(57)【要約】  本発明は、一般的に、液体クロマトグラフィ連結タンデム質量分析多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によってトランスジェニック植物サンプルを含む生体サンプル中の１つ又は複数のトランスジェニック標的タンパク質を直接定量化するために特異的なイオン化特性を有するペプチドバイオマーカーに関する。ＭＲＭベースの方法と組み合わせたペプチドバイオマーカーは、選択されたペプチドバイオマーカーを単独で又は組み合わせて利用して、トウモロコシなどのスタックされたトランスジェニック作物内の単一のトランスジェニック標的タンパク質又は複数のトランスジェニック標的タンパク質を定量化するために使用され得る。本開示は、植物マトリックスを含む種々の生体マトリックスにおける広範囲にわたる信頼性のある定量化を可能にする。本発明のペプチドバイオマーカーはさらに、特定のトランスジェニックイベントの同定及び／又は選択を支援するために形質バイオマーカーとして使用することができる。また、本発明の方法を実施するために使用することができる種々のペプチドバイオマーカーの組合せも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数のトランスジェニック植物からの１つ又は複数の生体サンプル中のトランスジェニックタンパク質及び非トランスジェニックタンパク質の混合物において、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３タンパク質、二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ｄｍＥＰＳＰＳ）タンパク質、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質及びホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）タンパク質からなる群から選択される標的トランスジェニックタンパク質を、質量分析アッセイで選択的に検出又は定量化する機能を果たす標識サロゲートペプチドであって、前記サロゲートペプチドが、標識と、ＧＳＡＱＧＩＥＧＳＩＲ（配列番号１）、ＩＶＡＱＬＧＱＧＶＹＲ（配列番号２）、ＴＬＳＳＴＬＹＲ（配列番号３）、ＤＶＳＶＦＧＱＲ（配列番号４）、ＴＹＰＩＲ（配列番号５）、ＴＶＳＱＬＴＲ（配列番号６）、ＷＹＮＴＧＬＥＲ（配列番号７）、ＥＷＥＡＤＰＴＮＰＡＬＲ（配列番号８）、ＶＷＧＰＤＳＲ（配列番号９）、ＡＰＭＦＳＷＩＨＲ（配列番号１０）、ＷＧＦＤＡＡＴＩＮＳＲ（配列番号１１）、ＮＱＡＩＳＲ（配列番号１２）、ＩＥＥＦＡＲ（配列番号１３）、ＳＧＦＳＮＳＳＶＳＩＩＲ（配列番号１４）、ＬＳＨＶＳＭＦＲ（配列番号１５）、ＥＩＹＴＮＰＶＬＥＮＦＤＧＳＦＲ（配列番号１６）、ＬＥＧＬＳＮＬＹＱＩＹＡＥＳＦＲ（配列番号１７）、ＹＮＱＦＲ（配列番号１８）、ＹＮＤＬＴＲ（配列番号１９）、ＳＰＨＬＭＤＩＬＮＳＩＴＩＹＴＤＡＨＲ（配列番号２０）、ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）、ＱＧＦＳＨＲ（配列番号２２）、ＭＤＮＮＰＮＩＮＥＣＩＰＹＮＣＬＳＮＰＥＶＥＶＬＧＧＥＲ（配列番号２３）、ＥＬＴＬＴＶＬＤＩＶＳＬＦＰＮＹＤＳＲ（配列番号２４）、ＲＰＦＮＩＧＩＮＮＱＱＬＳＶＬＤＧＴＥＦＡＹＧＴＳＳＮＬＰＳＡＶＹＲ（配列番号２５）、ＳＧＴＶＤＳＬＤＥＩＰＰＱＮＮＮＶＰＰＲ（配列番号２６）、ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）、ＡＶＮＥＬＦＴＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号２８）、ＩＴＱＬＰＬＴＫ（配列番号２９）、ＧＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号３０）、ＱＣＡＧＩＲＰＹＤＧＲ（配列番号３１）、ＩＥＦＶＰＡＥＶＴＦＥＡＥＹＤＬＥＲ（配列番号３２）、ＩＴＱＬＰＬＶＫ（配列番号３３）、ＭＴＡＤＮＮＴＥＡＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号３４）、ＶＹＩＤＫ（配列番号３５）、ＤＧＧＩＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号３６）、ＬＩＴＬＴＣＫ（配列番号３７）、ＥＬＬＬＡＴＤＬＳＮＫ（配列番号３８）、ＦＥＥＬＴＦＡＴＥＴＳＳＫ（配列番号３９）、ＥＶＬＦＥＫ（配列番号４０）、ＴＡＳＥＬＩＴＫ（配列番号４１）、ＤＶＳＥＭＦＴＴＫ（配列番号４２）、ＬＬＧＬＡＤＩＤＹＴＳＩＭＮＥＨＬＮＫ（配列番号４３）、ＩＤＦＴＫ（配列番号４４）、ＴＤＴＧＧＤＬＴＬＤＥＩＬＫ（配列番号４５）、ＤＩＭＮＭＩＦＫ（配列番号４６）、ＡＬＹＶＨＫ（配列番号４７）、ＶＮＩＬＰＴＬＳＮＴＦＳＮＰＮＹＡＫ（配列番号４８）、ＩＴＳＭＬＳＤＶＩＫ（配列番号４９）、ＱＮＬＱＬＤＳＦＳＴＹＲ（配列番号５０）、ＤＳＬＳＥＶＩＹＧＤＭＤＫ（配列番号５１）、ＭＩＶＥＡＫＰＧＨＡＬＩＧＦＥＩＳＮＤＳＩＴＶＬＫ（配列番号５２）、ＶＹＦＳＶＳＧＤＡＮＶＲ（配列番号５３）、ＮＱＱＬＬＮＤＩＳＧＫ（配列番号５４）、ＶＥＳＳＥＡＥＹＲ（配列番号５５）、ＹＭＳＧＡＫ（配列番号５６）、ＤＧＳＰＡＤＩＬＤＥＬＴＥＬＴＥＬＡＫ（配列番号５７）、ＶＹＥＡＫ（配列番号５８）、ＬＤＡＩＮＴＭＬＲ（配列番号５９）、ＧＫＰＳＩＨＬＫ（配列番号６０）、ＤＥＮＴＧＹＩＨＹＥＤＴＮＮＮＬＥＤＹＱＴＩＮＫ（配列番号６１）、ＤＮＦＹＩＥＬＳＱＧＮＮＬＹＧＧＰＩＶＨＦＹＤＶＳＩＫ（配列番号６２）、ＬＬＣＰＤＱＳＥＱＩＹＹＴＮＮＩＶＦＰＮＥＹＶＩＴＫ（配列番号６３）、ＳＱＮＧＤＥＡＷＧＤＮＦＩＩＬＥＩＳＰＳＥＫ（配列番号６４）、ＮＡＹＶＤＨＴＧＧＶＮＧＴＫ（配列番号６５）、ＬＤＧＶＮＧＳＬＮＤＬＩＡＱＧＮＬＮＴＥＬＳＫ（配列番号６６）、ＩＡＮＥＱＮＱＶＬＮＤＶＮＮＫ（配列番号６７）、ＹＥＶＴＡＮＦＹＤＳＳＴＧＥＩＤＬＮＫ（配列番号６８）、ＱＮＹＡＬＳＬＱＩＥＹＬＳＫ（配列番号６９）、ＱＬＱＥＩＳＤＫ（配列番号７０）、ＬＬＳＰＥＬＩＮＴＮＮＷＴＳＴＧＳＴＮＩＳＧＮＴＬＴＬＹＱＧＧＲ（配列番号７１）、ＹＶＮＥＫ（配列番号７２）、ＱＮＹＱＶＤＫ（配列番号７３）、ＭＡＧＡＥＥＩＶＬＱＰＩＫ（配列番号７４）、ＦＰＶＥＤＡＫ（配列番号７５）、ＥＩＳＧＴＶＫ（配列番号７６）、ＩＬＬＬＡＡＬＳＥＧＴＴＶＶＤＮＬＬＮＳＥＤＶＨＹＭＬＧＡＬＲ（配列番号７７）、ＤＦＥＬＰＡＰＰＲＰＶＲＰＶＴＱＩ（配列番号７８）、ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）、ＭＳＰＥＲ（配列番号８０）、ＨＧＧＷＨＤＶＧＦＷＱＲ（配列番号８１）、ＮＡＹＤＷＴＶＥＳＴＶＹＶＳＨＲ（配列番号８２）、ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（配列番号８３）、ＡＡＧＹＫ（配列番号８４）、ＹＰＷＬＶＡＥＶＥＧＶＶＡＧＩＡＹＡＧＰＷＫ（配列番号８５）、ＲＰＶＥＩＲＰＡＴＡＡＤＭＡＡＶＣＤＩＶＮＨＹＩＥＴＳＴＶＮＦＲ（配列番号８６）、ＥＮＡＡＧＩＰＭＤＡＡＥＲ（配列番号８７）、ＡＬＡＩＬＫ（配列番号８８）、ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）、ＧＳＱＱＬＱＬＫＰＧＥＳＡＦＩＡＡＮＥＳＰＶＴＶＫ（配列番号９０）、ＦＥＡＫＰＡＮＱＬＬＴＱＰＶＫ（配列番号９１）、ＳＴＬＬＧＥＡＶＡＫ（配列番号９２）、ＬＩＮＳＶＱＮＹＡＷＧＳＫ（配列番号９３）、ＨＮＳＥＩＧＦＡＫ（配列番号９４）、ＶＬＣＡＡＱＰＬＳＩＱＶＨＰＮＫ（配列番号９５）、ＴＡＬＴＥＬＹＧＭＥＮＰＳＳＱＰＭＡＥＬＷＭＧＡＨＰＫ（配列番号９６）、ＬＳＥＬＦＡＳＬＬＮＭＱＧＥＥＫ（配列番号９７）及びＱＧＡＥＬＤＦＰＩＰＶＤＤＦＡＦＳＬＨＤＬＳＤＫ（配列番号９８）からなる群から選択されるアミノ酸配列とを含む、標識サロゲートペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、安定同位体標識（ＳＩＬ）アミノ酸の取込みによって標識化される、請求項１に記載の標識サロゲートペプチド。
【請求項３】
前記ＳＩＬアミノ酸が、リジン、イソロイシン、バリン又はアルギニンである、請求項２に記載の標識サロゲートペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが前記混合物中のＣｒｙ１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、且つ、ＧＳＡＱＧＩＥＧＳＩＲ（配列番号１）、ＩＶＡＱＬＧＱＧＶＹＲ（配列番号２）、ＴＬＳＳＴＬＹＲ（配列番号３）、ＤＶＳＶＦＧＱＲ（配列番号４）、ＴＹＰＩＲ（配列番号５）、ＴＶＳＱＬＴＲ（配列番号６）、ＷＹＮＴＧＬＥＲ（配列番号７）、ＥＷＥＡＤＰＴＮＰＡＬＲ（配列番号８）、ＶＷＧＰＤＳＲ（配列番号９）、ＡＰＭＦＳＷＩＨＲ（配列番号１０）、ＷＧＦＤＡＡＴＩＮＳＲ（配列番号１１）、ＮＱＡＩＳＲ（配列番号１２）、ＩＥＥＦＡＲ（配列番号１３）、ＳＧＦＳＮＳＳＶＳＩＩＲ（配列番号１４）、ＬＳＨＶＳＭＦＲ（配列番号１５）、ＥＩＹＴＮＰＶＬＥＮＦＤＧＳＦＲ（配列番号１６）、ＬＥＧＬＳＮＬＹＱＩＹＡＥＳＦＲ（配列番号１７）、ＹＮＱＦＲ（配列番号１８）、ＹＮＤＬＴＲ（配列番号１９）、ＳＰＨＬＭＤＩＬＮＳＩＴＩＹＴＤＡＨＲ（配列番号２０）、ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）、ＱＧＦＳＨＲ（配列番号２２）、ＭＤＮＮＰＮＩＮＥＣＩＰＹＮＣＬＳＮＰＥＶＥＶＬＧＧＥＲ（配列番号２３）、ＥＬＴＬＴＶＬＤＩＶＳＬＦＰＮＹＤＳＲ（配列番号２４）、ＲＰＦＮＩＧＩＮＮＱＱＬＳＶＬＤＧＴＥＦＡＹＧＴＳＳＮＬＰＳＡＶＹＲ（配列番号２５）及びＳＧＴＶＤＳＬＤＥＩＰＰＱＮＮＮＶＰＰＲ（配列番号２６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の標識サロゲートペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、ＧＩＥＧＳＩＲ（配列番号９９）、ＥＧＳＩＲ（配列番号１００）、ＡＱＬＧＱＧＶＹＲ（配列番号１０１）、ＧＱＧＶＹＲ（配列番号１０２）；ＳＳＴＬＹＲ（配列番号１０３）、ＳＴＬＹＲ（配列番号１０４）、ＳＶＦＧＱＲ（配列番号１０５）、ＦＧＱＲ（配列番号１０６）、ＰＩＲ、ＴＹ、ＳＱＬＴＲ（配列番号１０７）、ＱＬＴＲ（配列番号１０８）、ＮＴＧＬＥＲ（配列番号１０９）、ＹＮＴＧＬＥＲ（配列番号１１０）、ＰＴＮＰＡＬＲ（配列番号１１１）、ＤＰＴＮＰＡＬＲ（配列番号１１２）、ＧＰＤＳＲ（配列番号１１３）、ＶＷ、ＨＲ、ＳＷＩＨＲ（配列番号１１４）、ＡＴＩＮＳＲ（配列番号１１５）、ＤＡＡＴＩＮＳＲ（配列番号１１６）、ＡＩＳＲ（配列番号１１７）、ＩＳＲ、ＥＦＡＲ（配列番号１１８）、ＥＥＦＡＲ（配列番号１１９）、ＳＮＳＳＶＳＩＩＲ（配列番号１２０）、ＳＳＶＳＩＩＲ（配列番号１２１）、ＳＭＦＲ（配列番号１２２）、ＶＳＭＦＲ（配列番号１２３）、ＥＮＦＤＧＳＦＲ（配列番号１２４）、ＧＳＦＲ（配列番号１２５）、ＹＡＥＳＦＲ（配列番号１２６）、ＬＥＧ、ＮＱＦＲ（配列番号１２７）、ＱＦＲ、ＤＬＴＲ（配列番号１２８）、ＮＤＬＴＲ（配列番号１２９）、ＴＩＹＴＤＡＨＲ（配列番号１３０）、ＹＴＤＡＨＲ（配列番号１３１）、ＰＬＴＫ（配列番号１３２）、ＳＡＥＦＮＮＩＩ（配列番号１３３）、ＦＳＨＲ（配列番号１３４）、ＧＦＳＨＲ（配列番号１３５）、ＥＶＬＧＧＥＲ（配列番号１３６）、ＧＧＥＲ（配列番号１３７）、ＦＰＮＹＤＳＲ（配列番号１３８）、ＰＮＹＤＳＲ（配列番号１３９）、ＰＳＡＶＹＲ（配列番号１４０）、ＹＲ、ＰＰＲ、及びＳＧＴＶＤＳＬＤＥ（配列番号１４１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する、請求項４に記載のサロゲートペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドがアミノ酸配列ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）を含み、且つ、アミノ酸配列ＰＬＴＫ（配列番号１３２）又はＳＡＥＦＮＮＩＩ（配列番号１３３）からなる遷移イオンを生成する、請求項４に記載のサロゲートペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドがｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、且つ、ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）、ＡＶＮＥＬＦＴＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号２８）、ＩＴＱＬＰＬＴＫ（配列番号２９）、ＧＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号３０）、ＱＣＡＧＩＲＰＹＤＧＲ（配列番号３１）及びＩＥＦＶＰＡＥＶＴＦＥＡＥＹＤＬＥＲ（配列番号３２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のサロゲートペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）、ＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４３）、ＴＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号１４４）、ＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号１４５）、ＱＬＰＬＴＫ（配列番号１４６）、ＴＱＬＰＬＴＫ（配列番号１４７）、ＤＳＳＴＴＫ（配列番号１４８）、ＳＳＴＴＫ（配列番号１４９）、ＰＹＤＧＲ（配列番号１５０）、ＤＧＲ、ＩＥＦ、及びＬＥＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する、請求項７に記載のサロゲートペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドがアミノ酸配列ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）を含み、且つ、アミノ酸配列ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）又はＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４３）からなる遷移イオンを生成する、請求項７に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドがｍＣｒｙ３Ａタンパク質を選択的に検出又は定量化し、且つ、ＩＴＱＬＰＬＶＫ（配列番号３３）、ＭＴＡＤＮＮＴＥＡＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号３４）及びＶＹＩＤＫ（配列番号３５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、ＱＬＰＬＶＫ（配列番号１５１）、ＴＱＬＰＬＶＫ（配列番号１５２）、ＡＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号１５３）、ＥＡＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号１５４）、ＹＩＤＫ（配列番号１５５）及びＩＤＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する、請求項１０に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１２】
前記ペプチドがＶｉｐ３Ａタンパク質を選択的に検出又は定量化し、且つ、ＤＧＧＩＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号３６）、ＬＩＴＬＴＣＫ（配列番号３７）、ＥＬＬＬＡＴＤＬＳＮＫ（配列番号３８）、ＦＥＥＬＴＦＡＴＥＴＳＳＫ（配列番号３９）、ＥＶＬＦＥＫ（配列番号４０）、ＴＡＳＥＬＩＴＫ（配列番号４１）、ＤＶＳＥＭＦＴＴＫ（配列番号４２）、ＬＬＧＬＡＤＩＤＹＴＳＩＭＮＥＨＬＮＫ（配列番号４３）、ＩＤＦＴＫ（配列番号４４）、ＴＤＴＧＧＤＬＴＬＤＥＩＬＫ（配列番号４５）、ＤＩＭＮＭＩＦＫ（配列番号４６）、ＡＬＹＶＨＫ（配列番号４７）、ＶＮＩＬＰＴＬＳＮＴＦＳＮＰＮＹＡＫ（配列番号４８）、ＩＴＳＭＬＳＤＶＩＫ（配列番号４９）、ＱＮＬＱＬＤＳＦＳＴＹＲ（配列番号５０）、ＤＳＬＳＥＶＩＹＧＤＭＤＫ（配列番号５１）、ＭＩＶＥＡＫＰＧＨＡＬＩＧＦＥＩＳＮＤＳＩＴＶＬＫ（配列番号５２）、ＶＹＦＳＶＳＧＤＡＮＶＲ（配列番号５３）、ＮＱＱＬＬＮＤＩＳＧＫ（配列番号５４）、ＶＥＳＳＥＡＥＹＲ（配列番号５５）、ＹＭＳＧＡＫ（配列番号５６）、ＤＧＳＰＡＤＩＬＤＥＬＴＥＬＴＥＬＡＫ（配列番号５７）、ＶＹＥＡＫ（配列番号５８）、ＬＤＡＩＮＴＭＬＲ（配列番号５９）、ＧＫＰＳＩＨＬＫ（配列番号６０）、ＤＥＮＴＧＹＩＨＹＥＤＴＮＮＮＬＥＤＹＱＴＩＮＫ（配列番号６１）、ＤＮＦＹＩＥＬＳＱＧＮＮＬＹＧＧＰＩＶＨＦＹＤＶＳＩＫ（配列番号６２）、ＬＬＣＰＤＱＳＥＱＩＹＹＴＮＮＩＶＦＰＮＥＹＶＩＴＫ（配列番号６３）、ＳＱＮＧＤＥＡＷＧＤＮＦＩＩＬＥＩＳＰＳＥＫ（配列番号６４）、ＮＡＹＶＤＨＴＧＧＶＮＧＴＫ（配列番号６５）、ＬＤＧＶＮＧＳＬＮＤＬＩＡＱＧＮＬＮＴＥＬＳＫ（配列番号６６）、ＩＡＮＥＱＮＱＶＬＮＤＶＮＮＫ（配列番号６７）、ＹＥＶＴＡＮＦＹＤＳＳＴＧＥＩＤＬＮＫ（配列番号６８）、ＱＮＹＡＬＳＬＱＩＥＹＬＳＫ（配列番号６９）、ＱＬＱＥＩＳＤＫ（配列番号７０）、ＬＬＳＰＥＬＩＮＴＮＮＷＴＳＴＧＳＴＮＩＳＧＮＴＬＴＬＹＱＧＧＲ（配列番号７１）、ＹＶＮＥＫ（配列番号７２）及びＱＮＹＱＶＤＫ（配列番号７３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、ＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号１５６）、ＧＤＫ、ＴＬＴＣＫ（配列番号１５７）、ＴＣＫ、ＡＴＤＬＳＮＫ（配列番号１５８）、ＬＡＴＤＬＳＮＫ（配列番号１５９）、ＴＦＡＴＥＴＳＳＫ（配列番号１６０）、ＦＡＴＥＴＳＳＫ（配列番号１６１）、ＦＥＫ、ＬＦＥＫ（配列番号１６２）、ＳＥＬＩＴＫ（配列番号１６３）、ＡＳＥＬＩＴＫ（配列番号１６４）、ＳＥＭＦＴＴＫ（配列番号１６５）、ＤＶＳ、ＩＭＮＥＨＬＮＫ（配列番号１６６）、ＭＮＥＨＬＮＫ（配列番号１６７）、ＤＦＴＫ（配列番号１６８）、ＦＴＫ、ＴＬＤＥＩＬＫ（配列番号１６９）、ＬＴＬＤＥＩＬＫ（配列番号１７０）、ＭＮＭＩＦＫ（配列番号１７１）、ＮＭＩＦＫ（配列番号１７２）、ＹＶＨＫ（配列番号１７３）、ＨＫ、ＶＮＩ、ＶＮＩＬ（配列番号１７４）、ＳＭＬＳＤＶＩＫ（配列番号１７５）、ＴＳＭＬＳＤＶＩＫ（配列番号１７６）、ＤＳＦＳＴＹＲ（配列番号１７７）、ＬＤＳＦＳＴＹＲ（配列番号１７８）、ＩＹＧＤＭＤＫ（配列番号１７９）、ＶＩＹＧＤＭＤＫ（配列番号１８０）、ＳＮＤＳＩＴＶＬＫ（配列番号１８１）、ＭＩＶ、ＳＧＤＡＮＶＲ（配列番号１８２）、ＳＶＳＧＤＡＮＶＲ（配列番号１８３）、ＬＬＮＤＩＳＧＫ（配列番号１８４）、ＬＮＤＩＳＧＫ（配列番号１８５）、ＳＳＥＡＥＹＲ（配列番号１８６）、ＥＳＳＥＡＥＹＲ（配列番号１８７）、ＳＧＡＫ（配列番号１８８）、ＭＳＧＡＫ（配列番号１８９）、ＴＥＬＴＥＬＡＫ（配列番号１９０）、ＤＧＳＰＡＤＩ（配列番号１９１）、ＹＥＡＫ（配列番号１９２）、ＥＡＫ、ＮＴＭＬＲ（配列番号１９３）、ＡＩＮＴＭＬＲ（配列番号１９４）、ＰＳＩＨＬＫ（配列番号１９５）、ＨＬＫ、ＤＹＱＴＩＮＫ（配列番号１９６）、ＮＫ、ＤＮＦ、ＤＮＦＹ（配列番号１９７）、ＰＮＥＹＶＩＴＫ（配列番号１９８）、ＬＬＣ、ＳＰＳＥＫ（配列番号１９９）、ＬＥＩＳＰＳＥＫ（配列番号２００）、ＮＡＹ、ＤＨＴＧＧＶＮＧＴＫ（配列番号２０１）、ＧＮＬＮＴＥＬＳＫ（配列番号２０２）、ＮＴＥＬＳＫ（配列番号２０３）、ＬＮＤＶＮＮＫ（配列番号２０４）、ＮＤＶＮＮＫ（配列番号２０５）、ＹＥ、ＤＬＮＫ（配列番号２０６）、ＱＩＥＹＬＳＫ（配列番号２０７）、ＬＱＩＥＹＬＳＫ（配列番号２０８）、ＳＤＫ、ＱＥＩＳＤＫ（配列番号２０９）、ＹＱＧＧＲ（配列番号２１０）、ＴＬＹＱＧＧＲ（配列番号２１１）、ＮＥＫ、ＶＮＥＫ（配列番号２１２）、ＤＫ、及びＶＤＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する、請求項１２に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドがｄｍＥＰＳＰＳタンパク質を選択的に検出又は定量化し、且つ、ＭＡＧＡＥＥＩＶＬＱＰＩＫ（配列番号７４）、ＦＰＶＥＤＡＫ（配列番号７５）、ＥＩＳＧＴＶＫ（配列番号７６）及びＩＬＬＬＡＡＬＳＥＧＴＴＶＶＤＮＬＬＮＳＥＤＶＨＹＭＬＧＡＬＲ（配列番号７７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１５】
前記ペプチドが、ＰＩＫ、ＥＩＶＬＱＰＩＫ（配列番号２１３）、ＰＶＥＤＡＫ（配列番号２１４）、ＶＥＤＡＫ（配列番号２１５）、ＳＧＴＶＫ（配列番号２１６）、ＧＴＶＫ（配列番号２１７）、ＩＬＬＬＡＡ（配列番号２１８）、及びＨＹＭＬＧＡＬＲ（配列番号２１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する、請求項１４に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドがＰＡＴタンパク質を選択的に検出又は定量化し、且つ、ＤＦＥＬＰＡＰＰＲＰＶＲＰＶＴＱＩ（配列番号７８）、ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）、ＭＳＰＥＲ（配列番号８０）、ＨＧＧＷＨＤＶＧＦＷＱＲ（配列番号８１）、ＮＡＹＤＷＴＶＥＳＴＶＹＶＳＨＲ（配列番号８２）、ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（配列番号８３）、ＡＡＧＹＫ（配列番号８４）、ＹＰＷＬＶＡＥＶＥＧＶＶＡＧＩＡＹＡＧＰＷＫ（配列番号８５）及びＲＰＶＥＩＲＰＡＴＡＡＤＭＡＡＶＣＤＩＶＮＨＹＩＥＴＳＴＶＮＦＲ（配列番号８６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドが、ＤＦＥ、ＤＦ、ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）、ＴＨＬＬＫ（配列番号２２１）、ＰＥＲ、ＳＰＥＲ（配列番号２２２）、ＧＦＷＱＲ（配列番号２２３）、ＶＧＦＷＱＲ（配列番号２２４）、ＳＴＶＹＶＳＨＲ（配列番号２２５）、ＳＨＲ、ＴＥＰＱＴ（配列番号２２６）、ＤＬＥＲ（配列番号２２７）、ＧＹＫ、ＡＧＹＫ（配列番号２２８）、ＧＰＷＫ（配列番号２２９）ＧＩＡＹＡＧＰＷＫ（配列番号２３０）、ＴＳＴＶＮＦＲ（配列番号２３１）、及びＮＦＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する、請求項１６に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドがアミノ酸配列ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）を含み、且つ、アミノ酸配列ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）又はＴＨＬＬＫ（配列番号２２１）からなる遷移イオンを生成する、請求項１６に記載のサロゲートペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドがＰＭＩタンパク質を選択的に検出又は定量化し、且つ、ＥＮＡＡＧＩＰＭＤＡＡＥＲ（配列番号８７）、ＡＬＡＩＬＫ（配列番号８８）、ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）、ＧＳＱＱＬＱＬＫＰＧＥＳＡＦＩＡＡＮＥＳＰＶＴＶＫ（配列番号９０）、ＦＥＡＫＰＡＮＱＬＬＴＱＰＶＫ（配列番号９１）、ＳＴＬＬＧＥＡＶＡＫ（配列番号９２）、ＬＩＮＳＶＱＮＹＡＷＧＳＫ（配列番号９３）、ＨＮＳＥＩＧＦＡＫ（配列番号９４）、ＶＬＣＡＡＱＰＬＳＩＱＶＨＰＮＫ（配列番号９５）、ＴＡＬＴＥＬＹＧＭＥＮＰＳＳＱＰＭＡＥＬＷＭＧＡＨＰＫ（配列番号９６）、ＬＳＥＬＦＡＳＬＬＮＭＱＧＥＥＫ（配列番号９７）及びＱＧＡＥＬＤＦＰＩＰＶＤＤＦＡＦＳＬＨＤＬＳＤＫ（配列番号９８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドが、ＰＭＤＡＡＥＲ（配列番号２３２）、ＧＩＰＭＤＡＡＥＲ（配列番号２３３）、ＡＩＬＫ（配列番号２３４）、ＬＫ、ＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３５）、ＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３６）、ＡＮＥＳＰＶＴＶＫ（配列番号２３７）、ＰＶＴＶＫ（配列番号２３８）、ＬＴＱＰＶＫ（配列番号２３９）、ＰＶＫ、ＧＥＡＶＡＫ（配列番号２４０）、ＬＧＥＡＶＡＫ（配列番号２４１）、ＱＮＹＡＷＧＳＫ（配列番号２４２）、ＮＹＡＷＧＳＫ（配列番号２４３）、ＮＳＥＩＧＦＡＫ（配列番号２４４）、ＨＮ、ＶＬＣＡＡＱ（配列番号２４５）、ＰＮＫ、ＷＭＧＡＨＰＫ（配列番号２４６）、ＴＡＬＴＥ（配列番号２４７）、ＮＭＱＧＥＥＫ（配列番号２４８）ＬＮＭＱＧＥＥＫ（配列番号２４９）、ＳＬＨＤＬＳＤＫ（配列番号２５０）、及びＨＤＬＳＤＫ（配列番号２５１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する、請求項１９に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドがアミノ酸配列ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）を含み、且つ、アミノ酸配列ＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３５）又はＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３６）からなる遷移イオンを生成する、請求項１９に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２２】
