(57)【要約】  細胞を成長させるための系および方法が提供される。細胞を成長させるまたは保存するためのカプセルは、内部区画を画定するシェルおよび該区画内に配置される細胞接着のための基材を含む。該基材は、ポリマーおよび1つ以上の接着分子を含む。細胞接着のための基材は、シェルの内表面および/または該内部区画内に配置されるヒドロゲルであり得る。該カプセルはさらに、基材に接着する、幹細胞などの細胞を含み得る。
2021503958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部区画を画定するシェル；および
該内部区画内に配置される細胞接着のための基材
を含む、細胞を成長させるまたは保存するためのカプセルであって、
該基材が、ポリマーおよび1つ以上の接着分子を含む、カプセル。
【請求項２】
細胞接着のための基材がシェルの内表面である、請求項１記載のカプセル。
【請求項３】
細胞接着のための基材が、内部区画内に配置されるヒドロゲルである、請求項１記載のカプセル。
【請求項４】
該ヒドロゲルが、架橋ポリエチレングリコール(PEG)、架橋ポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)またはそれらの組合せを含む、請求項３記載のカプセル。
【請求項５】
該シェルが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)、アルギネート、キトサン、アルギネートもしくはキトサンと共重合したPEG、アルギネートもしくはキトサンと共重合したPEGDA、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)、ポリ-L-リジン(PLL)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、およびポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)、ポリ[2-(メチルアクリルオキシ)エチルホスホリルコリン]-ブロック-(グリセロールモノメタクリレート)(PMPC-PGMA)、χ-アセチレン-ポリ(tert-ブチルアクリレート)(PtBA)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(ジビニルベンゼン-コ-グリシジルメタクリレート)(poly(divinylbenzene-co-glycidylamethacrylate))(P(DVB-GMA))、ポリ(アミドアミン)(PAMAM)、ポリ(D-グルコサミドエチレンメタクリレート)(PGAMA)、ポリ(2-ラクトビオンアミドエチルメタクリレート(PLAMA)、アルキルチオエーテル末端官能基化ポリ(メタクリル酸)(PMAA-DDT)、ポリ(エチレングリコール)-ホスフィン(PEG-ホスフィン)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリ(アクリル酸)-オクチルアミン(PAA-オクチルアミン)、およびポリ(無水マレイン酸-alt-1-オクタデセン-ブロック-ポリ(エチレングリコール)(PMAO-PEG)、またはそれらの組合せからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項１〜４いずれか記載のカプセル。
【請求項６】
１つ以上の接着分子が接着ペプチドを含む、請求項１〜５いずれか記載のカプセル。
【請求項７】
接着ペプチドが、RGDS、YIGSR、IKVAV、REDV、GKKQRFRHRNRKG、RNIAEIIKDIおよびKTRWYSMKKTTMKIIPFNR、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項６記載のカプセル。
【請求項８】
1つ以上の接着分子が接着タンパク質を含む、請求項１〜５いずれか記載のカプセル。
【請求項９】
接着タンパク質が、I型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、変性コラーゲン、IV型コラーゲンおよびMatrigel(登録商標)、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項８記載のカプセル。
【請求項１０】
1つ以上の接着分子が抗体を含む、請求項１〜５いずれか記載のカプセル。
【請求項１１】
抗体が、細胞表面受容体に結合する抗体である、請求項１０記載のカプセル。
【請求項１２】
抗体が、CD3、CD28およびCD40の少なくとも1つに結合する抗体である、請求項１０記載のカプセル。
【請求項１３】
1つ以上の接着分子が非ペプチド小分子を含む、請求項１〜５いずれか記載のカプセル。
【請求項１４】
非ペプチド小分子が非ステロイド性抗炎症分子である、請求項１３記載のカプセル。
【請求項１５】
小分子がステムレグリン(stemregulin)、リバーシンまたはそれらの組合せである、請求項１３記載のカプセル。
【請求項１６】
1つ以上の接着分子が、成育性、増殖、生存、成長、分化、またはそれらの任意の組合せに影響する分子である、請求項１〜５いずれか記載のカプセル。
【請求項１７】
基材がさらに成長因子を含む、請求項１〜１６いずれか記載のカプセル。
【請求項１８】
成長因子がポリマーにコンジュゲートされる、請求項１７記載のカプセル。
【請求項１９】
内部区画が、成長因子を含む液体を含む、請求項１または２記載のカプセル。
【請求項２０】
成長因子が、FGF、TGF-β1、VEGF、PDGF-BB、PDGF、IGF1、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、エリスロポイエチン、DL-1ノッチリガンド、Wnt、間質由来因子(SDF)-1、インターロイキン(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、IL-15R、CD40L、G-CSF、GM-CSF、4-1BBおよびBMPスーパーファミリーメンバー、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１６〜１９いずれか記載のカプセル。
【請求項２１】
シェルが多孔質である、請求項１〜２０いずれか記載のカプセル。
【請求項２２】
多孔質シェルが約10nm〜約35nmの孔径を有する、請求項２１記載のカプセル。
【請求項２３】
孔径が約20nmである、請求項２２記載のカプセル。
【請求項２４】
シェルがさらに、酵素感受性ペプチドを含む、請求項１〜２３いずれか記載のカプセル。
【請求項２５】
酵素感受性ペプチドがプロテアーゼ感受性ペプチドである、請求項２４記載のカプセル。
【請求項２６】
該ペプチドが、トリプシン、コラゲナーゼ、DNase、RNaseおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される酵素に対して感受性である、請求項２４記載のカプセル。
【請求項２７】
基材に接着した細胞をさらに含む、請求項１〜２６いずれか記載のカプセル。
【請求項２８】
接着性細胞が、幹細胞、膵島、末梢血単核細胞、内皮前駆細胞、血液線維細胞、骨髄細胞、T細胞、B細胞、樹状細胞、NK細胞、単球、CD34+細胞、肝細胞、胃腸細胞、皮膚細胞、皮膚前駆細胞、癌細胞、ハイブリドーマ細胞、原核細胞、HEK293Tパッケージ化細胞、酵母細胞、および膵臓前駆細胞からなる群より選択される、請求項２７記載のカプセル。
【請求項２９】
該細胞が、間葉幹細胞(MSC)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓上皮(MDCK)細胞、およびVero細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞、および多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項２７記載のカプセル。
【請求項３０】
DNA含有分子またはRNA含有分子をさらに含む、請求項１〜２９いずれか記載のカプセル。
【請求項３１】
DNA含有分子またはRNA含有分子が、基材に接着したウイルス粒子により保有される、請求項３０記載のカプセル。
【請求項３２】
DNA含有分子またはRNA含有分子が、cDNA、プラスミドDNA、転移DNA、ウイルスベクター、改変RNA、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子編集分子、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼの少なくとも1つを含む、請求項３０記載のカプセル。
【請求項３３】
DNA含有分子またはRNA含有分子が、脂質小包に含まれる、請求項３２記載のカプセル。
【請求項３４】
細胞を請求項１記載のカプセルに封入する工程、ここで該細胞は、該カプセルの内部区画内の基材に接着する；および
該細胞を、生存状態で該カプセル内に維持する工程
を含む、細胞を保存する方法。
【請求項３５】
該カプセルが多孔質シェルを含み、さらに該細胞を封入する工程が、カプセルの多孔質シェルを細胞に暴露する工程を含み、該細胞がシェルの内部区画にトランスロケーションする、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該カプセルが内部区画内に培養培地を含み、それにより封入された細胞の懸濁培養物を生じる方法であって、該方法が、該懸濁培養物内の細胞を成長または拡大させる工程をさらに含む、請求項３４または３５記載の方法。
【請求項３７】
懸濁培養物が撹拌槽懸濁培養物である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
カプセルのシェルを分解して細胞を回収する工程をさらに含む、請求項３４〜３７いずれか記載の方法。
【請求項３９】
ポリマー前駆材料および接着分子を含む第1の組成物；および
ポリマー前駆材料を重合させて、前駆材料の重合により生成されたポリマーおよび接着分子を含むシェルを有するカプセルを形成するための試薬を含む第2の組成物
を含む細胞培養キットであって、該接着分子がシェルの内表面上に存在する、細胞培養キット。
【請求項４０】
第1の組成物が成長因子をさらに含む、請求項３９記載の細胞培養キット。
【請求項４１】
第1の組成物が酵素感受性ペプチドをさらに含む、請求項３９または４０記載の細胞培養キット。
【請求項４２】
第2の組成物が、シェルの内部区画内にヒドロゲルを形成するための架橋試薬をさらに含む、請求項３９〜４１いずれか記載の細胞培養キット。
【請求項４３】
第1の組成物が凍結乾燥される、請求項３９〜４２いずれか記載の細胞培養キット。
【請求項４４】
第1の溶液が、ポリマーおよび親水性光開始剤を含み；
第2の溶液が、疎水性光開始剤を含むエマルジョンを含み、
少なくとも1つのポンプが、第1の溶液および第2の溶液を混合するように構成され、混合された第1および第2の溶液を、光反射装置を通してポンプ輸送するように構成され；
発光デバイスが、光反射装置を照らすように構成される、
カプセルを作製するための系。
【請求項４５】
