(57)【要約】  本開示は、治療用分子の発現を体系的に制御及びサイレンシングするための調節可能発現ベクター、ならびにその用途、例えば脈絡膜血管新生などの眼障害を治療する用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中止スイッチと、治療用分子をコードする核酸配列に機能可能に連結された調節可能エレメントとを含む発現ベクターであって、前記調節可能エレメントの活性が調節化合物によって調節され、前記中止スイッチの活性化が、前記治療用分子をコードする前記核酸の前記ベクターからの発現をサイレンシングする、前記発現ベクター。
【請求項２】
前記中止スイッチが第１部位特異的組換え配列及び第２部位特異的組換え配列を含み、前記第１部位特異的組換え配列と前記第２部位特異的組換え配列との間での組換えが前記治療用分子の発現をサイレンシングする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記第１部位特異的組換え配列が、前記治療用分子をコードする前記核酸配列の上流に配置されており、前記第２部位特異的組換え配列が、前記治療用分子をコードする前記核酸配列の下流に配置されている、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記第１部位特異的組換え配列及び前記第２部位特異的組換え配列がｌｏｘＰ部位である、請求項２または請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
調節化合物に結合することができる調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターをさらに含み、
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記治療用分子の発現を調節するものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物と結合すると前記治療用分子の発現を促進するものである、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物と結合すると前記治療用分子の発現を抑制するものである、請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子またはシステイン代謝リプレッサー（ＣｙｍＲ）のうちの１つ以上を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記調節化合物がテトラサイクリン、クメート（ｃｕｍａｔｅ）、プロゲステロン、グルココルチコイド、エストロゲンまたはミフェプリストンである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記調節可能エレメントが、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）、クメートオペレーター（ＣｕＯ）、エクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）、プロゲステロン応答エレメント（ＰＲＥ）、熱ショック配列エレメント（ＨＳＥ）または光誘導性プロモーターのうちの１つ以上を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記恒常的プロモーターが複合ヒトＣＭＶ−ＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターである、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記治療用分子が血管新生を阻害する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記治療用分子が、
−エンドスタチン、アンジオスタチン、もしくはエンドスタチンとアンジオスタチンとの融合体を含む；
−結合タンパク質である；
−抗体の抗原結合部位を含む；
−ラニビズマブ、ベバシズマブ及びアフリベルセプトからなる群から選択される；
−炎症を抑制する；または
−インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ）、もしくはＩＬ−１０とＩＬ−１ＲＡとの融合体である、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記ベクターがさらに、前記恒常的プロモーターと前記調節可能プロモーターとの間に転写遮断因子を含む、請求項５〜１３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
ウイルスベクターである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
対象における眼障害を治療する方法であって、中止スイッチと、治療用分子をコードする核酸とを含む有効量の発現ベクターを投与することを含み、前記中止スイッチの活性化が前記治療用分子の発現をサイレンシングする、前記方法。
【請求項１８】
前記発現ベクターが、前記治療用分子をコードする前記核酸に機能可能に連結された調節可能エレメントをさらに含み、前記調節可能エレメントの活性が前記対象への調節化合物の投与によって調節される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
調節化合物に結合することができる調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含む第２発現ベクターを投与することをさらに含み、前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記第１発現ベクターからの前記治療用分子の発現を調節するものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記発現ベクターが、前記調節化合物に結合する調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターをさらに含み、前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記治療用分子の発現を調節するものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記治療用分子の発現を促進するものである、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記治療用分子の発現を抑制するものである、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記中止スイッチの活性化が、
−１つ以上のプロモーター；及び／または
−前記治療用分子をコードする前記核酸
を切除する、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記中止スイッチが、
−１つ以上のプロモーター；及び／または
−治療用分子をコードする前記核酸
の脇に配された部位特異的組換え配列を含む、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法が、請求項１〜１６のいずれか１項によって定義される発現ベクターを投与することを含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記眼障害が、糖尿病網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、臨床的に重大な黄斑浮腫、ぶどう膜炎、虹彩炎、巨細胞性動脈炎、血管炎、扁平部炎、角膜移植拒絶反応、眼内炎症または表層角膜移植拒絶反応である、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記眼障害が、黄斑変性症、糖尿病網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、臨床的に重大な黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症または眼内血管新生である、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記発現ベクターの硝子体内または網膜下投与を含む、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記調節化合物を目に局所投与することを含む、請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記調節化合物が小分子である、請求項１８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記調節化合物がテトラサイクリンまたはクメートである、請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記調節化合物が点眼薬として投与される、請求項１８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
部位特異的リコンビナーゼ、または部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を投与することによって前記中止スイッチを活性化させることをさらに含み、
前記部位特異的リコンビナーゼが、第１部位特異的組換え配列と前記第２部位特異的組換え配列との間での組換えを触媒し、それによって前記治療用分子の発現をサイレンシングする、請求項１７〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
対象における眼障害を治療する方法であって、有効量の発現ベクターを投与することを含み、前記発現ベクターが、
中止スイッチ、治療用分子をコードする核酸、前記治療用分子をコードする前記核酸に機能可能に連結された調節可能プロモーター、及び調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーター
を含むものであり、前記調節可能プロモーターの活性が、前記対象への調節化合物の投与の後に前記調節化合物結合ポリペプチドによって調節され、前記中止スイッチの活性化が前記治療用分子の発現をサイレンシングする、前記方法。
【請求項３５】
前記治療用分子が核酸またはポリペプチドである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の発現ベクター、または請求項１７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療用分子がポリペプチドである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の発現ベクター、または請求項１７〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜４のいずれか１項によって定義される第１発現ベクター、及び調節化合物に結合することができる調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含む第２発現ベクターを含み、
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記第１発現ベクターからの前記治療用分子の発現を調節するものである、医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の発現ベクター、及び調節化合物を含む点眼薬製剤を含む、キット。
【請求項３９】
中止スイッチ活性化因子、または
中止スイッチ活性化因子をコードする核酸配列を含む発現ベクター
をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
−請求項１〜１６のいずれか１項に記載の発現ベクター、
−テトラサイクリンを含む点眼薬製剤、及び
−Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む発現ベクター
を含む、請求項３８または請求項３９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、治療用分子の発現を体系的に制御及びサイレンシングするための調節可能発現ベクター、ならびにその用途、例えば脈絡膜血管新生などの眼障害を治療する用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスベクターを使用する遺伝子送達は、目における長期にわたって持続する導入遺伝子発現をもたらすことができる。しかしながら、現在のシステムを臨床での実践に移すには技術的改良が必要とされる。１つの問題は、導入遺伝子発現を調節する能力である。治療薬の異常産生を回避するためには管理を時間的にのみならず定量的にも維持せねばならない。しかも、特定の疾患は治療上のゆとりが狭く、このため治療は細やかなものとせねばならないだけでなく時を得たものとせねばならない。細胞特異的な調節エレメントを組み込むことはこのプロセスの助けになる可能性はあるが、全ての眼細胞種においてそのようなエレメントが同定されているわけではなく、同定されているものは大抵、限られた積荷能力を有するウイルスベクターの大きさの制約を超えてかなり大きい。
【０００３】
したがって、調節される遺伝子送達のための新しい発現ベクター及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
目における治療遺伝子の発現の調節またはサイレンシングは、それらの作用が予想外または不要な影響を招く場合に必要になり得る。したがって、本発明者らは、治療用分子の発現を体系的に制御及びサイレンシングするための調節可能発現ベクターを開発した。
【０００５】
第一の例において本開示は、中止スイッチと、治療用分子をコードする核酸配列に機能可能に連結された調節可能エレメントとを含む発現ベクターであって、調節可能エレメントの活性が調節化合物によって調節され、中止スイッチの活性化が、治療用分子をコードする核酸のベクターからの発現をサイレンシングする、当該発現ベクターを包含する。
【０００６】
一例では、中止スイッチは第１部位特異的組換え配列及び第２部位特異的組換え配列を含み、第１部位特異的組換え配列と第２部位特異的組換え配列との間での組換えは治療用分子の発現をサイレンシングする。
【０００７】
一例では、第１部位特異的組換え配列は、治療用分子をコードする核酸配列の上流に配置されており、第２部位特異的組換え配列は、治療用分子をコードする核酸配列の下流に配置されている。
【０００８】
一例では、第１部位特異的組換え配列及び第２部位特異的組換え配列はｌｏｘＰ部位である。
【０００９】
一例では、発現ベクターは、調節化合物に結合することができる調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターをさらに含み、調節化合物結合ポリペプチドは、調節化合物に結合すると治療用分子の発現を調節するものである。
【００１０】
一例では、調節化合物結合ポリペプチドは、調節化合物と結合すると治療用分子の発現を促進するものである。
【００１１】
一例では、調節化合物結合ポリペプチドは、調節化合物と結合すると治療用分子の発現を抑制するものである。
【００１２】
一例では、調節化合物結合ポリペプチドは、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）またはシステイン代謝リプレッサー（ＣｙｍＲ）のうちの１つ以上を含む。
【００１３】
一例では、調節化合物結合ポリペプチドは、配列番号１７または配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
一例では、調節化合物はテトラサイクリン、クメート（ｃｕｍａｔｅ）、プロゲステロン、グルココルチコイド、エストロゲンまたはミフェプリストンである。
【００１５】
一例では、調節可能エレメントは、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）、クメートオペレーター（ＣｕＯ）、エクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）、プロゲステロン応答エレメント（ＰＲＥ）、熱ショック配列エレメント（ＨＳＥ）または光誘導性プロモーターのうちの１つ以上を含む。
【００１６】
一例では、調節可能エレメントは、配列番号４または配列番号５に示される核酸配列を含む。
【００１７】
一例では、恒常的プロモーターは複合ヒトＣＭＶ−ＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターである。
【００１８】
一例では、恒常的プロモーターは、配列番号６に示される核酸配列を含む。
【００１９】
一例では、治療用分子は血管新生を阻害する。
【００２０】
一例では、治療用分子は炎症を阻害する。
【００２１】
一例では、治療用分子は核酸またはポリペプチドである。一例では、治療用分子はポリペプチドである。
【００２２】
一例では、治療用分子は、
