(57)【要約】  ｂＰＡＧ１（bovine pregnancy-associated glycol protein 1）タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片；該抗体を生産するハイブリドーマ細胞；該抗体を有効成分として含む牛の妊娠診断用組成物；牛の妊娠診断キット；及び牛の妊娠診断方法に係り、該抗体は、牛の妊娠性血漿タンパク質であるｂＰＡＧ１に特異的に結合するので、牛のように繁殖が重要な動物において、妊娠を簡単に診断することができるが、繁殖効率を高め、畜産業に有用に利用されうる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
牛の妊娠関連グリコタンパク質１（ｂＰＡＧ１）タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するエピトープポリペプチドに特異的に結合するものである請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体の重鎖は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）である請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合断片は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１６であるハイブリドーマ細胞によって生産されるものである請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を生産するハイブリドーマ細胞（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１６）。
【請求項６】
ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む牛の妊娠診断のための組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む牛の妊娠を診断するためのキット。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片を検体試料に接触させる段階と、および前記抗体または抗原結合断片に結合されたｂＰＡＧ１タンパク質を検出する段階と、を含む牛の妊娠を診断する方法。
【請求項９】
前記検出する方法は、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光、免疫組織化学染色、流細胞分析法、免疫細胞化学法、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、免疫沈澱分析法、免疫拡散分析法、補体固定分析法及びタンパク質チップからなる群のうちから選択されたいずれか一つを遂行することを含むものである請求項８に記載の牛の妊娠を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１１月１５日に出願された大韓民国特許出願第１０−２０１７−０１５２２５７号を優先権として主張し、前記明細書の開示内容は、全体として援用により、本出願の明細書に含まれる。
【０００２】
本発明は、牛妊娠関連グリコタンパク質１（ｂＰＡＧ１：bovine pregnancy-associated glycoprotein 1）タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【０００３】
産業動物である牛の飼育においては、ほとんどが、子牛生産を介して、農家の所得が成り立っている実情である。一方、牛の繁殖においては、受胎させることも重要であるが、受精させた牛の妊娠いかんを早期に診断することも、非受胎動物を早期に別途管理することができ、空胎期間を縮めることができるので、農家の原価節減が可能である。現在、牛妊娠診断のほとんどは、獣医または人工受精者により、妊娠３０日ないし４２日に、胎膜触診法によってなされている。また、他の方法としては、牛乳内のプロゲステロンを、放射性免疫法（ＲＩＡ：radiommunoassay）を利用して検査する方法がある。該方法によれば、プロゲステロンは、妊娠の正常進行と正常維持に必要なステロイド系ホルモンであり、プロゲステロンの血清力価が妊娠初期に上昇するので、前記ホルモンの上昇程度を牛乳内で確認する方法である。しかし、前記放射性免疫分析法は、放射性物質を利用し、危険性が伴うだけではなく、複雑な実験装備を使用しなければならず、プロゲステロンの量は、牛によって異なるために、基準が不確かであり、正確な診断のためには、最小限２回以上の実験を行わなければならない問題点がある。従って、既存の問題点を解決すると共に、さらに簡便であって迅速に、牛の妊娠を初期に正確に診断することができる新たな方法の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ０３／０４３５２４
