(57)【要約】  本開示は、線維芽細胞と１つ以上のタイプの免疫細胞との機能的な相互作用が、その線維芽細胞、１つ以上のタイプの免疫細胞又はその両方に対して改変をもたらすような、その相互作用のためのシステム、方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態において、１つ以上のある特定の作用物質が、その相互作用中に、又はそれらのタイプのうちの１つの細胞の代わりに、利用される。具体的な実施形態において、細胞移植療法において使用される細胞は、低い免疫原性を有するように改変される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化線維芽細胞又は活性化免疫細胞又は活性化免疫細胞誘導体を作製するインビトロ方法であって、該方法は、
（ａ）免疫細胞由来の１つ以上の作用物質が、線維芽細胞を活性化して活性化線維芽細胞にするような条件下、及び線維芽細胞由来の１つ以上の抗原が、該免疫細胞からの１つ以上のサイトカインの産生を誘発して活性化免疫細胞を産生するような条件下において、該線維芽細胞を該免疫細胞に曝露する工程；及び／又は
（ｂ）１つ以上の成長因子及び／又は１つ以上のサイトカインが、線維芽細胞を活性化して活性化線維芽細胞にするような条件下において、該１つ以上の成長因子及び／又は該１つ以上のサイトカインに該線維芽細胞を曝露する工程
を含む、方法。
【請求項２】
治療有効量の前記活性化線維芽細胞及び／又は前記活性化免疫細胞が、それを必要とする個体に提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫細胞が、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、単球、単球前駆細胞、リンパ球、マクロファージ又はそれらの混合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）において、前記線維芽細胞を活性化して活性化線維芽細胞にする前記免疫細胞由来の前記１つ以上の作用物質が、サイトカイン、成長因子又はそれらの混合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記サイトカインが、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−３３及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記成長因子が、ＦＧＦ−１、ＶＥＧＦ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）において、前記免疫細胞からの１つ以上のサイトカインの産生を誘発する前記線維芽細胞由来の１つ以上の抗原が、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−３２、ＩＬ−３５、ＩＬ−１２ｐ４０ホモ二量体、ＩＬＡ−Ｇ、ＩＬＴ−３、インドールアミン２，３デオキシゲナーゼ又はそれらの組み合わせである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）において、前記線維芽細胞を活性化して活性化線維芽細胞にする前記１つ以上のサイトカインが、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−３３又はそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）において、前記線維芽細胞を活性化して活性化線維芽細胞にする前記１つ以上の成長因子が、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−３３又はそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）と工程（ｂ）とが同時に起きる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）と工程（ｂ）とが異なる時点において起きる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記線維芽細胞が、１つ以上のさらなる作用物質及び／又は条件に曝露される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫細胞が、１つ以上のさらなる作用物質及び／又は条件に曝露される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記さらなる条件が、培地への曝露を含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地が、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ−１６４０）、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、イーグル変法基本培地（ＥＭＥＭ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ、イスコーブ培地又はそれらの組み合わせを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記さらなる作用物質が、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清、ヒト血清、血清代替物又はそれらの組み合わせを含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫細胞が、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、同種異系ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、胸腺、末梢血、臍帯血、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血、脂肪組織及び胎盤又はそれらの組み合わせから単離される、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記制御性Ｔ細胞の集団が、選択下での培養において維持される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養中の制御性Ｔ細胞が、約７〜１２μｍの直径を有するように選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記線維芽細胞が、有効量のＰＢＭＣに曝露されて、前記線維芽細胞からの肝細胞成長因子の産生を増大させる、かつ／又はオーバル細胞増殖を増大させることができる活性を前記線維芽細胞に付与する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫細胞が、単球、単球前駆細胞又はそれらの混合物である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記単球及び／又は単球前駆細胞が、以下の特徴：（ａ）末梢血単核球に由来すること；（ｂ）ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ；ＣＤ１４、ＣＤ１６のうちの１つ以上を発現すること、（ｃ）プラスチック接着性であること；（ｄ）骨髄前駆細胞であること；（ｅ）骨髄に由来すること；及び／又は（ｆ）動員末梢血に由来することのうちの１つ以上を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記動員末梢血が、Ｇ−ＣＳＦ、ｆｌｔ−３リガンド及び／又はプレリキサホルのうちの１つ以上で個体を前処置することによって生成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記線維芽細胞が、線維芽細胞の増殖に適した培地中で培養される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
線維芽細胞の増殖を可能にする前記培地が、１つ以上の分裂促進因子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記曝露工程が、エクスビボ培養又はインビボにおいて行われる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫細胞が、未熟樹状細胞であり、前記線維芽細胞が、ストレスを受けた線維芽細胞である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＤ８Ｔ細胞が、前記免疫細胞から得られ、前記線維芽細胞が、ストレスを受けた線維芽細胞である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
細胞集団の免疫原性を低下させる方法であって、該集団は、ＩＦＮ−ガンマを含む組成物並びに必要に応じて１つ以上のさらなる作用物質及び／又は条件に曝される、方法。
【請求項３２】
前記細胞集団が、線維芽細胞、膵ベータ細胞、膵島、肝細胞、ニューロン、軟骨細胞、多能性幹細胞又はそれらの誘導体若しくは混合物の集団である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記多能性幹細胞が、誘導性多能性幹細胞、ストレス誘発性幹細胞、単為生殖由来幹細胞、胚性幹細胞、体細胞核移植由来幹細胞又はそれらの誘導体若しくは混合物を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記さらなる条件が、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ−１６４０）、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、イーグル変法基本培地（ＥＭＥＭ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ、イスコーブ培地又はそれらの組み合わせを含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記さらなる作用物質が、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清、ヒト血清、血清代替物又はそれらの組み合わせを含む、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記さらなる作用物質が、１つ以上の免疫調節剤を含む、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫調節剤が、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、ｓＣＲ１、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、アスピリン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ｎ−アセチルシステイン、ラパマイシン、ＩＶＩＧ、ナルトレキソン、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、オーラノフィン、ジシアノ金、スルファサラジン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、エタネルセプト、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト−ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、シクロスポリン、ＩＦＮ−ガンマ、エベロリムス、ラパマイシン又はそれらの組み合わせを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が、１つ以上の免疫調節剤を組換え発現するように改変される、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫調節剤が、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、ＴＧＦ−ベータ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＩＦＮ−ガンマ又はそれらの組み合わせである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上の免疫調節剤の発現が、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター又はそれらの組み合わせによって制御される、請求項３８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
治療有効量の前記細胞が、細胞移植療法を必要とする個体に投与される、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
治療有効量の前記細胞が、血管新生療法を必要とする個体に投与される、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
治療有効量の前記細胞が、個体に血管新生剤と同時投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が、１つ以上の血管新生剤を組換え発現するように改変される、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ以上の血管新生剤の発現が、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター又はそれらの組み合わせによって制御される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記血管新生剤が、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、アンジオポエチン、ＨＩＦ−１−アルファ又はそれらの組み合わせである、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
治療有効量の前記細胞が、免疫調節療法を必要とする個体に投与される、請求項３１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記個体が、急性散在性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、癒着性関節包炎、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、抗ＴＢＭ腎炎、関節線維症、心房線維症、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんま疹、軸索型及び神経型ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性ライム病、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、肝硬変、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、クローン病、嚢胞性線維症、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト欠損症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、デュピュイトラン拘縮、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎、家族性地中海熱、線維筋痛症  線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、多発血管炎性肉芽腫症、グレーヴズ病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、肝炎、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸障害、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ケロイド、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、骨髄線維症、筋炎、ナルコレプシー、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腎性全身性線維症、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、連鎖球菌関連小児自己免疫神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ペーロニー病、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群���心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性塊状線維症、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィ、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子自己免疫及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群、１型糖尿病、Ｉ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、脈管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑、ヴェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）を有するか又は有するリスクがある、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
個体における自己免疫状態又は炎症状態を処置する方法であって、ＩＦＮ−ガンマ並びに必要に応じて１つ以上のさらなる作用物質及び／又は条件に曝された治療有効量の細胞を含む組成物を該個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項５０】
前記細胞が、線維芽細胞、膵ベータ細胞、膵島、肝細胞、ニューロン、軟骨細胞、多能性幹細胞又はそれらの誘導体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記多能性幹細胞が、誘導性多能性幹細胞、ストレス誘発性幹細胞、単為生殖由来幹細胞、胚性幹細胞、体細胞核移植由来幹細胞又はそれらの誘導体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記さらなる条件が、特定の細胞培養培地を含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記培地が、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ−１６４０）、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ変法基本培地−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）、イーグル変法基本培地（ＥＭＥＭ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ、イスコーブ培地又はそれらの組み合わせを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記さらなる作用物質が、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清、ヒト血清、血清代替物又はそれらの組み合わせを含む、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記さらなる作用物質が、１つ以上の免疫調節剤を含む、請求項４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記免疫調節剤が、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、ｓＣＲ１、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、アスピリン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ｎ−アセチルシステイン、ラパマイシン、ＩＶＩＧ、ナルトレキソン、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、オーラノフィン、ジシアノ金、スルファサラジン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、エタネルセプト、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト−ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、シクロスポリン、ＩＦＮ−ガンマ、エベロリムス、ラパマイシン又はそれらの組み合わせを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が、１つ以上の免疫調節剤を組換え発現するように改変される、請求項４９〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫調節剤が、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、ＴＧＦ−ベータ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＩＦＮ−ガンマ又はそれらの組み合わせである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記１つ以上の免疫調節剤の発現が、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター又はそれらの組み合わせによって制御される、請求項５７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記自己免疫状態又は炎症状態が、急性散在性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、癒着性関節包炎、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、抗ＴＢＭ腎炎、関節線維症、心房線維症、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんま疹、軸索型及び神経型ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性ライム病、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、肝硬変、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、クローン病、嚢胞性線維症、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト欠損症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、デュピュイトラン拘縮、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎、家族性地中海熱、線維筋痛症  線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、多発血管炎性肉芽腫症、グレーヴズ病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、肝炎、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸障害、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ケロイド、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、骨髄線維症、筋炎、ナルコレプシー、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腎性全身性線維症、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、連鎖球菌関連小児自己免疫神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ペーロニー病、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋���、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性塊状線維症、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィ、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子自己免疫及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群、１型糖尿病、Ｉ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、脈管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑、ヴェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）を含む、請求項４９〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記さらなる作用物質が、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＰＤＧＦ又はそれらの組み合わせを含む、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記自己免疫状態又は炎症状態が、関節炎である、請求項４９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
細胞療法用の制御性Ｔ細胞の集団を作製するための方法であって、活性化線維芽細胞及び必要に応じて１つ以上のさらなる作用物質を含む組成物をＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞に曝露する工程を含む、方法。
【請求項６４】
前記活性化線維芽細胞が、ＩＦＮ−ガンマに曝露された細胞である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記曝露工程が、エクスビボ培養又はインビボにおいて行われる、請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、胸腺、末梢血、臍帯血、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血、脂肪組織及び胎盤又はそれらの組み合わせから単離される、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記培養物中の線維芽細胞とＴ細胞との比が、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１又は１００：１を含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記さらなる作用物質が、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、ラパマイシン、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−２又はそれらの組み合わせを含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記１つ以上のさらなる作用物質が、前記組成物に可溶性である、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記組成物において、１つ以上のさらなる作用物質が、前記線維芽細胞の表面に付着されている、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記組成物において、１つ以上のさらなる作用物質が、ビーズ上に固定化されている、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記組成物において、１つ以上のさらなる作用物質が、操作された細胞の表面上に固定化されていてもよい、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記組成物において、１つ以上のさらなる作用物質が、前記線維芽細胞によって発現される、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記１つ以上のさらなる作用物質が、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１２を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、同種異系ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に由来する、請求項６３〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記さらなる作用物質が、ヒト多血小板血漿を含む、請求項６３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記制御性Ｔ細胞の集団が、選択下での培養において維持される、請求項６３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記培養中の制御性Ｔ細胞が、約７〜１２μｍの直径を有するように選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記さらなる作用物質が、ラパマイシン、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ又はそれらの組み合わせを含む、請求項６３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記制御性Ｔ細胞集団の少なくとも一部が、好適な条件下で保存される、請求項６３〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
有効量の前記制御性Ｔ細胞を個体に投与して自己免疫状態又は炎症状態を処置する、請求項６３〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記自己免疫状態又は炎症状態が、急性散在性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、癒着性関節包炎、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、抗ＴＢＭ腎炎、関節線維症、心房線維症、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんま疹、軸索型及び神経型ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性ライム病、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、肝硬変、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、クローン病、嚢胞性線維症、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト欠損症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、デュピュイトラン拘縮、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎、家族性地中海熱、線維筋痛症  線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、多発血管炎性肉芽腫症、グレーヴズ病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、肝炎、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸障害、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ケロイド、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、骨髄線維症、筋炎、ナルコレプシー、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腎性全身性線維症、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、連鎖球菌関連小児自己免疫神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ペーロニー病、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋���、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性塊状線維症、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィ、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子自己免疫及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群、１型糖尿病、Ｉ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、脈管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑、ヴェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記制御性Ｔ細胞が、有効量の１つ以上のさらなる免疫制御性細胞とともに個体に投与される、請求項６３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記制御性Ｔ細胞が、１つ以上の免疫調節剤とともに個体に投与される、請求項６３〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記１つ以上の免疫調節剤が、イノシン、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、ｓＣＲ１、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、アスピリン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ｎ−アセチルシステイン、ラパマイシン、ＩＶＩＧ、ナルトレキソン、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、オーラノフィン、ジシアノ金、スルファサラジン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、エタネルセプト、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト−ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、シクロスポリン、ＩＦＮ−ガンマ、エベロリムス、ラパマイシン又はそれらの組み合わせである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記制御性Ｔ細胞を投与される前記個体が、該個体のマイクロバイオームの調節に曝されている、曝されてきた、かつ／又は曝されることになっている、請求項６３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記マイクロバイオームが、１つ以上のプレバイオティクス及び／又は１つ以上のプロバイオティクスを含む組成物によって調節される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記プレバイオティクスが、アラビノキシラン、キシロース、可溶性繊維デキストラン、可溶性トウモロコシ繊維、ポリデキストロース、ラクトース、Ｎ−アセチル−ラクトサミン、グルコース、ガラクトース、フルクトース、ラムノース、マンノース、ウロン酸、３’−フコシルラクトース、３’シアリラクトース、６’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、２’−２’−フコシルラクトース、アラビノース、フルクトース、フコース、ラクトース、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｄ−キシロース、キシリトール、リボース、キシロビオース、スクロース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、トレハロース、セロビオース及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるモノマー又はポリマーを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記組成物が、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２５以下、３０以下又は３５以下のタイプのプレバイオティクスを含む、請求項８７又は８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記組成物が、１〜３５、１〜３０、１〜２５、１〜２０；１〜１０、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、６〜１０、７〜１０、８〜１０、９〜１０；１〜９、２〜９、３〜９、４〜９、５〜９、６〜９、７〜９、８〜９；１〜８、２〜８、３〜８、４〜８、５〜８、６〜８、７〜８；１〜７、２〜７、３〜７、４〜７、５〜７、６〜７；１〜６、２〜６、３〜６、４〜６、５〜６；１〜５、２〜５、３〜５、４〜５；１〜４、２〜４、３〜４；１〜３、２〜３；１〜２；又は１タイプのプレバイオティクスを含む、請求項８７又は８８に記載の組成物。
【請求項９１】
前記組成物が、該組成物中に存在する他の任意のタイプのプレバイオティクスよりも少なくとも２、５、１０、５０、１００倍多い又は１００倍超多い量で存在する１タイプのプレバイオティクスを含む、請求項８７〜９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９２】
前記組成物中のプレバイオティクスが、少なくとも１μＭ又は少なくとも２μＭ又は少なくとも３μＭ又は少なくとも４μＭ又は少なくとも５μＭ又は少なくとも６μＭ又は少なくとも７μＭ又は少なくとも８μＭ又は少なくとも９μＭ又は少なくとも１０μＭ又は少なくとも２０μＭ又は少なくとも３０μＭ又は少なくとも４０μＭ又は少なくとも５０μＭ又は少なくとも６０μＭ又は少なくとも７０μＭ又は少なくとも８０μＭ又は少なくとも９０μＭ又は少なくとも１００μＭ又は少なくとも１５０μＭ又は少なくとも２００μＭ又は少なくとも２５０μＭ又は少なくとも３００μＭ又は少なくとも３５０μＭ又は少なくとも４００μＭ又は少なくとも４５０μＭ又は少なくとも５００μＭ又は少なくとも５５０μＭ又は少なくとも６００μＭ又は少なくとも６５０μＭ又は少なくとも７００μＭ又は少なくとも７５０μＭ又は少なくとも８００μＭ又は少なくとも８５０μＭ又は少なくとも９００μＭ又は少なくとも９５０μＭ又は少なくとも１ｍＭ又は少なくとも２ｍＭ又は少なくとも３ｍＭ又は少なくとも４ｍＭ又は少なくとも５ｍＭ又は少なくとも６ｍＭ又は少なくとも７ｍＭ又は少なくとも８ｍＭ又は少なくとも９ｍＭ又は少なくとも１０ｍＭの濃度で存在する、請求項８７〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
前記プロバイオティクスが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉを含む、請求項８７〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記プロバイオティクスが、Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｙａｎｔｅｌｌａ、Ｂｕｌｌｅｉｄｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ、Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｏｒｅａ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｆｌｅｘｉｓｔｉｐｅｓ、Ｆｕｌｖｉｍｏｎａｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｍｍｉｇｅｒ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｕｔｉｓｐｏｒａ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ、Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ、Ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ、Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｉｂｒａｃｈｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｃｏｈｎｅｌｌａ、Ｄｅｎｄｒｏｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｉｏｒｅｓｔｉｓ、Ｌａｃｈｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｏｃｅａｎ���ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｏｒｅｎｉａ（Ｓ．）、Ｏｘａｌｏｐｈａｇｕｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｌｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ、Ｓｐｏｒｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓｐｏｒｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂｏｔｕｌｕｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏｒａ、Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ又はそれらの組み合わせを含む、請求項８７〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記組成物が、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、５０以下又は１００以下のタイプのプロバイオティクスを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得る、請求項８７〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記組成物が、１〜１００、１〜５０若しくは１〜２０；又は１〜１０、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、６〜１０、７〜１０、８〜１０若しくは９〜１０；又は１〜９、２〜９、３〜９、４〜９、５〜９、６〜９、７〜９若しくは８〜９；又は１〜８、２〜８、３〜８、４〜８、５〜８、６〜８若しくは７〜８；又は１〜７、２〜７、３〜７、４〜７、５〜７若しくは６〜７；又は１〜６、２〜６、３〜６、４〜６若しくは５〜６；又は１〜５、２〜５、３〜５若しくは４〜５；又は１〜４、２〜４、３〜４；１〜３、２〜３；１〜２；又は１タイプのプロバイオティクスを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得る、請求項８７〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記組成物が、該組成物中に存在する他の任意のタイプのプロバイオティクスよりも少なくとも２、５、１０、５０、１００倍多い又は１００倍超多い量で存在する１タイプのプロバイオティクスを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、請求項８７〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記組成物において、前記プロバイオティクスの大部分が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉである、請求項８７〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記組成物において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉが、該組成物中の前記プロバイオティクスの少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％又は９９％超である、請求項８７〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記組成物中のプロバイオティクスの相対的存在が、１：１又は１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５；１：５０；１：７５、１：１００、１：２００、１：５００、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００という比若しくは１：１００，０００を超える比を含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる第１のタイプのプロバイオティクスと第２のタイプのプロバイオティクスとの比として表現される、請求項８７〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
所与のプロバイオティクスの濃度又は凝集組成物の濃度が、組成物１グラムあたり１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５個又は１×１０１５個を超える生存プロバイオティクスを含む、請求項８７〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
個体における肝不全を処置する方法であって、該方法は、有効量の細胞集団を該個体に投与する工程を含み、前記細胞集団は、免疫細胞に曝露された線維芽細胞集団；間葉系幹細胞、ＣＤ３４＋細胞；極小胚様幹細胞；セルトリ細胞；又はそれらの混合物である、方法。
【請求項１０３】
前記免疫細胞が、同種異系ＰＢＭＣ；制御性Ｔ細胞；２型単球；ＣＤ５陽性Ｂ細胞；２型ＮＫＴ細胞；免疫寛容原性樹状細胞；ガンマデルタＴ細胞；免疫制御特性を有するＴ細胞；又はそれらの混合物である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞集団中の細胞では、１つ以上の肝臓再生因子の産生が高まっている、請求項１０２又は１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記肝臓再生因子が、肝細胞成長因子である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記細胞集団中の細胞は、肝臓におけるオーバル細胞の増殖を増強する高い能力を有する、請求項１０２〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＰＢＭＣが、臍帯血単核細胞である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
前記免疫細胞が、前記線維芽細胞集団に曝露される前に免疫調節物質で処置される、請求項１０２〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
免疫調節物質による前記免疫細胞の前記処置が、該免疫細胞が活性化Ｔ細胞の増殖を阻害するのに十分な条件下での処置である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
免疫調節物質による前記免疫細胞の前記処置が、該免疫細胞が活性化Ｔ細胞のインターフェロンガンマ産生を阻害するのに十分な条件下での処置である、請求項１０８又は１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記免疫調節物質が、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２０、ＴＧＦ−ベータ、ＣＸＣＬ１２、インヒビン、ＶＥＧＦ、ＰＧＥ−２及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記間葉系幹細胞が、ａ）ワルトン膠様質；ｂ）骨髄；ｃ）末梢血；ｄ）動員末梢血；ｅ）子宮内膜；ｆ）毛嚢；ｇ）乳歯；ｈ）精巣；ｉ）脂肪組織；ｊ）皮膚；ｋ）羊水；ｌ）臍帯血；ｍ）網；ｎ）筋肉；ｏ）羊膜；ｏ）脳室周囲液（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）；ｐ）胎盤組織；及びｑ）それらの混合物からなる群より選択される組織に由来する、請求項１０２〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記間葉系幹細胞が、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ５４、ＣＤ１０６、ＨＬＡ−Ｉマーカー、ビメンチン、ＡＳＭＡ、コラーゲン−１、フィブロネクチン、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ６１、ＣＤ１８、ＣＤ２９、トロンボモジュリン、テロメラーゼ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＴＲＯ−２、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ１４６、ＴＨＹ−１及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のマーカーを発現する、請求項１０２〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記間葉系幹細胞が、実質的なレベルのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１７、ＣＤ４５又はそれらの組み合わせを発現しない、請求項１０２〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記間葉系幹細胞が、多能性幹細胞から発生する、請求項１０２〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記多能性幹細胞が、ａ）胚性幹細胞；ｂ）誘導性多能性幹細胞；ｃ）単為生殖幹細胞；ｄ）体細胞核移植由来幹細胞；及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記胚性幹細胞が、ステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１、Ｏｃｔ−３／４、Ｃｒｉｐｔｏ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体、ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）、Ｒｅｘ−１、ＧＣＴＭ−２、Ｎａｎｏｇ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子を発現する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記誘導性多能性幹細胞が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−アルファ、ＰＤ−Ｌ２及びＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃからなる群より選択されるマーカーを有し、前記誘導性多能性幹細胞が、継代の際に正常な核型を維持しつつ、培養中に少なくとも約４０回の倍加を起こす能力を有する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記単為生殖幹細胞が、カルシウム流動誘導剤（ｃａｌｃｉｕｍ  ｆｌｕｘ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を添加して卵母細胞を活性化した後、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるマーカーを発現する細胞の濃縮によって作製される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記体細胞核移植由来幹細胞が、ａ）ＳＳＥＡ−１が陰性である表現型；ｂ）ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１及び／又はアルカリホスファターゼが陽性である表現型；又はｃ）その両方を含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２１】
前記間葉系幹細胞が、ＳＭＡＤ−２／３経路の１つ以上の阻害剤の存在下の培養によって多能性幹細胞源から分化される、請求項１０２〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記阻害剤が、核酸である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記核酸阻害剤が、ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド；ｂ）ヘアピンループ低分子干渉ＲＮＡ；ｃ）化学的に合成された低分子干渉ＲＮＡ分子；ｄ）ハンマーヘッド型リボザイム；及びｅ）それらの組み合わせ又は混合物からなる群より選択される、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ＳＭＡＤ−２／３経路の阻害剤が、小分子阻害剤である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記小分子阻害剤が、ＳＢ−４３１５４２である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記線維芽細胞集団に曝露された細胞を濃縮するために選択プロセスが使用される、請求項１０２〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記線維芽細胞を間葉系幹細胞に曝露する前に、該間葉系幹細胞が、多能性幹細胞集団から分化した間葉系幹細胞を濃縮するための選択プロセスに供されている、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
選択プロセスが、間葉系幹細胞に関連する１つ以上のマーカーを発現する細胞をポジティブ選択する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記マーカーが、ＳＴＲＯ−１、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ５４、ＣＤ１０６、ＨＬＡ−Ｉマーカー、ビメンチン、ＡＳＭＡ、コラーゲン−１、フィブロネクチン、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ６１、ＣＤ１８、ＣＤ２９、トロンボモジュリン、テロメラーゼ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＴＲＯ−２、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ１４６、ＴＨＹ−１及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記線維芽細胞に曝露される細胞が、増強された免疫調節活性を示す間葉系幹細胞である、請求項１０２〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記増強された免疫調節活性が、前記間葉系幹細胞においてストレス応答を誘導する１つ以上の作用物質への曝露によって誘導される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記免疫調節活性が、肝星細胞の活性化を阻害する能力；肝線維症を阻害する能力；肝臓の再生を刺激する能力；及び／又はオーバル細胞若しくは肝臓前駆細胞の活性を増強する能力である、請求項１３０又は１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
星細胞の活性の阻害が、肝線維症の低減に関連する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記肝臓の再生が、傷害後の肝臓組織成長の開始期又は増殖期の刺激を含む、請求項１３２〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記細胞集団中の細胞が、肝臓におけるオーバル細胞の増殖を増強する高い能力を有し、前記オーバル細胞又は肝臓前駆細胞が、傷害又は損傷に応答して肝細胞が増殖を停止する条件下において新しい肝臓組織を生み出す、請求項１０２〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
ストレス応答を誘導することができる前記作用物質が、前記間葉系幹細胞において、ａ）核因子カッパーＢ（ＮＦ−ｋＢ）；ｂ）低酸素誘導因子アルファ（ＨＩＦ−１アルファ）、ｃ）ヘモキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）；ｄ）インドールアミン２，３デオキシゲナーゼ；ｅ）熱ショックタンパク質６５（ｈｓｐ−６５）；及びｆ）それらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の因子のベースラインと比べて１５パーセント高い転写のアップレギュレーションを誘導することができることを特徴とする、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３７】
ストレス応答を誘導することができる前記作用物質が、ａ）インターフェロンガンマ；ｂ）ＩＶＩＧ；ｃ）単球条件培地；ｄ）好中球細胞外トラップに曝露された末梢血単核球からの上清；ｅ）単球との共培養物；ｆ）ＩＶＩＧで前処置された単球との共培養物；ｇ）Ｔ細胞との共培養物；ｈ）Ｔ細胞刺激に曝露されたＴ細胞との共培養物；ｉ）ＮＫ細胞との共培養物；ｊ）グラム陽性菌から単離されたペプチドグリカン；ｋ）グラム陽性菌から単離されたリポテイコ酸；ｌ）グラム陽性菌から単離されたリポタンパク質；ｍ）マイコバクテリアから単離されたリポアラビノマンナン、ｎ）酵母細胞ウェルから単離されたザイモサン；ｏ）ポリアデニル酸−ポリウリジル酸；ｐ）ポリ（ＩＣ）；ｑ）リポ多糖；ｒ）モノホスホリルリピドＡ；ｓ）フラジェリン；ｔ）ガーディキモド；ｕ）イミキモド；ｖ）Ｒ８４８；ｗ）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオシド；ｘ）２３ＳリボソームＲＮＡ；及びｙ）それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３１又は１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記間葉系幹細胞が、ａ）脂肪由来間葉系幹細胞；ｂ）骨髄間葉系幹細胞；ｃ）臍帯間葉系幹細胞；ｄ）ワルトン膠様質間葉系幹細胞；ｅ）歯間葉系幹細胞；ｆ）羊水間葉系幹細胞；ｇ）胎盤間葉系幹細胞；ｈ）循環血間葉系幹細胞；ｉ）毛包間葉系幹細胞；及びｊ）それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０２〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記脂肪由来間葉系幹細胞が、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、ＡＢＣＧ２及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のマーカーを発現する、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記脂肪由来間葉系幹細胞が、約１ヶ月超にわたって培養中に増殖することができる脂肪組織から抽出され、精製された単核細胞の集団を含む、請求項１３８又は１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記骨髄間葉系幹細胞が、骨髄単核細胞に由来する、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
