(57)【要約】  本発明は、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫化するための、トレポネーマ属の複数種のバクテリンを含み、トレポネーマ属の複数種由来の又は限定するものではないが、Ｄ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の抗原が補充された新規の医薬組成物及びワクチン組成物を提供する。本発明はまた、トレポネーマ・ペディス及びトレポネーマ・ファゲデニスを、哺乳動物における趾皮膚炎（ＤＤ）、特に有蹄動物の趾皮膚炎の病因因子の２つとして特定している。したがって、本発明はまた、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫化するための、トレポネーマ・ペディス及びトレポネーマ・ファゲデニスの分離培養物を提供する。さらに、本発明は、一連の特異的トレポネーマ抗原により感染を検出することによってＤＤを診断する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原的有効量の少なくとも１種のトレポネーマ属の複数種のバクテリンと、トレポネーマ属の複数種由来の又は他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の１種以上の単離された抗原とを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記組成物は、免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディス、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・カリギラム、トレポネーマ・マルトフィラム及び／又はトレポネーマ・ブレナボレンスからなる群より選択される少なくとも１種のトレポネーマ属の複数種のバクテリンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物は、免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディス、トレポネーマ・ファゲデニス及び／又はトレポネーマ・メディウムからなる群から選択される少なくとも１種のトレポネーマ属の複数種のバクテリンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物は、免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディス及び／又はトレポネーマ・ファゲデニスからなる群より選択される少なくとも１種のトレポネーマ属の複数種のバクテリンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
そのような単離された抗原、好ましくは組み換え抗原は、アドヘシン、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
そのような単離された抗原は、以下の群：ＭＳＰ、ＰｒｔＰ、ＰｒｔＰＭ、ＴｙｌＣ、ＯｒｆＣ、溶血素ＩＩＩ、ＰｒｃＢ、ＰｒｃＡ、Ｃｙｓペプチダーゼ、溶血素赤血球溶解タンパク質２、表面抗原ＢｓｐＡ、フィラメントタンパク質、鞭毛フックタンパク質、オリゴペプチダーゼＢ、プロリルエンドペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼ若しくはオリゴペプチダーゼＦのいずれかから選択されるトレポネーマ属の複数種の抗原、及び／又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭ、又はそれらの任意の組み合わせであり、任意に前記抗原は、組み換え的に産生される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
そのような単離された抗原は、トレポネーマ・ペディス由来のＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣ、及び／又はトレポネーマ・ファゲデニス由来の抗原ＭＳＰ及び溶血素ＩＩＩ、及び／又はトレポネーマ・ヴィンセンティ由来の抗原ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、及び／又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される抗原であり、任意に前記抗原は、組み換え的に産生される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
そのような単離された抗原は、トレポネーマ・ペディス由来のＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣ、並びにディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭからなる群より選択され、任意に前記抗原は、組み換え的に産生される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記トレポネーマ属の複数種のバクテリンは、死滅細菌の懸濁液の形で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディスのバクテリンを含む、医薬組成物、好ましくはワクチン。
【請求項１１】
前記トレポネーマ・ペディスのバクテリンは、死滅細菌の懸濁液の形で存在する、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
トレポネーマ属の複数種由来の又は他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の１種以上の単離された抗原を更に含む、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記１種以上の単離された抗原は、アドヘシン、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素からなる群より選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記１種以上の単離された抗原は、トレポネーマ・ペディス由来のＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣ、及び／又はトレポネーマ・ファゲデニス由来の抗原ＭＳＰ及び溶血素ＩＩＩ、及び／又はトレポネーマ・ヴィンセンティ由来の抗原ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、及び／又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され、任意に前記抗原は、組み換え的に産生される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記１種以上の単離された抗原は、トレポネーマ・ペディス由来のＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣ、並びにディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭからなる群より選択され、任意に前記抗原は、組み換え的に産生される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、免疫原的有効量のトレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・カリギラム、トレポネーマ・マルトフィラム及び／又はトレポネーマ・ブレナボレンス又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるバクテリンを更に含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
免疫原的有効量のトレポネーマ・ファゲデニスのバクテリンを含む、医薬組成物、好ましくはワクチン。
【請求項１８】
前記トレポネーマ・ファゲデニスのバクテリンは、死滅細菌の懸濁液の形で存在する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
トレポネーマ属の複数種由来の又は他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の１種以上の単離された抗原を更に含む、請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記１種以上の単離された抗原は、アドヘシン、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素からなる群より選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記１種以上の単離された抗原は、トレポネーマ・ペディス由来のＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣ、及び／又はトレポネーマ・ファゲデニス由来の抗原ＭＳＰ及び溶血素ＩＩＩ、及び／又はトレポネーマ・ヴィンセンティ由来の抗原ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、及び／又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され、任意に前記抗原は、組み換え的に産生される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記１種以上の単離された抗原は、トレポネーマ・ペディス由来のＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣ、並びにディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭからなる群より選択され、任意に前記抗原は、組み換え的に産生される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記組成物は、免疫原的有効量のトレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ、トレポネーマ・ペディス、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・カリギラム、トレポネーマ・マルトフィラム及び／又はトレポネーマ・ブレナボレンス又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるバクテリンを更に含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記組成物は、ウシ呼吸器合胞体ウイルス抗原、ウシヘルペスウイルス抗原、レプトスピラ抗原、ウシ下痢ウイルス抗原、ウシパラインフルエンザウイルス抗原、水疱性口内炎ウイルス抗原、悪性カタル熱ウイルス抗原、ブルータングウイルス抗原、仮性狂犬病ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、牛疫ウイルス抗原、グッゲンハイメラ抗原、ポルフィロモナス抗原、バクテロイデス抗原、プレボテラ抗原、ペプトストレプトコッカス抗原、カンピロバクター抗原、マイコプラズマ抗原、コリネバクテリウム／アクチノマイセス抗原、クリプトスポリジウム抗原、ロタウイルス抗原、コロナウイルス抗原、フソバクテリウム・ネクロフォーラム抗原、ディケロバクター・ノドーサス抗原又はクロストリジウム属の複数種の抗原を更に含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むワクチン。
【請求項２７】
請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むワクチン。
【請求項２８】
請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むワクチン。
【請求項２９】
哺乳動物における趾皮膚炎の処置又は未然防止の方法に使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物又は請求項２６に記載のワクチン。
【請求項３０】
哺乳動物における趾皮膚炎の処置又は未然防止の方法に使用される、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物又は請求項２７に記載のワクチン。
【請求項３１】
哺乳動物における趾皮膚炎の処置又は未然防止の方法に使用される、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物又は請求項２８に記載のワクチン。
【請求項３２】
前記趾皮膚炎は、牛趾皮膚炎、伝染性羊趾皮膚炎及び／又は腐蹄病である、請求項２９に記載の医薬組成物又はワクチン。
【請求項３３】
前記趾皮膚炎は、牛趾皮膚炎、伝染性羊趾皮膚炎及び／又は腐蹄病である、請求項３０に記載の医薬組成物又はワクチン。
【請求項３４】
前記趾皮膚炎は、牛趾皮膚炎、伝染性羊趾皮膚炎及び／又は腐蹄病である、請求項３１に記載の医薬組成物又はワクチン。
【請求項３５】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物又は請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のワクチンを含む容器を含むことを特徴とする、ワクチン接種キット。
【請求項３６】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の前記医薬組成物又は請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の前記ワクチンの投与についての情報を含む情報マニュアル又はリーフレットを更に含むことを特徴とする、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディス、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・カリギラム、トレポネーマ・マルトフィラム及び／又はトレポネーマ・ブレナボレンスからなる群より選択されるトレポネーマ属の複数種のバクテリンを含む、医薬組成物、好ましくはワクチン。
【請求項３８】
前記組成物は、免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディス、トレポネーマ・ファゲデニス及び／又はトレポネーマ・メディウムからなる群より選択されるトレポネーマ属の複数種のバクテリンを含む、請求項３７に記載の医薬組成物、好ましくはワクチン。
【請求項３９】
請求項３７又は３８に記載の医薬組成物を含むワクチン。
【請求項４０】
哺乳動物における趾皮膚炎の処置又は未然防止の方法に使用される、請求項３７若しくは３８に記載の医薬組成物又は請求項３９に記載のワクチン。
【請求項４１】
前記趾皮膚炎は、牛趾皮膚炎、伝染性羊趾皮膚炎及び／又は腐蹄病である、請求項４０に記載の医薬組成物又はワクチン。
【請求項４２】
HIPRA SCIENTIFIC S.L.U.社（スペイン、ジローナ県アメール、セルバ通り，１３５）によりライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）においてアクセッション番号ＤＳＭ  ３２９５０として２０１８年１１月７日にブタペスト条約に基づき寄託されたＴ．ファゲデニス株。
【請求項４３】
HIPRA SCIENTIFIC S.L.U.社（スペイン、ジローナ県アメール、セルバ通り，１３５）によりライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）においてアクセッション番号ＤＳＭ  ３２６６３として２０１７年１０月１０日にブタペスト条約に基づき寄託されたＴ．ペディス株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トレポネーマ属のスピロヘータ細菌が関与する有蹄動物疾患の診断及び未然防止又は処置、特に哺乳動物における趾皮膚炎、更に特に牛趾皮膚炎の予防的処置に関する。さらに、本発明は、免疫原性組成物、診断用組成物、治療用組成物の開発並びに哺乳動物における趾皮膚炎に対するワクチンの作製及び投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
趾皮膚炎（ＤＤ）は、主に牛の蹄踵の皮膚を冒す細菌性疾患である。感染は炎症及び皮膚損傷を引き起こし、痛み及び不快感がもたらされる。ＤＤは牛の跛行の主な原因であり、最も一般的には集約的な乳牛に見られる。したがって、ＤＤは多くの国々の乳業にとって重大な問題であり、動物福祉の低下及び経済的損失を引き起こしている。ＤＤは英国の肉牛において新たに発生した問題として特定されており、ＤＤを引き起こすと考えられている細菌は、羊（伝染性羊趾皮膚炎として知られている）、乳用山羊及び更には野生の北米エルクでの同様の病変で同定されている。これに加えて、これらのＤＤ関連細菌は、過去１５年間に発生した３種類の重症のウシ蹄病変、つまり蹄尖壊死、非治癒性白帯病及び非治癒性蹄底潰瘍において検出されている。これらの展開は、家畜及び野生動物、そして農家及び獣医師にとってＤＤの重要性が高まることを浮き彫りにしている。
【０００３】
この疾患が経済的及び福祉的に重要であるにもかかわらず、その病因、伝染、未然防止及び処置に関して多くの疑問が残されている。その疾患の対処が困難であると分かっている理由は数多く存在し、第一にその感染は、病変から単離される、様々な細菌、特にトレポネーマ属の細菌による多微生物性のものであると思われる。さらに、ＤＤに関与する細菌のほとんどは、最初に培養で増殖することが困難であることが判明し、実験的な感染モデルを開発することが困難であるため、疾患伝染のメカニズムはかなり謎のままであるだけでなく、抗生物質で治癒した症例における再発率も高い。近年の実験室法の進歩により、最も重要な病原性細菌の同定並びに動物及び流行性ＤＤを伴う農場の環境におけるこれらの細菌の検出において幾らかの進展がもたらされた。
【０００４】
感染した農場では広範囲の感染レベルが見られたことから、ＤＤの出現率についての農場／群レベルの危険因子及び動物レベルの危険因子（例えば、経産回数及び授乳の段階）の両方の調査が促される。農場レベル及び動物レベルの両方の危険因子は、ＤＤの感染レベルの最小化を試みるときに有用な情報を提供することができ、感染のリスクが最も高い時期を理解することができる。関心が持たれているが、ほとんど調査されていないＤＤの側面は、疾患に対する易罹患性に動物間で個体差があるように思われることである。この意味では、従来技術の一部を構成する幾つかの科学出版物では全て、群内の一部の動物が繰り返し感染している一方で、同じ品種及び経産回数の同じ条件下で飼育されている他の動物は一切感染しないことが見出された。この易罹患性における個体差の理由を特定することができれば、それらは本発明者らが疾患を理解する一助となり、効果的な未然防止方法及び処置方法の探求に寄与し得る。
【０００５】
ＤＤ病変に関連するトレポネーマの型又は種の決定は、ＤＮＡ配列分析及び分類を基礎としている。Evansら（非特許文献１）により、１６Ｓ  ｒＤＮＡホモロジー及びｆｌａＢ２ホモロジーに対してクラスター化されたＴ．ヴィンセンティ（T. vincentii）／Ｔ．メディウム（T. medium）様、Ｔ．ファゲデニス（T. phagedenis）様、及びＴ．デンティコラ（T. denticola）／Ｔ．プチダム（T. putidum）様の３種の最も一般的な系統型が確立された。系統型（ＰＴ）は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が既知の種とは約２％だけ異なり、それらのクラスターの他の成員と９９％以上類似しているトレポネーマのクラスターとして規定される（非特許文献２）。他に、系統型の数は、Ｔ．ブレナボレンス（T. brennaborense）、Ｔ．マルトフィラム（T. maltophilum）様（Ｔ．マルトフィラム及びＴ．レシチノリティカム（T. lecithinolyticum）を含む）、Ｔ．レフリンゲンス（T. refringens）／Ｔ．カリギラム（T. calligyrum）様と共にＴ．デンティコラ／Ｔ．プチダムとクラスター化するＴ．ペディス（T. pedis）を含む７つにまで拡張された。
【０００６】
トレポネーマ属の複数種以外の種々の属の多くの細菌、例えばフソバクテリウム・ネクロフォーラム（Fusobacterium necrophorum）、ディケロバクター・ノドーサス（Dichelobacter nodosus）、プレボテラ属の複数種、及びポルフィロモナス属の複数種もＤＤ病変から分離されている。
【０００７】
以前はバクテロイデス（Bacteroides）として知られていたディケロバクター・ノドーサスは、病原性で嫌気性の非芽胞形成性グラム陰性細菌である。ディケロバクター・ノドーサスは、種々の地理的位置から多くのＤＤ病変において検出されている。病変におけるＤ．ノドーサスの発見は、Ｄ．ノドーサスがＤＤの病因に関与することを示唆している。羊での腐蹄病に関与する主要な作用因子としても認識されている。
【０００８】
フソバクテリウム・ネクロフォーラムは、牛、羊及び他の反芻動物における跛行の原因でもある。フソバクテリウム・ネクロフォーラムは嫌気性細菌である。フソバクテリウム・ネクロフォーラムは、主として表皮の表層の角質溶解層において検出されている。フソバクテリウム・ネクロフォーラムは、ＤＤ病変及び腐蹄病の２次性侵襲菌であることが示唆される。
【０００９】
ＤＤに関与する病原体について、幾つかの病原性因子が記載されている。例えば、非特許文献３では、アドヘシン、表面抗原及び運動性に関与するタンパク質等のトレポネーマ属の複数種の病原性因子が検出された。記載されているその他のトレポネーマ属の複数種の病原性因子は、ペプチダーゼ、プロテアーゼ及び溶血素である。Ｄ．ノドーサス等のその他のＤＤ関連病原体について、同じ種類の病原性因子が記載されている（非特許文献４）。
【００１０】
ＤＤの処置には、全身性抗生物質及び局所性抗生物質が含まれる。高い割合の動物がＤＤに感染している群では、個別の処置に非常に時間がかかるため、多くの農家はその代わりに足洗場を使用して群全体を処置している。残念ながら、ＤＤの排除はめったに見られないため、感染の再発を防ぐために処置を繰り返し適用する必要がある。ＤＤに感染すると、乳牛は抗体応答を生ずるが、一部の動物は繰り返し感染するので、この応答は更なる感染を防ぐには十分でないと思われる。ＤＤを処置して再発を防ぐことを試みる場合に直面する困難に関して示唆される１つの理由は、ＤＤに関与していると考えられている多くのトレポネーマが螺旋形だけでなく、被嚢形を有することが分かったということである。これらの被嚢形の細菌は病変内深くに存続し、後日に臨床疾患の再発を引き起こし得る可能性があるが、被嚢形の細菌及びそのＤＤ処置への応答の重要性を調べるには、より多くの調査が必要である。
【００１１】
ＤＤに対するワクチンを開発するために過去何年にもわたって多くの努力が払われてきたが、これらのワクチンはいずれも現在利用することができない。この意味で、Berryら（非特許文献５）は、ＴｒｅｐＳｈｉｅｌｄ（商標）（Novartis Animal Health社）として市販される種々のトレポネーマのバクテリンが試験されたネブラスカ州での２つの乳牛群での研究を報告した。この研究では、トレポネーマのバクテリンが、ワクチン接種された動物に有意な予防的効果又は治療的効果をもたらさないと結論づけられた。そのワクチン（ＴｒｅｐＳｈｉｅｌｄ（商標））はその後撤退した。
【００１２】
Fiddlerら（非特許文献６）により、民間企業によって開発されたセルペンス（Serpens）属の一種のバクテリンを含むワクチンを評価した研究の調査結果が報告された。Fiddlerらは、試験に関与した乳牛はバクテリンに対する免疫応答を生じたが、コントロールと比較した場合に、ワクチン接種された牛の間でＤＤ感染の有病率又は重症度の低下は見られないことを見出した。したがって、Fiddlerらは、そのワクチンはＤＤ未然防止に関して臨床的有効性を一切示さないと結論づけた。
【００１３】
それに対して、本発明は初めて、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫化する、トレポネーマ属の複数種のバクテリンを含み、好ましくはトレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の抗原が補充された新規のワクチン組成物を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Evans N.J., Brown J.M., Demirkan I., Murray R.D., Vink W.D., Blowey R.W., Hart C.A., Carter S.D. Three unique groups of spirochetes isolated from digital dermatitis lesions in UK cattle. Vet. Microbiol. 2008;130:141-150
【非特許文献２】Klitgaard K., Foix Breto A., Boye M., Jensen T.K. Targeting the treponemal microbiome of digital dermatitis infections by high-resolution phylogenetic analyses and comparison with fluorescent in situ hybridization. J. Clin. Microbiol. 2013;51:2212-2219
【非特許文献３】Nielsen M.W. et al., 2016
【非特許文献４】Kennan, R.M., Dhungyel, O. P., Whittington, R. J., Egerton, J. R., & Rood, J. I. The Type IV Fimbrial Subunit Gene (fimA) of Dichelobacter nodosus Is Essential for Virulence, Protease Secretion, and Natural Competence. Journal of bacteriology, 2001, 183.15: 4451-4458.
