(57)【要約】シヌクレオパチー状態、アミロイドパチー状態、タウオパチー状態、およびハンチントン病などの神経変性状態の処置のための医薬を開発するための方法を本明細書に提供する。方法は、状態に対する候補医薬の効果を決定するためにバイオマーカーを使用することを伴う。バイオマーカープロフィールは、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含み、ここで、神経変性タンパク質は、例えば、アルファ-シヌクレインおよび、アミロイドβ、タウまたはハンチンチンである。バイオマーカープロフィールは、神経変性タンパク質の、1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む。神経変性タンパク質は、例えば、対象の血液からのCNS由来エキソソームから、定量化することができる。2021508370.tif 000004
2021508370.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
a)生体試料のコレクション中の各生体試料を脳由来エキソソームについて濃縮する工程であって、ここで：
(i)生体試料のコレクションが対象のコホート中の対象に由来し、ここで、コホートが以下：
(1)複数の異なる病期の各々にある神経変性状態と診断された複数の対象であって、ここで、診断された対象の各々が推定神経保護剤を受けたことがある、複数の対象、および／または
(2)複数の健康なコントロール対象、
を含む対象を含み、ここで、生体試料が、推定神経保護剤の投与前に、および投与中に再び1回または複数回、および任意で、投与後に、収集された、工程；
b)バイオマーカー試料を生成するために、エキソソームの内部区画からタンパク質内容物を単離する工程；
c)データセットを作成するために、バイオマーカー試料において、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の量を測定する工程であって、
ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
d)神経変性タンパク質形態の各々の量の差を比較するために、
(i)疾患進行速度または推定神経保護剤に対する反応の程度を予測する診断アルゴリズムを決定するために、経時的に個々の対象において；または
(ii)(1)病原診断を行う、(2)臨床的に類似しているが病因的に異なる神経変性障害サブグループを分ける、または(3)対象が推定神経保護剤に反応する可能性が高いかどうかもしくは対象が推定神経保護剤に反応する可能性が高い程度を予測する、診断アルゴリズムを決定するために、異なる対象間で
データセットに対して統計解析を行う工程
を含む、方法。
【請求項２】
濃縮工程の前に：
I)対象のコホートを提供する工程であって、ここで、コホートが以下を含む対象：(i)複数の異なる病期の各々にある神経変性状態と診断された複数の対象、および／または(ii)複数の健康なコントロール対象を含む、工程；
II)診断された対象の各々へ推定神経保護剤を投与する工程；
III)推定神経保護剤の投与前に、および投与中に再び1回または複数回、および任意で、投与後に、コホート中の対象の各々から生体試料を収集する工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
測定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
診断アルゴリズムが、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態（例えば、相対量；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される形態（複数可）を使用する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
h)標準臨床的尺度に対して診断アルゴリズムのうちの1つまたは複数を検証する工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
統計解析が、相関、ピアソン相関、スピアマン相関、カイ二乗、平均値の比較（例えば、対応T検定、独立T検定、ANOVA）、回帰分析（例えば、単回帰、重回帰、線形回帰、非線形回帰、ロジスティック回帰、多項回帰、段階的回帰、リッジ回帰、ラッソ回帰、エラスティックネット回帰）またはノンパラメトリック分析（例えば、ウィルコクソン順位和検定、ウィルコクソン符号順位検定、符号検定）を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
統計解析がコンピューターによって実行される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
統計解析が機械学習を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
対象がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
神経変性状態がシヌクレイノパチー性障害である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
シヌクレイノパチー性障害がパーキンソン病である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
シヌクレイノパチー性障害がレヴィー小体認知症である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
神経変性タンパク質がアルファ-シヌクレインであり、オリゴマー形態が、1つまたは複数の比較的低分子量のシヌクレインオリゴマーを含む、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
神経変性タンパク質がアルファ-シヌクレインであり、オリゴマーシヌクレイン形態が約6量体〜18量体のサイズ範囲内のオリゴマー形態を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
標準臨床的尺度が、UPDRSスコア、CGIスコアおよび放射線学的所見より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
神経変性状態が、アミロイドパチー、タウオパチーまたはハンチントン病である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
生体試料が静脈血試料を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
異なる病期が、疑いあり、初期、中期、および臨床的進行のうちの1つまたは複数を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
投与中または投与後の時間が、処置後1、2、3ヵ月またはそれ以上より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
濃縮工程が、1つまたは複数の脳特異的タンパク質マーカーを使用することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
脳特異的マーカーのうちの少なくとも1つがK1camを含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
単離工程が、各濃縮試料中のエキソソームを洗浄し、表面膜結合タンパク質を除去することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
エキソソームをPBSで洗浄する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
神経変性タンパク質の形態を、ゲル電気泳動、ウェスタンブロットまたは蛍光技術によって測定する、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
以下の工程：
a)対象からの生体試料を脳由来エキソソームについて濃縮する工程；
b)バイオマーカー試料を生成するために、エキソソームの内部区画からタンパク質内容物を単離する工程；
c)神経変性タンパク質プロフィールを作成するために、バイオマーカー試料において、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の量を測定する工程であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
d)神経変性タンパク質プロフィールを関連付ける工程であって、以下：
(1)病原診断を行う、
(2)複数の臨床的に類似しているが病因的に異なる神経変性障害サブグループのうちの1つへ対象を分類する、または
(3)対象が推定神経保護剤に反応する可能性が高いかどうかもしくは対象が推定神経保護剤に反応する可能性が高い程度を予測する
のうちの1つを行う、工程
を含む、方法。
【請求項２７】
関連付ける工程が、神経変性タンパク質プロフィールに対して、請求項1記載の診断アルゴリズムを実行することを含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
診断アルゴリズムが、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態（例えば、モノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量）；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される神経変性タンパク質形態を使用する、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
ある期間にわたって対象から複数の生体試料を収集する工程を含み、任意でここで、対象が該期間中に推定または公知の神経保護剤を受けており、ここで、診断アルゴリズムが、疾患進行速度または推定神経保護剤に対する反応の程度を予測する、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
診断アルゴリズムが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を使用する、請求項26記載の方法。
【請求項３２】
診断アルゴリズムが、神経変性タンパク質の1つまたは複数のオリゴマー形態のパターンを使用する、請求項26記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程：
a)複数の対象の各々について、以下：
(1)神経変性状態の状況、および
(2)CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮された生体試料中の1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の量の定量的測定値
を示す値を含むデータセットを提供する工程であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
b)データセットに対して統計解析を行う工程であって、個体における神経変性状態の状況を推測するモデルを開発する、工程
を含む、方法。
【請求項３４】
1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の定量的測定値が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態（例えば、モノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量）；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
統計解析がコンピューターによって行われる、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
統計解析がコンピューターによって行われない、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
統計解析が、相関、ピアソン相関、スピアマン相関、カイ二乗、平均値の比較（例えば、対応T検定、独立T検定、ANOVA）、回帰分析（例えば、単回帰、重回帰、線形回帰、非線形回帰、ロジスティック回帰、多項回帰、段階的回帰、リッジ回帰、ラッソ回帰、エラスティックネット回帰）またはノンパラメトリック分析（例えば、ウィルコクソン順位和検定、ウィルコクソン符号順位検定、符号検定）を含む、請求項33記載の方法。
【請求項３９】
統計解析が、データセットに対して機械学習アルゴリズムを訓練することを含む、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
機械学習アルゴリズムが以下：人工神経回路網（例えば、バックプロパゲーションネットワーク）、デシジョンツリー（例えば、再帰分割プロセス、CART）、ランダムフォレスト、判別分析（例えば、BayesianクラシファイヤーまたはFischer分析）、線形分類器（例えば、多重線形回帰(MLR)、部分最小二乗(PLS)回帰、主成分回帰(PCR)）、混合または変量効果モデル、ノンパラメトリック分類器（例えば、ｋ最近傍）、サポートベクターマシン、およびアンサンブル法（例えば、バギング、ブースティング）より選択される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
状況が、神経変性状態の診断、病期、予後または進行より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項４２】
状況が、カテゴリー変数（例えば、バイナリー状況または複数のカテゴリー状況のうちの1つ）として測定される、請求項33記載の方法。
【請求項４３】
カテゴリーが、神経変性状態を有することと一致する診断（例えば、陽性または有すると診断される）および神経変性状態を有することと矛盾する診断（例えば、陰性または有さないと診断される）を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
カテゴリーが神経変性状態の異なる病期を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
状況が、（例えば、スケールにおける）連続変数として測定される、請求項33記載の方法。
【請求項４６】
連続変数が、神経変性状態の範囲または程度である、請求項41記載の方法。
【請求項４７】
対象が、動物、例えば、魚類、鳥類、両生類、爬虫類、または哺乳動物、例えば、げっ歯動物、霊長動物もしくはヒトである、請求項33記載の方法。
【請求項４８】
複数の対象が、少なくとも25、50、100、200、400または800のうちのいずれかである、請求項33記載の方法。
【請求項４９】
各対象について、定量的測定値が決定される試料を第1の時点で採取し、神経変性状態の状況を、後の時点である第2の時点で決定する、請求項33記載の方法。
【請求項５０】
神経変性タンパク質が、アルファ-シヌクレイン、タウ、アミロイドβおよびハンチンチンより選択される、請求項33記載の方法。
【請求項５１】
生体試料が、血液または血液分画（例えば、血漿または血清）を含む、請求項33記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも1つのオリゴマー形態がリン酸化形態を含む、請求項33記載の方法。
【請求項５３】
神経変性タンパク質がアルファ-シヌクレインであり、データセットが、個々にまたは集合的に、4〜16量体の範囲内のオリゴマー、またはp129アルファ-シヌクレインを含むオリゴマーの定量的測定値を含む、請求項33記載の方法。
【請求項５４】
神経変性タンパク質がアミロイドβの可溶性オリゴマー形態であり、データセットが、個々にまたは集合的に、8〜24量体の近似サイズ範囲内のオリゴマーの定量的測定値を含む、請求項33記載の方法。
【請求項５５】
神経変性タンパク質がタウであり、データセットが、個々にまたは集合的に、3〜15量体の近似範囲内のオリゴマーの定量的測定値を含む、請求項33記載の方法。
【請求項５６】
神経変性タンパク質がタウであり、オリゴマー形態がタウの過リン酸化形態である、請求項33記載の方法。
【請求項５７】
神経変性タンパク質がハンチンチンである、請求項33記載の方法。
【請求項５８】
神経変性状態が、パーキンソン病、レヴィー小体認知症、多系統萎縮症または関連障害より選択されるシヌクレイノパチーである、請求項33記載の方法。
【請求項５９】
神経変性状態が、アミロイドパチー、例えば、アルツハイマー病である、請求項33記載の方法。
【請求項６０】
神経変性状態が、タウオパチー、例えば、アルツハイマー病である、請求項33記載の方法。
【請求項６１】
神経変性状態がハンチントン病である、請求項33記載の方法。
【請求項６２】
神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態の、発症リスク、診断、病期、予後、または進行を推測する方法であって、以下の工程：
a)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する工程であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
b)データセットに対してモデル、例えば、請求項33記載のモデルを実行する工程であって、神経変性状態の、発症リスク、診断、病期、予後、または進行を推測する、工程
を含む、方法。
【請求項６３】
定量的測定値が決定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
モデルが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を、統計的に有意な数の対照個体における相対量と比較することを含む、請求項62記載の方法。
【請求項６６】
モデルが、複数のオリゴマー形態の相対量のパターンを検出することを含み、これからモデルが推測を行う、請求項62記載の方法。
【請求項６７】
対象が神経変性状態について無症候または症状発現前である、請求項62記載の方法。
【請求項６８】
対象が、定期的な通院中にまたは医師の通常の医療活動の一部として、医師などの医療提供者へ示す、請求項62記載の方法。
【請求項６９】
モデルがコンピューターによって実行される、請求項62記載の方法。
【請求項７０】
モデルがコンピューターによって実行されない、請求項62記載の方法。
【請求項７１】
神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態の処置における治療的介入の有効性を決定するための方法であって、以下の工程：
(a)以下の：
(1)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
(2)モデル、例えば、請求項33記載のモデルを使用して、初期状況を推測する段階；
によって、神経変性状態の初期状況を、複数の対象を含む集団中の各対象において、推測する工程；
(b)推測工程後、対象へ治療的介入を施す工程；
(c)施す工程後、以下の：
(1)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
(2)モデルを使用して後続状況を推測する段階
によって、神経変性状態の後続する後続状況（a subsequent a subsequent state）を、集団中の各対象個体において、推測する工程；ならびに
(d)集団中の初期および後続推測に基づいて、後続推測が初期推測と比較して正常状況の方への統計的に有意な変化を示す場合は、治療的介入が有効であること、または、後続推測が初期推測と比較して正常状況の方への統計的に有意な変化を示さない場合は、治療的介入が有効ではないことを決定する工程
を含む、方法。
【請求項７２】
定量的測定値が決定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、請求項71記載の方法。
【請求項７４】
治療的介入が薬物または薬物の組み合わせの投与を含む、請求項71記載の方法。
【請求項７５】
集団が、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100または少なくとも200の対象を含み、ここで、対象のうちの少なくとも20%、少なくとも35%、少なくとも50%、または少なくとも75%が、タンパク質のモノマー形態に対するタンパク質のオリゴマー形態の上昇した相対量を最初に有する、請求項71記載の方法。
【請求項７６】
対象のうちの少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、または少なくとも35%、少なくとも50%、少なくとも66%、少なくとも80%、または100%が、神経変性状態の診断を最初に有する、請求項71記載の方法。
【請求項７７】
モデルが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を使用する、請求項71記載の方法。
【請求項７８】
モデルが、神経変性タンパク質の1つまたは複数のオリゴマー形態のパターンを使用する、請求項71記載の方法。
