(57)【要約】生体試料に含まれる各生体細胞についてのサイトメトリーパラメータを測定するステップと、対応する生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義される、Ｎは３以上の整数であるＮ次元空間内の点を決定するステップと、試料クラスタファイルを定義するために、測定されたサイトメトリーパラメータに応じて、点を異なる細胞クラスタに自動的にクラスタリングするステップと、各参照クラスタファイルがそれぞれの病的又は異常な生体試料のサイトメトリーパラメータから定義されており、試料クラスタファイルと参照クラスタファイルとを比較するステップとを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球を含む生体細胞を含む生体試料を分析する分析方法であって、以下のステップ：
−  分析される前記生体試料の前記生体細胞の、フローサイトメータの測定セルへの通過、
−  分析される前記生体試料の各生体細胞についてのＮ個のサイトメトリーパラメータの測定、
−  分析される前記生体試料における各生体細胞について、対応する生体細胞について測定された前記サイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義される、Ｎ次元空間内の点の決定、ここでＮは３以上の整数、
−  試料クラスタファイルを定義するために、測定された前記サイトメトリーパラメータに応じて、決定された前記点を異なる細胞クラスタに自動的にクラスタリング、
−  前記試料クラスタファイルの前記異なる細胞クラスタによって定義される細胞集団の識別、
−  前記試料クラスタファイルの各細胞クラスタの前記点のカウント、
−  各参照クラスタファイルがそれぞれの病的又は異常な生体試料のサイトメトリーパラメータから定義されており、前記試料クラスタファイルと参照クラスタファイルとの比較、
を含む、分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の分析方法において、
前記試料クラスタファイルが参照クラスタファイルと少なくとも部分的に同一又は類似である場合に、警告メッセージを発生するステップをさらに含む、分析方法。
【請求項３】
請求項２に記載の分析方法において、
発生される前記警告メッセージは、前記試料クラスタファイルが少なくとも部分的に同一又は類似である前記参照クラスタファイルに関連する病理又は異常に関する表示を含む、分析方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法において、
前記試料クラスタファイル内の少なくとも１つの可能性のある異常を検出するように、前記試料クラスタファイルを分析するステップをさらに含む、分析方法。
【請求項５】
請求項４に記載の分析方法において、
前記比較のステップは、前記分析のステップ中に少なくとも１つの異常が検出された場合にのみ実行する、分析方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の分析方法において、
前記分析のステップが以下のステップ：
−  前記試料クラスタファイルの各細胞クラスタについて、前記細胞クラスタの少なくとも１つの形態学的パラメータの分析、
−  前記試料クラスタファイルの少なくとも１つの細胞クラスタの少なくとも１つの形態学的パラメータが、それぞれの所定の閾値を超える場合の異常の検出、
を含む、分析方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の分析方法において、
前記分析のステップが以下のステップ：
−  前記試料クラスタファイルの各細胞クラスタについて、前記細胞クラスタにクラスタリングされた点の数と、少なくとも１つのそれぞれの所定の閾値との比較、
−  少なくとも１つの細胞クラスタにクラスタリングされた点の数が、前記少なくとも１つのそれぞれの所定の閾値よりも少ない及び／又は多い場合の異常の検出、
を含む、分析方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の分析方法において、
前記分析のステップが以下のステップ：
−  前記試料クラスタファイルの各細胞クラスタ内の前記点の分布の分析、
−  少なくとも１つの細胞クラスタ内の前記点の分布がガウス分布でない場合の異常の検出、
を含む、分析方法。
【請求項９】
請求項４〜８のいずれか１項に記載の分析方法において、
前記分析のステップが以下のステップ：
−  前記試料クラスタファイルの前記細胞クラスタの配置の分析、
−  前記試料クラスタファイルの少なくとも２つの細胞クラスタが少なくとも部分的に雑然としている（confused）場合の異常の検出、
を含む、分析方法。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれか１項に記載の分析方法において、
前記分析のステップが以下のステップ；
−  試料クラスタファイルの前記細胞クラスタの分析、
−  少なくとも１つの所定の細胞クラスタの有無が検出された場合の異常の検出、
を含む、分析方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分析方法において、
サイトメトリーパラメータを測定する前記ステップは、分析される前記生体試料の前記生体細胞の形態及び／又は構造を表すサイトメトリーパラメータを測定する少なくとも１つのステップを含む、分析方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の分析方法において、
サイトメトリーパラメータを測定する前記ステップが、分析される前記生体試料の各生体細胞について、前記生体細胞の少なくとも１つの光学特性を測定する少なくとも１つのステップを含む、分析方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の分析方法において、
サイトメトリーパラメータを測定する前記ステップが以下：
−  各生体細胞によって小角度で散乱された光線の強度を測定するステップ、及び／又は
−  各生体細胞によって９０°で散乱された光線の強度を測定するステップ、及び／又は
−  各生体細胞によって入射光線の光路に沿って散乱された光線強度を測定するステップ、
を含む、分析方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の分析方法において、
サイトメトリーパラメータを測定する前記ステップが、各生体細胞により、例えば９０°で放射された少なくとも１つの蛍光線の強度を測定するステップを含む、分析方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の分析方法において、
サイトメトリーパラメータを測定する前記ステップが、以下のステップ：
−  入射光線が前記生体細胞の経路と交差するように、測定チャンバを通過する前記生体細胞に向けての入射光線の放射、
−  前記測定チャンバを通過する各生体細胞からの少なくとも１つの光線の検出、
を含む、分析方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の分析方法において、
以下のステップ：
−  参照生体試料の前記生体細胞の、フローサイトメータの測定セルへの通過、
−  前記参照生体試料の各生体細胞についてのＮ個のサイトメトリーパラメータの測定、
