(57)【要約】本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に、宿主細胞におけるフレーバー化合物（ラズベリーケトン）の生成に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素を発現することができ、好ましくは発現し、かつ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）及びベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）からなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素をさらに発現することができ、好ましくは発現し、任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をさらに発現することができ、好ましくは発現する、原核微生物細胞。
【請求項２】
ＴＡＬ活性を有する前記機能的異種酵素が、ロドバクター・カプスラータ、サッカロスリクス・エスパナエンシス、又はフラボバクテリウム・ジョンソニアエに由来し、
４ＣＬ及びＢＡＳからなる群から選択される前記少なくとも１種の機能的酵素が、ニコチアナ・タバカム、アラビドプシス・タリアナ、フィスコミトレラ・パテンス、若しくはストレプトマイセス・セリカラーに由来する４ＣＬであるか、又はルブス・イダエウス若しくはレウム・パルマツムに由来するＢＡＳであり、
前記任意選択のＢＡＲが、ルブス・イダエウスに由来する、
請求項１に記載の原核微生物細胞。
【請求項３】
ＴＡＬ活性を有する前記機能的異種酵素が、ロドバクター・カプスラータに由来し、
４ＣＬ及びＢＡＳからなる群から選択される前記少なくとも１種の機能的酵素が、フィスコミトレラ・パテンスに由来する４ＣＬ及びレウム・パルマツムに由来するＢＡＳからなる群から選択され、
前記任意選択のＢＡＲが、ルブス・イダエウスに由来する、
請求項１又は２に記載の原核微生物細胞。
【請求項４】
ＴＡＬ活性を有する前記機能的異種酵素が、配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号５と、好ましくは配列番号１と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６と、好ましくは配列番号２と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされており、
前記４ＣＬが、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、若しくは配列番号１３と、好ましくは配列番号１１と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、若しくは配列番号１４と、好ましくは配列番号１２と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされており、
前記ＢＡＬが、配列番号１５若しくは配列番号１７と、好ましくは配列番号１７と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号１６若しくは配列番号１８と、好ましくは配列番号１８と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされており、
前記ＢＡＲが、配列番号１９と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号２０と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の原核微生物細胞。
【請求項５】
前記酵素のうちの少なくとも１種をコードするポリヌクレオチド配列がコドン最適化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の原核微生物細胞。
【請求項６】
前記細胞が、グラム陽性原核微生物細胞、好ましくはコリネバクテリウム、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム、さらにより好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、さらにより好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２と比較して少なくとも２倍多くのＬ−チロシンを産生することができるコリネバクテリウムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の原核微生物細胞。
【請求項７】
前記酵素のうちの少なくとも２種が、単一の組換えポリヌクレオチド構築物によってコードされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の原核微生物細胞。
【請求項８】
少なくとも５ｍｇ／Ｌのラズベリーケトンを産生することができる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の原核微生物細胞。
【請求項９】
前記細胞が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の原核微生物細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、コリネバクテリウム・グルタミクムであり、少なくとも５ｍｇ／Ｌのラズベリーケトンを産生することができる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の原核微生物細胞。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞を生成する方法であって、
チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素をコードする発現構築物と、原核細胞を接触させるステップと、
４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）及びベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）からなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素をコードする発現構築物と、前記原核細胞を接触させるステップと、
任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をコードする発現構築物と、前記原核細胞を接触させるステップと
を含む、方法。
【請求項１２】
ラズベリーケトンを生成する方法であって、
ラズベリーケトンの生成を促す条件下で、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞を培養するステップと、
任意選択で、前記ラズベリーケトンを前記細胞及び／又は培養培地から単離及び／又は精製するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
原核宿主細胞、好ましくはグラム陽性原核宿主細胞においてラズベリーケトンを生成するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素の使用。
【請求項１４】
配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、若しくは７０と、より好ましくは配列番号５２と、若しくは配列番号７０と、最も好ましくは配列番号７０と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドを含むか、又は、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、若しくは６９と、より好ましくは配列番号５１と、若しくは配列番号６９と、最も好ましくは配列番号６９と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターから発現される、ポリペプチド生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野、詳細には宿主細胞におけるフレーバー化合物（ラズベリーケトン）の生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラズベリーケトンは、典型的なラズベリーの特徴及び低い臭気閾値を有する重要なフレーバー化合物のうちの１つである。ラズベリーケトンは、食品産業において広く使用されている高価なフレーバー化合物である。ラズベリーケトンは、当然ながらラズベリー（ルブス・イダエウス）（Ｒｕｂｕｓ  ｉｄａｅｕｓ）中に天然に見出されるが、他の果実、例えば、モモ、ブドウ、リンゴ、ベリーのいくつかの種において、ルバーブなどの野菜において、並びにいくつかの樹木、例えば、イチイ、カエデ、及びマツの樹皮においても見出される。
【０００３】
ラズベリーケトンは、様々な目的で、例えば、イチゴの芳香、キーウィの芳香、及びサクランボの芳香などの複数の芳香の配合において、並びに化粧品において、及び抗肥満剤として、使用される。
【０００４】
ラズベリーケトンの天然源から商業的に適切な方法でラズベリーケトンを得るのは単純なことではないが、その理由は、ラズベリーケトンを含有する果実及び他の源における含有量が低いため、抽出及び精製のプロセスに収益性がないからである（ラズベリー１ｋｇ当たりに得ることができるラズベリーケトンは４ｍｇ未満である）。これまで、ラズベリーケトンは、環境に優しくないプロセスであるｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドとアセトンの縮合によって化学的に生成されてきた。加えて、フレーバー化合物の化学合成は、望ましくないラセミバリアント及びラセミ混合物をもたらすことが多い（Ｖａｎｄａｍｍｅ及びＳｏｅｔａｅｒｔ  ２００２年、Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７巻：１３２３〜１３３２頁）。
【０００５】
ラズベリーにおいて、ラズベリーケトンの合成は、フェニルプロパノイド経路の二酵素部分である。この経路は、Ｂｏｒｅｊｓｚａ−Ｗｙｓｏｃｋｉ及びＨｒａｚｄｉｎａ（１９９４年）によって説明されている。第１のステップにおいて、クマロイル−ＣｏＡ（多くの植物組織中に存在する）が、１つのマロニルＣｏＡと縮合して、ベンザルアセトン（ｐ−ヒドロキシフェニルブタ−３−エン−２−オン）になる。このステップを触媒する酵素は、ベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）と呼ばれる。第２のステップにおいて、ベンザルアセトン中の二重結合が還元され、ラズベリーケトン（ｐ−ヒドロキシフェニル−２−ブタノン）がもたらされる。このステップを触媒する酵素は、ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）と呼ばれ、この酵素は、ＮＡＤＰＨの存在を必要とする。
【０００６】
ベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）、ＥＣ  ２．３．１．−は、ポリケタイドシンターゼファミリーのメンバーである。ベンザルアセトンシンターゼは、マロニル−ＣｏＡの１つのアセトン単位を１つのｐ−クマル酸と縮合して、ベンザルアセトンを生じる。ポリケタイドシンターゼファミリーについては、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ（１９９９年）に詳細に記載されている。Ａｂｅら（２００１年）は、ルバーブからのＢＡＳ遺伝子のクローニングを教示している。Ｋｏｅｄｕｋａら（２０１１年）は、ラズベリーＢＡＳの特徴付けについて教示している。
【０００７】
ＮＡＤＰＨを使用した二重結合の還元を触媒する可溶性酵素、例えばベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）は、国際生化学分子生物学連合により、酵素クラスＥＣ  １．３．１．Ｘに属するものとして分類されている。例えば、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）由来のＥＣ  １．３．１．１１とアノテートされる酵素は、クマレートから二重結合を除去すると報告されたが（Ｌｅｖｉ及びＷｅｉｎｓｔｅｉｎ、１９６４年）、この酵素活性に関連して識別されている遺伝子はない。酵素クラスＥＣ  １．３．１．Ｘにおける他の酵素は、オロト酸レダクターゼ、２−ヘキサデセナールレダクターゼ、コレステノン５アルファ−レダクターゼなどであり、これらの遺伝子は公知である。しかしながら、これらの酵素のうち、ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）活性を有すると報告されたものはない。４−ヒドロキシベンザルアセトンが、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ビューベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、及びカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）などの真菌又は酵母によってラズベリーケトンに変換され得ることは、文献から公知である（Ｆｕｇａｎｔｉ及びＺｕｃｃｈｉ、１９９８年）。Ｂｅｅｋｗｉｌｄｅｒら（２００７年）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＢＡＲ活性が存在すると報告している。しかしながら、この酵素活性に関連して識別されている遺伝子はない。
【０００８】
ラズベリーケトンを生合成する試みについては記載されている。Ｈｕｇｕｅｎｙら（１９９５年、Ｂｉｏｆｌａｖｏｕｒ  ９５巻、２６９〜２７３頁）は、ラズベリーケトンを生成するためのバイオテクノロジー方法を教示している。この方法は、第２級アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を有する微生物、例えば、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）を培養することと、培養培地に前駆体ベツロシドを添加することとを含む。この細胞環境において、第２級ＡＤＨは、ベツリゲノールを脱水素してラズベリーケトンにする。Ａｂｅら（２００１年）は、ルバーブＢＡＳのクローニング、大腸菌における遺伝子の発現、組換えＢＡＳタンパク質の精製、及びベンザルアセトンのインビトロ合成について教示している。しかしながら、この研究は、ベンザルアセトン又はラズベリーケトンのインビボ合成については教示していない。
【０００９】