【請求項７９】
推測がコンピューターによって行われる、請求項71記載の方法。
【請求項８０】
推測がコンピューターによって行われる、請求項71記載の方法。
【請求項８１】
神経変性状態の処置または予防のための治療的介入の臨床試験について対象を認定するための方法であって、以下の工程：
a)以下：
i)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
ii)プロフィールに対してモデル、例えば、請求項33記載のモデルを実行する段階であって、対象が神経変性状態に関して異常であることを推測する、段階
によって、神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態に関して対象が異常であることを決定する工程；ならびに
c)該神経変性状態についての潜在的治療的介入の臨床試験に対象を登録する工程
を含む、方法。
【請求項８２】
定量的測定値が決定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、請求項81記載の方法。
【請求項８４】
モデルが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を使用する、請求項81記載の方法。
【請求項８５】
モデルが、神経変性タンパク質の1つまたは複数のオリゴマー形態のパターンを使用する、請求項81記載の方法。
【請求項８６】
モデルがコンピューターによって実行される、請求項81記載の方法。
【請求項８７】
モデルがコンピューターによって実行されない、請求項81記載の方法。
【請求項８８】
神経変性状態についての治療的介入における対象の経過をモニタリングする方法であって、以下の工程：
(a)以下：
(1)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
(2)モデル、例えば、請求項33記載のモデルを実行する段階であって、神経変性状態の初期状況を推測する、段階
によって、神経変性状態の初期状況を、対象において、推測する工程；
(b)推測工程後、対象へ治療的介入を施す工程；
(c)施す工程後、以下の：
(1)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
(2)モデル、例えば、請求項33記載のモデルを実行する段階であって、神経変性状態の後続状況を推測する、段階
によって、神経変性状態の後続状況を、対象において、推測する工程；
(d)初期および後続状況推測に基づいて、後続推測が初期推測と比較して正常状況の方への変化を示す場合は、対象が治療的介入に対してプラスに反応していること、または、後続推測が初期推測と比較して正常状況の方への変化を示さない場合は、治療的介入が有効ではないことを決定する工程
を含む、方法。
【請求項８９】
定量的測定値が決定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択され決定される、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、請求項88記載の方法。
【請求項９１】
モデルが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を使用する、請求項88記載の方法。
【請求項９２】
モデルが、神経変性タンパク質の1つまたは複数のオリゴマー形態のパターンを使用する、請求項88記載の方法。
【請求項９３】
モデルがコンピューターによって実行される、請求項88記載の方法。
【請求項９４】
モデルがコンピューターによって実行されない、請求項88記載の方法。
【請求項９５】
(a)請求項62記載の方法によって、対象が、神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態を有することを決定する工程、および
(b)状態を処置するために効果的な緩和的または神経保護的な治療的介入を対象へ施す工程
を含む、方法。
【請求項９６】
治療的介入が正常の方へ対象のバイオマーカープロフィールを移動させ、ここで、正常の方への移動が神経保護を示す、請求項97記載の方法。
【請求項９７】
請求項62記載の方法によって異常なバイオマーカープロフィールを有すると決定された対象へ、状態を処置するために有効な緩和的または神経保護的な治療的介入を施す工程を含む、方法。
【請求項９８】
対象が神経変性状態について無症候または症状発現前である、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
アルファ-シヌクレイン、タウ、アミロイドβおよびハンチンチンより選択されるタンパク質のオリゴマー形態を検出するために十分な第1の試薬と、アルファ-シヌクレイン、タウ、アミロイドβおよびハンチンチンより選択されるタンパク質のモノマー形態を検出するために十分な第2の試薬とを含む、キット。
【請求項１００】
第1および第2の試薬が抗体を含む、請求項99記載のキット。
【請求項１０１】
神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態の、発症リスク、診断、病期、予後、または進行を推測する方法であって、以下の工程：
a)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する工程であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
b)神経変性タンパク質プロフィールを、神経変性状態の、発症リスク、診断、病期、予後、または進行と関連付ける工程
を含む、方法。
【請求項１０２】
神経変性タンパク質プロフィールが、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；または
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される定量的測定値を含む、請求項101記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援研究に関する声明
無し。
【０００２】
関連出願の参照
本出願は、2017年12月19日に出願された米国仮出願第62/607,345号、2018年10月8日に出願された米国仮出願第62/742,839号、および2018年11月19日に出願された米国仮出願第62/769,255号に関し、これらの内容はその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
神経変性疾患は、ニューロンの機能低下および死を含む、脳内の変性変化によって特徴付けられる。神経変性疾患としては、非限定的に、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症およびレヴィー小体認知症が挙げられる。
【０００４】
多くの神経変性疾患はタンパク質オリゴマー形態の異常な蓄積によって特徴付けられる。これらのオリゴマー形態はニューロンの変性および死に寄与すると考えられている。
【発明の概要】
【０００５】
開示の概要
本明細書に開示されるのは、数ある中でも、神経変性状態、例えば、シヌクレオパチー状態、アミロイドパチー状態、タウオパチーおよびハンチントン病、ならびにそれに関連する神経変性についてのバイオマーカープロフィールである。ある態様において、バイオマーカープロフィールは、アルファ-シヌクレイン、アミロイドβ、タウまたはハンチンチンなどの神経変性タンパク質の、1つまたは複数の異なる種（「形態」とも呼ばれる）の測定値を含む。神経変性タンパク質プロフィールは、(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；(II)複数のオリゴマー形態；(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態より選択される1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含むことができる。
【０００６】
ある態様において、タンパク質種は、例えば血液から単離された、CNS由来細胞外小胞（本明細書以下においてエキソソームと呼ばれる）から測定される。検査される種は、エキソソームの内部区画に由来し得、例えば、表面タンパク質が除去されたエキソソームに由来し得る。このように測定されるバイオマーカープロフィールは比較的簡単かつ非侵襲性の測定手段を示す。
【０００７】
従って、神経変性についてのバイオマーカープロフィールを測定するための本開示の方法は、（本明細書において推定神経保護剤と称すことがある）薬物候補の神経保護効能を試験するための薬物開発において有用である。例えば、本明細書に記載される方法は、シヌクレイノパチーなどの神経変性状態における、オリゴマー化の下流効果および分子基盤をさらに理解するため、および有効な治療戦略の開発を促進するために使用され得る。そのような方法はまた、臨床試験における登録について対象を特定するため、およびシヌクレオパチー状態の診断、予後、進行または発症リスクを決定するために有用である。シヌクレオパチー状態に関連する神経変性を有するとまたはこれを発症するリスクがあると、本開示の方法によって、決定された対象を処置する新規の方法、特に、神経保護処置を本明細書にさらに提供する。
【０００８】
本開示の他の目的は下記の明細書および特許請求の範囲を読むことにより当業者に明らかとなり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本開示の新規の特徴は添付の特許請求の範囲に特に記載される。本開示の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的な態様を記載する下記の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるだろう。
【００１０】
【図１】アルファ-シヌクレインのモノマーおよびオリゴマー形態を検出する例示的な方法のフローチャートを示す。
【図２】薬効を検証するための例示的なプロトコルのフローチャートを示す。
【図３】神経変性状態に関与するタンパク質のモノマーおよびオリゴマー形態を検出する例示的な方法のフローチャートを示す。
【図４】神経変性タンパク質のモノマーおよびオリゴマー形態を検出する例示的な方法のフローチャートを示す。
【図５】神経変性状態を診断するための診断モデルを作製および検証する例示的なフローチャートを示す。
【図６】バイオマーカープロフィールに対して、診断アルゴリズム、またはモデルを実行することによっていくつかの状況のいずれかに従って対象を分類するための例示的なフローチャートを示す。
【図７】5つの異なる状況でのアルファ-シヌクレインのモノマー種および5つのオリゴマー種を含む、例示的なバイオマーカープロフィールを示す。そのようなプロフィールは、様々な状況と関連付けるために使用され得る。プロフィールは、人間のオペレーターによってまたはコンピューターによって実行されるモデルによって使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
開示の詳細な説明
I．神経変性状態および関連タンパク質
本明細書に開示される方法は、様々な神経変性状態の診断およびこれらについての薬物開発のために有用である。これらとしては、非限定的に、シヌクレイノパチー（例えば、パーキンソン病、レヴィー小体認知症、多系統萎縮症）、アミロイドパチー（例えば、アルツハイマー病）、タウオパチー（例えば、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症）、およびハンチントン病が挙げられる。これらの疾患は、毒性オリゴマーポリペプチド種、および場合によっては異常にリン酸化されたオリゴマーまたはモノマー形態の蓄積と、CNS由来エキソソームにおいてそのような形態が検出され得ることが共通している。
【００１２】
本明細書において使用される場合、用語「神経変性タンパク質」は、オリゴマー化形態で、神経変性に関連する、タンパク質を指す。神経変性タンパク質としては、非限定的に、アルファ-シヌクレイン、タウ、アミロイドβおよびハンチンチンが挙げられる。
【００１３】
脳ポリペプチドのあるオリゴマー化形態または異常にリン酸化された形態は、様々な神経変性状態の基礎をなすと考えられている。これは、例えば、シヌクレイノパチー状態におけるアルファ-シヌクレイン、アミロイドパチー状態におけるアミロイドβ、タウオパチー状態におけるタウ、およびハンチントン病におけるハンチンチンの役割を含む。特に、現在の証拠は、α-シヌクレインオリゴマーがPDおよび他のシヌクレイノパチーにおいて毒性種として作用し得ることを示唆している。ある態様において、検出されるオリゴマー種は、異常にリン酸化された種である。
【００１４】
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；(II)複数のオリゴマー形態；(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに(VI)複数のオリゴマー形態より選択される1つまたは複数の神経変性タンパク質形態（例えば、アルファ-シヌクレイン、アミロイドβ、タウ、またはハンチンチンの形態）の各々の量を含むプロフィールは、数ある中でも、神経変性状態または神経変性状態への進行を推測するためにモデルにおいて使用され、典型的には、モデル中に含まれる1つまたは複数のオリゴマー形態が疾患の存在および活性または疾患への進行を示す。これは、シヌクレイノパチーの存在および活性、またはシヌクレイノパチーへの進行を示す、オリゴマーアルファ-シヌクレイン形態の漸増相対量；アミロイドパチーの存在および活性、またはアミロイドパチーへの進行を示す、オリゴマーアミロイドβの漸増相対量；タウオパチーの存在および活性、またはタウオパチーへの進行を示す、オリゴマーまたは異常にリン酸化されたタウの漸増相対量；ならびに、ハンチントン病の存在および活性、またはハンチントン病への進行を示す、オリゴマーハンチンチンの漸増相対量を含む。従って、そのようなオリゴマーの異常プロフィールは神経変性のプロセスを示す。
【００１５】
本明細書において使用される場合、用語「バイオマーカープロフィール」は、1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を示すデータを指す。これは、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、過リン酸化および、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの、種の量を含む。例えば、バイオマーカープロフィールは、(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；(II)複数のオリゴマー形態；(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態を含むことができる。
【００１６】
タンパク質形態は、個々のタンパク質種または種のコレクションを指し得る。例えば、アルファ-シヌクレインの6量体は、アルファバックスペース-シヌクレインの形態である。同様に、アルファ-シヌクレインの6量体〜18量体のコレクションは、集合的に、アルファ-シヌクレインの形態であり得る。
【００１７】
バイオマーカープロフィールは、複数のタンパク質形態を含み得る。一態様において、バイオマーカープロフィールは、神経変性タンパク質の複数のオリゴマー形態およびモノマー形態の各々の定量的測定値を含み得る。従って、例えば、バイオマーカープロフィールは、6量体、7量体、8量体、9量体、10量体、11量体、12量体、13量体、14量体、15量体、および16量体、9量体の各々の定量的測定値を含むことができる。
【００１８】
定量的測定値は、絶対的測定値、正規化測定値（例えば、参照測定に対して）、および相対的測定値であり得る。例えば、一態様において、バイオマーカープロフィールは、神経変性タンパク質のモノマー形態に対する神経変性タンパク質のオリゴマー形態の相対量を含む。
【００１９】
用語「バイオマーカープロフィール」はまた、モデルが、神経変性状態の、診断、病期、進行、速度、予後、薬物反応性および発症リスクに関連すると推測する、プロフィール中の特定のパターンを指すために使用され得る。従って、「シヌクレインバイオマーカープロフィール」は、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むプロフィールを指し、用語「アミロイドバイオマーカープロフィール」は、オリゴマーおよび、任意で、モノマーβ-アミロイドを含むプロフィールを指し、用語「タウバイオマーカープロフィール」は、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウを含むプロフィールを指し、用語「ハンチンチンバイオマーカープロフィール」は、オリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンを含むプロフィールを指す。
【００２０】
本明細書において使用される場合、用語「モノマータンパク質／ポリペプチド」は、リン酸化種などの、その任意の種を含む、単一の、非凝集タンパク質またはポリペプチド分子を指す。本明細書において使用される場合、用語「オリゴマータンパク質／ポリペプチド」は、リン酸化種を含む、個々のオリゴマー種または複数のオリゴマー種を含む凝集体を指す。タンパク質のオリゴマー形態の測定は、本明細書において使用される場合、全てのオリゴマー形態（総オリゴマー形態）または指定されるオリゴマー形態の測定を指し得ることが理解される。指定されるオリゴマー形態は、例えば、特定のサイズ範囲または物理的条件内の形態、例えば、可溶性フィブリルを含むことができる。
【００２１】
異常プロフィール（例えば、モノマー形態に対するオリゴマー形態の増加した相対量、または他のオリゴマー形態に比べてのあるオリゴマー形態の増加もしくは減少）は、病理学的活性、従って、将来の臨床的発症までの時間およびその後の臨床的進行速度を示す。さらに、バイオマーカープロフィールにおける正常の方への回復（例えば、モノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量の減少）は、候補神経保護介入の効能を反映する。従って、本明細書に記載されるバイオマーカープロフィールは、神経保護効果についての薬物候補の効能を決定するために有用である。
【００２２】
従って、バイオマーカープロフィールは、既存の病理学的状況の診断としてだけではなく、例えば、対象が発症前または症状発現前である場合、例えば、疾患の診断には不十分である徴候または症状を有する場合、臨床的発症前の病理の見張りとしても機能する。これは重要であり、何故ならば、神経保護処置の相対的な成功は、しばしば、それらのできるだけ早期の投与に関連するようであるためである。さらに、これらのバイオマーカープロフィールは、神経変性状態の病期または程度を示すと考えられる。従って、バイオマーカープロフィール（例えば、選択されたタンパク質のオリゴマーおよびモノマー形態の相対量）を決定することは、例えば、臨床試験における、および、個体における、例えば、シヌクレイノパチー、アミロイドパチー、タウオパチーまたはハンチントン病を含む、神経変性を処置するために有効であると考えられる治療的介入について、処置の有効性を決定するために有用である。
【００２３】
これらの状態の各々において、本明細書に記載されるポリペプチドのオリゴマー化／凝集形態は、ニューロンに有毒であると考えられており、これらのポリペプチドのオリゴマー形態および、任意で、モノマー形態を含むバイオマーカープロフィールは、病理学的活性を推測するようにモデルにおいて機能する。特に、モノマー形態と比較してのオリゴマー形態の増加した相対量は、病理を示す。これらのバイオマーカーの測定値は、既存のまたは開発中の療法に対する対象反応を追跡するために、ならびに疾患の発症または既存の疾患の状況もしくは進行を予測するために、使用され得る。
【００２４】
A．シヌクレイノパチー
1．状態
本明細書において使用される場合、用語「シヌクレイノパチー」および「シヌクレオパチー状態」は、アルファ-シヌクレインの異常な凝集形態である、オリゴマーアルファ-シヌクレインの異常プロフィールによって特徴付けられる状態を指す。ある態様において、シヌクレイノパチーは、例えば、PD、レヴィー小体認知症、多系統萎縮症、およびいくつかの形態のアルツハイマー病、ならびに他の稀な神経変性障害、例えば、様々な神経軸索ジストロフィーなどの、臨床的に明らかなシヌクレオパチー性疾患として発現する。シヌクレイノパチー性疾患の臨床診断に十分な徴候および、任意で、症状は、そのような臨床診断をするためにそのような状態の診断の分野における当業者に一般に十分なものである。
【００２５】
