(57)【要約】  ｐＨシフトアップを含む、哺乳動物細胞を培養し、哺乳動物細胞によって発現される組換え産物を産生するための方法が提供される。該方法は、工業規模の細胞培養と治療用産生物を産生する細胞の培養に特に適している。該方法は、第一ｐＨで実施される第一培養段階と、第二ｐＨより高い第二ｐＨで実施される第二培養段階とを含む。
2021503916.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ設定点を使用してｐＨを制御することを含む、哺乳動物細胞を培養するための流加方法において、
哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種し、細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階であって、ｐＨ設定点が第一ｐＨに維持される第一培養段階と；
第一ｐＨより高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階であって、設定点が第二ｐＨに維持される第二培養段階と
を含み、第二ｐＨが第一ｐＨよりも少なくとも０．１ｐＨ単位高く、第二培養段階が少なくとも６時間の持続期間を有する、方法。
【請求項２】
第二培養段階が少なくとも３日の持続期間を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法の温度が±０．５℃以内に維持される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一ｐＨが６．５〜７．５の範囲の値であり、かつ、
ａ．第二ｐＨが第一ｐＨよりも０．１〜０．５ｐＨ単位高いか；又は
ｂ．第二ｐＨが第一ｐＨよりも０．２ｐＨ単位高い、
請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ａ．第一ｐＨが約７．０であり；かつ
ｂ．第二ｐＨが、約（ｉ）ｐＨ７．１；（ｉｉ）ｐＨ７．２；（ｉｉｉ）ｐＨ７．３；（ｉｖ）ｐＨ７．４（ｖ）ｐＨ７．５、又は（ｖｉ）７．１〜７．５である、
請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
設定点を、（ａ）徐々に又は（ｂ）即時に、第一ｐＨから第二ｐＨに上昇させる、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
設定点を第一ｐＨから第二ｐＨに徐々に上昇させ、（ａ）設定点を連続的に上昇させるか、又は（ｂ）設定点を一連の不連続ステップで上昇させる、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｐＨを、約２４〜７２時間の期間にわたって第一ｐＨから第二ｐＨに徐々に上昇させる、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
培養培地にｐＨシフトアップフィード培地を添加することを含む、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
設定点が±０．０５ｐＨ単位の不感帯を有する、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
産生物が哺乳動物細胞によって発現され、場合によっては哺乳動物細胞が組換え細胞であり、産生物が組換えタンパク質である、産生物を産生するための方法である、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
産生物が（ａ）抗体；（ｂ）バヌシズマブ；又は（ｃ）エマクツズマブである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
産生物を単離する工程と、場合によっては産生物を含む組成物を調製する工程とを含む、請求項１２から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法により産生された産生物又は組成物。
【請求項１６】
請求項１から１５の何れか一項に記載の哺乳動物細胞を培養するための方法において、
ａ．産生物が哺乳動物細胞において発現される哺乳動物細胞培養物中において産生物力価を増加させるため；
ｂ．哺乳動物細胞培養物中において細胞生存率を増加させるため；
ｃ．哺乳動物細胞培養物の寿命を延ばすため；
ｄ．哺乳動物細胞培養物中の乳酸蓄積を減少させるため；
ｅ．哺乳動物細胞培養物中のアンモニウム蓄積を減少させるため；
ｆ．哺乳動物細胞培養においてｐＣＯ２プロファイルを改善するため；
ｇ．哺乳動物細胞培養において浸透圧を低下させるための；
ｐＨシフトアップフィード培地又はｐＨ上昇剤の使用であって、ｐＨシフトアップフィード培地又はｐＨ上昇剤を哺乳動物細胞培養物に添加して、ｐＨを第一ｐＨから第二ｐＨに上昇させる、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１７年１１月３０日に出願されたＥＰ出願第１７２０４７９４．６号の優先権を主張するもので、そのＥＰ出願の内容と要素はあらゆる目的のために出典明示によりここに援用される。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は哺乳動物細胞培養に関する。特に、本発明は、治療用産生物などの産生物を産生させるための哺乳動物細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体、抗原及び他の特殊なタンパク質モダリティを含む組換え発現されたバイオ治療薬は、オンコロジー、免疫抑制、自己免疫疾患、及び炎症性疾患などの分野の疾患の治療に益々使用されている（Ｌｅａｄｅｒ等，２００８；Ａｇｇａｒｗａｌ，２０１１）。これらの治療薬、つまり「バイオ治療薬」の多くが、高用量でがん及び自己免疫疾患の治療に最近承認されているため、増大する臨床的需要を満たすために、工業的スケールでのこれらのバイオ治療薬の産生が必要とされる。
【０００４】
組換え哺乳動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換え治療薬を製造するために製薬及びバイオテクノロジー工業において広く使用されている。最適な産生物品質で更に高容量の産生物収量を達成するために、哺乳動物細胞培養方法の改善が進んでいる。（Ｏｍａｓａ等，２０１０；Ｋｉｍ等，２０１２；Ｚｈｕ，２０１２）。しかし、哺乳動物細胞における治療薬の工業的スケールでの産生は困難なままである。
【０００５】
組換え治療薬の多くの産生方法は、流加培養法を使用しており、これは高細胞密度と高最終産生物濃度をもたらす。典型的な流加培養条件下では、細胞はグルコースとアミノ酸を過剰に消費してバイオマスと産生物を形成する。これにより、通常、乳酸やアンモニウムなどの多量の阻害性代謝物が生成され、培養培地に蓄積される。培養培地中に高濃度でこれらの阻害性代謝物が存在すると、細胞増殖に悪影響が及び、細胞濃度が低くなり、産生物の力価が低くなる場合がある（Ｚｈｏｕ等，１９９５；Ｏｚｔｕｒｋ等，１９９２；Ｌａｏ及びＴｏｔｈ，１９９７）。乳酸及び／又はアンモニウムが過剰なレベルで蓄積すると、培養培地の浸透圧が高くなり、これが細胞増殖の決定的な制限要因になる場合がある。高濃度の溶存二酸化炭素もまた細胞増殖に悪影響を及ぼしうる。
【０００６】
蓄積された乳酸は、細胞培養物を酸性化し、細胞増殖、細胞生産性及び最終産生物の品質に影響を与える場合がある。制御されたｐＨ条件下でさえ、十分に高い濃度の蓄積された乳酸は、哺乳動物細胞に毒性であり得、細胞培養プロセスの中期から後期の段階で、細胞増殖とタンパク質産生を阻害する場合がある。これは、細胞密度が高い場合に特にしかりである。
【０００７】
哺乳動物細胞培養の全体的な生産性を改善するためには、細胞増殖と代謝活動の効率的な制御が重要である。細胞解糖プロセス／トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルを制御し、培養細胞中の乳酸の蓄積を減らすために、多くの努力が払われてきた。この目的のために、次のような多くの戦略が追求されてきた：
１．解糖／ＴＣＡサイクル効率とタンパク質産生を改善するために、制限された量のグルコースを使用するか、細胞培養プロセス中にグルコースを低レベルに維持する（Ｘｉｅ及びＷａｎｇ，１９９３；Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ等，２００１；Ｚｈａｎｇ等，２００４；Ｍａｒａｎｇａ及びＧｏｏｃｈｅｅ，２００６）。しかし、Ｙｅｏ等（２００６）は、低いグルコースレベルはグルコース枯渇、アポトーシス、及び早期の細胞死を容易に引き起こしうると報告している。
２．乳酸の過剰な蓄積を減らすために、フルクトース、ガラクトース、及び／又は他のグルコース類似体などの代替糖を使用する（Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ等，２０００；Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ等，２００４；Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ等，２００６；Ｗａｌｓｃｈｉｎ及びＨｕ，２００７）。しかし、この戦略はまた細胞増殖率の低下又は細胞生産性の低下につながる可能性がある。
３．解糖活性を調節するための代謝工学的アプローチ。Ｐａｒｅｄｅｓ等（１９９９）は、細胞によって産生されるアンモニアと乳酸の量を減らすためのハイブリドーマ細胞株の遺伝子組換えを記載している。しかし、このアプローチの主な欠点は、形質転換細胞が安定していないことである。
４．相同組換え又はｓｉＲＮＡ技術を介した、又はオキサミン酸などのＬＤＨ競合阻害剤の使用による、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）発現のノックダウンによる細胞性乳酸デヒドロゲナーゼ活性の調節。（Ｃｈｅｎ等，２００１；Ｋｉｍ及びＬｅｅ，２００７ａ；Ｚｈｏｕ等，２０１１）。
５．ＴＣＡサイクルへの流入を改善するための、ピルビン酸カルボキシラーゼの過剰発現又はピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）活性化因子の使用（Ｉｒａｎｉ等，１９９９；Ｆｏｇｏｌｉｎ等，２００４；Ｋｉｍ及びＬｅｅ，２００７ｂ）。これらのアプローチは多くの場合時間がかかり、ＣＨＯ細胞培養において不安定な細胞株をもたらす可能性がある。
６．乳酸の蓄積を減らすための２価の遷移金属塩（例えば、銅、亜鉛）の添加。銅は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において使用して、正味の乳酸産生から正味の乳酸消費にシフトさせ、より高い細胞増殖と生産性を達成できる（Ｙｕｋ等，２０１４）。米国特許出願公開第２０１４００５１１２４号は、二価の遷移金属塩を使用して細胞培養における乳酸産生を減少させるそのような方法を記載している。
７．外因性乳酸の使用：米国特許第８４７０５５２号は、十分な濃度の外因性乳酸の存在下で動物細胞を培養して、乳酸産生を低下させる方法を記載している。
８．温度やｐＨなどの培養条件の制御。培養ｐＨは、哺乳動物細胞の増殖と標的タンパク質の産生に顕著な影響を持つことが知られている重要な生理学的パラメーターの一つである（Ｂｏｒｙｓ等，１９９３；Ｙｏｏｎ等，２００５）。Ｏｇｕｃｈｉ等（２００６）は、細胞寿命に対する低下したｐＨ条件の影響について記載しており、ｐＨがｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼさないことを報告している。より低いｐＨと低い温度の組み合わせが細胞寿命を誘導し、ｍＲＮＡ安定性を向上させるために必要である。Ｔｒｕｍｍｅｒ等（２００６）は低下した温度での細胞代謝の制御可能な減速を報告しており、ｐＨ値の低下により、分泌産生物の品質に影響を及ぼすことなく、ＣＨＯバッチ細胞培養における容量生産性を顕著に改善できることを報告している。
【０００８】
米国特許第８７６５４１３号は、ｐＨシフトダウンと温度シフトダウンを組み合わせて細胞代謝を遅くし、それによって乳酸形成を減らし、ＣＨＯ細胞培養における容量生産性を改善する類似のアプローチを記載している。米国特許第８７６５４１３号は、ＣＨＯ細胞は一般に、高い値（例えばｐＨ７．０）よりも低いｐＨ（例えばｐＨ６．８）で産生する乳酸が少ないことを報告しており、培養ｐＨを低い値にシフトすると、細胞外アンモニアの濃度が低下することをまた示唆している。
【０００９】
国際公開第２００８／０３３５１７号は、約７．１から７．２のｐＨから始めて、２４、４８、又は７２時間にわたって約６．９の最終ｐＨに低下させる線形ｐＨ勾配の使用を含む、組換えタンパク質（特に抗ＴＮＦα又は抗インターロイキン１２抗体）を産生するための方法と組成物を記載している。この方法により、細胞増殖と生産性が向上することが報告されている。
【００１０】
ＴＨＩＯＭＡＢ ３ＬＣ形成に対する温度とｐＨの影響の研究において、Ｇｏｍｅｚ等（２０１０）は、高温及び高ｐＨ条件が、低い細胞生存率と相関する乳酸蓄積を増加させることを報告している。
【００１１】
要約すると、過去の研究は、温度シフトダウンと組み合わせたｐＨシフトダウンが、哺乳動物細胞培養における細胞生存率、細胞生産性、及び／又は最終産生物品質にプラスの影響を与えることを示している。
【００１２】
乳酸に加えて、高レベルでのアンモニア蓄積が、哺乳動物細胞培養における細胞増殖、産生物力価、及び産生物の翻訳後修飾に悪影響を及ぼすこともまた知られている（Ｈａｓｓｅｌｌ等，１９９１；Ｏｚｔｕｒｋ等，１９９２）。
【００１３】
細胞培養培地に溶解したアンモニアは、培養培地ｐＨに依存性である反応においてアンモニウムに変換される（アンモニア＋Ｈ２Ｏ⇔アンモニウム＋ＯＨ−）。細胞培養方法における阻害性代謝物としてのそれらの影響を検討する場合、「アンモニア」と「アンモニウム」という用語は、一般に交換可能に使用される。
【００１４】
アンモニアが１４ｍＭを超えて蓄積すると、培養増殖に有害であることが示されており（Ｈａｙｔｅｒ等，１９９１；Ｌａｏ及びＴｏｔｈ，１９９７）、高アンモニウム濃度が、組換えタンパク質のグリコシル化パターンに悪影響を及ぼし、ガラクトシル化とシアリル化の双方を減少させることもまた知られている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ及びＧｏｏｃｈｅｅ，１９９５；Ｂｏｒｙｓ等，１９９４；Ｇａｗｌｉｔｚｅｋ等，２０００）。
【００１５】
Ｙａｎｇ及びＢｕｔｌｅｒ（２０００）は、細胞密度が５ｍＭアンモニアで１０％減少し、ＣＨＯ細胞培養ではグリコシル化パターンが１０ｍＭアンモニアで変化することを報告している。
【００１６】
これにもかかわらず、流加産生法におけるアンモニア蓄積の問題に対処することを試みた公開された研究はほとんどない。
【００１７】
溶存二酸化炭素レベルの上昇がまた哺乳動物細胞培養における細胞増殖とタンパク質産生に影響を与えることが知られている。バイオリアクターでの流加法では、ｐＣＯ２レベルが通常の生理学的値よりも大幅に高くなる可能性がある。そのような高レベルの溶存ＣＯ２は、細胞増殖と代謝を低下させ、生産性を低下させ、最終的にはグリコシル化に悪影響をもたらしうる（Ｍｏｓｔａｆａ及びＧｕ，２００３；Ｋｉｍｕｒａ及びＭｉｌｌｅｒ，１９９７；ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ等，２００２；Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ及びＭｉｌｌｅｒ，２００２；Ｚｈｕ等，２００５）。
【００１８】
流加法では、細胞代謝と、培養培地中での緩衝液としてのＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３の使用の双方から、高ｐＣＯ２濃度が通常生じる。加えて、細胞によって産生された乳酸を中和するために、更なるＮａＨＣＯ３が塩基としてしばしば添加される。
【００１９】
高ｐＣＯ２レベルを低下させる一つのアプローチは、重炭酸塩を低減させた又は重炭酸塩を含まない緩衝液を使用することである。Ｇｏｕｄａｒ等（２００７）は、灌流工程において重炭酸塩を含まない緩衝液を使用し、ｐＣＯ２レベルの７０％削減を達成し、続いて細胞増殖と比生産性に対して好ましい効果をまた達成している。にもかかわらず、ｐＣＯ２の上昇による悪影響は依然として有意なままである。
【００２０】
細胞培養物からＣＯ２を除去する別のアプローチはガスストリッピングであるが、これは、一般に、ＣＯ２の溶解度が比較的高く、ヘンリーの法則の定数が低いため、バイオリアクターでは効果は限られている。通常の細胞培養操作条件下では、高レベルのＣＯ２を除去するためには十分なガス分散と換気が必要とされる。しかし、気泡の滞留時間はスケールと共に増加するので、ＣＯ２除去の平均推進力は急速に減少する。従って、十分なＣＯ２ストリッピングを効果的に行うには、更に高いガス流量が必要である。しかしながら、これが細胞に及ぼす有害な影響を考慮すると、スパージング流量には上限がある（Ｍｉｃｈａｅｌｓ等，１９９５ａ，ｂ）。
【００２１】
ｐＣＯ２レベルとプロファイルのマッチングは、細胞培養プロセスのスケールアップと異なる製造設備間の移設の際にもまた望ましい。ここでの重要な問題の一つは、異なるスケールで同一又は類似のｐＣＯ２プロファイルを如何にして達成するかである。通常、スケールが大きいほど、発酵槽の静水圧、混合、及びＣＯ２ストリッピング特性の違いにより、ｐＣＯ２レベルが高くなる（Ｌｉ等，２００６；Ｍｏｓｔａｆａ及びＧｕ，２００３）。ｐＣＯ２が更に上昇するとプロセスが損傷状態になるおそれがあるため、高ｐＣＯ２レベルのプロセスはスケールアップが更に困難になる可能性がある。従って、ｐＣＯ２に対するプロセスレバーの理解を深め、将来のスケールダウンモデルに利益をもたらすために、スケール間のｐＣＯ２プロファイルの比較可能性を改善する明確な必要性もある。
【００２２】
哺乳動物細胞バイオリアクターにおけるｐＣＯ２制御に取り組む少数の研究では、主にＣＯ２添加の削減とＣＯ２除去に焦点が当てられている。代替の、より効果的なアプローチが必要とされる。
【００２３】
浸透圧は、哺乳動物細胞の培養中の別の重要なプロセス変数である。高レベルまで増加すると、浸透圧は哺乳動物細胞の培養に有害であることが見出されている（Ｋｉｍ及びＬｅｅ，２００２；ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ等，２００２；Ｃｈｅｒｌｅｔ及びＭａｒｃ，１９９９）。
【００２４】
流加培養中のバイオリアクターのｐＨは予め定められた設定点に制御されるので、ｐＨを制御する塩基として添加されたＨＣＯ３の濃度が増加する結果、ｐＣＯ２が高くなると、培地浸透圧が同時に増加する（Ｚａｎｇｈｉ等，１９９９；Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ等，２０００）。浸透圧とｐＣＯ２の両方が高いと、細胞死率が有意に増加し（ｄｅＺｅｎｇｏｔｉｔａ等，１９９８）、全体的な生産性の有意な低下につながる可能性がある。
【００２５】
上記に鑑みて、これらの欠陥を克服する効率的な細胞培養方法が引き続き必要とされている。本発明は、この必要性に取り組むことを目的とする。
【発明の概要】
【００２６】
この発明は、細胞、特に哺乳動物細胞を培養するための方法に関する。特に、本発明は、哺乳動物細胞を培養するための方法であって、ｐＨシフトアップを含む方法に関する。
第一の態様では、本発明は、哺乳動物細胞を培養するための流加方法において、哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種し、細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階と、第一ｐＨより高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階とを含む方法を提供する。
【００２７】
ここに開示される方法は、有利には、望ましくない代謝物の蓄積を回避する。そのような望ましくない代謝物には、乳酸、アンモニウム及びＣＯ２が含まれる。本発明の方法は、より高い細胞生存率、より高い細胞濃度及び／又はより高い産生物力価をもたらしうる。
【００２８】
本方法は、第一ｐＨでの第一培養段階と第二ｐＨでの第二培養段階とを含み、第二ｐＨは第一ｐＨよりも高い。第二ｐＨは、第一ｐＨよりも少なくとも０．１０ｐＨ単位高くてもよい。第二ｐＨは、第一ｐＨよりも約０．１〜０．５、０．１〜０．４、又は０．１〜０．３ｐＨ単位高くてもよい。第二ｐＨは、第一ｐＨよりも約０．２ｐＨ単位高くてもよい。第一ｐＨは約７．０でありうる。第一ｐＨは約７．０であり得、第二ｐＨは約７．２でありうる。
第一ｐＨは、第一下限と第一上限を有する範囲でありうる。第二ｐＨは、第二下限と第二上限を有する範囲であり得、第二下限は第一上限以上であり、又は第二下限は第一上限よりも高い。