【非特許文献５】Berry S L, Ertze R A, Read D H, Hird D W. Field evaluation of prophylactic and therapeutic effects of a vaccine against (papillomatous) digital dermatitis of dairy cattle in 2 California dairies. Proc 16th Intl Symp Lameness in Ruminants, Slovenia, 2004
【非特許文献６】Fidler A.P., Alley M.L., Smith G.W. Evaluation of a Serpens species bacterin for treatment of digital dermatitis in dairy cattle. Res. Vet. Sci. 2012;93:1258-1260. doi: 10.1016/j.rvsc.2012.07.002
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫化するための、トレポネーマ属の複数種のバクテリン、好ましくは、限定されるものではないが、トレポネーマ・ペディスのバクテリンを含み、任意にトレポネーマ属の複数種由来の又は限定されるものではないが、Ｄ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の抗原が補充された新規のワクチン組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、トレポネーマ・ペディスを、哺乳動物における趾皮膚炎（ＤＤ）、特に有蹄動物の趾皮膚炎の病因因子の１つとして特定している。したがって、本発明はまた、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫化するためのトレポネーマ・ペディスの分離培養物を提供する。さらに、本発明は、一連の特異的トレポネーマ抗原により感染を検出することによってＤＤを診断する方法を提供する。
【００１７】
こうして、一態様では、本発明は、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫化するための、好ましくはトレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の抗原が補充された、トレポネーマ属の複数種のバクテリン、好ましくはトレポネーマ・ペディスのバクテリンの生物学的培養物、好ましくは生物学的に純粋な培養物を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、好ましくは有蹄動物のトレポネーマ・ペディスのバクテリンの、好ましくは生物学的に純粋な培養物を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫化するための、免疫原的有効量のトレポネーマ属の複数種のバクテリン、好ましくはトレポネーマ・ペディスのバクテリンを含み、任意にトレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の抗原、好ましくは組み換え抗原が補充された医薬組成物を提供する。好ましくは、上記抗原は、ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質（Major Outer Sheath Protein））、ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）、ＴｌｙＣ（溶血素Ｃ）、ＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）及び溶血素ＩＩＩからなる群より選択されるトレポネーマ抗原である。これらの抗原の全ては、限定されるものではないが、Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス又はＴ．ヴィンセンティ等のトレポネーマ属の複数種から得ることができることに留意する。本発明において有用な追加の抗原は、Ｄ．ノドーサス又はＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子から選択され得る。これらの抗原の全ては、本発明の医薬組成物において組み合わせて使用することができ、好ましくは組み換え的に産生される。
【００２０】
より好ましくは、限定されるものではないが、本発明において有用な上記タンパク質、上記ポリペプチド又は上記抗原は、アドヘシン、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素等の病原性因子から選択される。更により好ましくは、本発明において有用な上記タンパク質、上記ポリペプチド又は上記抗原は、以下の群：
ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）；
ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）及びＰｒｔＰＭ（ＰｒｔＰ成熟タンパク質）；
ＴｙｌＣ（溶血素Ｃ）；
ＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）；
溶血素ＩＩＩ；
Ａｐｒ２（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ２）及びＡｐｒ２ＢＭ（Ａｐｒ２良性成熟タンパク質）；
Ａｐｒ５（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ５）及びＡｐｒ５Ｍ（Ａｐｒ５成熟タンパク質）；
Ｂｐｒ（塩基性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＢｐｒ及びＢｐｒＭ（Ｂｐｒ成熟タンパク質）；
ＰｒｃＢ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＢ様タンパク質）；
ＰｒｃＡ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＡ様タンパク質）；
Ｃｙｓペプチダーゼ；
溶血素赤血球溶解タンパク質２；
表面抗原ＢｓｐＡ；
フィラメントタンパク質；
鞭毛フックタンパク質；
プロリルエンドペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼＢ；並びに、
オリゴペプチダーゼＦ；
のいずれかから選択される。
【００２１】
更により好ましくは、上記抗原は、ＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣからなる群より選択されるトレポネーマ・ペディス由来の抗原、及び／又はトレポネーマ・ファゲデニス由来の抗原ＭＳＰ及び溶血素ＩＩＩ、及び／又はトレポネーマ・ヴィンセンティ由来の抗原ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、及び／又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭ、又はそれらの任意の組み合わせであり、任意に前記抗原は、組み換え的に産生される。
【００２２】
さらに、上記医薬組成物は、免疫原的有効量のトレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ
、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・ブレナボレンス、トレポネーマ・カリギラム及びトレポネーマ・マルトフィラムからなる群より選択されるバクテリンを更に含み得る。
【００２３】
別の態様では、本発明は、哺乳動物における趾皮膚炎（ＤＤ）、特に有蹄動物の趾皮膚炎の病因因子に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。この方法は、哺乳動物、好ましくは有蹄動物に上記段落で規定された医薬組成物を投与する工程を含む。
【００２４】
一実施の形態では、医薬組成物は、フソバクテリウム・ネクロフォーラム、ポルフィロモナス・レヴィ（Porphyromonas levii）及びディケロバクター・ノドーサスからなる群より選択される有蹄動物の腐蹄病を引き起こす生物由来の抗原を更に含む。別の実施の形態では、医薬組成物は、ウシ呼吸器合胞体ウイルス抗原、ウシヘルペスウイルス抗原、レプトスピラ抗原、ウシ下痢ウイルス抗原、ウシパラインフルエンザウイルス抗原、水疱性口内炎ウイルス抗原、悪性カタル熱ウイルス抗原、ブルータングウイルス抗原、仮性狂犬病ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、牛疫ウイルス抗原、フソバクテリウム・ネクロフォーラム抗原、ディケロバクター・ノドーサス抗原、グッゲンハイメラ抗原、ポルフィロモナス抗原、バクテロイデス抗原、プレボテラ抗原、ペプトストレプトコッカス抗原、カンピロバクター抗原、マイコプラズマ抗原、コリネバクテリウム／アクチノマイセス抗原、クリプトスポリジウム抗原、ロタウイルス抗原、コロナウイルス抗原又はクロストリジウム属の複数種の抗原等の追加の抗原を更に含む。
【００２５】
また更なる態様では、医薬組成物のトレポネーマ属の複数種のバクテリンは、死滅細菌又は弱毒化細菌の懸濁液の形で存在する。好ましくは、トレポネーマのバクテリンは、死滅細菌又は弱毒化細菌の懸濁液の形のＴ．ペディスのバクテリンである。好ましくは、Ｔ．ペディスのバクテリンは、死滅細菌の懸濁液の形で存在する。
【００２６】
別の実施の形態では、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含む。
【００２７】
別の実施の形態では、本発明の医薬組成物は、ワクチンである。
【００２８】
別の実施の形態では、本発明の医薬組成物又はワクチンは、非経口投与される。
【００２９】
別の実施の形態では、本発明の医薬組成物又はワクチンは、趾皮膚炎、好ましくは、牛趾皮膚炎、伝染性羊趾皮膚炎及び／又は腐蹄病、より好ましくは、牛趾皮膚炎の処置方法又は未然防止方法で使用される。
【００３０】
別の態様では、本発明は、本発明の医薬組成物又はワクチンを含む容器を含むことを特徴とするワクチン接種キットを提供する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、本発明の上記医薬組成物又は上記ワクチンの投与についての情報を含む情報マニュアル又はリーフレットを含むことを特徴とするワクチン接種キットを提供する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、生体試料中のトレポネーマ抗原又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子と特異的に免疫反応性である抗体の存在を検出する方法であって、上記試料を、トレポネーマ属の複数種の抗原：ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）、ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）、ＴｌｙＣ（溶血素Ｃ）、ＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）又は溶血素ＩＩＩから選択される抗原と接触させることを含む、方法を提供する。これらの抗原の全ては、限定されるものではないが、Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス又はＴ．ヴィンセンティ等のトレポネーマ属の複数種から得ることができ、及び／又は抗原はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子から選択され、それにより抗原／抗体複合体が形成され、該複合体の存在又は不存在が検出されることに留意する。より好ましくは、限定されるものではないが、本方法論において有用な上記タンパク質、上記ポリペプチド又は上記抗原は、アドヘシン、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素等の病原性因子から選択される。更により好ましくは、本方法論において有用な上記抗原は、以下の群：
ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）；
ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）及びＰｒｔＰＭ（ＰｒｔＰ成熟タンパク質）；
ＴｙｌＣ（溶血素Ｃ）；
ＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）；
溶血素ＩＩＩ；
Ａｐｒ２（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ２）及びＡｐｒ２ＢＭ（Ａｐｒ２良性成熟タンパク質）；
Ａｐｒ５（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ５）及びＡｐｒ５Ｍ（Ａｐｒ５成熟タンパク質）；
Ｂｐｒ（塩基性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＢｐｒ）及びＢｐｒＭ（Ｂｐｒ成熟タンパク質）；
ＰｒｃＢ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＢ様タンパク質）；
ＰｒｃＡ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＡ様タンパク質）；
Ｃｙｓペプチダーゼ；
溶血素赤血球溶解タンパク質２；
表面抗原ＢｓｐＡ；
フィラメントタンパク質；
鞭毛フックタンパク質；
プロリルエンドペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼＢ；並びに、
オリゴペプチダーゼＦ；
から選択される。
【００３３】
更により好ましくは、上記抗原は、ＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣからなる群より選択されるトレポネーマ・ペディス由来の抗原、及び／又はトレポネーマ・ファゲデニス由来の抗原ＭＳＰ及び溶血素ＩＩＩ、及び／又はトレポネーマ・ヴィンセンティ由来の抗原ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、及び／又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭ、又はそれらの任意の組み合わせであり、これらの抗原の全ては、抗原／抗体複合体の形成のために特に有用であり、したがって、複合体の存在又は不存在の検出のために特に有用である。
【００３４】
一実施の形態では、生体試料はウシ血清である。別の実施の形態では、抗原は固体表面上に固定化されている。別の実施の形態では、複合体は、標識された抗ウシ抗体を使用して検出される。
【００３５】
別の態様では、本発明は、生体試料中の有蹄動物のトレポネーマの存在又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の有蹄動物の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子の存在を検出する方法を提供する。この方法は、試料を上記の特定された抗原のいずれかから選択される抗原と特異的に免疫反応性である抗体と接触させることにより、抗原／抗体複合体を形成させる工程と、上記複合体の存在又は不存在を検出する工程とを含む。生体試料中の有蹄動物のトレポネーマの存在を検出する上記方法は、診断目的又は予後診断目的のために、例えば、ＤＤの診断、特に牛趾皮膚炎の診断のために有用である。
【００３６】
別の実施の形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。別の実施の形態では、抗体は固体表面上に固定化されている。別の実施の形態では、複合体は、標識された二次抗体を使用して検出される。別の実施の形態では、生体試料は有蹄動物の蹄組織である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ワクチン接種後４７日目に牛から得られた血清のＴ．ペディスに対する阻害アッセイ及び間接ＥＬＩＳＡ（１群当たり５頭の動物）を示す図である。Ａ）マイクロプレート中での１／３２希釈でのＴ．ペディスの阻害アッセイ（ワクチン接種後４７日目）。横軸としての種々の試験されたワクチンに対して、縦軸として螺旋形の量（０から３まで）が示される。Ｂ）ワクチン接種後４７日目でのＴ．ペディスに対する間接ＥＬＩＳＡ。横軸としての種々の試験されたワクチンに対して、縦軸として４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が示される。各ワクチンは実施例１に示されている。ワクチンＡ（トレポネーマ・ペディスのバクテリン＋４種の組み換えタンパク質）、ワクチンＢ（トレポネーマのバクテリンを有さず４種の組み換えタンパク質だけ）、ワクチンＣ（トレポネーマ・ペディスのバクテリンだけ）、ワクチンＤ（プラセボ）。
【図２】ワクチン接種後０日目、２１日目及び３５日目に牛から得られた血清のＴ．ペディス分離株に対するＥＬＩＳＡを示す図である。横軸としての種々の試験されたワクチンに対して、縦軸として４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の平均が示される。各ワクチンは実施例１に示されている。
【図３】ワクチン接種後０日目、２１日目及び３５日目に牛から得られた血清のＴ．ファゲデニス分離株に対するＥＬＩＳＡを示す図である。横軸としての種々の試験されたワクチンに対して、縦軸として４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の平均が示される。各ワクチンは実施例１に示されている。
【図４】種々の病変の重症度及びそれらの対応するスコアを示す画像である。Ａ）ＤＤのスコア＝１０及び感染後３２日目、Ｂ）ＤＤのスコア＝５及び感染後３２日目、Ｃ）ＤＤのスコア＝０及び感染後３２日目。実施例１。
【図５】感染後３２日目のアイオワスコア（Iowa score）及びウィスコンシンスコア（Wisconsin score）による病変スコア及びＢＤＤ病変を伴う動物のパーセンテージを表す図である。Ａ）感染後３２日目の最終的な肉眼的病変の評価（アイオワスコア）。横軸として示される種々のアッセイされるワクチンに対して、それぞれ左側の縦軸及び右側の縦軸に全アイオワスコア群（０〜５０）及び趾皮膚炎を伴う仔牛のパーセンテージが示される。Ｂ）感染後３２日目の全病変のパーセンテージ（ウィスコンシンスコア）。横軸としての種々の試験されたワクチンに対して、縦軸として全病変スコアのパーセンテージが示される。各ワクチンは、実施例１に示されている。
【図６】暗視野顕微鏡法を使用した、ワクチン接種後３５日目の血清からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ．ペディスの増殖アッセイ及び形態阻害アッセイを示す図である。Ａ）血清１（１／１６）ワクチン接種後０日目（ワクチン１）、Ｂ）血清１（１／１６）ワクチン接種後３５日目（ワクチン１）。実施例２。
【図７】ワクチン接種後０日目、２１日目及び３５日目に牛から得られた血清のＴ．ペディス（Ａ）、Ｔ．ファゲデニス（Ｂ）及びＴ．メディウム（Ｃ）に対する血清学／ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ２）を示す図である。横軸としての種々の試験されたワクチンに対して、縦軸として４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の平均が示される。各ワクチンは実施例２に示されている。
【図８】仔牛の各群についての感染後３２日目の病変スコアの箱ひげ図である。縦軸としての種々の試験されたワクチンに対して、横軸として趾皮膚炎の病変スコア（０から１０まで）が示される。実施例２。
【図９】ウサギにおける２種の異なるＴ．ペディス株に対する免疫原性アッセイ（ワクチン接種後０日目、１４日目及び３５日目に得られた血清のＥＬＩＳＡ）を示す図である。群１及び群２について、横軸としてのワクチン接種後の種々の日数で、縦軸として４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）の平均が示される。各群は実施例３に示されている。
【図１０】Ｔ．ファゲデニスのバクテリンでワクチン接種された牛から０日目、２１日目、３５日目、４８日目及び６９日目に得られた血清のＴ．ペディス（Ａ）、Ｔ．ファゲデニス（Ｂ）及びＴ．メディウム（Ｃ）に対する血清学／ＥＬＩＳＡを示す図である。横軸としての種々の群に対して、縦軸としてＩＲＰＣ（相対指数百分率）の平均が示される。各群は実施例４に示されている。
