(57)【要約】哺乳動物宿主細胞培養物からの組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の精製のための方法が、開示される。本開示は、本開示の方法によって生成される薬学的組成物、薬学的組成物、及び疾患の治療のために本明細書に記載される薬学的組成物を使用する方法をさらに提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物宿主細胞培養物からの組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の精製のための方法であって、
（ａ）複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、複数の哺乳動物宿主細胞を培養培地中で培養するステップであって、前記複数の哺乳動物宿主細胞が、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成するように、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされている、前記培養するステップと、
（ｂ）前記複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を含む前記培養培地を収集するステップと、
（ｃ）前記複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞から複数のｒＡＡＶ粒子を収集するステップと、
（ｄ）前記複数のｒＡＡＶ粒子をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮して、濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を生成するステップと、
（ｅ）完全なｒＡＡＶ粒子のために、前記濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を密度勾配超遠心分離によって富化して、富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を生成するステップと、
（ｆ）前記富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、精製及び富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を生成するステップと、
（ｇ）（ｆ）からの前記溶出液をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液へと透析濾過及び濃縮して、前記精製及び富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子ならびに前記製剤緩衝液を含む最終組成物を生成するステップと、を含む、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物宿主細胞培養物からの組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の精製のための方法であって、
（ａ）複数のｒＡＡＶ−ＲＥＰ１粒子の形成に好適な条件下で、複数の哺乳動物宿主細胞を培養培地中で培養するステップであって、前記複数の哺乳動物宿主細胞が、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成するように、外来配列を含むプラスミドベクターであって、前記外来配列が、ヒトＲａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）タンパク質をコードする配列を含む、前記プラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされている、前記培養するステップと、
（ｂ）前記複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を含む前記培養培地を収集するステップと、
（ｃ）前記複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞から複数のｒＡＡＶ粒子を収集するステップと、
（ｄ）前記複数のｒＡＡＶ粒子をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮して、濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を生成するステップと、
（ｅ）完全なｒＡＡＶ粒子のために、前記濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を密度勾配超遠心分離によって富化して、富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を生成するステップと、
（ｆ）前記富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、精製及び富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を生成するステップと、
（ｇ）（ｆ）からの前記溶出液をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液へと透析濾過及び濃縮して、前記精製及び富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子ならびに前記製剤緩衝液を含む最終組成物を生成するステップと、を含む、前記方法。
【請求項３】
前記培養培地が、低減した量のウシ胎仔血清を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地が、低減した量のウシ胎仔血清を含まない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地が、無血清培地を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地が、無血清培地からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地が、無タンパク質培地を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地が、無タンパク質培地からなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地が、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、Ｌ−バリン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ｉ−イノシトール、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水）、硝酸第二鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３”９Ｈ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）、及びＤ−グルコース（デキストロース）を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物細胞が、ＰＥＩ形質導入試薬を含む組成物でトランスフェクトされている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
外来配列を含む前記プラスミドベクターが、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
５’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲをコードする配列に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
５’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲをコードする配列と同一である配列を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
５’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲをコードする配列と同一でない配列を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
３’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の３’ＩＴＲをコードする配列に由来する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
３’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の３’ＩＴＲをコードする配列と同一である配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
３’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の３’ＩＴＲをコードする配列と同一でない配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
５’ＩＴＲをコードする前記配列または３’ＩＴＲをコードする前記配列が、１４５塩基対（ｂｐ）を含む、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
５’ＩＴＲをコードする前記配列または３’ＩＴＲをコードする前記配列が、１３４、１３５、１３６、もしくは１３７（ｂｐ）を含むか、またはそれからなる、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
外来配列を含む前記プラスミドベクター、前記ヘルパープラスミドベクター、またはウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含む前記プラスミドベクターが、選択マーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
選択マーカーをコードする前記配列が、カナマイシンに対する抵抗性を伝達する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記収集するステップ（ｃ）が、前記複数のトランスフェクトされた哺乳動物細胞によって生成された組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を放出するための、前記複数のトランスフェクトされた哺乳動物細胞の機械的破砕を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記機械的破砕が、微小流動化を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記濃縮するステップが、（１）前記濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を深層濾過によって清澄化して、濃縮及び清澄化された複数のｒＡＡＶ粒子を生成することをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記濃縮するステップが、（２）前記濃縮及び清澄化された複数のｒＡＡＶ粒子を−８０℃で凍結して、プロセス中間体を生成することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記富化するステップ（ｅ）が、富化された複数のｒＡＡＶ粒子を生成するためのイオジキサノール密度勾配超遠心分離を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記イオジキサノール密度勾配が、１５％、２５％、４０％、及び５７％の濃度を有するイオジキサノール組成物を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記精製するステップ（ｆ）の前記アフィニティークロマトグラフィーが、ＡＶＢセファロースマトリックスを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記製剤緩衝液が、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２、及びＮａＣｌを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記製剤緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記製剤緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含み、ポロキサマー１８８を０．００１％で含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＥＸクロマトグラフィーが、
ＡＥＸクロマトグラムを生成するステップと、
完全なｒＡＡＶ粒子を含む前記ＡＥＸクロマトグラム上のピークを選択するステップと、をさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｄ）またはステップ（ｇ）の前記ＴＦＦが、１００ｋＤａの中空線維フィルター（ＨＦＦ）を使用して実行される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｄ）またはステップ（ｇ）の前記ＴＦＦが、５０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｇ）前記方法が第２のＴＦＦをさらに含み、ステップ（ｄ）の前記ＴＦＦ及びステップ（ｇ）の第１のＴＦＦが１００ｋＤａのＨＦＦを使用して実行され、ステップ（ｇ）の前記第２のＴＦＦが５０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒトＲＥＰ１タンパク質をコードする前記配列が、
【化３５】
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の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ヒトＲＥＰ１タンパク質が、
【化３６】
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、のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法によって生成された複数のｒＡＡＶ粒子を含む、薬学的組成物。
【請求項３９】
（ａ）０．５〜２．５×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、
（ｂ）５０％未満の空のキャプシドと、
（ｃ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり４ｎｇ／ｍＬ未満の残存宿主細胞タンパク質と、
（ｄ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり７×１０−３ｐｇ／ｍｌ未満の残存宿主細胞ＤＮＡと、を含む、請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
前記組成物が、
（ｅ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬをさらに含み、機能的ベクターゲノムの各々が、形質導入に続いて細胞中で外来配列を発現することができる、請求項３９に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記薬学的組成物を用いた細胞の形質導入に続いて、前記複数の機能的ｖｇ／ｍＬが、形質導入されていない細胞中での対応する内因性配列の発現のレベルと比較される際に、前記外来配列を２倍の増加で発現する、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記薬学的組成物を用いた細胞の形質導入に続いて、前記複数の機能的ｖｇ／ｍＬが、形質導入されていない細胞中での対応する内因性配列の発現のレベルと比較される際に、前記外来配列を、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはその間の任意の他の倍増値の増加で発現する、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
前記外来配列及び前記対応する内因性配列が、同一である、請求項４１または４２に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
前記外来配列及び前記対応する内因性配列が、同一でない、請求項４１または４２に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
前記外来配列及び前記対応する内因性配列が同一でないが、前記外来配列によってコードされるタンパク質及び前記内因性配列によってコードされるタンパク質が同一である、請求項４１、４２、または４４に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
前記外来配列及び前記対応する内因性配列が、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意の百分率の同一性を有する、請求項４２または４３に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
前記外来配列が前記内因性配列と比較される際に、コドン最適化される、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
前記外来配列及び前記対応する内因性配列が、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意の百分率の相同性を有する、請求項４７に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
本開示の薬学的組成物を用いた細胞の形質導入に続いて、前記外来配列が、タンパク質をコードする、請求項３８〜４８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
前記外来配列によってコードされる前記タンパク質が、形質導入されていない細胞の対応する配列によってコードされるタンパク質の活性レベル以上の活性レベルを有する、請求項４９に記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
前記外来配列及び前記対応する内因性配列が、同一である、請求項５０に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
前記外来配列及び前記対応する内因性配列が、同一でない、請求項５０に記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
前記外来配列及び前記対応する内因性配列が、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意の百分率の同一性を有する、請求項５２に記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
前記活性が、１つ以上の官能基をリガンドまたは基質に結合、活性化、及び／または転移させることを含む、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
前記タンパク質がＲＥＰ−１タンパク質を含み、前記活性がＲＥＰ−１基質のプレニル化を含む、請求項３８〜５４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
（ａ）１．０〜２．０×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、請求項３８〜５５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
（ａ）約１．０×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、請求項３８〜５５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
（ａ）１．０×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、請求項３８〜５５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
（ｂ）５０％未満の空のキャプシドまたは３０％未満の空のキャプシドを含む、請求項３８〜５５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
前記複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）から単離される配列か、または血清型２のＡＡＶに由来する配列を含む、請求項３８〜５９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
ＡＡＶ２から単離される前記配列か、またはＡＡＶ２に由来する前記配列が、逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列を含む、請求項６０に記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
前記複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列を含む、請求項６０または６１に記載の薬学的組成物。
【請求項６３】
５’ＩＴＲをコードする前記配列及び３’ＩＴＲをコードする前記配列が、ＡＡＶ２  ＩＴＲの野生型配列を含む、請求項６２に記載の薬学的組成物。
【請求項６４】
前記宿主細胞が、培養された細胞株から単離されるか、または培養された細胞株に由来する、請求項３８〜６３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６５】
前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項６４に記載の薬学的組成物。
【請求項６６】
前記宿主細胞が、初代細胞株から単離されるか、または初代細胞株に由来する、請求項３８〜６３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６７】
前記宿主細胞が、不死化細胞または幹細胞である、請求項６６に記載の薬学的組成物。
【請求項６８】
前記宿主細胞が、培養された細胞株から単離されるか、または培養された細胞株に由来する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記宿主細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記宿主細胞が、初代細胞株から単離されるか、または初代細胞株に由来する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記宿主細胞が、不死化細胞または幹細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記最終組成物の前記複数の完全なｒＡＡＶ粒子の各完全なｒＡＡＶが、
（ａ）ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲをコードする配列と、
（ｂ）初期エンハンサー要素をコードする配列と、
（ｃ）プロモーターをコードする配列と、
（ｄ）エクソン及びイントロンをコードする配列と、
（ｅ）スプライス受容部位をコードする配列と、
（ｆ）Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）タンパク質をコードする配列と、
（ｇ）転写後制御性要素（ＰＲＥ）をコードする配列と、
（ｈ）ポリアデニル化（ポリＡ）部位をコードする配列と、
（ｉ）ＡＡＶ２  ３’ＩＴＲをコードする配列と、を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含む、請求項３８〜６７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７３】
前記初期エンハンサー要素が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から単離される配列か、またはサイトメガロウイルスに由来する配列を含む、請求項７２に記載の薬学的組成物。
【請求項７４】
前記初期エンハンサー要素が、
【化３７】
2021520233.tif 000115
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７３に記載の薬学的組成物。
【請求項７５】
前記初期エンハンサー要素が、
【化３８】
2021520233.tif 000116
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７３に記載の薬学的組成物。
【請求項７６】
前記プロモーターをコードする前記配列が、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）遺伝子をコードする配列から単離される配列か、もしくはニワトリベータアクチン遺伝子をコードする配列に由来する配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７７】
前記エクソン及びイントロンをコードする前記配列が、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）遺伝子をコードする配列から単離される配列か、もしくはニワトリベータアクチン遺伝子をコードする配列に由来する配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７８】
前記プロモーターをコードする前記配列が、
【化３９】
2021520233.tif 000117
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７９】
前記エクソン及びイントロンをコードする前記配列が、
【化４０】
2021520233.tif 000118
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２〜７８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８０】
前記スプライス受容部位をコードする前記配列が、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓベータグロビンスプライス受容部位をコードする配列から単離される配列か、またはそれに由来する配列を含む、請求項７２〜７９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８１】
前記Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓベータグロビンスプライス受容部位をコードする前記配列が、
【化４１】
2021520233.tif 000119
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項８０に記載の薬学的組成物。
【請求項８２】
前記初期エンハンサー要素を含む前記配列、前記プロモーターを含む前記配列、前記イントロン及びエクソンを含む前記配列、ならびに前記スプライス受容部位を含む前記配列が、
【化４２】
2021520233.tif 000120
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２〜８１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８３】
前記初期エンハンサー要素を含む前記配列、前記プロモーターを含む前記配列、前記イントロン及びエクソンを含む前記配列、ならびに前記スプライス受容部位を含む前記配列が、
【化４３】
2021520233.tif 000121
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２〜８１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８４】
前記ＲＥＰ１タンパク質をコードする前記配列が、哺乳動物ＲＥＰ１配列から単離される配列か、または哺乳動物ＲＥＰ１配列に由来する配列を含む、請求項７２〜８３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８５】
前記哺乳動物ＲＥＰ１配列が、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、もしくはヒトから単離されるか、またはそれに由来する、請求項８４に記載の薬学的組成物。
【請求項８６】
前記哺乳動物ＲＥＰ１配列が、ヒトから単離されるか、またはヒトに由来する、請求項８４に記載の薬学的組成物。
【請求項８７】
前記ヒトＲＥＰ１タンパク質をコードする前記配列が、
【化４４】
2021520233.tif 000122
の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項８６に記載の薬学的組成物。
【請求項８８】
前記ヒトＲＥＰ１タンパク質が、
【化４５】
2021520233.tif 000123
、のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項８６または８７に記載の組成物。
【請求項８９】
前記ＰＲＥをコードする前記配列が、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）から単離される配列か、またはウッドチャック肝炎ウイルスに由来する配列を含む、請求項７２〜８８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９０】
前記ＷＰＲＥをコードする前記配列が、
【化４６】
2021520233.tif 000124
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項８９に記載の薬学的組成物。
【請求項９１】
ポリアデニル化（ポリＡ）部位をコードする前記配列が、哺乳動物遺伝子から単離される配列か、または哺乳動物遺伝子に由来する配列を含む、請求項７２〜９０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９２】
ポリアデニル化（ポリＡ）部位をコードする前記配列が、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨ）から単離される配列か、またはウシ成長ホルモン遺伝子に由来する配列を含む、請求項９１に記載の薬学的組成物。
【請求項９３】
前記ポリＡ部位をコードする前記配列が、
【化４７】
2021520233.tif 000125
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
前記ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲをコードする前記配列が、
【化４８】
2021520233.tif 000126
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２〜９３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９５】
前記ＡＡＶ２  ３’ＩＴＲをコードする前記配列が、
【化４９】
2021520233.tif 000127
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２〜９３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９６】
要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む前記核酸が、ＤＮＡ配列を含むか、またはＤＮＡ配列からなる、請求項７２〜９５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９７】
要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ配列を含むか、または一本鎖ＤＮＡ配列からなる、請求項９６に記載の薬学的組成物。
【請求項９８】
前記最終組成物の前記複数の完全なｒＡＡＶの各ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２から単離されるキャプシドタンパク質か、またはＡＡＶ２に由来するキャプシドタンパク質を含む、請求項７２〜９７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９９】
前記ＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、アミノ酸配列
【化５０】
2021520233.tif 000128
、と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項９８に記載の薬学的組成物。
【請求項１００】
前記ＡＡＶ２キャプシドタンパク質が、前記アミノ酸配列
【化５１】
2021520233.tif 000129
、を含む、請求項９８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０１】
前記薬学的組成物が、製剤緩衝液をさらに含む、請求項７２〜１００のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０２】
前記製剤緩衝液が、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２、及びＮａＣｌを含む、請求項１０１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０３】
前記製剤緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む、請求項１０１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０４】
前記製剤緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含み、ポロキサマー１８８を０．００１％で含む、請求項１０１に記載の薬学的組成物。
【請求項１０５】
前記複数の完全なｒＡＡＶが、両端を含めて、１×１０８ゲノム粒子（ｇｐ）／ｍＬ〜１×１０１４ｇｐ／ｍＬの濃度にある、請求項７２〜１０４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０６】
前記複数の完全なｒＡＡＶが、両端を含めて、０．５×１０１０ｇｐ／ｍＬ〜２．５×１０１２ｇｐ／ｍＬの濃度にある、請求項１０５に記載の薬学的組成物。
【請求項１０７】
前記複数の完全なｒＡＡＶが、両端を含めて、１×１０１１ｇｐ／ｍＬ〜５×１０１３ｇｐ／ｍＬの濃度にある、請求項１０５に記載の薬学的組成物。
【請求項１０８】
前記複数の完全なｒＡＡＶが、両端を含めて、１×１０１１ｇｐ／ｍＬ〜２×１０１２ｇｐ／ｍＬの濃度にある、請求項１０５に記載の薬学的組成物。
【請求項１０９】
前記複数の完全なｒＡＡＶが、１×１０１２ｇｐ／ｍＬの濃度にある、請求項１０５に記載の薬学的組成物。
【請求項１１０】
前記複数の完全なｒＡＡＶが、１×１０１１ｇｐ／ｍＬの濃度にある、請求項１０５に記載の薬学的組成物。
【請求項１１１】
前記複数の完全なｒＡＡＶの前記濃度が、ｑＰＣＲを使用して測定される、請求項７２〜１１０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１２】
前記ｑＰＣＲが、標準としてスーパーコイルプラスミドベクターを使用する、請求項１１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１３】
前記ｑＰＣＲが、標準として直線化プラスミドベクターを使用する、請求項１１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１１４】
請求項７２〜１１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物を含む、送達デバイス。
【請求項１１５】
前記送達デバイスが、シリンジ、カテーテル、及び針のうちの１つ以上を含む、請求項１１４に記載の送達デバイス。
【請求項１１６】
前記送達デバイスが、前記薬学的組成物を注射によって投与するのに好適である、請求項１１４に記載の送達デバイス。
【請求項１１７】
前記送達デバイスが、前記薬学的組成物を注入によって投与するのに好適である、請求項１１４に記載の送達デバイス。
【請求項１１８】
前記送達デバイスが、前記薬学的組成物を網膜下経路によって投与するのに好適である、請求項１１４〜１１７のいずれか１項に記載の送達デバイス。
【請求項１１９】
前記送達デバイスが、前記薬学的組成物を脈絡膜上経路によって投与するのに好適である、請求項１１４〜１１７のいずれか１項に記載の送達デバイス。
【請求項１２０】
治療を必要とする対象において疾患または障害を治療する方法であって、治療有効量の請求項３８〜１１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２１】
前記疾患または障害が、網膜の疾患または障害である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記疾患または障害が、コロイデレミアである、請求項１２０または１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記治療有効量が、前記薬学的組成物の最小有効量と最大忍容量との間の量を含む、請求項１２０〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記最小有効量が、網膜の少なくとも１つのニューロンまたはその標的部分を形質導入するのに十分な前記薬学的組成物の量を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記最小有効量が、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意の百分率の前記網膜のニューロンまたはその標的部分を形質導入するのに十分な前記薬学的組成物の量を含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
前記最小有効量が、前記対象の視力を改善するのに十分な前記薬学的組成物の量を含む、請求項１２３〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記最小有効量が、網膜疾患の徴候または症状を低減するのに十分な前記薬学的組成物の量を含む、請求項１２３〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記網膜疾患が、コロイデレミアである、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記最大忍容量が、有害事象を誘発するのに十分な前記薬学的組成物の量を含む、請求項１２３〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
有害作用が、前記薬学的組成物に対する免疫応答を含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記免疫応答が、炎症を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記炎症が、全身性である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記炎症が、局所的である、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記有害事象が、重度である、請求項１２９〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記有害事象が、二次的医学的治療を前記対象に投与することによって防止、低減、または制御され得ない、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記治療有効量の前記薬学的組成物が、両端を含めて、１０４〜１０６の感染多重度（ＭＯＩ）を有する量を含む、請求項１２０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記治療有効量の前記薬学的組成物が、両端を含めて、１０４〜１０５の感染多重度（ＭＯＩ）を有する量を含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記治療有効量の前記薬学的組成物が、１０５の感染多重度（ＭＯＩ）を有する量を含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
前記治療有効量が、両端を含めて、１×１０８ｇｐ〜１×１０１３ｇｐを含む、請求項１２０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記治療有効量が、両端を含めて、６×１０９ｇｐ〜１×１０１３ｇｐを含む、請求項１２０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記治療有効量が、両端を含めて、６×１０９ｇｐ〜７×１０１２ｇｐを含む、請求項１２０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記治療有効量が、両端を含めて、６×１０９ｇｐ〜５×１０１２ｇｐを含む、請求項１２０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記治療有効量が、両端を含めて、１×１０１０ｇｐ〜１×１０１２ｇｐを含む、請求項１２０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記治療有効量が、１×１０１０ｇｐを含むか、またはそれからなる、請求項１２０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記治療有効量が、１×１０１１ｇｐを含むか、またはそれからなる、請求項１２０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記治療有効量が、１×１０１２ｇｐを含むか、またはそれからなる、請求項１２０〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記治療有効量が、両端を含めて、１０μＬ〜２００μＬの体積を含むか、またはそれからなる、請求項１２０〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記治療有効量が、各範囲について、両端を含めて、１０μＬ〜５０μＬ、５０μＬ〜１００μＬ、１００μＬ〜１５０μＬ、もしくは１５０μＬ〜２００μＬの体積を含むか、またはそれからなる、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記治療有効量が、両端を含めて、７０μＬ〜１２０μＬの体積を含むか、またはそれからなる、請求項１２０〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記治療有効量が、１００μＬの体積を含むか、またはそれからなる、請求項１２０〜１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記投与するステップが、注射または注入を含む、請求項１２０〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記投与するステップが、網膜下、脈絡膜上、または硝子体内経路を含む、請求項１２０〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記投与するステップが、網膜下注射または注入を含む、請求項１２０〜１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記網膜下注射または注入が、２ステップ網膜下注射を含む、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記投与するステップが、脈絡膜上注射または注入を含む、請求項１２０〜１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記対象が、男性である、請求項１２０〜１５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記対象が、少なくとも１８歳の年齢である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記対象が、コロイデレミアの遺伝学的に確認された診断を有する、請求項１２０〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記対象が、前記ＲＥＰ１遺伝子に変異を有するとして特定されている、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１６０】
前記対象が、少なくとも１つの目の黄斑においてコロイデレミアの臨床徴候を示す、請求項１２０〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記対象が、少なくとも１つの目に３４〜７３文字の最高矯正視力（ＢＣＶＡ）スコアを有する、請求項１２０〜１６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記対象が、軽度または初期段階のコロイデレミアを有する、請求項１２０〜１６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６３】
前記対象が、進行した、または重度のコロイデレミアを有する、請求項１２０〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６４】
前記方法が、少なくとも１つの目の網膜の１０ｍｍ２を治療することを含む、請求項１２０〜１６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記方法が、両端を含めて、少なくとも１つの目の網膜の５ｍｍ２〜１０ｍｍ２を治療することを含む、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記方法が、両端を含めて、少なくとも１つの目の網膜の２ｍｍ２〜１５ｍｍ２を治療することを含む、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６７】
前記薬学的組成物が、前記対象の１つの目に投与される、請求項１２０〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記薬学的組成物が、前記対象の両方の目に投与される、請求項１２０〜１６２１６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６９】
前記対象の前記目が、同時に治療される、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記対象の前記目が、順次治療される、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記対象の少なくとも１つの目が、前記薬学的組成物の前記対象への投与前に、コロイデレミアについて治療されている、請求項１２０〜１７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７２】