ＥＰ１２２６２６５は、ラズベリーケトンの前駆体として使用され得るパラヒドロキシケイ皮酸、別称ｐ−クマル酸の生物学的生成について教示している。ＥＰ１２２６２６５は、フェニルアンモニアリアーゼ酵素（ＰＡＬ）（ＥＣ４．３．１．５）について記載しているが、ラズベリーケトンのインビボ合成については教示していない。ＧＢ２４１６７６９及びＧＢ２４１６７７０は、大腸菌における、発酵に添加される前駆体ｐ−クマル酸からのラズベリーケトンの生物学的生成について記載している。同様に、Ｂｅｅｋｗｉｌｄｅｒら（２００７年）では、大腸菌において、発酵に添加される前駆体ｐ−クマル酸からラズベリーケトンが生成されている。２０１６年において、Ｌｅｅらは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における、発酵に添加される前駆体ｐ−クマル酸からのラズベリーケトンの生成の結果を発表した。加えて、Ｌｅｅらは、嫌気的発酵を使用し、サッカロマイセス・セレビシエにより微量のラズベリーケトン（０．４９ｍｇ／Ｌ）を生成した。微生物宿主細胞においてラズベリーケトンを生成できるようにするための前駆体の添加は、効率的ではない。加えて、嫌気的発酵における真核細胞の使用は、工業的規模においては確実に困難かつ非効率的である。よって、単純な発酵条件を使用した、原核微生物宿主細胞におけるラズベリーケトンのデノボの生物学的生成に対する必要性が存在する。これまで、かかる単純な好気性発酵を使用した、かかる原核宿主細胞によるラズベリーケトンのデノボの生物学的生成は提示されていない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、ラズベリーケトンを産生することができる細胞、及びこのような細胞が使用される方法に関する。第１の態様において、本発明は、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素を発現することができ、好ましくは発現し、かつ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）及びベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）からなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素をさらに発現することができ、好ましくは発現し、任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をさらに発現することができ、好ましくは発現する、原核微生物細胞を提供する。この態様の実施形態では、ＴＡＬ活性を有する機能的異種酵素が、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、サッカロスリクス・エスパナエンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ  ｅｓｐａｎａｅｎｓｉｓ）、又はフラボバクテリウム・ジョンソニアエ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ）に由来し、４ＣＬが、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、又はストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）に由来し、ＢＡＳが、ルブス・イダエウス又はレウム・パルマツム（Ｒｈｅｕｍ  ｐａｌｍａｔｕｍ）に由来し、任意選択のＢＡＲが、ルブス・イダエウスに由来する、細胞が提供される。特定の実施形態において、この態様は、当該酵素のうちの少なくとも１種のポリヌクレオチド配列がコドン最適化されている、細胞を提供する。さらなる実施形態において、この態様は、細胞が、グラム陽性原核微生物細胞、好ましくはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、さらにより好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、さらにより好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２と比較して少なくとも２倍多くのＬ−チロシンを産生することができるコリネバクテリウムである、細胞を提供する。この態様の好ましい実施形態では、酵素のうちの少なくとも２種が、単一の組換えポリヌクレオチド構築物によってコードされている、細胞が提供される。この態様のさらに好ましい実施形態では、少なくとも５ｍｇ／ｌのラズベリーケトンを産生することができる、細胞が提供される。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、第１の態様による細胞を生成する方法であって、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素をコードする発現構築物と、原核細胞を接触させるステップと、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）及びベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）からなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップと、任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップとを含む、方法を提供する。
【００１２】
第３の態様において、本発明は、ラズベリーケトンを生成する方法であって、ラズベリーケトンの生成を促す条件下で、本発明の第１の態様による細胞を培養するステップと、任意選択で、ラズベリーケトンを細胞及び／又は培養培地から単離及び／又は精製するステップとを含む、方法を提供する。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、原核宿主細胞、好ましくはグラム陽性原核宿主細胞においてラズベリーケトンを生成するための、本発明の第１の態様に記載のチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素の使用を提供する。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、特定のオペロン配列を含む発現ベクターを提供する。第６の態様において、本発明は、第５の態様による発現ベクターから発現されるポリペプチド生成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｌ−チロシンからラズベリーケトンを生成するための生合成経路；ＴＡＬ＝チロシンアンモニアリアーゼ；４ＣＬ＝４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ；ＢＡＳ＝ベンザルアセトンシンターゼ；ＢＡＲ＝ベンザルアセトンレダクターゼ。
【図２】プラスミドｐＥＣＸＫ＿Ｐのプラスミドマップ；ＲｐＢＡＳ＝レウム・パルマツムベンザルアセトンシンターゼ、Ｐｐ４ＣＬ＝フィスコミトレラ・パテンス４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ、ＲｃＴＡＬ＝ロドバクター・カプスラータチロシンアンモニアリアーゼ、Ｌａｃｌｑ＝リプレッサー遺伝子、Ｐｔｒｃ＝ＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーター；Ｔ１及びＴ２＝ｒｒｎＢ転写ターミネーターＴ１及びＴ２；ＫａｎＲ＝カナマイシン抵抗性；ｒｅｐＡ＝複製起点ｐＧＡ１；ｐｅｒ＝プラスミド複製の正のエフェクター。
【図３】プラスミドｐＥＣＸＫ＿ＰＢのプラスミドマップ；ＲｐＢＡＳ＝レウム・パルマツムベンザルアセトンシンターゼ；Ｐｐ４ＣＬ＝フィスコミトレラ・パテンス４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ；ＲｃＴＡＬ＝ロドバクター・カプスラータチロシンアンモニアリアーゼ；ＲｉＢＡＲ＝ルブス・イダエウスベンザルアセトンレダクターゼ；Ｌａｃｌｑ＝リプレッサー遺伝子；Ｐｔｒｃ＝ＩＰＴＧ誘導性Ｐｔｒｃプロモーター；Ｔ１及びＴ２＝ｒｒｎＢ転写ターミネーターＴ１及びＴ２；ＫａｎＲ＝カナマイシン抵抗性；ｒｅｐＡ＝複製起点ｐＧＡ１；ｐｅｒ＝プラスミド複製の正のエフェクター。
【図４Ａ】大腸菌における４−クマル酸のデノボ生成。図４Ａ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶ、図４Ｂ）Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図４Ｃ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図４Ｄ）４−クマル酸標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。４−クマル酸のピークは、１７．９分の保持時間において観察される。
【図４Ｂ】大腸菌における４−クマル酸のデノボ生成。図４Ａ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶ、図４Ｂ）Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図４Ｃ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図４Ｄ）４−クマル酸標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。４−クマル酸のピークは、１７．９分の保持時間において観察される。
【図４Ｃ】大腸菌における４−クマル酸のデノボ生成。図４Ａ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶ、図４Ｂ）Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図４Ｃ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図４Ｄ）４−クマル酸標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。４−クマル酸のピークは、１７．９分の保持時間において観察される。
【図４Ｄ】大腸菌における４−クマル酸のデノボ生成。図４Ａ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶ、図４Ｂ）Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図４Ｃ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図４Ｄ）４−クマル酸標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。４−クマル酸のピークは、１７．９分の保持時間において観察される。
【図５Ａ】大腸菌におけるヒドロキシフェニルブテノンのデノボ生成。図５Ａ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶ、図５Ｂ）Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図５Ｃ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図５Ｄ）ヒドロキシフェニルブテノン標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。ヒドロキシフェニルブテノンのピークは、２３．１分の保持時間において観察され、矢印によって示されている。
【図５Ｂ】大腸菌におけるヒドロキシフェニルブテノンのデノボ生成。図５Ａ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶ、図５Ｂ）Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図５Ｃ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図５Ｄ）ヒドロキシフェニルブテノン標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。ヒドロキシフェニルブテノンのピークは、２３．１分の保持時間において観察され、矢印によって示されている。
【図５Ｃ】大腸菌におけるヒドロキシフェニルブテノンのデノボ生成。図５Ａ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶ、図５Ｂ）Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図５Ｃ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図５Ｄ）ヒドロキシフェニルブテノン標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。ヒドロキシフェニルブテノンのピークは、２３．１分の保持時間において観察され、矢印によって示されている。
【図５Ｄ】大腸菌におけるヒドロキシフェニルブテノンのデノボ生成。図５Ａ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶ、図５Ｂ）Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図５Ｃ）Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図５Ｄ）ヒドロキシフェニルブテノン標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。ヒドロキシフェニルブテノンのピークは、２３．１分の保持時間において観察され、矢印によって示されている。
【図６Ａ】Ｃ．グルタミクムにおけるヒドロキシフェニルブテノンのデノボ生成のＨＰＬＣ分析。図６Ａ）Ｃｇ＿ＲＫ＿ＥＶ、図６Ｂ）Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図６Ｃ）Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図６Ｄ）ヒドロキシフェニルブテノン標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。ヒドロキシフェニルブテノンのピークは、２３．１分の保持時間において観察され、矢印によって示されている。
【図６Ｂ】Ｃ．グルタミクムにおけるヒドロキシフェニルブテノンのデノボ生成のＨＰＬＣ分析。図６Ａ）Ｃｇ＿ＲＫ＿ＥＶ、図６Ｂ）Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図６Ｃ）Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図６Ｄ）ヒドロキシフェニルブテノン標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。ヒドロキシフェニルブテノンのピークは、２３．１分の保持時間において観察され、矢印によって示されている。
