(57)【要約】垂直フロー検出デバイス及び関連する方法が提供される。デバイスは、第１の表面及び第２の表面を有する膜を備えることがあり、複数の多孔質構造が、前記第１の表面と前記第２の表面との間に延びて、前記第１の表面によって形成された第１の流体チャンバ及び前記第２の流体表面によって形成された第２の流体チャンバから流体導管を形成する。捕捉剤は、膜上及び／又は膜内に固定化される。剛性多孔質膜支持体が、前記膜を機械的に支持し、膜を横切る比較的均一な流れを実現する。膜の周りでの流体の漏れを防ぐために、膜の外縁の周りに様々なガスケット又はホルダ要素が位置決めされる。流体ポンプは、前記第１の流体チャンバから前記第２の流体チャンバへの方向に流体試料の流れを押し流すように構成される。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の表面及び第２の表面を有する膜であって、前記第１の表面が前記第２の表面と反対側に面し、前記第１の表面と前記第２の表面とが膜厚によって分離されている膜と、
前記第１の表面によって形成された第１の流体チャンバ及び前記第２の流体表面によって形成された第２の流体チャンバから流体導管を形成するように前記第１の表面と前記第２の表面との間に延びる複数の多孔質構造と、
前記膜の第１の表面に、及び／又は前記第１の膜表面と前記第２の膜表面との間で、前記膜の内部に固定化された捕捉剤と、
前記膜を機械的に支持し、使用中に前記第１の流体チャンバに露出される前記膜の前記第１の表面を横切る比較的均一な流れを実現するように位置決めされた剛性多孔質膜支持体と、
前記膜の外縁部の周りに位置決めされたガスケット又は流体不浸透性材料と、
前記膜と前記ガスケット又は前記流体不浸透性材料との密封構成を実現して、前記膜の周りでの流体の漏れを防ぐホルダと、
前記第１の流体チャンバから前記第２の流体チャンバへの方向に流体試料の流れを押し流すように構成されたフローデバイスと、
を備える垂直フロー検出デバイス。
【請求項２】
前記剛性支持体の外縁部の周り、及び前記剛性支持体と前記ホルダとの間に位置決めされたガスケットをさらに備える、請求項１に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項３】
前記捕捉剤に結合された流体試料中の標的分析物を検出するための検出器をさらに備え、前記検出器が、前記膜をスキャン又は撮像するように構成されたスキャナ又はイメージャを任意選択で備える、請求項１に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項４】
前記多孔質膜が、紙、ニトロセルロース、ポリカーボネート、及びＰＶＤＦからなる群から選択される材料を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項５】
前記ホルダが、前記デバイスを分解することなく前記膜を撮像するための撮像システムに取り付けて、ポイントオブケア環境で完全な試料を検出システムに提供するように構成された標準的な取付具を備え、前記撮像システムが、任意選択で、ポータブルイメージャ、スキャナ、又はスマートフォンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項６】
２つ以上の異なる標的分析物の多重化検出のための空間的に離散したアレイとして設けられた複数の個別の捕捉剤を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項７】
前記膜が間に設けられた上部ディフューザ膜及び下部ディフューザ膜と、
第１の剛性多孔質膜支持体及び第２の剛性多孔質膜支持体を構成するための追加の剛性多孔質膜であって、前記第１の剛性多孔質膜が前記上部ディフューザ膜の露出面に隣り合い、前記第２の剛性多孔質膜支持体が前記第２のディフューザ膜の露出面に隣り合う、追加の剛性多孔質膜と、
追加の支持及び封止を実現するために、前記第１の剛性多孔質膜支持体と統合された第１のガスケット、及び前記第２の剛性多孔質膜支持体と統合された第２のガスケットであって、前記剛性支持体の各表面毎に２つのガスケットを含み、全ての流体が前記膜の前記中央領域を通過することを保証するように前記膜及び前記ホルダとの封止を実現し、任意選択で、前記ガスケットが前記剛性支持体と統合される、第１のガスケット及び第２のガスケットと
をさらに備え、
前記上部ディフューザ膜及び下部ディフューザ膜が、固定化された捕捉剤を有する前記膜の前記第１の表面を含めた前記膜を通して比較的均一な流れを実現する、双方向フローに対応するように構成された請求項１〜６のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項８】
２つのＯリングをさらに備え、第１のＯリングが、前記第１の剛性多孔質膜支持体の上面によって支持され、第２のＯリングが、前記第２の剛性多孔質膜支持体の底面によって支持されて、流体チャンバと膜支持体との間の良好な封止を保証する、請求項７に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項９】
前記捕捉剤が抗体を含み、前記標的分析物が、前記抗体に特異的に結合し、検出可能な標識が前記標的分析物に直接的又は間接的に接続される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１０】
前記検出標識が、サンドイッチイムノアッセイの一部である、請求項９に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１１】
前記膜が、プラスチック及びポリマー、紙、ニトロセルロース、セルロース、ＰＶＤＦ、ポリカーボネート、セラミック、金属材料、ガラス（ガラスマイクロファイバを含む）、及び／又は陽極酸化アルミニウムを含む１つ又は複数の多孔質固体材料を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１２】
前記膜の特徴的な孔径が１０μｍ未満、１μｍ未満、０．５μｍ未満、又は０．１μｍ以下であり、１０％から９５％の間の多孔率を有し、任意選択で、相互接続又は繊維状の多孔質構造を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１３】
前記膜が、１μｍ以上、１０００μｍ以下の厚さを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１４】
前記多孔質膜支持体が、１μｍ以上、１０００μｍ以下の孔径を有し、前記膜を横切って実質的に均一な流量プロファイルを実現するように空間的に配置されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１５】
前記標的分析物が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、ポリペプチド、タンパク質、又は金属イオンのうちの１つ又は複数を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１６】
複数の捕捉剤スポット、及び１μｍ〜５ｍｍの間の捕捉剤スポットサイズを有し、流体試料の流れが前記捕捉剤スポットに均一に向けられる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１７】
流体フローを受けるように流れにさらされた膜表面積を有し、流れにさらされた膜表面積を調節するための手段をさらに備え、前記流れにさらされた膜表面積が、所望の流量及び試料体積に基づいて選択され、表面積が、試料体積の増加と共に増加する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１８】
前記調節するための手段が、調節可能なガスケット、前記膜の一部分を覆う不浸透性層、及び前記膜の上に位置決めされたマスク層からなる群から選択される、請求項１７に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項１９】
前記フローデバイスが、シリンジ、ポンプ、又は受動毛細管駆動式システムである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項２０】
前記膜に陽性対照スポットをさらに備える、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイス。
【請求項２１】
流体試料中の分析物を検出する方法であって、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の垂直フロー検出デバイスを用意するステップと、
前記第１の流体チャンバから前記第２の流体チャンバへの流体試料の流れを、前記膜の前記複数の細孔を通して押し流すステップと、
前記流体試料に存在する標的分析物を捕捉剤に結合するステップと、
前記捕捉剤に結合された前記標的分析物を前記検出器を用いて検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２２】
前記垂直フロー検出デバイスが、双方向フローに対応し、前記試料を反対の流れ方向に繰り返し向けて、試料の検出及び試料の使用を改善することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記押し流すステップが、前記第２の流体チャンバ内のより低い圧力と比べて前記第１の流体チャンバ内により高い圧力を生成することによる前記流体試料の圧送を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記押し流すステップが、前記流体試料の圧送を含み、前記圧送が、前記第２の流体チャンバ内でのより低い圧力に対して、より高い圧力を前記第１の流体チャンバ内で生成し、続いて前記第１の流体チャンバ内でのより低い圧力に対して、より高い圧力を前記第２の流体チャンバ内で生成し、以て制御された双方向の流れを実現することによって行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記圧送が、前記膜に垂直な方向に０．１ｍｍ／秒〜１０ｍｍ／秒の間の流速を生成する、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記流量が、前記捕捉剤からの結合された標的分析物の切り離しに対応する最大剪断応力よりも小さい剪断応力を前記細孔を通して生成する、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの追加の異なる捕捉剤で少なくとも１つの追加の標的分析物を検出するステップをさらに含み、以て多重検出を実現する、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]この出願は、２０１８年３月３０日に出願された米国仮出願第６２／６５０，８０８号の利益を主張し、この仮出願の全体を参照により本明細書に組み込む。
【連邦政府の支援による研究等に関する陳述】
【０００２】
[0002]本発明は、米国国防総省によって授与されたＧｒａｎｔ  Ｎｏ．  ＨＤＴＲＡ１−１６−Ｃ−００２６、及びＮＡＳＡによって授与されたＧｒａｎｔ  Ｎｏ．  ＮＮＸ１６Ａ０６９Ａの下で米国政府の支援を受けて成された。米国政府は、本発明において一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
[0003]心血管疾患、癌の予後モニタリング、感染症の診断、及び生物脅威検出などのポイントオブケア環境でバイオマーカを測定する必要がある場合が多い。残念ながら、これらのバイオマーカは低濃度であり、現在のポイントオブケア検査ソリューションは十分な感度がない。感度は、より遅い流れを伴うより小さい孔径、又は金ナノ粒子などの新規の検出メカニズムを使用することで改良することができる。
【０００４】
[0004]そのような感度の上昇に伴う問題は、流れが遅くなるとスループットが低下し得ることである。本明細書で提供されるデバイスは、垂直フロー構成デバイスにおいてより高い感度のためにより速い流れを実現することによってこれらの問題に対処する。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]本明細書では、バイオマーカを検出するための様々な垂直フロー向きのデバイス及びシステムが提供される。例えば、垂直フロー紙ベースイムノアッセイ（ＶＦＩ）は、様々な診断用途に適合されたプラットフォームを提供する。この手法は、特に資源が限られた状況で病原体及び毒素をより良く検出することができるように、感度及び効率が改良された使いやすい設計である。
【０００６】
[0006]本明細書では、様々な垂直フロー検出デバイス及びそれに関連する方法が提供される。例えば、垂直フロー検出デバイスは、第１の表面及び第２の表面を有する膜であって、第１の表面が第２の表面と反対側に面し、第１の表面と第２の表面とが膜厚によって分離されている膜と、第１の表面によって形成された第１の流体チャンバ及び第２の流体表面によって形成された第２の流体チャンバから流体導管を形成するために、第１の表面と第２の表面との間に延びる複数の多孔質構造と、膜の第１の表面に、及び／又は第１の膜表面と第２の膜表面との間で膜の内部に固定化された捕捉剤と、膜を機械的に支持し、使用中に第１の流体チャンバに露出される膜の第１の表面を横切る比較的均一な流れを実現するように位置決めされた剛性多孔質膜支持体と、膜の外縁部の周りに位置決めされたガスケット又は流体不浸透性材料と、膜とガスケット又は流体不浸透性材料との密封構成を実現して、膜の周りでの流体の漏れを防ぐホルダと、第１の流体チャンバから第２の流体チャンバへの方向に流体試料の流れを押し流すように構成されたフローデバイスとを備えることがある。
【０００７】
[0007]さらに、垂直フロー検出デバイスは、剛性支持体の外縁部の周り、及び剛性支持体とホルダとの間に位置決めされたガスケットを備えることもある。
【０００８】
[0008]さらに、垂直フロー検出デバイスはいずれも、捕捉剤に結合された流体試料中の標的分析物を検出するための検出器を備える。これらのデバイスは、様々な検出器の任意のものと適合性がある。例えば、検出器は、膜をスキャン又は撮像するように構成されたスキャナ又はイメージャを備えることがある。
【０００９】
[0009]垂直フロー検出デバイスはいずれも、紙、ニトロセルロース、ポリカーボネート、及びＰＶＤＦからなる群から選択される材料を含む多孔質膜を有することがある。
【００１０】
[0010]垂直フロー検出デバイスはいずれも、デバイスを分解することなく膜を撮像するための撮像システムに取り付けて、ポイントオブケア環境で完全な試料を検出システムに提供するように構成された標準的な取付具を備えるホルダを有することがあり、撮像システムは、任意選択で、ポータブルイメージャ、スキャナ、又はスマートフォンである。この態様では、「ポイントオブケア」は、通常であれば撮像及び付随する診断のために必要となる従来の実験室から離れて、現場で膜の有用な画像を取得することができる能力を表す。
【００１１】
[0011]垂直フロー検出デバイスはいずれも、２つ以上の異なる標的分析物の多重化検出のための空間的に離散したアレイとして提供される複数の個別の捕捉剤を含むことがある。
【００１２】
[0012]垂直フロー検出デバイスはいずれも、双方向フローに対応するように構成することができ、膜が間に設けられた上部ディフューザ膜及び下部ディフューザ膜と、第１の剛性多孔質膜支持体及び第２の剛性多孔質膜支持体を構成するための追加の剛性多孔質膜であって、第１の剛性多孔質膜が、上部ディフューザ膜の露出面に隣接し、第２の剛性多孔質膜支持体が、第２のディフューザ膜の露出面に隣接する、追加の剛性多孔質膜と、第１の剛性多孔質膜支持体と統合された第１のガスケット、及び第２の剛性多孔質膜支持体と統合されて追加の支持及び封止を実現する第２のガスケットであって、剛性支持体の各表面について２つのガスケットを含み、全ての流体が膜の中央領域を通過することを保証するために膜及びホルダとの封止を実現し、任意選択で、ガスケットが剛性支持体と統合される、第１のガスケット及び第２のガスケットとをさらに備えることがある。上部ディフューザ膜及び下部ディフューザ膜が、固定化された捕捉剤を有する膜の第１の表面を含めた膜を通して比較的均一な流れを実現する。
【００１３】
[0013]さらに、垂直フロー検出デバイスは、２つのＯリングを備えることがあり、第１のＯリングが、第１の剛性多孔質膜支持体の上面によって支持され、第２のＯリングが、第２の剛性多孔質膜支持体の底面によって支持されて、流体チャンバと膜支持体との間の良好な封止を保証する。
【００１４】
[0014]本明細書で述べる垂直フロー検出デバイスはいずれも、抗体を含む捕捉剤を有することがあり、標的分析物が抗体に特異的に結合し、検出可能な標識が標的分析物に直接的又は間接的に接続される。例えば、検出標識は、サンドイッチイムノアッセイの一部であり得る。
【００１５】
[0015]垂直フロー検出デバイスはいずれも、プラスチック及びポリマー、紙、ニトロセルロース、セルロース、ＰＶＤＦ、ポリカーボネート、セラミック、金属材料、ガラス（ガラスマイクロファイバを含む）、及び／又は陽極酸化アルミニウムを含む１つ又は複数の多孔質固体材料を含む膜を有することがある。
【００１６】
[0016]垂直フロー検出デバイスはいずれも、膜の特徴的な孔径に関して、例えば１０μｍ未満、１μｍ未満、０．５μｍ未満、又は０．１μｍ以下の特徴的な孔径、例えば０よりも大きい又は０．００１μｍよりも大きい、又は０．０１μｍよりも大きい、又は０．１μｍよりも大きい特徴的な孔径を有する下限によって；及び／又は多効率、例えば１０％〜９５％の間の多孔率及びその任意の部分範囲によって表すことができる。膜はいずれも、相互接続された、又は繊維状の多孔質構造を有し得る。膜はいずれも、１μｍ以上であり１０００μｍ以下の厚さ、及びその任意の部分範囲を含めた平均厚さなど、厚さに関して表すことができる。
【００１７】
[0017]垂直フロー検出デバイスはいずれも、多孔質膜支持体を有することがあり、多孔質膜支持体は、１μｍ以上であり１０００μｍ以下の孔径などの孔径によって特色付けられ、膜を横切って実質的に均一な流量プロファイルを実現するように空間的に配置されている。
【００１８】
[0018]垂直フロー検出デバイスはいずれも、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、ポリペプチド、タンパク質、又は金属イオンのうちの１つ又は複数を含む標的分析物と共に使用するように構成されることがある。
【００１９】
[0019]垂直フロー検出デバイスはいずれも、複数の捕捉剤スポット、及び１μｍ〜５ｍｍの間の捕捉剤スポットサイズを有することがある。流体試料の流れは、捕捉剤スポットに均一に向けられることがある。「均一に方向付けられた」とは、異なるスポット間で流体流速のばらつきが２０％未満であるように、膜を横切って流体試料を導入することを表す。このようにして、不均一な流れの問題が回避される。流れが適切に均一であることをさらに評価するために、陽性及び／又は陰性対照を膜の上に分散させることができる。
【００２０】
[0020]垂直フロー検出デバイスはいずれも、流体フローを受けるために、流れにさらされた膜表面積を有するものと表すことができる。さらに、デバイスは、流れにさらされた膜表面積を調節するための手段を備えることがあり、流れにさらされた膜表面積が、所望の流量及び試料体積に基づいて選択され、表面積が、試料体積の増加と共に増加する。同様に、膜表面に送達される所与の量の流体について、表面積を変化させることによって流量を変化させることができ、以て膜を通る流体流束を変化させる（例えば、流体流束＝Ｑ／面積、ここでＱは流量であり、面積は膜表面積であり、膜表面積を調節することができ、以て膜を通る流体流束を変化させる）。
【００２１】
[0021]調節のための例示的な手段としては以下のものを挙げられる：調節可能なガスケット、膜の一部を覆う不浸透性層（ワックス印刷、ＳＵフォトリソグラフィ、又は当技術分野で知られている他の印刷方法など、膜への不浸透性材料の印刷によるものを含む）、及び膜の上に位置決めされたマスク層。より高い表面積を有する膜への流体のアクセスを遮断するより低い表面積を有する層を交換することを含め、不浸透性層又はマスク層のフットプリント又は表面を変化させることによって、膜を通る有効な流体流量が増加する。
【００２２】
[0022]垂直フロー検出デバイスは、シリンジ、ポンプ、又は受動毛細管駆動式システムであるフローデバイスなど様々な流れ駆動構成要素と適合性がある。
【００２３】
[0023]本明細書で述べるデバイスはいずれも、デバイス及び任意の対応する方法の検証のために、膜に陽性対照スポットをさらに含むことができる。
【００２４】
[0024]本明細書で述べる垂直フロー検出デバイスはいずれも、流体試料中の分析物を検出するために使用することができる。例えば、流体試料中に分析物を検出する方法は、本明細書で述べる垂直フロー検出デバイスを用意するステップと、第１の流体チャンバから第２の流体チャンバへの流体試料の流れを、膜の複数の細孔を通して押し流すステップと、流体試料に存在する標的分析物を捕捉剤に結合するステップと、捕捉剤に結合された標的分析物を検出器を用いて検出するステップとを含むことがある。
【００２５】
[0025]この方法は、双方向フローに対応することがあり、試料を反対の流れ方向に繰り返し向けて、試料の検出及び試料の使用を改善することができる。このようにして、方法はいずれも、膜の第１の表面から膜の第２の表面への方向に連続的に流れ、所望の時間の後、流れ方向を膜の第２の表面から膜の第１の表面に切り替える流体試料を含むことがある。２以上、２〜１０、３〜７、又はその任意のサブ範囲など、任意の数の流れ方向シーケンシャルスイッチを使用することができる。
【００２６】
[0026]押し流すステップは、第２の流体チャンバ内のより低い圧力と比べて第１の流体チャンバ内に高い圧力を生成することによる流体試料の圧送を含むことがある。
【００２７】
[0027]押し流すステップは、流体試料の圧送を含むことがあり、圧送は、第２の流体チャンバ内でのより低い圧力に対して第１の流体チャンバ内でのより高い圧力を生成し、続いて第１の流体チャンバ内でのより低い圧力に対して第２の流体チャンバ内でのより高い圧力を生成し、以て順次様式を含めた制御された双方向の流れを実現し、捕捉剤による分析物の捕捉が成功する可能性を最大にすることによって感度をさらに高めることによって行われる。
【００２８】
[0028]圧送は、膜に垂直な方向に０．１ｍｍ／秒〜１０ｍｍ／秒の間の流速を生成することがある。
【００２９】
[0029]捕捉剤からの結合された標的分析物の切り離しに対応する最大剪断応力よりも小さい剪断応力を細孔を通して生成するために、流量（流体フラックス又は流体速度を含む）を選択することができる。
【００３０】
[0030]方法はいずれも、少なくとも１つの追加の異なる捕捉剤で少なくとも１つの追加の標的分析物を検出するステップをさらに含み、以て多重検出を実現することがある。
【００３１】
[0031]特定の理論に束縛されることを望まないが、本明細書に開示されるデバイス及び方法に関係する基礎となる原理の考え又は理解についての議論が本明細書においてあり得る。それにもかかわらず、機構的な説明又は仮説の最終的な正しさに関係なく、本発明の実施形態は、効果があり有用であり得ることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】垂直フロー形式での紙ベースイムノアッセイの概略図である。試料が多孔質膜に押し通されると、標的は、標的の試薬である成分と反応するなど、膜での成分と相互作用する。
【図１Ｂ】円柱として近似された、紙膜の多孔質構造の内面の概略図である。
【図１Ｃ】生物脅威を検出するためのサンドイッチアッセイの設計の概略図である。金ナノ粒子で標識された検出抗体は、システムの読出しとして比色信号を生成する。
【図２】（Ａ）は、ＶＦＩデバイスのスキーム及びその動作原理の概略図である。プラットフォームは、支持グリッドと封止ガスケットを備えたステンレス鋼フィルタホルダにカプセル化されたΦ＝１３ｍｍニトロセルロース膜に基づくことができる。（Ｂ）は、検出スポット（ｍＡｂ  ４Ｃ４）、陽性対照スポット（ヤギ抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ）、及び陰性対照スポット（１×ＰＢＳ）を含む、ＶＦＩデバイスの捕捉剤マイクロアレイのレイアウトの概略図である。
【図２Ｃ】ＶＦＩデバイスプラットフォームの動作原理を示す概略図である。
【図３Ａ】ＶＦＩ逐次対予混合処置を比較するプロットを示す図である。予混合手順からの検出スポットのグレースケール強度は、逐次手順のグレースケール強度よりも６．５倍高い。
【図３Ｂ】図３Ａの２つの異なる開示される手順で処理された２つの膜である。
【図４】ＡＥ９８膜を有する精製されたＣＰＡに関するグレースケール強度のプロットを示す図である。１．５ｍＬ／分の流量で５μｍの孔径のニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ  ＡＥ９８）を含むＶＦＩデバイスに関するＣＰＳ検出限界（ＬＯＤ）は、０．１ｎｇ／ｍＬとほぼ同じ又はわずかに低いものと決定される。
【図５】５μｍの孔径を有するニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ  ＡＥ９８）を用いた解析信号に対する試料流量の影響を示すプロットを示す図である。流量が増加すると、検出スポット及び陽性対照スポットからの信号が改善される。
【図６】５ｍＬ／分の流量で５μｍの孔径のニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ  ＡＥ９８）を有するＶＦＩデバイスのＬＯＤの決定に関する膜孔径によるグレースケール強度のプロットを示す図である。
【図７】ＣＰＳアッセイとのＶＦＩ膜材料の比較のプロットを示す図である。膜の孔径が小さくなるにつれて、信号が強調される。
【図８】０．１μｍの孔径の膜を用いた場合の信号強度に対する試料流速（例えば、膜を通過する試料流束）の影響を示す図である。
【図９Ａ】５ｍＬ／分の流量で０．１μｍの孔径のニトロセルロース膜を有するＶＦＩのＬＯＤを決定するためのプロットを示す図である。精製されたＣＰＳはアッセイ緩衝液で希釈され、４Ｃ４−ＧＮＰと混合され、ＶＦＩ膜に適用される。ＬＯＤは、０．０２ｎｇ／ｍＬ以下であると決定される。
【図９Ｂ】図９Ａの結果に関連する膜のスキャン画像を示す。
【図１０Ａ】同じ膜でのＣＰＳ及びＰＧＡの検出を伴うＣＰＳ及びＰＧＡ多重化ＶＦＩのための開示されるデバイスのＶＦＩ膜のマイクロアレイの設計を示す概略図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａの設計のための異なる試料（ＣＰＳ−／ＰＧＡ−、ＣＰＳ＋／ＰＧＡ−、ＣＰＳ−／ＰＧＡ＋、ＣＰＳ＋／ＰＧＡ＋）を用いた４つの膜のスキャン画像を示す図である。検出スポットは、対応する抗原が試料に存在するときにのみ陽性信号を示した。
【図１０Ｃ】図１０Ｂの多重化膜のヒストグラムのプロットを示す図である。
【図１１Ａ】図２及び図２Ｃのデバイスのフィルタホルダ内の流体及び圧力のインシリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）実験の結果を示す図である。
【図１１Ｂ】図２及び図２Ｃのデバイスのフィルタホルダ内の流体及び圧力のインシリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）実験の結果を示す図である。
【図１１Ｃ】図２及び図２Ｃのデバイスのフィルタホルダ内の流体及び圧力のインシリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）実験の結果を示す図である。
【図１１Ｄ】図２及び図２Ｃのデバイスのフィルタホルダ内の流体及び圧力のインシリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）実験の結果を示す図である。
【図１１Ｅ】図２及び図２Ｃのデバイスのフィルタホルダ内の流体及び圧力のインシリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）実験の結果を示す図である。
【図１２Ａ】皺の問題による染みの問題を示す膜の画像を示す図である。
【図１２Ｂ】皺の問題による染みの問題を示す膜の画像を示す図である。
【図１２Ｃ】皺の問題による染みの問題を示す膜の画像を示す図である。
【図１３Ａ】膜の染み及び皺の問題に対処するために取られる手法の画像を示す図である。
【図１３Ｂ】膜の染み及び皺の問題に対処するために取られる手法の画像を示す図である。
【図１３Ｃ】膜の染み及び皺の問題に対処するために取られる手法の画像を示す図である。
【図１４】膜の皺の背景にある提案された推論を示す概略図である。
【図１５Ａ】スクリーニングチャンバを組み立てる前に膜をＰＢＳで事前に湿らせることによる膜の皺及び染みの問題に対する解決策を示す画像を示す図である。
【図１５Ｂ】スクリーニングチャンバを組み立てる前に膜をＰＢＳで事前に湿らせることによる膜の皺及び染みの問題に対する解決策を示す画像を示す図である。
【図１６Ａ】抗体−抗原捕捉による生物学的標的を含む、診断用の垂直フロー構成の利点の概略図である。
【図１６Ｂ】抗体−抗原捕捉による生物学的標的を含む、診断用の垂直フロー構成の利点の概略図である。
【図１６Ｃ】抗体−抗原捕捉による生物学的標的を含む、診断用の垂直フロー構成の利点の概略図である。
【図１７】サンドイッチアッセイの概略図である。
【図１８】（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれ図１７のアッセイセットに関する膜アッセイ結果を示す図である。
【図１８Ｃ】図１７のアッセイセットに関する膜アッセイ結果を示す図である。
【図１８Ｄ】図１７のアッセイセットに関する膜アッセイ結果を示す図である。
【図１９】ＬｃｒＶ  ＬＦＩプロトタイプ試験の初期試験の結果を示す図である。
【図２０】ＬＦＩ形式でのＦ１抗体試験の結果を示す図である。
【図２１】材料の最適化及び比較に使用される膜の例を示す図である。
【図２２】ＣＰＳアッセイを用いたＶＦＩシステムでの６つの異なる膜材料のための試験の画像を含む図である。
【図２３Ａ】図２２のアッセイのためのグレースケール強度のプロットを示す図である。
【図２３Ｂ】図２２のアッセイのためのグレースケール強度のプロットを示す図である。
【図２４】図２２のアッセイのための膜乾燥時間研究の画像を含む図である。
【図２５Ａ】図２４の乾燥時間研究のためのグレースケール強度のプロットを示す図である。
【図２５Ｂ】図２４の乾燥時間研究のためのグレースケール強度のプロットを示す図である。
【図２６】図２２のアッセイのための抗体濃度研究のための膜の画像を含む図である。
【図２７Ａ】図２６の抗体濃度研究のためのグレースケール強度のプロットを示す図である。
【図２７Ｂ】図２６の抗体濃度研究のためのグレースケール強度のプロットを示す図である。
【図２８】ＣＰＳアッセイのための抗原濃度及び試料体積を試験するための実験の概略図である。
【図２９】図２８の抗原濃度及び試料体積研究のためのグレースケール強度のプロットを示す図である。
【図３０Ａ】膜のサイズを縮小するための概念的作業を示す図である。
【図３０Ｂ】膜のサイズを縮小するための概念的作業を示す図である。
【図３０Ｃ】膜のサイズを縮小するための概念的作業を示す図である。
【図３１Ａ】０．５ｍＬ／分の流量でのＣＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）アッセイを用いた３．５ｍｍ膜セットアップの試験のための実験セットアップを示す図である。
【図３１Ｂ】０．５ｍＬ／分の流量でのＣＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）アッセイを用いた３．５ｍｍ膜セットアップの試験のための実験セットアップを示す図である。
【図３１Ｃ】０．５ｍＬ／分の流量でのＣＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）アッセイを用いた３．５ｍｍ膜セットアップの試験のグレースケール強度の結果を示す図である。
【図３２】画像解析ソフトウェアにおける粗調整のためのウィンドウを示す図である。
【図３３】膜でのドットのパターンを検出し、画像解析ソフトウェアで各ドットを評価するためのウィンドウを示す図である。
【図３４Ａ】蠕動ポンプを使用する例示的なアッセイ設定を示す図である。
【図３４Ｂ】蠕動ポンプを使用する例示的なアッセイ設定を示す図である。
【図３５】受動毛細管駆動式垂直フローシステムの概略図である。
【図３６】照射後のＰＢＭＣからの放射線量測定遺伝子の発現レベルを評価するための垂直フロー紙ベースプラットフォーム（ＶＦＰ）の図である。
【図３７】宇宙ミッションのための核酸バイオマーカ検出のための自動化された試料調製を用いたユーザ中心のＶＦＰプラットフォームの動作の流れ図を示す。
【図３８】ＤＬＤチップのレイアウト、及び指定されたチャネルに分類されている白血球の蛍光画像を示す図である。
【図３９】モジュール式の自動化された試料調製及び監視システムに統合された人間中心のカートリッジ設計のプロセスフローを示す図である。
【図４０Ａ】紙ベースＶＦＩデバイスの設計を示す図である。
【図４０Ｂ】ＶＦＩ膜をスキャンするために使用されるプロトタイプ撮像プローブを示す図である。
【図４１】現在のベンチトップ画像解析ソフトウェアのユーザインターフェースを示す図である。