回収容器をさらに含む系であって、混合された第1および第2の溶液が、光反射装置を通って回収容器へと連続的にポンプ輸送される、請求項４２記載の系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2017年11月22日に出願された米国仮特許出願第62/589,934号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞は、ワクチンの製造から細胞療法としての使用まで、多くの工業用途に見られる。バイオリアクター系における細胞の懸濁液は、かかる工業用途のための細胞培養の自動化および大規模化(scale up)を可能にしている。特に興味深く困難なもののうち、足場依存性細胞は、Tフラスコ、多層細胞工場[3、4]およびローラーボトルまたは中空線維に基づくバイオリアクター系[5、6]などの2次元(2D)組織培養処理表面上で単層として培養されている。より最近では、懸濁培養は、特に商業的な製造規模について、記号論理学的に実際的でない平面成長表面積を必要とする従来の2D培養よりも空間的に効率的な形式において高い収率を提供する能力を有するので、懸濁培養における足場依存性細胞の培養への移行が出現している。
【０００３】
最も一般的には細胞接着のためのポリスチレン製でありかつコラーゲンまたはラミニンでコーティングされた微小担体により、撹拌槽バイオリアクターにおける足場依存性細胞の懸濁培養が可能になっている[7〜10]。間葉幹細胞(MSC)は、微小担体に接着して、大規模拡大のための300mL〜1000Lの範囲の撹拌槽バイオリアクター中で培養される[11]。微小担体系のバイオリアクター技術により、大きな表面積 対 体積比、プロセス制御、閉ループ試料採取および均一な培養条件などの有意な利点が提供される[12〜16]。微小担体技術の利点に関わらず、いくつかの克服すべき難題が残っており、足場依存性細胞を培養するための系および方法の向上のための必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本発明の方法および系は、細胞の拡大および/または保存のために使用され得る封入された細胞培養系を提供する。
【０００５】
一態様において、本発明は、接着性細胞などの細胞を成長または保存するためのカプセルに関する。該カプセルは、内部区画を画定するシェルおよび内部区画内に配置される細胞接着のための基材を含む。基材は、1つ以上の接着分子を含み得るポリマーを含む。
【０００６】
別の態様において、本発明は、内部区画を画定するシェルおよび内部区画内に配置される細胞接着のための基材を有するカプセルに細胞を封入する工程を含む、細胞を保存する方法に関する。細胞は、カプセルの内部区画内の基材に接着する。
【０００７】
いくつかの態様において、細胞接着のための基材はシェルの内表面および/または内部区画に配置されるヒドロゲルであり得る。ヒドロゲルは、架橋ポリエチレングリコール(PEG)、架橋ポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)、またはそれらの組合せを含み得る。シェルは、ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)、アルギネート、キトサン、アルギネートもしくはキトサンと共重合したPEG、およびアルギネートもしくはキトサンと共重合したPEGDA、またはそれらの組合せを含み得る。他のポリマーとしては、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)、ポリ-L-リジン(PLL)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリアクリルアミドポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)、ポリ[2-(メチルアクリルオキシ)エチルホスホリルコリン]-ブロック-(グリセロールモノメタクリレート)(PMPC-PGMA)、χ-アセチレン-ポリ(tert-ブチルアクリレート)(PtBA)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリ(アクリル酸) (PAA)、ポリ(ジビニルベンゼン-コ-グリシジルメタクリレート(poly(divinylbenzene-co-glycidylamethacrylate))(P(DVB-GMA))、ポリ(アミドアミン)(PAMAM)、ポリ(D-グルコサミドエチレンメタクリレート)(PGAMA)、ポリ(2-ラクトビオンアミドエチルメタクリレート(PLAMA)、アルキルチオエーテル末端官能基化ポリ(メタクリル酸)(PMAA-DDT)、ポリ(エチレングリコール)-ホスフィン(PEG-ホスフィン)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリ(アクリル酸)-オクチルアミン(PAA-オクチルアミン)、ポリ(無水マレイン酸-alt-1-オクタデセン-ブロック-ポリ(エチレングリコール)(PMAO-PEG)が挙げられ得る。ポリマーのさらなる例は、その全内容が参照により本明細書に援用されるLadj R. et al., Polymer encapsulation of inorganic nanoparticles for biomedical applications, Intl. J. of Pharm., 2013.  458(1): p. 230-241に見られ得る。
【０００８】
さらなる態様において、基材の接着分子は、物質への細胞接着、細胞成育性(viability)、細胞増殖、細胞生存、成長および/または細胞の分化に影響する接着分子であり得る。例えば、接着分子は、接着ペプチド、例えばRGDS(配列番号：1)、YIGSR(配列番号：2)、IKVAV(配列番号：3)、REDV(配列番号：4)、GKKQRFRHRNRKG(配列番号：5)、RNIAEIIKDI(配列番号：6)、KTRWYSMKKTTMKIIPFNR(配列番号：7)またはそれらの任意の組合せであり得る。さらに、または代替的に、接着分子は、例えばI型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、変性コラーゲン(ゼラチンとしても公知)、IV型コラーゲン、Matrigel(登録商標) (Corning Life Sciences, Bedford, MA)、ポリ-L-リジン(PLL)、ポリ-D-リジン(PDL)、またはそれらの任意の組合せなどの部分または全長タンパク質であり得る。細胞表面受容体(例えばCD3およびCD28)に結合する抗体および/または小分子(例えばステムレグリン(stemregulin)またはリバーシンなどの非ペプチド小分子)、例えば細胞の分化プログラムを活性化して接着を促進する小分子も、細胞接着のための基材に含まれる接着分子であり得る。
【０００９】
さらなる態様において、基材はさらに、内部区画内に配置され得る、例えばポリマーにコンジュゲートされ得る、ヒドロゲルに埋め込まれ得るおよび/または液体(例えば培養培地)内に配置され得る成長因子を含む。成長因子は、例えばFGF、TGF-β1、VEGF、PDGF-BB、PDGF、IGF1、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、エリスロポイエチン、DL-1ノッチリガンド、Wnt、間質由来因子(SDF)-1、インターロイキン(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、IL-15R、CD40L、G-CSF、GM-CSF、4-1BBおよびBMPスーパーファミリーメンバー、またはそれらの任意の組合せであり得る。
【００１０】
なおさらなる態様において、カプセルのシェルは、例えば約10nm〜約35nmまたは約20nmの孔径を有する多孔質である。シェルはさらに、酵素感受性ペプチド、例えばプロテアーゼ感受性ペプチド、または他の溶解性材料およびコンジュゲーション部分を含み得る。
【００１１】
なおさらなる態様において、カプセルは、DNA含有分子またはRNA含有分子を含む。DNA含有分子またはRNA含有分子は、内部区画内に配置され得、例えばポリマーにコンジュゲートされ得、ヒドロゲルに埋め込まれ得および/またはシェルに含まれる液体(例えば培養培地)に配置され得る。DNAまたはRNA含有分子は、例えばcDNA、プラスミドDNA、転移DNA(例えばsleeping beautyトランスポゾンを使用する)、ウイルスベクター(例えばアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス)、改変RNA、siRNA、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子編集分子、例えばCRISPR/gRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(例えばTALEN)、およびメガヌクレアーゼ、ならびにこれらの分子を含む脂質小胞、またはそれらの任意の組合せであり得る。
【００１２】
いくつかの態様において、カプセルは、幹細胞などの、基材に接着される細胞を含む。細胞は、例えば間葉幹細胞(MSC)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓上皮(MDCK)細胞、Vero細胞、膵島、末梢血単核細胞、内皮前駆細胞、血液線維細胞、骨髄細胞、T細胞、B細胞、樹状細胞、CD34+細胞、NK細胞、単球、肝細胞、神経幹細胞、胃腸細胞、皮膚細胞、皮膚細胞前駆細胞、癌細胞、ハイブリドーマ細胞、原核細胞、HEK293Tパッケージ化細胞株、酵母細胞、膵臓前駆細胞、胚性幹細胞または誘導多能性肝細胞であり得る。細胞は、カプセルの多孔質シェルを細胞に暴露することにより封入され得、該細胞は、孔を通ってシェルの内部区画にトランスロケーションする。代替的に、細胞は、カプセルの重合の間に封入され得る。カプセルは、内部区画内に培養培地を含み得、それにより封入された細胞の懸濁培養を生じる。細胞は、懸濁培養中で成長および/または拡大し得る。懸濁培養は、撹拌槽懸濁培養であり得る。細胞の培養または保存プロセスの完了時に、カプセルのシェルが分解され得、細胞が回収され得る。
【００１３】
別の態様において、本発明は、第1および第2の組成物を含む細胞培養キットに関する。第1の組成物は、ポリマー前駆材料および接着ペプチドを含む。第2の組成物は、ポリマー前駆材料を重合して、前駆材料および接着ペプチドの重合により生成されたポリマーを含むシェルを有するカプセルを形成するための試薬を含む。接着ペプチドは、シェルの内表面上に存在する。第1の組成物は、任意にさらに成長因子および/またはプロテアーゼ感受性ペプチドを含み得る。第2の組成物は、任意にさらに、シェルの内部区画内にヒドロゲルを形成するための架橋試薬を含み得る。第1の組成物は凍結乾燥され得る。
【００１４】
別の態様において、本発明は、第1および第2の組成物を含む、封入された細胞を作製するための系に関する。該系は、ポンプ装置、管系セット、特定の光源および液体処理/回収バッグで構成される。第1の組成物は、ポリマー前駆材料およびポリマーにコンジュゲートされる1つ以上の基材を含む。第2の組成物は、ポリマー前駆材料を重合して、前駆材料の重合により作製されるポリマーおよびコンジュゲートされた基材(1つまたは複数)を含むシェルを有するカプセルを形成するための試薬を含む。基材(1つまたは複数)は、シェルの内表面に存在する。第1の組成物は、任意にさらに成長因子、DNA/RNA含有構造および/またはプロテアーゼ感受性ペプチドを含み得る。第2の組成物は、任意にさらにシェルの内部区画内でヒドロゲルを形成するための架橋試薬を含み得る。第1の組成物は凍結乾燥され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図面の簡単な説明
