(57)【要約】CD152結合ドメインを含む単離されたモノクローナル抗体が開示されCD152結合ドメインを含む単離されたモノクローナル抗体が開示されており、該抗体はヒトCD152に特異的に結合する。癌および自己免疫疾患を含む疾患を治療するための抗体を作製および使用する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD152結合ドメインを含む単離されたモノクローナル抗体であって、該CD152結合ドメインは、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、CDR1、CDR2、およびCDR3は、
（1）それぞれ配列番号4、5、6；
（2）それぞれ配列番号10、11および12；
（3）それぞれ配列番号16、17および18；
（4）それぞれ配列番号22、23および24；
（5）それぞれ配列番号28、29および30；
（6）それぞれ配列番号34、35および36；
（7）それぞれ配列番号40、41および42；
（8）それぞれ配列番号46、47および48；
（9）それぞれ配列番号52、53および54；
（10）それぞれ配列番号58、59および60；
（11）それぞれ配列番号64、65および66；
（12）それぞれ配列番号70、71および72；
（13）それぞれ配列番号76、77および78；
（14）それぞれ配列番号82、83および84；
（15）それぞれ配列番号88、89および90；
（16）それぞれ配列番号94、95および96；
（17）それぞれ配列番号100、101および102；
（18）それぞれ配列番号106、107および108；
（19）それぞれ配列番号112、113および114；
（20）それぞれ配列番号118、119および120；
（21）それぞれ配列番号124、125および126；
（22）それぞれ配列番号130、131および132；
（23）それぞれ配列番号136、137および138；
（24）それぞれ配列番号142、143および144；
（25）それぞれ配列番号148、149および150；
（26）それぞれ配列番号154、155および156；
（27）それぞれ配列番号160、161および162；
（28）それぞれ配列番号166、167および168；
（29）それぞれ配列番号172、173および174；
（30）それぞれ配列番号178、179および180；
（31）それぞれ配列番号184、185および186；または
（32）それぞれ配列番号190、191および192
と少なくともと80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
該抗体が重鎖のみの抗体である、請求項０に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
該抗体が2つの免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
該抗体が2つの免疫グロブリン重鎖から構成される、請求項０から３のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項５】
2つの免疫グロブリン重鎖の少なくとも1つが、配列番号2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128 、134、140、146、152、158、164、170、176、182、または188と少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３または４に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項６】
免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183、または189と少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項０から５のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項７】
以下の特性の1つまたはそれ以上を示す、請求項０から６のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体：（a）ヒトCD152に特異的に結合する；（b）サルCD152に特異的に結合する；（c）マウスCD152に特異的に結合しない；（d）CD152のCD80、CD86、またはその両方への結合をブロックする；（e）免疫細胞によるIL-2の分泌を促進する；（f）T細胞の活性化を誘導する；（g）免疫細胞による抗腫瘍免疫応答を刺激する。
【請求項８】
以下の特性の1つまたはそれ以上を示す、請求項０から７のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体：（a）イピリムマブ類似体よりも高い親和性でヒトCD152に結合する；（b）イピリムマブ類似体より少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高い親和性でヒトCD152に結合する；（c）1.0*10-9M以下のKdでヒトCD152から解離する；（d）イピリムマブ類似体よりも低いKdでヒトCD152から解離する；（e）イピリムマブ類似体よりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍低いKdでヒトCD152から解離する。
【請求項９】
6.0＊10-11M以下のKdでヒトCD152から解離する、請求項１から８のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１０】
該抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１から９のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項０に記載の単離されたモノクローナル抗体、およびその薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容される賦形剤が、担体、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存剤、等張剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
二次抗体をさらに含み、該二次抗体が免疫刺激抗体またはコスティミュラトリー抗体である、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
免疫刺激抗体が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM3抗体、抗STAT3抗体、および抗ROR1抗体からなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
コスティミュラトリー抗体が抗CD137抗体または抗GITR抗体である、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項０からのいずれか１項に記載の単離された抗体をコードする核酸分子。
【請求項１７】
配列番号1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、163、169、175、181、または187に対して少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
請求項０６または１７に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、該核酸分子が、宿主細胞において該核酸分子の発現に適した調節配列に作動可能に連結されている、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
腫瘍関連抗原を発現する細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ADCC）を誘導する方法であって、該方法が、T細胞を請求項０から１０のいずれか１項に記載の単離された抗体と接触させることを含み、該接触が、腫瘍関連抗原を発現する細胞に対するADCCが誘導される条件下で行われる、方法。
【請求項２１】
障害を治療するための医薬品の製造における、請求項０から１０のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体または請求項１１から１５のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用であって、該障害が癌または自己免疫疾患である、使用。
【請求項２２】
該障害が癌である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２３】
癌が、白血病、リンパ腫、CLL、小リンパ球性リンパ腫、辺縁細胞B細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２４】
医薬品がさらなる治療薬をさらに含む、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
さらなる治療薬が抗癌剤である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２６】
さらなる治療薬がイピリムマブおよびそのバイオシミラー製品である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２７】
癌障害が自己免疫疾患である、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクロ−ナル抗CTLA−4抗体、該抗体をコ−ドする核酸、該核酸を含む発現ベクタ−および組換え細胞、ならびに該抗体を含む医薬組成物に関する。該抗体を製造する方法、および該抗体を使用して癌および自己免疫疾患を含む疾患を治療する方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
癌治療の最近の進歩である癌免疫療法は、腫瘍細胞を攻撃するために患者自身の免疫系を利用する。腫瘍微小環境での堅牢なCD8 T細胞依存性細胞毒性応答の促進は、効果的な抗腫瘍免疫応答の生成に重要である。しかしながら、腫瘍はT細胞抑制機構を利用して免疫監視を回避する傾向がある。腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）の枯渇は、細胞障害性T細胞のアネルギ−と腫瘍細胞の脱出をもたらす（WherryおよびKurachi, 2015, Nat Rev Immunol., 2015, 15: 486−499；DyckおよびMills, 2017, Eur. J. Immunol., 47(5): 765−779）。
【０００３】
免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、転移性黒色腫、肺癌、乳癌、腎細胞癌などのさまざまな腫瘍を治療する可能性がある。CTLA−4（CD152）は、T細胞の表面にあるそのような抑制性チェックポイント分子である。もともとは、マウスの細胞溶解性T細胞cDNAライブラリ−のディファレンシャルスクリ−ニングによって同定された（Brunetら、1987、Nature、328：267−270）。CTLA−4はT細胞活性化の負の調節因子として機能できることが示唆されている（Walunasら、1994, Immunity, 1:405−413）。CTLA−4は制御性T細胞の表面に構成的に発現しているが、その量は比較的少量である。T細胞の活性化時にアップレギュレ−ションされる。活性化すると、CTLA−4は、CD28のリガンドでもあるCD80（B7.1）およびCD86（B7.2）と相互作用し、CD28よりもはるかに高い結合親和性を示す（van der Merweら、1997, J Exp Med. 185: 393−403；Alegreら、2001, Nat Rev Immunol, 1; 220−228）。CD28シグナル伝達はT細胞の活性化を促進するが、CTLA−4とそのリガンドB7.1およびB7.2の相互作用は、T細胞のさらなる活性化を妨げる。
【０００４】
CTLA−4拮抗薬は、該拮抗薬によるCTLA−4の遮断が腫瘍に対する効果的な治療法として示されているため、魅力的である（米国特許第6,984,720号）。抗CTLA−4mAbなどのアンタゴニストを使用したこの表面受容体の阻害は、エフェクタ−CD4およびCD8 T細胞応答を増強し、Treg細胞の抑制機能を低下させた。CTLA−4拮抗薬ベ−スの治療は、近年急速に進歩した。イピリムマブ（VERYORR）はヒト化抗体であり、CTLA−4の効果をブロックし、このことが腫瘍細胞に対するT細胞の反応を増強する。イピリムマブは、無作為化対照第3相試験で転移性黒色腫患者の全生存期間の改善を示した最初の薬剤であった。それは、以前に他の治療を受けた患者で単剤療法として3mg/kgの投与量で、治療歴のない患者ではダカルバジンと組み合わせて10mg/kgの投与量で扱いやすい安全性プロファイルを有している。悪性黒色腫に加えて、イピリムマブはまた前立腺癌および非小細胞肺癌の治療のためにも開発中である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記の進歩にもかかわらず、親和性、特異性および開発可能性が改善されたCTLA−4アンタゴニストが望まれている。さらに、CTLA−4シグナル伝達活性を効果的に阻害する一方で、ヒトに最小限の副作用を引き起こす抗CTLA−4抗体を含むより効果的な治療法も必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
CD152結合ドメインを含む単離されたモノクロ−ナル抗体が開示され、該CD152結合ドメインは、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、CDR1、CDR2、およびCDR3は、（1）それぞれ配列番号4、5、6；（2）それぞれ配列番号10、11および12；（3）それぞれ配列番号16、17および18；（4）それぞれ配列番号22、23および24；（5）それぞれ配列番号28、29および30；（6）それぞれ配列番号34、35および36；（7）それぞれ配列番号40、41および42；（8）それぞれ配列番号46、47および48；（9）それぞれ配列番号52、53および54；（10）それぞれ配列番号58、59および60；（11）それぞれ配列番号64、65および66；（12）それぞれ配列番号70、71および72；（13）それぞれ配列番号76、77および78；（14）それぞれ配列番号82、83および84；（15）それぞれ配列番号88、89および90；（16）それぞれ配列番号94、95および96；（17）それぞれ配列番号100、101および102；（18）それぞれ配列番号106、107および108；（19）それぞれ配列番号112、113および114；（20）それぞれ配列番号118、119および120；（21）それぞれ配列番号124、125および126；（22）それぞれ配列番号130、131および132；（23）それぞれ配列番号136、137および138；（24）それぞれ配列番号142、143および144；（25）それぞれ配列番号148、149および150；（26）それぞれ配列番号154、155および156；（27）それぞれ配列番号160、161および162；（28）それぞれ配列番号166、167および168；（29）それぞれ配列番号172、173および174；（30）それぞれ配列番号178、179および180；（31）それぞれ配列番号184、185および186；または（32）それぞれ配列番号190、191および192と少なくともと80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００７】
場合によっては、抗体は重鎖のみの抗体である。場合によっては、抗体は免疫グロブリン軽鎖を含まない。場合によっては、抗体は1つの免疫グロブリン重鎖を含む。場合によっては、抗体は2つの免疫グロブリン重鎖を含む。場合によっては、抗体は2つの免疫グロブリン重鎖から構成される。場合によっては、2つの免疫グロブリン重鎖の少なくとも1つは、配列番号2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128 、134、140、146、152、158、164、170、176、182、または188と少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００８】
場合によっては、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183、または189と少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０００９】
場合によっては、抗体はヒトCD152に特異的に結合する。場合によっては、抗体はヒトCD152に高い親和性で結合する。場合によっては、抗体はイピリムマブ類似体よりも高い親和性でヒトCD152に結合する。場合によっては、抗体はイピリムマブ類似体より少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高い親和性でヒトCD152に結合する。
【００１０】
場合によっては、抗体は1.0*10−7M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、抗体は1.0*10−8M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、抗体は1.0*10−9M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、抗体は1.0*10−10M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、抗体は1.0*10−11M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、Kdは6.0*10−11M以下である。場合によっては、抗体はヒトCD152から、イピリムマブ類似体よりも低いKdで解離する。場合によっては、抗体は、イピリムマブ類似体よりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍低いKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、Kdは表面プラズモン共鳴によって決定される。
【００１１】
場合によっては、抗体はサルCD152に特異的に結合する。場合によっては、抗体はサルCD152に特異的に結合しない。場合によっては、抗体はCD152のCD80、CD86、またはその両方への結合をブロックする。場合によっては、抗体は免疫細胞によるIL−2の分泌を促進する。場合によっては、抗体はT細胞の活性化を誘導する。場合によっては、抗体は免疫細胞による抗腫瘍免疫応答を刺激する。場合によっては、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
【００１２】
別の側面において、本明細書に開示されるのは、CD152結合ドメインを含む単離されたモノクロ−ナル重鎖のみの抗体であり、該抗体はヒトCD152に特異的に結合する。場合によっては、抗体は免疫グロブリン軽鎖を含まない。場合によっては、抗体は1つの免疫グロブリン重鎖を含む。場合によっては、抗体は2つの免疫グロブリン重鎖を含む。場合によっては、抗体は2つの免疫グロブリン重鎖から構成される。
【００１３】
場合によっては、抗体はヒトCD152に高い親和性で結合する。場合によっては、抗体はイピリムマブ類似体よりも高い親和性でヒトCD152に結合する。場合によっては、抗体はイピリムマブ類似体より少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高い親和性でヒトCD152に結合する。
【００１４】
場合によっては、抗体は1.0*10−7M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、抗体は1.0＊10−8M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、抗体は1.0＊10−9M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、抗体は1.0＊10−10M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、抗体は1.0＊10−11M以下のKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、Kdは6.0＊10−11M以下である。場合によっては、抗体は、イピリムマブ類似体よりも低いKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、抗体は、イピリムマブ類似体よりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍低いKdでヒトCD152から解離する。場合によっては、Kdは表面プラズモン共鳴によって決定される。
【００１５】
場合によっては、抗体はサルCD152に特異的に結合する。場合によっては、抗体はサルCD152に特異的に結合しない。場合によっては、CD152結合ドメインは、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、CDR1、CDR2、およびCDR3は、（1）それぞれ配列番号4、5、6；（2）それぞれ配列番号10、11および12；（3）それぞれ配列番号16、17および18；（4）それぞれ配列番号22、23および24；（5）それぞれ配列番号28、29および30；（6）それぞれ配列番号34、35および36；（7）それぞれ配列番号40、41および42；（8）それぞれ配列番号46、47および48；（9）それぞれ配列番号52、53および54；（10）それぞれ配列番号58、59および60；（11）それぞれ配列番号64、65および66；（12）それぞれ配列番号70、71および72；（13）それぞれ配列番号76、77および78；（14）それぞれ配列番号82、83および84；（15）それぞれ配列番号88、89および90；（16）それぞれ配列番号94、95および96；（17）それぞれ配列番号100、101および102；（18）それぞれ配列番号106、107および108；（19）それぞれ配列番号112、113および114；（20）それぞれ配列番号118、119および120；（21）それぞれ配列番号124、125および126；（22）それぞれ配列番号130、131および132；（23）それぞれ配列番号136、137および138；（24）それぞれ配列番号142、143および144；（25）それぞれ配列番号148、149および150；（26）それぞれ配列番号154、155および156；（27）それぞれ配列番号160、161および162；（28）それぞれ配列番号166、167および168；（29）それぞれ配列番号172、173および174；（30）それぞれ配列番号178、179および180；（31）それぞれ配列番号184、185および186；または（32）それぞれ配列番号190、191および192と少なくともと80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１６】
