(57)【要約】本開示は、一般に、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放不足に関連する疾患または症状を処置するための、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための組成物および方法に関する。一態様では、抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列と；それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の軽鎖ＣＤＲ配列とを含む抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片が本明細書で提供される。
2021520393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列と；
それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の軽鎖ＣＤＲ配列とを含む、抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１に記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号９〜１７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む、抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であって、Ｃｘ４３に結合すると、ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩ（配列番号１９）のアミノ酸配列内に位置するエピトープに結合する、抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記エピトープが、配列番号１９のＦ１、Ｓ３、Ｒ４、Ｐ５、Ｔ６、Ｅ７、Ｋ８、Ｔ９およびＩ１０からなる群より選択される１個またはそれを超えるアミノ酸を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
前記エピトープが、配列番号１９のＦ１、Ｓ３、Ｒ４、Ｐ５、Ｔ６、Ｅ７、Ｋ８、Ｔ９およびＩ１０からなる、請求項４に記載の抗体またはその断片。
【請求項７】
前記エピトープが、配列番号１９の１０個すべてのアミノ酸を含む、請求項４に記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
前記エピトープが、配列番号１９の１０個すべてのアミノ酸からなる、請求項４に記載の抗体またはその断片。
【請求項９】
単離された抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であって、Ｃｘ４３への結合について、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と交差競合する、単離された抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
単離された抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であって、Ｃｘ４３への結合について、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と交差競合し、好ましくは、ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩ（配列番号１９）のアミノ酸配列内に位置するエピトープに結合し、より好ましくは、前記エピトープが、配列番号１９のＦ１、Ｓ３、Ｒ４、Ｐ５、Ｔ６、Ｅ７、Ｋ８、Ｔ９およびＩ１０からなる群より選択される１個またはそれを超えるアミノ酸を含み、さらにより好ましくは、前記エピトープが、配列番号１９の１０個すべてのアミノ酸を含む、単離された抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１２】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進するための、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための医薬組成物であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進するための、好ましくは癌、癌転移、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための医薬を製造するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片の使用。
【請求項１４】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進する、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための方法であって、前記骨細胞を、有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片と接触させることを含む、方法。
【請求項１５】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放に関連する疾患または症状を処置するための、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための方法であって、治療有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６５１，６６８号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権および利益を主張する。
【０００２】
配列表
ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された、４３，７８７バイトのサイズを有する２０１９年４月１日に作成された「１７２６２８＿０２０３０１＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」という名称のＡＳＣＩＩテキストファイルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
分野
本開示は、一般に、抗コネキシン（Ｃｘ）４３抗体と、例えば骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放に関連する疾患または症状の処置におけるその使用とに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
複数の予防的および治療的アプローチにもかかわらず、癌は、世界中で主な死因の１つである。２０１０〜２０２０年に、米国における新たな癌症例の数は、男性では約２４％増加して年間１００万症例を超え、女性では約２１％増加して年間９０万症例を超えると予想される。最も増加すると予想される癌のタイプは、男性および女性の両方で黒色腫；男性では前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌および膀胱癌；ならびに女性では肺癌、乳癌、子宮癌および甲状腺癌である。癌は依然として、米国における２番目に多い死因であり、死亡の４件ごとにほぼ１件を占めている。多くの癌は、現在のアプローチを用いて処置困難または不可能である。多くの癌は、現在の処置レジメンを回避するか、処置に対して耐性になるか、または処置後に再発する。
【０００５】
癌が、それが由来する身体部分（例えば、乳房または前立腺）から他の身体部分（例えば、肝臓または骨）に広がり、二次腫瘍を確立すると、癌転移が起こる。骨は、最も多い癌転移部位の１つである。骨に転移する癌としては、限定されないが、乳癌、前立腺癌、肺癌および皮膚癌（例えば、黒色腫）が挙げられる。骨転移は、進行性乳癌および前立腺癌を有する患者の最大７５％で特定され得る。骨転移（ｍｅｔｓ）は、臨床および生活の質に関する多くの重大な結果、例えば限定されないが、難治性疼痛、病的骨折、脊髄および神経圧迫、骨髄浸潤、ならびに運動障害に関連する。多くの場合、全身に存在する癌もまた、癌を治癒不能にし得る。
【０００６】
正常な骨は、３つの主要な細胞タイプ：骨形成骨芽細胞、骨吸収破骨細胞および骨細胞から構成される。骨細胞は骨の細胞の約９５％を構成し、溶骨活性および骨芽細胞活性を調整することにより骨再形成プロセスを維持する。癌細胞が骨に浸潤すると、正常な骨機能の多くが影響を受ける。癌細胞は局所微小環境と相互作用して、骨破壊および血管新生を介して癌細胞生存を促進する。
【０００７】
骨細胞は、コネキシン（Ｃｘ）４３ヘミチャネルとして公知のヘミチャネルを発現する。これらの骨細胞ヘミチャネルは、通常は閉鎖しており、機械刺激に曝露されると開放され得、様々な因子が骨微小環境に放出される。ヘミチャネルの開放により放出される因子は、腫瘍細胞遊走および骨転移を減少させ得る他のプロセスを媒介し得る。一般に使用されている有効なビスフォスフォネート薬であるアレンドロネート（ＡＤ）は、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルを開放することができることが示されている。ビスフォスフォネートは、骨転移を含む多くの骨障害の処置について公知の薬物のクラスである。乳癌を有する患者では、ビスフォスフォネートの投与は、骨転移の発生率の減少および死亡率の減少に関連することが示されている。ＡＤは、腫瘍の成長の減少ならびに骨破壊および疼痛の減少に関連している。ＡＤは破骨細胞活性を阻害し、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を誘導する。しかしながら、ＡＤ投与は、複数の重篤な副作用を伴う。
【０００８】
従って、例えばＣｘ４３ヘミチャネルを開放することにより癌転移を処置するための有効な方法および組成物の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放（例えば、開放不足または不全）に関連する疾患または症状、例えば癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための組成物および方法が本明細書で提供される。
【００１０】
一態様では、抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列と；