前述のものは、添付の図面に図示されるように以下の例示態様のより詳細な記載から明らかであり、該図面において同様の参照記号は異なる図面を通じて同じ部分に言及する。図面は必ずしも一定の割合で作られておらず、代わりに態様の図示が強調される。
【図１】図1は、断面図に示される先行技術の微小担体のダイアグラムである。
【図２−１】図2Aは、本発明のカプセルの例のダイアグラムであり、該図中、細胞はカプセルのシェルの内表面に沿って接着する。図2Bは、本発明のカプセルの別の例のダイアグラムであり、該図中、シェルはプロテアーゼ感受性ペプチドを含む。
【図２−２】図2Cは、本発明のカプセルの例のダイアグラムであり、該図中、細胞はカプセルのヒドロゲルコア内に埋め込まれるかまたはヒドロゲルコアに接着する。図2Dは、本発明のカプセルの別の例のダイアグラムであり、該図中、ヒドロゲルコアは、共有結合した成長因子(GF)を含む。
【図２−３】図2Eは、本発明のカプセルのさらに別の例のダイアグラムであり、該図中、ヒドロゲルコアは可溶性成長因子(GF)を含む。
【図２−４】図2Fは、本発明のカプセルの別の例のダイアグラムであり、該図中、カプセルは、接着ペプチド、プロテアーゼ感受性ペプチド、成長因子(GF)およびポリエチレングリコール(PEG)鎖に結合した細胞を含む。
【図３】図3Aは、静的条件(0rpm)下で培養される合成されたポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)カプセルを示す。図3Bは、従来の速度での撹拌(60rpm)下で培養される合成されたポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)カプセルを示す。図3Cは、高速での撹拌(250rpm)下で培養される合成されたポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)カプセルを示す。
【図４−１】図4Aは、合成されたPEGDA微小担体中に封入された間葉幹細胞(MSC)を示す。生細胞(緑色、太い矢印)および死細胞(赤色、細い矢印)を200μmスケールで示す。
【図４−２】図4Bは、2バッチの封入された細胞についての培養における細胞数 対 時間のグラフであり、それぞれのバッチは異なる入力細胞濃度を有する。
【図５】図5は、接着ペプチドRGDSのコンジュゲーション効率の評価における未反応遊離アミンの検出のための吸光度 対 グリシン濃度のグラフである。
【図６】図6は、動的スピナーフラスコ培養の3日目に試料採取されたローダミンファロイジン(赤色)およびDAPI(青色)染色された封入されたMSCを示す。
【図７】図7は、静的培養下で評価される細胞負荷(cell laden)液体コア(LC)または重合コア(PC)のいずれかを有するカプセルについての細胞数 対 培養時間のグラフである。
【図８−１】図8Aは、高撹拌速度(125rpm)での細胞培養の1日目に試料採取された細胞負荷重合コアカプセル内の生細胞(緑色)および死細胞(赤色)を示す。図8Bは、6日目に試料採取された図8Aのカプセルを示す。図8Cは、10日目に試料採取された図8Aおよび8Bのカプセルを示す。
【図８−２】図8Dは、図8A〜8Cのカプセルについての細胞数 対 日数での時間のグラフである。
【図９−１】図9Aは、低撹拌速度(30rpm)での細胞培養の1日目に試料採取された細胞負荷重合コアカプセルにおける生細胞(緑色)および死細胞(赤色)を示す。図9Bは、3日目に試料採取された図9Aのカプセルを示す。図9Cは、6日目に試料採取された図9Aおよび9Bのカプセルを示す。
【図９−２】図9Dは、図9A〜9Cのカプセルについての細胞数 対 日数での時間のグラフである。
【図１０−１】図10Aは、重合コア(PC)カプセルの数 対 カプセルの直径のグラフである。
【図１０−２】図10Bは、図10AのPCカプセルの表面積 対 カプセルの直径のグラフである。
【図１０−３】図10Cは、図10A〜10BのPCカプセルの体積 対 カプセルの直径のグラフである。
【図１１−１】図11Aは、液体コア(LC)カプセルの数 対 カプセルの直径のグラフである。
【図１１−２】図11Bは、図11AのLCカプセルの表面積 対 カプセルの直径のグラフである。
【図１１−３】図11Cは、図11A-11BのPCカプセルの体積 対 カプセルの直径のグラフである。
【図１２】図12Aは、コラゲナーゼ酵素への暴露の前の分解性カプセルを示す。図12Bは、コラゲナーゼへの暴露の3時間後の図12Aの分解性カプセルを示す。図12Cは、コラゲナーゼへの一晩の暴露後の図12Aおよび12Bの分解性カプセルを示す。図12Dは、図12A〜12Cのカプセルの分解を示す。
【図１３】図13Aは、コラゲナーゼ酵素への暴露の前の細胞負荷分解性カプセルを示す。図13Bは、ピペッティングによる機械的撹拌後の図13Aのカプセルの分解を示す。
【図１４】図14Aは、1日目に試料採取された高接着濃度を有するローダミンファロイジンおよびDAPIで染色された封入MSCを示す。図14Bは、7日目に試料採取された高接着濃度を有するローダミンファロイジンおよびDAPIで染色した封入MSCを示す。図14Cは、14日目に試料採取された高接着濃度を有するローダミンファロイジンおよびDAPIで染色された封入MSCを示す。図14Dは、1日目に試料採取された低接着濃度を有するローダミンファロイジンおよびDAPIで染色された封入MSCを示す。図14Eは、7日目に試料採取された低接着濃度を有するローダミンファロイジンおよびDAPI染色された封入MSCを示す。図14Fは、14日目に試料採取された低接着濃度を有するローダミンファロイジンおよびDAPIで染色された封入MSCを示す。図14Gは、1日目に試料採取された接着のないローダミンファロイジンおよびDAPIで染色された封入MSCを示す。図14Hは、7日目に試料採取された接着のないローダミンファロイジンおよびDAPIで染色された封入MSCを示す。図14Iは、14日目に試料採取された接着のないローダミンファロイジンおよびDAPIで染色された封入MSCを示す。
【図１５】図15Aは、細胞培養の1日目に試料採取された0mM PEG-RGDSを有するカプセル内のカルセインアセトキシメチルおよびエチジウムホモダイマー1で染色されたMSCを示す。図15Bは、細胞培養の1日目に試料採取された5mM PEG-RGDSを有するカプセル内のカルセインアセトキシメチルおよびエチジウムホモダイマー1で染色されたMSCを示す。図15Cは、細胞培養の1日目に試料採取された10mM PEG-RGDSを有するカプセル内のカルセインアセトキシメチルおよびエチジウムホモダイマー1で染色されたMSCを示す。図15Dは、細胞培養の1日目に試料採取された0mM PEG-RGDSおよびPEG-FGFを有するカプセル内のカルセインアセトキシメチルおよびエチジウムホモダイマー1で染色されたMSCを示す。図15Eは、細胞培養の1日目に試料採取された5mM PEG-RGDSおよびPEG-FGFを有するカプセル内のカルセインアセトキシメチルおよびエチジウムホモダイマー1で染色されたMSCを示す。図15Fは、細胞培養の1日目に試料採取された10mM PEG-RGDSおよびPEG-FGFを有するカプセル内のカルセインアセトキシメチルおよびエチジウムホモダイマー1で染色されたMSCを示す。
【図１６】図16Aは、0mM PEG-RGDSを有するカプセルから回収した後のカルセインアセトキシメチルおよびエチジウムホモダイマー1で染色された細胞を示す。図16Bは、5mM PEG-RGDSを有するカプセルから回収された後のカルセインアセトキシメチルおよびエチジウムホモダイマー1で染色された細胞を示す。図16Cは、10mM PEG-RGDSを有するカプセルから回収された後のカルセインアセトキシメチルおよびエチジウムホモダイマー1で染色された細胞を示す。
【図１７】図17Aは、細胞培養培地中での平衡化の1時間後の従来の微小担体を示す。図17Bは、静的条件下でのMSCとのインキュベーションの24時間後の図17Aの微小担体を示す。図17Cは、70rpmでのスピナーフラスコ内の動的培養の48時間後の図17Bの微小担体およびMSCを示す。
【図１８】図18は、高撹拌培養下での細胞成育性の図表である。
【図１９】図19Aは、1日目に試料採取されたコンジュゲートしたRGDSを有さない合成されたPEGDAカプセル内に封入されたMSCを示す。図19Bは、1日目に試料採取された10mMのコンジュゲートしたRGDSを有する合成PEGDAカプセル内に封入されたMSCを示す。図19Cは、7日目に試料採取されたコンジュゲートしたRGDSを有さない合成されたPEGDAカプセル内に封入されたMSCを示す。図19Dは、7日目に試料採取された10mMのコンジュゲートしたRGDSを有する合成されたPEGDAカプセル内に封入されたMSCを示す。図19Eは、14日目に試料採取されたコンジュゲートしたRGDSを有さない合成されたPEGDAカプセル内に封入されたMSCを示す。図19Fは、14日目に試料採取された10mMのコンジュゲートしたRGDSを有する合成されたPEGDAカプセル内に封入されたMSCを示す。
【図２０】図20Aは、1日目に試料採取された10mM RGDSを有し成長因子bFGFを有さないPEGDAカプセル内のMSCを示す。図20Bは、1日目に試料採取された10mM RGDSおよび0.25μg/L成長因子bFGFを有するPEGDAカプセル内のMSCを示す。図20Cは、1日目に試料採取された10mM RGDSおよび25μg/L成長因子bFGFを有するPEGDAカプセル内のMSCを示す。図20Dは、7日目に試料採取された10mM RGDSを有し成長因子bFGFを有さないPEGDAカプセル内のMSCを示す。図20Eは、7日目に試料採取された10mM RGDSおよび0.25μg/L成長因子bFGFを有するPEGDAカプセル内のMSCを示す。図20Fは、7日目に試料採取された10mM RGDSおよび25μg/L成長因子bFGFを有するPEGDAカプセル内のMSCを示す。図20Gは、14日目に試料採取された10mM RGDSを有し成長因子bFGFを有さないPEGDAカプセル内のMSCを示す。図20Hは、14日目に試料採取された10mM RGDSおよび0.25μg/L成長因子bFGFを有するPEGDAカプセル内のMSCを示す。図20Iは、14日目に試料採取された10mM RGDSおよび25μg/L成長因子bFGFを有するPEGDAカプセル内のMSCを示す。
【図２１】図21Aは、1日目に試料採取された10mM RGDS、25μg/L成長因子bFGFを有する非分解性PEGDAカプセル内のMSCを示す。図21Bは、1日目に試料採取された10mM RGDS、25μg/L成長因子bFGFを有する分解性PEGPQカプセル内のMSCを示す。図21Cは、7日目に試料採取された10mM RGDS、25μg/L成長因子bFGFを有する非分解性PEGDAカプセル内のMSCを示す。図21Dは、7日目に試料採取された10mM RGDS、25μg/L成長因子bFGFを有する分解性PEGPQカプセル内のMSCを示す。図21Eは、14日目に試料採取された10mM RGDS、25μg/L成長因子bFGFを有する非分解性PEGDAカプセル内のMSCを示す。図21Fは、14日目に試料採取された10mM RGDS、25μg/L成長因子bFGFを有する分解性PEGPQカプセル内のMSCを示す。
