(57)【要約】  本発明は、疾患に対する免疫系エンハンサー、サイレンサーおよびモジュレーターとしての免疫系に対する植物エクソソームの効果の使用に関する。本発明の範囲において、免疫調節効果を有する植物エクソソームは、主に自己免疫疾患において、および細胞、組織、臓器移植において、および移植片対宿主病において、免疫系エンハンサー、サプレッサーとして、または必要に応じて、最初の2つの機能の両方を行うモジュレーターとして使用される。
2021536257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系細胞を活性化、抑制および調節することによって疾患の予防および治療を可能にする植物由来のエクソソーム。
【請求項２】
植物全体、果実、葉、種子、根、または植物の培養培地、幹細胞、廃棄物、殻または師部などの分化した組織からなる群から選択される植物の少なくとも一部から得られる、請求項１に記載の植物由来のエクソソーム。
【請求項３】
類似の植物から得られるエクソソームよりも最大5倍高い濃度でエクソソームを生成すること、および生成されたエクソソームの含有量および特性を長期間維持することによって、農場、収穫、輸送などの影響を受けることが防止されるように、植物エクソソームが得られる供給源が、植物組織培養である、請求項２に記載の植物由来のエクソソーム。
【請求項４】
植物組織培養物中の細胞が免疫系を増強、抑制または調節するタンパク質を産生するためにトランスフェクトされる、請求項３に記載の植物由来のエクソソーム。
【請求項５】
液体二相系による単離、段階的遠心分離、限外濾過、クロマトグラフィー法、ポリマーベースの単離およびマイクロビーズによる単離からなる群から選択される単離方法によって単離される、請求項１に記載の植物由来のエクソソーム。
【請求項６】
主に自己免疫疾患において、および細胞、組織、臓器移植において、移植片対宿主病、ならびに関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、硬化症、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アレルギー性喘息、ウェゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、クローン病、乾癬、バセドウ病、セリアック病、円形脱毛症(alopecia areata)(円形脱毛症(pelade))、中枢神経系血管炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、ギランバレー症候群、結節性多発動脈炎、特発性血小板減少性紫斑病、側頭動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、アジソン病、強直性脊椎炎、ライター症候群、高安動脈炎、および白斑などの免疫系が影響を受ける疾患において、免疫系エンハンサー、サプレッサー、または必要に応じてモジュレーターとして使用される、請求項１に記載の植物由来のエクソソーム。
【請求項７】
免疫系媒介性疾患を治療するために患者に有効量の選択された植物エクソソームを投与するために、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮内、局所、腹腔内で、および注射によって投与される、請求項１に記載の植物由来のエクソソーム。
【請求項８】
免疫調節薬を運ぶめに使用される、請求項１に記載の植物由来のエクソソーム。
【請求項９】
ワクチン接種用のアジュバントとして使用される、請求項１に記載の植物由来のエクソソーム。
【請求項１０】
免疫系を調節する目的で栄養補助食品として使用される、請求項１に記載の植物由来のエクソソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患に対する免疫系エンハンサー、サイレンサーおよびモジュレーターとしての免疫系に対する植物エクソソームの効果の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞は、細胞内の物質の輸送および貯蔵に関与し、細胞質液から少なくとも1つの脂質二重層によって分離されている小さな嚢である。エクソソームは、原核生物から高真核生物や植物に至るまで多くの生物から放出される小胞であり、さまざまなサイズの脂質二重層小胞を含んでいる[1]。これらの小胞の重要性は、細胞機能に影響を与えるために他の細胞に情報を伝達する能力の下にある。エクソソームを介した信号伝達は、タンパク質、脂質、核酸および糖からなる多くの異なるカテゴリーの生体分子によって実行される[2]。
【０００３】
細胞外小胞と細胞との機能的相互作用は、精液血漿から単離された小胞が精子の運動性を増加させることを実験的に決定した1982年に最初に発見された[3]。この時点から、小胞の分子メカニズムに関連する開発と暗闇に残された問題を明らかにすることについて、今日まで多くの異なる組織で研究が行われてきた。
【０００４】
免疫システムは体の防御機構であり、感染症や病気から体を保護する。免疫システムは、ウイルス、細菌、真菌、原生動物および寄生虫など、微生物として定義される多くの微生物とそれらの有害な影響から人間を保護する。免疫システムの主な任務は、これらの有機体が体内に侵入するのを防ぎ、侵入した有機体を破壊し、それらの拡散を防止または遅延させることである。免疫系の主な要素は白血球である。白血球(white blood cells)または白血球(corpusclesまたはleukocytes)とも呼ばれる白血球は、骨髄、リンパ節、脾臓および胸腺で産生される。直径20ミクロンの白血球は、感染症や異物から体を守ることによって免疫系の重要な部分を構成している。白血球は2つのグループに分けられる。多核細胞は顆粒球と定義され、単核細胞はリンパ球および単球と定義される。白血球にはそれぞれ独自の防御機構がある。好中球は病気の原因となる細胞を破壊し、単球は死んだ組織から残っている細胞を破壊し、好酸球は有毒物質、アレルギーを引き起こす細胞および寄生虫を破壊し、リンパ球は体の完全な免疫系を形成し、それを保護する。100万個の細胞を含む健康な成人の血液には、4×103〜11×103個の白血球があり、言い換えれば、1滴の血液には約4,000〜11,000個の白血球が含まれている。
