(57)【要約】  本発明は、二重特異性の、ヘテロ二量体チェックポイント抗体に関する。【選択図】図１A、図 1 B、図 1 C、図 1 D
2021502100.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であって、
ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖と、
ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＬ−ＣＬを含む軽鎖と、を含み、
ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３が、図２４のＸＥＮＰ２６９４０由来のＣＤＲおよび図４０のＸＮＥ２８６５２由来のＣＤＲからなる群から選択される、抗体。
【請求項２】
前記ＶＨおよびＶＬが、ＸＥＮＰ２６９４０由来のＶＨおよびＶＬ、ならびにＸＥＮＰ２８６５２由来のＶＨおよびＶＬからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４由来のＦｃドメインからなる群から選択されるＦｃドメインである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記Ｆｃドメインが、バリアントヒトＩｇＧ１ドメインである、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記バリアントヒトＩｇＧ１ドメインが、アミノ酸置換４２７Ｌ／４３４Ｓを含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記バリアントヒトＩｇＧ１ドメインが、図５に示されているものから選択される切除バリアントを含む、請求項４または５に記載の抗体。
【請求項７】
Ｆｃドメインが、Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換を含むバリアントヒトＩｇＧ４ドメインである、請求項３に記載の抗体。
【請求項８】
ＸＮＥ２６９４０およびＸＥＮＰ２８６５２からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ａ）請求項１〜８のいずれかに記載の前記重鎖をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１〜８のいずれかに記載の前記軽鎖をコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
【請求項１０】
ａ）請求項９に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項９に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の前記第１および第２の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の発現ベクター組成物または請求項１１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
抗ＰＤ−１抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現される条件下で請求項１２に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項１４】
癌の治療を必要とする患者における癌を治療する方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
ヘテロ二量体二重特異性抗体であって、
ａ）第１の単量体であって、
ｉ）ヒトＰＤ−１に結合する一本鎖Ｆｖドメイン（ｓｃＦｖ）であって、
１）第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ１）、
２）ｓｃＦｖリンカー、および
３）第１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ１）を含む、前記ｓｃＦｖドメインと、
ｉｉ）第１のバリアントＦｃドメインと、を含む、第１の単量体と、
ｂ）第２の単量体であって、
ｉ）第２の可変重鎖ドメイン（ＶＨ２）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖、を含む、第２の単量体と、
ｃ）第２の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ２）および定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖と、を含み、
前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記第１の可変軽鎖ドメインが、図１５のＸＥＮＰ２５８０６由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２３４＿Ｌ３．１４４、図１５のＸＥＮＰ２５８１２由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４０＿Ｌ３．１４８、図１５のＸＥＮＰ２５８１３由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４１＿Ｌ３．１４８、および図１５のＸＥＮＰ２５８１９由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４１＿Ｌ３．９２からなる対から選択される配列を有する、第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１）を形成し、前記第２の可変重鎖ドメインおよび前記第２の可変軽鎖ドメインが、ヒトＣＴＬＡ−４、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＢＴＬＡ、およびヒトＩＣＯＳから選択される抗原に結合する、第２のＡＢＤ（ＡＢＤ２）を形成する、ヘテロ二量体二重特異性抗体。
【請求項１６】
前記第１の単量体が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ１−ヒンジ−バリアントＦｃドメインを含む、請求項１５に記載のヘテロ二量体二重特異性抗体。
【請求項１７】
前記第１の単量体が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ１−ヒンジ−バリアントＦｃドメインを含む、請求項１６に記載のヘテロ二量体二重特異性抗体。
【請求項１８】
前記ＡＢＤ２が、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する、請求項１５〜１７のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１９】
前記ＡＢＤ２が、ヒトＬＡＧ−３に結合する、請求項１５〜１７のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２０】
前記ＡＢＤ２が、ヒトＴＩＭ−３に結合する、請求項１５〜１７のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２１】
前記ＡＢＤ２が、ヒトＴＩＧＩＴに結合する、請求項１５〜１７のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２２】
前記ＡＢＤ２が、ヒトＩＣＯＳに結合する、請求項１５〜１７のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２３】
前記ＡＢＤ２が、ヒトＢＴＬＡに結合する、請求項１５〜１７のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２４】
前記抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤ２が、配列表の配列番号３８１３４および３８１３８、３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７、ならびに３６８１１および３６８１５、の対から選択される配列を有する、請求項１８に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２５】
前記抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤ２が、配列番号３２７５５および３２７６０、３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９、の対から選択される配列を有する、請求項１９に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２６】
前記抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ２が、配列番号３６５０８および３６５１３、３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される配列を有する、請求項２０に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２７】
前記抗ＴＩＧＩＴ  ＡＢＤ２が、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択される配列を有する、請求項２１に記載のヘテロ二量体抗体。  
【請求項２８】
前記抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ２が、
ａ）ＵＳ２０１８／０１２７５０１からの配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８の対、
ｂ）図４９のＸＥＮＣＳ５００のＶＨおよびＶＬの配列、
ｃ）図４９のＸＥＮＣＳ５０１のＶＨおよびＶＬの配列、からなる群から選択される配列を有する、請求項２２に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項２９】
前記抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤ２が、配列番号２０９３６および２０９４１、３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７ならびに３６７６１および３６７３５の対から選択される配列を有する、請求項２３に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３０】
前記第２のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、前記第１および第２のバリアントＦｃドメインが、それぞれアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、前記第１のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸置換Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第２のバリアントＦｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、付番は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従って行われる、請求項１５〜２９のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３１】
ａ）請求項１５〜３０のいずれかに記載の前記第１の単量体をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１５〜３０のいずれかに記載の前記第２の単量体をコードする第２の核酸と、
ｃ）請求項１５〜３０のいずれかに記載の前記軽鎖をコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。
【請求項３２】
ａ）請求項３１に記載の前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項３１に記載の前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）請求項３１に記載の前記第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
【請求項３４】
ヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現される条件下で請求項３３に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項３５】
癌の治療を必要とする患者における癌を治療する方法であって、請求項１５〜３０のいずれかに記載の抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｉ．優先権主張
この出願は、２０１７年１１月８日に提出された米国特許出願第６２／５８３，４３８号、２０１７年１２月１４日に提出された第６２／５９８，９３８号および２０１８年４月１６日に提出された第６２／６５８，２２７号の優先権を主張し、これらのすべては、その中の図、説明文、および請求の範囲を特に参照して、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
ＩＩ．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年４月１６日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーの名前は０６７４６１＿５２１５−ＰＲ＿ＳＬ．ｔｘｔで、サイズは３３，７１６，７８２キロバイトである。
【背景技術】
【０００３】
ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１（プログラムされた細胞死１）、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３）、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）などのチェックポイント受容体は、Ｔ細胞やその他の細胞型の活性化、増殖、および／またはエフェクター活性を阻害する。チェックポイント受容体が腫瘍細胞に対する内在性Ｔ細胞応答を抑制するという仮説に導かれて、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、およびトレメリムマブを含む抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体の前臨床および臨床試験は、免疫チェックポイント遮断が様々な悪性腫瘍を有する一部の患者において優れた抗腫瘍応答をもたらし、内在性Ｔ細胞を刺激して腫瘍細胞を攻撃し、長期の癌寛解をもたらすことを実証した。残念なことに、これらの治療法に応答するのは一部の患者だけであり、適応症および他の要因により異なるが、奏効率は一般に１０〜３０％の範囲で、場合によっては単剤療法についてより高くなる。これらの剤の治療的組み合わせ、例えばイピリムマブ＋ニボルマブはさらに高い奏効率をもたらし、場合によっては６０％に近づく。前臨床試験では、抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体の間に、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴなどの最近確認されたチェックポイント受容体の遮断による追加の相乗効果が示されている。多重チェックポイント遮断の可能性は非常に有望であるが、そのような薬剤との併用療法は高い経済的負担を伴うと予想される。さらに、併用療法、例えばニボルマブ＋イピリムマブの自己免疫毒性は、単独療法と比較して顕著に上昇し、多くの患者に療法を中止させる。
【０００４】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を試験している、多くの研究（Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１４：１５３７（２００９）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７（１７）：７８７５−７８８０（２０１０）、Ｆｏｕｒｃａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（４）：８８７−８９６（２０１２）およびＧｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２４（５）：２２４６（２０１４））は、ＴＩＬが、一般に複数のチェックポイント受容体を発現することを示している。さらに、複数のチェックポイントを発現するＴＩＬが、実際には腫瘍反応性が最も高い可能性がある。対照的に、末梢における非腫瘍反応性Ｔ細胞は、単一のチェックポイントを発現する可能性がより高い。単一特異性の完全長抗体によるチェックポイントの遮断は、自己免疫毒性に寄与すると想定される自己抗原反応性の単一発現Ｔ細胞と比較して、腫瘍反応性ＴＩＬの脱抑制に関して非差別的である可能性が高い。
【０００５】
したがって、本発明は、ヒトＰＤ−１と、第２の、異なるチェックポイント阻害剤タンパク質とに結合する、二重特異性抗体に関する。ヒトＰＤ−１に結合する単一特異性モノクローナル抗体も提供される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、新規の抗ＰＤ−１抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、ならびにＰＤ−１と、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡおよびＩＣＯＳからなる群から選択される第２の標的抗原と、に結合する抗ＰＤ−１一価モノクローナル抗体およびヘテロ二量体二重特異性抗体の作製におけるそれらの使用、およびこの抗体の作成方法と使用方法に関する。
【０００７】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、抗ＰＤ−１一価モノクローナル抗体を提供する。本態様では、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体であって、ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖と、ｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かってＶＬ−ＣＬを含む軽鎖と、を含み、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、およびＶＬＣＤＲ３が、図２４のＸＥＮＰ２６９４０由来のＣＤＲおよび図４０のＸＮＥ２８６５２由来のＣＤＲからなる群から選択される。
【０００８】
追加の態様では、抗体は、図２４に示されるＸＥＮＰ２６９４０由来のＶＨおよびＶＬを有する。
【０００９】
さらなる態様では、抗体は、図４０に示されるＸＥＮＰ２８６５２由来のＶＨおよびＶＬを有する。
【００１０】
いずれかの態様では、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４由来のＦｃドメインからなる群から選択されるＦｃドメインであり得る。ＩｇＧ１に由来する場合、Ｆｃドメインは、例えばアミノ酸置換４２７Ｌ／４３４Ｓを含むバリアントヒトＩｇＧ１ドメインであり得る。さらに、バリアントＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、図５に示されているものから選択された切除バリアント、特にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を含むことができる。ＦｃドメインがバリアントヒトＩｇＧ４ドメインである場合、それはＳ２２８Ｐアミノ酸置換を含むことができる。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、重鎖をコードする第１の核酸と、軽鎖をコードする第２の核酸とを含む、核酸組成物を提供する。また、第１の核酸を含む第１の発現ベクターおよび前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターを含む発現ベクター組成物、または前記第１および第２の核酸を含む単一の発現ベクターが含まれる。さらに含まれるのは、発現ベクター組成物または発現ベクターを含む、宿主細胞である。抗ＰＤ−１抗体を作製する方法も含まれ、前記抗体が発現される条件下で宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、を含む。さらに、本発明は、癌の治療を必要とする患者における癌を治療する方法であって、抗体を前記患者に投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様では、ヘテロ二量体二重特異性抗体が提供される。これらの抗体は、ａ）第１の単量体であって、ｉ）ヒトＰＤ−１に結合する一本鎖Ｆｖドメイン（ｓｃＦｖ）であって、１）第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ１）、２）ｓｃＦｖリンカー、および３）第１の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ１）を含む、前記ｓｃＦｖドメインと、ｉｉ）第１のバリアントＦｃドメインと、を含む、第１の単量体と、ｂ）第２の単量体であって、ｉ）第２の可変重鎖ドメイン（ＶＨ２）−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖、を含む、第２の単量体と、ｃ）第２の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ２）および定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖と、を含み、前記第１の可変重鎖ドメインおよび前記第１の可変軽鎖ドメインが、第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ１）を形成し、前記第２の可変重鎖ドメインおよび前記第２の可変軽鎖ドメインが、ヒトＣＴＬＡ−４、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＢＴＬＡおよびヒトＩＣＯＳから選択される抗原に結合する第２のＡＢＤ（ＡＢＤ２）を形成する。ＡＢＤ１は、図１３、１５、１６、１８、２０、２１、２４、３３、および４０で概説されている１Ｃ１１  ＶＨおよびＶＬドメインのいずれかであり得る。
【００１３】
特定の態様では、ＡＢＤ１は、図１５のＸＥＮＰ２５８０６由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２３４＿Ｌ３．１４４、図１５のＸＥＮＰ２５８１２由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４０＿Ｌ３．１４８、図１５のＸＥＮＰ２５８１３由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４１＿Ｌ３．１４８および図１５のＸＥＮＰ２５８１９由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４１＿Ｌ３．９２からなる対から選択される配列を有する。
【００１４】
これらの態様では、第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ１−ヒンジ−バリアントＦｃドメインを含み得る。
【００１５】
さらなる態様では、第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ１−ヒンジ−バリアントＦｃドメインを含み得る。
【００１６】
特定の態様では、ＡＢＤ１は、図１５のＸＥＮＰ２５８０６由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２３４＿Ｌ３．１４４、図１５のＸＥＮＰ２５８１２由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４０＿Ｌ３．１４８、図１５のＸＥＮＰ２５８１３由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４１＿Ｌ３．１４８および図１５のＸＥＮＰ２５８１９由来の１Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４１＿Ｌ３．９２からなる対から選択される配列を有し、ＡＢＤ２は、ヒトＣＴＬＡ−４、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＢＴＬＡおよびヒトＩＣＯＳから選択される抗原に結合する。
【００１７】
追加の態様では、抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤ２は、配列表の配列番号３８１３４および３８１３８、３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７、ならびに３６８１１および３６８１５、の対から選択される配列を有する。
【００１８】
追加の態様では、抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤ２は、配列番号３２７５５および３２７６０、３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９、の対から選択される配列を有する。
【００１９】
追加の態様では、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ２は、配列番号３６５０８および３６５１３、３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される配列を有する。
【００２０】
追加の態様では、抗ＴＩＧＩＴ  ＡＢＤ２は、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択される配列を有する。
【００２１】
追加の態様では、抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ２は、ａ）ＵＳ２０１８／０１２７５０１からの配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８の対、ｂ）図４９のＸＥＮＣＳ５００のＶＨおよびＶＬの配列、ｃ）図４９のＸＥＮＣＳ５０１のＶＨおよびＶＬの配列、からなる群から選択される配列を有する。
【００２２】
追加の態様では、抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤ２は、配列番号２０９３６および２０９４１、３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７ならびに３６７６１および３６７３５、の対から選択される配列を有する。
【００２３】
多くの態様では、本発明のヘテロ二量体抗体は、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含む、第２のバリアントＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有し、前記第１および第２のバリアントＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、それぞれアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、および前記第１のバリアントＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第２のバリアントＩｇＧ１  Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、付番は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従って行われる。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、ａ）前記第１の単量体をコードする第１の核酸と、ｂ）前記第２の単量体をコードする第２の核酸と、ｃ）請求項１５〜３０のいずれかに記載の前記軽鎖をコードする第３の核酸と、を含む核酸組成物を提供する。
【００２５】
追加の態様では、本発明は、ａ）前記第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、ｂ）前記第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、ｃ）前記第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む発現ベクター組成物を提供する。発現ベクター組成物を含む宿主細胞および、抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現される条件下で宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、による方法、もまた提供する。さらに、癌の治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、本発明のヘテロ二量体二重特異性抗体を患者に投与することを含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ−１Ｏ】本発明のいくつかの形式を示す。最初は、第１および第２の抗−抗原結合ドメインを有する「ボトルオープナー」形式である。さらに、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、セントラル−ｓｃＦｖ、セントラル−Ｆｖ、ワンアーム（ｏｎｅ  ａｒｍｅｄ）セントラル−ｓｃＦｖ、ワン（ｏｎｅ）ｓｃＦｖ−ｍＡｂ、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ、二重ｓｃＦｖ形式、ＤＶＤ−Ｉｇ、トライデントおよびｍＡｂ−（ｓｃＦｖ２）が、すべて表示される。示されているすべてのｓｃＦｖドメインについて、それらはＮ末端からＣ末端に向かって可変重鎖−（任意選択的なリンカー）−可変軽鎖、またはその逆のいずれかであってよい。さらに、ワンアームｓｃＦｖ−ｍＡｂの場合、ｓｃＦｖは重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合できる。
【図２Ａ−２Ｄ】臨床開発しやすいように両方に結合する抗原結合ドメインの開発を促進するための、多くの場合でヒトおよびカニクイザルの両方を含む、本発明で使用するいくつかの抗原の抗原配列を示す。特に明記しない限り、これらの抗原への言及はすべてヒト抗原に対するものである。ヒトＩＣＯＳ（ｓｐ｜Ｑ９Ｙ６Ｗ８）の配列は、ＷＯ／２０１８／０４５１１０に記載の配列番号２６２４６に示されている。ヒトＩＣＯＳ、細胞外ドメイン（ｓｐ｜Ｑ９Ｙ６Ｗ８｜２１−１４０）の配列は、ＷＯ／２０１８／０４５１１０に記載の配列番号２６２４７である。
【図３Ａ−３Ｆ】ヘテロ二量体化バリアントのセット（スキュー（ｓｋｅｗ）バリアントおよびＰＩバリアントを含む）の有用な対を示す。図３Ｅには、対応する「単量体２」バリアントがないバリアントがあり、これらは、例えば、いずれかの単量体で単独で使用できる、またはボトルオープナーのＦａｂ側に含めることができるｐＩバリアントであり、適切な荷電ｓｃＦｖリンカーを、第２の抗原結合ドメインとしてｓｃＦｖを利用する第２の単量体で使用できる。適切な荷電リンカーを図７に示す。
【図４】等価バリアント型抗体定常領域とそれらの置換の一覧を示す。ｐＩ＿（−）は低ｐＩバリアントを示し、ｐＩ＿（＋）は高ｐＩバリアントを示す。これらは、任意選択的に独立して、本発明の他のヘテロ二量体化バリアント（および本明細書に概説される他のバリアント型）と組み合わせることができる。
【図５】ＦｃγＲ結合を除去した有用な除去バリアントを示す（時折「ノックアウト」または「ＫＯ」バリアントと称される）。一般に、切除バリアントは両方の単量体に見られるが、場合によっては、それらは一方の単量体のみにあってもよい。
【図６Ａ−６Ｂ】本発明の２つの特に有用な実施形態を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】構成要素として、１つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体性抗体のｐＩを増加または減少するのに使用されるいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）正のリンカーは本明細書で、特に本明細書で示される抗ＣＤ３  ｖｌおよびｖｈ配列で、特に使用される。単一電荷を有する単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ６（８）：９８９−９９５（１９９３）から「Ｗｈｉｔｌｏｗ」として参照される。このリンカーは、ｓｃＦｖにおける凝集を減少させ、タンパク質分解安定性を高めるために使用されたことに留意すべきである。
【図８】ヘテロ二量体の収率（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸにより決定）および熱安定性（ＤＳＣにより決定）を含む操作されたヘテロ二量体スキューイングＦｃバリアントのリストを示す。決定されていない熱安定性は「ｎ．ｄ．」によって示される。
【図９】重鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する、ハイブリドーマクローン１Ｃ１１およびヒトＩｇＧ１の可変領域に基づくキメラ抗ＰＤ−１抗体、ＸＥＮＰ２１５７５の配列を示す。ＣＤＲは太字であり、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＨおよびＶＬドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図１０】抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１による、ＰＤ−１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断を示す。
【図１１】ＳＥＢ刺激Ｔ細胞への、抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１の結合を示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激および抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１による処理後のサイトカイン放出アッセイ（Ａ：ＩＬ−２、Ｂ：ＩＦＮγ）を示す。
【図１３Ａ−１３Ｃ】重鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有するヒトＩｇＧ１形式の、抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１の例示的なＦａｂヒト化バリアントの配列を示す。ＣＤＲは太字であり、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。当業者には理解されるように、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＦａｂまたはｓｃＦｖとして形式化することができる。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＨおよびＶＬドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図１４】Ｏｃｔｅｔ（および関連するセンサグラム）によって決定されたＰＤ−１に対するＸＥＮＰ２２５５３の親和性を示す。
【図１５Ａ−１５Ｔ】抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１の例示的なｓｃＦｖバリアントの配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれ、ｓｃＦｖリンカーには二重下線が引かれる（配列では、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、非荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーで置き換えることができる。）、およびスラッシュは可変ドメインの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かってｓｃＦｖの方向を示しており、この図の一部の配列はＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かって）として配向されているが、一部はＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かって）として配向されている。当業者には理解されるように、これらの配列は、ここでのそれらの描写から反対方向で使用することもできる。さらに、当業者には理解されるように、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＦａｂまたはｓｃＦｖとして形式化することができる。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＨおよびＶＬドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図１６Ａ−１６Ｈ】実施例ＸＤで説明されているように、選択されたｓｃＦｖからのＶＨおよびＶＬドメインを有する例示的なバリアントＰＤ−１  ｍＡｂの配列を示す。ＣＤＲは太字であり、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。当業者には理解されるように、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＦａｂまたはｓｃＦｖとして形式化することができる。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＨおよびＶＬドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図１７Ａ−１７Ｑ】ＤＳＦによって決定されたバリアント抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖの安定性と、Ｏｃｔｅｔによって決定されたバリアントｓｃＦｖからのＶＨ  ／  ＶＬに基づく、抗ＰＤ−１  ｍＡｂの平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）を示す。ｓｃＦｖのＸＥＮＰは太字で、完全長ｍＡｂのＸＥＮＰは括弧内に示す。
【図１８Ａ−１８Ｇ】クローン１Ｃ１１に基づく例示的なバリアント抗ＰＤ−１  ｍＡｂの配列を示す。ＣＤＲは太字であり、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。当業者には理解されるように、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＦａｂまたはｓｃＦｖとして形式化することができる。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＨおよびＶＬドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図１９】Ｏｃｔｅｔによって決定されたバリアント抗ＰＤ−１  ｍＡｂの平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。
【図２０Ａ−２０Ｌ】ＸＥＮＰ２２５５３の重鎖に基づくバリアント重鎖の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、ＶＨドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。当業者には理解されるように、ＶＨドメインはＦａｂまたはｓｃＦｖにて使用することができる。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＨドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図２１Ａ−２１Ｇ】ＸＥＮＰ２２５５３の軽鎖に基づくバリアント軽鎖の配列を示す。ＣＤＲは太字で示されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。当業者には理解されるように、ＶＬドメインはＦａｂまたはｓｃＦｖにて使用することができる。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＬドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図２２Ａ−２２Ｅ】Ｏｃｔｅｔによって決定されたバリアント抗ＰＤ−１  ｍＡｂの平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。図２０および図２１に示すように、バリアントは重鎖および軽鎖ＸｅｎＤによって定義される。
【図２３】Ｏｃｔｅｔによって決定されたバリアント抗ＰＤ−１  ｍＡｂの平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。図２０および図２１に示すように、バリアントは重鎖および軽鎖ＸｅｎＤによって定義される。
【図２４Ａ−２４Ｊ】クローン１Ｃ１１に基づく追加の例示的なバリアント抗ＰＤ−１  ｍＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。当業者には理解されるように、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＦａｂまたはｓｃＦｖとして形式化することができる。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＨおよびＶＬドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図２５】Ｏｃｔｅｔによって決定されたバリアント抗ＰＤ−１  ｍＡｂの平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。
【図２６】Ｂｉａｃｏｒｅによって決定された抗ＰＤ−１  １Ｃ１１バリアントの親和性（ＫＤ）を示す。
【図２７】親和性が最適化された抗ＰＤ−１  １Ｃ１１バリアントのＳＥＢ刺激Ｔ細胞への結合を示す。
【図２８】Ｏｃｔｅｔを使用したタンデムエピトープビニングアッセイ（ｔａｎｄｅｍ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｂｉｎｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）における正規化されたＢＬＩ応答によって決定される、抗ＰＤ−１  １Ｃ１１バリアントによるＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２結合の遮断を示す。
【図２９】指示された試験物質とのインキュベーション後の、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおけるＩＦＮγ分泌を示す。
【図３０】指示された試験物質とのインキュベーション後の、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおけるＩＦＮγ分泌を示す。
【図３１】２０μｇ／ｍＬの指示された試験物質とのインキュベーション後のＭＬＲアッセイにおけるＩＦＮγ分泌を示す。
【図３２】指示された濃度の指示された試験物質とのインキュベーション後のＭＬＲアッセイにおけるＩＦＮγ分泌を示す。
【図３３】切除バリアント（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７ｋ」）とＸｔｅｎｄバリアント（Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ）有する二価の抗ＰＤ−１  ｍＡｂであるＸＥＮＰ２６８４２の配列を示す。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＨおよびＶＬドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図３４】０日目にヒトＰＢＭＣを移植し、１日目および８日目に指示された試験物質を投与した後１４日目のＮＳＧマウスの全血中のＣＤ４５＋細胞数を示す。
【図３５】０日目にヒトＰＢＭＣを移植し、１日目に指示された試験物質を投与した後７日目のＮＳＧマウスの血清中のＩＦＮγ濃度を示す。
【図３６Ａ−３６Ｂ】ｐｐ６５反応性ｈｕＰＢＭＣで移植し指示された試験物質での処理後に、ｐｐ６５発現ＭＣＦ−７細胞を移植したＮＳＧマウスのＡ）平均腫瘍体積およびＢ）腫瘍体積の変化を示す。
【図３７Ａ−３７Ｄ】ｐｐ６５反応性ｈｕＰＢＭＣで移植し指示された試験物質での処理後に、ｐｐ６５発現ＭＣＦ−７細胞を移植したＮＳＧマウスの全血におけるＡ）ＣＤ４５＋細胞数、Ｂ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞数、Ｃ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞数、およびＤ）ＮＫ細胞数を示す。
【図３８】指示された試験物質を投与したｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける経時的な体重変化（初期体重のパーセンテージとして）を示す。
【図３９Ａ−３９Ｃ】指示された試験物質を投与した後のｈｕＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおけるＡ）ヒトＣＤ４５＋、Ｂ）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣ）ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞数を示す。
【図４０Ａ−４０ＢＢ】クローン１Ｃ１１に基づく追加の例示的なバリアント抗ＰＤ−１  ｍＡｂの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。当業者には理解されるように、ＶＨおよびＶＬドメインは、ＦａｂまたはｓｃＦｖとして形式化することができる。さらに、これらの配列はＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＳのＸｔｅｎｄ変異を含み得る。さらに、各ＣＤＲには配列表に独自の配列番号を有し、各ＶＨおよびＶＬドメインには配列表に独自の配列番号を有する。
【図４１】Ｏｃｔｅｔによって決定されたヒトＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１  １Ｃ１１バリアントの親和性／解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。
【図４２】Ｏｃｔｅｔによって決定されたヒトＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１  １Ｃ１１バリアントの親和性／解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。
【図４３】Ｏｃｔｅｔによって決定されたヒトＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１  １Ｃ１１バリアントの親和性／解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。
【図４４】Ｏｃｔｅｔによって決定されたヒトＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１  １Ｃ１１バリアントの親和性／解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。
【図４５】Ｏｃｔｅｔによって決定されたヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１  １Ｃ１１バリアントの親和性／解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。
【図４６】ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおける指示された１Ｃ１１バリアント（ならびに対照としてのニボルマブに基づくＰＢＳおよび抗ＰＤ−１  ＸＥＮＰ１６４３２）によるＩＦＮγの誘導を示す。ｐ値は対応のあるｔ検定によるもので、同じドナーからのＰＢＭＣによるＩＦＮγ分泌を比較している。
