている、スミス−ウォーターマンアルゴリズムによりヌクレオチド配列間のパーセント差を計算することにより、配列相同性を最適化してもよい。阻害的RNAと標的遺伝子間の90%より大きい配列相同性、さらには100％配列相同性が好ましい。あるいは、RNAの二本鎖領域は標的遺伝子転写物の部分とハイブリダイズすることができる（例えば、12-16時間、400 mM NaCl、40 mMパイプpH 6.4、1 mM EDTA、50° C.または70° C. ハイブリダイゼーション；そののち洗浄する）ヌクレオチド配列として機能上、定義されている。ある好ましい実施形態では、shRNAの二本鎖形成部分の長さは、（例えば、ダイサー依存切断により産生されるサイズでRNA産物に対応する、）少なくとも20、21または22ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、shRNAコンストラクトは、少なくとも25、50、100、200、300または400塩基長である。特定の実施形態では、shRNAコンストラクトは400-800塩基長である。shRNAにはループ配列およびループサイズの多様性に対する高い耐性がある。
[085]   細胞の内因性RNAポリメラーゼは、核酸コンストラクトにコードされたshRNAの転写を媒介する。shRNAコンストラクトは、細胞内に発現されるバクテリオファージRNAポリメラーゼ（例えばT3、T7、SP6）により合成されてもよい。好ましい実施形態では、1つのshRNAの発現は、1つのRNAポリメラーゼIIIプロモーターにより調節される。そのようなプロモーターは効率的なサイレンシングを産生するものとして知られている。本質的に任意のPolIIプロモーターを使用してもよいが、望ましい例は、ヒトU6 snRNAプロモーター、マウスU6 snRNAプロモーター、ヒトおよびマウスH1 RNAプロモーター、ならびにヒトtRNA-valプロモーターを含む。U6 snRNAリーダー配列を、一次転写物に付加してもよい。そのようなリーダー配列は、概して高効率のshRNAに影響をほとんどまたはまったく与えないのだが、最善の水準より低いshRNAの効率を高める傾向がある。インビボの導入遺伝子からの転写のために、調節的領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナーおよびアクセプター、ポリアデニル化）は使用して、shRNA鎖の発現を調節してもよい。阻害は、器官、組織または細胞型内の特異的転写；環境条件の刺激（例えば、感染、ストレス、温度、化学誘導物質）；および/または発生段階または年のエンジニアリング転写により制御してもよい。RNA鎖はポリアデニル化されていても、いなくてもよい。RNA鎖は、細胞の翻訳装置によりポリペプチドに翻訳することができても、できなくてもよい。発現コンストラクトの使用と生産は当業者に知られている（WO 97/32016; U.S. Pat. Nos. 5,593,874, 5,698,425, 5,712,135, 5,789,214および5,804,693；そこに引用されて参照文献を参照）。
[086]   望ましい実施形態では、shRNAコンストラクトは、ヒトU6 snRNA プロモーターにより産生された転写物が付属するU6 snRNAリーダー配列のあとに、29 bpの螺旋付きで設計されている。この転写ユニットは、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）ベースレトロウイルス経由で送達され、発現カセットがパッケージングシグナルの下流に挿入される。shRNAコンストラクトの最適化に関するさらなる情報は、例えば以下の参照文献に発見される可能性がある。Paddison, P. J., A. A. Caudy, and G. J. Hannon, Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells（「哺乳類細胞内でのRNAiによる遺伝子発現の安定した抑制」）. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99（3): p. 1443-8; 13.Brummelkamp, T. R., R. Bernards, and R. Agami, A System for Stable Expression of Short Interfering RNAs in Mammalian Cells（「哺乳類細胞における短干渉RNAの安定的発現のためのシステム」）. Science, 2002.  21: p. 21; Kawasaki, H. and K. Taira, Short hairpin type of dsRNAs that are controlled by tRNA（Val）promoter significantly induce RNAi-mediated gene silencing in the cytoplasm of human cells（「tRNA（Val)プロモーターにより制御されるdsRNAsの短ヘアピンタイプが、ヒト細胞の細胞質内でRNAi媒介遺伝子サイレンシングを著しく誘導する」）. Nucleic Acids Res, 2003. 31（2): p. 700-7; Lee, N. S., et al., Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells（ヒト細胞内のHIV-1 rev転写に対する小型干渉RNA標的の発現）. Nat Biotechnol, 2002. 20（5): p. 500-5; Miyagishi, M. and K. Taira, U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells（4つのウリジン3′オーバーハング付属U6プロモーター駆動siRNAは、効果的に哺乳類の標的遺伝子発現を抑制する）.Nat Biotechnol, 2002.20（5): p. 497-500; Paul, C. P., et al., Effective expression of small interfering RNA in human cells（ヒト細胞の小型干渉RNAの効果的発現）.Nat Biotechnol, 2002.20（5): p. 505-8.
