(57)【要約】  本発明は、新規のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びその使用に関する。本発明によると、配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列によって表されるタンパク質は、ガイドＲＮＡに連結された細胞内核酸配列を認識し、切断するエンドヌクレアーゼの活性を呈する。したがって、本発明の新規のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系においてゲノム編集のための異なるヌクレアーゼとして使用され得る。【選択図】  図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項２】
配列番号１の前記アミノ酸配列を有する前記Ｃａｓ１２ａタンパク質が、配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされている、請求項１に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項４】
配列番号１の前記アミノ酸配列を有する前記Ｃａｓ１２ａタンパク質が、ｐＨ７．０〜ｐＨ７．９で最適な活性を有する、請求項１に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項５】
９２５位のリジン（Ｌｙｓ）が別のアミノ酸で置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項６】
前記別のアミノ酸が、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びシステイン（Ｃｙｓ）からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項５に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項７】
配列番号３のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項８】
配列番号３の前記アミノ酸配列を有する前記Ｃａｓ１２ａタンパク質が、配列番号４のヌクレオチド配列によってコードされている、請求項７に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項７に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１０】
配列番号３の前記アミノ酸配列を有する前記Ｃａｓ１２ａタンパク質が、ｐＨ７．０〜ｐＨ７．９で最適な活性を有する、請求項７に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１１】
９３０位のリジン（Ｌｙｓ）が別のアミノ酸で置換されている、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１２】
前記別のアミノ酸が、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びシステイン（Ｃｙｓ）からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１１に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１３】
８７７位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１４】
前記別のアミノ酸が、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びシステイン（Ｃｙｓ）からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１３に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が低下している、請求項１３に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１６】
８７３位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が別のアミノ酸で置換されている配列番号３のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１７】
前記別のアミノ酸が、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びシステイン（Ｃｙｓ）からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１６に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１８】
前記タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性が低下している、請求項１６に記載のＣａｓ１２ａタンパク質。
【請求項１９】
活性成分として：ｍｇＣａｓ１２ａ；及びがん細胞に特異的に存在する核酸配列を標的とするｃｒＲＮＡを含む、がんを処置するための医薬組成物。
【請求項２０】
前記ｍｇＣａｓ１２ａが、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム編集は、生物の遺伝情報を自由に編集する技術である。生命科学分野の進歩及びゲノム配列決定技術の開発により、広範囲に遺伝情報を理解することが可能になった。例えば、動植物の繁殖、疾患及び成長、様々なヒトの遺伝的疾患を引き起こす遺伝的突然変異並びにバイオ燃料の生産に対する遺伝子の理解はすでに達成されている；しかしながら、生物を改善する及びヒト疾患を処置するためにこの理解を直接利用するにはさらなる技術的進歩が行われなければならない。
【０００３】
ゲノム編集技術を使用してヒトを含めた動物、植物及び微生物の遺伝情報を変化させることができ、したがって、その適用範囲は劇的に拡大され得る。所望の遺伝情報を正確に切断するために設計され、作られた分子ツールである遺伝子はさみは、ゲノム編集技術において鍵となる役割を果たす。遺伝子配列の分野を次のレベルに高める次世代配列決定技術と類似して、遺伝子はさみの使用は、遺伝情報の利用の速さ及び範囲を増大させ、新たな産業分野を創出する鍵となる技術になりつつある。
【０００４】
