(57)【要約】本技術は、ヒトＬｙ６Ｋおよびその相同体を阻害する化合物に関する。また、そのような化合物を使用して：細胞中のＬｙ６Ｋタンパク質の活性を阻害し；細胞の遊走、コロニー形成、および／または増殖を減少させ；細胞中の遺伝子の発現をモジュレートし、被験体におけるがんに対する免疫応答の抑制を低減し、被験体におけるがんの腫瘍化成長を減少させ、かつ被験体においてＬｙ６Ｋタンパク質により媒介される障害を処置または防止する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式Ｉ
【化８】
2021502371.tif 000011
の化合物またはその塩であって、式中：
【化９】
2021502371.tif 000012
は、単結合または二重結合であり；
Ｒ１は、−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ３〜８シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、−フェニレン−ＮＨ２、および−Ｃ１〜４アルキレン−ＮＨ２からなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、および−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜５アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３は、−Ｃ１〜６アルキルまたは−Ｃ１〜３アルキレン−ＯＨであり；
Ｒ４は、Ｈまたは−Ｃ１〜６アルキルであり；
Ｒ５は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、−ＮＲ２、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ６は、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ７は、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｎ＋−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−Ｓ（Ｏ２）−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｃ１〜３アルキル、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ８は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、−ＣＮ、−Ｃ−ＮＲ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、およびフェニルからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ９は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、−ＣＮ、−Ｃ−ＮＲ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、およびフェニルからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｎ＋−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−Ｓ（Ｏ２）−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｃ１〜３アルキル、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ１１は、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ１２は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、−ＮＲ２、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたはＣ１〜４アルキルであり；
Ｘは、−Ｃ（Ｒ１３，Ｒ１４）−、−Ｎ（Ｒ１５）−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群より選択され：
Ｒ１３およびＲ１４の一方は存在しないかもしくはＨであり、他方は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；またはＲ１３およびＲ１４は、一緒になって＝Ｏを形成し；
Ｒ１５は、存在しないかまたはＨ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択される、
式Ｉの化合物またはその塩；ならびに
（ｂ）式ＩＩ：
【化１０】
2021502371.tif 000013
の化合物であって、式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの１つは、ハロゲンであり、その他は、独立してＨ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＨ、および−Ｏ−Ｃ１〜３アルキルからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ１０は、独立してＨ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＳＲ、−ＮＲ２、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ７およびＲ９は、独立してＨ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＲ２、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ８は、Ｈ、−Ｃ１〜６アルキル、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＳＲ、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｘは、−Ｃ（Ｒ１１Ｒ１２）−、−Ｎ（Ｒ１３）−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群より選択され：
Ｒ１１およびＲ１２の一方はＨであり、他方は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；またはＲ１１およびＲ１２は、一緒になって＝Ｏを形成し；
Ｒ１３は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択される、
式ＩＩの化合物
からなる群より選択される化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）。
【請求項２】
式Ｉの化合物またはその塩である、請求項１に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）。
【請求項３】
（ａ）
【化１１】
2021502371.tif 000014
が、単結合または二重結合であり；
Ｒ１が、−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ３〜８シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、およびヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２が、Ｈまたは−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｒ３が、−Ｃ１〜６アルキルまたは−Ｃ１〜３アルキレン−ＯＨであり；
Ｒ４が、Ｈまたは−Ｃ１〜６アルキルであり；
Ｒ５が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、−ＮＲ２、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ６が、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ７が、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ８が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＣＮ、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、およびフェニルからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ９が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＣＮ、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、およびフェニルからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ１０が、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたはＣ１〜４アルキルであり；
Ｒ１１が、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ１２が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、−ＮＲ２、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたはＣ１〜４アルキルであり；
Ｘが、−Ｃ（Ｒ１３，Ｒ１４）−、−Ｎ（Ｒ１５）−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群より選択され：
Ｒ１３およびＲ１４の一方が存在しないかもしくはＨであり、他方が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；またはＲ１３およびＲ１４が、一緒になって＝Ｏを形成し；
Ｒ１５が、存在しないかまたはＨ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択され；
（ｂ）
【化１２】
2021502371.tif 000015
が、単結合または二重結合であり；
Ｒ１が、−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ３〜８シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、およびヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜３アルキル（例えば、Ｈ）であり；
Ｒ３が、−Ｃ１〜６アルキルまたは−Ｃ１〜３アルキレン−ＯＨであり；
Ｒ６が、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ７が、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−ＯＲ、−ＳＲ、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ８が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＣＮ、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、およびフェニルからなる群より選択され、各Ｒが、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｘが、−Ｃ（Ｒ１３，Ｒ１４）−、−Ｎ（Ｒ１５）−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群より選択され：
Ｒ１３およびＲ１４の一方が存在しないかもしくはＨであり、他方が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；またはＲ１３およびＲ１４が、一緒になって＝Ｏを形成し；
Ｒ１５が、存在しないかまたはＨ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択され；
（ｃ）
【化１３】
2021502371.tif 000016
が、二重結合であり；
Ｒ１が、−Ｃ１〜８アルキル（例えば、−Ｃ１〜４アルキル、例えば、エチル）であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜３アルキル（例えば、Ｈ）であり；
Ｒ３が、−Ｃ１〜６アルキル（例えば、−Ｃ１〜３アルキル、例えば、メチル）であり；
Ｒ６およびＲ７が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキル（例えば、Ｈ）であり；
Ｘが、−Ｎ（Ｒ１５）−であり、Ｒ１５が、存在しない；あるいは
（ｄ）
【化１４】
2021502371.tif 000017
が、二重結合であり；
Ｒ１が、−Ｃ１〜８アルキル（例えば、−Ｃ１〜４アルキル、例えば、エチル）であり；
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、およびＲ１２が、それぞれＨであり；
Ｒ３が、−Ｃ１〜６アルキル（例えば、−Ｃ１〜３アルキル、例えば、メチル）であり；
Ｒ６およびＲ７が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキル（例えば、Ｈ）であり；
Ｒ８が、Ｈまたは−Ｃ１〜３アルキル（例えば、Ｈ）であり；
Ｘが、−Ｎ（Ｒ１５）−であり、Ｒ１５が、存在しない、
請求項２に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）。
【請求項４】
式Ｉの化合物のアルキルスルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）。
【請求項５】
ＮＳＣ２４３９２８である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）。
【請求項６】
式ＩＩの化合物である、請求項１に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）。
【請求項７】
（ａ）
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のうちの１つが、ハロゲンであり、その他が、独立してＨ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＨ、および−Ｏ−Ｃ１〜３アルキルからなる群より選択され；
Ｒ４およびＲ５が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ６が、−ＯＲであり、Ｒが、Ｈまたは−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｒ７、Ｒ９、およびＲ１０が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｒ８が、−ＯＨまたは−Ｏ−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｘが、−Ｃ（Ｒ１１Ｒ１２）−、−Ｎ（Ｒ１３）−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群より選択され：
Ｒ１１およびＲ１２の一方がＨであり、他方が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；またはＲ１１およびＲ１２が、一緒になって＝Ｏを形成し；
Ｒ１３が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択され；
（ｂ）
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立してＨ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＨ、および−Ｏ−Ｃ１〜３アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３がハロゲンであり；
