(57)【要約】本開示は、自閉症スペクトラム障害を処置する方法を提供する。より詳細には、本開示は、臍帯血組織由来の間葉系間質細胞を使用して自閉症スペクトラム障害を処置する方法に関する。ある態様では、本開示は、自閉症スペクトラム障害を有するまたは有する疑いがある患者を処置する方法であって、患者に、治療有効量のヒト同種異系の臍帯組織由来の間葉系間質細胞（ｈＣＴ−ＭＳＣ）を投与することを含む方法を含む。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣは全身投与される。
2021520380.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自閉症スペクトラム障害を有するまたは有する疑いがある患者を処置する方法であって、前記患者に、治療有効量のヒト同種異系の臍帯組織由来の間葉系間質細胞（ｈＣＴ−ＭＳＣ）を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記ｈＣＴ−ＭＳＣが全身投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｈＣＴ−ＭＳＣが静脈内投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記患者が、約１歳から約４５歳までである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、約２歳から約１１歳までである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記患者が、約４歳から約８歳までである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ｈＣＴ−ＭＳＣが、１回用量、２回用量、３回用量、もしくは４回用量またはそれより多くの用量で投与される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
各用量が約１カ月から約６カ月まで離して投与される、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
各用量が約２カ月離して投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｈＣＴ−ＭＳＣの前記治療有効用量が、用量当たり細胞約１．０×１０６個／ｋｇ〜細胞約６．０×１０６個／ｋｇを含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記用量が、細胞約２．０×１０６個／ｋｇを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記用量が、細胞約３．０×１０６個／ｋｇを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記用量が、細胞約６．０×１０６個／ｋｇを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ｈＣＴ−ＭＳＣの治療有効用量が、合計で細胞約６．０×１０６個／ｋｇを含み、約６カ月以内に２回〜３回用量で投与される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ｈＣＴ−ＭＳＣの前記治療有効用量が、ＣＤ７３＋およびＣＤ９０＋が９０％を超える用量である、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ｈＣＴ−ＭＳＣの前記治療有効用量が、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ３１＋が１０％未満の用量である、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
自閉症スペクトラム障害に罹患している患者に対するｈＣＴ−ＭＳＣを用いた処置の治療効果を評価する方法であって、
（ａ）前記患者に対して１つまたは複数の適切な試験を実施して、行動および／またはバイオマーカーベースラインスコア（複数可）を確立するステップと、
（ｂ）前記患者に有効量のｈＣＴ−ＭＳＣを投与するステップと、
（ｃ）前記患者を、ｈＣＴ−ＭＳＣの投与後の１つまたは複数の時点で（ａ）に記載のものと同じ１つまたは複数の行動試験および／またはバイオマーカー試験について再評価するステップと、
（ｄ）（ｃ）の結果と（ａ）で確立された前記ベースラインスコア（複数可）を比較するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
（ａ）および（ｃ）で実施される前記行動試験（複数可）が、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度ＩＩ（ＶＡＢＳ−ＩＩ）、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度ＩＩＩ（ＶＡＢＳ−ＩＩＩ）、臨床全般印象尺度（ＣＧＩ）、広汎性発達障害行動調査票（ＰＤＤＢＩ）、表出一単語絵画語彙検査４（ＥＯＷＰＶＴ−４）、異常行動チェックリスト、感覚的経験質問票、反復的行動尺度、知能尺度（Ｍｕｌｌｅｎ初期学習尺度またはスタンフォードビネー）、言語環境分析、ＡＴＮ  ＧＩ症状調査票、および育児ストレスインデックスのうちの１つまたは複数を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｃ）における前記患者の再評価を、投与後２カ月、４カ月、６カ月、９カ月、１２カ月、１８カ月、２４カ月、２年、３年、４年、５年、１０年、１５年、２０年または無制限を含む１つまたは複数の時点で実施する、請求項１７から１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年４月４日に出願の米国特許仮出願第６２／６５２，７２２号の権益を主張する。
【０００２】
本開示は、自閉症スペクトラム障害を処置する方法を提供する。より詳細には、本開示は、ヒト臍帯血組織由来の間葉系間質細胞を使用して自閉症スペクトラム障害を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
自閉症、または自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、社会的コミュニケーションにおける障害および反復的な限定された範囲の活動の存在によって特徴付けられる様々な状態を指す不均一な神経発達障害であり、生後早期に発症する。ＡＳＤは、遺伝的影響および環境の影響の種々の組合せによって引き起こされる可能性がある、具体的な行動症状の存在に基づく臨床診断である。「スペクトラム」という用語は、自閉症を有する各人が有する難題および強度が広範に変動することを反映する。
【０００４】
疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：ＣＤＣ）によると、米国におけるＡＳＤの有病率は小児６８人に１人であると推定されている（MMWR  Surveill  Summ  2014;  63:1-21）。これは、少年４２人に１人および少女１８９人に１人を含む。ＡＳＤを有する個体の大多数は、独立して生きることができず、生涯の支援または補助を必要とする。したがって、ＡＳＤを有する個体の支援にかかる生涯費用は１４０万ドルになると推定される。知的障害も有する個体に関しては、推定される費用は２４０万ドルまで増加する。毎年、推定５０，０００人の自閉症を有する十代が成人になり、学校に基づいた自閉症援助を失う。自閉症を有する人のおよそ３分の１が、言語能力が低いままである。自閉症を有する人の約４０パーセントが知的障害を有する。自閉症には、ある特定の医学的問題および精神衛生上の問題が頻繁に伴う。それらとしては、胃腸（ＧＩ）障害、発作、睡眠障害、注意欠陥および多動性障害（ＡＤＨＤ）、不安および恐怖症が挙げられる。ＡＳＤに対する現行の処置手法としては、薬物適用、行動療法、作業療法および言語療法、ならびに特殊教育および職業支援が挙げられる。早期の集中的な行動介入には実質的に改善された転帰が伴うが、そのような介入を用いてさえ、ＡＳＤを有する個体の多くは著しく障害を持ったままである。現行の処置は支持的なものであり、理学療法、薬物適用、および外科手術に伴う後遺症を管理することに焦点があてられる。向精神薬などの現在利用可能な医学的処置は、易刺激性などの付随する併存症の症状を好転させることを意図したものであり、中核的なＡＳＤ症状に対処するものではない。これを踏まえると、ＡＳＤの中核症状を標的とする新規の効果的な処置というまだ対処されていない大きな必要性が存在する。
【０００５】
遺伝因子および環境因子の両方がＡＳＤの病因に寄与する（de  la  Torre-Ubieta  L,  et  al.  Nat  Med  2016;  22:345-361；Mandy  W,  Lai  MC.  J.  Child  Psychol  Psychiatry  2016;  57:271-292；Sahin  M,  Sur  M.  Science  2015;  350）。近年のＡＳＤのリスクの増大に関連付けられるいくつかの新規の変異、コピー数バリアント（ＣＮＶ）、および一塩基多型（ＳＮＰ）が同定されるような遺伝子の配列決定および分析の進歩にもかかわらず、症例の２０％未満しか公知の遺伝的リスク因子に帰することができないことが推定される（Abrahams  BS,  Geschwind  DH.  Arch  Neurol  2010;  67(4):395-399）。母体の催奇形因子への曝露、環境毒素、および父年齢の上昇を含めたいくつかの環境因子もＡＳＤのリスクの増大に関連付けられる。最後に、炎症および免疫機能障害もＡＳＤの病因に関係付けられる。
【０００６】
正確な病態生理は分かっていないが、知見として、脳の領域における異常なシナプス機能（Gao  R,  Penzes  P.  Curr  Mol  Med  2015;  15:146-167；Volk  L,  et  al.  Annu  Rev  Neurosci  2015;  38:127-149）、白質異常（Wolff  JJ,  et  al.  Am  J  Psychiatry  2012;  169:589-600）、および神経炎症（Young  AMH,  et  al.  Mol  Autism  2016;  7:1-8）が挙げられる。ＡＳＤを有する患者の脳における免疫病態の病理発生は、免疫関連遺伝子ネットワークの過剰発現（Voineagu  I,  et  al.  Nature  2011;  474:380-384）、胎児脳組織における母体抗体の存在（Braunschweig  D,  et  al.  Transl  Psychiatry  2013;  3:e277）、脳脊髄液中の非定型レベルの炎症促進サイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）（Vargas  DL,  et  al.  Ann  Neurol  2005;  57:67-81）、および異常な神経接続経路を導く過剰なミクログリア活性化（Morgan  JT,  et  al.  Biol  Psychiatry  2010;  68:368-376；Suzuki  K,  et  al.  JAMA  Psychiatry  2013;  70:49-58）に起因する可能性がある。そのように、神経接続の免疫調節または制御に影響を及ぼす治療手法は、この集団に対する新規の処置の論理的な標的である。
【０００７】
いくつかの異なる知見により、ＡＳＤの病因における免疫活性化および／または制御不全の役割が裏付けられる。多数の疫学的研究により、妊娠中に感染を有した母親から生まれた小児ではＡＳＤの率が上昇することが実証された。この関連性は、国および期間にわたって一貫しており、早くも１９７０年代に、米国では風疹パンデミック後に（Chess  S.  J  Autism  Child  Schizophr  1971;  1(1):33-47）、デンマークでは数十年にわたって（Atladottir  HO,  et  al.  J  Autism  Dev  Disord  2010;  40(12):1423-1430）、またスウェーデンおよび他の国で報告されている。母体の発熱、抗生物質による処置、炎症マーカーのレベルの上昇、およびいくつかの異なる微生物による感染が、小児におけるＡＳＤの発生のリスクの増加に関連付けられており、これは、感染に対する免疫応答が感染因子自体よりも大きな原因である可能性が高いことを示すものである。したがって、動物モデルでは、妊娠中の母親における免疫活性化を誘導することにより、ＡＳＤ表現型を有する子孫がもたらされた（Harvey  L,  Boksa  P.  Dev  Neurobiol  2012;  72(10):1335-1348；Malkova  NV,  et  al.  Brain  Behav  Immun  2012;  26(4):607-616）。潜在的な病態生理学的機構は、母体胎児間免疫寛容（母体抗体および／または細胞性免疫を介したもの）の変更、ならびに神経発達に有害であり得る、胎児の脳におけるサイトカインプロファイルおよびミクログリア活性化の変化を導く胎児の脳炎症を含む。ＡＳＤにおけるミクログリアの数の増加およびミクログリア活性化の増大に関する証拠が剖検研究、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）脳イメージング、および動物モデルによって得られた。さらに、脳における免疫系の側面（例えば、ニューロンシナプスへの支持をもたらすことが課せられたミクログリアなど）の異常な機能が記載されている（Takano  T.  Dev  Neurosci  2015;  37(3):195-202；Zantomio  D,  et  al.  Neurosci  Biobehav  Rev  2015;  52:172-177）。ＡＳＤは、血漿中サイトカインレベルの上昇、ミクログリア活性化に関連する遺伝子の上方制御、限局性の炎症および病理学的アストロサイト活性化に関連付けられる（Goines  PE,  Ashwood  P.  Clin  Rheumatol  2013;  33(11):1611-1619）。注目すべきことに、古典的に免疫制御に関連付けられている多くのサイトカインおよび分子が、現在は、正常な神経発達においても役割を果たすと理解されている。この二重機能性が、ＡＳＤにおける免疫に関連する変化と異常な神経発達の関連性の重要なつなぎであることが判明し得る。
【０００８】
ミクログリアは、中枢神経系（ＣＮＳ）傷害の伝播および消散において極めて重要であるが、それらが果たす役割は完全には理解されていない。これらの細胞は、神経炎症をモジュレートし、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、およびニューロンの活性を制御する因子を産生し、また、デブリを取り除いて、オリゴデンドロサイトがニューロンを再ミエリン化し始める環境をもたらす。マウスでは、ミクログリアは、元々は胎児発生の初期に胚体外卵黄嚢から導き出される脳における複製前駆体の独特のプールから生じる。骨髄由来の循環血液単球は、ＣＮＳ傷害を増悪または好転させる可能性がある浸潤性食細胞の別の潜在的な供給源を構成する。リンパ液と脳実質との間を単球が循環する経路が最近記載されているが、循環している単球の大多数は、傷害のない成人マウス脳には進入しないが、脳の放射線被曝、化学療法もしくは傷害、脱髄性状態、または慢性ストレスなどの侵襲後にはＣＮＳに浸潤し得る。いくつかのモデルでは、これらの浸潤性血液単球は炎症を活性化し、脱髄性事象に関与し得る。他のモデルでは、血液単球は再ミエリン化を容易にし得る。
【０００９】
シナプスは、電気的および化学的シグナル伝達を介した情報の組織化された通過を可能にするニューロン間の伝達点である。発達の初期にシナプス形成が強化される期間があるが、シナプスは、寿命全体を通して可塑性を保持し、これにより、例えば学習および記憶が可能になる。正常なシナプスの発達および維持は適切なニューロン機能に必須であり、いずれかのプロセスの異常は、ＡＳＤを含めた多数の神経発達的状態に関連付けられる。シナプスタンパク質をコードする遺伝子の変異がＡＳＤに関係付けられている。さらに、ヒトおよび動物での研究により、ＡＳＤおよび自閉症に関連する障害における樹状突起棘のサイズ、数、および形態の低減ならびに未成熟脊椎形態の増大が実証された（Phillips  M,  Pozzo-Miller  L.  Neurosci  Lett  2015;  601:30-40）。環境因子もシナプスの変化に影響を及ぼし得る可能性も高い。これらの変更により、長距離の接続不足および短距離の接続過剰などの、問題のあるニューロン接続性が導かれる可能性がある（Geschwind  DH,  Levitt  P.  Curr  Opin  Neurobiol  2007;  17(1):103-111；Maximo  JO,  et  al.  Neuropsychol  Rev  2014;  24(1):16-31）。
【００１０】
総じて、これらの知見により、環境リスク因子および遺伝的リスク因子の両方が、正常な脳の発達に悪影響を及ぼす免疫制御不全および／または異常なニューロン接続を引き起こすことによってＡＳＤの発生に寄与する可能性があることが示唆される。したがって、免疫調節療法がＡＳＤを有する小児の処置において役割を果たす可能性がある。間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、免疫調節能を有することが公知であり、診療所において多数の適用のために使用され、また、好都合な安全性プロファイルを有する。ＭＳＣは、ＡＳＤを有する小児の基礎をなす病態および結果生じる症状を効果的に処置する潜在性も有し得る。
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪組織、および分娩に関わる組織（臍帯血、臍帯組織、胎盤）を含めたいくつかの異なる組織から単離することができる、未分化の多能性細胞の不均一な群である。ＭＳＣは、骨、軟骨、および脂肪を含めた中胚葉系組織型に生じ得るが、それらの主な作用機構は免疫調節効果およびパラクリン効果に起因すると考えられている。ＭＳＣは、液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方に対する多数の免疫調節効果が実証されている。それらとしては、これだけに限定されないが、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、およびミクログリアの増殖の阻害、炎症促進性サイトカイン産生の減少、ならびに好中球動員の遮断が挙げられる。免疫応答をモジュレートすることができるにもかかわらず、ＭＳＣ自体の免疫原性は低い。これにより、ＭＳＣを、他の細胞型では典型的なドナー−レシピエントのＨＬＡ一致を必要とせずにＨＬＡ障壁を超えて同種異系の状況で使用することが可能になる。実際、静脈内同種異系ＭＳＣ投与に関する１３件のヒト研究についてのレビューでは、注入による毒性は報告されておらず（Lalu  MM,  et  al.  PLoS  One  2012;  7(10):e47559）、ＭＳＣが「免疫特権的」であり、免疫学的非自己認識を回避することができるという概念を支持している。治療用細胞として利用する場合、ＭＳＣは、栄養シグナル伝達を介して効果を発揮する。ＭＳＣはレシピエントに生着しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｌａｌｕ  ＭＭら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１２）７（１０）：ｅ４７５５９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＡＳＤの処置は一般に支持的なものであり、多くの場合、多様式である。手法としては、薬物適用、行動療法、作業療法および言語療法、ならびに特殊教育および職業支援が挙げられる。向精神薬などの現在利用可能な医学的処置は全て、易刺激性などの付随する併存症状を好転させることを意図したものであり、疾患修飾性ではない。早期診断および行動療法の進歩にもかかわらず、ＡＳＤを有する小児に対するより効果的な処置が必要とされており、ＡＳＤに対するより良好であり、より効果的であり、かつ疾患修飾性である医学的処置というまだ対処されていない大きな必要性が残っている。ヒト臍帯組織由来の間葉系間質細胞（ｈＣＴ−ＭＳＣ）療法には、脳における炎症プロセスをモジュレートすることによってＡＳＤ症状を緩和する潜在性があり得る。
【００１３】
本開示は、自閉症スペクトラム障害を有する疑いがある患者または自閉症スペクトラム障害に罹患している患者を、ヒト同種異系の臍帯組織由来の間葉系間質細胞（「ｈＣＴ−ＭＳＣ」）を投与することによって処置する方法を提供する。本開示は、バンクに保存されているまたは他のやり方で入手可能な自己臍帯血単位を有することの制限を排除するという利益を提供する。
【００１４】
ある態様では、本開示は、自閉症スペクトラム障害を有するまたは有する疑いがある患者を処置する方法であって、患者に、治療有効量のヒト同種異系の臍帯組織由来の間葉系間質細胞（ｈＣＴ−ＭＳＣ）を投与することを含む方法を含む。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣは全身投与される。一部の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣは静脈内投与される。一部の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣは静脈内注入により３０分間にわたって投与される。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣは単回用量または複数回用量で投与される。一部の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣは、１回用量、２回用量、３回用量、もしくは４回用量またはそれより多くの用量で投与される。ある特定の実施形態では、各用量は約１カ月から約６カ月まで離して投与される。
【００１５】
ある特定の実施形態では、患者にｈＣＴ−ＭＳＣを細胞約１．０×１０６個／ｋｇ〜細胞約６．０×１０６個／ｋｇの用量で投与する。ある特定の実施形態では、患者にｈＣＴ−ＭＳＣを用量当たり細胞約２．０×１０６個／ｋｇの用量で投与する。ある特定の実施形態では、患者にｈＣＴ−ＭＳＣを用量当たり細胞約３．０×１０６個／ｋｇの用量で投与する。ある特定の実施形態では、患者に合計で細胞６．０×１０６個／ｋｇを６カ月以内に２〜３回用量で投与する。一部の実施形態では、用量は、９０％を超えるＣＤ７３＋およびＣＤ９０＋細胞を含む。一部の実施形態では、用量は、１０％未満のＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ３１＋細胞を含む。
