(57)【要約】  ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードするＳｆｐ遺伝子と、インジゴイジン合成酵素をコードするｂｐｓＡ遺伝子とを、植物プロモーターを含むプラスミドの植物プロモーターの下流にそれぞれクローニングするステップ１）と、得られたプラスミドを大腸菌で増幅し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入するステップ２）と、Ｓｆｐ及びｂｐｓＡを含むＤＮＡを植物に導入するステップ３）と、を含むグルタミンからインジゴイジンへの合成を触媒して青い花を得る遺伝子組み換え方法を提供する。本発明で生産される青い花は、新鮮で花の香りをしており、脱色せず、無毒であるなど、天然の花のさまざまな特徴を有する。導入遺伝子によってコードされる酵素と生産されたインジゴイジンは液胞内にないので、植物の液胞の低ｐＨによる影響を受けず、ロイヤルブルーを形成できる。青色物質発生用の前駆体、つまり酵素の基質は、植物に豊富に含まれるグルタミンであり、酵素反応が１つのステップだけであり、自然界の白い花を出発材料として遺伝子変換を行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミンからインジゴイジンへの合成を触媒して青い花を持たせる植物を得る遺伝子組み換え方法であって、
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードするＳｆｐ遺伝子と、インジゴイジン合成酵素をコードするｂｐｓＡ遺伝子を選択し、植物プロモーターを含むプラスミドの植物プロモーターの下流にそれぞれクローニングするステップ１）と、
ステップ１）で得られたプラスミドを大腸菌で増幅し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入するステップ２）と、
アグロバクテリウム媒介で、Ｓｆｐ及びｂｐｓＡを含むＤＮＡを植物に導入するステップ３）と、
花弁細胞内でＳｆｐ及びＢｐｓＡタンパク質を機能的に発現させ、それによりグルタミンからインジゴイジンへの合成を介して花弁を青色に変えるステップ４）と、を含み、
前記Ｓｆｐ遺伝子は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする、任意の種に由来する遺伝子、またはホスホパンテテイニルトランスフェラーゼアイソエンザイムをコードする遺伝子であり、
前記ｂｐｓＡ遺伝子は、インジゴイジン合成酵素をコードする、任意の種に由来する遺伝子、またはインジゴイジン合成酵素アイソエンザイムをコードする遺伝子であることを特徴とする、遺伝子組み換え方法。
【請求項２】
前記Ｓｆｐ遺伝子のヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｓｆｐ遺伝子によってコードされるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｂｐｓＡ遺伝子のヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｂｐｓＡ遺伝子によってコードされるインジゴイジン合成酵素のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｓｆｐ遺伝子の上流の植物プロモーターＣＨＳｐのヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｂｐｓＡ遺伝子の上流の植物プロモーターＲｈＡＧｐのヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記植物プロモーターを含むプラスミドがｐＢＩ１２１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記植物が、バラ、ロサ・キネンシス、ユリ、菊、カーネーションまたはランであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
青い花を持たせる植物を得るための遺伝子組み換え方法であって、
植物の花弁に化合物インジゴイジンを含ませ、前記植物は、バラ、ロサ・キネンシス、ユリ、菊、カーネーションまたはランであることを特徴とする、遺伝子組み換え方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術分野に属し、グルタミンからインジゴイジンへの合成を触媒して青い花（場合により、青い花を持たせる植物（花卉）と呼ばれる）を得る遺伝子組み換え方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
花の色は観賞植物の重要な観賞特徴であり、花の色の改良は常に庭師の重要な課題の１つである。植物の花の色は、植物の受粉や繁殖に重要な役割を果たすだけでなく、人間にカラフルな視覚的体験を提供し、重要な美的価値を持っている（Grotewold, E.The genetics and biochemistry of floral pigments[J]. Annual Review of Plant Biology, 2006, 57(1):761.）。花卉（植物）のうち、重要な観賞植物として、ハイブリッド・ティー（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａ）は５０００年の栽培の歴史がある。今まで、２５００以上の品種を育ててきたが、本格的な青色のバラはない。