Ｒ４およびＲ５が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ６が、−ＯＲであり、Ｒが、Ｈまたは−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｒ７、Ｒ９、およびＲ１０が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｒ８が、−ＯＨまたは−Ｏ−Ｃ１〜３アルキルであり；
Ｘが、−Ｃ（Ｒ１１Ｒ１２）−、−Ｎ（Ｒ１３）−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群より選択され；
Ｒ１１およびＲ１２の一方がＨであり、他方が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；またはＲ１１およびＲ１２が、一緒になって＝Ｏを形成し；
Ｒ１３が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択され；
（ｃ）
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキル（例えば、Ｈ）であり；
Ｒ３が、ハロゲン（例えば、Ｃｌ）であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、およびＲ１０が、それぞれＨであり；
Ｒ６が、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル（例えば、−Ｏ−ＣＨ３）であり；
Ｒ８が、−ＯＨであり；
Ｘが、−Ｃ（Ｒ１１Ｒ１２）−であり、
Ｒ１１およびＲ１２の一方がＨであり、他方が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；またはＲ１１およびＲ１２が、一緒になって＝Ｏを形成し；あるいは
（ｄ）
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキル（例えば、Ｈ）であり；
Ｒ３が、ハロゲン（例えば、Ｃｌ）であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ９、およびＲ１０が、それぞれＨであり；
Ｒ６が、−ＯＨであり；
Ｒ８が、−ＯＨであり；
Ｘが、−Ｃ（Ｒ１１Ｒ１２）−であり、
Ｒ１１およびＲ１２の一方がＨであり、他方が、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；またはＲ１１およびＲ１２が、一緒になって＝Ｏを形成する、
請求項１または６に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）。
【請求項８】
ＮＳＣ１１１５０である、請求項１、６または７のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）。
【請求項９】
細胞中のＬｙ６Ｋタンパク質の活性を阻害する方法であって：
前記細胞と薬剤を、前記細胞中のＬｙ６Ｋタンパク質の活性を阻害するのに有効な条件下で接触させることを含み、前記薬剤が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である、方法。
【請求項１０】
前記薬剤が、請求項２〜５のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）であり、前記阻害することが、前記細胞中のＴＧＦ−βΙシグナル伝達を阻害することおよび／または前記細胞中のＳＭＡＤ２／３シグナル伝達を阻害することおよび／または前記細胞中のＳＭＡＤ２／３リン酸化を阻害することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記薬剤が、請求項６または７に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）であり、前記阻害することが、前記細胞中のＰＤ−Ｌ１発現を阻害することおよび／または前記細胞中のＩＦＮγシグナル伝達を阻害することおよび／または前記細胞中のＳｔａｔ１シグナル伝達を阻害することおよび／または前記細胞中のＳｔａｔ１リン酸化を阻害することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
細胞の遊走、コロニー形成、および／または増殖を減少させる方法であって：
前記細胞と薬剤を、前記細胞の遊走、コロニー形成、および／または増殖を減少させるのに有効な条件下で接触させることを含み、前記薬剤が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である、方法。
【請求項１３】
細胞中の遺伝子の発現をモジュレートする方法であって：
前記細胞と薬剤を、前記細胞中の遺伝子の発現をモジュレートするのに有効な条件下で接触させることを含み、前記薬剤が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）であり、前記遺伝子が、ＰＤ−Ｌ１、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＧ２、ＦＧＦ−７、ＮＡＮＯＧ、ＰＳＣＡ、ＣＤ３４、２ＥＢ１、Ｅ−カドヘリン、およびＮ−カドヘリンからなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
前記細胞が、Ｌｙ６Ｋタンパク質を過剰発現する、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、オランウータン、アカゲザル、ゴリラ）細胞、またはげっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、がん細胞である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、乳がん細胞、膀胱がん細胞、脳がん細胞、中枢神経系のがん細胞、腎がん細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞、胃がん細胞、結腸直腸がん細胞、子宮頸がん細胞、頭頸部がん細胞、食道がん細胞、および膵がん細胞からなる群より選択される、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、乳がん細胞である、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、トリプルネガティブ乳がん細胞、間葉系乳がん細胞、基底乳がん細胞、および／または免疫調節性乳がん細胞である、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記接触させることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる、請求項９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記接触させることが、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記接触させることが、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、式Ｉの化合物またはその塩である、請求項９および１２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、ＮＳＣ２４３９２８である、請求項９および１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物が、式ＩＩの化合物である、請求項９および１２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、ＮＳＣ１１１５０である、請求項９、１２〜２３、および２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞と、（ａ）式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）またはその塩および（ｂ）式ＩＩの化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）を接触させることを含む、請求項９および１２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
被験体におけるがんに対する免疫応答の抑制を低減する方法であって：
前記被験体におけるがんに対する免疫応答の抑制を低減するのに有効な条件下で、前記被験体に薬剤を投与することを含み、前記薬剤が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である、方法。
【請求項３０】
被験体におけるがんの腫瘍化成長を減少させる方法であって：
前記被験体におけるがんの腫瘍化成長を減少させるのに有効な条件下で、前記被験体に薬剤を投与することを含み、前記薬剤が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である、方法。
【請求項３１】
前記減少させることが、コロニー形成を低減すること、転移を低減すること、および／または細胞遊走を低減することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
被験体において、Ｌｙ６Ｋタンパク質により媒介される障害を処置または防止する方法であって：
前記障害を処置または防止するのに有効な条件下で、前記被験体に薬剤を投与することを含み、前記薬剤は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である、方法。
【請求項３３】
前記障害が、Ｌｙ６Ｋタンパク質の過剰発現により媒介される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記処置または防止することが、前記被験体における腫瘍成長を除去することおよび／または前記被験体における宿主保護的抗腫瘍免疫を誘導することを含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記障害が、がんである、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記がんが、乳がん、膀胱がん、脳がん、中枢神経系のがん、腎がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、および膵がんからなる群より選択される、請求項２９〜３１および３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記がんが、乳がんである、請求項２９〜３１、３５、および３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記がんが、トリプルネガティブ乳がん、間葉系乳がん、基底乳がん、および／または免疫調節性乳がんである、請求項２９〜３１および３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体が、哺乳動物被験体である、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体が、霊長類（例えば、ヒト、Ｐａｎ  ｓｐ．（例えば、チンパンジー）、Ｐｏｎｇｏ  ｓｐ．（例えば、オランウータン）、Ｍａｃａｃａ  ｓｐ．（例えば、アカゲザル）、Ｇｏｒｉｌｌａ  ｓｐ．）またはげっ歯類（例えば、Ｍｕｓ  ｓｐ．（例えば、マウス）、Ｒａｔｔｕｓ  ｓｐ．（ラット））である、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験体が、女性である、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験体が、男性である、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記男性が、精管切除されたかまたは生殖不能である、請求項２９〜４０および４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物が、式Ｉの化合物またはその塩である、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物が、ＮＳＣ２４３９２８である、請求項２９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記化合物が、式ＩＩの化合物である、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物が、ＮＳＣ１１１５０である、請求項２９〜４３および４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記被験体に、式Ｉの化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）および式ＩＩの化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）を投与することを含む、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５８３，９９８号の利益を主張し、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立がん研究所（National  Cancer  Institute）により授与された認可番号ＣＡ１７５８６２の下で政府援助を受けて行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本技術は、Ｌｙ６Ｋを阻害する化合物、ならびにそのような化合物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）は、高度に不均質の疾患であり、複数のサブタイプから構成される１。ＴＮＢＣ患者は、最悪の転帰に苦慮し、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性およびヒト上皮成長受容体（human  epidermal  growth  receptor）２（Ｈｅｒ  ２）陽性の乳がんを有する患者と比較して、治療的選択肢がほとんどない３。
【０００５】
ホルモン療法または抗Ｈｅｒ２療法などの標的化療法は、ＴＮＢＣに対して機能しない１。免疫療法は、がん治療にパラダイムシフトをもたらしたけれども、ＴＮＢＣにおけるその効果はわずかであった２。ＴＮＢＣは、より若い女性に発症し、乳がんサブタイプの間で最悪の全生存率を有する３。ＴＮＢＣを処置するための新規な、有効かつ安全な手法を特定し、開発することが緊急に必要とされている。
【０００６】
免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ−Ｌ１は、ＴＮＢＣにおいて増加し、その発現の増加は、腫瘍免疫エスケープの一因となっている４、５。ＴＧＦβシグナル伝達は、腫瘍進行の免疫および非免疫の関連経路の両方を活性化する、がんにおける別の重要な拠点となっている６、７。しかしながら、多くの正常な組織におけるＴＧＦβシグナル伝達およびＰＤ−Ｌ１の広範囲な発現および重要な機能のために、それらは治療介入に対して問題をはらむ標的となっている。
本技術は、これらおよび当技術分野における他の欠損を克服することを対象とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＬｅｈｍａｎｎおよびＰｉｅｔｅｎｐｏｌ、Ｂｒｅａｓｔ（２０１５）２４（補遺２）Ｓ３６〜４０
【非特許文献２】Ｎａｎｄａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１６）３４、２４６０〜２４６７
【非特許文献３】Ａｍｉｒｉｋｉａら、Ｃａｎｃｅｒ（２０１１）１１７、２７４７〜２７５３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本技術の第１の態様は：
（ａ）式Ｉ：
【化１】