前記方法が、両端を含めて、目あたり１〜１２の用量を投与することを含む、請求項１２０〜１７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記方法が、少なくとも１つの用量を少なくとも１日１回、１週間に１回、１カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回、または１年に１回投与することを含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記方法が複数の用量を投与することを含み、各用量が同じ量の前記薬学的組成物を含む、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記方法が複数の用量を投与することを含み、各用量が同じ量の前記薬学的組成物を含まない、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７６】
前記方法が複数の用量を投与することを含み、各連続する用量が以前の用量よりも多くの数の完全なｒＡＡＶを含む、請求項１７２〜１７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７７】
前記方法が複数の用量を投与することを含み、各連続する用量が以前の用量よりも少ない数の完全なｒＡＡＶを含む、請求項１７２〜１７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記対象が用量に続いて有害事象を経験し、後の用量が前記有害事象を誘発した以前の用量よりも少ない数の完全なｒＡＡＶを含む、請求項１７２〜１７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記対象が前記有害事象から回復し、前記薬学的組成物の後の用量が前記対象に投与される、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記有害事象を誘発した前記用量及び前記後の用量が、等しい数の完全なｒＡＡＶを含む、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記有害事象を誘発した前記用量及び前記後の用量が、等しい数の完全なｒＡＡＶを含まない、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８２】
前記方法が、治療有効量の前記薬学的組成物の投与前に、複数のプラセボｒＡＡＶの量を前記対象に投与することをさらに含み、各プラセボｒＡＡＶが空のｒＡＡＶである、請求項１２０〜１８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記空のｒＡＡＶが、外来配列を発現するためのプロモーターまたは外来配列のいずれも含まない、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
複数のプラセボｒＡＡＶの前記量の投与が、全身性である、請求項１２０〜１８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８５】
複数のプラセボｒＡＡＶの前記量の投与が、局所的である、請求項１２０〜１８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８６】
前記方法が、
（ａ）前記複数のプラセボｒＡＡＶが、前記対象において免疫応答を誘発したかどうかを決定すること、及び／または
（ｂ）前記対象が、前記複数のプラセボｒＡＡＶに対して免疫寛容を示したかどうかを決定し、それによって、治療有効量の前記薬学的組成物の投与が、前記対象において免疫媒介性有害事象を誘発するはずがないことを示すことをさらに含む、請求項１８２〜１８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８７】
前記方法が、免疫応答の抑制剤を投与することをさらに含む、請求項１２０〜１８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８８】
前記抑制剤が、抗炎症剤を含む、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記抗炎症剤が、コルチコステロイドを含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記コルチコステロイドが、プレドニゾンまたはプレドニゾロンを含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
免疫応答の前記抑制剤の前記投与が、全身性である、請求項１８７〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９２】
免疫応答の前記抑制剤が、経口投与される、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
免疫応答の前記抑制剤の前記投与が、局所的である、請求項１８７〜１９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９４】
免疫応答の前記抑制剤が、前記薬学的組成物で治療された前記目に投与される、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記薬学的組成物及び免疫応答の前記抑制剤が、同時に投与される、請求項１８７〜１９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９６】
前記薬学的組成物及び免疫応答の前記抑制剤が、同じ日に投与される、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記薬学的組成物及び免疫応答の前記抑制剤が、順次投与される、請求項１８７〜１９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９８】
前記抑制剤の前記投与が、前記薬学的組成物の前記投与に少なくとも１日先行する、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記薬学的組成物の前記投与が、前記抑制剤の前記投与に少なくとも１日先行する、請求項１９３に記載の方法。
【請求項２００】
前記方法が、前記対象の少なくとも１つの目におけるコロイデレミア媒介性損傷の初期重症度を決定することをさらに含む、請求項１２０〜１９９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記方法が、前記少なくとも１つの目への前記薬学的組成物の投与に続いて、前記対象の前記少なくとも１つの目におけるコロイデレミア媒介性損傷の後の重症度を決定することをさらに含む、請求項１２０〜２００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０２】
コロイデレミア媒介性損傷の前記初期または後の重症度が、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）試験スコアを決定すること、生存網膜組織の領域もしくは体積を測定すること、保存された楕円体ゾーンを測定すること、網膜感度を測定すること、コントラスト感度を測定すること、色覚を測定すること、低輝度視力を測定すること、速読を測定すること、またはこれらの任意の組み合わせによって決定される、請求項２００または２０１に記載の方法。
【請求項２０３】
前記ＢＣＶＡ試験が、（糖尿病網膜症の早期治療研究）ＥＴＤＲＳチャートを利用する、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記ＢＣＶＡ試験が、指のカウント、手の動き、光の知覚、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上の評価を含む、請求項２０２または２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
生存網膜組織が眼底自発蛍光を含み、生存網膜組織を測定することが眼底自発蛍光のレベルまたはパターンを検出することを含む、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０６】
保存された楕円体ゾーンを測定することが、スペクトルドメイン光干渉断層計（ＳＤ−ＯＣＴ）を含む、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０７】
網膜感度を測定することが、微小視野測定を含む、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０８】
前記治療有効量の前記薬学的組成物の投与が、コロイデレミアの徴候または症状の進行を阻害または低減する、請求項１２０〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０９】
前記治療有効量の前記薬学的組成物の投与が、コロイデレミアの徴候または症状を低減する、請求項１２０〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１０】
コロイデレミアの徴候または症状が、視細胞の喪失、ＲＰＥ細胞の喪失、視力の低下、低輝度視力の低下、保存された自発蛍光（ＡＦ）の総領域、ＢＣＶＡ試験での低いスコア、保存された楕円体ゾーンの領域の減少、網膜感度の低下、コントラスト感度の低下、色覚の低下もしくは色あせ、速読の速度の低下、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１２０〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１１】
コロイデレミアの前記徴候または症状の前記重症度が、健康な網膜と比較して決定される、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記健康な網膜が、同齢の対照対象に属する、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
請求項３８〜２１２のいずれか１項に記載の薬学的組成物の治療有効量を決定する方法であって、前記方法が、
（ａ）治療される対象の網膜の領域を測定することと、
（ｂ）（ａ）の前記領域が、中央の０．５ｍｍ２の中心窩領域にあるか、または黄斑にあるかを決定することと、
（ｃ）（ａ）の前記領域内の桿体、錐体、及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の数を計算することと、
（ｄ）細胞の総数に１×１０５の感染多重度（ＭＯＩ）を乗じて、前記治療有効量に含まれるゲノム粒子（ｇｐ）の数を計算することと、を含み、
治療される前記網膜の最大領域が、１０ｍｍ２であり、
前記網膜におけるＲＰＥ細胞の密度が、１ｍｍ２あたり５，０００細胞であり、
前記網膜における桿体の密度が、前記中央の０．５ｍｍ２の中心窩領域を除いて、１ｍｍ２あたり７５，０００個の桿体であり、
前記網膜における錐体の密度が、前記中央の０．５ｍｍ２の中心窩領域において１ｍｍ２あたり１５０，０００個の錐体であり、前記網膜における錐体の前記密度が、前記中央の０．５ｍｍ２の中心窩領域外側の前記黄斑において１ｍｍ２あたり２５，０００である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年４月５日出願の仮出願第ＵＳＳＮ６２／６５３，１３９号、２０１８年１０月１７日出願の仮出願第ＵＳＳＮ６２／７４６，９８０号、及び２０１８年１１月３０日出願の仮出願第ＵＳＳＮ６２／７７３，９７５号の優先権を主張し、これらの各々の内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組込み
２０１９年４月４日に作成され、６０ＫＢのサイズである「ＮＩＧＨ−０１３／００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」と名付けられたテキストファイルの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、ヒト治療薬、生物学的製剤、ヒトＤＮＡ配列のウイルス送達、及びそれらを製造する方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＡＡＶベースの送達ベクター及びこれらのＡＡＶベースの送達ベクターを製造する改善された方法に対して、長い間満たされないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、哺乳動物宿主細胞培養物からのＡＡＶ（ＡＡＶ）粒子の精製のための方法を提供し、（ａ）複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、培養培地中で培養するステップであって、複数の哺乳動物宿主細胞が、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成するように、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされている、培養するステップと、（ｂ）複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を含む培養培地を収集するステップと、（ｃ）複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞から複数のＡＡＶ粒子を収集するステップと、（ｄ）複数のＡＡＶ粒子をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮して、濃縮された複数のＡＡＶ粒子を生成するステップと、（ｅ）完全なＡＡＶ粒子のために、濃縮された複数のＡＡＶ粒子を、密度勾配超遠心分離によって富化して、富化された複数の完全なＡＡＶ粒子を生成するステップと、（ｆ）富化された複数の完全なＡＡＶ粒子を、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、精製及び富化された複数の完全なＡＡＶ粒子を含む溶出液を生成するステップと、（ｇ）（ｆ）からの溶出液を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液に透析濾過及び濃縮して、精製及び富化された複数の完全なＡＡＶ粒子及び製剤緩衝液を含む最終組成物を生成するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、完全なＡＡＶは、哺乳動物またはヒト細胞において外来配列を発現することができるプロモーターの制御下で、外来配列を含む。
【０００６】
本開示は、哺乳動物宿主細胞培養物からの組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の精製のための方法を提供し、（ａ）複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ粒子の形成に好適な条件下で、培養培地中で培養するステップであって、複数の哺乳動物宿主細胞が、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成するように、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされている、培養するステップと、（ｂ）複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を含む培養培地を収集するステップと、（ｃ）複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞から複数のｒＡＡＶ粒子を収集するステップと、（ｄ）タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって複数のｒＡＡＶ粒子を濃縮して、濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を生成するステップと、（ｅ）完全なｒＡＡＶ粒子のために、濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を、密度勾配超遠心分離によって富化して、富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を生成するステップと、（ｆ）富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、精製及び富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を生成するステップと、（ｇ）（ｆ）からの溶出液を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液に透析濾過及び濃縮して、精製及び富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子及び製剤緩衝液を含む最終組成物を生成するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、完全なｒＡＡＶは、哺乳動物またはヒト細胞において外来配列を発現することができるプロモーターの制御下で、外来配列を含む。
【０００７】
本開示は、哺乳動物宿主細胞培養物からの組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の精製のための方法を提供し、（ａ）複数の哺乳動物宿主細胞を、複数のｒＡＡＶ−ＲＥＰ１粒子の形成に好適な条件下で、培養培地中で培養するステップであって、複数の哺乳動物宿主細胞が、複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を生成するように、外来配列を含むプラスミドベクターであって、外来配列がヒトＲａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）タンパク質をコードする配列を含む、プラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、ならびにウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターでトランスフェクトされている、培養するステップと、（ｂ）複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞を含む培養培地を収集するステップと、（ｃ）複数のトランスフェクトされた哺乳動物宿主細胞から複数のｒＡＡＶ粒子を収集するステップと、（ｄ）タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって複数のｒＡＡＶ粒子を濃縮して、濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を生成するステップと、（ｅ）完全なｒＡＡＶ粒子のために、濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を、密度勾配超遠心分離によって富化して、富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を生成するステップと、（ｆ）富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、精製及び富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を生成するステップと、（ｇ）（ｆ）からの溶出液を、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって製剤緩衝液に透析濾過及び濃縮して、精製及び富化された複数の完全なｒＡＡＶ粒子及び製剤緩衝液を含む最終組成物を生成するステップと、を含む。
【０００８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ヒトＲＥＰ１タンパク質をコードする配列は、
【化１】
2021520233.tif 000003
、の核酸配列を含むか、またはそれからなり、
Ｋｏｚａｃコンセンサスは下線で示され、開始コドンは太字で示される。
【０００９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ヒトＲＥＰ１タンパク質は、
【化２】
2021520233.tif 000004
、のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００１０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、培養培地は、低減したウシ胎仔血清を含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、低減したウシ胎仔血清を含まない。
【００１１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。
【００１２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、培養培地は、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、Ｌ−バリン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ｉ−イノシトール、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水）、硝酸第二鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３”９Ｈ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）、及びＤ−グルコース（デキストロース）を含む。
【００１３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、培養培地は、無血清培地を含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、無血清培地からなる。
【００１４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、培養培地は、清澄化された培地を含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、清澄化された培地からなる。本開示の方法のいくつかの実施形態では、収集培地は、無タンパク質培地を含む。本開示の方法のいくつかの実施形態では、収集培地は、無タンパク質培地からなる。
【００１５】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ＰＥＩ形質導入試薬を含む組成物でトランスフェクトされている。
【００１６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクターは、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲをコードする配列に由来する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲをコードする配列と同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の５’ＩＴＲをコードする配列と同一でない配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の３’ＩＴＲをコードする配列に由来する。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の３’ＩＴＲをコードする配列と同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）の３’ＩＴＲをコードする配列と同一でない配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列または３’ＩＴＲをコードする配列は、１４５塩基対（ｂｐ）を含む。
【００１７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクター、ヘルパープラスミドベクター、またはウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、外来配列を含むプラスミドベクターは、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ヘルパープラスミドベクターは、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウイルスＲｅｐタンパク質及びウイルスＣａｐタンパク質をコードする配列を含むプラスミドベクターは、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーをコードする配列は、カナマイシンに対する抵抗性を伝達する。
【００１８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、収集するステップ（ｃ）は、複数のトランスフェクトされた哺乳動物細胞によって生成された組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を放出するための、複数のトランスフェクトされた哺乳動物細胞の機械的破砕を含む。いくつかの実施形態では、機械的破砕は、微小流動化を含む。
【００１９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、濃縮するステップは、（１）濃縮された複数のｒＡＡＶ粒子を深層濾過によって清澄化して、濃縮及び清澄化された複数のｒＡＡＶ粒子を生成することをさらに含む。
【００２０】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、濃縮するステップは、（２）濃縮及び清澄化された複数のｒＡＡＶ粒子を−８０℃で凍結して、プロセス中間体を生成することをさらに含む。
【００２１】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、富化するステップ（ｅ）は、富化された複数のｒＡＡＶ粒子を生成するためのイオジキサノール密度勾配超遠心分離を含む。いくつかの実施形態では、密度勾配は、不連続な密度勾配である。いくつかの実施形態では、イオジキサノール密度勾配は、それぞれ、１５％、２５％、４０％、及び５７％の濃度を有するイオジキサノール組成物のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、富化された複数のｒＡＡＶ粒子は、イオジキサノール密度勾配から単離される。いくつかの実施形態では、富化された複数のｒＡＡＶ粒子は、４０％の濃度を有するイオジキサノール組成物及び５７％の濃度を有するイオジキサノール組成物の界面から単離される。いくつかの実施形態では、濃縮及び清澄化された複数のｒＡＡＶ粒子は、本開示の密度勾配に適用され、その後、超遠心分離ステップに供される。いくつかの実施形態では、超遠心分離ステップに続いて、富化された複数のｒＡＡＶまたは完全なｒＡＡＶ粒子は、密度勾配から単離される。
【００２２】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、精製ステップ（ｆ）のアフィニティークロマトグラフィーは、ＡＶＢセファロースマトリックスを含む。
【００２３】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２、及びＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、０．００１％でのポロキサマー１８８と共に、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。
【００２４】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィーは、ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ  ＱまたはＰｏｒｏｓ  ＡＥＸクロマトグラフィーの使用を含む。いくつかの実施形態では、ＡＥＸクロマトグラフィーは、ＡＥＸクロマトグラムを生成するステップと、完全なｒＡＡＶ粒子を含むＡＥＸクロマトグラム上のピークを選択するステップと、をさらに含む。
【００２５】
本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の精製のための方法のいくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｇ）の前に希釈ステップをさらに含み、希釈ステップは、（１）クロマトグラフィーが第１の精製された複数のｒＡＡＶ粒子をＵｎｏＱと接触させることを含む際に、ステップ（ｅ）の前にステップ（ｄ）からの第１の精製された複数のｒＡＡＶ粒子を２０倍希釈すること、または（２）クロマトグラフィーが第１の精製された複数のｒＡＡＶ粒子をＡＶＢと接触させることを含む際に、ステップ（ｅ）の前にステップ（ｄ）からの第１の精製された複数のｒＡＡＶ粒子を６倍希釈することを含む。いくつかの実施形態では、希釈ステップは、希釈緩衝液を第１の精製された複数のｒＡＡＶ粒子に添加することを含み、クロマトグラフィーは第１の精製された複数のｒＡＡＶ粒子をＵｎｏＱと接触させることを含み、希釈緩衝液は１０ｍＭのＴｒｉｓをｐＨ９で含む。いくつかの実施形態では、希釈ステップは希釈緩衝液を第１の精製された複数のｒＡＡＶ粒子に添加することを含み、クロマトグラフィーは第１の精製された複数のｒＡＡＶ粒子をＡＶＢと接触させることを含み、希釈緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００のＮａＣｌをｐＨ８で含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｅ）は、第２の精製された複数のｒＡＡＶ粒子及び溶出緩衝液を含む組成物を生成する。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーはＵｎｏＱを含み、溶出緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ、６５０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ９で含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーはＡＶＢを含み、溶出緩衝液は、１０．８ｍＭのＮａＨＰＯ４、４４．６ｍＭのクエン酸、４００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ２．６で含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、中和緩衝液中に溶出される。いくつかの実施形態では、中和緩衝液は、１ＭのＴｒｉｓをｐＨ８．８で含む。
【００２６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）またはステップ（ｇ）のＴＦＦは、１００ｋＤａの中空繊維フィルター（ＨＦＦ）を使用して実行される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）またはステップ（ｇ）のＴＦＦは、７０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）またはステップ（ｇ）のＴＦＦは、５０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｇ）方法は第２のＴＦＦをさらに含み、ステップ（ｄ）のＴＦＦ及びステップ（ｇ）の第１のＴＦＦは１００ｋＤａのＨＦＦを使用して実行され、ステップ（ｇ）の第２のＴＦＦは５０ｋＤａまたは７０ｋＤａのＨＦＦを使用して実行される。
【００２７】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、培養された細胞株から単離されるか、または培養された細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【００２８】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、初代細胞株から単離されるか、または初代細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、不死化細胞または幹細胞である。
【００２９】
本開示は、本開示の方法によって生成された複数のｒＡＡＶ粒子を含む薬学的組成物を提供する。
【００３０】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）０．５〜２．５×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、（ｂ）５０％未満の空のキャプシドと、（ｃ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり４ｎｇ／ｍＬ未満の残存宿主細胞タンパク質と、（ｄ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり７×１０−３ｐｇ／ｍｌ未満の残存宿主細胞ＤＮＡと、を含む。
【００３１】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、（ｅ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬをさらに含み、機能的ベクターゲノムの各々は、形質導入に続いて細胞中で外来配列を発現することができる。
【００３２】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、薬学的組成物を用いた細胞の形質導入に続いて、複数の機能的ｖｇ／ｍＬは、形質導入されていない細胞中での対応する内因性配列の発現のレベルと比較される際に、外来配列を２倍の増加で発現する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物を用いた細胞の形質導入に続いて、複数の機能的ｖｇ／ｍＬは、形質導入されていない細胞中での対応する内因性配列の発現のレベルと比較される際に、外来配列を、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはその間の任意の他の倍増値の増加で発現する。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、同一である。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、同一でない。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は同一でないが、対応するポリペプチドは同一である。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意の百分率の同一性を有する。いくつかの実施形態では、外来配列は、対応する内因性配列と比較される際に、哺乳動物またはヒトにおける発現についてコドン最適化される。外来配列が対応する内因性配列と比較される際に哺乳動物またはヒトにおける発現のためにコドン最適化されるものを含む、いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意の百分率の相同性を有する。
【００３３】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物を用いた細胞の形質導入に続いて、外来配列は、タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、外来配列によってコードされるタンパク質は、形質導入されていない細胞の対応する配列によってコードされるタンパク質の活性レベル以上の活性レベルを有する。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、同一である。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、同一でない。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は同一でないが、対応するポリペプチドは同一である。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意の百分率の同一性を有する。外来配列が対応する内因性配列と比較される際に哺乳動物またはヒトにおける発現のためにコドン最適化されるものを含む、いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意の百分率の相同性を有する。いくつかの実施形態では、活性は、１つ以上の官能基をリガンドまたは基質に結合、活性化、及び／または転移させることを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質はＲＥＰ−１タンパク質を含み、活性はＲＥＰ−１基質のプレニル化を含む。
【００３４】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）１．０〜２．０×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）約１．０×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）１．０×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。
【００３５】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、（ｂ）５０％未満の空のキャプシドを含む。本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、（ｂ）３０％未満の空のキャプシドを含む。
【００３６】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、血清型２のＡＡＶ（ＡＡＶ２）から単離される配列か、またはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２から単離される配列か、またはＡＡＶ２に由来する配列は、逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２  ＩＴＲの野生型配列を含む。
【００３７】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、培養細胞株から単離されるか、または培養細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【００３８】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、初代細胞株から単離されるか、または初代細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、不死化細胞または幹細胞である。
【００３９】
本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶは、（ａ）ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲをコードする配列と、（ｂ）初期エンハンサー要素をコードする配列と、（ｃ）プロモーターをコードする配列と、（ｄ）エクソン及びイントロンをコードする配列と、（ｅ）スプライス受容部位をコードする配列と、（ｆ）Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）タンパク質をコードする配列と、（ｇ）転写後制御性要素（ＰＲＥ）をコードする配列と、（ｈ）ポリアデニル化（ポリＡ）部位をコードする配列と、（ｉ）ＡＡＶ２  ３’ＩＴＲをコードする配列と、を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含む（また、その内容の全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，８３４，７８８号も参照されたい）。
【００４０】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、初期エンハンサー要素は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から単離される配列か、またはサイトメガロウイルスに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、初期エンハンサー要素は、
【化３】
2021520233.tif 000005
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、初期エンハンサー要素は、
【化４】
2021520233.tif 000006
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４１】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、プロモーターをコードする配列は、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）遺伝子をコードする配列から単離される配列か、もしくはそれに由来する配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、プロモーターをコードする配列は、
【化５】
2021520233.tif 000007
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４２】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、エクソン及びイントロンをコードする配列は、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）遺伝子をコードする配列から単離される配列か、もしくはそれに由来する配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、エクソン及びイントロンをコードする配列は、
【化６】
2021520233.tif 000008
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４３】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、スプライス受容部位をコードする配列は、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓベータグロビンスプライス受容部位をコードする配列から単離される配列か、またはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓベータグロビンスプライス受容部位をコードする配列は、
【化７】
2021520233.tif 000009
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４４】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、初期エンハンサー要素を含む配列、プロモーターを含む配列、イントロン及びエクソンを含む配列ならびにスプライス受容部位を含む配列は、
【化８】
2021520233.tif 000010
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４５】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、初期エンハンサー要素を含む配列、プロモーターを含む配列、イントロン及びエクソンを含む配列ならびにスプライス受容部位を含む配列は、
【化９】
2021520233.tif 000011
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４６】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、ＲＥＰ１タンパク質をコードする配列は、哺乳動物ＲＥＰ１配列から単離される配列か、または哺乳動物ＲＥＰ１配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物のＲＥＰ１配列は、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類もしくはヒトから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、哺乳動物のＲＥＰ１配列は、ヒトから単離されるか、またはヒトに由来する。いくつかの実施形態では、ヒトＲＥＰ１タンパク質をコードする配列は、
【化１０】
2021520233.tif 000012
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ヒトＲＥＰ１タンパク質は、
【化１１】
2021520233.tif 000013
、のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４８】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、ＰＲＥをコードする配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＰＲＥ）から単離される配列か、またはウッドチャック肝炎ウイルスに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥをコードする配列は、
【化１２】
2021520233.tif 000014
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００４９】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、ポリアデニル化（ポリＡ）部位をコードする配列は、哺乳動物遺伝子から単離される配列か、または哺乳動物遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化（ポリＡ）部位をコードする配列は、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨ）から単離される配列か、またはウシ成長ホルモン遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ部位をコードする配列は、
【化１３】
2021520233.tif 000015
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００５０】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲをコードする配列は、
【化１４】
2021520233.tif 000016
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００５１】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ２  ３’ＩＴＲをコードする配列は、
【化１５】
2021520233.tif 000017
、の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００５２】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列は、ＤＮＡ配列を含むか、またはＤＮＡ配列からなる。いくつかの実施形態では、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ配列を含むか、または一本鎖ＤＮＡ配列からなる。