場合によっては、CD152結合ドメインは少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖を含み、免疫グロブリン重鎖は配列番号2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182、または188と少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。場合によっては、免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183、または189と少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１７】
場合によっては、抗体はCD152のCD80、CD86、またはその両方への結合をブロックする。場合によっては、抗体は免疫細胞によるIL−2の分泌を促進する。場合によっては、抗体はT細胞の活性化を誘導する。場合によっては、抗体は免疫細胞による抗腫瘍免疫応答を刺激する。場合によっては、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
【００１８】
別の側面では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される任意の抗体、およびその薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は、担体、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コ−ティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存剤、等張剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。場合によっては、医薬組成物は、二次抗体をさらに含み、二次抗体は、免疫刺激抗体またはコスティミュラトリ−抗体である。場合によっては、免疫刺激抗体は、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、抗LAG−3抗体、抗TIM3抗体、抗STAT3抗体、および抗ROR1抗体からなる群から選択される。場合によっては、コスティミュラトリ−抗体は抗CD137抗体または抗GITR抗体である。
【００１９】
別の側面では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される抗体をコ−ドする単離された核酸分子である。場合によっては、核酸分子は、配列番号1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、163、169、175、181、または187に対して少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、核酸分子は、配列番号1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、163、169、175、181、または187に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
別の側面では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される抗体をコ−ドする核酸セグメントを含む発現ベクタ−であり、該核酸セグメントは、宿主細胞において核酸セグメントの発現に適した調節配列に作動可能に連結されている。場合によっては、核酸セグメントは、配列番号1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、163、169、175、181、または187に対して少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。場合によっては、核酸セグメントは、配列番号1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、163、169、175、181、または187に示されるヌクレオチド配列を含む。。
【００２１】
別の側面では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示される発現ベクタ−を含む宿主細胞である。
【００２２】
別の側面では、本明細書に開示されるのは、CD152結合モノクロ−ナル抗体の製造方法であって、この方法は、核酸セグメントが発現される条件下で発現ベクタ−を含む宿主細胞を培養し、それによりCD152結合モノクロ−ナル抗体を産生することを含む。 場合によっては、宿主細胞はCHO、HEK293、またはCOS宿主細胞株である。場合によっては、CHO宿主細胞株はCHO−K1細胞株である。場合によっては、該方法は、CD152結合モノクロ−ナル抗体を回収することをさらに含む。
【００２３】
別の側面では、本明細書に開示されるのは、腫瘍関連抗原を発現する細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ADCC）を誘導する方法であって、この方法は、T細胞を本明細書に開示される抗体と接触させることを含み、該接触は、腫瘍関連抗原を発現する細胞に対するADCCが誘導される条件下で行われる。
【００２４】
別の側面では、本明細書に開示されるのは、対象の障害を治療する方法であって、該方法は、本明細書に開示される抗体または本明細書に開示される医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む。場合によっては、障害は癌である。場合によっては、癌は白血病、リンパ腫、CLL、小リンパ球性リンパ腫、辺縁細胞B細胞性リンパ腫、バ−キットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群から選択される。場合によっては、該方法は治療薬をさらに含む。場合によっては、治療薬は抗癌剤である。場合によっては、治療薬はイピリムマブまたはそのバイオシミラ−製品である。場合によっては、障害は自己免疫疾患である。
【００２５】
別の側面では、本明細書に開示されるのは、障害を治療するための医薬品の製造における、本明細書に開示される医薬組成物の使用である。場合によっては、障害は癌である。場合によっては、癌は白血病、リンパ腫、CLL、小リンパ球性リンパ腫、辺縁細胞B細胞性リンパ腫、バ−キットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群から選択される。場合によっては、障害は自己免疫疾患である。
【００２６】
別の側面では、本発明は、CDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域を含む重鎖可変領域を有する、単離されたモノクロ−ナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで、CDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域は、（1）それぞれ配列番号4、5および6;（2）それぞれ配列番号10、11および12;（3）それぞれ配列番号16、17および18;（4）それぞれ配列番号22、23および24;（5）それぞれ配列番号28、29および30;（6）それぞれ配列番号34、35および36;（7）それぞれ配列番号40、41および42;（8）それぞれ配列番号46、47および48;（9）それぞれ配列番号52、53および54;（10）それぞれ配列番号58、59および60;（11）それぞれ配列番号64、65および66;（12）それぞれ配列番号70、71および72;（13）それぞれ配列番号76、77および78;（14）それぞれ配列番号82、83および84;（15）それぞれ配列番号88、89および90;（16）それぞれ配列番号94、95および96;（17）それぞれ配列番号100、101および102;（18）それぞれ配列番号106、107および108;（19）それぞれ配列番号112、113および114;（20）それぞれ配列番号118、119および120;（21）それぞれ配列番号124、125および126;（22）それぞれ配列番号130、131および132;（23）それぞれ配列番号136、137および138;（24）それぞれ配列番号142、143および144;（25）それぞれ配列番号148、149および150;（26）それぞれ配列番号154、155および156;（27）それぞれ配列番号160、161および162;（28）それぞれ配列番号166、167および168;（29）それぞれ配列番号172、173および174;（30）それぞれ配列番号178、179および180;（31）それぞれ配列番号184、185および186;または（32）それぞれ配列番号190、191および192に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、抗体またはその抗原結合断片はCTLA−4に結合する。
【００２７】
別の側面では、本発明の単離されたモノクロ−ナル抗体またはその抗原結合部分は、配列番号3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183または189に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００２８】
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182または188に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含み、これは、配列番号1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、 151、157、163、169、175、181または187に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％の同一性を有する核酸配列によってコ−ドされてよい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、上記2つの重鎖から実質的になるか、または上記2つの重鎖からなる。
【００３０】
本発明の別の側面では、抗体またはその抗原結合部分は、抗体に連結された治療剤、例えば、細胞毒素または放射性同位元素を含む免疫複合体の一部である。別の側面では、抗体は、前記抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第2の機能的部分（例えば、第2の抗体）を含む二重特異性分子の一部である。別の側面では、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（CAR）または操作された（enfineered）T細胞受容体の一部にすることができる。本発明の抗体またはその抗原結合部分はまた、腫瘍溶解性ウイルスによってコ−ドされ得るか、または腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて使用され得る。
【００３１】
本発明の抗体またはその抗原結合部分、免疫複合体、二重特異性分子、キメラ抗原受容体、操作されたT細胞受容体、または腫瘍溶解性ウイルスを含み、任意で薬学的に許容される担体中に製剤化された医薬組成物もまた提供される。
【００３２】
医薬組成物は、他の抗癌剤をさらに含み得る。医薬組成物は、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、抗LAG−3抗体、抗TIM3抗体、抗STAT3抗体、および抗ROR1抗体、および/または抗CD137抗体または抗GITR抗体であり得るコスティミュラトリ−抗体からなる群から選択される少なくとも1つの追加の免疫刺激抗体をさらに含み得る。
【００３３】
本発明の抗体またはその抗原結合部分（例えば、可変領域および／またはCDR）をコ−ドする核酸分子、ならびに該核酸を含む発現ベクタ−および該発現ベクタ−を含む宿主細胞も提供される。発現ベクタ−を含む宿主細胞を使用して抗CTLA−4抗体を調製する方法も提供され、該方法は、（i）宿主細胞中で抗体を発現させる工程、および（ii）宿主細胞から抗体を単離する工程を含む。
【００３４】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。腫瘍は固形腫瘍でも非固形腫瘍でもよく、白血病、リンパ腫、CLL、小リンパ球性リンパ腫、辺縁細胞B細胞性リンパ腫、バ−キットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群から選択される。好ましくは、腫瘍は黒色腫、前立腺癌または非小細胞肺癌である。さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を対象に投与することを含む、対象の自己免疫疾患を治療する方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を対象に投与することを含む、対象におけるウイルス感染を治療する方法を提供する。別の実施形態では、該方法は、本発明の医薬組成物、二重特異性、または免疫複合体を投与することを含む。
【００３５】
別の側面では、本発明は、前記方法で使用するための、または前記方法で使用するための（例えば治療のために）医薬を製造するための抗CTLA−4抗体および本発明の組成物を提供する。
【００３６】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかであり、これらは限定として解釈されるべきではない。本願全体を通して引用されるすべての参考文献、Genbankエントリ、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
前記概要、ならびに以下の本発明の詳細な説明は、図面と併せて解釈すると、よりよく理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
【００３８】
以下の図面において：
【００３９】
【図１】図１は、293細胞で発現したヒトCTLA−4に対する本発明の抗CTLA−4抗体の結合活性を示す。
【００４０】
【図２】図２は、293細胞で発現したカニクイザルCTLA−4に対する本発明の抗CTLA−4抗体の結合活性を示す。
【００４１】
【図３】図３は、CTLA−4とB7.1との間の相互作用をブロックする際の本発明の抗CTLA−4抗体の能力を示す。
【００４２】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ドナ−1からのPBMCを用いたSEB依存性Tリンパ球刺激アッセイにおける抗CTLA−4抗体CL3、CL5、CL11およびCL22（A）、およびCL24、CL25およびCL30（B）のIL−2分泌への影響を示す。
【００４３】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ヒトCTLA−4またはマウスCTLA−4に対する抗CTLA−4抗体CL5、CL11、CL22、CL24およびCL25(A)およびCL5(B)の結合能力を示す。
【００４４】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ドナ−2からのPBMCを用いたSEB依存性Tリンパ球刺激アッセイにおける抗CTLA−4抗体CL5、CL11およびそれらの変異体（A）、およびCL22、CL25およびそれらの変異体（B）のIL−2分泌への影響を示す。
【００４５】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ヒトCTLA−4に対する抗CTLA−4抗体変異体の結合活性を示す。
【００４６】
【図８】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、CTAL−4とビオチン標識B7.1（AおよびB）およびB7.2（C）との間の相互作用をブロックすることに対する抗CTLA−4抗体変異体の活性を示す。
【００４７】
【図９】図９は、ドナ−3からのPBMCを用いたSEB依存性Tリンパ球刺激アッセイにおける抗CTLA−4抗体変異体のIL−2分泌への影響を示す。
【００４８】
【図１０】図１０は、BiaCoreにより測定された抗CTLA−4抗体CL5およびその変異体のヒトまたはカニクイザルCTLA−4への結合活性を示す。
【００４９】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、CHO K1−CTLA−4細胞に対する抗CTLA−4抗体CL5およびその変異体のインビトロADCC活性を示す。
【００５０】
【図１２】図１２は、雄C57BL/6マウスにおける抗CTLA−4抗体CL5の血清濃度−時間プロファイルを示す。
【００５１】
【図１３】図１３は、抗CTLA4 HCAb濃度の腫瘍対血清比を示す。
【００５２】
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、MC38腫瘍を有するマウスにおける抗CTLA−4抗体の抗腫瘍活性を示す。（A）異なるグル−プの腫瘍増殖曲線。（B）Time−to−End pointのカプランマイヤ−生存曲線。（C）ヒト抗CTLA−4抗体による治療とともに比較的一定に保たれたマウスの体重。デ−タは、平均+SEM、N=9として表した。
【００５３】
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、MC38を有するマウスにおけるヒト抗CTLA−4抗体による腫瘍増殖の阻害を示す。（A）腫瘍増殖曲線。（B）ヒト抗CTLA−4抗体による治療とともに比較的一定に保たれたマウスの体重。デ−タは、平均+SEM、N=6として表した。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
総括：
本開示は、CD152に特異的に結合する抗体を提供する。これらの結合分子は、CD152および別の標的に特異的に結合する。それを必要とする患者への治療有効量のCD152結合抗体の投与は、特定の癌を含む特定の障害の治療に有用である。CD152を発現するT細胞への抗体の結合は、腫瘍関連抗原を発現する細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞毒性を誘発する。本開示のCD152結合治療法は、患者の治療において、様々な利点、例えば、CD152への効果的な結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の効率的な誘導および／または有害事象（例えば毒性）のより低いリスクをもたらす。特定の側面では、CD152結合抗体は特定の形式（例えば、典型的な完全長抗体と比較して重鎖のみの抗体）でより効果的にCD152に結合し、CD152に関連する疾患の治療における効力を高め、有用性を向上させる。
【００５５】
定義：
本明細書で使用されているセクションの見出しは、整理を目的としたものであり、説明されている主題を制限するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用されるすべての文書または文書の一部は、いかなる目的であれ参照によりその全体が明示的に組み込まれる。組み込まれた文書または文書の一部が、本願でのその用語の定義と矛盾する用語を定義している場合、本願に表示される定義が制御する。しかしながら、本明細書で引用されている参考文献、論文、出版物、特許、特許公開、および特許出願についての言及は、有効な先行技術を構成することまたは世界のいかなる国での技術知識の一部を形成することの承認またはいかなる形の示唆としても受け取られるべきではない。。
【００５６】
本明細書において、濃度範囲、百分率範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に指定のない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の1/10および100分の1など）を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される「a」および「an」という用語は、特に指定のない限り、列挙された構成要素の「1つまたはそれ以上」を指すことが理解されるべきである。代替（例えば、「または」）の使用は、代替の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用する場合、「含む（include）」および「含む（comprise）」という用語は、同義的に使用される。さらに、本明細書に記載される成分（例えば、ドメインまたは領域）および置換基の様々な組み合わせを含むポリペプチドは、あたかも各ポリペプチドが個別に記載されているのと同じ程度に本出願によって開示されることが理解されるべきである。したがって、個々のポリペプチドの特定の成分の選択は、本開示の範囲内である。
【００５７】
本明細書で使用される参照数値およびその文法的等価物に関する用語「約」およびその文法的等価物は、その値からプラスまたはマイナス10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％の範囲などの、その値から±10％の値の範囲を含むことができる。 例えば、「約10」という量は、9から11までの量を含む。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」は、共有結合されたアミノ酸の単一の線状かつ連続した配置である。これには、鎖間ジスルフィド結合を介するなど、非線形に結合する2つのポリペプチド鎖は含まれない（例えば、軽鎖がジスルフィド結合を介して重鎖と結合している免疫グロブリン分子の半分）。ポリペプチドは、1つまたはそれ以上の鎖内ジスルフィド結合を有するか、形成することができる。本明細書に記載されるポリペプチドに関して、配列番号によって特定されるものに対応するアミノ酸残基への言及は、そのような残基の翻訳後修飾を含む。