2021502371.tif 000002
［式中：
【化２】
2021502371.tif 000003
は、単結合または二重結合であり；
Ｒ１は、−Ｃ１〜８アルキル、−Ｃ３〜８シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、−フェニレン−ＮＨ２、および−Ｃ１〜４アルキレン−ＮＨ２からなる群より選択され；
Ｒ２は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、および−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜５アルキルからなる群より選択され；
Ｒ３は、−Ｃ１〜６アルキルまたは−Ｃ１〜３アルキレン−ＯＨであり；
Ｒ４は、Ｈまたは−Ｃ１〜６アルキルであり；
Ｒ５は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、−ＮＲ２、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ６は、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ７は、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｎ＋−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−Ｓ（Ｏ２）−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｃ１〜３アルキル、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ８は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、−ＣＮ、−Ｃ−ＮＲ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、およびフェニルからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ９は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２、−ＣＮ、−Ｃ−ＮＲ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、およびフェニルからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ−、−ＮＨ−Ｎ＝Ｎ＋−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−Ｃ１〜３アルキレン−ＳＨ、−Ｓ（Ｏ２）−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｃ１〜３アルキル、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ１１は、Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＮＲ２、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ１２は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＯ２、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、ハロゲン、−ＮＲ２、および−Ｃ（Ｏ）−ＯＲからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたはＣ１〜４アルキルであり；
Ｘは、−Ｃ（Ｒ１３，Ｒ１４）−、−Ｎ（Ｒ１５）−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群より選択され：
Ｒ１３およびＲ１４の一方は存在しないかもしくはＨであり、他方は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；またはＲ１３およびＲ１４は、一緒になって＝Ｏを形成し；
Ｒ１５は、存在しないかまたはＨ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択される］の化合物またはその塩；および
（ｂ）式ＩＩ：
【化３】
2021502371.tif 000004
［式中：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの１つは、ハロゲンであり、その他は、独立してＨ、−Ｃ１〜４アルキル、−ＯＨ、および−Ｏ−Ｃ１〜３アルキルからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ１０は、独立してＨ、−Ｃ１〜３アルキル、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＳＲ、−ＮＲ２、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ７およびＲ９は、独立してＨ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＮＲ２、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｒ８は、Ｈ、−Ｃ１〜６アルキル、−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１〜３アルキル、−ＳＲ、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＲ２、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、およびハロゲンからなる群より選択され、各Ｒは、独立してＨまたは−Ｃ１〜４アルキルであり；
Ｘは、−Ｃ（Ｒ１１Ｒ１２）−、−Ｎ（Ｒ１３）−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群より選択され：
Ｒ１１およびＲ１２の一方はＨであり、他方は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択されるか；
またはＲ１１およびＲ１２は、一緒になって＝Ｏを形成し；
Ｒ１３は、Ｈ、−Ｃ１〜３アルキル、−Ｃ１〜３アルキレン−ハロゲン、および−ＣＦ３からなる群より選択される］の化合物
からなる群より選択される化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）に関する。
【０００９】
本技術の第２の態様は、細胞中のＬｙ６Ｋタンパク質の活性を阻害する方法に関し、前記方法は、細胞と薬剤を、細胞中のＬｙ６Ｋタンパク質の活性を阻害するのに有効な条件下で接触させることを含み、薬剤は、本技術の第１の態様に基づく化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である。
【００１０】
本技術の第３の態様は、細胞の遊走、コロニー形成、および／または増殖を減少させる方法に関し、前記方法は、細胞と薬剤を、細胞の遊走、コロニー形成、および／または増殖を減少させるのに有効な条件下で接触させることを含み、薬剤は、本技術の第１の態様に基づく化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である。
【００１１】
本技術の第４の態様は、細胞中の遺伝子の発現をモジュレートする方法に関し、前記方法は、細胞と薬剤を、細胞中の遺伝子の発現をモジュレートするのに有効な条件下で接触させることを含み、薬剤は、本技術の第１の態様に基づく化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）であり、遺伝子は、ＰＤ−Ｌ１、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＧ２、ＦＧＦ−７、ＮＡＮＯＧ、ＰＳＣＡ、ＣＤ３４、２ＥＢ１、Ｅ−カドヘリン、およびＮ−カドヘリンからなる群より選択される。
【００１２】
本技術の第５の態様は、被験体におけるがんに対する免疫応答の抑制を低減する方法に関し、前記方法は、被験体におけるがんに対する免疫応答の抑制を低減するのに有効な条件下で、被験体に薬剤を投与することを含み、薬剤は、本技術の第１の態様に基づく化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である。
【００１３】
本技術の第６の態様は、被験体におけるがんの腫瘍化成長を減少させる方法に関し、前記方法は、被験体におけるがんの腫瘍化成長を減少させるのに有効な条件下で、被験体に薬剤を投与することを含み、薬剤は、本技術の第１の態様に基づく化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である。
【００１４】
本技術の第７の態様は、被験体において、Ｌｙ６Ｋタンパク質により媒介される障害を処置または防止する方法に関し、前記方法は、障害を処置または防止するのに有効な条件下で、被験体に薬剤を投与することを含み、薬剤は、本技術の第１の態様に基づく化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）である。
【００１５】
本発明者らは、がん組織中で選択的に発現する、ＴＧＦβシグナル伝達および腫瘍進行の強力な活性化因子としての細胞表面タンパク質Ｌｙ６Ｋを同定した。Ｌｙ６Ｋレベルは、ＴＮＢＣの８０％で増加し、ｍＲＮＡ発現の増加は、ＴＮＢＣにおける生存転帰不良に関連する８。
【００１６】
本発明者らは、Ｌｙ６Ｋが、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長に必要とされ、かつＬｙ６Ｋが、ＴＧＦβシグナル伝達および上皮間葉転換を活性化することを示した９。Ｌｙ６Ｋはまた、がん細胞中のＩＦＮγ誘導性のＰＤ−Ｌ１の過剰発現にも必要とされる９。重要なことに、本発明者らは、Ｌｙ６Ｋのノックダウンまたは薬理学的阻害が、ＴＮＢＣ細胞中のＰＤ−Ｌ１発現を阻害することを見出した。さらに最近では、本発明者らは、Ｌｙ６Ｋの２つの小分子バインダー、ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０を同定し、これらは、例えば、同系マウスにおけるＴＧＦβシグナル伝達、ＰＤ−Ｌ１発現および腫瘍成長の活性化のような、Ｌｙ６Ｋの生物活性の多数の異なる側面を阻害する。
【００１７】
これらの観察に基づいて、本発明者らは、Ｌｙ６Ｋが、ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１経路の活性化を介して腫瘍進行に重要な役割を果たし、かつ小分子阻害剤によるＬｙ６Ｋ標的化が、がん細胞中のＴＧＦβシグナル伝達およびＰＤ−Ｌ１経路の組織特異的阻害をもたらすことを見出す。本発明者らの発見は、Ｌｙ６Ｋが、ＴＧＦβシグナル伝達を増強することにより腫瘍進行および免疫監視の抑制をもたらし、Ｌｙ６Ｋが、チェックポイントタンパク質ＰＤ−Ｌ１の上方制御により腫瘍免疫エスケープをもたらし、かつＬｙ６Ｋが、小分子を使用して標的とされ、ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１経路における免疫エスケープおよび腫瘍進行を阻害することができることを示している。
【００１８】
本発明者らは、ＴＮＢＣ細胞系、臨床試料、同系および異種移植の腫瘍モデルを使用して、Ｌｙ６Ｋが、ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の増加に重要な役割を果たしていることを示す。その組織特異的発現およびその腫瘍進行経路の強力な活性化により、Ｌｙ６Ｋは治療介入の魅力的な標的となる。本発明者らはここで初めて、Ｌｙ６Ｋの下流のＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１経路を効率的に阻害する、Ｌｙ６Ｋの２つの小分子バインダーを示す。本出願は、抗ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１発現の阻害のための新規な治療標的を定義することにより、ＴＮＢＣの処置のための、標的化免疫療法のための化合物および方法を提供する。
【００１９】
本技術は、以下の図を参照することによって、より良く理解することができる。図は、単独でまたは他の特色と組み合わせて使用され得るある特定の特色を例証するための単なる例示であり、本技術は、示した実施形態に限定されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＴＮＢＣにおけるＬｙ６Ｋ発現を示す。Ｏｎｃｏｍｉｎｅデータ解析を実施して、（Ａ）がんゲノムアトラスデータセットを使用して正常な乳房組織と比較した、乳がんにおけるＬｙ６ＫのｍＲＮＡ発現の増加、（Ｂ）Ｃｕｒｔｉｓデータセット１０を使用して、非ＴＮＢＣに対するＴＮＢＣにおけるｍＲＮＡ発現の増加を可視化した。２試料Ｔ検定、ｐ＜０．０５  有意。（Ｃ）Ｌｙ６Ｋ発現の増加は、予後ソフトウエアツールＰｒｏＧｇｅｎｅ  Ｖ２１１により可視化した、ＴＮＢＣ（データセットＩＤ：ＧＳＥ１９７８３）における生存不良と有意に関連する。遺伝子発現中央値を分岐点として使用して、試料を、遺伝子高発現群および遺伝子低発現群に分ける。生存データおよび連続発現変数を使用して、ライブラリー生存の関数「ｃｏｘｐｈ」を使用して、コックス比例ハザードモデルに適合させることにより、生存解析を行う。ハザード比（ＨＲ）およびログランクｐ値を、適合モデルから取得する。予後プロットを作成するために、高発現および低発現のカテゴリー変数を生存データと共に使用する。同じＲライブラリーの関数「ｓｕｒｖｆｉｔ」を使用して、プロットを作製する。ｐ＝０．０００５を伴うＨＲ、ハザード比、ｐ＜０．０５を有意と考える。上のライン：Ｌｙ６Ｋ低発現を伴うＴＮＢＣ；下のライン：Ｌｙ６Ｋ高発現を伴うＴＮＢＣ。（Ｄ）絶対的Ｌｙ６Ｋ  ｍＲＮＡ発現を、Ｌｅｈｍａｎらにより記載されたＴＮＢＣサブタイプ１２において定量化した。ＴＮＢＣ患者の関連ＧＥＯデータセット（ＨＧＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０アレイ）を、ロバストマルチ平均ＲＭＡ法およびｃｏｍｂａｔを使用して修正したバッチを使用して正規化した。パッケージｏｌｉｇｏ、ｓｖａおよびｌｉｍｍａを使用して、Ｒで解析を行った。ｎ＝組織試料の数。ウェルチ２試料Ｔ検定を適用してｐ値を決定し、ｐ＜０．０５を有意と考える。（Ｆ）「ヒトタンパク質アトラス」における公開情報では、ヒト正常組織のパネルにおいて、親和性リガンドＨＰＡ０１７７７０（Ｓｉｇｍａ）としてＰｒＥＳＴ−抗原を使用してアフィニティ精製された、確認済みのＬｙ６Ｋ抗体、ウサギポリクローナルを使用した、ＩＨＣの定量化を示している。ＩＨＣ標識化の強度はＹ軸に示され、Ｘ軸は、試験された臓器の名称を示す。挿入図では、Ｌｙ６Ｋ抗体を使用した正常な精巣および乳房からのＩＨＣ画像が示されている。（Ｇ）表は、Ｌｅｅら、２０１３年１３から採用され、これは、精製された免疫細胞中のＬｙ６ＤおよびＬｙ６Ｅ遺伝子のｍＲＮＡ発現を示す。Ｌｙ６ＫのｍＲＮＡ発現は、免疫細胞において検出されなかった。
【００２１】