−エンドスタチン、アンジオスタチン、もしくはエンドスタチンとアンジオスタチンとの融合体を含む；
−結合タンパク質である；
−抗体の抗原結合部位を含む；
−ラニビズマブ、ベバシズマブ及びアフリベルセプトからなる群から選択される；
−炎症を抑制する；または
−インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ）、もしくはＩＬ−１０とＩＬ−１ＲＡとの融合体である。
【００２３】
一例では、発現ベクターはさらに、恒常的プロモーターと調節可能プロモーターとの間に転写遮断因子を含む。
【００２４】
一例では、発現ベクターは、
−治療用分子をコードする核酸配列の上流に配置された第１ｌｏｘＰ部位、及び治療用分子をコードする核酸配列の下流に配置された第２ｌｏｘＰ部位、
−治療用分子をコードする核酸配列に機能可能に連結されたテトラサイクリン応答エレメントを含む調節可能プロモーター、及び
−リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）をコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーター
を含む。
【００２５】
一例では、発現ベクターはウイルスベクターである。一例では、発現ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【００２６】
本発明者らはまた、本明細書に開示されるベクターが炎症経路及び／または血管新生を調節するのに特に有効であるらしいことを突き止めた。これらの発見は、本開示の発現ベクターが眼障害を治療するのに役立つ可能性があることを示唆している。したがって、別の例において、本開示は、対象における眼障害を治療する方法であって、中止スイッチと、治療用分子をコードする核酸とを含む有効量の発現ベクターを投与することを含み、中止スイッチの活性化が治療用分子の発現をサイレンシングする、当該方法を包含する。
【００２７】
一例では、発現ベクターは、治療用分子をコードする核酸に機能可能に連結された調節可能エレメントをさらに含み、調節可能エレメントの活性は対象への調節化合物の投与によって調節される。
【００２８】
一例では、本明細書に記載の方法は、調節化合物に結合することができる調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含む第２発現ベクターを投与することをさらに含み、調節化合物結合ポリペプチドは、調節化合物に結合すると第１発現ベクターからの治療用分子の発現を調節するものである。
【００２９】
一例では、発現ベクターは、調節化合物に結合する調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターをさらに含み、調節化合物結合ポリペプチドは、調節化合物に結合すると治療用分子の発現を調節するものである。
【００３０】
一例では、調節化合物結合ポリペプチドは、調節化合物に結合すると治療用分子の発現を促進するものである。
【００３１】
一例では、調節化合物結合ポリペプチドは、調節化合物に結合すると治療用分子の発現を抑制するものである。
【００３２】
一例では、中止スイッチの活性化は、
−１つ以上のプロモーター；及び／または
−治療用分子をコードする核酸
を切除する。
【００３３】
一例では、中止スイッチは、
−１つ以上のプロモーター；及び／または
−治療用分子をコードする核酸
の脇に配された部位特異的組換え配列を含む。
【００３４】
一例では、方法は、本明細書中で定義される発現ベクターを投与することをさらに含む。
【００３５】
一例では、眼障害は糖尿病網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、臨床的に重大な黄斑浮腫、ぶどう膜炎、虹彩炎、巨細胞性動脈炎、血管炎、扁平部炎、角膜移植拒絶反応、眼内炎症または表層角膜移植拒絶反応である。
【００３６】
一例では、眼障害はがんである。一例では、がんはぶどう膜メラノーマである。
【００３７】
一例では、眼障害は、黄斑変性症、糖尿病網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、臨床的に重大な黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症または眼内血管新生である。
【００３８】
一例では、本明細書に記載の方法は発現ベクターの硝子体内または網膜下投与を含む。
【００３９】
本明細書に開示される様々な眼障害の現在の治療は、侵襲的硝子体内注射による治療薬の連続投与を必要とする。治療薬の硝子体内投与は、総じて不快であることに加えて、感染症または他の副作用のリスクが除かれていない。本明細書に開示されるベクターの１つの利点は、非侵襲的に調節するその能力である。例えば、本明細書に開示されるベクターは最初は硝子体内または網膜下注射によって投与され得るが、後にはそれは調節化合物（複数可）の局所または経口投与によって調節され得る。例えば、調節化合物は点眼薬製剤として投与され得る。したがって、別の例において本明細書に記載の方法は、調節化合物を目に局所投与することをさらに含む。
【００４０】
一例では、調節化合物は小分子である。
【００４１】
一例では、調節化合物はテトラサイクリンまたはクメートである。
【００４２】
一例では、調節化合物は点眼薬として投与される。
【００４３】
一例では、本明細書に記載の方法は、部位特異的リコンビナーゼ、または部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を投与することによって中止スイッチを活性化させることをさらに含み、部位特異的リコンビナーゼは、第１部位特異的組換え配列と第２部位特異的組換え配列との間での組換えを触媒し、それによって治療用分子の発現をサイレンシングする。
【００４４】
別の例において本開示は、対象における眼障害を治療する方法であって、有効量の発現ベクターを投与することを含み、発現ベクターが、中止スイッチ、治療用分子をコードする核酸、治療用分子をコードする核酸に機能可能に連結された調節可能プロモーター、及び調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含むものであり、調節可能プロモーターの活性が、対象への調節化合物の投与の後に調節化合物結合ポリペプチドによって調節され、中止スイッチの活性化が治療用分子の発現をサイレンシングする、当該方法を包含する。
【００４５】
別の例において本開示は、対象における眼障害の治療に使用するための、本明細書中で定義される発現ベクターを包含する。別の例において本開示は、眼障害の治療のための医薬品の製造における本明細書中で定義される発現ベクターの使用を包含する。
【００４６】
別の例において本開示は、本明細書中で定義される第１発現ベクター、及び調節化合物に結合することができる調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含む第２発現ベクターを含み、調節化合物結合ポリペプチドが、調節化合物に結合すると第１発現ベクターからの治療用分子の発現を調節するものである、医薬組成物を包含する。
【００４７】
別の例において本開示は、本明細書中で定義される発現ベクター（複数可）、及び本明細書中で定義される調節化合物（複数可）を含む点眼薬製剤を含む、キットを包含する。一例では、キットは、治療システムを含む。
【００４８】
一例では、キットは、本明細書中で定義される中止スイッチ活性化因子をさらに含む。
【００４９】
一例では、キットは、本明細書中で定義される中止スイッチ活性化因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターをさらに含む。
【００５０】
一例では、キットは、
−本明細書中で定義される発現ベクター（複数可）、
−テトラサイクリンを含む点眼薬製剤、及び
−Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む発現ベクター
を含む。
【００５１】
別段の記載がない限り、本明細書中のいかなる例も、適宜変更を加えられて他の任意の例に適用されるものと解釈されるべきである。
【００５２】
例示目的の意図しかない本明細書に記載の具体的な例によって本開示の範囲を限定すべきでない。機能的に等価な製品、組成物及び方法は明確に、本明細書に記載の本開示の範囲に含まれる。
【００５３】
本明細書の全体を通して、別段の記載または文脈による別段の定めがない限り、単一のステップ、組成物、ステップ群または組成物群への言及は、これらのステップ、組成物、ステップ群または組成物群のうちの１つ及び複数（つまり１つ以上）を包含すると解釈されるべきである。
【００５４】
これより、添付の図面を参照しながら以下の非限定的な実施例によって本開示を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】中止スイッチベクターの骨格のマップ。それは、複合ヒトＣＭＶ−ＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターによって機能するリプレッサークローニング部位と、関心対象のプロモーター及び遺伝子のためのクローニング部位とをコードする２シストロン性ベクターである。プロモーター部位は転写遮断因子によって隔てられている。ＡＡＶの中にパッケージングするための２つのＡＡＶ２  ＩＴＲ配列、ならびにベクターの切除及び中止の制御を可能にするＬｏｘＰ部位が構築物の脇に配されている。
【図２】ベクター構築物の模式図。テトラサイクリンまたはクメートリプレッサー遺伝子（それぞれ配列番号２及び配列番号３）をリプレッサークローニング部位１に、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を用いてクローニングした。対応するプロモーター（それぞれ配列番号４及び配列番号５）をプロモータークローニング部位２に、ＢｓｔＢＩ及びＳａｌＩ制限部位を用いてクローニングした。条件的に調節される関心対象の遺伝子をＧＯＩクローニング部位３に、ＳａｌＩ及びＮｈｅＩ制限部位を用いて（例えば、配列番号７〜１１に示されるＧＦＰ、ＩＬ−１０、エンド／アンジオスタチン融合タンパク質、ＩＬ１ＲＮ、またはＩＬ１０／ＩＬ１ＲＮ遺伝子）または適合性のＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位を用いて（Ｎａｎｏ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、配列番号１２）クローニングした。
【図３】中止スイッチの機序の模式図。２つのＬｏｘＰ部位の中に全ての発現配列が位置するベクターを構築した（配列番号１３）。この配置は、発現が起こることを可能にする。発現を永久的に停止させるまたは中止するには、Ｃｒｅをコードするベクターを細胞に加える。Ｃｒｅは２つのｌｏｘ部位におけるスプライシングによって全ての発現配列を除去する。結果としてベクターは発現機構がなくなり、導入遺伝子発現を誘導することができない。
【図４】ベクター構築物の中止スイッチを試験するために用いた実験デザイン。ヒト網膜色素上皮細胞株（ａＲＰＥ−１９）に、ＴｅｔもしくはＣｕ調節配列を含有するベクター構築物またはＣＭＶをトランスフェクトしてマーカー遺伝子ルシフェラーゼの発現を促した。２４時間後、細胞にＴｅｔまたはＣｕによる処理をするかまたはせずにさらに４８時間インキュベートし、その後、ルシフェラーゼの発現を評価した。ＬｏｘＰ部位間の発現配列を切り取るＣｒｅベクターを細胞にトランスフェクトすることによって、システムが導入遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現を中止する能力を調べた。細胞を洗浄し、薬物を、ルシフェラーゼの発現レベルの変化について培地を評価する７日目まで毎日添加し直す。
【図５】中止スイッチを検査することによって得た実験結果。Ａは、Ｔｅｔ活性化をあり（オンになったｐＡＡＶ−ＬＴｅｔＬ−ｌｕｃ）またはなし（オフになったｐＡＡＶ−ＬＴｅｔＬ−ｌｕｃ）にしてＴｅｔベクターで処理した細胞におけるルシフェラーゼの発現を示す。活性化細胞をその後にＣｒｅで処理し、ルシフェラーゼの検査をした。Ｂは、Ｃｕ活性化をありまたはなしにしてＣｕベクターで処理した細胞におけるルシフェラーゼの発現を示す。活性化したＣｕプロモーターを有する細胞をＣｒｅで処理し、ルシフェラーゼ発現を検査した。Ｃ及びＤは、それぞれＣｒｅ媒介切除をありまたはなしにしてＣＭＶベクターをトランスフェクトした後のルシフェラーゼの発現を示す。全てのＣｒｅ切除細胞において、有意により少ないルシフェラーゼ発現が検出された。
【図６Ａ】ベクターシステムによってもたらされる制御された発現の模式図。Ａは、Ｔｅｔ  Ｏｎシステムを示す。ＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターは、Ｔｅｔプロモーター中のＴｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）に結合することができず結果としてそれの不活性化及び導入遺伝子発現の欠如をきたすものであるＴｅｔトランス活性化因子タンパク質を、恒常的に発現させる。テトラサイクリンの存在下では、トランス活性化因子タンパク質はプロモーター中のＴｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）に結合してそれを活性化させ導入遺伝子の発現を誘導する。Ｂは、Ｃｕ  Ｏｎシステムを示す。このシステムでは、Ｃｕリプレッサータンパク質はＣｕの非存在下でＣｕオペレーター配列に結合し、それによってプロモーターを不活性化させ、結果として導入遺伝子の転写がなくなる。Ｃｕの添加があるとＣｕは、Ｃｕプロモーターに結合しているリプレッサータンパク質に結合し、それによってリプレッサーを遊離させて導入遺伝子転写を可能にする。
【図６Ｂ】ベクターシステムによってもたらされる制御された発現の模式図。Ａは、Ｔｅｔ  Ｏｎシステムを示す。ＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターは、Ｔｅｔプロモーター中のＴｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）に結合することができず結果としてそれの不活性化及び導入遺伝子発現の欠如をきたすものであるＴｅｔトランス活性化因子タンパク質を、恒常的に発現させる。テトラサイクリンの存在下では、トランス活性化因子タンパク質はプロモーター中のＴｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）に結合してそれを活性化させ導入遺伝子の発現を誘導する。Ｂは、Ｃｕ  Ｏｎシステムを示す。このシステムでは、Ｃｕリプレッサータンパク質はＣｕの非存在下でＣｕオペレーター配列に結合し、それによってプロモーターを不活性化させ、結果として導入遺伝子の転写がなくなる。Ｃｕの添加があるとＣｕは、Ｃｕプロモーターに結合しているリプレッサータンパク質に結合し、それによってリプレッサーを遊離させて導入遺伝子転写を可能にする。
【図７】ベクター構築物が導入遺伝子発現を調節する能力を試験するために用いた実験デザインの模式図。ヒト網膜色素上皮細胞株（ａＲＰＥ−１９）に、ＴｅｔもしくはＣｕ調節配列を含有するベクター構築物をトランスフェクトしてマーカー遺伝子ルシフェラーゼの発現を促した。２４時間後、細胞にＴｅｔまたはＣｕによる処理をするかまたはせずにさらに４８時間インキュベートし、その後、ルシフェラーゼの発現を評価した。ルシフェラーゼ発現を再検査する前に洗浄によって細胞からＴｅｔまたはＣｕを除去することによって、システムが導入遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現を停止させる能力を調べた。ＴｅｔまたはＣｕを有さない細胞を対照として使用し、ＴｅｔまたはＣｕが除去されていない細胞を同じく対照として使用した。
【図８】ベクター構築物を使用して調節された遺伝子発現。Ａは、導入遺伝子産生のスイッチを入れる薬剤としてテトラサイクリンを使用した実験の７日目に実施した発光アッセイからの結果を示す。Ｂは、導入遺伝子産生のスイッチを入れる薬剤としてクメートを使用した実験の７日目に実施した発光アッセイからの結果を示す。どちらの実験においても、基質（ＴｅｔまたはＣｕ）は有意なレベルのルシフェラーゼを誘導することができ、発現を基質の除去によって調節してルシフェラーゼの検出を有意に少なくすることができた。
【図９】Ｃｒｅありまたはなしで初代ヒト臍帯静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用するチューブ形成アッセイを用いてＬｏｘＰ部位に挟まれたエンド／アンジオスタチン融合体（ＥＡＳ）を含有するベクターが血管新生に及ぼす影響を調べるために用いた実験デザインの模式図。継代数の若い（ｐ２〜４）ＨＵＶＥＣに、ＥＡＳを産生するクメート調節性ベクター（ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に細胞を計数し、ｇｅｌｔｒｅｘ被覆ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１４〜１８時間インキュベートし、その後、ｇｅｌｔｒｅｘ中に形成されたチューブの写真を撮影し、ＩｍａｇｅＪ血管新生解析装置を使用して解析した。