前記Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質が配列番号２５９のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２３】
前記Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質がイベントＢｔ１１からのものである、請求項２２に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２４】
前記ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質が配列番号２６０のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２５】
前記ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質がイベント５３０７からのものである、請求項２４に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２６】
前記ｍＣｒｙ３Ａタンパク質が配列番号２６１のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２７】
前記ｍＣｒｙ３Ａタンパク質がイベントＭＩＲ６０４からのものである、請求項２６に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２８】
前記Ｖｉｐ３Ａタンパク質が配列番号２６２のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のサロゲートペプチド。
【請求項２９】
前記Ｖｉｐ３Ａタンパク質がイベントＭＩＲ１６２からのものである、請求項２８に記載のサロゲートペプチド。
【請求項３０】
前記ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質が配列番号２６３のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のサロゲートペプチド。
【請求項３１】
前記ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質がイベントＧＡ２１からのものである、請求項３０に記載のサロゲートペプチド。
【請求項３２】
前記ＰＡＴタンパク質が配列番号２６４のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のサロゲートペプチド。
【請求項３３】
前記ＰＡＴタンパク質がイベントＢｔ１１、５９１２２、ＴＣ１５０７、ＤＰ４１１４又はＴ２５からのものである、請求項３２に記載のサロゲートペプチド。
【請求項３４】
前記ＰＭＩタンパク質が配列番号２６５又は配列番号２６６のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のサロゲートペプチド。
【請求項３５】
前記ＰＭＩタンパク質がイベントＭＩＲ１６２、イベントＭＩＲ６０４、イベント５３０７又はイベント３２７２からのものである、請求項３４に記載のサロゲートペプチド。
【請求項３６】
前記トランスジェニックタンパク質の混合物が、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３Ａタンパク質、ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質、ＰＡＴタンパク質及びＰＭＩタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つのトランスジェニックタンパク質を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のサロゲートペプチド。
【請求項３７】
前記トランスジェニックタンパク質の混合物が、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３Ａタンパク質、ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質、ＰＡＴタンパク質及びＰＭＩタンパク質を含む、請求項３６に記載の標識サロゲートペプチド。
【請求項３８】
前記トランスジェニックタンパク質の混合物がさらに、Ｃｒｙ１Ａ．１０５タンパク質（配列番号２６７）、Ｃｒｙ２Ａｂタンパク質（配列番号２６８）、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質（配列番号２６９）、Ｃｒｙ３４タンパク質（配列番号２７０）及びＣｒｙ３５タンパク質（配列番号２７１）からなる群から選択される少なくとも１つのトランスジェニックタンパク質を含む、請求項３７に記載の標識サロゲートペプチド。
【請求項３９】
前記トランスジェニック植物が、コーン、大豆、綿、米、小麦、キャノーラ及びナスからなる群から選択される、請求項１に記載のサロゲートペプチド。
【請求項４０】
前記トランスジェニックコーン植物が、イベントＢｔ１１、イベント５３０７、イベントＭＩＲ６０４及びイベントＧＡ２１からなる群から選択されるトランスジェニックコーンイベントを含む、請求項３９に記載のサロゲートペプチド。
【請求項４１】
前記トランスジェニックコーン植物が、イベントＢｔ１１、イベント５３０７、ＭＩＲ６０４及びイベントＧＡ２１を含む、請求項４０に記載のサロゲートペプチド。
【請求項４２】
前記トランスジェニックコーン植物がさらに、イベント３２７２、イベントＭＯＮ８９０３４、イベントＤＰ４１１４、イベント１５７７又はイベント５９１２２を含む、請求項４１に記載のサロゲートペプチド。
【請求項４３】
前記生体サンプルが、葉組織、種子、子実、花粉、又は根組織からのものである、請求項１に記載のサロゲートペプチド。
【請求項４４】
前記生体サンプルが、イベントＢｔ１１からのＣｒｙ１Ａｂタンパク質、イベント５３０７からのｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、イベントＭＩＲ６０４からのｍＣｒｙ３Ａタンパク質、イベントＧＡ２１からのＥＰＳＰＳタンパク質、Ｂｔ１１、５９１２２、ＤＰ４１１４、ＴＣ１５０７若しくはＴ２５からのＰＡＴタンパク質、又はイベントＭＩＲ１６２、イベントＭＩＲ６０４、イベント５３０７若しくはイベント３２７２からのＰＭＩタンパク質を含む、請求項４３に記載のサロゲートペプチド。
【請求項４５】
前記生体サンプルがさらに、イベントＭＯＮ８９０３４からのＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質、イベント１５０７からのＣｒｙ１Ｆタンパク質又はイベント５９１２２からのＣｒｙ３４及びＣｒｙ３５タンパク質を含む、請求項４４に記載のサロゲートペプチド。
【請求項４６】
請求項１に記載の少なくとも２つの標識サロゲートペプチドを含むアッセイカセット。
【請求項４７】
標的トランスジェニックタンパク質及び非トランスジェニックタンパク質の混合物を含むトランスジェニック植物からの複合生体サンプル中の１つ又は複数の標的トランスジェニックタンパク質を同時に検出又は定量化する方法であって、
ａ．トランスジェニック植物から生体サンプルを得るステップと、
ｂ．前記生体サンプルからタンパク質を抽出し、タンパク質の混合物を含む抽出物をもたらすステップと、
ｃ．前記ステップｂの抽出物中の非トランスジェニック不溶性タンパク質の量を低減し、濃縮可溶性タンパク質の抽出物をもたらすステップと、
ｄ．前記ステップｃの抽出物中の前記可溶性タンパク質を消化して、ペプチド断片を含む抽出物をもたらすステップであって、前記ペプチド断片が、各標的トランスジェニックタンパク質に特異的な少なくとも１つのサロゲートペプチドを含む、ステップと、
ｅ．前記ステップｄの抽出物中の前記ペプチド断片を濃縮するステップと、
ｆ．請求項１に記載の１つ又は複数の標識サロゲートペプチドを添加するステップであって、各標識サロゲートペプチドが、前記標的トランスジェニックタンパク質の各サロゲートペプチドと同じアミノ酸配列を有し、添加される標識サロゲートペプチドの数が、前記混合物中の標的トランスジェニックタンパク質の数に等しい、ステップと、
ｇ．前記混合物中の非サロゲートペプチドの量を低減することによって、前記サロゲートペプチド及び前記標識サロゲートペプチドを濃縮するステップと、
ｈ．前記ステップｇからのペプチド断片混合物を液体クロマトグラフィにより分離するステップと、
ｉ．前記ステップｈから得られたペプチド断片混合物を質量分析により分析するステップであって、標識サロゲートペプチドの遷移イオン断片の検出が、前記サロゲートペプチドが由来する標的トランスジェニックタンパク質の存在を示す、ステップと、任意選択的に、
ｊ．前記ステップｉの遷移イオン断片から発生された質量分析シグナルと、標識サロゲートペプチドの遷移イオンにより発生された質量分析シグナルとを比較することによって、前記生体サンプル中の標的トランスジェニックタンパク質の量を計算するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
前記標的トランスジェニックタンパク質が、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３タンパク質、二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ｄｍＥＰＳＰＳ）タンパク質、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質又はホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）タンパク質である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記標的トランスジェニックタンパク質がＣｒｙ１Ａｂであり、前記標識サロゲートペプチドがアミノ酸配列ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）を含み、且つ、アミノ酸配列ＰＬＴＫ（配列番号１３２）又はＳＡＥＦＮＮＩＩ（配列番号１３３）からなる遷移イオンを生成する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｃｒｙ１Ａｂ標的タンパク質が、アミノ酸配列ＰＬＴＫ（配列番号１３２）からなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって前記生体サンプル中で定量化される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的トランスジェニックタンパク質がｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質であり、前記標識サロゲートペプチドがアミノ酸配列ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）を含み、且つ、アミノ酸配列ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）又はＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４３）からなる遷移イオンを生成する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記ｅＣｒｙ３．１Ａｂトランスジェニックタンパク質が、アミノ酸配列からなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって前記生体サンプル中で定量化される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記標識サロゲートペプチドがアミノ酸配列ＤＧＧＩＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号３６）を含み、且つ、アミノ酸配列ＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号１５６）又はＧＤＫからなる遷移イオンを生成する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５４】
前記標識サロゲートペプチドがアミノ酸配列ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）を含み、且つ、アミノ酸配列ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）又はＴＨＬＬＫ（配列番号２２１）からなる遷移イオンを生成する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５５】
前記標識サロゲートペプチドがアミノ酸配列ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）を含み、且つ、アミノ酸配列ＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３５）又はＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３６）からなる遷移イオンを生成する、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１８年８月７日に作成された９４キロバイトのサイズを有するファイル名「８１３１９−ＵＳ−Ｌ−ＯＲＧ−ＮＡＴ−１＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩ形式の配列表として、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照によってその全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、一般的に、複合生体サンプル中の標的トランスジェニックタンパク質を選択的に検出、定量化、及び特徴付けるための質量分析の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
トランスジェニック作物は、「遺伝子スタック」又は「形質スタック」とも呼ばれる異なる形質を付与する複数の導入遺伝子を含む、ますます複雑化する遺伝子改変からなる。例えば、現在市場に出ている多数のトランスジェニックコーン製品は、広範囲の害虫を防除するための複数の殺虫性タンパク質、広範囲の化学除草剤への耐性を植物に付与する複数のタンパク質、及び植物形質転換プロセスの間に選択可能なマーカーとして使用される複数のタンパク質を同じ植物内に含有する。害虫を防除するために使用されるトランスジェニックタンパク質の多く、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの結晶エンドトキシン（Ｃｒｙタンパク質と呼ばれる）は構造的に密接に関連しており、同様の全アミノ酸配列同一性を有するか、或いは互いに著しい同一性のあるモチーフ又はドメインを含有し得る。多くのＣｒｙタンパク質は、鱗翅目又は鞘翅目の害虫に対して活性である。鱗翅目活性Ｃｒｙタンパク質の例としては、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ及びＣｒｙ９が挙げられる。鞘翅目活性Ｃｒｙタンパク質の例としては、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ３Ｃ、Ｃｒｙ８、二成分Ｃｒｙ２３−Ｃｒｙ３７及び二成分Ｃｒｙ３４−Ｃｒｙ３５が挙げられる。ほとんどの個々のＣｒｙタンパク質は、所与の昆虫目内の狭い範囲の昆虫種に対して生物学的に活性である。
【０００４】
活性の範囲が増大されたハイブリッドＣｒｙタンパク質を作成するために、多くの成功した試みが文献に開示されている。例えば、Ｃｒｙ１Ａａタンパク質からのカイコガ（ボムビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ））特異性ドメインがＣｒｙ１Ａｃタンパク質に移動され、したがって、得られたＣｒｙ１Ａａ−Ｃｒｙ１Ａｃキメラタンパク質に新しい殺虫活性が付与された（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，ＰＮＡＳ  ８６：４０３７  ４０４１）。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６及び１９９７（米国特許第５，５２７，８８３号明細書及び同第５，５９３，８８１号明細書）は、野生型Ｃｒｙ１Ｆタンパク質及びＣｒｙ１Ｃタンパク質のプロトキシンテール領域をＣｒｙ１Ａｂタンパク質のプロトキシンテール領域に置き換え、いずれも特定の発現宿主細胞における発現が改善されたＣｒｙ１Ｆ−Ｃｒｙ１ＡｂハイブリッドＣｒｙタンパク質及びＣｒｙ１Ｃ−Ｃｒｙ１ＡｂハイブリッドＣｒｙタンパク質を作製した。Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９８（米国特許第５，７３６，１３１号明細書）は、Ｃｒｙ１Ｅａタンパク質及びＣｒｙ１Ａｂタンパク質のドメインＩＩＩをＣｒｙ１Ｃａタンパク質のドメインＩＩＩで置換することによって新しい鱗翅目活性タンパク質を作成し、したがって、Ｇ２７と呼ばれるＣｒｙ１Ｅ−Ｃｒｙ１ＣハイブリッドＣｒｙタンパク質、及びＨ０４と呼ばれるＣｒｙ１Ａｂ−Ｃｒｙ１ＣハイブリッドＣｒｙタンパク質が生成された。これらはいずれも、野生型Ｃｒｙタンパク質親分子よりも広範囲の鱗翅目活性を有する。Ｍａｌｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１（米国特許第６，２４２，２４１号明細書）は、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質のドメインＩと、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質のドメインＩＩ及びＩＩＩ及びプロトキシンテールとを結合して、親の野生型Ｃｒｙタンパク質よりも広い殺虫活性を有するＣｒｙ１Ａｃ−Ｃｒｙ１ＦハイブリッドＣｒｙタンパク質を作成した。Ｂｏｇｄａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１１（米国特許第８，０３４，９９７号明細書）は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質のドメインＩ及びＩＩと、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質のドメインＩＩＩとを結合し、Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質プロトキシンテールを付加して、Ｃｒｙ１Ａ．１０５と呼ばれる新しい鱗翅目活性ハイブリッドＣｒｙタンパク質を作成した。そして、Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２（米国特許第８，３０９，５１６号明細書）は、Ｃｒｙ３Ａタンパク質及び修飾Ｃｒｙ３Ａタンパク質のドメインＩ及びＩＩと、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質のドメインＩＩＩとを結合し、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質プロトキシンテールの一部を付加して、ＦＲ８ａと呼ばれる（ｅＣｒｙ３．１Ａｂとも呼ばれる）鞘翅目活性ハイブリッドＣｒｙタンパク質を作成した。今まで報告されたハイブリッドＣｒｙタンパク質の大部分は、Ｃｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｆ及びＣｒｙ３Ａなどの同じ種類の野生型Ｃｒｙタンパク質の全て又は一部を使用している。
【０００５】
いくつかの野生型Ｃｒｙタンパク質、例えば、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ｂａ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ９Ｃ及びＣｒｙ３４−Ｃｒｙ３５、並びに植物性の殺虫性タンパク質、例えば、Ｖｉｐ３Ａ（米国特許第５，８７７，０１２号明細書を参照）は、コーン、綿、米及び大豆を含むトランスジェニック作物植物において発現されており、これらのうちのいくつかは、特定の鱗翅目及び鞘翅目の害虫を防除するために、早くも１９９６年から商業的に活用されている。最近では、１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は挿入された改変Ｃｒｙタンパク質、例えば修飾Ｃｒｙ３Ａ（ｍＣｒｙ３Ａ；米国特許第７，２３０，１６７号明細書）、並びにハイブリッドＣｒｙタンパク質、例えば、上記のｅＣｒｙ３．１Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５を含有するトランスジェニック作物製品、例えばコーンが商業的に導入されている。
【０００６】
商業的及び工業的使用のためのトランスジェニック植物を生産するために組換えＤＮＡ技術の使用がますます増えることにより、トランスジェニック植物系統を分析する診断法の構築が必要とされる。このような方法は、育種の継続的世代を通してトランスジェニック植物種を維持するために、環境において又はトランスジェニック植物に由来する生体サンプルにおいてトランスジェニック植物又は植物部分の存在をモニターするために、そして望ましい又は最適な表現型を有する新しいトランスジェニック植物の迅速な作成及び開発を助けるために必要とされる。さらに、多くの国の規制機関からのトランスジェニック植物の安全性評価のための現在のガイドラインは、規制承認を獲得及び維持するためにＤＮＡ及びタンパク質レベルでの特徴付けを要求する。上記のようにトランスジェニック植物にスタックされた遺伝子及びタンパク質の複雑さの増大は、特に、スタックされたトランスジェニックタンパク質が互いに類似しているか、又は環境中の野生型非トランスジェニックタンパク質に類似しているか、又はトランスジェニック植物に内因性の非トランスジェニックタンパク質に類似している場合に、複雑な混合物内の任意の１つの標的タンパク質の特異的な検出及び定量化を困難にする。
【０００７】
イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着検定法アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、植物の遺伝子改変によって導入されたタンパク質の検出及び定量化のために農産業において現在好ましい方法である。イムノアッセイの重大な構成要素は、標的タンパク質（抗原）に対する特異性を有する抗体である。イムノアッセイは非常に特異的であることができ、サンプルは、分析の前に簡単な調製しか必要としないことが多い。さらに、イムノアッセイは、広範囲の濃度にわたって定性的又は定量的に使用することができる。通常、イムノアッセイは、対象の各タンパク質に対して別の試験を必要とする。抗体は、動物において産生されるポリクローナル、又は細胞培養により生成されるモノクローナルであり得る。本質的に、ポリクローナル抗体の混合物は複数の認識エピトープを有することになり、存在する種々の抗体パラトープの数と共に他のタンパク質との配列及び構造的相同性の可能性が高まるので、感度を増大させることができるが、特異性を低下させる恐れもある。モノクローナル抗体は、単一のエピトープ又は抗原決定基に対して一定の親和性及び特異性を表し、そして大量に産生され得るので、ポリクローナル抗体と比べていくつかの利点を提供する。しかしながら、類似のトランスジェニック又は内因性タンパク質の複雑な混合物中の単一のトランスジェニックタンパク質の選択的な検出及び定量化などのより厳しい用途に対して、全ての抗体にはその使用を制限する固有の特性がある。さらに、ポリクローナル及びモノクローナル抗体はいずれも、アッセイにおいて感度を高め、バックグラウンドを低下させるためにさらなる精製ステップを必要とし得る。さらに、ＥＬＩＳＡシステムは、その物理的及び生物学的特性に劇的な効果を及ぼし得る標的タンパク質のわずかな変化を検出することができない可能性がある。例えば、抗体は、リン酸化又はグリコシル化などの翻訳後修飾によって改変されているか、又は立体構造的に覆い隠されているか、又は部分分解によって修飾されている、特定の形態のタンパク質又はペプチドを認識できないかもしれない。これらのタンパク質の物理的及び生物学的特性の変化はその酵素的、臨床的又は他の生物学的活性において重要な役割を果たし得るので、このような修飾の同定は極めて重要である。このような変化は、ＥＬＩＳＡベースの定量化法の信頼性及び有用性を制限し得る。