−  前記参照生体試料の各生体細胞について、前記参照生体試料の前記生体細胞について測定された前記サイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義される、Ｎ次元空間内の点の決定、ここでＮは３以上の整数、
−  参照クラスタファイルを定義するために、前記参照生体試料の各生体細胞について測定された前記サイトメトリーパラメータに応じて、前記参照生体試料に関連して決定された前記点を異なる細胞クラスタに自動的にクラスタリング、
−  複数の参照クラスタファイルを定義するために、複数の参照生体試料について、前記の通過、測定、決定及びクラスタリングのステップの繰り返し、
をさらに含む、分析方法。
【請求項１７】
分析装置であって、
−  分析される生体試料の生体細胞の通過のための測定セルと、分析される前記生体試料の前記生体細胞のサイトメトリーパラメータを測定するように構成された測定手段とを含むフローサイトメータ、及び
−  以下を行うように構成された処理ユニット（３２）：
−  分析される前記生体試料の各生体細胞について、対応する生体細胞について測定された前記サイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義されるＮ次元空間内の点を決定し、ここでＮは３以上の整数であり、
−  試料クラスタファイルを定義するために、分析される前記生体試料の各生体細胞について測定された前記サイトメトリーパラメータに応じて、前記点を異なる細胞クラスタにクラスタリング、
−  各参照クラスタファイルがそれぞれの病的又は異常な生体試料のサイトメトリーパラメータから定義されており、前記試料クラスタファイルと参照クラスタファイルとの比較、
を備える、分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体細胞及び特に血球を含む生体試料を分析する方法並びにそのような分析方法の実施に適合した分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中を循環する細胞は、赤血球（red blood cells or erythrocytes）である非有核細胞（正常血液で約５，０００，０００／ｍｍ３）、血小板（約３００，０００／ｍｍ３）を含み、有核細胞である白血球（約１０，０００／ｍｍ３）を含む。血液は、未成熟な赤血球である赤芽球又は他のより希少な細胞などの、他の有核細胞を含む場合がある。各細胞型は、集団（a population）とも呼ばれるものを構成する。
【０００３】
他の体液（biological fluids）には、脳脊髄液又は尿など、血液細胞が含まれる。次に、生体試料（生物学的試料）であるが、これは血液試料に限定されず、血液細胞を含むすべての体液である。
【０００４】
従来の血液分析装置は、フローサイトメトリーを使用するかどうかにかかわらず、全血球算定（the Complete Blood Count）を実行し、細胞型によって定量的な異常が検出されたときに定性的な情報を提供することが意図されている。
【０００５】
免疫血液学に特化したサイトメトリー機器は、より洗練された技術及び特定の試薬の実装により、すべての細胞型に影響を与え得る血液学的病態をターゲットにできる。
【０００６】
フローサイトメトリーは、少なくとも１つの流体力学的絞り込みを行うこと、及び各細胞について特定の数の物理的測定値を、実装されたものに従い、生成する測定装置に血球を１つずつ通過させることから構成されていることが思い起こされる。測定が明確に行われるように、細胞は分離され、測定及びその取得を可能にする速度でスクロールするべきである。さらに、各集団の適切な統計的評価を可能にするのに十分な数が必要である。これを行うために、血液試料は純粋ではなく希釈して分析される。さらに、赤血球の量が白血球の数千倍であることを考慮に入れて、白血球集団を統計的に表す分析を実行するために、試料は、サイトメータで数分間通過させる必要がある。もう１つの解決策は、サイトメータでの試料の通過時間を１０分の１に短縮するために、試料の希釈に加えて、試料が白血球に十分に濃縮されるようにして、これらの集団について統計的に正確な数（counts）を得るために、選択的に赤血球を破壊する溶解を行うことである。
【０００７】
生成されるフローサイトメトリーパラメータには２つのタイプがある：
−  物理的又は形態学的性質のいずれか：インピーダンスによる細胞の体積の測定（コールター効果）、光吸収の測定、レーザービーム内の各細胞の通過によって生成されるさまざまな角度での回折、及び予めその細胞の存在下に置かれた１つ以上の蛍光色素が発する核酸の蛍光の測定。これらのデータは、各細胞を、その体積、その表面及びその内容に依存するその光吸収、その内部の複雑さ、その表面の性質、その組成並びに核細胞のその核活性、によって特徴付けることを可能にする；
−  免疫学的性質（免疫血液学）のいずれか：試料は、蛍光色素に接合し、特定の細胞の表面に発現する受容体に特異的な、抗体を含む試薬の存在下に置かれる。１つ又はいくつかのレーザービーム内の細胞の通過は、細胞表面のマーカーに比例する信号を生成し、したがって細胞を特徴付けることを可能にする。
【０００８】
生体細胞を含む生体試料を分析する方法は、既知の方法で、以下のステップを含む：
−  分析される生体細胞の生体試料の、フローサイトメータの測定セルへの通過、
−  分析される生体試料に含まれる各生体細胞についての、形態学的又は免疫学的サイトメトリーなどの、Ｎ個のサイトメトリーパラメータの測定、
−  分析される生体試料の各生体細胞について、対応する生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義されるＮ次元空間内の点の決定、ここでＮは２以上の整数、
−  全血球算定に限定された機能を持つ機器の場合、試料クラスタファイルを定義するために、測定されたサイトメトリーパラメータに応じて、点を異なる細胞クラスタにクラスタリングし、そのクラスタリングのステップは自動ゾーニング法、統計的方法又は点密度法を使用して実行され、
−  血液免疫測定を実行する、より高度な機器の場合、
・２つの測定軸で決定された点の表現、及び点の異なる細胞クラスタへの閾値による若しくは操作者によって選択されたゾーンによるクラスタリング基準にしたがうクラスタリングの、スペシャリストである血液学者などの、操作者による視覚分析、
・又は、試料クラスタファイルを定義するために、測定されたサイトメトリーパラメータに応じて点をさまざまな細胞クラスタに自動的にクラスタリング、及び試料クラスタファイルのコンピュータ分析、特にさまざまな細胞クラスタの分析であって、この分析のステップは、共通の特徴を持つ細胞クラスタを適性確認し定量化すること（qualifying and quantifying）を目的とし、
−  操作者による、正常な試料と比較した試料クラスタファイル内の１つ又は複数の異常の識別。
【０００９】
識別された異常から、例えば数値的閾値を超えることによって（細胞型の異常に低い又は異常に高い数）、及び医療サイトメトリーでの経験から、操作者は、生体試料が分析された患者の患者の病態若しくは関連する治療を直接決定でき、又は生体試料が分析された患者の考えられる病態に関する予後を発表し、その予後を確認するために補完的な血液検査を検討できる。
【００１０】
