(57)【要約】  本発明は、シーケンスリストにおいて、シーケンス１〜４に示されるＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの特異性アップストリーム及びダウンストリームプライマーシーケンスと、シーケンス５〜８に示されるＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの特異性ＴａｑＭａｎ‐ＭＧＢデュアル蛍光プローブシーケンスと、シーケンス９〜１２に示されるＣＹＰ３Ａ５＊３の特異性アップストリーム及びダウンストリームプライマーシーケンス、及びシーケンス１３〜１６に示されるＣＹＰ３Ａ５＊３の特異性ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢデュアル蛍光プローブシーケンスとを含む、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位を検出するキット及その方法を提供する。前記キットは、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子多型性部位を検出することにより、フェンタニル薬に対する被験者の代謝能力を判断し，したがって、実用的な臨床応用価値のあるフェンタニル薬の使用をより正確かつ効果的にガイドすることができる。前記キットを臨床診断に適用した後、先行技術と高く一致し、価格が低いし、汚染を防止し、再現性が高いし、特異性が強いし、感度が高いし、検出速度が速いし、結果分析が簡単で精度が高い。  【選択図】図5
2021531040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーと、特異性ＴａｑＭａｎデュアル蛍光プローブと、及びＰＣＲ増幅試薬とを含むＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位を検出するキットであって、
検出キットは、二つのグループに分けられ、
グループＡ
部位ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇを検出するプライマーシーケンス：
ＳＥＱ１：５’ＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＡＴＡＧＡＧ３’、
ＳＥＱ２：５’ＧＧＣＣＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡ３’、
部位ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇを検出するプローブシーケンス：
ＳＥＱ３：５’ＦＡＭ−ＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣ−３’ＭＧＢ、
ＳＥＱ４：５’ＶＩＣ−ＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＡＣＴＣ−３’ＭＧＢ、
部位ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するプライマーシーケンス：
ＳＥＱ５：５’ＡＧＡＧＴＧＧＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＡＣＣ  ３’、
ＳＥＱ６：５’ＧＴＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴ  ３’、
部位ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するプローブシーケンス：
ＳＥＱ７：５’ＦＡＭ−ＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣ−３’ＭＧＢ、
ＳＥＱ８：５’ＶＩＣ−ＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣ−３’ＭＧＢ、
グループＢ
部位ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇを検出するプライマーシーケンス：
ＳＥＱ９：５’ＣＴＴＡＣＧＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＡＧ  ３’、
ＳＥＱ１０：５’ＴＡＴＧＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＴＣ  ３’、
部位ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇを検出するプローブシーケンス：
ＳＥＱ１１：５’ＦＡＭ−ＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴ−３’ＭＧＢ、
ＳＥＱ１２：５’ＶＩＣ−ＣＴＣＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＡＣＴ−３’ＭＧＢ、
部位ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するプライマーシーケンス：
ＳＥＱ１３：５’ＧＡＧＡＧＴＧＧＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＡＣ  ３’、