【００１６】
別の態様では、本開示は、自閉症スペクトラム障害に罹患している患者に対するｈＣＴ−ＭＳＣを用いた処置の治療効果を評価する方法であって、（ａ）患者に対して１つまたは複数の適切な試験を実施して、行動および／またはバイオマーカーベースラインスコア（複数可）を確立するステップと、（ｂ）患者に有効量のｈＣＴ−ＭＳＣを投与するステップと、（ｃ）患者を、ｈＣＴ−ＭＳＣの投与後の１つまたは複数の時点で（ａ）に記載のものと同じ１つまたは複数の行動試験および／またはバイオマーカー試験について再評価するステップと、（ｄ）（ｃ）の結果と（ａ）で確立されたベースラインスコア（複数可）を比較するステップとを含む方法を含む。本開示のこの態様のある特定の実施形態では、（ａ）および（ｃ）で実施される行動試験（複数可）は、以下のうちの１つまたは複数を含む：Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度ＩＩ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｓｃａｌｅｓ−ＩＩ：ＶＡＢＳ−ＩＩ）、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度ＩＩＩ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｓｃａｌｅｓ−ＩＩＩ：ＶＡＢＳ−ＩＩＩ）、臨床全般印象尺度（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｃａｌｅ：ＣＧＩ）、広汎性発達障害行動調査票（Ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ：ＰＤＤＢＩ）、表出一単語絵画語彙検査４（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｏｎｅ−Ｗｏｒｄ  Ｐｉｃｔｕｒｅ  Ｖｏｃａｂｕｌａｒｙ  Ｔｅｓｔ−４：ＥＯＷＰＶＴ−４）、異常行動チェックリスト（Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ）、感覚的経験質問票（Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）、反復的行動尺度（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｓｃａｌｅ）、知能尺度（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  Ｓｃａｌｅｓ、Ｍｕｌｌｅｎ初期学習尺度（Ｍｕｌｌｅｎ  Ｓｃａｌｅｓ  ｏｆ  Ｅａｒｌｙ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）またはスタンフォードビネー（Ｓｔａｎｆｏｒｄ−Ｂｉｎｅｔ））、言語環境分析（Ｌａｎｇｕａｇｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）、ＡＴＮ  ＧＩ症状調査票（ＡＴＮ  ＧＩ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）、および育児ストレスインデックス（Ｐａｒｅｎｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｉｎｄｅｘ）。本開示のこの態様のある特定の実施形態では、（ｃ）における患者の再評価を、投与後２カ月、４カ月、６カ月、９カ月、１２カ月、および１８カ月、２４カ月、２年、３年、４年、５年、１０年、１５年、２０年または無制限を含む１つまたは複数の時点で実施する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＡＳＤを有する小児におけるｈＣＴ−ＭＳＣの第Ｉ相研究についての研究設計を示す図である。
【００１８】
【図２】図２は、第Ｉ相ｈＣＴ−ＭＳＣ研究の間に観察された有害事象の要約を示すグラフである。合計で３／５３（５．７％）の事象が研究製品に関連するものであった。低血圧および注入関連反応。
【００１９】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｂは、ＡＳＤを有する小児におけるｈＣＴ−ＭＳＣの第ＩＩ相研究についての一般的な研究設計を示す図である。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｂは、ＡＳＤを有する小児におけるｈＣＴ−ＭＳＣの第ＩＩ相研究についての一般的な研究設計を示す図である。
【００２０】
【図４】図４は、ｈＣＴ−ＭＳＣ集団の注入についての例示的なフローサイトメトリー分析を示すグラフである。この集団では、ＣＤ７３＋およびＣＤ９０＋が９０％を超え、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ３１＋が１０％未満である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
開示されるプロセスおよび材料を記載する前に、本明細書に記載される態様は、具体的な実施形態、装置または構成に限定されず、したがって、当然ながら異なることができることを理解すべきである。本明細書で使用される用語は特定の態様を記載することだけが目的であり、本明細書で別途定義されない限り、限定するものではないことも理解すべきである。
【００２２】
文脈によって別途明記されない限り、本発明の１つの態様または実施形態のために開示される実施形態は、本発明の他の態様もしくは実施形態において、および／または本発明の同じもしくは他の態様において開示される実施形態と組み合わせて、使用することができることも理解すべきである。したがって、そのような組合せが明示的に正確に示されていない場合でさえ、そのような組合せを本開示は含むことを意図しており、本発明はそれを含む。
【００２３】
文脈が別途要求しない限り、本明細書全体で、単語「含む（comprise）」および「含む（include）」および変異形（例えば、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」）は、明示される構成成分、特徴、要素もしくは工程、または構成成分、特徴、要素もしくは工程の群が含まれることを暗示するが、いかなる他の完全体もしくは工程も、または完全体もしくは工程の群も除外されないことを暗示するものと理解される。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明らかに別途指示しない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は複数形を含む。
【００２５】
本明細書では、範囲は「約」１つの特定の値から、かつ／または「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表されている場合、別の態様は、１つの特定の値から、かつ／または他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行する「約」を使用することによって近似で表されている場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されよう。さらに、範囲のそれぞれについての終点は、他の終点との関連で、および他の終点とは独立してのどちらでも意味があることも理解されよう。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、少なくとも１つの物質と別の物質の物理的接触を含む。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「処置」、「治療」および／または「治療レジメン」は、患者で顕在化したまたは患者がかかりやすい可能性がある疾患、障害または生理的状態（例えば、自閉症スペクトラム障害）に応答して行われる臨床的介入を指す。処置の目的としては、症状の緩和もしくは防止、疾患、障害、もしくは状態の増悪もしくは悪化の緩徐化もしくは停止、および／または疾患、障害もしくは状態（例えば、自閉症スペクトラム障害）の寛解が挙げられる。
【００２８】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは望ましい生物学的および／または臨床結果をもたらすために十分な量を指す。「有効量」または「治療有効量」は、医療従事者の熟練チームが決定することができ、行動試験、バイオマーカー試験、および神経生理学的または神経イメージング試験の使用を含む。例えば、行動試験としては、これだけに限定されないが、ＤＳＭ−５チェックリスト、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度ＩＩＩ（ＶＡＢＳ−ＩＩＩ）、臨床全般印象尺度（ＣＧＩ）、広汎性発達障害行動調査票（ＰＤＤＢＩ）、表出一単語絵画語彙検査４（ＥＯＷＰＶＴ−４）、小児に対する行動評価−社会能力下位尺度（Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ−Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｋｉｌｌｓ  ｓｕｂｓｃａｌｅ）、異常行動チェックリスト、感覚的経験質問票、反復的行動尺度、知能尺度（Ｍｕｌｌｅｎ初期学習尺度またはスタンフォードビネー）、弁別能力尺度第２版（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｃａｌｅｓ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ：ＤＡＳ−ＩＩ）、言語環境分析、就学前児童精神医学的評価（Ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ  Ａｇｅ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）、異常行動チェックリスト、ＡＴＮ  ＧＩ症状調査票、表出一単語絵画語彙検査４（ＥＯＷＰＶＴ−４）、および育児ストレスインデックスを挙げることができる。追加的な臨床調査としては、これだけに限定されないが、自閉症診断面接改訂版（Ａｕｔｉｓｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ−Ｒｅｖｉｓｅｄ：ＡＤＩ−Ｒ）、自閉症診断観察検査第２版（Ａｕｔｉｓｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｃｈｅｄｕｌｅ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ：ＡＤＯＳ−２）、Ｎｏｌｄｕｓ  ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎを用いた親子相互交流（Ｐａｒｅｎｔ−Ｃｈｉｌｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ＰＣＩ）、異常行動チェックリスト−コミュニティ（Ａｂｅｒｒａｎｔ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ−Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ：ＡＢＣ−Ｃ）、実行機能の行動評価調査票−就学前版（Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ：ＢＲＩＥＦ−Ｐ）、実行機能の行動評価調査票（Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）（ＢＲＩＥＦ）、感覚的経験質問票２．１版（Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１：ＳＥＱ２．１）、生後早期曝露評価ツール（Ｅａｒｌｙ  Ｌｉｆｅ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅｓ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ：ＥＬＥＡＴ）、および小児生活の質調査票（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ：ＰｅｄｓＱＬ）胃腸症状尺度（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ  Ｓｃａｌｅｓ）を挙げることができる。施行される客観的な神経学的試験としては、これだけに限定されないが、社会的刺激の視線追跡（Ｅｙｅ  Ｇａｚｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｔｉｍｕｌｉ：ＥＧＴ）、脳波記録法（ＥＥＧ）、コンピュータ視覚分析（Ｃｏｍｐ���ｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ＣＶＡ）、および脳核磁気共鳴画像法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ：ＭＲＩ）を挙げることができる。一部の実施形態では、試験は、現在利用可能であるまたは今後利用可能になる等価または代理試験を含み得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「被験体」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類などを含む。ある特定の実施形態では、被験体は、自閉症スペクトラム障害を有する疑いがある、それを有する、またはそれに罹患しているヒト患者である。一部の実施形態では、ヒト被験体は、小児である。ある特定の実施形態では、ヒト被験体は、成人である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「自閉症スペクトラム障害」および「自閉症」という用語は、互換的に使用され、一般に幼児期から現れる、他の人とコミュニケーションし、関係を形成すること、ならびに言語および抽象概念を使用することが困難であることによって特徴付けられるあらゆる範囲の精神的状態を指す。自閉症は、あらゆる年齢で診断され得るが、症状は一般に生後２年のうちに現れる。精神障害の診断と統計マニュアル（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＤＳＭ−５）によると、ＡＳＤを有する人は、他の人とのコミュニケーションおよび相互作用の困難、関心の制限および反復行動、ならびに学校、職場、および他の生活領域において相応に機能するという人間の能力が傷つけられる症状を有し得る。
【００３１】
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪組織、ならびに分娩に関わる組織（臍帯血、臍帯組織、および胎盤）を含めたいくつかの異なる組織から単離することができる未分化の多能性細胞の不均一な群である。ＭＳＣは、骨、軟骨、および脂肪を含めた中胚葉系組織型に生じ得るが、それらの主な作用機構は免疫調節効果およびパラクリン効果に起因すると考えられている。ＭＳＣは、液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方に対する多数の免疫調節効果が実証されている。それらとしては、これだけに限定されないが、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、およびミクログリアの増殖の阻害、炎症促進性サイトカイン産生の減少、ならびに好中球動員の遮断が挙げられる。免疫応答をモジュレートすることができるにもかかわらず、ＭＳＣ自体の免疫原性は低い。これにより、ＭＳＣを、他の細胞型では典型的なドナー−レシピエントのＨＬＡ一致を必要とせずにＨＬＡ障壁を越えて同種異系の状況で使用することが可能になる。実際、静脈内同種異系ＭＳＣ投与に関する１３件のヒト研究についてのレビューでは、注入による毒性は報告されておらず（Lalu  MM,  et  al.  PLoS  one  2012;  7(10):e47559）、ＭＳＣが「免疫特権的」であり、免疫学的非自己認識を回避することができるという概念を支持している。治療用細胞として利用する場合、ＭＳＣは、栄養シグナル伝達を介して効果を発揮する。ＭＳＣはレシピエントに生着しない。ＡＳＤにおけるＭＳＣの正確な作用機構は進行中の調査の主題であるが、ＭＳＣが細胞媒介性免疫調節、分子媒介性神経保護、および機能的な神経学的回路網の修復を含めた治療効果を発揮し得る潜在的手段がいくつか存在する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「同種異系の」という用語は、同じ種であるが遺伝学的に異なる別の実体から投与される実体の全体または一部（例えば、細胞、組織、臓器など）を指す。同種異系実体は遺伝学的に異なるので、同種異系実体では同種異系実体が投与される実体（レシピエント）において免疫反応が引き出される可能性がある。しかし、ＭＳＣは、免疫特権的であると考えられているので、免疫学的非自己認識を回避することができる。これは、レシピエント患者が同種異系のｈＣＴ−ＭＳＣの導入を炎症性免疫応答を引き出すことなく許容することができること、および同種異系のｈＣＴ−ＭＳＣが拒絶反応を起こすことなく長期間生存し得ることを意味する。
【００３３】
ｈＣＴ−ＭＳＣによる自閉症スペクトラム障害の処置
本開示を考慮して、当業者は本明細書に記載の方法を所望の必要性に見合うように構成することができる。一般に、開示される材料、方法、および装置は、自閉症スペクトラム障害を有する疑いがある被験体または自閉症スペクトラム障害に罹患している被験体を処置する方法であって、被験体に治療有効量のｈＣＴ−ＭＳＣおよび／またはその構成成分もしくは構成成分の混合物を投与し、その結果、自閉症スペクトラム障害が処置されることを含む、それからなる、またはそれから本質的になる方法をもたらすものである。
【００３４】
本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、「ｈＣＴ−ＭＳＣ」という用語は、具体的にそのように規定されているか否かにかかわらず、本明細書に記載の任意のフォーマットおよび／またはその構成成分もしくは構成成分の混合物を包含することを意味することが理解されるべきである。
【００３５】
患者は、任意のヒトまたは非ヒト動物であり得る。一部の実施形態では、患者は、ヒトである。特定の実施形態では、患者は、１８歳未満の、またはこのより広い年齢範囲に入る任意の年齢範囲の中のヒトである。非限定的な例では、患者は、２歳〜１８歳、２歳〜１７歳、２歳〜１６歳、２歳〜１５歳、２歳〜１４歳、２歳〜１３歳、２歳〜１２歳、２歳〜１１歳、２歳〜１０歳、２歳〜９歳、２歳〜８歳、２歳〜７歳、２歳〜６歳、２歳〜５歳、２歳〜４歳、２歳〜３歳、３歳〜１８歳、３歳〜１７歳、３歳〜１６歳、３歳〜１５歳、３歳〜１４歳、３歳〜１３歳、３歳〜１２歳、３歳〜１１歳、３歳〜１０歳、３歳〜９歳、３歳〜８歳、３歳〜７歳、３歳〜６歳、３歳〜５歳、３歳〜４歳、４歳〜１８歳、４歳〜１７歳、４歳〜１６歳、４歳〜１５歳、４歳〜１４歳、４歳〜１３歳、４歳〜１２歳、４歳〜１１歳、４歳〜１０歳、４歳〜９歳、４歳〜８歳、４歳〜７歳、４歳〜６歳、４歳〜５歳、５歳〜１８歳、５歳〜１７歳、５歳〜１６歳、５歳〜１５歳、５歳〜１４歳、５歳〜１３歳、５歳〜１２歳、５歳〜１１歳、５歳〜１０歳、５歳〜９歳、５歳〜８歳、５歳〜７歳、５歳〜６歳、６歳〜１８歳、６歳〜１７歳、６歳〜１６歳、６歳〜１５歳、６歳〜１４歳、６歳〜１３歳、６歳〜１２歳、６歳〜１１歳、６歳〜１０歳、６歳〜９歳、６歳〜８歳、６歳〜７歳、７歳〜１８歳、７歳〜１７歳、７歳〜１６歳、７歳〜１５歳、７歳〜１４歳、７歳〜１３歳、７歳〜１２歳、７歳〜１１歳、７歳〜１０歳、７歳〜９歳、または７歳〜８歳の小児であってもよい。
【００３６】
一部の実施形態では、患者は、約４５歳までの、または約１歳から約４５歳までのより広い年齢範囲に入る任意の年齢範囲の中のヒトである。例えば、約１８〜約４５歳、約２０〜約４５歳、約２５〜約４５歳、約３０〜約４５歳、約３５〜約４５歳、または約４０〜約４５歳。ある特定の実施形態では、患者は、１〜４５歳の間の任意の年齢のヒトである。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５歳。
【００３７】
ｈＣＴ−ＭＳＣは、全身送達を含めた当技術分野で公知の任意の技法によって患者に投与することができる。投与経路としては、これだけに限定されないが、静脈内投与または注入技法が挙げられる。注入技法は、ｈＣＴ−ＭＳＣを針またはカテーテルによって投与することを伴い得る。典型的には、注入とは、ｈＣＴ−ＭＳＣを静脈内投与または皮下投与することを意味する。一部の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを全身投与する。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを静脈内投与する（すなわち、静脈内（ＩＶ）注射によって）。
【００３８】
研究は、（１）ＡＳＤを有する若年小児におけるｈＣＴ−ＭＳＣの１回、２回または３回の静脈内用量の安全性、ならびに（２）ＡＳＤを有する若年小児における変化に対する感受性およびいくつかの異なる調査ツールの施行の実現性に焦点を当てたものであった。患者３人の第１のコホートには単回用量のｈＣＴ−ＭＳＣを投与した。患者３人の第２のコホートには２回用量のｈＣＴ−ＭＳＣを２カ月離して投与した。患者６人の第３のコホートには、３回用量のｈＣＴ−ＭＳＣを、各用量の間に２カ月の間隔をあけて投与した。主要なエンドポイントは安全性であり、これに関して、急性注入反応および感染の発生率を、ｈＣＴ−ＭＳＣの各注入中、各注入後２４時間以内、各注入の７〜１０日後、各注入の２カ月後、４カ月後および６カ月後、ならびに最終的な注入の６カ月後および１２カ月に調査した。注入期間にわたる、および最終的な注入の１２カ月後の有害事象の調査から、当該処置が安全であり、かつ忍容性が良好であることが示された。有害事象が報告され、患者１２人のうち１０人で少なくとも１つの有害事象が報告された。有害事象は軽度のものであり、予測されたものであり、研究製品とは無関係のものであった。重篤な有害事象は報告されなかった。副次的エンドポイントとして、ベースライン時、ｈＣＴ−ＭＳＣの最初の注入前、および最初のｈＣＴ−ＭＳＣ注入の６カ月後のＡＳＤ特異的転帰尺度を調査した。ベースライン時に非言語ＩＱが高かった患者については、親により報告される社会的コミュニケーションスキルの尺度（Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度）に関して患者の行動の有意な改善が観察された。