【図２２】図22Aは、1日目に試料採取されたRGDSを有さないPEGDAカプセル内のAtT-20細胞を示す。図22Bは、1日目に試料採取されたRGDSを有さないPEGDAカプセル内の3T3細胞を示す。図22Cは、1日目に試料採取されたRGDSを有さないPEGDAカプセル内のJURKAT細胞を示す。図22Dは、7日目に試料採取されたRGDSを有さないPEGDAカプセル内の3T3細胞を示す。図22Eは、7日目に試料採取されたRGDSを有さないPEGDAカプセル内のJURKAT細胞を示す。図22Fは、14日目に試料採取されたRGDSを有さないPEGDAカプセル内の3T3細胞を示す。図22Gは、14日目に試料採取されたRGDSを有さないPEGDAカプセル内のJURKAT細胞を示す。
【図２３】図23Aは、10μg/mL:100ng/mLの比の可溶性PHA/IL-2で刺激して、分解性PEGカプセル内に封入されたPBMCの細胞数 対 カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)信号のグラフである。細胞は刺激後4日目にカプセルから回収した。図23Bは、50ng/mL:50ng/mLの比の可溶性CD3/CD28で刺激して、分解性PEGカプセル内に封入されたPBMCの細胞数 対 CFSE信号のグラフである。細胞は刺激後4日目にカプセルから回収した。図23Cは、PEG化CD3/CD28 50ng/mL:50ng/mLで刺激して、分解性PEGカプセル内に封入されたPBMCの細胞数 対 CFSE信号のグラフである。細胞は刺激後4日目にカプセルから回収した。
【図２４】図24は、細胞計数装置および方法のダイアグラムである。
【図２５】図25は、カプセルを作製する方法を示すダイアグラムである。
【図２６】図26は、インサイチュ細胞工学のためのレンチウイルスをPEGにコンジュゲートさせる方法を示すダイアグラムである。
【図２７】図27は、PEGを分解性にする方法を示すダイアグラムである。
【図２８】図28は、分子的観点の架橋および封入の方法を示すダイアグラムである。
【図２９】図29は、バルクの観点の架橋および封入の方法を示すダイアグラムである。
【図３０】図30は、HEK293T細胞を用いてコンジュゲートされかつ封入されたレンチウイルス(LV)粒子を示す。この画像のRFP(赤色蛍光タンパク質)は、遺伝子が目的の細胞にある場合など、励起された場合に赤色の蛍光を発するフルオロフォアに対応し、HEK293T細胞の目的の遺伝子でのレンチウイルス形質導入および目的の遺伝子の宿主HEK293細胞ゲノムへの組み込みの発生が確認される。該画像のGFP(緑色蛍光タンパク質)は生細胞に対応し、カルセインAM染色由来のGFPは、インタクトな生細胞に容易に透過するので細胞成育性を決定するために使用される色素である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
例示態様の説明を以下にする。
【００１７】
本発明の方法および系は、接着性細胞の拡大および/または保存に使用され得る封入された細胞培養系を提供する。かかる封入された細胞培養の系および方法は、従来技術の微小担体を超えるいくつかの利点を提供する。
【００１８】
図1に示されるように、従来技術の微小担体は、担体の外側の細胞接着を提供し、懸濁培養中の接着細胞を液体せん断応力に暴露する。かかる暴露は微小担体からの細胞の剥離および細胞損傷をもたらし得る。多くのバイオプロセス用途にとって細胞の質は重要であるが、細胞療法のための細胞の成長および回収を含む用途にとってこれは特に重要である。例えば細胞がタンパク質産生の供給源でありバイオプロセスの後に廃棄される用途とは反対に、かかる用途について、細胞はバイオプロセスの完了時に回収される治療/医薬剤である。
【００１９】
従来技術の微小担体は、大規模バイオプロセス用途について2D細胞培養を超えるいくつかの利点をもたらすが、いくつかの欠点を有し、例えば間葉幹細胞(MSC)に関して表1に要約されるように、それらの用途にはいくつかの課題がある。MSCは、接着性細胞の型の一例であり、そのバイオプロセスは本発明の方法および系から利益を受け得る。しかしながら、他の細胞型に関して同じまたは同様の比較がなされ得、本発明の方法および系が、さらに記載されるように種々の異なる細胞型の培養および/または保存を提供または含み得ることが理解されるべきである。接着性集団を有するカプセルに投入され得る他の細胞型の例としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓上皮(MDCK)細胞、HeLa細胞、PC9細胞、Vero細胞、膵島、末梢血単核細胞、内皮前駆細胞、血液線維細胞、骨髄、T細胞、B細胞、樹状細胞、NK細胞、単球、CD34+細胞、iPSC細胞、EPC、肝細胞、神経幹細胞、胃腸細胞、皮膚細胞および前駆体、癌細胞、ハイブリドーマ細胞、微生物、HEK293Tパッケージング細胞株、酵母細胞、膵臓前駆細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞が挙げられる。
【表１】
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【００２０】
懸濁培養において、流体せん断は、細胞培養の均一性を確実にしながら担体の堆積および細胞凝集を有利に妨げるが、せん断応力は細胞成育性および形態に影響し、細胞の代謝および分化状態に対する調節効果を有し得る[29]。さらに、撹拌由来のせん断応力は、微小担体と微小担体または微小担体と推進物(またはプローブ/挿入物)の衝突のために細胞の損傷を生じる。この損傷は、微小担体のサイズ、濃度および撹拌強度が増加するにつれて増加し、スケールアップの制限を受ける[30]。より小さな微小担体は、せん断誘導細胞死を低減し得、成長速度を高め得るが、微小担体のサイズの低下は、同様に細胞接着および拡大に利用可能な表面積を低下させる。最小撹拌速度は、Zwieteringにより導かれた経験的な相関から推定され[101]、これは、微小担体は、1〜2秒より長く容器の底に残らないはずであると示唆する。Kolmogorovモデル[102]を参照すると、撹拌槽バイオリアクター微小担体培養における激しい渦は、細胞と微小担体の間のサイズの中間である。Kolmogorovの渦のサイズは、撹拌速度が増加するにつれて減少する。微小担体の表面と相互作用するこれらの渦のための高速の局所的なエネルギーの散逸は、細胞を損傷するかまたは微小担体表面から細胞を除去さえするのに十分に大きいせん断速度を引き起こし得る。さらに、エアレーションによる泡の形成は、大規模な培養において流体力学的な応力をもたらし、これは、微小担体の表面上の細胞成長に有害である[13、31]。細胞レベルで、堅い微小担体ビーズへの暴露およびせん断流体流パターンは、細胞成育性および機械変換(mechanotransduction)に対して劇的な影響を有し、最終的に培養された細胞の質に影響し得る。
【００２１】
努力は、微小担体技術を使用して拡張されたせん断力からの細胞の保護の方向に向かい始めており；せん断誘導損傷から細胞を保護し、担体の孔中での細胞の転移増殖により、より高い細胞成長を可能にする多孔質担体、例えばCultisphere(登録商標) (Sigma Aldrich, UK)が開発されている[32〜34]。妥当と思われる(plausible)溶液はGupta et al. [35]により同定されたが、別の重要な問題は、25rpmを超えるCytodex(登録商標)3微小担体培養(GE Healthcare, Marlborough, MA)の撹拌は、担体の破損を生じることである。このように、柔らかい担体、例えばCytodex(登録商標)1/3(GE Healthcare, Marlborough, MA)の使用は、細胞が任意の残存微小担体またはサブ粒子(sub-particle)を含まないことが必要であるインビボ用途についての安全性の懸念を生じる。細胞回収についての現在のアプローチは、拡大された細胞と、それらの担体とを分離するための細胞ストレイナーの使用を含むが、破損生成物は除去することが困難である。これらの担体不純物は、懸念であり続けており、微小担体上で培養された細胞治療薬の臨床適用についての主要な障害である。
【００２２】
本発明の方法および系は、例えば最終的な細胞生成物の成育性および純度の増加を促進することなどにより上述の欠点の1つ以上を回避し得る現在利用可能な微小担体の代替物を提供する。
【００２３】
一態様において、本発明は、内部区画を画定するシェル、および内部区画内に配置される細胞接着のための基材を含む、細胞を成長または保存するためのカプセルに関する。該基材は、ポリマーおよび1つ以上の接着分子を含む。該接着分子は接着コンジュゲートとも称され、例えば接着ペプチド、接着タンパク質、または細胞を基材に接着させ得るおよび/または接着物の分化パターンを活性化し得る小分子であり得る。例えば、接着コンジュゲートは、I型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、IV型コラーゲン、Matrigel、またはそれらの任意の組合せなどのタンパク質(例えば部分または全長タンパク質)であり得る。接着コンジュゲートはまた、T細胞受容体などの細胞表面受容体と結合する抗体であり得る。例えば、抗体は、CD3、CD28およびCD40の少なくとも1つに結合する抗体であり得る。接着コンジュゲートはまた、細胞内の分化プログラムを活性化して接着を促進する、ステムレグリンもしくはリバーシンなどの非ペプチド小分子、または非ステロイド性抗炎症分子であり得るか、あるいはそれらを含み得る。
【００２４】
カプセルの例を図2A〜2Eに示す。細胞接着のための基材は、例えば図2A〜2Bに示されるようなシェルの内部表面であり得、細胞は、カプセルの内部円周に沿ってカプセルに接着する。代替的に、または付加的に、細胞接着のための基材は、図2C〜2Eに示されるようなカプセルの内部区画内に配置されるヒドロゲルであり得る。
【００２５】
MSCなどの細胞の封入は、機械的撹拌およびせん断応力から細胞を保護しながら、カプセルの内部は、細胞が接着し得る表面積および細胞が細胞培養物として拡大し得る空間を提供する。いくつかの態様において、シェルは、天然または合成のポリマーを含む。ポリマーは、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)、アルギネート、キトサン、アルギネートもしくはキトサンと共重合したPEGおよびアルギネートもしくはキトサンと共重合したPEGDA、またはそれらの任意の組合せであり得る。他のポリマーとしては、PLGA、PLL、PDMS、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミド、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAAm)、ポリ[2-(メチルアクリルオキシ)エチルホスホリルコリン]-ブロック-(グリセロールモノメタクリレート)(PMPC-PGMA)、χ-アセチレン-ポリ(tert-ブチルアクリレート)(PtBA)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリ(アクリル酸)(PAA)、ポリ(ジビニルベンゼン-コ-グリシジルメタクリレート)(poly(divinylbenzene-co-glycidylamethacrylate))(P(DVB-GMA))、ポリ(アミドアミン)(PAMAM)、ポリ(D-グルコサミドエチレンメタクリレート)(PGAMA)、ポリ(2-ラクトビオンアミドエチルメタクリレート(PLAMA)、アルキルチオエーテル末端官能基化ポリ(メタクリル酸)(PMAA-DDT)、ポリ(エチレングリコール)-ホスフィン(PEG-ホスフィン)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリ(アクリル酸)-オクチルアミン(PAA-オクチルアミン)、ポリ(無水マレイン酸-alt-1-オクタデセン-ブロック-ポリ(エチレングリコール)(PMAO-PEG)が挙げられる。