【００５９】
「タンパク質」は、1つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。タンパク質はまた、炭水化物基などの非ペプチド成分を含むことができる。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加することができ、細胞のタイプによって異なるであろう。本明細書では、タンパク質はそれらのアミノ酸骨格構造に関して定義される；炭水化物基などの置換基は一般的に特定されないが、それでも存在し得る。
【００６０】
「抗体」、「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、本明細書では互換的に使用でき、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはこれらの組み合わせなどの標的を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、インタクトなポリクロ−ナル抗体、インタクトなモノクロ−ナル抗体、抗体フラグメント（Fab、Fab'、F(ab')2、およびFμフラグメントなど）、一本鎖Fμ（scFv）変異体、二重特異性抗体（二重結合抗体を含む）などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物活性を示す限り、抗原認識部位を含むその他の修飾免疫グロブリン分子などを包含する。「抗体」という用語はまた、4つのポリペプチド鎖（2つの軽（L）鎖と2つの重（H）鎖）で構成される、分子量が約150 kDaのY字型糖タンパク質を指す。ギリシャ文字のアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、ミュ−（μ）で示される、5つのタイプの哺乳類Ig重鎖アイソタイプがある。重鎖のタイプは、抗体のクラス、すなわち、それぞれIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMを定義する。γクラスとαクラスは、定常ドメインの配列と機能の違いに基づいて、サブクラス、たとえばIgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分類される。哺乳動物では、λとκの2種類の免疫グロブリン軽鎖がある。
【００６１】
本明細書で使用される「モノクロ−ナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、起こり得る天然の突然変異および／または少量で存在するかもしれない翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）以外は同一の集団を含む個々の抗体を指す。モノクロ−ナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられている。異なる決定基（エピト−プ）に対して向けられた異なる抗体を通常含むポリクロ−ナル抗体調製物とは対照的に、各モノクロ−ナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられたものである。それらの特異性に加えて、モノクロ−ナル抗体は、それらがハイブリド−マ培養によって合成され、他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。修飾語「モノクロ−ナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクロ−ナル抗体は、例えば、ハイブリド−マ法（例えば、KohlerおよびMilstein、Nature、256：495−97（1975）;Hongoら、Hybridoma, 14 (3): 253−260 (1995), Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版、1988);Hammerlingら、in: Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas 563−681 (Elsevier, N.Y., 1981)、組換えDNA法（例えば、米国特許第4,816,567号を参照）、ファ−ジディスプレイ技術（例えば、Clacksonら、Nature, 352: 624−628 (1991);Marksら、J. Mol. Biol. 222: 581−597 (1992);Sidhuら、J. Mol. Biol. 338(2): 299−310 (2004);Leeら、J. Mol. Biol.340(5): 1073−1093 (2004);Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467−12472 (2004);およびLeeら、J. Immunol. Methods 284(1−2): 119−132 (2004)を参照）、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコ−ドする遺伝子の一部または全部を有する動物でヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術（例えば、WO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993);Jakobovitsら、Nature 362: 255−258 (1993);Bruggemannら、Year in Immunol. 7:33 (1993);U.S. Pat. Nos. 5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;および5,661,016;Marksら、Bio/Technology 10: 779−783 (1992);Lonbergら、Nature 368: 856−859 (1994);Morrison, Nature 368: 812−813 (1994);Fishwildら、Nature Biotechnol. 14: 845−851 (1996);Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996);およびLonbergおよびHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65−93 (1995)を参照）を含む様々な技術により作製することができる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「重鎖のみの抗体」（HCAb）という用語は、2つの重鎖のみからなり、全長抗体に通常見られる2つの軽鎖を欠く抗体を指す。
【００６３】
本明細書に開示される様々な抗体を説明するために使用される場合の「単離された抗体」という用語は、それが発現された細胞または細胞培養物から同定および分離および／または回収された抗体を意味する。その自然環境の汚染成分は、典型的にポリペプチドの診断または治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS−PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリ−電気泳動）またはクロマトグラフィ−（例えば、イオン交換または逆相HPLC）によって決定されるように、95％または99％を超える純度に精製される。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、Flatmanら、J. Chromatogr. B 848:79−87 (2007)を参照。好ましい実施形態では、抗体は、（1）スピニングカップシ−ケンサ−を使用することによりN末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、または（2）クマシ−ブル−または、好ましくは銀染色を使用した非還元または還元条件下のSDS−PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体は、ポリペプチドの自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体を含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも1つの精製工程により調製されるであろう。
【００６４】
「単離された」核酸という用語は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外に、またはその本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００６５】
「軽鎖可変領域」（「軽鎖可変ドメイン」または「VL」またはVLとも呼ばれる）および「重鎖可変領域」（「重鎖可変ドメイン」または「VH」またはVHとも呼ばれる）という用語は、それぞれ抗体の軽鎖および重鎖からの可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（CDR）および「フレ−ムワ−ク領域」（FR）として知られる、明確に定義された個別のサブ領域で構成され、通常、アミノ末端からカルボキシル末端へFR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4の順に含む。一実施形態では、FRはヒト化される。「CL」という用語は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖からの定常領域を指す。「CH」という用語は、「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指し、抗体アイソタイプに応じて、CH1、CH2、およびCH3（IgA、IgD、IgG）、またはCH1、CH2、CH3、およびCH4ドメイン（IgE、IgM）にさらに分割できる。「Fab」（フラグメント抗原結合）は、抗原に結合する抗体の一部であり、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖に連結された重鎖の可変領域およびCH1ドメインを含む。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」または「結合領域」という用語は、抗原、リガンド、受容体、基質、阻害剤などの標的分子（例えば、CD152）を特異的に認識して結合する能力を有する、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドまたは抗体または抗体の結合ドメインのドメイン、領域、部分、または部位を指す。例示的な結合ドメインには、単鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、sFv、scFv、scFab）、受容体外部ドメイン、およびリガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）が含まれる。特定の実施形態において、結合ドメインは、抗原結合部位（例えば、可変重鎖配列および可変軽鎖配列または交互のフレ−ムワ−ク領域（FR）に配置された抗体からの3つの軽鎖相補性決定領域（CDR）および3つの重鎖CDRを含む）（例えば、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を任意に含むヒトFR）を含むまたはからなる。ウエスタンブロット、ELISA、ファ−ジディスプレイライブラリ−を含む、特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための様々なアッセイが知られている。本明細書で使用する場合、「CD152結合ドメイン」は、3つの重鎖CDR：CDR1、CDR2、およびCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を有することができる。
【００６７】
抗体または結合ドメインは、試験試料に存在する他の成分に有意に結合しないが、105M−1以上の親和性またはKa（すなわち、1/Mの単位の、特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的に結合するならば、標的に「特異的に結合」する。抗体または結合ドメインは、「高親和性」抗体または結合ドメインおよび「低親和性」抗体または結合ドメインとして分類することができる。「高親和性」抗体または結合ドメインは、Kaが少なくとも107M−1、少なくとも108M−1、少なくとも109M−1、少なくとも1010M−1、少なくとも1011M−1、少なくとも1012M−1、または少なくとも1013M−1の抗体または結合ドメインを指す。「低親和性」抗体または結合ドメインは、Kaが最大107M−1、最大106M−1、最大105M−1の抗体または結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Mの単位（例えば、10−5M〜10−13M）の、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Kd）として定義することができる。抗原に結合する抗体の場合、Ka=1/Kdである。本開示による抗体または結合ドメインの親和性は、表面プラズモン共鳴（例えば、Scatchardら、(1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660;および米国特許第5,283,173号、第5,468,614号、または等価物を参照）などの従来の技術を使用して容易に決定することができる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「CD152」は、細胞毒性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA−4）としても知られている分化抗原群152を指す。「CD152」、「CTLA−4」、および「CTLA4」という用語は、本明細書では互換的に使用される。同様に、「抗CD152」、「抗CTLA−4」、「抗CTLA4」も、本明細書では互換的に使用される。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「CD80」は、分化抗原群80を指し、これは、T細胞の活性化および生存に必要なコスティミュラトリ−シグナルを提供する、樹状細胞、活性化B細胞および単球に見られるタンパク質である。「CD80」、「B7−1」、および「B7.1」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「CD86」は、分化抗原群86を指し、これは、T細胞の活性化および生存に必要なコスティミュラトリ−シグナルを提供する抗原提示細胞上で発現されるタンパク質である。「CD86」、「B7−2」、および「B7.2」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「保存的置換」は、類似の特性を有する別のアミノ酸へのあるアミノ酸の置換として当技術分野で認識されている。例示的な保存的置換は当技術分野でよく知られている（例えば、1997年3月13日公開のWO97/09433、10頁;Lehninger, Biochemistry、第二版;Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71−77;Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8）。特定の実施形態では、保存的置換には、ロイシンからセリンへの置換が含まれる。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「イピリムマブ類似体」は、配列番号199のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号200のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、CTLA−4に特異的に結合するモノクロ−ナル抗体を指す。
【００７３】
本明細書で使用する場合、特に指定のない限り、生物学的製品の一般名または総称には、生物学的製品およびそのバイオシミラ−製品が含まれる。例えば、一般名のイピリムマブは、YERVOYという商品名で販売されている生物学的製品を指す；それにはまた、生物学的製剤のバイオシミラ−製品も含まれる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、特に指定のない限り、「バイオシミラ−製品」という用語は、1）参照製品と同一のアミノ酸配列を有する生物学的製品；2）参照製品とは異なるアミノ酸配列（例えば、NまたはC末端切断）を有する生物学的製品;または3）参照製品とは異なる翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化またはリン酸化）がある生物学的製品を指し、ここで、バイオシミラ−製品と参照製品は、疾患の予防、治療、または治癒のために同じメカニズムまたは作用メカニズムを使用する。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「誘導体」という用語は、酵素の有無にかかわらず、例えばグリコシル化、アルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成による、化学的または生物学的手段によるペプチドの1つまたはそれ以上のアミノ酸残基の修飾を指す。
【００７６】
本明細書で使用する場合、指定されたポリペプチドまたはタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。特定の実施形態では、特定の配列（「開始」または「親（parent）」または「親（parental）」配列と呼ばれることもある）に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、開始配列またはその部分と本質的に同一であるアミノ酸配列を有するか（ここで、該部分は、少なくとも10〜20アミノ酸、少なくとも20〜30アミノ酸、または少なくとも30〜50アミノ酸、または少なくとも50〜150アミノ酸からなる）、あるいは他の仕方で開始配列にその起源があると当業者が理解するアミノ酸配列を有する。例えば、結合ドメインは、例えば、Fab、F(ab ’)2、Fab’、scFv、単一ドメイン抗体（sdAb）などの抗体に由来し得る。
【００７７】
別のポリペプチドに由来するポリペプチドは、開始ポリペプチドに対して1つまたはそれ以上の変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換された、または1つまたはそれ以上のアミノ酸残基の挿入または欠失を有する1つまたはそれ以上のアミノ酸残基を有することができる。ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を含み得る。そのような変異は、必然的に、開始ポリペプチドと100％未満の配列同一性または類似性を有する。一実施形態では、変異体は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列と約60％〜100％未満のアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、変異体は、開始ポリペプチドと約75％〜100％未満、約80％〜100％未満、約85％〜100％未満、約90％〜100％未満、約95％〜100％未満のアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を有するであろう。
【００７８】
本明細書で使用する場合、別段の定めがない限り、免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基の位置は、IMGT番号付け規則に従って番号付けされ（Brochet, Xら、Nucl. Acids Res. (2008) 36, W503−508）、免疫グロブリン分子の定常領域内のアミノ酸残基の位置は、EU命名法に従って番号付けされる（Wardら、1995 Therap. Immunol. 2:77−94）。他の番号付け規則が当技術分野で知られている（例えば、Kabat番号付け規則（Kabat、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Bethesda、MD：Public Health Service、National Institutes of Health（1991））。
【００７９】