ｈＣＴ−ＭＳＣの調製
【００３９】
ヒト同種異系の臍帯由来の間葉系間質細胞は、当技術分野で公知の任意の方法によって調製し、保存し、投与のために調製することができる。一部の場合には、ｈＣＴ−ＭＳＣは、臍帯組織を小片に切断し、細かく切り刻み、ヒアルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、コラゲナーゼおよびパパインで消化することによって、クリーンルームにおいて調製することができる。結果として生じた細胞懸濁物は、次に培養物中に平板培養し、集密まで成長させてＰ０培養物を確立し、凍結保存することができる。Ｐ１およびＰ２培養物は、類似した条件の下で増殖させ、培養容器（cultureware）から取り出すことができる。最終生成物はＰ２培養から誘導することができ、それらは５％ヒト血清アルブミンを有するプラズマライトに採収され、洗浄され、デキストランを有する１０％ＤＭＳＯの最終濃度で細胞５０，０００，０００〜１００，０００，０００個を含有するコンパートメントクライオバッグの中で凍結保存される。投与の日、１つのコンパートメントを解凍し、１０〜４０ｍＬのプラズマライトＩＶ溶液に希釈し、シリンジまたはバッグに入れ、投与のためにベッドサイドに運搬することができる。
【００４０】
ｈＣＴ−ＭＳＣの投与
臍帯血の投与経路は、処置される疾患および所望の結果に基づいて当業者が選択することができる。したがって、ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣは、末梢静脈内（ＩＶ）注入を通して投与される。
【００４１】
一部の実施形態では、本開示のｈＣＴ−ＭＳＣを単回用量で投与することができる。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを複数回用量（例えば、処置当たり２つ、３つ、もしくは４つまたはそれより多くの単回用量）である期間（例えば、数日間、数週間、または数カ月間）にわたって投与することができる。ある特定の実施形態では、本開示のｈＣＴ−ＭＳＣを２回またはそれより多くの用量で投与することができ、各用量を、少なくとも約１週間、約２週間、約３週間離して、約１カ月〜約２カ月離して、約１カ月〜約３カ月離して、約１カ月〜約４カ月離して、約１カ月〜約５カ月離して、もしくは約１カ月〜約６カ月またはそれより長く離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約１週間離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約２週間離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約３週間離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約１カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約２カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約３カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約４カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約５カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約６カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約７カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約８カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約９カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約１０カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約１１カ月離して投与する。一部の実施形態では、各用量を約１２カ月離して投与する。
【００４２】
ある特定の実施形態では、本開示のｈＣＴ−ＭＳＣの各用量を、約２０分間〜約７５分間の範囲の期間にわたって、例えば、約２０分間〜約６０分間にわたって、または約２０分間〜約５０分間にわたって、または約２０分間〜約４０分間にわたって、または約２０分間〜約３０分間にわたって、または約２５分間〜約７０分間にわたって、または約２５分間〜約６０分間にわたって、または約２５分間〜約５０分間にわたって、または約２５分間〜約４０分間にわたって、または約３０分間〜約７０分間にわたって、または約３０分間〜約６０分間にわたって、または約３０分間〜約５０分間にわたって、または約３０分間〜約４０分間にわたって投与することができる。一部の実施形態では、用量を３０分間にわたって投与する。
【００４３】
ｈＣＴ−ＭＳＣは、治療有効用量で存在し得る。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣの治療有効用量は、投与時に、体重１ｋｇ当たり細胞約１×１０６〜約６×１０６個；例えば、細胞約１×１０６〜約２．５×１０６個／ｋｇ、または細胞約１．５×１０６〜約３×１０６個／ｋｇ、細胞約１．５×１０６〜約２．５×１０６個／ｋｇ、または細胞約２×１０６個／ｋｇを含む。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣの治療有効用量は、体重１ｋｇ当たり細胞約１．０×１０６個、または体重１ｋｇ当たり細胞約２．０×１０６個、または体重１ｋｇ当たり細胞約２．５×１０６個、または体重１ｋｇ当たり細胞約３．０×１０６個、または体重１ｋｇ当たり細胞約４．０×１０６個、または体重１ｋｇ当たり細胞約５．０×１０６個、または体重１ｋｇ当たり細胞約６．０×１０６個を含む。一部の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣの治療有効用量は、合計で体重１ｋｇ当たり細胞約６×１０６個を含み、約６カ月にわたって２〜３回用量で投与される。用量の適切な体積を所望の投与経路に基づいて選択することができることが当業者に理解されよう。例えば、静脈内投与では、約５ｍＬ〜約５０ｍＬの範囲の用量体積；例えば、約５ｍＬ〜約４０ｍＬ、または約５ｍＬ〜約３０ｍＬ、または約５ｍＬ〜約２０ｍＬ、または約５ｍＬ〜約１５ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約４０ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約３０ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約２０ｍＬ、または約１０ｍＬ〜約１５ｍＬ、または約２０ｍＬ〜約５０ｍＬ、または約２０ｍＬ〜約４０ｍＬ、または約２０ｍＬ〜約３０ｍＬ、または約３０ｍＬ〜約５０ｍＬ、または約３０ｍＬ〜約４０ｍＬ、または約４０ｍＬ〜約５０ｍＬを使用することができる。
【００４４】
一部の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、合計で体重１ｋｇ当たり細胞約６×１０６個の注入によって投与し、約６カ月にわたって２〜３回用量で投与する。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、体重１ｋｇ当たり細胞２×１０６個の単回用量の注入によって投与する。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、体重１ｋｇ当たり細胞６×１０６個の単回用量の注入によって投与する。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、体重１ｋｇ当たり細胞２×１０６個の２回用量の注入によって投与し、各注入を２カ月離して行う。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、体重１ｋｇ当たり細胞２×１０６個の３回用量の注入によって投与し、各注入を２カ月離して行う。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、体重１ｋｇ当たり細胞３×１０６個の単回用量の注入によって投与する。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、体重１ｋｇ当たり細胞４×１０６個の単回用量の注入によって投与する。一部の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、体重１ｋｇ当たり細胞３×１０６個の２回用量の注入によって投与し、各注入を約２カ月離して行う。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、体重１ｋｇ当たり細胞３×１０６個の２回用量の注入によって投与し、各注入を約３カ月離して行う。ある特定の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを、体重１ｋｇ当たり細胞３×１０６個の３回用量の注入によって投与し、各注入を約２〜３カ月離して行う。
【００４５】
特定の実施形態では、末梢ＩＶ投与が使用される場合、ＩＶ液は、約１．０〜約２．０回の維持のときに投与することができる。例えば、ＩＶ液は、注入後の約１．０〜約１．５回の維持または約１．５〜約２．０回の維持のときに投与することができる。維持ＩＶ液は、ｈＣＴ−ＭＳＣの注入後の約３０分〜約６０分にわたり投与することができる。例えば、維持ＩＶ液は、注入後の例えば約３０分〜約６０分、または約３０分〜約４５分、または約４５分〜約６０分にわたり投与することができる。
【００４６】
ｈＣＴ−ＭＳＣの注入後維持のために、任意の好適な静脈内液を使用することができる。ある特定の実施形態では、維持ＩＶ液は、食塩溶液またはリンゲルの乳酸溶液である。ある特定の実施形態では、維持ＩＶ液は、０．２５％生理食塩水である。ある特定の実施形態では、維持ＩＶ液は、０．５％生理食塩水である。
【００４７】
複数の調査を利用して、今後の第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床治験のエンドポイントとして投与の実現性および有用性の両方を決定する。これらの調査または試験は、行動試験、バイオマーカー試験、および神経生理学的または神経イメージング試験のどちらも含む。一部の実施形態では、実施または施行される行動試験としては、これだけに限定されないが、ＤＳＭ−５チェックリスト、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度ＩＩ（ＶＡＢＳ−ＩＩ）、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度ＩＩＩ（ＶＡＢＳ−ＩＩＩ）、臨床全般印象尺度（ＣＧＩ）、広汎性発達障害行動調査票（ＰＤＤＢＩ）、表出一単語絵画語彙検査４（ＥＯＷＰＶＴ−４）、小児に対する行動評価−社会能力下位尺度、異常行動チェックリスト、感覚的経験質問票、反復的行動尺度、知能尺度（Ｍｕｌｌｅｎ初期学習尺度またはスタンフォードビネー）、弁別能力尺度第２版（ＤＡＳ−ＩＩ）、言語環境分析、就学前児童精神医学的評価、異常行動チェックリスト、ＡＴＮ  ＧＩ症状調査票、表出一単語絵画語彙検査４（ＥＯＷＰＶＴ−４）、および育児ストレスインデックスが挙げられる。追加的な臨床調査としては、これだけに限定されないが、自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）、自閉症診断観察検査第２版（ＡＤＯＳ−２）、Ｎｏｌｄｕｓ  ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎを用いた親子相互交流（ＰＣＩ）、異常行動チェックリスト−コミュニティ（ＡＢＣ−Ｃ）、実行機能の行動評価調査票−就学前版（ＢＲＩＥＦ−Ｐ）、実行機能の行動評価調査票（ＢＲＩＥＦ）、感覚的経験質問票２．１版（ＳＥＱ２．１）、生後早期曝露評価ツール（ＥＬＥＡＴ）、および小児生活の質調査票（ＰｅｄｓＱＬ）胃腸症状尺度を挙げることができる。一部の実施形態では、施行される客観的な神経学的試験としては、これだけに限定されないが、社会的刺激の視線追跡（ＥＧＴ）、脳波記録法（ＥＥＧ）、コンピュータ視覚分析（ＣＶＡ）、および脳核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を挙げることができる。上記の試験に加えて、調査および試験は、あらゆる現行のまたは今後の代理または等価の試験も含み得る。
【００４８】
一部の実施形態では、ＡＳＤを有する患者に対して、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣを投与する前に行動試験および客観的バイオマーカー試験の１つまたは複数を実施して、ベースラインの行動スコアおよびバイオマーカースコアを確立する。一部の実施形態では、患者を、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣを投与した後に同じ１つまたは複数の行動試験、客観的バイオマーカー試験、および神経生理学的または神経イメージング試験について再評価する。一部の実施形態では、ｈＣＴ−ＭＳＣを投与した後に実施した試験の結果を、ｈＣＴ−ＭＳＣを投与する前に実施した同じ試験のベースラインの結果と比較する。一部の実施形態では、ＶＡＢＳ−ＩＩＩ親への問診（ＶＡＢＳ−ＩＩＩ  Ｐａｒｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ）が主要な行動エンドポイントである。一部の実施形態では、ＣＧＩ、ＰＤＤＢＩおよびＥＯＷＰＶＴが重要な副次的行動エンドポイントである。一部の実施形態では、客観的バイオマーカー試験はＥＧＴである。
【００４９】
一部の実施形態では、患者を、これだけに限定されないが、ｈＣＴ−ＭＳＣの投与の３カ月後、６カ月後、９カ月後、１２カ月後、１８カ月後、２４カ月後、３年後、４年後、５年後、１０年後、２０年後またはそれより後を含めた、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣを投与した後の１つまたは複数の時点で再評価する。ある特定の実施形態では、患者を無制限に再評価する。一部の実施形態では、患者を、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣの投与の３カ月後に再評価する。一部の実施形態では、患者を、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣの投与の６カ月後に再評価する。一部の実施形態では、患者を、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣの投与の９カ月後に再評価する。一部の実施形態では、患者を、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣの投与の１２カ月後に再評価する。一部の実施形態では、患者を、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣの投与の１８カ月後に再評価する。一部の実施形態では、患者を、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣの投与の２４カ月後に再評価する。一部の実施形態では、患者を、有効量のｈＣＴ−ＭＳＣの投与の３カ月後、６カ月後、９カ月後および１２カ月後に再評価する。
【００５０】
ここで本開示のある特定の態様を、以下の非限定的な例によってさらに説明する。
【実施例】
【００５１】
材料および方法
ヒト臍帯組織由来の間葉系間質細胞（ｈＣＴ−ＭＳＣ）の製造
細胞供給源
ｈＣＴ−ＭＳＣを、培養下で増大させ、凍結保存し、バンクに保存した消化臍帯組織由来の同種異系細胞から、クリーンルームＩＳＯ７施設においてｃＧＭＰの下で製造した。
【００５２】
収集／回収方法
ｈＣＴ−ＭＳＣを、赤子の臍帯血が母親からの書面のインフォームドコンセントを得た後にＤｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＦＤＡにより認可されたＦＡＣＴ公認の公立の臍帯血バンクであるＣａｒｏｌｉｎａｓ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋに供与された正常な満期分娩の胎盤から採取した臍帯組織から製造した。正常な満期妊娠後に選択的帝王切開によって分娩された男の赤子の胎盤から臍帯組織を採取した。ドナースクリーニング質問票を母体ドナーに記入してもらい、母体血液を伝染性疾患についてＣｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣにあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  ＣｒｏｓｓにおいてＣＬＩＡ認定ドナースクリーニング検査によって検査した。ドナーは、公立の臍帯血バンクへの同種異系使用のための供与に関して適格でなければならない。胎盤および臍帯の送達後、臍帯血を胎盤から無菌的に流出させた。次いで、臍帯を乾燥させ、クロロプレップを用いて清潔にし、胎盤の基部から分離し、プラズマライトＡを含有する滅菌されたボトルに入れ、室温で有効な容器中に入れてＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ（ＣＴ２）ＧＭＰ細胞処理研究室に輸送した。
【００５３】
ドナースクリーニングおよび試験
ドナースクリーニングおよび試験を、２１Ｃ．Ｆ．Ｒ．パート１２７１の全ての要件を満たすようにＣａｒｏｌｉｎａｓ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ標準操作手順に従って実施した。スクリーニングおよび試験は、現在推奨されており、ＦＤＡにより生物学的認可番号１８７０の下で認可されたものである。臍帯血の母体ドナーをＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、表面およびコア抗原）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）、ＣＪＤ（スクリーニングのみ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型および２型（ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２）、シャーガス、およびＣＭＶについてスクリーニングし、試験した。ＨＩＶ−１／２／Ｏ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、および西ナイルウイルスについての核酸試験も母体血液に対して実施した。ジカウイルスについてのスクリーニングも実施した。
【００５４】
臍帯組織はＣａｒｏｌｉｎａｓ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋへの供与について同意したドナーに由来するので、当該ドナーにドナースクリーニングおよび感染性疾患試験をこれらのＣａｒｏｌｉｎａｓ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ標準操作手順に従って行った。臍帯血関連母体試料および臍帯組織ＭＳＣ試料を今後の試験のための参照試料として本研究の一部として保持する。
【００５５】
細胞バンク系
マスターセルバンク（Ｐ０）。
ｈＣＴ−ＭＳＣのマスターセルバンク（ＭＣＢ）は、消化し、７〜１４日間培養で増大させておよそ２×１０７個の細胞を生成し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ１０（Ｂｉｏｌｉｆｅ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）中、１ｍＬ当たり細胞１×１０７個の濃度で、適正な数の、バイアル当たり細胞５×１０６個のアリコートとして凍結させた臍帯組織に由来するものであった。より詳細には、組織を、ＧＭＰグレードのコラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、パパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）、ＵＳＰグレードのヒアルロニダーゼ（Ｈａｌｏｚｙｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＧＭＰグレードのＤＮアーゼ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、およびＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ  Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む酵素カクテルを使用して消化した。次いで、組織を切断して４グラムの小片にし、酵素カクテルを伴う滅菌ＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ管中に入れ、消化した。消化後、得られた材料をＰｒｉｍｅ  ＸＶ  ＭＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＸＳＦＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）およびＧＭＰグレードの血小板溶解物（Ｃｏｍｐａｓｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）中、培養下に７〜１４日間置いた。細胞をトリプシン処理によって採取し、上記の通り凍結保存させた。細胞を、以下のマーカー：ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、およびＣＤ３を使用したフローサイトメトリーによって特徴付けた。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＭＡ）を使用して細胞計数を実施して、生存度、総細胞濃度、および生存細胞濃度を決定した。ＭＳＣ培養物由来の上清に対してＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）を使用した無菌試験を実施した。試料をマイコプラズマおよびエンドトキシン試験用にも保持した。ＭＣＢの各ロットは、その後の増大について認定するために以下の表１における判定基準を満たさなければならない。