【図２】図２は、Ｌｙ６Ｋが、ＴＧＦβシグナル伝達に必要とされることを示す。Ｌｙ６Ｋに対するｓｈＲＮＡ（Ｌｙ６Ｋ  ｓｈ１、Ｌｙ６Ｋ  ｓｈ２）または標的化しない対照ｓｈＲＮＡ（Ｖｅｃｔｏｒ）のレンチウイルス粒子は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において安定して形質導入された７。（Ａ）Ｌｙ６ＫのｍＲＮＡレベルを示すｑＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、＊＊はｐ＜０．００５を示す、両側スチューデントＴ検定。（Ｂ）Ｌｙ６Ｋに関するウェスタンブロット解析。（Ｃ）リン酸化Ｓｍａｄ２／３タンパク質および総Ｓｍａｄ２／３タンパク質に関するウェスタンブロット解析。（Ｄ）示された細胞を血清枯渇させ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１で３０分間刺激した。血清枯渇細胞は、検出可能なリン酸化Ｓｍａｄタンパク質を示さなかった。３０分間のＴＧＦβ１刺激により、リン酸化Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ１／５が誘導された。ｑＲＴ−ＰＣＲプライマーおよび抗体を記載する７。（Ｅ）ＴＧＦβ１、（Ｆ）ＧＤＦ１０のｍＲＮＡレベルに関するＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを使用するｑＲＴ−ＰＣＲ解析では、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す、両側スチューデントＴ検定。（Ｇ）Ｏｎｃｏｍｉｎｅを使用して、Ｃｕｒｔｉｓデータセット１を使用した、非ＴＮＢＣ臨床症例に対するＴＮＢＣ臨床症例における、示された遺伝子のｍＲＮＡレベルの同時発現を評価した。ｎ＝患者数。ｐ値は、Ｏｎｃｏｍｉｎｅソフトウェアにより算出された行内のｐ値を示す。最大発現の遺伝子を赤いバーで示し、最小発現の遺伝子を青いバーで示す。（Ｈ）Ｌｙ６Ｋは、腫瘍細胞成長および免疫抑制の増加のために、ＴＧＦβシグナル伝達に影響を及ぼし得る。
【００２２】
【図３】図３は、Ｌｙ６Ｋが、ＩＦＮγ／ＰＤ−Ｌ１経路に必要とされることを示す。（Ａ）示された細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγを用いる終夜の処置の前に、血清枯渇させた。細胞は、固定前に抗−ＰＤ−Ｌ１  ＢＶ５４０抗体またはアイソタイプ対照抗体で標識され、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の細胞表面発現を評価した。高ＰＤ−Ｌ１細胞のパーセンテージを、３回の異なる実験から棒グラフにプロットし、両側スチューデントＴ検定に供し、ｐ＜０．０５を有意と考える。（Ｂ）示されたタンパク質に関するウェスタンブロット解析。（Ｃ）ＰＤ−Ｌ１の増加をもたらすＩＦＮγ／Ｓｔａｔ１経路に対する、Ｌｙ６Ｋの仮定された影響。
【００２３】
【図４】図４は、Ｌｙ６Ｋが、同系の乳房腫瘍モデルにおける腫瘍成長に必要とされることを示す。（Ａ）スクランブルｓｈＲＮＡ（Ｃｏｎ）およびＬｙ６Ｋノックダウン（Ｌｙ６Ｋ  ｓｈ）細胞中のｍＲＮＡレベルに関するＴａｑＭＡｎ遺伝子発現アッセイを使用したｑＲＴ−ＰＣＲ解析。（Ｂ）ウェスタンブロット解析（細胞シグナル伝達抗体）。（Ｃ）４Ｔ１モデルに関して、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて２０Ｋ細胞／部位、およびＥ０７７１に関して、Ｃ５７ＢＬ／６同系マウスにおいて５００Ｋ細胞／部位を、皮下注射により、下部乳房脂肪パッドに移植した（細胞系の対当たりのマウスの数  １０）。腫瘍測定を、ノギスを使用して実施した。腫瘍体積を、式１／２×長さ×（幅×幅）を使用して算出した。両側スチューデントＴ検定において、＊＊は、ｐ＜０．００１を示し、ＮＳ＝有意でない（ｐ＞０．０５）。
【００２４】
【図５】図５は、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長に対する小分子の影響を示す。（Ａ）ＮＣＩデータに示された用量の生理食塩水中のＮＳＣ２４３９２８を、腹腔内経路（ｉ．ｐ．）により、９日間毎日、Ｌ１２白血病細胞を有するＢ１ＤＦ同系マウスに与えた。各群は６匹のマウスを有する。マウスを、薬物処置後の３０日間、モニターした。処置／対照（％）は、治療利益を表す。（Ｂ−Ｃ）５０〜７０ｍｍ３の腫瘍を有する４Ｔ１マウスを、ＮＳＣ２４３９２８（Ｂ）またはＮＳＣ１１１５０（Ｃ）で、２日毎に、生理食塩水中の示された用量で処置した。＊＊は、両側スチューデントＴ検定において、ｐ＜０．００５を表す。各群は１０匹のマウスを有する。腫瘍測定を、図４Ｃに示すように行った。
【００２５】
【図６】図６は、Ｈｓ５７８ｔ（左のパネル）における示されたタンパク質に関するウェスタンブロット（ＷＢ）解析を示す（Ｌｙ６ＫのためのレンチウイルスｓｈＲＮＡ（Ｌｙ６Ｋ  ｓｈ）および標的化しない対照ｓｈＲＮＡ（ｃｏｎ））。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（右のパネル）では、Ｌｙ６Ｋ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドおよび対照ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（それぞれ、Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ、ｃａｔ＃ｓｃ４０４２６４、ｓｃ−４１８９２２）は、製造業者の指示に基づいた。３つのクローンを、ＷＢにより解析した。
【００２６】
【図７】図７は、Ｌｙ６Ｋが、ＴＧＦβ受容体複合体と相互作用し、それをさらに安定化して、Ｓｍａｄ２／３のリン酸化を誘導し得ることを示す。
【００２７】
【図８】図８は、Ｌｙ６Ｋ（ＵｎｉＰｒｏｔ．ｏｒｇ）のタンパク質構造を示す。
【００２８】
【図９】図９は、細胞周期に対するＬｙ６Ｋの影響を示す。示された細胞は、終夜、血清枯渇させた。次に、細胞を、１０％の血清培地で４または２４時間刺激した。未処置細胞を、血清枯渇の最後に（０時間）収集した。ＰＩ標識化をフローサイトメトリー細胞周期解析のために実施した。細胞のパーセンテージを着色ボックス内に示す（各時間点に関して上方から下方へ：Ｓ期、Ｇ２期、Ｇ１期）。グラフは、３回の独立した実験のうちの１回を示す。両側スチューデントＴ検定、ｐ＜０．００５  有意、ｐ＞０．０５  有意でない（ＮＳ）。
【００２９】
【図１０】図１０は、ＩＦＮγ経路におけるＬｙ６Ｋの役割を示す。
【００３０】
【図１１−１】図１１は、Ｌｙ６Ｋの小分子バインダーを示す。（Ａ）Ｌｙ６Ｅ、Ｌｙ６ＤおよびＬｙ６Ｋの成熟型を、ｐＥＴ２４ａ  Ｎ末端Ｈｉｓタグベクター（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローン化し；ＢＬ２１ＤＥ  Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ；精製組換えタンパク質を、バッチ精製法を使用するヒスチジンカラムを使用して、５００ｍＭイミダゾールＰＢＳ中で溶離し、ＰＢＳ中で透析して調製した。５μｌの溶離液を、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、単一バンドの予期されるサイズのタンパク質の純度を示した。（Ｂ）ＮＳＣ２４３９２８の構造。（Ｇ）ＮＳＣ１１１５０の構造。（Ｃ〜Ｆ；Ｈ〜Ｋ）代表的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムは、Ｘ軸上に時間およびＹ軸上にＳＰＲ結合応答を示す。Ｌｙ６Ｋは、ＮＳＣ２４３９２８（Ｃ）およびＮＳＣ１１１５０（Ｈ）に対して用量依存的に結合応答を示す。Ｌｙ６Ｅ（Ｅ、Ｊ）およびＬｙ６Ｄ（Ｆ、Ｋ）は、ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０に対して結合応答を示さず；（Ｄ）は、化合物濃度に対してプロットされた定常状態応答値（黒い点）およびＫＤ値を決定するための実験データに対する単純非線形双曲線適合（赤い線）を示し、Ｌｙ６Ｋに結合しているＮＳＣ２４３９２８に関するＫＤ値は１．９μΜ±０．５である、Ｃｈｉ２  Ｔ検定、ｐ＝．００３６５。ＮＳＣ１１１５０に対応するデータを、対応する下のパネルに示す。（Ｉ）Ｌｙ６Ｋに対するＮＳＣ１１１５０のＫＤ＝１．６μΜ±０．５、Ｃｈｉ２  Ｔ検定、ｐ＝．００５０７。
【図１１−２】図１１は、Ｌｙ６Ｋの小分子バインダーを示す。（Ａ）Ｌｙ６Ｅ、Ｌｙ６ＤおよびＬｙ６Ｋの成熟型を、ｐＥＴ２４ａ  Ｎ末端Ｈｉｓタグベクター（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローン化し；ＢＬ２１ＤＥ  Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ；精製組換えタンパク質を、バッチ精製法を使用するヒスチジンカラムを使用して、５００ｍＭイミダゾールＰＢＳ中で溶離し、ＰＢＳ中で透析して調製した。５μｌの溶離液を、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、単一バンドの予期されるサイズのタンパク質の純度を示した。（Ｂ）ＮＳＣ２４３９２８の構造。（Ｇ）ＮＳＣ１１１５０の構造。（Ｃ〜Ｆ；Ｈ〜Ｋ）代表的な表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムは、Ｘ軸上に時間およびＹ軸上にＳＰＲ結合応答を示す。Ｌｙ６Ｋは、ＮＳＣ２４３９２８（Ｃ）およびＮＳＣ１１１５０（Ｈ）に対して用量依存的に結合応答を示す。Ｌｙ６Ｅ（Ｅ、Ｊ）およびＬｙ６Ｄ（Ｆ、Ｋ）は、ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０に対して結合応答を示さず；（Ｄ）は、化合物濃度に対してプロットされた定常状態応答値（黒い点）およびＫＤ値を決定するための実験データに対する単純非線形双曲線適合（赤い線）を示し、Ｌｙ６Ｋに結合しているＮＳＣ２４３９２８に関するＫＤ値は１．９μΜ±０．５である、Ｃｈｉ２  Ｔ検定、ｐ＝．００３６５。ＮＳＣ１１１５０に対応するデータを、対応する下のパネルに示す。（Ｉ）Ｌｙ６Ｋに対するＮＳＣ１１１５０のＫＤ＝１．６μΜ±０．５、Ｃｈｉ２  Ｔ検定、ｐ＝．００５０７。
【００３１】
【図１２】図１２は、Ｌｙ６Ｋの小分子バインダーの効果を示す。（Ａ）示された細胞を播種し、終夜、付着させ、次に２μΜの薬物で７２時間処置した。細胞力価アッセイを実施して、細胞成長を測定した。（Ｂ）細胞を血清枯渇させ、２μΜの薬物と共に１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγで処置した。ＰＤ−Ｌ１を、図３Ａに示すように、生細胞において測定した（ｚｏｍｂｉｅ  ｌｉｖｅ−ｄｅａｄ染色を使用）。グラフを、３回の実験からプロットした。（Ｃ、Ｄ）示された細胞を付着させ、終夜、血清枯渇させ、次に、ΤＧＦβ（Ｃ）またはＩＦＮγ（Ｄ）で、２μΜの薬物の存在下で３０分間処置し、ウェスタンブロット解析を実施した。両側スチューデントＴ検定において、＊＊＊は、ｐ＜０．０００５を表し、ＮＳ＝有意でない。
【００３２】
【図１３】図１３は、Ｌｙ６Ｋ成熟タンパク質の相同性モデル化を示す。（Ａ）タンパク質の骨格、（Ｂ）Ｌｙ６ファミリーのタンパク質におけるアミノ酸保存を伴う表面図（青−保存残基、赤−可変残基）、（Ｃ）Ｎ末端近くの結合部位１。対応する１２０°回転により、Ｌｙ６ＫのＣ−末端５の近位にある結合部位２が明らかになる。
【００３３】
【図１４】図１４は、Ｌｙ６Ｋの小分子バインダーの機構を示す。（Ａ〜Ｂ）部位１で結合している、ＮＳＣ１１１５０に結合しているＬｙ６Ｋ（Ａ）および部位２で結合している、ＮＳＣ２４３９２８に結合しているＬｙ６Ｋ（Ｂ）、リボンで示す（左のパネル）および表面モデル（右のパネル）。Ｓｗｉｓｓ  ｄｏｃｋを使用した結合予測。結合に関与するアミノ酸の正体を示す。（Ｃ）両方の分子とＬｙ６Ｋとの結合を示す表面図。（Ｄ）本発明者らが取り組んでいる仮説は、Ｌｙ６Ｋが、２つの構造的に異なる分子を介して標的化され、免疫チェックポイントタンパク質およびΤＧＦβシグナル伝達を制御し得るということである。
【００３４】
【図１５】図１５は、Ｌｙ６Ｋと小分子ＮＳＣ２４３９２８（４’−（９−アクリジニルアミノ）−３’−メトキシエタンスルホンアニリドメタンスルホネート）の間の結合相互作用の概略モデルを示す。
【００３５】
【図１６】図１６は、Ｌｙ６Ｋと小分子ＮＳＣ１１１５０（４−（４−クロロベンジル）ベンゼン−１，３−ジオール）の間の結合相互作用の概略モデルを示す。
【００３６】
【図１７】図１７は、Ｌｙ６Ｋ結合小分子が、腫瘍成長に対する免疫を誘導することを示す。個々の小分子を用いた、同系のＣ５７Ｂ１／６モデルにおけるＥ０７７１腫瘍の処置により腫瘍成長は低減し、一方、２つの小分子を用いた併用処置により腫瘍成長は完全に除去された。腫瘍消失の後に、処置を停止した。３週間後、治癒したマウスを、腫瘍成長に対する完全な、永続的な保護を伴い、Ｅ０７７１細胞を用いて再チャレンジした。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下の詳細な説明は、いかなる当業者も主題技術を利用することを可能にするために示される。説明を目的として、本発明の全体的理解をもたらすために、特定の用語が明示される。しかしながら、これらの特定の詳細が、本技術を実施するために必要とされないことが当業者には明らかであろう。特定の適用の記載は、代表例としてのみ提供される。本技術は、示される実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示される原理および特色と一致した、最も広い可能な範囲と一致されるべきである。本発明の所与の態様、特色、またはパラメーターに対する優先および選択肢は、文脈よりそうでない旨が示されない限り、本発明の全ての他の態様、特色、およびパラメーターに対する任意のおよび全ての優先および選択肢と組み合わせて開示されていると考えられるべきである。
【００３８】
本技術は、Ｌｙ６Ｋを阻害する化合物に関する。
【００３９】
「Ｌｙ６Ｋ」は、リンパ球抗原６ファミリーメンバーＫタンパク質を指す。好適なＬｙ６Ｋタンパク質には、ヒトＬｙ６Ｋ（例えば、ジェンバンク受託番号ＡＡＩ１７１４５．１、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）およびヒトＬｙ６Ｋの非ヒト相同体が含まれる。非ヒト相同体は、構造的にかつ機能的にヒトＬｙ６Ｋと同様であるタンパク質を指す。相同体は、例えば、他の霊長類（例えば、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ（オランウータン）、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔｏ（アカゲザル）、ゴリラ）およびげっ歯類（例えば、マウス、ラット）において同定されている。
【００４０】
ヒトＬｙ６Ｋの相同体にはまた、例えば、ヒトＬｙ６Ｋのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質も含まれる。本明細書で使用される同一性百分率は、別のアミノ酸配列に対する１つのアミノ酸（または核酸）配列の比較を指し、アミノ酸（または核酸）の一致によりスコア化される。同一性百分率は、２つの配列からの統計的に有意な数のアミノ酸（または核酸）を比較し、同一の２つのアミノ酸（または核酸）がある位置に存在する場合、一致をスコア化することにより決定される。同一性百分率は、当業者に公知でかつ使用されている種々のアライメントアルゴリズムのいずれかにより算出することができる。
【００４１】
化合物
本技術の化合物は、式Ｉおよび式ＩＩの、Ｌｙ６Ｋ阻害剤（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）を含む（表１を参照されたい）。
【表１−１】
2021502371.tif 000005
【表１−２】
2021502371.tif 000006
【００４２】
式Ｉの化合物は、ＮＳＣ２４３９２８およびその類似体を含む。式ＩＩの化合物は、ＮＳＣ１１１５０およびその類似体を含む。図１５および１６は、これらの化合物とＬｙ６Ｋ上のそれらの結合部位の間の相互作用に基づいて、それぞれ、式ＩおよびＩＩ内の、ＮＳＣ２４３９２８（図１５）およびＮＳＣ１１１５０（図１６）の類似体を作製する理論的根拠を示す。矢印は結合相互作用に関与しないと考えられる原子を表し；化合物が、その活性を維持しながら、これらの位置でかなりの変形を許容することができることが予測される。
【００４３】
用語「アルキル」とは、脂肪族の飽和または不飽和の炭化水素基を意味し、直鎖または分岐で鎖中に約１〜約８個の炭素原子を有してもよい。分岐とは、メチル、エチルまたはプロピルなどの１つまたは複数の低級アルキル基が、線状アルキル鎖に付着していることを意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、および３−ペンチルが挙げられる。用語「アルキレン」とは、本明細書に定義されるアルキルの２価の対応物を意味する。
【００４４】