【００２９】
本方法は、設定点を使用してｐＨを制御することを含みうる。この文脈において、設定点は変わりうる。従って、本方法は、ｐＨ設定点群を使用してｐＨを制御することを含みうる。本方法は、ｐＨ設定点に対して±０．０５ｐＨ単位でありうる、不感帯を使用してｐＨを制御することを更に含みうる。
本発明の方法はｐＨシフトアップを含む。本方法は、第一ｐＨでの第一培養段階と第二ｐＨでの第二培養段階とを含み、第二ｐＨは第一ｐＨよりも高い。第一培養段階は、哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種することを含みうる。ｐＨシフトアップ段階は、第一培養段階と第二培養段階の間にある。ｐＨシフトアップとは、第一ｐＨから第二ｐＨへのｐＨの上昇である。これは、連続的な上昇である場合もあれば、又は不連続ステップもしくは増分を含む場合もある、徐々の上昇でありうる。本方法は、ｐＨシフトダウンを含まない方法でありうる。
【００３０】
本方法は流加法でありうる。流加法では、培養工程中に一又は複数の栄養分が培養容器に添加される。細胞は、細胞培養工程全体を通じて培養容器中に残る。細胞及び／又は細胞の産生物は、工程の終わりに収集される。
本方法は、哺乳動物細胞を培養培地中に播種することを含みうる。第一ｐＨで実施される本方法の第一培養段階は、第一ｐＨで培養培地中に細胞を播種することを含みうる。細胞を培養培地中に播種するとは、細胞の集団でありうる一又は複数の細胞を、無菌培養培地中に添加することを意味する。播種はまたシーディングとも呼ばれる。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞でありうる。
【００３１】
本方法の温度は、実質的に一定の値に維持されうる。温度が実質的に一定の値に維持される方法は、第一培養段階と第二培養段階との間に有意な温度シフトを含まない。実質的に一定の温度値は、±０．５℃以内でありうる。実質的に一定の温度値は、約３７℃でありうる。実質的に一定の温度値は、約３６．５℃でありうる。実質的に一定の温度値は、３６．０〜３７．０℃でありうる。
【００３２】
本発明の方法は、抗体を発現することができる哺乳動物細胞を培養することを含みうる。細胞は組換え細胞でありうる。抗体は組換え抗体でありうる。細胞は、誘導性プロモーターでありうるプロモーターの制御下で抗体をコードする核酸を含みうる。
【００３３】
第二の態様では、本発明は、哺乳動物細胞を培養するための方法であって、第一ｐＨで細胞を培養することを含む第一培養段階と第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階とを含み、第二ｐＨが第一ｐＨよりも高く、方法の温度が実質的に一定の値に維持される方法を提供する。
【００３４】
第三の態様では、本発明は、抗体を発現することができる哺乳動物細胞を培養するための方法であって、第一ｐＨで培養培地中に哺乳動物細胞を播種し、細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階と、第一ｐＨよりも高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階とを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法の概要を示しており、１４日の実行期間の持続期間中、ｐＨは７．００±０．０５に維持される。
【図２−１０】図２Ａ−Ｇ、３Ａ−Ｇ、４Ａ−Ｇ、５Ａ−Ｇ、６Ａ−Ｇ、７Ａ−Ｇ、８Ａ−Ｇ、９Ａ−Ｇ、１０Ａ−Ｆ（図２〜１０の枝番Ｂ〜Ｇ）の各々において、以下に更に詳細に要約されるように、灰色の菱形は、７．００±０．０５に維持される方法を示し、黒い矩形は、ｐＨシフトアップを伴う方法を示す。図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、５Ｂ、６Ｂ、７Ｂ、８Ｂ、９Ｂ、１０Ｂ（枝番Ｂ）の各々は、平均細胞生存率（％）を示し；図２Ｃ、３Ｃ、４Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、７Ｃ、８Ｃ、９Ｃ、１０Ｃ（枝番Ｃ）の各々は、乳酸濃度（％）を示し；図２Ｄ、３Ｄ、４Ｄ、５Ｄ、６Ｄ、７Ｄ、８Ｄ、９Ｄ、１０Ｄ（枝番Ｄ）の各々は、アンモニウム濃度（％）を示し；図２Ｅ、３Ｅ、４Ｅ、５Ｅ、６Ｅ、７Ｅ、８Ｅ、９Ｅ、１０Ｅ（枝番Ｅ）の各々は、産生物力価（％）を示し；図２Ｆ、３Ｆ、４Ｆ、５Ｆ、６Ｆ、７Ｆ、８Ｆ、９Ｆ（枝番Ｆ）の各々は、ｐＣＯ２濃度（％）を示し；及び図２Ｇ、３Ｇ、４Ｇ、５Ｇ、６Ｇ、７Ｇ、８Ｇ、９Ｇ、１０Ｆ（枝番Ｇ）の各々は、浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）を示す。図２Ｂ−Ｇ、３Ｂ−Ｇ、４Ｂ−Ｇ、５Ｂ−Ｇ、６Ｂ−Ｇ、７Ｂ−Ｇ、８Ｂ−Ｇ、９Ｂ−Ｇ（図２−９、枝番Ｂ−Ｇの各々）の各々は、同一条件下での２基の２Ｌバイオリアクターの平均値をプロットしている。
【図２Ａ−２Ｇ】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法に対するｐＨシフトアップ（Δ０．２０のｐＨ勾配）の効果を示す。図２Ａは方法の概要を示している；本方法は、７．００±０．０５のｐＨ設定点で始まり、これが１４４時間から１９２時間の期間にわたって線形勾配で７．２０±０．０５まで上昇される。これに続いて、１４日の実行期間の残りの間、ｐＨ設定点は７．２０±０．０５に維持される。
【図３Ａ−３Ｇ】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法に対するｐＨシフトアップ（Δ０．２０のｐＨ勾配）の効果を示す。図３Ａは方法の概要を示している；本方法は、７．００±０．０５のｐＨ設定点で始まり、これが１５６時間から２０８時間の期間にわたって線形勾配で７．２０±０．０５まで上昇される。これに続いて、１４日の実行期間の残りの間、ｐＨは７．２０±０．０５に維持される。
【図４Ａ−４Ｇ】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法に対するｐＨシフトアップ（Δ０．３０のｐＨ勾配）の効果を示す。図４Ａは方法の概要を示している；本方法は、７．００±０．０５の設定点に維持されたｐＨで始まり、これが１９２時間から２４０時間の期間にわたって線形勾配で７．３０±０．０５まで上昇される。これに続いて、１４日の実行期間の残りの間、ｐＨは７．３０±０．０５に維持される。
【図５Ａ−５Ｇ】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法に対するｐＨシフトアップ（Δ０．１０のｐＨ勾配）の効果を示す。図５Ａは方法の概要を示している；本方法は、７．００±０．０５のｐＨ設定点で始まり、これが１９２時間から２４０時間の期間にわたって線形勾配で７．１０±０．０５まで上昇される。これに続いて、１４日の実行期間の残りの間、ｐＨは７．１０±０．０５に維持される。
【図６Ａ−６Ｇ】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法に対する即時のｐＨシフトアップ（Δ０．２０）の効果を示す。図６Ａは方法の概要を示している；本方法は、７．００±０．０５のｐＨ設定点で始まる。１４４時間で、ｐＨ設定点は即時に（単一ステップで）７．２０±０．０５まで上昇され、１４日の実行期間の残りの間、このレベルに維持される。
【図７Ａ−７Ｇ】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法に対するｐＨシフトアップ（Δ０．２０の不感帯拡大）の効果を示す。図７Ａに方法の概要を示している。本方法は、７．００±０．０５のｐＨ設定点で始まる。１４４時間で、ｐＨ不感帯は０．０５から０．２５に拡大される。１９２時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．２０に上昇され、ｐＨ不感帯が０．０５に戻る。１４日間の残りの実行時間の間、ｐＨ設定点は７．２０±０．０５に維持される。
【図８Ａ−８Ｇ】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法に対するｐＨシフトアップ（７．００から７．２０まで０．０５の漸進的な設定点上昇でのΔ０．２０）の効果を示す。図８Ａに方法の概要を示している。本方法は、７．００±０．０５のｐＨ設定点で始まる。１５６時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．０５±０．０５に上昇され、１２時間維持される。１６８時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．１０±０．０５に上昇され、１２時間維持される。１８０時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．１５±０．０５に上昇され、１２時間維持される。最後に、１９２時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．２０±０．０５に上昇され、１４日の実行期間の残りの間、このレベルに維持される。
【図９Ａ−９Ｇ】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法に対するｐＨシフトアップ（０．０５から０，２５までの０．０５の漸進的な不感帯拡大でのΔ０．２０）の効果を示す。図９Ａに方法の概要を示している。本方法は、７．００±０．０５のｐＨ設定点で始まる。１５２時間で、ｐＨ不感帯は±０．１０に拡大され、１２時間維持される。１６４時間で、ｐＨ不感帯は±０．１５に拡大され、１２時間維持される。１７６時間で、ｐＨ不感帯は±０．２０に拡大され、１２時間維持される。１８８時間で、ｐＨ不感帯は±０．２５に拡大され、１２時間維持される。最後に、２００時間で、ｐＨ設定点は±０．０５の不感帯でｐＨ７．２０に上昇され、１４日の実行期間の残りの間、このレベルに維持される。
【図１０Ａ−１０Ｆ】抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の産生方法に対する異なるｐＨ設定点及び不感帯設定の影響を示す。図１０Ａは、２つの方法の概要を示している。方法＃１は、７．００±０．０５のｐＨ設定点で始まり、これが１４４時間から１９２時間の期間にわたって線形勾配で７．２０±０．０５に上昇され、その後、１４日の実行期間の残りの間、このレベルに維持される。方法＃２は７．００±０．０５のｐＨ設定点で始まり、これが、４８時間で即時に６．８０±０．０５に低下され、１９２時間維持される。２４０時間で始まり、ｐＨ設定点は、２４０時間から２８８時間の期間にわたって線形勾配で６．８０±０．０５から７．００±０．０５に上昇され、その後１４日の実行期間の残りの間、このレベルに維持される。図１０Ｂは、平均細胞生存率（％）を示し；図１０Ｃは、乳酸濃度（％）を示し；図１０Ｄは、アンモニウム濃度（％）を示し；図１０Ｅは、産生物力価（％）を示し；図１０Ｆは、浸透圧（ｍＯｓｍ／ｋｇ）を示す。図１０Ｂ〜１０Ｆの各々は、一基のバイオリアクターの値をプロットしている。
【図１１Ａ−１１Ｇ】抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体の産生方法に対する温度シフトダウンの影響を示す。図１１Ａに方法の概要を示している。方法Ａでは、温度は３６．５℃に維持され、ｐＨ設定点は１４日間の実行期間全体にわたって７．００±０．０５に維持される。方法Ｂは、３６．５℃に維持された温度で始まる。６／７日後、温度は３４．０℃に低下され、その後１４日間の残りの実行期間はこのレベルに維持される。ｐＨは、ずっと７．００±０．０５の一定の設定点に維持される。図１１Ｂは、方法Ａ（灰色の菱形）及び方法Ｂ（黒い矩形）の平均細胞生存率（％）を示す折れ線グラフである。図１１Ｃは、方法Ａ（灰色の菱形）及び方法Ｂ（黒い矩形）の乳酸濃度（％）の時間経過プロファイルを示す折れ線グラフである。図１１Ｄは、方法Ａ（灰色の菱形）及び方法Ｂ（黒い矩形）のアンモニウム濃度（％）の時間経過プロファイルを示す折れ線グラフである。図１１Ｅは、方法Ａ（灰色の菱形）及び方法Ｂ（黒い矩形）の産生物力価（％）の時間経過プロファイルを示す折れ線グラフである。図１１Ｆは、方法Ａ（灰色の菱形）及び方法Ｂ（黒い矩形）のｐＣＯ２濃度（％）の時間経過プロファイルを示す折れ線グラフである。図１１Ｇは、方法Ａ（灰色の菱形）及び方法Ｂ（黒い矩形）の浸透圧の時間経過プロファイルを示す折れ線グラフである。図１１Ｂ〜１１Ｆにおいて、各プロットは、同一条件下での２基の２Ｌバイオリアクターの平均である。
【図１２】ここに開示される方法で産生されるタンパク質の関連したグリコシル化構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、哺乳動物細胞を培養するための方法を提供する。本発明の方法は、ｐＨシフトアップを含む。特に、本発明の方法は、持続的なｐＨシフトアップを含む。これにより、乳酸やアンモニウムなどの望ましくない代謝物の蓄積が減少する。ここに開示される方法は、中程度のｐＣＯ２レベル及び／又はより低い培養浸透圧の維持を改善しうる。その結果、本方法は、より高い細胞生存率、より高い細胞濃度、より高い細胞生産性、より高い産生物力価、及び／又は改善された産生物品質をもたらしうる。
【００３７】
ｐＨシフトアップを含む本方法は、工程全体にわたってｐＨが同じである対照方法（第一及び第二培養段階において同じｐＨ設定点）と比較して改善されうる。これらの改善は添付の図２Ａ−Ｇから図９Ａ−Ｇに示され、これらは、細胞生存率（一連の図Ｂ）、乳酸レベル（図Ｃ）、アンモニウムレベル（図Ｄ）、産生物力価（図Ｅ）、ｐＣＯ２プロファイル（図Ｆ）及び浸透圧（図Ｇ）の改善を示している。ここに開示される方法は、有利には、特に工程の後期及び工程の終わりにおける、過剰な乳酸の蓄積を回避しうる。本方法は、有利には、アンモニア生成を低減させ、及び／又は特に工程の後期及び工程の終わりにおける過剰なアンモニアの蓄積を低減しうる。
【００３８】
本方法は、工業規模の細胞培養、治療用産生物を産生する細胞の培養に特に適している。そのような細胞培養のための培養容器はバイオリアクターと呼ばれる場合がある。工業規模の方法は、培養培地の容量が少なくとも約５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、又は１００００Ｌである方法でありうる。工業規模の方法は、培地の容量が少なくとも約２０Ｌ、３０Ｌ又は４０Ｌである方法でありうる。工業規模の方法は、培養培地の容量が約２０〜１００Ｌ、２０〜５００Ｌ、２０〜１０００Ｌ、５０〜１００Ｌ、５０〜５００Ｌ、５０〜１０００Ｌ、５０〜５０００Ｌ、５０〜１００００Ｌ、５０〜２００００Ｌ、１００〜１０００Ｌ、１００〜５０００Ｌ、１００〜１００００Ｌ、１００〜２００００Ｌ、５００〜５０００Ｌ、５００〜１００００Ｌ、又は５００〜２００００Ｌである方法でありうる。
【００３９】
本発明の方法はｐＨシフトアップを含む。より具体的には、本発明の方法は、第一ｐＨでの第一培養段階と第二ｐＨでの第二培養段階とを含み、第二ｐＨは第一ｐＨよりも高い。第一培養段階は、哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種することを含みうる。第一培養段階は、工程の０日目に始まりうる。第一培養段階は初期培養段階である。第一培養段階は、細胞播種及び遅滞期の増殖が起こる段階でありうる。第一培養段階の直後にｐＨシフトアップが直接続き、その後に直接第二培養段階が続きうる。第二培養段階は、細胞及び／又は細胞によって産生された産生物を収集することを含みうる。本方法は、第二培養段階の終了時に終了しうる。
本方法は、工業規模の細胞培養、及び治療用産生物を産生する細胞の培養に特に適している。本方法は、第一ｐＨで実施される第一培養段階と、第一ｐＨより高い第二ｐＨで実施される第二培養段階とを含む。
【００４０】
ここに開示されるのは、哺乳動物細胞を培養するための流加法であり、該方法は、哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種し、細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階と、第一ｐＨよりも高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階とを含む。
ここに開示されるのは、バヌシズマブなどの抗体を発現するＣＨＯ細胞を培養するための流加法であり、該方法は、哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種し、細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階と、第一ｐＨよりも高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階とを含み、第一ｐＨは約７．０であり、第二ｐＨは第一ｐＨよりも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、又は０．１〜０．５単位高い。
【００４１】
第一ｐＨは、６．５〜７．５、６．６〜７．４、６．７〜７．３、６．８〜７．２、又は６．９〜７．１の範囲の値でありうる。第一ｐＨは約７．０でありうる。第一ｐＨは約７．０であり得、第二ｐＨは約７．２でありうる。
第一ｐＨは、約ｐＨ６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、又は７．５の値を有しうる。第二ｐＨは、約ｐＨ６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、又は７．６の値を有しうる。第一ｐＨは、約ｐＨ６．５〜７．５の値を有しうる。第二ｐＨは、約ｐＨ６．６〜７．６の値を有し得、第二ｐＨは第一ｐＨよりも高い。
【００４２】
第一ｐＨは、ｐＨ６．５±０．０５、６．６±０．０５、６．７±０．０５、６．８±０．０５、６．９±０．０５、７．０±０．０５、７．１±０．０５、７．２±０．０５、７．３±０．０５、７．４±０．０５、又は７．５±０．０５の値を有しうる。第二ｐＨは、ｐＨ６．６±０．０５、６．７±０．０５、６．８±０．０５、６．９±０．０５、７．０±０．０５、７．１±０．０５、７．２±０．０５、７．３±０．０５、７．４±０．０５、７．５±０．０５、又は７．６±０．０５の値を有しうる。第一ｐＨは、ｐＨ６．５±０．０５〜７．５±０．０５の値を有しうる。第二ｐＨは、ｐＨ６．６±０．０５〜７．６±０．０５の値を有し得、ここで、第二ｐＨは第一ｐＨよりも高い。第二ｐＨは、第一ｐＨよりも約０．１ｐＨ単位、又は少なくとも約０．１ｐＨ単位高くてもよい。第一ｐＨよりも約０．１ｐＨ単位高い第二ｐＨは、ここでは、ｐＨΔ０．１と呼ぶことがある。第二ｐＨは、第一ｐＨより約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０ｐＨ単位、又は少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０ｐＨ単位高くてもよい。第二ｐＨは、第一ｐＨより約０．１〜０．５ｐＨ単位高く、第一ｐＨより約０．１〜０．４単位高く、又は第一ｐＨより約０．１〜０．３ｐＨ単位高くてもよい。第一ｐＨは約７．０でありうる。第二ｐＨは、約７．１〜７．４、７．１〜７．５、７．２〜７．４又は約７．２〜７．５でありうる。
【００４３】
第一ｐＨは、６．５０〜７．５０、６．６０〜７．４０、６．７０〜７．３０、６．８０〜７．２０、又は６．９０〜７．１０の範囲の値でありうる。第一ｐＨは約７．００でありうる。第一ｐＨは約７．００であり得、第二ｐＨは約７．２０でありうる。
第一ｐＨは、約ｐＨ６．５０、６．６０、６．７０、６．８０、６．９０、７．００、７．１０、７．２０、７．３０、７．４０、又は７．５０の値を有しうる。第二ｐＨは、約ｐＨ６．６０、６．７０、６．８０、６．９０、７．００、７．１０、７．２０、７．３０、７．４０、７．５０、又は７．６０の値を有しうる。第一ｐＨは、約ｐＨ６．５〜７．５の値を有しうる。第二ｐＨは、約ｐＨ６．６〜７．６の値を有し得、ここで、第二ｐＨは第一ｐＨよりも高い。
【００４４】
第二ｐＨは、第一ｐＨよりも約０．１０ｐＨ単位、又は少なくとも約０．１０ｐＨ単位高くてもよい。第一ｐＨよりも約０．１０ｐＨ単位高い第二ｐＨは、ここではｐＨΔ０．１０と呼ばれうる。第二ｐＨは、第一ｐＨよりも約０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０又は１．００ｐＨ単位、又は少なくとも約０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０又は１．００ｐＨ単位高くてもよい。第二ｐＨは、第一ｐＨよりも約０．１０〜０．５０ｐＨ単位高く、第一ｐＨよりも約０．１０〜０．４０単位高く、又は第一ｐＨより約０．１０〜０．３０ｐＨ単位高くてもよい。第一ｐＨは約７．００でありうる。第二ｐＨは、約７．１０〜７．４０、７．１０〜７．５０、７．２０〜７．４０又は約７．２０〜７．５０でありうる。