それぞれ配列番号４、５および６のアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の軽鎖ＣＤＲ配列とを含む抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片が本明細書で提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインとを有し得る。
【００１２】
別の態様では、抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号９〜１７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片が本明細書で提供される。
【００１３】
別の態様では、抗体であって、ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩ（配列番号１９）のアミノ酸配列内に位置するエピトープに結合する抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、エピトープは、配列番号１９のＦ１、Ｓ３、Ｒ４、Ｐ５、Ｔ６、Ｅ７、Ｋ８、Ｔ９およびＩ１０からなる群より選択される１個またはそれを超えるアミノ酸を含み得る。一実施形態では、エピトープは、配列番号１９のＦ１、Ｓ３、Ｒ４、Ｐ５、Ｔ６、Ｅ７、Ｋ８、Ｔ９およびＩ１０からなる。いくつかの実施形態では、エピトープは、配列番号１９の１０個すべてのアミノ酸を含み得る。特定の実施形態では、エピトープは、配列番号１９の１０個すべてのアミノ酸からなる。
【００１４】
さらなる態様では、単離された抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であって、Ｃｘ４３への結合について、本明細書に開示される任意の抗体またはその断片と交差競合する単離された抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片が本明細書で提供される。特定の実施形態では、抗体またはその断片は、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進する。
【００１５】
別の態様では、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進するための、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための医薬組成物であって、本明細書に開示される抗体またはその断片と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【００１６】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進するための、好ましくは癌、癌転移、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための医薬を製造するための、本明細書に開示される抗体またはその断片の使用も本明細書で提供される。
【００１７】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進する、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための方法であって、前記骨細胞を、有効量の本明細書に開示される抗体またはその断片と接触させることを含む方法が本明細書でさらに提供される。
【００１８】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放（例えば、開放不足）に関連する疾患または症状を処置するための、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に開示される抗体またはその断片を、それを必要とする患者に投与することを含む方法も本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】抗体スクリーニングの生データの箱ひげ図。
【００２０】
【図２】高ストリンジェンシー条件下で抗体でプローブしたペプチドＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩの完全置換分析のレタープロットグラフ。塩基配列はグラフの下に掲載されており、塩基配列の平均シグナルは赤色の線である。所与の位置における置換は、その置き換えについて記録されたシグナル強度でプロットされている。
【００２１】
【図３】高ストリンジェンシー条件下で抗体でプローブしたペプチドＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩの完全置換分析のレタープロットグラフ。塩基配列はグラフの下に掲載されており、塩基配列の平均シグナルは赤色の線である。所与の位置における置換は、その置き換えについて記録されたシグナル強度でプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも、例示的および説明的なものにすぎず、本開示の組成物および方法を限定するものではないことを理解すべきである。
【００２３】
抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片に関する組成物および方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、国際公開第２０１５／０２７１２０号および国際公開第２０１７／１４７５６１号（これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものよりも優れた活性、薬物性（例えば、減少した毒性）、安定性および／または開発性（例えば、減少した生産コスト）を示す。特定の実施形態では、利点は予想外である。
【００２４】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語が本明細書にまとめられる。特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、以下の意味を有することを意図する。
【００２６】
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、その冠詞の１つのまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つの）文法的目的語を指すために本明細書で使用される。例として、「エレメント」は、１つのエレメントまたは１つを超えるエレメントを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記述されている値の２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくは５％以内の許容され得る変動を意味する。
【００２８】
「抗Ｃｘ４３抗体」は、Ｃｘ４３（例えば、その細胞外ドメイン）に免疫特異的に結合する抗体である。抗体は、単離された抗体であり得る。Ｃｘ４３へのこのような結合は、例えば、１μＭ以下、１００ｎＭ以下または５０ｎＭ以下の値を有するＫＤを示す。ＫＤは、当業者に公知の任意の方法、例えば表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイにより測定され得る。抗Ｃｘ４３抗体は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、標的エピトープに結合する結合ドメインを含むタンパク質である。抗体という用語は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖分子を含むモノクローナル抗体、単一重鎖可変ドメイン抗体、ならびにモノクローナルおよび単一重鎖可変ドメイン抗体のキメラバリアントを含むそれらのバリアントおよび誘導体を含む。結合ドメインは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされ、タンパク質は、抗原に免疫特異的に結合する。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定するガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類される。ヒトおよびマウス種を含むほとんどの脊椎動物生物の場合、典型的な免疫グロブリン構造単位は、各ペアが１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有するポリペプチド鎖の２つの同一のペアから構成されるテトラマーを含む。「ＶＬ」およびＶＨ」は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖の可変ドメインを指す。「ＣＬ」およびＣＨ」は、軽鎖および重鎖の定常ドメインを指す。ＶＬおよびＶＨ上の各３つのβ鎖のループは、抗原への結合に関与し、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。「Ｆａｂ」（断片、抗原結合）領域は、抗体の各重鎖および軽鎖由来の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメイン、すなわちＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１を含む。
【００３０】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンおよびその抗原結合断片を含む。「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合するか、または抗原結合（すなわち、特異的結合）についてインタクトな抗体と（すなわち、それらが由来するインタクトな抗体と）競合する抗体のポリペプチド断片を指す。抗原結合断片は、当技術分野で周知の組換えまたは生化学的方法により生産され得る。例示的な抗原結合断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ＣＤＲ、パラトープおよびＶＨ、ならびにＶＬ鎖が（直接的にまたはペプチドリンカーを介して）互いに接続されて連続ポリペプチドを形成した単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００３１】