ＳＥＱ１４：５’ＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴＡ  ３’、
部位ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するプローブシーケンス：
ＳＥＱ１５：５’ＦＡＭ−ＴＧＴＣＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣ−３’ＭＧＢ、
ＳＥＱ１６：５’ＶＩＣ−ＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣ−３’ＭＧＢ、
前記特異性ＴａｑＭａｎデュアル蛍光プローブは、特異性野生型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブと特異性突然変異型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブに分けられ，その５’端には、蛍光レポーターグループが結合され、３’端には、消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合され、前記特異性野生型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブと前記特異性突然変異型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブとの蛍光レポーターグループは、必ず異なり、消光子は、同じでも異なっていてもよく、
前記蛍光レポーターグループは、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、及びＨＥＸからなる群から選択されることができ、
前記消光子は、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＴＡＭＲＡ、及びＭＧＢからなる群から選択されることができ、
前記特異性野生型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブの蛍光レポーターグループは、ＦＡＭであり、消光子は、ＭＧＢであり、前記特異性突然変異型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブの蛍光レポーターグループは、ＶＩＣであり、消光子は、ＭＧＢであり、
ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位キットの検出は、フェンタニル薬に対する被験者の代謝能力を判断する際の適用である、前記ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位を検出するキット。
【請求項２】
前記ＰＣＲ増幅試薬は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ＵＤＧ酵素、Ｔａｑ酵素、及びｄｄ  Ｈ２Ｏを含むことを特徴とする
請求項１に記載のＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位を検出するキット。
【請求項３】
ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位を検出する検出方法であって、
５０〜９００ｎＭの濃度のプライマー溶液と、５０〜５００ｎＭの濃度のプローブ溶液を調剤する段階１と、
ＰＣＲ増幅液を調剤する段階２と、
【表１】
2021531040.tif 000010
被験サンプルのＤＮＡ、濃度は、１０〜１００ｎｇ／μＬであり、前記被験サンプルは、血液サンプル、唾液サンプル、口腔スワブ、またはそれらの組み合わせから選択される段階３）と、
ＰＣＲ増幅を実行する段階４）と、及び
【数１】
2021531040.tif 000011
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置を使用して、検出サンプルを検出する段階５）とを含む、前記検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、具体的には、遺伝子検出に関し、より具体的には、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位の遺伝子検出キット及びその方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＹＰ３Ａ４は、ＣＹＰ３Ａサブファミリーでの最も重要なメンバーであり、主に肝臓と腸に分布されるＰ４５０酵素システム全体の３０〜４０％を占める。それは、多くの薬や外因性毒物の酸化的代謝に関し、一般的に使用される臨床薬の約５０％を代謝することができる。研究によると、ヒトの肝臓におけるＣＹＰ３Ａ４の発現及びその活性には、明らかな個人差があり、こんな差の９０％は、遺伝子の遺伝子多型性に関連する。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子は、ヒトの７番目染色体７ｑ２１．１〜ｑ２２．１に位置し、長さは、約２７ｋｂｐであり、その遺伝子構造は、１３個のエキソンと１２個のイントロンを含む。ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇ（２０２３０Ｇ＞Ａ）は、ＣＹＰ３Ａ４のイントロン１０にある一塩基多型性（ＳＮＰ）であり、中国の漢族集団における発生頻度は、２２．１〜３７％であり。ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇは、アトルバスタチン、シクロスポリン、タクロリムス、フェンタニル等の薬物の用量、有効性、及び薬物動態の変化に関連する。