【００２６】
細胞封入のための材料に関して、げっ歯類モデルにおいていくつかの天然および合成のポリマーが研究されており；アルギネートおよびポリエチレングリコール(PEG)は前臨床試験および臨床試験に達している。アルギネートは、好ましいゲル化状態を提供するが、バッチごとの変動性、広い孔径分布、封入される生成物のサイズ(例えば植え付け体積)および大規模化可能性(scalability)に関する難問が存在する[10、11]。PEGは、島表面のコラーゲンおよび膜タンパク質のアミン基と反応し得るので、島の等角コートに使用されており[23〜25]、酸素、栄養およびインスリンについての拡散の距離がより短く、植込み部位がより小さいという利点を有する。さらに、PEGは、インスリン遺伝子の転写を刺激し、β細胞のアポトーシスを防ぎ、島の脈管形成を促進するようにペプチドおよび成長因子により機能化され得る[31〜33]。
【００２７】
封入される細胞を作製するための方法および開始(lead)材料の比較を表2に示す。アルギネートおよびPEGが例として提供されるが、重合され得る他の材料は、ポリマーマトリックス構成要素のために、本明細書に記載される封入方法または他の公知の封入方法と潜在的に組み合され得る。例えば、ハイスループット様式で小さい単一分散カプセルを作製する一方法は、開始材料の押し出しの際にノズルの噴出または振動の拍動(pulsation)を含み、しばしば層流噴出分散技術と称される。層流噴出分散技術は、噴出を、ノズルから同じサイズの液滴に分けるための線対称の乱れを含む。この技術は、1秒間当たり104個の粒子ほどの高い作製速度を達成し得る[22]。振動周波数、ノズルの直径、粘度、およびポリマー-細胞懸濁液の流速がマイクロカプセルのサイズおよび作製速度を決定する。別の例において、回転ディスクまたは噴出切断法は、小さな単一分散カプセルを作製するために使用され得る。噴出切断は、10,000Hzの周波数で封入された材料を有する粒子または1秒間当たり104個の粒子を生じるためのより高い作製速度を提供し得、これは60mL/分の500μmビーズのスループットに変換される[22]。
【００２８】
他の方法としては、押出し滴下方法と比較して規模が制限されない乳化技術が挙げられる。乳化技術を用いると、作製速度は、細胞封入が起こる容器のサイズにより決定される。乳化技術はまた、市販の微小担体に必要とされる2工程手順と比較して、単一工程において細胞負荷微小担体を作製する能力を提供する。適切な分散デバイスならびに、混合速度および界面活性剤などの操作条件は、カプセルサイズの低減を可能にし得る。
【表２】
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【００２９】
さらなる態様において、ポリマーシェルに加えて、カプセルはさらに、例えば図2D〜2Fに示されるようなヒドロゲルコアを含み得る。例えば、ヒドロゲルコアは、架橋ポリエチレングリコール(PEG)、架橋ポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)またはそれらの組合せを含み得る。
【００３０】
ポリマーシェルおよび/またはヒドロゲルコアは、カプセル内の細胞接着および/または分散を可能にする1つ以上の接着ペプチドで機能化され得る。接着ペプチドは、例えばRGDS(配列番号：1)、YIGSR(配列番号：2)、IKVAV(配列番号：3)、REDV(配列番号：4)、GKKQRFRHRNRKG(配列番号：5)、RNIAEIIKDI(配列番号：6)、KTRWYSMKKTTMKIIPFNR(配列番号：7)、またはそれら任意の組合せであり得る。接着ペプチドは、細胞の成育性、増殖、生存、成長および/または分化に影響するペプチドであり得る。
【００３１】
例えば、PEGは、所定のモル比(例えば50mM、pH8.5)でアクリレート-PEG-SVAと接着ペプチドを重炭酸ナトリウム中で一晩反応させて、その後透析して任意の未反応ペプチドを除去することにより、1つ以上の接着ペプチドを含むように化学的に改変され得る。改変ポリマー材料は、任意に凍結乾燥および保存され得る。接着ペプチドのコンジュゲーション効率は、ニンヒドリンアッセイにより任意の未反応遊離アミンを検出することにより評価され得る。許容可能なコンジュゲーション効率は、所望の用途に基づいて決定され得る。例えば、約85%以上のコンジュゲーション効率が許容可能であるとみなされ得る。接着ペプチド、タンパク質誘導体および得られるPEG化生成物の例を表3に示す。
【表３】
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【００３２】
コンジュゲートした接着ペプチド(例えばPEGコンジュゲート接着ペプチドまたはアクリル-PEG-AP)は、光重合プロセス(例えば光重合性PEGジアクリレート(PEGDA)に添加してフリーラジカル重合を行うことによる)を行い、細胞負荷PEGカプセルを形成する前に、細胞懸濁物(例えばMSC懸濁物)と合わされ得る。アクリル-PEG-APの濃度および組合せは、細胞接着を最適化するために、前駆溶液内で変化し得る。例えば、ヒドロゲルは、0.1g/mLの10kDa PEGDAと10±5mMのアクリル-PEG-APを10mM HEPES緩衝化食塩水(pH7.4)および光開始剤1.5% v/vトリエタノールアミン(TEOA)、37mM 1-ビニル-2-ピロリジノン(NVP)、および10μMエオシンY二ナトリウム塩中で合わせることにより形成され得る。次いで該溶液を、例えば0.2μmのフィルターにより濾過して滅菌し得る。前駆溶液中で細胞(例えばMSC)を合わせることにより、光重合およびカプセルの形成の間に細胞が封入され得る。例示的手順において、1-ビニル-2-ピロリジノン(300mg/mL)中に2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノンを含む疎水性光開始剤溶液を、鉱物油(3μL/mL)中で合わせて、そこに細胞-プレポリマー懸濁物を添加し得る。次いで合わせた溶液を周囲光中4秒間ボルテックスにかけ、その後白色光下でさらに3秒間ボルテックスにかけ得る。次いでボルテックスを停止させて、エマルジョンを、ボルテックスパルスを10秒間かけながら20秒間、白色光に暴露し得る。次いで、300gで5分間の遠心分離により架橋微小球を単離して、培地に再懸濁し、Transwell(登録商標) (Corning, Tewksbury, MA)細胞培養挿入物に配置し得る。
【００３３】
封入された細胞およびポリマーシェル/ヒドロゲルコアの形態学的評価は、蛍光染色を使用して行い得る。評価手順の例において、細胞および周囲のヒドロゲルマトリックスの相互作用を検証するために画像を撮り得る。生体活性を検証するために封入されたMSCのアクチン組織化を分析し得る。封入の際に、MSCをPEG化接着部分に固定されたPEGカプセルの内部膜に沿って接着させ得る。細胞負荷カプセル(代替的に、マイクロカプセルという)を4%ホルムアルデヒド溶液中で固定し、1% Triton X-100溶液を使用して透過性にし、次いで4単位/mlのファロイジンローダミン溶液中で30分間インキュベートし、DAPIなどの蛍光染色液を含むマウント溶液中にマウントし得る。細胞接着および拡散は、例えば光学顕微鏡検査および蛍光顕微鏡検査、例えばApoTomeシステム(Zeiss, Jena, Germany)を備えたAxio Observer Z1 (Zeiss, Jena, Germany)上でモニタリングして、光学的断片化を達成し得る。接着ペプチドの断片は、例えばペプチドなしの対照と比較して紡錘体形成を定量するためのペプチド当たりN=3バッチについてのランダム細胞カプセルの100枚の写真の半定量的分析により作製され得る。許容可能な接着効率は、所望の適用に基づいて決定され得る。例えば、少なくとも約60%の接着効率は許容可能とみなされ得る。代替的に、所望の接着ペプチドは、他の要因に基づいて選択され得る。例えば、RGDSは、生体材料との細胞結合を誘導することについて十分に特徴付けられるので、RGDSを含むことが望ましくあり得る[76〜78]。
【００３４】
細胞を含む前駆溶液を光重合して封入された細胞を形成することの例が記載されるが、細胞を封入する他の方法が可能である。例えば、カプセルは、多孔質シェルおよび/または多孔質ヒドロゲルコアを含み得る。次いで、細胞が、シェルの内部区画にトランスロケーションして基材と接着するように、多孔質カプセルを細胞懸濁物に暴露し得る。
【００３５】
一態様において、カプセルは、約10nm〜約35nm(例えば0.9nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、35.5nm)または約20nmの孔径を有する多孔質シェルを含む。
【００３６】
約10nm以上または約20nm以上の孔径を有するカプセルはまた、栄養物および老廃産物のカプセル内およびカプセル外への拡散を可能にし得る。孔径は、カプセルのシェルおよび/またはヒドロゲルコアを形成するヒドロゲルメッシュを作製するために使用されるポリマー前駆材料の重量を変更することにより調整され得る。例えば、5kDAの重量を有するPEG-SVAを使用して、10kDa PEG-SVAで作製されたヒドロゲルメッシュの孔径よりも大きい孔径を有するヒドロゲルメッシュを形成し得る。
【００３７】
別の態様において、カプセルは、1つ以上の成長因子を含み得る。成長因子を含むことはさらに、カプセル内での細胞成長および/または増殖を促進し得る。1つ以上の成長因子は、ポリマー(例えばポリマーシェル、ヒドロゲルコアまたはその両方)にコンジュゲートされ得る。代替的に、成長因子(1つまたは複数)は、カプセルの液体コアまたはヒドロゲルコア内で可溶性であり得る。適切な成長因子の例としては、FGF、TGF-β1、VEGF、PDGF-BB、PDGF、IGF1およびBMPスーパーファミリーメンバー、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００３８】
成長因子(GF)は、いくつかのインビトロ細胞培養に必要とされ得、典型的に可溶性GFとして培養培地に添加される。本発明のカプセルは、有利なことに、濃縮され、一過的な、制御された生体活性GFの供給を提供し得、典型的に培養細胞についての成長剤として使用される血清構成要素の必要性を低減し得る。例えば、PEG化GFは、カプセルのシェルおよび/またはコアに含まれ得る。FGF、TGF-β1[79][80]、IGF1[81]およびBMP[82][83]を含むPEG化GFの例を表4に示す。
【表４】
2021503958.tif 000006
【００３９】