本明細書中で使用する場合、「ヒト」抗体の用語は、ヒト起源の抗体またはヒト化抗体を指す。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「ヒト化」という用語は、非ヒト種（例えば、マウスまたはラット）に由来する抗体または免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドを、遺伝子工学的手法を用いて元の抗体の抗原結合特性を維持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるプロセスを指す。いくつかの実施形態では、抗体または免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドの結合ドメイン（複数可）（例えば、軽鎖および重鎖可変領域、Fab、scFv）がヒト化される。非ヒト結合ドメインは、CDRグラフティングとして知られている技術（Jonesら、Nature 321:522 (1986)）および、「再形成（reshaping）」（Verhoeyenら、1988 Science 239:1534−1536; Riechmannら、1988 Nature 332:323−337; Tempestら、Bio/Technol 1991 9:266−271）、「ハイパ−キメラ化（hyperchimerization）」（Queenら、1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029−10033;Coら、1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869−2873;Coら、1992 J Immunol 148:1149−1154）、および「ベニアリング（veneering）」（Markら、“Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti−CD18 antibodies.”In: Metcalf BW, Dalton BJ編、Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291−312）を含むその変異体を使用してヒト化できる。非ヒト供給源に由来する場合、抗体または免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドの他の領域、例えばヒンジ領域および定常領域ドメインもまたヒト化することができる。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「必要とする患者」または「必要とする対象」という用語は、本明細書で提供されるCD152結合抗体またはその組成物を用いた治療または改善の影響を受けやすい疾患、障害または状態のリスクがある、または患っている患者または対象を指す。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、当技術分野で周知の投与経路を使用して投与した場合に、一般にアレルギ−反応その他の深刻な有害反応を引き起こさない分子種および組成物を指す。連邦政府または州政府の規制機関によって承認された、または動物、特にヒトでの使用用として米国薬局方またはその他の一般的に認められている薬局方に記載されている分子種および組成物は、「薬学的に許容される」と見なされる。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「治療（treatment）」、「治療する（treating）」、または「改善する（ameliorating）」という用語は、治療的処置または予防的／防御的処置のいずれかを指す。処置を受ける個人の疾患の少なくとも1つの症状が改善するか、処置が個人の進行性疾患の悪化を遅らせるか、または追加の関連疾患の発症を防ぐことができる場合、処置は治療的である。
【００８４】
本明細書で使用する場合、特異的結合分子または化合物の「治療的有効量（または用量）」または「有効量（または用量）」という用語は、統計的に有意な仕方で治療されている1つまたはそれ以上の症状または疾患の改善または臓器機能の統計的に有意な改善をもたらすのに十分な化合物の量を指す。単独で投与される個々の活性成分に言及する場合、治療的有効量はその成分のみを指す。組み合わせについて言及する場合、治療的有効用量は、連続してまたは同時に（同じ製剤でまたは別々の製剤で同時に）投与されて、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせ量を指す。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」および「ADCC」という用語は、FcγRを発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラ−（NK）細胞などの単球細胞およびマクロファ−ジ）が、標的細胞上の結合抗体（またはFcγRに結合することができる他のタンパク質）を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性のプロセスを指す。原則として、活性化FcγRを持つエフェクタ−細胞は、ADCCの媒介を引き起こすことができる。ADCCを媒介する主要な細胞は、FcγRIIIのみを発現するNK細胞であり、単球は、活性化、局在、または分化の状態に応じて、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現できる。造血細胞でのFcγR発現の概説については、例えば、Ravetchら、1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457−92を参照。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「プロモ−タ−」という用語は、転写を開始するためのRNAポリメラ−ゼの結合に関与するDNAの領域を指す。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマ−を指す。特に限定されない限り、これらの用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の仕方で代謝される天然ヌクレオチドの類似体を含む核酸を包含する。特に指定のない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたはそれ以上の選択された（またはすべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成できる（Batzerら、(1991) Nucleic Acid Res. 19:5081;Ohtsukaら、(1985) J. Biol. Chem. 260:2605−2608;Cassolら、(1992); Rossoliniら、(1994) Mol. Cell. Probes 8:91−98）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコ−ドされるmRNAと互換的に使用される。本明細書で使用する場合、「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、DNA分子（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）、RNA分子（例えば、mRNA）、DNAまたはRNAの類似体（ヌクレオチド類似体、およびその誘導体、断片およびホモログを使用して生成される）を含むものとする。
【００８８】
「発現」という用語は、核酸によってコ−ドされる産物の生合成を指す。例えば、目的のポリペプチドをコ−ドする核酸セグメントの場合、発現は、核酸セグメントのmRNAへの転写および1つまたはそれ以上のポリペプチドへのmRNAの翻訳を含む。
【００８９】
「発現ユニット」および「発現カセット」という用語は、本明細書では互換的に使用され、目的のポリペプチドをコ−ドし、宿主細胞において核酸セグメントの発現を提供することができる核酸セグメントを表す。発現ユニットは、典型的には、転写プロモ−タ−、目的のポリペプチドをコ−ドするオ−プンリ−ディングフレ−ム、および転写タ−ミネ−タ−を、すべて作動可能な構成で含む。転写プロモ−タ−およびタ−ミネ−タ−に加えて、発現ユニットは、例えば、エンハンサ−またはポリアデニル化シグナルなどの他の核酸セグメントをさらに含むことができる。
【００９０】
本明細書で使用する場合、「発現ベクタ−」という用語は、1つまたはそれ以上の発現ユニットを含む、線状または環状の核酸分子を指す。1つまたはそれ以上の発現ユニットに加えて、発現ベクタ−はまた、例えば、1つまたはそれ以上の複製起点または1つまたはそれ以上の選択マ−カ−などの追加の核酸セグメントも含むことができる。発現ベクタ−は一般にプラスミドまたはウイルスDNAに由来するか、両方の要素を含むことができる。
【００９１】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」という用語は、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間、または2つまたはそれ以上のポリペプチド配列間の関係を指す。1つの配列内の位置が、比較配列の対応する位置の同じ核酸塩基またはアミノ酸残基によって占められている場合、配列はその位置で「同一」であると言われる。「配列同一性」のパ−センテ−ジは、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して「同一」の位置の数を得ることによって計算される。次に、「同一」の位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、100を掛けて「配列同一性」のパ−センテ−ジを算出する。「配列同一性」のパ−センテ−ジは、比較ウィンドウで2つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定される。核酸配列の比較ウィンドウは、例えば、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900または1000またはそれ以上の核酸の長さであってよい。ポリペプチド配列の比較ウィンドウは、例えば、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300またはそれ以上のアミノ酸の長さであってよい。比較のために配列を最適にアラインメントするため、参照配列を一定に保ちながら、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、ギャップと呼ばれる付加または欠失を含むことができる。最適なアライメントは、ギャップがあっても、参照配列と比較配列との間に可能な限り多くの「同一」の位置を生成するアライメントである。2つの配列間の「配列同一性」のパ−センテ−ジは、2004年9月1日付けで国立バイオテクノロジ−情報センタ−から入手可能なプログラム「BLAST 2 Sequences」のバ−ジョン（このプログラムはプログラムBLASTN（ヌクレオチド配列比較用）およびBLASTP（ポリペプチド配列比較用）を組み込んている（これらのプログラムは、KarlinおよびAltschulのアルゴリズムに基づいている）を使用して決定できる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873−5877, 1993）。「BLAST 2 Sequences」を使用する場合、2004年9月1日の時点でデフォルトパラメ−タであったパラメ−タを、ワ−ドサイズ（3）、オ−プンギャップペナルティ（11）、拡張ギャップペナルティ（1）、ギャップドロップオフ（50）、期待値（10）および、マトリックスオプションを含むがこれに限定されないその他の必要なパラメ−タに使用できる。2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、2つの配列が互いに少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する場合、「実質的に類似した配列同一性」または「実質的な配列同一性」を有すると見なされる。
【００９２】
抗体：
本明細書に開示されるのは、CD152結合ドメインを含むヒトモノクロ−ナル抗体である。抗体は重鎖のみの抗体であり得る。抗体は2本の重鎖のみで構成できる。抗体は軽鎖を含まなくてもよい。抗体はCD152に特異的に結合できる。抗体は、CD152に高い親和性で特異的に結合する単離されたモノクロ−ナル抗体であり得る。
【００９３】
本明細書に開示される抗CD152抗体は、ヒトCD152に特異的に結合することができる。場合によっては、抗CD152抗体は、高い親和性でヒトCD152に結合できる（例えば、KD<6.0*10−11M）。抗CD152抗体は、イピリムマブ類似体と比較した場合、CTLA−4に対し同等またはそれ以上の親和性を持つことができる。抗CD152抗体はまた、CD152とそのリガンドB7.1の結合をブロックすることもできる。抗CD152抗体は、イピリムマブ類似体よりも腫瘍/末梢血清比を高めることができる。抗CD152抗体はより高いADCCを誘導することができ、例えば、抗体は少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、または少なくとも約20倍のNK細胞による溶解活性の増加を誘導することができる。
【００９４】
抗CD152抗体は、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含むCD152結合ドメインを含むことができる。抗CD152抗体はまた、1つまたはそれ以上の保存的修飾によって本明細書に開示される抗CD152抗体のものとは異なるCDR1、CDR2、およびCDR3を含み得る。抗原結合を除去しない特定の保存的配列修飾を行うことができることは、当技術分野において理解されている。 例えば、Brummellら、1993, Biochem 32:1180−8;de Wildtら、1997, Prot. Eng. 10:835−41;Komissarovら、1997, J. Biol. Chem. 272:26864−26870;Hallら、1992, J. Immunol. 149:1605−12;KelleyおよびO'Connell, 1993, Biochem.32:6862−35;Adib−Conquyら、1998, Int. Immunol.10:341−6およびBeersら、2000, Clin. Can. Res. 6:2835−43を参照。
【００９５】
医薬組成物および製剤：
医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化された、本明細書に開示される1つまたはそれ以上の抗CD152抗体を含むことができる。レシピエント患者がその投与に耐えることができる場合、賦形剤は「薬学的に許容される賦形剤」であると言われる。使用できる賦形剤には、担体、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散剤または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コ−ティング剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存剤、等張剤、およびそれらの組み合わせが含まれる。適切な賦形剤の選択および使用は、Gennaro編、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第20版、(Lippincott Williams & Wilkins 2003)、およびGennaro編、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company、第19版、1995)に教示されている。無菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容される賦形剤の一例である。製剤はさらに、1つまたはそれ以上の担体、希釈剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミン等を含むことができる。
【００９６】
担体材料と組み合わせて単一剤形を生成することができる活性成分の量は、治療される対象および特定の投与様式に応じて変動し得、一般に、治療効果を生じる医薬組成物の量であり得る。一般に、活性成分の量は、組成物の約0.01％〜約99％（w/w）の範囲であり得、例えば、医薬組成物の約0.1％〜1％、約0.1％〜5％、約0.1〜10％、約0.1％〜20％、約0.5％〜1％、約0.5％〜5％、約0.5％〜10％、約0.5％〜20％、約1％〜5％、約1％〜10％、約1％〜20％、約5％〜10％、約5％〜20％、約10％〜20％、約10％〜30％、約20％〜30％、約20％〜40％、約30％〜40％、約30％〜50％、約40％〜50％、約40％〜60％、約50％〜60％、約50％〜70％、約60％〜70％、約60％〜80％、約70％〜80％、約70％〜90％、約80％〜90％、約80％〜95％、または95％〜99％であり得る。好ましくは、活性成分の量は、医薬組成物の約0.1％〜約70％、最も好ましくは約1％〜約30％であり得る。
【００９７】
医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、有効成分は、酸の作用およびそれを不活性化し得る他の自然条件からそれを保護するための材料でコ−ティングされ得る。本明細書で使用する「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を含むが、これらに限られない。あるいは、本発明の抗体は、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下または局所などの局所、表皮または粘膜投与経路などの非腸管外（non−parenteral）経路を介して投与することができる。医薬組成物は、無菌の水溶液または分散液の形態であり得る。医薬組成物はまた、マイクロエマルジョン、リポソ−ム、または高薬物濃度に適した他の秩序だった構造に製剤化することもできる。
【００９８】
医薬組成物は、経口単位剤形、静脈内単位剤形、鼻腔内単位剤形、坐剤単位剤形、皮内単位剤形、筋肉内単位剤形、腹腔内単位剤形、皮下単位剤形、硬膜外単位剤形、舌下単位剤形、および脳内単位剤形からなる群から選択される剤形に製剤化することができる。経口単位剤形は、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、粉末、ロゼンジ、顆粒、液剤、懸濁剤、乳濁剤、シロップ、エリキシル、徐放性製剤、エアロゾル、およびスプレ−からなる群から選択することができる。
【００９９】
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤であり得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコ−ル酸、コラ−ゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマ−を使用できる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照。
【０１００】
本明細書に開示されるモノクロ−ナル抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするように処方され得る。例えば、本発明の治療用抗体が血液脳関門を確実に通過するようにするために、それらをリポソ−ムに製剤化することができ、リポソ−ムは特定の細胞または器官への選択的輸送を増強するためのタ−ゲティング部分をさらに含み得る。例えば、米国特許第4,522,811号;第5,374,548号;第5,416,016号;および第5,399,331号；V. V. Ranade, 1989, J. Clin.Pharmacol.29:685；Umezawaら、1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038；Bloemanら、1995, FEBS Lett.357:140；M. Owaisら、1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39:180；Briscoeら、1995, Am. J. Physiol. 1233:134；Schreierら、1994, J. Biol. Chem. 269:9090；KeinanenおよびLaukkanen, 1994, FEBS Lett. 346:123;およびKillionおよびFidler, 1994, Immunomethods 4:273を参照。
【０１０１】
医薬組成物は、別の抗体または薬物などの、1つまたはそれ以上の追加の薬学的活性成分を任意に含むことができる。本発明の医薬組成物はまた、例えば、別の抗癌剤、別の抗炎症剤、またはワクチンとの併用療法で投与することができる。
【０１０２】
医薬組成物は、本明細書に記載される医薬組成物を含む容器を含むキットとして供給され得る。医薬組成物は、例えば、単回または複数回投与のための注射可能な溶液の形態で、または注射前に再構成される無菌粉末として提供することができる。あるいは、そのようなキットは、医薬組成物を投与するための乾燥粉末分散機、液体エアロゾル発生機、またはネブライザ−を含み得る。そのようなキットは、医薬組成物の適応症および使用法に関する書面の情報をさらに含むことができる。
【０１０３】
治療方法：
本明細書にさらに開示されるのは、対象に治療有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を投与することによって障害を治療する方法である。本明細書に開示される抗CD152抗体は、対象（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）を治療するための方法、または対象を治療するための医薬品の製造のために使用され得る。一般に、そのような方法は、そのような治療を必要とする対象に、本明細書に記載の抗CD152抗体を投与することを含む。
【０１０４】
本明細書に開示される抗CD152抗体は、対象（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）を治療するための方法、または対象を治療するための医薬品の製造のために使用され得る。一般に、そのような方法は、そのような治療を必要とする対象に、本明細書に記載の抗CD152抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態において、抗CD152抗体は、抗CD152抗体が対象においてCD152発現細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ADCC）および／または補体依存性細胞毒性（CDC）を誘導するように、ADCCおよび／またはCDCから選択される少なくとも１つのエフェクタ−機能を含む。
【０１０５】
癌などの腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする障害を治療する方法も本明細書に開示される。二重特異性抗CD152抗体によって認識され得る腫瘍抗原の例には、PSMA、CD19、CD20、CD37、CD38、CD123、Her2、ROR1、RON、糖タンパク質A33抗原（gpA33）およびCEAが含まれ得る。一般に、そのような方法は、そのような治療を必要とする対象に、本明細書に記載の腫瘍抗原に結合する第2の結合ドメインを含む治療有効量の抗CD152抗体を投与することを含む。抗CD152抗体は、対象の腫瘍抗原発現細胞に対するリダイレクティングされたT細胞の細胞毒性（redirected T−cell cytotoxicity; RTCC）を誘導することができる。
【０１０６】
この方法は、前立腺癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、唾液腺癌、膵臓癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、黒色腫、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、副腎癌、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（AML）、Bリンパ性白血病、芽球性形質細胞様樹状腫瘍（BPDCN）、および有毛細胞白血病などの癌の治療に用いることができる。。