【図４２】透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像及び吸収スペクトルを示す図であり、界面活性剤及びキャッピング剤を含まないシード媒介合成手法を使用して、再現性の高い高品質ＧＮＳの形態学的及び光学的調整を示す図である。
【図４３Ａ】様々なＡｇＮＯ３濃度の下で生成されたＧＮＳの実験セットアップを示す図である。
【図４３Ｂ】様々なＡｇＮＯ３濃度の下で生成されたＧＮＳの結果（ＴＥＭ及び３Ｄモデリング画像）を示す図である。
【図４４Ａ】液体を膜に押し通すためのアクチュエータの設計を示す図である。
【図４４Ｂ】液体を膜に押し通すためのガスシリンジの設計を示す図である。
【図４５】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ膜アレイ印刷の例示的な態様を示す図である。
【図４６Ａ】膜ベースの血漿抽出デバイス及び製造された指作動式の血漿抽出器の構造設計を示す図である。
【図４６Ｂ】膜ベースの血漿抽出デバイス及び製造された指作動式の血漿抽出器の構造設計を示す図である。
【図４７】緩衝液又は血清のいずれかにスパイクされた２５ｎｇ／ｍｌ  ＬｃｒＶの信号強度のプロットを示す図である。
【図４８】Ｆ１抗原の検出によって評価される、生物脅威（ペスト）を検出するためのＶＦＩアッセイのレイアウトの要約を示す図である。左側のパネルは、検出スポット（上に向かって６つのスポットで示されている）と制御／レイアウトスポット（検出スポットの下に３つのスポットで示されている）を有する基板を示す。中央のパネルは、標的に特異的な抗体（例えば、この例ではペストに関連するＦ１）、金ナノ粒子抗体に対応する検出標識を備えた検出スポットの構成を示す。右のパネルは、得られたＦ１検出ＶＦＩアッセイの写真である。
【図４９】図４８と同様であるが、野兎病に関連するＬＰＳ抗原の検出に関する図である。
【図５０】４つのＴｉｅｒ  Ｉ生物脅威：類鼻疽（Ｍｅｌｉｏｉｄｏｓｉｓ）−類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（ＣＰＳ））；炭疽（Ａｎｔｈｒａｘ）−炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（ＰＧＡ））；ペスト（Ｐｌａｇｕｅ）−ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ（Ｆ１））；野兎病（Ｔｕｌｅｒｅｍｉａ）−野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（ＬＰＳ））について、様々な生物剤にわたる改善された、又は同等の検出限界（ＬＯＤ）を実現するインスタントＶＦＩアッセイを示す表の要約を示す図である。
【図５１】核酸の検出のための処理ステップの要約を示す図である。
【図５２】垂直フロー紙ベースプラットフォーム（ＶＦＰ）における核酸の検出を示す図である。上のパネルは、ＶＦＰアッセイに導入することができる核酸を取得するためのプロセスを示す。下のパネルは、増幅された標的遺伝子を含む標的遺伝子の標的配列に選択的に結合するためのアクセス可能な５’ビオチン修飾プライマーを有する捕捉抗体（例えば、抗ビオチンｍＡｂ）を含む、膜に接続された成分の一般的な構成を示す。検出抗体（例えば、金で標識された抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ）は、捕捉抗体によって捕捉された標的遺伝子に選択的に結合することができる。
【図５３】陽性（ＲＮＡ含有）試料と陰性（緩衝液のみ）試料に関する比色強度のプロットであり、システム及びプロセスが核酸、この例では１ｍＬの緩衝液で希釈されたＣＤＫＮ１Ａアンプリコンに対して高い特異性を有することを示す図である。陰性試料は、アンプリコンを含まない緩衝液である。リバース：ビオチン；フォワード：ＦＩＴＣ。
【図５４】ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄなし、及びＣＤＫＮ１Ａなし（Ｈｉｓｔ−／ＣＤＫ−）、ＣＤＫＮ１Ａアンプリコンのみ（Ｈｉｓｔ−／ＣＤＫ＋）、及びＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄアンプリコンのみ（Ｈｉｓｔ＋／ＣＤＫ−）の試料に関する比色強度のプロットを示す図である。ＣＤＫＮ１Ａ：リバース：ビオチン；ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ：リバース：ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）。
【図５５】上部パネルは、細胞に放射線を照射し、照射されていない細胞と比較したアッセイの要約を示す図である。左下のパネルは、アガロースゲル電気泳動を使用した結果であり、アガロース技法では、非曝露細胞と５Ｇｙ放射線に曝露された細胞とを確実に区別することができないことを示す。右下のパネルは、インスタント垂直フローシステムが、照射された細胞（５Ｇｙ−より高い比色強度値）と照射されていない細胞（０Ｇｙ−対の左側にあり、より低い比色強度を有するより明るいバー）とを区別することが可能であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
[0087]一般に、本明細書で使用する用語及び語句は、当技術分野において認識されている意味を有し、そのような意味は、当業者に知られている標準的なテキスト、ジャーナル参考文献、及び文脈を参照することによって見ることができる。以下の記述に適用可能な場合、本発明の文脈における特定の用語及び語句の特定の使用を明瞭にするためにそれらの定義が提供される。
【００３４】
[0088]実施例１：生物脅威病原体の診断のための紙ベース垂直フローイムノアッセイ（ＶＦＩ）
[0089]前世紀中、基礎及び応用微生物学で成された進歩と並行して、生物剤及び生物毒素の武器化に対して成された進歩が懸念されている（Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；ＬＷ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。現在では、公衆衛生及び安全保障に対する潜在的な脅威として米国保健福祉省によって列挙された７０近くの生物剤が存在する。これらの化学剤への曝露は、様々なヒト及び動物疾患を引き起こすことがある（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；Ｌａｋｏｆｆ，２００８）。類鼻疽菌は、ヒト及び動物に致死的な病気である類鼻疽を引き起こす、土壌及び水中に生息する細菌であり、その武器化される可能性及び致死的疾患を生み出す能力のため、高い優先度の生物脅威と考えられる。最近では、世界中の類鼻疽の症例の総数は１６５，０００人と推定されており、そのうち８９，０００人が死亡している（Ｌｉｍｍａｔｈｕｒｏｔｓａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。類鼻疽は、現在の診断法は必要な感度を欠くことが多いため、診断及び治療が非常に難しい場合がある。類鼻疽は、皮膚や軟部組織の軽度の感染から臓器膿瘍まで及ぶ広範な臨床症状を示し（Ｗｉｅｒｓｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）、東南アジア及び北オーストラリアの多くの熱帯及び亜熱帯地域における市中感染性敗血症の最も一般的な原因の１つである（Ｌｉｍｍａｔｈｕｒｏｔｓａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。感染症は、症状発現後２４〜４８時間以内に、軽度の疾患から重篤な敗血症に変化し、類鼻疽の未治療症例は、９０％の死亡率を有する（Ｌｉｍｍａｔｈｕｒｏｔｓａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０ｂ）。早期の診断及び治療は、疾病管理を改善し、感染した患者の死亡率を下げる主因となる（Ｃｕｒｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
【００３５】
[0090]類鼻疽菌を検出するための免疫学的及び分子的手法におけるいくつかの進歩（Ｓｉｒｉｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）にもかかわらず、臨床試料（例えば、血液、尿、膿汁、唾液など）からの類鼻疽菌の培養が、依然として類鼻疽の診断のゴールデンスタンダードである。しかし、多くの臨床試料中に存在する細菌は低レベルであるため、実験室培養は非常に時間がかかり、困難であることも多い。ＰＣＲを含む培養及び他の分子診断手法は、資源が限られた地域では確保できないことが多い高度な機器及び熟練した職員を必要とする。これらの難しさにより、そのような地域では感染症が誤診され、極めて過少に報告される可能性がある（Ｌｉｍｍａｔｈｕｒｏｔｓａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０ｂ）。さらに、近年の統計的研究において、培養法は、感度が低いため、類鼻疽感染症の診断のための高信頼性のゴールドスタンダードではないことがわかっている（Ｌｉｍｍａｔｈｕｒｏｔｓａｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０ａ）。これらの理由から、臨床試料から類鼻疽菌などの生物脅威剤を迅速且つ正確に検出することができる単純で迅速なポイントオブケア（ＰＯＣ）診断ツールが非常に必要とされている。
【００３６】
[0091]ナノテクノロジー及びバイオセンシング技術の進歩に伴い、紙材料が生物医学的応用に利用されてきた（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｐａｒｏｌｏ  ａｎｄ  Ａｒｂｅｎ  Ｍｅｒｋｏｃｉ，２０１３；Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｙｅｔｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。紙ベースデバイスは、タンパク質（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）、核酸（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）、及び細胞活性（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）を検出することが報告されている。報告されている紙デバイスの大部分は、流体フローが紙の表面に平行であるラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩ）形式で設計されている。この形式は通常、裏打ち層と結合されたいくつかの紙セグメントからなり（Ｙｅｔｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）、試験流体は、紙の毛細管力によってこれらのセグメントを通じて移送される。ＬＦＩの主要な利点としては、低コスト、迅速な結果、柔軟性、及び使いやすさが挙げられる。しかし、適切な流量を達成するために、紙材料の孔径は数ミクロン以上に限定され、これは、生体分子の捕捉を妨げ、したがってアッセイの感度を低下させることがある。
【００３７】
[0092]さらに、試料体積の制約及び多重化の難しさが、ＬＦＩ開発が直面する他のハードルである。多重検出のためのいくつかのＬＦＩプロトタイプは、分枝幾何形状（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；Ｍｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）、多重試験ライン（Ｒｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）、及びマイクロアレイ（Ｈｅｌｅｎｅ  ａｎｄ  Ｓｖａｈｎ，２０１４；Ｌａｆｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；Ｓａｆｅｎｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）を含む紙デバイスを使用して報告されている。全体的に、統合化アッセイの数は、依然として限られており、アッセイは、上流の反応が下流の反応に影響を及ぼさないように、交差汚染を防止するために膜の幾何形状及びマイクロアレイレイアウトの入念な設計を必要とする。
【００３８】
[0093]ＬＦＩプラットフォームを改良する１つの手法は、垂直フロースルーデバイスの使用である。この代替形式は、膜ベースのイムノアッセイであるという点で類似しているが、流体は平行ではなく紙の表面に垂直に加えられる（Ｄｅｓｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；Ｐａｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。１つの設計では、従来の横方向フローセグメントを積み重なるように置き換えるだけで、液体を下層から上層に拡散させる（Ｅｌｔｚｏｖ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ，２０１７；Ｈａｒｅｎｄａｒｃｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，２０１７）。他の方法は、アッセイ試薬を段階的にただ１つの膜に押し通し、標的が膜の試薬と反応することを可能にすることである。垂直フローアレルゲンマイクロアレイアッセイは、アレルゲン成分を含むヒト血清試料中のＩｇＥ活性を検出するために構築された（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｒｅｕｔｅｒｓｗａｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。同様に、ＨＩＶ  ｐ２４とＢ型肝炎ウイルス抗原の同時検出のための免疫濾過アッセイが最近報告された（Ｃｒｅｔｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。９６ウェル真空プレートを使用して、ニトロセルロース膜を通して試薬を引き出し、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）由来のリポ多糖体（ＬＰＳ）に特異的なＩｇＭを検出する、別の垂直フロー形式が開発された（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。近年、より高い感度に向けて、垂直フローアッセイを表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）などのより高度な読出し技術と結合する可能性を研究するための取組みが行われている（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７）。
【００３９】
[0094]本実施例は、生物脅威病原体の検出のための紙ベース垂直フローイムノアッセイ（ＶＦＩ）デバイスを提示する。類鼻疽の原因物質である類鼻疽菌をモデル菌として使用した。以前の研究では、類鼻疽菌のための診断バイオマーカとして、莢膜多糖（ＣＰＳ）、すなわち１，３結合した２−Ｏ−アセチル−６−デオキシ−ｂ−Ｄ−マンノース−ヘプトピラノース残基のポリマーが検証されている（ＡｕＣｏｉｎ，  ２０１２；Ｎｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。ＬＦＩによってＣＰＳを正常に検出することができることも示されている（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。ＣＰＳ  ＬＦＩによって検出できない低レベルのＣＰＳを有する類鼻疽患者もいることは明らかである。本実施例では、ＶＦＩパラメータを最適化して、感度が向上され、生物脅威病原体のシンプレックス検出能力とマルチプレックス検出能力の両方を備えたＰＯＣアッセイを開発した。
【００４０】
[0095]開示されるデバイスのＶＦＩプラットフォームを最適化するために考慮される必要があるいくつかの重要なパラメータがある。ＶＦＩ膜の面積は大きいが、表面試薬を有する感知スポットは、小体積の試薬を堆積させることによって縮小することができる。これにより、空間的に独立したスポットマイクロアレイを作成する同じ膜に様々なアッセイを組み込むことによって、多重検出が可能となる。以前の研究では、試料体積の増加がフロースルー免疫センサの感度を向上させることができることが報告されている（Ｐａｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。しかし、試料流量の影響は、垂直フローデバイスを使用して研究されてはいない。流量は、このようなアッセイを行うために必要な時間に影響を与えるので重要な因子であり、定義上、ポイントオブケアデバイスは迅速である。開示されるデバイスのＶＦＩプラットフォームでは、本実施例は、試料流量の増加が単位面積当たりの試料体積を直接増加させ、それによりＶＦＩベースのアッセイの感度を向上させることを示している。最後に、ＶＦＩデバイスの流路は、ＬＦＩの数センチメートルの流路と比較して、膜厚のみまで劇的に減少した。これにより、サブミクロンの孔径を有する膜の利用が可能となった。ナノ細孔膜の使用がＶＦＩアッセイの感度を大幅に改善することができることがいくつかの結果により示されている。
【００４１】
[0096]紙ベース免疫バイオセンサの分析：図１Ａは、開示される垂直フロー検出デバイス１で使用される、垂直フロー形式での紙ベース免疫バイオセンサの原理を示す。図１Ｂに示されるように、輸送プロセスの推定を助けるために、膜３の多孔質構造１１を束ねられた管として近似した。細孔半径ｄを有する多孔質材料２４において、液体は、
【数１】
2021520482.tif 000003
のフロー２３速度、及び感知長さＬｓで膜３を通って流れ、感知長さＬｓは、膜３の検出可能な厚さ９である。感知領域は（撮像面も）、上面Ａｖ、例えば半径Ｒｍを有する円形である第１の表面５であり、第２の表面は、膜厚９によって離された膜の底部側（観察できない側）にある。図１Ｃは、多孔質構造１１の内面が、表面濃度γを有する捕捉抗体、例えば捕捉剤１９でコーティングされていることを示している。標的の拡散係数はＤであり、抗原−抗体対は、ｋｏｎの結合定数、及び物質移動係数ｋｃを有する。
【００４２】
[0097]ＶＦＩシステムには２つの重要な無次元数がある（Ｓｃｈｌａｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｓｑｕｉｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。第１の無次元数は、ダムケラー数（Ｄａ）であり、吸着速度と輸送速度の関係を特徴付ける。
【数２】
2021520482.tif 000004
【００４３】
[0098]第２の無次元数は、ペクレ数（Ｐｅ）であり、これを使用して、対流速度と拡散速度を比較することができる。
【数３】
2021520482.tif 000005
【００４４】
[0099]低濃度で標的抗原１３を捕捉するためには、２つの条件が望まれる：（１）効率的な捕捉アッセイ（Ｄａ＞＞１）。捕捉抗体１９に結合する抗原１３の速度は、抗原１３の分子が例えば多孔質構造１１の孔壁に移送される速度よりも速い。高い流速２３は、移送速度Ｋｃを増加させ、Ｄａを低下させ、捕捉効率を低下させる。しかし、これは、高い結合反応速度を有するアッセイを使用することによって相殺することができる。本実施例では、高い捕捉抗体密度を有する低濃度の抗原１３の検出に焦点を当て、したがって、捕捉は、Ｄａ＞＞１を保証するのに十分に速いと仮定した。（２）非拡散制限アッセイ（Ｐｅ＜１）により、感知領域を通して抗原１３を対流させる前に、全ての送達された抗原１３が孔壁に拡散することができる。以前のシミュレーションにおいて、Ｐｅ＜１を維持することで、＞９０％の捕捉効率が保証されることが示されている（Ｓｃｈｌａｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。式（２）でＰｅ＜１を設定すると、体積流量（Ｑ）に次の制約が設けられる。
【数４】
2021520482.tif 000006
【００４５】
[0100]ここで、Φは膜３の多孔率である。式（３）によれば、膜３の孔径を縮小することは、フロー２３の最大流量Ｑを増加させるのに効果的な方法であり、より多くの抗原１３がセンサによって検出され得る。理論的分析に基づいて、高いフロー２３速度と小さい膜３孔径とを有するデバイス１に関するＶＦＩ設計が、アッセイ感度を改良することができることが決定された。
【００４６】
[0101]材料及び方法：ＶＦＩプラットフォームの構成：図２の（Ａ）に示されるように、デバイス１のＶＦＩプラットフォームは、支持要素及び封止要素と共に、例えば支持体２１とホルダ２９と共に、ステンレス鋼フィルタホルダ２９（Ｓｗｉｎｎｙ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｏｌｄｅｒ  １３ｍｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州））に封入された直径１３ｍｍのニトロセルロース膜（実際のフロースルー領域は直径１０ｍｍ）を備える。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ガスケット２５及びＯリング７７をそれぞれ紙膜３の下及び上に置いて、液体流路を封止し、漏れを防止する。シリンジ６及びポンプ３１（図３０Ｂ）（Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（米国ニューヨーク州））は、制御されたフロー２３流量で、試料及び試薬を垂直に紙膜３に押し通すことができる。
【００４７】
[0102]市販のステンレス鋼膜支持体が使用された従来の垂直フローシステムでは、０．１μｍ超の孔径を有する膜において大きな信号変動が報告された（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。この変動は、ステンレス鋼支持体の可撓性に一部起因すると考えられた。したがって、ディープエッチング法を使用して、ステンレス鋼よりも高いヤング率を有するシリコンで支持体２１を作製する。シリコングリッドは、あまり変形せずにフロー２３に対して膜３を機械的に支持し、したがって信号変動を低減した。したがって、本明細書で提供されるデバイスはいずれも、シリコングリッドを含む、ステンレス鋼のヤング率よりも高いヤング率を有する材料から形成された支持体を使用することがある。
【００４８】
[0103]デバイス１でのＶＦＩは、その高いタンパク質結合能（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）及び小さい孔径の範囲での利用可能性により、ニトロセルロース膜３を使用して作製することができる。４つのニトロセルロース膜、すなわちＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｒｏｔｒａｎ  ０．１μｍ  ＮＣ、０．２μｍ  ＮＣ、０．４５μｍ  ＮＣ、及びＷｈａｔｍａｎ  ＡＥ９８（孔径５μｍ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国ペンシルバニア州））を試験して比較する。ＣＯ２レーザ（ＶｅｒｓａＬａｓｅｒ  ２．３０，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（米国アリゾナ州））を使用して、膜を直径１３ｍｍのディスクに切断する。捕捉抗体マイクロアレイは、マイクロソレノイドロボットディスペンサ（ＢｉｏＪｅｔ  Ｅｌｉｔｅ、Ｂｉｏｄｏｔ（米国カリフォルニア州）を含むＡＤ１５２０マイクロディスペンサ）を使用して、１ナノリットルの液滴体積で紙ディスクに定量供給され、これは、直径２２０μｍの円形スポットを作成する。
【００４９】
[0104]類鼻疽菌検出マイクロアレイ：類鼻疽菌の検出は、感染中に細菌によって放出される莢膜抗原１３であるＣＰＳを標的とするサンドイッチイムノアッセイに基づく（Ｎｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。Ｂｉｏｄｏｔマイクロディスペンサを使用して、捕捉剤スポット７９のアレイとして紙膜３に捕捉抗体１９を固定化する。図２の（Ｂ）は、１２０個の複製された検出スポット７９と、３個の陰性対照スポット７９と、１９個の陽性対照スポット７９とを含む、類鼻疽菌検出マイクロアレイのレイアウトを示す。検出スポット７９では、スポット７９毎に１ｎＬで１滴ずつ、ＣＰＳ特異的ｍＡｂ  ４Ｃ４（１０ｍｇ／ｍＬ）を堆積する。陽性対照スポット７９では、スポット７９毎に１ｎＬで３滴ずつ、ヤギ抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ（１ｍｇ／ｍＬ）（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ（米国アリゾナ州））を堆積する。陰性対照スポット７９では、スポット７９毎に１ｎＬで１滴ずつ、１×ＰＢＳを堆積する。定量供給された膜３は、使用するまで、シリカ乾燥剤を含むアルミニウムパウチに室温で保存される。細菌の分離と培養、バイオマーカの発見、及びモノクローナル抗体の親和性の特性評価の詳細なプロセスが、以前の報告で紹介されている（Ｎｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。
【００５０】
[0105]ＶＦＩ操作ワークフロー：ＣＰＳは、糖単位の繰り返しから構成される線状ポリマーである（Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。その結果、繰り返しのエピトープ結合部位により、同じ抗体をＣＰＳの捕捉及び検出に使用できるようになる。図２Ｃに示されるＶＦＩワークフローでは、捕捉抗体アレイとして紙膜３にＣＰＳ特異的ｍＡｂ  ４Ｃ４を固定化し、検出試薬として４Ｃ４標識金ナノ粒子１２（４Ｃ４−ＧＮＰ）を使用した。直径４０ｎｍの金コロイドへのｍＡｂ  ４Ｃ４の受動吸収によって、４Ｃ４−ＧＮＰ１２原液を調製した。洗浄して遊離抗体を除去した後、４Ｃ４−ＧＮＰ１２溶液を５４０ｎｍでＯＤ＝９に濃縮し、これは、１．５ｎＭの濃度に相当する。ＣＰＳ及び４Ｃ４−ＧＮＰ１２を膜３に押し通すと、抗原１３−抗体１０複合体は、捕捉剤１９の抗体スポット７９のアレイに結合し、サンドイッチアレイを形成した。実験後、通常の卓上スキャナで膜３をスキャンして、図２Ｃの「上面図」で示されるように、金ナノ粒子１２によって生成された比色信号を抽出した。ＶＦＩ試験手順は、３０分未満で完了することができる。
【００５１】
[0106]詳細な実験手順は、膜３の平衡化のために膜３を通して１ｍＬの１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ（米国マサチューセッツ州））を流すことを含む。次いで、阻害緩衝液（２．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭのホウ酸塩緩衝液、ｐＨ＝８）を流すことによって膜３を処理し、膜３を阻害し、非特異的結合を防止した。ＣＰＳスパイクアッセイ緩衝溶液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と０．１％のＢＳＡとを含む０．１ＭのＰＢ緩衝液、ｐＨ＝７．２）を、制御されたフロー２３流量及び持続時間で、シリンジ６のフローデバイス（例えばポンプ３１）を使用して膜３に押し通した。２つの反応スキーム、すなわち逐次プロトコルと予混合プロトコルを試験する。
【００５２】
[0107]逐次プロトコル：ＣＰＳスパイクアッセイ緩衝液を膜３に押し通して、ＣＰＳを膜３の捕捉抗体剤１９に結合させた。次いで、４Ｃ４−ＧＮＰ１２溶液を膜３に押し通した。第２のステップ中、４Ｃ４−ＧＮＰ１２は、膜３の捕捉抗体剤１９にすでに捕捉され結合されているＣＰＳに結合した。
【００５３】
[0108]予混合プロトコル：ＣＰＳスパイクアッセイ緩衝溶液を、４Ｃ４−ＧＮＰ１２と１０分間予混合した。この予混合ステップは、４Ｃ４−ＧＮＰ１２が溶液中の遊離ＣＰＳを結合する追加の時間を提供する。次いで、シリンジ３によってこの混合物を膜３に押し通して、膜３の捕捉抗体１９によるＣＰＳ−４Ｃ４−ＧＮＰ１２複合体の捕捉を可能にした。
【００５４】
[0109]試料を処理した後、膜３を通して１．５ｍＬのブランクアッセイ緩衝液を流すことによって膜３を洗浄し、非特異的又は緩く結合されたタンパク質及び過剰な４Ｃ４−ＧＮＰ１２を除去した。ＶＦＩデバイス１を解体し、急速乾燥ステップとして５分間、膜３を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ定性濾紙、グレード１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国ペンシルバニア州）））の上に置き、その後、卓上スキャナを使用してスキャンした。ＶＦＩ試験プロセス全体が３０分未満で終了した。
【００５５】
[0110]１×ＰＢＳは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製である。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＰＢ緩衝液、ホウ酸、及び四ホウ酸ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製である。使用される全ての化学物質は分析グレードであり、さらに精製又は変更することなく適用される。
【００５６】
[0111]画像処理及びデータ解析：乾燥プロセス後、非圧縮ＴＩＦＦファイル形式にエクスポートして、４８ビットＲＧＢ環境及び２４００ｄｐｉ解像度で、消費者グレードの卓上スキャナ（ＣａｎｏｎＳｃａｎ  ９０００Ｆ  ＩＩ）及びＳｃａｎ  ＩＪ  Ｕｔｉｌｉｔｙ（ＣａｎｏｎＳｃａｎ用デフォルトソフトウェア）を用いてＶＦＩ膜３をスキャンした。次いで、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ（米国マサチューセッツ州））の組み込み関数ｒｇｂ２ｇｒａｙを使用して、４８ビットＲＧＢ画像を１６ビットグレースケール画像に変換した。得られた画像をＩｍａｇｅＪにインポートし、マイクロアレイグリッドを使用してスポット７９を解析して、ローカルバックグラウンドを差し引いたスポット７９から平均グレースケール値を抽出した。Ｅｘｃｅｌ２０１６（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（米国ワシントン州））を使用して、データ処理及び解析を行った。
【００５７】
[0112]ＶＦＩ反応スキーム
[0113]本発明者らの初期のインシリコ理論分析は、より小さな孔径及び高い試料流速で膜を組み込んだ多孔質膜ベースの免疫センサが、従来のＬＦＩよりも良い感度を実現することを示す。以下の実験結果は、理論的発見を検証し、類鼻疽菌アッセイを用いてＶＦＩの検出限界（ＬＯＤ）に対する膜孔径及び試料流速の影響を特性評価する。
【００５８】
[0114]最初に実施した実験では、２つのＶＦＩ反応スキーム、すなわち逐次及び予混合を比較した。逐次手法は、スポット７９の捕捉抗体剤１９マイクロアレイによるＣＰＳの捕捉に依拠し、続いて、シリンジ６によって４Ｃ４−ＧＮＰ１２溶液を膜３に押し通したときに、捕捉されたＣＰＳに４Ｃ４−ＧＮＰ１２を結合させた。予混合手法は、抗原１３（ＣＰＳ）と検出抗体１０粒子（４Ｃ４−ＧＮＰ１２）とに相互作用及び結合のための追加時間を与えてから、スポット７９の捕捉抗体剤１９マイクロアレイに押し通して、そのマイクロアレイによって捕捉した。どちらの手法も、孔径０．２μｍのニトロセルロース膜３．１ｍＬのアッセイ緩衝溶液にスパイクされた１ｎｇ／ｍＬのＣＰＳ、及び１０μＬのＯＤ＝９（５４０ｎｍ）４Ｃ４−ＧＮＰ１２を使用した。図３Ｂに示されるように、予混合プロトコルにより、逐次プロトコルよりも強い信号を有する検出スポット７９（中央アレイ）を得た。相対強度は、図３Ａで示されるように、６．５倍増加した。本実施例では、予混合手法の感度の向上は、ＣＰＳと４Ｃ４−ＧＮＰ１２との結合時間の増加、及び表面反応と比較したときの液体反応のより良い効率に起因すると考えられる。この後の実験は全て、予混合法を使用して行った。
【００５９】
[0115]孔径５μｍの膜を有するＶＦＩ：反応スキームを選択した後、孔径５μｍのニトロセルロース膜３（Ｗｈａｔｍａｎ  ＡＥ９８，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実験を行った。この膜３は、ＣＰＳ  ＬＦＩプロトタイプ（孔径１０μｍ、Ｗｈａｔｍａｎ  ＦＦ１２０ｈｐ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で使用されたニトロセルロース膜３と同様の孔径を有するが、支持層はない（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。１０分間１．５ｍＬ／分のフロー２３の体積流量、すなわちＬＦＩの流量に相当するフロー２３流量で、予混合された試料溶液をシリンジ６によって膜３に押し通した。精製されたＣＰＳをＶＦＩで試験して、この条件下でＬＯＤを決定した。ＣＰＳの希釈液（１、０．５、０．２、０．１、０．０４、０．０２、及び０．００４ｎｇ／ｍＬ）をアッセイ緩衝液中で調製し、ＶＦＩ膜３に加えた。フロースルーステップ前に、試料に１５μＬの４Ｃ４−ＧＮＰ１２溶液を加え、１０分間混合した。ＬＯＤは、バックグラウンド信号よりも標準偏差（ＳＤ）の３倍を超える信号を生成した濃度として定義した。図４に示されるように、ＬＯＤは、０．１ｎｇ／ｍＬ又はそれよりもわずかに低いものと決定された。
