(57)【要約】本発明は、化学式１乃至４で表される化合物から選択される１種以上を有効成分とする、炎症性疾患、白血球減少症、又は好中球減少症の予防又は治療用の薬学的組成物及びその合成方法を提供する。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式１乃至４で表される化合物から選択される１種以上を有効成分とする、炎症性疾患、白血球減少症又は好中球減少症の予防又は治療用の薬学的組成物。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【請求項２】
前記有効成分は、化学式１で表される化合物及び化学式２で表される化合物の混合物である、請求項１に記載の炎症性疾患、白血球減少症又は好中球減少症の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項３】
前記有効成分は、化学式３で表される化合物及び化学式４で表される化合物の混合物である、請求項１に記載の炎症性疾患、白血球減少症又は好中球減少症の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項４】
前記有効成分は、炎症性サイトカインの生成を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患、白血球減少症又は好中球減少症の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項５】
前記炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎、浮腫、皮膚炎、アレルギー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉頭炎、扁桃炎、肺炎、胃炎、大腸炎、痛風、強直性脊椎炎、線維筋痛症、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎炎からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患、白血球減少症又は好中球減少症の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項６】
前記好中球減少症の疾患は、抗がん化学療法薬物により誘導される好中球減少症であることを特徴とする、請求項１に記載の炎症性疾患、白血球減少症又は好中球減少症の予防又は治療用の薬学的組成物。
【請求項７】
下記の化学式５乃至８で表される化合物を有効成分として含む、炎症性疾患の予防又は改善用健康機能食品。
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【請求項８】
（ａ）パルミチン酸と、下記化学式９で表される化合物を塩基条件下で反応させて、１−パルミトイルグリセロールを合成する段階と、
（ｂ）前記１−パルミトイルグリセロールとアセチルハライドを塩基条件下で反応させて、１−パルミトイル−３−アセチルグリセロールを合成する段階と、及び
（ｃ）前記１−パルミトイル−３−アセチルグリセロールと共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を塩基条件下で反応させる段階を含む、
１−パルミトイル−２−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロール（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の合成方法。
【化９】
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（前記式において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ３のアルキル基である。）
【請求項９】
前記段階（ａ）でピバロイルハライド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｈａｌｉｄｅ）を添加してパルミチン酸を活性化するか、又は
前記段階（ｃ）でピバロイルハライド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｈａｌｉｄｅ）を添加して共役リノール酸を活性化することを特徴とする、請求項８に記載の１−パルミトイル−２−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロール（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の合成方法。
（ハライドは、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩである。）
【請求項１０】
前記共役リノール酸は、共役リノール酸（ｃｉｓ−９、ｔｒａｎｓ−１１）と共役リノール酸（ｔｒａｎｓ−１０、ｃｉｓ−１２）の混合物である、請求項８に記載の１−パルミトイル−２−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロール（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の合成方法。
【請求項１１】
（ａ）共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）と下記化学式１０で表される化合物を塩基条件下で反応させて、１−共役リノレオイル−グリセロールを合成する段階と、
（ｂ）前記１−共役リノレオイル−グリセロールとアセチルハライドを塩基条件下で反応させて、１−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロールを合成する段階と、及び
（ｃ）前記１−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロールとパルミチン酸を塩基条件下で反応させる段階を含む、１−共役リノレオイル−２−パルミトイル−３−アセチルグリセロール（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の合成方法。
【化１０】
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（前記式において、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ３のアルキル基である。）
【請求項１２】
前記段階（ａ）で、バロイルハライド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｈａｌｉｄｅ）を添加して共役リノール酸を活性化するか、又は
前記段階（ｃ）でピバロイルハライド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｈａｌｉｄｅ）を添加してパルミチン酸を活性化することを特徴とする、請求項１１に記載の１−共役リノレオイル−２−パルミトイル−３−アセチルグリセロール（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の合成方法。
（ハライドはＣｌ、Ｂｒ、又はＩである。）
【請求項１３】
前記共役リノール酸は、共役リノール酸（ｃｉｓ−９、ｔｒａｎｓ−１１）と共役リノール酸（ｔｒａｎｓ−１０、ｃｉｓ−１２）の混合物である、請求項１１に記載の１−共役リノレオイル−２−パルミトイル−３−アセチルグリセロール（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鹿茸から分離した新規化合物及びその薬学的用途に関するものであり、さらに前記新規化合物の化学的合成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
鹿茸（Ｃｅｒｖｉ  Ｐａｒｖｕｍ  Ｃｏｒｎｕ）とは、シカ科シカ属（Ｃｅｒｖｕｓ）に属するニホンジカ（Ｃｅｒｖｕｓ  ｎｉｐｐｏｎ）、アカシカ（Ｃｅｒｖｕｓ  ｅｌａｐｈｕｓ）、又はアメリカアカシカ（Ｃｅｒｖｕｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）などの骨化されていない鹿の角を切って乾燥したものである。