しかし、クラスタリング、分析及び識別のステップは非常に主観的であり、サイトメトリーにおける操作者の経験に強く依存しているため、操作者によって患者に示される診断又は予後は、操作者の質及び経験に依存する。しかし、これらのステップは時間と労力を要する。これらの機器の処理速度は、血液カウンターの処理速度と比較して遅い。
【００１１】
さらに、抗体を使用して非常に特異的な方法で細胞を特徴付ける免疫血液学のサイトメトリーは、高価な製品を使用するため、サイトメトリーを型どおりの方法（a routine method）として確立するのが困難になる。
【００１２】
最後に、共通の特性を持つ細胞をクラスタリングすることを目的としたこのタイプの分析は、集団を列挙及び適性判断して（qualify）、集団のタイプによってその異常を特定することが意図されている。したがって、このタイプの分析は、患者の試料の全体像のような、全体のデータには関心がない。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、これらの欠点を克服すること、及び、生体細胞を特徴付けるためにフローサイトメータによって収集されたデータを使用し、それらをクラスタごとに自動的にクラスタリングし、クラスタの集団を同定及び認定する（identify and qualify）だけでなく、データ全体を生体試料の画像表現とみなし、この画像を参照画像と相対的に処理することにより、新しい枠組みを取り入れることを目的とする。
【００１４】
本発明の、根底にある技術的課題は、特に、測定からのデータの処理を最適化し、得られる結果の再現性を保証し、この処理が高速の装置と相性がよく操作者に特別なスキルや時間を必要としないことを保証する、ということにある。
【００１５】
この目的のために、本発明は、血球を含む生体細胞を含む生体試料を分析する分析方法に関し、この方法は以下のステップを含む：
−  分析される生体試料の生体細胞の、フローサイトメータの測定セルへの通過、
−  分析される生体試料の生体細胞の、Ｎ個のサイトメトリーパラメータの測定、
−  分析される生体試料の各生体細胞について、対応する生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義される、Ｎ次元空間内の点の決定、ここでＮは３以上の整数、
−  試料クラスタファイルを定義するために、分析される生体試料の各生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じて、決定された点を異なる細胞クラスタに自動的にクラスタリングし、その試料クラスタファイルは、有利には、分析される生体試料をデジタルで記述し、好ましくは標準に従って記述されたコンピュータファイルであり、
−  試料クラスタファイルの異なる細胞クラスタによって定義される細胞集団の識別、
−  試料クラスタファイルの各細胞クラスタの点のカウント、
−  各参照クラスタファイルがそれぞれの病的又は異常な生体試料のサイトメトリーパラメータから定義されており、試料クラスタファイルと参照クラスタファイルとの比較。
【００１６】
本発明に係る分析方法のそのような構成は、分析される生体試料をデジタルで記述する試料クラスタファイルと１つ又は複数の参照クラスタファイルとの間の考えられる類似性を自動的に識別し、それゆえ比較のステップの最後に操作者に返される表示の関連性を（例えば、返される測定値に追加される特定の表示又は警告を介して）改善し、それゆえ診断を迅速化するために可能な限り最も適切な推奨事項を操作者に提供するのに役立つ、ことが可能になる。特に、本発明に係る分析方法により、実験室は、決定のための時間を節約し、その後の調査の範囲を特定し、必要な場合は、血液学者をより迅速に血液塗抹検査とそれに続くシンプルで安価な堅牢な手段を使用した顕微鏡分析又は免疫測定であってもよい補足分析に導くことができる。このプロセスを、追加の費用、材料、時間もなしに、デジタル血球算定から可能な限り最大限の情報を引き出すため、血液塗抹標本の画像の分析に置き換えることは問題ではない。
【００１７】
本発明に係る分析方法は、より詳細には、サイトメトリー測定に基づいて、考慮される生体試料の参照生体試料との比較形態学的分析、より具体的には、分析される生体試料から確立された試料クラスタファイルの、臨床データが既知である病的又は異常な生体試料から確立された参照クラスタファイルとの比較形態学的分析を実行することにより構成される。
【００１８】
したがって、本発明に係る分析方法は、その病理が既知である試料から得られた参照ファイルを実行することに基づく。これは実際には、臨床試験の編集によって行われた学習であり、新しい異常又は病理に対応する新しい参照ファイルに応じて進行し得る。
【００１９】
各学習バージョンは各マシンに固有のものではなく、調製（希釈、溶解、蛍光標識）のために同一の組成の試薬で動作する同じタイプのすべてのマシンに有効であり適用されるものである。
【００２０】
血液中を循環する細胞は、造血によって、内皮細胞の剥離によって、及び細菌などの同種異系物質（allogeneic agents）又はマラリア原虫（plasmodium）などの寄生虫による感染によって、生成されるものから生じる。造血は、骨髄において、一方では白血球、すなわち多核又は好中球、好酸球及び好塩基球の顆粒球、単球及びリンパ球、また他方では赤血球及び血小板を産生した。各タイプの細胞は、例えば、まだ核を備えている赤血球又はもはや核を持たないが依然としてリボソームを有しミトコンドリアの活動のある網状赤血球である赤芽球などの、血液中の未成熟細胞の原因となり得るあるさまざまなタイプの病状の影響を受ける可能性がある。
【００２１】
本発明の一実施形態によれば、測定されるサイトメトリーパラメータは、各生体細胞の体積、光吸収、大きな角度での回折、小さな角度での回折などの物理的測定結果である。
【００２２】
分析方法は、単独で又は組み合わせて、以下の特徴の１つ以上をさらに備えていてもよい。
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、分析される生体細胞は、血液細胞、より具体的には、調製の対象物である血液細胞であってもよい。調整は、細胞を保存するための、及びそれらをサイトメータで十分に間隔を空けることができるようにして最適条件で各サイトメトリーパラメータを測定するための、等張希釈、又は白血球よりも約１０００倍数が多い赤血球を排除する選択的溶解操作である。この溶解操作には、白血球をより短時間で識別してカウントでき、また、溶解の種類に応じて、観察される非溶解細胞の量及び光学応答を変化させるという効果がある。
【００２４】
実際、本発明の好ましい実施形態は、２つのサイトメータを並行して使用し、第１には生体試料を希釈するだけであり、第２には溶解した生体試料を処理し、より詳細には有核細胞を観察する。これにより、溶解した生体試料及び溶解していない生体試料の両方について、次元Ｎ＞３の空間でデータを収集できるようになる。これは、赤血球及び血小板である非有核細胞が有核細胞と同じタイプのアルゴリズムによって処理されることを意味する。
【００２５】
本発明の一実施形態によれば、クラスタリングのステップは、特定のアルゴリズムに従って、分析される生体試料の各生体細胞に対応するＮ個のサイトメトリーパラメータによって決定される点の自動処理によって実行される。その異なる点は、Ｎ次元空間に配置されたクラスタにグループ化された、各細胞を表す点によって分析される生体試料をデジタルで記述するファイルを定義するために、例えば、Ｎ次元空間内のこれらの点の統計的基準又は密度基準に従って、点の異なるクラスタにクラスタリングされてもよい。