前記骨髄間葉系幹細胞が、分化刺激への曝露の後に以下の細胞型：骨；軟骨；又は脂肪組織のうちの１つ以上に分化する能力に基づいて選択される、請求項１３８又は１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記骨髄間葉系幹細胞が、以下の抗原：ＣＤ９０、ｃ−ｋｉｔ、ｆｌｋ−１、Ｓｔｒｏ−１、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ３１、ＣＤ１４６、血管内皮カドヘリン、ＣＤ１３３及び／又はＣＸＣＲ−４のうちの１つ以上の発現に基づいて選択される、請求項１３８、１４１又は１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記骨髄間葉系幹細胞が、ＣＤ９０及び／又はＣＤ７３の発現について濃縮される、請求項１３８、１４１、１４２又は１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記骨髄間葉系幹細胞が、ＣＤ３４の有意な発現を欠く、請求項１３８、１４１、１４２、１４１、１４４又は１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記胎盤間葉系幹細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＳＨ−３、ＳＨ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−４  Ｓｏｘ−２及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の抗原の発現に基づいて同定される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４７】
前記羊水間葉系幹細胞が、超音波誘導下における羊膜腔への体液採取手段の挿入によって単離される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４８】
前記羊水間葉系幹細胞が、以下の抗原：ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、Ｔｒａ−２−５４、ＨＬＡクラスＩ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１０５、Ｏｃｔ−４、Ｒｅｘ−１、ＤＡＺＬ及び／又はＲｕｎｘ−１のうちの１つ以上の発現に基づいて選択される、請求項１３８又は１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記羊水間葉系幹細胞が、以下の抗原：ＣＤ３４、ＣＤ４５及び／又はＨＬＡクラスＩＩのうちの１つ以上の発現の欠如に基づいて選択される、請求項１３８、１４７又は１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記循環血間葉系幹細胞が、１ヶ月超の期間にわたってインビトロにおいて増殖する能力を特徴とする、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１５１】
前記循環血間葉系幹細胞が、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１１７、ＣＤ１１３及び／又はｃ−ｍｅｔの発現を特徴とする、請求項１３８又は１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記循環血間葉系幹細胞が、１つ以上の分化関連マーカーの実質的な発現を欠く、請求項１３８、１５０又は１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記分化関連マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ８６、ＣＤ６６ｂ、ＨＬＡ−ＤＲ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記間葉系幹細胞が、以下のマーカー：ＳＴＲＯ−１、ＣＤ１０５、ＣＤ５４、ＣＤ１０６、ＨＬＡ−Ｉマーカー、ビメンチン、ＡＳＭＡ、コラーゲン−１、フィブロネクチン、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ６１、ＣＤ１８、ＣＤ２９、トロンボモジュリン、テロメラーゼ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＴＲＯ−２、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ１４６及び／又はＴＨＹ−１のうちの１つ以上を発現する、請求項１０２〜１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記間葉系幹細胞が、実質的なレベルのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１７及び／又はＣＤ４５を発現しない、請求項１０２〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記細胞が、約１時間〜約１６０時間、約３時間〜約７２時間又は約４８時間という時間にわたってインターフェロンガンマで処置されたワルトン膠様質由来間葉系幹細胞である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１５７】
前記細胞が、約２０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、約５０〜５００ＩＵ／ｍｌ又は約１５０ＩＵ／ｍｌに及ぶ総濃度のインターフェロンガンマで処置されたワルトン膠様質由来間葉系幹細胞である、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１５８】
個体におけるウイルス誘導肝不全を処置する方法であって、１つ以上のストレス誘導刺激で予め調節された有効量の線維芽細胞の集団を該個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１５９】
前記ストレス誘導刺激が、インターフェロンガンマを含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ストレス誘導刺激が、ａ）オゾン及び／又はオゾン処理された培地；ｂ）過酸化水素；ｃ）７、６、５、４、３又は２未満のｐＨ；並びにｄ）それらの組み合わせからなる群より選択される培養条件への曝露を含む、請求項１５８又は１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記線維芽細胞が、免疫学的に活性な細胞に曝露された細胞である、請求項１５８〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記個体に、前記線維芽細胞と免疫学的に活性な細胞とを同時に投与する、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記免疫学的に活性な細胞が、単球である、請求項１６１又は１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記単球が、Ｍ２マクロファージに分化した、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記Ｍ２マクロファージが、単球によるアルギナーゼの産生を、インターロイキン４で処置されていない単球が産生するベースラインの５０％を超えるまで増加させる条件下で該単球をインターロイキン４において培養することによって作製される、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
血管新生性マクロファージを産生する方法であって、ａ）単球及び／又は単球前駆細胞を得る工程；及びｂ）前記単球及び／又は単球前駆細胞に血管新生を刺激する能力を付与する条件下で前記単球及び／又は単球前駆細胞を線維芽細胞と接触させる工程を含む、方法。
【請求項１６７】
前記単球及び／又は単球前駆細胞が、以下の特徴：（ａ）末梢血単核球に由来すること；（ｂ）ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂ；ＣＤ１４、ＣＤ１６のうちの１つ以上を発現すること、（ｃ）プラスチック接着性であること；（ｄ）骨髄前駆細胞であること；（ｅ）骨髄に由来すること；及び／又は（ｆ）動員末梢血に由来すること、のうちの１つ以上を有する、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
前記動員末梢血が、Ｇ−ＣＳＦ、ｆｌｔ−３リガンド及び／又はプレリキサホルのうちの１つ以上による個体の前処置によって産生される、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記線維芽細胞が、線維芽細胞の増殖に適した培地中で培養される、請求項１６６〜１６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７０】
前記培地が、１つ以上の分裂促進因子を含む、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
前記分裂促進因子が、ａ）ＦＧＦ−１；ｂ）ＦＧＦ−２；ｃ）ＦＧＦ−５；ｄ）ＥＧＦ；ｅ）ＣＮＴＦ；ｆ）ＫＧＦ−１；ｇ）ＰＤＧＦ；ｈ）多血小板血漿；ｉ）ＴＧＦ−アルファ；ｊ）ＨＧＦ−１；及びｋ）それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記線維芽細胞が、低酸素条件下で培養される、請求項１６６〜１７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記線維芽細胞が、１つ以上の炎症性刺激で処置される、請求項１６６〜１７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記炎症性刺激が、１つ以上の炎症性サイトカインを含む、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記炎症性サイトカインが、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−３３及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記炎症性サイトカインが、ＩＬ−６、ミオシン１、ＩＬ−３３、低酸素誘導因子−１、グアニル酸結合タンパク質アイソフォームＩ、アミノレブリン酸デルタシンターゼ２、ＡＭＰデアミナーゼ、ＩＬ−１７、ＤＮＡＪ様２タンパク質、カテプシンＬ、転写因子−２０、Ｍ３１７２４、ピエニルアルキルアミン結合タンパク質；ＨＥＣ、ＧＡ１７、アリールスルファターゼＤ遺伝子、アリールアウルファターゼＥ遺伝子、サイクリンタンパク質遺伝子、血小板前駆細胞塩基性タンパク質遺伝子、ＰＤＧＦＲＡ、ヒトＳＴＳ  ＷＩ−１２０００、マンノシダーゼ、ベータＡ、リソソームＭＡＮＢＡ遺伝子、ＵＢＥ２Ｄ３遺伝子、Ｉｇガンマ重鎖に対するヒトＤＮＡ、ＳＴＲＬ２２、ＢＨＭＴ、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓダウン症候群重要領域、ＺＮＦ遺伝子ファミリーメンバーを含むＦＩ５６１３、ＩＬ８、ＥＬＦＲ、二重特異性ホスファターゼＭＫＰ−５に対するｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ、Ｇタンパク質シグナル伝達１０の完全ｍＲＮＡのｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ制御因子、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｗｎｔ−１３  Ｍｍａ、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｎ末端アセチルトランスフェラーゼ複合体ａｒｄ１サブユニット、リボソームタンパク質Ｌ１５  ｍＲＮＡ、ＰＣＮＡ  ｍＲＮＡ、ＡＴＲＭ遺伝子エキソン２１、無毛タンパク質エキソン２に対するＨＲ遺伝子、Ｎ−末端アセチルトランスフェラーゼ複合体ａｒｄ１サブユニット、ＨＳＭ８０１４３１  ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ、ＣＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ４３４Ｎ２０７２、ＲＰＬ２６及び無毛タンパク質に対するＨＲ遺伝子、Ｇタンパク質シグナル伝達の制御因子からなる群より選択される遺伝子の発現を線維芽細胞において刺激することができる、請求項１７４又は１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記単球及び／又は単球前駆細胞が、１個の単球及び／若しくは単球前駆細胞対１００個の線維芽細胞という比；１個の単球及び／若しくは単球前駆細胞対１０個の線維芽細胞という比；１個の単球及び／若しくは単球前駆細胞対１０個の線維芽細胞という比；又は１個の単球及び／若しくは単球前駆細胞対１個の線維芽細胞という比で前記線維芽細胞とともに培養される、請求項１６６〜１７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記単球及び／又は単球前駆細胞が、１時間〜７日間；１２時間〜５日間；又は１〜３日間という期間にわたって前記線維芽細胞とともに培養される、請求項１６６〜１７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記単球及び／又は単球前駆細胞が、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ−１６４０）、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ変法基本培地−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）、イーグル変法基本培地（ＥＭＥＭ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ、イスコーブ培地及びそれらの組み合わせからなる群より選択される培地中で前記線維芽細胞とともに培養される、請求項１６６〜１７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８０】
前記培地に、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清、ヒト血清、血清代替物又はそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上の成長因子が補充されている、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記血管新生性マクロファージが、新しい血管の成長を刺激することができる、請求項１６６〜１７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８２】
前記血管新生性マクロファージが、Ｍ２マクロファージである、請求項１６６〜１８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８３】
前記マクロファージが、ＩＬ−３３を発現する、請求項１６６〜１８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８４】
個体における虚血状態を処置する方法であって、ＩＦＮ−ガンマ又はＰＧＥ−２並びに必要に応じて１つ以上のさらなる作用物質及び／又は条件に曝された治療有効量の細胞を含む組成物を該個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項１８５】
前記さらなる作用物質が、１つ以上の免疫調節剤を含む、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記免疫調節剤が、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、ｓＣＲ１、アルギナーゼ、アスピリン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ｎ−アセチルシステイン、ラパマイシン、ＩＶＩＧ、ナルトレキソン、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、オーラノフィン、ジシアノ金、スルファサラジン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、エタネルセプト、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト−ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、シクロスポリン、ＩＦＮ−ガンマ、エベロリムス、ラパマイシン又はそれらの組み合わせを含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記細胞が、１つ以上の免疫調節剤を組換え発現するように改変される、請求項１８４〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８８】
免疫調節剤が、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、ｓＣＲ１、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、アスピリン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ｎ−アセチルシステイン、ラパマイシン、ＩＶＩＧ、ナルトレキソン、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、オーラノフィン、ジシアノ金、スルファサラジン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、エタネルセプト、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト−ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、シクロスポリン、ＩＦＮ−ガンマ、エベロリムス、ラパマイシン又はそれらの組み合わせを含む、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記１つ以上の免疫調節剤の発現が、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター又はそれらの組み合わせによって制御される、請求項１８７又は１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記個体が、血管新生療法を必要とする、請求項１８４〜１８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９１】
前記１つ以上のさらなる作用物質が、１つ以上の血管新生剤である、請求項１８４〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９２】
前記細胞が、１つ以上の血管新生剤を組換え発現するように改変される、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記１つ以上の血管新生剤の発現が、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって制御される、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記血管新生剤が、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、アンジオポエチン、ＨＩＦ−１−アルファ又はそれらの組み合わせである、請求項１９１〜１９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９５】
前記さらなる作用物質が、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清、ヒト血清、血清代替物又はそれらの組み合わせを含む、請求項１８４〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
樹状細胞の成熟を誘導する方法であって、ストレスを受けた線維芽細胞に未熟樹状細胞を曝露する工程を含む、方法。
【請求項１９７】
前記ストレスを受けた線維芽細胞が、高熱、血清枯渇又はその両方に曝露された、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記高熱曝露が、前記線維芽細胞において１つ以上の熱ショック因子の発現をもたらした、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記熱ショック因子が、熱ショックタンパク質９０である、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
前記高熱が、３９〜４２℃を含む、請求項１９７〜１９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記高熱が、１〜８時間の持続時間を有する、請求項１９７〜２００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０２】
前記血清枯渇が、１２〜４８時間の持続時間である、請求項１９７〜２０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記方法によって産生された成熟樹状細胞が、骨髄樹状細胞又はリンパ系樹状細胞である、請求項１９７〜２０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０４】
前記未熟骨髄樹状細胞が、高レベルのＣＤ８３、ＩＬ−１０又はその両方を発現する、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
前記未熟骨髄樹状細胞が、低レベルのＩＬ−１２、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６又はそれらの組み合わせを発現する、請求項２０３又は２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記未熟樹状細胞が、混合リンパ球反応の不十分な刺激物質、Ｔ細胞活性化の不十分な刺激物質（例えば、ＬＰＳによって活性化されたＤＣと比べて５０％未満）又はその両方である、請求項１９６〜２０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０７】
前記未熟樹状細胞が、前記線維芽細胞と同種異系である、請求項１９６〜２０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０８】
前記未熟樹状細胞が、前記線維芽細胞に対して自家である、請求項１９６〜２０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０９】
前記未熟樹状細胞が、単球を含む、請求項１９６〜２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
ＣＤ８Ｔ細胞の１つ以上の活性を高める方法であって、ストレスを受けた線維芽細胞を、免疫細胞又は該免疫細胞から産生された若しくは得られたＣＤ８Ｔ細胞に曝露する工程を含む、方法。
【請求項２１１】
前記ストレスを受けた線維芽細胞に曝露される又は曝露された前記免疫細胞からＣＤ８Ｔ細胞を抽出する工程を含む、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
前記１つ以上の活性が、前記ストレスを受けた線維芽細胞への曝露の非存在下におけるＣＤ８Ｔ細胞のそれぞれの活性と比べて、高い増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性、及び／又は少ない共刺激分子の所要量を含む、請求項２１０又は２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
前記サイトカイン産生が、ＩＬ−２、ＩＬ−７及び／又はＩＬ−１５の分泌を含む、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
前記増殖が、前記ＣＤ８Ｔ細胞への１つ以上のサイトカインの投与に応答して増大する、請求項２１２又は２１３に記載の方法。
【請求項２１５】
前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−７及び／又はＩＬ−１５を含む、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記増殖が、Ｔ細胞受容体連結に応答して増大する、請求項２１２又は２１３に記載の方法。
【請求項２１７】
前記Ｔ細胞受容体連結が、１つ以上の抗原及び／又は１つ以上のマイトジェンによって達成される、請求項２１６に記載の方法。
【請求項２１８】
前記細胞傷害性が、標的細胞を殺滅する能力、パーフォリン産生及び／又はグランザイム産生を含む、請求項２１２〜２１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１９】
前記少ない共刺激分子の所要量が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、及び／又はＣＤ２８の連結の少ない所要量を含む、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２２０】
前記免疫細胞及び／又は前記ＣＤ８Ｔ細胞が、非内在性遺伝子産物を発現するように操作される、請求項２１０〜２１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２１】
前記免疫細胞及び／又は前記ＣＤ８Ｔ細胞が、ｓｉＲＮＡ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体を発現するように操作される、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
前記ｓｉＲＮＡが、免疫阻害性分子を標的化する、請求項２２１に記載の方法。
【請求項２２３】
前記免疫阻害剤分子が、ＣＴＬＡ−４、ＳＴＡＴ６、ＩＬ−１０又はＰＤ−１である、請求項２２２に記載の方法。
【請求項２２４】
前記ＣＡＲが、腫瘍抗原を標的化する、請求項２２１に記載の方法。
【請求項２２５】
前記曝露工程が、Ｔ細胞増殖を刺激することができる１つ以上の抗原を含む培地中で行われる、請求項２１０〜２２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２６】
前記線維芽細胞が、１つ以上の非内在性遺伝子産物を発現する、請求項２１０〜２２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２７】
前記線維芽細胞が、Ｔ細胞増殖を刺激することができる１つ以上の抗原を発現する、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
前記曝露工程が、ウシ胎仔血清、ヒト血清、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−ベータ及び／又はＴＮＦ−アルファを含む培地中で行われる、請求項２１０〜２２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２９】
前記線維芽細胞が、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、脳、脂肪組織、胎盤及び／又は包皮を含む組織に由来する、請求項１〜２２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３０】
前記線維芽細胞が、胎盤、胎児、新生児若しくは成体の線維芽細胞又はそれらの混合物である、請求項１〜２２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３１】
前記線維芽細胞が、生検材料に由来し、前記生検材料は、処置される個体、又は処置される個体とは異なる個体に由来する、請求項１〜２３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３２】
前記線維芽細胞と前記免疫細胞とが、同種異系細胞である、請求項１〜２３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３３】
前記線維芽細胞と前記免疫細胞とが、自家細胞である、請求項１〜２３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３４】
前記ＩＦＮ−ガンマが、前記組成物中に１〜５００ＩＵ／ｍＬ、５〜５００ＩＵ／ｍＬ、１０〜５００ＩＵ／ｍＬ、１５〜５００ＩＵ／ｍＬ、２０〜５００ＩＵ／ｍＬ、２５〜５００ＩＵ／ｍＬ、３０〜５００ＩＵ／ｍＬ、３５〜５００ＩＵ／ｍＬ、４０〜５００ＩＵ／ｍＬ、４５〜５００ＩＵ／ｍＬ、５０〜５００ＩＵ／ｍＬ、６０〜５００ＩＵ／ｍＬ、７０〜５００ＩＵ／ｍＬ、８０〜５００ＩＵ／ｍＬ、９０〜５００ＩＵ／ｍＬ、１００〜５００ＩＵ／ｍＬ、１５０〜５００ＩＵ／ｍＬ、２００〜５００ＩＵ／ｍＬ、２５０〜５００ＩＵ／ｍＬ、３００〜５００ＩＵ／ｍＬ、３５０〜５００ＩＵ／ｍＬ、４００〜５００ＩＵ／ｍＬ、４５０〜５００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜４５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１〜４５０ＩＵ／ｍＬ、５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、５０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、６０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、７０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、８０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、９０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１００〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１５０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、２００〜４５０ＩＵ／ｍＬ、２５０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、３００〜４５０ＩＵ／ｍＬ、３５０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、４００〜４５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜４００ＩＵ／ｍＬ、０．５〜４００ＩＵ／ｍＬ、１〜４００ＩＵ／ｍＬ、５〜４００ＩＵ／ｍＬ、１０〜４００ＩＵ／ｍＬ、１５〜４００ＩＵ／ｍＬ、２０〜４００ＩＵ／ｍＬ、２５〜４００ＩＵ／ｍＬ、３０〜４００ＩＵ／ｍＬ、３５〜４００ＩＵ／ｍＬ、４０〜４００ＩＵ／ｍＬ、４５〜４００ＩＵ／ｍＬ、５０〜４００ＩＵ／ｍＬ、６０〜４００ＩＵ／ｍＬ、７０〜４００ＩＵ／ｍＬ、８０〜４００ＩＵ／ｍＬ、９０〜４００ＩＵ／ｍＬ、１００〜４００ＩＵ／ｍＬ、１５０〜４００ＩＵ／ｍＬ、２００〜４００ＩＵ／ｍＬ、２５０〜４００ＩＵ／ｍＬ、３００〜４００ＩＵ／ｍＬ、３５０〜４００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜３５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１〜３５０ＩＵ／ｍＬ、５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、５０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、６０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、７０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、８０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、９０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１００〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１５０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、２００〜３５０ＩＵ／ｍＬ、２５０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、３００〜３５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜３００ＩＵ／ｍＬ、０．５〜３００ＩＵ／ｍＬ、１〜３００ＩＵ／ｍＬ、５〜３００ＩＵ／ｍＬ、１０〜３００ＩＵ／ｍＬ、１５〜３００ＩＵ／ｍＬ、２０〜３００ＩＵ／ｍＬ、２５〜３００ＩＵ／ｍＬ、３０〜３００ＩＵ／ｍＬ、３５〜３００ＩＵ／ｍＬ、４０〜３００ＩＵ／ｍＬ、４５〜３００ＩＵ／ｍＬ、５０〜３００ＩＵ／ｍＬ、６０〜３００ＩＵ／ｍＬ、７０〜３００ＩＵ／ｍＬ、８０〜３００ＩＵ／ｍＬ、９０〜３００ＩＵ／ｍＬ、１００〜３００ＩＵ／ｍＬ、１５０〜３００ＩＵ／ｍＬ、２００〜３００ＩＵ／ｍＬ、２５０〜３００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜２５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１〜２５０ＩＵ／ｍＬ、５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、５０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、６０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、７０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、８０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、９０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１００〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１５０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、２００〜２５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜２００ＩＵ／ｍＬ、０．５〜２００ＩＵ／ｍＬ、１〜２００ＩＵ／ｍＬ、５〜２００ＩＵ／ｍＬ、１０〜２００ＩＵ／ｍＬ、１５〜２００ＩＵ／ｍＬ、２０〜２００ＩＵ／ｍＬ、２５〜２００ＩＵ／ｍＬ、３０〜２００ＩＵ／ｍＬ、３５〜２００ＩＵ／ｍＬ、４０〜２００ＩＵ／ｍＬ、４５〜２００ＩＵ／ｍＬ、５０〜２００ＩＵ／ｍＬ、６０〜２００ＩＵ／ｍＬ、７０〜２００ＩＵ／ｍＬ、８０〜２００ＩＵ／ｍＬ、９０〜２００ＩＵ／ｍＬ、１００〜２００ＩＵ／ｍＬ、１５０〜２００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、１〜１５０ＩＵ／ｍＬ、５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、５０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、６０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、７０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、８０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、９０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、１００〜１５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１００ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１００ＩＵ／ｍＬ、１〜１００ＩＵ／ｍＬ、５〜１００ＩＵ／ｍＬ、１０〜１００ＩＵ／ｍＬ、１５〜１００ＩＵ／ｍＬ、２０〜１００ＩＵ／ｍＬ、２５〜１００ＩＵ／ｍＬ、３０〜１００ＩＵ／ｍＬ、３５〜１００ＩＵ／ｍＬ、４０〜１００ＩＵ／ｍＬ、４５〜１００ＩＵ／ｍＬ、５０〜１００ＩＵ／ｍＬ、６０〜１００ＩＵ／ｍＬ、７０〜１００ＩＵ／ｍＬ、８０〜１００ＩＵ／ｍＬ、９０〜１００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜９０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜９０ＩＵ／ｍＬ、１〜９０ＩＵ／ｍＬ、５〜９０ＩＵ／ｍＬ、１０〜９０ＩＵ／ｍＬ、１５〜９０ＩＵ／ｍＬ、２０〜９０ＩＵ／ｍＬ、２５〜９０ＩＵ／ｍＬ、３０〜９０ＩＵ／ｍＬ、３５〜９０ＩＵ／ｍＬ、４０〜９０ＩＵ／ｍＬ、４５〜９０ＩＵ／ｍＬ、５０〜９０ＩＵ／ｍＬ、６０〜９０ＩＵ／ｍＬ、７０〜９０ＩＵ／ｍＬ、８０〜９０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜８０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜８０ＩＵ／ｍＬ、１〜８０ＩＵ／ｍＬ、５〜８０ＩＵ／ｍＬ、１０〜８０ＩＵ／ｍＬ、１５〜８０ＩＵ／ｍＬ、２０〜８０ＩＵ／ｍＬ、２５〜８０ＩＵ／ｍＬ、３０〜８０ＩＵ／ｍＬ、３５〜８０ＩＵ／ｍＬ、４０〜８０ＩＵ／ｍＬ、４５〜８０ＩＵ／ｍＬ、５０〜８０ＩＵ／ｍＬ、６０〜８０ＩＵ／ｍＬ、７０〜８０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜７０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜７０ＩＵ／ｍＬ、１〜７０ＩＵ／ｍＬ、５〜７０ＩＵ／ｍＬ、１０〜７０ＩＵ／ｍＬ、１５〜７０ＩＵ／ｍＬ、２０〜７０ＩＵ／ｍＬ、２５〜７０ＩＵ／ｍＬ、３０〜７０ＩＵ／ｍＬ、３５〜７０ＩＵ／ｍＬ、４０〜７０ＩＵ／ｍＬ、４５〜７０ＩＵ／ｍＬ、５０〜７０ＩＵ／ｍＬ、６０〜７０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜６０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜６０ＩＵ／ｍＬ、１〜６０ＩＵ／ｍＬ、５〜６０ＩＵ／ｍＬ、１０〜６０ＩＵ／ｍＬ、１５〜６０ＩＵ／ｍＬ、２０〜６０ＩＵ／ｍＬ、２５〜６０ＩＵ／ｍＬ、３０〜６０ＩＵ／ｍＬ、３５〜６０ＩＵ／ｍＬ、４０〜６０ＩＵ／ｍＬ、４５〜６０ＩＵ／ｍＬ、５０〜６０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜５０ＩＵ／ｍＬ、１〜５０ＩＵ／ｍＬ、５〜５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜４５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜４５ＩＵ／ｍＬ、１〜４５ＩＵ／ｍＬ、５〜４５ＩＵ／ｍＬ、１０〜４５ＩＵ／ｍＬ、１５〜４５ＩＵ／ｍＬ、２０〜４５ＩＵ／ｍＬ、２５〜４５ＩＵ／ｍＬ、３０〜４５ＩＵ／ｍＬ、３５〜４５ＩＵ／ｍＬ、４０〜４５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜４０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜４０ＩＵ／ｍＬ、１〜４０ＩＵ／ｍＬ、５〜４０ＩＵ／ｍＬ、１０〜４０ＩＵ／ｍＬ、１５〜４０ＩＵ／ｍＬ、２０〜４０ＩＵ／ｍＬ、２５〜４０ＩＵ／ｍＬ、３０〜４０ＩＵ／ｍＬ、３５〜４０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜３５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜３５ＩＵ／ｍＬ、１〜３５ＩＵ／ｍＬ、５〜３５ＩＵ／ｍＬ、１０〜３５ＩＵ／ｍＬ、１５〜３５ＩＵ／ｍＬ、２０〜３５ＩＵ／ｍＬ、２５〜３５ＩＵ／ｍＬ、３０〜３５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜３０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜３０ＩＵ／ｍＬ、１〜３０ＩＵ／ｍＬ、５〜３０ＩＵ／ｍＬ、１０〜３０ＩＵ／ｍＬ、１５〜３０ＩＵ／ｍＬ、２０〜３０ＩＵ／ｍＬ、２５〜３０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜２５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜２５ＩＵ／ｍＬ、１〜２５ＩＵ／ｍＬ、５〜２５ＩＵ／ｍＬ、１０〜２５ＩＵ／ｍＬ、１５〜２５ＩＵ／ｍＬ、２０〜２５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜２０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜２０ＩＵ／ｍＬ、１〜２０ＩＵ／ｍＬ、５〜２０ＩＵ／ｍＬ、１０〜２０ＩＵ／ｍＬ、１５〜２０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１５ＩＵ／ｍＬ、１〜１５ＩＵ／ｍＬ、５〜１５ＩＵ／ｍＬ、１０〜１５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１０ＩＵ／ｍＬ、１〜１０ＩＵ／ｍＬ、５〜１０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜５ＩＵ／ｍＬ、１〜５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜０．５ＩＵ／ｍＬで含まれる、請求項５、９、３１、３７、３９、４９、５６、５８、６４、８５、１８４、１８６、１８８又は２２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３５】
前記細胞が、１時間〜１４日間、２時間〜１４日間、３時間〜１４日間、４時間〜１４日間、５時間〜１４日間、６時間〜１４日間、７時間〜１４日間、８時間〜１４日間、９時間〜１４日間、１０時間〜１４日間、１１時間〜１４日間、１２時間〜１４日間、１８時間〜１４日間、１日間〜１４日間、２日間〜１４日間、３日間〜１４日間、４日間〜１４日間、５日間〜１４日間、６日間〜１４日間、７日間〜１４日間、８日間〜１４日間、９日間〜１４日間、１０日間〜１４日間、１１日間〜１４日間、１２日間〜１４日間、１３日間〜１４日間；又は１時間〜１３日間、２時間〜１３日間、３時間〜１３日間、４時間〜１３日間、５時間〜１３日間、６時間〜１３日間、７時間〜１３日間、８時間〜１３日間、９時間〜１３日間、１０時間〜１３日間、１１時間〜１３日間、１２時間〜１３日間、１日間〜１３日間、２日間〜１３日間、３日間〜１３日間、４日間〜１３日間、５日間〜１３日間、６日間〜１３日間、７日間〜１３日間、８日間〜１３日間、９日間〜１３日間、１０日間〜１３日間、１１日間〜１３日間、１２日間〜１３日間；又は１時間〜１２日間、２時間〜１２日間、３時間〜１２日間、４時間〜１２日間、５時間〜１２日間、６時間〜１２日間、７時間〜１２日間、８時間〜１２日間、９時間〜１２日間、１０時間〜１２日間、１１時間〜１２日間、１２時間〜１２日間、１日間〜１２日間、２日間〜１２日間、３日間〜１２日間、４日間〜１２日間、５日間〜１２日間、６日間〜１２日間、７日間〜１２日間、８日間〜１２日間、９日間〜１２日間、１０日間〜１２日間、１１日間〜１２日間；又は１時間〜１１日間、２時間〜１１日間、３時間〜１１日間、４時間〜１１日間、５時間〜１１日間、６時間〜１１日間、７時間〜１１日間、８時間〜１１日間、９時間〜１１日間、１０時間〜１１日間、１１時間〜１１日間、１２時間〜１１日間、１日間〜１１日間、２日間〜１１日間、３日間〜１１日間、４日間〜１１日間、５日間〜１１日間、６日間〜１１日間、７日間〜１１日間、８日間〜１１日間、９日間〜１１日間、１０日間〜１１日間１１日間；又は１時間〜１０日間、２時間〜１０日間、３時間〜１０日間、４時間〜１０日間、５時間〜１０日間、６時間〜１０日間、７時間〜１０日間、８時間〜１０日間、９時間〜１０日間、１０時間〜１０日間、１１時間〜１０日間、１２時間〜１０日間、１日間〜１０日間、２日間〜１０日間、３日間〜１０日間、４日間〜１０日間、５日間〜１０日間、６日間〜１０日間、７日間〜１０日間、８日間〜１０日間、９日間〜１０日間１０日間；又は１時間〜９日間、２時間〜９日間、３時間〜９日間、４時間〜９日間、５時間〜９日間、６時間〜９日間、７時間〜９日間、８時間〜９日間、９時間〜９日間、１０時間〜９日間、１１時間〜９日間、１２時間〜９日間、１日間〜９日間、２日間〜９日間、３日間〜９日間、４日間〜９日間、５日間〜９日間、６日間〜９日間、７日間〜９日間、８日間〜９日間９日間；又は１時間〜８日間、２時間〜８日間、３時間〜８日間、４時間〜８日間、５時間〜８日間、６時間〜８日間、７時間〜８日間、８時間〜８日間、９時間〜８日間、１０時間〜８日間、１１時間〜８日間、１２時間〜８日間、１日間〜８日間、２日間〜８日間、３日間〜８日間、４日間〜８日間、５日間〜８日間、６日間〜８日間、７日間〜８日間；又は１時間〜７日間、２時間〜７日間、３時間〜７日間、４時間〜７日間、５時間〜７日間、６時間〜７日間、７時間〜７日間、８時間〜７日間、９時間〜７日間、１０時間〜７日間、１１時間〜７日間、１２時間〜７日間、１日間〜７日間、２日間〜７日間、３日間〜７日間、４日間〜７日間、５日間〜７日間、６日間〜７日間；又は１時間〜６日間、２時間〜６日間、３時間〜６日間、４時間〜６日間、５時間〜６日間、６時間〜６日間、７時間〜６日間、８時間〜６日間、９時間〜６日間、１０時間〜６日間、１１時間〜６日間、１２時間〜６日間、１日間〜６日間、２日間〜６日間、３日間〜６日間、４日間〜６日間、５日間〜６日間；又は１時間〜５日間、２時間〜５日間、３時間〜５日間、４時間〜５日間、５時間〜５日間、６時間〜５日間、７時間〜５日間、８時間〜５日間、９時間〜５日間、１０時間〜５日間、１１時間〜５日間、１２時間〜５日間、１日間〜５日間、２日間〜５日間、３日間〜５日間、４日間〜５日間；又は１時間〜４日間、２時間〜４日間、３時間〜４日間、４時間〜４日間、５時間〜４日間、６時間〜４日間、７時間〜４日間、８時間〜４日間、９時間〜４日間、１０時間〜４日間、１１時間〜４日間、１２時間〜４日間、１日間〜４日間、２日間〜４日間、３日間〜４日間；又は１時間〜３日間、２時間〜３日間、３時間〜３日間、４時間〜３日間、５時間〜３日間、６時間〜３日間、７時間〜３日間、８時間〜３日間、９時間〜３日間、１０時間〜３日間、１１時間〜３日間、１２時間〜３日間、１日間〜３日間、２日間〜３日間；又は１時間〜２日間、２時間〜２日間、３時間〜２日間、４時間〜２日間、５時間〜２日間、６時間〜２日間、７時間〜２日間、８時間〜２日間、９時間〜２日間、１０時間〜２日間、１１時間〜２日間、１２時間〜２日間、１日間〜２日間；又は１時間〜１日間、２時間〜１日間、３時間〜１日間、４時間〜１日間、５時間〜１日間、６時間〜１日間、７時間〜１日間、８時間〜１日間、９時間〜１日間、１０時間〜１日間、１１時間〜１日間、１２時間〜１日間；又は１時間〜１２時間、２時間〜１２時間、３時間〜１２時間、４時間〜１２時間、５時間〜１２時間、６時間〜１２時間、７時間〜１２時間、８時間〜１２時間、９時間〜１２時間、１０時間〜１２時間、１１時間〜１２時間；又は１時間〜１１時間、２時間〜１１時間、３時間〜１１時間、４時間〜１１時間、５時間〜１１時間、６時間〜１１時間、７時間〜１１時間、８時間〜１１時間、９時間〜１１時間、１０時間〜１１時間；又は１時間〜１０時間、２時間〜１０時間、３時間〜１０時間、４時間〜１０時間、５時間〜１０時間、６時間〜１０時間、７時間〜１０時間、８時間〜１０時間、９時間〜１０時間；又は１時間〜９時間、２時間〜９時間、３時間〜９時間、４時間〜９時間、５時間〜９時間、６時間〜９時間、７時間〜９時間、８時間〜９時間；又は１時間〜８時間、２時間〜８時間、３時間〜８時間、４時間〜８時間、５時間〜８時間、６時間〜８時間、７時間〜８時間；又は１時間〜７時間、２時間〜７時間、３時間〜７時間、４時間〜７時間、５時間〜７時間、６時間〜７時間；又は１時間〜６時間、２時間〜６時間、３時間〜６時間、４時間〜６時間、５時間〜６時間；又は１時間〜５時間、２時間〜５時間、３時間〜５時間、４時間〜５時間；又は１時間〜４時間、２時間〜４時間、３時間〜４時間；又は１時間〜３時間、２時間〜３時間；又は１時間〜２時間に及ぶ時間にわたってＩＦＮ−ガンマに曝される、請求項５５、９、３１、３７、３９、４９、５６、５８、６４、８５、１８４、１８６、１８８又は２２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３６】
個体における移植片対宿主病を処置する方法であって、該個体に有効量の線維芽細胞を、細胞移植片、組織移植片若しくは器官移植片とともに、及び／又は前記移植の間に若しくは前記移植の後に、該個体に提供する工程を含む、方法。
【請求項２３７】
前記線維芽細胞が、ＣＤ１０５陽性である、請求項２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
前記線維芽細胞が、十分量のプロスタグランジンＥ２に曝露された、請求項２３６又は２３７に記載の方法。
【請求項２３９】
心筋再生を必要とする個体における心筋再生の方法であって、有効量の、線維芽細胞と単球との共培養物を該個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２４０】
前記線維芽細胞及び単球が、好適な条件下において、プロスタグランジン−Ｅ２と共培養された、請求項２３９に記載の方法。
【請求項２４１】
前記単球が、ＣＤ１４陽性である、請求項２３９又は２４０に記載の方法。
【請求項２４２】
前記単球が、アルギナーゼ陽性である、請求項２３９〜２４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４３】
前記単球及び／又は線維芽細胞が、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及び／又はＥＧＦを産生する、請求項２３９〜２４２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１７年１１月２９日出願の米国仮特許出願第６２／５９１，８５８号に対する優先権を主張する。この仮特許出願は、その全体が本明細書中で参照により援用される。
【０００２】
本開示の実施形態は、少なくとも、細胞生物学、分子生物学、免疫学及び医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞療法の移植、特に同種移植では、「ユニバーサルドナー」アプローチを利用することが可能である。細胞を同種移植できれば、治療活動に対して最適化された細胞の利用が可能になる。例えば、自家骨髄療法の場合、血管新生作用又は栄養作用を有する細胞画分は、年齢とともに減少し、糖尿病又は末梢動脈疾患などの患者の共存症によってさらに複雑になる。同種異系細胞が利用できれば、効率を最適化した細胞製品の投与が可能になる。
【０００４】
同種異系の細胞製品には、宿主の免疫系による拒絶反応という問題がある。起こると知られている拒絶反応のプロセスにはタイプが２つある。ＣＤ４＋Ｔ細胞によって古典的に媒介されるように、レシピエントのＴ細胞受容体とドナーのＭＨＣ  ＩＩ分子との会合によって、直接的な拒絶反応が刺激される。レシピエントの抗原提示細胞が、ドナー細胞を貪食し、それらをＭＨＣ  Ｉ上に提示すると、間接的な拒絶反応が起きるので、ＣＤ８＋Ｔ細胞が刺激される。同種異系細胞の拒絶反応では、抗原提示の直接的な経路と間接的な経路との両方が、免疫媒介性の破壊に関わることが知られている。細胞性拒絶を阻害する現行の手段としては、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン）又はｍＴＯＲの阻害剤（例えば、ラパマイシン及びエベロリムス）の使用が挙げられる。
【０００５】
種々の同種異系細胞を用いて細胞療法の治験が行われてきたが、種々の治験が、継続的な免疫抑制の使用を要求した。胎児由来の幹細胞、膵島、胚由来の組織を問わず、継続的な免疫抑制の使用が行われている。残念なことに、継続的な免疫抑制は、当該個体に対して感染症、新形成及び臓器不全のリスク、特に、カルシニューリン阻害剤を含むレジメンの場合における腎不全のリスクを増大させる可能性がある。
【０００６】
したがって、治療目的で利用される細胞の免疫原性を低下させる必要性が当該分野にある。さらに、種々の病状に対する細胞療法の改善が、当該分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の実施形態は、細胞の改変及び細胞療法のための組成物、方法及びシステムを包含する。特定の実施形態において、本開示は、第１のタイプの細胞と第２のタイプの細胞及び／又はある特定の作用物質との相互作用に関し、その相互作用の結果としての第１及び／又は第２のタイプの細胞に対する改変を含む。具体的な実施形態において、本開示は、ある特定の細胞及び／又はある特定の作用物質に曝露された際に線維芽細胞が改変される組成物、方法及び系を含む。具体的な実施形態において、本開示は、線維芽細胞及び／又は線維芽細胞から産生されたある特定の作用物質に曝露された際にある特定の細胞が改変される組成物、方法及びシステムに関する。特定の実施形態において、線維芽細胞と他の１つ以上のタイプの細胞との相互作用（及び必要に応じてその相互作用は１つ以上のある特定の作用物質も含む）は、線維芽細胞及び／又はそれらの他のタイプの細胞の改変をもたらす。具体的な実施形態において、それらの他のタイプの細胞は、少なくとも免疫細胞を含む。
【０００８】
ある特定の実施形態において、１つ以上のタイプの免疫細胞への線維芽細胞の曝露は、線維芽細胞及び／又は免疫細胞に対して改変をもたらす。ある特定の態様において、線維芽細胞及び／若しくはそれらから産生された作用物質の曝露は、１つ以上のタイプの免疫細胞に対して改変をもたらし、かつ／又は１つ以上のタイプの免疫細胞及び／若しくはそれらから産生された作用物質の曝露は、線維芽細胞に対して改変をもたらす。具体的な実施形態において、１つ以上の作用物質も、その曝露に含められ、それらの作用物質は、外から提供されてもよいし、それらが環境及び／又は細胞及び／又は組織にとって内因性である他の場合のように外から提供されなくてもよい。
【０００９】
具体的な実施形態において、本開示の方法は、エクスビボにおいて、例えば、培養物において行われる。特定の場合において、それらの方法は、人間の手によって行われ、身体内での通常の又は無作為の実施を包含しない。本開示の方法は、特定の態様において非天然の方法である。具体的な実施形態において、１つのタイプの細胞を別のタイプの細胞に曝露する方法において使用される細胞の濃度は、自然界には存在せず、自然界で無作為に生じない。具体的な実施形態において、１つ以上の作用物質を１つ以上のタイプの細胞に曝露する方法において使用される１つ以上の作用物質の濃度は、自然界には存在せず、自然界で無作為に生じない。エクスビボ又はインビトロで行われる、本開示によって包含される任意のタイプの細胞の改変は、同じようにインビボで自然には生じない。
【００１０】
本開示は、線維芽細胞、免疫細胞及びそれらの混合物を含む細胞の治療的な使用を包含する。少なくともいくつかの場合において、線維芽細胞は、免疫細胞（例えば、活性化された免疫細胞）への曝露の前に改変されているか、又は通常は身体内で見られない条件に曝露されており、他の場合においては、免疫細胞又はそれらの誘導体が、線維芽細胞への曝露の前に改変されている（例えば、活性化されている細胞）。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞移植療法において使用されるように細胞の免疫原性を低下させるための系、方法及び組成物に関する。一般的な実施形態において、細胞集団が、１つ以上のタイプの培地及び／又は細胞集団の免疫原性を低下させることができる１つ以上の作用物質を含む１つ以上の組成物に曝される。本開示の特定の実施形態において、方法は、細胞集団に関し、ここで、それらの細胞は、任意のタイプであり得る少なくとも線維芽細胞を含む。
【００１２】
ある特定の実施形態において、本開示は、線維芽細胞の免疫原性を低下させるために、例えば、少なくとも、線維芽細胞の、拒絶反応を起こさない同種移植（又は異種移植若しくは同系移植）を含む移植を可能にするために、１つ以上の作用物質を使用することに関する。少なくともいくつかの場合において、それらの作用物質は、線維芽細胞において１つ以上の免疫原性分子の発現をダウンレギュレートすることができる。
【００１３】
本開示の実施形態は、線維芽細胞の免疫原性を低下させるために、培養条件を改変することによって、線維芽細胞を同種異系（又は異種若しくは同系）の治療用細胞として利用する手段を提供する。本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞は、免疫原性がより低い起源（例えば、胎盤線維芽細胞、大網組織由来の線維芽細胞、臍帯血由来の線維芽細胞など）から抽出される。別の実施形態において、任意のレベルの免疫原性の線維芽細胞が、例えばエクスビボでの培養において、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）に曝される。これは、機構に限定されることなく免疫原性を低下させると本発明者らによって実証された。免疫原性の低下は、具体的な実施形態において、線維芽細胞がアロ反応性のＴ細胞応答を惹起する能力を阻害することによって例証される。本開示の具体的な実施形態において、これらの改変された線維芽細胞は、「ユニバーサルドナー」線維芽細胞と称され、これは、それらが任意の個体に投与され得ること（レシピエント個体において有害な免疫応答を惹起しない様式での投与を含む）を意味する。いくつかの場合において、免疫原性がより低い起源から抽出された線維芽細胞も、十分量のＩＦＮ−ガンマに曝されて、免疫原性がさらに低下する。
【００１４】
本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞は、線維芽細胞の生存能及び増殖能を保つためにエクスビボで培養される。本開示は、レシピエントの免疫系による線維芽細胞の認識を低下させるような公知の培養手法の改変を提供する。１つの実施形態において、線維芽細胞は、異種の成分を欠く条件（例えば、異種成分不含培地）において培養される；いくつかの場合において、その培地は、例えばウシ胎仔血清を含まない。具体的な実施形態において、本開示は、他の１つ以上の作用物質（例えば、線維芽細胞の免疫原性の低下を促進する作用物質、例えば、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清、並びに／又は１つ以上の規定のサイトカイン、例えば、線維芽細胞成長因子１〜１８、上皮成長因子、白血病抑制因子、インスリン様成長因子、アンジオポエチン及び血管内皮成長因子）によるウシ胎仔血清の置換を包含する。
【００１５】
本開示の１つの実施形態において、本開示によって包含される方法において調製された有効量の線維芽細胞が、１つ以上の病状の治療又は予防のために個体に投与される。具体的な実施形態において、それらの線維芽細胞は、血管新生と呼ばれるプロセスである新しい血管の形成を刺激するために投与される。他の状況においては、投与される線維芽細胞は、血管の欠陥を修復するために利用される。例示的な欠陥としては、内皮の応答性の喪失、弾性の低下及び／又は血栓形成促進性（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の低下が挙げられる。線維芽細胞は、新しい血管の形成を直接又は間接的に刺激し得るが、いくつかの実施形態では、血管新生の刺激は、線維芽細胞によって放出される１つ以上の成長因子及び／又はレシピエント個体における線維芽細胞と１つ以上のタイプの細胞との相互作用によって達成される。
【００１６】
本開示の具体的な実施形態は、血管新生療法のための方法を提供する。当該分野において、血管新生療法は、これまで幹細胞に限定されてきた。しかしながら、本開示の実施形態は、線維芽細胞を用いて行われる血管新生療法の方法を提供する。当該分野において、血管新生療法は、「生物学的バイパス」として説明されてきており、その根底にある概念は、側枝形成を誘導することができる作用物質の投与によるものであり、より天然のタイプの「バイパス」を達成できる。当該分野において、虚血性の筋肉が、低酸素に応答して血管新生因子を分泌すること、及び天然の血管新生が、重症虚血肢（ＣＬＩ）の動物モデル及びヒトにおいてある程度生じることが観察されている（Ｍｉｌｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；ｖａｎ  Ｗｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。本開示の１つの実施形態において、有効量のユニバーサルドナー線維芽細胞が、例えば注射、例えば筋肉内注射によって、被験体の低酸素の領域、又は新しい血管の形成若しくは修復を必要とする任意の領域に投与される。