【００４５】
ここに開示される方法は、ｐＨ設定点を使用してｐＨを制御することを含みうる。設定点は、望ましい又は目標のｐＨ値である。本方法は、ｐＨ設定点を使用してｐＨを調節するようにプログラム可能なバイオリアクター又は他の制御された培養設備においてなされうる。この文脈において、バイオリアクターは、培養ｐＨを監視するための少なくとも一のｐＨプローブを含む。培養ｐＨがその設定点から外れると、ｐＨ補正作用（又はｐＨ調節作用）がトリガーされ、ｐＨを設定点に近づけうる。ｐＨ補正作用は、ｐＨを低下させる薬剤（例えばＣＯ２、ＨＣｌ又は任意の他の適切な酸）の添加、又はｐＨを上昇させる薬剤（例えばＮａＯＨ又は任意の他の適切な塩基）の添加を含みうる。ｐＨ補正作用は、ｐＨを低下させる薬剤の除去（例えば、ＣＯ２ストリッピングとして知られているＣＯ２の除去）を含みうる。ｐＨ補正作用は、ｐＨをそれぞれ上昇させ又は低下させるために、ｐＨを低下させ又は上昇させる薬剤の添加を減弱させること、例えば、比較的高いｐＨを維持するためにＣＯ２の添加を減弱させることを含みうる。
【００４６】
本方法は、不感帯を使用してｐＨを制御することを含みうる。不感帯は、ｐＨ補正作用がトリガーされないゾーンを定義する。不感帯によって定義されたゾーンの外にｐＨがドリフトした場合のみ、ｐＨ補正作用がトリガーされる。ｐＨ設定点は不感帯を有しうる。不感帯は±０．０５であり得、つまり、不感帯はｐＨ設定点に対して±０．０５ｐＨ単位でありうる。
【００４７】
ここに開示される方法は、ｐＨ設定点を使用してｐＨを制御することを含み得、第一培養段階では設定点は第一ｐＨに設定され、第二培養段階では設定点は第二ｐＨに設定される。第一培養段階では、設定点は第一ｐＨに維持されうる。第二培養段階では、設定点は第二ｐＨに維持されうる。第一培養段階では、設定点は第一ｐＨに維持され得、第二培養段階では、設定点は第二ｐＨに維持されうる。設定点の維持は、第一及び第二培養段階において、それぞれ第一及び第二培養段階の持続期間について以下に述べるような持続期間を有しうる。第一培養段階、又は第二培養段階、又はその両方に対する設定点は、少なくとも２、４、６、８、１２、又は１８時間；あるいは３〜１０日、４〜１０日、４〜８日、又は４〜６日；あるいは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間、維持されうる。第一培養段階では、設定点は、ｐＨ６．５０、６．６０、６．７０、６．８０、６．９０、７．００、７．１０、７．２０、７．３０、７．４０、又は７．５０に設定されうる。第二培養段階では、設定点は、ｐＨ６．６０、６．７０、６．８０、６．９０、７．００、７．１０、７．２０、７．３０、７．４０、７．５０、又は７．６０に設定され得、第二培養段階のｐＨ設定点は第一培養段階のｐＨ設定点よりも高い。第二培養段階のｐＨ設定点は、第一培養段階のｐＨ設定点よりも、約０．１０ｐＨ単位、又は少なくとも約０．１０ｐＨ単位高くてもよい。第一ｐＨよりも約０．１０ｐＨ単位高い第二ｐＨは、ここではｐＨΔ０．１０と呼ばれる場合がある。第二のｐＨ設定点は、第一ｐＨ設定点より、約０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０又は１．００ｐＨ単位、又は少なくとも約０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０又は１．００ｐＨ単位高くてもよい。第二のｐＨ設定点は、第一のｐＨ設定点よりも約０．１０〜０．５０ｐＨ単位高く、第一のｐＨ設定点より約０．１０〜０．４０単位高く、又は第一のｐＨ設定点より約０．１０〜０．３０ｐＨ単位高くてもよい。第一のｐＨ設定点は約７．００でありうる。第一のｐＨ設定点は、６．５０〜７．５０、６．６０〜７．４０、６．７０〜７．３０、６．８０〜７．２０、又は６．９０〜７．１０の範囲の値でありうる。ｐＨ設定点には、工程全体を通じて同じである不感帯がありうる。つまり、不感帯は一定の値を持ちうる。第一培養段階におけるｐＨ設定点は、第二培養段階におけるｐＨ設定点の不感帯と同じである不感帯を有しうる。あるいは、第一培養段階におけるｐＨ設定点と第二培養段階におけるｐＨ設定点は、互いに異なる不感帯を有しうる。
【００４８】
第一培養段階及び／又は第二培養段階におけるｐＨ設定点は、±０．５０の不感帯、±０．２５の不感帯、±０．１０の不感帯、±０．０５ｐＨ単位の不感帯、±０．０１の不感帯、又は±０．００５ｐＨ単位の不感帯を有しうる。
【００４９】
第一培養段階のｐＨ設定点は７．００±０．０５でありうる。第二培養段階のｐＨ設定点は、７．１０±０．０５〜７．４０±０．０５でありうる。第一培養段階のｐＨ設定点は７．００±０．０５で、第二培養段階のｐＨは７．１０±０．０５〜７．４０±０．０５でありうる。第一培養段階のｐＨ設定点は７．００±０．０５であり得、第二培養段階のｐＨ設定点は７．１０±０．０５でありうる。第一培養段階のｐＨ設定点は７．００±０．０５であり得、第二培養段階のｐＨ設定点は７．２０±０．０５でありうる。第一培養段階のｐＨ設定点は７．００±０．０５であり得、第二培養段階のｐＨ設定点は７．３０±０．０５でありうる。第一培養段階のｐＨ設定点は７．００±０．０５であり得、第二培養段階のｐＨ設定点は７．４０±０．０５でありうる。
【００５０】
第一ｐＨは、第一下限と第一上限を有する範囲でありうる。第二ｐＨは、第二下限と第二上限を有する範囲でありうる。第二下限は、第一ｐＨの第一上限以上（≧）、又は第一ｐＨの第一上限より高く（＞）てもよい。本発明の方法において、第一培養段階は、第一下限と第一上限を有する範囲内で細胞を培養することを含み、第二培養段階は、第二下限と第二上限を有する範囲内で細胞を培養することを含む。
【００５１】
第二下限は、第一ｐＨの第一上限と等しくてもよい。例えば、第一ｐＨは、６．９５の第一下限と７．０５の第一上限を有する範囲でありうる。例えば、第二ｐＨは、７．０５の第二下限と７．１５の第二上限を有する範囲でありうる。第二下限は、第一ｐＨの第一上限より大きくてもよい。例えば、第一ｐＨは、６．９５の第一下限と７．０５の第一上限を有する範囲でありうる。例えば、第二ｐＨは、７．０５より高い第二下限と７．１５より高い第二上限を有する範囲でありうる。
【００５２】
第二下限は、第一上限よりも少なくとも０．１０ｐＨ単位高くてもよい。例えば、第一ｐＨは、６．９５の第一下限と７．０５の第一上限を有する範囲であり得、第二ｐＨは、７．１５の第二下限と７．２５の第二上限を有する範囲でありうる。
【００５３】
第二下限は、第一上限よりも少なくとも０．２０ｐＨ単位高くてもよい。例えば、第一ｐＨは、６．９５の第一下限と７．０５の第一上限を有する範囲であり得、第二ｐＨは、７．２５の第二下限と７．３５の第二上限を有する範囲でありうる。
【００５４】
第二下限は、第一上限よりも、０．１０ｐＨ単位高くてもよいか、又は少なくとも０．１０ｐＨ単位高くてもよい。第二下限は、第一上限よりも０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０又は１．００ｐＨ単位高くてもよいか、又は少なくとも０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０又は１．００ｐＨ単位高くてもよい。
【００５５】
第一ｐＨ及び／又は第二ｐＨは、１．００、０．５０、０．２０、０．１０、０．０２又は０．０１ｐＨ単位の幅を有する範囲でありうる。第一ｐＨは、ｐＨ６．５０、６．６０、６．７０、６．８０、６．９０、７．００、７．１０、７．２０、７．３０、７．４０、又は７．５０の中点値を有する範囲でありうる。第二ｐＨは、ｐＨ６．６０、６．７０、６．８０、６．９０、７．００、７．１０、７．２０、７．３０、７．４０、７．５０、又は７．６０の中点値を有する範囲でありうる。例えば、第一ｐＨは、ｐＨ７．００の中点値と０．１０の幅を有する範囲であり得、これは、ｐＨ６．９５〜７．０５の範囲である。第二ｐＨは、ｐＨ７．２０の中点値と０．１０の幅を有する範囲であり得、これは、ｐＨ７．１５〜７．２５の範囲である。
【００５６】
本方法は、ｐＨシフトダウン（負のシフト）を含まない方法でありうる。すなわち、本方法は、ｐＨの有意な低下を含まない方法でありうる。ｐＨの有意な低下は、少なくとも０．１０、０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０又は１．００ｐＨ単位の低下であり得、これは少なくとも１、５、又は３０分持続しうる。本方法は、第一ｐＨよりも低い任意のｐＨで細胞を培養することを含まない方法でありうる。
【００５７】
本発明の方法はｐＨシフトアップを含む。ｐＨシフトアップは、第一培養段階と第二培養段階の間にある。ｐＨシフトアップは正のシフト又はアルカリ性シフトである。つまり、ｐＨシフトアップはｐＨの上昇である。ｐＨシフトアップは、第一ｐＨから第二ｐＨへのｐＨの上昇である。
【００５８】
ｐＨシフトアップは徐々でありうる。すなわち、ｐＨシフトアップは、一定期間にわたるｐＨの徐々の上昇を含みうる。ｐＨは、例えば、２４〜７２時間の期間にわたって、第一ｐＨから第二ｐＨに徐々に上昇されうる。期間は、２４〜７２時間、３６〜６０時間、又は約４８時間でありうる。期間は、６、１２、２４、３６、又は４８時間であり得、又は少なくとも６、１２、２４、３６、又は４８時間でありうる。ｐＨの徐々の上昇は、ｐＨを、１時間当たり、約０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、又は０．０５ｐＨ単位、あるいは約０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、又は０．０５ｐＨ単位未満、上昇させうる。ｐＨの徐々の上昇は、ｐＨを、１時間当たり約０．００１〜０．０５、０．００１〜０．０１、０．００１〜０．００５、又は０．００２〜０．００８ｐＨ単位、上昇させうる。
【００５９】
あるいは、ｐＨシフトアップは「非漸進的」でありうる。そのようなｐＨシフトアップは、２時間未満、又は１時間未満、又は３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１分未満の期間を有しうる。ｐＨの非漸進的な上昇は、１時間当たり、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５又は３．０ｐＨ単位、又は少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５又は３．０ｐＨ単位、上昇させうる。
【００６０】
ｐＨを徐々に上昇させることは、有利には、哺乳動物細胞への有害な影響を最小化しうる。有害な影響は、培養培地のｐＨの即時又は突然の上昇に関連している場合があり、その影響はｐＨの徐々の上昇によって回避される。ｐＨが徐々に上昇される本発明の方法は、ｐＨの上昇が非漸進的である方法、又は以下で検討するようにｐＨ設定点が単一ステップで上昇される方法と比較して、改善された産生物力価及び／又は産生物品質を有しうる。
【００６１】
ｐＨ設定点を使用してｐＨを制御することを含む本発明の方法は、設定点を（ａ）徐々に又は（ｂ）即時に第一ｐＨから第二ｐＨに上昇させるｐＨシフトアップを含みうる。
ｐＨ設定点が徐々に上昇される場合、これは、ある期間にわたる第一ｐＨから第二ｐＨへの設定点の連続的な上昇を含みうる。あるいは、これは、ある期間にわたる第一ｐＨから第二ｐＨへの設定点の段階的な上昇を含みうる。この期間は、２４〜７２時間、３６〜６０時間、又は約４８時間でありうる。この期間は、少なくとも６、１２、２４、３６、又は４８時間でありうる。
【００６２】
ｐＨ設定点の徐々の連続的な上昇は、ｐＨ勾配又はｐＨ線形勾配と呼ばれることがある。従って、本発明の方法は、設定点が第一ｐＨから第二ｐＨに連続的に上昇されるｐＨ勾配であるｐＨシフトアップを含みうる。
【００６３】
ｐＨ設定点の徐々の段階的上昇は、不連続ステップ又は増分を含みうる。これは段階的に変わる（gradated）上昇と呼ばれることがある。各不連続ステップは、ｐＨ設定点を少なくとも約０．０５ｐＨ単位、上昇させうる。各不連続ステップは、ｐＨ設定点を少なくとも約０．０１、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、又は０．２５ｐＨ単位、上昇させうる。各不連続ステップは、少なくとも約１２時間である期間、維持されうる。各不連続ステップは、少なくとも約１、２、４、６、８、１２、１８、２４又は３６時間、又は少なくとも約１〜２４又は６〜１８時間の期間、維持されうる。
【００６４】
ｐＨ設定点が第二ｐＨに到達するまでｐＨ設定点を繰り返し上昇させることにより、ｐＨ設定点の徐々の段階的上昇が実施されうる。段階的な上昇は、一連の不連続ステップ又は増分でｐＨ設定点を繰り返し上昇させうる。
例えば、ｐＨ設定点の徐々の段階的上昇は、
ａ）第一ｐＨから中間ｐＨ設定点までｐＨ設定点を漸進的に上昇させ、この中間ｐＨ設定点で所定期間、培養物を維持する；
ｂ）ｐＨ設定点をより高い中間ｐＨ設定点まで漸進的に上昇させ、所定期間、培養物をこのより高い中間ｐＨ設定点に維持する；及び；
ｃ）ｐＨ設定点が第二ｐＨに達するまで、工程ｂ）を繰り返す
ことにより、実施されうる。
【００６５】
ｐＨ設定点を漸進的に上昇させることは、０．０５ｐＨ単位の増分、又は少なくとも０．０５ｐＨ単位の増分だけ、ｐＨ設定点を上昇させることを含みうる。増分は、約０．０１、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、又は０．２５ｐＨ単位であり得、又は少なくとも約０．０１、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、又は０．２５ｐＨ単位でありうる。中間のｐＨ設定点は、少なくとも約１２時間である期間、維持されうる。各不連続ステップ又は増分は、少なくとも約１、２、４、６、８、１２、１８、２４又は３６時間、又は少なくとも１〜２４又は６〜１８時間である期間、維持されうる。各不連続ステップは、約１２時間維持される約０．０５ｐＨ単位でありうる。
【００６６】
段階的なｐＨ設定点の上昇であるｐＨ設定点の徐々の上昇が、ある状況では好ましい場合がある。例えば、技術的な制限により、連続的な上昇でｐＨ設定点を徐々に上昇させるようにバイオリアクターをプログラムできない場合である。
【００６７】
ｐＨ設定点は即時に上昇されうる。ｐＨ設定点の即時の変化は、単一ステップでの第一ｐＨから第二ｐＨへのｐＨ設定点の上昇を含みうる。このようにして、ｐＨ設定点は、如何なる中間値にも設定されることなく、第一ｐＨから第二ｐＨに直接変えられる。ｐＨ設定点が第一ｐＨから第二ｐＨに即時に上昇されると、発酵のｐＨが非漸進的に増加しうる。発酵のｐＨが第一ｐＨから第二ｐＨに変化するのにかかる時間は、発酵の容量及び／又は撹拌速度に依存しうる。例えば、以下の実施例６はｐＨ設定点の即時の上昇を含み、発酵が第一ｐＨから第二ｐＨに上昇するのにかかる時間は、２Ｌの発酵では約１０分、１０００Ｌの発酵では１〜２時間であった。
【００６８】
不感帯は、工程全体を通じて一定の値に維持されうる。例えば、不感帯は、工程全体を通じて設定点に対して±０．０５ｐＨ単位でありうる。ｐＨ設定点の上昇が徐々である実施態様では、不感帯は、第一培養段階、ｐＨシフトアップ、及び第二培養段階において一定値に維持されうる。不感帯が一定値に維持される方法の実施態様は、図２Ａ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、８Ａ、及び１０Ａに示される。
【００６９】
あるいは、不感帯は拡大されうる。特に、ｐＨシフトアップは、不感帯拡大を含みうる。不感帯は即時に拡大されうる。つまり、不感帯は単一ステップで拡大されうる。不感帯が単一ステップで拡大される方法の実施態様は図７Ａに示される。あるいは、不感帯は徐々に拡大され得、例えば、不感帯は、一連の不連続ステップ又は増分で拡大されうる。不感帯が一連の増分で拡大される方法の実施態様は図９Ａに示される。
【００７０】
ｐＨシフトアップは、単一ステップで、又は即時に不感帯を拡大させることを含みうる。ｐＨシフトアップは、不感帯を、第一ｐＨに設定された設定点について初期値から、単一ステップで第一ｐＨに設定された設定点についてより広い値に、それが第二ｐＨを包含するように、拡大させ、ついでｐＨ設定点を第二ｐＨに上昇させることを含みうる。不感帯は、ｐＨ設定点が第二ｐＨに上昇されると同時に、ｐＨ設定点についてのその初期値に復元されうる。あるいは、不感帯はその初期値とは異なる値に復元されうる。不感帯は、第一ｐＨを包含しない値に復元されうる。
例えば、本方法は、ｐＨ７．００での第一培養段階とｐＨ７．２０での第二培養段階を含み得；第一培養段階及び第二培養段階におけるｐＨ設定点は、±０．０５の不感帯を有し得；ｐＨシフトアップは、第一ｐＨに設定されている設定点についての不感帯を、それが第二ｐＨを包含するように単一ステップで±０．０５〜±０．２５拡大させ（ｐＨ７．００±０．０５〜ｐＨ７．００±０．２５）、ついでｐＨ設定点を第二ｐＨに上昇させることを含みうる。不感帯は、ｐＨ設定点が第二ｐＨに上昇されると同時に、第二ｐＨに設定されたｐＨ設定点について±０．０５に復元されうる（ｐＨ７．２０±０．０５）。図７Ａは、この実施態様に係る方法を示す。
【００７１】
ｐＨシフトアップは、不感帯を単一ステップで±０．０５から±０．２５に拡大することを含みうる。ｐＨシフトアップは、±０．０１から±０．０５まで、±０．０５から±０．２５まで、±０．０５から±０．５０まで、又は±０．１０から±０．５０まで単一ステップで不感帯を拡大することを含みうる。
不感帯は単一ステップで拡大され得、拡大された不感帯は約１２、１８、２４、３６、４８、６０又は７２時間、又は少なくとも１２、１８、２４、３６、４８、６０又は７２時間、維持されうる。拡大された不感帯は、３６〜６０、４０〜５６又は４４〜５２時間、又は約４８時間、維持されうる。拡大された不感帯は、ｐＨが第二ｐＨに達するまで維持されうる。
【００７２】
ｐＨシフトアップは、不感帯の徐々の拡大を含みうる。ｐＨシフトアップは、一連の不連続ステップ又は増分で不感帯を繰り返し拡大させることを含みうる。ｐＨシフトアップは、不感帯が第二ｐＨを包含するまで、一連の不連続ステップ又は増分で第一ｐＨに設定されたｐＨ設定点についての初期値から不感帯を繰り返し拡大させ、ついでｐＨ設定点を第二ｐＨに上昇させることを含みうる。不感帯は、ｐＨ設定点が第二ｐＨに増加されると同時に、第二ｐＨに設定される設定点についてのその初期値に復元されうる。あるいは、不感帯はその初期値とは異なる値に復元されうる。不感帯は、第一ｐＨを包含しない値に復元されうる。
【００７３】
例えば、本方法は、ｐＨ７．００での第一培養段階とｐＨ７．２０での第二培養段階を含み得；第一培養段階及び第二培養段階におけるｐＨ設定点は、±０．０５の不感帯を有し得；ｐＨシフトアップは、第一ｐＨに設定された設定点についての不感帯を±０．０５から一連の増分、例えば４つの増分でｐＨ７．２０を含む値まで徐々に拡大させることを含みうる。次に、不感帯は、ｐＨが第二ｐＨに増加される同時に、第二ｐＨに設定されたｐＨ設定点について±０．０５に復元されうる（ｐＨ７．２０±０．０５）。図９Ａは、この実施態様に係る方法を示す。
【００７４】
ｐＨシフトアップは、一連の増分又は不連続ステップで不感帯を拡大することを含みうる。増分は０．０５ｐＨ単位でありうる。増分、又は不連続ステップは、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、又は０．０５ｐＨ単位であり得、あるいは０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、又は０．０５ｐＨ単位未満でありうる。少なくとも２、３、４、又は５の増分がありうる。増分は、互いに同じサイズでも、異なるサイズでもよい。例えば、±０．０５の不感帯は、次のように、０．０５ｐＨ単位の一連の４増分で、±０．２５まで拡大されうる：±０．１０まで、±０．１５まで、±０．２０まで、±０．２５まで。
【００７５】
不感帯は、一連の増分又は不連続ステップで拡大され得、各増分又は不連続ステップは、約１２時間、又は少なくとも１２時間、維持されうる。各増分又は不連続ステップは、約２、４、６、８、１２、１８、又は２４時間、又は少なくとも２、４、６、８、１２、１８、又は２４時間、維持されうる。増分は、互いに同じ期間、又は異なる期間を有しうる。
【００７６】
ｐＨシフトアップは、ある期間にわたる不感帯の連続的な徐々の拡大を含みうる。ｐＨシフトアップは、第一ｐＨに設定されたｐＨ設定点についての初期値から、不感帯が第二ｐＨを包含するまで、不感帯を連続的に拡大させ、次にｐＨ設定点を第二ｐＨまで上昇させることを含みうる。不感帯は、ｐＨ設定点が第二ｐＨに上昇されると同時に、第二ｐＨに設定される設定点についてのその初期値に復元されうる。あるいは、不感帯はその初期値とは異なる値に復元されうる。不感帯は、第一ｐＨを包含しない値に復元されうる。