【０００５】
T細胞は、細胞の異常や感染を制御し、免疫系の保護に重要な役割を果たす白血球の一種である。体内の少数のT細胞の破壊的影響は、HIV/AIDSなどの疾患において非常に重要である。いくつかの異なるT細胞がある。一般的に、それらは2つの異なるタイプに分けることができる。まず、「CD8表面マーカー陽性キラーT細胞」は、感染細胞または癌細胞を追跡し、破壊する。第二に、「CD4表面マーカー陽性ヘルパーT細胞」は免疫系の応答を調節し、免疫系のすべての部分において重要な役割を果たす。
【０００６】
T細胞の機能を明らかにするために、私たちの身体において、それらは、
・外来侵入者について細胞内環境をチェックし、
・ウイルス感染細胞や細菌感染細胞を直接殺すコマンドを実行し、
・がん細胞を破壊するために戦い、
・病原体を中和するための体内で生成される抗体と呼ばれる構造の活性化を補佐し、そして、
・何年も前に体内で遭遇した微生物を思い出し、それに応じて予防策を講じる。
【０００７】
T細胞はまた、移植された臓器の拒絶反応、糖尿病や多発性硬化症などの免疫系疾患、およびグルテン不耐性などのアレルギー反応などの免疫系反応の原因となる。低いＴ細胞数は、高いＴ細胞数よりも一般的である。T細胞数が少ない場合は、通常、免疫系またはリンパ節に問題があることを示す。T細胞数の低下は、インフルエンザなどのウイルス誘発性感染症において、および免疫系欠損症、放射線被曝、HIVおよびAIDSの場合、および白血病などの血液やリンパ節に影響を与える疾患に見られる。化学療法薬、放射線療法、免疫抑制薬はT細胞の数に影響を与える可能性がある。
【０００８】
B細胞は、液性免疫応答において主要な役割を果たすリンパ球である。人体は毎日何百万もの異なるタイプのB細胞を産生し、各タイプは、その膜の特定の抗原に結合することができる特定の受容体タンパク質を有する。CD19は、B細胞膜全体にマーカーとして存在する。人体では、何百万ものB細胞が、抗体を産生することなく血液やリンパ液を循環する。いずれかのB細胞が抗原に遭遇し、ヘルパーT細胞から追加のシグナルを受け取ったとき、それは、以下に説明する2つの異なるタイプのB細胞のうちの1つに分化する。B細胞は、これらの細胞タイプの1つに直接形質転換することができるが、中間ステップの後に形質転換することもできる。
【０００９】
ナチュラルキラー細胞は、免疫系の特殊化されていない防御細胞である。ナチュラルキラー細胞は、血液中のリンパ球の約10％を占める。それらは、TおよびBリンパ球に見られる抗原受容体をコードする遺伝子の再配列を欠いている。ナチュラルキラー細胞は、MHCクラス1分子の正常なレベルを示す細胞を攻撃しないが、外来MHCを殺し、MHCI発現が低下または欠如している細胞も殺す。これは、ウイルス感染や癌で見られることが多い。ナチュラルキラー細胞は、末梢血において赤い顆粒を含む大きなリンパ球として検出されうる。CD56接着分子は、典型的なナチュラルキラー細胞のマーカーである。
【００１０】
アジュバントの一般的な目的は次のとおりである：
組換え型または徹底的な精製によって得られた抗原の免疫原性を高めること、
短期間でより強力で長続きする免疫応答を生み出すこと、
一次免疫応答を達成するために必要な抗原の量またはワクチン接種の数を減らし、それによってワクチン接種のコストを減らすこと、
新生児、高齢者および免疫不全を有する人においてワクチンの活性を高めること、
粘膜による抗原の取り込みを強化する(粘膜免疫を刺激する)こと、
細胞性免疫を刺激すること、
混合ワクチンにおける抗原競争力を防ぐのを補佐すること。
【００１１】
細胞内病原性微生物に対する防御には細胞性免疫応答が必要であり、細胞外微生物に対する防御には液性免疫応答が必要である。アルミニウム塩は、液性免疫応答を刺激するだけで抗体応答を増加させるため、弱いアジュバントである。それらは、防御のために液性免疫応答を必要とする疾患(B型肝炎や百日咳など)には十分である。しかしながら、それらは、細胞傷害性Tリンパ球細胞を刺激する活性(細胞性免疫)は有さない。たとえば、HIVワクチンでは、標的は抗体を産生することではなく、細胞傷害性リンパ球を刺激することである。さらに、アルミニウム化合物は、経口または鼻腔内投与には適していない。それらは粘膜IgA応答を引き起こすことができない。逆に、それらは、IgE反応を高めることによってアレルギー反応を起こすこともある。そのため、免疫系の活動の結果として生成される多くの化学物質、生化学物質およびタンパク質(サイトカインなど)が、潜在的なアジュバントとして近年調査され始めている。しかしながら、これらの物質のほとんどに見られる局所および全身毒性が、現在、それらの多くをヒトワクチンのアジュバントとして使用することを許可していない。アジュバント活性が高いほど、副作用の発生率が高くなる。アジュバントによる、痛み、炎症、腫れ、注射部位の壊死、肉芽腫、無菌性膿瘍およびリンパ節腫脹などの局所的な副作用、および悪心、発熱、関節炎、ブドウ膜炎、好酸球増加症、アレルギー、アナフィラキシー、免疫抑制および自己免疫疾患などの全身性副作用が発生する可能性がある。アジュバント研究では、毒性を最小限に抑えることが最も困難なステップと見られている。このため、アルミニウムアジュバントのみが約1世紀の間ヒトワクチンのアジュバントとして使用され続けてきた。