パーキンソン病（「PD」）は、60歳以上の成人集団において1%〜2%の有病率を有する、中枢神経系(CNS)の進行性障害である。PDは、振戦、硬直、姿勢動揺および随意運動の緩慢を含む、運動症状によって特徴付けられる。総PD症例の90%超を構成する、疾患の特発型の原因は、捉えがたいままであるが、現在は、環境的および遺伝的要因の両方を伴うと考えられている。運動症状は、黒質におけるドーパミン産生ニューロンの進行性変性と明らかに関係がある。ごく最近になって、PDは、大脳基底核（例えば、PD）、または大脳皮質（例えば、レヴィー小体認知症）、または大脳基底核、脳幹および脊髄（例えば、多系統萎縮症）に主に影響を与える、多系統疾患の群の1つと認識されるようになり、これらは全て、アルファ-シヌクレインと呼ばれる脳タンパク質から主になる細胞内沈着物（レヴィー小体）の存在によって結び付けられる。従って、これらの障害は、Hallevorden-Spatz症候群、神経軸索ジストロフィー、および外傷性脳損傷と共に、「シヌクレイノパチー」としばしば呼ばれてきた。
【００２６】
PDの徴候および症状は、例えば、安静時振戦、硬直、運動緩徐、姿勢動揺および加速パーキンソン病様歩行（festinating parkinsonian gate）を含み得る。PDの1つの徴候は、カルビドパ-レボドパに対するこれらの運動機能障害における肯定的な反応である。
【００２７】
パーキンソン病の臨床的に認識される病期は以下を含む：ステージ1−軽度；ステージ2−中程度；ステージ3−中期；ステージ4−重症；ステージ5−進行。
【００２８】
現在、PDの診断は、改変Hoehn and Yahr病期分類スケール(Hoehn and Yahr, 1967, Neurology, 17:5, 427-442)および統一パーキンソン病評価尺度(UPDRS)の使用によってしばしば定量化される身体検査の結果に主に基づく。パーキンソニズムの他の形態、例えば進行性核上性麻痺(PSP)に対するPDの鑑別診断は、困難であると分かる場合があり、誤診は、従って、患者の最大25%において生じ得る。実際に、PDは、一般に、最初の臨床診断がなされ得る前の数年間、発見されないままである。これが起こる時には、黒質中のドーパミンニューロンの減少は、既に50%を超過しており、70%に近づいている場合がある。PDまたは任意の関連するシヌクレイノパチーについての血液検査はまだ検証されていない。陽電子断層撮影法(PET)またはMRIを使用するイメージング研究が、神経変性プロセスの場所および程度についての情報を提供することによって、PDの診断において使用されてきたが、それらは、観察された変性の病因についての情報をほとんどまたは全く与えず、特定のシヌクレオパチー性特異的介入の選択の指針とならない。
【００２９】
レヴィー小体認知症(LBD)は、米国において約130万人の人に影響を与えている。症状としては、例えば、認知症、認知変動、パーキンソニズム、睡眠障害および幻覚が挙げられる。それは、アルツハイマー病に次ぐ認知症の2番目に高頻度の形態であり、通常、50歳を過ぎてから発症する。パーキンソン病と同様に、LBDは、脳内におけるアルファ-シヌクレインの異常な沈着物によって特徴付けられる。
【００３０】
多系統萎縮症(MSA)は、2つのタイプ、パーキンソン病型および小脳型に分類される。パーキンソン病型は、例えば、PDのパーキンソン病様症状によって特徴付けられる。小脳型は、例えば、運動および協調障害、構音障害、視覚障害ならびに嚥下困難によって特徴付けられる。MSA症状は、脳、特に、黒質、線条、下オリーブ核、および小脳の損傷領域における、細胞消失およびグリオーシスまたは星状細胞の増殖を反映する。異常なアルファ-シヌクレイン沈着物が特徴的である。
【００３１】
PDおよび他のシヌクレイノパチーについての誤診断率は、神経保護療法などの、有効な疾患修飾療法の導入で重要となり得る事態である、特にそれらの初期段階で、比較的高い場合がある。
【００３２】
2．アルファ-シヌクレイン
アルファ-シヌクレインはヒト脳中に見られるタンパク質である。ヒトアルファ-シヌクレインタンパク質は、140個のアミノ酸で作られており、SNCA遺伝子（PARK1とも呼ばれる）によってコードされる。(アルファ-シヌクレイン: 遺伝子ID: 6622; ホモサピエンス; 細胞遺伝学的位置: 4q22.1.)。
【００３３】
本明細書において使用される場合、用語「アルファ-シヌクレイン」は、正常（未修飾）種、ならびに修飾種を含む。アルファ-シヌクレインは、モノマー形態または凝集形態で存在し得る。アルファ-シヌクレインモノマーはオリゴマーへと異常に凝集し得、オリゴマーアルファ-シヌクレインはフィブリルへと凝集し得る。フィブリルはさらに凝集し、レヴィー小体と呼ばれる細胞内沈着物を形成し得る。モノマーアルファ-シヌクレインおよびその様々なオリゴマーは平衡状態で存在すると考えられている。脳内におけるアルファ-シヌクレインプロセシングはまた、セリン129でリン酸化されたアルファ-シヌクレイン（「p129アルファ-シヌクレイン」）などの、他の推定的に異常な種を産生し得る。
【００３４】
アルファ-シヌクレインは、ヒト中枢神経系(CNS)においては豊富に、様々な他の器官においてはより少ない程度に発現される。脳内において、アルファ-シヌクレインは、特に、大脳皮質、海馬、黒質および小脳中の、ニューロンの末端において主に見られ、ここで、それは神経伝達物質放出の調節に寄与する。正常な環境下で、この可溶性モノマータンパク質は、凝集に抵抗する安定して折り畳まれた四量体を形成する傾向がある。しかし、ある病理学的状態において、理由は分からないが、アルファ-シヌクレインは、異常にβプリーツを形成し、ミスフォールドし、オリゴマー化し、そして凝集し、最終的にフィブリルを形成し、これは、高い細胞毒性中間体をもたらし得る代謝経路である。
【００３５】
本明細書において使用される場合、用語「モノマーアルファ-シヌクレイン」は、その任意の種を含む、単一の、非凝集アルファ-シヌクレイン分子を指す。本明細書において使用される場合、用語「オリゴマーアルファ-シヌクレイン」は、複数のアルファ-シヌクレインタンパク質分子を含む凝集体を指す。これは、総オリゴマーアルファ-シヌクレインおよびその形態または選択された種を含む。オリゴマーアルファ-シヌクレインは、少なくとも2つの単量体単位を有する形態からプロトフィブリル形態までを含む。これは、例えば、2〜約100個の単量体単位、例えば、4〜16個の単量体単位または少なくとも2、3、4または5ダースの単量体単位を有するオリゴマー形態を含む。本明細書において使用される場合、用語「比較的低分子量のシヌクレインオリゴマー」は、30個までの単量体単位（30量体）から構成されるシヌクレインオリゴマーを指す。ある態様において、アルファ-シヌクレインは、特定の検出方法によって検出される形態（複数可）を指す。例えば、形態は、アルファ-シヌクレインの特定のモノマーまたはオリゴマー形態に対して惹起された抗体で検出可能なものであり得る。
【００３６】
オリゴマー化形態へと異常にプロセシングされたアルファ-シヌクレインの神経毒性ポテンシャルは、現在は、前述の病理学的状態、とりわけ、PD、レヴィー小体認知症、多系統萎縮症、およびいくつかの他の障害の、症状の発症およびその後の進行に寄与すると考えられている。これらは、一般に、異常なアルファ-シヌクレイン凝集体の細胞内蓄積によって部分的に特徴付けられる神経変性障害の群と定義され、これらのうちのいくつかは、有毒であるようであり、前述の障害の病因に寄与し得る。酸化ストレス、ミトコンドリア損傷、および孔形成としてのそのような因子についての役割が示唆されたが、アルファ-シヌクレインのあるオリゴマー化形態が正確にどのように神経変性を引き起こし得るかは未だに分かっていない。それにもかかわらず、多数が、現在、アルファ-シヌクレインオリゴマー化および凝集へ至るプロセスは、これらの障害において生じる細胞損傷および破壊の中心であり得ると考えている。
【００３７】
いくつかの研究が、プレフィブリルシヌクレインオリゴマーおよびプロトフィブリルは特に神経毒性を与える傾向があることを示した（Loov et al.,“α-Synuclein in Extracellular Vesicles: Functional Implications and Diagnostic Opportunities”, M. Cell Mol Neurobiol. 2016 Apr;36(3):437-48. doi: 10.1007/s10571-015-0317-0.）。他のものは、より低度のオリゴマーシヌクレイン種が主に原因であることを示唆し、正確にどのシヌクレイン種が、または異なるβシート配置を有する種のどのアンサンブルが、単一のまたは複数の病理学的機構によって単独でまたは協力して作用して、PDにおいてまたは任意の関連するシヌクレイノパチーにおいて最も神経毒性であるかは、ほとんど明らかでないままである（Wong et al.,“α-synuclein toxicity in neurodegeneration: mechanism and therapeutic strategies”, Nat Med. 2017 Feb 7;23(2): 1-13. doi: 10.1038/nm.4269）。
【００３８】
細胞内シヌクレインの一部は、その代謝産物の一部と共に、エキソソーム小胞内にパッケージ化され、脳内の細胞内液中へ放出され、ここから、それは脳脊髄液(CSF)および末梢血循環中へ移行する。アルファ-シヌクレインはヒト脳中に見られるタンパク質である。ヒトアルファ-シヌクレインタンパク質は、140個のアミノ酸で作られており、SNCA遺伝子（PARK1とも呼ばれる）によってコードされる。(アルファ-シヌクレイン: 遺伝子ID: 6622; ホモサピエンス; 細胞遺伝学的位置: 4q22.1.)。
【００３９】
B．アミロイドパチー
1．状態
本明細書において使用される場合、用語「アミロイドパチー」は、脳内のアミロイドポリマーの蓄積によって特徴付けられる状態を指す。アミロイドパチーとしては、非限定的に、アルツハイマー病およびある他の神経変性障害、例えば、後期PDが挙げられる。アルツハイマー病は認知症の最も一般的な形態である。それは、β-アミロイドの凝集形態から作られるアミロイド斑の蓄積、ならびに神経原線維変化によって、解剖学的なレベルで特徴付けられる。症状的には、進行性記憶喪失、認知低下および神経行動変化によって特徴付けられる。アルツハイマー病は進行性であり、現在、この疾患を停止または逆転させる公知の方法はない。
【００４０】
2．アミロイドβ
アミロイドベータ（アミロイド-β、Aβ、A-ベータおよびベータ-アミロイドとも呼ばれる）は、アミロイド前駆体タンパク質のペプチド断片である。アミロイドβは、典型的に、36〜43個のアミノ酸を有する。アミロイドβは、凝集し、いくつかの形態で存在し得る可溶性オリゴマーを形成する。アミロイドβのミスフォールドされたオリゴマーは、他のアミロイドβ分子に、ミスフォールドされたオリゴマー形態をとらせ得ると考えられている。A-β1-42は、アミノ酸配列：
2021508370.tif 000003
を有する。
【００４１】
アルツハイマー病において、アミロイド-βおよびタウタンパク質はオリゴマー化し、脳組織内に蓄積し、ここで、それらは、ニューロン損傷および喪失を引き起こすようであり；実際に、一部は、凝集のそのような可溶性中間体、またはオリゴマーは、毒性を媒介しそして疾患において播種および拡散の基礎となる重要な種であると断言されている（The Amyloid-β Oligomer Hypothesis: Beginning of the Third Decade. Cline EN, Bicca MA, Viola KL, Klein WL. J Alzheimers Dis. 2018;64(s1):S567-S610; "Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer's and Parkinson's diseases,” Choi ML, Gandhi S. FEBS J. 2018 Jun 20.）。アミロイドβオリゴマーは、ADの発症および進行に不可欠であり、一般的な薬物標的であるとされ、恐らく最も直接的なバイオマーカーである。タウタンパク質はまた異常に過リン酸化され得る。
【００４２】
A-βのモノマーおよびオリゴマー形態を定量化するための現在使用されている方法としては、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、単一オリゴマー検出のための方法などが挙げられ、これらは主にバイオセンサーに基づく方法である（"Methods for the Specific Detection and Quantitation of Amyloid-β Oligomers in Cerebrospinal Fluid”, Schuster J, Funke SA. J Alzheimers Dis. 2016 May 7;53(1):53-67.）。
【００４３】
表面ベースの蛍光強度分布解析(sFIDA)は、高度に特異的かつ感受性のオリゴマー定量化ならびにモノマーへの完全非感受性の両方を特徴とする（“Advancements of the sFIDA method for oligomer-based diagnostics of neurodegenerative diseases”, Kulawik A. et al., FEBS Lett. 2018 Feb;592(4):516-534）。
【００４４】
C．タウオパチー
1．状態
本明細書において使用される場合、用語「タウオパチー」は、神経変性に関連する蓄積および凝集によって特徴付けられる状態を指す。タウオパチーとしては、非限定的に、アルツハイマー病（「AD」）、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、およびピック病が挙げられる。
【００４５】
ADはまた、第2の病理学的特徴である、神経原線維変化(NFT)によって特徴付けられる。NFTは解剖学的にニューロン喪失に関連し、NFT形成のプロセスをニューロン損傷および脳機能不全に結び付ける。NFTの主成分は、微小管結合タンパク質である、タウの過リン酸化形態である。NFT形成中、タウは、タウオリゴマーを含む、様々な異なる凝集種を形成する。増加する証拠は、タウオリゴマー形成が、神経原線維変化の出現に先行し、ニューロン喪失に重要に寄与することを示している（J Alzheimers Dis. 2013;37(3):565-8 “Tauopathies and tau oligomers”, Takashima A.）。
【００４６】
非線維性可溶性多量体は、線維状タウから作られた神経原線維変化よりもより有毒であるようである。
【００４７】
前頭側頭葉認知症において、完全長TAR DNA結合タンパク質（「TDP-43」）は、脳の前頭部中に蓄積する毒性アミロイドオリゴマーを形成する。筋萎縮性側索硬化症(ALS)も含む、TDP-43タンパク質症は、ポリユビキチン化および過リン酸化されている完全長および切断型TDP-43によって形成される封入体によって特徴付けられる。組換え完全長ヒトTDP-43は、抗アミロイドオリゴマー特異的抗体と共通のエピトープを共有する、構造的に安定した、球状オリゴマーを形成する。TDP-43オリゴマーは、インビトロおよびインビボの両方において神経毒性であることがわかった。（Nat Commun. 2014 Sep 12;5:4824. Full-length TDP-43 forms toxic amyloid oligomers that are present in frontotemporal lobar dementia-TDP patients）。TDP-43オリゴマーの存在および存在量の決定は、FTLD-TDPの種々のサブタイプの中でもTDP-Oと呼ばれる特異的TDP-43アミロイドオリゴマー抗体を使用して達成することができる（"Detection of TDP-43 oligomers in frontotemporal lobar degeneration-TDP”, Kao PF, Ann Neurol. 2015 Aug;78(2):211-21.）。
【００４８】
2．タウ
タウは、最長のタウアイソフォーム上に79個の潜在的なセリン(Ser)およびトレオニン(Thr)リン酸化部位を有する、リンタンパク質である。タウは、結合ドメインの数によって識別される、6つのアイソフォームで存在する。3つのアイソフォームは3つの結合ドメインを有し、他の3つは4つの結合ドメインを有する。アイソフォームは、タウ遺伝子のエクソン2、3、および10における選択的スプライシングに起因する。タウは、11個のエクソンを有する、MAPT遺伝子よってコードされる。ハプログループH1は、アルツハイマー病などの、ある認知症の増加した確率に関連するようである。
【００４９】
6〜18量体の範囲のものを含む、様々なタウオリゴマー種が、タウオパチー性脳障害に関連する神経毒性プロセスに関与し、ウェスタンブロットおよび単一分子蛍光を含む他の技術によって測定された（例えば、Kjaergaard M., et al., Oligomer Diversity during the Aggregation of the Repeat Region of Tau” ACS Chem Neurosci. 2018 Jul 17; Ghag G et al.,“Soluble tau aggregates, not large fibrils, are the toxic species that display seeding and cross-seeding behavior”, Protein Sci. 2018 Aug 20. doi: 10.1002/pro.3499; およびComerota MM et al.,“Near Infrared Light Treatment Reduces Synaptic Levels of Toxic Tau Oligomers in Two Transgenic Mouse Models of Human Tauopathies”, Mol Neurobiol. 2018 Aug 17を参照のこと）。
【００５０】
オリゴマータウ種を測定するための方法としてはイムノアッセイが挙げられる。タウは、通常の発現、続いてのクロマトグラフィー、例えば、アフィニティー、サイズ排除、および陰イオン交換クロマトグラフィーによって単離することができる。この形態は、動物を免疫化して抗体を作製するために使用することができる。タウの凝集はアラキドン酸を使用して誘導され得る。オリゴマーは、ショ糖ステップ勾配による遠心分離によって精製することができる。タウのオリゴマー形態はまた、動物を免疫化して抗体を作製するために使用することができる。タウオリゴマー特異的TOC1抗体を利用するサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法が、オリゴマータウを検出するために使用することができる。タウオリゴマー複合体1(TOC1)抗体は、トリス不溶性、サルコシル可溶性フラクションにおいて、オリゴマータウ種を特異的に同定する。（Shirafuji N., et al,“Homocysteine Increases Tau Phosphorylation, Truncation and Oligomerization”, Int J Mol Sci. 2018 Mar 17;19(3).）（例えば、Methods Cell Biol. 2017;141 :45-64. doi: 10.1016/bs.mcb.2017.06.005. Epub 2017 Jul 14. Production of recombinant tau oligomers in vitro. Combs B1 , Tiernan CT 1 , Hamel C1 , Kanaan NM.を参照のこと）。
【００５１】
D．ハンチントン病
1．ハンチントン病
ハンチントン病は、ハンチンチン遺伝子中の常染色体優性突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患である。突然変異は、CAGトリプレットの複製によって特徴付けられる。それは進行性神経変性によって特徴付けられる。症状としては、運動障害、例えば、不随意運動、歩行障害、ならびに嚥下および発語での困難が挙げられる。それはまた、進行性の認知低下によって特徴付けられる。
【００５２】
2．ハンチンチンタンパク質
ハンチントンタンパク質は、HTTまたはHDとも呼ばれるハンチントン遺伝子によってコードされる。正常なハンチントンタンパク質は約3144個のアミノ酸を有する。タンパク質は、通常は、約300 KdAである。
【００５３】
ハンチントン病(HD)において、より小さな、可溶性の凝集傾向があるmhtt断片への、完全長突然変異ハンチンチン(mhtt)タンパク質の切断は、この障害の病態生理学において重要なプロセスであるようである。実際に、増加した数のポリグルタミン(polyQ)リピートを含有する突然変異タンパク質の凝集および細胞毒性は、HDに加えて、いくつかの疾患の特徴である。細胞内で、突然変異ハンチンチン(mHtt)および他のポリグルタミン拡大突然変異タンパク質は、モノマー、可溶性オリゴマー、および不溶性封入体として存在する。（J Huntingtons Dis. 2012; 1 (1): 119-32. Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules. Sontag EM, et al. , Brain Sci. 2014 Mar 3;4(1):91-122. Monomeric, oligomeric and polymeric proteins in Huntington disease and other diseases of polyglutamine expansion. Hoffner G. et al.）。ある態様において、オリゴマーは、高さが2〜10 nmであり、2.5未満のアスペクト比（交差する最短距離に対する交差する最長距離）を有し、球状構造を示す。