【図１０】ＥＡＳがＨＵＶＥＣにおける小管の形成に及ぼす影響を試験することによって得られた結果。Ａは、Ｃｕ活性化なしで非ＥＡＳ発現ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳがトランスフェクトされた細胞におけるＨＵＶＥＣチューブ形成を示す。Ｂは、ＨＵＶＥＣを活性化ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳで処理したときのチューブ形成の阻害を示す。Ｃは、活性化ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳをＣｒｅによって切除したときのチューブ形成能力の回復を示す。Ｄ及びＥはそれぞれ、ＩｍａｇｅＪ血管新生解析装置ソフトウェアを使用して総メッシュ面積及び総分岐長さを定量するものである。ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳベクターはチューブ形成を減少させることができたが、ベクターをＣｒｅで切除するとこのチューブ形成は概して逆転した。
【図１１】ＣｒｅありまたはなしでＩＬ−６発現によって決定される炎症促進性シグナル伝達の誘導に関して、ＬｏｘＰ部位が脇に配されたＣｕ調節性ＩＬ−１０を含有するベクターを評価するために用いた実験デザインの模式図。ヒト網膜色素上皮細胞株（ａＲＰＥ−１９）に、Ｃｕ調節配列を含有するベクター構築物をトランスフェクトして抗炎症性ＩＬ−１０の発現を促した。陰性対照は、Ｃｕ活性化を欠きＣｒｅで処理されたＩＬ１０ベクターからなっていた。ＩＬ−１０群は、Ｃｕによって活性化されたＩＬ１０ベクターからなっていた。中止群は、Ｃｒｅで処理された活性化ＩＬ１０ベクターからなっていた。ＩＬ−１０及び炎症促進性マーカーＩＬ−６の発現について細胞をＥＬＩＳＡによって検査した。
【図１２】Ｃｒｅの添加をありまたはなしにしてＩＬ−１０を含有するクメート調節性ベクターでトランスフェクトした後にＩＬ−１０及びＩＬ−６の同時ＥＬＩＳＡから得られた結果。陰性対照ベクター（Ｃｕなし及びＣｒｅあり）で処理した細胞において、検出されたＩＬ−１０のレベルは低く、高レベルの炎症促進性ＩＬ−６と相関していた。反対に、Ｃｕの存在下でＣｕ調節性ＩＬ１０ベクター（オンになっているＩＬ１０ベクター）で処理した細胞は高レベルのＩＬ−１０を発現させ、これは低レベルのＩＬ−６発現と相関していた。ＩＬ−１０がＣｒｅによって切除されたベクター（中止されているＩＬ１０ベクター）はＩＬ−１０及びＩＬ−６のレベルが陰性対照のそれと同程度になり、ベクター発現が好結果に中止されたことを示していた。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
配列表の手引き
配列番号１：核酸配列、中止スイッチベクター骨格。
配列番号２：核酸配列、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）。
配列番号３：核酸配列、クメートリプレッサー（ＣｙｍＲ）。
配列番号４：核酸配列、テトラサイクリンプロモーター。
配列番号５：核酸配列、クメートプロモーター。
配列番号６：核酸配列、ＣＭＶ−ＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーター。
配列番号７：核酸配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）。
配列番号８：核酸配列、治療用ポリペプチド、インターロイキン（ＩＬ）１０。
配列番号９：核酸配列、治療用ポリペプチド、エンド／アンジオスタチン。
配列番号１０：核酸配列、治療用ポリペプチド、インターロイキン−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ）。
配列番号１１：核酸配列、治療用ポリペプチド、ＩＬ−１０−ＩＬ−１ＲＡ。
配列番号１２：核酸配列、Ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
配列番号１３：核酸配列、ＬｏｘＰ部位
配列番号１４：核酸配列、転写遮断因子
配列番号１５：核酸配列、ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳ
配列番号１６：核酸配列、ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＩＬ１０
配列番号１７：アミノ酸配列、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）
配列番号１８：アミノ酸配列、クメートリプレッサー（ＣｙｍＲ）
配列番号１９：アミノ酸配列、治療用ポリペプチド、インターロイキン（ＩＬ）１０
配列番号２０：アミノ酸配列、治療用ポリペプチド、エンド／アンジオスタチン
配列番号２１：アミノ酸配列、治療用ポリペプチド、インターロイキン−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ）
配列番号２２：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−変異体
配列番号２３：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−ｌｏｘ５１１
配列番号２４：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−ｌｏｘ５１７１
配列番号２５：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−ｌｏｘ２２７２
配列番号２６：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−Ｍ２
配列番号２７：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−Ｍ３
配列番号２８：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−Ｍ７
配列番号２９：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−Ｍ１１
配列番号３０：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−ｌｏｘ７１
配列番号３１：核酸配列、ＬｏｘＰ部位−ｌｏｘ６６
配列番号３２：核酸配列、ＦＲＴ部位
配列番号３３：核酸配列、ＦＲＴ部位−変異体
配列番号３４：核酸配列、ＦＲＴ部位−ＦＬ−ＩＬ−１０Ａ
配列番号３５：核酸配列、ＦＲＴ部位−ＦＲＴ／ＦＬ−ＩＬ−１０Ａ
配列番号３６：核酸配列、ｒｏｘ部位−ＷＴ
配列番号３７：核酸配列、ｒｏｘ部位−ｒｏｘ７
配列番号３８：核酸配列、ｒｏｘ部位−ｒｏｘ８
配列番号３９：核酸配列、ｒｏｘ部位−ｒｏｘ１２
配列番号４０：核酸配列、ｒｏｘ部位−ｒｏｘ６１
配列番号４１：核酸配列、ｒｏｘ部位−ｒｏｘ８５
配列番号４２：核酸配列、ａｔｔ部位−ａｔｔＰ
配列番号４３：核酸配列、ａｔｔ部位−ａｔｔＢ
配列番号４４：核酸配列、ａｔｔ部位−ｐｒｏＢ
配列番号４５：核酸配列、ａｔｔ部位−ｔｒｐＣ
配列番号４６：核酸配列、ａｔｔ部位−ｇａｌＴ
配列番号４７：核酸配列、ａｔｔ部位−ｔｈｒＡ
配列番号４８：核酸配列、ａｔｔ部位−ｒｒｎＢ
【００５７】
別段の定めがない限り、本明細書中で使用する全ての科学技術用語は、当技術分野（例えば、分子生物学、遺伝子療法、遺伝子改変、生化学、生理学及び臨床試験）で通常の技能を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
【００５８】
特に示されていない限り、本開示の中で利用される分子的及び統計学的技術は、当業者に知られている標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５  ａｎｄ  １９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての更新を含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの全ての更新を含む）などを出典とする文献の全体にわたって記載及び説明されている。
【００５９】
様々な対象に、本開示に係る発現ベクターが投与され得る。一例を挙げると、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、イヌもしくはネコなどの伴侶動物であってもよし、またはウマもしくはウシなどの家畜動物であってもよい。別の例を挙げると、対象はヒトである。「対象」、「患者」または「個体」などの用語は、本開示において文脈中で交換可能に使用され得る用語である。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、「治療する」または「治療」などの用語は、治療しようとする個体または細胞の自然な過程を臨床病態の経過中に変化させることを意図した臨床介入を指す。治療の望ましい効果としては、疾患進行を減速させること、疾患状態を改善または緩和すること、及び寛解または予後の改善が挙げられる。個体は、例えば疾患に関連する１つ以上の症候が和らぐまたはなくなる場合に、好結果に「治療された」ことになる。一例として、「治療」という用語は、標的とする障害を逆転させる、防止するまたは減速（減少）させることを目的とした眼障害、例えば、滲出型黄斑変性症、糖尿病網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、臨床的に重大な黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症または眼内血管新生などに対する治療処置と予防的または保護的措置との両方を指す。治療を必要とする者には、眼障害を既に有する者、またはそのような障害を有する傾向にある者、またはそのような障害を予防せねばならない者が含まれる。一例として、治療は視力の安定及び／または改善を包含する。
【００６１】
「有効量」は、必要な期間にわたって投薬量で少なくとも所望の治療的または予防的転帰を実現するのに有効な量を指す。有効量は１回以上の投与で提供され得る。本開示のいくつかの例では、「有効量」という用語は、先に記載した眼の障害または症状の治療をもたらすのに必要な量を指して使用される。有効量は、治療する疾患または症状によって、さらには体重、年齢、人種的背景、性別、健康及び／または身体状態、ならびに治療する哺乳動物に関係する他の因子によって様々であり得る。典型的には、有効量は、医師による慣例的な試験及び実験によって決定され得る比較的広い範囲（例えば「投薬量」範囲）の内に入るであろう。有効量は単回用量で、または治療期間にわたって１回もしくは数回繰り返される用量で投与され得る。
【００６２】
「治療的有効量」は、少なくとも、特定の眼障害（例えば滲出型黄斑変性症）の測定可能な改善をもたらすために必要とされる最低濃度である。本明細書において治療的有効量もまた、患者の疾患状態、年齢、性別及び体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す治療薬の能力などの因子によって様々であり得る。治療的有効量は、治療上有益な効果の方が治療薬のいかなる有毒または有害な影響よりも重要になる量でもある。滲出型黄斑変性症の治療のためには生体内での有効性は例えば以下のうちの１つ以上によって測定され得る：ベースラインから所望の時間までの最良矯正視力（ＢＣＶＡ）の平均変化の評価、ベースラインと比較して所望の時間に視力が１５文字未満に減る対象の割合の評価、ベースラインと比較して所望の時間に視力が１５文字以上に増える対象の割合の評価、所望の時間に２０／２０００と等価またはそれより悪いスネレンの視力を有する対象の割合の評価、ＮＥＩ視覚機能質問票の評価、フルオレセイン血管造影法によって評価したときの所望の時間での脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の大きさ及び／またはＣＮＶの漏出量の評価。
【００６３】
本明細書中で使用する場合、「プロモーター」という用語は、その最も広い文脈で解釈されるべきであり、核酸の発現を、例えば発達及び／または外部刺激に応答してまたは組織特異的な方法で変化させる追加の調節エレメント（例えば、上流の活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー）があろうとなかろうと正確な転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックスまたは開始エレメントを含めた、ゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。例示的なプロモーターは、上記核酸の発現をさらに増強する及び／または空間的発現及び／または一時的発現を変化させるための追加の１つ以上の特異的調節エレメントのコピーを含有し得る。一例においてプロモーターは本明細書に記載の調節可能プロモーターである。本開示によって包含されるプロモーターの他の例としては「恒常的プロモーター」が挙げられる。そのようなプロモーターは恒常的に活性である（つまり、それらは定常的に核酸の発現をもたらす、活性化させるまたは増強する）。
【００６４】
「機能可能に連結された」という用語は、核酸の発現が発現エレメントによって制御されるように発現エレメントを本明細書中で定義される核酸に対して相対的に配置することを意味する。
【００６５】
本明細書及び別記の特許請求の範囲の中で使用する場合、単数形の用語ならびに単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は例えば任意選択的に複数形での意味を含むが、但し、そうでないことが文脈から明らかである場合を除く。したがって、例えば、「治療用分子」に対する言及は任意選択的に１つ以上の治療用分子を含む。
【００６６】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、指定された値の＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％、より好ましくは＋／−１％を指すが、但し、そうでないことが示される場合を除く。
【００６７】
「及び／または」、例えば「Ｘ及び／またはＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のどちらかを意味すると理解されるべきであり、両方の意味またはどちらかの意味に対する明示的な支持を与えるものとして解釈されるべきである。
【００６８】
本明細書の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる」は、明記された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を包含するが他の任意の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を排除しないことを暗に意味すると理解されよう。
【００６９】
中止スイッチ
本開示によって包含される発現ベクターは「中止スイッチ」を含む。「中止スイッチ」という用語は、治療用分子（複数可）をコードする核酸のベクターからの発現をサイレンシングすることができる本明細書中で定義されるベクターの要素（複数可）を指す。「サイレンシング」という用語はこの文脈では完全かつ不可逆的な発現抑制を指して使用される。一例では、サイレンシングは、治療用分子をコードする核酸の本明細書中で定義される発現ベクターからの発現を完全に消滅させる。
【００７０】
一例では、中止スイッチは、治療用分子（複数可）をコードする核酸配列またはその一部をベクターから除去することを容易にすることができる。別の例では、中止スイッチは、治療用分子（複数可）の発現に必要とされる転写機構のいくつかまたは全てをベクターから除去することを容易にする。別の例では、中止スイッチは１つ以上のプロモーターの除去を容易にする。別の例では、中止スイッチはトランス活性化因子遺伝子の除去を容易にする。別の例では、中止スイッチは発現カセット全体をベクターから除去することを容易にする（つまり、全ての外来遺伝子及び調節エレメントが除去される）。別の例では、中止スイッチは、上記要素のうちの１つ以上をコードする配列の反転を容易にする。例えば、中止スイッチは、プロモーター（複数可）、治療用分子（複数可）またはトランス活性化因子をコードする配列（複数可）のいくつかまたは全部の反転を容易にすることができる。中止スイッチベクター骨格の一例は配列番号１に示される。
【００７１】
