(57)【要約】【課題】  本発明は、細胞においてＤＳＢ修復を増強するのに有効な量で１つまたは複数の異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現する組換え真核細胞を提供する。【解決手段】  組換え真核細胞は目的の組換え産物を発現しうる。真核細胞における二本鎖切断（ＤＳＢ）修復を増強し、目的の組換え産物の生産のための宿主細胞を確立し、目的の組換え産物を生産し、真核細胞による目的の組換え産物の生産を改善し、および／または目的の組換え産物を生産するための宿主細胞としての真核細胞の適合性を調べるための方法も提供される。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を、細胞でのＤＳＢ修復を増強するのに有効な量で発現した組換え真核細胞。
【請求項２】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が、細胞の安定性を増強するのに有効な量で少なくとも１カ月間発現される、請求項１に記載の組換え真核細胞。
【請求項３】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が、ＤＮＡリガーゼＩＶ（ＬＩＧ４）、Ｘ線修復クロス補完６（ＸＲＣＣ６）、ＢＲＣＡ２のパートナーおよびローカライザー（ＰＡＬＢ２）、ならびにＰＡＲＰＢＰ遺伝子によりコードされるＰＡＲＰ１結合タンパク質（ＰＡＲＩ）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の組換え真核細胞。
【請求項４】
異種ＤＳＢ修復タンパク質がＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６である、請求項３に記載の組換え真核細胞。
【請求項５】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が一過性に発現される、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の組換え真核細胞。
【請求項６】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が安定的に発現される、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の組換え真核細胞。
【請求項７】
組換え真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の組換え真核細胞。
【請求項８】
哺乳動物細胞が、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の組換え真核細胞。
【請求項９】
哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え真核細胞。
【請求項１０】
異種ＤＳＢ修復タンパク質がチャイニーズハムスター由来である、請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の組換え真核細胞。
【請求項１１】
異種ＤＳＢ修復タンパク質がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来である、請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の組換え真核細胞。
【請求項１２】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え真核細胞。
【請求項１３】
組換え真核細胞が、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種ＤＳＢ修復遺伝子を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え真核細胞。
【請求項１４】
異種ＤＳＢ修復遺伝子が、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列を含む、請求項１３に記載の組換え真核細胞。
【請求項１５】
異種ＤＳＢ修復遺伝子が、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項１３または１４に記載の組換え真核細胞。
【請求項１６】
目的の組換え産物をコードし目的の組換え産物を発現する異種核酸配列を含む、請求項１から請求項１５のいずれか一項に記載の組換え真核細胞。
【請求項１７】
目的の組換え産物が、タンパク質またはポリペプチドである、請求項１６に記載の組換え真核細胞。
【請求項１８】
タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の組換え真核細胞。
【請求項１９】
目的の組換え産物をコードする異種核酸配列が、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項１６に記載の組換え真核細胞。
【請求項２０】
組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれた選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含む、請求項１９に記載の組換え真核細胞。
【請求項２１】
目的の組換え産物が、分泌型胚性アルカリホスフェート（ＳＥＡＰ）である、請求項１６から請求項２０のいずれか一項に記載の組換え真核細胞。
【請求項２２】
真核細胞において二本鎖切断（ＤＳＢ）修復を増強するための方法であって、真核細胞において有効量の異種ＤＳＢ修復タンパク質を発現させる工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
真核細胞の安定性を所定期間にわたり増強する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
真核細胞中に異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸遺伝子を導入する工程をさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸配列が、過剰発現、トランス遺伝子発現、遺伝子ノックイン、遺伝子活性化、転写活性化、翻訳活性化、遺伝子突然変異またはその組合せにより真核細胞中に導入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
目的の組換え産物の生産のために宿主細胞を確立するための方法であって、
（ａ）真核細胞において異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の真核細胞においてＤＳＢ修復を判定する工程と、
（ｃ）ＤＳＢ修復が増強される真核細胞を宿主細胞として単離する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２７】
宿主細胞のゲノムを編集して宿主細胞におけるＤＳＢ修復を改善する工程をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
目的の組換え産物を生産するための方法であって、
（ａ）培養培地で真核細胞を成長させる工程であって、前記組換え真核細胞が、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含む、該成長させる工程と、
（ｂ）真核細胞において異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程と、
（ｃ）真核細胞により目的の組換え産物を発現させる工程と
を含む、前記方法。
【請求項２９】
真核細胞による目的の組換え産物の平均生産性の低下が、少なくとも８週間の期間にわたり３０％未満である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
真核細胞が、少なくとも８週間の期間にわたり目的の組換え産物をコードする異種核酸配列のコピー数の少なくとも７０％を保持する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
真核細胞のゲノムを編集して真核細胞におけるＤＳＢ修復を改善する工程をさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
真核細胞による目的の組換え産物の生産を改善する方法であって、真核細胞は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含み、目的の組換え産物を生産し、該方法は、組換え真核細胞により異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程を含む、前記方法。
【請求項３３】
真核細胞においてＤＳＢ修復を増強する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
真核細胞の安定性を所定期間にわたり増強する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
目的の組換え産物を生産するための宿主細胞としての真核細胞の適合性を調べる方法であって、真核細胞が、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含み、
（ａ）真核細胞により異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程と、
（ｂ）真核細胞においてＤＳＢ修復を判定する工程であって、前記ＤＳＢ修復の改善が、真核細胞が目的の組換え産物を生産するための宿主細胞として適切であることを示す、該判定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項３６】
ＤＳＢ修復タンパク質が、ＤＮＡリガーゼＩＶ（ＬＩＧ４）、Ｘ線修復クロス補完６（ＸＲＣＣ６）、ＢＲＣＡ２のパートナーおよびローカライザー（ＰＡＬＢ２）、ならびにＰＡＲＰＢＰ遺伝子によりコードされるＰＡＲＰ１結合タンパク質（ＰＡＲＩ）からなる群から選択される、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