【００５４】
II．モノマーおよびオリゴマーの検出および測定
A．生体試料
本明細書において使用される場合、用語「試料」は、分析物を含む組成物を指す。試料は、生の試料（ここで、分析物は、その天然形態で他の材料と混合されている）（例えば、供給源材料）、分画試料（ここで、分析物は、少なくとも部分的に濃縮されている）、または精製試料（ここで、分析物は少なくとも実質的に純粋である）であり得る。本明細書において使用される場合、用語「生体試料」は、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、脂質、およびより高次レベルのこれらの物質、例えば、エキソソーム、細胞、組織または器官を含む、生物学的物質を含む試料を指す。
【００５５】
アルファ-シヌクレイン、アミロイドβ、タウおよびハンチンチンなどの神経変性タンパク質のオリゴマーおよびモノマー形態は、対象由来の体液試料からのエキソソームにおいて検出され得る。より詳しくは、CNS由来エキソソームの単離物は、シヌクレオパチー状態の検出および解析のためのエキソソームの好ましいサブセットである。特に、エキソソームの内部区画からのタンパク質が有用である。
【００５６】
エキソソームは、対象由来の様々な生体試料から単離することができる。ある態様において、生体試料は体液である。エキソソームの体液供給源としては、例えば、血液（例えば、全血またはその分画、例えば、血清もしくは血漿、例えば、末梢静脈血）、脳脊髄液、唾液、乳および尿、またはそれらの分画が挙げられる。エキソソームの供給源としての静脈血の使用は、医療現場での常用される静脈穿刺の安全性、受容性および利便性が理由で、成人および小児の両方における使用予定の診断検査について好ましい試料である。
【００５７】
B．オリゴマーおよびモノマーポリペプチドの量を決定する方法
タンパク質のモノマーおよびオリゴマー形態は、非限定的に、イムノアッセイ（例えば、ELISA）、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー、ウェスタンブロットおよび蛍光ベースの方法（例えば、蛍光分光法またはFRET）および近接ライゲーションアッセイを含む、当技術分野において公知の任意の方法によって検出することができる。
【００５８】
1．アルファ-シヌクレイン
モノマーアルファ-シヌクレインおよびオリゴマーアルファ-シヌクレインの量は、個々に決定され得る。代わりに、試料中の総アルファ-シヌクレインが、モノマーアルファ-シヌクレインまたはオリゴマーアルファ-シヌクレインのいずれかと共に測定され得、他方の種の量は差に基づいて決定され得る。
【００５９】
モノマー、オリゴマーおよび総アルファ-シヌクレインは、例えば、イムノアッセイ（例えば、ELISAもしくはウェスタンブロット）、質量分析またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、検出され得る。アルファ-シヌクレインに対する抗体は、例えば、Abeam (Cambridge, MA)、ThermoFisher (Waltham, MA)およびSanta Cruz Biotechnology (Dallas, TX)から市販されている。
【００６０】
以下の参考文献は、総アルファ-シヌクレイン含有量を測定する方法を記載した。Mollenhauer et al. (Movement Disorders, 32:8 p. 1117 (2017))は、体液から総アルファ-シヌクレインを測定する方法を記載する。Loov et al. (Cell Mol. Neurobiol., 36:437-448 (2016))は、血漿からL1CAM陽性エキソソームを単離するための抗体の使用を記載する。Abd-Elhadi et al. (Anal Bioanal Chem. (2016) Nov;408(27):7669-72016)は、脂質-ELISAによって決定されたヒト血液細胞、CSF、および唾液中の総アルファ-シヌクレインレベルを決定する方法を記載する。
【００６１】
総アルファ-シヌクレインは、例えば、捕捉のための抗ヒトα-synモノクローナル抗体211 (Santa Cruz Biotechnology, USA)、およびホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)結合化学発光アッセイによる検出のための抗ヒトα-synポリクローナル抗体FL-140 (Santa Cruz Biotechnology, USA)を使用して、ELISAにおいて検出することができる。そのようなアプローチは、モノマーα-シヌクレインの検出を回避するが、異なる多量体形態を識別しない。
【００６２】
アルファ-シヌクレインのモノマーおよびオリゴマー形態は、例えば、形態に特異的な抗体を使用するイムノアッセイによって、検出することができる。例えば、Williams et al. (Oligomeric alpha-synuclein and β-amyloid variants as potential biomarkers for Parkinson's and Alzheimer's diseases”, Eur J Neurosci. (2016) Jan;43(1):3-16)およびMajbour et al. (Oligomeric and phosphorylated alpha-synuclein as potential CSF biomarkers for Parkinson’s disease”, Molecular Neurodegeneration (2016) 11:7)を参照のこと。El-Agnaf O. et al, (FASEB J. 2016;20:419-425)は、PDについての潜在的なバイオマーカーとしてのヒト血漿中のアルファ-シヌクレインタンパク質のオリゴマー形態の検出を記載した。
【００６３】
アルファ-シヌクレインモノマーおよびオリゴマーに対する抗体は、アルファ-シヌクレインモノマーまたはオリゴマーで動物を免疫化することによって生成することができる。（例えば、米国出願公開第2016/0199522号(Lannfelt et al.)、同第2012/0191652号(El-Agnaf)を参照こと）。アルファ-シヌクレインオリゴマーはEl Agnaf (U.S. 2014/0241987)の方法によって調製することができ、ここで、新たに調製されたα-シヌクレイン溶液は、1 :7のモル比(α-シヌクレイン:ドーパミン)でドーパミンと混合され、37℃でインキュベートされた。アルファ-シヌクレインの異なるオリゴマー形態に対する抗体はまた、Emadi et al. (“Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity”, J Mol Biol. 2007; 368:1132-1144. [PubMed: 17391701])（二量体および四量体）およびEmadi et al. (“Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein”, J Biol Chem. 2009; 284:11048-11058. [PubMed: 19141614])（三量体および六量体）において記載されている。プロトフィブリル結合抗体は、例えば、U.S. 2013/0309251 (Nordstrom et al.)に記載されている。
【００６４】
モノマーアルファ-シヌクレインは、シヌクレインのオリゴマー形態によって一意的に認識される抗体を使用するイムノアッセイによってポリマー性アルファ-シヌクレインと識別することができる。別の方法は、例えば質量分析を使用する、質量差の検出を伴う。蛍光方法を使用することができる。（例えば、Sangeeta Nath, et al.,“Early Aggregation Steps in α-Synuclein as Measured by FCS and FRET: Evidence for a Contagious Conformational Change” Biophys J. 2010 Apr 7; 98(7): 1302-1311, doi: 10.1016/j.bpj.2009.12.4290; およびLaura Tosatto et al.,“Single-molecule FRET studies on alpha-synuclein oligomerization of Parkinson’s disease genetically related mutants”, Scientific Reports 5, December 2015を参照のこと）。別の方法は、総アルファシヌクレインの測定、続いて非病理学的アルファシヌクレインのプロテイナーゼK消化および残存するアルファシヌクレインの検出を伴う。別の方法はアルファシヌクレイン近接ライゲーションアッセイを伴う。タンパク質ライゲーションアッセイプローブは、推定される相互作用に関与するタンパク質の各々についてのものである、関心対象のタンパク質に対して惹起された抗体から作製され、これらは短いオリゴヌクレオチドへコンジュゲートされる。プローブが相互作用タンパク質に結合する場合、オリゴヌクレオチドは増幅反応をプライミングするために十分に接近しており、これは、タグ化オリゴヌクレオチドによって検出され得、点状シグナルとして観察され得、各点は相互作用を示す。（Roberts RF et al.,“Direct visualization of alpha-synuclein oligomers reveals previously undetected pathology in Parkinson’s disease brain. Brain”, 2015;138:1642-1657. doi: 10.1093/brain/awv040、およびNora Bengoa-Vergniory et al., “Alpha-synuclein oligomers: a new hope”, Acta Neuropathol. 2017; 134(6): 819-838）。
【００６５】
モノマーに対するアルファ-シヌクレインのオリゴマー形態の相対量は、比率として表すことができる。
【００６６】
数量または量は、例えば、体積当たりの質量によって、アッセイからの信号出力として、または、例えば標準曲線からの、変換後の絶対量として、表すことができる。
【００６７】
試料中のアルファ-シヌクレイン種をさらに階層化することができる。例えば、オリゴマー種は、より低位のオリゴマー、例えば、2〜24の単量体単位、より高位のオリゴマー、例えば、24〜100の単量体単位、またはプロトフィブリルなどへ分割することができる。
【００６８】
2．アミロイドβ
オリゴマーおよびモノマーは、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を使用して識別することができる。このアッセイはサンドイッチELISAに似ている。Aβモノマーは1つのエピトープを含有し、一方、オリゴマーは複数のこれらのエピトープを含有する。従って、上記ユニークエピトープに向かうエピトープ重複抗体が、捕捉および検出抗体のために使用される場合、特異的かつユニークなエピトープへの結合は、これら2つの抗体間での競合を生じさせるだろう。換言すると、モノマーは、捕捉抗体または検出抗体によって占有され、その両方によってではないだろう。（"Oligomeric forms of amyloid-β protein in plasma as a potential blood-based biomarker for Alzheimer's disease”, Wang MJ et al. Alzheimers Res Ther. 2017 Dec 15;9(1):98.“Potential fluid biomarkers for pathological brain changes in Alzheimer's disease: Implication for the screening of cognitive frailty”, Ruan Q et al., Mol Med Rep. 2016 Oct; 14(4):3184-98. "Methods for the Specific Detection and Quantitation of Amyloid-β Oligomers in Cerebrospinal Fluid,” Schuster J, Funke SA. J Alzheimers Dis. 2016 May 7;53(1):53-67）。
【００６９】
検出のためのアミロイドβのオリゴマー形態としては、例えば、アミロイドβの4〜24量体が挙げられる。
【００７０】
3．タウ
生体液、例えばCSF中のタウオリゴマーは、抗タウオリゴマー抗体を使用してELISAおよびウェスタンブロット分析によって測定することができる（Sengupta U, et al., “Tau oligomers in cerebrospinal fluid in Alzheimer's disease”, Ann Clin Transl Neurol. 2017 Apr; 4(4): 226-235。
【００７１】
検出のためのタウのオリゴマーは、例えば、低分子量オリゴマー、例えば、20量体以下、例えば、3〜18量体を含む。脳脊髄液中の溶性オリゴマーの存在は、ウェスタンブロットおよびサンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法(sELISA)を用いてモノクローナル抗オリゴマー抗体で検出することができる。David, MA et al.,“Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients”, Front Neurol. 2014 Dec 2;5:251。タウのオリゴマー形態はオリゴマータウの過リン酸化形態を含む。
【００７２】
4．ハンチンチン
最近の定量化研究はTR-FRETベースのイムノアッセイを使用した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)および時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)を組み合わせる一つの検出方法は、脳内における天然可溶性mhtt種および不溶性凝集体の形成および凝集の分解および定義を可能にする。“Fragments of HdhQ150 mutant huntingtin form a soluble oligomer pool that declines with aggregate deposition upon aging”, Marcellin D. et al., PLoS One. 2012;7(9):e44457。
【００７３】
様々な公表された技術が、オリゴマーハンチンチン種をアッセイするために使用されており、これらは、例えば、アガロースゲル電気泳動(AGE)分析（天然もしくは軽度変性、0.1 % SDS条件下またはBlue-Native PAGE、天然条件下）を含み、これは、多数の免疫反応性オリゴマーを提供し；抗ハンチンチン抗体は、特異的ハンチンチンオリゴマーを差別的に認識する。
【００７４】
ワンステップTR-FRETベースイムノアッセイが、細胞および組織ホモジネート中の可溶性および凝集mHttを定量化するために開発された（TR-FRET-based duplex immunoassay reveals an inverse correlation of soluble and aggregated mutant huntingtin in Huntington's disease. Baldo B, et al., chem Biol. 2012 Feb 24;19(2):264-75）。
【００７５】
時間分解Forsterエネルギー移動(TR-FRET)ベースアッセイは、関心対象のタンパク質の定量化について広く用いられるハイスループットの、均一な、高感度イムノアッセイである。TR-FRETは短い距離に対して非常に感受性であり、従って、選択的抗体によって認識されるような標的タンパク質上に存在するエピトープの露出および相対的位置の検出に基づいて構造情報を提供することができる。本発明者らは、異なるアミノ末端HTTエピトープに特異的な抗体の使用に基づいてHTTタンパク質を定量化するためのTR-FRETアッセイを以前報告した（Fodale, V. et al.,“Polyglutamine- and temperature-dependent conformational rigidity in mutant huntingtin revealed by immunoassays and circular dichroism spectroscopy”, PLoS One. 2014 Dec 2;9(12):e112262. doi:10.1371/journal. pone.0112262. eCollection 2014。
【００７６】
C．エキソソームの単離
エキソソームは、中間エンドサイトーシス区画である、多小胞体(MVB)の、原形質膜との融合時に、細胞から放出されると考えられている細胞外小胞である。このプロセスにおいて放出される小胞は、エキソソームと呼ばれる。エキソソームは、CNSニューロン間ならびにCSFおよび他の体液中への毒性シヌクレイン種の拡散に寄与すると考えられている。エキソソームは、典型的に、約20 nm〜約100 nmの範囲内にある。
【００７７】
エキソソームを単離する多くの方法が当技術分野において公知である。これらとしては、例えば、免疫親和性捕捉方法、サイズベースの単離方法、示差超遠心分離、エキソソーム沈殿、およびマイクロ流体ベースの単離技術が挙げられる。Loov C. et al. Cell Neurobiol. 2016 (上記)。
【００７８】
免疫親和性捕捉方法は、抽出部分へ結合された抗体を使用し、エキソソームに結合し、試料中の他の材料からそれらを分離する。固体支持体は、例えば、磁気的に誘引可能な微粒子であり得る。ラテックスイムノビーズを使用することができる。
【００７９】
特に、この方法は、脳特異的バイオマーカー（例えば、神経および神経膠マーカー）を使用してCNS由来エキソソームを単離するために有用であり、1つのそのようなマーカーはL1CAMである。別のマーカーはKCAMである。他の比較的脳特異的なタンパク質もまたこの能力において役立ち得る。CNS由来エキソソームは、例えば、KCAM、L1CAMおよびNCAMを含む、脳に関連するタンパク質マーカーによって特徴付けられる。（例えば、US 2017/0014450、US 2017/0102397、US 9,958,460を参照のこと）。CNS由来エキソソームは、親和性捕捉方法を使用して単離することができる。そのような方法は、例えば、L1CAMなどの特異的マーカーに対する抗体へ結合された常磁性ビーズを含む。（例えば、Shi et al.,“Plasma exosomal α-alpha-synuclein is likely CNS-derived and increased in Parkinson’s disease”, Acta Neuropathol. 2014 November; 128(5): 639-650を参照のこと）。
【００８０】
Qiagenは、血清、血漿、細胞培養上澄みおよび他の生体液からエキソソームおよび他の細胞外小胞を効率的に単離するために膜親和性スピンカラムを使用するとしてそのexoEasy Maxi Kitに記載している。
【００８１】
サイズベースの単離方法としては、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーおよび限外濾過が挙げられる。サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、多孔性固定相が、サイズに基づいてエキソソームを分離するために使用される。限外濾過において、多孔性膜フィルターが、それらのサイズまたは分子量に基づいてエキソソームを分離するために使用される。
【００８２】
分画超遠心分離は、試料中の他の成分から密度およびサイズの差に基づいてエキソソームを単離するために、異なる遠心力および期間の、一連の遠心分離サイクルを伴う。遠心力は、例えば、約100,000〜120,000 x gであり得る。タンパク質分解を防ぐために、プロテアーゼ阻害剤を使用することができる。試料から他の大きな物質を除去するために、事前の浄化ステップを使用することができる。
【００８３】
エキソソームは、それらの可溶性または分散性を変えることによって生物学的物質の溶液から単離することができる。例えば、例えば8000 Daの分子量を有する、ポリエチレングリコール(PEG)などのポリマーの添加を、溶液からエキソソームを沈殿させるために使用することができる。
【００８４】
マイクロ流体ベースの方法を、エキソソームを単離するために使用することができる。これらとしては、例えば、音波、電気泳動および電磁方法が挙げられる。例えば、アコースティックナノフィルターは、それらのサイズおよび密度に従って試料中のエキソソームを分離するために超音波定在波を使用する。
【００８５】