【０００３】
「ブルーエンチャントレス」（Ｂｌｕｅ  ｅｎｃｈａｎｔｒｅｓｓ）など、市販されている青いバラは、実際には染料で青く染められているものである（Holton T. A, Tanaka Y. Blue roses: a pigment of our imagination? [J]. Trends in Biotechnology: United Kingdom, 1994, 12(2): 40-42.）。青いバラ（Ｂｌｕｅ  ｒｏｓｅ）は不可能な奇跡を示す英語の慣用句として、映画、テレビ、詩、小説、ドラマなど、さまざまな文芸作品に頻繁に使用されている。
【０００４】
植物の花の色は、フラボノイド類のアントシアニン、テルペノイド類のカロチン、液胞のｐＨ、金属イオンなど、多くの要因により決定される（Tanaka Y, Brugliera F. Flower colour and cytochromes P450 [J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 2013, 368(1612): 283-291.）。アントシアニンのヒドロキシル化の部位や程度の相違により、花の色が異なり、その中でも、フラボノイド３'５'ヒドロキシラーゼ（Ｆ３'５'Ｈ）は、青いデルフィニジンの形成を触媒し、それは、多くの植物が青い花を有する原因である。バラなどの植物を含む多くの植物はＦ３'５'Ｈをコードする遺伝子を欠いているため、そのような植物には青い花がない（Mikanagi Y, Saito N, Yokoi M, et al.Anthocyanins in flowers of genus Rosa,sectionsCinnamomeae (=Rosa), Chinenses, Gallicanae and some modern garden roses [J]. Biochemical Systematics &Ecology, 2000, 28(9): 887.）。
【０００５】
日本のサントリー社は、遺伝子組み換え技術を使用してＦ３'５'Ｈを含む外来遺伝子を導入しながら、他のいくつかの遺伝子の発現を阻害することで、自然界で青い花を咲かない植物で青い花を実現する。この方法は、複数の遺伝子を改造する必要があり、必要な前駆体物質が複雑で、製造コストが非常に高く、この技術はカーネーションや菊で成功しており、バラの液胞ｐＨは非常に低い（ｐＨは約２．７）ので、バラに用いた結果、浅紫色の花しか得られず、本格的な青色を実現できない（図１）（Katsumoto Y, Fukuchimizutani M, Fukui Y, et al. Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin. [J]. Plant & Cell Physiology, 2007, 48(11): 1589.）。それにもかかわらず、浅紫色のバラは、価格が１本２２〜３５ドルであり(Staff (20 October 2009)."Blue roses to debut in Japan". The Independent, House and Home.Retrieved 30 August 2012.)、サントリー社に巨大な経済的利益をもたらしており、現在のところ、このようなバラは日本とアメリカ大陸でのみ販売されている。本格的な真色バラは、依然として解決できていない技術的課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、従来技術の欠陥を解決して、グルタミンからインジゴイジンへの合成を触媒して青い花を得る遺伝子組み換え方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の技術案の概要は、以下の通りである。
グルタミンからインジゴイジンへの合成を触媒して青い花を得る遺伝子組み換え方法であって、
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードするＳｆｐ遺伝子と、インジゴイジン合成酵素をコードするｂｐｓＡ遺伝子を選択し、植物プロモーターを含むプラスミドの植物プロモーターの下流にそれぞれクローニングするステップ１）と、
ステップ１）で得られたプラスミドを大腸菌で増幅し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入するステップ２）と、
アグロバクテリウム媒介で、Ｓｆｐ及びｂｐｓＡを含むＤＮＡを植物に導入するステップ３）と、
花弁細胞内でＳｆｐ及びＢｐｓＡタンパク質を機能的に発現させ、それによりグルタミンからインジゴイジンへの合成を介して花弁を青色に変えるステップ４）と、を含み、
前記Ｓｆｐ遺伝子は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする、任意の種に由来する遺伝子、またはホスホパンテテイニルトランスフェラーゼアイソエンザイムをコードする遺伝子であり、
前記ｂｐｓＡ遺伝子は、インジゴイジン合成酵素をコードする、任意の種に由来する遺伝子、またはインジゴイジン合成酵素アイソエンザイムをコードする遺伝子であり、
前記植物プロモーターは、植物細胞において下流遺伝子の発現を駆動できるＤＮＡ配列である、遺伝子組み換え方法。
【０００８】
好ましくは、Ｓｆｐ遺伝子のヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示される。