【特許文献２】ＵＳ７６８７２８１
【特許文献３】ＫＲ１０−２０１３−００００９５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一様相は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供することである。
【０００６】
他の様相は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を生産するハイブリドーマ細胞（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１６）を提供することである。
【０００７】
他の様相は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を提供することである。
【０００８】
他の様相は、前記組成物を含む牛の妊娠診断用キットを提供することである。
【０００９】
他の様相は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を検体試料と接触させる段階と、および前記抗体または抗原結合断片に結合されたｂＰＡＧ１タンパク質を検出する段階と、を含む牛で妊娠を診断する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、牛の妊娠性血漿タンパク質であるｂＰＡＧ１に特異的に結合する新規単一クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞を作製し、前記細胞から、前記抗体を多量に分離精製し、牛の妊娠いかんを、比較的簡単な方法で確認することにより、本発明を完成した。
【００１１】
本明細書内の用語「牛の妊娠関連グリコタンパク質１（ｂＰＡＧ１：bovine pregnancy-associated glycoprotein 1）タンパク質」は、牛の妊娠性血漿タンパク質であり、妊娠によって出現または増量する血流タンパク質を総称する。前記ｂＰＡＧ１は、タンパク質の天然形態、その変異体、及びその機能的等価物を含む。前記ｂＰＡＧ１は、天然細胞または組み換え細胞から分離されると、あるいは人工的にも合成される。
【００１２】
本明細書内の用語「抗体」は、単一抗原性部位に特異的に結合する抗体を意味する。前記抗体は、異なって言及がなければ、当業界で知られた重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとによって形成された抗原結合特異的部位を含む分子またはその抗原結合断片でもある。前記抗体は、血漿細胞（plasma cell）またはハイブリドーマ細胞によっても生産されえる。前記抗体は、単一クローン抗体（monoclonal antibody）でもありうる。具体的には、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１６であるハイブリドーマ細胞によって生産されるｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する単一クローン抗体であってもよい。本明細書内の用語「抗原・抗体複合体」は、ｂＰＡＧ１タンパク質と、それを認知する抗体との結合物を意味する。前記複合体は、試料中のｂＰＡＧ１タンパク質の検出にも使用されえる。前記複合体は、例えば、牛の尿、血清または血漿のような生物学的試料において、ｂＰＡＧ１を検出するのにも使用される。
【００１３】
一つの態様は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。具体的には、本発明による抗体は、前記抗体が、牛の妊娠性血漿タンパク質であるｂＰＡＧ１タンパク質を選別的に認知することができる限り、抗原結合断片を含み、前記抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ，Ｆａｂ，Ｆｖ断片などを含んでもよい。
【００１４】
一実施例において、ｂＰＡＧ１タンパク質に係わる単一クローン抗体と特異的に結合するエピトープ（epitope）を分析した結果、抗原の濃度依存的に、前記抗原と特異的に結合する抗体の量が増加することを確認することができた。特に、前記抗体は、同一抗原濃度において、配列番号２ないし４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに比べ、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的に結合する量が顕著に多かった。従って、前記ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するエピトープポリペプチドに結合するものでもありうる。