CNS由来エキソソームを単離する他の方法は、例えば、Kanninnen, KM et al.,“Exosomes as new diagnostic tools in CNS diseases”, Biochimica et Biophysica Acta, 1862 (2016) 403-410に記載されている。
【００８６】
ヒト神経変性疾患の病因へ結び付けられる、アルファシヌクレインなどの多くのタンパク質は、CNSの外側でならびに脳内で生成され、エキソソームの外表面へ結合され得、これは、血液脳関門を通り抜けて末梢循環に達する。従って、本明細書に開示される方法のある態様において、エキソソーム分画は、エキソソーム表面へ結合された分子を除去するために処理される。これは、例えば、リン酸緩衝液液(PBS)でなど、ストリンジェントな洗浄手順によって行われ得る。そのような処理後、エキソソームの内容物をアッセイのために処理することができる。
【００８７】
III．神経変性状態の診断、病期、進行、予後および発症リスクの決定
生体試料中の神経変性タンパク質バイオマーカーのオリゴマーおよび、任意で、モノマー形態の量（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、過リン酸化および、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの種の量）を含む、バイオマーカープロフィール、ならびに経時的なプロフィールの変化は、神経変性タイプの神経変性状態の存在、重症度および方向性を示す。特に、本明細書に開示されるタンパク質バイオマーカーの、異常な比率、例えば、上昇した量は、神経変性のプロセスを示す。このプロセスは、検査されずに、シヌクレオパチー状態における症状を発現するように至らせ得る。従って、凝集タンパク質、例えば、アルファ-シヌクレイン、アミロイドβ、タウまたはハンチンチンの異常な量によって特徴付けられる神経変性状態（各々、本明細書において、「ニューロパチー状態」、例えば、「シヌクレイノパチー状態」、「アミロイドパチー状態」、「タウオパチー状態」、「ハンチントン状態」と呼ばれる）の診断、病期、進行、速度、予後、薬物反応性および発症リスクを対象（例えば、症候性または無症候性の個体）において確認する方法を本明細書に提供する。
【００８８】
本明細書において使用される場合、用語「診断」は、例えば、その状態の病期を含む、特定の病原性状態を有するかまたは有さないとしての個体の分類を指す。
【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「臨床的に類似しているが病因的に異なる」は、臨床的徴候および／または症状を共有するが、異なる生物学的原因に起因する、状態を指す。
【００９０】
本明細書において使用される場合、用語「病期」は、状態の重症度の相対的な程度、例えば、疾患の疑いあり、初期、中期または進行期を指す。病期分類は、病因、病態生理学、重症度などに基づいて患者をグループ化するために使用することができる。
【００９１】
本明細書において使用される場合、用語「進行」は、経時的な状態の病期または重症度の、変化、またはその欠如を指す。これは、状態の重症度の増加、減少または停滞を含む。ある態様において、進行の速度、即ち、経時的な変化を測定する。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語「予後」は、状態の予測される経過、例えば、進行の見込みを指す。例えば、予後は、状態の重症度が、将来ある時点で増加する、減少するまたは同じままである可能性が高いという予測を含み得る。本開示の文脈において、予後は、個体が以下となる見込みを指し得る：(1)神経変性状態を発症する、(2)状態のある病期から別の、より進行した、病期へ進行する、(3)状態の重症度の減少を示す、(4)ある速度で機能低下を示す、(5)一定期間、ある状態と共に生存する（例えば、生存率）、または(6)状態の再発を有する。状態は、シヌクレオパチー状態（例えば、PD、レヴィー小体認知症、多系統萎縮症またはいくつかの関連するシヌクレイノパチー）、アミロイドパチー状態（例えば、アルツハイマー病）、タウオパチー状態（例えば、アルツハイマー病）、およびハンチントン病であり得る。これらの用語は、医療診断の分野の当業者によって認識されるように、絶対的であるようには意図されない。
【００９３】
本明細書において使用される場合、用語「発症するリスク」は、無症候または症状発現前である個人が疾患の確定診断へ発展する確率を指す。確率を決定することは、「どちらかといえば多分」、「可能性が高い」、「可能性が低い」、またはパーセント見込み、例えば、「90%」のような、正確な確率および相対的確率の両方を含む。リスクは、一般集団と比較することができ、または、年齢、性別、遺伝的リスク、および環境的リスク因子のいずれかに基づいて対象と一致させた集団と比較することができる。そのような場合、対象は、集団の他のメンバーと比較して増加したまたは減少したリスクがあると決定され得る。
【００９４】
一般に、アルファ-シヌクレイン、ベータアミロイド、タウおよびハンチンチンなどの、モノマー神経変性タンパク質に対するオリゴマー神経変性タンパク質の漸増相対量は、神経変性プロセス、疾患の存在、疾患のより進行した病期、より深刻な病期への進行、より悪い予後、疾患を発症する増加したリスク、または実験的治療的介入の無効性と相関する。ある態様において、末梢血中のCNS由来エキソソームからのアルファ-シヌクレインを測定することが好ましい。例えば、正常と比較して少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも100%、少なくとも250%、少なくとも500%または少なくとも1000%の、モノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量の増加は、疾患の存在などの異常な状態を示す。
【００９５】
IV．神経変性状態の診断、病期、進行、予後および発症リスクを推測するための神経変性タンパク質の種のプロフィールのモデリング
神経変性状態の診断、病期、進行、予後およびリスクを決定することは、疾患/健康(診断)、ステージI/ステージII/ステージIII(病期)、寛解する可能性が高い/進行する可能性が高い(予後)またはある範囲におけるスコアを割り当てることなどの、異なる状態またはある状況内の異なるクラスもしくは状態へ、対象を分類するプロセスである。バイオマーカープロフィールを使用する分類方法は、様々な状況に特徴的であるプロフィールを同定すること、およびクラスまたは状況を有する対象由来のプロフィールと関連付けることを伴い得る。そのようなプロフィールを同定することは、異なる状況に属する対象由来のバイオマーカープロフィールの解析、およびパターンまたはプロフィール間の差異を見分けることを伴う。解析はプロフィールの目視検査によってまたは統計解析によって行うことができる。
【００９６】
A．統計解析
典型的に、解析は、統計的に有意な結果を提供するために十分に多い数の試料の統計解析を伴う。当技術分野における公知の任意の統計法がこの目的のために使用することができる。そのような方法、またはツールとしては、非限定的に、相関、ピアソン相関、スピアマン相関、カイ二乗、平均値の比較（例えば、対応T検定、独立T検定、ANOVA）、回帰分析（例えば、単回帰、重回帰、線形回帰、非線形回帰、ロジスティック回帰、多項回帰、段階的回帰、リッジ回帰、ラッソ回帰、エラスティックネット回帰）またはノンパラメトリック分析（例えば、ウィルコクソン順位和検定、ウィルコクソン符号順位検定、符号検定）が挙げられる。そのようなツールは、MATLAB、JMP Statistical SoftwareおよびSASなどの市販の統計パッケージ中に含まれている。そのような方法は、特定のバイオマーカープロフィールを特定の状況へ分類するために使用することができるモデルまたはクラシファイヤーを作る。
【００９７】
統計解析は、オペレーター実行され得るかまたは機械学習によって実行され得る。
【００９８】
B．機械学習
ある態様において、統計解析は、機械学習ツールの使用によって増強される。そのようなツールは学習アルゴリズムを用い、ここで、関連する変数（複数可）が、異なる可能な状況において測定され、状況を区別するパターンが決定され、試験対象を分類するために使用される。従って、本開示の任意の分類方法が、特定のシヌクレイノパチー性状況内の様々な状態に属する対象における1つまたは複数の変数の測定を比較することによって、開発することができる。これは、例えば、様々な診断を有するかまたは様々な時点での様々な病期にある対象におけるオリゴマーアルファ-シヌクレインおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインの1つまたは複数の形態の量を含むバイオマーカープロフィールを決定し、診断、病期、進行、予後、薬物反応性またはリスクの予測を可能にすることを含む。家族歴、生活習慣、化学物質への曝露、様々な表現型形質などの、他の変数が同様に含まれ得る。
【００９９】
1．訓練データセット
訓練データセットは、複数の対象（より一般にはオブジェクトと呼ばれる）の各々についての複数の特徴の各々についての値のベクターを典型的に含むデータセットである。特徴のうちの1つは、対象の分類、例えば、診断またはスケールにおける程度の測定値であり得る。これは、教師あり学習法において使用され得る。他の特徴は、例えば、神経変性タンパク質の複数の異なる形態の各々の測定量であり得る。異なる形態は、例えば、1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、複数の異なる種を含む。典型的に、特徴は、複数の異なるオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む。従って、例えば、個々の対象についてのベクターは、神経変性状態の診断（例えば、パーキンソン病を有するまたは有さないと診断）、ならびに単量体アルファシヌクレイン、二量体アルファシヌクレイン、三量体アルファシヌクレイン、四量体アルファシヌクレイン、... 28量体アルファシヌクレイン、29量体アルファシヌクレインおよび30量体アルファシヌクレインより選択される複数の形態の測定値を含み得る。他の態様において、形態は、比較的低分子量のアルファ-シヌクレイン種などの、種のコレクションである。ある態様において、クラシファイヤーを作製するために使用される訓練データセットは、少なくとも100、少なくとも200、または少なくとも400の異なる対象からのデータを含む。状態を有すると分類された対象 対 状態を有さないと分類された対象の比は、少なくとも2:1、少なくとも1:1、または少なくとも1:2であり得る。代わりに、状態を有すると事前分類された対象は、対象の多くとも66%、多くとも50%、多くとも33%または多くとも20%を含み得る。
【０１００】
2．学習アルゴリズム
機械学習アルゴリズムとも呼ばれる、学習アルゴリズムは、例えば、クラスタリング、分類またはプロフィール認識について、解析モデル構築を自動化する、コンピューター実行アルゴリズムである。学習アルゴリズムは、アルゴリズムへ提供された訓練データセットに対して解析を行う。
【０１０１】
学習アルゴリズムは、クラシファイヤー、分類アルゴリズムまたは診断アルゴリズムとも呼ばれる、モデルを出力する。モデルは、インプットとして、テストデータを受け入れ、アウトプットとして、診断、病期、予後、疾患進行、薬物に対する反応性などの、いずれかのクラス、クラスター群またはスケールにおける位置に属するとしての入力データの推測または分類を生じさせる。
【０１０２】
様々な機械学習アルゴリズムを、対象の状態または状況を推測するために使用することができる。機械学習アルゴリズムは、教師ありまたは教師なしであり得る。学習アルゴリズムとしては、例えば、人工神経回路網（例えば、バックプロパゲーションネットワーク）、判別分析（例えば、BayesianクラシファイヤーまたはFischer分析）、サポートベクターマシン、デシジョンツリー（例えば、再帰分割プロセス、例えば、CART - 分類および回帰ツリー）、ランダムフォレスト、線形分類器（例えば、多重線形回帰(MLR)、部分最小二乗(PLS)回帰および主成分回帰(PCR)）、階層的クラスタリングならびにクラスター解析が挙げられる。学習アルゴリズムは、推測、例えば、対象の疾患状況についての推測を行うために使用することができるモデルまたはクラシファイヤーを作る。
【０１０３】
3．検証
モデルは、検証データセットを使用して続いて検証され得る。検証データセットは、典型的に、訓練データセットと同じ特徴についてのデータを含む。モデルが訓練データセットに対して実行され、真陽性、真陰性、偽陽性および偽陰性の数が、モデルの性能の指標として、決定される。
【０１０４】
モデルは、次いで、その有用性を決定するために検証データセットに対して試験され得る。典型的に、学習アルゴリズムは複数のモデルを作製する。ある態様において、モデルは、検討中の状態を診断するために使用される標準臨床的尺度に対する忠実度に基づいて検証することができる。これらのうちの1つまたは複数が、その性能特性に基づいて選択することができる。
【０１０５】
C．コンピューター
本明細書に記載される状況のいずれかに基づく対象の状態の分類は、プログラム可能なデジタルコンピューターによって行うことができる。コンピューターは、対象中の、タンパク質バイオマーカーの1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、モノマー形態（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの種）の少なくとも測定値を受容しそして任意で保存する有形メモリ、ならびに分類アルゴリズムを具体化するコードの実行によってこのデータを処理するプロセッサーを含むことができる。分類アルゴリズムは、オペレーターが実行した、または機械学習で実行した、統計解析の結果であり得る。
【０１０６】
第1のコンピューターへデータを送信しかつ／またはリモートコンピューターへ本明細書に記載されるような分類などの試験の結果を送信するように構成された通信ネットワークと連絡する、記載されるような第1のコンピューターを、システムは含む。通信ネットワークは、例えば、非限定的に、デジタル加入者線(DSL)、ケーブルモデム、ファイバー、ワイヤレス、人工衛星および電力線ブロードバンド(BPL)を含む、高速伝送網を利用し得る。システムは、通信ネットワークを通して第1のコンピューターへ接続されたリモートコンピューターをさらに含み得る。
【０１０７】
D．モデル実行および推測実施
選択されたモデルは、オペレーター実行統計解析または機械学習のいずれかに由来し得る。いずれの場合でも、モデルは、試験対象について推測（例えば、予測）を行うために使用され得る。例えば、モデルによって使用される特徴の値を含有する、ベクターを含む、例えば、試験データセットの形態の、バイオマーカープロフィールは、試験対象から採取された試料から作成することができる。試験データセットは、訓練データセット中に使用された同じ特徴の全て、またはこれらの特徴のサブセットを含み得る。モデルは、次いで、試験データセットへ適用されるかまたはこれに対して実行される。神経変性タンパク質プロフィールを状態、疾患状況、予後、進行のリスク、薬物応答の見込みなどと関連付けることは、モデルを実行する形式である。関連付けは人によってまたは機械によって行うことができる。選択は関連付けの操作の複雑さに依存し得る。これは、推測、例えば、クラスもしくはクラスター群（例えば、診断）、またはスケールにおける場所（例えば、治療的介入に対して反応する見込み）に属するとしての対象の分類をもたらす。
【０１０８】
ある態様において、クラシファイヤーは、神経変性タンパク質の、複数のオリゴマータンパク質形態および、典型的に、しかし必ずではなく、1つまたは複数のモノマー形態を含む。クラシファイヤーは、例えば、形式AX+BY+CZ = Nの、線形モデルであってもなくてもよく、ここで、A、BおよびCは、形態X、YおよびZの測定量である。クラシファイヤーは、例えば、サポートベクターマシン解析を必要とし得る。例えば、推測モデルはパターン認識を行い得、ここで、バイオマーカープロフィールは、正常と異常との間のスケール上にあり、様々なプロフィールが正常の方へまたは異常の方へ、より向かっている。従って、クラシファイヤーは、プロフィールが正常または異常である信頼水準を示し得る。
【０１０９】
クラシファイヤーまたはモデルは、1つまたは複数の測定された形態から、モデルとして機能する単一の診断数を生じさせ得る。神経病理学的状況、例えば、シヌクレオパチー性状況（例えば、診断、病期、進行、予後およびリスク）を分類することは、診断数が閾値（「診断レベル」）を上回るかまたは下回るかどうかを決定することを伴い得る。例えば、診断数は、モノマー神経変性タンパク質（例えば、アルファ-シヌクレイン）に対するオリゴマー神経変性タンパク質（例えば、アルファ-シヌクレイン）の相対量であり得る（各々の特定の種またはリン酸化形態の測定を含む）。その閾値は、例えば、神経変性（例えば、シヌクレオパチー性）状態のいかなる徴候も有さない正常な個体を上回る診断数の一定の偏差に基づいて決定することができる。診断数の、平均値、中央値または最頻値などの、代表値は、統計的に有意な数の正常および異常な個体において決定することができる。正常な量を上回るカットオフは、神経変性（例えば、シヌクレイノパチー性）状態の診断レベルとして選択され得る。その数は、例えば、変動または標準偏差などの、代表値からの偏差の一定の程度であり得る。一態様において、偏差の測定値は、正常平均値からの標準偏差のZスコアまたは数である。ある態様において、1.5:1、2:1、5:1、または10: 1より大きな、オリゴマーアルファ-シヌクレイン対モノマーアルファ-シヌクレインの量は、神経変性、例えば、シヌクレオパチー状態の存在または増加した発現リスクを示す。
【０１１０】
モデルは、所望のレベルの感度、特異性または陽性予測力を提供するように選択され得る。例えば、診断レベルは、少なくとも80%、90%、95%もしくは98%のいずれかの感度、および／または少なくとも80%、90%、95%もしくは98%のいずれかの特異性、および／または少なくとも80%、90%、95%もしくは98%のいずれかの陽性予測値を提供することができる。試験の感度は、陽性の試験結果が出る実際の陽性のパーセンテージである。試験の特異性は、陰性の試験結果が出る実際の陰性のパーセンテージである。試験の陽性予測値は、陽性の試験結果が出る対象が実際の陽性である確率である。
【０１１１】
V．神経変性状態を処置するための治療的介入の開発
別の局面において、神経変性状態、例えば、シヌクレオパチー状態、アミロイドパチー状態、タウオパチー状態、およびハンチントン病についての治療的介入の実際的な開発を可能にする方法を、本明細書に提供する。方法は、数ある中でも、臨床試験について対象を選択する工程、および対象のセットにおける治療的介入の有効性を決定する工程を伴う。
【０１１２】
神経変性タンパク質（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの種）のバイオマーカープロフィールをモニタリングする工程を含む方法は、実験的治療的介入がシヌクレイノパチーの臨床的発症の予防もしくはその後の進行の阻害において有効であるかどうか、または、そのような状態を処置するための薬物候補の効能を試験するために対象が臨床試験に登録されるべきかどうかを決定するために有用である。神経変性タンパク質のバイオマーカープロフィールまたはバイオマーカープロフィールの変化（例えば、タンパク質バイオマーカー（例えば、オリゴマーおよびモノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよびモノマーアミロイドβ、オリゴマーおよびモノマータウ；ならびにオリゴマーおよびモノマーハンチンチンの種）のオリゴマーおよびモノマー形態の相対量または相対量の変化率）は、例えば基礎疾患プロセスを含む、状態に対する処置効果の直接的決定を可能にする。
【０１１３】
A．対象登録
臨床試験は、医薬などの、潜在的な治療的介入の効能および安全性を試験するための対象の登録を伴う。典型的に、対象は、状況の異なる状態を有するように選択される；例えば、疾患の診断を有するもしくは有さない、または異なる疾患病期にある、または異なる疾患サブタイプ、または異なる予後の対象。臨床試験対象は、同じにまたは異なって処置される異なる群へ階層化することができる。階層化は、疾患の病期を含む、任意の数の因子に基づき得る。疾患病期分類は、診断所見を使用する分類システムであり、病因、病態生理学および重症度などの因子に基づいて患者のクラスターをもたらす。それは、臨床的に均質な患者をクラスター化し、ケアの質、臨床転帰の分析、リソースの利用、および代替処置の効能を評価するための基礎として役立ち得る。
【０１１４】
一つの方法において、潜在的な臨床試験対象は、少なくとも部分的に、タンパク質バイオマーカー（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの種）のオリゴマーおよび、任意で、モノマー形態のバイオマーカープロフィールに対して階層化される。従って、例えば、異なるバイオマーカープロフィール（例えば、より高いおよびより低い相対量）を有する対象は、異なる群へ割り当てられ得る。