抗体はまた、バリアント、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む。本明細書で使用される場合、「抗体バリアント」という用語は、重鎖および／または軽鎖に単一または複数の突然変異を有する抗体を指す。いくつかの実施形態では、突然変異は可変領域に存在する。いくつかの実施形態では、突然変異は定常領域に存在する。「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖の各アミノ酸配列の一部が、特定の種に由来するかまたは特定のクラスに属する抗体における対応する配列と相同であり、鎖の残りのセグメントが、別のものにおける対応する配列と相同である抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体では、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、ある種の哺乳動物に由来する抗体の可変領域を模倣し、定常部分は、別のものに由来する抗体における配列と相同である。このようなキメラ形態の１つの明確な利点は、例えば、例えば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて、非ヒト宿主生物由来の容易に入手可能なハイブリドーマまたはＢ細胞を使用して、現在公知の供給源から、可変領域を好都合に誘導し得ることである。可変領域は調製容易性の利点を有し、特異性はその供給源により影響を受けないが、ヒトの定常領域は、非ヒト供給源由来の定常領域よりも、抗体が注射された場合にヒト被験体から免疫反応を誘発する可能性が低い。しかしながら、前記定義は、この特定の例に限定されない。「ヒト化」抗体は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく残りの免疫グロブリン分子構造とを有する分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメイン、または可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域にグラフトされた相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含み得る。抗原結合部位は野生型であり得るか、または１つもしくはそれを超えるアミノ酸置換により改変され得、例えば、ヒト免疫グロブリンにより近く似るように改変され得る。ヒト化抗体のいくつかの形態は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体由来の６つすべてのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対して変化した１つまたはそれを超えるＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）を有し、これらは、１つまたはそれを超えるＣＤＲに「由来する」１つまたはそれを超えるＣＤＲとも称される。
【００３２】
本明細書に記載される場合、抗体のアミノ酸残基は、カバット（Ｋａｂａｔら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）の一般的なナンバリングにしたがってナンバリングされ得る。
【００３３】
抗体と標的としてのＣｘ４３のエピトープとの間の結合の文脈で本明細書で使用される場合、「結合」という用語は、分子間の非共有結合的相互作用のプロセスを指す。好ましくは、前記結合は特異的である。抗体の特異性は、親和性に基づいて決定され得る。特異的抗体は、そのエピトープに対して１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−８Ｍ未満の結合親和性または解離定数ＫＤを有し得る。
【００３４】
「親和性」という用語は、抗体の結合ドメインとエピトープとの間の結合反応の強度を指す。それは、結合ドメインとエピトープとの間で作用する引力および反発力の合計である。本明細書で使用される場合、親和性という用語は、解離定数ＫＤを指す。
【００３５】
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合物により結合されることができ、さらに、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するために動物で使用されることができる分子または分子の一部を指す。抗原は、１つまたはそれを超えるエピトープを有し得る。
【００３６】
「癌」という用語は、周囲組織および潜在的には宿主における初期の異常細胞成長部位に遠位の組織への浸潤につながる宿主自体の細胞の無制御で異常な成長を広く指す。主要なクラスとしては、上皮組織（例えば、皮膚、扁平上皮細胞）の癌である癌腫；結合組織（例えば、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管など）の癌である肉腫；造血組織（例えば、骨髄組織）の癌である白血病；免疫細胞の癌であるリンパ腫および骨髄腫；ならびに脳および脊髄組織由来の癌を含む中枢神経系癌が挙げられる。「癌」、「新生物」および「腫瘍」は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「癌」は、新たなものまたは再発性のものにかかわらず、白血病、癌腫および肉腫を含むすべてのタイプの癌または新生物または悪性腫瘍を指す。癌の具体例は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫および混合型腫瘍である。癌の非限定的な例は、脳、黒色腫、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、腎臓、肺、非小細胞肺、中皮腫、卵巣、前立腺、肉腫、胃、子宮および髄芽腫の新たなまたは再発性の癌である。
【００３７】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。特定の実施形態では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面基、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルを含み、特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴および／または特定の電荷特徴を有し得る。一実施形態では、エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。特定の実施形態では、抗体は、それが、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するといわれる。エピトープマッピングのための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｘ線共結晶学、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、部位特異的突然変異誘発、ハイスループット突然変異誘発マッピングおよび水素−重水素交換である。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングにより並置した隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露で保持されるのに対して、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的には、ユニークな空間的コンフォメーションで少なくとも３個、より通常には少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。
【００３８】
エピトープに結合する抗体上の部位は「パラトープ」と称され、典型的には、結合されるとエピトープに近接するアミノ酸残基を含む。Ｓｅｌａ−Ｃｕｌａｎｇら、Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４：３０２を参照のこと。
【００３９】
「免疫組織化学」または「ＩＨＣ」は、組織切片の細胞における抗原を検出し、生物学的組織における目的の抗原を免疫特異的に認識する抗体の結合およびその後の検出を可能にするプロセスを指す。ＩＨＣ技術の総説については、例えば、Ｒａｍｏｓ−Ｖａｒａら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４  ｖｏｌ．５１  ｎｏ．１，４２−８７（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ＩＨＣ結果を評価するために、異なる定性的および半定量的スコアリングシステムが開発されている。例えば、Ｆｅｄｃｈｅｎｋｏら、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４；９：２２１（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。一例は、３００の可能な値で細胞の割合に（「シグナルなし」の０から「強いシグナル」の３までのスコア化される）染色強度順序値を乗算した結果を追加することにより決定されるＨスコアである。
【００４０】
「免疫特異的」または「免疫特異的に」（「特異的に」と互換的に使用されることがある）は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされるドメインを介して、目的のタンパク質の１つまたはそれを超えるエピトープに結合するが、抗原分子の混合集団を含有するサンプル中の他の分子を実質的に認識せずそれに結合しない抗体を指す。典型的には、抗体は、例えば、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイ、例えばＯｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸバイオセンサーにより、または表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により、または溶液親和性ＥＬＩＳＡにより測定した場合に、５０ｎＭ以下の値を有するＫＤで同族抗原に免疫特異的に結合する。このようなアッセイの使用は、当技術分野で周知である。
【００４１】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出により、リアルタイム生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【００４２】