【０００９】
好ましくは、Ｓｆｐ遺伝子によってコードされるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示される。
【００１０】
好ましくは、ｂｐｓＡ遺伝子のヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示される。
【００１１】
好ましくは、ｂｐｓＡ遺伝子によってコードされるインジゴイジン合成酵素のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示される。
【００１２】
好ましくは、Ｓｆｐ遺伝子の上流の植物プロモーターＣＨＳｐのヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示される。
【００１３】
好ましくは、ｂｐｓＡ遺伝子の上流の植物プロモーターＲｈＡＧｐのヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示される。
【００１４】
植物プロモーターを含むプラスミドが、好ましくはｐＢＩ１２１である。
【００１５】
前記植物（花卉）が、バラ、ロサ・キネンシス、ユリ、菊、カーネーションまたはランである。
【００１６】
青い花を持たせる植物（花卉）を得るための遺伝子組み換え方法であって、
植物（花卉）の花弁に化合物インジゴイジンを含ませ、前記植物（花卉）は、バラ、ロサ・キネンシス、ユリ、菊、カーネーションまたはランである、遺伝子組み換え方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の利点は、以下の通りである。
本発明は、染料による染色、及び遺伝子組み換え方法などの従来技術の欠陥を解決し、染料で花を染色する場合、明らかな人為的な操作が見られ、脱色しやすく、使用される有機染料が通常有毒であり、花は通常、花の香りのない乾燥花であり、生花を染色した場合は、保存には適しておらず、すぐに枯れてしまう。本発明の方法で生産される青い花は、新鮮で花の香りをしており、脱色せず、無毒であるなど、天然の花の様々な特徴を有する。
【００１８】
本発明で使用される方法では、導入遺伝子によってコードされる酵素は液胞内になく、生成されたインジゴイジンも液胞内にないので、植物液胞の低ｐＨによる影響を受けないため、純粋な青色（ロイヤルブルー）を形成できる。青色物質発生用の前駆体、つまり酵素の基質は、植物に豊富に含まれる単純なアミノ酸、グルタミンであり、酵素反応が１つのステップだけであり、複雑な前駆体物質を必要とせずに、自然界の白い花を出発材料として遺伝子変換を行うことができる。
【００１９】
遺伝子組み換え方法を使用して、ユリ、ロサ・キネンシス、菊、カーネーションやランなどの青い花、特に青いバラを栽培する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】日本サントリー社の青いバラの改造手段である。図１−１はサントリー社がデルフィニジン生合成を利用して浅紫色バラを得る遺伝子変換経路図であり、図１−２はサントリー社が最終的に栽培した浅紫色バラの写真である。
【図２】ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＳｆｐとインジゴイジン合成酵素ｂｐｓＡの情報図である。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの反応プロセスの模式図（図２−１）、コードされたインジゴイジン合成酵素ｂｐｓＡの構造及び反応メカニズムの模式図（図２−２）、インジゴイジン合成酵素ｂｐｓＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターン（図２−３）、及び青色化合物であるインジゴイジンの光吸収スペクトル（図２−４）を含む。
【図３】発現プラスミドｐＢＩ１２１−ＧＥＮＥＳ２の構築の模式図である。そのうち、ｏｒｉＴ：転移開始領域、遺伝子転移因子；ｏｒｉＶ：プラスミド複製開始領域；ＩＳ１：遺伝子転位因子；ＫａｎＲ：カナマイシン耐性遺伝子；ＬＢ／ＲＢ：ｎｏｐａｌｉｎｅ  Ｃ５８Ｔ−ＤＮＡ由来の反復配列、遺伝子転位因子；ＭＡＳｔ／ＮＯＳｔ：ターミネーター；ＣＨＳｐ：Ｃｈａｌｃｏｎｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ遺伝子プロモーター；ＲｈＡＧｐ：ＡＧＡＭＯＵＳ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子プロモーター。
【図４】アグロバクテリウム媒介でｂｐｓＡ遺伝子を一過性導入（一過性形質転換）したバラの青い花弁の図である。図４−１は、形質転換後の青い花弁を示しており、図４−２の左側の花はアセトシリンゴンなしの陰性対照であり、右側の花はアセトシリンゴンを添加しており一過性導入された青いバラの花弁であり、矢印は一過性導入の位置を示し、点線の円は青いスポットの領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明では、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを利用してインジゴイジン合成酵素を活性化し、活性化されたこの酵素は、グルタミンからの青色化合物インジゴイジンの合成を触媒することで、白色バラを青色に見えるようにする。本発明は、例としてハイブリッド・ティー（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａ）を使用するが、この方法を使用して得られる青い花は、ハイブリッド・ティーに限定されず、実験により、本発明の方法によれば、青色のバラ、バラ、ユリ、菊、カーネーションやランが得られることが示されている。本発明の特定の実施例では、植物細胞形質転換方法は、物理的、化学的または生物学的手段によって人工的に改造された遺伝子配列を植物細胞に導入するプロセスであり得る。本発明に採用される生物学的手段は、アグロバクテリウム媒介での植物細胞の遺伝子組み換え方法である。