異種ＤＳＢ修復タンパク質がＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が一過性に発現される、請求項２２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が安定的に発現される、請求項２２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項２２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
哺乳動物細胞が、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が、チャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞由来である、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来である、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
異種ＤＳＢ修復タンパク質が、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
真核細胞が、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種ＤＳＢ修復遺伝子を含む、請求項２２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
異種ＤＳＢ修復遺伝子が、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
異種ＤＳＢ修復遺伝子が、真核細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
真核細胞により選択マーカーを発現させる工程をさらに含み、真核細胞が、選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含み、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列および選択マーカーをコードする異種核酸配列が、真核細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項２８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ＤＮＡ損傷を誘発する条件下で真核細胞を成長させる工程をさらに含む、請求項２８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
目的の組換え産物がタンパク質またはポリペプチドである、請求項２８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
異種ＤＳＢ修復タンパク質がＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６であり、真核細胞においてＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６の発現を定量化する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
真核細胞による目的の組換え産物の発現を定量化する工程をさらに含む、請求項３５または５３に記載の方法。
【請求項５５】
目的の組換え産物をコードする異種核酸配列がそのゲノム中に組み込まれている真核細胞を同定する工程をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
目的の組換え産物を、組換え真核細胞について１リットル当たり１００ｍｇよりも多い量で生産する真核細胞を同定する工程をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
請求項２６または２７に記載の方法に従って確立された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２日に提出の米国特許仮出願第６２／６５１，３１７号の優先権を主張するものであり、前記特許文献の内容は参照によりその全体をあらゆる目的のために本明細書に組み込む。
【０００２】
米国政府支援への言及
本発明は、米国科学財団による認可番号１４１２３６５および１５３９３５９の下、政府の支援で行われた。合衆国は本発明にある特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は一般的には、組換えタンパク質を生産するための宿主細胞の安定性の改善に関する。
【背景技術】
【０００４】
生物製剤部門は製薬産業のうち最も急速に成長している部分である。年間成長率９．２％で、組換え治療タンパク質の世界的年間売上高は２０１５年に１５４０億ドルに達し、成長し続けている。市場からの強い要望が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された革新的な治療用タンパク質の数が増えていることと併せて、これらの分子を製造するのに使用される既存のおよび新たに創造された細胞株の安定した高い生産性および製品品質を確保する重要な推進力となっている。
【０００５】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、治療用タンパク質の商業生産のための最も重要な細胞株であり、年間１０００億ドル以上の製品を生み出している。プラットホームとしてのＣＨＯの広範な使用をもたらすキーとなる要因は、無血清懸濁培養液中での高細胞密度での成長を可能にし、高い生産性を含む多様な表現型を有するクローンならびに所望の製品特性を有する製品を発現するクローンの選択も可能にするこの細胞の計り知れない適応能力である。ＣＨＯ細胞のまれな適応性は、固有のゲノム不安定性、すなわち、細胞培養中に、ＤＮＡ配列が変化し染色体再編が頻繁に起こることから生じる。しかし、この「不安定なゲノム」は、所望の特性を有する選択されたクローンに関して言えば、望ましくない結果も招き：細胞がコピー数を減らすまたは組み込まれたトランス遺伝子の発現を変更する可能性があり、これが今度は商業的応用に適切な時間：約６０日間の培養、にわたり高い生産性または製品品質を維持できなくなる形で現れる。このような生産不安定性は商業的製造工程では依然として重大な懸念である。
【０００６】
ゲノム不安定性以外に、生産不安定性の別の報告がされることの多い原因は、主にプロモーターのメチル化およびヒストン修飾による後成的サイレンシングに起因するトランス遺伝子転写物の減少である。今までのところ、２つの報告がこの機構を標的にして、ＣＭＶプロモーター突然変異体を使用してプロモーターのメチル化を防ぐことにより、またはおそらくヒストン脱アセチル化を減らすように作用する遺伝子Ｆａｍ６０Ａを欠失させることにより生産安定性を増やした。しかし、一部の細胞株では、後成的転写サイレンシングは生産不安定性を伴っていたが、大多数の細胞株においては、ゲノム不安定性に起因するトランス遺伝子コピー数の低下が生産不安定性の優勢な原因であった。ゲノム完全性を維持できないことは、長期の培養中すべてではないにしても大半の生産細胞株において生産安定性に否定的な影響を及ぼす。ＣＨＯ細胞におけるゲノム不安定性問題に取り組むことにより生産安定性を制御できた研究はこれまでない。
【０００７】
ゲノム不安定性は、ほとんどのがんの共通の特徴であり、ＤＮＡ損傷修復の欠陥から生じることがある。ＤＮＡ損傷のあらゆる種類のうち、最も毒性が高いのは二本鎖切断（ＤＳＢ）である。２つの異なる相補的なＤＳＢ修復経路（ＮＨＥＪおよびＨＤＲ）は、ＤＳＢの有害作用からゲノムを保護するために進化してきた。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路は、ＤＮＡ末端の刈込を制限すると共に、切断されたＤＮＡの両端をライゲートするが、内因的に誤りがちである。これとは対照的に、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路は、切断されたＤＮＡの最初の配列を忠実に回復させるのに相同配列を必要とする。多くの遺伝子がその２つの経路に関与しており、これらの遺伝子の突然変異は、ＤＮＡ配列変化および染色体再編をもたらすおそれがあり、これが発癌の一因となることが多い。ＣＨＯ細胞の固有のゲノム不安定性、特に頻繁な染色体再編は、ＤＳＢ修復遺伝子の突然変異により引き起こされるＤＳＢ修復不全に起因している可能性がある。ＣＨＯ細胞が元来由来するチャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞は、安定なゲノムを持ち、機能的なＤＳＢ修復を有していることを考えると、ＣＨＯ細胞において機能的な（ＣＨ）ＤＳＢ修復遺伝子を発現すれば、ＤＳＢ修復システムを救済し、ゲノム安定性を改善する潜在的な方法となりうる。
【０００８】
組換えタンパク質を生産するために宿主細胞の安定性を改善する方法の必要性が残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、真核細胞における二本鎖切断（ＤＳＢ）修復の増強および真核細胞の安定性ならびに目的の産物を生産するそのような真核細胞の使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
組換え真核細胞が提供される。組換え真核細胞は、異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を、細胞でのＤＳＢ修復を増強するのに有効な量で発現する。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、少なくとも１カ月、間細胞の安定性を増強するのに有効な量で発現されうる。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、ＤＮＡリガーゼＩＶ（ＬＩＧ４）、Ｘ線修復クロス補完６（ｘ−ｒａｙ  ｒｅｐａｉｒ  ｃｒｏｓｓ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ６）（ＸＲＣＣ６）、ＢＲＣＡ２のパートナーおよびローカライザー（ＰＡＬＢ２）、ならびにＰＡＲＰＢＰ遺伝子によりコードされるＰＡＲＰ１結合タンパク質（ＰＡＲＩ）からなる群から選択されうる。異種ＤＳＢ修復タンパク質はＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は一過性にまたは安定的に発現されてもよい。