また、前記抗体の完全な形態は、２個の全体長の軽鎖、及び２個の全体長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されているものでもある。前記重鎖は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の不変領域ドメインＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖、並びにその断片のいずれもでもありうる。前記軽鎖は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ、及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖、並びにその断片をいずれも意味することができる。ここで、前記重鎖は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）の不変領域を含み、軽鎖は、カッパ（κ）タイプ及びラムダ（λ）タイプの不変領域を含む。前記抗体は、例えば、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）でもありうる。
【００１５】
他の態様は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を生産するハイブリドーマ細胞（受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１６）を提供する。前記ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の具体的な内容は、前述の通りである。具体的には、本発明の一実施例においては、マウスの脾臓細胞を確保し、それをマウス骨髄腫細胞と融合して培養した後、牛の妊娠性血漿タンパク質であるｂＰＡＧ１に特異的に結合する抗体が確認されたハイブリドーマ細胞のみを選択した。その後、前記ハイブリドーマ細胞を、韓国細胞株研究財団（KCLB, Korean Cell Line Bank）に寄託し、２０１７年１２月２２日、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１６を受けた。
【００１６】
前記抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、それを、試験管内または生体内において、多量に培養するところにも使用されえる。前記ハイブリドーマ細胞が生産する抗体は、精製しないで使用することができるが、最善の結果を得るために、公知された方法により、高純度、例えば、９５％以上に精製して使用することができる。前記抗体は、例えば、透析、塩沈殿、クロマトグラフィのような精製方法を利用し、培養培地または腹水液（ascites fluid）から分離することができる。
【００１７】
他の態様は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む牛の妊娠診断用組成物を提供する。前記ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の具体的な内容は、前述の通りである。前記組成物は、前記抗体に対する希釈剤、バッファ、安定化剤のような担体を含んでもよい。前記組成物は、抗原・抗体複合体を検出するための検出試薬を含んでもよい。
【００１８】
他の様相は、前記抗体または抗原結合断片を含む牛の妊娠診断用キットを提供する。前記ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の具体的な内容は、前述の通りである。具体的には、本発明による牛の妊娠診断用キットには、ｂＰＡＧ１タンパク質を特異的に認識する抗体またはその抗原結合断片、及び免疫学的分析に使用されるツールまたは試薬が含まれてもよい。前記抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するエピトープポリペプチドに特異的に結合するものでもある。ここで、免疫学的分析に使用されるツールまたは試薬としては、適する担体、検出可能な信号を生成することができる標識物質、溶解剤、洗浄剤などが含まれてもよい。前記標識物質が酵素である場合、前記キットは、酵素活性を測定することができる基質及び反応停止試薬などを含んでもよい。
【００１９】
前記担体は、可溶性担体、例えば、当分野に公知された生理学的に許容される緩衝液、例えば、ＰＢＳ；不溶性担体、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子；その他紙；ガラス；金属；アガロース；及びそれらの組み合わせでもある。
【００２０】