【０１１５】
臨床試験における対象の集団は、薬物が転帰において統計的に有意な差をもたらすかどうかを示すために十分であるべきである。このパワーレベルに依存して、試験中の個体の数は、少なくとも20、少なくとも100または少なくとも500の対象であり得る。これらの中でも、神経変性状態を有することと一致するバイオマーカープロフィール（例えば、増加したレベルのシヌクレインバイオマーカー、即ち、モノマーアルファ-シヌクレインに対するオリゴマーアルファ-シヌクレインの相対的レベル）を示す有意な数の個体が存在しなければならない。例えば、対象の少なくとも20%、少なくとも35%、少なくとも50%、または少なくとも66%が、そのようなバイオマーカープロフィール（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの様々な種を含む）を最初に有し得る。さらに、有意な数の対象がクラス状況間で分割される。例えば、対象の少なくとも20%、少なくとも35%、少なくとも50%、少なくとも66%または100%が、神経変性状態（例えば、シヌクレオパチー状態（例えば、PD）、アミロイドパチー状態、タウオパチー状態およびハンチントン病）の診断を最初に有し得る。
【０１１６】
B．薬物開発
臨床試験の開始で、異なる階層化群に対する治療的介入の有効性は、神経変性タンパク質のバイオマーカープロフィール（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの種のプロフィール）に対する効果の関数として迅速に決定することができる。より具体的には、タンパク質のオリゴマーおよび、任意で、モノマー形態のバイオマーカープロフィールの変化は、治療的介入の臨床的有効性を予測する。方法は、タンパク質バイオマーカーのオリゴマーおよび、任意で、モノマー形態（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの種）を含むバイオマーカープロフィールを決定するために、個体を先ず試験する工程を一般に伴う。測定後、治療的介入、例えば、実験的薬物を、対象の少なくともサブセットへ投与する。典型的に、対象の少なくともサブセットにプラセボを与えるかまたは処置を与えない。場合によっては、対象はそれら自身の対照として役立ち、先ずプラセボを受容し、次いで、比較のために、実験的介入を受容し、または逆を受容する。ある場合において、これは、既に認識された処置形態の投与と併せて行われ得る。集団は治療的介入の投薬、タイミングおよび投与速度によって分割され得る。倫理規定は、統計的に有意な改善が試験対象において見られる場合には試験を中止することを要求し得る。本明細書において使用される場合、「実験的薬物」および「薬物候補」は、治療効果について試験されたかまたは試験される薬剤を指す。「推定神経保護剤」は、神経保護作用を有すると試験されたかまたは試験される薬剤を指す。
【０１１７】
治療的介入の投与後、バイオマーカープロフィールを再び決定する。
【０１１８】
治療的介入は薬物候補の投与であり得る。標準統計法を使用して、治療的介入が、タンパク質バイオマーカーのオリゴマーおよび、任意で、モノマー形態（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの種）を含むバイオマーカープロフィールに対して有意な影響を有したかどうかを決定することができる。一般に、統計的に有意な変化、特に、最初のバイオマーカープロフィールと比較しての、正常プロフィールの方へのシフトは、治療的介入が神経保護的であり、従って、臨床的発症を遅らせるか、または神経変性状態（例えば、シヌクレオパチー状態、アミロイドパチー状態、タウオパチー状態、ハンチントン病）の進行を遅くするかもしくは好ましくは逆転させることを示す。
【０１１９】
従って、タンパク質（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの種）のモノマー形態に対するオリゴマー形態（代わりに、タンパク質のオリゴマー形態および総形態）を含むバイオマーカープロフィールが測定され得る対象としては、例えば、以下が挙げられる：(1)神経変性状態（例えば、シヌクレオパチー状態、アミロイドパチー状態、タウオパチー状態、ハンチントン病）について無症候である対象；(2)最小限の神経変性疾患症状を有するかまたは神経変性状態を示唆する徴候を有さない対象（例えば、特に、ある遺伝的および／または環境的リスク因子が同定された場合、神経変性状態について「疑いあり」または「症状発現前」と診断され得る対象）；(3)「可能性の高い」神経変性状態の診断を有する対象および神経変性状態と診断された（「確定診断」）対象。これらとしては以下が挙げられる：例えば、(1)シヌクレオパチー状態について無症候である対象；(2)最小限のパーキンソン病様症状を有するかまたはシヌクレイノパチー状態を示唆する徴候を有さない対象（例えば、特に、ある遺伝的および／または環境的リスク因子が同定された場合、PDまたはいくつかの関連するシヌクレイノパチーについて「疑いあり」または「症状発現前」と診断され得る対象）；(3)「可能性の高い」シヌクレイノパチー（例えば、PD）の診断を有する対象およびシヌクレイノパチー状態と診断された（「確定診断」）対象。
【０１２０】
対象は、典型的にヒトであるが、非ヒト動物、例えば、PDについてのモデルとして使用される非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）、ネコ、イヌ、他の家畜化された四肢動物（例えば、ウマ、ヒツジおよびブタ）、ならびに非ヒト霊長動物（例えば、サル）も含む。動物モデルは、遺伝モデルにおよび神経毒に基づくモデルの両方を含む。そのようなモデルにおいて使用される神経毒は、例えば、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)および1-メチル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)投与、ならびにパラコートおよびロテノンを含む。遺伝モデルは、SNCA (α-syn、PARK1、および4)、PRKN (パーキンRBR E3ユビキチンタンパク質リガーゼ、PARK2)、PINK1 (PTEN誘導推定キナーゼ1、PARK6)、DJ-1 (PARK7)、およびLRRK2 (ロイシンリッチリピートキナーゼ2、PARK8)における遺伝子突然変異を含む。
【０１２１】
シヌクレイノパチーなどの神経変性状態のための神経保護療法についての臨床試験は、潜在的な療法の有効性を即座に示す尺度を必要とする。そうでなければ、臨床観察に基づく薬効の決定は、通常、何カ月もかかる。神経変性タンパク質オリゴマーおよび任意でモノマーを含むバイオマーカープロフィールは、そのような尺度を提供し、従って、PDなどの致命的な脳障害に苦しむ対象における疾患修飾薬物効能の実際的な評価を可能にする。
【０１２２】
VI．処置方法
本明細書に記載されるようなバイオマーカープロフィールに基づいて対象が分類される神経変性状態（例えば、シヌクレオパチー状態、アミロイドパチー状態、タウオパチー状態、ハンチントン病）の病期またはクラスに依存して、対象は治療的介入の必要があり得る。本明細書に開示される方法によって、神経変性状態（例えば、シヌクレオパチー状態、およびアミロイドパチー状態、タウオパチー状態、ハンチントン病）を示すと決定された対象を、状態を処置するために有効な治療的介入で処置する方法を本明細書に提供する。タンパク質バイオマーカー（例えば、オリゴマーおよびモノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよびモノマーアミロイドβ、オリゴマーおよびモノマータウ；ならびにオリゴマーおよびモノマーハンチンチン）のモノマー形態に対するタンパク質バイオマーカーのオリゴマー形態の量を変化させる治療的介入、特に、減少させる治療的介入は、有効な処置、例えば、本明細書中の方法によって開発され、そして臨床的に検証された治療的介入を反映する。
【０１２３】
本明細書において使用される場合、用語「治療的介入」、「療法」および「処置」は、治療効果をもたらす（例えば、「治療的に有効」である）介入を指す。治療的に有効な介入は、シヌクレイノパチー状態などの疾患を、予防する、その進行を遅くする、その症状の発症を遅らせる、その状態を改善する（例えば、その寛解をもたらす）、その症状を改善する、または治癒する。治療的介入は、例えば、処置の投与、医薬、または治療的意図を持っての生物学的もしくは栄養補助物質の投与を含み得る。治療的介入に対する反応は完全または部分的であり得る。いくつかの局面において、疾患の重症度は、例えば、投与前の個体または処置を受けない対照個体と比較した場合、少なくとも10%減少する。いくつかの局面において、疾患の重症度は、少なくとも25%、50%、75%、80%、または90%減少するか、または場合によっては、標準診断技術を使用してもはや検出可能でない。対象のあるサブグループが療法に対して反応しない場合があることを認識して、治療有効性の一つの尺度は、少なくとも100人の対象に関して、介入を受けている対象の少なくとも90%についての有効性であり得る。
【０１２４】
本明細書において使用される場合、治療的介入（「有効な処置」もしくは「に対して有効な処置」）または薬学的薬物の量（「有効量」）を修飾するような用語「有効な」は、上述のような、障害を改善するためのその処置または量を指す。例えば、所与のパラメータについて、治療有効量は、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、75%、80%、90%、または少なくとも100%のパラメータの増加または減少を示す。治療効能はまた、「倍」増加または減少として表すことができる。例えば、治療有効量は、対照と比べて少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、またはそれ以上の効果を有し得る。現在、パーキンソン病様対象における運動症状の重症度に対する臨床的効能は、UPDRSおよびHoehn and Yahrスケール；精神（metal）および認知症状についてはADAS-cogまたはMMPIスケールなどの標準化スケールを使用して測定することができる。（そのようなスケールの有用性は、基礎疾患状態のタイプまたは性質に必ずしも依存するとは限らないことが、認識される）。
【０１２５】
従って、いくつかの方法によれば、対象は、先ず、対象由来の生体試料中の神経変性タンパク質のオリゴマー形態および／またはモノマー形態を含むバイオマーカープロフィールについて試験される。適切な状態またはクラスへの分類が、バイオマーカープロフィールに基づいて決定される。分類に基づいて、対象への最適に有効な治療的介入の投与についての、タイプ、量、経路およびタイミングに関して決定がなされ得る。
【０１２６】
A．シヌクレイノパチー状態
ある態様において、PDについての症状修飾治療的介入（即ち、対症または緩和療法）は、ドーパミンアゴニスト（例えば、プラミペキソール(例えば、Mirapex)、ロピニロール(例えば、Requip)、ロチゴチン(例えば、Neupro)、アポモルフィン(例えば、Apokyn)）、レボドパ、カルビドパ-レボドパ(例えば、Rytary、Sinemet)、MAO-B阻害剤（例えば、セレギリン(例えば、Eldepryl、Zelapar)もしくはラサギリン(例えば、Azilect)）、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ(COMT)阻害剤（例えば、エンタカポン(Comtan)もしくはトルカポン(Tasmar)）、抗コリン作用薬（例えば、ベンズトロピン(例えば、Cogentin)もしくはトリヘキシフェニジル）、アマンタジンまたはコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、リバスチグミン(Exelon)）またはいくつかの同様の薬剤もしくは薬剤の群より選択される薬物の投与を含む。
【０１２７】
ある態様において、PDについての神経保護的または疾患修飾治療的介入は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、以下の仮特許出願のいずれかに記載されるような推定的疾患修飾薬の投与を含む：2017年3月27日に出願された、シリアル番号62/477187；2017年4月10日に出願された、シリアル番号62/483,555；2017年4月13日に出願された、シリアル番号62/485,082；2017年5月26日に出願された、シリアル番号62/511,424；2017年7月3日に出願された、シリアル番号62/528,228；2017年4月24日に出願された、シリアル番号62/489,016；2017年6月30日に出願された、シリアル番号62/527,215。
【０１２８】
B．アミロイドパチー状態
ある態様において、アミロイドパチー状態についての症状修飾治療的介入（即ち、対症または緩和療法）は、Razadyne（登録商標）(ガランタミン)、Exelon（登録商標）(リバスチグミン)、およびAricept（登録商標）(ドネペジル)などの薬物の投与を含む。
【０１２９】
C．タウオパチー状態
ある態様において、タウオパチー状態についての症状修飾治療的介入（即ち、対症または緩和療法）は、Razadyne（登録商標）(ガランタミン)、Exelon（登録商標）(リバスチグミン)、およびAricept（登録商標）(ドネペジル)、またはPDの対症療法について使用される本明細書において引用されるものなどの薬物の投与を含む。
【０１３０】
D．ハンチントン病
ある態様において、ハンチントン病についての症状修飾治療的介入（即ち、対症または緩和療法）は、テトラベナジン(Austedo（登録商標）(デューテトラベナジン)、IONIS-HTTRx、ならびに様々な神経弛緩薬およびベンゾジアゼピン類などの薬物の投与を含む。
【０１３１】
VII．治療的介入に対する反応性を評価する方法
神経変性障害（例えば、シヌクレオパチー状態、アミロイドパチー状態、タウオパチー状態、ハンチントン病）に苦しむ対象において、治療的介入の有効性または治療的介入に対する対象の反応性は、バイオマーカープロフィールに対する治療的介入の効果を評価することによって決定することができる。これは、任意の神経変性状況、例えば、診断、病期、進行、予後およびリスクにおける有効性を含む。より正常のプロフィールの方へのバイオマーカープロフィールの変化は、治療的介入の有効性を示す。
【０１３２】
タンパク質バイオマーカーのオリゴマーおよび、任意で、モノマー形態（例えば、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよび、任意で、モノマーアミロイドβ、オリゴマーおよび、任意で、モノマータウ；ならびにオリゴマーおよび、任意で、モノマーハンチンチンの種）を含むバイオマーカープロフィールの使用は、そのような事態における処置効能を判断するための従来の手段（例えば、総体的症状、機能的スケールまたは放射線スキャンの変化）に比べて利点を与える。効能を判断するそのような従来の手段は低感度、不正確かつ半定量的であるだけでなく、正確に測定するために十分な大きさになる前に長期間（例えば、数年）を典型的に必要とする。従って、試験される潜在的に有用な処置の数は著しく減少し、臨床試験の費用および従って有用な薬の最終的なコストは実質的に増加する。
【０１３３】
ある態様において、タンパク質バイオマーカー種（例えば、アルファ-シヌクレイン、アミロイドβ、タウまたはハンチンチン）のバイオマーカープロフィールは、複数回、典型的に、治療的介入の投与の前、中および後に、または治療的介入後の複数の時点で、測定される。
【０１３４】
VIII．キット
別の局面において、オリゴマーおよびモノマータンパク質バイオマーカー（例えば、オリゴマーおよびモノマーアルファ-シヌクレイン；オリゴマーおよびモノマーアミロイドβ、オリゴマーおよびモノマータウ；ならびにオリゴマーおよびモノマーハンチンチンの種）を検出し、そのように得られた結果を解釈するためのキットを、本明細書に提供する。キットは、体液からエキソソームを単離するための試薬、全てのエキソソームからCNS由来エキソソームを優先的に単離するための試薬、タンパク質バイオマーカー（例えば、アルファ-シヌクレイン、アミロイドβ、タウまたはハンチンチン）のオリゴマー形態を検出するために十分な第1の試薬、およびタンパク質バイオマーカー（例えば、アルファ-シヌクレイン、アミロイドβ、タウまたはハンチンチン）のモノマー形態を検出するために十分な第2の試薬、または総タンパク質バイオマーカー種（例えば、アルファ-シヌクレイン、アミロイドβ、タウまたはハンチンチン）を検出するための試薬を保持するための容器を含むことができる。
【０１３５】
例えば、生体試料中のシヌクレイノパチー性疾患状況を検出および病期分類することにおける使用のためのキットは、試薬、緩衝液、酵素、抗体、およびこの目的に特異的な他の組成物を含むことができる。キットはまた、典型的に、使用説明書ならびにデータ解析および解釈のためのソフトウェアを含むことができる。キットは、標準として役立つ試料をさらに含み得る。各溶液または組成物はバイアルまたはボトル中に含有され得、全てのバイアルは、商用販売用の箱の中に厳重に閉じ込められた状態で保持され得る。
【０１３６】
例示的な態様
限定するものではないが、本発明の例示的な態様は、以下を含む。
１．
以下の工程：
a)生体試料のコレクション中の各生体試料を脳由来エキソソームについて濃縮する工程であって、ここで：
(i)生体試料のコレクションが対象のコホート中の対象に由来し、ここで、コホートが以下：
(1)複数の異なる病期の各々にある神経変性状態と診断された複数の対象であって、ここで、診断された対象の各々が推定神経保護剤を受けたことがある、複数の対象、および／または
(2)複数の健康なコントロール対象、
を含む対象を含み、ここで、生体試料が、推定神経保護剤の投与前に、および投与中に再び1回または複数回、および任意で、投与後に、収集された、工程；
b)バイオマーカー試料を生成するために、エキソソームの内部区画からタンパク質内容物を単離する工程；
c)データセットを作成するために、バイオマーカー試料において、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の量を測定する工程であって、
ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
d)神経変性タンパク質形態の各々の量の差を比較するために、
(i)疾患進行速度または推定神経保護剤に対する反応の程度を予測する診断アルゴリズムを決定するために、経時的に個々の対象において；または
(ii)(1)病原診断を行う、(2)臨床的に類似しているが病因的に異なる神経変性障害サブグループを分ける、または(3)対象が推定神経保護剤に反応する可能性が高いかどうかもしくは対象が推定神経保護剤に反応する可能性が高い程度を予測する、診断アルゴリズムを決定するために、異なる対象間で
データセットに対して統計解析を行う工程
を含む、方法。
２．
濃縮工程の前に：
I)対象のコホートを提供する工程であって、ここで、コホートが以下を含む対象：(i)複数の異なる病期の各々にある神経変性状態と診断された複数の対象、および／または(ii)複数の健康なコントロール対象を含む、工程；
II)診断された対象の各々へ推定神経保護剤を投与する工程；
III)推定神経保護剤の投与前に、および投与中に再び1回または複数回、および任意で、投与後に、コホート中の対象の各々から生体試料を収集する工程
をさらに含む、態様1または上記態様のいずれかの方法。
３．
測定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、態様1または上記態様のいずれかの方法。
４．
診断アルゴリズムが、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態（例えば、相対量；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される形態（複数可）を使用する、態様1または上記態様のいずれかの方法。
５．
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、態様1または上記態様のいずれかの方法。
６．
h)標準臨床的尺度に対して診断アルゴリズムのうちの1つまたは複数を検証する工程
をさらに含む、態様1または上記態様のいずれかの方法。
７．
統計解析が、相関、ピアソン相関、スピアマン相関、カイ二乗、平均値の比較（例えば、対応T検定、独立T検定、ANOVA）、回帰分析（例えば、単回帰、重回帰、線形回帰、非線形回帰、ロジスティック回帰、多項回帰、段階的回帰、リッジ回帰、ラッソ回帰、エラスティックネット回帰）またはノンパラメトリック分析（例えば、ウィルコクソン順位和検定、ウィルコクソン符号順位検定、符号検定）を含む、態様1または上記態様のいずれかの方法。
８．
統計解析がコンピューターによって実行される、態様1または上記態様のいずれかの方法。
９．
統計解析が機械学習を含む、態様8または上記態様のいずれかの方法。
１０．
対象がヒトである、態様1または上記態様のいずれかの方法。
１１．
神経変性状態がシヌクレイノパチー性障害である、態様1または上記態様のいずれかの方法。
１２．