【図４７】ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおける指示された１Ｃ１１バリアント（ならびに対照としてのニボルマブに基づくＰＢＳおよび抗ＰＤ−１  ＸＥＮＰ１６４３２）によるＩＬ−２の誘導を示す。ｐ値は対応のあるｔ検定によるもので、同じドナーからのＰＢＭＣによるＩＬ−２分泌を比較している。
【図４８】ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおける、指示された、ニボルマブおよびＸＥＮＰ２８６５２に基づく抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１６４３２によるＩＦＮγの誘導を示す。ｐ値は対応のあるｔ検定によるもので、同じドナーのＰＢＭＣによるＩＦＮγ分泌を比較している。
【図４９Ａ−４９ＫＫ】「ＸＥＮＣＳ」付番を使用して命名された、「ボトルオープナー」形式での、本発明のヘテロ二量体抗体のいくつかの配列を示す。それぞれに３つのポリペプチド鎖が示され（「Ｆａｂ鎖、ｓｃＦｖ鎖、軽鎖」）、ＣＤＲには下線が引かれ、リンカーには二重下線が引かれ、ドメイン間の接合部は「／」で示される。これらにはそれぞれ独自の配列を有し、したがって識別子を有する。
【図５０Ａ−５０Ｅ】いくつかの有用な「ボトルオープナー」形式の「骨格」の配列を示し、ｓｃＦｖ側のＦｖはいくつかの特定の抗ＰＤ−１  ＡＢＤに向けられているが、「Ｆａｂ」側のＦｖ配列はない。当業者によって理解され、以下で概説されるように、これらの「骨格」配列は、本明細書で概説され、配列表内に含まれる任意のＦａｂ配列と共に使用することができる（例えば、「Ｆａｂ側重鎖」または「Ｆａｂ単量体」に結合したＶＨおよび定常軽鎖に結合したＶＬ）。また、これらのボトルオープナーの骨格配列は、図１Ｆのセントラル−ｓｃＦｖ形式（「２＋１」形式とも称される）での使用が見出され、本明細書で説明するように第２のＶＨおよびＣＨ１ドメインが追加されている。それぞれのＦａｂ鎖は、ＣＨ１ドメインの始まりを示す「／」で始まり、本明細書に記載のＡＢＤからのＶＨドメインがＮ末端で融合されて、全長重鎖を形成し、ＡＢＤからの対応するＶＬドメインが軽鎖のＣＬドメインの始まりを示す「／」にＮ末端で融合しているため、ＦａｂがＦａｂ鎖および軽鎖で形成される。ｓｃＦｖ鎖は、特定の抗ＰＤ−１  ＡＢＤについて概説され、ＣＤＲには下線が引かれ、ｓｃＦｖリンカーには二重下線が引かれ、「／」はドメインの接合部を示している。ＢＯ骨格１〜４（ＸＥＮＣＳ５５６〜５５９）は、ＢＯ骨格５〜８（ＸＥＮＣＳ５６０〜５６３）と同じであるが、後者には４２８Ｌ／４３４Ｓ「ＸＴｅｎｄ（登録商標）」Ｆｃバリアントが含まれている。
【図５１】主題の二重特異性抗体ＸｍＡｂ２０７１７（抗ＣＴＬＡ−４  ｘ抗ＰＤ−１）がＰＤ１とＣＴＬＡ４を共発現する２９３  Ｔ細胞を選択的に標的とすることを示す。
【図５２】ＸｍＡＢ２０７１７の結合活性がＴ細胞の活性化に寄与することを示す。具体的には、１４日目のＩＦＮγレベルは、０日目にヒトＰＢＭＣをＮＳＧマウスに移植した後、１日目に指示された試験物質を投与した後に示される。
【図５３】ＸｍＡＢ２０７１７が抗ＰＤ１二価抗体と比較して優れたＴ細胞活性化を促進することを示す。具体的には、１４日目のＣＤ４５  ＋細胞数とＩＦＮγレベルは、０日目にヒトＰＢＭＣをＮＳＧマウスに移植した後、１日目に指示された試験物質を投与した後に示される。
【図５４】ＸｍＡｂ２０７１７がマウスの同種抗腫瘍応答を増強することを示すグラフである。ＮＳＧマウスにＫＧ１ａ−ｌｕｃを移植した後、ｈｕＰＢＭＣを使用して移植した。提示された腫瘍量は、ＫＧ１ａ−ｌｕｃのＩＶＩＳイメージングによって取得された幾何平均フラックスから誘導される。
【図５５】ＣＤ４５＋細胞数で測定したように、ＰＤ１  ｘ  ＣＴＬＡ４二重特異性抗体がチェックポイント遮断のマウスモデルで非常に活性であることを示すグラフである。
【図５６】ＣＴＬＡ４×ＬＡＧ３二重特異性が活性であり、チェックポイント遮断用のマウスモデルの三重遮断のため抗ＰＤ−１と組み合わされることを示すグラフである。
【図５７Ａ−５７Ｂ】染色により示されるように、非占有のＣＴＬＡ−４および／またはＬＡＧ−３受容体を有するＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の両方を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の集団のパーセンテージによって示される、指示された試験物質によるチェックポイント受容体占有率を示す。
【図５８】指示された試験物質での処理後の、（Ｑ１）ＣＴＬＡ−４−ＰＤ−１＋細胞、（Ｑ２）ＣＴＬＡ−４＋ＰＤ−１＋細胞、（Ｑ３）ＣＴＬＡ−４−ＰＤ−１＋細胞、および（Ｑ４）ＣＴＬＡ−４−ＰＤ−１−細胞の集団を示したＦＡＣＳ散布図を示す。
【図５９Ａ−５９Ｂ】ＫＧ１ａ−ｌｕｃを移植され、ＸｍＡｂ２０７１７での処理後にｈｕＰＢＭＣを移植されたＮＳＧマウスにおける腫瘍量（ＫＧ１ａ−ｌｕｃのＩＶＩＳイメージングによって取得された幾何平均フラックスに由来）を示す。
【図６０】ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＸｍＡｂ２２８４１の結合を示す。
【図６１Ａ−６１Ｄ】染色により示されるように、非占有のＣＴＬＡ−４および／またはＬＡＧ−３受容体を有するＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３の両方を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の集団のパーセンテージによって示される、指示された試験物質によるチェックポイント受容体占有率を示す。
【図６２Ａ−６２Ｂ】指示された試験物質での処理後のＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３の両方を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞上の非占有のＡ）ＬＡＧ−３およびＢ）ＣＴＬＡ−４受容体の量を示す。
【図６３Ａ−６３Ｆ】指示された試験物質の、６人の別々のＰＢＭＣドナー（Ａ〜Ｆ）からのＳＥＢ刺激Ｔ細胞との結合を示す。
【図６４】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）での処理よりも、ＸＥＮＰ１６４３２、ＸｍＡｂ２０７１７、ＸｍＡｂ２２８４１、およびＸｍＡｂ２２８４１とＸＥＮＰ１６４３２との組み合わせでの処理後のＳＥＢ刺激Ｔ細胞によるＩＬ−２放出の倍数増加を示す。
【図６５】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）での処理よりも、ＸＥＮＰ１６４３２、ＸｍＡｂ２０７１７、ＸｍＡｂ２２８４１、およびＸｍＡｂ２２８４１とＸＥＮＰ１６４３２との組み合わせでの処理後のＳＥＢ刺激Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出の倍数増加を示す。
【図６６】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）での処理よりも、抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３２）での処理後のＳＥＢ刺激Ｔ細胞による免疫関連遺伝子の発現の倍数変化（ｘ軸）を示している。ｙ軸は有意性を示す。
【図６７】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）での処理よりもＸｍＡｂ２０７１７で処理後の、ＳＥＢ刺激Ｔ細胞による免疫関連遺伝子の発現の倍数変化（ｘ軸）を示している。
【図６８】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）での処理よりもＸｍＡｂ２２８４１での処理後の、ＳＥＢ刺激Ｔ細胞による免疫関連遺伝子の発現の倍数変化（ｘ軸）を示す。
【図６９】抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３２）での処理よりもＸｍＡｂ２０７１７での処理後の、ＳＥＢ刺激Ｔ細胞による免疫関連遺伝子の発現の倍数変化（ｘ軸）を示している。
【図７０】抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３２）での処理よりもＸｍＡｂ２２８４１での処理後の、ＳＥＢ刺激Ｔ細胞による免疫関連遺伝子の発現の倍数変化（ｘ軸）を示す。
【図７１】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）での処理よりも、抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３２）と組み合わせたＸｍＡｂ２２８４１での処理後の、ＳＥＢ刺激Ｔ細胞による免疫関連遺伝子の発現の倍数変化（ｘ軸）を示す。
【図７２】抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３２）単独での処理よりも抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３２）を組み合わせたたＸｍＡｂ２２８４１での処理後の、ＳＥＢ刺激Ｔ細胞による免疫関連遺伝子の発現の倍数変化（ｘ軸）を示す。
【図７３】抗ＲＳＶ抗体の配列を示している。これらの配列は、除去バリアント（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１に基づいて生成されたことに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図７４】ニボルマブの可変領域を有する抗ＰＤ−１抗体の配列を示している。これらの配列は、除去バリアント（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１に基づいて生成されたことに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図７５】ペムブロリズマブの可変領域を有する抗ＰＤ−１抗体の配列を示している。これらの配列は、Ｓ２２８Ｐバリアントとともに、ヒトＩｇＧ４に基づいて生成されたことに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられる付番によってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他の付番システムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図７６Ａ−７６Ｂ】ｈＦｃＲｎ（Ｔｇ２７６）マウスへの２ｍｇ／ｋｇ単回静脈内投与後の個々のマウスにおけるＡ）ＸＥＮＰ２００５３およびＢ）ＸｍＡｂ２０７１７の薬物動態プロファイルを示す。
【図７７】ｈＦｃＲｎ（Ｔｇ２７６）マウスにおける２ｍｇ／ｋｇ単回静脈内投与後のＸＥＮＰ２００５３およびＸｍＡｂ２０７１７（個々の動物）の半減期をを示す。
【図７８】ｈＦｃＲｎ（Ｔｇ２７６）マウスにおける２ｍｇ／ｋｇ単回静脈内投与後のＸＥＮＰ２００５３およびＸｍＡｂ２０７１７（個々の動物）のＣｍａｘを示す。
【図７９】ｈＦｃＲｎ（Ｔｇ２７６）マウスにおける２ｍｇ／ｋｇ単回静脈内投与後のＸｍＡｂ２０７１７およびＸＥＮＰ２００５３の選択されたＰＫパラメータの平均を示す。
【図８０Ａ−８０Ｊ】ＰＢＳ、プレート結合ＸｍＡｂ２０７１７、可溶性ＸｍＡｂ２０７１７、およびプレート結合抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）で処理したヒトＰＢＭＣからの、Ａ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＩＬ−１β、Ｃ）ＩＬ−２、Ｄ）ＩＬ−４、Ｅ）ＩＬ−８、Ｆ）ＩＬ−６、Ｇ）ＩＬ−１０、Ｈ）ＩＬ−１２ｐ７０、Ｉ）ＩＬ−１３、およびＪ）ＴＮＦαの放出を示す。
【図８１Ａ−８１Ｂ】ＸｍＡｂ２０７１７のＡ）ヒトＣＴＬＡ−４およびＢ）カニクイザルＣＴＬＡ−４への結合を示すセンサグラムを示す。
【図８２Ａ−８２Ｂ】ＸｍＡｂ２０７１７のＡ）ヒトＰＤ−１およびＢ）カニクイザルＰＤ−１への結合を示すセンサグラムを示す。
【図８３】ＸｍＡｂ２０７１７のヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１への結合の平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。
【図８４】ＸｍＡｂ２０７１７プレインキュベーションの有無によるＣＴＬＡ−４とリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６の競合結合実験からのセンサグラムを示す。
【図８５】ＸｍＡｂ２０７１７プレインキュベーションの有無によるＰＤ−１とリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の競合結合実験からのセンサグラムを示す。
【図８６】ＸｍＡｂ２０７１７（実線）とヒトＩｇＧコンパレータ（天然のＩｇＧ１定常領域を有する抗ＣＤ１９抗体、点線）の、Ａ）ヒトＦｃγＲＩ、Ｂ）ヒトＦｃγＲＩＩｂ、Ｃ）ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｈ）、Ｄ）ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｒ）、Ｅ）ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｖ）、およびＦ）ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）への結合を示す、センサグラムを示す。
【図８７】ＸｍＡｂ２０７１７（実線）とヒトＩｇＧコンパレータ（天然のＩｇＧ１定常領域を有する抗ＣＤ１９抗体、点線）の、Ａ）カニクイザルＦｃγＲＩ、Ｂ）カニクイザルＦｃγＲＩＩＡ、Ｃ）カニクイザルＦｃγＲＩＩｂ、およびＤ）カニクイザルＲｃγＲＩＩＩＡへの結合を示すセンサグラムを示す。
【図８８】ＸｍＡｂ２０７１７（実線）とヒトＩｇＧコンパレータ（天然のＩｇＧ１定常領域を有する抗ＣＤ１９抗体、点線）のＡ）マウスＦｃγＲＩ、Ｂ）マウスＦｃγＲＩＩｂ、Ｃ）マウスＦｃγＲＩＩＩおよびＤ）マウスＦｃγＲＩＶへの結合を示すセンサグラムを示す。
【図８９】ｐＨ６．０でのヒト、カニクイザル、マウスのＦｃＲｎへのＸｍＡｂ２０７１７とＸＥＮＰ２００５３の結合の平衡解離定数（ＫＤ）を示す。
【図９０】ｐＨ６．０でのＸｍＡｂ２０７１７とＸＥＮＰ２００５３のヒト、カニクイザル、およびマウスＦｃＲｎ（１０００、５００、２５０、および１２５ｎＭ）への結合を示すセンサグラムを示す。
【図９１】ＰＤ−１を搭載し、ＸｍＡｂ２０７１７または緩衝液に浸漬した後、ＣＴＬＡ−４抗原に最後に浸漬したバイオセンサを示すインタンデムＢＬＩ実験を示している。
【図９２】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１５０７４、抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１６４３２、およびＸｍＡｂ２０７１７による処理後の、ＳＥＢ刺激ヒトＰＢＭＣによるＩＬ−２分泌を示す。各ポイントは、固有のヒトドナーを表す。
【図９３】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１５０７４、抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１６４３２、およびＸｍＡｂ２０７１７による処理後の刺激されていないヒトＰＢＭＣによるＩＬ−２分泌を示す。各ポイントは、固有のヒトドナーを表す。
【図９４】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１５０７４、ＸＥＮＰ２０１１１およびＸＥＮＰ２００５９の組み合わせ（ＸｍＡｂ２０７１７の抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４結合ドメインに基づく一価ｍＡｂｓ）、ならびにＸｍＡｂ２０７１７による処理後の刺激されていないヒトＰＢＭＣによるＩＬ−２分泌を示す。各ポイントは、固有のヒトドナーを表す。
【図９５】静脈内ＯＳＰ（ｉ．ｖ．ＯＳＰ）でヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスの経時的な体重の変化（初期体重のパーセンテージとして）を示す。死亡したマウスは初期体重の７０％に設定された。＊は、ｐ＜０．０５、対応のないスチューデントのｔ検定、ｈｕＰＢＭＣと比較した各群を示す。三角形は投与日を示す。
【図９６】静脈内ＯＳＰでヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスの生存率を示す。
【図９７】静脈内ＯＳＰでヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスにおける経時的な血清ＩＦＮγ濃度を示す。
【図９８Ａ−９８Ｃ】静脈内ＯＳＰでヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスの血液中における経時的なＡ）ヒトＣＤ４５＋細胞、Ｂ）ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞、およびＣ）ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞数を示す。
【図９９】切除バリアント（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７ｋ」）を含むアテゾリズマブに基づく二価の抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１６４３４の配列を示す。
【図１００】静脈内ＯＳＰでヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスの経時的な体重の変化（初期体重のパーセンテージとして）を示す。死亡したマウスは初期体重の７０％に設定された。
【図１０１】静脈内ＯＳＰでヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスの生存率を示す。
【図１０２Ａ−１０２Ｃ】静脈内ＯＳＰでヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスの１４日目の血液中のＡ）ヒトＣＤ４５＋細胞数、Ｂ）ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞数、およびＣ）ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞数を示す。
【図１０３】示された濃度の指示された試験物質で前処理されたＰＤ−１＋  ＣＴＬＡ−４＋細胞へのＸｍＡｂ２０７１７の結合を示す。
【図１０４】示された濃度の指示された試験物質で前処理されたＰＤ−１＋  ＣＴＬＡ−４＋細胞へのＸｍＡｂ２０７１７の結合を示す。
【図１０５】ＰＤ−１＋  ＣＴＬＡ−４＋細胞へのＸｍＡｂ２０７１７の結合を遮断するためのペムブロリズマブのＥＣ５０を示す。ＥＣ５０の値は、最小二乗法を使用してカーブフィットしたＰｒｉｓｍソフトウェアから得られた。
【図１０６Ａ−１０６Ｊ】ＰＢＳ、プレート結合ＸｍＡｂ２２８４１、可溶性ＸｍＡｂ２２８４１、およびプレート結合抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）で処理したヒトＰＢＭＣからのＡ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＩＬ−１β、Ｃ）ＩＬ−２、Ｄ）ＩＬ−４、Ｅ）ＩＬ−８、Ｆ）ＩＬ−６、Ｇ）ＩＬ−１０、  Ｈ）ＩＬ−１２ｐ７０、Ｉ）ＩＬ−１３、およびＪ）ＴＮＦαの放出を示す。
【図１０７】室内（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）生産のＴＧＮ１４１２であるＸＥＮＰ２９１５４の配列を示している。
【図１０８Ａ−１０８Ｊ】風乾したＸｍＡｂ２２８４１、風乾したＸＥＮＰ１５０７４（アイソタイプ対照）、および風乾したＸＥＮＰ２９１５４（陽性対照）で処理したヒトＰＢＭＣからのＡ）ＩＦＮγ、Ｂ）ＩＬ−１β、Ｃ）ＩＬ−２、Ｄ）ＩＬ−４、Ｅ）ＩＬ−８、Ｆ）ＩＬ−６、Ｇ）ＩＬ−１０、Ｈ）ＩＬ−１２ｐ７０、Ｉ）ＩＬ−１３、およびＪ）ＴＮＦαの放出を示す。
【図１０９Ａ−１０９Ｂ】ＸｍＡｂ２２８４１のＡ）ヒトＣＴＬＡ−４およびＢ）カニクイザルＣＴＬＡ−４への結合を示すセンサグラムを示す。
【図１１０Ａ−１１０Ｂ】ＸｍＡｂ２２８４１のＡ）ヒトＬＡＧ−３およびＢ）カニクイザルＬＡＧ−３への結合を示すセンサグラムを示す。
【図１１１】ＸｍＡｂ２２８４１のヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３への結合に関する平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を示す。
【図１１２】ＸｍＡｂ２２８４１プレインキュベーションの有無によるＣＴＬＡ−４とリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６の競合結合実験からのセンサグラムを示す。
【図１１３】ＸｍＡｂ２２８４１によるＲａｍｏｓ細胞の細胞表面ＭＨＣクラスＩＩへの可溶性ＬＡＧ−３−Ｆｃ結合の阻害を示す。
【図１１４】ＸｍＡｂ２２８４１（実線）およびヒトＩｇＧコンパレータ（天然ＩｇＧ１定常領域を持つ抗ＣＤ１９抗体、点線）の、Ａ）ヒトＦｃγＲＩ、Ｂ）ヒトＦｃγＲＩＩｂ、Ｃ）ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｈ）、Ｄ）ヒトＦｃγＲＩＩＡ（１３１Ｒ）、Ｅ）ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｖ）、およびＦ）ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）への結合を示すセンサグラムを示す。
【図１１５】ＸｍＡｂ２２８４１（実線）およびヒトＩｇＧコンパレータ（天然ＩｇＧ１定常領域を有する抗ＣＤ１９抗体、点線）の、Ａ）カニクイザルＦｃγＲＩ、Ｂ）カニクイザルＦｃγＲＩＩＡ、Ｃ）カニクイザルＦｃγＲＩＩｂ、およびＤ）カニクイザルＲｃγＲＩＩＩＡへの結合を示すセンサグラムを示す。
【図１１６】ＸｍＡｂ２２８４１（実線）およびヒトＩｇＧコンパレータ（天然ＩｇＧ１定常領域を有する抗ＣＤ１９抗体、点線）の、Ａ）マウスＦｃγＲＩ、Ｂ）マウスＦｃγＲＩＩｂ、Ｃ）マウスＦｃγＲＩＩＩ、およびＤ）マウスＦｃγＲＩＶへの結合を示すセンサグラムを示す。
【図１１７】ｐＨ６．０でのヒト、カニクイザル、マウスのＦｃＲｎへのＸｍＡｂ２２８４１とＸＥＮＰ２２６０２の結合の平衡解離定数（ＫＤ）を示している。
【図１１８】ｐＨ６．０でのＸｍＡｂ２２８４１およびＸＥＮＰ２２６０２のヒト、カニクイザル、およびマウスＦｃＲｎ（１０００、５００、２５０、および１２５ｎＭ）への結合を示すセンサグラムを示す。
【図１１９】ＬＡＧ−３を搭載し、ＸｍＡｂ２２８４１または緩衝液に浸漬した後、ＣＴＬＡ−４抗原を最後に浸漬したバイオセンサを示す、インタンデムＢＬＩ実験を示す。
【図１２０】静脈内ＯＳＰでヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスの経時的な体重の変化（初期体重のパーセンテージとして）を示す。死亡したマウスは初期体重の７０％に設定された。
【図１２１】静脈内ＯＳＰでヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスの生存率を示す。
【図１２２Ａ−１２２Ｂ】静脈内ＯＳＰでヒトＰＢＭＣを移植しおよび指示された試験物質を投与したＮＳＧマウスの、７日目および１４日目の、血清中のＡ）ＩＦＮγ濃度およびＢ）ＩＬ−１０濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ａ．資料の組み込み
１．図および説明文
２０１７年１１月８日に出願された米国特許出願第６２／５８３，４３８号、２０１７年１２月１４日に出願された同第６２／５９８，９３８号、２０１８年４月１６日に出願された同第６２／６５８，２２７号、２０１６年１１月１０日に出願された同第６２／４２０，５００号、２０１６年６月２２日に出願された同第６２／３５３，５１１号、２０１６年６月１４日に出願された同第６２／３５０，１４５号、２０１７年６月１４日に出願された同第１５／６２３，３１４号、および２０１７年６月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１７／３７５５５、のすべての図、付随する説明文および配列（それらの識別子および／または説明付き）、とりわけそこに示されたアミノ酸配列に関して、すべて、参照によりその全体が明示的かつ独立して本明細書に組み込まれる。
【００２８】
２．配列
添付の配列表について以下のように説明する：ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＰＤ−１配列には、配列番号６２０９〜１１４６４（ＰＤ−１  ｓｃＦｖ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はＦａｂとしての形式をとることができる）、配列番号１１４６５〜１７１３４（ＰＤ−１  Ｆａｂ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３３００３〜３３０７２（追加のＰＤ−１  Ｆａｂ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３３０７３〜３５３９４（追加のＰＤ−１  ｓｃＦｖ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はＦａｂとしての形式をとることができる）および配列番号３６１２７〜３６１４６（ＰＤ−１の二価の構築物で、ｓｃＦｖまたはＦａｂのいずれかとしての形式をとることができる）が含まれる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＣＴＬＡ−４配列には、配列番号２１〜２９１８（ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はＦａｂとしての形式をとることができる）、配列番号２９１９〜６２０８（ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３６７３９〜３６８１８（追加のＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３５３９５〜３５４１６（ＣＴＬＡ−４のワンアーム構築物で、ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかとしての形式をとることができる）が含まれる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＬＡＧ−３配列には、配列番号１７１３５〜２０７６４（ＬＡＧ−３  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３６８１９〜３６９６２（追加のＬＡＧ−３  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３５４１７〜３５６０６（追加のＬＡＧ−３  Ｆａｂｓであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号２５１９４〜３２７９３（追加のＬＡＧ−３  Ｆａｂｓであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３２７９４〜３３００２（ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかとしての形式をとることができるワンアームＬＡＧ−３構築物）が含まれる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４（ＴＩＭ−３  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３７５８７〜３７６９８（追加のＴＩＭ−３  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３６３４７〜３６７０６（ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかとしての形式をとることができる二価のＴＩＭ−３構築物）が含まれる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３（ＢＴＬＡ  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３６７０７〜３６７３８（追加のＢＴＬＡ  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）が含まれる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３（ＴＩＧＩＴ  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３７４３５〜３７５８６（追加のＴＩＧＩＴ  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）が含まれる。当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になる。
【００２９】
本発明の二重特異性抗体には、配列番号３５６０７〜３５８６６および配列番号２１５２４〜２２６２０のＬＡＧ３  Ｘ  ＣＴＬＡ４構築物が含まれる。ＰＤ−１  Ｘ  ＣＴＬＡ４の構築物には、配列番号３６１６７〜３６３４６および配列番号２３３１６〜２３７３５として記載されるものが含まれる。ＰＤ−１  Ｘ  ＴＩＭ３構築物には、配列番号２５１７４〜２５１９３として記載されるものが含まれる。ＰＤ−１  Ｘ  ＬＡＧ３構築物には、配列番号３５８６７〜３６１２６および配列番号２３７３６−２５１３３として記載されるものが含まれる。ＰＤ−１  Ｘ  ＴＩＧＩＴ構築物には、配列番号２５１３４〜２５１７３として記載されるものが含まれる。ＰＤ−１  Ｘ  ＢＴＬＡ構築物には、配列番号２２７２４〜２３３１５および配列番号３６１４７−３６１６６として記載されるものが含まれる。ＣＴＬＡ４  Ｘ  ＢＴＬＡ構築物には、配列番号２２６２４〜２２７２３として記載されるものが含まれる。最後に、ＸＥＮＰ２３５５２、ＸＥＮＰ２２８４１、ＸＥＮＰ２２８４２、ＸＥＮＰ２２８４３、ＸＥＮＰ２２８４４、ＸＥＮＰ２２８４５、ＸＥＮＰ２２８４６、ＸＥＮＰ２２８４７、ＸＥＮＰ２２８４８、ＸＥＮＰ２２８４９、ＸＥＮＰ２２８５０、ＸＥＮＰ２２８５１、ＸＥＮＰ２２８５２、ＸＥＮＰ２２８５８、ＸＥＮＰ２２８５４、ＸＥＮＰＸＥＮＰ２２８５５の名前はすべて、不注意で省略された、「Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ」の表記を表題に含むべきであった。
【００３０】
Ｂ．命名法
本発明の二重特異性抗体を、いくつかの異なるフォーマットに列挙する。各ポリペプチドには固有の「ＸＥＮＰ」番号（もしくは場合によっては、「ＸＥＮＣＳ」番号）が付与されるが、当技術分野で理解されるように、より長い配列はより短い配列を含み得る。例えば、所与の配列のボトルオープナー形式のｓｃＦｖ側単量体の重鎖は第１のＸＥＮＰ番号を有し、一方でｓｃＦｖドメインは異なるＸＥＮＰ番号を有する。いくつかの分子には３つのポリペプチドがあるため、ＸＥＮＰ番号が構成要素とともに名称として使用される。したがって、ボトルオープナー形式である、分子ＸＥＮＰ２０７１７は、一般に、「ＸＥＮＰ２０７１７  ＨＣ−Ｆａｂ」、「ＸＥＮＰ２０７１７ＨＣ−ｓｃＦｖ」、および「ＸＥＮＰ２０７１７ＬＣ」と称される３つの配列、または等価物含むが、当業者は、配列アライメントによりこれらを容易に同定することができるだろう。これらのＸＥＮＰ番号は、配列表ならびに識別子にあり、図で使用される。さらに、３つの構成要素を含む１つの分子は、複数の配列識別子を生成する。例えば、Ｆａｂ単量体のリストには、完全長配列、可変重配列、可変重配列の３つのＣＤＲがあり、軽鎖には、完全長配列、可変軽配列、および可変軽配列の３つのＣＤＲがあり、ｓｃＦｖ−Ｆｃドメインには、完全長配列、ｓｃＦｖ配列、可変軽配列、３つの軽鎖ＣＤＲ、ｓｃＦｖリンカー、可変重配列、および３つの重鎖ＣＤＲがあり、ｓｃＦｖドメインを含む本明細書のすべての分子は、単一の荷電ｓｃＦｖリンカー（＋Ｈ）を使用するが、他の分子も使用できることに留意されたい。さらに、特定の可変ドメインの命名法では、「Ｈｘ．ｘｘ＿Ｌｙ．ｙｙ」タイプの形式が使用され、番号は特定の可変鎖配列の一意の識別子である。したがって、ＸＥＮＰ２２８４１のＦａｂ側の可変ドメインは、「７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４」であり、これは、可変重鎖ドメインＨ３．３０が軽鎖ドメインＬ１．３４と組み合わされたことを示す。これらの配列がｓｃＦｖとして使用される場合、名称「７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４」は、可変重鎖ドメインＨ３．３０が軽鎖ドメインＬ１．３４と組み合わされ、ＮからＣ末端に向かってｖｈ−リンカー−ｖｌ配向にあることを示す。重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの同一の配列を有するが逆順のこの分子は、「７Ｇ８＿Ｌ１．３４＿Ｈ３．３０」と名付けられる。同様に、配列表および図から明らかなように、異なる構築物は重鎖および軽鎖を「混合および適合」し得る。
【００３１】
Ｃ．定義
本出願をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的同等物を包含することを意図する。
【００３２】
本明細書において「除去」とは、活性の低下または排除を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合を切除する」とは、特定のバリアントを含有しないＦｃ領域と比較して、Ｆｃ領域アミノ酸バリアントが、開始結合の５０％未満を有することを意味し、活性を７０〜８０〜９０〜９５〜９８％超えて喪失していることが好ましく、一般に、活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲ、またはＢＬＩアッセイにおいて、検出可能な結合レベルを下回る。ＦｃγＲ結合の切除において特に使用されるものは、図５に示すものであり、これらは一般に両方の単量体に付加される。
【００３３】
本明細書で使用される「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。
【００３４】
本明細書で使用される「ＡＤＣＰ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞食作用」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的食細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応を意味する。
【００３５】
本明細書において「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」とは、ポリペプチド配列の一部として存在する場合、本明細書で考察される標的抗原と特異的に結合する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを意味する。したがって、「チェックポイント抗原結合ドメイン」は、本明細書に概説されるように標的チェックポイント抗原に結合する。当該技術分野で知られているように、これらのＣＤＲは、可変重鎖ＣＤＲ（ｖｈＣＤＲまたはＶＨＣＤＲ）の第１のセットおよび可変軽鎖ＣＤＲの第２のセット（ｖｌＣＤＲまたはＶＬＣＤＲ）として一般に存在し、各々が３つのＣＤＲ、即ち重鎖についてｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、軽鎖についてｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、可変重および可変軽鎖ドメインにそれぞれ存在し、一緒になってＦｖ領域を形成する。（ＣＤＲ付番スキームについては、表１および上記の関連する説明を参照されたい）。したがって、場合によっては、抗原結合ドメインの６つのＣＤＲには、可変重鎖および可変軽鎖ドメインが寄与する。「Ｆａｂ」フォーマットにおいて、６つのＣＤＲのセットには、２つの異なるポリペプチド配列、すなわち可変重鎖ドメイン（ｖｈまたはＶＨ、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む）および可変軽鎖ドメイン（ｖｌまたはＶＬ、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３を含む）が寄与され、このうちｖｈドメインのＣ末端が重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端と結合し、ｖｌドメインのＣ末端が定常軽鎖ドメインのＮ末端と結合している（したがって、軽鎖を形成する）。ｓｃＦｖ形式では、ｖｈおよびｖｌドメインは、一般に本明細書に概説されているように、リンカー（「ｓｃＦｖリンカー」）の使用によって、単一のポリペプチド配列に共有結合され、それは（Ｎ末端から開始して）ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈのいずれかであってよく、前者が一般的に好ましい（使用される形式（例えば、図１からのもの）に応じて、両側の任意選択的なドメインリンカーを含む）。一般に、ｓｃＦｖドメインのＣ末端は、第２の単量体のヒンジのＮ末端に結合される。
【００３６】
本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変された炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。
【００３７】
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しないかのいずれか）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、２７２位のグルタミン酸がチロシンで置換されているバリアントポリペプチド、この場合はＦｃバリアント体を指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、開始アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物発現レベルを増加させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（アルギニンをなおコードする）に交換する）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にもかかわらず、タンパク質は、それが開始される特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
【００３８】
本明細書で使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、２３３位の後、および２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後、かつ２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。
【００３９】
本明細書で使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。
【００４０】
本明細書で使用される「バリアントタンパク質」または「タンパク質バリアント」または「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するが、バリアントタンパク質は、以下に記載されるようなアライメントプログラムを使用して親タンパク質と整列しないほど多くはない。一般に、本明細書で概説するバリアントタンパク質（バリアントＦｃドメインなど）は、ＢＬＡＳＴなど、以下に説明するアラインメントプログラムを使用して親タンパク質に対して、一般に少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。
【００４１】
以下に記載するように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来の重鎖定常ドメインまたはＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、バリアントを有するヒト配列もまた、「親ポリペプチド」として機能することができ、例えば、米国公開第２００６／０１３４１０５号のＩｇＧ１／２ハイブリッドを含めることができる。本明細書のタンパク質バリアントの配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５−９８−９９％の同一性を有する。したがって、本明細書で使用される「抗体バリアント」または「バリアント抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「ＩｇＧバリアント」または「バリアントＩｇＧ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親ＩｇＧ（ここでも、多くの場合はヒトＩｇＧに由来）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「免疫グロブリンバリアント」または「バリアント免疫グロブリン」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親免疫グロブリン配列のそれとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」または「バリアントＦｃ」は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較してアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。
【００４２】
本発明のＦｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換セリンを有するＦｃバリアントであり、ここで付番はＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを有するＦｃ変異を定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は特定されていなくてもよく、その場合、前述のバリアントは４２８Ｌ／４３４Ｓと称される。置換が提供される順序は任意であり、すなわちそれは、例えばＮ４３４Ｓ／Ｍ４２８ＬはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃバリアントである、などということである。抗体に関連する本発明において論じられる全ての位置について、特に明記しない限り、アミノ酸位置の付番はＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックス、またはＫａｂａｔもしくはＥＵ付番スキームにあるようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の付番を指す。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５（これにより参照によりその全体が組み込まれる）も参照されたい。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。
【００４３】
本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。さらに、本発明の抗体を作成するポリペプチドには、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。
【００４４】
「残基」とは、本明細書で使用されるとき、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸素性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。
【００４５】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、概して２つの異なるポリペプチド鎖の（例えば、一方の鎖のＶＨ−ＣＨ１、他方の鎖のＶＬ−ＣＬ）、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、この領域単独、または本発明の二重特異性抗体との関係においてこの領域を指し得る。Ｆａｂの関連で、Ｆａｂは、ＣＨ１およびＣＬドメインに加えてＦｖ領域を含む。
【００４６】
本明細書で使用される「Ｆｖ」または「Ｆｖフラグメント」または「Ｆｖ領域」は、ＡＢＤのＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖ領域は、Ｆａｂ（上述のとおり、概して上記に概説されている定常領域も含む２つの異なるポリペプチド）とｓｃＦｖの両方としてフォーマットすることができ、ｖｌおよびｖｈドメインを（一般に、本明細書で考察されるリンカーで）組み合わせてｓｃＦｖを形成する。
【００４７】
本明細書における「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は概して、本明細書で論じられるｓｃＦｖリンカーを使用してｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変軽鎖ドメインに共有結合した可変重鎖ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって（ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈ）のいずれの向きにもあり得る。配列表および図に示す配列では、ｖｈおよびｖｌドメインの順序が名前に示される。例えば、Ｈ．Ｘ＿Ｌ．Ｙは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ｖｈ−リンカー−ｖｌ、およびＬ．Ｙ＿Ｈ．Ｘがｖｌ−リンカー−ｖｈであることを意味する。
【００４８】
本明細書で使用される「ＩｇＧサブクラス修飾」または「アイソタイプ修飾」とは、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、整合したＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６においてＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス修飾であると考えられる。
【００４９】
本明細書で使用される「天然に存在しない修飾」とは、アイソタイプ性ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ヒトＩｇＧのうちのいずれも４３４位にセリンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（またはそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、天然に生じない修飾であると見なされる。
【００５０】
本明細書で使用される「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。
【００５１】
本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用される「ＩｇＧ  Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域と結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと相同なＦｃ受容体のファミリーである、Ｆｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）が含まれる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ１９０：１２３−１３６（参照により全体が組み込まれる））。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧ  Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書で使用される「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域と結合してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００５３】