【００１７】
本開示の実施形態は、ユニバーサルドナー線維芽細胞を、血管新生を刺激する１つ以上の作用物質とともに同時投与するための方法を提供する。本開示の具体的な実施形態において、ユニバーサルドナー線維芽細胞を、一例としてＶＥＧＦとともに同時投与するための方法が提供される。本開示の１つの実施形態において、免疫原性を低下させる条件下において処置された線維芽細胞に由来するユニバーサルドナー線維芽細胞が、個体の内在性細胞からのＶＥＧＦ産生を刺激するために利用される。
【００１８】
本開示の具体的な実施形態において、ユニバーサルドナー線維芽細胞を、例えばＦＧＦ−１とともに同時投与するための方法が提供される。当該分野において、サイトカインであるＦＧＦ−１は、ＶＥＧＦの「上流」にあることが知られているので、より成熟した血管を作り出すように数多くの血管新生プロセスを刺激すると考えられる（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＨＩＦ−１アルファも同様に、ある特定の実施形態において、ＦＧＦ−１及び／若しくはＶＥＧＦの代替物として、又はそれらに加えて、線維芽細胞とともに個体に同時投与され得る。
【００１９】
本開示の特定の実施形態において、１つ以上の血管新生剤が、真核細胞において作動可能な１つ以上の組換え発現ベクターを介してユニバーサルドナー線維芽細胞において発現され、その血管新生剤の発現は、例えば、構成的プロモーター又は誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって、制御され得る。具体的な実施形態において、そのベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルス）であるか、又はそのベクターは、非ウイルスベクター（例えば、裸のＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡなど）である。
【００２０】
本開示の実施形態は、特定のタイプの線維芽細胞の免疫原性を低下させる方法を提供する。線維芽細胞は、生検によって（適宜）又は剖検の際に得ることができる、様々な組織又は器官（例えば、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、脳、包皮）に由来し得る。いくつかの態様において、それらの細胞は、胎児、新生児、成体起源由来であり得る線維芽細胞又はそれらの組み合わせを含む。
【００２１】
本開示の任意の方法において使用するための線維芽細胞は、具体的な実施形態において、ある特定の培地成分に曝露され得る。例えば、線維芽細胞は、（ａ）免疫原性を低下させる１つ以上の作用物質、（２）血清、及び／又は（３）血清代替物が補充された培地中のエクスビボ培養物に再懸濁され得る。血清は、ウシ胎仔血清、ヒト血清又は血清代替物を含む任意の起源の血清であり得る。いくつかの実施形態において、血清代替物とは、サイトカイン／成長因子を含む培地のことを指し、その場合において、それらのサイトカイン／成長因子は、血清で見られる濃度と類似の濃度で提供されるので、血清ベースの培地によって提供されるものと類似の様式で細胞の増殖及び活性を可能にすることができる。血清代替物培地の例は、以下の米国特許に記載されており、これらは参照により援用される：９，６３７，７２１号；９，５８０，６８７号；６，１６２，６４３号；６，１０３，５２９号；６，０４８，７２８号；７，７０９，２２９号；４，５６０，６５５号；及び５，３２４，６６６号。いくつかの実施形態では、包皮フィーダー細胞などの細胞に対して異種成分不含環境を提供するために、ヒト血清又は血清代替物が利用される。具体的な実施形態において、培養の後、本開示のヒト包皮フィーダー細胞は、組織培養プレートなどの固相に接着すると、単層を形成することができる［Ｄｕｇｄａｌｅ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄａｌｌ（１９６９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｌａｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６：３１−５］。特定の実施形態において、本開示のヒト包皮フィーダー細胞のこの特徴は、それらの細胞が、免疫原性の低下の割には高い複製能力及びＩＦＮ−ガンマでの処置に対する応答性を有することが理由で、それらの細胞を好適なユニバーサルドナーとする。１つの実施形態において、線維芽細胞は、ある特定の濃度のインターフェロンガンマで処置される。当業者は、異なる起源由来の線維芽細胞が、インターフェロンガンマの異なる濃度において異なるレベルの免疫原性低下を有し得ることを認識するだろう。具体的な実施形態において、本開示は、行われる免疫原性評価のための方法、例えば、混合リンパ球反応を調節する能力を定量するための方法を提供する。そのような混合リンパ球反応による免疫原性の評価は、そのようなある特定の線維芽細胞集団を使用するか否かを判定する際に考慮され得る。
【００２２】
インターフェロンガンマで処置された線維芽細胞を同種異系リンパ球とともに共培養することによって、混合リンパ球反応が行われ得る。通常、同種異系リンパ球の増殖係数を取得して、刺激物質である線維芽細胞の免疫原性の程度が表現される。本開示のいくつかの実施形態において、リンパ球との培養の前に、線維芽細胞が有糸分裂的に不活性化される。有糸分裂の不活性化は、マイトマイシンＣ、又は生存能を低下させることなく増殖を阻止する他の作用物質による処置によって行われ得る。有糸分裂の不活性化に化学剤が利用されるとき、その化学剤は、応答リンパ球の阻害を防ぐために細胞から洗浄除去され得る。
【００２３】
本開示のいくつかの実施形態において、応答リンパ球によるサイトカイン産生の評価が行われ得る。評価され得るサイトカインとしては、炎症プロセス及びマクロファージの刺激に関わるインターロイキン（ＩＬ）−１；Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化に関連するＩＬ２；マクロファージを活性化し、並びにＴｈ１極性化を助ける、インターフェロンガンマ；並びにＮＫ細胞を活性化し、細胞傷害性応答の発生に関連する、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８が挙げられる。本開示の方法の実施のための具体的な実施形態において、混合リンパ球反応において応答リンパ球が、より少ない炎症性サイトカインを生成することが有用である。逆に、免疫抑制性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの評価も、本開示の状況において行われ得る。サイトカインの例としては、Ｔｈ２細胞を刺激するＩＬ−４、とりわけ制御性Ｔ細胞を活性化するＩＬ１０、及び炎症を阻害するＴＧＦ−Ｂが挙げられる。
【００２４】
本開示のいくつかの実施形態において、線維芽細胞の免疫原性を低下させるために、線維芽細胞の遺伝子改変が利用される。１つの方法は、免疫原性が低い細胞（例えば、未熟樹状細胞）による、細胞質移行を含む遺伝子改変を提供する。別の実施形態において、炎症惹起遺伝子（例えば、ＨＬＡ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ５、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３及び／又はＩＬ−２７）を選択的に切り取るように、遺伝子編集が利用される。
【００２５】
本開示の特定の実施形態において、１つ以上の免疫調節剤は、例えば真核細胞において作動可能な組換え発現ベクターを介して、ユニバーサルドナー線維芽細胞において発現され、その免疫調節剤の発現は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって制御され得る。具体的な実施形態において、そのベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルス）であるか、又はそのベクターは、非ウイルスベクター（例えば、裸のＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡ）である。トランスフェクションのための免疫調節剤としては、少なくとも以下が例として挙げられる：Ｆａｓリガンド、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、インドールアミン２，３デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ガレクチンファミリーメンバー、ガレクチン３、アルギナーゼ及び／又はＩＬ−２０。
【００２６】
本開示の実施形態は、ストレスを受けた線維芽細胞に未熟樹状細胞を曝露することによって、樹状細胞の成熟を誘導する方法を含み、いくつかの場合において、それらの線維芽細胞は、高熱及び／又は血清枯渇によってストレスを受ける。
【００２７】
いくつかの実施形態において、血管新生性マクロファージを作製する方法が存在し、その方法は、ａ）単球及び／又は単球前駆細胞を得る工程；並びにｂ）その単球及び／又は単球前駆細胞に血管新生を刺激する能力を付与する条件下で、その単球及び／又は単球前駆細胞を線維芽細胞と接触させる工程を含み得る。
【００２８】
ある特定の実施形態において、１つ以上のストレス誘導刺激で予め調節された有効量の線維芽細胞集団を個体に投与することによってその個体におけるウイルス誘導肝不全を処置する方法が提供される。
【００２９】
本開示の専門家が上記細胞を臨床において投与するための様々な品質管理の手段が、当該分野で公知である。細胞の適格性に対する基準の例としては、フローサイトメトリーなどの手段を用いたマーカー識別、生存能、エンドトキシン含有量、並びに微生物汚染及びマイコプラズマ汚染に対する評価が挙げられる。
【００３０】
前述では、以下に続く発明の詳細な説明をよりよく理解できるように、本発明の特長及び技術的利点をやや広く概説した。本発明の請求項の主題を成す本発明のさらなる特長及び利点を本明細書の以後で説明する。開示される概念及び具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を果たすために、他の構造を改変又は設計するための基礎として容易に利用され得ることが当業者に認識されるだろう。そのような等価な構成は、添付の請求項に示されているような本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことも、当業者に容易に理解されるだろう。さらなる目的及び利点とともに、本発明の構成と実施方法の両方に関して本発明に特有であると考えられる新規の特長は、添付の図面に関連して考慮するとき、以下の説明からよりよく理解されるだろう。しかしながら、それらの各図面は、例証目的及び説明目的で提供されるだけであり、本発明の限度の定義として意図されていないことが明確に理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本発明の理解をより完全なものにするために、添付の図面と併せて解釈される以下の説明について言及する。
【００３２】
【図１】図１は、線維芽細胞及び／又はそれらから産生される１つ以上の作用物質と、１つ以上のタイプの免疫細胞及び／又はそれらから産生される１つ以上の作用物質との相互作用の具体例を図示している。
【００３３】
【図２】図２は、インターフェロンガンマによる前処置が、線維芽細胞の同種刺激活性を低下させることを示している。
【００３４】
【図３】図３は、インターフェロンガンマで処置された線維芽細胞が、同種異系リンパ球からのインターフェロンガンマ産生を阻害することを実証している。
【００３５】
【図４】図４は、インターフェロンガンマで処置された線維芽細胞が、同種異系リンパ球からのインターロイキン−４産生を刺激することを実証している。
【００３６】
【図５】図５は、インターフェロンガンマで処置された線維芽細胞が、同種異系リンパ球からのＴＮＦ−アルファ産生を阻害することを示している。
【００３７】
【図６】図６は、多血小板血漿による前処置が、線維芽細胞の同種刺激活性を低下させることを示している。
【００３８】
【図７】図７は、線維芽細胞によるコラーゲン誘発関節炎の処置を、ＩＦＮ−ガンマで前処置された線維芽細胞による処置と対比して示している。
【００３９】
【図８】図８は、線維芽細胞、及びＰＲＰで前処置された線維芽細胞によるコラーゲン誘発関節炎の処置を図示している。
【００４０】
【図９】図９は、包皮線維芽細胞の添加が、エクスビボ培養において制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）の拡大を加速させることを実証している。臍帯血細胞を加える前に、包皮線維芽細胞を５０％培養密度で予めプレーティングしておいた。「Ｘ」の記号は、線維芽細胞とカクテルとの共培養におけるＴｒｅｇの成長を示す。正方形の記号は、線維芽細胞のみとの共培養におけるＴｒｅｇの成長を示す。三角形の記号は、カクテルのみとの培養におけるＴｒｅｇの成長を示す。培養の開始時に、５０，０００個のＴｒｅｇを加えた。Ｔｒｅｇの計数は、フローサイトメトリーによって行った。
【００４１】
【図１０Ａ】図１０Ａは、リンパ球によって活性化された線維芽細胞が、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ；図１０Ａ）のレベルを有意に低下させたことを示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、リンパ球によって活性化された線維芽細胞が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ；図１０Ｂ）のレベルを有意に低下させたことを示している。
【００４２】
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＣＣＬ４及び活性化線維芽細胞と比べた、ＣＣＬ４で処置されたマウスにおける肝臓（図１１Ａ）の病理学的な変化を示している。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＣＣＬ４及び活性化線維芽細胞と比べた、ＣＣＬ４で処置されたマウスにおける肝臓の組織切片（図１１Ｂ）の病理学的な変化を示している。
【００４３】
【図１２】図１２は、線維芽細胞で処置された単球、線維芽細胞のみ、又は単球のみへの曝露後のＨＵＶＥＣ培養物からのＶＥＧＦ産生を示している。
【００４４】
【図１３】図１３は、線維芽細胞で処置された単球、線維芽細胞のみ、又は単球のみへの曝露後のＨＵＶＥＣ培養物からのＩＬ−３３産生を示している。
【００４５】
【図１４】図１４は、線維芽細胞で処置された単球、線維芽細胞のみ、又は単球のみへの曝露後のＨＵＶＥＣ細胞の増殖を示している。
【００４６】
【図１５】図１５は、線維芽細胞で処置されたＰＢＭＣ、ＰＢＭＣのみ又は線維芽細胞のみへの曝露後のＨＵＶＥＣ細胞の増殖を示している。
【００４７】
【図１６】図１６は、コントロール線維芽細胞と比べて、ストレスを受けた線維芽細胞とともに培養したとき、ＣＤ８０の高発現が観察されたことを実証している。
【００４８】
【図１７】図１７は、コントロール線維芽細胞と比べて、ストレスを受けた線維芽細胞とともに培養したとき、ＣＤ８６の高発現が観察されたこと示している。
【００４９】
【図１８】図１８は、高熱又は血清枯渇線維芽細胞における培養によるＣＤ８増殖の増加を示している。
【００５０】
【図１９】図１９は、培養細胞を用いた心筋梗塞マウスモデルの処置を示している。菱形は、単球を反映しており、四角形は、線維芽細胞であり、三角形は、食塩水であり、「ｘ」は、単球と線維芽細胞との組み合わせである。
【００５１】
【図２０Ａ−Ｃ】図２０Ａ−Ｃは、ＧＶＨＤを有する個体を有効量の線維芽細胞に曝露した後のＣ反応性タンパク質の減少を示している。
【００５２】
【図２１Ａ−Ｃ】図２１Ａ−Ｃは、ＧＶＨＤを有する個体を有効量の線維芽細胞に曝露した後のＴＮＦアルファの減少を示している。
【００５３】
【図２２Ａ−Ｃ】図２２Ａ−Ｃは、ＧＶＨＤを有する個体を有効量の線維芽細胞に曝露した後のＩＬ−６の減少を示している。
【００５４】
【図２３Ａ−Ｃ】図２３Ａ−Ｃは、ＧＶＨＤを有する個体を有効量の線維芽細胞に曝露した後のＩＦＮγ産生の増加を示している。
【００５５】
【図２４Ａ−Ｃ】図２４Ａ−Ｃは、ＧＶＨＤを有する個体を有効量の線維芽細胞に曝露した後のナチュラルキラー（ＮＫ）活性の増加を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
Ｉ．定義の例
長年の特許法の慣習に沿って、語「ａ」及び「ａｎ」は、語「〜を含む」と合わせて本明細書（請求項を含む）において使用されるとき、「１つ以上の」を表す。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上のエレメント、方法工程及び／又は方法からなり得るか、又は本質的になり得る。本明細書中に記載される任意の方法又は組成物が、本明細書中に記載される他の任意の方法又は組成物に対して実行され得ることが企図される。
【００５７】
本明細書中で使用されるとき、用語「約」又は「およそ」とは、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％ほども変動する、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さのことを指す。特定の実施形態において、用語「約」又は「およそ」は、数値の前につくとき、その値プラス又はマイナス１５％、１０％、５％又は１％の範囲を示す。生体系又は生物学的プロセスに関して、その用語は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。別段述べられない限り、用語「約」は、特定の値に対する許容され得る誤差範囲内を意味する。
【００５８】
本明細書中で使用されるとき、用語「活性化線維芽細胞」とは、その細胞において１つ以上の変更：代謝的な変更、免疫学的な変更、成長因子分泌の変更、表面マーカー発現の変更及び／又はマイクロベシクル産生の変更を誘導できる１つ以上の刺激で処置された線維芽細胞のことを指す。
【００５９】
本明細書中で使用されるとき、用語「活性化免疫細胞」とは、その細胞において１つ以上の変更：代謝的な変更、免疫学的な変更、成長因子分泌の変更、表面マーカー発現の変更及びマイクロベシカル産生の変更を誘導できる１つ以上の刺激で処置された免疫細胞のことを指す。
【００６０】
用語「投与される」又は「投与する」は、本明細書中で使用されるとき、組成物が患者に対して意図した効果を及ぼすように、その組成物を個体に提供する任意の方法のことを指す。例えば、投与方法の１つは、医療デバイス（例えば、カテーテル、アプリケーターガン、シリンジなどであるがこれらに限定されない）を用いた間接的な機構による方法である。第２の例示的な投与方法は、局所組織投与、経口摂取、経皮パッチ、局所適用、吸入、坐剤などのような直接的な機構による方法である。
【００６１】
本明細書中で使用されるとき、「同種異系」とは、同じ種の１つ以上の個体からではあるが、天然の状況においては免疫学的に不適合であるか又は免疫学的に不適合である能力がある、別の身体由来の組織又は細胞のことを指す。
【００６２】
本明細書中で使用されるとき、用語「同種移植」とは、ドナーからレシピエントへの器官、組織及び／又は細胞の移植のことを指し、ここで、そのドナーとレシピエントは、異なる個体であるが、同じ種である。そのような手順によって移植された組織は、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）又は同種移植片（ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）と称される。
【００６３】
本明細書中で使用されるとき、用語「同種刺激性」及び「アロ反応性」とは、同種異系抗原、すなわち「同種抗原」、又は非類似のＨＬＡハプロタイプを発現する細胞に応答した免疫系の刺激及び反応のことを指す。
【００６４】
本明細書中で使用されるとき、用語「血管新生」とは、既存の血管からの新しい血管の成長を含む生理学的プロセスのことを指し、血管新生の開始、既存の血管から開始することによる新しい血管の形成、及び分割型血管新生（重積：既存の血管を分割することによる新しい血管の形成）を含む。
【００６５】
本明細書中で使用されるとき、用語「自己免疫」とは、自身の健康な細胞及び組織に対する生物の免疫応答の系のことを指す。
【００６６】
本明細書中で使用されるとき、「自家」とは、同じ個体の身体に由来する又は同じ個体の身体から移される組織又は細胞を指す（すなわち、自己血輸血；自家骨髄移植）。
【００６７】
本明細書中で使用されるとき、用語「自家移植」とは、ある個体の身体のある部分から同じ個体の別の部分への器官、組織及び／又は細胞の移植のことを指し、すなわち、ドナーとレシピエントは、同じ個体である。そのような「自家」手技によって移植された組織は、自家移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）又は自家移植片（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）と称される。
【００６８】
用語「生物学的に活性な」とは、構造的、制御的又は生化学的な機能を有する任意の分子のことを指す。例えば、生物学的活性は、例えば、タンパク質活性を欠く細胞の野生型成長の回復によって決定され得る。タンパク質活性を欠く細胞は、多くの方法（すなわち、例えば、点変異及びフレームシフト変異）によって作製され得る。相補性は、タンパク質活性を欠く細胞に、当該タンパク質、その誘導体又はそれらの一部を発現する発現ベクターをトランスフェクトすることによって達成される。他の場合では、遺伝子産物（例えば、タンパク質）のフラグメントは、その完全長の遺伝子産物の活性を保持するが、低下しているが検出可能なレベルの完全長の遺伝子産物の活性であり得る場合、生物学的に活性であると見なされ得る（又は機能的に活性と称されることがある）。
【００６９】
「細胞培養」は、静止状態であるか、老化しているか、（活発に）分裂しているかを問わず、生細胞を含む人工的なインビトロ系である。細胞培養において、細胞は、適切な温度、典型的には３７℃の温度並びに典型的には酸素及びＣＯ２を含む雰囲気下において生育、維持される。培養条件は、細胞型ごとに大きく異なり得るが、特定の細胞型に対する条件が異なると、異なる表現型が発現される可能性がある。培養系において最もよく変動する因子は、成長培地である。成長培地は、栄養分、成長因子の濃度及び他の成分の存在が異なり得る。培地に補充するために使用される成長因子は、動物血液由来であることが多く、例えば、子ウシ血清である。
【００７０】
「慢性創傷」とは、不完全な治癒に関連する状態、疾患又は治療を有する患者における、創傷の発生から１２週間で完全に閉じていない創傷を意味する。不十分な治癒に関連する状態、疾患又は治療としては、例えば、糖尿病、動脈不全、静脈不全、ステロイドの慢性使用、癌化学療法、放射線療法、放射線被曝及び栄養失調が挙げられる。慢性創傷には、過剰な炎症（例えば、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）及びＭＭＰの過剰産生）、適切な治癒に必要な重要な成長因子の欠乏、細菌の異常増殖及び線維芽細胞の老化をもたらす欠陥が含まれる。慢性創傷は、創傷の表面全体を覆うことができない上皮層を有し、細菌がコロニー形成しやすい。
【００７１】
本明細書中で使用されるとき、用語「側枝形成」とは、終末器官又は血管床に十分に提供できない別の血管と同じ終末器官又は血管床を提供する、１つの血管又はいくつかの血管の成長のことを指す。
【００７２】
本明細書全体にわたって、文脈が他のことを要求しない限り、語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載の工程若しくはエレメント又は工程群若しくはエレメント群を包含するが、他の任意の工程若しくはエレメント又は工程群若しくはエレメント群を排除しないことを暗に示すと理解される。「〜からなる」は、句「〜からなる」の前に何が置かれたとしても、「〜を含み、それらに限定される」ことを意味する。したがって、句「〜からなる」は、列挙されたエレメントが、不可欠又は必須であること、及び他のエレメントが存在しない可能性があることを示唆する。「〜から本質的になる」は、この句の前に列挙される任意のエレメントであって、列挙されたエレメントに対する本開示に明示される活性又は作用を干渉しない又はそれらに寄与しない他のエレメントに限定されるエレメントを含むことを意味する。したがって、句「〜から本質的になる」は、列挙されたエレメントが、不可欠又は必須であるが、他のエレメントは自由選択ではなく、それらが列挙されたエレメントの活性又は作用に影響するか否かに応じて、存在してもよいか、又は存在してはならないことを示唆する。
【００７３】
用語「薬物」、「作用物質」又は「化合物」は、本明細書中で使用されるとき、所望の効果を達成する、投与されることが可能な任意の薬理学的に活性な物質のことを指す。薬物又は化合物は、合成のもの又は天然に存在するもの、非ペプチド、タンパク質若しくはペプチド、オリゴヌクレオチド若しくはヌクレオチド（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、多糖又は糖であり得る。
【００７４】
「成長因子」は、細胞増殖及び／又は細胞分化及び／又は細胞遊走を刺激することができる、天然に存在するタンパク質、内因性タンパク質若しくは外来性タンパク質又は組換えタンパク質であり得る。
【００７５】
用語「個体」は、本明細書中で使用されるとき、医療施設に収容されていてもよいし収容されていなくてもよく、医療施設の外来患者として処置されてもよい、ヒト又は動物のことを指す。個体は、インターネットを介して１つ以上の医学的組成物を受け取っていてもよい。個体には、任意の齢のヒト又は非ヒト動物が含まれ得るので、個体は、成体及び若年者（すなわち、小児）及び乳児を含む。用語「個体」は、医学的処置の必要性を暗示すると意図されないので、個体は、臨床的であるか基礎科学研究の支援であるかを問わず、自発的又は非自発的に実験の一部となる場合がある。用語「被験体」又は「個体」は、交換可能に使用されてよく、それらは、方法又は材料の対象である任意の生物又は動物被験体のことを指し、それらとしては、哺乳動物、例えば、ヒト、実験動物（例えば、霊長類、ラット、マウス、ウサギ）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シチメンチョウ及びニワトリ）、家庭のペット（例えば、イヌ、ネコ及びげっ歯類）、ウマ及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。
【００７６】
本明細書中で使用されるとき、用語「虚血」又は「虚血状態」とは、身体の器官又は部分への血液の供給が不十分であることを指す。そのような状態には、心虚血、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、虚血性脳卒中、脳虚血、腎虚血及び肢虚血が含まれ得る。
【００７７】
「間葉系幹細胞」又は「ＭＳＣ」とは、（１）プラスチックに接着性である、（２）ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲ陰性でありつつ、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５抗原を発現する、並びに（３）例えば骨形成系列、軟骨形成系列及び脂肪生成系列に分化する能力を有する、細胞のことを指す。具体的な実施形態において、間葉系幹細胞は、実質的な（例えば、ベースラインと比べて５０％を超える）レベルのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１７、ＣＤ４５又はそれらの組み合わせを発現しない。本明細書中で使用されるとき、「間葉系間質細胞」（「間葉系幹細胞」とも称されることがある）又は「ＭＳＣ」は、骨髄、脂肪組織、羊水、子宮内膜、トロホブラスト由来組織、臍帯血、ワルトン膠様質、胎盤、多能性幹細胞に由来する羊膜組織及び歯を含むがこれらに限定されない任意の組織に由来し得る。本明細書中で使用されるとき、「間葉系間質細胞」又は「ＭＳＣ」は、組織から初めて単離された際にはＣＤ３４陽性の細胞であるが、表現型的及び機能的に記載された細胞に類似の細胞を含む。本明細書中で使用されるとき、「ＭＳＣ」は、ＮＧＦ−Ｒ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ−Ｒ、ＣＤ２９、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５６、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４６、ＣＤ２７１、ＭＳＣＡ−１、ＳＳＥＡ４、ＳＴＲＯ−１及びＳＴＲＯ−３を含むリストから選択される細胞表面マーカー又はそれらの任意の組み合わせを用いて組織から単離された細胞であって、拡大の前又は後にＩＳＣＴ基準を満たす細胞を含む。本明細書中で使用されるとき、「間葉系間質細胞」又は「ＭＳＣ」には、骨髄間質幹細胞（ＢＭＳＳＣ）、骨髄から単離された成体多能性誘導性細胞（ＭＩＡＭＩ）細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、間葉系成体幹細胞（ＭＡＳＣＳ）、ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）、Ｐｒｏｃｈｙｍａｌ（登録商標）、レメステムセル（ｒｅｍｅｓｔｅｍｃｅｌ）−Ｌ、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）、歯髄幹細胞（ＤＰＳＣ）、ＰＬＸ細胞、ＰＬＸ−ＰＡＤ、ＡｌｌｏＳｔｅｍ（登録商標）、Ａｓｔｒｏｓｔｅｍ（登録商標）、Ｉｘｍｙｅｌｏｃｅｌ−Ｔ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、ＮｕｒＯｗｎＴＭ、ＳｔｅｍｅｄｙｎｅＴＭ−ＭＳＣ、Ｓｔｅｍｐｅｕｃｅｌ（登録商標）、ＳｔｅｍｐｅｕｃｅｌＣＬＩ、ＳｔｅｍｐｅｕｃｅｌＯＡ、ＨｉＱＣｅｌｌ、Ｈｅａｒｔｉｃｅｌｌｇｒａｍ−ＡＭＩ、Ｒｅｖａｓｃｏｒ（登録商標）、Ｃａｒｄｉｏｒｅｌ（登録商標）、Ｃａｒｔｉｓｔｅｍ（登録商標）、Ｐｎｅｕｍｏｓｔｅｍ（登録商標）、Ｐｒｏｍｏｓｔｅｍ（登録商標）、Ｈｏｍｅｏ−ＧＨ、ＡＣ６０７、ＰＤＡ００１、ＳＢ６２３、ＣＸ６０１、ＡＣ６０７、子宮内膜再生細胞（ＥＲＣ）、脂肪由来再生幹細胞（ＡＤＲＣ）として文献に記載されている細胞が含まれる。
【００７８】
本明細書全体にわたる「１つの実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」又は「さらなる実施形態」又はそれらの組み合わせに対する言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特長、構造又は特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含められることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所における前述の句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態について言及しているわけではない。さらに、特定の特長、構造又は特徴が、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされ得る。
【００７９】
用語「薬学的に」又は「薬理学的に許容され得る」は、本明細書中で使用されるとき、動物又はヒトに投与されたとき、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応をもたらさない分子実体及び組成物のことを指す。
【００８０】
用語「薬学的に許容され得るキャリア」は、本明細書中で使用されるとき、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、並びに植物油、コーティング、等張剤及び吸収遅延剤、リポソーム、商業的に入手可能な洗剤などを含むがこれらに限定されない任意のあらゆる溶媒又は分散媒を含む。補足的な生理活性成分も、そのようなキャリアに組み込まれ得る。
【００８１】
用語「低減する」、「阻害する」、「減少する」、「抑制する」、「低下させる」、「予防する」及び文法上の等価物（「より低い」、「より小さい」などを含む）は、処置された被験体と比べた無処置の被験体における任意の症状の表現に関して、処置された被験体における症状の量及び／又は規模が、無処置の被験体よりも、医学の訓練を受けた任意の人材によって臨床的に妥当であると認識される任意の量だけ少ない／小さいことを意味する。１つの実施形態において、処置された被験体における症状の量及び／又は規模は、無処置の被験体における症状の量及び／又は規模よりも少なくとも１０％少ない／小さい、少なくとも２５％少ない／小さい、少なくとも５０％少ない／小さい、少なくとも７５％少ない／小さい、かつ／又は少なくとも９０％少ない／小さい。
【００８２】
「治療薬」は、血管新生及び／又は創傷治癒の調節において「治療効果」を有することを意味し、その治療薬の量は、その量の治療薬の投与が、血管新生の調節を必要としている被験体（例えば、動物モデル又はヒト患者）に投与されたとき、血管新生活性の有意な調節（すなわち、増加又は減少）を引き起こすのに十分である場合、「血管新生調節量」であると言われる。
【００８３】
本明細書中で使用されるとき、用語「治療有効量」は、「有効量」と同義であり、「治療的に有効な用量」及び／又は「有効な用量」とは、専門家が求める生物学的、美容的又は臨床的応答の誘発を必要とする個体において、そのような生物学的、美容的又は臨床的応答を誘発する化合物の量のことを指す。一例として、有効量は、細胞群の免疫原性を低下させるのに十分な量である。非限定的な例として、有効量は、移植された組織を支援するのに十分な血液供給の形成を促進するのに十分な量である。別の非限定的な例として、有効量は、新しい血管及び付随する脈管構造の形成（血管新生）を促進するのに十分な量並びに／又は既存の血管及び付随する脈管構造の修復若しくはリモデリングを促進するのに十分な量である。本開示の方法の特定の用途のために投与される適切な有効量は、本明細書中に提供されるガイダンスを用いて当業者が決定し得る。例えば、有効量は、本明細書に記載されるようなインビトロ及びインビボアッセイから外挿され得る。当業者は、個体の状態が、治療過程全体にわたってモニターされ得ること、及び投与される本明細書中に開示される化合物又は組成物の有効量が、しかるべく調整され得ることを認識するだろう。
【００８４】
本明細書中で使用されるとき、用語「移植」とは、生組織又は生細胞を取得し、それを身体の別の部分又は別の身体に植え込むプロセスのことを指す。
【００８５】
「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔ）」又は「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患又は状態の影響を低減する方法を意味する。処置とは、単に症状ではなく疾患自体又は状態自体を低減する方法のことも指し得る。処置は、処置前のレベルからの任意の低減であり得、疾患、状態、又はその疾患若しくは状態の症状の完全な消失であり得るが、それに限定されない。ゆえに、本開示の方法において、処置とは、確立した疾患の重症度又は疾患進行の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の低減（疾患の少なくとも１つの症状の重症度の低下を含む）のことを指し得る。例えば、同じ被験体における処置前のレベル又はコントロール被験体と比べて細胞の免疫原性の検出可能な低減が存在する場合、細胞の免疫原性を低下させるための本開示の方法は、処置であると見なされる。したがって、低減は、天然のレベル又はコントロールレベルと比べて１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％又はその中間の任意の量の低減であり得る。「処置」は、必ずしも疾患又は状態の治癒のことを指さず、疾患又は状態の見通しの改善のことを指すことが理解され、本明細書中で企図される。具体的な実施形態において、処置とは、少なくとも１つの症状の重症度又は程度の低下のことを指し、代替的又は追加的に、少なくとも１つの症状の発生の遅延のことを指し得る。
【００８６】
ＩＩ．線維芽細胞と免疫細胞との機能的相互作用
本開示の特定の実施形態では、非同一タイプの第１の細胞と第２の細胞との間に、生物学的な機能的クロストークがあり、その相互作用（ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎ）によって、（直接又は間接的に）それらの２つのタイプの細胞のうちの少なくとも１つが、特定の治療目的のために利用され得るような１つ以上の改変を有するようになる。いくつかの場合では、第１のタイプの細胞と第２のタイプの細胞との間に、生物学的な機能的クロストークがあり、その相互作用によって、両方のタイプの細胞がそれぞれの治療目的のために利用され得るような１つ以上の改変を各タイプの細胞が有するようになる。いくつかの実施形態において、免疫細胞（単球、単球前駆細胞、ＰＢＭＣ、ＭＳＣなどを含む）又は他の細胞への線維芽細胞の曝露によって、それぞれの線維芽細胞、及び免疫細胞又は他の細胞が、その曝露の非存在下ではそれぞれの細胞が発現できなかった及び／又は有することができなかった１つ以上の作用物質を発現できる及び／又は１つ以上の活性を有することができるようになる。特定の実施形態において、線維芽細胞及び免疫細胞又は他の細胞は、互いに対して同種異系であるが、他の実施形態では、それらは互いに対して自家である。
【００８７】
特定の実施形態において、本開示は、活性化線維芽細胞又は活性化免疫細胞又は活性化免疫細胞誘導体を作製するインビトロ方法に関し、その方法は、免疫細胞由来の１つ以上の作用物質が、線維芽細胞を活性化して活性化線維芽細胞にするような条件下において、線維芽細胞を免疫細胞に曝露する工程を含む。具体的な実施形態では、このことに加えて、線維芽細胞由来の１つ以上の抗原が、免疫細胞からの１つ以上のサイトカインの産生を誘発して、活性化免疫細胞を産生する。ある特定の実施形態において、１つ以上の成長因子及び／又は１つ以上のサイトカインが線維芽細胞を活性化して活性化線維芽細胞にするような条件下において、１つ以上の成長因子及び／又は１つ以上のサイトカインに線維芽細胞を曝露することによって、活性化線維芽細胞又は活性化免疫細胞又は活性化免疫細胞誘導体を作製するインビトロ方法が存在する。
【００８８】
このスキームの実施形態を図１に図示する。簡潔にするために、図１の例において、以後、用語「単球」は、単に、免疫リンパ球などの末梢血単核球又は例えばＭＳＣを含む他の細胞の代表例となるだけであり、樹状細胞を利用してもよい。図１のエレメント１では、線維芽細胞（任意の起源由来）と単球とを、例えば、細胞生存度を維持できる及び分子と細胞外ベシクルとの相互作用を可能にできる液体培地中で、互いに曝露する及び／又は互いに接触させる。その結果、線維芽細胞抗原が、単球からのサイトカイン産生の引き金を引く。いくつかの場合では、単球への線維芽細胞の曝露の代わりに又はその曝露に加えて、溶液中のサイトカイン及び／又は成長因子を線維芽細胞に曝露する。単球又は遊離サイトカインは、線維芽細胞において免疫応答を活性化し、それにより、「治癒／傷害応答」に向けて線維芽細胞を活性化し、少なくともいくつかの場合では、線維芽細胞の免疫原性を低下させる（エレメント２）。少なくともいくつかの場合では、この免疫原性の低下により、本来その線維芽細胞の起源でなかった個体においてその線維芽細胞の使用が容易になる。
【００８９】
次に、得られた活性化線維芽細胞は、１つ以上のある特定の活性化マーカーを発現し得、かつ／又は１つ以上の成長因子及び／若しくは１つ以上のサイトカイン（例えば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０など）を産生し得（エレメント３）、その結果、これらの因子は、特定の実施形態（エレメント４ａ）において数多くの治療的介入（例えば、血管新生、炎症反応の低減など）に有用になる。エレメント４ａでは、数々の病気に罹患している個体が、それらの症状、例えば、内因性の自己免疫活性、慢性炎症、Ｔ細胞機能亢進又は肝臓再生のうちの１つ以上を軽減するために活性化線維芽細胞療法を受けることができる。
【００９０】
追加的又は代替的に、線維芽細胞への曝露の後に共培養された単核細胞（又はそれらから産生された細胞）は、例えば、創傷治癒の促進及び／又は自己免疫を阻害する制御性Ｔ細胞の作製のために、例えば、Ｍ１からＭ２に活性化されたマクロファージを使用した他の１つ以上の病気の処置のために使用することができる（エレメント４ｂ）。
【００９１】
本開示の１つの実施形態では、ユニバーサルドナー線維芽細胞を個体に投与して、血管新生と呼ばれるプロセスである新しい血管の形成を刺激する。いくつかの実施形態において、血管新生の刺激は、線維芽細胞によって放出される１つ以上の成長因子、及び／又は線維芽細胞とレシピエントの細胞との相互作用によって達成される。特定の実施形態において、そのような線維芽細胞は、少なくともＩＦＮ−ガンマに曝露された細胞である。
【００９２】
本開示の具体的な実施形態は、血管新生療法のための方法を提供する。本開示の実施形態は、線維芽細胞を用いて行われる血管新生療法の方法を提供する。本開示のある特定の実施形態において、治療有効量のユニバーサルドナー線維芽細胞が、血管新生を刺激する目的で被験体に投与される。いくつかの場合では、その線維芽細胞は、血管新生を刺激する意図された目的なしに個体に提供されるが、それでもその線維芽細胞は、血管新生を刺激する。本開示の実施形態は、ユニバーサルドナー線維芽細胞と、１つ以上の作用物質（血管新生を刺激する１つ以上の作用物質を含む）とを同時投与するための方法を提供する。
【００９３】
本開示の具体的な実施形態において、ユニバーサルドナー線維芽細胞と、治療有効量の１つ以上の成長因子（例えば、精製されたＶＥＧＦを含むＶＥＧＦ）とを同時投与するための方法が提供される。他の成長因子としては、以下が挙げられる：ＨＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＰＤＧＦ及び／又はアンジオポエチン。本開示の１つの実施形態において、ユニバーサルドナー線維芽細胞は、個体の細胞からの成長因子（例えば、ＶＥＧＦ）の産生を刺激するために利用される。本開示の具体的な実施形態において、ユニバーサルドナー線維芽細胞と、治療有効量のＦＧＦ−１（例えば、一例として、精製されたＦＧＦ−１）とを同時投与するための方法が提供される。
【００９４】
本開示の特定の実施形態において、１つ以上の血管新生剤が、真核細胞において作動可能な組換え発現ベクターを介して、本開示のユニバーサルドナー線維芽細胞において発現され、その血管新生剤の発現は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって制御され得る。具体的な実施形態において、そのベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルス）であるか、又はそのベクターは、非ウイルスベクター（例えば、裸のＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡ）である。具体的な場合において、組換え発現される血管新生剤は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＥＧＦ、アンジオポエチン、ＨＩＦ−１−アルファ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ又はそれらの組み合わせを含み得る。
【００９５】
具体的な実施形態では、２つのタイプの細胞及び／又はそれらの１つ以上の作用物質の間にクロストークが存在するが、いくつかの場合において、第２のタイプの細胞が、第１のタイプの細胞によって同時に改変されないとき、第１のタイプの細胞が、第２のタイプの細胞によって改変される。
【００９６】
以下の例は、互いに対する同時曝露（及び／又はある特定の作用物質への曝露）後の線維芽細胞及び／又は免疫細胞のある特定の使用用途、及びその後のそれぞれの細胞型の改変を説明する。
【００９７】
Ａ．エクスビボで培養された細胞の細胞免疫原性の低下
本開示のいくつかの実施形態において、細胞集団の免疫原性を低下させる方法が存在し、ここで、その集団は、ＩＦＮ−ガンマ並びに必要に応じて１つ以上のさらなる作用物質及び／又は条件を含む組成物に曝される。
【００９８】
一般的な実施形態において、１つ以上の特定の培地及び／又は１つ以上の作用物質を含む１つ以上の組成物が細胞集団の免疫原性を低下させることができるようにその細胞集団がその組成物に曝される。本開示の特定の実施形態において、方法は、細胞集団に関し、ここで、その細胞は、任意のタイプの線維芽細胞であり、その線維芽細胞は、低下した免疫原性を有し、治療的な容量において利用され得るように、改変されるようになる。ある特定の実施形態において、その線維芽細胞は、例えば、胎盤線維芽細胞又は包皮線維芽細胞をはじめとした、任意の種類であり得る。他の実施形態では、線維芽細胞以外の細胞が、その方法の非存在下と比べて低下した免疫原性を有するように改変され、それらの細胞は、膵ベータ細胞、膵島、肝細胞、ニューロン、軟骨細胞、多能性幹細胞又はそれらの誘導体であり得、そのような細胞は、１つ以上のタイプの線維芽細胞との混合物中に存在してもよいし、存在しなくてもよい。それらの細胞が多能性幹細胞である実施形態において、その幹細胞は、例えば、誘導性多能性幹細胞、ストレス誘発性（ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ）幹細胞、単為生殖由来幹細胞、胚性幹細胞、体細胞核移植由来幹細胞又はそれらの誘導体を含み得る。ある特定の場合において、本開示の方法は、自家細胞に関する。他の場合において、本開示の方法は、同種異系細胞、異種細胞又は同系細胞に関する。
【００９９】
本開示の実施形態は、線維芽細胞（又は上で述べたような他のタイプの細胞）の免疫原性を低下させるために、培養条件の改変によって、その線維芽細胞を同種異系の治療用細胞として利用する手段を提供する。本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞は、免疫原性がより低い起源（例えば、胎盤線維芽細胞など）から抽出される。別の実施形態において、線維芽細胞は、エクスビボで培養され、機構に限定されることなく免疫原性を低下させると本発明者らによって実証されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）に曝される。免疫原性の低下は、線維芽細胞がアロ反応性のＴ細胞応答を誘発する能力の阻害によって例証され得る。
【０１００】
具体的な実施形態において、本開示は、行われる免疫原性を評価するための方法、例えば、混合リンパ球反応を調節する能力を定量するための方法を提供する。混合リンパ球反応は、当該分野で周知である。典型的には、混合リンパ球反応は、線維芽細胞（この場合、インターフェロンガンマで処置された線維芽細胞）を同種異系リンパ球とともに共培養することによって行われる。ある特定の実施形態において、免疫原性の調節を示す混合リンパ球反応のパラメータとしては、Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌及び細胞傷害性が挙げられる。Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌及び細胞傷害性を定量するための方法は、当該分野で周知である。ある特定の実施形態において、免疫原性の調節は、ＴＮＦ−アルファ、インターフェロンガンマ、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−３３又はそれらの組み合わせを含む１つ以上のサイトカインの分泌を定量することによって測定され得る。
【０１０１】
具体的な実施形態において、本開示は、免疫原性が低下した細胞の投与を必要とする個体への、免疫原性が低下した細胞の投与に関する方法を提供する。免疫原性が低下した細胞集団は、所望のとおり投与され得る。所望の応答、投与様式、細胞の寿命及び／又は存在する細胞の数に応じて、様々なプロトコルが使用され得る。
【０１０２】
Ｂ．免疫調節のための細胞移植療法
自己免疫疾患は、内在性組織に対する免疫系の過剰な反応を特徴とする。免疫系は、内在性組織を戦うべき異物として誤って認識する。これにより、重篤な炎症反応が生じ、それらに影響される器官が損傷する。内因性構造と外因性構造を区別する上で重要な部分は、Ｔリンパ球またはＴ細胞によって行われる。Ｔリンパ球またはＴ細胞は、胸腺で「トレーニング」されて、内因性細胞表面分子、いわゆるＭＨＣ分子にのみドッキングし、内因性構造を許容する。
【０１０３】
自己免疫疾患では、Ｔ細胞群が異常にふるまう。それらは、外来性の分子及び生物からの今までどおり機能している防御に加えて、内在性の構造も攻撃する。器官又は組織は、外来性として認知される。様々な結果が生じ得る。生命維持に必要な構造が影響を受けると、自己免疫疾患は、致命的な経過をたどる。免疫系は、これらの構造に対する防御を指示し、細胞性及びまた体液性の防御反応が発動され、自己抗体が形成され、その結果、影響を受けた器官は、時間とともに機能するのをやめる。最も一般的には、免疫系が弱り、身体があらゆる種類の疾患に罹りやすくなる。いくつかの状況下では、外来性の認識も妨害され、その結果、（例えば）変性した癌細胞の拡散を効果的に防ぐことができなくなり、影響を受けた者は感染症にかかりやすくなる。疾患の過程において、免疫系の細胞が、内在性の構造を破壊するが、身体の修復機構は、損傷した器官の部分を可能な限り再生しようとする。概して、処置がなければ、防御系のこの誤った攻撃は、生涯を通じて、又は標的構造が完全に破壊されるまで続く。
【０１０４】
自己免疫疾患は、影響を受ける器官に応じて処置される。これにおいて、原因療法の基本原理は、免疫抑制剤、例えば、コルチゾンの投与によって免疫系の活性を抑制することである。これらの物質は、複数の全身性の副作用及び相互作用によって特徴付けられ、これに基づいて、疾患イベントに関わる機構に特に影響する新薬を開発する試みが行われている。
【０１０５】
本開示の１つの実施形態では、自己免疫障害又は炎症性障害を処置するために、改変された線維芽細胞を個体に投与する。本開示のいくつかの実施形態では、線維芽細胞をエクスビボで培養し、それらの免疫原性を低下させる条件に供し、次いで、それらの線維芽細胞を利用して、抗炎症特性及び／又は免疫調節特性を刺激する。追加の実施形態は、自己免疫状態及び／又は炎症状態を処置する目的で、細胞の投与を必要とする個体に細胞を投与する方法に関する。
【０１０６】
本開示は、細胞移植療法において使用される細胞の免疫原性を低下させるためのシステム、方法及び組成物に関する。一般的な実施形態では、細胞集団の免疫原性を低下させることができる１つ以上のタイプの培地及び／又は１つ以上の作用物質を含む１つ以上の組成物に細胞集団を曝す。本開示の特定の実施形態において、方法は、細胞集団に関し、ここで、その細胞は、少なくとも線維芽細胞を含む。
【０１０７】
本開示の実施形態は、線維芽細胞の免疫原性を低下させるために、培養条件の改変によって、治療用の同種異系細胞として線維芽細胞を利用する手段を提供する。本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞は、免疫原性がより低い起源（例えば、胎盤線維芽細胞など）から抽出される。別の実施形態において、線維芽細胞は、機構に限定されることなく免疫原性を低下させると本発明者らによって実証されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）に、例えばエクスビボでの培養において、曝される。免疫原性の低下は、具体的な実施形態において、線維芽細胞がアロ反応性のＴ細胞応答を惹起する能力を阻害することによって例証される。本開示の具体的な実施形態において、これらの改変された線維芽細胞は、ユニバーサルドナー線維芽細胞である。
【０１０８】
本開示のある特定の方法は、一例として包皮線維芽細胞を含む任意の種類の線維芽細胞の免疫原性を低下させることに関する。ある特定の実施形態では、線維芽細胞を、培地（例えば、血清又は血清代替物が補充された培地）中のエクスビボ培養物に再懸濁する。血清は、ウシ胎仔血清、ヒト血清又は血清代替物をはじめとした任意の起源の血清であり得る。ある特定の実施形態において、ヒト血清又は血清代替物は、線維芽細胞（例えば、包皮フィーダー細胞）に異種成分不含環境を提供するために利用される。１つの実施形態において、線維芽細胞は、１つ以上のある特定の濃度のＩＦＮ−γで処置される。
【０１０９】
本開示の実施形態は、炎症状態及び自己免疫状態を処置するために、自家又は同種異系の線維芽細胞を使用するためのシステム及び方法に関する。本開示の方法及び組成物は、炎症状態及び自己免疫状態を処置するための、ある特定の操作された細胞を包含する。特に、それらの細胞には、少なくとも任意の種類の線維芽細胞が含まれる。線維芽細胞の操作手段、並びに炎症性及び／又は自己免疫性のプロセスを積極的に阻害する種々の組織起源の線維芽細胞が、開示される。本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞は、免疫応答を阻害する能力に利用され、自己免疫状態の予防及び／又は処置のための細胞療法としても利用される。１つの実施形態において、線維芽細胞が作製又は操作され、免疫活性化を抑制する能力を評価する混合リンパ球反応において利用される。具体的な実施形態では、炎症性及び／又は自己免疫性のプロセスを直接又は間接的に処置できる１つ以上の特定の作用物質及び／又は条件で線維芽細胞を処置する。特定の実施形態において、その作用物質は、インターフェロンガンマ及び／又は多血小板血漿を含み、いくつかの場合において、少なくともインターフェロンガンマ及び／又は多血小板血漿（及び／又は多血小板溶解産物）は、線維芽細胞に、免疫応答を直接又は間接的に積極的に抑制する能力を付与し得る。これらの条件下において培養された線維芽細胞が、自己免疫性障害若しくは炎症性障害に罹患している又はそれらのリスクがある個体に投与される。投与経路、投与量及び投与頻度は、疾患プロセス並びに疾患のステージに応じて決定され、医学における日常的な習慣に従って最適化され得る。
【０１１０】
１つの実施形態において、同種異系（又は異種又は同系）の線維芽細胞が、操作されない様式で（例えば、インターフェロンガンマなどの１つ以上の特定の作用物質への事前の曝露なしに）個体に投与されるが、天然で免疫調節活性によって特徴づけられる起源（例えば、胎盤線維芽細胞又は脂肪組織に関連する線維芽細胞など）から選択される。本開示の他の実施形態では、任意の線維芽細胞が、線維芽細胞に未熟な表現型を付与するために逆分化を誘導することができる条件下において培養され、ここで、その未熟な表現型は、増強された抗炎症性及び／又は免疫調節の潜在能力と相関する。例えば、線維芽細胞は、バルプロ酸などの１つ以上のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下において培養され得る（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＨＤＡＣ阻害剤に加えて、線維芽細胞の脱分化を誘導する他の手段も、本開示の状況において利用され得る（例えば、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）；Ｍ−ＣＳＦ処置（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）；レベレシンへの曝露（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）；及び／又は幹細胞抽出物への曝露（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４））。線維芽細胞の脱分化の特徴付けは、細胞外マーカー（例えば、ＣＸＣＲ４、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３４及び／又はＣＤ１３３）並びに細胞内マーカー（例えば、ＳＯＸ−２、ＮＡＮＯＧ及び／又はＯＣＴ−４）の評価によって行うことができる。
【０１１１】
本開示のいくつかの実施形態では、脱分化した線維芽細胞が、免疫調節のために利用され得、テロメラーゼ、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ベータ−ＩＩＩ−チューブリン、ＮＦ−Ｍ、ＭＡＰ２、ＡＰＰ、ＧＬＵＴ、ＮＣＡＭ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｕｒｒ１、ＧＦＡＰ、ＮＧ２、Ｏｌｉｇ１、アルカリホスファターゼ、ビメンチン、オステオネクチン、オステオプロテグリン、オステリックス、アディプシン、エリスロポエチン、ＳＭ２２−アルファ、ＨＧＦ、ｃ−ＭＥＴ、アルファ−１−アントリプトリプシン（Ａｎｔｒｉｐｔｒｙｐｓｉｎ）、セルロプラスミン、ＡＦＰ、ＰＥＰＣＫ１、ＢＤＮＦ、ＮＴ−４／５、ＴｒｋＡ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＰＤＧＦ、ＰＧＦ、ＴＧＦアルファ、ＴＧＦベータ、ＶＥＧＦ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のマーカーを発現する。
【０１１２】
本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞は、免疫調節特性を有する１つ以上の作用物質とともに投与される。そのような作用物質としては、以下の例が挙げられる：１）ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）７／９アンタゴニストとして部分的に作用するがゆえに自然免疫活性化を低減する、ヒドロキシクロロキン（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）；２）ピリミジン合成及びタンパク質チロシンキナーゼ活性を阻害し（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、その結果、Ｔ細胞応答を抑制し（Ｄｉｍｉｔｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、樹状細胞（ＤＣ）の活性化を阻害するとも実証された（Ｋｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、代謝拮抗物質であるレフルノミド；３）直接又はジシアノ金（ｉ）などの代謝産物を介して、Ｔ細胞及び抗原提示細胞の活性化を阻害する（Ｔｅｐｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、並びにＴｈ２偏向を引き起こす（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）と実証された、注射可能な金化合物（例えば、オーラノフィン）；４）１９５０年以後使用されており、主にシクロオキシゲナーゼ及びリポキシゲナーゼの阻害を通じて作用する（Ｔａｇｇａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、スルファサラジン；及び５）Ｔ細胞の活性化及び増殖を阻害し、ＲＡに対するゴールデンスタンダードの１つである（Ｂａｎｓａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、葉酸代謝拮抗薬であるメトトレキサート。典型的には、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）と糖質コルチコイドとの併用が使用されるか、あるいは炎症の全般的な阻害をもたらすために、１パルス以上の高用量の糖質コルチコイドが投与される（Ｂｉｊｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。使用される線維芽細胞の濃度は、疾患のステージ並びに患者の履歴及び以前の治療に対する応答性に左右される。
【０１１３】