【００１２】
細胞性または液性のいずれのが防御が望まれるかにかかわらず、理想的なアジュバントは、所望の免疫を提供すべきであり；免疫記憶、すなわち 長期的な免疫を提供すべきであり；安全で、副作用が最小限であるべきであり；自己免疫を刺激する効果をもつべきではなく； 変異原性、発がん性、催奇形性をもつべきではなく；そして、安価で、長い貯蔵寿命をもつべきである。
【００１３】
サポニンは、植物、いくつかの原始的な海洋生物および細菌に見られるステロイドまたはトリテルペノイド配糖体である。それらは自然に豊富である。テルペノイドサポニンは、大豆、豆、エンドウ豆、茶、ほうれん草、テンサイ、甘草、ヒマワリ、マロニエおよび高麗人参に見られ、ステロイドサポニンは、オート麦、ピーマン、ナス、トマト種子、玉ねぎ、アスパラガス、スイートポテトおよび高麗人参に見られる。トリテルペノイドサポニンは、疎水性核およびそれに結合した炭水化物鎖を含む。サポニン含有アジュバントは、細胞性免疫と液性免疫の両方を刺激する。アジュバント活性には、低用量で十分である。サポニンはまた、CD8(+)細胞傷害性リンパ球応答を増加させ、粘膜抗原に対する免疫応答を強化する。しかしながら、それらは界面活性剤であるので、インビトロ研究において、溶血を引き起こすことが見出されている。サポニンを含む多種多様なアジュバントがある。
【００１４】
免疫調節化学物質の使用は、非常に重要な治療法として今日頻繁に行われている細胞または臓器移植を実行し、継続性を維持する上で非常に重要である。特に固形臓器移植や造血幹細胞移植において発生し、健康なTリンパ球を介した重度の免疫反応を特徴とする移植片対宿主病(GVHD)は、免疫調節剤が広く使用されている疾患の1つである。これの最も重要な理由は、それが移植後のプロセスにおいて最も重要な死亡率と罹患率の要因であるということである。この疾患は、移植後最初の3か月以内に発生する可能性があり、主に皮膚、肝臓および腸に大きな影響を及ぼす。シクロスポリンやメトトレキサートなどの免疫抑制薬によるその予防において、過去から現在に至るまで大きな進歩が見られているが、残念ながら、その治療の進歩は限定されている。一般に、造血幹細胞移植後の発症時期に応じて、急性GVHDと慢性GVHDの2つに分けられる。したがって、3か月目以降に発生する慢性GVHDの治療は高用量の免疫抑制薬を伴い、長期間持続するため、生検による診断を確認することが重要である。さらに、治療過程で発生する感染症は、慢性GVHD患者の最も一般的な死因の1つである。したがって、免疫抑制療法中のこれらの患者への予防的抗菌薬の投与は重要な要件となっている。急性および慢性の両方のGVHDの病因の発見に従って、さまざまな予防的および治療的方法の開発に関する研究が近年進行中である。
【００１５】
免疫系が抗原に遭遇したときの過剰な、または不適切な反応は、過敏症と呼ばれる。健常人の免疫系は、細胞に大きなダメージを与えることなく病原体と戦うことができるが、過敏症の人の免疫応答は、健康な組織にダメージを与える。アレルギー、つまり無害な抗原に対する免疫系の反応は、過敏症の範囲に含まれる。湿疹、アレルギー性喘息および花粉症は、最も一般的な慢性アレルギーの1つである。
【００１６】
過敏症の治療では、広範囲の抗炎症薬、抗サイトカイン療法、そして、特により深刻な場合には、体内のリンパ球細胞の数を減らす治療が使用される。脱感作療法は、アレルギーを引き起こす抗原に対する個人の感受性を低下させるために使用することができる。脱感作は、個人がアレルギーを起こす抗原を、治療期間中に制御された用量で投与することによって達成され、それによって抗原に対する耐性を構築する。
【００１７】
最先端の出願で決定された問題は、次のようにリストすることができる：
・アルミニウムアジュバントの重要な問題は、それらの使用が、中和抗体の産生を必要とする細菌およびウイルスワクチンに限定されていることである；
・アルミニウムアジュバントは、IgE産生の増加により、アレルギーを起こしやすく、神経毒性を引き起こす可能性がある；
・アルミニウム中毒は、筋萎縮性側索硬化症およびアルツハイマー病にも関連する；
・植物由来のサポニンを含むアジュバントは、界面活性剤であるため、インビトロ試験で溶血を引き起こす；
・シクロスポリンおよびメトトレキサートなどの免疫抑制薬は、長期使用において患者を感染症にかかりやすくする；
・GVHDの治療に積極的に使用されているシクロスポリンは、重大な腎毒性と高血圧を引き起こす[4]；
・多発性硬化症(MS)の患者にインターフェロンベータ(IFNB)を皮下注射した後、注射部位に、最初に脂肪織炎、次に局所脂肪異栄養症が起こる；
・免疫抑制の目的で使用される薬アザチオプリンおよび6-メルカプトプリンは、使用期間に応じて、身体を肝炎、膵炎および他の多くの感染症に曝露させる；
・フラボノイド、多糖類、ラクトン、アルカロイド、ジテルペノイドおよび配糖体などの植物化学物質を含むさまざまな植物抽出物は、免疫系に対して調節作用を及ぼす；しかしながら、有効成分に加えて、存在する化学汚染物質の比率が高いため、それらの効果的な使用および潜在的な副作用について、ためらいが存在する。
【００１８】
最新技術で知られている出願である、韓国特許出願文書番号KR20120002942は、細胞のプロトプラストに由来する微小胞およびその使用を開示する。これらの細胞は、細菌細胞、古細菌細胞、カビ細胞、植物細胞またはL型細菌でありうる。疾患またはワクチンを診断または治療するための材料を送達するための組成物は、微小胞を含む。微小胞を製造する方法は、細胞から細胞壁を除去してプロトプラストを調製し、プロトプラストを含む懸濁液中の微小胞を調製し、次に懸濁液から微小胞を単離するステップを含む。
【００１９】