【図６Ｃ】Ｃ．グルタミクムにおけるヒドロキシフェニルブテノンのデノボ生成のＨＰＬＣ分析。図６Ａ）Ｃｇ＿ＲＫ＿ＥＶ、図６Ｂ）Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図６Ｃ）Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図６Ｄ）ヒドロキシフェニルブテノン標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。ヒドロキシフェニルブテノンのピークは、２３．１分の保持時間において観察され、矢印によって示されている。
【図６Ｄ】Ｃ．グルタミクムにおけるヒドロキシフェニルブテノンのデノボ生成のＨＰＬＣ分析。図６Ａ）Ｃｇ＿ＲＫ＿ＥＶ、図６Ｂ）Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ、及び図６Ｃ）Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株、並びに図６Ｄ）ヒドロキシフェニルブテノン標準物質についてのＨＰＬＣクロマトグラムが示されている。ヒドロキシフェニルブテノンのピークは、２３．１分の保持時間において観察され、矢印によって示されている。
【図７Ａ】Ｃ．グルタミクムにおけるラズベリーケトン生成のＧＣ−ＭＳ分析。Ｃｇ＿ＲＫ＿ＥＶ、Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ、及びＣｇ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株についてのＧＣ−ＭＳクロマトグラムが図７Ａに示されている。ラズベリーケトンのピークは、１４．２分の保持時間において観察される。図７Ｂには、菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢによって生成されたラズベリーケトンの質量スペクトルが示されている。図７Ｃには、真正のラズベリーケトン標準物質の質量スペクトルが示されている。
【図７Ｂ】Ｃ．グルタミクムにおけるラズベリーケトン生成のＧＣ−ＭＳ分析。Ｃｇ＿ＲＫ＿ＥＶ、Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ、及びＣｇ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株についてのＧＣ−ＭＳクロマトグラムが図７Ａに示されている。ラズベリーケトンのピークは、１４．２分の保持時間において観察される。図７Ｂには、菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢによって生成されたラズベリーケトンの質量スペクトルが示されている。図７Ｃには、真正のラズベリーケトン標準物質の質量スペクトルが示されている。
【図７Ｃ】Ｃ．グルタミクムにおけるラズベリーケトン生成のＧＣ−ＭＳ分析。Ｃｇ＿ＲＫ＿ＥＶ、Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ、及びＣｇ＿ＲＫ＿ＰＢの菌株についてのＧＣ−ＭＳクロマトグラムが図７Ａに示されている。ラズベリーケトンのピークは、１４．２分の保持時間において観察される。図７Ｂには、菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢによって生成されたラズベリーケトンの質量スペクトルが示されている。図７Ｃには、真正のラズベリーケトン標準物質の質量スペクトルが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
驚くべきことに、ラズベリーケトンは、単純な好気性発酵条件を使用し、組換え原核微生物宿主細胞によってグルコースからデノボで合成され得ることが、本発明者らによって確証された。
【００１７】
したがって、本発明の第１の態様は、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素を発現することができ、好ましくは発現し、かつ、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）及びベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）からなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素をさらに発現することができ、好ましくは発現し、任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をさらに発現することができ、好ましくは発現する、原核微生物細胞を提供する。このような原核微生物細胞を、以下、本発明による細胞という。
【００１８】
好ましい実施形態において、この態様は、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素を発現し、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）及びベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）からなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素をさらに発現し、任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をさらに発現する、原核微生物細胞を提供する。
【００１９】
特定の実施形態において、この態様は、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素を発現し、機能的４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）酵素をさらに発現し、任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をさらに発現する、原核微生物細胞を提供する。
【００２０】
特定の実施形態において、この態様は、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素を発現し、機能的ベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）酵素をさらに発現し、任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をさらに発現する、原核微生物細胞を提供する。
【００２１】
特定の実施形態において、この態様は、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素を発現し、機能的４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）酵素及び機能的ベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）酵素をさらに発現し、任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をさらに発現する、原核微生物細胞を提供する。
【００２２】
特定の実施形態において、この態様は、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素を発現し、機能的４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）酵素及び機能的ベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）酵素をさらに発現し、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をさらに発現する、原核微生物細胞を提供する。
【００２３】
原核微生物細胞は、当技術分野において周知である。原核生物は、膜結合核、ミトコンドリア、及び他の膜結合オルガネラが欠如している単細胞生物である。原核生物の例は、細菌及び古細菌である。好ましい原核細胞は、培養が十分に確立されているため、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌、又は好ましくはコリネバクテリウムなど、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムなどのグラム陽性細菌である。好ましい実施形態において、この態様は、細胞が、グラム陽性原核微生物細胞、好ましくはコリネバクテリウム、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム、さらにより好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、さらにより好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２と比較して少なくとも２倍多くのＬ−チロシンを産生することができるコリネバクテリウムである、本発明による細胞を提供する。菌株ＡＴＣＣ１３０３２は、当業者には公知であり、この菌株は、ＤＳＭ  ２０３００、ＪＣＭ  １３１８、ＬＭＧ  ３７３０、及びＮＣＩＭＢ  １００２５としても知られている。
【００２４】
本出願の随所において、発現は、酵素などの機能的ポリペプチドをもたらす、機能的ｍＲＮＡへの遺伝子の転写であると考えられる。酵素は、反応を触媒することができるポリペプチドである。これに関連して、酵素の発現の増加は、当該酵素をコードするｍＲＮＡのレベルの上昇、酵素ポリペプチドのレベルの上昇、又は当該酵素の全活性の増加と考えることができる。好ましくは、酵素の発現の増加は、当該酵素の活性の増加をもたらし、これは、酵素ポリペプチドのレベルの上昇によって引き起こされ得る。関連する反応を触媒することにおいて活性を示す酵素は、機能的酵素である。ＴＡＬ、４ＣＬ、ＢＡＳ、及びＢＡＲに関連する反応は、本明細書の他の箇所に記載する。活性は、クロマトグラフィー技術、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は質量分析方法と有利に合わせたＧＣ若しくは液体クロマトグラフィー、例えば、ＬＣＭＳ若しくはＧＣＭＳを使用して、生成物濃度の増加をモニタリングすることによって判定することができる。中間体の検出のための好ましい方法は、ＧＣＭＳである。ラズベリーケトンの検出のための好ましい方法は、ＧＣＭＳである。
【００２５】
本出願との関連で、酵素を発現することができる細胞は、当該酵素を発現するために必要とされる遺伝情報、好ましくは当該酵素をコードする核酸を含む、細胞である。これは、酵素が必ず発現されることを意味するものではない。非限定的な一例として、酵素をコードする核酸を含み、この核酸が、特定の誘導に応答するプロモーターの制御下にある細胞では、プロモーターは必ずしも誘導されるわけではなく、したがってこの酵素は、必ずしも発現されるわけではないが、細胞は実際、このような発現が可能である。本発明の好ましい実施形態において、機能的酵素を発現することができる好ましい細胞は、当該機能的酵素を発現する細胞である。
【００２６】
異種酵素は、異なる生物に由来する酵素である。異種ポリヌクレオチドは、異なる生物に由来するポリヌクレオチドである。異種ポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドであってもよい。好ましい実施形態において、当該酵素のうちの少なくとも１種をコードするポリヌクレオチド配列がコドン最適化されている、本発明による細胞が提供される。コドン最適化されたポリヌクレオチド配列は、コードされるポリペプチドを変化させることなく、代替的なコドンの選択によって、コドン使用バイアスが軽減されている配列である。例えば、稀なコドンを、より一般的なコドンに置き換えてもよいし、又は、多くの同一のコドンを含む領域を、同義的なコドンの置換によって中断して、多くの同一のコドンに対する必要性を低減させてもよい。コドン最適化は当技術分野で公知であり、コドン最適化のためのバイオインフォマティクスツールが、インターネット上で様々な提供元から自由に利用可能である。
【００２７】
チロシンアンモニウムリアーゼ（以下、ＴＡＬという）は、チロシンアンモニアリアーゼ、Ｌ−チロシンアンモニアリアーゼ、及びチラーゼとしても知られている。ＴＡＬは、Ｌ−チロシンをｐ−クマル酸に変換し、アンモニウムを放出する、天然フェノール生合成経路における酵素（ＥＣ  ４．３．１．２３）である。Ｐ−クマル酸は、パラクマル酸、４−クマル酸、４−ヒドロキシケイ皮酸、及び（Ｅ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−プロペノン酸としても知られている。好ましいＴＡＬ又はＴＡＬ活性を有する好ましい酵素は、本発明による細胞とは異なる生物に由来するＴＡＬ又はＴＡＬ活性を有する酵素である、異種ＴＡＬ又はＴＡＬ活性を有する異種酵素である。ＴＡＬ又はＴＡＬ活性を有する酵素の源となり得る好ましい生物は、ロドバクター・カプスラータ（例えば、配列番号１によって表され、配列番号２によってコードされるＲｃＴＡＬ。Ｋｙｎｄｔら、２００２年ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１２巻：２４０〜２４４頁を参照されたい）、サッカロスリクス・エスパナエンシス（例えば、配列番号３によって表され、配列番号４によってコードされるＳｅＳａｍ８。Ｂｅｒｎｅｒら、２００６年Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８巻：２６６６〜２６７３頁を参照されたい）、及びフラボバクテリウム・ジョンソニアエ（例えば、配列番号５によって表され、配列番号６によってコードされるＦｊＴＡＬ。Ｊｅｎｄｅｒｓｅｎら、２０１５年Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８１巻：４４５８〜４４７６頁を参照されたい）である。好ましいＴＡＬ又はＴＡＬ活性を有する酵素は、配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号５と、好ましくは配列番号１と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６と、好ましくは配列番号２と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている。ＴＡＬをコードする好ましいポリヌクレオチド、又はＴＡＬ活性を有する酵素をコードする好ましいポリヌクレオチドは、コドン最適化されている。酵素のＴＡＬ活性は、ＴＡＬ活性について試験しようとする酵素を好適な緩衝液中でＬ−チロシンと接触させたときの、ｐ−クマル酸の生成又はアンモニア放出をクロマトグラフ的にモニタリングすることにより、検定することができる。
【００２８】