用語「シクロアルキル」は、非芳香族の飽和または不飽和の単環式または多環式の環系を指し、３〜６個の炭素原子を含有してもよく；少なくとも１つの二重結合を含んでもよい。シクロアルキル基の例としては、限定されることなく、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、ａｎｔｉ−ビシクロプロパン、およびｓｙｎ−ビシクロプロパンが挙げられる。
【００４５】
用語「アリール」は、６〜１９個の炭素原子を含有する芳香族の単環式または多環式の環系を指し、環系は、必要に応じて置換されていてもよい。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アズレニル、フェナントレニル、アントラセニル、フルオレニル、ピレニル、トリフェニレニル、クリセニル、およびナフタセニルなどの基が挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも１つの実施形態では、アリールは、６〜９個の炭素原子を含有する単環式の環系である。
【００４６】
用語「ヘテロシクリル」は、炭素原子ならびに窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される１から５個のヘテロ原子からなる、安定な３〜１８員環ラジカルを指す。本技術の目的上、ヘテロシクリルラジカルは、単環式、または多環式の環系であり得、これらは縮合環、架橋環、またはスピロ環系を含み得；ヘテロシクリルラジカル中の窒素、炭素、または硫黄原子は、必要に応じて酸化され得；窒素原子は必要に応じて四級化され得；環ラジカルは、部分的にまたは完全に飽和されていてもよい。そのようなヘテロシクリルラジカルの例には、限定されることなく、アゼピニル、アゾカニル、ピラニル、ジオキサニル、ジチアニル、１，３−ジオキソラニル、テトラヒドロフリル、ジヒドロピロリジニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリジニル、オキシラニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロピラニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、およびチアモルホリニルスルホンが含まれる。少なくとも１つの実施形態では、ヘテロシクリルは、３〜９個の炭素原子を含有する単環ラジカルである。
【００４７】
用語「ヘテロアリール」は、炭素原子ならびに窒素、酸素、および硫黄からなる群より選択される１から５個のヘテロ原子からなる芳香族環ラジカルを指す。本発明の目的上、ヘテロアリールは、単環式または多環式の環系であってもよく；ヘテロアリール環中の窒素、炭素、および硫黄原子は、必要に応じて酸化され得；窒素は必要に応じて四級化され得る。ヘテロアリール基の例には、限定されることなく、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、フリル、チオフェニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、チエノピロリル、フロピロリル、インドリル、アザインドリル、イソインドリル、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、イミダゾピリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラゾロピリジニル、トリアゾロピリジニル、チエノピリジニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル（benzofuyl）、ベンゾチオフェニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノリジリニル、フタラジニル、ベンゾトリアジニル、クロメニル、ナフチリジニル、アクリジニル、フェナンジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、プテリジニル、およびプリニルが含まれる。少なくとも１つの実施形態では、ヘテロアリールは、６〜１９個の環原子を含有する単環式または多環式の環系である。少なくとも１つの実施形態では、ヘテロアリールは、６〜９個の環原子を含有する単環式の環系である。
【００４８】
さらなる複素環およびヘテロアリールは、COMPREHENSIVE  HETEROCYCLIC  CHEMISTRY:  THE  STRUCTURE,  REACTIONS,  SYNTHESIS  AND  USE  OF  HETEROCYCLIC  COMPOUNDS  Vol.  1-8  (Alan  R.  Katritzky  et  al.  eds.,  1st  ed.  1984)に記載されており、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを意味する。
【００５０】
本技術の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）は、必要に応じて修飾され、タグを含むことができる。「タグ」には、本明細書で使用される場合、化合物（すなわち、本技術の化合物、以下に記載される化合物−グルタミナーゼＧＬＳ１タンパク質コンジュゲート、以下に記載されるコンジュゲートされた化合物／阻害剤、および／または以下に記載されるコンジュゲートされたグルタミナーゼＧＬＳ１タンパク質）の検出、定量化、単離、および／または精製を容易にする任意の標識化部分が含まれる。小分子を修飾してタグを含ませる方法は、当技術分野で周知である。例えば、クリックケミストリー（例えば、Ｓｈａｒｐｌｅｓｓらに対する米国特許第７，３７５，２３４号を参照されたい、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）は、タグを化合物に付着させるために使用され得る。
【００５１】
好適なタグには、精製タグ、放射性標識もしくは蛍光標識、酵素タグ、補欠分子族、発光物質、生物発光物質、陽電子放出金属、非放射性常磁性金属イオン、ならびに放射測定、比色分析、蛍光定量、サイズ分離、もしくは沈殿手段、または他の当技術分野で公知の手段による、検出および／もしくは測定に好適な任意の他のシグナルを含む標識が含まれる。
【００５２】
マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６−）、またはグルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ−）などであるが、これらに限定されない精製タグは、化合物の精製または分離を補助し得るが、後に除去され、すなわち、回収に続いて化合物から切断することができる。プロテアーゼ特異的切断部位を使用して、精製タグの除去を容易にすることができる。所望の生成物をさらに精製して、切断した精製タグを除去することができる。
【００５３】
他の好適なタグには、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１５Ｉｎ、９９ＴＣ、２１３Ｂｉ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇｅ、１６６Ｈｏ、１４０Ｌａ、１７７Ｌｕ、５４Ｍｎ、９９Ｍｏ、１０３Ｐｄ、３２Ｐ、１４２Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、１５３Ｓｍ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ、８５Ｓｒ、３５Ｓ、２０１Ｔｉ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、３Ｈ、１３３Ｘｅ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、９０Ｙ、および６５Ｚｎなどの放射性標識が含まれる。化合物を放射性標識化する方法は、当技術分野で公知であり、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎらに対する米国特許第５，８３０，４３１号に記載されており、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。放射能は、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーを使用して検出されかつ定量化される。さらなる例には、様々な陽電子断層撮影を使用する陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。
【００５４】
あるいは、化合物を、蛍光タグにコンジュゲートすることができる。好適な蛍光タグには、限定されることなく、キレート（ユウロピウムキレート）、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリン、テキサスレッド、およびウンベリフェロンが含まれる。蛍光標識は、CURRENT  PROTOCOLS  IN  IMMUNOLOGY  (Coligen  et  al.  eds.,  1991)に開示される技術を使用して化合物にコンジュゲートすることができ、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。蛍光は、蛍光計を使用して検出されかつ定量化することができる。
【００５５】
酵素タグは、一般に、発色性基質の化学的変化を触媒し、これは様々な技術を使用して測定することができる。例えば、酵素は、基質における色変化を触媒し得、これは分光光度的に測定することができる。あるいは、酵素は、基質の蛍光または化学発光を変化させ得る。好適な酵素タグの例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；例えば、米国特許第４，７３７，４５６号、Ｗｅｎｇらを参照されたい、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。酵素をタンパク質およびペプチドにコンジュゲートする技術は、O'Sullivan  et  al.,  Methods  for  the  Preparation  of  Enzyme  -  Antibody  Conjugates  for  Use  in  Enzyme  Immunoassay,  in  METHODS  IN  ENZYMOLOGY  147-66  (Langone  et  al.  eds.,  1981)に記載されており、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
補欠分子族複合体には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、化合物は、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれるが、これらに限定されない発光物質または生物発光物質にコンジュゲートすることができる。
【００５７】
本技術の化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）は、必要に応じて修飾することができ、繊維性の試験片、カラム、マルチウェルマイクロリットルプレート、試験管、またはビーズなどの固体表面への付着を含む。小分子をそのような表面に付着させる方法は、共有結合（例えば、前記のようにクリックケミストリーを介する）と同様に、抗体−抗原パートナー、相補的核酸の使用を通した非共有結合などを含み、当技術分野で周知である。
【００５８】
薬学的に許容される塩には、アミン塩、例えば、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、アンモニア、ジエタノールアミンおよび他のヒドロキシアルキルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、１−パラ−クロロベンジル−２−ピロリジン−１’−イルメチル−ベンゾイミダゾール、ジエチルアミンおよび他のアルキルアミン、ピペラジン、ならびにトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどであるが、これらに限定されず；アルカリ金属塩、例えば、リチウム、カリウム、およびナトリウムなどの塩であるが、これらに限定されず；アルカリ土類金属塩、例えば、バリウム、カルシウム、およびマグネシウムなどの塩であるが、これらに限定されず；遷移金属塩、例えば、亜鉛などの塩であるが、これらに限定されず；ならびに他の金属塩、例えば、リン酸水素ナトリウムおよびリン酸二ナトリウムなどであるが、これらに限定されない塩が含まれるが、これらに限定されず；また鉱酸の塩、例えば、塩酸塩および硫酸塩などであるが、これらに限定されず；ならびに有機酸の塩、例えば、酢酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、酪酸塩、吉草酸塩およびフマル酸塩などであるが、これらに限定されない塩も含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容されるエステルには、カルボン酸、リン酸、ホスフィン酸、スルホン酸、スルフィン酸、およびボロン酸が含まれるが、これらに限定されない酸性基の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルおよびヘテロシクリルのエステルが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容されるエノールエーテルには、式Ｃ＝Ｃ（ＯＲ）の誘導体［式中、Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリルである］が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容されるエノールエステルには、式Ｃ＝Ｃ（ＯＣ（Ｏ）Ｒ）の誘導体［式中、Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリルである］が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される溶媒和物および水和物は、化合物と、１つもしくは複数の溶媒もしくは水分子、または１〜約１００、もしくは１〜約１０、もしくは１〜約２、３もしくは４の溶媒もしくは水分子との複合体である。
【００５９】
Ｌｙ６Ｋ阻害化合物は、化合物（またはその薬学的に許容される塩、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、溶媒和物もしくは水和物）を含む医薬組成物の形態で投与されてもよい。医薬組成物は、本技術の化合物および薬学的に許容される担体、ならびに必要に応じて、以下で論じられる１つまたは複数の追加の活性剤を含むことができる。
【００６０】
本発明に基づく化合物を投与するのに好適な様々な製剤を調製するための手順が記載してある、非常に多くの標準的な参照文献が入手可能である。可能性がある製剤および調製の例は、例えば、HANDBOOK  OF  PHARMACEUTICAL  EXCIPIENTS  (American  Pharmaceutical  Association,  current  edition)、PHARMACEUTICAL  DOSAGE  FORMS:  TABLETS  (Lieberman  et  al.  eds.,  Marcel  Dekker,  Inc.,  pubs.,  current  edition)、およびREMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCES  1553-93  (Arthur  Osol  ed.,  current  edition)に含まれ、これらは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤およびエリキシル剤を調製するのに好適な任意の薬学的に許容される液体担体が、医薬組成物に利用されてもよい。化合物は、水、有機溶媒、または薬学的に許容される油もしくは脂肪、またはこれらの混合物などの薬学的に許容される液体担体中に、溶解されるかまたは懸濁化され得る。液体組成物は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味料、矯味矯臭剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤、浸透圧調整剤（osmo-regulator）、賦形剤などの他の好適な医薬添加物を含有してもよい。経口投与および非経口投与に好適な液体担体の例には、水（詳細には、例えば、セルロース誘導体、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液のような上記の添加剤を含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）もしくはそれらの誘導体、または油（例えば、分画されたココナッツ油およびラッカセイ油）が含まれる。非経口投与では、担体は、オレイン酸エチルまたはミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。