他の態様は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を検体試料に接触させる段階と、および前記抗体または抗原結合断片に結合されたｂＰＡＧ１タンパク質を検出する段階と、を含む牛の妊娠を診断する方法を提供する。前記ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の具体的な内容は、前述の通りである。
【００２１】
一具体例による牛の妊娠を診断する方法は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を検体試料に接触させる段階を含む。前記試料は、牛から分離された生物学的試料でもある。具体的には、前記試料は、妊娠いかんを確認しようとする牛の乳汁、組織、細胞、血液、血清、血漿、唾液または尿でもある。前記接触させる段階は、前記抗体またはその抗原結合断片と試料とを液体媒質内でインキュベーションすることでもある。前記インキュベーションは、試料中において、抗原と前記抗体とが抗原・抗体結合を行うのに適する温度、ｐＨ及び撹拌条件で行われるものでもある。前記インキュベーションは、２℃ないし３７℃で行われるものでもある。前記インキュベーションは、ｐＨ６ないし８で行われるものでもある。
【００２２】
一具体例による牛の妊娠診断方法は、前記抗体または抗原結合複合体を検出する段階を含む。前記検出する段階は、抗原・抗体複合体を直接分離し、その存在を確認する、あるいは分離することも分離しないこともなしに、前記複合体を、バイオケミストリ、免疫化学分析法などの方法を遂行して検出することでもある。前記分析方法は、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング（Western blotting）、免疫蛍光（immunofluorescence）、免疫組織化学染色（immunohistochemistry staining）、流細胞分析法（flow cytometry）、免疫細胞化学法、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、免疫沈澱分析法（immunoprecipitation assay）、免疫拡散分析法（immunodiffusion assay）、補体固定分析法（complement fixation assay）及びタンパク質チップ（protein chip）からなる群のうちから選択されたいずれか一つでもある。
【００２３】
前記方法において、前記抗原・抗体複合体は、検出可能な標識（detectable label）によって標識されるか、あるいは検出可能な標識を発生させることができる物質によっても標識される。前記検出可能な標識、または検出可能な標識を発生させることができる物質は、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（microparticla）、レドックス分子及び放射線同位元素からなる群のうちからも選択される。前記酵素は、例えば、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ及びＧＤＰａｓｅ、ＲＮａｓｅ、グルコースオキシダーゼ及びルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、ホスホエノールピルビン酸デカルボキシラーゼ、β−ラタマーゼ、またはそれらの組み合わせでもある。前記蛍光物質は、フルオレシン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリテリン、フィコシアニン、アロピコシアニン、ｏ−フタルデヒド、フルオレスカミンなどがあるが、それらに制限されるものではない。リガンドには、ビオチン誘導体などがある。前記発光物質は、アクリジニウムエステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼなどがある。前記微細粒子は、コロイド金、着色されたラテックスなどがあるが、それらに制限されるものではない。レドックス分子には、フェロセン、ルテニウム錯化合物、ビオロゲン、キノン、Ｔｉイオン、Ｃｓイオン、ジイミド、１，４−ベンゾキノン、ヒドロキノン、Ｋ４Ｗ（ＣＮ）８、［Ｏｓ（ｂｐｙ）３］２＋、［ＲＵ（ｂｐｙ）３］２＋または［ＭＯ（ＣＮ）８］４−などでもある。前記放射線同位元素は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉまたは１８６Ｒｅなどでもある。
【００２４】
前述のところのように、本発明によるｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、牛の妊娠いかんによって出現または増量する血漿タンパク質に特異的に結合し、抗原・抗体複合体を形成し、前記抗原・抗体複合体の分析を介し、牛の妊娠いかんを比較的簡単な方法で診断することができるが、牛の繁殖効率を高め、畜産業に有用に利用されうる。
【発明の効果】
【００２５】