【図１１】ワクチン接種された牛から０日目、２１日目、３５日目、４８日目及び６９日目に得られた血清のＴ．ペディスのＰｒｔＰＭタンパク質（Ａ）、Ｄ．ノドーサスのＡｐｒ２タンパク質（Ｂ）及びＴ．ファゲデニスのＭＳＰタンパク質（Ｃ）に対する血清学／ＥＬＩＳＡを示す図である。横軸としての種々の群に対して、縦軸としてＩＲＰＣ（相対指数百分率）の平均が示される。各群は実施例５に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、活性成分として少なくともトレポネーマ属の複数種のバクテリン、好ましくは、免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディス、トレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・ブレナボレンス、トレポネーマ・カリギラム及び／又はトレポネーマ・マルトフィラムからなる群より選択されるバクテリン、より好ましくは、免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディス及びトレポネーマ・ファゲデニスから選択されるバクテリンを有する、趾皮膚炎用、好ましくは牛趾皮膚炎用の医薬組成物又はワクチン組成物を提供する。さらに、本発明は、趾皮膚炎の診断アッセイのための核酸及びタンパク質の産生並びに趾皮膚炎用のワクチン組成物で使用される免疫原性タンパク質及び組成物の調製を含む様々な用途におけるトレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の単離された抗原、好ましくは組み換え抗原であって、これらの組成物において、上記抗原は、免疫原的有効量のトレポネーマ属の複数種のバクテリン、好ましくは免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディスのバクテリン又は好ましくは免疫原的有効量のトレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・ブレナボレンス、トレポネーマ・カリギラム及びトレポネーマ・マルトフィラムからなる群より選択されるバクテリンと組み合わせて使用される、抗原を提供する。さらに、本発明の好ましい実施形態では、上記単離された抗原は、アドヘシン、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素等の病原性因子から選択される。より好ましくは、上記単離された抗原は、以下の群：ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）、ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）及びＰｒｔＰＭ（ＰｒｔＰ成熟タンパク質）、ＴｙｌＣ（溶血素Ｃ）、ＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）、溶血素ＩＩＩ、Ａｐｒ２（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ２）及びＡｐｒ２ＢＭ（Ａｐｒ２良性成熟タンパク質）、Ａｐｒ５（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ５）及びＡｐｒ５Ｍ（Ａｐｒ５成熟タンパク質）、Ｂｐｒ（塩基性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＢｐｒ）及びＢｐｒＭ（Ｂｐｒ成熟タンパク質）、ＰｒｃＢ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＢ様タンパク質）、ＰｒｃＡ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＡ様タンパク質）、Ｃｙｓペプチダーゼ、溶血素赤血球溶解タンパク質２、表面抗原ＢｓｐＡ、フィラメントタンパク質、鞭毛フックタンパク質、プロリルエンドペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼＢ並びにオリゴペプチダーゼＦから選択される。更により好ましくは、上記単離された抗原は、トレポネーマ・ペディス由来のＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣ、及び／又はトレポネーマ・ファゲデニス由来の抗原ＭＳＰ及び溶血素ＩＩＩ、及び／又はトレポネーマ・ヴィンセンティ由来の抗原ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、及び／又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭからなる群より選択される。既に述べたように、上記抗原は、趾皮膚炎の診断アッセイのための核酸及びタンパク質の製造、並びに任意にトレポネーマ属の複数種に属する細菌を含む趾皮膚炎用のワクチン組成物で使用される免疫原性タンパク質及び組成物の調製を含む様々な用途で使用され得る。
【００３９】
定義
本明細書で使用される場合に、以下の用語は、別段の定めがない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００４０】
「トレポネーマ」、「有蹄動物のトレポネーマ」、及び「ウシトレポネーマ」は、有蹄動物及びウシの生体試料、特に蹄足組織及び蹄組織に同定された又はそこから分離されたトレポネーマ属の柔軟な螺旋形のスピロヘータ細菌を指す。その定義はまた、趾皮膚炎の未然防止及び／又は処置に有用である反芻動物、ブタ、ヒツジ及び／又はヒト等の他の起源由来のトレポネーマ様種の分離株に関連する。
【００４１】
「有蹄動物」とは、牛、馬、羊及び山羊等の蹄を持つ動物を指す。
【００４２】
「ウシ」とは、牛（雄牛、雌牛、仔牛）を指す。典型的には、トレポネーマ属のスピロヘータは、ＤＤ（趾皮膚炎）に感染した蹄を持つ動物の蹄組織又は蹄足組織から分離され得る。
【００４３】
「バクテリリン」は、ワクチンとして使用するのに適した不活化された全体的な細菌細胞又は部分的な細菌細胞の調製物を指す。
【００４４】
「トレポネーマ・ペディス」は、ホルスタイン・フリーシアン牛における牛趾皮膚炎病変において初めて記載され、トレポネーマ・ペディス  Evans et al. 2009（ＤＳＭ番号：１８６９１、基準株Ｔ３５５２Ｂ）として初めて寄託された。本発明において、「トレポネーマ・ペディス」という用語は、Ｔ．ペディス種、特に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９９％の全１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子ＥＦ０６１２６８（ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号）に対する配列同一性を有する細菌株に属する任意の株を指す。他のトレポネーマ起源もその定義に含まれる。したがって、全１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対して配列同一性を有する任意の特定のトレポネーマ株も本発明に含まれる。Ｔ．ペディス株の幾つかの例は、Ｔ３５５２Ｂ、Ｇ８１９ＣＢ、Ｔ１８Ｂ、Ｔ３５４Ａである。あらゆるＴ．ペディス株が、本発明で使用するのに適している。好ましくは、使用される株は、HIPRA SCIENTIFIC S.L.U.社（スペイン、ジローナ県アメール、セルバ通り（Avda. La Selva），１３５）によりライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH））（ドイツ、ブラウンシュバイク、インホッフェン通り７  Ｂ  ３８１２４）においてアクセッション番号ＤＳＭ  ３２６６３として２０１７年１０月１０日に寄託されたＴ．ペディスである。
【００４５】
「トレポネーマ・メディウム」は、Umemoto T, Nakazawa F, Hoshino E, Okada K, Fukunaga M, Namikawa I. Treponema medium sp. nov., isolated from human subgingival dental plaque. Int J Syst Bacteriol. 1997 Jan;47(1):67-72において規定される細菌種を指す。その定義には、反芻動物、ブタ、ヒツジ、ヒト等のような他の起源由来のトレポネーマ・メディウム様種からの分離株も含まれる。Ｔ．メディウム株の幾つかの例は、Ｔ１８Ａ、Ｔ１９、Ｔ３５Ｂ１、３Ｃ１４、Ｂ−８３０７である。あらゆるＴ．メディウム株が、本発明で使用するのに適している。
【００４６】
「トレポネーマ・ファゲデニス」は、Standards in Genomic Sciences 2015; https://doi.org/10.1186/s40793-015-0059-0, Mushtaq et al. 2015に記載されている。本発明において、「トレポネーマ・ファゲデニス」という用語は、Ｔ．ファゲデニス種、特に少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％のトレポネーマ・ファゲデニスのＶ１株の全１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対する配列同一性を有する細菌株に属する任意の株を指す。Ｔ．ファゲデニス株の幾つかの例は、Ｖ１、Ｖ２、Ｔ４１３、Ｔ５５１Ｂ、Ｔ６０３、Ｂ−７３３０である。あらゆるＴ．ファゲデニス株が、本発明で使用するのに適している。好ましくは、使用される株は、HIPRA SCIENTIFIC S.L.U.社（スペイン、ジローナ県アメール、セルバ通り，１３５）によりライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）（ドイツ、ブラウンシュバイク、インホッフェン通り７  Ｂ  ３８１２４）においてアクセッション番号ＤＳＭ  ３２９５０として２０１８年１１月７日に寄託されたＴ．ファゲデニスである。
【００４７】
トレポネーマ又は他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子の「タンパク質」又は「ポリペプチド」又は「抗原」は、アミノ酸残基の重合体を指し、産物の最小長さに限定されない。ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体はその定義に含まれる。それは、天然の集団に通常見られるアレル変異及び組み換え技術により導入される変化を含む。当業者であれば、アミノ酸の付加、欠失及び置換を含む様々な方法でタンパク質が修飾され得ることを認識している。本発明で有用な特定のトレポネーマ又は他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子のタンパク質、ポリペプチド又は抗原は、限定されるものではないが、以下の通りである。
【００４８】
Ｔ．ペディスの「ＰｒｔＰ」（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）及び「ＰｒｔＰＭ」（ＰｒｔＰ成熟タンパク質）タンパク質は、それぞれ配列番号１若しくは配列番号２又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００４９】
配列番号１（ＰｒｔＰ、Ｔ．ペディス）：
MKKILVLSAVLAILAGSCSFNIDPQNISSNEQRVQSMEALYGNSSSVIPYAPKDEDTVDGFFIVKTKDGFDKTAFEEKGFTVKGALPLTGTGFTYWYLNKEGNDKKNLSVISSVKGVISAESDYKVEPPDGIKVAKTVDGGGLVDISRLINGDYSGDPIANNSDYGLSITEALKAYKEIGYGDKTVVAGIIATGINMTHKDFKDENGNSIVLYAKSCVKSNGGTYIGNGNPFTEIPIGENWDKGAAGTHCSGTICARGDNNAGIAGVAWKNTKLISYQSLDVDGGGSAWAVYGALADLTRTVNILRKPKSDRTLDENNALPSYLKNEDFQITQKTVPVNMSLGGSYGTEFAFSVLTAAVKNNILPVIAMGNEGRYTAAYPAAFPGMLAVGATNGKDKKVHFSNKGAWISISAPGDGIKSCGISGDDDYETMSGTAMATPFVTGVISYLLSFNNAHNLTPYQIKSLLEKTADKVDGAVSFTEGYGHGRVNVYNAAKAIRENSIPQVNEIYSEGSVYVEVKNNNEVIASKISLVDEETKVPLAYVAGLGNNPVVEFKGLVKGKSYSVYASLLKYAKKETFTADGSDKTVTIQFNKNLAWVSTVPSLHYNGGNEQPDTKIIVFKADSSGNLSRSPSPILIYDKDYLDTAYFEYESGAEYYAEITGLKDEQGIFRGGNYVVKIGLTPLDLNGEDIIDGSRVASDNDTHEDDDEPDKAKLKGNAWEKKYACNLAAHGTNNEDIDFFYIKMP
【００５０】
配列番号２（ＰｒｔＰ成熟タンパク質（ＰｒｔＰＭ）、Ｔ．ペディス）：
GDPIANNSDYGLSITEALKAYKEIGYGDKTVVAGIIATGINMTHKDFKDENGNSIVLYAKSCVKSNGGTYIGNGNPFTEIPIGENWDKGAAGTHCSGTICARGDNNAGIAGVAWKNTKLISYQSLDVDGGGSAWAVYGALADLTRTVNILRKPKSDRTLDENNALPSYLKNEDFQITQKTVPVNMSLGGSYGTEFAFSVLTAAVKNNILPVIAMGNEGRYTAAYPAAFPGMLAVGATNGKDKKVHFSNKGAWISISAPGDGIKSCGISGDDDYETMSGTAMATPFVTGVISYLLSFNNAHNLTPYQIKSLLEKTADKVDGAVSFTEGYGHGRVNVYNAAKAIRENS
【００５１】
Ｔ．ペディスの「ＴｌｙＣ」（溶血素Ｃ）タンパク質は、配列番号３又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００５２】
配列番号３（ＴｌｙＣ、Ｔ．ペディス）：
MGLFDKFKKKPNVSQILKNGLNDEKRDMIRGIVDLSDTAVKEVMIPRIDVDFLSLDTPGNEILDKISESGHSRFPVYEDSIDNVIGILYVKDILKLLPKNEKIDLKKVVRKAFFVPESKRIDDLLREFKRRHLHIAIAVDEYGGTSGIVCMEDIIEEIVGDIQDEFDNEGEDITKIGEGVWLCDARIDLDDLKEAIDAEDLPADEFETLGGFVFDLFGKIPVKYEKAVWQNYDFIVQDMDGHKVKTVKIILNKEALKPEAE
【００５３】
Ｔ．ペディスの「ＭＳＰ」（主要外鞘タンパク質）は、配列番号４又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００５４】
配列番号４（ＭＳＰ、Ｔ．ペディス）：
MKKILSILIALVLVGGAVFAQDAPEMPAPVFKGSATLSWGIDLGYGTDKYGSALISHGFLNEATASVSLPFVKSGSKKGEGDVYALINLDGVKLGLEADLKEAKATGKIDKVEAKIVFYGAYITVYNAPEMKTKYAADATSLINDDNFGIFNSGFGGYGTKIGYANPDLMDLDVGIKFTSNGSWKDRDGSLGAEYVKTVTVKANRVNGTGTVHLEDGQELRDMSGKVVERGPGWKRVPSGQYMIYRSAYYRYRMNGHYGLGIDFHMAPVDKYLTVDANFNMTFDTAGSYRTDVESNFDDMRVMNVGAMIKSEPIDGLMFKLGFDGGHAFKKASDASAPLFAWALGFGTEYKDSRAGTINAGLYVSSDGTPYGNAGIFDPYKLNFVPDGKGGFKEEKRPDGTRPGRGITDIAFTVGYSGLPAVEGLDLHARLNVFGLLSKISKEERAMGELIPLGLNVGAGYKAMLTDSIWIKPYADLWGETNSDIYSDDTPKSKQKLYFGLAYKVGLSVSPMERLTIDLNWSHGKAFNPDVLMGTGSMFGLGQWRSTPFQHKADNGRFVVSAKITY
【００５５】
Ｔ．ペディスの「ＯｒｆＣ」（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）は、配列番号５又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００５６】
配列番号５（ＯｒｆＣ、Ｔ．ペディス）：
MQKIKKKLSFVFFLFTFSVFAEFNFDLIVQPFTGTEFFVDGKTVKPLVLEKDNTLAKVRLILKDSASAIEVKNKGFRTVNLTDELIRLKNDVGKTADLKAPFSIKALAILSRKESKFDTKAFFPTGRQPKSVTFVNSDTVAVALLDGNGADIINIETGEKKRISPPKEYAEKLGFVEALVLKNKNELWISQMPTALIHVFNLTTFEYKTAVKTSGKWSKVMAYNPLTDRVYLSNWQTFDISVINTETYSEEKKIKTKAVPRGMAFSEDGKFIYCAQFEDAAGNSNCRLVKKELDTFKTVSESGMKGAKRHIVTDYKQGRLYVSDMLNAVIEVYSLKDESLIKTVKVFSHPNTIQLSPDGKFLYVSCRGPNNPDKGYLYKGYVMGRLDIIDTETLTRIESVEAGNQPTGLDISPDGKTIVLSDFLDNRIRVFKKN
【００５７】
Ｔ．ヴィンセンティの「ＰｒｔＰ」（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）は、配列番号６又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００５８】
配列番号６（ＰｒｔＰ、Ｔ．ヴィンセンティ）：
MIKQKKFRFTLFFITSALAAVFAGCAMGFVNNSAKSDGTGSVHGTADSNTVFNSKWIISQQERHDKGTVVREGYSIVKTVDSFNPDSFTALNGSVAATQDLHDGYLYFLIKTESDAAQFRTAVRTLEGVLYAQPDYHYDAPAAMVDNTARPPVRNRGAAGKGTLGTADGNLDNDPKAALADWGLTATGALEAFKRYDAKYPVLAAIIDTGVNSLHEDFYDKNNKSIILYAKSSLHRGDVTQYTNPIPISLDENWDNHGHGTHCSGTIAAVGNNGIGICGVSHANTKLITYRGLDASGGDTYATYSCLGDLAEIITELRKEPGSRNSAVFAGLPPDVINYPQLRQKTVPVNLSLGGPAGHPYEVEMMNKALAAGVLPVIAMGNDGKTLAEYPAALQGILAVGATTMDDTRAAFSNGGTWMSVCAPGESIYSCGNGGQNWANSHSPDVKSSYRWMSGTSMATPFVTGVVTYLLSINPDLSPYQIKALLENTADKIDRGSPYGQYDSRGFSKWYGYGRVNVLKATEALVTGSNIPAEGSVYSEKAVMITLKKAGAAQKKTPVWLYEKATGICAAVGLTDETNGIVRFYGLRTGLEYEIGVNDAGTYKTYIITATNDSDIDYTFLL
【００５９】
Ｔ．ヴィンセンティの「ＰｒｔＰＭ」（ＰｒｔＰ成熟タンパク質）は、配列番号７又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００６０】
配列番号７（ＰｒｔＰ成熟タンパク質（ＰｒｔＰＭ）、Ｔ．ヴィンセンティ）：
NDPKAALADWGLTATGALEAFKRYDAKYPVLAAIIDTGVNSLHEDFYDKNNKSIILYAKSSLHRGDVTQYTNPIPISLDENWDNHGHGTHCSGTIAAVGNNGIGICGVSHANTKLITYRGLDASGGDTYATYSCLGDLAEIITELRKEPGSRNSAVFAGLPPDVINYPQLRQKTVPVNLSLGGPAGHPYEVEMMNKALAAGVLPVIAMGNDGKTLAEYPAALQGILAVGATTMDDTRAAFSNGGTWMSVCAPGESIYSCGNGGQNWANSHSPDVKSSYRWMSGTSMATPFVTGVVTYLLSINPDLSPYQIKALLENTADKIDRGSPYGQYDSRGFSKWYGYGRVNVLKATEALVTGSN
【００６１】
Ｔ．ファゲデニスの「溶血素ＩＩＩ」は、配列番号８又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００６２】