【表１】
2021520380.tif 000003
【００５６】
作業用セルバンク（Ｐ１）
作業用セルバンク（ＷＣＢ）をＭＣＢ（Ｐ０）から生成した。ＭＣＢから適正な数のバイアルを解凍し、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に入れ、５〜７日間増大させて、およそ２．７５×１０８個の細胞を生成した。Ｐ１細胞を採取し、適正な数の５ｍＬクライオバイアル中、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ１０中１ｍＬ当たり細胞１×１０７個の濃度で凍結保存した。細胞を、以下のマーカー、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ３、およびＣＤ１０５を使用したフローサイトメトリーによって特徴付けた。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して細胞計数を実施して、生存度、総細胞濃度、および生存細胞濃度を決定した。培養上清に対してＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍを使用した無菌試験を実施した。試料をマイコプラズマおよびエンドトキシン試験用にも保持した。ＷＣＢの各ロットは、その後の増大について認定するために上の表１における判定基準を満たさなければならない。
【００５７】
最終的な研究材料（Ｐ２）
最終的な研究材料をＷＣＢ（Ｐ１）から生成した。ＷＣＢから適正な数のバイアルを解凍し、２０個のＨＹＰＥＲＦｌａｓｋに入れ、５〜７日間増大させて、およそ１．２５×１０９個の細胞を生成した。Ｐ２細胞を採取し、ＣｒｙｏＰＲＯ  ５コンパートメントバッグ（ＳｙｎＧｅｎ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）中、５％ＨＳＡ（Ｇｒｉｆｏｌｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）および１０％ＤＭＳＯ（Ａｋｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）を伴うプラズマライトＡ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）中１ｍＬ当たり細胞１×１０７〜２×１０７個の濃度で凍結保存した。細胞を、以下のマーカー、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ３、およびＣＤ１０５を使用したフローサイトメトリーによって特徴付けた。Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して細胞計数を実施して、生存度、総細胞濃度、および生存細胞濃度を決定した。培養上清に対してＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍを使用した無菌試験を実施した。試料をマイコプラズマおよびエンドトキシン試験用にも保持した。各ロットは、臨床使用について認定を受けるために以下の表２における判定基準を満たさなければならない。
【表２】
2021520380.tif 000004
【表３】
2021520380.tif 000005
【００５８】
ヒト臍帯組織由来の間葉系間質細胞（ｈＣＴ−ＭＳＣ）の調製
細胞収集の方法／処理／培養条件
全ての製造をＣＴ２  ＧＭＰ施設において実施した。クリーンルームをプロトコールに従ってモニタリングおよび清掃し続け、スタッフメンバーは全員、適切に訓練され、相応に更衣した。訓練をＳＯＰに従って文書に記録した。人員は、ＣＴ２  ＧＭＰ施設について検証された文書追跡システムであるＭａｓｔｅｒＣｏｎｔｒｏｌにより維持された承認されたプロトコールに従った。以下のＳＯＰは、更衣および清掃について記載するものであり、要求に応じて入手可能である：ＣＴ２−ＳＯＰ−００３、ＣＴ２  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ａｃｃｅｓｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ；ＣＴ２−ＳＯＰ−００４、Ｇｏｗｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ＣＴ２  ＧＭＰ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ；ＣＴ２−ＳＯＰ−００６、Ｃｌｅａｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓａｎｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ  Ａｒｅａｓ  ｉｎ  ＣＴ２  ＧＭＰ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ；ＣＴ２−ＳＯＰ−００９、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ，Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｗａｓｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ａｎｄ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＴ２  ＧＭＰ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ。
【００５９】
ｈＣＴ−ＭＳＣ出発材料は、母親から、書面のインフォームドコンセントを得た後に供与された臍帯組織であった。製造に使用した臍帯組織は、手術室における併発症を伴わない選択的帝王切開による分娩から得た満期胎盤から採取し、収集時に１２桁のＩＳＢＴバーコード識別子を割り当てた。臍帯組織がＣＴ２  ＧＭＰ施設に到着したら、ＣＴ２  ＧＭＰ施設に特異的な新しい１２桁のＩＳＢＴバーコード識別子を割り当て、ｈＣＴ−ＭＳＣの製造プロセス全体を通して追跡した。この新しいバーコード識別子を収集場所で組織に割り当てられた元のＩＳＢＴ番号と関連付けた。ドナースクリーニングおよび試験は、バンクに保存されるｈＣＴ−ＭＳＣのための臍帯血認可に関する仕様を満たすものでなければならない。
【００６０】
Ｐ０（ＭＣＢ）を生成するための臍帯組織（ＣＴ２−ＭＳＣ−００２）の処理
男性ドナー臍帯組織を受け取るとすぐ、製造のゼロ日目を開始した。臍帯組織は、プラズマライトＡを含有する容器中に入った状態で、訓練された宅配業者によりＣＴ２施設に送達された。受領時に目視検査を実施して、臍帯組織が処理の要件を満たすことを確実にした。臍帯組織には収集時に１２桁のバーコードが割り当てられており、組織がＣＴ２施設に到着した際に割り当てた新しい１２桁のＩＳＢＴバーコード識別子と関連付けた。全てのバッチ記録、機器プリントアウト、管、バイアルなど用の十分な数のバーコード標識を発行し、製造実行の終わりに照合した。
【００６１】
バイオセーフティキャビネット内で、臍帯組織を秤量し、切断しておよそ４グラムの小片にした。臍帯組織小片を、リベラーゼ、ハイレネックス、パパイン、およびベンゾナーゼを含有する酵素カクテル（表３参照）を伴う滅菌管に入れた。次いで、組織小片を細かく切り、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｏｃｔｏ  ＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒで消化した。解離後、消化された組織を濾過し、遠心分離し、１％血小板溶解物を補充したＰｒｉｍｅ  ＸＶ  ＭＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＸＳＦＭを含有する一層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）にプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
【００６２】
培地交換および採取（ＣＴ２−ＭＳＣ−００３）（ＭＣＢ）
培養の最初の３日以内に、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫをインキュベーターから短時間取り出し、顕微鏡下でコンタミネーションのあらゆる視覚的証拠および／またはあらゆる普通でない形態または不規則な成長について観察した。次いで、培地全てをフラスコから除去し、等体積の新鮮なＰｒｉｍｅ  ＸＶ  ＭＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＸＳＦＭおよび１％血小板溶解物で置き換えた。フラスコをインキュベーターに戻して７日目まで置いた。
【００６３】
７日目に、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫをインキュベーターから短時間取り出し、顕微鏡下でコンタミネーションのあらゆる視覚的証拠および／またはあらゆる普通でない形態または不規則な成長について観察した。培養物が８０〜９０％集密度に達しない場合、培地の全てをフラスコから除去し、等体積の新鮮なＰｒｉｍｅ  ＸＶ  ＭＳＣ増大培地および１％血小板溶解物で置き換えた。フラスコをインキュベーターに戻した。
【００６４】
Ｐ０  ＣｅｌｌＳＴＡＣＫを７日目から１４日目の間に８０〜９０％集密度に達したら採取した。採取日に、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫをインキュベーターから取り出し、顕微鏡下でコンタミネーションのあらゆる視覚的証拠および／またはあらゆる普通でない形態または不規則な成長について観察した。細胞を、１×ＴｒｙｐＬＥを使用してＣｅｌｌＳＴＡＣＫから取り出し、計数し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ１０中で凍結保存した。細胞を、細胞およそ５×１０６個のアリコートとして、２ｍＬクライオバイアル中、１ｍＬ当たり細胞１×１０７個の濃度で、速度制御されたフリーザーを使用して凍結させた。細胞を、液体窒素フリーザーにおいて、気相中に保管した。残余の培養培地を無菌試験のために好気性培養ボトルおよび嫌気性培養ボトルに接種した。アリコートの細胞を細胞の特徴付け、マイコプラズマ、およびエンドトキシン試験のために取り出した。
【００６５】
Ｐ１（ＣＴ２−ＭＳＣ−００５）（ＷＣＢ）を生成するためのＰ０の解凍および増大
Ｐ０バイアルを３７℃のウォーターバス中で解凍し、４つのＨＹＰＥＲＦｌａｓｋに、Ｐｒｉｍｅ  ＸＶ  ＭＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ中、それぞれ１．７×１０６個の細胞を播種した。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。Ｐ１  ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋを５日目〜７日目の間に８０〜９０％集密度に達したら採取した。
【００６６】
Ｐ１（ＣＴ２−ＭＳＣ−００５）（ＷＣＢ）の回収
採取日に、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋをインキュベーターから取り出し、顕微鏡下でコンタミネーションのあらゆる視覚的証拠および／またはあらゆる普通でない形態または不規則な成長について観察した。細胞を、１×ＴｒｙｐＬＥを使用してＨＹＰＥＲＦｌａｓｋから取り出し、計数し、バイアル中、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ１０中に凍結保存した。細胞を、細胞およそ４．５×１０７個のアリコートとして、５ｍＬクライオバイアル中、１ｍＬ当たり細胞１×１０７個の濃度で、速度制御されたフリーザーを使用して凍結させた。細胞を、液体窒素フリーザーにおいて、気相中に保管した。使用した培養培地を無菌試験のために好気性培養ボトルおよび嫌気性培養ボトルに接種した。アリコートの細胞を細胞の特徴付け、マイコプラズマ、およびエンドトキシン試験のために取り出した。
【００６７】
Ｐ２（研究製品）（ＣＴ２−ＭＳＣ−００５  ＦＲＭ４）を生成するためのＰ１（ＷＣＢ）の解凍および増大
Ｐ１バイアルを解凍し、２０個のＨＹＰＥＲＦｌａｓｋに、Ｐｒｉｍｅ  ＸＶ  ＭＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ中、それぞれ１．７×１０６個の細胞を播種した。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。Ｐ２  ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋを５日目から７日目の間に、８０〜９０％集密度に達したら採取した。
【００６８】
最終的な採取−Ｐ２（研究製品）（ＣＴ２−ＭＳＣ−００５  ＦＲＭ５）の採取
採取日に、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋをインキュベーターから取り出し、顕微鏡下でコンタミネーションのあらゆる視覚的証拠および／またはあらゆる普通でない形態または不規則な成長について観察した。フラスコをＰＢＳで洗浄し、細胞を、１０×ＴｒｙｐＬＥを使用してＨＹＰＥＲＦｌａｓｋから取り出した。次いで、細胞を、プラズマライト／５％ＨＳＡで洗浄し、計数し、プラズマライト／５％ＨＳＡ  ２０ｍＬ中に製剤化した。デキストラン−４０中５５％ＤＭＳＯ（Ａｋｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）を添加するため、およびＣｒｙｏＰＲＯ  ５コンパートメントバッグセットに移すためにＳｙｎＧｅｎ  ＣｒｙｏＰＲＯ（ＳｙｎＧｅｎ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）を使用した。バッグ当たりおよそ２．５×１０８〜５×１０８個の細胞を、プラズマライト／５％ＨＳＡ／１０％ＤＭＳＯ  ２５ｍＬ中、１ｍＬ当たり細胞１×１０７〜２×１０７個の濃度で添加した。したがって、各コンパートメントが５０，０００，０００〜１００，０００，０００個の細胞を含有した。製品を、速度制御されたフリーザーを使用して凍結保存し、液体窒素フリーザーにおいて気相中で保管した。残余の培養培地を無菌試験のために好気性培養ボトルおよび嫌気性培養ボトルに接種した。アリコートの細胞をマイコプラズマ、エンドトキシン、細胞の特徴付け、および機能アッセイに関する試験のために取り出した。免疫表現型検査パネルは、ＭＳＣ表現型を確認するためにＣＤ７３およびＣＤ９０を含み、造血細胞または内皮細胞によるコンタミネーションがほとんど〜全くないことを実証するためにＣＤ４５、ＣＤ３、およびＣＤ３１を含む。仕様は、＞９０％のＣＤ７３＋およびＣＤ９０＋、それと共に＜１０％のＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ３１＋である（図４参照）。以下のマーカーを参考までに含める：ＣＤ１０５およびＣＤ１６６。細胞懸濁物のアリコートを、蛍光標識された抗体と一緒にインキュベートし、ＰＢＳ／ＨＳＡ緩衝液で洗浄した。データを、ＤｉＶａソフトウェアを備えたＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏで取得し、臨床使用に関して以前に検証されたＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して分析した。各マーカーと反応する細胞のパーセンテージ分析証明書に報告されている。
【００６９】
Ｐ２細胞の試料に対して機能試験を実施した。ｈＣＴ−ＭＳＣは、骨組織、脂肪組織、および軟骨組織に分化することが予測された。細胞を、骨分化についてオステオカルシンの発現によって、脂肪について脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ−４）を使用して、および軟骨についてアグリカンを使用して検査した。細胞を、マイトジェンアッセイにおいても試験して、マイトジェンに対するＴ細胞応答を抑制する細胞の能力を検査した。試験仕様を満たさないあらゆるロットを廃棄した。
【００７０】
処理のタイミングおよび中間保管
ｈＣＴ−ＭＳＣを臍帯組織からマスターセルバンク、作業用セルバンク、および研究製品を生成する一連の３つのステップで製造した。各ステップの産物を液体窒素フリーザーにおいて気相中で凍結させ、保管した。凍結させた産物の安定性プログラムが製品の開発の一部であった。
【００７１】
最終製剤
被験体の処置日に、細胞を解凍し、プラズマライトＡ／５％ＨＳＡに１：１希釈し、アリコートを細胞計数、生存度、および無菌試験のために取り出した。細胞計数および生存度を、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ａｕｔｏ  ２０００を使用して得た。細胞が≧７０％生存可能の場合、最終製品の体積を、細胞２×１０６個／ｋｇが研究被験体に送達されるように調整した。細胞をｌｕｅｒ−ｌｏｃｋシリンジに移し、ベッドサイドに届けた。プラズマライトは、抗菌剤を含有しない無菌、非発熱性、等張性溶液である。取り出されたあらゆる細胞懸濁物を無菌試験のために好気性培養ボトルおよび嫌気性培養ボトルに接種した。
【００７２】
ｈＣＴ−ＭＳＣ製品は室温で最大４時間にわたって安定である。最終的な賦形剤中の解凍されたｈＣＴ−ＭＳＣ製品の安定性を、ＣＴ２  ＧＭＰ施設報告書（ＣＴ２−２０１６−０１９−Ｐ）のＭＳＣのパイロット処理ロットの製造（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｉｌｏｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｌｏｔｓ  ｏｆ  ＭＳＣｓ）に記録した。
【００７３】
シリンジを、患者に投与するためのポイントオブケアのために室温で輸送するための輸送用容器に包装した。産生バッチ記録および分析証明書のＱＡ精査時に、製品をＳＯＰに従って診療所に輸送するためにリリースした。ｈＣＴ−ＭＳＣ製品には分析証明書および加工流通過程の管理フォームの両方が添付される。ｈＣＴ−ＭＳＣ製品を含有するシリンジが診療所に到着するとすぐに、研究被験体に投与した。
【００７４】
正体
ｈＣＴ−ＭＳＣの細胞組成を、ＭＳＣ表現型を確認するためにＣＤ７３およびＣＤ９０、ならびに造血細胞または内皮細胞によるコンタミネーションがほとんど〜全くないことを実証するためにＣＤ４５、ＣＤ３、およびＣＤ３１に対する蛍光標識された抗体のパネルを使用して免疫表現型検査によって決定する。ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を参考までに使用する。仕様は、＞９０％のＣＤ７３＋およびＣＤ９０＋、それと共に＜１０％のＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、またはＣＤ３１＋である（図４参照）。データを、ＤｉＶａソフトウェアを備えたＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏで取得する。データを、臨床使用に関して以前に検証されたＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して分析する。各マーカーを発現する細胞のパーセンテージが分析証明書に報告されている。リリース仕様は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ３、およびＣＤ３１について、非臨床データ、パイロット処理実行からの結果、および被験体の安全性に関する医療チームからの入力に基づいて確立されたものである。パネル内の他の全てのマーカーのパーセンテージは、参考までに報告する。候補効力アッセイが出現すると、免疫表現型検査データが相関し、したがって、その後のＩＮＤ相の前に仕様を確立することができる。
【００７５】
ＭＳＣと同様に、これらの臍帯組織由来製品は、骨細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を示すことが予測される。各細胞製品の分化能を、明確に定義された培養条件を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでモニタリングする。最終的に、蛍光顕微鏡を使用して細胞を検査する。分化した骨細胞は、オステオカルシンの発現によって弁別される。分化された脂肪細胞は、脂肪酸結合タンパク質４の発現によって弁別される。最後に、分化された軟骨細胞は、アグリカンの発現によって弁別される。
【００７６】
ｈＣＴ−ＭＳＣの免疫調節能をモニタリングするために、ｈＣＴ−ＭＳＣを、マイトジェンに対するＴ細胞応答を抑制する能力についてアッセイした。この抑制の背後にある潜在的な機構を探究するために、インターフェロン−γに対する細胞応答を測定した。ｈＣＴ−ＭＳＣがこの炎症促進シグナルに曝露されると、ｈＣＴ−ＭＳＣによるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）の発現が増大した。同時に、ｈＣＴ−ＭＳＣの細胞表面におけるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２タンパク質の両方の発現も増大した。これらの研究から、ｈＣＴ−ＭＳＣによって媒介される免疫調節には多数の異なる機構が関連する可能性があることが示唆される（データは示していない）。
【００７７】
純度
エンドトキシンレベルを、ＳＯＰに従い、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒのＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳをＦＤＡにより許可されたＬｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）カートリッジと共に使用して決定する。この方法は、試験される全ての細胞／培地組合せについて検証される。最大２５０μＬの、プラズマライト／５％ＨＳＡ中の最終製品を、エンドトキシンを含まない脱イオン水に希釈し、ＳＯＰに従って試験する。リリースのためには、エンドトキシンレベルは、１時間当たり体重１ｋｇ当たり５ＥＵまたは５ＥＵ／ｍＬよりも少ないかまたはそれと等しくなければならない。予測されるｈＣＴ−ＭＳＣ製品の投与時間は１時間未満である。最大の妥当な希釈および単位／ｋｇ／時間から単位／ｍＬへの変換を、アッセイ検証の間に決定した。エンドトキシンの上限は、注入用製品のリリース前に各被験体の体重を使用して算出される。