これまでに開発されてきた遺伝子はさみは、その登場した順番により３つの世代に分けられ得る。遺伝子はさみの第１世代は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり；遺伝子はさみの第２世代は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり；最近の研究である、クラスター化された規則的間隔のパリンドローム様短反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）が、遺伝子はさみの第３世代である。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲは、配列決定された細菌のおよそ４０％及び配列決定された古細菌の９０％のゲノムに見られる、複数の短い直列反復を含有する遺伝子座である。Ｃａｓ９タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と称される２つのＲＮＡと複合体形成すると活性なエンドヌクレアーゼを形成し、それによって侵入ファージ又はプラスミド中の外来性遺伝的エレメントを細断して、宿主細胞を保護する。ｃｒＲＮＡは、外来の侵入物によって以前から占められていた宿主ゲノムのＣＲＩＳＰＲエレメントから転写される。
【０００６】
このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に由来するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ゲノム編集ができるツールを提供する。特に、単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質を使用して細胞並びに器官のゲノムを編集できる技術に関する研究が、活発に行われてきた。近年では、Ｃｐｆ１タンパク質［プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）１から得られる］が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系における別のヌクレアーゼタンパク質として報告されており（Ｂ．Ｚｅｔｓｃｈｅ、ら、２０１５年）、ゲノム編集に一層広い選択肢をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ゲノム編集において知られているヌクレアーゼより効果的なタンパク質を開発することに継続して取り組んだ結果、本発明者らは、標的核酸配列を認識し、切断する新規のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を見出し、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、標的核酸配列を認識し、切断する新規のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述の目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質を提供する。
【００１０】
加えて、本発明は、９２５位のリジン（Ｌｙｓ）が別のアミノ酸で置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質を提供する。
【００１１】
加えて、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質を提供する。
【００１２】
加えて、本発明は、９３０位のリジン（Ｌｙｓ）が別のアミノ酸で置換されている、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質を提供する。
【００１３】
加えて、本発明は、８７７位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が別のアミノ酸で置換されている、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質を提供する。
【００１４】
加えて、本発明は、８７３位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が別のアミノ酸で置換されている、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣａｓ１２ａタンパク質を提供する。
【００１５】
加えて、本発明は、活性成分として：ｍｇＣａｓ１２ａ；及びがん細胞に特異的に存在する核酸配列を標的とするｃｒＲＮＡを含むがんを処置するための医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列で表されるタンパク質は、ガイドＲＮＡに結合する細胞内核酸配列を認識し、切断するエンドヌクレアーゼ活性を有する。したがって、本発明の新規のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系においてゲノム編集を行う別のヌクレアーゼとして使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】メタゲノムからＣａｓ１２ａを発見する過程の概念図である。
【図２Ａ】発見されているＣａｓ１２ａの系統樹を示す図である。
【図２Ｂ】新規のＣａｓ１２ａ及びＡｓＣａｓ１２ａの構造を示す図である。
【図３】既存のＣａｓ１２ａ及び本発明のｍｇＣａｓ１２ａのアミノ酸配列を示し、その配列を、ＥＳＰｒｉｐｔプログラムを使用して整列させた図である。
【図４】既存のＣａｓ１２ａ及び本発明のｍｇＣａｓ１２ａのアミノ酸配列を示し、その配列を、ＥＳＰｒｉｐｔプログラムを使用して整列させた図である。
【図５】既存のＣａｓ１２ａ及び本発明のｍｇＣａｓ１２ａのアミノ酸配列を示し、その配列を、ＥＳＰｒｉｐｔプログラムを使用して整列させた図である。
【図６】既存のＣａｓ１２ａ及び本発明のｍｇＣａｓ１２ａのアミノ酸配列を示し、その配列を、ＥＳＰｒｉｐｔプログラムを使用して整列させた図である。
【図７】既存のＣａｓ１２ａ及び本発明のｍｇＣａｓ１２ａのアミノ酸配列を示し、その配列を、ＥＳＰｒｉｐｔプログラムを使用して整列させた図である。
【図８】既存のＣａｓ１２ａ及び本発明のｍｇＣａｓ１２ａのアミノ酸配列を示し、その配列を、ＥＳＰｒｉｐｔプログラムを使用して整列させた図である。
【図９Ａ】Ｃａｓ１２ａ及び本発明のｍｇＣａｓ１２ａの配列情報を比較し、要約することによって得た表である。
【図９Ｂ】Ｃａｓ１２ａ及び本発明のｍｇＣａｓ１２ａの配列情報を比較し、要約することによって得た表である。
【図１０】本発明に記載のｍｇＣａｓ１２ａのｐＨに応じた活性を同定することによって得られた結果を示す図である。他方、図１０のｃｒＲＮＡ＃１は、配列番号２５のヌクレオチド配列を有し、図１１のｃｒＲＮＡ＃２は、配列番号２６のヌクレオチド配列を有する。
【図１１】本発明に記載のｍｇＣａｓ１２ａのｐＨに応じた活性を同定することによって得られた結果を示す図である。他方、図１０のｃｒＲＮＡ＃１は、配列番号２５のヌクレオチド配列を有し、図１１のｃｒＲＮＡ＃２は、配列番号２６のヌクレオチド配列を有する。
【図１２】本発明に記載のｍｇＣａｓ１２ａのｐＨに応じた活性を同定することによって得られた結果を示す図である。他方、図１０のｃｒＲＮＡ＃１は、配列番号２５のヌクレオチド配列を有し、図１１のｃｒＲＮＡ＃２は、配列番号２６のヌクレオチド配列を有する。
【図１３】標的核酸配列及びｃｒＲＮＡが結合する位置を示す図である。
【図１４】遺伝子ＣＣＲ５及びＤＮＭＴ１のそれぞれに対するｃｒＲＮＡが使用される場合にそれぞれのタンパク質（Ｍｏｃｋ、ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２）によって達成された遺伝子編集効率を同定することによって得られた結果を示す図である。