４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（以下、４ＣＬという）は、４ＣＬ、４−クマロイル−ＣｏＡシンテターゼ、ｐ−クマロイルＣｏＡリガーゼ、ｐ−クマリル補酵素Ａシンテターゼ、ｐ−クマリル−ＣｏＡシンテターゼ、ｐ−クマリル−ＣｏＡリガーゼ、フェルロイルＣｏＡリガーゼ、ヒドロキシシンナモイルＣｏＡシンテターゼ、及び様々な他の名称としても知られている。４ＣＬは、ＡＴＰの消費下で４−クマロイル−ＣｏＡを生じる、補酵素Ａ（ＣｏＡ）と４−クマレートのコンジュゲーションを触媒する酵素（ＥＣ  ６．２．１．１２）である。４−クマロイル−ＣｏＡは、クマロイル−ＣｏＡとしても知られている。好ましい４ＣＬは、本発明による細胞とは異なる生物に由来する４ＣＬである、異種４ＣＬである。４ＣＬの源となり得る好ましい生物は、ニコチアナ・タバカム（例えば、配列番号７によって表され、配列番号８によってコードされるＮｔ４ＣＬ。Ｌｅｅ及びＤｏｕｇｌａｓ、１９９６年Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２巻：１９３〜２０５頁を参照されたい）、アラビドプシス・タリアナ（例えば、配列番号９によって表され、配列番号１０によってコードされるＡｔ４ＣＬ。Ｅｈｌｔｉｎｇら、１９９９年Ｐｌａｎｔ．Ｊ．１９巻：９〜２０頁）、フィスコミトレラ・パテンス（例えば、配列番号１１によって表され、配列番号１２によってコードされるＰｐ４ＣＬ。Ｓｉｌｂｅｒら、２００８年Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．６９巻：２４４９〜２４５６頁）、及びストレプトマイセス・セリカラー（例えば、配列番号１３によって表され、配列番号１４によってコードされるＳｃ４ＣＬ）である。好ましい４ＣＬは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１と、若しくは配列番号１３、好ましくは配列番号１１と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、若しくは配列番号１４と、好ましくは配列番号１２と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている。４ＣＬをコードする好ましいポリヌクレオチドは、コドン最適化されている。
【００２９】
ベンザルアセトンシンターゼ（以下、ＢＡＳという）は、植物特異的なＩＩＩ型ポリケタイドシンターゼ（ＰＫＳ）である。ＢＡＳは、４−クマロイル−ＣｏＡの４−ヒドロキシベンザルアセトンへの変換を触媒する酵素（ＥＣ  ２．３．１．２１２）である。４−ヒドロキシベンザルアセトンは、ヒドロキシフェニルブテノン、ｐ−ヒドロキシベンザルアセトン、１−（４−ヒドロキシベンジリデン）アセトン、及び（３Ｅ）−４−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ブテン−２−オンとしても知られている。好ましいＢＡＳは、本発明による細胞とは異なる生物に由来するＢＡＳである、異種ＢＡＳである。ＢＡＳの源となり得る好ましい生物は、ルブス・イダエウス（例えば、配列番号１５によって表され、配列番号１６によってコードされるＲｉＰＫＳ。Ｚｈｅｎｇ及びＨｒａｚｄｉｎａ  ２００８年Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ４７０巻：１３９〜１４５頁を参照されたい）、及びレウム・パルマツム（例えば、配列番号１７によって表され、配列番号１８によってコードされるＲｐＢＡＳ。Ａｂｅら、２００１年Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６８巻：３３５４〜３３５９頁を参照されたい）である。好ましいＢＡＳは、配列番号１５若しくは配列番号１７と、好ましくは配列番号１７と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号１６若しくは配列番号１８と、好ましくは配列番号１８と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている。ＢＡＳをコードする好ましいポリヌクレオチドは、コドン最適化されている。
【００３０】
ベンザルアセトンレダクターゼを、以下、ＢＡＲという。ＢＡＲは、４−ヒドロキシベンザルアセトンのラズベリーケトンへの変換を触媒する酵素（ＥＣ  １．３．１．−）である。ラズベリーケトンは、４−（４−ヒドロキシフェニル）ブタン−２−オン、ｐ−ヒドロキシベンジルアセトン、４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、フランビノン、オキシフェニロン、レオスミン、及びラズケトンとしても知られている。好ましいＢＡＲは、本発明による細胞とは異なる生物に由来するＢＡＲである、異種ＢＡＲである。ＢＡＲの源となり得る好ましい生物は、ルブス・イダエウス（例えば、配列番号１９によって表され、配列番号２０によってコードされるＲｉＢＡＲ。Ｋｏｅｄｕｋａら、２０１１年Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４１２巻：１０４〜１０８頁を参照されたい）。好ましいＢＡＲは、配列番号１９と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号２０と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている。ＢＡＲをコードする好ましいポリヌクレオチドは、コドン最適化されている。
【００３１】
この態様において、
ＴＡＬ活性を有する機能的異種酵素が、ロドバクター・カプスラータ、サッカロスリクス・エスパナエンシス、又はフラボバクテリウム・ジョンソニアエに由来し、好ましくは、ロドバクター・カプスラータに由来し、
４ＣＬ及びＢＡＳからなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素が、ニコチアナ・タバカム、アラビドプシス・タリアナ、フィスコミトレラ・パテンス、若しくはストレプトマイセス・セリカラーに由来する４ＣＬであるか、又はルブス・イダエウス若しくはレウム・パルマツムに由来するＢＡＳであり、好ましくは、ＢＡＳが、レウム・パルマツムに由来し、好ましくは、４ＣＬが、フィスコミトレラ・パテンスに由来し、
任意選択のＢＡＲが、ルブス・イダエウスに由来する、
本発明による好ましい細胞が提供される。
【００３２】
より好ましい実施形態では、
ＴＡＬ活性を有する機能的異種酵素が、ロドバクター・カプスラータ、サッカロスリクス・エスパナエンシス、又はフラボバクテリウム・ジョンソニアエに由来し、好ましくは、ロドバクター・カプスラータに由来し、
４ＣＬ及びＢＡＳからなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素が、ニコチアナ・タバカム、アラビドプシス・タリアナ、フィスコミトレラ・パテンス、若しくはストレプトマイセス・セリカラーに由来する４ＣＬであるか、又はルブス・イダエウス若しくはレウム・パルマツムに由来するＢＡＳであり、好ましくは、ＢＡＳが、レウム・パルマツムに由来し、好ましくは、４ＣＬが、フィスコミトレラ・パテンスに由来し、
ＢＡＲが、ルブス・イダエウスに由来する、
本発明による細胞が提供される。
【００３３】
さらにより好ましい実施形態では、
ＴＡＬ活性を有する機能的異種酵素が、ロドバクター・カプスラータに由来し、
４ＣＬ及びＢＡＳからなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素が、フィスコミトレラ・パテンスに由来する４ＣＬ及びレウム・パルマツムに由来するＢＡＳからなる群から選択され、
任意選択のＢＡＲが、ルブス・イダエウスに由来する、
本発明による細胞が提供される。
【００３４】
特定の実施形態において、ＢＡＳ及び４ＣＬの両方が、本発明による細胞において発現される。このような実施形態では、
ＴＡＬ活性を有する機能的異種酵素が、ロドバクター・カプスラータ、サッカロスリクス・エスパナエンシス、又はフラボバクテリウム・ジョンソニアエに由来し、
４ＣＬが、ニコチアナ・タバカム、アラビドプシス・タリアナ、フィスコミトレラ・パテンス、又はストレプトマイセス・セリカラーに由来し、
ＢＡＳが、ルブス・イダエウス又はレウム・パルマツムに由来し、
任意選択のＢＡＲが、ルブス・イダエウスに由来する、
本発明による細胞が提供される。
【００３５】
より好ましいかかる実施形態では、
ＴＡＬ活性を有する機能的異種酵素が、ロドバクター・カプスラータに由来し、
４ＣＬが、フィスコミトレラ・パテンスに由来し、
ＢＡＳが、レウム・パルマツムに由来し、
任意選択のＢＡＲが、ルブス・イダエウスに由来する、
本発明による細胞が提供される。
【００３６】
この態様における好ましい実施形態では、本発明は、
ＴＡＬ活性を有する機能的異種酵素が、配列番号１、配列番号３、若しくは配列番号５と、好ましくは配列番号１と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６と、好ましくは配列番号２と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされており、
４ＣＬが、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、若しくは配列番号１３と、好ましくは配列番号１１と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、若しくは配列番号１４と、好ましくは配列番号１２と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされており、
ＢＡＳが、配列番号１５若しくは配列番号１７と、好ましくは配列番号１７と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号１６若しくは配列番号１８と、好ましくは配列番号１８と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされており、
ＢＡＲが、配列番号１９と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するか、又は、配列番号２０と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされている、
本発明による細胞を提供する。
【００３７】
この態様では、１種より多くの酵素をコードするポリヌクレオチド構築物を使用することが有利であり得る。例えば、ポリシストロニック構築物、又は１種より多くの酵素が単一のプロモーターの制御下にあるオペロンを使用してもよい。このような構築物は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作出することができる。
【００３８】
したがって、好ましい実施形態において、この態様は、酵素のうちの少なくとも２種が、単一の組換えポリヌクレオチド構築物によってコードされている、本発明による細胞を提供する。このような構築物は、プラスミドであってもよい発現ベクターに含まれていてもよい。２種の酵素は、単一の融合ポリペプチドであってもよい。
【００３９】
ラズベリーケトンは、４−（４−ヒドロキシフェニル）ブタン−２−オンであり、ｐ−ヒドロキシベンジルアセトン、４−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、フランビノン、オキシフェニロン、レオスミン、及びラズケトンとしても知られている。ラズベリーケトンは、レッドラズベリーの主な芳香化合物である、天然のフェノール化合物である。ラズベリーケトンは、クランベリー及びブラックベリーも含む種々の果実において生じる。本発明による細胞は、ラズベリーケトンを産生することができ、培養するとラズベリーケトンを産生する。本発明による好ましい細胞は、少なくとも３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも５ｍｇ／Ｌのラズベリーケトンを産生することができ、好ましくは産生する。より好ましくは、本発明による細胞は、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ，１８ｇ／Ｌ、１９ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、２２ｇ／Ｌ、２３ｇ／Ｌ、２４ｇ／Ｌ、又は２５ｇ／Ｌのラズベリーケトンを産生することができ、好ましくは産生する。好ましくは、ラズベリーケトンは、本発明による細胞及び／又は本発明による細胞の培養ブロス若しくは前記細胞が培養されるヘッドスペースにおいて検出される。
【００４０】
したがって、この態様は、少なくとも５ｍｇ／Ｌのラズベリーケトンを産生することができる、本発明による細胞を提供する。好ましい実施形態は、少なくとも１ｇ／Ｌのラズベリーケトンを産生することができる、本発明による細胞を提供する。より好ましい実施形態は、少なくとも５ｇ／Ｌのラズベリーケトンを産生することができる、本発明による細胞を提供する。さらにより好ましい実施形態は、少なくとも１０ｇ／Ｌのラズベリーケトン、最も好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌのラズベリーケトンを産生することができる、本発明による細胞を提供する。ラズベリーケトンの産生は、産生培地から得られた試料にクロマトグラフィー技術を使用してモニタリングすることができる。このような量は、好ましくは、培養の最大２週間以内、１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、１日以内、１５時間以内、１０時間、５時間、４時間、３時間、２時間以内、又は１時間以内、好ましくは培養の２４時間後に得られる。
【００４１】
細胞の生成
第２の態様において、本発明は、本発明による細胞を生成する方法を提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本発明の第１の態様の特徴である。この態様の実施形態では、本発明による細胞を生成する方法であって、
チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素をコードする発現構築物と、原核細胞を接触させるステップと、
４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）及びベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）からなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップと、
任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップと
を含む、方法が提供される。
【００４２】
この態様の好ましい実施形態では、本発明は、本発明による細胞を生成する方法であって、
チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素をコードする発現構築物と、原核細胞を接触させるステップと、