バイオレイヤー干渉法は、生体分子相互作用を測定するための無標識技術である。それは、２つの面（バイオセンサーチップ上の固定化タンパク質の層および内部参照層）から反射された白色光の干渉パターンを分析する光学分析技術である。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化は、リアルタイムで測定され得る干渉パターンのシフトを引き起こす（Ａｂｄｉｃｈｅ，Ｙ．Ｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００８），３７７（２），２０９−２１７）。特定の実施形態では、「リアルタイムバイオレイヤー干渉ベースのバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸアッセイ）」を使用して、本明細書に開示される特定の抗Ｃｘ４３抗体の結合特徴を評価した。
【００４３】
「交差競合する」、「交差競合」、「交差遮断する（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋ）」、「交差遮断された」および「交差遮断する（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）」という用語は本明細書では互換的に使用され、直接的に、または標的Ｃｘ４３に対する本開示の抗Ｃｘ４３抗体のアロステリックモジュレーションを介して間接的に結合を妨害する抗体またはその断片の能力を意味する。抗体またはその断片が標的への別のものの結合を妨害することができる程度、およびしたがってそれが、本開示にしたがって交差遮断または交差競合するといえるかは、競合結合アッセイを使用して決定され得る。１つの特に適切な定量的交差競合アッセイは、ＦＡＣＳまたはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎベースのアプローチを使用して、標識（例えば、Ｈｉｓタグ付き、ビオチン化または放射性標識）抗体またはその断片と、他の抗体またはその断片との間の競合を、標的へのそれらの結合の点から測定する。一般に、交差競合抗体またはその断片は、例えば、アッセイ中に、二次抗体またはその断片の存在下で、本開示の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはポリペプチドの記録された置換が、所与の量で存在する試験すべき潜在的交差遮断抗体またはその断片による最大理論置換（例えば、交差遮断されることを必要とする非放射性（例えば、非標識）抗体またはその断片による置換）の（例えば、ＦＡＣＳベースの競合アッセイで）１００％までになるように、交差競合アッセイで標的に結合し得るものである。好ましくは、交差競合抗体またはその断片は、１０％〜１００％、より好ましくは５０％〜１００％である記録された置換を有する。
【００４４】
抗体間の相互競合はまた、リアルタイム無標識バイオレイヤー干渉アッセイにより測定され得る。２つの抗体間の交差競合は、自己間結合のためにバックグラウンドシグナル未満である二次抗体の結合として表現され得る（一次抗体および二次抗体は同じ抗体である）。２つの抗体間の交差競合は、例えば、ベースライン自己間バックグラウンド結合未満である二次抗体の結合％として表現され得る（一次抗体および二次抗体は同じ抗体である）。
【００４５】
本明細書で互換的に使用される場合、「促進する」、「増強する」および「誘導する」という用語は、生物学的活性（例えば、ヘミチャネル開放）の任意の統計的に有意な増加を指す。例えば、「促進」は、生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の増加を指し得る。
【００４６】
「被験体」または「患者」という用語は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトまたは他の哺乳動物を含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置」という用語は、本明細書に記載されるものなどの治療的または予防的手段を指す。「処置」の方法は、癌もしくは再発性癌の１つもしくはそれを超える症候を予防し、治癒し、遅延させ、その重症度を軽減しもしくは改善するために、またはこのような処置の非存在下で予想されるものを超えて患者の生存を延長させるために、本明細書で提供されるＣｘ４３リガンドを患者、例えば癌を有する患者に投与することを用いる。「処置」の方法はまた、このような処置の非存在下で予想されるものを超える癌治療を患者において提供するために、本明細書で提供されるＣｘ４３リガンド（例えば、抗体）を患者に投与することを用いる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、患者に投与された場合に、癌の処置、予後予測または診断を達成するために十分な薬剤、例えばＣｘ４３リガンド、例えば抗Ｃｘ４３抗体の量を指す。治療有効量は、処置されている患者および疾患症状、患者の体重および年齢、疾患症状の重症度、投与方法などに応じて変動し、当業者により容易に決定され得る。投与のための投与量は、例えば、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合部分の約１ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、約５ｎｇ〜約９，５００ｍｇ、約１０ｎｇ〜約９，０００ｍｇ、約２０ｎｇ〜約８，５００ｍｇ、約３０ｎｇ〜約７，５００ｍｇ、約４０ｎｇ〜約７，０００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約６，５００ｍｇ、約１００ｎｇ〜約６，０００ｍｇ、約２００ｎｇ〜約５，５００ｍｇ、約３００ｎｇ〜約５，０００ｍｇ、約４００ｎｇ〜約４，５００ｍｇ、約５００ｎｇ〜約４，０００ｍｇ、約１μｇ〜約３，５００ｍｇ、約５μｇ〜約３，０００ｍｇ、約１０μｇ〜約２，６００ｍｇ、約２０μｇ〜約２，５７５ｍｇ、約３０μｇ〜約２，５５０ｍｇ、約４０μｇ〜約２，５００ｍｇ、約５０μｇ〜約２，４７５ｍｇ、約１００μｇ〜約２，４５０ｍｇ、約２００μｇ〜約２，４２５ｍｇ、約３００μｇ〜約２，０００、約４００μｇ〜約１，１７５ｍｇ、約５００μｇ〜約１，１５０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１，１２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，１００ｍｇ、約１．２５ｍｇ〜約１，０７５ｍｇ、約１．５ｍｇ〜約１，０５０ｍｇ、約２．０ｍｇ〜約１，０２５ｍｇ、約２．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約３．０ｍｇ〜約９７５ｍｇ、約３．５ｍｇ〜約９５０ｍｇ、約４．０ｍｇ〜約９２５ｍｇ、約４．５ｍｇ〜約９００ｍｇ、約５ｍｇ〜約８７５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約８２５ｍｇ、約３０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約７７５ｍｇ、約５０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７２５ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６７５ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約５００ｍｇまたは約５２５ｍｇ〜約６２５ｍｇの範囲であり得る。投与は、例えば、毎週、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごとまたは６週間ごとであり得る。投与レジメンは、最適な治療反応を提供するように調整され得る。有効量はまた、薬剤の毒性または有害効果（副作用）が最小化され、および／またはそれらを有益な効果が上回るものである。投与は、正確に、または毎週約６ｍｇ／ｋｇもしくは１２ｍｇ／ｋｇで、または隔週１２ｍｇ／ｋｇもしくは２４ｍｇ／ｋｇで静脈内的であり得る。さらなる投与レジメンは以下に記載される。
【００４９】
本明細書で使用される場合、組換え核酸技術、微生物学、免疫学、抗体操作ならびに分子生物学および細胞生物学の分野で使用される他の用語は、一般に、該当分野の当業者により理解されるであろう。例えば、従来技術は、組換えＤＮＡを調製し、オリゴヌクレオチド合成を実施し、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたはリポフェクション）を行うために使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書にしたがって、または当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載されるように実施され得る。前述の技術および手順は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法にしたがって、本明細書を通して引用および議論される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実施され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（これは、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。特に具体的な定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学ならびに医療および医薬品化学に関連して利用される命名法ならびにそれらの実験手順および技術は、一般に使用される当技術分野で周知のものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品調製、製剤化および送達ならびに患者の処置に使用され得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、所与の実施形態に存在するが、不特定のエレメントを含み得る組成物、方法およびそれらの各構成要素に関して使用される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、本開示のその実施形態の基本的および新規または機能的特徴に実質的に影響を及ぼさないさらなるエレメントの存在を許容する。
【００５２】