【００７７】
例えば、本方法は、ｐＨ７．００での第一培養段階とｐＨ７．２０での第二培養段階を含み得；第一培養段階と第二培養段階におけるｐＨ設定点は、±０．０５の不感帯を有し得；ｐＨシフトアップは、第一ｐＨに設定される設定点についての不感帯を、±０．０５からｐＨ７．２０を包含する値に連続的に拡大することを含みうる。次に、不感帯は、ｐＨが第二ｐＨに上昇されると同時に、第二ｐＨに設定されたｐＨ設定点についての±０．０５に復元されうる（ｐＨ７．２０±０．０５）。
【００７８】
不感帯が連続的に拡大される期間は、２４〜７２時間、３６〜６０時間、又は約４８時間でありうる。この期間は、少なくとも６、１２、２４、３６、又は４８時間でありうる。
ある状況では、不感帯の漸進的な上昇が好ましい場合がある。例えば、技術的な制限により、連続的な上昇でｐＨ設定点を徐々に上昇させるようにバイオリアクターをプログラムできない場合や、技術的な制限により、不感帯を連続的に拡大するようにバイオリアクターをプログラムできない場合などである。
【００７９】
ｐＨシフトアップは、設定点の上昇と不感帯の拡大を、上記の任意の作用可能な組み合わせで含みうる。幾つかの状況では、図２Ａ〜９Ａに示される実施態様における組み合わせは、例えば、ｐＨの変動（ｐＨの乱れ）を最小限に抑えるために好ましい場合がある。
【００８０】
ｐＨはオンライン又はオフラインで測定されうる。ここで検討されるｐＨ値は、特に明記しない限り、オンライン値を意味する。ｐＨは３７．０±１．０℃で測定されうる。ｐＨは３６．５±１．０℃で測定されうる。ｐＨは、製造用発酵のためのバイオリアクターにおいて使用される温度で測定されうる。オンライン測定の場合、ｐＨはバイオリアクター内のプローブによって測定される。オンライン測定に適したｐＨプローブには、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ ＩｎＰｒｏのｐＨセンサーが含まれる。オフライン測定の場合、例えば温度制御されたサンプル容器内において、ｐＨはバイオリアクターからのサンプルにおいてプローブによって測定される。オフライン測定に適した装置には、Ｋｎｉｃｋ Ｐｏｒｔａｖｏ９０７のｐＨメーター、ｐＨ３３１０ＷＴＷ、及びＭｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ ＩｎＰｒｏ Ｓｅｍｉ−Ｍｉｃｒｏ ｐＨ電極が含まれる。適切なサンプリング装置には、Ｓ−Ｓ−ＭＯＮＯＶＥＴＴＥ（登録商標）９ｍＬ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）が含まれる。
【００８１】
オフラインｐＨ測定の手順は次の通りでありうる：測定温度の水浴に又はアルミニウムブロックを浸漬することにより、ベンチトップｐＨ電極を測定温度（例えば、３７．０±１．０℃）に予熱する；次に、サンプルを測定温度（例えば、３７．０±１．０℃）に加熱し、サンプルが測定温度に到達したら直ぐ（例えば、３分後）ｐＨを測定する；次に、安定したｐＨ値に達するまで待つ（例えば、１分未満）；安定なｐＨ値はオフライン測定値として使用される。較正緩衝液、例えばデュラカル緩衝液（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を、ｐＨ測定装置を較正するために使用することができる。
【００８２】
オンライン測定値がオフライン測定値と大幅に異なる場合、オンライン測定値は再校正されうる。例えば、オンライン測定値が０．０５ｐＨ単位を超えて異なる場合である。再校正手順は、最初のサンプルがオンライン値と０．０５ｐＨ単位を超えて異なるオフラインｐＨ値を有していると測定された場合、バイオリアクターから第二のサンプルを採取することを含みうる。第二のサンプルもまたオンライン値と０．０５ｐＨ単位を超えて異なるオフラインｐＨ値を有する場合、オンライン（内部）ｐＨプローブは、オフライン（外部）ｐＨプローブで決定されたｐＨ値に設定することによって再校正される。
【００８３】
本発明の方法は、培養培地へのｐＨシフトアップフィード培地の添加を含みうる。ｐＨシフトアップフィード培地は、培養培地に対してアルカリ性（塩基性）ｐＨを有しうる。あるいは、又は加えて、ｐＨシフトアップフィード培地は、細胞によって代謝されたときに培養培地のｐＨを上昇させる栄養分などの因子を含みうる。例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸及びアラニンなどの所定のアミノ酸は、細胞によって代謝されてアンモニウムを生じる。ｐＨシフトアップフィード培地は、グルタミン酸、アスパラギン酸及び／又はアラニンを含みうる。
【００８４】
あるいは、又は加えて、ｐＨシフトアップは、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、又はＮａＨＣＯ３などのアルカリ剤（塩基）を培養培地に添加することを含みうる。アルカリ剤は、塩基、アルカリ、及びアルカリ塩と呼ばれる場合がある。
【００８５】
あるいは、又は加えて、ｐＨシフトアップは、細胞培養が培養培地のｐＨを上昇させる細胞代謝物を蓄積することを可能にすることを含みうる。
あるいは、又は加えて、ｐＨシフトアップは、例えばバイオリアクターからＣＯ２をストリッピングすることにより、培養培地から溶存ＣＯ２を除去することを含みうる。バイオリアクターからＣＯ２を取り除くと、溶存ＣＯ２が培養培地から排出される。培養培地のｐＨは溶存ＣＯ２と重炭酸塩（ＨＣＯ３−）のバランスに依存するため、培養培地からの溶存ＣＯ２の除去は、培養培地のｐＨが変化させうる。
【００８６】
ｐＨシフトアップフィード培地の添加及び／又は細胞培養が培養培地のｐＨを上昇させる代謝物を蓄積することを可能にすることを含む幾つかの実施態様では、本方法は、２４時間当たり０．１５、０．２０、０．２５、又は０．５ｐＨ単位より速い速度でのｐＨの上昇を含まない。
ｐＨシフトアップフィード培地の添加及び／又は細胞培養が培養培地のｐＨを上昇させる代謝物を蓄積することを可能にすることを含む幾つかの実施態様では、本方法は、また、培養培地へのアルカリ試薬（塩基）、例えばＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３の濃溶液の添加を含まない。アルカリ試薬（塩基）の濃溶液は、例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０Ｍを超える濃度を有するものである。ｐＨシフトアップが塩基の濃溶液の添加を含まない方法は、有利には培養浸透圧の増加を最小限に抑えうる。
【００８７】
ｐＨシフトアップフィード培地の添加は、単一の工程ステップで細胞培養のフィードと細胞培養のｐＨの上昇の両方を効率的に可能にするので、本発明の流加法では有利である。所定の期間にわたるｐＨシフトアップフィード培地の添加はまた所定の期間にわたるｐＨの漸進的な上昇を促進し、これは、上で検討されたように有利でありうる。
【００８８】
本発明の方法は、培養培地に細胞を播種することを含む。細胞を培養培地に播種するとは、一又は複数の細胞又は細胞の集団を無菌培養培地に添加することを意味する。播種はシーディングと呼ばれる場合もある。培養工程の期間とタイミングの文脈では、培養培地への細胞の播種は、工程の０日目を定義する。
【００８９】
本発明の方法は、流加法でありうる（Ｗｈｉｔｆｏｒｄ，２００６）。流加法は、細胞が培養容器又はバイオリアクターで培養され、培養工程中にバイオリアクターに細胞増殖又は産生物形成に必要な一又は複数の栄養分が添加される細胞培養方法又は発酵方法である。栄養分は培養容器に連続的又は断続的に添加されうる。栄養分はフィード培地の形態で添加されうる。栄養分には、糖及びアミノ酸、並びにビタミン、ヌクレオシド、有機化合物、及び無機金属塩が含まれる。フィード培地は、糖（単糖又は二糖）、アミノ酸、ビタミン、ヌクレオシド、有機化合物、及び無機金属塩を含みうる。細胞は、細胞及び／又は細胞産生物が収集されるまで、細胞培養工程全体を通じてバイオリアクター中に残る。
【００９０】
対照的に、バッチ法は、細胞と全ての必要な培養培地成分が発酵工程の初めに培養容器に添加され、その後は栄養分が培養容器に添加されない細胞培養方法である。流加法とは異なり、バッチ法では、培養物へのフィード培地の添加はない。例えば、バッチ法では、糖（例えば、グルコース）の添加も、及び／又はアミノ酸の添加もない。
本発明の流加法は、バッチ法ではない。本発明の流加法は、培養培地への糖の添加を含みうる。本発明の流加法は、培養培地へのフィード培地の添加を含みうる。
【００９１】
細胞は培養培地に播種される。培養培地は、市販の培地でありうる。培養培地は化学的に既知組成であり、タンパク質や血清を含まず、例えばＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，フォーミュラ番号Ａ１５６４９）でありうる。
本発明の流加法では、フィード培地（「フィード１」）が培養培地に添加される。この文脈において、初期培養培地は、流加培養法中にフィード培地が補充される基本培地と呼ばれうる。基本培地は、化学的に既知組成であり、タンパク質や血清を含まず、例えばＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，フォーミュラ番号Ａ１５６４９）でありうる。基本培地は、供給業者又は製造業者の説明書に従って使用される、カスタム培地を含む、任意の適切な市販培地でありうる。
【００９２】
フィード培地は、追加のメチオニン、スレオニン、セリン、チロシン及びグリシンを含みうる。フィード培地は、約０．５ｇ／ｌ〜約１．５ｇ／ｌの範囲の各濃度で、追加のメチオニン、スレオニン、セリン、チロシン及びグリシンを含みうる。
フィード培地は、１日当たりの初期培養重量の約２．０〜約３．０重量％の範囲で培養培地に添加されうる。
【００９３】
フィード培地は、例えば、フィードベース５培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０７４−９１０１１ＤＷ）、フィードベース２培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０７４−９１００７ＭＶ）、フィードベース６培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０７４−９１０１２ＭＷ）、最小必須培地ビタミン（ＭＥＭ１００×、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０７４−９１００８ＢＸ）、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，フォーミュラ番号Ａ１５６４９）、及びＳＰＥ（Ｌｏｎｚａ Ｖｅｒｖｉｅｒｓ Ｓｐｒｌ，カタログ番号ＢＥＳＰ５３１Ｆ）を含むフィード培地でありうる。フィード培地は、特定の比率のフィードベース５培地、フィードベース２培地、フィードベース６培地、最小必須培地ビタミン、ＳＰＥ及びＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ培地を含む培地でありうる。フィード培地は、フィードベース５培地、フィードベース２培地、及びフィードベース６培地を組み合わせてフィード培地を提供することにより調製され得、最小必須培地ビタミン、ＳＰＥ及びＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ培地の何れもまたフィード培地に含めることができる。フィード培地は、供給業者又は製造業者の説明書に従って使用される、カスタム培地を含む、任意の適切な市販培地でありうる。
【００９４】
本発明の流加法は、ｐＨシフトアップフィード培地（「フィード２」）の添加を更に含みうる。ｐＨシフトアップフィード培地は、細胞によって代謝されるとｐＨを上昇させる栄養分を含みうる。ｐＨシフトアップフィード培地は、フィード培地と比較して高レベルのグルタミン酸、アスパラギン酸及び／又はアラニンを含みうる。ｐＨシフトアップフィード培地は、追加のリジン、スレオニン、セリン、バリン、ロイシン及びトリプトファンを含みうる。ｐＨシフトアップフィード培地は、約０．５ｇ／ｌ〜約６．０ｇ／ｌの範囲の各濃度で、追加のリジン、スレオニン、セリン、バリン、ロイシン及びトリプトファンを含みうる。
【００９５】
ｐＨシフトアップフィード培地は、例えば、フィードベース８培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０７４−９１０１３ＲＷ）及びフィードベース９培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０７４−９１０１４ＥＷ）を含むフィード培地でありうる。ｐＨシフトアップフィード培地は、フィードベース８培地とフィードベース９培地を組み合わせてｐＨシフトアップ培地を提供することにより調製されうる。ｐＨシフトアップ培地は、約１０〜１１のｐＨを有しうる。フィードベース８培地とフィードベース９培地の相対的な比率は、例えば実験方法の準備デザインにおいて、常套的な手法を使用して、任意の細胞培養において所望されるｐＨシフトアップを達成する効果について調整され試験されうる。
【００９６】
ｐＨシフトアップフィード培地は、培養培地に対して塩基性（アルカリ性）ｐＨを有しうる。ｐＨシフトアップフィード培地は、１０．０を超えるｐＨを有しうる。ｐＨシフトアップ培地は、８．０、９．０、又は１０．０を超えるｐＨを有しうる。ｐＨシフトアップ培地は約８．０〜１２．０、約１０．０〜１１．０、又は約１０〜１１のｐＨを有しうる。ｐＨシフトアップフィード培地は約１０．０、１０．５又は１１．０のｐＨを有しうる。ｐＨシフトアップフィード培地は、約１０又は約１１のｐＨを有しうる。
シフトアップフィード培地は、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の範囲の初期培養重量で培養培地に添加されうる。
【００９７】
本発明の流加法は、第一培養段階中に培養培地にフィード培地を添加し、その後、培養培地にｐＨシフトアップ培地を添加することを含みうる。フィード培地は、以下で検討されるように、所定の日数の後に、ｐＨシフトアップ培地で置換されうる。培養物へのｐＨシフトアップ培地の添加は、以下で検討されるように、ｐＨシフトアップの数日前に行われうる。
追加のグルコースフィード溶液が、適切なグルコース濃度、例えば≧３ｇ／ｌを維持するために培養物に添加されうる。
【００９８】
以下の実験例は、（ｐＨシフトアップ培地の成分ではなく）本発明に従って実施される方法において有利な効果を引き起こすのは、ｐＨシフトアップ自体であることを証明している。これは、本発明に係る方法の各実施例が、ｐＨシフトアップ培地が発酵槽に添加されるが、ｐＨの如何なる上昇もＣＯ２の添加により抵抗を受ける対照方法と比較されるためである（例えば、実施例１に記載されたプロトコルを参照）。これは、実施例２〜９及び実施例１０の方法＃１において観察された有利な効果が、本発明の方法に係るｐＨシフトアップに直接起因することを意味する。本発明の方法に係るｐＨシフトアップは、任意の適切な培養培地を使用して実施されうる。
【００９９】
実施例１０はまた本発明に係るｐＨシフトアップ（ｐＨシフトアップの後に第一培養段階よりも高いｐＨでの第二培養段階が続く、方法＃１）が、ｐＨシフトアップがあるが、第一培養段階（細胞が培地に播種された培養段階、又は０日目で始まる培養段階）より高いｐＨでの培養段階がない方法（方法＃２）と比較して有利であることを実証する。
培養工程の期間とタイミングの文脈において、培養培地への細胞の播種は、工程の０日目を定義する。
【０１００】
本発明の方法は、３、４、５又は６日の持続期間、又は少なくとも３、４、５又は６日の持続期間を有する第一培養段階を含みうる。第一培養段階は、１、２、４、６、８、１２、又は１８時間、又は少なくとも１、２、４、６、８、１２、又は１８時間の持続期間を有しうる。第一培養段階は、３〜１０日、４〜１０日、４〜８日又は４〜６日の持続期間を有しうる。第一培養段階は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の持続期間を有しうる。第一培養段階は、細胞培養培地への細胞の播種で始まりうる。哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である場合、第一培養段階は６、７、８又は９日の持続期間を有しうる。所定の期間を有する第一培養段階への言及は、培養がその持続期間の間、第一ｐＨにあるか、又はそれに維持されることを特に意味しうる。この文脈において、「維持される」は「連続的に維持される」を意味しうる。すなわち、本発明の方法は、１、２、４、６、８、１２、又は１８時間の間、又は少なくとも１、２、４、６、８、１２、又は１８時間の間；あるいは３〜１０日、４〜１０日、４〜８日、又は４〜６日の間；あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の間、細胞を第一ｐＨで培養し、又は第一ｐＨを維持し、又は第一ｐＨに設定される設定点を維持することを含む第一培養段階を含みうる。
【０１０１】
本発明の方法は持続性ｐＨシフトアップを含む。持続性ｐＨシフトアップは、所定の持続期間、維持されるｐＨシフトアップである。例えば、持続性ｐＨシフトアップは、少なくとも１時間、又は第一及び／又は第二培養段階に対する持続期間としてここに開示される持続期間の間、維持されるｐＨシフトアップでありうる。本発明の方法は、４、５、又は６日又は少なくとも４、５、又は６日の持続期間を有する第二培養段階を含みうる。第二培養段階は、１、２、４、６、８、１２、又は１８時間、又は少なくとも１、２、４、６、８、１２、又は１８時間の持続期間を有しうる。第二培養段階は、３〜１０日、４〜１０日、４〜８日又は４〜６日の持続期間を有しうる。第二培養段階は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日、あるいは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の持続期間を有しうる。第二培養段階は、工程の終了まで継続しうる。第二培養段階は、細胞及び／又は細胞によって発現された産生物の収集で終了しうる。哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である場合、第二培養段階は、６、７、８又は９日の持続期間を有しうる。所定の持続期間を有する第二培養段階への言及は、培養がその持続期間の間、第二ｐＨにあるか又はそれに維持されることを特に意味しうる。この文脈において、「維持される」は「連続的に維持される」を意味しうる。すなわち、本発明の方法は、１、２、４、６、８、１２、又は１８時間の間、又は少なくとも１、２、４、６、８、１２、又は１８時間の間；あるいは３〜１０日、４〜１０日、４〜８日、又は４〜６日の間；あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の間、細胞を第二ｐＨで培養し、又は第二ｐＨを維持し、又は第二ｐＨに設定される設定点を維持することを含む第二培養段階を含みうる。
【０１０２】
本発明の方法は、哺乳動物細胞を培養するための方法であり得、該方法は、第一培養段階と第二培養段階を含み、第一培養段階は、第一ｐＨであるか又はそれに維持され、第二培養段階は、第一ｐＨよりも高い第二ｐＨにあるか又はそれに維持される。第一培養段階は、哺乳動物細胞を第一ｐＨの培養培地中に播種することを含みうる。本方法は流加法でありうる。本方法は、温度が実質的に一定の値に維持される方法でありうる。本方法は、哺乳動物細胞が抗体を発現することができる方法でありうる。
【０１０３】
本発明の方法は、ｐＨ設定点を使用してｐＨを制御することを含み得、本方法は、設定点が第一ｐＨに設定される第一培養段階と、設定点が第二ｐＨに設定される第二培養段階とを含む。第一培養段階は、哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種することを含みうる。第一培養段階は、設定点がその持続期間の間、第一ｐＨで維持される、上記のように特定の持続期間を有しうる。第二培養段階は、設定点がその持続期間の間、第二ｐＨで維持される、上記のように特定の持続期間を有しうる。
【０１０４】
本開示の文脈において、「細胞を培養する」とは、特定の持続期間、特定のｐＨで細胞を培養することを意味しうる。これは、より具体的には、特定の持続期間、維持される特定のｐＨで細胞を培養することを意味しうる。これは、特定の持続期間、特定のｐＨ設定点を使用して細胞を培養することを意味しうる。例えば、「第二ｐＨで細胞を培養する」ことを含む第二培養段階への言及は、第二ｐＨに設定された設定点を使用して特定の持続期間、第二ｐＨで細胞を培養することを意味しうる。