【０００８】
現在、トランスジェニックタンパク質を含有するトランスジェニック植物製品の有効な同定、又は市販の作物製品中のトランスジェニックタンパク質の定量化は、イムノアッセイの精度に依存している。成功したイムノアッセイの構築は、抗体の構築に使用される抗原の特定の特性、すなわち抗原のサイズ、疎水性及び三次構造、並びに抗体の品質及び精度に依存する。抗体の特異性は、偽陽性結果を生じ得る類似の物質との任意の交差反応性を解明するために、注意深く検査されなければならない。産業界の現在の問題は、市販の試験キット中の抗体の多くが、種々の製品中の類似のトランスジェニックタンパク質を区別しない、又はトランスジェニックタンパク質を野生型タンパク質から区別しないことであり、差別的な製品の同定及び定量化を困難又は不可能にする。例えば、同じ野生型Ｃｒｙタンパク質、例えばＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｆ及びＣｒｙ３のうちの１つ又は複数を使用し、トランスジェニック作物製品中に既に存在する同じ野生型Ｃｒｙタンパク質の全部又は一部から作られたハイブリッドＣｒｙタンパク質を発現する作物が導入されている、現在市販されている多くのトランスジェニック作物製品の場合、複合生体サンプル、例えば、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分又はトランスジェニック微生物からのサンプル中に一緒に存在する場合に、野生型Ｃｒｙタンパク質を互いに、そしてその同じ野生型Ｃｒｙタンパク質の全部又は一部を含有するハイブリッドＣｒｙタンパク質から区別することができるように、新しい且つ改善された診断方法を構築することが継続的に必要とされている。
【０００９】
質量分析（ＭＳ）は、タンパク質分析のためのＥＬＩＳＡの多数の制限を克服する代替のプラットフォームを提供する。ＭＳベースの分析の分野は、タンデム質量分析と連結されたエレクトロスプレー液体クロマトグラフィ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による多重反応モニタリング（ＭＲＭ）などの、標的タンパク質分析の重要な進歩をもたらした。基礎にある概念は、タンパク質消化後にその特異的な構成ペプチド（サロゲートペプチド）を測定することによって、タンパク質が定量化され得ることである。選択されたペプチドのみのデータ収集は、より高い精度、感度、及びスループットの測定を可能にする。サロゲートペプチドのＭＲＭベースの測定によるタンパク質の定量化は、タンパク質分析におけるＭＳの最も急成長している用途である。ＭＲＭベースのタンパク質アッセイは免疫ベースのアッセイと比べて２つの説得力のある利点を提供し、第１の利点は、抗体を使用することなく本質的に任意のタンパク質に対して特異的なアッセイを系統的に構成できることである。第２の利点は、標的ＭＳアッセイが１回の分析で多数のペプチドの多重分析を実施できることである。さらに、ＭＲＭは直接分析であり、免疫ベースのアッセイは間接分析である。免疫ベースのアッセイは、特異的に結合する検出試薬と共に固相に固定化され得る連結試薬で構成される結合アッセイに依存し、適切に定量化可能なシグナルを発生するために酵素を使用する。
【００１０】
市販のトランスジェニック作物製品は、殺虫性タンパク質、除草剤耐性タンパク質及び選択可能なマーカータンパク質のスタックを含む。同じ野生型殺虫性Ｃｒｙタンパク質、例えばＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｆ及びＣｒｙ３の１つ又は複数を使用し、トランスジェニック作物製品中に既に存在する同じ野生型Ｃｒｙタンパク質の全部又は一部から作られたハイブリッドＣｒｙ殺虫性タンパク質、例えば、ｍＣｒｙ３Ａ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ及びＣｒｙ１Ａ．１０５を発現する作物が導入されている、多くのこのような市販のトランスジェニック作物製品の場合、ＭＲＭベースのアッセイは、これらの密接に関連するトランスジェニック標的殺虫性タンパク質、並びに除草剤耐性及び選択可能なマーカータンパク質を区別できるはずである。したがって、ＭＲＭベースのアッセイにおいて機能するために必要な生化学的特性を全て有し、そしてそのアミノ酸配列の大部分が重複し得る標的トランスジェニックタンパク質に対して絶対的に特異的である付加的な特性を有するサロゲートペプチドを同定することが継続的に必要とされており、すなわち、サロゲートペプチドの遷移状態の１つ又は複数は、複数の複雑なマトリックスにわたって２つの密接に関連する標的タンパク質を妨害なしに明確に区別することができる。このような選択的サロゲートペプチド及びその遷移状態は、互いに類似しているか、又は環境中の野生型非トランスジェニックタンパク質に類似しているか、又はトランスジェニック植物に内因性の非トランスジェニックタンパク質に類似している標的トランスジェニックタンパク質を区別できるはずである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、質量分析を用いて複合生体マトリックス中にある標的トランスジェニックタンパク質を選択的に検出又は定量化するのに有用である標識サロゲートペプチド及びそのそれぞれの遷移イオンを提供する。本発明はさらに、標識サロゲートペプチド及び遷移イオンを用いて、複合生体マトリックス中の標的トランスジェニックタンパク質を選択的に検出又は定量化するための方法及びシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様において、内部標準ペプチドマーカーは、経験的分析及びコンピュータでの消化分析を通して設計され、重アミノ酸残基を用いて化学的に合成されるか、或いは安定同位体標識化されたアミノ酸又は代謝中間体の存在下で合成遺伝子を発現させることにより遺伝的に合成される。特定の実施形態では、内部標準は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、より具体的には、液体クロマトグラフィ連結タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を含む質量分析（ＭＳ）によって個々に特徴付けされ得る。特徴付けの後、各ペプチドのモノアイソトピック質量、そのサロゲート電荷状態、サロゲートｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、及び各遷移イオンのイオンタイプなどの、予め選択されたペプチドのパラメータを収集することができる。他の検討事項には、ペプチドサイズの最適化、翻訳後修飾の回避、プロセス誘発性修飾の回避、及び高率のプロテアーゼ切断の誤りの回避が含まれる。
【００１３】
単一のトランスジェニックイベント、複数のイベントの育種スタック（ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｓｔａｃｋ）、又は複数の標的トランスジェニックタンパク質の分子スタックを有する植物中に含まれ得る、殺虫性タンパク質Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ及びＶｉｐ３、除草剤耐性タンパク質ｄｍＥＰＳＰＳ及びＰＡＴ、並びに植物形質転換の選択可能なマーカータンパク質ＰＭＩからなる群から選択されるトランスジェニックタンパク質の選択的な検出又は定量化のために、配列番号１〜９８のいずれか１つ又はこれらの組合わせを含むペプチドを含む、特有の安定同位体標識（ＳＩＬ）サロゲートペプチドの例示的なリストが本明細書中に提供される。７つのタンパク質に由来する各ペプチドに対する各サロゲートペプチド配列及び遷移イオンは、質量分析ベースの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイにおいて有用である。
【００１４】
本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはＣｒｙ１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号１〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の態様では、標識サロゲートペプチドはＣｒｙ１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号９９〜１４１の少なくとも１つ又はペプチドＰＩＲ、ＴＹ、ＶＷ、ＨＲ、ＹＲ若しくはＰＰＲから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）を含み、アミノ酸配列ＰＬＴＫ（配列番号１３２）又はＳＡＥＦＮＮＩＩ（配列番号１３３）からなる遷移イオンを生成する。
【００１５】
本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号２７〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号１４２〜１５０の少なくとも１つ又はペプチドＤＧＲ、ＩＥＦ若しくはＬＥＲから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）を含み、アミノ酸配列ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）又はＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４３）からなる遷移イオンを生成する。
【００１６】
本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはｍＣｒｙ３Ａタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号３３〜３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはｍＣｒｙ３Ａタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号１５１〜１５５の少なくとも１つ又はペプチドＩＤＫから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＬＱＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５２）を含み、アミノ酸配列ＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５３）又はＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５４）からなる遷移イオンを生成する。
【００１７】
本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはＶｉｐ３タンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号３６〜７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはＶｉｐ３タンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号１５６〜２１２の少なくとも１つ又はペプチドＴＣＫ、ＦＥＫ、ＤＶＳ、ＦＴＫ、ＨＫ、ＶＮＩ、ＭＩＶ、ＥＡＫ、ＨＬＫ、ＮＫ、ＤＮＦ、ＬＬＣ、ＮＡＹ、ＹＥ、ＳＤＫ、ＮＥＫ、ＤＫ若しくはＶＤＫから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＤＧＧＩＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号３６）を含み、アミノ酸配列ＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号１５６）又はアミノ酸配列ＧＤＫからなる遷移イオンを生成する。
【００１８】
本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはｄｍＥＰＳＰＳタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号７４〜７７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはｄｍＥＰＳＰＳタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号２１３〜２１９の少なくとも１つ又はペプチドＰＩＫから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＡＴＹＶＬＤＧＶＰＲ（配列番号２５７）を含み、アミノ酸配列ＧＶＰＲ（配列番号２５８）又はアミノ酸配列ＰＲからなる遷移イオンを生成する。
【００１９】
本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはＰＡＴタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号７８〜８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはＰＡＴタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号２２０〜２３１の少なくとも１つ又はペプチドＤＦＥ、ＤＦ、ＰＥＲ、ＳＨＲ、ＧＹＫ若しくはＮＦＲから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）を含み、アミノ酸配列ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）又はＴＨＬＬＫ（配列番号２２１）からなる遷移イオンを生成する。
【００２０】
本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはＰＭＩタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号８７〜９８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはＰＭＩタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号２３２〜２５１の少なくとも１つ又はペプチドＬＫ、ＰＶＫ、ＨＮ若しくはＰＮＫから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）を含み、アミノ酸配列ＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３５）又はＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３６）からなる遷移イオンを生成する。
【００２１】
本発明の他の態様において、本発明の標識サロゲートペプチド及びそれから得られる遷移イオンは、配列番号２５９を含むＣｒｙ１Ａｂタンパク質、又は配列番号２６０を含むｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、又は配列番号２６１を含むｍＣｒｙ３Ａタンパク質、又は配列番号２６２を含むＶｉｐ３タンパク質、又は配列番号２６３を含むｄｍＥＰＳＰＳタンパク質、又は配列番号２６４を含むＰＡＴタンパク質、又はＰＭＩタンパク質配列番号２６５又は配列番号２６６を選択的に検出又は定量化する。
【００２２】
他の態様において、本発明の標識サロゲートペプチドは、トランスジェニック植物からの生体サンプル中に標的タンパク質がある場合に、本発明の標的タンパク質を選択的に検出又は定量化する。この態様のいくつかの実施形態では、生体サンプルは、トランスジェニック植物の葉組織、種子、子実、花粉又は根組織からのものである。
【００２３】
本発明の他の態様において、本発明の標識サロゲートペプチド及びそれから得られる遷移イオンは、トランスジェニックイベントＢｔ１１を含むコーン植物からのＣｒｙ１Ａｂタンパク質、又はトランスジェニックイベント５３０７を含むコーン植物からのｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、又はトランスジェニックイベントＭＩＲ６０４を含むコーン植物からのｍＣｒｙ３Ａタンパク質、又はトランスジェニックイベントＭＩＲ１６２を含むコーン植物から、若しくはトランスジェニックイベントＣＯＴ１０２を含む綿植物からのＶｉｐ３タンパク質、又はトランスジェニックイベントＧＡ２１を含むコーン植物からのｄｍＥＰＳＰＳタンパク質、又はトランスジェニックイベントＢｔ１１、ＤＡＳ−５９１２２、ＴＣ１５０７、ＤＰ４１１４若しくはＴ２５を含むコーン植物からのＰＡＴタンパク質、又はトランスジェニックイベントＭＩＲ１６２、ＭＩＲ６０４、５３０７若しくは３２７２を含むコーン植物からのＰＭＩタンパク質を選択的に検出又は定量化する。
【００２４】
サロゲートペプチド多数の異なる組合わせは、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及び／又はＰＭＩタンパク質からの特異的なサロゲートペプチドの１つ又は複数を用いるＭＲＭアッセイによって同時にモニター及び定量化することができ、したがって、生体サンプルから得られる所与のタンパク質調製物中のこれらのタンパク質のそれぞれの総量を質量分析によって測定する手段を提供することができる。これらのペプチドはＭＲＭベースのアッセイと併用して、トランスジェニック植物の異なる成長段階における発現レベルを決定するため、葉組織、種子及び子実、花粉及び根組織を含むがこれらに限定されない、異なるトランスジェニック植物組織及び器官における発現レベルを決定するため、規制リスク評価のための潜在的な曝露レベルを決定するため、食品加工、比較、及び世代研究における異なるレベルのタンパク質を決定するための定量的ペプチド／タンパク質分析を含む多数の用途を有する。最も広い意味では、７つのタンパク質のためのこれらの特有のサロゲートペプチドは、生体及び非生体マトリックスの全てのタイプにおける、農業用途、生物学的同等性試験、バイオマーカー、診断、発見、食品、環境、治療モニタリングを含む多数の用途のために、ＭＲＭアッセイと組み合わせて使用され得る。本発明のいくつかの態様において、配列番号１〜９８のいずれかを含む本発明の１つ又は複数の標識サロゲートペプチドを含むアッセイカセットが提供され、これは、本発明の任意の１つ又は複数の標的タンパク質の同時及び選択的な検出又は定量化を可能にする。
【００２５】
本発明は、トランスジェニック標的タンパク質を発現するトランスジェニック植物からの生体サンプルなどの複合生体マトリックスにおいて、トランスジェニック標的タンパク質を選択的に検出又は定量化するための方法も提供する。このような方法は、トランスジェニック植物からのサンプル、例えば、葉、種子又は子実、花粉又は根からのサンプルを得るステップと、植物サンプルからタンパク質を抽出するステップと、抽出物中の非トランスジェニック不溶性タンパク質の量を低減することによって標的タンパク質プールを濃縮するステップと、選択された酵素、例えばトリプシンを用いて抽出物中の可溶性タンパク質を消化して、ペプチド断片を含む抽出物をもたらすステップであって、ペプチド断片が各標的トランスジェニックタンパク質に特異的な少なくとも１つのサロゲートペプチドを含むステップと、標的タンパク質を特異的に検出するＳＩＬペプチドのアッセイカセットを添加するステップであって、各標識サロゲートペプチドが、標的トランスジェニックタンパク質の各サロゲートペプチドと同じアミノ酸配列を有し、添加される標識サロゲートペプチドの数が、混合物中の標的トランスジェニックタンパク質の数に等しいステップと、混合物中の非サロゲートペプチドの量を低減することによって、サロゲートペプチド及び標識サロゲートペプチドを濃縮するステップと、液体クロマトグラフィを用いてペプチド断片混合物を分離するステップと、質量分析を用いてペプチド断片混合物を分析するステップであって、標識サロゲートペプチドの遷移イオン断片の検出が、サロゲートペプチドが由来する標的トランスジェニックタンパク質の存在を示すステップと、任意選択的に、遷移イオン断片から発生された質量分析シグナルと、標識サロゲートペプチドの遷移イオンにより発生された質量分析シグナルとを比較することによって、生体サンプル中の標的トランスジェニックタンパク質の量を計算するステップとを含む。本発明のトランスジェニックタンパク質に由来するＳＩＬサロゲートペプチドはそれぞれ、質量分析ベースの多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイの間に、特有の遷移イオンを有する。したがって、これらのペプチドは、異なる度合いのイオン化をもたらす衝突エネルギーのわずかな変化のために、選択的なＭＳイオンを発生し得る。例えば、トリプル四重極ＭＳを使用して、ペプチド特異的な高ｍ／ｚイオンを生成することができる。結果として、本発明の方法は選択的利点を提供し、当該技術分野において知られているかもしれない、より低ｍ／ｚの高強度イオンマーカーの使用と比べて、内因性バックグラウンドを低下させることができる。
【００２６】
本発明のいくつかの態様では、本発明の方法において選択的に検出又は定量化される標的タンパク質は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３タンパク質、二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ｄｍＥＰＳＰＳ）タンパク質、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質又はホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）タンパク質である。
【００２７】
本発明の他の態様では、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３タンパク質、二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ｄｍＥＰＳＰＳ）タンパク質、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質又はホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）タンパク質を検出又は定量化するために本発明の方法において有用である標識サロゲートペプチドは、配列番号１〜９８のいずれか１つを含む。
【００２８】
本発明の方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはＣｒｙ１Ａｂを選択的に検出又は定量化し、配列番号１〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。別の態様では、標識サロゲートペプチドはＣｒｙ１Ａｂを選択的に検出又は定量化し、配列番号９９〜１４１の少なくとも１つ又はペプチドＰＩＲ、ＴＹ、ＶＷ、ＨＲ、ＹＲ若しくはＰＰＲから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）を含み、アミノ酸配列ＰＬＴＫ（配列番号１３２）又はＳＡＥＦＮＮＩＩ（配列番号１３３）からなる遷移イオンを生成する。別の態様では、Ｃｒｙ１Ａｂ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＰＬＴＫ（配列番号１３２）からなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって、生体サンプル中で定量化される。
【００２９】
本発明の方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号２７〜３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号１４２〜１５０の少なくとも１つ又はペプチドＤＧＲ、ＩＥＦ若しくはＬＥＲから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）を含み、アミノ酸配列ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）又はＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４３）からなる遷移イオンを生成する。別の態様では、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）からなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって、生体サンプル中で定量化される。この態様の別の実施形態では、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＡＶＦＮＥＬＦＴＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号２８）を含み、アミノ酸配列ＴＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号１４４）又はＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号１４５）からなる遷移イオンを生成する。別の態様では、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＴＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号１４４）からなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって、生体サンプル中で定量化される。