【００７８】
母体細胞の試験
臨床試験における使用のために選択されたｈＣＴ−ＭＳＣ製品は全て、Ｐ１およびＰ２の製造のための最終的な選択の前に高分解能ＨＬＡクラス１（ＡＢＣ）およびクラスＩＩ（ＤＲ）にタイピングされたものである。この技法は、第三者（母体）ＨＬＡ対立遺伝子の検出に関して大いに感度が高い。母体細胞のコンタミネーションがない単位のみを、Ｐ１およびＰ２（ＷＣＢおよび最終製品）製造のために選択する。
【００７９】
Ｐ５３変異の試験
Ｐ５３変異の存在の試験を、デューク大学臨床分子診断研究室（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）により臨床試験において使用するために選択されたＰ２培養物の全てのロットに対して実施する。細胞調製物から抽出されたゲノムＤＮＡを、ＴＰ５３エクソン４から１１までのＰＣＲ増幅のために使用する。次いで、精製されたＤＮＡアンプリコンを、ユニバーサルＭ１３フォワードプライマーおよびリバースプライマーならびにＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して配列決定する。製品を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して精製し、ＡＢＩ  ３１３０ｘＩ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して解析する。データを、ＡＢＩ  Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎソフトウェア、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアおよびＳｅｑＳｃａｐｅソフトウェアを使用して分析する。
【００８０】
効力
効力は、開発中のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現アッセイによって決定することができ、結果は情報試験として報告される。FDA  Guidance  for  Industry:  Potency  Tests  for  Cellular  and  Gene  Therapy  Products  (January  2011)において推奨されている通り、効力アッセイの開発は、前臨床的開発で開始され、ＢＬＡのファイリング前の検証された効力アッセイまたはアッセイマトリックスを目標に臨床相全体を通して継続される。リリースのために必要なものに加えて、広範囲の製品特質を測定すると同時に、作用機構を研究し、製品の関連性のある生物活性を特徴付ける。製造の実施が進展するにしたがい、候補効力アッセイを再評価し、必要に応じて認定する。
【００８１】
生存度
生存度を、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ａｕｔｏ  ２０００を使用し、ＳＯＰに従って決定する。最低７０％の生存度のｈＣＴ−ＭＳＣ製品がリリースのために必要とされる。
【００８２】
細胞数／用量
本研究では３つの投薬コホートが存在した。この研究には、１２人の被験体が登録された。患者３人の第１のコホートは単回用量を受けた。安全性の懸念がなければ、患者３人の第２のコホートは２回用量を、２カ月離して受けた。第３のコホートは６人の患者からなり、それぞれが３回のｈＣＴ−ＭＳＣ注入を用量間に２カ月の間隔をあけて受けた。被験体に、解凍後計数に基づいてｈＣＴ−ＭＳＣ２×１０６個／ｋｇを投薬した。注入日の総細胞計数は、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ａｕｔｏ  ２０００を使用して自動化細胞計数によって決定した。解凍後の細胞計数を使用して、上記の最終製剤の用量を算出した。リリース試験および最終製剤に必要とされるものよりも過剰な細胞はいずれも効力アッセイを開発するための情報試験のために使用することができる。
【００８３】
安全性評価基準
患者を、各注入中に観察し、注入反応について各注入後２４時間にわたってモニタリングした。追加的な有害事象（ＡＥ）を、ｈＣＴ−ＭＳＣの各注入の７〜１０日後、２カ月後および４カ月後、および最後の注入の６カ月後および１２カ月後に患者の親／保護者との電話面接によって、ならびにベースライン時および６カ月の診療所での診察時に対面によって同定した。分析のために、逐語的にＡＥ用語を有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）バージョン４．０によって定義される標準の用語法にマッピングし、試験担当医によって判断された重症度および介入との関係に従って要約した。
【００８４】
臨床的調査
複数の調査を利用して、今後の第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床試験のエンドポイントとして投与の実現性および有用性の両方を決定した。最初の調査は、自閉症診断観察検査第２版（ＡＤＯＳ−２）および自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）−短縮版（Ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）から情報を得たものであるＤＳＭ−５チェックリストに基づいてＡＳＤの診断を確認するために実施した。ＡＤＯＳ−２およびＡＤＩ−Ｒの施行に関して信頼できるリサーチ能力を有するとして認定された臨床リサーチスタッフが診断的評価を完了させた。各患者についてのベースラインを確立するため、ならびに今後の第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床試験のエンドポイントとしての有用性を決定するために、追加的な調査を実施した。これらには、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度ＩＩＩ（ＶＡＢＳ−ＩＩＩ）、臨床全般印象尺度（ＣＧＩ）、広汎性発達障害行動調査票（ＰＤＤＢＩ）、知能尺度（Ｍｕｌｌｅｎ初期学習尺度ＡＧＳ版、および弁別能力尺度第２版（ＤＡＳ−ＩＩ）を含めた。他の一般に使用される調査は、表出一単語絵画語彙検査４（ＥＯＷＰＶＴ−４）、スコア、ＰＤＤＢＩスコア、およびＣＧＩ−Ｉスコアである）。
【００８５】
自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）、短縮版（Rutter  M,  et  al.  ADI-R.  Torrence,  CA:  Western  Psychological  Services;  2008）は、３つのドメイン：言語／コミュニケーション、相互社会的相互作用、ならびに限られた反復性の常同的な行動および関心における初期機能を調査する、包括的な親との面接である。信頼できるリサーチ能力を有する面接者は、情報を得ることおよび応答を記録することに関して、標準化された手順に従う。面接での質問は、患者のバックグラウンド、行動、初期発達および重大な出来事、言語習得、現在のコミュニケーション機能、社会性発達および社会的遊び、関心および行動、ならびに任意の他の臨床的に意義のある行動を含めた種々の内容の領域を含む。ＡＤＩ−Ｒ短縮版は、標準のＡＤＩ−Ｒと同じプロトコールに従うが、スコアを得るために必要でない質問のうちのいくつかが省略されたものである。ＡＤＩ−Ｒ短縮版は、小児の年齢および行動の複雑さに応じて９０〜１５０分を要する。スクリーニングプロセスの間に各患者に対してＡＤＩ−Ｒを完了させ、ＡＳＤのＤＳＭ−５による診断の通知を補助するために使用する。
【００８６】
自閉症診断観察検査第２版（ＡＤＯＳ−２）（Lord  C,  et  al.  Autism  Diagnostic  Observation  System.  Los  Angeles,  CA:  Western  Psychological  Services;  1999）は、中核ＡＳＤ総体的症状に関する標準化された観察に基づく調査である。年齢依存性モジュールおよび言語依存性モジュールは、小児のコミュニケーション、社会的相互作用、遊び、および限られた反復行動を観察するための、訓練された、信頼できるリサーチ能力を有する臨床医によって導かれる一連の活動で構成される。ＡＤＯＳ−２プロトコールは、ＡＳＤ  ＤＳＭ−５基準に直接マッピングされる行動が引き出されるように設計される。ＡＤＯＳ−２は、１２カ月齢という若さの幼児に施行することができる。年齢および言語能力を使用して、適正なモジュール（幼児、１、２、３または４）を決定する。各ＡＤＯＳ−２幼児モジュール（ＡＤＯＳ−２  Ｔｏｄｄｌｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅ）調査について、Esler  et  al.  (2015)によって開発された幼児モジュール較正重症度スコア（Ｔｏｄｄｌｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅｓ）を使用してスコアを生成して、他のモジュールとの比較を容易にする。モジュール１〜４を用いた重症度スコアも生成する。ＡＤＯＳ−２の施行には約４５〜６０分を要する。この調査は、ＡＳＤのＤＳＭ−５による診断の通知を補助するために使用し、各患者についてベースライン診察時に完了させた。
【００８７】
診断と統計マニュアル−５チェックリスト（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ−５  Ｃｈｅｃｋｌｉｓ：ＤＳＭ−５）は、精神障害の診断と統計マニュアル−５（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−５）中のＡＳＤの診断基準に基づく、臨床医によるチェックリストである。診断基準をＤＳＭ−５から取得し、研究に含めるための適正なＡＳＤ診断を確認するために利用する。このチェックリストは、訓練された臨床医が臨床医の最良の判断を使用して完了させ、ＡＤＩ−Ｒ短縮版およびＡＤＯＳ−２の施行中に集められた情報から情報を得た。ＤＳＭ−５は、各患者についてベースライン診察時に完了させた。
【００８８】
Ｍｕｌｌｅｎ初期学習尺度ＡＧＳ版（Mullen  EM,  Western  Psychological  Services;  1995）は、出生から６８カ月までの極めて若年の小児および就学前児童のために特別に設計された認知機能調査である。これは、認知機能の５つの尺度：粗大運動（Ｇｒｏｓｓ  Ｍｏｔｏｒ）、視覚的受容（Ｖｉｓｕａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｉｏｎ）、微細運動（Ｆｉｎｅ  Ｍｏｔｏｒ）、表出性言語（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｌａｎｇｕａｇｅ）、および受容性言語（Ｒｅｃｅｐｔｉｖｅ  Ｌａｎｇｕａｇｅ）を測定するものである（注：本研究に関しては、粗大運動下位尺度は施行しない）。各尺度を個別に試験し、この検査は時間を設定せずに行う。質問のいくつかは、小児の能力を調査するために親による入力が必要なものであり得る。この検査は、相互作用的なものであり、検査中に小児の気を引くための玩具および操作できるものを含む。試験施行時間は、１歳に対しておよそ１５分間から５歳に対して１時間まで変動する。Mullenは、ベースライン診察時に４歳０カ月未満の患者に対して使用し、ベースライン診察時にのみ行った。
【００８９】
弁別能力尺度第２版（ＤＡＳ−ＩＩ）（Elliott  CG.  Differential  Ability  Scales,  2nd  ed.  San  Antonio,  Tx:  Harcourt  Assessment;  2007）は、行動を観察するため、およびスコアを計算して認知能力を調査するための、訓練された臨床医によって施行される調査である。この試験は、２歳６カ月齢〜１７歳１１カ月齢に適しており、ベースライン時に４歳０カ月齢およびそれより年長の患者に使用される。この調査には約４５分を要し、ベースライン診察時に行った。
【００９０】
Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動評価尺度ＩＩＩ（ＶＡＢＳ−ＩＩＩ）（Sparrow  S,  et  al.  Vineland  Adaptive  Behavior  Scales:  Interview  Edition.  Circle  Pines,  MN:  American  Guidance  Service;  1984）は、広範囲のドメインにわたる小児の適応行動を調査するために使用される介護者への質問票である。ＶＡＢＳ−ＩＩＩは、全体的な複合スコア、ならびに以下のドメインの下位尺度標準スコア：社会化（Ｓｏｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）、コミュニケーション（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、日常生活技能（Ｄａｉｌｙ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｓｋｉｌｌｓ）、および運動技能（Ｍｏｔｏｒ  Ｓｋｉｌｌ）をもたらす強力な信頼度および妥当性を有する十分に標準化された尺度である（Balboni  G,  et  al.  J  Autism  Dev  Disord  2016;  46:42-52；Perry  A,  et  al.  J  Autism  Dev  Disord  2009;  39:1066-1078；Yang  S,  et  al.  J  Autism  Dev  Disord  2016;  46:64-73；Sparrow  S,  et  al.  Vineland  Survey  Forms  Manual.  2nd  ed.  Minneapolis,  MN;  NCS  Pearson  Inc;  2005）。ＶＡＢＳ−ＩＩＩは、各患者の主要な介護者から、ベースラインおよび６カ月時点の診察時に収集した。社会化下位尺度スコアを使用して、社会的行動に関する中核ＡＳＤ症状の改善を測定した。
【００９１】
Ｎｏｌｄｕｓ  ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎを用いた親子相互交流（Ｐａｒｅｎｔ−Ｃｈｉｌｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：ＰＣＩ）：親子相互交流課題（Ｐａｒｅｎｔ−Ｃｈｉｌｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｔａｓｋ）の間、Ｎｏｌｄｕｓ  ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎを使用する。ビデオ追跡の目的は、ＡＳＤを有する小児において社会的アプローチまたは回避に関連する小児の動作の自動追跡を確実に施行できるかどうか決定すること、および社会的コミュニケーションに関する妥当な尺度をもたらすことである。このパラダイムは、親しい成人がいるＡＳＤを有する小児の社会的アプローチおよび回避行動に関連する動作を自動的に追跡するために設計される。主要な従属変数は、成人の近くで過ごす時間に対する部屋の外縁部で過ごす時間である。（１）６分間の、利用可能な玩具で自由に遊ばせ、その間介護者は部屋の隅で静かに座っているセッション、および（２）６分間の、親が小児との相互作用的な遊びに参加して、小児が成人とどのように遊ぶか、または逆に成人が小児とどのように遊ぶかを見る親−小児相互作用で構成される、同じ部屋で行った２回の連続したセッションの間、参加者を観察した。天井に取り付けられたカメラから行動を記録し、ソフトウェアを使用して、小児の動作を自動的に追跡する。従属変数は、介護者関心領域（ＲＯＩ）内で過ごしたセッションのパーセンテージ、介護者ＲＯＩにアプローチするまでの潜伏期、およびＲＯＩ周辺で過ごした時間のパーセンテージを含む。親子相互交流課題は、ベースライン時、６カ月および１２カ月時点の診察時に行う。
【００９２】
臨床全般印象（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＣＧＩ）は、症状の重症度および処置への応答または時点間の行動の変化を測定する一般に使用される評定尺度である。２つのバージョンのＣＧＩを使用した：ＣＧＩ−重症度（ＣＧＩ−Ｓ）およびＣＧＩ−改善（ＣＧＩ−Ｉ）。ＣＧＩ−Ｓは、専門評定者が過去に同じ診断を有する患者で経験したものと比べた、調査時の各患者のＡＳＤの症状の重症度を示す７点の尺度である。専門評価者のこれまでの人生での臨床経験および全ての入手可能な情報に基づいて、各患者を１：存在しない（ＡＳＤではない）、２：ＡＳＤ症状がほとんど見られない、３：軽度のＡＳＤ症状、４：中等度のＡＳＤ症状、５：中程度に重度のＡＳＤ症状、６：重度のＡＳＤ症状、または７：極めて重度のＡＳＤ症状として評定した。各患者に、ベースライン時および６カ月時点の診察時にＣＧＩ−Ｓ評点を割り当てた。ＣＧＩ−Ｉは、ベースラインと比べたＡＳＤ症状の改善または悪化の度合いを示す７点の尺度である。全ての入手可能な情報に基づいて、各患者を、１：非常に大きく改善された、２：大きく改善された、３：わずかに改善された、４：変化なし、５：わずかに悪化した、６：大きく悪化した、または７：非常に大きく悪化したとして評定した。各患者に、６カ月時点の診察時にＣＧＩ−Ｉ評点を割り当て、それぞれベースラインＣＧＩ−Ｓ評点と比べた改善または悪化の度合いを参照した。ＣＧＩ−Ｓ評点およびＣＧＩ−Ｉ評点は全て、ＡＳＤに関する専門知識を有する高度に経験を積んだ臨床医が行った。
【００９３】
ＣＧＩ面接（ＣＧＩ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ）：ＣＧＩ介護者面接（ＣＧＩ  Ｃａｒｅｇｉｖｅｒ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ）は、臨床医により完了され、主要な介護者と共に行われる。この面接は、参加者の社会的コミュニケーション能力および難題、関心の限定、反復行動、および全体的な機能に焦点を当てるものである。臨床医は、例えば、自宅、学校、およびコミュニティなどの異なる状況での行動の頻度および質に関する詳細、ならびに各状況において小児が機能するために必要な支援のレベルに関する詳細を得る。この面接は、ベースライン診察時に完了させ、６カ月時点および１２カ月時点の診察時に更新される。この面接では、ベースライン診察時には完了までおよそ４５分を要し、６カ月時点および１２カ月時点の診察時には完了までおよそ３０分を要する。この情報を使用して、ＣＧＩ−Ｉ評点およびＣＧＩ−Ｓ評点を得る。
【００９４】
広汎性発達障害行動調査票（ＰＤＤＢＩ）（Cohen  IL,  et  al.  J  Autism  Dev  Disord.  33(1):31-45(2003)）は、ＡＳＤを有する小児における介入への応答性を調査するために設計された、介護者への質問票である。ＰＤＤＢＩは、１歳６カ月齢〜１２歳５カ月齢の小児のために設計された情報提供者に基づく評定尺度である。ＰＤＤＢＩでは、問題行動ならびに適正な社会的技能、言語技能、および学習／記憶技能を調査する。ＰＤＤＢＩでは、活動的であるが風変わりなＡＳＤの亜型に典型的に関連する社会的障害および相互社会的行動の改善ために不可欠な向社会的技能の発達の両方を調査する。ＰＤＤＢＩでは、生スコア、ならびに様々な人種、民族、および社会経済的バックグラウンドのＡＳＤを有する小児の介護者および教師の標準化されたＡＳＤ集団の比較に基づいたｔ−スコアが付与される。（Cohen  IL,  Sudhalter  V.  PDD  Behavioral  Inventory  Professional  Manual.  Lutz,  FL:  Psychological  Assessment  Resources  Inc;  2005）。ＰＤＤＢＩは、各患者の主要な介護者から、ベースラインおよび６カ月時点の診察時に収集した。
【００９５】
表出一単語絵画語彙検査４（ＥＯＷＰＶＴ−４）（Martin  NA,  Brownell  R.  EOWPVT-4.  4th  ed.  Novator,  CA:  Academic  Therapy  Publication  Inc;  2011）は、話された言葉を物体、行為、または概念の画像と一致させる個体の能力を測定する、臨床医により施行される調査である。ＥＯＷＰＶＴ−４では、１つの言葉から、カラーのイラストで提示された時に物体、行為、および概念を指名する個体の能力を試験する。この試験は、２〜８０歳に適しており、完了させるのに約１０〜３０分を要する。完了時間は個体の言語能力により決定される。この調査は、ベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点の診察時に行う。
【００９６】
患者が行動、話し言葉、職業、および他の行動療法に関わった時間数ならびに小児が受けた教育サービスの時間数に関する情報はこの研究には含めなかったが、親との構造化された介入歴面接（Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗｓ）を介して含めることができる。
【００９７】
親介護者への質問票
介護者への質問票は全て、Ｄｕｋｅの認可されたＥＤＣシステムを通じてオンラインでまたは紙によって完了させる。Ｄｕｋｅ利用者には、大学全体のサイトライセンスによってＥＤＣ調査ツールが利用可能である。ＥＤＣにはＤｕｋｅのＮｅｔＩＤ認証システムが組み込まれているが、非Ｄｕｋｅ利用者と調査を共有することが許容される。
【００９８】
広汎性発達障害行動調査票（ＰＤＤＢＩ）。ＰＤＤＢＩは、ＡＳＤを有する小児における介入への応答性を調査するために開発された。ＰＤＤＢＩは、１歳６カ月齢〜１２歳５カ月齢の小児に対して設計された、情報提供者に基づく評定尺度である。ＰＤＤＢＩでは、問題行動ならびに適正な社会的技能、言語技能、および学習／記憶技能を調査する。ＰＤＤＢＩでは、活動的であるが風変わりなＡＳＤの亜型に典型的に関連する社会的障害および相互社会的行動の改善ために不可欠な向社会的技能の発達の両方を調査する。ＰＤＤＢＩでは、生スコア、ならびに標準化されたＡＳＤ集団との比較に基づいたｔ−スコアが付与される。ＰＤＤＢＩは、１歳から１７歳の間の小児３１１人のＰＤＤＢＩ開発試料において検証されている。これは、１８８項目の親への質問票であり、完了までおよそ３０〜４５分を要する。ＰＤＤＢＩは、ベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点の診察時において、ならびに３カ月時点および９カ月時点において遠隔的に施行される。