一例では、中止スイッチは一対の部位特異的組換え配列である。この例では、部位特異的組換え配列間での組換えが、治療用分子をコードする核酸の発現をサイレンシングする。別の例では、中止スイッチは、リコンビナーゼと接触した後に切断される一対の部位特異的組換え配列である。一例では、部位特異的組換え配列は、治療用分子をコードする核酸の「脇に配されている」。別の言い方をすると、第１部位特異的組換え配列が治療用分子の上流に配置されており、第２部位特異的組換え配列が治療用分子の下流に配置されている。別の例では、治療用分子をコードする核酸の発現に関与する転写機構のいくつかまたは全部の脇に部位特異的組換え配列が配されている。例えば、部位特異的組換え配列は、本明細書に開示される１つ以上のプロモーターの脇に配され得る。別の例では、ベクター内の全ての遺伝子及び調節エレメントの脇に部位特異的組換え配列が配されている。当業者であれば、ベクター内の全ての遺伝子及び調節エレメントの脇に配された部位特異的組換え配列があることで、例えば宿主における異常免疫応答または悪性形質転換の場合に全ての外来遺伝子及び調節エレメントをベクターから除去することができるような安全性の機序が提供されることを認識するであろう。
【００７２】
当業者であれば、部位特異的組換え配列の位置及び配向はベクターからの領域の反転または切除を促すことができるものであることを認識するであろう。このように、一例では、部位特異的組換え配列は切除を促すように配置される。例えば、部位特異的組換え配列は同じ向きで配置され得る。別の例では、部位特異的組換え配列は反転を促すように配置され得る。例えば、部位特異的組換え配列は、対向する配向で配置され得る。
【００７３】
一例では、中止スイッチは、Ｃｒｅリコンビナーゼと接触した後に切断される一対のＬｏｘＰ部位を含み得る。例示的なＬｏｘＰ部位は、Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＰＮＡＳ，３３９８：４０２に記載されている。例えば、本明細書中で定義されるベクターは、カノニカルｌｏｘＰ配列ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ−［スペーサー］−ＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴを含み得る。一例では、本明細書中で定義されるベクターは、一対の、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を有する部位を含み得る。他の例またはＬｏｘＰ部位を表１に示す。
【表１】
2021511834.tif 000002
【００７４】
別の例では、中止スイッチは、フリッパーゼ（Ｆｌｐ）と接触した後に切断される一対の短いフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位を含み得る。例示的なＦＲＴ部位は、Ｂｏｌｕｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：５２５９−６９に記載されている。例えば、本明細書中で定義されるベクターは、カノニカルＦＲＴ配列ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ−［スペーサー］−ＧｔＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ（例えば配列番号３２）を含み得る。他の例またはＦＲＴ部位を表２に示す。
【表２】
2021511834.tif 000003
【００７５】
別の例では、中止スイッチは、Ｄｒｅリコンビナーゼと接触した後に切断される一対のｒｏｘ部位を含み得る。例示的なｒｏｘ部位は、Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ  ２：５０８−５１５に記載されている。例えば、本明細書中で定義されるベクターはカノニカルｒｏｘ配列ＴＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴ−［スペーサー］−ＡＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＡを含み得る。他のｒｏｘ部位の例はＣｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６  Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）６：５５９−５７１に記載されており、表３に示されているものを含む。
【表３】
2021511834.tif 000004
【００７６】
別の例では、中止スイッチは、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼと接触した後に切断される一対のａｔｔ部位を含み得る。例示的なａｔｔ部位は、Ｔｈｏｒｐｅ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９８  ＰＮＡＳ  ９５：５５０５−５５１０に記載されている。例えば、本明細書中で定義されるベクターはカノニカルａｔｔＰ配列ＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＧＴＴＧＧ（配列番号４２）及びカノニカルａｔｔＢ配列ＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡ（配列番号４３）を含み得る。２番目に重要なａｔｔ部位の例としては、表４に示されるものが挙げられる。
【表４】
2021511834.tif 000005
【００７７】
本明細書中で定義される中止スイッチは、様々な機序を用いて活性化され得る。例えば、中止スイッチを「中止スイッチ活性化因子」と接触させることができる。「中止スイッチ活性化因子」という用語は、本開示の文脈では、本明細書に開示される中止スイッチを活性化させること及び治療用ポリペプチドをコードする核酸の発現をサイレンシングすることができるエレメントを指して使用される。一例では、中止スイッチ活性化因子は酵素である。例えば、酵素は、上記の部位特異的組換え配列の１つ以上に結合することができる。一例では、酵素はリコンビナーゼである。一例では、酵素はチロシンリコンビナーゼである。一例では、酵素はＣｒｅリコンビナーゼである（例えば、Ｓａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ８５：５１６６−５１７０、ＵＳ４９５９３１７、登録Ｐ０６９５６を参照されたい）。一例では、酵素はＤｒｅリコンビナーゼである（例えば、Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ  ２：５０８−５１５、登録ＡＡＶ８４９４９を参照されたい）。別の例では、酵素はフリッパーゼである。例えば、酵素はＦＬＰリコンビナーゼであり得る（例えば、Ｓａｄｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｚｈｕ（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７０：２３０４４：２３０５４、登録Ｐ０３８７０を参照されたい）。別の例では、酵素はセリンリコンビナーゼである。一例では、酵素はｐｈｉＣ３１インテグラーゼである（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９８  ＰＮＡＳ  ９５：５５０５−５５１０、登録ＮＰ＿０４７９７４を参照されたい）。
【００７８】
発現ベクター
「発現ベクター」という用語は、本開示の文脈では、宿主細胞における核酸の発現を容易にすることができる遺伝子構築物を指して使用される。発現ベクターは、単離されたポリヌクレオチド、例えば「裸のＤＮＡ」の状態で存在する場合もあるし、または宿主細胞への送達を増強する１つ以上の薬剤、例えば、ウイルスカプシド及び／またはエンベロープ、脂質、もしくはポリマーを含む場合もある。したがって、本開示によって包含される発現ベクターの例としては、裸のＤＮＡ、ファージ、ウイルス、ナノ粒子、例えば脂質に基づくナノ粒子、プラスミド、直鎖ＤＮＡ、コスミド、エピソーム、（例えばＵＳ２００４／０２１４３２９に記載されている）小環状ＤＮＡ、及び細菌が挙げられるが、これらに限定されない。別の例では、発現ベクターはトランスポゾン、例えばＰｉｇｇｙＢａｃ及びＰｉｇｇｙＢａｔである（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０３：１５００８−１３，２００６；及びＷＯ２０１０／０８５６９９を参照のこと）。
【００７９】
本開示によって包含される発現ベクターにはＤＮＡまたはＲＮＡベクターが含まれる。一例では、発現ベクターは一本鎖である。別の例では、発現ベクターは二本鎖である。
【００８０】
例示的なベクター構成要素は以下のうちの１つ以上を含むが、それらに限定されない：治療用分子及び／または調節化合物結合ポリペプチドをコードする配列、プロモーター、例えば本明細書中で定義される調節可能プロモーター、ならびに転写終結配列。
【００８１】
一例では、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換すること及び治療用分子をコードする核酸の発現をもたらすことができる。一例では、発現ベクターは宿主細胞内で複製されることもできる。別の例では、発現ベクターは、宿主細胞内で複製されることができない。いくつかの例では、発現ベクターは宿主細胞のゲノムの中に組み込まれることができる。
【００８２】
発現ベクターの選択は、様々な因子、例えば、宿主、ベクターの免疫原性、治療用分子産生の所望の持続期間などによって決まるであろう。一例では、発現ベクターはウイルスベクターである。一例では、発現ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一例では、発現ベクターはレトロウイルスベクターである。一例では、発現ベクターはレンチウイルスベクターである。一例では、発現ベクターはアデノウイルスベクターである。
【００８３】
ＡＡＶベクターは、典型的には、ＤＮＡ複製のため及び核酸送達用ビリオンとなるパッケージングのために必要とされる配列を含有する１４５ｎｔの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を両端に含む。一例では、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲを使用する。しかしながら、他の好適な血清型からのＩＴＲを選択してもよい。これらのＩＴＲまたは他のＡＡＶ構成要素は、当業者にとって利用可能な技術を用いてＡＡＶ血清型から容易に単離され得る（ＷＯ２００６／１１０６８９参照）。様々な組換えＡＡＶベクターシステムが核酸送達のために開発されている、というのも、それらは非病原性であり、広範な組織特異性を発揮するからである。ＡＡＶベクターは、当技術分野で知られている技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び第５，１３９，９４１号、国際公開第ＷＯ１９９２／０１０７０号及び第ＷＯ１９９３／０３７６９号、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３９８８−３９９６，１９８８、Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃａｒｔｅｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５３３−５３９，１９９２、Ｍｕｚｙｃｚｋａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９，１９９２、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１，１９９４、Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１６５−１６９，１９９４、及びＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５，１９９４を参照されたい。
【００８４】
別の例では、ＡＡＶは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃ−ＡＡＶ）である（例えば、ＵＳ２０１２／０１４１４２２を参照されたい）。自己相補性ＡＡＶベクターは、ＤＮＡ合成または複数のベクターゲノム同士の塩基対合を必要とせずに折りたたまれてｄｓＤＮＡになる逆向き反復配列ゲノムをパッケージングしている。
【００８５】
レトロウイルスベクターは一般に、６〜１０ｋｂ以下の外来配列をパッケージングする能力を有するシス作用性長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。ベクターの複製及びパッケージングには最小限のシス作用性ＬＴＲで十分であり、これはその後、発現構築物を標的細胞に組み込んで長期発現をもたらすために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳｒＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５６：２７３１−２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１６３５−１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｏｌ．７６：５８−５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２７４−２３１８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０，１９８９、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：５−１４，１９９０、Ｓｃａｒｐａ  ｅｔ  ａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：８４９−８５２，１９９１、Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７，１９９３を参照されたい）。
【００８６】
別のウイルスベクターとしては、例えば、ポックスファミリーのウイルス、例えばワクチニアウイルス及び鳥類ポックスウイルス、もしくはアルファウイルスに由来するもの、または複合ウイルスベクター（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５６：３１７−３２１，１９８９に記載されているもの）が挙げられる。
【００８７】
別の例では、発現ベクターはプラスミドである。一例では、発現ベクターは高コピー数プラスミドであり得る。一例では、高コピー数プラスミドは細胞１つあたり約１００〜１，０００コピーを生成することができる。別の例では、高コピー数プラスミドは細胞１つあたり約２００〜５００コピーを生成することができる。別の例では、発現ベクターは低コピー数プラスミドである。一例では、低コピー数プラスミドは細胞１つあたり約２０〜１００コピーを生成することができる。別の例では、低コピー数プラスミドは細胞１つあたり約２０〜５０コピーを生成することができる。
【００８８】
他の例としての好適な発現ベクターにも、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞において機能する（つまり発現を促す）ものが含まれる。
【００８９】
いくつかの例では、発現ベクターは特定の細胞種における治療用ポリペプチドの発現を促す。したがって、いくつかの例では発現ベクターは細胞種特異的プロモーターを含む。一例では、発現ベクターは、網膜細胞特異的プロモーター、例えば、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子−１（ＥＦＳ）プロモーター、卵黄様黄斑ジストロフィー（ＶＭＤ２）プロモーター、赤色／緑色オプシンプロモーター、胸腺細胞抗原プロモーターまたはロドプシン（Ｒｈｏ）プロモーターを含む。他の例では、発現ベクターは腫瘍細胞における発現を促す。そのようなベクターは、例えば、腫瘍特異的プロモーター（複数可）、及び／または腫瘍特異的細胞表面分子に結合して腫瘍細胞内への進入を容易にする分子を含み得る。
【００９０】
本開示によって包含される発現ベクターは、治療用分子をコードする核酸の発現を増加させるように改変されてもよい。発現を増加させるのに有用な組換え技術としては、限定されないが、治療用分子をコードする核酸配列を高コピー数プラスミドに機能的に連結すること、上記分子を１つ以上の宿主細胞染色体の中に組み込むこと、ベクター安定性配列を加えること、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換えまたは改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列）の置換えまたは改変、治療用分子をコードする核酸配列を宿主細胞のコドン使用に対応するように改変すること、及び転写産物を不安定化させる配列の欠失が挙げられる。
【００９１】