【００２２】
以下、特定の実施例にて本発明をさらに説明する。
実施例１  遺伝子の選択
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）は、非リボソーム型ポリペプチド合成酵素のスルフヒドリル化ドメインＴを活性化するものであり、その反応メカニズムを図２−１に示し、活性化後のＴドメインは、基質を固定するものとして機能し、この機能は、非リボソーム型ポリペプチド合成酵素がその触媒機能を果たすために必要である。
【００２３】
本発明で使用されるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの遺伝子Ｓｆｐは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２１３３２（ＮＣＢＩ番号：ＡＬＳ８３４４６）に由来し、バラ科植物の遺伝子コドン使用バイアスに従って遺伝子コドンを調整して最適化し、ヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１を得る。Ｓｆｐ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されている。Ｓｆｐ遺伝子の選択は、本発明におけるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼへの保護範囲を制限するものではなく、任意の他の種に由来する、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、またはホスホパンテテイニルトランスフェラーゼアイソエンザイムをコードする遺伝子を使用して、インジゴイジン合成酵素と共作用して青い花を得る方法は、すべて本発明によって保護される。
【００２４】
インジゴイジン合成酵素（Ｉｎｄｉｇｏｉｄｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）は非リボソーム型ポリペプチド合成酵素であり、２つのアミノ酸特異的認識ドメインＡ、１つのフラビン（ＦＭＮ）を含む酸化ドメインＯｘ、１つのＴｈｉｏｌａｔｉｏｎドメインＴ、及び生成物を単離するための１つのドメインＴＥを含む。インジゴイジン合成酵素は２分子のグルタミンからの青色化合物インジゴイジンの合成を触媒する機能を有し、そのメカニズムを図２−２に示す。形成されたインジゴイジン（Ｉｎｄｉｇｏｉｄｉｎｅ）は、分子式を図２−２に示し、光吸収スペクトルを図２−４に示し、他の染料に比べて非常に良好な水溶性、青い光沢を有し、今のところ、植物細胞には明らかな損傷作用が認められなかった。
【００２５】
本発明で選択されたインジゴイジン合成酵素をコードする遺伝子ｂｐｓＡは、ストレプトマイセス・ラベンジュレＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ  ＡＴＣＣ１１９２４に由来し、ｂｐｓＡによってコードされるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４（ＮＣＢＩ番号：ＷＰ＿０３０２３７９４９）に示され、バラ科植物の遺伝子コドン使用バイアスに従って遺伝子コドンを調整して最適化し、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３を得る。ｂｐｓＡ遺伝子によってコードされるインジゴイジン合成酵素遺伝子は、全長３８４６塩基であり、コードするタンパク質は１２８２アミノ酸であり、約１４０ＫＤであり、精製されたタンパク質の発現は、ＳＤＳポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）タンパク質ゲルでは、図２−３に示される通りである。ｂｐｓＡ遺伝子の選択は、本発明におけるインジゴイジン合成酵素への保護範囲を制限するものではなく、任意の他の種に由来する、インジゴイジン合成酵素をコードする遺伝子、またはインジゴイジン合成酵素アイソエンザイムをコードする遺伝子を使用して、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼと共発現させて青い花を得る方法は、本発明によって保護される。
【００２６】
ハイブリッド・ティー（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａ）に由来する植物プロモーターのＣＨＳｐプロモーター及びＲｈＡＧｐプロモーター配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５（ＮＣＢＩ番号：ＦＷ５５６９４６）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６（ＮＣＢＩ番号：Ｕ４３３７２）に示されている。