【００２６】
本発明の一実施形態によれば、分析方法は、Ｎ個の測定チャネル各々についてデジタルオシログラムに類似した第１の生データファイルを定義するために、測定のステップ中に生成されたアナログ信号の組をサンプリング及びデジタル化するステップと、コンピュータ処理の第１レベルによって、分析される試料の各生体細胞についてのＮ個のデジタル化信号の同期及びグループ化のステップとを含む。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、クラスタリングのステップは、統計的方法を使用して決定された点を異なる細胞クラスタにクラスタリングすること、又はＮ次元空間内の細胞を表す点の空間密度分析によってクラスタを分離することを可能にすることにより構成されている。
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、Ｎ次元空間の各座標軸は、それぞれのサイトメトリーパラメータに対応する。
【００２９】
本発明の一実施形態によれば、Ｎは４以上の整数であり、例えば５に等しくてもよい。
【００３０】
本発明の一実施形態によれば、試料クラスタファイルは、ＦＣＳ（フローサイトメトリースタンダード）フォーマットである。
【００３１】
本発明の一実施形態によれば、分析方法は、試料クラスタファイルが参照クラスタファイルと少なくとも部分的に同一又は類似であるとき、及び例えば試料クラスタファイルの所定の細胞クラスタが参照クラスタファイルの所定の細胞クラスタと同一又は類似であるとき、警告メッセージを発生させる（emitting an alarm message）ステップをさらに含む。
【００３２】
本発明の一実施形態によれば、発せられる警告メッセージは、試料クラスタファイルが少なくとも部分的に同一又は類似である参照クラスタファイルに関連する病理又は異常に関連する表示を含む。これらの構成により、分析される生体試料に関連する病理の可能性を操作者に伝えることができるが、分析される生体試料が採取された患者が影響を受ける可能性のある病理の診断にはならない。
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、分析方法は、試料クラスタファイル内の少なくとも１つの起こり得る異常を検出するために試料クラスタファイルを分析するステップをさらに含む。
【００３４】
本発明の一実施形態によれば、比較のステップは、分析のステップ中に少なくとも１つの異常が検出された場合にのみ実行される。
【００３５】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップ中に少なくとも１つの異常が検出されると、発生のステップ（the emission step）で発生される警告メッセージは、その少なくとも１つの検出された異常に関する情報も含む。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは、試料クラスタファイルの各細胞クラスタについて、前記細胞クラスタの少なくとも１つの形態学的パラメータを分析するステップを含む。
【００３７】
本発明の一実施形態によれば、試料クラスタファイルの各細胞クラスタの少なくとも１つの形態学的パラメータは、前記細胞クラスタの配置、前記細胞クラスタの点の分布、前記細胞クラスタの点の数、及び／又は前記細胞クラスタの存在又は不在を含む。したがって、細胞クラスタの異常なカウント、異なる細胞クラスタ間の異常な相対位置、又は異常な細胞集団に関連する細胞のクラスタの存在を検出することにより、試料クラスタファイルの異常を検出が可能になる。
【００３８】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは、試料クラスタファイルの少なくとも１つの細胞クラスタの少なくとも１つの形態学的パラメータがそれぞれの所定の閾値を超える場合に異常を検出するステップを含む。
【００３９】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは以下を含む： 
−  試料クラスタファイルの各細胞クラスタについて、前記細胞クラスタにクラスタリングされた点の数と、少なくとも１つのそれぞれの所定の閾値との比較、
−  少なくとも１つの細胞クラスタにクラスタリングされた点の数が、少なくとも１つのそれぞれの所定の閾値よりも小さい及び／又は大きい場合の異常の検出。
【００４０】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは以下を含む：
−  試料クラスタファイルの各細胞クラスタについて、前記細胞クラスタにクラスタリングされた点の数と、それぞれの所定の比較的小さな閾値又はそれぞれの所定の比較的大きな閾値との比較、
−  少なくとも１つの細胞クラスタにクラスタリングされた点の数が、それぞれの所定の比較的小さな閾値よりも少ない場合、又はそれぞれの所定の比較的大きな閾値よりも大きい場合の、異常の検出。
【００４１】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは以下を含む： 
−  試料クラスタファイルの各細胞クラスタ内の点の分布の分析、
−  少なくとも１つの細胞クラスタ内の点の分布がガウス分布でない場合の異常の検出。
【００４２】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは以下を含む： 
−  試料クラスタファイルの細胞クラスタの配置の分析、
−  試料クラスタファイルの少なくとも２つの細胞クラスタが少なくとも部分的に雑然としている（confused）場合の異常の検出。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは以下を含む： 
−  試料クラスタファイルの細胞クラスタの分析、
−  少なくとも１つの所定の細胞クラスタの有無が検出された場合の異常の検出。
【００４４】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは以下を含む：
−  試料クラスタファイルの分析、
−  細胞クラスタの数が所定の参照値よりも大きい又は小さい場合の異常の検出。
【００４５】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは、異常又は非定型の細胞クラスタ、すなわち、例えば未成熟細胞又は寄生虫に対応し得る正常又は非定型の細胞クラスタの外部に位置する異常又は非定型の細胞クラスタを検索するステップを含む。分析方法は、これらの異常又は非定型の細胞クラスタを参照ファイルと比較するステップをさらに含み得る。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、サイトメトリーパラメータを測定するステップは、分析される生体試料の生体細胞の形態及び／又は構造を表すサイトメトリーパラメータを測定する少なくとも１つのステップを含む。
【００４７】
本発明の一実施形態によれば、サイトメトリーパラメータを測定するステップが、分析される生体試料の各生体細胞について、前記生体細胞の少なくとも１つの光学特性を測定する少なくとも１つのステップを含む。
【００４８】
本発明の一実施形態によれば、サイトメトリーパラメータを測定するステップが、分析される生体試料の各生体細胞について、前記生体細胞の少なくとも１つの電気的及び／又は電磁気的特性を測定する少なくとも１つのステップを含む。