【００６０】
[0116]孔径５μｍの膜に対する流速の影響：次に、アッセイの感度に対するフロー２３速度の影響を調べた。より速いフロー２３速度は、より多くの抗原１３を膜３センサに送達し、これは感度を改善することができると考えられた。ＶＦＩシステムは、アッセイ緩衝液にスパイクされた１ｎｇ／ｍＬ  ＣＰＳを使用して、異なるフロー２３速度で、ＡＥ９８膜３で１０分間の一定のアッセイ時間を用いて試験した。ＧＮＰ１２の最終濃度を一定に維持するように、ＣＰＳ試料に加えた４Ｃ４−ＧＮＰ１２原液の体積を調整した。図５に示される結果によれば、フロー２３速度（体積フロー２３流量を膜３の表面積８１で割った値に等しい）が増加するにつれて、検出スポット及び陽性対照スポット７９の両方からの信号が増加された。
【００６１】
[0117]試料フロー２３速度の増加が感度を改善することができるとわかったところで、５ｍＬ／分のより高いフロー２３流量で、ＶＦＩデバイス１のＬＯＤを再び試験した。精製ＣＰＳの希釈液（１、０．５、０．２、０．１、０．０４、０．０２、及び０．００４ｎｇ／ｍＬ）をアッセイ緩衝液中で調製し、ＶＦＩ膜３に加えた。５０μＬの４Ｃ４−ＧＮＰ１２溶液をＣＰＳ試料に加えて、１０分間混合した。図６に示されるように、ＬＯＤは、０．０４ｎｇ／ｍＬ又はそれよりもわずかに低いものと決定された。
【００６２】
[0118]ＶＦＩ膜孔径効果：異なる孔径（０．１μｍ、０．２μｍ、０．４５μｍ、及び５μｍ）を有する４つのニトロセルロース膜３を試験して、ＣＰＳ  ＶＦＩの感度に対する膜３孔径の効果を決定した。０．１μｍが、市販のニトロセルロース膜の最小孔径である。１つの濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ定性濾紙、グレード１、有効孔径１１μｍ）も試験したが、捕捉抗体固定化ステップで失敗した。全体を通して、アッセイ緩衝溶液にスパイクされた１ｎｇ／ｍＬのＣＰＳを試験試料として使用した。１．５ｍＬ／分のフロー２３流量及び１０分のアッセイ時間で試料を処理した。異なるニトロセルロース膜３を使用して得た結果が図７に示されている。ニトロセルロース膜の孔径の減少により、検出スポット７９に対する信号の強調が得られた。０．１μｍの膜３からの信号は、５μｍの膜３に関して観察された信号の２倍の強さだった。
【００６３】
[0119]孔径０．１μｍの膜に対する流速の影響：本実施例では、様々な孔径の膜３のうちで最良の信号を示した０．１μｍの膜を使用して、フロー２３速度の影響を試験した。１０分の一定時間に関して、０．５、１、１．５、２、３、４、５ｍＬ／分のフロー２３流量で、１ｎｇ／ｍＬのＣＰＳをスパイクしたアッセイ緩衝溶液を膜３に押し通した。図８に示される結果によれば、より大きなフロー２３流量で増加した信号強度が観察された。孔径５μｍの膜３を用いて、より大きなフロー２３流量での感度の増加も観察されたが、全体の信号は、孔径０．１μｍの膜３を用いたほうが強かった。膜３の孔径の変化に伴うバックグラウンドレベルの有意な変化はなかった。
【００６４】
[0120]最適化されたＶＦＩシステムのＬＯＤ：２つの重要な因子、すなわち膜の孔径及び試料流速の影響を、スパイクされた試料を用いた実験を通して個別に実証し、理論モデルとの良好な一致を示した。フロー２３流量及び膜３孔径の研究から得られた知見を使用して、最良の性能のフロー２３流量及び膜３の条件を統合して、最適条件、すなわち最小の膜３孔径及び最高のフロー２３流量でのＶＦＩデバイス１のＬＯＤを決定した。孔径０．１μｍの膜３を選択して、５ｍＬ／分の最高フロー２３流量で試料を通した。精製ＣＰＳの希釈液（１、０．５、０．２、０．１、０．０４、０．０２、及び０．００４ｎｇ／ｍＬ）をアッセイ緩衝液で調製し、５０μＬの４Ｃ４−ＧＮＰ１２溶液と１０分間混合し、次いで、シリンジ６を使用してＶＦＩ膜３に通した。膜３のスキャン画像が、各膜３から抽出された信号と共に図８に示されている。ＬＯＤは、０．０２ｎｇ／ｍＬであるか、又はそれよりもわずかに低いものと決定された。
【００６５】
[0121]生物脅威病原体の多重化検出のためのＶＦＩ−概念実証：異なる捕捉抗体剤１９を利用するスポット７９のマイクロアレイを収容する能力により、ＶＦＩは、多重バイオマーカ検出に本質的に適している。生物脅威の検出に関して、ＶＦＩデバイス１プラットフォームを使用して概念実証実験を行って、ＣＰＳとＰＧＡ（炭疽菌の原因物質である炭疽菌に関するバイオマーカ）の２つの標的を同時に検出した（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。多重化ＶＦＩ膜３の設計が図１０Ａに示されている。検出マイクロアレイを２つの部分に分割した。半分は、ＣＰＳを標的とするｍＡｂ  ４Ｃ４でコーティングし、残りの半分は、ＰＧＡを標的とするｍＡｂ  ８Ｂ１０でコーティングした。ヤギ抗マウスＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ及び１ＸＰＢＳも、陽性対照及び陰性対照として同じ膜３に定量供給した。異なる抗原１３含有量を有する４つの試料（ＣＰＳ陰性／ＰＧＡ陰性、１ｎｇ／ｍＬ  ＣＰＳ／ＰＧＡ陰性、ＣＰＳ陰性／１ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＡ、及び１ｎｇ／ｍＬ  ＣＰＳ／１ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＡ）を、１ｍＬ／分の流量及び１０分のアッセイ時間で０．１μｍの孔径のＶＦＩ膜３によって処理した。図１０Ｂは、４つの膜３のスキャンされた画像を示す。図１０Ｃは、４つの膜３からの信号強度を示す。検出スポット７９は、対応する抗原１３が試料に存在するときにのみ陽性信号を示した。この実験は、ＶＦＩデバイス１プラットフォームが複数の生物脅威剤を同時に検出することができることを実証した。ＬＦＩとは異なり、ＶＦＩデバイス１では、検出スポット７９が空間的に離され、反応が互いに独立しており、ＶＦＩを大規模な多重化検出に特に適したものにする。しかしながら、交差反応又は非特異的結合が起こる可能性が依然としてあり（Ｊｕｎｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）、予混合条件及び緩衝溶液のさらなる特性評価を必要とすることがある。この実験は、ＶＦＩプラットフォームが複数の生物脅威剤を同時に検出することが可能であったことを示す。ＬＦＩとは異なり、検出スポットは空間的に離れており、反応はＶＦＩシステム内で互いに独立しており、これは、本明細書で実現されるＶＦＩデバイスをより大規模な多重化検出に特に適したものにする。
【００６６】
[0122]ＶＦＩ流体シミュレーション：膜３を横切る流れの均一性を調べるために、ＦＥＭソフトウェアＣＯＭＳＯＬ  Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ  ５．０（ＣＯＮＳＯＬ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州ロサンジェルス））を使用して流体シミュレーションを行った。シミュレーションは、紙膜３又はＳｉグリッド支持体２１を使用せずに、ステンレス鋼ホルダ２９チャンバを用いて開始した。流体力学の性質により、速度は、図１１Ａに示されるように、ホルダ２９チャンバの中央部分でかなり高かった。支持体２１（複数の開口部を有する非変形可能な固体構造としてモデル化）と紙膜３（多孔質薄膜としてモデル化）とをモデルに実装すると、液体流れプロファイルが大幅に変化した。図１１Ｂに示されるように、支持体２１及び膜３は、フローチャンバを横切る流体のフロー２３を均一にした。図１１Ｃは、膜３を横切るフロー２３の大きさのプロファイルの拡大図を示す。固体部分の上部での速度よりも、Ｓｉグリッド支持体２１の中空部分の上部の速度のほうが高い。図１１Ｄ及び１１Ｅで示されるように、この速度変動は、紙膜３での圧力の変動に変わる。しかし、撮像面として最も重要な部分である紙膜３の上面５に対する圧力は、圧力変動は１％以内である。したがって、膜３を横切るフロー２３及び圧力は均一であるとみなすことができる。
【００６７】
[0123]考察：本実施例では、生物脅威病原体の検出は、ナノ多孔性ニトロセルロース膜３に統合されたサンドイッチイムノアッセイに基づき、比色分析信号を読出し情報として生成する。ＶＦＩデバイス１の技術は、生物脅威病原体検出のための、単純で小型化された迅速な（３０分以内のサンプルトゥーアンサー（ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ａｎｓｗｅｒ）時間）プラットフォームを実現する。
【００６８】
[0124]フロースルーデバイス１の流量の影響を試験するとき、一般的な実験スキームは、試料体積を一定に保ち、流量を変化させることである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。これは、限された試料体積で高速の処理速度でアッセイを続行するのに効果的である。しかし、実際の用途では、特に尿や環境水などの豊富な試料を扱うときは、試料体積はもはや制約ではない。したがって、本実施例での実験は、１０分の一定のアッセイ時間で、フロー２３流量を変えて、すなわち試料体積を変えて行い、ＶＦＩの検出感度を比較した。ＬＦＩ試験に必要な時間と一致するように、１０分のアッセイ時間を選択した。２つのタイプの膜３（孔径５μｍ及び０．１μｍ）を用いて、フロー２３速度の影響を試験した。どちらの場合にも、フロー２３流量が増加するにつれて、検出スポット７９からの信号が強調された。フロー２３速度と信号強度とのこの関係は、膜３の多孔質構造２３を束になったナノチューブとしてモデル化して、フロースルー表面イムノセンサに関する古典的なモデル（Ｓｑｕｉｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）で説明することができる。フロー２３流量が増加するにつれて、表面抗体捕捉剤１９によって標的抗原１３を捕捉することができる枯渇区域の厚さが減少した。しかしまた、増加されたフロー２３流量は、より多くの試料を膜３に送達し、これは、減少された枯渇区域の厚さによる結合の損失を相殺した。
【００６９】
[0125]開示されるＶＦＩデバイス１の設計により、固定化された捕捉抗体剤１を有する領域に押し通された試料のみを検出することができた。他の領域を通った試料の残りは廃棄した。したがって、検出領域に送達される試料の量を決定したのは、総試料体積ではなく、単位面積当たりの試料体積であった。単位面積当たりの試料体積が多いほど、捕捉抗体剤１９によって捕捉することができる標的抗原１３の量が多くなる。表１は、いくつかの従来の免疫濾過デバイスの重要な特徴を要約したものである。開示されるＶＦＩデバイス１は、以前の研究と比較して、単位面積当たりの試料体積がはるかに大きい。その結果、ＶＦＩの感度は改善された。
【００７０】
[0126]表１：提示されたＶＦＩと以前に報告された免疫濾過デバイスとの重要な特徴の比較。開示されるＶＦＩデバイス１での単位面積当たりの試料体積が大きいため、より良い感度が達成された。
【表１】
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【００７１】
[0127]膜３にわたる平均ＣＶは、１０％であると計算された。これは、以前に開発されたシステムに匹敵する（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。図１１に示されるように、流体シミュレーションを行って、濾紙ホルダ内のフロー２３プロファイルを調査し、膜３にわたる均一性を確認した。特に、Ｓｉ支持体２１を使用するとき、より大きな孔の膜３を用いた場合でも、以前の文献（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）で報告された高いＣＶ値（ＣＶ＞０．８５）は観察されなかった。本実施例において作製されたシリコングリッド支持体２１は、市販のステンレス鋼よりも高いヤング率を有することが可能である。このＳｉグリッド支持体２１は、変形の影響を受けにくく、以て不均質なフロー２３が起こるのを防止する。
【００７２】
[0128]理論モデルに基づいて予測され、後で本実施例の実験を通して示されるように、ＶＦＩの利点は、２つの要因、すなわち単位面積当たりの試料体積及び膜３孔径から主に生じる。従来のＬＦＩは、長い膜（約４０ｍｍ）を通して液体を移送するために毛細管力に依拠しており、これは、膜３孔径に制限を与える。ＬＦＩ膜孔径の一般的な範囲は、３〜１２μｍである（Ｐｏｓｔｈｕｍａ−Ｔｒｕｍｐｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。しかし、ＶＦＩは、サブミクロンの孔径を有する膜３を使用できるようにする、短い膜３フロー２３経路（約１３０μｍ）を有する。より小さい孔径は、多孔質構造１１内でより多くの結合部位を生成する、より高いタンパク質装填容量を実現する。また、より小さな孔径は、抗原１３が膜表面の抗原捕捉剤１９によって捕捉されるのに必要な拡散距離を減少させる。ＬＦＩシステムの膜孔径を減少させることも、アッセイ感度を高めるための効果的な方法であり得ることが示されている（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，２００２）。これらの理由に基づいて、本実施例では、孔径０．１μｍを有するニトロセルロース膜３をＣＰＳアッセイのための最適化された基材として選択した。しかし、標的抗原１３がＣＰＳよりも大きい用途では、０．２μｍ及び０．４５μｍの選択肢も残っている。
【００７３】
[0129]さらに良好な感度を得ることを妨げる主要な障害の１つは、低い４Ｃ４−ＧＮＰ１２濃度であった。現在のＶＦＩは、単位面積当たりの大きい試料体積を実現するために、大きい総試料体積を必要とする。一方、大きい試料体積の使用は、結合効率を増加させるためにかなりの量の標識ナノ粒子１２を必要とする。この問題を解決するための１つの取り得る解決策は、単位当たりの大きい試料体積を維持しながら、試料の総体積を減少させることである。これに対する１つの手法は、より小さい表面積８１を有する小型化ＶＦＩデバイス１を開発することである。
【００７４】
[0130]本実施例は、生物脅威病原体の迅速な診断のための開示される紙ベース垂直フローイムノアッセイ（ＶＦＩ）デバイス１のプロトタイプの開発及び最適化を述べる。類鼻疽の原因物質である類鼻疽菌をモデル細菌標的として使用し、サンドイッチアッセイを開発して、診断用バイオマーカとして莢膜多糖（ＣＰＳ）を検出した。ＶＦＩデバイス１は、場合により互いに異なることがある少なくとも１２０個の検出スポット７９、３０分未満のアッセイ時間、及び通常の卓上スキャナに適用可能な金ナノ粒子１２媒介比色読出値を組み込む。試料フロー２３流量及び膜３孔径が、開示されるＶＦＩデバイス１の性能に及ぼす影響を調査した。本実施例の結果は、ナノ細孔膜３を通る高いフロー２３速度が、より高い感度を実現する鍵であることを示す理論分析とよく一致した。ディープエッチングされたシリコングリッド支持体２１を市販のステンレス鋼支持体の代わりに使用して、より大きな孔径の膜３を有する大きな信号変動を防止するのを助けた。２つの反応スキームを比較した。その結果、試料と抗体標識ナノ粒子１２とを事前に混合した予混合法がより効果的であることが判明した。精製されたＣＰＳを用いて、０．０２ｎｇ／ｍＬの検出限界（ＬＯＤ）を示した。ＶＦＩデバイス１プラットフォームを使用したＣＰＳ及びＰＧＡを用いた多重化生物脅威検出も示された。開示されるＶＦＩデバイス１は、資源が限られた又は臨床の様々な状態で生物脅威剤を検出して減少させるための有益な手法を実現する。
【００７５】
[0131]例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｐａｐｅｒ−ｂａｓｅｄ  Ｖｅｒｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  （ＶＦＩ）  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏ−ｔｈｒｅａｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ”  Ｔａｌａｎｔａ  １９１（１）：８１−８８（２０１９年１月−２０１８年８月１７日オンラインで閲覧可能）及び裏付ける補完資料を参照されたい。それらの全てを参照により本明細書に援用する。
【００７６】
[0132]実施例２：垂直紙ベース免疫診断システム（ＶＰＩ−ＤＳ）の設計規則
[0133]本実施例は、均一性及びＰＧＡアレイ印刷；ＰＧＡのためのｍＡｂの精製及び共役、並びにＬＰＳ、ＬｃｒＶ、及びＦ１のためのｍＡｂの開発、ＬＦＩによるｐＨ及びイオン強度の影響の決定、並びにＬｃｒＶ及びＦ１  ＬＦＩの試験に対処する。開示されるデバイス１を使用するＶＰＩアッセイも、ＣＰＳ及び自動画像解析ソフトウェアに関して評価した。
【００７７】
[0134]膜全体にわたるＴ信号の変動：スクリーニング実験後のニトロセルロース膜３の皺の問題を解決するために、いくつかの手法を取った。図１２Ａ〜１２Ｃは、これらの問題を様々な程度で表す膜３の画像を示す。
【００７８】
[0135]問題：処理された試料のほとんどにおいて、スクリーニング実験後、ニトロセルロース膜３に濃い円形の染み１４が見て取れる。これは、液体が通過した後の膜３の皺によるものであり、この皺によって平坦でない紙表面が生成され、これが次いで濃い染み１４として撮像される。染み１４は、検出スポット７９及び背景のグレースケール強度を変化させ、誤検出結果を招く可能性があるため問題となる。
【００７９】
[0136]図１３Ａ〜１３Ｃは、以下のような、この問題の解決を試みて失敗したいくつかの手法を示す：１）ステンレス鋼グリッドではなく、膜３支持体としてのＳｉグリッド支持体２１の使用。本発明者らは、膜３の形状をより良く維持するために、Ｓｉの高い剛性を利用することを試みた（図１３Ａ）。２）管調整器３３。本発明者らは、スクリーニングチャンバ３９の出口３７に接続されている垂直配管３５を延長して、液体が垂直に膜３を通って流れるようにした（図１３Ｂ）。３）カスタマイズされたＯリング７７。本発明者らは、より均一な力を膜３に加えるために、平坦な表面を有する独自のＯリング７７を作製した（図１３Ｃ）。
【００８０】
[0137]図１４は、皺の背景にある提案される推論を示す概略図である：スクリーニングチャンバ３９を組み立てるとき、膜３に加えられる力（クランプ力及びねじり力）は膜３の縁部でより高く、これにより膜３がドーム状になる。液体が膜３を通って流れると、より高い圧力が中央部にかかり、それにより皺が発生する。
【００８１】
[0138]図１５Ａ及び１５Ｂは、膜３の皺及び染みの問題に対する解決策を示す。最終的な解決策：スクリーニングチャンバを組み立てる前から、膜３をＰＢＳで事前に濡らす。ここまで、本発明者らは、気泡と膜３の皺の問題を解決した。品質は、（図１５Ｂを図１５Ａと比較してわかるように）大きく向上している。
【００８２】
[0139]信号均一性研究：ＶＦＩにおける懸念の１つは、膜３を横切る液体のフロー２３の変動が信号の不均一性をもたらす可能性があることである。本発明者らは、膜３に加えられた圧力のインシリコでの結果を提示している。これは、膜３全体で一貫性があり比較的均一であるように見える。試料の一部を用いて分析を行い、信号均一性を調べる。
【００８３】
[0140]本発明者らは、例として、乾燥時間実験結果から１０分間の試料を使用する。アレイ内の多くの検出スポット７９の間で変動が見られる場合でも、以前の出版物で報告されているように明確なパターンを観察することはできない。変動はランダムに現れる。現在のデバイス１では、信号の変動は約１５％であり、これは文献で報告されている値と比較してかなりの改良である。ディスペンサ自体の精度によって主に決定されるディスペンシングプロセスには、ベンダの仕様に応じて１０％超の変動がある。
【００８４】
[0141]本明細書で提供されるシステム及び方法により、ラテラルフローシステムを凌駕する信号検出及び感度の実現が容易になる。例えば、図１６Ａは、表面に様々な捕捉剤（例えば、この例では抗体）を有する膜を示しており、各捕捉抗体に関連する流れの断面積を反映するように中空チューブとして概略的にモデル化されている。図１６Ｂは、それぞれ対応する比色読出値を有する４つの異なる捕捉抗体（１つの対照捕捉抗体及び３つの異なる捕捉抗体）を示す断面の拡大図である。図１６Ｃは、流速（μ）、感知長さ（Ｌｓ）、膜孔径（ｄ）、及び拡散率（Ｄ）に基づいたモデルを示す。拡散時間（ｔｄｉｆ）及び滞留時間（ｔｒｅｓ）は、以下のように計算する。
[0142]ｔｄｉｆ＝ｄ２／（４Ｄ）
[0143]ｔｒｅｓ＝Ｌｓ／μ
【００８５】
[0144]このようにして、本明細書で提供される垂直フローシステム（ＶＦＩ）のナノ細孔は、高い流速でのより良い標的捕捉を可能にする。さらに、ＶＦＩは、ラテラルフローシステム（ＬＦＩ）では通常４０ｍｍ以上であるのに対し、約１００μｍ以下の短い流れ経路を有する。
【００８６】
[0145]ＰＧＡアッセイ定量供給及びＶＦＩ試験：ＣＰＳアッセイ以外に、本発明者らは、ＰＧＡアッセイの初期研究の一部を開始した。ＰＧＡのためのサンドイッチが以下で作製される。図１７に示されるように、このアッセイでは、捕捉抗体（８Ｂ１０）剤１９及び検出抗体１０（８Ｂ１０−ＧＮＰ）を使用する。同じレシピで、図１８の（Ａ）及び（Ｂ）に示されるように、ＢｉｏＤｏｔディスペンサを使用してニトロセルロース膜３に８Ｂ１０捕捉抗体（８Ｂ１０）剤１９を定量供給することができる。
【００８７】
[0146]概念実験では、５ｎｇ／ｍＬの濃度で８Ｂ１０サンドイッチアッセイを試験する。結果が図１８Ｃ及び１８Ｄに示されている。サンドイッチアッセイは、０．２μｍと０．４５μｍの膜３の両方で機能する。５ｎｇ／ｍＬのＣＰＳと５ｎｇ／ｍＬのＣＰＳとの結果を並べて示す。実際には、ＰＧＡアッセイは、より強い信号を示している。本発明者らは、このアッセイはより感度が高いと予想する。
【００８８】
[0147]ｍＡｂの開発及び精製：炭疽菌ＰＧＡ  ｍＡｂの産生及び精製：炭疽菌ポリγＤ−グルタミン酸（ＰＧＡ）特異的ｍＡｂ、８Ｂ１０を、組換えタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して精製する。さらに、精製されたｍＡｂを４０ｎｍの金コロイドに結合させた。精製されたＰＧＡと共に、標識されていないｍＡｂと標識されたｍＡｂとの両方を、垂直フローアッセイ形式で最適化される第２の抗体−抗原対の一部として準備する。
【００８９】
[0148]野兎病菌ＬＰＳ  ｍＡｂの産生及び精製：野兎病菌ＬＰＳ反応性ｍＡｂ、１Ａ４を産生するハイブリドーマ細胞株を、組織培養用Ｉｎｔｅｇｒａフラスコで増殖させる。組換えタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用した１ラウンドの精製により、４０ｍｇの抗体の収量が得られる。しかし、細胞株は高密度Ｉｎｔｅｇｒａ培養条件下では不安定であることがわかっている。これに応じて、ＬＰＳに対する高親和性モノクローナル抗体のより大規模なライブラリを単離するために、新たな１組のマウスを野兎病菌ＬＰＳで免疫する。免疫後６週間の血清力価によって、複数のマウスが高レベルのＬＰＳ特異的抗体を有することが示された。Ｆｔ  ＬＰＳでさらに追加免疫した後、ハイブリドーマの産生のために脾細胞を単離する。
【００９０】
[0149]ペスト菌ＬｃｒＶ及びＦ１  ｍＡｂの産生、精製、及び特性評価：ＬｃｒＶモノクローナル抗体：８つの精製されたＬｃｒＶモノクローナル抗体全てに対してＳＰＲ分析を行い、ｍＡｂ結合反応速度及び精製された組換えＬｃｒＶへの親和性を決定した（以下の表２）。各ｍＡｂについて会合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）を決定し、平衡解離定数又は「親和性」（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を計算するために使用した。代替として、定常状態平衡モデル（ＳＳＫＤ）を使用して親和性も計算した。他の全てのＬｃｒＶモノクローナル抗体と比較したとき、ｍＡｂ  ８Ｆ１０では１０倍高い会合速度（ｋａ）が観察された。モノクローナル抗体６Ｆ１０が、試験した８つの抗体の中で最も遅い解離速度を示した。全体として、ｍＡｂ  ８Ｆ１０はＳＰＲ分析で最高の性能を示し、最も高い結合親和性を示した。
【００９１】
[0150]抗原１３捕捉ＥＬＩＳＡ形式でＬｃｒＶ  ｍＡｂを使用して、ＬＦＩ産生のための最良の抗体対を決定した。８つのＬｃｒＶ  ｍＡｂを全てＨＲＰ結合し、ｒＬｃｒＶの検出に使用した。ｒＬｃｒＶは、ＥＬＩＳＡ形式で、標識されていないＬｃｒＶ抗体によって捕捉された。各抗体対の検出限界（ＬＯＤ（ｎｇ／ｍｌ））を計算した（以下の表３）。
【００９２】
[0151]Ｆ１モノクローナル抗体：１２個のモノクローナル抗体Ｆ１抗体のライブラリを生成し、組換えタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィを使用して精製した。精製された抗原１３及びＥＬＩＳＡの作業負荷を節約するために、１２個の精製されたＦ１  ｍＡｂに関するスクリーニング戦略を（ＬｃｒＶ戦略から）変更した。１２個のＦ１  ｍＡｂを全て金で標識して、プロトタイプＬＦＩで湿式試験して、上位８個のｍＡｂ候補を、ＳＰＲ分析及び抗原１３捕捉ＥＬＩＳＡによるさらなるスクリーニングのために選択した。Ｆ１  ｍＡｂ間で結合反応速度又は親和性に有意差は認められず、Ｆ１  ｍＡｂは、他の抗体と比較して１０倍高い会合速度を示した（以下の表４）。８つのＦ１ｍＡｂを全てＨＲＰ結合し、組換えＦ１を使用して抗原１３捕捉ＥＬＩＳＡ形式で試験した。バックグラウンドレベルの５倍のカットオフを使用して、各抗体対の検出限界を決定した（表５）。
【００９３】
[0152]バイオマーカの精製：市販のバイオマーカ（ＬＰＳ、ＰＧＡ、Ｆ１）を購入する。
【００９４】
[0153]ＬＦＩ（ＣＰＳ）によるｐＨ及びイオン強度の影響：ｍＡｂ結合反応性に対するｐＨ及びイオン条件の影響を比較する最初の実験では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）とラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩ）の結果を直接比較することができないことが示された。ＬＦＩ形式は、開発中の垂直フローアッセイに最も類似しているため、このイムノアッセイのみを使用して試験系列を継続することを決定した。４Ｃ４ラテラルフローイムノアッセイのバックグラウンド及び感度に対するイオン条件の影響を調査するために、界面活性剤Ｐ２０を用いて又は用いずに、様々なイオン強度でリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を使用してＬＦＩを行った。１００ｍＭ未満のＮａＣｌ塩濃度（イオン濃度：０．１２５ｍｏｌ／Ｌ）で有意なバックグラウンドが観察された。３００ｍＭ（イオン濃度：０．３２５ｍｏｌ／Ｌ）までの塩濃度の上昇は、ＬＦＩ性能に有意な変化をもたらさなかった（以下の表１）。これらの結果は、０．３２５ｍｏｌ／Ｌを超えるイオン濃度を有するＰＢＳの使用により、本発明者らのＬＦＩでの偽陽性結果が減少する可能性があることを示している。イオン条件の試験を完了するために、本発明者らは、より高いイオン条件での４Ｃ４  ＬＦＩの試験を計画し、場合によっては、開示されるデバイス１の垂直フローアッセイ形式とより適合性があり得る緩衝剤の試験を計画する。
【００９５】
[0154]ペスト菌ＬｃｒＶ及びＦ１  ＬＦＩプロトタイプの開発：ＬｃｒＶ  ｍＡｂの大部分が、抗原１３捕捉ＥＬＩＳＡで良好に機能したので、全てのＬｃｒＶ  ｍＡｂを金結合し、ＬＦＩプラットフォームでの検出器及び／又は捕捉抗体としての評価のために試験ラインとしてニトロセルロースに噴霧した。全てのＬｃｒＶ  ＬＦＩプロトタイプの初期試験が完了し、視覚的検出限界が１〜１０ｎｇ／ｍｌの有望な候補がいくつかある（図１９）。
【００９６】
[0155]ＥＬＩＳＡにおいて最も高い反応性を有する８つのＦ１抗体を、ＬＦＩ形式での同様の試験のために選択した（図２０）。いくつかのプロトタイプは、組換えＦ１で１〜１０ｎｇ／ｍｌの視覚的検出限界を有する。
【００９７】
[0156]初期試験は、緩衝液にスパイクされたｒＬｃｒＶ又はｒＦ１を使用して実施した。ここで、現在の取組みは、マトリックスとしてヒト血清と共に使用するためにＬＦＩプロトタイプを最適化することに焦点を当てている。
【００９８】
[0157]図１９に示されるように、様々な濃度のｒＬｃｒＶ（左から右に、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ）及び陰性対照を用いて、（Ａ）８Ｆ７：６Ｆ１０、（Ｂ）８Ｆ１０：２Ｂ２、（Ｃ）８Ｆ１０：６Ｅ５（Ｄ）８Ｆ１０：６Ｆ１０のラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩ）試験を行った。２０分後に画像を記録した。
【００９９】
[0158]図２０に示されるように、様々な濃度の組換えＦ１（左から右に、１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５００ｐｇ／ｍＬ、及び陰性対照）を用いて、（Ａ）４Ｅ５：３Ｆ２、（Ｂ）１０Ｄ９：３Ｆ２、（Ｃ）１１Ｃ７：３Ｆ２、（Ｄ）１１Ｃ７：１５Ｃ４のラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩ）を試験した。２０分後に画像を記録した。
【０１００】
[0159]ＶＰＩ  ＣＰＳ最適化：まず動作範囲を得るために、異なるパラメータを個別に試験した。次いで、ＤＳＤによるＤＯＥスクリーニングを行って、重要なパラメータを選択し、次いで、最終的な最適化のために、重要なパラメータに対して完全な要因実験を行う。
【０１０１】
[0160]膜材料の比較及び最適化：図２１は、本実施例のために最適化及び比較に使用する膜３の例を示す。開示されるデバイス１における垂直フロー２３システムの利点の１つは、液体輸送がニトロセルロース膜３の多孔質構造１１に依拠しないことであり、これにより、膜３材料の孔径をはるかに小さくすることができる。小さな孔径を有するそのような膜３は、より多くの捕捉抗体剤１９に結合するためのはるかに高い装填容量を有する。さらに、抗体−抗原結合を促進するために、拡散範囲を大幅に縮小する。
【０１０２】
[0161]本発明者らは、まず、ＳＥＭを用いて、０．２μｍ及び０．４５μｍの孔径を有する２種類の垂直フローニトロセルロース膜３、典型的なラテラルフロー膜（１０μｍの孔径）、及び濾紙を調べた（２Ｋ倍率での結果を上で見ることができる）。そのようなより微細な多孔質構造１１により、検出効率を大幅に改良可能であることを想像することができる。
【０１０３】
[0162]次いで、本発明者らは、ＣＰＳのアッセイを用いて、開示されるデバイス１のＶＦＩシステムにおいて６種類の材料を試験した。ラテラルフロー膜を比較するために、同じ供給業者によって提供されている最も近い膜であるので、８μｍ及び１２μｍのニトロセルロース膜３を選択した。
【表２】
2021520482.tif 000008
【０１０４】
[0163]１ｍＬ／分のスクリーニング速度で５ｎｇ／ｍＬの濃度で１ｍＬのＣＰＳを用いた結果を図２２で見ることができる。ニトロセルロース膜３の全ての試料において、陽性対照スポット７９（図２２の上部及び下部の列）をはっきりと見ることができ、検出スポット７９（中央アレイ）は様々な強度を有する。しかし、濾紙では、定量供給されたマイクロアレイが汚れており、検出又は対照スポットのいずれからも信号を観察することができない。
【０１０５】
[0164]次に、画像（図２３Ａ及び２３Ｂ）から獲得したグレースケール強度を見てみる。１６ビットのグレースケールスキャンを使用しており、したがって値の範囲を１〜６５５３５にする必要があることに留意されたい。孔径が小さくなるに従い、信号が強調されることがわかる。特に、検出スポット７９では、０．１μｍ膜３からの信号は、１２μｍ膜３からの信号の１６倍の強度である。この結果によって、孔径がはるかに小さいニトロセルロース材料を選択することで、検出感度を大幅に向上させることができるという本発明者らの理論が強力に裏付けられる。
【０１０６】
[0165]乾燥時間研究：開示されるデバイス１のＶＦＩシステムの多くの利点の１つは、ラテラルフロー試験ストリップ（μＬレベル）では不可能である大きい体積の試料（ｍＬレベル）の処理を高速で可能にすることである。しかし、膜３をスキャンして画像解析及び信号抽出を行う前に、ある程度の乾燥時間が依然として必要である。
【０１０７】
[0166]本発明者らは、乾燥時間（１０〜３０分）の影響を調べた。乾燥時間は、膜３を液体から取り出してから画像をスキャンするまでの時間である。スキャンされた画像が図２４に示されている。
【０１０８】
[0167]検出スポット７９のグレースケール強度は、図２５Ａ及び２５Ｂで見ることができる。乾燥時間が長くなるにつれて、検出スポット７９とバックグラウンドとの絶対強度（未処理の強度）がどちらも上昇する。膜３の余剰の水が蒸発するにつれて、膜３の反射率が変化し、膜３の色が明るく見えることを説明できる。対照的に、相対強度（検出スポット７９からバックグラウンドを差し引く）は、乾燥時間が長くなってもそれほど変化しない。したがって、本発明者らは、最短の乾燥時間である１０分を選択し、試験時間全体をできるだけ短くすることができる。乾燥時間は、乾燥パッド９１（図３１Ａ）、又は同様の能動的乾燥機構を使用することによってさらに短縮できることに留意されたい。