【０００３】
ＣＹＰ３Ａ５は、ヒトの７番目染色体ｑ２１．１〜ｑ２２．１に位置し、遺伝子の全長は、３１．８ｋｂであり、１３個のエキソンを有し、５０２個のアミノ酸をコードする。ＣＹＰ３Ａ５は、ＣＹＰ３Ａの総量の５０％を占め、主に肝臓、小腸、及び腎臓、前立腺、及び肺などの肝外組織で発現され、ＣＹＰ３Ａ５の発現と活性との多型性は、高くて、個人や種族によって大きな違いがある。ＣＹＰ３Ａ５酵素のアミノ酸は、ＣＹＰ３Ａ４酵素をコードするアミノ酸と８４％の類似性があり、ＣＹＰ３Ａ５酵素とＣＹＰ３Ａ４酵素とは、多くの重複する代謝基質と類似な触媒活性を有するが、ＣＹＰ３Ａ５酵素活性は、ＣＹＰ３Ａ４より８０％低い。ここで、イントロン３に位置するＳＮＰ（６９８６Ａ＞Ｇ突然変異）が最も重要であり、突然変異は、ＣＹＰ３Ａ５＊３として定義され、中国人の集団における発生頻度は、比較的に高い（７１％〜７７．８％）。
【０００４】
フェンタニル薬は、人工合成された強力な麻酔性鎮痛薬であり、鎮痛メカニズムは、モルフィンに類似し，オピウム受容体アゴニストであり、効果の強度は、モルフィンの６０〜８０倍である。主に肝臓チトクローム酵素Ｐ４５０システムのＣＹＰ３Ａ４／ＣＹＰ３Ａ５サブファミリーによって代謝され，体内における薬物の代謝速度は、酵素活性の影響を受ける。フェンタニル薬は、主な臨床麻酔用薬であるが、薬物の用量が過剰すると、呼吸抑制を引き起こし、死も引き起こすリスクがある。フェンタニル薬の主な代謝遺伝子であるＣＹＰ３Ａ４／ＣＹＰ３Ａ５の遺伝子の部位を検出することにより、フェンタニル薬に対する患者の代謝能力を判断し、薬物の投与量をガイドする。
【０００５】
現在、多くの薬物がＰ４５０ファミリーの酵素によって代謝され、Ｐ４５０遺伝子型を測定し、酵素活性を決定することが重要である。ただし、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子のいくつかの重要な部位は、シーケンス構造が比較的に特殊であり、蛍光プローブを設計する難易度が高く、設計されたプローブが遺伝子型に対する解像度が低く、同時に、一致するＰＣＲプライマーの要求も高く、プライマー自体またはアップストリームとダウンストリームとのプライマーの間には、二次構造があり、または、プライマーとＤＮＡテンプレート間の結合効率が低く、アップストリームとダウンストリームとのプライマーの間のＤＮＡテンプレートシーケンスは、高いＧＣ等の特殊構造を有し、以上の全部が低いＰＣＲ効率に繋がる。現在、市場に販売されるタイピング製品は、世界最大のバイオ会社であるサーマルフィッシャー（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｆｉｓｈｅｒ）によってのみ提供され、そのシーケンスと処方は、すべて機密であり、キットは、高価である。現在、中国では、遺伝子多型性の検出に直接シーケンシングと定性ＰＣＲ法が一般的に使用される。これら二つの方法の感度と特異性とは、高くなく、遺伝子多型性を正確に検出することができない。さらに、ほとんどの直接シーケンシング法は、外部委託の実験が使用され、検出時間が長すぎて、少なくとも２４時間が必要であるため、検出に不便が生じる。
【０００６】
要約すると、本分野では、中国のＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子検出の欠如を補うために、操作が簡単で、特異性が優れ、精度が高く、効率的にＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位を検出できるキットと方法とを早急に開発する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
広範囲にわたる詳細な研究と大量のスクリーニングを通じて、本発明者は、ＣＹＰ３Ａ４＊１ＧとＣＹＰ３Ａ５＊３との遺伝子検出に適した特異性プライマーと特異性ＴａｑＭａｎ−ＭＧＢデュアル蛍光プローブを発見し，具体的に、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子の多型性部位を検出するリアルタイム蛍光ＰＣＲ検出キットを作製するための、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇ遺伝子とＣＹＰ３Ａ５＊３遺伝子とのアップストリーム及びダウンストリームプライマーと、及び特異性蛍光プローブを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明により提供されるＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位を検出するキットは、シーケンスリストにおいて、シーケンス１〜４に示されるＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの特異性プライマーのアップストリーム及びダウンストリームシーケンスと、シーケンス５〜８に示されるＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの特異性ＴａｑＭａｎ〜ＭＧＢデュアル蛍光プローブシーケンスと、シーケンス９〜１２に示されるＣＹＰ３Ａ５＊３の特異性プライマーのアップストリーム及びダウンストリームシーケンスと、及びシーケンス１３〜１６に示されるＣＹＰ３Ａ５＊３の特異性ＴａｑＭａｎ〜ＭＧＢデュアル蛍光プローブシーケンスと、２×マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）と、及び取扱説明書を含む。