【００９９】
異常行動チェックリスト−コミュニティ（ＡＢＣ−Ｃ）。親が完了させるこの評定尺度は、引きこもりに重点を置いて、ＡＳＤに関連する異常行動を測定するために使用される。ＡＢＣ−Ｃは、発達障害のある個体を用いた研究における薬物および他の処置の効果を評価することができる、検証された尺度である。施設に入れられた参加者の試料からのデータの別々の因子分析（ステージ１ではｎ＝４１８［平均年齢２９．５歳］およびステージ２ではｎ＝５０９［平均年齢２５．９歳］）の結果、５８項目で構成される５因子尺度がもたらされた。因子は、（１）易刺激性、興奮、泣き叫び、（２）引きこもり、（３）常同行動、（４）活動亢進、不従順、および（５）不適切な発話能力として標識される。ＡＢＣ−ＳＱＷは、自閉症の中核社会的症状およびコミュニケーションの症状に焦点を当てた他の臨床試験において使用されている。ＡＢＣ−Ｃは５８項目を有し、各項目が０＝全く問題なし、１＝行動に問題があるが、わずかな程度である、２＝問題が中等度に重篤なものである、または３＝問題の程度が重度であると評定される。親が完了させるこの評定尺度は、完了までにおよそ１０〜１５分を要する。ＡＢＣ−Ｃは、ベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点の診察時に完了させ、加えて３カ月時点および９カ月時点で遠隔により完了させる。
【０１００】
介入歴質問票（Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）。この質問票は、過去３カ月にわたって、または質問票が最後に施行されてから小児／家族が関与した行動健康介入に関する詳細な情報を得るために、主要な介護者が完了させるものである。小児が受けている介入、サービス、および処置の型および数量に関する情報を収集する。この質問票は毎月ベースで施行される。
【０１０１】
実行機能の行動評価調査票−就学前版（ＢＲＩＥＦ−Ｐ）。この調査は、専門家が家庭および就学前の環境での実行機能行動を調査することを可能にする、就学前年齢の小児の親に対する質問票である。ＢＲＩＥＦ−Ｐは、突発的な学習能力障害および注意障害、言語障害、外傷性脳損傷、鉛への曝露、広汎性発達障害、ならびに他の発生神経学的、精神医学的、および医学的状態を有する就学前児童を含めた広範囲の就学前児童に対して設計されている。ＢＲＩＥＦ−Ｐは６３項目を含有し、完了するまで約１５分を要する。ＢＲＩＥＦ−Ｐは、ベースライン時に５歳未満の参加者に使用される。この質問票は、ベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点の診察時に完了させる。
【０１０２】
実行機能の行動評価調査票（ＢＲＩＥＦ）。この調査は、専門家が家庭および学校環境での実行機能行動を調査することを可能にする、就学年齢の小児の親に対する質問票である。ＢＲＩＥＦの親フォームは、実行機能の異なる側面を測定する８つの理論的かつ経験的に導き出された臨床的尺度：抑制（Ｉｎｈｉｂｉｔ）、シフト（Ｓｈｉｆｔ）、感情制御（Ｅｍｏｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、開始（Ｉｎｉｔｉａｔｅ）、作業用メモリ（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｍｅｍｏｒｙ）、計画／組織（Ｐｌａｎ／Ｏｒｇａｎｉｚｅ）、道具の整理（Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、およびモニタ（Ｍｏｎｉｔｏｒ）の中に８６項目を含有する。ＢＲＩＥＦは、完了するまで約１５分を要し、ベースライン時に５歳およびそれより年長の参加者に使用される。この質問票は、ベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点の診察時に完了させる。
【０１０３】
感覚的経験質問票２．１版（ＳＥＱ２．１）。ＳＥＱ２．１は、親に、自身の子の、日常活動およびルーチンの状況での知覚刺激に対する応答の頻度に関する４５個の質問に、５点のリカート尺度で返答するよう求めるものである。この研究では、親にリカート尺度の質問のみを完了させることを求め、自由回答質問は全て省略した改変版を使用する。ＳＥＱ２．１は、２〜１２歳の自閉症の小児に関して検証されており、ＡＳＤを有する小児が発育遅延および典型的には発達対照と区別されることが示されており、また、内的整合性が高い（α＝０．８０）。要約スコアを応答性亢進（ＳＯＲ）に関して導き出す。ＳＥＱ２．１は、完了まで約１０分を要し、ベースライン診察時にのみ完了させる。
【０１０４】
生後早期曝露評価ツール（ＥＬＥＡＴ）。これは、親／子が、子の生後早期および発達期に曝露した可能性がある多数の環境曝露について調査する、親への質問票である。この質問票では、妊娠前、妊娠中、および子の生後１年の間の生活に関する種々の質問がなされ、有害であった可能性があるあらゆる可能性のある食物または化学的曝露に関する非常に詳細な定量的調査がなされる。本研究では関連性のある変数のみを含むＥＬＥＡＴの改変および短縮版を使用する。この調査は、完了まで約１０分を要し、ベースライン診察時にのみ完了させる。
【０１０５】
小児生活の質調査票（ＰｅｄｓＱＬ）胃腸症状尺度。ＰｅｄｓＱＬ胃腸症状尺度は、ＡＳＤを有する小児の５０％よりも多くが胃腸の不快感を被っていることから、小児の胃腸症状を測定する１０分間の親への質問票である。この調査は、ベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点の診察時に完了させる。
【０１０６】
自閉症および脳発達センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  ａｎｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（ＣＡＢＤ）人口統計フォーム（Ｄｅｍｏｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｆｏｒｍ）。ＣＡＢＤ人口統計フォームでは、ＮＩＨにより報告された標準に従って人種および民族に関して収集する。追加的な質問により、集団の特徴付けに役立つデータを収集する。この親への質問票は、完了まで５分未満を要し、ベースライン診察時にのみ完了させる。
【０１０７】
神経生理学および神経イメージング
脳波記録法（ＥＥＧ）：ＥＥＧは、脳活動の非侵襲的尺度である。電極の柔軟な高密度アレイ（ＥＧＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  ４００、Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｇｅｏｄｅｓｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を頭部にわたって配置し、あごひもで固定する。ＥＥＧシグナルを増幅し、オンラインで見るために記録コンピュータに送る。本試験では、ＥＥＧを使用して、社会的刺激および非社会的刺激によって引き出される脳活動のパターンを調査する。ＥＥＧは約２０分を要し、ベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点の診察時に完了させる。
【０１０８】
ＥＥＧを使用して、ベースライン状態の間ならびに社会的刺激および非社会的刺激を見ている間の皮質活性化の変化（アルファリズム、シータリズム、およびベータリズムの変化に反映される）ならびに機能的接続性（ＥＥＧコヒーレンスの変化に反映される）を調査する。アルファ振動は、視床−皮質ネットワークの活性化により出現することが示されており、また、海馬領域を含めた皮質下領域に存在することも実証されている。アルファ周波数は、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンとの間の相反相互作用に起因し、コリン作動性機構、セロトニン作動性機構、およびグルタミン酸作動性機構の影響を受ける。アルファ活動は、弛緩状態の間は増大し、活発な刺激処理の間は低下する。シータ振動は、海馬領域で特に顕著であり、グルタミン酸作動性ニューロンとおよびガンマアミノ酪酸作動性（ＧＡＢＡ作動性）ニューロンとの間の相互作用の影響を受け、また、シナプス可塑性と相関し得る。
【０１０９】
ＥＥＧを、安静のベースライン状態の間、ならびに社会的刺激（童謡を歌う女性）および非社会的刺激（玩具の稼働）の標準化されたビデオテープに録画されたセグメントを見ている間、記録する。就学前年齢のＡＳＤを有する小児の研究では、社会的刺激および非社会的刺激を見ている間のアルファおよびシータＥＥＧパワーは、行動処置に応じて変化し、社会的行動の改善と特異的に相関することが示されている。自閉症を処置するための自己臍帯血の安全性および有効性を評価するＤｕｋｅで行われた第Ｉ相非盲検治験により、処置後のアルファパワーの増大に反映されるＥＥＧスペクトラムの正常化が実証された。ＥＥＧデータを１２８チャネル高密度電極アレイジオデシックセンサーネットから５００Ｈｚで記録（頭頂を参照してオンラインで記録）し、０．１Ｈｚでの高域フィルターにかけ、２００Ｈｚでの低域フィルターにかける。ＥＥＧを自動アーチファクト検出ソフトウェア（Ｎｅｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ４．４）およびグループメンバーシップの知見を用いない手動編集の両方によって編集する。
【０１１０】
スペクトラム分析。ＥＥＧデータを、ウエルチ法を使用してフーリエ変換する（Ｍａｔｌａｂにおいて実行、Ｒ２０１２ｂ）。パワー推定値を、電極群（右後側および前側、左後側および前側、正中後頭部の電極）にわたって平均し、自然対数変換して歪みを低減する。自閉症の症状の改善に関する自己臍帯血の有効性が評価された以前の非盲検治験では、注入後にＥＥＧスペクトラムの特徴の有意な変化も見いだされ、これは、アルファパワーおよびベータパワーの増大ならびにＥＥＧシータパワーの低減によって特徴付けられるものであった。さらに、ベースラインの後側ＥＥＧベータパワーが大きいことが、社会的コミュニケーション症状の改善の程度が大きいことに関連し、これにより、ＥＥＧバイオマーカーにより転帰の変動が予測される潜在性が強調される。
【０１１１】
視線追跡（ＥＧＴ）。ＥＧＴは、制御された状況で特殊設備を使用して、自閉症の小児の眼球運動によって視覚的注意を追跡する、１５分間の技術的調査である。ＡＳＤを有する小児は、典型的に発達している小児よりも社会的刺激への注意が少ないことが見いだされている。自閉症の処置に関する自己臍帯血の有効性を評価するＤｕｋｅで行われた第Ｉ相非盲検治験では、社会的刺激への注意の増大が実証され、これは、ＶＡＢＳで報告された社会的能力の増大と相関した。この調査は、１歳の小児〜成人に適している。小児に社会的刺激および非社会的刺激を伴う場面のビデオテープを見せる。従属変数は、小児の注意を誘引し保持する社会的刺激の特定の側面を含めた、小児がビデオテープ中の社会的刺激に注目している時間と、それに対して非社会的刺激に注目している時間を含む。ＥＧＴは、ベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点の診察時に行う。
【０１１２】
コンピュータ視覚分析（ＣＶＡ）。ＣＶＡ調査は、注意応答、顔面表情、および運動応答を含めた自閉症の症状が引き出されるように設計された一連の簡単な動的刺激からなる。コンピュータ視覚分析を使用して、これらの行動を自動的に符号化する。研究により、ＣＶＡが、自閉症の症状を客観的に、確実に、かつ高感度で定量化することができることが示されている。ＣＶＡは、ベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点の診察時に行う。
【０１１３】
神経イメージング。細胞療法の前後に、ＭＲＩを使用して、脳における潜在的な構造的／解剖学的改変、および機能的変化を調査する。ＭＲＩ画像を使用して、脳鉄とＡＳＤ症状を相関させる。ＭＲＩ画像の変化は、アストロサイト活性の変更、血液灌流、線維路完全性、脳ネットワーク完全性、ミエリン微細構造完全性および脳機能接続性を反映し得る。自閉症の症状の処置に関する自己臍帯血の有効性を評価する非盲検治験では、３つの行動転帰尺度の改善が、左側頭極と左海馬との接続性の増大と相関した（ＶＡＢＳ  ＩＩ  ｐ＜０．００１；ＥＯＷＰＶＴ−４  ｐ＜０．０５；ＣＧＩ−Ｉ  ｐ＜０．０００１）。ＶＡＢＳ  ＩＩおよびＥＯＷＰＶＴ−４の両方の改善が、どちらも左半球における紡錘細胞と被殻との接続性の増大（ＶＡＢＳ  ＩＩ  ｐ＜０．０５；ＥＯＷＰＶＴ−４  ｐ＝０．０１）ならびに下側頭回と海馬との接続性の増大（どちらもｐ＜０．０５）と相関した。最後に、ＶＡＢＳ  ＩＩおよびＣＧＩ−Ｉの両方の改善と、左半球における下側頭回と上側頭回との接続性の増大（ＶＡＢＳ  ＩＩ  ｐ＜０．０５、ＣＧＩ−Ｉ  ｐ＜０．０１）および側頭極と淡蒼球との接続性の増大（ＶＡＢＳ  ＩＩ  ｐ＜０．０１；ＣＧＩ−Ｉ  ｐ＜０．０５）との間に有意な相関が見られた。ＶＡＢＳ  ＩＩおよびＣＧＩ−Ｉの改善は、右半球における前頭極と淡蒼球との接続性の増大および島と被殻との接続性の増大（全てｐ＜０．０５）とも有意に相関した。
【０１１４】
ＧＥのＦＤＡに認可されたＰｒｅｍｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍの改善版であり、高分解能イメージング能がより優れているＧＥ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ３Ｔ  ＭＲＩスキャナーを使用した研究を実施する。この改善されたシステムでの操作パラメータは全て、同じ最小リスクデバイス基準を満たし、ヒト被験体に対する安全性が確実になるように、ＦＤＡガイドラインの範囲内のものである。したがって、治験用医療機器の適用免除（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｅｘｅｍｐｔｉｏｎ）（ＩＤＥ）は必要ない。このプロトコールの下で行われたリサーチは、このデバイスの安全性および有効性を評価するものではない。
【０１１５】
以下のイメージングを利用することができる：
・高分解能Ｔ１イメージング、３Ｄ  ＩＲ調製ＦＳＰＧＲ、１×１×１ｍｍ分解能、推定イメージング時間３分。
・高分解能灌流イメージング、動脈スピン標識を伴う３Ｄスパイラル、標的分解能１．５×１．５×１．５ｍｍ（１×１×１によりもたらされるＳＮＲで十分であると評価されることになる）、推定イメージング時間３分。
・高分解能拡散テンソルイメージング、２ＤマルチショットＤＷ  ＥＰＩ基本シーケンス、２５拡散エンコーディング方向、ｂ因子８００ｓ／ｍｍ２、標的分解能１．５．×１．５×１．５ｍｍ（１×１×１によりもたらされるＳＮＲで十分であると評価されることになる）、推定イメージング時間１０分間。
・高分解能ｆｃＭＲＩ、２Ｄシングルショットまたは２ショットＥＰＩ基本シーケンス、標的分解能１．５×１．５×１．５ｍｍ（１×１×１によりもたらされるＳＮＲで十分であると評価されることになる）、推定イメージング時間１０分（１回の実行当たり５分、２回の実行）。
・高分解能定量的磁化率イメージング、マルチエコー３Ｄ  ＦＳＰＧＲに基づく撮像、標的分解能１×１×１ｍｍ、推定イメージング時間５分。
【０１１６】
分析集団
最大分析集団。治験に登録したすべての参加者。
【０１１７】
安全性分析集団。研究製品の投与を少なくとも１回受けた参加者全員。この集団において安全性エンドポイントの分析を行う。
【０１１８】
改変処置企図（ｍＩＴＴ）集団。ベースライン時および６カ月時点で主要転帰が観察された参加者全員。この集団において一次エンドポイントおよび二次エンドポイントを分析する。参加者を、割り当てられた処置に応じて分析する。欠測データがなければ、この集団は最大分析集団と等価になる。しかし、ｍＩＴＴと最大分析集団との間に実質的な差異がある場合には、逆確率重み付け（inverse  probability  weighting）または欠測データシナリオに適した他の手法を検討する。
【０１１９】
安全性および有害事象の報告
有害事象（ＡＥ）：有害事象は、治験製品に関連するものと考えられるかどうかにかかわらず、治験製品の使用に付随するあらゆる好ましくない医療上のできごとである。
【０１２０】
重篤な有害事象（ＳＡＥ）：有害事象または疑わしい有害反応は、試験担当医または治験依頼者のいずれかの見解で、以下の転帰のいずれかがもたらされる場合、「重篤」であるとみなされる：死亡、命にかかわる有害事象、患者の入院または入院の延長、持続的なもしくは著しい無能力もしくは正常な生活機能を行う能力の実質的な破壊、または先天異常／先天性欠損。死亡をもたらすものでも、生命を脅かすものでも、入院を必要とするものでもない可能性がある重大な医学的事象は、適正な医学的判断に基づいて、患者または被験体を危険にさらす恐れがあり、この定義に列挙されている転帰の１つを防止するために医学的または外科的介入を必要とし得る場合に、重篤であるとみなされる。
【０１２１】
グレード／重症度：グレード／重症度をＣＴＣＡＥ  ｖ５．０ガイドラインに従って調査する。
【０１２２】
疑わしい有害反応：疑わしい有害反応は、治験製品により有害事象が引き起こされたという合理的な可能性がある、あらゆる有害事象である。「合理的な可能性」とは、治験製品と有害事象との間の因果関係（ｃａｕｓａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）を示唆する証拠があることを意味する。
【０１２３】
因果関係（ｃａｕｓａｌｉｔｙ）：試験担当医は、有害事象と治験製品の因果関係（ｃａｕｓａｌｉｔｙ）を調査する際に以下の質問を使用する：「治験製品により事象が引き起こされたという合理的な可能性があるか？」。肯定的な答えにより、その事象が疑わしい有害反応であることが示される。
【０１２４】
有害事象の報告
【０１２５】
ｈＣＴ−ＭＳＣ注入時から開始して研究中に報告されたまたは観察された全ての有害事象を記録しなければならない。登録した参加者の５％に生じるＡＥは、clinicaltrials.govに報告される。報告される情報には、現場が事象をいつ知ったか、試験担当医により明記された重症度および研究治療との関係の調査、代替病因があるかどうか、重篤度、ならびに、あらゆる必要な処置または評価、および転帰が含まれる。一般に、試験担当医は、有害事象を、できる限り、個々の構成要素である症状、徴候、検査値異常、および後遺症を報告するのではなく、疾患または症候群として報告すべきである。
【０１２６】
重症の有害な注入反応（致死的、生命を脅かすまたは入院を必要とするもの）は、情報の受領から７暦日以内に報告される。致死的なまたは命にかかわるＳＡＥは全て、ＦＤＡガイドラインに従い、試験担当医またはその代表者からＦＤＡに情報の受領から７暦日以内に電話またはファックスによって報告される。重篤な予想外のＡＥは全て、ＦＤＡに、情報の受領から１５日以内に書面の報告書で報告する（２１ＣＦＲ３１２．３２）。試験責任医師が事象を研究に無関係であると評価した場合には、事象を迅速に報告する必要はないが、年次概要報告書に含める。
【０１２７】
ｈＣＴ−ＭＳＣ注入から２４時間以内の以下の事象もｅ−ＣＲＦに記録する：アレルギー反応／過敏症、洞徐脈、洞頻脈、高血圧、低血圧、発熱、悪寒（ｒｉｇｏｒ）／悪寒（ｃｈｉｌｌ）、悪心、嘔吐、感染、呼吸困難、低酸素症、およびヘモグロビン尿。
【０１２８】
重篤な有害事象の報告
【０１２９】
試験責任医師またはその代表者には、あらゆる予想外のＳＡＥをＦＤＡに電話またはファックスにより報告する責任がある。試験責任医師またはその代表者は、研究治療の使用に関連するあらゆる致死的または命にかかわる経験（優先報告）を、情報の受領後７暦日までにできるだけ早く、ＦＤＡに電話またはファックスによって通知する。最初の届出の後に、１５暦日以内に書面の報告書を提出する。研究治療の使用に関連するＳＡＥについては、試験責任医師は、情報を最初に受領してから１５日までにできるだけ早くＦＤＡに通知する。試験責任医師または試験分担医師には、治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）（ＩＲＢ）およびＤＳＭＢにあらゆる研究関連ＳＡＥおよび予想外のＳＡＥを通知する責任がある。
【０１３０】
停止ガイドライン
【０１３１】
以下の停止ガイドラインを研究の持続時間にわたってモニタリングする。停止ガイドラインは、研究チームによりモニタリングされ、試験担当医およびＤＳＭＢによる考察が必要になる境界を示すために使用される。この研究は、以下の場合に安全性の精査のために停止する：
・被験体のいずれかに、注入から４８時間以内にグレード４〜５の注入反応が生じた場合；または
・研究製品と時間的に関連することが医学的安全性モニターおよび／もしくはＤＳＭＢにより決定された２つまたはそれより多くのグレード４〜５の有害事象が生じた場合；または
・被験体のいずれかに、注入から６カ月以内に血流感染が生じた場合；または
・被験体のいずれかに、グレードＩＩ〜ＩＶ  ＧｖＨＤが発生した場合；または
・あらゆる死亡。
【０１３２】
（実施例１）
自閉症スペクトラム障害の若年小児に対してｈＣＴ−ＭＳＣ注入は安全であり、実行可能である
研究設計および概要
ヒト臍帯組織由来の間葉系間質細胞（ｈＣＴ−ＭＳＣ）を２カ月ごとに１回、２回または３回の静脈内注入で投与する第Ｉ相、単施設、非盲検治験を、ＡＳＤを有する小児１２人に対して実施した。小児全員を最初にスクリーニングプロトコールで登録して、診療記録を得た。患者全員の介護者が電話での研究前スクリーニング面接を完了し、治験に対する適格性を決定するための研究チームによる精査のために医療記録およびビデオが提供された。ＡＳＤの確定診断を有する２〜１１歳の小児を参加に適格とした。書面のインフォームドコンセントを、スクリーニングおよび治験の処置段階で得た。治験は、Ｄｕｋｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによって承認されたものであり、ＩＮＤ＃１７３１３の下で行われた。
【０１３３】
患者（ｎ＝１２）および介護者は、研究への参加の一環として、施行されるｈＣＴ−ＭＳＣ注入の回数に応じて２〜４回、Ｄｕｋｅ大学を訪れた。ベースライン診察時に、各患者を評価し、単回静脈内ｈＣＴ−ＭＳＣ注入を行った。患者３人の第１のコホートは単回用量を受けた。患者３人の第２のコホートは２回用量を受け、２カ月離して投与された。患者６人の第３のコホートは３回用量を受け、それぞれ２カ月離して投与された。ベースライン診察および最初のｈＣＴ−ＭＳＣ注入の６カ月後に、患者は追跡臨床調査のために再訪した（研究の図式については図１を参照）。各患者について、追加的な介護者面接および調査を、各注入の７〜１０日後、２カ月後および４カ月後、ならびに最後のｈＣＴ−ＭＳＣ注入の６カ月後および１２カ月後に収集した。
【０１３４】
患者