配列番号８（溶血素ＩＩＩ、Ｔ．ファゲデニス）：
MTNKIKRRYTVGEEIANAITHGVGVGLSIAALVLLIVRANRYAPPELKAGYIVGFSIFGASLIILYLFSTLYHALPLGAKKVFQIFDHCSIYILIAGTYTAFCLTALHGAIGWTIFGIIWGFAIAGIVLYAIFQNKFPIFSLITYIVMGWIIIFAARPLKSQLPSISFLFLILGGIVYTAGCIFFALKKIRWMHTIWHFFVLGGSILHFFSMYYSL
【００６３】
Ｄ．ノドーサスの「Ａｐｒ２」（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ２）は、配列番号９又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００６４】
配列番号９（Ａｐｒ２、Ｄ．ノドーサス）：
MKRFIMNKMALVVCAALVGQVASAETMVNYASAKAIGKQPAGSVRFIVKYKDNSQSSKDLKNRSTTKVMANGMQVAGFNAQFVRMTGAGAGIFSVPDLKTTKEAHLVMDTIASNPDVEFVEVDRIARPTAAPNDQHYREQWHYFDRYGVKADKVWDMGFTGQNVVVAVVDTGILHHRDLNANVLPGYDFISNSQISLDGDGRDADPFDEGDWFDNWACGGRPDPRKERSDSSWHGSHVAGTIAAVTNNRIGVAGVAYGAKVVPVRALGRCGGYDSDISDGLYWAAGGRIAGIPENRNPAKVINMSLGSDGQCSYNAQTMIDRATRLGALVVVAAGNENQNASNTWPTSCNNVLSVGATTSRGIRASFSNYGVDVDLAAPGQDILSTVDSGTRRPVSDAYSFMAGTSMATPHVSGVAALVISAANSVNKNLTPAELKDVLVSTTSPFNGRLDRALGSGIVDAEAAVNSVLGNEGNNGRDDRRDNVAPVENARNYANNSIKFIRDYRLTSSVIEVEGRSGAANGKINLALDIRHGNRSQLSIQLTSPAGHVYHINHDGARRPNLSGTVEIPVQNEQINGAWVLQVGDHGRGATGYIKSWSLTL
【００６５】
Ｄ．ノドーサスの「Ａｐｒ２ＢＭ」（Ａｐｒ２良性成熟タンパク質）は、配列番号１０又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００６６】
配列番号１０（Ａｐｒ２良性成熟タンパク質（Ａｐｒ２ＢＭ）、Ｄ．ノドーサス）：
AAPNDQHYREQWHYFDRYGVKADKVWDMGFTGQNVVVAVVATGILHHRDLNANVLPGYDFISNSQISLDGDGRDADPFDEGDWFDNWACGGRPDPRKERSDSSWAGSHVAGTIAAVTNNRIGVAGVAYGAKVVPVRALGRCGGYDSDISDGLYWAAGGRIAGIPENRNPAKVINMSLGSDGQCSYNAQTMIDRATRLGALVVVAAGNENQNASNTWPTSCNNVLSVGATTSRGIRASFSNYGVDVDLAAPGQDILSTVDSGTRRPVSDAYSFMAGTAMATPHVSGVAALVISAANSVNKNLTPAELKDVLVSTTSPFNGRLDRALGSGIVDAEAA
【００６７】
Ｄ．ノドーサスの「Ｂｐｒ」（塩基性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＢｐｒ）は、配列番号１１又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００６８】
配列番号１１（Ｂｐｒ、Ｄ．ノドーサス）：
MNLSNISAVKVLTLVVSAAIAGQVCAAESIVNYESANAISKQPEGSVRFIVKYKDGTPSSQGLKTRSTTKVMASGMQVAGFEAQFVRTTGLGAGIFAVPELKTTKEAHLVMDTIASNPDVEFVEVDRLAYPKAAPNDPSYRQQWHYFSNYGVKADKVWDRGFTGQGVVVSVVDTGILDHVDLNGNMLPGYDFISSAPKARDGDQRDNNPADEGDWFDNWDCGGYPDPRREKRFSTWHGSHVAGTIAAVTNNGVGVAGVAYGAKVIPVRVLGKCGGYDSDITDGMYWSAGGHIDGVPDNQNPAQVINMSLGGDGDCSQSSQRIIDKTTNLGALIVIAAGNENQDASRTWPSSCNNVLSVGATTPKGKRAPFSNYGARVHLAAPGTNILSTIDVGQAGPVRSSYGMKAGTSMAAPHVSGVAALVISAANSIGKTLTPSELSDILVRTTSRFNGRLDRGLGSGIVDANAAVNAVLGDQNRAQPRPPVNQPINSGNKVYRSDRRVAIRDLRSVTSGIRVNDQARVGSANITLTLDIRHGDRSQLAVELIAPSGRVYPIYHDGKRQPNIVGPATFSVKNERLQGTWTLKVTDKARGVTGSIDSWSLTF
【００６９】
Ｄ．ノドーサスの「ＢｐｒＭ」（Ｂｐｒ成熟タンパク質）は、配列番号１２又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００７０】
配列番号１２（Ｂｐｒ成熟タンパク質（ＢｐｒＭ）、Ｄ．ノドーサス）：
AAPNDPSYRQQWHYFSNYGVKADKVWDRGFTGQGVVVSVVATGILDHVDLNGNMLPGYDFISSAPKARDGDQRDNNPADEGDWFDNWDCGGYPDPRREKRFSTWAGSHVAGTIAAVTNNGVGVAGVAYGAKVIPVRVLGKCGGYDSDITDGMYWSAGGHIDGVPDNQNPAQVINMSLGGDGDCSQSSQRIIDKTTNLGALIVIAAGNENQDASRTWPSSCNNVLSVGATTPKGKRAPFSNYGARVHLAAPGTNILSTIDVGQAGPVRSSYGMKAGTAMAAPHVSGVAALVISAANSIGKTLTPSELSDILVRTTSRFNGRLDRGLGSGIVDANAA
【００７１】
Ｄ．ノドーサスの「Ａｐｒ５」（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ５）は、配列番号１３又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００７２】
配列番号１３（Ａｐｒ５、Ｄ．ノドーサス）：
MKQSGINGVKTLTLVVCAALASQAYAAVNYESANYIGSQPEGSVRFIIKYKDKSQSQQMMTNRSTTSVMNNNNITIAGFNAQFVRTMTIGAGIFAVPDLKTTKEAHLVMDTIASNPDVEYVEVDRWLRPFAAPNDPFYNDQWHYYSEYGVKADKVWDRGITGKGVTVAVVDTGIVNHPDLNANVIPGSGYDFIQEAEIAQDGDGRDSNPADAGDWHSNWACGKYPDPRYEKRNSSWHGSHVAGTIAAVTNNRIGVSGVAYDAKIVPVRVLGRCGGYNSDINEGMYWAAGGHIDGVPDNKHPAQVINMSLGGPGVCGSTEQTLINRATQLGATIIVAAGNDNIDAYGVTPASCDNILTVGATTSNGTRAYFSNHGSVVDISAPGAGITSTVDSGARYPSGPSYSLMDGTSMATPHVAGVAALVISAANSVNKEMTPAQVRDVLVRTVSSFNGTPDRRIGAGIVDADAAVNAVLDGNVVERPIDELKPQAEYRNPQIKLIRDYQMMFSEIKVNGRPGNTKFAVVKADIRHTDPSQLKLRLVSPKGYEYAVHYDNIKNKSSELITFPRDEQMNGYWRLKIVDTKRGVTGYTRGWSVAF
【００７３】
Ｄ．ノドーサスの「Ａｐｒ５Ｍ」（Ａｐｒ５成熟タンパク質）は、配列番号１４又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００７４】
配列番号１４（Ａｐｒ５成熟タンパク質（Ａｐｒ５Ｍ）、Ｄ．ノドーサス）：
AAPNDPFYNDQWHYYSEYGVKADKVWDRGITGKGVTVAVVATGIVNHPDLNANVIPGSGYDFIQEAEIAQDGDGRDSNPADAGDWHSNWACGKYPDPRYEKRNSSWAGSHVAGTIAAVTNNRIGVSGVAYDAKIVPVRVLGRCGGYNSDINEGMYWAAGGHIDGVPDNKHPAQVINMSLGGPGVCGSTEQTLINRATQLGATIIVAAGNDNIDAYGVTPASCDNILTVGATTSNGTRAYFSNHGSVVDISAPGAGITSTVDSGARYPSGPSYSLMDGTAMATPHVAGVAALVISAANSVNKEMTPAQVRDVLVRTVSSFNGTPDRRIGAGIVDADAA
【００７５】
配列番号１５（主要外鞘タンパク質（ＭＳＰ）、Ｔ．ファゲデニス）：
MKKYLIAFSIFAFALGIAFAQEAEAAEPAQKAAAAEPAQKAAAAEPAKEPEVYALTSGAKASIEGSTKLEWGIDLGAGKVTKDSIAHGFKNSGSWKVSFPLFEKKSFTSKADTPVYAEVIIKDVELGIQSKNKSKKEKDFAFTGKVDEIVGTLYFYDAYLKIYKKPGFKVNYAQIWDPLKADDWDKSGYKFEPGFDIAGGTTLGYKKDNIGNSGLDLDAGVKFGSNGNWETEGKSDYEGSPQYALITGPATLAKGSTYVELEPVYGKEAEEKASYIMLDNQRFKITSNFKKVSPDKDLEVKEGKYYAKIDGLTKKDTPATKNRYGMGFYTSVAYKPGDLKYIGFNFDINTTFCSHKDWENNTEKGNYFNVSFGTKITSEPVKDLSLVLAFDGEPFVNGEKKFAWDMLFDTTYKWVGAGVYVGNENTFYKSNKDKVDMSIYAKFETKGDKKKANFLVENLNAGAAIYVHHLLSKPVSPKTVPIGLKVYADYKYDINDSMWLKPYASFYGETNHAEPKFGVYYNVGLTFSPLERLELTADWEQGKVVKNKHEGFIEKSAGKEHNGRFKLGCKVSF
【００７６】
Ｔ．ファゲデニスのＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）は、配列番号１５又はその免疫原性断片に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を指す。
【００７７】
本発明において有用な他の候補タンパク質、ポリペプチド又は抗原は、アドヘシン、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素等の既知の病原性因子から選択される。好ましくは、以下の群：
ＰｃｒＢ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＢ様タンパク質）；
ＰｃｒＡ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＡ様タンパク質）；
Ｃｙｓペプチダーゼ；
溶血素赤血球溶解タンパク質２；
表面抗原ＢｓｐＡ；
フィラメントタンパク質；
鞭毛フックタンパク質；
プロリルエンドペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼＢ；並びに、
オリゴペプチダーゼＦ；
から選択される。
【００７８】
本明細書で使用されるトレポネーマ又は他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子の「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。当業者であれば、トレポネーマのタンパク質の発現において又は診断プローブとして使用するために、ポリヌクレオチド配列は同一である必要はなく、本明細書に開示される配列と実質的に同一であり得ることを認識するであろう。特に、挿入されたポリヌクレオチド配列が転写及び翻訳されて機能的なポリペプチドが産生される場合に、当業者であれば、コドンの縮重のため、幾つかのポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードすることを認識するであろう。
【００７９】
「生体試料」は、生存生物又は死生物から得られるあらゆる試料を指す。生体試料の例には、生体液及び組織標本が含まれる。組織標本の例には、蹄足組織及び蹄組織も含まれる。そのような生体試料は、分析のためにｉｎ  ｓｉｔｕ技術を使用して調製され得る。
【００８０】
「生物学的に純粋な培養物」又は「生物学的純粋な培養物」は、他の生物を実質的に含まない有蹄動物のトレポネーマの連続的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物を指す。標準的な採取手順（以下に説明する）により、少なくとも約９０％、好ましくは９９％以上の生物、例えばトレポネーマを含む調製物が得られる場合に、培養物は他の生物を実質的に含まない。
【００８１】
ポリヌクレオチド及びポリペプチドについての「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウに対して最適にアライメントされた２つの配列を比較することによって決定され、その際、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。そのパーセンテージは、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致する位置の数を得て、その一致した位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数により割って、その結果に１００を掛けて計算することで、配列同一性のパーセンテージが得られる。比較のための配列の最適なアラインメントは、既知のアルゴリズムのコンピュータ実装（アメリカ国立生物工学情報センターのリソースにおけるＢＬＡＳＴ、欧州バイオインフォマティクス研究所のリソースにおけるＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（ウィスコンシン州マジソン、サイエンスドライブ  ５７５）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は検分によって行うことができる。
【００８２】
ポリヌクレオチド配列の実質的な同一性は、ポリヌクレオチドが、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。典型的には、２つのポリペプチドは、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が同一又は保存的置換であれば、実質的に同一であるとみなされる。配列は、好ましくは、デフォルトパラメーターを用いてＧＡＰを使用して参照配列と比較される。
【００８３】
ポリヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである。ストリンジェントな条件は配列に依存し、状況によって異なる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列についての熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全一致したプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度及びｐＨ下での）温度である。典型的には、サザンブロットプロトコルのためのストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ洗浄液で室温にて洗浄することを含む。
【００８４】
「特異的又は選択的にハイブリダイズする」という語句は、標的がポリヌクレオチドと他の化合物との不均一混合物中にある場合に、プローブが実質的に標的配列にのみ結合してハイブリダイゼーション複合体が形成されるプローブと標的配列との間のハイブリダイゼーションを指す。そのようなハイブリダイゼーションは、標的配列の存在の決定因子である。プローブは他の無関係な配列と結合する場合があるが、形成されるハイブリダイゼーション複合体の少なくとも９０％、好ましくは９５％以上が標的配列と結合する。
【００８５】
「抗体」は、抗原上の特異的エピトープに結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体はポリクローナルな混合物又はモノクローナルであり得る。抗体は、天然起源又は組み換え起源に由来するインタクトな免疫グロブリンであってもよく、インタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２を含む様々な形態並びに一本鎖で存在し得る。重鎖及び軽鎖のための遺伝子が単一のコーディング配列へと結合されている一本鎖抗体を使用することもできる。
【００８６】
「免疫原性組成物」又は「免疫学的組成物」は、ヒトを含む脊椎動物に投与することで、組成物に対する細胞性免疫応答型又は抗体媒介性免疫応答型の宿主における免疫学的応答を誘発する物質を指す。免疫原性組成物は、中でも死滅又は弱毒化させた細菌又はウイルス等の抗原性特性を有する分子、そしてまた免疫原性ポリペプチドを含む。免疫原性ポリペプチドは、一般的に抗原性とも呼ばれる。分子が免疫グロブリン（抗体）又はＴ細胞抗原受容体等の免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができる場合に、その分子は「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５個、特に少なくとも約１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個又は少なくとも５０個のアミノ酸のエピトープを含む。エピトープとも呼ばれるポリペプチドの抗原性部分は、抗体又はＴ細胞受容体の認識に対して免疫優性である部分であってもよく、又は免疫化のために抗原性部分を担体ポリペプチドにコンジュゲートさせることによってその分子に対する抗体を作製するために使用される部分であってもよい。免疫原性組成物は、この記載によれば、活性分子、上記分子を含む組成物又は特定の免疫反応が望まれる２つ以上の抗原性分子を含む組成物に関連する。免疫原性組成物の例には、細菌、原生動物及びウイルスを含む微生物培養物の上清が含まれる。上記上清は、それに対する免疫応答を開始するための対象の抗原性分子を含み、それらの抗原性分子は、微生物細胞又は粒子（ウイルス）が分離された後に、微生物が増殖する培養培地に放出（外毒素）又は送達されている。その上清はまた、これにより無細胞調製物と呼ばれる。
【００８７】
「抗原」は、被験体が免疫応答、例えば体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を開始することができる分子を指す。組成物の意図される機能に応じて、１つ以上の抗原が含まれ得る。
【００８８】
「免疫学的有効量」又は「免疫学的有効用量」とは、疾患の処置又は未然防止のいずれかのために、動物における疾患の罹患率を減らし、又は感染若しくはその疾患罹患の重症度を下げる免疫応答を誘発する又は誘発することができる単回投与での又は連続投与の一部としての抗原の量又は用量の投与を意味する。免疫学的有効量又は免疫学的有効用量はまた、疾患の処置又は未然防止のいずれかのための抗体の産生を誘導することもできる。この量は、被験体の体調を含む様々な要因に応じて変動し、当業者によって容易に決定され得る。
【００８９】
本明細書で使用される「ワクチン」は、動物に投与されると、動物において免疫応答を直接的又は間接的に誘発する又は誘発することができる適切な添加剤及び／又は担体を伴う本発明の免疫原性組成物を意味する。特に、本発明のワクチンは、被験体に投与することで、細胞性又は抗体媒介性の宿主における防御的な免疫学的応答を誘発する。「混合ワクチン」という用語は、ワクチンが単一の製剤中に様々な抗原を含むことから、２つ以上の疾患又は２種以上の微生物によって引き起こされる１つの疾患から防御することを意味する。したがって、ワクチンは、本発明によれば「有効成分」として「免疫原性組成物」を含む。
【００９０】
本明細書で使用される「医薬品」は、広く受け入れられるように、ヒトを含む動物における疾患を治癒、処置又は未然防止するために使用される医薬品又は獣医薬（薬剤、薬物又は単に薬とも呼ばれる）と同義である。薬は様々な方法で分類される。１つの主な区別は、通常は化学合成から誘導される従来の低分子薬と、組み換えタンパク質、ワクチン、治療に使用される血液製剤（例えば、ＩＶＩＧ）、遺伝子治療、モノクローナル抗体及び細胞治療（例えば、幹細胞治療）を含む生物医薬品との間でなされる。本発明において、医薬は、好ましくは獣医学用医薬であり、更により好ましくは獣医学用途のワクチンである。