【０１０５】
本発明の方法は、６〜８日目（１４４〜１９２時間）での、又はそこから始まるｐＨシフトアップを含みうる。本発明の方法は、５〜９日目又は４〜１０日目のｐＨシフトアップを含みうる。本方法は、４、５、６、７、８、９、又は１０日目、又は４、５、６、７、８、９、又は１０日目以降にｐＨシフトアップを含みうる。哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である場合、本方法は、６日目（１４４時間）、１５６時間、７日目（１６８時間）、又は８日目（１９２時間）にｐＨシフトアップを含みうる。
【０１０６】
ｐＨシフトアップの最適なタイミングは、一連の準備、実験デザイン、過程において決定されうる。例えば、ｐＨシフトアップのタイミングは、重要な産生物品質パラメーターを望ましい範囲内に保持しながら（例えば、その治療用産生物の承認においてＦＤＡ又はＥＭＥＡによって指定された特定の範囲内に重要品質特性を維持しながら（以下を参照））、最終産生物の力価を最大化するように選択されうる。ｐＨシフトアップのタイミングは、臨床的用途に適した産生物品質プロファイルで最大の産生物力価を生じるｐＨシフトアップのタイミングを決定するために一連の準備、実験デザイン、過程において最終産生物の力価を測定することにより、決定されうる。このような場合、産生物の力価と品質は、ｐＨシフトアップのタイミングが変化させられ、ｐＨシフトアップのタイミングが、最大の産生物力価と臨床的用途に適した産生物品質プロファイルを生じる方法を提供するために決定される日に起こるように選択される、一連の準備方法（これは本方法のスケールを縮小したバージョンでありうる）で測定できる。産生物品質プロファイルは、グリコシル化、ＩＥＣパターン、電気泳動パターン、質量分析、クロマトグラフィー、又はキャリパーデータを測定することによって決定されうる。
【０１０７】
臨床的用途に適した産生物品質プロファイルは、特定の治療用産生物についてＦＤＡ又はＥＭＥＡによって承認されたものでありうる。例えば、承認された産生物は、サイズ関連バリアント、電荷関連バリアント、トリスルフィド含有量、Ｆｃグリコシル化、微小不均一性、グリケーション、作用機序関連の生体機能、配列バリアント、細胞年齢に関連する産生物修飾及びプロセス関連の不純物の何れか又は全てに関して所定の特性を有していることが必要とされうる。細胞レベルでの治療用産生物の特定の作用機序（ＭｏＡ）は、通常十分に記載されている。ＭｏＡ、非臨床的安全性データ、臨床試験の登録、及び臨床試験結果の初期段階に基づいて、任意の特定の薬物に対する一連の品質パラメーターは明確に定められうる。後期の原薬の製造では、原薬は、望ましい治療効果を達成するために、類似又は同等の品質を維持すべきである。重要な原薬の品質パラメーターは、薬物ごとに異なりうる。これらの品質パラメーターには通常、グリコシル化、グリケーション、アミノ酸誤取り込み、Ｃ末端リジン除去、Ｃ末端アミド化、システインへの付加、不正確なジスルフィドペアリング、トリスルフィド形成、脱アミド化、スクシンイミド形成、硫酸化、リン酸化、Ｍｅｔ／Ｔｒｐ酸化、γ−カルボキシル化、β−ヒドロキシル化などが含まれる。
【０１０８】
所定の特性は、産生物の安全性又は有効性に影響を与える可能性があるため、製造及び保管時に管理されなければならない重要品質特性（ＣＱＡ）として分類される。治療用抗体などの治療用タンパク質の製造は、一貫した産生物品質を提供するために、明確化された限界内にＣＱＡの望ましいレベルを管理するように設計されている。
【０１０９】
ここに開示される方法において、ｐＨシフトアップのタイミング、適切な全工程持続期間、又は収集時間などの変数は、臨床応用のための許容可能な産生物品質プロファイルを伴う最大最終産生物力価の基準によって決定されうる。
【０１１０】
本発明の流加法は、フィード培地を培養物に添加することを含みうる。フィード培地は、１〜３日目に添加されうる。フィード培地は、１〜３日目、１〜４日目、１〜５日目、又は１〜６日目に添加されうる。図中、フィード培地は「フィード−１」と記載される。
【０１１１】
本発明の流加法は、ｐＨシフトアップフィード培地を培養物に加えることを含みうる。ｐＨシフトアップフィード培地は４〜１４日目に添加されうる。ｐＨシフトアップフィード培地は、工程の４、５、６、又は７日目とその後の各日に添加されうる。フィード培地は、工程の４日目、５日目、６日目、又は７日目以降に、ｐＨシフトアップフィード培地で置き換えることができる。図中、ｐＨシフトアップフィード培地は「フィード−２」と記載される。ｐＨシフトアップフィード培地は、例えば、細胞によって産生される酸性代謝物を中和することによって、細胞培養培地のｐＨのシフトダウンを防止しうる。あるいは、ｐＨシフトアップフィード培地は、細胞培養培地のｐＨを上昇させうる。
【０１１２】
本発明の流加法は、適切なグルコース濃度を維持するために、ｐＨシフトアップ培地が培養物に添加される日に、培養物にグルコース溶液を補充することを含みうる。
【０１１３】
本発明の方法は、少なくとも６日、又は少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８日の持続期間を有しうる。全持続期間は、播種の日（０日目）から細胞及び／又は細胞によって発現された産生物の収集の日までの持続期間でありうる。哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である場合、本方法は１４日の持続期間を有しうる。工程の合計日数は、「実行期間（ランタイム）」とも呼ばれる。本方法の実行期間は、最大産生物力価、又は産生物品質プロファイルが一定の最大産生物力価に対して選択されうる。産生物品質プロファイルは、臨床応用のために予め定義されうる。産生物品質プロファイルは、グリコシル化、及び／又はイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）パターンを測定することによって決定されうる。
【０１１４】
第一培養段階は、１〜５、１〜４又は１〜３日の持続期間を有しうる。ｐＨシフトアップは、約１０又は３０分、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、２４、３６、４８、５２、又は６０時間の持続期間を有し得、又は約２〜７２、２〜６０、２〜５２、２〜４８、８〜５２、１２〜５２、１２〜４８、２４〜５２又は２４〜４８時間の持続期間を有しうる。ｐＨシフトアップは、少なくとも約１０又は３０分、又は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、２４、３６、４８、５２、又は６０時間の持続期間を有し得、又は少なくとも約２〜７２、２〜６０、２〜５２、２〜４８、８〜５２、１２〜５２、１２〜４８、２４〜５２又は２４〜４８時間の持続期間を有しうる。第二培養段階は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日、又は約４〜１４、５〜１４、６〜１４、７〜１４、又は８〜１４日の持続期間を有しうる。
【０１１５】
本方法は、収集工程を含みうる。収集工程では、細胞及び／又は産生物が収集される。収集工程は本方法を終結させる。収集工程は、１０〜１８日目、例えば１４日目でありうる。
【０１１６】
収集工程のタイミングは、細胞生存率を毎日測定することによって決定されうる。収集工程は、細胞生存率が８５％、８０％、７５％又は７０％未満となる工程の最初の日に実施されうる。
【０１１７】
本発明の方法における収集工程のタイミングは、対照方法における乳酸の蓄積を測定することにより決定されうる。対照方法は、第一ｐＨが工程全体にわたって（第一及び第二培養段階の両方を通じて）維持されることを除いて、本発明の方法と同一である。乳酸は、対照方法において毎日測定される。収集工程は、乳酸の少なくとも４日、少なくとも５日、又は少なくとも６日連続の増加が測定された後の対照方法の第二培養段階の最初の日に対応する日数で実施されうる。本発明の方法において、前日と比較して乳酸の増加が測定されない日にのみ収集工程が実施されうるという追加の基準が適用されうる。
【０１１８】
収集工程のタイミングは、産生物力価を測定することによって決定されうる。収集工程のタイミングは、どのタイミングが臨床応用に適した産生物品質プロファイルを備えた最高の産生物力価をもたらすかを決定するために一連の準備、実験デザイン、過程において最終産生物力価を測定することによって決定されうる。そのような場合、産生物力価及び品質は、準備過程（本発明の方法の縮小バージョンである場合もあれば、本発明の方法と同一である場合もある）において毎日測定することができ、収集工程は臨床応用に適した産生物品質プロファイルを備えた最高の産生物力価の日に行われるように選択されうる。
【０１１９】
収集工程のタイミングは、産生物品質を測定することにより決定されうる。産生物品質は、グリコシル化（例えば、ガラクトシル化、高マンノース構造）の点から、又はそれを超えると産生物が最適ではない閾値を有するインビトロ又はインビボ活性の点から、測定できる。そのような場合、産生物品質は、準備過程（本発明の方法の縮小バージョンである場合もあれば、本発明の方法と同一である場合もある）において毎日測定することができ、収集工程は、産生物品質が準備過程において最適ではないと決定された日の前日に行われる。
【０１２０】
本発明の方法の温度は、実質的に一定の値に維持されうる。
温度が実質的に一定の値に維持されている場合、有意な温度シフトはない。有意な温度シフトは、約０．５、１．０、１．５、２．０、３．０、４．０、又は５．０℃以上のシフトとして定義されうる。実質的に一定の値は、目標値の±０．１℃、±０．２℃、±０．３℃、±０．４℃、±０．５℃、±１．０℃、±１．５℃、又は±２．０℃以内でありうる。目標値は３５．０、３５．５、３６．０、３６．５、３７．０、又は３７．５℃でありうる。
【０１２１】
実質的に一定の値の温度は、３６．０〜３７．０℃でありうる。すなわち、温度は３６．０℃と３７．０℃の値の間に維持されうる。同様に、実質的に一定の値の温度は、３６．４〜３６．６℃でありうる。実質的に一定の値の温度は、３６．５℃でありうる。温度は、バイオリアクターのオンライン温度センサーを使用して測定されうる。
【０１２２】
本方法の温度を実質的に一定の値に維持することは、本方法中の有意な温度シフトによって引き起こされる問題を有利に回避することができる。組換えタンパク質の産生のための細胞培養方法における温度の低下は、産生物品質に望ましくない変化（例えば、グリコシル化の変化）を引き起こし得、又は細胞生産性の損失を引き起こしうる。温度の低下は、細胞生産性の指標であり、従って最終産生物力価と一般的に相関する積分生細胞密度を低下させうる。
【０１２３】
哺乳動物細胞は組換え細胞でありうる。組換え細胞は、異種タンパク質をコードする核酸配列を含みうる。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、より具体的には組換えＣＨＯ細胞でありうる。哺乳動物細胞はＣＨＯ Ｋ１でありうる。哺乳動物細胞はＣＨＯ Ｋ１ＳＶでありうる。哺乳動物細胞は、ＢＨＫ細胞、より具体的には組換えＢＨＫ細胞でありうる。哺乳動物細胞は、ＢＨＫ−２１細胞でありうる。哺乳動物細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞でありうる。哺乳動物細胞は、骨髄腫細胞株に由来しうる。哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３及びその派生体並びにＰＥＲ．Ｃ６などのヒト細胞株でありうる。哺乳動物細胞は、抗体を発現することができる可能性がある。哺乳動物細胞は、抗体をコードする核酸を含みうる。抗体をコードする核酸は、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターに作用可能に連結されうる。抗体は、多重特異性抗体、抗体断片、多重特異性機能を有する抗体断片、融合抗体、又は融合抗体断片でありうる。抗体はモノクローナル抗体でありうる。抗体は治療用抗体でありうる。抗体は二重特異性抗体でありうる。抗体はヒト化抗体でありうる。抗体は抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ−ＣｒｏｓｓＭａｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ２０１１；Ｆｅｎｎ ２０１３）でありうる。
【０１２４】
本方法は、哺乳動物細胞によって発現される産生物を産生するための方法でありうる。
【０１２５】
哺乳動物細胞は、産生物を発現するように操作されうる。細胞を遺伝子操作して目的のタンパク質を発現させるための発現系、方法、及びベクターは、当業者によく知られている；例えば、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3版(2001)に様々な技術が例証されている。哺乳動物細胞は、ＧＳ遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｐｌｃ，Ｓｌｏｕｇｈ ＵＫ）を使用して産生物を発現するように操作されうる。
【０１２６】
産生物は組換えタンパク質でありうる。産生物は抗体でありうる。抗体は、多重特異性抗体、抗体断片、多重特異性機能を有する抗体断片、融合抗体、又は融合抗体断片でありうる。抗体はモノクローナル抗体でありうる。抗体は治療用抗体でありうる。抗体は二重特異性抗体でありうる。抗体は、ＣｒｏｓｓＭＡｂ抗体などの二価の二重特異性抗体でありうる（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等，２０１１；Ｆｅｎｎ等，２０１３）。抗体は、抗体の生物学的に機能的な断片でありうる。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、単鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【０１２７】
産生物は、Ａｎｇ２とＶＥＧＦに結合する二価の二重特異性抗体でありうる。産生物は、Ａｎｇ２とＶＥＧＦに結合する二価の二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体でありうる。産生物は、抗体抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ−ＣｒｏｓｓＭａｂでありうる（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等 ２０１１；Ｆｅｎｎ等 ２０１３）。産生物はバヌシズマブであり得、すなわち、産生物は、ＩＮＮバヌシズマブを有する抗体抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ−ＣｒｏｓｓＭａｂでありうる。産生物は、国際公開第２０１１／１１７３２９号に記載されている抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ−ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体であり得、又は国際公開第２０１１／１１７３２９号に記載されている抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ−ＣｒｏｓｓＭａｂの第一及び第二抗原結合部位の、重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を有するか、又はＶＨ及びＶＬドメインアミノ酸配列を有する抗体、又は国際公開第２０１１／１１７３２９号に記載されている抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ−ＣｒｏｓｓＭａｂの断片でありうる。産生物は、バヌシズマブの第一及び第二抗原結合部位の、重鎖及び軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を有するか、又はＶＨ及びＶＬドメインアミノ酸配列を有する抗体、又はバヌシズマブの治療的に活性な断片でありうる。産生物は、ＣＳＦ−１Ｒに結合するモノクローナル抗体でありうる。産生物は、ＩＮＮエマクツズマブを有する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体でありうる。産生物は、国際公開第２０１１／０７００２４号に記載されている抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体であり得、又は国際公開第２０１１／０７００２４号に記載されている抗体の（又はエマクツズマブの）、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列、又はＶＨ及びＶＬドメインアミノ酸配列を有する抗体、又は国際公開第２０１１／０７００２４号に記載されている抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の（又はエマクツズマブの）断片でありうる。あるいは、産生物は治療用タンパク質、ペプチド又は酵素でありうる。産生物は、組換えヒトグルクロニダーゼ、組換えヒト酸性αグルコシダーゼ、又は組換えヒトインスリンでありうる。本方法は、抗ＴＮＦα抗体ではない抗体を産生するための方法でありうるか、又は抗ＴＮＧα抗体を産生するための方法ではない方法でありうる。
【０１２８】
治療用抗体には、抗ＶＥＧＦ抗体抗；抗Ａｎｇ２抗体；抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体；抗ＨＥＲ２抗体 抗ＣＤ２０抗体；抗ＩＬ−８抗体；抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体；抗ＣＤ１１ｂ抗体；抗ＣＤ１１ｃ抗体；抗ＣＤ１８抗体；抗ｌｇＥ抗体；抗Ａｐｏ−２受容体抗体；抗Ａｐｏ２：／ＴＲＡＩＬ抗体；抗組織因子（ＴＦ）抗体；抗ヒトα４β７インテグリン抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ＣＤ３抗体；抗ＣＤ２５抗体；抗ＣＤ４抗体；抗ＣＤ５２抗体；抗Ｆｃ受容体抗体；抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体；乳房上皮細胞に対する抗体；大腸癌細胞に結合する抗体；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ３３抗体；抗ＣＤ２２抗体；抗ＥｐＣＡＭ抗体；抗Ｇｐｌｌｂ／ＩＩＩａ抗体；抗ＲＳＶ抗体；抗ＣＭＶ抗体；抗ＨＩＶ抗体；抗肝炎抗体；抗ＣＡ１２５抗体；抗αｖβ３抗体；抗ヒト腎細胞癌抗体；抗ヒト１７−１Ａ抗体；抗ヒト結腸直腸腫瘍抗体；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮癌；及び抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、抗ＨＬＡ ＤＲ抗体；抗ＩｇＥ抗体；抗ＨＥＲ３抗体；抗ＨＥＲ４抗体；抗ＤＲ５抗体；抗ＩＣＡＭ抗体；抗ＶＬＡ−４抗体；抗ＶＣＡＭ抗体、及び抗ＩＬ１７Ａ抗体が含まれるが、これらに限定されない。
産生物は、Ｅｐｏ−Ｆｃではないタンパク質又は抗体でありうる。
【０１２９】
本発明の方法は、産生物を単離するか、又は産生物を精製する工程を更に含みうる。産生物を単離し又は精製する工程は、イオン交換クロマトグラフィーを含みうる。産生物を単離し又は精製する工程は、産生物を含む組成物をイオン交換クロマトグラフィー材料上にロードし、場合によってはイオン交換クロマトグラフィー材料を洗浄し、及び産生物をイオン交換クロマトグラフィー材料から溶出させることを含みうる。産生物を含む組成物は、細胞培養物からの培養培地を含み得、及び／又は溶解した哺乳動物細胞でありうる哺乳動物細胞を含みうる。産生物を単離し又は精製する方法は、産生物を含む組成物を調製する工程を含みうる。産生物を含む組成物を調製する工程は、細胞を収集し、及び／又は細胞を溶解し、及び／又は細胞培養培地を収集することを含みうる。産生物を含む組成物を調製する工程は、プロテインＡクロマトグラフィーを含みうる。組成物を調製する工程は、産生物を凍結乾燥することを含みうる。組成物を調製する工程は、薬学的に許容される担体（例えば、生理食塩水）中に産生物を処方し、及び／又は一又は複数の薬学的賦形剤を含む溶液中に産生物を処方することを含みうる。
【０１３０】
本発明は本発明の方法により産生された産生物及び組成物を更に提供する。
本発明の方法は、乳酸及びアンモニウムなどの望ましくない代謝物の過剰な蓄積を回避しうる。本発明の方法は、中程度のｐＣＯ２レベル及び／又はより低い培養浸透圧の維持を改善しうる。
【０１３１】