[087]   一般的に、1つ以上の標的遺伝子の部分的または全部の相補性（すなわち、1つ以上の標的遺伝子の1つ以上の転写物の相補性）を備えるように設計されている。標的遺伝子は、細胞、内因性遺伝子、導入遺伝子、または病原体に感染したあと、細胞内に存在するそれに由来する遺伝子でもよい。特異な標的遺伝子、shRNAの性質、およびshRNAの発現のレベル次第で（例えば、コピー数、プロモーターの強度次第で）、当該手順は標的遺伝子の機能の部分的または全部の喪失を生じさせることがある。細胞の遺伝子発現の計量に関して、標的mRNAまたは標的タンパク質の翻訳の蓄積レベルが、阻害の類似の量を示すこともある。
[088]   「遺伝子発現の阻害」は、標的遺伝子からのタンパク質および/またはmRNAプロダクトのレベルの不在または観察できる減少を指す。「特異性」は、細胞のその他の遺伝子への明らかな効果なしで、標的遺伝子を阻害する能力を指す。阻害の結果は、（これらの例に関して以下に記載されているような）細胞や生物の外側の特性の検査により、ならびにRNA溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイ付き遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素とリンクした免疫吸着剤アッセイ（ELISA)、ウェスタンブロッティング、放射線免疫アッセイ（RIA)、他の免疫アッセイ、および蛍光発色細胞分析（FACS）などの手法により確証することができる。細胞株または生物全体のRNA介在阻害については、遺伝子発現は、そのタンパク質産物が容易に検査できるレポーター遺伝子または薬剤抵抗遺伝子の使用により従来的な検査される当該レポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（AHAS)、アルカリホスファターゼ（AP)、β-ガラクトシターゼ（LacZ)、β-グルクロニダーゼ（GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT)、緑色蛍光タンパク質（GFP)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)、ルシフェラーゼ（Luc)、ノパリンシンターゼ（NOS)、オクトピンシンターゼ（OCS)、およびそれらの誘導体が含まれる。次のものに耐性を提供する複数の選択マーカーが使用可能である。すなわちアンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンである。
[089]   アッセイ次第では、遺伝子発現の量の計量により、抑制の程度を決定することができる。抑制の程度は、本発明に従って処理されなかった細胞と比較して、10%、33%、50%、90%、95%または99%以上大きい。1つの例として、抑制の効率は、細胞内の遺伝子産物の量を評価することで決定してもよい。抑制性の二本鎖RNAに対して使用される領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブを使用して、mRNAが検出してもよい。または、その領域のポリペプチド配列に対して産生される抗体により、翻訳されたポリペプチドが検出してもよい。
[090]   PCT出願PCT/US2016/051992記載の図1-6に示されているように、目的の遺伝子を標的とするshGOI = shRNAは、miR30などのmiRNAバックボーン内のshRNAであってもよい。
[091]   本明細書に記載されているように、本発明は標的遺伝子またはヌクレオチド配列のいかなるタイプにも制限されない。可能な標的遺伝子の以下のクラスを説明のためにのみ列挙する。発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Writファミリーメンバー、Paxファミリーメンバー、翼状螺旋ファミリーメンバー、Hoxファミリーメンバー、サイトカイン/リンホカインおよびそれらのレセプター、生長/分化因子およびそれらのレセプター、神経伝達物質およびそれらのレセプター）；癌遺伝子（例えば、ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIM 1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3、およびYES)；癌抑制遺伝子（例えば、APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、p53、BIM、PUMAおよびWTI）；ならびに酵素（例えば、ACCシンターゼおよびオキシダーゼ、ACP不飽和化酵素およびヒドロキシラーゼ、ADPグルコースピロホスホリラーゼ、ATPアーゼ、アルコール脱水素酵素、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコン合成酵素、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、脱炭酸酵素、デキストリナーゼ、DNAおよびRNAポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコース酸化酵素、顆粒結合デンプン合成酵素、GTP加水分解酵素、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、異性化酵素、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスフォターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物生長レギュレーターシンターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロティナーゼおよびペプチダーゼ、プラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ルビスコ、トポイソメラーゼ、およびキシラナーゼ）。
[092]   インビボのshRNAコンストラクトの発現を制御するために使用することができるプロモーター/エンハンサーは、限定されるものではないが、以下が挙げられる。PolIIIヒトまたはマウスU6およびH1システム、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター/エンハンサー、ヒトβアクチンプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス末端反復配列（MMTV LTR）内のあるグルココルチコイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（MuLV LTR）の末端反復配列、SV40初期または後期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の3′末端反復配列内のプロモーター、単純ヘルペスウイルスLATプロモーター。例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘、アデノウイルス（例えばアデノウイルス2）、ウシ乳頭腫、トリ肉腫、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよび猿ウイルス40（SV40）など、ウイルスのゲノムから得られたプロモーター、免疫グロブリンプロモーターなどの非相同哺乳類プロモーター、および熱ショックプロモーターにより、そのようなプロモーターが宿主細胞システムと適合している場合に限り、哺乳類宿主細胞のベクターからの転写物が制御される。Tetプロモーターなどの誘導系が使用されてもよい。さらに、望む回数のshRNAコンストラクトの切除を可能にするように、Cre/loxなど、リコンビナーゼシステムを使用してもよい。Creは、（転写後または転写前に）タモキシフェンなどの外部シグナルに反応する。