【０００３】
鹿茸は伝統的に補薬を代表する漢方薬材として広く利用されており、東医宝鑑などによると、強壮作用、補血作用、強精作用、鎮痛作用、造血作用、生長発育促進作用、心不全の治療作用、機能亢進作用、疲労回復、身体活力増強、及び腎臓の利尿機能強化など、非常に多様な効能を持つことが知られている。
【０００４】
鹿茸は、様々な遊離アミノ酸と多糖類、グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）、ヒアルロン酸、ケラチン、シアル酸、コレステロール、脂肪酸、リン脂質、ミネラル成分などが含まれていることが知られている。
【０００５】
鹿茸の服用方法としては、鹿茸を様々な種類の生薬材料と一緒に熱水抽出して、そのろ液を服用したり、生薬材料と粉砕して粉末にした後、丸にして服用したりする方法が主に利用されているが、溶媒抽出及び分画法を利用して、鹿茸から生理活性有効成分を抽出、分離しようとする様々な研究が進められた。
【０００６】
韓国公開特許第１９９９−００４４７８１号公報は、鹿茸（ニホンジカ）をクロロホルムで抽出し、前記クロロホルム抽出物について、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画して、５種のモノアセチルジアシルグリセロール化合物を分離し、そのうち、下記の化学式１で表される１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＬＡＧ、以下「ＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ」）の造血幹細胞及び血小板の前駆細胞の増殖促進活性を開示しており、以後、ＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ研究に関連して韓国公開特許第２００６−００４７４４７号公報は、免疫調節剤及び抗がん剤、韓国公開特許第２０１５−００２１４６４号公報は、血液がん又はがん転移抑制用組成物、韓国公開特許第２０１５−００２１４６５号公報は、関節リウマチの予防又は治療用組成物、韓国公開特許第２０１７−０００５４８４号公報は、白血球減少症及び血小板減少症の治療用組成物を開示している。
【０００７】
【化１】
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【０００８】
一方、韓国公開特許第２０００−００５９４６８号公報は、鹿茸（ニホンジカ）をエタノールで抽出し、前記エタノール抽出物について、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画し、下記化学式２の化合物をはじめとする４種のホスホリピド系新規化合物の構造及びその抗真菌活性について開示している。
【０００９】
【化２】
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【００１０】
鹿茸は、上述したように、様々な薬理活性があり、その成分も非常に多様で、まだ知られていない薬理活性成分に対する持続的な研究が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】韓国公開特許第１９９９−００４４７８１号公報
【特許文献２】韓国公開特許第２００６−００４７４４７号公報
【特許文献３】韓国公開特許第２０１５−００２１４６４号公報
【特許文献４】韓国公開特許第２０１５−００２１４６５号公報
【特許文献５】韓国公開特許第２０１７−０００５４８４号公報
【特許文献６】韓国公開特許第２０００−００５９４６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、溶媒抽出及び分画法を用いて、鹿茸から抗炎症生理活性を有する新規化合物を分離し、前記化合物の安定的な大量生産が可能となるように化学的合成をすることにより、炎症性疾患の予防又は治療用組成物と、白血球減少症又は好中球減少症に対する治療用組成物を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、鹿茸から分離した有効成分を分析し、下記の化学式３乃至６で表される化合物から選択される１種以上を有効成分とする、炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００１４】
一方、本発明は、下記化学式３乃至６で表される化合物から選択される１種以上を有効成分とする、白血球減少症、好中球減少症の予防又は治療用組成物を提供する。
【００１５】
【化３】
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【００１６】
【化４】
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【００１７】
【化５】
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【００１８】
【化６】
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【００１９】
前記化学式３で表される化合物及び化学式４で表される化合物は、互いに異性体であり、前記化学式５で表される化合物及び化学式６で表される化合物も、互いに異性体である。
【００２０】
本発明に係る前記化合物は、炎症性サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）で発症する炎症性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、浮腫、皮膚炎、アレルギー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉頭炎、扁桃炎、肺炎、胃炎、大腸炎、痛風、強直性脊椎炎、線維筋痛症、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎炎からなる群から選択される炎症性疾患の予防又は治療に使用することができる。
【００２１】
本発明に係る前記化合物は、抗がん化学療法薬物により誘導される好中球減少症（ＣＩＮ）の予防又は治療に使用することができる。
【００２２】
一方、本発明は、（ａ）パルミチン酸と、下記化学式５で表される化合物を塩基条件下で反応させて、１−パルミトイルグリセロールを合成する段階；（ｂ）前記１−パルミトイルグリセロールとアセチルハライドを塩基条件下で反応させて、１−パルミトイル−３−アセチルグリセロールを合成する段階；及び（ｃ）前記１−パルミトイル−３−アセチルグリセロールと共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を塩基条件下で反応させる段階を含む、１−パルミトイル−２−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロール（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の合成方法を提供する。
【００２３】
一方、本発明は、（ａ）共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）と下記化学式５で表される化合物を塩基条件下で反応させて、１−共役リノレオイル−グリセロールを合成する段階；（ｂ）前記１−共役リノレオイル−グリセロールとアセチルハライドを塩基条件下で反応させて、１−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロールを合成する段階；及び（ｃ）前記１−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロールとパルミチン酸を塩基条件下で反応させる段階を含む、１−共役リノレオイル−２−パルミトイル−３−アセチルグリセロール（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の合成方法を提供する。
【００２４】