機能的４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）及び機能的ベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップと、
任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップと
を含む、方法が提供される。
【００４３】
この態様の好ましい実施形態では、本発明は、本発明による細胞を生成する方法であって、
チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素をコードする発現構築物と、原核細胞を接触させるステップと、
機能的４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップと、
任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップと
を含む、方法が提供される。
【００４４】
この態様の好ましい実施形態では、本発明は、本発明による細胞を生成する方法であって、
チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素をコードする発現構築物と、原核細胞を接触させるステップと、
機能的ベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップと、
任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をコードする発現構築物と、当該原核細胞を接触させるステップと
を含む、方法が提供される。
【００４５】
コリネバクテリウム、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム
好適な細胞型については、本明細書の上記において定義した。好ましい原核細胞は、グラム陽性細胞、より好ましくはコリネバクテリウム、さらにより好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクムである。
【００４６】
したがって、この態様の好ましい実施形態では、本発明は、本発明による細胞を生成する方法であって、
チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素をコードする発現構築物と、コリネバクテリウム細胞、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム細胞を接触させるステップと、
４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）及びベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）からなる群から選択される少なくとも１種の機能的酵素をコードする発現構築物と、当該コリネバクテリウム細胞を接触させるステップと、
任意選択で、異種ベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）をコードする発現構築物と、当該コリネバクテリウム細胞を接触させるステップと
を含む、方法を提供する。
【００４７】
本発明による原核細胞における酵素の発現、並びに本発明による原核細胞のさらなる遺伝子改変のために、本発明による原核細胞は、当業者に公知の任意の方法により、本明細書に記載の核酸又は核酸構築物で形質転換され得る。このような方法は、例えば、標準的ハンドブック、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、又はＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７年）から公知である。細菌細胞の形質転換及び遺伝子改変の方法は、例えば、米国特許第６，６９９，６９６号又は米国特許第４，７７８，７５９号から公知である。コリネバクテリウムについては、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ及びＲｅｙｅｓ  ２００５年Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｉｎ：Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｌ．、Ｂｏｔｔ，Ｍ．（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、３５３５〜３５６６頁が参照される。例は、コンピテント細胞若しくはスーパーコンピテント細胞を使用した形質転換、電気穿孔、トランスフェクション脂質の使用、トランスフェクションポリマーの使用、又はジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）形質転換である。好ましい方法は、電気穿孔である。
【００４８】
本発明による原核細胞における酵素の発現のために核酸構築物を使用する場合、酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物中に、選択可能なマーカーが存在してもよい。「マーカー」という用語は、本明細書では、マーカーを含有する細胞の選択又はスクリーニングを可能にする形質又は表現型をコードする遺伝子を指す。マーカー遺伝子は、適切な抗生物質を使用して、形質転換されていない細胞から形質転換細胞を選択することができるように、抗生物質抵抗性遺伝子であってもよい。好ましい選択マーカーは、カナマイシン及び対応するカナマイシン抵抗性遺伝子である。しかしながら、好ましくは、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２）などの非抗生物質抵抗性マーカーが使用される。本発明による好ましい細胞、例えば、核酸構築物で形質転換された細胞は、マーカー遺伝子を含まない。組換えのマーカー遺伝子を含まない微生物宿主細胞を構築する方法は、（Ｃｈｅａｈら、２０１３年）に記載されており、双方向性マーカーの使用に基づく。或いは、スクリーニング可能なマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−グルクロニダーゼを、本発明による核酸構築物に組み込み、形質転換細胞をスクリーニングできるようにしてもよい。
【００４９】
ラズベリーケトンを生成する方法
本発明による原核細胞は、単純な好気性発酵方法を使用した、ラズベリーケトンのデノボの生物学的生成のために有用である。したがって、第３の態様において、本発明は、ラズベリーケトンを生成する方法であって、
ラズベリーケトンの生成を促す条件下で、本発明による細胞を培養するステップと、
任意選択で、ラズベリーケトンを細胞及び／又は培養培地から単離及び／又は精製するステップと
を含む、方法を提供する。
【００５０】
好ましい実施形態において、この態様は、ラズベリーケトンを生成する方法であって、
ラズベリーケトンの生成を促す条件下で、本発明による細胞を培養するステップと、
任意選択で、ラズベリーケトンを細胞及び／又は培養培地から単離及び／又は精製するステップと
を含む、方法を提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本発明の第１の態様及び第２の態様の特徴である。
【００５１】
この方法を、以下、本発明による方法という。好ましくは、ラズベリーケトンを生成する本発明による方法は、本発明による細胞、好ましくは本発明の第１の態様において定義したグラム陽性細胞、より好ましくは第１の態様において定義したコリネバクテリウム細胞を培養するステップを含み、ここで、培養条件は、ＬＢ培地又はＹＴ培地又はＣｇＸＩＩ培地において、好ましくはＣｇＸＩＩ培地において、約３０℃で細胞を培養することを含み、この培地は、好ましくは、約２０ｇ／ＬのＤ−グルコースを追加したものであり、任意選択で、カナマイシン（好ましくは約５０μｇ／ｍＬ）を追加したものである。培養物は、好ましくは、約２５０ｒｐｍで振盪又は撹拌される。培養は、当業者には明らかであるように、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）若しくはアラビノース、又は別の好適な誘導剤を使用した誘導を伴い得る。培養は、出発培養物の使用を要し得る。促進性条件のさらなる例は、実施例において提示する。
【００５２】
通常、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１％のグルコースを追加した５ｍＬのＬＢ培地に、単一コロニーを播種する。この出発培養物を、一晩にわたり、３７℃で２３０ｒｐｍにて増殖させることができる。約２００μｌの出発培養物を使用して、１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ内の、約５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを追加した約２０ｍｌの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）に播種し、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００又はＡ６００）が０．４〜０．６になるまで、３７℃、２３０ｒｐｍでインキュベートすることができる。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加することができ、培養物を３０℃で２５０ｒｐｍにてインキュベートすることができる。任意選択で、培養物に、４−クマル酸、好ましくは約３ｍＭの４−クマル酸を追加してもよい。全細菌培養物は、ＩＰＴＧによる誘導の２４時間後に収集するのが好ましく、これは、−２０℃で保管することができる。この方法は、大腸菌に特に好適である。
【００５３】
或いは、出発培養物を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１％のグルコースを追加した２５ｍＬのＬＢ培地において、２５０ｒｐｍ及び３０℃で、４８時間にわたって増殖させてもよい。次いで、出発培養物を約１０分間にわたって約５０００ｒｐｍで遠心分離してもよく、細菌ペレットを約１．５ｍｌのＣｇＸＩＩ最少培地中に再懸濁してもよい。その後、約５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び約２０ｇ／ＬのＤ−グルコースを追加した約２５ｍＬのＣｇＸＩＩ最少培地を含む約１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに培養物を移してもよく、次いで、約１ｍＭのＩＰＴＧで直接的に誘導してもよい。細菌培養物を、約３０℃及び約２５０ｒｐｍで、約３０時間から最長約４日間にわたって培養してもよい。任意選択で、培養物に、４−クマル酸、好ましくは約３ｍＭの４−クマル酸を追加してもよい。発酵後、全細菌培養物を収集し、−２０℃で保管してもよい。この方法は、Ｃ．グルタミクムに特に好適である。
【００５４】
好ましい方法では、ラズベリーケトンを培養ブロスから分離する。この分離は、生成方法と連続して実行してもよいし、又は生成方法の後に実行してもよい。分離は、当業者に公知のいずれの分離方法に基づいてもよい。クロマトグラフィー又は液体／液体抽出は魅了的な技術である。
【００５５】
本発明による細胞及び本発明による方法によって生成されるラズベリーケトンは、化学合成後に残る微量の不純物を含まないなど、特異的な特性を有する。したがって、本発明による方法によって得ることができるラズベリーケトンが提供される。
【００５６】
本発明による方法を使用して得られたラズベリーケトンは、生成物中で好都合に使用され得る。したがって、本発明による方法によって得ることができるラズベリーケトンを含む、医薬組成物、フレーバー組成物、フレグランス組成物、化粧品組成物、又は食物組成物が提供される。
【００５７】
本発明による方法は、好ましくは、デノボプロセス、すなわち、ラズベリーケトンのデノボ生成の方法である。デノボプロセスでは、後に発酵を介して変換される特化した前駆体を培養物に添加しない。換言すると、デノボプロセスにおいて、意図される生成物は、培養ブロス中に従来存在する代謝物から生じる。非限定的な一例として、ラズベリーケトンを得るための方法において培養ブロスに４−クマル酸を添加する場合、これはデノボプロセスではないと考えることができるが、その理由は、ラズベリーケトンが、少なくとも部分的に、外から添加された４−クマル酸から生じ、４−クマル酸は、培養ブロスの従来の成分ではないためである。非限定的な一例として、Ｌ−チロシンからのラズベリーケトンの形成は、Ｌ−チロシンが培養ブロス中にルーチン的に存在するため、デノボ生成と考えることができる。
【００５８】
ＴＡＬの使用
ＴＡＬの機能性は、本発明の重要な特徴である。したがって、第４の態様において、本発明は、原核宿主細胞、好ましくはグラム陽性原核宿主細胞においてラズベリーケトンを生成するための、本明細書の上記において定義したチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的酵素の使用を提供する。この態様の特徴は、好ましくは、本発明の第１の態様、第２の態様、及び第３の態様の特徴である。この態様の好ましい実施形態において、本発明は、原核宿主細胞、好ましくはグラム陽性原核宿主細胞においてラズベリーケトンを生成するための、本明細書の上記において定義したチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素の使用を提供する。この態様のより好ましい実施形態において、本発明は、グラム陽性原核宿主細胞、好ましくはコリネバクテリウム宿主細胞、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミクム宿主細胞においてラズベリーケトンを生成するための、本明細書の上記において定義したチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する機能的異種酵素の使用を提供する。特徴及び定義は、本明細書の他の箇所に提示する。
【００５９】
発現ベクター
本発明の第５の態様では、本明細書の上記において定義したオペロン及び発現ベクターが提供される。この態様の特徴は、好ましくは、本発明の第１の態様、第２の態様、第３の態様、及び第４の態様の特徴である。このような発現ベクターを、本明細書では、本発明による発現ベクターという。このようなオペロンを、本明細書では、本発明によるオペロンという。したがって、この第５の態様の好ましい実施形態は、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、若しくは７０と、より好ましくは配列番号５２と、若しくは配列番号７０と、最も好ましくは配列番号７０と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドを含むか、又は、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、若しくは６９と、より好ましくは配列番号５１と、若しくは配列番号６９と、最も好ましくは配列番号６９と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる、発現ベクターを提供する。