【０１０９】
[0168]検出抗体１０の研究：サンドイッチアッセイの重要な部分として、検出抗体１０と捕捉された抗原１３との結合が、最終的な信号の強度を主に決定する。ＣＰＳは多価標的であるため、検出Ａｂ１０の濃度が増加するにつれて、より多くのナノ粒子１２が抗原１３に結合する。したがって、信号が強調される。しかし、飽和点に到達してそれを超えると、検出Ａｂ１０濃度がさらに上昇しても、バックグラウンドが増加するだけである。したがって、検出抗体１０の最適な濃度を特徴評価して見つけ出すことが重要である。
【０１１０】
[0169]ここで、本発明者らは、緩衝液にスパイクした１ｍＬ  ＣＰＳ  １ｎｇ／ｍＬを試料溶液として使用し、５μＬ〜６０μＬまでの様々な量の検出Ａｂ１０を試験する。結果は図２６で見ることができる。図２７Ａ及び２７Ｂに示されるように、検出Ａｂ１０濃度が上昇し、検出スポット７９及び陽性対照スポット７９の強度がどちらも増強される。
【０１１１】
[0170]検出スポット７９及び陽性対照スポット７９の値は、検出Ａｂ１０の濃度が増加するにつれて両方の信号が改善されるという同じ規則を示している。４０μＬと６０μＬの差は、２０μＬと４０μＬの差よりもはるかに小さいことに留意されたい。これは、約４０〜６０μＬの検出抗体１０で、サンドイッチアッセイが飽和点に達する可能性があることを示している。
【０１１２】
[0171]試料体積及び捕捉抗体剤１９濃度の研究：スクリーニング試料が膜３を通過するときに、捕捉抗体が抗原１３を捕捉する。予想できるように、膜３に定量供給される捕捉抗体剤１９が多いほど、より多くの抗原１３が捕捉される。また、捕捉抗体剤１９には飽和点があり、この点を超えると、より多くの捕捉抗体剤１９を加えても、捕捉される抗原１３の量はそれ以上増加しない。異なる濃度の捕捉抗体剤１９溶液を定量供給することは可能であるが、ディスペンサには、定量供給する液体の粘度に対する制限がある。したがって、本発明者らは、膜３の捕捉抗体剤１９の量を増加させるために、捕捉抗体剤１９溶液の複数の液滴を定量供給することを選択する。
【０１１３】
[0172]ｍＬレベルで試料を処理できることが、開示されるデバイス１のＶＦＩシステムの別の利点である。試料体積は、検出スポット７９を通過する抗原１３の実際の量を決定する。試料体積の増加は、標的濃度の減少を補償し、したがって、開示されるデバイス１のシステム感度を向上させる。
【０１１４】
[0173]本発明者らは、これら２つの因子を同時に試験するために、図２８に示される実験を設計した。マイクロアレイ（左側）は、６列の検出スポット７９を有する。各列には異なる数の液滴（１〜６滴、捕捉抗体剤１９溶液の濃度は１０ｍｇ／ｍＬ）が定量供給され、それにより、捕捉抗体剤１９の量は列毎に異なっていた。本発明者らは、異なる体積（１ｍＬから１０ｍＬ）であるが同じＣＰＳ濃度０．０４ｎｇ／ｍＬの６つのスクリーニング試料を調製した。１ｍＬ／分のフロー２３速度で試料をスクリーニングした。
【０１１５】
[0174]結果は図２９で見ることができる。試料体積が増加するにつれて、信号強度が増加する。１０ｍＬの試料は、１ｍＬの試料よりも有意に高い信号を示す。しかし、同じ試料内では、異なる捕捉抗体剤１９濃度のスポット７９間で結果はあまり変化しない。これは、１０ｍｇ／ｍＬの４Ｃ４捕捉抗体剤１９の液滴１滴だけでも、通過する全ての抗原１３を捕捉するのに十分であることを示す。
【０１１６】
[0175]上記の単一パラメータ研究により、重要な因子及び関心範囲を特定するのに役立つ。
【０１１７】
[0176]開示されるデバイス１のための３．５ｍｍ膜３のシステム開発：ここで、本発明者らは、単位面積当たりの試料がＶＦＩシステムにおける主要な因子であることを確認した。単位面積当たりの試料を増加するには、１）総試料体積を増加させること、及び２）膜３のサイズを小さくすることの２つの方法がある。第１の方法は比較的簡単で、実験装置に変更を加える必要がない。特に、尿など、典型的には大きい体積を有する生体試料に適している。しかし、試料の処理にかなり長い時間を要する。さらに、本発明者らは、図３０Ａ〜３０Ｃに示されるように、膜３のサイズを小さくするためのいくつかの概念的な作業を試みた。
【０１１８】
[0177]標準的な１３ｍｍ膜３に対して、本発明者らは、直径がわずか３．５ｍｍのより小さいバージョンを作製した。これは、ニードル４１の内側の空間に収まるほど十分に小さい（図３０Ａ）。また、ガスケット２５、Ｓｉグリッド支持体２１、Ｏリング７７（図３０Ｃ）、及びアダプタ４３のより小さいバージョンを作製して、それらをニードルチャンバ４５内に組み付けた（図３０Ｂ）。理論的には、シリンジ６のポンプ３１なしで作動させることが可能であり、可搬性が高い。
【０１１９】
[0178]図３１Ａ、３１Ｂ、及び３１Ｃは、０．５ｍＬ／分のフロー２３速度でのＣＰＳ（５ｎｇ／ｍＬ）アッセイを用いた３．５ｍｍ膜３セットアップの試験のための実験セットアップ及びグレースケール強度結果を示す。図３１Ｃにプロットされた結果は、標準的な１３ｍｍディスク膜３からの信号と比較して、有意に強い信号（最大２０倍）を示す。開示されるデバイス１のそのようなより小さな実施形態は、試料体積が小さく、超高感度を必要とする用途に特に有用であり得る。
【０１２０】
[0179]６つの設計因子を含む新規のＶＦＩデバイス１の設計を完了した：相対グレースケール強度を制御する最も重要な主要効果は、抗原１３の濃度及び検出抗体１０の濃度であった。また、抗原１３の濃度に関連する有意な二次効果と共に、抗原１３の濃度に関連する２つの重要な双方向相互作用があった。
【０１２１】
[0180]追加の設計パラメータは、膜３の孔径、緩衝液ｐＨ、及び緩衝液イオン強度である。関連する設計パラメータの例は、以下のものである：１．膜３の孔径（０．１〜０．４５μｍ）；２．抗原１３の濃度（０．５〜１．５ｎｇ／ｍＬ）；３．検出Ａｂ１０の濃度（範囲はまだ決定されていないことに留意されたい；現在の飽和点は６０μＬである）；４．フロー２３速度（０．５〜１．５ｍＬ／分）；５．緩衝液ｐＨ（６．５〜８．５）；６．イオン強度（０．１〜０．５）。
【０１２２】
[0181]目標は、開示されるデバイス１で最大の相対グレースケール強度を生成するこれらの設計要素全ての理想的な値を特定することである。
【０１２３】
[0182]応答曲面での曲率に関するエビデンス（ｅｖｉｄｅｎｃｅ）に基づいて、ここでも決定的スクリーニング計画（ＤＳＤ）が適切である。ＤＳＤは、比較的少量の実行（合計１７回）で６つの設計因子に対応することができ、追加の実行なしで２次効果の推定を可能にする。実行順序がランダム化された１７回の実行計画表を以下に示す。
【表３】
2021520482.tif 000009
【０１２４】
[0183]自動画像解析ソフトウェア：観察者の影響を最小限に抑えるためには、客観的な観察及び解析ソフトウェアシステムが必要である。ソフトウェアは、膜３の画像を解析して試験領域を位置特定し、各試験スポット７９に関する値を測定する。プログラミング環境はＬａｂＶＩＥＷである。
【０１２５】
[0184]第１のステップは、パターンを位置特定し、既知の位置に方向付けることである。第２のステップは、パターン内のスポット７９を解析して、それらの強度を決定することである。現在、ソフトウェアはファイルを読み取ることができる。粗調整では、図３２に示されるように、画像を回転させて画像を方向付ける。位置特定が終了した後、ソフトウェアは、画像が真っ直ぐになるように微調整を行う必要がある。画像を方向付けると、ソフトウェアはパターンを検出し、各スポット７９のドットを評価することができる。現在、図３３に示されるように、ソフトウェアは、各スポット７９のドットの中心２５ピクセルの平均を提供する。プログラムの現在の状態では、試験ケースの８０％で自動方向付けが成功している。本発明者らは、このプロセスを改善するための方法を検討して試験している。現時点では、ユーザが解析プロセスを調整する必要がある。この部分は、既知の方法及び手順を使用して自動化することができる。
【０１２６】
[0185]リスク及び問題：リスク１−バイオドットディスペンサの変動が、系統的な変動を生じることがある。緩和戦略：工業レベル又は圧電作動式のマイクロディスペンサを使用する。解像度：本発明者らが使用している液滴サイズ（１ｎＬ）は、通常、マイクロソレノイドディスペンサのカットオフサイズである。液滴のばらつきは、１０％の通常値よりも大きい。工業レベルのマイクロディスペンサを使用して、開示されるデバイス１でのＶＦＩシステム全体の安定性を高めることができる。
【０１２７】
[0186]リスク２−ｍＡｂ  １Ａ４細胞株の不安定性。緩和戦略：１Ａ４細胞株がまだ産生している間、不安定であり増殖が遅いことから、Ｆｔ反応性ｍＡｂを産生するハイブリドーマを増やすという決定が成された。解決策：１０匹のマウスをＦｔ  ＬＰＳで免疫し、現在、最大の免疫反応に関して監視及び追加免疫している。脾臓摘出術及び融合術を実施して、高い反応性のＦｔ  ｍＡｂのより大きなライブラリを作成する。
【０１２８】
[0187]検査すべき他の因子は以下のものを含む：異なるイオン条件でＬＦＩによって決定される類鼻疽菌抗体−抗原結合。高い反応性のペスト菌ＬｃｒＶ及びＦ１特異的ｍＡｂのライブラリの生成、精製、及び特性評価。ペスト菌ＬｃｒＶ及びＦ１  ＬＦＩプロトコルの開発及び試験。緩衝液にスパイクされた組換えタンパク質を使用した初期段階プロトタイプによる検出限界の決定。１Ａ４（Ｆｔ  ＬＰＳ特異）ｍＡｂの精製。新たなマウスの免疫化と野兎病菌ＬＰＳに特異的な力価の生成。
【０１２９】
[0188]機会には以下のことが含まれる：図３４Ａ及び３４Ｂに示されるように、蠕動ポンプ３１で試料を再循環させる。代替法は、より大きな試料体積を必要とせずに、単位面積当たりの試料を増加することである。このようにして、双方向フロー４７に関して、捕捉のための追加の機会が利用可能である。何らかのアクティブな乾燥ステップを組み込んで、膜３の乾燥時間を５分未満にさらに短縮する。開示されるデバイス１のＶＦＩシステムでは、本発明者らは、ＬＦＩに使用される膜の１００分の１である０．１μｍの小さな孔径を有する膜３を使用することができる。そのような小さい拡散範囲では、抗原１３は、膜３の細孔を通過するときに捕捉剤１９によってより容易に捕捉される。単位面積当たりの試料は、現在のサンドイッチアッセイにおいて最も主要な因子である。本発明者らは、膜３のサイズを小さくすることにより最大の信号強調を実現した。異なるイオン条件のチェイス緩衝液を用いた４Ｃ４  ＬＦＩの試験では、抗体−抗原結合のための最適なイオン条件の重要性が強調された。
【０１３０】
表１：４Ｃ４  ＬＦＩプロトタイプを、緩衝液のみ、又はチェイス緩衝液中に界面活性剤Ｐ２０を伴う若しくは伴わない様々なイオン強度でのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中の１ｎｇ／ｍｌ  ＣＰＳで試験した。２０分後にＥＳＥリーダを使用して光学密度を取得した。結果は、２つの独立した実験の平均値を表す。
【表４】
2021520482.tif 000010
【表５】
2021520482.tif 000011
【０１３１】
表２：ＳＰＲ分析によって決定されたＬｃｒＶ  ｍＡｂの結合反応速度及び親和性。読取値は、２つの独立した実験の平均値を表す。
【表６】
2021520482.tif 000012
【０１３２】
表３：抗原１３捕捉ＥＬＩＳＡによって決定されたＬｃｒＶ  ｍＡｂ対の検出限界（ＬＯＤ）。ＬＯＤを、バックグラウンドの５倍（ＯＤ＝４５０ｎｍ）で信号を生成するｒＬｃｒＶの濃度（ｎｇ／ｍｌ）として計算した。読取値は、各濃度で３回行われた、２つの独立したＥＬＩＳＡの平均値を表す。
【表７】
2021520482.tif 000013
【０１３３】
表４：Ｆ１  ｍＡｂの結合反応速度及び親和性をＳＰＲ分析によって決定した。読取値は、２つの独立した実験の平均値を表す。
【表８】
2021520482.tif 000014
【０１３４】
表５：抗原１３捕捉ＥＬＩＳＡによって決定されたＦ１  ｍＡｂ対の検出限界（ＬＯＤ）。ＬＯＤを、バックグラウンドの５倍（ＯＤ＝４５０ｎｍ）で信号を生成するｒＦ１の濃度（ｎｇ／ｍｌ）として計算した。読取値は、各濃度で３回行われた、２つの独立したＥＬＩＳＡの平均値を表す。
【表９】
2021520482.tif 000015
【０１３５】
[0189]実施例３：高流量感受性垂直フロー診断デバイス１及び使用方法：
[0190]心血管疾患及び癌予後モニタリング、並びに感染症診断及び生物脅威検出など、ポイントオブケア環境において資源が限られた現場でバイオマーカ測定を行う必要がある多くのシナリオが存在する。多くの場合、これらのバイオマーカは低濃度（例えば、＜１ｎｇ／ｍｌ）で検出する必要がある。しかし、最も一般的なＰＯＣ試験形式である現在の紙ベースラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩ）は、この要件に対して十分な感度がない。一例は、類鼻疽用のバイオマーカである莢膜多糖（ＣＰＳ）であり、これは、米国政府によってリストされているＴｉｅｒ  Ｉ生物脅威剤である。現在のＬＦＩは、診療所での検出限界（ＬＯＤ）が約１ｎｇ／ｍｌである。この感度では、依然として、感染した患者の有意な割合がアッセイによって診断されない。より高い感度の単純なＰＯＣアッセイが非常に必要である。
【０１３６】
[0191]以前に、ラテラルフローイムノアッセイ感度を改善する様々な方法が報告されている。それらの方法は、主に２つのグループに分けられる。１つは、センサの動力学、すなわち紙の孔径、幾何形状、試料体積の効果を利用する。孔径がより小さく、ＬＦＩでの流れがより遅いほど、感度が高くなることがよく知られている。さらに、Ｐａｒｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）は、ＬＦＩでのより良い感度のために試料を濃縮するための幾何形状を報告している；Ｐａｒｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、異なる体積の試料を紙に通すことによって、ＬＯＤを要求に応じたものにするためのシリンジ垂直フロー形式のＬＦＩの変形を報告している；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）は、紙膜のサイズを縮小し、体積を大きくすると、感度が高まることを報告している。しかし、試料流速の影響については言及されていない。垂直フロー形式でのバイオマーカの多重検出に関するＣｈｉｎｎａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）による別の論文では、高速の流体フローが、剪断力によりバックグラウンドを低減することが報告されており、最適な流速は約１．５ｍｌ／分（すなわち、０．３３ｍｍ／秒）であると報告されている。
【０１３７】
[0192]感度を改善するための別の様式は、新規の検出メカニズムによるものである。大抵のＬＦＩアッセイは、単純な比色検出のための標識として金ナノ粒子を使用する。デュアル金ナノ粒子、銀増強、又は化学発光検出用の結合酵素などの他の検出スキームは、感度を向上させることができるが、複雑性が増すという犠牲を払う。
【０１３８】
[0193]本出願では、ＬＦＩでのより高い感度のためのより遅い流れのよく知られている効果とは対照的に、本発明者らは、開示される垂直フローデバイス１でのより高い感度のための速いフロー２３の利益を実現する。イムノアッセイなどのリガンド−受容体結合バイオセンサでは、感度はセンサを通過する試料の量とセンサでの捕捉剤の効率によって制限される。ＰＯＣ試験は短時間で行うことが好ましいので、ＰＯＣ時間枠（例えば１０分）内により多くの試料を送達するためのより高い流速、及びより良い捕捉効率のためのより小さい紙膜孔径が、アッセイを改良する。本明細書で提供されるデバイス１及び方法はいずれも、以下のことを含み得る。
【０１３９】
[0194]１．フロー２３速度は、従来のアッセイ（約３．３ｍｍ／秒）の速度よりも高いが、剪断によって標的及び標識の捕捉を切り離す速度（特定の結合反応速度及び強度に依存し、約３３ｍｍ／秒よりも大きいことがある）よりも小さい。そのような剪断は、非特異的結合を除去してバックグラウンドを低減し、信号及び感度をさらに向上させるのに役立つ。したがって、本明細書で提供されるデバイス及び方法はいずれも、３３ｍｍ／秒未満であるが３．３ｍｍ／秒を超える、又は約３３ｍｍ／秒〜１０ｍｍ／秒の間、又は約３３ｍｍ／秒〜２０ｍｍ／秒の間、又はそれらの任意のサブ範囲にある流速又は流束に関係することがある；２．紙膜３の孔径は、より良い捕捉効率のために、従来のＬＦＩ以下である（＜１５μｍ）。
【０１４０】
[0195]一般に、開示される垂直フローデバイス１は、以下のものを含む：１．捕捉剤１９及び診断アッセイ用の対照試薬が装填された多孔質膜３；２．損壊を回避するために液体のフロー２３に対して膜３を機械的に支持することができる多孔質膜支持体２１。支持体は、流体が流れて通過できるようにする複数の細孔若しくは多孔質膜３又は組合せなどを有するグリッドを備えたＳｉウェハ又は鋼片でよい；３．紙膜３を押し下げ、液漏れを防止するためのガスケット２５；４．ガスケット２５／膜３／支持体２１のアセンブリを保持し、ガスケット２５を支持体２５での膜３に押し付けて、内側ガスケット２５領域内でのみ流体が膜３及び支持体２１を通って流れるホルダ２９；５．膜３／支持体２１にわたる圧力差を生成して、任意の所望のフロー２３流量での流体フロー２３を垂直に膜３に押し通すＰＯＣポンプ３１（例えば、手動作動することができ、又は動力式ポンプ３１に接続することができるシリンジ６）。ポンプ３１は、異なる用途に必要なフロー２３流量に応じて、手動で押すことによって置き換えることができる；６．膜３の上面５に及び／又は膜３の内側に、例えば細孔表面に沿って固定化された捕捉剤１９の１つ又は複数のスポット７９。マイクロディスペンシング技術を使用して、捕捉抗体剤１９のスポット７９のアレイを膜３に定量供給することができる。各スポットは、１つのタイプの標的を検出することができる。このマイクロアレイ設計は、異なるアッセイ間の相互汚染も最小限に抑える；７．膜３の捕捉スポット７９によって捕捉することができる標的バイオマーカを含むことも含まないこともある試料溶液；８．標的バイオマーカに特異的に結合し、検出可能な信号を生成することができる標識剤を含む検出溶液；９．一実施形態では、順次に膜３を通って流れる試料溶液及び検出溶液２３；別の実施形態では、混合され、次いで複合体として膜３を通って流れる試料及び検出溶液２３；１０．卓上スキャナによる金粒子１２ベースの比色検出などの、膜３の表面５の標識を検出する検出システム４９。
【０１４１】
[0196]より速いフロー２３と、より小さな孔径との両方が、紙膜３を通して試料を流すために作動圧力を増加させる。本明細書で提供されるデバイス１及び方法は、比較的高圧下（例えばＨＰＬＣで、約＜５００バール）で機能することができる。高圧の手動生成のために、小さなピストン面積を有するシリンジ６を使用することができる（例えば、ピストン直径＜５ｍｍ）。
【０１４２】
[0197]ホルダ２９が高圧に耐えることができるためには、ガスケット２５／膜３／支持体２１を収容するチャンバ３９のサイズを小型化することもまた良好である。
【０１４３】
[0198]試料体積が限られている場合、膜３の面積８１の縮小により、高フロー２３操作に必要とされる単位面積当たりの所望の試料体積に到達することができる。試料体積が限られている場合、流体の漏れを防ぐために膜３をガスケット２５で挟む２つの支持体２１により、試料を双方向フロー４７で前後に膜３のセンサに押し通して、有効な試料体積を増加することができる。
【０１４４】
[0199]支持体２１及びガスケット２５は、より単純なデバイス１及びその操作のために、ホルダ２９に一体化することができる。
【０１４５】
[0200]膜３の面積を減少するために、ワックスを印刷して膜３に溶かして、望ましくない膜３の領域を遮ることができる。
【０１４６】
[0201]米国保健福祉省によれば、約７０の物質（病原体及び毒素）が、曝露時にヒト及び動物の健康に深刻な脅威をもたらす可能性がある。他のＣＢＲＮの脅威も、保安及び事故に関する主要なリスクである。曝露は、農村地域、さらには戦場において、資源が限られた状況で発生することがよくある。したがって、これらの環境の下で独立して動作することができる、迅速でありポイントオブケア（ＰＯＣ）の、多重化された使いやすい診断デバイスを開発する必要があることは明らかである。
【０１４７】
[0202]紙は、非常に安価で広く入手可能な材料として、そのようなタスクを実施するためによく追究されてきた。一般的に見られるラテラルフロー形式は、その低いコスト及び低い複雑さにより、過去数十年にわたって迅速な診断の主流となっている。しかし、標的抗原１３の数が増加するにつれてアッセイの性能が低下する可能性があるので、ディップスティック設計で多重検出を実施することは困難である。
さらに、試料体積は、液体を輸送するために紙の毛細管力のみに依拠しているので制限される。最も重要なことに、バイオマーカが検出限界（ＬＯＤ）未満しか蓄積しない特定の感染症には感度が不十分である。これらの制限は、試験の精度を低下させ、したがってその臨床的重要性を低下させる可能性がよくある。
【０１４８】
[0203]本明細書で提供されるのは、異なる診断用途に容易に適合させることができる、新規の垂直フロー紙ベースイムノアッセイ（ＶＦＩ）デバイス１のプラットフォームである。図示されるように、アッセイ試薬を含む試験膜３は、アダプタ４３を使用して、シリンジ６のポンプ３１の針４１のチャンバ４５に挿入される。機械的グリッド支持体２１は、液体フロー２３に対して膜３を支持するために、膜３の下に配置される。液漏れを抑制及び防止するために、Ｏリング７７が膜３の上に配置される。試験試料はシリンジに貯蔵され、手動で押すことによって、又はシリンジ６のポンプ３１を用いて、膜３を通して垂直に移動される。デバイス１は、スクリーニング試験後に分解して、撮像及び他の後続の分析のために膜３を回収することができる。
【０１４９】
[0204]開示されるデバイス１及び方法は、比色検出以外の異なる検出方法と適合性がある。例えば、バイオマーカの電気化学的検出は、膜３の基質上の印刷された電極を用いて実施することができる。光学検出（ＳＥＲＳなど）や磁気検出などの他のスキームも実装することができる。
【０１５０】
[0205]垂直フロー診断デバイス１は、以下のうちのいずれか１つ又は複数を含むことがある：１．ニトロセルロース膜３、ＰＶＤＦ膜３、膜３としての濾紙などであり得る：２．孔径の選択に関して高い耐性がある（従来の範囲は０．０１μｍ〜２０μｍ）。より小さい孔径は、拡散範囲を大幅に縮小し、捕捉剤１９が関与する捕捉反応を促進し、感度を高める；３．１０μｍ〜１０００μｍ、しかし好ましくは１０〜３０μｍの厚さ９を有して、標的捕捉に十分な場所を確保し、またフロー２３の抵抗を最小限に抑える。
【０１５１】
[0206]膜支持体２１は：１．Ｓｉやステンレス鋼などにすることができる；２．膜３を支持するのに十分に大きな厚さを有する（＞１０μｍなど）；３．１μｍ〜１０００μｍの孔径を有する；５．膜３を横切る均一なフロー２３など、ガスケット２５領域内の所望のフロー２３流量プロファイルを与える分布を有するガスケット２５領域内の複数の細孔。
【０１５２】
[0207]ガスケット２５は：１．Ｏリングなどの弾性材料にすることができる；２．内側ガスケット２５領域を画定する構造を備えた微細加工材料にすることもできる。
【０１５３】
[0208]異なる用途シナリオを含む、３つの構成を以下に例示する。
【０１５４】
[0209]構成１：流体フロー２３は、特定の現実的な時間枠（例えば、ポイントオブケア用途に関しては１０分）中に標識信号が最大化されるように、所定の最適流量で制御することができる。手動で押して、流体を膜３に押し通す。シリンジ６のピストン面積は、利用可能な最大圧力が最適な流量２３に到達することを可能にするために減少される。臨床試料からの非特異的結合は、流体フロー２３によっても減らすことができる。Ｏリング７７の開口部は比較的大きく、大きい試料体積を用いた高多重検出に適している。
【０１５５】
[0210]構成２：内側ガスケット２５の面積は、単一の膜３支持体の孔径（例えば、約０．００００８ｍｍ２、０．１μｍ細孔の膜３に関しては直径約１０μｍ）と同様まで、構成１での膜３の面積よりも小さくなるように制御される（約９６ｍｍ２、直径約３．５ｍｍ）。非常に優れた感度、多重化に対する低い要件、小さい試料体積を必要とする用途に適している。
【０１５６】
[0211]構成３：膜３は、２つの膜支持体２１の間に挟まれている。ガスケット２５を支持体２１と統合するために、支持体２１にナイフエッジを製造することができる。このサンドイッチ構成は、双方向の流体フロー４７が、最適な流量で膜３を通るリサイクルを可能にできるようにする。限られた試料体積で超高感度を必要とするアプリケーションに使用することができる。
【０１５７】
[0212]実施例４：Ｔｉｅｒ  Ｉ生物脅威剤の多重検出のための垂直フロー紙ベースイムノアッセイ（ＶＦＩ）法の開発
[0213]７０を超える生物学的因子及び毒素が、ヒト及び動物の両方の健康に深刻な脅威をもたらすことが確認されている。これらの薬剤への曝露は、多くの場合、資源が限られている戦場や農村地域などの厳しい環境で発生する。したがって、多重化に適した、感度が高く、費用対効果が高く、使いやすいポイントオブケア診断ツールを開発することが不可欠である。本発明者らは、Ｔｉｅｒ  Ｉの生物脅威の多重検出を実施する垂直フロー紙ベースイムノアッセイ（ＶＦＩ）精密濾過デバイス１を開発し、特性評価した。デバイス１のプラットフォームは、１０分未満で直接可視化するための比色信号を生成する微生物抗原１３の捕捉に基づいている。
【０１５８】
[0214]類鼻疽菌（Ｔｉｅｒ  Ｉ剤）は、壊滅的な細菌感染症である類鼻疽の原因物質である。垂直フロー形式で類鼻疽菌莢膜多糖（ＣＰＳ）を検出するために、サンドイッチイムノアッセイを構築した。ＣＰＳ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ  ４Ｃ４）を、ニトロセルロース膜３（孔径＜１μｍ）に固定化し、捕捉抗体剤１９として働かせた。マイクロディスペンサを使用して、ｍＡｂ  ４Ｃ４をニトロセルロース膜３のスポット７９アレイ形式にスポットした。ｍＡｂ  ４Ｃ４と結合された金ナノ粒子１２（ＧＮＰ）は、ＣＰＳへの結合後に比色信号を生成する検出抗体１０として働いた。検出抗体１０を、ＣＰＳでスパイクされた緩衝液と事前に混合することによってＶＦＩを実行し、次いで、シリンジ６のポンプ３１を用いて試料を垂直に膜３に通した。洗浄及び乾燥ステップの後、膜３を標準的な卓上スキャナでスキャンし、自動撮像解析ソフトウェアを使用して分析した。
【０１５９】
[0215]開示されるデバイス１のＶＦＩシステムを特性評価するために、実験計画（ＤＯＥ）スクリーニング分析をＪＭＰ  Ｐｒｏ  １３で作成した。６つの連続する因子（フロー２３流量、アッセイ時間、ＧＮＰ１２の量、予混合時間、緩衝液ｐＨ、緩衝液イオン強度、及び１つのカテゴリ因子）と、膜３タイプとを含む７つのＶＦＩパラメータを研究した。
【０１６０】
[0216]結果及び結論：従来の紙ベースラテラルフローアッセイは、小さい試料体積、及び標的の捕捉には非効率的な比較的大きな膜孔径（＞１０μｍ）の必要性により、感度及び多重化機能が制限されることがある。開示されるＶＦＩデバイス１は、能動流体圧送を実施することによって、これらの問題に対する優れた解決策を提供する。
【０１６１】
[0217]ＤＯＥの結果によれば、フロー２３流量及びアッセイ時間は、平均信号強度に影響を与える２つの最も重要な因子であり、次いで膜３のタイプ、ｐＨ、及び予混合時間が続いた。フロー２３流量とアッセイ時間との間に２因子相互作用があった。これは、単位面積当たりの試料体積が、開示されるＶＦＩデバイス１の感度をさらに改善するための鍵となり得ることを示す。信号の変動に関しては、ＧＮＰ１２の量及び膜３のタイプが支配的な要因であり、次いでフロー２３流量が続いた。スクリーニング設計により、ＶＦＩデバイス１のさらなる最適化のために調査される重要な因子を特定した。
【０１６２】
[0218]これらの最適な実験条件下で、ＣＰＳアッセイに関する現在のＶＦＩの検出限界（ＬＯＤ）は、４ｐｇ／ｍＬ（従来のラテラルフローデバイスの１０分の１）である。また、本発明者らは、ＣＰＳ及びＰＧＡ（炭疽の原因物質である炭疽菌のためのバイオマーカ）の多重検出についても実証する。開示されるデバイス１のＶＦＩシステムは、様々な生物脅威の検出について特性評価されることがあり、多重化能力、及び小型化による性能の改善について検証され得る。
【０１６３】
[0219]実施例５：設計ガイドライン及びシステム仕様
[0220]パラメータ１−膜３の材料と孔径：設計規則：高いタンパク質結合能を有する膜３の材料が好ましい。膜３の孔径が小さいほど、検出感度が高くなる。フロー２３の経路が非常に小さいため（約１３０μｍ）、開示されるデバイス１のＶＦＩシステムでナノ細孔膜３を使用することができる。推奨値：０．１μｍの孔径を有するニトロセルロース膜３は、類鼻疽、炭疽菌、及びペストに関するアッセイで最高の感度を示す。
【０１６４】
[0221]パラメータ２−捕捉抗体剤１９：設計規則：膜３の捕捉抗体剤１９の密度が高いほど、標的抗原１３を捕捉するためにより多くの結合部位が利用可能になる。捕捉抗体剤１９の濃度は、膜３の材料の装填容量に基づいて飽和状態に押し上げるべきである。推奨値：１つの液滴（１ナノリットルの体積）の捕捉抗体剤１９溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）が、検出スポット７９として膜３に堆積される。
【０１６５】
[0222]パラメータ３−ｐＨ：設計規則：緩衝液中の試験範囲（ｐＨ６．４〜８．４）では、ｐＨが重要になることがある。推奨値：アッセイに依存する。
【０１６６】
[0223]パラメータ４−イオン強度：設計規則：本発明者らが試験した範囲（５０〜４５０ｍＭ）では、１５０ｍＭ未満の値は、高いバックグラウンドを与えた；ＶＦＩシステムでの１５０〜４５０ｍＭの値では、イオン強度の有意な影響は観察されなかった。推奨値：１５０〜４５０ｍＭ。
【０１６７】
[0224]パラメータ５−マトリックスタイプ
[0225]設計規則：開示されるＶＦＩデバイス１では、３つのタイプの最も一般的に使用されるヒト体液、すなわち血清、血漿、尿を使用することができる。血清及び血漿は、狭いｐＨ及びイオン強度の範囲を有し、これら２つの因子からの変動は通常は重要ではない。ｐＨ及びイオン強度の大きなばらつき（最大１０倍の差）が知られているヒト尿試料。これは、開示されるデバイス１のＶＦＩシステムでより詳細な特性評価を必要とする。ＶＦＩ膜３を閉塞することがある微粒子や細胞成分を除去するには、０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜による前濾過が好ましい。推奨値：血清、血漿、又は尿。
【０１６８】
[0226]パラメータ６−ＶＦＩデバイス１の反応スキーム：設計規則：予混合スキーム：試料がＶＦＩ膜３を通って流される前に、試料を、ＧＮＰ１２で標識された検出抗体１０と混合する；逐次スキーム：溶液で標識された試料及び検出抗体１０を、逐次ステップで膜３を通して流す。推奨値：本発明者らの結果は、予混合が好ましいことを示すが、アッセイに依存することがある。
【０１６９】
[0227]パラメータ７−ＡｕＮＰ１２で標識された検出抗体１０：設計規則：ＣＰＳアッセイなど、検出と捕捉の両方に同じ抗体を使用するアッセイの場合、ＡｕＮＰ１２で標識された検出抗体１２の濃度を上昇させても、検出感度は大幅には向上しない。ＬｃｒＶアッセイなど、検出と捕捉に関して異なる抗体を使用するアッセイの場合、ＡｕＮＰ１２で標識された検出抗体１０の濃度を上昇させると、検出感度が大幅に向上する可能性がある。現在、ＬｃｒＶアッセイにおいて、検出スポット７９とバックグラウンドとの最良のコントラストを与えるＡｕＮＰ１２標識抗体の最適濃度を見つけるために、実験がさらに行われている。ＣＣＤベースのカメラ検出で使用されるとき、分枝ＮＰはより高い散乱係数及び調節可能な波長を有しており反射率を高める可能性があるので、金ナノスターと標準回転楕円体ＮＰ１２との比較も評価中である。推奨値：アッセイに依存する。
【０１７０】
[0228]パラメータ８−単位流量：設計規則：単位流量（ｍｍ／秒）は、試料体積流量（ｍＬ／分又はｃｍ３／分）をＶＦＩ膜３の表面積８１（ｍｍ２）で割った値として定義される。単位流量が高いほど、より多くの試料を一定時間に感知領域８１に送達することができ、より良い検出感度を実現することができる。単位流量は、ポンプ３１によって制限される。フロー２３流量が高いほど、より高い圧力が必要になり、これは、ポンプ３１を停止させる、又はＶＦＩハウジング（例えばホルダ２９）を破損する可能性がある。推奨値：ポンプ３１に基づいて、本発明者らは、現在、Ｎｅｗ  ＥｒａシリンジポンプＮＥ１０００を使用しており、フロー２３流量は容易に１．５ｍｍ／秒にすることができる。
【０１７１】
[0229]パラメータ９−ＶＦＩ試験時間：設計規則：予混合時間：これは、試料が、ＡｕＮＰ１２溶液で標識された抗体と混合される時間である。予混合時間が長いほど、抗原１３をＡｕＮＰ１２でより良く標識することができる。ＶＦＩ実行時間：試料（標識ＡｕＮＰ１２と混合された）がＶＦＩ膜３を押し通される時間である。一定のフロー２３流量の場合、実行時間が長いほど、検出感度がより良くなる。推奨値：現在の設定は、１０分の予混合時間及び１０分の実行時間である。１０分の実行時間は、ラテラルフロー試験に必要な時間と一致するように選択したが、ユーザのニーズに基づいて変更することができる。
【０１７２】