前記合成に利用される共役リノール酸は、共役リノール酸（ｃｉｓ−９、ｔｒａｎｓ−１１）、共役リノール酸（ｔｒａｎｓ−１０、ｃｉｓ−１２）の単独又は混合物であることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る実施例１及び２の新規化合物は、対照区に比べて、代表的炎症性サイトカインであるＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−αの生成が顕著に抑制され、抗がん剤によって引き起こされる好中球減少症も顕著に抑制されており、比較例のＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌと対比しても、サイトカインの生成抑制及び好中球減少症の抑制効果が有意であることが確認された。したがって、本発明に係る炎症性疾患の予防、改善又は治療用組成物として有用に使用することができ、また、抗がん化学療法薬物により誘導される好中球減少症（ＣＩＮ）を有意に抑制する効果を見せ、その予防又は治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明により、鹿茸から３種類の有機溶媒を用いた抽出方法を示すダイアグラムである。
【図２】図２は、本発明により、鹿茸から抽出した抽出物Ｃ２の分画方法を示すダイアグラムである。
【図３】図３は、本発明による分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−Ｍｓの質量分析データである。
【図４】図４は、本発明による分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−ＭｓのＬＣデータである。
【図５】図５の（Ａ）は、本発明による分画物Ｃ２−２−Ｅａ−ＭｓのＵＶ分析データであり、（Ｂ）は、比較例のＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌのＵＶ分析データであり、（Ｃ）は、共役リノール酸（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）のＵＶ分析データであり、（Ｄ）は、リノール酸のＵＶ分析データである。
【図６】図６は、本発明の実施例１及び実施例２の新規化合物のＭＴＴ  ａｓｓａｙによる細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の測定結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例１及び実施例２の新規化合物のＩＬ−６の生成抑制効果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例１及び実施例２の新規化合物のＩＬ−１β生成抑制効果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例１及び実施例２の新規化合物のＴＮＦ−α抑制効果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例１及び実施例２の新規化合物のＮＯ形成抑制効果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例１及び実施例２の新規化合物の、抗がん剤（ゲムシタビン）により誘導される好中球減少症の抑制効果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例１及び実施例２の新規化合物の、抗がん剤（タモキシフェン）により誘導される好中球減少症の抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明者は、鹿茸由来の炎症性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を開発するために、先行文献の溶媒抽出法及び分画法を多角的に分析して実施し、下記のような方法で炎症性疾患に優れた生理活性を有する新規化合物を分離し、前記新規化合物が、抗がん化学療法薬物により誘導される好中球減少症（ＣＩＮ）を有意に抑制する効果を確認し、前記化合物の新規合成方法を開発し、本発明を完成した。
【００２８】
鹿茸から生理活性成分を抽出するために、図１に図示したように、鹿茸（ニホンジカ）をヘキサン、クロロホルム、７０％エタノールの３種類の有機溶媒を用いて順次抽出を実施し、図２に図示したように、シリカゲルカラムクロマトグラフィー及び薄膜液体クロマトグラフィーを実施して、抗炎症活性に優れた新規化合物を分離した。
【００２９】
有機溶媒による抽出
市販で購入したニホンジカ（Ｃｅｒｖｕｓ  ｎｉｐｐｏｎ）２ｋｇを粉砕してビーカーに入れ、１次抽出溶媒としてヘキサン（ｎ−Ｈｅｘａｎｅ）９Ｌを入れてから、８０℃で２時間加熱する方式で、２回抽出しろ過してヘキサン抽出液を得た後、前記ヘキサン抽出液を減圧下で蒸留、乾燥させて抽出物Ｃ１  ３０．３ｇを収得した。
【００３０】
ヘキサン抽出後に残った残渣に、２次抽出溶媒としてクロロホルム（ＣＨＣｌ３）９Ｌを入れてから、８０℃で２時間加熱して、２回抽出しろ過してクロロホルム抽出液を得た後、クロロホルム抽出液を減圧下で蒸留、乾燥させて抽出物Ｃ２  １７．９ｇを収得した。
【００３１】
クロロホルム抽出した後に残った残渣に、３次抽出溶媒として７０％エタノール９Ｌを入れてから、８０℃で５時間加熱して、２回抽出しろ過してエタノール抽出液を得た後、エタノール抽出液を減圧下で蒸留、乾燥させて抽出物Ｃ３  ８９．２ｇを収得した。
【００３２】
前記で収得した抽出物Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３のそれぞれについて、抗炎症活性実験を行った結果、抽出物Ｃ２で抗炎症活性効果が高いことが確認され、抽出物Ｃ２を対象にシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて生理活性成分を分画した。
【００３３】
シリカゲルカラムクロマトグラフィー
粉末シリカゲルにＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（５００：１、ｖ／ｖ）混合溶液を加えて膨潤させた後、開いたカラムに充填させた。前記収得した抽出物Ｃ２  １７．９ｇをＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（５００：１、ｖ／ｖ）に溶解させ、シリカゲルが充填されたカラムに適用させた。カラムに溶離液としてＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（５００：２、ｖ／ｖ）を流し込みながら５０ｍｌずつの溶出分画を受けた後、ＴＬＣ（展開溶媒：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝３００：１）で展開して、ヨウ素（Ｉ２）で発色させた後、Ｒｆ値によって分離して、７つの主要分画を分離した。分離されたそれぞれの分画を減圧蒸留して乾燥させて分画物Ｃ２−１乃至Ｃ２−７を収得した。前記７つの分画物について、抗炎症活性実験を行った結果、分画物Ｃ２−２で抗炎症活性効果が高いことが確認され、分画物Ｃ２−２を対象にシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて生理活性成分を再び分画した。
【００３４】
前記分画物Ｃ２−２  １．８ｇを収得した。粉末シリカゲル２０ｇにヘキサン（ｎ−Ｈｘ）／酢酸エチル（ＥＡ）（５０：１）混合溶液５０ｍｌを加え膨潤させ、カラムに充填した。分画物Ｃ２−２  １．８ｇを溶離液であるｎ−Ｈｘ／ＥＡ（５０：１、ｖ／ｖ）最少量に溶解させ、シリカゲルカラムに適用させた。前記シリカゲルカラムに溶離液を流しながら１５ｍｌずつ溶出分画を受け、ＴＬＣ（展開溶媒：ｎ−Ｈｘ／ＥＡ＝５０：１、ｖ／ｖ）で展開して、ヨウ素で発色させた後、Ｒｆによって分離して、６つの主要分画を分離した。前記分離されたそれぞれの分画を減圧蒸留して乾燥させて分画物Ｃ２−２−Ａ乃至Ｃ２−２−Ｆを収得した。前記６つの分画物について抗炎症活性実験を行った結果、分画物Ｃ２−２−Ｅで抗炎症活性効果が高いことが確認されて、分画物Ｃ２−２−Ｅを対象にシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて生理活性成分を再び分画した。