【図１５】それぞれの遺伝子ＦｕｃＴ１４−１及びＦｕｃＴ１４−２に対して２つのｃｒＲＮＡが使用される場合にそれぞれのタンパク質（ＦｎＣｐｆ１、ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２）によって達成された遺伝子編集効率を同定することによって得られた結果を示す図である。
【図１６Ａ】ＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質のＤＮＡ切断活性を同定することによって得られた結果を示す図である。
【図１６Ｂ】ＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質のＤＮＡ切断活性を同定することによって得られた結果を示す図である。
【図１７】既存のＣａｓ１２ａ（ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ又はＬｂＣａｓ１２ａ）及び新規のＣａｓ１２ａ（ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１、ｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ−１、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２又はｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ−２）の非特異的ＤＮａｓｅ機能を同定することによって得られた結果を示す図である。
【図１８Ａ】ＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質が、ｃｒＲＮＡなしに非特異的ＤＮａｓｅ機能を有するかどうか同定することによって得られた結果を示す図である。
【図１８Ｂ】ＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質が、ｃｒＲＮＡなしに非特異的ＤＮａｓｅ機能を有するかどうか同定することによって得られた結果を示す図である。
【図１９】ｍｇＣａｓ１２ａが、既存のＣａｓ１２ａの５’ハンドルを使用してＤＮＡ切断を実行できるかどうか同定することによって得られた結果を示す図である。
【図２０Ａ】二価イオン中のＦｎＣａｓ１２ａ、ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質のＤＮＡ切断活性を示す図である。
【図２０Ｂ】二価イオン中のＦｎＣａｓ１２ａ、ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質のＤＮＡ切断活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
〔本発明を実施するための最良の形態〕
本発明の態様において、メタゲノムから得られた新規のＣａｓ１２ａタンパク質が、提供される。
【００１９】
本明細書では、用語「Ｃａｓ１２ａ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質であり、Ｃｐｆ１と称される場合もある。加えて、Ｃｐｆ１は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系に見られるエフェクタータンパク質である。単一のエフェクタータンパク質であるＣａｓ１２ａは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に見られるエフェクタータンパク質であるＣａｓ９と類似しており、ｃｒＲＮＡと組み合わさって標的遺伝子を切断する。しかしながら、２つは、作用の仕方が異なる。Ｃａｓ１２ａタンパク質は、一本鎖ｃｒＲＮＡと作用する。したがって、Ｃａｓ１２ａタンパク質の場合、Ｃａｓ９のように、ｃｒＲＮＡとトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を同時に使用する又はｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを合成的に組合せることによって単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を創出する必要性はない。
【００２０】
加えて、Ｃａｓ９とは異なり、Ｃａｓ１２ａ系は、標的配列の５’位置に存在するＰＡＭを認識する。加えて、Ｃａｓ１２ａ系において、標的を決定するガイドＲＮＡも、Ｃａｓ９より短い長さを有する。加えて、Ｃａｓ１２ａは、標的ＤＮＡにおける切断部位で平滑末端ではなく５’突出（付着末端）を生成し、したがってより正確で多様な遺伝子編集が可能になるという点で有利である。
【００２１】
従来、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）、ラクノスピラ属（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）、ブチリビブリオ属（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、ペレグリニバクテリア属（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属、フランシセラ属、カンジダタスメタノプラズマ属（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）又はユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から得られ得る。特に、ＰｂＣａｓ１２ａは、パルクバクテリアバクテリウム（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７から得られるタンパク質であり；ＰｅＣａｓ１２ａは、ペレグリニバクテリアバクテリウム（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０から得られるタンパク質であり；ＡｓＣａｓ１２ａは、アシドアミノコッカス属種ＢＶＢＬＧから得られるタンパク質であり；ＰｍＣａｓ１２ａは、ポルフィロモナスマカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）から得られるタンパク質であり；ＬｂＣａｓ１２ａは、ラクノスピラバクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６から得られるタンパク質であり；ＰｃＣａｓ１２ａは、ポルフィロモナスクレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）から得られるタンパク質であり；ＰｄＣａｓ１２ａは、プレボテーラディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｄｉｓｉｅｎｓ）から得られるタンパク質であり；ＦｎＣａｓ１２ａは、フランシセラノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２から得られるタンパク質である。しかしながら、各Ｃａｓ１２ａタンパク質は、そのタンパク質が由来する微生物によって異なる活性を有し得る。