[0230]パラメータ１０−膜支持体２１のグリッド：設計規則：膜支持体２１の剛性は、フロースルーステップ中の膜３の変形を決定し、この変形は、膜３全体にわたる信号均一性に影響を与えることがある。支持体２１がより剛性になり得るほど、膜３を横切る信号はあまり不均一でなくなる。推奨値：開示されるデバイス１に関する現在のＶＦＩセットアップでは、ディープエッチングされたＳｉ支持体２１が使用される。
【０１７３】
[0231]パラメータ１１−膜３のサイズ及び多重度：設計規則：ＶＦＩ膜３の表面積８１はスポット７９の総数を決定し、したがって、試験の多重度を、開示されるＶＦＩデバイス１と統合することができる。スポット７９サイズは多重度の制限因子であり、これはマイクロディスペンサの液滴サイズに依存する。本発明者らの現在のマイクロソレノイド値ディスペンサでは、最小の液滴体積は１ナノリットルである。しかし、より高度なピエゾディスペンサを用いると、液滴サイズをピコリットルレベルに縮小することができ、したがってスポット７９サイズをはるかに小さくすることができる。推奨値：本発明者らの現在のディスペンサでは、７スポット／ｍｍ２を有することができたが、他のディスペンサは１１スポット／ｍｍ２を示した。
【０１７４】
[0232]パラメータ１２−試料体積：設計規則：試料体積は、単位流量及び膜３の表面積８１によって決定される。ＶＦＩは、はるかに大きい範囲の試料体積に対処する：現在、標準的なＶＦＩは、１ｍＬ〜５０ｍＬ以上の試料を処理し、ミニＶＦＩは５００μＬ〜５ｍＬの試料を処理する。余剰の希釈ステップを追加すると、感度を大きく失うことなく、下限をさらに１００μＬまで拡張することができる。そのような広範囲の試料体積は、開示されるＶＦＩデバイス１に、様々なタイプの試料を処理する際の多くの融通性を与える。推奨値：標準的なＶＦＩデバイス１は、１ｍＬ〜５０ｍＬ以上の試料を処理し、ミニＶＦＩデバイス１は、１００μＬ〜５ｍＬの試料を処理する。
【０１７５】
[0233]パラメータ１３−デバイス１の統合及びソフトウェア：設計規則：現在、開示されるデバイス１に関する膜３及び支持体２１は、ほとんどの標準的なシリンジ６に適合するようにルアーロックデバイスとして設計されている。核酸構成の場合、開示されるデバイス１のシステムはまた、ＶＦＩデバイス１と結合された試料調製モジュールを統合する。スマートフォンデバイス５１のカメラ５３で撮像するためのデータ解析ソフトウェア。推奨値：プラスチックシリンジ及びルアーロックコネクタ。
【０１７６】
[0234]実施例６：受動毛細管駆動式システム５５による垂直フロー２３
[0235]適切な垂直フロー２３が膜３を横切って発生することを確実にするために、他のシステムが利用可能である。例えば、受動／毛細管ポンプ式の垂直フローデバイス１は、大きな試料体積／面積と適合性がある。能動ポンプ式デバイス１（例えば、電気などの外部エネルギー源によって動力を供給されるポンプ３１）と比較して同様の試料体積／面積が実現される。能動ポンプ３１を受動フロー２３に置き換えることにより、プロセスがより単純になる。
【０１７７】
[0236]本実施例のデバイス１は、シングルプレックス又はマルチプレックスバイオマーカ検出用の垂直フローデバイス１である。このデバイス１と前述の垂直フローデバイス１との違いは、このデバイス１の試薬／流体が、能動的機械的ポンプ３１とは対照的に、吸収性材料５７の受動毛細管力によって圧送されることである。
【０１７８】
[0237]図３５は、受動毛細管駆動式の垂直フローシステム５５の例示的実施形態を示す。関連する態様は、以下のことを含む：（１）他の垂直フローデバイス１の検出膜３と同様の検出膜３があり、捕捉剤１９を膜３に固定化することができる；（２）検出領域８１は、面積「Ａ」を有する。この領域８１は、ガスケット２５メカニズムによって、又はワックス印刷など、膜３に液体不浸透性材料（液体遮断材料５８）の層を印刷することによって、又はマスキングテープによって画定することができる。（３）試料を保持するために検出膜３の上には「試料チューブ／ホルダ」５９がある。試料は、検出膜３に入る前に事前濾過される。プレフィルタ５６は、外部にあっても、試料チューブ／ホルダ５９と一緒でもよい。（４）時間の経過と共に検出膜３を通して試料を引っ張る毛細管ポンプとして作用する吸収性材料５７があり：（ａ）検出領域８１を通過する試料体積は、検出膜３の約２００μＬ／ｍｍ２、すなわち総体積２００ｍｍ×Ａよりも高く；（ｂ）毛細管作用がポイントオブケア時間枠内で、例えば１０〜３０分で完了され、これは、流体フロー２３速度が約０．２ｍｍ／秒よりも高いことを意味し；（ｃ）全ての試料体積を収容する吸収性材料５７が、「Ａ」を中心として比較的均一に扇形に広がる。
【０１７９】
[0238]実用の際には、通常、「Ａ」は、１００〜０．０１ｍｍ２の面積を有し、「Ａ」は円形を有することができる。「Ａ」は線形状を有していてもよいが、その場合も、吸収性材料５７は、「Ａ」の外形を超えて均一に扇形に広がる。
【０１８０】
[0239]実施例７：放射線傷害の診断をサポートするための好適な線量測定のための費用対効果の高い方法
[0240]テロリストの非人道的な爆弾の爆発や原子力発電所の事故など大量の死傷者が出る原子力災害は、多くの命を治療して救うために効果的且つ迅速な医療応答を必要とする。第一対応者は、即時の医療介入が必要な人と遅延治療の候補者とを区別するために、吸収された放射線量を正確に評価しなければならない。
【０１８１】
[0241]米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された生物学的線量測定法はまだないが、現在、二動原体染色体アッセイ（ＤＣＡ）が「ゴールデンスタンダード」とみなされている。このアッセイは電離放射線に非常に特異的であり、二動原体染色体のバックグラウンドレベルが低いので高感度である。しかし、全ての細胞遺伝学ベースのアッセイと同様に、ＤＣＡは労働集約的であり、線量を推定するのに長い時間がかかる。これは、緊急シナリオでの放射線量評価の重要な制限である。
【０１８２】
[0242]特に末梢血リンパ球における遺伝子発現プロファイルの開発は、生物学的放射線量測定への代替手法として提案されている。ＩＲを含む環境ストレスへのヒト細胞の曝露は、複数の信号伝達経路を活性化することが知られており、遺伝子発現変化の複雑なパターンを急速に生じる。ＤＣＡ又は小核アッセイとは対照的に、遺伝子発現は細胞分裂を必要とせず、高度な分子アッセイで迅速に分析することができる（Ｌａｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８）。しかし、そのような多数の試料を処理して分析し、数時間で結果を返すために、技術開発には、ハイスループットプラットフォームに統合されたポイントオブケアデバイスを実現するための自動化及び小型化が必要である。
【０１８３】
[0243]ナノテクノロジーの進歩に伴い、紙材料は生物医学的用途に利用されており、有望な性能及び利点を示している。報告されている紙デバイスの大部分は、流体の流れが紙の表面に平行であるラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩ）形式で設計されている。ＬＦＩの主な利点には、低コスト、迅速な結果、柔軟性、使いやすさが含まれる。しかし、適切な流量を実現するために、紙材料の孔径は数マイクロメートル以上に制限され、これは、生体分子の捕捉、したがってアッセイ感度を妨げる。さらに、試料体積の制約及び多重化の難しさが、ＬＦＩ開発が直面する他のハードルである。ＬＦＩプラットフォームを改善するための１つの手法は、フロースルーデバイスの開発である。この代替形式は、膜ベースのイムノアッセイであるという点でＬＦＩと同様であるが、流体は、膜の表面に平行ではなく垂直に適用される（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８）。したがって、垂直フローイムノアッセイは、より良い感度を実現し、より速く、フック効果を回避する。
【０１８４】
[0244]本明細書では、核酸検出のための費用対効果が高く、迅速なフロースルー紙ベースデバイス１であり、既存のＤＣＡアッセイよりも高い特異性及び感度を有する、正確で、信頼性があり、小型化され、自動化された高スループットの生物学的線量測定プラットフォームが実現される。
【０１８５】
[0245]技術的目的：特に血液などの体液中のヒト循環細胞からの遺伝子発現プロファイルの評価は、生物学的放射線量測定のための標準的であるが労力及び費用のかかる細胞遺伝学的アッセイに対する有望な手法である。本明細書で提供されるのは、照射後にＰＢＭＣからの放射線量測定遺伝子の発現レベルを評価するための垂直フロー紙ベースデバイス１プラットフォーム（ＶＦＰ）（図３６）である。このようにして、デバイス及び方法は、吸収された照射線量を正確に測定することができる。
【０１８６】
[0246]ＶＦＰ手法を使用した４つの異なる遺伝子（３つの放射線応答遺伝子及び１つのハウスキーピング遺伝子）の検出。このデバイスは、同じ膜３で３つの放射線応答遺伝子を検出し、正規化のために同様に同じ膜３で検出されたハウスキーピング遺伝子を使用することによって（単一の膜３での合計４つの遺伝子）、非照射試料と照射試料との間で発現レベルを測定及び計算する。結果は、細胞株からの２つの遺伝子をＶＦＰ膜３で同時に増幅及び検出することができることを示す。ここで、本発明者らは、全血を生物学的試料として使用して、ヒト体液に対するアッセイ実現可能性を示す。血液試料を照射され、ＲＮＡを抽出して定量化する。ＰＣＲプライマーを遺伝子のパネル用に設計し、標準的なＰＣＲを使用して標的を増幅し、アガロースゲルを使用してアンプリコンを評価する。最も高い信号を有する３つの放射線応答遺伝子及びハウスキーピング遺伝子を選択して、ＶＦＰ膜３に通して検出する。照射後の遺伝子発現変化を検出及び定量化する開示されるＶＦＰデバイス１の能力を評価するために、ＶＦＰを使用する遺伝子発現を分析し、リアルタイムｑＰＣＲ手法と比較する。
【０１８７】
[0247]関連する側面は以下のものを含む：全血試料採取及び試料処理（細胞培養、照射、ＲＮＡ抽出、ＲＮＡ定量化など）；放射線応答遺伝子及びハウスキーピング遺伝子のパネル用のＰＣＲプライマーの開発（プライマー設計、ＰＣＲ実験の最適化、製品評価）；ＶＦＰを使用した検出と、リアルタイムｑＰＣＲとの比較（特異性、多重化、信号感度などと共に、範囲、精度、及びスループットの確認）。
【０１８８】
[0248]他の技術的側面には、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を使用する等温増幅が含まれる。本発明者らは、放射線傷害の診断のためのＶＦＰを同時に開発しながら、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を使用する等温増幅法を開発する。この手法は、標準的な増幅を回避することによって、より迅速な試料調製を容易にし、したがって、フェーズＩＩプロトタイプへの成熟のために、開示されるＶＦＰデバイス１と組み合わされる完全に自動化された試料調製プラットフォームへの統合がより容易になる。技術目標１で述べたのと同じプライマーを使用して、全血を使用してＲＰＡを開発する。アンプリコンの品質は、ＶＦＰで試験する前に、アガロースゲル又はＥＬＩＳＡを使用して評価する。
【０１８９】
[0249]これらの側面は以下のものを含む：全血試料の採取／処理（細胞培養、照射、ＲＮＡ抽出、ＲＮＡ定量化など）；ＲＰＡ開発（実験的最適化、プライマー設計、製品評価）；開示されるＶＦＰデバイス１を使用した検出（特異性、多重化、信号感度と共に範囲、精度、スループットの確認）；ＶＦＰに関する等温増幅の最適化（時間、温度など）。
【０１９０】
[0250]容易に拡張可能であるように照射の吸収線量を正確に測定するために、考慮すべき側面は以下のものを含む：ａ）指定された標的遺伝子パネル用のＰＣＲプライマー（プライマー設計）及びｂ）ＰＣＲ製品品質評価法；最良の信号対雑音比を実現するための検出器の選択；結果を報告するための定量化戦略；試料タイプ、採取、及び保管；試料処理。最良の信号対雑音比の観点から結合親和性を実証するためにシステムを評価する。
【０１９１】
[0251]方法：
[0252]試料の採取及び処理−異なる個人及び混合性からプールされた全血試料を、認定された会社（ＢｉｏＣｈｅｍｅｄ）に注文する。抗凝固剤として使用されることがあるキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）がマグネシウムに干渉し、それによりＰＣＲの効率を低下させる可能性があるため、ヘパリン又はクエン酸ナトリウムを用いて採取した血液が好ましい。
【０１９２】
[0253]受領後、血液を、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ（約１ｍＬ）にアリコートし、Ｘ−ＲＡＤ  ３２０（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｘ−Ｒａｙ  Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈ  Ｂｒａｎｆｏｒｄ（米国コネチカット州））を使用して０、２、４、及び６ＧｙのＸ線にさらす。２ｍｍＡｌフィルタを用いて３２０ｋＶｐ及び１２．５ｍＡで照射を行う。線源と軸との間の距離は４２ｃｍであり、線量率は３Ｇｙ／分である。ＵＮＩＤＯＳ  Ｅ  ＰＴＷ  Ｔ１００１０電位計及びＴＮ３００１３電離箱を使用してビームを較正し、測定は空気中で１５ｃｍ×１５ｃｍのフィールドサイズに関して行う。照射後、血液試料を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：１に希釈し、６ウェルプレートで３７℃で２４時間、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータでインキュベートすることができる。
【０１９３】
[0254]２４時間後、製造業者の推奨に従ってＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＲＮＡ血液ミニハンドブック（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出する。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＥｐｏｃｈ（商標）マイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用してＲＮＡの品質を試験及び定量化し、その後、使用するまで−８０℃で保管する。
【０１９４】
[0255]標準的な増幅−成功率を最大化するために、いくつかの放射線応答遺伝子及びハウスキーピング遺伝子からのＰＣＲプライマーを設計する。放射線応答遺伝子として、ＢＡＸ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＤＢ２、ＦＤＸＲ、ＧＡＤＤ４５Ａ、及びＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄを選択する。これらの遺伝子は、ＰＢＭＣでの放射線量測定バイオマーカ候補として多くの研究によって特定されており、最近、いくつかのメタアナリシスで検討されている（Ｌａｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１４）。ハウスキーピング遺伝子として、ＣＤＲ２、ＭＲＰＳ５、及びＭＲＰＳ１８Ａ遺伝子を選択する。これらの遺伝子は公開されており、現在、検証及び承認された診断の放射線血液検査において正規化に使用されている（ＤｘＴｅｒｉｔｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。ＰＲＩＭＥＲ−Ｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ）を使用することによってＰＣＲプライマーを設計する。一部の遺伝子が複数の転写変異体を有するかどうかにかかわらず、これらの変異体全てを標的とするプライマー対を優先的に選択する。特異性を確保するために、他の遺伝子と架橋するプライマーは除外する。４００塩基対（ｂｐ）を超えるサイズを有するアンプリコンは、アガロースゲルによって検出可能であるように選択する。ＶＦＰを使用するイムノアッセイによって検出されるようにするために、各プライマー対に関して、フォワードプライマーを、その５’末端で、ＦＩＴＣ群を追加することによって修飾し、リバースプライマーを、その５’末端で、各遺伝子毎に異なる化学基を追加することによって修飾する（Ｃｙ３、ＤＩＧ、ＤＮＰなど）。
【０１９５】
[0256]まず、ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡ  ＥｃｏＤｒｙ（商標）Ｐｒｅｍｉｘ（Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ）キット（タカラ）を使用することによって、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。このキットは、効率的であり正確なファーストストランドｃＤＮＡ合成を可能にする便利なドライマスタミックスである。したがって、マスタミックスにＲＮＡと共にＰＣＲグレードの水を加えることによって、再構成が簡単になる。したがって、このシステムは、試料調製のための自動化されたポイントオブケアプラットフォームへの統合可能性をもたらす。次に、Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＰＣＲ  ＥｃｏＤｒｙ（商標）Ｐｒｅｍｉｘを使用して、ＰＣＲによる標準的な増幅を行う。ＲＴ−ＰＣＲキットと同様に、このキットは、ＰＣＲグレードの水、ｃＤＮＡ、及び設計されたプライマーによって再構成された凍結乾燥マスタミックスを含む。ＶＦＰ分析の前に、増幅効率及びアンプリコンサイズを、臭化エチジウムを含む従来の２％アガロースゲルによって評価する。ＶＦＰの定量効率を評価するために、アンプリコンもリアルタイムｑＰＣＲによって増幅する。５’末端に修飾がない同じプライマーを使用して、ｑＰＣＲを行う。ｑＰＣＲは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で、製造業者の推奨に従ってＲＴ２  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＯＸ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行う。ΔΔＣＴ法によって相対倍率変化を計算する。最良の個人又はパネルのハウスキーピング遺伝子を定義するために、ＣＤＲ２及び／又はＭＲＰＳ５及び／又はＭＲＰＳ１８Ａ遺伝子発現レベルにデータを正規化する。
【０１９６】
[0257]線形回帰に基づいて１つの分析を行う。各遺伝子について、直線当てはめ（倍率変化対放射線量）に関するＲ２値を計算し、Ｒ２＞０．９の遺伝子（又は最高のＲ２値を有する３つの遺伝子）を、線形に挙動するものとして選択する。マルチプレックスＶＦＰ分析に関しては、アガロースゲルに対して最高の信号を示す３つの放射線応答遺伝子及びハウスキーピング遺伝子と、最高の線形性を有する放射線応答遺伝子を選択する。
【０１９７】
[0258]遺伝子発現レベルをハウスキーピング遺伝子で正規化し、倍率変化を計算して、ＶＦＰとｑＰＣＲで比較する。マルチプレックスＶＦＰ分析に関しては、アガロースゲルに対して最高の信号を示す３つの放射線応答遺伝子及びハウスキーピング遺伝子と、ｑＰＣＲによって検出された非照射試料と照射試料との最高の倍率変化とを選択する。
【０１９８】
[0259]ＶＦＰデバイス１の構成及びデータ解析−開示されるＶＦＰデバイス１は、ステンレス鋼フィルタホルダ２９（Ｓｗｉｎｎｙ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｏｌｄｅｒ  １３ｍｍ  ＸＸ３００１２００，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州））にカプセル化された直径１３ｍｍ又は３ｍｍのニトロセルロース膜３を備える。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）ガスケット２５及びＯリング７７を、それぞれ紙膜３の下及び上に配置して、液体フロー２３の経路を封止する。ガスケット２５及びＯリング７７は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＳｗｉｎｎｙフィルタホルダ７７と共にパッケージとして購入される。シリンジ６のポンプ３１（ＮＥ−１０００自動シングルシリンジポンプ、Ｎｅｗ  Ｅｒａ  Ｐｕｍｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（米国ニューヨーク州））を使用して、試料及び試薬を、制御されたフロー２３の流量で垂直に紙膜３に押し通す。本発明者らは、市販のステンレス鋼支持体を使用する代わりに、ディープエッチング法を使用してシリコンを用いて支持体２１を製造する。支持体２１のシリコングリッドは、フロースループロセス中にフロー２３に対して膜３を機械的に支持する。
【０１９９】
[0260]ＶＦＰデバイス１は、小さい孔径の範囲でのニトロセルロース膜３の高いタンパク質結合能力及び利用可能性により、ニトロセルロース膜３を使用して構築することができる。４つのニトロセルロース膜３、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｒｏｔｒａｎ  ０．１μｍ  ＮＣ、０．２μｍ  ＮＣ、０．４５μｍ  ＮＣ、及びＷｈａｔｍａｎ  ＡＥ９８（孔径５μｍ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ペンシルバニア州）を試験及び比較することができる。４種類の膜３は全て、異なる孔径を有する１００％純粋なニトロセルロースからなる。ＣＯ２レーザ（ＶｅｒｓａＬａｓｅｒ  ２．３０、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国アリゾナ州）を使用して、膜３を所定の形状に切断する。スポット７９の捕捉抗体剤１９マイクロアレイは、マイクロソレノイド非接触ロボットディスペンサ（ＢｉｏＪｅｔ  Ｅｌｉｔｅ、Ｂｉｏｄｏｔ（米国カリフォルニア州）を含むＡＤ１５２０マイクロディスペンサ）を使用して、１ナノリットルの液滴体積で紙ディスクに定量供給し、これが、直径２２０μｍの円形スポット７９を作成する。
【０２００】
[0261]まず、（各遺伝子について異なる化合物で特異的に標識されたアンプリコンの一方の末端に対する）特異的捕捉剤１９抗体を紙膜３に固定化する。ＦＩＴＣ修飾５’末端、したがってＦＩＴＣ標識金ナノ粒子１２（ＦＩＴＣ−ＧＮＰ）も含む全てのアンプリコンを、全ての標的に関する固有の検出剤として使用する。２つの実験手順、すなわち予混合及び逐次を試験して比較することができる。ＰＣＲ産物を、ＦＩＴＣ−ＧＮＰ１２を含む緩衝液溶液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍ  ＰＢ緩衝液、ｐＨ＝７．２）に１０分間スパイクする。その間に、膜３を阻害緩衝液（２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭホウ酸塩緩衝液、ｐＨ＝８）で処理する。試料混合物を膜３に押し通して、膜３の捕捉剤１９抗体によるＰＣＲ産物−ＦＩＴＣ−ＧＮＰ１２複合体の捕捉を可能にする。試料を処理した後、１．５ｍＬのブランクアッセイ緩衝液を膜３に流すことによって膜３を洗浄して、非特異的又は緩く結合したアンプリコン及び過剰なＦＩＴＣ−ＧＮＰ１２を除去する。ＶＦＰデバイス１を解体し、乾燥ステップとして５分間、膜３を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ定性濾紙、グレード１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に置く。その後、ＶＦＰ膜３を、消費者グレードの卓上スキャナ（ＣａｎｏｎＳｃａｎ  ９０００  Ｆ  ＩＩ）及びＳｃａｎ  ＩＪ  Ｕｔｉｌｉｔｙ（ＣａｎｏｎＳｃａｎ用のデフォルトソフトウェア）を用いてスキャンし、４８ビットＲＧＢ環境及び２４００ｄｐｉの解像度を非圧縮ＴＩＦＦファイル形式にエクスポートする。次いで、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ（米国マサチューセッツ州））の組み込み関数ｒｇｂ２ｇｒａｙを使用して、４８ビットＲＧＢ画像を１６ビットのグレースケール画像に変換する。得られた画像をＩｍａｇｅＪにインポートし、マイクロアレイグリッドを使用してスポット７９を分析して、ローカルバックグラウンドを差し引かれたスポット７９からの平均グレースケール値を抽出する。検出限界（ＬＯＤ）は、バックグラウンド信号よりも３標準偏差（ＳＤ）を超えて大きい信号を生成した濃度として定義する。データ処理及び分析を行う。
【０２０１】
[0262]４つの捕捉剤１９抗体を印刷された膜３を通して個々のアンプリコンを流すことによって、ＶＦＰ膜３の特異性を評価する。実際、まず、４つの特異的捕捉剤１９抗体で膜３をコーティングする。次に、アンプリコンを１つだけ含む試料を膜３に流す。この実験を、各アンプリコン毎に４回繰り返す。各捕捉剤１９抗体について信号を検出する。信号がバックグラウンドの少なくとも２倍高い場合、標的抗体に関する信号は有意であり特異的であるとみなされる（ＰＢＳを印刷されたスポット７９によって生成された信号として決定される）。放射線応答遺伝子の発現レベルを、選択したハウスキーピング遺伝子で正規化する。ｑＰＣＲデータ処理と同様に、ＶＦＰとｑＰＣＲとの結果を比較し、生物学的線量測定遺伝子発現アッセイとしてＶＦＰパワーを評価するために、結果として生じる倍率変化を放射線量の関数として直線当てはめ曲線にプロットする。
【０２０２】
[0263]等温核酸増幅−等温核酸増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）に基づくことができ、これは、高速で可搬性のある核酸検出アッセイの開発のための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に対する非常に多用途の代替物である。前述したのと同じ全血試料からＲＰＡを開発する。前述したのと同じプロトコルに従ってＲＮＡを抽出する。ＲＰＡ増幅は、製造業者の推奨に従ってＴｗｉｓｔＡｍｐキット（ＴｗｉｓｔＤＸ）を使用することによって完全に行うことができる。このキットはＤＮＡを増幅するために開発されているが、本発明者らは、ＲＮＡを増幅するために、反応混合物に逆転写酵素（ＡＭＶ逆転写酵素、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４２℃で効率的）を追加する。標準的なＰＣＲ用に設計されたものと同じＰＣＲプライマーを反応に使用する。アガロースゲルによってＲＰＡ産物を評価し、最終的にＶＦＰで検出することができる。
【０２０３】
[0264]まず、４２℃で３０分、反応を行う。効率的である場合には、様々なタイミングポイントが評価され、可能であれば最大１０分まで短縮される。ＶＦＰは非常に高感度であり、本発明者らは、短時間の増幅でも信号を検出するのに十分であり得ると予想する。
【０２０４】
[0265]しかし、製造業者は、ＲＰＡがＰＣＲプライマーと共に機能することができると主張しているが、ＲＰＡは、より短い配列を増幅するより長いプライマーを必要とすることがある。アンプリコンを検出することができない場合は、ＲＰＡ専用に新たなプライマーを設計する。そのような手法の場合、アガロースゲル技法はＲＰＡ産物（ＰＣＲ産物よりも短い）の検出には理想的ではないことがあり、そこで、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してＲＰＡ効率を評価することができる。
【０２０５】
[0266]本発明者らは、同じＶＦＰ膜３において２つの異なる遺伝子（ＣＤＫＮ１Ａ及びＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ）を高い特異性で検出することができ、複数の標的のためのマルチプレックス手法を使用する可能性を示唆する。ＶＦＰ膜３での比色信号を定量化することによって、本発明者らは、非照射試料と照射試料との遺伝子発現レベルの相違を検出する能力も示す。
【０２０６】
[0267]また、本発明者らは、類鼻疽菌病原体の表面莢膜多糖（ＣＰＳ）も検出する。本発明者らは、ＶＦＰのパラメータ及び重要な因子を最適化する。したがって、本発明者らは、フロー２３の速度を高め（最大１．０６ｍｍ／秒）、膜３の孔径を小さくする（０．１μｍまで）と、感度を少なくとも５倍に高めることができることを示す。緩衝溶液中のスパイクされたＣＰＳに関するＶＦＰの検出限界は０．０２ｎｇ／ｍＬに決定され、これは、開示されるＶＦＰデバイス１が、様々な臨床条件及び資源が限られた条件（例えば農村又は戦場の環境）における分子の免疫検出用のポイントオブケアツールとして大きな可能性を示すことを示唆する。
【０２０７】
[0268]本実施例は、公衆衛生上の緊急事態の場合に放射線被曝、線量、及び傷害を定義することができる低密度遺伝子の発現レベルを迅速に測定するのに適した生物学的線量測定デバイス１を実現する。
【０２０８】
[0269]デバイス及び方法は、複数の部位及び異なる治療モダリティからの癌患者の大きな集団を用いて、機関の規制を満たすことを含めて検証することができる。
【０２０９】
[0270]実施例８：垂直フロー紙ベース健康監視プラットフォームの人間中心の設計増強
[0271]この例は、遺伝子発現に基づく健康監視のための統合された試料調製モジュールを含む、宇宙ミッションのための微小重力環境で動作するＶＦＰプラットフォームの人間中心の設計を提示する。このプラットフォームは、宇宙飛行時の安全な動作と、エンドユーザ（宇宙飛行士）の固有の人口統計への使いやすさを保証するように設計される。これは、開示される垂直フロー紙ベースプラットフォーム（ＶＦＰ）デバイス１に関する人間中心の設計を開発するという現場のニーズに対応し、操作性及び使いやすさを向上させ、効率及び安全性を高め、エラーを減らし、宇宙での健康状態監視のための学習曲線を減らす。
【０２１０】
[0272]開示されるＶＦＰデバイス１は、（例えば、図２〜図２Ｃを参照して図示して上述したように）小さい又は大きい体積の体液中の数十又は数百のバイオマーカを短期間（約１０分）で検出することが可能な小型の「シリンジ状の」カートリッジを使用するモバイルポイントオブケア（ＰＯＣ）機器である。デバイス１のプラットフォームは、肉眼で直接検出する又はリーダとしてのスマートフォン５１の標準的なカメラ５３によって検出することができるナノ粒子１２標識からの比色信号を伴う特異的抗体対による抗原１３の捕捉に基づく。開示されるＶＦＰデバイス１のプラットフォームは、抗原１３バイオマーカ検出のための標準的なラテラルフローアッセイと比較して、約２５倍改善された感度を示した。ＴＲＩＳＨ  ＶＦＰプロジェクトは、宇宙飛行中の宇宙飛行士の健康状態を監視するための遺伝子発現バイオマーカ（例えば生物学的線量測定や感染）を検出することによって、開示されるデバイス１のプラットフォームの機能を拡張している。
【０２１１】
[0273]開示されるデバイス１の現在のＶＦＰプラットフォームは、地球上の抗原１３バイオマーカのＰＯＣ検出のために設計されているが、宇宙ミッションには最適化されていなかった。遺伝子発現バイオマーカ検出用のデバイス１のプラットフォームの拡張には、試料調製プロセス用の追加モジュールも必要である。宇宙ミッション中に操作されるデバイス１の場合、一般市民、宇宙飛行士、ＮＡＳＡの人員、高価値機器の安全を含め、ミッションの安全性を確保することが不可欠である。宇宙飛行士の人口統計を考慮することも重要である。宇宙飛行士は、高度な教育を受け、訓練され、高いモチベーションを持つが、作業が過酷である。また、宇宙ミッションには、宇宙ミッション中の宇宙飛行士の情報処理能力、記憶想起、強さ、及び注意力を低下させる多くの因子がある。例えば、重力の低下、概日リズムのずれによる疲労、頭部方向への体液シフトによる視力の低下、音響感度、及び長期間の深宇宙探査の他のストレスである。特殊な環境（例えば電離放射線）、及び宇宙ミッションでの限られた資源（質量、パワー、体積など）は、宇宙飛行中に使用されるデバイスについて考慮する必要がある追加の因子である。
【０２１２】
[0274]上記の条件に対処するために、本発明者らは、宇宙ミッションのための核酸バイオマーカ検出用の自動化された試料調製を含むユーザ中心のＶＦＰプラットフォームを設計する。核酸ＶＦＰプラットフォームは、宇宙飛行士の介入の必要性を最小限に抑えるためのモジュール式のプラグアンドプレイ設計を有する。図３７は、プラットフォームの動作のプロセス４００流れ図を示している。これは主に３つのモジュールを備える。すなわち、ブロック４０３：試料Ｐｒｅｐ１−白血球選別、ブロック４０５：試料Ｐｒｅｐ２−ＲＮＡ増幅（細胞溶解、ｍＲＮＡ逆転写、ｃＤＮＡ等温増幅を含む）、及びブロック４０７：最終的なＶＦＰアッセイ及び検出。
【０２１３】