本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームであるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームであるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプであるＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプであるＶ１５８およびＦ１５８を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプであるＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照により全体が組み込まれるＪｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）、ならびに任意の発見されていないヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。当該技術分野において既知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と称される２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ−２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされている。本明細書において別段の記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させるために、そしていくつかの場合には血清半減期を増加させるために使用される様々なＦｃＲｎバリアントが使用できる。「ＦｃＲｎバリアント」とは、ＦｃＲｎへの結合を増加させるものであり、好適なＦｃＲｎバリアントを以下に示す。
【００５５】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、バリアントを生成するようにその後修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドのバリアントもしくは操作されたバージョンであってもよい。したがって、本明細書で使用される「親免疫グロブリン」とは、バリアントを生成するように修飾される非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」とは、バリアント抗体を生成するように修飾される非修飾抗体を意味する。「親抗体」には、以下に概説するように、既知の市販の組み換えで産生した抗体が含まれることに注意すべきである。このような関係では、「親Ｆｃドメイン」は、列挙されたバリアントに関連するものであり、したがって、「バリアントヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン」はヒトＩｇＧ１の親Ｆｃドメインと比較され、「バリアントヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン」は親ＦｃドメインヒトＩｇＧ４と比較される等である。
【００５６】
本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、ＩｇＧ分子のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを意味し、場合によってはヒンジを含む。ヒトＩｇＧ１のＥＵ付番では、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインはアミノ酸２３１〜４４７を含み、ヒンジは２１６〜２３０である。したがって、「Ｆｃドメイン」の定義には、アミノ酸２３１〜４４７（ＣＨ２−ＣＨ３）または２１６〜４４７（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の両方、またはそのフラグメントが含まれる。このような関係では「Ｆｃフラグメント」は、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方のより少ないアミノ酸を含有してもよいが、一般的にサイズに基づく標準的な方法（例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）を使用して検出できるように、別のＦｃドメインまたはＦｃフラグメントと二量体を形成する能力を依然として保持する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインは、本発明において、特に有用なものであり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４由来のＦｃドメインであってよい。
【００５７】
「バリアントＦｃ領域」は、親のＦｃドメインと比較したアミノ酸修飾を含む。したがって、「バリアントヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、アミノ酸修飾（切除バリアントの場合はアミノ酸欠失が含まれるが、一般的にアミノ酸置換）を含むものである。一般に、バリアントＦｃドメインは、対応する親ヒトＩｇＧＦｃドメインに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７、９８または９９パーセントの同一性を有する（以下に考察する同一性アルゴリズム（一実施形態では当技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズム）をデフォルトパラメータを用いて使用する）。代替的に、バリアントＦｃドメインは、親Ｆｃドメインと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のアミノ酸修飾を有し得る。さらに、本明細書で考察されるように、本明細書のバリアントＦｃドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載の既知の技術を使用して測定される別のＦｃドメインとともに二量体を形成する能力を依然として保持する。
【００５８】
本明細書における「重鎖定常領域」とは、可変重鎖ドメインを除く、抗体（またはそのフラグメント）のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味し、ヒトＩｇＧ１のＥＵ付番では、これはアミノ酸１１８〜４４７である。本明細書における「重鎖定常領域フラグメント」とは、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方からのアミノ酸がより少ない重鎖定常領域を意味するが、別の重鎖定常領域と二量体を形成する能力を依然として保持する重鎖定常領域を意味する。
【００５９】
本明細書で使用される「位置」は、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順番に付番されるか、または確立されたフォーマット、例えば、抗体付番のためのＥＵインデックスによって付番されてもよい。
【００６０】
「標的抗原」は、本明細書で使用されるとき、所与の抗体の可変領域を含む抗体結合ドメインによって特異的に結合される分子を意味する。以下で論じるように、本事例の場合、標的抗原はチェックポイントタンパク質である。
【００６１】
本明細書中の本発明のヘテロ二量体抗体の単量体に牽連して「撚り度（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「マッチ」する２本鎖ＤＮＡと同様に、「マッチ」してヘテロ二量体を形成する能力を保持するようにヘテロ二量体化バリアントを各単量体に組み込むことを意味する。例えば、いくつかのｐＩバリアントが単量体Ａへと操作される（例えば、ｐＩをより高くする）場合、同様に利用され得る「電荷対」である立体変異はｐＩバリアントを妨害せず、例えば、ｐＩを高くした電荷変異が同一の「鎖」または「単量体」に置かれ、両方の機能を保持する。同様に、以下により詳細に概説されるように、対のセットになる「スキュー（ｓｋｅｗ）」バリアントついて、当業者は、対の１つのセットが、どちらの鎖または単量体に入るかを決定する際に、ｐＩを考慮し、そのため、ｐＩ分離もまた、スキューのｐＩを使用して最大化される。
【００６２】
「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【００６３】
本明細書の本発明による二重特異性抗体を製造する文脈における「宿主細胞」とは、二重特異性抗体の構成要素をコードする外因性核酸を含み、好適な条件下で二重特異性抗体を発現できる細胞を意味する。好適な宿主細胞について以下で説明する。
【００６４】
本明細書で使用される「可変領域」または「可変ドメイン」とは、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成するＶκ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含み、抗原特異性を付与するＣＤＲを含有する、免疫グロブリンの領域を意味する。したがって、「可変重鎖ドメイン」は「可変軽鎖ドメイン」と対になって抗原結合ドメイン（「ＡＢＤ」）を形成する。さらに、各可変ドメインは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）（可変重鎖ドメインではｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３、可変軽鎖ドメインではｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３）と４つのフレームワーク（ＦＲ）領域とを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、次の順序で配置される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。
【００６５】
本明細書における「野生型またはＷＴ」とは、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００６６】
本発明は、ヒト抗体ドメインと配列同一性を有するいくつかの抗原結合ドメインを提供する。２つの類似する配列（抗体可変ドメインなど）間の配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［局所的相同性アルゴリズム］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆  Ｗｕｎｓｃｈ，ＣＤ．（１９７０）“Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［相同性アライメントアルゴリズム］、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４［類似性検索法］、またはＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，（１９９０）”Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ，“Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，「ＢＬＡＳＴ」アルゴリズム（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを参照されたい）などのアルゴリズムによって測定できる。前述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメータ（ウィンドウの長さ、ギャップペナルティなど）が使用される。一実施形態では、配列同一性は、デフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して測定される。
【００６７】
本発明の抗体は一般に、単離されるか、または組換えである。本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用される「単離された」とは、それが発現された細胞または細胞培養物から特定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるであろう。「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組み換え体」は、外来性宿主細胞において組み換え核酸技術を用いて抗体が生成されることを意味し、それらも単離され得る。
【００６８】
特定の抗原またはエピトープとの「特異的結合」もしくは「〜に特異的に結合する」または特定の抗原またはエピトープ「〜に対して特異的である」とは、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有さない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と同様である対照分子との競合によって決定することができる。
【００６９】
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対して少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替的に少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上のＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤとは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。
【００７０】
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は一般的に、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲまたはＢＬＩアッセイを用いて測定される。
【００７１】
Ｄ．抗体
本発明は、本明細書で論じられるような２つの異なるチェックポイント抗原に結合する二重特異性チェックポイント抗体の生成に関する。以下で考察するように、「抗体」という用語は全般的に使用される。本発明で使用される抗体は、本明細書に記載されているようにいくつかのフォーマットをとることができ、本明細書に記載され図に示される従来の抗体、および抗体誘導体、断片および模倣物を含む。
【００７２】
従来の抗体構造単位は、典型的には四量体を含む。各四量体は、典型的には、２本の同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１本の「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量）と、１本の「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量）とを有する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。本発明は、一般にＩｇＧクラスに基づく二重特異性抗体を対象とし、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４が、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。ＩｇＧ１は、３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）で多型を有する異なるアロタイプを有することに留意すべきである。本明細書に示される配列は３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプも本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプの代わりに３５６Ｄ／３５８Ｌを有することができる。
【００７３】
さらに、本明細書中の配列の多くは、位置２２０の少なくとも１つのシステインをセリンで置換したものであり、これは一般に、本明細書に記載の配列の大部分について「ｓｃＦｖ単量体」側にあるが、ジスルフィド形成を減少させるために「Ｆａｂ単量体」側、またはその両方にすることもできる。本明細書中の配列内に具体的に含まれるのは、これらのシステインの一方または両方が置換されたもの（Ｃ２２０Ｓ）である。
【００７４】
したがって、本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。例えば、参照により組み込まれる米国公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本発明は、ヒトＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドの使用である。
【００７５】
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域においておよそ、アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域においてはおよそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）からのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））ならびに／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６−１０１（ＨＣＤＲ３）を包含する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。本発明の特定のＣＤＲを以下に記載する。
【００７６】
当業者には理解されるように、ＣＤＲの正確な付番および配置は、異なる付番システムで異なり得る。しかしながら、可変重鎖および／または可変軽鎖配列の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。ＣＤＲ付番の有用な比較は以下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７（２００３）を参照されたい。
【表１】
2021502100.tif 000003
【００７７】
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ付番系は一般に、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照するときに使用され、ＥＵ付番系は、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上述（１９９１））。
【００７８】
重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」とは、抗体の第１のおよび第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２１５で終わり、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３１で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、本明細書では、位置２１６（ＩｇＧ１中のＥ２１６）〜２３０（ＩｇＧ１中のＰ２３０）を含むように定義され、付番はＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスによる。場合によっては、「ヒンジフラグメント」が使われ、それは、ヒンジドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方でより少ないアミノ酸を含有する。本明細書に記載のとおり、ｐＩバリアントはヒンジ領域にも同様に作製することができる。
【００７９】
軽鎖は、一般に、可変軽鎖ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重鎖ドメインとともにＦｖ領域を形成する）、および定常軽領域（しばしばＣＬまたはＣκと称される）の２つのドメインを含む。
【００８０】
以下に概説される追加の置換のための別の目的とする領域は、Ｆｃ領域である。
【００８１】
本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合において、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖および３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えばｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれより大きな可変軽または可変重鎖ドメインの一部であり得る。さらに、本明細書により完全に概説されているように、可変重および可変軽鎖ドメインは、重鎖および軽鎖が使用されるとき（例えば、Ｆａｂが使用されるとき）には別個のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合には単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
【００８２】
ＣＤＲは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。単一抗原が、２つ以上のエピトープを有してもよい。
【００８３】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成要素とも称される）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基、換言すると、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にあるアミノ酸残基を含み得る。
【００８４】
エピトープは、立体配座または直線状のいずれかであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸の空間的な並置によって作り出される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって作り出されるものである。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別され得る。
【００８５】
エピトープは、典型的には、固有の空間立体構造内に、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説するように、本発明は、列挙された抗原結合ドメインおよび本明細書の抗体を含むだけでなく、列挙された抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとの結合について競合するものも含む。
【００８６】
したがって、本発明は異なる抗体ドメインを提供する。本明細書中に記載され、当技術分野において既知のとおり、本発明のヘテロ二量体抗体は、重鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、Ｆａｂドメイン、およびｓｃＦｖドメインを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、任意選択的にヒンジドメイン（−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３（Ｃγ２およびＣγ３）と、ＣＨ１（Ｃγ１）とＣＨ２（Ｃγ２）の間の下部ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、カルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むように定義され、付番は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従っている。したがって、ＩｇＧに関連して「ＣＨ」ドメインは次のとおりである：「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従って位置１１８〜２１５を指す。「ヒンジ」は、ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従って位置２１６〜２３０を指す。「ＣＨ２」はＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従って位置２３１−３４０に、「ＣＨ３」はＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックスに従って位置３４１−４４７を指す。したがって、「Ｆｃドメイン」には−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインおよび、任意選択的にヒンジドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）が含まれる。本明細書の実施形態では、ｓｃＦｖがＦｃドメインに結合しているとき、Ｆｃドメインのヒンジの全部または一部に結合しているのはｓｃＦｖ構築物のＣ末端であり、例えば、それは一般にヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳに結合している。いくつかの実施形態では、以下により詳細に記載されるように、例えば本明細書に概説されるように、１つ以上のＦｃγＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への結合を変化させるために、およびヘテロ二量体の形成および精製を可能にするために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。
【００８８】
重鎖は、可変重鎖ドメインおよび定常ドメインを含み、これは、ＣＨ１−任意選択的なＣＨ２−ＣＨ３を含むヒンジ−Ｆｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽鎖定常ドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、および可変軽鎖ドメインを含む。本明細書に概説した構築物および配列のほとんどにおいて、可変重鎖のＣ末端はｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合し、そのＣ末端は可変軽鎖のＮ末端に結合している（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）が、これはスイッチすることができる（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態は、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含み、それは天然に生じないが、ｓｃＦｖリンカーによってともに連結した可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとを一般に含む。本明細書に概説するように、ｓｃＦｖドメインは、一般に、Ｎ末端からＣ末端方向にｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌであるが、これは、ｓｃＦｖドメイン（または、Ｆａｂ由来のｖｈおよびｖｌ配列を使用して構築されたドメイン）のいずれに関しても、形式に応じて片端または両端の任意のリンカーを用いて、ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈへと逆転させることができる（一般的に図１を参照されたい。）。
【００９０】
本明細書に示されるように、好適なリンカー（ドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかとして使用）にはいくつかあり、列挙されたドメインに共有結合（組み換え技術により生成される従来型ペプチド結合を含む）するために使用することができる。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で２つの分子を結合させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１〜５０アミノ酸長、好ましくは約１〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、１〜２０アミノ酸長のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では、約５〜約１０アミノ酸が使用されている。有用なリンカーには、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５７）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５８）、（ｎは少なくとも１（および一般に３〜４）の整数である）を含むグリシン−セリンポリマー、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ならびに他の可動性リンカーが含まれる。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして有用であり得る。
【００９１】
他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列を含むが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基を含まない場合があり、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２アミノ酸残基である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、ＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、および他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来してもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインをともに連結するために使用される「ドメインリンカー」である。例えば、図１Ｆにおいて、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＮ末端に結合するドメインリンカーがあってよく、別の任意のドメインリンカーはｓｃＦｖのＣ末端をＣＨ２ドメインに結合している（ただし、多くの実施形態では、このドメインリンカーとしてヒンジが使用される）。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５７）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５８）（ｎは、少なくとも１（一般に３〜４〜５）の整数である）、を含むドメインリンカーとしてグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組み換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、以下に概説する「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」に注意を払って、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、荷電ドメインリンカーを使用することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書で考察されるｖｈおよびｖｌドメインを共有結合するために使用されるｓｃＦｖリンカーである。多くの場合では、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーであり、そのいくつかは図７に示されている。したがって、本発明はさらに、第１の単量体と第２の単量体との間のｐＩの分離を促進するための荷電ｓｃＦｖリンカーを提供する。すなわち、正または負のいずれかの荷電ｓｃＦｖリンカー（または異なる単量体に対してｓｃＦｖを使用する足場の場合は両方）を組み込むことによって、Ｆｃドメインをさらに変化させずに、荷電リンカーを含む単量体はｐＩを変えることを可能にする。これらの荷電リンカーは、標準的なリンカーを含む任意のｓｃＦｖ中に置換することができる。また、当業者には理解されるように、ｐＩの所望の変化に従って、荷電ｓｃＦｖリンカーが正しい「鎖」または単量体上に使用される。例えば、本明細書で論じられるように、トリプルＦフォーマットヘテロ二量体抗体を作製するために、所望の抗原結合ドメインのそれぞれについてのＦｖ領域の元のｐＩが計算され、そしてｓｃＦｖを作製するために１つが選択され、ｐＩに応じて、正または負のリンカーのいずれかが選択される。
【００９４】
荷電ドメインリンカーも同様に、本発明の単量体のｐＩ分離を増加させるために使用することができ、したがって、
【００９５】
図７に含まれるものは、リンカーが利用される本明細書の任意の実施形態で使用することができる。
【００９６】
具体的には、図１に示す形式は、「ヘテロ二量体抗体」と称される抗体であり、タンパク質が、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己組織化した少なくとも２つの関連Ｆｃ配列、およびＦａｂとしてまたはｓｃＦｖとしてであれ少なくとも２つのＦｖ領域を有することを意味する。
【００９７】
Ｅ．キメラ抗体およびヒト化抗体
特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含み得るかまたはそれからなり得る。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することと、ヒト抗体の配列に最も近い配列である（即ち、最も高い同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンを選択することとによって（本明細書に概説される方法を使用する）、そのようなものとして同定され得る。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に生じる体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したときに、抗体をヒト配列に由来するものとして特定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％までも同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０〜２０個以下のアミノ酸差しか示さない（本明細書中の任意のスキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントの導入前、すなわち、本発明のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５個以下、またはさらには４、３、２、もしくは１個以下のアミノ酸差しか示さない場合がある（同様に、本明細書における任意のスキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントの導入前、すなわち、本発明のバリアントの導入前は、バリアントの数は一般に少ない）。
【００９８】
一実施形態では、親抗体は、当技術分野で既知のとおり、親和性成熟されたものである。構造に基づく方法が、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載されているように、ヒト化および親和性成熟のために用いられ得る。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１０）：７５３−７５９に記載される方法を含むがこれらに限定されない選択に基づく方法が抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟のために使用でき、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部のみを移植することを含んでもよく、これには、これらに限定されないが、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：１１１９−１１２５、Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：３０７６−３０８４に記載される方法が含まれ、これらは参照によりすべての内容が組み込まれる。
【００９９】
ＶＩＩ．ヘテロ二量体抗体
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己組織化してヘテロ二量体Ｆｃドメインおよびヘテロ二量体抗体を形成する、２つの異なる重鎖バリアントＦｃ配列の使用に依存するヘテロ二量体チェックポイント抗体を提供する。
【０１００】
本発明は、例えば二重特異性結合を可能にするために、２つ以上のチェックポイント抗原またはリガンドへの結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規構築物に関する。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、集合して「二量体」を構築する２つの「単量体」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下でさらに詳しく説明するとおり、各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は概して、ヘテロ二量体チェックポイント抗体の生成に関し、それはヘテロ二量体形成を促進するために、かつ／またはホモ二量体よりもヘテロ二量体の精製を容易にするために、各鎖で異なる定常領域中のアミノ酸バリアントに応じて、抗原をいくつかの方法で共結合することができるものである。
【０１０１】
したがって、本発明は二重特異性抗体を提供する。抗体技術における継続的な問題は、２つの異なる抗原に同時に結合する「二重特異性」抗体であって、一般に、異なる抗原を近接させ、新しい機能と新しい治療法をもたらすことができる、「二重特異性」抗体に対する要望である。一般に、これらの抗体は、各重鎖および軽鎖の遺伝子を宿主細胞に含めることによって作成される。これにより、一般に、２つのホモ二量体（Ａ−ＡおよびＢ−Ｂ（軽鎖ヘテロ二量体の問題は含まない））だけでなく、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）が形成される。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ホモ二量体抗体から離してヘテロ二量体抗体を精製すること、および／またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。
【０１０２】
本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができるいくつかのメカニズムが存在する。さらに、当業者には理解されるように、これらのメカニズムを組み合わせて高いヘテロ二量体化を確実にすることができる。したがって、ヘテロ二量体の産生をもたらすアミノ酸バリアントは、「ヘテロ二量体化バリアント」と称される。後述するように、ヘテロ二量体化バリアントは、ヘテロ二量体からのホモ二量体の精製を可能にする立体バリアント（例えば、後述の「ノブアンドホール」または「スキュー」バリアントおよび「電荷対」変異）ならびに「ｐＩバリアント」を含み得る。一般にＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されように、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には以下で「ヘテロ二量体化バリアント」の考察について本明細書に援用されるように、ヘテロ二量体化の有用な機構には「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」、本明細書において時折「スキュー」バリアントとして（ＷＯ２０１４／１４５８０６中の考察を参照）、「ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されているような「静電ステアリング」または「電荷対」、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されるようなｐＩ変異、およびＷＯ２０１４／１４５８０６および以下に概説されているような一般的なさらなるＦｃバリアントが含まれる。
【０１０３】
本発明において、ヘテロ二量体抗体の精製を容易にすることができるいくつかの基本的な機構が存在し、その１つは、各単量体が異なるｐＩを有することによって、Ａ−Ａ、Ａ−ＢおよびＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製が可能になるｐＩバリアントの使用に依存する。代替的に、「トリプルＦ」フォーマットなどの一部の足場フォーマットでは、サイズに基づいて分離することもできる。以下にさらに概説するように、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成を「スキューさせる」ことも可能である。したがって、立体的ヘテロ二量体化バリアントおよびｐＩバリアントまたは電荷対バリアントの組み合わせは、本発明において特に使用される。
【０１０４】
一般に、本発明において特に使用される実施形態は、スキューバリアントを含むバリアントのセットに依存し、これは、２つの単量体間でｐＩ差異を増加させるｐＩバリアントと組み合わせて、ホモ二量体化形成より優先してヘテロ二量体化形成を促し、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体の精製を容易にする。
【０１０５】
さらに、以下により詳細に概説されるように、ヘテロ二量体抗体の形式に応じて、ｐＩバリアントは単量体の定常ドメインおよび／またはＦｃドメイン内に含まれるか、またはドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかである荷電リンカーを使用され得る。すなわち、トリプルＦ形式などのｓｃＦｖ（複数可）を利用する足場には、精製目的でさらにｐＩを高めることができる、荷電ｓｃＦｖリンカー（正または負のいずれか）を含めることができる。当業者によって理解されるように、いくつかのトリプルＦ形式では、帯電ｓｃＦｖリンカーのみで、追加のｐＩ調整なしで有用であるが、本発明は、単量体の一方または両方にあるｐＩバリアント、および／または荷電ドメインリンカーも提供する。さらに、代替の機能性のためのさらなるアミノ酸操作もまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯバリアントなどのｐＩ変化を付与し得る。
【０１０６】
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてｐＩを利用する本発明においては、アミノ酸変異を一方または両方の単量体のポリペプチドに導入することができ、すなわち、単量体の一方（本明細書では簡単のために「単量体Ａ」と呼ぶ）のｐＩを単量体Ｂと異なるように操作でき、または、単量体ＡとＢの両方の変化を、単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを減少させるように改変できる。論じられるように、いずれかまたは両方の単量体のｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば中性アミノ酸を正または負に荷電したアミノ酸残基で置換する、例えばグリシンからグルタミン酸）、荷電残基を正または負から反対の電荷への変更することによって（例えばアスパラギン酸からリジンへ）、または荷電残基を中性残基への変更することよって（例えば電荷の消失、リジンからセリン）、実施することができる。いくつかのこれらのバリアントを図に示す。
【０１０７】
したがって、本発明のこの実施形態は、ヘテロ二量体をホモ二量体から分離することができるように、少なくとも１つの単量体に十分なｐＩの変化を生じさせることを提供する。当業者には理解されるように、そして以下にさらに論じるように、これは、「野生型」重鎖定常領域およびそのｐＩ（ｗｔＡ−＋ＢまたはｗｔＡ−−Ｂ）を増加または減少させるように操作された変異領域を使用することによって、または一方の領域を増加して他方の領域を減少させることによって（Ａ＋−Ｂ−またはＡ−Ｂ＋）、実施できる。
【０１０８】
したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、二量体タンパク質の単量体の両方ではないにしても少なくとも一方の等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩバリアント」または「ｐＩ置換」）を単量体の一方または両方に組み込むことによって、変化させて「ｐＩ抗体」を形成することを目的とする、抗体の定常領域におけるアミノ酸バリアントである。本明細書中に示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５以上異なるものがすべて本発明において使用される。
【０１０９】
当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各単量体または両単量体（複数可）に含まれるべきｐＩバリアントの数は、構成要素の出発ｐＩ、例えばトリプルＦ形式における目的のｓｃＦｖおよびＦａｂの出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」か（例えば、より正またはより負）を決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列を計算し、そこから決定される。当技術分野において既知のように、異なるＦｖは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各単量体の総ｐＩ差をもたらすように操作され、本明細書に概説されるように０．２〜０．５が好ましい。
【０１１０】
さらに、当業者には理解され、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体はサイズに基づいてホモ二量体から分離することができる。図１に示すように、例えば、形式のいくつかは、サイズに基づいてヘテロ二量体およびホモ二量体の分離を可能にする。
【０１１１】
Ａ．ヘテロ二量体化バリアント
本発明は、ヘテロ二量体形成および／またはホモ二量体からの精製を可能にするためにヘテロ二量体化バリアントを利用する、様々な形式のヘテロ二量体抗体を含む、ヘテロ二量体タンパク質を提供する。
【０１１２】
ヘテロ二量体化スキューバリアントのセットのいくつかの好適な対がある。これらのバリアントは、「セット」の「対」になる。すなわち、一方のセットの対が第１の単量体に組み込まれ、他のセットの対が第２の単量体に組み込まれる。注目すべきは、これらのセットは、一方の単量体上の残基と他方の単量体上の残基との間で一対一の対応関係を有する「ノブインホール」バリアントとして必ずしも振舞わないことであり、すなわち、これらのセットの対は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げる２つの単量体間の境界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体の割合を予想の５０％（２５％ホモ二量体Ａ／Ａ：５０％ヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％ホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく９０％以上にする。
【０１１３】
Ｂ．立体バリアント
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体の形成は、立体バリアントの付加によって促進され得る。すなわち、各重鎖中のアミノ酸を変えることによって、異なる重鎖が会合して同一のＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりもヘテロ二量体構造を形成する可能性が高い。図には、好適な立体バリアントが含まれる。
【０１１４】
１つの機構は、当該技術分野において一般的に「ノブアンドホール」と称され、ヘテロ二量体形成を有利にし、ホモ二量体形成を不利にする立体効果をもたらすアミノ酸操作を指し、任意選択的に使用することもできる；これは時折、「ノブアンドホール」と称され、ＵＳＳＮ  ６１／５９６，８４６、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号に記載されるようなものであり、それらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「単量体Ａ−単量体Ｂ」対を特定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール（ｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ）」変異は、ヘテロ二量体化に対するスキュー形成へのジスルフィド結合と組み合わせることができる。