例示的な手順において、組み換えGFを、1:15(ペプチド:PEG)モル比で、50mM重炭酸ナトリウム(pH8.5)中アクリレート-PEG-SVAと反応させることによりPEGにコンジュゲートさせ、次いでアルゴン下で一晩撹拌し、凍結乾燥させ、-80℃で保存し得る。ウエスタンブロットを使用して、得られたアクリル-PEG-GFを分析し得る。可溶性およびPEGコンジュゲートGFを、4〜15% SDS-PAGEゲル上で分離させ、ニトロセルロース膜に転写し得る。膜を、TBS中0.1%(vol/vol)Tween 20(TBST)を含むバッファ中5%ミルクを用いて、4℃で一晩インキュベートし得る。膜を、ウサギ抗GFと、室温で1時間インキュベートし得る。TBSTで2回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgGを添加して、室温で1時間インキュベートし、検出のためにピコ-化学発光試薬で処理し得る。PEG-GFコンジュゲートの生体活性を評価して、生体活性がコンジュゲーションプロセスによりまたは立体障害のために影響を受けなかったことを検証し得る。PEG-GFコンジュゲートを、ある範囲の濃度(例えば1μg/L、2.5μg/Lまたは5μg/L)のGFで、カプセル中で評価し得る。細胞成長は、(i)未改変または可溶性GF、および(ii)PEG-コンジュゲート化GFの存在下で測定して、適用のためのコンジュゲート化GFの適切性を決定し得る。例えば、PEGに対するPEG-GFによる許容可能成長利点であるPEGに対するPEG-GFによる50%成長利点が望ましくあり得る。MSCを、5000細胞/カプセルの推定密度で12ウェルプレートに播種し、37℃/5% CO2環境中、7日の成長促進アッセイの間インキュベートし得る。7日後、細胞成長を評価するための画像化およびMTSアッセイにより細胞カプセルを定量し得る。細胞培養培地へのさらなるGFの補充は、PEG-GFを含むカプセルにおいては必要ではないことがある。
【００４０】
上述のように、先行技術の微小担体からの細胞の精製は困難であり得、しばしば残存微小担体およびサブ粒子の存在を有する生成物を生じる。この欠点に対処するために、PEGヒドロゲルは、ヒドロゲル生分解を制御するためのタンパク質分解的に分解性のペプチド配列を含み得る。一態様において、本発明のカプセルは、酵素感受性、例えばプロテアーゼ感受性ペプチド(例えばGGGPQG↓IWGQGK(配列番号：8)、GGL↓GPAGGK、GGG↓LGPAGGK(配列番号：9)を含む。酵素感受性ペプチドは、カプセルのシェルおよび/またはヒドロゲルコアに含まれ得る。細胞拡大プロセスが完了した後、カプセル材料を分解させ得、次いで標準的な細胞濃縮方法を使用して、細胞材料を精製し得る。使用される酵素のいくつかの例は、トリプシン、コラゲナーゼ、DNase、RNaseおよびホースラディッシュペルオキシダーゼである。温度感受性、光感受性または小分子感受性、およびタンパク質に基づく感受性を示す他の感受性構造を、カプセルにドープし得る。例えば、分解性PEGヒドロゲル構築物内のPEG化GF(1つまたは複数)の共有結合バルク固定は、カプセル分解も提供しながら、MSC成長および拡大を刺激するための制御された一過的な局所的なGF(1つまたは複数)の放出を提供し得る。分解性PEGの例を表5に示す。
【表５】
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【００４１】
ヒドロゲルは、例えばコラゲナーゼ感受性ペプチド配列、例えばGGGPQG↓IWGQGK(配列番号：8)、(PQ)の共有結合的組込みにより分解性になり得、ここで↓は、ロイシン残基とグリシン残基の間のコラゲナーゼによる切断点を示す。単一および複数部位のPQドメインは、アクリレート基の間に組み込まれ得る。分解性カプセルを形成するための例示的手順を以下に示す。単一ドメインについて、PQペプチドを50mM NaHCO3(pH8.0)に溶解して、1:2(PQ:PEG-SVA)のモル比で、室温、一晩でPEG-SVA(MW=3400Da)と反応させ、ペプチド配列の両末端上でPEGに結合させ得る(PEG-PQ-PEG)。得られた生成物、アクリレート-PEG-ペプチド-PEG-アクリレートを透析し、凍結乾燥し、アルゴン下-20℃で凍結保存し得る。複数ドメインPQコンジュゲート化について、ペプチドを、等モル比のアクリル-PEG-SVAと反応させ、次いで透析し、凍結乾燥し、望ましくない生成物を除去し得る。このアクリル-PEG-ペプチドを、さらにSVA-PEG-SVA(MW3400Da)と反応させ、透析し、凍結乾燥し得る。反応工程を反復してさらなるPEG-ペプチドを付加し得る。最終工程において、以前の生成物をアクリル-PEG-SVAと反応させ、複数部位PQ分解性PEGDAマクロマーを形成し得る。最終生成物アクリレート-(PEG-ペプチド)3-PEG-アクリレートを透析し、凍結乾燥し、-20℃で保存し得る。
【００４２】
コラゲナーゼ感受性PEGヒドロゲル内のMSCの侵入速度を評価して、GF(1つまたは複数)への局所的アクセスを有する分解性基材内でのMSC拡大に対するマイクロカプセルの伝導性(conductiveness)を決定し得る。ヒドロゲル分解速度論は、例えばマイクロカプセルを1mM CaCl2を有するPBS中37℃で24時間膨潤させることにより決定し得る。次いでマイクロカプセルを、1mM CaCl2を有するPBS中のヒトリチクス菌由来のコラゲナーゼと37、33または25℃でインキュベートし得る。マイクロカプセルの湿式重量の変化を経時的に測定し得る。酵素濃度、時間、温度および中和に関する分解条件を決定し得る。
【００４３】
ポリマー分解の非酵素方法も、本発明の方法および系に含まれ得る。例えば、PEG断片を、Kohn et al. [84〜86]に記載されるようなチロシン誘導体化ポリカーボネートに組み込み得るか、および/またはチオール官能基化PEGマクロマーを使用して、グルタチオンの存在下などの還元性微小環境に応答する分解可能性を提供し得る[87]。この分解は、チオール-ジスルフィド交換反応を介して生じ得る。この反応は、ポリマーを可溶性単位に断片化する[103]。このように、マイクロカプセルは、それぞれのアームがチオール基で終結する4アームPEGまたはPEGテトラアクリレート(PEGTA)[104]を使用して、PEG-ジエステル-ジチオールクロスリンカーを形成することにより調製される。ジスルフィド結合の存在は、グルタチオンの存在下でのヒドロゲル分解を可能にする。代替的に、水溶性PEGマイクロカプセルはまた、トリエタノールアミン(TEA)中アクリレート 対 チオールの1:1のモル比でPEGTAをジチオトレイトール(DTT)と反応させ、37℃でゲル化させることにより調製される[105、106]。カプセルの分解は、水が加水分解的に不安定なエステル結合を分解するにつれて経時的に起こり、ここで分解速度論は反応に依存する[105]。細胞接着性リガンドなどのペプチドを結合させるために、4アームPEG-ビニルスルホン(PEG-VS)をTEAバッファに溶解させ、システイン終結ペプチドを大きな化学量論的な不足でVS基に添加して、VSに共有結合させる[106][107]。
【００４４】
成長因子および接着ペプチドを含む生化学的合図(cue)などの可溶性因子に加えて、細胞はまた、基材の表面形態および剛性/硬さなどの物理的および機械的合図により影響を受け得る。カプセルはさらに、細胞拡大の際に多能性を保持する係数を有するように最適化され得る。
【００４５】
細胞接着ペプチドの空間的組織化および基材の機械的硬さを最適化するための原理は、かかる特性が多能性細胞機能の制御に重大な役割を果たし得るということである[88〜90]。微小担体に関して、硬さおよび曲率などの特性は、接着した細胞をバイオリアクター内での細胞に対するせん断応力の変化を通じてバイオリアクター内で培養する間、細胞活性に影響を及ぼす[91]。これまで、多能性細胞機能の制御に対する微小担体の特性および幾何学の役割を画定するために限られた努力がなされてきた[92、93]。MSC細胞運命の制御は、基材の剛性に依存し、これはMSCの細胞外マトリックス(ECM)、接着ペプチド(例えばインテグリン)および細胞骨格相互作用を調節する。これらの特性の制御の不首尾は、MSCの望ましくない分化および免疫調節力の喪失をもたらし得る。
【００４６】
本発明のカプセルの基材の係数は調節可能であり得る。例えば、ポリマーの分子量および前駆溶液中の濃度は、より柔かい/より硬い基材を提供するように調整され得る。一例において、3400Da PEG-SVAおよび10% 10kDa PEGDAがマイクロカプセル形成に使用され得る。細胞接着および分散が分析され得、マトリックスが細胞接着に対して「柔らか」すぎる場合に、ポリマー重量は低減され得る。いくつかの分子量のPEGDA(例えば3.4kDaおよび5kDa)が使用され得、濃度は、将来の目的での細胞培養およびリアクター条件に対する基材の係数を調節するように変化し得る(例えば10%または15%)。基材の硬さが適切であるかどうかを決定するために、マイクロカプセルを用いた細胞増殖は14日間続き得、所定の時点でMTSアッセイにより測定され得る。代替的に、ポリマー前駆材料の所定の重量/濃度は、他の要因に基づいて選択され得る。例えば、10% 10kDa PEGDAという組合せは基材の剛性、有孔性および分解速度の間のバランスを提供するので、10% 10kDa PEGDAを含むことが望ましくあり得る。
【００４７】
いくつかの態様において、本発明のカプセルは、基材に接着した細胞、例えば幹細胞等を含む。本発明のカプセルに封入され得る接着細胞の例として間葉幹細胞(MSC)が使用されているが、代替的に他の接着性細胞が含まれ得ることが理解されるべきである。MSCに加えて、適切な細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、Madin-Darbyイヌ腎臓上皮(MDCK)細胞、Vero細胞、膵島、膵臓前駆細胞、胚性幹細胞および多能性肝細胞が挙げられる。カプセル内に含まれる細胞は、懸濁培養中で維持するなどにより、生存状態で維持され得る。封入された細胞はまた、低温保存プロセスを行うことなどにより、その後の使用のために保存され得る。
【００４８】
細胞計数方法および装置
細胞計数方法および装置の例を図24に示す。懸濁されたカプセルを含むある量の溶液を、ピペットにより吸い取り、リン酸緩衝化食塩水(PBS)と混合し、計数溶液を作製し得る。例えば、10μLの試料を吸い取り、示されるように200μLピペットを使用して、10μLのPBSと混合する。吸い取られた試料を、シリコンカバーを有する血球計算板に配置し得る。例えば、5〜6μLの試料を吸い取り得、溶液が血球計算板の中央の正方形を占めるように血球計算板に配置し得る。計算のために4つの外側の正方形を使用し得るかまたは中央の正方形を使用し得るかのいずれかである。既知の大きさの面積にカプセルを制限するために、図において、中央の正方形を使用するとして示す。
【００４９】
次いで試料を顕微鏡下に配置し得、中央の正方形内のカプセルを計数し得る。1mL当たりのカプセルの合計数は、希釈係数をかけて、10,000カプセル/mLをかけた計算されたカプセル数と等しい。カバーガラスの使用によりカプセルが壊れることがある。カバーガラスを使用する代わりに、溶液をしかるべき位置に維持するためにシリコーンを使用し得る。
【００５０】
光に基づく重合を使用した連続フローカプセル作製
連続カプセル作製系の例を図25に示す。親水性光開始剤を含むポリマー溶液を、鉱物油中で疎水性光開始剤と混合する。用語親水性および疎水性は、光開始剤が存在する溶液を指定するために使用される。鉱物油溶液(例えば示されるように、5μLアセトフェノン/NVP溶液および1mL鉱物油)は疎水性である。PEGDA溶液(例えば示されるように、0.1g PEGDA、15uL TEOA、10uLエオシンY二ナトリウム塩、3.75μL NVP、493.025uL HBS溶液および10uLプルロニック酸(Pluronic acid))は親水性である。