本開示の１つの実施形態において、免疫調節に使用される線維芽細胞は、例えば、ａ）１つ以上の自己抗原；及び／又はｂ）１つ以上の免疫調節タンパク質を発現するように遺伝的に操作される。その後、操作された細胞は、免疫寛容の誘導に使用される。個体及び疾患の特徴は、どの遺伝子が、少なくともいくつかの場合において線維芽細胞の操作に使用されるべきかを決定づけることがある。例えば、１型糖尿病の場合、数多くの自己抗原、例えば、ＩＧＲＰ（Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、ＩＡ−２（Ｇｕｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、プロインスリン−２（Ｂａｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）及びＧＡＤ６５（Ｐｈｅｌｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）が、当該分野において知られている。これらの場合、その自己抗原を、ポリヌクレオチドの形態で線維芽細胞にトランスフェクトし得、その線維芽細胞を、免疫調節を可能にするために培養するか、又は免疫調節を可能にする遺伝子でトランスフェクトする。免疫調節を誘導するためのトランスフェクション用の特定の目的の遺伝子としては、少なくとも以下が挙げられる：Ｆａｓリガンド、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、インドールアミン２，３デオキシゲナーゼ、ガレクチンファミリーメンバー、ガレクチン３、アルギナーゼ及び／又はＩＬ−２０（ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｃａｎｃｅｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。本明細書中に記載される遺伝子のいずれか又はその活性な部分が、線維芽細胞において発現を可能にするＣＭＶプロモーターなどのプロモーター配列を含む哺乳動物発現構築物にクローニングされ得る［Ａｒｔｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９５，４：３１７−２１］。好適な構築物の例としては、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ＰｚｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ（これらの各々が、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に入手可能である）又は制御されたポリヌクレオチド発現をヒト包皮細胞において可能にするｐＳＨ発現ベクター［Ｖｅｎｔｕｒａ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：８６７−９］が挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクター及びパッケージングシステムの例は、マルチクローニングサイトへのクローニングを可能にするＲｅｔｒｏ−ＸベクターであるｐＬＮＣＸ及びｐＬＸＳＮをはじめとした、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから商業的に入手可能なものであり、導入遺伝子は、ＣＭＶプロモーターから転写される。導入遺伝子が５’ＬＴＲプロモーターから転写されるｐＢａｂｅなどのＭｏ−ＭｕＬＶに由来するベクターも挙げられる。プラスミドのトランスフェクションが完了した後、線維芽細胞は、組織培養プレートからの剥離を可能にする手段、例えば、トリプシン処理によって、回収され、増殖に向けて６ウェル（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）又は２４ウェルのプレート（Ｎｕｎｃ）に移される。トランスフェクションのおよそ３日後に、細胞培地を、改変された線維芽細胞の増殖及び拡大に適した培地に交換する。一例は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２％Ｂ２７サプリメント及びレチノイン酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２％ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）、０．０８％ＦＧＦ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．２％ヘパリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、並びに１μＭの濃度までのバルプロ酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ（ＮＢＡ）増殖培地である。その後、その培地を、例えば週３回、交換し、細胞を定期的に再度プレーティングして（例えば、最大週１回の再プレーティング、２〜８回、コロニーが発生し始めたら、より定期的に行う）、広範なコロニー形成が達成されるまで、再プログラムされていない細胞を除去する。本開示の専門家が上記細胞を臨床において投与するための様々な品質管理の手段が当該分野で公知である。細胞の適格性に対する基準の例としては、フローサイトメトリーなどの手段を用いたマーカー識別、生存能、エンドトキシン含有量、並びに微生物汚染及びマイコプラズマ汚染に対する評価が挙げられる。
【０１１４】
本開示の１つの実施形態では、線維芽細胞の生存能及び増殖能を保つための当該分野で公知の手段を用いて、線維芽細胞をエクスビボで培養する。本開示は、レシピエントの免疫系による線維芽細胞の認識を低下させるための公知の培養手法の改変を提供する。１つの実施形態では、ウシ胎仔血清などの異種成分を欠く条件において、線維芽細胞を培養する。異種成分は、抗体反応及びＴ細胞反応の誘発をはじめとした免疫学的反応の引き金を引くと知られている（Ｓｅｌｖａｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｋａｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｆｏｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７６；Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。多くの個体において、ウシ胎仔血清関連成分に対するＩｇＭアイソタイプの天然抗体が存在しており（Ｉｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４）、ウシ胎仔血清の存在下において生育された細胞の投与後に拒絶、炎症又はアナフィラキシーが引き起こされる（Ｍａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。具体的な実施形態において、本開示は、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清及び／又は規定のサイトカインミックスによるウシ胎仔血清の置換を、線維芽細胞の免疫原性を低下させるためのさらなる特長として包含する。他の細胞型に対する異種成分不含培地中で組織を培養する手段は、当該分野で公知であり、参照により援用される（Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１１５】
本開示の実施形態は、特定のタイプの線維芽細胞の免疫原性を低下させる方法を提供する。線維芽細胞は、生検によって（適宜）又は剖検の際に入手できる様々な組織又は器官（例えば、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、脳及び／又は包皮）に由来し得る。いくつかの態様において、それらの細胞は、胎児、新生児、成体起源由来であり得る線維芽細胞又はそれらの組み合わせを含む。
【０１１６】
包皮線維芽細胞は、免疫原性を低下させる１つ以上の作用物質、血清及び／又は血清代替物が補充された培地中のエクスビボ培養物に再懸濁され得る。血清は、ウシ胎仔血清、ヒト血清又は血清代替物（例えば、ヒト血小板溶解物による代替物（Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓｃｈａｌｌｍｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｃａｐｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｃａｒｒａｎｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓａｌｖａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｂｉｅｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）））を含む任意の起源の血清であり得る。いくつかの実施形態では、包皮フィーダー細胞に対して異種成分不含環境を提供するために、ヒト血清又は血清代替物が利用される。培養の後、本開示のヒト包皮フィーダー細胞は、組織培養プレートなどの固相に接着すると、単層を形成することができる［Ｄｕｇｄａｌｅ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄａｌｌ（１９６９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｌａｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２６：３１−５］。本開示のヒト包皮フィーダー細胞のこの特徴は、それらの細胞が、免疫原性の低下の割には高い複製能力及びＩＦＮ−ガンマでの処置に対する応答性を有することが理由で、これらの細胞を好適なユニバーサルドナーとする。当業者は、異なる起源由来の線維芽細胞が、インターフェロンガンマの異なる濃度において異なる免疫原性低下を有し得ることを認識するだろう。具体的な実施形態において、本開示は、行われる免疫原性評価のための方法、例えば、混合リンパ球反応を調節する能力を定量するための方法を提供する。
【０１１７】
典型的には、線維芽細胞の免疫原性を計測するために、インターフェロンガンマで処置された線維芽細胞を同種異系リンパ球とともに共培養することによって、混合リンパ球反応が行われる。通常、同種異系リンパ球の増殖係数を取得して、刺激物質である線維芽細胞の免疫原性の程度が表現される。本開示のいくつかの実施形態において、リンパ球との培養の前に、線維芽細胞が有糸分裂的に不活性化される。有糸分裂の不活性化は、１つ以上の作用物質（例えば、マイトマイシンＣ、又は生存能を低下させることなく増殖を阻止する他の作用物質）による処置によって行われ得る。有糸分裂の不活性化に化学剤が利用されるとき、その化学剤は、応答リンパ球の阻害を防ぐために細胞から洗浄除去される。
【０１１８】
本開示の他の実施形態において、処置された線維芽細胞は、リンパ球への応答によるサイトカイン産生の評価など、免疫原性のレベルについて特徴付けられる。注目すべきサイトカインの例としては、炎症プロセス及びマクロファージの刺激に関わるＩＬ−１；Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化に関連するＩＬ−２；マクロファージを活性化し、Ｔｈ１極性化を助ける、インターフェロンガンマ；並びに／又はＮＫ細胞を活性化し、細胞傷害性応答の発生に関連する、ＩＬ−１２及び／若しくはＩＬ−１８が挙げられる。本開示の実施のために、混合リンパ球反応において応答リンパ球が、より少ない炎症性サイトカインを生成することが望ましい。したがって、特定の実施形態において、線維芽細胞が、応答リンパ球においてＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８の産生を誘発する場合の使用のために線維芽細胞が選択される。逆に、免疫抑制性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの評価も、本開示の状況において行われ得る。サイトカインには、Ｔｈ２細胞を刺激するインターロイキン４；とりわけ制御性Ｔ細胞を刺激するインターロイキン１０；及び炎症を阻害するＴＧＦ−Ｂが含まれる。
【０１１９】
本開示のいくつかの実施形態において、線維芽細胞の免疫原性を低下させるために、線維芽細胞の遺伝子改変が行われる。１つの方法は、免疫原性が低い細胞（例えば、未熟樹状細胞）による細胞質移行を含む遺伝子改変を提供する。別の実施形態において、炎症惹起遺伝子（例えば、ＨＬＡ又は共刺激分子、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＮＦ−アルファ、ＨＭＧＢ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７、ＦＡＰ、ＩＬ−１８、ＩＬ−３３又はそれらの組み合わせ）を選択的に切り取るために、遺伝子編集が利用される。
【０１２０】
本開示の特定の実施形態において、１つ以上の免疫調節剤が、真核細胞において作動可能な組換え発現ベクターを介してユニバーサルドナー線維芽細胞において発現され、その免疫調節剤の発現は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターによって制御され得る。具体的な実施形態において、そのベクターは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス又は単純ヘルペスウイルス）であるか、又はそのベクターは、非ウイルスベクター（例えば、裸のＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ又はミニサークルＤＮＡ）である。線維芽細胞へのトランスフェクション用の特定の目的のポリヌクレオチドとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｆａｓリガンド、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＨＬＡ−Ｇ、インドールアミン２，３デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ガレクチンファミリーメンバー、ガレクチン３、アルギナーゼ、ＩＬ−２０、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−１１、アンジオポエチン、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−１５又はそれらの組み合わせ。具体的な場合において、組換え発現される血管新生剤としては、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、ＴＧＦ−ベータ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＩＦＮ−ガンマ又はそれらの組み合わせが挙げられ得る。
【０１２１】
本開示の専門家が上記細胞を臨床において投与するための様々な品質管理の手段が当該分野で公知である。細胞の適格性に対する基準の例としては、フローサイトメトリーなどの手段を用いたマーカー識別、生存能及び／又はエンドトキシン含有量、並びに微生物汚染及びマイコプラズマ汚染に対する評価が挙げられる。
【０１２２】
本開示の１つの実施形態では、自己免疫障害又は炎症性障害を処置するために、ユニバーサルドナー線維芽細胞を個体に投与する。本開示のいくつかの実施形態では、細胞をエクスビボで培養し、免疫原性を低下させ、かつ抗炎症特性及び／又は免疫調節特性を刺激する条件に供する。追加の実施形態は、それらの細胞の投与を必要とする個体に、自己免疫状態及び／又は炎症状態を処置する目的でそれらの細胞を投与する方法に関する。
【０１２３】
本開示の特定の実施形態は、１つ以上の自己免疫状態又は炎症状態（例えば、急性散在性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、癒着性関節包炎、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、抗ＴＢＭ腎炎、関節線維症（ａｒｔｈｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心房線維症、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんま疹（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｕｒｔｉｃａｒｉａｌ）、軸索型及び神経型ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性ライム病、慢性再発性多発性骨髄炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ  ｏｓｔｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡（ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｌｄ）、肝硬変、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、クローン病、嚢胞性線維症、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト欠損症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｓ）、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、デュピュイトラン拘縮、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｆａｃｓｃｉｉｔｉｓ）、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎、家族性地中海熱、線維筋痛症  線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、多発血管炎性肉芽腫症（ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｓｕｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙａｎｇｉｔｉｓ）、グレーヴズ病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、肝炎、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸障害、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ケロイド、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬（ｌｉｃｈｅｎ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｏｌｙａｎｇｉｔｉｓ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、骨髄線維症、筋炎、ナルコレプシー、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腎性全身性線維症、視��経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、眼瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ−ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｌｄ）、視神経炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、連鎖球菌関連小児自己免疫神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ペーロニー病、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛（ｐｏｌｙｍｙａｌｇｉａ  ｒｈｅｍａｔｉｃａ）、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性塊状線維症、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎（ｒｅａｃｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、反射性交感神経性ジストロフィ、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子自己免疫及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群、１型糖尿病、Ｉ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、脈管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑及びヴェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる））を処置するための方法を提供する。
【０１２４】
本開示のある特定の方法は、少なくとも包皮線維芽細胞を含む線維芽細胞の免疫原性を低下させることに関する。ある特定の実施形態では、線維芽細胞を、血清又は血清代替物が補充された培地におけるエクスビボ培養物に再懸濁する。血清は、ウシ胎仔血清、ヒト血清及び／又は血清代替物をはじめとした任意の起源の血清であり得る。ある特定の実施形態において、ヒト血清又は血清代替物は、包皮フィーダー細胞に異種成分不含環境を提供するために利用される。１つの実施形態において、包皮線維芽細胞は、０．１〜５００単位／ミリリットル（ＩＵ／ｍｌ）の範囲の濃度（本明細書中の他の箇所に記載される濃度範囲を含む）のＩＦＮ−ガンマで処置される。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、治療有効量の改変された細胞が、１つ以上の免疫調節剤とともに個体に同時投与される。例示的な免疫調節剤としては、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、ｓＣＲ１、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、アスピリン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ｎ−アセチルシステイン、ラパマイシン、ＩＶＩＧ、ナルトレキソン、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、オーラノフィン、ジシアノ金、スルファサラジン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、エタネルセプト、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト−ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、シクロスポリン、ＩＦＮ−ガンマ、エベロリムス、ラパマイシン又はそれらの組み合わせが挙げられ得る。
【０１２６】
本開示の特定の実施形態は、急性散在性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、癒着性関節包炎、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、抗ＴＢＭ腎炎、関節線維症、心房線維症、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんま疹、軸索型及び神経型ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性ライム病、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、肝硬変、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、クローン病、嚢胞性線維症、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト欠損症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、デュピュイトラン拘縮、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎、家族性地中海熱、線維筋痛症  線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、多発血管炎性肉芽腫症、グレーヴズ病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、肝炎、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸障害、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ケロイド、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、骨髄線維症、筋炎、ナルコレプシー、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腎性全身性線維症、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、連鎖球菌関連小児自己免疫神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ペーロニー病、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、心���梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性塊状線維症、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィ、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子自己免疫及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群、１型糖尿病、Ｉ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、脈管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑及び多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）を含む１つ以上の自己免疫状態又は炎症状態を処置又は予防するための方法を提供する。
【０１２７】
免疫調節のための線維芽細胞の生育は、例えば、種々の組織培養培地において行われ得る。本開示の１つの実施形態において、それらの細胞を培養するための培地の１つとしては、ＤＭＥＭ−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含むダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）が挙げられる。ＤＭＥＭ−ＬＧには、ウシ胎仔血清及び／又はヒト血清などの血清が補充され得る。典型的には、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（例えば、規定のウシ胎仔血清，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ  Ｕｔａｈ）が、抗生物質／抗真菌薬（（好ましくは、１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００ミリグラム／ミリリットルのストレプトマイシン及び０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））及び０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）とともに加えられる。いくつかの場合では、種々の成長培地が使用されるか、又は種々の補充が行われ、これらは、通常、成長培地への補充として本文中に示される。ある特定の既知組成培地では、細胞は、血清が全く存在しない状態で生育され得る。そのような場合、細胞は、ある特定の成長因子を必要とすることがあり、その成長因子は、その細胞を支援及び維持するために培地に加えられ得る。無血清培地における生育のために加えられるべきある特定の因子としては、いくつかの場合において、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ及びＰＤＧＦのうちの１つ以上が挙げられる。いくつかの実施形態において、これらの因子のうちの２つ、３つ又は４つすべてが、無血清培地又は既知組成培地に加えられる。他の実施形態では、細胞の生育を支援又は改善するために、ＬＩＦが無血清培地に加えられる。
【０１２８】
Ｃ．エクスビボ培養における制御性Ｔ細胞の拡大
本例は、特定のＴ細胞の拡大に対する当該分野における長年にわたる必要性に対して解決策を提供する。
【０１２９】
制御性Ｔ細胞は、自己免疫攻撃から身体を守る免疫系の必須の成分である。これは、新生仔期に胸腺摘除されたマウスが全身性自己免疫に罹患する初期の研究によって説明されており、そのマウスは、ＣＤ４細胞の移入によってレスキューされた（Ｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。その後の研究から、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）表現型がＩＬ−２受容体ＣＤ２５を有すると特定されたが、この受容体が活性化Ｔ細胞上でも見られることを考えると、このことはいくらか問題である。末梢血は、制御性Ｔ表現型（「Ｔｒｅｇ」）を発現する、すなわち、ＣＤ４抗原とＣＤ２５抗原の両方が陽性であるＴ細胞リンパ球の小さな集団を含む。Ｔｒｅｇ細胞には、サブセットがいくつかある。制御性細胞のサブセットの１つは、胸腺において発達する。胸腺由来のＴｒｅｇ細胞は、細胞間接触を必要とする、サイトカインと無関係な機構によって機能する。それらは、自己寛容の誘導及び維持、並びに自己免疫の予防に必須である（Ｓｈｅｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これらの制御性細胞は、胸腺での除去を免れた又は胸腺外の抗原を認識する自己反応性Ｔ細胞の活性化及び増殖を妨げるので、制御性細胞は、ホメオスタシス及び免疫制御、並びに自己免疫の発生からの宿主の防御にとって極めて重要である。したがって、免疫制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、「プロフェッショナルサプレッサー細胞」と称されることが多い。Ｔｒｅｇ細胞による免疫の抑制は、いくつかの機構を通じて生じる。１つは、活性化Ｔ細胞の直接的な溶解であり（Ｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｇｏｎｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、もう１つは、樹状細胞成熟の阻害（Ｍｉｙａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ゆえに、免疫系の抗原提示細胞群がＴ細胞応答を惹起する又は永続化させる能力の阻害である。
【０１３０】
内因性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞（ｎＴｒｅｇ）は、胸腺において高親和性リガンドに対してポジティブ選択された細胞の独特の細胞集団であり、自己抗原に対する免疫寛容の確立及び維持において重要な役割を果たすと示された（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。これらの細胞の発達及び／又は機能の欠如は、ヒトにおいて及び先天性又は誘導性の自己免疫の様々な動物モデルにおいて重大な自己免疫に関連する。
【０１３１】
Ｔｒｅｇ細胞は、細胞間接触を介して直接的に、又は可溶性因子を介して間接的に、免疫寛容誘発の効果を発揮する。これらの細胞の抑制性の機構は、まだ完全に解明されていないが、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）におけるＩＬ−２発現の阻止、Ｔｅｆｆ細胞の物理的除去、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７軸を介した免疫寛容原性樹状細胞（ＤＣ）の誘導、並びにＴＧＦ−ベータ及びＩＬ−１０を介したＴｅｆｆ細胞の阻害が、現在までに関係していると見なされている機構の一部である。また、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０を介したＴｅｆｆ細胞への逆シグナル伝達が、Ｔｒｅｇ細胞によるそれらの阻害において重要な役割を果たすことも示されている。同様に、Ｔｒｅｇ細胞上のＣＴＬＡ−４とＤＣ上のＣＤ８０との相互作用が、逆シグナル伝達、及びトリプトファン代謝の制御を介した寛容に関わるインドールアミンジオキシゲナーゼ酵素のアップレギュレーションをもたらし得る。
【０１３２】
本開示の実施形態は、細胞療法を必要とする個体に細胞療法を提供するための、又は細胞療法を改善するための、組成物及び方法を提供する。実施形態は、細胞療法を必要とする個体（例えば、１つ以上の自己免疫疾患又は他の疾患を有する個体）に対する治療と、その治療をもたらす方法の両方を包含する。
【０１３３】
特定の実施形態において、ｎＴｒｅｇを含むＴｒｅｇが個体への治療に使用できるように、Ｔｒｅｇを拡大するための方法及び組成物が存在する。具体的な実施形態において、Ｔｒｅｇは、後にその細胞が望まれないタイプに復帰すること（例えば、ｎＴｒｅｇからＴエフェクター細胞への復帰）なく拡大される。したがって、そのような拡大の方法は、免疫調節特性（例えば、免疫抑制特性）の刺激に有用な細胞バンクの確立を可能にする。
【０１３４】
本開示の１つの態様において、ｎＴｒｅｇの拡大は、所望の細胞起源からｎＴｒｅｇを単離し、その後、それらの細胞を、線維芽細胞（又は線維芽細胞と他の作用物質との組み合わせ）において見られる一次シグナル及び共刺激シグナルの存在下の培養において拡大することによって、行われ得る。Ｔｒｅｇに対する一次シグナル及び共刺激シグナルの刺激に有用な作用物質は、本明細書中に記載されるように、可溶型で使用され得、線維芽細胞の表面に接着され得、かつ／又は表面に固定化され得る。
【０１３５】
１つの実施形態において、主要な作用物質と共刺激の作用物質の両方が、表面上に、例えば、基材（例えば、ビーズ）上又は操作された細胞上に同時に固定化される。１つの実施形態において、一次活性化シグナル（例えば、ＣＤ３リガンド（例えば、架橋抗体又はレクチン））及び共刺激分子（例えば、ＣＤ２８リガンド）を提供する分子が、同じ基材、例えば、粒子、ビーズ又は操作された細胞に結合されるか、又はロードされる。それらの細胞は、拡大されたら、自己免疫疾患を処置するために、単独で投与され得るか、又は１つ以上の他の免疫制御性細胞とともに投与され得る。
【０１３６】
別の実施形態において、本開示は、ｎＴｒｅｇなどのＴｒｅｇを、反復刺激手順を用いてかなりの数まで拡大する方法を提供する。一例として、ＣＤ４細胞などの同種異系ナイーブ細胞を、インターフェロンガンマ及び／又は多血小板血漿で培養された線維芽細胞とともに培養する。１つの実施形態において、ｎＴｒｅｇを拡大する方法は、例えば細胞サイズに基づいて、ｎＴｒｅｇを繰り返し刺激する工程を含む。具体的な場合において、細胞サイズが休止ｎＴｒｅｇのサイズとほぼ同じｎＴｒｅｇが、反復刺激のために選択される。いくつかの場合において、休止ｎＴｒｅｇのサイズは、約８．５μｍである。つまり、本発明は、細胞のサイズが、ｎＴｒｅｇの表現型及びサプレッサー活性を失うことなくｎＴｒｅｇの拡大の成功に寄与するパラメータであるという発見を包含する。別の実施形態において、ｎＴｒｅｇを拡大する方法は、特定の作用物質（例えば、ラパマイシン若しくはエベロリムス、又は哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の他の任意の阻害剤）の存在下においてｎＴｒｅｇを繰り返し刺激する工程を含む。ある特定の場合において、末梢血から単離されたｎＴｒｅｇは、ラパマイシンの存在下において再度刺激される。つまり、本発明は、線維芽細胞が共培養物に加えられる場合に、ラパマイシンがｎＴｒｅｇの表現型及びサプレッサー活性を失わずに末梢血から単離されたｎＴｒｅｇの拡大の成功に寄与する実施形態を包含する。特定の実施形態において、本開示の方法によって作製され、拡大された細胞は、ｎＴｒｅｇを示唆するＦｏｘｐ３プロファイルを維持する。１つの実施形態において、拡大されたｎＴｒｅｇの集団は、特異的な天然のＴｒｅｇマーカー（例えば、Ｆｏｘｐ３及び潜在関連ペプチド（ＬＡＰ））を発現し、Ｆｏｘｐ３遺伝子においてＴｒｅｇ特異的脱メチル化を示し、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１７を分泌する細胞をほとんど含まない。本開示の拡大された細胞は、例示的なコラーゲン誘発関節炎モデルにおいて観察されるように、自己免疫を抑制することもできる。他の実施形態において、活性な細胞集団の少なくとも一部が、後の移植／注入のために保存され得る。その集団は、ｎＴｒｅｇ集団の一部が後に利用するために保持され、一部が直ちに患者に適用されるように、２つ以上のアリコート又は単位に分割され得る。それらの細胞の全部又は一部の、細胞バンクにおける中期から長期にわたる保存も、本開示の範囲内である。本開示では、Ｔｒｅｇ及びｎＴｒｅｇが、本方法の状況において利用され得る。
【０１３７】
本開示の１つの実施形態では、インビトロ又はインビボにおいて生成されたＴｒｅｇ細胞は、宿主マイクロバイオームの調節によって、活性がさらに増強される。マイクロバイオームの調節は、プロバイオティクス及び／又はプレバイオティクスの投与によって行われ得る。腸管微生物叢が、Ｔｒｅｇ、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞の分化及び拡大を制御することによって宿主の免疫ホメオスタシスを駆動することは当該分野で公知である。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の欠乏によって、腸内菌共生バランス失調及び自己免疫が生じることが実証されている。マイクロバイオームをリモデリングする手段としては、自己免疫の動物モデルにおいて生存期間の延長及び多臓器炎症の低減と関連するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉの投与が挙げられる。本開示の１つの実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞の欠乏によって乱されたメタボロームプロファイルを変化させるために、及び／又はプリン代謝産物であるイノシンのレベルを回復させるために、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉが投与される。したがって、本開示の１つの実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞の生成とともにイノシンを投与することが、高い抑制活性を刺激するために利用され、それにより自己免疫が処置される。イノシンを投与する手段及びＴｒｅｇ細胞を増強するためのマイクロバイオームの調節は、以下の論文（参照により援用される）に記載されている：Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｈｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｔｈａｋｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｈａｉｌｅｓｅｌａｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｎａｒｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｍｅｒｃａｄａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｂａｒｌｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｍｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｓｍｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｊｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌｏｐｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｆｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｌａｖａｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；ｄｅ  Ｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｋａｒｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；及びＦｅｌｅｓｚｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７。
【０１３８】
１つの実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は、線維芽細胞の存在下における、成熟した末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化によって生成される。いくつかの実施形態では、免疫調節に関連する条件下で線維芽細胞を培養する。研究から、末梢由来のＴｒｅｇ細胞は、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ベータ）及びＩＬ−１０などの免疫抑制性サイトカインを産生することによって、それらのＴｒｅｇ細胞の阻害活性を媒介することが示唆されている。したがって、１つの実施形態において、線維芽細胞とＴ細胞との共培養が、様々な濃度及びレベルのＴＦＧ−ベータ及びＩＬ−１０において行われ、最適なＴｒｅｇ生成条件を選択するためのマーカーとして評価される。ＩＬ−１０及びＴＧＦ−ベータの産生に基づく免疫寛容誘発活性の評価は、以下の論文に記載されており、参照により援用される：Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：１０８０；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：６２９−６４４）。いずれにしても、本開示の実施形態は、線維芽細胞及び／又はＴ細胞をＴＧＦ−ベータ及び／又はＩＬ−１０に曝露して、Ｔｒｅｇを効果的に生成する方法を含む。
【０１３９】
本開示の１つの実施形態において、インビトロでＴｒｅｇ細胞を拡大する既存の方法は、線維芽細胞をフィーダー細胞層として利用するという適合を行って利用される。本開示の実施に有用な線維芽細胞の濃度は、典型的には、１個のＴ細胞に対する１個の線維芽細胞から、１個の線維芽細胞に対する１００個のＴ細胞（又はそれらの近似値）にまで及ぶ。さらに特定の実施形態では、線維芽細胞とＴ細胞との比は、１個のＴ細胞に対しておよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超える線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２などの１つ以上の成長因子の添加が、拡大される線維芽細胞及び／又はＴ細胞の曝露のために加えられる。線維芽細胞の非存在下でＴｒｅｇ細胞を培養する手段は、Ｔｒｅｎａｄｏらによって提供されており、彼らは、エクスビボで活性化及び拡大されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性細胞のインビボ疾患マウスモデルにおける治療効果の評価を初めて報告した（Ｔｒｅｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２（１１）：１６８８−１６９６）。
【０１４０】
本開示の１つの実施形態において、処置された線維芽細胞が、Ｔｒｅｇ細胞のインビトロ又はインビボでの拡大のために間葉系幹細胞に取って代わるために用いられるが、いくつかの場合では、その両方が利用される。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いたインビトロでのＴｒｅｇの作製を誘導する手段は、本開示によると、間葉系幹細胞を線維芽細胞で置き換えることによって適応できる手法に取って代わられる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと）。以前の研究では、間葉系幹細胞は、細胞増殖に関連する成長因子（例えば、ＦＧＦ（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｃｏｕｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ＶＥＧＦ（Ｋｉｎｎａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｋｉｎｎａｒｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ＩＧＦ−１（Ｍｏｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）及びＨＧＦ（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５））を産生できることが実証された。実際に、ＭＳＣフィーダー細胞層は、これまで、造血性幹細胞（Ｗａｌｅｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）及び多能性幹細胞（Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を未分化な状態で維持しつつ、これらの細胞を拡大するために使用されてきた。さらに、ＭＳＣは、インビトロ（Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｌｕｚ−Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｅｒｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｅｎｇｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）及びインビボ（Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｔｒｅａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）でのＴｒｅｇ細胞の作製を促進すると実証されている。本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞は、ＭＳＣの代替物として利用される。
【０１４１】
本開示の一般的な実施形態は、１つ以上の作用物質への曝露後及び／又は改変された線維芽細胞を含む線維芽細胞への曝露後の免疫細胞の拡大に関する改善された方法、システム及び組成物を提供する。具体的な実施形態では、ＩＦＮ−ガンマ、多血小板血漿（ヒトを含む）又はそれらの組み合わせに曝露された線維芽細胞に曝露するときに、例えばエクスビボ培養において、制御性Ｔ細胞の集団を拡大する方法が、本明細書中に提供される。
【０１４２】
ある特定の実施形態において、本開示の治療方法又は予防方法において利用される、制御性Ｔ細胞などのＴ細胞は、それらを含む組織（例えば、胸腺、末梢血、月経血、脂肪組織、骨髄、胎盤、臍帯血、脳脊髄液又はそれらの組み合わせ）から単離され、具体的な場合において、それらのＴ細胞は、本開示の方法を用いて拡大されるときには、それらのＴ細胞を投与されることになっている個体から単離される。具体的な場合では、それらのＴ細胞は、１つの個体の組織から得られ、それらの細胞は、本開示の方法を用いて拡大され、次いで、異なる個体に提供される。他の場合では、線維芽細胞に曝されるＴ細胞は、別の方法で、例えば、商業的に、入手され得る。
【０１４３】
具体的な実施形態において、Ｔ細胞の集団は、線維芽細胞（改変された線維芽細胞を含む）並びに必要に応じて１つ以上のさらなる作用物質及び／又は条件を含む１つ以上の組成物に１回以上曝される。具体的な実施形態において、改変された線維芽細胞は、少なくともＩＦＮ−ガンマに曝露された線維芽細胞である。線維芽細胞の曝露は、それらの線維芽細胞及び／又はＩＦＮ−ガンマが、外から個体に提供されるのであれば（身体内において、改変されていない天然の状況でＩＦＮ−ガンマに曝露される線維芽細胞とは対照的に）、エクスビボで行われてもよいし、インビボで行われてもよい。特定の実施形態において、線維芽細胞は、上記方法の少なくとも１つの工程において、人間の手で操作される。
【０１４４】
ある特定の実施形態において、線維芽細胞は、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、脳及び／又は包皮を含む組織に由来し得る。具体的な実施形態において、線維芽細胞は、胎盤、胎児、新生児若しくは成体の線維芽細胞又はそれらの混合物である。追加の実施形態において、培養物における線維芽細胞とＴ細胞との比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、２００：１、３００：１などの比を含む。特定の実施形態において、共培養物における線維芽細胞とＴ細胞との比は、２：１である。代替の実施形態において、培養物におけるＴ細胞と線維芽細胞との比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、２００：１、３００：１などの比を含む。
【０１４５】
特定の実施形態において、Ｔ細胞及び改変された線維芽細胞（並びに／又は１つ以上のさらなる作用物質及び／若しくは条件）の組成物を含む共培養物は、ＣＤ３リガンド（例えば、架橋抗体又はレクチン）、ＣＤ２８リガンド（例えば、ＣＤ８０又はＣＤ８６又は架橋抗体）、ラパマイシン、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−２、ｈＣＧ、ＰＧＥ−２、エストロゲン、プロゲステロン、サリチル酸、エベロリムス又はそれらの組み合わせを含む１つ以上のさらなる作用物質を含み得る。具体的な実施形態において、１つ以上のさらなる作用物質は、線維芽細胞とともに溶液中に存在し、線維芽細胞の表面に接着されており、ビーズに固定化されており、操作された細胞（例えば、１つ以上の共刺激分子及び／又は１つ以上の架橋抗体及び／又は１つ以上の（ｍｏｒｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）操作された受容体（例えば、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体）を発現するように操作された、線維芽細胞又はＣＨＯ細胞）の表面に固定化されており、かつ／又は線維芽細胞内で発現されている。
【０１４６】
具体的な実施形態において、制御性Ｔ細胞は、同種異系ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８細胞、ガンマデルタＴ細胞又はそれらの混合物に由来する。
【０１４７】
追加の実施形態において、線維芽細胞が曝露される組成物は、その組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％の濃度でヒト多血小板血漿を含む。
【０１４８】
具体的な実施形態において、制御性Ｔ細胞の集団は、約７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１２、１０〜１１又は１１〜１２μｍの直径を有するように選択される。直径は、７、８、９、１０、１１又は１２μｍであり得る。特定の場合において、制御性Ｔ細胞の集団の大部分は、約８．５μｍの直径を有する。他の場合において、その集団中の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超える細胞が、約７〜１２μｍの直径を有する。
【０１４９】
改変された線維芽細胞に曝露したときのＴｒｅｇ細胞の拡大後、作製された制御性Ｔ細胞集団は、利用されてもよいし、後の使用のために保存されてもよい。追加の実施形態は、少なくとも１つのアリコートが、後の使用のために貯蔵され、少なくとも１つのアリコートが、自己免疫状態又は炎症状態を処置するために個体に投与されるように、細胞集団を２つ以上のアリコートに分割するための手段を提供する。
【０１５０】
追加の実施形態は、制御性Ｔ細胞が少なくとも１つの自己免疫状態又は炎症状態を処置するために個体に投与される方法に関する。いくつかの場合では、調製されたＴ細胞集団の一部が、１つの状態を処置するために１つの個体に提供される一方で、調製されたＴ細胞集団の別の一部が、同じ又は異なる自己免疫状態又は炎症状態を処置するために別の個体に提供される。
【０１５１】
特定の実施形態において、調製されたＴ細胞集団は、自己免疫状態又は炎症状態（例えば、急性散在性脳脊髄炎、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、癒着性関節包炎、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、抗ＴＢＭ腎炎、関節線維症、心房線維症、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんま疹、軸索型及び神経型ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（ＣＩＤＰ）、慢性ライム病、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、肝硬変、コーガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、クローン病、嚢胞性線維症、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト欠損症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、デュピュイトラン拘縮、子宮内膜症、心内膜心筋線維症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、実験的アレルギー性脳脊髄炎、家族性地中海熱、線維筋痛症  線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞心筋炎、糸球体腎炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、多発血管炎性肉芽腫症、グレーヴズ病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、肝炎、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸障害、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ケロイド、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、縦隔線維症、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、骨髄線維症、筋炎、ナルコレプシー、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、腎性全身性線維症、視神経脊髄炎（デビック病）、好中球減少症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルグ症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、連鎖球菌関連小児自己免疫神経精神疾患（ＰＡＮＤＡＳ）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ペーロニー病、ＰＯＥＭＳ症候群、���節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、進行性塊状線維症、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィ、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子自己免疫及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、高安動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群、１型糖尿病、Ｉ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩ型多腺性自己免疫症候群、ＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、ブドウ膜炎、脈管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑又はヴェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）など）を有する個体に提供される。
【０１５２】
特定の実施形態において、制御性Ｔ細胞は、１つ以上のさらなる免疫制御性細胞（例えば、未熟樹状細胞、ＮＫＴ細胞、ＴＲ１細胞、ガンマデルタＴ細胞、ＣＤ５Ｂ細胞又はそれらの混合物）とともに個体に投与される。
【０１５３】
追加の実施形態において、制御性Ｔ細胞は、個体に１つ以上の免疫調節剤（例えば、イノシン、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、ｓＣＲ１、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、アスピリン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ｎ−アセチルシステイン、ラパマイシン、ＩＶＩＧ、ナルトレキソン、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、オーラノフィン、ジシアノ金、スルファサラジン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、エタネルセプト、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト−ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、シクロスポリン、ＩＦＮ−ガンマ、エベロリムス、ラパマイシン又はそれらの組み合わせ）と同時投与され得る。
【０１５４】
本開示の具体的な実施形態は、細胞が提供される個体（「宿主」）のマイクロバイオームの調節によって、投与される制御性Ｔ細胞（いくつかの場合では、改変された線維芽細胞に加えて）を改変することを含む。特定の実施形態において、宿主のマイクロバイオームは、１つ以上のプレバイオティクス及び／又は１つ以上のプロバイオティクスを含む組成物によって調節される。宿主のマイクロバイオームは、拡大されたＴ細胞の送達前、送達中及び／又は送達後に線維芽細胞によって改変され得、宿主におけるマイクロバイオームの改変は、１つ以上の微生物の経口消費、直腸への移植及び／又は糞便移植などによって行われ得る。具体的な実施形態において、宿主のマイクロバイオームは、１つ以上の細菌を宿主に加えることによって改変される。
【０１５５】
特定の実施形態において、１つ以上のプロバイオティクスを含む組成物が宿主に提供され、ここで、そのプロバイオティクスは、Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ａｎａｅｒｏｆｕｓｔｉｓ、Ａｎａｅｒｏｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｙａｎｔｅｌｌａ、Ｂｕｌｌｅｉｄｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｏｃｃｕｓ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ、Ｃｏｐｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｏｒｅａ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｆｌｅｘｉｓｔｉｐｅｓ、Ｆｕｌｖｉｍｏｎａｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｍｍｉｇｅｒ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｏｌｄｅｍａｎｉａ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｎｉｆａｃｔｏｒ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｕｔｉｓｐｏｒａ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎｉｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ａｃｅｔｏｎｅｍａ、Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ、Ａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ、Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｉｂｒａｃｈｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ｃｏｈｎｅｌｌａ、Ｄｅｎｄｒｏｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉ���ｐｈｉｌｕｍ、Ｈｅｌｉｏｒｅｓｔｉｓ、Ｌａｃｈｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｏｒｅｎｉａ（Ｓ．）、Ｏｘａｌｏｐｈａｇｕｓ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｌｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｓｐｏｒａ、Ｓｐｏｒｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ、Ｓｐｏｒｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂｏｔｕｌｕｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｓｐｏｒａ、Ｔｅｒｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｎｕｓ又はそれらの組み合わせを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる。特定の実施形態において、プロバイオティクスの組成物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉを含む。