【００２２】
本発明において、新規のＣａｓ１２ａは、メタゲノム中の遺伝子を分析することによって同定された。以降、メタゲノム由来Ｃａｓ１２ａは、ｍｇＣａｓ１２ａと称され得る。ＡｓＣａｓ１２ａと同様に、本発明のｍｇＣａｓ１２ａは、ＷＥＤ、ＲＥＣ、ＰＩ、ＲｕｖＣ、ＢＨ及びＮＵＣドメインを含む（図２）。加えて、これまでに知られているＣａｓ１２ａタンパク質と類似して、本発明のｍｇＣａｓ１２ａタンパク質は、ｃｒＲＮＡ及び５’ハンドルを含むｇＲＮＡにより遺伝子切断を実行できることが同定された。ｍｇＣａｓ１２ａは、ＦｎＣａｓ１２ａと同じ配列を有する５’ハンドルＲＮＡを使用することが同定された。特に、５’ハンドルＲＮＡは、ＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＧＵＵＧＵＡＧＡＵ（配列番号１２）の配列を有し得る。しかしながら、ｍｇＣａｓ１２ａが、ＡｓＣａｓ１２ａ及びＬｂＣａｓ１２ａにおける５’ハンドルＲＮＡとも作用することが同定された（図１９）。
【００２３】
ｍｇＣａｓ１２ａは、分離及び精製のためのタグをさらに含んでもよい。タグは、ｍｇＣａｓ１２ａのＮ末端又はＣ末端に結合されてもよい。加えて、タグは、ｍｇＣａｓ１２ａのＮ末端及びＣ末端に同時に結合されてもよい。タグの特定の例の１つは、６×Ｈｉｓタグでもよい。
【００２４】
ｍｇＣａｓ１２ａのある特定の例として、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。加えて、ｍｇＣａｓ１２ａの活性が変化しない限り、アミノ酸の部分の欠失又は置換がその中に作られてもよい。特に、ｍｇＣａｓ１２ａは、９２５位のリジン（Ｌｙｓ）が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。ここで、別のアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びシステイン（Ｃｙｓ）からなる群から選択されるいずれか１つでもよい。特に、タンパク質は、９２５位のリジンがグルタミンで置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有してもよい。即ち、タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を有してもよい。
【００２５】
加えて、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでもよい。加えて、配列番号１のアミノ酸配列を有するｍｇＣａｓ１２ａは、本発明によると、ｐＨ７．０〜ｐＨ７．９で最適な活性を有し得る。
【００２６】
ｍｇＣｐｆ１の別の特定の例として、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。加えて、ｍｇＣｐｆ１の活性が変化しない限り、アミノ酸の部分の欠失又は置換がその中に作られてもよい。特に、ｍｇＣｐｆ１は、９３０位のリジン（Ｌｙｓ）が別のアミノ酸で置換されている配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質でもよい。ここで、別のアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びシステイン（Ｃｙｓ）からなる群から選択されるいずれか１つでもよい。特に、タンパク質は、９３０位のリジンがグルタミンで置換されている配列番号３のアミノ酸配列を有してもよい。即ち、タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を有してもよい。
【００２７】
配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドでもよい。
【００２８】
加えて、配列番号３のアミノ酸配列を有するｍｇＣａｓ１２ａは、本発明によると、ｐＨ７．０〜ｐＨ７．９で最適な活性を有し得る。
【００２９】
本発明の別の態様において、エンドヌクレアーゼ活性が低下したｍｇＣａｓ１２ａタンパク質が、提供される。その特定の例の１つは、８７７位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が別のアミノ酸で置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有するｍｇＣａｓ１２ａでもよい。ここで、別のアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びシステイン（Ｃｙｓ）からなる群から選択されるいずれか１つでもよい。特に、タンパク質は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）をアラニン（Ａｌａ）で置換することによって得られるタンパク質でもよい。
【００３０】
ｍｇＣａｓ１２ａタンパク質の別の特別な例は、８７３位のアスパラギン酸（Ａｓｐ）が別のアミノ酸で置換されている配列番号３のアミノ酸配列を有するｍｇＣａｓ１２ａでもよい。ここで、別のアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、リジン（Ｌｙｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）及びシステイン（Ｃｙｓ）からなる群から選択されるいずれか１つでもよい。特に、タンパク質は、アスパラギン酸（Ａｓｐ）をアラニン（Ａｌａ）で置換することによって得られるタンパク質でもよい。ここで、エンドヌクレアーゼ活性が低下したｍｇＣａｓ１２ａは、不活化ｍｇＣａｓ１２ａ又はｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａと称されてもよい。ｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａは、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を有してもよい。
【００３１】
加えて、本発明のさらに別の態様において、活性成分として：ｍｇＣａｓ１２ａ；及びがん細胞に特異的に存在する核酸配列を標的とするｃｒＲＮＡを含むがんを処置するための医薬組成物が提供される。ここで、ｍｇＣａｓ１２ａは、配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つを有し得る。本明細書では、用語「がん細胞内に特異的に存在する核酸配列」とは、正常細胞内には存在せず、がん細胞内にのみ存在する核酸配列のことを指す。即ち、本用語は、正常細胞内の配列とは異なる配列のことを指し、２つの配列は、少なくとも１つの核酸だけで異なっていてもよい。加えて、そのような差異は、遺伝子の部分の置換又は欠失に起因してもよい。ある特定の例として、がん細胞内に特異的に存在する核酸配列は、がん細胞内に存在するＳＮＰでもよい。がん細胞内に存在する上述の配列を有する標的ＤＮＡと標的ＤＮＡに相補的な配列を有するガイドＲＮＡは、互いに特異的に結合する。