一態様は、ｂＰＡＧ１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に係わるものであり、前記抗体は、牛の妊娠性血漿タンパク質であるｂＰＡＧ１に特異的に結合するので、牛のように繁殖が重要な動物において、妊娠を簡単に診断することができるが、繁殖効率を高め、畜産業に有用に利用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明によるｂＰＡＧ１タンパク質の分子的情報を示した図である。
【図２】イソタイプスクリーニングテスト結果を示した図である。
【図３Ａ】免疫グロブリンＭを分離した後、Bradford assayを介して確認した結果を示した図であり、分離された３Ｂ１クローンの定量グラフを示した図である。
【図３Ｂ】免疫グロブリンＭを分離した後、Bradford assayを介して確認した結果を示した図であり、分離された３Ｂ３クローンの定量グラフを示した図である。
【図３Ｃ】免疫グロブリンＭを分離した後、Bradford assayを介して確認した結果を示した図であり、分離精製した抗体のメンブレイン上での活性程度を示した写真である。
【図４】ｂＰＡＧ１タンパク質に係わる単一クローン抗体のエピトープ分析結果を示した図である。
【図５】牛の妊娠診断方法を示した模式図である。
【図６】簡易製造したキットを利用し、牛の妊娠を診断した結果を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の理解の一助とするために、望ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものであるのみ、下記実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。
【００２８】
抗体製造用抗原ペプチドは、ｂＰＡＧ１タンパク質の１５０〜２００番目及び３５０〜４００番目のアミノ酸配列のうちから４０個を選定し、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ：keyhole limpet hemocyanin）の有無により、４種類で進めた。ｂＰＡＧ１タンパク質断片のアミノ酸配列は、配列番号５（ＰＡＧ１＿１００）及び配列番号６（ＰＡＧ１＿３００）の配列を有する。
【実施例】
【００２９】
実施例１．抗原を用いた免疫反応誘導
１−１．ｂＰＡＧ１＿１００
準備例の抗原（ｂＰＡＧ１＿１００）１００μlと、同量のコンプリートアジュバント（complete adjuvant）とを利用して抗原乳化液を作った後、８週齢のメスマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）皮下に投与し、免疫反応を誘導した。一次投与後、２週間隔で、同一抗原１００μｌと、同量のインコンプリートアジュバント（incomplete adjuvant）とを利用し、前記マウスの皮下に投与した。抗原投与日程などに係わる事項は、下記表１に示されている通りである。
【００３０】
１−２．ｂＰＡＧ１＿１００−ＫＬＨ
抗原ｂＰＡＧ１＿１００−ＫＬＨを使用したという点を除いては、前記実施例１−１と同様方法で遂行した。
【００３１】
１−３．ｂＰＡＧ１＿３００
抗原ｂＰＡＧ１＿３００を使用したという点を除いては、前記実施例１−１と同様方法で遂行した。
【００３２】
１−４．ｂＰＡＧ１＿３００−ＫＬＨ
抗原ｂＰＡＧ１＿３００−ＫＬＨを使用したという点を除いては、前記実施例１−１と同様方法で遂行した。
【００３３】
【表１】
2021503014.tif 000003
【００３４】
実施例２．抗体の力価確認
２−１．ｂＰＡＧ１＿１００
前記実施例１−１の抗原投与を３回進めた後、前記マウスの尾静脈から血清（serum）を少量採血し、ＥＬＩＳＡ testを介し、血清内多クローン抗体の力価を確認した。具体的には、ｂＰＡＧ１＿１００抗原２μｇ／ｍｌを、ウェル当たり１００μｌずつ４℃で１８時間反応させた後、コーティングした。翌日、ブロッキングバッファ（blocking buffer）を利用し、室温で１時間反応（blocking）させた。その後、マウス血液から得た血清を使用し、倍率に合うように希釈し、ウェルに１００μｌを分注した後、１時間室温で反応させた。反応が完了したプレートは、ＰＢＳＴを使用して洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲーション（conjugation）されているヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを、１：２，０００比率で希釈し、ウェルに１００μｌを分注し、室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳＴを使用して洗浄し、ＴＭＢ溶液を分注し、１５分間反応させた後、反応停止液を使用して反応を終結させた。４５０／６２０ｎｍで吸光度値を測定し、血清内力価（titer）を確認し、その結果を下記表２及び表３に示した。