[093]   特定の実施形態では、shRNAコンストラクトを細胞に導入するためのベクターシステムは、レンチウイルスベクターシステムなど、レトロウイルスベクターシステムである。レンチウイルスシステムは、shRNAコンストラクトの送達および発現を、インビトロおよびインビボの分裂細胞集団および非分裂細胞集団に対して可能にする。レンチウイルスベクターの例は、HIV、FIVおよびEIAVに基づくベクターである。例えば、Lois, C., et al., Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors（生殖系列伝達およびレンチウイルスベクターにより送達された導入遺伝子の組織特異的発現）参照。 Science, 2002. 295（5556): p. 868-72.大部分のウイルスシステムはパッケージングに必要なシス要素を含むが、その一方、トランス活性化因子は、ベクターによりパッケージング細胞株に同時導入される分離プラスミドにより供給される。特定の実施形態では、高度に遺伝子導入可能な293細胞株を、パッケージングベクターとして使用することができる。また、ウイルスは、安定性を向上させ、感染症の広い宿主範囲を得るために、VSV-Gエンベロープ糖タンパク質が付いている偽型であってもよい。ある態様では、本発明はshRNA発現カセットとの併用に適合した新しいベクターを提供する。単純な組換えによる、異なるベクターバックボーンへのshRNAコンストラクトの移動およびバックボーンからの移動を促進するために、出入口レシピエント配列をパッケージングシグナルの下流に挿入してもよい。別の例として、組換えシグナルは挿入されて、例えばゲノム全体のshRNAライブラリーから、shRNAのインビボ転移を促進する。
[094]   使用するベクターとプロモーターのタイプは、部分的には、影響を受ける生物と細胞型に基づいて、選択する必要がある。ヒト患者のための生体外幹細胞治療の場合には、ヒト細胞におけるトランスフェクションおよび発現が可能であるベクターおよびプロモーターを選択する必要がある。
[095]   特定の実施形態では、レトロウイルスプラスミドベクターがそこから誘導されるレトロウイルスは、限定されるものではないが、以下のものが含まれる。すなわち、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスである。レトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を導入し、産生株細胞株を形成してもよい。遺伝子導入されるパッケージング細胞の例は、限定されるものではないが、以下のものを含む。Miller, Human Gene Therapy 1:5-14（1990)に記載されている、PE501、PA317、R-2、R-AM、PA12、T19-14.times.、VT-19-17-H2、RCRE、RCRIP、GP+E-86、GP+envAml2、およびDAN細胞株。上記論文の全体が参照用に本明細書に含まれている。ベクターは、当業者に知られている任意の手段により、パッケージング細胞を導入することができる。産生細胞株は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む感染性のレトロウイルスベクター粒子を産生する。その後、そのようなレトロウイルスベクターは使用して、インビトロとインビボのいずれかの真核生物細胞に形質を導入してもよい。形質導入された真核生物細胞は、本発明のポリペプチドを発現させる。
[096]   特定の実施形態では、腺関連ウイルス（AAV)を使用して、細胞は操作される。AAVはヘルパーウイルスに感染粒子を産生させる、自然に発生する欠陥ウイルスである（Muzyczka, N., Curr. Topics in Microbiol. Immunol. 158:97（1992))。それは、自己のDNAを非分割細胞に組み込む少数のウイルスの1つである。AAVのわずか300塩基対しかない含むベクターをパッケージすることができ、組み込むことができるが、外因的なDNAのスペースは約4.5 kbに制限されている当該AAVを産生し、使用する方法は当業者に知られている。例えば、U.S. Pat. Nos. 5,139,941, 5,173,414, 5,354,678, 5,436,146, 5,474,935, 5,478,745および5,589,377を参照。例えば、AAVベクターは、DNA複製、キャプシド形成、および宿主細胞組込みのために必要なすべての配列を含んでいてもよい。リボフェクション、電気穿孔、カルシウムリン酸塩沈殿など、任意の標準手法を使用して、リコンビナントAAVベクターを、ヘルパーウイルスにより遺伝子導入されたパッケージング細胞に遺伝子導入してもよい。適合するヘルパーウイルスには、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが含まれる。パッケージング細胞は、遺伝子導入されると、ポリヌクレオチドコンストラクトを含む感染性のAAVウイルス粒子を産生する。次に、これらのウイルス粒子を、真核生物細胞を遺伝子導入するのに使用する。
[097]   基本的に、核酸コンストラクトを細胞に導入するために、任意の方法を使用することができる。核酸を導入する物理的方法は、コンストラクトを含む溶液の注入、コンストラクトにより覆われた粒子の照射、細胞、組織サンプルまたは生物の核酸溶液への浸潤、またはコンストラクトの存在の下での細胞膜の電気穿孔を含む。ウイルス粒子に詰め込まれたウイルスコンストラクトを使用して、発現コンストラクトの細胞への効率的な導入と、コードされたshRNAの転写の両方を達成してもよい。例えば、脂質媒介担体輸送、（カルシウムリン酸塩など）化学媒介輸送など、核酸を細胞に導入する、当業者に知られている他の方法を使用してもよい。かくして、shRNAコードする核酸コンストラクトは、1つ以上の次の行為を実行するコンポーネントとともに導入してもよい。すなわち、細胞によるRNAの取り込みを向上させること、二本鎖のアニーリングを促進すること、アニーリングされた鎖を安定させること、またはその他の方法で標的遺伝子の抑制を高めることである。
[098]   shRNAおよび遺伝子導入マウスのためのさらなる方法は、US Publication No. 2009/0217404に記載されている。
[099]   アプローチ
[0100] 本発明者は、RNAiによる遺伝子抑制はマウス8における遺伝子機能の喪失を模倣することを示し、ドキシサイクリン（dox）応答、GFP融合のshRNAを胚性幹細胞（ESC）の定義された遺伝子座9-11に導入するための迅速で効率的なアプローチを開発した。このシステムを使用して、本発明者は200以上のマウス株を生成し、遺伝子機能を探査し、インビボでの組織的遺伝子サイレンシングの治療的な可能性をテストした（図1A-1C）。例えば、本発明者は、Trp53、INK4a/ARF、APCおよびPTENなど、複数の腫瘍抑制遺伝子を標的にするトランスジェニックshRNAは、対応するノックアウト動物の表現型を再現するばかりでなく、病状悪化10-12に関する遺伝子修復の結果を評価する手段を提供することを示した。本発明者は、マウスのMyc13、Cdk914、Rpa315、Brd416、Ptgs217、eIF4F18、Nuak1（印刷中）およびその他のRNAi媒介サイレンシングは、新規の治療的標的候補の評価を可能にしたことを実証した。