【００６２】
任意の特定の患者用の具体的な用量レベルは、利用される具体的な化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄率、薬物組合せおよび治療を受けている特定の疾患の重症度を含む種々の要因に依存することが理解されよう。
【００６３】
方法
用語「阻害する」または「阻害すること」とは、Ｌｙ６Ｋタンパク質の活性を阻害すること、ＴＧＦ−βΙ、ＳＭＡＤ２／３、ＩＦΝγもしくはＳｔａｔ１シグナル伝達を阻害すること、ＳＭＡＤ２／３もしくはＳｔａｔ１のリン酸化を阻害すること、またはＰＤ−Ｌ１発現の阻害に適用される場合、活性／シグナル伝達／リン酸化／発現を抑制し、減少させ、減じるか、または低下させることを意味する。全ての場合に、阻害は部分的または完全であり得る。
【００６４】
用語「モジュレートすること」とは、遺伝子の発現をいう場合、発現を増加または減少させることを意味し、転写、翻訳、および／または翻訳後プロセシングをモジュレートすることを含む。少なくとも１つの実施形態では、発現のモジュレートとは、産生されるｍＲＮＡの量を増加または減少させることを意味する。少なくとも１つの実施形態では、発現のモジュレートとは、産生される成熟タンパク質の量を増加または減少させることを意味する。
【００６５】
用語「処置」または「処置すること」とは、疾患または障害の１つまたは複数の症状が、好転させる（ameliorate）かまたはそうでなければ有益に変化させる、任意の手法を意味する。処置はまた、Ｌｙ６Ｋにより媒介される疾患または障害を処置するための使用などの、本明細書の組成物の任意の薬学的使用も包含する。Ｌｙ６Ｋにより媒介される障害には、Ｌｙ６Ｋが過剰発現するか、かつ／または過剰活性である障害が含まれる。好適な障害には、限定されることなく、がんが含まれる。
【００６６】
Ｌｙ６Ｋ発現が、少なくとも乳がん、膀胱がん、脳がん、中枢神経系のがん、腎がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん（cervical  cancer）、頭頸部がん、食道がん、および膵がんにおいて、それらの正常な対応物と比較して、有意に増加していることが示された（例えば、Luo  et  al.,  Oncotarget  7(10):  11165-93  (2016);  Al  Hossiny  et  al.,  Cancer  Res.  76(11):  3376-86  (2016)、これらのそれぞれは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｌｙ６Ｋ高発現はまた、少なくとも乳がん、膀胱がん、脳がん、中枢神経系のがん、腎がん、肺がん、卵巣がん、胃がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、頭頸部がん、食道がん、および膵がんにおいて、臨床転帰不良と有意に相関していることも示された（例えば、Luo  et  al.,  Oncotarget  7(10):  11165-93  (2016);  Al  Hossiny  et  al.,  Cancer  Res.  76(11):  3376-86  (2016)、これらのそれぞれは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｌｙ６Ｋはまた、トリプルネガティブ乳がんにおいてもより高度に発現し、間葉系、基底、および免疫調節性のサブタイプが最も高い発現を示す（例えば、以下の実施例を参照されたい）。
【００６７】
細胞と１つまたは複数の化合物を接触させることを含む方法を対象とする本技術の全ての態様では、接触させることは、当業者に明らかな方法を使用して行うことができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。
【００６８】
本発明の化合物は、標的とされる細胞／組織／臓器に直接送達されてもよい。さらにおよび／または代替的に、化合物は、標的とされる組織、臓器、または細胞までの化合物の移動（および／またはそれらによる取込み）を容易にする１つまたは複数の薬剤と共に、標的とされていない領域に投与されてもよい。当業者に明らかであるように、化合物自体が修飾されて、標的とされる組織、臓器、または細胞までのその輸送を、血液脳関門を横切るその輸送を含んで、容易にし；かつ／または標的細胞によるその取込み（例えば、細胞膜を横切るその輸送）を容易にすることができる。
【００６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、上述のように、被験体への全身投与を介するか、または罹患した組織、臓器、および／または細胞への標的化投与を介するかのいずれかで達成することができる。典型的には、治療剤（すなわち、Ｌｙ６Ｋ阻害化合物）は、治療剤（複数可）を標的細胞、組織、または臓器まで送達するビヒクル中で患者に投与される。典型的には、治療剤は、上述のものなどの医薬製剤として投与される。
【００７０】
化合物は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、局所的適用、舌下、関節腔内（関節の中へ）、皮内、頬側、眼部（眼内を含む）、鼻腔内（カニューレの使用を含む）により、または他の経路により投与することができる。化合物は、経口的に、例えば、所定の量の有効成分を含有する錠剤もしくはカシェ剤、ゲル剤、ペレット、ペースト剤、シロップ、ボーラス、舐剤、スラリー、カプセル剤、散剤、顆粒剤として、水性液体もしくは非水性液体中の液剤もしくは懸濁剤として、水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして、ミセル製剤を介して（例えば、ＷＯ９７／１１６８２を参照されたい、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）、リポソーム製剤を介して（例えば、欧州特許第７３６２９９号、ＷＯ９９／５９５５０、およびＷＯ９７／１３５００を参照されたい、これらは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）、その全容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ０３／０９４８８６に記載される製剤を介して、またはいくつかの他の形態で投与することができる。化合物はまた、経皮的に（すなわち、リザーバー型もしくはマトリクス型のパッチ、マイクロニードル、熱穿孔（thermal  poration）、皮下針、イオン導入、電気穿孔、超音波もしくは他の形態のソノフォレーシス、ジェット注射、または任意の前述の方法の組合せで（例えば、Prausnitz  et  al.,  Nature  Reviews  Drug  Discovery  3:115  (2004)、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）投与することもできる。化合物は、局部的に、例えば、傷害部位において、傷ついた血管まで投与することができる。化合物は、ステント上にコーティングすることができる。化合物は、米国特許出願公開第２００２００６１３３６号に記載されるヒドロゲル粒子製剤を使用して、高速経皮粒子注射技術を使用して投与することができ、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。追加の粒子製剤は、ＷＯ００／４５７９２、ＷＯ００／５３１６０、およびＷＯ０２／１９９８９に記載され、これらは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。プラスターおよび吸収促進剤ジメチルイソソルビドを含有する経皮製剤の例は、ＷＯ８９／０４１７９に見出すことができ、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。ＷＯ９６／１１７０５は、その全容が参照により本明細書に組み込まれ、経皮投与に好適な製剤を提供する。
【００７１】
エアゾール剤としての使用のために、溶液または懸濁液中の化合物は、加圧式エアゾール容器中に、好適な噴霧体と共に、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素噴霧体を従来のアジュバントとパッケージ化されてもよい。化合物はまた、非加圧式形態で投与されてもよい。
【００７２】
送達デバイスの例としては、限定されることなく、ネブライザー、アトマイザー、リポソーム（能動的および受動的な薬物送達技術の両方を含む）（Wang  &  Huang,  Proc.  Nat'l  Acad.  Sci.  USA  84:7851-55  (1987);  Bangham  et  al.，  J.  Mol.  Biol.  13:238-52  (1965)；米国特許第５，６５３，９９６号、Ｈｓｕ；米国特許第５，６４３，５９９号、Ｌｅｅら；米国特許第５，８８５，６１３号、Ｈｏｌｌａｎｄら；米国特許第５，６３１，２３７号、ＤｚａｕおよびＫａｎｅｄａ；米国特許第５，０５９，４２１号、Ｌｏｕｇｈｒｅｙら;  Wolff  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta  802:259-73  (1984)、これらのそれぞれは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）、経皮パッチ、インプラント、植込み型または注射用のタンパク質デポー組成物、およびシリンジが挙げられる。また、当業者に公知の他の送達系を利用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで所望の臓器、組織、または細胞に化合物の所望の送達を達成することもできる。
【００７３】
接触させること（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与を含む）は、必要とされるだけ頻繁に、かつ所望の効果をもたらすのに好適な持続期間、行うことができる。例えば、接触させることは１回または複数回行うことができ、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与を単回の持続放出投薬製剤で、または複数回（例えば、毎日）用量で行うことができる。
【００７４】
投与される量は、当然のことながら、特定の状態および処置レジメンに応じて変化する。所望の効果を得るのに必要とされる量／用量は、薬剤、製剤、細胞型、培養条件（ｅｘ  ｖｉｖｏ実施形態に関して）、処置が所望される持続期間、および、ｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態に関して、薬剤が投与される個体に応じて変化し得る。
【００７５】
有効量は、当業者により経験的に決定され得る。例えば、これには、種々の量の化合物を培養中の細胞に投与し、所望の結果を得るのに有効な濃度を算出するアッセイが含まれ得る。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与用の有効量の決定はまた、種々の用量の薬剤を培養中の細胞に投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏで必要とされる濃度を算出するために、所望の結果を達成するのに有効な薬剤の濃度を決定するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイも含まれ得る。有効量は、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物研究に基づいてもよい。
【００７６】
化合物は、単独で、または上述のような医薬製剤の有効成分として、投与することができる。本発明の化合物は、有効成分が実質的に純粋である形態で投与することができる。
【００７７】
治療用化合物の投与が、疾患または障害に対して有効な治療レジメンである被験体または患者は、好ましくはヒトであるが、臨床試験またはスクリーニングまたは活性実験の文脈における実験動物を含む、任意の動物であり得る。したがって、当業者に容易に理解できるように、本発明の方法、化合物および組成物は、任意の動物に、詳細には哺乳動物、そして霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、アカゲザル）、飼育動物、例えば、ネコ（ferine）（例えば、ネコ）またはイヌ(canine)（例えば、イヌ）の被験体、農場動物、例えば、ウシ（bovine）（例えば、ウシ）、ウマ(equine)（例えば、ウマ）、ヤギ(caprine)（例えば、ヤギ）、ヒツジ(ovine)（例えば、ヒツジ）、およびブタ(porcine)（例えば、ブタ）の被験体などであるが、これらに限定されず、野生または非飼育動物（野生であるかまたは動物園におけるかのいずれか）、研究動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ラクダ、ラマ、サル、ゼブラフィッシュなど、鳥類、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、鳴禽類などが含まれるが、これらに限定されない動物に、すなわち、獣医学的使用のための投与に特に適している。
【００７８】
現在の文献は、Ｌｙ６Ｋが、精子形成を除く正常な細胞機能に必要とされないことを示している。したがって、一部の実施形態では、被験体は、Ｌｙ６Ｋ阻害剤を投与した結果として男性生殖能に有害な影響を与えることが懸念されることがない集団、例えば女性または精管切除された、かつ／もしくは生殖不能な男性から選択される。
【００７９】
本技術のこれらの態様は、以下の実施例によりさらに例証される。本出願の全体を通して引用された全ての参考文献は、図および実施例を含み、その全容が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、本技術の実施形態を例示するために提供されるが、決してその範囲を限定することを意図するものではない。
【００８１】
（実施例１  トリプルネガティブ乳がんのＴＧＦβおよび免疫エスケープ経路におけるＬｙ６Ｋの役割）
本出願は、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）の処置のための、ＴＧＦβシグナル伝達およびＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を阻害するためのＬｙ６Ｋ−標的化戦略を提供する。ホルモン療法または抗Ｈｅｒ２療法などの標的化療法は、ＴＮＢＣに対して有効ではない１。免疫療法は、がん治療にパラダイムシフトをもたらしたけれども、ＴＮＢＣにおけるその効果は良くてもわずかなものであった２。ＴＮＢＣは、より若い女性に発症し、乳がんサブタイプの間で最悪の全生存率を有する３。本出願は、ＴＮＢＣを処置するための新規な、有効かつ安全な手法を特定し、開発するという緊急の必要性を満たすものである。
【００８２】