最新技術で知られている出願である、国際特許出願文書番号WO2016166716は、レモンによって単離されたナノベシクルの抗腫瘍活性を開示する。柑橘類の植物からナノベシクルを取得するためのプロセスは、以下のステップを含む：a)1つ以上の連続したサイクルで絞り汁を遠心分離およびろ過する；b)ステップ(a)で得られた絞り汁を超遠心分離して、ナノベシクルを含む上清および沈降ペレットを得、ベシクルを回収する。工程はさらに、以下のステップを含みうる：c)回収したペレットをショ糖勾配超遠心分離に付す；d)1.12〜1.19g/mlの密度を有する画分を単離する；e)必要に応じて画分を超遠心分離に付す；およびf)必要に応じて、ペレットを生理学的溶液で洗浄する。
【００２０】
最新技術で知られている出願である、中国特許出願文書番号CN102697812は、ニワトリ胆汁からエクソソームを抽出する方法および免疫学における前記エクソソームの適用を開示する。エクソソームは、免疫調節のための免疫反応のアジュバントとして使用することができる。
【００２１】
最新技術で知られている出願である、国際特許出願文書番号WO2016168680は、エクソソームベースのワクチンを開発するための方法を開示する。該発明の実施態様は、免疫原性組成物を作製するための方法、およびさまざまな疾患を治療するためにそのような免疫原性組成物を使用する方法に関する。
【００２２】
最新技術で知られている出願である、トルコ特許出願文書番号TR2012/05117(EP1267924B1)は、免疫療法の方法および組成物を開示する。該発明は、抗原提示細胞に化学物質を導入する方法および組成物に関する。結果として生じる、抗原提示細胞の表面上の前記抗原の提示は、免疫系に影響を与える。該発明はまた、結果として生じる修飾抗原提示細胞およびこれらの細胞を含む医薬組成物に関する。該発明は、一連の関連ペプチドおよび前記ペプチドを組み込んだリン脂質小胞を含む、アジュバントおよびアジュバント調製物における新しい理解を開示する。
【００２３】
最新技術で知られている出願である、トルコ特許出願文書番号TR2016/08391(EP2591802B1)は、リポソームにカプセル化されたスチコリシンに基づくワクチン組成物を開示する。前記発明は、人間の健康に適用されるバイオテクノロジーの分野に関する。ここでは、真核生物からの毒素が、脂質組成がジパルミトイルホスファチジルコリン：コレステロールが皮下または筋肉内投与のための1：1のモル比である、脱水-再水和手順によって得られる多層小胞にカプセル化されるワクチンビヒクルについて記載される。これらの組成物は、他のアジュバントの使用を必要としない。開示された組成物は、毒素含有リポソームに共カプセル化された1つまたはいくつかの抗原に対するCTL特異的免疫応答の調節を可能にする。前記発明のワクチンビヒクルは、誘導された免疫応答の頑健性および機能性ならびにその免疫調節特性のために、先行技術によって開示された他のものよりも有利である。
【００２４】
US9717733、WO2006007529、WO1999003499、WO2017004526およびUS20100092524と番号付された特許出願もまた、最新技術の出願である
【発明の概要】
【００２５】
発明の概略
本発明の目的は、植物溶解物から単離された植物エクソソームを、免疫系障害に起因する疾患に対する免疫系エンハンサー、サイレンサーおよびモジュレーターとして使用することである。
【００２６】
本発明のもう1つの目的は、血球の活性化の抑制において現在使用されている類似の活性剤および化学物質から得られる物質によって得られるものと比較して、より高い抑制を提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、血球の活性化を増強するために現在使用されている類似の活性剤および化学物質から得られる物質によって得られるものと比較して、より高い活性化を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、完全に植物起源であるので、肝臓および他の薬物のように他の器官に毒性作用を及ぼさない免疫調節剤を提供することである。
【００２９】
発明の詳細な記載
本発明の目的を達成するために開発された「免疫系細胞に対する調節効果を示すための植物エクソソームの使用」を、添付の図に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の範囲内で、縮れ葉(Warty-Leaved)のルバーブ植物から単離されたエクソソームの特徴のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置によるエクソソーム特性マーカーである、CD9、CD63およびHSP70抗体によって測定されたフローサイトメトリーグラフ(a)；およびエクソソーム直径測定グラフ(b))
【図２】本発明の範囲内で、セロリから単離されたエクソソームの特徴のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置によるエクソソーム特性マーカーである、CD9、CD63およびHSP70抗体によって測定されたフローサイトメトリーグラフ(a)；およびエクソソーム直径測定グラフ(b))
【図３】本発明の範囲内で、ザクロから単離されたエクソソームの特徴のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置によるエクソソーム特性マーカーである、CD9、CD63およびHSP70抗体によって測定されたフローサイトメトリーグラフ(a)；およびエクソソーム直径測定グラフ(b))