「からなる」という用語は、実施形態のその説明に記載されていない任意のエレメントを除外した本明細書に記載される組成物、方法およびそれらの各構成要素を指す。
【００５３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載され、および／または本開示などを読んだ当業者に明らかになるであろう１つまたはそれを超える方法および／または工程のタイプを含む。
【００５４】
様々な態様および実施形態は、以下のサブセクションでさらに詳細に記載される。
【００５５】
Ｃｘ４３
タンパク質コネキシンにより形成されたヘミチャネルおよびギャップ結合を介して、様々な細胞が互いにおよび細胞外環境と伝達することができる。コネキシンタンパク質は、体全体に遍在的に発現される。６つのコネキシンタンパク質が１つのヘミチャネルを構成し、２つのヘミチャネルが１つのギャップ結合チャネルを構成する。ギャップ結合は、隣接細胞間の原形質膜に位置するチャネルのクラスタであり、細胞間伝達を媒介する。ヘミチャネルは、ギャップ結合チャネルとは別個の実体である。ヘミチャネルは、細胞内区画と細胞外環境との間の分子の交換を可能にする。
【００５６】
骨細胞は、コネキシン（Ｃｘ）４３ヘミチャネルとして公知のヘミチャネルを発現する。これらの骨細胞ヘミチャネルは、通常は閉鎖しており、機械刺激に曝露されると開放され得、様々な因子が骨微小環境に放出される。ヘミチャネルの開放により放出される因子は、腫瘍細胞遊走および骨転移を減少させ得る他のプロセスを媒介し得る。
【００５７】
コネキシン−４３は、ギャップ結合アルファ−１タンパク質（ＧＪＡ１）としても公知であり、３８２個のアミノ酸から構成される４３．０ｋＤａのタンパク質である（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００１５６．１）。ＧＪＡ１は、長いＣ末端尾部、Ｎ末端ドメインおよび複数の膜貫通ドメインを含有する。このタンパク質はリン脂質二重層を４回通過し、そのＣ末端およびＮ末端は細胞質に露出している。Ｃ末端尾部は５０個のアミノ酸から構成され、翻訳後修飾部位、ならびに転写因子、細胞骨格エレメントおよび他のタンパク質のための結合部位を含む。その結果として、Ｃ末端尾部は、ｐＨゲーティングおよびチャネルアセンブリの調節などの機能の中心である。特に、この尾部をコードするＧＪＡ１遺伝子（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２６９７）のＤＮＡ領域は高度に保存されているが、これは、それが突然変異耐性であるか、または突然変異すると致死的になることを示している。一方、Ｎ末端ドメインは、チャネルゲーティングおよびオリゴマー化に関与するので、チャネルの開放および閉鎖状態の切り替えを制御し得る。膜貫通ドメインはギャップ結合チャネルを形成し、細胞外ループは適切なチャネルドッキングを促進する。また、２つの細胞外ループはジスルフィド結合を形成し、２つのヘキサマーと相互作用して、完全なギャップ結合チャネルを形成する。
【００５８】
抗Ｃｘ４３抗体
Ｃｘ４３ヘミチャネル開放の促進または増強は、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を誘導または促進し、それにより、例えば癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置し得る。従って、抗Ｃｘ４３抗体は、癌治療における有効な薬剤として使用され得る。
【００５９】
特定の実施形態では、抗Ｃｘ４３抗体は、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり得る。特定の実施形態では、抗Ｃｘ４３抗体は、改変されたもの、例えば、マウス抗Ｃｘ４３抗体に由来するキメラまたはヒト化抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗Ｃｘ４３抗体は、ヒトＣｘ４３タンパク質上に存在するエピトープ、例えば細胞外ループまたはその一部に結合する抗体またはその抗原結合断片である。
【００６０】
例示的な抗Ｃｘ４３抗体は、以下のＣＤＲ配列の１つまたはそれよりも多くを有し得る：
重鎖：
ＣＤＲ１（配列番号１）：ＧＹＴＦＴＳＹＹ
ＣＤＲ２（配列番号２）：ＩＮＰＳＮＡＧＴ
ＣＤＲ３（配列番号３）：ＴＲＥＧＮＰＹＹＴＭＮＹ
軽鎖：
ＣＤＲ１（配列番号４）：ＱＳＬＬＥＳＤＧＫＴＹ
ＣＤＲ２（配列番号５）：ＬＶＳ
ＣＤＲ３（配列番号６）：ＷＱＧＴＨＦＰＷＴ
【００６１】
いくつかの実施形態では、驚くべきことに、上記ＣＤＲ配列を有する抗体は、国際公開第２０１５／０２７１２０号および国際公開第２０１７／１４７５６１号に開示されているものと比較して優れた結合親和性および／または抗体安定性を示すことが発見された。理論に縛られるものではないが、重鎖ＣＤＲ２における「ＮＧ」から「ＮＡ」への突然変異は、脱アミド化を減少させ得ると考えられる。特にＣＤＲ領域における抗体脱アミド化は、結合親和性の変化、抗体の分解および電荷バリアントの変化を引き起こし得、抗体機能に影響を与え、抗体生産のコストを増加させ得る。従って、本明細書に開示されるＣＤＲは、改善された結合親和性および抗体安定性を提供し、国際公開第２０１５／０２７１２０号および国際公開第２０１７／１４７５６１号に開示されているものよりも有利な技術的効果をもたらす。
【００６２】
例えば、ＣＤＲグラフティング、生殖細胞系列モデリングおよび３Ｄ構造分析を使用してモノクローナル抗体をヒト化および最適化して、抗体の薬剤性および／または開発性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、ヒト化の後、抗Ｃｘ４３抗体は、以下の可変ドメインの一方または両方を有し得る：
重鎖可変ドメイン（配列番号７）：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMYWVRQAPGQGLEWIGGINPSNAGTNFNEKFKNRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGNPYYTMNYWGQGTLVTVSS
軽鎖可変ドメイン（配列番号８）：
DVVMTQSPLSLPVTIGQPASISCKSSQSLLESDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPWTFGGGTKVEIK
【００６３】
選択実施形態では、抗Ｃｘ４３抗体は、例えば、１つまたはそれを超える突然変異を必要に応じて含有し得る例えばヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の定常領域（ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇａｉｎ）に融合された可変ドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、突然変異は、結合親和性および抗体の安定性を維持しながら、抗体の細胞傷害性エフェクター機能を低減または最小化するように設計され得る。例えば、抗Ｃｘ４３抗体は、以下の重鎖配列（太字部分は可変ドメインに対応し、非太字部分は定常領域に対応する）の１つまたはそれよりも多くを有し得る。
【００６４】
【化１】
2021520393.tif 000003
【化２】
2021520393.tif 000004
【化３】
2021520393.tif 000005
【００６５】
いくつかの実施形態では、抗Ｃｘ４３抗体は、以下の軽鎖配列（太字部分は可変ドメインに対応し、非太字部分は定常領域に対応する）を有し得る。
【化４】
2021520393.tif 000006
【００６６】
さらに別の実施形態では、抗Ｃｘ４３抗体は、それぞれがＣｘ４３上の同じまたは異なるエピトープに結合する２つまたはそれを超える抗Ｃｘ４３抗体の混合物またはカクテルを含み得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、特異性の少なくとも１つが本明細書に開示される抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片である二重特異性抗体が作製され得る。他の特異性は、処置されている疾患に関与する別の標的に対するものであり得る。
【００６８】
一態様では、医薬の製造のためのＣｘ４３リガンドの使用が提供される。別の態様では、患者における腫瘍成長および／または転移を抑制する方法であって、患者に有効量のＣｘ４３リガンドを投与することを含む方法が提供される。
【００６９】
抗Ｃｘ４３抗体の調製
抗Ｃｘ４３抗体は、当技術分野で一般に公知の様々な方法を使用して作製され得る。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ヒト抗体ライブラリーをスクリーニングし、治療のための完全ヒトモノクローナル抗体を生産し得る。高親和性結合物は、中和研究の候補と考えられ得る。あるいは、従来のモノクローナルアプローチを使用し得、マウスまたはウサギをヒトタンパク質で免疫化し、候補結合物を同定および試験し、最後に、重鎖および軽鎖の結合部位をヒト抗体コード配列にグラフトすることにより、ヒト化抗体を生産し得る。
【００７０】
抗体は、典型的には、各ペアが（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）１つの全長「軽」鎖および（典型的には約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）１つの全長「重」鎖を有するポリペプチド鎖の２つの同一のペアを含む。各鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識に典型的に関与する約１００〜１１０個またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能に関与する定常領域を規定する。重鎖および軽鎖の各可変領域は、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域により接続された４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む同じ一般構造を示す。各ペアの２つの鎖由来のＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によりアライメントされ、このアライメントが、特定のエピトープへの結合を可能にし得る。Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖および重鎖可変領域は両方とも、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、典型的には、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７  ａｎｄ  １９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）、Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７またはＣｈｏｔｈｉａら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３）の定義に従う。