トリプルネガティブ乳がんにおける最近の発見は、免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ−Ｌ１がＴＮＢＣで増加し、その発現の増加が腫瘍免疫エスケープの一因となっていることを示唆している４、５。ＴＧＦβシグナル伝達は、腫瘍進行の免疫および非免疫の関連経路の両方を活性化する、がんにおける別の重要な拠点となっている６、７。しかしながら、多くの正常な組織におけるＴＧＦβシグナル伝達およびＰＤ−Ｌ１の広範囲な発現および重要な機能のために、それらは治療介入に対して問題をはらむ標的となっている。本発明者らの実験室は、がん組織中で選択的に発現する、ＴＧＦβシグナル伝達および腫瘍進行の強力な活性化因子としての細胞表面タンパク質Ｌｙ６Ｋを同定した。Ｌｙ６Ｋレベルは、８０％のＴＮＢＣで増加し、ｍＲＮＡ発現の増加は、ＴＮＢＣにおける生存転帰不良に関連する８。本発明者らは、Ｌｙ６Ｋが、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長に必要とされ、かつＬｙ６Ｋが、ＴＧＦβシグナル伝達および上皮間葉転換を活性化することを示した９。Ｌｙ６Ｋはまた、がん細胞中のＩＦＮγ誘導性のＰＤ−Ｌ１の過剰発現にも必要とされる９。重要なことに、本発明者らは、Ｌｙ６Ｋのノックダウンまたは薬理学的阻害が、ＴＮＢＣ細胞中のＰＤ−Ｌ１発現を阻害することを見出し、かつ、Ｌｙ６Ｋの２つの小分子バインダー、ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０を同定し、これらは、例えば、同系マウスにおけるＴＧＦβシグナル伝達、ＰＤ−Ｌ１発現および腫瘍成長の活性化のような、Ｌｙ６Ｋの生物活性の多数の異なる側面を阻害する。
【００８３】
これらの観察に基づいて、本発明者らは、Ｌｙ６Ｋが、ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１経路の活性化を介して腫瘍進行に重要な役割を果たしていることに注目し、かつ驚いたことに、小分子阻害剤によるＬｙ６Ｋ標的化が、がん細胞中のＴＧＦβシグナル伝達およびＰＤ−Ｌ１経路の組織特異的阻害をもたらすことを見出した（図式１）。
【化４】
2021502371.tif 000007
理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、Ｌｙ６Ｋが、ＴＧＦβシグナル伝達を増強することにより腫瘍進行および免疫監視の抑制をもたらし、Ｌｙ６Ｋが、チェックポイントタンパク質ＰＤ−Ｌ１の上方制御により腫瘍免疫エスケープをもたらし、かつＬｙ６Ｋが、小分子を使用して標的化され、ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１経路における免疫エスケープおよび腫瘍進行を阻害することができることを示唆する。
【００８４】
Ｌｙ６Ｋが、ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の増加に重要な役割を果たしているという観察が、ＴＮＢＣ細胞系、臨床試料、同系および異種移植の腫瘍モデルを使用して実証された。その組織特異的発現およびその腫瘍進行経路の強力な活性化により、Ｌｙ６Ｋは治療介入の魅力的な標的となる。本発明者らはここで初めて、Ｌｙ６Ｋの下流のＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１経路を効率的に阻害する、Ｌｙ６Ｋの２つの小分子バインダーを示す。本出願は、抗ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１発現の阻害のための新規な治療標的を定義することにより、ＴＮＢＣの処置のための標的化免疫療法を提供する。
【００８５】
Ｌｙ６Ｋは、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）における転帰不良のマーカーであり、妥当な治療標的である。ＴＮＢＣは、高度に不均質の疾患であり、複数のサブタイプから構成される１。ＴＮＢＣ患者は、最悪の転帰に苦慮し、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性およびヒト上皮成長受容体２（Ｈｅｒ  ２）陽性の乳がんを有する患者と比較して、治療的選択肢がほとんどない３。したがって、この疾患に対する新規な標的化処置を開発することが緊急に必要とされている。本発明者らは、ＴＮＢＣ症例の８０％では、Ｌｙ６Ｋのタンパク質発現が増加していることを報告した９。タンパク質発現パターンと一致して、ＴＮＢＣにおいて、非ＴＮＢＣと比較して、Ｌｙ６ＫのｍＲＮＡ発現もまた増加した（図１Ａ、Ｂ）。本発明者らは、Ｌｙ６ＫのｍＲＮＡ発現の増加が、乳がんおよび他の固形悪性疾患における転帰不良に関連することを実証する１３０の臨床研究の生物情報学解析を公表した８。
【００８６】
新しい解析はまた、Ｌｙ６ＫのｍＲＮＡ発現の増加が、ＴＮＢＣにおける転帰不良とも関連付けられることを示している（基底サブタイプ、他のサブタイプに関してデータは利用可能ではない）（図１Ｃ）。Ｌｙ６ＫのｍＲＮＡ発現がＴＮＢＣの異なるサブタイプに関連するかどうかを試験するために、本発明者らは、様々なＴＮＢＣサブタイプの大量の遺伝子発現データセットを使用した１０。本発明者らはメタ解析を実施して、組み込んだアレイ対照を使用して正規化シグナル強度により定義された、スケール０（検出不能）から１２（最高強度）までにおけるＬｙ６Ｋの絶対的ｍＲＮＡ発現レベルを決定した。Ｌｙ６ＫのｍＲＮＡレベルは、管腔アンドロゲン受容体（ＬＡＲ）のＴＮＢＣにおけるより、基底様（ＢＬ）、免疫調節系（ＩＭ）、間葉系（Ｍ）においてより高いことが見出された。さらなる解析は、関連する細胞系モデルを使用して、Ｌｙ６Ｋの最高レベルを発現するＴＮＢＣサブタイプ、すなわちＢＬ、ＩＭおよびＭに集中している（図ＩＤ）。正常組織のパネルの中で、Ｌｙ６Ｋのタンパク質発現は、精巣に限定されることが見出された（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ）１１、１２（図１Ｆ）。正常組織においてＬｙ６Ｋタンパク質発現が存在しないことは、ＴＮＢＣにおいてまた増加しているＬｙ６ＥおよびＬｙ６Ｄとは反対に、さらなる研究のためにＬｙ６Ｋ遺伝子を選択する重要な判断基準であった８。Ｌｙ６ＥおよびＬｙ６Ｄは、正常な肝臓および骨髄において高いｍＲＮＡおよびタンパク質発現を有し、造血において重要な役割を果たす１３（図１Ｇ）。精巣におけるＬｙ６Ｋの正常な機能は、精子形成に関連する１４。現在の文献は、Ｌｙ６Ｋが、精子形成を除く正常な細胞機能に必要とされないことを示唆している。したがって、Ｌｙ６Ｋの標的化に集中した今後の治療的手法は、女性のＴＮＢＣ患者において最小限の毒性を有するはずであることは妥当と考えられる。Ｌｙ６Ｋの発現増加は、膀胱がん、胃がん、頭頸部がん、および卵巣がんで十分に立証されており、そのため、Ｌｙ６Ｋに向けた治療的戦略は、複数のがんタイプに適用され得る８、１５〜１７。
【００８７】
Ｌｙ６Ｋは、ＴＧＦβシグナル伝達の増加に必要とされる。ＴＧＦβシグナル伝達の増加は、持続的な腫瘍進行に必要とされる６、１８。細胞内のＴＧＦβシグナル伝達は、上皮間葉転換を誘導し、がん細胞中の細胞周期進行、増殖、遊走および治療耐性を増加させる１９〜２１。細胞外のＴＧＦβシグナル伝達は、Ｔ細胞の細胞溶解機能を抑制し、抑制性の制御性Ｔ細胞を増大させ、ＮＫ細胞の抗腫瘍機能を阻害し、樹状細胞機能の阻害および腫瘍促進活性を有するＭ２−型マクロファージの促進により、腫瘍免疫エスケープを推進する２２〜２５。ＴＧＦβ１は、強力な免疫抑制サイトカインであり、腫瘍微小環境においてがん細胞を含む複数の細胞型により分泌され、乳がんにおける生存転帰不良に関連する２１、２５〜２７。本発明者らは、Ｌｙ６Ｋが、ＴＮＢＣ細胞中の内在性またはリガンド刺激性のＴＧＦβ／Ｓｍａｄシグナル伝達および上皮間葉転換（ＥＭＴ）に必要とされることをこれまで詳細に示してきた９。図２Ａ〜Ｄは、本発明者らの主要なデータの一部を要約している９（図２Ａ〜Ｄ）。本発明者らの新しいデータは、Ｌｙ６Ｋが、がん細胞中のＴＧＦβ１リガンドの転写上方制御の上流であることを示している（図２Ｅ）。これまでに、本発明者らは、Ｌｙ６Ａ／Ｓｃａ−１が、腫瘍抑制因子サイトカインＧＤＦ１０の転写抑制に必要とされることを見出したが２８；しかしながら、Ｌｙ６Ｋは、ＧＤＦ１０のｍＲＮＡの発現に影響を及ぼさなかった（図２Ｆ）。上に要約したように、現在の文献は、ＴＧＦβシグナル伝達とがん免疫応答の間の直接的なつながりを示唆している。したがって、本発明者らは、Ｌｙ６Ｋが、ＴＮＢＣ臨床症例における免疫調節性遺伝子発現シグネチャーと相関しているかどうかを試験した。Ｏｎｃｏｍｉｎｅ解析は、Ｌｙ６Ｋが、ＴＮＢＣにおいて非ＴＮＢＣに対して、炎症性サイトカインＴＧＦβ１／２、Ｂｍｐ２、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮγ；免疫調節性タンパク質ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ８０、ＣＤ２５、ＩＤＯ１と有意に同時発現することを示した（図２Ｇ）。現在の文献はまた、ＴＮＢＣでは、がん細胞の免疫エスケープに関連する遺伝子の発現が増加していることも示す２９。これらの症例は、免疫治療に、より良好に応答するはずであると議論されてきたが、しかしながら、ＴＮＢＣ症例は、これまでのところ免疫治療に対して限られた応答を示した２、３０、３１。抗ＴＧＦβ１療法は、微小環境における腫瘍免疫応答および腫瘍細胞に対する直接的効果を誘導することが示されてきた３２。残念ながら、ＴＧＦβシグナル伝達を標的化する現在の治療は、ＴＧＦβ受容体および／またはＳｍａｄエフェクター分子の直接標的化に集中しており、このことは、正常な細胞機能に必要とされるＴＧＦβシグナル伝達の起こり得る損失に起因して起きる重度の副作用に潜む原因であり得る３３〜３６。したがって、がん特異的な抗ＴＧＦβ１治療に対する重要な必要性がある。本発明者らは、ここに、Ｌｙ６Ｋ発現増加を伴うＴＮＢＣにおける免疫エスケープ、炎症表現型、腫瘍成長およびＴＧＦβシグナル伝達を調査するためのヒト化ＰＤＸモデルを含むマウス腫瘍モデルにおいて、小分子ＮＳＣ２４３９２８が、Ｌｙ６Ｋ依存的にＴＧＦβシグナル伝達を��害する（以下に記載）ことを示す。Ｌｙ６Ｋを標的化することにより、ＴＮＢＣにおけるＴＧＦβ関連の免疫抑制（外因性）および腫瘍細胞成長（内因性）（図２Ｈ）が、制限され得る。
【００８８】
Ｌｙ６Ｋは、がん細胞中の免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ−Ｌ１の増加に必要とされる。図２Ｇに示すように、Ｌｙ６Ｋは、ＰＤ−Ｌ１（最後の行から５番目）を含む、腫瘍免疫応答を阻害する遺伝子と同時発現する。ＰＤ−Ｌ１は、がん細胞において高度に発現するタンパク質であり、がん細胞に対するＴ−細胞媒介性細胞傷害の非活性化に重要な役割を果たす５、３７。がん細胞中のＰＤ−Ｌ１発現は、Ｔ−細胞およびナチュラルキラー細胞により産生されるＩＦＮγを含む複数出現する経路により制御される３８。ＪＡＫキナーゼによるＳｔａｔ１のリン酸化は、ＩＦＮγ刺激後のＰＤ−Ｌ１の転写活性化における主要なステップであり得る３９。Ｌｙ６ＫおよびＰＤ−Ｌ１の同時発現の性質を探究するために、本発明者らは、対照細胞およびＬｙ６Ｋノックダウン細胞をＩＦＮγで処置し、ＰＤ−Ｌ１発現を評価した。本発明者らは、Ｌｙ６Ｋノックダウンが、ＩＦＮγ刺激細胞中のＰＤ−Ｌ１タンパク質発現の低減をもたらすことを見出した。未処置細胞では差異は見られなかった９（図３Ａ）。本発明者らは、Ｌｙ６Ｋのノックダウンが、Ｓｔａｔ１リン酸化を消失させるが、総Ｓｔａｔ１タンパク質レベルには影響を及ぼさないことを見出した（図３Ｂ）。したがって、これらの結果から、Ｌｙ６Ｋ誘導性のがん進行が、ＰＤ−Ｌ１発現に対するその影響に少なくとも部分的に起因し、かつ小分子ＮＳＣ１１１５０によるＬｙ６Ｋの標的化が、Ｌｙ６Ｋ−ＩＦＮγ／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達を阻害すると考えられる。ＰＤ−Ｌ１媒介性の免疫エスケープにおけるＬｙ６Ｋおよびその小分子バインダーＮＳＣ１１１５０の役割（図３Ｃ）は、本開示においてさらに解明される。
【００８９】
Ｌｙ６Ｋは、複数のマウスモデルにおけるｉｎ  Ｖｉｖｏ腫瘍成長に必要とされる。本発明者らは、Ｌｙ６Ｋ発現が、免疫無防備状態のヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の異種移植腫瘍モデルにおける腫瘍進行に必要とされることを見出した９。ヌードマウスは、障害のある免疫系を有するため、本発明者らは、免疫関連の腫瘍成長機構およびＴＧＦβシグナル伝達を研究するために広く使用される４Ｔ１（Ｂａｌｂ／ｃ起源）マウスを使用して、十分に研究された同系の乳房腫瘍マウスモデルにおける腫瘍成長に対するＬｙ６Ｋの影響を試験することを決定した４０〜４２。本発明者らは、がん免疫療法研究およびＴＧＦβシグナル伝達に広く使用される、第２の同系の乳房腫瘍モデル−Ｅ０７７１（Ｃ５７ＢＬ／６起源）を使用した４３、４４。本発明者らは、レンチウイルスの標的化しないｓｈＲＮＡおよびマウスＬｙ６ＫのｓｈＲＮＡを使用して対照のならびにＬｙ６Ｋノックダウンの４Ｔ１およびＥ０７７１細胞を作製した。Ｌｙ６Ｋノックダウン細胞は、対照細胞と比較して、Ｌｙ６ＫのｍＲＮＡレベルの有意な低減を示した。マウスのＬｙ６Ｅ、Ｌｙ６ＤおよびＬｙ６Ａ（Ｓｃａ−１）のｍＲＮＡ発現は、ノックダウンにより影響を受けなかった（図４Ａ）。Ｌｙ６Ｋノックダウン細胞はまた、Ｌｙ６Ｋのタンパク質レベルの有意な低減も示した。加えて、Ｌｙ６Ｋノックダウン細胞は、Ｓｍａｄ２／３リン酸化の消失を示した（図４Ｂ）。Ｌｙ６Ｋノックダウン細胞は、同遺伝子系の腫瘍移植を起こさなかった（図４Ｃ）。これらの結果は、Ｌｙ６Ｋが、非免疫および免疫の関連する腫瘍成長の機構に有意な影響を与え得ることを示している。
【００９０】
小分子によるＬｙ６Ｋシグナル伝達の阻害は実行可能である。本発明者らは、表面プラズモン共鳴を使用して、Ｌｙ６Ｋの小分子バインダーを同定した。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＤＴＰ、ＮＣＩ）から得た、２０００の小分子のパネルをスクリーニングした。本発明者らは、Ｌｙ６Ｋに特異的に結合することができるが、Ｌｙ６ＥにもＬｙ６Ｄにも結合を示さない５つの小分子を発見した（ＫＤ範囲：１〜１０μＭ）。これら５つの分子を、細胞死、ＴＧＦβ１／Ｓｍａｄ２／３リン酸化、ＩＦＮγ／Ｓｔａｔ１リン酸化およびＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を誘導する能力に関してさらに試験した。バイオアッセイおよび構造的可撓性における特異性および選択性に基づいて、ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０をさらなる研究のために選択し、これらは綿密な研究に必要とされる今後の改変を可能にする（図１１に記載）。小分子ＮＳＣ２４３９２８は、１９５５年から１９７５年の間に使用された標準的モデルである、ＢＤＦ１同系マウスにおけるＬ１２１０白血病モデルに関するＮＣＩによるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍スクリーニングにこれまで使用されてきた。この腫瘍モデルにおける平均生存は、２〜３週間である。ＮＳＣ２４３９２８を用いた処置により、生存上の利益は、用量依存的に３０％から１００％まで増加した。薬物は、１０ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．処置までは有毒ではないと分かっていたが、しかしながら、詳細なデータは公表されていなかった（図５Ａ）。ＮＳＣ１１１５０は、ｉｎ−ｖｉｖｏまたはｉｎ−ｖｉｔｒｏの抗腫瘍スクリーニングでの試験はされていなかった。興味深いことに、ＮＳＣ１１１５０は、口腔衛生製品の有効成分として、抗微生物性および抗細菌性の薬剤として使用されてきた（ＩＤ：ＥＰ０６９３９１９、ＥＰ０６９６４４９）。本発明者らは、驚いたことに、ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０（５ｍｇ／ｋｇ／ｉ．ｐ．５０〜７０ｍｍ３の腫瘍確立後、週２回）は、同系マウスモデルにおける４Ｔ１乳房腫瘍成長も抑制できることを見出した（図５Ｂ、Ｃ）。以下で論じられるように、ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０は、Ｌｙ６Ｋ依存的にＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１経路を阻害し、これらの化合物の新規な活性の機構的基礎を示している（図１１、１２を参照されたい）。これらの実験は、Ｌｙ６Ｋの小分子標的化が、機能的意義を有し、潜在的にがん処置においてより良好な転帰をもたらすという原理の証拠を提供する。