【図４】本発明の範囲内で、リーキから単離されたエクソソームの特徴のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置によるエクソソーム特性マーカーである、CD9、CD63およびHSP70抗体によって測定されたフローサイトメトリーグラフ(a)；およびエクソソーム直径測定グラフ(b))
【図５】本発明の範囲内で、ホースラディッシュから単離されたエクソソームの特徴のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置によるエクソソーム特性マーカーである、CD9、CD63およびHSP70抗体によって測定されたフローサイトメトリーグラフ(a)；およびエクソソーム直径測定グラフ(b))
【図６】本発明の範囲内で、ショウガから単離されたエクソソームの特徴のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置によるエクソソーム特性マーカーである、CD9、CD63およびHSP70抗体によって測定されたフローサイトメトリーグラフ(a)；およびエクソソーム直径測定グラフ(b))
【図７】本発明の範囲における白血球に対する縮れ葉ルバーブエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図８】本発明の範囲におけるIL2活性化白血球に対する縮れ葉ルバーブエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図９】本発明の範囲におけるPHA活性化白血球に対する縮れ葉ルバーブエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１０】本発明の範囲におけるダニアレルゲン活性化白血球に対する縮れ葉ルバーブエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１１】本発明の範囲における花粉アレルゲン活性化白血球に対する縮れ葉ルバーブエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１２】本発明の範囲における白血球に対するセロリエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１３】本発明の範囲におけるIL2活性化白血球に対するセロリエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１４】本発明の範囲におけるPHA活性化白血球に対するセロリエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１５】本発明の範囲におけるダニアレルゲン活性化白血球に対するセロリエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１６】本発明の範囲における花粉アレルゲン活性化白血球に対するセロリエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１７】本発明の範囲における白血球に対するザクロエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１８】本発明の範囲におけるIL2活性化白血球に対するザクロエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図１９】本発明の範囲におけるPHA活性化白血球に対するザクロエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２０】本発明の範囲におけるダニアレルゲン活性化白血球に対するザクロエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２１】本発明の範囲における花粉アレルゲン活性化白血球に対するザクロエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２２】本発明の範囲における白血球に対するリーキエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２３】本発明の範囲におけるIL2活性化白血球に対するリーキエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２４】本発明の範囲におけるPHA活性化白血球に対するリーキエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２５】本発明の範囲におけるダニアレルゲン活性化白血球に対するリーキエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２６】本発明の範囲における花粉アレルゲン活性化白血球に対するリーキエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２７】本発明の範囲における白血球に対するホースラディッシュエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２８】本発明の範囲におけるIL2活性化白血球に対するホースラディッシュエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図２９】本発明の範囲におけるPHA活性化白血球に対するホースラディッシュエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図３０】本発明の範囲におけるダニアレルゲン活性化白血球に対するホースラディッシュエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図３１】本発明の範囲における花粉アレルゲン活性化白