【００９１】
「と特異的に免疫反応性」という語句は、タンパク質又はペプチドに言及する場合に、タンパク質と、タンパク質及び他の化合物の不均質な集団の存在下で該タンパク質の存在を決定する抗体との間の結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下では、特定された抗体は、特定のタンパク質に結合し、試料中に存在する他のタンパク質にはあまり多量には結合しない。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択された抗体を必要とし得る。様々なイムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択することができ、それらは以下で詳細に記載される。
【００９２】
「実質的に純粋な」又は「単離された」という語句は、トレポネーマのペプチド又はタンパク質に言及する場合に、トレポネーマ生物の他の細胞内成分を含まない化学組成物を意味する。典型的には、試料の少なくとも約８５％以上が単一のポリペプチド骨格を示す場合に、単量体タンパク質は実質的に純粋である。マイナー変異体又は化学修飾は、典型的に、同じポリペプチド配列を共有し得る。精製手順に応じて、８５％、好ましくは９５％を上回る純度が可能である。タンパク質の純度又は均質性は、当該技術分野でよく知られる多くの手段、例えばタンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動に続いての、銀染色又はクマシー染色によるポリアクリルアミドゲル上の単一のポリペプチドバンドの可視化によって示され得る。或る特定の目的のために、高分解能が必要となり、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又は同様の手段が精製に利用される。
【００９３】
「標識」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段又は化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素（例えば、通常ＥＬＩＳＡで使用される）、ビオチン、ジオキシゲニン又はハプテン及び抗血清又はモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質が含まれる。
【００９４】
「組み換え」という用語は、細胞又は核酸又はベクターに関して使用される場合に、細胞又は核酸又はベクターが異種核酸の導入又は天然の核酸の改変によって修飾されていること、又は細胞がそのように修飾された細胞から誘導されることを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態内に見られない遺伝子を発現する、又はそうでなければ異常発現される、過小発現される若しくは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００９５】
「薬学的に許容可能」とは、生物学的に又は他の点で不所望でない材料を意味し、すなわち、その材料は、不所望な生物学的効果を一切引き起こさず、又は医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な相互作用を起こすことなく、トレポネーマ抗原と一緒に個体に投与することができる。
【００９６】
「未然防止する」、「未然防止すること」又は「未然防止」には、限定されるものではないが、症状、障害、状態又は疾患のリスクの減少、軽減又は改善、及び症状、障害、状態又は疾患からの動物の保護が含まれる。未然防止は、予防的に適用又は施与され得る。
【００９７】
「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、限定されるものではないが、既存の症状、臨床徴候、障害、状態又は疾患の進行又は重症度の抑制、減速、停止、軽減、改善又は復帰を含む。処置は、治療的に適用又は施与され得る。
【００９８】
「被験体」とは、個体を意味する。一態様では、被験体は、哺乳動物、例えばヒトを含む霊長類である。別の態様では、哺乳動物は、中でも、マーモセット、サル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、及びテナガザル等の非ヒト霊長類である。「被験体」という用語には、家庭動物、例えば猫、犬等、家畜、例えば牛、馬、豚、羊、山羊等、実験動物、例えばフェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミ、モルモット等、及び鳥類、例えば鶏、七面鳥、アヒル、キジ、ハト、コバト、オウム、バタン、ガチョウ等も含まれる。被験体には、限定されるものではないが、魚（例えば、ゼブラフィッシュ、金魚、ティラピア、サケ、及びマス）、両生類及び爬虫類も含まれ得る。本明細書で使用される場合に、「被験体」は「患者、患畜（patient）」又は「罹患した被験体」と同じであり、それら用語は、区別なく使用され得る。
【００９９】
発明の説明
本発明は、トレポネーマ属の複数種のバクテリンを含み、任意にトレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の抗原が補充された新規の医薬組成物及び／又はワクチン組成物を提供する。上記ワクチン組成物は、好ましくは易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫するためのものであり、その際、上記トレポネーマ属の複数種のバクテリンは、好ましくはＴ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス、Ｔ．ヴィンセンティ、Ｔ．メディウム、Ｔ．レフリンゲンス、Ｔ．カリギラム、Ｔ．マルトフィラム及び／又はＴ．ブレナボレンス、好ましくはＴ．ペディス又はＴ．ファゲデニスから選択される。
【０１００】
さらに、本発明は、趾皮膚炎のための診断アッセイのための核酸及びタンパク質の産生並びに趾皮膚炎用のワクチン組成物で使用される免疫原性タンパク質及び組成物の調製を含む様々な用途におけるトレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の単離された抗原、好ましくは組み換え抗原であって、これらの組成物において、上記抗原は、免疫原的有効量のトレポネーマ属の複数種のバクテリン、好ましくは免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディスのバクテリン又は好ましくは免疫原的有効量のトレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・ブレナボレンス、トレポネーマ・カリギラム及びトレポネーマ・マルトフィラム又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるバクテリンと組み合わせて使用される、抗原を提供する。好ましい実施形態では、上記抗原は、ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）、ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）、ＴｌｙＣ（溶血素Ｃ）、ＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）及び溶血素ＩＩＩからなる群より選択されるトレポネーマ属の複数種、例えば限定されるものではないが、Ｔ．ペディス由来の単離された抗原である。より好ましい実施形態では、上記抗原は、トレポネーマ・ペディス由来の単離された抗原であり、ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）、ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）、好ましくはＰｒｔＰＭ（ＰｒｔＰ成熟タンパク質）、ＴｙｌＣ（溶血素Ｃ）及びＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）、及び／又はトレポネーマ・ファゲデニス由来の抗原ＭＳＰ及び溶血素ＩＩＩ、及び／又はトレポネーマ・ヴィンセンティ由来の抗原ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、及び／又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ２）、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ（Ａｐｒ２良性成熟タンパク質）、Ａｐｒ５（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ５）、好ましくはＡｐｒ５Ｍ（Ａｐｒ５成熟タンパク質）及びＢｐｒ（塩基性細胞外サブチリシン様タンパク質Ｂｐｒ）、好ましくはＢｐｒＭ（Ｂｐｒ成熟タンパク質）並びにアドヘシン、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素等の病原性因子から選択される本発明において有用な他の候補タンパク質、ポリペプチド又は抗原からなる群より選択される。更に別の好ましい実施形態では、本発明において有用な上記ポリペプチド又は上記抗原は、以下の群：
ＰｃｒＢ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＢ様タンパク質）；
ＰｃｒＡ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＡ様タンパク質）；
Ｃｙｓペプチダーゼ；
溶血素赤血球溶解タンパク質２；
表面抗原ＢｓｐＡ；
フィラメントタンパク質；
鞭毛フックタンパク質；
プロリルエンドペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼＢ；並びに、
オリゴペプチダーゼＦ；
から選択することができ、趾皮膚炎の診断アッセイのための核酸及びタンパク質の製造、並びに任意にトレポネーマ属の複数種に属する細菌を含む趾皮膚炎用のワクチン組成物で使用される免疫原性タンパク質及び組成物の調製を含む様々な用途で使用することができる。好ましくは、トレポネーマ属の複数種に属する細菌を含む上記趾皮膚炎用のワクチン組成物は、以下のトレポネーマ種：Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス、Ｔ．ヴィンセンティ、Ｔ．メディウム、Ｔ．レフリンゲンス、Ｔ．カリギラム、Ｔ．マルトフィラム及び／又はＴ．ブレナボレンスの少なくとも１種以上を含む。
【０１０１】
一方、本発明は、トレポネーマ・ペディスを、哺乳動物における趾皮膚炎（ＤＤ）、特に有蹄動物の趾皮膚炎の病因因子の１つとして特定している。したがって、本発明はまた、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫化するためのトレポネーマ・ペディスの分離培養物、及び一連の特異的トレポネーマ抗原により感染を検出することによってＤＤを診断する方法を提供する。
【０１０２】
したがって、本発明は、任意にトレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の単離された１種以上の抗原が補充された又はそれらと組み合わされた、ワクチンとして使用される、トレポネーマ属の複数種のバクテリン、好ましくはトレポネーマ・ペディスのバクテリン又はＴ．ファゲデニス、Ｔ．ヴィンセンティ、Ｔ．メディウム、Ｔ．レフリンゲンス、Ｔ．カリギラム、Ｔ．マルトフィラム及び／又はＴ．ブレナボレンスの好ましくは生物学的に純粋な培養物を提供する。
【０１０３】
そのような抗原は、既に先に列記されている。
【０１０４】
本発明の先に特定された態様及び実施形態は全て、トレポネーマ属の複数種のバクテリンが、哺乳動物を趾皮膚炎、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫したという驚くべき知見に基づくものである。この意味で、実施例１で、ＢＤＤの実験的感染に対する実験的ワクチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性を評価した。これらのワクチンについての仔牛におけるＢＤＤの実験的感染に対するｉｎ  ｖｉｖｏ有効性も試験した。これらのワクチンに関連する材料及び方法、それらの調製並びに定性的組成及び定量的組成、使用されたワクチン接種プロトコル及び動物は、実施例の節に記載されている。
【０１０５】
実施例１に示される結果に例示されるように、ワクチンＢ（トレポネーマのバクテリンを有しない４種の組み換えタンパク質のみ）及びワクチンＤ（プラセボ）は明らかに有効ではなかった。それに対して、ワクチンＡ（トレポネーマ・ペディスのバクテリン＋４種の組み換えタンパク質）及びワクチンＣ（トレポネーマ・ペディスのバクテリン単独）により、本発明の著者らは、Ｔ．ペディスに対して強い応答を得ただけでなく、Ｔ．ファゲデニスに対しても強い応答を得た。試験された製剤のいずれもＴ．ファゲデニスを含まなかったので、これは、潜在的な交差反応性によるものとしか説明することができない。さらに、アジュバントＡ又はアジュバントＢの使用の間に違いはなかった。さらに、細菌単独を含むワクチンに対して、混合ワクチン（バクテリン＋組み換え体）の免疫学的応答の増加が見られ（Ａ対Ｃ）、ワクチン接種後４７日目の血清力価で実証された。
【０１０６】
さらに、実施例２に示されるように、本発明の著者らは、仔牛でのＢＤＤの実験的感染に対する２種の実験的ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を評価したところ、上記の結果が確認される。この最後の実験から、ワクチンＡ又はワクチンＢのいずれかを、実施例１に示された先の一連の実験からのワクチン番号Ｃと比較すると、ほとんどの潜在的な治療効果がトレポネーマのバクテリンに起因することが明らかであり、一方で、先行する実験のワクチンＡで使用された組み換え抗原が、不活化されたＴ．ペディスのバクテリンを含むワクチンの免疫学的反応を増強するらしいことに注目すると非常に興味深い。
【０１０７】
さらに、本出願は、特に実施例４において、ＢＤＤに対する実験的なＴ．ファゲデニスワクチンの免疫原性を更に開示しており、ここで、試験された種々のトレポネーマ属の複数種（Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス及びＴ．メディウム）に対する免疫学的応答が、群２の動物の血清から明らかに観察された。群２のワクチン製剤はＴ．ペディス又はＴ．メディウムのバクテリンを含まなかったため、ワクチン接種された動物に観察された免疫学的応答は、トレポネーマ属の複数種間の交差反応に起因し得る（図１０）。さらに、Ｔ．ファゲデニスのバクテリンでワクチン接種された仔牛の血清（群２）に関してＴ．ファゲデニスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に対する明らかな阻害効果が観察された。この阻害効果は、コントロール群には観察されなかった。
【０１０８】
これらの結果は、ワクチン接種された動物に観察された免疫学的応答が、交差反応の原因となる幾つかのエピトープを共有するトレポネーマ種間の交差反応性に起因し得ることを示唆している。
【０１０９】
さらに、本出願は、特に実施例５で、ＢＤＤに対する抗原が補充された実験的なＴ．ファゲデニスのワクチンの免疫原性を更に開示しており、ここで、ワクチン接種された群２の動物の血清におけるワクチン組成物中に存在する全ての抗原に対する免疫学的応答が明らかに観察された。さらに、バクテリンに組み換えタンパク質が補充された場合（群２）にＴ．ファゲデニスのＭＳＰタンパク質に対する免疫学的応答が増加した。けれども、群３（バクテリン単独）も同様に明らかな免疫学的応答を生じた。それに対して、コントロール群（群１）は、試験された抗原のいずれに対しても免疫学的応答を生じなかった。
【０１１０】
さらに、群２（バクテリン＋組み換えタンパク質）及び群３（バクテリン単独）のワクチン接種された仔牛の血清において、Ｔ．ファゲデニスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に対する明らかな阻害効果が観察された。これらの結果は、群２及び群３でのワクチン接種された動物における中和抗体の存在を裏付けている。
【０１１１】
したがって、これらの知見は、トレポネーマ種が幾つかのエピトープ、おそらく外膜又は鞭毛のエピトープを共有し、それらが交差反応性の原因となり、トレポネーマ属の複数種の異なる種間で保存されていることを示している。２種の異なる実験的なトレポネーマ属の複数種のワクチンを使用することによる仔牛での実験的感染においてこれまでにこうして得られてきた結果を考慮して、これらのエピトープは明らかに防御に関与する。
【０１１２】
したがって、本明細書に示される結果により、任意のトレポネーマ属の複数種のワクチン組成物に対して同じことを推定することが可能であり、特に、本発明は、一態様では、免疫原的有効量のＴ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス、Ｔ．ヴィンセンティ、Ｔ．メディウム、Ｔ．レフリンゲンス、Ｔ．カリギラム、Ｔ．マルトフィラム及び／又はＴ．ブレナボレンスを含む医薬組成物を提供する。更に特に、これらの結果を考慮して、本発明は、トレポネーマ・ペディス及びトレポネーマ・ファゲデニスを、哺乳動物における趾皮膚炎（ＤＤ）、特に有蹄動物の趾皮膚炎の病因因子の２つとして特定している。したがって、本発明は、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤに対して、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫化するためのトレポネーマ・ペディス及びトレポネーマ・ファゲデニスのワクチンの分離培養物、並びに一連の特異的なトレポネーマ抗原により感染を検出することによるＤＤの診断方法を提供する。したがって、一態様では、本発明は、免疫原的有効量のトレポネーマ・ペディス及び／又はトレポネーマ・ファゲデニスのバクテリン、好ましくは任意のＴ．ペディス株、例えば、限定されるものではないが、Ｔ３５５２Ｂ、Ｇ８１９ＣＢ、Ｔ１８Ｂ若しくはＴ３５４Ａ、又はHIPRA SCIENTIFIC S.L.U.社（スペイン、ジローナ県アメール、セルバ通り，１３５）によりライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）（ドイツ、ブラウンシュバイク、インホッフェン通り７  Ｂ  ３８１２４）においてアクセッション番号ＤＳＭ  ３２６６３として２０１７年１０月１０日に寄託されたＴ．ペディス株、又は好ましくは任意のＴ．ファゲデニス株、例えば、限定されるものではないが、Ｖ１、Ｖ２、Ｔ４１３、Ｔ５５１Ｂ、Ｔ６０３、Ｂ−７３３０、若しくはHIPRA SCIENTIFIC S.L.U.社（スペイン、ジローナ県アメール、セルバ通り，１３５）によりライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）においてアクセッション番号ＤＳＭ  ３２９５０として２０１８年１１月７日にブタペスト条約に基づき寄託されたＴ．ファゲデニス株を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、上記医薬組成物は、トレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の単離された抗原、好ましくは組み換え抗原を更に含む。より好ましくは、上記医薬組成物は、ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）、ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）、ＴｌｙＣ（溶血素Ｃ）、ＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）及び溶血素ＩＩＩからなる群より選択されるトレポネーマ属の複数種由来の単離された抗原を更に含む。更により好ましくは、上記医薬組成物は、ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）、ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）、好ましくはＰｒｔＰＭ（ＰｒｔＰ成熟タンパク質）、ＴｙｌＣ（溶血素Ｃ）及びＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）からなる群より選択されるトレポネーマ・ペディス由来の単離された抗原、及び／又はトレポネーマ・ファゲデニス由来の抗原ＭＳＰ及び溶血素ＩＩＩ、及び／又はトレポネーマ・ヴィンセンティ由来の抗原ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、及び／又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ２）、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ（Ａｐｒ２良性成熟タンパク質）、Ａｐｒ５（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ５）、好ましくはＡｐｒ５Ｍ（Ａｐｒ５成熟タンパク質）及びＢｐｒ（塩基性細胞外サブチリシン様タンパク質Ｂｐｒ）、好ましくはＢｐｒＭ（Ｂｐｒ成熟タンパク質）、並びにアドヘシン、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素から選択される本発明において有用な他の候補タンパク質、ポリペプチド又は抗原を更に含む。本発明において有用な他のポリペプチド又は抗原は、好ましくは、以下の群：