【０１１５】
ヘテロ二量体の生成に使用される追加のメカニズムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、時折「静電ステアリング」と称される。これは、本明細書において、時折「電荷対」と称される。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロ二量体化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらは、ｐＩ、すなわち精製にも影響を及ぼす可能性があり、したがって場合によってはｐＩバリアントと見なすこともできる。しかしながら、これらはヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体バリアント」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「単量体の対応セットである）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１６】
さらなる単量体Ａおよび単量体Ｂのバリアントは、本明細書に概説されるｐＩバリアントまたは参照によりその図、説明文および配列番号それらの全てが本明細書に明示的に組み込まれるＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７に示される他の立体バリアントなどの他のバリアントと、任意の量で任意選択的にかつ独立して組み合わせることができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される立体バリアントは、任意のｐＩバリアント（またはＦｃバリアント、ＦｃＲｎバリアント等の他のバリアント）を一方または両方の単量体に任意選択的にかつ独立して組み込むことができ、本発明のタンパク質に独立してかつ任意選択的に含むかまたは除外することができる。
【０１１８】
好適なスキューバリアントのリストが図３に見られおよび図８は多くの実施形態における特に有用性のいくつかの対を示す。多くの実施形態において特に有用であるのは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択的に架橋ジスルフィドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）を含むがこれらに限定されないセットの対である。命名法に関して、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、一方の単量体が二重バリアントセットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が二重バリアントセットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味し、上述のように、これらの対の「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は出発ｐＩに依存する。
【０１１９】
Ｃ．ヘテロ二量体のｐＩ（等電点）バリアント
一般に、当業者には理解されるように、ｐＩ変異には２つの一般的なカテゴリーがある：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）とタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）。本明細書中に記載されるように、これらの変異の全ての組み合わせがなされ得る：一方の単量体は野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さない変異であり得、他方がより塩基性またはより酸性のいずれかであり得る。代替的に、各単量体は、１つがより塩基性に、１つがより酸性へと変化する。
【０１２０】
ｐＩバリアントの好ましい組み合わせを図４に示す。本明細書に概説し、図に示すように、これらの変化はＩｇＧ１と比較して示されているが、すべてのアイソタイプをこのように変更することができ、アイソタイプハイブリッドも同様である。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４に由来する場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑもまた使用され得る。
【０１２１】
一実施形態において、例えば図１Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩ形式において、ｐＩバリアントの好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１に対しての場合、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つの単量体（負のＦａｂ側）と、（ＧＫＰＧＳ）４（配列番号３７７５５）を含む正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）とを有する。しかしながら、当業者によって理解されるように、第１の単量体は、位置２０８を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物（例えば、ドメインの１つにＣＨ１ドメインを利用しないヘテロ二量体抗体の場合、たとえば、図１Ｂ、Ｃ、またはＤに示されているようなデュアルｓｃＦｖ形式または「ワンアーム」形式の場合）において、好ましい負のｐＩバリアントＦｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１に対しての場合、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。
【０１２２】
したがって、いくつかの実施形態では、一方の単量体は図４からの置換のセットを有し、他方の単量体は荷電リンカー（形式に示されるように、その単量体がｓｃＦｖまたは荷電ドメインリンカーを含むため荷電ｓｃＦｖリンカーの形式のいずれかで、図７に示されているものから選択できる）を有する。
【０１２３】
１．同型変異体
さらに、本発明の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、バリアントに望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減または排除する。これらのいくつかは、米国公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示され、参照により本明細書に組み込まれる。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（または上昇）し、さらにより長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入すると、得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。以下に記載されるように、いくつかのアミノ酸置換は一般に、バリアント抗体のｐＩに顕著な影響を与えるために必要とされる。しかしながら、ＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることが以下に論じられるように留意されるべきである。
【０１２４】
他の実施形態では、非アイソタイプのアミノ酸変化を行って、（例えば、高ｐＩのアミノ酸から低ｐＩのアミノ酸へと変化させることによって）得られるタンパク質の全体的な荷電状態を低下させるか、または以下でさらに詳細に説明する安定性等のための構造の調整を可能にする。
【０１２５】
さらに、重定常ドメインと軽定常ドメインの両方をｐＩ操作することによって、ヘテロ二量体の各単量体における顕著な変化を見ることができる。本明細書で考察されるように、２つの単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることが、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に高感度な他の方法による分離を可能する。
【０１２６】
Ｄ．ｐＩの計算
各単量体のｐＩは、バリアント重鎖定常ドメインのｐＩおよび全単量体のｐＩに依存し、バリアント重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを用いて、バリアント重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で論じるように、どの単量体を操作するかは概して、Ｆｖおよび足場の固有のｐＩによって決定される。代替的に、各単量体のｐＩを比較することができる。
【０１２７】
Ｅ．より良好なインビボ結合のＦｃＲｎも付与するｐＩバリアント
ｐＩバリアントが単量体のｐＩを減少させる場合、それらはインビボでの血清保持を改善するというさらなる利点を有することができる。
【０１２８】
まだ検討中ではあるが、エンドソームにおいてｐＨ６でＦｃＲｎに結合するとＦｃが捕捉されるため、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられている（Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８、参照によりその全体が組み込まれる）。次いでエンドソーム区画はＦｃを細胞表面にリサイクルする。区画が細胞外空間に開くと、約７．４のより高いｐＨが、血中へのＦｃの放出を誘導する。マウスにおいて、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合が増加したＦｃ変異は、実際に血清濃度を低下させおよび野生型Ｆｃと同一の半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０、参照によりその全体が組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの親和性の増加は、血中へのＦｃの放出を妨げると考えられる。したがって、インビボでのＦｃの半減期を増加させるＦｃ変異は、理想的には、より高いｐＨでのＦｃの放出をなお可能にしながら、より低いｐＨでのＦｃＲｎ結合を増加させる。アミノ酸ヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲でその荷電状態を変化させる。それ故、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な位置にＨｉｓ残基を見出すことは驚くべきことではない。
【０１２９】
最近、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体は、より長い血清半減期も有する可能性があることが示唆されている（Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２、参照によりその全体が組み込まれる）。しかし、このメカニズムはまだよくわかっていない。さらに、可変領域は抗体ごとに異なる。本明細書に記載されるように、ｐＩが低下し半減期が延長された定常領域バリアントは、抗体の薬物動態特性を改善するためのよりモジュール化されたアプローチを提供するであろう。
【０１３０】
Ｆ．追加の機能性のための追加のＦｃバリアント
ｐＩアミノ酸変異に加えて、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合の改変、ＦｃＲｎ受容体への結合の改変等を含むがこれらに限定されない、様々な理由で実施することができるいくつかの有用なＦｃアミノ酸修飾が存在する。
【０１３１】
したがって、本発明のタンパク質は、ｐＩバリアントおよび立体バリアントを含む、本明細書に概説したヘテロ二量体化バリアントを含むアミノ酸修飾を含むことができる。バリアントの各セットは独立して任意選択的に特定のヘテロ二量体タンパク質に含み得るかまたはそれから除外し得る。
【０１３２】
Ｇ．ＦｃγＲバリアント
ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を改変するために実施され得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、すなわち、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応）の増加をもたらすことが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への結合の減少も有益であり得る。本発明で使用されるアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６に列挙されるものが含まれ、それらのすべてはその全体が、具体的にはそこで開示されるバリアントが参照により、明示的に本明細書に組み込まれる。使用される特定のバリアントには、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、および２９９Ｔが含まれるがこれらに限定されない。
【０１３３】
さらに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示されているように、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない、ＦｃＲｎ受容体への結合の増加および血清半減期の増加に利用される追加のＦｃ置換が存在する。
【０１３４】
Ｈ．切除バリアント
同様に、機能性バリアントの別のカテゴリーは「ＦｃγＲ切除バリアント」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）」バリアントである。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、１つ以上またはすべてのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減または除去して、追加の作用機序を回避することが望ましい。これは、例えば、多くの実施形態において、特に、Ｆｃドメインのうちの１つが１つ以上のＦｃγ受容体切除バリアントを含むように、ＦＣγＲＩＩＩａ結合を切除してＡＤＣＣ活性を排除または顕著に減少させることが望ましい二重特異性免疫調節抗体の使用においてである。これらの切除バリアントは、図５に示され、それぞれは、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される切除バリアントを用いる好ましい態様で、独立して任意選択的に含まれるか除外することができる。本明細書で言及される切除バリアントは、ＦｃγＲ結合を切除するが、ＦｃＲｎ結合を切除しないことに留意されたい。
【０１３５】
当技術分野で知られているように、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインはＦｃγ受容体への結合が最も高く、したがってヘテロ二量体抗体の骨格の定常ドメイン（またはＦｃドメイン）がＩｇＧ１である場合、切除バリアントを使用できる。代替的に、またはＩｇＧ１バックグラウンドの切除バリアントに加えて、グリコシル化位置２９７（一般にＡまたはＳへの）での変異は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を有意に切除することができる。ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、Ｆｃγ受容体への結合が自然に低下しているため、これらの骨格は、切除バリアントの有無にかかわらず使用できる。
【０１３６】
Ｉ．ヘテロ二量体とＦｃバリアントの組み合わせ
当業者には理解されるように、列挙されたヘテロ二量体化バリアント（スキューバリアントおよび／またはｐＩバリアントを含む）はすべて、それらの「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」または「単量体分割」を保持する限り、任意の方法で任意選択的にかつ独立して組み合わせることができる。さらに、これらのバリアントはすべて、ヘテロ二量体化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。
【０１３７】
ｐＩバリアントの場合、特に使用される実施形態が図面に示されているが、精製を促進するために２つの単量体間のｐＩの差異を変えるという基本的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。
【０１３８】
さらに、ヘテロ二量体化変異、スキュー、およびｐＩのいずれも、本明細書で一般的に概説されるように、Ｆｃ除去変異、Ｆｃ変異、ＦｃＲｎ変異と独立して任意選択的に組み合わせることができる。図６に、好ましい組み合わせを示す。
【０１３９】
標的抗原への抗原結合ドメイン
本発明の二重特異性抗体は、図１に一般的に示されるように、二価、二重特異性形式または三価、二重特異性形式のいずれかで、２つの異なる標的抗原（「標的対」）に結合する２つの異なる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を有する。本発明において、二重特異性ヘテロ二量体抗体は、一方の側でヒトＰＤ−１を標的とし、もう一方の側で、それらの配列を図２に示す、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡから選択される第２の抗原を標的とする。したがって、好適な二重特異性抗体は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡならびにＰＤ−１およびＩＣＯＳに結合する。一般に、これらの二重特異性抗体は「抗ＰＤ−１  Ｘ  抗ＣＴＬＡ−４」と呼ばれるか、一般に単純化されて、または簡単に（したがって交換可能に）各ペアの「ＰＤ−１  Ｘ  ＣＴＬＡ−４」などと呼ばれることに注意されたい。ここで指示されていない限り、名前の抗原リストの順序は構造を与えないことに注意されたく、すなわち、ＰＤ−１  Ｘ  ＣＴＬＡ−４ボトルオープナー抗体はｓｃＦｖをＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４に結合させることができるが、場合によっては、指示されているとおりの順序で構造が特定される。
【０１４０】
本明細書でより詳細に概説されるように、ＡＢＤのこれらの組み合わせは、以下に概説されるように、一般に一方のＡＢＤがＦａｂ形式であり、他方がｓｃＦｖ形式である組み合わせで、様々な形式であり得る。ここで説明し、図１に示すように、一部の形式は単一のＦａｂと単一のｓｃＦｖを使用し（図１Ａ、ＣおよびＤ）、一部の形式は２つのＦａｂと単一のｓｃＦｖを使用する（図１Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩ）。
【０１４１】
ＶＩＩＩ．抗原結合ドメイン
本明細書で論じられるように、本発明の二重特異性ヘテロ二量体抗体は、それぞれが異なる標的タンパク質に結合する２つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む。本明細書で概説するように、これらのヘテロ二量体抗体は、二重特異性および二価（各抗原は、例えば、図１Ａに示される形式で単一のＡＢＤによって結合される）、または二重特異性および三価（例えば、図１Ｆに示すように、１つの抗原は単一のＡＢＤによって結合され、他は２つのＡＢＤによって結合される）であり得る。
【０１４２】
さらに、一般に、ＡＢＤのうちの１つは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌまたはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈのＮ末端からＣ末端への方向で、本明細書に概説されるようなｓｃＦｖを含む。方式に応じて、他のＡＢＤのうちの１つまたは両方は一般にＦａｂであり、１つのタンパク質鎖にｖｈドメイン（一般的に重鎖の構成要素として）と別のタンパク質鎖にｖｌドメイン（一般的に軽鎖の構成要素として）を含む。
【０１４３】
本発明は、以下に概説するように、いくつかの異なる標的タンパク質に結合するいくつかのＡＢＤを提供する。当業者によって理解されるように、６つのＣＤＲまたはｖｈおよびｖｌドメインの任意のセットは、ｓｃＦｖ形式またはＦａｂ形式であり得、それは次に、重定常ドメインがバリアントを含む（ＣＨ１ドメインとＦｃドメイン内を含む）、重および軽定常ドメインに追加される。配列リストに含まれるｓｃＦｖ配列は特定の荷電リンカーを利用するが、ここで概説するように、図７に示されるものを含めて、非荷電または他の荷電リンカーを使用できる。
【０１４４】
さらに、上記で考察されるように、ＣＤＲの識別のために配列リストで使用される付番はＫａｂａｔであるが、表１に示すように、ＣＤＲのアミノ酸配列を変更する別の付番を使用できる。
【０１４５】
本明細書に記載されているすべての可変重鎖および軽鎖ドメインについて、さらなるバリアントを作製することができる。本明細書で概説されるように、いくつかの実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、０、１、２、３、４または５のアミノ酸修飾（特に使用されるアミノ酸置換による）を有し、ならびに、可変重鎖および軽鎖ドメインのフレームワーク領域であって、このフレームワーク（ＣＤＲを除く）が、図と説明文が組み込まれている米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されているもの（その図および説明文は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）から選択されたヒト生殖系列配列と少なくとも約８０、８５、または９０％の同一性を保持している限りにおいてそのフレームワーク領域の変化を、有することができる。したがって、例えば、フレームワーク領域が米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されたものから選択されたヒト生殖系列配列と少なくとも８０、８５または９０％の同一性を保持している限り、本明細書に記載の同一のＣＤＲをヒト生殖系列配列由来の異なるフレームワーク配列と組み合わせることができる。代替的に、ＣＤＲはアミノ酸修飾（たとえば、ＣＤＲのセット内の１、２、３、４、または５アミノ酸修飾（すなわち、ＣＤＲは、６つのＣＤＲのセット内の変更の総数が６アミノ酸未満の修飾である限り、修飾でき、ＣＤＲの任意の組み合わせが変更され、例えば、ｖｌＣＤＲ１で１つの変更、ｖｈＣＤＲ２で２つ、ｖｈＣＤＲ３で何も変更されないなど））を有することができ、およびフレームワーク領域が、米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されたものから選択されたヒト生殖系列配列と少なくとも８０、８５または９０％の同一性を保持している限り、フレームワーク領域の変更を有する。
【０１４６】
Ａ．ＰＤ−１抗原結合ドメイン
本発明の実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはヒトＰＤ−１に結合する。参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／２１８７０７号、具体的には、抗ＰＤ−１配列を示す図、説明文および配列識別子は、他のチェックポイント阻害剤に対するＡＢＤと組み合わせて使用できる多数の抗ＰＤ−１  ＡＢＤの概要を説明する。しかしながら、本開示は、図１３、１５、１６、１８、２０、２１、２４、３３および４０に示される、１Ｃ１１クローンに基づく追加の抗ＰＤ−１  ＡＢＤを対象とする。
【０１４７】
当技術分野で知られているように、可変ドメインの安定性は、形式に基づいて変化する可能性がある。つまり、Ｆａｂ形式で識別しおよび／または有用なＶＨドメインとＶＬドメインは、ｓｃＦｖ形式では安定性が低く、このため安定性を高めるためにときには追加の操作が行われる（例えば、Ｔｍ）。
【０１４８】
有用な実施形態では、本発明は、アミノ酸配列ＨＹＧ（Ｍ／Ｉ）Ｎを含むＶＨＣＤＲ１、アミノ酸配列ＷＩＮＴ（Ｙ／Ｈ）ＴＧＥＰ（Ｔ／Ｙ）ＹＡ（Ｄ／Ｐ）ＧＦ（Ｔ／Ｑ）（Ｇ／Ｅ）を含むＶＨＣＤＲ２、アミノ酸配列ＤＹ（Ｆ／Ｙ）ＧＳＳＰＹを含むＶＨＣＤＲ３、アミノ酸配列ＶＬＣＤＲ１  Ｒ（Ｓ／Ａ）ＳＱＳＩＶ（Ｆ／Ｈ）ＳＮＧＮＴＹＬＥを含むＶＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＫＶＳＮＲＦ（Ｓ／Ｔ）を含むＶＬＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＦＱＧＳＨＶＰＮを含むＶＨＣＤＲ３、を含む抗ＰＤ−１  ＡＢＤを提供する。知られているように、「（Ｓ／Ｔ）」と表示されているアミノ酸は、どちらかのアミノ酸がこの位置にある可能性があることを意味する。さらに、＊＊ＧＧを含む
【０１４９】
有用な実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ヒトＰＤ−１に対するＡＢＤを含む。これらの実施形態では、ＰＤ−１への結合を与える６つのＣＤＲは、図１３、１５、１６、１８、２０、２１、２４、３３および４０のいずれかに示されるものから選択される。代替的に、これらの実施形態では、ＰＤ−１への結合を与えるＶＨおよびＶＬドメインは、図１３、１５、１６、１８、２０、２１、２４、３３および４０のいずれかに示されるものから選択される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆａｂ形式のＰＤ−１に対するＡＢＤを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１に対するＡＢＤは、図１３、１６、１８、２０、２１、２４、３３および４０の任意のＡＢＤの６つのＣＤＲ、または図１３、１６、１８、２０、２１、２４、３３および４０の任意のＡＢＤからのＶＨおよびＶＬドメインを含む。
【０１５１】
ＰＤ−１に対するＦａｂ  ＡＢＤを有する多くの実施形態において特に有用なものは、図２４のＸＥＮＰ２６９４０  １Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．３０３＿Ｌ３．１５２のＡＢＤである。したがって、ＸＥＮＰ０２６９４０からの６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインは、本発明の構築物において使用され得る。
【０１５２】
ＰＤ−１に対するＦａｂ  ＡＢＤを有する多くの実施形態で特に有用なものは、図４０のＸＥＮＰ２８６５２  １Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．３２８＿Ｌ３．１５３のＡＢＤである。したがって、ＸＥＮＰ２８６５２からの６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインは、本発明の構築物において使用され得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ｓｃＦｖ形式のＰＤ−１に対するＡＢＤを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１に対するＡＢＤは、図１５の任意のＡＢＤの６つのＣＤＲ、または図１５の任意のＡＢＤからのＶＨおよびＶＬドメインを含む。
【０１５４】
図１５に示すように、ＰＤ−１に対するｓｃＦｖ  ＡＢＤを有する多くの実施形態で特に有用なものは、ＸＥＮＰ０２５８０６  １Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２３４＿Ｌ３．１４４のＡＢＤである。したがって、ＸＥＮＰ０２５８０６からの６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインは、本発明の構築物において使用され得る。
【０１５５】
図１５に示すように、ＰＤ−１に対するｓｃＦｖ  ＡＢＤを有する多くの実施形態で特に有用なものは、ＸＥＮＰ０２５８１２  １Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４０＿Ｌ３．１４８のＡＢＤである。したがって、ＸＥＮＰ０２５８１２からの６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインは、本発明の構築物において使用され得る。
【０１５６】
図１５に示すように、ＰＤ−１に対するｓｃＦｖ  ＡＢＤを有する多くの実施形態で特に有用なものは、ＸＥＮＰ０２５８１３  １Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４１＿Ｌ３．１４８のＡＢＤである。したがって、ＸＥＮＰ０２５８１３からの６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインは、本発明の構築物において使用され得る。
【０１５７】
図１５に示すように、ＰＤ−１に対するｓｃＦｖ  ＡＢＤを有する多くの実施形態で特に有用なものは、ＸＥＮＰ０２５８１９  １Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．２４１＿Ｌ３．９２のＡＢＤである。したがって、ＸＥＮＰ０２５８１９からの６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインは、本発明の構築物において使用され得る。
【０１５８】
Ｂ．ＣＴＬＡ−４抗原結合ドメイン
当業者に理解されるように、二重特異性抗体の作製において、任意の数の抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤ配列を本発明のｓｃＦｖ抗ＰＤ−１配列と組み合わせて使用することができる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＣＴＬＡ−４配列には、配列番号２１〜２９１８（ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はＦａｂとしての形式をとることができる）、配列番号２９１９〜６２０８（ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３６７３９〜３６８１８（追加のＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３５３９５〜３５４１６（ＣＴＬＡ−４のワンアーム構築物で、ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかとしての形式をとることができる）が含まれる。当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列表の配列番号３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７ならびに３６８１１および３６８１５の対から選択される。
【０１６０】
本発明において特に興味深いのは、ＶＨ（配列番号３８１３４、ＶＨＣＤＲ（配列番号３８１３５、３８１３６および３８１３７を含む）およびＶＬ（配列番号３８１３８、ＶＬＣＤＲ（配列番号３８１３９、３８１４０および３８１４１を含む）を含む、ＣＴＬＡ−４  Ｈ３＿Ｌ０．２２のＦａｂ  ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤの配列である。
【０１６１】
Ｃ．ＬＡＧ−３抗原結合ドメイン
当業者に理解されるように、二重特異性抗体の作製において、任意の数の抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤ配列を本発明のｓｃＦｖ抗ＰＤ−１配列と組み合わせて使用することができる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＬＡＧ−３配列には、配列番号１７１３５〜２０７６４（ＬＡＧ−３  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３６８１９〜３６９６２（追加のＬＡＧ−３  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３５４１７〜３５６０６（追加のＬＡＧ−３  Ｆａｂｓであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号２５１９４〜３２７９３（追加のＬＡＧ−３  Ｆａｂｓであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３２７９４〜３３００２（ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかとしての形式をとることができるワンアームＬＡＧ−３構築物）が含まれる。当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５と３６９５９の対から選択される。
【０１６３】
本発明において特に興味深いのは、ＶＨ（配列番号３２７５５、ＶＨＣＤＲ（配列番号３２７５６、３２７５７および３２７５８を含む）およびＶＬ（配列番号３２７６０、ＶＬＣＤＲ（配列番号３２７６１、３２７６２および３２７６３を含む）を含む、ＸＥＮＰ２２５９４のＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ＡＢＤの配列である。
【０１６４】
本発明において特に興味深いのは、ＶＨ（配列番号２８８１５、ＶＨＣＤＲ（配列番号２８８１６、２８８１７、および２８１１８を含む）およびＶＬ（配列番号２８８２０、ＶＬＣＤＲ（配列番号２８８２１、２８８２２および２８８２３を含む）を含む、ＸＥＮＰ２２６５６のＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ＡＢＤの配列である。
【０１６５】
Ｄ．ＴＩＭ−３抗原結合ドメイン
当業者に理解されるように、二重特異性抗体の作製において、任意の数の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ配列を本発明のｓｃＦｖ抗ＰＤ−１配列と組み合わせて使用することができる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４（ＴＩＭ−３  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３７５８７〜３７６９８（追加のＴＩＭ−３  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３６３４７〜３６７０６（ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかとしての形式をとることができる二価のＴＩＭ−３構築物）が含まれる。当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になる。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤは、配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される。
【０１６７】
本発明において特に興味深いのは、ＶＨ（配列番号３６５０８、ＶＨＣＤＲ（配列番号３６５０９、３６５１０、および３６５１１を含む）およびＶＬ（配列番号３６５１３、ＶＬＣＤＲ（配列番号３６５１４、３６５１５および３６５１６を含む）を含む、ＸＥＮＰ２１１８９の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列である。
【０１６８】
Ｅ．ＢＴＬＡ抗原結合ドメイン
当業者に理解されるように、二重特異性抗体の作製において、任意の数の抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤ配列を本発明のｓｃＦｖ抗ＰＤ−１配列と組み合わせて使用することができる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３（ＢＴＬＡ  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３６７０７〜３６７３８（追加のＢＴＬＡ  Ｆａｂであるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）が含まれる。当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本発明で使用される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤは、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７ならびに３６７６１および３６７３５の対から選択される。
【０１７０】
本発明において特に興味深いのは、ＶＨ（配列番号２０９３６、ＶＨＣＤＲ（配列番号２０９３７、２０９３８、および２０９３９を含む）およびＶＬ（配列番号２０９４１、ＶＬＣＤＲ（配列番号２０９４２、２０９４３および２０９４４を含む）を含む、ＸＥＮＰ２０２６９の抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤのＦａｂ配列である。
【０１７１】
Ｆ．ＩＣＯＳ抗原結合ドメイン
当業者に理解されるように、二重特異性抗体の作製において、任意の数の抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ配列を本発明のｓｃＦｖ抗ＰＤ−１配列と組み合わせて使用することができる。ＡＢＤとしての使用に適した抗ＩＣＯＳ配列には、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれ、具体的には説明文および図１９、２０および２４、その中に示される配列にあるＵＳ２０１８／０１２７５０１に開示されている多くのもの、ならびに命名法で示されているいくつかのＩＣＯＳ  Ｆａｂ配列（重鎖ＶＨ１−ＣＨ１および軽鎖ＶＬ１−ＣＬ）を含有するＵＳ２０１８／０１２７５０１からの配列番号２７８６９〜２８０８６が含まれる。当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明で使用される抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤは、ＵＳ２０１８／０１２７５０１からの配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２および２６３５３および２６３５８の対から選択される。
【０１７３】
本発明において特に興味深いのは、ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０を含む、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤのＦａｂ配列である。
【０１７４】
本発明において特に興味深いのは、ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０を含む、図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤのＦａｂ配列である。
【０１７５】
Ｇ．ＴＩＧＩＴ抗原結合ドメイン
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。
【０１７６】
ＩＸ．一価抗ＰＤ−１抗体
さらに、当業者によって理解されるように、本明細書に概説される新規のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二量体二重特異性形式の両方で使用され得る。
【０１７７】
したがって、本発明は、図からの６つのＣＤＲおよび／またはｖｈおよびｖｌ配列を含み、一般にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域を有する、モノクローナル（単一特異性）抗体を提供し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換を含むＩｇＧ４定常領域を含む）を有する場合、いくつかの実施形態において特に使用される。すなわち、本明細書で「Ｈ＿Ｌ」の名称を有する任意の配列は、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域に連結することができる。
【０１７８】
Ａ．抗ＰＤ−１モノクローナル抗体
当業者によって理解されるように、本明細書に概説される新規のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二量体二重特異性形式の両方で使用され得る。したがって、本発明は、図からの６つのＣＤＲおよび／またはｖｈおよびｖｌ配列を含み、一般にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域を有する、モノクローナル（単一特異性）抗体を提供し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換を含むＩｇＧ４定常領域を含む）を有する場合、いくつかの実施形態において特に使用される。すなわち、本明細書で「Ｈ＿Ｌ」の名称を有する任意の配列は、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域に連結することができる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、図１３、１６、１８、２０、２１、２４、３３および４０に示されるものから選択される。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、抗体は図２４のＸＥＮＰ２６９４０  １Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．３０３＿Ｌ３．１５２からのＶＨおよびＶＬドメインを含む。したがって、ＸＥＮＰ０２６９４０からの６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインは、モノクローナル抗体の作製に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＸＥＮＰ０２６９４０からのＶＨおよびＶＬは、ＩｇＧ１定常ドメインとともに使用することができる。いくつかの実施形態では、ＸＥＮＰ０２６９４０からのＶＨおよびＶＬは、追加のＦｃバリアント、特に４２８Ｌ／４３４Ｓ  ＦｃＲｎバリアントを含み得るＩｇＧ１定常ドメインと共に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＸＥＮＰ０２６９４０からのＶＨおよびＶＬは、ＩｇＧ４定常ドメイン、特にＳ２２８Ｐアミノ酸置換と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はＸＥＮＰ０２６９４０である。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、抗体は、図４０のＸＥＮＰ２８６５２  １Ｃ１１［ＰＤ−１］＿Ｈ３．３２８＿Ｌ３．１５３からのＶＨおよびＶＬドメインを含む。したがって、ＸＥＮＰ２８６５２からの６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインは、モノクローナル抗体の作製に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＸＥＮＰ２８６５２からのＶＨおよびＶＬは、ＩｇＧ１定常ドメインとともに使用することができる。いくつかの実施形態では、ＸＥＮＰ２８６５２からのＶＨおよびＶＬは、追加のＦｃバリアント、特に４２８Ｌ／４３４Ｓ  ＦｃＲｎバリアントを含み得るＩｇＧ１定常ドメインと共に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＸＥＮＰ２８６５２からのＶＨおよびＶＬは、ＩｇＧ４定常ドメイン、特にＳ２２８Ｐアミノ酸置換と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、抗体はＸＥＮＰ２８６５２である。
【０１８２】
Ｘ．本発明の有用な形式
当業者には理解され、以下でより詳細に説明するように、概して図１に示すように、本発明の二重特異性ヘテロ二量体抗体は、多種多様な立体配置をとることができる。いくつかの図は、「シングルエンド型」立体配置を示し、分子の一方の「アーム」には１つのタイプの特異性があり、他方の「アーム」には異なる特異性がある。他の図は、「デュアルエンド型」立体配置を示し、分子の「上部」に少なくとも１つのタイプの特異性があり、分子の「底部」に１つ以上の異なる特異性がある。したがって、本発明は、異なる第１および第２の抗原を共結合させる新規な免疫グロブリン組成物に関する。
【０１８３】
当業者には理解されるように、本発明のヘテロ二量体形式は、異なる価数を有し得るとともに、二重特異性であり得る。すなわち、本発明のヘテロ二量体抗体は、二価かつ二重特異性であり得、ここで、一方のチェックポイント標的は、一方のＡＢＤによって結合され、他方のチェックポイント標的は、第２のＡＢＤによって結合される。ヘテロ二量体抗体はまた、三価および二重特異性であり得、第１の抗原は２つの結合ドメインによって結合され、第２の抗原は第２の結合ドメインによって結合される。
【０１８４】
Ａ．ボトルオープナー形式
本発明において特に使用されるヘテロ二量体足場は、図１に示されるような「トリプルＦ」または「ボトルオープナー」足場形式である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は一本鎖Ｆｖ（本明細書で定義される「ｓｃＦｖ」）を含み、他方の重鎖は、可変重鎖および軽鎖を含む「通常の」Ｆａｂ形式である。この構造は、ボトルオープナーと視覚的に大まかに似ているため、ここでは「トリプルＦ」形式（ｓｃＦｖ−Ｆａｂ−Ｆｃ）または「ボトルオープナー」（ＢＯ）形式と称されることがある（図１Ａを参照）。２つの鎖は、以下により詳細に記載されるように、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域）におけるアミノ酸バリアントの使用により一緒にされる。
【０１８５】
本発明の「トリプルＦ」形式には、いくつかの明確な利点がある。当技術分野で知られているように、２つのｓｃＦｖ構築物に依存する抗体類似体は、安定性および凝集の問題を有することが多く、本発明では、「通常の」重鎖および軽鎖の対合を加えることによって軽減できる。さらに、２つの重鎖と２つの軽鎖に依存する形式とは対照的に、重鎖と軽鎖の誤った対合（たとえば、重鎖１と軽鎖２の対合など）の問題はない。
【０１８６】
本明細書で概説される実施形態の多くは、一般に、ｓｃＦｖを含む第１の単量体を含むボトルオープナー形式に依存し（本明細書では、ＢＯ形式の「ｓｃＦｖ単量体」または「ｓｃＦｖ鎖」と称されることもある）、このｓｃＦｖは、ｓｃＦｖリンカー（全ての場合ではないが、多くの場合は荷電されている）を使用して共有結合された可変重鎖および可変軽鎖ドメインを含み、ｓｃＦｖは通常ドメインリンカー（本明細書で概説されるように、非荷電または荷電されているを介して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合され、外因性または内在性であり得る（例えば、全部または一部が天然ヒンジドメイン）。したがって、ｓｃＦｖ単量体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ１−オプションのリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３、ＶＬ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ１−任意選択的なリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３、ＶＨ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、から選択される構造を有することができる。ボトルオープナー形式の第２の単量体は重鎖（ＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり、組成物はさらに軽鎖（ＶＬ２−ＣＬ）を含む。
【０１８７】
さらに、ボトルオープナー形式のＦｃドメインは、一般にスキューバリアント（例えば、図３および図８に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に切除バリアント（図５に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアントを含む（図４に示すものを含む）。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ボトルオープナー形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ボトルオープナー形式であって、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では図７の＋Ｈ配列が好ましい）、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書で概説するＰＤ−１に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説する第２の抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む、ボトルオープナー形式、を含む。