シヌクレイノパチー性障害がパーキンソン病である、態様11または上記態様のいずれかの方法。
１３．
シヌクレイノパチー性障害がレヴィー小体認知症である、態様11または上記態様のいずれかの方法。
１４．
神経変性タンパク質がアルファ-シヌクレインであり、オリゴマー形態が、1つまたは複数の比較的低分子量のシヌクレインオリゴマーを含む、態様12または上記態様のいずれかの方法。
１５．
神経変性タンパク質がアルファ-シヌクレインであり、オリゴマーシヌクレイン形態が約6量体〜18量体のサイズ範囲内のオリゴマー形態を含む、態様12または上記態様のいずれかの方法。
１６．
標準臨床的尺度が、UPDRSスコア、CGIスコアおよび放射線学的所見より選択される、態様12または上記態様のいずれかの方法。
１７．
神経変性状態が、アミロイドパチー、タウオパチーまたはハンチントン病である、態様1または上記態様のいずれかの方法。
１８．
生体試料が静脈血試料を含む、態様1または上記態様のいずれかの方法。
１９．
異なる病期が、疑いあり、初期、中期、および臨床的進行のうちの1つまたは複数を含む、態様1または上記態様のいずれかの方法。
２０．
投与中または投与後の時間が、処置後1、2、3ヵ月またはそれ以上より選択される、態様1または上記態様のいずれかの方法。
２１．
濃縮工程が、1つまたは複数の脳特異的タンパク質マーカーを使用することを含む、態様1または上記態様のいずれかの方法。
２２．
脳特異的マーカーのうちの少なくとも1つがK1camを含む、態様21または上記態様のいずれかの方法。
２３．
単離工程が、各濃縮試料中のエキソソームを洗浄し、表面膜結合タンパク質を除去することを含む、態様1または上記態様のいずれかの方法。
２４．
エキソソームをPBSで洗浄する、態様23または上記態様のいずれかの方法。
２５．
神経変性タンパク質の形態を、ゲル電気泳動、ウェスタンブロットまたは蛍光技術によって測定する、態様1または上記態様のいずれかの方法。
２６．
以下の工程：
a)対象からの生体試料を脳由来エキソソームについて濃縮する工程；
b)バイオマーカー試料を生成するために、エキソソームの内部区画からタンパク質内容物を単離する工程；
c)神経変性タンパク質プロフィールを作成するために、バイオマーカー試料において、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の量を測定する工程であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
d)神経変性タンパク質プロフィールを関連付ける工程であって、以下：
(1)病原診断を行う、
(2)複数の臨床的に類似しているが病因的に異なる神経変性障害サブグループのうちの1つへ対象を分類する、または
(3)対象が推定神経保護剤に反応する可能性が高いかどうかもしくは対象が推定神経保護剤に反応する可能性が高い程度を予測する
のうちの1つを行う、工程
を含む、方法。
２７．
関連付ける工程が、神経変性タンパク質プロフィールに対して、態様1の診断アルゴリズムを実行することを含む、態様26または上記態様のいずれかの方法。
２８．
診断アルゴリズムが、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態（例えば、モノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量）；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される神経変性タンパク質形態を使用する、態様26または上記態様のいずれかの方法。
２９．
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、態様26または上記態様のいずれかの方法。
３０．
ある期間にわたって対象から複数の生体試料を収集する工程を含み、任意でここで、対象が該期間中に推定または公知の神経保護剤を受けており、ここで、診断アルゴリズムが、疾患進行速度または推定神経保護剤に対する反応の程度を予測する、態様26の方法。
３１．
診断アルゴリズムが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を使用する、態様26または上記態様のいずれかの方法。
３２．
診断アルゴリズムが、神経変性タンパク質の1つまたは複数のオリゴマー形態のパターンを使用する、態様26または上記態様のいずれかの方法。
３３．
以下の工程：
a)複数の対象の各々について、以下：
(1)神経変性状態の状況、および
(2)CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮された生体試料中の1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の量の定量的測定値
を示す値を含むデータセットを提供する工程であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
b)データセットに対して統計解析を行う工程であって、個体における神経変性状態の状況を推測するモデルを開発する、工程
を含む、方法。
３４．
1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の定量的測定値が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態（例えば、モノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量）；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、態様33または上記態様のいずれかの方法。
３５．
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、態様33または上記態様のいずれかの方法。
３６．
統計解析がコンピューターによって行われる、態様33または上記態様のいずれかの方法。
３７．
統計解析がコンピューターによって行われない、態様33または上記態様のいずれかの方法。
３８．
統計解析が、相関、ピアソン相関、スピアマン相関、カイ二乗、平均値の比較（例えば、対応T検定、独立T検定、ANOVA）、回帰分析（例えば、単回帰、重回帰、線形回帰、非線形回帰、ロジスティック回帰、多項回帰、段階的回帰、リッジ回帰、ラッソ回帰、エラスティックネット回帰）またはノンパラメトリック分析（例えば、ウィルコクソン順位和検定、ウィルコクソン符号順位検定、符号検定）を含む、態様33または上記態様のいずれかの方法。
３９．
統計解析が、データセットに対して機械学習アルゴリズムを訓練することを含む、態様36または上記態様のいずれかの方法。
４０．
機械学習アルゴリズムが以下：人工神経回路網（例えば、バックプロパゲーションネットワーク）、デシジョンツリー（例えば、再帰分割プロセス、CART）、ランダムフォレスト、判別分析（例えば、BayesianクラシファイヤーまたはFischer分析）、線形分類器（例えば、多重線形回帰(MLR)、部分最小二乗(PLS)回帰、主成分回帰(PCR)）、混合または変量効果モデル、ノンパラメトリック分類器（例えば、ｋ最近傍）、サポートベクターマシン、およびアンサンブル法（例えば、バギング、ブースティング）より選択される、態様39または上記態様のいずれかの方法。
４１．
状況が、神経変性状態の診断、病期、予後または進行より選択される、態様33または上記態様のいずれかの方法。
４２．
状況が、カテゴリー変数（例えば、バイナリー状況または複数のカテゴリー状況のうちの1つ）として測定される、態様33または上記態様のいずれかの方法。
４３．
カテゴリーが、神経変性状態を有することと一致する診断（例えば、陽性または有すると診断される）および神経変性状態を有することと矛盾する診断（例えば、陰性または有さないと診断される）を含む、態様42または上記態様のいずれかの方法。
４４．
カテゴリーが神経変性状態の異なる病期を含む、態様42または上記態様のいずれかの方法。
４５．
状況が、（例えば、スケールにおける）連続変数として測定される、態様33または上記態様のいずれかの方法。
４６．
連続変数が、神経変性状態の範囲または程度である、態様41または上記態様のいずれかの方法。
４７．
対象が、動物、例えば、魚類、鳥類、両生類、爬虫類、または哺乳動物、例えば、げっ歯動物、霊長動物もしくはヒトである、態様33または上記態様のいずれかの方法。
４８．
複数の対象が、少なくとも25、50、100、200、400または800のうちのいずれかである、態様33または上記態様のいずれかの方法。
４９．
各対象について、定量的測定値が決定される試料を第1の時点で採取し、神経変性状態の状況を、後の時点である第2の時点で決定する、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５０．
神経変性タンパク質が、アルファ-シヌクレイン、タウ、アミロイドβおよびハンチンチンより選択される、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５１．
生体試料が、血液または血液分画（例えば、血漿または血清）を含む、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５２．
少なくとも1つのオリゴマー形態がリン酸化形態を含む、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５３．
神経変性タンパク質がアルファ-シヌクレインであり、データセットが、個々にまたは集合的に、4〜16量体の範囲内のオリゴマー、またはp129アルファ-シヌクレインを含むオリゴマーの定量的測定値を含む、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５４．
神経変性タンパク質がアミロイドβの可溶性オリゴマー形態であり、データセットが、個々にまたは集合的に、8〜24量体の近似サイズ範囲内のオリゴマーの定量的測定値を含む、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５５．
神経変性タンパク質がタウであり、データセットが、個々にまたは集合的に、3〜15量体の近似範囲内のオリゴマーの定量的測定値を含む、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５６．
神経変性タンパク質がタウであり、オリゴマー形態がタウの過リン酸化形態である、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５７．
神経変性タンパク質がハンチンチンである、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５８．
神経変性状態が、パーキンソン病、レヴィー小体認知症、多系統萎縮症または関連障害より選択されるシヌクレイノパチーである、態様33または上記態様のいずれかの方法。
５９．
神経変性状態が、アミロイドパチー、例えば、アルツハイマー病である、態様33または上記態様のいずれかの方法。
６０．
神経変性状態が、タウオパチー、例えば、アルツハイマー病である、態様33または上記態様のいずれかの方法。
６１．
神経変性状態がハンチントン病である、態様33または上記態様のいずれかの方法。
６２．
神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態の、発症リスク、診断、病期、予後、または進行を推測する方法であって、以下の工程：
a)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する工程であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
b)データセットに対してモデル、例えば、態様33のモデルを実行する工程であって、神経変性状態の、発症リスク、診断、病期、予後、または進行を推測する、工程
を含む、方法。
６３．
定量的測定値が決定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、態様62または上記態様のいずれかの方法。
６４．
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、態様62または上記態様のいずれかの方法。
６５．
モデルが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を、統計的に有意な数の対照個体における相対量と比較することを含む、態様62または上記態様のいずれかの方法。
６６．
モデルが、複数のオリゴマー形態の相対量のパターンを検出することを含み、これからモデルが推測を行う、態様62または上記態様のいずれかの方法。
６７．
対象が神経変性状態について無症候または症状発現前である、態様62または上記態様のいずれかの方法。
６８．
対象が、定期的な通院中にまたは医師の通常の医療活動の一部として、医師などの医療提供者へ示す、態様62または上記態様のいずれかの方法。
６９．
モデルがコンピューターによって実行される、態様62または上記態様のいずれかの方法。
７０．
モデルがコンピューターによって実行されない、態様62または上記態様のいずれかの方法。
７１．
神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態の処置における治療的介入の有効性を決定するための方法であって、以下の工程：
(a)以下の：
(1)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
(2)モデル、例えば、態様33のモデルを使用して、初期状況を推測する段階；
によって、神経変性状態の初期状況を、複数の対象を含む集団中の各対象において、推測する工程；
(b)推測工程後、対象へ治療的介入を施す工程；
(c)施す工程後、以下の：
(1)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
(2)モデルを使用して後続状況を推測する段階
によって、神経変性状態の後続する後続状況（a subsequent a subsequent state）を、集団中の各対象個体において、推測する工程；ならびに
(d)集団中の初期および後続推測に基づいて、後続推測が初期推測と比較して正常状況の方への統計的に有意な変化を示す場合は、治療的介入が有効であること、または、後続推測が初期推測と比較して正常状況の方への統計的に有意な変化を示さない場合は、治療的介入が有効ではないことを決定する工程
を含む、方法。
７２．
定量的測定値が決定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、態様71または上記態様のいずれかの方法。
７３．
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、態様71または上記態様のいずれかの方法。
７４．
治療的介入が薬物または薬物の組み合わせの投与を含む、態様71または上記態様のいずれかの方法。
７５．
集団が、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100または少なくとも200の対象を含み、ここで、対象のうちの少なくとも20%、少なくとも35%、少なくとも50%、または少なくとも75%が、タンパク質のモノマー形態に対するタンパク質のオリゴマー形態の上昇した相対量を最初に有する、態様71または上記態様のいずれかの方法。
７６．
対象のうちの少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、または少なくとも35%、少なくとも50%、少なくとも66%、少なくとも80%、または100%が、神経変性状態の診断を最初に有する、態様71または上記態様のいずれかの方法。
７７．
モデルが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を使用する、態様71または上記態様のいずれかの方法。
７８．
モデルが、神経変性タンパク質の1つまたは複数のオリゴマー形態のパターンを使用する、態様71または上記態様のいずれかの方法。
７９．
推測がコンピューターによって行われる、態様71または上記態様のいずれかの方法。
８０．
推測がコンピューターによって行われる、態様71または上記態様のいずれかの方法。
８１．
神経変性状態の処置または予防のための治療的介入の臨床試験について対象を認定するための方法であって、以下の工程：
a)以下：
i)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
ii)プロフィールに対してモデル、例えば、態様33のモデルを実行する段階であって、対象が神経変性状態に関して異常であることを推測する、段階
によって、神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態に関して対象が異常であることを決定する工程；ならびに
c)該神経変性状態についての潜在的治療的介入の臨床試験に対象を登録する工程
を含む、方法。
８２．
定量的測定値が決定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される、態様81または上記態様のいずれかの方法。
８３．
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、態様81または上記態様のいずれかの方法。
８４．
モデルが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を使用する、態様81または上記態様のいずれかの方法。
８５．
モデルが、神経変性タンパク質の1つまたは複数のオリゴマー形態のパターンを使用する、態様81または上記態様のいずれかの方法。
８６．
モデルがコンピューターによって実行される、態様81または上記態様のいずれかの方法。
８７．
モデルがコンピューターによって実行されない、態様81または上記態様のいずれかの方法。
８８．
神経変性状態についての治療的介入における対象の経過をモニタリングする方法であって、以下の工程：
(a)以下：
(1)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
(2)モデル、例えば、態様33のモデルを実行する段階であって、神経変性状態の初期状況を推測する、段階
によって、神経変性状態の初期状況を、対象において、推測する工程；
(b)推測工程後、対象へ治療的介入を施す工程；
(c)施す工程後、以下の：
(1)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する段階であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、段階；および
(2)モデル、例えば、態様33のモデルを実行する段階であって、神経変性状態の後続状況を推測する、段階
によって、神経変性状態の後続状況を、対象において、推測する工程；
(d)初期および後続状況推測に基づいて、後続推測が初期推測と比較して正常状況の方への変化を示す場合は、対象が治療的介入に対してプラスに反応していること、または、後続推測が初期推測と比較して正常状況の方への変化を示さない場合は、治療的介入が有効ではないことを決定する工程
を含む、方法。
８９．
定量的測定値が決定される神経変性タンパク質形態が、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；ならびに
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択され決定される、態様88または上記態様のいずれかの方法。
９０．
オリゴマー形態のうちの少なくとも1つが、神経変性タンパク質の種のコレクションを構成する、態様88または上記態様のいずれかの方法。
９１．
モデルが、神経変性タンパク質のモノマー形態に対するオリゴマー形態の相対量を使用する、態様88または上記態様のいずれかの方法。
９２．
モデルが、神経変性タンパク質の1つまたは複数のオリゴマー形態のパターンを使用する、態様88または上記態様のいずれかの方法。
９３．
モデルがコンピューターによって実行される、態様88または上記態様のいずれかの方法。
９４．
モデルがコンピューターによって実行されない、態様88または上記態様のいずれかの方法。
９５．
(a)態様62の方法によって、対象が、神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態を有することを決定する工程、および
(b)状態を処置するために効果的な緩和的または神経保護的な治療的介入を対象へ施す工程
を含む、方法。
９６．
治療的介入が正常の方へ対象のバイオマーカープロフィールを移動させ、ここで、正常の方への移動が神経保護を示す、態様97または上記態様のいずれかの方法。
９７．
態様62の方法によって異常なバイオマーカープロフィールを有すると決定された対象へ、状態を処置するために有効な緩和的または神経保護的な治療的介入を施す工程を含む、方法。
９８．
対象が神経変性状態について無症候または症状発現前である、態様97または上記態様のいずれかの方法。
９９．