【０１０７】
また、本明細書に記載の医薬組成物または抗CD152抗体の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法が開示される。
【０１０８】
本明細書に記載の抗CD152抗体の投与の対象には、特定の障害を発症するリスクが高い患者、並びに既存のそのような障害を示す患者が含まれる。典型的には、対象は、治療が求められている障害を有すると診断されている。さらに、対象は、障害の変化について（例えば、障害の臨床症状の増加または減少について）、治療の経過中にモニタ−することができる。また、いくつかの変形において、対象は、CD152発現細胞を標的とすることを含む治療を必要とする別の障害に罹っていない。
【０１０９】
予防的適用において、医薬組成物は、特定の障害にかかりやすいか、そうでなければそのリスクがある患者に、障害のリスクを排除または低減するか、または障害の発症を遅らせるのに十分な量で投与され得る。治療的適用では、組成物は、障害の症状およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、そのような障害の疑いがある、またはすでに罹患している患者に投与することができる。これを達成するのに十分な量は、治療的有効用量または治療有効量と呼ばれる。予防的および治療的計画の両方において、十分な応答が達成されるまで、薬剤をいくつかの投薬量で投与することができる。典型的に、応答がモニタ−され、所望の応答が衰退し始めた場合、反復投与が与えられる。
【０１１０】
本開示の方法に従って治療する対象患者を特定するために、受け入れられたスクリ−ニング方法を採用して特定の障害に関連するリスク要因を決定し、または対象で特定された既存の障害の状態を決定することができる。そのような方法は、例えば、個体が特定の障害と診断された親族を有するかどうかを決定することを含み得る。スクリ−ニング方法はまた、例えば、遺伝的要素を有することが知られている特定の障害の家族状態を決定するための従来の精密検査を含み得る。例えば、さまざまな癌には特定の遺伝的要素があることも知られている。癌の遺伝的要素には、例えば、形質転換している複数の遺伝子の変異（例えば、Ras、Raf、EGFR、cMetなど）、特定のHLA分子およびキラ−阻害受容体（KIR）分子の有無、または癌細胞がNK細胞やT細胞のような細胞の免疫抑制を直接的または間接的に調節できるメカニズムが含まれる（例えば、LjunggrenおよびMalmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329−339, 2007;BoytonおよびAltmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1−8, 2007を参照）。この目的に向けて、ヌクレオチドプロ−ブをル−チンに使用して、対象となる特定の疾患に関連する遺伝子マ−カ−を保有する個人を特定することができる。さらに、特定の障害のマ−カ−を同定するのに有用な多種多様な免疫学的方法が当技術分野で知られている。例えば、モノクロ−ナル抗体プロ−ブを使用して特定の腫瘍に関連する抗原を検出する様々なELISAイムノアッセイ法が利用可能であり、当技術分野で周知である。スクリ−ニングは、既知の患者の症状、年齢要因、関連するリスク要因などによって示されるように実施できる。これらの方法により、臨床医は、本明細書に記載の治療を必要とする患者をル−チンに選択できる。これらの方法に従って、病理学的腫瘍抗原発現細胞を標的とすることは、独立した治療プログラムとして、または他の治療に対するフォロ−アップ、補助、または調整治療レジメンとして実施することができる。
【０１１１】
この文脈での有効量の決定は、通常、動物モデル研究とそれに続くヒトの臨床試験に基づいており、モデル対象における対象障害の発生または重症度を大幅に軽減する有効量と投与プロトコルを決定することによって導かれる。本開示の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、他の薬物投与、治療が予防的であるか治療的であるか、ならびに組成物自体の比活性および個体において所望の応答を誘発するその能力を含む多くの異なる要因に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、いくつかの疾患では、患者は非ヒト哺乳動物であり得る。典型的には、投薬レジメンは、最適な治療反応を提供するように、すなわち、安全性および有効性を最適化するように調整される。したがって、治療的有効量はまた、本明細書に記載される抗CD152抗体を投与することの有益な効果により、望ましくない副次的効果を上回る量でもある。抗CD152抗体の投与の場合、投与量は対象の体重1kgあたり約0.1μg〜100mgまたは1μg〜約50mg、より一般的には10μg〜5mgの範囲である。より具体的な実施形態では、薬剤の有効量は、約1μg/kg〜約20mg/kg、約10μg/kg〜約10mg/kg、または約0.1mg/kg〜約5mg/kgの範囲である。この範囲内の投与量は、例えば、1日あたりの複数回投与または毎日、毎週、隔週、または毎月の投与を含む、単回または複数回の投与によって達成することができる。例えば、特定の変形において、レジメンは、最初の投与と、それに続く、毎週または隔週の間隔での複数回のその後の投与からなる。別のレジメンは、最初の投与に続いて、毎月または隔月の間隔での複数のその後の投与からなる。あるいは、障害の臨床症状をモニタリングすることにより示されるように、投与は不規則な基準であり得る。
【０１１２】
医薬組成物の投与量は、標的部位で所望の濃度を維持するために主治医が変えることができる。例えば、静脈内送達モ−ドが選択される場合、標的組織における血流中の薬剤の局所濃度は、対象の状態および予測される測定応答に応じて、リットルあたり約0.01〜50ナノモルの組成物、時にはリットルあたり約1.0ナノモル〜リットルあたり10、15、または25ナノモルであり得る。より高いまたはより低い濃度は、送達の様式、例えば、経表皮送達ｖｓ粘膜表面への送達に基づいて選択することができる。投与量はまた、投与される製剤の放出速度、例えば、鼻スプレ−ｖｓ粉末、徐放性経口または注射粒子、経皮製剤などに基づいて調整する必要がある。同じ血清濃度レベルを達成するには、例えば、（標準条件下で）5ナノモルの放出速度での徐放性粒子は、10ナノモルの放出速度での粒子の投与量の約1倍で投与されるであろう。
【０１１３】
抗CD152治療薬（例えば、抗CD152抗体）はまた、体重1キログラム（mpk）あたり約0.001〜約10ミリグラム（mg）の1日投与量で投与され得、好ましくは1日1回投与としてまたは1日に約2〜6回の分割投与にて与えられる。ヒト成人患者への投与の場合、治療的有効量は、0.2mg/用量、0.5mg/用量、1mg/用量、5mg/用量、10mg/用量、25mg/用量、100mg/用量、200mg/用量、および400mg/用量を含むがこれらに限られない、0.2mg〜800mg/用量の範囲の用量で投与することができ、複数の通常は連続した毎日の用量を治療の過程で投与することができる。抗CD152治療薬は、1日の異なる時間に投与することができる。一実施形態では、最適な治療用量を夕方に投与することができる。別の実施形態では、最適な治療用量を朝に投与することができる。したがって、抗CD152治療薬の1日の総投与量は、一実施形態では、約1mg〜約2gの範囲であり得、多くの場合、約100mg〜約1.5gの範囲であり、最も多くの場合、約200mg〜約1200mgの範囲である。典型的な70kgの成人の場合、抗CD152治療薬の総1日量は、約2mg〜約1200mgの範囲であり得、しばしば、上記のように、約0.2mg〜約800mgの範囲である。
【０１１４】
投薬レジメンはまた、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整され得る。例えば、単回ボ−ラスを投与することができ、いくつかの分割用量を経時的に投与することができ、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少または増加させることができる。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、非経口組成物を投薬単位形態で処方することが特に有利である。本明細書で使用される投薬単位形態は、治療される対象の単一投与量として適した物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の有効成分を含む。あるいは、抗体は徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。
【０１１５】
抗体の投与について、投薬量は、約0.0001〜100mg/kg、より通常には0.01〜5mg/kg（宿主の体重）の範囲であり得る。例えば、投薬量は、0.3 mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重または10mg/kg体重、または1〜10mg/kgの範囲内であり得る。例示的な治療レジメンは、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回、1ヶ月に1回、3ヶ月に1回、または3〜6ヶ月に1回の投与を伴う。本発明の抗CD152抗体の好ましい投薬レジメンには、静脈内投与による1mg/kg体重または3mg/kg体重が含まれ、抗体は以下の投与スケジュ−ルの1つを使用して与えられる：（i）4週間ごと6回の投与、その後3か月ごと；（ii）3週間ごと；（iii）3mg/kg体重を1回投与した後、3週間ごとに1mg/kg体重。いくつかの方法では、用量は、約1〜1000μg/ml、いくつかの方法では、約25〜300μg/mlの血漿抗体濃度を達成するように調整される。
【０１１６】
本発明の抗CD152抗体の「治療的有効量」は、好ましくは、疾患症状の重症度の減少、疾患無症状期間の頻度および持続期間の増加、または疾患の苦痛による障害の防止をもたらす。例えば、腫瘍を有する対象の治療では、「治療的有効量」は、未処置の対象と比較して、腫瘍の増殖を少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、さらにより好ましくは少なくとも約80％阻害する。治療的抗体の治療的有効量は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ、典型的にはヒトであるかまたは別の哺乳動物であり得る被験体の症状を改善することができる。
【０１１７】
特に固形腫瘍の治療に関して、エンドポイントおよび抗腫瘍活性を評価するためのプロトコルは、当技術分野でよく知られている。各プロトコルは腫瘍応答評価を異なる方法で定義する可能性があるが、RECIST（固形腫瘍における応答評価基準）基準は現在、国立癌研究所による腫瘍応答の評価のための推奨ガイドラインであると考えられている（Therasseら、J. Natl. Cancer Inst. 92:205−216, 2000を参照）。RECIST基準によると、腫瘍応答はすべての測定可能な病変または転移の減少または排除を意味する。疾患が一般的に測定可能であると見なされるのは、従来の技術で少なくとも1次元で>20mm、またはスパイラルCTスキャンで医用写真またはX線、コンピュ−タ−化された軸方向断層撮影（CT）、磁気共鳴画像法（MRI）、または臨床検査（病変が表在性の場合）によってマ−ジンが明確に定義された>10mmと正確に測定できる病変を含む場合である。測定不能な疾患とは、従来の技術では<20mm、またはスパイラルCTスキャンでは<10mmの病変と、真に測定不可能な病変（小さすぎて正確に測定できない）で構成される疾患を意味する。測定不可能な疾患には、胸水、腹水、および間接的な証拠によって文書化された疾患が含まれる。
【０１１８】
固形腫瘍応答を評価するためのプロトコルには、客観的ステ−タスの基準が必要である。代表的な基準は以下のとおりである：（1）すべての測定可能な疾患の完全な消失として定義される完全奏効（CR）；新しい病変はない；疾患に関連する症状はない；測定不能な疾患の証拠はない；（2）標的病変の最長直径の合計の30％減少として定義される部分応答（PR）；（3）標的病変の最長直径の合計の20％増加または新しい病変の出現として定義される進行性疾患（PD）;（4）CR、PR、または進行性疾患に当てはまらないとして定義される、安定または応答なし。（上記のTherasseらを参照）
【０１１９】
腫瘍学分野で認められているその他のエンドポイントには、全生存期間（OS）、無病生存期間（DFS）、客観的奏効率（ORR）、進行までの時間（TTP）、および無進行生存期間（PFS）がある（Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics、2005年4月、Center for Drug Evaluation and Research、FDA、ロックビル、MD.を参照）。
【０１２０】
抗CD152抗体は、免疫応答を負に調節するCTLA−4を介したシグナル伝達経路を抑制し、したがって腫瘍特異的免疫応答を増強するために、単剤療法として、または抗PD−L1モノクロ−ナル抗体その他の抗がん剤と組み合わせて用いることができる。
【０１２１】
抗体の製造方法：
本明細書に開示される抗体は、ハ−バ−（Harbour）ヒト化マウス（米国特許第9,353,179号、第9,346,877号および第8,921,522号および欧州特許第1776383号および第1864998号）から作製されたヒト重鎖のみ抗体（HCAb）であり得る。HCAbマウスによって生成された分子は可溶性で、従来のヒトIgG抗体に匹敵する親和性、多様性、および/または物理化学的特性を持つことができる。
【０１２２】
HCAbマウスからのHCAbの調製は、最小の免疫グロブリン認識ユニットである可溶性ヒトVHドメインの生成を促進し、したがって、二重特異性抗体、抗体薬物複合体またはVHドメイン由来の診断または治療分子などの、複数のVHドメインかまたは他の分子に結合したVHドメインのいずれかを含む新しい多機能分子の構築を促進する。
【０１２３】
抗CD152抗体はまた、本明細書に開示される抗CD152抗体の1つまたはそれ以上のVH配列を有する抗体を、改変された抗体を操作するための出発物質として使用して調製され得る。抗体は、可変領域（すなわち、VHおよび／またはVL）内、例えば1つまたはそれ以上のCDR領域内および／または1つまたはそれ以上のフレ−ムワ−ク領域内の1つまたはそれ以上の残基を修飾することによって操作することができる。さらに、またはあるいは、抗体は、例えば、抗体のエフェクタ−機能を変更するために、定常領域内の残基を改変することによって操作され得る。
【０１２４】
所望のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、該分子をベクタ−に配置することにより伝播することができる。プラスミドを含む、ウイルスベクタ−および非ウイルスベクタ−を使用することができる。プラスミドの選択は、伝播が望まれる細胞のタイプと伝播の目的に依存する。特定のベクタ−は、大量の所望のDNA配列を増幅および作成するのに適している。他のベクタ−は培養細胞での発現に適している。さらに他のベクタ−は、動物全体またはヒトの細胞への導入および発現に適している。適切なベクタ−の選択は、十分に当業者の範囲内である。このようなベクタ−の多くは市販されている。部分長または完全長のポリヌクレオチドは、典型的にはベクタ−内の切断された制限酵素部位へのDNAリガ−ゼ付着によってベクタ−に挿入される。あるいは、インビボでの相同組換えにより、所望のヌクレオチド配列を挿入することができる。典型的には、これは、相同性の領域をベクタ−に所望のヌクレオチド配列の両横で付着させることによって達成される。相同領域は、例えば、オリゴヌクレオチドのライゲ−ションによって、または相同領域と所望のヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマ−を使用するポリメラ−ゼ連鎖反応によって付加される。
【０１２５】
発現のためには、発現カセットまたはシステムが使用され得る。本明細書に開示されるポリペプチドをコ−ドする核酸を発現するため、発現ベクタ−における転写発現を制御する調節配列に機能的に連結された、ポリペプチドをコ−ドする核酸分子が宿主細胞に導入される。プロモ−タ−およびエンハンサ−などの転写調節配列に加えて、発現ベクタ−は、翻訳調節配列および発現ベクタ−を保有する細胞の選択に適したマ−カ−遺伝子を含むことができる。本開示のポリヌクレオチドによってコ−ドされる遺伝子産物は、例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類および哺乳動物系を含む、任意の好都合な発現系で発現される。発現ベクタ−において、ポリペプチドをコ−ドするポリヌクレオチドは、所望の発現特性を得るのに適切なように調節配列に連結される。これらには、プロモ−タ−、エンハンサ−、タ−ミネ−タ−、オペレ−タ−、リプレッサ−、およびインデュ−サ−が含まれる。プロモ−タ−は調節され得る（例えば、ステロイド誘導性pINDベクタ−（Invitrogen）からのプロモ−タ−）または構成的（例えば、CMV、SV40、伸長因子、またはLTR配列からのプロモ−タ−）であり得る。これらは、ベクタ−への結合について上記の技術を使用して、所望のヌクレオチド配列に結合される。当技術分野で知られている任意の技法を使用することができる。したがって、発現ベクタ−は、一般に、転写および翻訳開始領域（誘導性または構成性であり得、コ−ド領域が、転写開始領域の転写制御下で機能的に連結される）、および転写および翻訳終結領域を提供するであろう。
【０１２６】
発現カセットは、プラスミド、BAC、YAC、バクテリオファ−ジ、例えば、ラムダ、P1、M13など、植物または動物ウイルスベクタ−（例えば、レトロウイルスベ−スのベクタ−、アデノウイルスベクタ−）などのさまざまなベクタ−に導入でき、ここで、ベクタ−は通常、発現ベクタ−を含む細胞の選択を提供する能力を特徴とする。ベクタ−は、特にプラスミドまたはウイルスとして染色体外維持、または宿主染色体への組み込みを提供することができる。染色体外維持が望まれる場合、プラスミドの複製のために、コピ−数の少ないまたは多い複製起点配列が提供される。多種多様なマ−カ−、特に毒素、とりわけ抗生物質に対して保護するマ−カ−を利用できる。選択される特定のマ−カ−は、宿主の性質に応じて選択され、場合によっては、栄養要求性宿主での補完を利用することができる。DNA構築物の導入は、例えば、接合、細菌形質転換、カルシウム沈殿DNA、エレクトロポレ−ション、融合、トランスフェクション、ウイルスベクタ−による感染、バイオリスティックなどを含む、任意の便利な方法を使用することができる。本開示は、核酸セグメントを含む発現ベクタ−に関し、前記核酸セグメントは、配列番号1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、163、169、175、181、または187に示されるヌクレオチド配列を含み得る。
【０１２７】
したがって、本開示内で使用するためのタンパク質は、従来の技術に従って遺伝子操作された宿主細胞において産生され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAで形質転換またはトランスフェクションでき、培養で増殖できる細胞タイプであり、細菌、真菌細胞、および培養高等真核細胞（多細胞生物の培養細胞を含む）、特に培養哺乳類細胞を含む。クロ−ニングしたDNA分子を操作し、外因性DNAをさまざまな宿主細胞に導入する技術は、SambrookおよびRussell, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual (第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor Laboratory、NY, 2001)、およびAusubelら、Short Protocols in Molecular Biology (第4版、John Wiley & Sons, 1999)に開示されている。
【０１２８】
組換えタンパク質を宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列（リ−ダ−配列としても知られている）が発現ベクタ−に提供される。分泌シグナル配列は、組換えタンパク質の天然型のものであるか、または別の分泌タンパク質に由来するか、または新規に合成することができる。分泌シグナル配列は、ポリペプチドをコ−ドするDNA配列に機能的に連結される、すなわち、2つの配列は正しいリ−ディングフレ−ムで結合され、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導くように配置される。分泌シグナル配列は通常、目的のポリペプチドをコ−ドするDNA配列の5'に配置されるが、特定のシグナル配列は目的DNA配列内の他のどこかの場所に配置できる（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照）。
【０１２９】