いくつかの例では、発現ベクターは、調節配列、例えば、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、及び対象に適合しており治療用分子をコードする核酸配列の発現を制御する他の調節配列を含有し得る。転写制御配列は、転写の開始、伸長及び／または終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御するもの、例えば、プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列である。好適な様々な転写制御配列が当業者に知られている。例としては、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージラムダ、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、アルファ−接合因子、ピキアアルコール酸化酵素、アルファウイルスサブゲノムプロモーター（例えばシンドビスウイルスサブゲノムプロモーター）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ昆虫ウイルス、ワクチニアウイルス、ヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（例えば中間早期プロモーター）、サルウイルス４０、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルス長鎖末端反復配列、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸及び硝酸転写制御配列が挙げられる。
【００９２】
一例では、発現ベクターはさらに、恒常的プロモーターと調節可能プロモーターとの間に転写遮断因子を含む。転写遮断因子は、近傍にある複数のプロモーター間での転写干渉を防止するために使用され得る。そのような転写遮断因子は、厳密に調節された例えば遺伝子療法に利用される発現システムにとって有益である。転写遮断因子は、１つ以上のポリアデニル化シグナル配列、及びバックグラウンドでの発現を減らすための転写休止部位を含み得る。好適な転写遮断因子は、例えば、Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：２５３９−２５４８，１９９３に記載されている。一例では、転写遮断因子は、配列番号１４に示される配列を含む。
【００９３】
別の例では、発現ベクターは、配列番号１５に示される核酸配列を含む。別の例では、発現ベクターは、配列番号１６に示される核酸配列を含む。
【００９４】
調節可能エレメント、調節化合物、及び調節化合物結合分子
一例では、本明細書中で定義されるベクターは、治療用分子をコードする核酸配列に機能可能に連結された調節可能エレメントを含む。例えば、調節可能エレメントは、以下に記載する治療用分子をコードする核酸配列に機能可能に連結され得る。
【００９５】
本開示の文脈で使用される「調節可能エレメント」という用語は、それに機能可能に連結されている核酸の発現をもたらす、活性化させる、増強するまたは抑制する組換えの合成または融合核酸（複数可）を指す。例えば、本明細書中で定義される治療用分子に機能可能に連結された調節可能エレメントは、本明細書中で定義される治療用分子の発現をもたらす、活性化させる、増強するまたは抑制する。
【００９６】
一例では、調節可能エレメントは、調節化合物の存在に応答する核酸配列を含み得る。一例では、調節可能エレメントは、機能可能に連結された核酸の発現を促進することによって調節化合物の存在に応答し得る。別の例では、調節可能エレメントは、機能可能に連結された核酸の発現を抑制することによって調節化合物の存在に応答し得る。
【００９７】
調節可能エレメントは、それが本明細書中で定義されるベクターからの治療用分子の発現を選択的に調節することができる限り、特に限定されない。一例では、調節可能エレメントは、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）、クメートオペレーター（ＣｕＯ）、エクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）、ホルモン応答エレメント（ＨＲＥ）、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）、プロゲステロン応答エレメント（ＰＲＥ）、熱ショック配列エレメント（ＨＳＥ）のうちの１つ以上を含む。
【００９８】
一例では、調節可能エレメントは調節可能プロモーターである。調節可能プロモーターの例としては、限定はしないが、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えば配列番号４）、クメート調節性プロモーター（例えば配列番号５）、ラパマイシン誘導性プロモーター、ステロイドホルモン誘導性プロモーター、金属応答プロモーター、熱ショック応答プロモーター、光応答プロモーター、インターフェロン応答プロモーター及びミフェプリストン調節性プロモーターが挙げられる。調節可能プロモーターの例は、Ｇｏｖｅｒｄｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１２：１８９−２１１，２００５、Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  ａｎｄ  Ｌｏｔｚｅ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０５：１１７７−１１８３、及びＭｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，６：４３，２００６）に記載されている。調節可能プロモーターの他の例としては、眼内血管新生または加齢黄斑変性症が低酸素に関連している場合に活性となる低酸素誘導性プロモーター、ＩＬ−８プロモーター、またはメタロチオネイン誘導性プロモーターが挙げられる。
【００９９】
一例では、調節可能プロモーターはテトラサイクリン調節性プロモーターである。別の例では、調節可能プロモーターはクメート調節性プロモーターである。
【０１００】
一例では、調節可能プロモーターは、配列番号４または配列番号５に示される配列を含む。一例では、調節可能プロモーターの核酸配列は、配列番号４または配列番号５に示される配列からなる。
【０１０１】
本開示によって包含される調節可能プロモーターなどの「調節可能エレメント」の活性（すなわち、核酸の発現をもたらす、活性化させる、増強するまたは抑制する能力）は、単独の、あるいは調節化合物結合タンパク質と結合した調節化合物によって調節される。
【０１０２】
一例では、調節化合物は、調節可能プロモーターに直接結合してその活性を調節することができる。例えば、調節化合物と調節可能プロモーターとの結合は、治療用ポリペプチドをコードする核酸の発現を促進することができる。別の例では、調節化合物と調節可能プロモーターとの結合は、治療用分子をコードする核酸の発現を抑制する。
【０１０３】
別の例において調節化合物は、調節可能プロモーターと結合してその活性を調節するためには本明細書中で定義される発現ベクターから発現する調節化合物結合分子に結合せねばならない。一例では、本明細書中で定義される発現ベクターにおいて調節化合物結合分子は恒常的プロモーターに機能可能に連結されている。この例では、調節化合物結合分子は、本明細書中で定義される発現ベクターから継続的に発現し、調節化合物との結合時に、治療用ポリペプチドに機能可能に連結された調節可能プロモーターに結合してその活性を調節することができる。
【０１０４】
調節化合物結合分子をコードする核酸に機能可能に連結され得る様々な恒常的プロモーターが当技術分野で知られている。例としては、サイトメガロウイルス即時早期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター、ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーターを含むハイブリッド調節エレメント、または免疫グロブリンプロモーターもしくはその活性断片が挙げられる。例えば、恒常的プロモーターは複合ヒトＣＭＶ−ＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターであり得る。
【０１０５】
一例では、恒常的プロモーターは、配列番号６に示される配列を含む。一例では、恒常的プロモーターの核酸配列は、配列番号６に示される配列からなる。
【０１０６】
一例では、調節化合物結合分子及び治療用分子は同じベクターから発現する。別の例では、調節化合物結合分子及び治療用分子は別個のベクターから発現する。
【０１０７】
当業者であれば、適切な調節化合物が調節可能プロモーター及び／または調節化合物結合分子によって指令されることを理解するであろう。例えば、テトラサイクリン調節性プロモーターにとって適切な調節化合物はテトラサイクリンまたはその構造類縁体、例えばドキシサイクリンであろう。別の例では、クメート調節可能プロモーターにとって適切な調節化合物はクメートまたはその構造類縁体であろう。別の例では、ラパマイシン誘導性プロモーターにとって適切な調節化合物はラパマイシンまたはその構造類縁体であろう。別の例では、ステロイドホルモン誘導性プロモーターにとって適切な調節化合物は、プロゲステロンなどのステロイドホルモン、またはその構造類縁体、例えばミフェプリストンであろう。
【０１０８】
一例では、調節化合物は小分子である。一例では、調節化合物はテトラサイクリンである。一例では、調節化合物はクメートである。一例では、調節化合物はラパマイシンである。
【０１０９】
いくつかの例では、調節化合物はステロイドホルモンまたはその類縁体である。一例では、調節化合物はプロゲステロンである。一例では、調節化合物はエクジソンである。一例では、調節化合物はグルココルチコイドである。一例では、調節化合物はエストロゲンである。一例では、調節化合物はミフェプリストンである。
【０１１０】
一例では、調節可能エレメントはテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）を含み、調節化合物はテトラサイクリンまたはその構造類縁体である。一例では、調節可能エレメントはクメートオペレーター（ＣｕＯ）を含み、調節化合物はクメートまたはその構造類縁体である。一例では、調節可能エレメントはエクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）を含み、調節化合物はエクジソンまたはその構造類縁体である。一例では、調節可能エレメントはエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）を含み、調節化合物はエストロゲンまたはその構造類縁体である。一例では、調節可能エレメントはグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含み、調節化合物はグルココルチコイドまたはその構造類縁体である。一例では、調節可能エレメントはプロゲステロン応答エレメント（ＰＲＥ）を含み、調節化合物はプロゲステロンまたはその構造類縁体である。
【０１１１】
重ねて、当業者であれば、調節化合物と調節化合物結合分子との適切な組合せを認識するであろう。一例では、調節化合物結合分子はポリペプチドである。一例では、調節化合物結合分子は、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｔＴＡ）、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）、またはリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）（例えば、配列番号２、配列番号１７）を含む。別の例では、調節化合物結合分子はシステイン代謝リプレッサー（ＣｙｍＲ）（例えば、配列番号３、配列番号１８）を含む。別の例では、調節化合物結合分子は、ステロイドホルモン受容体、例えば、プロゲステロン受容体、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはエクジソン受容体（ＥｃＲ）を含む。いくつかの例では、調節化合物結合分子はラパマイシン結合タンパク質を含む。いくつかの例では、調節化合物結合分子はＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの例では、調節化合物結合分子はＶＰ１６活性化ドメインを含む。別の例では、調節化合物結合分子は、本明細書に記載の分子の１つ以上の融合体である。例えば、調節化合物結合分子は、ＣｙｍＲとＶＰ１６活性化ドメインとの融合体を含み得る。
【０１１２】
一例では、調節化合物結合分子は、配列番号１７または配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。一例では、調節化合物結合分子は、配列番号１７または配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる。
【０１１３】
治療用分子
本開示によって包含される治療用分子は、それが本明細書に開示される発現ベクターから発現することができる、または上記発現ベクターから発現する核酸配列から翻訳されることができる限り、特に限定されない。
【０１１４】
一例では、発現した核酸配列は治療用ポリペプチドをコードする。例えば、核酸配列は、本明細書中で定義される発現ベクターから発現し、細胞機構によって翻訳されて治療用ポリペプチドを生成することができる。
【０１１５】
例示的な治療用ポリペプチドは、免疫グロブリン、抗体及び抗原結合断片などの結合タンパク質を含む。例えば、治療用ポリペプチドには、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）ｎ、抗体の定常領域に連結されたｓｃＦｖまたはｄｉ−ｓｃＦｖ、Ｆｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ならびに抗体が含まれる。一例では、治療用ポリペプチドは抗体またはＴＲＡＰ分子である。そのような治療用分子の例としては、ラニビズマブ、ベバシズマブ及びアフリベルセプトが挙げられる。
【０１１６】
別の例では、治療用ポリペプチドは抗体の抗原結合部位を含む。
【０１１７】
別の例では、治療用分子は阻害性オリゴヌクレオチドであり得る。例示的な阻害性オリゴヌクレオチドとしては、単離または合成アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣体、ｓｈＲＮＡまたはＤＮＡ、及びキメラアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。本明細書中で使用する「アンチセンス」という用語は、コード配列と相補的な、よってそれと結合することができる、ヌクレオチドの配列を意味し、これは、転写を受けるＤＮＡ二重らせんの鎖のものか、伝令ＲＮＡ分子のものかのどちらかであり得る。「短鎖ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」という用語は、二本鎖領域及びループ領域を有するＲＮＡ構造体を指す。短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られることもある低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）という用語は、長さ２０〜２５塩基対の二本鎖ＲＮＡ分子の部類である。特定のタンパク質への翻訳を阻害するまたは妨げるｓｉＲＮＡは、タンパク質名にｓｉＲＮＡという用語を繋げて表される。したがって、ＶＥＧＦの翻訳に干渉するｓｉＲＮＡは「ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ」という表記で表される。「マイクロＲＮＡ」（略してｍｉＲＮＡ）という用語は、遺伝子発現のＲＮＡサイレンシング及び転写後調節において機能する、植物、動物及びいくつかのウイルスにみられる（約２２ヌクレオチドを含有する）低分子非コードＲＮＡ分子である。「ｍｉＲ」という接頭辞の後にダッシュ及び数字が続き、後者は命名の順番を示すことが多い。１つまたは２つのヌクレオチドを除けばほぼ同一の配列を有する種々のｍｉＲＮＡは、追加の小文字で注記される。多くのｍｉＲＮＡが当技術分野で知られている（ｍｉＲＢａｓｅ  Ｖ．２１命名法、Ｋｏｚｏｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．２００４）。別の例では、本開示によって包含される阻害性オリゴヌクレオチドは１つ以上のｍｉＲＮＡの活性を阻害する。様々な種がこの目的に適する。例としては、アンタゴミール、干渉ＲＮＡ、リボザイム、ｍｉＲＮＡスポンジ及びｍｉＲマスクが挙げられる。「アンタゴミール」という用語は、標的ｍｉＲＮＡに結合し、ｍｉＲＮＡとその同族遺伝子標的との結合を妨げることによってｍｉＲＮＡ機能を阻害する、化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを指して本開示の文脈で使用される。
【０１１８】