[0275]ブロック４０３、試料Ｐｒｅｐ１−白血球選別モジュール：最小侵襲性で採取することができる全身性の体液であるので、現在の遺伝子発現生物学的線量測定バイオマーカが血液中のリンパ球から検出される。白血球からの遺伝子発現を検出するために、通常、赤血球を除去して、大量のＲＮＡバックグラウンドからの干渉を低減する必要がある。従来、これはＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配分離によって行われる。しかし、このプロセスは、複数の手動取扱いが必要であり、自動化するのは困難である。この問題を克服するために、決定的側方変位（ＤＬＤ）に基づく白血球選別マイクロ流体チップが使用され、ここで、異なるサイズを有する細胞がマイクロポストアレイを通って流れ、アレイのカラムが細胞ストリームに対してわずかに傾いており、アレイによって定義された「クリティカルサイズ」よりも大きい細胞は、元のストリームから押し出される（及び分離される）。本発明者らは、遺伝子発現アプリケーション用のＤＬＤチップを実証し、試料調製の最初のステップとしてＶＦＰプラットフォームにそのＤＬＤチップを統合した。図３８は、ＤＬＤチップ４０のレイアウト、及び指定されたチャネル６２に分類されている白血球６０の蛍光画像を示す。
【０２１４】
[0276]ブロック４０５／試料Ｐｒｅｐ２−ＲＮＡ増幅モジュール：ＲＮＡ増幅モジュールは、白血球溶解、ｍＲＮＡ逆転写、及び等温ＤＮＡ増幅を実現する。
【０２１５】
[0277]ＲＮＡは、有機抽出、フィルタベースのスピンバスケット、磁性粒子、又は直接溶解によって、検出用の様々なプロセスを通じて調製することができる。直接溶解法は：（ｉ）正確なＲＮＡ表現の可能性が最も高く、（ｉｉ）小さい試料で作用することができ、（ｉｉｉ）単純な自動化に適している。直接溶解アッセイ化学を、ＶＦＰ遺伝子発現検出に使用して、マイクロ流体カートリッジを介して実装することができる。
【０２１６】
[0278]抽出されたｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに逆転写され、ＶＦＰ検出のために増幅される必要がある。従来、ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による周期的な加熱／冷却プロセスによって増幅されている。しかし、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）など、単純な自動化及びＰＯＣ用途のためのいくつかの等温増幅プロセスが最近報告されている。他の等温増幅の欠点を克服するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）プロセスを採用することができる。逆転写プロセスを増幅プロセスと統合することも可能である。ラテラルフロー試験のための金ナノ粒子１２標識試薬用の市販キットが利用可能であり、それらのキットをＶＦＰアッセイ及び検出に直接採用することができる。マイクロプロセスコントローラによって制御されるマイクロ流体カートリッジは、ＶＦＰ検出のための逆転写及び増幅プロセスを自動化するように設計される。
【０２１７】
[0279]ブロック４０７／ＶＦＰアッセイ及び検出モジュール：このモジュールは、試料処理用のシリンジ６カートリッジ、並びに検出及びデータ解析用のリーダを含む、本明細書で述べるデバイスのいずれかの現在の抗原１３検出ＶＦＰプラットフォームの主な特徴を含む。主検出膜３は、膜ホルダ２９内に収容されている。膜ホルダ２９は、シリンジ６カートリッジに取り付けることができ、それにより、増幅されたＤＮＡ試料を、捕捉剤１９による標的捕捉のために膜３に押し通すことができる。次いで、膜ホルダ２９を取り外して、アレイスキャン及びデータ解析のためにリーダに取り付けることができる。図３６は、データ獲得のためにスマートフォン５１のアダプタ１５７に取り付けられた小型の膜ホルダ２９の現在の設計の拡大図と共に、流体の取扱いを容易にするための動力源のないばね式のシリンジ６カートリッジの現在の設計を示す。これらの要素は、上流の試料調製モジュール（例えばブロック４０３及び／又は４０５）とインターフェースするように再構成される。
【０２１８】
[0280]全体的なプラットフォーム設計：最後に、試料ＰｒｅｐとＶＦＰモジュール（ブロック４０３、４０５、及び４０７）とを、人間中心のカートリッジ設計によって統合する。これは、宇宙ミッションの成功を最適化すると共に人間の健康を維持するために動作上の妥当性を保証するための人間システムの統合に役立つ。設計活動は、システム及び乗組員因子、すなわち宇宙飛行士乗組員及び宇宙医学チームを通じて、有人宇宙飛行の運用（すなわち臨床宇宙医学や遠征支援など）のより広範な目的のために、ＮＡＳＡの顧客に対して製品プラットフォームの明確な価値を強調することを狙いとしている。
【０２１９】
[0281]宇宙ベースのプラットフォーム（例えば、現在は国際宇宙ステーション（ＩＳＳ）であるが、軌道上を周る地球外の基地に関して）に乗ると、研究者は、ほぼリアルタイムでの計画されたアップグレードを伴う実験データを毎日監視する。この高スループットの、再構成可能であり自動化されたアーキテクチャにより、微小重力のスケーラブルで手頃な使用が可能になる。図３９は、モジュール式の自動化された試料調製及び監視システムに統合された人間中心のカートリッジ設計のプロセスワークフロー７００を示す。設計中、宇宙ミッションの各段階中の保管温度、パワー要件、遠隔測定速度などの動作制約に従う。設計は、仕様毎に、流体フロー２３とフィルタリングを制御するための内部電子機器を含む。適切な画像分析ソフトウェアがシステムで使用され、関連するデータの収集及び検証を保証する。
【０２２０】
[0282]したがって、単純な指先からの血液採取を使用して宇宙飛行時の健康監視のために微小重力環境で動作可能な、遺伝子発現バイオマーカ検出のための試料調製を含むＶＦＰプラットフォーム設計であって、宇宙ミッションに関して承認された使い捨てカートリッジ及び適切な試料ポートを含むワークフロー７００の自動化された試料調製、処理、及び監視システムに統合される、ＶＦＰプラットフォーム設計が実現される。
【０２２１】
[0283]実施例９：多重病原体検出のための垂直フロー紙ベースイムノアッセイ（ＶＰＩ）診断システムの開発
[0284]この例は、多重病原体検出のための垂直統合フローアッセイシステム技術（Ｖｅｒｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、「ＶＥＲＩＦＡＳＴ」）を提供する。ＶＥＲＩＦＡＳＴは、複数のケア段階及び現場で使用するための迅速な（＜３０分）ポイントオブニード診断デバイス１である。
【０２２２】
[0285]実現可能性の初期研究は、開示されるデバイス１の統合垂直フローイムノアッセイプラットフォームのための提案されたバイオマーカパネル及びアッセイキットの性能を実証する。ＶＥＲＩＦＡＳＴ（商標）の次の段階は、ＦＤＡデバイスのガイドラインを満たす詳細なユーザ要件を定義することである。要件の範囲は、試料調製、安定化／輸送、調製、定量化／検出、マルチプレックスアレイ画像の解釈、及び完全に統合された自動ポイントオブニード（ＰＯＮ）システムへのそれらの組み込みを含めた、マルチプレックスバイオマーカパネル及びプロトコルの各構成部分を含む。得られるのは、成果物をチェックして適切に変更することができる要件のリストである。
【０２２３】
[0286]ＶＥＲＩＦＡＳＴシステム用のシステムに統合するための主要なプロセスは以下のものである：臨床試料（例えば血液や尿）及び非臨床試料（例えば増殖培地や土壌懸濁液マトリックス）に関する試料調製の向上；マルチプレックスシグネチャとアッセイ化学の最適化（すなわち５つの病原体；ナノ粒子１２の増強された光学特性１２）；現在のベンチトップ走査システムから、ポイントオブニード構成のためのコンパクトなスマートフォン５１のへ光学検出モジュールのアップグレード；血清及び環境試料又は実験室で成長させた試料からのマルチプレックスバイオマーカの適切な分析のためのデータ解釈ソフトウェアの変更及び最適化。
【０２２４】
[0287]できるだけ高い成功率を実現するようにプロセスを最適化するために、試料調製カートリッジ及び計装ハードウェアを設計し、構築し、（反復して）試験する。適切なデータ保護及びデータ秘匿化の達成に成功した後、これらのエキスパートシステムを外部サーバへのゲートウェイを介して利用可能にすることができる。このタスクは、指定されたモバイルシステムとの適合性を保証するように調整する。その後の評価のために、システム対応の試料調製カートリッジのパッケージングを提供する。
【０２２５】
[0288]主な目的は、ヒト臨床流体又は環境試料での生物学的特徴の迅速な検出（＜３０分）及び多重化同定のために設計された、可搬性がある迅速なマルチプレックス体液調製、処理、及び「サンプルトゥーアンサー（ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ａｎｓｗｅｒ）」分析システムにおいて、紙ベースマイクロ流体垂直フロー統合アッセイ技術プラットフォーム（ＶＥＲＩＦＡＳＴ）を実現することである。技術的側面は、以下のようなものである：バイオアッセイの設計及び統合。本発明者らは、試料採取、試料体積処理、緩衝液組成、試料実行時間、及び結果分析を含む、マイクロ流体デバイスのためのワークフロー統合を設計する；標準的なＬＦＩアッセイに関する、各バイオマーカについてのＶＥＲＩＦＡＳＴアッセイの評価及び検証。ＶＥＲＩＦＡＳＴシステムを、以前に開発された又は開発プロセス中の関連するＬＦＩと比較する。これは、特に提案される多重化構成において、ＶＥＲＩＦＡＳＴがＬＦＩよりも改善された分析感度を実現することができるかどうかを示す；ＶＥＲＩＦＡＳＴプラットフォーム全体の設計、組立て、及び検証。反復プロセスを通じて、ＶＥＲＩＦＡＳＴアッセイを、分析感度（例えば、検出限界、ＬＯＤ）について最適化する；前臨床試験へのＶＥＲＩＦＡＳＴプラットフォームシステムの変換；製品開発及びＦＤＡ承認のための準備。
【０２２６】
[0289]製品の説明：以下は、開示されるデバイス１の現在のＶＦＩシステム及びその次世代（ＶＥＲＩＦＡＳＴ（商標））の仕様の要約である。
【表１０】
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【０２２７】
[0290]図３６は、ポイントオブニードコンセプトに関するＶＥＲＩＦＡＳＴ開発の図である。
【０２２８】
[0291]試料採取モジュールに重要なのは以下のことである：モジュールの採取デバイスは、少なくとも２００μＬ〜５ｍＬの全血からある範囲の体積を確実に採取することが可能でなければならない；又は培地培養用の土壌懸濁液を調製するように構成されることが可能でなければならない；モジュールの採取デバイスは、適切なトレーニングを受けた比較的熟練していない個人によるリモート環境での使用に適合性がなければならない；モジュールの採取デバイスは、採取されたバイオ試料を、ＶＥＲＩＦＡＳＴシステムプラットフォームのマルチプレックスアッセイ検出の次のサブシステムに確実に送達することが可能でなければならない；モジュールの採取デバイスは、ユーザ追跡情報を追跡してＶＥＲＩＦＡＳＴシステムプラットフォームに転送して、情報の証拠保全を保証するのに適切な方法でなければならない。
【０２２９】
[0292]ＶＦＩ膜に関連する関連の側面は以下のことを含む：膜基板は、様々なフロー２３の流速レジームに対応するための良好な機械的特性を有し、小型化構成に適した全ての必要な流体特性を最適化するために適合性のある制御された孔径を有する；膜には全ての必要な試薬を事前に装填することができる；膜は、６ヶ月の最低保存期間を有するようにパッケージ化することができ、３年が好ましい。
【０２３０】
[0293]マルチプレックスアッセイに関する関連する側面は以下のことを含む：アッセイは、ポイントオブニードで少量（例えば、＜２００μＬ）から多量（＞５ｍＬ）まで様々な体積で採取された生物学的流体の５つの病原体バイオマーカを区別することが可能である；アッセイは、２桁の対数目盛にわたって線形である分析範囲を有することができ、投入された標本に応じてナノモル未満の標的濃度が好ましい；アッセイに関する分析性能要件（正確さ及び精度）は、最終的なマルチプレックスバイオマーカアルゴリズムから導出され、療法決定点の前又は近くで再現性のある診断を可能にするように設計される；アッセイは、肉眼で、又はモバイルスマートフォンデバイス５１などで容易に利用可能な光学撮像システムを使用して読み取ることができる；アッセイは、全血又は尿の投入から開始し、少なくとも、撮像センサ（例えばスマートフォン５１のカメラ５３）によって検出することができるナノ粒子１２標識から散乱信号を特異的に生成している抗体カップリングを有する複数の標的バイオマーカから病原体への個人の生物学的曝露を決定することができる。
【０２３１】
[0294]
【表１１】
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【０２３２】
[0295]ＶＥＲＩＦＡＳＴプラットフォームは、操作者が、患者試料を個別に含むプラスチックシリンジ６又は同等のカートリッジモジュールを装填することを可能にする。デバイス１は、４つのステップで処理し、多重病原体アッセイを行い、バイオマーカの相互作用を記録し、診断結果を提供するために必要な分析を行う：１．体液の濾過及び前処理（例えば、血清と血漿の分離）；２．マルチプレックスアッセイを使用した、抗原１３とのＡｂ標識及びハイブリダイゼーション反応；３．撮像検出（例えば、ナノ粒子１２の散乱）；４．結果を決定するためのバイオマーカ検出の数値処理。
【０２３３】
[0296]結果は、機器のデータベースに記録され、特定の要件及び用途、例えばモバイル環境又は現場操作シナリオに適合される形式で操作者に提供される。操作者は、処理されたデバイス１を廃棄することができる。
【０２３４】
[0297]ＶＥＲＩＦＡＳＴ技術プラットフォームは、多重病原体バイオマーカパネルシステムとして要約され、このシステムは、開示されるデバイス１の様々な実施形態を参照して前述したいくつかの主要なサブシステムに分割される。
【０２３５】
[0298]ＶＥＲＩＦＡＳＴシステムプラットフォームは、いくつかの学際的分野での進歩を統合して、新たな自立型の統合された紙ベースマイクロ流体垂直フローデバイス１診断プラットフォームシステムを実現することによって、遠隔環境で少なくとも５つの細菌性病原体の複数のバイオマーカでイムノアッセイ試験を行う能力を大幅に改善及び変更する。いくつかのシングルプレックスラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩ）は、細菌検出用にすでに存在し、他の用途で使用されている。しかし、本発明者らは、専門家ではないユーザが電力を必要とせずに操作するのに適した、完全に自動化された小型のポイントオブニーズ形式で現在使用されているマルチプレックスＴｉｅｒ  Ｉ病原体ベースのシステムはないことを認識している。あるいは、直接の視覚化又は標準的なモバイル電子機器（例えばスマートフォン５１のカメラ５３）を使用した撮像によって、必要な全てのアッセイ試薬、オンボード流体管理、及び多重検出を事前にロードされた自立型の垂直フローデバイスへの試料装填を超える複数ステップの手動準備もないことを認識している。本実施例では、本発明者らは、複合の知識及び学際的知識を構築し、この統合されたテクノロジーをモバイル環境で使用できるようにするのに必要な検証を概説する。ＶＥＲＩＦＡＳＴプラットフォームを特色付けるのは、検出が高感度であり特異的であるだけでなく、多重生物学的信号の特性評価のための分析が、一連の独立したアッセイではなく同時に行われることである。本実施例の統合システム手法は、既存の技術的及び科学的サブコンポーネントの統合に基づく、完全にハンドヘルドの「サンプルトゥーアンサー」分析手法につながる。
【０２３６】
[0299]このデバイス及び方法は、体液中の重要な病原体の現在の細菌バイオマーカに焦点を合わせることができるが、アッセイは、他の非臨床標的との二重使用のために設計することもできる。本研究で使用する検出バイオマーカは、多様なプラットフォーム技術にわたって複数のシステムでそれらをスクリーニングすることによって、特異性について検証される。ＶＥＲＩＦＡＳＴシステムプラットフォームを用いて、病原体への曝露の有無に対する生物学的応答を、容易に利用可能な液体又は環境試料で迅速に評価することができることは、アクティブなミッションに従事する現場操作者の効果的な保護に向けて大きな飛躍をもたらす。
【０２３７】
[0300]図３９は、本実施例に関するアッセイワークフロー７００、例えばＶＥＲＩＦＡＳＴ自動アッセイワークフローの図である。
【０２３８】
[0301]本実施例で提示される解決策は、臨床実験室の試験能力の現在のパラダイムから、資源が限られたフィールドフォワードの厳しい環境での臨床試料と環境試料との二重試験の包括的なハンドヘルド診断能力にシフトする。そのような変換は、分子アッセイ技術の進歩、細菌性病原体に関する高感度であり特異的なバイオマーカの開発及び検証、並びにマルチプレックス垂直フローイムノアッセイ技術の進歩により、現在ようやく可能になっている。開示されるＶＥＲＩＦＡＳＴシステムプラットフォームは、これらの進歩を医療的防衛ソリューションに統合して、体液中の病原体を、できるだけ早い曝露時点で迅速に特定できるようにする。研究室からフィールドフォワード環境への既存の技術の移行は、簡単なことではなく、この変換作業が本実施例の主な焦点である。例えば、研究室では、単一の特定の標的を評価するアッセイに焦点が当てられることがよくあり、これらのアッセイは、多くの場合、一度に１つずつ使用される。対照的に、ポイントオブニード環境では、生物学的摂動の多くが同様の症状を示す可能性があるため、広範な標的を迅速に検出することができる能力が主な目的となる。本発明者らの手法の重要な革新は、広範なプラットフォーム検証及び迅速なプロトタイピングが現在行われているポイントオブニード紙ベースマイクロ流体垂直フローイムノアッセイのためのこれらの既存の技術を、広範に検証される試薬キットと組み合わせて、厳しい環境で作業する人員によるフィールドフォワード用途のためにＴｉｅｒ  Ｉ病原体曝露に対する複数の生物学的応答を同時に試験するためのロバストな診断プラットフォームにすることである。
【０２３９】
[0302]ＡｕＣｏｉｎ研究所は、感染症のためのバイオマーカの発見とイムノアッセイの開発を専門とする。このチームは、患者試料内の脱落／分泌された微生物抗原１３を同定するために、インビボ微生物抗体発見（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、「ＩｎＭＡＤ」）を含む複数のプラットフォームを開発した（Ｙｕａｎ，  Ｆａｌｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；Ｙｕａｎ，  Ｋｈｏｕｒｙ，  ２０１２）。これは、微生物抗原１３の直接検出のための複数アッセイの開発及び最適化につながっている（Ｙｕａｎ，  Ｆａｌｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｉｎｄｒａｓｅｋａｒａ，  Ｍｅｙｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５；Ｉｎｄｒａｓｅｋａｒａ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８）。本発明者らのアッセイ開発ワークフローは、以下のことを含む。（ｉ）患者試料中の複数の脱落した微生物バイオマーカの同定、（ｉｉ）各標的に対するよく特性化された捕捉剤１９ｍＡｂの大きなパネルの分離（各標的に対して＞２０ｍＡｂを生成することが、優れたアッセイ性能を保証する）、（ｉｉｉ）ｍＡｂの選択肢を絞り、バイオマーカ検出のために抗原捕捉ＥＬＩＳＡを最適化する、及び（ｉｖ）アッセイを様々な診断形式（ＬＦＩ、ＶＦＩなど）に移行する。
【０２４０】
[0303]このプログラムは、保健福祉省によって分類された全てのＴｉｅｒ  Ｉ細菌選択剤を含むがそれらに限定されない、多くの病原体に関するＬＦＩの開発に焦点を当てている。これらの病原体には、炭疽菌、類鼻疽菌、鼻疽菌、野兎病菌、及びペスト菌が含まれる。これらは、この本実施例で研究される感染症である。以下の表は、５つの病原体のバイオマーカと各シングルプレックスＬＦＩアッセイの現状を要約したものである。本発明者らは、ＶＥＲＩＦＡＳＴシステムに関して同じバイオマーカを引き続き使用する。結果を、対応するＬＦＩと比較する。現在、類鼻疽菌用に開発されたＬＦＩは、鼻疽菌もよく同定することが期待され、これは、各種によって産生される保存された莢膜多糖（ＣＰＳ）によるものである。炭疽菌及び類鼻疽菌ＬＦＩは、ＩｎＢｉｏｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（米国ワシントン州シアトル）と共同開発され、１ｎｇ／ｍｌの検出限界（ＬＯＤ）を実現することが示されている。これらのアッセイはどちらも実施中であり、現在、前臨床環境で評価している。野兎病菌用のＬＦＩは進行中であり、ＶＦＩシステムの評価にバイオマーカ及び鉛ｍＡｂが利用可能である。ペスト菌に関するバイオマーカが同定されており、ｍＡｂは現在精製中である。モノクローナル抗体産生、ＢＳＬ３病原体の増殖、細菌標的の精製、及びプロトタイプアッセイの開発は、ＡｕＣｏｉｎ研究所で進行中である。
【０２４１】
[0304]
【表１２】
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【０２４２】
[0305]図４０Ａは、本実施例による紙ベースＶＦＩデバイス１（Ｃｈｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１９）の設計を示す。このデバイスは、ニトロセルロース膜３ベースの垂直フローイムノアッセイ（ＶＦＩ）診断デバイス１を備える。図４０の挿入図は、スポット７９のマイクロアレイからの陽性信号を示す例示的な膜３である。図４０のプロトタイプは、スポット抗体捕捉剤７９アレイを備えたニトロセルロース膜３（例えば、直径３．５ｍｍ）と、シリコン膜支持体２１と、ポリカーボネートハウジング（例えばホルダ２９）内に位置するＯリング７７とを含む。ＶＦＩデバイス１は、標準的なルアーロック取付具を使用して試料シリンジ６に接続する。試料実行が完了した後、図４０Ｂに示されるプロトタイプ化された撮像検出システム４９のモジュール設計に示されるように、ルアーロックを試料シリンジ６から簡便に切り離し、スマートフォン５１のカメラ５３の撮像プローブに再接続することができる。図４０Ｂに示されるセットアップは、スマートフォン５１のカメラ５３でＶＦＩ膜３をスキャンするために使用される撮像検出システム５９モジュールの一例である。このプロセスでは、膜３はＶＦＩデバイス１の内部に留まり、これにより、バイオハザードの可能性のある試料へのユーザの曝露が最小限に抑えられる。
【０２４３】
[0306]図４０Ａの挿入図は、スポット７９のマイクロアレイからの陽性信号を示す膜３の例である。マイクロアレイスポット７９を、病原体パネルの様々なバイオマーカを標的とする捕捉剤１９抗体と共に堆積する。マイクロアレイ膜３を、１ナノリットルの液滴サイズを有するＢｉｏＤｏｔ（商標）マイクロソレノイドディスペンサで製造し、これは、膜３に約２２０μｍのスポット７９サイズをもたらす。スポット７９サイズ、スポット７９の空間分解能、及び多重化の数など、ＶＦＩ膜３の品質は、インラインカメラフィードバックモジュールを備えた高度なマイクロピエゾディスペンシングシステムでさらに改善することができる。
【０２４４】
[0307]Ｓｉ支持体２１は、深掘りＲＩＥ法を使用して製造されたフロー貫通穴（直径１５０μｍ）を有する円形シリコンディスクである。Ｓｉ支持体２１は、液体フロー２３に対する膜３の機械的支持を実現する。シリコン支持体２１は、市販のステンレス鋼支持体よりも高いヤング率を有し、したがって、フロー２３の圧力下での変形の影響を受けにくい。これにより、膜３でのスポット７９マイクロアレイ全体にわたる信号均一性が大幅に向上される。
【０２４５】
[0308]垂直フロー診断プラットフォームを最適化するための現在進行中の研究の重要な部分として、複数のシステムパラメータが理論的及び実験的に調査されている。開示されるＶＦＩデバイス１のプラットフォームは、サンドイッチイムノアッセイに基づいて生物脅威病原体を検出する。開示されるデバイス１のＶＦＩシステムには、２つの重要な無次元数がある。１つは、ダムケラー数（Ｄａ）であり、吸着速度と輸送速度の関係を特徴付ける。第２の無次元数は、ペクレ数（Ｐｅ）であり、対流速度と拡散速度との比である。捕捉剤１９を使用して低濃度で標的抗原１３を捕捉するために、２つの条件が望まれる：（１）効率的な捕捉アッセイ（Ｄａ＞＞１）。捕捉剤１９抗体に結合する抗原１３の速度が、膜３の細孔壁への抗原１３分子輸送の速度よりも速い；（２）非拡散制限アッセイ（Ｐｅ＜１）は、送達される全ての抗原１３が、感知領域８１を通して対流される前に、膜３の細孔壁に拡散することを可能にする。
【０２４６】
[0309]これらの２つの要件に基づいて、ＶＦＩ設計は、アッセイ感度を改良するために、高いフロー２３速度及び小さい膜３孔径を有する。
【０２４７】
[0310]以下の表は、開示されるデバイス１のＶＦＩシステムの性能に対する影響を決定するために、開示されるデバイス１のＶＦＩシステムについて調べた因子を要約したものである。因子は、それぞれ試料、デバイス、アッセイ、及び操作プロトコルに関連する４つのグループに分けることができる。
【表１３】
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【０２４８】
[0311]膜３の材料の孔径及び試料フロー２３流量など、いくつかの因子が非常に重要であることが見出されている。実験結果は、より小さいナノメートル孔径を有するニトロセルロース膜３が、開示されるデバイス１のＶＦＩプラットフォームに実装されている現在の４つの生物脅威アッセイで最高の感度を実現することを示している。単位流量が高いほど、より多くの試料が一定時間に感知領域８１に送達され、より良い検出感度を実現することができる。対照的に、捕捉剤１９抗体の密度など、いくつかの因子はそれほど重要ではない。膜３のスポット領域が飽和している限り、より多くの捕捉剤１９抗体を同じ領域に追加しても、開示されるＶＦＩデバイス１の感度はさらには向上されない。
【０２４９】
[0312]生物脅威性病原体の検出及び多重検出におけるＶＦＩシステムの性能
[0313]以下の表は、同じアッセイを使用するラテラルフローイムノアッセイシステムと比較したＶＦＩデバイスの主要な仕様を表示する。
【表１４】
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【０２５０】
[0314]エリア８１を通るより大きな流れ、及び能動ポンプメカニズム（例えば、ポンプ３１）の統合により、ＶＦＩデバイス１は、尿又は環境水土壌懸濁液試料など、より大きな体積を有する試料を処理することが可能である。より大きい試料体積の場合には試料調製ステップがより長いので、開示されるＶＦＩデバイス１の合計試験時間はＬＦＩよりも長くなるが、それでも３０分のベンチマークを下回る。開示されるＶＦＩデバイス１の感度は、同様のＬＦＩ構成よりも約２５倍感度が高い。
【０２５１】
[0315]本発明者らは、開示されるデバイス１のＶＦＩプラットフォームを使用して実験を行い、２つの標的、すなわちＣＰＳ及びＰＧＡを同時に検出する。多重化ＶＦＩ膜３の設計は、図１０Ａ〜１０Ｃに示されており、ＶＦＩとＣＰＳ及びＰＧＡとの多重化アッセイが同じ膜で検出される。図１０Ｂは、異なる試料（ＣＰＳ−／ＰＧＡ−、ＣＰＳ＋／ＰＧＡ−、ＣＰＳ−／ＰＧＡ＋、ＣＰＳ＋／Ｐ）を用いた４つの膜３のスキャンされた画像を示す。検出スポット７９マイクロアレイを、２つの部分に分けた。半分は、ＣＰＳを標的とするｍＡｂ  ４Ｃ４捕捉剤１９でコーティングし、残りの半分は、ＰＧＡを標的とするｍＡｂ  ８Ｂ１０捕捉剤１９でコーティングした。異なる抗原８１含有量を有する４つの試料（ＣＰＳ陰性／ＰＧＡ陰性、１ｎｇ／ｍＬ  ＣＰＳ／ＰＧＡ陰性、ＣＰＳ陰性／１ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＡ、１ｎｇ／ｍＬ  ＣＰＳ／１ｎｇ／ｍＬ  ＰＧＡ）をＶＦＩ膜３で処理した。図１０Ｂは、４つの膜３のスキャンされた画像を示す。図１０Ｃは、４つの膜３からの信号強度を示す。検出スポット７９は、対応する抗原８１が試料中に存在した場合にのみ陽性信号を示した。この実験は、開示されるデバイス１のＶＦＩプラットフォームが複数の生物脅威剤を同時に検出することができることを実証した。ＬＦＩとは異なり、開示されるデバイス１のＶＦＩシステムでは、検出スポット７９が空間的に離され、互いに独立しており、開示されるＶＦＩデバイス１を大規模な多重化検出に特に適したものにする。
【０２５２】
[0316]図４１は、現在のベンチトップ画像分析ソフトウェア１６１のユーザインターフェースを示す。ｍｉｎｉＶＦＩ膜を分析するためのソフトウェアのワークフローは、３つの主要なステップを含む：１）事前定義されたテンプレートを使用して画像を識別及び回転する；２）マイクロアレイ内の各スポット７９を位置特定する。テンプレートを識別した後、テンプレートを基準にしてｘ／ｙ２軸座標が作成される。各スポット７９の座標は、ピッチ距離及び走査ｄｐｉに基づいて計算することができる；３）各スポット７９及びその背景から強度を取得する；４）各スポット７９に関する診断レポート（陽性、陰性、及び不明）を生成する。これは、場合によっては１つのタイプのバイオマーカに関するものでもよい。
【０２５３】
[0317]本発明者らは、結果を、ＩｍａｇｅＪを使用した手動の方法と比較した。平均して、差は最大１５％だった。膜からの信号強度自体が１０％の変動を有することを考えると、ソフトウェアからの結果はかなり正確である。注：ソフトウェア１６１システムは、ＬＦＩストリップを分析するように構成されてもいる。
【０２５４】
[0318]プラズモニックナノ粒子のうち、界面活性剤を含まない分枝金ナノ粒子は、表面増強光感知及び撮像用途から、癌治療のための光熱処理及び光免疫療法に至るまで、幅広い用途のためのナノプラットフォームとして優れた特性を示している。球状コアから突き出た複数の鋭い枝を有する金ナノ粒子を合成するための、界面活性剤及びキャッピング剤を使用しない方策が導入されており、これは「金ナノスター」（ＧＮＳ）と呼ばれている（Ｎｕｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。リガンド交換や広範な精製プロトコルを必要としない、生体適合性のあるリガンドフリーの表面化学、直接的な表面機能化の容易さ、及び生体分子の装填に利用可能な優れた表面積（同じ直径の球状金ナノ粒子と比較して）は、他のタイプの金ナノ粒子と比較したＧＮＳによって実現されるいくつかの主要な利点である（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）；Ｙｕａｎ，Ｗｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；Ｙｕａｎ，Ｋｈｏｕｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；Ｙｕａｎ，Ｆａｌｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｉｎｄｒａｓｅｋａｒａ，Ｍｅｙｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｌｉｕ，Ａｓｈｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５；Ｉｎｄｒａｓｅｋａｒａ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８；Ｌｅｎｓｈｏｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；Ｋｕｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。さらに、ＧＮＳは、高散乱断面積、プラズモン増強吸収、可視から近赤外スペクトル範囲での形状制御されたプラズモン吸収帯の調整可能性など、独特であり優れた光学特性を示す（Ｎｕｔｉ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１１；Ｇｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１３）。一括して、ＧＮＳの化学的特性と光学的特性との両方が、ＶＥＲＩＦＡＳＴプラットフォームの用途の光学的検出性能を高めるための多用途プラットフォームを実現することができる。
【０２５５】
[0319]生物医学的用途におけるナノ粒子の有効性及び信頼性は、ナノ粒子の物理的、化学的、及び光学的特性の一貫性及び再現性に強く依拠し、そのような一貫性及び再現性は、主にそれらの形態学的特徴によって決定される。設計パラメータは、高い信頼性で、目的に合わせた製造ＧＮＳ用に開発した。ＧＮＳの再現性及び均質性を改善する最適化されたボトムアップ合成プロトコルと、それらの形態、特に分枝密度、分枝の幾何学的特徴を変調して、所望の光学特性を取得する機能が備わっている。実験パラメータの体系的な変更により、ＧＮＳは、図４２に示されるように、３〜３０分枝／粒子の範囲の分枝密度、３０〜２００ｎｍの全体サイズ、及び５３０ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の光吸収で製造することができる（Ｎｕｔｉ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１１；Ｇｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１３）。図４２は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像及び吸収スペクトルを示しており、界面活性剤及びキャッピング剤を含まないシード媒介合成手法を使用して高い再現性を有する高品質ＧＮＳの形態学的及び光学的調整を示す。
【０２５６】
[0320]バイオマーカパネルの開発：ｍＡｂの精製及びＱＣ（品質管理）試験