血球に対するホースラディッシュエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図３２】本発明の範囲における白血球に対するショウガエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図３３】本発明の範囲におけるIL2活性化白血球に対するショウガエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図３４】本発明の範囲におけるPHA活性化白血球に対するショウガエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図３５】本発明の範囲におけるダニアレルゲン活性化白血球に対するショウガエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【図３６】本発明の範囲における花粉アレルゲン活性化白血球に対するショウガエクソソームの効果のグラフ表示を示す。(フローサイトメトリー装置による表面マーカーである抗体を用いたCD4 Tヘルパーリンパ球、CD8 T細胞傷害性リンパ球、CD19 Bリンパ球およびCD56ナチュラルキラー細胞の測定のグラフ)
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の主題は、植物溶解物から単離された植物エクソソームを、免疫系に影響を与える疾患に対する免疫系エンハンサー、サイレンサーおよびモジュレーターとして使用することである。本発明の植物エクソソームは、免疫系細胞を活性化、抑制および調節することによって疾患の予防および治療を可能にする植物由来のエクソソームである。
【００３２】
本発明の植物エクソソームの免疫系への影響は、免疫系細胞の分裂への影響に基づく。免疫系を活性化する植物のエクソソームは、免疫系細胞を刺激して、増殖を可能にし、それによって免疫応答を強化する。一方、抑制性植物エクソソームは、免疫系細胞を分裂に対して非感受性にし、それによって免疫系応答を抑制する。本発明で考察されるエクソソームのこれらの効果は、それらが適用される免疫系細胞の表面タンパク質(CD8、CD19およびCD56)の変化によって提示されるデータに示される。
【００３３】
本発明の範囲において、植物エクソソームは、主に自己免疫疾患において、および細胞、組織、臓器移植において、および移植片対宿主病において、免疫系増エンハンサー、サプレッサーとして、または必要に応じて、最初の2つの機能の両方を実行するモジュレーターとして使用される。
【００３４】
本発明の範囲内で、植物エクソソームは、植物全体、果実、葉、種子、根、または植物の培養培地、幹細胞、廃棄物、殻または師部などの分化した組織からなる群から選択される植物の少なくとも一部から得られる。類似の植物から得られるエクソソームよりも最大5倍高い濃度でエクソソームを生成すること、および生成されたエクソソームの含有量および特性を長期間維持することによって、農場、収穫、輸送などの影響を受けることが防止されるので、植物組織培養が、植物エクソソームが得られる供給源として好ましい。
【００３５】
本発明の植物エクソソームは、植物組織培養物中の細胞が免疫系を増強、抑制または調節するタンパク質を産生することを可能にするためにトランスフェクトされる。トランスフェクションは、細胞への外部遺伝子導入である。植物培養における細胞のトランスフェクションは、それらが標的タンパク質を産生することを可能にすることができ、したがって、これらの細胞によって分泌されるエクソソームは、これらのタンパク質を含むことができる。
【００３６】
本発明の範囲内で、植物エクソソームは、液体二相系による単離、段階的遠心分離、限外濾過、クロマトグラフィー法、ポリマーベースの単離およびマイクロビーズによる単離からなる群から選択される単離方法によって単離される。それらの中で、最も純粋なエクソソーム単離は、液体二相系による単離によって達成され、したがって、この単離方法は、本出願の範囲内で好ましい。
【００３７】
本発明の植物由来エクソソームは、主に自己免疫疾患において、および細胞、組織、臓器移植において、移植片対宿主病、ならびに関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、硬化症、シェーグレン症候群、1型糖尿病、アレルギー性喘息、ウェゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、クローン病、乾癬、バセドウ病、セリアック病、円形脱毛症(alopecia areata)(円形脱毛症(pelade))、中枢神経系血管炎、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、ギランバレー症候群、結節性多発動脈炎、特発性血小板減少性紫斑病、側頭動脈炎、原発性胆汁性肝硬変、アジソン病、強直性脊椎炎、ライター症候群、高安動脈炎、および白斑などの免疫系が影響を受ける疾患において、免疫系エンハンサー、サプレッサー、または必要に応じてモジュレーターとして使用される。植物由来のエクソソームは、免疫系媒介性疾患を治療するために患者に有効量の選択された植物エクソソームを投与するために、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮内、局所、腹腔内に、および注射によって投与される。それらはまた、免疫調節薬を運ぶ目的で、ワクチン接種用のアジュバントとして、および免疫系を調節する目的で栄養補助食品として使用される。
【００３８】
本発明の範囲で使用される植物エクソソームの単離に使用される液体二相系を介した単離の方法は、以下のステップを含む：
-エクソソームを単離する植物をブレンダーで分解して、その溶解物を得る；