【０１８９】
この形式について、いくつかの好適な組み合わせがＷＯ２０１７／２１８７０７に概説されている。一般に、本発明は、新しく同定されたクローン１Ｃ１１に基づく新しい抗ＰＤ−１  ＡＢＤの使用を対象とする。この場合、ヘテロ二量体抗体はＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ（すべてチェックポイント受容体として分類される）およびＩＣＯＳ（これは活性化体である）からなる群から選択された第２の標的抗原に結合する。
【０１９０】
一部の実施形態では、抗ＰＤ−１  ＡＢＤは、ボトルオープナー形式のｓｃＦｖ側である。したがって、好適なＡＢＤ対には、（第１がｓｃＦｖ、第２がＦａｂ）、ＰＤ−１  Ｘ  ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１  Ｘ  ＬＡＧ−３、ＰＤ−１  Ｘ  ＴＩＭ−３、ＰＤ−１  Ｘ  ＢＴＬＡ、ＰＤ−１  Ｘ  ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１  Ｘ  ＩＣＯＳが挙げられる。好適なＣＤＲセットならびにＡＢＤが以下に記載され、特に有用な組み合わせが同様に以下に記載される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、ボトルオープナー形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ボトルオープナー形式であって、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では図７の＋  Ｈ配列が好ましい）、スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓおよび本明細書で概説するＰＤ−１に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、  ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓおよび可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説する第２の抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む、ボトルオープナー形式、を含む。
【０１９２】
具体的には、図５０は、ＰＤ−１  ｓｃＦｖ単量体を有するが反対側で使用できるＦａｂ配列が欠落しているいくつかのボトルオープナー「骨格」配列を示している。すなわち、本明細書で論じられるようなＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ−、ＴＩＧＩＴおよびＩＣＯＳに対する任意のＡＢＤのＦａｂ部分に対するＦｖ配列である。
【０１９３】
特定のボトルオープナー実施形態を以下に概説する。
【０１９４】
Ｂ．ｍＡｂ−Ｆｖ
本発明において特に使用されるヘテロ二量体足場は、図１に示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式である。この実施形態では、形式は、「余分な」可変重鎖ドメインの１つの単量体へのＣ末端結合と、「余分な」可変軽鎖ドメインのもう一方の単量体へのＣ末端結合の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、本明細書で概説されるように標的抗原に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインはＰＤ−１に結合する。
【０１９５】
この実施形態では、第１の単量体は、第１の可変重鎖ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメインを含む第１の重鎖を含み、ドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている第１の可変軽鎖ドメインを有する（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択的なリンカー］−ｖｌ２）。第２の単量体は、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメインの第２の可変重鎖ドメインと、ドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている第３の可変重鎖ドメインを含む（ｖｊ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択的なリンカー］−ｖｈ２。２つのＣ末端に結合した可変ドメインは、ＰＤ−１に結合するＦｖを構成する。この実施形態はさらに、重鎖と会合して標的抗原に結合する２つの同一のＦａｂを形成する可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
【０１９６】
さらに、ｍＡｂ−Ｆｖ形式のＦｃドメインは、スキューバリアント（例えば、図３および８に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に切除バリアント（図５に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアントを含む（図４に示すものを含む）。
【０１９７】
一部の実施形態では、ｍＡｂ−Ｆｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｍＡｂ−Ｆｖ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと一緒にＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインおよび第２の可変重鎖ドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに第１の可変軽鎖ドメインと一緒にＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインおよび、第２の可変重鎖ドメインと一緒になってＰＤ−１に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む、第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む、ｍＡｂ−Ｆｖ形式、を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−Ｆｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｍＡｂ−Ｆｖ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと一緒に抗原に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖ドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに第１の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説する抗原に結合するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインおよび、第１の単量体の第２の可変重鎖ドメインと一緒になってＰＤ−１に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む、第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む、ｍＡｂ−Ｆｖ形式を含む。
【０１９９】
Ｃ．ｍＡｂ−ｓｃＦｖ
本発明において特に使用されるヘテロ二量体足場は、図１に示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、形式は、単量体うちの１つへのｓｃＦｖのＣ末端結合の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、本明細書に概説される抗原の１つに結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインはＰＤ−１に結合する。したがって、第１の単量体は、第１の重鎖（可変重鎖ドメインと定常ドメインを含む）を含み、いずれかの向きでｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含む、Ｃ末端で共有結合されたｓｃＦｖを有する（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択的なリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２またはｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択的なリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２）。この実施形態は、重鎖と会合して抗原に結合する２つの同一のＦａｂを形成する、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
【０２００】
さらに、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、スキューバリアント（例えば、図３および８に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に切除バリアント（図５に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアントを含む（図４に示すものを含む）。
【０２０１】
一部の実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通の軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通の軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式、を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに共通の軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、  ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに共通の軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式、を含む。
【０２０３】
Ｄ．セントラルｓｃＦｖ
本発明において特に使用されるヘテロ二量体足場は、図１に示されるセントラルｓｃＦｖ形式（「２＋１」形式とも称されることもある）である。この実施形態では、形式は、挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は標的抗原に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインはＰＤ−１に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域の間に挿入され、これにより第３の抗原結合ドメインを提供する。これは実際にはボトルオープナー形式への追加と考えることができ、共通の軽鎖を利用するｓｃＦｖのＮ末端に追加のＶＨ−ＣＨ１ドメインが追加される。
【０２０４】
この実施形態では、１つの単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン（および任意選択的なヒンジ）およびＦｃドメインを含む第１重鎖を含み、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖを有する。ｓｃＦｖは、任意選択的なドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端の間に共有結合される。（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択的なリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２−［ヒンジを含む任意選択的なリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３、またはｓｃＦｖに対して反対方向の、ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択的なリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２−［ヒンジを含む任意選択的なリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）。もう１つの単量体は、標準のＦａｂ側である。この実施形態は、重鎖と会合して標的抗原に結合する２つの同一のＦａｂを形成する、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
【０２０５】
さらに、セントラルｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、スキューバリアント（例えば、図３および８に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に切除バリアント（図５に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアントを含む（図４に示すものを含む）。
【０２０６】
一部の実施形態では、セントラルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、セントラルｓｃＦｖ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む、セントラルｓｃＦｖ形式、を含む。
【０２０７】
一部の実施形態では、セントラルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアント、およびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、セントラルｓｃＦｖ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／  Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、  ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む、セントラルｓｃＦｖ形式、を含む。
【０２０８】
Ｅ．セントラルＦｖ
本発明で特に使用されるヘテロ二量体足場は、図１Ｇに示されるセントラルＦｖ形式である。この実施形態では、形式は、挿入されたＦｖドメイン（すなわち、セントラルＦｖドメイン）の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は標的抗原に結合し、「セントラルＦｖ」はＰＤ−１に結合する。ｓｃＦｖドメインはＦｃドメインと単量体のＣＨ１−Ｆｖ領域の間に挿入され、第３の抗原結合ドメインを提供し、各単量体はｓｃＦｖの構成要素を含む（例えば、１つの単量体は可変重鎖ドメインを含み、もう１つは可変軽鎖ドメインを含む）。
【０２０９】
この実施形態では、１つの単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメインを含む第１の重鎖ならびに追加の可変軽鎖ドメインを含む。軽鎖ドメインは、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端の間に共有結合される（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択的なリンカー］−ｖｌ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。もう１つの単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む第１の重鎖ならびに追加の可変重鎖ドメインを含む（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択的なリンカー］−ｖｈ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。軽鎖ドメインは、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端の間に共有結合される。
【０２１０】
この実施形態は、重鎖と会合して標的抗原に結合する２つの同一のＦａｂを形成する、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
【０２１１】
Ｆ．ワンアームセントラルｓｃＦｖ
本発明において特に使用されるヘテロ二量体足場の１つは、図１に示されるワンアームセントラルｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、他方の単量体は挿入されたｓｃＦｖドメインを使用し、したがって第２の抗原結合ドメインを形成する。この形式では、Ｆａｂ部分が標的抗原に結合し、ｓｃＦｖがＰＤ−１に結合するか、またはその逆である。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域の間に挿入される。
【０２１２】
この実施形態では、１つの単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む第１の重鎖を含み、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含む。ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端の間に共有結合される。第二の単量体はＦｃドメインを含む。この実施形態はさらに、重鎖と会合してＦａｂを形成する可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
【０２１３】
さらに、ワンアームセントラルｓｃＦｖ形式のＦｃドメインには、一般にスキューバリアント（例えば、図３および８に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、  Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に切除バリアント（図５に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示すものを含む）が含まれ、および重鎖はｐＩバリアント（図４に示すものを含む）を含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、ワンアームセントラルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを含む。したがって、ワンアームセントラルｓｃＦｖ形式のいくつかの実施形態は、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含むＦｃドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ワンアームセントラルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、ワンアームセントラルｓｃＦｖ形式のいくつかの実施形態は、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有する、Ｆｃドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む。
【０２１６】
Ｇ．  ワンアームｓｃＦｖ−ｍＡｂ
本発明において特に使用されるヘテロ二量体足場の１つは、図１に示されるワンアームｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式である。この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、他方の単量体は、一般にリンカーの使用を通じて、重鎖のＮ末端に結合したｓｃＦｖドメインを使用する。ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−［オプションのドメインリンカー］−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３または（反対方向）ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−［オプションのドメインリンカー］−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３。この形式では、Ｆａｂ部分はそれぞれターゲット抗原に結合し、ｓｃＦｖはＰＤ−１に結合する。この実施形態はさらに、重鎖と会合してＦａｂを形成する可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
【０２１７】
さらに、ワンアームｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式のＦｃドメインには、一般にスキューバリアント（例えば、図３および８に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に切除バリアント（図５に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示すものを含む）が含まれ、および重鎖はｐＩバリアント（図４に示すものを含む）を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ワンアームｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを含む。したがって、ワンアームｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式のいくつかの実施形態は、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを有する、Ｆｃドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、ワンアームｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態のワンアームｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書に概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７ＫおよびＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有する、Ｆｃドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖と、を含む。
【０２２０】
Ｈ．  ｓｃＦｖ−ｍＡｂ
本発明において特に使用されるヘテロ二量体足場は、図１Ｅに示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、形式は、単量体のうちの１つへのｓｃＦｖのＮ末端結合の使用に依存し、これにより第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は標的抗原に結合しおよび「余分」のｓｃＦｖドメインはＰＤ−１に結合する。
【０２２１】
この実施形態では、第１の単量体は、第１の重鎖（可変重鎖ドメインおよび定常ドメインを含む）を含み、Ｎ末端に共有結合されたｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインをいずれかの方向で含む（（ｖｈ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ１−  ［任意選択的なドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）または（反対方向のｓｃＦｖを使用して）（（ｖｌ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ１−［任意選択的なドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３））。この実施形態はさらに、重鎖と会合して標的に結合する２つの同一のＦａｂを形成する可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を利用する。本明細書の実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれる。
【０２２２】
さらに、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式のＦｃドメインは、一般にスキューバリアント（例えば、図３および８に示すようなアミノ酸置換のセットであって、特に有用なスキューバリアントはＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６ＷおよびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択的に切除バリアント（図５に示すものを含む）、任意選択的に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示すものを含む）を含み、および重鎖はｐＩバリアント（図４に示すものを含む）を含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに共通の軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式を含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに共通の軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書で概説されるように標的抗原に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、およびＰＤ−１に結合するｓｃＦｖドメインを含む第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに共通の軽鎖の可変軽鎖ドメインと一緒に、本明細書で概説されるように標的に結合するＦｖを構成する可変重鎖ドメインと、ｃ）可変軽鎖ドメインと定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖と、を含む、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式を含む。
【０２２５】
Ｉ．デュアルｓｃＦｖ形式
本発明はまた、当技術分野で知られており、図１Ｂに示されているようなデュアルｓｃＦｖ形式を提供する。この実施形態では、ＳＳＴＲ２  ｘ  ＣＤ３ヘテロ二量体二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖ−Ｆｃ単量体（両方とも（ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−［任意選択的なドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）形式または（ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−［任意選択的なドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）形式のいずれかで、あるいは一方の単量体を一方の方向に、もう一方を他方の方向にして構成される。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、デュアルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、デュアルｓｃＦｖ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＰＤ−１または他の標的抗原のいずれかに結合する第１のｓｃＦｖを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＰＤ−１または他の標的抗原のいずれかに結合する第２のｓｃＦｖを含む、第２の単量体と、を含むデュアルｓｃＦｖ形式を含む。
【０２２７】
いくつか実施形態では、デュアルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、切除バリアントおよびＦｃＲｎバリアントを含む。いくつかの実施形態では、デュアルｓｃＦｖ形式は、スキューバリアント、ｐＩバリアント、および切除バリアントを含む。したがって、いくつかの実施形態は、デュアルｓｃＦｖ形式であって、ａ）スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および第１のｓｃＦｖを含む、第１の単量体と、ｂ）スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切除バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および第２のｓｃＦｖを含む第２の単量体と、を含むデュアルｓｃＦｖ形式を含む。
【０２２８】
ＸＩ．本発明の特定の実施形態
当業者によって理解されるように、本発明は、本発明の異なる形式における異なる標的抗原について、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖ配列とＡＢＤとの多数の可能な組み合わせを提供する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、図１の任意の形式で、図１３、１５、１６、１８、２０、２１、２４、３３および４０の任意のＰＤ−１  ＡＢＤを、任意の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、任意の抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤ、任意の抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ、任意の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、任意の抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤ、または任意の抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤと組み合わせることができる。特に有用なのは、これらのＡＢＤに対する配列表のＦａｂ  ＡＢＤと組み合わせた図１５の抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖ配列である。いくつかの実施形態では、これらの組み合わせは、米国公開第２０１６／０３５５６０８号の図１６２に示されているようなボトルオープナー形式の「骨格」配列を使用して（セントラルｓｃＦｖ形式にも使用できる）、または米国公開第２０１６／０３５５６０８号の図１６３に示されている「ｍＡｂ−ｓｃＦｖ」形式の骨格」配列を使用して作成されたものであり、その両方の図（および付随する説明文）は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２３０】
Ａ．  ＰＤ−１  Ｘ  ＣＴＬＡ−４ボトルオープナーの実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＰＤ−１およびヒトＣＴＬＡ−４の両方に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。当業者に理解されるように、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖ配列とＣＴＬＡ−４のＡＢＤとの可能な組み合わせは多数ある。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖであり、ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤはＦａｂ構築物である。これらの実施形態では、図１５からの任意のｓｃＦｖ  ＡＢＤを、任意の抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤ配列と組み合わせることができる。本発明での使用に適した抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤ配列には、配列番号２１〜２９１８（ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はＦａｂとしての形式をとることができる）、配列番号２９１９〜６２０８（ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）、配列番号３６７３９〜３６８１８（追加のＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ配列であるが、それらの中のＦｖ配列はｓｃＦｖとしての形式をとることができる）および配列番号３５３９５〜３５４１６（ＣＴＬＡ  −４のワンアーム構築物で、ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかとしての形式をとることができる）が含まれる。当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、本発明のヘテロ二量体抗体は、ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤが本配列表の配列番号２９１９〜６２０８と配列番号３５３９５〜３５４１６の対から選択される場合、図１５からのＰＤ−１  ＡＢＤをｓｃＦｖとして使用し、ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤをＦａｂ  Ｆｖとして使用するボトルオープナー形式で作製される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７１に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂのＶＬが配列番号４７３に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４７２に追加される。  いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７４に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂのＶＬが配列番号４７６に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４７５に追加される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７７に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂのＶＬが配列番号４７９に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４７８に追加される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４８０に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂのＶＬが配列番号４８２に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４８１に追加される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列番号３８１３４の可変重鎖ドメインおよび配列番号３８１３８の可変軽鎖ドメインを含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、本明細書の配列番号２９１９〜６２０８および配列番号３６７３９〜３６８１８のいずれかから選択され、配列番号３８１３４の可変重鎖ドメインおよび配列番号３８１３８の可変軽鎖ドメインを含むＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５６であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５６のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５６の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、本明細書の配列番号２９１９〜６２０８および配列番号３６７３９〜３６８１８のいずれかから選択され、配列番号３８１３４の可変重鎖ドメインおよび配列番号３８１３８の可変軽鎖ドメインを含むＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５７であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５７のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５７の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、本明細書の配列番号２９１９〜６２０８および配列番号３６７３９〜３６８１８のいずれかから選択され、配列番号３８１３４の可変重鎖ドメインおよび配列番号３８１３８の可変軽鎖ドメインを含むＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５８であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５８のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５８の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、本明細書の配列番号２９１９〜６２０８および配列番号３６７３９〜３６８１８のいずれかから選択され、配列番号３８１３４の可変重鎖ドメインおよび配列番号３８１３８の可変軽鎖ドメインを含むＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５９であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５９のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５９の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、本明細書の配列番号２９１９〜６２０８および配列番号３６７３９〜３６８１８のいずれかから選択され、配列番号３８１３４の可変重鎖ドメインおよび配列番号３８１３８の可変軽鎖ドメインを含むＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６０であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６０のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６０の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、本明細書の配列番号２９１９〜６２０８および配列番号３６７３９〜３６８１８のいずれかから選択され、配列番号３８１３４の可変重鎖ドメインおよび配列番号３８１３８の可変軽鎖ドメインを含むＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６１であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６１のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６１の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、本明細書の配列番号２９１９〜６２０８および配列番号３６７３９〜３６８１８のいずれかから選択され、配列番号３８１３４の可変重鎖ドメインおよび配列番号３８１３８の可変軽鎖ドメインを含むＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６２であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６２のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６２の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、本明細書の配列番号２９１９〜６２０８および配列番号３６７３９〜３６８１８のいずれかから選択され、配列番号３８１３４の可変重鎖ドメインおよび配列番号３８１３８の可変軽鎖ドメインを含むＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６３であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６３のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６３の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列表の配列番号３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７ならびに３６８１１および３６８１５の対から選択される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５６であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５６のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５６の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列表の配列番号３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７ならびに３６８１１および３６８１５の対から選択される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５７であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５７のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５７の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列表の配列番号３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７ならびに３６８１１および３６８１５の対から選択される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５８であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５８のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５８の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列表の配列番号３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７ならびに３６８１１および３６８１５の対から選択される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５９であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５９のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５９の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列表の配列番号３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７ならびに３６８１１および３６８１５の対から選択される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６０であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６０のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６０の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列表の配列番号３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７ならびに３６８１１および３６８１５の対から選択される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６１であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６１のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６１の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列表の配列番号３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７ならびに３６８１１および３６８１５の対から選択される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６２であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６２のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６２の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂは、配列表の配列番号３６７３９および３６７４３、３６７４７および３６７５１、３６７５５および３６７５９、３６７６３および３６７６７、３６７７１および３６７７５、３６７７９および３６７８３、３６７８７および３６７９１、３６７９５および３６７９９、３６８０３および３６８０７ならびに３６８１１および３６８１５の対から選択される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６３であり、すなわち、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６３のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＣＴＬＡ−４  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６３の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ−１  Ｘ  ＣＴＬＡ−４ヘテロ二量体抗体は、ＸＥＮＣＳ５０２、ＸＥＮＣＳ５０９、ＸＥＮＣＳ５１６、ＸＥＮＣＳ５２３、ＸＥＮＣＳ５３０、ＸＥＮＣＳ５３７、ＸＥＮＣＳ５４４およびＸＥＮＣＳ５５１からなる群から選択される。
【０２５１】