培養哺乳動物細胞は、本開示内で使用するための組換えタンパク質の産生に適した宿主である。外因性DNAを哺乳類宿主細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Wiglerら、Cell 14:725, 1978;CorsaroおよびPearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981:GrahamおよびVan der Eb, Virology 52:456, 1973）、エレクトロポレ−ション（Neumannら、EMBO J. 1:841−845, 1982）、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション（Ausubelら、上記）、およびリポソ−ム媒介トランスフェクション（Hawley−Nelsonら、Focus 15:73, 1993;Ciccaroneら、Focus 15:80, 1993）が含まれる。培養された哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、Levinsonら、米国特許第4,713,339号、ハ−ゲンら、米国特許第4,784,950号、Palmiterら、米国特許第4,579,821号；およびRingold、米国特許第4,656,134号に開示されている。適切な哺乳動物宿主細胞の例には、アフリカミドリザル腎臓細胞（Vero;ATCC CRL 1587）、ヒト胚腎臓細胞（293−HEK;ATCC CRL 1573）、ベビ−ハムスタ−腎臓細胞（BHK−21、BHK−570;ATCC CRL 8544 、ATCC CRL 10314）、イヌ腎細胞（MDCK;ATCC CCL 34）、チャイニ−ズハムスタ−卵巣細胞（CHO−K1;ATCC CCL61;CHO DG44;CHO DXB11（Hyclone、Logan、UT））;また、例えば、Chasinら、Som. Cell, Molec. Genet. 12:555, 1986）をも参照）、ラット下垂体細胞（GH1;ATCC CCL82）、HeLa S3細胞（ATCC CCL2.2）、ラット肝癌細胞（H−4−II−E;ATCC CRL 1548）、SV40形質転換サル腎細胞（COS−1;ATCC CRL 1650）およびマウス胚細胞（NIH−3T3;ATCC CRL 1658）が含まれる。追加の適切な細胞株は当技術分野で知られており、アメリカン・タイプ・カルチャ−・コレクション、バ−ジニア州マナッサスなどの公的な寄託機関から入手できる。SV−40またはサイトメガロウイルス由来のプロモ−タ−などの強力な転写プロモ−タ−を使用できる。例えば、米国特許第4,956,288号を参照。他の適切なプロモ−タ−には、メタロチオネイン遺伝子（米国特許第4,579,821号および第4,601,978号）からのプロモ−タ−およびアデノウイルス主要後期プロモ−タ−が含まれる。
【０１３０】
薬剤選択は一般に、外来DNAが挿入された培養哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は一般に「トランスフェクタント」と呼ばれる。選択剤の存在下で培養され、目的の遺伝子を子孫に受け継ぐことができる細胞は、「安定したトランスフェクタント」と呼ばれる。例示的な選択マ−カ−には、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコ−ドする遺伝子（これにより、G−418などのネオマイシン型薬剤の存在下で選択を行うことができる）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラ−ゼのgpt遺伝子（ミコフェノ−ル酸/キサンチンの存在下で宿主細胞の増殖を可能にする）、およびゼオシン、ブレオマイシン、ブラストシジン、およびハイグロマイシンに対する耐性を提供するマ−カ−（例えば、Gatignolら、Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987;Drocourtら、Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990）が含まれる。目的遺伝子の発現レベルを増加させるために選択システムを使用することもでき、これは「増幅」と呼ばれるプロセスである。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、ついで選択剤の量を増加させて導入遺伝子の高レベルの産物を産生する細胞を選択することによって行われる。例示的な増幅可能な選択マ−カ−は、ジヒドロ葉酸レダクタ−ゼであり、これはメトトレキサ−トに対する耐性を与える。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピュ−ロマイシンアセチルトランスフェラ−ゼ）を使用することもできる。
【０１３１】
昆虫細胞、植物細胞および鳥類細胞を含む他の高等真核細胞も宿主として使用することができる。植物細胞で遺伝子を発現させるためのベクタ−としてのアグロバクテリウム・リゾゲネスの使用は、Sinkarら、J. Biosci. (Bangalore) 11:47−58, 1987で概説されている。昆虫細胞の形質転換および昆虫細胞での外来ポリペプチドの産生は、Guarinoら、米国特許第5,162,222号およびWO94/06463に開示されている。
【０１３２】
昆虫細胞は、通常オ−トグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）に由来する組換えバキュロウイルスに感染することができる。KingおよびPossee, The Baculovirus Expression System:  A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London);O’Reillyら、Baculovirus Expression Vectors:  A Laboratory Manual (Oxford University Press、ニュ−ヨ−ク1994);およびBaculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson編、Humana Press、トトワ、NJ, 1995)を参照。組換えバキュロウイルスはまた、Luckowら（J. Virol. 67:4566−4579, 1993）によって記載されたトランスポゾンベ−スのシステムを使用することによっても産生することができる。このシステムはトランスファ−ベクタ−を利用するものであり、キットの形で市販されている（BAC−TO−BACキット；Life Technologies、ゲ−サ−ズバ−グ、MD）。トランスファ−ベクタ−（例えば、PFASTBAC1；Life Technologies）には、目的のタンパク質をコ−ドするDNAを、「バクミド」と呼ばれる大きなプラスミドとして大腸菌で維持されているバキュロウイルスゲノムに移動するTn7トランスポゾンが含まれている。Hill−PerkinsおよびPossee, J. Gen. Virol. 71:971−976, 1990;Bonningら、J. Gen. Virol. 75:1551−1556, 1994;およびChazenbalkおよびRapoport, J. Biol. Chem. 270:1543−1549, 1995を参照。さらに、トランスファ−ベクタ−は、上記に開示されるようなポリペプチド伸長または親和性タグをコ−ドするDNAとのインフレ−ム融合を含み得る。当技術分野で公知の技術を使用して、タンパク質をコ−ドするDNA配列を含むトランスファ−ベクタ−を大腸菌宿主細胞に形質転換し、組換えバキュロウイルスを示す中断されたlacZ遺伝子を含むバクミドについて細胞をスクリ−ニングする。組換えバキュロウイルスゲノムを含むバクミドDNAは、一般的な技術を使用して分離され、Sf9細胞などのスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用される。その後、目的タンパク質を発現する組換えウイルスが産生される。組換えウイルスストックは、当技術分野で一般的に使用されている方法によって作製される。
【０１３３】
タンパク質産生のため、組換えウイルスは、宿主細胞、典型的には、秋のヨモギ、スポドプテラ・フルギペルダ（例えば、Sf9またはSf21細胞）またはトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）（例えば、HIGH FIVE細胞;Invitrogen、カ−ルスバッド、CA）に由来する細胞株に感染するために使用される。一般的に、GlickおよびPasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press、ワシントンD.C., 1994)を参照。米国特許第5,300,435号をも参照。細胞の増殖および維持に無血清培地が使用される。適切な培地処方物は当該分野で公知であり、商業的供給業者から入手され得る。細胞は約2〜5x105細胞の接種密度から1〜2x106細胞の密度に増殖され、この時点で組換えウイルスストックが0.1〜10、より典型的には3に近い感染多重度（MOI）で追加される。使用される手順は、一般に入手可能な実験室のマニュアルに記載されている（例えば、上記のKingおよびPossee；上記のO'Reillyら；上記のRichardsonを参照）。
【０１３４】
酵母細胞を含む真菌細胞も、本開示内で使用することができる。これに関する酵母種には、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）が含まれる。外因性DNAでサッカロミセス・セレビシエ細胞を形質転換し、そこから組換えポリペプチドを産生する方法は、例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kawasakiら、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；およびMurrayら、米国特許第4,845,075号に開示されている。形質転換された細胞は、選択マ−カ−、通常は薬剤耐性または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の不在下で増殖する能力によって決定される表現型によって選択される。サッカロミセス・セレビシエで使用するための例示的なベクタ−システムは、Kawasakiら（米国特許第4,931,373号）によって開示されたPOT1ベクタ−システムであり、このシステムではグルコ−ス含有培地での増殖により形質転換細胞を選択することができる。酵母での使用に適したプロモ−タ−およびタ−ミネ−タ−には、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Kingsmanら、米国特許第4,615,974号；およびBitter、米国特許第4,977,092号を参照）およびアルコ−ルデヒドロゲナ−ゼ遺伝子由来のものが含まれる。米国特許第4,990,446号；米国特許第5,063,154号；米国特許第5,139,936号；および米国特許第4,661,454号をも参照。ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイウェロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイウェロマイセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタダタイカ（Pichia metadataica）、ピキア・ギリエルモンディ（Pichia guillermondii）、およびカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）を含む他の酵母の形質転換システムは、当技術分野で知られている。例えば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol. 132:3459−3465, 1986;Cregg、米国特許第4,882,279号;およびRaymondら、Yeast 14:11−23, 1998を参照。アスペルギルス細胞は、McKnightら、米国特許第4,935,349号の方法に従って利用することができる。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換する方法は、Suminoらの米国特許第5,162,228号により開示されている。ニュ−ロスポラ（Neurospora）を形質転換する方法は、Lambowitzの米国特許第4,486,533号に開示されている。ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）における組換えタンパク質の産生は、米国特許第5,716,808号；米国特許第5,736,383号；米国特許第5,854,039号；および米国特許第5,888,768号に開示されている。
【０１３５】
大腸菌、バチルスその他の属の菌株を含む原核宿主細胞も、本開示内で有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、そこにクロ−ニングされた外来DNA配列を発現させる技術は当技術分野でよく知られている（例えば、上記のSambrookおよびRussellを参照）。大腸菌などの細菌で組換えタンパク質を発現させる場合、タンパク質は、通常は不溶性顆粒として細胞質に保持されるか、細菌の分泌配列によってペリプラズム空間に誘導される。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒は回収され、例えば、イソチオシアン酸グアニジンまたは尿素を使用して変性される。次に、尿素溶液に対する透析および還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの組み合わせによるなどの変性剤の希釈と、その後の緩衝生理食塩水に対する透析により、変性タンパク質をリフォ−ルディングして二量体化できる。あるいは、タンパク質を細胞質から可溶性の形で回収し、変性剤を使用せずに単離することもできる。タンパク質は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水中の水性抽出物として細胞から回収される。目的タンパク質を捕捉するには、抽出物を固定化抗体やヘパリン−セファロ−スカラムなどのクロマトグラフィ−媒体に直接適用する。分泌されたタンパク質は、ペリプラズム空間の内容物を放出するために細胞を破壊して（例えば、超音波処理または浸透圧ショックにより）可溶性で機能的な形態でペリプラズム空間から回収され、タンパク質を回収し、それにより変性およびリフォ−ルディングの必要が省略される。一本鎖抗体を含む抗体は、既知の方法に従って細菌宿主細胞で産生することができる。例えば、Birdら、Science 242：423−426、1988；Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883, 1988；およびPantolianoら、Biochem. 30:10117−10125, 199を参照。
【０１３６】
形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖に必要な栄養素および他の成分を含む培養培地中で従来の手順に従って培養される。限定培地および複合培地を含む様々な適切な培地が当技術分野で知られており、一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルが含まれる。培地には、必要に応じて、成長因子や血清などの成分を含めることもできる。増殖培地は一般に、例えば、薬物選択または必須栄養素の欠乏により、外因的に添加されたDNAを含む細胞を選択し、これは、発現ベクタ−上に運ばれるかまたは宿主細胞に同時トランスフェクションされる選択マ−カ−によって補完される。
【０１３７】
抗CD152抗体は、従来のタンパク質精製法、典型的にはクロマトグラフィ−技術の組み合わせによって精製することができる。一般的に、Affinity Chromatography:  Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology、ウプサラ、スウエ−デン、1988); Scopes, Protein Purification:  Principles and Practice (スプリンガ−−フェアラ−ク、ニュ−ヨ−ク1994)を参照。免疫グロブリンFc領域を含むタンパク質は、固定化プロテインAまたはプロテインGのアフィニティ−クロマトグラフィ−で精製できる。ゲルろ過などの追加の精製ステップを使用して、所望レベルの純度を取得し、または脱塩、緩衝液交換などを提供することができる。
【０１３８】
本発明の以下の実施例は、本発明の性質をさらに説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって決定されることが理解されるべきである。
【０１３９】
実施例１：抗CTLA−4抗体の生成
ヒトCTLA−4−ECDタンパク質（Acro Bio）を免疫原として使用して、抗CTLA−4抗体を作製した。ヒト抗体の開発および調製のためのヒト免疫グロブリントランスジェニックマウス技術の使用は、最初にAbgenix（xeno mouse and Medarex（HuMab "mouse"）;Lonbergら、1994, Nature, 368: 856−859;LonbergおよびHuszar, 1995, Internal Rev. Immunol., 13: 65−93;HardingおよびLonberg, 1995, Ann. NY Acad. Sci., 764: 536−546）に記載された。
【０１４０】
HCAbマウスを、ヒトCTLA−4−ECDタンパク質で20mg/マウスにて2週間ごとに3回免疫し、そのうち6匹をさらに5回、44mg/マウスで免疫した。Stimune（Prionics）をアジュバントとして使用した最初の注射を除いて、すべての追加免疫をRibiアジュバント（SigmaアジュバントシステムS6322−1VL）で行った。免疫後、マウスの骨髄、脾臓およびリンパ節から単細胞懸濁液を分離した。次に、形質細胞分離キット（Miltenyi、カタログ番号130−092−530）を使用してマウス形質細胞を分離した。簡単に説明すると、マウス形質細胞からト−タルRNAを調製し、大きなプ−ルでcDNAに逆転写した。以下のプライマ−を使用して、ヒトVH領域をcDNAから増幅した。
フォワ−ドプライマ−：
lib−3−23/53−S：5’−GTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTG（配列番号193）および
lib−3−11−S：5’−GTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTG（配列番号194）
逆プライマ−：
mG1hrv：5’−GGCTTACAACCACAATCCCTGGGC（配列番号195）
【０１４１】
増幅されたVHドメインを含むPCRフラグメントはすべて、哺乳動物発現ベクタ−pTT5にクロ−ニングされた。得られたプラスミドをエレクトロポレ−ションにより細菌（DH5α）に形質転換した。プラスミドを複製して精製し、ついで抗体産生のためにHEK293細胞にトランスフェクションした。
【０１４２】
293細胞を293FreeStyle培地（12338018、Thermo）で10日間インキュベ−トし、上清をELISAアッセイでスクリ−ニングした。組換えヒトCTLA4−hisタンパク質（Acro Bio）を2μg/mLの濃度にPBSで希釈し、100μLの希釈したCTLA−4−hisタンパク質をELISAマイクロプレ−トにウェルごとに加え、4℃で一晩インキュベ−トしてプレ−トに組換えタンパク質をコ−ティングした。次にプレ−トをELISAブロック溶液（2％BSA、0.05％（v/v）Tween−20、pH7.4 PBS緩衝液、w/vを含む）で37℃にて2時間ブロックし、ついで上清と37℃で1時間インキュベ−トした。プレ−トを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（HRP）結合ヤギ抗ヒトIgG（H+L）抗体（A18805、Life Technologies）と共に37℃で1時間インキュベ−トした。100μLのテトラメチルベンジジン（TMB）を添加し、プレ−トを室温で15分間インキュベ−トした。50μLの1N HClを加えて反応を停止させた。有意な染色を示す35個の陽性クロ−ンをさらなる試験のために選んだ。
【０１４３】
前記35個のクロ−ンを配列決定し、35個のうち9個のクロ−ンを独特のCDR3配列で選択した。これらの9つの抗CTLA−4抗体の核酸配列およびアミノ酸配列を表1にまとめた。HCAb抗体は2つの重鎖のみを含んでいた。
表1：ヒト抗CTLA−4抗体の核酸配列およびアミノ酸配列
2021508255.tif 000002
na：核酸；aa：アミノ酸
【０１４４】
実施例２：抗CTLA−4抗体の調製および精製
工程1：hCTLA−4を過剰発現するHEK293F細胞の調製
【０１４５】
ヒトCTLA−4をコ−ドするヌクレオチド配列（配列番号196；配列番号197のアミノ酸配列をコ−ドする）をpcDNA3.1ベクタ−（Clontech）にサブクロ−ニングしてプラスミドを得た。HEK293細胞およびCHO−K1細胞（Invitrogen）にPEIを使用してプラスミドを一過性にトランスフェクションし、形質転換体を0.5g/mLのペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％（w/w）ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM培地で2週間培養した。96ウェル培養プレ−トへの限定希釈を行い、プレ−トを37℃、5％（v/v）CO2で約2週間インキュベ−トした。モノクロ−ンを6ウェルプレ−トで拡大し、拡大したクロ−ンを市販の抗hCTLA−4抗体（R＆D Systems）を使用してフロ−サイトメトリ−でスクリ−ニングした。FACSで測定した、より高い増殖率とより高い蛍光強度を示すクロ−ンをさらに拡大し、液体窒素で凍結保存した。
【０１４６】
工程２：HEK293F細胞培地での抗CTLA−4抗体の結合活性のELISAおよび細胞ベ−スのFACS結合アッセイによる測定
【０１４７】
組換えヒトCTLA4−hisタンパク質（Acro Bio）を2μg/mLの濃度にPBSで希釈し、ELISAマイクロプレ−トに100μLの希釈したCTLA−4−hisタンパク質をウェルごとに加え、4℃で一晩インキュベ−トしてプレ−トに組換えタンパク質をコ−ティングした。次にプレ−トをELISAブロック溶液（2％BSA、0.05％（v/v）Tween−20、pH7.4 PBS緩衝液、w/vを含む）で37℃にて2時間ブロックし、ついで抗CTLA−4抗体（実施例1を参照）を含有する293F細胞培地と37℃で1時間インキュベ−トした。プレ−トを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（HRP）結合ヤギ抗ヒトIgG（H+L）抗体（A18805、Life Technologies）と共に37℃で1時間インキュベ−トした。100μLのテトラメチルベンジジン（TMB）を添加し、プレ−トを室温で15分間インキュベ−トした。50μLの1N HClを加えて反応を停止させ、OD450nmをELISAプレ−トリ−ダ−で測定した。
【０１４８】