【０１５６】
ある特定の実施形態において、プロバイオティクス組成物は、せいぜい１、せいぜい２、せいぜい３、せいぜい４、せいぜい５、せいぜい６、せいぜい７、せいぜい８、せいぜい９、せいぜい１０、せいぜい１１、せいぜい１２、せいぜい１３、せいぜい１４、せいぜい１５、せいぜい１６、せいぜい１７、せいぜい１８、せいぜい１９、せいぜい２０、せいぜい５０又はせいぜい１００のプロバイオティクスを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得る。ある特定の実施形態において、プロバイオティクス組成物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも５０又は少なくとも１００のプロバイオティクスを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得る。
【０１５７】
特定の実施形態において、上記組成物は、１〜１００；１〜５０；１〜２０；１〜１０；２〜１０；３〜１０；４〜１０；５〜１０；６〜１０；７〜１０；８〜１０；９〜１０；１〜９；２〜９；３〜９；４〜９；５〜９；６〜９；７〜９；８〜９；１〜８；２〜８；３〜８；４〜８；５〜８；６〜８；７〜８；１〜７；２〜７；３〜７；４〜７；５〜７；６〜７；１〜６；２〜６；３〜６；４〜６；５〜６；１〜５；２〜５；３〜５；４〜５；１〜４；２〜４；３〜４；１〜３；２〜３；又は１〜２タイプのプロバイオティクスを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得るか；又はただ１つのタイプのプロバイオティクスだけが存在する。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、プロバイオティクス組成物は、宿主に送達される組成物中に存在する他の任意のタイプのプロバイオティクスよりも少なくとも又はせいぜい２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍又は１００倍超多い量で存在する１つのタイプのプロバイオティクスを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
【０１５９】
特定の実施形態において、プロバイオティクス組成物中のプロバイオティクスの大部分が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉである。選ばれた実施形態において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉは、プロバイオティクス組成物中の少なくとも又はせいぜい２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％又は９９％超のプロバイオティクスを構成する。
【０１６０】
ある特定の実施形態において、組成物中のプロバイオティクスの相対的存在は、１：１又は１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５；１：５０；１：７５、１：１００、１：２００、１：５００、１：１０００、１：１０，０００、１：１００，０００の比又は１：１００，０００を超える比を含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる、第１のタイプのプロバイオティクスと第２のタイプのプロバイオティクスとの比として表現される。
【０１６１】
特定の実施形態において、１つ以上のプレバイオティクスが、線維芽細胞で拡大されたＴ細胞を投与される個体に与えられる。プレバイオティクス組成物のプレバイオティクスは、アラビノキシラン、キシロース、可溶性繊維デキストラン、可溶性トウモロコシ繊維、ポリデキストロース、ラクトース、Ｎ−アセチル−ラクトサミン、グルコース、ガラクトース、フルクトース、ラムノース、マンノース、ウロン酸、３’−フコシルラクトース、３’シアリラクトース、６’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、２’−２’−フコシルラクトース、アラビノース、フルクトース、フコース、ラクトース、ガラクトース、グルコース、マンノース、Ｄ−キシロース、キシリトール、リボース、キシロビオース、スクロース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、トレハロース、セロビオース及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるモノマー又はポリマーを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得る。
【０１６２】
ある特定の実施形態において、上記組成物は、せいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０又は３５のタイプのプレバイオティクスを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得る。ある特定の実施形態において、上記組成物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０又は少なくとも３５のタイプのプレバイオティクスを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得る。
【０１６３】
追加の実施形態において、プレバイオティクス組成物は、１〜３５；１〜３０；１〜２５；１〜２０；１〜１０；２〜１０；３〜１０；４〜１０；５〜１０；６〜１０；７〜１０；８〜１０；９〜１０；１〜９；２〜９；３〜９；４〜９；５〜９；６〜９；７〜９；８〜９；１〜８；２〜８；３〜８；４〜８；５〜８；６〜８；７〜８；１〜７；２〜７；３〜７；４〜７；５〜７；６〜７；１〜６；２〜６；３〜６；４〜６；５〜６；１〜５；２〜５；３〜５；４〜５；１〜４；２〜４；３〜４；１〜３、２〜３；又は１〜２のタイプのプレバイオティクスを含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから本質的になり得るか；又は１つのタイプのプレバイオティクスが存在する。
【０１６４】
特定の実施形態において、プレバイオティクス組成物は、その組成物中に存在する他の任意のタイプのプレバイオティクスよりも少なくとも又はせいぜい２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍又は１００倍超多い量で存在する少なくとも１つのタイプのプレバイオティクスを含み得るか、それからなり得るか、又はそれから本質的になり得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、上記組成物中の１つ以上のプレバイオティクスは、少なくとも１μＭ又は少なくとも２μＭ又は少なくとも３μＭ又は少なくとも４μＭ又は少なくとも５μＭ又は少なくとも６μＭ又は少なくとも７μＭ又は少なくとも８μＭ又は少なくとも９μＭ又は少なくとも１０μＭ又は少なくとも２０μＭ又は少なくとも３０μＭ又は少なくとも４０μＭ又は少なくとも５０μＭ又は少なくとも６０μＭ又は少なくとも７０μＭ又は少なくとも８０μＭ又は少なくとも９０μＭ又は少なくとも１００μＭ又は少なくとも１５０μＭ又は少なくとも２００μＭ又は少なくとも２５０μＭ又は少なくとも３００μＭ又は少なくとも３５０μＭ又は少なくとも４００μＭ又は少なくとも４５０μＭ又は少なくとも５００μＭ又は少なくとも５５０μＭ又は少なくとも６００μＭ又は少なくとも６５０μＭ又は少なくとも７００μＭ又は少なくとも７５０μＭ又は少なくとも８００μＭ又は少なくとも８５０μＭ又は少なくとも９００μＭ又は少なくとも９５０μＭ又は少なくとも１ｍＭ又は少なくとも２ｍＭ又は少なくとも３ｍＭ又は少なくとも４ｍＭ又は少なくとも５ｍＭ又は少なくとも６ｍＭ又は少なくとも７ｍＭ又は少なくとも８ｍＭ又は少なくとも９ｍＭ又は少なくとも１０ｍＭの濃度で存在する。
【０１６６】
Ｄ．肝臓の病状の処置
本開示の実施形態は、肝不全などの肝臓の病状の処置又は予防を必要とする個体において肝臓再生プロセスを増強するためのものを含む、肝臓の病状の処置又は予防の分野に関する。より詳細には、本開示は、少なくともいくつかの場合では同時に肝線維症を低減しつつ、肝臓再生を刺激する免疫調節特性を付与された線維芽細胞の利用に関する。
【０１６７】
肝不全は、医療制度に対する大きな負担であり、先進工業国における死因の第７位である。現在までのところ、肝不全に対する唯一の治療法は移植であるが、移植は、ドナー不足及び慢性免疫抑制の有害作用によって非常に限られたものになっている。現在、幹細胞療法が、肝不全の処置のために開発中であるが、これらには、数多くの欠点がある。胚性幹細胞及びｉＰＳ由来幹細胞はすべて、大量に生育することが困難であり、発癌又は奇形腫形成の可能性がある。さらに、肝臓の微小環境における異所性の組織分化が、壊滅的な結果をもたらす可能性がある。成体幹細胞は、いくらかの臨床的有用性を誘導する可能性をもたらすが、しかしながら、現在のところ、反応は顕著でない。これは一部には、成体幹細胞が完全に肝臓組織に取って代わることができないことが理由である。本開示は、成体幹細胞によるかそれとも免疫細胞によるかを問わず、例えば、肝不全を阻害して疾患の後退を誘導する手段としての免疫調節を包含する。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、有効量の、免疫細胞に曝露された線維芽細胞集団；間葉系幹細胞、ＣＤ３４＋細胞；極小胚様幹細胞；セルトリ細胞；又はそれらの混合物を個体に提供することによって、その個体における肝不全を処置する方法が存在する。
【０１６９】
本開示の１つの態様において、高い肝原性活性（ｈｅｐａｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）で予備刺激された線維芽細胞が、正常な肝臓再生のプロセスを加速する又は正常な肝臓再生のプロセスを線維症から守るなどのために、肝臓の病状を有するか又は有するリスクがある個体に提供される。肝臓は最大７０％切除しても、完全な再生がもたらされることが実証されている（Ｆａｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ，２０１１）。しかしながら、これは、肝細胞の増殖の阻害が存在しない場合である。これらの場合では、肝臓は、オーバル細胞の増殖に依存する。
【０１７０】
本開示の１つの態様では、個体が、生体ドナー移植、２段階肝切除術及び／又は分割肝移植（これらは、様々な肝臓病理又は線維症を有するある特定の個体に対しては不可能であり得る）などの手技を受けられるようにするために、予備刺激された線維芽細胞が投与される。
【０１７１】
本開示に従って予め活性化された又は「予備刺激された」線維芽細胞を使用することによって介入を行うことができる肝臓再生には３段階あり、その３段階は、以下である：ａ）予備刺激；ｂ）増殖；及びｃ）終結（Ｆａｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。肝細胞は、最終分化細胞ではなく、増殖休止の状態で存在する細胞であることに注意することが重要である。詳細には、肝細胞は、それらが通常、細胞周期のＧ０期にあるという点において、造血幹細胞などの他の再生細胞と特長を共有する。これは、肝臓再生中に変化する。古典的な肝臓再生は、肝不全などのある特定の状況では肝細胞によって媒介されるが（Ｆａｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｍｉｙａｏｋａ  ａｎｄ  Ｍｉｙａｊｉｍａ，２０１３）、肝細胞が再生を媒介する能力は限られており、肝臓前駆細胞（ＬＰＣ）がこのプロセスを行わなければならない。
【０１７２】
肝臓外の細胞起源が再生に寄与し得る可能性とともに、肝臓の強力な再生性の性質を考慮して、肝不全を処置するために細胞療法を利用する試みが数多く行われてきた。当初の肝臓の細胞療法は、同種異系肝細胞の投与を必要とし、これは、３０年以上前に動物モデルにおいて試みられ、実験的に臨床で用いられている。残念なことに、この手順を日常的に使用できないようにする大きな障害がある。本開示の具体的な実施形態において、ＬＰＣの刺激は、これらの細胞に対して成長因子の支援を提供する免疫細胞の投与によって行われ得る。特定の実施形態において、これは、ＨＧＦ及び他の肝原性の成長因子が増加するように培養された臍帯血単核細胞又は単球の投与を含む。
【０１７３】
ＭＳＣは、肝不全に対していくらかの活性を有することができることが当該分野で知られているが、しかしながら、これらは臨床現場で適切に利用されていない。本開示の実施形態では、肝不全の処置に対して最適化された治療効果を誘導するように、ＭＳＣを免疫学的に操作する。クリニカルトランスレーション（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）の点からは、骨髄ＭＳＣが最先端であるが、特定の条件に有用であり得る様々な特性を有する他のいくつかのＭＳＣ起源が知られている。骨髄は、肝臓再生にも使用されている造血幹細胞（ＨＳＣ）の起源でもある。同様に、ヒト胎盤は、容易に入手可能な大量のＭＳＣの起源であり、それらのＭＳＣは、インビトロにおいて分化し得る。最後に、組織再生能を有するＭＳＣは、脂肪組織からも単離され得、多数が肝細胞に誘導され得る。
【０１７４】
脂肪組織は、以下の理由：ａ）脂肪由来細胞の抽出は、骨髄抽出よりもかなり低侵襲性の簡便な手順である；ｂ）脂肪組織は、骨髄と比べて間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の含有量が多く、ゆえに、インビトロでの拡大に必要な時間がより短い；及びｃ）脂肪組織由来のＭＳＣは、加齢に伴って数が減少しない（Ｓｔｒｉｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｙｉ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，２０１２；Ｍｏｓｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）ということから、変性状態全般及び詳細には肝不全を処置するための幹細胞の起源として、魅力的な骨髄代替物である（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｐｕｇｌｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ，．２０１１）。
【０１７５】
本開示の方法において利用されるＭＳＣは、脂肪組織、肝臓組織、胎盤由来組織、臍帯由来組織、月経血由来組織、末梢血由来組織、胎盤（ｐａｃｅｎｔａｌ）由来組織などをはじめとした任意の組織を起源とし得る。本発明の１つの実施形態において、ＭＳＣは、肝臓再生のプロセスを加速させるため、及び／又は線維性組織の後退を誘導するために、内皮細胞及び／又は内皮前駆細胞とともに利用される。
【０１７６】
実際に、免疫調節に脂肪組織ＭＳＣ（ＡＴ−ＭＳＣ）を使用するためにそれらに免疫調節遺伝子をトランスフェクトすることは、本開示の状況の範囲内である。本開示の方法の実施にとって有用な選択された遺伝子は、調節が求められる肝臓再生の段階に依存する。例えば、強い予備刺激が求められる場合、ＩＬ−６、補体成分であるＣ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ３ａ及び／若しくはＣ３ｂ、又はＴＬＲ活性化物質（例えば、ＢＣＧ、イミキモド（ｉｍｉｑｉｍｏｄ）、ベータ−グルカン、ｈｓｐ６５、ｈｓｐ９０、ＨＭＧＢ−１、リポ多糖、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ポリＩ：ポリＣ、フラジェリン、ＭＡＬＰ−２、イミダゾキノリン  レシキモド、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ザイモザン、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、グラム陽性菌由来のリポタンパク質、マイコバクテリア由来のリポアラビノマンナン、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸、モノホスホリルリピドＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、８５２Ａ、リンタトリモド（ｒｉｎｔａｔｏｌｉｍｏｄ）、ガーディキモド及びリポ多糖ペプチド）をＭＳＣにトランスフェクトし得る。増殖期の増強が求められる場合、成長因子（例えば、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ又はＰＤＧＦ）をＭＳＣにトランスフェクトし得る。抗線維化機構の刺激が求められる場合、様々なＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９）を細胞にトランスフェクトし得る。
【０１７７】
具体的な実施形態において、使用される骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）は、本開示によって包含される方法において利用される。特定の実施形態において、ＢＭＭＣは、ＣＤ１３３陽性及び／又はＣＤ３４陽性である。ＭＭＰは、局所環境を変化させるために線維性組織を切断することができるだけでなく、肝臓再生にとって重要な血管新生において役割を果たすので、肝臓再生に重要である（Ｂｅｌｌａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍａｌｅｍｕｄ，２００６；Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。したがって、ＭＭＰ発現を刺激する作用物質とこの実施形態の状況におけるＭＳＣとの組み合わせは、治療的な混合物となる。
【０１７８】
間葉系幹細胞の様々な集団が、本開示の実施形態を実施するために使用され得る。骨髄、脂肪又は臍帯に由来する間葉系幹細胞に加えて、羊膜間葉系幹細胞が、免疫調節細胞として利用され得る。１つの具体的な実施形態では、羊膜の８×８ｃｍ２切片を入手する。その切片を、３００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び３００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含む１．０Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）で洗浄し、直ちに、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）、３００ＩＩＵ／ｍｌペニシリン及び３００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）−高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）に浸漬する。すべてのサンプルを、回収後１２〜１５時間以内に処理する。羊膜を、１．０Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の０．１％コラゲナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で処置し、３７℃で２０分間インキュベートする。各羊膜を、低グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で３回洗浄し、その羊膜を静かにマッサージした後、剥離した細胞を回収する。その細胞を３７℃、３００ｇで１０分間遠心し、その後、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、次いで、２５ｃｍ２フラスコにおいて１×１０６細胞／ｍｌの密度で生育する。２４時間のインキュベーション後、非接着細胞を除去する。培養培地は、３日ごとに交換する。８０〜９０％コンフルエンスに達するまで、接着細胞を培養する。その後、細胞を、純度（例えば、＞９０％ＣＤ９０及びＣＤ１０５陽性）、無菌性（例えば、エンドトキシン及びマイコプラズマ／細菌汚染が無いこと）及び効力（例えば、ＩＦＮ−ガンマなどの炎症性サイトカインの産生を抑制することによってインビトロにおいて免疫調節する能力）を含む品質管理手順に基づいて選択する。その後、細胞は、外リンパ投与又はリンパ管内投与のために利用され得る。本開示は、胎盤／臍帯、骨髄、皮膚又は歯髄組織に由来する天然に存在するＭＳＣ集団の回収及び送達を企図する。本開示によると、ＭＳＣは一般に、フローサイトメトリーによって検出されるとき、マーカーＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し（＞９０％）、ＣＤ３４及びＣＤ４５及びＭＨＣクラスＩＩを発現しない（＜５％）、接着細胞集団であり得るが、本明細書中に記載される他のマーカーも利用され得る。
【０１７９】
上述した組織のいずれかを起源とする細胞に対する細胞拡大は、細胞療法用の製造を目的として構築され、ＧＭＰのクリーンルーム等級を満たす、クリーンルーム施設において行われ得る。クラス１０，０００のクリーン製造室（ｃｌｅａｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｕｉｔｅ）に配置された滅菌されたクラスＩＩ生物学的安全キャビネットにおいて、細胞を、制御された条件下で解凍し、１５ｍＬコニカルチューブ内において、１００ＥＵ／ｍＬ以下のエンドトキシンレベル（慣例的には１０ＥＵ／ｍＬ以下のレベル）及び３０ｍｇ／ｄｌ以下のヘモグロビンレベル（慣例的には２５ｍｇ／ｄｌ以下のレベル）を有すると明示された、ＢＳＥ％ウシ胎仔血清を有しないことが確認された乳牛由来の２０％ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｓ）が補充された１０ＭＬのＤＭＥＭ−低グルコース完全培地（ｃＤＭＥＭ）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）で洗浄した。使用した血清ロットを取っておき、すべての実験に対して１つのロットを使用した。その後、細胞を、４５ｍＬのｃＤＭＥＭを含むＴ−２２５フラスコに入れ、十分加湿された雰囲気において、３７℃、５％ＣＯ２において２４時間培養する。これにより、ＭＳＣは接着が可能になった。ｃＤＭＥＭを用いてフラスコを軽くすすぐことによって、非接着性細胞を洗浄除去した。これにより、開始Ｔ−２２５フラスコ１つあたりおよそ６００万個の細胞が得られた。次いで、第１のフラスコの細胞を４つのフラスコに分割した。細胞を４日間生育した後、フラスコ１つあたりおよそ６００万細胞（合計で２４００万細胞）が得られた。このスキームを繰り返したが、細胞は、継代が１０回を超えて拡大することはなく、次いで、送達用の密封バイアルに６００万個の細胞を入れたアリコートとして預けた。作製、拡大及び製品製造におけるすべてのプロセスを、現行のＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｓｓ及び適切な管理、並びに１９９８年にＦＤＡが発行したガイダンスであるＧｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；ｔｈｅ  ２００８  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ＦＤＡ  Ｒｅｖｉｅｗｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｐｏｎｓｏｒｓ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＭＣ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＩＮＤｓ）に準拠した条件下及び試験において行った。記載されている細胞生成物の作製については、マスター細胞バンクに関する１９９３年のＦＤＡの留意事項書類にすべて従った。ドナー細胞を滅菌条件において回収し、契約製造施設に発送し、混入が無いことについて評価し、拡大する。拡大した細胞を、クライオバイアルにおいて、およそ６００万細胞／バイアルで保存する（１ドナーあたりおよそ１００本のバイアル）。拡大の各工程において、混入又は異常な細胞増殖が無いことを保証するために、品質管理手順を配置した。
【０１８０】
具体的な実施形態において、間葉系幹細胞は、高い免疫調節特性を有するように最適化される。１つの実施形態において、これは、間葉系幹細胞を低酸素条件に曝露することによって行われ得る。詳細には、低酸素条件は、１０％より低い酸素レベルを含み得る。いくつかの実施形態において、低酸素条件は、約７％までの酸素を含む。例えば、低酸素条件は、最大約７％、最大約６％、最大約５％、最大約４％、最大約３％、最大約２％の酸素又は最大約１％の酸素を含み得る。別の例として、低酸素条件は、最大７％、最大６％、最大５％、最大４％、最大３％、最大２％又は最大１％の酸素を含み得る。いくつかの実施形態において、低酸素条件は、約１％の酸素から約７％までの酸素を含む。例えば、低酸素条件は、約１％の酸素から約７％までの酸素；約２％の酸素から約７％までの酸素；約３％の酸素から約７％までの酸素；約４％の酸素から約７％までの酸素；約５％の酸素から約７％までの酸素；又は約６％の酸素から約７％までの酸素を含み得る。別の例として、低酸素条件は、１％の酸素から７％までの酸素；２％の酸素から７％までの酸素；３％の酸素から７％までの酸素；４％の酸素から７％までの酸素；５％の酸素から７％までの酸素；又は６％の酸素から７％までの酸素を含み得る。別の例として、低酸素条件は、約１％の酸素から約７％までの酸素；約１％の酸素から約６％までの酸素；約１％の酸素から約５％までの酸素；約１％の酸素から約４％までの酸素；約１％の酸素から約３％までの酸素；又は約１％の酸素から約２％までの酸素を含み得る。別の例として、低酸素条件は、１％の酸素から７％までの酸素；１％の酸素から６％までの酸素；１％の酸素から５％までの酸素；１％の酸素から４％までの酸素；１％の酸素から３％までの酸素；又は１％の酸素から２％までの酸素を含み得る。別の例として、低酸素条件は、約１％の酸素から約７％までの酸素；約２％の酸素から約６％までの酸素；又は約３％の酸素から約５％までの酸素を含み得る。別の例として、低酸素条件は、１％の酸素から７％までの酸素；２％の酸素から６％までの酸素；又は３％の酸素から５％までの酸素を含み得る。いくつかの実施形態において、低酸素条件は、約２％以下の酸素を含み得る。例えば、低酸素条件は、２％以下の酸素を含み得る。具体的な場合では、低酸素条件には、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、＜１％又は０％が含まれる。
【０１８１】
Ｅ．線維芽細胞を用いたＭ２表現型へのマクロファージのインビトロ及びインビボでの再プログラミング
本開示のある特定の実施形態は、炎症の阻害及び／又は血管新生の刺激を必要とする個体において炎症の阻害及び／又は血管新生の刺激に有用な細胞調製物を包含する。具体的な実施形態において、本開示の方法によって作製された細胞は、炎症の阻害及び／又は血管新生の刺激を必要とする個体において、炎症の阻害及び／又は血管新生の刺激のために利用される。１つの実施形態において、線維芽細胞（及び／又は１つ以上の作用物質）と単球及び／又は単球前駆細胞との培養によって、炎症の阻害及び／又は血管新生の刺激に有用な免疫細胞がもたらされる。１つの実施形態において、Ｍ２マクロファージが、ある特定の細胞を線維芽細胞とともに培養することによって生成され、それは、血管新生を刺激するため及び炎症を阻害するための治療用細胞として利用され、特徴付けられる。ある特定の実施形態において、それらの治療用細胞は、アルギナーゼを発現すること及び／又は一酸化窒素（ＮＯ）を産生する能力が低下していることによって表される。いくつかの場合では、その方法によって作製された細胞は、個体に送達する前に、アルギナーゼの発現及び／又はＮＯ産生能力の低下について試験されるが、他の場合では、試験されない。
【０１８２】
ある特定の実施形態は、血管新生刺激の事項に関し、具体的な実施形態において、本開示は、単球及び／又は単球前駆細胞と、ある特定の線維芽細胞を含む線維芽細胞集団との培養物から生成されるマクロファージを用いた血管新生の発生に関する。
【０１８３】
１つの実施形態において、線維芽細胞を単球及び／又は単球前駆体（単球前駆細胞とも称されることがある）と共培養するとき、その線維芽細胞は、Ｍ２マクロファージの生成を増加させるために使用され、その後、それらの単球及び／又は単球（ｍｏｎｏｃｙｃｔｉｃ）前駆体から生成されたＭ２マクロファージは、種々の状況において治療的に有用となる。例えば、Ｍ２マクロファージは、梗塞後の心筋傷害の低減のために利用されることがあり、そのようなＭ２マクロファージは、炎症を抑制し得、血管新生を刺激し得、かつ／又はＭ１マクロファージの形成を阻害し得る（Ｍ１マクロファージは、病的な心臓リモデリング及び心不全への進行に関連する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。したがって、本開示の１つの態様において、Ｍ２マクロファージが、インビトロで生成され、心筋梗塞に罹患している又はそのリスクがある個体に全身的又は局所的に投与される。
【０１８４】
本開示のいくつかの実施形態において、線維芽細胞によって培養されたＭ２細胞が、心臓の修復を必要とする個体のある領域に、１つ以上の血管新生成長因子（例えば、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ｆｌｔ−３Ｌ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−２０、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＬＩＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ、アクチビン−Ａ、ＶＥＧＦ又はそれらの組み合わせ）とともに投与される。
【０１８５】
本開示のいくつかの実施形態において、線維芽細胞が、少なくともＰＧＥ−２の存在下において、任意の種類の免疫細胞（単球、単球前駆細胞、ＰＢＭＣ、ＭＳＣなどを含む）と共培養される。さらなる実施形態において、それらの細胞に曝露されるＰＧＥ−２の濃度は、およそ１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬ、７５００ｎｇ／ｍＬ、１〜５０００ｎｇ／ｍＬ、１〜２５００ｎｇ／ｍＬ、１，０００ｎｇ／ｍＬ、１〜７５０ｎｇ／ｍＬ、１〜５００ｎｇ／ｍＬ、２５０〜１００００ｎｇ／ｍＬ、２５０〜７５００ｎｇ／ｍＬ、２５０〜５０００ｎｇ／ｍＬ、５００〜１００００ｎｇ／ｍＬ、５００〜５０００ｎｇ／ｍＬ、５００〜２５００ｎｇ／ｍＬ、１０００〜１００００ｎｇ／ｍＬ、１０００〜７５００ｎｇ／ｍＬ、１０００〜５０００ｎｇ／ｍＬ、５０００〜１００００ｎｇ／ｍＬ、５０００〜７５００ｎｇ／ｍＬなどである。いくつかの実施形態において、ＰＧＥ−２の濃度は、およそ１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、１，０００ｎｇ／ｍＬ、２，０００ｎｇ／ｍＬ、２，５００ｎｇ／ｍＬ、５，０００ｎｇ／ｍＬ、７，５００ｎｇ／ｍＬ又は１０，０００ｎｇ／ｍＬである。具体的な実施形態において、線維芽細胞は、例えば、少なくとも又はせいぜい１〜７２、１〜５０、１〜２５、２５〜７２、２５〜５０若しくは５０〜７２時間にわたって、又は１〜７２、１〜５０、１〜２５、２５〜７２、２５〜５０若しくは５０〜７２時間もの時間にわたって、ＰＧＥ−２の存在下において免疫細胞と共培養される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、およそ１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間又は７２時間にわたって、ＰＧＥ−２の存在下において免疫細胞と共培養される。ある特定の実施形態において、ＰＧＥ−２を伴う線維芽細胞と免疫細胞との共培養は、その組み合わされた培養物に、少なくともいくつかの態様において心筋再生にとって有益な、相乗的な量のＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及び／又はＥＧＦを産生する能力を付与する。別の実施形態において、ＰＧＥ−２の存在下における線維芽細胞と免疫細胞との共培養によって、線維芽細胞と協力して心筋再生を誘導するＭ２マクロファージの治療用集団が作製される。ある特定の実施形態において、培養された線維芽細胞と免疫細胞との組み合わせは、患者が心筋梗塞に罹患した少なくとも又はせいぜい３日後〜１５日後に、患者に投与される。ある特定の実施形態において、培養された線維芽細胞と免疫細胞との組み合わせは、患者が心筋梗塞に罹患したおよそ３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後又は１５日後に患者に投与される。
【０１８６】
ある特定の実施形態は、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｃｔ）の後の患者を処置する方法を提供し、その方法は、必要に応じて線維芽細胞を得る工程；心臓修復（ｃａｒｄｉａｃ−ｒｅｐａｉｒａｔｉｖｅ）特性を獲得するために線維芽細胞を免疫細胞とともに培養する工程；及び梗塞に罹患している又は梗塞を有していたと疑われる又は梗塞を有していると疑われる又は梗塞を有することになる患者に、その線維芽細胞と免疫細胞との組み合わせを投与する工程を含む。それらの細胞は、個体に関して自家起源又は同種異系起源に由来し得る。それらの線維芽細胞は、脂肪、皮膚、臍帯、包皮、胎盤、大網及びそれらの組み合わせからなる群より選択される組織に由来し得る。いくつかの実施形態において、線維芽細胞と免疫細胞との組み合わせを培養する工程は、少なくともＰＧＥ−２の存在下において培養する工程を含む。さらなる実施形態において、それらの細胞に供給されるＰＧＥ−２の濃度は、およそ１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬである。さらなる実施形態において、ＰＧＥ−２の濃度は、１〜１，０００ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、ＰＧＥ−２の濃度は、およそ１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、１，０００ｎｇ／ｍＬ、２，０００ｎｇ／ｍＬ、２，５００ｎｇ／ｍＬ、５，０００ｎｇ／ｍＬ、７，５００ｎｇ／ｍＬ又は１０，０００ｎｇ／ｍＬである。具体的な実施形態において、線維芽細胞は、少なくとも又はせいぜい１時間〜７２時間にわたって、ＰＧＥ−２の存在下において免疫細胞と共培養される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、およそ１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間又は７２時間にわたって、ＰＧＥ−２の存在下において免疫細胞と共培養される。ある特定の実施形態において、ＰＧＥ−２を伴う線維芽細胞と免疫細胞との共培養は、その組み合わされた培養物に、心筋再生にとって有益な、相乗的な量のＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＧＦを産生する能力を付与する。別の実施形態において、ＰＧＥ−２の存在下における線維芽細胞と免疫細胞との共培養によって、線維芽細胞と協力して心筋再生を誘導するＭ２マクロファージの治療用集団が生成される。ある特定の実施形態において、培養された線維芽細胞と免疫細胞との組み合わせは、患者が心筋梗塞に罹患した少なくとも又はせいぜい３日後及び１５日後に、患者に投与される。ある特定の実施形態において、培養された線維芽細胞と免疫細胞との組み合わせは、患者が心筋梗塞に罹患したおよそ３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日���、１２日後、１３日後、１４日後又は１５日後に患者に投与される。
【０１８７】
本開示は、Ｍ２マクロファージ細胞の生成を可能にする、線維芽細胞と免疫細胞との共培養を包含するが、しかしながら、最適な生成は、少なくともいくつかの場合では、少なくともＰＧＥ−２の存在下における培養の後に明らかになることがある。線維芽細胞と共培養された免疫細胞の使用は、Ｍ２細胞が適用された領域に適用され得る。例えば、機構的に、Ｍ２マクロファージは、血管新生の刺激による梗塞後の心筋傷害の低減と関連することが示されており（Ｄａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、これは、参照により援用される。Ｍ２刺激性サイトカインであるインターロイキン１３が遺伝的に欠損したマウスにおける洗練された研究は、Ｍ２マクロファージが欠損したマウスでは、梗塞のサイズが大きいこと及び梗塞後の治癒が低減することを示した。これらの結果は、ＣＳＦ−１受容体のシグナル伝達経路の欠損によってＭ２マクロファージの枯渇が達成された別の研究でも再現された。梗塞後の心不全を増悪する処置は、Ｍ２マクロファージの蓄積を減少させる。さらに、治癒及び血管新生の加速を誘導する治療は、Ｍ２マクロファージの生成を刺激すると多くの状況において示された。例えば、間葉系幹細胞の投与は、Ｍ１マクロファージの減少及びＭ２マクロファージの増加を誘導すると示され、これは、血管新生の刺激による梗塞後の回復の改善と相関する。機構的に、Ｍ２マクロファージは、炎症を抑制する並びに血管新生を刺激すると知られており、これは、梗塞後の治癒の重要な態様である。さらに、Ｍ２マクロファージは、Ｍ１マクロファージの形成を阻害する。Ｍ１マクロファージは、病的な心臓リモデリング及び心不全への進行に関連するので、このことは、重要である。したがって、本発明の１つの態様において、Ｍ２マクロファージがインビトロで生成され、心筋梗塞に罹患している患者に全身的又は局所的に投与される。
【０１８８】
本開示の実施形態は、心筋梗塞の処置又は予防又はその発症及び／若しくは重症度の遅延を必要とする個体に対して、心筋梗塞を処置するか又は予防するか又はその発症及び／若しくは重症度を遅延させる方法を包含する。方法は、治療有効量の線維芽細胞をその個体に送達する工程（心臓への局所送達を含む）を含み得る。いくつかの場合では、その線維芽細胞は、改変されている。具体的な実施形態では、線維芽細胞を、その線維芽細胞及び／又は免疫細胞である単球に、心臓修復特性を付与する条件下において十分量の免疫細胞（例えば、単球（例えば、自家又は同種異系））に曝露し；具体的な場合では、その線維芽細胞及び／又は免疫細胞は、それを必要とする個体に提供される。その個体は、心筋梗塞を有していた必要があり得るか、心筋梗塞を現在有している必要があり得るか、又は心筋梗塞を有していたことを含む心疾患の個人歴若しくは家族歴があるために心筋梗塞を有するリスクがある必要があり得る。個体がすでに心筋梗塞を起こしていた場合、１回目の心筋梗塞における損傷原因から心臓を修復するため、及び／又は２回目若しくはそれ以降の心筋梗塞を予防するため若しくはその重症度を低下させるため（又はその発症を遅延させるため）に線維芽細胞及び／又は免疫細胞が提供され得る。
【０１８９】
線維芽細胞及び／又は免疫細胞（それらが、本明細書中に記載されるような培養において互いに曝露されたか否かを問わない）が、心臓の状態のために個体に提供される場合、それらは、心筋内に投与され得るか、梗塞に関連する動脈にバルーンカテーテルによって投与され得るか、又は例えば冠状静脈洞に、バルーン談合を用いて逆行性投与され得る。
【０１９０】
特定の実施形態において、培養のための免疫細胞は、プラスチックへの接着によって得られるか、マーカーＣＤ１４に対するフローサイトメトリー精製によって得られるか、又はマーカーＣＤ１４に対する磁気活性化選別（ＭＡＣＳ）精製によって得られる、単球であり得る。線維芽細胞及び単球は、およそ１対１の比で培養され得る。単球は、線維芽細胞との組織培養後にアルギナーゼ活性を発現し得る。
【０１９１】
本開示のある特定の実施形態は、身体における任意の種類の炎症を処置するための方法及び組成物（治療的組成物を含む）を提供する。特定の実施形態は、マクロファージのＭ２極性化を誘導することによって、心筋梗塞を処置するため、及び／又は梗塞後の治癒プロセスを加速させるための方法及び治療的組成物を提供する。方法は、線維芽細胞及び／又はマクロファージを含む組成物を１つ以上の炎症部位に投与する工程を含む方法を含み、その組成物は、インターロイキン−４、インターロイキン−１０、ＩＬ−１Ｒａ、ＴＧＦ−ベータ、ｓＴＮＦ−ＲＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＶＥＧＦ及びｓＩＬ−１ＲＩＩ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のタンパク質をさらに含み得る。具体的な実施形態において、その組成物中の各タンパク質の濃度は、線維芽細胞の存在とともに、正常な血液中の当該タンパク質の濃度より高い。具体的な実施形態において、その組成物中のそのタンパク質の濃度は、正常な血液中のそのタンパク質の濃度より高く、特定の態様において、そのタンパク質は、線維芽細胞の存在下において投与される。それらの組成物は、白血球、血小板、濃縮血漿、骨髄穿刺液、脂肪組織、それらの一部分及びそれらの組み合わせも含み得る。具体的な実施形態において、タンパク質溶液は、処置を必要とする被験体からサイトカイン細胞懸濁液を得て、そのサイトカイン細胞懸濁液を分画することにより、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１Ｒａ及び／又はＴＧＦ−ベータを含む自家タンパク質溶液を得ることによって生成され、そのタンパク質溶液は、線維芽細胞とともに投与される。線維芽細胞は、レシピエント個体に対して同種異系であってもよいし、その個体に対して自家であってもよい。次いで、その組成物は、ヒト又は他の動物被験体の炎症部位に投与され得る。具体的な場合において、分画は、血液を２つ以上の画分に分離するように使用できるセパレーターを含む容器に血液を入れること；及びそのセパレーターを遠心分離して、多血小板血漿画分を得ることを含む。その多血小板血漿は、固体抽出材料と接触され得る。
【０１９２】
Ｆ．線維芽細胞によって再プログラムされた自家Ｔ細胞による血管新生の刺激及び／又は創傷治癒の加速
血管新生の刺激及び／又は創傷治癒の加速を必要とする個体にある特定の細胞を投与することによって、血管新生を刺激する及び／又は創傷治癒を加速させる方法が開示される。特定の実施形態において、その個体は、自家Ｔ細胞にＴｈ１サイトカインプロファイルの阻害及びＴｈ２／Ｔｈ３プロファイルの増強を付与することができる条件下、並びにＴ細胞において遺伝的プログラムを誘導して、応答するＴ細胞が血管新生促進遺伝子プログラムの発現を惹起できるようにすることができる条件下において線維芽細胞（例えば、同種異系のものを含む）によって再プログラムされた有効量の自家Ｔ細胞を投与され、ここで、その血管新生促進遺伝子プログラムは、いくつかの場合において、ＨＩＦ−１アルファの核移行を少なくともいくつかの場合において含む。１つの実施形態において、身体における１つ以上の虚血状態を処置する新規の手段が提供される。
【０１９３】
特定の実施形態において、血管新生の領域を問わず、本開示は、Ｔ細胞と線維芽細胞（例えば、同種異系細胞）との事前の共培養によって、血管新生を刺激する能力を免疫系のＴ細胞に付与することを含む、免疫細胞を用いた血管新生の刺激に関する。そのようなＴ細胞は、活性化Ｔ細胞と称されることがある。
【０１９４】
本開示の実施形態は、共培養系を用いて血管新生促進表現型をＴ細胞に付与するための、同種異系線維芽細胞の使用を包含する。いくつかの実施形態において、共培養物は、線維芽細胞（接着性線維芽細胞を含む）とともに、Ｔ細胞を含む非接着性細胞集団、又は精製されたＴ細胞を含む。本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞は、ウシ胎仔血清及び／又は血小板溶解物及び／又は多血小板血漿をおよそ１０体積％の濃度で含む、公知の培地（例えば、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ−１６４０）、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、イーグル変法基本培地（ＥＭＥＭ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ、イスコーブ培地又はそれらの組み合わせ）から選択され得る好適な組織培養培地中で培養される。いくつかの場合では、線維芽細胞を、基材（天然に存在し得る基材）に接着させ、その後、Ｔ細胞が加えられる。１つの特定の実施形態において、Ｔ細胞は、末梢血単核球の集団の一部である。線維芽細胞及びＴ細胞は、特定の時間にわたって、例えば、１時間〜２週間にわたって、共に培養される。具体的な実施形態において、それらは、少なくとも又はせいぜい約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４時間又は１、２、３、４、５、６、７日間又は１若しくは２週間にわたって、共に培養される。具体的な実施形態において、線維芽細胞とＴ細胞は、約４８時間にわたって共に培養される。続いて、非接着性Ｔ細胞、及びＴ細胞を含む細胞集団が抽出され、血管新生を刺激するための投与に利用される。機構に拘束されるものではないが、線維芽細胞との組織培養によって生成されたＴ細胞は、マイトジェンとして内皮細胞に対して直接作用することによって血管新生を刺激し得、かつ／又は身体の細胞、例えば、血液の細胞において血管新生促進サイトカインの産生を誘導することによって血管新生を刺激し得る。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、非接着性細胞の除去によって、かつさらなる処理の非存在下において、線維芽細胞との共培養物から抽出され、いくつかの場合、Ｔ細胞は、１つ以上のアッセイによってさらに精製される。いくつかの場合では、非接着性細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用して、さらに精製される。ＭＡＣＳを使用する場合、１つ以上のＴ細胞マーカーに対する選択が行われる。１つの実施形態では、Ｔ細胞マーカーＣＤ２５を使用して活性化Ｔ細胞を選択し、その後、病状（例えば、虚血性疾患、創傷など）の処置を必要とする個体におけるそのような処置のために、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を投与する。特定の実施形態において、虚血性疾患の処置は、Ｔ細胞を線維芽細胞とともに培養した後のＴ細胞の筋肉内投与によって行われる。虚血性疾患としては、少なくとも重症虚血肢、心虚血、腰部虚血及び腸管虚血が挙げられる。他の実施形態において、Ｔ細胞は、創傷（例えば、熱傷、切り傷、擦過傷、裂傷、穿刺、剥離又はそれらの組み合わせ）を有する個体において創傷治癒を加速させるために投与される。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、線維芽細胞への曝露の後、生分解性インプラントの一部として個体に投与されるが、代替の実施形態では、そのインプラントは、生分解性でないか、又はＴ細胞は、インプラントの非存在下において投与される。具体的な実施形態において、インプラントは、Ｔ細胞、及びそのＴ細胞によって放出される１つ以上の血管新生因子を含む（インプラントの移植後を含む）。このタイプの実施形態では、インプラントは、長期間にわたって植え込み部位内に残存するように、及びそのインプラントに含まれるＴ細胞から周囲の環境に血管新生因子をゆっくり放出するように選択され得るキャリアを含み得る。この送達様式によって、血管新生因子をその部位内に長期間にわたって治療有効量で残存させることができる。血管新生因子をキャリア内に提供することによって、血管新生因子を標的領域に直接放出するという利点が実現する。いくつかの実施形態において、インプラント用のキャリアは、注射可能な形態で提供される。注射可能性は、侵襲性が最小の方法でキャリアが送達されることを可能にし、その送達は、例えば、経皮的、筋肉内、皮下、大網内、心室内及び／又は髄腔内であり得る。いくつかの実施形態において、注射可能なキャリアは、ゲルである。他では、注射可能なキャリアとしては、ヒアルロン酸（ＨＡ）が一例として挙げられる。
【０１９７】
Ｔ細胞移植片、すなわちＴ細胞インプラントに対するいくつかの実施形態において、キャリアは、少なくとも２５マイクロメートルという平均孔サイズを有する多孔性マトリックスを含む。ある特定の実施形態において、多孔性マトリックスは、２５マイクロメートル〜１１０マイクロメートルの平均孔サイズを有する。平均孔サイズがこの範囲内であるとき、具体的な実施形態では、多孔性マトリックスは、標的領域において血管新生を刺激する細胞になることができる細胞（例えば、単球、内皮前駆細胞、骨髄前駆細胞及び／又は間葉系幹細胞）を内殖するためのスキャフォールドとしても作用する。多孔性マトリックスを形成するために使用され得る有機材料の数多くの例は、当業者に公知であり、それらとしては、コラーゲン、ポリアミノ酸又はゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない。コラーゲンの起源は、人工的なもの（すなわち、組換え）であってもよいし、インプラントを受け入れる哺乳動物に対して自家のものであってもよいし、同種異系のものであってもよいし、異種のものであってもよい。コラーゲンは、アテロペプチド又はテロペプチドのコラーゲンの形態でもあり得る。さらに、高レベルの血管新生に関連する起源由来のコラーゲン（例えば、胎盤由来のコラーゲン）が使用され得る。マトリックスを形成するために使用され得る合成ポリマーの例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はポリ乳酸／ポリグリコール酸の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。マトリックス材は、１つ以上の吸収性ポリマー及び／又は１つ以上の非吸収性ポリマーを含み得る。当業者は、多孔性又は半多孔性という用語が、マトリックスにおける孔密度が様々であることを指すことを認識するだろう。スキャフォールドの構造は、いくつかの実施形態において、インプラントと解剖学的構造（そのような解剖学的構造は、例えば、骨、軟骨、神経、腱及び／又は靭帯であり得る）との接着をつなぎ留めるか又は高めるか又は実質的に引き起こすために使用され得る。いくつかの実施形態において、インプラントを解剖学的構造に接着させる手段は、ゲルであり得る。ゲルはインプラントとともに、移植部位に、いくつかの実施形態では、関節鏡下の流動性の条件下において、注入され得る。ゲルは、少なくともいくつかの場合では身体環境において時宜を得た形式で再吸収する能力を有する生体吸収型又は生体吸収性の材料から形成される生物学的なゲル又は合成ゲルであり得る。好適なスキャフォールド物質も当業者に公知であり、それらとしては、ヒアルロン酸、フィブリン糊、フィブリン塊、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ゼラチン−レゾルシン−ホルマリン接着剤、イガイ系（ｍｕｓｓｅｌ−ｂａｓｅｄ）接着剤、ジヒドロキシフェニルアラニンベースの接着剤、キトサン、トランスグルタミナーゼ、ポリ（アミノ酸）系接着剤、セルロース系接着剤、多糖系接着剤、合成アクリレート系接着剤、多血小板血漿（ＰＲＰ）ゲル、乏血小板血漿（ＰＰＰ）ゲル、ＰＲＰクロット、ＰＰＰクロット、マトリゲル、モノステアロイルグリセロールｃｏ−スクシネート（ＭＧＳＡ）、モノステアロイルグリセロールｃｏ−スクシネート／ポリエチレングリコール（ＭＧＳＡ／ＰＥＧ）共重合体、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（オキシアルキレン）、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）の共重合体、ポリ（ビニルアルコール）及びそれらの組み合わせが挙げられ得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、スキャフォールドが植え込みの標的部位の寸法に適応できるようにするために、しなやかなスキャフォールドが利用される。例えば、スキャフォールドは、ゲル様材料又は接着剤、並びに発泡体又はメッシュの構造を含み得る。ある特定の実施形態において、スキャフォールドは、生体吸収性材料である。スキャフォールドは、連続気泡孔構造を有する孔を有する高分子発泡体成分から形成され得る。孔サイズは、様々であり得るが、特定の場合では、孔は、組織又は血管新生の内殖を可能にするサイズである。いくつかの実施形態において、孔サイズは、約４０〜９００マイクロメートルの範囲内である。高分子発泡体成分は、必要に応じて、例えば、織物構造、編物構造、縦編物構造（すなわち、レース様）、不織布構造及び／又は編組構造などの補強成分を含み得る。いくつかの実施形態において、高分子発泡体成分が補強成分を含む場合、その発泡体構成要素の孔が、補強成分のメッシュを貫通し、補強成分とからみ合うように、発泡体成分は、補強成分と統合され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の血管新生成長因子は、主に、持続性の送達デバイスを介した（例えば、ポリマーを介した）拡散によって持続性の送達デバイスから放出される。他では、血管新生因子は、主に、持続性の送達デバイスの生分解（例えば、ポリマーの生分解）によって持続性の送達デバイスから放出される。いくつかの実施形態において、インプラントは、徐々に侵食されることにより血管新生因子を徐々に放出させる生体吸収型材料を含む。いくつかの実施形態において、インプラントは、生体吸収型ポリマーを含む。特定の実施形態において、生体吸収型ポリマーは、少なくとも１ヶ月という半減期を有する。したがって、いくつかの実施形態において、インプラントは、１つ以上の血管新生因子と混ぜられた共重合体ポリ−ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）を含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、インプラントは、ヒドロゲル（ヒドロゲルからなるか又はヒドロゲルから本質的になるものを含む）を含む。ヒドロゲルは、持続放出の様式で、１つ以上の低灌流領域に１つ以上の血管新生因子を送達するためにも使用され得る。「ヒドロゲル」は、本明細書中で定義されるとき、有機ポリマー（天然のもの又は合成のもの）が固化又は凝固して、水又は他の溶液の分子を捕捉してゲルを形成する３次元の開放格子構造を形成するときに形成される物質である。その凝固は、例えば、凝集、凝結、疎水性相互作用又は架橋によって生じ得る。ヒドロゲルは、急速に凝固して、血管新生因子を、低灌流の原因となる血管又は低灌流に関連する領域に近接して維持し得る。いくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、微細な粉状の合成ヒドロゲルである。好適なヒドロゲルは、最適なマトリックスポリマーとの適合性、及び生体適合性のような特性の最適な組み合わせを示す。ヒドロゲルには、以下のうちの１つ以上が含まれ得る：多糖、タンパク質、ポリホスファゼン、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックポリマー、エチレンジアミンのポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）ブロックポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸との共重合体、ポリ（酢酸ビニル）、及び／又はスルホン化ポリマー。
【０２００】
特定の実施形態において、本開示は、１つ以上の血管新生成長因子を産生できるＴ細胞を含む。ある特定の実施形態において、それらのＴ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８、ガンマデルタ、ＮＫＴ細胞又はそれらの混合物を含む）は、ａ）線維芽細胞集団（例えば、胎盤、胎児、新生児若しくは成体の線維芽細胞集団又はそれらの混合物）を提供する工程；ｂ）その線維芽細胞集団を同種異系細胞集団と接触させる工程であって、その集団は、Ｔ細胞を含む、工程；及びｃ）それらのＴ細胞に１つ以上の血管新生特徴（例えば、事前に線維芽細胞に曝露されていなかったＴ細胞では欠いている能力を含む、１つ以上の血管新生成長因子を産生する能力）を付与するのに十分な時間にわたってかつ付与するのに十分な条件下で、同種異系線維芽細胞を、Ｔ細胞を含む同種異系細胞集団とともに培養する工程を含む工程によって生成され得る。血管新生成長因子の例としては、少なくとも、（ａ）ＰＤＧＦ−ＢＢ；（ｂ）アンジオポエチン；（ｃ）ＶＥＧＦ；（ｄ）ＥＧＦ；（ｅ）ＦＧＦ−１；（ｆ）ＦＧＦ−２；（ｇ）ＦＧＦ−５；（ｈ）ＭＭＰ３；（ｉ）ＭＭＰ９；及び／又は（ｊ）ストロメライシンが挙げられる。
【０２０１】
いくつかの場合では、線維芽細胞とＴ細胞との共培養物は、他の１つ以上の作用物質、例えば、１つ以上の免疫調節剤を含む。具体的な実施形態において、免疫調節剤としては、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、ｓＣＲ１、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、アスピリン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ｎ−アセチルシステイン、ラパマイシン、ＩＶＩＧ、ナルトレキソン、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、オーラノフィン、ジシアノ金、スルファサラジン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、エタネルセプト、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト−ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、シクロスポリン、ＩＦＮ−ガンマ、エベロリムス、ラパマイシン又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２０２】
具体的な実施形態において、線維芽細胞、及びＴ細胞を含む集団は、液体培地（例えば、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ−１６４０）、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、イーグル変法基本培地（ＥＭＥＭ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ、イスコーブ培地又はそれらの組み合わせ）中で培養される。具体的な場合では、１つ以上のさらなる作用物質（例えば、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清、ヒト血清、血清代替物又はそれらの組み合わせ）が、培地に加えられる。いくつかの場合では、血清代替物が、培地組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。具体的な実施形態において、ヒト多血小板血漿は、培地組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。いくつかの場合では、血小板溶解物は、培地組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。いくつかの場合では、臍帯血血清は、培地組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。ある特定の場合では、自己血清は、培地組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。特定の場合において、ヒト血清は、培地組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。
【０２０３】
特定の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７及び／又はＩＬ−１５が、線維芽細胞、及びＴ細胞増殖を高めるＴ細胞を含む細胞集団（例えば、ＰＢＭＣ）との組織培養物に含まれており、具体的な場合では、ＩＬ−２が、１０ピコグラム／ｍｌ組織培養培地から約１マイクログラム／ｍｌ組織培養培地に及ぶ濃度で加えられ得る。
【０２０４】
いくつかの場合では、Ｔ細胞において１つ以上の特定の遺伝子産物の発現を誘導するために、１つ以上のある特定の作用物質が組織培養物に曝露される。例えば、いくつかの場合では、Ｔ細胞においてＣＤ２５の発現を誘導するために、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体がＴ細胞に曝露される。具体的な場合では、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体が、例えばビーズ及び／又は組織培養フラスコなどの固体表面に固定化され、ＣＤ２５、ＣＤ６９及び／又はＣＴＬＡ４のＴ細胞発現を誘導するのに十分な濃度及び時間で組織培養培地に曝露される。
【０２０５】
Ｇ．ストレスを受けた線維芽細胞を用いた樹状細胞成熟の最適化
いくつかの実施形態において、本開示は、免疫療法の分野に関し、より詳細には、本開示は、特定の抗原に対して免疫を誘導するための抗原提示細胞の使用に関し、より詳細には、本開示は、樹状細胞の免疫原性を増強するための、ストレスを受けた線維芽細胞の使用（ストレスを受けたとは、生理的ではない任意の状態である）に関する。本開示の具体的な実施形態は、ストレスを受けた線維芽細胞の特性を利用して、樹状細胞の成熟を誘導する。
【０２０６】