【００３２】
特に、がん細胞内に特異的に存在する核酸配列に関して、ｃｒＲＮＡは、様々ながん組織のゲノム配列決定によりがん細胞内にだけ存在する特異的ＳＮＰを発見し、そのＳＮＰを使用することによって創出され得る。これは、がん細胞特異的毒性を呈する方法で行われ、したがって患者特異的な抗がん治療薬の開発が可能になる。加えて、がん細胞内に特異的に存在する核酸配列は、正常細胞とは異なり、がん細胞内で高コピー数多型（ＣＮＶ）を有する遺伝子でもよい。
【００３３】
がんの特定の一例は、膀胱がん、骨がん、血液がん、乳がん、黒色腫、甲状腺がん、副甲状腺がん、骨髄がん、直腸がん、咽喉がん、喉頭がん、肺がん、食道がん、膵臓がん、胃がん、舌がん、皮膚がん、脳腫瘍、子宮がん、頭頸部がん、胆嚢がん、口腔がん、大腸がん、肛門周囲がん、中枢神経系腫瘍、肝臓がん及び結腸直腸がんからなる群から選択されるいずれか１つでもよい。特に、がんは、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん及び乳がんであってもよく、これらがんは、韓国における５つの主要ながんとして知られている。
【００３４】
ここで、がん細胞内に特異的に存在する核酸配列を標的とするｃｒＲＮＡは、１つ又は複数のｇＲＮＡ配列を含んでもよい。例えば、ｃｒＲＮＡは、卵巣がん又は乳がんに存在するＢＲＣＡ１のエクソン１０及び１１を同時に標的標的とすることができるｇＲＮＡを使用してもよい。加えて、ｃｒＲＮＡは、ＢＲＣＡ１のエクソン１１を標的とする２つ以上のｇＲＮＡを使用してもよい。したがって、ｇＲＮＡの組合せは、がん処置の目的及びがんの型に応じて適切に選択され得る。即ち、異なるｇＲＮＡが選択され、使用されてもよい。
【実施例】
【００３５】
〔発明の様式〕
以降、本発明は、以下の例によってさらに詳細に記載される。しかしながら、以下の例は、単なる例示目的であり、本発明の範囲はそれに限定されない。
【００３６】
実施例１．メタゲノム由来Ｃａｓ１２ａタンパク質の発見
メタゲノムヌクレオチド配列をＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ＢＬＡＳＴデータベースからダウンロードし、ローカルＢＬＡＳＴｐデータベースを構築した。加えて、１６個のＣａｓ１２ａ及び様々なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ１）のアミノ酸配列を、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースからダウンロードした。ＭｅｔａＣＲＴプログラムを使用して、メタゲノム中のＣＲＩＳＰＲ反復及びスペーサー配列を見いだした。次いで、ＣＲＩＳＰＲ配列を有するメタゲノム配列だけを抽出し、その遺伝子を、Ｐｒｏｄｉｇａｌプログラムを使用して予測した。
【００３７】
予測された遺伝子の中で、ＣＲＩＳＰＲ配列の１０ｋｂ上流又は下流の範囲にある遺伝子を抽出し、Ｃａｓ１２ａのアミノ酸配列を使用して問題の遺伝子の中からＣａｓ１２ａホモログを予測した。Ｃａｓ１遺伝子を使用して、Ｃａｓ１ホモログがＣａｓ１２ａホモログの上流又は下流にあるかどうか予測し；Ｃａｓ１を周辺に有する８００ａａ〜１５００ａａのＣａｓ１２ａ遺伝子を選択した。これら遺伝子のそれぞれについて、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ非冗長データベースにおいてＢＬＡＳＴｐを使用して、遺伝子がすでに報告されている遺伝子かどうか又は遺伝子がＣＲＩＳＰＲと全く連関がない遺伝子かどうかを決定する。
【００３８】
メチオニン（Ｍｅｔ）から始まらない断片化したＣａｓ１２ａを除去した後、これら遺伝子を、高速フーリエ変換（ＭＡＦＦＴ）プログラムを使用する多重整列化を使用して整列させた。次いで、ＭＥＧＡ７を使用して近隣結合（１００×ブートストラップ）により系統樹を描いた。これまでに知られているＣａｓ１２ａ遺伝子と共に単一系統分類群を形成する遺伝子を選択し、ＭＥＧＡ７、最尤法、及び１０００ｘブートストラップを使用して既存のＣａｓ１２ａのアミノ酸配列と一緒にその系統樹を描いて、それらの進化的関係を調査した。ここで、メタゲノムからＣａｓ１２ａを発見する過程を図１に図式的に例示する。加えて、Ｃａｓ１２ａの系統樹を図２Ａに例示する。ここで、配列番号１のアミノ酸配列を有する新規のタンパク質をＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１と命名した。加えて、配列番号３のアミノ酸配列を有する新規のタンパク質をＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２と命名した。加えて、ＡｓＣａｓ１２ａ、ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２の構造を図２Ｂに例示する。
【００３９】
実施例２．ｍｇＣａｓ１２ａのバリアントの作製
Ｃａｓ１２ａ候補を、ＥＳＰｒｉｐｔプログラムを使用してＡｓＣａｓ１２ａ及びＬｂＣａｓ１２ａの構造に基づいて整列させた。ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２の場合、アミノ酸の部分の置換を作製し、そのエンドヌクレアーゼ活性を増大させた。９２５番目のアミノ酸Ｌｙｓ（Ｋ）をＧｌｕ（Ｑ）で置換したＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１を、ｍｇＣａｓ１２ａ−１と命名した。加えて、９３０番目のアミノ酸Ｌｙｓ（Ｋ）をＧｌｕ（Ｑ）で置換したＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２を、ｍｇＣａｓ１２ａ−２と命名した。得られたバリアントを、ヒト、シロイヌナズナ及び大腸菌のコドン使用頻度を考慮してコドン最適化に供し、次いで、その遺伝子合成をＢｉｏｎｉｃｓに依頼した。ここで、ヒトコドンに最適化したｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号７及び配列番号８に示す。加えて、ＥＳＰｒｉｐｔプログラムを使用して整列させた既存のＣａｓ１２ａ［ＡｓＣａｓ１２ａ（配列番号９）、ＬｂＣａｓ１２ａ（配列番号１０）及びＦｎＣａｓ１２ａ（配列番号１１）］及びＣａｓ１２ａ候補（ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２）のアミノ酸配列を図３〜図８に例示し；その配列情報を比較及び要約することによって得た結果を、図９Ａ及び図９Ｂに例示する。
【００４０】