【００３５】
２−２．ｂＰＡＧ１＿１００−ＫＬＨ
抗原ｂＰＡＧ１＿１００−ＫＬＨを使用したという点を除いては、前記実施例２−１と同様方法で遂行した。
【００３６】
２−３．ｂＰＡＧ１＿３００
抗原ｂＰＡＧ１＿３００を使用したという点を除いては、前記実施例２−１と同様方法で遂行した。
【００３７】
２−４．ｂＰＡＧ１＿３００−ＫＬＨ
抗原ｂＰＡＧ１＿３００−ＫＬＨを使用したという点を除いては、前記実施例２−１と同様方法で遂行した。
【００３８】
【表２】
2021503014.tif 000004
【００３９】
【表３】
2021503014.tif 000005
【００４０】
その結果、表２及び表３に示されているように、ｂＰＡＧ１の抗原性分析を介して合成して得られたＰＡＧ１−１００とＰＡＧ１−３００とのペプチドがｂＰＡＧ１抗体を量産したということを確認することができた。
【００４１】
実施例３．ｂＰＡＧ１タンパク質に係わる単一クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞の製造、及び単一クローン抗体の分離
３−１．ハイブリドーマ細胞の製造
前記実施例２の抗体力価確認実験を介して確認されたマウスの血清内力価を基準に、高力価を有する抗体が生成されたことを確認し、前記マウスのリンパ球を分離し、細胞融合を実施した。具体的には、前記実施例１−１ないし１−４において、免疫反応が誘導されたマウスの脾臓を、損傷なしに摘出し、ＤＭＥＭ（Dulbecco/Vogt modified Eagle’s minimal essential medium）培地で洗浄し、リンパ球を分離し、６０ｍｍディッシュ（dish）にＤＭＥＭ培地を入れ、単一細胞に分離させた。その後、ＲＢＣ溶解バッファ（lysis buffer）を使用し、リンパ球に混ざっている赤血球を除去した後、ＤＭＥＭ培地で洗浄し、準備された骨髄腫細胞（myeloma cell；ＳＰ２／０ Ａｇ １４−ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−１５８１）とリンパ球とを、細胞数対比で１：５で混合した。その後、前記混合された細胞にＰＥＧ１５００ １．７ｍｌを添加して細胞融合を誘導し、９６ウェルプレートに、ウェル当たり２００μｌずつ細胞を分注した後、ＣＯ２インキュベータ（incubator）で培養した。細胞融合２日後、各ウェル当たり５０％を、ＨＡＴ培地（hypoxanthine-aminopterinthymidine medium）に交換し、１２日後、コロニー（colony）を確認し、ｂＰＡＧ１タンパク質ペプチド（ＥＬＩＳＡ確認用抗原）との反応いかんを、前記実施例２と同一ＥＬＩＳＡ（Ａｓｂ．４５０ｎｍ）方式で進めて決定した。前記ＥＬＩＳＡの結果において、Ｏ．Ｄ値を基準に、１．０以上である場合、陽性（positive）と選定し、単一クローン抗体を生産するための母細胞として選定し、その結果を下記表４に示した。
【００４２】
【表４】
2021503014.tif 000006
【００４３】
３−２．単一クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の選別
前記実施例３−１で製造した融合細胞群において、ｂＰＡＧ１にのみ特異的に反応する細胞を選別し、抗体生成いかんを確認するために、酵素免疫方法を利用してスクリーニングした。
【００４４】
細胞融合後１２日目に培地を交換し、交換した培地を一次抗体として使用し、ＥＬＩＳＡ試験を行った。ＥＬＩＳＡ試験後、当該抗原に陽性を示すウェルを選択し、２４ウェルに移して培養した。２４ウェルで培養したハイブリドーマ細胞株を、同一方法でさらにＥＬＩＳＡ試験を行い、抗体力価を確認すると共に、抗体生成細胞株を二次スクリーニングした。２４ウェルで育てた融合細胞の吸光度（Ｏ．Ｄ値）をＥＬＩＳＡで確認し、吸光度が１を超える融合細胞のみを選択し、６ウェル培養フラスコに移して培養し、遠心分離した後、上澄み液を取ってＥＬＩＳＡで確認し、三次スクリーニングを行った。三次スクリーニングを基に選択された融合細胞をさらに７５Ｔ／Ｃ培養フラスコで移して培養し、ＥＬＩＳＡで吸光度を確認し、吸光度が１を超える融合細胞のみを選択した。前記過程を経て選定された細胞株を下記表５に示した。
【００４５】
【表５】
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【００４６】
表５に示されているように、ｂＰＡＧ１−１００を結合部位とする抗体は、１Ａ６，２Ａ６，２Ｂ６，２Ｃ４，３Ａ６，３Ｂ１，３Ｂ３細胞株及び３Ｂ５細胞株が最終選別され、ｂＰＡＧ−３００を結合部位とする抗体は、４Ａ１細胞株及び４Ａ３細胞株が選別された。そのうち、融合細胞３Ｂ１を韓国細胞株研究財団（ＫＣＬB：Korean Cell Line Bank）に２０１７年１２月５日付けで寄託した（受託番号：ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００４１６）。