【００３５】
前記分画物Ｃ２−２−Ｅ  ２１２ｍｇを収得した。粉末シリカゲル３．５ｇにｎ−Ｈｘ／ＥＡ／ＡｃＯＨ（２０：１：０．５、ｖ／ｖ／ｖ）混合溶液１０ｍｌを加え膨潤させ、カラムに充填させた。分画物Ｃ２−２−Ｅ  ２１２ｍｇを溶離液であるｎ−Ｈｘ／ＥＡ／ＡｃＯＨ（２０：１：０．５、ｖ／ｖ／ｖ）に溶解させてシリカゲルカラムに適用させた。前記シリカゲルカラムに溶離液を流しながら１０ｍｌずつ溶出分画を受け、ＴＬＣ（展開溶媒：ｎ−Ｈｘ／ＥＡ／ＡｃＯＨ＝２０：１：０．５、ｖ／ｖ／ｖ）で展開して、ヨウ素で発色させた後、Ｒｆによって分離して、２つの主要な分画を分離した。前記分離されたそれぞれの分画を減圧蒸留して乾燥させて、それぞれの分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ及びＣ２−２−Ｅ−ｂを収得した。前記２種類の分画物について抗炎症活性実験を行った結果、分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａで抗炎症活性効果が高いことが確認されて、分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａを対象にシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて生理活性成分を再び分画した。
【００３６】
前記分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ  １３７ｍｇを収得した。このＣ２−２−Ｅ−ａにメタノール５ｍｌを加えて混合させてメタノール−可用性分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−Ｍｓとメタノール−不溶性分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−Ｍｉに分離し、それぞれの分画を減圧蒸留して乾燥させて分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−Ｍｓ  ６３ｍｇを収得した。前記２種類の分画物について抗炎症活性実験を行った結果、分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−Ｍｓで抗炎症活性効果が高いことが確認された。
【００３７】
後述する実験例２による方法を介して、前記分画物の抗炎症抑制評価を行い、その結果を下記表１に示した。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
前記表１に示すように、分画物が小分画するほど、炎症性サイトカインであるＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αの生成が抑制されることがわかる。分画物の中で最も炎症抑制活性が高い分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−Ｍｓの有効成分を確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａｆｌｅｘｔｒｅｍｅＴＭ、Ｇｅｒｍａｎ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及びＵＶ分析器を利用して、成分分析を実施した。
【００４０】
図３は、分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−Ｍｓの質量分析データであり、図４は、分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−ＭｓのＬＣデータであり、図５の（Ａ）は、本発明に係る分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−ＭｓのＵＶ分析データ、（Ｂ）は、比較例のＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌのＵＶ分析のデータ（Ｃ）は、共役リノール酸（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）のＵＶ分析のデータ、（Ｄ）は、リノール酸のＵＶ分析データである。
【００４１】
本発明の分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−Ｍｓの有効成分の質量を分析した結果、質量は鹿茸から分離された公知のＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（韓国公開特許第１９９９−００４４７８１号公報の化合物ＫＪ−３）と同じたが、ＵＶ分析結果、ＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌとは全く異なるＵＶ分析パターンを示した。図５の（Ｃ）共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）ＵＶパターン、（Ｄ）リノール酸（Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）のＵＶパターンと比較することにより、本発明の分画物Ｃ２−２−Ｅ−ａ−Ｍｓの化合物は、共役リノレオイル（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）の新規な構造を有することが確認された。
【００４２】
本発明に係る前記抗炎症生理活性有効成分は、グリセロール構造にアセチル基（ａｃｅｔｙｌ）、パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）、共役リノレオイル（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）が結合された下記の化学式７乃至１０で表される新規化合物であることが、本発明で初めて確認された。
【００４３】
【化７】
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【００４４】
【化８】
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【００４５】
【化９】
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【００４６】
【化１０】
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【００４７】
前記化学式７及び化学式８で表されるＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌの化学的合成
本発明に係る化学式７、化学式８の化合物（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）は、下記反応式１によって高収率で製造することができる。
【００４８】
【化１１】
2021531275.tif 000014
【００４９】
本発明に係るＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌは、
（ａ）パルミチン酸と、下記化学式５で表される化合物を塩基条件下で反応させて、１−パルミトイルグリセロールを合成する段階；
（ｂ）前記１−パルミトイルグリセロールとアセチルハライドを塩基条件下で反応させて、１−パルミトイル−３−アセチルグリセロールを合成する段階；及び
（ｃ）前記１−パルミトイル−３−アセチルグリセロールと共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を塩基条件下で反応させて、１−パルミトイル−２−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロール（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を合成する段階を含む。
【００５０】