【００６０】
この第５の態様のより好ましい実施形態は、配列番号５２と、若しくは配列番号７０と、最も好ましくは配列番号７０と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドを含むか、又は、配列番号５１と、若しくは配列番号６９と、最も好ましくは配列番号６９と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる、発現ベクターを提供する。
【００６１】
この第５の態様のさらに好ましい実施形態は、配列番号４６、４８、５２、５４、若しくは７０と、最も好ましくは配列番号４６、４８、５２、若しくは５４と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する第１のポリヌクレオチドを含むか、又は、配列番号４５、４７、５１、５３、若しくは６９と、最も好ましくは配列番号４５、４７、５１、若しくは５３と、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる、発現ベクターを提供する。
【００６２】
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列によって表される。ポリペプチドは、アミノ酸配列によって表される。核酸構築物は、天然に存在する遺伝子から単離されたポリヌクレオチド、又は、さもなければ天然に存在しない様式で組み合わされるか若しくは並べられたポリヌクレオチドのセグメントを含有するように改変されているポリヌクレオチドと定義される。任意選択で、核酸構築物中に存在するポリヌクレオチドは、細胞又は対象における当該ペプチド又はポリペプチドの産生又は発現を指示する１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結されている。
【００６３】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、天然であってもよいし、又はコドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、コードされるポリペプチドのためのコドン使用を、このポリペプチドを生成しようとする生物のコドンバイアスに向かって適応させる。コドン最適化は、一般に、宿主細胞、例えば、本明細書において好ましい宿主：コリネバクテリウムにおいて、コードされるポリペプチドの生成レベルを上昇させるのに役立つ。当業者には、コドン最適化のための多くのアルゴリズムが利用可能である。好ましい方法は、インターネット上でｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／において利用可能なモンテカルロアルゴリズムに基づいた「ガイド下ランダム法（ｇｕｉｄｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｅｔｈｏｄ）」である（Ｐ．Ｐｕｉｇｂｏ、Ｅ．Ｇｕｚｍａｎ、Ａ．Ｒｏｍｅｕ、及びＳ．Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｌｖｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７年７月；３５巻（ウェブサーバー号）：Ｗ１２６〜Ｗ１３１頁）。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「異種配列」又は「異種核酸」という用語は、当該第１のヌクレオチド配列の近傍の配列と作動可能に連結されている状態で天然に見出されることがない配列又は核酸である。本明細書において使用される場合、「異種」という用語は、「組換え」を意味する場合がある。「組換え」とは、一般に天然に見出される遺伝的実体とは明確に異なる遺伝的実体を指す。ヌクレオチド配列又は核酸分子に適用される場合、これが意味するのは、当該ヌクレオチド配列又は核酸分子が、クローニングステップ、制限ステップ、及び／又はライゲーションステップ、並びに天然に見出される配列又は分子とは明確に異なる構築物の生成をもたらす他の手順の様々な組み合わせの生成物であるということである。組換えオリゴヌクレオチドは、１つよりも多くの源に由来する配列を含むオリゴヌクレオチドであり得る。
【００６５】
本明細書において、「作動可能に連結されている」は、制御配列が、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、制御配列が細胞及び／又は対象における本発明のペプチド又はポリペプチドの産生／発現を指示するような位置に適切に配置されている構成として定義される。
【００６６】
「作動可能に連結されている」は、ある配列が、機能的ドメインをコードする別の配列に対して、細胞及び／又は対象においてキメラポリペプチドがコードされるような位置に適切に配置されている構成を定義するために使用される場合もある。本出願の随所において、酵素をコードする任意の核酸配列は、好ましくは、別のかかる配列又はプロモーターに作動可能に連結されている。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、１つ又は複数の核酸分子の転写を制御するように機能し、核酸分子の転写開始部位の転写の方向に関して上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、並びに、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位、及びプロモーターからの転写の量を調節するように直接的又は間接的に作用することが当業者に公知であるヌクレオチドの任意の他の配列を含むがこれらに限定されない、任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に識別される、核酸断片を指す。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件及び発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的制御又は発生的制御下で活性であるプロモーターである。
【００６８】
本発明による核酸構築物中に存在し得る任意選択のさらなるエレメントとしては、１つ又は複数のリーダー配列、エンハンサー、組込み因子、及び／又はレポーター遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロメア、及び／又はマトリックス結合（ＭＡＲ）配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による核酸構築物は、一般に核酸／核酸配列の制限及び連結などの技術を含む本質的に公知である様式において用意することができ、この技術に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓなどの標準的ハンドブックが参照される。
【００６９】
ポリペプチド
第６の態様において、本発明は、本発明による発現ベクターから発現されるポリペプチド生成物を提供する。特徴及び定義は、本発明の他の箇所に提示してあり、好ましくは、本発明の第１の態様、第２の態様、第３の態様、第４の態様、及び第５の態様の特徴及び定義である。
【００７０】
定義
アミノ酸配列又は核酸配列との関連での「配列同一性」又は「同一性」は、本明細書では、２つ以上のアミノ酸（ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質）配列、又は２つ以上の核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド）配列を比較することによって判定される、これらの配列同士の関係として定義される。当技術分野において、「同一性」はまた、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列（該当する場合）のストリング間のマッチによって判定される、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列同士の配列関連性の度合いを意味する。本発明において、特定の配列との配列同一性は、好ましくは、当該特定のポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の全長にわたる配列同一性を意味する。本明細書において提示する配列情報は、誤って識別された塩基の包含を必要とするものと狭義に解釈されてはならない。当業者は、このような誤って識別された塩基を識別することができ、このようなエラーを補正する方法を知っている。
【００７１】
同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間の最も大きなマッチを与えるように設計される。同一性及び類似性を判定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を判定する好ましいコンピュータプログラム方法は、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２巻（１号）：３８７頁（１９８４年））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）を含む。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他のソースから公的に利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して、同一性を判定することもできる。
【００７２】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターは、次のものを含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；比較行列：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９巻：１０９１５〜１０９１９頁（１９９２年）のＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；及びギャップ長ペナルティ：４。これらのパラメーターで有用なプログラムは、「Ｏｇａｐ」プログラムとして、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから公的に利用可能である。前述のパラメーターは、アミノ酸比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドキャップに対するペナルティはない）。
【００７３】
核酸比較のための好ましいパラメーターは、次のものを含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；比較行列：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３。Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして利用可能。上記に示したのは、核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００７４】
本明細書において、中等度条件は、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００ヌクレオチド以上の核酸配列が、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ溶液又は比較可能なイオン強度を有する任意の他の溶液中で、約４５℃の温度においてハイブリダイズすることを可能にする条件、及び、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ溶液又は比較可能なイオン強度を有する任意の他の溶液中で、室温における洗浄と定義される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち少なくとも１０時間にわたって行われ、好ましくは、洗浄は、洗浄液を少なくとも２回交換して、少なくとも１時間にわたって行われる。これらの条件は、通常、最大５０％の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。当業者は、同一性が５０％〜９０％で異なる配列を特異的に識別するために、これらのハイブリダイゼーション条件を改変することができる。
【００７５】
発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むがこれらに限定されない、ペプチド又はポリペプチドの生成に関与する任意のステップを含むように理解されるものとする。
【００７６】
本文書及びその特許請求の範囲において、「を含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞、及びその活用形は、該当する単語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が除外されないことを意味するように、その非限定的な意味において使用される。加えて、「ａ」又は「ａｎ」という不定冠詞による要素の参照は、要素のうちの１つが１つだけ存在することが文脈上明らかに必要な場合を除き、その要素が１つよりも多く存在する可能性を除外するものではない。したがって、「ａ」又は「ａｎ」という不定冠詞は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００７７】
「約」又は「およそ」という単語は、数値に関連して使用される場合（例えば、約１０）、好ましくは、その値が、所与の値（１０）から１０％多いか又は少ない値であり得ることを意味する。
【００７８】
本明細書において提示する配列情報は、誤って識別された塩基の包含を必要とするものと狭義に解釈されてはならない。当業者は、このような誤って識別された塩基を識別することができ、このようなエラーを補正する方法を知っている。配列エラーがある場合、酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、及び１９によって表される遺伝子の発現によって得ることができる酵素の配列が優先するものとする。
【００７９】
本明細書において引用されるすべての特許及び文献の参照は、ここに参照することによって全体が組み込まれる。
【実施例】
【００８０】
実施例１−ラズベリーケトンを生成するための酵素及び合成オペロン