【００４９】
本発明の一実施形態によれば、サイトメトリーパラメータを測定するステップが、分析される生体試料の各生体細胞によって吸収又は再放射される光の量を測定するステップを含む。
【００５０】
本発明の一実施形態によれば、サイトメトリーパラメータを測定するステップが以下を含む：
−  各生体細胞によって小角度で散乱された光線の強度を測定するステップ、及び／又は
−  各生体細胞によって９０°で散乱された光線の強度を測定するステップ、及び／又は
−  各生体細胞によって入射光線の光路に沿って散乱された光線強度を測定するステップ。
【００５１】
各生体細胞によって散乱された光は、前記生体細胞の形態及び構造に関する情報を提供する。特に、各生体細胞によって小さい角度、例えば１５°未満の角度、有利には４°及び／又は９°に等しい角度で散乱された光線の強度は、前記生体細胞のサイズに実質的に比例する。一方、各生体細胞によって９０°で散乱された光線の強度は、前記生体細胞の形状、内部構造及び粒度に比例する。さらに、各生体細胞による入射光線の光軸における光線の強度は、前記生体細胞のサイズ及び生存能力（the viability）に比例する。入射光線の光路に沿ったそのような散乱の測定は、各生体細胞の光吸収の強度の測定に対応する。
【００５２】
したがって、これら２つ又は３つの前述のパラメータ（インピーダンス測定、光吸収測定、異なる角度での散乱測定）を同時に用いると、生体試料、例えば血小板、赤血球、リンパ球、単球及び多形核白血球の異なる集団を、区別できるようになる。
【００５３】
以下で伝達される角度値は、入射光線の光路に相対的なものであると理解される。
【００５４】
本発明の一実施形態によれば、サイトメトリーパラメータを測定するステップは、各生体細胞により、例えば９０°で放射された少なくとも１つの蛍光線の強度を測定するステップを含む。
【００５５】
本発明の一実施形態によれば、サイトメトリーパラメータを測定するステップは、生体細胞が測定チャンバを通過することによって発生する電気インピーダンスの変動を測定するステップをさらに含む。
【００５６】
本発明の一実施形態によれば、サイトメトリーパラメータを測定するステップは、以下のステップを含む：
−  入射光線が生体細胞の経路と交差するように、測定チャンバを通過する生体細胞に向けての入射光線の放射、
−  測定チャンバを通過する各生体細胞からの少なくとも１つの光線の検出。
【００５７】
本発明の一実施形態によれば、通過ステップは、測定チャンバを通過する生体細胞の流体力学的被覆の少なくとも１つのステップを含む。
【００５８】
本発明の一実施形態によれば、検出ステップは、測定チャンバを通過する各生体細胞によって散乱される少なくとも１つの光線と、測定チャンバを通過する各生体細胞によって放射される少なくとも１つの蛍光線とを同時に検出するステップを含む。
【００５９】
本発明の一実施形態によれば、検出ステップは、少なくとも２つの異なる波長を有し、測定チャンバを通過する各生体細胞によって少なくとも２つの異なる方向に散乱される光線と、測定チャンバを通過する各生体細胞によって放射される少なくとも２つの蛍光線とを同時に検出するステップを含む。
【００６０】
本発明の一実施形態によれば、分析方法は、前記生体細胞の構造及び／又は形状を決定するステップを含む。
【００６１】
本発明の一実施形態によれば、分析方法は、生体細胞の濃度及び／又はそれぞれの細胞クラスタにおける生体細胞の分布を決定するステップを含む。
【００６２】
本発明の一実施形態によれば、分析方法は、さらに、以下のステップを含む：
−  参照生体試料の生体細胞の、フローサイトメータの測定セルへの通過、
−  参照生体試料の各生体細胞についてのＮ個のサイトメトリーパラメータの測定、
−  参照生体試料の各生体細胞について、参照生体試料の前記生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義される、Ｎ次元空間内の点の決定、ここでＮは３以上の整数、
−  参照クラスタファイルを定義するために、参照生体試料の各生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じて、参照生体試料に関連して決定された点を異なる細胞クラスタに自動的にクラスタリング、
−  複数の参照クラスタファイルを定義するために、複数の参照生体試料について、前記の通過、測定、決定及びクラスタリングのステップの繰り返し。
【００６３】
本発明の一実施形態によれば、分析方法は、分析される生体試料の生体細胞の通過のステップの前に、分析される生体試料を調製するステップを含む。この調整ステップは、例えば等張希釈剤を使用して、例えば分析される生体試料を希釈するステップを含む。調製ステップはまた、この希釈ステップに加えて、分析される生体試料に含まれる少なくともいくつかのの生体細胞、例えば赤血球の、選択的溶解のステップを含み得る。
【００６４】
本発明の一実施形態によれば、調製ステップは、分析される生体試料に含まれる少なくともいくつかの生体細胞、より詳細には、分析される生体試料に含まれる少なくともいくつかの生体細胞の核酸を、蛍光染料（a fluorescent dye）などの蛍光色素（a fluorochrome）で標識するステップを含む。
【００６５】
本発明の一実施形態によれば、分析方法は、試料クラスタファイルを参照クラスタファイルとして統合するステップを含む。このような統合ステップは、特に、血液学者が分析される生体試料に関連する病理を識別し、そのような病理に関連する表示を試料クラスタファイルに関連付けた後に実行される。
【００６６】
本発明の一実施形態によれば、分析方法、特に分析のステップは、試料クラスタファイルを正常なクラスタファイルと比較するステップを含み、その正常なクラスタファイルの各々は、それぞれの正常な生体試料のサイトメトリーパラメータから定義される。本明細書において、用語「正常な」生体試料は、病的ではなく、異常ではない生体試料を意味する。
【００６７】
本発明の一実施形態によれば、調製ステップは、分析される生体試料中に、生体細胞の膜上に位置する受容体に特異的な抗体を含む１つ又は複数の試薬を加えることを含む。これらの抗体は、蛍光トレーサー、又は各細胞上で１つ以上の特定の信号を生成できるようにする粒子に接合されている。したがって、本発明に係る分析方法は、診断をより適切に特定又は確認できるようにするために、サイトメトリーパラメータにデジタル変換された基本的な物理的大きさ（the basic physical magnitudes）に、要求に応じて免疫血液学的測定値を追加することを可能にする。
【００６８】
本発明はさらに、以下を備える分析装置に関する：
−  分析される生体試料の生体細胞の通過のための測定セルと、分析される生体試料の生体細胞のサイトメトリーパラメータを測定するように構成された測定手段とを含むフローサイトメータ、及び
−  以下のように構成された処理ユニット：
−  分析される生体試料の各生体細胞について、対応する生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義されるＮ次元空間内の点を決定し、ここでＮは３以上の整数であり、
−  試料クラスタファイルを定義するために、分析される生体試料の各生体細胞について、測定されたサイトメトリーパラメータに応じて、点を異なる細胞クラスタにクラスタリングし、
−  各参照クラスタファイルがそれぞれの病的又は異常な生体試料のサイトメトリーパラメータから定義されており、試料クラスタファイルと参照クラスタファイルとを比較する。