Ｂ．  ＰＤ−１  Ｘ  ＩＣＯＳボトルオープナーの実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＰＤ−１およびヒトＩＣＯＳの両方に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。当業者によって理解されるように、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖ配列とＩＣＯＳのＡＢＤとの可能な組み合わせは多数ある。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖであり、ＩＣＯＳ  ＡＢＤはＦａｂ構築物である。これらの実施形態では、図１５からの任意のｓｃＦｖ  ＡＢＤを任意の抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ配列と組み合わせることができる。ＡＢＤとしての使用に適した抗ＩＣＯＳ配列には、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれ、具体的には説明文および図１９、２０および２４、その中に示される配列にあるＵＳ２０１８／０１２７５０１に開示されている多くのもの、ならびに命名法で示されているいくつかのＩＣＯＳ  Ｆａｂ配列（重鎖ＶＨ１−ＣＨ１および軽鎖ＶＬ１−ＣＬ）を含有するＵＳ２０１８／０１２７５０１からの配列番号２７８６９〜２８０８６が含まれる。さらに、ＵＳ２０１８／０１２７５０１からの配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２および２６３５３および２６３５８のＶＨ／ＶＬ対の抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤも含まれる。当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になる。
【０２５３】
本発明において特に興味深いのは、ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０を含む、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤのＦａｂ配列である。本発明において特に興味深いのは、ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０を含む、図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤのＦａｂ配列である。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７１に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂのＶＬが配列番号４７３に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４７２に追加される。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７４に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂのＶＬが配列番号４７６に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４７５に追加される。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７７に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂのＶＬが配列番号４７９に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４７８に追加される。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４８０に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂのＶＬが配列番号４８２に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４８１に追加される。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂは、ＵＳ２０１８／０１２７５０１の配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８のＶＨ／ＶＬ対から選択され、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０）および図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）のＦａｂ配列は特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５６であり、すなわち、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５６のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５６の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂは、ＵＳ２０１８／０１２７５０１の配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８のＶＨ／ＶＬ対から選択され、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０）および図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）のＦａｂ配列は特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５７であり、すなわち、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５７のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５７の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂは、ＵＳ２０１８／０１２７５０１の配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８のＶＨ／ＶＬ対から選択され、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０）および図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）のＦａｂ配列は特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５８であり、すなわち、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５８のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５８の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂは、ＵＳ２０１８／０１２７５０１の配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８のＶＨ／ＶＬ対から選択され、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０）および図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）のＦａｂ配列は特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５９であり、すなわち、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５９のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５９の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂは、ＵＳ２０１８／０１２７５０１の配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８のＶＨ／ＶＬ対から選択され、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０）および図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）のＦａｂ配列は特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６０であり、すなわち、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６０のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６０の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂは、ＵＳ２０１８／０１２７５０１の配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８のＶＨ／ＶＬ対から選択され、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０）および図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）のＦａｂ配列は特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６１であり、すなわち、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６１のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６１の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂは、ＵＳ２０１８／０１２７５０１の配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８のＶＨ／ＶＬ対から選択され、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０）および図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）のＦａｂ配列は特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６２であり、すなわち、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６２のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６２の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂは、ＵＳ２０１８／０１２７５０１の配列表からの配列番号２６３２３および２６３２８、２７４７７および２７４５２ならびに２６３５３および２６３５８のＶＨ／ＶＬ対から選択され、図４９のＸＥＮＣＳ５００からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０＿Ｌ０）および図４９のＸＥＮＣＳ５０１からの抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤ（ＶＨ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０およびＶＬ＿ＩＣＯＳ＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）のＦａｂ配列は特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６３であり、すなわち、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６３のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＩＣＯＳ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６３の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ−１  Ｘ  ＩＣＯＳヘテロ二量体抗体は、ＸＥＮＣＳ５００、ＸＥＮＣＳ５０１、ＸＥＮＣＳ５０７、ＸＥＮＣＳ５０８、ＸＥＮＣＳ５１４、ＸＥＮＣＳ５１５、ＸＥＮＣＳ５２１、ＸＥＮＣＳ５２２、ＸＥＮＣＳ５２８、ＸＥＮＣＳ５２９、ＸＥＮＣＳ５３５、ＸＥＮＣＳ５２６、ＸＥＮＣＳ５４２、ＸＥＮＣＳ５４３、ＸＥＮＣＳ５４９およびＸＥＮＣＳ５５０からなる群から選択される。
【０２６４】
Ｃ．ＰＤ−１  Ｘ  ＬＡＧ−３ボトルオープナーの実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＰＤ−１およびヒトＬＡＧ−３の両方に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。当業者に理解されるように、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖ配列とＬＡＧ−３のＡＢＤとの可能な組み合わせは多数ある。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖであり、ＬＡＧ−３  ＡＢＤはＦａｂ構築物である。これらの実施形態では、図１５からの任意のｓｃＦｖ  ＡＢＤを、任意の抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤ配列と組み合わせることができる。ＡＢＤとしての使用に適した抗ＬＡＧ−３配列には、配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、配列番号３２７９４〜３３００２（当業者から理解されるように、これらの配列識別子のすべては、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になる。）、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂ（配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１、および３６９５５および３６９５９の対から選択される）、ならびに、ＸＥＮＰ２２５９４のＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ＡＢＤの配列であって、ＶＨ（配列番号３２７５５、ＶＨＣＤＲ（配列番号３２７５６、３２７５７および３２７５８を含む）およびＶＬ（配列番号３２７６０、ＶＬＣＤＲ（配列番号３２７６１、３２７６２および３２７６３）を含む）が含まれる配列、およびＸＥＮＰ２２６５６のＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ＡＢＤの配列であって、ＶＨ（配列番号２８８１５、ＶＨＣＤＲ（配列番号２８８１６、２８８１７、および２８１１８を含む）およびＶＬ（配列番号２８８２０、ＶＬＣＤＲ（配列番号２８８２１、２８８２２、および２８８２３を含む）が含まれる配列、が含まれる。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７１に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂのＶＬが配列番号４７３に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４７２に追加される。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７４に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂのＶＬが配列番号４７６に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４７５に追加される。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７７に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂのＶＬが配列番号４７９に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４７８に追加される。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４８０に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂのＶＬが配列番号４８２に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４８１に追加される。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９の対から選択され、ＸＥＮＰ２２５９４のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号３２７５５およびＶＬ配列番号３２７６０）およびＸＥＮＰ２２６５６のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号２８８１５  ＶＬ配列番号２８８２０）は、特に使用される。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９の対から選択され、ＸＥＮＰ２２５９４のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号３２７５５およびＶＬ配列番号３２７６０）およびＸＥＮＰ２２６５６のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号２８８１５  ＶＬ配列番号２８８２０）は、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５６であり、すなわち、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５６のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５６の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９の対から選択され、ＸＥＮＰ２２５９４のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号３２７５５およびＶＬ配列番号３２７６０）およびＸＥＮＰ２２６５６のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号２８８１５  ＶＬ配列番号２８８２０）は、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５７であり、すなわち、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５７のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５７の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９の対から選択され、ＸＥＮＰ２２５９４のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号３２７５５およびＶＬ配列番号３２７６０）およびＸＥＮＰ２２６５６のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号２８８１５  ＶＬ配列番号２８８２０）は、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５８であり、すなわち、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５８のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５８の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９の対から選択され、ＸＥＮＰ２２５９４のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号３２７５５およびＶＬ配列番号３２７６０）およびＸＥＮＰ２２６５６のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号２８８１５  ＶＬ配列番号２８８２０）は、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５９であり、すなわち、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５９のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５９の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５と３６９５９の対から選択され、ＸＥＮＰ２２５９４のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号３２７５５およびＶＬ配列番号３２７６０）およびＸＥＮＰ２２６５６のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号２８８１５  ＶＬ配列番号２８８２０）は、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６０であり、すなわち、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６０のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６０の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９の対から選択され、ＸＥＮＰ２２５９４のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号３２７５５およびＶＬ配列番号３２７６０）およびＸＥＮＰ２２６５６のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号２８８１５  ＶＬ配列番号２８８２０）は、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６１であり、すなわち、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６１のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６１の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９の対から選択され、ＸＥＮＰ２２５９４のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号３２７５５およびＶＬ配列番号３２７６０）およびＸＥＮＰ２２６５６のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号２８８１５  ＶＬ配列番号２８８２０）は、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６２であり、すなわち、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６２のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６２の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂは、配列番号３６８１９および３６８２３、３６８２７および３６８３１、３６８３５および３６８３９、３６８４３および３６８４７、３６８５１および３６８５５、３６８５９および３６８６３、３６８６７および３６８７１、３６８７５および３６８７９、３６８８３および３６８８７、３６８９１および３６８９５、３６８９９および３６９０３、３６９０７および３６９１１、３６９１５および３６９１９、３６９２３および３６９２７、３６９３１および３６９３５、３６９３９および３６９４３、３６９４７および３６９５１ならびに３６９５５および３６９５９の対から選択され、ＸＥＮＰ２２５９４のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号３２７５５およびＶＬ配列番号３２７６０）およびＸＥＮＰ２２６５６のＶＨ／ＶＬ（ＶＨ配列番号２８８１５  ＶＬ配列番号２８８２０）は、特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６３であり、すなわち、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６３のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＬＡＧ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６３の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ−１  Ｘ  ＬＡＧ−３ヘテロ二量体抗体は、ＸＥＮＣＳ５０３、ＸＥＮＣＳ５０４、ＸＥＮＣＳ５１０、ＸＥＮＣＳ５１１、ＸＥＮＣＳ５１７、ＸＥＮＣＳ５１８、ＸＥＮＣＳ５２１、ＸＥＮＣＳ５２４、ＸＥＮＣＳ５２５、ＸＥＮＣＳ５３１、ＸＥＮＣＳ５３２、ＸＥＮＣＳ５３８、ＸＥＮＣＳ５３９、ＸＥＮＣＳ５４５、ＸＥＮＣＳ５４６、ＸＥＮＣＳ５５２およびＸＥＮＣＳ５５３からなる群から選択される。
【０２７７】
Ｄ．ＰＤ−１  Ｘ  ＴＩＭ−３ボトルオープナーの実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＰＤ−１およびヒトＴＩＭ−３の両方に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。当業者に理解されるように、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖ配列とＴＩＭ−３のＡＢＤとの可能な組み合わせは多数ある。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖであり、ＴＩＭ−３  ＡＢＤはＦａｂ構築物である。これらの実施形態では、図１５からの任意のｓｃＦｖ  ＡＢＤを、任意の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ配列と組み合わせることができる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、配列番号３６３４７〜３６７０６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤで配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、が含まれ、ならびにＸＥＮＰ２１１８９（ＶＨ配列番号３６５０８およびＶＬ配列番号３６５１３）の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列が特に使用される。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７１に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂのＶＬが配列番号４７３に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４７２に追加される。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７４に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂのＶＬが配列番号４７６に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４７５に追加される。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７７に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂのＶＬが配列番号４７９に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４７８に追加される。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４８０に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂのＶＬが配列番号４８２に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがその配列番号４８１に追加される。
【０２８０】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、配列番号３６３４７〜３６７０６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤで配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、が含まれ、ならびにＸＥＮＰ２１１８９（ＶＨ配列番号３６５０８およびＶＬ配列番号３６５１３）の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列が特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５６であり、すなわち、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５６のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５６の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２８１】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、配列番号３６３４７〜３６７０６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤで配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、が含まれ、ならびにＸＥＮＰ２１１８９（ＶＨ配列番号３６５０８およびＶＬ配列番号３６５１３）の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列が特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５７であり、すなわち、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５７のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５７の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２８２】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、配列番号３６３４７〜３６７０６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤで配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、が含まれ、ならびにＸＥＮＰ２１１８９（ＶＨ配列番号３６５０８およびＶＬ配列番号３６５１３）の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列が特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５８であり、すなわち、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５８のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５８の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２８３】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、配列番号３６３４７〜３６７０６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤで配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、が含まれ、ならびにＸＥＮＰ２１１８９（ＶＨ配列番号３６５０８およびＶＬ配列番号３６５１３）の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列が特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５９であり、すなわち、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５９のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５９の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２８４】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、配列番号３６３４７〜３６７０６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤで配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、が含まれ、ならびにＸＥＮＰ２１１８９（ＶＨ配列番号３６５０８およびＶＬ配列番号３６５１３）の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列が特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６０であり、すなわち、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６０のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６０の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２８５】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、配列番号３６３４７〜３６７０６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤで配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、が含まれ、ならびにＸＥＮＰ２１１８９（ＶＨ配列番号３６５０８およびＶＬ配列番号３６５１３）の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列が特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６１であり、すなわち、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６１のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６１の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２８６】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、配列番号３６３４７〜３６７０６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤで配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、が含まれ、ならびにＸＥＮＰ２１１８９（ＶＨ配列番号３６５０８およびＶＬ配列番号３６５１３）の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列が特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６２であり、すなわち、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６２のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６２の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２８７】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＭ−３配列には、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、配列番号３６３４７〜３６７０６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤで配列番号３５７５７および３７５９１、３７９５９および３７５９９、３７６０３および３７６０７、３７６１１および３７６１５、３７６１９および３７６２３、３７６２７および３７６３１、３７６３５および３７６３９、３７６４３および３７６４７、３７６５１および３７６５５、３７６５９および３７６６３、３７６６７および３７６７１、３７６７５および３７６７９、３７６８３および３７６８７ならびに３７６９１および３７６９５、の対から選択される抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ、が含まれ、ならびにＸＥＮＰ２１１８９（ＶＨ配列番号３６５０８およびＶＬ配列番号３６５１３）の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤのＦａｂ配列が特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６３であり、すなわち、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６３のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＭ−３  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６３の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＤ−１  Ｘ  ＴＩＭ−３ヘテロ二量体抗体は、ＸＥＮＣＳ５０５、ＸＥＮＣＳ５１２、ＸＥＮＣＳ５１９、ＸＥＮＣＳ５２６、ＸＥＮＣＳ５３３、ＸＥＮＣＳ５４０、ＸＥＮＣＳ５４７およびＸＥＮＣＳ５５４からなる群から選択される。
【０２８９】
Ｅ．ＰＤ−１  Ｘ  ＴＩＧＩＴボトルオープナーの実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＰＤ−１およびヒトＴＩＧＩＴの両方に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。当業者によって理解されるように、抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖ配列とＴＩＧＩＴのＡＢＤとの可能な組み合わせは多数ある。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖであり、ＴＩＧＩＴ  ＡＢＤはＦａｂ構築物である。これらの実施形態では、図１５からの任意のｓｃＦｖ  ＡＢＤを任意の抗ＴＩＧＩＴ  ＡＢＤ配列と組み合わせることができる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７１に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂのＶＬが配列番号４７３に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４７２に追加される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７４に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂのＶＬが配列番号４７６に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４７５に追加される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７７に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂのＶＬが配列番号４７９に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４７８に追加される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４８０に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂのＶＬが配列番号４８２に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４８１に追加される。
【０２９２】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５６であり、すなわち、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５６のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５６の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２９３】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５７であり、すなわち、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５７のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５７の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２９４】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５８であり、すなわち、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５８のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５８の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２９５】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５９であり、すなわち、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５９のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５９の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２９６】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６０であり、すなわち、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６０のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６０の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２９７】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６１であり、すなわち、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６１のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６１の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２９８】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６２であり、すなわち、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６２のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６２の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０２９９】
ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＴＩＧＩＴ配列には、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、ならびに、配列番号３７４３５および３７４３９、３７４４３および３７４４７、３７４５１および３７４５５、３７４５９および３７４６３、３７４６７および３７４７１、３７４７５および３７４７９、３７４８３および３７４８７、３７４９１および３７４９５、３７４９９および３７５０３、３７５０７および３７５１１、３７５１５および３７５１９、３７５２３および３７５２７、３７５３１および３７５３５、３７５３９および３７５４３、３７５４７および３７５５１、３７５５５および３７５５９、３７５６３および３７５６７、３７５７１および３７５７５ならびに３７５７９および３７５８３、の対から選択されるＴＩＧＩＴ  ＡＢＤが含まれる。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６３であり、すなわち、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６３のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＴＩＧＩＴ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６３の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０３００】
Ｆ．ＰＤ−１  Ｘ  ＢＴＬＡボトルオープナーの実施形態
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖであり、ＢＴＬＡ  ＡＢＤはＦａｂ構築物である。これらの実施形態では、図１５からの任意のｓｃＦｖ  ＡＢＤを、任意の抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤ配列と組み合わせることができる。ＡＢＤとしての使用に適した抗ＢＴＬＡ配列は、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７および３６７６１および３６７３５の対から選択される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが含まれ、ＸＥＮＰ２０２６９（ＶＨ  配列番号２０９３６およびＶＬ  配列番号２０９４１）のＦａｂ抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが特に使用される。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７１に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂのＶＬが配列番号４７３に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４７２に追加される。いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７４に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂのＶＬが配列番号４７６に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４７５に追加される。いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４７７に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂのＶＬが配列番号４７９に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４７８に追加される。いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡ  ＦａｂのＶＨドメインがＵＳ２０１６／０３５５６０８の配列番号４８０に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂのＶＬが配列番号４８２に追加され、ＰＤ−１  ｓｃＦｖがＵＳ２０１６の配列番号４８１に追加される。