[0101] 本発明は、トランスジェニックRNAiラットモデルの効率的生産のプラットフォームを含んでおり、また、可逆的遺伝子サイレンシング能力を示した（図3）。第1の実施形態では、本発明はCRISPR/Cas9を使用して、ラットのシステムのキーコンポーネントを確立する（図2B）。本発明は、RNAiテクノロジーをラットモデルに転移させる、将来の高効率編集の基礎として役立つ新しいラット株を包含する。第2の実施形態では、本発明はさらに、小型誘導性shRNAを前処理されている胚に組み込み、効率とスケーラビリティのための最良の実施法を決定することを包含する。第3の実施形態では、本発明は、shRNA標的Brd4を内部に持つラットとともにRNAiプラットフォームを使用することを包含し、ラットのRNAi媒介遺伝子サイレンシングを使用する薬剤介入を模倣する。Brd4の検証研究は、本発明者の結果を本発明者のBrd4 RNAiマウスと比較し、潜在的な生物多様性を特定し、BETインヒビター36-38を使用して、すでに開始されている早期の臨床試験研究を知らせることにもなる、価値のあるデータを生み出すために実行される。本発明は、ラットのRNAi媒介遺伝子抑制を提供し、また、将来RNAirttoと他の種の大規模生産のためのプラットフォームを開発する。
[0102] CRISPR/Cas9を使用するファウンダーノックインラットの確立
[0103] 第１の実施形態では、本発明は、以下のものを内部に持つ、少なくとも3つのラット株など、CRISPR/Cas9ゲノム編集の使用を包含する。（1）のちのラット世代でのshRNAの迅速で効率的な挿入のためのTREプロモーター、GFPレポーターおよび一意的標的部位（TRE-GFP-UTSまたはUTS）を含む2.5kb「ホーミングカセット」（図2A）、（2）ラットBrd4遺伝子（TRE-GFP-shBrd4）を標的とするtet誘導性GFPと結合したshRNA、ならびに（3）dox誘導発現のためのCAG-rtTA3 tetトランス活性化因子カセット（図2B）。従来の相同的組換えより効率的な相同性指向修復（HDR）39-41を使用して、正確なゲノム位置にノックインするCRISPRシステムノックイン外来DNA要素。ただし、挿入のサイズが増大するにつれて、HDRの効率は低下する。マウスでは、挿入が<1.5kbの場合は、成功率~30-50%を達成した。ただし、>2kbの鋳型を使用する場合は、この成功率は著しく<10%に低下する。このため、本発明者は、直接注入法を使用して、最大10kbの挿入により、マウスを生成するのに成功したものの、日常的にTRE- GFP-shRNAカセットの全体を注入して、各新しいRNAiラットモデルを生成するのは、商業的には実行不可能である。高効率を容易にするに、本発明は、各RNAiモデル（すなわちTRE-GFP-miRE）で使用される共通要素を含む2.5kbの挿入物、プラス特異的shRNAの次の導入のための共通の「ランディングパッド」として役立つ一意的gRNA標的配列（UTS）を挿入することを含む（図2A）。本発明は、染色体10上のCol1a1遺伝子の下流の領域を挿入のために使用することを包含する。と言うのも、この領域は、マウスの広範な導入遺伝子発現のための安全な避難所であることが示されているからである。並行して、本発明は、検証のために即座に使用できるラットを得るための、TRE-GFP-shBrd4カセット全体を含むモデルを生成し、同時に高効率標的プラットフォームを確立することをすることを包含する。最後に、本発明は、Rosa26位置への挿入により、CAG-rtTA3ラット株を生成することが包含する。本発明は、CRISPR試薬（Cas9 protein + gRNA + ドナー鋳型）のスプラーグドーリー（SD）胚への直接注入により、各ラット株を生成することを包含する。各株からの少なくとも2つのファウンダーに関して、SD対照動物とともに、全ゲノム配列決定を行い、オフターゲット効果を特定する1つの実施形態では、SD株が選択されるが、他の株を選択してもよい。他の実施形態では、近交系を操作してもよい。他の株は、限定されるものではないが、以下のものを含む。Brown Norwayラット、Buffaloラット、Copenhagenラット、Dahl/Salt sensitiveラット、F344ラット、FHHラット、Fischerラット、Goto-Kakizakiラット、Lewisラット、Lister Hoodedラット、Long-Evansラット、Obese Prone CDラット、Obese Resistant CDラット、OFAラット、SHRラット、SHHFラット、Wistar Rats, ZDFラット、Zuckerラット。
[0104] 1つの実施形態では、UTS配列は表1記載の下記のものから選択してもよい。
[0105] 表1：ラットCTE UTS 
【表１−１】
2021503968.tif 000003
【表１−２】
2021503968.tif 000004
【表１−３】
2021503968.tif 000005
【表１−４】
2021503968.tif 000006
【表１−５】
2021503968.tif 000007
【表１−６】
2021503968.tif 000008
[0106] 第1の実施形態は、第2の実施形態のための高効率プラットフォームを提供し、第3の実施形態での本発明者のRNAiプラットフォームの検証を提供する。本発明は、図2Bに概略が描かれている対立遺伝子を内部に持つ3つの独立ラット株の世代を包含する。  本発明は、潜在的なオフターゲット効果を特定し、望ましくない変異誘発を持つファウンダーを除去するために、各株から2-3ファウンダーの全ゲノム配列を包含する。
[0107]  Dr. Thom Saunders（ミシガン大学）は、Gopalakrishnan K、Kumarasamy S、Abdul-Majeed S、Kalinoski AL、Morgan EE、Gohara AF、Nauli SM、Filipiak WE、Saunders TL、Joe B.において開示されたように、CRISPR/Cas9を使用して、>400ノックインラットの生成に成功した。高血圧のラット遺伝子モデルのAdamts16遺伝子の標的破壊。Proc Natl Acad Sci U S A, 2012 Dec 11; 109（50):20555-20559.（PMID 23185005） PMC 3528556. 
[0108] 5' ColA1用遺伝子型判定PCRが、配列ID番号：11として以下に示されている。
[0109] caataccagacgcacagcat[YY1] cacgggcaaactcgcacgcacttcaaatcccggaccacccatacctcaggccagaatcctaatggtgtatcactcttccatgatgtagacctgaggcc
[0110] Tggcgaggtgttgcctatgggtcctgagaggctcagggactctcaaaaggatccagagggagggaacagggactgagtcatggaggaccaggtttctccctggtcaagcatggaggggtagtt
[0111] Ggcttctccccatctcttgcccaaagaaacaagtgatttgatatagaaggggccttttgaggctggagtgccaccgattgcatatctgggggatcgattctagattcgagtttaccactccctatca
[0112] Gtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatc
[0113] Agtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctat
[0114] Cagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgaggtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacg
[0115] ctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccgtcgagcttgcgttggatccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacg[YY3] 
[0116]  そこにおいて[YY1]はCol F1であり、[YY3]はEGFP NRである。PCR産物サイズ：WTを含む。：  PCR産物とCol1A1カセットKIは866 bpである。