【００３０】
本発明の方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはｍＣｒｙ３Ａタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号３３〜３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはｍＣｒｙ３Ａタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号１５１〜１５５の少なくとも１つ又はペプチドＩＤＫから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＬＱＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５２）を含み、アミノ酸配列ＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５３）又はＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５４）からなる遷移イオンを生成する。別の態様では、ｍＣｒｙ３Ａ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５３）からなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって、生体サンプル中で定量化される。
【００３１】
本発明の方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはＶｉｐ３タンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号３６〜７３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはＶｉｐ３タンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号１５６〜２１２の少なくとも１つ又はペプチドＴＣＫ、ＦＥＫ、ＤＶＳ、ＦＴＫ、ＨＫ、ＶＮＩ、ＭＩＶ、ＥＡＫ、ＨＬＫ、ＮＫ、ＤＮＦ、ＬＬＣ、ＮＡＹ、ＹＥ、ＳＤＫ、ＮＥＫ、ＤＫ若しくはＶＤＫから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＤＧＧＩＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号３６）を含み、アミノ酸配列ＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号１５６）又はアミノ酸配列ＧＤＫからなる遷移イオンを生成する。別の態様では、Ｖｉｐ３標的タンパク質は、アミノ酸配列ＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号１５６）からなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって、生体サンプル中で定量化される。この態様の別の実施形態では、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＦＴＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５５）を含み、アミノ酸配列ＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５６）又はアミノ酸配列ＬＫからなる遷移イオンを生成する。別の態様では、Ｖｉｐ３標的タンパク質は、アミノ酸配列ＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５６）からなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって、生体サンプル中で定量化される。
【００３２】
本発明の方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはｄｍＥＰＳＰＳタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号７４〜７７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはｄｍＥＰＳＰＳタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号２１３〜２１９の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＡＴＹＶＬＤＧＶＰＲ（配列番号２５７）を含み、アミノ酸配列ＧＶＰＲ（配列番号２５８）又はアミノ酸配列ＰＲからなる遷移イオンを生成する。別の態様では、ｄｍＥＰＳＰＳ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＰＲからなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって、生体サンプル中で定量化される。
【００３３】
本発明の方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはＰＡＴタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号７８〜８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはＰＡＴタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号２２０〜２３１の少なくとも１つ又はペプチドＤＦＥ、ＤＦ、ＰＥＲ、ＳＨＲ、ＧＹＫ若しくはＮＦＲから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）を含み、アミノ酸配列ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）又はＴＨＬＬＫ（配列番号２２１）からなる遷移イオンを生成する。別の態様では、ｄｍＥＰＳＰＳ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）からなる遷移イオン断片から発生される質量分析シグナルを比較することによって、生体サンプル中で定量化される。
【００３４】
本発明の方法の別の態様では、標識サロゲートペプチドはＰＭＩタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号８７〜９８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明の別の態様において、標識サロゲートペプチドはＰＭＩタンパク質を選択的に検出又は定量化し、配列番号２３２〜２５１の少なくとも１つ又はペプチドＬＫ、ＰＶＫ、ＨＮ若しくはＰＮＫから選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。この態様の実施形態において、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）を含み、アミノ酸配列ＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３５）又はＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３６）からなる遷移イオンを生成する。
【００３５】
本発明はさらに、トランスジェニック標的タンパク質のハイスループット検出又は定量化のためのシステムを提供する。このようなシステムは、トランスジェニック標的タンパク質に特異的である予め設計された標識サロゲートペプチドのカセットと、１つ又は複数の質量分析計とを含む。
【００３６】
本発明の種々の目的、特徴、態様、及び利点は、添付の図面及び配列表と共に、本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
配列の簡単な説明
配列番号１〜２６は、トランスジェニックＣｒｙ１Ａｂタンパク質の選択的な検出及び定量化のための安定同位体標識サロゲートペプチドのアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２７〜３２は、トランスジェニックｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質の選択的な検出及び定量化のための安定同位体標識サロゲートペプチドのアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号３３〜３５は、トランスジェニックｍＣｒｙ３Ａタンパク質の選択的な検出及び定量化のための安定同位体標識サロゲートペプチドのアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号３６〜７３は、トランスジェニックＶｉｐ３タンパク質の選択的な検出及び定量化のための安定同位体標識サロゲートペプチドのアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号７４〜７７は、トランスジェニックｄｍＥＰＳＰＳタンパク質の選択的な検出及び定量化のための安定同位体標識サロゲートペプチドのアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号７８〜８６は、トランスジェニックＰＡＴタンパク質の選択的な検出及び定量化のための安定同位体標識サロゲートペプチドのアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号８７〜９８は、トランスジェニックＰＭＩタンパク質の選択的な検出及び定量化のための安定同位体標識サロゲートペプチドのアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号９９〜１４１は、配列番号１〜２６のＳＩＬサロゲートペプチドの遷移イオンのアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１４２〜１５０は、配列番号２７〜３２のＳＩＬサロゲートペプチドの遷移生成物のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号１５１〜１５５は、配列番号３３〜３５のＳＩＬサロゲートペプチドの遷移生成物のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号１５６〜２１２は、配列番号３６〜７２のＳＩＬサロゲートペプチドの遷移生成物のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号２１３〜２１９は、配列番号７４〜７７のＳＩＬサロゲートペプチドの遷移生成物のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２２０〜２３１は、配列番号７９〜８６のＳＩＬサロゲートペプチドの遷移生成物のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号２３２〜２５１は、配列番号８７〜９８のＳＩＬサロゲートペプチドの遷移生成物のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２５２〜２５４は、トランスジェニックｍＣｒｙ３Ａタンパク質の選択的な検出及び定量化のためのＳＩＬサロゲートペプチド及びその遷移生成物のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号２５５〜２５６は、トランスジェニックＶｉｐ３Ａタンパク質の選択的な検出及び定量化のためのＳＩＬサロゲートペプチド及び遷移生成物のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号２５７〜２５８は、トランスジェニックｄｍＥＰＳＰＳタンパク質の選択的な検出及び定量化のためのＳＩＬサロゲートペプチド及び遷移生成物のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号２５９〜２７０は、本発明の例示的な標的トランスジェニックタンパク質のアミノ酸配列である。
【００５５】
詳細な説明
この説明は、本発明が実施され得る種々の方法の全て、又は本発明に追加され得る特徴の全ての詳細な一覧であることを意図しない。例えば、１つの実施形態に関して説明される特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して説明される特徴をその実施形態から削除することができる。したがって、本発明は、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意の特徴又は特徴の組合わせが排除又は省略され得ることを企図する。さらに、本明細書で示唆される種々の実施形態に対する多数の変化及び追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、本発明から逸脱するものではない。そのため、以下の記載は本発明のいくつかの特定の実施形態を説明することが意図され、それらの置換、組合わせ及び変化の全てを徹底的に特定することは意図されない。
【００５６】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用途は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の本発明の記載において使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明するためのものであって、本発明の限定は意図されない。本明細書で使用される用語法は特定の実施形態のみを説明するためのものであって、本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解されるべきである。本発明に関連する一般的な参考文献には、Ａｌｗｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５３５０−５４；Ｂａｌｄｗｉｎ（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ３（１）：１−９；Ｃａｎ  ａｎｄ  Ａｎｎａｎ（１９９７）Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．編  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，ｐ．１０．２１．１−１０．２１．２７；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２（２）：２９５−３１７；Ｄｏｍｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２（５７７１）：２１２−１７；Ｎａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．２３：５９−６５；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．編  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，ｐ．１０．２２．１−１０．２２．２４；Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ（１９９５）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １６：１７９１−１８１４；Ｒａｊａｇｏｐａｌ  ａｎｄ  Ａｈｅｒｎ（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４（５５５１）：２５７１−７３；Ｓｅｓｉｋｅｒａｎ  ａｎｄ  Ｖａｓａｎｔｈｉ（２００８）Ａｓｉａ  Ｐａｃ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１７  Ｓｕｐｐｌ．１：２４１−４４；及びＴｏｐｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．２２：２３７−５０が含まれる。
【００５７】
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、１つ又は２つ以上を意味することができる。したがって、例えば、「植物」への言及は、単一の植物又は複数の植物を意味することができる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連の記載事項の１つ又は複数の任意及び全ての可能な組合わせ、並びに代替の「又は」で解釈される場合には組合わせの欠如を指し、これらを包含する。
【００５９】
「約」という用語は、本明細書では、およそ、大体、ほぼ、又は辺りを意味するために使用される。「約」という用語が数値の範囲と共に使用される場合、記載されるその数値よりも上及び下に境界を広げることによってその範囲は修正される。一般に、「約」という用語は、本明細書では、２０パーセント、好ましくは１０パーセント上方又は下方の（より高い又はより低い）変動によって、数値を記載される値よりも上及び下に修正するために使用される。温度に関しては、「約」という用語は、±１℃、好ましくは±０．５℃を意味する。本発明の文脈において（例えば、温度又は分子量の値と組み合わせて）「約」という用語が使用される場合、正確な値（すなわち、「約」を伴わない）が好ましい。
【００６０】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書中で使用される場合、記載される特徴、整数、ステップ、操作、要素、及び／又は成分の存在を特定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分、及び／又はこれらの群の存在又は追加を除外しない。
【００６１】
本明細書で使用される場合、移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」（及び文法的な変形）は、特許請求の範囲が、特許請求の範囲に記載される特定の材料又はステップと、特許請求される本発明の「基本的及び新規の特徴を実質的に変更しないもの」とを包含すると解釈されるべきであることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、本発明の特許請求の範囲で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価であると解釈されることは意図されない。
【００６２】
本明細書で使用される「Ｃｒｙタンパク質」という用語は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の成長サイクルの胞子形成期の間に、天然条件下で結晶形態のプロトキシンとして蓄積する球状タンパク質分子である殺虫性タンパク質を指す。「Ｃｒｙ毒素」及び「デルタ−エンドトキシン」という用語は、「Ｃｒｙタンパク質」という用語と互換的に使用することができる。Ｃｒｙタンパク質及びＣｒｙタンパク質をコードする遺伝子の現在の命名法は、アミノ酸配列相同性に基づく（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１３）。この当該技術分野において承認されている分類において、各Ｃｒｙタンパク質は、第１のランク（アラビア数字）、第２のランク（大文字）、第３のランク（小文字）、及び第４のランク（別のアラビア数字）を組み込んだ特有の名前が割り当てられる。例えば、Ｃｒｉｃｋｍｏｅ  ｅｔ  ａｌ．によると、４５％未満の相同性を有する２つのＣｒｙタンパク質は特有の第１のランクが割り当てられ、例えば、Ｃｒｙ１及びＣｒｙ２であり得る。４５％超であるが７０％未満である相同性を有する２つのＣｒｙタンパク質は同じ第１のランクが与えられるが、異なる第２のランクが割り当てられ、例えば、Ｃｒｙ１Ａ及びＣｒｙ１Ｂであり得る。７０％〜９５％の相同性を有する２つのＣｒｙタンパク質は同じ第１及び第２のランクが割り当てられるが、異なる第３のランクが割り当てられ、例えば、Ｃｒｙ１Ａａ及びＣｒｙ１Ａｂであり得る。そして９５％超であるが１００％未満である相同性を有する２つのＣｒｙタンパク質は同じ第１、第２及び第３のランクが割り当てられるが、異なる第４のランクが割り当てられ、例えば、Ｃｒｙ１Ａｂ１及びＣｒｙ１Ａｂ２であり得る。
【００６３】
本明細書で使用される「Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質」は、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に従い、インターネットウェブサイト「ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／」において受入番号ＡＡＡ２２３３０で開示されるホロタイプＣｒｙ１Ａｂアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、天然に存在するか又は合成であるバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来の殺虫性結晶タンパク質を意味する。Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質（受入番号を伴う）の例としては、制限なしに、Ｃｒｙ１Ａｂ１（ＡＡＡ２２３３０）、Ｃｒｙ１Ａｂ２（ＡＡＡ２２６１３）、Ｃｒｙ１Ａｂ３（ＡＡＡ２２５６１）、Ｃｒｙ１Ａｂ４（ＢＡＡ０００７１）、Ｃｒｙ１Ａｂ５（ＣＡＡ２８４０５）、Ｃｒｙ１Ａｂ６（ＡＡＡ２２４２０）、Ｃｒｙ１Ａｂ７（ＣＡＡ３１６２０）、Ｃｒｙ１Ａｂ８（ＡＡＡ２２５５１）、Ｃｒｙ１Ａｂ９（ＣＡＡ３８７０１）、Ｃｒｙ１Ａｂ１０（Ａ２９１２５）、Ｃｒｙ１Ａｂ１１（Ｉ１２４１９）、Ｃｒｙ１Ａｂ１２（ＡＡＣ６４００３）、Ｃｒｙ１Ａｂ１３（ＡＡＮ７６４９４）、Ｃｒｙ１Ａｂ１４（ＡＡＧ１６８７７）、Ｃｒｙ１Ａｂ１５（ＡＡＯ１３３０２）、Ｃｒｙ１Ａｂ１６（ＡＡＫ５５５４６）、Ｃｒｙ１Ａｂ１７（ＡＡＴ４６４１５）、Ｃｒｙ１Ａｂ１８（ＡＡＱ８８２５９）、Ｃｒｙ１Ａｂ１９（ＡＡＷ３１７６１）、Ｃｒｙ１Ａｂ２０（ＡＢＢ７２４６０）、Ｃｒｙ１Ａｂ２１（ＡＢＳ１８３８４）、Ｃｒｙ１Ａｂ２２（ＡＢＷ８７３２０）、Ｃｒｙ１Ａｂ２３（ＨＱ４３９７７７）、Ｃｒｙ１Ａｂ２４（ＨＱ４３９７７８）、Ｃｒｙ１Ａｂ２５（ＨＱ６８５１２２）、Ｃｒｙ１Ａｂ２６（ＨＱ８４７７２９）、Ｃｒｙ１Ａｂ２７（ＪＮ１３５２４９）、Ｃｒｙ１Ａｂ２８（ＪＮ１３５２５０）、Ｃｒｙ１Ａｂ２９（ＪＮ１３５２５１）、Ｃｒｙ１Ａｂ３０（ＪＮ１３５２５２）、Ｃｒｙ１Ａｂ３１（ＪＮ１３５２５３）、Ｃｒｙ１Ａｂ３２（ＪＮ１３５２５４）、Ｃｒｙ１Ａｂ３３（ＡＡＳ９３７９８）、Ｃｒｙ１Ａｂ３４（ＫＣ１５６６６８）、Ｃｒｙ１Ａｂ３５（ＫＴ６９２９８５）、及びＣｒｙ１Ａｂ３６（ＫＹ４４０２６０）が挙げられる。本発明のＣｒｙ１Ａｂタンパク質の例示的な例は、配列番号２５９によって表される。
【００６４】
本明細書で使用される「Ｃｒｙ３」という用語は、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に従ってＣｒｙ３に分類される前述の配列に対して高度の配列同一性又は類似性を共有する殺虫性タンパク質を指し、その例は、インターネットウェブサイト「ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／」において開示されており、Ｃｒｙ３Ａａ１（ＡＡＡ２２３３６）、Ｃｒｙ３Ａａ２（ＡＡＡ２２５４１）、Ｃｒｙ３Ａａ３（Ｃａａ６８４８２）、Ｃｒｙ３Ａａ４（ＡＡＡ２２５４２）、Ｃｒｙ３Ａａ５（ＡＡＡ５０２５５）、Ｃｒｙ３Ａａ６（ＡＡＣ４３２６６）、Ｃｒｙ３Ａａ７（ＣＡＢ４１４１１）、Ｃｒｙ３Ａａ８（ＡＡＳ７９４８７）、Ｃｒｙ３Ａａ９（ＡＡＷ０５６５９）、Ｃｒｙ３Ａａ１０（ＡＡＵ２９４１１）、Ｃｒｙ３Ａａ１１（ＡＡＷ８２８７２）、Ｃｒｙ３Ａａ１２（ＡＢＹ４９１３６）、Ｃｒｙ３Ｂａ１（ＣＡＡ３４９８３）、Ｃｒｙ３Ｂａ２（ＣＡＡ００６４５）、Ｃｒｙ３Ｂａ３（ＪＱ３９７３２７）、Ｃｒｙ３Ｂｂ１（ＡＡＡ２２３３４）、Ｃｒｙ３Ｂｂ２（ＡＡＡ７４１９８）、Ｃｒｙ３Ｂｂ３（Ｉ１５４７５）、及びＣｒｙ３Ｃａ１（ＣＡＡ４２４６９）が含まれる（受入番号を伴う）。アミノ酸の挿入、置換又は欠失によって改変されたＣｒｙ３タンパク質は、本明細書では「修飾Ｃｒｙ３タンパク質」又は「ｍＣｒｙ３タンパク質」と称される。このような「修飾Ｃｒｙ３タンパク質」は通常、「修飾Ｃｒｙ３タンパク質」が由来する野生型Ｃｒｙ３タンパク質と比較して、特定の害虫、例えばコーンルートワーム（ディアブロティカ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ）種）に対して増強された活性を有する。「修飾Ｃｒｙ３タンパク質」の例は、配列番号２６２のアミノ酸配列によって表される「ｍＣｒｙ３Ａ」である。「修飾Ｃｒｙ３」タンパク質の他の例としては、制限なしに、米国特許第８，２４７，３６９号明細書に開示される「ｍＣｒｙ３Ａタンパク質」、米国特許第９，１０９，２３１号明細書に開示される「ｍＣｒｙ３Ａタンパク質」、及び米国特許第６，０６０，５９４号明細書に開示される「ｍＣｒｙ３Ｂタンパク質」が挙げられる。