精神障害の診断と統計マニュアル第５版（ＤＳＭ−５）（DSM-5.  American  Psychiatric  Association  2013;  Washington,  D.C.）に基づくＡＳＤの臨床診断基準を満たした２歳から１１歳の間の患者を研究に含めるために適格とした。小児１２人、うち女児３人、男児９人、平均年齢６．４歳（４〜９歳）を登録した。１１人の被験体が白人であり、１人がアジア人であった。２人はヒスパニックまたはラテン系アメリカ人であった。３つの異なるロットから合計で２７のｈＣＴ−ＭＳＣ用量を投与した。各投与の標的用量はＴＮＣ２．０×１０６個／ｋｇ（ＴＮＣ＝総有核細胞数）であった。注入された実際の用量の平均は、ＴＮＣ２．０×１０６個／ｋｇであり、標準偏差はＴＮＣ０．４×１０６個／ｋｇであった。１人の患者は低用量のＴＮＣ１．７９×１０６個／ｋｇを受けた（患者１２、注入３にて）。ＡＳＤのＤＳＭ−５による診断は、専門臨床医によって確立されたものであり、自閉症診断観察検査第２版（ＡＤＯＳ−２）（Lord  C,  et  al.  ADOS-2.  Torrence,  CA:  Western  Psychological  Services  2012）および自閉症診断面接改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）（Rutter  M,  et  al.  ADI-R.  Torrence,  CA:  Western  Psychological  Services  2008）から情報を得た。追加的な組入基準には以下を含めた：（１）患者が、注入前少なくとも２カ月にわたって現行の薬物適用で安定であったこと、（２）脆弱Ｘ試験を実施し、陰性であったこと、（３）リンパ球絶対数が正常であること（≧１５００／μＬ）、（４）Ｄｕｋｅ大学を最大４回（ベースライン時、その後の注入のために２カ月ごとに、および最初の注入の６カ月後）訪れることができること、（５）患者および親が英語を話すこと、ならびに（６）親の同意があること。除外基準には以下を含めた：（１）以前の細胞療法、静脈注射用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）もしくは他の抗炎症性薬物適用（ＮＳＡＩＤは例外として）の使用、または現行もしくは以前の免疫抑制療法の病歴がある場合、（２）遺伝的（例えば、脆弱Ｘ）症候群または他の重大な医学的共存症が公知の場合、（４）例えばＣＮＳ感染またはＨＩＶ陽性など、活動性または無制御の感染が公知の場合、（５）これだけに限定されないが、代謝障害、ミトコンドリア機能不全、無制御の発作性障害、活動性悪性疾患または化学療法を用いた処置を受けた以前の悪性疾患  原発性免疫不全障害、自己免疫性血球減少症、遺伝的症候群が示唆される明白な身体的異常形態、腎機能または肝機能障害、著しい知覚または運動障害などの医学的障害が公知の場合、ならびに（６）うつ病、双極性障害、統合失調症、強迫性障害、トゥレット症候群を含めた共存する精神医学的状態の診断が公知の場合。
【０１３５】
研究の理論的根拠
本臨床研究についての機構的な理論的根拠は、ｈＣＴ−ＭＳＣがパラクリンおよび異分泌（allocrine）機構を通じて作用して、脳における持続的な炎症および／または免疫病態をモジュレートし、おそらくニューロンをさらなる傷害から保護することができると仮定するものである。多くの状況において、ＭＳＣは、免疫学的反応および炎症反応を強化するのではなく、弱める。実証された機構は、調節性Ｔ細胞集団の生成および抗炎症性サイトカインを導く単球／樹状細胞サイトカイン生成の変化などの、エフェクターＴ細胞のシフトを含む。多数の投薬レジメンにより、応答の全体的な速度および持続時間を改善することができる。
【０１３６】
ＭＳＣは、免疫調節効果を発揮することが示されている（Vellasamy  et  al.,  Cytotherapy  2016;  18(10):1270-1283；Gesundheit,  et  al.,  Med  Hypotheses  2015;  84(3):169-177；Koh  et  al.,  J  Neurosci  2015；35(47):15649-15665；(Jaimes  et  al.,  Stem  Cells  2016;  doi:10.1002/stem.2541；およびOoi  et  al.,  Neuroimmunomodulation  2015;  22(4):233-242を参照）。これらの現象がＭＳＣの直接効果によって引き起こされるのかまたは別の機構によって媒介されるものなのかは不明である。Ｄｕｋｅ大学におけるリサーチから、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）によるサイトカインアレイを使用して、ｈＣＴ−ＭＳＣが多数のサイトカインおよびケモカインを産生し、分泌することが実証された。ＢｉｏｐｌｅｘアッセイおよびＥＬＩＳＡを使用して、選択されたサイトカイン／ケモカインの測定レベルを表４に示す。
【表４】
2021520380.tif 000006
【０１３７】
手順：ｈＣＴ−ＭＳＣ注入
上記の通り、最終製品をＰ２培養物から導き出し、それを５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｇｒｉｆｏｌｓ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）を伴うプラズマライト（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）中に採取し、洗浄し、５つのコンパートメントクライオバッグ（Ｓｙｎｇｅｎ）中、５０，０００，０００〜１００，０００，０００個の細胞をデキストラン（Ａｋｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）を伴う１０％ＤＭＳＯの最終濃度で含有する５ｍＬで凍結保存した。投与当日に、１つのコンパートメントを解凍し、プラズマライトＩＶ溶液１０〜４０ｍＬに希釈し、シリンジまたはバッグに入れ、３０〜６０分にわたる投与のためにベッドサイドに運んだ。
【０１３８】
３ロットのｈＣＴ−ＭＳＣを本臨床治験のために選択した。表５に従って各ロットを１〜２人の患者において各用量レベルで試験した。合計で１２人の患者を３つの投薬レジメンで処置した。複数回用量を受けた患者に関しては、各用量はｈＣＴ−ＭＳＣ２×１０６個／ｋｇからなり、用量を２カ月離して与えた。
【表５】
2021520380.tif 000007
【０１３９】
被験体全員が同種異系のｈＣＴ−ＭＳＣ細胞の注入を少なくとも１回受けた。注入日に、ｈＣＴ−ＭＳＣ細胞を解凍し、ＣＴ２  ＧＭＰ実験室で標準操作手順に従って調製し、診療所において研究チームおよび小児血液および骨髄移植プログラムスタッフの監督の下で患者に注入するために準備した。ベースラインの生命徴候（心拍数、血圧、体温、呼吸数）を得た。パルスオキシメトリーを、注入全体を通しておよび注入後少なくとも５分間継続してモニタリングした。末梢ＩＶを臨床スタッフ、麻酔、または研究チームのメンバーにより行った。ベナドリル（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）およびソルメドロール（０．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）の前投薬後、患者に、ｈＣＴ−ＭＳＣを体重１ｋｇ当たり細胞２×１０６個の用量で３０〜６０分にわたって注入した。患者を最低でも注入後１時間、診療所で観察した。患者は、少なくとも１時間後に、全ての生命徴候がベースライン時レベルになり、患者が毒性の証拠もなく無症候であったら、診療所から出た。患者を注入の翌日（注入から２４時間以内）に研究スタッフが評価して、あらゆる注入に関連する有害反応または併発症について調査した。注入の安全性を調査するために、研究スタッフによる親／保護者への電話呼び出しを注入の７〜１０日後に行った。
【０１４０】
ｈＣＴ−ＭＳＣ注入の安全性
この非盲検第Ｉ相治験の主要エンドポイントは安全性であった。結果から、ｈＣＴ−ＭＳＣ注入の忍容性が良好であったことが示される。本研究には１２人の患者が登録され、１回、２回または３回のｈＣＴ−ＭＳＣ注入を受けた。１２人の患者全員がｈＣＴ−ＭＳＣ注入（複数可）を完了した。注入期間にわたる、および最終的な注入の１２カ月後の有害事象の調査から、当該処置が安全であり、かつ忍容性が良好であることが示された。有害事象は軽度のものであり、予測されたものであり、研究製品とは無関係のものであった。重篤な有害事象は報告されなかった。より詳細には、患者２人において３つの反応が注入から２４時間以内に報告された。コホート２の患者１人では注入２の後にアレルギーおよび中等度の低血圧が生じた。最初の注入中のＩＶベナドリルに対する極度の興奮という有害反応に起因して、この患者は、第２の注入については代替の前投薬として経口アタラックスを受けた。第２のｈＣＴ−ＭＳＣ注入の開始直後に、患者にびまん性紅皮症および咳が発生し、その後、軽度の低血圧および低酸素症が発生した。注入をすぐに停止し、患者は輸液ボーラスおよび余分の用量のＩＶソルメドロールで完全に回復した。ＩＶベナドリル用量後の残りのｈＣＴ−ＭＳＣ注入は首尾よく完了した。コホート３の患者１人は注入３の後に中等度の低血圧を生じ、追加的なＩＶ輸液を受けた。
【０１４１】
登録された患者１２人のうち１１人の中で合計５３件の重篤でない有害事象（ＡＥ）が報告された（軽度が５３件、および中等度が１件）（図２）。最も頻繁に生じた事象は、興奮であり（１３件の事象、または報告された事象の総計の２６％）、その後に他の精神医学的症状が続いた（７件の事象、または報告された事象全ての１３％）。興奮は、コホート１における事象の３分の１、コホート２における事象の１／２、およびコホート３における事象の約１／５を占めた。興奮の報告は第１の注入後が最も多く（８件の事象）、その後、第２の注入（４件の事象）および第３の注入（１件の事象）が続いた。興奮事象は全て注入と同じ日に報告され、消散も同じ日であった。８件の他の精神医学的症状が５人の異なる被験体において報告された：コホート１において１人の被験体／１件の事象、およびコホート３において４人の被験体／７件の事象。精神医学的症状のうち６件は、第１の注入後に生じ、２件の事象は第３の注入後に生じた。注入後に精神医学的症状が発症するまでの平均時間は２０日であった（ｓｄ＝１５．２；範囲：２〜４４日）。最初のｈＣＴ−ＭＳＣ用量の６カ月後に、処置前には検出可能なＨＬＡ抗体を有していなかった５人の参加者において、ＨＬＡ抗体の発生が認められた（データは示していない）。当該参加者にはモニタリングを継続し、臨床的に有意なものにはなっていない。
【０１４２】
行動試験
投与の実現性も試験し、ＡＳＤを有する小児における行動転帰を調査するために典型的に使用されるいくつかの尺度の結果を記述した。親により評定される尺度および臨床医により評定される尺度を複数評価した。第１の患者１０人に関する分析から、患者１０人のうち６人が、臨床全般印象（ＣＧＩ）尺度に関して改善を示していると評定され、患者１０人のうち７人がＶｉｎｅｌａｎｄ適応行動（ＶＡＢ）尺度の社会化下位尺度またはコミュニケーション下位尺度のいずれかの改善を示したことが示された。ベースライン時に非言語ＩＱが高かった患者について、社会的コミュニケーションスキルの親により報告される尺度（Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度）に関して患者の行動の有意な改善が認められた。
【０１４３】
行動転帰調査の結果を表６に示す。以下に報告する尺度は、３点およびそれを超える増加により改善が示される社会的コミュニケーションスキル（ＶＡＢＳ）の調査、低下により改善が示される自閉症の症状の重症度（ＰＤＤ−ＢＩ）、および改善なしから大きな改善までにわたる専門家による臨床的判断（ＣＧＩ）を含む。患者の５８パーセント（７／１２）が尺度の少なくとも２／３に改善を示し、４２％（５／１２）が３つの尺度全てに改善を示し、１６％（２／１２）が尺度の２／３に改善を示した。転帰尺度の２／３が改善した８人の小児のうち、２人が１回用量を受けた小児であり、２人が２回用量を受けた小児であり、３人が３回用量を受けた小児であった。
【表６】
2021520380.tif 000008
【０１４４】
考察
この第Ｉ相非盲検研究では、ＡＳＤを有する若年小児における１回、２回および３回の静脈内ｈＣＴ−ＭＳＣ注入の安全性および実現性を評価した。種々の行動転帰尺度および機能転帰尺度の変化も記載して、いずれが今後の細胞療法の治験におけるエンドポイントとして使用するために最適であるかを決定した。注入後１２カ月にわたる有害事象の調査により、ｈＣＴ−ＭＳＣ注入（複数可）が安全かつ忍容性が良好であることが示された。関連する事象は全て、予測される、ｈＣＴ−ＭＳＣ（研究製品）とは無関係のものとみなされ、また、後遺症を伴わずに消散した。
【０１４５】
（実施例２）
第ＩＩ相研究：ＡＳＤを有する小児におけるｈＣＴ−ＭＳＣの単回および反復静脈内用量の有効性および安全性。
本試験は、ＡＳＤを有する若年小児におけるｈＣＴ−ＭＳＣの静脈内投薬の有効性を調査するために設計された第ＩＩ相、前向き、無作為化治験である。ＡＳＤを有する４〜８歳の小児を参加に適格であるとする。全ての被験体をｈＣＴ−ＭＳＣで処置する。Ａ群に無作為化された被験体は、１キログラム当たり２×１０６個のｈＣＴ−ＭＳＣの静脈内用量を２回、ベースライン時に１回および３カ月時点で１回受け、その後、６カ月時点で盲検でのプラセボ注入を受ける。Ｂ群に無作為化された被験体は、プラセボ注入を２回、ベースライン時に１回および３カ月時点で１回受け、その後、６カ月時点で１キログラム当たり２×１０６個のｈＣＴ−ＭＳＣの静脈内用量を受ける（図３Ａ参照）。全ての参加者に最初の臨床的評価を行って、ＡＳＤの診断を検証し、プロトコール適格性を確認する。一次エンドポイントは、ベースラインから最初のｈＣＴ−ＭＳＣ注入の６カ月後までの社会的コミュニケーションスキル（自閉症の中核症状）の変化であり、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度（ＶＡＢＳ）−３調査面接フォーム（３  Ｓｕｒｖｅｙ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ  Ｆｏｒｍ）、社会化下位尺度標準スコア（Ｓｏｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｃａｌｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｃｏｒｅ）によって測定される。重要な二次エンドポイントには、ＶＡＢＳ−３コミュニケーション下位尺度標準スコア（ＶＡＢＳ−３  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｃａｌｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｃｏｒｅ）、ＰＤＤ−ＢＩ複合スコア（ＰＤＤ−ＢＩ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｓｃｏｒｅ）、臨床全般印象尺度重症度および改善（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｃａｌｅ−Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）、および表出一単語語彙検査（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｏｎｅ−Ｗｏｒｄ  Ｖｏｃａｂｕｌａｒｙ  Ｔｅｓｔ）の生スコアを含める。探索的分析により、本研究における主要転帰尺度を、国立精神衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ：ＮＩＭＨ）において行われたＡＳＤの自然経過の縦断的研究に参加した同様の年齢のＡＳＤを有する小児のコホートにおいて観察された同じ転帰と比較する。下記の追加的なＡＳＤ特異的転帰尺度をベースライン時、６カ月時点および１２カ月時点で調査する。急性注入反応、感染の発生率、および同種異系免疫のマーカーを含めた安全性調査を収集し、記述した。研究参加の持続時間は、第１のｈＣＴ−ＭＳＣ注入時から１２カ月である。
研究目的
【０１４６】
主目的：ＡＳＤを有する小児における社会的コミュニケーションスキルの改善に関するｈＣＴ−ＭＳＣの有効性を決定すること。
【０１４７】
二次目的：ｈＣＴ−ＭＳＣによる処置後の自閉症の症状の重症度、言語能力の臨床医により調査された全般的な改善および変化を記述すること。
【０１４８】
探索的目的：（１）本研究においてｈＣＴ−ＭＳＣを用いた処置を受けた被験体と、ＮＩＭＨにより資金提供されたＡＳＤの自然経過の縦断的研究において観察された同様の年齢範囲のＡＳＤを有する小児との間の社会的コミュニケーションスキルの差異を記述すること。（２）ｈＣＴ−ＡＳＤ処置後の適応行動および運動技能の変化を記述すること。（３）ｈＣＴ−ＭＳＣ処置後のＭＲＩ、ＥＥＧ、注意に関する視線追跡尺度、および自閉症の症状のコンピュータ視覚分析の変化を記述すること。
【０１４９】
研究設計
一般設計
【０１５０】
これは、ＡＳＤを有する４〜８歳の小児６０人における静脈内ｈＣＴ−ＭＳＣ注入に関する単施設、第ＩＩ相、前向き、無作為化研究である。全ての被験体を、異なる投薬スキーマを試験する１：１無作為化スキームを用いてｈＣＴ−ＭＳＣで処置する（図３Ａおよび図３Ｂ参照）。主要なエンドポイントは、社会的コミュニケーションスキル（自閉症の中核症状）のベースラインから最初のｈＣＴ−ＭＳＣ注入の６カ月後までの変化であり、これは、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度（ＶＡＢＳ）−３調査面接フォーム、社会化下位尺度標準スコア（Ｓｏｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎｓ  Ｓｕｂｓｃａｌｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｃｏｒｅ）によって測定される。研究参加の持続時間は、第１のｈＣＴ−ＭＳＣ注入時点から１２カ月である。
【０１５１】
研究エンドポイント
一次エンドポイント：本研究の一次エンドポイントは、ベースラインから最初のｈＣＴ−ＭＳＣ注入の６カ月後までの社会化技能（自閉症の中核症状）の変化であり、これは、ＶＡＢＳ−３社会化標準スコア（ＶＡＢＳ−３  Ｓｏｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｃｏｒｅ）によって測定される。ＡおよびＢ群（６×１０６／ｋｇの総曝露を単回用量で）をＣおよびＤ群（６×１０６／ｋｇの総曝露を３回の同等に分割した用量で）と比較する。ＡおよびＣ群およびＢおよびＤ群をＤｕｋｅＡＣＴ治験からの外部のプラセボ対照群と比較する。
【０１５２】
二次エンドポイント：以下のエンドポイントに関してベースラインから６カ月時点までに測定された変化を、ＡおよびＢ群、ＣおよびＤ群、ならびにＤｕｋｅＡＣＴプラセボ群の間で比較する。
１．ＶＡＢＳ−３コミュニケーション標準スコア（ＶＡＢＳ−３  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｃｏｒｅ）。
２．ＣＧＩ−ＳおよびＣＧＩ−Ｉ。
３．表出一単語絵画語彙検査。
【０１５３】
探索的エンドポイント：ベースラインから１２カ月時点までに測定された変化を以下の転帰尺度に関して評価する。Ａ群、Ｂ群、Ｃ群、およびＤ群を互いに、およびＤｕｋｅＡＣＴ治験からのプラセボ群と比較する。
１．ＶＡＢＳ−３社会化標準スコア。
２．ＶＡＢＳ−３コミュニケーション標準スコア。
３．ＶＡＢＳ−３適応行動複合（ＶＡＢＳ−３  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）ならびに日常生活技能、コミュニケーションおよび運動技能下位尺度のスコア。
４．ＭＲＩ尺度。
５．ＥＥＧ尺度。
６．視線追跡を介して調査される注意。
７．コンピュータ視覚分析（ＣＶＡ）によって調査される自閉症の症状。
【０１５４】
安全性エンドポイント：ＡＳＤを有する小児におけるｈＣＴ−ＭＳＣ注入の安全性を以下によって調査する：
１．注入反応の発生率および重症度。
２．製品に関連する感染の発生率および重症度。
３．抗ＨＬＡ抗体および抗ＲＢＣ抗体による同種異系免疫の証拠ならびに全身性炎症の非特異的マーカー（ＥＳＲ、ＣＲＰ）。
４．移植片対宿主疾患の発生率および重症度。
５．研究製品との関連による予想外の有害事象の発生率および重症度。
【０１５５】
リサーチ参加者の選択および撤回
研究集団
【０１５６】
ＡＳＤの確定診断を有する４〜８歳の小児６０人。
【０１５７】
組入基準
１．同意時に年齢が４歳以上〜９歳以下（８歳、３６４日）であること。
２．ＤＳＭ−５を使用した自閉症スペクトラム障害の臨床的ＤＳＭ−５による診断が確認されていること。自閉症診断観察尺度２（Ａｕｔｉｓｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｃａｌｅ−２）から情報を得たチェックリスト。
３．脆弱Ｘ試験が実施されており、陰性であること；ＣＭＡおよび／または全エキソーム配列決定が実施されており、その結果が自閉症診断と関連付けられていないこと。
４．現行の精神医学的薬物適用レジメン（用量および投薬スケジュール）で研究製品の注入前少なくとも２カ月にわたって安定であること。
５．リンパ球絶対数が正常であること（≧１５００／μＬ）。
６．参加者および親／保護者が英語を話すこと。
７．Ｄｕｋｅ大学を３回（ベースライン、３カ月、６カ月）訪れることができ、また、親／保護者が暫定調査および面接に参加できること。
８．親の同意があること。
【０１５８】
除外基準
１．一般：
ａ．医療記録についての精査により、ＡＳＤ診断の可能性が低いことが示される場合。
ｂ．以下の共存する精神医学的状態：うつ病、双極性障害、統合失調症、双極性障害を伴う強迫性障害、トゥレット症候群のいずれかの診断が公知の場合。
ｃ．スクリーニングデータにより、研究チームが調査して、参加者が研究手順の要件に応じることができないことが示唆される場合。
ｄ．家族が、プロトコール追跡を含め、研究に関連する調査の全てに参加することに同意する意志がないまたは同意することができない場合。
ｅ．同胞が本研究（Ｄｕｋｅ  ｈＣＴ−ＭＳＣ試験）に登録されている場合。
２．遺伝学的：
ａ．記録により、小児が（これだけに限定されないが）脆弱Ｘ症候群、神経線維腫症、レット症候群、結節硬化症、ＰＴＥＮ変異、嚢胞性線維症、筋ジストロフィーまたはＡＳＤに関連することが決定的に公知の遺伝子欠損などの公知の遺伝症候群を有することが示される場合。
ｂ．公知のＡＳＤに関連する病原性変異またはコピー数多型（ＣＮＶ）（例えば、１６ｐ１１．２、１５ｑ１３．２、２ｑ１３．３）。