【００１１】
組換え真核細胞は哺乳動物細胞でもよい。哺乳動物細胞は、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞からなる群から選択されうる。哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でもよい。
【００１２】
異種ＤＳＢ修復タンパク質はチャイニーズハムスター由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１または２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。
【００１３】
異種ＤＳＢ修復タンパク質はチャイニーズハムスター卵巣細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含みうる。
【００１４】
組換え真核細胞は、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種ＤＳＢ修復遺伝子を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列を含みうる。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００１５】
組換え真核細胞は、目的の組換え産物をコードして目的の組換え産物を発現する異種核酸配列を含みうる。目的の組換え産物は、タンパク質またはポリペプチドでもよい。タンパク質はモノクローナル抗体でもよい。目的の組換え産物をコードする異種核酸配列は組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。目的の組換え産物は、分泌型胚性アルカリホスフェート（ＳＥＡＰ）でもよい。
【００１６】
組換え真核細胞は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれた選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含みうる。
【００１７】
真核細胞において二本鎖切断（ＤＳＢ）修復を増強するための方法（増幅法）が提供される。該方法は、真核細胞において有効量の異種ＤＳＢ修復タンパク質を発現させる工程を含む。該方法は、真核細胞の安定性を一定期間、所定期間にわたり増強する工程をさらに含みうる。該方法は、真核細胞中に異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸遺伝子を導入する工程をさらに含みうる。異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸配列は、過剰発現、トランス遺伝子発現、遺伝子ノックイン、遺伝子活性化、転写活性化、翻訳活性化、遺伝子突然変異またはその組合せにより真核細胞中に導入しうる。
【００１８】
目的の組換え産物の生産のために宿主細胞を確立するための方法（確立法）が提供される。該方法は、（ａ）真核細胞において異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程；（ｂ）工程（ａ）の真核細胞においてＤＳＢ修復を判定する工程；および（ｃ）ＤＳＢ修復が増強される真核細胞を宿主細胞として単離する工程を含む。該方法は、宿主細胞のゲノムを編集して宿主細胞におけるＤＳＢ修復を改善する工程をさらに含んでいてもよい。本方法に従って確立された宿主細胞が提供される。
【００１９】
目的の組換え産物を生産するための方法（生産法）が提供される。該方法は、（ａ）培養培地で真核細胞を成長させる工程であって、前記組換え真核細胞が、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含む、該成長させる工程と；（ｂ）真核細胞において異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程と；（ｃ）真核細胞により目的の組換え産物を発現させる工程とを含む。真核細胞による目的の組換え産物の平均生産性は、少なくとも８週間の期間にわたって３０％未満に低下しうる。真核細胞は、少なくとも８週間の期間にわたって目的の組換え産物をコードする異種核酸配列のコピー数の少なくとも７０％を保持しうる。該方法は、真核細胞のゲノムを編集して真核細胞におけるＤＳＢ修復を改善する工程をさらに含んでいてもよい。該方法は、真核細胞により選択マーカーを発現させる工程をさらに含んでいてもよく、この真核細胞は、選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含んでいてもよく、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列および選択マーカーをコードする異種核酸配列は、真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。該方法は、ＤＮＡ損傷を誘発する条件下で真核細胞を成長させる工程をさらに含んでいてもよい。目的の組換え産物はタンパク質またはポリペプチドでもよい。タンパク質はモノクローナル抗体でもよい。
【００２０】
真核細胞による目的の組換え産物の生産を改善する方法（改善法）が提供される。真核細胞は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含み、目的の組換え産物を生産する。該方法は、組換え真核細胞により異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程を含む。該方法は、真核細胞におけるＤＳＢ修復を増強する工程をさらに含んでいてもよい。該方法は、真核細胞の安定性を一定期間、所定期間にわたり増強する工程をさらに含んでいてもよい。該方法は、真核細胞により選択マーカーを発現させる工程をさらに含んでいてもよく、この真核細胞は選択マーカーをコードする異種核酸配列を含む。目的の組換え産物をコードする異種核酸配列および選択マーカーをコードする異種核酸配列は、真核細胞のゲノム内に組み込まれていてもよい。該方法は、ＤＮＡ損傷を誘発する条件下で真核細胞を成長させる工程をさらに含んでいてもよい。目的の組換え産物はタンパク質またはポリペプチドでもよい。タンパク質はモノクローナル抗体でもよい。
【００２１】
目的の組換え産物を生産するための宿主細胞としての真核細胞の適合性を調べる方法（調査法）が提供される。真核細胞は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含む。該方法は、（ａ）真核細胞により異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程；および（ｂ）真核細胞においてＤＳＢ修復を判定する工程であって、前記ＤＳＢ修復の改善が、真核細胞が目的の組換え産物を生産するための宿主細胞として適切であることを示す、該判定する工程を含む。ＤＳＢ修復タンパク質は、ＤＮＡリガーゼＩＶ（ＬＩＧ４）、Ｘ線修復クロス補完６（ＸＲＣＣ６）、ＢＲＣＡ２のパートナーおよびローカライザー（ＰＡＬＢ２）、ならびにＰＡＲＰＢＰ遺伝子によりコードされるＰＡＲＰ１結合タンパク質（ＰＡＲＩ）からなる群から選択されうる。異種ＤＳＢ修復タンパク質はＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質がＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６である場合、該方法は、真核細胞においてＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６の発現を定量化する工程をさらに含んでいてもよい。該方法は、真核細胞による目的の組換え産物の発現を定量化する工程をさらに含んでいてもよい。該方法は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列がそのゲノム中に組み込まれている真核細胞を同定する工程をさらに含んでいてもよい。該方法は、目的の組換え産物を、例えば、流加培養で成長させた組換え真核細胞について１リットル当たり１００ｍｇよりも多い量で生産する真核細胞を同定する工程をさらに含んでいてもよい。該方法は、真核細胞により選択マーカーを発現させる工程をさらに含んでいてもよく、この真核細胞は、選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含んでいてもよく、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列および選択マーカーをコードする異種核酸配列は、真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。該方法は、ＤＮＡ損傷を誘発する条件下で真核細胞を成長させる工程をさらに含んでいてもよい。目的の組換え産物はタンパク質またはポリペプチドでもよい。タンパク質はモノクローナル抗体でもよい。
【００２２】
増強法、確立法、生産法、改善法、または調査法では、異種ＤＳＢ修復タンパク質は一過性または安定的に発現されてもよい。真核細胞は哺乳動物細胞でもよい。哺乳動物細胞は、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞からなる群から選択しうる。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。真核細胞は、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種ＤＳＢ修復遺伝子を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％同一である核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（Ａ）ＣＨＯ−Ｋ１、ＢＨＫ−２１およびｂＥｎｄ．３細胞における内因性ＤＳＢ数、ならびに１０（Ｂ）または５０μｇ／ｍＬ（Ｃ）のブレオマイシンでの１時間処理後の残りのＤＳＢ数を示す図である。それぞれのエラーバーは、平均の９５％信頼区間を使用して構築されている。文字ｎは、γＨ２ＡＸ病巣を数えるために使用される細胞数を表している。ｐ値はスチューデントｔ検定により得られた。散布図では、所与の時点での平均ＤＳＢ数についての９５％信頼区間が描かれている。