本発明の方法は、対照方法に対して改善されたパラメーターを有する方法であり得、ここで、対照方法は、第一ｐＨが本方法全体にわたって（第一及び第二培養段階の両方を通して）維持されることを除いて、本発明の方法と同一である。例えば、対照方法は、第一培養段階のｐＨが７．００であり、第二培養段階のｐＨが７．００である方法でありうる。
【０１３２】
パラメーターは、収集工程で、又は収集工程の日に決定されうる。哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である場合、パラメーターは１４日目に決定されうる。
本発明の方法は、細胞生存率が対照方法よりも少なくとも１０％、１５％又は２０％高い方法でありうる。
本発明の方法は、乳酸レベルが対照方法よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％低い方法でありうる。
本発明の方法は、アンモニウムレベルが対照方法よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は８０％低い方法でありうる。
本発明の方法は、産生物力価が対照方法よりも少なくとも５％、１０％又は１５％高い方法でありうる。
本発明の方法は、浸透圧が対照方法より少なくとも５％低い方法でありうる。本発明の方法は、浸透圧が収集工程で５００Ｏｓｍ／ｋｇ未満である方法でありうる。
本発明の方法は、実施例２〜９と添付図によって示されるように、（実施例１におけるように）本方法全体を通してｐＨが同じ値に維持される方法と比較して改善される。
【０１３３】
本発明の方法は、実施例１０の方法＃１及び＃２によって示されるように、初期値からのｐＨシフトダウンとその後の初期値へのｐＨシフトアップを含む方法と比較してまた改善される。初期値からのｐＨシフトダウンとその後の初期値へのｐＨシフトアップを含む方法は、米国特許第８７６５４１３号に開示されている。
【０１３４】
本発明は、哺乳動物細胞培養物の寿命を延ばす方法であって、上記の本発明の方法を含む方法を更に提供する。本発明は、哺乳動物細胞培養における細胞生存率を増加させる方法であって、上記の本発明の方法を含む方法を提供する。本発明は、哺乳動物細胞培養において積分生細胞密度（ＩＶＣＤ）を増加させる方法であって、上記の本発明の方法を含む方法を提供する。本発明は、哺乳動物細胞培養物における乳酸蓄積を低下させる方法であって、上記の本発明の方法を含む方法を提供する。本発明は、哺乳動物細胞培養物におけるアンモニウム蓄積を低下させる方法であって、上記の本発明の方法を含む方法を提供する。本発明は、哺乳動物細胞培養においてｐＣＯ２プロファイルを改善する方法であって、上記の本発明の方法を含む方法を提供する。本発明は、哺乳動物細胞培養において浸透圧を低下させる方法であって、上に開示された本発明の方法を含む方法を提供する。
【０１３５】
本発明は、上で開示された本発明の方法又はプロセスを実施することにより、哺乳動物細胞培養物の寿命を延ばすため；哺乳動物細胞培養における細胞生存率を増加させるため；哺乳動物細胞培養におけるＩＶＣＤを増加させるため；哺乳動物細胞培養における乳酸蓄積を低下させるため；哺乳動物細胞培養におけるアンモニウム蓄積を低下させるため；哺乳動物細胞培養におけるｐＣＯ２プロファイルを改善するため；又は哺乳動物細胞培養における浸透圧を低下させるための、ｐＨシフトアップフィード培地、又はｐＨ上昇剤（例えば、アルカリ剤、又は塩基）の使用を更に提供する。本方法は、ｐＨシフトアップ培地又はｐＨ上昇剤を哺乳動物細胞培養物に添加して、ｐＨを第一ｐＨから第二ｐＨに上昇させることを含む。すなわち、本発明が特定の目的を達成するためのｐＨシフトアップ培地又はｐＨ上昇剤の使用である場合、その使用は、哺乳動物細胞培養の培養培地にｐＨシフトアップ培地又はｐＨ上昇剤を添加して、第一培養段階と第二培養段階の間に生じるｐＨシフトアップを行うことを含む。本発明は、哺乳動物細胞培養における産生物力価を増加させるための、ｐＨシフトアップフィード培地、又はｐＨ上昇剤（例えば、アルカリ剤、又は塩基）の使用を更に提供する。例えば、本発明は、ここに開示される哺乳動物細胞を培養するための方法において産生物力価を増加させるためのｐＨ上昇剤の使用を提供し、ここで、産生物は、哺乳動物細胞によって発現され、例えば抗体などの組換えタンパク質である。産生物力価の増加は、哺乳動物細胞培養物にｐＨ上昇剤が添加されない哺乳動物細胞培養物に対するものである。本発明は、ここに開示される産生物（組換えタンパク質産生物など）を産生するための方法における産生物力価を増加させるためのｐＨ上昇剤の使用を提供する。第二の態様では、本発明は、哺乳動物細胞を培養するための方法であって、第一ｐＨで細胞を培養することを含む第一培養段階と、第二ｐＨで細胞を培養することを含み、第二ｐＨが第一ｐＨよりも高い第二培養段階とを含み、方法の温度が実質的に一定の値に維持される方法を提供する。
【０１３６】
第三の態様では、本発明は、哺乳動物細胞が抗体を発現することができる哺乳動物細胞を培養する方法であって、第一ｐＨで培養培地中に哺乳動物細胞を播種し、細胞を第１ｐＨで培養することを含む第一培養段階と、第一ｐＨよりも高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階とを含む方法を提供する。
本発明の第二及び第三の態様は、本発明の第一の態様に関連して上で検討された本発明の方法の特徴の何れも含みうる。
【０１３７】
上記の実施態様のありとあらゆる互換性のある組み合わせは、そのような組み合わせが明らかに許容されないか又は明示的に回避される場合を除いて、ありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に記載されたかのように、ここで明示的に開示される。
ここで使用されているセクションの見出しは、整理を目的としたものであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明の様々な更なる態様及び実施態様は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。
【０１３８】
以下の特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈が他の定義を必要としない限り、「含む（comprise）」という語、及び「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形語は、記載された整数又は工程あるいは整数又は工程の群の包含を意味し、任意の他の整数又は工程あるいは整数又は工程の群の除外を意味するものではないことが理解される。「及び／又は」は、ここで使用される場合、他のものの有無を問わず、二つの特定された特徴又は構成要素のそれぞれの特定の開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、あたかもそれぞれがここで個別に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示とみなされるべきである。
【０１３９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の定義を指し示していない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。範囲は、「約」一特定値のから、及び／又は「約」別の特定値までとしてここでは表されうる。そのような範囲が表される場合、別の実施態様は、ある特定の値から及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用することにより、値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施態様を形成することが理解される。例えば、約７．２のｐＨは、７．２のｐＨでありうる。
「約」所定の数値であるｐＨ値は、それが表される精度の程度に従って解釈されうる。例えば、「約７．０」のｐＨは、ｐＨ６．９５〜７．０５を意味し得、「約１０」のｐＨは、ｐＨ９．５〜１０．５を意味しうる。
ｐＨスケールで相対的に高いｐＨ値は相対的にアルカリ性で、相対的に低いｐＨ値は相対的に酸性である。従って、本開示の文脈におけるより高いｐＨは、よりアルカリ性のｐＨを指す。
【０１４０】
文脈が他の内容を指し示さない限り、上記の特徴の説明及び定義は、本発明の如何なる特定の態様又は実施態様にも限定されず、説明される全ての態様及び実施態様に等しく適用される。
次に、本発明の所定の態様及び実施態様を、実施例によって、上記の図を参照して例証する。実施例は、この発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例は例示の目的で含められており、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。更なる態様及び実施態様は、当業者には明らかであろう。この明細書において言及されている全ての文書は、出典明示によりここに援用される。
【実施例】
【０１４１】
行った実験と達成した結果を含む次の実施例は、例証のみを目的として提供されており、全ての可能な実施態様を、特許請求の範囲により権利が与えられる均等物の全範囲と共に含んでいると解釈されなければならない。
【０１４２】
［細胞株、培養培地、及び培養方法］
次の実施例の全てにおいて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に由来する細胞株であるＣＨＯ Ｋ１ＳＶを宿主細胞株として使用した（ＧＳ遺伝子発現系，Ｌｏｎｚａ Ｂｒｏｃｈｕｒｅｓ，Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｐｌｃ，Ｓｌｏｕｇｈ ＵＫ）。ＧＳ発現ベクター系はＬｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから提供された。実施例１〜９及び１１において、一方の腕でＶＥＧＦ−Ａを、他方でＡｎｇ２を認識する（Ｓｃｈａｅｆｅｒ等，２０１１；Ｆｅｎｎ等，２０１３）二重特異性モノクローナル抗体である抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ−ＣｒｏｓｓＭａｂ（抗Ａ２Ｖ；バヌシズマブ、又はＲＧ７２２１；国際公開第２０１１／１１７３２９号に記載）を発現するように、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞を操作した。実施例１０において、ＣＳＦ−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）活性化を阻害する（Ｒｉｅｓ等，２０１４）ヒト化モノクローナル抗体（抗ＣＳＦ−１Ｒ；エマクツズマブ、又はＲＧ７１５５；国際公開第２０１１／０７００２４号に記載）を発現するように、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞を操作した。コロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）とその受容体であるＣＳＦ−１Ｒは、マクロファージとその前駆体の移動、分化、生存を調節する（Ｈｕｍｅ及びＭａｃＤｏｎａｌｄ，２０１２）。
【０１４３】
全ての場合において、市販されている無血清の既知組成のＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（商標）培地基本培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，フォーミュラ番号Ａ１５６４９）を使用して、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞を培養した。解凍後、細胞をこの培地中において５０μＭのメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ；Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｏｈｉｏ）の存在下で３〜４日のスケジュールで振盪フラスコ中で継代した。継代条件は、Ｋｕｈｎｅｒ Ｓｈａｋｅｒ Ｘプラットフォーム（Ａｄｏｌｆ Ｋｕeｈｎｅｒ ＡＧ，Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して１２５ｍＬ及び５００ｍＬフラスコに対して、３６．５℃、７％ＣＯ２、及び１６０ｒｐｍであった。
【０１４４】
培養細胞を使用して、ＭＳＸなしで約３．０×１０５細胞／ｍＬでＮ−１工程の播種を行った。製造用バイオリアクターに、ＭＳＸなしで約６．０×１０５細胞／ｍＬで播種した。細胞は、予め定められたｐＨ、溶存酸素、温度及び栄養分供給戦略での流加培養条件下、製造用バイオリアクターで培養した。特に明記しない限り、初期培養容量が１．２Ｌの２Ｌバイオリアクターを用いた。
【０１４５】
バイオリアクター内の温度を３６．５℃に制御し、撹拌速度を約２１３ｒｐｍに設定した。空気、ＣＯ２、及びＯ２を含むガス混合物を提供した。溶存二酸化炭素濃度（ｄＣＯ２）を１日１回オフラインで測定した。溶存酸素濃度（ＤＯ）はオンラインで制御し、ガス混合物中の酸素分圧を変えることにより２５％に調整した。特に断りのない限り、ＣＯ２又は１．０ＭのＮａＨＣＯ３を添加することにより、ｐＨを定められた設定点又は定められた不感帯内に維持した。
【０１４６】
フィード培地（図では「フィード−１」と記載）とｐＨシフトアップフィード培地（図では「フィード−２」と記載）には、グルコース、グルタミン、アミノ酸、増殖因子、ヌクレオシド、ビタミン、微量元素、及び塩の組み合わせを含めた。
【０１４７】
フィード培地には、フィードベース５培地（カタログ番号０７４−９１０１１ＤＷ）、フィードベース２培地（カタログ番号０７４−９１００７ＭＶ）、フィードベース６培地（カタログ番号０７４−９１０１２ＭＷ）、最小必須培地ビタミン（ＭＥＭ １００×，カタログ番号０７４−９１００８ＢＸ）、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ（商標）培地（フォーミュラ番号Ａ１５６４９）、及びＳＰＥ（Ｌｏｎｚａ Ｖｅｒｖｉｅｒｓ Ｓｐｒｌ，カタログ番号ＢＥＳＰ５３１Ｆ）を含めた。
【０１４８】
ｐＨシフトアップフィード培地には、フィードベース８培地（カタログ番号０７４−９１０１３ＲＷ）及びフィードベース９培地（カタログ番号０７４−９１０１４ＥＷ）を含めた。
【０１４９】
フィード培地とｐＨシフトアップ培地の処方は、Ｌｏｎｚａ Ｖｅｒｖｉｅｒｓ Ｓｐｒｌから入手できる。
オフライン分析のために、約１０ｍｌのサンプルをシリンジで毎日採取した。典型的には、製造期間は約１４日続いた。
【０１５０】
［細胞分析とオフライン測定］
細胞濃度と生存率は、ＣＥＤＥＸ機器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してトリパンブルー排除法によって測定した。オフライン測定は、グルコース、グルタミン、グルタミン酸、乳酸、アンモニウム、及び産生物濃度について、ＣＯＢＡＳ ＩＮＴＥＧＲＡ（登録商標）４００プラス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。
溶存二酸化炭素及び酸素は、Ｃｏｂａｓ ｂ２２１アナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｌｔｄ．ＣＨ−６３４３ Ｒｏｔｋｒｅｕｚ, Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で分析した。浸透圧は、Ｏｓｍｏｍａｔ Ａｕｔｏ Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ｇｏｎｏｔｅｃ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での凝固点降下によって測定した。
【０１５１】
実施例１：対照方法−全体を通して同一のＰＨ（一定のｐＨ設定点）
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００の一定ｐＨ設定点で、開始した。つまり、上で検討したように、培養培地（ＣＤ ＣＨＯ培地ＡＧＴ（商標）培地）に約６．０×１０５細胞／ｍＬを播種して工程を開始した（０日目）。
【０１５２】
フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１５３】
オンラインｐＨ設定点は７．００±０．０５で、二酸化炭素ガス注入を使用するか、又は１Ｍの炭酸ナトリウムを追加することで維持した。オフラインｐＨ測定値がオンライン測定値から０．０５ｐＨ単位以上ずれている場合、オンラインｐＨ測定値をオフラインｐＨ測定値と等しくなるように再校正した。
【０１５４】
培養物から工程サンプルを毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
図１は、培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定、及びフィードスケジュールを示している。
【０１５５】
実施例２：ｐＨ勾配（１４４時間と１９２時間の間でΔ０．２０）
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００のｐＨ設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１５６】
図２Ａは、培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定及びフィードスケジュールを示している。オンラインｐＨ設定点は、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。約１４４時間から開始して、ｐＨ設定点を、約４８時間の期間にわたって、ｐＨ勾配で７．００から７．２０に徐々に上昇するように設定した。約１９２時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．２０±０．０５に達し、製造工程が終了するまでこの値に維持した。工程サンプルを培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
【０１５７】
図２Ｂ−Ｇは、図２Ａ（黒い矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、ｐＣＯ２、及び浸透圧に対する効果を、図１（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。図２Ｂは、１４日間の製造工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法（１４４〜１９２時間の間でΔｐＨ０．２０単位）での細胞生存率が、そのようなｐＨ勾配を伴わない方法よりも高かったことを示している。図２Ｃは、ｐＨ勾配を伴う方法では、乳酸レベルが４〜５日目の間に約８８％の高い値に達した後、約７２％に低下し、そこで工程の最後まで維持されることを示している。工程の最後に、ｐＨ勾配を伴わない方法と比較して、より少ない量の乳酸がｐＨ勾配の設定で生成される。図２Ｄは、アンモニウムレベルが約１００時間で約８０％の高い値に達した後、約２０％まで低下し、そこで工程の最後まで維持されることを示している。ｐＨ勾配を伴わない方法と比較して、ｐＨ勾配の設定では更に少ない量のアンモニウムが生成される。図２Ｅは、工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法での産生物力価が、ｐＨ勾配を伴わない方法におけるよりも高いことを示している。図２Ｆは、ｐＨ勾配を伴う方法では、ｐＣＯ２レベルが適度に増加したが、工程の終了まで約１８％未満に維持されていたことを示している。対照的に、ｐＨ勾配を伴わない方法では、特に１６０〜３２０時間の間で、更に高いｐＣＯ２レベルが観察された。図２Ｇは、工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法での培養浸透圧が、ｐＨ勾配を伴わない方法におけるよりも低いことを示している。
【０１５８】
実施例３：ｐＨ勾配（１５６時間と２０８時間の間でΔ０．２０）
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００のｐＨ設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目の間に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１５９】