【０００９】
プライマーと、特異性ＴａｑＭａｎデュアル蛍光プローブと、及びＰＣＲ増幅試薬とを含むＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位を検出するキットであって、ここで、検出キットは、二つのグループに分けられ、
グループＡ
部位ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇを検出するプライマーシーケンス：
ＳＥＱ１：５’ＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＣＡＴＡＧＡＧ３’、
ＳＥＱ２：５’ＧＧＣＣＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡ３’、
部位ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇを検出するプローブシーケンス：
ＳＥＱ３：５’ＦＡＭ−ＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣ−３’ＭＧＢ、
ＳＥＱ４：５’ＶＩＣ−ＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＡＣＴＣ−３’ＭＧＢ、
部位ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するプライマーシーケンス：
ＳＥＱ５：５’ＡＧＡＧＴＧＧＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＡＣＣ３’、
ＳＥＱ６：５’ＧＴＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＴ３’、
部位ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するプローブシーケンス：
ＳＥＱ７：５’ＦＡＭ〜ＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣ〜３’ＭＧＢ、
ＳＥＱ８：５’ＶＩＣ〜ＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣ〜３’ＭＧＢ、
グループＢ
部位ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇを検出するプライマーシーケンス：
ＳＥＱ９：５’ＣＴＴＡＣＧＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＡＧ３’、
ＳＥＱ１０：５’ＴＡＴＧＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＣＣＡＣＴＣ３’、
部位ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇを検出するプローブシーケンス：
ＳＥＱ１１：５’ＦＡＭ−ＣＴＣＣＡＴＧＴＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴ−３’ＭＧＢ、
ＳＥＱ１２：５’ＶＩＣ〜ＣＴＣＣＡＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＡＣＴ〜３’ＭＧＢ、
部位ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するプライマーシーケンス：
ＳＥＱ１３：５’ＧＡＧＡＧＴＧＧＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＡＣ３’、
ＳＥＱ１４：５’ＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴＡ３’、
部位ＣＹＰ３Ａ５＊３を検出するプローブシーケンス：
ＳＥＱ１５：５’ＦＡＭ〜ＴＧＴＣＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣ−３’ＭＧＢ、
ＳＥＱ１６：５’ＶＩＣ〜ＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣ−３’ＭＧＢ、