【００５１】
ポリマー溶液は、ポリマー(例えばPEG)、細胞(例えばNK細胞、MSC、CHO)、接着ペプチド(例えばRGDS)、ならびに任意に成長因子(例えばFGF)、ウイルス粒子および分解ペプチド(例えばPQペプチド)などの他の因子を含み得る。
【００５２】
図25に図示される系において、PEGDAポンプは、PEGDA溶液を反射性白色光ボックスにポンプ輸送し、一方で鉱物油ポンプは、疎水性光開始剤と共に鉱物油を白色光ボックスにポンプ輸送する。ポンプおよび反射性白色光ボックスは管系により連結され得る。白色光ボックスは照明器に連結される。
【００５３】
管系は、白色光ボックスを通って、処理されたカプセルを保存するためのレセプタクルに通じる。例えば、系が連続基準連続系(continuous basis continuous system)上でカプセルを処理するので、カプセルは75cm2 Tフラスコ内に回収され得る。
【００５４】
溶液が白色光ボックス内に存在する時間は、反射ボックスと共に使用される光源の数、光源の型および反射ボックスの設定に依存し得る。ポンプ速度は、溶液が適切な時間、光に暴露されることを確実にするように調整され得る。例えば、1つの光源を有する図25に示される系を用いて、溶液は、約3分間、白色光ボックスに存在し得る。他の配置(configuration)が可能であり、その例は以下：
・鉱物油144mL/分およびPEDGA 1.3mL/分、3分の光暴露
・鉱物油144mL/分およびPEDGA 1.3mL/分、光ボックスを使用せず、点ブランク(blank)により管系の1インチごとに混合溶液管を15秒間暴露
・鉱物油96mL/分およびPEDGA 1.3mL/分、光ボックスを使用せずに、点ブランクにより管系の1インチごとに混合溶液管を15秒間暴露
である。
【００５５】
ポンプ速度もカプセルサイズに影響し得る。鉱物油溶液のポンプ速度を増加することにより、両方の溶液が混合される場合、PEDGA溶液のサイズが低減され得る。これは、より小さなカプセルサイズを可能にし得る。
【００５６】
インサイチュ細胞工学のためのPEGへのレンチウイルスのコンジュゲーション
コンジュゲートしたレンチウイルスを含むカプセルを作製するための方法の例を図26〜29に示す。図26に示されるように、プロセスの第1の部分は、レンチウイルス粒子のPEGへのコンジュゲーションを含む。コンジュゲーションは、それによりアクリレート-PEG-SVA(分子量(MW)：3,400)が、レンチウイルス粒子のウイルスカプシド糖タンパク質サブユニットgp120の一部であるリジン残基上の表面暴露第1級アミンと反応して、それによりアクリル-PEG-VPを形成する、例えばアミン架橋剤(NHS)反応性化学を用いて達成され得る。
【００５７】
例えば、該方法は、超遠心分離(例えば25,000rpm、4℃で2時間)を使用してウイルス粒子を濃縮することおよび該粒子をPBS(例えば25mL)に再懸濁することを含み得る。次いで、懸濁物をポリマー(例えば25mL PBSに溶解した10mg PEG-SVA)と合わせて、合わせた溶液(例えば50mL体積の合わせた溶液)を提供し得る。次いで混合物を、適切な温度で一定の時間の間(例えば4℃で一晩)、振盪し得る。
【００５８】
さらに図27に示されるように、アクリル-SVAを分解性にし得る。例えば別のポリマー混合物を、コラゲナーゼ感受性ペプチド配列GGGPQG↓IWGQGK(配列番号：8)、(PQ)の共有結合的組込みにより、PEGヒドロゲル分解性にし得る。PQペプチドはアクリル-PEG-SVAと反応してアクリル-PEG-PQ-PEG-アクリルを生じる。
【００５９】
さらに図28に示されるように、ポリマーの架橋および細胞の封入は、例えば図25に関して示され、上述されるような二元的光開始剤エマルジョン系技術を使用して達成され得る。白色光および光開始剤への暴露は、アクリル基二重結合を切断して、VP-PEG-アクリル-PEG-PQ-PEG-アクリルポリマー鎖を形成し得る。エマルジョンポリマーは、開始剤として作用するフリーラジカルがアクリルモノマー内の2つの炭素原子の間の二重結合を切断する際に形成を開始し、モノマー単位(例えば10,000モノマー単位ほど多く)を一緒に結合しポリマー鎖にし得る反応を開始させる。
【００６０】
図28に示されるプロセスのバルクの図を図29に示す。図示されるように細胞培養物(例えばNK細胞)を、PEG-PQ、PEG-VPおよび重合構成要素(例えばエオシンT、トリエタノールアミンおよび1-ビニル-2ピロリジノン)と混合し、白色光に暴露し得る。
【実施例】
【００６１】
実施例
実施例1. ポリエチレングリコール(PEG)カプセルの機械的特性
現在の微小担体は、一般的に機械的に耐久性ではなく、バイオリアクター撹拌プロセス中に損傷を受け、例えば断片化された残骸を生じることが知られる。速い撹拌条件下で予備的な試験においてポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)カプセルを試験し、視覚的完全性について評価した。図3A〜3Cは、PEGDAカプセルの機械的耐久性を図示する。PEGDAカプセルは、水-油エマルジョン化法により合成し、静的(図3A)、従来の速度(図3B)および高速(図3C)の撹拌条件で培養した。図3A〜3Cの顕微鏡写真は、カプセルが、培養に使用される従来の速度(約75rpm)を超える高い1分あたりの回転(rpm)でもカプセルの完全性を維持することを示す。図3A〜3Cもカプセル断片残骸の欠如を示す。
【００６２】
実施例2. PEGカプセルは細胞成長を支持する
非修飾PEGDAカプセルを用いた予備的試験を、静的条件下で行い、生体材料特性を検証した。ポリエチレングリコール(PEG)は、調整可能な生化学的および機械的特性を有する多用途のポリマーであり、その安全性プロフィールは十分に確立される。PEGは、それだけでタンパク質吸着およびその後の細胞表面相互作用を抑えるが、生体活性リガンドの付加も提供するブランク状態を提供する。このように、PEGは、非特異的なタンパク質吸着および細胞接着を抑制しながら細胞相互作用および接着を促進する表面を作製する機会を提供する。
【００６３】
白色光重合を介してMSCをPEGDAに封入した。細胞は、2つの異なる投入細胞濃度で、細胞-材料バルク混合物に封入した。カルセインアセトキシメチル(AM)染色により検出された生存細胞は、12日の培養プロセスの最後にMSC球として観察された(図4A)。具体的には、LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicityキットを使用して、生細胞(緑色)をカルセインAMで、死細胞(赤色)をエチジウムホモダイマー(Ethidium Homodomer)1で検出した。
【００６４】
封入効率および細胞増殖を、Cell Titer 96(登録商標) AQueous One Solution Cell Proliferation Assayにより、12日の培養プロセスにわたり定量した。結果は、成長因子または接着ペプチドを含まずに12日の間にわたりカプセル内で約3倍の拡大を示す。封入の効率は、予測されたように、所定のフィード材料ストック当たりの細胞密度に相関した。封入された細胞は、成長因子または接着ペプチドをカプセル材料に何ら添加することなく、約2〜3日の倍加時間(工業用MSC培養について許容され得る範囲内)を示した(図4B)。
【００６５】
実施例3A. RGDSコンジュゲート化PEGカプセルは細胞接着および拡散を促進する
ペプチドRGDSは、ペプチドとアクリレート-PEG-SVAを反応させることによりPEGに成功裡にコンジュゲートさせた。接着ペプチドコンジュゲーション効率は、ニンヒドリンアッセイにより任意の未反応遊離アミンを検出することにより評価した。遊離アミン標準としてグリシンを使用した。PEGコンジュゲート化RGDS(PEG-RGDS)は、任意の未反応遊離アミンを検出するようにアッセイした。87%コンジュゲーション効率が達成された(図5)。パイロット試験においてMSCを、重合中心コアを有する接着ペプチド(RGDS)機能化PEGDAカプセルに封入し、動的条件(125rpm)下で培養した。シェルおよびコアの材料は同じであり得、重合技術は、重合シェルまたは重合シェルおよび重合コア(重合中心コアと称される)のいずれかを作製し得ることに注意すべきである。違いは架橋の程度である。液体コアカプセルにおいて、カプセルの中心コアは架橋しないまま残り、シェルのみが重合する。ヒドロゲルまたは重合コアカプセルにおいて、中心コアも架橋する。3日目に試料採取した細胞負荷カプセルを、ローダミンファロイジンおよびDAPIで染色して、封入された細胞のアクチン組織化を可視化した(図6)。具体的には、ローダミンファロイジン(赤色)およびDAPI(青色)で染色された封入されたMSCの共焦点画像を、動的スピナーフラスコ培養物から3日目に試料採取した。図6の画像は、細胞接着および拡散の予備的な証拠を示す。
【００６６】
実施例3B. 接着性カプセルを用いた効果的な細胞接着
接着の生体活性を評価するためにさらなる試験を行い、その結果を図14A〜14Iに示す。
【００６７】
MSCを、接着ペプチド(RGDS)機能化PEGカプセルに封入して動的条件(125rpm)下で培養した。5mM(低)および10mM(高)濃度でのPEG-RGDSを使用して、細胞接着および細胞拡散をローダミンファロイジン染色細胞の共焦点顕微鏡検査画像化により評価した。対照としてのPEG-RGDSカプセルは使用しなかった。培養プロセスの終わりの14日目に10mM(高)接着により高い細胞拡散が示された。
【００６８】
実施例4A. 細胞増殖における成長因子の効果
細胞負荷液体コア(LC)および重合コア(PC)カプセルを、細胞増殖に対する成長因子(GF)の効果を試験するために静的培養下で評価し、その結果を図7に示す。特に、カプセルは、PEG化RGDSを用いて作製し、PEG化FGF、可溶性GFの1つを含むかまたはGFを含まなかった。MSCはLCまたはPCカプセルに封入した。試料を1、4および6日目に採取して、細胞増殖を評価した。結果は、PEG-FGFを含むカプセルが、PEG-FGFがヒドロゲルコア(すなわちPCカプセル)またはカプセルのシェル(すなわちLCカプセル)内のいずれに位置するかに関わらず、最も大きい細胞増殖を有し、一方PCカプセル内の可溶性FGFは、封入された播種密度で細胞数を維持したことを示す。
【００６９】
実施例4B. 材料内の成長因子の添加は、封入後の成育性を向上する
FGFありおよび無しでのカプセル内のMSC成育性を評価するためにさらなる試験を行った。異なる濃度のPEG化接着性ペプチドRGDSおよびPEG化FGFペプチドを試験して、その結果を図15A〜15Fに示す。
【００７０】
MSCを、接着ペプチド(RGDS)およびFGF機能化PEGカプセルに封入して、動的条件(125rpm)下で培養した。PEG化FGFは、それぞれ0mM、5mMおよび10mMのPEG-RGDS試料に2.5μg/Lで添加した。FGFなし対照に対する比較は、PEG化FGFの存在下で、より高い封入後成育性を示す。
【００７１】
FGFペプチドを有するカプセルは、FGFを欠くカプセルよりも高い封入後1日目の成育性を示した。
【００７２】
実施例5A. 細胞成育性、増殖および担体完全性に対する撹拌の効果