【００２７】
実施例２  プラスミドのクローニング
本発明では、出発プラスミドベクターとして、植物バイナリー発現ベクターｐＢＩ１２１が使用される。
【００２８】
図３に示すように、プラスミドｐＢＩ１２１の制限部位ＰｍｅＩとＳａｃＩの間に人工合成断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）を挿入して、プラスミドｐＢＩ１２１−ＣＨＳ−ＲｈＡＧを構築した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７は、Ｍａｎｎｏｐｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅのターミネーター配列ＭＡＳｔ、プロモーター配列ＣＨＳｐ及びプロモーター配列ＲｈＡＧｐを含む。
【００２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３の配列を含むプラスミドをテンプレートとして、ＢｐｓＡ−ＦＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）及びＢｐｓＡ−ＲＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９）をプライマーとして、ＰＣＲにより断片ｂｐｓＡを得た。
【００３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１の配列を含むプラスミドをテンプレートとして、Ｓｆｐ−ＦＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０）及びＳｆｐ−ＲＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１）をプライマーとして、ＰＣＲにより断片Ｓｆｐを得た。
【００３１】
プラスミドｐＢＩ１２１−ＣＨＳ−ＲｈＡＧを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで消化し、精製・回収して、断片ＣＨＳ−ＲｈＡＧ及びプラスミドｐＢＩ１２１骨格を得、［ｉｍａｇｅ］  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）システムを使用し、５０℃の条件で１時間反応させた後、大腸菌コンピテント細胞に形質転換し、クローンを取得し、含むプラスミドを増幅し、シーケンシングしたところ、正しい配列を確認すると、バイナリー発現プラスミドｐＢＩ１２１−ＧＥＮＥＳ２を得た。図３を参照することができる。
【００３２】
実施例３：標的遺伝子を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスのコンピテント細胞の調製
大腸菌からプラスミドを抽出することにより得られたプラスミドｐＢＩ１２１−ＧＥＮＥＳ２をアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換した。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのコンピテント細胞の調製は一般的な方法により行われ、具体的には、以下の通りである。
【００３３】
１．アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＧＶ３１０１）を、１０μｇ／ｍＬリファンピシンと５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含むＬＢ寒天培地において、２８℃で２日間培養した。
【００３４】
２．モノクローナルコロニーを同じ抗生物質を含むＬＢ培養液５ｍＬ（１０μｇ／ｍＬリファンピシン及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン）に接種し、２８℃のシェーカーにて１５０回転／分で一晩培養した。
【００３５】
３．一晩培養したアグロバクテリウム・ツメファシエンス培養液２ｍＬを２００ｍＬのＬＢ培養液に希釈し、２８℃（回転数２５０回転／分）のシェーカーにて、細胞密度ＯＤ６００が０．３〜０．５となるまで培養した。
【００３６】
４．アグロバクテリウム・ツメファシエンス培養液を５０ｍＬの遠心分離管に入れ、氷冷し、３０００×ｇの回転数で遠心分離した。
【００３７】
５．上清を除去した後、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞を、氷上で予冷したＣＣＭＢ８０バッファー８０ｍＬに再懸濁させ、氷上に２０分間放置した。ＣＣＭＢ８０バッファーの処方は、１０ｍＭ酢酸カリウム、８０ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０ｍＭ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０％グリセロール、ｐＨ６．４である。
【００３８】
６．細胞を再度遠心分離し、上清を除去し、予冷したＣＣＭＢ８０バッファー５ｍＬに再懸濁させた。
【００３９】
７．  １．５ｍＬのＥＰチューブに、チューブあたり１００μＬで分注し、次に、液体窒素で速やかに凍結して、−８０℃の冷蔵庫に保管した。
【００４０】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換の実験操作も同様な操作であり、具体的には、以下の通りである。
【００４１】