ＰｃｒＢ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＢ様タンパク質）；
ＰｃｒＡ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＡ様タンパク質）；
Ｃｙｓペプチダーゼ；
溶血素赤血球溶解タンパク質２；
表面抗原ＢｓｐＡ；
フィラメントタンパク質；
鞭毛フックタンパク質；
プロリルエンドペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼＢ；並びに、
オリゴペプチダーゼＦ；
又はそれらの任意の組み合わせ；
から選択される。
【０１１３】
さらに、本発明で使用される組み換え抗原は、例示されたワクチン組成物の免疫学的応答を増強したので、したがって、本明細書に示される結果により、任意のトレポネーマ属の複数種のワクチン組成物に対して同じことを推定することが可能である。したがって、更なる態様では、本発明は、免疫原的有効量のトレポネーマ属の複数種のバクテリンであって、好ましくは、Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス、Ｔ．ヴィンセンティ、Ｔ．メディウム、Ｔ．レフリンゲンス、Ｔ．カリギラム、Ｔ．マルトフィラム及び／又はＴ．ブレナボレンス、好ましくはＴ．ペディス又はＴ．ファゲデニスから選択される、トレポネーマ属の複数種のバクテリンと、トレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の単離された１種以上の抗原とを含む医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、易罹患性の哺乳動物、好ましくは有蹄動物をＤＤ、特に牛趾皮膚炎に対して効果的に免疫するために有用であり、ここで、そのような単離された抗原、好ましくは組み換え抗原は、トレポネーマ属の複数種又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子から得られることが好ましい。より好ましくは、上記抗原は、ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）、ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）、ＴｌｙＣ（溶血素Ｃ）、ＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）及び溶血素ＩＩＩからなる群より選択されるトレポネーマ抗原である。これらの抗原の全ては、限定されるものではないが、Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス又はＴ．ヴィンセンティ等のトレポネーマ属の複数種から得ることができることに留意する。本発明において有用な追加の抗原は、Ｄ．ノドーサス又はＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子から選択され得る。これらの抗原の全ては、本発明の医薬組成物において組み合わせて使用することができ、好ましくは組み換え的に産生される。より好ましくは、本発明において有用な上記タンパク質、上記ポリペプチド又は上記抗原は、アドヘシン、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、表面抗原、運動性に関与するタンパク質及び溶血素等の病原性因子から選択される。更により好ましくは、本発明において有用な上記タンパク質、上記ポリペプチド又は上記抗原は、以下の群：
ＭＳＰ（主要外鞘タンパク質）；
ＰｒｔＰ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｔＰ様タンパク質）及びＰｒｔＰＭ（ＰｒｔＰ成熟タンパク質）；
ＴｙｌＣ（溶血素Ｃ）；
ＯｒｆＣ（表面抗原ＯｒｆＣリポタンパク質）；
溶血素ＩＩＩ；
Ａｐｒ２（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ２）及びＡｐｒ２ＢＭ（Ａｐｒ２良性成熟タンパク質）；
Ａｐｒ５（酸性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＡｐｒ５）及びＡｐｒ５Ｍ（Ａｐｒ５成熟タンパク質）；
Ｂｐｒ（塩基性細胞外サブチリシン様プロテアーゼＢｐｒ）及びＢｐｒＭ（Ｂｐｒ成熟タンパク質）；
ＰｒｃＢ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＢ様タンパク質）；
ＰｒｃＡ（セリン−プロテアーゼ複合体ＰｒｃＡ様タンパク質）；
Ｃｙｓペプチダーゼ；
溶血素赤血球溶解タンパク質２；
表面抗原ＢｓｐＡ；
フィラメントタンパク質；
鞭毛フックタンパク質；
プロリルエンドペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼ；
オリゴペプチダーゼＢ；並びに、
オリゴペプチダーゼＦ；
から選択される。
【０１１４】
更により好ましくは、上記抗原は、トレポネーマ・ペディス由来のＭＳＰ、ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＯｒｆＣ、又はトレポネーマ・ファゲデニス由来の抗原ＭＳＰ及び溶血素ＩＩＩ、又はトレポネーマ・ヴィンセンティ由来の抗原ＰｒｔＰ、好ましくはＰｒｔＰＭ、又はディケロバクター・ノドーサス由来の抗原Ａｐｒ２、好ましくはＡｐｒ２ＢＭ、Ａｐｒ５、好ましくはＡｐｒ５Ｍ及びＢｐｒ、好ましくはＢｐｒＭ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される抗原であり、任意に前記抗原は、組み換え的に産生される。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含み得る。ワクチンを液体形で調製するのに適した担体には、水、又は等張生理食塩液、すなわち生理学的な細胞培地と同じ塩濃度を有する等張生理食塩液、又は油、又は細菌が培養される培養液、又はそれらの混合物が含まれ得る。
【０１１６】
さらに、所望であれば、担体には、他の補助物質又は薬学的に許容可能な添加剤、例えば、湿潤剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤）、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、デンプン又はデキストラン）又はタンパク質（例えば、アルブミン、カゼイン、ウシ血清又はスキムミルク）等の安定化剤が含まれ得る。
【０１１７】
添加剤の物理化学的特徴及び市販される商品名は、R.C. Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4thedition, Pharmaceutical Press, London, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9]の書籍に見出すことができる。
【０１１８】
上記の医薬組成物、好ましくは、ワクチン組成物は、哺乳動物における趾皮膚炎（ＤＤ）、特に有蹄動物の趾皮膚炎の処置及び／又は未然防止のための様々な医薬調剤に使用することができる。本発明の医薬組成物は、典型的には、トレポネーマ属の複数種に感染した牛、羊、山羊等の蹄を持つ動物、及びヒトを含む他の動物にワクチン接種するために使用される。
【０１１９】
本ワクチンの活性成分として使用される免疫原性細胞生物は、弱毒化又は不活化されたＤＤ関連のトレポネーマ属の複数種、好ましくは不活化されたトレポネーマ属の複数種のバクテリン、より好ましくは不活化されたトレポネーマ・ペディス又はトレポネーマ・ファゲデニスのバクテリンを含む。不活化は、すなわち化学的処理、分子的処理又は熱処理によって達成され得る。これらのスピロヘータは、ＤＤに罹患した被験体から分離され得る。スピロヘータは、感染した被験体又は適切な栄養培地において維持され得る。免疫原性スピロヘータは、典型的には、罹患した動物の皮膚から分離され、規定の培地中で培養される。スピロヘータ培養物は、化学的処理、分子的処理又は熱処理のいずれかによって不活化され得る。スピロヘータは、培養物を好気性（酸素）条件下に曝すことによって不活化することもできる。不活化過程は、他の特性、典型的には免疫原性を維持しつつ培養物の毒性をなくす。
【０１２０】
ワクチンを調製するために、まずスピロヘータを遠心分離若しくは濾過により、又は選択培地等の使用により培地から分離する。スピロヘータは、化学的処理を含む多くの方法により処理して、上記説明のように不活化することができる。スピロヘータの懸濁液は、凍結乾燥によって乾燥させるか、又はその水性懸濁液中で凍結させることで、不活化された全細胞を得ることができる。
【０１２１】
次いで、乾燥又は培養された全細胞を、使用のために適切な濃度に調節し、任意に適切なアジュバントと組み合わせ、包装する。適切なアジュバントには、限定されるものではないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、ビタミンＥ、スクアレン、スクアレン、サポニン類、例えばＱｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１、チョウセンニンジン、ザイモサン、グルカン類、非イオン性ブロックポリマー、モノホスホリルリピドＡ、植物油、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、油中水型、水中油型、水中油中水型のエマルジョン、Ｒｉｂｉアジュバントシステム（Ribi Inc.社）、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（組み換え又はその他）、コレラ毒素、ジメチルアミノエチルデキストラン、デキストラン類又はそれらの類似体若しくは混合物が含まれる。
【０１２２】
最後に、免疫原性産物は、ワクチン製剤で使用されるリポソーム中に組み込むことができ、又は多糖類若しくは他のポリマーにコンジュゲートさせることができる。
【０１２３】
本発明のワクチンは、典型的に、溶液、エマルジョン又は液体懸濁液の形で非経口ワクチンとして調製される。本発明のワクチンはまた、注射前に液体ビヒクル中に溶解又は懸濁するのに適した固体形で調製され得る。
【０１２４】
特に、ワクチンは、
（ａ）液体形で、又は、
（ｂ）凍結乾燥、フリーズドライ、噴霧乾燥若しくは泡沫乾燥された乾燥粉末形で、
存在する。
【０１２５】
本発明のワクチンの用量の典型的な容量は、０．１ｍｌから５ｍｌの間、特に０．１５ｍｌから３ｍｌの間、更に特に０．２ｍｌから２ｍｌの間である。
【０１２６】
通常、筋肉内投与のためには、０．５ｍｌから５ｍｌの間、特に１ｍｌから３ｍｌの間、更に特に１ｍｌから２ｍｌの間で使用される。
【０１２７】
本発明のワクチンの調製に使用され得る液体ビヒクルには、例えば、水（特に、注射用水）、生理的塩濃度の生理食塩液、又は細菌が培養される培養液が含まれる。
【０１２８】
本発明のワクチンは、種々の投与経路によって投与され得る。特定の経路には、限定されるものではないが、経口経路、経皮経路、経粘膜経路、皮内経路、皮下経路、筋肉内経路、腹腔内経路又は静脈内経路が含まれる。特に、本発明のワクチンは、筋肉内経路によって投与される。処置の所望の期間及び有効性に従って、本発明による組成物は、例えば数日間、数週間又は数ヶ月間にわたって毎日、種々の投与量で１回又は数回、また断続的に投与され得る。特に、本発明の免疫原性組成物は数回投与される。更に特に、ワクチン接種計画は２回の用量を含み、２回目の用量は１回目の用量の３週間後に投与される。上記ワクチンは、例えばRemington The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000 [ISBN: 0-683-306472]のマニュアルに記載されているように、種々の投与形に適した医薬製剤の調製のために当業者により使用される通常の方法に従って調製され得る。更に特に、ワクチンは、筋肉内経路により使用される。
【０１２９】
非経口投与のために、抗原を適切な担体と組み合わせることができる。例えば、抗原は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、ムラミルジペプチド、細菌性エンドトキシン、脂質、百日咳菌等のような様々なアジュバント又は免疫調節剤と一緒に又はそれらを伴わずに、水、生理食塩水又は緩衝化ビヒクル中で投与され得る。そのようなアジュバントは、様々な供給元から市販されており、例えばＭｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６（Merck and Company, Inc.社、ニュージャージー州ローウェイ）である。他の適切なアジュバントは、ＭＰＬ＋ＴＤＭエマルジョン（RIBBI Immunochem Research Inc.社、米国）である。他の免疫刺激剤には、インターロイキン１、インターロイキン２及びインターフェロン−γが含まれる。これらのタンパク質は、ワクチンと一緒に、又はワクシニアウイルス等の組み換えワクチン系で機能的オペロンとして提供されるそれらの対応する遺伝子配列と一緒に供給され得る。抗原とアジュバントとの割合は、両方が有効量で存在する限り、広範囲にわたって変動し得る。
【０１３０】
既に述べたように、トレポネーマ属の複数種のバクテリン、好ましくはトレポネーマ・ペディス又はトレポネーマ・ファゲデニスのバクテリンに加えて、ワクチンはまた、上述のようにトレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の抗原を含み得る。さらに、他の有蹄動物疾患についての抗原がワクチンに含まれていてもよい。例えば、ワクチンは、有蹄動物のフソバクテリウム・ネクロフォーラム抗原、ポルフィロモナス・レヴィ抗原及びディケロバクター・ノドーサス抗原（腐蹄病として一般的に知られる趾間壊死桿菌症を引き起こす生物）、レプトスピラ症細菌抗原、ウシ呼吸器合胞体ウイルス抗原、ウシヘルペスウイルス抗原、ウシ下痢ウイルス抗原、ウシパラインフルエンザウイルス抗原、水疱性口内炎ウイルス抗原、悪性カタル熱ウイルス抗原、ブルータングウイルス抗原、仮性狂犬病ウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、牛疫ウイルス抗原、グッゲンハイメラ抗原、ポルフィロモナス抗原、バクテロイデス抗原、プレボテラ抗原、ペプトストレプトコッカス抗原、カンピロバクター抗原、マイコプラズマ抗原、コリネバクテリウム／アクチノマイセス抗原、クリプトスポリジウム抗原、ロタウイルス抗原、コロナウイルス抗原及びクロストリジウム属の複数種の抗原を含み得る。
【０１３１】
さらに、ワクチンが少なくともトレポネーマ・ペディス又はトレポネーマ・ファゲデニスを含む場合に、該ワクチンは、免疫原的有効量のトレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ、トレポネーマ・ファゲデニス、トレポネーマ・ペディス、トレポネーマ・レフリンゲンス、トレポネーマ・カリギラム、トレポネーマ・マルトフィラム及びトレポネーマ・ブレナボレンス、好ましくは、トレポネーマ・メディウム、トレポネーマ・ヴィンセンティ、トレポネーマ・ペディス及びトレポネーマ・ファゲデニスからなる群より選択されるバクテリンを更に含み得る。実施例に示されるように、これらのバクテリンは、トレポネーマ・ペディスを含む本発明のワクチンの治療効果を改善した。
【０１３２】
さらに、本発明のワクチン組成物を、感染症に罹りやすい又はその他に感染のリスクにある牛、羊、馬又は山羊に投与することで、抗原に対する免疫応答が誘導され、したがって、患畜自身の免疫応答能力が増強されることに更に留意する。そのような量は、本明細書全体を通して既に述べられているように、「免疫原的有効量」であると規定される。この使用において、正確な量は、ワクチン製造業者及び処方する獣医師の判断に依存し、患畜の健康状態及び体重、投与方式、製剤の性質等の検討を含むこととなる。
【０１３３】
牛及び他の動物の免疫化において、様々なワクチン接種計画が有効であり得る。例えば、有蹄動物の幼体及び成体の両方に、好ましくは仔牛にワクチン接種することができる。１回目の免疫化の２週間後〜４週間後に、２回目の免疫化がなされる。予めトレポネーマに曝された動物は、ブースター注射を必要とし得る。ブースター注射は、好ましくは、最大負荷及び／又は流産のリスクの時期と一致するように時期が調整される。獣医師の判断に応じて、種々の免疫化計画が採用され得る。一般的に、１用量当たりを基準に、トレポネーマ属の複数種のバクテリン、典型的には全細胞の濃度は、１用量当たり約１０個〜約１０９個の細胞、又は１用量当たり１μｇ〜約１００ｍｇの抗原の範囲であり得る。牛に投与する場合に、好ましい範囲は、単位用量当たり約１０３個〜１０９個の細胞又は単位用量当たり１μｇ〜１ｍｇの抗原、好ましくは１０μｇ〜１ｍｇ、より好ましくは３０μｇ〜１ｍｇ、更により好ましくは５０μｇ〜１ｍｇの抗原である。適切な用量の容量範囲は、０．５ｍｌ〜２．０ｍｌ、好ましくは約２ｍｌである。したがって、例えば、筋肉内注射のために典型的な用量は、１０９個の細胞又は５０μｇの抗原を含む２ｍｌを含むこととなる。
【０１３４】
本発明のワクチンは、トレポネーマ属の複数種、好ましくはトレポネーマ・ペディス若しくはトレポネーマ・ファゲデニス又は本明細書全体を通して例示された任意のその他のトレポネーマ属の複数種の粗製抽出物を含み得る。化学的に固定された細胞を使用することもできる。上記のように、好ましいワクチンは、部分的に又は完全に精製されたトレポネーマのタンパク質調製物を含む。組み換えＤＮＡ技術により産生された抗原は、それが他の起源よりも経済的であり、容易に多量に精製されるため好ましい（標準的組み換え技術は、例えばJ. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A laboratory manual, 4thedition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2012のような当業者によく知られたマニュアルに記載されるように実施することができる）。組み換え発現系で使用する他に、単離されたトレポネーマ遺伝子配列を使用して、動物の宿主細胞にトランスフェクションするウイルスを形質転換することもできる。ワクシニア又はアデノウイルス等の弱毒化生ウイルスは、それらが廉価に産生され、輸送及び投与が容易であるため、ワクチンの簡便な代替物である。本発明の組み換え抗原を発現させるのに、細菌（例えば、大腸菌）又はピチア、サッカロマイセス等の酵母細胞のような他のタンパク質発現系も有用である。
【０１３５】
本発明での使用に適したウイルスには、限定されるものではないが、バキュロウイルス、カナリア痘ウイルス及び牛痘ウイルス等のポックスウイルス、及びワクシニアウイルス、アルファウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス並びに他の動物ウイルスが含まれる。組み換えウイルスは、当該技術分野でよく知られる方法によって、例えば、相同組み換え又は２つのプラスミドのライゲーションを使用して産生することができる。組み換えカナリア痘ウイルス又は牛痘ウイルスは、例えば、トレポネーマのタンパク質又はその断片をコードするＤＮＡをプラスミドへと、それらが両側でウイルス配列に隣接するように挿入することによって作製することができる。次いで、トレポネーマのポリペプチドをコードするＤＮＡが、ウイルスゲノム中に相同組み換えによって挿入される。
【０１３６】