【図２】（Ａ）実験過程の図解を示している。（Ｂ）１０μｇ／ｍＬのブレオマイシンでの１２時間処理後のＣＨＯ−Ｋ１、ＢＨＫ−２１およびｂＥｎｄ．３細胞における残りの平均ＤＳＢ数を示す図である。散布図では、所与の時点での平均ＤＳＢ数についての９５％信頼区間が描かれている。
【図３】ブレオマイシン処理後の種々の時間でのＣＨバージョンＤＳＢ修復遺伝子の発現ありでの、または、発現なしでのＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＤＳＢ数を示す図である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞には、指示されたＣＨバージョン遺伝子を発現するヌルベクタープラスミド（単数または複数）をトランスフェクトした。細胞は、１０μｇ／ｍＬのブレオマイシンと一緒に１２時間インキュベートした。それぞれのエラーバーは、平均の９５％信頼区間を使用して構築されている。
【図４】ブレオマイシン処理後のＣＨバージョンのＸＲＣＣ６またはＸＲＣＣ５を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞における残りのＤＳＢの数を示す図である。対照ＣＨＯ−Ｋ１細胞にはヌルベクタープラスミドをトランスフェクトした。すべての細胞は１０μｇ／ｍＬのブレオマイシンで１２時間処理した。それぞれのエラーバーは、平均の９５％信頼区間を使用して構築されている。
【図５】ＤＳＢ修復に対する４つのＤＳＢ遺伝子発現レベルの効果を示す図である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞には、ヌルベクタープラスミドを、またはＣＨまたはＣＨＯバージョンのＰＡＲＩ（Ａ）、ＸＲＣＣ６（Ｂ）、ＬＩＧ４（Ｃ）およびＰＡＬＢ２（Ｄ）を発現する指示された量のプラスミドをトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは４００万個の細胞で行った。細胞は１０μｇ／ｍＬのブレオマイシンで１２時間処理した。それぞれのエラーバーは、平均の９５％信頼区間を使用して構築されている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、組換えタンパク質を生産するための宿主細胞の安定性の変更に関する。本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における二本鎖切断（ＤＳＢ）修復およびゲノム安定性を調べていた際の驚くべき発見に基づいている。発明者らは、ＣＨＯ細胞でのＤＳＢ修復が欠損しているが、ＣＨＯ細胞でのチャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞由来のＤＳＢ修復遺伝子の異種発現がＣＨＯ細胞においてＤＳＢ修復を劇的に改善することができることを発見した。細胞でのＤＳＢ修復が増強されると、細胞のゲノムおよび生産安定性が増加する。
【００２５】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基のポリマーのことであり、ポリマーの最小長に関して制限はない。例えば、ポリペプチドは、少なくとも２０アミノ酸を有していてもよい。ポリペプチドは、例えば、グリコシル化および／またはリン酸化により修飾されうる。
【００２６】
本明細書で使用される用語「タンパク質」とは、１つまたは複数のポリペプチドを含む生体分子のことである。タンパク質は、抗体、またはその変異体、誘導体、類似体、もしくは断片でもよく、これらは目的の抗原に特異的に結合する。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体またはヒト化抗体でもよい。
【００２７】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド残基のポリマーのことであり、ポリマーの最小長に関して制限はない。例えば、ポリヌクレオチドは少なくとも６０ヌクレオチドを有していてもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、またはその組合せでもよい。
【００２８】
本明細書で使用される用語、タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「変異体」とは、それぞれ改変された、例えば、欠失された、挿入された、または置換された少なくとも１つのアミノ酸または核酸を有すること以外、元のタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸または核酸配列と同じであるアミノ酸または核酸配列を有するそれぞれのタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのことである。タンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの変異体は、元のタンパク質、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸配列または核酸配列と少なくとも約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％、好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％同一であるアミノ酸または核酸配列を有していてもよい。
【００２９】
組換え真核細胞が提供される。組換え真核細胞は、１つまたは複数の異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を、細胞においてＤＳＢ修復を増強するのに有効な量で発現する。ＤＳＢ修復タンパク質は、一定期間、所定期間にわたり細胞の安定性を増強するのに有効な量で発現しうる。
【００３０】
本明細書で使用される用語「二本鎖切断（ＤＳＢ）修復」とは、細胞が、相同組換えまたは非相同末端結合組換えとして知られる２つの機構のどちらかを使用して、ＤＮＡの両方の鎖の切断を修復することができる細胞内部の分子機構のことである。細胞（単数または複数）中のＤＳＢ修復は、γ−Ｈ２ＡＸアッセイと呼ばれるアッセイを使用することにより評価しうる。例えば、リン酸化ヒストンＨ２ＡＸはＤＮＡ二本鎖切断をモニターするツールとなりうる。なぜならば、コアヒストンＨ２Ａファミリーの変異体であるＨ２ＡＸ中のＳｅｒ１３９残基は、ＤＮＡ損傷の導入直後にリン酸化されることが知られているからである。Ｈ２ＡＸのこのリン酸化バーションはγ−Ｈ２ＡＸとして知られ、γ−Ｈ２ＡＸに結合する抗体を用いてアッセイし測定しうる。観察されるγ−Ｈ２ＡＸの量が多くなるにしたがって、存在するＤＳＢの数も多くなる可能性がある。
【００３１】
本明細書で使用される用語「安定性」とは、一定期間、所定期間にわたり細胞の１つまたは複数の特徴に有意な変化がない（例えば、１％、２％、５％、１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％以下）ことである。期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７週間、１カ月、または細胞培養の１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、もしくは６０集団倍加でもよい。期間は、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしく２４週間以下、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしくは２４カ月以下、または細胞培養の７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０集団倍加以下でもよい。期間は、細胞培養の開始から１〜１０、１〜３０、または１〜６０日間でもよい。細胞の特徴の例は、細胞の成長速度またはゲノム、細胞による内在性タンパク質または成長因子の発現、異種核酸配列、細胞のゲノムに組み込まれているかどうか、および、細胞による、例えば、特定の改変を持つ組換えタンパク質の生産を含む。
【００３２】
一実施形態では、真核細胞は、例えば、少なくとも、１、２、３、４、５、６もしくは７週間、１カ月、または細胞培養の１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、もしくは６０集団倍加、および／または８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしく２４週間以下、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしくは２４カ月以下、または細胞培養の７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０集団倍加以下の期間にわたり、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸配列のコピー数の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を保持しうる。異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする核酸配列は、細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００３３】