３．感染：
ａ．公知の活動的なＣＮＳ感染症。
ｂ．記録または臨床調査に基づく無制御感染症の証拠がある場合。
ｃ．公知のＨＩＶ陽性。
４．医学的：
ａ．公知の代謝障害。
ｂ．公知のミトコンドリア機能不全。
ｃ．不安定なてんかんまたは無制御の発作性障害、点頭痙攣、レノックスガストー症候群、ドラベ症候群、または他の同様の慢性発作性障害の病歴がある場合。
ｄ．活動的な悪性疾患または化学療法を用いて処置された以前の悪性疾患がある場合。
ｅ．原発性免疫不全障害の病歴がある場合。
ｆ．自己免疫性血球減少症（すなわち、ＩＴＰ、ＡＩＨＡ）の病歴がある場合。
ｇ．小児の研究手順の併発症のリスクを高めると思われる共存する医学的状態がある場合。
ｈ．今後幹細胞移植が必要になる可能性がある同時の遺伝性または後天性疾患または共存症（複数可）がある場合。
ｉ．著しい知覚機能障害（例えば、失明、聴覚消失、未矯正聴力）または運動機能障害（例えば、脳性麻痺）がある場合。
ｊ．公知のジルベール病の患者を除き、血清クレアチニン＞１．５ｍｇ／ｄＬまたは総ビリルビン＞１．３ｍｇ／ｄＬによって決定される腎機能または肝機能障害がある場合。
ｋ．ヘモグロビン＜１０．０ｇ／ｄＬ、ＷＢＣ細胞＜３，０００個／ｍＬ、ＡＬＣ＜１０００／μＬ、血小板＜１５０×１０ｅ９／μＬと定義される著しい血液異常がある場合。
ｌ．ＰＩまたは神経発達状態に関連する異常形態的特色の同定に関して訓練された医学的遺伝学者および精神科医を含めた他の試験担当医が調査して、遺伝症候群が示される臨床的に意義のある身体的異常形態の証拠がある場合。
５．現行／以前の治療：
ａ．バンクに保存されている、認定された自己臍帯血単位の利用可能性がある場合。
ｂ．以前の細胞療法の病歴がある場合。
ｃ．ＮＳＡＩＤは例外として、ＩＶＩＧまたは他の抗炎症性薬物適用の現行または以前の使用がある場合。
ｄ．現行または以前の免疫抑制療法がある場合：
ｉ．＞２週間続く全身性ステロイド薬による治療を受けておらず、登録前３カ月以内に全身性ステロイド薬を使用していないこと。局所および吸入ステロイドは許容される。
【０１５９】
リサーチ参加者の早期撤回
【０１６０】
プロトコール療法からの除外基準：（ａ）評価または研究中に遺伝子疾患の診断を受けた場合。（ｂ）研究への参加を妨げる医学的状態の変化があった場合。
【０１６１】
プロトコール療法から離脱した患者は、研究除外基準を満たすまで追跡される（以下を参照）。プロトコール離脱参加者に関して、同意が撤回されない限り、追跡データを得る。ｈＣＴ−ＭＳＣ注入前に研究から離脱した被験体は評価可能でないとみなされ、別の被験体を補充することができる。
【０１６２】
研究除外基準：
１．死亡。
２．追跡不能。
３．あらゆるさらなるデータ収集についての同意の撤回。
４．最終的な研究診察の完了。
【０１６３】
ヒト臍帯組織由来の間葉系間質細胞（ｈＣＴ−ＭＳＣ）
ｈＣＴ−ＭＳＣは、培養下で増大させ、凍結保存し、バンクに保存されている、消化臍帯組織から製造される同種異系細胞の製品である。ｈＣＴ−ＭＳＣは、Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＦＤＡにより認可されたＦＡＣＴ公認の公共の臍帯血バンクであるＣａｒｏｌｉｎａｓ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋに赤子の母親から書面のインフォームドコンセントを得た後に供与された臍帯組織から製造される。臍帯組織を正常な満期妊娠後に選択的帝王切開によって分娩された男の赤子の胎盤から採取する。ドナースクリーニング質問票を母体ドナーに完了してもらい、母体血液を伝染性疾患についてＣｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣにあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  ＣｒｏｓｓにおいてＣＬＩＡ認定ドナースクリーニング検査によって検査する。ドナーは、公共の臍帯血バンクへの同種異系使用のための供与に関して適格でなければならない。胎盤および臍帯の分娩後、臍帯血を胎盤から無菌的に流出させる。次いで、臍帯を乾燥させ、クロロプレップを用いて清潔にし、胎盤の基部から分離し、プラズマライトＡを含有する滅菌されたボトルに入れ、室温で有効な容器中に入れてＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＣＴ２  ＧＭＰ細胞処理研究室に輸送する。
【０１６４】
クリーンルーム製造スイートの、バイオセーフティキャビネット内で、臍帯組織を培地から取り出し、滅菌ディッシュに入れ、小片に切断し、次いで、細かく切り、ＧＭＰグレードの酵素：ヒアルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、コラゲナーゼ、パパインを伴うＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ  Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ中で消化させる。結果として生じた細胞懸濁物を１％血小板溶解物入りのＰｒｉｍｅ  ＸＶ  ＭＳＣ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＸＳＦＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地の中の培養に置き、集密まで増殖させて（約７〜１４日）Ｐ０培養物を確立する。マスター細胞バンクを確立するために、Ｐ０を採収し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ１０培地（ＢｉｏＬｉｆｅ）入りのクリオバイアルに凍結保存し、液体窒素の気相に保管する。Ｐ１およびＰ２培養物は、投与のための作業用細胞バンクおよび製品をそれぞれ作製するために、必要に応じて、血小板溶解物無しのｈｙｐｅｒｆｌａｓｋｓまたはｈｙｐｅｒｓｔａｃｋｓの中で類似した条件の下で増殖させる。Ｐ１およびＰ２からの細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してプラスチック培養容器から取り出す。最終生成物はＰ２培養物から誘導され、それらは５％ヒト血清アルブミンを有するプラズマライトに採収され、洗浄され、デキストランを有する１０％ＤＭＳＯ（Ａｋｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の最終濃度で細胞５０，０００，０００〜１００，０００，０００個を含有する５ｍＬ中で、５個のコンパートメントクライオバッグ（Ｓｙｎｇｅｎ）の中で凍結保存される。投与の日、１つのコンパートメントを解凍し、１０〜４０ｍｌのプラズマライトＩＶ溶液に希釈し、シリンジまたはバッグに入れ、３０〜６０分間の投与のためにベッドサイドに運ぶ。
【０１６５】
各継代で、細胞製品を、細胞表面表現型をフローサイトメトリーならびにＴ細胞増殖およびミクログリア活性化の器官型モデルによる機能アッセイにより調査することによって特徴付ける。Ｐ２の凍結保存前の各ロットを、無菌性、エンドトキシンおよびマイコプラズマについても試験し、これらの試験は仕様を満たさなければならない。投薬のために、解凍および希釈後のリリース試験は、セロメーターによるＴＮＣＣおよび生存度を含む。無菌培養（１４日間）も開始するが、結果は注入時には利用不可能である。患者に、解凍後計数に基づいてｈＣＴ−ＭＳＣ２×１０６個／ｋｇを投薬する。
ドナースクリーニングおよび試験
【０１６６】
２１ＣＦＲパート１２７１の全ての必要条件を満たすために、ドナースクリーニングおよび試験を、Ｃａｒｏｌｉｎａｓ  Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋの標準操作手順により実行する。スクリーニングおよび試験は推奨通りであり、生物学的認可番号１８７０の下でＦＤＡによって承認されている。臍帯血の母体ドナーは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、表面およびコア抗原）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）、ＣＪＤ（スクリーニングのみ）、シャガス病、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型および２型（ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２）ならびにＣＭＶに関してスクリーニングされ、試験される。母体血液に対してＨＩＶ−１／２／Ｏ、ＨＢＶ、ＷＮＶおよびＨＣＶについての核酸試験も実施する。ジカウイルスについてのスクリーニングも実施することができる。
【０１６７】
プロセスおよび最終製剤
ｈＣＴ−ＭＳＣを、単一の臍帯組織から、マスターセルバンク、作業用セルバンク、および研究製品を生成する一連の３つのステップで製造する。各ステップの製品を凍結し、液体窒素フリーザー内で気相中に保管する。Ｐ２では、そのロットの製品による患者の処置前に、代表的なクライオバッグを解凍し、資格を与える。試験は、細胞計数、生存度、表現型、機能アッセイ、エンドトキシン、マイコプラズマ、グラム染色および無菌性を含む。
【０１６８】
処置日に、細胞をＳＯＰ  ＣＴ２−ＭＳＣ−００６に従って解凍し、プラズマライト−Ａ＋５％ＨＳＡ  １０〜４０ｍＬ中に希釈し、細胞計数、生存度、および無菌培養のためにアリコートを取り出す。細胞がリリース基準を満たした場合、最終製品の体積を、適正な用量（細胞２×１０６個または６×１０６個／ｋｇ）が研究被験体に送達されるように調整する。細胞を、プラズマライト−Ａ、５％ＨＳＡ、および残留ＤＭＳＯを含有するバッグまたはシリンジに入れてベッドサイドに届ける。取り出されたあらゆる細胞懸濁物を無菌試験のために好気性培養ボトルおよび嫌気性培養ボトルに接種する。細胞の有効期限は解凍後４時間である。
【０１６９】
ｈＣＴ−ＭＳＣ最終製品を、解凍後の細胞計数および生存度について試験した後、患者への投与のために条件付きでリリースする。最終的なリリースは、研究製品の１４日間の無菌培養期間後に行う。無菌培養が製品の投与後に陽性に変わった場合には、生物体を同定し、抗生物質感受性を実施する。患者の家族と接触して、症候性であるか（すなわち、発熱）を決定する。無症候性患者は抗生物質で処置しない。症候性患者は、必要に応じて血液培養物および抗生物質を用いて適切に評価し、処置する。製品を受け、その後無菌試験が陽性の患者全員を、無菌試験陽性が示された後１４日間、研究看護師が毎日接触することによって経過観察する。
【０１７０】
プラセボ製品
投与のために解凍された凍結保存ｈＣＴ−ＭＳＣには、凍結保存に使用されたＤＭＳＯに起因する特有の匂いがある。患者および家族が受ける注入の型に関して真に盲検になるように、プラセボ製品は外観および匂いの両方が同様でなければならない。したがって、プラセボ製品は無細胞であり、細胞製品の標準の成分である１％ＤＭＳＯを伴うプラズマライト−Ａからなる。プラセボ製品の体積は１０〜４０ｍＬであり、これはｈＣＴ−ＭＳＣ製品で使用されるものと同じ範囲である。プラセボ溶液を同じ最終容器に入れ、したがって、臨床スタッフ、患者、および家族は６カ月時点での注入時に研究製品またはプラセボに関して盲検のままになる。
【０１７１】
製品の投与
患者は、予定された注入日に注入施設に入院する。患者は、安静にしていることも協力することもできない場合には、ＩＶ設置前にある程度の鎮静を必要とするかもしれない。末梢ＩＶは臨床または研究スタッフが設置する。患者にベナドリル０．５ｍｇ／ｋｇ／用量、ＩＶおよびソルメドロール０．５〜１ｍｇ／ｋｇ、ＩＶを前投薬する。ｈＣＴ−ＭＳＣまたはプラセボ製品を３０〜６０分にわたって静脈内投与する。生命徴候（心拍数、血圧、体温、呼吸数）を診療所への到着時に試み、臨床的に必要が示される通りモニタリングする。パルスオキシメトリーを、注入全体を通して継続的に、および注入後少なくとも５分間モニタリングする。患者を注入後最低１５〜３０分にわたって観察すべきである。
【０１７２】
安全性経過観察
各注入後１日目に、参加者を研究スタッフが見て、あらゆる注入に関連する有害反応または併発症について調査する。各注入の７〜１０日後に、研究チームのメンバーが親または保護者に電話または電子メールで接触して、患者の状態およびあらゆる有害事象を調査する。その後の各診察時ならびに６カ月時点および１２カ月時点で質問票による調査を施行して、重篤な有害事象について調査する。ＰＲＡを処置前ならびにＭＳＣ投薬後６カ月時点および１２カ月時点で得る。
【０１７３】
研究計画
概要
全てのスクリーニングが完了し、患者が研究判定基準を満たす可能性が高くなったら、患者は最初の診察のためにＤｕｋｅを訪れる。１日目に、インフォームドコンセントを得、患者の適格性を身体観察およびＤＳＭ−５基準に従ったＡＳＤ診断の検証によって決定する。小児が適格であるとみなされたら、当該小児を研究に登録し、ｈＣＴ−ＭＳＣ投薬コホートの１つに無作為化する。当該小児の最初の診察中、当該小児は追加的な臨床的および神経心理学的評価、ＥＥＧ試験、視線追跡、およびＣＶＡ調査、ならびにＭＲＩも受ける。参加者を、各注入の翌日に、対面または電話呼び出しのいずれかによって評価し、各注入の７〜１０日後に経過観察安全性評価のために親に接触する。参加者は予定されたｈＣＴ−ＭＳＣ注入およびモニタリングのために、ならびに、初回用量の６カ月後および１２カ月後に臨床的、神経心理学的、ＥＥＧ、視線追跡、ＣＶＡ、および安全性経過観察の反復のためにＤｕｋｅを再訪する。
【０１７４】
患者スクリーニング
研究のスクリーニングを別々のＩＲＢにより承認されたスクリーニングプロトコール（Ｐｒｏ０００６３５６３）の下で行う。このプロトコールの下で、親／保護者から書面のインフォームドコンセントを得た後に、患者の医学的および心理学的記録、学校記録、写真、行動ビデオ、およびすべての遺伝子検査の結果を得、２つのチームにより精査する。小児看護師、看護実践者、および医師のチームが医学的精査を行って、あらゆる代謝的、免疫学的、神経学的、知覚、遺伝学的、または臨床検査値除外基準の存在を同定する。そのような除外基準が同定されなければ、次いで、ＡＳＤを有する小児の診断および処置に関する専門知識を有する心理学者、精神科医、およびソーシャルワーカーの組合せにより精神医学的精査を行う。患者の心理学的記録ならびに入手可能なあらゆる学校および治療記録の広範囲にわたる精査を実施する。精神医学的スクリーニングチームはＡＤＩ−Ｒ調査を行う。どちらのチームも患者の写真および記録を精査して、異常形態的特色を評価する。次いで、疑わしい顔の特徴または遺伝子検査の所見を有するあらゆる患者を、ＡＳＤに関連する遺伝学的状態に関する専門知識を有する医学的遺伝学者が精査する。患者は、さらなる実験室または電話もしくは対面のスクリーニングおよび研究への登録に進むためには医学的スクリーニングチームおよび精神医学的スクリーニングチームのどちらからも承認されなければならない。スクリーニングプロセス中に以前に診断未確定であった状態または遺伝学的所見が生じる懸念がある場合、患者の親（複数可）／保護者（複数可）と考察し、必要が示された場合には評価および処置のために適正な医学的または精神医学的提供者への照会を行う。
【０１７５】
研究注入
被験体全員が同種異系のｈＣＴ−ＭＳＣ細胞の注入を少なくとも１回受ける。注入日に、ｈＣＴ−ＭＳＣ細胞またはプラセボ製品を、ＣＴ２  ＧＭＰ実験室および／またはＤｕｋｅ幹細胞研究室（Ｄｕｋｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ）で標準操作手順に従って解凍し、調製し、診療所において研究チームならびに小児血液および骨髄移植プログラムスタッフの監督の下で患者に注入するために準備する。ベースラインの生命徴候（心拍数、血圧、体温、呼吸数）を得る。末梢ＩＶを臨床スタッフ、麻酔、または研究チームのメンバーが設置する。注入前に、前投薬（ベナドリル、ソルメドロール）を投与する。研究製品を３０分間にわたって注入する。小児を診療所で注入後最低でも１５〜３０分間観察する。１．５維持でＩＶ輸液（Ｄ５  １／２ＮＳ）を試みる。患者は、少なくとも１時間後に、全ての生命徴候がベースラインになり、毒性の証拠もなく無症候性であるという条件で診療所を出る。患者を注入翌日に研究スタッフが評価して、あらゆる注入に関連する有害反応または併発症について調査する。注入の安全性を調査するために、研究スタッフによる親／保護者の電話呼び出しを、注入の７〜１０日後に行う。
【０１７６】
患者が計画された注入日に、これだけに限定されないが、３８．５℃を超える発熱、嘔吐、下痢、または呼吸窮迫を含めた疾病の証拠を有する場合、注入を延期する。
【０１７７】
予想外の事象中の介護
研究注入の間に患者にじんま疹、呼吸困難、咳、喘鳴、または嘔吐を含めたアナフィラキシーの徴候または症状が発生した場合には、注入を終了し、適正な医学的治療を開始する。
評価
【表７】
2021520380.tif 000009
【表８】
2021520380.tif 000010
【０１７８】
統計学的検討事項
これは、ＡＳＤを有する２〜７歳の小児６０人における静脈内ｈＣＴ−ＭＳＣ注入に関する単施設、第ＩＩ相、前向き研究である。全ての被験体をｈＣＴ−ＭＳＣで処置する。被験体を４つの投薬スキーマのうちの１つに均等割付けを使用して無作為化する。研究参加の持続時間は最初のｈＣＴ−ＭＳＣ注入時点から１２カ月である。外部対照群を使用して有効性を調査する。
【０１７９】
研究持続時間：リサーチ参加者は、ｈＣＴ−ＭＳＣの第１の用量の投与の１２カ月後に本研究に登録される。
【０１８０】
人口統計およびベースラインの特徴：人口統計およびベースラインの特徴をリサーチ参加者全員について要約する。検査される特徴は、年齢、性別、人種／民族性、およびベースラインの行動の状態を含む。
【０１８１】
一次エンドポイント：本研究の一次エンドポイントは、社会的コミュニケーションスキル（自閉症の中核症状）のベースラインから最初のｈＣＴ−ＭＳＣ注入の６カ月後までの変化であり、これは、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度（ＶＡＢＳ）−３調査面接フォーム、社会化下位尺度標準スコアによって測定される。ＡおよびＢ群（６×１０６／ｋｇの総曝露を単回用量で）をＣおよびＤ群（６×１０６／ｋｇの総曝露を３回の同等に分割した用量で）と比較する。ＡおよびＣ群およびＢおよびＤ群とＤｕｋｅＡＣＴ治験からの外部のプラセボ対照群の比較も行う。Ａ群からＤ群までの個別の分析を探索的分析に含める。
【０１８２】
試料サイズおよび検出力計算：以下は、分析のためにＤｕｋｅＡＣＴからの患者レベルデータが本研究からのデータと共にプールされていると仮定する。統計学的検出力の評価では、ベースラインスコア、年齢、非言語発達指数（ＮＶＤＱ）、および研究指標（ＤｕｋｅＡＣＴまたは本研究）を連続共変量として使用し、一般的な直線モデル（ＧＬＭ）を当てはめて、６カ月時点のＶＡＢＳ−３社会化標準スコアを予測すると仮定する。ＤｕｋｅＡＣＴ研究の暫定分析からの盲検データ（Ｎ＝１１９）に基づいて、ならびに、本研究とＤｕｋｅＡＣＴにおける同様の適格性判断基準に基づく限定された研究間変動性の仮定の下で、共変量と６カ月時点でのスコアとの間の重相関をｒ＝０．８５（Ｒ平方＝０．７２９１）と仮定した。
【０１８３】
ＡおよびＢ群（６×１０６／ｋｇの総曝露を単回用量で）ならびにＣおよびＤ群（６×１０６／ｋｇの総曝露を３回の同等に分割した用量で）をＤｕｋｅＡＣＴプラセボ群と、および互いに対して比較するＧＬＭから対比が導き出されると仮定して統計学的検出力を算出した。これらの対比に関連する統計学的仮説を以下の表９に記載する。
【表９】
2021520380.tif 000011
【０１８４】
標準化された効果サイズを使用して、Ａ群、Ｂ群、Ｃ群、およびＤ群のそれぞれの患者１５人の試料ならびにＤｕｋｅＡＣＴプラセボ群からの６０の試料を仮定して検出力が算出される３つの可能性のある代替仮説を表した。検出力計算では、試験に関するアルファ０．０１２５（以下の表１０の実験に関するアルファ０．０５を４つの仮説試験で割る）を仮定し、上述の連続共変量および重相関を仮定する。分析は全てＳＡＳ  ｖ９．４（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）中のＰＲＯＣ  ＧＬＭＰＯＷＥＲを使用して行った。
【表１０】
2021520380.tif 000012
【０１８５】
表は、合計で１２０人の参加者（ＡおよびＢ群およびＣおよびＤ群のそれぞれに３０人、ならびにＤｕｋｅＡＣＴから６０人）により、第１種の過誤の厳密な制御および共変量の調整を伴って、ｈＣＴ−ＭＳＣの中等度の一般的な処置効果またはｈＣＴ−ＭＳＣの単一の投薬レジメンのみでの処置効果の検出に関して少なくとも９０％の検出力がもたらされることを示す。本研究の検出力は、小さい〜中等度のサイズの直線用量反応の検出に関してはより小さい。具体的には、この代替の下で１回用量と３回用量の効果を区別することに関しては検出力が低下する。
【０１８６】
上記の統計学的検出力の推定値は、共変量と応答との関連性の強度に関して大いに感度が高いことが理解されるべきである。約０．８を下回る相関の結果、研究が従来の標準による検出力を下回るものになる。
【０１８７】
本開示は、ＡＳＤを有する若年小児における同種異系のｈＣＴ−ＭＳＣの静脈内注入が安全であり、実行可能であることを実証する。本開示は、注入後最初の６カ月時点で観察される行動の有意な改善およびこれらの有意な改善が注入の１２カ月後に持続していたという結論を裏付ける。ベースライン非言語ＩＱが高いことが改善の程度が大きいことに関連した。本開示は、実行可能であり、変化に対する感度が高く、発生的に適正であり、したがって、今後の臨床治験および治療状況においてＡＳＤを有する若年小児を処置するためのｈＣＴ−ＭＳＣ治療の有効性を試験するための使用に適する転帰尺度を同定する。
【０１８８】
本明細書に記載の実施例および実施形態は単に例示するためのものであり、それらを考慮すれば種々の改変または変化が当業者に示唆され、本出願の主旨および権限ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に組み込まれることが理解される。本明細書において引用されている全ての刊行物、特許および特許出願がこれによりあらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021520380.tif 000013
【図２】
2021520380.tif 000014
【図３−１】
2021520380.tif 000015
【図３−２】
2021520380.tif 000016
【図４】
2021520380.tif 000017
【国際調査報告】
2021520380.tif 000018
2021520380.tif 000019