前記特異性ＴａｑＭａｎデュアル蛍光プローブは、特異性野生型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブと特異性突然変異型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブに分けられ、その５’端には、蛍光レポーターグループが結合され、３’端には、消光子（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が結合され、前記特異性野生型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブと前記特異性突然変異型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブとの蛍光レポーターグループは、必ず異なり、消光子は、同じでも異なっていてもよい。
【００１０】
前記蛍光レポーターグループは、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、及びＨＥＸからなる群から選択されることができ、
前記消光子は、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＴＡＭＲＡ、及びＭＧＢからなる群から選択されることができる。
【００１１】
好ましくは、本発明による特異性野生型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブの蛍光レポーターグループは、ＦＡＭであり、消光子は、ＭＧＢであり、前記特異性突然変異型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブの蛍光レポーターグループは、ＶＩＣであり、消光子は、ＭＧＢである。
【００１２】
前記ＰＣＲ増幅試薬は、ＰＣＲバッファーｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ＵＤＧ酵素、Ｔａｑ酵素、及びｄｄ  Ｈ２Ｏを含む。
【００１３】
本発明のキットは、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との多型性部位の検出に使用することができ、検出方法は、
ゲノム抽出法を使用して、１０〜１００ｎｇ／μＬの濃度で被験サンプルのゲノムＤＮＡを抽出し、前記被験サンプルは、血液サンプル、唾液サンプル、口腔スワブ、またはそれらの組み合わせから選択される段階１と、
５０〜９００ｎＭの濃度のプライマー溶液と、５０〜５００ｎＭの濃度のプローブ溶液と、ＰＣＲ増幅試薬（２×マスターミックス）を調剤する段階２と、
【表１】
2021531040.tif 000003
ＰＣＲ増幅試薬、特異性プライマーのアップストリーム及びダウンストリーム、特異性野生型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブ、特異性突然変異型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブ、被験サンプルのゲノムＤＮＡと、及びｄｄＨ２Ｏを含む、蛍光定量ＰＣＲ反応システムを調剤する段階３と、
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置を使用して、ＰＣＲ増幅を実行する段階４と、及び
【数１】
2021531040.tif 000004
増幅されたデータを分析して、遺伝子のタイピング結果を得る段階５を含む。
【００１４】
前記キットは、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子多型性部位を検出することにより、フェンタニル薬に対する被験者の代謝能力を判断し、従って、フェンタニル等の薬物の使用をより正確かつ効果的にガイドすることができる。
【００１５】
ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子多型性部位を検出することにより、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子の組み合わせの用量勾配等級（表１）を提供し，低から高の用量を等級Ｉ〜ＩＶ（即ち、等級Ｉが最小量を使用し、等級ＩＶが最大量を使用する）に等級付け、実際の投与量は、実際の臨床を基準とする。例えば、同じ鎮痛効果が得られる場合、＊１Ｇ／＊１Ｇグループの患者が消費するＰＣＩＡスフェンタニルの量は、（４９．８±１０．２）μｇであり、＊１／＊１グループ（６４．６±１０．９）μｇ及び＊１／＊１Ｇグループ（６２．５±１２．７）μｇと比較して、すべて減少する（Ｐ＜０．０１）。
【表２】
2021531040.tif 000005
【発明の効果】
【００１６】
前記キットは、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子多型性部位を迅速かつ簡単に検出することができ、その利点は次のとおりである。
【００１７】
１、特異性が強い：本キットは、特異性ＴａｑＭａｎデュアル蛍光プローブを使用して、遺伝子多型性部位を識別し、ＴａｑＭａｎプローブは、３’端にＭＧＢ消光子が結合される。ＭＧＢプローブには、蛍光消光子がないため、背景信号を減少し、信号対ノイズ比が増加し、プローブのＴｍ値が約１０℃上昇して、プローブとテンプレートコンジュゲートのアニーリング温度が上昇し、ＤＮＡの結合が強化され、プローブがテンプレートの単一ベースと一致しない場合、二つの結合を抑制し、プローブの特異性を向上させることができる。
【００１８】
２、汚染防止：ＰＣＲ増幅試薬にｄＵＴＰ及びＵＤＧ酵素を追加すると、エアロゾル汚染を防止することができ、前記キットの増幅と検出のプロセスは、蓋を開ける必要がなく、同じチューブで実行されたため、汚染の可能性を低くする。