樹状細胞の抗原提示能力を高める方法が提供され、ここで、ある特定の細胞が、すでにストレスを受けた線維芽細胞とともに培養される（が、それらの線維芽細胞は、樹状細胞の存在下においてストレスを受けてもよい）。本開示の１つの実施形態において、単球が、樹状細胞の分化に適した条件下において培養され、続いて、ストレスを受けた線維芽細胞とともに培養されることにより、例えば、その単球から生成された樹状細胞の成熟及び抗原提示活性の最適化が誘導される。１つの実施形態において、樹状細胞は、線維芽細胞に対して同種異系である。別の実施形態において、樹状細胞は、線維芽細胞に対して自家であるが、具体的な場合においては同種異系であってもよい。
【０２０７】
本実施形態は、樹状細胞成熟を刺激するための、ストレスを受けた線維芽細胞の使用を提供する。樹状細胞成熟の刺激には、樹状細胞における共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６）の発現の増強、並びに少なくともいくつかの場合では、Ｔ細胞の活性化を高める能力の増強が含まれる。１つの実施形態において、本開示は、１つ以上の熱ショックタンパク質の発現を誘導する及び／又は線維芽細胞の成長因子の産生活性を変化させるのに十分な持続時間にわたる非生理学的条件への線維芽細胞の曝露を包含し、例示的な成長因子としては、ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−５、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、アンジオポエチン、ＩＧＦ−１及び／又はＨＧＦが挙げられる。１つの実施形態において、線維芽細胞は、樹状細胞に対して同種異系であり、別の実施形態において、線維芽細胞は、樹状細胞に対して自家である。
【０２０８】
線維芽細胞に対するストレスへの曝露は、当該分野で公知の様々な手段を用いて行われ得る。１つの実施形態において、線維芽細胞は、高熱に曝露され、その高熱は、少なくとも又はせいぜい１〜８時間にわたる温度の上昇を含み得、いくつかの場合において、その温度の上昇は、少なくとも又はせいぜい３９、４０、４１又は４２℃であり得る。具体的な場合において、細胞は、およそ４０℃の温度において約４時間にわたって高熱に曝露される。いくつかの実施形態において、樹状細胞は、個体の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から生成され、ＣＤ８細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いてＰＢＭＣ（例えば）から精製される。他の実施形態において、ＣＤ８Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球から抽出される。
【０２０９】
本開示の１つの態様において、樹状細胞は、従来のプロトコルに従って単離され、ストレスを受けた線維芽細胞に曝露される。具体的な実施形態において、樹状細胞活性化の刺激の背後にある機構は、組織傷害又は発病の脅威に関連するｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストなどの、「危険」信号と記載される、自然免疫系を活性化するシグナルを模倣するように線維芽細胞を生成するものである。樹状細胞は、マクロファージ又はＢ細胞などの他の抗原提示細胞とは対照的に、抗原特異的な系とポリクローナル実験（例えば、混合リンパ球反応）の両方においてＴ細胞応答を刺激する高い能力を示すので（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，１９９８）、本実施形態は、樹状細胞の活性化に焦点を合わせている。ＤＣは、末梢組織（リンパ節の外側）において、食作用及び受容体媒介性エンドサイトーシスを含むいくつかの相補的な機構によって抗原を捕捉することが知られている。未熟ＤＣは、高い食作用活性及び低レベルの抗原提示活性を有すると知られている。正常には、末梢組織におけるＤＣは、未熟である。これらの未熟ＤＣは、抗原を効率的に捕捉する能力を有し、それらは、その後期エンドソーム−リソソームコンパートメント内にＭＨＣクラスＩＩ分子を蓄積でき、低レベルの共刺激分子を発現でき、リンパ系組織への遊走を可能にするユニークなセットのケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ７）を発現でき、サイトカインを分泌する能力は限定的である（Ｔｒｏｍｂｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｍａｎ，２００５）。本開示は、インビボで生じるＤＣ活性化の天然のプロセスを模倣する手段を包含するが、本開示は、エクスビボでのこの誘導を包含する。
【０２１０】
本開示は、ストレスを受けた線維芽細胞上に発現される１つ以上の刺激シグナル（例えば、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（熱ショックタンパク質、例えば、ｈｓｐ９０及び／又はｈｓｐ７０を含む））への曝露によるものなどの、活性化ＤＣを生成する手段を提供する。ストレスを受けた線維芽細胞への曝露は、ＤＣの食作用活性を低下させ、次いでＤＣが、少なくともいくつかの場合において、輸入リンパ管を通じて流入領域リンパ節に遊走するのを可能にする。輸送プロセスの間、ＤＣは、摂取したタンパク質を分解して、ＭＨＣクラスＩ分子とＭＨＣクラスＩＩ分子の両方に結合するペプチドにする。これにより、ＤＣは、ａ）それが外来性抗原を摂取するが、ＭＨＣ  Ｉ経路においてペプチドを提示するという点において交差提示を行うこと；及びｂ）ＣＤ８（ＭＨＣ  Ｉを介して）とＣＤ４（ＭＨＣ  ＩＩを介して）の両方を活性化することが可能になる。興味深いことに、脂質抗原は、異なる経路を介して処理され、ＣＤ１ファミリーの非古典的なＭＨＣ分子上にロードされる（Ｉｔａｎｏ  ａｎｄ  Ｊｅｎｋｉｎｓ，２００３）。
【０２１１】
本開示は、ＤＣの成熟を誘導する手段を包含し、いくつかの場合において、その成熟は、抗原捕捉活性のダウンレギュレーション、表面ＭＨＣクラスＩＩ分子及び共刺激分子の高発現、サイトカインを分泌する能力、並びに流入領域リンパ節へのＤＣの遊走を可能にするＣＣＲ７の獲得に関連する。共刺激受容体ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５としても知られる）の連結は、未熟ＤＣから、Ｔ細胞媒介性の適応免疫を開始できる完全に成熟したＤＣへの分化にとって必須のシグナルである（Ｃａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。しかしながら、ＤＣの成熟だけでは、ユニークなＤＣ表現型をもたらさない。その代わりに、直接又は周囲の免疫細胞を介して種々の微生物又はウイルスによって提供される種々のシグナルが、最終的に種々の免疫応答に寄与する独特の表現型をＤＣが獲得するように誘導する。実際には、微生物が、パターン認識受容体（ＰＰＲ）と呼ばれる独特のＤＣ分子センサーの引き金を引く種々の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を発現するので、ＤＣの成熟は、種々の微生物によって異なる。著しいことに、ほとんどの微生物がＤＣを活性化するが、いくつかは、様々な経路によってＤＣの成熟を阻止できる（Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。組織局在型ＤＣは、傷害に応答する周囲の免疫細胞から放出される生成物によって独特の表現型に極性化され得る。例えば、γｄ−Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を放出し、マスト細胞は、予め形成されたＩＬ−４及びＴＮＦを放出し、ｐＤＣは、ＩＦＮａを分泌し、間質細胞は、ＩＬ−１５及び胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）を分泌する。したがって、本開示の１つの態様において、ストレスを受けた線維芽細胞／未熟樹状細胞前駆細胞は、インビボでの免疫応答を模倣するために、さらなる細胞及び／又は細胞産生因子（例えば、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４  ＴＮＦ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＬ−１５及び／又はＴＳＬＰ）の存在下において培養される。
【０２１２】
これらのサイトカインは、前駆細胞又は単球などの前駆体細胞から、ユニークなタイプのＴ細胞をもたらす独特の炎症性ＤＣへの分化を誘導する。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞とＤＣとが相互作用すると、その後、これらの細胞は、種々の機能を有する抗原特異的エフェクターＴ細胞に分化し得る。ＣＤ４Ｔ細胞は、Ｂ細胞が抗体分泌細胞に分化するのを助ける、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ１７細胞、又は濾胞性ヘルパーＴ（Ｔ）細胞、並びにＴｒｅｇ細胞になることができる。ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞は、エフェクター細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生じ得る。ＤＣの興味深い活性は、ナイーブＴ細胞の活性化を介した免疫応答の刺激に加えて、ＤＣが阻害性細胞としても作用できることである。これは、直接、Ｔ細胞活性化の阻害及び／又はＴ細胞アネルギーの誘導を介して（Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、並びに制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の刺激を介して間接的に（Ｔｕｒｎｑｕｉｓｔ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｓｏｎ，２０９０８；Ｐｌｅｔｉｎｃｋｘ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）行われる。興味深いのは、Ｔｒｅｇ細胞だけでなく、アネルギーＴ細胞も、ＤＣの活性化を阻害できることであり（Ｆｒａｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｖｅｎｄｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｖｅｌｄｈｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ゆえに、自己で維持する免疫制御性フィードバックループを刺激する可能性がある。実際に、Ｔｒｅｇが未熟ＤＣを刺激し、その未熟ＤＣが新しいＴｒｅｇ細胞の産生を刺激するというようなシナリオが、これまでに報告されている（Ｇｕｉｌｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｒｏｅｌｏｆｓ−Ｈａａｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０２１３】
ＤＣの活性化を増大させるために、ストレスを受けた線維芽細胞に曝露すると、数多くのタイプのＤＣベースの治療法が生成され得る。そのような治療法としては、アンドロゲン抵抗性前立腺癌の処置に対してＦＤＡが承認していて、ＧＭ−ＣＳＦと前立腺特異的抗原である前立腺酸性ホスファターゼとを含むキメラタンパク質を用いて生育された自家末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来樹状細胞に由来する細胞製品である、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（シプロイセル−Ｔ）（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｇｏｍｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）；特定のペプチド（例えば、ＰＳＭ−Ｐ１又はＰ２）をパルスされたＤＣ；ＧＭ−ＣＳＦ−ＰＡＰ融合タンパク質をパルスされたＤＣ；ＰＳＡタンパク質をパルスされたＤＣ（Ｂａｒｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ（１４−２２））、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ（２９９−３０７））、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ（４−１２））及び／又は前立腺特異的抗原（ＰＳＡ（１５４−１６３））に由来する抗原ペプチドをロードされたＤＣ（Ｗａｅｃｋｅｒｌｅ−Ｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）などが挙げられる。
【０２１４】
本開示の１つの実施形態において、樹状細胞の成熟（成熟樹状細胞、例えば、骨髄樹状細胞又はリンパ系樹状細胞）を誘導する方法が存在し、その方法は、（ａ）未熟な状態の樹状細胞（骨髄樹状細胞又はリンパ系樹状細胞）を得る工程；及び（ｂ）その未熟樹状細胞を、ストレスを受けた線維芽細胞集団の存在下において培養する工程（その線維芽細胞は、少なくとも真皮、陰茎包皮、脂肪組織、胎盤組織などを含む任意の組織から入手され得る）を含む。具体的な実施形態において、未熟な状態の骨髄樹状細胞は、高レベルのＣＤ８３及び／若しくはＩＬ−１０を発現し、かつ／又は低レベルのＩＬ−１２、ＣＤ４０、ＣＤ８０及び／若しくはＣＤ８６を発現する。具体的な実施形態において、未熟骨髄樹状細胞は、高レベル（例えば、赤血球と比べて５０％超）のＣＤ８３、ＩＬ−１０又はその両方を発現する。具体的な実施形態において、未熟樹状細胞は、混合リンパ球反応の不十分な刺激物質及び／又はＴ細胞活性化の不十分な刺激物質である。具体的な実施形態において、ＣＤ８Ｔ細胞は、樹状細胞及び／又は線維芽細胞に対して自家又は同種異系である。具体的な場合において、未熟樹状細胞には、単球又は骨髄前駆細胞が含まれる。
【０２１５】
線維芽細胞は、１つ以上のストレッサーに曝露されて、ストレスを受けた線維芽細胞になることがあり、任意の好適なストレッサーを利用してよい。具体的な実施形態において、ストレッサーは、高熱であり、いくつかの場合において、高熱には、熱ショックタンパク質９０の発現を誘導できる持続時間にわたる高温への曝露が含まれる。その高熱は、少なくとも又はせいぜい約１、２、３、４、５、６、７又は８時間にわたる４０℃の温度への曝露において誘発され得る。いくつかの場合において、高熱及び別のストレッサー（例えば、血清枯渇）が利用されるが、いくつかの場合では、血清枯渇が高熱なしで用いられる。具体的な実施形態において、ストレッサーには、少なくとも又はせいぜい約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７又は４８時間にわたる血清枯渇への曝露が含まれる。具体的な場合では、ストレッサーは、２４時間にわたる血清枯渇への曝露又は１２〜４８時間にわたる血清枯渇への曝露である。
【０２１６】
Ｈ．同種異系線維芽細胞フィーダー細胞を用いてＣＤ８Ｔ細胞を拡大する方法
Ｔ細胞は、元々は胸腺に由来し、免疫系が機能する際に決定的な役割を果たすことが示されている。大まかには、Ｔ細胞は、マーカーＣＤ４を発現するＴヘルパー細胞と、マーカーＣＤ８を発現する傷害性Ｔ細胞とに分けられる。癌免疫療法の分野において、研究から、腫瘍へのＣＤ８  Ｔ細胞の浸潤が、生存時間の延長と相関することが示された。残念なことに、腫瘍は、免疫抑制因子の分泌によって、免疫が媒介する破壊から自身を守る（Ｗｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｍｅｄｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｓｔｒａｔｔｏｎ  ａｎｄ  ＤｉＳａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｐｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ａｖｒａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｐｏｐｅ，１９８５；Ｐｏｐｅ，１９８５ｂ，Ｐｉｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｋｐｐｉ  ａｎｄ  Ｈａｌｌｉｄａｙ，１９８３）。エクスビボで（身体外で）免疫細胞を刺激することは、インビボよりもかなり容易である。なぜなら、前者において、免疫細胞は、腫瘍が分泌する免疫抑制因子の非存在下で維持されるので、活性化が容易になるからである。一部の研究者は、患者を免疫調節物質「漬けにする」ことによって、インビボにおいて宿主の免疫細胞を活性化しようと試みた。しかしながら、適切な活性化を達成するために必要な大量のサイトカインは、毒性を誘導し得るので、これらのプロトコルには問題があった。周知の例は、免疫活性化を達成するために必要な投与量が、多くの患者が毒性のために治療を中止しなければならないほど多かった、インターロイキン−２（ＩＬ−２）試験である（Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｌｏｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｂｒｕｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｉｅｌｌｅｒ，１９９４；Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｄｕ  Ｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｓｈｕｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。いくつかのグループは現在も、デキサメタゾン（Ｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ペントキシフィリン（Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、インドメタシン（Ｍｅｒｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）及びメラトニン（Ｌｉｓｓｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）をはじめとした様々な作用物質とＩＬ−２を同時投与することによって、ＩＬ−２の毒性を低下させようと試みている。エクスビボでの免疫細胞の刺激は、使用する免疫賦活薬の量がより少ないので、全身の免疫調節よりも毒性が低く、また、安価である。
【０２１７】
エクスビボでの刺激アプローチは、腫瘍に対する免疫を、脾細胞を移植することによって抵抗性マウスからコントロールマウスに移すことができたというマウスの研究から始まった（Ｔａｋｅｉｃｈｉ  ａｎｄ  Ｂｏｏｎｅ，１９７５；Ｔｉｎｇ，１９７６；Ｔｉｎｇ，１９７８；Ｉｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｎｇ，１９８１；Ｍｕｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。さらなる解析によって、防御の最適な移行のためには、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞を一緒に移さなければならないことが明らかになった（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。しかしながら、これらのマウス研究は、リンパ球の刺激がマウスの内部で行われたので、真の意味でのエクスビボ実験ではなかった。疑問は、「免疫細胞をエクスビボで非特異的に活性化できるのか」、又はさらには「癌に特異的なＴ細胞をエクスビボで活性化できるか」ということであった。後者のアプローチは、非特異的なエクスビボ活性化が自己免疫の引き金を引き得る自己反応性免疫細胞の再活性化をもたらす可能性があるため、前者よりも優れている。初期の試みは、白血球を取り出し、ポリクローナルＴ細胞マイトジェンＰＨＡをエクスビボで加え、次いで、活性化された細胞を宿主に再注入して戻すことによって、実際に患者の細胞を非特異的に活性化していた。この治療の成功は、化学療法又は放射線照射などの従来の処置よりも優れていなかったので、断念された（Ｃｈｅｅｍａ  ｎｄ  ｈｅｒｓｈ，１９７２；Ｇａｒｏｖｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３）。
【０２１８】
他のエクスビボ刺激アプローチは、より高い成功率を有した。このアプローチは、末梢血単核球（すなわち、リンパ球）を精製し、それらを免疫賦活薬のインターロイキン２で活性化し、活性化されたリンパ球を自家患者に再注入して戻すことを含んだ。Ｔ細胞を非特異的に活性化することを目的とした第１のアプローチとは対照的に、このアプローチは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びリンパ球活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と呼ばれるＮＫ様の能力を有するＴ細胞のサブセットを活性化した（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｇｌａｓｓｍａｎ，１９８９；Ｇｒｉｍｍ，１９８６）。これらの細胞は、異常なレベルのＭＨＣを発現する腫瘍細胞（Ｔｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  ｈｅｌａｎｄｅｒ，１９９７）及び空のＭＨＣクラス１を発現しない標的細胞（ＲＧ  Ｍｉｌｌｅｒ，私信）を殺滅する能力を有する。
【０２１９】
エクスビボで免疫細胞を活性化させる別の免疫療法アプローチは、固形腫瘍に対する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用を必要とする。ＴＩＬは、種々の腫瘍において認められており、肝臓癌腫（Ｋａａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、メラノーマ（Ｍｉｗａ，１９８４；Ｌｉｐｐｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、膀胱癌（Ｌｉｐｐｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、直腸結腸癌（Ｒｏｐｐｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及び卵巣癌（Ｍａ  ａｎｄ  Ｇｕ，１９９１；Ｔｏｍｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）をはじめとしたある特定の癌において好ましい予後と相関する。多くの腫瘍免疫学者は、ＴＩＬが腫瘍に浸潤してその根絶を誘導すると考えているが、しかしながら、腫瘍が分泌する免疫抑制因子が免疫活性化を阻害するので、インビボではこのようなことは起こらない。ＴＩＬ治療は、外科的に腫瘤を摘出し、密度勾配で腫瘍細胞からＴＩＬを分離し、インビトロの免疫賦活性条件下でリンパ球を拡大し、活性化されたキラー細胞を患者に再注入して戻すことを必要とする（Ｆｉｌｇｕｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｔｏｐａｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。ＴＩＬ療法とＬＡＫ療法の抗腫瘍の有効性を対比させたマウスモデルでは、ＴＩＬ療法が、およそ１００倍高い殺腫瘍効果を有すると示された（Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０。ＴＩＬが腫瘍根絶効果を増強した理由として考えられるのは、この治療が腫瘍を認識し、それに反応しているリンパ球だけを活性化させるということである。これは、多数の細胞を活性化するＬＡＫ療法とは対照的であり、それらの細胞のうち、腫瘍に特異的な細胞はごく一部である。臨床では、ＴＩＬを用いた結果は、メラノーマ患者のおよそ２０％において再現性のある反応が得られており、適正であった（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，１９９１）。ＴＩＬの有効性を増強する手段は、ＴＮＦに対するｃＤＮＡをＴＩＬにトランスフェクトすることによって殺滅能力を高めることである（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【０２２０】
養子Ｔ細胞療法の最も強力で臨床的に成功した例の１つは、おそらく、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の使用である。その一例は、卵巣癌関連抗原であるアルファ−葉酸受容体（ＦＲ）に対する反応性を有するＴ細胞を、Ｆｃ受容体ガンマ鎖のシグナル伝達ドメインに連結された抗ＦＲ一本鎖抗体を組み込んだキメラ遺伝子で自家Ｔ細胞を遺伝子改変することによって作製したという最近の発表である。その研究では、患者を２つのコホートのうちの１つに割り当てた。コホート１の８人の患者には、用量漸増のＴ細胞を高用量のインターロイキン−２と併用して投与し、コホート２の６人の患者には、二重特異性Ｔ細胞（ＦＲと同種異系細胞の両方に反応性）の投与に続いて同種異系末梢血単核球による免疫化を行った。コホート１の５人の患者が、おそらくインターロイキン−２投与に起因するグレード３〜４の処置関連毒性を経験したが、これは、標準的な措置によって管理することができた。コホート２の患者は、グレード１〜２の症状の比較的軽度の副作用を経験した。いずれの患者においても、腫瘍量の減少は見られなかった。コホート１における追跡用の１１１Ｉｎで標識された養子移植されたＴ細胞は、腹膜沈着物においていくらかのシグナルが検出された１人の患者を除いて、腫瘍へのＴ細胞の特異的な局在化がなかったことを明らかにした。ＰＣＲ解析は、遺伝子を改変されたＴ細胞が、移植後の最初の２日間は循環中に大量に存在したが、これらはすぐに、１ヶ月後にはほとんどの患者においてほとんど検出できない程度に減少したことを示した（Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。同様のＣＡＲ−Ｔ臨床研究が、神経芽細胞腫（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、Ｂ細胞悪性腫瘍（Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，２０１０；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋｅｂｒｉａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，２０１３；Ｄａｖｉｌａ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，２０１３；Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）メラノーマ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、卵巣癌（Ｋａｎｄａｌａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、腎癌（Ｌａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、中皮腫（Ｓｃｈｕｂｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）及び頭頸部癌（ｖａｎ  Ｓｃｈａｌｗｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に対して報告されている。
【０２２１】
本開示の実施形態は、当該分野の欠陥に対処し、エクスビボ培養によってＣＤ８  Ｔ細胞の活性を高める方法を含む。本開示の実施形態は、ＣＤ８系列のＴ細胞を拡大する分野、及びそれらのＴ細胞に１つ以上の能力（例えば、サイトカインを産生する能力、増殖する能力及び／又は細胞傷害性を引き起こす能力）を付与する分野に関する。特定の実施形態において、ＣＤ８Ｔ細胞は、非内在性受容体（非内在性ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、αβ受容体などを含む）を発現するように操作される。
【０２２２】
本開示の特定の実施形態において、線維芽細胞は、１つ以上のストレッサーに曝露され、その後、それらは、ＣＤ８系列のＴ細胞とともに培養される。次いで、そのストレスを受けた線維芽細胞は、強力に増殖を拡大することができ、サイトカイン産生を増加させることができ、ＣＤ８Ｔ細胞の細胞傷害活性を増加させることができる。１つの実施形態において、線維芽細胞は、およそ２４時間、１つ以上のストレッサー（例えば、血清枯渇）に曝露される。別の実施形態において、線維芽細胞は、高熱を含む１つ以上のストレッサーに曝露され、例えば、４時間、およそ４０℃の高熱に曝露される。
【０２２３】
本開示は、ＣＤ８  Ｔ細胞を刺激するために、「ストレスを受けた」線維芽細胞をフィーダー細胞として使用することを提供する。ＣＤ８  Ｔ細胞の刺激には、増殖能の増強、サイトカイン分泌の増強、細胞傷害活性の増大及び／又は共刺激の所要量の減少が挙げられる。本開示の１つの実施形態において、熱ショックタンパク質の発現を誘導するのに十分な及び線維芽細胞の成長因子産生活性を変化させるのに十分な持続時間にわたる、非生理学的条件への線維芽細胞の曝露が存在する。線維芽細胞がストレスを受けるのと同時に、又は線維芽細胞がストレスを受けた後、その線維芽細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞に曝される。１つの実施形態において、線維芽細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞と同種異系であり、別の実施形態において、線維芽細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞と自家である。
【０２２４】
線維芽細胞に対するストレスへの曝露は、当該分野で公知の様々な手段を用いて行われ得る。１つの実施形態において、線維芽細胞は、高熱に曝露され、その高熱は、１〜８時間にわたる温度の上昇を含み得、その温度の上昇は、３９〜４２℃であり得る。具体的な場合において、細胞は、およそ４０℃において４時間にわたって高熱に曝露される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離され、ＣＤ８細胞は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いて精製される。他の実施形態において、ＣＤ８Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球から抽出される。腫瘍浸潤リンパ球を単離する方法は、当該分野で公知であり、参照により援用される（Ｉｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０２２５】
１つの実施形態において、ＣＤ８  Ｔ細胞の集団は、被験体由来の血液サンプルから得られ、例えば、アフェレーシスによって得られる。１つの実施形態において、アフェレーシスによって回収された免疫エフェクター細胞は、血漿画分を除去するために洗浄され、必要に応じて、それらの細胞は、その後の処理工程のために適切な緩衝液又は培地中に提供される。１つの実施形態において、それらの細胞は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。ある実施形態において、それらの細胞は、１つ以上の二価カチオン（例えば、カルシウム及び／又はマグネシウム）を欠く洗浄液で洗浄される。１つの実施形態において、それらの免疫エフェクター細胞は、二価カチオンを実質的に有しない緩衝液で洗浄される。
【０２２６】
１つの実施形態において、上記方法は、免疫エフェクター細胞の集団から、外来性ｓｉＲＮＡを一過性に発現する、ｓｉＲＮＡによって操作されたＴ細胞の集団を作製する工程を含む。上記方法は、線維芽細胞への曝露の前又は後に、インビトロで転写されたｓｉＲＮＡ又は合成ｓｉＲＮＡを免疫細胞に導入する工程を含む。そのｓｉＲＮＡトランスフェクションは、免疫細胞からのＣＤ８  Ｔ細胞の抽出の前又は後に行われ得る。具体的な場合において、そのｓｉＲＮＡは、免疫学的チェックポイントなどの免疫阻害性分子を標的化する。数多くの免疫学的チェックポイントが当該分野で公知であり、それらとしては、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＳＴＡＴ６、ＩＬ−１０及び／又はＰＤ−１が挙げられる。１つの実施形態において、そのｓｉＲＮＡは、エレクトロポレーションによって免疫エフェクター細胞に導入される。１つの実施形態において、その免疫エフェクター細胞の少なくとも少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、そのｓｉＲＮＡを発現する。１つの実施形態において、その免疫エフェクター細胞は、その免疫エフェクター細胞を、リガンド、例えば、同族抗原分子又は抗イディオタイプ抗体の存在下において培養することによって、拡大及び／又は活性化される。１つの実施形態において、その免疫エフェクター細胞は、ｓｉＲＮＡがその免疫エフェクター細胞に導入された少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２８、３２、３６、３６又は４８時間後に、同族抗原分子又は抗イディオタイプ抗体と接触される。１つの実施形態において、その免疫エフェクター細胞は、ＲＮＡがその免疫エフェクター細胞に導入された２４、１５、１２、１０又は８時間未満後に、同族抗原分子又は抗イディオタイプ抗体と接触される。具体的な実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ｓｉＲＮＡが免疫エフェクター細胞に導入されてから少なくともある特定の長さの時間の後に、同族抗原分子又は抗イディオタイプ抗体と接触され、その場合、ＣＤ８細胞は、まだ抽出されておらず、その免疫エフェクターは、活性化され；その後、ＣＤ８細胞が抽出される。
【０２２７】
本開示のいくつかの実施形態において、Ｔ細胞増殖を刺激することができる抗原が、ストレスを受けた線維芽細胞／Ｔ細胞培養物に加えられる。抗原は、その培養物に、タンパク質、ペプチド及び／又は変更されたペプチドリガンドとして加えられ得るか、又はそれらのうちの任意のものが、線維芽細胞に遺伝的に操作され得る。腫瘍免疫療法において使用するためのＣＤ８細胞の拡大の状況において、腫瘍抗原が利用され得る。例示的な腫瘍抗原としては、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ−１１Ｒ．アルファ．、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＦＡＰ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣＳＤ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点（ｓａｒｃｏｍａ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン（ｌｅｇｕｍａｉｎ）、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５及び／又はＩＧＬＬ１が挙げられる。
【０２２８】
１つの実施形態において、抗原を伴う又は伴わない線維芽細胞とＣＤ８Ｔ細胞との培養物は、増殖及び／又は生存能を高めるための１つ以上の因子（例えば、以下：インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−ベータ及びＴＮＦ−アルファ又は細胞増殖のための他の任意の添加物のうちの１、２、３、４、５つ又はそれ以上を含む血清（例えば、ウシ胎仔血清又はヒト血清）を含む）をさらに含む。１つの実施形態において、反応混合物は、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−７をさらに含む。１つの実施形態において、それらの細胞は、ＩＬ−２の存在下において拡大される。
【０２２９】
１つの実施形態において、ストレスを受けた線維芽細胞は、抗原提示細胞として作用し、他の実施形態では、抗原提示細胞が、培養物に加えられる。
【０２３０】
本開示の実施形態は、ＣＤ８  Ｔ細胞の活性を高める方法を含み、その方法は、ａ）線維芽細胞の集団を１つ以上のストレッサーに曝露する工程；ｂ）それらの線維芽細胞をＣＤ８系列のＴ細胞と組み合わせて培養する工程；ｃ）その培養物からＣＤ８Ｔ細胞を抽出する工程を含む。具体的な実施形態において、ストレッサーは、高熱、例えば、熱ショックタンパク質９０の発現を誘導できる持続時間にわたる高温への曝露である。その高熱は、１、２、３、４、５、６、７若しくは８時間又はそれらの間の任意の範囲にわたる４０℃の温度への曝露であり得る。ストレッサーは、１２、１３、１４、１５、１６、１、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７若しくは４８時間又はそれらの間の任意の範囲（１２〜４８時間を含む）にわたる血清枯渇への曝露を含み得る。
【０２３１】
特定の実施形態において、ストレスを受けた線維芽細胞へのＣＤ８Ｔ細胞の曝露の後、ＣＤ８  Ｔ細胞の１つ以上の活性は、ストレスを受けた線維芽細胞への曝露の非存在下におけるＣＤ８  Ｔ細胞の活性と比べて変化する。そのような活性は、ａ）増殖；ｂ）サイトカイン産生；ｃ）細胞傷害性；及びｄ）それらの組み合わせからなる群より選択される活性を少なくとも含む。サイトカイン産生は、ＩＬ−２、ＩＬ−７及び／又はＩＬ−１５の分泌の増加を含み得る。具体的な実施形態において、増殖は、サイトカイン投与に応答して増加し、そのようなサイトカインは、ａ）ＩＬ−２；ｂ）ＩＬ−７；ｃ）ＩＬ−１５；及びｄ）それらの組み合わせからなる群より選択され得る。ＣＤ８  Ｔ細胞に対するある特定の場合において、ストレスを受けた線維芽細胞へのＣＤ８  Ｔ細胞の曝露の後、それらの増殖は、Ｔ細胞受容体の連結（例えば、抗原又はマイトジェンによって達成される）に応答するなどして、増加する。特定の実施形態において、ストレスを受けた線維芽細胞へのＣＤ８  Ｔ細胞の曝露の後、ＣＤ８  Ｔ細胞は、高い細胞傷害性（標的細胞を殺滅する能力、高いパーフォリン産生；及び／又は高いグランザイム産生を含む）を有する。
【０２３２】
本開示の実施形態は、ストレスを受けた線維芽細胞へのＣＤ８  Ｔ細胞の曝露後の活性の増大を含み、その活性には、ＣＤ８  Ｔ細胞が、ａ）増殖する能力；ｂ）サイトカインを産生する能力；及び／又はｃ）ストレッサーに曝露された線維芽細胞の存在下で培養されてないＣＤ８  Ｔ細胞と比べて少ない所要量の共刺激分子で細胞傷害性を誘導する能力が含まれる。そのような共刺激分子としては、ＣＤ８０；ＣＤ８６；ＣＤ４０；ＣＤ２８の連結；ＩＬ−２；及び／又はＩＬ−１２が挙げられる。
【０２３３】
Ｉ．線維芽細胞及びその集団による移植片対宿主病の処置
特定の実施形態において、本開示は、細胞療法、より詳細には、移植片対宿主病を刺激する可能性を有する細胞要素を運ぶことができる、器官及び／又は細胞移植片の移植に関する。具体的な実施形態において、本開示は、移植片対宿主病を予防するため、抑制するため、及び逆転させるための細胞療法の利用に関する。具体的な実施形態では、個体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を抑制するために、線維芽細胞を利用する。
【０２３４】
本実施形態は、ＧＶＨＤを刺激する移植片におけるドナー細胞に対処する。特定の場合において、これらのドナー細胞は、ドナーの細胞又は組織（例えば、幹細胞接種材料）に存在するドナーＴリンパ球であって、効果的な免疫応答を開始するのに必要なドナーＴリンパ球である。機能的な免疫系は、外来性のドナー由来のＴ細胞を拒絶することができるが、レシピエントの免疫系が、様々な免疫除去剤の使用（化学療法及び／又は放射線療法）によって損なわれているとき、そのレシピエントは、移植された細胞を拒絶できない。特定の実施形態において、ドナーとレシピエントで異なる組織抗原は、主要及びマイナーヒト白血球抗原（ＨＬＡ）であり、細胞表面上でのそれらの発現は、同種異系のＴ細胞の活性化及び疾患の開始に不可欠である。
【０２３５】
１つの実施形態において、線維芽細胞系列の細胞が、移植片対宿主反応の予防及び／又は処置を必要とする個体に対する、移植片対宿主反応の予防及び／又は処置に利用される。本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞が、移植片（例えば、同種異系細胞移植片、組織移植片又は器官移植片）のレシピエントに適した条件下において投与される。具体的な場合において、そのような線維芽細胞は、ドナーのリンパ球がレシピエントの組織に対する免疫学的反応を誘発するのを防ぐ。具体的な実施形態では、ドナーのリンパ球がレシピエントの組織に対する免疫学的反応を誘発するのを防ぐために、同種異系皮膚線維芽細胞が、同種異系細胞移植片のレシピエントに投与される。
【０２３６】
１つの具体的な実施形態において、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、リポ多糖又はＨＭＢＧ−１）によって刺激された単球からのＴＮＦ−アルファの産生を抑制する能力について線維芽細胞が選択される。それらの線維芽細胞は、樹状細胞の成熟を阻害する能力に関連する１つ以上のマーカーの発現（例としてＩＬ−１０、ヒト絨毛性ゴナドトロピン及び／又はＩＬ−２０の分泌が挙げられる）に基づいて単離され得る。
【０２３７】
本発明は、同種異系線維芽細胞が、全身の免疫抑制を誘導することなく、慢性状態において炎症性サイトカインを減少させるというこれまで予期されなかった能力を教示する。詳細には、本発明は、腫瘍に伴う悪液質などの炎症状態において、同種異系起源の線維芽細胞の導入が、炎症の低減及び免疫学的パラメータの回復をもたらすことを教示する。
【０２３８】
１つの具体的な実施形態において、同種異系線維芽細胞の投与は、造血幹細胞移植の状況におけるＧＶＨＤを低減するために利用される。他の実施形態において、レシピエント及び／又はドナーの線維芽細胞が、細胞移植片（例えば、骨髄、膵島、又は他の単一細胞若しくは複合性の細胞移植片）の導入の前及び／又は後に投与される。
【０２３９】
線維芽細胞は、種々の組織に由来し得る。１つの実施形態において、単離された細胞は、ＳＳＥＡ−１マーカーをほとんど又はまったく発現しない。本発明の有用な細胞は、正常にはヒト間葉系幹細胞上に見られるが正常にはヒト幹細胞上には見られない細胞表面抗原も高レベルで発現し、それらは、ＣＤ５６（９９．６％）、アミノペプチダーゼＮ、ＣＤ４４（９９．７％）ヒアルロン酸結合受容体、ＣＤ４９ｂ（９９．８％）コラーゲン／ラミニン結合インテグリンアルファ２、及びＣＤ１０５（９７％）エンドグリンを含む。線維芽細胞培養物に胚性幹細胞マーカーと固有マーカーの両方が存在することは、本明細書中に記載されるように生育され、増やされた線維芽細胞が、新規クラスの再生細胞であることを示唆する。
【０２４０】
本開示のいくつかの実施形態において、培養物中の細胞の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、ＣＤ５６を発現する。追加の実施形態において、培養物中の細胞の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が、ＣＤ３７を発現する。本発明のいくつかの実施形態において、培養物中の細胞の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲が、ＣＤ１２７を発現する。本発明のさらなる実施形態において、培養物中の細胞の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の範囲が、ＣＤ１２７を発現する。
【０２４１】
本開示の１つの特定の実施形態において、再生細胞は、連続培養において未分化な状態で無期限に増やされ得る線維芽細胞である。用語「未分化な」とは、特殊化した細胞型になっていない細胞のことを指す。「栄養培地」は、増殖を促進する栄養分を含む、細胞を培養するための培地である。栄養培地は、以下のうちのいずれかを適切な組み合わせで含み得る：等張食塩水、緩衝剤、アミノ酸、抗生物質、血清又は血清代替物、及び外から加えられる因子。羊水線維芽細胞は、所望のとおりの期間にわたって未分化な状態で生育され得（及び必要に応じて、上に記載されたように保存され得）、次いで、分化した状態に進むのを可能にするある特定の条件下で培養され得る。いったん十分な細胞塊が得られたら、細胞は、インビトロ及びインビボにおいて、内胚葉、中胚葉及び外胚葉に由来する組織に分化できることが知られている。この未分化細胞から特定の細胞型又は組織型への計画された特殊な分化は、「有向分化」と呼ばれる。抗炎症性の表現型への有向分化を用いて再生細胞から調製され得る例示的な細胞型としては、脂肪細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝臓細胞、脳細胞、血液細胞、ニューロン、グリア細胞、膵臓細胞などを含む群から選択される細胞と関連するＣＤ１０５を有する細胞の誘導が挙げられるがこれに限定されない。
【０２４２】
ある特定の実施形態において、ＧＶＨＤの処置又は予防を必要とする個体に治療有効量の線維芽細胞を送達することによって、ＧＶＨＤを処置又は予防する方法が存在する。その方法は、いくつかの場合において、線維芽細胞集団を得る工程；及びその線維芽細胞集団をエクスビボで拡大する工程も含み得る。その個体は、有害な免疫反応を誘発し得る治療（例えば、免疫療法）を受けてきた、受けている、及び／又は受けることになっているので、ＧＶＨＤの処置又は予防を必要とし得る。線維芽細胞の投与は、ＧＶＨＤの発症を遅延させ得、かつ／又はその重症度を低下させ得る。
【０２４３】
Ｊ．線維芽細胞単球混合物の投与による梗塞後リモデリングの処置
いくつかの実施形態において、線維芽細胞の存在下において培養された自家単球の投与による、梗塞後の心臓損傷の修復に有用な組成物、処置及びプロトコルが存在する。１つの実施形態において、プロスタグランジン−Ｅ２の存在下における線維芽細胞と単球との共培養は、心筋再生を誘導でき、病的な梗塞後リモデリングを抑制できる、細胞組成物を生成する。
【０２４４】
本開示は、例えばＰＧＥ−２の存在下において、線維芽細胞を単球とともに培養することによって得られる、成長因子産生と抗炎症効果との予想外の相乗作用を包含する。この培養によって付与される特性は、動物モデルにおいて心筋再生を誘導し、梗塞後の心臓容積を保つ。
【０２４５】
本開示の１つの実施形態では、様々な濃度のＰＧＥ−２によって、単球と線維芽細胞との共同培養物に、心筋再生に有益な相乗的な量のＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ及びＥＧＦを産生する能力が付与される。別の実施形態において、本開示は、線維芽細胞と相乗作用を示し、その線維芽細胞に心筋再生を誘導する能力を付与する、Ｍ２細胞の治療的集団を作製する手段を提供する。
【０２４６】
本開示は、Ｍ２細胞が生成されるのを可能にする、単球と線維芽細胞との共培養物の投与を包含するが、しかしながら、いくつかの場合では、ＰＧＥ２が、最適な生成のために利用される。線維芽細胞と単球との共培養された細胞の使用は、Ｍ２細胞が適用されている領域に適用され得る。例えば、機構的に、Ｍ２マクロファージは、血管新生の刺激による梗塞後の心筋傷害の低減と関連することが示されており、これは、参照により援用される（Ｄａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｍ２刺激性サイトカインであるインターロイキン１３が遺伝的に欠損したマウスにおける洗練された研究は、Ｍ２マクロファージが欠損したマウスでは、梗塞のサイズが大きいこと及び梗塞後の治癒が低減することを示した（Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。これらの結果は、ＣＳＦ−１受容体のシグナル伝達経路の欠損によってＭ２マクロファージの枯渇が達成された別の研究でも再現された（Ｌｅｂｌｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。梗塞後の心不全を増悪する処置は、Ｍ２マクロファージの蓄積を減少させる（Ｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。さらに、治癒及び血管新生の加速を誘導する治療は、Ｍ２マクロファージの生成を刺激すると多くの状況において示された（Ｂｅｎ−Ｍｏｒｄｅｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｗｅｉ，２０１４；Ｃｏｕｒｔｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｗｅｉｒａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｒａｆａｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｄｉ  Ｆｉｌｉｐｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｓｉｎｇｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｙａｂｌｕｃｈａｎｓｋｉｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。例えば、間葉系幹細胞の投与は、Ｍ１マクロファージの減少及びＭ２マクロファージの増加を誘導すると示され、これは、血管新生の刺激による梗塞後の回復の改善と相関する（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。機構的に、Ｍ２マクロファージは、炎症を抑制し、血管新生を刺激すると知られており（Ｂａｒｂａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、これは、梗塞後の治癒の重要な態様である。さらに、Ｍ２マクロファージは、Ｍ１マクロファージの形成を阻害する。Ｍ１マクロファージは、病的な心臓リモデリング及び心不全への進行に関連するので、このことは、重要である（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。したがって、本開示の１つの態様において、Ｍ２マクロファージがインビトロで生成され、心筋梗塞に罹患している患者に全身的又は局所的に投与される。
【０２４７】
いくつかの実施形態において、心筋梗塞症の後の個体を処置する方法が存在し、その方法は、ａ）線維芽細胞集団を得る工程；ｂ）その線維芽細胞集団を単球（処置される個体に対して、自家、同種異系又は異種）とともに、それらの線維芽細胞及び／又は単球に心臓修復特性を付与するのに十分な期間にわたって及び付与するのに十分な濃度で培養し、それにより、心臓修復特性を有する線維芽細胞及び／又は単球の集団を作製する工程；及びｃ）その集団をその個体に投与する工程を含む。それらの線維芽細胞は、自家起源、同種異系起源又は異種起源から入手され得る。それらの線維芽細胞は、任意の種類であってよく、それらとしては、ａ）脂肪線維芽細胞；ｂ）皮膚線維芽細胞；ｃ）臍帯線維芽細胞；ｄ）包皮線維芽細胞；ｅ）胎盤線維芽細胞；ｆ）大網線維芽細胞；及びｇ）それらの組み合わせからなる群より選択される組織に由来する線維芽細胞が挙げられる。
【０２４８】
そのような方法において、単球は、プラスチックへの接着によって入手され得る。それらの単球は、フローサイトメトリー精製（マーカーＣＤ１４に対するものを含む）によって入手され得る。具体的な実施形態において、それらの単球は、マーカーＣＤ１４に対する磁気活性化選別（ＭＡＣＳ）精製によって入手される。
【０２４９】
線維芽細胞と単球とが共培養されるとき、それらは、任意の好適な条件及び任意の好適な比で共培養され得る。具体的な実施形態において、それらの線維芽細胞及び単球は、およそ１：１、２：１、５：１、１０：１、５０：１、１００：１、１：２、１：５、１：１０、１：５０、１：１００などの比で培養される。線維芽細胞及び単球は、ＰＧＥ２の存在下において、およそ１〜７２、１〜６０、１〜５０、１〜４８、１〜３６、１〜２４、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜７２、２〜６０、２〜５０、２〜４８、２〜３６、２〜２４、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、６〜７２、６〜６０、６〜５０、６〜４８、６〜３６、６〜２４、６〜１８、６〜１２、６〜１０、１０〜７２、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４８、１０〜３６、１０〜２４、１０〜１８、１０〜１２、１８〜７２、１８〜６０、１８〜５０、１８〜４８、１８〜３６、１８〜２４、１８〜２０、２０〜７２、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、２４〜７２、２４〜４８、２４〜３６、２４〜２８、３０〜７２、３０〜６０、３０〜４８、３０〜３６、４８〜７２、４８〜６０、４８〜５０、５０〜７２、５０〜６０又は６０〜７２時間にわたって培養され得る。線維芽細胞及び単球は、ＰＧＥ２の存在下において、およそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２時間又はそれ以上にわたって培養され得る。
【０２５０】
培養物中のプロスタグランジンＥ２の量は、およそ１〜１００００、１〜７５００、１〜５０００、１〜１０００、１〜５００、１〜２５０、１〜１００、１〜５０、５０〜１００００、５０〜７５００、５０〜５０００、５０〜１０００、５０〜５００、５０〜１００、１００〜１００００、１００〜７５００、１００〜５０００、１００〜２５００、１００〜１０００、１００〜５００、５００〜１００００、５００〜７５００、５００〜５０００、５００〜２５００、５００〜１０００、５００〜７５０、７５０〜１００００、７５０〜７５００、７５０〜５０００、７５０〜２５００、７５０〜２０００、７５０〜１０００、１０００〜１００００、１０００〜７５００、１０００〜５０００、１０００〜２５００、２５００〜１００００、２５００〜５０００、５０００〜１００００又は７５００〜１００００ナノグラム／ｍｌであり得る。培養物中のプロスタグランジンＥ２の量は、およそ１、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、５７５０、６０００、６２５０、６５００、６７５０、７０００、７２５０、７５００、７７５０、８０００、８２５０、８５００、８７５０、９０００、９２５０、９５０、９７５０又は１００００ナノグラム／ｍｌ又はそれ以上であり得る。
【０２５１】
具体的な実施形態において、単球は、線維芽細胞との組織培養後にアルギナーゼ活性を発現する。
【０２５２】
単球と線維芽細胞との共培養後に、それらは、梗塞の約３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜９、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、７〜１１、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、８〜１０、８〜９、９〜１５、９〜１４、９〜１３、９〜１２、９〜１１、９〜１０、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１１〜１２、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜１５、１３〜１４又は１４〜１５日後の個体に投与され得る。いくつかの場合では、単球と線維芽細胞との共培養物は、梗塞後３日未満に、例えば、１〜２日後に、送達される。
【０２５３】
共培養された単球と線維芽細胞との組み合わせが、心筋内を含む任意の好適な経路によって投与され得る。それは、梗塞に関係のある動脈に、例えばバルーンカテーテルによって投与され得る。具体的な場合において、培養された単球と線維芽細胞との組み合わせは、冠状静脈洞へのバルーン談合を用いて逆行性に投与される。
【０２５４】
Ｋ．線維芽細胞の投与による多発性硬化症の処置
この実施形態において、個体において多発性硬化症の発症を阻害できる免疫学的プロセスを刺激する手段が存在する。本開示の１つの特定の実施形態において、多発性硬化症を阻害するための線維芽細胞の投与（静脈内投与を含む）、及び／又は多発性硬化症における再生の刺激が存在する。他の特定の処置方法は、ミエリン塩基性タンパク質及びその抗原性フラグメントに特異的な制御性Ｔ細胞を増強するために、線維芽細胞に続く低用量でのインターロイキン−２の投与を含む。
【０２５５】
本開示の実施形態は、多発性硬化症を処置する方法を含み、その方法は、それを必要とする個体に線維芽細胞を投与する工程を含む。その投与は、例えば静脈内であってもよいし、そうでなくてもよい。具体的な実施形態において、線維芽細胞は、ａ）大網；ｂ）皮膚；ｃ）臍帯血；ｄ）胎盤；ｅ）ワルトン膠様質；ｆ）末梢血；又はｇ）脂肪組織に由来する。具体的な場合において、線維芽細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるマーカーを発現する。線維芽細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のマーカーの発現を欠き得る。線維芽細胞は、プラスチックに接着性であり得る。線維芽細胞は、個体に対して自家、同種異系又は異種であり得る。線維芽細胞は、進行中の混合リンパ球反応に加えられると、混合リンパ球反応を＞５０％阻害する能力を有し得る。上記方法の具体的な実施形態において、応答リンパ球の増殖が評価される。応答リンパ球からのインターフェロンガンマの産生が評価され得る。
【０２５６】
特定の実施形態において、線維芽細胞は、１用量あたり（例えば、１注入あたり）約１０，０００〜２，０００，０００／ｋｇの濃度で投与される。その用量は、例えば、１用量あたり１０，０００〜２，０００，０００；１０，０００〜１，０００，０００；１０，０００〜５００，０００；１０，０００〜２５０，０００；１０，０００〜１００，０００；１００，０００〜２，０００，０００；１００，０００〜１，０００，０００；１００，０００〜５００，０００；１００，０００〜２５０，０００；２５０，０００〜２，０００，０００；２５０，０００〜１，０００，０００；２５０，０００〜５００，０００；５００，０００〜２，０００，０００；又は５００，０００〜１，０００，０００／ｋｇであり得る。線維芽細胞は、１用量あたり１０，０００／ｋｇ；１用量あたり５０，０００／ｋｇ；１用量あたり１００，０００／ｋｇ；１用量あたり５００，０００／ｋｇ；１用量あたり１，０００，０００／ｋｇ；又は１用量あたり２，０００，０００／ｋｇの濃度で投与され得る。
【０２５７】
具体的な実施形態において、制御性Ｔ細胞（例えば、１用量あたり１０，０００〜２，０００，０００；１０，０００〜１，０００，０００；１０，０００〜５００，０００；１０，０００〜２５０，０００；１０，０００〜１００，０００；１００，０００〜２，０００，０００；１００，０００〜１，０００，０００；１００，０００〜５００，０００；１００，０００〜２５０，０００；２５０，０００〜２，０００，０００；２５０，０００〜１，０００，０００；２５０，０００〜５００，０００；５００，０００〜２，０００，０００；又は５００，０００〜１，０００，０００／ｋｇ）が、線維芽細胞とともに投与される。具体的な場合において、線維芽細胞は、例えば、９６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり１００，０００細胞の濃度で培養されたとき、少なくとも１０、２０、５０、１００ｐｇ／ｍｌ又はそれ以上のＴＧＦ−ベータを産生することができる。
【０２５８】
多発性硬化症は、神経系組織に対するＴ細胞の攻撃に関連する場合もあるし、関連しない場合もある。いくつかの場合では、例えば線維芽細胞が同種異系又は異種であるとき、寛容の発生を高めるために、ラパマイシンが線維芽細胞とともに投与される。ある特定の実施形態では、例えば線維芽細胞が同種異系又は異種であるとき、寛容の発生を高めるために、抗ＣＤ３抗体が線維芽細胞とともに投与される。ある特定の実施形態では、例えば線維芽細胞が同種異系又は異種であるとき、寛容の発生を高めるために、抗ＣＤ５２抗体が線維芽細胞とともに投与される。
【０２５９】
本開示の１つの実施形態において、多発性硬化症の病理に関与する又は少なくとも関係する自己反応性Ｔ細胞のレベル及び／又は活性を低下させる手段としての線維芽細胞の投与が存在する。
【０２６０】
本開示は、制御性Ｔ細胞数の増加をインビボで刺激することによって自己反応性Ｔ細胞を減少させることができる線維芽細胞の様々な集団を提供する。これらの細胞は、自己免疫攻撃から身体を防御する免疫系の必須の構成要素である。これは、新生仔期に胸腺摘除されたマウスが全身性自己免疫に罹患し、そのマウスがＣＤ４細胞の移入によってレスキューされたという初期の研究によって説明される。本発明の１つの実施形態によると、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）の表現型は、ＩＬ−２受容体であるＣＤ２５を有すると記載される。末梢血は、制御性Ｔの表現型（「Ｔｒｅｇ」）を発現する、すなわち、ＣＤ４抗原とＣＤ２５抗原の両方が陽性である、Ｔ細胞リンパ球の小さい集団を含む。本開示の方法の実施において、Ｔｒｅｇ細胞のいくつかのサブセットが定義される。制御性細胞の１つのサブセットは、胸腺において発生する。胸腺由来のＴｒｅｇ細胞は、細胞間接触を必要とする、サイトカインと無関係な機構によって機能する。それらは、自己寛容の誘導及び維持並びに自己免疫の予防に必須である。これらの制御性細胞は、胸腺での除去を免れた自己反応性Ｔ細胞の活性化及び増殖を防ぐか、又は胸腺外の抗原を認識するので、それらは、ホメオスタシス及び免疫制御、並びに自己免疫の発生からの宿主の防御にとって重要である。したがって、免疫制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は、「プロフェッショナルサプレッサー細胞」と称されることが多い。