本発明のワクチンは、哺乳動物、好ましくは有蹄動物における疾患の未然防止及び／又は処置の方法に、更に特に、被験体におけるトレポネーマ属のスピロヘータ細菌によって引き起こされる趾皮膚炎又は関連疾患を未然防止及び／又は処置するために使用される。したがって、本発明のワクチンは、それを必要とする被験体に、趾皮膚炎、特に牛趾皮膚炎、伝染性羊趾皮膚炎及び／又は腐蹄病、更に特に、牛趾皮膚炎を未然防止及び／又は処置する方法において免疫学的有効量で投与され得る。すなわち、上記規定の免疫原性組成物又はワクチンは、トレポネーマ属の複数種により引き起こされる趾皮膚炎又は関連疾患の処置及び／又は未然防止のための医薬の製造のためのものである。
【０１３７】
さらに、既に上述したように、本発明は、既に先に特定された抗原の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ又は３つから選択される、トレポネーマ属の複数種由来の又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の、好ましくはトレポネーマ・ペディス若しくはトレポネーマ・ファゲデニス由来の単離された抗原、好ましくは組み換え抗原を、趾皮膚炎用のワクチン組成物で使用される免疫原性タンパク質及び組成物の調製において提供する。そのような単離された抗原は、免疫原的有効量の、好ましくはＴ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス、Ｔ．ヴィンセンティ、Ｔ．メディウム、Ｔ．レフリンゲンス、Ｔ．カリギラム、Ｔ．マルトフィラム及び／又はＴ．ブレナボレンス、好ましくはＴ．ペディス又はＴ．ファゲデニスからなる群より選択されるトレポネーマ属の複数種のバクテリンを含むあらゆるワクチンの免疫学的効果を増強することに留意する。そのようなワクチンは、哺乳動物、好ましくは有蹄動物における疾患の処置方法に、更に特に、被験体におけるトレポネーマ属のスピロヘータ細菌によって引き起こされる趾皮膚炎又は関連疾患を未然防止及び／又は処置するために使用される。したがって、これらのワクチンは、それを必要とする被験体に、趾皮膚炎、特に牛趾皮膚炎を未然防止及び／又は処置する方法において免疫学的有効量で投与され得る。すなわち、これらの免疫原性組成物又はワクチンはまた、トレポネーマ属の複数種により引き起こされる趾皮膚炎又は関連疾患の処置及び／又は未然防止のための医薬の製造のためのものである。
【０１３８】
さらに、本発明は、本発明の医薬組成物又はワクチンを含む容器を含むことを特徴とするワクチン接種キットも提供する。
【０１３９】
別の態様では、本発明は、本発明の上記医薬組成物又は上記ワクチンの投与についての情報を含む情報マニュアル又はリーフレットを含むことを特徴とするワクチン接種キットを提供する。
【０１４０】
さらに、本発明はまた、生体試料中のトレポネーマ属の複数種又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の任意の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子の存在又は不存在を検出する方法を提供する。例えば、任意のトレポネーマ属の複数種又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の任意の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子と特異的に反応性の抗体は、トレポネーマ又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子由来の任意の他の抗原のいずれかを使用して検出することができる。そのような抗原又はタンパク質は、本発明全体を通して記載されている。そのようなタンパク質又は抗原及び分離株を使用することで、試料中の抗原を検出する特異的抗体（モノクローナル又はポリクローナルのいずれか）を産生することができる。これらのアッセイの各々は以下に記載される。
【０１４１】
免疫学的手法及びイムノアッセイ手順の概要については、一般にAntibodies: A Laboratory Manual (Greenfield E.A., 2nd ed. 2014)を参照のこと。本発明のイムノアッセイは、Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980)；Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (1985)において広範囲に概説される幾つかの構成のいずれかで実施することができる。例えば、本明細書に開示されるタンパク質及び抗体は、ＥＬＩＳＡ、イムノブロット分析及び凝集アッセイで簡便に使用される。簡潔には、抗トレポネーマ抗体又はＤ．ノドーサス若しくはＦ．ネクロフォーラム等の任意の他の趾皮膚炎の原因となる病理学的作用因子若しくは抗原に対する抗体を測定するイムノアッセイは、競合的結合アッセイ又は非競合的結合アッセイのいずれかであり得る。競合的結合アッセイでは、試料分析物（例えば、抗トレポネーマ抗体）は、固体表面に結合された捕捉剤（例えば、単離されたトレポネーマのタンパク質）上の特異的な結合部位について、標識された分析物（例えば、抗トレポネーマモノクローナル抗体）と競合する。捕捉剤に結合された標識された分析物の濃度は、試料中に存在する遊離の分析物の量と反比例している。
【０１４２】
非競合的アッセイは、典型的には、２つの分析物に特異的な結合試薬の間に試料分析物が結合されるサンドイッチ分析である。結合剤の１つは捕捉剤として使用され、固体表面に結合されている。二次結合剤は標識されており、得られた複合体を視覚的手段又は機器的手段により測定又は検出するために使用される。
【０１４３】
捕捉剤と標識された結合剤との多くの組み合わせを使用することができる。例えば、ＭＳＰ、ＰｒｔＰ、ＯｒｆＣ及びＴｌｙＣ又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、好ましくはトレポネーマ・ペディス由来の単離されたトレポネーマ抗原を、捕捉剤として使用することができ、ウシ抗体の定常領域に特異的な標識された抗ウシ抗体を、標識された結合剤として使用することができる。ウシ免疫グロブリン定常領域（例えば、γ又はμ）に特異的なヤギ抗体、ヒツジ抗体及び他の非ウシ抗体は、当該技術分野でよく知られている。あるいは抗ウシ抗体が捕捉剤であってもよく、抗原は標識されていてもよい。
【０１４４】
抗原、抗トレポネーマ抗体又は抗ウシ抗体を含むアッセイの様々な構成要素は、固体表面に結合され得る。生体分子を様々な固体表面に固定化するための多くの方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、固体表面は、膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイターディッシュ（例えば、ＰＶＣ又はポリスチレン）又はビーズであり得る。所望の構成要素は、共有結合される、又は非特異的結合によって非共有結合的に結合され得る。
【０１４５】
あるいはイムノアッセイは液相中で行うことができ、結合された標識された構成要素と結合されていない標識された構成要素とを分離するために、様々な分離方法を使用することができる。これらの方法は当業者に知られており、免疫沈降、カラムクロマトグラフィー、吸着、結合剤で被覆された磁化可能な粒子の添加及び他の同様の手順を含む。
【０１４６】
イムノアッセイは、分離手順なくして液相中で実施することもできる。タンパク質分析物のためのイムノアッセイに、目下、様々な均一イムノアッセイ法が適用されている。これらの方法では、分析物への結合剤の結合により、標識によって発せられるシグナルに変化が生じるため、結合された標識された構成要素と結合されていない標識された構成要素とを分離せずに結合を測定することができる。
【０１４７】
ウエスタンブロット（イムノブロット）分析を使用して、試料中のトレポネーマに対する抗体の存在を検出することもできる。この技術は、試料中の特定のタンパク質に対する抗体の存在を確認するための信頼性のある方法である。その技術は一般に、分子量に基づくゲル電気泳動によりタンパク質を分離することと、分離されたタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は誘導体化ナイロンフィルター）に転写することと、試料を分離されたタンパク質と一緒にインキュベートすることとを含む。これにより、試料中に存在する特異的な標的抗体がそれぞれのタンパク質に結合される。次いで、標識された抗ウシ抗体を使用して、標的抗体が検出される。
【０１４８】
上記のイムノアッセイの形式は、標識されたアッセイ構成要素を使用する。標識は、様々な形であり得る。標識は、当該技術分野でよく知られる方法に従って、アッセイの所望の構成要素に直接的又は間接的に結合され得る。広く様々な標識が使用され得る。構成要素は、幾つかの方法のいずれか１つにより標識され得る。従来は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐを含む放射性標識が使用された。非放射性標識には、標識された抗体に結合するリガンド、蛍光体、化学発光剤、酵素及び標識されたリガンドに対して特異的結合する相手の成員として機能し得る抗体が含まれる。標識の選択は、必要な感度、化合物とのコンジュゲートのし易さ、安定性の要件、及び利用可能な機器に依存する。
【０１４９】
標識として関心が持たれる酵素は、主にヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ又はオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光性化合物には、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン等が含まれる。化学発光性化合物には、ルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。使用され得る様々な標識又はシグナル生成系の概要については、米国特許第４，３９１，９０４号（これは、引用することにより本明細書の一部をなす）を参照のこと。
【０１５０】
非放射性標識は、しばしば間接的手段により結合される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次いで、リガンドは、もとより検出可能であるか、又は検出可能な酵素、蛍光性化合物若しくは化学発光性化合物等のシグナル系に共有結合される抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。多くのリガンド及び抗リガンドを使用することができる。リガンドが天然の抗リガンド、例えばビオチン、チロキシン及びコルチゾールを有する場合に、リガンドは、標識された天然に存在する抗リガンドと併せて使用することができる。あるいは任意のハプテン性化合物又は抗原性化合物を、抗体と組み合わせて使用することができる。
【０１５１】
幾つかのアッセイ形式は、標識された構成要素の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイを使用して、標的抗体の存在を検出することができる。この場合に、抗原で被覆された粒子が、標的抗体を含む試料によって凝集される。この形式では、どの構成要素も標識されている必要はなく、標的抗体の存在は簡単な視覚的検査によって検出される。
【０１５２】
最後に、本発明は、HIPRA SCIENTIFIC S.L.U.社（スペイン、ジローナ県アメール、セルバ通り，１３５）によりライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）（ドイツ、ブラウンシュバイク、インホッフェン通り７  Ｂ  ３８１２４）においてアクセッション番号ＤＳＭ  ３２６６３として２０１７年１０月１０日に寄託されたＴ．ペディス株、又はHIPRA SCIENTIFIC S.L.U.社（スペイン、ジローナ県アメール、セルバ通り，１３５）によりライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）においてアクセッション番号ＤＳＭ  ３２９５０として２０１８年１１月７日にブタペスト条約に基づき寄託されたＴ．ファゲデニス株に関する。本発明の医薬組成物及びワクチンはまた、寄託された両方の株及び哺乳動物における趾皮膚炎の処置又は未然防止の方法におけるそれらの使用を包含し、ここで、趾皮膚炎は、好ましくは牛趾皮膚炎、伝染性羊趾皮膚炎及び／又は腐蹄病である。
【０１５３】
本発明を、以下の実施例に照らして更に示すが、実施例は本発明を例示するにすぎず、本発明を限定するものではない。さらに、本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態及び好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを対象に含める。
【実施例】
【０１５４】
実施例１：仔牛におけるＢＤＤに対する実験的ワクチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性及びｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
この研究のために、Ｔ．ペディス及びＴ．ファゲデニスに対する抗体を持たずＢＤＤの臨床徴候を有しない２ヶ月齢から４ヶ月齢の間の３５頭の仔牛を選択した。これらの動物を、各群に５頭の仔牛の７群（Ａ〜Ｇ）に無作為に割り当てた。０日目に、群の割り当てに従って、仔牛に実験的ワクチンの１回目の用量を投与した。３週間後（２１日目）に、仔牛にワクチンの２回目の用量を投与した。ワクチンは、各投与につき２ｍＬで皮下経路により頸部に投与した。
【０１５５】
４８日目に、自然発生したＢＤＤ病変から得られた浸軟された培養物を仔牛に負荷した。負荷接種物は、異なる牛からのＢＤＤの活動的病変の２３個の試料を均質化することにより得られた。浸軟された培養物は、Ｔ．ファゲデニス、Ｔ．メディウム／Ｔ．ヴィンセンティ及びＴ．ペディスからなっていた（ＢＤＤ病変試料の９２％がＴ．ファゲデニスに陽性、８５％がＴ．メディウム／Ｔ．ヴィンセンティ様に陽性、１３％がＴ．ペディスに陽性）。さらに、ＢＤＤ病変試料の５６％及び６５％は、それぞれＤ．ノドーサス及びＴ．プラエアクタ（T. praeacuta）に陽性であった。
【０１５６】
群Ａには、１用量当たり１０９個の細菌の不活化されたＴ．ペディス分離株（参照番号Ｂ−８３０８、HIPRA SCIENTIFIC, S.L.U.社）及び１用量当たり７０μｇのそれぞれ精製されたＴ．ペディスの組み換えタンパク質ＭＳＰ（配列番号４）、ＰｒｔＰＭ（配列番号２）及びＯｒｆＣ（配列番号５）並びにＤ．ノドーサスのＡｐｒ２ＢＭ（配列番号１０）を含むワクチンＡを投与した。該ワクチンは、アジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを用いて５０％（重量／重量）で製剤化した。鉱物油と、脂肪酸及び糖アルコールから得られる生成物との組み合わせ物を基礎とするアジュバント、例えばSEPPIC社により商品名Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）として市販されるアジュバント。上記アジュバントを用いて、水中油中水型のエマルジョンを調製することができる。
【０１５７】
群Ｂには、１用量当たり７０μｇのそれぞれ精製されたＴ．ペディスの組み換えタンパク質ＭＳＰ（配列番号４）、ＰｒｔＰＭ（配列番号２）及びＯｒｆＣ（配列番号５）並びにＤ．ノドーサスのＡｐｒ２ＢＭ（配列番号１０）を含むワクチンＢを投与した。該ワクチンは、同じアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを用いて５０％（重量／重量）で製剤化した。
【０１５８】
群Ｃには、１用量当たり１０９個の細菌の群Ａの同じ不活化されたＴ．ペディス分離株を含むワクチンＣを投与した。該ワクチンは、同じアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを用いて５０％（重量／重量）で製剤化した。
【０１５９】
群Ｄは、抗原を有しないＰＢＳ及び５０％（容量／容量）の同じＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａアジュバントを含むワクチンＤを投与したコントロール群に相当した。
【０１６０】
群Ｅには、１用量当たり１０９個の細菌の群Ａと同じ不活化されたＴ．ペディス分離株及び１用量当たり７０μｇのそれぞれ精製されたＴ．ペディスの組み換えタンパク質ＭＳＰ（配列番号４）、ＰｒｔＰＭ（配列番号２）及びＯｒｆＣ（配列番号５）並びにＤ．ノドーサスのＡｐｒ２ＢＭ（配列番号１０）を含むワクチンＥを投与した。該ワクチンは、ＡｌＯＨ３／ＡｌＰＯ４を基礎とする２５％（容量／容量）のアジュバントＢ及び２％（重量／容量）のＤＥＡＥデキストランを用いて製剤化した。
【０１６１】
群Ｆには、１用量当たり７０μｇのそれぞれ精製されたＴ．ペディスの組み換えタンパク質ＭＳＰ（配列番号４）、ＰｒｔＰＭ（配列番号２）及びＯｒｆＣ（配列番号５）並びにＤ．ノドーサスのＡｐｒ２ＢＭ（配列番号１０）を含むワクチンＦを投与した。該ワクチンは、ＡｌＯＨ３／ＡｌＰＯ４を基礎とする２５％（容量／容量）のアジュバントＢ及び２％（重量／容量）のＤＥＡＥデキストランを用いて製剤化した。
【０１６２】
群Ｇには、１用量当たり１０９個の細胞の群Ａ、群Ｃ及び群Ｅと同じ不活化されたＴ．ペディス分離株を含むワクチンＧを投与した。該ワクチンは、ＡｌＯＨ３／ＡｌＰＯ４を基礎とする２５％（容量／容量）のアジュバントＢ及び２％（重量／容量）のＤＥＡＥデキストランを用いて製剤化した。
【０１６３】
種々の群及びワクチンの概要を以下の表に示す。
【０１６４】
【表１】
2021503509.tif 000002
【０１６５】
０日目、２１日目、３５日目、４７日目、５９日目、８０日目、９７日目に全ての仔牛から血液試料を採集して、血清を得た。
【０１６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果
実験的ワクチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性を、ワクチン接種された動物からの血清の中和効果を４７日目にＴ．ペディスの増殖において分析し、Ｔ．ペディスに対する間接ＥＬＩＳＡにより動物の血清中の抗体の存在を検出することにより行った（図１）。
【０１６７】
血清の阻害効果は、組み換えタンパク質を有する及び有しないＴ．ペディスのバクテリンを含む実験的ワクチン（ワクチンＡ、ワクチンＣ、ワクチンＥ及びワクチンＧ）に対応した。アジュバントＡ及びアジュバントＢの両方を使用した場合に、同様の結果が得られた。
【０１６８】
ワクチン接種後の血清学を、ワクチン接種後の種々の日での全細菌Ｔ．ペディス及びＴ．ファゲデニスに対するＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ２）により分析することで（図２及び図３）、抗体の体液性応答を評価した。
【０１６９】
単独で投与した場合（ワクチンＢ）及びコントロール群（ワクチンＤ）における組み換えタンパク質の免疫学的応答は観察されなかった。混合ワクチン（バクテリン＋組み換えタンパク質；ワクチンＡ）を動物に投与した場合に、より良い免疫学的応答が観察された。単独で投与されたバクテリンを基礎とするワクチン（ワクチンＣ）と比較した場合に、混合ワクチンに対する免疫学的応答もより良好であった。
【０１７０】
アジュバントＡ及びアジュバントＢの両方で、同様の応答があった。
【０１７１】
Ｔ．ファゲデニスについて、Ｔ．ペディスよりも低い免疫学的応答が観察された。ワクチン製剤はＴ．ファゲデニス抗原を含まなかったので、交差反応性が想定された。
【０１７２】
注射後のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の結果
実験的ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を評価するために、群Ａ、群Ｃ及び群Ｄへのワクチン接種後４８日目に負荷を行った。組み換えタンパク質を単独でのみ含む実験的ワクチンを投与した群Ｂについてｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性が観察されなかったので、この群は負荷しないままにした。
【０１７３】