【００７１】
モノクローナル抗体の開発により、抗体は、医薬品として有用かつ興味深いものになった。モノクローナル抗体は、抗体分子を生産する任意の方法を使用して、培養液中の連続細胞株により生産される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）のハイブリドーマ法およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；およびＢｒｏｄｅｕｒら、１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．５１−６３）が挙げられる。
【００７２】
モノクローナル抗体は、治療薬として使用するために改変され得る。一例は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体である。他の例は、それらが所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片である。米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５を参照のこと。関連開発は「ＣＤＲグラフト」抗体であり、この抗体は、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する１つまたはそれを超える相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、抗体鎖の残りは、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である。
【００７３】
別の開発は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で周知である（米国特許第５，５８５，０８９号および米国特許第５，６９３，７６２号を参照のこと；ラマ抗体のヒト化については、Ｃｅｃｉｌｅ  Ｖｉｎｃｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９；２８４：３２７３−３２８４も参照のこと）。一般に、ヒト化抗体は非ヒト動物により産生され、次いで、典型的にはこの抗体の非抗原認識部分由来の特定のアミノ酸残基が、対応するアイソタイプのヒト抗体における前記残基と相同になるように改変される。ヒト化は、例えば、当技術分野で記載されている方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）を使用して、齧歯類可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより実施され得る。
【００７４】
より最近は、ヒトへの抗原の曝露を伴わないヒト抗体（「完全ヒト抗体」）の開発である。内因性マウス免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、必要に応じて担体にコンジュゲートされた（典型的には少なくとも６つの連続アミノ酸を有する）抗原による免疫化により生産される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照のこと。これらの方法の一例では、トランスジェニック動物は、その中のマウス重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することにより生産される。次いで、完全未満の改変を有する部分的改変動物を交配させて、所望の免疫系改変のすべてを有する動物を得る。免疫原を投与されると、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に対して免疫特異的な抗体であって、可変領域を含む（マウスではなく）ヒトアミノ酸配列を有する抗体を産生する。国際公開第９６／３３７３５号および国際公開第９４／０２６０２号（これらは、参照により組み込まれる）を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開第９１／１０７４１号、国際公開第９０／０４０３６号ならびに欧州特許第５４６０７３号および欧州特許出願公開第５４６０７３号（これらは、参照により組み込まれる）に記載されている。ヒト抗体はまた、本明細書に記載されるように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現により、またはハイブリドーマ細胞における発現により生産され得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ファージディスプレイ技術は、治療用抗体をスクリーニングするために使用され得る。ファージディスプレイでは、抗体レパートリーを線維状バクテリオファージの表面上にディスプレイし得、免疫原に結合するファージについて、構築ライブラリーをスクリーニングし得る。抗体ファージは、バクテリオファージの遺伝子操作、ならびに反復ラウンドの抗原誘導選択およびファージ増殖に基づく。この技術は、Ｃｘ４３モノクローナル抗体のインビトロ選択を可能にする。ファージディスプレイプロセスは、抗体ライブラリー調製から始まり、続いて、可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）ＰＣＲ産物をファージディスプレイベクターにライゲーションし、モノクローナル抗体のクローンの分析に至る。Ｍ１３バクテリオファージに元々由来する大腸菌の線維状バクテリオファージのｐＩＩＩマイナーカプシドタンパク質に融合されたｓｃＦｖとしてＶＨおよびＶＬを発現するように操作されたファージディスプレイベクター（例えば、ファージミドｐＣｏｍｂ３Ｘ）に、抗体レパートリーに相当するＶＨおよびＶＬ  ＰＣＲ産物をライゲーションする。しかしながら、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｘは、大腸菌で完全バクテリオファージをコードするために必要なすべての他の遺伝子を有しない。それらの遺伝子については、ファージディスプレイベクターライブラリーで形質転換された大腸菌にヘルパーファージを追加する。結果は、それぞれがその表面上にＣｘ４３モノクローナル抗体を発現し、中に各ヌクレオチド配列を有するベクターを内包するファージのライブラリーである。ファージディスプレイはまた、大腸菌の特定の株で（ファージカプシドタンパク質に付着されていない）Ｃｘ４３モノクローナル抗体それ自体を生産するために使用され得る。生産されたｍＡｂの特性評価および精製を可能にするために、ファージディスプレイベクター内でＶＬおよびＶＨ配列の後に、さらなるｃＤＮＡが操作される。具体的には、溶液からの容易な精製を可能にするために、組換え抗体は、血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグおよびポリヒスチジンを有し得る。
【００７６】
多様な抗体ファージライブラリーは、ヘルパーファージを感染させた約１０８個の独立した大腸菌形質転換体から生産される。バイオパニングを使用して、ライブラリーは、モノクローナル抗体の発現表面を介して、上記免疫原配列またはその断片に結合するファージについてスクリーニングされ得る。周期的なパニングは、潜在的に非常にまれな抗原結合クローンを取り出すことを可能にし、複数ラウンドの（ＥＬＩＳＡプレート上に、または溶液中では細胞表面上に固定化された）抗原へのファージ結合、洗浄、溶出、および大腸菌におけるファージ結合物の再増幅からなる。各ラウンド中に、特異的結合物は、非結合物を洗い流し、結合ファージクローンを選択的に溶出することによりプールから選択される。３または４ラウンドの後、表面Ｃｘ４３モノクローナル抗体を介したファージクローンの高度に特異的な結合は、固定化免疫原における直接選択に特徴的である。
【００７７】
別の方法は、アフィニティークロマトグラフィーによる精製に適切なＣ末端Ｈｉｓタグを上記免疫原配列に追加することである。精製タンパク質は、適切なアジュバントと一緒にマウスに接種され得る。ハイブリドーマで産生されたモノクローナル抗体は、免疫原への結合について試験され得、陽性結合物は、本明細書のアッセイに記載されているようにスクリーニングされ得る。
【００７８】
完全ヒト抗体はまた、（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；およびＭａｒｋｓら、１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されているように）ファージディスプレイライブラリーから生産され得る。これらのプロセスは、線維状バクテリオファージの表面上への抗体レパートリーのディスプレイ、および選択した抗原へのそれらの結合によるその後のファージ選択を通じて、免疫選択を模倣する。１つのこのような技術は、このようなアプローチを使用するＭＰＬおよびｍｓｋ受容体に対する高親和性機能的アゴニスト抗体の単離について記載する国際公開第９９／１０４９４号（これは、参照により組み込まれる）に記載されている。
【００７９】
上記抗体をコードするヌクレオチド配列が決定され得る。その後、キメラ、ＣＤＲグラフト、ヒト化および完全ヒト抗体もまた、組換え方法により生産され得る。抗体をコードする核酸は宿主細胞に導入され、当技術分野で一般に公知の材料および手順を使用して発現され得る。
【００８０】
本開示は、Ｃｘ４３に対する抗体を提供する。好ましくは、抗体はＣｘ４３に結合する。好ましい実施形態では、本開示は、重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子、特にその可変領域に対応する配列をコードするヌクレオチド配列およびそれらを含むアミノ酸配列を提供する。好ましい実施形態では、特にＣＤＲ１からＣＤＲ３のＣＤＲに対応する配列が提供される。さらなる実施形態では、本開示は、このような免疫グロブリン分子を発現するハイブリドーマ細胞株およびそれから産生されるモノクローナル抗体、好ましくはヒトＣｘ４３に対する精製ヒトモノクローナル抗体を提供する。