一例では、治療用分子は「抗血管新生分子」である。「抗血管新生分子」という用語は、血管の発達を阻害する、例えば、血管新生、内皮細胞成長、血管の安定性及び／または脈管形成を阻害する、本明細書中で定義される発現ベクターから発現する分子を指して本開示の文脈で使用される。本開示によって包含される抗血管新生分子は、ポリヌクレオチド（複数可）、ポリペプチド（複数可）、抗体（複数可）、またはその複合体もしくは融合タンパク質を含む。例示的な抗血管新生分子としては、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリーのメンバー、Ｐ１ＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン）、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３及びＡＮＧＰＴＬ４の阻害剤が挙げられる。他の例では、抗血管新生分子は、成長ホルモン、例えば、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦ及びＣＴＧＦファミリーのメンバー、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βを阻害する。抗血管新生分子の他の例としては、ＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体、ならびに血管新生阻害剤、例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン及びその融合体が挙げられる。したがって、一例では、治療用分子はエンドスタチン及び／またはアンジオスタチン（例えば、配列番号９、配列番号２０）を含む。別の例では、治療用分子は本明細書に記載の分子の１つ以上の融合体である。例えば、治療用分子は、エンドスタチンとアンジオスタチンとの融合体を含み得る。
【０１１９】
一例では、治療用分子は抗炎症性分子である。一例では、抗炎症性分子はインターロイキン、例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１１またはＩＬ−１３である。例えば、抗炎症性分子はＩＬ−１０（例えば、配列番号８、配列番号１９）であり得る。別の例では、抗炎症性分子は、インターロイキンＩＬ−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ）（例えば、配列番号１０、配列番号２１）、またはＩＬ−１０とＩＬ−１ＲＡとの融合体（例えば、配列番号１１）である。他の例では、抗炎症性分子は、炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）またはＩＬ−１８を阻害する。他の例では、抗炎症性分子は、対象におけるＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞の産生または数を増加させる、ＩＬ−６レベルを低下させる、ＴＮＦ−アルファレベルを低下させる、及び／またはＩＬ−１０レベルを向上させる。
【０１２０】
別の例では、治療用分子は神経栄養因子である。神経栄養因子は、発達途上のニューロンの発達及び成体のニューロンの維持を担っていると考えられている。これに関して、神経栄養因子は、神経細胞の変性及び死を抑制するまたは逆転させるために使用され得る。神経栄養因子の例としては、例えば、脳由来神経栄養因子、神経成長因子、形質転換増殖因子、神経膠細胞株由来神経栄養因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４／５、及びインターロイキン１−Ｂが挙げられる。
【０１２１】
別の例では、治療用分子はがん細胞に対して細胞毒性である。他の例では、治療用分子は、核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）、Ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７、幹細胞因子受容体）、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）、Ｒａｓ−Ｒａｆマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）経路、Ｂｃｌ−２、ＩＬ−２のうちの１つ以上を阻害する。
【０１２２】
一例では、治療用分子は、配列番号１９〜２１に示されるアミノ酸配列を含む。一例では、調節化合物結合分子は、配列番号１９〜２１に示されるアミノ酸配列からなる。
【０１２３】
治療及び予防
本開示の方法は眼障害の治療及び／または予防に関する。「眼障害」という用語は、ヒトの目及び視覚系に影響を及ぼす障害及び異常を指して本開示の文脈で使用される。例えば、眼障害としては、先天性の、発達上の、炎症性の、感染性の、血管の、閉塞性の、血管新生の、変性の、新生物の、新生物発生前の、医原性の、外傷性の、緑内障性の、移植後合併症の、白内障の、及び特発性の、目、網膜、脈絡膜もしくは黄斑の疾患、またはこれらの疾患の全身的素因、関連もしくは合併症（例えば、転移性ぶどう膜メラノーマ、または遺伝性ジストロフィーにおける多臓器作用）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
他の例示的な眼障害としては、糖尿病網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、臨床的に重大な黄斑浮腫、ぶどう膜炎、虹彩炎、巨細胞性動脈炎、血管炎、扁平部炎、角膜移植拒絶反応、眼内炎症及び表層角膜移植拒絶反応が挙げられる。本開示によって包含される眼障害の他の例としては、黄斑変性、糖尿病網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、臨床的に重大な黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症または眼内血管新生が挙げられる。例えば、眼障害は「眼内新生血管疾患」であり得る。「眼内新生血管疾患」という用語は、眼内血管新生を特徴とする疾患を指して本開示の文脈で使用される。眼内新生血管疾患の例としては、例えば、増殖網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、乾燥型加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、湿潤型加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症及び他の虚血性網膜症、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル−リンドウ病、目のヒストプラズマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生及び網膜血管新生が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本開示の方法は、湿潤型ＡＭＤを治療することを包含する。別の例では、本開示の方法は、ＣＮＶを治療することを包含する。
【０１２５】
一例では、本開示の方法は、網膜における内皮細胞成長の阻害を包含する。例えば、本開示の方法は、網膜下色素上皮及び／または網膜下空間における内皮細胞成長の阻害を包含する。
【０１２６】
別の例では、眼障害は感染症である。
【０１２７】
別の例では、眼障害はがんである。一例では、がんは、ぶどう膜メラノーマ、毛様体メラノーマ、虹彩メラノーマ、脈絡膜メラノーマ、眼内リンパ腫、網膜芽細胞腫、または髄上皮腫、脈絡膜血管腫、脈絡膜転移、結膜カポジ肉腫、悪性結膜腫瘍、眼窩または涙腺リンパ腫、結膜のリンパ腫、結膜メラノーマ、または異型を伴う原発性後天性メラノーシス、眼窩の悪性腫瘍、涙腺の悪性腫瘍、色素性結膜腫瘍、結膜の扁平上皮癌腫、結膜の上皮内新生物、または眼表面扁平上皮新生物である。一例では、がんはぶどう膜メラノーマである。
【０１２８】
別の例では、眼障害は、脈絡膜母斑、脈絡膜骨腫、太田母斑、結膜母斑、前眼部デルモイド、涙腺の良性腫瘍、眼窩の良性腫瘍、甲状腺眼症の顕在化、瞼裂斑または翼状片である。
【０１２９】
別の例では、眼障害は、ＲＰＥ６５によるレーバー先天性黒内障、またはＲＰＥ６５突然変異によって引き起こされる眼障害である。別の例では、眼障害は、ＭＥＲＴＫもしくはＲＰＧＲもしくはＰＤＥ６ＢもしくはＲＬＢＰ１もしくは他の遺伝子の突然変異によって引き起こされる色素性網膜炎、またはＭＥＲＴＫもしくはＲＰＧＲもしくはＰＤＥ６ＢもしくはＲＬＢＰ１の突然変異によって引き起こされる別の疾患である。別の例では、眼障害は、コロイデレミア、またはＣＨＭの突然変異によって引き起こされる眼障害である。別の例では、眼障害は、色覚異常、またはＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＰＤＥ６Ｃ、ＰＤＥ６Ｈ及びＡＴＦ６遺伝子の突然変異によって引き起こされる眼障害である。別の例では、それは、Ｘ染色体連鎖性網膜分離症、またはＲＳ１の突然変異によって引き起こされる眼障害である。別の例では、眼障害は、レーベル遺伝性神経症である。別の例では、眼障害は移植の合併症である。
【０１３０】
一例では、上記の方法は、本明細書に記載の発現ベクターを投与することを含む。例えば、上記の方法は、中止スイッチと治療用分子をコードする核酸とを含む発現ベクターを投与することを含み得、中止スイッチの活性化は、治療用分子をコードする核酸の発現をサイレンシングする。一例では、ベクターは、治療用分子をコードする核酸に機能可能に連結された調節可能エレメントをさらに含み、調節可能プロモーターの活性は、調節化合物を対象に投与することによって調節される。一例では、発現ベクターは、調節化合物に結合する調節化合物結合分子に機能可能に連結された恒常的プロモーターをさらに含み、調節物質結合ポリペプチドは調節化合物と結合した時に治療用分子の発現を調節する。
【０１３１】
別の例では、調節化合物結合分子及び治療用分子は別個の発現ベクターから発現する。
【０１３２】
製剤
発現ベクター、調節化合物、及び本明細書に記載の他の分子は、対象への投与に適した医薬組成物として製剤化され得る。例示的な医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含み得る。特定の投与経路に応じて、当技術分野で知られている様々な許容される担体、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）に記載されているものが使用され得る。
【０１３３】
例示的な医薬組成物は、薬学的に許容される無菌水溶液または非水溶液、分散体、懸濁液またはエマルジョン、ならびに使用直前に無菌注射液または分散体に再構成するための無菌粉末も含み得る。好適な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及びその好適な混合物、植物油、ならびに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。組成物は、佐薬、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤、または抗菌及び抗真菌剤などを含有していてもよい。
【０１３４】
別の例では、発現ベクターは、徐放性または指向的送達システムの中に組み込まれ得る。例示的な徐放性システムとしては、ポリマーマトリックス、リポソーム及びマイクロスフェアが挙げられる。リポソームは生分解性及び両親媒性の薬物送達システムであってもよく、これをリン脂質及びコレステロールを使用して製剤化してもよい。マイクロスフェアは、生分解性及び生体適合性ポリマーを使用して製剤化され得る。
【０１３５】
一例では、調節化合物は局所用製剤中に含まれた状態で提供される。例えば、調節化合物を点眼薬製剤として提供することができる。好適な点眼薬製剤の例としては、液剤、懸濁剤、軟膏剤、ゲル剤または泡剤が挙げられる。一例では、点眼薬製剤は、本明細書中で定義される調節化合物と好適な担体とを含む。例示的な担体としては、生理食塩水溶液、水性ポリエーテル、例えばポリエチレングリコール、ポリビニル、例えばポリビニルアルコール及びポビドン、セルロース誘導体、例えばメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース、石油誘導体、例えば鉱油及び白色ワセリン、動物性脂肪、例えばラノリン、アクリル酸のポリマー、例えばカルボキシポリメチレンゲル、植物性脂肪、例えばピーナッツ油、ならびに多糖、例えばデキストラン、ならびにグリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸ナトリウム、ならびに塩、例えば塩化ナトリウム及び塩化カリウムが挙げられる。
【０１３６】
一例では、発現ベクターは、発現ベクターの制御放出または持続放出を可能にする装置、例えば眼科用のスポンジ、網目状材料、機械的リザーバまたは機械的移植片の中または上に存在する。移植片（例えば、Ｕ．Ｓ．５，４４３，５０５、４，８５３，２２４、及び４，９９７，６５２を参照されたい）、装置（例えば、Ｕ．Ｓ．５，５５４，１８７、４，８６３，４５７、５，０９８，４４３、及び５，７２５，４９３を参照されたい）、例えば埋込型装置、例えば、機械的リザーバ、眼内装置、もしくは眼内導管付き眼外装置、またはポリマー組成物を含む移植片もしくは装置は、発現ベクターを眼内投与するのに特に有用である。
【０１３７】
一例では、発現ベクターは、形質導入効率を向上させるために、つまり宿主細胞内へのベクターの形質導入を強化するために製剤化される。好適な組成物については米国特許第６，２２５，２８９号及び第６，５１４，９４３号の中でさらなる記載がなされている。
【０１３８】
投与及び投薬
一例では、本明細書中で定義される発現ベクターを対象に投与する。その後、対象への調節化合物の投与によって発現ベクターからの治療用分子の発現を調節する。その後、中止スイッチ活性化因子を対象に投与すること、または中止スイッチ活性化因子をコードする核酸配列を含むベクターを投与することによって治療用分子の発現をサイレンシングする。ベクター、調節化合物及び中止スイッチ活性化因子の各々は医薬組成物として対象に投与され得る。投与経路の選択は、様々な因子、例えば、宿主、ベクターの免疫原性、治療用分子産生の所望の持続期間などによって決まるであろう。
【０１３９】
医薬組成物は例えば局所に投与され得る。例えば、組成物を点眼薬によって投与することができる。この例では、組成物またはその一部は疎水性の角膜によって眼内環境へと拡散し得る。別の例では、組成物を硝子体内注射によって投与する。別の例では、組成物を網膜下注射によって投与する。一例では、網膜下注射の前に硝子体切除術を実施する。別の例では、組成物を皮下注射によって投与する。別の例では、組成物を筋肉内注射によって投与する。別の例では、組成物を静脈内注射によって投与する。別の例では、組成物を食品組成物または飲料組成物として投与する。調節化合物として熱または光の使用を伴う他の例では、そのような化合物を必要に応じて対象の眼に適用する。
【０１４０】
一例では、ベクターを含む医薬組成物は、目の特定領域への送達のための眼科機器によって投与される。特殊な眼科機器の使用は、隣接する眼組織への損傷を最小限に抑えながら発現ベクターの正確な投与を保証する。目の特定領域への発現ベクターの送達はまた、罹患していない細胞の治療用分子への曝露を制限し、それによって副作用のリスクを低減する。そのような眼科機器の一例は、鉗子と、網膜下針または鋭角屈曲カニューレとの組合せである。
【０１４１】
一例では、発現ベクターを含む医薬組成物を硝子体内または網膜下注射によって投与し、次いで調節化合物（複数可）を含む医薬組成物を点眼薬によって局所投与し、次いで中止スイッチ活性化因子を局所に、及び／または硝子体内もしくは網膜下注射によって投与する。
【０１４２】
別の例では、発現ベクターを含む医薬組成物を硝子体内または網膜下注射によって投与し、次いで調節化合物（複数可）を含む食品組成物または飲料組成物を投与し、次いで中止スイッチ活性化因子を局所に、及び／または硝子体内もしくは網膜下注射によって投与する。
【０１４３】
一例では、中止スイッチ活性化因子を本明細書に記載のベクターから発現させることができる。一例では、中止スイッチを含むものを１つ目とし、中止スイッチ活性化因子をコードする核酸配列を含むものを２つ目とする、２つのベクターを対象に投与することができる。したがって、第１ベクターを投与して治療用分子を発現させることができ、続いてその後、治療用分子の発現をもはや必要としなくなったまたは望まなくなったときに第２ベクターを投与して中止スイッチ活性化因子を発現させて、それによって治療用分子の発現をサイレンシングすることができる。いくつかの例では、中止スイッチ活性化因子をコードする核酸配列は調節可能プロモーターに機能可能に連結されている。
【０１４４】
別の例では、本明細書に開示される中止スイッチを含むベクターは、調節可能プロモーターに機能可能に連結された中止スイッチ活性化因子をさらに含み得る。したがって、いくつかの例では、治療用分子及び中止スイッチ活性化因子を両方ともコードする核酸配列が同一ベクター内に存在し得る。この例では、調節化合物を対象に投与して調節可能プロモーターを活性化させ、中止スイッチ活性化因子の発現を促進し、これによって中止スイッチを活性化させてベクターからの治療用分子（複数可）の発現をサイレンシングする。同様に、別の例では、調節化合物結合分子を別のベクターから発現させることができる。例えば、調節可能エレメントを含むものを１つ目とし、調節化合物結合分子をコードする核酸に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含むものを２つ目とする、２つのベクターを対象に投与することができる。この例では、調節化合物が対象に投与されて調節化合物結合分子と結合し、調節可能プロモーターの発現を調節する。