前記段階（ａ）で化学式５の化合物は、１，３−ジオール化合物で保護されたグリセロール誘導体である。前記反応は、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）のような塩基条件下で実施することができ、パルミチン酸の反応活性を極大化させるために、ピバロイルハライド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｈａｌｉｄｅ）を添加してａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎを通じて実施することができる。反応後、塩酸などを使用して脱保護させると、１−パルミトイルグリセロールが合成される。パルミチン酸と化学式５の化合物の当量（ｅｑ．）は、０．９：１．１〜１．１：０．９が好ましいが、これに制限されるものではない。
【００５１】
前記段階（ｂ）で１−パルミトイルグリセロールとアセチルハライドの当量は、１：１〜１：１．６が好ましいが、これに制限されるものではない。
【００５２】
前記段階（ｃ）で共役リノール酸の反応活性を極大化させるために、ピバロイルハライド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｈａｌｉｄｅ）を添加してａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎを通じて実施することができる。１−パルミトイル−３−アセチルグリセロールと共役リノール酸の当量（ｅｑ．）は、０．９：１．１〜１．１：０．９が好ましいが、これに制限されるものではない。
【００５３】
一方、本発明に係る化学式９、化学式１０の化合物（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）は、下記反応式２によって高収率で製造することができる。
【００５４】
【化１２】
2021531275.tif 000015
【００５５】
本発明に係るＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌは、
（ａ）共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）と下記化学式５で表される化合物を塩基条件下で反応させて、１−共役リノレオイル−グリセロールを合成する段階；
（ｂ）前記１−共役リノレオイル−グリセロールとアセチルハライドを塩基条件下で反応させて、１−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロールを合成する段階；及び
（ｃ）前記１−共役リノレオイル−３−アセチルグリセロールとパルミチン酸を塩基条件下で反応させて、１−共役リノレオイル−２−パルミトイル−３−アセチルグリセロール（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を合成する段階を含む。前記段階（ａ）、（ｃ）でａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎのために、ピバロイルハライド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｈａｌｉｄｅ）を添加することができる。
【００５６】
以下、実施例を通じて本発明の新規化合物の合成方法を具体的に説明する。
【実施例１】
【００５７】
実施例１：１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の製造
（１）１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌの製造
【００５８】
【化１３】
2021531275.tif 000016
【００５９】
塩化メチレン（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＭＣ）２００ｍｌにパルミチン酸（Ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）２０．０ｇとトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１７．０ｇを添加し、０℃に冷却した後、ピバロイルクロリド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）１０．０ｇをゆっくりと滴加し、２時間攪拌した後、ソルケタール（Ｓｏｌｋｅｔａｌ）１０．８ｇと４−ジメチルアミノピリジン（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）０．１ｇを添加した後、室温で１２時間攪拌して精製水２００ｍｌを添加して層分離した後、有機層は、真空濃縮した。濃縮母液にメタノール２００ｍｌ、塩酸２０ｍｌを投入し、室温で１０時間攪拌した後、ｎ−ヘキサン（ｎ−ｈｅｘａｎｅ）３００ｍｌ、精製水３００ｍｌを投入して３時間攪拌した後、ろ過して、真空乾燥して目的化合物２１．９ｇ（収率：８５．０％）を収得した。
【００６０】
（２）１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌの製造
【００６１】
【化１４】
2021531275.tif 000017
【００６２】
ＭＣ２００ｍｌに、前記収得した１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ２０．０ｇとピリジン（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ）３３．５ｇ、４−ジメチルアミノピリジン（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）０．２ｇを添加し、１時間攪拌した後、アセチルクロリド（Ａｃｅｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．１ｇを滴加し、５時間攪拌した。精製水２００ｍｌを投入して希塩酸で中和して層分離した後、有機層をＭｇＳＯ４で脱水した後、真空濃縮して、ｎ−ヘキサン（ｎ−ｈｅｘａｎｅ）１００ｍｌを投入し、１０℃以下で結晶化し、ろ過した後、真空乾燥して目的化合物１８．５ｇ（収率：８２．０％）を収得した。
【００６３】
（３）１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−Ｃ−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の製造
【００６４】
【化１５】
2021531275.tif 000018
【００６５】
ｎ−ヘキサン（ｎ−Ｈｅｘａｎｅ）１８０ｍｌに共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｃｉｓ−９、ｔｒａｎｓ−１１／ｔｒａｎｓ−１０、ｃｉｓ−１２）１４．０ｇとトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１０．８ｇを添加して０℃に冷却し、ピバロイルクロリド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．０ｇをゆっくりと滴加した。滴加終了後、同温度で１時間攪拌した。その後、１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−Ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  １８．０ｇと４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  １．０ｇを添加し、室温で１０時間攪拌した。精製水１８０ｍｌを投入して層分離し、有機層はＭｇＳＯ４で脱水した後、真空濃縮してシリカゲルカラム精製（溶出液：ｎ−Ｈｘ：ＥＡ＝２０：１、ｖ／ｖ）して目的化合物２６．１ｇ（収率：８５％）を取得した。
【実施例２】
【００６６】
実施例２：１−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ−ｌｉｎｏｅｏｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の製造
（１）１−Ｃ−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌの製造