[0117] 3' ColA1用遺伝子型判定PCRは、以下に配列ID番号：12として示されている。
[0118] ggggcaaagttttcagggtg[YY1] ttgtttagaatgggaagatgtcccttgtatcaccatggaccctcatgataattttgtttctttcactttctactctgttgacaaccattgtctcctcttattttctttt
[0119] Cattttctgtaactttttcgttaaactttagcttgcatttgtaacgaatttttaaattcacttttgtttatttgtcagattgtaagtactttctctaatcacttttttttcaaggcaatcagggtatattatattgt
[0120] Acttcagcacagttttagagaacaattgttataattaaatgataaggtagaatatttctgcatataaattctggctggcgtggaaatattcttattggtagaaacaactacaccctggtcatcatcctg
[0121] Cctttctctttatggttacaatgatatacactgtttgagatgaggataaaatactctgagtccaaaccgggcccctctgctaaccatgttcatgccttcttctctttcctacagctcctgggcaacgtgct
[0122] Ggttgttgtgctgtctcatcattttggcaaaggattcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatcgttttccctctgcc
[0123] Aaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaatttctcgatcgctagtacgaccgtaagaatgttctgaggtc
[0124] actcttgctctcaccagagggaggtgcccagctcccaaagggatctcctgggggctcttagagagctgtggtgaaggaacttccagtgtgtcaccagaaaggacaggaccccac[YY2] 
[0125]  そこにおいて、[YY1]はRGB F1であり、[YY2]はCol R1である。  PCR産物サイズはWTを含む。  PCR産物とCol1A1カセットKI：  900 bp。
[0126] Col1A1カセットポジティブ動物ID：274、278、283、284、285、291および294。遺伝子型判定PCR産物配列概要は表2に示されている。
[0127] 表2：遺伝子型判定PCR産物配列概要
【表２】
2021503968.tif 000009
[0128] 注：ミスマッチの大部分は、スペース領域または非必須領域に位置する。  
[0129] 図5A-5Bは、5' ColA1 #261-284のPCRの結果を示している。図5C-5Dは、5' ColA1 #285-300のPCRの結果を示している。 
[0130] 図7A-7Bは、5' ColA1 #701-724のPCRの結果を示している。は、3' ColA1 #261-284のPCRの結果を示している。図6C-6Dは、3' ColA1 #258-300のPCRの結果を示している。 
[0131] 図7A-7Bは、5' ColA1 #701-724のPCRの結果を示している。図7C-7Dは、5' ColA1 #725-748のPCRの結果を示している。図7E-7Gは、5' ColA1 #749-773のPCRの結果を示している。 
[0132] 図8A-8Fは、3' ColA1  #701-773のPCRの結果を示している。
[0133] オフターゲット切断は、改変ヌクレアーゼ42に関する一般的に懸念である。ただし、いくつかの研究は、部分的には、Cas9とgRNAが胚内においては短命なRNAでしかないがゆえに、CRISPR/Casシステムのオフターゲット効果は、培養細胞におけるよりずっと低いことを示唆している43,44。高いオフターゲットインビボ変異誘発42の最近のレポートにも関わらず、多くはそのような主張を反駁し、この論文においては、主要な容疑者としてCRISPR試薬の高い濃度を批判し、データの解釈に関するさらなる編集レビューを強いる。それにも関わらず、オフターゲット切断を有するファウンダーの繁殖を最小化するために、本発明は、Cas9の潜在的なオフターゲット切断を特定するために、各株から少なくとも2匹のファウンダーラットの全ゲノム配列決定を包含する。本発明は、オフターゲットイベントなしのラットのみを繁殖させることを包含する。ただし、すべてのファウンダー動物で変異が生じた場合、本発明者は変異対立遺伝子を、本発明者の株から分離し、除去するために繁殖させる。
[0134] UTS標的プラットフォームの効率の評価
[0135] 第2の実施形態において、本発明は、shRNA配列を迅速に修飾し、UTS「ホーミングカセット」プラットフォームに挿入することを包含する。上記目的を達するために、本発明は、UTSおよびCAG-rtTA3ラットを繁殖させて、妊娠しているドナーメスから一細胞胚を取得することを包含する。本発明は、複数の実験条件の下で、Cas9/gRNAs + shRNA ssODNドナーカセットの細胞質および前核の注入を実行し、それにより、発明者の設定のためのCRISPR/Cas9媒介HDRの効率を最大化するために、最適なパラメーターを確立することを包含する（図4）。1つの実施形態において、実験条件は、限定されるものではないが、以下のものを含む。Cas9 mRNA：~100ng/ul；gRNA ~50ng/ul（2以上の場合はそれぞれ）；ssODNまたはドナーDNA（~50ng/ul)。  多様な濃度が変更する条件である。  Cas9が高い濃度であり、ドナーDNAがHDR効率を高めうるとしても、注入混合物の粘性が高くなって、より大型のマイクロインジェクションチップを必要とするようになることもある。これにより、最終的には、胚の破壊、または生存可能性の低下、および/または胚盤胞を受容するメスへ移植が不可能になることもある。さらに、合成ガイド（市販品）により事前に複雑になっているCas9タンパク質の使用は、インビトロ転写で産生されるCas9 mRNAより効率が高くなり、実験室で両方法を使用すると、同様の効率が得られることが報告されている。本発明は、様々な条件と試薬を使用し、将来の系統的な生成のための最適な方法を定義する。本発明は、注入に続いて、胚盤胞ステージまでの胚の培養、T7エンドヌクレアーゼサーベイヤーアッセイによるスクリーニングのための胚の採取、ならびにドキシサイクリン処理後のDNA配列決定およびGFP/shRNA誘導を包含する。各条件のための効率を注意深く記録して、「最良の実施法」を特定し、発明者の方法を拡大する費用対効果のすぐれた方法のためのプロトコルを確立する。発明者の比類のないshRNA ssODNのサイズが一定である限り、本発明は将来のすべての生産に使用される濃度とCas9試薬を標準化する。最後に、最も効果的なマイクロインジェクションの条件を選択することで、本発明は、生成タイムラインを最適化し、RNAiラット生成のための迅速なプラットフォームを確立し、RNAラットを迅速に生産するアプローチの商業化を証明する。
[0136] 第2の実施形態は以下のものを包含する。1）小型一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）の形態のshRNAの挿入により、RNAiラット胚を生成すること。2）CRISPR/Cas9媒介HDRのための最も効率的な方法と濃度を決定すること。3）スケーラビリティと迅速な生産のための最良の実施法を確立すること。