【００６５】
「ｅＣｒｙ３．１Ａｂ」という用語は、米国特許第８，３０９，５１６号明細書に記載されるように、Ｎ末端からＣ末端方向にＣｒｙ１Ａａ又はＣｒｙ１Ａｂタンパク質のＣ末端領域に融合されたＣｒｙ３Ａタンパク質のＮ末端領域を含む、改変されたハイブリッド殺虫性タンパク質を指す。「ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質」の例は、配列番号２６０のアミノ酸配列によって表される。
【００６６】
本明細書で使用される場合、トランスジェニック「イベント」という用語は、異種ＤＮＡ、例えば、対象の遺伝子を含む発現カセットによる単一の植物細胞の形質転換及び再生により産生された組換え植物を指す。「イベント」という用語は、異種ＤＮＡを含む元の形質転換体及び／又は形質転換体の子孫を指す。「イベント」という用語は、形質転換体と別のコーン系統との間の有性外交配（ｓｅｘｕａｌ  ｏｕｔｃｒｏｓｓ）によって生じる子孫も指す。反復親に対して戻し交配を繰り返した後でも、形質転換親からの挿入ＤＮＡ及び隣接ＤＮＡは、同じ染色体位置において交配の子孫に存在する。通常、植物組織の形質転換は複数のイベントを生じ、そのそれぞれは、植物細胞のゲノムの異なる位置へのＤＮＡ構築物の挿入を表す。導入遺伝子又は他の望ましい特徴の発現に基づいて、特定のイベントが選択される。本発明のこのようなトランスジェニックイベントの非限定的な例としては、ｃｒｙ１Ａｂ及びｐａｔ遺伝子を含み、米国特許第６１１４６０８号明細書に記載される「イベントＢｔ１１」（「Ｂｔ１１イベント」又は単に「Ｂｔ１１」ともいう）、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ及びＰＭＩ遺伝子を含み、米国特許第８４６６３４６号明細書に記載される「イベント５３０７」（「５３０７イベント」又は単に「５３０７」ともいう）、ｍＣｒｙ３Ａ及びＰＭＩ遺伝子を含み、米国特許第７３６１８１３号明細書に記載される「イベントＭＩＲ６０４」（「ＭＩＲ６０４イベント」又は単に「ＭＩＲ６０４」ともいう）、Ｖｉｐ３Ａ及びＰＭＩ遺伝子を含み、米国特許第８２３２４５６号明細書に記載される「イベントＭＩＲ１６２」（「イベントＭＩＲ１６２」又は単に「ＭＩＲ１６２」ともいう）、ｄｍＥＰＳＰＳ遺伝子を含み、米国特許第６５６６５８７号明細書に記載される「イベントＧＡ２１」（「ＧＡ２１イベント」又は単に「ＧＡ２１」ともいう）、アルファ−アミラーゼ７９７Ｅ及びＰＭＩ遺伝子を含み、米国特許第７６３５７９９号明細書に記載される「イベント３２７２」（「３２７２イベント」又は単に「３２７２」ともいう）、Ｃｒｙ１Ａｂを含み、米国特許第６７１３２５９号明細書に記載される「イベントＭＯＮ８１０」（「ＭＯＮ８１０イベント」又は単に「ＭＯＮ８１０」ともいう）、Ｃｒｙ１Ａ．１０５及びＣｒｙ２Ａｂ遺伝子を含み、米国特許第８０６２８４０号明細書に記載される「イベントＭＯＮ８９０３４」（「ＭＯＮ８９０３４イベント」又は単に「ＭＯＮ８９０３４」ともいう）、Ｃｒｙ１Ｆ及びＰＡＴ遺伝子を含み、米国特許第７２８８６４３号明細書に記載される「イベントＴＣ１５０７」（「ＴＣ１５０７イベント」又は単に「ＴＣ１５０７」ともいう）、Ｃｒｙ３４／Ｃｒｙ３５及びＰＡＴ遺伝子を含み、米国特許第７３２３５５６号明細書に記載される「イベントＤＡＳ５９１２２」（「ＤＡＳ５９１２２イベント」又は単に「ＤＡＳ５９１２２」ともいう）、並びにＣｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ３４／Ｃｒｙ３５及びＰＡＴ遺伝子を含み、米国特許第９７９０５６１号明細書に記載される「イベントＤＰ４１１４」（「ＤＰ４１１４イベント」又は単に「ＤＰ４１１４」ともいう）が挙げられる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ハイブリッドＣｒｙタンパク質」という用語は、天然に存在しない改変された殺虫性タンパク質であり、その少なくとも一部は、少なくとも、隣接する２７％のＣｒｙ１Ａｂタンパク質のアミノ酸配列を含む。２７％の限界は、ハイブリッドＣｒｙタンパク質中の隣接するＣｒｙ１Ａｂアミノ酸の数をハイブリッドＣｒｙタンパク質中のアミノ酸の総数で割ることによって計算される。例えば、ハイブリッドＣｒｙタンパク質ｅＣｒｙ３．１Ａｂ（配列番号２６１）は、１７４個のＣｒｙ１Ａｂアミノ酸（４８０位〜６５３位）、及び全部で６５３個のアミノ酸を有する。したがって、ｅＣｒｙ３Ａ．１Ａｂは、少なくとも、隣接する２７％のＣｒｙ１Ａｂタンパク質のアミノ酸配列を有する。本発明に従うハイブリッドＣｒｙタンパク質の別の例であるＣｒｙ１Ａ．１０５は、配列番号２６７によって表される。
【００６８】
「ｄｍＥＰＳＰＳ」（５−エノールピルビルシキミ酸（ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｕｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ）−３−リン酸シンターゼ）は、ＰＣＴ公開番号国際公開第９７／０４１０３号に記載されるように、グリホサート除草剤への耐性を植物に付与する改変タンパク質である。本発明のｄｍＥＰＳＰＳの例示的な例は、配列番号２６３によって表される。
【００６９】
本明細書で使用される「高度に関連する殺虫性タンパク質」は、少なくとも９５％の全配列同一性を有するか、又は少なくとも８０％の配列同一性を有する共通のモチーフを有するタンパク質を指す。「高度に関連する」殺虫性タンパク質の例としては、少なくとも８０％の配列同一性を有する共通のモチーフを有するＣｒｙ１Ａｂ（配列番号２５９）及びｅＣｒｙ３．１Ａｂ（配列番号２６０）と、少なくとも８０％の配列同一性を有する共通のモチーフを有するｅＣｒｙ３．１Ａｂ（配列番号２６０）及びｍＣｒｙ３Ａ（配列番号２６１）とが挙げられる。
【００７０】
「単離された」核酸分子、ポリヌクレオチド又は毒素という用語は、もはやその天然環境に存在しない核酸分子、ポリヌクレオチド又は毒性タンパク質である。本発明の単離された核酸分子、ポリヌクレオチド又は毒素は精製形態で存在してもよいし、或いはトランスジェニック細菌細胞又はトランスジェニック植物などの組換え宿主中に存在してもよい。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「質量分析」という一般的な用語は、例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型（ＴＯＦ）ＭＳ、大気圧（ＡＰ）ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、真空ＭＡＬＤＩ  ＭＳ、タンデムＭＳ、又はこれらの任意の組合わせを含む、任意の適切な質量分析方法、装置又は配置を指す。質量分析装置は、一連の磁場及び電場を通して分子の飛行経路を測定することによって、分子の分子質量（分子の質量対電荷比に応じて）を測定する。質量対電荷比は、帯電粒子の電気力学において広く使用される物理量である。特定のペプチドの質量対電荷比は、当業者により先験的に計算することができる。異なる質量対電荷比を有する２つの粒子は、同じ電場及び磁場にさらされたときに真空中で同じ経路で移動することはない。本発明は、とりわけ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）と、その後のペプチドタンデムＭＳ分析との使用を含む。「タンデム質量分析」において、サロゲートペプチドはＭＳ機器で選別され、サロゲートペプチドは続いて断片化されて１つ又は複数の「遷移イオン」を生じることができ、これは、第２のＭＳ手順において分析（検出及び／又は定量化）される。
【００７２】
質量分析の方法論及び装置の詳細な概説は、参照によって本明細書に援用される以下の参考文献において見出すことができる：Ｃａｎ  ａｎｄ  Ａｎｎａｎ（１９９７）Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．編  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，ｐ．１０．２１．１−１０．２１．２７；Ｐａｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ（１９９５）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １６：１７９１−１８１４；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．編  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，ｐ．１０．２２．１−１０．２２．２４；及びＤｏｍｏｎ  ａｎｄ  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２（５７７１）：２１２−１７。
【００７３】
ペプチドは、アルファ−アミノ酸の規定の順番での連結から形成される短いポリマーである。またペプチドは、プロテアーゼによるポリペプチド、例えばタンパク質の消化によって生成され得る。
【００７４】
「植物」は、任意の発達段階の任意の植物であり、特に種子植物である。
【００７５】
「植物細胞」は、プロトプラスト及び細胞壁を含む、植物の構造的及び生理学的な単位である。植物細胞は、単離された単一の細胞又は培養された細胞の形態であってもよいし、或いは、例えば、植物組織、植物器官、又は植物全体などの高度に組織化された単位の一部としてであってもよい。
【００７６】
「植物細胞培養物」は、種々の発達段階における、例えば、プロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合体及び胚などの植物単位の培養物を意味する。
【００７７】
「植物材料」は、葉、茎、根、花若しくは花部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞若しくは組織培養物、又は植物の任意の他の部分若しくは生成物を指す。
【００７８】
「植物器官」は、根、茎、葉、つぼみ、又は胚などの、明確に且つ視覚的に構造化及び分化した植物の部分である。
【００７９】
本明細書で使用される「植物組織」は、構造的及び機能的な単位に組織化された植物細胞の群を意味する。植物体又は培養物中の植物の任意の組織が含まれる。この用語には、植物全体、植物器官、植物種子、組織培養物、並びに構造的及び／又は機能的な単位に組織化された植物細胞の任意の群が含まれるが、これらに限定されない。上記に記載されるか又は他にこの定義に包含される任意の特定のタイプの植物組織と併用した、又は併用しないこの用語の使用は、任意の他のタイプの植物組織を除外することは意図されない。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「サロゲートペプチド」という用語は、タンパク質消化、例えばトリプシン消化によって標的トランスジェニックタンパク質から誘導され、質量分析アッセイにおいて、１つ又は複数の遷移イオンを生成する機能を果たすペプチドを指し、遷移イオンは、サロゲートペプチドと共同して、標的トランスジェニックタンパク質がトランスジェニック植物からのサンプルなどの複合生体マトリックスにおいて１つ又は複数の他のトランスジェニックタンパク質及び／又は非トランスジェニックタンパク質の存在下にある場合に、標的トランスジェニックタンパク質を差別的に検出及び／又は定量化し、そして生体マトリックス中の１つ又は複数の他のトランスジェニックタンパク質又は非トランスジェニックタンパク質を検出及び／又は定量化しない。「サロゲートペプチド」は、標的トランスジェニックタンパク質の「シグネチャーペプチド」と呼ばれることもある。例えば、本発明のＣｒｙ１Ａｂサロゲートペプチドは１つ又は複数の遷移イオンを生成し、これは、Ｃｒｙ１Ａｂ−サロゲートペプチドと共同して、Ｃｒｙ１Ａｂトランスジェニックタンパク質が１つ又は複数の非Ｃｒｙ１Ａｂトランスジェニックタンパク質、例えば、本発明のｅＣｒｙ３．１Ａｂ殺虫性タンパク質又はｍＣｒｙ３Ａ殺虫性タンパク質、及び／又は非トランスジェニックタンパク質の存在下にある場合に、複合生体マトリックス中の標的Ｃｒｙ１Ａｂトランスジェニック殺虫性タンパク質を差別的に検出及び／又は定量化する。別の例では、本発明のｅＣｒｙ３．１Ａｂサロゲートペプチドは１つ又は複数の遷移イオンを生成し、これは、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ−サロゲートペプチドと共同して、ｅＣｒｙ３．１Ａｂトランスジェニックタンパク質が複合生体マトリックス中で１つ又は複数の非ｅＣｒｙ３．１Ａｂトランスジェニックタンパク質、例えば、本発明のＣｒｙ１Ａｂ又はｍＣｒｙ３Ａ、及び／又は非トランスジェニックタンパク質の存在下にある場合に、複合生体マトリックス中の標的ｅＣｒｙ３．１Ａｂトランスジェニックタンパク質を差別的に検出及び／又は定量化する。本発明の実施形態によると、複合生体マトリックス中の２つ以上の標的トランスジェニックタンパク質を検出及び／又は定量化するために、本発明の２つ以上の標識サロゲートペプチドは、質量分析アッセイにおいて同時に使用され得る。
【００８１】
「標識サロゲートペプチド」は、質量分析アッセイにおいてサロゲートペプチドを検出しやすくするために標識化された天然に存在しないサロゲートペプチドである。例えば、標識は、リジン、イソロイシン、バリン又はアルギニンなどの安定同位体標識アミノ酸（ＳＩＬ）であり得る。したがって、ＳＩＬ標識サロゲートペプチドは、サロゲートペプチドのアミノ酸の１つ又は複数が重同位体によって標識化されていることを除いて、非標識サロゲートペプチドと同じアミノ酸配列を有する。例えば、本明細書に記載されるように、サロゲートペプチドＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）は重リジン（Ｋ）によって標識化されており、ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ［Ｃ１３Ｎ１５−Ｋ］と呼ぶことができる；サロゲートペプチドＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）は重バリン（Ｖ）によって標識化されており、ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ［Ｃ１３Ｎ１５−Ｖ］と呼ぶことができる；サロゲートペプチドＬＱＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５２）はアルギニン（Ｒ）によって標識化されており、ＬＱＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ［Ｃ１３Ｎ１５−Ｒ］と呼ぶことができる；サロゲートペプチドＤＧＧＩＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号３６）は重リジン（Ｋ）によって標識化されており、ＤＧＧＩＳＱＦＩＧＤＫ［Ｃ１３Ｎ１５−Ｋ］と呼ぶことができる；サロゲートペプチドＦＴＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５５）は重リジン（Ｋ）によって標識化されており、ＦＴＴＧＴＤＬＫ［Ｃ１３Ｎ１５−Ｋ］と呼ぶことができる；サロゲートペプチドＳＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＡＴＹＶＬＤＤＧＶＰＲ（配列番号２５７）は重アルギニン（Ｒ）によって標識化されており、ＳＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＡＴＹＶＬＤＤＧＶＰＲ［Ｃ１３Ｎ１５−Ｒ］と呼ぶことができる；サロゲートペプチドＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）は重リジンによって標識化されており、ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ［Ｃ１３Ｎ１５−Ｋ］と呼ぶことができる；サロゲートペプチドＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９は重アルギニン（Ｒ）によって標識化されており、ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ［Ｃ１３Ｎ１５−Ｒ］と呼ぶことができる、などである。
【００８２】
「ＰＡＴ」（ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）タンパク質は、ＰＣＴ公開番号国際公開第８７／０５６２９号に記載されるように、グルホシネート除草剤への耐性を植物に付与する。本発明のＰＡＴタンパク質の例示的な例は、配列番号２６４によって表される。
【００８３】
「ＰＭＩ」（マンノース６−リン酸イソメラーゼ）タンパク質は、米国特許第５７６７３７８号明細書に記載されるように、マンノースを利用する能力を植物細胞に付与する。本発明のＰＭＩタンパク質の例示的な例は、配列番号２６５及び配列番号２６６によって表される。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「スタックされた」又は「スタッキング」という用語は、植物のゲノム中に取り込まれた複数の異種ポリヌクレオチド又はトランスジェニックタンパク質又はトランスジェニックイベントの存在を指す。
【００８５】
本明細書で使用される「標的タンパク質」は、標的タンパク質が複合生体マトリックス中にあるときに、標識サロゲートペプチドによって選択的に検出及び／又は定量化されることが意図されるタンパク質、通常はトランスジェニックタンパク質を意味する。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「トランスジェニックタンパク質」という用語は、非天然の形態、位置、生物などにおいて産生されるタンパク質又はペプチドを意味する。したがって、「トランスジェニックタンパク質」は、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、或いは天然に存在しないアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。例えば、天然のＣｒｙ１Ａｂ産生生物であるバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの野生型Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するＣｒｙ１Ａｂタンパク質は、トランスジェニック植物又は細菌内で産生される場合に「トランスジェニックタンパク質」である。
【００８７】
ヌクレオチドは本明細書では以下の標準的な略語によって示される：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びグアニン（Ｇ）。アミノ酸は同様に以下の標準的な略語によって示される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；１）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【００８８】
本発明は、それぞれが質量分析アッセイの結果に異なる影響を与え得る、トランスジェニック及び非トランスジェニックタンパク質の混合物を含むトランスジェニック植物に由来する複合生体サンプル、例えば、１つ又は複数のトランスジェニック植物の葉、茎、根、花粉及び種子からの生体サンプルにおいて、１つ又は複数の標的トランスジェニックタンパク質の差別的な検出及び／又は定量化のために質量分析を実行するのに有用な組成物、方法及びシステムを包含する。本発明の組成物、方法及びシステムは、例えば他家受粉によって近隣の植物からの導入遺伝子で汚染されている危険性がある非トランスジェニック植物を試験するためにも有用である。これらの実施形態により、導入遺伝子の偶発的な存在がモニター及び制限され得る。他の実施形態では、本明細書に開示される方法は、植物形質転換手順の結果をスクリーニングして、トランスジェニックタンパク質の望ましい発現特徴を示す形質転換体を同定するために使用され得る。
【００８９】
分析すべき特定の標的タンパク質の優先度は当業者の判断による。このようなタンパク質は植物、動物、細菌、酵母などに由来するものであり得るが、これらに限定されず、非形質転換細胞において見出されないか又は形質転換細胞において見出されるタンパク質のいずれかであり得る。トランスジェニック植物において発現される特に適切なタンパク質は、除草剤、昆虫、又はウィルスへの耐性を付与するもの、及び栄養価の改善、収量増大、乾燥耐性、窒素利用、有用な工業化合物の製造、植物の加工特性、又はバイオレメディエーションの可能性を提供する遺伝子である。このようなタンパク質の例としては、殺虫性結晶タンパク質、すなわちＣｒｙタンパク質、及び植物性の殺虫性タンパク質、すなわちバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からのＶｉｐｓ、又はそれに由来する昆虫耐性を付与するための改変タンパク質、５’−エノールピルビル−３’−ホスホシキミ酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）若しくはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）などの除草剤耐性タンパク質、又はホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）などの選択可能なマーカータンパク質が挙げられる。当業者には容易に理解されるように、所望の形質を付与するタンパク質はどれも組換えＤＮＡ技術を用いて植物細胞において発現させることができ、したがって、本発明に従う標的トランスジェニックタンパク質であり得る。
【００９０】
より具体的には、本発明は、葉、根、茎、花粉、種子又は子実などのトランスジェニック植物組織のサンプルからの複合生体マトリックス中のＣｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩトランスジェニックタンパク質の特異的な差別的検出及び／又は定量化を可能にする組成物、診断法、及び診断法を実行するのに有用なシステムを提供する。本発明の組成物、診断法及びシステムは、トランスジェニック殺虫性タンパク質を含む複合生体サンプル中の、非常に類似しているトランスジェニック殺虫性タンパク質、例えば、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ及びｅＣｒｙ３．１Ａｂの差別的な検出及び／又は定量化のために特に有用である。現在の最先端技術では、２つのタンパク質が同じ生体サンプル中にある場合、２つのタイプのタンパク質間で抗体の高い交差反応性があるので、抗体に基づく市販のイムノアッセイは、かなりの量のＣｒｙ１Ａｂタンパク質のアミノ酸配列を用いて改変されたハイブリッドＣｒｙタンパク質からＣｒｙ１Ａｂタンパク質を差別的に検出するのに有用でない。例えば、Ｃｒｙ１Ａｂ検出イムノアッセイで使用するために野生型Ｃｒｙ１Ａｂに対して産生させた抗体は、２つのタンパク質が同じ生体サンプル中にある場合に、野生型Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質に由来するそのアミノ酸をわずか２７％しか有さないハイブリッドＣｒｙタンパク質と交差反応する。したがって、例えば、このような複合生体サンプル中の野生型Ｃｒｙ１Ａｂの定量化は、１つ又は複数の非標的野生型Ｃｒｙタンパク質又は非標的ハイブリッドＣｒｙタンパク質の存在によって混乱され得る。さらに、野生型Ｃｒｙ１Ａｂ及び本発明の１つ又は複数のハイブリッドＣｒｙタンパク質を含む市販のトランスジェニック植物製品の同一性保持のための発現タンパク質の検出の使用は、トランスジェニック植物製品中のＣｒｙ１Ａｂタンパク質及びハイブリッドＣｒｙタンパク質の両方に対する抗体の交差反応性のために困難である。本明細書に開示される方法及び組成物はこれらの問題に対する解決法を提供し、標的タンパク質が他の非常に密接に関連するトランスジェニックタンパク質及び非トランスジェニックタンパク質の混合物中にある場合でも標的タンパク質を差別的に検出及び／又は定量化するために、標的トランスジェニックタンパク質からのサロゲートペプチド及びサロゲートペプチドに由来する遷移イオンに依存する。
【００９１】
質量分析多重反応モニタリングアッセイ（ＭＲＭ）による標的タンパク質の定量化の精度は、適切なサロゲートペプチドの選択と、サロゲートペプチド／遷移イオンの組合わせが標的タンパク質を区別する能力とに完全に依存する。本発明のサロゲートペプチドの多数の異なる組合わせは、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及び／又はＰＭＩタンパク質からの特異的なペプチドのうちの１つ又は複数を用いるＭＲＭアッセイによって同時にモニター及び定量化することができ、したがって、所与の生体サンプル内の標的タンパク質のそれぞれを質量分析によって同定及び定量化する手段を提供する。７つの標的タンパク質のサロゲートペプチは、それぞれの対応する標的タンパク質、すなわちＣｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及び／又はＰＭＩを定量化するためにカセットを構成することができる。カセットを構成する利用可能なサロゲートペプチドは、単一のＭＲＭアッセイにおいて単独又は任意の組合わせで分析されてもよいし、或いは複数のＭＲＭアッセイにおいて分析されてもよい。