[0321]ＶＦＩ形式で使用するミリグラム量（≧５００ｍｇ）の各ｍＡｂ捕捉剤１９のを精製する。プロトタイプ抗原８１捕捉アッセイ、ＬＦＩ、及びＶＰＩを開発するために、捕捉剤１９ｍＡｂが必要である。既存のハイブリドーマ細胞株を、ハイブリドーマ増殖培地を含むＩｎｔｅｇｒａバイオリアクタ（Ｉｎｔｅｇｒａ  ｓｙｓｔｅｍｓ）で培養する。ハイブリドーマ上清液を定期的に採取し、ｍＡｂを、タンパク質Ａカラムでの親和性クロマトグラフィによって精製する。遺伝的浮動の結果として生じ得る悪影響を回避するために、ハイブリドーマ細胞株の新たなバイアルを定期的に起こし、抗体サブクラスを定期的に監視する。捕捉剤１９ｍＡｂの各ロットに、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ−／Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００）アッセイを含む厳密なＱＣ試験を施して、捕捉剤１９ｍＡｂの性能を確認する。ＳＰＲアッセイは、動力学的結合データ（オンレート及びオフレート）の決定を含むｍＡｂ親和性の詳細な評価を可能にする。簡潔に言うと、精製された細菌バイオマーカを、Ｂｉａｃｏｒｅセンサチップに固定化する。試料（ｍＡｂの２倍段階希釈［３３３−５．２ｎＭ］）をセンサ表面にわたって６０秒間注入し、その後、捕捉剤１９ｍＡｂを受動的に解離させる。ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して、Ｋａ（オンレート）、Ｋｄ（オフレート）、及びＫＤ（平衡解離定数又は「親和性」）を決定する。解離定数（ＫＤ）は、ＢＩＡ評価ソフトウェアにおいて定常状態モデルを使用して決定する。
【０２５７】
[0322]受動吸収又は機能化表面化学のいずれかを使用して、検出ｍＡｂを、ＥＬＩＳＡの場合には西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に、ＬＦＩ及びＶＰＩの場合にはＧＮＰ１２及びＧＮＳに結合させる。また、共役試薬に、ＥＬＩＳＡ又はＬＦＩ形式での検証を含む定量及びＱＣ法を施す。
【０２５８】
[0323]バイオマーカの精製及び細菌分離株の調製：ミリグラム量（≧２０ｍｇｓ）の各バイオマーカ（細菌抗原８１）を精製して使用する。これは、開発されるプロトタイプＬＦＩ及びＶＰＩのそれぞれの性能を試験するために必要である。類鼻疽菌ＣＰＳ、炭疽菌ＰＧＡ、及び野兎病菌ＬＰＳの精製は、病原体の増殖を必要とする（場合によっては、選択された化学剤免除株が使用されることがある）。ペスト菌によって発現されるバイオマーカを、組換え法によって発現する。さらに、各細菌性病原体の、熱又は化学的に不活化された全細胞及び全細胞溶解物を生成する。作業はＢＳＬ３実験室で行う。組換えタンパク質及び細菌調製物を使用して、各バイオマーカに関するＶＦＩのＬＯＤ（ｐｇ／ｍｌ及びｃｆｕ／ｍｌ）を決定する。
【０２５９】
[0324]プロトタイプシングルプレックスＬＦＩ開発：プロトタイプシングルプレックスＬＦＩを製造して、対応するＶＦＩと比較するために使用する。ＶＦＩの目標は、ＬＯＤにおいて少なくとも１０倍の改良を実現することである。現在、炭疽菌、類鼻疽菌、及び鼻疽菌に関するプロトタイプＬＦＩが使用できる。バイオマーカＬＰＳ、ＬｃｒＶ、及びＦ１を使用する野兎病菌及びペスト菌に関するプロトタイプＬＦＩが、現在このプロジェクトのために製造されている。ＢｉｏＤｏｔ  ３０５０を使用して、プロトタイプＬＦＩを製造する。ＬＦＩの各成分及びパラメータを、試料パッド、試料体積、チェイス緩衝液、共役パッド、ｍＡｂラベリング、膜、試験ラインｍＡｂ、吸収パッドなど、従来の方法に基づいて最適化する。分析感度／検出限界（ＬＯＤ）を、各プロトタイプＬＦＩアッセイに関して決定する。さらに、精製されたバイオマーカと全細菌細胞を、関連の試料マトリックス（例えば、血液、尿）にスパイクして、ＬＯＤを決定する。パフォーマンス結果を、対応するＶＰＩと比較する。ＬＦＩ膜とＶＦＩ膜３とをどちらも同じ画像分析アルゴリズムで撮像する。
【０２６０】
[0325]光学的検出剤の開発：ＶＦＩ金ナノ粒子１２標識の光学的特性を最適化するために、主なタスクは製造プロセスの最適化に焦点を当てる。シード媒介手法による界面活性剤及びキャッピング剤を含まないＧＮＳの合成が記載されている（Ｙｕａｎ，  Ｋｈｏｕｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。ＧＮＳ合成のこの方法は、他のナノ粒子合成と比較して非常に単純であり、形態学的特徴と光吸収（局在表面プラズモン）位置との優れた微調整を可能にしながら、完了に約１０秒しかかからない（Ｙｕａｎ，  Ｋｈｏｕｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；Ｙｕａｎ，  Ｆａｌｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；Ｉｎｄｒａｓｅｋａｒａ，  Ｍｅｙｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｌｉｕ，  Ａｓｈｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５；Ｉｎｄｒａｓｅｋａｒａ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８）。簡潔に言うと、多結晶球状金ナノ粒子（金シード）と塩化金の酸性混合物にＡｇＮＯ３（形状指向剤）及びアスコルビン酸（還元剤）を迅速に順次添加すると、瞬時にＧＮＳが生成される（図４３Ａ及び４３Ｂ）。図４３Ａは、ＧＮＳ合成の概略図である。図４３Ｂは、様々なＡｇＮＯ３濃度下で形成されたＧＮＳのＴＥＭ及び３Ｄモデリング画像（スケールバー５０ｎｍ）である：（Ｓ５：５μＭ、Ｓ１０：１０μＭ、Ｓ２０：２μＭ、Ｓ３０：３０μＭ）。合成されたＧＮＳは、さらに使用するまで４℃で保存することができ、又はポリエチレングリコールでコーティングしてコロイド安定性及びさらなる機能化の目的を向上させることができる。
【０２６１】
[0326]金ナノ粒子１２のバッチを生成する能力及びＡｂとのカップリング：現場で使用される場合、開示されるＶＥＲＩＦＡＳＴデバイス１の処理は、２つの主要なステップを含む。第１のステップは、抗原８１が捕捉剤１９抗体に結合することができるように、膜３を通して試料を流すことである。第２のステップは、膜３を通して洗浄緩衝液を流して、余剰のナノ粒子１２及び非特異的な緩く結合された抗原８１を除去することである。本発明者らは、三方弁システム１６３（概念実証アクチュエータの概略が図４４Ａに示されている）を使用して、２つの液体を膜３に送達することができる。ユーザがシリンジ６を交換して液体を切り替える現在の実験室での実践と比較して、バルブシステム１６３の使用にはいくつかの利点がある。操作が簡単である。また、シリンジ６を切り替えるときの圧力降下による気泡の問題も解消する。液体封鎖システムを形成して、危険であり得る試料へのユーザの曝露を低減する。本発明者らの現在の実験室セットアップでは、シリンジ６のポンプ３１（１２０Ｖ  ＡＣ電源を使用）を使用して、プロトタイプデバイス１の膜３を通して液体を押し出す。現場での電力供給が限られていることを考慮して、本発明者らは、液体を作動させるために外部電源を必要としない代替方法を使用することを提案する。図４４Ｂは、ガスシリンジ４を使用して膜３を通して液体を押すプロトタイプ設計である。１５ポンドのガスシリンジ４の本発明者らの予備試験では、所望の時間枠内で試薬を流すことができることが示されている。より小型化されて単純化された液体作動法が、ＶＥＲＩＦＡＳＴシステムプラットフォームに統合される。
【０２６２】
[0327]Ｓｉ膜支持体２１の製造：Ｓｉ膜支持体２１は、膜３を横切る均一な信号を容易に実現するＶＦＩデバイス１の重要な構成要素である。現在、それは半導体微細加工技法によって製造されている。まず、フォトリソグラフィを使用して、両面研磨されたＳｉウェハにレジスト層をパターン形成する。次いで、レジストをオーブン又はホットプレート内で熱硬化させて、Ｓｉウェハの深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）用のマスクとして機能させ、基板に異方性貫通穴アレイを作成する。マスクの設計、レジストの回転、フォトリソグラフィ、及びレジストのベーキングは、クリーンルームで行うことができる。Ｓｉウェハ当たりの支持体２１が多いほど、支持体２１の単価は下がるが、ウェハにエッチングされる貫通穴が増えるため、ウェハが破損する可能性もある。最適な設計に到達すると、支持体２１の製造が、プロトタイピングデバイス１の製造のために拡張される。
【０２６３】
[0328]小型化された膜での複製を用いたアレイ印刷：図４５の（Ａ）〜（Ｃ）は、本実施例の膜３アレイ印刷の態様を示す。図４５の（Ａ）は、ＶＦＩデバイス１設計におけるニトロセルロース膜３の表面積８１を示す（Φ＝３．５ｍｍ；膜３の灰色の領域は、Ｏリング７７によって覆われている）。エッチングされた貫通穴を有するＳｉ支持体２１のフロースルー領域は、直径２ｍｍの円内にある。
【０２６４】
[0329]図４５の（Ｂ）は、スポット７９の多重アレイの設計である。マイクロソレノイドディスペンサを使用すると、最小液滴体積は１ナノリットルであり、２３０μｍのスポット７９サイズが得られる。本発明者らは、フロースルーエリア８１内に最大６つの検出スポット７９を適合させることができ、各抗原８１につき１つのみである。しかし、試験の精度及び信頼性を改善するために、各抗原８１について二重さらには三重のスポット７９が望まれる。図４５の（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれ二重及び三重の５つの抗原８１に関するスポット７９の多重マイクロアレイの設計である。本発明者らの小型の膜３内のこれらの追加の検出スポット７９に適合するために、スポット７９サイズとピッチ距離との両方を低減する必要がある。スポット７９サイズに基づいて、所望の液滴体積は約４５０ピコリットルであると計算することができる。現在のマイクロソレノイドディスペンサは、このピコリットルディスペンシングを行うことができない。ピエゾディスペンサは、そのような小さな液滴サイズを実現し、定量供給の空間分解能を向上させることができる。
【０２６５】
[0330]ピエゾ液体ディスペンサを用いて、所望のスポット７９サイズ及びピッチ距離を実現するために、様々なパラメータを試験する。小型化された膜３の中心に多重化されたｃＡｂアレイを印刷するためのプロトコルが開発されている。多重化されたｃＡｂアレイ膜３の少量生産のための手順も開発されている。簡潔に言うと、複数の小型化された膜を、ＣＯ２レーザによって大きな膜３シートから切り取る。次いで、小さな膜３を、アレイ印刷のために剛性の膜ホルダに装填する。膜３のホルダは、ポリカーボネート又は他の硬質プラスチックのＣＮＣ機械加工によって製造することができる。ポリカーボネートの剛性は、小さな膜３へのディスペンサの正確な位置合わせを可能にする。
【０２６６】
[0331]試料マトリックスにおける試料調製及びアッセイの最適化：試料調製は、実世界での用途のための任意のアッセイの重要な部分である。血漿や尿などの複数の試料マトリックスのためのＰＯＮ環境（例えば、５分未満の時間枠）に適した試料調製モジュールとプロトコルが望まれる。調製された試料の品質は、抗原の損失を最小限に抑え、ベンチトップ手順に対する同様のアッセイ分析感度を確保するように特徴付けることができる。
【０２６７】
[0332]血液用の血漿抽出カートリッジ：選択されるバイオマーカ病原体は、迅速な疾患診断のための患者の循環系における細菌抗原である（Ｎｕｔｉ，  ｅｔ．  ａｌ．，  ２０１１）。血漿／血清は、病原体イムノアッセイのための一般的な試料である。従来の血漿／血清は、全血を遠心分離し、細胞を含まない上清を採取することによって調製される。しかし、ＰＯＮ環境において、場所を取り、高電力を必要とする遠心分離を使用することは現実的ではない。単純であり迅速な血漿／血清生成法が非常に必要である。血漿や血清などの血液成分のうち、血漿は凝血因子の凝固を必要としないため、より速くなる可能性があり、通常はＰＯＮ用途のための選択肢となる。
【０２６８】
[0333]全血からの血漿分離の重要性のために、これを実現するための多くの研究が報告されており、電気力（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）、音響力（Ｌｅｎｓｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、流体力学（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７）、構造化（Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）又は膜濾過（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）の使用を含む。それらの技法のうち、膜ベースの濾過が最も単純な形式である。膜ベースの濾過では、市販の非対称ポリスルホン膜（例えば、Ｖｉｖｉｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｐａｌｌ）を使用して、全血から血漿を２分で分離することができる。図４６Ａ及び４６Ｂは、膜ベースの血漿抽出装置１６５（図４６Ａ）、及び作製された指作動式血漿抽出器１６７（図４６Ｂ）の基本構造を示す。図４６Ａに示されるように、膜１６９は、上部プレート１７１及び下部プレート１７３の前に挟まれている。上部プレート１７１は、入口１７５と、血液試料を収容するための支持構造１７９を備えた及びチャンバ１７７とを有する。下部プレート１７３は、膜１６９から血漿を抽出するための毛細管構造１８１を有する。血漿出口１８３は、抽出された血漿を圧出することができる別の毛細管構造である。
【０２６９】
[0334]血漿分離抽出器デバイス（１６５、１６７）は、生物学的線量測定のために製造されて試験されている。得られた知識を、このタスクに活用することができる。上部プレート１７１と下部プレート１７３との両方の幾何形状及び表面張力を調査して、試料の損失を最小限に抑えながら高速の血漿抽出を実現する。現在、膜１６９は、５０μＬ／ｃｍ２未満の全血容量に制限されている。しかし、膜面積８１を拡大することにより、現場でのミリリットルスケールの血液の取扱いが報告されている（Ｇｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。３Ｄ構造、例えば積層された膜１６９を使用してさらなる拡張を探る。さらに、細胞沈降を使用して、血漿抽出の速度及びスループットを改良することができる（Ｄｉｍｏｖ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１１；Ｇａｌｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。例えば、図４６Ａ及び４６Ｂの基本構造は、細胞沈降による濾過能力を改善するために、底部にある超疎水性血液チャンバ１７７を用いて上下逆にひっくり返すことができる。同様のデバイスで、約６．５倍優れた膜１６９容量が報告されている（Ｌｉｕ，  Ｌｉａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。
【０２７０】
[0335]圧力／真空及び等張希釈による赤血球の凝集などの他の現象も、約５分以内に数ミリリットルの血漿を抽出するという目標を達成するために利用される。最後に、抽出血漿の品質は、５つの抗原８１全てに関するスパイク回復実験を使用して特性評価され、ベンチトップ手順と比較される。抗原８１の損失及び分析感度の変化を使用して、デバイス／プロトコルの最適化をガイドする。
【０２７１】
[0336]尿は、ＶＦＩデバイス及びＶＦＩデバイスを利用する用途のための別の一般的な試料マトリックスである。血液試料とは異なり、尿は、分離する必要のある細胞が大量には含まれておらず、開示される任意のＶＦＩデバイスで直接使用することができる。しかし、よく調節された血漿とは異なり、尿は大きく変動する組成を有する。ｐＨは、ｐＨ４．５〜８．０の間で変化することがあり、浸透圧は５０〜１３００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、尿比重（ＵＳＧ）は１．００５〜１．０３０の間で変化することがある（Ｓｖｉｒｉｄｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。本発明者らは、ｐＨがアッセイ結果に影響を与える可能性があり、０．１５未満のイオン強度が信号バックグラウンドを増加させる可能性があることを示している。しかし、ｐＨの変動が、イヌの尿中のＩＬ−６の検出にあまり影響を与えなかったことも報告されている（Ｗｏｏｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。これらの影響は、ヒト尿マトリックスでさらに研究される（試料マトリックスでのアッセイ最適化を参照）。必要であれば、ｐＨストリップを使用して試料のｐＨを試験し、ＨＣｌ又はＮａＯＨによって中和することができる。ＮａＣｌを加えることによってイオン強度を増加させることができる。
【０２７２】
[0337]血漿マトリックス最適化：血漿又は血清は、イムノアッセイにおける抗原に対する強い阻害効果を有する可能性があることが報告されている（Ｔａｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；ｄｅ  Ｊａｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。スパイク及び回復実験では、特定の抗原に関する血清／血漿中の回復率が１％と低いことが示されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ−Ｈａｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。これは、ＶＦＩアッセイでも観察される。図４７は、緩衝液又は血清のいずれかにスパイクされた２５ｎｇ／ｍｌ  ＬｃｒＶを示す。強いマトリックス阻害効果を示す、緩衝液及び血清中のスパイクされた２５ｎｇ／ｍＬ  ＬｃｒＶの信号がプロットされている。血清試料からの信号は、ＧＮＰ  １２濃度が４倍高くても、緩衝液の信号よりもかなり小さい。しかし、血漿の希釈は、このマトリックス阻害効果を一部緩和することができ、希釈していない試料よりもわずかに希釈した試料のほうが好ましいことが示唆されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ−Ｈａｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。一方、本発明者らは、最小の０．１μｍニトロセルロース膜を通して希釈されていない血清試料を流すとき、膜の目詰まりも確認した。両方の観察結果が、ＶＦＩデバイスで使用するための血漿試料の希釈を示唆する。それにもかかわらず、アッセイ感度への重大な影響を回避するために、より小さな希釈倍率が依然として好ましい。
【０２７３】
[0338]マトリックス効果の複雑さにより、本発明者らは、血漿マトリックスにおけるＶＦＩデバイス１アッセイを最適化するための実験計画法（ＤＯＥ）を使用する。重要なパラメータは以下のものである：（１）血漿希釈倍率；（２）膜３の孔径；（３）フロー２３の速度；（４）ＧＮＰ  １２−ｄＡｂ  １０濃度。まず、スクリーニング実験を行って、４つの因子のどれがアッセイ性能に大きな影響を与えているかを決定する。実験のこの段階の目標は、応答に有意な影響を有していない設計因子を排除することである。第２の実験は、応答曲面タイプ設計であり、ここで、因子レベル最適化を容易にするために、設計因子とそれらの相互作用と間の真の関係が決定される。膜阻害及び適切な希釈緩衝液も事前に個別に試験する。さらに、本発明者らは、事前に、試料及び金ナノ粒子１２検出抗体１０の予混合に１０分を費やし、試料実行時間はさらに１０分であった。この例では、本発明者らは、新たな手法を採用して、短い混合時間の直後に試料を実行する。このようにすると、試料実行時間は２０分に近づき、センサを通される試料を２倍にすると同時に、溶液中での液体抗原−抗体反応を依然として可能にする。血漿試料の希釈は直線的ではなく、異なる抗原に対するその影響は抗原毎に異なる可能性があるため、各抗原は個別に最適化される。
【０２７４】
[0339]前述のように、ヒトの尿は、ｐＨ（４．５〜８．０）、浸透圧（０．０５〜１．３Ｏｓｍ／ｋｇ）、及びＵＳＧ１．００２〜１．０３０で大きなばらつきがある（Ｓｖｉｒｉｄｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；Ｃｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。また、ヒトの尿は、タンパク質と、血漿に比べて大量の尿素や馬尿酸などとの複雑な混合物を含む（Ｓｖｉｒｉｄｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。ＵＳＧが高いほど特定のサイトカインの回復が改善されるという興味深い観察結果と共に、尿マトリックスによる阻害効果も報告されている（Ｗｏｏｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。ＶＦＩに対する尿マトリックスの影響を十分に研究することは重要な取組みとなる。したがって、最初の取組みでは、尿試料のｐＨ及びイオン強度の影響を研究する。購入した尿試料のｐＨ及びイオン強度を、ｐＨメータ（又はｐＨストリップ）及び導電率メータで測定する。次いで、酸／塩基及びＮａＣｌの滴定によってｐＨ及びイオン強度を調整することができ、異なるｐＨ、イオン強度条件下で、スパイクされた抗原８１に対してＶＦＩを実施することができる。ｐＨとイオン強度に加えて、希釈倍率、膜孔径、流速、ＧＮＰ  １２−ｄＡｂ１０濃度など他の関連パラメータも、血漿マトリックス研究と同様のＤＯＥ戦略を使用してアッセイ最適化のために試験する。ＵＳＧ及び浸透圧データが尿供給業者から要求され、プロジェクト中に監視する。結果は、開示されるデバイス１を用いたＶＦＩアッセイに関する最終的な試料調製戦略に影響を与える。
【０２７５】
[0340]標本採取及び処理モジュールの実証：プラットフォーム最適化のための実験的手法は連続的である。典型的には、スクリーニング実験は、選択された要因のどれがアッセイ性能に大きな影響を与える可能性があるかを決定するために行う。次いで、設計因子とそれらの相互作用との間の真の関係を決定することができる応答曲面型設計を適用して、因子レベル最適化を容易にする。スクリーニング段階に関して、決定的スクリーニング計画（ＤＳＤ）が使用される可能性が高い。これは、ＤＳＤが、効率的なスクリーニング設計として機能すると共に、いくつかの魅力的な相関特性と、実験の第２の段階での効率を見出すのに適切な統計モデルに当てはめることができる機能とを実現するからである。スクリーニング段階の結果に応じて、拡張ＤＳＤ、又は中央複合設計などの従来の応答曲面設計のいずれかが使用される。
【０２７６】
[0341]ＶＦＩ膜３から獲得した画像を確実に分析するためのソフトウェアが必要である。既存のソフトウェアアルゴリズム（ＣＫ  Ｐｏｉｎｔ  ＃２．４）は、画像を調べ、試験パターンを位置特定し、必要に応じて画像の向きを調整し、次いでドットパターンを分析して、バックグラウンド値と比較した信号スポット７９の値を決定して、標的が検出されたかどうかを判断する。このソフトウェアは、任意の受信画像に関する選択されたクラウドの場所を監視する。画像が到着すると、プログラムは、画像を開いて分析し、次いでアーカイブのための安全な場所に移して、結果を報告する。この構成は、データセキュリティ及び通信プロトコル並びに（例えば防衛共同体によって確立された）要件内で、モバイルハンドヘルドデバイスプラットフォーム（例えばスマートフォン５１又は等価な電子機器）への変換に対応するように再プログラムされる。
【０２７７】
[0342]電子機器（例えばスマートフォン５１）用アプリケーション
[0343]ソフトウェアは、信頼性が高く、使いやすいエンドユーザインターフェースを容易に実現することができる。軍が承認したスマートフォン５１用に設計されたアプリケーション（例えば、ｉＰｈｏｎｅ及びＧａｌａｘｙデバイスを備えたＮｅｔｔ  Ｗａｒｒｉｏｒネットワーク）は、ＣＣＤフォン５１のカメラ５３を使用して試験膜３の必要な４８ビット画像を取得することができる。次いで、アプリケーションは、既存のソフトウェアによって分析されるように、軍が承認したネットワーク上の場所に画像を送信することができ、又はスマートフォン５１で直接分析が行われるようにアプリケーションを書くことができ、軍が承認したネットワーク上の場所に結果が送信される。
【０２７８】
[0344]主要な５つの病原体カテゴリそれぞれの試料サイズは、以下の表に基づいて決定され、これは、いくつかの推定感度及び特異性に関して、試料サイズと９５％信頼区間との関係を示す。
【表１５】
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【０２７９】
[0345]実地試験の目標は、ＶＥＲＩＦＡＳＴ  ＰＯＮ試験の性能測定基準を正確に確立することである。採取された試料の数が多いほど、マルチプレックス試験の感度と特異性との両方について、精度がより良くなる、又は９５％ＣＩ幅が狭くなる。
【０２８０】
[0346]一例として、参照標準実験室増殖培養試験に関して、５００人の被験者から採取することによって９０％のＰＯＮ試験感度を実現した場合、９５％ＣＩは約±２．６％になる。同様に、感染していない１０００個の試料を採用することで導出される７０％の特異性は、９５％ＣＩが±２．８％になる。この測定基準は、検証研究のためにスポンサーへのデバイスの納品後に必要となる、カテゴリ毎の患者又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）試料の数を推定するための手段を提供する。
【０２８１】
[0347]実施例１０：核酸及び生物学的製剤の検出
[0348]本明細書で述べるシステム及びプロセスのいずれかを使用して、核酸、より一般的には生物学的製剤を検出することができる。例えば、図４８〜５０は、生物脅威に対応するものを含む様々な生物製剤を検出するための垂直フロー検出デバイスの有用性を示す。図４８及び４９は、Ｆ１（ペスト）及びＬＰＳに特異的な抗体である、膜に接続された捕捉剤を示す。ＶＦＩ膜の写真が右側に示され、対照スポット及び検出スポットを有する。図５０は、４つのＴｉｅｒ  Ｉ生物脅威に関する検出結果を要約したものである。
【０２８２】
[0349]図５１は、細胞から核酸を取得するための１つのプロセスの要約である。ＲＮＡは細胞株から抽出することができ、望まれるときには、標準的なＲＴ及び標準的なＰＣＲを含め、標的の増幅を生じることができる。次いで、試料を、本明細書で述べるＶＦシステムのいずれかに導入することができる。図５１は、細胞培養を示し、本明細書で提供されるシステム及び方法は、限定はしないが組織生検又は体液を含む様々な試料出発材料と適合性がある。図５２は、本明細書で述べるシステムのいずれかを使用した核酸の検出の概略図である。捕捉抗体は、標的核酸配列に特異的な膜に接続される。検出抗体を使用して、捕捉抗体に結合された標的核酸配列の存在を検出することができる。
【０２８３】
[0350]本明細書で提供されるシステム及び方法は、高い特異性を有する。例えば、図５３は、ヌクレオチドスポット（左端のバー）及び陰性スポット（右バー）での陽性試料（１ｍＬの緩衝液で希釈されたＣＤＫＮ１Ａアンプリコン）に関する垂直フローを使用するＣＤＫＮ１Ａの検出を示す。陰性試料（１ｍＬの緩衝液）に関して、統計的に有意な比色信号は検出されない。
【０２８４】
[0351]図５４は、垂直フローデバイスを使用したＣＤＫＮ１Ａ及びＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄの検出に関する結果を要約したものである。このシステムは、陰性試料と、２つの標的のうちの１つだけが存在する試料とによって示されるように、所望の標的に対して高い特異性を有する。
【０２８５】
[0352]本明細書で提供されるシステムは、放射線に曝露された細胞の検出に有用である。図５５の上部パネルは、細胞が３Ｇｙ／分の線量で放射線に曝露されていない（０Ｇｙ）又は曝露されている（５Ｇｙ）、照射プロトコルを要約したものである。ＲＮＡを抽出して増幅し、得られたアンプリコンをアガロースゲル（左下のパネル）又は垂直フローデバイスに通す。アガロースゲルに関して統計的な相違は観察されないが、垂直フローデバイス及び方法によって放射線との有意な違いが確実に検出される。これは、本明細書で提供される方法及びデバイスが非常に感度及び特異性が高く、様々な用途に役立つことを示す。
【０２８６】
[0353]例えば、膜で検出することが可能な遺伝子の数を増やすことができる。さらなる定量化は、例えば、正規化を容易にするために１つ又は複数のハウスキーピング遺伝子を使用することによって実現される。４つの遺伝子を使用する１つの例は以下のものである：（１）ＣＤＫＮ１Ａ（リバース：ビオチン）；（２）ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｄ（リバース：ジゴキシゲニン）；（３）ＤＤＢ２（リバース：ジニトフェニル）；（４）ハウスキーピング遺伝子ＭＲＰＳ５（リバース：Ｃｙ３）。同様に、タンパク質検出のための多重化は、それぞれ関連のタンパク質又はその一部に特異的な異なる捕捉抗体を使用することによって適合性がある。タンパク質検出の例には、莢膜多糖（ＣＰＳ）を標的とする類鼻疽菌の検出が含まれる。他の細胞内タンパク質バイオマーカ（例えば、リンパ球タンパク質ＦＤＸＲ、ＢＡＸ、ＤＤＢ２、及びＡＣＴＮ１）も、本発明の垂直フローデバイスで調べることができる。垂直フローデバイス及びシステムは、血液試料である試料とも適合性がある。
【０２８７】
[0354]例えば等温リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を使用することによって、膜への導入の上流での試料調製を単純化することができる。システムは、流体カートリッジを含む様々なフォームファクタと適合性があり、様々なシステムに統合することができる。例えば、シリンジポンプなどの流体ポンプは、可搬性のある小型で軽量の電源内蔵システムで置き換えることができる。一般的な要件には、約２ｍＬ〜５ｍＬの総体積と、０．２〜０．５ｍＬ／分の範囲の一定の流量が含まれる。例としては、摩擦や流れの変動を低減するための定力ばね及び／又はボールスライドなど、動力がなく、定荷重を加えることが可能な単純でロバストなシステムを挙げることができる。
【参考文献】
【０２８８】
[0355]         AuCoin, D.P., 2012. In vivo microbial antigen discovery:finding the “needle in the haystack.” Expert Rev. Mol. Diagn. 12, 219-221.doi:10.1586/erm.12.8
[0356]         Berger, A.G., Restaino, S.M., White, I.M., 2016. Vertical- flowpaper SERS system for therapeutic drug monitoring of flucytosine in serum.Anal. Chim. Acta 4-11. doi:10.1016/j.aca.2016.10.035
[0357]         Chen, P, Gates-Hollingsworth, M, Pandit, S, Park, A, Montgomery, D,Aucoin, D, Gu, J, and Zenhausern, F, Paper-based Vertical Flow Immunoassay(VFI) for Detection of Bio-threat Pathogens. Talanta, 191, 1, 81-88 (Jan.2019), doi.org: 10.1016/j.talanta.2018.08.043
[0358]         Chinnasamy, T., Segerink, L.I., Nystrand, M., Gantelius, J., Svahn,H.A., 2014. Point-of-care vertical flow allergen microarray assay: Proof of concept.Clin. Chem. 60, 9, 1209-1216. doi:10.1373/clinchem.2014.223230
[0359]         Clarke, O.J.R., Goodall, B.L., Hui, H.P., Vats, N., Brosseau, C.L.,2017. Development of a SERS-Based Rapid Vertical Flow Assay for Point-of- CareDiagnostics. Anal. Chem. doi:10.1021/acs.analchem.6b04710
[0360]         Cook J, Caplan Y, LoDico C, Bush D. The characterization of humanurine for specimen validity determination in workplace drug testing: A review.J. Anal.Toxicol. 2000; 24:579-88.