【００９１】
Ｌｙ６Ｋは、ＴＮＢＣ細胞系、臨床試料、ならびに同系および異種移植の腫瘍モデルを使用して本明細書に示されるように、ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の増加に重要な役割を果たす。その組織特異的発現およびその腫瘍進行経路の強力な活性化により、Ｌｙ６Ｋは治療介入の魅力的な標的となる。
【００９２】
したがって、本発明者らは、がん細胞に特異的に発現し、かつ正常細胞の発現は精巣に限定される細胞表面タンパク質であるＬｙ６Ｋが、乳がん、卵巣がん、肺がん、胃がん、頭頸部がん、膀胱がんおよび結腸がんの臨床転帰不良に関連する新規なバイオマーカーであることを見出した。
【００９３】
Ｌｙ６Ｋはまた、がんにおけるＴＧＦβおよびＥＭＴ経路の増強因子でもあることも見出されている。
【００９４】
本発明者らはまた、驚いたことに、Ｌｙ６Ｋの結合を介してＴＧＦβシグナル伝達を阻害する公知の構造の分子に関する新規な活性と同様に、Ｌｙ６Ｋの結合を介して免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ−Ｌ１を阻害する公知の構造の分子に関する新規な活性も見出した。
【００９５】
したがって、本開示は、抗ＴＧＦβおよびＰＤ−Ｌ１発現の阻害のための新規な治療標的を定義する。
【００９６】
ＴＮＢＣ細胞系：トリプルネガティブ乳がん（「ＴＮＢＣ」）細胞系は、それらの遺伝子発現シグネチャーに基づいて、異なるＴＮＢＣサブタイプに割り当てられてきた１０。全ての試験されたＴＮＢＣ細胞系は、Ｌｙ６Ｋの発現増加を示した９。間葉系、基底、および免疫調節性のＴＮＢＣサブタイプは、最も高いＬｙ６Ｋ発現を有する。本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞９のＴＮＢＣ細胞においてｓｈＲＮＡレンチウイルス技術を使用して安定なＬｙ６Ｋノックダウン細胞の作製に成功し、かつ同一の方法を使用して、対照細胞およびＬｙ６ＫノックダウンＨＳ５７８ｔ  Ｌｙ６Ｋノックダウン細胞を作製した（図６、左のパネル）。本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から３つのＬｙ６Ｋ  ＣＲＩＳＰＲクローンを開発し、検証した（図６、右のパネル）。ＣＲＩＳＰＲを介したＬｙ６ＫのＤＮＡ欠失は、Ｓｍａｄ２／３のリン酸化の消失をもたらした（図６）。
【００９７】
理論に束縛されることは望まないが、Ｌｙ６Ｋが、ＴＮＢＣにおけるＴＧＦβシグナル伝達を増強することにより、腫瘍進行および免疫監視の抑制を増加させるようである。
【００９８】
ＴＧＦβ受容体複合体の形成に対するＬｙ６Ｋの影響：Ｌｙ６Ｋは、内在性およびＴＧＦβ１リガンド刺激性のＳｍａｄ２／３リン酸化に必要とされる（図７）。それらのリガンドによる活性化時に、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴβＲＩ）およびＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）は複合体を形成し、次にＳｍａｄ２／３のリン酸化を誘導することができる。リン酸化されたＳｍａｄ２／３タンパク質は、Ｓｍａｄ４に結合し、続いて核にトランスロケーションし、ＴＧＦβ応答性遺伝子の転写を誘導することができる。
【００９９】
Ｌｙ６Ｋ媒介性のＴＧＦβ１シグナル伝達のグリコシル化および脂質化：Ｎ末端上の１〜１７アミノ酸残基およびＣ−末端残基１３９〜１４１は切断され、成熟Ｌｙ６Ｋタンパク質を形成する。１８〜１３８残基の成熟Ｌｙ６Ｋタンパク質は、グリコシル化（Ｎ２０）および脂質化（Ｇ１３８）部位を有する（図８）。グリコシル化および脂質化は、重要な翻訳後修飾であり、タンパク質機能にとって重要であることが示され、かつ腫瘍形成において変化することが多い４５〜４９。
【０１００】
Ｌｙ６Ｋ／ＴＧＦβ軸および腫瘍細胞成長に対するその影響：ＴＧＦβは、細胞周期チェックポイント制御、Ｇ１／Ｓ移行、アポトーシスおよびオートファジーを含む、がん細胞の進行に対して複数の影響を及ぼす５１、５２。本発明者らは、Ｌｙ６Ｋが、血清枯渇後のＧ１／Ｓ移行に必要とされることを見出した（Ｇ０／Ｇ１ブロック）。対照細胞は、Ｇ１期における細胞のパーセンテージの着実な減少およびＳ期細胞における増加を示した。Ｌｙ６Ｋノックダウン細胞は、停滞Ｇ１期およびＳ期の細胞を示した（図９）。
【０１０１】
ＩＦＮγ経路におけるＬｙ６Ｋ：Ｌｙ６Ｋは、ＴＮＢＣ細胞中のＩＦＮγ誘導性のＳｔａｔ１／３リン酸化ならびにＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現に必要とされる（図１０）。ＩＦＮγは、Ｔ−細胞により分泌され、がん細胞およびマクロファージにおけるＰＤ−Ｌ１発現を増加させる５４、５５。ＩＦＮγは、ＩＦＮγ受容体Ｉ（ＩＦＮγＲ１）と結合してそのダイマー化を誘導し、次いで、ダイマー化したＩＦＮγＲ１は、ダイマー化したＩＦＮγＲＩＩと会合することができる。次に、複合体は、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２の活性化を可能にし、細胞内空間で露出したＳｔａｔ１ドッキング部位に至る。チロシンリン酸化されたＳｔａｔ１は、この複合体から解離し、ホモダイマーを形成する。このホモダイマーは核内にトランスロケーションし、ＰＤ−Ｌ１などのＩＦＮγ応答性遺伝子の転写を誘導する４、５６。
【０１０２】
ＩＦＮγ受容体レベルの安定化に対するＬｙ６Ｋの影響：Ｌｙ６Ｋは、ＧＰＩアンカー型タンパク質であり、細胞表面に位置する。このクラスのタンパク質は、受容体媒介性のシグナル変換経路および膜トラフィッキングに関与する脂質ラフト中に濃縮し得る１２、１３。Ｌｙ６Ｋは、細胞表面上のＩＦＮγＲ１／２の適切な局在化に必要とされ得る。
【０１０３】
ＩＦＮγ誘導性のＰＤ−Ｌ１発現におけるＬｙ６Ｋ：がん細胞中のＬｙ６Ｋは、ＩＦＮγ誘導性のＰＤ−Ｌ１発現を増加させる代替経路に関与し得、これは、ＩＦＮγのＩＦＮγＲ１／２との結合、続くＳｔａｔ３のリン酸化という古典的シグナル伝達カスケードを回避し得る。
【０１０４】
Ｌｙ６Ｋ修飾およびＩＦＮγシグナル伝達におけるその役割：細胞表面のＬｙ６Ｋは、ＩＦＮγ受容体複合体の安定性およびＳｔａｔ１のリン酸化に必要とされ得、これはＰＤ−Ｌ１の発現増加をもたらす。
【０１０５】
腫瘍退縮におけるＬｙ６Ｋの小分子バインダーの効果：本発明者らは、表面プラズモン共鳴アッセイを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を使用して、精製ヒトＬｙ６Ｋタンパク質をＣＭ５チップの表面に固定化し、２０００の化合物を含有する小分子ライブラリー（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ、ＮＣＩ）で結合をスクリーニングすることにより実施した。分子の最初のスクリーニングを、１または１０μＭの化合物で、溶解度に基づいて実施した。本発明者らは、実際の結合最大値（ＲＵａｃｔｕａｌ）と理論上の結合最大値（ＲＵｔｈｅｏｒ）を比較するモデルを使用した。０．９〜１．０の間であるＲＵａｃｔｕａｌのＲＵｔｈｅｏｒに対する比は結合を示唆しており、対応する化合物を「ヒット」と考えた。次に、ヒット（ＲＵａｃｔｕａｌがＲＵｔｈｅｏｒに対して０．７〜２．０）は、医薬品化学者チームにより見直され、構造的可能性があるものをさらなる研究用に選択した。選択された分子を、Ｌｙ６ファミリーの他のメンバー、すなわちＬｙ６ＥおよびＬｙ６Ｄとの結合に関して試験した。選択された化合物のうちの５つが、Ｌｙ６Ｋとの特異的結合を示した。ＮＳＣ１１５０を、化合物のタグ付けおよびさらなる改善に必要とされる構造的修飾に好適であるその構造により、リードヒット化合物としてさらなる解析用に選択した。図１１Ａ〜Ｋを参照されたい。
【０１０６】
Ｌｙ６Ｋ結合小分子は、Ｌｙ６Ｋ／ＴＧＦβおよびＬｙ６Ｋ／ＩＦＮγシグナル伝達を妨害する。ＮＳＣ２４３９２８は、対照ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の成長を減じたが、Ｌｙ６Ｋノックダウン細胞ではその活性を消失した。ＮＳＣ１１１５０は、２μＭで細胞死に対して有意な効果を示さなかった（図１２Ａ）。ＮＳＣ１１１５０は、対照細胞およびＬｙ６Ｋノックダウン細胞の両方において、１ΟΟμＭで細胞死を誘導した（図示せず）。ＮＳＣ１１１５０を用いた処置は、対照細胞ではＰＤ−Ｌ１発現の阻害をもたらし、一方、ＮＳＣ２４３９２８は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現に有意な効果を示さなかった（図１２Ｂ）。ＮＳＣ２４３９２８は、ＴＧＦβ１誘導性のＳｍａｄ２／３のリン酸化を阻害し；ＮＳＣ１１１５０は、ＴＧＦβ１／Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達に効果がなかった（図１２Ｃ）。ＮＳＣ１１１５０は、ＩＦＮγ誘導性のＳｔａｔ１のリン酸化を阻害し；ＮＳＣ２４３９２８は、ＩＦＮγ／Ｓｔａｔ１シグナル伝達に効果がなかった（図１２Ｄ）。これらのデータは、本発明者らが、細胞成長、ＴＧＦβ１／Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達におけるＮＳＣ２４３９２８の新規な活性、ならびにＰＤ−Ｌ１タンパク質発現およびＩＦＮγ／Ｓｔａｔ１シグナル伝達におけるＮＳＣ１１１５０の新規な活性を同定したことを示唆している。
【０１０７】
ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０は、Ｌｙ６Ｋ上に異なる結合ポケットを有する。ヒトＬｙ６Ｋタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ  ｉｄ−Ｑ１７ＲＹ６）の相同性モデル化を、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲおよび鋳型としてヒトＬＹＮＸ１（ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：２Ｌ０３）の構造を使用して実施した５７。ＬＹＮＸ１の残基１〜１２１は、Ｌｙ６Ｋの成熟型を構成する残基１８〜１３８に対応する。−１．６２のＣスコア、０．５２±０．１５０の推定ＴＭスコアを伴う最良のＬｙ６Ｋモデルを、立体的衝突に起因して、Ｃ−末端上の１２のアミノ酸を取り除くように修飾した。残基１８〜１２６を含むＬｙｓ６Ｋモデルを、ドッキング研究用に使用した。ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０とＬｙ６Ｋモデルとのドッキングを、ＳｗｉｓｓＤｏｃｋ５８で「自動モード」を使用して実施して、可能性のある結合ポケットを同定した。このモデル化により、Ｌｙ６Ｋタンパク質上の２つの可能性のある結合部位が明らかにされた。図１３Ａ〜Ｃを参照されたい。ＮＳＣ１１１５０に対する「ＦｕｌｌＦｉｔｎｅｓｓ」パラメーターにより判断して、最良の予測されたポーズのおよそ１０％が、結合部位１に対応した。同時に、ＮＳＣ２４３９２８に対する最良のポーズの約５％が、結合部位２に対応した。図１４Ａ〜Ｄを参照されたい。
【０１０８】
ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０に関する最大耐用量（ＭＴＤ）の決定：予備実験では、本発明者らは、ＮＳＣ２４３９２８およびＮＳＣ１１１５０に関して、５ｍｇ／ｋｇ／ｉｐ用量において認識できる毒性を伴わない治療利益を認めた。
【０１０９】
（実施例２  小分子阻害剤とＬｙ６Ｋの間の結合相互作用の評価）
Ｌｙ６Ｋと小分子阻害剤ＮＳＣ２４３９２８の間の結合相互作用を評価した。図１５に示すように、疎水性接触が、ＮＳＣ２４３９２８とＬｙ６Ｋの間の相互作用に最も重要な役割を果たすと考えられる。アクリジニルアミノ基は、Ｐｈｅ３５、Ｐｈｅ６２、Ｖａｌ６４およびＴｙｒ９５の側鎖と広範囲にわたる接触を形成する。同時に、Ｉｌｅ５２およびＡｌａ５４の側鎖は、フェニル基の近傍にあると予測される。本発明者らのモデルはまた、ＡｓｐｌおよびＬｙｓ９７が、スルホアニリド部分との相互作用に関与する、可能性のある候補であることも示唆している。
【０１１０】
Ｌｙ６Ｋと小分子阻害剤ＮＳＣ１１１５０の間の結合相互作用もまた評価した。図１６に示すように、炭素１に付着しているヒドロキシル基は、２つの水素結合に関与する。第１の水素結合は、化合物とＡｓｐ１０の側鎖カルボキシル基からの酸素の間に形成され、第２の水素結合は、Ｃｙｓ９８の主鎖からの窒素原子を含む。ＮＳＣ１１１５０と密接な接触を形成するいくつかのアミノ酸がある。例えば、Ａｓｎ３、Ｇｌｎ８、Ｐｒｏｌ１、Ａｌａ７４およびＧｌｕ７６は、大部分の相互作用をもたらす結合部位１の一部を形成している。
【０１１１】
（実施例３  Ｌｙ６Ｋの小分子バインダーは、腫瘍化成長を阻害しかつ免疫を誘導する。）
本発明者らは、これまで、Ｌｙ６遺伝子ファミリーのメンバー、すなわちＬｙ６Ｅ、Ｌｙ６Ｄ、Ｌｙ６ＨおよびＬｙ６Ｋが、複数の型のヒト固形がんに発現し、これらの遺伝子の発現増加が転帰不良に関連することを示してきた（Luo  et  al.,  Oncotarget  7(10):  11165-93  (2016)、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明者らはまた、Ｌｙ６ＫおよびＬｙ６Ｅが、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長および抗腫瘍免疫応答に必要とされることも見出した（Al  Hossiny  et  al.,  Cancer  Res.  76(11):  3376-86  (2016)、これは、その全容が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｌｙ６Ｋは、そのがん細胞特異的発現により魅力的な標的であり；Ｌｙ６Ｋの正常臓器発現は精巣に限定される。本発明者らは、表面プラズモン共鳴技術を使用して、Ｌｙ６Ｋの２つの小分子バインダーを同定した。これらの分子は、Ｌｙ６Ｋに対して強い結合を示した（ｋｄ範囲１〜２μＭ）が、Ｌｙ６ＥおよびＬｙ６Ｄに対しては示さなかった。小分子処置の併用は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞中のＴＧＦβシグナル伝達の低減およびＰＤＬ１発現の低減をもたらした。相同性モデル化は、２つの小分子が、成熟Ｌｙ６Ｋタンパク質のＮ末端およびＣ末端にそれぞれ結合することを示した。個々の小分子を用いた、同系のＣ５７Ｂ１／６モデルにおけるＥ０７７１腫瘍の処置により、腫瘍成長は低減し、一方、２つの小分子を用いた併用処置により、腫瘍成長は完全に除去された（図１７）。腫瘍消失の後に、処置を停止した。３週間後、治癒したマウスを、Ｅ０７７１細胞を用いて再チャレンジしたが、腫瘍成長に対して完全かつ永続的に保護された。これらの結果は、Ｌｙ６Ｋ阻害剤が抗腫瘍特性を有し、宿主保護的抗腫瘍免疫を誘導することを示唆している。本発明者らのデータは、新規なバイオマーカーＬｙ６Ｋを、Ｌｙ６Ｋの高発現を伴う複数の腫瘍タイプにおける治療標的および免疫調節物質として意味付ける。
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【０１１２】
好ましい実施形態を本明細書に詳細に示しかつ記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な改変、追加、代用などを行うことができ、したがって、これらは、以下の特許請求の範囲に定義する本発明の範囲内であると考えられることは当業者に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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