図３Ａは、培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定及びフィードスケジュールを示している。オンラインｐＨ設定点は、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。約１５６時間から開始して、ｐＨ設定点を、約５２時間の期間にわたって、ｐＨ勾配で７．００から７．２０に徐々に上昇するように設定した。約２０８時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．２０±０．０５に達し、製造工程が終了するまでこの値に維持した。工程サンプルを培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
【０１６０】
図３Ｂ−Ｇは、図３Ａ（黒い矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、ｐＣＯ２、及び浸透圧に対する効果を、図１（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。
【０１６１】
図３Ｂは、１４日間の製造工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法（１５６〜２０８時間の間でΔｐＨ０．２０単位）での細胞生存率が、ｐＨ勾配を伴わない方法よりも高かったことを示している。図３Ｃは、ｐＨ勾配を伴う方法では、乳酸レベルが約１４０時間で約８８％の高い値に達した後、約７０％に低下し、そこで工程の最後まで維持されることを示している。工程の最後に、ｐＨ勾配を伴わない方法と比較して、より少ない量の乳酸がｐＨ勾配の設定で生成される。図３Ｄは、アンモニウムレベルが約１１０時間で約１００％の高い値に達した後、約２０％まで低下し、そこで工程の最後まで維持されることを示している。ｐＨ勾配を伴わない方法と比較して、ｐＨ勾配の設定では更に少ない量のアンモニウムが生成される。図３Ｅは、工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法での産生物力価が、ｐＨ勾配を伴わない方法におけるよりも高いことを示している。図３Ｆは、ｐＨ勾配を伴う方法では、ｐＣＯ２レベルが適度に増加したが、工程の終了まで約１９％以下に維持されていたことを示している。対照的に、ｐＨ勾配を伴わない方法では、特に１６０〜３２０時間の間で、更に高いｐＣＯ２レベルが観察された。図３Ｇは、工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法での培養浸透圧が、ｐＨ勾配を伴わない方法におけるよりも低いことを示している。
【０１６２】
実施例４：ｐＨ勾配（１９２時間と２４０時間の間でΔ０．３０）
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００のｐＨ設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１６３】
図４Ａは、培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定及びフィードスケジュールを示している。オンラインｐＨ設定点は、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。約１９２時間から開始して、ｐＨ設定点は、約４８時間の期間にわたって、ｐＨ勾配で７．００から７．３０に徐々に上昇するように設定した。約２４０時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．３０±０．０５に達し、製造工程が終了するまでこの値に維持した。工程サンプルを培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
【０１６４】
図４Ｂ−Ｇは、図４Ａ（黒い矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、ｐＣＯ２、及び浸透圧に対する効果を、図１（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。
【０１６５】
図４Ｂは、１４日間の製造工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法（１９２〜２４０時間の間でΔｐＨ０．３０単位）での細胞生存率が、ｐＨ勾配を伴わない方法よりも高いことを示している。図４Ｃは、ｐＨ勾配を伴う方法では、乳酸レベルが約１４０時間で約９０％の高い値に達した後、約６０％に低下し、その後、工程の終わりの９０％未満まで徐々に上昇することを示している。工程の最後に、ｐＨ勾配を伴わない方法と比較して、より少ない量の乳酸がｐＨ勾配の設定で生成される。図４Ｄは、ｐＨ勾配を伴う方法においてアンモニウムレベルが約１１０時間で約９７％の高い値に達した後、約２８％まで急に低下し、その後、工程の終わりに約１５％の低レベルまで低下し続けることを示している。ｐＨ勾配を伴わない方法と比較して、ｐＨ勾配の設定では更に少ない量のアンモニウムが生成される。図４Ｅは、工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法での産生物力価が、ｐＨ勾配を伴わない方法におけるよりも高いことを示している。図４Ｆは、ｐＨ勾配を伴う方法では、ｐＣＯ２レベルが約２００時間で約２４％まで穏やかに増加した後、工程の終了までに約１５％未満まで低下したことを示している。対照的に、ｐＨ勾配を伴わない方法では、特に１６０〜３２０時間の間で、更に高いｐＣＯ２レベルが観察された。図４Ｇは、工程の最後に、ｐＨ勾配（１９２時間と２４０時間の間でΔｐＨ０．３０単位）を伴う方法での培養浸透圧が、ｐＨ勾配を伴わない方法におけるよりも低いことを示している。
【０１６６】
実施例５：ｐＨ勾配（１９２時間と２４０時間の間でΔ０．１０）
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００のｐＨ設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１６７】
図５Ａは、培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定及びフィードスケジュールを示している。オンラインｐＨ設定点は、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。約１９２時間から開始して、ｐＨ設定点は、約４８時間の期間にわたって、ｐＨ勾配で７．００から７．３０に徐々に上昇するように設定した。約２４０時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．３０±０．０５に達し、製造工程が終了するまでこの値に維持した。工程サンプルを培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
【０１６８】
図５Ｂ−Ｇは、図５Ａ（黒い矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、ｐＣＯ２、及び浸透圧に対する効果を、図１（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。
【０１６９】
図５Ｂは、１４日間の製造工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法（１９２〜２４０時間でΔｐＨ０．１０単位）での細胞生存率が、ｐＨ勾配を伴わない方法よりも高かったことを示している。図５Ｃは、ｐＨ勾配を伴う方法では、乳酸レベルが約１１０時間で約９０％の高い値に達した後、約５５％に低下し、プロセスの終わりに８０％未満まで徐々に上昇することを示している。工程の最後に、ｐＨ勾配を伴わない方法と比較して、より少ない量の乳酸がｐＨ勾配の設定で生成される。図５Ｄは、ｐＨ勾配を伴う方法においてアンモニウムレベルが約１１０時間で約９７％の高い値に達した後、約２７％まで急に低下し、工程の最後に約４２％の低レベルまで増加することを示している。ｐＨ勾配を伴わない方法と比較して、ｐＨ勾配の設定では更に少ない量のアンモニウムが生成される。図５Ｅは、工程の最後に、ｐＨ勾配を伴う方法での産生物力価が、ｐＨ勾配を伴わない方法におけるよりも高いことを示している。図５Ｆは、ｐＨ勾配を伴う方法では、ｐＣＯ２レベルが約２００時間で中程度の約２６％まで増加した後、工程の終了までに約２０％未満に低下したことを示している。対照的に、ｐＨ勾配を伴わない方法では、特に１６０〜３２０時間で、更に高いｐＣＯ２レベルが観察された。図５Ｇは、工程の最後に、ｐＨ勾配（１９２時間と２４０時間の間でΔｐＨ０．１０単位）のある方法での培養浸透圧が、ｐＨ勾配を伴わない方法におけるよりも僅かに高いことを示している。
【０１７０】
実施例６：即時のｐＨシフトアップ（１４４時間にΔ０．２０）
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００のｐＨ設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１７１】
図６Ａは、培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定及びフィードスケジュールを示している。オンラインｐＨ設定点は、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。約１４４時間で、ｐＨ設定点を、単一のステップで、ｐＨ±０．０５の同じ不感帯で７．００から７．２０に上昇させ、製造工程が終了するまでこの値に維持した。工程サンプルを培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
【０１７２】
図６Ｂ−Ｇは、図６Ａ（黒い矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、ｐＣＯ２、及び浸透圧に対する効果を、図１（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。
【０１７３】
図６Ｂは、１４日間の製造工程の最後に、即時のｐＨシフトアップを伴う方法（１４４時間にΔｐＨ０．２０単位）における細胞生存率が、ｐＨシフトアップを伴わない方法における細胞生存率に匹敵することを示している。図６Ｃは、即時のｐＨシフトアップを伴う方法では、乳酸レベルが約２００時間で約７８％の高い値に達した後、工程の終わりに４０％未満まで徐々に低下することを示している。工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、より少ない量の乳酸が即時のｐＨシフトアップの設定で生成される。図６Ｄは、即時のｐＨシフトアップを伴う方法においてアンモニウムレベルが約１１０時間で約９０％の高い値に達し、ついで約２０％まで急に低下した後、工程の最後までこの低レベルに維持されることを示している。ｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、即時のｐＨシフトアップの設定では少ない量のアンモニウムが生成される。図６Ｅは、工程の最後に、即時のｐＨシフトアップを伴う方法での産生物力価が、ｐＨシフトアップを伴わない方法におけるよりも高いことを示している。図６Ｆは、即時のｐＨシフトアップを伴う方法では、工程の終了までにｐＣＯ２レベルが次第に穏やかに増加して約２６％になることを示している。対照的に、ｐＨシフトアップを伴わない方法では、特に１６０〜３２０時間の間で、更に高いｐＣＯ２レベルが観察された。図６Ｇは、工程の最後に、即時のｐＨシフトアップを伴う方法での培養浸透圧が、ｐＨシフトアップを伴わない方法におけるよりもほんの僅かに高いことを示している。
【０１７４】
実施例７：ｐＨ不感帯拡大を通してのｐＨシフトアップ
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００のｐＨ設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１７５】
図７Ａは、培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定及びフィードスケジュールを示している。オンラインｐＨ設定点は、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。約１４４時間で、ｐＨ設定点は７．００のままで、ｐＨ不感帯を±０．０５から±０．２５に拡大した。約１９２時間で、ｐＨ設定点を７．００から７．２０に上昇させ、不感帯を±０．０５に戻した。ｐＨ設定点は、製造工程が終了するまでこの値に維持した。工程サンプルを培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
【０１７６】
図７Ｂ−Ｇは、図７Ａ（黒い矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、ｐＣＯ２、及び浸透圧に対する効果を、図１（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。
【０１７７】
図７Ｂは、１４日間の製造工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴う方法（１４４時間と１９２時間の間でｐＨ不感帯を拡大することによるΔｐＨ０．２０単位）における細胞生存率が、ｐＨシフトアップを伴わない方法における細胞生存率よりも高いことを示している。図７Ｃは、ｐＨシフトアップを伴う方法では、乳酸レベルが約２４０時間で約７０％の高い値に達した後、工程の終わりに４５％まで徐々に低下することを示している。工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、より少ない量の乳酸がｐＨシフトアップの設定で生成される。図７Ｄは、ｐＨシフトアップを伴う方法においてアンモニウムレベルが約１１０時間で約９０％の高い値に達し、ついで約２２％まで急に低下した後、工程の最後まで２２〜３２％の間に維持されることを示している。ｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、ｐＨシフトアップの設定では少ない量のアンモニウムが生成される。図７Ｅは、工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴う方法における産生物力価が、ｐＨシフトアップを伴わない方法におけるよりも少なくとも１０％高いことを示している。図７Ｆは、ｐＨシフトアップを伴う方法では、ｐＣＯ２レベルが約１４０時間で約１６％まで徐々に増加し、その後、工程の終了までこのレベルに維持されることを示している。対照的に、ｐＨシフトアップを伴わない方法では、特に１６０〜２８０時間の間で、更に高いｐＣＯ２レベルが観察された。図７Ｇは、工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴う方法における培養浸透圧が、ｐＨシフトアップを伴わない方法におけるよりも低いことを示している。
【０１７８】
実施例８：漸進的なｐＨ設定点の上昇
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００のｐＨ設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１７９】
図８Ａは、培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定及びフィードスケジュールを示している。オンラインｐＨ設定点は、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。約１５６時間で、ｐＨ設定点は７．０５±０．０５に上昇させ、１２時間維持した。約１６８時間で、ｐＨ設定点をｐＨ７．１０±０．０５に上昇させ、１２時間維持した。約１８０時間で、ｐＨ設定点をｐＨ７．１５±０．０５に上昇させ、更に１２時間維持した。最後に、約１９２時間で、ｐＨ設定点をｐＨ７．２０±０．０５に上昇させ、製造工程が終了するまでこの値に維持した。工程サンプルは培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
【０１８０】
図８Ｂ−Ｇは、図８Ａ（黒い矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、ｐＣＯ２、及び浸透圧に対する効果を、図１（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。
【０１８１】
図８Ｂは、１４日間の工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴う方法（１５６時間と１９２時間の間でｐＨ設定点を段階的に上昇させることによるΔｐＨ０．２０単位）における細胞生存率が、ｐＨシフトアップを伴わない方法の細胞生存率よりも高いことを示している。図８Ｃは、ｐＨシフトアップを伴う方法では、乳酸レベルが約１４０時間で約７０％の高い値に達し、その後、工程の終わりに約５８％まで徐々に低下することを示している。工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、より少ない量の乳酸がｐＨシフトアップの設定で生成される。図８Ｄは、ｐＨシフトアップを伴う方法においてアンモニウムレベルが約１１６時間で約９０％の高い値に達し、約１８８時間後に約２５％まで急に低下し、その後、工程の終わりまで２１〜２４％の間に維持されることを示している。ｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、ｐＨシフトアップの設定では少ない量のアンモニウムが生成される。図８Ｅは、工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴う方法における産生物力価が、ｐＨシフトアップを伴わない方法におけるよりも少なくとも１５％高いことを示している。図は、ｐＨシフトアップを伴う方法では、ｐＣＯ２レベルが約２１０時間で約１７％まで徐々に増加し、その後、工程の終了までこのレベルに維持されることを示している。対照的に、ｐＨシフトアップを伴わない方法では、特に１６０〜２８０時間の間で、更に高いｐＣＯ２レベルが観察された。図８Ｇは、工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴う方法における培養浸透圧が、ｐＨシフトアップを伴わない方法におけるよりも低いことを示している。
【０１８２】
実施例９：漸進的なｐＨ不感帯の拡大
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００のｐＨ設定点で、開始した。フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１８３】
図９Ａは、培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定及びフィードスケジュールを示している。オンラインｐＨ設定点は、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。約１５２時間で、ｐＨ不感帯を±０．１０に拡大し、１２時間維持した。約１６４時間で、ｐＨ不感帯を再び±０．１５に拡大し、１２時間維持した。約１７６時間で、ｐＨ不感帯を±０．２０に拡大し、更に１２時間維持した。約１８８時間で、ｐＨ不感帯を±０．２５に拡大し、１２時間維持した。最後に、約２００時間で、ｐＨ設定点をｐＨ７．２０±０．０５に上昇させ、製造工程が終了するまでこの値に維持した。工程サンプルは培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
【０１８４】
図９Ｂ−Ｇは、図９Ａ（黒い矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、ｐＣＯ２、及び浸透圧に対する効果を、図１（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。
【０１８５】
図９Ｂは、１４日間の工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴う方法（１５２時間と２００時間の間でｐＨ不感帯を段階的に拡大させることによるΔｐＨ０．２０単位）における細胞生存率が、ｐＨシフトアップを伴わない方法における細胞生存率よりも高いことを示している。図９Ｃは、ｐＨシフトアップを伴う方法では、乳酸レベルが約１４０時間で約８０％の高い値に達し、工程の終わりに約４２％まで徐々に低下することを示している。特に、工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、より少ない量の乳酸がｐＨシフトアップの設定を伴う方法で生成される。図９Ｄは、ｐＨシフトアップを伴う方法においてアンモニウムレベルが約１１６時間で約９０％の高い値に達し、その後、約１９０時間後に約２５％まで急に低下し、ついで工程の最後まで２１〜２８％の間に維持されることを示している。ｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、ｐＨシフトアップの設定を伴う方法では少ない量のアンモニウムが生成される。図９Ｅは、１４日間の工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴う方法における産生物力価が、ｐＨシフトアップを伴わない方法におけるよりも約１５％高いことを示している。図９Ｆは、ｐＨシフトアップを伴う方法では、ｐＣＯ２レベルが約２１０時間で約２２％まで徐々に上昇し、その後、工程の終了まで２２〜２５％の間に維持されたことを示している。対照的に、ｐＨシフトアップを伴わない方法では、特に１６０〜２８０時間の間で、更に高いｐＣＯ２レベルが観察された。図９Ｇは、工程の最後に、ｐＨシフトアップを伴う方法における培養浸透圧が、ｐＨシフトアップを伴わない方法におけるよりも低いことを示している。