【０２６１】
本発明の１つの実施形態において、内因性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の産生の刺激は、線維芽細胞を静脈内に投与することによって達成される。天然に存在するＴｒｅｇは、胸腺において高親和性リガンドに対してポジティブ選択され、自己抗原に対する免疫寛容の確立及び維持において重要な役割を果たすと示された、細胞の独特の細胞集団であることが知られている。これらの細胞の発生及び／又は機能の欠陥は、ヒト及び先天性の又は誘導された自己免疫の様々な動物モデルにおいて重篤な自己免疫に関連した。
【０２６２】
本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞の静脈内投与の結果として生じる、免疫寛容誘発サイトカインの増強によって生成されたＴｒｅｇ細胞は、細胞間接触によって直接的に、又は可溶性因子を介して間接的に、免疫寛容誘発効果を示す。理論に拘束されることを望むものではないが、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）におけるＩＬ−２発現の阻止、Ｔｅｆｆ細胞の物理的排除、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７軸による免疫寛容原性樹状細胞（ＤＣ）の誘導、並びにＴＧＦ−ベータ及びＩＬ−１０を介したＴｅｆｆ細胞の阻害が、現在までに関係していると見なされている機構の一部である。また、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０を介したＴｅｆｆ細胞への逆シグナル伝達が、Ｔｒｅｇ細胞によるそれらの阻害において重要な役割を果たすことも示されている。同様に、Ｔｒｅｇ細胞上のＣＴＬＡ−４とＤＣ上のＣＤ８０との相互作用が、逆シグナル伝達、及びトリプトファン代謝の制御を介した寛容に関わるインドールアミンジオキシゲナーゼ酵素のアップレギュレーションをもたらし得る。
【０２６３】
本発明の様々な実施形態に従って使用されるのに適切な線維芽細胞の用量は、数多くの因子に依存する。それは、種々の状況に対してかなり異なり得る。一次療法及び補助的療法のために投与される線維芽細胞の最適な用量を決定するパラメータは、通常、以下のうちのいくつか又はすべてを含む：処置される疾患及びそのステージ；被験体の種、健康状態、性別、齢、体重及び代謝速度；被験体の免疫能；施される他の治療；及び被験体の履歴又は遺伝子型から予想される潜在的な合併症。それらのパラメータには、線維芽細胞が、同系であるのか、自家であるのか、同種異系であるのか、異種であるのか；それらの効力（比活性）；線維芽細胞が有効になるために標的化されなければならない部位及び／又は分布；並びにそのような部位の特徴（例えば、線維芽細胞への到達性及び／又は線維芽細胞の生着）も含まれ得る。さらなるパラメータとしては、線維芽細胞と他の因子（例えば、成長因子及びサイトカイン）との同時投与が挙げられる。所与の状況における最適な用量は、細胞が製剤化される方法、それらが投与される方法、及び投与後に細胞が標的部位に局在する程度も考慮に入れる。最後に、最適な投与の決定は、必然的に、有益な最大効果の閾値よりも低くなく、線維芽細胞の用量に関連する悪影響が用量増加の利点を上回る閾値よりも高くない、有効量を提供する。
【０２６４】
いくつかの実施形態に対する線維芽細胞の最適な用量は、同種異系間葉系幹細胞に対して用いられる用量の範囲内である。線維芽細胞のかなり純粋な調製物の場合、様々な実施形態における最適な用量は、１投与あたり１０４〜１０８線維芽細胞／ｋｇレシピエント質量という範囲である。いくつかの実施形態において、１投与あたりの最適な用量は、１０５〜１０７線維芽細胞／ｋｇである。多くの実施形態において、１投与あたりの最適な用量は、５×１０５〜５×１０６線維芽細胞／ｋｇである。参考として、前述におけるより高い用量は、同種異系間葉系幹細胞の移植において用いられる有核細胞の用量に類似している。単回用量は、一度にすべて送達され得るか、分割して送達され得るか、又はある時間にわたって持続的に送達され得ることが認識されるべきである。全用量が、単一の箇所に送達されてもよいし、分割していくつかの箇所に広げられてもよい。ヒト被験体は、一般に実験動物よりも長く処置されることに注意されたいが、処置は一般に、疾患の経過及び処置の有効性に比例した長さを有する。当業者は、ヒトにとって適切な用量を決定するためにヒト及び／又は動物（例えば、ラット、マウス、非ヒト霊長類など）において行われた他の手順の結果を用いてこのことを考慮に入れる。これらの考慮すべき事柄に基づき、本開示及び従来技術によって提供されるガイダンスを考慮に入れて、そのような決定によって、当業者が過度の実験を行うことなくそれを行うことが可能となる。最初の投与及びさらなる投与又は連続投与に対する好適なレジメンは、すべて同じであってもよいし、定まっていなくてもよい。適切なレジメンは、本開示、本明細書に引用された書類及び当該分野の知識から、当業者が確かめることができる。
【０２６５】
本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞は、多発性硬化症に罹患している患者の静脈内に、同じ人物（自家）又は異なる人物（同種異系）から得られた制御性Ｔ細胞とともに投与される。Ｔｒｅｇ細胞は、様々な研究室において公知であって日常的に用いられている手段によって生成され得る。任意の細胞単離方法が、本教示に従って用いられ得る。末梢血から制御性細胞を単離する１つの例示的な方法は、勾配（例えば、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配）あり又はなしでの遠心分離を含む。この手法では、密度に基づいて細胞を分離する。使用され得る別の例示的な方法としては、例えば、細胞表面上の分子（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０など）を認識し、結合する抗体として、表面又は磁気ビーズに固定化された分子をそれぞれ用いる、パニング及び免疫磁気単離が挙げられる。表面に固定化された又は磁気ビーズに結合体化された分子は、特定の細胞型の細胞特異的表面マーカーの１つ以上を認識し、結合する。１つ以上の細胞表面マーカーを有する細胞は、固定化された分子によって結合されるか、又はビーズに結合体化された細胞を磁場に曝露することによって結合され、他の任意の細胞が洗浄除去される。ポジティブ選択手順では、目的の細胞型が保持され、ネガティブ選択手順では、目的の細胞型が除かれる。本教示に従って使用され得る別の単離手順としては、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。蛍光タグを有する抗体が、目的の細胞に結合するために使用され得る。それらの抗体は、細胞表面分子（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０など）に結合し、次いで、ＦＡＣＳ選別機が、観察される蛍光に基づいて細胞を選別し、回収し得る。次いで、ある特定の蛍光を示す細胞が、単離され得る。免疫制御性細胞の単離の後、それらの細胞は、さらに培養され得、拡大され得、かつ／又は刺激され得る。単離された免疫制御性細胞のエクスビボでの拡大には、例えば、制御性Ｔ細胞のプロトコルが含まれる：細胞が、ＩＬ−２の高濃度、ＩＬ−１０、及び樹状細胞による刺激／教育の存在下において、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激（例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体）を用いて培養される。本明細書中に記載されるような（すなわち、抗原提示細胞を用いた）エクスビボでの細胞の拡大はまた、抗原特異的な免疫制御性細胞を選択的に濃縮し得る。それらの免疫制御性細胞は、単離及びエクスビボ操作の前にこれらの細胞の数を増加させるためにインビボにおいても拡大され得ることが認識されるだろう。
【０２６６】
Ｌ．線維芽細胞によって媒介される自己免疫処置
この実施形態は、誘導性の様式又は恒常的な様式で目的の抗原を発現するように線維芽細胞を遺伝的に改変することによって抗原特異的寛容を誘導する手段に関する。当該分野の以前の研究は、非免疫原性の経路（例えば、経口的、鼻腔内、又は未熟樹状細胞を用いた送達）における自己抗原の投与を含み、これらは、臨床的有効性のいくつかの徴候を示した。しかしながら、その効果は、ヒトにおいて治療の成功を可能にするほど十分強くなかった。本実施形態では、自己免疫などに対する処置としてユニバーサルドナー抗原特異的免疫寛容誘発ワクチンを作製するための、制御された様式で自己抗原の過剰発現を誘導する線維芽細胞の遺伝子改変が存在する。線維芽細胞は、これまで知られていなかった、線維芽細胞のａ）制御性Ｔ細胞を誘導する能力；ｂ）ヘルパーＴ細胞、傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞（例えば）を抑制する能力；及びｃ）抗原提示細胞が抗原提示のプロセスを行う能力を低下させる阻害性プロセスを刺激する能力の発見に基づいて、抗原特異的寛容の誘導の基礎として利用される。本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞が同種異系の様式で利用されることを考えると、寛容の誘導は、主に抗原提示の間接的経路によって生じ得、これは、免疫調節因子の状況において免疫寛容誘発（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）の影響を受けやすい。
【０２６７】
免疫寛容は、免疫系の重要な特長であり、それは、身体に属する抗原を選択的に無視しつつ、病理学的脅威の認識及び排除を可能にする。免疫寛容の機構を理解すること、及びこのプロセスを誘導する能力を有することは、米国の人口のおよそ８％が罹患する自己免疫状態に大きな影響を及ぼし得る。
【０２６８】
主要な自己免疫疾患としては、関節リウマチ、多発性硬化症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス及び炎症性腸疾患が挙げられる。従来から、自己免疫状態は、炎症の非特異的阻害剤（例えば、ステロイド）、並びに免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、５−アザトリオプリン及びメトトレキサート）で処置される。これらのアプローチは、免疫機能を包括的に抑制し、数多くの望ましくない副作用を有する。残念なことに、自己免疫を有する患者において観察された生活の質の実質的な低下を考えると、自己免疫の症状の軽減の可能性は、日和見感染及び新形成への素因の増加などの副作用を上回る。抗ＴＮＦ−アルファ抗体などの「生物学的治療」の導入は、予後をいくらか改善したが、その介入の非特異的性質に起因して、なおも副作用が存在する。にもかかわらず、ＴＮＦ−アルファ阻害剤の販売は、かなり成功している：Ｈｕｍｉｒａ（＄９．２Ｂ；２０１２）、Ｅｎｂｒｅｌ（＄７．８Ｂ；２０１１）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（＄６．７Ｂ；２０１１）。これらのアプローチは、自己免疫を「治癒」させず、単に総合的症状を軽減するだけである。
【０２６９】
自己免疫を「治癒」させるためには、選択的な様式で、自己抗原を認識するＴ細胞クローンを除去／不活性化することが不可欠である。これは、寛容誘導の天然のプロセスを再現することに似ているかもしれない。胸腺の除去は、自己反応性Ｔ細胞の選択的な削除に関与すると特定された元のプロセスであったが、新生児期に限定されない数多くの冗長な機構が存在することが明らかになった。詳細には、「鏡像」免疫系が、従来の免疫系と共存すると実証された。従来のＴ細胞は、自己抗原によって活性化されて胸腺で死に、活性化されていない従来のＴ細胞は生存シグナルを受け取る（Ｒａｍｓｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｆｏｗｌｋｅｓ，１９９０）。「鏡像」である制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、実際には、自己抗原との遭遇によって生きるように選択され、自己抗原に結合しないＴｒｅｇ細胞が、除去される（Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ａｓｃｈｅｎｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。したがって、免疫系による自己−非自己の識別は、Ｔｒｅｇ細胞の生成を促進しつつ、自己反応性Ｔ細胞を枯渇させる自己抗原に部分的に基づいて生じる。抗原特異的免疫寛容誘発ワクチンの開発にとって重要な点は、成体の生涯にわたって末梢において、自己反応性Ｔ細胞は、危険信号の非存在下での自己抗原の提示によって「アネルギー化」され、自己反応性Ｔｒｅｇが自己抗原に応答して生成されるということである。胸腺におけるＴ細胞除去のプロセスは、Ｔ細胞アネルギーの誘導と異なり、胸腺におけるＴｒｅｇの生成は、末梢で誘導されたＴｒｅｇと比べて異なるタイプのＴｒｅｇを生じるが、多くの態様において、成体の免疫寛容誘発の最終結果は、新生児期に生じるものと似ている。本開示の１つの実施形態では、線維芽細胞に自己抗原をトランスフェクトし、前記トランスフェクトされた線維芽細胞を、そのような抗原に対して免疫寛容を生じる様式で投与する。線維芽細胞の投与は、制御性Ｔ細胞の生成を誘導するため、及び自己反応性Ｔ細胞の活性化を阻害するために行われる。これは、特に、自己抗原が十分に定義された自己免疫性の状態において妥当である。
【０２７０】
本開示は、自己抗原をトランスフェクトされた線維芽細胞の投与によって、免疫寛容誘発の天然のプロセスを再現しようとするものである。例えば、妊娠、癌及び経口寛容などの状況では成体においても免疫寛容誘発が生じることが知られている。本発明は、線維芽細胞を免疫寛容誘発メディエーターとして改変するために、これらの状況において生じる分子、細胞及びプロセスの利用を教示する。
【０２７１】
妊娠の状況では、胎児抗原を認識する母体のＴ細胞クローンの選択的な不活性化が、種々の機構（胎児細胞上及び胎盤細胞上でのＦａｓＬの発現（Ｖａｃｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｈｏｄｅｓ，２００５）、ＰＤ１−Ｌの状況における抗原提示（Ｄ’Ａｄｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）及びＩＬＴ４などの免疫阻害性受容体とのＨＬＡ−Ｇの相互作用（Ｋｕｒｏｋｉ  ａｎｄ  Ｍａｅｎａｋａ，２００７）を含む）を介して生じることが研究によって実証された。したがって、本発明は、ＦａｓＬなどの死誘導分子、ＰＤ−Ｌ１などの共阻害性分子及びＩＬＴ４などの免疫調節分子と組み合わせた自己抗原による線維芽細胞のコトランスフェクションを教示する。
【０２７２】
妊娠中、「免疫寛容誘発の抗原提示」は、抗原提示の間接的な経路によってのみ生じる（Ｅｒｌｅｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。妊娠中の選択的な免疫寛容誘発の他の経路としては、妊娠の成功に必須であると実証されたＴｒｅｇ細胞の刺激が挙げられる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。本開示は、１つの実施形態において、線維芽細胞から抗原提示細胞を作製するために、ＭＨＣ又はＭＨＣ様分子をトランスフェクトすることによる線維芽細胞の改変に関し、ここで、前記抗原提示細胞は、治療的に十分な濃度及び頻度で宿主に投与されたとき、抗原特異的寛容を誘導できる。
【０２７３】
癌の状況では、他の抗原に対する特異性を有するＴ細胞を温存しつつ、腫瘍特異的Ｔ細胞を枯渇させることが、腫瘍自体又は腫瘍関連細胞によって実証された（Ｈａｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。これは、宿主が広く免疫適格性になることを可能にしつつ、癌が「レパートリーの穴」を選択的に誘導できる機構である。さらに、Ｔｒｅｇ細胞は、おそらく腫瘍免疫回避の「バックアップ」機構として、抗腫瘍Ｔ細胞を積極的に抑制すると実証された（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｐｅｄｒｏｚａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｄｏｎｋｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。臨床レベルでは、腫瘍が末梢Ｔ細胞の活性を阻害できることが、数多くの研究において予後不良と関連した（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，２００４；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，１９９９；Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。したがって、本発明の１つの実施形態において、Ｔｒｅｇの生成を刺激する分子の利用、並びに生成されたＴｒｅｇを拡大する分子の投与が、利用される。１つの実施形態において、Ｔｒｅｇの生成を増加させるために、線維芽細胞にインターロイキン−２とともに自己抗原をトランスフェクトする。他の実施形態において、インビボでのＴｒｅｇの増殖を増加させるために、インターロイキン２が全身投与される。
【０２７４】
線維芽細胞を改変するためのテンプレートとして本発明が利用する寛容の別の天然の例は、経口寛容である。経口寛容は、経口摂取された抗原が、抗原特異的ＴＧＦ−ベータ産生細胞（一部で「Ｔｈ３」と呼ばれる）（Ｆａｒｉａ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，２００５；Ｗｅｉｎｅｒ，２００１；Ｆｕｋａｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、並びにＴｒｅｇ細胞（Ｐａｌａｍａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）の産生を誘導するプロセスである。自己抗原コラーゲンＩＩ（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を含む抗原の経口摂取は、特定の様式でＴ細胞応答とＢ細胞応答の両方の阻害を誘導すると示された（Ｗｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｆａｒｉａ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，２００６）。制御性細胞の誘導並びにエフェクター細胞の欠失／アネルギーは、免疫寛容誘発様式での抗原提示に関連するとみられる（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。自己抗原の経口投与による、ＲＡ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、多発性硬化症（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）及びＩ型糖尿病（Ｈａｎｎｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，２００４）の動物モデルにおける疾患の緩解が報告された。さらに、臨床試験は、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ（ｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、自己免疫性ブドウ膜炎（Ｔｈｕｒａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及び多発性硬化症（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３））における経口寛容の有効性のシグナルを示した。これらの天然の寛容条件のすべてにおいて、共通の分子及び機構が作動しているようである。したがって、寛容を誘導する天然の手段は、寛容誘導の生理学的条件に見られる分子に類似の分子を生成する免疫寛容誘発の潜在能力を有する「ユニバーサルドナー」細胞の投与であり得る。いくつかの実施形態において、経口寛容が、本発明の、自己抗原をトランスフェクトされた線維芽細胞とともに利用される。例えば、１型糖尿病を有する患者を処置する場合、その患者には、ＧＡＤ６５などの糖尿病特異的自己抗原をトランスフェクトされた線維芽細胞が投与され得る。さらに、その線維芽細胞は、ＩＬ−１０などの免疫寛容誘発分子をトランスフェクトされてもよく、その線維芽細胞が投与されるとき、免疫寛容誘発プロセスを増強するために、経口的に送達されるＧＡＤ６５が利用され得る。別の実施形態において、本開示は、ＴＧＦ−ベータなどの経口免疫寛容誘発に関連する分子と組み合わせた、自己抗原による線維芽細胞のトランスフェクションに関する。
【０２７５】
いくつかの実施形態において、間葉系幹細胞の免疫調節活性に似せるために、線維芽細胞は、生物学的に有効な分子をトランスフェクトされる。例えば、これらの細胞は、ＩＬ−２受容体アルファ（ＣＤ２５）の阻害を通じてＴ細胞の活性化を抑制することが知られている（Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。したがって、１つの実施形態において、Ｔ細胞が活性化されないようにＩＬ−２を「吸い上げる」ために、線維芽細胞は、１つ以上の自己抗原並びにＩＬ−２受容体をトランスフェクトされる。他の実施形態において、分裂停止の誘導（Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、直接的な（Ｚａｐｐｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）又は未熟ＤＣを介した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）Ｔ細胞アネルギーの誘導、活性化Ｔ細胞のアポトーシスの刺激（ｌｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ＩＬ−２シグナル伝達の遮断及びＰＧＥ２産生の誘導（Ｒａｓｍｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｅｎｇｌｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｐａｇｇｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｙａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｚａｆｒａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＴＧＦ−ベータの誘導（Ｎａｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ＨＬＡ−Ｇの産生（Ｍａｇａｔｔｉ  ｅｔ  ａｏ．，２００８）、セリンプロテアーゼ阻害剤６の発現（Ｅｌ  Ｈａｄｄａｄ  ｔ  ａｌ．，２０１１）、一酸化窒素放出の刺激（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、インドールアミン２，３デオキシゲナーゼの刺激（ＤｅｌａＲｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｔｉｐｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｆｒａｎｃｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、アデノシンを生成するエクト酵素（例えば、ＣＤ３９及びＣＤ７３）の発現（Ｓａｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓａｌｄｈａｎａ−Ａｒａｕｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ガレクチンの発現（Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｇｉｅｓｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ヘモキシゲナーゼ１の誘導（Ｃｈａｂａｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｍｏｕｇｉａｋａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ＰＤ１経路の活性化（Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ａｕｇｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌｕｚ−Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、Ｆａｓリガンドの発現（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＣＤ２００の発現（Ｎａｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、Ｔｈ２偏向（Ｂａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｚａｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、Ｔｈ１７分化の阻害（Ｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｒａｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｔａｔａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｄｕｆｆｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌｕｚ−Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＴＳＧ−６の発現（Ｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＮＯＴＣＨ−１の発現（Ｄｅｌ  Ｐａｐ  ｅ  ���ｌ．，２０１３），Ｔｒｅｇ細胞生成の刺激（Ｍａｃｃａｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｐｒｅｖｏｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｄｉ  Ｉａｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｃａｓｉｒａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｂｏｕｍａｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｍａｄｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｍｅｌｉｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）といった特性を線維芽細胞に付与するために、前記線維芽細胞は、間葉系幹細胞の培養に使用される条件下で培養される。Ｔｒｅｇ生成の機構は、直接的であり得るか、又はＤＣの調節を介し得る。本発明者らなどが、共刺激シグナルの非存在下でのＴ細胞の活性化は、免疫抑制性のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を生成すると報告している（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｉｃｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。したがって、リンパ節における免疫の局所的な活性化は、理論的には、ＭＳＣ投与後のＤＣにおける共刺激分子の低発現（これによりＴｒｅｇ生成に傾き得る）に関連し得る。逆に、Ｔｒｅｇは、ＤＣをＤＣ２表現型で維持することに関わっていることが知られている（Ｔｉｅｍｅｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。実際に、数多くの研究によって、ＭＳＣがＴｒｅｇ細胞を誘導する能力が実証された（Ｄｉ  Ｉａｎｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｃａｓｉｒａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０２７６】
本開示の実施形態は、個体における自己免疫の処置方法に関し、その方法は、治療を必要とする個体に、改変された線維芽細胞を投与する工程を含む。いくつかの場合において、その方法は、ａ）線維芽細胞集団を得る工程；ｂ）改変された線維芽細胞を生成するために、前記線維芽細胞集団に、目的の１つ以上の自己抗原（正常に身体に属する免疫系によって認識される分子実体）をトランスフェクトする工程；及びｃ）治療を必要とする個体に前記改変された線維芽細胞を投与する工程を含む。具体的な場合において、その線維芽細胞は、脂肪組織由来の接着細胞であり、それらの細胞には、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のマーカーを発現する細胞が含まれる。具体的な場合において、その線維芽細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びそれらの組み合わせからなる群より選択される１つ以上のマーカーの発現を欠く。少なくともいくつかの実施形態において、自己抗原は、ミエリン乏突起膠細胞タンパク質；ｂ）ミエリン塩基性タンパク質；ｃ）コラーゲンＩＩ；ｄ）筋原線維タンパク質；及びｅ）それらの組み合わせからなる群より選択される。トランスフェクトされる任意の細胞が、プラスミドＤＮＡ又はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス又はアデノウイルス）を用いてトランスフェクトされ得る。具体的な実施形態において、線維芽細胞は、ａ）脂肪；ｂ）大網；ｃ）骨髄；ｄ）胎盤；ｅ）臍帯；ｆ）皮膚；ｇ）ワルトン膠様質；及びｈ）それらの組み合わせからなる組織起源の群から選択される。
【０２７７】
１型糖尿病を処置する実施形態において、自己抗原は、インスリン、プロインスリン、ＧＡＤ６５（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）、ＩＡ−２（膵島抗原２；チロシンホスファターゼ）及びＺｎＴ８トランスポーター（インスリン分泌顆粒の膜上に局在するｚｉｎｋトランスポーター８）からなる群より選択され得る。任意の自己抗原に由来する機能的フラグメント、並びに免疫調節性ペプチドＤｉａＰｅｐ２７７（ｈｓｐ６０タンパク質に由来）が利用され得、他のＨＳＰ６０由来ペプチドも、自己抗原として使用され得る。
【０２７８】
多発性硬化症を処置する実施形態において、自己抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン乏突起膠細胞タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。自己抗原のフラグメントは、トランスフェクションの目的で自己抗原として使用され得る。フラグメントの例としては、ＢＰ１３−３２、ＭＢＰ８３−９９、ＭＢＰ１１１−１２９、ＭＢＰ１４６−１７０、ＭＯＧ１−２０、ＭＯＧ３５−５５及びＰＬＰ１３９−１５４が挙げられる。
【０２７９】
ＩＩＩ．一般的な実施形態
免疫細胞への線維芽細胞（及び／又はある特定の作用物質）の曝露を含む方法は、いくつかの場合において、共通のパラメータを共有し得る。そのようなパラメータの例は、下記で述べられるが、実際には、１つ以上が適宜変更され得る。
【０２８０】
個体に投与するための任意のタイプの細胞の量は、処置される疾患のタイプ、その疾患の重症度及びステージ、並びに／又は処置のために注射される細胞のタイプに依存し得る。それらの細胞は、薬学的に許容され得るキャリア、例えば、滅菌された等張性食塩水溶液での投与のために調製され得る。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得るキャリアは、１つ以上のさらなる作用物質（例えば、ＦＡＳリガンド、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、ＩＬ−３５、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、Ｉ−３０９、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＣＤ２００、ガレクチン３、ｓＣＲ１、アルギナーゼ、ＰＧＥ−２、アスピリン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、ｎ−アセチルシステイン、ラパマイシン、ＩＶＩＧ、ナルトレキソン、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ４５ＲＢ抗体、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、オーラノフィン、ジシアノ金、スルファサラジン、メトトレキサート、糖質コルチコイド、エタネルセプト、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト−ｓｚｚｓ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、シクロスポリン、ＩＦＮ−ガンマ、エベロリムス、ラパマイシン、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、アンジオポエチン、ＨＩＦ−１−アルファ又はそれらの組み合わせ）を含み得る。
【０２８１】
本開示の１つの実施形態において、線維芽細胞が、低酸素領域などにおける注射（例えば、筋肉内注射）を含む任意の好適な経路によって被験体に投与される。好適な経路としては、静脈内、皮下、髄腔内、経口、直腸内、髄腔内、大網内（ｉｎｔｒａ−ｏｍｅｎｔｒａｌ）、心室内、肝臓内及び腎臓内が挙げられる。
【０２８２】
ある特定の実施形態において、線維芽細胞は、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、脳、脂肪組織、包皮、胎盤及び／又は臍帯を含む組織に由来し得る。具体的な実施形態において、線維芽細胞は、胎盤、胎児、新生児若しくは成体の線維芽細胞又はそれらの混合物である。
【０２８３】
個体への細胞の投与回数は、本明細書中に記載される因子に少なくとも部分的に依存し、当該分野の通例の方法を用いて最適化され得る。具体的な実施形態では、単回投与が必要とされる。他の実施形態では、細胞の複数回投与が必要とされる。上記のシステムは、時間及び状況、細胞の喪失又は個々の細胞の活性の喪失の結果としての細胞活性の喪失速度などに応じて変化し得る変数（例えば、個体の特定のニーズ）の影響を受けやすいことが認識されるべきである。ゆえに、各個体は、適切な投与量についてモニターされ得ることが予想されるが、そのような個体のモニタリングの実施は、当該分野において通例である。
【０２８４】
ある特定の実施形態において、ＩＦＮ−ガンマが利用され、組成物中のＩＦＮ−ガンマの濃度は、０．１〜５００単位／ミリリットル（ＩＵ／ｍｌ）、０．５〜５００ＩＵ／ｍＬ、１〜５００ＩＵ／ｍＬ、５〜５００ＩＵ／ｍＬ、１０〜５００ＩＵ／ｍＬ、１５〜５００ＩＵ／ｍＬ、２０〜５００ＩＵ／ｍＬ、２５〜５００ＩＵ／ｍＬ、３０〜５００ＩＵ／ｍＬ、３５〜５００ＩＵ／ｍＬ、４０〜５００ＩＵ／ｍＬ、４５〜５００ＩＵ／ｍＬ、５０〜５００ＩＵ／ｍＬ、６０〜５００ＩＵ／ｍＬ、７０〜５００ＩＵ／ｍＬ、８０〜５００ＩＵ／ｍＬ、９０〜５００ＩＵ／ｍＬ、１００〜５００ＩＵ／ｍＬ、１５０〜５００ＩＵ／ｍＬ、２００〜５００ＩＵ／ｍＬ、２５０〜５００ＩＵ／ｍＬ、３００〜５００ＩＵ／ｍＬ、３５０〜５００ＩＵ／ｍＬ、４００〜５００ＩＵ／ｍＬ、４５０〜５００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜４５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１〜４５０ＩＵ／ｍＬ、５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜４５０ＩＵ／ｍＬ、５０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、６０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、７０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、８０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、９０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１００〜４５０ＩＵ／ｍＬ、１５０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、２００〜４５０ＩＵ／ｍＬ、２５０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、３００〜４５０ＩＵ／ｍＬ、３５０〜４５０ＩＵ／ｍＬ、４００〜４５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜４００ＩＵ／ｍＬ、０．５〜４００ＩＵ／ｍＬ、１〜４００ＩＵ／ｍＬ、５〜４００ＩＵ／ｍＬ、１０〜４００ＩＵ／ｍＬ、１５〜４００ＩＵ／ｍＬ、２０〜４００ＩＵ／ｍＬ、２５〜４００ＩＵ／ｍＬ、３０〜４００ＩＵ／ｍＬ、３５〜４００ＩＵ／ｍＬ、４０〜４００ＩＵ／ｍＬ、４５〜４００ＩＵ／ｍＬ、５０〜４００ＩＵ／ｍＬ、６０〜４００ＩＵ／ｍＬ、７０〜４００ＩＵ／ｍＬ、８０〜４００ＩＵ／ｍＬ、９０〜４００ＩＵ／ｍＬ、１００〜４００ＩＵ／ｍＬ、１５０〜４００ＩＵ／ｍＬ、２００〜４００ＩＵ／ｍＬ、２５０〜４００ＩＵ／ｍＬ、３００〜４００ＩＵ／ｍＬ、３５０〜４００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜３５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１〜３５０ＩＵ／ｍＬ、５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜３５０ＩＵ／ｍＬ、５０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、６０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、７０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、８０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、９０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１００〜３５０ＩＵ／ｍＬ、１５０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、２００〜３５０ＩＵ／ｍＬ、２５０〜３５０ＩＵ／ｍＬ、３００〜３５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜３００ＩＵ／ｍＬ、０．５〜３００ＩＵ／ｍＬ、１〜３００ＩＵ／ｍＬ、５〜３００ＩＵ／ｍＬ、１０〜３００ＩＵ／ｍＬ、１５〜３００ＩＵ／ｍＬ、２０〜３００ＩＵ／ｍＬ、２５〜３００ＩＵ／ｍＬ、３０〜３００ＩＵ／ｍＬ、３５〜３００ＩＵ／ｍＬ、４０〜３００ＩＵ／ｍＬ、４５〜３００ＩＵ／ｍＬ、５０〜３００ＩＵ／ｍＬ、６０〜３００ＩＵ／ｍＬ、７０〜３００ＩＵ／ｍＬ、８０〜３００ＩＵ／ｍＬ、９０〜３００ＩＵ／ｍＬ、１００〜３００ＩＵ／ｍＬ、１５０〜３００ＩＵ／ｍＬ、２００〜３００ＩＵ／ｍＬ、２５０〜３００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜２５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１〜２５０ＩＵ／ｍＬ、５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜２５０ＩＵ／ｍＬ、５０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、６０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、７０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、８０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、９０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１００〜２５０ＩＵ／ｍＬ、１５０〜２５０ＩＵ／ｍＬ、２００〜２５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜２００ＩＵ／ｍＬ、０．５〜２００ＩＵ／ｍＬ、１〜２００ＩＵ／ｍＬ、５〜２００ＩＵ／ｍＬ、１０〜２００ＩＵ／ｍＬ、１５〜２００ＩＵ／ｍＬ、２０〜２００ＩＵ／ｍＬ、２５〜２００ＩＵ／ｍＬ、３０〜２００ＩＵ／ｍＬ、３５〜２００ＩＵ／ｍＬ、４０〜２００ＩＵ／ｍＬ、４５〜２００ＩＵ／ｍＬ、５０〜２００ＩＵ／ｍＬ、６０〜２００ＩＵ／ｍＬ、７０〜２００ＩＵ／ｍＬ、８０〜２００ＩＵ／ｍＬ、９０〜２００ＩＵ／ｍＬ、１００〜２００ＩＵ／ｍＬ、１５０〜２００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、１〜１５０ＩＵ／ｍＬ、５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜１５０ＩＵ／ｍＬ、５０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、６０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、７０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、８０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、９０〜１５０ＩＵ／ｍＬ、１００〜１５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１００ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１００ＩＵ／ｍＬ、１〜１００ＩＵ／ｍＬ、５〜１００ＩＵ／ｍＬ、１０〜１００ＩＵ／ｍＬ、１５〜１００ＩＵ／ｍＬ、２０〜１００ＩＵ／ｍＬ、２５〜１００ＩＵ／ｍＬ、３０〜１００ＩＵ／ｍＬ、３５〜１００ＩＵ／ｍＬ、４０〜１００ＩＵ／ｍＬ、４５〜１００ＩＵ／ｍＬ、５０〜１００ＩＵ／ｍＬ、６０〜１００ＩＵ／ｍＬ、７０〜１００ＩＵ／ｍＬ、８０〜１００ＩＵ／ｍＬ、９０〜１００ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜９０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜９０ＩＵ／ｍＬ、１〜９０ＩＵ／ｍＬ、５〜９０ＩＵ／ｍＬ、１０〜９０ＩＵ／ｍＬ、１５〜９０ＩＵ／ｍＬ、２０〜９０ＩＵ／ｍＬ、２５〜９０ＩＵ／ｍＬ、３０〜９０ＩＵ／ｍＬ、３５〜９０ＩＵ／ｍＬ、４０〜９０ＩＵ／ｍＬ、４５〜９０ＩＵ／ｍＬ、５０〜９０ＩＵ／ｍＬ、６０〜９０ＩＵ／ｍＬ、７０〜９０ＩＵ／ｍＬ、８０〜９０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜８０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜８０ＩＵ／ｍＬ、１〜８０ＩＵ／ｍＬ、５〜８０ＩＵ／ｍＬ、１０〜８０ＩＵ／ｍＬ、１５〜８０ＩＵ／ｍＬ、２０〜８０ＩＵ／ｍＬ、２５〜８０ＩＵ／ｍＬ、３０〜８０ＩＵ／ｍＬ、３５〜８０ＩＵ／ｍＬ、４０〜８０ＩＵ／ｍＬ、４５〜８０ＩＵ／ｍＬ、５０〜８０ＩＵ／ｍＬ、６０〜８０ＩＵ／ｍＬ、７０〜８０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜７０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜７０ＩＵ／ｍＬ、１〜７０ＩＵ／ｍＬ、５〜７０ＩＵ／ｍＬ、１０〜７０ＩＵ／ｍＬ、１５〜７０ＩＵ／ｍＬ、２０〜７０ＩＵ／ｍＬ、２５〜７０ＩＵ／ｍＬ、３０〜７０ＩＵ／ｍＬ、３５〜７０ＩＵ／ｍＬ、４０〜７０ＩＵ／ｍＬ、４５〜７０ＩＵ／ｍＬ、５０〜７０ＩＵ／ｍＬ、６０〜７０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜６０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜６０ＩＵ／ｍＬ、１〜６０ＩＵ／ｍＬ、５〜６０ＩＵ／ｍＬ、１０〜６０ＩＵ／ｍＬ、１５〜６０ＩＵ／ｍＬ、２０〜６０ＩＵ／ｍＬ、２５〜６０ＩＵ／ｍＬ、３０〜６０ＩＵ／ｍＬ、３５〜６０ＩＵ／ｍＬ、４０〜６０ＩＵ／ｍＬ、４５〜６０ＩＵ／ｍＬ、５０〜６０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜５０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜５０ＩＵ／ｍＬ、１〜５０ＩＵ／ｍＬ、５〜５０ＩＵ／ｍＬ、１０〜５０ＩＵ／ｍＬ、１５〜５０ＩＵ／ｍＬ、２０〜５０ＩＵ／ｍＬ、２５〜５０ＩＵ／ｍＬ、３０〜５０ＩＵ／ｍＬ、３５〜５０ＩＵ／ｍＬ、４０〜５０ＩＵ／ｍＬ、４５〜５０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜４５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜４５ＩＵ／ｍＬ、１〜４５ＩＵ／ｍＬ、５〜４５ＩＵ／ｍＬ、１０〜４５ＩＵ／ｍＬ、１５〜４５ＩＵ／ｍＬ、２０〜４５ＩＵ／ｍＬ、２５〜４５ＩＵ／ｍＬ、３０〜４５ＩＵ／ｍＬ、３５〜４５ＩＵ／ｍＬ、４０〜４５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜４０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜４０ＩＵ／ｍＬ、１〜４０ＩＵ／ｍＬ、５〜４０ＩＵ／ｍＬ、１０〜４０ＩＵ／ｍＬ、１５〜４０ＩＵ／ｍＬ、２０〜４０ＩＵ／ｍＬ、２５〜４０ＩＵ／ｍＬ、３０〜４０ＩＵ／ｍＬ、３５〜４０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜３５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜３５ＩＵ／ｍＬ、１〜３５ＩＵ／ｍＬ、５〜３５ＩＵ／ｍＬ、１０〜３５ＩＵ／ｍＬ、１５〜３５ＩＵ／ｍＬ、２０〜３５ＩＵ／ｍＬ、２５〜３５ＩＵ／ｍＬ、３０〜３５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜３０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜３０ＩＵ／ｍＬ、１〜３０ＩＵ／ｍＬ、５〜３０ＩＵ／ｍＬ、１０〜３０ＩＵ／ｍＬ、１５〜３０ＩＵ／ｍＬ、２０〜３０ＩＵ／ｍＬ、２５〜３０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜２５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜２５ＩＵ／ｍＬ、１〜２５ＩＵ／ｍＬ、５〜２５ＩＵ／ｍＬ、１０〜２５ＩＵ／ｍＬ、１５〜２５ＩＵ／ｍＬ、２０〜２５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜２０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜２０ＩＵ／ｍＬ、１〜２０ＩＵ／ｍＬ、５〜２０ＩＵ／ｍＬ、１０〜２０ＩＵ／ｍＬ、１５〜２０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１５ＩＵ／ｍＬ、１〜１５ＩＵ／ｍＬ、５〜１５ＩＵ／ｍＬ、１０〜１５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１０ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１０ＩＵ／ｍＬ、１〜１０ＩＵ／ｍＬ、５〜１０ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜５ＩＵ／ｍＬ、０．５〜５ＩＵ／ｍＬ、１〜５ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜１ＩＵ／ｍＬ、０．５〜１ＩＵ／ｍＬ；又は０．１〜０．５ＩＵ／ｍＬを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
【０２８５】
本開示の方法は、規定の時間にわたって細胞集団をＩＦＮ−ガンマに曝す工程を包含し得る。ある特定の実施形態において、細胞は、約１時間〜約１４日間の範囲の時間にわたってＩＦＮ−ガンマに曝される。ある特定の実施形態において、細胞は、少なくとも又はせいぜい約１時間〜１４日間、２時間〜１４日間、３時間〜１４日間、４時間〜１４日間、５時間〜１４日間、６時間〜１４日間、７時間〜１４日間、８時間〜１４日間、９時間〜１４日間、１０時間〜１４日間、１１時間〜１４日間、１２時間〜１４日間、１８時間〜１４日間、１日間〜１４日間、２日間〜１４日間、３日間〜１４日間、４日間〜１４日間、５日間〜１４日間、６日間〜１４日間、７日間〜１４日間、８日間〜１４日間、９日間〜１４日間、１０日間〜１４日間、１１日間〜１４日間、１２日間〜１４日間、１３日間〜１４日間；又は１時間〜１３日間、２時間〜１３日間、３時間〜１３日間、４時間〜１３日間、５時間〜１３日間、６時間〜１３日間、７時間〜１３日間、８時間〜１３日間、９時間〜１３日間、１０時間〜１３日間、１１時間〜１３日間、１２時間〜１３日間、１日間〜１３日間、２日間〜１３日間、３日間〜１３日間、４日間〜１３日間、５日間〜１３日間、６日間〜１３日間、７日間〜１３日間、８日間〜１３日間、９日間〜１３日間、１０日間〜１３日間、１１日間〜１３日間、１２日間〜１３日間；又は１時間〜１２日間、２時間〜１２日間、３時間〜１２日間、４時間〜１２日間、５時間〜１２日間、６時間〜１２日間、７時間〜１２日間、８時間〜１２日間、９時間〜１２日間、１０時間〜１２日間、１１時間〜１２日間、１２時間〜１２日間、１日間〜１２日間、２日間〜１２日間、３日間〜１２日間、４日間〜１２日間、５日間〜１２日間、６日間〜１２日間、７日間〜１２日間、８日間〜１２日間、９日間〜１２日間、１０日間〜１２日間、１１日間〜１２日間；又は１時間〜１１日間、２時間〜１１日間、３時間〜１１日間、４時間〜１１日間、５時間〜１１日間、６時間〜１１日間、７時間〜１１日間、８時間〜１１日間、９時間〜１１日間、１０時間〜１１日間、１１時間〜１１日間、１２時間〜１１日間、１日間〜１１日間、２日間〜１１日間、３日間〜１１日間、４日間〜１１日間、５日間〜１１日間、６日間〜１１日間、７日間〜１１日間、８日間〜１１日間、９日間〜１１日間、１０日間〜１１日間１１日間；又は１時間〜１０日間、２時間〜１０日間、３時間〜１０日間、４時間〜１０日間、５時間〜１０日間、６時間〜１０日間、７時間〜１０日間、８時間〜１０日間、９時間〜１０日間、１０時間〜１０日間、１１時間〜１０日間、１２時間〜１０日間、１日間〜１０日間、２日間〜１０日間、３日間〜１０日間、４日間〜１０日間、５日間〜１０日間、６日間〜１０日間、７日間〜１０日間、８日間〜１０日間、９日間〜１０日間１０日間；又は１時間〜９日間、２時間〜９日間、３時間〜９日間、４時間〜９日間、５時間〜９日間、６時間〜９日間、７時間〜９日間、８時間〜９日間、９時間〜９日間、１０時間〜９日間、１１時間〜９日間、１２時間〜９日間、１日間〜９日間、２日間〜９日間、３日間〜９日間、４日間〜９日間、５日間〜９日間、６日間〜９日間、７日間〜９日間、８日間〜９日間９日間；又は１時間〜８日間、２時間〜８日間、３時間〜８日間、４時間〜８日間、５時間〜８日間、６時間〜８日間、７時間〜８日間、８時間〜８日間、９時間〜８日間、１０時間〜８日間、１１時間〜８日間、１２時間〜８日間、１日間〜８日間、２日間〜８日間、３日間〜８日間、４日間〜８日間、５日間〜８日間、６日間〜８日間、７日間〜８日間；又は１時間〜７日間、２時間〜７日間、３時間〜７日間、４時間〜７日間、５時間〜７日間、６時間〜７日間、７時間〜７日間、８時間〜７日間、９時間〜７日間、１０時間〜７日間、１１時間〜７日間、１２時間〜７日間、１日間〜７日間、２日間〜７日間、３日間〜７日間、４日間〜７日間、５日間〜７日間、６日間〜７日間；又は１時間〜６日間、２時間〜６日間、３時間〜６日間、４時間〜６日間、５時間〜６日間、６時間〜６日間、７時間〜６日間、８時間〜６日間、９時間〜６日間、１０時間〜６日間、１１時間〜６日間、１２時間〜６日間、１日間〜６日間、２日間〜６日間、３日間〜６日間、４日間〜６日間、５日間〜６日間；又は１時間〜５日間、２時間〜５日間、３時間〜５日間、４時間〜５日間、５時間〜５日間、６時間〜５日間、７時間〜５日間、８時間〜５日間、９時間〜５日間、１０時間〜５日間、１１時間〜５日間、１２時間〜５日間、１日間〜５日間、２日間〜５日間、３日間〜５日間、４日間〜５日間；又は１時間〜４日間、２時間〜４日間、３時間〜４日間、４時間〜４日間、５時間〜４日間、６時間〜４日間、７時間〜４日間、８時間〜４日間、９時間〜４日間、１０時間〜４日間、１１時間〜４日間、１２時間〜４日間、１日間〜４日間、２日間〜４日間、３日間〜４日間；又は１時間〜３日間、２時間〜３日間、３時間〜３日間、４時間〜３日間、５時間〜３日間、６時間〜３日間、７時間〜３日間、８時間〜３日間、９時間〜３日間、１０時間〜３日間、１１時間〜３日間、１２時間〜３日間、１日間〜３日間、２日間〜３日間；又は１時間〜２日間、２時間〜２日間、３時間〜２日間、４時間〜２日間、５時間〜２日間、６時間〜２日間、７時間〜２日間、８時間〜２日間、９時間〜２日間、１０時間〜２日間、１１時間〜２日間、１２時間〜２日間、１日間〜２日間；又は１時間〜１日間、２時間〜１日間、３時間〜１日間、４時間〜１日間、５時間〜１日間、６時間〜１日間、７時間〜１日間、８時間〜１日間、９時間〜１日間、１０時間〜１日間、１１時間〜１日間、１２時間〜１日間；又は１時間〜１２時間、２時間〜１２時間、３時間〜１２時間、４時間〜１２時間、５時間〜１２時間、６時間〜１２時間、７時間〜１２時間、８時間〜１２時間、９時間〜１２時間、１０時間〜１２時間、１１時間〜１２時間；又は１時間〜１１時間、２時間〜１１時間、３時間〜１１時間、４時間〜１１時間、５時間〜１１時間、６時間〜１１時間、７時間〜１１時間、８時間〜１１時間、９時間〜１１時間、１０時間〜１１時間；又は１時間〜１０時間、２時間〜１０時間、３時間〜１０時間、４時間〜１０時間、５時間〜１０時間、６時間〜１０時間、７時間〜１０時間、８時間〜１０時間、９時間〜１０時間；又は１時間〜９時間、２時間〜９時間、３時間〜９時間、４時間〜９時間、５時間〜９時間、６時間〜９時間、７時間〜９時間、８時間〜９時間；又は１時間〜８時間、２時間〜８時間、３時間〜８時間、４時間〜８時間、５時間〜８時間、６時間〜８時間、７時間〜８時間；又は１時間〜７時間、２時間〜７時間、３時間〜７時間、４時間〜７時間、５時間〜７時間、６時間〜７時間；又は１時間〜６時間、２時間〜６時間、３時間〜６時間、４時間〜６時間、５時間〜６時間；又は１時間〜５時間、２時間〜５時間、３時間〜５時間、４時間〜５時間；又は１時間〜４時間、２時間〜４時間、３時間〜４時間；又は１時間〜３時間、２時間〜３時間又は１時間〜２時間の範囲の時間にわたってＩＦＮ−ガンマに曝される。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、細胞は、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ−１６４０）、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）、イーグル変法基本培地（ＥＭＥＭ）、Ｏｐｔｉｍｅｍ、イスコーブ培地又はそれらの組み合わせを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる１つ以上の培地組成物に曝される。
【０２８７】
本開示の１つの実施形態において、細胞（例えば、線維芽細胞）は、それらの細胞の生存能及び増殖能を保つための当該分野で公知の手段を用いてエクスビボで培養される。線維芽細胞の場合の具体的な実施形態において、細胞に対して１つ以上の所望の効果を達成するため、例えば、レシピエントの免疫系に対する線維芽細胞の視認性を低下させるための公知の培養手法の改変が存在し得る。１つの実施形態において、細胞（例えば、線維芽細胞）は、１つ以上の異種成分（例えば、ウシ胎仔血清）を欠く条件において培養される。具体的な実施形態において、本開示は、例えば、細胞（例えば、線維芽細胞）の免疫原性を低下させるための、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清及び／又は既定のサイトカインミックスによるウシ胎仔血清の置換をさらなる特長として包含する。
【０２８８】
ある特定の実施形態において、上記細胞は、ヒト多血小板血漿、血小板溶解物、臍帯血血清、自己血清、ヒト血清、血清代替物又はそれらの組み合わせを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる１つ以上の組成物に曝される。具体的な実施形態において、そのようなエレメントを有する組成物は、培地組成物である。１つの実施形態において、血清代替物は、組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。別の実施形態において、ヒト多血小板血漿は、組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。なおも別の実施形態において、血小板溶解物は、組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。１つの実施形態において、臍帯血血清は、組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。１つの実施形態において、自己血清は、組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。別の実施形態において、ヒト血清は、組成物の体積の少なくとも又はせいぜい１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０％を構成する。
【０２８９】
組換え技術が用いられる場合、目的の遺伝子産物をコードする発現ベクターを有するように、１つ以上のタイプの細胞が操作される。組換え発現ベクターは、そのベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする少なくとも１つのマーカーが存在し得る１つ以上のＤＮＡ分子又は構築物として導入され得る。そのベクターは、従来の方法で調製することができ、ここで、遺伝子及び制御性領域が、単離され、適宜ライゲートされ、適切なクローニング宿主にクローニングされ、配列決定又は他の好都合な手段によって解析され得る。特に、ＰＣＲを用いて、機能単位の全部又は一部を含む個々のフラグメントが単離され得、いくつかの場合では、１つ以上の変異が、適宜、「プライマー修復」、ライゲーション、インビトロ突然変異誘発などを用いて、導入され得る。それらのベクターは、いったん完成し、適切な配列を有すると実証されたら、任意の好都合な手段によって宿主細胞に導入され得る。それらの構築物は、細胞への感染又は導入のために、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）など（レトロウイルスベクターを含む）のような複製しない欠陥ウイルスゲノムにインテグレートされ、パッケージングされ得る。それらのベクターは、所望であれば、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、その構築物は、融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入され得る。宿主細胞は、ベクターの導入の前に培養において生育され、拡大され得、その後、ベクターの導入及びベクターのインテグレーションのために適切に処置され得る。次いで、それらの細胞は、拡大され、その構築物に存在するマーカーによってスクリーニングされる。首尾よく使用され得る様々なマーカーとしては、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが挙げられる。
【０２９０】