【００５３】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶは、ＡＡＶ２から単離されるキャプシドか、またはＡＡＶ２に由来するキャプシドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、アミノ酸配列
【化１６】
2021520233.tif 000018
と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、アミノ酸配列
【化１７】
2021520233.tif 000019
を含む。
【００５５】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、製剤緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、Ｔｒｉｓ、ＭｇＣｌ２、及びＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、０．００１％でのポロキサマー１８８と共に、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。
【００５６】
最終組成物の複数の完全なｒＡＡＶの各完全なｒＡＡＶが、要素（ａ）〜（ｉ）を５’から３’まで含む核酸配列をさらに含むものを含む、本開示の薬学的組成物のいくつかの実施形態では、複数の完全なｒＡＡＶは、両端を含めて、１×１０８ゲノム粒子（ｇｐ）／ｍＬ〜１×１０１４ｇｐ／ｍＬの濃度にある。いくつかの実施形態では、複数の完全なｒＡＡＶは、両端を含めて、０．５×１０１０ｇｐ／ｍＬ〜２．５×１０１２ｇｐ／ｍＬの濃度にある。いくつかの実施形態では、複数の完全なｒＡＡＶは、両端を含めて、１×１０１１ｇｐ／ｍＬ〜５×１０１３ｇｐ／ｍＬの濃度にある。いくつかの実施形態では、複数の完全なｒＡＡＶは、両端を含めて、１×１０１１ｇｐ／ｍＬ〜２×１０１２ｇｐ／ｍＬの濃度にある。いくつかの実施形態では、複数の完全なｒＡＡＶは、１×１０１２ｇｐ／ｍＬの濃度にある。いくつかの実施形態では、複数の完全なｒＡＡＶは、１×１０１１ｇｐ／ｍＬの濃度にある。いくつかの実施形態では、複数の完全なｒＡＡＶの濃度は、ｑＰＣＲを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲは、標準としてスーパーコイルプラスミドベクターを使用する。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲは、標準として直線化プラスミドベクターを使用する。
【００５７】
本開示は、本開示の薬学的組成物を含む送達デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、送達デバイスは、シリンジ、カテーテル及び針のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、送達デバイスは、注射によって薬学的組成物を投与するのに好適である。いくつかの実施形態では、送達デバイスは、注入によって薬学的組成物を投与するのに好適である。いくつかの実施形態では、送達デバイスは、網膜下経路によって薬学的組成物を投与するのに好適である。いくつかの実施形態では、送達デバイスは、脈絡膜上経路によって薬学的組成物を投与するのに好適である。
【００５８】
本開示は、治療有効量の本開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法を提供する。
【００５９】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、疾患または障害は、網膜の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、コロイデレミアである。
【００６０】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、治療有効量は、薬学的組成物の最小有効量と最大忍容量との間の量を含む。
【００６１】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、最小有効量は、網膜の少なくとも１つのニューロンまたはその標的部分を形質導入するのに十分な薬学的組成物の量を含む。いくつかの実施形態では、最小有効量は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意の百分率の網膜のニューロンまたはその標的部分を形質導入するのに十分な薬学的組成物の量を含む。いくつかの実施形態では、最小有効量は、対象の視力を改善するのに十分な薬学的組成物の量を含む。いくつかの実施形態では、最小有効量は、網膜疾患の徴候または症状を低減するのに十分な薬学的組成物の量を含む。いくつかの実施形態では、網膜疾患は、コロイデレミアである。
【００６２】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、最大忍容量は、有害事象を誘発するのに十分な薬学的組成物の量を含む。いくつかの実施形態では、有害作用は、薬学的組成物に対する免疫応答を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は、炎症を含む。いくつかの実施形態では、炎症は、全身性である。いくつかの実施形態では、炎症は、局所的である。いくつかの実施形態では、有害事象は、重度である。いくつかの実施形態では、有害事象は、二次的医学的治療を対象に投与することによって防止、低減、または制御されることができない。いくつかの実施形態では、二次的医学的治療は、免疫系の抑制剤を含む。いくつかの実施形態では、抑制剤は、抗炎症剤を含む。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、コルチコステロイドを含む。いくつかの実施形態では、コルチコステロイドは、プレドニゾンまたはプレドニゾロンを含む。
【００６３】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、治療有効量の薬学的組成物は、両端を含めて、１０４〜１０７の感染多重度（ＭＯＩ）を有する量を含む。いくつかの実施形態では、治療有効量の薬学的組成物は、両端を含めて、１×１０６〜９×１０６の感染多重度（ＭＯＩ）を有する量を含む。いくつかの実施形態では、治療有効量の薬学的組成物は、両端を含めて、１０４〜１０５の感染多重度（ＭＯＩ）を有する量を含む。いくつかの実施形態では、治療有効量の薬学的組成物は、１０５の感染多重度（ＭＯＩ）を有する量を含む。
【００６４】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、治療有効量は、両端を含めて、１×１０８ｇｐ〜１×１０１３ｇｐを含む。いくつかの実施形態では、治療有効量は、両端を含めて、６×１０９ｇｐ〜１×１０１３ｇｐを含む。いくつかの実施形態では、治療有効量は、両端を含めて、６×１０９ｇｐ〜７×１０１２ｇｐを含む。いくつかの実施形態では、治療有効量は、両端を含めて、６×１０９ｇｐ〜５×１０１２ｇｐを含む。いくつかの実施形態では、治療有効量は、両端を含めて、１×１０１０ｇｐ〜１×１０１２ｇｐを含む。いくつかの実施形態では、治療有効量は、１×１０１０ｇｐを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、１×１０１１ｇｐを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、１×１０１２ｇｐを含むか、またはそれからなる。
【００６５】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、治療有効量は、両端を含めて、１０μＬ〜２００μＬの体積を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、各範囲について、両端を含めて、１０μＬ〜５０μＬ、５０μＬ〜１００μＬ、１００μＬ〜１５０μＬ、もしくは１５０μＬ〜２００μＬの体積を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、両端を含めて、７０μＬ〜１２０μＬの体積を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、１００μＬの体積を含むか、またはそれからなる。
【００６６】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、治療有効量は、両端を含めて、１０μＬ〜２００μＬの体積の少なくとも１回の注射を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、治療有効量は、両端を含めて、１０μＬ〜２００μＬの体積の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０回の注射を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、２回以上の注射は、同じ目に対する同じ医学的処置中に網膜下腔中に行われる。いくつかの実施形態では、２回以上の注射は、同じ目に対する同じ医学的処置中に２つ以上の異なる網膜下腔中に行われる。いくつかの実施形態では、治療有効量のベクターによって接触される網膜下腔の領域は、５〜２０ｍｍ２を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、治療有効量のベクターによって接触される網膜下腔の領域は、１０ｍｍ２を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、１回以上の注射は、目の網膜の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる領域中に行われる。いくつかの実施形態では、１回以上の注射は、単一の処置中に、目の網膜の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる領域中に行われる。いくつかの実施形態では、１回以上の注射は、２つ以上の処置の過程にわたって、目の網膜の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の異なる領域中に行われる。
【００６７】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、治療有効量は、同じデバイスから投与される、両端を含めて、１０μＬ〜２００μＬの体積の少なくとも１回の注射を含むか、またはそれからなる。本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、治療有効量は、１回以上の注射の間で分けられた分割用量として同じデバイスによって送達される。分割用量は、同じ目の中の同じ網膜下腔または２つ以上の異なる網膜下腔に投与され得る。
【００６８】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、投与するステップは、注射または注入を含む。いくつかの実施形態では、投与するステップは、網膜下、脈絡膜上、または硝子体内経路を含む。いくつかの実施形態では、投与するステップは、網膜下注射または注入を含む。いくつかの実施形態では、網膜下注射または注入は、２ステップ網膜下注射を含む。いくつかの実施形態では、投与するステップは、脈絡膜上注射または注入を含む。
【００６９】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、対象は、男性である。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１８歳の年齢である。いくつかの実施形態では、対象は、コロイデレミアの遺伝学的に確認された診断を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ＲＥＰ１遺伝子に変異を有するとして特定されている。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの目の黄斑においてコロイデレミアの臨床徴候を示す。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの目に３４〜７３文字の最高矯正視力（ＢＣＶＡ）スコアを有する。いくつかの実施形態では、対象は、軽度または初期段階のコロイデレミアを有する。いくつかの実施形態では、対象は、進行した、または重度のコロイデレミアを有する。
【００７０】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの目の網膜の１０ｍｍ２を治療することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、両端を含めて、少なくとも１つの目の網膜の５ｍｍ２〜１０ｍｍ２を治療することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、両端を含めて、少なくとも１つの目の網膜の２ｍｍ２〜１５ｍｍ２を治療することを含む。
【００７１】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対象の１つの目に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対象の両方の目に投与される。いくつかの実施形態では、対象の目は、同時に治療される。いくつかの実施形態では、対象の両方の目は、順次治療される。いくつかの実施形態では、対象の少なくとも１つの目は、薬学的組成物の対象への投与前に、コロイデレミアについて治療されている。
【００７２】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、両端を含めて、目あたり１〜１２の用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの用量を少なくとも１日１回、１週間に１回、１カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回、または１年に１回投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は複数の用量を投与することを含み、各用量は同じ量の薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態では、方法は複数の用量を投与することを含み、各用量は同じ量の薬学的組成物を含まない。いくつかの実施形態では、方法は複数の用量を投与することを含み、各連続する用量は以前の用量よりも多くの数の完全なｒＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、方法は複数の用量を投与することを含み、各連続する用量は以前の用量よりも少ない数の完全なｒＡＡＶを含む。
【００７３】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、両端を含めて、目あたり１〜１２の用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、用量は、回復期間に続いて提供される。いくつかの実施形態では、回復期間は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはその間の分の任意の数である。いくつかの実施形態では、回復期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間である。いくつかの実施形態では、回復期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日である。いくつかの実施形態では、回復期間は、少なくとも１、２、３、または４週間である。いくつかの実施形態では、回復期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月である。いくつかの実施形態では、回復期間は、少なくとも１、２、３、４、５または６年である。
【００７４】
方法が、両端を含めて、目あたり１〜１２の用量を投与することを含むものを含む、本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、対象は、治療有効用量に続いて有害事象を経験し、後の用量は、有害事象を誘発した以前の用量よりも少ない完全なｒＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、対象は有害事象から回復し、薬学的組成物の後の用量は対象に投与される。いくつかの実施形態では、有害事象を誘発した治療有効用量及び後の用量は、等しい数の完全なｒＡＡＶを含む。いくつかの実施形態では、有害事象を誘発した治療有効用量及び後の用量は、等しい数の完全なｒＡＡＶを含まない。
【００７５】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の薬学的組成物の投与前に、複数のプラセボｒＡＡＶの量を対象に投与することをさらに含み、各プラセボｒＡＡＶは、空のｒＡＡＶである。いくつかの実施形態では、空のｒＡＡＶは、外来配列を発現するためのプロモーターまたは外来配列のいずれも含まない。いくつかの実施形態では、複数のプラセボｒＡＡＶの量の投与は、全身性である。いくつかの実施形態では、複数のプラセボｒＡＡＶの量の投与は、局所的である。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）複数のプラセボｒＡＡＶが対象において免疫応答を誘発したかどうかを決定すること、及び／または（ｂ）対象が、複数のプラセボｒＡＡＶに対して免疫寛容を示したかどうかを決定し、それによって、治療有効量の薬学的組成物の投与が、対象において免疫媒介性有害事象を誘発するはずがないないことを示すことをさらに含む。
【００７６】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象に免疫応答の抑制剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抑制剤は、抗炎症剤を含む。いくつかの実施形態では、抗炎症剤は、コルチコステロイドを含む。いくつかの実施形態では、コルチコステロイドは、プレドニゾンまたはプレドニゾロンを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答の抑制剤の投与は、全身性である。いくつかの実施形態では、免疫応答の抑制剤は、経口投与される。いくつかの実施形態では、免疫応答の抑制剤の投与は、局所的である。いくつかの実施形態では、免疫応答の抑制剤は、薬学的組成物で治療された目に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物及び免疫応答の抑制剤は、同時に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物及び免疫応答の抑制剤は、同じ日に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物及び免疫応答の抑制剤は、順次投与される。いくつかの実施形態では、抑制剤の投与は、薬学的組成物の投与に少なくとも１日先行する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物の投与は、抑制剤の投与に少なくとも１日先行する。
【００７７】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、対象の少なくとも１つの目におけるコロイデレミア媒介性損傷の初期重症度を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの目への薬学的組成物の投与に続いて、対象の少なくとも１つの目におけるコロイデレミア媒介性損傷の後の重症度を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、コロイデレミア媒介性損傷の初期または後の重症度が、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）試験スコアを決定すること、生存網膜組織の領域もしくは体積を測定すること、保存された楕円体ゾーンを測定すること、網膜感度を測定すること、コントラスト感度を測定すること、色覚を測定すること、低輝度視力を測定すること、速読を測定すること、またはこれらの任意の組み合わせによって決定される。いくつかの実施形態では、ＢＣＶＡ試験は、（糖尿病網膜症の早期治療研究）ＥＴＤＲＳチャートを利用する。いくつかの実施形態では、ＢＣＶＡ試験は、指のカウント、手の動き、光の知覚及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上の評価を含む。いくつかの実施形態では、生存網膜組織は眼底自発蛍光を含み、生存網膜組織を測定することが眼底自発蛍光のレベルまたはパターンを検出することを含む。いくつかの実施形態では、保存された楕円体ゾーンを測定することは、スペクトルドメイン光干渉断層計（ＳＤ−ＯＣＴ）を含む。いくつかの実施形態では、網膜感度を測定することは、微小視野測定を含む。
【００７８】
本開示の疾患または障害を治療する方法のいくつかの実施形態では、治療有効量の薬学的組成物の投与は、コロイデレミアの徴候または症状の進行を阻害または低減する。いくつかの実施形態では、治療有効量の薬学的組成物の投与は、コロイデレミアの徴候または症状を低減する。いくつかの実施形態では、コロイデレミアの徴候または症状は、視細胞の喪失、ＲＰＥ細胞の喪失、視力の低下、低輝度視力の低下、保存された自発蛍光（ＡＦ）の総領域、ＢＣＶＡ試験での低いスコア、保存された楕円体ゾーンの領域の減少、網膜感度の低下、コントラスト感度の低下、色覚の低下もしくは色あせ、速読の速度の低下、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、コロイデレミアの徴候または症状の重症度は、健康な網膜に対して決定される。いくつかの実施形態では、健康な網膜は、同齢の対照対象に属する。
【００７９】
本開示は、本開示の薬学的組成物の治療有効量を決定する方法を提供し、方法は、（ａ）治療される対象の網膜の領域を測定することと、（ｂ）（ａ）の領域が、中央の０．５ｍｍ２の中心窩領域にあるか、または黄斑にあるかを決定することと、（ｃ）（ａ）の領域内の桿体、錐体、及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の数を計算することと、（ｄ）細胞の総数に１×１０５の感染多重度（ＭＯＩ）を乗じて、治療有効量に含まれるゲノム粒子（ｇｐ）の数を計算することと、を含み、治療される網膜の最大領域が、１０ｍｍ２であり、網膜におけるＲＰＥ細胞の密度が、１ｍｍ２あたり５，０００細胞であり、網膜における桿体の密度が、中央の０．５ｍｍ２の中心窩領域を除いて、１ｍｍ２あたり７５，０００個の桿体であり、網膜における錐体の密度が、中央の０．５ｍｍ２の中心窩領域において１ｍｍ２あたり１５０，０００個の錐体であり、網膜における錐体の密度が、中央の０．５ｍｍ２の中心窩領域外側の黄斑において１ｍｍ２あたり２５，０００である。
【００８０】
本開示は、それを必要とする対象において疾患または障害を治療することにおける使用のための本開示の薬学的組成物を提供する。
【００８１】
本開示は、それを必要とする対象において疾患または障害を治療することにおける使用のための本開示のベクターを提供する。
【００８２】
本開示は、それを必要とする対象において疾患または障害を治療することにおける使用のための本開示のＡＡＶまたはｒＡＡＶを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】例示的なＡＡＶ２−構築物原薬製造方法（プロセス２）の概要である。
【図２−１】図１に提供される概要に対応するフロー図である。
【図２−２】図１に提供される概要に対応するフロー図である。
【図２−３】図１に提供される概要に対応するフロー図である。
【図３】例示的なＡＡＶ２−構築物の構造組織化を示す図である。
【図４】ＨＥＫ２９３  ＭＣＢ生成の概要である。
【図５】ＡＡＶ２−構築物原薬製造方法（元のプロセス）の概要である。
【図６−１】図５に提供される概要に対応するフロー図である。
【図６−２】図５に提供される概要に対応するフロー図である。
【図７】ＡＡＶ２−構築物製剤製造方法（元のプロセス）を示すフロー図である。
【図８−１】元の方法と改善された方法との比較−−細胞培養フェーズを示すフロー図の対である。
【図８−２】元の方法と改善された方法との比較−−細胞培養フェーズを示すフロー図の対である。
【図９】元の方法と改善された方法との比較−−細胞培養フェーズを示すグラフである。
【図１０】元の方法と改善された方法との比較−−細胞培養フェーズを示すグラフである。
【図１１】元のプロセスから改善されたプロセスに移された下流方法を示すフロー図である。
【図１２】ＡｍｐＲ（左のバー）及びＫａｎＲ（右のバー）プラスミドについての収量解析ＡＶＧ  ＤＲＰ／ｃｍ２の比較を示すグラフである。
【図１３】ＡＡＶ２−構築物での形質導入に続く各細胞からの構築物発現を解明する検出可能な標識の平均蛍光強度を示すグラフである。
【図１４】ＡＡＶ２−構築物での形質導入に続く構築物タンパク質を発現する細胞の百分率を示す、フローサイトメトリーによって決定された、ＧＦＰ陽性細胞の百分率を示すグラフである。
【図１５】ＡＡＶ２−構築物収量解析の平均収量結果を示すグラフである。
【図１６】ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）組成物（改善されたプロセスから）についての純度データを示すゲル電気泳動の写真である。
【図１７】元のプロセス及び改善されたプロセスによって生成された（非ＧＭＰ）組成物からのＡＡＶ２−構築物ベクターの等価なＭＯＩでのＨＥＫ２９３細胞のインビトロ形質導入に続く、構築物の発現及び活性を示すゲル電気泳動の写真である。
【図１８】ｐＡＡＶ−ＲＥＰ１−Ｋａｎプラスミドのマップである。
【図１９】ｐＢＣ−ｈＲＥＰ１ベクターの完全な配列である（配列番号２４）。
【図２０】遺伝子療法（実施例１３）の２年後での治療された及び治療されていない目の視力を示すグラフである。合併症を伴わずに網膜下遺伝子療法を受けた１２人のコロイデレミア患者において２年目に糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）チャートで測定された視力（水平線は中央値を表し、箱ひげ図は四分位範囲を表し、ひげは限界値を表す）。治療された目は青で示され、治療されていない目は緑で示される（各時点でそれぞれ左のバー及び右のバー）。１年目での中間データも、示される。遺伝子療法の２年後に治療された目において視力の改善があった（ｐ＝０．０２０）。治療された目は、この期間にわたって治療されていない目と比較して改善した（ｐ＝０．００３）。
【図２１】遺伝子療法の２年後の治療された及び治療されていない目における黄斑機能を示すグラフである。微小視野測定で測定された網膜感度は、黄斑全体の点を含み、網膜機能の改善に伴って増加する。治療されていない目において網膜感度がベースラインから２年の間に低下したが（ｐ＝０．００４）、この期間にわたって治療された目の有意な変化はなかった。１年目での中間データも、示される。治療された目は青で示され、治療されていない目は緑で示される（各時点でそれぞれ左のバー及び右のバー）−エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【図２２】実施例１４に記載されるＧＥＭＩＮＩ治験デザインを示す概略図である。
【図２３】ＡＡＶ２ベクターの硝子体切除術（Ａ）及び網膜下注射（Ｂ）を示す概略図である。（Ａ）硝子体ゲルを除去するためのＢＩＯＭ操作システムによる標準硝子体切除術の後には、（Ｂ）２ステップの処置が続く：１）ＢＳＳの注入による網膜剥離、２）４１ゲージのカニューレを通じた網膜下腔中への０．１ｍＬの量のベクター懸濁液の注射。
【図２４】実施例１５に記載されるＳＴＡＲ治験のデザインを示す概略図である。
【図２５】ＰＣＲにより決定されたＡＡＶ力価を示すグラフである。試料は、平衡生理食塩水溶液（ＢＳＳ）中に１×１０１２ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）／ｍＬ、１×１０１１ＤＲＰ／ｍＬ及び１×１０１１ＤＲＰ／ｍＬの初期力価でＸ軸上にある。Ｙ軸上には、試料がグラフの右側に記載されるように処理された後に測定された力価が、示される。
【図２６】１×１０１２ＤＲＰ／ｍＬの高用量及び１０，０００のＭＯＩでＡＡＶ２．ＲＥＰ１．ＥＮＧ１０１４−Ａベクターを使用する適合性研究におけるｒＡＡＶ２．ＲＥＰ−１のプレニル化活性を示すウエスタンブロットの一連の３つの写真である。上から順に、ｈＲＥＰ１（８３ＫＤａ）、アクチン（４２ＫＤａ）、ビオチン化Ｒａｂ６ａ（２４ＫＤａ）が、示される。タンパク質サイズは、上から下に、１８０、１３５、１００、７５、６３、４８、３５、２５、２０、１７、及び１１ＫＤａとして左側に示される。三重の試料は、左から右に、形質導入されていない対照、ベースラインベクターで、４℃で６時間保持されたベクターで、４℃で６時間保持され１８０分後に注射されたベクターで、４℃で６時間及びシリンジ中で１８０分間保持されたベクターで形質導入された細胞、ならびに陽性対照として魚類ＲＥＰ１（単一試料）である。
【図２７】１×１０１１ＤＲＰ／ｍＬの低用量及び１０，０００のＭＯＩでＡＡＶ２．ＲＥＰ１．ＥＮＧ１０１４−Ａベクターを使用する適合性研究におけるｒＡＡＶ２．ＲＥＰ−１のプレニル化活性を示すウエスタンブロットの一連の３つの写真である。上から順に、ｈＲＥＰ１（８３ＫＤａ）、アクチン（４２ＫＤａ）、ビオチン化Ｒａｂ６ａ（２４ＫＤａ）が、示される。タンパク質サイズは、上から下に、１８０、１３５、１００、７５、６３、４８、３５、２５、２０、１７、及び１１ＫＤａとして左側に示される。三重の試料は、左から右に、形質導入されていない対照、ベースラインベクターで、４℃で６時間保持されたベクターで、４℃で６時間保持され１８０分後に注射されたベクターで、４℃で６時間及びシリンジ中で１８０分間保持されたベクターで形質導入された細胞、ならびに陽性対照として魚類ＲＥＰ１（単一試料）である。
【図２８】ＡＡＶ２．ＲＥＰ１．ＥＮＧ１０１４−Ａベクターを使用する適合性研究におけるｒＡＡＶ２．ＲＥＰ−１のプレニル化活性のウエスタンブロットの半定量化を示すプロットの対である。（Ａ）正規化されたＲＥＰ１を示す。バンド密度値（ａ．ｕ．）はｙ軸上にあり、１×１０１２ＤＲＰ／ｍＬの高用量及び１×１０１１ＤＲＰ／ｍＬの低用量でのＡＡＶ２−ＲＥＰ１はｘ軸上にある。（Ｂ）正規化されたビオチン化Ｒａｂ６ａを示す。バンド密度値（ａ．ｕ．）はｙ軸上にあり、１×１０１２ＤＲＰ／ｍＬの高用量及び１×１０１１ＤＲＰ／ｍＬの低用量でのＡＡＶ２−ＲＥＰ１はｘ軸上にある。（Ａ）及び（Ｂ）では、左から右への各用量についてのバーは、形質導入されていない細胞、ベースラインベクターで、４℃で６時間保持され、さらに４℃で６時間保持され１８０分後に２０℃で注射されたベクターで、４℃で６時間及びシリンジ中で２０℃で１８０分保持されたベクターで形質導入された細胞を示す。
【図２９−１】５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列、ＣＡＧプロモーターをコードする配列、ヒトＲＥＰ１タンパク質をコードする配列、変異したＷＰＲＥシグナルをコードする配列、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルをコードする配列、及び３’ＩＴＲをコードする配列を含むヌクレオチド配列を５’から３’まで含むか、またはそれからなる本開示の例示的な構築物である。
【図２９−２】５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列、ＣＡＧプロモーターをコードする配列、ヒトＲＥＰ１タンパク質をコードする配列、変異したＷＰＲＥシグナルをコードする配列、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルをコードする配列、及び３’ＩＴＲをコードする配列を含むヌクレオチド配列を５’から３’まで含むか、またはそれからなる本開示の例示的な構築物である。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
詳細な説明
本開示は、本開示の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子の精製のための方法を提供する。本開示は、本開示の方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって生成されるｒＡＡＶ粒子を含む薬学的組成物は、（ａ）０．５〜２．５×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、（ｂ）５０％未満の空のキャプシドと、（ｃ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり４ｎｇ／ｍＬ未満の残存宿主細胞タンパク質と、（ｄ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり７×１０−３ｐｇ／ｍｌ未満の残存宿主細胞ＤＮＡと、を含む。
【００８５】
本開示は、治療有効量の本開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、網膜の疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、コロイデレミアである。
【００８６】
本開示は、（ａ）０．５〜２．５×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、（ｂ）５０％未満の空のキャプシドと、（ｃ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり４ｎｇ／ｍＬ未満の残存宿主細胞タンパク質と、（ｄ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり７×１０−３ｐｇ／ｍｌ未満の残存宿主細胞ＤＮＡと、を含む薬学的組成物を提供する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）０．５〜２．５×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、（ｂ）５０％未満の空のキャプシドと、（ｃ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり４ｎｇ／ｍＬ未満の残存宿主細胞タンパク質と、（ｄ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり７×１０−３ｐｇ／ｍｌ未満の残存宿主細胞ＤＮＡと、（ｅ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬと、を含み、機能的ベクターゲノムの各々は、形質導入に続いて細胞中で外来配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物での細胞の形質導入に続いて、複数の機能的ｖｇ／ｍＬは、形質導入されていない細胞における対応する内因性配列の発現のレベルと比較される際に、２倍の増加で外来配列を発現する。いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物を用いた細胞の形質導入に続いて、複数の機能的ｖｇ／ｍＬは、形質導入されていない細胞中での対応する内因性配列の発現のレベルと比較される際に、外来配列を、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、またはその間の任意の他の倍増値の増加で発現する。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は同一である。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は同一でない。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意の百分率の同一性を有する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、（ａ）０．５〜２．５×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの複製欠損及び組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、（ｂ）５０％未満の空のキャプシドと、（ｃ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり４ｎｇ／ｍＬ未満の残存宿主細胞タンパク質と、（ｄ）１．０×１０１２ｖｇ／ｍＬあたり７×１０−３ｐｇ／ｍｌ未満の残存宿主細胞ＤＮＡと、（ｅ）複数の機能的ｖｇ／ｍＬと、を含み、機能的ベクターゲノムの各々は、形質導入に続いて細胞中で外来配列を発現することができる。いくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物での細胞の形質導入に続いて、外来配列は、タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、外来配列によってコードされるタンパク質は、形質導入されていない細胞の対応する配列によってコードされるタンパク質の活性レベル以上の活性レベルを有する。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は同一である。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は同一でない。いくつかの実施形態では、外来配列及び対応する内因性配列は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはその間の任意の百分率の同一性を有する。いくつかの実施形態では、活性は、１つ以上の官能基をリガンドまたは基質に結合、活性化、及び／または転移させることを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質はＲＥＰ−１タンパク質を含み、活性はＲＥＰ−１基質のプレニル化を含む。
【００８９】
ＡＡＶ組成物
本開示の組成物は、哺乳動物への、好ましくはヒトへの全身性または局所投与に好適な治療用構築物を含む。本開示の例示的な構築物は、遺伝子またはその一部をコードする配列を含む。好ましくは、本開示の構築物は、ヒト遺伝子またはその一部をコードする配列を含む。本開示の例示的な構築物は、遺伝子またはその一部の発現を可能にするか、またはそれを増強するための制御性要素をコードする１つ以上の配列（複数可）をさらに含むことができる。例示的な制御性要素は、プロモーター、イントロン、エンハンサー要素、応答要素（転写後応答要素または転写後制御性要素を含む）、ポリアデノシン（ポリＡ）配列、ならびに転写の効率的な終止を促進するための遺伝子断片（β−グロビン遺伝子断片及びウサギβ−グロビン遺伝子断片を含む）を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、構築物は、ヒトＲａｂエスコートタンパク質１型（ＲＥＰ−１）タンパク質またはその一部に対応するヒト遺伝子またはその一部を含む。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、構築物は、コドン最適化配列を含むヒト遺伝子またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、配列は、哺乳動物における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化される。
【００９１】
構築物がヒトＲＥＰ−１タンパク質またはその一部を含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、構築物は、「ＡＡＶ２−ＲＥＰ１またはＡＡＶ２．ＲＥＰ１」と呼ばれ、国際一般名（ＩＮＮ）は、ティムレピジェンエンパルヴォヴェク（ｔｉｍｒｅｐｉｇｅｎｅ  ｅｍｐａｒｖｏｖｅｃ）である。いくつかの実施形態では、構築物は、
【化１８】
2021520233.tif 000020
【化１９】
2021520233.tif 000021
、の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、構築物は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはその間の任意の百分率の、
【化２０】
2021520233.tif 000022
【化２１】
2021520233.tif 000023
の配列との同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、構築物は、
【化２２】
2021520233.tif 000024
の配列を有するヒトＲＥＰ１配列をコードする配列、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはその間の任意の百分率の、
【化２３】
2021520233.tif 000025
の配列との同一性を有する配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、構築物は、
【化２４】
2021520233.tif 000026
の配列を有するＣＡＧプロモーターをコードする配列、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはその間の任意の百分率の、
【化２５】
2021520233.tif 000027
の配列との同一性を有する配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、構築物は、
【化２６】
2021520233.tif 000028
の配列を有する変異したＷＰＲＥシグナルをコードする配列、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはその間の任意の百分率の、
【化２７】
2021520233.tif 000029
の配列との同一性を有する配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、構築物は、
【化２８】
2021520233.tif 000030
の配列を有するウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルをコードする配列、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはその間の任意の百分率の、
【化２９】
2021520233.tif 000031
の配列との同一性を有する配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、構築物は、
【化３０】
2021520233.tif 000032
の配列を有する５’ＩＴＲをコードする配列、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはその間の任意の百分率の、
【化３１】
2021520233.tif 000033
の配列との同一性を有する配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、構築物は、
【化３２】
2021520233.tif 000034
の配列を有する３’ＩＴＲをコードする配列、または少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくはその間の任意の百分率の、
【化３３】
2021520233.tif 000035
の配列との同一性を有する配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００９８】
構築物がヒトＲＥＰ−１タンパク質またはその一部を含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、構築物は、「ＡＡＶ２−ＲＥＰ１またはＡＡＶ２．ＲＥＰ１」と呼ばれ、国際一般名（ＩＮＮ）は、ティムレピジェンエンパルヴォヴェクである。構築物がヒトＲＥＰ−１タンパク質またはその一部を含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１生成物は、ヒトＲａｂエスコートタンパク質１型（ＲＥＰ１）のｃＤＮＡをコードする精製された組換え血清型２アデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）からなる。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、１７７ｂｐの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、９３４ｂｐのサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）ハイブリッドプロモーター、１９６２ｂｐのヒトＲＥＰ１  ｃＤＮＡ、５８９ｂｐのウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御性要素（ＷＰＲＥ）、２４２ｂｐのウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ−ポリＡ）、及び１６５ｂｐの３’ＩＴＲを含む、長さ４１７３ｂｐの一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１ベクターを生成するために使用されるｐＡＡＶ．ＲＥＰ−１−Ｋａｎプラスミドは、図１８に示される。いくつかの実施形態では、１９６２ｂｐのヒトＲＥＰ１  ｃＤＮＡは、
【化３４】
2021520233.tif 000036
の核酸配列を含む。
【００９９】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、構築物は、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一でない。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ２）から単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、短縮化された野生型ＡＡＶ２配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、同じＡＡＶ血清型の野生型配列と比較される際に、変動を含む。いくつかの実施形態では、変動は、置換、挿入、欠失、逆位、または転位を含む。いくつかの実施形態では、変動は、野生型またはバリアント配列の短縮または伸長を含む。
【０１００】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）に対応する配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一である。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は同一でない。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ２）から単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、短縮化された野生型ＡＡＶ２配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列は、同じＡＡＶ血清型の野生型配列と比較される際に、変動を含む。いくつかの実施形態では、変動は、置換、挿入、欠失、逆位、または転位を含む。いくつかの実施形態では、変動は、野生型またはバリアント配列の短縮または伸長を含む。