別の実施形態では、真核細胞は、例えば、少なくとも、１、２、３、４、５、６もしくは７週間、１カ月、または細胞培養の１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、もしくは６０集団倍加、および／または８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしく２４週間以下、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしくは２４カ月以下、または細胞培養の７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０集団倍加以下の期間にわたり、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列のコピー数の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を保持しうる。目的の組換え産物をコードする核酸配列は、細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００３４】
本明細書で使用される用語「生産性」とは、一定期間、所定期間にわたり培養培地で成長した真核細胞により生産される目的の組換え産物の量のことである。生産性は、細胞が容器内の培地において培養され、培養の持続期間を延ばす目的で栄養物が容器に定期的に添加される流加培養法では、１リットル当たりのグラムの単位で表しうる。容器へ栄養物を定期的に添加する目的は、生産される組換えタンパク質の量を増やすためでもよい。連続培養法では、栄養物は容器内で成長させる細胞に連続して添加され、老廃物は容器から連続して除去される。連続培養法では、細胞の生産性は、１日当たりの１リットル当たりグラムの単位で容積測定生産性として表しうる。目的の組換え産物は、細胞により発現され、細胞の内部に残留しまたは細胞により培養培地中に分泌されてもよい。真核細胞による目的の組換え産物の生産性は、一定期間、所定期間にわたり低下することがある。目的の組換え産物の生産は、目的の組換え産物、例えば、異種組換えタンパク質（例えば、抗体）の生産性の１％、２％、５％、１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％以下が真核細胞において一定期間、所定期間にわたり低下する場合、安定的生産と見なされる。期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７週間、１カ月、または細胞培養の１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、もしくは６０集団倍加でもよい。期間は、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしく２４週間以下、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしくは２４カ月以下、または細胞培養の７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０集団倍加以下でもよい。期間は、細胞培養の開始から１〜１０、１〜３０、または１〜６０日間でもよい。
【００３５】
本明細書で使用される用語「有効な量」とは、表明された目標（例えば、細胞におけるＤＳＢ修復の増強または細胞の安定性の増強）を達成するのに必要な細胞において発現される異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質（複数可）の量のことである。異種ＤＳＢ修復タンパク質（複数可）の有効な量は、表明された目標、細胞の生物学的状態および細胞を取り巻く環境に応じて変動しうる。
【００３６】
組換え真核細胞は哺乳動物細胞でもよい。哺乳動物細胞は、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞でもよい。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞でもよい。
【００３７】
異種ＤＳＢ修復タンパク質は一過性にまたは安定的に発現されてもよい。一実施形態では、異種ＤＳＢ修復タンパク質は安定的に発現されうる。
【００３８】
異種ＤＳＢ修復タンパク質は、組換え真核細胞が調製される真核細胞以外のいかなる細胞由来でもよく、そこではＤＳＢ修復は自然に起きる。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、組換え真核細胞が調製される真核細胞以外の細胞において、ＤＳＢ修復に関与する内在性タンパク質と同一でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、組換え真核細胞が調製される真核細胞以外の細胞由来の内在性ＤＳＢ修復タンパク質、またはその変異体と同一でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞中の内在性ＤＳＢ修復タンパク質、またはその変異体と同一でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株中の内在性ＤＳＢ修復タンパク質、またはその変異体と同一でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、ＤＮＡリガーゼＩＶ（ＬＩＧ４）、Ｘ線修復クロス補完６（ＸＲＣＣ６）、ＢＲＣＡ２のパートナーおよびローカライザー（ＰＡＬＢ２）、ならびにＰＡＲＰＢＰ遺伝子によりコードされるＰＡＲＰ１結合タンパク質（ＰＡＲＩ）からなる群から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＤＳＢ修復タンパク質はＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６であってもよい。
【００３９】
異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列からなっていてもよい。
【００４０】
組換え真核細胞は、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種ＤＳＢ修復遺伝子を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩをコードしてもよい。いくつかの実施形態では、異種ＤＳＢ修復遺伝子はＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６をコードしていてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列からなっていてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００４１】
組換え真核細胞は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含み、目的の組換え産物を発現しうる。目的の組換え産物をコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００４２】
目的の組換え産物は、タンパク質、ポリペプチド、または抗体でもよい。例えば、目的の組換え産物は、分泌型胚性アルカリホスフェート（ＳＥＡＰ）でもよい。目的の組換え産物は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体またはヒト化抗体でもよい。一実施形態では、目的の組換え産物はモノクローナル抗体でもよい。
【００４３】
組換え真核細胞は、選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含んでいてもよい。選択マーカーをコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００４４】
真核細胞において二本鎖切断（ＤＳＢ）修復を増強するための方法（増強法）が提供される。該方法は、真核細胞において有効量の異種ＤＳＢ修復タンパク質を発現させる工程を含む。真核細胞は哺乳動物細胞でもよい。哺乳動物細胞は、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞からなる群から選択しうる。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来でもよい。
【００４５】
増強法は、真核細胞の安定性を一定期間、所定期間にわたり増強する工程をさらに含みうる。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩであってもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列からなっていてもよい。
【００４６】
増強法は、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸遺伝子を真核細胞中に導入する工程をさらに含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸配列は、過剰発現、トランス遺伝子発現、遺伝子ノックイン、遺伝子活性化、転写活性化、翻訳活性化、遺伝子突然変異またはその組合せにより真核細胞内に導入しうる。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩをコードしてもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６をコードしてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列からなっていてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００４７】
目的の組換え産物を生産するための宿主細胞を確立するための方法（確立法）が提供される。該方法は、真核細胞において異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程と；工程（ａ）の真核細胞においてＤＳＢ修復を判定する工程と；ＤＳＢ修復が増強される真核細胞を宿主細胞として単離する工程とを含む。該方法は、宿主細胞のゲノムを編集し宿主細胞におけるＤＳＢ修復を改善する工程をさらに含んでいてもよい。