１）プラスミドＤＮＡ  １μｇ（ｐＢＩ１２１−ＧＥＮＥＳ２）を氷上で、上記で調製したアグロバクテリウム・ツメファシエンスのコンピテント細胞懸濁液１００μＬに加え、次に、液体窒素で速やかに凍結した。
【００４２】
２）プラスミドＤＮＡを含む上記アグロバクテリウム・ツメファシエンスコンピテント細胞を３７℃の水浴鍋で５分間解凍した。
【００４３】
３）抗生物質を含まないＬＢ培養液１ｍＬを加え、２８℃のシェーカーにて、１５０回転／分で３時間振とう培養した。
【００４４】
４）低速遠心分離により細胞を得た。
【００４５】
５）細胞をＬＢ寒天プレートに塗布し、プレートを２８℃のインキュベーターに入れ、耐性遺伝子を含むコロニーを抗生物質でスクリーニングした。ＬＢプレートには、１０μｇ／ｍＬリファンピシン、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンが含まれている。
【００４６】
６）２〜３日後、コロニーの成長は認められた。
【００４７】
実施例４  アグロバクテリウム媒介でｂｐｓＡを一過性導入した遺伝子組み換え青いバラの取得
１．上記形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１コロニーを、抗生物質を含むＬＢ培養液５ｍＬ（１０μｇ／ｍＬリファンピシン、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、５０μｇ／ｍＬカナマイシン）に接種し、２８℃、２００回転／分で一晩振とう培養した。
【００４８】
２．上記アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌液１ｍＬを同じ抗生物質を含むＬＢ培養液１００ｍＬに移し、ＯＤ６００が１．５となるまで２８℃、２００ＲＰＭで培養した。
【００４９】
３．アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞を３０００×ｇで１０分間遠心分離して、上清を除去した後、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．６バッファー（陰性対照）、または上記と同じバッファーに１５０μｇ／ｍＬアセトシリンゴンを添加したもの（陽性対照）を用いて、細胞密度ＯＤ６００が０．５〜１．０の範囲となるまで細胞を懸濁させ、遮光下、室温で３〜５時間保管した。
【００５０】
４．新鮮な白色バラのＲｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａの花の完全な枝付き切り花を取り、花の茎を滅菌水に浸した。
【００５１】
５．組織の損傷を避けるように、花弁の脈を、花弁の裏面にマークした。
【００５２】
６．１ｍＬの使い捨て針シリンジを使用して、ステップ３でアセトシリンゴンを含む（陽性対照）と含まない（陰性対照）アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞懸濁液１００〜１５０μｌを主脈から徐々に注入し、遮光下、２２℃で１２時間以上保管した。
【００５３】
実験結果を図４に示し、矢印は一過性導入の位置を示し、点線の円は青いスポットの領域を示す。図４−１は、形質転換後の青い花弁を示している。図４−２の左側の花は、アセトシリンゴンを含まない同じ細胞密度のアグロバクテリウム・ツメファシエンスのコンピテント細胞であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞は、注入した位置、及び花の脈を介して転送される場所の近くにあり、図４−２の右側の花は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスから植物細胞への遺伝子の形質転換を刺激できるアセトシリンゴンの存在下で遺伝子組み換えを行うことで、花弁を青色に見えるようにするものである。
【００５４】
実験結果から明らかなように、ストレプトミセスに由来するｂｐｓＡ及び枯草菌に由来するＳｆｐ遺伝子は、アグロバクテリウム媒介で、バラの細胞に入り、対応する活性非リボソーム型ポリペプチド合成酵素を植物細胞内で発現させ、植物体内のグルタミンを利用してインジゴイジンを合成し、それにより、バラの花弁を青色に見えるようにする。
【図１】
2021511810.tif 000002
【図２】
2021511810.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月2日(2020.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミンからインジゴイジンへの合成を触媒して青い花を持たせる植物を得る遺伝子組み換え方法であって、
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードするＳｆｐ遺伝子と、インジゴイジン合成酵素をコードするｂｐｓＡ遺伝子を植物に導入し、植物の花弁細胞内でＳｆｐ及びＢｐｓＡタンパク質を機能的に発現させ、それによりグルタミンからインジゴイジンへの合成を介して花弁を青色に変える、導入ステップを含み、
前記Ｓｆｐ遺伝子は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、またはホスホパンテテイニルトランスフェラーゼアイソエンザイムをコードする遺伝子であり、