[0361]         Cretich, M., Torrisi, M., Daminelli, S., Gagni, P., Plavisch, L.,Chiari, M., 2015. Flow-through, viral co-infectionassay for resource-limited settings. Talanta 132, 315- 15   320.doi:10.1016/j.talanta.2014.09.027
[0362]         Currie, B.J., Ward, L., Cheng, A.C., 2010. The Epidemiology andClinical Spectrum of Melioidosis: 540 Cases from the 20 Year Darwin ProspectiveStudy. PLoS Negl. 18, Trop. Dis. 4. doi:10.1371/journal.pntd.0000900
[0363]         de Jager W, Bourcier K, Rijkers GT, Prakken BJ, Seyfert-Margolis V.Prerequisites for cytokine measurements in clinical trials with multipleximmunoassays. BMC Immunol. 2009; 10:52.
[0364]         Desmet, C., Le Goff, G.C., Bres, J.-C., Rigal, D., Blum, L.J., Marquette,C. a, 2011. Multiplexed immunoassay for the rapiddetection of anti-tumor-associated antigens 21       antibodies.Analyst 136, 2918-2924. doi:10.1039/c1an15121e
[0365]         Dimov IK, Basabe-Desmonts L, Garcia-Cordero JL, Ross BM, Ricco AJ,Lee LP. Stand-alone self powered integrated microfluidic blood analysis system(SIMBAS). Lab Chip 2011; 11:845-50.
[0366]         Eltzov, E., Marks, R.S., 2017. Colorimetric stack pad immunoassayfor bacterial identi 23 fi cation. Biosens. Bioelectron. 87, 572-578.doi:10.1016/j.bios.2016.08.044
[0367]         Galligan C, Nichols J, Kvam E, Spooner P, Gettings R, Zhu L, et al.Mesoscale blood cell sedimentation for processing millilitre sample volumes.Lab Chip 2015; 15:3274-7.
[0368]         Gao, R., Ko, J., Cha, K., Ho Jeon, J., Rhie, G.E., Choi, J.,deMello, A.J., Choo, J., 2015. Fast and sensitive detection of an anthraxbiomarker using SERS-based solenoid microfluidic sensor. Biosens. Bioelectron.72, 230-236. 27, doi:10.1016/j.bios.2015.05.005
[0369]         Gong MM, MacDonald BD, Trung Vu Nguyen, Kinh Van Nguyen, Sinton D.Field tested milliliterscale blood filtration device for point-of-careapplications. Biomicrofluidics 2013; 7:044111
[0370]         Harendarcikova, L., Baron, D., Sebestova, A., Rozsypal, J., Petr,J., 2017. True lab-in-a-syringe technology for bioassays. Talanta 174, 285-288.30   doi:10.1016/j.talanta.2017.06.017
[0371]         He, Y., Zeng, K., Zhang, S., Gurung, A.S., Baloda, M., Zhang, X.,Liu, G., 2012. Visual detection of gene mutations based on isothermalstrand-displacement polymerase reaction and lateral flow strip. Biosens.Bioelectron. 31, 310-315. 34, doi:10.1016/j.bios.2011.10.037
[0372]         Helene, S., Svahn, A., 2014. A lateral flow paper microarray forrapid allergy point of care diagnostics. Analyst. doi:10.1039/c3an01806g
[0373]          Henderson, K., Stewart, J., 2002. Factors influencing themeasurement of oestrone sulphate by dipstick particle capture immunoassay. J.Immunol. Methods 270, 77- 3, 84. doi:10.1016/S0022-1759(02)00280-6
[0374]         Higgins, J.A., Ibrahim, M.S., Knauert, F.K., Ludwig, G. V, Kijek,T.M., Ezzell, J.W., Courtney, B.C., Henchal, E. a, 1999. Sensitive and rapididentification of biological threat agents. Ann. N. Y. Acad. Sci. 894, 130-148.doi:10.1111/j.1749- 76632.1999.tb08056.x
[0375]         Houghton, R.L., Reed, D.E., Hubbard, M.A., Dillon, M.J., Chen, H.,Currie, B.J., Mayo, M., Sarovich, D.S., Theobald, V., Limmathurotsakul, D.,Wongsuvan, G., Chantratita, N., Peacock, S.J., Hoffmaster, A.R., Duval, B.,Brett, P.J., Burtnick, M.N., AuCoin, D.P., 2014. Development of a PrototypeLateral Flow Immunoassay (LFI) for the Rapid Diagnosis of Melioidosis. PLoSTrop. Dis. 8. 13, doi:10.1371/journal.pntd.0002727
[0376]         Hu, J., Wang, S., Wang, L., Li, F., Pingguan-murphy, B., Jian, T.,Xu, F., 2014. Advances in paper-based point-of-care diagnostics. Biosens.Bioelectron. 54, 585- 16, 597. doi:10.1016/j.bios.2013.10.075
[0377]         Indrasekara, A. S. D. S.; Johnson, S. F.; Odion, R. A.; Vo-Dinh, T.Manipulation of the Geometry and Modulation of the Optical Response ofSurfactant-Free Gold Nanostars: A Systematic Bottom-Up Synthesis
[0378]         Indrasekara, A. S. D. S.; Meyers, S.; Shubeita, S.; Feldman, L. C.;Gustafsson, T.; Fabris, L. Gold Nanostar Substrates for SERS-Based ChemicalSensing in the Femtomolar Regime Nanoscale 2014, 6, 8891- 8899 DOI:10.1039/C4NR02513J
[0379]         Jansen, H.J., Breeveld, F.J., Stijnis, C., Grobusch, M.P., 2014.Biological warfare, bioterrorism, and biocrime. Clin. Microbiol. Infect. 20, 488-496.19 doi:10.1111/1469-0691.12699
[0380]         Jiang H, Weng X, Chon CH, Wu X, Li D. A microfluidic chip for bloodplasma separation using electro-osmotic flow control. J MicromechMicroengineering 2011; 21:085019.
[0381]         Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H., 2014.Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays:Shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37.doi:10.1016/j.cbpa.2013.11.012
[0382]         Kim B, Oh S, You D, Choi S. Microfluidic Pipette Tip for High-Purityand High-Throughput Blood Plasma Separation from Whole Blood. Anal.Chem. 2017;89:1439-44.
[0383]         Kuo J, Zhan Y. Microfluidic chip for rapid and automatic extractionof plasma from whole human blood. Microsyst.Technol. 2015; 21:255-61.
[0384]         Lacombe J, Sima C, Amundson SA, Zenhausern F. Candidate gene biodosimetry markers of exposure to external ionizing radiation in human blood: Asystematic review. PLoS One. 2018 Jun 7;13(6):e0198851
[0385]         Lafleur, L., Stevens, D., Mckenzie, K., Ramachandran, S.,Spicar-Mihalic, P., Singhal, M., Arjyal, A., Osborn, J., Kauffman, P., Yager,P., Lutz, B., 2012. Progress toward multiplexed sample-to-result detection inlow resource settings using microfluidic immunoassay cards. Lab Chip 12, 1119-1127.27, doi:10.1039/c2lc20751f
[0386]         Lakoff, A., 2008. The Generic Threat, or how we became unprepared.Cult. Anthropol. 29, 23, 399-428. doi:10.1525/can.2008.23.3.399.C
[0387]         Lenshof A, Ahmad-Tajudin A, Jaras K, Sward-Nilsson A, Aberg L,Marko-Varga G, et al. Acoustic Whole Blood Plasmapheresis Chip for ProstateSpecific Antigen Microarray Diagnostics. Anal.Chem. 2009; 81:6030-7.
[0388]         Li, C.Z., Vandenberg, K., Prabhulkar, S., Zhu, X., Schneper, L.,Methee, K., Rosser, C.J., Almeide, E., 2011. Paper based point-of-care testingdisc for multiplex whole cell bacteria analysis. Biosens. Bioelectron. 26, 4342-4348.33    doi:10.1016/j.bios.2011.04.035
[0389]         Li, Z., Wang, Y., Wang, J., Tang, Z., Pounds, J.G., Lin, Y., 2010.Rapid and Sensitive Detection of Protein Biomarker Using a PortableFluorescence Biosensor Based on Quantum Dots and a Lateral Flow Test Strip.Anal. Chem. 82, 7008-7014.
[0390]         Limmathurotsakul, D., Golding, N., Dance, D.A.B., Messina, J.P.,Pigott, D.M., Moyes, C.L., Rolim, D.B., Bertherat, E., Day, N.P.J., Peacock,S.J., Hay, S.I., 2016. Predicted global distribution of Burkholderiapseudomallei and burden of melioidosis. Nat. Microbiol. 1, 6-10.doi:10.1038/nmicrobiol.2015.8
[0391]         Limmathurotsakul, D., Jamsen, K., Arayawichanont, A., Simpson, J.A.,White, L.J., Lee, S.J., Wuthiekanun, V., Chantratita, N., Cheng, A., Day,N.P.J., Verzilli, C., Peacock, S.J., 2010a. Defining the True Sensitivity ofCulture for the Diagnosis of Melioidosis Using Bayesian Latent Class Models.PLoS One 5. 6  doi:10.1371/journal.pone.0012485
[0392]         Limmathurotsakul, D., Wongratanacheewin, S., Teerawattanasook, N.,Wongsuvan, G., 2010b. Increasing Incidence of Human Melioidosis in NortheastThailand. Am. J. 9 Trop. Med. Hyg. 82, 1113-1117.doi:10.4269/ajtmh.2010.10-0038
[0393]         Liu C, Liao S, Song J, Mauk MG, Li X, Wu G, et al. A high-efficiency superhydrophobic plasma separator. Lab Chip 2016;16:553-60.
[0394]         Liu, G., Mao, X., Phillips, J.A., Xu, H., Tan, W., Zeng, L., 2009. Aptamer-Nanoparticle Strip Biosensor for Sensitive Detection of Cancer Cells. Anal.Chem. 12        81, 10013-10018. 
[0395]         Liu, Y.; Ashton, J. R.; Moding, E. J.; Yuan, H.; Register, J. K.;Fales, A. M.; Choi, J.; Whitley, M. J.; Zhao, X.;Qi, Y.; Ma, Y.; Vaidyanathan,G.; Zalutsky, M. R.; Kirsch, D. G.; Badea, C. T.; Vo-Dinh, T. A Plasmonic GoldNanostar Theranostic Probe for In Vivo Tumor Imaging and Photothermal TherapyTheranostics 2015, 5,946- 960 DOI: 10.7150/thno.11974
[0396]         Lu, Y., Shi, W., Qin, J., Lin, B., 2010. Fabricationand characterization of paper-based microfluidics prepared in nitrocellulosemembrane by Wax printing. Anal. Chem. 15, 82, 329-335. doi:10.1021/ac9020193
[0397]         Lu et al. Sci Rep. 2014 
[0398]         Lucas, J, Dressman, H, Suchindran, S, Nakamura, M, Chao, N, Himburg, H,Minor, K, Phillips, G, Ross, J, Abedi, M, Terbrueggen, R, Chute, J, PlosOne, 9,9 (Sept. 2014) doi.org/10.1371/journal.pone.0107897
[0399]         LW, C., LJ, C., JA, P., EM, E., Jr, 1997. Biological warfare: Ahistorical perspective. 17 JAMA 278, 412-417.
[0400]         Mu, X., Zhang, L., Chang, S., Cui, W., Zheng, Z., 2014. Multiplexmicrofluidic paper-based immunoassay for the diagnosis of hepatitis C virus infection.Anal. Chem. 2086, 5338-5344. doi:10.1021/ac500247f
[0401]         Nuti, D.E., Crump, R.B., Handayani, F.D., Chantratita, N., Peacock,S.J., Bowen, R., Felgner, P.L., Davies, D.H., Wu, T., Lyons, C.R., Brett, P.J.,Burtnick, M.N., Kozel, T.R., AuCoina, D.P., 2011. Identification of circulatingbacterial antigens by in vivo microbial antigen discovery. MBio 2, 1-8.doi:10.1128/mBio.00136-11
[0402]         Oh, Y.K., Joung, H.-A., Kim, S., Kim, M.-G., 2013. Vertical flowimmunoassay (VFA) biosensor for a rapid one-step immunoassay. Lab Chip 13, 768-72.27 doi:10.1039/c2lc41016h
[0403]         Park, J., Park, J.K., 2017. Pressed region integrated 3D paper-basedmicrofluidic device that enables vertical flow multistep assays for thedetection of C-reactive protein based on programmed reagent loading. SensorsActuators, B Chem. 246, 1049- 31   1055.doi:10.1016/j.snb.2017.02.150
[0404]         Parolo, C., Arben Merkoci, 2013. Paper-based nanobiosensors for diagnostics.Chem 33 Soc Rev 450-457. doi:10.1039/c2cs35255a
[0405]         Pauli, G.E.N., Escosura-muniz, A. De, Parolo, C., Bechtold, I.H.,Merkoci, A., 2015. Lab-in-a-syringe using gold nanoparticles for rapidimmunosensing of protein 36 biomarkers. Lab Chip 15, 399-405.doi:10.1039/C4LC01123F
[0406]         Perry, M.B., Lean, M., Schollaardt, T., Bryan, L.E., Ho, M., 1995.Structural Characterization of the Lipopolysaccharide O Antigens ofBurkholderia pseudomallei. Infect. Immun. 63, 3348-3352.
[0407]         Posthuma-Trumpie, G.A., Korf, J., Van Amerongen, A., 2009. Lateralflow (immuno)assay: Its strengths, weaknesses, opportunities and threats. Aliterature 4 survey. Anal. Bioanal. Chem. 393, 569-582.doi:10.1007/s00216-008-2287-2
[0408]         Ramachandran, S., Singhal, M., McKenzie, K., Osborn, J., Arjyal, A.,Dongol, S., Baker, S., Basnyat, B., Farrar, J., Dolecek, C., Domingo, G., Yager,P., Lutz, B., 2013. A Rapid, Multiplexed, High-Throughput Flow-Through MembraneImmunoassay: A Convenient Alternative to ELISA. Diagnostics 3, 244-260. 9 doi:10.3390/diagnostics3020244
[0409]         Reutersward, P., Gantelius, J., Andersson Svahn, H., 2015. An 8 minute colorimetric paper-based reverse phase vertical flowserum microarray for screening of hyper 12 IgE syndrome. Analyst 140, 7327-7334.doi:10.1039/C5AN01013F
[0410]         Rivas, L., De, E.A., Serrano, L., Altet, L., Francino, O., Sanchez, A.,Merkoci, A., 2015. Triple lines gold nanoparticle-basedlateral flow assay for enhanced and simultaneous detection of Leishmania DNAand endogenous control. Nano Res. 8, 16 3704-3714.doi:10.1007/s12274-015-0870-3
[0411]         Robertson, G., Sorenson, A., Govan, B., Ketheesan, N., Houghton, R.,Chen, H., Aucoin, D., Dillon, M., Norton, R., 2015. Rapid diagnostics formelioidosis: A comparative study of a novel lateral flow antigen detection assay.J. Med. Microbiol. 64, 845-848. doi:10.1099/jmm.0.000098
[0412]         Rosenberg-Hasson Y, Hansmann L, Liedtke M, Herschmann I, Maecker HT.Effects of serum and plasma matrices on multiplex immunoassays. Immunol.Res.2014; 58:224-33.
[0413]         Safenkova, I. V, Pankratova, G.K., Zaitsev, I.A., Varitsev, Y.A.,Vengerov, Y.Y., Zherdev, A. V, Dzantiev, B.B., 2016. Multiarray on a test strip( MATS ): rapid multiplex immunodetection of priority potato pathogens. Anal.Bioanal. Chem. 24 6009-6017. doi:10.1007/s00216-016-9463-6
[0414]         Schlappi, T.S., McCalla, S.E., Schoepp, N.G., Ismagilov, R.F., 2016.Flow-through Capture and in Situ Amplification Can Enable Rapid Detection of aFew Single Molecules of Nucleic Acids from Several Milliliters of Solution.Anal. Chem. 88, 7647-7653. doi:10.1021/acs.analchem.6b01485
[0415]         Sirisinha, S., Anuntagool, N., Dharakul, T., 2000. Recentdevelopments in laboratory diagnosis of melioidosis. Acta Trop. 74, 235-245.
[0416]         Squires, T.M., Messinger, R.J., Manalis, S.R., 2008. Making itstick: convection, reaction and diffusion in surface-based biosensors. Nat.Biotechnol. 26, 417-426. doi:10.1038/nbt1388
[0417]         Sviridov D, Hortin GL. Urine albumin measurement: Effects of urinematrix constituents. Clinica Chimica Acta 2009; 404:140-3.
[0418]         Tate J, Ward G. Interferences in immunoassay. The Clinicalbiochemist. Reviews 2004; 25:105-20.
[0419]         Wang, H.-N.; Crawford, B. M.; Fales, A. M.; Bowie, M. L.; Seewaldt,V. L.; Vo-Dinh, T. Multiplexed Detection of MicroRNA Biomarkers UsingSERS-Based Inverse Molecular Sentinel (iMS) Nanoprobes J. Phys. Chem. C 2016,120, 21047- 21055 DOI: 10.1021/acs.jpcc.6b03299
[0420]         Warren, A.D., Kwong, G.A., Wood, D.K., Lin, K.Y., Bhatia, S.N.,2014. Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using syntheticurinary biomarkers and paper microfluidics. Proc. Natl. Acad. Sci. 111.doi:10.1073/pnas.1314651111
[0421]         Wiersinga, W.J., Currie, B.J., Peacock, S.J., 2012. Melioidosis. N.Engl. J. Med. 1035-1044. doi:10.1056/NEJMra1204699
[0422]         Wood MW, Nordone SK, Vaden SL, Breitschwerdt EB. Assessment of urinesolute and matrix effects on the performance of an enzyme-linked immunosorbentassay for measurement of interleukin-6 in dog urine. J. Vet.Diagn.Invest. 2011;23:316-20.
[0423]         Yetisen, A.K., Akram, M.S., Lowe, C.R., 2013. Paper-basedmicrofluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip 13, 2210-51.doi:10.1039/c3lc50169h
[0424]         Yuan, H.; Fales, A. M.; Vo-Dinh, T. TAT Peptide-Functionalized GoldNanostars: Enhanced Intracellular Delivery and Efficient NIR PhotothermalTherapy Using Ultralow Irradiance J. Am. Chem. Soc. 2012, 134,11358- 11361 DOI:10.1021/ja304180y
[0425]         Yuan, H.; Khoury, C. G.; Hwang, H.; Wilson, C. M.; Grant, G. A.;Vo-Dinh, T. Gold Nanostars: Surfactant-Free Synthesis, 3D Modelling, andTwo-Photon Photoluminescence Imaging Nanotechnology 2012,23075102 DOI:10.1088/0957-4484/23/7/075102
[0426]         Zimmermann, M., Delamarche, E., Wolf, M., Hunziker, P., 2005.Modeling and optimization of high-sensitivity, low-volume microfluidic-basedsurface immunoassays. Biomed. Microdevices 7, 99-110.doi:10.1007/s10544-005-1587-y
【０２８９】
（参照による組み込みに関する記述及び変形形態）
[0427]本出願全体にわたる全ての参照、例えば、発行又は付与された特許若しくは均等物を含む特許文書；特許出願公開；及び非特許文献又は他の原資料は、各参考文献が本出願の開示と少なくとも部分的に矛盾しない範囲で、参照により個別に組み込まれているかのように、それらの全体を参照により本明細書に組み込む（例えば、一部矛盾する参考文献は、その参考文献の一部矛盾する部分を除いて参照により組み込まれる）。
【０２９０】
[0428]本明細書で採用されている用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定ではない。そのような用語及び表現の使用には、図示されて述べられている特徴又はその一部の均等物を除外する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識されている。したがって、本発明は、好ましい実施形態、例示的な実施形態、及び任意選択的な特徴によって具体的に開示されているが、当業者は、本明細書に開示される概念の修正及び変形に依拠することもでき、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義されているように本発明の範囲内にあるとみなされる。本明細書で提供される特定の実施形態は、本発明の有用な実施形態の例であり、本発明が、本明細書に記載されたデバイス、デバイス構成要素、方法ステップの多くの変形形態を使用して実施することができることが当業者には明らかである。当業者には明らかであるように、本発明の方法に有用な方法及びデバイスは、多数の任意選択的な組成物及び処理要素及びステップを含むことができる。
【０２９１】
[0429]本明細書において１群の置換が開示されるとき、その群の全ての個々の要素及び全てのサブグループが別々に開示されることが理解される。本明細書でマーカッシュ群又は他のグループ化が使用されるとき、グループの全ての個々の要素、及びグループの取り得る全ての組合せ及び部分組合せが本開示に個別に含まれることが意図されている。
【０２９２】
[0430]本明細書において記載又は例示されるあらゆる製剤又は成分の組合せは、特に明記しない限り、本発明を実施するために使用することができる。
【０２９３】
[0431]本明細書で範囲が与えられているときは常に、例えば、サイズ範囲、数値範囲、孔径範囲、多孔率範囲、厚さ範囲、ＬＯＤ範囲、温度範囲、時間範囲、流量範囲、又は組成若しくは濃度範囲、全ての中間範囲及びサブ範囲、並びに与えられた範囲に含まれる全ての個々の値が本開示に含まれることを意図されている。本明細書の説明に含まれる範囲又は部分範囲内の任意の部分範囲又は個々の値は、本明細書における特許請求の範囲から除外することができることを理解されたい。
【０２９４】
[0432]本明細書に記載されている全ての特許及び公開物は、本発明が関係する分野の当業者の技術レベルを示している。本明細書で引用される参考文献は、それらの公開日又は出願日現在の技術水準を示すために、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、この情報は、必要であれば、先行技術における特定の実施形態を除外するように本明細書で使用できることが意図されている。例えば、物質の組成が特許請求される場合、本明細書に引用された参考文献において実施可能な開示がなされている化合物を含め、本出願人の発明の前に当技術分野で知られており利用可能な化合物は、本明細書における物質の組成クレームに含まれないことが意図されている。
【０２９５】
[0433]本明細書で使用するとき、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であり、非限定的（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ又はｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であり、引用されていない追加の要素又は方法ステップを除外しない。本明細書で使用するとき、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、クレーム要素で指定されていない要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書で使用するとき、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲の基本的且つ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップを除外しない。本明細書における各場合において、「備える」、「本質的にからなる」、及び「からなる」という用語の任意のものを、他の２つの用語のいずれかで置き換えることができる。本明細書で例示的に述べられる本発明は、適切には、任意の要素がない状態で実施することができ、本発明の限定は本明細書に特に開示されていない。
【０２９６】
[0434]具体的に例示されたもの以外の出発材料、生物学的材料、試薬、合成方法、精製方法、分析方法、アッセイ方法、及び生物学的方法を、必要以上の実験に頼ることなく本発明の実践において使用できることを当業者は理解されよう。そのような材料及び方法の全ての当技術分野で知られている機能的等価物は、本発明に含まれることが意図されている。採用されている用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定ではない。そのような用語及び表現の使用には、図示されて述べられている特徴又はその一部の均等物を除外する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識されている。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択的な特徴によって具体的に開示されているが、当業者は、本明細書に開示される概念の修正及び変形に依拠することもでき、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義されているように本発明の範囲内にあるとみなされる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【国際調査報告】
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