【００４８】
該確立法によれば、異種ＤＳＢ修復タンパク質は、真核細胞において、一過性にまたは安定的に、好ましくは安定的に発現しうる。真核細胞は哺乳動物細胞でもよい。哺乳動物細胞は、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞からなる群から選択してもよい。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩであってもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列からなっていてもよい。真核細胞は、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩをコードしてもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６をコードしてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列からなっていてもよい。
【００４９】
該確立法によれば、真核細胞は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含み、目的の組換え産物を発現しうる。目的の組換え産物をコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。目的の組換え産物はタンパク質またはポリペプチドでもよい。例えば、目的の組換え産物は、分泌型胚性アルカリホスフェート（ＳＥＡＰ）でもよい。目的の組換え産物は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体またはヒト化抗体でもよい。一実施形態では、目的の組換え産物はモノクローナル抗体でもよい。真核細胞は、選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含みうる。選択マーカーをコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００５０】
目的の組換え産物の生産用の宿主細胞を確立するための方法ごとに、確立した宿主細胞が提供される。
【００５１】
目的の組換え産物の生産のための方法（生産法）が提供される。該方法は、培養培地で真核細胞を成長させる工程を含む。真核細胞は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含む。該方法は、真核細胞において異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程と；真核細胞により目的の組換え産物を発現させる工程とをさらに含む。該方法は、真核細胞のゲノムを編集して、真核細胞におけるＤＳＢ修復を改善する工程をさらに含みうる。該方法は、ＤＮＡ損傷を誘発する条件下で真核細胞を成長させる工程をさらに含んでいてもよい。ＤＮＡ損傷を誘発する条件は、ＤＮＡ損傷および二本鎖切断を誘発すると予想される化学物質を培養物へ添加することを含んでいてもよい。ＤＮＡ損傷を誘発する別の条件は、ＤＮＡ損傷および二本鎖切断を誘発すると予想される態様での培養物への放射線曝露の使用を含んでいてもよい。ＤＮＡ損傷を誘発するさらに別の条件は、適切な量の化学薬品の存在下で生き延びることができ、ＤＮＡ損傷および二本鎖切断を誘発しうる細胞のみが可能になるように化学的選択圧の細胞への適用を含んでいてもよい。
【００５２】
該生産法によれば、異種ＤＳＢ修復タンパク質は、真核細胞において一過性にまたは安定的に、好ましくは、安定的に発現しうる。真核細胞は哺乳動物細胞でもよい。哺乳動物細胞は、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞からなる群から選択してもよい。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩであってもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列からなっていてもよい。真核細胞は、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩをコードしてもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６をコードしてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列からなっていてもよい。
【００５３】
該生産法によれば、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。目的の組換え産物はタンパク質またはポリペプチドでもよい。目的の組換え産物は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体またはヒト化抗体でもよい。一実施形態では、目的の組換え産物はモノクローナル抗体でもよい。真核細胞は、選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含みうる。選択マーカーをコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００５４】
本発明に係る生産法によれば、真核細胞による目的の組換え産物の生産性は、一定期間、所定期間にわたり、５％未満、１０％未満、１５％未満、１８％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満または７０％未満低下する場合がある。期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７週間、１カ月、または細胞培養の１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、もしくは６０集団倍加でもよい。期間は、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしく２４週間以下、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしくは２４カ月以下、または細胞培養の７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０集団倍加以下でもよい。期間は、細胞培養の開始から１〜１０、１〜３０、または１〜６０日間でもよい。例えば、真核細胞による目的の組換え産物の生産性は、８週間にわたり３０％未満、または少なくとも１１週間の期間にわたり１８％未満、低下する場合がある。
【００５５】
本発明に係る生産法によれば、真核細胞は、一定期間、所定期間にわたり目的の組換え産物をコードする異種核酸配列のコピー数の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を保持しうる。期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７週間、１カ月、または細胞培養の１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、もしくは６０集団倍加でもよい。期間は、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしく２４週間以下、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしくは２４カ月以下、または細胞培養の７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０集団倍加以下でもよい。期間は、細胞培養の開始から１〜１０、１〜３０、または１〜６０日間でもよい。一実施形態では、真核細胞は、少なくとも８週間の期間にわたり、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列のコピー数の少なくとも７０％を保持しうる。別の実施形態では、真核細胞は、少なくとも１１週間の期間にわたり、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列のコピー数の少なくとも７５％を保持しうる。
【００５６】
真核細胞による目的の組換え産物の生産を改善する方法（改善法）が提供される。真核細胞は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含み、目的の組換え産物を生産する。該方法は、組換え真核細胞により異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程を含む。該方法は、真核細胞におけるＤＳＢ修復を増強する工程をさらに含みうる。該方法は、一定期間、所定期間にわたり真核細胞の安定性を増強する工程をさらに含みうる。期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７週間、１カ月、または細胞培養の１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、もしくは６０集団倍加でもよい。期間は、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしく２４週間以下、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８もしくは２４カ月以下、または細胞培養の７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、もしくは１５０集団倍加以下でもよい。期間は、細胞培養の開始から１〜１０、１〜３０、または１〜６０日間でもよい。方法は、ＤＮＡ損傷を誘発する条件下で真核細胞を成長させる工程をさらに含みうる。
【００５７】