【００４７】
実施例４．ｂＰＡＧ１タンパク質に係わる単一クローン抗体の生産及び精製
前記実施例３−２で最終選択した融合細胞から、ｂＰＡＧ１のタンパク質に係わる単一クローン抗体を量産するために、６週齢マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の腹腔に、０．５ｍｌインコンプリートアジュバントを投与した。３日後、前記実施例３−１で選定されたハイブリドーマ細胞において、Ｏ．Ｄ値が高いと確認されたそれぞれの細胞を、マウス１匹当たり１００μｌ（１ｘ１０６cell）ずつ投与した。６〜１０日後、前記マウスの腹腔から腹水（ascite）を採取した。
【００４８】
実施例５．ｂＰＡＧ１タンパク質に係わる単一クローン抗体の分離
前記実施例３で選別した融合細胞から、ｂＰＡＧ１に特異的に結合する抗体を分離するために、透析パック（dialysis pack）に、注射器を使用して腹水を入れておいた。その後、２ｍＭ ＰＢ ２Ｌをビーカに入れ、マグネチックバーと試料とが入っている透析袋を入れた後、４℃で３〜４日間透析した。ここで、バッファは、１日に１回ずつ交換した。透析が完了した後、透析液内に存在した液体を収去して遠心分離した後、上澄み液を収去し、タンパク質の定量を行い、さらにメンブレン上で抗原・抗体反応を確認した。
【００４９】
その結果、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、３Ｂ１融合細胞株の場合、腹水１ｍｌ当たり約１．５ｍｇの抗体を生産し、３Ｂ３融合細胞株の場合、腹水１ｍｌ当たり約２ｍｇの抗体を生産した。前記過程を介して分離された抗体のメンブレン上での活性を確認するために、メンブレンに妊娠した牛の血清を少量ローディングして乾燥させた後、金粒子を接合させた各抗体を展開溶液と混合して流した。その結果、図３Ｃに示されているのように、２Ｃ４，３Ｂ１，３Ｂ３抗体及び４Ａ１抗体において、抗原（ｂＰＡＧ１）との結合を意味する鮮明なスポットを確認することができた。
【００５０】
実施例６．ｂＰＡＧ１タンパク質に係わる単一クローン抗体のエピトープ（epitope）の分析
抗体生産に使用したペプチドを使用し、エピトープマッピング（epitope mapping）を実施した。マッピングに使用されたペプチドは、既存抗原生産に使用されたＰＡＧ１タンパク質の１００，３００sizeの一部のみを使用し、下記表６に示されているように、４種類で進めた。
【００５１】
【表６】
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【００５２】
具体的には、抗原ｂＰＡＧ１＿１００及びｂＰＡＧ１＿３００を、それぞれ１００μｇ／ウェルのウェル当たり２５，５０，１００μｌ及び２００μｌずつ分注してコーティングした後、室温で２時間反応させた。その後、ブロッキングバッファを利用し、室温で１時間ブロッキングした後、精製されたサンプルを使用し、ウェルに１００μｌ分注し、１時間室温で反応させた。その後、反応が完了したプレートを、ＰＢＳＴを使用して洗浄し、ＨＲＰがコンジュゲーションされているヤギ抗マウスＩｇＭを、１：５０，０００比率で希釈し、ウェルに１００μｌ分注し、１時間反応させた。反応完了後、ＰＢＳＴを使用して洗浄し、ＴＭＢ溶液を分注し、１５分間反応させた。その後、反応停止液を使用して反応を終結させ、４５０／６２０ｎｍで吸光度値を測定し、サンプル内力価を確認した。
【００５３】
その結果、図４に示すように、抗原の濃度依存的に、前記抗原と特異的に結合する抗体の量が増加することを確認することができた。特に、ペプチド１の場合、同一抗原の濃度対比で、ペプチド２〜４に比べ、抗原と特異的に結合する量が顕著であるというところから見て、本発明による抗体エピトープがアミノ酸配列であるということが分かる。
【００５４】
実施例７．分離精製した抗体を用いた牛の妊娠診断
前記実施例３で選別した抗体を利用し、妊娠した牛の血液内に存在すると知られているｂＰＡＧ１を検出した。具体的には、前記抗体をメンブレンに分注し、金粒子が結合された抗原結合部位の異なる抗体を利用し、人工受精後６週、７週及び８週になった牛の血液を採取し、遠心分離して血清を分離した。分離された血清０．０５ｍｌを、簡易製造したキットの検体積載部にローディングし、１５分経過した後で結果を判定した。
【００５５】
その結果、図６に示されているように、受精６週後から、検査線に帯が生成されることを確認することができた。すなわち、前記抗体を利用した牛の血液内ｂＰＡＧ１の存在を確認することにより、牛の妊娠を診断することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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