本発明者らは、特異的な４酵素経路を大腸菌及びコリネバクテリウム・グルタミクムに導入して、ラズベリーケトンを生成した。４つのステップにおいてＬ−チロシンからラズベリーケトン（４−（４−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン）を生成するための生合成経路を設計した（図１）。ラズベリーケトンの生合成のための特化した第１のステップは、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）によるＬ−チロシンの４−クマル酸（４−ヒドロキシケイ皮酸）への変換である。第２のステップでは、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）が、４−クマル酸の活性化を触媒して、そのＣｏＡエステルである４−クマロイル−ＣｏＡにする。第３のステップでは、ベンザルアセトンシンターゼ（ＢＡＳ）が、４−クマロイル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡの１ステップ脱炭酸性縮合を触媒して、ヒドロキシフェニルブテノン（（Ｅ）−４−（４−ヒドロキシフェニル）−３−ブテン−２−オン）を生成する。ラズベリーケトン生合成の最終ステップでは、ベンザルアセトンレダクターゼ酵素（ＢＡＲ）活性を有する酵素が、ヒドロキシフェニルブテノンからラズベリーケトンを生成する。
【００８１】
大腸菌又はＣ．グルタミクムにおいて４−クマル酸を生成するために、次の３種のＴＡＬ酵素を使用した：ロドバクター・カプスラータに由来するＴＡＬ（ＲｃＴＡＬ、配列番号１、２）、サッカロスリクス・エスパナエンシスに由来するＴＡＬ（ＳｅＳａｍ８、配列番号３、４）、又はフラボバクテリウム・ジョンソニアエに由来するＴＡＬ（ＦｊＴＡＬ、配列番号５、６）。大腸菌又はＣ．グルタミクムにおいて４−クマロイル−ＣｏＡを生成するためには、次の４ＣＬ酵素を使用した：Ｎ．タバカムに由来する４ＣＬ（Ｎｔ４ＣＬ、配列番号７、８）、アラビドプシス・タリアナに由来する４ＣＬ（Ａｔ４ＣＬ、配列番号９、１０）、フィスコミトレラ・パテンスに由来する４ＣＬ（Ｐｐ４ＣＬ、配列番号１１、１２）、又はストレプトマイセス・セリカラーに由来する４ＣＬ（Ｓｃ４ＣＬ、配列番号１３、１４）。大腸菌又はＣ．グルタミクムにおいてヒドロキシフェニルブテノンを生成するためには、２種のベンザルアセトンシンターゼを使用した：ルブス・イダエウスに由来するＢＡＳ（ＲｉＰＫＳ、配列番号１５、１６）又はレウム・パルマツムに由来するＢＡＳ（ＲｐＢＡＳ、配列番号１７、１８）。ルブス・イダエウスに由来するベンザルアセトンレダクターゼ（ＢＡＲ）酵素を使用した（ＲｉＢＡＲ、配列番号１９、２０）。Ｎｔ４ＣＬを除くすべての遺伝子を、Ｃ．グルタミクムにおける発現のためにコドン最適化し、化学合成によって得た。Ｎｔ４ＣＬ遺伝子は、プラスミドｐＡＣ−４ＣＬ−ＳＴＳ（Ｂｅｅｋｗｉｌｄｅｒら、２００６年Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２巻：５６７０〜５６７２頁を参照されたい）において得て、コドン最適化しなかった。
【００８２】
その後、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ方法を使用して、生合成遺伝子をアセンブルして、ＢＡＳ遺伝子、４ＣＬ遺伝子、及びＴＡＬ遺伝子をそれぞれこの順序で含む３遺伝子オペロンにした。２つのＢＡＳ遺伝子、４つの４ＣＬ遺伝子、及び３つのＴＡＬ遺伝子を、合計２４個の可能性のある組み合わせで組み合わせた、コンビナトリアルスキームに従った（表１）。
【００８３】
生合成遺伝子のそれぞれを、ＰＣＲによって増幅した。ベクターとインサートとの間の接合領域にまたがるように、又は２つの隣接する遺伝子の間の接合部にまたがるように、増幅プライマーを設計した。この設計により、ＰＣＲ生成物において、プラスミドアセンブリが進行できるようにする、重複する領域が作出された。さらに、リボソーム結合部位ＡＧＧＡＧＧを含有する２０ヌクレオチドの遺伝子間スペーサーを付加した。遺伝子の増幅のためのプライマーを、配列表に列挙する（ＲｉＰＫＳ：配列番号７１、７２、７３、７４、７５；ＲｐＢＡＳ：配列番号７６、７７、７８、７９、８０；Ａｔ４ＣＬ：配列番号８１、８２、８３、８４、８５；Ｐｐ４ＣＬ：配列番号８６、８７、８８、８９、９０；Ｓｃ４ＣＬ：配列番号９１、９２、９３、９４、９５；Ｎｔ４ＣＬ：配列番号９６、９７、９８、９９、１００；ＲｃＴＡＬ：配列番号１０１、１０２、１０３、１０４、１０５；ＦｊＴＡＬ：配列番号１０６、１０７、１０８、１０９、１１０；ＳｅＳａｍ８：配列番号１１１、１１２、１１３、１１４、１１５）。この結果、各ＢＡＳ遺伝子につき４つの異なるＰＣＲ生成物、各４ＣＬ遺伝子につき６つの異なるＰＣＲ生成物、及び各ＴＡＬ遺伝子につき４つの異なるＰＣＲ生成物が作製された。
【００８４】
プルーフリーディングＱ５ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から得た）を用いて遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は次のとおりであった：９８℃で３０秒の初期変性の後、９８℃で１０秒、５２℃で２０秒、及び７２℃で１分のＰＣＲサイクル３５回、並びに７２℃で２分の最終伸長を行った。ＰＣＲ試薬の最終濃度は、５０μＬの全反応体積において、１×Ｑ５反応緩衝液（ＮＥＢ）、４００μＭのｄＮＴＰ、４００ｎＭのプライマー、及び０．５μＬのＱ５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）であった。得られたＰＣＲ断片を電気泳動し、その後、アガロースゲルから精製した。
【００８５】
ｐＧＡ１複製起点及びカナマイシン抵抗性マーカー（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ２１９６８３．１）を搭載した大腸菌−コリネバクテリウム・グルタミクムシャトルベクターｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅ（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ及びＴａｕｃｈ  ２００３年Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０４巻：２８７〜２９９頁を参照されたい）を、ＳａｃＩ制限酵素及びＢａｍＨＩ制限酵素（ＮＥＢ）を用いた制限によって直線化した。直線化されたベクターを電気泳動し、その後、アガロースゲルから精製した。ＢＡＳ−４ＣＬ−ＴＡＬオペロンを含有する環状プラスミドを作出するため、直線化されたベクター１００ｎｇを、２４個の可能性のある組み合わせにおいて、ＢＡＳ合成遺伝子、４ＣＬ合成遺伝子、及びＴＡＬ合成遺伝子の精製されたＰＣＲ生成物を含有する反応ミックスに、ベクター−インサート比を１：３に維持して添加した。次に、１×Ｇｉｂｓｏｎアセンブリミックス（ＮＥＢ）を反応物に添加し、全反応体積を２０μｌに維持した。反応物を４時間にわたって５０℃でインキュベートし、その後、化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１％のグルコースを追加したＬＢプレートにおいて、組換え細菌を選択した。正しいサイズのＢＡＳ−４ＣＬ−ＴＡＬオペロンアセンブリを含有する組換え細胞を、コロニーＰＣＲによって識別した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１％のグルコースを追加した５ｍｌの液体ＬＢ培地に、単一の細菌コロニーを播種し、３７℃で２５０ｒｐｍにて一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを単離し、オペロンとベクターとの間の接合部位、及びオペロン内の遺伝子間の接合部位を、ベクター及び遺伝子特異的プライマーの選択を使用したＳａｎｇｅｒシーケンシングによってシーケンシングした。この手順によって得られた大腸菌ＤＨ５αの菌株（表１）を、グリセロールストックとして維持し、−８０℃で保管した。さらに、空のプラスミドｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅを含有する大腸菌ＤＨ５αの菌株を作製した。この菌株を、Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶと名付けた。
【００８６】
その後、Ｒ．イデアウス（Ｒ．ｉｄｅａｕｓ）に由来するベンザルアセトンレダクターゼ（ＲｉＢＡＲ）をオペロンに添加した。この目的のために、ＳａｌＩ制限酵素（ＮＥＢ）を使用して、プラスミドｐＥＣＸＫ＿Ｐ（ＲｐＢＡＳ−Ｐｐ４ＣＬ−ＲｃＴＡＬオペロンを含有する、図２参照）を直線化した。直線化されたベクターを電気泳動し、その後、アガロースゲルから精製した。ＲｉＢＡＲ合成遺伝子を、プルーフリーディングＱ５ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）で増幅した。ＰＣＲ条件は次のとおりであった：９８℃で３０秒の初期変性の後、９８℃で１０秒、５２℃で２０秒、及び７２℃で１分のＰＣＲサイクル３５回、並びに７２℃で２分の最終伸長を行った。ＰＣＲ試薬の最終濃度は、５０μＬの全反応体積において、１×Ｑ５反応緩衝液（ＮＥＢ）、４００μＭのｄＮＴＰ、４００ｎＭのプライマー、及び０．５μＬのＱ５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）であった。得られたＰＣＲ断片を電気泳動し、その後、アガロースゲルから精製した。増幅プライマーは、隣接するＲｃＴＡＬ遺伝子及びｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅプラスミドと重複するように設計した（ＲｉＢＡＲ：配列番号１１６、配列番号１１７）。さらに、リボソーム結合部位ＡＧＧＡＧＧを含む２０ｂｐの遺伝子間領域をフォワードプライマーに付加した（配列番号１１６）。環状プラスミドを作出するために、精製されたＲｉＢＡＲ  ＰＣＲ生成物を含有する反応物に、１００ｎｇの直線化されたプラスミドｐＥＣＸＫ＿Ｐを添加した。次に、１×Ｇｉｂｓｏｎアセンブリミックス（ＮＥＢ）を反応物に添加し、全反応体積を２０μｌに設定した。反応物を４時間にわたって５０℃でインキュベートし、その後、化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１％のグルコースを追加したＬＢプレートにおいて、組換え細菌を選択した。正しいサイズのＲｐＢＡＳ−Ｐｐ４ＣＬ−ＲｃＴＡＬ−ＲｉＢＡＲオペロンアセンブリを含むプラスミドを含有する組換え細胞を、コロニーＰＣＲによって識別した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１％のグルコースを含有する５ｍｌの液体ＬＢ培地に、形質転換した細菌の単一コロニーを播種し、３７℃で２５０ｒｐｍにて一晩増殖させ、プラスミドを単離した。ＲｉＢＡＲ遺伝子と、ＲｃＴＡＬ遺伝子と、ＲｉＢＡＲ遺伝子と、ｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅベクターとの間の接合部位を、ベクター及び遺伝子特異的プライマーを使用したＳａｎｇｅｒシーケンシングによって確認した。この手順によって得られた構築物を、プラスミドｐＥＣＸＫ＿ＰＢと名付けた（ＲｐＢＡＳ−Ｐｐ４ＣＬ−ＲｃＴＡＬ−ＲｉＢＡＲ−ｐＥＣＸＫ；配列番号６９、７０）。図３参照。この手順によって得られた大腸菌ＤＨ５αの菌株を、Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢと名付け、グリセロールストックとして維持し、−８０℃で保管した。
【表１】
2021503307.tif 000002
【００８７】
実施例２−大腸菌におけるヒドロキシフェニルブテノン及びラズベリーケトンの生成
５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１％のグルコースを追加した５ｍＬのＬＢ培地に、菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ及びＥｃ＿ＲＫ＿ＰＢの単一コロニーを播種した。この出発培養物を、一晩にわたり、３７℃で２３０ｒｐｍにて増殖させた。２００μｌの出発培養物を使用して、１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ内の、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを追加した２０ｍｌの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）に播種し、６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００又はＡ６００）が０．４〜０．６に達するまで、３７℃及び２３０ｒｐｍでインキュベートした。その後、１ｍＭのＩＰＴＧを培地に添加し、培養物を３０℃で２５０ｒｐｍにてインキュベートした。各細菌菌株のために４つの発酵フラスコを並行してセットアップし、そのうち２つには３ｍＭの４−クマル酸を追加し、したがって２つには４−クマル酸を添加しなかった。対照菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶを用いた発酵実験を同じ様式でセットアップした。誘導の２４時間後に全細菌培養物を収集し（ＩＰＴＧ）、−２０℃で保管した。
【００８８】
ＨＰＬＣ分析のために、５００μｌの１００％メタノールを５００μｌの細菌培養物に添加した。この混合物を２０秒間ボルテックスすることによって混合し、その後、１０分間にわたって超音波処理した。次に、抽出物を卓上遠心分離機において１５分間１３．０００ｒｐｍで遠心分離し、Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＳＲＰ４シリンジフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して上清を濾過した。５μｌの抽出物をＨＬＰＣ分析のために使用した。
【００８９】
ＨＰＬＣシステムは、Ｗａｔｅｒｓ  ｅ２６９５  ＨＰＬＣ、Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器、及び４０℃のカラムインキュベーターを備えた。使用したＨＰＬＣカラムは、Ｌｕｎａ  ３ｕ  Ｃ１８（２）１００Ａ  １５０×２ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＣＡ）であった。使用した溶出液は、０．１％のギ酸を含むＭＱ水、及び０．１％のギ酸を含むアセトニトリルであった。抽出物中の化合物の分離を４０分のランにおいて行い、この間、０．１９ｍＬ／分の流量で５〜３５％の直線的なアセトニトリル勾配を適用した。カラムから溶出した化合物を、ＰＤＡ検出器（２４０〜６００ｎｍの吸光度範囲に設定した）に通した。発酵試料中のピークの保持時間及び最大吸光波長を、４−クマル酸（Ｓｉｇｍａ）、ヒドロキシフェニルブテノン（Ｐｆａｌｔｚ及びＢａｕｅｒ）、及びラズベリーケトン（Ａｐｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）の真正標準物質と比較した。２１．９分の保持時間におけるラズベリーケトンの検出について、溶出した化合物のピーク強度を、２８０ｎｍの波長で分析した。また、２３．１分の保持時間におけるヒドロキシフェニルブテノン、及び１７．９分の保持時間における４−クマル酸の検出について、溶出した化合物のピーク強度を、３１２ｎｍの波長で分析した。