【００６７】
【化１６】
2021531275.tif 000019
【００６８】
ｎ−ヘキサン（ｎ−Ｈｅｘａｎｅ）２００ｍｌに共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｃｉｓ−９、ｔｒａｎｓ−１１／ｔｒａｎｓ−１０、ｃｉｓ−１２）２２．０ｇとトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１０．８ｇを添加し、０℃に冷却し、ピバロイルクロリド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．０ｇをゆっくりと滴下し、同温度で１時間攪拌した後、ソルケタール（Ｓｏｌｋｅｔａｌ）１０．８ｇと４−ジメチルアミノピリジン（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）０．１ｇを添加した後、室温で１２時間攪拌して、精製水２００ｍｌを添加して、層分離した後、有機層は真空濃縮した。濃縮母液にメタノール２００ｍｌ、塩酸２０ｍｌを投入し、室温で攪拌し、１０時間攪拌した後、ｎ−ヘキサン（ｎ−ｈｅｘａｎｅ）３００ｍｌ、精製水３００ｍｌを投入して３時間攪拌した後、ろ過して、真空乾燥して目的化合物２２．８ｇ（収率：８２％）を収得した。
【００６９】
（２）１−Ｃ−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌの製造
【００７０】
【化１７】
2021531275.tif 000020
【００７１】
ＭＣ  ２００ｍｌに、１−Ｃ−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ２０．０ｇとピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）  ３３．５ｇ、４−ジメチルアミノピリジン（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）  ０．２ｇを添加し、１時間攪拌した後、アセチルクロリド（Ａｃｅｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）６．６ｇを滴加し、５時間攪拌した。精製水２００ｍｌを投入して希塩酸で中和して層分離した後、有機層をＭｇＳＯ４で脱水した後、真空濃縮してｎ−ヘキサン（ｎ−ｈｅｘａｎｅ）１００ｍｌを投入し、１０℃以下で結晶化し、ろ過した後、真空乾燥して目的化合物１７．７ｇ（収率：７９．０％）を収得した。
【００７２】
（３）１−Ｃ−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の製造
【００７３】
【化１８】
2021531275.tif 000021
【００７４】
ｎ−ヘキサン（ｎ−Ｈｅｘａｎｅ）１８０ｍｌに、パルミチン酸（Ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）１２．２ｇとトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１０．８ｇを添加し、０℃に冷却し、ピバロイルクロリド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．０ｇをゆっくりと滴加した。滴加終了後、同温度で１時間攪拌した後、１−Ｃ−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  １８．０ｇと４−ジメチルアミノピリジン（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）１．０ｇを添加し、室温で１０時間攪拌した。精製水１８０ｍｌを投入して層分離し、有機層はＭｇＳＯ４で脱水した後、真空濃縮してシリカゲルカラム精製（溶出液：ｎ−Ｈｘ：ＥＡ＝２０：１、ｖ／ｖ）して、目的化合物２５．９ｇ（収率：８６％）を収得した。
【００７５】
比較例：１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の製造
【００７６】
【化１９】
2021531275.tif 000022
【００７７】
実施例１と同様の方法で実施するが、共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｃｉｓ−９、ｔｒａｎｓ−１１／ｔｒａｎｓ−１０、ｃｉｓ−１２）の代わりに、リノール酸（Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｃｉｓ−９、ｃｉｓ−１２）を使用してＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌを合成した。
【００７８】
ｎ−ヘキサン（ｎ−Ｈｅｘａｎｅ）１８０ｍｌに、リノール酸（Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ｃｉｓ−９、ｃｉｓ−１２）１４．０ｇとトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１０．８ｇを添加し、０℃に冷却し、ピバロイルクロリド（Ｐｉｖａｌｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）７．０ｇをゆっくりと滴加した。滴加終了後、同温度で１時間攪拌した後、１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−３−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  １８．０ｇと４−ジメチルアミノピリジン（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）１．０ｇを添加し、室温で１０時間攪拌した。精製水１８０ｍｌを投入して層分離し、有機層はＭｇＳＯ４で脱水した後、真空濃縮してシリカゲルカラム精製（溶出液：ｎ−Ｈｘ：ＥＡ＝２０：１、ｖ／ｖ）して目的化合物２４．９ｇ（収率：８１％）を収得した。
【００７９】
前記実施例１、２、及び比較例で合成された化合物の抗炎症活性の実験を次のような動物実験で評価した。
【００８０】
Ａ．実験動物
実験動物として８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスを温度２２±２℃、相対湿度６５±５％で、明暗１２時間周期の環境で、７日間飼育して実験室の環境に適応させた後、実験に使用した。固形飼料（三養飼料（株））と水を十分に供給した。
【００８１】
Ｂ．腹腔大食細胞の分離培養
マウスにＨＢＳＳを腹腔注射して、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）を抽出し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ培地に１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを入れて腹腔大食細胞を分離し、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養した後、実験に使用した。
【００８２】
実験例１：ＭＴＴ  ａｓｓａｙによる細胞毒性の評価
前記培養された腹腔大食細胞を３×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに１００ｕＬずつ分注して、一晩培養した。培地を除去した後、前記実施例１（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、実施例２（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の化合物を濃度別（それぞれ１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及び２００μｇ／ｍｌ）に腹腔大食細胞に処理した後、３７℃、５％ＣＯ２の培養器で２４時間培養した。培養後、培地を除去し、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）試薬を４０ｕＬずつ分注して、ＣＯ２の培養器で４時間培養した後、ＭＴＴ試薬を除去し、ＤＭＳＯ試薬を６００ｕＬずつ分注した後、３０分間常温で放置した。以後、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）で、５４０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。