【０１８６】
実施例１０：異なるｐＨ制御戦略
抗ＣＳＦ−１Ｒ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃、±０．０５ｐＨ単位の不感帯の７．００のｐＨ設定点で、開始した。０．２５Ｌのバイオリアクターを、０．２Ｌの初期培養容量で、用いた。フィード培地を溶液で調製し、１〜３日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、４〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、４〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１８７】
図１０Ａは、二つの異なる培養方法のｐＨ設定点と不感帯設定及びフィードスケジュールを示している。
産生方法＃１では、オンラインｐＨ設定点を、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。約１４４時間から開始して、ｐＨ設定点を約４８時間以内に７．００から７．２０に徐々に上昇するように設定した。約１９２時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．２０±０．０５に達し、該産生方法の終了までこの値に維持された。
【０１８８】
産生方法＃２では、オンラインｐＨ設定点を、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムを添加することにより、最初は７．００±０．０５に維持した。４８時間の時点で、ｐＨ設定点を６．８０±０．０５に下げ、２４０時間までこの値に維持した。約２４０時間から開始して、ｐＨ設定点を約４８時間以内に６．８０±０．０５から７．００±０．０５に徐々に上昇するように設定した。約２８８時間で、ｐＨ設定点はｐＨ７．００±０．０５に達し、該産生方法の終了までこの値に維持された。
【０１８９】
工程サンプルを培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
図１０Ｂ−Ｆは、図１０Ａの方法＃１（黒い矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、及び浸透圧に対する効果を、図１０Ａの方法＃２（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。
【０１９０】
図１０Ｂは、二つの培養方法（黒い矩形の方法＃１；灰色の菱形の方法＃２）の間の細胞生存率の差異を示している。１４日後、方法＃１（１４４時間と１９２時間の間でΔｐＨ０．２０単位のｐＨ勾配）における細胞生存率は、方法＃２におけるよりも高い。図１０Ｃは、方法＃１において、乳酸レベルが１４日間の産生方法の終了時に約６８％に達することを示している。本発明に係るｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、本発明の方法に係るｐＨシフトアップを伴う方法では、より少量の乳酸が生成される。方法＃２では、ｐＨは上昇するが、この方法には、第一ｐＨで細胞を播種し、その第一ｐＨで細胞を培養することを含む第一培養段階と、続く細胞を第一ｐＨよりも高い第二ｐＨで培養する第二培養段階は含まれない。方法＃１とは異なり、方法＃２はｐＨシフトダウンを含む。図１０Ｄは、方法＃１において、１１５時間後にアンモニウムレベルが約９０％の高い値に達し、約１５％に低下した後、産生工程の最後に約８０％に増加することを示している。本発明に係るｐＨシフトアップを伴わない方法と比較して、本発明に係るｐＨシフトアップを含む方法では、より少量のアンモニウムが生成される。図１０Ｅは、１４日間の産生工程の終了時に、方法＃１の抗ＣＳＦ−１Ｒ産生物力価が方法＃２のものよりも高いことを示している。図１０Ｆは、工程の終わりに、本発明に係るｐＨシフトアップを伴う方法における培養浸透圧は、本発明に係るｐＨシフトアップを伴わない方法におけるよりも低いことを示している。
【０１９１】
実施例１１：低下した温度
抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ発現ＣＨＯ ＫＳＶ細胞を振盪フラスコで増殖させ、数回継代した。製造用発酵の実行は、約６．０×１０５細胞／ｍＬの初期細胞数で、３６．５℃の初期温度、±０．０５ｐＨ単位の不感帯を持つ７．００のｐＨ設定点で、開始した。
フィード培地を溶液で調製し、３〜６日目に、１日当たり約２．０〜約３．０重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。
ｐＨシフトアップフィード培地を溶液で調製し、７〜１４日目に、１日当たり約０．５〜約１．５重量％の初期培養重量の範囲の量で培養物に連続的に添加した。追加のグルコースフィード溶液を調製し、７〜１４日目の間に培養物に連続的に添加して、グルコース濃度を約≧３ｇ／ｌに維持した。
【０１９２】
図１１Ａは、二つの異なる培養方法に対する温度設定、ｐＨ設定点及び不感帯設定、並びにフィードスケジュールを示している。
【０１９３】
産生方法Ａでは、オンラインｐＨ設定点を、工程の全持続期間にわたって、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムの添加により、７．００±０．０５に一定に維持した。工程の全持続期間中、温度は３６．５℃に一定に維持した。
産生方法Ｂでは、オンラインｐＨ設定点を、工程の全持続期間にわたって、二酸化炭素ガス注入を使用するか又は１Ｍの炭酸ナトリウムの添加により、７．００±０．０５に一定に維持した。温度は最初は３６．５℃に維持した。約１４４時間で、温度を３４．０℃に低下させ、産生方法の終わりまでこの値に維持した。
【０１９４】
工程サンプルは培養物から毎日採取し、必要とされるパラメーターについて分析した。
生細胞密度（ＶＣＤ）は、Ｃｅｄｅｘ ＨｉＲｅｓアナライザー（資料番号：０５６５０２１６００１，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するトリパンブルー色素排除法で測定した。生細胞密度の積分値（ＩＶＣＤ）は、次の方程式を使用して計算した：
2021503916.tif 000003
ここで、ｔ＝培養期間、ＶＣＤ＝生細胞密度。
主要な培養産生工程の最後に、遠心分離により細胞培養液を収集した。上清をプロテインＡを用いた更なる小規模精製に供した。
【０１９５】
精製した抗体のグリコシル化パターンを、２ＡＢ標識Ｎ−グリカンを用いたＥＳＩ−ＭＳと組み合わせたＲＰ−ＨＰＬＣを使用して分析した（Ｃｈｅｎ及びＦｌｙｎｎ，２００７）。
【０１９６】
図１１Ｂ−Ｇは、図１１Ａの方法Ａ（灰色の菱形）に係るｐＨ設定を有する培養方法における細胞生存率、乳酸濃度、アンモニウム濃度、産生物力価、ｐＣＯ２、及び浸透圧に対する効果を、図１１Ａの方法Ｂ（黒の矩形）に係るｐＨ設定を有する培養方法と比較して、示している。
【０１９７】
図１１Ｂは、二つの培養方法（灰色の菱形の方法Ａ；黒の矩形の方法Ｂ）の間の細胞生存率の差異を示している。１４日後、方法Ａ（一定の３６．５℃の温度）における細胞生存率は、方法Ｂ（１４４時間で３６．５℃から３４．０℃への温度シフトダウン）よりも僅かに低い。図１１Ｃは、方法Ａにおいて、乳酸レベルが１４日間の産生工程の終わりに約３４％に達し、方法Ｂでは同じ時点で１００％の乳酸レベルが生成されたことを示している。図１１Ｄは、方法Ａにおいて、１１５時間後にアンモニウムレベルが約９７％の高い値に達し、約３３％に低下した後、産生工程の終わりに約７２％に増加することを示している。対照的に、方法Ｂでは同じ時点で約８５％ものアンモニウムレベルが生成された。図１１Ｅは、１４日間の工程の終了時に、方法Ａにおける産生物力価が方法Ｂにおけるよりも約２０％高いことを示している。図１１Ｆは、方法Ａにおいて、ｐＣＯ２レベルが約２００時間で２９％超まで増加し、ついで工程の終わりまでこの高レベルに維持されたことを示している。方法Ｂでは、ｐＣＯ２レベルは約２００時間で２９％超まで増加し、約２６０時間までこの高レベルに維持され、その後工程の終わりに約６％に低下した。図１１Ｇは、工程の終わりに、方法Ａにおける培養浸透圧が方法Ｂにおけるよりも僅かに低いことを示している。
【０１９８】
３６．５℃から約３４．０℃への温度シフトは、細胞により産生される抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ−ＣｒｏｓｓＭａｂの品質を変化させた。例えば、Ｇ０Ｆ抗体の含有量は約３％増加し、Ｇ１Ｆ構造は幾つかの変化を示した（図１２）。温度シフトによって引き起こされる産生物品質の変化に関連する問題は、実質的に一定の温度を維持することによって、本発明の方法において有利に回避されうる。
【０１９９】
３６．５℃から約３４．０℃への温度シフトは、細胞能力の指標であり、一般に最終産生物力価と相関する、積分生細胞密度（ＩＶＣＤ）を減少させた。培養温度を下げると、細胞の最終的な生存率が改善されうるが、ＩＶＣＤの低下や産生物力価の低下の問題をまた引き起こす（表１）。これらの問題は、温度を実質的に一定の値に維持することにより、ここに開示される方法において有利に回避されうる。
【０２００】
2021503916.tif 000004
2021503916.tif 000005
【０２０１】
［参考文献］
本発明と本発明が関係する最新技術をより完全に説明し開示するために、多くの刊行物を上で引用している。これら参考文献の完全な引用文献を以下に示す。これら参考文献のそれぞれの全体がここに援用される。
【０２０２】
標準的な分子生物学技術については、Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3版 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと
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【０２０３】
［特許引用文献］
米国特許出願公開第２０１４００５１１２４号、米国特許第８４７０５５２号、米国特許第８７６５４１３号、国際公開第２００８／０３３５１７号、国際公開第２０１１／０７００２４号、国際公開第２０１１／１１７３２９号
【０２０４】
次のステートメントは、本開示の態様に関し、明細書の一部を構成する
１．  哺乳動物細胞を培養するための流加方法において、
哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種し、細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階と；
第一ｐＨより高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階と
を含む、方法。
２．  ｐＨ設定点を使用してｐＨを制御することを含む、哺乳動物細胞を培養するための流加方法において、
哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種し、細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階であって、ｐＨ設定点が第一ｐＨに維持される第一培養段階と；
第一ｐＨより高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階であって、設定点が第二ｐＨに維持される第二培養段階と
を含み、第二ｐＨが第一ｐＨよりも少なくとも０．１ｐＨ単位高く、第二培養段階が少なくとも６時間の持続期間を有する、方法。
３．  第二培養段階が少なくとも３日の持続期間を有する、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
４．  方法の温度が±０．５℃以内に維持される、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
５．  場合によっては第一ｐＨが６．５〜７．５の範囲の値であり、かつ
ａ．第二ｐＨが第一ｐＨよりも少なくとも０．１ｐＨ単位高いか；
ｂ．第二ｐＨが第一ｐＨよりも約０．１〜０．５ｐＨ単位高いか；又は
ｃ．第二ｐＨが第一ｐＨよりも約０．２ｐＨ単位高い、
前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
６．  ａ．第一ｐＨが約７．０であり；かつ
ｂ．第二ｐＨが、約（ｉ）ｐＨ７．１；（ｉｉ）ｐＨ７．２；（ｉｉｉ）ｐＨ７．３；（ｉｖ）ｐＨ７．４（ｖ）ｐＨ７．５、又は（ｖｉ）７．１〜７．５であり、
あるいは、
ａ．第一ｐＨが約７．０±０．０５であり；かつ
ｂ．第二ｐＨが、（ｉ）ｐＨ７．１±０．０５；（ｉｉ）ｐＨ７．２±０．０５；（ｉｉｉ）ｐＨ７．３±０．０５；（ｉｖ）ｐＨ７．４±０．０５（ｖ）ｐＨ７．５±０．０５、又は（ｖｉ）７．１〜７．５±０．０５である、
前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
７．  ｐＨ設定点を使用してｐＨを制御することを含み、
第一培養段階において設定点が第一ｐＨに設定され、かつ
第二培養段階において設定点が第二ｐＨに設定される、
前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
８．  設定点を、（ａ）徐々に又は（ｂ）即時に、第一ｐＨから第二ｐＨに上昇させる、ステートメント７に記載の方法。
９．  設定点を第一ｐＨから第二ｐＨに徐々に上昇させ、（ａ）設定点を連続的に上昇させるか、又は（ｂ）設定点を一連の不連続ステップで上昇させる、ステートメント８に記載の方法。
１０．  ｐＨを、約２４〜７２時間の期間にわたって第一ｐＨから第二ｐＨに徐々に上昇させる、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
１１．  培養培地にｐＨシフトアップフィード培地を添加することを含む、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
１２．  設定点が±０．０５ｐＨ単位の不感帯を有する、ステートメント７から１１の何れか一に記載の方法。
１３．  哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
１４．  産生物が哺乳動物細胞によって発現され、場合によっては哺乳動物細胞が組換え細胞であり、産生物が組換えタンパク質である、産生物を産生するための方法である、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
１５．  産生物が（ａ）抗体；（ｂ）バヌシズマブ；又は（ｃ）エマクツズマブである、ステートメント１４に記載の方法。
１６．  産生物を単離する工程と、場合によっては産生物を含む組成物を調製する工程とを含む、ステートメント１４から１５の何れか一に記載の方法。
１７．  ステートメント１６の方法により産生された産生物又は組成物。
１８．  哺乳動物細胞の培養培地中への播種が０日目であり、１０〜１８日目の何れか一が、細胞及び／又は産生物を収集することにより方法を終結させることを含む収集工程を含む、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
１９．  細胞及び／又は産生物を収集することにより方法が終結される、収集工程を含み、収集工程では、
ａ．細胞生存率が、対照方法よりも少なくとも２０％高く；
ｂ．乳酸レベルが、対照方法よりも少なくとも２０％低く；
ｃ．アンモニウムレベルが、対照方法よりも少なくとも４０％低く；及び／又は
ｄ．産生物力価が、対照方法よりも少なくとも５％高く；
対照方法は、第二培養段階が細胞を第一ｐＨで培養することを含むことを除いて、ステートメントに開示された方法と同じである、前記ステートメントの何れか一に記載の方法。
２０．  哺乳動物細胞を培養するための方法において、
細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階と；
第二ｐＨで細胞を培養することを含み、第二ｐＨが第一ｐＨより高い第二培養段階と
を含み、方法の温度が実質的に一定の値に維持される、方法。
２１．  抗体を発現することができる哺乳動物細胞を培養するための方法において、
哺乳動物細胞を第一ｐＨで培養培地中に播種し、細胞を第一ｐＨで培養することを含む第一培養段階と；
第一ｐＨより高い第二ｐＨで細胞を培養することを含む第二培養段階と
を含む、方法。
２２．  前記ステートメントの何れか一に記載の哺乳動物細胞を培養するための方法において、
ａ．産生物が哺乳動物細胞において発現される哺乳動物細胞培養物中において産生物力価を増加させるため；
ｂ．哺乳動物細胞培養物中において細胞生存率を増加させるため；
ｃ．哺乳動物細胞培養物の寿命を延ばすため；
ｄ．哺乳動物細胞培養物中の乳酸蓄積を減少させるため；
ｅ．哺乳動物細胞培養物中のアンモニウム蓄積を減少させるため；
ｆ．哺乳動物細胞培養においてｐＣＯ２プロファイルを改善するため；
ｇ．哺乳動物細胞培養において浸透圧を低下させるための；
ｐＨシフトアップフィード培地又はｐＨ上昇剤の使用であって、ｐＨシフトアップフィード培地又はｐＨ上昇剤を哺乳動物細胞培養物に添加して、ｐＨを第一ｐＨから第二ｐＨに上昇させる、使用。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｅ】
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【図２Ｆ−２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−３Ｅ】
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【図３Ｆ−３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−４Ｅ】
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【図４Ｆ−４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−５Ｅ】
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【図５Ｆ−５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−６Ｅ】
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【図６Ｆ−６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ−７Ｅ】
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【図７Ｆ−７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−８Ｅ】
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【図８Ｆ−８Ｇ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−９Ｅ】
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【図９Ｆ−９Ｇ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ−１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ−１０Ｅ】
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【図１１Ｆ−１１Ｇ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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