【００１９】
３、感度が高い：非常に少量のゲノムＤＮＡでも、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子多型性を検出することができる。
【００２０】
４、検出速度が速い：ＰＣＲ反応時間が短く、反応が完了直後に検出結果を確認することができ、一度に一つまたは複数のサンプルを検出することができる。
【００２１】
５、結果分析が簡単で精度が高い：本キットには、二つの特異性ＴａｑＭａｎ〜ＭＧＢプローブがあり、検出結果は、増幅曲線から直接得ることができ、遺伝子多型性部位を判断する精度を向上する。
【００２２】
６、前記キットは、ＣＹＰ３Ａ４とＣＹＰ３Ａ５との遺伝子多型性部位を検出することにより、フェンタニル薬に対する被験者の代謝能力を判断し，したがって、実用的な臨床応用価値のあるフェンタニル薬の使用をより正確かつ効果的にガイドすることができる。前記キットを臨床診断に適用した後、先行技術と高く一致し、価格が低く、再現性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】サンプル１のグループＡのＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの増幅曲線図である。
【図１Ｂ】サンプル１のグループＢのＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの増幅曲線図である。
【図２Ａ】サンプル１のグループＡのＣＹＰ３Ａ５＊３の増幅曲線図である。
【図２Ｂ】サンプル１のグループＢのＣＹＰ３Ａ５＊３の増幅曲線図である。
【図３Ａ】サンプル２のグループＡのＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの増幅曲線図である。
【図３Ｂ】サンプル２のグループＢのＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの増幅曲線図である。
【図４Ａ】サンプル２のグループＡのＣＹＰ３Ａ５＊３の増幅曲線図である。
【図４Ｂ】サンプル２のグループＢのＣＹＰ３Ａ５＊３の増幅曲線図である。
【図５】サンプル増幅曲線図の包括的な比較図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、実施例及び図面を参照して、本発明の内容をより具体的に説明し、本発明をさらに説明するが、これらの実施例は、決して本発明を限定するものではない。
【００２５】
実施例１：サンプルの収集
サンプル収集の３０分前に、患者はきれいな水で口を漱ぎ、３０分以内に飲食してはいけない。
【００２６】
１、口腔スワブパッケージを開き、スワブを慎重に取り出し、スワブヘッドを口腔の内壁で前後に２０〜３０回擦る。
【００２７】
２、唾液保存チューブを開き、保存チューブでスワブヘッドを切断し、保存チューブの蓋を閉じて、サンプル収集を完了する。
【００２８】
実施例２：ＤＮＡ抽出
この抽出段階では、Ｍｏｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．、Ｌｔｄ．の唾液ＤＮＡ抽出キット（磁気ビーズ法）を使用して、抽出する。被験サンプル１、２、３を抽出する。
【００２９】
１．収集したサンプルを恒温振とうミキサーに置き、５６℃、１５ｍｉｎ、８００ｒｐｍ／ｍｉｎのパラメーターを選択する。唾液サンプルの前処理を実行する。
【００３０】
２．キットを開き、チューブを取り出し、６〜１０回上下に振って、チューブのウェル(7)の磁気ビーズを均等に混ぜ、シーリングフィルムを注意深く剥がす。
【００３１】
３．最初のウェル(1)に処理済み唾液サンプル３００μＬを加えた後、ウェル(9)に溶出バッファー１００μＬを加え、ＣＴＣ−２０００核酸抽出器の引き出しにチューブを入れ、磁気ロッドカバーを取り付く、ｓａｌｉｖａ  ＤＮＡプログラムを選択して実行するだけである。
【００３２】
４．プログラムが終了後、抽出したＤＮＡをウェル(9)に収集して、次の実験に使用するか、−２０℃で保存する。
【００３３】
検出した結果、被験サンプル１、２のＤＮＡ濃度は、それぞれ１０ｎｇ／μＬ、４０ｎｇ／μＬである。
【００３４】
実施例３：蛍光ＰＣＲ検出
１．  ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇ特異性アップストリーム及びダウンストリームプライマーシーケンス１及びシーケンス２、特異性ＴａｑＭａｎ〜ＭＧＢデュアル蛍光プローブシーケンス５及びシーケンス６、ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇ特異性アップストリーム及びダウンストリームプライマーシーケンス３及びシーケンス４、特異性ＴａｑＭａｎ〜ＭＧＢデュアル蛍光プローブシーケンス７及びシーケンス８、ＣＹＰ３Ａ５＊３特異性アップストリーム及びダウンストリームプライマーシーケンス９及びシーケンス１０、特異性ＴａｑＭａｎ〜ＭＧＢデュアル蛍光プローブシーケンス１３及びシーケンス１４、ＣＹＰ３Ａ５＊３特異性アップストリーム及びダウンストリームプライマーシーケンス１１及びシーケンス１２、及び特異性ＴａｑＭａｎ〜ＭＧＢデュアル蛍光プローブシーケンス１５及びシーケンス１６を、ＰＣＲ実験用に二つのグループ（それぞれ、グループＡ、グループＢ）に分け、詳細は、次の表に示したとおりである。