次いで、ｐＵＣ５７ベクターにクローニングされているＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２、ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２遺伝子のそれぞれを、ｐＥＴ２８ａ−ＫａｎＲ−６×Ｈｉｓ−ＢＰＮＬＳベクターに再挿入し、次いでクローニングを実行した。クローニングしたベクターを、大腸菌株ＤＨ５ａ及びロゼッタにそれぞれ形質転換した。ｃｒＲＮＡの５’ハンドル配列をメタゲノムＣＲＩＳＰＲ反復配列から抽出した。抽出したＲＮＡをＤＮＡオリゴに合成した。ＤＮＡオリゴマーの転写を、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  ＲＮＡ転写酵素キットを使用して実行し、転写された５’ハンドルの濃度をＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａによって確認した。
【００４１】
実施例３．タンパク質発現及び精製
終夜培養した大腸菌ロゼッタ（ＤＥ３）５ｍＬを、１００ｍｇ／ｍＬカナマイシン抗生物質で補充した液体ＴＢ培地５００ｍＬに植菌した。培地を、ＯＤ６００が０．６に達するまでインキュベーター内で、３７℃で培養した。タンパク質発現のために、０．４μＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による処理を実行し、次いでさらなる培養を２２℃で１６〜１８時間実行した。遠心分離後、得られた細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール及びＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル）１０ｍＬと混合し、次いで超音波処理に供して細胞破砕した。破砕物を、それぞれ６０００ｒｐｍで２０分間、３回遠心分離し、０．２２ミクロンフィルターによって次いで濾過した。
【００４２】
その後、洗浄及び溶出をニッケルカラム（ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ、５ｍＬ）及び３００ｍＭイミダゾール緩衝液を使用して実行し、タンパク質を親和性クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質サイズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって確認し、透析を透析緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール）に対して終夜実行した。次いで、タンパク質を、そのサイズに応じて濾過及び濃縮に選択的に供した（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  １００，０００  ＭＷＣＯ）。タンパク質の場合、ブラッドフォード定量方法を使用して、その濃度を測定した。次いで、タンパク質を−８０℃で貯蔵し、使用した。
【００４３】
実施例４．切断分析によるｍｇＣａｓ１２ａに適切なｐＨ範囲の同定
レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）のキシロシルトランスフェラーゼをＰＣＲによって増幅してプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を予測し、その結果ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計した。ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の場合、各ｍｇＣａｓ１２ａタンパク質を、分子比１：１．２５でｇＲＮＡと室温で２０分間混合して各ＲＮＰ複合体を作製した。精製したキシロシルトランスフェラーゼＰＣＲ産物を、様々な濃度でＲＮＰによる処理に供した。次いで、濃度調整を、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  １．１（１×緩衝液成分、１０ｍＭ  Ｂｉｓ−トリス−プロパン−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２．１（１×緩衝液成分、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）及びＮＥＢｕｆｆｅｒ  ３．１（１×緩衝液成分、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）で行い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断分析を３７℃で実行した。ここで、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  １．１、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２．１及びＮＥＢｕｆｆｅｒ  ３．１は、２５℃でそれぞれｐＨ７．０、ｐＨ７．９及びｐＨ７．９値を有した。各反応が完了した後、反応を６５℃で１０分間のインキュベーションによって停止させ、完了した反応を１．５％アガロースゲル電気泳動法によって確認した。結果を図１０〜図１２に例示する。図１０〜図１２において、ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２は、それぞれｈｅｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｈｅｍｇＣａｓ１２ａ−２によって示される。加えて、キシロシルトランスフェラーゼ中の標的核酸配列及びｃｒＲＮＡを結合する位置を図中に示し、この図を図１３に例示する。
【００４４】
図１０〜図１２に例示した通り、ｍｇＣａｓ１２ａ−１とｃｒＲＮＡの複合体をＮＥＢｕｆｆｅｒ  １．１で処理した場合、標的ｄｓＤＮＡは切断された。加えて、ｍｇＣａｓ１２ａ−２とｃｒＲＮＡの複合体をＮＥＢｕｆｆｅｒ  １．１で処理した場合、標的ｄｓＤＮＡは切断された。これらの結果から、ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２がｐＨ７．０で活性であることが判明した。
実施例５．動物細胞におけるｍｇＣａｓ１２ａの遺伝子編集効率の分析
実施例５．１．ＣＣＲ５及びＤＮＭＴ１の遺伝子編集のためのｍｇＣａｓ１２ａ−１又はｍｇＣａｓ１２ａ−２を含むＲＮＰの作製
【００４５】
ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリンストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）で補充したＤＭＥＭ培地中で、５％  ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で培養した。ｍｇＣａｓ１２ａ−１タンパク質及びｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質各１００ｐｍｏｌｅ並びにＣＣＲ５標的化ｃｒＲＮＡ及びＤＮＭＴ１標的化ｃｒＲＮＡそれぞれ２００ｐｍｏｌｅを２０分間室温でインキュベートして、各ＲＮＰを調製した。ここで、ＣＣＲ５及びＤＮＭＴ１のｃｒＲＮＡ配列を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）で合成し、下の表１に示す。