PEG化RGDSおよびFGFを有する細胞負荷重合コアカプセルを、スピナーフラスコ中高(125rpm)および低(30rpm)撹拌速度に暴露した。結果を図8A〜8D(高撹拌培養)および9A〜9D(低撹拌培養)に示す。試料は1、3、6および10日目に採取した。培養期間の終了時に、高撹拌培養は封入された細胞数の約18倍の増加を生じ、一方低撹拌培養は細胞数の3倍のみの増加を生じた。これは、低撹拌での不十分な栄養および老廃物交換のためであり得、一方で高撹拌/せん断はPEGカプセルに封入された細胞に有害ではないことも強調される。
【００７３】
実施例5B. 高速撹拌培養後のMSC成育性
分解性PEGカプセル中生体活性因子PEG-RGDSおよびPEG-FGFの存在下、スピナーフラスコにおける高速撹拌培養(125rpm)後のMSC成育性を評価するためにさらなる試験を行った。
【００７４】
結果を図18に示す。両方の生体活性構成要素PEG-RGDSおよびPEG-FGFの存在は、可溶性FGFに対して向上された細胞成育性および有意に向上された成育性をもたらした。
【００７５】
実施例6. 重合コア(PC)カプセルの特性
担体サイズ分布、表面積および体積を試験するためにCoulter Counter上でPCカプセルを分析した。接着ペプチドまたはGFを有さない光重合による重合コアとして空のPEGDAカプセルを作製した。不均一なサイズ分布のカプセルを、70um〜250umの許容されかつ予測される直径限界内で作製した。このように作製されたカプセルの平均体積および表面積は、PCについてそれぞれ3x107um3および1.5x106um2であり、LCについてそれぞれ7.2x106um3および3.4x105um2であった。結果を図10A〜10Cに示す。
【００７６】
実施例7. 液体コア(LC)カプセルの特性
担体サイズ分布、表面積および体積を試験するためにCoulter Counter上でLCカプセルを分析した。接着ペプチドまたはGFを有さない光重合による液体コアを用いてLCカプセルを形成した。不均一なサイズ分布のカプセルを、70um〜250umの許容されかつ予測される直径限界内で作製した、このように作製されたカプセルの平均体積および表面積は、PCについてそれぞれ3x107um3および1.5x106um2であり、LCについてそれぞれ7.2x106um3および3.4x105um2であった。結果を図11A〜11Cに示す。
【００７７】
実施例8. カプセル分解
コラゲナーゼ分解性ペプチド(GGGPQG↓IWGQGK)(配列番号：8)をPEGにコンジュゲートして、分解性カプセルを形成した。コラゲナーゼ分解性ペプチドは、1:2(ペプチド:PEG)のモル比でコンジュゲート化された。次いでコンジュゲートしたPEGを使用して、白色光重合により、非細胞負荷(図12A〜12D)および細胞負荷(図13A〜13B)PCカプセルを形成した。接着ペプチドまたはGFは使用しなかった。次いで分解性カプセルをコラゲナーゼに暴露して、静的条件下(図12A〜12D)および機械的撹拌条件下(図13A〜13B)の異なる時点でカプセル完全性を分析した。結果を図12A〜12Dおよび13A〜13Bに示す。図12Aに示されるように、プロテアーゼ感受性ペプチドを有するカプセルおよびコラゲナーゼとともにインキュベートしなかったカプセルは分解しなかった。図12B〜Dに示されるように、プロテアーゼ感受性ペプチドをドープしたカプセルは、コラゲナーゼへの暴露の際に経時的に分解の徴候を示す。機械的撹拌なしの分解は、数時間、この実施例において>24時間かかり得るプロセスである。
【００７８】
図13A〜13Bに示されるように、細胞負荷PCカプセルの分解は、機械的撹拌後ほぼ即座に起こり、この実施例において、これは、溶液の反復押出しにより行われた。図12Dおよび13Bの両方に示されるように、近似において約1μmのサイズを超える残存サブ粒子は見られなかった。細胞負荷カプセルの実施例において、図13Bの矢印はカプセル分解後に残る回収された細胞を示す。
【００７９】
実施例9. 細胞精製後に維持されるMSC形態
異なる濃度の接着性ペプチドを含むカプセルからの回収後のMSC形態を評価するためにさらなる試験を行い、この結果を図16A〜16Cに示す。これらの試験は、カプセル材料(PEG、PQまたはRGDS)が回収後のMSCのTCP接着、拡散および増殖に対してなんら有害な効果を有さなかったことを確認するために行った。試料間で細胞の形態に差は観察されなかった。10mMのPEG-RGDSはより高い細胞収率を示した。
【００８０】
実施例10. 工業標準担体に対する比較
微小担体を細胞培養培地中で平衡化して、MSC細胞を、静的条件下で微小担体表面に接着させた(図17A〜B)。Cytodex 3 (Corning)微小担体を使用した。微小担体接着MSCを標準的な細胞培養培地条件下70rpmで培養した。
【００８１】
図17Cに示されるように、動的培養で48時間後、MSCは微小担体表面からはがれ、凝集細胞残骸がスピナーフラスコ内に見られた。
【００８２】
実施例11. 0mMまたは10mMのRGDSを有するPEGDA内でのMSCの比較上の成育性
10mMのコンジュゲートしたRGDS有りおよび無しのPEGDA内のMSCの成育性を評価するために試験を行った。試料は1、7および14日目に採取し、その結果を図19A〜19Fに示す。この実験の目的は、接着性ペプチドが封入されたMSCの成育性および増殖に影響するかどうかを決定することであった。封入されたMSCを高撹拌(125rpm)で、スピナーフラスコ内で培養し、37℃/5% CO2で、インキュベーター内で維持した。生体活性構成要素の存在下で、PEG-RGDSは0mM PEG-RGDSコホートを超えて、1日目までに向上した細胞成育性をもたらした。
【００８３】
実施例12. 10mMのRGDSおよび異なる濃度のbFGFを有するPEGDA内でのMSCの比較上の成育性
異なる濃度のbFGF(0μg/L、0.25μg/Lおよび25μg/L)を有するPEGDA内でのMSCの成育性を評価するために試験を行った。試料は1、7および14日目に採取し、その結果を図20A〜20Iに示す。封入されたMSCを、高撹拌(125rpm)で、スピナーフラスコ内で培養し、37℃/5% CO2で、インキュベーター内で維持した。MSC増殖は、該濃度のbFGFにより正の影響を受けた。マイクロカプセルにコンジュゲートしたより高い濃度のbFGFを用いて、本発明者らは、増殖MSCのマイクロカプセル壁に沿ったより密集したポケットを見出した。図(GIGs.)20A〜20Iに見られるように、両方の生体活性構成要素PEG-RGDSおよびPEG-FGFの存在は、可溶性FGFを超える向上した細胞成育性および有意に向上した成育性をもたらした。
【００８４】
実施例13. 非分解性および分解性カプセル内でのMSCの比較上の成育性
非分解性および分解性カプセル内でのMSCの成育性を評価するために試験を行った。10mM RGDSおよび25μg/L FGFを含むカプセルを、PEGDA(非分解性)およびPEGPQ(分解性)を用いて作製した。試料は1、7および14日目に採取し、その結果を図21A〜21Fに示す。
【００８５】
封入されたMSCを、高撹拌(125rpm)で、スピナーフラスコ内で培養し、37℃/5% CO2で、インキュベーター内で維持した。bFGF(25μg/L)を補充したPEGDA(非分解性)カプセル内のMSCは、マイクロカプセル壁に沿って密な成育性のあるポケットを示し、これはMSC増殖を示唆した。PEGPQ(分解性)カプセル内のMSCは密な成育性のあるポケットを生じたが、PEGDA内に封入したMSCと比較して数は少なかった。PQペプチドは、カプセル内で酸性微小環境を生じ得、MSC成育性に負の影響をもたらし得る。
【００８６】
実施例14. PEGDA中の複数の細胞型の比較上の成育性
AtT-20、3T3およびJURKAT細胞を含む複数の細胞株を用いて試験を行った。細胞を、0mMを有する合成PEGDAカプセル内に封入して、1、7および14日目に試料採取し、その結果を図22A〜22Gに示す。
【００８７】
封入されたMSCを、高撹拌(125rpm)で、スピナーフラスコ内で培養し、37℃/5% CO2で、インキュベーター内で維持した。この実験の目的は、PEGDAカプセルがMSCだけでなく、細胞療法生成物の開発に関するさらなる細胞株にも適合性であるかどうかを決定することであった。本発明者らは、PEGDAカプセルが、懸濁液中で成長させたJurkat細胞株とは反対に、AtT-20および3T3を含む接着細胞株と実際に適合性であることを見出した。7および14日目のAtT-20についての写真は、これらの試験が進行中であるため示さなかった。
【００８８】
実施例15. PBMC刺激
可溶性CD3/CD28 対 PEG化CD3/CD28によるPBMC刺激の効率を比較するための試験を行い、その結果を図23A〜23Cに示す。CFSE染色した細胞を、可溶性PHA/IL2または可溶性CD3/CD28またはPEG化CD3/CD28を含むPEGPQカプセルに封入した。細胞は刺激の4日後に回収し、フローサイトメトリー分析を使用してCFSEシグナルを評価した。可溶性およびPEG化CD3/CD28の間に刺激効率の差は見られなかった。カプセル中PHA/IL2によりPBMC活性化も達成され、これは懸濁細胞と比較して、封入プロセス間またはカプセル内で刺激効率が消失しないことを示唆した。
【００８９】
実施例16. ウイルス粒子
図25〜29に関して上述のプロセスによりレンチウイルス(LV)粒子をHEK 293T細胞とコンジュゲートして、HEK 293T細胞を封入した試験を行った。結果を図30に示す。RFP(赤色蛍光タンパク質)は、レンチウイルス粒子に保有される遺伝子構築物である(例えば宿主細胞HEK293TゲノムへのRFP遺伝子の組み込みに基づく形質導入効率を評価するための発現マーカー)。この画像におけるRFPは、遺伝子が目的の細胞内にある場合などの励起した場合、赤色の蛍光を発するフルオロフォアに対応し、目的の遺伝子を有するHEK293T細胞のレンチウイルス形質導入が起こったことを確認し得る。画像内のGFP(緑色蛍光タンパク質)は生細胞に対応する。(カルセインAM染色由来のGFP)は、容易にインタクトの生細胞に浸透するので、細胞成育性を決定するために使用される色素である。特に、2μLのカルセインを1mLの培地および封入された細胞に添加して、その後ZEISS顕微鏡を使用して画像化し、その際に図30の画像を回収した。この特定の実験において、本発明者らは、コンジュゲートされたレンチウイルス粒子が標的細胞に目的の遺伝子(RFP)を形質導入し得るというおよび一定の時間の間の後、カプセルが依然として生細胞(GFP染色)を含むという配年の証拠を試験した。本発明者らは、RFPマーカーを使用して封入されたHEK293T細胞のレンチウイルスによる成功裡の形質導入を示すことにより、粒子の感染性を維持しながら、細胞を封入し、レンチウイルス粒子を成功裡にPEGカプセルの内部にコンジュゲートする能力を結論付けた。
【００９０】
参照文献
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【００９１】
本明細書に引用される全ての特許、公開出願および参照文献の教示は、それらの全体において参照により援用される。
【００９２】
例示態様が特に示され、記載されるが、添付の特許請求の範囲に包含される態様の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本発明においてなされ得ることが当業者に理解される。
【図１】
2021503958.tif 000018
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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