【００９２】
本発明のサロゲートペプチドは、ＭＲＭベースのアッセイと併用して、異なる成長段階において発現レベルを決定するため、環境リスク評価のための潜在的な曝露レベルを決定するため、食品加工において異なるレベルの標的タンパク質を決定するため、比較研究において発現レベルを決定するため、そして世代研究において発現レベルを比較するための定量的ペプチド／タンパク質分析を含む、多数の用途を有する。最も広い意味では、７つのタンパク質のこれらの特有のサロゲートペプチドは、ＭＲＭアッセイと併用して、特定の組織（すなわち、葉、根、穀粒、花粉）内の単一のトランスジェニックイベント、又は複数のトランスジェニックイベントの育種スタックのいずれかであり得る、選択可能なマーカー、除草耐性又は殺虫性形質のいずれかをモニター又は定量化するために使用され得る。
【００９３】
ＭＲＭベースのアッセイは、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及び／又はＰＭＩを含むタンパク質からの特異的なサロゲートペプチドの相対レベル又は絶対レベルのいずれかを定量化又は測定し得る。これらのタンパク質の相対的な定量レベルは、シグネチャーピーク面積を互いに比較することによってＭＲＭアッセイにより決定することができる。個々のＣｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及び／又はＰＭＩサロゲートペプチドの相対レベルは、異なるサンプル又は組織タイプから定量化することができる。一般に、相対的な定量レベルは、各標的サロゲートペプチドに対する内部標準として安定同位体標識（ＳＩＬ）合成ペプチド類似体を用いるＭＲＭ測定においてペプチド存在量を比較することによって決定される。当該技術分野において通常教示されることに反して、通常、ＳＩＬペプチドは［13Ｃ615Ｎ2］リジン又は［13Ｃ615Ｎ4］アルギニンの取込みによって標識化されるが、イソロイシン及びバリンなどの他のアミノ酸を含むこともできる。ＳＩＬ標準物は高純度を有することが必要であり、アミノ酸分析によって定量的に標準化されなければならない。当該技術分野において通常教示されることに反して、本発明のＳＩＬはタンパク質消化の直後にサンプル中に添加され、したがって、その後の分析ステップを補正する働きをする。ＳＩＬは液体クロマトグラフィ分離において非標識サロゲートペプチドと共溶出し、同一のＭＳ／ＭＳ断片化パターンを示すが、同位体標識化のために質量のみが異なる。標識サロゲートペプチド及び生成物イオンの両方において結果として生じるこの質量シフトにより、質量分析計は非標識ペプチド及び標識ペプチドを区別することができる。複雑なペプチド消化は、標的ペプチドと間違えられる可能性のある共溶出遷移物の複数のセットを含有することが多いので、同位体標識された標準物の共溶出により、正しいシグナルが同定され、偽陽性の定量化からの最良の防御が提供される。既知の濃度の添加ＳＩＬ標準物が各サンプルに添加されるので、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及び／又はＰＭＩについて、異なる標的タンパク質からの対応するサロゲートペプチドのそれぞれの定量的な相対量が決定され得る。個々のペプチド（単数又は複数）の相対的な定量化は、サンプル内又はサンプル間で、別のペプチド（単数又は複数）の量に対して実施され得るので、ピーク面積が生体サンプル内で互いに関連しているかどうかを決定することによって、存在するペプチドの相対量を決定することが可能である。異なるサンプル間の個々のシグネチャーピーク面積から得られる相対的な定量データは、通常、サンプルごとに分析されるタンパク質の量に対して正規化される。相対的な定量化は、単一のサンプル中で同時に複数のタンパク質からの多数のペプチドにわたって、及び／又は他のペプチド／タンパク質に関する１つのペプチド／タンパク質の相対的なタンパク質量へのさらなる洞察を得るために多数のサンプルにわたって実施することができる。
【００９４】
Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３、ｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及び／又はＰＭＩについての絶対的な定量レベルは、１つの生体サンプル中の対応するタンパク質からの個々のサロゲートペプチドのシグネチャーピーク面積を、サンプル中の既知の量の１つ又は複数の内部標準と比較することによってＭＲＭベースのアッセイにより決定することができる。これは、標的タンパク質を含有しない負の対照マトリックスに、既知の濃度のこれらのタンパク質を添加することによって達成され得る。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイは、正確な添加濃度の７つのタンパク質のそれぞれを有する非トランスジェニックサンプルを秤量し；サンプルを溶解緩衝液中に抽出及び均質化し；サンプルを遠心分離して、可溶性及び不溶性タンパク質を濃縮するために分離して、抽出の複雑さを低減し；可溶性タンパク質サンプルをトリプシンで消化し（組織又は生体サンプルは、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ及びＬｙｓ−Ｃを含むがこれらに限定されない１つ又は複数のプロテアーゼによって、サンプルを十分に消化する時間の間、処理され得る）；サンプルを遠心分離し、固定濃度のＳＩＬペプチド（絶対的な定量化においてＳＩＬは指標として使用される）を添加し；カチオン交換を利用する固相抽出によって脱塩して、マトリックス効果又は妨害を最小限にし、イオン抑制を低減し；そしてタンデム質量分析に連結された液体クロマトグラフィによってサンプルを分析することを含む。通常、イオントラップ質量分析計、又は単一の複合タンパク質／ペプチドライセートからできるだけ多くのペプチドを同定するための包括的なプロファイリングを実施することができる別の形態の質量分析計が、通常、分析のために実施される。ＭＲＭベースのアッセイは任意のタイプの質量分析計において構築及び実施することができるが、ＭＲＭアッセイのための最も有利な機器プラットフォームは、トリプル四重極機器プラットフォームであると考えられることが多い。７つのタンパク質に特有の対象のサロゲートペプチド及びＳＩＬは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定される。ピーク面積比（サロゲートペプチドのピーク面積／対応するＳＩＬペプチドのピーク面積）は、対象の各ペプチドに対して決定される。対象の７つのタンパク質の濃度は、ピーク面積比を用いて較正曲線から逆に計算される。絶対的な定量化は、多数のペプチドにわたって（これは、単一のサンプルにおいて同時に複数のタンパク質の定量的決定を可能する）、及び／又は個々の生体サンプル又は大きいサンプルセットにおける絶対的なタンパク質量への洞察を得るために複数のサンプルにわたって実施することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明は、１つ又は複数のトランスジェニック植物からの１つ又は複数の生体サンプル中のトランスジェニックタンパク質及び非トランスジェニックタンパク質の混合物において、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３タンパク質、二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ｄｍＥＰＳＰＳ）タンパク質、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質及びホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）タンパク質からなる群から選択される標的トランスジェニックタンパクを、質量分析アッセイ、例えば、多重反応モニタリングアッセイで選択的に検出又は定量化する機能を果たす標識サロゲートペプチドを包含し、サロゲートペプチドは、標識と、ＧＳＡＱＧＩＥＧＳＩＲ（配列番号１）、ＩＶＡＱＬＧＱＧＶＹＲ（配列番号２）、ＴＬＳＳＴＬＹＲ（配列番号３）、ＤＶＳＶＦＧＱＲ（配列番号４）、ＴＹＰＩＲ（配列番号５）、ＴＶＳＱＬＴＲ（配列番号６）、ＷＹＮＴＧＬＥＲ（配列番号７）、ＥＷＥＡＤＰＴＮＰＡＬＲ（配列番号８）、ＶＷＧＰＤＳＲ（配列番号９）、ＡＰＭＦＳＷＩＨＲ（配列番号１０）、ＷＧＦＤＡＡＴＩＮＳＲ（配列番号１１）、ＮＱＡＩＳＲ（配列番号１２）、ＩＥＥＦＡＲ（配列番号１３）、ＳＧＦＳＮＳＳＶＳＩＩＲ（配列番号１４）、ＬＳＨＶＳＭＦＲ（配列番号１５）、ＥＩＹＴＮＰＶＬＥＮＦＤＧＳＦＲ（配列番号１６）、ＬＥＧＬＳＮＬＹＱＩＹＡＥＳＦＲ（配列番号１７）、ＹＮＱＦＲ（配列番号１８）、ＹＮＤＬＴＲ（配列番号１９）、ＳＰＨＬＭＤＩＬＮＳＩＴＩＹＴＤＡＨＲ（配列番号２０）、ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）、ＱＧＦＳＨＲ（配列番号２２）、ＭＤＮＮＰＮＩＮＥＣＩＰＹＮＣＬＳＮＰＥＶＥＶＬＧＧＥＲ（配列番号２３）、ＥＬＴＬＴＶＬＤＩＶＳＬＦＰＮＹＤＳＲ（配列番号２４）、ＲＰＦＮＩＧＩＮＮＱＱＬＳＶＬＤＧＴＥＦＡＹＧＴＳＳＮＬＰＳＡＶＹＲ（配列番号２５）、ＳＧＴＶＤＳＬＤＥＩＰＰＱＮＮＮＶＰＰＲ（配列番号２６）、ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）、ＡＶＮＥＬＦＴＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号２８）、ＩＴＱＬＰＬＴＫ（配列番号２９）、ＧＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号３０）、ＱＣＡＧＩＲＰＹＤＧＲ（配列番号３１）、ＩＥＦＶＰＡＥＶＴＦＥＡＥＹＤＬＥＲ（配列番号３２）、ＩＴＱＬＰＬＶＫ（配列番号３３）、ＭＴＡＤＮＮＴＥＡＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号３４）、ＶＹＩＤＫ（配列番号３５）、ＤＧＧＩＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号３６）、ＬＩＴＬＴＣＫ（配列番号３７）、ＥＬＬＬＡＴＤＬＳＮＫ（配列番号３８）、ＦＥＥＬＴＦＡＴＥＴＳＳＫ（配列番号３９）、ＥＶＬＦＥＫ（配列番号４０）、ＴＡＳＥＬＩＴＫ（配列番号４１）、ＤＶＳＥＭＦＴＴＫ（配列番号４２）、ＬＬＧＬＡＤＩＤＹＴＳＩＭＮＥＨＬＮＫ（配列番号４３）、ＩＤＦＴＫ（配列番号４４）、ＴＤＴＧＧＤＬＴＬＤＥＩＬＫ（配列番号４５）、ＤＩＭＮＭＩＦＫ（配列番号４６）、ＡＬＹＶＨＫ（配列番号４７）、ＶＮＩＬＰＴＬＳＮＴＦＳＮＰＮＹＡＫ（配列番号４８）、ＩＴＳＭＬＳＤＶＩＫ（配列番号４９）、ＱＮＬＱＬＤＳＦＳＴＹＲ（配列番号５０）、ＤＳＬＳＥＶＩＹＧＤＭＤＫ（配列番号５１）、ＭＩＶＥＡＫＰＧＨＡＬＩＧＦＥＩＳＮＤＳＩＴＶＬＫ（配列番号５２）、ＶＹＦＳＶＳＧＤＡＮＶＲ（配列番号５３）、ＮＱＱＬＬＮＤＩＳＧＫ（配列番号５４）、ＶＥＳＳＥＡＥＹＲ（配列番号５５）、ＹＭＳＧＡＫ（配列番号５６）、ＤＧＳＰＡＤＩＬＤＥＬＴＥＬＴＥＬＡＫ（配列番号５７）、ＶＹＥＡＫ（配列番号５８）、ＬＤＡＩＮＴＭＬＲ（配列番号５９）、ＧＫＰＳＩＨＬＫ（配列番号６０）、ＤＥＮＴＧＹＩＨＹＥＤＴＮＮＮＬＥＤＹＱＴＩＮＫ（配列番号６１）、ＤＮＦＹＩＥＬＳＱＧＮＮＬＹＧＧＰＩＶＨＦＹＤＶＳＩＫ（配列番号６２）、ＬＬＣＰＤＱＳＥＱＩＹＹＴＮＮＩＶＦＰＮＥＹＶＩＴＫ（配列番号６３）、ＳＱＮＧＤＥＡＷＧＤＮＦＩＩＬＥＩＳＰＳＥＫ（配列番号６４）、ＮＡＹＶＤＨＴＧＧＶＮＧＴＫ（配列番号６５）、ＬＤＧＶＮＧＳＬＮＤＬＩＡＱＧＮＬＮＴＥＬＳＫ（配列番号６６）、ＩＡＮＥＱＮＱＶＬＮＤＶＮＮＫ（配列番号６７）、ＹＥＶＴＡＮＦＹＤＳＳＴＧＥＩＤＬＮＫ（配列番号６８）、ＱＮＹＡＬＳＬＱＩＥＹＬＳＫ（配列番号６９）、ＱＬＱＥＩＳＤＫ（配列番号７０）、ＬＬＳＰＥＬＩＮＴＮＮＷＴＳＴＧＳＴＮＩＳＧＮＴＬＴＬＹＱＧＧＲ（配列番号７１）、ＹＶＮＥＫ（配列番号７２）、ＱＮＹＱＶＤＫ（配列番号７３）、ＭＡＧＡＥＥＩＶＬＱＰＩＫ（配列番号７４）、ＦＰＶＥＤＡＫ（配列番号７５）、ＥＩＳＧＴＶＫ（配列番号７６）、ＩＬＬＬＡＡＬＳＥＧＴＴＶＶＤＮＬＬＮＳＥＤＶＨＹＭＬＧＡＬＲ（配列番号７７）、ＤＦＥＬＰＡＰＰＲＰＶＲＰＶＴＱＩ（配列番号７８）、ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）、ＭＳＰＥＲ（配列番号８０）、ＨＧＧＷＨＤＶＧＦＷＱＲ（配列番号８１）、ＮＡＹＤＷＴＶＥＳＴＶＹＶＳＨＲ（配列番号８２）、ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（配列番号８３）、ＡＡＧＹＫ（配列番号８４）、ＹＰＷＬＶＡＥＶＥＧＶＶＡＧＩＡＹＡＧＰＷＫ（配列番号８５）、ＲＰＶＥＩＲＰＡＴＡＡＤＭＡＡＶＣＤＩＶＮＨＹＩＥＴＳＴＶＮＦＲ（配列番号８６）、ＥＮＡＡＧＩＰＭＤＡＡＥＲ（配列番号８７）、ＡＬＡＩＬＫ（配列番号８８）、ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）、ＧＳＱＱＬＱＬＫＰＧＥＳＡＦＩＡＡＮＥＳＰＶＴＶＫ（配列番号９０）、ＦＥＡＫＰＡＮＱＬＬＴＱＰＶＫ（配列番号９１）、ＳＴＬＬＧＥＡＶＡＫ（配列番号９２）、ＬＩＮＳＶＱＮＹＡＷＧＳＫ（配列番号９３）、ＨＮＳＥＩＧＦＡＫ（配列番号９４）、ＶＬＣＡＡＱＰＬＳＩＱＶＨＰＮＫ（配列番号９５）、ＴＡＬＴＥＬＹＧＭＥＮＰＳＳＱＰＭＡＥＬＷＭＧＡＨＰＫ（配列番号９６）、ＬＳＥＬＦＡＳＬＬＮＭＱＧＥＥＫ（配列番号９７）及びＱＧＡＥＬＤＦＰＩＰＶＤＤＦＡＦＳＬＨＤＬＳＤＫ（配列番号９８）からなる群から選択されるアミノ酸配列とを含む。他の実施形態では、サロゲートペプチドは、安定同位体標識（ＳＩＬ）アミノ酸の取込みによって標識化される。他の実施形態では、ＳＩＬペプチドは、［13Ｃ615Ｎ2］リジン、［13Ｃ615Ｎ2］イソロイシン、［13Ｃ615Ｎ2］バリン又は［13Ｃ615Ｎ2］アルギニンの取込みによって標識化される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、標識サロゲートペプチドはトランスジェニック及び非トランスジェニックタンパク質の混合物中のＣｒｙ１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、ＧＳＡＱＧＩＥＧＳＩＲ（配列番号１）、ＩＶＡＱＬＧＱＧＶＹＲ（配列番号２）、ＴＬＳＳＴＬＹＲ（配列番号３）、ＤＶＳＶＦＧＱＲ（配列番号４）、ＴＹＰＩＲ（配列番号５）、ＴＶＳＱＬＴＲ（配列番号６）、ＷＹＮＴＧＬＥＲ（配列番号７）、ＥＷＥＡＤＰＴＮＰＡＬＲ（配列番号８）、ＶＷＧＰＤＳＲ（配列番号９）、ＡＰＭＦＳＷＩＨＲ（配列番号１０）、ＷＧＦＤＡＡＴＩＮＳＲ（配列番号１１）、ＮＱＡＩＳＲ（配列番号１２）、ＩＥＥＦＡＲ（配列番号１３）、ＳＧＦＳＮＳＳＶＳＩＩＲ（配列番号１４）、ＬＳＨＶＳＭＦＲ（配列番号１５）、ＥＩＹＴＮＰＶＬＥＮＦＤＧＳＦＲ（配列番号１６）、ＬＥＧＬＳＮＬＹＱＩＹＡＥＳＦＲ（配列番号１７）、ＹＮＱＦＲ（配列番号１８）、ＹＮＤＬＴＲ（配列番号１９）、ＳＰＨＬＭＤＩＬＮＳＩＴＩＹＴＤＡＨＲ（配列番号２０）、ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）、ＱＧＦＳＨＲ（配列番号２２）、ＭＤＮＮＰＮＩＮＥＣＩＰＹＮＣＬＳＮＰＥＶＥＶＬＧＧＥＲ（配列番号２３）、ＥＬＴＬＴＶＬＤＩＶＳＬＦＰＮＹＤＳＲ（配列番号２４）、ＲＰＦＮＩＧＩＮＮＱＱＬＳＶＬＤＧＴＥＦＡＹＧＴＳＳＮＬＰＳＡＶＹＲ（配列番号２５）及びＳＧＴＶＤＳＬＤＥＩＰＰＱＮＮＮＶＰＰＲ（配列番号２６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９７】
他の実施形態では、本発明のＣｒｙ１Ａｂ特異的な標識サロゲートペプチドは、ＧＩＥＧＳＩＲ（配列番号９９）、ＥＧＳＩＲ（配列番号１００）、ＡＱＬＧＱＧＶＹＲ（配列番号１０１）、ＧＱＧＶＹＲ（配列番号１０２）；ＳＳＴＬＹＲ（配列番号１０３）、ＳＴＬＹＲ（配列番号１０４）、ＳＶＦＧＱＲ（配列番号１０５）、ＦＧＱＲ（配列番号１０６）、ＰＩＲ、ＴＹ、ＳＱＬＴＲ（配列番号１０７）、ＱＬＴＲ（配列番号１０８）、ＮＴＧＬＥＲ（配列番号１０９）、ＹＮＴＧＬＥＲ（配列番号１１０）、ＰＴＮＰＡＬＲ（配列番号１１１）、ＤＰＴＮＰＡＬＲ（配列番号１１２）、ＧＰＤＳＲ（配列番号１１３）、ＶＷ、ＨＲ、ＳＷＩＨＲ（配列番号１１４）、ＡＴＩＮＳＲ（配列番号１１５）、ＤＡＡＴＩＮＳＲ（配列番号１１６）、ＡＩＳＲ（配列番号１１７）、ＩＳＲ、ＥＦＡＲ（配列番号１１８）、ＥＥＦＡＲ（配列番号１１９）、ＳＮＳＳＶＳＩＩＲ（配列番号１２０）、ＳＳＶＳＩＩＲ（配列番号１２１）、ＳＭＦＲ（配列番号１２２）、ＶＳＭＦＲ（配列番号１２３）、ＥＮＦＤＧＳＦＲ（配列番号１２４）、ＧＳＦＲ（配列番号１２５）、ＹＡＥＳＦＲ（配列番号１２６）、ＬＥＧ、ＮＱＦＲ（配列番号１２７）、ＱＦＲ、ＤＬＴＲ（配列番号１２８）、ＮＤＬＴＲ（配列番号１２９）、ＴＩＹＴＤＡＨＲ（配列番号１３０）、ＹＴＤＡＨＲ（配列番号１３１）、ＰＬＴＫ（配列番号１３２）、ＳＡＥＦＮＮＩＩ（配列番号１３３）、ＦＳＨＲ（配列番号１３４）、ＧＦＳＨＲ（配列番号１３５）、ＥＶＬＧＧＥＲ（配列番号１３６）、ＧＧＥＲ（配列番号１３７）、ＦＰＮＹＤＳＲ（配列番号１３８）、ＰＮＹＤＳＲ（配列番号１３９）、ＰＳＡＶＹＲ（配列番号１４０）、ＹＲ、ＰＰＲ、及びＳＧＴＶＤＳＬＤＥ（配列番号１４１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。
【００９８】
さらに他の実施形態では、本発明のＣｒｙ１Ａｂ特異的な標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）を含み、アミノ酸配列ＰＬＴＫ（配列番号１３２）又はＳＡＥＦＮＮＩＩ（配列番号１３３）からなる遷移イオンを生成する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明の標識サロゲートペプチドはｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質を選択的に検出又は定量化し、ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）、ＡＶＮＥＬＦＴＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号２８）、ＩＴＱＬＰＬＴＫ（配列番号２９）、ＧＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号３０）、ＱＣＡＧＩＲＰＹＤＧＲ（配列番号３１）及びＩＥＦＶＰＡＥＶＴＦＥＡＥＹＤＬＥＲ（配列番号３２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１００】
他の実施形態では、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ特異的な標識サロゲートペプチドは、ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）、ＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４３）、ＴＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号１４４）、ＳＳＮＱＩＧＬＫ（配列番号１４５）、ＱＬＰＬＴＫ（配列番号１４６）、ＴＱＬＰＬＴＫ（配列番号１４７）、ＤＳＳＴＴＫ（配列番号１４８）、ＳＳＴＴＫ（配列番号１４９）、ＰＹＤＧＲ（配列番号１５０）、ＤＧＲ、ＩＥＦ、及びＬＥＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。
【０１０１】
さらに他の実施形態では、本発明のｅＣｒｙ３．１Ａｂ特異的な標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）を含み、アミノ酸配列ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）又はＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４３）からなる遷移イオンを生成する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、標識サロゲートペプチドはｍＣｒｙ３Ａタンパク質を選択的に検出又は定量化し、ＩＴＱＬＰＬＶＫ（配列番号３３）、ＭＴＡＤＮＮＴＥＡＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号３４）、ＶＹＩＤＫ（配列番号３５）及びＬＱＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
他の実施形態では、ｍＣｒｙ３Ａ特異的なサロゲートペプチドは、ＱＬＰＬＶＫ（配列番号１５１）、ＴＱＬＰＬＶＫ（配列番号１５２）、ＡＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号１５３）、ＥＡＬＤＳＳＴＴＫ（配列番号１５４）、ＹＩＤＫ（配列番号１５５）及びＩＤＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。
【０１０４】
さらに他の実施形態では、本発明のｍＣｒｙ３Ａ特異的な標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＬＱＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５２）を含み、アミノ酸配列ＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５３）及びＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５４）からなる遷移イオンを生成する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明の標識サロゲートペプチドはＶｉｐ３Ａタンパク質を選択的に検出又は定量化し、ＤＧＧＩＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号３６）、ＬＩＴＬＴＣＫ（配列番号３７）、ＥＬＬＬＡＴＤＬＳＮＫ（配列番号３８）、ＦＥＥＬＴＦＡＴＥＴＳＳＫ（配列番号３９）、ＥＶＬＦＥＫ（配列番号４０）、ＴＡＳＥＬＩＴＫ（配列番号４１）、ＤＶＳＥＭＦＴＴＫ（配列番号４２）、ＬＬＧＬＡＤＩＤＹＴＳＩＭＮＥＨＬＮＫ（配列番号４３）、ＩＤＦＴＫ（配列番号４４）、ＴＤＴＧＧＤＬＴＬＤＥＩＬＫ（配列番号４５）、ＤＩＭＮＭＩＦＫ（配列番号４６）、ＡＬＹＶＨＫ（配列番号４７）、ＶＮＩＬＰＴＬＳＮＴＦＳＮＰＮＹＡＫ（配列番号４８）、ＩＴＳＭＬＳＤＶＩＫ（配列番号４９）、ＱＮＬＱＬＤＳＦＳＴＹＲ（配列番号５０）、ＤＳＬＳＥＶＩＹＧＤＭＤＫ（配列番号５１）、ＭＩＶＥＡＫＰＧＨＡＬＩＧＦＥＩＳＮＤＳＩＴＶＬＫ（配列番号５２）、ＶＹＦＳＶＳＧＤＡＮＶＲ（配列番号５３）、ＮＱＱＬＬＮＤＩＳＧＫ（配列番号５４）、ＶＥＳＳＥＡＥＹＲ（配列番号５５）、ＹＭＳＧＡＫ（配列番号５６）、ＤＧＳＰＡＤＩＬＤＥＬＴＥＬＴＥＬＡＫ（配列番号５７）、ＶＹＥＡＫ（配列番号５８）、ＬＤＡＩＮＴＭＬＲ（配列番号５９）、ＧＫＰＳＩＨＬＫ（配列番号６０）、ＤＥＮＴＧＹＩＨＹＥＤＴＮＮＮＬＥＤＹＱＴＩＮＫ（配列番号６１）、ＤＮＦＹＩＥＬＳＱＧＮＮＬＹＧＧＰＩＶＨＦＹＤＶＳＩＫ（配列番号６２）、ＬＬＣＰＤＱＳＥＱＩＹＹＴＮＮＩＶＦＰＮＥＹＶＩＴＫ（配列番号６３）、ＳＱＮＧＤＥＡＷＧＤＮＦＩＩＬＥＩＳＰＳＥＫ（配列番号６４）、ＮＡＹＶＤＨＴＧＧＶＮＧＴＫ（配列番号６５）、ＬＤＧＶＮＧＳＬＮＤＬＩＡＱＧＮＬＮＴＥＬＳＫ（配列番号６６）、ＩＡＮＥＱＮＱＶＬＮＤＶＮＮＫ（配列番号６７）、ＹＥＶＴＡＮＦＹＤＳＳＴＧＥＩＤＬＮＫ（配列番号６８）、ＱＮＹＡＬＳＬＱＩＥＹＬＳＫ（配列番号６９）、ＱＬＱＥＩＳＤＫ（配列番号７０）、ＬＬＳＰＥＬＩＮＴＮＮＷＴＳＴＧＳＴＮＩＳＧＮＴＬＴＬＹＱＧＧＲ（配列番号７１）、ＹＶＮＥＫ（配列番号７２）、ＱＮＹＱＶＤＫ（配列番号７３）及びＦＴＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