一方、工程1で調製した293−hCTLA−4細胞を培養し、抗体結合活性を測定するのに用いた。細胞を無酵素細胞解離液（Versene solution、Invitrogen）で処理し、ついで回収した。BSAを細胞懸濁液に1％の最終濃度になるように加え、細胞を氷上で30分間ブロックし、次にHBSSで2回洗浄した。遠心分離後に細胞を回収し、FACS緩衝液（HBSS+1％BSA、v/v）に2x106細胞/mLで再懸濁した。次に、細胞懸濁液100μLを96ウェルプレ−トの各ウェルに加えた。抗CTLA−4抗体（実施例1を参照）を含む293F細胞培地100μLを96ウェルプレ−トの各ウェルに加え、氷上で1時間インキュベ−トした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、100μLのAlexa488標識抗ヒト（H+L）抗体（Invitrogen）を96ウェルプレ−トに加え、氷上で1時間インキュベ−トした。試料をFACS緩衝液で3回洗浄し、100μLの固定緩衝液（4％パラホルムアルデヘv/v）を各ウェルに加え、10分間インキュベ−トした。次に、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、100μLのFACS緩衝液に再懸濁した。平均蛍光強度（MFI）を、FACS Calibur（BD）を使用して決定した。
【０１４９】
工程３：主要な候補抗体の産生および精製
【０１５０】
HEK293細胞からの抗体の濃度は約1〜10μg/mLであり、大きく異なっていた。さらに、FBSおよび培地の成分は分析を妨害する可能性があった。したがって、小規模（1〜5mg）の抗体産生および精製を行う必要があった。
【０１５１】
抗CTLA−4抗体（表1に記載）をコ−ドするヌクレオチド配列を含む構築物を293細胞に導入した。標的抗体を含む上清を、トランスフェクションの6〜7日後に遠心分離および濾過により回収した。モノクロ−ナル抗体は、2mLのProtein Gカラム（GE Healthcare）に通して精製した。プロテインGカラムを最初にPBS緩衝液（pH7.2）で平衡化し、ついでハイブリド−マ培養上清を、3mL/分の一定流量で平衡化したプロテインGカラムに適用した。次に、カラムをそれぞれカラムの3倍の容量のPBS緩衝液で洗浄した。次に抗CTLA−4抗体を溶出緩衝液（0.1M酢酸緩衝液、pH2.5）で溶出し、UV検出器（A280 UV吸収ピ−ク）を使用して溶出液のUV吸光度をモニタ−した。1.0M Tris−HCL緩衝液10％を溶出液に添加してpHを中和し、試料を0.22ミクロンのフィルタ−に通して滅菌ろ過した。無菌濾過された精製抗CTLA−4抗体を得た。
【０１５２】
精製した抗CTLA−4抗体の濃度をUV吸光度（A280/1.4）で測定し、純度およびエンドトキシンレベル（Lonzaキット）を測定した。精製された抗CTLA−4抗体は、エンドトキシン濃度が1.0EU/mg未満であった。
【０１５３】
実施例３：主要な候補抗体の特性評価
293細胞を、ヒトCTLA−4をコ−ドする核酸配列（配列番号196）を含むpTT5プラスミドで安定にトランスフェクションして、ヒトCTLA−4を安定して発現する293F細胞（本明細書では293−hCTLA−4細胞と呼ぶ）を生成した。追加の293細胞を、完全長のカニクイザルCTLA−4（配列番号198）をコ−ドする核酸配列を含むpIRESプラスミドで安定的にトランスフェクションして、カニクイザルCTLA−4を安定して発現する293細胞（本明細書では293−cynoCTLA−4細胞と呼ぶ）を生成した。293−hCTLA−4細胞および293−cynoCTLA−4細胞を培養し、T−75培養フラスコで90％コンフルエンスまで増殖させた。培養培地を吸引し、細胞をHBSS（ハンクス平衡塩類溶液、Invitrogen）で2回洗浄した。細胞を無酵素細胞解離液（Versene solution、Invitrogen）で処理し、回収した。次に、細胞をHBSSで2回洗浄し、細胞数を決定し、細胞をHBSSで2x106細胞/mLで再懸濁した。BSAを細胞懸濁液に1％の最終濃度になるように加え、細胞を氷上で30分間ブロックし、次にHBSSで2回洗浄した。遠心分離後に細胞を回収し、FACS緩衝液（HBSS+1％BSA、v/v）に2x106細胞/mLで再懸濁した。次に、細胞懸濁液100μLを96ウェルプレ−トの各ウェルに加えた。実施例2の精製抗CTLA−4抗体または対照抗体100μLを96ウェルプレ−トの各ウェルに加え、氷上で1時間インキュベ−トした。ここで、イピリムマブ類似体の重鎖および軽鎖は、それぞれ、配列番号199および配列番号200のアミノ酸配列を有していた。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、100μLのAlexa488標識抗ヒト（H+L）抗体（Invitrogen）を96ウェルプレ−トに加え、氷上で1時間インキュベ−トした。試料をFACS緩衝液で3回洗浄し、固定緩衝液（4％パラホルムアルデヒド、v/vを含む）100μLを各ウェルに加え、10分間インキュベ−トした。次に、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、100μLのFACS緩衝液に再懸濁した。
【０１５４】
FACS Calibur（BD）を使用して平均蛍光強度（MFI）を決定し、結果を図1および図2に示した。実施例2の抗体は、293F細胞でヒトまたはカニクイザルCTLAに対して、イピリムマブ類似体に匹敵する結合活性を示した。
【０１５５】
実施例４：B7.1へのCTLA−4の結合をブロックする抗CTLA−4抗体の能力の決定
細胞ベ−スの受容体−リガンド結合アッセイを実施して、抗CTLA−4抗体がCTLA−4のそのリガンドB7.1への結合をブロックする能力を決定した。製造元の指示に従って、組換えB7.1ECD−Fcタンパク質（B71−H5259、Acro Bio）をEZ−LINK NHS−PEG12−Biotin（Thermo Scientific＃21312）を使用してビオチン化した。ビオチン化B7.1ECD−Fcタンパク質を濃縮し、Amicon遠心フィルタ−（10kDaカットオフ）を使用して遊離標識を除去した。B7.1の細胞外ドメインは、Uniprotデ−タベ−スタンパク質P33681のアミノ酸Val35−Asn242に対応していた。
【０１５６】
実施例3で調製した293−hCTLA−4細胞をT−75培養フラスコで培養し、60〜80％コンフルエンスまで増殖させた。培養培地を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄した。細胞を無酵素細胞解離液（Versene solution、Invitrogen）で処理し、回収した。培養培地8mLを加えて解離液を中和し、細胞数を測定した。細胞を300gで5分間遠心分離し、ブロック緩衝液（2％BSA、pH7.4 PBS緩衝液、w/vを含む）に1x106細胞/mLで再懸濁した。細胞を37℃で15分間ブロックした。一方、96ウェルの丸底プレ−トのウェルを200μLのブロック緩衝液で37℃にて1時間ブロックした。ブロック緩衝液を廃棄し、200μLの細胞を96ウェルプレ−トの各ウェルに分注した（2x105細胞/ウェル）。プレ−トを500gで5分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞を、ブロック緩衝液でさまざまな濃度に調製した抗CTLA−4抗体100μLに再懸濁した。100μLのビオチン化B7.1ECD−Fc（ブロック緩衝液中60μg/mL）を96ウェルプレ−トの各ウェルに加え、軽く振って混合した。プレ−トを4℃で90分間インキュベ−トし、200μLのブロック緩衝液で2回洗浄した。ブロック緩衝液を廃棄し、細胞を100μLのストレプトアビジン−Alexa 488溶液（Invitrogen、ブロック緩衝液中1:500）に再懸濁し、4℃で1時間インキュベ−トした。プレ−トをブロック緩衝液で3回洗浄し、200μLのブロック緩衝液を加えた。
平均蛍光強度（MFI）は、FACS Calibur（BD）を使用して決定した。結果は、図3に示すように、抗CTLA−4抗体が、細胞発現CTLA−4のそのリガンドB7.1への結合を、イピリムマブ類似体に匹敵するレベルでブロックできることを示した。
【０１５７】
実施例５：抗CLTA−4 HCAb抗体はIL−20の放出を促進した
工程1：PBMC刺激試験
【０１５８】
100μLのPBMC（1x105細胞を含む）を96ウェルプレ−トのウェルに加え、ついで、さまざまな濃度の各試験抗体50μLを96ウェルプレ−トに加え、室温で15分間インキュベ−トした。50μLの100ng/ml SEBを各ウェルに加え、37℃、5％CO2で72時間培養した。上清を回収し、分析まで−20℃で保存した。
【０１５９】
工程２：ELISAによるインタ−ロイキンIL−2分泌の検出
【０１６０】
培養上清中のIL−2のレベルの定量は、製造元が提供する操作説明書に従って、Human IL−2 Quantikine ELISA Kit（DY202、R＆D Systems）を使用して行った。簡単に説明すると、抗IL−2ポリクロ−ナル抗体をELISAマイクロプレ−トにコ−ティングし、100μLの培養上清および標準を各ウェルに加え、室温で2時間インキュベ−トした。プレ−トを洗浄緩衝液で4回洗浄した後、HRP結合抗ヒトIL−2抗体を加え、室温で2時間インキュベ−トした。洗浄後、発色性基質（5120−0077、SeraCare）を加え、暗所で室温にて30分間インキュベ−トし、停止液（E661006−0200、BBI Life sciences）を添加して反応を停止させた。
【０１６１】
ELISAプレ−トリ−ダ−を使用して450nmでの吸光度を測定し、結果は、図4Aおよび図4Bに示すように、一部の抗CTLA−4抗体が、ヒトIgG（AB170090、Crown Bio）またはイピリムマブ類似体に比べて低濃度でIL−2分泌を増加し得ることを示した。
【０１６２】
実施例６：ELISAアッセイにおいてヒトCTLA−4には結合したがマウスCTLA−4には結合しなかった抗CTLA−4 HCAb抗体
組換えヒトまたはマウスCTLA4−hisタンパク質（ヒトタンパク質の場合はCT4−H5229、マウスタンパク質の場合はCT4−M52H5、Acro Bio）をPBSで2μg/mLの濃度に希釈し、100μLの希釈したCTLA−4−hisタンパク質をウェルあたりELISAマイクロプレ−トに加え、4℃で一晩インキュベ−トしてプレ−トを組換えタンパク質でコ−ティングした。次にプレ−トをELISAブロック溶液（2％BSA、0.05％（v/v）Tween−20、pH7.4 PBS緩衝液、w/vを含む）で37℃にて2時間ブロックし、様々な濃度の抗CTLA−4抗体と37℃で1時間インキュベ−トした。プレ−トを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（HRP）結合ヤギ抗ヒトIgG（H+L）抗体（A18805、Life Technologies）と共に37℃で1時間インキュベ−トした。100μLのテトラメチルベンジジン（TMB）を添加し、プレ−トを室温で15分間インキュベ−トした。50μLの1N HClを加えて反応を停止させ、OD450nmをELISAプレ−トリ−ダ−で測定した。
【０１６３】
デ−タは図５Ａおよび図５Ｂに示されており、すべてのクロ−ンがヒトCTLA−4に結合したがマウスCTLA−4にはほとんど結合しなかったことを示唆している。
【０１６４】
実施例７：抗CTLA−4抗体変異体はIL−20放出を促進した
上記のいくつかの抗体とその変異体に対してT細胞刺激アッセイを実施し、CTLA−4とそのリガンドB7.1およびB7.2の結合をブロックすることにより、T細胞刺激に対するこれらの抗体の効果を調べた。
【０１６５】
HCAbクロ−ン5、クロ−ン11、クロ−ン22、クロ−ン25およびクロ−ン30のFc定常ドメインにS239DおよびI332E変異をPCRで適用することにより、抗体変異体を調製した。変異抗体をHEK293細胞で発現させ、実施例2の記載と同様にして精製した。抗体変異体の核酸配列およびアミノ酸配列は、標準的な分子生物学的方法を使用して決定され、表2にまとめてある。
表２：抗CTLA−4抗体変異体の核酸配列およびアミノ酸配列
2021508255.tif 000003
na：核酸；aa：アミノ酸
【０１６６】
PBMC刺激試験およびELISAによるインタ−ロイキンIL−2分泌の検出は、実施例5と同様に行った。
【０１６７】
図６Ａおよび６Ｂの結果は、抗CTLA−4抗体変異体が、ヒトIgG1アイソタイプ対照およびそれらの親クロ−ンと比較して、IL−2分泌をより促進したことを示した。
【０１６８】
実施例８：PTMを除去した抗CTLA−4抗体変異体
7つのHCAbクロ−ン（CL22、CL25、CL5、CL3、CL11、CL30、CL24）のアミノ酸配列を遺伝子IGHV3−53*
01にアラインメントし、表3に表示した。生殖系列遺伝子およびPTM部位の違いを強調表示してある。配列は、Chothia番号付けスキ−ムで番号付けした。
【０１６９】
生殖系列遺伝子IGHV3−53には、N−グリコシル化モチ−フは本来備わっておらず、7つのHCAbクロ−ンに含まれるN−グリコシル化モチ−フは体細胞変異によって形成された。したがって、このモチ−フを削除するための1つのアプロ−チは、生殖細胞系列の対応する対応残基で置換すること、例えば、CL11のCDR1のNVSモチ−フを生殖細胞系列のTVSに置き換えることである。ヒト化に使用されるCDR移植の概念に基づいて、PTM除去と「生殖細胞形成（germlining）」を組み合わせることにより、代替アプロ−チも検討された。2番目のアプロ−チでは、各HCAbのCDRが生殖細胞系IGHV3−53フレ−ムワ−クに移植され、親HCAbからの主要なフレ−ムワ−ク残基も保持された。一部の抗体では、CTLA−4と抗体間の結合活性に影響を与える可能性のある特別な残基にあるアミノ酸変異が復元された。PTMが除去されたヒト抗CTLA−4 HCAb抗体変異体の核酸配列およびアミノ酸配列を表4に記載した。
表３：生殖系列配列と比較したHCAbアミノ酸配列の違い
2021508255.tif 000004
表４：PTMが除去された抗CTLA−4抗体変異体の核酸配列およびアミノ酸配列
2021508255.tif 000005
na：核酸；aa：アミノ酸
【０１７０】
実施例９：PTMが除去された抗CTLA−4抗体変異体の細胞ベ−スの結合活性
細胞ベ−スの結合アッセイを実施して、PTMが除去された抗CTLA−4抗体変異体のヒトCTLA−4への結合能力を決定した。アッセイ手順は、実施例3に記載されたものと同様であった。簡単に言えば、293F−hCTLA−4細胞を無酵素細胞解離溶液（Versene solution、Invitrogen）を使用して回収し、次いで培地により中和し、細胞数を決定した。細胞を遠心分離し、ブロック緩衝液（2％BSA、pH7.4 PBS緩衝液、w/vを含む）で1x106細胞/mLで37℃にて15分間ブロックした。200μLの細胞を96ウェルプレ−トの各ウェルに分注した（2×105細胞/ウェル）。プレ−トを遠心分離し、上清を捨てた。細胞をブロック緩衝液で調製した抗CTLA−4抗体100μLに再懸濁した。プレ−トを4℃で90分間インキュベ−トし、2回洗浄した。ブロック緩衝液を廃棄した後、細胞を100μLのAlexa 488標識抗ヒト（H+L）抗体（1:500、Invitrogen）に再懸濁し、4℃で1時間インキュベ−トした。細胞を洗浄し、200μLのブロック緩衝液に再懸濁した。平均蛍光強度（MFI）を、FACS Calibur（BD）を使用して決定した。
【０１７１】
結果は、図７Ａおよび図７Ｂに示すように、PTMが除去された抗CTLA−4抗体変異体が細胞発現ヒトCTLA−4に結合したことを示した。
【０１７２】
実施例１０：CTLA−4−B7.1およびB7.2相互作用に対するPTMが除去された抗CTLA−4抗体変異体のブロッキング活性
細胞ベ−スの受容体リガンド結合アッセイを実施例4の記載と同様に実施して、PTMが除去された抗CTLA−4抗体変異体がCTLA−4のそのリガンドB7.1への結合をブロックする能力を決定した。
【０１７３】
結果は、図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃに示すように、PTMが除去された抗CTLA−4抗体変異体が、イピリムマブ類似体に匹敵するレベルで、細胞発現CTLA−4とそのリガンドB7.1およびB7.2（デ−タは示さず）の結合をブロックすることを示した。
【０１７４】
実施例１１：PTMが除去された抗CTLA−4抗体変異体はIL−20放出を促進した
実施例5の記載と同様にして、PBMC刺激およびIL−20レベルの定量を実施した。
【０１７５】
結果は、図９に示すように、PTMを除去した抗CTLA−4抗体変異体がIL−2分泌を依然として促進できることを示した。S239DおよびI332E変異を有しPTMを除去した抗CTLA−4抗体は、S239DおよびI332E変異を有しPTMを除去しない抗CTLA−4抗体よりも増大したIL−2分泌を誘導した。
【０１７６】
実施例１２：PTMを除去した抗CTLA−4抗体変異体の結合親和性および解離定数
解離定数は、製造元が提供する機器の仕様に従って、Biacore T200（GE Healthcare）によって決定した。簡単に説明すると、10mM NaOAc（pH5.0、sigma）中の1μg/mLの希釈抗CTLA−4抗体を、Series S CM5センサ−チップのフロ−セルに固定化した。残りの活性エステル基は1Mエタノ−ルアミン（pH8.5）でブロックした。HBS−EP+をランニング緩衝液として、5つの連続希釈濃度の組換えヒトCTLA−4−his（CT4−H5229、AcroBio）およびカニクイザルCTLA−4−hisタンパク質（CT4−C5227、AcroBio）をフロ−セルに30μL/分、関連付け時間（association time）180秒で注入した。解離のために緩衝液フロ−を600秒間維持した。抗体と抗原の間の各相互作用のKD値は、Biacore T200評価ソフトウェア1.0と1:1結合のフィッティングモデルを使用して評価した。
【０１７７】
結果を図１０および表５に示した。2つのクロ−ンの結合親和性はイピリムマブ類似体のそれと類似していた。
表５：Biacore T200によって測定された、ヒトCTLA−4ECD−hisタンパク質およびカニクイザルCTLA−4ECD−hisタンパク質に対するヒト抗CTLA−4 Abの結合速度論および親和性
2021508255.tif 000006
【０１７８】
実施例１３：インビトロADCC機能分析
ヒト抗CTLA−4抗体の推定NK依存性細胞傷害活性を確認するため、CTLA−4発現CHO−K1細胞およびCTLA−4発現インビトロ刺激Treg細胞の両方で抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）アッセイを実施した。
【０１７９】
実施例2、工程1に記載したCTLA−4−発現CHO−K1細胞を、ADCC培地（フェノ−ルレッドを含まないRPMI1640、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含む）で2×105細胞/mLの濃度に調整した。50μLの細胞懸濁液（1×104生細胞）をv底の96ウェルプレ−トの各ウェルに加えた。被験抗体をADCC培地（フェノ−ルレッドなし）で連続希釈し、得られた各溶液50μLをウェルに3回加えた。最終的な抗体濃度は、0.087pM、0.44pM、2.2pM、10.9pM、54pM、272pM、1.36nM、および6.8nMであった。プレ−トを37℃で30分間インキュベ−トした。FcγRIII158Vで安定的にトランスフェクションしたNK92細胞を、FcγRIII158Vで安定的にトランスフェクションした100μLのNK92細胞を標的細胞に加えることにより、エフェクタ−と標的細胞の比率が5:1になるように、ADCC培地（フェノ−ルレッドなし）で調整した。次にプレ−トを37℃で6時間インキュベ−トした。6時間のインキュベ−ション後、プレ−トを遠心分離し、各上清50μLを新しいプレ−トに移した。上清を50μLのLDH検出緩衝液と室温で30分間インキュベ−トし、490nmでの吸光度を測定した。最大の細胞溶解対照として、50μLのCTLA−4発現CHO−K1細胞、50μLのADCC培地、および100μLの1％triton−X100緩衝液をLDH検出用に添加した。最小の細胞溶解対照として、50μLのCTLA−4発現CHO−K1細胞および150μLのADCC培地をLDH検出用に添加した。492/650nmでの吸光度を測定した。細胞溶解のパ−センテ−ジは、100*（試料の吸光度−バックグラウンドの吸光度）/（最大放出の吸光度−最小放出の吸光度）として計算した。細胞溶解値のすべてのパ−センテ−ジは、GraphPad Prism 5.0を使用して計算した。
【０１８０】
結果は、図１１に示すように、クロ−ンCL5−dPTM'抗体はCTLA−4−発現CHO−K1細胞に対するADCC効果を誘導し、S239DおよびI332E変異が追加されたクロ−ンCL5−eA−dTPM'はイピリムマブ類似体よりも高いADCC活性を誘発することを示した。
【０１８１】
CTLA−4発現インビトロ刺激Treg細胞は、インビトロで単離されたナイ−ブCD4+T細胞に由来する。最初に、製造元の指示（Miltenyi、130−094−131）に従って、ナイ−ブCD4+T細胞を初代PBMCから単離した。次に、ナイ−ブCD4+T細胞を、DynabeadsヒトT−アクティベ−タ−CD3/CD28（1:1）（Thermo、11131D）、10ng/mlのIL−2（PeproTech、200−02−B）および20ng/mlのTGF−β1（PeproTech、100−21）とともに3日間インキュベ−トすることにより活性化した。ADCC殺傷実験の日に、刺激されたTreg細胞をADCC培地（フェノ−ルレッドを含まないRPMI1640、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含む）で1×106細胞/mLの濃度に調整した。1×106個の細胞を5μlのカルセインAM（Therom、C34851、50μlのDMSOあたり50μgとして調製したストック）で37℃にて1時間染色した。Treg細胞をADCC培地で3回洗浄した。50μLのTreg細胞懸濁液（5×103生細胞）をv底の96ウェルプレ−トの各ウェルに加えた。試験抗体をADCC培地（フェノ−ルレッドなし）で連続希釈し、得られた各溶液50μLをウェルに3回加えた。最終抗体濃度は、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、および100nMであった。プレ−トを室温で30分間インキュベ−トした。新鮮なPBMC（Miaotong）をADCC培地（フェノ−ルレッドなし）で5×106細胞/mLに調整した。染色されたTreg細胞に50μLの新鮮なPBMCを加えることにより、エフェクタ−と標的細胞の比率は50:1になった。次にプレ−トを37℃で2時間インキュベ−トした。2時間のインキュベ−ション後、プレ−トを遠心分離し、各上清100μLを新しいプレ−トに移した。上清をEnspire機器で測定した。最大の細胞溶解対照として、50μLのカルセインAM染色Treg細胞、50μLのADCC培地、および100μLの1％triton−X100緩衝液を放出されたカルセインAM検出のために追加した。最小の細胞溶解対照として、50μLのカルセインAM染色細胞および150μLのADCC培地を放出されたカルセインAM検出のために添加した。520/650nmでの吸光度を測定した。特定の殺害のパ−センテ−ジは、100*（試料の吸光度−バックグラウンドの吸光度）/（最大放出の吸光度−最小放出の吸光度）として計算される。特定の殺害値のすべてのパ−センテ−ジは、GraphPad Prism 5.0を使用して計算された。