【００９０】
４−クマル酸を培地に添加しなかった菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐの培養物において、４−クマル酸のデノボ生成が観察された（図４Ａ〜４Ｄ）。４−クマル酸は、５４±３ｍｇ／培養物１Ｌで蓄積した。さらに、ヒドロキシフェニルブテノンの生成が、０．２±０．０ｍｇ／細菌培養物１Ｌの濃度で観察された（図５Ａ〜５Ｄ）。Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ菌株のＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、ラズベリーケトンは観察されなかった。菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢでは、４９±１ｍｇ／培養物１Ｌにおける４−クマル酸、及び０．１±０．０ｍｇ／Ｌにおけるヒドロキシフェニルブテノンの蓄積が観察された。菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢに関するＨＰＬＣでは、ラズベリーケトンは検出されなかった。空のｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅプラスミドで形質転換した菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶでは、予想されたとおり、４−クマル酸、ヒドロキシフェニルブテノン、又はラズベリーケトンの蓄積は観察されなかった。
【００９１】
３ｍＭの４−クマル酸を追加した大腸菌培養物では、Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢ、及びＥｃ＿ＲＫ＿ＥＶの培養物で、それぞれ、３２８±１６ｍｇ／細菌培養物１Ｌ、３４５±２６ｍｇ／細菌培養物１Ｌ、及び３０３±３ｍｇ／細菌培養物１Ｌにおける４−クマル酸の蓄積が観察された。３ｍＭの４−クマル酸を追加したＥｃ＿ＲＫ＿Ｐ及びＥｃ＿ＲＫ＿ＰＢの細菌菌株に関して、それぞれ、４．０±０．１ｍｇ／Ｌ及び３．９±０．１ｍｇ／Ｌのヒドロキシフェニルブテノンの生成が観察された。菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ及びＥｃ＿ＲＫ＿ＰＢでは、ラズベリーケトンの生成は観察されなかった。４−クマル酸を追加した場合の菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶについては、予想されたとおり、ヒドロキシフェニルブテノン又はラズベリーケトンの生成は観察されなかった。
【００９２】
この実験から、大腸菌の発酵において４−クマル酸が蓄積すると結論付けられた。大腸菌におけるヒドロキシフェニルブテノンの生成は成功した。ラズベリーケトンの生成についてさらに調査するため、より感度の高いＧＣ−ＭＳ分析を用いた。
【００９３】
ＧＣ−ＭＳ分析のために、Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ、Ｅｃ＿ＲＫ＿ＰＢ、及びＥｃ＿ＲＫ＿ＥＶの菌株の（４−クマル酸を追加していない）１６ｍｌの細菌培養物を、４ｍｌの酢酸エチルで抽出した。これらの培養物及び抽出物を２０秒間ボルテックスすることによって混合し、その後、１０分間にわたって超音波処理した。培養物を１２００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離し、ＥｔＡｃを新しいガラスバイアルに収集した。Ｎａ２ＳＯ４カラムを使用して試料を乾燥させた。３０ｍ×０．２５ｍｍ、０．２５ｍｍフィルム厚のカラム（ＺＢ−５、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備えたガスクロマトグラフ（５８９０シリーズＩＩ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を使用し、担体ガスとしてヘリウムを１ｍｌ／分の流速で使用して、１μＬの試料から分析物を分離した。入り口温度を２５０℃に設定して、スプリットレスモードでインジェクターを使用した。４５℃の初期オーブン温度を、１分後に１０℃／分の速度で３００℃まで上昇させ、５分間３００℃に保った。ＧＣをマスセレクティブディテクター（モデル５９７２Ａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）に連結した。質量スペクトル及び保持時間（ｒｔ）をラズベリーケトンの真正標準物質（Ａｐｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）のものと比較することにより、ラズベリーケトンを識別した。菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿Ｐ及びＥｃ＿ＲＫ＿ＰＢの抽出物中に微量のラズベリーケトンが観察された。菌株Ｅｃ＿ＲＫ＿ＥＶでは、ラズベリーケトンの生成は観察されなかった。
【００９４】
実施例３−ラズベリーケトンを生成するためのＣ．グルタミクム菌株
次に、ラズベリーケトン生成のためのプラスミドを、野生型Ｃ．グルタミクム菌株ＡＴＣＣ１３０３２のエレクトロコンピテント細胞に形質転換した。この手順により、２５種の細菌菌株を作出し、表１に列挙した。３０℃で２日間にわたるインキュベーションの後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１％のグルコースを追加したＬＢプレートにおいて、組換え細菌を選択した。さらに、空のｐＥＣ−ＸＫ９９ＥベクターをＣ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、得られた菌株をＣｇ＿ＲＫ＿ＥＶと名付けた。この手順によって得られた菌株のグリセロールストックを、−８０℃に維持した。
【００９５】
実施例４−Ｃ．グルタミクムにおけるラズベリーケトンの生成
Ｃ．グルタミクム菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ、Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢ、及びＣｇ＿ＲＫ＿ＥＶの出発培養物を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１％のグルコースを追加した２５ｍＬのＬＢ培地において、２５０ｒｐｍ及び３０℃で、４８時間にわたって増殖させた。出発培養物を１０分間にわたって５０００ｒｐｍで遠心分離し、細菌ペレットを１．５ｍｌのＣｇＸＩＩ最少培地中に再懸濁した（Ｅｇｇｅｌｉｎｇ及びＲｅｙｅｓ  ２００５年を参照されたい）。その後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０ｇ／ＬのＤ−グルコースを追加した２５ｍＬのＣｇＸＩＩ最少培地を含む１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに培養物を移し、１ｍＭのＩＰＴＧで直接的に誘導した。各細菌菌株のために４つの発酵フラスコを並行してセットアップし、そのうち２つには３ｍＭの４−クマル酸を追加し、２つには４−クマル酸を添加しなかった。細菌培養物を３０℃及び２５０ｒｐｍで３０時間にわたって培養した。発酵後、全細菌培養物を収集し、分析まで−２０℃で保管した。
【００９６】
代謝物の抽出及びＨＰＬＣ分析を、実施例２に記載したように行った。３ｍＭの４−クマル酸を追加した培養物と、４−クマル酸を添加しなかった培養物とのいずれにおいても、Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ、Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢ、及びＣｇ＿ＲＫ＿ＥＶの菌株のＣ．グルタミクム抽出物に関して、４−クマル酸の蓄積は観察されなかった。これは、４−クマル酸がＣ．グルタミクムによって代謝されたことを示す。菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐでは、４−クマル酸を発酵に加えなかった場合、ヒドロキシフェニルブテノンのデノボ生成が、１３．２±０．０ｍｇ／Ｌで観察された（図６Ａ〜６Ｄ）。３ｍＭの４−クマル酸を追加したＣｇ＿ＲＫ＿Ｐ培養物では、３．７±０．３ｍｇ／Ｌにおけるヒドロキシフェニルブテノンの生成が観察された。菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿ＥＶのＣ．グルタミクム培養物では、ヒドロキシフェニルブテノンは観察されなかった。Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ及びＣｇ＿ＲＫ＿ＥＶの細菌菌株に関するＨＰＬＣでは、３ｍＭの４−クマル酸を追加した培養物についても、基質を追加しなかった培養物についても、ラズベリーケトンの生成は検出されなかった。
【００９７】
菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢでは、ヒドロキシフェニルブテノンの生成は、基質を追加しなかった培養物と、４−クマル酸を追加した培養物とで、それぞれ、７．１±０．３及び２．５±０．２ｍｇ／Ｌであった。これは、菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐと比較した４６％及び３３％のヒドロキシフェニルブテノン生成の低減に対応する。加えて、菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢについてのＨＰＬＣにおいて、ラズベリーケトンの明らかなピークが観察された。これは、ＢＡＲ遺伝子の添加が、Ｃ．グルタミクムにおけるヒドロキシフェニルブテノンのラズベリーケトンへの変換を著しく増加させたことを示す。実施例２に記載したプロトコールを使用して、ラズベリーケトンの生成をＧＣ−ＭＳによってさらに分析した。
【００９８】
ＧＣ−ＭＳ分析では、Ｃｇ＿ＲＫ＿ＰＢ菌株の抽出物において、ラズベリーケトンの主なピークが観察された（図７Ａ〜７Ｃ）。生成は、１９ｍｇ／Ｌで定量化された。菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿Ｐ及び菌株Ｃｇ＿ＲＫ＿ＥＶのＧＣ−ＭＳ分析において、ラズベリーケトンは観察されなかった。
【００９９】
参考文献
Kyndt et al. 2002 FEBS Lett. 512: 240-244
Berner el al. 2006 J Bacteriol 188: 2666-2673
Jendersen et al. 2015 Appl Environ Microbiol81:4458-4476
Lee & Douglas. 1996 Plant Physiol. 112:193-205
Ehlting et al. 1999 Plant. J. 19: 9-20
Silber et al. 2008 Phytochem. 69: 2449-2456
Zheng & Hrazdina 2008 Arch Biochem Biophys470: 139-145
Abe et al. 2001 Eur J Biochem 268: 3354-3359
Koeduka et al. 2011 Biochem Biophys Res Commun412: 104-108
Beekwilder et al. 2006 Appl Environ Microbiol72: 5670-5672
Gibson et al. 2009 Nature Methods 6:343-345
Vandamme and Soetaert 2002; J Chem TechnoBiotechnol 77:1323-1332
Kirchner & Tauch 2003 J Biotechnol104:287-299
Borejsza-Wysocki and Hrazdina (1994) PlantPhysiol. 1996 Mar;110(3):791-799.
Schroder 1999 (Comprehensive naturalproducts chemistry vol 1: polyketides and other secondary metabolites includingfatty acids and their derivatives [U. Sankawa Ed] pp 749-771)
Eggeling & Reyes 2005 Experiments. In: Eggeling, L., Bott, M. (Eds.), Handbook of Corynebacteriumglutamicum. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 3535-3566
Levi and Weinstein, 1964 Biochemistry,1964, 3 (12), pp 1944-1947
Fuganti and Zucchi, 1998 Journal ofMolecular Catalysis B: Enzymatic 4, 289-293
Hugueny et al (1995, Bioflavour 95 pp 269-273
EP1226265; GB2416769 GB2416770
Beekwilder et al (2007) Biotechnol. J. 2007, 2, 1270-1279
2016, Lee et al Microb Cell Fact. 15:49.
【図１】
2021503307.tif 000003
【図２】
2021503307.tif 000004
【図３】
2021503307.tif 000005
【図４Ａ】
2021503307.tif 000006
【図４Ｂ】
2021503307.tif 000007
【図４Ｃ】
2021503307.tif 000008
【図４Ｄ】
2021503307.tif 000009
【図５Ａ】
2021503307.tif 000010
【図５Ｂ】
2021503307.tif 000011
【図５Ｃ】
2021503307.tif 000012
【図５Ｄ】
2021503307.tif 000013
【図６Ａ】
2021503307.tif 000014
【図６Ｂ】
2021503307.tif 000015
【図６Ｃ】
2021503307.tif 000016
【図６Ｄ】
2021503307.tif 000017
【図７Ａ】
2021503307.tif 000018
【図７Ｂ】
2021503307.tif 000019
【図７Ｃ】
2021503307.tif 000020
【配列表】
2021503307000001.app
【国際調査報告】
2021503307.tif 000021
2021503307.tif 000022
2021503307.tif 000023
2021503307.tif 000024