該改善法によれば、異種ＤＳＢ修復タンパク質は、真核細胞において一過性にまたは安定的に、好ましくは、安定的に発現しうる。真核細胞は哺乳動物細胞でもよい。哺乳動物細胞は、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞からなる群から選択してもよい。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩであってもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列からなっていてもよい。真核細胞は、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩをコードしてもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６をコードしてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列からなっていてもよい。
【００５８】
該改善法によれば、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。目的の組換え産物はタンパク質またはポリペプチドでもよい。目的の組換え産物は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体またはヒト化抗体でもよい。一実施形態では、目的の組換え産物はモノクローナル抗体でもよい。真核細胞は、選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含みうる。選択マーカーをコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【００５９】
目的の組換え産物を生産するための宿主細胞としての真核細胞の適合性を調べる方法（調査法）が提供される。真核細胞は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列を含む。該方法は、真核細胞により異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質を発現させる工程と；真核細胞におけるＤＳＢ修復を判定する工程とを含む。ＤＳＢ修復の改善は、真核細胞が目的の組換え産物を生産するのに宿主細胞として適切であることを示す。該方法は、真核細胞における異種二本鎖切断（ＤＳＢ）修復タンパク質、例えば、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６の発現を定量化する工程をさらに含みうる。該方法は、真核細胞による目的の組換え産物の発現を定量化する工程をさらに含みうる。該方法は、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列が組み込まれるゲノムを持つ真核細胞を同定し、任意選択的に、組換え真核細胞では１リットル当たり１ｍｇよりも多い量、１０ｍｇよりも多い量、５０ｍｇよりも多い量、１００ｍｇよりも多い量、１５０ｍｇよりも多い量、２００ｍｇよりも多い量、２５０ｍｇよりも多い量または５００ｍｇよりも多い量で目的の組換え産物を生産する真核細胞を同定する工程をさらに含みうる。該方法は、ＤＮＡ損傷を誘発する条件下で真核細胞を成長させる工程をさらに含みうる。
【００６０】
該調査法によれば、異種ＤＳＢ修復タンパク質は、真核細胞において一過性にまたは安定的に、好ましくは、安定的に発現しうる。真核細胞は哺乳動物細胞でもよい。哺乳動物細胞は、げっ歯動物細胞、マウス細胞およびチャイニーズハムスター細胞からなる群から選択してもよい。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、チャイニーズハムスター（ＣＨ）細胞由来でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩであってもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６でもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復タンパク質は、配列番号１、２、３または４のアミノ酸配列からなっていてもよい。真核細胞は、異種ＤＳＢ修復タンパク質をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、ＬＩＧ４、ＸＲＣＣ６、ＰＡＬＢ２またはＰＡＲＩをコードしてもよく、好ましくは、ＬＩＧ４またはＸＲＣＣ６をコードしてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列を含んでいてもよい。異種ＤＳＢ修復遺伝子は、配列番号５、６、７または８の核酸配列からなっていてもよい。
【００６１】
該調査法によれば、目的の組換え産物をコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。目的の組換え産物はタンパク質またはポリペプチドでもよい。目的の組換え産物は、抗体、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体またはヒト化抗体でもよい。一実施形態では、目的の組換え産物はモノクローナル抗体でもよい。真核細胞は、選択マーカーをコードする異種核酸配列をさらに含みうる。選択マーカーをコードする異種核酸配列は、組換え真核細胞のゲノム中に組み込まれていてもよい。
【実施例１】
【００６２】
ＣＨＯ細胞における欠損ＤＮＡ二本鎖切断修復の救済
材料および方法
プラスミド構築
８つのＤＳＢ修復遺伝子をクローン化するため、ＣＨＯ−Ｋ１細胞またはチャイニーズハムスター肝臓組織由来の全ｍＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを使用して抽出し、ｃＤＮＡに逆転写してＰＣＲにより遺伝子断片を作成するための鋳型とした。クローニングに使用したすべてのプライマーを表１に示す。ＦＢＸＯ１８遺伝子ならびにＲＮＦ８およびＬＩＧ４遺伝子の部分的配列は、ｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）として合成した。ベクター断片は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏ（＋）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）からＰＣＲ増幅により得た。ＤＳＢ修復遺伝子を発現するプラスミドは、製造業者の使用説明書に従って遺伝子断片（複数可）およびベクター断片のギブソンアセンブリ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ｌｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を経て構築した。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
細胞培養およびトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１、ＢＨＫ−２１ハムスター線維芽細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）およびｂＥｎｄ．３マウス内皮細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を添加した５ｍＬのイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）において、Ｔ−２５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中で３７℃および５％のＣＯ２で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１におけるＤＳＢ修復遺伝子の一過性発現では、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＴ（Ｌｏｎｚａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、６×１０６細胞を６μｇのプラスミド（別段指示がなければ）でトランスフェクトした。
【００６５】
免疫蛍光
ＣＨＯ−Ｋ１、ｂＥｎｄ．３またはトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、０．５ｍＬの培養培地を用いて２×１０５細胞／ｍＬで８ウェル室のカバーグラスのチャンバー（Ｃｅｌｌｖｉｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）に播種した。２４時間のインキュベーション後、細胞を１０μｇ／ｍＬのブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて１時間もしく１２時間、または５０μｇ／ｍＬのブレオマイシンを用いて１時間処理し、続いて新鮮で温かい培養培地で直ちに培地交換した。新鮮な培地での指示されたインキュベーション時間の後、処理された細胞をトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄し、ＴＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＴＢＳで３回洗浄し、ＴＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で５分間透過処理し、ＴＢＳで３回洗浄した。細胞を、３％のヤギ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有するＴＢＳ中で１時間ブロックし、１：５００の一次抗体（抗リン酸化γＨ２ＡＸ抗体、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）で、４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳで３回洗浄し、１：１０００のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、室温で１時間インキュベートした。３回のＴＢＳ洗浄後、核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で１５分間染色し、再びＴＢＳで３回洗浄した。画像は、６３×対物レンズ付きのＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を用いて撮影した。少なくとも５０細胞および病巣を、ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用して、二重培養の細胞試料ごとに計数した。