【０１０１】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、複製欠損ＡＡＶの形成に必須のウイルス配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス配列は、５’ＩＴＲをコードする配列もしくは３’ＩＴＲをコードする配列の１つもしくは両方と同じ血清型のＡＡＶから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列、または３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２から単離されるか、またはＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列、及び３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２から単離されるか、またはＡＡＶ２に由来する。
【０１０２】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、複製欠損ＡＡＶの形成に必須のウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列を含むが、ＡＡＶから単離されるか、またはＡＡＶに由来するいかなる他の配列も含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、複製欠損ＡＡＶの形成に必須のウイルス配列、５’ＩＴＲをコードする配列、３’ＩＴＲをコードする配列、及び本開示の構築物をコードする配列を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞においてｒＡＡＶを作成するために使用されるプラスミドＤＮＡは、選択マーカーを含む。例示的な選択マーカーは、抗生物質抵抗性遺伝子を含むが、これに限定されない。抗生物質抵抗性遺伝子の例は、アンプリシリン及びカナマイシンを含むが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーは、薬物または小分子抵抗性遺伝子を含むが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーは、これらに限定されないが、ｄａｐＤと、これらに限定されないが、ｄａｐＤ発現を制御または抑制するｌａｃＯ／Ｐ構築物を含む抑制可能オペレーターと、を含み、プラスミド選択は、オペレーターリプレッサータイトレーション（ＯＲＴ）が可能なプラスミドに形質転換された細胞を投与または接触させることにより実行される。例示的な選択マーカーは、ｃｃｄ選択遺伝子を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、ｃｃｄ選択遺伝子は、毒性ｃｃｄＢ遺伝子を発現するように操作された宿主細胞株を救済するｃｃｄＡ選択遺伝子をコードする配列を含む。例示的な選択マーカーは、限定されないが、ｓａｃＢを含み、ＲＮＡは、宿主細胞に投与または接触されて、スクロース培地中でのｓａｃＢ遺伝子の発現を抑制する。例示的な選択マーカーは、Ｈｏｋ（宿主殺傷遺伝子）及びＳｏｋ（殺傷の抑制）から構成されるｐａｒＡＢ＋座位などの分離殺傷メカニズムを含むが、これに限定されない。
【０１０４】
ＡＡＶ−構築物構造
ＡＡＶ２−構築物生成物は、治療用構築物をコードするｃＤＮＡをコードする精製された組換え血清型２アデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）からなる。例示的な図が、図３に提供される。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２−構築物は、５’ＩＴＲをコードする配列、３’ＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型２アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ２）から単離され、及び／またはそれに由来するキャプシドタンパク質をコードする配列のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２−構築物は、５’ＩＴＲをコードする配列、３’ＩＴＲをコードする配列、ならびに血清型２アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ２）から単離され、及び／またはそれに由来するキャプシドタンパク質をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２−構築物は、血清型２アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ２）から単離され、及び／またはそれに由来する、５’ＩＴＲをコードする短縮化された配列と、３’ＩＴＲをコードする配列と、を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２−構築物は、野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ（野生型５’ＩＴＲ及び野生型３’ＩＴＲ）を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）治療用構築物をコードするｃＤＮＡ、及び（ｄ）３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）１４５ｂｐの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）治療用構築物をコードするｃＤＮＡ、及び（ｄ）１４５ｂｐの３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）治療用構築物をコードするｃＤＮＡ、及び（ｄ）３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含み、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、１３４、１３５、１３６、もしくは１３７ｂｐを含むか、またはそれからなる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）１４５ｂｐの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）治療用構築物をコードするｃＤＮＡ、（ｅ）ポリアデニル化配列（ポリＡ）、及び（ｆ）１４５ｂｐの３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）治療用構築物をコードするｃＤＮＡ、（ｅ）ポリアデニル化配列（ポリＡ）、及び（ｆ）３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含み、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、１３４、１３５、１３６、もしくは１３７ｂｐを含むか、またはそれからなる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）１４５ｂｐの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）治療用構築物をコードするｃＤＮＡ、（ｄ）転写後制御性要素（ＰＲＥ）、（ｅ）ポリアデニル化配列（ポリＡ）、及び（ｆ）１４５ｂｐの３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）哺乳動物細胞における発現に好適なプロモーター、（ｃ）治療用構築物をコードするｃＤＮＡ、（ｄ）転写後制御性要素（ＰＲＥ）、（ｅ）ポリアデニル化配列（ポリＡ）、及び（ｆ）３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含み、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、１３４、１３５、１３６、もしくは１３７ｂｐを含むか、またはそれからなる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）１４５ｂｐの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）任意選択で、９３４ｂｐのサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）ハイブリッドプロモーターである、プロモーター、（ｃ）治療用構築物をコードするｃＤＮＡ、（ｄ）５８９ｂｐのウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御性要素（ＷＰＲＥ）、（ｅ）２４２ｂｐのウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ−ポリＡ）、及び（ｆ）１４５ｂｐの３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含む。いくつかの実施形態では、各２０ｎｍのＡＡＶビリオンは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、（ｂ）任意選択で、９３４ｂｐのサイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）ハイブリッドプロモーターである、プロモーター、（ｃ）治療用構築物をコードするｃＤＮＡ、（ｄ）５８９ｂｐのウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御性要素（ＷＰＲＥ）、（ｅ）２４２ｂｐのウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ−ポリＡ）、及び（ｆ）３’ＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ挿入配列（加えて、各要素に隣接する短いクローニング部位）を含み、５’ＩＴＲまたは３’ＩＴＲは、１３４、１３５、１３６、もしくは１３７ｂｐを含むか、またはそれからなる。
【０１１１】
本開示のＡＡＶまたは構築物は、哺乳動物細胞における発現が可能なプロモーターをコードする配列を含むことができる。好ましくは、本開示のＡＡＶまたは構築物は、ヒト細胞における発現が可能なプロモーターをコードする配列を含むことができる。本開示の例示的なプロモーターは、構成的に活性なプロモーター、細胞型特異的プロモーター、ウイルスプロモーター、哺乳動物プロモーター、及びハイブリッドまたは組換えプロモーターを含むが、これらに限定されない。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ２−構築物の治療用構築物は、ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡ）プロモーターの制御下にある。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＣＢＡプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをコードする配列及びニワトリベータアクチンプロモーター（様々にＣＢＡまたはＣＡＧと呼ばれる）をコードする配列を含む。
【０１１２】
本開示のＡＡＶまたは構築物は、転写後制御性要素（ＰＲＥ）をコードする配列を含むことができる。本開示の例示的なＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御性要素（ＷＰＲＥ）を含むが、これに限定されない。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ウイルスＳ転写物の３’領域に由来する、本開示の治療用構築物をコードするｃＤＮＡの直接下流にある５８９ｂｐのＷＰＲＥを含む。このＷＰＲＥは、ｍＲＮＡ処理及びイントロンのない遺伝子の輸送を増強するように作用する、ネイティブｍＲＮＡ転写産物の高レベルの発現のために重要である。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、翻訳開始部位の切除によるウイルスＸ抗原の発現を防止するように改変されている。このことは、Ｗｅ２プロモーター／エンハンサーを欠失させること、及びＷｅ１プロモーターを変異させることによって達成されている。
【０１１３】
本開示のＡＡＶまたは構築物は、ポリアデノシン（ポリＡ）配列を含むことができる。本開示の例示的なポリＡ配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ−ポリＡ）配列を含むが、これに限定されない。ＢＧＨ−ポリＡ配列は、遺伝子発現を増強するために使用され、ＳＶ４０及びヒトコラーゲンポリＡなどの他のポリＡ配列よりも３倍高い発現レベルをもたらすことが示されている。この増加した発現は、上流のプロモーターまたは導入遺伝子の型と大いに独立している。ＢＧＨ−ポリＡ及びＷＰＲＥ配列の両方を使用して発現レベルを増加させることは、注射されるＡＡＶまたはプラスミドベクターのより低い全体的用量を可能にし、そのことで宿主免疫応答を生成する可能性がより低くなる。
【０１１４】
１つの例示的な実施形態では、ｐＢＣ−ｈＲＥＰ１ベクターは、配列番号２４で示される核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０１１５】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、原薬を含む。本明細書で使用される場合、原薬は、本開示の構築物を含む本開示のｒＡＡＶを含む。
【０１１６】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、製剤を含む。本明細書で使用される場合、製剤は、疾患または障害の治療または予防のために対象への投与のために製剤化された原薬を含む。
【０１１７】
本開示の例示的な製剤の構成要素、それらの機能及び仕様が、表１に列挙される。
【０１１８】
【表１】
2021520233.tif 000037
【０１１９】
剤形
本開示の組成物は、全身性または局所投与のために製剤化され得る。
【０１２０】
本開示の組成物は、注射または注入のための懸濁液として製剤化され得る。
【０１２１】
本開示の組成物は、これらに限定されないが、硝子体内注射もしくは注入、網膜下注射もしくは注入、または脈絡膜上注射もしくは注入を含む、任意の経路による注射または注入のために製剤化され得る。
【０１２２】
本開示の組成物は、両端を含めて、１．０×１０＾１０ＤＲＰ／ｍＬ〜１．０×１０＾１４ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、約１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、０．１×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ〜１０．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、０．１×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ〜５．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、０．１×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ〜２．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、０．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ〜１．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、０．７×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ〜１．３×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、０．８×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ〜１．２×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、０．９×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ〜１．１×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬの濃度で製剤化され得る。
【０１２３】
本開示の組成物は、本開示の希釈剤を使用して、投与前に希釈され得る。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ２−構築物製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一である。いくつかの実施形態では、希釈剤は、ＡＡＶ２−構築物製剤の調製のために使用される製剤緩衝液と同一でない。
【０１２４】
表１に記載されるＡＡＶ２−構築物製剤を含む本開示の組成物は、１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬを含む注射のための懸濁液として製剤化され得る。プロトコルのために必要とされる場合、ＡＡＶ２−構築物製剤は、本開示の希釈剤を使用する投与の前に、クリニックにおいて（すなわち、医療専門家によって）希釈され得る。いくつかの実施形態では、この希釈剤は、ＡＡＶ２−構築物製剤の調製のために使用される同じ製剤緩衝液である。
【０１２５】
薬学的製剤
本開示の組成物は、原薬を含むことができる。いくつかの実施形態では、原薬は、ＡＡＶ２−構築物を含むか、またはＡＡＶ２−構築物からなる。いくつかの実施形態では、原薬は、ＡＡＶ２−構築物及び製剤緩衝液を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、０．００１％でのポロキサマー１８８と共に、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８で含む。
【０１２６】
賦形剤
本開示の組成物は、製剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、製剤は、原薬及び製剤緩衝液を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、製剤は、製剤緩衝液中で希釈された原薬を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、製剤は、製剤緩衝液中の最終製剤ＡＡＶ２−構築物ベクターゲノム（ｖｇ）濃度に希釈されたＡＡＶ２−構築物原薬を含むか、またはそれからなる。
【０１２７】
眼球製剤
本開示の組成物は、眼球の注射または注入のための最適濃度のＡＡＶ２−構築物原薬を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるように製剤化され得る。
【０１２８】
本開示の組成物は、本開示のＡＡＶの安定性を増加または増強する１つ以上の緩衝液を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、本開示のＡＡＶ２の安定性を確実にするか、または増強する１つ以上の緩衝液を含むことができる。代替的には、または加えて、本開示の組成物は、ＡＡＶ粒子凝集を防止するか、減少させるか、または最小化する１つ以上の緩衝液を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ＡＡＶ２粒子凝集を防止するか、減少させるか、または最小化する１つ以上の緩衝液を含むことができる。
【０１２９】
本開示の組成物は、中性またはわずかに塩基性のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、両端を含めて、７〜９の中性またはわずかに塩基性のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、約８のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、７．５〜８．５のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、７．７〜８．３のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、７．９〜８．１のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、８のｐＨを誘導または維持する１つ以上の構成要素を含む。
【０１３０】
本開示の組成物及び細胞の接触に続いて、ＡＡＶ２−構築物は、遺伝子またはその一部を発現し、遺伝子またはその一部によってコードされる生成物の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、細胞は、標的細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、網膜細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ニューロンである。いくつかの実施形態では、ニューロンは、視細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、またはインサイツである。細胞がインビボであるものを含む、いくつかの実施形態では、接触させることは、対象への組成物の投与に続いて起こる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２−構築物は、遺伝子またはその一部を発現し、遺伝子生成物の発現の治療上有効なレベルで、遺伝子またはその一部によってコードされる生成物の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子生成物は、タンパク質である。
【０１３１】
バッチ製剤
本開示の組成物は、両端を含めて、バッチあたり１〜１０００バイアルの規模で製造され得る。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり５０〜５００バイアルの規模で製造され得る。本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物、原薬、または製剤は、両端を含めて、バッチあたり１００〜４１５バイアルの規模で製造され得る。
【０１３２】
本開示の例示的なバッチは、両端を含めて、０．０１ｍＬ〜５ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のバッチは、両端を含めて、０．０１ｍＬ〜１ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のバッチは、両端を含めて、０．１ｍＬ〜１ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のバッチは、両端を含めて、０．１ｍＬ〜５ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のバッチは、両端を含めて、０．２５ｍＬ〜０．３５ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のバッチは、約０．３ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のバッチは、０．３ｍＬの本開示の組成物、原薬、または製剤を含むことができる。
【０１３３】
【表２】
2021520233.tif 000038
【０１３４】
製剤の調製のための本開示の方法のいくつかの実施形態では、原薬は＋３５±２℃で解凍され、必要とされる場合、滅菌製剤緩衝液中で標的濃度（１．０×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ）まで希釈される。
【０１３５】
本開示の組成物のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ２−構築物製剤の標的最終ＤＲＰ力価は１×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬであり、最小及び最大許容力価は、それぞれ０．８×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ及び１．５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬである。ＡＡＶ２−構築物製剤は、滅菌濾過され、バイアルあたり０．３ｍＬの体積でブロモブチルゴムストッパーを用いて３ｍＬの２Ｒ  Ｉ型ガラス製バイアルに充填される。次いで、バイアルは、凍結され、−６０℃以下で保管される。ＱＰ発表及び現場への流通の前のラベル付け及び保管のために、製剤は、認定された臨床販売業者に移される。製剤は、ＱＰ発表及び流通まで、温度監視された冷凍庫中で−６０℃以下で保管される。
【０１３６】
組成物の保管
組成物が製剤を含み、組成物が滅菌バイアル中に供給されるものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、ゼロ（℃）未満で保管され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、製剤の有効性または滅菌包装への完全性を失うことなく解凍及び凍結され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、製剤の有効性または滅菌包装への完全性を失うことなく、複数回の解凍及び凍結を受けることができる。
【０１３７】
組成物が製剤を含み、組成物が滅菌バイアル中に供給されるものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、組成物は、室温で保管され得る。
【０１３８】
有機材料
本開示の緩衝液及び培地の調製において使用される出発物質は、動物由来の材料を含まないことが証明されている。
【０１３９】
公定資料：表３を参照されたい。
【表３】
2021520233.tif 000039
【０１４０】
非公定資料：表４を参照されたい。
【表４−１】
2021520233.tif 000040
【表４−２】
2021520233.tif 000041
【０１４１】
動物由来の原材料
ウシ胎仔血清は動物由来である。これらの原材料の出所、製造業者、及び使用法が、表５に要約される。
【０１４２】
【表５】
2021520233.tif 000042
【０１４３】
フィルター及びクロマトグラフィーマトリックス
原薬及び製剤の濾過のために使用されるフィルターは、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ０．４５μｍ及び０．２μｍフィルターである。フィルターは、購入時に非滅菌であり、オートクレーブ処理によって契約製造業者での社内において滅菌される。それらは、３．２バールでのバブルポイント試験によって完全性を試験される。
【０１４４】
すべてのクロマトグラフィー材料は、使用前に解析証明書上で発表される。カラムは、プレパックされて購入され、使用前に消毒される。
【０１４５】
ＡＡＶ２−構築物製剤の製造の方法
「元のプロセス」（プロセス１）
ＡＡＶ２−構築物原薬についての例示的な製造プロセスの概要が、図８に示される。このプロセスに対応するフロー図が、図９及び１０に提供される。図８、９及び１０に記載される製造プロセスは、本明細書では「プロセス１」と呼ばれる場合がある。
【０１４６】
プロセス１への例示的な変更が、以下の表６に提供される。プロセス２のいくつかの実施形態は、表６に記載される変更を含むことができる。
【０１４７】
【表６】
2021520233.tif 000043
【０１４８】
プロセス１の最適化（上流プロセス）
プロセス１のための出発物質を、開発細胞バンク（ＤＣＢ）からのＨＥＫ２９３細胞の単一のバイアルから開始した。このＤＣＢを、ＡＴＣＣ  ＨＥＫ２９３細胞の単一のバイアルを使用して生成した。ＣＳ１０を使用してＨＥＫ２９３細胞を培養したが、この培養物の規模を１２のＣＳ１０から２４のＣＳ１０に増加させて、同時に実行されていた後のプロセス開発のために追加的な材料を生成した。手順は２×１２のＣＳ１０で形質導入の時点まで進行し、その時に、２４のＣＳ１０を、同じ操作の中で処理した。
【０１４９】
細胞培養容器及び原材料：表７は、２つの異なる製造プロセスのために使用される原材料の間の主要な差異を強調し、変更の何らかの重要性に関する注意を提供する。
【０１５０】
【表７】
2021520233.tif 000044
【０１５１】
細胞培養：改善されたプロセスのために使用される細胞の供給源は、ＤＣＢ  ＨＥＫ２９３細胞の単一のバイアルからのものであった。これは元のプロセスのバッチを生成するために使用された異なるバンクであり、ＡＴＣＣ細胞の同じ元の供給源であったが、培養の規模は増加し（１２のＣＳ１０から２４のＣＳ１０）、血清の異なる供給源が細胞増幅の間の細胞成長を支持するために使用されたため、この段階は、相応に適応された。改善されたプロセスの前培養細胞成長は、元のプロセスによって生成されたバッチについての１０継代と比較して、８継代を含んだ。加えて、継代後の細胞密度は、元のプロセスに従って可変であったが、改善されたプロセスに従って固定された。図８は、プロセスの細胞培養フェーズについて両方の部位の間の比較を示す。
【０１５２】
細胞成長を、細胞密度測定を使用して、元のプロセスと改善されたプロセスとの間で評価した。結果は、改善されたプロセスによって生成された細胞がより速く成長したことを示した。このことは、異なる血清源、及び／または改善されたプロセスの固定した播種密度に基づく細胞継代体制に潜在的に起因し得る。両方のプロセスについて、集団倍加時間は、細胞成長が安定すると、２０〜３０時間であることが示された（図１０）。
【０１５３】
表７に列挙される原材料（血清を除く）を利用するものを含む、プロセス２のいくつかの実施形態では、細胞培養及び／または細胞成長培地は、無血清培地を含むか、または無血清培地からなる。
【０１５４】
形質導入：改善されたプロセスの一部としての形質導入を、元のプロセスと同じ方法を使用して実行した。
【０１５５】
細胞収集：改善されたプロセスに従って、収集物を、元のプロセス（１×１２のＣＳ１０）を表すように、１２のＣＳ１０の２つの収集に分割した。収集に続いて、細胞を、ＰＡＮＤＡデバイスを使用して破砕し、ベクターの力価を測定した。改善されたプロセス中に使用されたＰＡＮＤＡデバイスは、元のプロセス中に使用された細胞破砕機とは異なる製造業者であったが（下の表８を参照されたい）、元のプロセスの細胞破砕機と同じ圧力で細胞溶解を実行する能力を有する（８０バール）。
【０１５６】
【表８】
2021520233.tif 000045
【０１５７】
上流処理後ベクター力価：１×１２のＣＳ１０（６．４×１０１５ＤＲＰ／バッチ）からの上流プロセスベクター材料の力価（改善されたプロセスに従う）は、同じ規模の上流プロセス（１．４４×１０１５ＤＲＰ／バッチ）から生成されたもの（元のプロセスに従う）に匹敵した。
【０１５８】
プロセス１の最適化（下流プロセス）
元のプロセスから改善されたプロセスに移された下流プロセスが、図１１に示される。
【０１５９】
実験材料及び原材料：可能な場合に、元のプロセスにおいて使用されるものと同じ機器、原材料、及び供給業者を、下流の「改善された」プロセスにおける使用のために選択した。
【０１６０】
下流の能力：個々のプロセス段階での観察結果は、以下に要約される。
【０１６１】
【表９】
2021520233.tif 000046
【０１６２】
【表１０】
2021520233.tif 000047
【０１６３】
【表１１】
2021520233.tif 000048
【０１６４】
【表１２】
2021520233.tif 000049
【０１６５】
【表１３】
2021520233.tif 000050
【０１６６】
ヘパリン透析、透析濾過及び濾過のステップ：生成物は、イオジキサノール勾配ステップから最終生成物まで透明で無色であった。予想外の観察は、これらのステップ中では明白でなかった。
【０１６７】
「改善されたプロセス」（プロセス２）
生成物のバッチは、ＡＡＶ２−構築物生物生成物を生成するプラスミドＤＮＡトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を含む２４のＣｏｒｎｉｎｇ  １０スタック容器からなる単一の生成キャンペーンから調製される。細胞塊及び細胞培養培地は、２４のＣｏｒｎｉｎｇ  １０スタック容器から収集及びプールされ、その後に１回の精製プロセスが続く。単一のキャンペーンから調製された生成物のバッチは、原薬の５×１０１３以上のウイルス粒子（ｖｐ、本明細書ではベクター粒子とも呼ばれる）を生成すると予想される。
【０１６８】
ＡＡＶ２構築物原薬についての例示的な製造プロセスの概要が、図１に示される。このプロセスに対応するフロー図が、図２に提供される。この例に記載される製造プロセスは、本明細書で「プロセス２」と呼ばれる場合がある。
【０１６９】
プロセス２のいくつかの実施形態では、２４のＣｏｒｎｉｎｇ  １０スタック容器から収集及びプールされた細胞培養培地は、無血清培地を含む。プロセス２のいくつかの実施形態では、２４のＣｏｒｎｉｎｇ  １０スタック容器から収集及びプールされた細胞培養培地は、無血清培地からなる。
【０１７０】
細胞増殖及びＣｏｒｎｉｎｇ細胞スタック播種
以下に提供される例示的な製造プロセスの発明を実施するための形態に対応する概略図については、図２を参照されたい。
【０１７１】
ステップ１：ＡＡＶ２−構築物原薬を生成するために使用される細胞の解凍及び播種。以下の温度、持続時間、スピン速度、及び体積は、使用される細胞型に依存して最適な結果のために調整され得る。以下に記載される例示的な実施形態について、条件を、ＨＥＫ２９３細胞の使用のために最適化した。
【０１７２】
ＨＥＫ２９３細胞の解凍及び１つのＴ７５フラスコ中への播種：ＨＥＫ２９３  ＭＣＢのバイアルは、３７±２℃で解凍される。細胞は、９ｍＬの低温成長培地（５％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ培地）を含む１５ｍＬのチューブに移される。バイアルは、１ｍＬの成長培地ですすがれる。懸濁液は４℃で５分間、３００ｇで遠心分離され、上清は廃棄され、細胞は１０ｍＬの予熱された成長培地に懸濁される。細胞密度は決定され、細胞懸濁液は、１０．５ｍＬの成長培地を含むＴ７５ｃｍ２フラスコに移されて、２０ｍＬの最終体積が得られる。Ｔ７５ｃｍ２フラスコは、加湿された４〜６％ＣＯ２雰囲気下で、３７±１℃のインキュベーターに移される。解凍２４±４時間後、成長培地は、２０ｍＬの予熱された成長培地に置き換えられる。
【０１７３】
ＨＥＫ２９３細胞の解凍及び１つのＴ７５フラスコ中への播種のステップのいくつかの実施形態では、細胞は、９ｍＬの低温成長培地を含む１５ｍＬのチューブに移される。いくつかの実施形態では、成長培地は、グリシン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−Ｈ２Ｏ、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、Ｌ−バリン、塩化コリン、Ｄ−パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、塩酸チアミン、ｉ−イノシトール、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水）、硝酸第二鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３”９Ｈ２Ｏ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）、及びＤ−グルコース（デキストロース）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、成長培地は、無血清培地を含むか、または無血清培地からなる。いくつかの実施形態では、成長培地は、清澄化された培地を含むか、または清澄化された培地からなる。
【０１７４】
ステップ２：ＡＡＶ２−構築物原薬を生成するために使用される細胞の増殖。以下の温度、持続時間、及び体積は、使用される細胞型に依存して最適な結果のために調整され得る。以下に記載される例示的な実施形態について、条件を、ＨＥＫ２９３細胞の使用のために最適化した。
【０１７５】
１つのＴ７５フラスコから１×Ｔ１７５ＣＢまたは３つのＴ７５フラスコへの増殖：培地は廃棄され、細胞は予熱したＰＢＳで洗浄される。細胞は、ＴｒｙｐＬＥ細胞解離試薬でほぐされる。Ｔフラスコまたは細胞スタックは、３７±１℃に設定されたインキュベーター中で５〜１０分間インキュベートされ、細胞は、容器を軽く叩くことによって完全に取り出される。成長培地は、ＴｒｙｐＬＥを阻害するために添加される。異なる支持物に対して使用される成長培地、ＰＢＳ、及びＴｒｙｐＬＥの量が、表１４に示される。次いで、すべての細胞懸濁液が、プールされる。
【０１７６】
【表１４】
2021520233.tif 000051
【０１７７】
細胞数及び細胞生存率は、決定され、細胞は、表１５に従って播種され、インキュベートされ、継代される。
【０１７８】
【表１５】
2021520233.tif 000052
【０１７９】
インプロセス制御（ＩＰＣ）：細胞数及び細胞生存率
【０１８０】
ステップ３：１つのＴ１７５ＣＢから４つのＴ１７５ＣＢまたは３つのＴ７５フラスコから４つのＴ１７５ＣＢへの増殖：ステップ２を参照されたい。
【０１８１】
ＩＰＣ：細胞数及び細胞生存率。
【０１８２】
ステップ４：４つのＴ１７５ＣＢから８つのＴ１７５ＣＢへの増殖：ステップ２を参照されたい。
【０１８３】
ＩＰＣ：細胞数及び細胞生存率。
【０１８４】
ステップ５：６つのＴ１７５ＣＢから３つのＣＳ２ＣＢへの増殖：ステップ２を参照されたい。
【０１８５】
ＩＰＣ：細胞数及び細胞生存率。
【０１８６】
ステップ６：２つのＣＳ２ＣＢから３つのＣＳ１０ＣＢへの増殖：ステップ２を参照されたい。
【０１８７】
ＩＰＣ：細胞数及び細胞生存率。
【０１８８】
ステップ７：２つのＣＳ１０ＣＢから８つのＣＳ１０ＣＢへの増殖：ステップ２を参照されたい。
【０１８９】
ＩＰＣ：細胞数及び細胞生存率。
【０１９０】
ステップ８：８つのＣＳ１０ＣＢから２４個のＣＳ１０ＣＢへの増殖。ステップ２を参照されたい。
【０１９１】
ＩＰＣ：細胞数及び細胞生存率
【０１９２】
プラスミドＤＮＡトランスフェクション
ステップ９：ＡＡＶ２−構築物原薬を生成するために使用される細胞のトランスフェクション。以下の温度、持続時間、スピン速度、及び体積は、使用される細胞型に依存して最適な結果のために調整され得る。以下に記載される例示的な実施形態について、条件を、ＨＥＫ２９３細胞の使用のために最適化した。
【０１９３】
ＨＥＫ２９３細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して３つのプラスミドでトランスフェクトされる。
【０１９４】
３つのプラスミド（ｐＡＡＶ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ−Ｋａｎ、ｐＨＥＬＰ−Ｋａｎ、及びｐＮＬＲｅｐ−Ｃａｐ２−Ｋａｎ）は、特定の比率を有する連続的方法で添加される。
【０１９５】
【表１６】
2021520233.tif 000053
【０１９６】
プラスミド及びＰＥＩは、成長培地で調製される。
【０１９７】
プラスミドＤＮＡの必要な量が、表１７に示される。
【０１９８】
【表１７】
2021520233.tif 000054
【０１９９】
必要な量のＰＥＩ混合物は、ＤＮＡ混合物に移されて、ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体を形成し、１０秒間振とうし、室温でインキュベートする。ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体は、８．２Ｌの成長培地に移される。成長培地及びＰＥＩ−ＤＮＡ複合体の混合物は均質化され、ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体ボトルはすすがれ、成長培地及びＰＥＩ−ＤＮＡ複合体の混合物は再び均質化される。培地はＣＳ１０ＣＢから排出され、２Ｌの成長培地／ＰＥＩ−ＤＮＡ複合混合物はＣＳ１０ＣＢに移される。トランスフェクトされたＣＳ１０ＣＢは、加湿された４〜６％ＣＯ２雰囲気下の３７±１℃に設定されたインキュベーター中に移される。
【０２００】
トランスフェクション混合物は細胞上に２４±１時間置かれ、次いで、培地はＤＭＥＭグルタマックスへ置き換えられる。
【０２０１】
ＩＰＣ：細胞数及び細胞生存率。
【０２０２】
ステップ１０：ＡＡＶ２−構築物原薬を生成するために使用される細胞の収集。以下の温度、持続時間、スピン速度、及び体積は、使用される細胞型に依存して最適な結果のために調整され得る。以下に記載される例示的な実施形態について、条件を、ＨＥＫ２９３細胞の使用のために最適化した。
【０２０３】
収集は、トランスフェクションの６０±１３時間後に行われる。
【０２０４】
生成物は、以下の手順によって収集される。
・培地の前半は、収集バッグに移される。
・ＣＳ１０ＣＢは振とうされ、残りの培地及び細胞は収集される。
・２００ｍＬのＨＢＳＳ−ＥＤＴＡは、ＣＳ１０ＣＢに移され、室温で１０分間インキュベートされる。
・インキュベーション時間の最後に、緩衝液は、収集バッグに排出される。
【０２０５】
この収集プロセスは、すべての容器で繰り返される。
【０２０６】
収集後、ＭｇＣｌ２  １Ｍは５ｍＭの最終濃度まで添加され、ベンゾナーゼは９０Ｕ／ｍＬの最終濃度まで添加される。
【０２０７】
ＩＰＣ：外来性ウイルス、バイオバーデン、マイコプラズマ、物理力価。
【０２０８】
ステップ１１：微小流動化溶解。
【０２０９】
ＰＡＮＤＡ破砕機は、最小３ＬのＴｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ８緩衝液で平衡化される。ベンゾナーゼで処理された収集物を含むバッグは、溶解アセンブリに接続される。生成物は、８０±１０バールの圧力でＰＡＮＤＡシステムに負荷され、新しいバッグに回収される。生成物を負荷した後、システムは、２×２００ｍＬのＴｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ８緩衝液ですすがれる。両方のリンスは、溶解生成物と共にプールされる。
【０２１０】
ＩＰＣ：物理力価
【０２１１】
ステップ１２：ベンゾナーゼインキュベーション。
【０２１２】
微小流動化された細胞は、ベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ活性について１８時間の最大持続時間、室温で一晩インキュベートされる。
【０２１３】
ステップ１３：凍結／解凍。
【０２１４】
最終的な溶解ステップは、細胞破片の凝集を促進し、清澄化ステップを促進するための、室温での一晩の解凍が後に続く、−１５〜−２５℃での凍結である。
【０２１５】
精製
ステップ１４：微小流動化された溶解物の清澄化。
【０２１６】
濾過プロセスは、バイオバーデン低減のためのフィルター（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２、０．２μｍ、０．２ｍ２）及びＴｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ  ｐＨ８フラッシング用緩衝液が後に続く、プレフィルター（Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ  ＧＦ  ０．６５μｍ  ０．４ｍ２）を利用する。
【０２１７】
ＩＰＣ：Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ、物理力価
【０２１８】
ステップ１５：大規模ＴＦＦ濃縮及び透析濾過。
【０２１９】
このプロセスは、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の原理を使用して、体積の低減及び初期精製を達成する。体積低減は、１００倍にもなり得る。塩及び界面活性剤の溶液（ＳＳＳ、４．１４Ｍ  ＮａＣｌ＋非イオン性界面活性剤）は、１／１０の溶解物重量を有する清澄化された溶解物に添加される。精製は、試料からより小さな分子量の不純物を「洗い流す」ための、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％の非イオン性界面活性剤を有する濃縮液の透析濾過（１００ｋＤａ）によって達成される。この部分は、タンパク質／ＡＡＶ粒子の沈殿を伴わずに高レベルの濃度を達成するために必要とされる。
【０２２０】
ＩＰＣ：物理力価、総粒子数（ＥＬＩＳＡ）、完全／空粒子比率。
【０２２１】
ステップ１６：イオジキサノール精製。
【０２２２】
このプロセスは、４層の不連続なイオジキサノール勾配を使用してｒＡＡＶを精製するように設計されている（１５％、２５％、４０％、５７％）。この直交精製ステップは、ＤＮＡを含むｒＡＡＶ粒子の調製を大幅に富化するが、一方で、超遠心分離に続くイオジキサノール勾配培地におけるこれらの粒子の示差的浮遊密度に基づいて、ＤＮＡを含まないｒＡＡＶ粒子（空の粒子）の大部分を除去する。ＤＮＡを含むｒＡＡＶの密度は、ｒＡＡＶの４０％イオジキサノール層への移動をもたらすが、一方で、混入している細胞タンパク質の大部分は、２５％／４０％界面に移動する。タンパク質及びＤＮＡを有するｒＡＡＶの凝集は、粒子の浮遊密度を変更できるため、１５％イオジキサノール層に１ＭのＮａＣｌを含めることは、この凝集が最小化する。
【０２２３】
分離は、超遠心分離において高いｇの力を受けるイオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ  ５７％溶液）の不連続勾配によって達成される。４０％の画分は、不純物バンドに到達するまで収集される（約３ｍＬ）。
【０２２４】
回収された画分は、プールされ、＋２／＋８℃で後の精製ステップまで保管される。
【０２２５】
ステップ１７：希釈。
【０２２６】
精製ステップの最後に得られた画分は、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＧＭＰロットＧ２１４／ＲＥＰ１／ＦＣ００１の精製のためにＴｒｉｓ  １０ｍＭ、ｐＨ９．０緩衝液で２０倍に希釈される。ＡＶＢアフィニティーによる精製については、精製（密度勾配）ステップの最後にプールされた画分は、ｐＨ８緩衝液で２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭ  ＮａＣｌで６倍に希釈される。
【０２２７】
ＩＰＣ：物理力価、総粒子数（ＥＬＩＳＡ）、完全／空粒子比率、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ。
【０２２８】
ステップ１８：陰イオン交換クロマトグラフィー。
【０２２９】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｖａｎｔａｇｅ  ＶＬ  １１×２５０カラムにおいてＴｒｉｓ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ  ｐＨ９を用いて１４ｍＬ／分の流量で充填されたＵｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｑ（ＵｎｏＱ）培地（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて室温で実行される（充填体積約９．５ｍＬ）。カラムは、第１にＴｒｉｓ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １Ｍ  ｐＨ９緩衝液で、第２にＴｒｉｓ  １０ｍＭ、ｐＨ９緩衝液で調整されて、ｐＨ９．０±０．２に等しいｐＨ及びＴｒｉｓ  １０ｍＭ、ｐＨ９．０導電率±１０％に等しい導電率が得られる。
【０２３０】
希釈された生成物は、Ｓａｒｔｏｓｃａｌｅ  ０．２μｍ  １７ｃｍ２フィルターを通じて濾過される。
【０２３１】
それはカラムに負荷され、カラムは平衡緩衝液ですすがれる。Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  ４５ｍＭ  ｐＨ９緩衝液での第２の洗浄後、生成物は、最小３０カラム体積のＴｒｉｓ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  ６５０ｍＭ  ｐＨ９緩衝液で溶出される。