【００６９】
本発明の一実施形態によれば、分析装置は、血液装置（a hematology device）などのインビトロ診断のための分析装置である。
【００７０】
本発明の一実施形態によれば、フローサイトメータの測定セルは、水平面に対して、例えば約４５°の角度だけ傾斜している。
【００７１】
いずれの場合でも、本発明は、非限定的な例として、このフローサイトメータの実施形態を表す添付の概略図を参照して、以下の説明より、明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明に係るフローサイトメータに属するフローサイトメータの斜視図である。
【図２】本発明に係るフローサイトメータに属するフローサイトメータの斜視図である。
【図３】図１のフローサイトメータの断面図である。
【図４】図３の細部の拡大図である。
【図５】図１のフローサイトメータの断面図である。
【図６】図２のVI-VI線に沿った断面図である。
【図７】図３の細部の拡大図である。
【図８】本発明に係るフローサイトメータを含む分析装置の上面図である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
図１〜７は、本発明に係る分析装置２に属する、サイトメトリー測定ヘッド（cytometric measurement head）とも呼ばれるフローサイトメータ３を示す。
【００７４】
フローサイトメータ３は、例えば金属支持体であってもよい一体型の支持体４を備える。支持体４は平行六面体形状であり、内部受容ハウジング５を区切る。支持体４は、特に、支持体４の６つの外面にそれぞれ形成された６つの通路開口部を含む。
【００７５】
フローサイトメータ３はさらに、測定チャンバ７の境界を少なくとも部分的に定める測定セル６（図４により詳細に示される）、生体細胞の流れＦを測定チャンバ７に注入するように配置された注入装置８、及び測定チャンバ７に注入された生体細胞の流れＦをフローサイトメータ３の外部に排出するように構成された排出装置９を含む。
【００７６】
図４に示すように、測定セル６は環状であり、注入装置及び排出装置８、９の間に密封するようにして挿入されている。測定セル６は、支持体４によって区切られた受容ハウジング５に収容され、流体的に隔離されている。測定セル６は、電気的に絶縁性で光を透過する材料で構成されていることが好ましく、例えば、自家蛍光を避けるためにポリメチルメタクリレート、ガラス又は石英で構成されている。
【００７７】
注入及び排出装置８、９は、支持体４の２つの反対側の外面、例えば、支持体４の反対側の外側面にそれぞれ固定されている。しかし、注入及び排出装置８、９は、支持体４の上下２つの外面にそれぞれ固定されていてもよい。
【００７８】
図３及び６により詳細に示されるように、注入装置８は、内部チャンバ１２の範囲を定める注入ノズル１１を備える。注入ノズル１１は、測定チャンバ７に開口し、内部チャンバ１２を測定チャンバ７に流体接続する（fluidly connect）ように配置された、注入口１３を備える。
【００７９】
注入装置８はさらに、分析される生体細胞を懸濁状態で含む分析される生体試料を内部チャンバ１２に供給するための第１の管状供給導管１４を備える。
【００８０】
図１に示すように、注入装置８はさらに、内部チャンバ１２に流体接続され、内部チャンバ１２の内容物をフローサイトメータ３の外部に輸送するための輸送導管１５を備える。輸送導管１５は、より詳細には、内部チャンバ１２に導かれたすすぎ流体を、第１の供給ダクト１４を介してフローサイトメータ３の外部に送るためのものである。
【００８１】
注入装置８はさらに、内部チャンバ１２に被覆流体（a sheathing fluid）を供給するように意図された第２の供給導管１６を備える。注入ノズル１１及び第２の供給導管１６は、第２の供給導管１６を介して内部チャンバ１２に導かれる被覆流体が、内部チャンバ１２に導かれる生体試料を、その生体試料が注入口１３を通過する前に、流体力学的に被覆できるように構成されている。
【００８２】
図７に示すように、排出装置９は、測定チャンバ７に開口する内部チャンバ１７の境界を定め、測定チャンバ７に流体接続され、測定チャンバ７に注入された生体細胞の流れＦをフローサイトメータ３の外部に排出するための管状排出導管１８をさらに備える。排出ダクト１８は、部分的に内部チャンバ１７内に延在し、注入口１３の反対側の測定チャンバ７内に開口している。
【００８３】
排出装置９は、測定チャンバ７に流体接続され、測定チャンバ７に被覆流体を供給するための第３の供給導管１９をさらに備える。測定チャンバ７及び第３の供給導管１９は、第３の供給導管１９を介して測定チャンバ７に導かれる被覆流体が、測定チャンバ７を通って流れる生体細胞の流れＦを流体力学的に被覆できるように構成されている。
【００８４】
図１及び７に示されるように、排出装置９はさらに、測定チャンバ７に流体接続され、測定チャンバ７の内容物をフローサイトメータ３の外部に送るための輸送導管２１を備える。輸送導管２１は、より具体的には、測定チャンバ７に導かれたすすぎ流体を、第３の供給導管１９を介してフローサイトメータ３の外部に送るためのものである。
【００８５】
フローサイトメータ３はさらに、分析される生体細胞のサイトメトリーパラメータを測定するように、特に、分析される生体細胞の光学的及び電気的特性を測定するように、構成された測定手段を備える。
【００８６】
図１〜７に示される実施形態によれば、測定手段は、測定チャンバ７の方向に向かって、測定チャンバ７に導かれる生体細胞の流れＦと交差可能な、すなわち、生体細胞の流れＦを横切ることが可能な、入射光線を放射するように配置された放射装置２２と、生体細胞の流れＦに対して角度的にオフセットされ、測定チャンバ７を通過する生体細胞から発せられる光線を収集するように配置されたいくつかの収集装置２３ａ、２３ｂ、２３ｃとを備える。それにもかかわらず、測定手段は、例えば、生体細胞の流れに対して角度的にオフセットされたいくつかの放射装置、及び単一の又はいくつかの収集装置を備えていてもよい。
【００８７】
放射及び収集装置は、支持体４の上側及び下側の外面に取り付けられ、生体細胞の流れＦの流れ方向に実質的に垂直な平面内に及ぶ。収集装置２３ａは、例えば、測定セル６に対して放射装置２２の反対側に配置され、その一方で収集装置２３ｂ及び２３ｃは、測定セル６に対して放射装置２２と垂直に配置される。しかし、本発明の変形例によれば、放射装置２２及び収集装置２３ａは、支持体４の外側面に取り付けられていてもよい。
【００８８】
放射装置２２は、入射光線を発生するように構成された光源２４を備える。光源２４は、例えば、レーザービームを発生するように構成されたレーザー光源であってもよい。
【００８９】
図１〜７に示される実施形態及び図１からのさらに詳細な以下によれば、収集装置２３ａは、複数の収集光学要素、より具体的には中央収集光ファイバ２５ａ、及び１つ又はいくつかの周辺収集光ファイバ２５ｂを備える。例えば、中央収集光ファイバ２５ａは、入射光線の光路に沿って、すなわち０°で、測定チャンバ７からの光線を収集することが意図され、周辺収集光ファイバ２５ｂは、いくつかは測定チャンバ７から４°の角度範囲で光線を収集し、そのほかは測定チャンバ７から９°の角度範囲で光線を収集することが意図されている。しかし、収集装置２３ａは、単一の周辺収集光ファイバ２５ｂを備えていてもよい。
【００９０】