【００６６】
ＤＳＢ誘導後の細胞の生存率
細胞は、１０μｇ／ｍＬのブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて、または、１０μｇ／ｍＬのブレオマイシンを用いずに１２時間処理し、続いて新鮮で温かい培養培地で直ちに培地交換した。生存細胞はＤＳＢ誘導後４日目まで毎日計数した。生存率は、処理試料中の生存細胞を非処理対照試料中の生存細胞で割って計算した。
【００６７】
結果
ＣＨＯ細胞はＤＳＢ修復が欠損している
ＣＨＯ細胞においてＤＳＢ修復機構が有効に機能していないという我々の仮説を試験するため、３種の細胞株、ＣＨＯ−Ｋ１、ＢＨＫ−２１およびｂＥｎｄ．３の間でＤＳＢ修復を比較した。ＤＳＢの形成および修復に対する外部培養環境の可能性のある差示的な影響を排除するため、３種の細胞は同じ培養培地およびインキュベーション条件で維持し、実験中は常に同じ手法で処理した。内因性ＤＳＢレベルは、最初に１００を超える細胞の細胞当たりのγＨ２ＡＸ病巣の数を計数することにより推定した。ＣＨＯ細胞はｂＥｎｄ．３細胞よりも平均で０．７多くＤＳＢを有していたが、その差は有意ではなかった（ｐ値＝０．２０、スチューデントｔ検定）。なぜならば、両細胞は類似するレベルの内在性ＤＳＢを示しており、細胞当たり約４．４ＤＳＢ形成であったからである（図１Ａ）。ＢＨＫ−２１細胞が有する内在性ＤＳＢレベルはＣＨＯ−Ｋ１およびｂＥｎｄ．３細胞よりも低く、細胞当たり１．７ＤＳＢ形成だけであった。
【００６８】
次に、３種の細胞のＤＳＢ修復を、１０または５０μｇ／ｍＬのブレオマイシン（ＢＬ）の１時間処理を用いたＤＳＢ誘導後のγＨ２ＡＸ病巣数の減少速度を計算することにより比較した。予想通り、培地に添加したブレオマイシンの濃度が高いほど細胞中で多くのＤＳＢが誘導された（図１Ｂおよび１Ｃ、ならびに表２）。しかしながら、ＣＨＯ細胞は、両条件下でのブレオマイシン処理後のＤＳＢはかなり少なく、また、示した修復速度もＢＨＫ−２１とｂＥｎｄ．３細胞の両方よりも遅く、１時間当たりの修復した誘導ＤＳＢは少なかった（表２）。２つの可能性はこれらの所見と一致している。ＣＨＯ細胞は一般にＢＨＫ−２１とｂＥｎｄ．３細胞よりもＤＳＢ修復速度が低いか、またはＢＨＫ−２１とｂＥｎｄ．３細胞におけるＤＳＢの増加がより高いＤＳＢ修復速度を引き起こすかのいずれかである。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
修復効率のより適切な比較には、すべての細胞株における等価なレベルの誘導されたＤＳＢ形成が必要である。等価なレベルの誘導されたＤＳＢがあれば、ＤＳＢ消失の速度の観察される違いはそれぞれの細胞株の修復能力により支配されることから、異なる細胞型間のＤＳＢ修復の違いをより正確に反映することができる。しかしながら、誘導されたＤＳＢの数はブレオマイシンの細胞内濃度に比例しており、ブレオマイシンの輸送機構は異なる細胞株間で変化する可能性がある。ＣＨＯ、ＢＨＫ−２１およびｂＥｎｄ．３細胞におけるブレオマイシンの輸送速度について詳細に理解していなければ、１時間の処理では、ブレオマイシンを細胞において同じ細胞内レベルに到達させるのに十分ではないかもしれない。あるいは、十分な処理時間が与えられるならば、任意の細胞膜を通じたブレオマイシンの受動拡散は平衡に達し、それにより同じ量の細胞内ブレオマイシンが生成され、その後、同じ数のＤＳＢが生成される。したがって、１０μｇ／ｍＬのブレオマイシンを用いた１２時間の処理が試験された。ＤＳＢの誘導および修復は１２時間の間に同時に起こり、ゆっくりと修復をする細胞は、ブレオマイシン除去後に、より多くのＤＳＢを示すと考えられる（図２Ａ）。実際、修復が遅いため、ＣＨＯ細胞はｂＥｎｄ．３細胞よりも多くのＤＳＢを有した（図２Ｂ）。ブレオマイシンの除去後、ＣＨＯ細胞は１時間当たり０．８９ＤＳＢの速度でＤＳＢを修復し続けたが、これはｂＥｎｄ．３細胞による１時間当たり１．０３ＤＳＢの速度よりも有意に低かった（ｐ値＝２．０６×１０−１０、ＡＮＣＯＶＡ分析）。ＣＨＯおよびＢＨＫ−２１細胞は、１２時間処理後に残る類似のＤＳＢを有していた。しかし、ブレオマイシンの除去後、ＢＨＫ−２１細胞は、１時間当たり２．６４ＤＳＢというはるかに高い修復速度を示した（統計解析を追加）。３つの条件下でＤＳＢ修復を比較した結果はいずれも、ＣＨＯ細胞ではＤＳＢ修復が欠損しているという仮説と首尾一致していた。
【００７１】
ＣＨバージョン遺伝子の発現はＤＳＢ修復を改善した
ＣＨＯ−Ｋ１とＣＨゲノム配列を比較することにより、７つのＤＳＢ修復遺伝子は、ＣＨＯとＣＨ細胞の間で顕著な配列偏差を生じていることが分かり（表３）、これらの遺伝子が、ＣＨＯ細胞のＤＳＢ修復システムの効率を低下させる欠損遺伝子である可能性が示唆された。遺伝子の配列偏差が修復能力に及ぼす影響を試験するため、機能的（ＣＨ）バージョンの７つのＤＳＢ修復遺伝子をクローン化し、ＣＨＯ細胞において個々に一過性発現させた。１０μｇ／ｍＬのブレオマイシンを用いて１２時間処理してＤＳＢを誘導した。ブレオマイシンの除去後、γＨ２ＡＸ病巣の数を４つの時点で定量化し、ＣＨバージョン遺伝子を発現しているＣＨＯ細胞におけるＤＳＢ修復を評価した。ブレオマイシンの除去後１時間では、対照ＣＨＯ−Ｋ１細胞において多数のＤＳＢがまだ修復されていなかった（図３）が、４つのＣＨバージョン遺伝子は、細胞がより低いＤＳＢレベルに到達するのを助けた（ＬＩＧ４、ＰＡＬＢ２、ＸＲＣＣ６およびＰＡＲＩ）。さらに、ＣＨＯ細胞は、ブレオマイシンの除去後２４時間以内に一定量のＤＳＢを修復することに成功したが、４つのＣＨバージョン遺伝子は、ＤＳＢ数をさらに減少させ、ＤＳＢ修復を有意に改善することに繋げた。この結果は、４つのＤＳＢ修復遺伝子の配列変異が、ＣＨＯ細胞の欠損したＤＳＢ修復システムと関連している可能性があって、かつ、機能的ＣＨバージョン遺伝子を発現させることにより、ＤＳＢ修復を改善できることを示唆している。
【００７２】
【表３】
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【００７３】
ＣＨＯのＤＳＢ修復におけるＣＨバージョンＸＲＣＣ６の有意なプラスの影響は、そのパートナーであるＣＨバージョンＸＲＣＣ５についての疑問に繋がる。ＮＨＥＪ経路に参画するためには、ＸＲＣＣ６は、ＤＳＢを迅速に認識しＤＮＡ末端に高親和性で結合するために、ＸＲＣＣ５とヘテロ二量体（Ｋｕと呼ばれる）を形成する必要がある。Ｋｕはまた、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼを活性化し、ＮＨＥＪ経路における他の重要なコンポーネントをリクルートするための足場としての役目を果たす。思いがけないことに、ＣＨバージョンＸＲＣＣ５の発現はＣＨＯ細胞において修復を改善しなかった（図４）。これらの所見は、Ｋｕ中のＸＲＣＣ５ではなく、ＸＲＣＣ６ユニットが欠損構成成分であり、ＮＨＥＪ経路に障害を与え、ＣＨＯ細胞においてＤＳＢ修復能力を損なうことを示唆している可能性がある。
【００７４】
特定のＤＳＢ修復遺伝子の過剰発現はＤＳＢ修復を改善することができる
ａ）４つのＣＨＯバージョン遺伝子の配列の相違がタンパク質機能を損なうとともに、正しいＣＨバージョンの発現がＤＳＢ修復経路を救済する；またはｂ）ＣＨＯバージョン遺伝子が十分に機能するとともに、ＣＨ遺伝子の異種発現は修復速度を増加する機能タンパク質のコピーを提供するだけであるという、２つの考えられる根底にある機構が、４つのＣＨバージョンＤＳＢ修復遺伝子を発現することにより、修復の観察された改善もたらしている可能性がある。この問題に取り組むため、４種の修復遺伝子、ＰＡＬＢ２、ＰＡＲＩ、ＬＩＧ４、およびＸＲＣＣ６を、対応するＣＨＯバージョン配列とともにクローン化した。修復能力に対するＣＨまたはＣＨＯバージョン遺伝子の効果を、発現プラスミドの２つのバージョンをトランスフェクトさせたＣＨＯ細胞において比較した。遺伝子存在量とＤＳＢ修復の間の関係もまた、種々の濃度のプラスミドをトランスフェクトすることにより調べた。試験した４つすべての遺伝子では、ＣＨバージョンを発現する細胞は、所与の時点でＣＨＯバージョンの遺伝子を発現する細胞と比べて、ＤＳＢ修復の有意な改善を提供しているようには思われなかった（図５）。この所見は、ＣＨＯバージョン遺伝子がＣＨバージョン遺伝子と比較して十分に機能していることと一致しており、ＣＨＯバージョンの過剰発現は、ＤＳＢ修復改善に対してＣＨ対応物と同様の影響をもたらすであろう。別の興味深い所見は、ＸＲＣＣ６またはＰＡＲＩを発現する細胞では、ＤＳＢ修復効率が濃度依存的態様で変化した（図５ＡおよびＢ）が、ＰＡＬＢ２でもＬＩＧ４では変化しなかった（図５ＣおよびＤ）ことである。ＸＲＣＣ６またはＰＡＲＩの発現が増加すると、ＣＨＯ細胞は残存ＤＳＢが少ないことを示し、よって、より良好なＤＳＢ修復を有した。これらの結果は、ＣＨ−またはＣＨＯ−バージョンＤＳＢ遺伝子を発現することによるＤＳＢ修復の改善が、主にそれぞれのタンパク質の存在量が増加したことに起因する機構と一致している。
【００７５】
本明細書に引用されるすべての文書、書籍、手引書、論文、特許、公開された特許出願、案内書、要約、および／または他の参考文献は、参照によりその全体を組み込む。本発明に係る他の実施形態は、本明細書に開示された本発明に係る明細および実施を考慮すると、当業者には明らかであろう。本明細書および実施例は、例示的なものとしてのみ考慮されるだけであり、本発明に係る真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１ＢＣ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【配列表】
2021520193000001.app
【国際調査報告】
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2021520193.tif 000014
2021520193.tif 000015