【０２３２】
溶出した生成物は、＋２／＋８℃で次のステップまで保管される。
【０２３３】
ＩＰＣ：Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ、物理力価
【０２３４】
ＡＶＢセファロースアフィニティークロマトグラフィーを用いるステップ１８。
【０２３５】
アフィニティークロマトグラフィーは、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ  ｐＨ８緩衝液中に充填及びフラッシュされたＶａｎｔａｇｅ−Ｌ  ＶＬ２２ｘ２５０カラム（ベッド高さ８±１ｃｍ）に充填されたＡＶＢセファロースＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて室温で実行され、次いで、Ｈ３ＰＯ４  ０．１７Ｍ、ＮａＣｌ  １Ｍで３０分間消毒される。消毒に続いて、カラムは、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ  ｐＨ８中に希釈された生成物（ステップ１６からのプールされた画分）の負荷前に、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ  ｐＨ８緩衝液中で平衡化される。希釈した生成物は、カラム負荷前に、Ｓａｒｔｏｓｃａｌｅ  ０．２μｍ  １７ｃｍ２フィルターを通じて濾過される。負荷されると、カラムは、およそ３５カラム体積のＴｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ  ｐＨ８緩衝液で洗浄され、次いで、およそ２０カラム体積のＮａ２ＨＰＯ４  １０．８ｍＭ、クエン酸４４．６ｍＭ、ＮａＣｌ  ４００ｍＭ  ｐＨ２．６緩衝液で溶出される。溶出に続いて直ちに、溶出液は、およそ４カラム体積のＴｒｉｓ  １Ｍ  ｐＨ８緩衝液で中和される。
【０２３６】
溶出した生成物は、＋２／＋８℃で次のステップまで保管される。
【０２３７】
ＩＰＣ：Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ、物理力価
【０２３８】
ステップ１９：透析及び最終製剤。
【０２３９】
このプロセスは、所望の最終製剤緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのＮａＣｌ、任意選択で、０．００１％でのポロキサマー）中へＡＡＶ生成物を製剤化するために透析を利用する。
【０２４０】
溶出生成物のタンジェンシャルフロー濾過は、１００ｋＤａ分子量カットオフを有する中空線維カートリッジを使用して行われる（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）。カートリッジ及びシステムは、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ  ｐＨ８緩衝液で平衡化されて、透過液側でｐＨ８．０±０．２が得られる。
【０２４１】
生成物は、製剤緩衝液の最小６体積に対して連続モードでの透析濾過を行う前に、最小体積に濃縮される。濃縮液が、回収される。システムは、製剤緩衝液ですすがれる。このすすぎは、異なる容器に回収される。
【０２４２】
ＩＰＣ：物理力価。
【０２４３】
ステップ２０：精製されたバルク原薬のサブミクロン濾過。
【０２４４】
長期保管（６０日超）のために必要とされる場合、生成物は、０．２μｍフィルターを使用してサブミクロン濾過される。原薬が完全に濾過されたら、フィルターは、最終製剤緩衝液ですすがれる。
【０２４５】
ＱＣサンプリング後、精製されたバルク原薬は、−６０℃未満で保管される。
【０２４６】
原薬から製剤を作製する方法
本開示は、原薬（出発物質として）から製剤を作製するいくつかの例示的なプロセス／方法を提供する。これらの例示的な方法のうちの２つは、プロセス１（元のプロセス）及びプロセス２（改善されたプロセス）である。本明細書に記載されるように、プロセス２は、プロセス１に行われた変更及び／または改善を含む。
【０２４７】
プロセス１とプロセス２の両方は、原薬は、解凍され、希釈され、滅菌濾過されて、一次包装容器中に充填される。しかしながら、改善されたプロセス（プロセス２）は、元の手順に以下の変更を導入した（インプロセス制御は不変のままである）。
・室温から＋３５±２℃までの解凍温度の変化
・０．５ｍＬのポリプロピレン製クライオバイアルから３ｍＬのＩ型ガラス製バイアル及びブロモブチルゴムストッパーへの一次包装の変更
・０．１ｍＬ／バイアルから０．３ｍＬ／バイアルへの単一のバイアルあたりの充填サイズの変化
【０２４８】
本開示の組成物は、液体として供給され得る。組成物が製剤を含むものを含む、本開示の組成物のいくつかの実施形態では、製剤は、滅菌ガラス製バイアル中に供給される。いくつかの実施形態では、滅菌ガラス製バイアルは、滅菌透明ガラス製バイアルである。いくつかの実施形態では、滅菌ガラス製バイアルは、栓を有する蓋付きである。いくつかの実施形態では、栓はプラスチックである。いくつかの実施形態では、滅菌ガラス製バイアルは、蓋付きであり、オーバーシールでさらに封入される。
【０２４９】
製造プロセスの最適化
元の製造プロセス（プロセス１）の見直しに続いて、将来の臨床及び商業製品の質を改善する、及び／またはより頑健なプロセスを作製する機会を、プロセス２として特定及び実施した。着手されたプロセス開発活動は、（１）プロセス変更、（２）プロセス最適化の２つのカテゴリに分類される。プロセス開発戦略及び理論的根拠の概要が、表１８に示され、各カテゴリは、以下でより詳細に議論される。
【０２５０】
【表１８】
2021520233.tif 000055
【０２５１】
要約すると、プロセス２を生成するために、ＭＣＢが生成される細胞の供給源、３つのプラスミドの抗生物質選択遺伝子、上流処理ステップの規模、形質導入試薬、アフィニティークロマトグラフィーステップならびに最終生成物の容器及び閉鎖を、変更した。
【０２５２】
ＨＥＫ２９３マスター細胞バンク
プロセス１：第１の臨床バッチを生成するために使用されるＭＣＢを、ＡＡＶ２生成に最適化された細胞から生成した。細胞がどのように最適化されたか、及び動物由来の材料への曝露の両方の観点において、この細胞株の歴史のトレーサビリティは限られている。
【０２５３】
プロセス１への変更：ＡＴＣＣに寄託されたＨＥＫ２９３細胞の元のバイアル（プロセス１が生成された前駆細胞バンク）を使用して、新しいＧＭＰ  ＭＣＢの製造を開始した。現在特徴付け及び試験されているこのＭＣＢは、臨床ＡＡＶベクター製造を支持するために使用され、商業製造のために使用され得る。細胞継代数、使用した材料、従った方法、及び実行した細胞バンク特徴付けの完全なトレーサビリティは、製品の質、トレーサビリティ、及び安全性という増加した安心を提供する。その後、機能する細胞バンクを、適正製造規範（ＧＭＰ）の条件下でＧＭＰ  ＭＣＢの単一バイアルから生成して、ＧＭＰ  ＷＣＢを形成する。現在特徴付け及び試験されているこのＷＣＢは、商業製造のために使用され得る。細胞継代数、使用した材料、従った方法、及び実行した細胞バンク特徴付けの完全なトレーサビリティは、製品の質、トレーサビリティ、及び安全性という増加した安心を提供する。
【０２５４】
ＡＴＣＣ調達のＨＥＫ２９３細胞を、定義されたプロトコルに従って比較可能性について評価し、それによって、ゲノム力価によって評価されるベクター産生を、元のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ細胞からのものと直接比較した。ベクター力価を、低継代及び高継代の両方を含む、同等の継代限界での細胞から、三重かつ同時に評価した。細胞を、成長動態及び生存率についても評価した。加えて、細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ベクターで処理して、形質導入有効性を評価した。
【０２５５】
ＡＴＣＣ調達の細胞を、元の臨床バッチと同じバッチ製造プロトコルに従って、プラスミド変更（以下を参照されたい）と組み合わせて完全規模の非ＧＭＰ操作実行の一部としても評価した。このバッチを、インプロセス制御試験、バルク収集、原薬及び製剤試験（バイオバーデン、エンドトキシン、滅菌性及び外来性物質に対するこれらの試験を除く）の完全パネルに対して試験し、以前に臨床バッチ（元のプロセス）から得られた同じ試験結果に対して比較した。
【０２５６】
ＡＴＣＣ  ＨＥＫ２９３細胞の適合性が確立されると、ＧＭＰ  ＭＣＢを、調製し、外来性媒介物、同一性、純度、及び安全性について完全に試験した。ＧＭＰ  ＭＣＢは、後のＧＭＰ製造のためにＱＡ発表された。
【０２５７】
ベクタープラスミド
プロセス１：プラスミド生成中の選択のために使用される、アンピシリン抵抗性をコードする遺伝子を含むＡＡＶ２−構築物ベクターを生成するために使用される３つのプラスミド構築物。β−ラクタム抗生物質であるアンピシリンは、ＡＡＶ２−構築物ベクターの製造プロセスにおいて使用されないが、ＡｍｐＲの除去は、プラスミド生成プロセスからＡＡＶ２−構築物生成プロセスへの残存アンピシリンのいかなるキャリーオーバーの可能性を回避するためにも好ましく、アンピシリン抵抗性をコードする遺伝子が最終包装生成物に存在する可能性を除去する。
【０２５８】
プロセス１への変更：各プラスミドを、アンピシリン抵抗性遺伝子をカナマイシン抵抗性をコードする遺伝子へ置き換えるために、改変した。プラスミドバックボーンの残りは変更されなかった。プラスミド製造中に、プラスミド選択のために使用されたアンピシリンは、ＡＡＶ２−構築物製造プロセス中にキャリーオーバーされ、β−ラクタム抗生物質への感受性を有する患者に対する潜在的なリスクを提起する場合がある。加えて、プラスミド材料からのアンピシリン抵抗性遺伝子の存在は、最後には最終ベクター生成物へと包装され、理論的に抗生物質抵抗性をレシピエントに付与するか、または移すことができる。いずれかのリスクの可能性は低いと見なされるが、可能な場合、β−ラクタムの使用は回避するべきであることが、理解される。したがって、生成物の安全性プロファイルは、ＡｍｐＲをＫａｎＲに置き換えることによって改善された。
【０２５９】
新しいプラスミドを完全に配列決定し、この配列決定は、抵抗性遺伝子のみが変化したという確認を提供した。
【０２６０】
新しいプラスミドを使用してＡＡＶ２−構築物生成を評価する比較可能性研究を、定義されたプロトコルに従って行った。ＡｍｐＲ（古い）とＫａｎＲ（新しい）のプラスミドの両方を使用して、ＨＥＫ２９３細胞を同時にトランスフェクトし、ベクター産生を、ゲノム力価を評価することによって比較した。三重試験を実行し、ベクター力価の比較を報告した。
【０２６１】
許容力価の実証に続いて、改変されたプラスミドを、元の臨床バッチと同じバッチ製造プロトコルに従って、細胞の変更（上記で詳述された）と組み合わせて、完全規模の非ＧＭＰ生成実行の一部としても評価した。バッチを、バルク収集、原薬、及び製剤の試験（バイオバーデン、エンドトキシン、滅菌性及び外来性物質に対するこれらの試験を除く）の完全パネルに対して試験し、臨床バッチ（元のプロセス）から得られた同じ試験結果に対して比較した。この技術的実行からのデータが生成され、許容されると見なされると、ＧＭＰ生成物製造における使用に好適なプラスミドの製造を、実施した。
【０２６２】
ヘパリンクロマトグラフィー
プロセス１：アフィニティークロマトグラフィーカラムを、ＡＡＶ２−構築物を選択的に精製するために使用した。カラム内で使用される動物由来マトリックス（例えば、ヘパリン）は、ヒト治療用生成物の製造における使用に好適なＧＭＰ材料として供給され得る。動物由来マトリックスの供給源、製造、供給は、ＧＭＰ及びヒトの使用の観点から認められているが、ウイルス安全性リスクは、動物由来の原材料の使用と共に残っている。
【０２６３】
プロセス１への変更：代替的な、非動物由来のクロマトグラフィーマトリックスを、動物由来マトリックス（例えば、ヘパリン）で充填された現在のアフィニティーカラムの置き換えのために、検討した。最初にイオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用して、改善されたプロセスに従って動物由来マトリックスを第１のＧＭＰバッチに置き換え、その後、非動物由来のアフィニティークロマトグラフィー樹脂を導入した。この変更を、動物由来の原材料に関連するバイオセーフティリスクの低減を達成するために実施した。
【０２６４】
異なるクロマトグラフィーマトリックスを評価し、適合性は、最終生成物の純度／不純物プロファイル、力価、及び効力に基づいていた。
【０２６５】
最終生成物容器及び容器閉鎖
元のプロセス：製剤を、バイアルあたり０．１ｍＬの体積で、０．５ｍＬの滅菌ポリプロピレン製スクリューキャップ付きガスケット付きバイアル中に充填した。
【０２６６】
プロセス１への変更：ブロモブチルストッパー及び圧着（不正開封防止）バイアルオーバーシール閉鎖を有する、１型ホウケイ酸ガラス製注射バイアル中への０．３ｍＬの製剤の充填。この変更を、最終製剤の改善された完全性、使用中の改善された封じ込め、材料に接触する一次容器生成物の改善された薬学的許容性、目視検査の容易性及び安全性（不正開封防止オーバーシールによって提供されるセキュリティ）を達成するために実施した。
【０２６７】
ガラス製バイアル中の製剤の適合性の評価を、生成物回復及び生成物安定性によって実行した。
【０２６８】
上流プロセスステップのスケールアップ
プロセス１：ＨＥＫ２９３  ＭＣＢの単一のバイアルの、連続継代を通じた１２の１０層細胞スタックへの拡張及びスケールアップ。
【０２６９】
プロセス１への変更：ＨＥＫ２９３  ＭＣＢの単一のバイアルの、連続継代を通じた２４の１０層細胞スタックへの拡張及びスケールアップ。この変更を、試験及び充填仕上げのための増加した原薬体積と同様に、インプロセス試験及び制御のための追加的な材料を可能にする上流プロセスの増加した規模を達成するために実施した。さらに、この変更を、製剤の可用性を増加させるために実施した。
【０２７０】
細胞生存率、成長速度及び細胞収量の解析を評価して、最適及び一貫した能力を決定した。
【０２７１】
プロセス最適化
元の製造プロセスからの多くのプロセスステップは、物理的及び化学的定義の観点において不変のままであった。しかしながら、それらを、プロセスの理解及び特徴付けを改善し、プロセスの一貫性及び頑健性の観点から最適なプロセス能力を確実にするために、さらに評価した。
【０２７２】
ＨＥＫ２９３細胞培養物及び増殖
プロセス１：ＨＥＫ２９３  ＭＣＢの単一のバイアルの、連続継代を通じた１２の１０層細胞工場への拡張及びスケールアップ。
【０２７３】
プロセスの最適化：１２のＣＳ１０から２４のＣＳ１０への細胞培養規模の変更と同時に、播種密度を最適化し、最適な細胞培養能力についての成長動態を評価するための研究を、実行した。操作上（非プロセス）の変更を最適化して、プロセスの一貫性及び頑健性を確実にするためのプロセスステップの制御及び再現性を改善した。具体的には、プロセスのこの側面を最適化して、収量を改善するために１２のＣＳ１０から２４のＣＳ１０に増加させた。
【０２７４】
細胞生存率、成長速度及び細胞収量の解析を実行して、最適及び一貫した能力を決定した。
【０２７５】
プラスミド三重トランスフェクション及び収集
プロセス１：ＨＥＫ２９３細胞の３つのプラスミドトランスフェクションを、細胞のクロロキン前処理に続くリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿によって実行した。
【０２７６】
プロセス最適化：細胞播種条件、リン酸カルシウムとポリエチレンイミンとの比較を含む、トランスフェクションを最適化する。プラスミド濃度／比率を最適化する。培地の交換及び収集のためのトランスフェクション後の最適な日を決定する。操作上（非プロセス）の変更を最適化して、プロセスの一貫性及び頑健性を確実にするためのプロセスステップの制御及び再現性を改善した。クロロキンを、安全性を改善するためプロセスから除去した。
【０２７７】
細胞播種密度、細胞成長用培地、ＦＢＳ濃度、ＤＮＡ：ＰＥＩ比率を含む、さらなる最適化を、小規模で実行した。最適化されたトランスフェクションプロセスが確立されると、プロセスを、ＰＥＩを使用して完全規模で実行し、リン酸カルシウムを使用する同じプロセスと比較して比較可能性を実証した。
【０２７８】
細胞破砕のための微小流動化
プロセス１：このプロセスは、マイクロフルイダイザーを使用して細胞内ウイルスを放出するために、細胞の機械的溶解を使用する。
【０２７９】
プロセス最適化：このプロセスステップへの変更は、実行されなかった。ＧＭＰの製造及び封じ込めに好適なサニタリーマイクロフルイダイザーを使用した操作条件の最適化及び定義に焦点を当てた開発研究。操作上（非プロセス）の変更を実施して、プロセスの一貫性及び頑健性を確実にするためのプロセスステップの制御及び再現性を改善し、プロセスの理解及び特徴付けを改善した。生成物純度及びベクター力価についてのインプロセス制御試験の一貫性を決定した。
【０２８０】
密度勾配超遠心分離
プロセス１：プロセスの不純物を低減するための密度勾配精製。
【０２８１】
プロセス最適化：現在の勾配精製方法が手動であるため、それがプロセス変動に寄与し得る可能性がある。精製方法の原則は不変のままであるが、このプロセスステップをより頑健及び半自動化されたようにする機会を、評価した。操作上（非プロセス）の変更を実施して、プロセスの一貫性及び頑健性を確実にするためのプロセスステップの制御及び再現性を改善し、プロセスの理解及び特徴付けを改善した。生成物純度及びベクター力価の試験の一貫性を、決定した。
【０２８２】
限外濾過（ＵＦ）／透析濾過（ＤＦ）
プロセス１：ＵＦ／ＤＦ及び透析を通じた緩衝液交換。
【０２８３】
プロセス最適化：ＵＦ／ＤＦ及び透析を通じた緩衝液交換を伴う各プロセスステップを、生成物の質に対する接触材料の許容性を確実にするのと同様に、重大なプロセスパラメータを確立するために最適化した。この変更を、プロセスの一貫性及び頑健性を確保し、プロセスの理解及び特徴付けを改善し、生成物接触材料の適合性を確実にするために実施した。ウイルス収量及び不純物プロファイルを、評価した。
【０２８４】
プラスミドコードされた抗生物質抵抗性における切り替え
治療用構築物を発現するＡＡＶ２−構築物臨床ベクターは、３つのプラスミド、治療用構築物／導入遺伝子及び逆方向末端反復配列を有するプロモーターを含むベクタープラスミド、ＡＡＶ２−Ｒｅｐ及びＣａｐ配列を含むＡＡＶヘルパープラスミド、ならびに最後に必須のアデノウイルス遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡをコードするヘルパープラスミドを利用した一過性形質導入プラットフォームを介して生成される。元のプロセスに従って作成されたＡＡＶ２−構築物臨床ベクターの作成のために使用された３つすべてのプラスミドには、アンピシリン（Ａｍｐ）選択マーカーを含んだ。残存アンピシリンへの患者の感受性及び最終ベクターへのＡｍｐＲ遺伝子の理論的転移に及ぶ懸念を回避するために、プラスミドを、Ａｍｐ選択マーカー配列をカナマイシン（Ｋａｎ）抵抗性配列に交換するように再操作した。完全な配列決定を実行して、残りのプラスミドバックボーンが３つのプラスミドすべてについて同じであることを確認した。これらのプラスミドを、小規模インビトロ研究においてｒＡＡＶを産生する際のそれらの収量能力について評価して、ｃＧＭＰ生成における使用のためのそれらの適合性を確立した。プラスミドのこの実験的解析は、ＡＡＶ２−構築物臨床ベクターの産生のために以前に使用されたプラスミドからなる対照との収量の直接比較を介したものであり、以下に記載される。プラスミドの適合性が小規模インビトロ研究において確認されると、ＫａｎＲプラスミドを、完全規模の非ＧＭＰプロセスにおいて評価した。
【０２８５】
マスター細胞バンク細胞株の変化
元のプロセスからのＡＡＶ２−構築物臨床ベクターの産生は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅを通じて市販されるＨＥＫ２９３細胞株からＧＭＰ施設（元のプロセス１）によって誘導、試験、及び預けられたＨＥＫ２９３細胞株を利用した。この細胞バンクを、完全に試験し、特徴付けたが、細胞バンクの完全な文書化された履歴は、利用可能でなかった。ＨＥＫ２９３細胞の完全なトレーサビリティを確実にするために、新しい細胞を、ＡＴＣＣから調達し、元のプロセス１細胞に対する比較可能性について評価し、ＧＭＰ  ＭＣＢ生成のために使用した。３つの細胞株（２つのＨＥＫ２９３細胞株及び１つの２９３Ｔ細胞株）を、以下のパラメータの直接比較でスクリーニングして、ＡＡＶ２−構築物ベクターの産生のために最適な細胞株を決定した：１）ＡＡＶベースのｅＧＦＰプラスミドを使用したＧＦＰ平均蛍光強度及びＧＦＰパーセントを介した一般的な形質導入効率、２）ＤＲＰ（ＤＮａｓｅ抵抗性粒子）解析を介したＡＡＶ２−構築物の収量を評価するＡＡＶ２−構築物生成物に対する特異的形質導入効率、３）細胞数及び生存細胞のパーセントによる成長動態、ならびに４）形質導入効率を後の継代での細胞と比較するための、収量及び形質導入効率についての継続的な継代及び再試験。
【０２８６】
ＡＡＶ２精製クロマトグラフィーの改善された頑健性
元の第１／２フェーズにおける動物由来（例えば、ヘパリン）アフィニティーカラムステップ製造プロセスを、非動物由来イオン交換（ＡＥＸ）カラム、ＵｎｏＱに置き換えて、安全上の懸念（動物由来マトリックスからの外来性汚染物質の可能性）を改善した。図２は、主要なプロセスステップ及び最終的なカラムクロマトグラフィーステップ（ステップ１８）を強調するプロセスのフロー図を示す。最終のＵｎｏＱ精製ステップの前に、低塩分希釈ステップは、導電率を低減させ、カラムへの効率的なＡＡＶ２−構築物結合を支持する。この段階の成功する能力のための許容される塩濃度（導電率）の範囲は、非常に狭いことが実証された。導電率が高すぎる場合、生成物は、ＡＥＸカラムに結合せず、フロースルーにおいて失われた。導電率が低すぎる場合、生成物は、凝集し、精製中の生成物の喪失をもたらす場合がある。このことは、生成物の収量及び濃度、結果としてバッチの成功に影響を与えた−低収量バッチは、臨床研究を支持するために必要とされる材料の観点において生存可能でないだろう。しかしながら、この改善されたプロセスを使用した非臨床ＡＡＶ２−構築物バッチ及びＧＭＰバッチの成功した生成によって実証されるように、ＵｎｏＱステップは、生成物の有効性または安全性にいかなる悪影響も及ぼさなかった。
【０２８７】
ＡＥＸの前に必要とされる狭い塩の範囲に対処するために、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅからの代替的な非動物由来のアフィニティークロマトグラフィーカラム、ＡＶＢセファロースを評価した。以下に記載されるように、生成物の比較可能性の維持を確実にするための包括的な開発フェーズに続いて、アフィニティーカラム（動物由来マトリックスを有する）を、後のＧＭＰバッチの製造のためにＡＶＢに置き換えた。
【０２８８】
ＡＶＢセファロースは、高い純度及び収量生成を可能にするための、ＡＡＶ２精製において使用されるアデノ随伴ウイルスに対する親和性を有するアフィニティー培地である。アフィニティーリガンドは、酵母において発現した一本鎖抗体からの１４ｋＤａ断片である。ＡＶＢカラムは、ＡＡＶ２−構築物の良好な結合及び溶出を可能にし、高塩分（導電率）において実行され得る。したがって、ＡＶＢカラムは、生成物の喪失を最小化する頑健なプロセスステップを表す。ＡＶＢは非動物由来であるため、その使用は、外来性汚染物質による安全性へのリスクを提起しない。
【０２８９】
本開示の原薬の制御
例示的な原薬は、表１９に列挙される試験によって特徴付けられる。
【０２９０】
【表１９】
2021520233.tif 000056
【０２９１】
解析手順
物理力価：ゲノム力価は、ｑＰＣＲを使用して決定される。この方法は、ゲノムのコピー数の定量化を可能にする。ベクターストックの試料は、緩衝液中で希釈される。試料はＤＮａｓｅ処理され、ウイルスキャプシドはプロテイナーゼＫで溶解されてゲノムＤＮＡを放出する。次いで、希釈系列が、作製される。各試料の複製物は、ＣＡＧ配列に対して特異的なＴａｑｍａｎベースのプライマー／プローブセットを使用するｑＰＣＲに供される。標準曲線は、標準プラスミド希釈系列の線形範囲において各点の平均を取ることと、各点についての平均ＣＴ値に対して対数コピー数をプロットすることと、によって生成される。ｒＡＡＶベクターの力価は、標準曲線から計算され得、ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）／ｍＬとして表される。
【０２９２】
感染単位（ＩＵ）力価：このアッセイは、ＡＡＶの感染性粒子の数を定量化する。定量化は、ＲＣ３２細胞（ＨｅＬａ発現ＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐ）に、段階希釈のベクター試料と均一濃度の野生型アデノウイルスとを感染させて、ヘルパー機能を提供することによって実行される。感染の数日後、細胞は、ＤＮａｓｅ及びプロテイナーゼＫ消化が省略され、かつｑＰＣＲ部分のみが実行されることを除いて、上記の物理力価アッセイに記載されたのと同じ方法で、ＰＣＲ阻害剤を低減するために溶解希釈され、ｑＰＣＲによってアッセイされる。個々のウェルは、ＡＡＶ増幅に対して陽性または陰性としてスコアリングされる。スコアリングされたウェルは、Ｋａｒｂｅｒ法を使用してＩＵ／ｍＬでのＴＣＩＤ５０を決定するために使用される。
【０２９３】
総粒子：アッセイはＥＬＩＳＡ技法（ＡＡＶ２タイトレーションＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ）を使用する。組み立てられたＡＡＶ２キャプシド上のコンフォメーションエピトープに対して特異的なモノクローナル抗体は、マイクロタイターストリップ上にコーティングされ、検体からのＡＡＶ２粒子を捕捉するために使用される。捕捉されたＡＡＶ粒子は、２つのステップで検出される。第１に、ＡＡＶ２に対するビオチン共役モノクローナル抗体は、免疫複合体に結合する。第２のステップでは、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートは、ビオチン分子と反応する。基質溶液の添加は、特異的に結合したウイルス粒子の量に比例する呈色反応をもたらす。吸光度は、４５０ｎｍで測光的に測定される。
【０２９４】
完全：空比率（透過型電子顕微鏡法）：ＡＡＶ２粒子の完全：空比率は、陰性染色透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用して決定され得る。試料は、固定されたグリッドに適用される。試料は、透過型電子顕微鏡を使用して視覚化され、完全な（すなわち、ＤＮＡを含む）及び空のＡＡＶ２キャプシド粒子の計数は、それらの形態に基づいて実行される。完全：空粒子の比率は、粒子数から計算される。
【０２９５】
完全：空比率（解析用超遠心分離）：ＡＡＶ２粒子の完全：空比率は、解析用超遠心分離（ＡＵＣ）を使用して決定され得る。ＡＵＣは、非破壊的である他の方法よりも有利であり、すなわち、試料は、追加的な試験のためにＡＵＣに続いて回収され得る。空及び完全なＡＡＶ２粒子を含む試料は、超遠心分離中にＡＡＶ２がそれを通じて移動する液体組成物に適用される。１つ以上のＡＡＶ２粒子の沈降速度の測定は、ＡＡＶ粒子のサイズ及び形状に関する流体力学的情報を提供する。沈降平衡の尺度は、ＡＡＶ２粒子の溶液モル質量、化学量論、会合定数、及び溶液の非理想性に関する熱力学的情報を提供する。ＡＵＣ中に取得される例示的な測定は、放射状濃度分布、または「スキャン」である。いくつかの実施形態では、スキャンは、数分（速度沈降について）から数時間（平衡沈降について）の範囲に及ぶ間隔で取得される。本開示の方法のスキャンは、光学測定（例えば、吸光度、干渉及び／または蛍光）を含むことができる。超遠心分離速度は、両端を含めて、毎分１０，０００回転（ｒｐｍ）〜７５，０００ｒｐｍの範囲であり得る。完全なＡＡＶ２粒子及び空のＡＡＶ２粒子はＡＵＣによる明確な測定を実証し、試料の完全／空比率はこの方法を使用して決定され得る。
【０２９６】
ベクター同一性（ＤＮＡ）：このアッセイは、ウイルスＤＮＡ配列の確認を提供する。このアッセイは、ウイルスキャプシドを消化することと、ウイルスＤＮＡを精製することと、によって実行される。ＤＮＡは、可能な場合には、順方向と逆方向の両方で最小２倍の範囲で配列決定される（いくつかの領域、例えば、ＩＴＲは、配列決定するのに問題がある）。ＤＮＡ配列決定コンティグは、同一性を確認するために、予想される配列と比較される。
【０２９７】
総タンパク質：このアッセイは、Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡキットを使用して、試験品に存在するタンパク質の総量を定量化する。製剤緩衝液のマトリックス作用を排除するために、試料はアセトンで沈殿され、沈殿したタンパク質は解析前に等量の水に再懸濁される。タンパク質濃度決定は、試験品または希釈された試験品をキットに提供されるＭｉｃｒｏ−ＢＣＡ試薬と混合することにより実行される。同じことが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準の希釈液を使用して実行される。混合物は６０℃でインキュベートされ、吸光度は５６２ｎｍで測定される。標準曲線は、直線回帰適合を使用して標準吸光度及び既知の濃度から生成される。未知の試料は、直線回帰に従って定量化される。
【０２９８】
純度：このアッセイは、ＡＡＶ純度の半定量的測定を提供する。ＡＡＶ２キャプシド粒子ＥＬＩＳＡの結果に基づいて、試料はＳｐｅｅｄＶａｃによって濃縮され、４×１０＾１０または１×１０＾１１粒子のいずれかは負荷され、キャプシドタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離される。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ染色ゲルのデンシトメトリー解析は、キャプシドタンパク質（Ｖｐ１、Ｖｐ２、及びＶｐ３）に対するおよその不純物レベルの計算を可能にする。
【０２９９】
増殖型ＡＡＶ：試験品は、野生型アデノウイルスの存在下または非存在下でＨＥＫ２９３細胞を形質導入するために使用される。細胞増幅の３回の連続ラウンドが行われ、全ゲノムＤＮＡは各増幅ステップで抽出される。
【０３００】
ｒｃＡＡＶ２は、リアルタイム定量的ＰＣＲによって検出される。２つの配列は単離されたゲノムＤＮＡである。１つはＡＡＶ２  Ｒｅｐ遺伝子に特異的であり、１つはＨＥＫ２９３細胞（ヒトアルブミン）の内因性遺伝子に特異的である。細胞あたりのＲｅｐ遺伝子の相対コピー数は、決定される。陽性対照は、単独で、またはｒＡＡＶベクター調製物の存在下で試験された野生型ＡＡＶウイルス血清型２である。
【０３０１】
アッセイの検出限界は、各試験されたバッチについて検証される。検出限界は、１×１０＾８、または１×１０＾１０ゲノムコピーの試験試料あたり、１０  ｒｃＡＡＶである。試験試料がＲｅｐ配列に対して陰性である場合、この試料の結果は、次のように報告されるであろう：ＮＯ  ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、１×１０＾８（または１×１０＾１０）ゲノムコピーの試験試料あたり１０  ｒｃＡＡＶ未満。試験試料がＲｅｐ配列に対して陽性である場合、この試料の結果は、ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮのように報告されるであろう。
【０３０２】
ＨＥＫ２９３宿主細胞タンパク質：ＨＥＫ２９３宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）アッセイは、免疫酵素アッセイである。精製されたウイルスの試料は、アフィニティ精製された捕捉抗体でコーティングされたマイクロタイターストリップ中で反応する。二次的ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役酵素は、同時に反応し、固相抗体−ＨＣＰ−酵素標識抗体のサンドイッチ複合体の形成をもたらす。マイクロタイターストリップは、未結合の反応物を除去するために洗浄される。ＨＥＫ２９３  ＨＣＰの量は、ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼの各ウェルへの添加によって検出される。加水分解された基質の量は、プレートリーダー上で読み取られ、存在するＨＥＫ２９３  ＨＣＰの濃度に正比例する。
【０３０３】
総ＤＮＡ：Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ試薬は、二本鎖ＤＮＡに結合し、高発光複合体（λ励起＝４８０ｎｍ−λ発光＝５２０ｎｍ）を形成する超高感度蛍光核酸染色剤である。この蛍光発光強度は、溶液中のｄｓＤＮＡ量に比例する。既知の濃度を有するＤＮＡ標準曲線を使用すると、試験試料におけるＤＮＡ含有量は、測定された蛍光を変換することによって取得される。
【０３０４】
ＨＥＫ２９３宿主細胞ＤＮＡ：元のプロセスは３つの異なるアンプリコンのサイズ及び量を測定したが、改善されたプロセスは高分子量及び断片化されたＤＮＡを含む総ｈｃＤＮＡを測定する。改善されたプロセスからの資格認定データは、アッセイが特異的であり、１０ｎｇ／用量未満の用量あたりのｈｃＤＮＡを評価する要件を満たすのに十分な感度があることを実証する（ＷＨＯ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，２０１３）。
【０３０５】
残存ＢＳＡ：残存ＢＳＡは、Ｂｅｔｈｙｌによって製造及び販売される市販のＥＬＩＳＡキットを使用して定量化される。ＥＬＩＳＡキットの科学的原理は、宿主細胞タンパク質ＥＬＩＳＡについて指定されたものと非常に類似している。
【０３０６】
残存ベンゾナーゼ：このアッセイは、ベンゾナーゼエンドヌクレアーゼに特異的な精製されたポリクローナル抗体を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって試験試料中の残存ベンゾナーゼを検出する。正確な測定は、試料のシグナルを、同時にアッセイされたベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ標準と比較することによって達成される。
【０３０７】
バイオバーデンアッセイ：この手順は、試料に存在するバイオバーデンの量を定量的に（検出可能な場合）決定するために使用される。使用される方法は、試料の半分の２つの膜の各々に対する膜濾過を伴う。膜は、２０〜２５℃及び３０〜３５℃で順次好気性及び嫌気性条件でインキュベートされる別々の寒天培地プレート上に置かれる。インキュベーションの終わりに、好気性菌、嫌気性菌、及び真菌の計数は、試料のＣＦＵ／ｍＬとして表される。
【０３０８】
エンドトキシンアッセイ：このアッセイは、細菌性エンドトキシンが試験品に存在するかどうかを決定するために使用される。定量的手順は、速度論的発色法によって実行される。既知の量のエンドトキシンは、細菌性エンドトキシンのレベルの正確な決定のために、試験品と並行して試験される。試験品による干渉の可能性は、試験品に加えＬＡＬ試薬を特定のレベルのエンドトキシンでスパイクさせることにより検査される。阻害／増強試験に続いて、試験品のエンドトキシン含有量が、測定される。
【０３０９】
残存ＡＶＢ：残存ＡＶＢ解析は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって製造される、商業的ＥＬＩＳＡキット、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＶＢセファロースＨＰリガンド漏出ＥＬＩＳＡを使用して実行される。サンドイッチＥＬＩＳＡの原理は、試料に存在するＡＶＢを捕捉するために、抗アフィニティーリガンドポリクローナルヤギ抗体でマイクロタイタープレートをコーティングすることを伴う。検出は、ビオチン化アフィニティ精製抗ＡＶＢリガンドポリクローナルヤギ抗体と、ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートと、を介する。試料中の残存ＡＶＢの濃度は、標準曲線に対する測定によって決定される。
【０３１０】
ＡＡＶ組成物の安定性
本開示の組成物は、−６０℃未満で保管される際に長期安定性を維持する。例えば、本開示の組成物は、両端を含めて、−８０℃〜４０℃の温度（およそヒトの体温）で保管される際に、長期安定性を維持する。例えば、本開示の組成物は、両端を含めて、−８０℃〜５℃の温度で保管される際に、長期安定性を維持する。例えば、本開示の組成物は、−８０℃、−２０℃または５℃で保管される際に、長期安定性を維持する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、液体または懸濁液として製剤化され、１つ以上の容器（例えば、バイアル）中に等分され、−６０℃未満で保管される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、液体または懸濁液として製剤化され、１つ以上の容器（例えば、バイアル）中に等分され、−８０℃、−２０℃または５℃で保管される。
【０３１１】
本開示の組成物は、−６０℃未満で保管される際に長期安定性を維持するために、最適な表面積対体積比率を有する容器に提供され得る。本開示の組成物は、−８０℃、−２０℃または５℃で保管される際に長期安定性を維持するために、最適な表面積対体積比率を有する容器に提供され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、液体または懸濁液として製剤化され、１つ以上の容器（例えば、バイアル）中に等分され、すべての保管要件が考慮される際に、表面積対体積比率が可能な限り大きな１つ以上の容器に保管される。
【０３１２】
本開示の組成物は、周囲相対湿度で保管される際に、長期安定性を維持する。
【０３１３】
臨床用量デザイン
コロイデレミア（ＣＨＭ）は、１９世紀に初めて記載された遺伝性Ｘ連鎖性網膜ジストロフィーである。ＲＥＰ１をコードするＣＨＭ遺伝子の欠失または変異は、脈絡膜、ＲＰＥ及び網膜の変性につながる。コロイデレミアは、罹患した男性における進行性脈絡網膜変性と、保因者女性における穏やかな徴候と、によって特徴付けられる。罹患した男性の症状は、夜盲症から周辺視野喪失に発展し、中心視力は晩年まで保存される場合がある。保因者の女性は一般的に無症候性であるが、脈絡網膜変性の徴候は慎重な眼底検査で観察され得る。これらの徴候は、２０年後により容易に明らかになる。
【０３１４】
ＣＨＭは、ＲＥＰ１と呼ばれるＲａｂゲラニル−ゲラニル−トランスフェラーゼの構成要素ＡをコードするＣＨＭ遺伝子（Ｘｑ２１）の変異によって引き起こされる。ＲＥＰ１は、細胞内トラフィッキングのために必要とされ、したがって正常な網膜機能に必須である。ＣＨＭ患者の場合のようにＲＥＰ１が欠損している場合、網膜色素上皮、視細胞、及び脈絡膜の機能及び萎縮の漸進的喪失があり、最終的に失明につながる。本開示の薬学的組成物の開発前は、ＣＨＭのために利用可能な治療はなかった。
【０３１５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用する網膜遺伝子療法投与は、生涯にわたり作用を与え得る単回用量の計算を伴う。伝統的な全身性薬物投与では、薬物の半減期は血中で測定され、このことは１日を通して投与される反復投与の頻度を決定し、そのため、ピークレベルは非毒性であり、トラフレベルは薬力学的活性を維持するのに十分である。伝統的な投与レジメンでは、健康なボランティアを使用して薬物クリアランスを計算し、したがって薬物の半減期を計算し、それにより投与の用量及び頻度を計算するために必要とされる血漿レベルを推定することが可能である。調整は行われ得る−例えば、投与は、肝不全の場合、肝臓によって代謝される薬物について低減され得る。小児の場合、投与は、少量の血液量及び標的臓器を認識する体重に従って調整され得る。投与量を能動的に漸増させるこれらの伝統的な方法は、眼科遺伝子療法投与に伴う課題を示すが、それは、本開示の薬学的組成物の治療及び使用の方法の好ましい実施形態において、治療の目的が、生涯にわたる治療効果を達成するであろう１回の用量のみを与えることだからである。
【０３１６】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、薬学的組成物は、網膜下注射を介して目に投与され、ＲＰＥ及び視細胞細胞層を標的とする。網膜下注射のための外科的手順の一部として、硝子体切除術は、網膜下拒絶反応の前に、治療される目に対して実行される。この硝子体切除術の後に、平衡塩溶液の網膜下注入が続いて、半球状の濾過胞を形成する。本開示のいくつかの実施形態では、半球状の濾過胞はおよそ１０ｍｍ２の面積であるか、または半球状の濾過胞は、１０ｍｍ２の面積である。本開示のいくつかの実施形態では、本開示の薬学的組成物は、０．１ｍＬの最終体積で製剤化され、事前形成された濾過胞中に注射され、薬学的組成物が網膜表面全体（例えば、１０ｍｍ２の網膜表面全体にわたる）にそれ自体で均一に分布することを可能にする。したがって、薬学的組成物がその中に注射され得る半球状の濾過胞が形成される実施形態では、濾過胞は、網膜のＲＰＥ細胞層全体にわたる組成物の完全なｒＡＡＶの均一な分布を促進する。薬学的組成物の注射に続いて、濾過胞は、手術後数時間以内に解消する。
【０３１７】
硝子体切除術／網膜下手術の潜在的な合併症は、手術直後に低減する視力（ＶＡ）である。別の潜在的かつ長期的な合併症は、白内障の形成である。これらの要因の両方は、ＶＡ試験が実行される際に視力に影響を与え、したがって、これらの要因は、用量範囲のアウトカムを決定する際に、特に、ＶＡが有効な用量決定の唯一の予測因子である際に考慮される。
【０３１８】
遺伝子療法治験において適切な用量を選択することは、用量範囲を評価する伝統的な方法とは異なる。目標は、安全であることが知られている、可能な最高の効果的用量を投与することである。この理由は、主に、網膜視細胞についての感染多重度（ＭＯＩ）が網膜細胞あたり１０５ゲノム粒子（ｇｐ）のオーダーで非常に高いという事実によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、かつ治療されている個々の対象の生物学に応じて、治療され得る網膜の最大面積はおよそ１０ｍｍ２であり、治療可能である網膜の領域が黄斑周辺であるとすると、この領域における桿体、錐体、及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の数はおよそ１×１０６の細胞であり、研究における（実施例１３に記載される）低用量コホート（１０１０ｇｐ）は１×１０４ｇｐのみのＭＯＩを提供するが、同じ研究における高用量群（１０１１ｇｐ）は１×１０５ｇｐのＭＯＩを提供する。
【０３１９】
第Ｉ／ＩＩ相のデータが、実施例１３に提供される。この研究の高用量（１０１１ｇｐ）は、安全かつ効果的であることが示されている。ある特定の実施形態では、ステロイド療法レジメンは、薬学的組成物のＡＡＶに対する対象の任意の免疫応答に対処するために使用され得る。実施例１３に記載されるように、本開示の薬学的組成物の１０１１ｇｐの用量は、１０５ｇｐの好ましい範囲中のＭＯＩをもたらす。
【０３２０】
コロイデレミアにおける治療用量を評価する
測定するための１つのパラメータは、視覚機能の改善である。このことは、視覚機能パラメータが、遺伝的欠陥によって悪影響を受けており、したがってある程度可逆的であり得ることを仮定しており、そのため、改善は、成功する遺伝子導入に続いて測定され得る。ＣＨＭを治療する方法のいくつかの実施形態では、視力（ＶＡ）、網膜感度及び暗順応視力の測定を含むがこれらに限定されない視覚機能パラメータが、測定される。しかしながら、いくつかの対象について、欠損の重症度及び変性の段階に応じて、上記の視覚機能パラメータのうちのいくつかは、正常であると見なされ得る。本開示の治療の方法のいくつかの実施形態では、対象の視覚機能パラメータは治療に続いて改善し、改善は、健康な対象（ＣＨＭを有しない者）及び治療を受けなかった者から得られたそれらの測定値に等しい視覚機能パラメータ測定値をもたらす。いくつかの実施形態では、健康な対象は、例えば、ＣＨＭと独立している自然な加齢に伴う視力低下を説明するための、同齢の個人である。さらに、男性及び女性はそれらの色覚視力において異なる場合があるため、いくつかの実施形態では、健康な対象は、同じＸＹ染色体組成を有する個人である。対象が既に顕著な網膜損傷（神経喪失）を経験しているか、あるいは網膜の無影響領域が小さい、及び／または不連続である実施形態を含む、本開示の治療の方法のいくつかの実施形態では、視覚機能の完全な回復は、予想され得ない。部分的回復のみが可能である実施形態では、改善が対象のベースライン機能（薬学的組成物の投与前に、この対象において、かつ治療された眼において評価される機能）と比較される際に、視覚機能の改善は、明らかであり得る。部分的な回復のみが可能である実施形態においてさえ、治療は、目のベースライン機能及び対象の視覚機能を高め、そのため、ＣＨＭ及び／または加齢に伴う網膜変性は遅延または低減され、それにより対象についての有用な視力の寿命が延長される。
【０３２１】
標的ゾーンにおける網膜細胞の解剖学的密度
インビボでの臨床治療についてのＭＯＩを計算するために、治療される区域におけるベクター粒子の総数及び標的細胞の数が、決定される。これらの数は、ベクターに曝露された網膜の領域と、その区域における異なる細胞型の各々の密度と、に依存する。
【０３２２】
本開示の薬学的組成物は、誘発された網膜剥離に続く網膜下注射を介してＣＨＭ患者に投与される。例えば、網膜剥離が約２〜３の円盤直径の直線寸法であると仮定すると、網膜剥離のこの領域は、３〜４ｍｍの直径、またはおよそ１０ｍｍ２の領域を有する円に等価である。
【０３２３】
本開示は、例示的な用量計算のための例示的な細胞密度を提供するが、本開示の薬学的組成物の用量は、これらの例示的な計算によって拘束されない。中央の黄斑では、正常なヒト対象におけるＲＰＥ細胞の密度は、１ｍｍ２あたり５，０００細胞である（４０〜５０歳の年齢群の患者における死後研究に基づく）。中央の黄斑では、正常なヒト対象における桿体細胞の密度は、１ｍｍ２あたり７５，０００細胞であるが、およそ０．５ｍｍ２の中央の中心窩領域は除く。中央の黄斑では、正常なヒト対象における錐体細胞の密度は、中央の０．５ｍｍ２の中心窩において１ｍｍ２あたり１５０，０００（合計７５，０００）であり、加えて、中心窩領域外の黄斑において１ｍｍ２あたり２５，０００である。したがって、これらの例示的な細胞密度に基づく本開示のいくつかの実施形態では、標準の１０ｍｍ２の剥離における本開示の薬学的組成物のｒＡＡＶに曝露される３つの細胞型の各々の総数は、上記から以下のように計算され得る：（ａ）ＲＰＥ：１ｍｍ２あたり５，０００細胞−合計＝１０ｍｍ２において５×１０４；（ｂ）桿体：１ｍｍ２あたり７５，０００細胞、ただし中央の０．５ｍｍ２中心窩を除く−合計＝１０ｍｍ２において７．１×１０５；及び（ｃ）錐体：中央の０．５ｍｍ２中心窩（７５，０００）において１ｍｍ２あたり１５０，０００細胞、ただし中心窩外１ｍｍ２あたり２５，０００細胞のみ−合計＝１０ｍｍ２において３．１×１０５。ＲＰＥ、桿体及び錐体の密度は、黄斑の中央の１０ｍｍ２において異なり、約１対数単位で変動し、最低密度（したがって最高ＭＯＩ）がＲＰＥに関連して見られる。
略語のリスト
【表Ａ−１】
2021520233.tif 000057
【表Ａ−２】
2021520233.tif 000058
【表Ａ−３】
2021520233.tif 000059
【表Ａ−４】
2021520233.tif 000060
【実施例】
【０３２４】
実施例１：元のプロセス及び改善されたプロセスからの比較解析試験データ
元のプロセスからの試料は、改善されたプロセスのデータ解析における使用のために提供され、そのため、別段明記されていない限り、データは、生成されたデータの直接相対比較を可能にする同じ方法（該当する場合）を使用して、バッチの両方のセットから生成され得る。以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０３２５】
改善されたプロセスによって生成された中間生成物を、物理力価（ｑＰＣＲ）、総タンパク質（Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡ）、総ＤＮＡ（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ）及び純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ染色）について解析した。