【０１４５】
当業者であれば、宿主の免疫系に起因する発現ベクターの損失を最小限に抑えるように投薬量及び投与経路を選択することができることを認識するであろう。例えば、生体内で眼細胞と接触させるためには、本明細書に記載の方法を実施する前に欠失発現ベクター（すなわち、治療用分子をコードする核酸配列を含んでいない発現ベクター）を宿主に投与することが有益であり得る。欠失発現ベクターの事前投与は、宿主における発現ベクターに対する免疫（例えば寛容）を生み出す役割を果たすことができ、それによって、宿主の免疫系によって取り除かれるベクターの量を減らすことができる。
【０１４６】
本明細書に開示される組成物を例えば静脈内または腹腔内投与によって全身投与することもできる。別の例では、組成物が経口投与され得る。別の例では、組成物は鼻腔内に投与され得る。
【０１４７】
一例では、対象に第１用量を投与し、続いて後の１つ以上の用量を投与する。一例では、第１用量は、本明細書に開示されるベクターを含む。一例では、ベクターを含む後の１つ以上の用量を投与する。調節化合物を同時にまたは後の１つ以上の用量として投与してベクターからの治療用分子の発現を調節してもよい。例えば、本明細書に開示されるベクターを含む第１用量を対象に投与することができ、調節化合物を含む後の一連の用量を対象に投与することができる。この例では、後の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、１００個またはそれよりも多くの用量が対象に投与され得る。この例では、後の用量の調節化合物は、本明細書に開示される後の用量の発現ベクターと同時にまたはその後に提供され得る。一例では、投薬は１日１回、１日おき、１週間おき、１ヶ月おきである。一例では、１日用量は、投与１回あたり単回の適用または複数回の適用を含む。例えば、投与１日あたり少なくとも２回、３回、４回またはそれよりも多い適用が提供され得る。
【０１４８】
キット
本開示に係る組成物はキットまたはパックとして提供され得る。例えば、本明細書に開示される組成物を、眼障害を治療するための説明が書かれた好適な容器で包装してもよい。一例では、組成物は点眼薬またはプレフィルドシリンジなどの単回用量容器に入れて提供され得る。
【０１４９】
本開示のキットは治療システムを含んでいてもよい。そのような治療システムは、予めプログラムされた付き添いなしでの組成物の送達を、特定の治療的必要性を満たすように確立された一定速度及び一定期間でもたらすことができる。システムは、例えば、患者の介入を最小限に抑えるように、及び定められた投薬計画の遵守を最適化するように設計され得る。
【０１５０】
一例では、キットは、眼障害を治療する方法に使用するための、本明細書中で定義される発現ベクター（複数可）と本明細書中で定義される調節化合物（複数可）を含む点眼薬製剤とを含む。
【０１５１】
一例では、キットは、本明細書中で定義される中止スイッチ活性化因子をさらに含む。
【０１５２】
一例では、キットは、本明細書中で定義される中止スイッチ活性化因子をコードする核酸配列を含む発現ベクターをさらに含む。
【０１５３】
一例では、キットは、
−本明細書中で定義される発現ベクター（複数可）、
−テトラサイクリンを含む点眼薬製剤、及び
−Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む発現ベクター
を含む。
【実施例】
【０１５４】
実施例１−方法
ベクターの構築
ｐＡＡＶ．ＬＬ中止スイッチベクター骨格（図１）を合成によって構築し、ＡＡＶ  ＩＴＲを含有するｐＡＡＶ−ｍｃｓの中にライゲートした。ｐＡＡＶ．ＬＬ骨格の中へのクローニングを可能にするための制限部位を有する合成の各ベクターインサートも合成した。ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ部位が脇に配されたテトラサイクリンまたはクメートリプレッサー遺伝子を骨格上のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。ＢｓｔＢＩ及びＳａｌＩ部位が脇に配されたテトラサイクリンまたはクメート応答プロモーター及びＣＭＶプロモーターを特有の骨格中のＢｓｔＢＩ−ＳａｌＩ部位にクローニングした。最後に、ＳａｌＩ及びＮｈｅＩが脇に配された関心対象の遺伝子（ＧＦＰ、ＩＬ−１０、エンド／アンジオスタチン、ＩＬ−１ＲＡ、及びＩＬ−１０−ＩＬ−１ＲＡ）をＳａｌＩ−ＮｈｅＩ部位にクローニングした。Ｎａｎｏ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを、適合性のＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位を有する中止スイッチベクター上のＳａｌＩ−Ｎｈｅ部位にクローニングした（図２）。
【０１５５】
マーカー遺伝子ルシフェラーゼを含有するベクター構築物の中の中止スイッチの作用の評価
１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と１００Ｉ．Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と共にＡＲＰＥ−１９細胞をＴ−７５組織培養フラスコ内で約８０％の集密度になるまで培養した。細胞を０．０５％のトリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理し、２０，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェル組織培養処理プレートに播種した。１２〜２４時間後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して細胞に、どれもマーカー遺伝子ｎａｎｏ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを含有するものであるｐＡＡＶ−ＬＴｅｔＬ−ｌｕｃ、ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ｌｕｃ、及びｐＡＡＶ−ＬＣＭＶＬ−ｌｕｃをトランスフェクトした。
【０１５６】
トランスフェクションから２４時間後に細胞を穏やかに洗浄し、培地を、ドキシサイクリン（テトラサイクリン構造類縁体）及びクメートで活性化させた細胞のサブセット、ならびに対応する活性化させていない細胞のサブセットと交換した（図４）。４日目に、活性化を確かめるためにＮａｎｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて発光を測定し、その後、活性化細胞のサブセットにＣｒｅを含有するベクターをトランスフェクトした。細胞を毎日洗浄し、７日目に発光を測定した。手短に述べると、各処理ウェルからの１０ｕｌの培地を黒色透明底３８４ウェルプレートに加えることによってＮａｎｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを実施した。その後、１０ｕｌのｐｒｏｍｅｇａ基質をこれらのウェルに加え、混合し、３分間室温で放置した。発光プレートリーダーで発光を読み取った。この実験の模式図を図４に示し、ベクター中止の結果を図５に示す。
【０１５７】
マーカー遺伝子ルシフェラーゼを含有するベクター構築物の活性化及び不活性化の評価
ＡＲＰＥ−１９細胞を上記のとおりに播種した。１２〜２４時間後、細胞にｐＡＡＶ−ＬＴｅｔＬ−ｌｕｃ、及びｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ｌｕｃをトランスフェクトした。翌日に培地を交換し、ドキシサイクリンまたはクメートを細胞のサブセットに添加した（図７）。３日目に培地交換した後の４日目にＮａｎｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを用いて細胞からの培地をマーカー遺伝子ルシフェラーゼの発現について検査した。Ｎａｎｏ−Ｇｌｏｗルシフェラーゼアッセイを上記のとおりに実施した。
【０１５８】
ルシフェラーゼアッセイに続いて、全てのウェルで培地を変更した。ドキシサイクリン及びクメートで活性化させた細胞のサブセットを洗浄してベクターを不活性化させた。３日洗浄した後にＮａｎｏ−Ｇｌｏｗルシフェラーゼアッセイを再び実施し、結果を図８に示す。
【０１５９】
エンド／アンジオスタチンを含有するベクター構築物の血管新生に対する作用の評価
標準的な内皮細胞チューブ形成アッセイを製造業者のプロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、血管新生スターターキット：Ａ１４６０９−０１）に従って用いて、ベクターの血管新生に対する作用を評価した。手短に述べると、初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に、エンド／アンジオスタチンを含有するクメート調節性ベクター（ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳ）をＣｒｅありまたはなしでトランスフェクトした（上記のとおり）。細胞をトランスフェクションから２４時間以内に洗浄し、トランスフェクションから４８時間後にｇｅｌｔｒｅｘ（基底膜マトリックス）上に播種した。１４〜１８時間後、チューブを撮影し、ＩｍａｇｅＪ血管新生解析装置ソフトウェア（ＮＩＨ、ＭＤ，ＵＳＡ）で解析した。実験の模式図を図９に示し、結果を図１０に示す。
【０１６０】
ＩＬ−１０を含有するベクター構築物における炎症マーカーの調節の評価
ＡＲＰＥ−１９細胞を播種し、Ｃｕ調節性ＩＬ−１０を含有するベクターであるｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＩＬ−１０をトランスフェクトした（上記のとおり）。抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を含有するこのベクターを使用して炎症促進性シグナル伝達の誘導を、ＩＬ−６の発現を測定することによって試験した。内部中止スイッチを活性化させるために、ならびに活性化及び不活性化したベクターをサイレンシングするために、Ｃｒｅを使用した。ＡＲＰＥ−１９をトランスフェクションした後、細胞を２日間洗浄し、４日目に回収した培地を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用してＩＬ−６及びＩＬ−１０の濃度を製造業者の指示（ｅｌｉｓａｋｉｔ．ｃｏｍ−００１２、ｅｌｉｓａｋｉｔ．ｃｏｍ−００３１）に従って決定した。実験の模式図を図１１に示し、結果を図１２に示す。
【０１６１】
統計解析
統計解析は全て、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ  １３．０（Ｓｙｓｔａｔソフトウェア、ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて実施した。ベクターの遺伝子調節の差異は全て、ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなしてｔ検定によって評価した。
【０１６２】
実施例２−発現ベクター
テトラサイクリンまたはクメートリプレッサー遺伝子（それぞれ配列番号２及び３）をベクター骨格のリプレッサークローニング部位１（図１）に、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を用いてクローニングした。対応するプロモーターをプロモータークローニング部位２に、ＢｓｔＢＩ及びＳａｌＩ制限部位を用いてクローニングした（それぞれ配列番号４及び５）。条件付きで調節されるポリペプチドをＧＯＩクローニング部位３に、ＳａｌＩ及びＮｈｅＩ制限部位を用いて（ＧＦＰ、ＩＬ−１０、エンド／アンジオスタチン融合タンパク質、ＩＬ−１ＲＡ、またはＩＬ−１０／ＩＬ−１ＲＡ遺伝子；配列番号７〜１１）または適合性ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位を用いて（Ｎａｎｏ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、配列番号１２）クローニングした。図２は、いかにして発現ベクターを構築したかについての模式図を示す。
【０１６３】
実施例３−中止スイッチ活性化
全ての発現配列を２つのＬｏｘＰ部位内に位置させて発現ベクターを構築した（図１及び図２）。永久的に発現をサイレンシングするために、Ｃｒｅを発現させるベクターを細胞にトランスフェクトした。Ｃｒｅは、全ての発現配列を２つのｌｏｘＰ部位での部位特異的組換えによって除去する（配列番号１３）。結果として得られるベクターは、発現機構が存在しておらず、導入遺伝子発現を誘導することができない。
【０１６４】
ヒト網膜色素上皮細胞株（ａＲＰＥ−１９）に、テトラサイクリンもしくはクメート調節エレメントまたはＣＭＶプロモーターを含有するベクター構築物をトランスフェクトしてマーカー遺伝子ルシフェラーゼの発現を促した。２４時間後、細胞をテトラサイクリン（Ｔｅｔ）またはクメート（Ｃｕ）で処理したかまたは処理せず、ルシフェラーゼの発現を評価する前にさらに４８時間インキュベートした。細胞内にＣｒｅベクターをトランスフェクトしてＬｏｘＰ部位間の発現配列を切り取ることによって、導入遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現を中止するシステムの能力を調べた。細胞を洗浄し、調節化合物（Ｔｅｔ及びＣｕ）を、ルシフェラーゼの発現レベルの変化について培地を検査する７日目まで毎日添加し直した。
【０１６５】
Ｔｅｔ活性化をあり（オンになったｐＡＡＶ−ＬＴｅｔＬ−ｌｕｃ）またはなし（オフになったｐＡＡＶ−ＬＴｅｔＬ−ｌｕｃ）にしてＴｅｔベクターで処理した細胞におけるルシフェラーゼの発現を図５のａに示す。Ｃｕ活性化をありまたはなしにしてＣｕベクターで処理した細胞におけるルシフェラーゼの発現を図５のｂに示す。Ｃｒｅ媒介切除をありまたはなしにしてＣＭＶベクターをトランスフェクトした後のルシフェラーゼの発現を図５のｃに示す。ルシフェラーゼ発現は全てのＣｒｅ切除細胞において効果的にサイレンシングされた。
【０１６６】
実施例４−治療薬調節
使用したＴｅｔ  Ｏｎシステムを図６のａにまとめる。ＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターは、Ｔｅｔプロモーター中のＴｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）に結合することができず結果としてそれの不活性化及び導入遺伝子発現の欠如をきたすものであるＴｅｔトランス活性化因子タンパク質を恒常的に発現させる。Ｔｅｔの存在下では、トランス活性化因子タンパク質はプロモーター中のＴｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）に結合してそれを活性化させ、導入遺伝子の発現を誘導する。使用したＣｕ  Ｏｎシステムを図６のｂにまとめる。このシステムでは、Ｃｕリプレッサータンパク質はＣｕの非存在下でＣｕオペレーター配列に結合し、それによってプロモーターを不活性化させ、結果として導入遺伝子転写がなくなる。Ｃｕの添加があるとＣｕは、Ｃｕプロモーターに結合しているリプレッサータンパク質に結合し、それによってリプレッサーを遊離させて導入遺伝子転写を可能にする。
【０１６７】
ヒト網膜色素上皮細胞株（ａＲＰＥ−１９）に、ＴｅｔもしくはＣｕ調節配列を含有するベクター構築物をトランスフェクトしてマーカー遺伝子ルシフェラーゼの発現を促した。２４時間後、細胞にＴｅｔまたはＣｕによる処理をするかまたはせずにさらに４８時間インキュベートし、その後、ルシフェラーゼの発現を評価した。ルシフェラーゼ発現を再検査する前に洗浄によって細胞からＴｅｔまたはＣｕを除去することによって、システムが導入遺伝子（ルシフェラーゼ）の発現を停止させる能力を調べた。ＴｅｔまたはＣｕを有さない細胞を対照として使用し、ＴｅｔまたはＣｕが除去されていない細胞を同じく対照として使用した。
【０１６８】
図８のａは、導入遺伝子産生のスイッチを入れる薬剤としてテトラサイクリンを使用した実験から７日目に実施した発光アッセイからの結果を示す。図８のｂは、導入遺伝子産生のスイッチを入れる薬剤としてクメートを使用した実験の７日目に実施した発光アッセイからの結果を示す。どちらの実験においても、基質（ＴｅｔまたはＣｕ）は有意なレベルのルシフェラーゼ発現を誘導することができ、基質の除去によって調節され、結果として検出されるルシフェラーゼが有意に減少した。
【０１６９】
実施例５−チューブ形成アッセイ