【００８３】
実施例１及び実施例２の化合物のＭＴＴ  ａｓｓａｙによる細胞生存率（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定し、下記の表２及び図６のグラフに示した。表２及び図６に示すように、細胞生存率は、最高２００μｇ／ｍｌの処理時にも有意な差がないことがわかる。したがって、本発明に係る新規化合物は、細胞毒性がないことが確認された。
【００８４】
【表２】
2021531275.tif 000023
【００８５】
実験例２：抗炎症活性実験（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−αの生成抑制の評価）
炎症反応の誘導因子であるリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、ＬＰＳ）により誘導されたマウスの腹腔大食細胞から分泌されたＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−α分泌量をＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）を用いて測定することで、抗炎症活性を評価した。
【００８６】
細胞培養液を得るために、マウスの腹腔大食細胞を３×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整して、９６ウェルプレートに接種し、２４時間培養した後、前記実施例１（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、実施例２（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）及び比較例（ＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の化合物を濃度別（それぞれ１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、及び２００μｇ／ｍｌ）に処理し、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を処理した。正常群は無処理、対照群はＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）のみを腹腔大食細胞に処理した。１２時間培養した後、遠心分離を通じて上澄み液を得た。ＥＬＩＳＡは、マイクロプレートに捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）で、抗マウスＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−αを分注した。以降、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳＴ）で洗浄し、１０％のＦＢＳで遮断した後、ＰＢＳＴで洗浄し、ウェルに細胞培養上澄み液を分注し、室温で２時間反応させた。反応後、ＰＢＳＴで洗浄し、希釈したビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）の抗マウスＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−αの検出抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とストレプトアビジン−ＨＲＰ接合体（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を分注して室温で１時間反応させた。その後、再びＰＢＳＴで洗浄し、ＯＰＤ溶液を添加して、室温で３０分間、暗反応させた。２ＮＨ２ＳＯ４で反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）を利用して、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００８７】
実施例１及び実施例２の化合物のＩＬ−６生成量を測定し、下記の表３に図示し、図７のグラフに示した。表３及び図７に示すように、実施例１及び２で製造された化合物は、対照群に比べてＩＬ−６生成量が著しく減少されており、比較例と対比しても、有意なＩＬ−６の生成抑制効果を有することがわかる。
【００８８】
【表３】
2021531275.tif 000024
【００８９】
実施例１及び実施例２の化合物のＩＬ−１β生成量を測定して、下記表４に図示し、図８のグラフに示した。表４及び図８に示すように、実施例１及び２で製造された化合物は、対照群に比べてＩＬ−１β生成量が著しく減少されており、比較例と対比しても、有意なＩＬ−１β生成抑制効果を有することがわかる。
【００９０】
【表４】
2021531275.tif 000025
【００９１】
実施例１及び実施例２の化合物のＴＮＦ−αの生成量を測定して、下記表５に図示し、図９のグラフに示した。表５及び図９に示すように、実施例１及び２で製造された化合物は、対照群に比べてＴＮＦ−αの生成量が著しく減少されており、比較例と対比しても、有意なＴＮＦ−αの生成抑制効果を有することがわかる。
【００９２】
【表５】
2021531275.tif 000026
【００９３】
実験例３：抗炎症活性実験（ＮＯ形成抑制の評価）
前記培養された腹腔大食細胞を、１０％ＦＢＳが含まれるＤＭＥＭに懸濁させた後、９６ウェルプレートに５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注して、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養し、新しいＤＭＥＭ培地に交換した後、実施例１、２、及び比較例の化合物それぞれを濃度別（それぞれ１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、及び２００μｇ／ｍｌ）に腹腔大食細胞に処理して、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を処理した後、２４時間培養した。培養後、上澄み液を分離して３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、分離された上澄み液を新しいマイクロプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）に分注した。正常群は無処理、対照群はＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）のみを腹腔大食細胞に処理した。
【００９４】
同じ量のグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬（１％ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ、０．１％ｎａｐｈｔｈｙｌ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、２％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）を処理して、室温で１０分間反応させた。培養液とグリース溶液を５分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。
【００９５】
図１０は、本発明の実施例１及び実施例２の新規化合物のＮＯ生成抑制効果を示すグラフである。
【００９６】
実施例１及び実施例２の化合物の一酸化窒素（ＮＯ）生成率を測定して、下記表６に図示し、図１０のグラフに示した。表６及び図１０に示すように、実施例１及び２で製造された化合物は、対照群に比べてＮＯ生成率が著しく減少されており、比較例と対比しても、有意なＮＯ生成抑制効果を有することがわかる。