【０３２６】
元のプロセスからの試料についてのゲノム力価データを、提供された試験文書から取得した。
【０３２７】
明細書に示される元のインプロセス中間試料からの総タンパク質及び総ＤＮＡデータを、元のプロセスから生成された出発物質からの改善されたプロセスに従って生成した。
【０３２８】
完全対空粒子比率の決定のために使用される電子顕微鏡法（ＥＭ）解析は、プロセスが元のプロセスから改善されたプロセスに移された時には完全に確立されていなかった。元のプロセスは、精製（密度勾配）ステップを評価するため、または最終製剤を測定するためのいずれかの、臨床バッチ内の完全対空粒子の比率を決定するための製造時のいかなる試験も伴わず、したがって、改善されたプロセスからの精製（密度勾配）プロセスステップの元のプロセスからのものとの比較のためのデータは、利用可能でなかった。したがって、完全対空粒子比率を、比較可能性の評価として使用しなかった。代わりに、ｑＰＣＲによって測定された物理力価（またはゲノム粒子）の決定は、プロセス全体の成功した転移及び個々のプロセスステップの成功した転移の好適な決定と見なされたが、このことは、ベクター生成物に固有であり、したがって、完全なキャプシドを表すためである。しかしながら、元のプロセスについては、解析用超遠心分離（ＡＵＣ）に基づく方法を使用して、完全対空比率を情報のみについて評価した。この試験の結果を表３３に示した。
【０３２９】
ＥＭは、好ましい方法であり、これまでに製造されたすべてのバッチに対して実行されている。追加的に、ＥＭ解析を後ろ向きに使用して、完全対空比率の理解を得るために元のプロセスからの両方のバッチを試験した。この試験は、改善されたプロセスが表２０に示されるように完全対空キャプシドの同等の比率を生成することができることを実証している。
【０３３０】
【表２０】
2021520233.tif 000061
【０３３１】
出発物質及び参照物質（元のプロセスからの両方）からの解析結果が、表２１に要約される。
【０３３２】
【表２１】
2021520233.tif 000062
【０３３３】
改善されたプロセスによって生成された収集材料は、元のプロセスによって生成された収集材料よりも高い総タンパク質濃度を含んだ。しかしながら、最終原薬の純度プロファイルは、元のプロセスと改善されたプロセスとの間で類似しており、主要な不純物は検出されなかった。元のプロセスと改善されたプロセスとの間の力価回復も、類似していた。
【０３３４】
プロセスの成功した技術移転のために定義された合格判定基準に関して、改善されたプロセスは制御され、改善されたプロセスの個々のプロセスステップの能力は、元のプロセス中に観察されたものと類似していた。改善されたプロセスからのプロセス回復（ベクター力価）は、元のプロセスで得られたものの２０％以内であった。改善されたプロセスからの最終生成物純度（ＤＮＡ／タンパク質含有量）は、同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを有する元のプロセスによって得られたものの２０％以内にあった。
【０３３５】
実施例２：製造プロセスの最適化
以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０３３６】
プラスミド三重トランスフェクション及び収集
プロセス１：ＨＥＫ２９３細胞の３つのプラスミドトランスフェクションを、細胞のクロロキン前処理に続くリン酸カルシウムＤＮＡ沈殿によって実行した。
【０３３７】
プロセス最適化：細胞播種条件、リン酸カルシウムとポリエチレンイミンとの比較を含む、トランスフェクションを最適化する。プラスミド濃度／比率を最適化する。培地の交換及び収集のためのトランスフェクション後の最適な日を決定する。操作上（非プロセス）の変更を最適化して、プロセスの一貫性及び頑健性を確実にするためのプロセスステップの制御及び再現性を改善した。クロロキンを、安全性を改善するためプロセスから除去した。
【０３３８】
ベクター力価収量の解析を、実行した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション試薬をリン酸カルシウム（プロセス１のために使用される）と比較して、前者が、より頑健なトランスフェクション試薬としてリン酸カルシウムを置き換えるために使用され得るかどうかを決定した。クロロキンを用いた前処理についての要件も、評価した。すべてのパラメータを、検証されていない方法を使用するｑＰＣＲにより物理力価を決定することによって評価した。
【０３３９】
表２２は、ＰＥＩでのトランスフェクションに続くベクターの力価が、クロロキンの存在下及び非存在下の両方でリン酸カルシウムを使用して得られた力価と直接比較された、最初の結果を示す。すべての研究を、すべての上流プロセスステップのために使用される培地である、グルタマックスを含むＤＭＥＭ培地を用いて実行した。
【０３４０】
【表２２】
2021520233.tif 000063
【０３４１】
この研究は、ＰＥＩを使用する成功した形質導入を実証したが、物理力価の結果は、リン酸カルシウムを使用したトランスフェクションと比較される際により低くなる。この研究は、ＰＥＩがトランスフェクション試薬として使用される際に、クロロキン前処理は、必要とされず、プロセスから除去され得ることも示した。
【０３４２】
この結果に基づいて、細胞播種密度、細胞成長用培地、ＦＢＳ濃度、ＤＮＡ：ＰＥＩ比率を含む、さらなる最適化を、小規模で実行した。最適化されたトランスフェクションプロセスが確立されていると、プロセスを、ＰＥＩを使用して完全規模で実行し、リン酸カルシウムを使用した同じプロセスと比較して、比較可能性を実証した。
【０３４３】
表２３は、完全規模の製造から得られたデータを示しており、トランスフェクション試薬としてのＰＥＩの適合性及び比較可能性を実証する。このデータに基づいて、ＰＥＩを、リン酸カルシウムと比較される際により頑健なプロセスステップを可能にするために、特別なトランスフェクション試薬として選択した。
【０３４４】
【表２３】
2021520233.tif 000064
【０３４５】
さらに、改善されたプロセスによって生成されるバッチの全体的な生産性及びプロセス収量は、元のプロセス（表２４）によって生成されるものに匹敵し、トランスフェクション試薬としてのＰＥＩの適合性を実証する。
【０３４６】
【表２４】
2021520233.tif 000065
【０３４７】
実施例３：プラスミドコードされた抗生物質抵抗性における切り替え−ＡｍｐＲからＫａｎＲへ
以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０３４８】
研究材料及び手順
元のプロセスによって生成された臨床バッチの生成のために使用されたアンピシリン含有プラスミドは、ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）／ｃｍ２の観点におけるＡＡＶ２構築物ベクターの解析のための対照として機能した。実験を、同じ細胞解凍事象から実行し、すべての細胞は、実験を通して同じ処理、培地、試薬及び成長条件を受けた。
【０３４９】
試験されたプラスミド：ｐＡＡＶ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ（ＫＡＮ）；ｐＮＬＲＥＰ−ＣＡＰ２（ＫＡＮ）；ｐＨＥＬＰ（ＫＡＮ）；ｐＡＡＶ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ、ＣＮ１０５５ＣＭ（元のプロセス；Ａｍｐバージョン、対照として使用された）；ｐＮＬＲＥＰ−ＣＡＰ２、ＣＮ１０５４ＣＭ（元のプロセス；Ａｍｐバージョン、対照として使用された）、ｐＨＥＬＰ、ＣＮ２２９１ＣＭ（元のプロセス；Ａｍｐバージョン、対照として使用された）。
【０３５０】
三重試験を、プラスミドの各セットについて実行した。３つの１−スタックを、ｐＡＡＶ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ（ＫＡＮ）、ｐＮＬＲＥＰ−ＣＡＰ２（ＫＡＮ）及びｐＨＥＬＰ（ＫＡＮ）でトランスフェクトした。３つの１−スタックを、等価なＡｍｐＲ含有プラスミドでトランスフェクトした。細胞を形質導入後１６〜２６時間で再フィードし、培地及び細胞を形質導入後４４〜５２時間で収集し、ＤＲＰの収量を決定された各１−スタックについて決定した。
【０３５１】
結果
平均ＤＲＰ／ｃｍ２を、ｑＰＣＲを介して試験された３つの複製物の間で決定した。培地及び細胞溶解物の両方からの収量を、別々に解析し、次いで、添加して複製あたりの総ベクター収量を決定し、次いで、それを平方センチメートルの数で除した。
【０３５２】
【表２５】
2021520233.tif 000066
【０３５３】
原薬及び製剤の製造のために使用される再操作された（Ｋａｎ）プラスミドに対する合格判定基準を、対照プラスミドの収量の４倍以上であるとして定義した。再クローニングされたＫａｎバージョンのプラスミドは、合格判定基準を満たした。得られたＤＲＰの同様の収量と配列確認とに基づいて、ＫａｎＲ含有プラスミドは、ＡＡＶ２−構築物の臨床バッチの製造に好適であると見なされる。
【０３５４】
実施例４：マスター細胞バンク細胞株のＡＴＣＣ  ＨＥＫ−２９３への変更
以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０３５５】
研究材料及び手順
元のプロセスによるＧＭＰバッチの生成のために使用された元のプロセス１細胞株は、ＡＡＶ２−構築物ベクターのトランスフェクション効率及び収量に対する対照として機能した。収量及びトランスフェクション効率についての継続的な継代及び再試験は、以前に評価されておらず、それは、元のプロセス１が細胞を使用し、試験は情報のみのためであったことによる。トランスフェクション効率、収量解析、及び成長動態についての実験を、同じ細胞解凍事象（複数可）から実行し、すべての細胞は、スクリーニング実験を通して同じ処理、培地、試薬、及び成長条件を受けた。
【０３５６】
試験した細胞株：ＡＴＣＣ＝［ＨＥＫ−２９３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３ＴＭ）、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ＝２９３細胞（Ｇ９５００１  ２）、プロセス１細胞株、及び２９３Ｔ＝２９３Ｔ／１７［ＨＥＫ  ２９３Ｔ／１７］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−ｌ  １２６８ＴＭ）。注目すべきことに、２９３Ｔ細胞株は代替供給源として含まれていた。
【０３５７】
トランスフェクション効率及び収量解析のために、各細胞株の単層を、関連するプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクション後１６〜２６時間で再フィードした。ＧＦＰまたはＡＡＶ２−構築物ＤＲＰ解析のための細胞及び培地の収集を、形質導入後４４〜５２時間で行った。
【０３５８】
成長動態を、Ｔ１７５フラスコに１０＾７または２．５×１０＾６細胞／フラスコのいずれかで播種することによって評価し、播種後１、２、３、４及び７日目に細胞の健康、コンフルエンシー、細胞数及び生存率を、記録した。このことを、１５以上の継代で繰り返した。
【０３５９】
結果
平均蛍光強度：平均蛍光強度を、フローサイトメトリーを介して解析して、ウイルス収量との相関における全体的な遺伝子発現の指標としてトランスフェクトされた細胞の数と結びついたＧＦＰタンパク質発現のレベルを測定した。
【０３６０】
【表２６】
2021520233.tif 000067
【０３６１】
ＧＦＰのパーセント：フローサイトメトリーによって決定されたＧＦＰ陽性細胞の百分率が、図１３及び１４に示される。
【０３６２】
ＡＡＶ２−構築物収量解析：ＤＲＰ力価アッセイ結果を、ｑＰＣＲ解析あたり各処理（１−スタック）について、収集された細胞及び培地におけるＡＡＶ２−構築物収量の直接比較解析のために生成した。
【０３６３】
細胞株が臨床製造における使用に好適であるという合格判定基準を、処理あたりの対照（元のプロセス１細胞）の４倍以下の差異であると見なされた。実験１（Ｅｘｐ１）を細胞継代７で行い、実験２（Ｅｘｐ２）を継代１５で行った。
【０３６４】
【表２７】
2021520233.tif 000068
【０３６５】
成長動態：成長動態を、播種後１、２、３、４及び７日目に、２つの密度で同時に播種されたＴ１７５フラスコの細胞数及び生存率を記録することによって評価した。各実験は、連続した継代上の２つの複製からなった。実験１を、継代７で行い、解凍からの継代８で繰り返した。実験２を、継代１５で行い、解凍からの継代１６で繰り返した。生存細胞の量及び百分率を、トリパンブルー染色によって決定した。
【０３６６】
【表２８−１】
2021520233.tif 000069
【表２８−２】
2021520233.tif 000070
【表２８−３】
2021520233.tif 000071
【０３６７】
４つすべての細胞株は、相関する収量解析に対する以前の経験に基づいて、良好な形質導入効率について予想されるものと一致するレベルで、ＧＦＰを発現した。ＡＴＣＣからの２つの細胞株であるＨＥＫ２９３（ＣＲＬ−１５７３）及び２９３Ｔ（ＣＲＬ−１１２６８）は、解凍から良好な細胞成長及び増殖を示した。注目すべきは、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ細胞株が、より乏しい全体的な細胞の健康を伴う、他の細胞株及び対照に対してより緩徐な初期の成長及び増殖を有したことである。また、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ細胞株は、ＡＴＣＣ細胞株の両方が最小合格判定基準内に収まる両方の実験について、対照の４倍以内に収まるという合格判定基準も満たすことができなかった。
【０３６８】
ＡＡＶ２−構築物ベクターのさらなる生成のために、ＡＴＣＣ細胞株ＨＥＫ２９３（ＣＲＬ−１５７３）を、本開示の製造プロセスの例示的な実施形態について上に示された結果に基づいて選択した。
【０３６９】
実施例５：製造プロセスの解析開発
以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０３７０】
元のプロセスから改善された製造プロセスに移すための戦略の一部として、解析戦略を、並行して開発した。可能な場合、元のプロセスのために開発された方法は、改善されたプロセスまたは次世代プロセスに移された。
【０３７１】
【表２９−１】
2021520233.tif 000072
【表２９−２】
2021520233.tif 000073
【表２９−３】
2021520233.tif 000074
【０３７２】
元のｒｃＡＡＶアッセイ及び改善されたｒｃＡＡＶアッセイは、対照としてＡＡＶ２−構築物または野生型（ｗｔ）ＡＡＶの希釈液に感染したヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）を利用する。次いで、細胞は、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）に同時感染して、ｒｃＡＡＶ（存在する場合）のためにヘルパー機能を提供する。最大の細胞変性効果（ＣＰＥ）で、細胞は溶解する。このことは、ベクターの継代０（Ｐ０）の最後を構成する。継代１（増幅１）では、Ｐ０溶解物の一部は、Ａｄ５に同時感染したか、またはＡｄ５を伴わずに同時感染したＨＥＫ２９３細胞に接種するために使用される。Ａｄ５を有しない細胞は、細胞中へのＤＮＡの入力レベルを決定するのに役立つが、一方で、Ａｄ５を有する細胞は、ｒｃＡＡＶ２−構築物、または対照の場合はｗｔ  ＡＡＶの増幅を可能にする。元のアッセイでは、Ａｄ５陽性試料が第１の増幅後に最大ＣＰＥに達する際に、細胞は、ＰＣＲによって解析される。改善されたアッセイでは、細胞溶解／増幅ステップは、ＰＣＲ解析の前に合計３回実行される。
【０３７３】
アッセイは、改善されたプロセスの限界試験として検証されている。元の臨床バッチも操作バッチのいずれもこの検証の一部として解析されず、そのため、得られた結果の直接比較は、可能でない。元のアッセイは、検証されてない。結論として、２つの方法は、顕著に異ならない結果を提供する。
【０３７４】
元のプロセス及び改善されたプロセス両方からのｈｃＤＮＡ測定は、Ｔａｑｍａｎ装置上でｑＰＣＲを使用する。元のアッセイは、各アンプリコンについて２０ｐｇ／ｍＬの感度（ＬＯＤ）で３つの異なるアンプリコン（１０２、４０１及び７６５ｂｐ）を測定した。改善されたプロセスによって使用されるアッセイは、単一のアンプリコン及び１．３１５６ｎｇ／ｍＬの感度（ＬＯＱ）を有する。方法の直接比較を行わなかったが、ｈｃＤＮＡ方法は、その後、認定され、目的に適合していることが実証された。したがって、比較可能性評価に対する悪影響はない。
【０３７５】
残存ＢＳＡを、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの市販のＥＬＩＳＡキット、カタログ番号Ｅ１０−１１３を使用して元のプロセスによって測定した。元のプロセスにおいて使用されたこのキットの感度は、１２．６ｎｇ／ｍＬであった。市販のＥＬＩＳＡキット、Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号８１００が、改善されたプロセスにおいて使用される。このキットは検証されていないが、感度は最低のキャリブレーション標準、すなわち、１ｎｇ／ｍＬとして定義される。両方のキットで使用される一次抗体の製造業者は、一次抗体がヒトＢＳＡの検出に対して特異的であることを断定する。方法の直接比較を行わなかった。しかしながら、データに対して試験されたすべてのバッチは、非常に低いレベルの残存ＢＳＡ（方法の感度未満）を実証した。
【０３７６】
したがって、すべてのバッチは比較的低いレベルの残存ＢＳＡを含むことが結論付けられた。
【０３７７】
加えて、ＢＳＡはヒトにおいてアレルギー反応を引き起こす場合があるため、世界保健機関（ＷＨＯ）は、ワクチン用量あたり５０ｎｇ以下の残存ＢＳＡのガイダンスを設定している。例えば、１００μＬのＡＡＶ２−構築物の用量について、ＢＳＡの濃度限界は、５００ｎｇ／ｍＬであろう。元のプロセス及び改善されたプロセスにおいて使用される両方のＥＬＩＳＡキットアッセイは、この必要とされる限界未満の感度のレベルを有し、したがって、許容される限界内の残存ＢＳＡを測定する際に同等と見なされる。
【０３７８】
感染力価
感染力価アッセイを、元のプロセスから改善されたプロセスに移した。アッセイの細胞培養部分及びＰＣＲの両方を、元のプロセスにおいて使用された手順に従って、この転移の一部として実行した。ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）（元のプロセスによる）を、アッセイ転移中に３回解析し、得られた結果を、２．９０×１０１０ＩＵ／ｍＬの感染力価と比較した。得られたデータが、表３０に提供される。
【０３７９】
【表３０】
2021520233.tif 000075
【０３８０】
アッセイ転移研究から得られたデータは、顕著に異ならず、すなわち、元のプロセスから得られた結果の４倍の範囲内にある。
【０３８１】
元のプロセスによって生成されたＡＡＶ−構築物（非ＧＭＰ）を、改善されたプロセスに従って３回解析し、結果は、報告された力価（４．９５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ）（元のプロセス）に対して表３１に提供される。データを、元のプロセスに従って報告された結果の３倍の範囲内にあれば、許容されると見なした。
【０３８２】
【表３１】
2021520233.tif 000076
【０３８３】
その後、アッセイは検証され、表３２における追加的な値を、ＡＡＶ−構築物（非ＧＭＰ）（元のプロセスから）材料（１０００及び１０，０００の希釈結果のみ）から得た。
【０３８４】
【表３２】
2021520233.tif 000077
【０３８５】
ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）材料（元のプロセスから）は、方法の継続した同等の能力を確実にするための名目力価（４．９５×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬ）（元のプロセスによって決定される）から３倍の差異内として設定される、システム適合性合格判定基準を有する内部標準対照（一次標準）として、ＤＳ及びＤＰ試料解析において日常的に解析される。
【０３８６】
実施例６：改善されたプロセスによって生成される組成物の比較
以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０３８７】
変更プロセス変更／最適化（プロセス２を生成するためのプロセス１）が、生成されたベクター材料の重大な品質属性に影響を与えていないことを実証するために、比較可能性評価を、実行した。
【０３８８】
プロセス変更が、細胞、プラスミド、トランスフェクション条件、アフィニティークロマトグラフィーカラム、規模及び最終容器に行われ、最適化作業がプロセス１に関して完了すると、臨床フェーズ３材料の新しい製造プロセスを定義し、完全規模の「操作」バッチを実行して、プロセス能力と、原薬及び製剤の元のプロセスによって生成された材料に対する等価性と、を測定した。
【０３８９】
以下の解析は、改善されたプロセスからの完全規模の操作バッチ及びＧＭＰバッチから生成されたデータを、元のプロセスによって生成された操作バッチ及び臨床材料と比較する。
【０３９０】
追加的な試験が実行されて（以下の表３３を参照）、改善されたプロセスによって生成された操作バッチとの比較のための情報を提供する、元のプロセス（ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ））によって生成された操作バッチ。
【０３９１】
【表３３−１】
2021520233.tif 000078
【表３３−２】
2021520233.tif 000079
【表３３−３】
2021520233.tif 000080
【０３９２】
追加的な解析情報及びデータ
物理力価：充填された製剤臨床材料（ＧＭＰ生成物）に対する目標物理力価は、１×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬであった（元のプロセスによって生成される）。元のプロセス（非ＧＭＰ生成物）によって製造された操作バッチについて、目標力価はなく、ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）は、このバッチが製剤に進行した場合、目標の充填濃度に希釈されるであろう原薬を表した。改善されたプロセスによって生成されたＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）について、目標濃度は、１〜２×１０＾１２ＤＲＰ／ｍＬであった。ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）について１．８７×１０＾１１ＤＲＰ／ｍＬの報告された力価は、予想よりも低いが、このことは、最終原薬が濃縮される範囲を限定する最終的なタンジェンシャルフロー限外濾過ステップ（ＴＦＦ２）における最小ホールドアップ体積による。具体的には、この不完全な濃縮は、６倍濃縮されていないバッチをもたらした。物理力価及び感染力価がこの６倍希釈について補正される場合、表３４に要約されるように、物理力価、感染力価、物理：感染力価比率は、バッチ間で類似している。より低いホールドアップ体積（より小さな）ＴＦＦカートリッジの使用は、より高い濃縮係数を達成するために評価されている。
【０３９３】
【表３４】
2021520233.tif 000081
【０３９４】
純度：純度は、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ染色され、還元されたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた解析によって測定される。図１６は、改善されたプロセスによって生成されたＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）バッチについて生成された純度プロファイルを示す。データは、３つのウイルスキャプシド（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）タンパク質の存在を示し、追加的な不純物は検出されなかった。
【０３９５】
構築物タンパク質発現：構築物タンパク質発現に対する定量的アッセイ（ＥＬＩＳＡ法による）の導入前に、予備解析を、定性的非ＧＭＰアッセイを使用して実行した。以下に記載される、この細胞ベースのインビトロアッセイは、ヒト細胞株における構築物発現と発現された構築物の生物活性の両方を測定することができる。アッセイは、次の３つの構成要素を有する。
・細胞培養及びウイルスベクター形質導入
・構築物タンパク質発現の検出のためのウエスタンブロット
・構築物タンパク質活性の検出のためのアッセイ
【０３９６】
細胞培養は、既知及び同等の物理力価のＡＡＶ２−構築物ベクターで形質導入されるＨＥＫ２９３細胞を使用して実行される。これらの細胞は、このアッセイ内で検出されたものの限界以下のレベルで構築物タンパク質を発現し、ＡＡＶ２−構築物ベクターからの細胞の形質導入及び発現による増加した構築物タンパク質発現の比較定性的評価を可能にする。形質導入及びインキュベーションに続いて、細胞溶解物は回収され、細胞質ゾル画分は、それぞれ、構築物タンパク質の発現及び活性を決定するために、ウエスタンブロット及びインビトロアッセイにおいて使用される。タンパク質検出は、構築タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を使用して実行され、発現レベルは、例えば、細胞内Ｂ−アクチン発現に対して正規化されて半定量的解析を提供する。
【０３９７】
図１７は、元のプロセス及び改善されたプロセスからの操作ロットを有する培養されたＨＥＫ２９３細胞の形質導入後に続く構築物発現及び機能的活性の結果を示すデータを示す。構築物タンパク質の染色は、両方のロットに対して陽性であり、形質導入されていない対照２９３細胞において見られるベースライン構築物タンパク質発現レベルと比較して、構築物タンパク質の発現の増加したレベルを示す。構築物タンパク質の基質の検出は、両方のロットに対しても陽性であり、形質導入されていない対照２９３細胞において見られるベースラインレベルと比較して、基質での増加した活性レベルを示す。さらに、構築物発現及び基質活性のレベルは、元の操作及び改善された操作実行について両方で同等であると思われ、これらのバッチについての同等の効力を実証する。ＧＭＰバッチからのデータは、構築物の発現及び活性の増加も示す。
【０３９８】
最適化されたプロセスの生成物：
安全性：バイオバーデン及びエンドトキシンのデータは、新しい汚染物質の導入に関連する安全性に問題がないことを示した。元のプロセス及び改善されたプロセスからのバッチは、この点において顕著に異ならない。
【０３９９】
不純物：プロセス関連不純物（ＨＣＰ、残存ベンゾナーゼ、ＢＳＡ、総タンパク質）のレベルは、すべてのバッチについて顕著に異ならなかった。
【０４００】
宿主細胞ＤＮＡ（ｈｃＤＮＡ）レベルのいくつかの差異は、目立っている。どちらも元のプロセスによって生成された、ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）とＡＡＶ２−構築物（ＧＭＰ）との差異は、ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）が非ＧＭＰ研究室において生成されたが、ＡＡＶ２−構築物（ＧＭＰ）がＧＭＰクリーンルームにおいて生成されたという事実による場合があり、プロセスステップ、プロセス操作、サンプリング、試験、及び原料の制御がより存在し、より良い、かつより再現性の高い結果が得られることを可能にする。加えて、細胞のプラスミド形質導入に続くより長いインキュベーション時間を使用して、ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）を生成した。ＡＡＶ２−構築物（ＧＭＰ）を生成するために使用される細胞についての２３時間と比較して、細胞のフィードから収集まで７２時間であった。より長いインキュベーションは、より多くの細胞成長と、より多くのｈｃＤＮＡがそれらの細胞によって放出されることと、を可能にすることができる。
【０４０１】
これらの差異は、元のプロセスによって生成された２ロットの材料間のｈｃＤＮＡレベルにおいて観察された差異を説明できる。
【０４０２】
逆に、それらのすべてが改善されたプロセスによって生成された、ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）及び２つのＧＭＰロットについて、ｈｃＤＮＡレベルは、はるかに低くなる（それぞれ、５３０ｐｇ／ｍＬまたは＜ＬＯＤ）。これらのバッチを生成するために使用されるプロセスでは、残存ＤＮＡを除去することができるクロマトグラフィー精製及び研磨ステップがある。
【０４０３】
生成物の特徴：外観、ｐＨ及び重量モル浸透圧濃度は、すべてのバッチについて顕著に異ならなかった。
【０４０４】
ベクター特性：改善されたプロセスによって生成された非ＧＭＰ及びＧＭＰバッチは、非定量的アッセイにおいて評価された際に、同等の構築物発現及び生物活性を示す。これらのバッチは、元のプロセスによって生成されたバッチと同等の純度を有し、検出可能な不純物はなかった。
【０４０５】
完全対空ベクターキャプシドの比率に関するデータは同様であり、上に示される構築物の発現及び活性からのデータは、改善されたプロセスによって生成される（非ＧＭＰ）バッチにおける完全対空ベクターキャプシドの比率が、元のプロセスによって生成されるＧＭＰバッチと等価であり、ヒト細胞に形質導入し生物活性を実証するベクターの能力に負の影響を与えないことを確認する。
【０４０６】
同一性に関するデータ（ベクター配列）は、変異が導入されていないすべてのバッチの完全な配列にわたる相同性を確認する。同一性は、インビトロ構築物の発現及び生物活性を検出する能力によっても確認され、それらの両方は、ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接する無傷かつ機能的な構築物タンパク質に依存する。
【０４０７】
増殖型ＡＡＶは、いかなるバッチにおいても検出されてない。ｒｃＡＡＶの存在は、プラスミド及びベクターの遺伝学の性質による可能性は低いが、患者の安全を確保するための臨床研究についての発表前に、任意のＧＭＰバッチについて引き続き評価されるであろう。
【０４０８】
プロセス収量：
表３５は、改善されたプロセスの全体的なプロセス収量を要約する。１０個のスタック細胞工場の２倍の数（２４、元のプロセスについては１２であることを参照されたい）から、２倍の数のウイルス粒子（ＤＲＰ）が作成される（６．７×１０＾１３、元のプロセスについては３．４×１０＾１３であることを参照されたい）。全体的なプロセス回復はより低いが、このことは、部分的には、元のバッチ生成中には含まれていない、改善されたプロセス開発中に実行される追加的なインプロセス及び品質管理試験によるものである。
【０４０９】
【表３５】
2021520233.tif 000082
【０４１０】
上に示されるデータに基づいて、新しい最適化されたプロセスから生成されたＡＡＶ２−構築物非臨床バッチは、元のプロセスによって生成された非臨床及び臨床バッチに匹敵すると見なされる。このプロセスを使用して、改善されたプロセスに従って第１のＧＭＰバッチを生成した。
【０４１１】
実施例７：ＡＡＶ２精製クロマトグラフィーの改善された頑健性
生成物の質及び有効性に関連するすべての試験パラメータを、ＡＶＢの導入に続いて評価し、表３６〜表４１に詳述されるように、ＡＶＢクロマトグラフィー由来生成物の質または有効性プロファイルにおける検出可能な変化はなかった。
【０４１２】
加えて、残存ＡＶＢリガンドを検出するための新しい方法は、導入され、ＡＶＢセファロースカラムを使用して製造された材料のうちのいずれにおいても検出可能なＡＶＢリガンドがないことが実証された。
【０４１３】
７つのＡＶＢ操作実行を、５つの実行が小規模（１．５〜７Ｌ）で、２つの実行が大規模（１６Ｌ）として、ＡＡＶ２−構築物収集材料（図２、ステップ１３）を用いて実行し、凝集防止及びステップ収量を評価した。ＡＶＢステップは、すべての実験において良好に実行され、４０〜７８％の収量（６４％の平均収量）の良好なステップ回復であった。顕著な凝集は、いずれの実験においても検出されなかった。ＡＶＢクロマトグラフィーに続いて、潜在的な不純物またはプロセス汚染物質のレベルは、すべて低く、以前に実証されたレベルと一致し、最終ベクター生成物は、良好な効力及び感染力価を示した。ＡＶＢセファロース精製ステップを用いたスケールダウン実行からの結論では、すべてのアッセイ結果（表３６）は、元のフェーズ１／２プロセス（動物由来マトリックス充填アフィニティークロマトグラフィーを使用）及びＡＡＶ２−構築物ＧＭＰ臨床材料に対する最初の「改善された」プロセス（ＵｎｏＱ陰イオン交換プロセス）との良好な比較可能性を示す。
【０４１４】
【表３６】
2021520233.tif 000083
【０４１５】
【表３７】
2021520233.tif 000084
【０４１６】
ＡＶＢアフィニティークロマトグラフィーステップを使用した小規模開発実行及びスケールアップ生成ロットによる生成物比較可能性及び改善されたプロセス頑健性の実証に続いて、ＡＡＶ２−構築物ＧＭＰを、ＡＶＢプロセスを使用して製造した。このＧＭＰバッチのすべての解析試験結果は、仕様及び期待を満たしている。
【０４１７】
ＡＡＶ２−構築物ＧＭＰ原薬及び製剤（改善されたプロセスによって生成された）の予備解析結果が、以下の表３８及び表３９に要約される。すべての試験は、仕様及び期待を満たす。
【０４１８】
【表３８】
2021520233.tif 000085
【０４１９】
【表３９】
2021520233.tif 000086
【０４２０】
精製プロセス改善は、元のプロセスからのプロセス及び生成物と比較される際に、同等のＡＡＶ２−構築物原薬及び改善されたプロセス頑健性をもたらした。
【０４２１】
改善されたプロセスによる製造中に、完全対空粒子の比率は、特徴付け試験として決定される。
【０４２２】
潜在的な生成物関連不純物が、表４０に挙げられる。
【０４２３】
【表４０】
2021520233.tif 000087
【０４２４】
潜在的なプロセス関連不純物及びそれらの対照が、表４１に挙げられる。
【０４２５】
【表４１】
2021520233.tif 000088
【０４２６】
実施例８：原薬の制御
以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０４２７】
解析手順の検証：方法検証結果の概要が、利用可能な場合、以下に示される。
【０４２８】
物理力価：このアッセイは、以下の基準を満たすことが検証されている（表４２を参照されたい）。「実測値」は、本開示の例示的なＡＡＶ２−構築物に対する値である。
【０４２９】
【表４２−１】
2021520233.tif 000089
【表４２−２】
2021520233.tif 000090
【０４３０】
ＤＲＰ：ＩＵ比率−計算：検証は必要とされない。物理力価及び感染単位力価アッセイのデータからの計算によって決定された値。
【０４３１】
総粒子：総粒子アッセイは、検証されている。検証結果の概要が、表４３に示される。「実測値」は、本開示の例示的なＡＡＶ２−構築物に対して測定される値である。
【０４３２】
【表４３】
2021520233.tif 000091
【０４３３】
完全：空比率：薬物特異的アッセイの検証は実行されない。ＧＭＰ準拠施設において実行された透過型電子顕微鏡画像での完全な及び空のＡＡＶ２粒子の計数。
【０４３４】
ベクター同一性（ＤＮＡ）：薬物特異的アッセイ検証は実行されない。ＤＮＡ配列決定は、ＧＭＰ準拠施設において認定された方法及び機器を使用して実行される。
【０４３５】
総タンパク質アッセイ：このアッセイは、以下の基準を満たすことが検証される（表４４を参照されたい）。
【０４３６】
【表４４】
2021520233.tif 000092
【０４３７】
純度アッセイ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：純度アッセイは、検証されている。検証結果の概要が、示される（表４５）。「実測値」は、本開示の例示的なＡＡＶ２−構築物に対して測定される値である。
【０４３８】
【表４５】
2021520233.tif 000093
【０４３９】
増殖型ＡＡＶ：増殖型ＡＡＶアッセイは、不純物に対する限界試験についてのＩＣＨ  Ｑ２（Ｒ１）において指定されるような関連する検証要件を満たすように検証されている（表４６を参照されたい）。検証結果の概要が、以下に示される。「実測値」は、本開示の例示的なＡＡＶ２−構築物の測定値である。
【０４４０】
【表４６】
2021520233.tif 000094
【０４４１】
総ＤＮＡ：総ＤＮＡアッセイは検証されている。検証結果の概要が、示される（表４７を参照されたい）。提供される「実測値」は、本開示の例示的なＡＡＶ２−構築物の測定値である。
【０４４２】
【表４７】
2021520233.tif 000095
【０４４３】
ＨＥＫ２９３宿主細胞ＤＮＡ：ＨＥＫ２９３宿主細胞ＤＮＡアッセイは、認定されている（表４８を参照されたい）。資格認定結果の概要が、以下に示される。提供される「実測値」は、本開示の例示的なＡＡＶ２−構築物の測定値である。
【０４４４】
【表４８】
2021520233.tif 000096
【０４４５】
バイオバーデンアッセイ：これは、ＥＰ２．６．１２及びＵＳＰ＜６１＞の要件を満たすように統一された公定方法である。資格認定／検証は、関連する薬局方のモノグラフに従って行われる。
【０４４６】
エンドトキシンアッセイ：これは、ＥＰ２．６．１４及びＵＳＰ＜８５＞の要件を満たすように統一された公定方法である。資格認定／検証は、関連する薬局方のモノグラフに従って行われる。
【０４４７】
実施例９：プロセス２を使用して製造される組成物に対するバッチ解析結果
以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０４４８】
２つの非ＧＭＰ及び２つのＧＭＰバッチからのバッチ解析データが、以下の表５０に示される。
【０４４９】
【表５０−１】
2021520233.tif 000097
【表５０−２】
2021520233.tif 000098
【表５０−３】
2021520233.tif 000099
【０４５０】
実施例１０：プロセス１を使用して製造される組成物に対するバッチ解析結果
以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０４５１】
１つの臨床ＧＭＰバッチは、プロセス１に従って製造されている。この原薬のバッチからのバッチ解析データが、表５１に提供される。
【０４５２】
【表５１】
2021520233.tif 000100
【０４５３】
実施例１１：ＡＡＶ組成物の安定性
ＡＡＶ２−構築物原薬のアリコートは、−６０℃未満のＡＡＶ２−構築物原薬保管条件を支持するための長期安定性について解析される。この試験は、進行中の製剤のリアルタイム研究と、−８０℃、−２０℃、及び５℃での加速安定性研究を補強する。
【０４５４】
ＡＡＶ２−構築物原薬は、完全サイズのＡＡＶ２−構築物原薬容器を表す小さな容器（５ｍＬのＰＥＴＧスクリューキャップボトル）中に等分されて、十分な容器が長期にわたって安定性試験のために利用可能であることを確実にする。これらの容器は、同じ生成物接触材料を有し、体積に対する表面積の比率を除いて、最終ＡＡＶ２−構築物原薬容器を最もよく表すように選択されている。小さな容器のアリコートにおけるより小さな体積及びより大きな表面積対体積比率は、ＡＡＶ２−構築物原薬の長期安定性に関して「最悪のシナリオ」を表すと考えられる。
【０４５５】
等分されたＡＡＶ２−構築物原薬は、周囲相対湿度を伴う−８０±１０℃で置かれる。
【０４５６】
ＡＡＶ２−構築物原薬の不十分なアリコートが３６カ月の研究全体を完了するために利用可能である場合、研究はより早い時点で中断されるであろう。
【０４５７】
低減した支持安定性研究は、小規模ＡＡＶ２−構築物（非ＧＭＰ）バッチからの材料を使用して開始されている。この研究では、−６０℃未満で保管される２ｍＬのポリプロピレン製クライオチューブ中の１００μｌのアリコートを使用する。小さな容器のアリコートにおけるより小さな充填体積及びより大きな表面積対体積比率は、ＡＡＶ２−構築物原薬の長期安定性に関して「最悪のシナリオ」を表すと考えられる。この研究は、２、６及び１２カ月の時点での原薬安定性を評価する。この研究の追加的な詳細は、以下に示される。
【０４５８】
試験要件
アッセイは、以下の理論的根拠に基づいて、主要な安定性プロトコルについて選択されている（表５２を参照されたい）
【０４５９】
【表５２】
2021520233.tif 000101
【０４６０】
アッセイは、表５３に示されるように、支持安定性プロトコルに、物理力価、純度、総粒子数、及び効力を含めるように選択されている。これらの安定性試験及び時点（表５４及び表５７）は、研究を実行するために利用可能な材料の量に最も適していると見なされた。ベクター凝集の評価は、方法が現在ＡＡＶ２ベクター材料について開発中であるため、この研究には含まれていない。容器完全性は、このことが低減した支持安定性研究であるため、研究から除外された。
【０４６１】
【表５３】
2021520233.tif 000102
【０４６２】
【表５４】
2021520233.tif 000103
【０４６３】
【表５５】
2021520233.tif 000104
【０４６４】
【表５６】
2021520233.tif 000105
【０４６５】
【表５７】
2021520233.tif 000106
【０４６６】
実施例１２：臨床製剤の解析
以下に提供されるデータについて、測定は、ＡＡＶ２−構築物のうちの１つ以上のバッチから取得され、構築物は、すべてのバッチにおいて同一である。
【０４６７】
ＡＡＶ２−構築物製剤の放出試験のために実行される解析手順は、それぞれの仕様に加えて、表５８に詳述される。
【０４６８】
【表５８】
2021520233.tif 000107
【０４６９】
解析手順：製剤を制御するために使用される方法が、以下に要約される。
【０４７０】
外観（ＥＰ２．２．１、２．２．２及び２．９．２０ならびにＵＳＰ＜６３１＞）：生成物は、透明度、色、及び異物粒子の存在／非存在について目視検査されるであろう。生成物は、白及び黒の背景に対して検査されるであろう。
【０４７１】
ｐＨ（ＥＰ  ２．２．３及びＵＳＰ＜７９１＞）：生成物のｐＨは、温度補償付きのマイクロｐＨ電極を使用して決定されるであろう。
【０４７２】
重量モル浸透圧濃度（ＥＰ２．２．３５及びＵＳＰ＜７８５＞）：重量モル浸透圧濃度は、凝固点降下法によって決定される。
【０４７３】
物理力価：最終生成物の物理力価測定は、本明細書に記載されるように実行されるであろう。
【０４７４】
感染単位力価アッセイ：最終生成物に対する感染性力価アッセイは、本明細書に記載されるように実行されるであろう。
【０４７５】
効力：このアッセイは、構築タンパク質が、試験品で形質導入された細胞中において、過剰生成され、活性であることを実証するために使用される。細胞、ＨＥＫ２９３は、内因性構成タンパク質を非常に低いレベルで発現し、形質導入されていない細胞と比較して、細胞形質導入及びＡＡＶ２−構築物ベクターからの発現による増加した構築物タンパク質発現の比較評価を可能にする。形質導入に続いて、細胞は溶解され、溶解物中の構築物濃度はウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡで測定される。発現された構築物タンパク質の活性は、ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡを使用して基質へのビオチン標識ＧＰＰの組込みを測定する反応を使用して、細胞溶解物に対して測定される。
【０４７６】
滅菌性試験（ＥＰ２．６．１及びＵＳＰ＜７１＞）：この手順は、試験品が生存可能な細菌性及び真菌性汚染を含まないかどうかを決定するために使用される。試験品は、無菌的に大豆−カゼインダイジェスト培地（ＳＣＤＭ）及び液体チオグリコレート培地（ＦＴＭ）中に移される。これらの培養液は、１４日間インキュベートされ、細菌性及び真菌性成長の証拠について検査される。
【０４７７】
エンドトキシン（ＥＰ２．６．１４及びＵＳＰ＜８５＞）：このアッセイは、細菌性エンドトキシンが試験品に存在するかどうかを判定するために使用される。定量的手順は、速度論的発色法によって実行される。既知の量のエンドトキシンは、細菌性エンドトキシンのレベルの正確な決定のために、試験品と並行して試験される。試験品による干渉の可能性は、試験品に加えＬＡＬ試薬を特定のレベルのエンドトキシンでスパイクさせることにより検査される。次いで、以下の阻害／増強試験、試験品のエンドトキシン含有量が、測定される。
【０４７８】
解析手順の検証：方法検証結果の概要が、利用可能な場合、以下に示される。
【０４７９】
外観：これは、ＥＰ２．２．１／２．２．２及びＵＳＰ＜６３１＞の要件を満たすように統一された公定方法である。資格認定／検証は、関連する薬局方のモノグラフに従って行われる。
【０４８０】
ｐＨ：これは、ＥＰ２．２．３及びＵＳＰ＜７９１＞の要件を満たすように統一された公定方法である。資格認定／検証は、関連する薬局方のモノグラフに従って行われる。
【０４８１】
重量モル浸透圧濃度：これは、ＥＰ２．２．３５及びＵＳＰ＜７８５＞の要件を満たすように統一された公定方法である。資格認定／検証は、関連する薬局方のモノグラフに従って行われる。
【０４８２】
滅菌性：これは、ＥＰ２．６．１及びＵＳＰ＜７１＞の要件を満たすように統一された公定方法である。資格認定／検証は、関連する薬局方のモノグラフに従って行われる。
【０４８３】
実施例１３：臨床用量デザイン
コロイデレミアは、希少な現在不治のＸ連鎖性劣性網膜変性であり、小児期後期に現れ、失明につながる。この例は、コロイデレミア導入遺伝子（ＮＣＴ０１４６１２１３）を発現するアデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ２）ベクターを使用して、網膜遺伝子療法を評価する非無作為化、２年間の、第１〜２相オープンラベル臨床治験の主要エンドポイントを提供する。最初に、１２人の患者を募集し、そのうち５人はＡＡＶ．ＲＥＰ１の１×１０１０ゲノム粒子（ｇｐ）を受け、６人は１×１０１１ｇｐを受けた。１人の患者の外科的合併症は、網膜菲薄化及び１０１０ｇｐ未満の低減したベクター用量につながった。安全性及び有効性の主要アウトカム尺度は、２年目での視力であった。網膜感度及び解剖学的変化は副次的エンドポイントであった。１４人の患者の群全体にわたって、２年までに、視力の中央値は、治療されていない目における１．５文字の喪失と比較して、治療された目において４．５文字改善した（ｐ＝０．０３）。合併症を有しない遺伝子療法を受けている１２人の患者について、治療された目は、２年でそれらのベースラインレベルより５．５文字増加した（ｐ＝０．０２）。治療されていない目と比較して、このことは、２年までに遺伝子療法を受けている目に有利な、４．５文字の増加の中央値を表した（ｐ＝０．００３）。この時までに、１２の治療された目のうち６つは、１２の治療されていない目のいずれも増加していないことと比較して、２つ以上の視線（５文字超）増加した。最後のフォローアップ（範囲２〜５年）では、視力は、１２の治療されていない目のうちの４つのみと比較して、プロトコルに従って遺伝子療法を受けた１２の研究目すべてにおいて、維持または増加していた。このことは、１５．９文字（３つの線超）の平均差異に等価であった。２年間のフォローアップ中に、微小視野測定、網膜の厚さ、または治療された及び治療されていない目の間の網膜の外縁の喪失などの副次的エンドポイントにおいて統計学的に有意な差異は見られなかった。コロイデレミアに対する網膜遺伝子療法は、安全であると考えられ、視力に利点を提供することができる。
【０４８４】