収集装置２３ｂは、例えば、中央収集光ファイバなどの単一の収集光学要素を備えていてもよく、収集装置２３ｃは、例えば、中央収集光ファイバなどの単一の収集光学要素を備えていてもよい。
【００９１】
測定手段は、各々がそれぞれの収集装置２３ａ〜２３ｃに関連付けられた複数の検出要素（図示しない）をさらに備える。各検出要素は、それぞれの収集装置によって収集された光線に応じて決定された測定信号を出力するように構成されている。各生体細胞が入射光線を通過するとき、各検出要素によって出力される各測定信号は、例えば、前記生体細胞によって吸収又は再放射される光量に比例する。各検出要素は、例えば、フォトダイオード又は光電子増倍管などの光検出器であってもよい。
【００９２】
測定手段はさらに、生体細胞が注入口１３を通過することによって発生する電気インピーダンスの変動を測定するように構成された電気インピーダンス変動測定装置を備えることが有利である。電気インピーダンス変動測定装置は、例えば、注入口１３のいずれかのサイドにそれぞれ配置された第１及び第２の電極（図示しない）を備える。第１及び第２の電極は、注入口１３を通して電場を発生させるために、生体細胞の流れＦと電気的に接触することが意図されている。電気インピーダンス変動測定装置の変形例によれば、後者は、内部チャンバ１７内に少なくとも部分的に配置された単一の電極を備えていてもよく、内部チャンバ１２の電位を接地して、電気インピーダンス変動測定装置が内部チャンバ１２及び内部チャンバ１７内に配置された電極間の電気インピーダンス変動を測定するように構成されていてもよい。
【００９３】
このような電気インピーダンス変動測定装置は、注入口１３を通過する生体細胞の数を数えること、及び、サイズ、より具体的には生体細胞の体積を決定することを可能にする。そのような電気インピーダンス変動測定装置の動作は当業者に知られており、したがって詳細には説明されない。しかし、各生体細胞が注入口１３を通過すると、前記生体細胞のサイズ又は体積に比例する電気パルスが発生することに留意されたい。
【００９４】
図８に示すように、分析装置２は、フローサイトメータ３の測定手段によって測定されたサイトメトリーパラメータを分析し、特に各検出要素によって提供される測定信号を分析するように構成された処理ユニット３２をさらに備える。処理ユニット３２は、より詳細には、分析される生体試料の生体細胞を区別及び識別するように、特に、測定手段によって測定されたサイトメトリーパラメータから生体細胞の構造及び形状を決定するように構成されている。処理ユニット３２は、より具体的には、マイクロプロセッサを備えた少なくとも１つの電子処理カードを備える。
【００９５】
図８に示されるように、分析装置２は、２つのフローサイトメータ３、及び少なくとも１つのラックを第１の変位方向Ｄ１に変位させるように配置されたローディングモジュール３３、少なくとも１つのラックを第２の変位方向Ｄ２に変位させるように構成されたアンローディングモジュール３４、ローディングモジュールとアンローディングモジュールとの間で少なくとも１つのラックを変位させるように構成された攪拌モジュール（図８では視認できない）とを備え、攪拌モジュール、ローディング及びアンローディングモジュールは、略Ｕ字型のラック輸送経路を定義する。有利には、分析装置２はまた、攪拌モジュール内に配置されたラックに収容された容器内の生体液の試料を採取するように構成されたサンプリングモジュール３６を備える。
【００９６】
分析装置２はまた、以下を備えていてもよい。
【００９７】
−  ローディングモジュールとアンローディングモジュールとの間に配置され、実質的に垂直な回転軸を有するローディングロータ３７であって、このローディングロータ３７は、分析される生体液又は反応生成物の試料が入った容器を収容可能な、特に免疫血液学だけでなく全血液に対する免疫学試験を実行するためのカートリッジを収容可能な、複数のハウジング３８を備え、回収モジュール３６は、ローディングロータ３７に収容された容器から試料又は反応生成物を回収するように構成されている。
【００９８】
−  ローディングロータ３７に関連し、ローディングロータ３７をその回転軸の周りに回転駆動するように構成された回転駆動手段。
【００９９】
−  実質的に垂直な回転軸を有する調製ロータ３９であって、この調製ロータ３９は複数の調製キュベット４１を含み、サンプリングモジュール３６は、事前に採取された生体液又は反応生成物の試料を調製キュベット４１に供給するように構成されており、
−  調製ロータ３９に関連付けられ、その回転軸の周りに調製ロータ３９を回転駆動するように構成された回転駆動手段。
【０１００】
ローディングロータ３７におけるカートリッジの存在により、追加の調製試薬を加えることができ、したがって、物理的又は形態学的性質のサイトメトリーパラメータの測定に、免疫血液学的性質のサイトメトリーパラメータの測定を追加できる。
【０１０１】
さらに、分析装置２は、調製ロータ３９に設けられた、溶液中の磁性粒子を捕捉することを可能にする磁性装置を備えていてもよい。これらの磁性粒子は、特定の種類の細胞、例えばすべての白血球を、選択的に捕捉できるようにする抗体で覆われている。したがって、等張希釈剤に再懸濁した後、調製された生体試料は白血球のみを含み、数千倍も多い赤血球を溶解によって破壊する必要はなかった。したがって、白血球は損傷を受けておらず、少数又はレアな細胞を識別する可能性があるとともに、非常に多くの細胞においてＮ個のサイトメトリーパラメータの測定を実行できるような希釈率を適応させることが可能である。さらに、白血球はまた、従来の免疫学的同定のために選択的に標識され得る（例えば、Ｔリンパ球）。
【０１０２】
次に、本発明に係るフローサイトメータ２を用いて生体細胞を含む生体試料を分析する方法について説明する。
【０１０３】
このような分析プロセスは、以下のステップを含む：
−  分析される生体試料の調製であって、この調製ステップは、例えば、等張希釈剤を使用して、例えば分析される生体試料を希釈するステップ、及び／又は赤血球などの分析される生体試料に含まれる生体細胞の少なくともいくつかを選択的に溶解するステップを含む調製ステップ、及び／又は分析される生体試料に含まれる生体細胞の少なくともいくつかを蛍光色素で標識するステップ、
−  分析される生体試料に含まれる生体細胞の、フローサイトメータ３の測定チャンバ７への通過。
【０１０４】
−  フローサイトメータ３を使用して、分析される生体試料の生体細胞の形態及び／又は構造を表すサイトメトリーパラメータなど、分析される生体試料に含まれる各生体細胞のＮ個のサイトメトリーパラメータの測定、
−  分析される生体試料の各生体細胞について、分析される生体試料の前記生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義されるＮ次元空間内の点の決定であって、Ｎ次元空間の各座標軸は、それぞれの測定されたサイトメトリーパラメータ又は前記それぞれの測定されたサイトメトリーパラメータから計算された値に対応し、
−  例えばＦＣＳ（フローサイトメトリースタンダード）フォーマットである試料クラスタファイルを定義するために、分析される生体試料の各生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じて、異なる細胞クラスタにおける分析される生体試料に関連する点を自動的にクラスタリング、
−  試料クラスタファイルの異なる細胞クラスタによって定義された細胞集団の自動識別、
−  試料クラスタファイルの各細胞クラスタの点の自動カウント、