他の実施形態では、Ｖｉｐ３Ａ特異的な標識サロゲートペプチドは、ＳＱＦＩＧＤＫ（配列番号１５６）、ＧＤＫ、ＴＬＴＣＫ（配列番号１５７）、ＴＣＫ、ＡＴＤＬＳＮＫ（配列番号１５８）、ＬＡＴＤＬＳＮＫ（配列番号１５９）、ＴＦＡＴＥＴＳＳＫ（配列番号１６０）、ＦＡＴＥＴＳＳＫ（配列番号１６１）、ＦＥＫ、ＬＦＥＫ（配列番号１６２）、ＳＥＬＩＴＫ（配列番号１６３）、ＡＳＥＬＩＴＫ（配列番号１６４）、ＳＥＭＦＴＴＫ（配列番号１６５）、ＤＶＳ、ＩＭＮＥＨＬＮＫ（配列番号１６６）、ＭＮＥＨＬＮＫ（配列番号１６７）、ＤＦＴＫ（配列番号１６８）、ＦＴＫ、ＴＬＤＥＩＬＫ（配列番号１６９）、ＬＴＬＤＥＩＬＫ（配列番号１７０）、ＭＮＭＩＦＫ（配列番号１７１）、ＮＭＩＦＫ（配列番号１７２）、ＹＶＨＫ（配列番号１７３）、ＨＫ、ＶＮＩ、ＶＮＩＬ（配列番号１７４）、ＳＭＬＳＤＶＩＫ（配列番号１７５）、ＴＳＭＬＳＤＶＩＫ（配列番号１７６）、ＤＳＦＳＴＹＲ（配列番号１７７）、ＬＤＳＦＳＴＹＲ（配列番号１７８）、ＩＹＧＤＭＤＫ（配列番号１７９）、ＶＩＹＧＤＭＤＫ（配列番号１８０）、ＳＮＤＳＩＴＶＬＫ（配列番号１８１）、ＭＩＶ、ＳＧＤＡＮＶＲ（配列番号１８２）、ＳＶＳＧＤＡＮＶＲ（配列番号１８３）、ＬＬＮＤＩＳＧＫ（配列番号１８４）、ＬＮＤＩＳＧＫ（配列番号１８５）、ＳＳＥＡＥＹＲ（配列番号１８６）、ＥＳＳＥＡＥＹＲ（配列番号１８７）、ＳＧＡＫ（配列番号１８８）、ＭＳＧＡＫ（配列番号１８９）、ＴＥＬＴＥＬＡＫ（配列番号１９０）、ＤＧＳＰＡＤＩ（配列番号１９１）、ＹＥＡＫ（配列番号１９２）、ＥＡＫ、ＮＴＭＬＲ（配列番号１９３）、ＡＩＮＴＭＬＲ（配列番号１９４）、ＰＳＩＨＬＫ（配列番号１９５）、ＨＬＫ、ＤＹＱＴＩＮＫ（配列番号１９６）、ＮＫ、ＤＮＦ、ＤＮＦＹ（配列番号１９７）、ＰＮＥＹＶＩＴＫ（配列番号１９８）、ＬＬＣ、ＳＰＳＥＫ（配列番号１９９）、ＬＥＩＳＰＳＥＫ（配列番号２００）、ＮＡＹ、ＤＨＴＧＧＶＮＧＴＫ（配列番号２０１）、ＧＮＬＮＴＥＬＳＫ（配列番号２０２）、ＮＴＥＬＳＫ（配列番号２０３）、ＬＮＤＶＮＮＫ（配列番号２０４）、ＮＤＶＮＮＫ（配列番号２０５）、ＹＥ、ＤＬＮＫ（配列番号２０６）、ＱＩＥＹＬＳＫ（配列番号２０７）、ＬＱＩＥＹＬＳＫ（配列番号２０８）、ＳＤＫ、ＱＥＩＳＤＫ（配列番号２０９）、ＹＱＧＧＲ（配列番号２１０）、ＴＬＹＱＧＧＲ（配列番号２１１）、ＮＥＫ、ＶＮＥＫ（配列番号２１２）、ＤＫ、及びＶＤＫからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。
【０１０７】
さらに他の実施形態では、本発明のＶｉｐ３Ａ特異的な標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＦＴＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５５）を含み、アミノ酸配列ＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５６）及びＬＫからなる遷移イオンを生成する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明の標識サロゲートペプチドはｄｍＥＰＳＰＳタンパク質を選択的に検出又は定量化し、ＭＡＧＡＥＥＩＶＬＱＰＩＫ（配列番号７４）、ＦＰＶＥＤＡＫ（配列番号７５）、ＥＩＳＧＴＶＫ（配列番号７６）、ＩＬＬＬＡＡＬＳＥＧＴＴＶＶＤＮＬＬＮＳＥＤＶＨＹＭＬＧＡＬＲ（配列番号７７）及びＳＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＡＴＹＶＬＤＧＶＰＲ（配列番号２５７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
他の実施形態では、ＥＰＳＰＳ特異的な標識サロゲートペプチドは、ＰＩＫ、ＥＩＶＬＱＰＩＫ（配列番号２１３）、ＰＶＥＤＡＫ（配列番号２１４）、ＶＥＤＡＫ（配列番号２１５）、ＳＧＴＶＫ（配列番号２１６）、ＧＴＶＫ（配列番号２１７）、ＩＬＬＬＡＡ（配列番号２１８）、及びＨＹＭＬＧＡＬＲ（配列番号２１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。
【０１１０】
さらに他の実施形態では、本発明のｄｍＥＰＳＰＳ特異的な標識サロゲートペプチドは、アミノ酸配列ＳＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＡＴＹＶＬＤＧＶＰＲ（配列番号２５７）を含み、アミノ酸配列ＰＲ及びＧＶＰＲ（配列番号２５８）からなる遷移イオンを生成する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明の標識サロゲートペプチドはＰＡＴタンパク質を選択的に検出又は定量化し、ＤＦＥＬＰＡＰＰＲＰＶＲＰＶＴＱＩ（配列番号７８）、ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）、ＭＳＰＥＲ（配列番号８０）、ＨＧＧＷＨＤＶＧＦＷＱＲ（配列番号８１）、ＮＡＹＤＷＴＶＥＳＴＶＹＶＳＨＲ（配列番号８２）、ＴＥＰＱＴＰＱＥＷＩＤＤＬＥＲ（配列番号８３）、ＡＡＧＹＫ（配列番号８４）、ＹＰＷＬＶＡＥＶＥＧＶＶＡＧＩＡＹＡＧＰＷＫ（配列番号８５）及びＲＰＶＥＩＲＰＡＴＡＡＤＭＡＡＶＣＤＩＶＮＨＹＩＥＴＳＴＶＮＦＲ（配列番号８６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
他の実施形態では、ＰＡＴ特異的な標識サロゲートペプチドは、ＤＦＥ、ＤＦ、ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）、ＴＨＬＬＫ（配列番号２２１）、ＰＥＲ、ＳＰＥＲ（配列番号２２２）、ＧＦＷＱＲ（配列番号２２３）、ＶＧＦＷＱＲ（配列番号２２４）、ＳＴＶＹＶＳＨＲ（配列番号２２５）、ＳＨＲ、ＴＥＰＱＴ（配列番号２２６）、ＤＬＥＲ（配列番号２２７）、ＧＹＫ、ＡＧＹＫ（配列番号２２８）、ＧＰＷＫ（配列番号２２９）ＧＩＡＹＡＧＰＷＫ（配列番号２３０）、ＴＳＴＶＮＦＲ（配列番号２３１）、及びＮＦＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。
【０１１３】
さらに他の実施形態では、ＰＡＴ特異的な標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）を含み、アミノ酸配列ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）又はＴＨＬＬＫ（配列番号２２１）からなる遷移イオンを生成する。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明の標識サロゲートペプチドはＰＭＩタンパク質を選択的に検出又は定量化し、ＥＮＡＡＧＩＰＭＤＡＡＥＲ（配列番号８７）、ＡＬＡＩＬＫ（配列番号８８）、ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）、ＧＳＱＱＬＱＬＫＰＧＥＳＡＦＩＡＡＮＥＳＰＶＴＶＫ（配列番号９０）、ＦＥＡＫＰＡＮＱＬＬＴＱＰＶＫ（配列番号９１）、ＳＴＬＬＧＥＡＶＡＫ（配列番号９２）、ＬＩＮＳＶＱＮＹＡＷＧＳＫ（配列番号９３）、ＨＮＳＥＩＧＦＡＫ（配列番号９４）、ＶＬＣＡＡＱＰＬＳＩＱＶＨＰＮＫ（配列番号９５）、ＴＡＬＴＥＬＹＧＭＥＮＰＳＳＱＰＭＡＥＬＷＭＧＡＨＰＫ（配列番号９６）、ＬＳＥＬＦＡＳＬＬＮＭＱＧＥＥＫ（配列番号９７）及びＱＧＡＥＬＤＦＰＩＰＶＤＤＦＡＦＳＬＨＤＬＳＤＫ（配列番号９８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
他の実施形態では、ＰＭＩ特異的な標識サロゲートペプチドは、ＰＭＤＡＡＥＲ（配列番号２３２）、ＧＩＰＭＤＡＡＥＲ（配列番号２３３）、ＡＩＬＫ（配列番号２３４）、ＬＫ、ＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３５）、ＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３６）、ＡＮＥＳＰＶＴＶＫ（配列番号２３７）、ＰＶＴＶＫ（配列番号２３８）、ＬＴＱＰＶＫ（配列番号２３９）、ＰＶＫ、ＧＥＡＶＡＫ（配列番号２４０）、ＬＧＥＡＶＡＫ（配列番号２４１）、ＱＮＹＡＷＧＳＫ（配列番号２４２）、ＮＹＡＷＧＳＫ（配列番号２４３）、ＮＳＥＩＧＦＡＫ（配列番号２４４）、ＨＮ、ＶＬＣＡＡＱ（配列番号２４５）、ＰＮＫ、ＷＭＧＡＨＰＫ（配列番号２４６）、ＴＡＬＴＥ（配列番号２４７）、ＮＭＱＧＥＥＫ（配列番号２４８）ＬＮＭＱＧＥＥＫ（配列番号２４９）、ＳＬＨＤＬＳＤＫ（配列番号２５０）、及びＨＤＬＳＤＫ（配列番号２５１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する遷移イオンを生成する。
【０１１６】
さらに他の実施形態では、ＰＭＩ特異的なサロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）を含み、アミノ酸配列ＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３５）又はＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３６）からなる遷移イオンを生成する。
【０１１７】
いくつかの実施形態によると、本発明のＣｒｙ１Ａｂ特異的な標識サロゲートペプチドは、配列番号２５９のアミノ酸配列を含むＣｒｙ１Ａｂタンパク質を検出及び／又は定量化する。他の実施形態では、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質は、トランスジェニックコーンイベントＢｔ１１からのものである。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明のｅＣｒｙ３．１Ａｂ特異的な標識サロゲートペプチドは、配列番号２６０のアミノ酸配列を含むｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質を検出及び／又は定量化する。他の実施形態では、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質は、トランスジェニックコーンイベント５３０７からのものである。
【０１１９】
いくつかの実施形態によると、本発明のｍＣｒｙ３Ａ特異的な標識サロゲートペプチドは、配列番号２６１のアミノ酸配列を含むｍＣｒｙ３Ａタンパク質を検出及び／又は定量化する。他の実施形態では、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質は、トランスジェニックコーンイベントＭＩＲ６０４からのものである。
【０１２０】
いくつかの実施形態によると、本発明のＶｉｐ３特異的な標識サロゲートペプチドは、配列番号２６２のアミノ酸配列を含むＶｉｐ３Ａａタンパク質を検出及び／又は定量化する。他の実施形態では、Ｖｉｐ３Ａａタンパク質は、トランスジェニックコーンイベントＭＩＲ１６２からのものである。
【０１２１】
いくつかの実施形態によると、本発明のｄｍＥＰＳＰＳ特異的な標識サロゲートペプチドは、配列番号２６３のアミノ酸配列を含むｄｍＥＰＳＰＳタンパク質を検出及び／又は定量化する。他の実施形態では、ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質は、トランスジェニックコーンイベントＧＡ２１からのものである。
【０１２２】
いくつかの実施形態によると、本発明のＰＡＴ特異的な標識サロゲートペプチドは、配列番号２６４のアミノ酸配列を含むＰＡＴタンパク質を検出及び／又は定量化する。他の実施形態では、ＰＡＴタンパク質は、トランスジェニックコーンイベントＢｔ１１、５９１２２、ＴＣ１５０７、ＤＰ４１１４又はＴ２５からのものである。
【０１２３】
いくつかの実施形態によると、本発明のＰＭＩ特異的な標識サロゲートペプチドは、配列番号２６５又は配列番号２６６のアミノ酸配列を含むＰＭＩタンパク質を検出及び／又は定量化する。他の実施形態では、ＰＭＩタンパク質は、トランスジェニックコーンイベントＭＩＲ１６２、ＭＩＲ６０４、５３０７又は３２７２からのものである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明の標識サロゲートペプチドは、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３Ａタンパク質、ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質、ＰＡＴタンパク質及びＰＭＩタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つのトランスジェニックタンパク質を含むトランスジェニックタンパク質の混合物において、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３タンパク質、ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質、ＰＡＴタンパク質又はＰＭＩタンパク質を特異的に検出又は定量化する。他の実施形態では、トランスジェニックタンパク質の混合物は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３Ａタンパク質、ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質、ＰＡＴタンパク質及びＰＭＩタンパク質を含む。さらに他の実施形態では、トランスジェニックタンパク質の混合物はさらに、Ｃｒｙ１Ａ．１０５タンパク質（配列番号２６７）、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質（配列番号２６８）、Ｃｒｙ３４タンパク質（配列番号２６９）及びＣｒｙ３５タンパク質（配列番号２７０）からなる群から選択される少なくとも１つのトランスジェニックタンパク質を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明の標識サロゲートペプチドは、トランスジェニック植物からの生体サンプル中のトランスジェニックタンパク質の混合物において、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３タンパク質、ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質、ＰＡＴタンパク質又はＰＭＩタンパク質を特異的に検出又は定量化し、ここで、トランスジェニック植物は、コーン植物、大豆植物、綿植物、米植物、小麦植物又はキャノーラ植物である。他の実施形態では、トランスジェニック植物は、イベントＢｔ１１、イベント５３０７、イベントＭＩＲ６０４、イベントＭＩＲ１６２、イベント３２７２及びイベントＧＡ２１からなる群から選択されるトランスジェニックイベントを含むコーン植物である。さらに他の実施形態では、トランスジェニックコーン植物はさらに、イベントＭＯＮ８９０３４、イベントＤＰ４１１４、イベントＴＣ１５０７、イベント５９１２２又はイベントＴ２５を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本発明の標識サロゲートペプチドは、トランスジェニック植物からの葉組織、種子、子実、花粉、又は根組織からの生体サンプルにおいて、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３タンパク質、ｄｍＥＰＳＰＳタンパク質、ＰＡＴタンパク質又はＰＭＩタンパク質を特異的に検出又は定量化する。他の実施形態では、葉組織、種子、子実、花粉又は根組織は、トランスジェニックコーンイベントＢｔ１１、５３０７、ＭＩＲ６０４、ＭＩＲ１６２、ＧＡ２１、３２７２、５９１２２、ＤＰ４１１４、ＴＣ１５０７及びＴ２５の１つ又は複数を含むトランスジェニックコーン植物からのものである。
【０１２７】
例えば、Ｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８：６９６−７０５及び米国特許第８，２２７，２５２号明細書など、当該技術分野の多数の参考文献が、どのサロゲートペプチドが任意の所与の標的タンパク質に最適であるかを予測する多数の異なる方法を示唆しており、多数の参考文献が、質量分析を用いて標的タンパク質を定量化する近道を示唆している。しかしながら、予測不能な因子が質量分析ベースのアッセイを妨げ、したがって、感度の損失及び不正確な定量化を引き起こし得るので、このような予測方法及び近道への依存は、混乱した結果をもたらし得る。少なくとも１つの主要な因子は生体マトリックス自体にある。例えば、トランスジェニック植物からの葉、根、花粉及び種子からの生体サンプルと共に等しくうまく機能し得るサロゲートペプチドからの単一の遷移イオンを同定することは非常に予測不能であり、困難である。マトリックスの化学組成、ｐＨ、又はイオン強度の差異は、ＭＳ機器におけるタンパク質分解、ペプチド安定性、凝集、又はイオン化に影響を与え得る。したがって、関連のあるマトリックス、特にトランスジェニック植物のものの全てにわたって、サロゲートペプチド及び特異的なサロゲートペプチド／遷移イオンの組合わせを同定及び実験的に試験することは、このようなアッセイの予測不能な性質を克服するために必須である。本発明は、標的トランスジェニックタンパク質を特異的に検出及び／又は定量化するための質量分析アッセイの構築において、１）タンパク質分解的に切断された標的タンパク質から得られるペプチドのプールからサロゲートペプチドを試験及び選択し、ＳＩＬサロゲートペプチド及び遷移イオンペプチドの組合わせを試験し、全ての生体マトリックス、例えば、トランスジェニック植物の葉、根、花粉又は種子からの生体サンプルにわたって標的タンパク質を特異的に検出及び定量化する組合わせを選択することと、２）トランスジェニック植物、特にトランスジェニックコーン植物の葉、根、花粉及び種子を含む全ての生体マトリックス中の全てのサロゲートペプチド及びサロゲートペプチド／遷移イオンの組合わせのために役立つ、サンプル調製の適切な方法及び質量分析計の条件を実験的に決定することとを含む、２段階アプローチを使用する。
【０１２８】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、標的トランスジェニックタンパク質及び非トランスジェニックタンパク質の混合物を含むトランスジェニック植物からの複合生体サンプル中の１つ又は複数の標的トランスジェニックタンパク質を同時に検出及び／又は定量化する方法を包含し、本方法は、以下のステップを含む：ａ）トランスジェニック植物から生体サンプルを得るステップ；ｂ）生体サンプルからタンパク質を抽出し、タンパク質の混合物を含む抽出物をもたらすステップ；ｃ）ステップｂの抽出物中の非トランスジェニック不溶性タンパク質の量を低減し、濃縮可溶性タンパク質の抽出物をもたらすステップ；ｄ）ステップｃの抽出物中の可溶性タンパク質を消化して、ペプチド断片を含む抽出物をもたらすステップであって、ペプチド断片が、各標的トランスジェニックタンパク質に特異的な少なくとも１つの非標識サロゲートペプチドを含むステップ；ｅ）ステップｄの抽出物中のペプチド断片を濃縮するステップ；ｆ）本発明の１つ又は複数の標識サロゲートペプチドを添加するステップであって、各標識サロゲートペプチドが、標的トランスジェニックタンパク質に由来する各非標識サロゲートペプチドと同じアミノ酸配列を有し、添加される標識サロゲートペプチドの数が、混合物中の標的トランスジェニックタンパク質の数に等しいステップ；ｇ）混合物中の非サロゲートペプチドの量を低減することによって、非標識サロゲートペプチド及び標識サロゲートペプチドを濃縮するステップ；ｈ）ステップｇからのペプチド断片混合物を液体クロマトグラフィにより分離するステップ；ｉ）ステップｈから得られたペプチド断片混合物を質量分析により分析するステップであって、非標識サロゲートペプチドの遷移イオン断片の検出が、サロゲートペプチドが由来する標的トランスジェニックタンパク質の存在を示すステップ；並びに任意選択的に、ｊ）ステップｉの遷移イオン断片から発生された質量分析シグナルと、標識サロゲートペプチドの遷移イオンにより発生された質量分析シグナルとを比較することによって、生体サンプル中の標的トランスジェニックタンパク質の量を計算するステップ。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、上記の方法によって検出及び／又は定量化される標的トランスジェニックタンパク質は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質、ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質、ｍＣｒｙ３Ａタンパク質、Ｖｉｐ３タンパク質、二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ｄｍＥＰＳＰＳ）タンパク質、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）タンパク質又はホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）タンパク質である。
【０１３０】
本発明の方法により包含される他の実施形態では、標的トランスジェニックタンパク質はＣｒｙ１Ａｂであり、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＡＥＦＮＮＩＩＰＳＳＱＩＴＱＩＰＬＴＫ（配列番号２１）を含み、アミノ酸配列ＰＬＴＫ（配列番号１３２）又はＳＡＥＦＮＮＩＩ（配列番号１３３）からなる遷移イオンを生成する。さらに他の実施形態では、Ｃｒｙ１Ａｂ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＰＬＴＫ（配列番号１３２）からなる非標識及び標識遷移イオンから発生される質量分析シグナルを比較することによって定量化される。
【０１３１】
本発明の方法により包含される他の実施形態では、標的トランスジェニックタンパク質はｅＣｒｙ３．１Ａｂであり、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＴＤＶＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号２７）を含み、アミノ酸配列ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）又はＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４３）からなる遷移イオンを生成する。さらに他の実施形態では、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＴＤＹＨＩＤＱＶ（配列番号１４２）からなる非標識及び標識遷移イオンから発生される質量分析シグナルを比較することによって定量化される。
【０１３２】
本発明の方法により包含される他の実施形態では、標的トランスジェニックタンパク質はｍＣｒｙ３Ａであり、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＬＱＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５２）を含み、アミノ酸配列ＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５３）又はＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５４）からなる遷移イオンを生成する。さらに他の実施形態では、ｍＣｒｙ３Ａ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＳＧＡＳＶＶＡＧＰＲ（配列番号２５３）からなる非標識及び標識遷移イオンから発生される質量分析シグナルを比較することによって定量化される。
【０１３３】
本発明の方法により包含される他の実施形態では、標的トランスジェニックタンパク質はＶｉｐ３Ａであり、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＦＴＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５５）を含み、アミノ酸配列ＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５６）又はＬＫからなる遷移イオンを生成する。さらに他の実施形態では、Ｖｉｐ３Ａ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＴＧＴＤＬＫ（配列番号２５６）からなる非標識及び標識遷移イオンから発生される質量分析シグナルを比較することによって定量化される。
【０１３４】
本発明の方法により包含される他の実施形態では、標的トランスジェニックタンパク質はｄｍＥＰＳＰＳであり、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＬＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮＡＴＹＶＬＤＧＶＰＲ（配列番号２５７）を含み、アミノ酸配列ＰＲ又はＧＶＰＲ（配列番号２５８）からなる遷移イオンを生成する。さらに他の実施形態では、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＰＲからなる非標識及び標識遷移イオンから発生される質量分析シグナルを比較することによって定量化される。
【０１３５】
本発明の方法により包含される他の実施形態では、標的トランスジェニックタンパク質はＰＡＴであり、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＬＧＬＧＳＴＬＹＴＨＬＬＫ（配列番号７９）を含み、アミノ酸配列ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）又はＴＨＬＬＫ（配列番号２２１）からなる遷移イオンを生成する。さらに他の実施形態では、ＰＡＴ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＹＴＨＬＬＫ（配列番号２２０）からなる非標識及び標識遷移イオンから発生される質量分析シグナルを比較することによって定量化される。
【０１３６】