【００８１】
本開示の抗Ｃｘ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲは、同じまたは別の種由来のフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされ得る。特定の実施形態では、抗Ｃｘ４３抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲにグラフトされ得る。コンセンサスヒトＦＲを作るために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲをアライメントさせて、コンセンサスアミノ酸配列を特定する。抗Ｃｘ４３抗体重鎖または軽鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖由来のＦＲに置き換えられ得る。抗Ｃｘ４３抗体の重鎖および軽鎖のＦＲにおけるまれなアミノ酸は、典型的には置き換えられないが、ＦＲアミノ酸の残りは置き換えられ得る。まれなアミノ酸は、それらがＦＲに通常見られない位置にある特定のアミノ酸である。本開示の抗Ｃｘ４３抗体由来のグラフト可変領域は、抗Ｃｘ４３抗体の定常領域とは異なる定常領域と共に使用され得る。あるいは、グラフト可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲグラフティングは、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号および米国特許第５，５３０，１０１号（これらは、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ハイブリドーマ株により産生され得る。これらの実施形態では、本開示の抗体は、約４ｐＭ〜１μＭの解離定数（ＫＤ）でＣｘ４３に結合する。本開示の特定の実施形態では、抗体は、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満または約１０ｎＭ未満のＫＤでＣｘ４３に結合する。
【００８３】
実施形態では、本開示の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプ、例えばＩｇＧ１アイソタイプのものである。特定の実施形態では、抗体は、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４重鎖を含む。実施形態では、抗体の可変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプの定常領域にライゲーションされる。特定の実施形態では、抗体の可変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプの定常領域以外の定常領域にライゲーションされる。特定の実施形態では、本開示の抗体は、哺乳動物細胞における発現のためにクローニングされる。
【００８４】
代替的な実施形態では、本開示の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で発現され得る。これらの実施形態では、特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用され得る。これらの実施形態によれば、形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法であって、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクター）にパッケージングすること、および宿主細胞にウイルス（またはベクター）を形質導入することを含む方法を使用して、または当技術分野で公知のトランスフェクション手順により達成され得る。このような手順は、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，９１２，０４０号、米国特許第４，７４０，４６１号および米国特許第４，９５９，４５５号（これらはすべて、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に例示されている。一般に、使用される形質転換手順は、形質転換すべき宿主に依存し得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は当技術分野で周知であり、限定されないが、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【００８５】
本開示の方法の特定の実施形態によれば、Ｃｘ４３抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域または軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的なライゲーション技術を使用して適切な発現ベクターに挿入される。好ましい実施形態では、Ｃｘ４３抗体重鎖または軽鎖定常領域は、適切な可変領域のＣ末端に追加され、発現ベクターにライゲーションされる。ベクターは、典型的には、用いられる特定の宿主細胞で機能的であるように選択される（すなわち、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こり得るように、ベクターは宿主細胞機構と適合性である）。発現ベクターの総説については、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．），１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【００８６】
典型的には、宿主細胞のいずれかで使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための、ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有し得る。このような配列は、典型的には、以下のヌクレオチド配列の１つまたはそれよりも多くを含む：プロモーター、１つまたはそれを超えるエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能なマーカーエレメント。これらの配列は、当技術分野で周知である。
【００８７】
本開示の発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築され得る。このようなベクターは、所望の隣接配列のすべてを含有してもよいしまたは含有しなくてもよい。本明細書に記載される隣接配列の１つまたはそれよりも多くがベクターにまだ存在しない場合、それらは個別に取得され、ベクターにライゲーションされ得る。各隣接配列を得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【００８８】
ベクターが構築され、抗Ｃｘ４３抗体を含む軽鎖または重鎖または軽鎖および重鎖をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成ベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現のための適切な宿主細胞に挿入され得る。選択宿主細胞への抗Ｃｘ４３抗体の発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、または他の公知の技術を含む周知の方法により達成され得る。選択方法は、部分的には、使用すべき宿主細胞のタイプに依存するであろう。これらの方法および他の適切な方法は当業者に周知であり、例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されている。
【００８９】
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると抗Ｃｘ４３抗体を合成し、続いて、（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合には）培養培地から、または（それが分泌されない場合には）それを産生する宿主細胞から直接収集し得る。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易性などの様々な要因に依存するであろう。
【００９０】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、限定されないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株、例えば限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ）、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）および多くの他の細胞株が挙げられる。特定の実施形態では、どの細胞株が高い発現レベルを有し、構成的Ｃｘ４３結合特性を有する抗体を産生するかを決定することにより、細胞株を選択し得る。別の実施形態では、それ自体抗体を作製しないが、異種抗体を作製および分泌する能力を有するＢ細胞系統（例えば、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０およびＳＰ２／０）から細胞株を選択し得る。
【００９１】
エピトープマッピングおよび関連技術
本開示は、Ｃｘ４３分子の１つまたはそれを超えるドメイン、例えば細胞外ループ内に見られる１つまたはそれを超えるアミノ酸と相互作用する抗Ｃｘ４３抗体を提供する。抗体が結合するエピトープは、１つまたはそれを超える細胞外ループ内に位置する２つまたはそれを超える（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたはそれを超える）アミノ酸の１つまたはそれを超える隣接配列を含み得る。あるいはまたは加えて、エピトープは、１つまたはそれを超える細胞外ループ（例えば、立体構造エピトープ）内に位置する１つまたはそれを超える非隣接アミノ酸（またはアミノ酸配列）を含み得る。
【００９２】