この非マスク化、非無作為化、前向き介入的遺伝子療法臨床治験では、１４人の参加者は、インフォームドコンセントを用いて募集され、ＡＡＶ２．ＲＥＰ１ベクターを使用して１つの目に遺伝子療法治療を受けた。一般的に、治療のために選択された目は、ベースライン時で劣った視力を有したが、３つの場合では、視野狭窄などの他の要因のため、より良い視力を有する目を選択した。すべての参加者は、ＣＨＭ遺伝子に確認されたヌル変異を有する２５〜７３歳の範囲に及ぶ年齢の男性であった。治験の主要な目的は、術後２年までに視力を維持することに関する安全性を評価することであった。最初に、１２人の患者を６人の患者の２つの用量コホートへと募集し、それらの各々を２４カ月間モニタリングし得る。しかしながら、２人の患者における合併症が、治験の途中において２４カ月の遅延と、使用された外科的技法及び免疫抑制レジメンに関連するプロトコルの変更につながった。倫理委員会は２人のさらなる患者の募集とともに治験の延長を承認し、そのため、合計１２人の患者がプロトコルに従って合併症を伴わずに遺伝子療法治療を受けた。
【０４８５】
６人の患者の第１のコホートでは、スーパーコイルプラスミドベクター参照を使用してアッセイされた最大１×１０１０ゲノム粒子（ｇｐ）の網膜下注射を、２段階の手順で網膜下に注射した。このことは、４１ゲージ（Ｇ）テフロン（登録商標）カニューレ（ＤＯＲＣ  ＢＶ、Ｚｕｉｄｌａｎｄ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を通じて送達される平衡塩溶液を用いた網膜の最初の剥離と、新しく作成された網膜下腔へのＡＡＶ．ＲＥＰ１ベクターの２次注射と、を含んだ。患者６（Ｃ１）では、網膜を剥離すること及び乳頭黄斑束を伸張させることの困難さは、６×１０９未満の低減した遺伝子療法用量と、その後の網膜菲薄化をもたらしたが、他のすべての患者は、プロトコルに従って、１×１０１０ｇｐの完全な低用量（Ｌ１〜５）または１×１０１１ｇｐ（Ｃ２及びＨ１〜７）の高用量のいずれかを受けた。最初に、経口プレドニゾロンを、遺伝子療法の前の３日間及び遺伝子療法の後の７日間、１ｍｇ／ｋｇで投与したが、Ｃ２は、術後２週間で硝子体炎及び網膜炎を発症し、Ｃ２の視力に悪影響を与えた。その後、プロトコルは修正され、そのため、Ｈ１〜７はプレドニゾロンレジメンの延長を受けた：０．５ｍｇ／ｋｇ（８〜１４日目）、０．２５ｍｇ／ｋｇ（１５〜１６日目）、次いで０．１２５ｍｇ／ｋｇ（１７〜１８日目）。注射システム中の気泡が、Ｈ３の網膜下腔中に拡大し、ベクター投与は、ベクターが網膜下の空気によって置き換えられるであろうと感じられたため、延期された。注射システムを、網膜下腔へのベクターのより制御された注入を可能にし、閉じ込められた気泡の可能性を低減するために修正した。プロトコルは、外科的理由で指示された場合、延期されたベクター投与を可能にし、Ｈ３は、ベクターの完全用量が合併症を伴わずに投与された際に、より後の日での網膜遺伝子療法のために戻った。
【０４８６】
網膜剥離を視覚化することを支援し、網膜伸展をモニタリングするために、術中光干渉断層計（ＯＣＴ）イメージングを、Ｈ３〜７に導入した。このことは、網膜下注射の平面と網膜伸展の程度とを評価するために、さまざまな段階で手術野に出入りされる垂直方向に配置されたＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓを含んだ。
【０４８７】
コロイデレミアでは、多くの他の網膜変性とは異なり、ＲＰＥの喪失は、下にある脈絡膜の瘢痕反応につながり、次いで、残存網膜にしっかりと付着する。しかしながら、機能的な網膜の中央の島は、無傷のままであり、ＲＰＥと視細胞との間のベクター投与のための組織面は、その中で識別され得る。しかしながら、液体がこの平面にあまりに急速に注射されると、発達中の液体の濾過胞は、末梢瘢痕組織が網膜下液が網膜の周囲に外向きに伝播するのを防止するため、詰まった泡を形成し、網膜中心部を伸展させる。この網膜伸展反応は、２つの悪影響を有する。第１に、それは、神経感覚網膜を直接損傷する場合がある−Ｃ１では、以前に報告されたように、乳頭黄斑束が伸展しやすかったが、それは、外顆粒層がこの領域において欠乏しており、網膜中心部よりも薄くしており、フックの法則に従って所与の圧力でより伸展しやすかったためである。第２に、濾過胞におけるより高い流体圧力は、拡大された網膜切開を通って硝子体に戻るベクター懸濁液の逆流をもたらし、それによって、送達される治療用量を低減させ、炎症のリスクを増加させるであろう。したがって、ベクターが１ｍｌのシリンジから手動で注射されたＣ１における合併症に続いて、新しいベクター投与デバイスを設計及び試験し、そのことは、ベクターの正確な足ペダル制御の緩徐な注入を可能にした。このことは、ベクター投与が合併症でなかったＨ３〜７において成功して使用された。重い液体である、パーフルオロ−ｎ−オクタン（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）の泡を使用して、ベクター注入中のＰ１０とＰ１１における網膜菲薄化の焦点領域を安定させた。
【０４８８】
視覚機能を、糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）プロトコルに従って、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）で評価した。加えて、Ｐｅｌｌｉ−Ｒｏｂｓｏｎコントラスト感度試験を、ベースライン、１年、２年で実行した。ＭＡＩＡマイクロペリメーター（ＣｅｎｔｅｒＶｕｅ  ＳｐＡ，Ｐａｄｏｖａ，Ｉｔａｌｙ）を使用したマイクロペリメトリー試験は、標準のカスタマイズされていない２０°（３８刺激）の中央グリッドが使用されたＨ３〜７を除いて、前述のプロトコル［ＭａｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４］に従った。２０°グリッド上でかろうじて検出可能な、または０ｄＢの平均閾値感度を達成できる、深い視野制限を有する参加者（Ｈ４〜６）に対して、１０°の中央グリッドを、代わりに使用した。Ｌ３において改善された色覚の主観的な報告に従って、Ｆａｒｎｗｏｒｔｈ−Ｍｕｎｓｅｌｌ  １００色相（ＦＭ１００）試験を使用した色覚評価を、プロトコル変更に追加し、Ｈ１〜７に含めた。治療された目における改善した色覚のさらなる主観的な記載が、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、及びＨ７によって報告された一方で、試験は、進行した視野喪失を有する患者において実行することが困難であると判明した。解剖学的評価は、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したスペクトルドメイン光干渉断層計（ＯＣＴ）及び眼底自発蛍光（ＡＦ）イメージング（ＢｌｕｅＰｅａｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を含んだ。ＡＡＶ（ＥＬＩＳｐｏｔ）に対するＴ細胞反応を評価するための免疫試験は、前述の方法論［ＭａｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４］に従った。
【０４８９】
研究に近最大視力を有する目を含めることの天井効果により、ＥＴＤＲＳスコアは、歪んでいることが見いだされ（０．０５アルファでのＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ正規性検定）、したがって、四分位範囲の中央値（ＩＱＲ）として示される。治療された目と対照の目との間の変化を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位検定を使用して比較した。微小視野測定データ及び解剖学的評価は、正規分布であると見いだされ、対応のあるｔ検定を使用して比較された。
【０４９０】
結果
合計１４人の患者が募集され、そのうち１３人が１×１０１０ｇｐ（Ｌ１〜５）または１×１０１１ｇｐ（Ｃ２及びＨ１〜７）のＡＡＶ．ＲＥＰ１ベクターを受けた（表５９）。２人の患者Ｃ１及びＣ２のベクター投与に関連する重大な有害事象（ＡＥ）があった。Ｃ１では、外科的合併症により網膜菲薄化をもたらし、ベクターの投与量が少なかった。Ｃ２では、術後２週間で有意な網膜炎症があり、それはベクターに関連する可能性が最も高かった。Ｈ３では、網膜下の気泡により、第１の試みでベクターの投与が妨げられたが、二次ベクターの送達は、後日合併症を伴わずに成功した。特に手術に関するプロトコルの変更は、これらの有害事象が将来発生する可能性を低減するように設計されている。倫理委員会は、さらに２人の患者の募集を承認し、それによって、低用量（Ｌ１〜５）での５人及び高用量（Ｈ１〜７）での７人を含む、２年間のフォローアップを有するプロトコルに従って治療を受けた１２人の患者を提供した。
【０４９１】
【表５９】
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【０４９２】
視力の評価
合計で、１２人は、合併症なしに網膜下注射によってＡＡＶ．ＲＥＰ１ベクターを受け、２人は、有害事象の結果としてプロトコル外で治療された。２年間の治験終了時点で、治療した１４の目の視力の中央値は、４．５文字（ＩＱＲ：−２．０〜８．８）改善し、１４の治療されていない目では、１．５文字（ＩＱＲ：−５．０〜０．０）低下した。したがって、２人の患者における顕著な合併症にもかかわらず、治療された目全体を支持する（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位検定、Ｗ＝６８，ｚ＝２．１２，ｐ＝０．０３４）。以降、治験薬（ＩＭＰ）の有効性を評価する目的で、プロトコルに従って遺伝子療法を受けた１２人の患者（Ｌ１〜５及びＨ１〜７）は、外科的または医学的合併症のある２人の患者（Ｃ１及びＣ２）とは別個に報告される。
【０４９３】
外科的技法を最適化するための治験の途中での遅れにより、初めの５人の患者（Ｌ１〜５）は、５年間のフォローアップを持っているが、最後の５人（Ｈ３〜７）は、最近になってやっと２年のフォローアップに達したが、その間で、中間のフォローアップ期間があった。したがって、データは、２つの方法で示され、１つ目は、プロトコルで定義された元のエンドポイントに従って、２年間で１２人の患者全員にわたるものであり、２つ目は、フォローアップの最後のポイントであり、Ｌ１〜５及びＨ１〜２は、２年を超えて延長する。
【０４９４】
２年までに、視力中央値は、１２人の治療された目において５．５文字改善した（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位検定、Ｗ＝６０，ｚ＝２．３３，ｐ＝０．０２０）。対照的に、この期間中の処理されていない目における−１．０文字（ＩＱＲ：−５．０〜＋１．０）の少量の喪失があった（表６０及び図２０）。このことは、治療されていない人の目よりも治療された目の４．５文字の中央値増加（ＩＱＲ：２．０から１４．０）を表した（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位検定、Ｗ＝７６，ｚ＝２．９６，ｐ＝０．００３）。最後のフォローアップでは、治療された目は、６．５文字（ＩＱＲ：３．８〜１０．３）の中央値を得たが、治療されていない目は、−２．０文字（ＩＱＲ：−５．３〜０．３）を喪失した。このことは、治療されていない目よりも治療された目の８文字の中央値増加（ＩＱＲ：４．０から１８．５）を表した（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位検定、Ｗ＝７８，ｚ＝３．０４，ｐ＝０．００２）。
【０４９５】
最後のフォローアップまでに、遺伝子療法を受けた１２の治療された目すべてで視力が維持または増加したが、この期間中、１２の治療されていない目のうち８つの目はさまざまな量で悪化した。視力は、変動する生物学的読みであり、試験は標準的な方法で行われ、治療されていない目はいずれも、２４カ月で２つ以上の線（５文字超）が増加しなかった。対照的に、治療された１２の目のうち６つ（５０％）は、２４カ月で２つ以上の線が増加した。治療されていない目と比較して、１２人の患者のうち４人の患者において、２４カ月で２つの線以上の増加が見られた（表６０：太字）。これにより、これらのうち４つが、治療された目に有利な、３つ以上の線（１５文字以上）の増加があり、最後のフォローアップまでに、１２のうちの６つ（５０％）がさらに増加した（表６０：太字）。最後のフォローアップでは、治療された目における視力は、１２人の患者の全員において、治療されていない目に対して改善しており（中央値＝８．５文字、ＩＱＲ：４．０から１８．５）、これは、遺伝子療法を受けている目に有利な、１５．９文字の平均増加に同等である（３つのライン超）。
【０４９６】
【表６０】
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【０４９７】
微小視野測定は、視力よりも黄斑の広い領域にわたる平均網膜感度を評価するが、特に固視が不良な患者の場合、実行に時間がかかり、集中が必要である［Ｊｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７］。治療された目の平均網膜感度は、ベースラインで４．０±０．７デシベル（ｄＢ）、２年間で３．３±０．６であり、統計学的に有意でない減少であった（ｐ＝０．０７）。対照的に、治療されていない目は、ベースラインでの４．８±０．８ｄＢから２年間で３．３±０．７ｄＢに大幅に減少した（ｐ＝０．００４）。２年間の研究エンドポイントで、治療されていない目よりも治療された目を支持する相対利得が０．８±０．５３ｄＢ（９５％ＣＩ：−０．３〜１．８ｄＢ）であったが、統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．１７）。１年後のデータ及び中間解析を、図２１に示す。この段階までに、治療された目の平均網膜感度の低下は、治療されていない目よりも０．９±０．５ｄＢ（９５％ＣＩ：０．０〜１．８ｄＢ）少なくなり、２年間で見られた治療されていない目と比較して改善が持続し得ることを示唆している。
【０４９８】
微小視野測定は、固視、つまり最大感度を有する網膜領域（通常は中心窩）に関する有用な情報も提供する。Ｌ１を除くすべての患者は、ある程度の中心窩または傍中心窩固視を依然として保持しており、この疾患における視野喪失の求心性の性質と一致している。Ｌ１が治療されていない網膜の島を迂回しながら、この治療された島を使用するように固視（または見やすい網膜部位）を変更したことが以前に顕著であった。これは、この患者で最大５年間維持され、視力の持続的な改善と一致している。
【０４９９】
網膜構造の維持：解剖学的評価には、網膜の厚さ及び自発蛍光を測定する断面図を得る光干渉断層計（ＯＣＴ）が含まれ、残存する網膜領域を推定するために使用することができるマップを生成する。目は無作為化されておらず、１２人の研究患者のうち９人で遺伝子療法のために選択された視力の観点においてより進行した目となった（表５９）。
【０５００】
ＯＣＴは、主に安全性のために使用して、例えば、外科的外傷から、またはＲＥＰ１タンパク質の過剰発現による長期的な毒性作用がある場合に発生し得る網膜菲薄化を評価した。ベースラインでの固視点での１２のプロトコルで治療した目の平均厚さ（微小視野測定で示される）は、治療されていない目の２５１．９μｍと比較して２２４．８μｍであった。２４カ月までに、治療された目は、平均２０７．７μｍに低減し、治療されていない目は、２４５．６μｍに低減し、統計的に有意であった（ｎ＝１２、ｐ＝０．０４）。しかしながら、さらなるサブグループ解析により、網膜下腔へのベクターの手動注射を受けた第１の７つの目（Ｌ１〜５及びＨ１〜２）では、網膜菲薄化は、治療されていない目（６．４μｍ）よりも治療された目（平均２３．１μｍ）で大きかった（ｎ＝７、ｐ＝０．０２）。しかしながら、ベクター送達システム（Ｈ３〜７）の改善後に自動注射を受けた目では、有意差は検出されなかった（ｎ＝５、ｐ＝０．７２）。
【０５０１】
領域測定について、自発蛍光領域は、楕円体ゾーンを通る複数のスライスから計算された残存する視細胞の領域と相関する。１２人の患者の群全体で、自発蛍光領域の８１．１±３．２％が、治療された目に保存されていたのに対し、８０．８±２．１％は、治療されていない目に２年間保存され、これは同様であった。しかしながら、ＡＦの収縮は、変性の前縁にある最も外側の網膜細胞からのみ発生し、健康な中央ゾーンに対する網膜遺伝子療法の長期的な作用を評価するには２年では不十分であることに注意すべきである。１人の患者（Ｈ５）のみが、２年までに測定可能な低下（１００％の維持）を示さず、治療された目でのみ観察された。５人の患者の長期（５年）フォローアップは、同様のパターンを示し、治療されていない目での６４．９±３．６％と比較して、治療された目では６６．１±５．０％の自発蛍光が残存している（表Ｓ２Ｂ）。しかしながら、これは混合画像であり、視力が大幅に向上した患者は、他の患者よりもはるかに優れていることに注意すべきである。さらに、この期間にわたって、測定された変性率の患者間での有意な差が、手術されていない目でさえ現れ、５８％から７８％の範囲に及んだ。これは、限定された非無作為化データセットを過度に解釈する必要がないことを強調している。
【０５０２】
有害事象
４１ゲージの網膜切開の明確な視界が必要なため、すべての患者は、視覚的に有意な白内障なしでベースラインに登録されたが、白内障の形成は、硝子体切除術手術のよく知られているほぼ避けられない副作用である。２人の参加者（Ｈ５及びＨ６）では、以前に白内障手術が行われていた。１人の患者（Ｈ３）は、視覚的に有意な白内障を発症し、これは遺伝子療法の１年後に除去されたが、他の４人の患者（Ｌ２、Ｌ４、Ｌ５、Ｈ２）は、２年のフォローアップの完了後に白内障手術を受けた。残りの５人の患者（Ｌ１、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ４、及びＨ７）で白内障手術はまだ行われていないが、すべて、ＬＯＣＳ  ＩＩＩ白内障の等級付けで白内障の進行の徴候がある。合併症のある２人の患者さえ含む１４人の患者の群全体にわたって、治療された目の視力は、この期間にわたって治療されていない目と比較して改善した。２年のエンドポイントまでに、プロトコル偏差を有さない、合併症のない網膜遺伝子療法を受けた１２人の患者のみを考慮すると、ベースラインと比較して、治療された目の視力は改善した。最長５年の解析された最後の時点で、この期間中の１２の治療されていない目のうち８つの視力のさまざまな損失にもかかわらず、１２の治療された目すべてがベースラインレベルを超える視力を維持したまたは得た。良好な安全性プロファイルと組み合わされた視力への有益な効果は、完全無作為化前向き第ＩＩＩ相臨床治験での潜在的な治療としてのコロイデレミア遺伝子療法のさらなる評価を保証する（実施例１４を参照）。
【０５０３】
低用量コホートと高用量コホートの間で視力の向上に有意差はなかった一方で、これは非常に小規模な研究群であり、低用量（１×１０１０）で治療された患者は５人だけであったことに注意すべきである。ヒト先天性抗ウイルス免疫システムの不均一な性質を考えると、閾値用量は一部の患者では治療可能であり得るが、すべての患者が治療可能ではないと思われる。したがって、毒性作用が見られない限り、最大耐性用量で治療することは、有利であり得る。長期にわたる高用量患者における視覚機能の優れた保存は、このアプローチを支持する。また、この研究のために選択された患者は、一般に、残存網膜の非常に小さな島を伴う末期であり、したがって、治療する残りの網膜細胞が多くないことも考慮する必要がある。低用量は、はるかに大きな標的領域がベクターに曝露される初期段階の患者には不十分な場合がある。この研究に使用される薬学的製剤は、治療効果を改善し得るＰＲＥまたはＷＰＲＥ要素を含まないことにも注意すべきである。
【０５０４】
Ｈ５を除いて、残りの患者の自発蛍光の領域のさらなる狭窄は、単一遺伝子置換から生じる視覚機能の改善が常に網膜変性の遅延に関連する他の前臨床モデルと一致していなかった。しかしながら、ここで、２年間の時間枠にわたって測定された変性の進行は網膜変性の最端部にあるだけであり、この部分は救済するには進行し過ぎている可能性があることを考慮することは、重要である。対照的に、視力の向上は、主に中心網膜から生じた。また、コロイデレミアの網膜は、残存している網膜の縁を越えて剥離することは困難であり、その結果、上にある濾過胞が伸展される。網膜下腔の凹面形状は、中心に濾過胞の高さを増加させ、したがって、これは、流体が再吸収されるときに再付着する網膜の最後の部分になる。このことは、潜在的に、最周辺部と比較して、さらに数時間のベクターへのさらなる曝露を中心網膜に提供し得る。最終的に、目は無作為化されておらず、ベースラインで一部の患者に見られる残存している網膜の領域における目の間の違いは、変性の非対称率を示していることに注意すべきである。悪化した目を治療することにより、定義により、より急速な変性を伴う目を治療することにバイアスがかかる。
【０５０５】
研究期間を通して、すべての治療された目において視力が維持または増加したが、微小視野測定で測定された網膜感度は低下の傾向を示し、数値は治療されていない目よりも良好であったが、２つの間に統計学的有意差はなかった。これは、高コントラストの視力検査表で単一の文字の読み取りと比較して、微小視野測定を実行する際の変動の増加による可能性が最も高い。それにもかかわらず、試験は、それらが測定するものに微妙な違いがある。微小視野測定は、中心網膜の１０〜３０度を平均した多くの点から網膜機能を評価するのに対して、視力は、一般的に最大の感度で、中心に位置する単一の点からとられた測定である。したがって、網膜感度の維持は、測定されている領域全体の成功した形質導入から残存している網膜の縁に至るまで改善される。例えば、網膜色素上皮細胞の２０％のみを中心でベクターによってうまく形質導入した場合、これは、これらの細胞が中心窩の下にある場合、視力の向上を確認するには十分であり得る。しかしながら、形質導入されていない細胞の残りの８０％は変性し続け、この低下は経時的な微小視野測定における漸進的な低下に反映されるが、視力は安定したままであろう。しかしながら、遺伝子療法がうまく形質導入された領域の変性の停止に成功した場合、最終的には形質導入された細胞のみが残り、微小視野測定の読み取り値が安定し、経時的に一定に保たれ得る。この「プラトー」効果は、視力の向上も維持しており、最長のフォローアップを有するＬ１に現れている。あるいは、微小視野測定によって測定された網膜感度が、高コントラストの視力よりも白内障の形成に対してより感度が高いということが、単純な要因であり得る。硝子体切除術から２年後の時点で、有水晶体プロトコルで治療された１０人の患者のうち１人だけが白内障手術を受けていた。
【０５０６】
網膜下でのベクターの送達を含むこの及び任意の他の遺伝子療法研究の結果を解釈する場合、手術の成功は重要な要素である。網膜伸展の１つの潜在的な有害事象は、手術に関連していた。炎症の他の重要な有害事象は、注射中に硝子体腔内へのベクターの逆流があった場合にも同様に外科手術に関連している可能性があり、それは炎症を引き起こすことが知られている。治験の途中でプロトコルを変更した後、網膜下腔へのベクターの正確かつ制御された送達を可能にする網膜下注射の自動システムが採用された。これは、剥離された網膜のリアルタイム断面画像を提供し、より進行した患者の一部において網膜下腔を特定するために役立つ術中網膜走査（ＯＣＴ）によってさらに促進された。これらの追加的な外科的改善により、将来の遺伝子療法研究における安全性が向上する。それにもかかわらず、この第Ｉ／ＩＩ相臨床治験の結果は、コロイデレミアの遺伝子療法が一般的に安全であることを示す。
【０５０７】
実施例１４：Ｇｅｍｉｎｉ研究
これは、遺伝的に確認されたＣＨＭを持つ成人男性対象におけるＡＡＶ２−ＲＥＰ１の多施設非盲検、前向き、二国間介入安全性試験である。
【０５０８】
この研究は、スクリーニング来院、続いて、２つの治療期間（期間１及び期間２）で構成され、期間あたり最大９回の来院が行われる（図２２）。スクリーニング来院時に、対象は、両方の目の適格性について評価される。治験責任医師は、目を治療する順序（すなわち、それぞれ、研究目１［ＳＥ１］及び研究目２［ＳＥ２］）を割り当て、それぞれの目に番号を割り当てる。この割り当ては、対象と共同で行われるが、一般的にはまず悪い方の目を治療に選択する。ＳＥ１及びＳＥ２における外科的処置の間の目標間隔は、スクリーニング来院時に決定される。各研究目は、治療後少なくとも１２カ月間、治療期間あたり最大９回の来院で追跡する：来院１（０日目、注射の来院日）；来院２（１日目、術後フォローアップ来院）；来院３（３日目）；来院４（７日目）；来院５（１４日目）；来院６（１カ月目）；来院７（３カ月目）；来院８（６カ月目）及び来院９（１２カ月目）。
【０５０９】
期間１の来院１（０日目、ＳＥ１の注射の来院日）で、対象は、網膜剥離を伴う硝子体切除術を受け、ＳＥ１にＡＡＶ２−ＲＥＰ１の網膜下注射を受ける。来院２〜９は、期間２がこの期間中に開始されない限り、研究手順のスケジュールに従って行われる。期間１の来院２〜９の眼科評価は、両方の目に行われる。
【０５１０】
期間２の来院１（０日目、ＳＥ２の注射の来院日）で、対象は、網膜剥離を伴う硝子体切除術を受け、反対側の治療されていない目（ＳＥ２）にＡＡＶ２−ＲＥＰ１の網膜下注射を受ける。対象は、もはや期間１の来院スケジュールに従わないが、代わりに研究手順のスケジュールに従って期間２の来院２〜９に参加する。期間２の来院２〜９に予定されている眼科評価は、両方の目に行われる。
【０５１１】
対象は、研究を通して安全性及び有効性について評価され、評価は、研究手順のスケジュールに概説されている。白内障を発症した対象は、臨床的に必要と思われる場合、白内障手術を受けてもよい。白内障手術が行われる場合は、それぞれの目に対して１２カ月（来院９）前の少なくとも４週間前に行われる。
【０５１２】
主要エンドポイントは、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の両側投与後の安全性の評価である。研究の副次的エンドポイントは、糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）チャートによって測定された最高矯正視力（ＢＣＶＡ）におけるベースラインからの変化、自発蛍光（ＡＦ）におけるベースラインからの変化、スペクトルドメイン光干渉断層計（ＳＤ−ＯＣＴ）におけるベースラインからの変化、及び微小視野測定におけるベースラインからの変化を含む。
【０５１３】
試験対象患者基準：
スクリーニング来院時に、対象は、以下の試験対象患者基準のすべてを満たす場合、研究参加について適格である。試験対象患者基準：（１）研究に参加して両方の目を治療する意思がある、及びインフォームドコンセントを提供できる、（２）男性で１８歳以上である、（３）遺伝的に確認されたＣＨＭの診断を受けている、（４）両方の目の黄斑領域内で臨床的に可視的な活動性疾患がある、（５）ＡＡＶ２−ＲＥＰ１による事前の治療がない場合、両方の目において、７４以上のＥＴＤＲＳ文字（６／９または２０／３２スネレン、小数０．６３、ＬｏｇＭａｒ  ０．２以上に相当する）、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１による治療前を別の研究において受けていた場合、治療されていない目において７４以上のＥＴＤＲＳ文字（６／９または２０／３２スネレン、小数０．６３、ＬｏｇＭａｒ  ０．２以上に相当する）のＢＣＶＡを有する。別の研究において以前にＡＡＶ２−ＲＥＰ１で治療されていた場合、対象は、スポンサーの承認後に参加する資格があり得る。
【０５１４】
除外基準：
スクリーニング来院時に、対象は、以下の除外基準のうちのいずれかを満たす場合、研究参加には適格ではない。除外基準：（１）いずれかの目に弱視または炎症性疾患の病歴がある、（２）いずれかの目にＡＡＶ２−ＲＥＰ１で治療してから３カ月間、バリア避妊法の使用を望まない、（３）いずれかの目のスクリーニング来院から３カ月以内に眼内手術が行ったことがある、（４）任意の他の有意な眼球または非眼球疾患／障害を有し、治験責任医師の見解では、研究への参加のために対象を危険にさらす可能性があるか、または研究の結果、もしくは対象の研究への参加能力に影響を与える可能性がある、及び（５）ＡＡＶ２−ＲＥＰ１を用いて別の研究内で治療された場合を除いて、過去１２週間に治験薬を含む別の調査研究に参加したことがある、またはいかなる時点でも遺伝子／細胞ベースの治療法を以前に受けたことがある。この重大な眼球または非眼球疾患／障害は、治験責任医師の見解では、研究への参加のために対象を危険にさらす可能性がある、または研究の結果もしくは対象の研究への参加能力に影響を与える可能性があり、ａ）経口コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン／プレジニゾン）の禁忌、ｂ）いずれかの目に臨床的に重大な白内障がある、ｃ）治験責任医師の臨床見解では、網膜下手術の適切な候補者でない、潜在的な対象が含まれるが、これらに限定されない。
【０５１５】
試験生成物、投与量、及び投与方法：対象は、それぞれの目に対して硝子体切除術及び網膜剥離を行い、０．１ｍＬの体積の１×１０１１のＡＡＶ２−ＲＥＰ１ゲノム粒子を含む研究薬物の網膜下注射を受ける。
【０５１６】
評価基準：安全性評価は、完全眼科検査（眼圧［ＩＯＰ］、細隙灯検査、水晶体混濁度の等級付け及び拡張検眼鏡検査を含む）、眼底撮影、有害事象（ＡＥ）報告、ベクターの脱落及び免疫原性サンプリング、ならびにバイタルサインに基づいている。
【０５１７】
有効性：有効性評価は、ＢＣＶＡ（ＥＴＤＲＳチャートによって測定されるように）、眼底自発蛍光、ＳＤ−ＯＣＴ、及び微小視野測定に基づいている。
【０５１８】
統計的方法論：正式な試料サイズの計算は実行されなかった。連続変数は、記述統計学（すなわち、平均、標準偏差、９５％信頼区間［ＣＩ］、中央値、Ｑ１、Ｑ３、Ｐ０５、Ｐ９５、最小値、最大値）を使用して、経時的に要約される。カテゴリ変数は、計数、百分率、及び９５％ＣＩを使用して、経時的に記載される。要約は、来院及び目ごとに表にされる。正式な統計試験は、実行されない。ＡＥは、システム臓器クラス、好ましい用語、及び目ごとに要約される。ＡＥを経験している対象の数及び目の数、ならびに事象の数の両方が要約されている。同様の要約は、研究薬物／処置関連ＡＥ、中止につながるＡＥ、及び重篤なＡＥのために作成されるであろう。ＡＥは、最大の重症度、研究薬物／処置との関係、ならびに発症及び解消までの時間によっても要約される。ベクターの脱落及び免疫応答プロファイルについて説明する。残りの安全評価は、記述統計学を使用して解析される。
【０５１９】
ＣＨＭは、治療不能であり、本開示の薬学的組成物の開発前は、治療は支持的でしかなかった。この試験の対象に投与される薬学的組成物、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１は、野生型ヒトＲＥＰ１遺伝子の１．９６２ｋＢ相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）をカプセル化するＡＡＶ２粒子である。ＡＡＶ２−ＲＥＰ１は、高レベルのヒトＲＥＰ１タンパク質を発現し、ＲＥＰ１をヒトＣＨＭ線維芽細胞に復元し、ヒトＣＨＭ細胞の機能的救済を提供し、インビボでＣＨＭマウスの網膜にタンパク質を発現し、１つのログ単位で過剰発現する場合に、非毒性である。さらに、ヒトＲＥＰ１タンパク質の過剰発現は、網膜機能に大きな悪影響を与えない。
【０５２０】
ＣＨＭが両方の目に影響を与えることを考えると、この研究は、両側ＡＡＶ２−ＲＥＰ１投与を実証している。ＡＡＶ２ベクターを使用した非臨床及び臨床研究からの新興データは、ＡＡＶ２ベクターが両側投与後を含め、最小限の免疫応答を誘発することを示している。この研究の目的は、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１を用いた逐次的な両側性治療の安全性及び耐容性に関する重要な洞察を提供することである。
【０５２１】
投与された治療
適格な対象は、それぞれの目に硝子体切除術及び網膜剥離を受ける。期間１の来院１（０日目、ＳＥ１の注射の来院日）で、対象は、ＳＥ１において、０．１ｍＬの体積の１×１０１１のＡＡＶ２−ＲＥＰ１  ｇｐを含む研究薬物の網膜下注射を受ける。期間２の来院１（０日、ＳＥ２の注射の来院日）で、対象は、ＳＥ２において、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の同じ網膜下注射を受ける。
【０５２２】
薬学的組成物の説明
ＡＡＶ２ベクターには、ＲＥＰ１（ＡＡＶ２−ＲＥＰ１）をコードする組換えヒトｃＤＮＡが含まれている。ベクターゲノム（ＡＡＶ２−ＣＢＡ−ｈＲＥＰ１−ＷＰＲＥ−ＢＧＨ）は、強力な構成的発現カセット、ハイブリッドＣＢＡプロモーター、ＲＥＰ１をコードするヒトｃＤＮＡ、改変されたウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御性要素（ＷＰＲＥ）配列、及びＡＡＶ２逆方向末端反復が隣接するウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ−ポリＡ）配列から構成される。ｃＤＮＡ断片は、元来、非罹患の個人からのヒト網膜ｃＤＮＡライブラリから単離された。
【０５２３】
ＡＡＶ２−ＲＥＰ１製剤は、滅菌２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で製剤化され、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．００１％ＰＦ６８を含む。製剤は、１×１０１２ｇｐ／ｍＬの標的濃度を有する、透明からわずかに乳白色の無色滅菌濾過懸濁液である。
【０５２４】
ＡＡＶ２−ＲＥＰ１は、栓付きかつ蓋付きの滅菌バイアル中に供給される。合計０．３ｍＬのベクター懸濁液が、治療される各目に供給される。出荷前に、各バイアルは、ラベルの付いた二次容器に入れられる。製剤は、アクセス制御された、温度監視付き冷凍庫で、＜−６０℃（＜−７６°Ｆ）で保管される。
【０５２５】
硝子体切除術手順及びＡＡＶ２−ＲＥＰ１の注射
ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の注射は、適切に認定され、かつ経験を有する網膜外科医によって実行される。ＣＨＭにおける網膜の剥離の複雑さ及び予測不可能性のため、網膜及び脈絡膜は、非常に薄く、場所によって融合している可能性があり、網膜下遺伝子療法の技術に対する修正が開発されている。これは、硝子体切除術後の２つのステップでベクター送達を実行することを含む。２つのステップの手順の利点は、網膜剥離のいかなる予想外の合併症も保守的に管理され、ベクターの硝子体への脱出に関する懸念を最小化することができることである。さらに、例えば、ガスによる治療を必要とする黄斑円孔が形成された場合、注射は後日まで延期され得る。また、中心窩を剥離するために必要な液体の量は可変であるため、第１のステップからベクターを除去することにより、ゲノム粒子に関して正確な一貫した用量を、依然として網膜下腔に適用することができる。
【０５２６】
最初に、対象は、標準的な硝子体切除術及びそれぞれの研究目における後部硝子体の剥離を受ける（図２３）。すべての手術は、標準的なＢＩＯＭ硝子体切除システムを使用して行われる。２３ゲージの縫合アプローチは、創傷漏出のいかなる潜在的なリスクを回避するためにも、通常は推奨される。網膜は、硝子体注射セットに接続された４１ゲージの網膜下カニューレを通して注射された０．１〜０．５ｍＬの平衡塩溶液（ＢＳＳ）で剥離される。ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の単回投与は、同じ入口部位を通じて網膜下液中に注射される。
【０５２７】
手順の第２のステップでは、ＢＳＳカニューレは目から除去され、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１は注射のために調製される。１．０×１０１１の用量のＡＡＶ２−ＲＥＰ１  ｇｐは、同じ入口部位を通じて網膜下腔に注射される。ベクターは、気泡の形成を回避するために、１ｍＬシリンジ中で刺激される必要があり、コネクタは、１ｍＬシリンジが硝子体切除術機の定圧ラインに接続され得るように使用される。網膜下注射は、黄斑のいかなる領域も標的とするが、可能な場合、中心窩も含む。いずれの場合にも、網膜下液は、眼底自発蛍光によって特定されるように、脈絡網膜の変性をまだ受けていない中央領域のエッジ境界をすべて覆うように、ベクターが注射される。創傷閉鎖後、目を通過した可能性のあるすべての洗浄液を処分して、潜在的なベクターの広がりを制限するように注意が払われる。
【０５２８】
併用療法：
対象は、過去１２週間に治験薬を含む別の研究に参加する、またはＡＡＶ２−ＲＥＰ１を用いて別の研究で治療された場合を除いて、これまでにいかなる時点でも遺伝子／細胞ベースの治療を受けることはできない。研究を通して、治験責任医師は、適切な支持療法を提供するために必要であると見なされる併用薬または治療剤を処方することができる。併用薬の詳細は、スクリーニング来院時に回収され、すべての研究来院（該当する場合、ＥＴ来院を含む）で更新される。研究中に服用した併用薬（経口コルチコステロイドを含む）は、対象の医療記録及びｅＣＲＦに記録され、これに対する例外は、研究手順を実施する過程で使用されるあらゆる薬物である（例えば、麻酔、拡張点眼薬）。
【０５２９】
手術による炎症及びベクター／トランス遺伝子に対する潜在的または予想外の免疫応答を最小限に抑えるために、すべての対象に、各手術の前に、２１日間のコースで経口プレドニゾン／プレドニゾロンが投与される。したがって、各手術において、これは、１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾン／プレドニゾロンが合計１０日間（ベクター注射の２日前に開始、注射当日、次いで７日間）、続いて０．５ｍｇ／ｋｇ／日で７日間；０．２５ｍｇ／ｋｇ／日で２日間；及び０．１２５ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（合計２１日間）であり得る。コルチコステロイドの使用法の詳細は、各対象が日記カードに記録する。
【０５３０】
研究手順
各研究来院時に、両方の目ですべての手順を実行する試みを行う必要がある。
【０５３１】
スクリーニング来院
治験責任医師は、研究の目的、手順、及びそれぞれの潜在的な研究対象に対する対象の責任について説明する。スクリーニング手順は、以下から構成される（すべての目の評価は両方の目で行われる）：人口統計学、病歴及び眼科歴、バイタルサイン、体重、ベクターの脱落サンプリング−血液、涙（両方の目）、尿、唾液、免疫原性サンプリング（酵素免疫測定法［ＥＬＩＳＡ］及び酵素結合免疫スポット［ＥＬＩＳＰＯＴ］）、ＢＣＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、自発蛍光、微小視野測定、７視野カラー眼底写真（視野１、２、及び３のステレオ写真を含む）、重篤なＡＥ（ＳＡＥ）モニタリング、薬歴調査。
【０５３２】
試験対象患者基準のすべてを満たし、除外基準のいずれも満たさない対象には、対象番号が割り当てられ、研究に登録される。治験担当医師は、目を治療する順序（すなわち、それぞれ、ＳＥ１及びＳＥ２）を割り当てる。これは、対象と共同で行われるが、一般的にはまず悪い方の目を治療に選択する。ＳＥ１及びＳＥ２における外科的処置の間の目標間隔は、この来院時に決定される。
【０５３３】
各対象について、ＳＥ１及びＳＥ２の治療の間隔は、数週間から数カ月の範囲であると予想される。この間隔はケースバイケースを基本に決定される一方で、連続的治療投与の免疫学的及び安全性プロファイルをより良く特徴付けるため、さまざまな治療間隔（例えば、１、３、または６カ月以上の間隔で）を計画する努力が、なされるべきである。
【０５３４】
次の研究来院（期間１、来院１）は、スクリーニング来院から１０週間以内にスケジュールされる。対象は、２回目の手術の来院（期間２、来院１）が開始しない限り、期間１の来院２〜９に参加し、これにより、研究期間２の開始がマークされる。２回目の手術の来院（期間２、来院１）のタイミングは、対象によって異なるため、研究期間１の期間も変動する。
【０５３５】
対象は、２１日間のコースで経口コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン／プレドニゾロン）が２回投与され、次の手術、ＳＥ１では期間１の来院１、及びＳＥ２では期間２の来院１の２日前に薬物摂取を開始するように指示される。対象には、２１日間の各期間を通してコルチコステロイドのコンプライアンスを記録するための日記カードが発行される。対象は、治療されてから３カ月間、バリア避妊を使用するように指示される。
【０５３６】
処置のスケジュールは、期間１及び２と同一であり、各期間中、処置は、ＳＥ１及びＳＥ２の両方で実行される。
【０５３７】
対象が、ＣＨＭの治療のためにＡＡＶ２−ＲＥＰ１の臨床治験にこれまでに参加したことがあり、片方の目にＡＡＶ２−ＲＥＰ１を投与されている場合、治療されていない目は、スクリーニング来院時にＳＥ２として割り当てられ、対象は、直ちに期間２に入る。
【０５３８】
期間１及び２、来院１（０日目、注射の来院日）
来院１（０日目、注射の来院日）では、以下の評価が行われる：完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、及び併用薬歴調査（コルチコステロイド日記カードの見直しを含む）。
【０５３９】
次いで、対象は、硝子体切除術を受け、第１の（ＳＥ１）目に、０．１ｍＬの体積の１×１０１１ｇｐを含むＡＡＶ２−ＲＥＰ１の網膜下注射を受ける。
【０５４０】
対象は、処置中のＡＥの発生について注意深くモニタリングされる。対象は、術後フォローアップ（それぞれ、来院２［１日目］、来院３［３日目］、来院４［７日目］、及び来院５［１４日目］）のために手術から１、３、７、及び１４日後に施設に戻る。
【０５４１】
ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の安全性及び免疫原性プロファイルを正確に特徴付けるために、計画された治療日から３カ月以内に同じ目に以前の眼内手術が行われた場合、ＳＥ２の治療は行うべきではない。眼内手術が３カ月以内に行われた場合、ＳＥ２の治療は、３カ月の間隔が経過し、目の完全な術後回復が見られるまで延期するべきである。
【０５４２】
期間１及び２、来院２（術後来院１日目）
来院２では、眼球の評価及び処置が各目に対して行われる。来院２（１日目）では、対象は、来院１（期間１［ＳＥ１］または期間２［ＳＥ２］）で手術を受けたのと同じ目における１回目の術後来院のために施設に戻る。以下の評価が行われる：バイタルサイン、ベクターの脱落サンプリング−血液、涙（両方の目）、尿、唾液、免疫原性サンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、薬歴調査（コルチコステロイド日記カードの見直しを含む）。
【０５４３】
期間１及び２、来院３（３日目）
来院３（３日目）では、眼球の評価及び処置が各目に対して行われる。来院３（３日目）で、対象は、来院１（期間１［ＳＥ１］または期間２［ＳＥ２］）で手術を受けたのと同じ目における２回目の術後来院のために施設に戻る。以下の評価が行われる：バイタルサイン、ベクターの脱落サンプリング−血液、涙（両方の目）、尿、唾液、ＢＣＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、及び薬歴調査（コルチコステロイド日記カードの見直しを含む）。
【０５４４】
期間１及び２、来院４（７日目）
来院４（７日目±１日）では、眼球の評価及び処置が各目に対して行われる。来院４（７日目±１日）で、対象は、来院１（期間１［ＳＥ１］または期間２［ＳＥ２］）で手術を受けたのと同じ目における３回目の術後来院のために施設に戻る。以下の評価が行われる：ベクターの脱落サンプリング−血液、涙（両方の目）、尿、唾液、免疫原性サンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、自発蛍光、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、及び薬歴調査（コルチコステロイド日記カードの見直しを含む）。
【０５４５】
期間１及び２、来院５（１４日目）
来院５（１４日目±３日）では、眼球の評価及び処置が各目に対して行われる。来院５（１４日目±３日）で、対象は、来院１（期間１［ＳＥ１］または期間２［ＳＥ２］）で手術を受けたのと同じ目における４回目の術後来院のために施設に戻る。以下の評価が行われる：ベクターの脱落サンプリング−血液、涙（両方の目）、尿、唾液、免疫原性サンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、自発蛍光、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、及び薬歴調査（コルチコステロイド日記カードの見直しを含む）。
【０５４６】
期間１及び２、来院６（１カ月目）及び来院７（３カ月目）
来院６（１カ月目±７日）及び来院７（３カ月目±１４日）では、眼球の評価及び処置が各目に対して行われる。以下の評価が行われる：ベクターの脱落サンプリング−血液、涙（両方の目）、尿、唾液、免疫原性サンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、自発蛍光、微小視野測定、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、ならびに薬歴調査（コルチコステロイド日記カードの見直し及び返還を含む）。
【０５４７】
期間１及び２、来院８（６カ月目）及び来院９（１２カ月目）
来院８（６カ月目±１４日）及び来院９（１２カ月目±１４日）では、眼球の評価及び処置が各目に対して行われる。以下の評価が行われる：バイタルサイン（来院９、１２カ月目のみ）、免疫原性サンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、自発蛍光、微小視野測定、
【数１】
2021520233.tif 000110
−視野カラー眼底写真（視野１、２、及び３のステレオ写真を含む）（来院９、１２カ月目のみ）、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、及び薬歴調査。
【０５４８】
早期終了
対象がいかなる時点でも研究を中止した場合には、施設は、適切なあらゆる努力を払って、ＥＴ来院が確実に行われるようにする必要がある。以下の評価が行われなければならない（すべての眼科評価は両方の目で行われる）：バイタルサイン、ベクターの脱落サンプリング−血液、涙（両方の目）、尿、唾液（ＥＴ来院が治療後３カ月以内に発生した場合のみ）、免疫原性サンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、自発蛍光、微小視野測定、７視野カラー眼底写真（視野１、２、及び３のステレオ写真を含む）、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、及び薬歴調査。
【０５４９】
有害事象
ＡＥは、臨床調査対象における任意の有害な医学的発生であり、必ずしも研究薬物治療／外科的処置との因果関係を有するわけではない。したがって、ＡＥとは、任意の好ましくない、意図しない兆候（異常な検査所見を含む）、症状、または治験薬に関連するか否かにかかわらず、薬物治療／外科的処置の使用、もしくはこのプロトコルに記載される外科的処置の使用と一時的に関連している疾患であり得る。ＡＥには、いかなる既存の状態（ＣＨＭ以外）または研究中に悪化する（すなわち、頻度もしくは強度を増加する）疾病も含まれる。
【０５５０】
重篤有害事象
ＳＡＥとは、死に至り、生命にかかわる事象であり、入院患者の入院もしくは既存の入院の延長を必要とし、永続的もしくは重大な身体障害／運動不能をもたらし、先天性異常／出生異常をもたらし、失明に至るか、または視力を脅かし、別の重要な医療事象（複数可）である、任意の有害な医学的事象として定義される。「重篤な」の定義における「生命にかかわる」という用語は、事象の時に対象が死のリスクにある事象を指す。それは、仮にそれがより重度であった場合に死を引き起こし得る事象を指さない。悪化していない選択的処置を含む既存の状態の入院は、ＳＡＥを構成しない。死をもたらしたり、生命を脅かしたり、入院を必要とする可能性はない他の事象は、適切な医学的判断を基にして、その事象が、対象を危険にさらし得、上記の結果のうちの１つを防ぐために医学的または外科的介入が必要であり得る場合に、ＳＡＥと見なされ得る。
【０５５１】