【００９７】
【表６】
2021531275.tif 000027
【００９８】
本発明に係る化合物は、炎症性サイトカインで発症する炎症性疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、浮腫、皮膚炎、アレルギー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉頭炎、扁桃炎、肺炎、胃炎、大腸炎、痛風、強直性脊椎炎、線維筋痛症、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎炎からなる群から選択される炎症性疾患の予防又は治療に利用することができる。
【００９９】
比較例のＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌは、抗がん化学療法薬物により誘導される好中球減少症（ＣＩＮ）の候補物質ＥＣ−１８として、最近、ＦＤＡの臨床２相が完了したと知られており、従来の治療法であるＧ−ＣＳＦ（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）又はその誘導体等（ｐｅｇｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）とは異なる作用メカニズムにより、好中球減少症を抑制させるものと報告されている。
【０１００】
以下では、本発明の実施例１、２の化合物と比較例の化合物の抗がん化学療法薬物により誘導される好中球減少症の抑制効果を、マウス実験を通じて検証する。
【０１０１】
実験例４：抗がん化学療法によって誘導された好中球減少症のマウス実験
抗がん剤として使用されるゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）５０ｍｇ／ｋｇをＣ５７ＢＬ／６マウスに、毎日３週間腹腔内注射をして対照群とし、実施例１、実施例２、及び比較例１の化合物５０ｍｇ／ｋｇを毎日３週間経口投与し、３週経過した後、自動血液サンプル分析装置（Ａｕｔｏ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＢＣ−５９００、Ｍｉｎｄｒａｙ社）を用いて、血液１μL内の好中球数を測定し、その結果を下記表７及び図１１に示した。
【０１０２】
【表７】
2021531275.tif 000028
【０１０３】
前記表７及び図１１に示すように、ゲムシタビンを投与したマウスで好中球数は約４５％の減少を示したのに対し、比較例の化合物（ＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）では１４．５％好中球数の減少を示した一方、実施例１の化合物（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）では約２％減少し、実施例２の化合物（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）では約６．７％の減少となり、対照群はもちろん、比較例と比較しても有意な効果があることが確認された。抗がん剤として使用されるタモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）５０ｍｇ／ｋｇをＣ５７ＢＬ／６マウスに、毎日３週間腹腔内注射をして対照群とし、実施例１、実施例２、及び比較例１の化合物５０ｍｇ／ｋｇを毎日３週間経口投与して、３週経過した後、自動血液サンプル分析装置（Ａｕｔｏ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＢＣ−５９００、Ｍｉｎｄｒａｙ社）を用いて、血液１μL内の好中球数を測定し、その結果を下記表８及び図１２に示した。
【０１０４】
【表８】
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【０１０５】
前記表８及び図１２に示すように、タモキシフェンを投与したマウスで好中球数は約３７％の減少を示したのに対し、比較例の化合物（ＰＬＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）では１２．９％好中球数の減少を示した一方、実施例１の化合物（ＰＣＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）では約６．３％減少し、実施例２の化合物（ＣＰＡ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）では約８．２％の減少となり、対照群はもちろん、比較例と比較しても有意な効果があることが確認された。本発明の化合物は、前記抗がん化学療法薬物以外にも、公知の前記抗がん化学療法薬物は、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）、レナリドミド（Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、ペメトレキセド（Ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、メクロレタニメ（Ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｎｉｍｅ）、クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ、ＢＣＮＵ）、ロムスチン（Ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ、ＣＣＮＵ）、イホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ダカルバジン（Ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ、ＤＴＩＣ）、アルトレタミン（Ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、メスナ（Ｍｅｓｎａ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−メルカプトプリン（６−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、６−チオグアニン（６−Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、イダルビシン（Ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（Ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アザチオプリン（Ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、２−クロロデオキシアデノシン（２−Ｃｈｌｏｒｏ  ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、５−フルオロウラシル（５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、アザシチジン（Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、フルダラビンリン酸エステル（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、Ｎａｂ−パクリタキセル（Ｎａｂ−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）などで、引き起こされる好中球減少症の抑制薬物として有効に利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明は、鹿茸から分離した新規化合物及びその薬学的用途に関するものであり、さらに前記新規化合物の化学的合成方法に関するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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