Ｃｒｅありまたはなしで初代ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においてチューブ形成アッセイを用いて、ＬｏｘＰ部位が脇に配されたエンド／アンジオスタチン（ＥＡＳ）を含有するベクターの血管新生に対する作用を評価した（図９）。継代数の若い（ｐ２〜４）ＨＵＶＥＣに、ＥＡＳを産生するクメート調節性ベクター（ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に細胞を計数し、ｇｅｌｔｒｅｘ被覆ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で１４〜１８時間インキュベートし、その後、ｇｅｌｔｒｅｘ中に形成されたチューブの写真を撮影し、ＩｍａｇｅＪ血管新生解析装置を使用して解析した。
【０１７０】
図１０のＡは、Ｃｕ活性化なしで非ＥＡＳ発現ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳがトランスフェクトされた細胞におけるＨＵＶＥＣチューブ形成を示す。図１０のＢは、ＨＵＶＥＣを活性化ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳで処理したときのチューブ形成の阻害を示す。図１０のＣは、活性化ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳをＣｒｅによって切除したときのチューブ形成能力の回復を示す。図１０のＤ及びＥはそれぞれ、ＩｍａｇｅＪ血管新生解析装置ソフトウェアを使用して総メッシュ面積及び総分岐長さを定量するものである。ｐＡＡＶ−ＬＣｕＬ−ＥＡＳベクターはチューブ形成を減少させることができたが、ベクターをＣｒｅで切除するとこのチューブ形成は概して逆転した。
【０１７１】
実施例６−炎症促進性シグナル伝達
炎症促進性シグナル伝達の誘導に対する、ＬｏｘＰ部位が脇に配されたＣｕ調節性ＩＬ−１０を含有するベクターの影響を、ＣｒｅありまたはなしでＩＬ−６発現を測定することによって決定した（図１１）。ヒト網膜色素上皮細胞株（ａＲＰＥ−１９）に、Ｃｕ調節配列を含有するベクター構築物をトランスフェクトして抗炎症性ＩＬ−１０の発現を促した。陰性対照は、Ｃｕ活性化を欠きＣｒｅで処理されたＩＬ−１０ベクターからなっていた。ＩＬ−１０群は、Ｃｕによって活性化されたＩＬ−１０ベクターからなっていた。中止群は、Ｃｒｅで処理された活性化ＩＬ−１０ベクターからなっていた。ＩＬ−１０及び炎症促進性マーカーＩＬ−６の発現について細胞をＥＬＩＳＡによって検査した。
【０１７２】
図１２は、Ｃｒｅの添加をありまたはなしにしてＩＬ−１０を含有するクメート調節性ベクターでトランスフェクトした後にＩＬ−１０及びＩＬ−６の同時ＥＬＩＳＡから得られた結果を示す。陰性対照ベクター（Ｃｕなし及びＣｒｅあり）で処理した細胞において、検出されたＩＬ−１０のレベルは低く、高レベルの炎症促進性ＩＬ−６と相関していた。反対に、Ｃｕの存在下でＣｕ調節性ＩＬ−１０ベクター（オンになっているＩＬ−１０ベクター）で処理した細胞は高レベルのＩＬ−１０を発現させ、これは低レベルのＩＬ−６発現と相関していた。ＩＬ−１０がＣｒｅによって切除されたベクター（中止されているＩＬ−１０ベクター）はＩＬ−１０及びＩＬ−６のレベルが陰性対照のそれと同程度になり、ＩＬ−１０の発現が効果的にサイレンシングされたことを示していた。
【０１７３】
当業者であれば、具体的な実施形態に示されるように、大まかに記載されている本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく本開示に対して多くの変更及び／または改変がなされ得ることを認識するであろう。したがって、本発明の実施形態はあらゆる点において例示的であり非制限的であると解釈されるべきである。
【０１７４】
本明細書中で考察及び／または言及がなされている全ての刊行物の全体を本明細書に援用する。
【０１７５】
本明細書中に含まれている文書、法令、材料、装置、物品などについてのいかなる考察も、単に本発明に文脈を提供する目的のためのものである。それを、本出願の各請求項の優先日よりも前に存在していたからといってこれらの事柄のいずれかまたは全てが先行技術の土台の一部を形成しているまたは本発明の該当分野の一般常識であったと認めるものとして捉えるべきではない。
【０１７６】
本出願は、２０１８年１月２３日に出願されたＡＵ２０１８９００２０６に基づく優先権を主張するものであり、参照によりその内容全体を本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月31日(2019.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現ベクターであって、
ａ）第１部位特異的組換え配列及び第２部位特異的組換え配列を含む中止スイッチと、
ｂ）治療用分子をコードする核酸配列に機能可能に連結された調節可能エレメントであって、前記調節可能エレメントの活性が調節化合物によって調節される、前記調節可能エレメントと、
ｃ）調節化合物に結合することができる調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターであって、前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記治療用分子の発現を調節するものである、前記恒常的プロモーターと、を含み、
前記第１部位特異的組換え配列と前記第２部位特異的組換え配列との間での組換えによる前記中止スイッチの活性化が、前記治療用分子をコードする前記核酸の前記ベクターからの発現をサイレンシングする、前記発現ベクター。
【請求項２】
前記第１部位特異的組換え配列が、前記治療用分子をコードする前記核酸配列の上流に配置されており、前記第２部位特異的組換え配列が、前記治療用分子をコードする前記核酸配列の下流に配置されている、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記第１部位特異的組換え配列及び前記第２部位特異的組換え配列がｌｏｘＰ部位である、請求項１または請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物と結合すると前記治療用分子の発現を促進するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物と結合すると前記治療用分子の発現を抑制するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子またはシステイン代謝リプレッサー（ＣｙｍＲ）のうちの１つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記調節化合物がテトラサイクリン、クメート（ｃｕｍａｔｅ）、プロゲステロン、グルココルチコイド、エストロゲンまたはミフェプリストンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記調節可能エレメントが、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）、クメートオペレーター（ＣｕＯ）、エクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）、プロゲステロン応答エレメント（ＰＲＥ）、熱ショック配列エレメント（ＨＳＥ）または光誘導性プロモーターのうちの１つ以上を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記恒常的プロモーターが複合ヒトＣＭＶ−ＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記治療用分子が血管新生を阻害する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記治療用分子が、
−エンドスタチン、アンジオスタチン、もしくはエンドスタチンとアンジオスタチンとの融合体を含む；
−結合タンパク質である；
−抗体の抗原結合部位を含む；
−ラニビズマブ、ベバシズマブ及びアフリベルセプトからなる群から選択される；
−炎症を抑制する；または
−インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ）、もしくはＩＬ−１０とＩＬ−１ＲＡとの融合体である、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ベクターがさらに、前記恒常的プロモーターと前記調節可能プロモーターとの間に転写遮断因子を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
ウイルスベクターである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
対象における眼障害を治療する方法であって、有効量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載のベクターを投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
対象における眼炎症性障害を治療する方法であって、中止スイッチと、治療用分子をコードする核酸とを含む有効量の発現ベクターを投与することを含み、前記中止スイッチの活性化が前記治療用分子の発現をサイレンシングする、前記方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターが、前記治療用分子をコードする前記核酸に機能可能に連結された調節可能エレメントをさらに含み、前記調節可能エレメントの活性が前記対象への調節化合物の投与によって調節される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
調節化合物に結合することができる調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含む第２発現ベクターを投与することをさらに含み、前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記第１発現ベクターからの前記治療用分子の発現を調節するものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現ベクターが、前記調節化合物に結合する調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーターをさらに含み、前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記治療用分子の発現を調節するものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記治療用分子の発現を促進するものである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記調節化合物結合ポリペプチドが、前記調節化合物に結合すると前記治療用分子の発現を抑制するものである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記中止スイッチの活性化が、
−１つ以上のプロモーター；及び／または
−前記治療用分子をコードする前記核酸
を切除する、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記中止スイッチが、
−１つ以上のプロモーター；及び／または
−治療用分子をコードする前記核酸
の脇に配された部位特異的組換え配列を含む、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、請求項１〜１４のいずれか１項によって定義される発現ベクターを投与することを含む、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記眼障害が、糖尿病網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、臨床的に重大な黄斑浮腫、ぶどう膜炎、虹彩炎、巨細胞性動脈炎、血管炎、扁平部炎、角膜移植拒絶反応、眼内炎症、表層角膜移植拒絶反応、ぶどう膜メラノーマまたは網膜芽細胞腫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記眼障害が、黄斑変性症、糖尿病網膜症、嚢胞様黄斑浮腫、臨床的に重大な黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症または眼内血管新生である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記眼炎症性障害が、ぶどう膜炎、眼内炎症、虹彩炎、巨細胞性動脈炎、血管炎、扁平部炎、色素性網膜炎、角膜移植拒絶反応または表層角膜移植拒絶反応である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記発現ベクターの硝子体内または網膜下投与を含む、請求項１５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記調節化合物を目に局所投与することを含む、請求項１５または請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記調節化合物が小分子である、請求項１５または請求項１７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記調節化合物がテトラサイクリンまたはクメートである、請求項１５または請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記調節化合物が点眼薬として投与される、請求項１５または請求項１７〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
部位特異的リコンビナーゼ、または部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を投与することによって前記中止スイッチを活性化させることをさらに含み、
前記部位特異的リコンビナーゼが、第１部位特異的組換え配列と第２部位特異的組換え配列との間での組換えを触媒し、それによって前記治療用分子の発現をサイレンシングする、
請求項１５〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
対象における眼障害を治療する方法であって、有効量の発現ベクターを投与することを含み、前記発現ベクターが、
第１部位特異的組換え配列及び第２部位特異的組換え配列を含む中止スイッチ、治療用分子をコードする核酸、前記治療用分子をコードする前記核酸に機能可能に連結された調節可能プロモーター、ならびに調節化合物結合ポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能に連結された恒常的プロモーター
を含むものであり、前記調節可能プロモーターの活性が、前記対象への調節化合物の投与の後に前記調節化合物結合ポリペプチドによって調節され、前記第１部位特異的組換え配列と前記第２部位特異的組換え配列との間での組換えによる前記中止スイッチの活性化が前記治療用分子の発現をサイレンシングする、前記方法。
【請求項３５】
前記治療用分子が核酸またはポリペプチドである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の発現ベクター、または請求項１５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療用分子がポリペプチドである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の発現ベクター、または請求項１５〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜１４のいずれか１項によって定義される発現ベクターを含む医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の発現ベクター、及び調節化合物を含む点眼薬製剤を含む、キット。
【請求項３９】
リコンビナーゼ、または
リコンビナーゼをコードする核酸配列を含む発現ベクター
をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
−請求項１〜１４のいずれか１項に記載の発現ベクター、
−テトラサイクリンを含む点眼薬製剤、及び
−Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはＣｒｅリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む発現ベクター
を含む、請求項３８または請求項３９に記載のキット。
【国際調査報告】
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2021511834.tif 000020
2021511834.tif 000021
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