以下の失明または視力を脅かす事象は、ＳＡＥとして報告される：手術関連の事象を除いて、ベースラインと比較したＥＴＤＲＳチャートでのＶＡの１５文字以上の持続的な減少。持続的とは、回復するまで４８時間以上続くと定義され、回復とは、ベースラインＶＡの５文字以内に戻るＶＡとして定義される。
【０５５２】
ＶＡ減少の手術関連事象は、研究薬物治療の外科的投与との密接な時間的関連（２４時間以内に）で発生するＶＡ減少として定義され、術後７日目（期間１／２、来院４）で解消する。これらの事象は、ＡＥまたはＳＡＥとして報告されない。しかしながら、治験責任医師の見解では、期間または重症度の観点からのそれらの進展を手順で説明できない場合、それらはＡＥとして報告されるべきである。これには、手術後のＶＡ減少の異常な経過が、手術または研究薬物治療に起因する別の合併症に関連している場合、または術後のＶＡ減少の異常な経過が別の特定できる原因に起因し得る場合が含まれるが、これらに限定されない。治験責任医師の見解では、視力の永久的喪失を防ぐために、任意の外科的または医学的介入を実際にまたは潜在的に必要とするＡＥ。
【０５５３】
実験的評価
ベクターの脱落
血液、涙（両方の目）、尿、及び唾液の試料を回収し、適切なアッセイを使用して、ベクターの脱落及び分散の証拠を試験する。
【０５５４】
免疫原性
免疫原性の評価のために、表６１（研究手順のスケジュール）に示されている時間で血液を採血する。イムノアッセイは、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１に対する抗体及び細胞ベースの応答を評価するために計画されている。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、導入遺伝子に対するＴ細胞性免疫応答に使用され、抗体応答は、ＥＬＩＳＡベースの方法を使用してアッセイされる。
【０５５５】
バイタルサイン
バイタルサイン（脈拍及び収縮期及び拡張期血圧）は、表６１（研究手順のスケジュール）に示されている時間で取得される。バイタルサインは、対象が少なくとも５分間座った後に取得する必要がある。
【０５５６】
完全眼科検査
完全眼科検査は、表６１（研究手順のスケジュール）に示されている時間で、両方の目に対して行われる。各眼科検査には、ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁度の等級付け、及び拡張型検眼鏡検査が含まれる。同じ細隙灯機及び照明条件は、任意の所与の対象の研究来院全体にわたって使用されるべきである。上記のパラメータに加えて、対象は、ベクター投与後の眼内炎症の存在について慎重に検査される。白内障はまた、硝子体切除術の結果として発生することもあり、ＶＡに潜在的に影響を与え得る。したがって、術前の水晶体混濁度及び色の等級付けを文書化するべきである。白内障を発症した対象は、臨床的に必要と思われる場合、白内障手術を受けることがある。白内障手術が行われる場合は、それぞれの目に対して１２カ月目（来院９）の少なくとも４週間前に行われるべきである。
【０５５７】
７視野カラー眼底写真
７視野カラー眼底写真は、表６１（研究手順のスケジュール）に示されている時間で、両方の目に対して行われる。眼底写真は、瞳孔拡張後に認定技術者によって行われる。ステレオ写真は、視野１、２、及び３で行われる必要がある。すべての眼底写真は、施設から見直しのためにＣｅｎｔｒａｌ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＣＲＣ）に送信され、ＣＲＣは、データを電子データ収集（ＥＤＣ）システムに入力する。眼底写真の完全な技術的明細事項については、（測定値が得られる方法に関するＣＲＣからの手順が含まれる）Ｓｔｕｄｙ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【０５５８】
有効性の評価
視力
研究期間にわたる視力（ＶＡ）の変化を評価するために、ＢＣＶＡは、ＥＴＤＲＳ  ＶＡチャートを使用して評価され、表６１（研究手順のスケジュール）に示されている時間で、両方の目に対して行われる。瞳孔拡張の前に、ＢＣＶＡ試験を実行し、ＢＣＶＡを測定する前に、遠方屈折を実行する必要がある。最初に、文字は、チャートから４メートルの距離で読み取られる。４メートルで２０文字未満を読み取る場合、１メートルで試験を行う必要がある。ＢＣＶＡは、対象が正しく読み取った文字の数として報告される。ＢＣＶＡについて、評価者は、評価を行うために適切に認定されるであろう。
【０５５９】
眼底自発蛍光
生存可能な網膜組織の領域の変化を評価するために、眼底自発蛍光は、表６１（研究手順のスケジュール）に示されている時間で、両方の目に対して行われる。
【０５６０】
スペクトラルドメイン光干渉断層法（ＳＤ−ＯＣＴ）
ＳＤ−ＯＣＴは、表６１（研究手順のスケジュール）に示されている時間で、両方の目に対して行われる。ＳＤ−ＯＣＴは、楕円体ゾーンの完全性と、外顆粒層及び脈絡膜からのシグナルの低減と、を定量化するために使用される。加えて、中心窩の変化が評価される。
【０５６１】
微小視野測定
微小視野測定は、表６１（研究手順のスケジュール）に示されている時間で、両方の目に対して行われる。微小視野測定は、黄斑内の網膜感度の変化を評価するために行われる。
【０５６２】
【表６１】
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【０５６３】
実施例１５：Ｓｔａｒ研究
この研究は、非盲検、マスク化された結果アセスメント、前向き、無作為化、並行対照群、多施設共同、全体的、介入研究である。研究は、１２カ月の評価期間を持つ８回の来院で構成されている。スクリーニング／ベースライン来院時に、各対象は、適格性について評価される。適格な対象に対して、研究目が割り当てられ、対象は、２：１：２の比で無作為化され、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１高用量（１．０×１０１１ゲノム粒子［ｇｐ］）、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１低用量（１．０×１０１０ｇｐ）のいずれかを受けるか、または未治療対照群に入る。
【０５６４】
注射の来院日（来院２、０日目）で、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の高用量及び低用量の治療群の対象は、硝子体切除術を受け、二重マスク化の様式で、研究目に割り当てられた治療用量のＡＡＶ２−ＲＥＰ１の網膜下注射を受け、これらの対象は、１日目（来院３）及び７日目（来院４）の２回の術後フォローアップ来院のために施設に戻る。対照群の対象は、手術を受けていないか、研究目（すなわち、対照研究目）において任意の研究薬物を受けているか、または２回の施設内術後来院に参加している。代わりに、施設からの電話連絡は、０日目（来院２）、１日目（来院３）、及び７日目（来院４）に対照群に発生する。すべての対象は、来院２（０日目）から１２カ月間追跡される。
【０５６５】
研究データは、各対象の両方の目で回収される。ＡＡＶ２−ＲＥＰ１治療は全身麻酔下での侵襲的外科的処置を必要とするため、スポンサー、治験責任医師、及び対象は、研究処置（すなわち、硝子体切除術及び網膜下注射）に対してマスク化されていないが、治療群内では、スポンサー、治験責任医師、及び対象は、割り当てられた用量（１．０×１０１１ｇｐまたは１．０×１０１０ｇｐ）にマスク化される。治療されている及び治療されていない目の評価の潜在的な偏りをさらに最小限に抑えるために、スクリーニング／ベースライン来院（来院１）及び１カ月目（来院５）以降（１２カ月目の主要エンドポイントの評価を含む）のすべての主観的眼科評価は、マスク化された評価者によって行われる。
【０５６６】
対象は、研究手順のスケジュールに示されているように、研究を通して有効性及び安全性について評価される。白内障を発症した対象は、臨床的に必要と思われる場合、白内障手術を受けてもよく、手術を行った場合、１２カ月目の来院／研究終了（ＥＯＳ）来院の少なくとも４週間前に行われるべきである。
【０５６７】
対象
２：１：２の比で無作為化されたおよそ１４０人の対象；ＡＡＶ２−ＲＥＰ１高用量（１．０×１０１１ｇｐ）群の５６人の対象、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１低用量（１．０×１０１０ｇｐ）の２８人の対象、及び未治療対照群の５６人の対象。
【０５６８】
試験対象患者基準：対象は、以下の試験対象患者基準のすべてを満たしている場合、研究参加の資格がある：（１）研究への参加について、インフォームドコンセントを提供する意思があり、同意できること、（２）男性で１８歳以上である、（３）遺伝的に確認されたＣＨＭの診断を受けている、（４）研究目において黄斑領域内に臨床的に可視的な活動性疾患を有する、（５）研究目において３４〜７３  ＥＴＤＲＳ文字のＢＣＶＡを有する（６／１２または２０／４０スネレン視力以下に相当するが、６／６０または２０／２００スネレン以上に相当する）。
【０５６９】
除外基準：以下の除外基準のいずれかを満たしている場合、対象は研究への参加資格がない：（１）適格な目に弱視の病歴がある、（２）ＡＡＶ２−ＲＥＰ１で治療した場合、３カ月間バリア避妊法の使用を望まない、（３）来院１から３カ月以内に研究目において眼内手術を以前に行ったことがある、（４）任意の他の重大な眼球または非眼球疾患／障害を有し、治験責任医師の見解では、研究への参加のために対象を危険にさらす可能性があるか、または研究の結果、もしくは対象の研究への参加能力に影響を与える可能性がある（経口コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン／プレジニゾン）の禁忌、臨床的に重大な白内障を患っており、治験責任医師の臨床的見解では、網膜下手術の適切な候補者でないなどであるが、これらに限定されない）、ならびに（５）過去１２週間に治験薬を含む別の調査研究に参加したか、またはいかなる時点でも遺伝子／細胞ベースの治療法を以前に受けたことがある。
【０５７０】
試験生成物、投与量、及び投与方法：積極的な治療を受けているすべての対象は、硝子体切除術を受け、研究目において、０．１ｍＬの体積の高用量（１．０×１０１１ｇｐ）のＡＡＶ２−ＲＥＰ１または低用量（１．０×１０１０ｇｐ）のＡＡＶ２−ＲＥＰ１のいずれかを含む研究薬物の網膜下注射を受ける。
【０５７１】
評価に対する基準：
主要有効性エンドポイントは、糖尿病網膜症の早期治療研究（ＥＴＤＲＳ）チャートによって測定された、１２カ月目での最高矯正視力（ＢＣＶＡ）におけるベースラインから１５文字以上の改善を有する対象の割合である。主要な副次的エンドポイントは、１２カ月間のＢＣＶＡの変化と比較した場合に、１２カ月目のＢＣＶＡのベースラインから１５文字以上の改善を有する対象の割合である。他の副次的エンドポイントには、（１）１２カ月目のＢＣＶＡのベースラインからの１０文字超の増加を有する対象の割合、（２）４、８、及び１２カ月目に回収されたＢＣＶＡのベースラインからの平均変化の平均、（３）１２カ月の保存された自発蛍光（ＡＦ）の全領域のベースラインからの変化、（４）１２カ月目の保存された楕円ゾーンの領域におけるベースラインからの変化（スペクトルドメイン光干渉断層計［ＳＤ−ＯＣＴ］）、（５）１２カ月目の微小視野測定のベースラインからの変化、（６）１２カ月目のコントラスト感度スコアのベースラインからの変化、（７）１２カ月目の色覚のベースラインからの変化、（８）１２カ月目の読書速度試験のベースラインからの変化、（９）ＥＴＤＲＳチャートで測定される１２カ月目のＢＣＶＡの維持、（１０）１２カ月目の２５項目の視覚機能アンケート（ＶＦＱ−２５）のベースラインからの変化、が含まれる。予備的有効性エンドポイントには、他の解剖学的及び機能的結果判定法のタン評価が含まれる。安全性エンドポイントには、有害事象（ＡＥ）を含む安全性評価の評価が含まれる。
【０５７２】
有効性：有効性評価は、ＢＣＶＡ、眼底ＡＦ、ＳＤ−ＯＣＴ、微小視野測定、コントラスト感度、色覚、読書速度試験評価、ＶＦＱ−２５、及び低輝度視力（ＬＬＶＡ）に基づいている。
【０５７３】
安全性：安全性評価は、完全眼科検査（眼圧、細隙灯検査、水晶体混濁度の等級付け、及び拡張型検眼鏡検査を含む）、眼底写真、ＡＥ報告、免疫原性、及びバイタルサインに基づいている。有効性評価（例えば、ＢＣＶＡ）の結果として回収された任意の安全性情報は、必要に応じて全体的な安全性評価に使用される。
【０５７４】
研究設計
図２４は、この研究の設計の概略図を提供する。
【０５７５】
スクリーニング／ベースライン来院（来院１）時に、各対象は、両方の目の適格性について評価される。対象に適格な目が１つしかない場合、その目は、「研究目」と表され、対象のもう一方の（適格でない）目は、「僚目」と表される。対象に２つの適格な目がある場合、「研究目」の選択は、臨床的根拠に基づいて行われ、一般に罹患した悪い方の目である。この決定は、詳細に議論され、インフォームドコンセントプロセスの一部として各対象が同意する。対象の選択は、変性が２つの目で比較的対称的である場合に考慮される。
【０５７６】
スクリーニング／ベースライン来院時に、適格な対象は、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１高用量群（１．０×１０１１ｇｐ）、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１低用量群（１．０×１０１０ｇｐ）、または未治療対照群のいずれかに、２：１：２の比で無作為化される。研究設計の理解を容易にするために、目は、治療群の割り当て及び研究／僚目の指定に基づいて４つのカテゴリ：ＡＡＶ２−ＲＥＰ１研究目（高用量及び低用量を含む）、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１僚目（高用量及び低用量を含む）、対照研究目、ならびに対照僚目、に分類される。
【０５７７】
注射の来院日（来院２、０日目）で、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の治療群の対象は、硝子体切除及び網膜剥離術を受けた後に、二重マスク化の様式で、研究目（すなわち、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１研究目）においてＡＡＶ２−ＲＥＰ１高用量（１．０×１０１１ｇｐ）またはＡＡＶ２−ＲＥＰ１低用量（１．０×１０１０ｇｐ）の網膜下注射を受け、これらの対象は、１日目（来院３）及び７日目（来院４）の２回の術後フォローアップ来院のために施設に戻る。対照群の対象は、手術を受けていないか、研究薬物を受け取っていないか、または２回の施設内安全性術後来院に参加している。代わりに、施設からの電話連絡は、０日目（来院２）、１日目（来院３）、及び７日目（来院４）に対照群に発生する。すべての対象は、来院２（０日目）から１２カ月間追跡される。
【０５７８】
研究データは、各対象の両方の目で回収される。ＡＡＶ２−ＲＥＰ１治療は、全身麻酔下での侵襲的外科的処置を必要とするため、スポンサー、治験責任医師、及び対象は、研究処置（すなわち、硝子体切除術及び網膜下注射）に対してマスク化されていないが、治療群内では、スポンサー、治験責任医師、及び対象は、割り当てられた用量（１．０×１０１１ｇｐまたは１．０×１０１０ｇｐ）にマスク化（すなわち、二重マスク化）される。治療されている及び治療されていない目の評価の潜在的な偏りをさらに最小限に抑えるために、スクリーニング／ベースライン来院（来院１）及び１カ月目（来院５）以降のすべての主観的眼科評価は、マスク化された評価者によって行われる。対象は、研究を通して有効性及び安全性について評価される。有効性評価は、ＢＣＶＡ、眼底ＡＦ、ＳＤ−ＯＣＴ、微小視野測定、コントラスト感度、色覚、読書速度試験評価、ＶＦＱ−２５、及び低輝度視力（ＬＬＶＡ）に基づいている。安全性評価は、完全眼科検査（眼圧［ＩＯＰ］、細隙灯検査、水晶体混濁度の等級付け、及び拡張検眼鏡検査を含む）、眼底撮影、有害事象（ＡＥ）報告、実験的評価（免疫原性）、ならびにバイタルサインに基づいている。有効性評価の結果として回収された安全性情報（ＢＣＶＡなど）は、必要に応じて全体的な安全性評価に使用される。
【０５７９】
白内障を発症した対象は、臨床的に必要と思われる場合、白内障手術を受けてもよく、手術を行った場合、１２カ月目の来院／研究終了（ＥＯＳ）来院（主要エンドポイント）の少なくとも４週間前に行われるべきである。
【０５８０】
対象は、１２カ月目の評価を完了した場合、研究を完了したと見なされる。治験の終了は、最後の対象が１２カ月目の評価を完了した（または早期中止の場合の早期終了［ＥＴ］評価）日付、または最後の対象がフォローアップを失った場合、最後のデータ回収の日付である。研究完了後、治療された対象は、５年間の治療後の期間にわたって継続的な有効性及び安全性のモニタリングを可能にする長期フォローアップ研究に参加するよう招待される。
【０５８１】
投与された治療
スクリーニング／ベースライン来院時に、適格な対象は、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１低用量（１．０×１０１０ｇｐ）またはＡＡＶ２−ＲＥＰ１高用量（１．０×１０１１ｇｐ）のいずれかを受けるために、２：１：２の比で無作為化されるが、未治療対照群の対象は、偽手術も研究薬物治療も受けない。注射の来院日（来院２、０日目）時に、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１を、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１群の対象の硝子体切除術後に、網膜下注射として投与される。
【０５８２】
薬学的組成物の説明
ＡＡＶ２ベクターには、ＲＥＰ１（ＡＡＶ２−ＲＥＰ１）をコードする組換えヒトｃＤＮＡが含まれている。ベクターゲノム（ＡＡＶ２−ＣＢＡ−ｈＲＥＰ１−ＷＰＲＥ−ＢＧＨ）は、強力な構成的発現カセット、ハイブリッドＣＢＡプロモーター、ＲＥＰ１をコードするヒトｃＤＮＡ、改変されたウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御性要素（ＷＰＲＥ）配列、及びＡＡＶ２逆方向末端反復が隣接するウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ−ポリＡ）配列から構成される。ｃＤＮＡ断片は、元来、非罹患の個人からのヒト網膜ｃＤＮＡライブラリから単離された。
【０５８３】
ＡＡＶ２−ＲＥＰ１製剤は、滅菌２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で製剤化され、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．００１％ＰＦ６８を含む。製剤は、１×１０１２ｇｐ／ｍＬの標的濃度を有する、透明からわずかに乳白色の無色滅菌濾過懸濁液である。
【０５８４】
ＡＡＶ２−ＲＥＰ１は、栓付きかつ蓋付きの滅菌バイアル中に供給される。合計０．３ｍＬのベクター懸濁液が、治療される各目に供給される。出荷前に、各バイアルはラベルの付いた二次容器に入れられる。製剤は、制御されたアクセスの温度監視付き冷凍庫で、＜−６０℃（＜−７６°Ｆ）で保管される。
【０５８５】
硝子体切除術手順及びＡＡＶ２−ＲＥＰ１の注射
ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の注射は、適切に認定され、かつ経験を有する網膜外科医によって実行される。ＣＨＭにおける網膜の剥離の複雑さ及び予測不可能性のため、網膜及び脈絡膜は、非常に薄く、場所によって融合している可能性があり、網膜下遺伝子療法の技術に対する修正が開発されている。これは、硝子体切除術後の２つのステップでベクター送達を実行することを含む。２つのステップの手順の利点は、網膜剥離のいかなる予想外の合併症も保守的に管理され、ベクターの硝子体への脱出に関する懸念を最小化することができることである。さらに、例えば、ガスによる治療を必要とする黄斑円孔が形成された場合、注射は後日まで延期され得る。また、中心窩を剥離するために必要な液体の量は可変であるため、第１のステップからベクターを除去することにより、ゲノム粒子に関して正確な一貫した用量を、依然として網膜下腔に適用することができる。
【０５８６】
最初に、対象は、標準的な硝子体切除術及びそれぞれの研究目における後部硝子体の剥離を受ける（図２３）。すべての手術は、標準的なＢＩＯＭ硝子体切除システムを使用して行われる。２３ゲージの縫合アプローチは、創傷漏出のいかなる潜在的なリスクを回避するためにも、通常は推奨される。網膜は、硝子体注射セットに接続された４１ゲージの網膜下カニューレを通して注射された０．１〜０．５ｍＬの平衡塩溶液（ＢＳＳ）で分離される。ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の単回投与は、同じ入口部位を通じて網膜下液中に注射される。
【０５８７】
手順の第２のステップでは、ＢＳＳカニューレは目から除去され、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１は注射のために調製される。１．０×１０１１の用量のＡＡＶ２−ＲＥＰ１  ｇｐを同じ入口部位から網膜下腔に注射する。ベクターは、気泡の形成を回避するために、１ｍＬシリンジ中で刺激される必要があり、コネクタは、１ｍＬシリンジが硝子体切除術機の定圧ラインに接続され得るように使用される。網膜下注射は、黄斑のいかなる領域も標的とするが、可能な場合、中心窩も含む。いずれの場合にも、網膜下液が、眼底自発蛍光によって特定されるように、脈絡網膜の変性をまだ受けていない中央領域のエッジ境界をすべて覆うように、ベクターが注射される。創傷閉鎖後、眼を通過した可能性のあるすべての洗浄液を処分して、潜在的なベクターの広がりを制限するように注意が払われる。
【０５８８】
無作為化
スクリーニング／ベースライン来院時に、すべての患者は、センター番号及び対象番号を含むスクリーニング識別子が割り当てられる。対象が、スクリーニング／ベースライン来院時に、すべての適格性基準を満たしている場合、研究目が割り当てられ、対象は、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１高用量（１．０×１０１１ｇｐ）、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１低用量（１．０×１０１０ｇｐ）のいずれかを受けるか、または未治療対照群に入るように、２：１：２の比で無作為化される。無作為化は、無作為化番号への治療群の無作為割り当てを自動化する検証済みシステムを使用して生成され、外科群によって層別化される。
【０５８９】
併用療法：
対象は、過去１２週間に治験薬を含む別の研究に参加する、またはＡＡＶ２−ＲＥＰ１を用いて別の研究で治療された場合を除いて、これまでにいかなる時点でも遺伝子／細胞ベースの治療を受けることはできない。研究を通して、治験責任医師は、適切な支持療法を提供するために必要であると見なされる併用薬または治療剤を処方することができる。併用薬の詳細は、スクリーニング来院時に回収され、すべての研究来院（該当する場合、ＥＴ来院を含む）で更新される。研究中に服用した併用薬（経口コルチコステロイドを含む）は、対象の医療記録及びｅＣＲＦに記録され、これに対する例外は、研究手順を実施する過程で使用されるあらゆる薬物である（例えば、麻酔、拡張点眼薬）。
【０５９０】
手術による炎症及びベクター／導入遺伝子に対する潜在的または予想外の免疫応答を最小限に抑えるために、すべての対象に、各手術の前に、２１日間のコースで経口プレドニゾン／プレドニゾロンが投与される。したがって、各手術において、これは、１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾン／プレドニゾロンが合計１０日間（ベクター注射の２日前に開始、注射当日、次いで７日間）、続いて０．５ｍｇ／ｋｇ／日で７日間；０．２５ｍｇ／ｋｇ／日で２日間；及び０．１２５ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（合計２１日間）であり得る。コルチコステロイドの使用法の詳細は、各対象が日記カードに記録する。
【０５９１】
研究来院及び手順
研究手順のスケジュールが、表６２：研究手順のスケジュールに示される。
【０５９２】
来院１（スクリーニング／ベースライン来院）
治験責任医師は、研究の目的、手順、及びそれぞれの潜在的な研究対象に対する対象の責任について説明する。プロトコル要件を満たす対象の意欲及び能力が判定される。
【０５９３】
インフォームドコンセントが得られた後、対象は、対象識別子番号が割り当てられ、適格性を判定するために評価される。スクリーニング／ベースライン手順は、以下から構成される（必要に応じて、評価は連続した２日間にまたがることができる）：人口統計学、病歴及び眼科歴（遺伝的に確認されたＣＨＭに罹患している対象のみが研究に登録することができる。遺伝的確認は、来院１の前に得られなければならない）、バイタルサイン、体重、イムノアッセイのサンプリング（酵素結合免疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］及び酵素結合免疫スポット［ＥＬＩＳＰＯＴ］）、ＢＣＶＡ、ＬＬＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、ＡＦ、微小視野測定、コントラスト感度試験、色覚試験、７視野カラー眼底写真（視野１、２、及び３のステレオ写真を含む）、読書速度試験（該当する場合）、ＶＦＱ−２５、重篤なＡＥ（ＳＡＥ）モニタリング、薬歴調査、ならびにコルチコステロイド調剤（ＡＡＶ２−ＲＥＰ１群に無作為化される場合）。来院１（スクリーニング／ベースライン）時に正確なＢＣＶＡ値を取得するために、以下の条件がＢＣＶＡ評価に適用される：来院１（スクリーニング／ベースライン）時のＢＣＶＡ値が、前回のＮＩＧＨＴ研究の来院（該当する場合）と比較して、研究目において、≧±１０文字の増加または減少である場合、ＢＣＶＡは、さらに２回繰り返す必要があり、来院１時に合計３つのＢＣＶＡの測定値をもたらす。さらなるＢＣＶＡの測定を容易にするために、この来院を２日間にわたって行うことが必要であり、ＢＣＶＡが、１日目に２回、２日目に１回（瞳孔拡張の前に）測定される。３つのＢＣＶＡ値はすべて、ｅＣＲＦに記録する必要がある。最高のスコアは、対象の適格性を定義するために使用される。来院１（スクリーニング／ベースライン）時のＢＣＶＡ値は、前回のＮＩＧＨＴ研究来院と比較して研究目において＜±１０文字異なる場合、ＢＣＶＡは、すぐに回収され、繰り返されない。
【０５９４】
試験対象患者基準のすべてを満たし、除外基準のいずれも満たさない対象には、研究目が割り当てられ、研究に登録される。この時点で、対象は、無作為化の結果（すなわち、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１治療または対照群）を知らされ、研究中にマスクされた評価者へ治療群の割り当てを明らかにしないように指示される。ＡＡＶ２−ＲＥＰ１治療群に無作為化された対象（治験責任医師及びスポンサーとともに）は、割り当てられた用量に対してマスク化されたままである。
【０５９５】
次の研究来院（来院２）は、スクリーニング／ベースライン来院から８週間以内にスケジュールされている。ＡＡＶ２−ＲＥＰ１群に無作為化された対象は、２１日間のコースで経口コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン／プレドニゾロン）が投与され、次の研究来院（来院２）から２日前に薬の服用を開始するように指示される。ＡＡＶ２−ＲＥＰ１群に無作為化された対象は、治療されてから３カ月間、バリア避妊を使用するように指示される。
【０５９６】
対象が無作為に対照群に無作為化される場合、来院２は、電話で構成される。
【０５９７】
来院２（０日目、注射の来院日、または電話による接触）
来院２（０日目）時に、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１群のすべての対象が、外科施設を来院し、以下の評価が行われる：完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、及び併用薬歴調査、ならびにコルチコステロイドコンプライアンス調査。
【０５９８】
ＡＡＶ２−ＲＥＰ１群の対象は、硝子体切除術を受け、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１の網膜下注射を受け、これには、研究目においてＡＡＶ２−ＲＥＰ１低用量（１×１０１０ｖｇ）またはＡＡＶ２−ＲＥＰ１高用量（１×１０１２ｖｇ）のいずれかが含まれる。対象は、処置中のＡＥの発生について注意深くモニタリングされる。対象は、術後フォローアップ（それぞれ、来院３［１日目］及び来院４［７日目］）のために手術から１及び７日後に施設に戻る。
【０５９９】
対照群の対象は、合意された日時に研究来院の電話を受ける。施設は、電話中に以下の評価を行いる：ＡＥ／ＳＡＥモニタリング及び併用薬歴調査。
【０６００】
来院３（術後来院１日目）
来院３（１日目）時に、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１群の対象は、術後来院のために外科施設に戻る。以下の評価が行われる：バイタルサイン、イムノアッセイサンプリング（ＥＬＩＳＡのみ）、ＢＣＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、薬歴調査、ならびにコルチコステロイドコンプライアンス調査。対象は、治療時から３ヶ月間バリア避妊を使用する必要があることを思い出される。
【０６０１】
対照群の対象は、合意された日時に研究来院の電話を受ける。施設は、電話中に以下の評価を行いる：ＡＥ／ＳＡＥモニタリング及び併用薬歴調査。
【０６０２】
来院４（術後来院７日目±３日）
来院４（７日目±３日）時に、ＡＡＶ２−ＲＥＰ１群の対象は、２回目の術後来院のために、ホスト施設（すなわち、来院１スクリーニング／ベースライン来院が行われた場所と同じ施設）に戻る。しかしながら、非外科施設から外科施設に移動した対象、及び術後の合併症が発生した場合、または研究外科医及び外科施設の治験責任医師によって適切であると見なされた任意の他の安全上の理由により、来院４は、外科施設で行われ得る。この場合、術後フォローアップは、外科医／外科施設の治験責任医師が、非外科施設のケアを受けて対象を退院させることに同意するまで、外科施設で継続する必要がある。以下の評価が行われる：バイタルサイン、イムノアッセイサンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、ＬＬＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、ＡＦ、微小視野測定、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、薬歴調査、ならびにコルチコステロイドコンプライアンス調査。
【０６０３】
対照群の対象は、合意された日時に研究来院の電話を受ける。施設は、電話中に以下の評価を行いる：ＡＥ／ＳＡＥモニタリング及び併用薬歴調査。
【０６０４】
来院５（１カ月目±７日）
すべての対象が、来院５以降、ホスト施設（すなわち、来院１スクリーニング／ベースライン来院が行われた場所と同じ施設）に参加する。来院５（１カ月目±７日）時に、以下の評価がすべての対象に対して行われる（必要に応じて、評価は連続した２日間にまたがることができる）：バイタルサイン、イムノアッセイサンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、ＬＬＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、ＡＦ、微小視野測定、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、薬歴調査、ならびにコルチコステロイドコンプライアンス調査。
【０６０５】
来院６（４カ月目±７日）
来院６（４カ月目±７日）時に、以下の評価が行われる（必要に応じて、評価は連続した２日間にまたがることができる）：イムノアッセイサンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、ＬＬＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、ＡＦ、微小視野測定、コントラスト感度試験、色覚試験、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、ならびに薬歴調査。
【０６０６】
来院７（８カ月目±１４日）
来院７（８カ月目±１４日）時に、以下の評価が実行される（必要に応じて、評価は連続した２日間にまたがることができる）：ＢＣＶＡ、ＬＬＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、ＡＦ、微小視野測定、コントラスト感度試験、色覚試験、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、ならびに薬歴調査。
【０６０７】
来院８（１２カ月目±１４日、研究来院の最後）
来院８（１２カ月目±１４日）時に、以下の評価が実行される（必要に応じて、評価は連続した２日間にまたがることができる）：バイタルサイン、ＢＣＶＡ、ＬＬＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、ＡＦ、微小視野測定、コントラスト感度試験、色覚試験、７視野カラー眼底写真（視野１、２、及び３のステレオ写真を含む）、読書速度試験（該当する場合）、ＶＦＱ−２５、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、ならびに薬歴調査。
【０６０８】
早期終了来院
対象がいかなる時点でも研究を中止した場合には、施設は、適切なあらゆる努力を払って、ＥＴ来院が確実に行われるようにする必要がある。以下の評価が実行される必要がある：バイタルサイン、ＥＴ来院が４カ月以内に生じる場合、イムノアッセイのサンプリング（ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴ）、ＢＣＶＡ、ＬＬＶＡ、完全眼科検査（ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁、及び拡張型眼底検査を含む）、ＳＤ−ＯＣＴ、ＡＦ、微小視野測定、コントラスト感度試験、色覚試験、７視野カラー眼底写真（視野１、２、及び３のステレオ写真を含む）、読書速度試験（該当する場合）、ＶＦＱ−２５、ＡＥ／ＳＡＥモニタリング、ならびに薬歴調査。
【０６０９】
有効性の評価
すべての来院のために、両方の目ですべての手順を実行する試みが行われるべきである。
【０６１０】
最高矯正視力
研究期間にわたる視力（ＶＡ）の変化を評価するために、ＢＣＶＡは、表６２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、ＥＴＤＲＳ  ＶＡチャートを使用して、両方の目に対して評価される。瞳孔拡張の前にＢＣＶＡ試験を実行し、ＢＣＶＡを測定する前に遠方屈折を実行する必要がある。最初に、文字はチャートから４メートルの距離で読み取られる。４メートルで２０文字未満を読み取る場合、１メートルで試験を実行する必要がある。ＢＣＶＡは、対象が正しく読み取った文字の数として報告される。スクリーニング／ベースライン来院時に、３４〜７３  ＥＴＤＲＳ文字のＢＣＶＡを有する目（６／１２または２０／４０スネレン視力以下に相当するが、６／６０または２０／２００スネレン以上に相当する）は、研究の資格がある。対象がＢＣＶＡチャートのいかなる文字も読むことができない場合、対象は、指の数え方、手の動き、または光の知覚について試験される。
【０６１１】
眼底自発蛍光
生存可能な網膜組織の領域の変化を評価するために、眼底ＡＦは、表６２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、両方の目に対して行われる。すべての眼底ＡＦ画像は、対象の瞳孔の拡張後、施設で認定技術者によって撮影される。
【０６１２】
スペクトラルドメイン光干渉断層法（ＳＤ−ＯＣＴ）
ＳＤ−ＯＣＴは、表２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、両方の目に対して行われる。ＳＤ−ＯＣＴの測定は、対象の瞳孔の拡張後、施設で認定技術者によって得られる。楕円体ゾーンの完全性と、外顆粒層及び脈絡膜からのシグナルの低減と、を定量化することを含む、多くの変数を評価するために出されたＳＤ−ＯＣＴ。加えて、進行性の中心窩肥厚がＣＨＭの初期段階で確認されるため、中心窩の変化が評価される。
【０６１３】
微小視野測定
微小視野測定は、表６２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、両方の目に対して行われる。微小視野測定は、黄斑内の網膜感度の変化を評価するために認定技術者によって行われる。
【０６１４】
コントラスト感度
コントラスト感度は、表６２：研究手順のスケジュールに示される時間で、両方の目に対して測定される。コントラスト感度は、ペリロブソンチャートを使用して瞳孔拡張の前に測定される。
【０６１５】
色覚
色覚は、表６２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、瞳孔拡張の前に両方の目に対して試験される。目は、各評価で別々に同じ順序で試験される。
【０６１６】
低輝度視力
ＬＬＶＡは、表６２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、両方の目に対して測定される。ＢＣＶＡ試験の後、瞳孔拡張の前に試験を実行し、ＬＬＶＡを測定する前に遠方屈折を実行する必要がある。ＬＬＶＡは、２．０対数単位の中性密度フィルターを各目の前部上に配置し、対象に通常照明のＥＴＤＲＳチャートを読み取らせることによって測定される。最初に、文字はチャートから４メートルの距離で読み取られる。４メートルで２０文字未満を読み取る場合、１メートルで試験を実行する必要がある。ＬＬＶＡは、対象が正しく読み取った文字数として報告される。
【０６１７】
読書速度試験
読書能力は、１７の言語の読書能力の標準化評価を提供する国際読書速度テキスト（ＩＲｅＳＴ）を使用して、表６２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、瞳孔拡張の前に評価される（Ｔｒａｕｚｅｔｔｅｌ−Ｋｌｏｓｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０６１８】
ＶＦＱ−２５アンケート
対象は、表６２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、ＶＦＱ−２５を完了する。このアンケートは、眼疾患のある人にとって最も重要な、自己申告の視覚標的の健康状態の程度を測定する（Ｍａｎｇｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。ＶＦＱ−２５の改善は、個々のスコア、サブスケールスコア、及び全体的な複合スコアを使用して評価される。
【０６１９】
安全性の評価
完全眼科検査
完全眼科検査は、表６２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、両方の目に対して行われる。ＡＡＶ２−ＲＥＰ１群の対象では、完全眼科検査は、硝子体切除術及び適切な研究来院時の研究薬物治療薬の投与の前に行われる。眼科検査には、ＩＯＰ、細隙灯検査、水晶体混濁度の等級付け、及び拡張型検眼鏡検査が含まれる。同じ細隙灯機及び照明条件は、任意の所与の対象の研究訪問全体にわたって使用されるべきである。
【０６２０】
上記のパラメータに加えて、関連する対象は、ベクター投与後の眼内炎症の存在について慎重に検査される。白内障は硝子体切除術の結果として発生することもあり、ＶＡに影響を与える可能性がある。したがって、術前の水晶体混濁度及び色の等級付けは、確立された臨床水晶体混濁度分類システムによって文書化するべきである。白内障手術は、ＣＨＭを有する対象において効果的であり、いずれの特定のリスクも有しない。したがって、臨床的に示される場合、白内障を発症した対象は、白内障手術を受けてもよい。白内障手術が行われる場合は、１２カ月来院／ＥＯＳ来院の少なくとも４週間前に行われるべきである。
【０６２１】
視野カラー眼底写真
進行性網膜の変化の客観的評価に役立てるために、７視覚色眼底写真は、表６２：研究手順のスケジュールに示されている時間で、両方の目に対して行われる。眼底写真は、瞳孔拡張後に認定技術者によって行われる。ステレオ写真は、視野１、２、及び３で行われる必要がある。
【０６２２】
有害事象
ＡＥは、臨床調査対象における任意の有害な医学的発生であり、必ずしも研究薬物治療／外科的処置との因果関係を有するわけではない。したがって、ＡＥとは、任意の好ましくない、意図しない兆候（異常な検査所見を含む）、症状、または治験薬に関連するか否かにかかわらず、研究薬物治療／外科的処置の使用、もしくはこのプロトコルに記載される外科的処置の使用と一時的に関連している疾患であり得る。ＡＥには、いかなる既存の状態（ＣＨＭ以外）または研究中に悪化する（すなわち、頻度もしくは強度を増加する）疾病も含まれる。
【０６２３】
重篤有害事象
ＳＡＥとは、死に至り、生命にかかわる事象であり、入院患者の入院もしくは既存の入院の延長を必要とし、永続的もしくは重大な身体障害／運動不能をもたらし、先天性異常／出生異常をもたらし、失明に至るか、または視力を脅かし、別の重要な医療事象（複数可）である、任意の有害な医学的事象として定義される。「重篤な」の定義における「生命にかかわる」という用語は、事象の時に対象が死のリスクにある事象を指す。これは、仮にそれがより深刻であった場合に死亡を引き起こす可能性のある事象を指さない。悪化していない選択的処置を含む既存の状態の入院は、ＳＡＥを構成しない。死をもたらしたり、生命を脅かしたり、入院を必要とする可能性はない他の事象は、適切な医学的判断を基にして、その事象が、対象を危険にさらし得、上記の結果のうちの１つを防ぐために医学的または外科的介入が必要であり得る場合に、ＳＡＥと見なされ得る。
【０６２４】
以下の失明または視力を脅かす事象は、ＳＡＥとして報告される：手術関連の事象を除いて、ベースラインと比較したＥＴＤＲＳチャートでのＶＡの１５文字以上の持続的な減少。持続的とは、回復するまで４８時間以上続くと定義される。ＶＡとして定義された回復は、ベースラインＶＡの５文字以内に戻った。
【０６２５】
ＶＡ減少の手術関連事象は、研究薬物治療の外科的投与との密接な時間的関連（＜２４時間以内に）で発生するＶＡ減少として定義され、術後７日目（期間１／２、来院４）で解消する。これらの事象は、ＡＥまたはＳＡＥとして報告されない。しかしながら、治験責任医師の見解では、期間または重症度の観点からのそれらの進展を手順で説明できない場合、それらはＡＥとして報告されるべきである。これには、手術後のＶＡ減少の異常な経過が、手術もしくは研究薬物治療に起因する別の合併症に関連している場合、または術後のＶＡ減少の異常な経過が別の特定できる原因に起因し得る場合が含まれるが、これらに限定されない。治験責任医師の見解では、視力の永久的喪失を防ぐために、任意の外科的または医学的介入を実際にまたは潜在的に必要とするＡＥ。
【０６２６】
有効性解析
統計試験は、０．０５のアルファレベルで実行される（他で指定されていない限り）。統計試験及び９５％ＣＩは、両側である。
【０６２７】
主要有効性エンドポイント
主要エンドポイントは、１２カ月目の来院時のＢＣＶＡのベースラインから１５文字以上増加した対象の割合として計算される。１２カ月目の来院時にＶＡが欠測している場合、欠測値は、ＬＯＣＦ方法を使用して帰属される。主要エンドポイントは、９５％ＣＩを含むカテゴリデータに対する要約統計量を使用して要約される。主要エンドポイントの成功の割合は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｘａｃｔ試験を使用して、研究治療群間（高用量対対照、低用量対対照）で比較される。
【０６２８】
主要な副次的有効性エンドポイント
主要な副次的エンドポイントは、ＢＣＶＡがＮＩＧＨＴ研究（ＮＳＲ−ＣＨＭ−ＯＳ１）の４カ月目（来院２）から１６カ月目（来院５）までで１５文字以上増加した対象の割合と比較した、ＳＴＡＲ試験内の治療された研究目における１２カ月目の来院時のＢＣＶＡのベースラインから１５文字以上増加した対象の割合のペア試料解析である。主要な副次的エンドポイントの解析は、歴史的対照完全解析セット上で実行される。主要な副次的エンドポイントは、９５％ＣＩを含むカテゴリデータに対する要約統計値を使用した、要約された治療後（ＳＴＡＲデータ）及び治療前（ＮＩＧＨＴデータ）であるだろう。カテゴリ変数に対する成功の割合は、マクネマー検定を別々に使用して、各治療群における治療前と治療後とが比較されるだろう。
【０６２９】
他の二次的有効性エンドポイント
カテゴリ副次的エンドポイントは、カテゴリ主要エンドポイントと同じ手順を使用して要約及び解析される。
【０６３０】
主要エンドポイントは、９５％ＣＩを含む連続データに対する要約統計値を使用して要約される。ベースライン及びその９５％ＣＩからの平均変化の治療差は、外科群、評価のベースライン値、研究治療群、及び研究治療群と外科群間の相互作用を含むＡＮＣＯＶＡモデルのＬＳＭＥＡＮＳに基づいて計算される。ベースラインからの変化は、上記のＡＮＣＯＶＡモデルを使用して、研究治療群間（高用量対対照、低用量対対照）で比較される。ＶＦＱ−２５の総合複合スコアについては、共変量年齢及び人種を、モデルに追加する。
【０６３１】
安全性解析
安全性解析についての有意差検定は、実行されない。安全性解析は、説明的であり、９５％ＣＩが適切な場合に計算される。
【０６３２】
有害事象
ＡＥは、規制関連業務のための医学辞書を使用してコード化されている。データベースロック時の現在の辞書のバージョンが、使用されるであろう。事象は、システム臓器クラス、好ましい用語、及び群ごとに要約される。ＡＥを経験している目／対象の数、及び事象の数の両方が要約されている。同様の要約は、研究薬物／処置関連ＡＥ、中止につながるＡＥ、及びＳＡＥのために作成される。ＡＥは、最大の重症度、研究薬物／処置との関係、ならびに発症及び解消までの時間によって要約される。
【０６３３】
完全眼科検査
ＩＯＰ及びＩＯＰのベースラインからの変化は、来院ごと、治療ごと、目ごとに要約される。異常な細隙灯検査の所見及び拡張型検眼鏡検査の所見、ならびにベースラインからのシフトは、来院ごと、治療ごと、及び目ごとに要約される。水晶体混濁カテゴリ及びベースラインからのシフトは、来院ごと、治療ごと、及び目ごとに要約される。
【０６３４】
視野カラー眼底写真
カラー眼底写真所見のカテゴリ及びベースラインからのシフトは、来院ごと、治療ごと、目ごとに要約される。
【０６３５】
【表６２】
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【０６３６】
参照による組込み
あらゆる相互参照または関連する特許または出願を含む、本明細書に引用されたすべての文献は、明示的に除外されない限り、または特に限定されない限り、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。任意の文献の引用は、それが、本明細書に開示、もしくは請求されたいずれかの発明に関する先行技術であること、または、それ単独で、もしくは任意の他の文献との任意の組み合わせで、任意のそのような発明を教示、示唆、もしくは開示することを認めるものではない。さらに、本文書中の用語の任意の意味または定義が、参照により組み込まれる文献における同じ用語の任意の意味または定義と矛盾する限りにおいて、本文書中でその用語に割り当てられた意味または定義が適用されるものとする。
【０６３７】
他の実施形態
本開示の特定の実施形態を図示し、説明してきたが、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な他の変更及び修正を行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を含む。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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