【００４６】
【表１】
2021532819.tif 000003
【００４７】
培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞２×１０５個を、ヌクレオフェクション試薬２０μＬと混合し、ＲＮＰ複合体１０μＬと次いで混合した。その後、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイス（Ｌｏｎｚａ）を使用して、トランスフェクションした。トランスフェクションの４８及び７２時間後に、ゲノムＤＮＡをピュアリンク（ＰｕｒｅＬｉｎｋ）（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から抽出した。
【００４８】
実施例５．２．標的部位の配列決定分析
実施例５．１において抽出したゲノムＤＮＡを、下の表２に示したＣＣＲ５又はＤＮＭＴ１用のアダプタプライマーを使用して増幅させた。
【００４９】
【表２】
2021532819.tif 000004
【００５０】
その後、精製及び配列決定ライブラリ調製を、Ｉｌｌｕｍｉｎａのプロトコールにしたがって実行し、次いでディープシーケンシング分析を、ＭｉｎｉＳｅｑ装置を使用して標的部位で実行した。ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質によって達成された遺伝子編集効率を図１４に例示し、標的部位の配列決定分析結果を下の表３に示す。図１４に例示した通り、ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質は、Ｍｏｃｋタンパク質より高い遺伝子編集効率を呈した。
【００５１】
【表３】
2021532819.tif 000005
【００５２】
実施例６．植物細胞におけるｍｇＣａｓ１２ａの遺伝子編集効率の分析
実施例６．１．植物プロトプラストの単離
タバコ種子を、５０％  Ｃｌｏｒｏｘによる１分間の処理によって殺菌した。殺菌した種子を種子発芽のために培地上に置き、１週間栽培した。次いで、種子を栽培に使用するマゼンタ色の箱に移し、３週間成長させた。使用した電照栽培条件は照明１６時間及び暗闇８時間であり、種子を温度２５℃〜２８℃で成長させた。植物の場合、４〜６週間成長した葉を使用した。葉をガラスプレート上に置き、葉の内側部分だけを使用するように葉端及び柄をそこから切断した。ここで、葉を０．５ｍｍ又はより小さい断片に切断した。切断した葉断片を、酵素溶液１０ｍＬ中に置き、室温で、暗所で、回転振とう機（５０ｒｐｍ）上で３〜４時間インキュベートした。
【００５３】
インキュベーション後、Ｗ５溶液１０ｍＬを添加し、慎重に混合した。細胞濾過器（７０μｍ）を使用して、酵素溶液中に存在するプロトプラストを濾過した。濾過したプロトプラストを、１００×ｇで６分間遠心分離した。上清を廃棄し、プロトプラストペレットをＭＭＧ溶液の添加によって慎重に懸濁した。次いで、懸濁液を氷上に１０〜３０分間置いた。懸濁液の一部について、プロトプラスト数を、計数プレートであるＨｅｍ血球計算器及び顕微鏡を使用して計数した。その後、プロトプラスト濃度が２×１０６個細胞／ｍＬになるようにＭＭＧ溶液をさらに添加して希釈した。酵素溶液、ＭＭＧ溶液及びＰＥＧ溶液のそれぞれの組成を下の表４に示す。
【００５４】
【表４】
2021532819.tif 000006
【００５５】
実施例６．２．標的部位の配列決定分析及びそれに対する編集効率の同定
ｃｒＲＮＡ、ｍｇＣａｓ１２ａタンパク質及びＮＥＢｕｆｆｅｒ１．１を、最終容量２０μＬになるように２ｍＬ  ｅ管に添加し、次いで、反応を室温で１０分間進行させた。実施例６．１において得たプロトプラスト２００μＬ（５×１０５個細胞）並びに反応させたｃｒＲＮＡ及びｍｇＣａｓ１２タンパク質（容積２０μＬ）をｅ管（２ｍＬ）に添加し、よく混合し、クリーンベンチ内で１０分間次いで培養した。その後、インキュベートした容積と同じ容積のＰＥＧ溶液２２０μＬをそれに添加し、慎重に混合した。混合物を室温で１５分間培養した。次いで、Ｗ５溶液８４０μＬをそれに添加し、よく混合した。１００ｘｇで２分間遠心分離した後、上清を廃棄した。次いで、培養をＷ５溶液中で２日間実行した。次いで、細胞を採取し、ＤＮＡをそこから抽出した。
【００５６】
抽出したＤＮＡを使用して標的部分をＰＣＲに供し、次いで、標的遺伝子編集効率を、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって同定した。結果を下の表５に示す。表５に示すように、ｍｇＣａｓ１２ａ−１タンパク質によって達成された遺伝子編集効率は、ＦｎＣｐｆ１より１．８倍高かった。
【００５７】
【表５】
2021532819.tif 000007
【００５８】
加えて、タバコＦｕｃＴ１４遺伝子に対してｃｒＲＮＡを２つ使用することにより達成された遺伝子編集効率を、各タンパク質について同定した。結果を図１５に例示する。図１５に例示されるように、ｍｇＣａｓ１２ａ−１タンパク質によって達成された遺伝子編集効率は、ＦｎＣｐｆ１より２倍高かった。ここで、標的遺伝子ＮｂＦｕｃＴ１４＿１並びにＮｂＦｕｃＴ１４＿２に対するｃｒＲＮＡ及びプライマー配列を下の表６及び表７に示す。
【００５９】
【表６】
2021532819.tif 000008
【００６０】
【表７】
2021532819.tif 000009
【００６１】
実施例７．ＦｎＣａｓ１２ａとｍｇＣａｓ１２ａ間の遺伝子編集効率の比較
ＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質及びｃｒＲＮＡからなる各リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するために、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質６ｐｍｏｌ及びｃｒＲＮＡ  ７．５ｐｍｏｌを、ＮＥＢ１．１緩衝液及び１×蒸留水と室温で３０分間混合した。ｃｒＲＮＡ依存的Ｃａｓ１２ａ（ＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２）を使用してｄｓＤＮＡ切断活性を同定するために、標的ｄｓＤＮＡ（直鎖状又は環状）０．３ｐｍｏｌをそれに添加し、次いで反応を３７℃で２時間進行させた。ここで、ＨｓＣＣＲ５、ＨｓＤＮＭＴ１及びＨｓＥＭＸ１を、ＤＮＡとして使用した。加えて、実験に使用した直鎖状ＤＮＡ（配列番号２７〜配列番号２９）は、ＰＣＲ精製した産物であり、環状ＤＮＡ（配列番号３０〜配列番号３２）は、精製したプラスミドであった。ＳＤＳ及びＥＤＴＡ（ゲルローディング色素、ＮＥＢ）をそれに添加し、次いで、混合物を−２０℃で１０分間貯蔵して反応を停止させた。各ＤＮＡを１％アガロースゲルにロードし、次いで電気泳動に供してＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２に起因するＤＮＡ切断活性を確認した。結果を、図１６Ａ（直鎖状ＤＮＡ）及び図１６Ｂ（環状ＤＮＡ）に例示する。図１６Ａ及び図１６Ｂにおいて、Ｓは基質を示し、ゲルの下に示した各数字は、基質ＤＮＡバンドがどの程度濃いかを示す。