[0137] 第2の実施形態は、本発明者の「ホーミングカセット」内にあるssODNのUTSへの挿入の実現可能性および効率を評価する。これらの胚を使用する完全なRNAiラットは生成されていないが、胚の遺伝子編集の効率は、将来のRNAiラットの生産の成功率を正確に反映する。培養された胚の遺伝子編集のプラクティスは、CRISPR/Cas9によるマウスの生成時の本発明者の標準手順である。これにより、複数の条件のテストが可能になり、動物全体を生成する時間と費用を投資する前に、ストラテジーを最適化できるようになり、その結果、生きている動物の生成とスクリーニングおよび動物の排泄物を減少させることができる。ラットのCRISPR編集を利用し、数多くの条件をテストし、小型のドナー鋳型のみを使用することで、本発明は成功するターゲティング標的のための最適化プロトコルを確立する。
[0138] 誘導可能なshBrd4ラットを使用するRNAiプラットフォーム検証
[0139] 第3の実施形態は、ラットモデルの強力で可逆的な遺伝子発現を誘導するRNAiシステムを包含する。これを実現するために、本発明は、誘導性のshBrd4株およびCAG-rtTA3株を交雑させて、バイトランスジェニックラットを生成する。これらのラットは、8〜14日間ドキシサイクリンで処理し、次に、ドキシサイクリン処理から取り出し、先行研究16,23,24と同様に、表現型的および組織学的に分析し、消化器系幹細胞コンポーネント、重量減少/増加、上皮および心筋を検査する。本発明は、選択組織のウェスタンブロット分析を行って、ノックダウンレベルを計量することを包含する。さらに、本発明は以下のことを評価する。（1）全組織イメージングおよび高い倍率での組織切断面の蛍光顕微鏡検査によるGFP誘導；（2）免疫蛍光法によるBrd4のノックダウンおよびGFP発現との比較（逆相関になる）；および（3）腸管、皮膚、膵臓、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、筋肉および骨髄など、主要臓器システムの組織学を使用して、ラットとマウスの比較表現型分析。第3の実施形態は、RNAiラットモデルの概念実証、および迅速な生産と商業化のためのプラットフォームの開発続行の正当化を提供する。
[0140] 第3の実施形態は次のものを包含する。1）全組織の全GFP発現を評価すること；2）ラットの強力なBrd4ノックダウンを実証すること；3）shBrd4ラットの毒性を評価し、他の先行研究と比較すること。
[0141] 組込みのためのCol1a1およびRosa26の位置を利用することで、マウスとラットの染色体相同性のゆえに、マウスで機能する安全な避難位置は、ラットゲノムの安全な避難位置に翻訳される。実際、マウスで広く使用されている2つの位置、Rosa26およびHprtは、トランスジェニックラットを生成し、マウスにおけるのと類似の発現パターンを示すのに使用されてきた45,46。第3の実施形態は、最終的に、shRNAとCAG-rtTA3の両方の、それぞれの位置への組込みを実証し、ラット全体での強力で遍在する発現を可能にする。CAG-rtTA3株の生成に何らかの困難がある場合、第3の実施形態では、テストのためにRosa26-rtTA2株46を使用してもよい。
[0142] 将来の方向
[0143] 本発明は、内在性遺伝子の時間的かつ可逆的な抑制のための比類のない能力を持つ、誘導性RNAiラットモデルの系統的な生成のための迅速で柔軟かつ拡張可能なプラットフォームを生成する。RNAiマウスを生成するのに使用する高処理量システムは、ラットシステムにも適用でき、拡張すれば、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒト以外の霊長類、ブタなど、他の哺乳類モデルにも適用できる。本発明は、従来の遺伝子欠失アプローチより迅速で費用対効果のよい代替アプローチを提供し、動物モデルの特異的遺伝子の機能の理解を追い求める研究者を支援する。誘導性RNAiラットモデルは、ヒトの疾患をモデル化し、想定される薬剤の挙動を模倣し、費用のかかる薬剤開発に先立って、インビボでの治療ターゲティングストラテジーの可能性を評価するのに使用することができる、疑いもなく強力なツールである。本発明は、臨床治療を導くために、STAG147、CMTM648およびFZD549など、新規標的の系統的な抑制と関連する潜在的な毒性を検査してもよい。現代医学において、薬物誘導毒性からの多くの障害は、潜在的な害を予測できるならば、回避できる（例えば、CAR-T治療によって生じるサイトカイン放出症候群は、トシリズマブ、IL6R抗体50の1つによる同時処置によって、いまや効果的に管理できる）。誘導性RNAiラットを生成する速度と費用の改善、および当該ラットが提供する見通しは、民間研究所にも学術研究所からの要求を大いに高める。
[0144] 説明的使用
[0145] A. 遺伝子操作と処理の方法
[0146] ある態様では、本発明は、特異的遺伝子損傷を生成し、CRISPR/Cas9媒介遺伝子エンジニアリングにより疾患を緩和することもある細胞の遺伝子発現およびshRNA発現をそれぞれ減衰させる方法を提供する。本明細書で開示されている方法に従えば、gRNA、Cas9およびshRNAは多様な細胞型においてインビボで発現する信頼性が高い。特定の実施形態では、ある状態を取り扱うために、細胞を管理する。細胞のshRNA発現と関係する遺伝子操作は、ある条件を取り扱うのに有用な多様な機構がある。例えば、ある条件は、部分的には、望ましくない遺伝子の組み合わせを発現する細胞の集団により生じる。細胞の一部は遺伝子的に変容したに違いなく、別の一部は治療的利益を得るために抑圧されることもある。これらの細胞を除去し、正しい遺伝子およびshRNAを含む、管理されている細胞と交換してもよい。正しい遺伝子およびshRNAは、それぞれ、特異的遺伝子を「修理」し、および/または望ましい遺伝子の疾患の発現を低減させる。あるいは、疾患の細胞が、管理された細胞により駆逐されることもある。別の例では、ある条件が分泌因子の欠失により生じることもある。そのような障害の改善は、（例えば、インヒビターの抑制発現により、）分泌因子の産生を間接的に刺激するshRNAを発現する細胞を管理することにより達成できる。
[0147] CRISPR/Cas9は、ほとんどあらゆる遺伝子の遺伝子構造を変えるために、使用してもよい。一部の例では、このコンビネーションは、ある条件を取り扱うのに助けになることもある、遺伝子発現プロファイルを達成するのに必要である。例えば、癌治療法の場合には、単独療法は大抵効果がなく、併用療法が最良の予後を提供する効果的な治療の主軸である。標的遺伝子は主題となる疾患のプロセスに関わることもある。標的遺伝子は、細胞に感染するとき、ウイルスが結合する細胞表面受容体など、ウイルスに利用される宿主タンパク質をコードする。HIVは、CD4およびCXCR5など、複数の細胞表面受容体に結合する。特異的遺伝子操作、およびHIVレセプターまたはコレセプターに向いているshRNAを保有するHSCまたは他のT細胞前駆体の導入は、耐性T細胞のプールを生成し、それによりHIV感染の重篤さを回復させることが予期される。類似した原理は他のウイルス感染に適用される。
[0148] 免疫拒絶は、外来の主要組織適合抗原の認識により媒介される。非相同細胞を被験体に投与する場合、宿主免疫系により認識される傾向がある任意のMHCコンポーネントを標的とするshRNAにより当該細胞を遺伝的に変更し、当該shRNAを導入してもよい。
[0149] 多くの実施形態において、shRNAが導入された細胞では、被験体内の疾患細胞の集団を交換することで、部分的にまたは全面的に、利益が得られる。遺伝子導入細胞は、被験体の細胞に由来するが、利益のある効果を与えるshRNAを保有する自家細胞であってもよい。
[0150] B. 動物の疾患誘導性と処理