本発明の方法により包含される他の実施形態では、標的トランスジェニックタンパク質はＰＭＩであり、標識サロゲートペプチドはアミノ酸配列ＳＡＬＤＳＱＱＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号８９）を含み、アミノ酸配列ＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３５）又はＧＥＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３６）からなる遷移イオンを生成する。さらに他の実施形態では、ＰＭＩ標的タンパク質は、アミノ酸配列ＰＷＱＴＩＲ（配列番号２３５）からなる非標識及び標識遷移イオンから発生される質量分析シグナルを比較することによって定量化される。
【０１３７】
他の実施形態では、本発明は、トランスジェニック標的タンパク質のハイスループット検出又は定量化のためのシステムを包含する。このようなシステムは、トランスジェニック標的タンパク質に特異的である予め設計された標識サロゲートペプチドのカセットと、１つ又は複数の質量分析計とを含む。この実施形態の１つの態様では、カセットは、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩからなる群から選択される標的タンパク質に特異的な標識サロゲートペプチドを含む。この実施形態の他の態様では、標識サロゲートペプチドは、配列番号１〜９８のいずれか１つを含む。この実施形態の他の態様では、標識サロゲートペプチドは、配列番号９９〜２５１の少なくとも１つ、配列番号２５４、２５５、２５６、ペプチドＰＩＲ、ＴＹ、ＶＷ、ＨＲ、ＩＳＲ、ＬＥＧ、ＱＦＲ、ＹＲ、ＰＰＲ、ＤＧＲ、ＩＥＦ、ＬＥＲ、ＩＤＫ、ＧＤＫ、ＴＣＫ、ＦＥＫ、ＤＶＳ、ＦＴＫ、ＨＫ、ＶＮＩ、ＭＩＶ、ＥＡＫ、ＨＬＫ、ＮＫ、ＤＮＦ、ＬＬＣ、ＮＡＹ、ＹＥ、ＳＤＫ、ＮＥＫ、ＤＫ、ＶＤＫ、ＰＩＫ、ＤＦＥ、ＤＦ、ＰＥＲ、ＳＨＲ、ＧＹＫ、ＮＦＲ、ＬＫ、ＰＶＫ、ＨＮ、ＰＮＫ及びＰＲからなる群から選択されるペプチド配列を含む１つ又は複数の遷移イオンを生成する。
【０１３８】
以下の特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は本発明の実施においてうまく機能することが本発明者らにより発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると考えられ得ることは、当業者により認識されるべきである。しかしながら、当業者は本開示を考慮して、本発明の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態において多数の変化がなされ、同様又は類似の結果を依然として得ることができることを認識するべきである。より具体的には、同じ又は類似の結果を達成しながら、本明細書に記載される薬剤の代わりに化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤が使用され得ることは認識されるであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換及び修正は全て、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内であると見なされる。
【実施例】
【０１３９】
実施例１−サロゲートペプチドの選択
ＭＲＭベースのアッセイは予め決定されたペプチドセットの選択に頼り、選択された各サロゲートペプチドに対して特異的な断片化／遷移イオンに依存する。適切なサロゲート又はシグネチャーペプチドを選択するためにいくつかの基準が必要とされる。第１に、標的タンパク質カセットを構成するタンパク質を選択しなければならない。第２に、各標的タンパク質に対して、良好な質量分析応答を提示し、標的タンパク質又はその特異的な修飾（すなわち、翻訳後修飾）を独特に同定するペプチドを同定しなければならない。第３に、質量分析に適した各ペプチドに対して、最適なシグナル強度を提供し、サロゲートペプチドを、サンプル中に存在する他のペプチド種から独特に区別する遷移イオンを同定しなければならない。これらの基準は、ＭＲＭベースのアッセイを実施するのに不可欠である。
【０１４０】
ＭＲＭベースのアッセイのために、７つのトランスジェニックタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａ、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩからのサロゲートペプチドを同定及び選択した。トリプシンにより消化される、微生物が産生するタンパク質を用いて、ＭＲＭアッセイを構築した。微生物産生タンパク質は、水を用いて個々に再構成した。次に、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を各タンパク質のアリコートに添加した後、１００ｍＭの重炭酸アンモニウム及びトリプシン（１：１０（ｗ：ｗ）酵素：タンパク質比）を添加した。サンプルを約３７℃で一晩消化した後、約０．０５Ｍのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を添加した。各タンパク質のアリコートを取って、約２００ｐｍｏｌ／μＬの最終濃度を有するプールを作成した。このペプチド混合物を用いて、ＱＴＲＡＰ６５００質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＬＬＣ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ  ＵＳＡ）においてＭＲＭアッセイを構築した。選択反応モニタリングＭＳ／ＭＳを用いて、ペプチド当たり最適な２つの遷移状態（質量分析計によりモニターされる、ペプチドサロゲート及び断片イオン質量対電荷（ｍ／ｚ）比の組合わせ）を決定した。各ペプチドに対して、二重及び三重荷電ペプチドイオンのシグネチャー質量、並びに［ｍ／ｚ（サロゲート）＋２０Ｄａ］よりも大きいｍ／ｚを有する第１及び第２のｙ断片イオンを計算することにより、ＭＳ／ＭＳ法を構築した。ＭＲＭスキャンの間にこれらの計算された遷移状態が観察されたら、機器は自動的にＭＳ／ＭＳモードに切り替わり、サロゲートペプチドイオンの全ＭＳ／ＭＳスペクトルが獲得された。獲得された各ペプチドについて、ＭＳ／ＭＳスペクトルの２つの最も高強度の断片イオン（ｂ又はｙ断片イオンのみ）及びその溶出時間を決定した。次に、選択された遷移状態のそれぞれに対して衝突エネルギー（ＣＥ）を最適化した。構築されたＭＲＭアッセイを較正曲線サンプルの分析のために利用した。
【０１４１】
ＭＲＭアッセイでは、７つのトランスジェニックタンパク質から１９３個のプロテオタイプペプチドを標的とした。これらのうち、１１１個のペプチドが７つのタンパク質に特有であり、既知のトウモロコシタンパク質と重複しなかった。表１は、アミノ酸配列（少なくとも４つのアミノ酸を含むペプチドに対して配列表識別子を含む）、モノアイソトピック質量、シグネチャー電荷状態、シグネチャーｍ／ｚ、及び生成物遷移ｍ／ｚを含む、各標的タンパク質のサロゲートペプチド及び遷移イオンの特徴を記載する。７つのタンパク質；Ｃｒｙ１Ａｂ（２６）、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ（６）、ｍＣｒｙ３Ａ（４）、Ｖｉｐ３Ａａ２０（３９）、ｄｍＥＰＳＰＳ（５）、ＰＡＴ（９）及びＰＭＩ（１２）の全てに対して特有のサロゲートペプチドが同定された。Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａ、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩからのこれらのサロゲートペプチドは、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａ、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩトランスジェニックタンパク質の絶対量又は相対量の決定において有用であると特定された。これらのペプチドのそれぞれ又は表１に記載されるペプチドの組合わせはライセートにおける質量分析によって検出されたものであり、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａ、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩの定量化のためにＭＲＭベースのアッセイにおいて使用するための潜在的な候補である。
【０１４２】
【表１−１】
2021536570.tif 000002
【表１−２】
2021536570.tif 000003
【表１−３】
2021536570.tif 000004
【表１−４】
2021536570.tif 000005
【表１−５】
2021536570.tif 000006
【表１−６】
2021536570.tif 000007
【表１−７】
2021536570.tif 000008
【０１４３】
標的タンパク質Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａ、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩの複数の潜在的なサロゲートペプチドの同定の後、最適なシグナル強度を提供すると共に、標的サロゲートペプチドを生体サンプルマトリックス（例えば、トウモロコシの葉、根、花粉、又は穀粒（種子））中に存在する他の種から区別する能力を有する遷移イオンに基づいて、個々のサロゲートペプチドをさらに選択した。これは、マトリックス妨害（すなわち、マトリックス妨害は、対象のペプチドにおいて又はその近くで検出されるマトリックス内の１つ又は複数の特定の構成要素である）と、潜在的なキャリーオーバー（すなわち、キャリーオーバーは、サンプル分析システムの化学／物理特性又はその両方のために、前に注入されたサンプルがその後の分析において溶出する結果である）との両方を含む。個々のサロゲートペプチドを含有するカセットのこれらの最適化された遷移状態は、ＭＲＭアッセイ全体を構成する。本開示において、最高感度（最も高強度の断片）を提供し、且つ所望の特異性を有する、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａ、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩからのサロゲートペプチドをさらに選択して、７つの標的タンパク質を定量化するためのサロゲートペプチドのカセットを構成した。表２は、各標的タンパク質Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａａ２０ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩの好ましいサロゲートペプチドと、対応する安定同位体標識（ＳＩＬ）ペプチドとを記載する。サロゲートペプチドのカセットは、同時にモニター及び／又は定量化されるペプチドの１つ又は複数を含む。各ペプチドに特異的な断片化／遷移イオンを有するサロゲートペプチドのこのカセットは、対応する標的タンパク質を定量化するためにＭＲＭアッセイにおいて使用され得る。
【０１４４】
【表２】
2021536570.tif 000009
【０１４５】
実施例２−トランスジェニック植物組織中のトランスジェニックタンパク質の検出のためのアッセイ
標的タンパク質を直接モニターするための高感度の方法の構築は、トランスジェニック植物の組織、例えば、葉、穀粒、根及び花粉組織などからの生体マトリックスにおける定量的評価のために非常に望ましい。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ／）と連結された液体クロマトグラフィ（ＬＣ）によって所与のサンプル内の複数のタンパク質を定量化するために有望なプラットフォームとして出現した。ＭＲＭアッセイはタンパク質分解性ペプチドの配列特異的なタンデムＭＳ断片化を利用し、そのため、別個の標的タンパク質に対する高度に選択性及び特異的な測定を提供する。これらの進歩にもかかわらず、低含量のタンパク質又は分離に影響を与える特異的な物理化学特性を有するものにおいて正確な定量的測定を得ることは依然として困難なままである。
【０１４６】
ＭＲＭアッセイは通常トリプル四重極質量分析計において実施されるが、この方法論は、シグネチャーイオンが断片化されると規定の質量範囲又は全質量範囲の断片イオンにおいてＭＳ／ＭＳデータが収集されるイオントラップ機器にも適用され得る。一連の遷移状態（シグネチャー／断片イオンｍ／ｚ対）は、標的ペプチドの保持時間と組み合わせてＭＲＭアッセイを構成することができる。最適ＭＲＭアッセイを達成するために、（１）標的タンパク質／ペプチドが選択される必要があり、（２）サロゲートペプチドは良好なＭＳ及びＭＳ／ＭＳシグナルを発生しなければならず、（３）選択された各ペプチド断片イオンは最適シグナル強度を提供し、標的ペプチドを複合生体サンプル中に存在する他のペプチド種から区別しなければならない。まとめると、所望の遷移状態だけが記録され、サンプル中に存在する他のシグナルが無視されるので、サロゲートペプチド及び断片イオンはペプチド選択に対して高い特異性を提供する。
【０１４７】
当該技術分野における一般的な誤解は、ＭＲＭアッセイが特異性及び感度を保証し、サンプル調製が簡易化され、さらには除去されることができ、クロマトグラフ分離が全く又はほとんど必要とされないことである。しかしながら、この誤った認知に反して、ＭＲＭアッセイはサンプルの複雑さによって大きく影響される傾向があり、したがって、特定の標的ペプチドの感度が低減される。特異性及び感度は、マトリックス効果、例えば、葉、花粉、根、茎の間の差異によって影響され、ＭＳ分析の間に起こるイオン抑制をもたらし得る。一般に、ほとんどの帯電した又はイオン化可能な分子、例えば、塩、カオトロープ、洗剤、ポリマー、全ての不揮発性イオン化合物は、所望の分析物、すなわちペプチド／タンパク質のイオン化を妨害し、したがって競合し、シグナル抑制及び／又はバックグラウンドノイズの上昇を引き起こす。イオン抑制は、検出能力、正確さび精度などのいくつかの分析パラメータに悪影響を与える。したがって、当該技術分野のＭＲＭ質量分析法におけるこれらの欠損の全てを克服するために、複合生体サンプル、例えばトランスジェニック植物サンプルから標的タンパク質を効率的に抽出して、標的タンパク質を濃縮し、そして／或いは、標的タンパク質／ペプチドのイオン強度を低減し、アッセイの再現性及び精度に影響し得る妨害を除去するための方法を構築することが必要とされている。
【０１４８】
一般に、サンプル調製の改善は、マトリックス効果を低減し、そしてイオン抑制を回避する最も有効な方法であり得る。本方法は、妨害を強くすることなく、選択された標的タンパク質及びペプチドを濃縮する能力を可能にする。低標的タンパク質濃度における正確及び精密な定量化が可能になる。
【０１４９】
サロゲートペプチド（表１又は表２のいずれかから）のカセットを利用するＭＲＭベースのアッセイを使用して、７つのタンパク質の少なくとも１つを含有する種々のトランスジェニックイベントにおけるＣｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａ、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩを測定した（表４）。研究で評価したトランスジェニックイベントは次の通りであった：Ｂｔ１１（Ｃｒｙ１Ａｂ及びＰＡＴ）；５３０７（ｅＣｒｙ３．１Ａｂ及びＰＭＩ）；ＭＩＲ６０４（ｍＣｒｙ３Ａ及びＰＭＩ）；ＭＩＲ１６２（Ｖｉｐ３Ａａ２０及びＰＭＩ）及びＧＡ２１（ｄｍＥＰＳＰＳ）。
【０１５０】
組織抽出−１２〜１５ｍｇの凍結乾燥した組織（葉、根、花粉  穀粒及び植物全体）を２μＬのＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａ  ＦａｓｔＰｒｅｐ管（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）に入れた。次に、０．１％のＲａｐｉＧｅｓｔを含む１．０〜１．５μＬ（ｗ／ｖ）のＰＢＳを添加した。次に、Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａ（ガーネットマトリックス及び１／４インチのセラミック球ビーズ）を有するＦａｓｔＰｒｅｐ−２４組織ホモジナイザー（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）において、周囲温度で１サイクル（４０秒、速度設定６）の間サンプルを抽出した。タンパク質は、凍結乾燥組織１ｍｇにつき５０μｌの抽出緩衝液（６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＨＥＰＥＳ）中で、選択された組織から抽出した。
【０１５１】
遠心分離−組織抽出の後、サンプルを４℃において１５，０００ｇで約５分間遠心分離する。このステップは不溶性タンパク質、例えばヒストン及びアクチンを取り出し、したがって、消化の前に抽出物の複雑さを低減する。したがって、可溶性タンパク質のみが酵素消化ステップに移る。
【０１５２】
トリプシン消化−遠心分離ステップからの上澄みの総タンパク質濃度は、均質化緩衝液中での希釈により、約０．２μｇ／μｌに調整される。３０μｇに相当するタンパク質をウェルプレートに移す。１体積のトリフルオロエタノールをサンプルに添加し、低速で振とうさせながら室温で約３０分間インキュベートする。４体積の１００ｍＭの重炭酸アンモニウムを添加する。約１２μｌのトリプシン（０．１μｇ／μｌ）を次に添加する。サンプルを３７℃で一晩インキュベートする。次に、サンプルを２０％のギ酸（１％最終）でクエンチする。次に、２０μｌの安定同位体標識ペプチドを添加する。
【０１５３】
遠心分離−次に、前のステップからのサンプルを４℃において１５，０００ｇで約５分間遠心分離する。
【０１５４】
ＭＣＸによる脱塩−遠心分離の後、サンプルを脱塩する。このステップは、イオン交換カラムにおいて実施される。この脱塩ステップは、ウォッシュスルー（ｗａｓｈ−ｔｈｒｏｕｇｈ）において対象でないペプチドを廃棄することによって、対象のペプチドを濃縮する。対象でないペプチドを除去することに加えて、このステップは、対象のサロゲートペプチドのイオン化及び検出を妨害し得る塩及び小分子も除去する。対象のペプチドの濃縮、並びに妨害となる塩及び小分子の除去は、当該技術分野において既知の他の方法と比べて本発明のＭＲＭアッセイの感度を上昇させる。
【０１５５】
ＱＴＲＡＰ−ＭＲＭ−ＭＲＭ分析は、Ｈａｌｏ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＳ−Ｃ１８カラムを有するＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣに連結されたＱＴＲＡＰ  ６５００を用いて実施される。流速は約１８μｌ／分である。溶媒Ａは約９７／３の水／ＤＭＳＯ＋０．２％のギ酸（ＦＡ）であり、溶媒Ｂは約９７／３のアセトニトリル（ＣＡＮ）／ＤＭＳＯ＋０．２％のＦＡである。オートサンプラーの温度は、分析の間約４℃に保持される。周囲温度に保持されたカラムに全部で８μｌのサンプルを注入する。
【０１５６】
データ分析−データ収集はＡｎａｌｙｓｔソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて実施され、データ分析はＭｕｌｔｉｑｕａｎｔソフトウェア（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）を用いて実施される。
【０１５７】
本発明の好ましい標識サロゲートペプチドを用いて標的トランスジェニックタンパク質の検出のレベル（ＬＯＤ）を決定するために、７つの標的タンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａ、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩの全てを混ぜ合わせ、非トランスジェニックコーン植物の葉、根、穀粒及び花粉組織に添加した。表３〜６は、ＭＲＭによる標的タンパク質の検出のレベル（ＬＯＤ）を示し、各標識サロゲートペプチド及び結果として生じるその遷移イオンが、全ての植物マトリックスにわたって標的タンパク質が他のトランスジェニック及び非トランスジェニックタンパク質の存在下にある場合に、標的タンパク質を選択的に検出及び定量化できることを実証する。表２のそれぞれの好ましいサロゲートペプチドについて良好な直線性（ｒ＝０．９８８〜０．９９８）が達成された。各サロゲートペプチドのＬＯＤはＥＬＩＳＡにより確立された定量範囲よりも低く、本発明の組成物及び方法が、植物中のトランスジェニックタンパク質を定量化するために使用される現在の標準と等しいか、又はそれよりも優れていることが示された。
【０１５８】
【表３】
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【０１５９】
【表４】
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【０１６０】
【表５】
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【０１６１】
【表６】
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【０１６２】
次に、Ｂｔ１１（Ｃｒｙ１Ａｂ及びＰＡＴを含む）、５３０７（ｅＣｒｙ３．１Ａｂ及びＰＭＩを含む）、ＭＩＲ６０４（ｍＣｒｙ３Ａ及びＰＭＩを含む）、ＭＩＲ１６２（Ｖｉｐ３Ａ及びＰＭＩを含む）及びＧＡ２１（ｄｍＥＰＳＰＳを含む）からなる群から選択されるトランスジェニックイベントを含むトランスジェニックコーン植物からの葉、穀粒、根及び花粉組織中の標的タンパク質を特異的に検出するその能力を決定するために、好ましい標識サロゲートペプチド（表２）及びその遷移イオンを試験した。７つの好ましいサロゲートペプチドのそれぞれをトランスジェニックイベントのそれぞれに対して試験した。表７は、標的タンパク質の定量化の結果を示す。結果は、Ｃｒｙ１Ａｂ及びＰＡＴサロゲートペプチド並びに標識サロゲートペプチドが、イベントＢｔ１１を含むトランスジェニックコーン植物からの葉、穀粒、根及び花粉中のＣｒｙ１Ａｂ及びＰＡＴを検出及び／又は定量化できることを実証する。試験した植物について、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質は花粉組織においてＬＯＤよりも低く（表５を参照）、ＰＡＴタンパク質は穀粒及び花粉においてＬＯＤ（表４及び５を参照）よりも低かった。ｅＣｒｙ３．１Ａｂ及びＰＭＩサロゲートペプチド並びに標識サロゲートペプチドは、イベント５３０７を含むトランスジェニックコーン植物からの葉、穀粒、根及び花粉中のｅＣｒｙ３．１Ａｂ及びＰＭＩを検出することができる。ｅＣｒｙ３．１Ａｂタンパク質は、試験した植物の花粉においてＬＯＤよりも低かった（表５を参照）。ｍＣｒｙ３Ａ及びＰＭＩサロゲートペプチド並びに標識サロゲートペプチドは、イベントＭＩＲ６０４を含むトランスジェニックコーン植物からの葉、穀粒、根及び花粉中のｍＣｒｙ３Ａ及びＰＭＩタンパク質を検出することができる。ｍＣｒｙ３Ａタンパク質は、試験した植物の花粉においてＬＯＤよりも低かった（表５を参照）。Ｖｉｐ３Ａａ２０及びＰＭＩサロゲートペプチド並びに標識サロゲートペプチドは、イベントＭＩＲ１６２を含むトランスジェニックコーン植物からの葉、穀粒、根及び花粉中のＶｉｐ３Ａａ２０及びＰＭＩタンパク質を検出することができる。ｄｍＥＰＳＰＳサロゲートペプチド及び標識サロゲートペプチドは、イベントＧＡ２１を含むトランスジェニックコーン植物からの葉、穀粒、根及び花粉中のｄｍＥＰＳＰＳタンパク質を検出することができる。
【０１６３】
本発明の好ましい標識サロゲートペプチドの能力をさらに特徴付けるために、７つのタンパク質、Ｃｒｙ１Ａｂ、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ３Ａ、ｄｍＥＰＳＰＳ、ＰＡＴ及びＰＭＩを全て発現する育種スタックにおいて上記のアッセイを実行した。結果は、育種スタックに含有される７つのタンパク質が全て、ＬＣ−ＳＲＭによって同時に検出及び定量化され得ることを実証する。
【０１６４】
表１及び／又は表２に記載されるサロゲートペプチド及び標識サロゲートペプチドは、本発明の標的タンパク質を検出及び／又は定量化することができる。これらのペプチドのそれぞれ又はこれらのペプチドの組合わせは、標的タンパク質の定量的ＭＲＭアッセイにおける使用の候補であり得る。
【０１６５】
【表７】
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【０１６６】
本発明はその特定の実施形態に関連して記載されたが、本発明のデバイスがさらに修正可能であることは理解されるであろう。本特許出願は、一般的に本発明の原理に従い、且つ本開示からのこのような逸脱を含む本発明の任意の変化、使用、又は適応を、本発明が関連する技術分野内の既知又は通例の実施の範囲内に入り、上記で本明細書中に示される本質的な特徴に適用され、そして添付の特許請求の範囲の範囲内で行なわれるように包含することが意図される。
【０１６７】
本明細書中で言及される全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者の技能のレベルを示すものである。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ参照によって援用されると具体的及び個別に示されているのと同程度まで参照によって本明細書に援用される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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