本明細書中に記載される遺伝子若しくは遺伝子産物の任意のもの又はその活性な部分が、細胞での発現を可能にするＣＭＶプロモーターなどの１つ以上のプロモーター配列を含む哺乳動物発現構築物にクローニングされ得る［Ａｒｔｕｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９５，４：３１７−２１］。好適な構築物の例としては、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ＰｚｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ（これらの各々が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）から商業的に入手可能である）又は制御されたポリヌクレオチド発現をヒト包皮細胞において可能にするｐＳＨ発現ベクター［Ｖｅｎｔｕｒａ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：８６７−９］が挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクター及びパッケージングシステムの例は、マルチクローニングサイトへのクローニングを可能にするＲｅｔｒｏ−ＸベクターであるｐＬＮＣＸ及びｐＬＸＳＮをはじめとした、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡが販売しているものであり、導入遺伝子は、ＣＭＶプロモーターから転写される。導入遺伝子が５’ＬＴＲプロモーターから転写されるｐＢａｂｅなどのＭｏ−ＭｕＬＶに由来するベクターも挙げられる。プラスミドのトランスフェクションが完了した後、線維芽細胞は、組織培養プレートからの剥離を可能にする手段、例えばトリプシン処理によって、収集され、増殖に向けて６ウェル（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）又は２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に移される。トランスフェクションのおよそ３日後に、細胞培地を、改変された線維芽細胞の増殖及び拡大を可能にする培地に交換する。一例は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２％Ｂ２７サプリメント及びレチノイン酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２％ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）、０．０８％ＦＧＦ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．２％ヘパリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、及び１μＭの濃度までのバルプロ酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ（ＮＢＡ）増殖培地である。その後、その培地を、週３回交換し、細胞を定期的に再度プレーティングして（例えば、最大週１回の再プレーティング、２〜８回、コロニーが発生し始めたら、より定期的に行う）、広範なコロニー形成が達成されるまで、再プログラムされていない細胞を除去する。
【０２９１】
いくつかの場合では、１つ以上の作用物質（例えば、血管新生剤又はその機能的フラグメント）が、一過性の発現のためのＲＮＡ分子として細胞に導入され得る。ＲＮＡは、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション及び脂質媒介性トランスフェクションをはじめとした様々な手段によって、本開示の任意の細胞（任意の改変された細胞を含む）に送達され得る。特定の態様において、細胞へのベクターの導入は、トランスポゾンを介して行われ得る。使用するための合成トランスポゾンの例は、血管新生剤遺伝子を含む発現カセットを含むＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。あるいは、相同組換えのための標的部位を有し得、ここで、相同組換えについて当該分野で公知であるような材料及び方法を用いてベクターを特定の遺伝子座にインテグレートすることが望ましい。相同組換えの場合、ＯＭＥＧＡ又はＯ−ベクターを使用し得る。例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８７；Ｍａｎｓｏｕｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８；及びＪｏｙｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと。
【０２９２】
上記ベクターは、少なくとも１つの作用物質（１つ以上の血管新生剤又はそれらの機能的フラグメントを含む）及び必要に応じて別のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）をコードする単一のＤＮＡ分子、又は１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）を有する異なるＤＮＡ分子として導入され得る。上記ベクターは、同時に又は連続的に導入され得、それぞれが同じ又は異なるマーカーを有する。例証的な例では、１つのベクターが、特定の制御配列の支配下に１つ以上の作用物質（例えば、血管新生剤）を含み得る。
【０２９３】
ベクターＤＮＡのストックを調製するため及びトランスフェクションを行うために使用され得る、細菌又は酵母の複製開始点、選択可能及び／又は増幅可能なマーカー、原核生物又は真核生物における発現のためのプロモーター／エンハンサーエレメントなどの有用なエレメントを含むベクターが当該分野で周知であり、多くが商業的に入手可能である。
【０２９４】
ある特定の実施形態において、ＲＮＡ又はタンパク質配列は、同じ宿主細胞において他の選択されたＲＮＡ又はタンパク質配列と同時発現され得ることが企図される。同時発現は、宿主細胞に２つ以上の異なる組換えベクターをコトランスフェクトすることによって達成され得る。あるいは、単一の組換えベクターが、ＲＮＡに対する複数の異なるコード領域を含むように構築され得、その後、それらの異なるコード領域は、その単一のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞において発現され得る。
【０２９５】
いくつかの状況では、改変された細胞を殺滅することが望ましいことがある（例えば、目的が処置を終了させることであるとき、細胞が腫瘍性になったとき、当該細胞が存在した後にその細胞が存在しなくなることに着目している研究において、及び／又は別の事象において）。この目的のために、ある特定の遺伝子産物の発現が提供され得、ここで、改変された細胞は、自殺遺伝子などの制御された条件下において、殺滅され得る。自殺遺伝子は当該分野で公知であり、例えば、改変型のカスパーゼ９が、小分子、例えば、ＡＰ１９０３と二量体化できる、ｉＣａｓｐａｓｅ９システムである。例えば、Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０５：４２４７−４２５４（２００５）を参照のこと。
【０２９６】
Ｖ．本開示のキット
本明細書中に記載される細胞性及び／若しくは非細胞性組成物の任意のもの、又はそれに類似のものが、キットに含められ得る。非限定的な例では、細胞療法を調製するための方法において使用するための１つ以上の試薬が、キットに含められ得る。そのような試薬としては、細胞、ＩＦＮ−ガンマ、多血小板血漿、血小板溶解物、１つ以上の血管新生因子、１つ以上の成長因子、ベクター、１つ以上の共刺激因子、培地、酵素、緩衝液、ヌクレオチド、塩、プライマーなどが挙げられ得る。キットは、本開示に列挙される任意のタンパク質を含み得る。キットの構成要素は、好適な容器手段の中に提供される。
【０２９７】
キットのいくつかの構成要素は、水性媒質中に又は凍結乾燥された形態で、包装され得る。キットの容器手段としては、一般に、ある構成要素が入れられ得る、好ましくは、適切に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段が挙げられる。２つ以上の構成要素がキットに存在する場合、そのキットは、通常、追加の構成要素が別々に入れられ得る、第２、第３又は他のさらなる容器も含み得る。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、バイアルに含められてもよい。本開示のキットはまた、典型的には、商業的販売のために厳重に閉じ込められた構成要素を含めるための手段も含む。そのような容器には、所望のバイアルを保持する、射出成形又はブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。
【０２９８】
上記キットの構成要素が、１つ及び／又はそれ以上の液体溶液として提供されるとき、その液体溶液は、水溶液であり、滅菌された水溶液が特に有用である。いくつかの場合において、容器手段は、それ自体が、シリンジ、ピペット及び／若しくは他のこのような装置であってもよいし、所望の反応のために複数のコンパートメントを有する基材であってもよい。
【０２９９】
キットのいくつかの構成要素は、乾燥粉末として提供され得る。試薬及び／又は構成要素が、乾燥粉末として提供されるとき、その粉末は、好適な溶媒を加えることによって再構成され得る。その溶媒も別の容器手段内に提供され得ることが構想される。キットは、滅菌された許容され得る緩衝液及び／又は他の希釈剤を含めるための第２の容器手段も含み得る。
【０３００】
具体的な実施形態において、試薬及び材料には、所望の配列を増幅するためのプライマー、ヌクレオチド、好適な緩衝液又は緩衝試薬、塩などが含まれ、いくつかの場合において、それらの試薬には、特定の所望の細胞を単離するための装置又は試薬が含まれる。
【０３０１】
特定の実施形態において、個体から１つ以上のサンプルを抽出するのに適した１つ以上の装置がキット内に存在する。その装置は、シリンジ、細針、メスなどであり得る。
【実施例】
【０３０２】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本開示の方法の実施において十分に機能すると本発明者らによって発見された手法であるので、それを実施するのに好ましい形式を構成すると見なすことができることが、当業者によって認識されるだろう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果をなおも得ることができることを認識するだろう。
【０３０３】
実施例１
インターフェロンガンマによる前処置は線維芽細胞の同種刺激活性を低下させる
本実施例では、線維芽細胞のタイプの一例として包皮線維芽細胞の同種刺激活性を低下させるための、ＩＦＮ−ガンマの使用を特徴付ける。
【０３０４】
包皮線維芽細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から購入し、記載の濃度のインターフェロンガンマ（２５及び５０ユニット）で２４時間、５％二酸化炭素の十分に加湿された雰囲気において前処置した（図２）。細胞に曝露し、それを混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の刺激物質として利用した。このＭＬＲにおける応答細胞は、５ｍｌの血液からフィコール密度勾配（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であった。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、丸底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）にプレーティングした。各ウェルにおいて、１０，０００、２０，０００又は１００，０００個のＰＢＭＣを、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ培地中に総体積が２００ｕＬになるまで加えた。細胞を４８時間培養し、培養の最後の８時間において１マイクロキュリーのトリチウムチミジンによるローディングの後のチミジン取り込みによって、増殖を評価した（図２）。
【０３０５】
そこに示されているように、ＩＦＮ−ガンマを線維芽細胞に曝露すると、線維芽細胞に対する同種刺激活性が低下する。
【０３０６】
実施例２
インターフェロンガンマで処置された線維芽細胞は同種異系リンパ球からのインターフェロンガンマ産生を阻害する
包皮線維芽細胞を、実施例１に記載されたように２つの濃度のインターフェロンガンマで処置し、それを利用して混合リンパ球反応を刺激した。４８時間培養した後、培養上清に対してＥＬＩＳＡアッセイを行うことによって、インターフェロンガンマの分泌を評価した（図３）。そこに示されているように、処置された線維芽細胞は、リンパ球からのＩＦＮ−ガンマの産生を阻害した。
【０３０７】
実施例３
インターフェロンガンマで処置された線維芽細胞は同種異系リンパ球からのインターロイキン−４産生を刺激する
包皮線維芽細胞を、実施例１に記載されたようにインターフェロンガンマで処置し、それを利用して混合リンパ球反応を刺激した。４８時間培養した後、培養上清に対してＥＬＩＳＡアッセイを行うことによって、インターロイキン−４の分泌を評価した（図４）。
【０３０８】
ＩＬ−４の産生は、コントロールと比べて、ＩＦＮ−ガンマで処置された線維芽細胞を用いたとき増加した。
【０３０９】
実施例４
インターフェロンガンマで処置された線維芽細胞は同種異系リンパ球からのＴＮＦ−アルファ産生を阻害する
包皮線維芽細胞を、実施例１に記載されたようにインターフェロンガンマで処置し、それを利用して混合リンパ球反応を刺激した。４８時間培養した後、培養上清に対してＥＬＩＳＡアッセイを行うことによって、ＴＮＦ−アルファの分泌を評価したところ（図５）、ＩＦＮ−ガンマで処置された線維芽細胞ではＴＮＦ−アルファの分泌が減少することが示された。
【０３１０】
実施例５
多血小板血漿による前処置は線維芽細胞の同種刺激活性を低下させる
包皮線維芽細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から購入し、記載の濃度の多血小板血漿（５％及び１０％容積／容積）で２４時間、５％二酸化炭素の十分に加湿された雰囲気において前処置した（図６）。細胞に曝露し、それを混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の刺激物質として利用した。このＭＬＲにおける応答細胞は、５ｍｌの血液からフィコール密度勾配（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって単離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であった。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、丸底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）にプレーティングした。各ウェルにおいて、１０，０００、２０，０００又は１００，０００個のＰＢＭＣを、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ培地中に総体積が２００ｕＬになるまで加えた。細胞を４８時間培養し、培養の最後の８時間において１マイクロキュリーのトリチウムチミジンによるローディングの後のチミジン取り込みによって、増殖を評価した（図６）。
【０３１１】
多血小板血漿による前処置は、処置された線維芽細胞の同種刺激活性を低下させる。
【０３１２】
実施例６
免疫調節のための細胞移植療法
本実施例は、細胞療法の免疫調節を必要とする個体に対する、細胞療法の免疫調節のための方法に関する。
【０３１３】
線維芽細胞及びＩＦＮ−ガンマで前処置された線維芽細胞によるコラーゲン誘発関節炎の処置
包皮線維芽細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から購入し、記載の濃度のインターフェロンガンマ（２５単位）で２４時間、５％二酸化炭素の十分に加湿された雰囲気において前処置した。下記に記載されるように作製されたコラーゲン誘発関節炎マウスに、１回目のコラーゲンＩＩ免疫化の後、７日目及び１４日目に２回、５００万個の線維芽細胞を静脈内注射した。それらの動物を、関節炎発症後（２回目のＣＩＩ免疫化の７日後）、４週間観察した。各肢を０〜４のスケールで採点し、患部の足１本あたりの平均臨床スコアを計算した。
【０３１４】
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の誘導を、７週齢のＤＢＡ／１  ＬａｃＪマウスにおいて通知し、２００μｇのウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１００μｌの０．０５Ｍ酢酸に溶解し、等体積のＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合したものを、尾の基部のいくつかの部位の皮内に免疫した（０日目）。ＣＩＩは、４℃で一晩撹拌することによって２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。初回刺激の後の２１日目に、等体積（１００μｌ）のＰＢＳ中の２００μｇのＣＩＩを腹腔内注射してマウスの追加免疫を行った。マウスを１週間に３回、末梢関節への関節炎の出現について視覚的に調べ、疾患の重症度に対する関節炎スコア指標を以下のとおり与えた：０、紅斑及び腫脹のエビデンスなし；１、紅斑及び軽度の腫脹が中足部（ｍｉｄｆｏｏｔ）（足根）又は足首関節に限定される；２、紅斑及び軽度の腫脹が足首から中足部に広がっている；３、紅斑及び中等度の腫脹が足首から中足関節に広がっている；４、紅斑及び重度の腫脹が足首、足及び指を包囲している。スコアリングは、２人の独立した観察者が、実験群及びコントロール群に関して知らない状態で行った。図７は、静脈内の線維芽細胞又はＩＦＮ−ガンマで処置された線維芽細胞による関節炎スコアの低下を示している。
【０３１５】
線維芽細胞及びＰＲＰで前処置された線維芽細胞によるコラーゲン誘発関節炎の処置
包皮線維芽細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）から購入し、記載の濃度のＰＲＰ（５％ｖ／ｖ）で２４時間、５％二酸化炭素の十分に加湿された雰囲気において前処置した。下記に記載されるように作製されたコラーゲン誘発関節炎マウスに、１回目のコラーゲンＩＩ免疫化の後、７日目及び１４日目に２回、５００万個の線維芽細胞を静脈内注射した。それらの動物を、関節炎発症後（２回目のＣＩＩ免疫化の７日後）、４週間観察した。各肢を０〜４のスケールで採点し、患部の足１本あたりの平均臨床スコアを計算した。
【０３１６】
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の誘導を、７週齢のＤＢＡ／１  ＬａｃＪマウスにおいて通知し、２００μｇのウシＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１００μｌの０．０５Ｍ酢酸に溶解し、等体積のＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合したものを、尾の基部のいくつかの部位の皮内に免疫した（０日目）。ＣＩＩは、４℃で一晩撹拌することによって２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。初回刺激の後の２１日目に、等体積（１００μｌ）のＰＢＳ中の２００μｇのＣＩＩを腹腔内注射してマウスの追加免疫を行った。マウスを１週間に３回、末梢関節への関節炎の出現について視覚的に調べ、疾患の重症度に対する関節炎スコア指標を以下のとおり与えた：０、紅斑及び腫脹のエビデンスなし；１、紅斑及び軽度の腫脹が中足部（足根）又は足首関節に限定される；２、紅斑及び軽度の腫脹が足首から中足部に広がっている；３、紅斑及び中等度の腫脹が足首から中足関節に広がっている；４、紅斑及び重度の腫脹が足首、足及び指を包囲している。スコアリングは、２人の独立した観察者が、実験群及びコントロール群に関して知らない状態で行った。図８は、静脈内の線維芽細胞又はＰＲＰで処置された線維芽細胞による関節炎スコアの低下を図示している。
【０３１７】
したがって、本実施例は、個体における１つ以上の自己免疫状態又は炎症状態の処置に関する。特定の実施形態では、細胞集団をＩＦＮ−ガンマ（並びに必要に応じて１つ以上のさらなる作用物質及び／又は条件）に曝して、組成物を生成する。追加の実施形態では、有効量のその組成物を個体に投与して、自己免疫状態又は炎症状態を処置する。
【０３１８】
実施例７
制御性Ｔ細胞の培養及び拡大
本実施例は、インビトロ及びインビボにおいて線維芽細胞を用いた、自己免疫を阻害できる制御性Ｔ細胞の生成に関する。
【０３１９】
本開示の実施形態は、改変された線維芽細胞に曝露された及び／又は曝露されているある特定の制御性Ｔ細胞を調製するため及び臨床で使用するための方法及び組成物を含む。特定のケースにおいて、それらの線維芽細胞は、少なくともＩＦＮ−ガンマへの曝露によって改変された。追加の実施形態は、１つ以上の作用物質（例えば、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、ラパマイシン、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−２又はそれらの組み合わせ）への線維芽細胞の曝露を含む。具体的な実施形態は、以下の研究において実証される：
【０３２０】
凍結保存された臍帯血バッグ（１単位バッグ）を解凍し、単核細胞を精製するために、０．５％ＨＳＡ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗｅｓｔｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡ）を含むＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄した。続いて、細胞ＣＤ２５＋細胞濃縮を、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を製造者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って使用するポジティブ選択によって行った。細胞を生存能についてチェックし、続いてＣＤ３／２８共発現Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＣｌｉｎＥｘＶｉｖｏＴＭ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）と、１細胞：３ビーズの比で（Ｔｈａｋｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）共培養することによって刺激し、１０％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）］及び２００ＩＵ／ｍｌインターロイキン（ＩＬ）−２（ＣＨＩＲＯＮ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）が補充されたＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。ＣＤ２５＋細胞とビーズとのエクスビボ共培養を、３７℃、５％ＣＯ２を含む雰囲気における組織培養フラスコ内で行った。このＣＢ由来のＣＤ２５＋濃縮Ｔ細胞を、４８〜７２時間ごとに新鮮培地及びＩＬ−２（２００ＩＵ／ｍｌを維持）を加えることによって、１×１０６細胞／ｍｌで維持した。いくつかの培養物では、包皮線維芽細胞を加えた。具体的な実施形態では、上に記載されたように、臍帯血細胞を加える前に包皮線維芽細胞を５０％培養密度で予めプレーティングした。図９は、制御性Ｔ細胞の培養及び拡大を図示しており、ここで、「Ｘ」は、線維芽細胞及びカクテルの培養を示している。正方形は、線維芽細胞のみを表し、三角形は、カクテルのみを表す。培養の開始時に、５０，０００個のＴｒｅｇ細胞を加えた。フローサイトメトリーによってＴｒｅｇのカウントを行った。
【０３２１】
実施例８
同種異系リンパ球によって活性化された線維芽細胞による肝不全の処置
本実施例は、同種異系末梢血単核球で前処置された線維芽細胞の利用による肝不全の処置及び肝臓再生の増強の手段に関する。１つの実施形態では、肝細胞成長因子の産生を増強するために同種異系末梢血単核球とともに予め培養された線維芽細胞によって肝不全を処置する。
【０３２２】
ＢＡＬＢ／ｃ起源のマウス線維芽細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地中で培養し、細胞を継代した後、２４時間にわたる等量の同種異系Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞への曝露によって「予備刺激」した。その後、その線維芽細胞を洗浄して脾細胞を除去し、実験に利用した。
【０３２３】
体重が１８〜２０ｇで６〜８週齢の健康なオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて１２時間明暗期サイクルの従来の実験環境下に収容した。それらのマウスは、標準的な市販のマウス食餌及び水を自由に摂取できた。すべての実験を、承認されたプロトコルに従って行った。動物モデルの準備は、先に記載されたように行った（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。手短に言えば、１８匹のマウスを、以下の３群にランダムに割り当てた（ｎ＝６）。（１）正常なコントロール群。まずマウスにコーン油の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行い、次いで、３０分後に２００ｕｌのＰＢＳを静脈内に注射した。（２）無処置群。まずマウスに、急性肝臓傷害を誘導するために単回用量のＣＣｌ４（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）のｉ．ｐ．注射を行い、３０分後に２００μｌのＰＢＳを静脈内に注射した（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。（３）活性化線維芽細胞処置群。まずマウスにＣＣｌ４のｉ．ｐ．注射を行い、３０分後に、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した継代数４の１×１０６個の活性化線維芽細胞を静脈内に注射した（Ｓｐｉｅｗａｋ−Ｒｉｎａｕｄｏ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ，１９９７）。ＣＣｌ４の注射の２４時間後にマウスを屠殺し、血液を回収した。次いで、肝臓及び脾臓を、後の解析のために迅速に取り出すか又は８０℃で凍結保存した。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性を、それぞれＣｈｅｍｉＬａｂ  ＡＬＴ及びＡＳＴアッセイキット（ＩＶＤＬａｂ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａ）を用いる標準的な分光光度的手順によって計測した。酵素活性は、１リットルあたりの国際単位（ＩＵ／Ｌ）で示した。肝臓スライスを左葉の一部から作製し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、５μｍ切片に切断した。検体を脱脂し、水和させ、通常の様式において標準的なヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、形態を調べた。
【０３２４】
図１０Ａ及び１０Ｂでは、正常なコントロールマウス、四塩化炭素で処置されたマウス、及び四塩化炭素と１０６個のリンパ球活性化線維芽細胞とを静脈内注射されたマウスから血清サンプルを回収した。リンパ球活性化線維芽細胞は、無処置のＡＬＩ群と比較して、（図１０Ａ）ＡＬＴ及び（図１０Ｂ）ＡＳＴの血清レベルを有意に低下させた。棒グラフは、３つの別個の実験の平均値±ＳＥＭを表している。１元配置分散分析によってＰ値を求めた。データは、行われた３つの別個の実験の代表である（正常なコントロール群に対して＃＃ｐ＜０．０１、無処置群に対して＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝６）。
【０３２５】
マウスをＣＣｌ４（１ｍｌ／ｋｇ体重、トウモロコシで１：３希釈したもの）で処置して、急性肝臓傷害を誘導し、次いで、ＣＣｌ４注射の３０分後に一度だけ、リンパ球活性化線維芽細胞（１×１０６／０．２ｍｌ／マウス、ＰＢＳに懸濁したもの）を２４時間、静脈内投与した。ＣＣｌ４注射の２４時間後に、肝臓の写真を撮影した。図１１Ａは、肝臓の肉眼的な病理学的変化を示している。図１１Ｂは、肝臓の組織学的切片の代表的な顕微鏡写真を示している（２００×、ヘモトキシリン及びエオシン染色）。無処置群の肝臓は、正常なコントロール群の肝臓よりも膨らんだ肝細胞、アポトーシス及びネクローシスを示し、それらは、ｐｐＭＳＣ処置によって有意に軽減された（ｎ＝６）。
【０３２６】
実施例９
線維芽細胞によって再プログラムされた単球によるＨＵＶＥＣ培養物からのＶＥＧＦ産生の刺激
マクロファージは、炎症の制御並びに組織リモデリングなどの生理学的プロセスにおいて主要な役割を果たす自然免疫系の重要な構成要素である（ｖａｎ  Ｆｕｒｔｈ  ａｎｄ  Ｃｏｈｎ，１９６８；Ｗｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。このマクロファージの多様な役割は、創傷治癒（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｖａｎｎｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｗｙｎｎ，２０１７；Ｂｏｄｄｕｐａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）から心筋梗塞（Ｇｏｍｂｏｚｈａｐｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖｅｌａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、腎不全（Ｇｕｉｔｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）及び肝不全（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）に至る状態において見られる。
【０３２７】
分化したマクロファージ及びそれらの前駆体は、それらの表現型及び機能を変化させることによって微小環境シグナルに適応できる万能な細胞である（Ｇｒａｔｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。それらは、長年にわたって研究されてきたが、これらの細胞は、古典的なＭ１及び代替のＭ２として知られる異なる亜集団を含むことが最近示されただけである（Ｍｉｌｌｓ，２０１２）。Ｔｈ１細胞の命名法をまねて、Ｍ１マクロファージは、ＩＦＮ−ガンマ及びＬＰＳによって誘導されるマクロファージの炎症促進性のサブタイプと説明される。それらは、エフェクター分子（例えば、活性酸素種）及び炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ及びＩＬ−６）を産生し、Ｔｈ１極性化応答を引き起こす（Ｍｉｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｅｙ，２０１４）。Ｍ２マクロファージは、さらにＭ２ａ（ＩＬ−４又はＩＬ−１３への曝露後）、Ｍ２ｂ（免疫複合体及びＴｏｌｌ様受容体又はＩＬ−１ｂリガンド）及びＭ２ｃ（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ及び糖質コルチコイドによって誘導される）に細分される。３つすべてのサブタイプが、ＩＬ−１０．ｓｕｐ．ｈｉｇｈ（特に、Ｍ２ｂ＋Ｍ２ｃ）、ＲＥＬＭ−アルファｈｉｇｈ（マウスのみ）、ＣＤ２０６ｈｉｇｈ及びＩＬ−１２ｌｏｗ（Ｍ２ａ）を特徴とする抗炎症性の表現型を有する（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０３２８】
正常な炎症において、マクロファージは、これらの極性化状態の間でダイナミックな切り替えを起こす。Ｍ１マクロファージは、初期の段階においてより豊富に存在し、クリアランス及び他のエフェクター細胞の動員を媒介するのに対し、Ｍ２マクロファージは、炎症の終わりに向かって優勢となり、血管新生及び新しい組織形成を促進する（Ｆｅｒｒａｎｔｅ  ａｎｄ  Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ，２０１２）。炎症の経過は、この適切にバランスがとれたＭ１／Ｍ２マクロファージの比に強く依存する。Ｍ１からＭ２への優勢の切り替えに失敗すると、慢性炎症における炎症促進性の環境の永続化及び強化に至ることがある。ゆえに、Ｍ１での停止は、炎症の消散を妨げ得る（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０３２９】
Ｍ１／Ｍ２比の乱れは、いくつかの自己免疫疾患及び慢性炎症性疾患、並びに代謝関連疾患（例えば、糖尿病及び代謝症候群）において観察された（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，．２０１３）。肥満個体由来の脂肪組織マクロファージ（ＡＴＭ）は、Ｍ２（ＣＤ２０６＋、ＣＤ３０１＋、Ａｒｇ１＋）からＭ１（ＮＯＳ２＋、ＣＤ１１ｃ＋）への表現型のシフトを起こすと示され、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦ−アルファ及びＩＬ−１ベータ）を産生し（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ゆえにレプチン及びアディポネクチンの効果をアンタゴナイズした（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。同様のＭ１関連病理が、アテローム性動脈硬化症などの循環器疾患（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｖｅｌａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、及び自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ（ｄｅ  Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、多発性硬化症（Ｇｕｉｔｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、全身性エリテマトーデス（Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）及びクローン病（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５））と関連した。
【０３３０】
初期の炎症反応中のＭ１マクロファージの残留も、いくつかの慢性皮膚疾患において炎症の消散を妨げ得る。糖尿病に伴う皮膚潰瘍において炎症促進性Ｍ１マクロファージの数を減少させると、創傷の炎症が弱まり、創傷閉鎖が促進し得る。慢性静脈性潰瘍を有するヒト患者では、Ｍ１マクロファージの残留によって、活性酸素種の生成が誘導され、それがＤＮＡ損傷を引き起こし、不完全な組織修復に至る。活性化（おそらくＭ１）マクロファージは、別の慢性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎とも関連し、アトピー性皮膚炎は、先進国の小児の１０〜２０％及び成人の１〜３％が罹患しており、経済的影響が数十億ドルに達し、有病率が上昇している。
【０３３１】
Ｍ１及びＭ２マクロファージの重要性を考えると、Ｍ２マクロファージを生成する手段及び方法を得ることは、当該分野において有用である。本開示は、このニーズに応える。
【０３３２】
インビトロにおいて血管新生プロセスを再現するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養を９６ウェルプレートにおいて行う。ＨＵＶＥＣ細胞を、１ウェルあたり２０，０００細胞の濃度でプレーティングする。様々な濃度の単球、線維芽細胞、又は予め線維芽細胞とともにインキュベートしておいた単球を、ＨＵＶＥＣ細胞に加える。
【０３３３】
単球を、末梢血単核球のプラスチックへの接着性によって得て、ＣＤ１４磁気活性化分離（ＭＡＣＳ）によって精製する。線維芽細胞をＡＴＣＣから購入する。単球を線維芽細胞とともにインキュベーションするために、１対１の比の単球と線維芽細胞とを、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＭＰＩ培地中、３７℃にて、５％二酸化炭素を含む十分に加湿された雰囲気において４８時間、培養する。培養の後、細胞をトリプシン処理し、ＭＡＣＳを用いてＣＤ１４選択によって単球を精製する。その後、細胞を１ウェルあたり合計２００ｕＬの培地においてＨＵＶＥＣ細胞と記載の比でインキュベートする。４８時間培養した後、条件培地を抽出し、ＥＬＩＳＡによってＶＥＧＦ産生を解析する（図１２）。
【０３３４】
実施例１０
線維芽細胞によって再プログラムされた単球によるＨＵＶＥＣ培養物からのＩＬ−３３産生の刺激
インビトロにおいて血管新生プロセスを再現するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養を９６ウェルプレートにおいて行う。ＨＵＶＥＣ細胞を、１ウェルあたり２０，０００細胞の濃度でプレーティングする。様々な濃度の単球、線維芽細胞、又は予め線維芽細胞とともにインキュベートしておいた単球を、ＨＵＶＥＣ細胞に加える。単球を、末梢血単核球のプラスチックへの接着性によって得て、ＣＤ１４磁気活性化分離（ＭＡＣＳ）によって精製する。線維芽細胞をＡＴＣＣから購入する。単球を線維芽細胞とともにインキュベーションするために、１対１の比の単球と線維芽細胞とを、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＭＰＩ培地中、３７℃にて、５％二酸化炭素を含む十分に加湿された雰囲気において４８時間、培養する。培養の後、細胞をトリプシン処理し、ＭＡＣＳを用いてＣＤ１４選択によって単球を精製する。その後、細胞を１ウェルあたり合計２００ｕＬの培地においてＨＵＶＥＣ細胞と記載の比でインキュベートする。４８時間培養した後、条件培地を抽出し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−３３産生を解析する（図１３）。
【０３３５】
実施例１１
線維芽細胞によって再プログラムされた単球によるＨＵＶＥＣ増殖の刺激
インビトロにおいて血管新生プロセスを再現するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養を９６ウェルプレートにおいて行う。ＨＵＶＥＣ細胞を、１ウェルあたり２０，０００細胞の濃度でプレーティングする。様々な濃度の単球、線維芽細胞、又は予め線維芽細胞とともにインキュベートしておいた単球を、ＨＵＶＥＣ細胞に加える。単球を、末梢血単核球のプラスチックへの接着性によって得て、ＣＤ１４磁気活性化分離（ＭＡＣＳ）によって精製する。線維芽細胞をＡＴＣＣから購入する。単球を線維芽細胞とともにインキュベーションするために、１対１の比の単球と線維芽細胞とを、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＭＰＩ培地中、３７℃にて、５％二酸化炭素を含む十分に加湿された雰囲気において４８時間、培養する。培養の後、細胞をトリプシン処理し、ＭＡＣＳを用いてＣＤ１４選択によって単球を精製する。
【０３３６】
加えた細胞を、マイトマイシンＣとともにインキュベーションすることによって（５ｕｇ／ｍｌ、１２時間）、有糸分裂的に不活性化する。続いて、細胞を、１ウェルあたり合計２００ｕＬの培地において、７２時間、記載の比でＨＵＶＥＣ細胞とともにインキュベートする。１ｕＣｕｒｉｅ／ｍｌのトリチウムチミジンを、培養の最後の１２時間で加え、シンチレーション測定法によって増殖を定量する。増殖は、毎分カウント数として表現する（図１４）。
【０３３７】
実施例１２
線維芽細胞によって再プログラムされた自家Ｔ細胞を用いた血管新生の刺激／創傷治癒の加速
虚血性疾患は、今日の社会の著しい罹患率及び死亡率の原因である。手術又は血管内インターベンションなどの現在用いられている介入の成功は限定的であり、再狭窄及び炎症反応に部分的に起因して、再介入が必要になることが多い。虚血性疾患を処置する有望な手段の１つは、血管新生療法の使用によるものである。しかしながら、例えば重症虚血肢を有する患者への血管新生因子の投与は、初期の試験ではいくらかの利点を誘導するが、無作為化試験のデータは、現在までに広範な使用を裏付けるものではない。ＨＩＦ−１アルファなどの上流転写因子のトランスフェクションは、トランスフェクション後に複数の成長因子が誘導されるという点において天然の血管新生を模倣するので、有望なアプローチである。しかしながら、臨床結果は、確固たる結論に達するには早すぎるものであった。本開示は、線維芽細胞によって再プログラムされたＰＢＭＣを用いてＴ細胞を再プログラムすることによって、血管新生療法の使用の限界を克服する。
【０３３８】
実施例１３
線維芽細胞によって再プログラムされた末梢血単核球によるＨＵＶＥＣ増殖の刺激
インビトロにおいて血管新生プロセスを再現するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養を９６ウェルプレートにおいて行う。ＨＵＶＥＣ細胞を、１ウェルあたり２０，０００細胞の濃度でプレーティングする。様々な濃度のＰＢＭＣ、線維芽細胞、又は予め線維芽細胞とともにインキュベートしておいたＰＢＭＣを、ＨＵＶＥＣ細胞に加える。
【０３３９】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール密度勾配によって得る。線維芽細胞をＡＴＣＣから購入する。
【０３４０】
ＰＢＭＣを線維芽細胞とともにインキュベーションするために、１対１の比のＰＢＭＣと線維芽細胞とを、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＭＰＩ培地中、３７℃にて、５％二酸化炭素を含む十分に加湿された雰囲気において４８時間、培養する。培養の後、非接着性細胞をピペッティングによって回収する。細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、続いて、１ウェルあたり合計２００ｕＬの培地において、記載の比でＨＵＶＥＣ細胞とインキュベートする。４８時間後に、トリチウムチミジン取り込みによって、増殖を評価した（図１５）。
【０３４１】
実施例１４
ストレスを受けた線維芽細胞による樹状細胞ＣＤ８０の刺激
末梢血単核球をフィコール法によって末梢血から単離した。簡潔には、血液を、ヘパリンＥＤＴＡを用いて抽出し、５０ｍｌコニカルチューブ内のＦｉｃｏｌｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅに重層した。細胞を１２００ｇで３０分間遠心し、単核細胞を単離した。前記単核細胞をリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＡ培地に再懸濁した。細胞を６ウェルフラスコにプレーティングし、２時間、接着させた。接着細胞を単球の起源として使用した。単球を、コントロール線維芽細胞並びにストレスを受けた線維芽細胞の存在下、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４及び１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ中で７日間培養した。
【０３４２】
コントロール線維芽細胞及びストレスを受けた線維芽細胞を作製するために、包皮線維芽細胞をＡＴＣＣから購入し、製造者の指示書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）のとおり１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質／抗真菌剤混合物が補充されたＭｅｄｉａ１０６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で培養した。７５％培養密度に達するまで、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の十分に加湿された雰囲気において、Ｔ−１７５フラスコ内で培養した。細胞を４０℃のウォーターバス内で４時間加熱することによって、高熱を適用した。コントロール細胞は、３７℃のウォーターバスに入れた。血清枯渇の場合は、包皮線維芽細胞を、上に記載されたように培養し、ウシ胎仔血清を含まないＭｅｄｉａ１０６に２４時間曝露した。
【０３４３】
組織培養の７日後に、樹状細胞を成熟マーカーＣＤ８０についてフローサイトメトリーで評価した。図１６に見られるように、コントロール線維芽細胞と比べて、ストレスを受けた線維芽細胞とともに培養したとき、ＣＤ８０の高発現が観察された。
【０３４４】
実施例１５
ストレスを受けた線維芽細胞による樹状細胞ＣＤ８６の刺激
末梢血単核球をフィコール法によって末梢血から単離した。簡潔には、血液を、ヘパリンＥＤＴＡを用いて抽出し、５０ｍｌコニカルチューブ内のＦｉｃｏｌｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅに重層した。細胞を１２００ｇで３０分間遠心し、単核細胞を単離した。前記単核細胞をリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＡ培地に再懸濁した。細胞を６ウェルフラスコにプレーティングし、２時間、接着させた。接着細胞を単球の起源として使用した。単球を、コントロール線維芽細胞並びにストレスを受けた線維芽細胞の存在下、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４及び１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ中で７日間培養した。
【０３４５】
コントロール線維芽細胞及びストレスを受けた線維芽細胞を作製するために、包皮線維芽細胞をＡＴＣＣから購入し、製造者の指示書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）のとおり１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質／抗真菌剤混合物が補充されたＭｅｄｉａ１０６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で培養した。７５％培養密度に達するまで、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の十分に加湿された雰囲気において、Ｔ−１７５フラスコ内で培養した。細胞を４０℃のウォーターバス内で４時間加熱することによって、高熱を適用した。コントロール細胞は、３７℃のウォーターバスに入れた。血清枯渇の場合は、包皮線維芽細胞を、上に記載されたように培養し、ウシ胎仔血清を含まないＭｅｄｉａ１０６に２４時間曝露した。
【０３４６】
組織培養の７日後に、樹状細胞を成熟マーカーＣＤ８６についてフローサイトメトリーで評価した。図１７に見られるように、コントロール線維芽細胞と比べて、ストレスを受けた線維芽細胞とともに培養したとき、ＣＤ８６の高発現が観察された。
【０３４７】
実施例１６
高熱又は血清枯渇線維芽細胞における培養によるＣＤ８増殖の増加
包皮線維芽細胞をＡＴＣＣから購入し、製造者の指示書（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）のとおり１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質／抗真菌剤混合物が補充されたＭｅｄｉａ１０６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で培養した。７５％培養密度に達するまで、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の十分に加湿された雰囲気において、Ｔ−１７５フラスコ内で培養した。細胞を４０℃のウォーターバス内で４時間加熱することによって、高熱を適用した。コントロール細胞は、３７℃のウォーターバスに入れた。
【０３４８】
血清枯渇の場合は、包皮線維芽細胞を、上に記載されたように培養し、ウシ胎仔血清を含まないＭｅｄｉａ１０６に２４時間曝露した。
【０３４９】
続いて、細胞をトリプシン処理し、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって単離されたＣＤ８細胞とともに５０％培養密度でＴ−１７５フラスコにプレーティングした。健康ドナー由来の末梢血単核球を、単離用のＴ細胞の起源として使用した。ＣＤ８細胞及び線維芽細胞の培養を、記載の比で確立した。
【０３５０】
４８時間のインキュベーションの後、非接着性細胞を洗浄によって単離し、フィトヘマグルチニン（５ｕｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。１マイクロキュリー／ｍｌのトリチウムチミジンを１２時間パルスすることによるトリチウムチミジン取り込みによって、増殖を評価した。増殖は、シンチレーション測定法による毎分カウント数として表現した（図１８）。
【０３５１】
実施例１７
ＰＧＥ２中で培養された線維芽細胞及び単球の投与による拡張末期容量の保存
心筋梗塞を模倣するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを左冠動脈前下行枝の結紮に供した。１日目に、マウスをヒト単球、ヒト線維芽細胞又はその組み合わせで処置した。ヒト単球とヒト線維芽細胞との組み合わせの培養を、１００ｎｇ／ｍｌのＰＧＥ−２における３６時間の培養によって行った。細胞をトリプシン処理によって解離し、洗浄し、静脈内投与した。投与は、１００万個の細胞で行った。拡張末期容量を心エコー図によって計測した。１群あたり１０匹のマウスを使用した。組み合わせで処置された動物では、心室容量の有意な保存が観察された（図１９）。菱形は単球であり、正方形は線維芽細胞であり、三角形は食塩水であり、「ｘ」は、単球と線維芽細胞との組み合わせである。
【０３５２】
実施例１８
線維芽細胞及びその集団による移植片対宿主病の処置
実施例Ａ：前臨床試験
８〜１２週齢の雌Ｂ６マウスを、０日目に、１５０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の腹腔内注射で処置して、同種異系再構成を可能にできる造血傷害の状態を誘導した。
【０３５３】
５−ＦＵを投与した後、１日目に、１処置あたり１０匹のマウスの群に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）コントロール、又はＢＡＬＢ／ｃマウス由来の１５，０００；３０，０００；若しくは６０，０００個の骨髄単核細胞を投与した。
【０３５４】
同時にマウスを、プラセボ（食塩水）及びレシピエント起源（Ｂ６）、ドナー起源（ＢＡＬＢ／ｃ）又は第三者のコントロール（Ｃ３Ｈ）の線維芽細胞で、マウス１匹あたり１００，０００個の細胞の濃度において、尾静脈を介して静脈内処置した。
【０３５５】
臨床病理学に基づくと、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の３０，０００；又は６０，０００個の骨髄単核細胞を投与されたすべてのコントロールＢ６マウスにおいてＧＶＨＤが生じた。同種異系、レシピエント又はドナー起源由来の線維芽細胞を投与されたマウスは、ＧＶＨＤを起こさなかったか、又はコントロールと比べて顕著に低減した。
【０３５６】
実施例Ｂ：炎症マーカーの臨床上の減少
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）が正常よりも増加している、ＧＶＨＤに罹患している１２人の患者に、＞８０％のＣＤ７３及び＞８０％のＣＤ１０５を発現している皮膚起源に由来する２０００万個の線維芽細胞を静脈内投与する。ＣＲＰ（図２０Ａ〜２０Ｃ）、ＴＮＦアルファ（図２１Ａ〜２１Ｃ）及びＩＬ−６（図２２Ａ〜２２Ｃ）のレベルを、細胞投与前並びに１、２及び３週間後に計測した。
【０３５７】
濃度は、ピコグラム／ｍｌを単位として表現する。重要なことに、線維芽細胞の投与は、ＩＦＮ−ガンマ産生の増加（図２３Ａ〜２３Ｃ）及びＮＫ活性の増加（図２４Ａ〜２４Ｃ）と関連したことから、炎症を低減しつつ、選択的な抗癌効果が示唆される。
【０３５８】
実施例１９
多発性硬化症を有する患者における線維芽細胞の臨床試験
処置抵抗性の二次性進行型ＭＳを有する患者において静脈内投与された線維芽細胞の安全性を明らかにするために、臨床試験を行う。安全性は、処置に関連する有害事象が無いことと定義される。有効性パラメータは、ａ）ＥＤＳＳ；ｂ）Ｓｃｒｉｐｐｓ神経評価尺度（ＮＲＳ）；ｃ）定速聴覚的連続加算テスト（ＰＡＳＡＴ）；ｄ）９ホールペグ試験；ｅ）２５歩歩行時間；ｆ）ショートフォーム３６（ＳＦ−３６）ＱｏＬ質問票；ｇ）ガドリニウムＭＲＩの変化並びに；ｅ）ＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３発現によって定義される制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の変化というエンドポイントを含む。
【０３５９】
０日目に、Ｉｓｏｌｙｔｅに懸濁した５０ｍｌの体積で２５００万個、５０００万個又は１億個の線維芽細胞を静脈内投与するように、患者を無作為化する。多発性硬化症を有する患者に線維芽細胞を投与する理由は、以前の研究が、多発性硬化症の動物モデルの抑制においてこれらの細胞の有効性を示したから、並びに以前にＭＳ動物モデルにおいて臨床で利用されていた骨髄間葉系幹細胞と比べて優れた免疫調節活性が実証されたからである。詳細には、線維芽細胞は、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１２及びＩＬ−１７の発現を阻害しつつ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、インドールアミン２，３デオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）及びＨＬＡ−Ｇの発現を増加させると実証された。
【０３６０】
具体的な実施形態では、以下の来院スケジュールが利用され得る。
【０３６１】
来院１回目：スクリーニングのための来院及びベースライン評価（注入の１週間前）
インフォームドコンセント
病歴
理学的検査
ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＰｏｓｅｒ基準に従ったＭＳ診断
臨床検査−化学及びＣＢＣ
ＥＤＳＳ
Ｓｃｒｉｐｐｓ神経評価尺度（ＮＲＳ）
定速聴覚的連続加算テスト（ＰＡＳＡＴ）
９ホールペグ試験
２５歩歩行時間
ショートフォーム３６（ＳＦ−３６）ＱｏＬ質問票
ガドリニウムＭＲＩ
Ｔｒｅｇ評価
【０３６２】
来院２回目：０日目、最初の注入（ＥＲＣ−１２４投与）
ＪＤ−００１静脈内注射
注射部位評価
ＥＫＧ
【０３６３】
来院３回目：７日目、通話
・有害事象
【０３６４】
来院４回目：３０日目、評価
・ＥＫＧ
・有害事象評価
・臨床検査−化学及びＣＢＣ
・ＥＤＳＳ
・Ｓｃｒｉｐｐｓ神経評価尺度（ＮＲＳ）
・定速聴覚的連続加算テスト（ＰＡＳＡＴ）
・９ホールペグ試験
・２５歩歩行時間
・ショートフォーム３６（ＳＦ−３６）ＱｏＬ質問票
・ガドリニウムＭＲＩ
・Ｔｒｅｇ評価
【０３６５】
来院５回目：９０日目、評価
・臨床検査−化学及びＣＢＣ
・ＥＤＳＳ
・Ｓｃｒｉｐｐｓ神経評価尺度（ＮＲＳ）
・定速聴覚的連続加算テスト（ＰＡＳＡＴ）
・９ホールペグ試験
・２５歩歩行時間
・ショートフォーム３６（ＳＦ−３６）ＱｏＬ質問票
・Ｔｒｅｇ評価
【０３６６】
来院６回目：１８０日目、評価
・臨床検査−化学及びＣＢＣ
・ＥＤＳＳ
・Ｓｃｒｉｐｐｓ神経評価尺度（ＮＲＳ）
・定速聴覚的連続加算テスト（ＰＡＳＡＴ）
・９ホールペグ試験
・２５歩歩行時間
・ショートフォーム３６（ＳＦ−３６）ＱｏＬ質問票
・ガドリニウムＭＲＩ
・Ｔｒｅｇ評価
【０３６７】
被験体は、スクリーニングのための来院、及び細胞投与前の７日以内に行うベースライン評価を受けなければならず、すべての選択規準及び除外規準を満たさなければならない。すべての選択規準及び除外規準を満たしたことを保証するすべてのベースライン評価の結果が、その被験体の登録前に試験責任医師又はその被指名人によって審査されなければならない。当該試験のすべての態様について被験体に知らせなければならず、試験開始前に被験体から書面によるインフォームドコンセントを得なければならない。
【０３６８】
選択規準：
・ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＰｏｓｅｒ基準に従って、臨床的に確定的な二次性進行型ＭＳを有する１８〜６５歳。
・総合障害度評価尺度（ＥＤＳＳ）スコアが２．０〜６．５である。
・再発ではなく一定の進行が、前の２年間における障害の増大の主な原因でなければならない。進行が、ＥＤＳＳの少なくとも１点の上昇又は患者メモにおける障害の増大の臨床記述から明らかであり得る。
・ガドリニウムＭＲＩを受けることができる。
【０３６９】
除外規準：
・出血性障害。
・治験参加前の６ヶ月以内にインターフェロンベータ又は酢酸グラチラマーを投与されていた。
・心臓血管の状態が不安定な患者。
・試験担当医師によって処置が必要であると判断されていない場合を除く、活動性感染を有する患者。
・ＨＩＶ、Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎への感染の血清学的エビデンスを有する患者。
・ａ）閉経後ではない、ｂ）外科的に生殖不能にされていない、又はｃ）許容され得る避妊方法：経口避妊薬、ノルプラント、デポプロベラ、及び殺精子ゲルと併用するバリアデバイスを用いない、性的に活発な女性。
・悪性病変を有することが判明しているか又は以前に悪性病変を有していた患者。試験担当医師の意見によれば、線維芽細胞による処置を受けることを危険にし得る任意の状態又は任意の状況を有する患者。
・網膜症を有する患者。
・ウシの製品に対してアレルギーを有する患者。
【０３７０】
線維芽細胞には、ＷＨＯの血液バンキング規制及び同種異系製品に対する２１ＣＦＲ１２７１  Ｓｕｂｐａｒｔ  Ｃのドナー規制に従って純度及び汚染物質の欠如を証明する各バッチの分析証明書が提供される。Ｃｈａｒｔｅｒ  ＣＦ−５０のバッグに、生成、試験されたセルバンクからの細胞製品が充填される。それらのバッグの充填は、継代数９のワーキングセルバンクから予め拡大された細胞を用いて、Ｇｅｎｅｒａｌ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙが行う。細胞を、１０％ＤＭＳＯを含む５０ｍＬのＩｓｏｌｙｔｅ  Ｓ  Ｍｕｌｔｉ−Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）に再懸濁する。各Ｃｈａｒｔｅｒ  ＣＦ−５０バッグには、５０ｍｌの容積に２５００万個、５０００万個又は１億個の細胞が入れられている。１臨床用量あたりおよそ２５００万個、５０００万個又は１億個の細胞が必要である。
【０３７１】
線維芽細胞を投与される患者は、ＥＤＳＳスコアの用量依存的低下を示し、ガドリニウムＭＲＩにおいてプラークの消散を示す。
【０３７２】
本明細書において言及されたすべての特許及び刊行物が、本開示が関係する当業者のレベルを示唆する。すべての特許及び刊行物は、各個別の刊行物が参照により援用されると明確かつ個別に示されたのと同程度に、参照により本明細書中に援用される。
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U.S. Patent No. 7,709,229
U.S. Patent No. 6,162,643
U.S. Patent No. 6,103,529
U.S. Patent No. 6,048,728
U.S. Patent No. 5,324,666
U.S. Patent No. 4,560,655
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本開示及びその利点を詳細に記載してきたが、添付の請求項によって定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換及び改変が本明細書中で行われ得ることが理解されるべきである。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法及び工程の特定の実施形態に限定されると意図されていない。当業者は、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たす又は実質的に同じ結果を達成する、すでに現在存在している又は後に開発される、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法又は工程が本開示に従って利用され得ることを本開示の開示からすぐに認識する。したがって、添付の請求項は、そのようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法又は工程の範囲内に含めるように意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【国際調査報告】
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