【０１８２】
結果は、図１１Ｂに示すように、ヒト抗CTLA−4抗体はCTLA−4−発現Treg細胞に対するADCC効果を誘導し、S239DおよびI332E変異を有する抗体は非変異のものよりも高いADCC活性を示すことを示した。
【０１８３】
実施例１４：抗CTLA−4抗体の薬物動態研究
工程１：マウスにおける単回用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体治療
【０１８４】
雄C57BL/6マウスに3mg/kgの抗CTLA−4抗体を尾静脈から注入して、抗CTLA−4抗体の血清濃度を測定した。動物を手動で拘束し、後眼窩穿刺を介して約100μLの血液/時点を回収した。時点は、投与前、抗体注入後0.167時間、1時間、4時間、8時間、24時間、2日、4日、7日、14日であった。最終回収は心臓穿刺を介して行った。血液試料を室温で保存し、2,000Xgで5分間4℃にて遠心分離して血清試料を得た。
【０１８５】
工程２：ELISAにより測定した抗CTLA−4抗体の血清濃度
【０１８６】
最初に、すべての血清試料をアッセイ希釈液で20倍に希釈した。5％マウス血清（PBS、v/v）でさらに希釈した。組換えヒトCTLA4−hisタンパク質（Acro Bio）をPBSで0.5μg/mLの濃度に希釈し、ELISAマイクロプレ−トにウェルごとに50μLの希釈したCTLA−4−hisタンパク質試料を加え、4℃で一晩インキュベ−トしてプレ−トに組換えタンパク質をコ−ティングした。次に、プレ−トをELISAブロック溶液（2％BSA、0.05％（v/v）Tween−20、pH7.4 PBS緩衝液、w/vを含む）で37℃にて2時間ブロックした。ブロック緩衝液を吸引除去し、プレ−トを希釈血清試料と37℃で1時間インキュベ−トした。プレ−トを洗浄緩衝液（PBS+0.01％（v/v）Tween 20）で3回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（HRP）結合ヤギ抗ヒトIgG（Fc）抗体（A0170、Sigma）と37℃で1時間インキュベ−トした。100μLのテトラメチルベンジジン（TMB）を添加し、プレ−トを室温で15分間インキュベ−トした。100μLの0.1N HClを各ウェルに加えて反応を停止させた。ELISAプレ−トリ−ダ−（SpectraMax M2）で450nmの吸光度を測定した。
【０１８７】
抗CTLA−4抗体の対応する血清濃度を図１２に示し、詳細なデ−タを表６に示した。
表６：マウスにおける3 mg/kgのIV投与後の抗体の平均血清濃度
2021508255.tif 000007
2021508255.tif 000008
【０１８８】
さらに、抗CTLA4 HCAb濃度の血清対腫瘍比を、MC38腫瘍を有するC57BL/6マウスで測定した。マウスに3mg/kgの抗CTLA−4抗体を尾静脈から注入して、抗CTLA−4抗体の血清および腫瘍内濃度を測定した。動物を手動で拘束し、後眼窩穿刺を介して約100μLの血液/時点を回収した。時点は注入後8時間および24時間であった。最終回収は心臓穿刺を介して行った。血液試料を室温で保存し、2,000Xgで5分間4℃にて遠心分離して血清試料を得た。抗CTLA−4抗体の血清および腫瘍濃度も、工程2と同様にELISAによって試験した。
【０１８９】
図１３に示すように、CL5−eA−dPTM'グル−プの抗CTLA4 HCAb濃度の血清対腫瘍比は、Ipi類似体グル−プよりも約1倍高かったが、これは重鎖のみのHCAb抗体の独特の特性によるものである。血清対腫瘍比のより高い分布は、HCAb抗体のより高い腫瘍組織浸透につながる。
【０１９０】
実施例１５：MC38腫瘍を有するマウスはヒト抗CTLA−4抗体でよりよく生存した
凍結保存されたマウス結腸癌MC−38細胞株を回収し、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM培地で37℃にて培養して腫瘍移植に十分な細胞を得た。培養したMC−38細胞を回収し、生存率>90％で1x107細胞/mlの密度でPBSに再懸濁し、120匹のhCTLA−4ノックインマウス（GempharmaTech）の右側腹部に皮下移植した。腫瘍接種の5日後に、腫瘍サイズが26〜64mm3（平均腫瘍サイズは40mm3）の81匹のマウスを選択し、腫瘍体積に基づいてグル−プごとに9匹のマウスで層別無作為化を使用して9グル−プに割り当てた。無作為化の日（D0と定義）から治療を開始した。グル−プ1はhlgG1 i.p.で10mpkにてD0、D3、D6、D10、D13、D16で治療した；グル−プ2はCL20'−eA（表7の配列）i.p.で5.4mpkにてD0、D3、D6、D10、D13、D16で治療した；グル−プ3は、イピリムマブ類似体i.p.で10mpkにてD0、D3、D6、D10、D13、D16で治療した；グル−プ4は、イピリムマブ類似体i.p.で1mpkにてD0、D3、D6、D10、D13、D16で治療した；グル−プ5はCL5'−dPTM'i.p.で5.4mpkにてD0、D3、D6、D10、D13、D16で治療した；グル−プ6はCL5'−dPTM'i.p.で0.54mpkにてD0、D3、D6、D10、D13、D16で治療した；グル−プ7はCL5'−eA−dPTM'i.p.で5.4mpkにてD0、D3、D6、D10、D13、D16で治療した；グル−プ8はCL5'−eA−dPTM'i.p.で1.5mpkにてD0、D3、D6、D10、D13、D16で治療した；およびグル−プ9はCL5'−eA−dPTM'i.p.で0.54mpkにてD0、D3、D6、D10、D13、D16で治療した。
表７：クロ−ンCL20'−eAの核酸配列およびアミノ酸配列
2021508255.tif 000009
na：核酸；aa：アミノ酸
【０１９１】
腫瘍サイズは、治療の間、週に3回測定した。個々の動物が終了エンドポイント（TV>2000mm3）に達したとき、安楽死させた。治療開始から終了までの時間を生存時間とした。生存曲線はカプランマイヤ−法によってプロットした。生存期間の中央値（MST）を各グル−プについて計算した。寿命の延長（ILS）は、次の式に従って計算した。
ILS(%)＝（MSTTreatment− MSTVehicle）/MSTVehiclex100％）。
【０１９２】
ILS(%)>25％は、National Cancer Instituteの基準によると、生物学的に有意な生存利益と見なされる。
【０１９３】
各マウスの体重の相対変化（RCBW）は、次の式に従って計算した：RCBW（％）＝（BWi−BW0）/BW0×100％（式中、BWiはi日目の平均体重、BW0は0日目の平均体重である）。
【０１９４】
腫瘍体積（TV）は、次の式に基づいて計算した：腫瘍体積＝（長さ×幅2）/2。
【０１９５】
各投薬グル−プの腫瘍増殖阻害率（TGI％）は、次の式に従って計算した：TGI％＝[1−TVi/TVvi]*100％（式中、TViはi日目の投薬グル−プの平均腫瘍体積、TVviはi日目の媒体グル−プの平均腫瘍体積である）。
【０１９６】
各グル−プのマウスの体重の平均および標準誤差（SEM）、RCBWおよび腫瘍体積は、Microsoft Excel 2007を使用して計算した。体重、体重の相対変化、腫瘍増殖曲線、および腫瘍増殖阻害の図を、GraphPad Prism 5を使用してプロットした。異なるグル−プ間の腫瘍の増殖は、Two−way RM ANOVAを使用して分析した。カプランマイヤ−生存曲線を、ログランク検定を使用して分析した。<0.05のP値は統計的に有意であると見なした。
【０１９７】
研究全体をD65に終了した。各グル−プの個々の腫瘍増殖曲線を図１４Ａに示した。動物のtime−to−end pointカプランマイヤ−生存曲線を図１４Ｂに示した。図１４Ｃで観察されるように、すべての治療は、いかなる悪影響もなく許容された。これらのグル−プのほとんどで、腫瘍体積が2000mm3に達したときにマウスはすべて屠殺した。グル−プ7では、5.4mpkのCL5'−eA−dPTM'で処理された9匹のマウスのうち3匹が、D65で腫瘍のない状態で生存した。グル−プ9では、0.54mpkのCL5'−eA−dPTM'を投与した9匹のマウスのうち2匹が、D65で腫瘍のない状態で生存した。
【０１９８】
MSTを各グル−プについて計算し、表８に示した。5.4mpkでの媒体グル−プhIgG1および5.4mpkでのCL20'−eAのMSTは、いずれも14日であった。10mpkおよび1mpkのイピリムマブ類似体、5.4mpkおよび0.54mpkのCL5'−dPTM'、5.4mpk、1.5mpkおよび0.54mpkのCL5'−eA−dPTM'での治療グル−プのMSTは、それぞれ、14、23、19、21、14、40、21、および28日であった。また、表８に示すように、治療グル−プのILSは、媒体処置グル−プhIgG1と比較して、64.3％、35.7％、50％、0％、185.7％、50％および100％であった。10mpkのイピリムマブ類似体、5.4mpkのCL5'−dPTM'、5.4mpk、1.5mpkおよび0.54mpkのCL5'−eA−dPTM'は、生存期間の中央値を大幅に増加させた。5.4mpkのCL5'−eA−dPTM'を投与したマウスは、10mpkのイピリムマブ類似体を投与したマウスよりも優れたILSを示した。
表8：生存分析
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（注）ILS＝(MSTGT−MSTG1)/MSTG1＊100％；P値は全てのグル−プをG1グル−プと比較した。
【０１９９】
実施例１６：抗CTLA−4 HCAbによるhCTLA−4ノックインマウスでのMC38腫瘍増殖の阻害
凍結保存されたマウス結腸癌MC−38細胞株を回収し、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM培地で37℃にて培養して腫瘍移植に十分な細胞を得た。培養したMC−38細胞を回収し、生存率>90％で5x106細胞/mlの密度でPBSに再懸濁し、60匹のhCTLA−4ノックインマウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍接種の5日後に、平均腫瘍サイズが102mm3の30匹の腫瘍を有するマウスを選択し、腫瘍サイズに基づいて5つのグル−プ（n=6）に無作為化した。無作為化の日（D0と定義）に治療を開始した。登録されたマウスは、それぞれ、hIgG1（0.5mpk）、イピリムマブ類似体（0.5および0.2mpk）およびCL5'−eA−dPTM'（0.27および0.1mpk）で、D0、D6、D9、D13、D16およびD19に腹腔内（i.p.）処置した。マウスを毎日モニタ−し、体重を就業日に記録した。腫瘍サイズは、治療の間、週に2回測定した。
【０２００】
体重の相対変化（RCBW）、腫瘍体積（TV）、および腫瘍増殖阻害率（TGI％）を実施例16と同様に計算した。各グル−プのマウスの体重の平均および標準誤差（SEM）、RCBWおよび腫瘍体積は、Microsoft Excel 2007を使用して計算した。体重、体重の相対変化、腫瘍増殖曲線、および腫瘍増殖阻害の図を、GraphPad Prism 5を使用してプロットした。異なるグル−プ間の腫瘍の増殖は、Two−way RM ANOVAを使用して分析した。カプランマイヤ−生存曲線を、ログランク検定を使用して分析した。<0.05のP値は統計的に有意であると見なした。
【０２０１】
腫瘍増殖曲線を図１５Ａに示した。図１５Ｂで観察されるように、すべての治療は、いかなる悪影響もなく許容された。0.1mpkおよび0.27mpkのCL5'−eA−dPTM'のグル−プ、0.5mpkのイピリムマブ類似体のグル−プのマウスは、0.2mpkのhIgG1のグル−プのマウスと比較して、D20からD30に有意な腫瘍増殖阻害を示した。一方、0.2mg/kgのイピリムマブ類似体治療は、0.2mpkのhIgG1と比較して有意な腫瘍増殖阻害を示さなかった。CL5'−eA−dPTM'は、同じ用量でイピリムマブ類似体よりも優れた腫瘍増殖阻害を促進した。
【０２０２】
本発明を詳細に、またその特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および修正を加えることができることは当業者には明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月18日(2020.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD152結合ドメインを含む単離されたモノクローナル抗体であって、該CD152結合ドメインは、CDR1、CDR2、およびCDR3を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、CDR1、CDR2、およびCDR3は、
（1）それぞれ配列番号4、5、6；
（2）それぞれ配列番号10、11および12；
（3）それぞれ配列番号16、17および18；
（4）それぞれ配列番号22、23および24；
（5）それぞれ配列番号28、29および30；
（6）それぞれ配列番号34、35および36；
（7）それぞれ配列番号40、41および42；
（8）それぞれ配列番号46、47および48；
（9）それぞれ配列番号52、53および54；
（10）それぞれ配列番号58、59および60；
（11）それぞれ配列番号64、65および66；
（12）それぞれ配列番号70、71および72；
（13）それぞれ配列番号76、77および78；
（14）それぞれ配列番号82、83および84；
（15）それぞれ配列番号88、89および90；
（16）それぞれ配列番号94、95および96；
（17）それぞれ配列番号100、101および102；
（18）それぞれ配列番号106、107および108；
（19）それぞれ配列番号112、113および114；
（20）それぞれ配列番号118、119および120；
（21）それぞれ配列番号124、125および126；
（22）それぞれ配列番号130、131および132；
（23）それぞれ配列番号136、137および138；
（24）それぞれ配列番号142、143および144；
（25）それぞれ配列番号148、149および150；
（26）それぞれ配列番号154、155および156；
（27）それぞれ配列番号160、161および162；
（28）それぞれ配列番号166、167および168；
（29）それぞれ配列番号172、173および174；
（30）それぞれ配列番号178、179および180；
（31）それぞれ配列番号184、185および186；または
（32）それぞれ配列番号190、191および192
と少なくともと80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
該抗体が重鎖のみの抗体である、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
該抗体が2つの免疫グロブリン重鎖を含む、請求項１または２に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
該抗体が2つの免疫グロブリン重鎖から構成される、請求項１から３のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項５】
2つの免疫グロブリン重鎖の少なくとも1つが、配列番号2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128 、134、140、146、152、158、164、170、176、182、または188と少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３または４に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項６】
免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183、または189と少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３から５のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項７】
以下の特性の1つまたはそれ以上を示す、請求項１から６のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体：（a）ヒトCD152に特異的に結合する；（b）サルCD152に特異的に結合する；（c）マウスCD152に特異的に結合しない；（d）CD152のCD80、CD86、またはその両方への結合をブロックする；（e）免疫細胞によるIL-2の分泌を促進する；（f）T細胞の活性化を誘導する；（g）免疫細胞による抗腫瘍免疫応答を刺激する。
【請求項８】
以下の特性の1つまたはそれ以上を示す、請求項１から７のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体：（a）イピリムマブ類似体よりも高い親和性でヒトCD152に結合する；（b）イピリムマブ類似体より少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍高い親和性でヒトCD152に結合する；（c）1.0*10-9M以下のKdでヒトCD152から解離する；（d）イピリムマブ類似体よりも低いKdでヒトCD152から解離する；（e）イピリムマブ類似体よりも少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも50倍、または少なくとも100倍低いKdでヒトCD152から解離する。
【請求項９】
6.0＊10-11M以下のKdでヒトCD152から解離する、請求項１から８のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１０】
該抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１から９のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体、およびその薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容される賦形剤が、担体、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、保存剤、等張剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
二次抗体をさらに含み、該二次抗体が免疫刺激抗体またはコスティミュラトリー抗体である、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
免疫刺激抗体が、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM3抗体、抗STAT3抗体、および抗ROR1抗体からなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
コスティミュラトリー抗体が抗CD137抗体または抗GITR抗体である、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の単離された抗体をコードする核酸分子。
【請求項１７】
配列番号1、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、163、169、175、181、または187に対して少なくとも80％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、該核酸分子が、宿主細胞において該核酸分子の発現に適した調節配列に作動可能に連結されている、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
腫瘍関連抗原を発現する細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ADCC）を誘導する方法であって、該方法が、T細胞を請求項１から１０のいずれか１項に記載の単離された抗体と接触させることを含み、該接触が、腫瘍関連抗原を発現する細胞に対するADCCが誘導される条件下で行われる、方法。
【請求項２１】
障害を治療するための医薬品の製造における、請求項１から１０のいずれか１項に記載の単離されたモノクローナル抗体または請求項１１から１５のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用であって、該障害が癌または自己免疫疾患である、使用。
【請求項２２】
該障害が癌である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
癌が、白血病、リンパ腫、CLL、小リンパ球性リンパ腫、辺縁細胞B細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、腎細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、上皮扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
医薬品がさらなる治療薬をさらに含む、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
さらなる治療薬が抗癌剤である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
さらなる治療薬がイピリムマブおよびそのバイオシミラー製品である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
癌障害が自己免疫疾患である、請求項２１に記載の使用。
【国際調査報告】
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