【０３０２】
ＡＢＤとしての使用に適した抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７および３６７６１および３６７３５の対から選択される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが含まれ、ＸＥＮＰ２０２６９（ＶＨ  配列番号２０９３６およびＶＬ  配列番号２０９４１）のＦａｂ抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５６であり、すなわち、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５６のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５６の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０３０３】
ＡＢＤとしての使用に適した抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７および３６７６１および３６７３５の対から選択される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが含まれ、ＸＥＮＰ２０２６９（ＶＨ  配列番号２０９３６およびＶＬ  配列番号２０９４１）のＦａｂ抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５７であり、すなわち、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５７のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５７の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０３０４】
ＡＢＤとしての使用に適した抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７および３６７６１および３６７３５の対から選択される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが含まれ、ＸＥＮＰ２０２６９（ＶＨ  配列番号２０９３６およびＶＬ  配列番号２０９４１）のＦａｂ抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５８であり、すなわち、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５８のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５８の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０３０５】
ＡＢＤとしての使用に適した抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７および３６７６１および３６７３５の対から選択される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが含まれ、ＸＥＮＰ２０２６９（ＶＨ  配列番号２０９３６およびＶＬ  配列番号２０９４１）のＦａｂ抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５５９であり、すなわち、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５５９のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５５９の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０３０６】
ＡＢＤとしての使用に適した抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７および３６７６１および３６７３５の対から選択される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが含まれ、ＸＥＮＰ２０２６９（ＶＨ  配列番号２０９３６およびＶＬ  配列番号２０９４１）のＦａｂ抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６０であり、すなわち、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６０のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６０の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０３０７】
ＡＢＤとしての使用に適した抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７および３６７６１および３６７３５の対から選択される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが含まれ、ＸＥＮＰ２０２６９（ＶＨ  配列番号２０９３６およびＶＬ  配列番号２０９４１）のＦａｂ抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６１であり、すなわち、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６１のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６１の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０３０８】
ＡＢＤとしての使用に適した抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７および３６７６１および３６７３５の対から選択される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが含まれ、ＸＥＮＰ２０２６９（ＶＨ  配列番号２０９３６およびＶＬ  配列番号２０９４１）のＦａｂ抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６２であり、すなわち、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６２のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６２の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０３０９】
ＡＢＤとしての使用に適した抗ＢＴＬＡ配列には、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（当業者から理解されるように、これらの配列識別子は、配列識別子から明らかであるように、可変重鎖および軽鎖について「対」になっている）、配列番号３６７０７および３６７１１、３６７１５および３６７１９、３６７２３および３６７２７および３６７６１および３６７３５の対から選択される抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが含まれ、ＸＥＮＰ２０２６９（ＶＨ  配列番号２０９３６およびＶＬ  配列番号２０９４１）のＦａｂ抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤが特に使用される。これらの実施形態では、ヘテロ二量体抗体の残部は図５０のＸＥＮＣＳ５６３であり、すなわち、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＨはＸＥＮＣＳ５６３のＦａｂ鎖のＮ末端に追加され、ＢＴＬＡ  ＦａｂからのＶＬはＸＥＮＣＳ５６３の軽鎖のＮ末端に追加される。
【０３１０】
ＸＩＩ．本発明の核酸
本発明はさらに、本発明のヘテロ二量体二重特異性抗体ならびに本明細書に概説される単一特異性抗体をコードする核酸組成物を提供する。
【０３１１】
当業者には理解されるように、核酸組成物はヘテロ二量体タンパク質の形式および足場に依存する。したがって、例えば、トリプルＦ形式（例えば、ＦｃドメインとｓｃＦｖを含む第１のアミノ酸単量体、重鎖と軽鎖を含む第２のアミノ酸単量体）など、３つのアミノ酸配列が形式に必要な場合、発現のために、３つの核酸配列を１つ以上の発現ベクターに組み込むことができる。同様に、いくつかの形式（例えば、図１に開示されているようなデュアルｓｃＦｖフォーマット）は２つの核酸のみを必要とし、同様に、それらを１つまたは２つの発現ベクターに組み込むことができる。
【０３１２】
当該技術分野で知られているように、本発明の構成要素をコードする核酸は、本発明のヘテロ二量体抗体を産生するために使用される宿主細胞に応じて、当該技術分野で知られているように、発現ベクターに組み込むことができる。一般に、核酸は任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能マーカー、リボソーム結合部位、インデューサーなど）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは組み込みベクターであり得る。
【０３１３】
次いで、本発明の核酸および／または発現ベクターを、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および／または真菌細胞を含む当該技術分野で周知の任意の数の異なる種類の宿主細胞に形質転換するが、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）が、多くの実施形態において使用される。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、各単量体をコードする核酸および、形式に応じて適用可能な、軽鎖をコードする任意の核酸は、一般に異なるまたは同じプロモーター制御下で単一の発現ベクター内にそれぞれ含有される。本発明において特に使用される実施形態では、これら２つまたは３つの核酸の各々は異なる発現ベクターに含まれる。本明細書および参照により本明細書に組み込まれる６２／０２５，９３１に示されるように、ヘテロ二量体形成を推進するために異なるベクター比を使用することができる。すなわち、驚くべきことに、（ヘテロ二量体抗体を含む３つのポリペプチド有する本明細書の実施形態の多くの場合）タンパク質は、第１単量体：第２単量体：軽鎖を１：１：２の比率で含むが、これらは最高の結果が得られる比率ではない。
【０３１５】
本発明のヘテロ二量体抗体は、当該技術分野において周知のように、発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養することによって作製される。生成されると、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む従来の抗体精製工程が実施される。本明細書で考察されるように、２つの単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることが、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に高感度な他の方法による分離を可能する。すなわち、各単量体の等電点（ｐＩ）が異なるｐＩを有し、かつヘテロ二量体も異なるｐＩを有するように各単量体の等電点（ｐＩ）を変化させるｐＩ置換を含むことによって、「トリプルＦ」ヘテロ二量体の等電点精製（例えば、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム）を促進する。これらの置換はまた、精製後、混入したデュアルｓｃＦｖ−ＦｃおよびｍＡｂホモ二量体の決定およびモニタリングにも役立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析用ＩＥＸカラム）。
【０３１６】
ＸＩＩＩ．ヘテロ二量体チェックポイント抗体の生物学的および生化学的機能
一般に、本発明の二重特異性ヘテロ二量体抗体は、癌を有する患者に投与され、そして有効性は、本明細書中に記載されるようないくつかの方法で評価される。このため、癌量、腫瘍のサイズ、転移の存在または程度の評価等の、有効性の標準的なアッセイを実行し得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて評価され得る。これは、生体外アッセイおよび生体内アッセイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。例えば、腫瘍量、サイズ、侵襲性、ＬＮ関与、転移などといった「古典的な」測定と併せて、免疫状態（例えば、ｉｐｉ治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在）の変化の評価を実施することができる。したがって、以下のいずれかまたはすべてを評価できる：ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化または増殖、ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞の活性化または増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害活性および／またはＣＴＬ媒介性細胞枯渇、ＮＫ細胞活性およびＮＫ媒介性細胞枯渇、に対するチェックポイントの阻害効果。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、例えば、ＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞のＫｉ６７細胞内染色、および３Ｈ−チミジン組み込み法を使用して、免疫細胞増殖を評価することによって行われる。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、およびＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定される細胞脱顆粒のうちの１つ以上を含む、遺伝子発現の増加または活性化関連マーカーの増加したタンパク質レベルを評価することによって行われる。
【０３１９】
一般に、遺伝子発現アッセイは、当該技術分野で既知であるように行われる。
【０３２０】
一般に、タンパク質発現測定も同様に、当該技術分野で知られているように実施される。
【０３２１】
いくつかの実施形態において、治療の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、補酵素産生、およびヌクレオチド取り込み活性などの多数の細胞パラメータを推測することを通した標的細胞生存検出によって測定される細胞傷害性活性を評価することによって行なわれる。これらのアッセイの具体的な例としては、トリパンブルーまたはＰＩ染色、５１Ｃｒまたは３５Ｓ放出法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴおよび／またはＷＳＴアッセイ、カルセイン−ＡＭアッセイ、発光系アッセイ、ならびに他のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、サイトカイン産生によって測定されるＴ細胞活性を評価することによって行われ、周知の技法を使用して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むがこれらに限定されないサイトカインを使用して、培養上清液中で細胞内のいずれかで測定する。
＊＊製剤化等
＊＊ＥＥ
＊＊ＴＴ
【実施例】
【０３２３】
【０３２４】
Ａ．実施例１  ＸｍＡｂ２２８４１のインビトロでの結合の調査
１．１Ａ：ＸｍＡｂ２０７１７は、細胞表面に発現したＰＤ−１とＣＴＬＡ−４を同時に占有する
ＣＴＬＡ−４を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）に、ＰＤ−１をコードするｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を指示された試験物質で、４℃で３０分間処理した。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、パシフィックブルーコンジュゲートＸＥＮＰ２０１１１（ＸｍＡｂ２０７１７由来の抗ＰＤ−１アームに基づくワンアームｓｃＦｖ−Ｆｃ）およびＡＰＣコンジュゲートＸＥＮＰ２００５９（ＸｍＡｂ２０７１７由来の抗ＣＴＬＡ−４アームに基づくワンアームＦａｂ−Ｆｃ）で４℃で３０分間で染色しし、フローサイトメトリーでアッセイした。図５７および図５８は、染色により示される占有されていないＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１受容体を有するＧＦＰ＋（ＣＴＬＡ−４＋ＰＤ−１  ＋）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の様々な集団のパーセンテージで示される、様々な試験物質による処理後の受容体占有率を示す。例えば、ＣＴＬＡ−４受容体の占有率は、ＰＤ−１＋  ＣＴＬＡ−４＋およびＰＤ−１−  ＣＴＬＡ−４＋集団のパーセンテージを減少させ、およびＰＤ−１＋  ＣＴＬＡ−４−およびＰＤ−１−  ＣＴＬＡ−４−集団のパーセンテージを増加させる。図５７Ａ〜Ｂは、ＰＤ−１＋  ＣＴＬＡ−４＋およびＰＤ−１  −  ＣＴＬＡ−４−の有病率を示す。図５８は、１２．５μｇ／ｍＬの指定された試験物質による処理後の様々な集団の有病率を表す散布図を示している。データは、ＸｍＡｂ２０７１７がＰＤ−１とＣＴＬＡ−４を同時に発現する細胞を選択的に標的とすることを示している。
【０３２５】
Ｂ．実施例２：ＸｍＡｂ２０７１７はマウスの同種抗腫瘍応答を増強する
ＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスは、０日目にＫＧ１Ａ−ｌｕｃがん細胞を移植した。２１日目に、ヒトＰＢＭＣをマウスの腹腔内に移植した。ＰＢＭＣ生着後、指示された試験物質を腹腔内注射で（コントロールマウスはＰＢＳを投与）４週間、毎週投与した（または合計４回投与）。腫瘍増殖は、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩＩ）を用いて、マウス当たりの総フラックスを測定することによりモニターし、データは、（１回目の投与後の日数）
【０３２６】
図５９に示される。
【０３２７】
Ｃ．実施例３：ＸｍＡｂ２２８４１のインビトロでの結合の調査
１．ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ２９３ＴへのＸｍＡｂ２２８４１の結合
ＣＴＬＡ−４を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）に、ＬＡＧ−３をコードするｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を以下の試験物質の指示された濃度で、４℃で３０分間インキュベートした：ＸｍＡｂ２２８４１、ＸＥＮＰ１６４３３（ＸｍＡｂ２２８４１の抗ＣＴＬＡ−４アームが由来する親クローンに基づく二価ｍＡｂ）、ＸＥＮＰ１６４３６（ＸｍＡｂ２２８４１の抗ＬＡＧ−３アームが由来する親クローンに基づく二価ｍＡｂ）、ＸＥＮＰ２４８９３（ＸｍＡｂ２２８４１由来の抗ＣＴＬＡ−４アームに基づくワンアームｓｃＦｖ−Ｆｃ）、ＸＥＮＰ２４８９５（ＸｍＡｂ２２８４１由来の抗ＬＡＧ−３アームをベースにしたワンアームＦａｂ−Ｆｃ）およびＸＥＮＰ１５０７４（対照としての二価の抗ＲＳＶ  ｍＡｂ）。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、抗ヒトＦｃ−Ａ６４７コンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で結合を検出した。ＧＦＰ＋細胞（すなわちＣＴＬＡ−４  ＋ＬＡＧ−３＋）への試験物質の結合を示すＭＦＩを図６０に示す。
【０３２８】
２．ＸｍＡｂ２２８４１によるＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３を発現するＨＥＫ２９３ＴでのＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３の占有率
ＣＴＬＡ−４を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）に、ＬＡＧ−３をコードするｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を４℃で３０分間、次の試験物質で処理した：ＸｍＡｂ２２８４１、ＸＥＮＰ１６４３３、ＸＥＮＰ１６４３６、ＸＥＮＰ２４８９３、ＸＥＮＰ２４８９５、およびＸＥＮＰ１５０７４。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、パシフィックブルーコンジュゲートＸＥＮＰ２４８９５およびＡ６４７コンジュゲートＸＥＮＰ２３５５２で染色した。図６１Ａ−Ｄは、染色により示される占有されていないＣＴＬＡ−４および／またはＬＡＧ−３受容体を有するＧＦＰ＋（ＣＴＬＡ−４＋ＬＡＧ−３＋）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の様々な集団のパーセンテージで示される、様々な試験物質による処理後の受容体占有率を示す。例えば、ＣＴＬＡ−４受容体の占有率は、ＬＡＧ−３＋  ＣＴＬＡ−４＋およびＬＡＧ−３−  ＣＴＬＡ−４＋集団のパーセンテージを減少させおよびＬＡＧ−３＋  ＣＴＬＡ−４−およびＬＡＧ−３−  ＣＴＬＡ−４−集団のパーセンテージの増加させる。図６２Ａ〜Ｂは、ＸＥＮＰ２４８９５およびＸＥＮＰ２３５５２の結合によって示されるように、試験物質による処理後のＧＦＰ＋細胞上の占有されていないＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４受容体の量をそれぞれ示す。
【０３２９】
３．ＸｍＡｂ２２８４１のＳＥＢ刺激Ｔ細胞への結合
Ｔ細胞へのＸｍＡｂ２２８４１の結合をＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイで測定した。ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４などのチェックポイント受容体の発現を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した活性化によって達成されるのと同様にＴ細胞の活性化および増殖を引き起こす超抗原である。したがって、６ドナーからのヒトＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激した。次に、細胞を指示された試験物質の指示された濃度で３０分間処理した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、抗ヒトＦｃ−Ａ６４７抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。ＣＤ３＋  Ｔ細胞への試験物質の結合を示すＭＦＩを、各ドナーについてそれぞれ図６３Ａ〜Ｆに示す。
【０３３０】
データは、各ドナーからのＰＢＭＣで、ＸｍＡｂ２２８４１が単一特異性対照と比較してＣＤ３＋  Ｔ細胞により強く結合することを示し、ヒトＴ細胞への結合が、単一特異性抗体によるよりも、各アームが異なる抗原に一価結合する二重特異性抗体ＸｍＡｂ２２８４１によるほうが著しく優れていることを示している。
【０３３１】
Ｄ．実施例４：二重特異性チェックポイント抗体による治療後のサイトカイン放出および免疫関連遺伝子発現プロファイルの調査
ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。刺激後、細胞を２回洗浄し、１００  ｎｇ／ｍＬのＳＥＢと２０μｇ／ｍＬの指示された試験物質で再刺激した。細胞上清を処理の２４時間後に収集し、ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ  ３８４−Ｗｅｌｌ  Ｓｐｏｔプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、  Ｍｄ．）でのマルチプレックスアッセイによりＩＬ−２およびＩＦＮγについてアッセイした。ＲＮＡを細胞から抽出し、免疫応答をカバーする７７０の標的遺伝子をアッセイするｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、  Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）でアッセイした。
【０３３２】
図６４と図６５は、抗ＲＳＶ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）と比較した、抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３２）、ＸｍＡｂ２０７１７、およびＸｍＡｂ２２８４１、ならびに抗ＰＤ−１  ｍＡｂと組み合わせたＸｍＡｂ２２８４１による処理後のＩＬ−２およびＩＦＮγの倍数増加を、それぞれ示す。特に、ＸｍＡｂ２２８４１と抗ＰＤ−１  ｍＡｂの組み合わせは、単独の場合よりも著しく多くのサイトカイン放出をもたらし、トリプル免疫チェックポイント遮断の利点を示している。図６６〜図７２は、二重特異性チェックポイント抗体、抗ＰＤ−１  ｍＡｂ、および抗ＲＳＶ  ｍＡｂ間の様々な遺伝子の発現（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によって決定）の倍数変化を示している。
【０３３３】
Ｅ．実施例５：抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１の生成
１．抗ＰＤ−１ハイブリドーマの生成とスクリーニング
さらなるＰＤ−１標的化アームを開発するために、ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅを介する、それらの標準法およびラピッドプライム法によって、ハイブリドーマ技術により、モノクローナル抗体を最初に作成した。標準法では、抗原を３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。ハイブリドーマ生成のために犠牲にされる７〜１０日前に、免疫されたマウスは抗原追加免疫を受けた。抗体力価を抗原に対するＥＬＩＳＡによって評価し、そして最も応答のよいマウスを融合のために選択する。最後の抗原追加免疫は融合の４日前に与えられる。マウス由来のリンパ球をプールし、精製し、次いでＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させる。融合細胞をＨＡＴ選択的シングルステップクローニング培地上で１０〜１２日間増殖させ、その時点でハイブリドーマはスクリーニングの準備ができていた。ラピッドプライム法では、抗原を３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。１９日後、全てのマウス由来のリンパ球をプールし、精製し、次いでＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させる。融合細胞をＨＡＴ選択的シングルステップクローニング培地上で１０〜１２日間増殖させ、その時点でハイブリドーマはスクリーニングの準備ができていた。使用した抗原（複数可）は、ヒトＰＤ−１のマウスＦｃ融合体（ｈｕＰＤ−１−ｍＦｃ）、カニクイザルＰＤ−１のマウスＦｃ融合体（ｃｙｎｏＰＤ−１−ｍＦｃ）、Ｈｉｓタグ付きヒトＰＤ−１（ｈｕＰＤ−１−Ｈｉｓ）、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＰＤ−１（ｃｙｎｏＰＤ−１−Ｈｉｓ）またはそれらの混合物であった。
【０３３４】
上述のようにして生成した抗ＰＤ−１ハイブリドーマクローンを、Ｏｃｔｅｔ、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法を用いて２回のスクリーニングにかけた。Ｏｃｔｅｔの実験工程は、一般的に以下を含んでいた：固定化（バイオセンサ上へのリガンドまたは試験物質の捕捉）、会合（対応する試験物質またはリガンドの連続希釈物を含むウェルへのリガンドまたは試験物質をコーティングしたバイオセンサの浸漬）、および試験物質の親和性を決定するための解離（緩衝液を含むウェルにバイオセンサを戻すこと）。緩衝液のみを含む参照ウェルもまた、データ処理中のバックグラウンド補正のための方法に含まれた。
【０３３５】
１回目のラウンドでは、抗マウスＦｃ（ＡＭＣ）バイオセンサを用いてクローンを５００ｎＭの二価ヒトおよびカニクイザルＰＤ−１−Ｆｃ−Ｈｉｓに浸漬して捕捉した。２回目のラウンドでは、１回目のラウンドで同定された、ヒトとカニクイザルのＰＤ−１の両方に陽性のクローンをＡＭＣバイオセンサに捕捉し、５００ｎＭの一価ヒトとカニクイザルのＰＤ−１−Ｈｉｓに浸した。
【０３３６】
２．クローン１Ｃ１１の特徴付け
例１で同定された１つのハイブリドーマクローンはクローン１Ｃ１１であった。ハイブリドーマクローン１Ｃ１１のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターｐＴＴ５に標準的な分子生物学技術を用いてサブクローニングしてＸＥＮＰ２１５７５を生成し、その配列を図９に示す。
【０３３７】
３．クローン１Ｃ１１によるＰＤ−Ｌ１遮断
チェックポイント受容体／リガンド相互作用の遮断はＴ細胞活性化に必要である。ＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブの可変領域を有する抗ＰＤ−１  ｍＡｂ）、ＸＥＮＰ２１４６１（ペムブロリズマブの可変領域を有する抗ＰＤ−１  ｍＡｂ）、およびコントロールとしてＸＥＮＰ１５０７４（モタビズマブの可変領域を有する抗ＲＳＶＭａｂ）について、ＸＥＮＰ２１５７５の遮断能力を細胞結合アッセイで調査した。ＰＤ−１を発現するようにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＸＥＮＰ２１５７５、および対照抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、ＰＤ−Ｌ１のマウスＦｃ融合体を添加してインキュベートした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃの結合を抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出し、そのデータを図１０に示す。データは、ＸＥＮＰ２１５７５によるＰＤ−Ｌ１遮断がＸＥＮＰ１６４３２およびＸＥＮＰ２１４６１による遮断に類似していたことを示している。
【０３３８】
４．クローン１Ｃ１１のＴ細胞表面結合
Ｔ細胞への抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１の結合をＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイで測定した。ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は、ＰＤ−１などのチェックポイント受容体の発現を含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した活性化によって達成されるのと同様にＴ細胞の活性化および増殖を引き起こす超抗原である。ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬで３日間刺激した。刺激後、ＰＢＭＣを示された濃度の指示された試験物質と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＵＣＨＴ１）およびヒト免疫グロブリンκ軽鎖のためのＡＰＣ標識抗体で染色した。ＦＩＴＣ＋細胞上のＡＰＣ  ＭＦＩによって示されるような試験物質のＴ細胞への結合を図１１に示す。
【０３３９】
５．クローン１Ｃ１１によるＴ細胞活性化
サイトカイン分泌によって示されるように、クローン１Ｃ１１によるＴ細胞活性化を、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて調べた。ヒトＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。次いで細胞を培地中で２回洗浄し、示された試験物質の示された量と組み合わせた５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２４時間刺激した。次いで上清を細胞によってＩＬ−２およびＩＦＮγについてアッセイし、そのデータを図１２に示す。
【０３４０】
６．クローン１Ｃ１１のヒト化
クローン１Ｃ１１は、ストリング含有量最適化を用いてヒト化した（例えば、２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号を参照）。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、そして標準的な分子生物学技術を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。二価抗体形式のクローン１Ｃ１１の例示的ヒト化バリアントの配列を図１３に示す。
【０３４１】
ＸＥＮＰ２２５５３の親和性は、概して実施例に記載さているように、Ｏｃｔｅｔを用いて決定した。特に、抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサを使用して、試験物質を複数濃度のヒスチジンタグ付きＰＤ−１に浸漬して捕捉した。親和性の結果および対応するセンサグラムを図１４に示す。
【０３４２】
７．ｓｃＦｖ形式でのクローン１Ｃ１１のヒト化バリアントの安定性最適化
抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１ヒト化バリアントＨ３Ｌ３（ＸＥＮＰ２２５５３と同様）の可変領域は、ｓｃＦｖに関連して（親和性を維持しながら）安定性を向上させるために（たとえば、二重特異性抗体で使用するために）操作された。ＸＥＮＰ２２５５３の可変重鎖領域と可変軽鎖領域を含むｓｃＦｖをコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、標準的な分子生物学技術を使用して発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。ｓｃＦｖのＣ末端には、精製用のポリヒスチジンタグは含んでいた。次に、標準的な変異誘発により、ｓｃＦｖバリアントのライブラリーを構築した。その例示的な配列を図１５に示す（ただし、ポリヒスチジンタグは削除されている）。
【０３４３】
ｓｃＦｖ−Ｈｉｓの安定性を、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）を使用して評価した。ＤＳＦ実験は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。タンパク質をＳＹＰＲＯオレンジ蛍光色素と混合し、ＰＢＳで０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＳＹＰＲＯオレンジの最終濃度は１０倍であった。２５℃で最初の１０分間のインキュベーション期間の後、タンパク質を１℃／分の加熱速度で２５℃〜９５℃に加熱した。蛍光測定は３０秒ごとに実施された。融解温度（Ｔｍ）は機器のソフトウェアを用いて計算した。安定性の結果を図１７に示す。データは、融解温度（Ｔｍ）が最大１９°Ｃ上昇したことを示す。
【０３４４】
バリアントの親和性を決定するために、ｓｃＦｖからの可変領域を、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を含む二価ＩｇＧ１のＦａｂとして形式化した。例示的な配列を、図１６に示す。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、そして標準的な分子生物学技術を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一時的にトランスフェクトした。上清のアフィニティスクリーニングは、Ｏｃｔｅｔを使用して行った。抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサを使用して、各上清の１：２希釈を２．０ｎｍの密度まで捕捉し、ＫＤ決定のためにＰＤ−１−Ｈｉｓに浸漬した。親和性の結果を、図１７に示す。
【０３４５】
８．Ｆａｂ形式でのクローン１Ｃ１１のヒト化バリアントの親和性最適化
抗ＰＤ−１クローン１Ｃ１１ヒト化バリアントＨ３Ｌ３（ＸＥＮＰ２２５５３と同様）の可変領域は、Ｆａｂ形式で生成され、例えば、二価の単一特異性抗体としての使用に、または二重特異性抗体での使用に、最適化された親和性のために操作された。
【０３４６】
最初のライブラリーでは、親和性が増加していることが判明した、例４Ｄで生成されたｓｃＦｖからの可変の重鎖領域と軽鎖領域を組み合わせて、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価ＩｇＧ１形式を生成した。その例示的な配列を図２０に示す。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、そして標準的な分子生物学技術を用いてＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一時的にトランスフェクトした。抗体をプロテインＡクロマトグラフィーで精製し、Ｏｃｔｅｔを使用してアフィニティースクリーニングを行った。ＡＨＣバイオセンサを使用して抗体を捕捉し、ＫＤ測定のために複数の濃度のＰＤ−１−Ｈｉｓに浸漬した。親和性の結果を、図１９に示す。
【０３４７】
２番目のライブラリでは、ＸＥＮＰ２２５５３の重鎖または軽鎖のいずれかをコードする発現ベクター上で、標準的な変異誘発によって追加のバリアントが構築された。追加の重鎖および軽鎖バリアントの例示的な配列を図２０および図２１に示す。追加の重鎖バリアントをコードするＤＮＡとＸＥＮＰ２２５５３の軽鎖をコードするＤＮＡ、またはＸＥＮＰ２２５５３の重鎖をコードするＤＮＡと追加の軽鎖バリアントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一時的にトランスフェクトした。上清のアフィニティスクリーニングは、Ｏｃｔｅｔを使用して行った。抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサを使用して、各上清の１：２希釈を２．０ｎｍの密度まで捕捉し、ＫＤ決定のためにＰＤ−１−Ｈｉｓに浸漬した。親和性の結果を、図２２に示す。フォローアップスクリーニングで、選択した抗体をコードするＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、抗体をプロテインＡクロマトグラフィーで抗体を精製し、Ｏｃｔｅｔを使用して親和性をスクリーニングした。抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサを使用して抗体を捕捉し、ＫＤ測定のために複数の濃度のＰＤ−１−Ｈｉｓに浸漬した。それらの結果を図２３に示す。
【０３４８】
上記で一般的に説明したように、別のライブラリが生成された。得られた抗体の例示的な配列を図２４に示す。選択した抗体をコードするＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、抗体をプロテインＡクロマトグラフィーで精製し、Ｏｃｔｅｔを使用して親和性をスクリーニングした。抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサを使用して抗体を捕捉し、ＫＤ測定のために複数の濃度のＰＤ−１−Ｈｉｓに浸漬した。それらの結果を図２５に示す。
【０３４９】
９．Ｂｉａｃｏｒｅによって決定された、親和性が最適化された１Ｃ１１バリアントの親和性スクリーニング
上記のように生成された１Ｃ１１バリアントの親和性と、ニボルマブ（ＸＥＮＰ１６４３２）およびペンブロリズマブ（ＸＥＮＰ２１４６１）に基づく対照ｍＡｂの親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの技術であるＢｉａｃｏｒｅを使用して決定された。Ｂｉａｃｏｒｅの実験手順には、一般的に次のものが含まれた：固定化（センサチップへのリガンドの捕捉）、会合（センサチップ上での様々な濃度の検体の流れ）、および試験物質の親和性を決定するための解離（センサチップ上を流れる緩衝液）。緩衝液のみを含む参照流れもまた、データ処理中のバックグラウンド補正のための方法に含まれた。結合親和性と速度定数は、１：１結合モデルを使用して処理されたデータを分析することにより得られた。特に、抗ＰＤ−１  ｍＡｂがプロテインＡセンサチップに捕捉させ、次に複数の濃度のヒスチジンタグ付きヒトＰＤ−１またはヒスチジンタグ付きカニクイザルＰＤ−１がセンサチップ上に流された。得られた解離定数（ＫＤ）を図２６に示す。
【０３５０】
１０．親和性最適化１Ｃ１１バリアントのＴ細胞表面結合
Ｔ細胞への親和性最適化１Ｃ１１バリアントの結合は、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイで測定された。ヒトＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激した。刺激後、ＰＢＭＣを示された濃度の指示された試験物質と共に３０分間インキュベートした。ＰＢＭＣを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＵＣＨＴ１）およびヒトＦｃのためのＡ６４７標識抗体で染色した。ＦＩＴＣ＋細胞上のＡ６４７  ＭＦＩによって示されるような試験物質のＴ細胞への結合を図２７に示す。
【０３５１】
１１．親和性最適化１Ｃ１１バリアントによるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合の遮断
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を遮断する親和性最適化１Ｃ１１バリアントの能力は、Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸ機器を使用したタンデムエピトープビニングアッセイで調査された。Ｏｃｔｅｔの実験手順は、概して実施例で記載された。具体的には、ヒトＰＤ−１のマウスＦｃ融合をＡＭＣ（抗マウスＦｃ捕捉）バイオセンサに搭載してから、１００ｎＭの第１の試験物質（図２８に示す表の左側に示されている）に浸漬し、次に、１００ｎＭの第２の試験物質（図２８に示す表の上部に示されている）に浸漬した。試験物質には、ヒト化クローン１Ｃ１１の親和性最適化バリアントとＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２のＦｃ融合（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）が含まれていた。各試験物質対のＢＬＩ応答は、バイオセンサをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液に浸漬してから試験物質に浸漬した場合の応答に対して正規化された。各試験物質対の正規化されたＢＬＩ応答を図に示す。第２の試験物質が０．４未満の正規化されたＢＬＩ応答を提示した場合、第２の試験物質のＰＤ−１への結合は第１の試験物質によって遮断されたと見なされた。第２の試験物質が０．４と０．６の間の正規化されたＢＬＩ応答を提示した場合、遮断は境界にある見なされる。第２の試験物質が０．６より大きい正規化されたＢＬＩ応答を提示した場合、第２の試験物質のＰＤ−１への結合は、第１の試験物質によって遮断されていないと見なされた。データは、抗ＰＤ−１  １Ｃ１１バリアントのそれぞれがＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合を遮断したことを示している。
【０３５２】
Ｆ．実施例６：さらに操作された親和性最適化１Ｃ１１バリアント
前述のアプローチを使用して、ならびに親和性を最適に調節すると思われる置換をうまく組み合わせることにより、さらに１Ｃ１１バリアントを操作してＰＤ−１親和性を調節した。さらに、バリアント１Ｃ１１可変重鎖とバリアント１Ｃ１１可変軽鎖を組み合わせて、好ましい親和性調節を実証した。得られた抗体の例示的な配列を図４０に示す。
【０３５３】
１．追加の親和性操作１Ｃ１１バリアントのアフィニティスクリーニング
追加の親和性操作１Ｃ１１バリアントの親和性は、一般的に上記のように、Ｏｃｔｅｔを使用して決定された。特に、ＡＨＣバイオセンサを使用して１Ｃ１１バリアントを捕捉させ、Ｈｉｓタグ付きヒトＰＤ−１（ならびに図４１に示すデータのＨｉｓタグ付きカニクイザルＰＤ−１）の複数の濃度に浸漬した。得られた解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を図４１〜４５（各図は別々の実験セットを示している）に示す。
【０３５４】
２．ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおける１Ｃ１１バリアントによるサイトカイン分泌の誘導
実験間およびＯｃｔｅｔまたはＢｉａｃｏｒｅから得られたデータ間で技術的なばらつきがあったが、１Ｃ１１＿Ｈ３Ｌ３（Ｏｃｔｅｔで測定）の親和性は一般に１５〜１９ｎＭの範囲であった（実験の４／６から）。操作の様々なラウンドから、ヒトＰＤ−１に対する、親和性がはるかに強い１Ｃ１１バリアント（例えば、Ｏｃｔｅｔによって決定される親和性が０．５１〜０．７４ｎＭの範囲のＸＥＮＰ２６９４０、および０．７７ｎＭの親和性を有するＸＥＮＰ２８６５２）と、親和性がはるかに弱いバリアント（例えば、Ｏｃｔｅｔによって決定される３３３ｎＭの親和性を有するＸＥＮＰ２６９２８）が得られた。したがって、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイで、サイトカイン分泌によって示されるように、親和性の異なるバリアントによるＴ細胞の活性化を調査した。１８の固有のドナー由来のＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。次に、細胞を洗浄し、ＳＥＢと２０μｇ／ｍＬの試験物質で再刺激した。ＩＦＮγおよびＩＬ−２分泌を示すデータを、それぞれ図４６および図４７に示す。データは、ＸＥＮＰ２６９２８の弱い結合親和性と対応するサイトカイン分泌の弱い誘導によって示されるように、１Ｃ１１バリアントの活性とそれらの親和性の間の相関を示唆している。
【０３５５】
要約すると、１Ｃ１１＿Ｈ３Ｌ３（ＸＥＮＰ２２５３３）としてヒト化すると、ニボルマブに基づく抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  ＸＥＮＰ１６４３２と比較して同様の親和性を有する新規の抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  １Ｃ１１が特定された（Ｂｉａｃｏｒｅによる決定でそれぞれ８．６  ｎＭおよび４．５  ｎＭ  、Ｏｃｔｅｔによる決定でそれぞれ約１８ｎＭおよび１０ｎＭ）。図１１に示すように、ＸＥＮＰ２２５３３は同様の親和性にもかかわらず、ＸＥＮＰ１６４３２よりもＴ細胞に強く結合する。Ｏｃｔｅｔで測定したＰＤ−１に対して２桁を超える調節した親和性を持つバリアントを生成するようにＸＥＮＰ２２５３３を操作した。この「アフィニティラダー（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌａｄｄｅｒ）」は、ＰＤ−１受容体のリサイクル、抗体：抗原複合体の寿命、および抗体血清の半減期の複雑な生理的挙動を最もうまくナビゲートできるＰＤ−１に対する最適な親和性を特定するのに役立つ。これらのファクターは、将来のインビボマウス腫瘍モデルで検討される。
【０３５６】
Ｇ．実施例７：ＸｍＡｂ２２８４１およびαＰＤ−１によるトリプルチェックポイント遮断は、ＳＥＢ刺激細胞からのサイトカイン分泌を増強する。
ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。細胞を２回洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢと２０μｇ／ｍＬの指示された被験物質で２４時間再刺激した。図２９および図３０に示すように、細胞上清を収集し、ＩＦＮγおよびＩＬ−２分泌についてアッセイした。データは、ＸｍＡｂ２２８４１とＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブに基づく切除されたエフェクター機能を有する二価のαＰＤ−１ｍＡｂ）の組み合わせによって有効になるトリプルチェックポイント遮断が、ＸＥＮＰ１６４３２またはＸｍＡｂ２２８４１単独のいずれかを超えてサイトカイン分泌を増強することを示している。特に、ＸｍＡｂ２２８４１とＸＥＮＰ１６４３２の組み合わせは、ＸＥＮＰ１６４３２、ＸＥＮＰ１６４３３（イピリムマブに基づく切除されたエフェクター機能を有する二価のαＣＴＬＡ−４ｍＡｂ）、およびＸＥＮＰ１６４３６（２５Ｆ７に基づく切除されたエフェクター機能を有する二価のαＬＡＧ−３ｍＡｂ）の組み合わせによるトリプルチェックポイント遮断と同様のレベルにサイトカイン分泌を強化する。