-植物溶解物からエクソソームを分離するために、2,000g〜10,000gの攪拌速度で5〜20分間遠心分離する；
-遠心分離後のろ過により、サイズ220nm以上の粒子を除去する；
-遠心分離によって得られたエクソソーム-タンパク質混合物を、分離のためにPEG相とDEX相を含む液体二相系に移す；
-タンパク質に対するPEG相およびリン脂質構造膜に対するDEX相の化学的傾向を利用して、エクソソームから非エクソソームタンパク質、細胞脂肪およびその他の不純物を除去する；
-単離されたエクソソームを得る。
【００３９】
本発明は、疾患に対する免疫系エンハンサー、サイレンサーおよびモジュレーターとしての免疫系に対する植物エクソソームの効果を利用するためのものである。本発明の範囲において、植物エクソソームの免疫調節効果は、主に自己免疫疾患において、および細胞、組織、臓器移植において、および移植片対宿主病において、免疫系増エンハンサー、サプレッサーとして、または必要に応じて、最初の2つの機能の両方を実行するモジュレーターとして使用される。植物のエクソソームの効果は、エクソソームが単離された植物によってさまざまでありうる。これらは、植物全体、果実、葉、種子、および根でありうるが、植物の培養培地、幹細胞、廃棄物、殻または師部などの分化した組織である場合もある。植物のエクソソームは、液体二相系による単離、段階的遠心分離機、限外濾過、クロマトグラフィー法、ポリマーベースの単離およびマイクロビーズによる単離などの多くの方法によって単離することができる。本発明の範囲内で実施された研究で使用されたエクソソームは、表1に開示された植物から単離される。
【００４０】
表1：本発明の範囲内でエクソソームの単離に使用される植物
【表１】
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【００４１】
植物溶解物からのエクソソーム単離のために2,000gから10,000gの間で5〜20分間行われる遠心分離による植物崩壊から生じる大きなサイズの粒子は、デキストラン相に、二相分離プロセス中に適用される遠心分離およびそれらの重量による沈殿時の不純物を引き起こさないことを意図する。さらに、220ナノメートル以上のサイズの粒子を除去するために実行されるろ過プロセス中に使用されるフィルターは、詰まらないことを保証される。液体二相系のタンパク質に対するPEG相とリン脂質構造膜に対するDEX相の化学的傾向を利用することにより、非エクソソームタンパク質、細胞脂肪、およびその他の不純物が、エクソソームから除去される。溶液中で使用されるポリマーの濃度によって形成されたDEX相は、エクソソームを分離する。
【実施例】
【００４２】
実証研究
単離されたエクソソームは、エクソソームによって運ばれる表面マーカーCD9、CD63およびHSP70抗体によってマークされ、これらのマーカーを運ぶエクソソームは、フローサイトメトリー装置によって測定される。同時に、ゼータサイザーデバイスで分離されたエクソソームの寸法も測定される(図1-6)。
【００４３】
血球に対する植物のエクソソームの効果を決定するために、白血球の単離を行う。EDTAまたは血液凝固を可能にする溶液を含むチューブに導入された血液を、1：1の体積比でPBSと混合する。それを、相を混合せずに、別のチューブのフィコール溶液に注意深く注ぐ。血液、PBSおよびフィコールを含むチューブを約3000RPMで15分間遠心分離する。遠心分離後、上部血漿とフィコールの間に白血球を含む白色中間相を取り出し、クリーンなチューブに移し、その上に約10mLのPBSを加えることによって洗浄する。細胞を再び1500RPMで5分間遠心分離する。細胞ペレットを除去し、白血球を培地中で培養する。これらの単離された白血球には、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、および樹状細胞などの免疫系で役割を果たす細胞が含まれる。
【００４４】
培地で増殖した細胞をIL2、PHA、ダニアレルゲンおよび花粉アレルゲンとインキュベートすることによって、免疫系細胞を活性化する。単離された植物エクソソームは、活性化および非活性化血液細胞に送達される。白血球に対する植物エクソソームの効果を実証するために、CD4、CD8、CD19およびCD56抗体でマークされた白血球のパーセンテージをフローサイトメトリー装置によって測定する。縮れ葉ルバーブのエクソソームの、血球に対するその効果を図7に示し、IL2活性化血液細胞に対するその効果を図8に示し、PHA活性化血液細胞に対するその効果を図9に示し、ダニアレルゲン活性化血球に対するその効果を図10に示し、花粉アレルゲン活性化血球に対するその効果を図11に示す。セロリのエクソソームの、血球に対するその効果を図12に示し、IL2活性化血液細胞に対するその効果を図13に示し、PHA活性化血液細胞に対するその効果を図14に示し、ダニアレルゲン活性化血球に対するその効果を図15に示し、花粉アレルゲン活性化血球に対するその効果を図16に示す。ザクロのエクソソームの、血球に対するその効果を図17に示し、IL2活性化血液細胞に対するその効果を図18に示し、PHA活性化血液細胞に対するその効果を図19に示し、ダニアレルゲン活性化血球に対するその効果を図20に示し、花粉アレルゲン活性化血球に対するその効果を図21に示す。リーキのエクソソームの、血球に対するその効果を図22に示し、IL2活性化血液細胞に対するその効果を図23に示し、PHA活性化血液細胞に対するその効果を図24に示し、ダニアレルゲン活性化血球に対するその効果を図25に示し、花粉アレルゲン活性化血球に対するその効果を図26に示す。ホースラディッシュのエクソソームの、血球に対するその効果を図27に示し、IL2活性化血液細胞に対するその効果を図28に示し、PHA活性化血液細胞に対するその効果を図29に示し、ダニアレルゲン活性化血球に対するその効果を図30に示し、花粉アレルゲン活性化血球に対するその効果を図31に示す。ショウガのエクソソームの、血球に対するその効果を図32に示し、IL2活性化血液細胞に対するその効果を図33に示し、PHA活性化血液細胞に対するその効果を図34に示し、ダニアレルゲン活性化血球に対するその効果を図35に示し、花粉アレルゲン活性化血球に対するその効果を図36に示す。