−  各参照クラスタファイルが、それぞれの病的又は異常な生体試料のサイトメトリーパラメータから定義されており、試料クラスタファイルと参照クラスタファイルとの比較、
−  試料クラスタファイルが参照クラスタファイルと少なくとも部分的に同一又は類似である場合、特に試料クラスタファイルの所定の細胞クラスタが参照クラスタファイルの所定の細胞クラスタと同一又は類似である場合の、警告メッセージの発生であって、発生された警告メッセージは、有利には、試料クラスタファイルが少なくとも部分的に同一又は類似である参照クラスタファイルに関連する病理又は異常に関する表示を含み、決定、クラスタリング、比較及び発生のステップは、処理ユニット３２によって実行される。
【０１０５】
このような自動クラスタリングのステップは、当業者に知られているさまざまな方法で実行できるため、ここでは詳細に説明しない。
【０１０６】
本発明の一実施形態によれば、分析方法は、Ｎ個の測定チャネルの各々について第１のデジタル化生データファイルを定義するために、測定のステップ中に生成されたアナログ信号の組をサンプリング及びデジタル化するステップを含み、第１レベルのコンピュータ処理によって分析される試料の各生体細胞のＮ個のデジタル化された信号を同期及びクラスタリングするステップを含む。前記サンプリング及びデジタル化ステップは、ファイルを分析するＰＣタイプのコンピュータユニット（図８には図示しない）にイーサネットリンクによってファイルを送信する処理ユニット３２によって実行される。
【０１０７】
分析方法の実施形態によれば、後者は、試料クラスタファイル内の少なくとも１つの考えられる異常を検出するために試料クラスタファイルを分析するステップをさらに含み、この分析のステップは、処理ユニット３２によって実行される。有利には、比較のステップは、分析のステップ中に少なくとも１つの異常が検出された場合にのみ実行され、送信のステップ中に発生された警告メッセージは、検出された少なくとも１つの異常に関する情報も含む。これらの構成により、一方では、分析される生体試料が正常で病的でない場合に比較のステップを実行する必要がなくなるため、計算の実行時間を短縮し、分析結果をより迅速に操作者に提供でき、及び他方では、分析される生体試料が病的又は異常である場合、可能な限り詳細な警告メッセージを操作者に伝達できる。
【０１０８】
分析のステップは、有利には以下のステップを含む：
−  試料クラスタファイルの各細胞クラスタについて、前記細胞クラスタの配置、前記細胞クラスタの点の分布、前記細胞クラスタの点の数、及び／又は前記細胞クラスタの有無などの、前記細胞クラスタの少なくとも１つの形態学的パラメータの分析、
−  試料クラスタファイルの少なくとも１つの細胞クラスタの少なくとも１つの形態学的パラメータが、それぞれの所定の閾値を超える場合の異常の検出。
【０１０９】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは、より具体的には以下のステップを含む：
−  試料クラスタファイルの各細胞クラスタについて、前記細胞クラスタにおいてクラスタリングされた点の数と、少なくとも１つのそれぞれの所定の閾値との比較、
−  試料クラスタファイルの各細胞クラスタ内の点の分布の分析、
−  試料クラスタファイルの細胞クラスタの配置の分析、
−  少なくとも特定の所定の細胞クラスタの存在及び／又は不在の分析、
−  少なくとも１つの細胞クラスタ内の点の分布がガウス分布でない場合の異常の検出、
−  試料クラスタファイルの少なくとも２つの細胞クラスタが少なくとも部分的に雑然としている場合の異常の検出、
−  少なくとも１つの所定の細胞クラスタの有無が検出された場合の異常の検出、
−  細胞クラスタの数が所定の参照値より大きいか又は小さい場合の異常の検出、
−  細胞クラスタの少なくとも１つにクラスタリングされた点の数が、それぞれの所定の閾値より小さい及び／又は大きい場合の異常の検出。
【０１１０】
本発明の一実施形態によれば、分析のステップは、試料クラスタファイルを正常なクラスタファイルと比較するステップを含み、正常なクラスタファイルの各々は、それぞれの正常な生体試料のサイトメトリーパラメータから定義される。これらの配置により、特に試料クラスタファイル内の異常の検出が容易になる。
【０１１１】
本発明の一実施形態によれば、サイトメトリーパラメータを測定するステップは、以下のステップを含む：
−  放射装置２２を使用して、入射光線が生体細胞の経路と交差するように、測定チャンバ７を通過する生体細胞に向かう入射光線を放出し、
−  収集装置２３ａ〜２３ｃを使用して、測定チャンバ７を通過する各生体細胞からの異なる光線の検出し、
異なる収集装置２３ａ〜２３ｃの構成及び配置を前提とすると、サイトメトリーパラメータを測定するステップは、特に以下のステップを含む： 
−  収集装置２３ａの収集光ファイバ２５ｂ、２５ｃを使用し、各生体細胞によって小さな角度で散乱された光ビームの強度を測定する、
−  収集装置２３ａの中央収集光ファイバ２５ａを使用し、各生体細胞によって入射光線の光路に沿って散乱された光線の強度の測定、
−  収集装置２３ｂを使用し、各生体細胞により９０°で散乱された光線の強度の測定、及び
−  収集装置２３ｃを使用し、各生体細胞により９０°で放射された蛍光線の強度の測定。
【０１１２】
有利には、サイトメトリーパラメータを測定するステップは、電気インピーダンス変動測定装置を使用して、生体細胞が測定チャンバ７を通過することによって発生する電気インピーダンスの変動を測定するステップをさらに含む。
【０１１３】
有利には、分析方法は、最初の以下のステップを含む：
−  フローサイトメータ３を使用して、参照生体試料に含まれる各生体細胞についてのサイトメトリーパラメータを測定する、
−  参照生体試料の各生体細胞について、参照生体試料の各生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じてその座標が定義されるＮ次元空間内の点を決定する、ここで、Ｎ次元空間の各座標軸はそれぞれの測定されるサイトメトリーパラメータに対応する、
−  参照クラスタファイルを定義するために、参照生体試料に関連する点を、参照生体試料の各生体細胞について測定されたサイトメトリーパラメータに応じて、異なる細胞クラスタに自動的にクラスタリングし、ここで、各参照クラスタファイルは、例えばＦＣＳ（フローサイトメトリースタンダード）フォーマットであり、決定及びクラスタリングのステップは、処理ユニット３２により実行され、
−  複数の参照クラスタファイルを定義するために、複数の参照生体試料について、前記初期測定、決定及びクラスタリングの各ステップを繰り返す。
【０１１４】
もちろん、本発明は、例としての記載した、フローサイトメータの実施形態及び分析方法の実施形態に限定されず、それとは逆に、そのすべての変形を包含する。
【図１】
2021516335.tif 000003
【図２】
2021516335.tif 000004
【図３】
2021516335.tif 000005
【図４】
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【図５】
2021516335.tif 000007
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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