前記ｂｐｓＡ遺伝子は、インジゴイジン合成酵素をコードする遺伝子、またはインジゴイジン合成酵素アイソエンザイムをコードする遺伝子であることを特徴とする、遺伝子組み換え方法。
【請求項２】
前記Ｓｆｐ遺伝子のヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示され、および／または
前記Ｓｆｐ遺伝子によってコードされるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｂｐｓＡ遺伝子のヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示され、および／または
前記ｂｐｓＡ遺伝子によってコードされるインジゴイジン合成酵素のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードするＳｆｐ遺伝子と、前記インジゴイジン合成酵素をコードするｂｐｓＡ遺伝子とを、それぞれプラスミドにクローニングすることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記プラスミドが植物プロモーターを含み、前記プラスミドの１つの植物プロモーターの下流に、それぞれ前記Ｓｆｐ遺伝子と前記ｂｐｓＡ遺伝子をクローニングすることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｓｆｐ遺伝子の上流の前記植物プロモーターであるＣＨＳｐのヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示され、および／または
前記ｂｐｓＡ遺伝子の上流の前記植物プロモーターであるＲｈＡＧｐのヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記導入ステップにおいて、前記ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードするＳｆｐ遺伝子と、前記インジゴイジン合成酵素をコードするｂｐｓＡ遺伝子とを、前記植物のゲノムに組み込んでいることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プラスミドを大腸菌で増幅し、増幅されたプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに導入することを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｓｆｐ遺伝子および前記ｂｐｓＡ遺伝子を、アグロバクテリウム媒介で植物に導入することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物が、バラ、ロサ・キネンシス、ユリ、菊、カーネーションまたはランであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により得られる植物。
【請求項１２】
青い花を持たせる植物を得るための遺伝子組み換え方法であって、
植物の花弁に化合物インジゴイジンを含ませ、前記植物は、バラ、ロサ・キネンシス、ユリ、菊、カーネーションまたはランであることを特徴とする、遺伝子組み換え方法。
【請求項１３】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードするＳｆｐ遺伝子と、インジゴイジン合成酵素をコードするｂｐｓＡ遺伝子とを植物に導入し、植物の花弁細胞内でＳｆｐ及びＢｐｓＡタンパク質を機能的に発現させ、それによりグルタミンからインジゴイジンへの合成を介して花弁を青色に変える、導入ステップを含み、
前記Ｓｆｐ遺伝子は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、またはホスホパンテテイニルトランスフェラーゼアイソエンザイムをコードする遺伝子であり、
前記ｂｐｓＡ遺伝子は、インジゴイジン合成酵素をコードする遺伝子、またはインジゴイジン合成酵素アイソエンザイムをコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１２に記載の遺伝子組み換え方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法により得られる植物。
【請求項１５】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードするＳｆｐ遺伝子と、インジゴイジン合成酵素をコードするｂｐｓＡ遺伝子とで一過性または安定的に導入された植物であって、
前記Ｓｆｐ遺伝子によってコードされるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼと、前記ｂｐｓＡ遺伝子によってコードされるインジゴイジン合成酵素とを、植物の花弁細胞内で機能的に発現させ、それによりグルタミンからインジゴイジンへの合成を介して花弁を青色に変え、かつ
前記Ｓｆｐ遺伝子は、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、またはホスホパンテテイニルトランスフェラーゼアイソエンザイムをコードする遺伝子であり、
前記ｂｐｓＡ遺伝子は、インジゴイジン合成酵素をコードする遺伝子、またはインジゴイジン合成酵素アイソエンザイムをコードする遺伝子である、植物。
【国際調査報告】
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