[0151] 本発明の有用性の1つは、疾患プロセスを開始する可能性を備えていて、同時に、疾患自体を治療するために使用できる1つのshRNAまたは複数のshRNAを担ってもいる動物モデルを生成することである。胚幹細胞（ESC）の図1-?で記述されているコンストラクトを組み込むことにより、ESC由来動物を胚盤胞注入により生成できる。任意の時点で、CRISPR/Cas9媒介変異誘発は、動物をドキシサイクリンで処理することによって誘導される。妊娠中の母親をドキシサイクリンで治療することによっても、変異誘発が胚で引き起こされる場合があります。これらの誘発された変異は、疾患を感作し、疾患の病因につながる一連の事象を引き起こす。疾患発症中のさまざまな時点で、CRE/タモキシフェンによる治療により、挿入されたカセットの逆位が誘発される。その後、この逆位事象に続いて、ドキシサイクリンによる処理は、shRNA発現を誘発させることができ、これにより、疾患を治療する、または疾患プロセスを減衰させるための治療の可能性を有する特異的遺伝子をサイレンシングすることができる。
[0152] このシステムは、マウスを他の疾患対立遺伝子保有株に渡さなくても、特定の時点で複数の遺伝子操作を誘発する独特の能力を提供する。遺伝子機能を抑制するshRNAもまた、疾患進行の発症後に使用して、標的遺伝子が治療の潜在力を有するか、または疾患を促進する可能性があるかを決定することができることが特徴的である。
[0153] C. スクリーニングアッセイ
[0154] 本発明の一つの有用性は、CRISPR/casa9を介して特異的表現型を誘導し、生物、特に高等真核生物の特定の表現型文脈における遺伝子機能を同定する方法であり、これは、以前に知られていない機能の標的遺伝子の活性を阻害するための二本鎖RNAの使用を含むことである。伝統的な遺伝子スクリーニングによる変異体の時間がかかる面倒な単離の代わりに、機能的ゲノムは、本発明を使用して、特徴付けられていない遺伝子の機能を決定して、標的遺伝子活性の量を減少させ、および/またはそのタイミングを変更することを想定するであろう。本発明は、医薬品の潜在的な標的を決定し、開発に関連する正常および病理学的な事象を理解し、出生後の発育/老化に関与するシグナル伝達経路などを決定するのに使用することができる。哺乳動物ゲノムの全配列を含む、ゲノムおよび発現した遺伝子源からヌクレオチド配列情報を取得する速度の増加を、細胞または生物全体の遺伝子機能を決定する本発明と組み合わせることができる。特定のコドンを使用する異なる生物の好み、関連する遺伝子産物のための配列データベースの探索、遺伝子形質の結合マップを、ヌクレオチド配列が由来する物理的マップと相関させること、ならびに人工知能法を使用して、このような配列決定プロジェクトで得られたヌクレオチド配列から推定的なオープンリーディングフレームを定義することができる。
[0155] 発現した配列タグ（EST）から利用可能な部分配列に従って遺伝子発現を阻害する簡便なアッセイ。成長、発達、代謝、疾患耐性、または他の生物学的プロセスにおける機能的な変化は、EST遺伝子産物の正常な役割を示すであろう。
[0156] 表現型が容易に生成され得、次いで、dsRNAコンストラクトが、標的遺伝子を含む同じインタクトな細胞/生物において容易に活性化され得ることは、本発明を高スループットスクリーニング（HTS）で使用することを可能にする。例えば、二重鎖RNAは、標的細胞または生物に由来する任意の遺伝子ライブラリーの挿入物に隣接するプライマーを用いた増幅反応によって生成することができる。挿入物は、ゲノムDNAまたはmRNA（例えば、cDNAおよびcRNA）から誘導することができる。ライブラリーからの個々のクローンを複製し、次いで別々の反応で単離することができるが、好ましくは、ライブラリーは、本発明を実施するのに必要な工程数を最小化し、プロセスの自動化を可能にするために、個別の反応容器（例えば96ウェルマイクロタイタープレート）内に維持する。
[0157] 例示的な実施形態において、本発明は、RNAiコンストラクトの配列されたライブラリーを提供する。アレイは、マルチウェルプレートなどの溶液の形態であってもよく、または細胞を成長させることができる固体基板上に「印刷」してもよい。例示するために、多様な発現した遺伝子を阻害することができる二重鎖RNAを含む溶液を、マイクロタイタープレート上に配置された個々のウェルに整列した配列として配置することができる。また、各ウェル内の無傷の細胞/生物は、標的遺伝子活性の阻害による挙動または発達の任意の変化または修飾についてアッセイすることができる。
[0158] ある態様において、本発明は、インビボで遺伝子機能を評価するための方法を提供する。標的遺伝子の発現を減少させるように設計されたshRNA発現コンストラクトを含む細胞を動物に導入し、表現型を評価して、減少した遺伝子発現の効果を決定することができる。標的遺伝子の発現を減少させるように設計されたshRNA発現コンストラクトを含む細胞（例えば、ES細胞）から動物全体を生成することができる。トランスジェニック動物の表現型を評価することができる。
[0159] 動物は、本質的には、非ヒト霊長類、齧歯類（例えば、マウス）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、イヌ科（例えば、飼い犬）、ネコ科（例えば、飼い猫）などの実験上扱いやすい動物であってもよい。一般に、完全なまたはほぼ完全なゲノムプロジェクトを有する動物が好ましい。
[0160] 評価される表現型は、本質的に興味のあるものとすることができる。特定の組織または腫瘍に寄与する幹細胞の傾向を定量することは、幹細胞分化、および腫瘍形成および腫瘍維持プロセスに関わる標的遺伝子を同定する強力な方法である。ウイルス、バクテリアまたは他の感染、インスリン産生またはグルコース恒常性、筋肉機能、神経再生、1種以上の代謝物の産生、挙動パターン、炎症、自己抗体の産生、肥満などに対する感受性など、疾患状態に関連性を有する表現型を観察することができる。
[0161] 様々な程度に標的遺伝子発現に影響を及ぼすshRNAのパネルを使用してもよく、表現型を評価してもよい。特に、遺伝子発現減少の程度と特定の表現型との間の任意の相関を測定することが有用であり得る。
[0162] shRNAコンストラクトの不均一プールを細胞に導入することができ、これらの細胞を動物に導入することができる。このタイプの実験の実施形態では、細胞は選択的な圧力にさらされ、次いで、選択的圧力に対して耐性または感受性を付与するshRNAを同定することが可能であろう。選択的圧力は、極めてわずかなものであっても、意図しないものであってもよい。例えば、トランスフェクションされたhscの単なる移植は選択的な圧力になり得るのであり、一部のshRNAは移植を妨害し、他のshRNAは移植を促進する。発達および分化は、いくつかのshrnaが、特定の幹細胞の傾向を調節して、子孫の異なるサブセットに分化するようにする、「選択的な圧力」として見ることができる。化学療法剤による治療は、以下に記載するように、選択的圧力として使用することができる。shRNAの不均一プールはライブラリーから得ることができ、特定の好ましい実施形態では、ライブラリーは、shRNA種の迅速な同定を可能にするバーコード化ライブラリーである。
[0163] 特定の様態において、本発明は、化学療法剤に対する腫瘍細胞の感受性に影響を及ぼす遺伝子を同定する方法を提供する。ヒト癌における化学抵抗性の下にある分子メカニズムは、ほとんど知られていない。種々の抗癌剤は、異なる作用メカニズムを明確に有しているが、最も究極的には、DNA合成を妨げるか、またはDNA損傷を生じさせるかのいずれかである。これは、アポトーシスまたは老化によって細胞増殖を停止させて、修復を可能にする、または細胞周期からの永久的に離脱させる、細胞のチェックポイントを誘発する。