アルファ-シヌクレイン、タウ、アミロイドβおよびハンチンチンより選択されるタンパク質のオリゴマー形態を検出するために十分な第1の試薬と、アルファ-シヌクレイン、タウ、アミロイドβおよびハンチンチンより選択されるタンパク質のモノマー形態を検出するために十分な第2の試薬とを含む、キット。
１００．
第1および第2の試薬が抗体を含む、態様99または上記態様のいずれかのキット。
１０１．
神経変性タンパク質によって特徴付けられる神経変性状態の、発症リスク、診断、病期、予後、または進行を推測する方法であって、以下の工程：
a)データセットを作成するために、CNS由来ミクロソーム粒子について濃縮される対象からの生体試料から、1つまたは複数の神経変性タンパク質形態の各々の定量的測定値を含む神経変性タンパク質プロフィールを決定する工程であって、ここで、神経変性タンパク質形態が1つまたは複数のオリゴマー形態および、任意で、1つまたは複数のモノマー形態を含む、工程；ならびに
b)神経変性タンパク質プロフィールを、神経変性状態の、発症リスク、診断、病期、予後、または進行と関連付ける工程
を含む、方法。
１０２．
神経変性タンパク質プロフィールが、以下：
(I)少なくとも1つのオリゴマー形態；
(II)複数のオリゴマー形態；
(III)少なくとも1つのオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(IV)複数のオリゴマー形態および少なくとも1つのモノマー形態；
(V)少なくとも1つのオリゴマー形態および複数のモノマー形態；または
(VI)複数のオリゴマー形態および複数のモノマー形態
より選択される定量的測定値を含む、態様101または上記態様のいずれかの方法。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は、限定のためではなく、例示のために提示される。
【０１３８】
実施例1：シヌクレオパチー状態において、アルファ-シヌクレインオリゴマーは、アルファ-シヌクレインモノマーと比較して上昇する
シヌクレオパチー状態と診断され、活性な治療的介入を与えられ、次いで、異なる、不活性であることが恐らく知られているものまたはその逆が与えられる、個体のコホートが、研究の対象である。または、シヌクレオパチー状態と診断された複数の対象中のシヌクレオパチー状態について無症候である複数の対象を含むコホートが、研究の対象である。いずれの場合においても、静脈血試料を、ベースラインまたは対照（例えば、不活性介入処置）条件下で、および潜在的に活性な（例えば、実験的介入）処置の投与中に再び、を含む様々な時間で、静脈穿刺によって各対象から採取する。CNS由来エキソソームを、本明細書に記載される方法を使用して血液から単離する。単離されたエキソソーム内に含有される、モノマーアルファ-シヌクレインおよびオリゴマーアルファ-シヌクレインまたはその特定の種の量を測定する。モノマーアルファ-シヌクレインに対するオリゴマーアルファ-シヌクレイン種の比率を決定する。結果は、シヌクレオパチー状態と診断された対象のコホートにおいて、モノマーアルファ-シヌクレインに対するオリゴマーアルファ-シヌクレインの比率は、統計的に有意な程度まで増加することを示す。このバイオマーカーアッセイの結果において有意な変化を有すると分かったものは、臨床状況において比例した変化を有すると後で分かる。
【０１３９】
実施例2：対象階層化／臨床試験
PDを有さないおよびPDを有するボランティアの対象を試験し、CNS由来エキソソーム中のオリゴマーおよびモノマーアルファ-シヌクレインの相対量を決定する。決定された相対量に基づいて、また、上記実施例において決定されたカットオフを使用して、対象をいくつかの試験群へクラスター化する。ある試験群にプラセボを与える。他の試験群に、臨床試験において異なる量の化合物を投与する。投与中および／または投与後に、試験を繰り返す。収集した測定値を解析する。治療的介入は、モノマーアルファ-シヌクレインに対するオリゴマーアルファ-シヌクレインの相対量の統計的に有意な減少をもたらすと決定される。
【０１４０】
実施例3：シヌクレイノパチーについて神経保護的である薬物候補についての臨床試験
第II相試験の目的は、PDおよび関連障害を有する患者において、アプレピタントと共にかつ任意でロバスタチンまたは同様に有効な薬物有りまたは無しで与えられる、プラミペキソールの安全性、認容性および初期効能を評価することである。PD(PD)、多系統萎縮症(MSA)、レヴィー小体認知症(LBD)、または関連するシヌクレオパチー性障害を有する最大30人の患者において、連続処置、漸増用量、交差、外来患者試験を行う。医学的に許容されると見なされる程度まで試験の全体にわたって安定用量で維持される、レボドパ-カルビドパ(Sinemet)を除き、参加者の誰も、臨床研究エントリー前の3ヵ月間中にドーパミンアゴニストまたは他の中枢作用薬で処置されることは認められない。統一PD評価尺度(UPDRS-パートIII)およびシヌクレインバイオマーカー決定を含む、ベースライン臨床および実験室評価に続いて、登録基準を満たしている同意する個体を、研究前PD処置レジメンからプラミペキソールERおよびアプレピタントを含むものへ切り替える。プラミペキソールER用量を、最適に許容される用量（または最大9 mg/日）へ用量設定し、次いで、最大約12〜16週間安定に維持する。その最大認可用量で与えられる追加の薬物（例えば、スタチン）での共処置を、臨床的に適切であると見なされる場合は、追加の3ヵ月間について次いで開始してもよく、この時、全ての対象を、それらの入院前処置レジメンへ戻す。試験の間、シヌクレインバイオマーカーレベルの決定を含む、ベースライン効能および安全性測定を一定間隔で繰り返した。効能は、オリゴマーアルファ-シヌクレインおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン種を含むバイオマーカープロフィールの、正常の方への統計的に有意な変化の関数として決定される。
【０１４１】
実施例4：診断
対象は、PDと一致するある症状を有することを示すが、この病気の顕著な臨床的特徴の多くを未だ欠いている場合は症状発現前レベルである。血液を静脈穿刺によって対象から採取する。オリゴマーおよびモノマーアルファ-シヌクレインの量を血液中のCNS由来エキソソームから測定する。バイオマーカープロフィールを決定する。診断アルゴリズムは、プロフィールについて、PDの診断と一致する、と分類する。対象をPDと診断し、症状を軽減するための緩和的処置、または神経保護の目的での疾患の病因に向けられた処置のいずれかの、治療レジメンに置く。
【０１４２】
実施例5：病期分類
対象は、PDであるとの診断を示す。医師は対象に対して血液検査を命じ、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールを決定する。オリゴマーアルファ-シヌクレインおよび、任意でモノマーを含むバイオマーカープロフィールに基づいて、医師は、対象がPDの初期にあり、従って特定の治療的介入に対してより反応性であることを決定する。
【０１４３】
実施例6：予後／進行
対象は、PDであるとの診断を示す。医師は、数ヵ月間離して、対象に対して第1および第2の血液検査を命じ、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールを決定する。バイオマーカープロフィール、モノマーに対するオリゴマーアルファ-シヌクレインに基づいて、医師は、対象の疾患が徐々に進行していること、および、対象が、危険な治療的介入無しでさえ、数年間の寿命を有すると予想されることを決定する。
【０１４４】
実施例7：リスク評価
対象は、身体検査について、シヌクレイノパチー性疾患の症状を有さないことを示す。この場合、この個体は、遺伝的または環境的リスク因子を自覚している。医師は対象に対して血液検査を命じ、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールを決定する。健康な対照個体と比較して、オリゴマーアルファ-シヌクレインの一部のまたは全部の測定可能な種の相対的に異常なバイオマーカープロフィールに基づいて、医師は、対象がPDを発症する低い確率を有することを決定する。
【０１４５】
実施例8：療法に対する反応
対象は、PDであるとの診断を示す。医師は、対象に対して最初の血液検査を命じ、処置を開始する前に、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールを決定する。一連の処置後、しかし臨床症状が変化する前に、医師は第2の血液検査を命じる。aにおける（in the a）正常の方への変化に基づいて、医師は、処置が有効であること、または用量を変更するかまたは繰り返す必要があるかどうかを決定する。
【０１４６】
実施例9：診断法の開発
PDを有さないおよび異なる診断された病期にあるPDを有するボランティアの対象を試験し、複数のオリゴマーアルファ-シヌクレインおよびモノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールを決定する。決定されたバイオマーカープロフィールに基づいて、対象を、疾患の存在または非存在および、任意で疾患の病期を示すと分類する。プロフィールは、コンピューター化学習アルゴリズムを使用して決定され、これは、データ解析後、診断を推測する分類アルゴリズムを生じさせる。推測モデルは、所望の感度および特異性で試験をもたらすように選択される。
【０１４７】
実施例10：アルファ-シヌクレインオリゴマープロフィールはシヌクレオパチー状態において変化する
研究の対象である個体のコホートは、シヌクレオパチー状態と診断された。対象に、活性な治療的介入、次いで、異なる、不活性であることが恐らく知られているものを与える。代わりに、介入を逆の順序で与えることができる。または、シヌクレオパチー状態と診断された複数の対象中の、シヌクレオパチー状態について無症候である複数の対象を含むコホートが、研究の対象である。いずれの場合においても、静脈血試料を、ベースラインまたは対照（例えば、不活性介入処置）条件下で、および潜在的に活性な（例えば、実験的介入）処置の投与中に再び、を含む様々な時間で、静脈穿刺によって各対象から採取する。CNS由来エキソソームを、本明細書に記載される方法を使用して血液から単離する。単離されたエキソソーム内に含有される、モノマーアルファ-シヌクレインおよびオリゴマーアルファ-シヌクレインを含む、複数のアルファ-シヌクレイン形態の量を測定する。これらのデータをデータセットへと組み合わせる。データセットを、統計法を使用して解析し、この場合、学習アルゴリズム（例えば、サポートベクターマシン）を訓練するために使用し、対象がシヌクレオパチー状態を有するまたは有さないと分類されるべきかどうかを推測するモデルを開発する。結果は、シヌクレオパチー状態と診断された対象のコホートにおいて、ある種のオリゴマーアルファ-シヌクレインが、他のオリゴマー種および、任意で、モノマー種と比べて、統計的に有意な程度まで増加することを示す。このバイオマーカーアッセイの結果において有意な変化を有すると分かったものは、臨床状況において比例した変化を有すると後で分かる。
【０１４８】
実施例11：対象階層化／臨床試験
PDを有さないおよびPDを有するボランティアの対象を試験し、CNS由来エキソソーム中のオリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインのバイオマーカープロフィールを決定する。決定されたバイオマーカープロフィールに基づいて、また、上記実施例において決定されたクラシファイヤーを使用して、対象をいくつかの試験群へクラスター化する。ある試験群にプラセボを与える。他の試験群に、臨床試験において異なる量の化合物を投与する。投与中に、および任意で投与後に、試験を繰り返す。収集した測定値を解析する。治療的介入は、オリゴマーアルファ-シヌクレインおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールの正常の方への統計的に有意な変化をもたらすと決定される。
【０１４９】
実施例12：シヌクレイノパチーについて神経保護的である薬物候補についての臨床試験
第II相試験の目的は、PDおよび関連障害を有する患者において、アプレピタントと共にかつ任意でロバスタチンまたは同様に有効な薬物有りまたは無しで与えられる、プラミペキソールの安全性、認容性および初期効能を評価することである。PD(PD)、多系統萎縮症(MSA)、レヴィー小体認知症(LBD)、または関連するシヌクレオパチー性障害を有する最大30人の患者において連続処置、漸増用量、交差、外来患者試験を行う。医学的に許容されると見なされる程度まで試験の全体にわたって安定用量で維持される、レボドパ-カルビドパ(Sinemet)を除き、参加者の誰も、臨床研究エントリー前の3ヵ月間中にドーパミンアゴニストまたは他の中枢作用薬で処置されることは認められない。統一PD評価尺度(UPDRS-パートIII)およびシヌクレインバイオマーカー決定を含む、ベースライン臨床および実験室評価に続いて、登録基準を満たしている同意する個体を、研究前PD処置レジメンからプラミペキソールERおよびアプレピタントを含むものへ切り替える。プラミペキソールER用量を、最適に許容される用量（または最大9 mg/日）へ用量設定し、次いで、最大約12〜16週間安定に維持する。その最大認可用量で与えられる追加の薬物（例えば、スタチン）での共処置を、臨床的に適切であると見なされる場合は、追加の3ヵ月間について次いで開始してもよく、この時、全ての対象を、それらの入院前処置レジメンへ戻す。試験の間、シヌクレインバイオマーカーレベルの決定を含む、ベースライン効能および安全性測定を一定間隔で繰り返した。効能は、オリゴマーアルファ-シヌクレインおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレイン種を含むバイオマーカープロフィールの正常の方への統計的に有意な変化の関数として決定される。
【０１５０】
実施例13：診断
対象は、PDと一致するある症状を有することを示すが、この病気の顕著な臨床的特徴の多くを未だ欠いている場合は症状発現前レベルである。血液を静脈穿刺によって対象から採取する。オリゴマーおよびモノマーアルファ-シヌクレインの量を血液中のCNS由来エキソソームから測定する。バイオマーカープロフィールを決定する。診断アルゴリズムは、PDの診断と一致するとプロフィールを分類する。対象をPDと診断し、症状を軽減するための緩和的処置、または神経保護の目的での疾患の病因に向けられた処置のいずれかの、治療レジメンに置く。
【０１５１】
実施例14：病期分類
対象は、PDであるとの診断を示す。医師は対象に対して血液検査を命じ、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールを決定する。オリゴマーアルファ-シヌクレインおよび、任意でモノマーを含むバイオマーカープロフィールに基づいて、医師は、対象がPDの初期にあり、従って特定の治療的介入に対してより反応性であることを決定する。
【０１５２】
実施例15：予後／進行
対象は、PDであるとの診断を示す。医師は、数ヵ月間離して、対象に対して第1および第2の血液検査を命じ、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールを決定する。バイオマーカープロフィール、モノマーに対するオリゴマーアルファ-シヌクレインに基づいて、医師は、対象の疾患が徐々に進行していること、および、対象が、危険な治療的介入無しでさえ、数年間の寿命を有すると予想されることを決定する。
【０１５３】
実施例16：リスク評価
対象は、身体検査について、シヌクレイノパチー性疾患の症状を有さないことを示す。この場合、この個体は、遺伝的または環境的リスク因子を自覚している。医師は対象に対して血液検査を命じ、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールを決定する。健康な対照個体と比較して、オリゴマーアルファ-シヌクレインの一部のまたは全部の測定可能な種の相対的に異常なバイオマーカープロフィールに基づいて、医師は、対象がPDを発症する低い確率を有することを決定する。
【０１５４】
実施例17：療法に対する反応
対象は、PDであるとの診断を示す。医師は、対象に対して最初の血液検査を命じ、処置が開始する前に、オリゴマーおよび、任意で、モノマーアルファ-シヌクレインを含むバイオマーカープロフィールを決定する。一連の処置後、しかし臨床症状が変化する前に、医師は第2の血液検査を命じる。aにおける（in the a）正常の方への変化に基づいて、医師は、処置が有効であること、または用量を変更するかまたは繰り返す必要があるかどうかを決定する。
【０１５５】
実施例18：例示的なバイオマーカープロフィール
図7は、5つの異なる状況でのアルファ-シヌクレインのモノマー種および5つのオリゴマー種を含む、例示的なバイオマーカープロフィールを示す。状況は、正常、パーキンソン病ステージ1(PD-1)、パーキンソン病ステージ2(PD-2)、治療剤1での処置(Rx-1)および治療剤2での処置(Rx-2)を含む。オリゴマー種の各々の相対量は線の黒さによって示される。理解され得るように、オリゴマー4は、ステージ1およびステージ2パーキンソン病の両方において上昇している。対照的に、オリゴマー1、2および3は、ステージ1においては上昇しているが、ステージ2においては上昇していない。治療剤1はオリゴマー4の相対量を減少させ、神経保護活性を有すると考えられる。比較すると、治療剤2はオリゴマー4を減少させず、この実施例において、神経保護的ではないと考えられる。
【０１５６】
実施例19：アルツハイマー病についての診断法の開発
医療専門家によってアルツハイマー病を有するまたはアルツハイマー病を有さないと診断されたボランティアの対象は、検査のために血液試料を提供する。脳由来エキソソームの内容物を単離する。モノマーa-ベータおよび複数の種のオリゴマーa-ベータの各々の量を決定する。結果の比較は、アルツハイマー病と診断された対象において、1つのオリゴマー形態が、モノマーa-ベータと比較した場合に一貫して増加していることを示す。所定の閾値レベルを上回るこの形態の量は、85%の感度および98%の特異性でアルツハイマー病の診断を提供することがさらに決定される。この閾値レベルは、アルツハイマー病を有する他の対象を診断するために使用される。
【０１５７】
実施例20：ハンチントン病についての診断法の開発
医療専門家によってハンチントン病を有するまたはハンチントン病を有さないと診断されたボランティアの対象は、検査のために血液試料を提供する。脳由来エキソソームの内容物を単離する。複数の種のオリゴマーハンチンチンタンパク質の各々の量を決定する。線形回帰分析を使用して、3つの別個のオリゴマー形態の量を組み合わせて、線形数学モデルの形式でハンチントン病を診断することができることがわかる。
【０１５８】
本明細書において使用される場合、特別の定めのない限り、以下の意味が適用される。単語「得る（may）」は、義務的な意味（即ち、しなければならないを意味する）ではなくむしろ、許容的な意味（即ち、可能性を有することを意味する）で使用される。単語「含む（include）」、「含む（including）」、および「含む（includes）」などは、含むが、限定されないことを意味する。単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は複数の指示物を含む。従って、例えば、「要素（an element）」への参照は、「1つまたは複数の」のような、1つまたは複数の要素についての他の用語および句の使用にもかかわらず、2つ以上の要素の組み合わせを含む。用語「または」は、特別の指示のない限り、非排他的であり、即ち、「および」および「または」の両方を包含する。修飾語と一連のものとの間の「のうちのいずれか」という用語は、修飾語が、一連のものの各メンバーを修飾することを意味する。従って、例えば、句「少なくとも1、2または3のうちのいずれか」は、「少なくとも1、少なくとも2または少なくとも3」を意味する。句「少なくとも1つ」は「複数」を含む。
【０１５９】
本明細書に言及される全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が参照により組み入れられるように具体的かつ個々に示されているのと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６０】
本発明のある態様を本明細書において表示および記載したが、そのような態様はほんの一例として提供されることが当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく今では当業者に想到されるだろう。本明細書に記載される本発明の態様の様々な代替物が、本発明の実施において用いられ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を規定すること、およびこの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造体ならびにそれらの等価物はそれによって保護されることが、意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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