【表３】
2021531040.tif 000006
【００３５】
２．蛍光定量ＰＣＲ反応システムの調剤：ＰＣＲ増幅試薬、特異性プライマーのアップストリーム及びダウンストリーム、特異性野生型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブ、特異性突然変異型ＴａｑＭａｎ蛍光プローブ、被験サンプルのゲノムＤＮＡ、及びｄｄＨ２Ｏを含み、
ＴａｑＭａｎ蛍光定量２×マスターミックス（１ｍＬ）の成分は次のとおりである。
【表４】
2021531040.tif 000007
【００３６】
ＰＣＲ反応システム（１０μＬ）は次のとおりである。
【表５】
2021531040.tif 000008
【００３７】
３．反応条件は、５０℃で２分間→９５℃で１０分間→［９５℃で１５秒間、６０℃で１分間］の合計４０サイクルである。
【００３８】
４．図４に示されたように、結果は、本キットＣＹＰ３Ａ５＊３の二つのグループのプライマーとプローブとが増幅した後、すべて増幅曲線実験の結果を有することを示す。
【００３９】
サンプル１の二つのグループのＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの増幅曲線は、図１に示されたように、結果は、前記キットＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの二つのグループのプライマーとプローブとが増幅した後、すべて増幅曲線を有するが、グループＢ（図１Ｂ）の増幅効率は、グループＡ（図１Ａ）の増幅效率より高いことを示す。図面から、サンプル１のＦＡＭとＶＩＣとの蛍光には、増幅曲線があるため、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子型は、ヘテロ接合型（ＣＹＰ３Ａ４＊１／＊１Ｇ）であることを明確に判断することができる。
【００４０】
サンプル１の二つのグループのＣＹＰ３Ａ５＊３の増幅曲線は、図２に示されたように、結果は、前記キットＣＹＰ３Ａ５＊３の二つのグループのプライマーとプローブとが増幅した後、すべて増幅曲線を有するが、グループＢ（図２Ｂ）の増幅効率は、グループＡ（図２Ａ）の増幅效率より高いことを示す。図面から、サンプル１には、ＦＡＭ蛍光の増幅曲線があるが、ＶＩＣ蛍光の増幅曲線がないため、サンプル１のＣＹＰ３Ａ５遺伝子型は、野生ホモ接合型（ＣＹＰ３Ａ５＊１／＊１）であることを明確に判断することができる。
【００４１】
サンプル２の二つのグループのＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの増幅曲線は、図３に示されたように、結果は、本キットＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇの二つのグループのプライマーとプローブとが増幅した後、すべて増幅曲線を有するが、グループＢ（図３Ｂ）の増幅効率は、グループＡ（図３Ａ）の増幅效率より高いことを示す。図面から、サンプル２には、ＶＩＣ蛍光の増幅曲線のみがあり、ＦＡＭ蛍光の増幅曲線がないため、サンプル２のＣＹＰ３Ａ４遺伝子型は、突然変異ほむ接合型（ＣＹＰ３Ａ４＊１Ｇ／＊１Ｇ）であることを明確に判断することができる。
【００４２】
サンプル２の二つのグループのＣＹＰ３Ａ５＊３の増幅曲線について、グループＢ（図４Ｂ）の増幅効率は、グループＡ（図４Ａ）の増幅效率より高い。図面から、サンプル２のＦＡＭとＶＩＣとの二つの蛍光には、すべて増幅曲線があるため、サンプル２のＣＹＰ３Ａ５遺伝子型は、ヘテロ接合型（ＣＹＰ３Ａ５＊１／＊３）であることを明確に判断することができる。
【表６】
2021531040.tif 000009
【００４３】
以上、実施例の前後順序は、説明を容易にするためだけのものであり、実施例の優劣を表すものではない。
【００４４】
最後に、以上の実施例は、本発明の技術的解決策を説明するためにのみ使用され、本発明を限定するものではないことに留意されたいし、本発明は、前述の実施例を参照して詳細に説明したが、当業者は、前述の実施例で説明した技術的解決策を変更すること、または、同等にいくつかの技術的特徴を置換することは依然として可能であり、しかしながら、これらの修正または置換は、対応する技術的解決策の本質が、本発明の実施例の技術的解決策の精神及び範囲から逸脱することがないことに理解されたい。
【図１Ａ】
2021531040.tif 000012
【図１Ｂ】
2021531040.tif 000013
【図２Ａ】
2021531040.tif 000014
【図２Ｂ】
2021531040.tif 000015
【図３Ａ】
2021531040.tif 000016
【図３Ｂ】
2021531040.tif 000017
【図４Ａ】
2021531040.tif 000018
【図４Ｂ】
2021531040.tif 000019
【図５】
2021531040.tif 000020
【国際調査報告】
2021531040.tif 000021
2021531040.tif 000022
2021531040.tif 000023
2021531040.tif 000024
2021531040.tif 000025
2021531040.tif 000026