[0164] 特定の実施形態において、本方法は、shRNAをコードする核酸コンストラクトを含むトランスフェクトされた幹細胞を被験体に導入することを含み、shRNAは標的遺伝子の少なくとも一部に相補的であり、トランスフェクトされた幹細胞は標的遺伝子の減少した発現を示す、トランスフェクトされた幹細胞はインビボでトランスフェクトされた腫瘍細胞を生じさせる。例えば、幹細胞は、腫瘍形成に対する遺伝的素因を有する動物、例えば、癌遺伝子過剰発現動物（例えば、(e.g. Eμ-mycマウス)または腫瘍抑制ノックアウト（例えば、p53 −/− 動物）に由来してもよい。あるいは、幹細胞から誘導された細胞を含む腫瘍が生成されるように、幹細胞を含む動物を発癌性条件に暴露してもよい。腫瘍を有する動物を化学療法または他の抗腫瘍治療法で治療することができ、shRNAを発現する細胞に対するこの治療法の効果を評価することができる。抗腫瘍治療後に過剰表現されるshRNAは、耐性を付与する遺伝子に対して標的化される可能性が高い。抗腫瘍治療後に過少表現されshRNAは、耐性を付与する遺伝子に対して標的化される可能性が高い。過少表現するshRNAは、問題の化学療法剤と共投与される共治療薬としての使用するために開発されて、耐性を抑制する。
[0165] 過剰表現および過少表現は一般に比較用語であり、これらのパラメーターの決定は、一般に対照またはベンチマークとの比較を含む。比較は、単純に化学療法投与前の同じ動物に対してでもよい。比較はまた、化学療法剤を投与されなかった対照被験体にも対してでもよい。比較は、複数の他のshRNA試験の平均であってもよい。プロトコルは実質的に同一であるべきであるが、あらゆる対照が実験と同時である必要はない。
[0166] この技術は、個々のshRNA（例えば、以下の実施例において、BIM shRNAを参照されたい）に対して実施することができる。本技術は、高度に平行なスクリーニングのために採用することもできる。例えば、ある方法は、複数のトランスフェクトされた幹細胞を被験体に導入し、各トランスフェクトされた幹細胞は、shRNAライブラリーの代表的なshRNAを含む核酸コンストラクトを含み、shRNAライブラリーの代表的なshRNAは、代表的標的遺伝子の少なくとも一部に対する相補性を有し、複数のトランスフェクトされた幹細胞が、代表的な標的遺伝子の発現を減少させ、かつ、複数のトランスフェクトされた幹細胞が、インビボでトランスフェクトされた腫瘍細胞を生じさせるのでもよい。特に、全てのshRNAが異なっていることも、すべてのトランスフェクトされた細胞が腫瘍の一部となることも、必要ではないし、期待もされない。腫瘍が生成されると、化学療法薬を投与する、または他の抗腫瘍治療法を施し、shRNA種の過剰表現または過少表現を評価することができる。特定の好ましい実施形態において、代表的shRNAのそれぞれは、各shRNAの迅速な同定を可能にする識別可能なタグに結びついている。例えば、shRNAは、バーコード化されたshRNAライブラリーから取得することができる。
[0167] 本明細書に記載された特定の方法は、多数の癌細胞（例えば、リンパ腫細胞）を、罹患したマウスから単離し、同系の免疫適格レシピエントに移植して、自然疾患から実質的に区別できないリンパ腫を作成することができるという事実を利用する。これにより、腫瘍細胞のインビトロでの操作が可能になり、インビボで分析可能な潜在的に化学耐性のある変異体を生成することができる。特定の例示的な実施形態では、本発明は、Eμ-mycシステムの利点を利用して、広く使用されているアルキル化剤CTXなどの化学療法薬に対する耐性を付与することができる遺伝的変化のための不偏探索を行うことができる。
[0168] 以下は、不偏な遺伝的アプローチを使用してCTXに耐性を付与する遺伝子を同定するための検査の一例の概要である。図19に検査の概要を示す。Eμ-mycマウス由来の単離されたリンパ腫細胞の集団は、特異的にマウス遺伝子を標的とする、配列検証されたshRNAのプールを受け取る。操作された細胞は、免疫適格な同系のレシピエント動物に導入される。腫瘍が出現した場合、動物をCTXで処理することができる。各場合において、寛解の時間が測定され、再発の際に、動物は第2ラウンドの処理を受ける。2回の治療のあと、耐性集団に常在するshRNAを同定し、リンパ腫細胞の新鮮な集団に移し、これをナイーブな動物に移植する。適切な数の選択サイクルのあと、薬剤耐性を付与することができる個々のshRNAが得られる。
[0169] D. 細胞送達システム
[0170] 特定の実施形態では、本発明は、ヒトの患者または患畜のような、患者への投与のために処方された組成物を提供する。このように配合された組成物は、特定の遺伝子変化を誘導するCas9タンパク質およびgRNAを含む幹細胞と、標的遺伝子の発現を減少させるように設計されたshRNAをコードする核酸コンストラクトとを含むことができる。組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むこともできる本質的に、本明細書に開示されるものの中から選択された細胞を含む、任意の適切な細胞を使用することができる。トランスフェクトされた細胞は、被験者の治療のための薬剤の製造にも使用することができる。薬学的に許容される賦形剤の例には、細胞が付着することができる（任意に固体または中空のビーズ、管または膜として形成される）マトリックス、足場、他の基質、ならびに、細胞（例えば、ソルベート、EDTA、EGTA、または四級アミンまたは他の抗生物質などのキレート剤）を保存する、または移植を促進する、投与を容易にするのに役立つ試薬（例えば、緩衝剤および塩）が含まれる。
[0171] 細胞は、膜中またはマイクロカプセル内に封入することができる。細胞は、アルギン酸またはポリアクリル酸塩からなるマイクロカプセル内に配置することができる。 Aebischer et al. U.S. Pat. No. 4,892,538; Aebischer et al. U.S. Pat. No. 5,106,627;, U.S. Pat. No. 4,391,909; U.S. Pat. No. 4,353,888.
[0172] インスリン産生細胞組成物の移植部位は、細胞の種類および治療目的に応じて当業者が選択することができる。例示的な移植部位には、静脈内または動脈内投与、肝臓への投与（門脈注射による）、腹膜腔、腎臓被膜または骨髄が含まれる。
[0173] 他の例示的な用途は、本明細書中に参考として援用される、植物ゲノムおよび他の治療方法を含む、米国特許出願8,697,359号に見出すことができる。
[0174] 本明細書に記載された全ての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許が具体的にかつ個々に参照により援用されるように示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書のいずれかの定義を含む本出願が優越する。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【図６ＡＢ】
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【図６ＣＤ】
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【図７ＡＢ】
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【図７ＣＤ】
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【図７ＥＦ】
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【図７Ｇ８Ａ】
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【図８ＢＣ】
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【図８ＤＥ】
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【図８Ｆ】
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【国際調査報告】
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