【０３５７】
Ｈ．実施例８：ＸｍＡｂ２２８４１の結合活性がＭＬＲからのサイトカイン放出の原因である
２人の固有のドナーからのＰＢＭＣを混合し（４００，０００細胞／ドナー）、２０μｇ／ｍＬの指示された試験物質と５日間インキュベートした。インキュベーション後、図３１に示すように、細胞をＩＦＮγについてアッセイした。同様の実験で、混合ＰＢＭＣを様々な濃度の指示された試験物質と５日間インキュベートし、ＰＢＳに対するＩＦＮγの倍数誘導を図３２に示す。データは、ＸｍＡｂ２２８４１が、ＸＥＮＰ２４８９５（ＸｍＡｂ２２８４１の抗ＬＡＧ−３アームに基づくワンアーム一価ｍＡｂ）とＸＥＮＰ２４８９３（ＸｍＡｂ２２８４１の抗ＣＴＬＡ−４アームに基づくワンアーム一価ｍＡｂ）の組み合わせを超えてＩＦＮγ分泌を増強することを示しており、二価結合によって可能になる結合活性は、サイトカイン放出を高めるために必要であることを示している。
【０３５８】
Ｉ．実施例９：ＸｍＡｂ２２８４１およびαＰＤ−１によるトリプルチェックポイント遮断は、ＮＳＧマウスのＧＶＨＤを増強する
ＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（グループあたり１０匹）に、０日目に１０  ｘ  １０６のヒトＰＢＭＣをＩＶ−ＯＳＰで移植した。４週間にわたり、１日目に、マウスにＸＥＮＰ２６８４２（切除したエフェクター機能とＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ  Ｘｔｅｎｄ変異を有するニボルマブに基づく二価のαＰＤ−１ｍＡｂ、図３３に示す配列）、ＸｍＡｂ２２８４１、ＸｍＡｂ２２８４１とＸＥＮＰ１６４３２の組み合わせ、またはＰＢＳを投与した（合計４回投与）。７、１４、および２１日目に採血して、図３４（１４日目）に示すように様々なリンパ球集団と、図３５（７日目）に示すようにＩＦＮγの血清濃度を計数した。
【０３５９】
Ｊ．実施例１０：ＸｍＡｂ２２８４１とαＰＤ−１によるトリプルチェックポイント遮断は、マウスの抗腫瘍応答を増強する。
ＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（１グループあたり１０匹）に、１４日目に、背腹部に３×１０６個のｐｐ６５を発現するＭＣＦ−７細胞を皮内移植した。０日目に、マウスに、Ｔ細胞ｐｐ６５反応性（または対照マウスのＰＢＳ）に対して陽性とスクリーニングされたＨＬＡ適合ＣＭＶ＋ドナーからの５×１０６個のヒトＰＢＭＣを腹腔内に移植した。マウスを毎週、ＸＥＮＰ１６４３２、ＸｍＡｂ２２８４１、ＸｍＡｂ２２８４１とＸＥＮＰ１６４３２の組み合わせ、またはＰＢＳ（対照マウス用）で４週間処理した（合計４回投与）。腫瘍体積はキャリパー測定によりモニターされ、そのデータを図３６Ａ〜Ｂに示す（初回投与後の日数）。図３７Ａ〜Ｄに示すように、７、１２、１９、および２６日目に採血し、フローサイトメトリーで分析して、様々なリンパ球集団を計数した。データは、リンパ球数（特にＣＤ８＋Ｔ細胞）が、様々なチェックポイント阻害剤の有無にかかわらず類似していたことを示している。しかしながら、様々な試験物質での処理は、腫瘍体積の顕著な減少をもたらし、チェックポイント遮断によるＴ細胞活性の抑制解除による抗腫瘍応答の増強を示した。さらに、データは、ＸｍＡｂ２２８４１（ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３を標的とする）とＸＥＮＰ１６４３２（ＰＤ−１を標的とする）の組み合わせ処理により、トリプルチェックポイント遮断が有効になり、ＸｍＡｂ２２８４１またはＸＥＮＰ１６４３２単独の処理よりも抗腫瘍応答が相乗的に増強したことを示している。
【０３６０】
Ｋ．実施例１１：抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  １Ｃ１１はＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスのＧＶＨＤを増強する
ＧＶＨＤ研究では、ヒト化抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  １Ｃ１１＿Ｈ３Ｌ３（ＸＥＮＰ２２５５３）の効果を調査した。ＮＳＧマウスに、０日目に１０  ｘ  １０６のヒトＰＢＭＣを静脈内移植し、続いて１、８、１５、および２１日目に以下の試験物質で処置した：ＰＢＳ対照、ＸＥＮＰ１６４３２（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切除バリアントを有するニボルマブに基づく抗ＰＤ−１抗体）、およびＸＥＮＰ２２５５３。図３８は、マウスの体重の変化（初期体重のパーセンテージとして）を示し、図３９は、マウスの血液中のヒトＣＤ４５＋細胞数、ＣＤ４＋Ｔ細胞数、およびＣＤ８＋Ｔ細胞数を経時的に示す。
【０３６１】
Ｌ．実施例１２：Ｘｔｅｎｄ  Ｆｃドメインは、ｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける抗ＰＤ−１  ｘ  抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体の半減期を延長する
Ｔｇ２７６トランスジェニックｈＦｃＲｎマウス（ｈＦｃＲｎに対して半接合性、ｎ＝５）は、０日目に２ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ２０７１７またはＸＥＮＰ２００５３（ＸｍＡｂ２０７１７の無Ｘｔｅｎｄ類似体）で処理した。全血サンプルを、処理後１時間、２、５、８、１２、１５、１９、２２、１６、２９、３３、および３５日目に収集した。試験物質濃度は、ヒトＰＤ−１およびヒトＣＴＬＡ−４抗原を使用して検出した。ＰＫ解釈分析は、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（バージョン６．４．０．７６８）を使用して、遊離薬物の血清濃度と時間の非コンパートメント分析のＰＫパラメータを使用して実行された。ＸｍＡｂ２０７１７およびＸＥＮＰ２００５３の薬物動態プロファイルを図７６に示し、半減期を図７７に示し、Ｃｍａｘを図７８に示す。追加のＰＫパラメータを図７９に要約する。
【０３６２】
Ｍ．実施例１３：ＸｍＡｂ２０７１７は、ナイーブＴ細胞Ｐにおいてサイトカイン放出を誘導しない
ＢＭＣを一晩解凍し、２０μｇ／ｍＬの指示された可溶性またはプレート結合の試験物質で２４時間処理した。抗ＣＤ３抗体はクローンＯＫＴ３であった。次に、細胞上清を収集し、Ｖ−ＰＬＥＸ炎症促進性パネル１ヒトキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）でアッセイした。各ポイントは、テクニカルシングレットで試験された固有のヒトドナーを表す。対応のあるｔ検定を使用して、統計的有意性を決定した（ｎ．ｓ．はｐ値＞０．０５を示す）。図８０に示すデータは、ＸｍＡｂ２０７１７がナイーブＴ細胞で、サイトカインの放出を誘導しないことを示している（Ａ：ＩＦＮγ、Ｂ：ＩＬ−１β、Ｃ：ＩＬ−２、Ｄ：ＩＬ−４、Ｅ：ＩＬ−８、Ｆ：ＩＬ−６、Ｇ：ＩＬ−１０；Ｈ：ＩＬ−１２ｐ７０；Ｉ：ＩＬ−１３、Ｊ：ＴＮＦα）。
【０３６３】
Ｎ．実施例１４：ＸｍＡｂ２０７１７による結合のさらなる特徴付け
１．Ａ：ＸｍＡｂ２０７１７は、ヒトおよびカニクイザルのＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１に結合する
ＸｍＡｂ２０７１７のヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１への結合は、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法であるＯｃｔｅｔを使用して特徴付けられた。結合親和性は、１：１結合モデルを使用して処理されたデータを包括的に分析することによって取得された。Ｏｃｔｅｔのセンサグラムを図８１と図８２に示す。結果として生じる平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度定数（ｋａ）、および解離定数（ｋｄ）を図８３に示す。ヒトとカニクイザルの両方のＣＴＬＡ−４の親和性は、それぞれ約４．１および２３ｎＭと測定された。ヒトおよびカニクイザルのＰＤ−１の結合親和性は、それぞれ１．４および５．５ｎＭであった。
【０３６４】
２．Ｂ：ＸｍＡｂ２０７１７は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１のリガンドとの結合について競合する
ＸｍＡｂ２０７１７あり／なしのＣＴＬＡ−４へのＣＤ８０とＣＤ８６の結合、およびＸｍＡｂ２０７１７あり／なしのＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２の結合は、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法であるＯｃｔｅｔを使用して特徴付けられた。Ｏｃｔｅｔのセンサグラムを図８４および図８５に示す。すべての場合において、１００ｎＭ  ＣＴＬＡ−４および１００  ｎＭ  ＰＤ−１は、それらのリガンド（それぞれＣＤ８０／ＣＤ８６およびＰＤＬ１／ＰＤＬ２）との結合シグナルを示す。過剰なＸｍＡｂ２０７１７の存在下、実験前にＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１と室温で１時間プレインキュベートした場合、それぞれそれらのリガンドＣＤ８０／ＣＤ８６およびＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２に対するＸｍＡｂ２０７１７とＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１との競合により、いずれのリガンドにも結合シグナルは観察されない。
【０３６５】
３．Ｃ：ＸｍＡｂ２０７１７はＦｃγＲに結合しない
ＸｍＡｂ２０７１７のヒト、カニクイザル、およびマウスのＦｃγＲへの結合は、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法であるＯｃｔｅｔを使用して特徴付けられた。コンパレータ（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）抗体も同様の方法を使用して試験された：天然ＩｇＧ１定常領域を有する抗ＣＤ１９抗体。Ｏｃｔｅｔのセンサグラムを図８６〜図８８に示す。天然ヒトＩｇＧ１抗体の予想される結合パターンはコンパレータ抗体で観察されたが、ＸｍＡｂ２０７１７ではＦｃγＲへのいずれの結合も検出されなかった
【０３６６】
４．Ｄ：ＸｍＡｂ２０７１７は、ｐＨ  ６．０でヒト、カニクイザル、およびマウスのＦｃＲｎに結合する
ＸｍＡｂ２０７１７のｐＨ  ６．０でのヒト、カニクイザル、およびマウスのＦｃＲｎへの結合は、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法であるＯｃｔｅｔを使用して特徴付けられた。コンパレータ抗体も同様の方法を使用して試験された：ＸｍＡｂ２０７１７と同じ可変領域と操作された定常領域を含むが、ＸｍＡｂ２０７１７がＦｃＲｎ結合を強化するために含有するアミノ酸置換を欠く、抗ＰＤ１×抗ＣＴＬＡ４二重特異性抗体、ＸＥＮＰ２００５３。結合親和性は、１：１ラングミュアモデルを使用して処理されたデータを包括的に分析することによって取得された。Ｏｃｔｅｔのセンサグラムを図９０に示す。得られた平衡解離定数（ＫＤ）を図８９に示す。ＸｍＡｂ２０７１７で測定された親和性は、コンパレータで測定されたものよりも強力であり、ＸｍＡｂ２０７１７に含まれるＦｃ置換が、エンドソーム輸送の生理学的に適切なｐＨ、ｐＨ  ６．０でのＦｃＲｎに対する親和性を改善することを示す。
【０３６７】
５．Ｅ：ＸｍＡｂ２０７１７はＰＤ−１とＣＴＬＡ−４を同時に結合する
ＰＤ１およびＣＴＬＡ４抗原の両方へのＸｍＡｂ２０７１７の結合は、Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸ機器でＢＬＩテクノロジーを使用したインタンデムディップアプローチ（ｉｎ−ｔａｎｄｅｍ  ｄｉｐ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用して試験された。最初に、バイオセンサにＰＤ−１を搭載し、次にＸｍＡｂ２０７１７または対照としての緩衝液に浸漬し、最後にＣＴＬＡ−４に浸漬した。図９１は、ＸｍＡｂ２０７１７が両方の抗原に同時に結合できることを示す結合センサグラムを示している。ＸｍＡｂ２０７１７センサグラムは、最後のＣＴＬＡ４抗原の浸漬中に信号が増加し続けるが、ＸｍＡｂ２０７１７が搭載されていない対照センサグラムは平坦なままである。
【０３６８】
Ｏ．実施例１５：さらなるＸｍＡｂ２０７１７のインビトロ特徴付け
１．Ａ：ＸｍＡｂ２０７１７は、抗ＰＤ−１抗体と比較して、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＬ−２分泌を促進する
２２の固有のドナー由来のＰＢＭＣは、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで４８時間刺激された。次に、細胞を培養液で２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢと２０μｇ／ｍＬの指定された試験物質で１８時間再刺激した。培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２濃度についてアッセイした。そのデータを図９２に示す。
【０３６９】
２．Ｂ：ＸｍＡｂ２０７１７は、抗ＰＤ−１抗体と比較して、刺激されていないヒトＰＢＭＣからのＩＬ−２分泌を抑制する
２２の固有のドナー由来の刺激されていないＰＢＭＣは、２０μｇ／ｍＬの指定された試験物質で７２時間処理された。培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２濃度についてアッセイした。そのデータを図９３に示す。
【０３７０】
３．Ｃ：ＸｍＡｂ２０７１７は、ＸｍＡｂ２０７１７を含む構成要素アームの混合物と比較して、ヒトリンパ球からのＩＬ−２分泌を促進する
２２の固有のドナー由来のＰＢＭＣは、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで４８時間刺激された（図９２から複製されたＸＥＮＰ１５０７４およびＸＥＮＰ２０７１７からのデータ）。次に、細胞を培養液で２回洗浄し、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢと２０μｇ／ｍＬの指示された試験物質で１８時間再刺激した。培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２存在量をアッセイした。そのデータを図９４に示す。
【０３７１】
Ｐ．実施例１６：マウスモデルにおけるインビボ試験のさらなる分析
以前の実施例で説明したＧＶＨＤ調査のデータをさらに分析した。図９５は、経時的なマウスの体重の平均変化（初期体重のパーセンテージとして）を示す。図９６は、経時的なマウスの生存率を示す。図９７は、マウスの経時的な平均ＩＦＮγレベルを示す。図９８は、経時的なマウスの血液中のヒトＣＤ４５＋細胞数、ＣＤ４＋  Ｔ細胞数、およびＣＤ８＋  Ｔ細胞数を示す。
【０３７２】
Ｑ．実施例１７：ＸｍＡｂ２０７１７はＧＶＨＤモデルのＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わせる
別のＧＶＨＤ研究では、ＸｍＡｂ２０７１７とＰＤ−Ｌ１遮断（抗ＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ）の組み合わせを調査した。ＮＳＧマウスに、０日目に１０  ｘ  １０６個のヒトＰＢＭＣを静脈内移植し、その後１、８、１５、および２１日目に以下の試験物質で処置した：ＰＢＳ対照、ＸｍＡｂ２０７１７、ＸＥＮＰ１６４３４（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切除バリアントを有するアテゾリズマブに基づく抗ＰＤ−Ｌ１抗体、図９９に示す配列）、およびＸＥＮＰ１６４３４と組み合わせたＸｍＡｂ２０７１７。図１００は、経時的なマウスの体重の変化（初期体重のパーセンテージとして）を示し、図１０１は、経時的なマウスの生存を示し、図１０２は、１４日目のマウス血液中のヒトＣＤ４５＋細胞数、ＣＤ４＋  Ｔ細胞数、およびＣＤ８＋  Ｔ  細胞数を示す。
【０３７３】
Ｒ．実施例１８：ＸｍＡｂ２０７１７とコンパレータ抗ＰＤ−１抗体との相互作用
ペンブロリズマブまたはニボルマブがＸｍＡｂ２０７１７の結合活性を妨げるかどうかを判断するために、ＰＤ−１−ＧＦＰおよびＣＴＬＡ−４を安定して発現する２９３Ｔ細胞をニボルマブまたはペンブロリズマブで、４°Ｃで３０分間処理した（１００μｇ／ｍＬで開始する１６ポイント２倍段階希釈）。細胞を２００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳに３％ＦＢＳ）で２回洗浄し、氷上でＡｌｅｘａ６４７にコンジュゲートしたＸｍＡｂ２０７１７（２００μｇ／  ｍＬで開始する１６ポイント３倍段階希釈）で３０分間染色した。次に、細胞を、ＸｍＡｂ２０７１７による結合についてＦＡＣＳによって分析した。そのデータは図１０３および図１０４に示す。図１０３に示したデータは、ニボルマブがＸｍＡｂ２０７１７のＰＤ−１＋ＣＴＬＡ−４＋細胞への結合を大幅に妨害しないことを示している。図１０４に示すデータは、ペムブロリズマブがＸｍＡｂ２０７１７のＰＤ−１＋  ＣＴＬＡ−４＋細胞への結合を妨害することを示しているが、ただし、図１０５に示されているデータは、ペンブロリズマブによる干渉が高濃度のＸｍＡｂ２０７１７で克服できることを示している。これは、ＸｍＡｂ２０７１７がニボルマブまたはペンブロリズマブによる治療と組み合わせて、またはそれに続いて対象に投与できることを示唆している。
【０３７４】
Ｓ．実施例１９：ＸｍＡｂ２２８４１はナイーブＴ細胞でサイトカイン放出を誘導せず、超アゴニスト性（ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔｉｃ）ではない
ＰＢＭＣを一晩解凍し、２０μｇ／ｍＬの指示された可溶性またはプレート結合の試験物質で２４時間処理した。抗ＣＤ３抗体はクローンＯＫＴ３であった。次に、細胞上清を収集し、Ｖ−ＰＬＥＸ炎症促進性パネル１ヒトキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）でアッセイした。各ポイントは、テクニカルシングレットで試験された固有のヒトドナーを表す。対応のあるｔ検定を使用して、統計的有意性を決定した（ｎ．ｓ．はｐ値＞０．０５を示す）。図１０６に示すデータは、ＸｍＡｂ２２８４１がナイーブＴ細胞で、サイトカインの放出を誘導しないことを示している（Ａ：ＩＦＮγ、Ｂ：ＩＬ−１β、Ｃ：ＩＬ−２、Ｄ：ＩＬ−４、Ｅ：ＩＬ−８、Ｆ：ＩＬ−６、Ｇ：ＩＬ−１０；Ｈ：ＩＬ−１２ｐ７０；Ｉ：ＩＬ−１３、Ｊ：ＴＮＦα）。
【０３７５】
ＸｍＡｂ２２８４１の超アゴニスト特性は、Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓプロトコル（Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．２００７）に従って風乾によっても評価された。試験物質の風乾は、ＳｐｅｅｄＶａｃ  ＴＭで２時間、室温で乾燥することにより行った。ヒトＰＢＭＣを１０μｇの風乾ＸｍＡｂ２２８４１で２４時間処理し、活性は１０μｇの風乾ＸＥＮＰ１５０７４（抗ＲＳＶ陰性アイソタイプ対照）または超アゴニストＴＧＮ１４１２（ＸＥＮＰ２９１５４、図１０７に示されている配列）と比較した。）。ＴＧＮ１４１２は、水性吸着法を使用してアッセイプレートに結合させた場合、なんら活性がなかったが、ただし、風乾ＴＧＮ１４１２は、刺激されていないヒトＰＢＭＣからのＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、およびＴＮＦサイトカイン分泌を促進した。比較すると、風乾ＸｍＡｂ２２８４１で処理したＰＢＭＣのサイトカインレベルは、風乾ＸＥＮＰ１５０７４の陰性対照と同様のままであった（図１０８に示すデータ）。
【０３７６】
Ｔ．実施例２０：ＸｍＡｂ２２８４１による結合のさらなる特徴付け
１．Ａ：ＸｍＡｂ２２８４１は、ヒトおよびカニクイザルのＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３に結合する
ＸｍＡｂ２２８４１のヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３への結合は、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法であるＯｃｔｅｔを使用して特徴付けられた。結合親和性は、１：１結合モデルを使用して処理されたデータを包括的に分析することによって取得された。Ｏｃｔｅｔのセンサグラムを図１０９と図１１０に示す。結果として得られる平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度定数（ｋａ）、および解離定数（ｋｄ）を図１１１に示す。ヒトとカニクイザルの両方のＣＴＬＡ−４の親和性は、それぞれ約４．６および１７．６ｎＭと測定された。ヒトおよびカニクイザルのＬＡＧ−３の結合親和性は、それぞれ１．４および１．３ｎＭであった。
【０３７７】
２．Ｂ：ＸｍＡｂ２２８４１は、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３のリガンドとの結合について競合する
ＸｍＡｂ２２８４１がある場合とない場合のＣＴＬＡ−４へのＣＤ８０およびＣＤ８６の結合は、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）ベースの方法であるＯｃｔｅｔを使用して特徴付けられた。Ｏｃｔｅｔのセンサグラムを図１１２に示す。どちらの場合も、１００  ｎＭ  ＣＴＬＡ−４はそれらのリガンド（ＣＤ８０／ＣＤ８６）との結合シグナルを示す。過剰なＸｍＡｂ２２８４１の存在下、実験前にＣＴＬＡ−４と室温で１時間プレインキュベートした場合、そのリガンドＣＤ８０／ＣＤ８６に対するＸｍＡｂ２２８４１とＣＴＬＡ−４との競合により、いずれのリガンドにも結合シグナルは観察されない。
【０３７８】
可溶性ＬＡＧ−３は、がん細胞系の表面に発現するＭＨＣクラスＩＩに結合する。したがって、ＸｍＡｂ２２８４１と複合体を形成したときに、ＸｍＡｂ２２８４１がＭＨＣＩＩ＋  Ｒａｍｏｓ細胞への可溶性ＬＡＧ−３結合を遮断できるかどうかを決定した。図１１３に示すように、ＸｍＡｂ２２８４１は、Ｒａｍｏｓ細胞への可溶性ＬＡＧ−３抗原の結合を用量依存的に遮断した。
【０３７９】
３．Ｃ：ＸｍＡｂ２２８４１はＦｃγＲに結合しない
ＸｍＡｂ２２８４１のヒト、カニクイザル、およびマウスのＦｃγＲへの結合は、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法であるＯｃｔｅｔを使用して特徴付けられた。コンパレータ抗体も同様の方法を使用して試験された：天然ＩｇＧ１定常領域を有する抗ＣＤ１９抗体。Ｏｃｔｅｔのセンサグラムを図１１４〜図１１６に示す。天然ヒトＩｇＧ１抗体の予想される結合パターンはコンパレータ抗体で観察されたが、ＸｍＡｂ２２８４１ではＦｃγＲへのいずれの結合も検出されなかった
【０３８０】
４．Ｄ：ＸｍＡｂ２２８４１は、ｐＨ  ６．０でヒト、カニクイザル、およびマウスのＦｃＲｎに結合する
ＸｍＡｂ２２８４１のｐＨ  ６．０でのヒト、カニクイザル、およびマウスのＦｃＲｎへの結合は、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法であるＯｃｔｅｔを使用して特徴付けられた。コンパレータ抗体も同様の方法を使用してテストされた：ＸｍＡｂ２２８４１と同じ可変領域と操作された定常領域を含むが、ＸｍＡｂ２２８４１がＦｃＲｎ結合を強化するために含有するアミノ酸置換を欠く、抗ＣＴＬＡ−４  ｘ抗ＬＡＧ−３二重特異性抗体、ＸＥＮＰ２２６０２。結合親和性は、１：１ラングミュアモデルを使用して処理されたデータを包括的に分析することによって取得された。Ｏｃｔｅｔのセンサグラムを図１１８に示す。得られた平衡解離定数（ＫＤ）を図１１７に示す。ＸｍＡｂ２２８４１で測定された親和性は、コンパレータで測定されたものよりも強力であり、ＸｍＡｂ２２８４１に含まれるＦｃ置換が、エンドソーム輸送の生理学的に適切なｐＨ、ｐＨ  ６．０でのＦｃＲｎに対する親和性を改善することを示す。
【０３８１】
５．Ｅ：ＸｍＡｂ２２８４１はＣＴＬＡ−４とＬＡＧ−３を同時に結合する
アプローチは、Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸ機器でＢＬＩテクノロジーを使用する。最初に、バイオセンサにＬＡＧ３を搭載し、次にＸｍＡｂ２２８４１または対照としての緩衝液に浸漬し、最後にＣＴＬＡ４に浸漬した。図１１９は、ＸｍＡｂ２２８４１が両方の抗原に同時に結合できることを示す結合センサグラムを示している。ＸｍＡｂ２２８４１センサグラムは、最後のＣＴＬＡ４抗原の浸漬中に信号が増加し続けるが、ＸｍＡｂ２２８４１が搭載されていない対照センサグラムは平坦なままである。
【０３８２】
Ｕ．実施例２１：ＸｍＡｂ２２８４１およびＰＤ−１の遮断によるＧＶＨＤのさらなる分析
以前の例で説明したＸｍＡｂ２２８４１およびＰＤ−１の遮断によるトリプルチェックポイント遮断を調査するＧＶＨＤ研究からのデータをさらに分析した。図１２０は、経時的なマウスの体重の平均変化（初期体重のパーセンテージとして）を示す。図１２１は、経時的なマウスの生存率を示す。図１２２は、７日目と１４日目のＩＦＮγとＩＬ−１０の濃度を示す。
【図１Ａ】
2021502100.tif 000004
【図１Ｂ】
2021502100.tif 000005
【図１Ｃ】
2021502100.tif 000006
【図１Ｄ】
2021502100.tif 000007
【図１Ｅ】
2021502100.tif 000008
【図１Ｆ】
2021502100.tif 000009
【図１Ｇ】
2021502100.tif 000010
【図１Ｈ】
2021502100.tif 000011
【図１Ｉ】
2021502100.tif 000012
【図１Ｊ】
2021502100.tif 000013
【図１Ｋ】
2021502100.tif 000014
【図１Ｌ】
2021502100.tif 000015
【図１Ｍ】
2021502100.tif 000016
【図１Ｎ】
2021502100.tif 000017
【図１Ｏ】
2021502100.tif 000018
【図２Ａ】
2021502100.tif 000019
【図２Ｂ】
2021502100.tif 000020
【図２Ｃ】
2021502100.tif 000021
【図２Ｄ】
2021502100.tif 000022
【図３Ａ】
2021502100.tif 000023
【図３Ｂ】
2021502100.tif 000024
【図３Ｃ】
2021502100.tif 000025
【図３Ｄ】
2021502100.tif 000026
【図３Ｅ】
2021502100.tif 000027
【図３Ｆ】
2021502100.tif 000028
【図４】
2021502100.tif 000029
【図５】
2021502100.tif 000030
【図６Ａ】
2021502100.tif 000031
【図６Ｂ】
2021502100.tif 000032
【図７Ａ】
2021502100.tif 000033
【図７Ｂ】
2021502100.tif 000034
【図８】
2021502100.tif 000035
【図９】
2021502100.tif 000036
【図１０】
2021502100.tif 000037
【図１１】
2021502100.tif 000038
【図１２Ａ】
2021502100.tif 000039
【図１２Ｂ】
2021502100.tif 000040
【図１３Ａ】
2021502100.tif 000041
【図１３Ｂ】
2021502100.tif 000042
【図１３Ｃ】
2021502100.tif 000043
【図１４】
2021502100.tif 000044
【図１５Ａ】
2021502100.tif 000045
【図１５Ｂ】
2021502100.tif 000046
【図１５Ｃ】
2021502100.tif 000047
【図１５Ｄ】
2021502100.tif 000048
【図１５Ｅ】
2021502100.tif 000049
【図１５Ｆ】
2021502100.tif 000050
【図１５Ｇ】
2021502100.tif 000051
【図１５Ｈ】
2021502100.tif 000052
【図１５Ｉ】
2021502100.tif 000053
【図１５Ｊ】
2021502100.tif 000054
【図１５Ｋ】
2021502100.tif 000055
【図１５Ｌ】
2021502100.tif 000056
【図１５Ｍ】
2021502100.tif 000057
【図１５Ｎ】
2021502100.tif 000058
【図１５Ｏ】
2021502100.tif 000059
【図１５Ｐ】
2021502100.tif 000060
【図１５Ｑ】
2021502100.tif 000061
【図１５Ｒ】
2021502100.tif 000062
【図１５Ｓ】
2021502100.tif 000063
【図１５Ｔ】
2021502100.tif 000064
【図１６Ａ】
2021502100.tif 000065
【図１６Ｂ】
2021502100.tif 000066
【図１６Ｃ】
2021502100.tif 000067
【図１６Ｄ】
2021502100.tif 000068
【図１６Ｅ】
2021502100.tif 000069
【図１６Ｆ】
2021502100.tif 000070
【図１６Ｇ】
2021502100.tif 000071
【図１６Ｈ】
2021502100.tif 000072
【図１７Ａ】
2021502100.tif 000073
【図１７Ｂ】
2021502100.tif 000074
【図１７Ｃ】
2021502100.tif 000075
【図１７Ｄ】
2021502100.tif 000076
【図１７Ｅ】
2021502100.tif 000077
【図１７Ｆ】
2021502100.tif 000078
【図１７Ｇ】
2021502100.tif 000079
【図１７Ｈ】
2021502100.tif 000080
【図１７Ｉ】
2021502100.tif 000081
【図１７Ｊ】
2021502100.tif 000082
【図１７Ｋ】
2021502100.tif 000083
【図１７Ｌ】
2021502100.tif 000084
【図１７Ｍ】
2021502100.tif 000085
【図１７Ｎ】
2021502100.tif 000086
【図１７Ｏ】
2021502100.tif 000087
【図１７Ｐ】
2021502100.tif 000088
【図１７Ｑ】
2021502100.tif 000089
【図１８Ａ】
2021502100.tif 000090
【図１８Ｂ】
2021502100.tif 000091
【図１８Ｃ】
2021502100.tif 000092
【図１８Ｄ】
2021502100.tif 000093
【図１８Ｅ】
2021502100.tif 000094
【図１８Ｆ】
2021502100.tif 000095
【図１８Ｇ】
2021502100.tif 000096
【図１９】
2021502100.tif 000097
【図２０Ａ】
2021502100.tif 000098
【図２０Ｂ】
2021502100.tif 000099
【図２０Ｃ】
2021502100.tif 000100
【図２０Ｄ】
2021502100.tif 000101
【図２０Ｅ】
2021502100.tif 000102
【図２０Ｆ】
2021502100.tif 000103
【図２０Ｇ】
2021502100.tif 000104
【図２０Ｈ】
2021502100.tif 000105
【図２０Ｉ】
2021502100.tif 000106
【図２０Ｊ】
2021502100.tif 000107
【図２０Ｋ】
2021502100.tif 000108
【図２０Ｌ】
2021502100.tif 000109
【図２１Ａ】
2021502100.tif 000110
【図２１Ｂ】
2021502100.tif 000111
【図２１Ｃ】
2021502100.tif 000112
【図２１Ｄ】
2021502100.tif 000113
【図２１Ｅ】
2021502100.tif 000114
【図２１Ｆ】
2021502100.tif 000115
【図２１Ｇ】
2021502100.tif 000116
【図２２Ａ】
2021502100.tif 000117
【図２２Ｂ】
2021502100.tif 000118
【図２２Ｃ】
2021502100.tif 000119
【図２２Ｄ】
2021502100.tif 000120
【図２２Ｅ】
2021502100.tif 000121
【図２３】
2021502100.tif 000122
【図２４Ａ】
2021502100.tif 000123
【図２４Ｂ】
2021502100.tif 000124
【図２４Ｃ】
2021502100.tif 000125
【図２４Ｄ】
2021502100.tif 000126
【図２４Ｅ】
2021502100.tif 000127
【図２４Ｆ】
2021502100.tif 000128
【図２４Ｇ】
2021502100.tif 000129
【図２４Ｈ】
2021502100.tif 000130
【図２４Ｉ】
2021502100.tif 000131
【図２４Ｊ】
2021502100.tif 000132
【図２５】
2021502100.tif 000133
【図２６】
2021502100.tif 000134
【図２７】
2021502100.tif 000135
【図２８】
2021502100.tif 000136
【図２９】
2021502100.tif 000137
【図３０】
2021502100.tif 000138
【図３１】
2021502100.tif 000139
【図３２】
2021502100.tif 000140
【図３３】
2021502100.tif 000141
【図３４】
2021502100.tif 000142
【図３５】
2021502100.tif 000143
【図３６Ａ】
2021502100.tif 000144
【図３６Ｂ】
2021502100.tif 000145
【図３７Ａ】
2021502100.tif 000146
【図３７Ｂ】
2021502100.tif 000147
【図３７Ｃ】
2021502100.tif 000148
【図３７Ｄ】
2021502100.tif 000149
【図３８】
2021502100.tif 000150
【図３９Ａ】
2021502100.tif 000151
【図３９Ｂ】
2021502100.tif 000152
【図３９Ｃ】
2021502100.tif 000153
【図４０Ａ】
2021502100.tif 000154
【図４０Ｂ】
2021502100.tif 000155
【図４０Ｃ】
2021502100.tif 000156
【図４０Ｄ】
2021502100.tif 000157
【図４０Ｅ】
2021502100.tif 000158
【図４０Ｆ】
2021502100.tif 000159
【図４０Ｇ】
2021502100.tif 000160
【図４０Ｈ】
2021502100.tif 000161
【図４０Ｉ】
2021502100.tif 000162
【図４０Ｊ】
2021502100.tif 000163
【図４０Ｋ】
2021502100.tif 000164
【図４０Ｌ】
2021502100.tif 000165
【図４０Ｍ】
2021502100.tif 000166
【図４０Ｎ】
2021502100.tif 000167
【図４０Ｏ】
2021502100.tif 000168
【図４０Ｐ】
2021502100.tif 000169
【図４０Ｑ】
2021502100.tif 000170
【図４０Ｒ】
2021502100.tif 000171
【図４０Ｓ】
2021502100.tif 000172
【図４０Ｔ】
2021502100.tif 000173
【図４０Ｕ】
2021502100.tif 000174
【図４０Ｖ】
2021502100.tif 000175
【図４０Ｗ】
2021502100.tif 000176
【図４０Ｘ】
2021502100.tif 000177
【図４０Ｙ】
2021502100.tif 000178
【図４０Ｚ】
2021502100.tif 000179
【図４０ＡＡ】
2021502100.tif 000180
【図４０ＢＢ】
2021502100.tif 000181
【図４１】
2021502100.tif 000182
【図４２】
2021502100.tif 000183
【図４３】
2021502100.tif 000184
【図４４】
2021502100.tif 000185
【図４５】
2021502100.tif 000186
【図４６】
2021502100.tif 000187
【図４７】
2021502100.tif 000188
【図４８】
2021502100.tif 000189
【図４９Ａ】
2021502100.tif 000190
【図４９Ｂ】
2021502100.tif 000191
【図４９Ｃ】
2021502100.tif 000192
【図４９Ｄ】
2021502100.tif 000193
【図４９Ｅ】
2021502100.tif 000194
【図４９Ｆ】
2021502100.tif 000195
【図４９Ｇ】
2021502100.tif 000196
【図４９Ｈ】
2021502100.tif 000197
【図４９Ｉ】
2021502100.tif 000198
【図４９Ｊ】
2021502100.tif 000199
【図４９Ｋ】
2021502100.tif 000200
【図４９Ｌ】
2021502100.tif 000201
【図４９Ｍ】
2021502100.tif 000202
【図４９Ｎ】
2021502100.tif 000203
【図４９Ｏ】
2021502100.tif 000204
【図４９Ｐ】
2021502100.tif 000205
【図４９Ｑ】
2021502100.tif 000206
【図４９Ｒ】
2021502100.tif 000207
【図４９Ｓ】
2021502100.tif 000208
【図４９Ｔ】
2021502100.tif 000209
【図４９Ｕ】
2021502100.tif 000210
【図４９Ｖ】
2021502100.tif 000211
【図４９Ｗ】
2021502100.tif 000212
【図４９Ｘ】
2021502100.tif 000213
【図４９Ｙ】
2021502100.tif 000214
【図４９Ｚ】
2021502100.tif 000215
【図４９ＡＡ】
2021502100.tif 000216
【図４９ＢＢ】
2021502100.tif 000217
【図４９ＣＣ】
2021502100.tif 000218
【図４９ＤＤ】
2021502100.tif 000219
【図４９ＥＥ】
2021502100.tif 000220
【図４９ＦＦ】
2021502100.tif 000221
【図４９ＧＧ】
2021502100.tif 000222
【図４９ＨＨ】
2021502100.tif 000223
【図４９ＩＩ】
2021502100.tif 000224
【図４９ＪＪ】
2021502100.tif 000225
【図４９ＫＫ】
2021502100.tif 000226
【図５０Ａ】
2021502100.tif 000227
【図５０Ｂ】
2021502100.tif 000228
【図５０Ｃ】
2021502100.tif 000229
【図５０Ｄ】
2021502100.tif 000230
【図５０Ｅ】
2021502100.tif 000231
【図５１】
2021502100.tif 000232
【図５２】
2021502100.tif 000233
【図５３】
2021502100.tif 000234
【図５４】
2021502100.tif 000235
【図５５】
2021502100.tif 000236
【図５６】
2021502100.tif 000237
【図５７Ａ】
2021502100.tif 000238
【図５７Ｂ】
2021502100.tif 000239
【図５８−１】
2021502100.tif 000240
【図５８−２】
2021502100.tif 000241
【図５９Ａ】
2021502100.tif 000242
【図５９Ｂ】
2021502100.tif 000243
【図６０】
2021502100.tif 000244
【図６１Ａ】
2021502100.tif 000245
【図６１Ｂ】
2021502100.tif 000246
【図６１Ｃ】
2021502100.tif 000247
【図６１Ｄ】
2021502100.tif 000248
【図６２Ａ】
2021502100.tif 000249
【図６２Ｂ】
2021502100.tif 000250
【図６３Ａ】
2021502100.tif 000251
【図６３Ｂ】
2021502100.tif 000252
【図６３Ｃ】
2021502100.tif 000253
【図６３Ｄ】
2021502100.tif 000254
【図６３Ｅ】
2021502100.tif 000255
【図６３Ｆ】
2021502100.tif 000256
【図６４】
2021502100.tif 000257
【図６５】
2021502100.tif 000258
【図６６】
2021502100.tif 000259
【図６７】
2021502100.tif 000260
【図６８】
2021502100.tif 000261
【図６９】
2021502100.tif 000262
【図７０】
2021502100.tif 000263
【図７１】
2021502100.tif 000264
【図７２】
2021502100.tif 000265
【図７３】
2021502100.tif 000266
【図７４】
2021502100.tif 000267
【図７５】
2021502100.tif 000268
【図７６Ａ】
2021502100.tif 000269
【図７６Ｂ】
2021502100.tif 000270
【図７７】
2021502100.tif 000271
【図７８】
2021502100.tif 000272
【図７９】
2021502100.tif 000273
【図８０Ａ】
2021502100.tif 000274
【図８０Ｂ】
2021502100.tif 000275
【図８０Ｃ】
2021502100.tif 000276
【図８０Ｄ】
2021502100.tif 000277
【図８０Ｅ】
2021502100.tif 000278
【図８０Ｆ】
2021502100.tif 000279
【図８０Ｇ】
2021502100.tif 000280
【図８０Ｈ】
2021502100.tif 000281
【図８０Ｉ】
2021502100.tif 000282
【図８０Ｊ】
2021502100.tif 000283
【図８１Ａ】
2021502100.tif 000284
【図８１Ｂ】
2021502100.tif 000285
【図８２Ａ】
2021502100.tif 000286
【図８２Ｂ】
2021502100.tif 000287
【図８３】
2021502100.tif 000288
【図８４】
2021502100.tif 000289
【図８５】
2021502100.tif 000290
【図８６】
2021502100.tif 000291
【図８７】
2021502100.tif 000292
【図８８】
2021502100.tif 000293
【図８９】
2021502100.tif 000294
【図９０】
2021502100.tif 000295
【図９１】
2021502100.tif 000296
【図９２】
2021502100.tif 000297
【図９３】
2021502100.tif 000298
【図９４】
2021502100.tif 000299
【図９５】
2021502100.tif 000300
【図９６】
2021502100.tif 000301
【図９７】
2021502100.tif 000302
【図９８Ａ】
2021502100.tif 000303
【図９８Ｂ】
2021502100.tif 000304
【図９８Ｃ】
2021502100.tif 000305
【図９９】
2021502100.tif 000306
【図１００】
2021502100.tif 000307
【図１０１】
2021502100.tif 000308
【図１０２Ａ】
2021502100.tif 000309
【図１０２Ｂ】
2021502100.tif 000310
【図１０２Ｃ】
2021502100.tif 000311
【図１０３】
2021502100.tif 000312
【図１０４】
2021502100.tif 000313
【図１０５】
2021502100.tif 000314
【図１０６Ａ】
2021502100.tif 000315
【図１０６Ｂ】
2021502100.tif 000316
【図１０６Ｃ】
2021502100.tif 000317
【図１０６Ｄ】
2021502100.tif 000318
【図１０６Ｅ】
2021502100.tif 000319
【図１０６Ｆ】
2021502100.tif 000320
【図１０６Ｇ】
2021502100.tif 000321
【図１０６Ｈ】
2021502100.tif 000322
【図１０６Ｉ】
2021502100.tif 000323
【図１０６Ｊ】
2021502100.tif 000324
【図１０７】
2021502100.tif 000325
【図１０８Ａ】
2021502100.tif 000326
【図１０８Ｂ】
2021502100.tif 000327
【図１０８Ｃ】
2021502100.tif 000328
【図１０８Ｄ】
2021502100.tif 000329
【図１０８Ｅ】
2021502100.tif 000330
【図１０８Ｆ】
2021502100.tif 000331
【図１０８Ｇ】
2021502100.tif 000332
【図１０８Ｈ】
2021502100.tif 000333
【図１０８Ｉ】
2021502100.tif 000334
【図１０８Ｊ】
2021502100.tif 000335
【図１０９Ａ】
2021502100.tif 000336
【図１０９Ｂ】
2021502100.tif 000337
【図１１０Ａ】
2021502100.tif 000338
【図１１０Ｂ】
2021502100.tif 000339
【図１１１】
2021502100.tif 000340
【図１１２】
2021502100.tif 000341
【図１１３】
2021502100.tif 000342
【図１１４】
2021502100.tif 000343
【図１１５】
2021502100.tif 000344
【図１１６】
2021502100.tif 000345
【図１１７】
2021502100.tif 000346
【図１１８】
2021502100.tif 000347
【図１１９】
2021502100.tif 000348
【図１２０】
2021502100.tif 000349
【図１２１】
2021502100.tif 000350
【図１２２Ａ】
2021502100.tif 000351
【図１２２Ｂ】
2021502100.tif 000352
【配列表】
2021502100000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月13日(2020.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2021502100000001.app
【国際調査報告】
2021502100.tif 000353
2021502100.tif 000354
2021502100.tif 000355
2021502100.tif 000356
2021502100.tif 000357