【００６２】
実施例８．ｍｇＣａｓ１２ａの非特異的ＤＮａｓｅ活性の同定
Ｃａｓ１２ａ（ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ又はＬｂＣａｓ１２ａ）及びｍｇＣａｓ１２ａ（ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１、ｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ−１、ＷＴｍｇＣａｓ１２ａ−２又はｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ−２）のランダムなＤＮａｓｅ機能を同定するために、実験を、実施例７と同じ様式で実行した。ここで、ｄ−ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ−２は、Ａｓｐ（ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１の８７７位又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２の８７３位）のＡｌａによる置換によってＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１及びＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２からそれぞれ得られたタンパク質のことを指す。
【００６３】
特に、７つの型のＣａｓ１２ａのそれぞれ及びｃｒＲＮＡからなる各リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するために、各Ｃａｓ１２ａタンパク質６ｐｍｏｌ及びｃｒＲＮＡ  ７．５ｐｍｏｌを、ＮＥＢ１．１緩衝液及び１×蒸留水の存在下で、室温で３０分間反応させた。その後、標的ｄｓＤＮＡ  ０．３ｐｍｏｌをそれに添加し、次いで、反応を３７℃で１２時間又は２４時間進行させた。ここで、ＨｓＣＣＲ５、ＨｓＤＮＭＴ１及びＨｓＥＭＸ１を、ＤＮＡとして使用した。ＳＤＳ及びＥＤＴＡ（ゲルローディング色素、ＮＥＢ）をそれに添加し、次いで、混合物を−２０℃で１０分間貯蔵して反応を停止させた。各ＤＮＡを１％アガロースゲルにロードし、次いで電気泳動に供してＣａｓ１２ａの７つの型に起因するＤＮＡ切断活性を確認した。結果を図１７に例示する。図１７において、Ｓは基質を示し、ゲルの下に示した各数字は、基質ＤＮＡバンドがどの程度濃いかを示す。
【００６４】
図１７に例示する通り、新規のＣａｓ１２ａであるＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１、ｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ−１、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２又はｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ−２及びｃｒＲＮＡからなる各リボ核タンパク質複合体は、既存のＣａｓ１２ａであるＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ又はＬｂＣａｓ１２ａ及びｃｒＲＮＡからなるリボ核タンパク質複合体より弱い非特異的ＤＮａｓｅ機能を呈した。加えて、全体として、Ｃａｓ１２ａ  ＲＮＰとＤＮＡの反応が、非特異的ＤＮａｓｅ機能をもたらすと推定される可能性がある。
【００６５】
実施例９．ｃｒＲＮＡを含まない条件下でのＣａｓ１２ａの非特異的ＤＮａｓｅ機能の同定
Ｃａｓ１２ａが、ｃｒＲＮＡがなくてもＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質に対してランダムなＤＮａｓｅ機能を有するかどうか同定するために、実験を、ｃｒＲＮＡを含まない条件を使用したことを除いて、実施例７と同じ様式で時間を変動させて実行した。結果を図１８Ａ及び図１８Ｂに例示する。図１８Ａ及び図１８Ｂに例示した通り、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質は、ｃｒＲＮＡがなくても、ランダムなＤＮａｓｅ機能を有し、中でもＦｎＣａｓ１２ａタンパク質のランダムなＤＮａｓｅ機能が最初に現れた。
【００６６】
実施例１０．既存のＣａｓ１２ａのハンドルを使用するｍｇＣａｓ１２ａのＤＮＡ切断機能の同定
新たなＣａｓ１２ａ（ｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａ）が、既存のＣａｓ１２ａ（ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ又はＬｂＣａｓ１２ａ）配列の５’末端に位置するハンドルを使用してＤＮＡ切断を実行し得るかどうか同定するために、実験を、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ又はＬｂＣａｓ１２ａのそれぞれのハンドルを使用したことを除いて、実施例７と同じ様式で反応時間を変動させて実行した。結果を図１９に例示する。
【００６７】
図１９に例示した通り、ＤＮＡ切断を、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ又はＬｂＣａｓ１２ａのハンドルを使用してｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａタンパク質で実行させた場合、ＤＮＡ切断効率はそれぞれのハンドルによってわずかに異なるものの、３つの型のハンドルを使用した全てのｄ＿ｍｇＣａｓ１２ａ又はＷＴ  ｍｇＣａｓ１２ａタンパク質が、ＤＮＡ切断機能を有した。これらの結果から、ＤＮＡ切断の場合、ｍｇＣａｓ１２ａは、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ又はＬｂＣａｓ１２ａのハンドルを使用し得ることが判明した。
【００６８】
実施例１１．二価イオン中のＦｎＣａｓ１２ａ又はｍｇＣａｓ１２ａの活性の同定
加えて、二価イオン（ＣａＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＦｅＣｌ２、ＭｎＳＯ４、ＮｉＳＯ４又はＺｎＳＯ４）中でのＦｎＣａｓ１２ａ、ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質のＤＮＡ切断活性を同定するために、実験を、予め定めた量の二価イオンをＮＥＢｕｆｆｅｒ  １．１の代わりに使用したことを除いて、実施例４と同じ様式で実行した。結果を図２０Ａ及び図２０Ｂに例示する。図２０Ａ及び図２０Ｂに例示した通り、ＦｎＣａｓ１２ａ、ｍｇＣａｓ１２ａ−１又はｍｇＣａｓ１２ａ−２タンパク質は、同じ二価イオン中で類似のＤＮＡ切断活性を呈した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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