実験的ワクチンの感染後の有効性を評価するために、臨床的な肉眼的病変の重症度の評価を行った。評価は感染後３２日目に行った。種々の方法を使用した。これらの方法は、疾患の事前に確立されたパラメーターを評価することにより、各動物にスコアを割り当てることに基づくものであった。２つの異なるスコアを使用した：アイオワスコア（Krull, A. C., Cooper, V. L., Coatney, J. W., Shearer, J. K., Gorden, P. J., & Plummer, P. J. A highly effective protocol for the rapid and consistent induction of digital dermatitis in Holstein calves. PloS one, 2016, 11.4: e0154481）及びウィスコンシンスコア（Gomez, A., Cook, N. B., Bernardoni, N. D., Rieman, J., Dusick, A. F., Hartshorn, R., Socha M.T., Read D.H., Doepfer D. An experimental infection model to induce digital dermatitis infection in cattle. Journal of dairy science, 2012, 95.4: 1821-1830）。表２は、アイオワスコアをどのように得るかを示す（図４も同様に参照のこと）。
【０１７４】
【表２】
2021503509.tif 000003
【０１７５】
群Ａ及び群Ｃでは、１／５及び２／５の仔牛はそれぞれ臨床的病変を生じなかったが、群Ｄ（コントロール）の５／５の動物が病変を生じた。さらに、病変の重症度を評価すると、両方のスコア（アイオワ及びウィスコンシン）に関して、群Ａ及び群Ｃは、コントロール群（Ｄ）に対して、より低い病変スコア及び牛趾皮膚炎病変を伴う仔牛のパーセンテージを示した。ワクチンＡ（バクテリン＋組み換えタンパク質）でワクチン接種した群では、ＤＤの病変（アイオワスコア≧７）を示す動物のパーセンテージも大幅に減少した（図５）。
【０１７６】
実施例１の結論
Ｔ．ペディスのバクテリン又はバクテリンと組み換えタンパク質との組み合わせでワクチン接種された仔牛の血清におけるＴ．ペディスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に対する明らかな阻害効果が観察された。この効果は、組み換えタンパク質単独でワクチン接種された動物由来の血清では見られなかった。
【０１７７】
Ｔ．ペディスのバクテリンのワクチンを組み換えタンパク質と組み合わせた場合に、Ｔ．ペディスに対するより高い体液性応答が観察された。
【０１７８】
Ｔ．ファゲデニス、Ｔ．メディウム−ヴィンセンティ様、及びＴ．ペディスを含む接種物による実験的感染の後に、Ｔ．ペディス単独を有するワクチン又はＴ．ペディスと組み換えタンパク質とを組み合わせて有するワクチンは、コントロール群と比較して、ＤＤ病変の罹患率及び重症度を低下させることが観察された。混合ワクチン（バクテリン＋組み換えタンパク質）でワクチン接種された群が、より低いパーセンテージのＤＤ病変を伴う動物を示すことも観察された。
【０１７９】
実施例２：仔牛におけるＢＤＤの実験的感染に対する実験的ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の評価
この研究のために、Ｔ．ペディス及びＴ．ファゲデニスに対する抗体を持たずＢＤＤの臨床徴候を有しない２ヶ月齢から３ヶ月齢の間の３０頭の仔牛を選択した。これらの動物を、各群に１０頭の仔牛の３群（群Ａ〜群Ｃ）に無作為に割り当てた。０日目に、群の割り当てに従って、仔牛にワクチンの１回の用量を投与した。３週間後（２１日目）に、仔牛にワクチンの２回目の用量を投与した。ワクチンは、各投与につき２ｍＬで筋肉内経路により頸部に投与した。
【０１８０】
４９日目に、実施例１と同様に、自然発生したＢＤＤ病変から得られた浸軟された培養物を仔牛に負荷した。浸軟物は、１０頭の種々の牛からのＢＤＤの活動的病変の１３個の試料の均質化物からなっていた。この場合に、試料の１００％はＴ．ファゲデニス及びＴ．メディウム／Ｔ．ヴィンセンティ様に陽性であり、６９％はＴ．ペディスに陽性であった。したがって、浸軟物は、Ｔ．ファゲデニス、Ｔ．メディウム／ヴィンセンティ様及びＴ．ペディスからなっていた。さらに、ＢＤＤ試料の２３％はまた、Ｄ．ノドーサスに陽性であった。
【０１８１】
群Ａには、不活化されたＴ．ペディス（実施例１で使用されたのと同じ分離株）、不活化されたＴ．ファゲデニス（分離株の参照番号Ｂ−７３３０、HIPRA SCIENTIFIC, S.L.U.社）、不活化されたＴ．メディウム（分離株の参照番号Ｂ−８３０７、HIPRA SCIENTIFIC, S.L.U.社）と組み合わせて、Ｔ．ペディスの組み換えタンパク質ＭＳＰ（配列番号４）、ＰｒｔＰＭ（配列番号２）及びＴｌｙＣ（配列番号３）並びにＤ．ノドーサス由来のＡｐｒ２ＢＭ（配列番号１０）を含むワクチン１を投与した。ワクチン１は、実施例１に記載されるアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを５０％（重量／重量）で含んでいた。力価は、２ｍｌの用量当たり１０９個の総細菌及び２ｍｌの用量当たり５０μｇの各組み換えタンパク質であった。
【０１８２】
群Ｂには、不活化されたＴ．ペディス分離株、不活化されたＴ．ファゲデニス分離株、及び不活化されたＴ．メディウム分離株（群Ａと同じ分離株）を含むワクチン２を投与した。このワクチンは、組み換えタンパク質を含まなかった。該ワクチンは、実施例１に記載されるアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを５０％（重量／重量）で含んでいた。力価は、２ｍｌの用量当たり１０９個の総細菌であった。
【０１８３】
群Ｃは、実施例１に記載されるアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを５０％（重量／重量）で用いて製剤化された抗原を有しないＰＢＳ溶液からなるワクチン３を投与したコントロール群に相当した。
【０１８４】
【表３】
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【０１８５】
０日目、２１日目、３５日目、４６日目、５７日目、６４日目、７０日目、８１日目及び９５日目に、全ての動物から血液を採取することで、血清を得た。
【０１８６】
ワクチン接種後に得られた血清からのトレポネーマ属の複数種の増殖阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
阻害アッセイは、ワクチン接種された動物からワクチン接種後３５日目に得られた血清を使用して実施した。増殖阻害アッセイは、Ｔ．ペディス及びＴ．ファゲデニスについて実施した。このアッセイにより、ワクチン接種された群Ａ及び群Ｂに属する仔牛だけが両方の細菌の増殖を阻害することが裏付けられた。コントロール群に属する血清からは、増殖阻害に対する効果は観察されなかった（図６）。
【０１８７】
ワクチン接種後の血清学的結果
ワクチン接種による体液性応答を評価するために、種々のＥＬＩＳＡアッセイを実施した。ワクチン接種後０日目、２１日目及び３５日目からの血清を用いてＥＬＩＳＡアッセイを実施することで、Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス、Ｔ．メディウム、Ｄ．ノドーサスに対する抗体、及びＴ．ペディス由来の組み換えタンパク質ＭＳＰ、ＰｒｔＰＭ、ＴｌｙＣ及びＤ．ノドーサス由来のＡｐｒ２ＢＭに対する抗体を検出した。種々の動物から得られた血清を１／４００に希釈して、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
【０１８８】
この研究で存在する全ての抗原に対するＩｇＧ２抗体の良好な血清変換が観察された（図７）。ワクチン接種群とコントロール群との間の血清変換について有意差が示された。トレポネーマ属の複数種のバクテリンと組み換えタンパク質との組み合わせ（ワクチン１）でワクチン接種された動物では、ワクチン２（バクテリンを基礎とするワクチン）と比較して、より高いＴ．ペディス及びＴ．メディウムに対する体液性応答が得られた。
【０１８９】
感染後のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の結果
感染後３２日目（研究の８１日目）のＢＤＤ病変の最終評価を実施した。その評価は、実施例１で説明されたアイオワスコアを使用して実行した。
【０１９０】
【表４】
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【０１９１】
病変重症度のスコアに関して、群Ａ（ワクチン１）及び群Ｂ（ワクチン２）では、重症度はより低く、更には群Ａ及び群Ｂの１／１０及び３／１０はそれぞれ病変の徴候を現さなかったが、コントロール群の全ての動物は趾病変を生じた。
【０１９２】
アイオワスコアに関して、最低７のスコアに至った仔牛のパーセンテージ（アイオワスコアは、少なくとも７のスコアを確立することで、ＢＤＤ病変とみなされる）は、群Ａ（ワクチン１）、群Ｂ（ワクチン２）及び群Ｃ（ワクチン３）についてそれぞれ４０％、６０％及び８０％であった。群Ａと群Ｃ（ワクチン３、プラセボ）との間に有意差が観察された（マン・ホイットニーの検定を使用してｐ値＝０．０４）。
【０１９３】
要約すると、両方のワクチン接種された群では、コントロール群に対して病変の罹患率及び重症度が減少することが観察された。さらに、コントロール群に対する差は有意であったため、群Ａ（バクテリンと組み換えタンパク質との組み合わせを含むワクチン）でより高い防御が観察された（図８）。
【０１９４】
概要
ワクチン接種された動物の血清において、Ｔ．ペディス及びＴ．ファゲデニスの明らかなｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖阻害効果が観察された。したがって、これらのトレポネーマ属の複数種に対して産生された抗体は、明らかな阻害効果を示した。
【０１９５】
３種のトレポネーマ属の複数種、すなわちＴ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス及びＴ．メディウムに対して、ワクチン接種後の高い体液性応答が観察された。コントロール群に対する有意差も観察された。
【０１９６】
トレポネーマ属の複数種のバクテリンと組み換えタンパク質とを組み合わせたワクチンの場合に、Ｔ．ペディスに対してより高い体液性応答が観察された。
【０１９７】
感染後３２日目の病変の重症度の評価により、コントロール群の全ての動物が趾の病変を生ずるが、ワクチン接種された幾つかの動物は病変を一切示さないことが裏付けられた。さらに、ワクチン接種により病変の重症度が軽減された。
【０１９８】
感染後３２日目の最終評価において、ＢＤＤ病変（アイオワスコアによる７以上のグレード）を伴う動物の割合及び最終病変スコアの両方は、ワクチン接種された群１（バクテリンと組み換えタンパク質との組み合わせ）とコントロール群との間に統計学的有意性を示した。
【０１９９】
実施例３：種々のＴ．ペディス株間での免疫応答の同等性の実証
この研究では、少なくとも３週齢の６匹のニュージーランドウサギを、２つの異なるトレポネーマ・ペディス株からのバクテリンに基づく２つの異なる製剤で各製剤につき３匹の動物で免疫した。群１は、実施例１及び実施例２に開示されるのと同じＴ．ペディス株でワクチン接種し、群２は、HIPRA SCIENTIFIC S.L.U.社（スペイン、ジローナ県アメール、セルバ通り，１３５）によりライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）においてアクセッション番号ＤＳＭ  ３２６６３（２０１７年１０月１０日）として寄託されたＴ．ペディス株でワクチン接種した。
【０２００】
ワクチン組成物は、フロイントアジュバントを用いて製剤化し、両方とも１用量当たり１０９個の細菌を含んでいた。動物に２回の１ｍｌの用量を皮下投与した。１回目の用量は、研究の０日目にＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）においてアジュバント添加され、２回目の用量は、２週間後に研究の１４日目にＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント）においてアジュバント添加された。倫理上の理由から１ｍｌの容量を頸部にそれぞれ０．５ｍｌの２つの箇所に分けて投与した。
【０２０１】
研究の０日目、１４日目及び３５日目に血液試料を収集した。次いで、この研究中に実施された採血から、血清学的応答をＥＬＩＳＡ／ウエスタンブロットにより分析した。
【０２０２】
それらの結果により、両方の群について同種のトレポネーマ種に対して血清変換が示された。両方のワクチンについてワクチン接種後０日目と比較すると、ワクチン接種後１４日目及び３５日目の血清変換は有意であった。１回の用量又は２回の用量のどちらでも、両方の群について応答は同等であった（図９）。
【０２０３】
Ｔ．ファゲデニス及びＴ．メディウム等の異種のトレポネーマ種に対する血清学的応答も分析した。両方の群について同等の応答が見られた。Ｔ．ファゲデニス及びＴ．メディウムの両方について血清変換が観察されたことから、Ｔ．ペディス株の交差防御が裏付けられた。
【０２０４】
それらの結果から、異なる株が同等の血清学的応答を有したので、Ｔ．ペディスのバクテリンを含むワクチンの防御は特定の株に依存しないと結論づけることができる。さらに、Ｔ．ファゲデニス及びＴ．メディウム等の異種のトレポネーマ属の複数種に対して、Ｔ．ペディス株の交差防御が見られた。
【０２０５】
実施例４：ＢＤＤに対する実験的Ｔ．ファゲデニスのワクチンの免疫原性
この研究のために、Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス及びＴ．メディウムに対する抗体を低いレベルで持つ又は該抗体を持たずＢＤＤの臨床徴候を有しない２ヶ月齢から３ヶ月齢の間の２０頭の仔牛を選択した。これらの動物を、各群に１０頭の仔牛の２つの処置群（群１及び群２）に無作為に割り当てた。
【０２０６】
群１には、実施例１に記載されるアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを５０％（重量／重量）で用いて製剤化された抗原を有しないＰＢＳ滅菌溶液を含むワクチンを投与した。この群は、コントロール群に相当した。
【０２０７】
群２には、１用量当たり１０９個の総細菌の不活化されたＴ．ファゲデニス分離株（参照番号Ｂ−７３３０、HIPRA SCIENTIFIC, S.L.U.社）を含むＴ．ファゲデニスのバクテリンを基礎とするワクチンを投与した。群２のワクチンは、実施例１に記載されるアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを用いて５０％（重量／重量）で製剤化した。
【０２０８】
ワクチンを、各投与につき２ｍＬで筋肉内経路により頸部領域に投与した。両方の群に、０日目に１回目の用量のワクチンを投与した。３週間後（２１日目）に、仔牛に反対側の頸部に２回目の用量のワクチンを投与した。
【０２０９】
実験的ワクチンの免疫原性を、ワクチン接種された動物からの血清をワクチン接種後０日目、２１日目、３５日目、４８日目及び６９日目に間接ＥＬＩＳＡアッセイにより分析し、動物の血清中の抗体の存在を検出した。
【０２１０】
ワクチン接種後の血清学を、全細菌のＴ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス及びＴ．メディウムに対するＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ２）により分析することで、そのトレポネーマ属の複数種に対する抗体の体液性応答を評価した。
【０２１１】
試験された種々のトレポネーマ属の複数種（Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス及びＴ．メディウム）に対する免疫学的応答が、群２の動物の血清から明らかに観察された。群２のワクチン製剤はＴ．ペディス又はＴ．メディウムのバクテリンを含まなかったため、ワクチン接種された動物に観察された免疫学的応答は、トレポネーマ属の複数種間の交差反応に起因し得る（図１０）。
【０２１２】
さらに、Ｔ．ファゲデニスのバクテリンでワクチン接種された仔牛の血清（群２）に関してＴ．ファゲデニスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に対する明らかな阻害効果が観察された。この阻害効果は、コントロール群には観察されなかった。
【０２１３】
また、これらの結果は、ワクチン接種された動物に観察された免疫学的応答が、交差反応の原因となる幾つかのエピトープを共有するトレポネーマ種間の交差反応性に起因し得ることを示唆している。
【０２１４】
実施例５：ＢＤＤに対する実験的ワクチンの免疫原性
この研究のために、Ｔ．ペディス、Ｔ．ファゲデニス及びＴ．メディウムに対する抗体を低いレベルで持つ又は該抗体を持たずＢＤＤの臨床徴候を有しない２ヶ月齢から３ヶ月齢の間の３０頭の仔牛を選択した。これらの動物を、各群に１０頭の仔牛の３つの処置群（群１、群２及び群３）に無作為に割り当てた。
【０２１５】
群１には、実施例１に記載されるアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを５０％（重量／重量）で用いて製剤化された抗原を有しないＰＢＳ滅菌溶液を含むワクチンを投与した。この群は、コントロール群に相当した。
【０２１６】
群２には、１用量当たり１０９個の総細菌の不活化されたＴ．ファゲデニス分離株（参照番号Ｂ−７３３０、HIPRA SCIENTIFIC, S.L.U.社）と組み合わせて、以下の組み換えタンパク質：Ｔ．ファゲデニスのＭＳＰタンパク質（配列番号１５）、Ｔ．ペディスのＰｒｔＰＭタンパク質（配列番号２）及びＤ．ノドーサスのＡｐｒ２ＢＭタンパク質（配列番号１０）を１用量当たり５０μｇの各組み換えタンパク質で含むＴ．ファゲデニスのバクテリンを基礎とするワクチンを投与した。そのワクチンは、実施例１に記載されるアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを５０％（重量／重量）で用いて製剤化された。
【０２１７】
群３には、１用量当たり１０９個の総細菌の不活化されたＴ．ファゲデニス分離株（参照番号Ｂ−７３３０、HIPRA SCIENTIFIC, S.L.U.社）を含む、Ｔ．ファゲデニスのバクテリンを基礎とするワクチンを投与した。このワクチンは、実施例１に記載されるアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  Ａを用いて５０％（重量／重量）で製剤化した。
【０２１８】
【表５】
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【０２１９】
全ての群における仔牛に、０日目に１回目の用量のワクチンを頸部領域で投与した。３週間後（２１日目）に、仔牛に反対側の頸部に２回目の用量のワクチンを投与した。ワクチンは、各投与につき２ｍｌで筋肉内経路により頸部領域に投与した。
【０２２０】
実験的ワクチンの免疫原性を、ワクチン接種された動物からの血清をワクチン接種後０日目、２１日目、３５日目、４８日目及び６９日目に間接ＥＬＩＳＡアッセイにより分析し、動物の血清中の抗体の存在を検出した。
【０２２１】
ワクチン接種後の血清学を、Ｔ．ペディスのＰｒｔＰＭタンパク質、Ｄ．ノドーサスのＡｐｒ２タンパク質及びＴ．ファゲデニスのＭＳＰタンパク質に対するＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ２）により分析することで（図１１）、該タンパク質に対するワクチンにより授けられる抗体の体液性応答を評価した。
【０２２２】
ワクチン接種された群２の動物の血清におけるワクチン組成物中に存在する全ての抗原に対する免疫学的応答が明らかに観察された。さらに、バクテリンに組み換えタンパク質を補充した場合（群２）にＴ．ファゲデニスのＭＳＰタンパク質に対する免疫学的応答が増加した。けれども、群３（バクテリン単独）も同様に明らかな免疫学的応答を生じた。
【０２２３】
それに対して、コントロール群（群１）は、試験された抗原のいずれに対しても免疫学的応答を生じなかった。
【０２２４】
さらに、群２（バクテリン＋組み換えタンパク質）及び群３（バクテリン単独）のワクチン接種された仔牛の血清において、Ｔ．ファゲデニスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に対する明らかな阻害効果が観察された。これらの結果は、群２及び群３のワクチン接種された動物における中和抗体の存在を裏付けている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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