【００４５】
本発明の範囲内で、免疫系に対する植物エクソソームの効果を、疾患に対する免疫系エンハンサー、サイレンサーおよびモジュレーターとして使用することの利点を、以下のように列挙することができる：
・エクソソームが、すべて植物由来である；
・活性化は、類似の活性剤(IL2)よりも優れており、類似の化学物質として得られる物質よりも結果良好である；
・安価で大量に入手することが可能である；
・血球の活性化抑制率は、類似の化学物質として得られる物質よりも結果良好である；
・完全に植物由来であるため、他の薬剤のように肝臓および他の臓器に毒性を及ぼすことはない；
・組織および臓器の移植において免疫系を抑制するために使用される幹細胞治療の代わりに使用することができる植物由来の製品である；
・植物、動物、化学物質由来の汚染物質が含まれていないため、これらの汚染物質による副作用が生じない；
・これらのエクソソームの使用は、過度の使用が身体に有害であることが知られているアルミニウムなどの元素の使用の代わりとなる。
【００４６】
参考文献
(1) Ludwig、A. K. and B. Giebel (2012).「Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication.」Int J Biochem Cell Biol44(1): 11-15. 
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(3) Stegmayr、B. and G. Ronquist (1982).「Promotive effect on human sperm progressive motility by prostasomes.」Urol Res10(5): 253-257. 
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【図１（ａ）】
2021536257.tif 000004
【図１（ｂ）】
2021536257.tif 000005
【図２（ａ）】
2021536257.tif 000006
【図２（ｂ）】
2021536257.tif 000007
【図３（ａ）】
2021536257.tif 000008
【図３（ｂ）】
2021536257.tif 000009
【図４（ａ）】
2021536257.tif 000010
【図４（ｂ）】
2021536257.tif 000011
【図５（ａ）】
2021536257.tif 000012
【図５（ｂ）】
2021536257.tif 000013
【図６（ａ）】
2021536257.tif 000014
【図６（ｂ）】
2021536257.tif 000015
【図７】
2021536257.tif 000016
【図８】
2021536257.tif 000017
【図９】
2021536257.tif 000018
【図１０】
2021536257.tif 000019
【図１１】
2021536257.tif 000020
【図１２】
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【図１３】
2021536257.tif 000022
【図１４】
2021536257.tif 000023
【図１５】
2021536257.tif 000024
【図１６】
2021536257.tif 000025
【図１７】
2021536257.tif 000026
【図１８】
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【図１９】
2021536257.tif 000028
【図２０】
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【図２１】
2021536257.tif 000030
【図２２】
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【図２３】
2021536257.tif 000032
【図２４】
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【図２５】
2021536257.tif 000034
【図２６】
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【図２７】
2021536257.tif 000036
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2021536257.tif 000039
【図３１】
2021536257.tif 000040
【図３２】
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【図３３】
2021536257.tif 000042
【図３４】
2021536257.tif 000043
【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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