当業者に公知の様々な技術は、抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１つまたはそれを超えるアミノ酸と相互作用する」かを決定するために使用され得る。例示的な技術としては、ルーチンな交差遮断アッセイ、例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されているものが挙げられる。他の方法としては、アラニンスキャニング突然変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３−６３）、ペプチド切断分析結晶学的研究およびＮＭＲ分析が挙げられる。加えて、エピトープ切断、エピトープ抽出および抗原の化学的改変などの方法が用いられ得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７−４９６）。
【００９３】
抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用され得る別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般に、水素／重水素交換法では、目的のタンパク質を重水素標識し、続いて、抗体を重水素標識タンパク質に結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体により保護されたアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素−水素逆交換を受ける。その結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は重水素を保持し得るので、界面に含まれないアミノ酸と比較して比較的高い質量を示し得る。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基が明らかになる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７：２５２−２５９；Ｅｎｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ−２６５Ａを参照のこと。
【００９４】
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知の改変支援プロファイリング（ＭＡＰ）は、化学的または酵素的に改変された抗原表面への各抗体の結合プロファイルの類似性にしたがって、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号（これは、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。各カテゴリーは、別のカテゴリーにより表されるエピトープとは明らかに異なるかまたは部分的に重複するユニークなエピトープを反映し得る。遺伝的に異なる抗体に対して特性評価を集中させ得るように、この技術は、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生するまれなハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰは、本発明の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体のグループに選別するために使用され得る。
【００９５】
本開示は、同じエピトープまたはエピトープの一部に結合する抗Ｃｘ４３抗体を提供する。同様に、本開示はまた、Ｃｘ４３またはその断片への結合について、本明細書に記載される特定の例示的な抗体のいずれかと競合する抗Ｃｘ４３抗体を含む。例えば、本開示は、Ｃｘ４３への結合について、本明細書に記載される抗体から得られた１つまたはそれを超える抗体と交差競合する抗Ｃｘ４３抗体を含む。
【００９６】
当技術分野で公知のルーチンな方法を使用することにより、抗体が参照抗Ｃｘ４３抗体と同じエピトープに結合するか、または結合について競合するかを容易に決定し得る。例えば、試験抗体が本発明の参照抗Ｃｘ４３抗体と同じエピトープに結合するかを決定するために、飽和条件下で参照抗体をＣｘ４３またはペプチドに結合させ得る。次に、Ｃｘ４３分子に結合する試験抗体の能力を評価する。参照抗Ｃｘ４３抗体との飽和結合後に、試験抗体がＣｘ４３に結合することができる場合、試験抗体は、参照抗Ｃｘ４３抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方、参照抗Ｃｘ４３抗体との飽和結合後に、試験抗体がＣｘ４３に結合することができない場合、試験抗体は、本開示の参照抗Ｃｘ４３抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合し得る。
【００９７】
結合について抗体が参照抗Ｃｘ４３抗体と競合するかを決定するために、上記結合方法論が２方向で実施され得る。第１の方向では、飽和条件下で参照抗体をＣｘ４３に結合させ、続いて、Ｃｘ４３分子への試験抗体の結合を評価し得る。第２の方向では、飽和条件下で試験抗体をＣｘ４３分子に結合させ、続いて、Ｃｘ４３分子への参照抗体の結合を評価し得る。両方向で、第１の（飽和）抗体のみがＣｘ４３分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗体は、Ｃｘ４３への結合について競合すると結論付けられる。当業者により認識されるように、結合について参照抗体と競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合しなくてもよいが、重複または隣接エピトープに結合することにより参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
【００９８】
２つの抗体は、それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じまたは重複エピトープに結合する。すなわち、１、５、１０、２０または１００倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイで測定した場合に、他方の結合を少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％またはさらに９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０  ５０：１４９５−１５０２を参照のこと）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原における本質的にすべてのアミノ酸突然変異が他方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または排除するいくつかのアミノ酸突然変異が他方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は重複エピトープを有する。
【００９９】
次いで、さらなるルーチン実験（例えば、ペプチド突然変異および結合分析）を行って、試験抗体の結合の観察された欠如が、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠如の原因であるかを確認し得る。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して実施され得る。
【０１００】
様々な実施形態では、抗体であって、ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩ（配列番号１９）のアミノ酸配列内に部分的または全体的に位置するエピトープに結合する抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、エピトープは、配列番号１９のＦ１、Ｓ３、Ｒ４、Ｐ５、Ｔ６、Ｅ７、Ｋ８、Ｔ９およびＩ１０からなる群より選択される１つまたはそれを超えるアミノ酸を含み得る。一実施形態では、エピトープは、配列番号１９のＦ１、Ｓ３、Ｒ４、Ｐ５、Ｔ６、Ｅ７、Ｋ８、Ｔ９およびＩ１０からなる。いくつかの実施形態では、エピトープは、配列番号１９の１０個すべてのアミノ酸を含み得る。特定の実施形態では、エピトープは、配列番号１９の１０個すべてのアミノ酸からなる。
【０１０１】
医薬組成物およびその使用
別の態様では、本明細書に開示される方法で使用され得る医薬組成物、すなわち、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進するための、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための医薬組成物が提供される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、Ｃｘ４３リガンドと、薬学的に許容され得る担体とを含む。Ｃｘ４３リガンドは、薬学的に許容され得る担体と共に医薬組成物に製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、例えば、組成物を患者の処置に使用して、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進するための、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための説明書を含み得る。
【０１０３】
一実施形態では、Ｃｘ４３リガンドは、抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片であり得る。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、生理学的に適合する任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファーならびに他の賦形剤などを含む。好ましくは、担体は、非経口、経口または局所投与に適切である。投与経路に応じて、活性化合物、例えば小分子または生物剤は、酸の作用および化合物を不活性化し得る他の天然条件から化合物を保護する材料でコーティングされ得る。
【０１０５】
薬学的に許容され得る担体としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射液または分散液の即時調製のための滅菌粉末、ならびに錠剤、丸剤、カプセルなどの調製のための従来の賦形剤が挙げられる。薬学的に活性な物質の製剤化のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合であることを除いて、本明細書で提供される医薬組成物におけるそれらの使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。
【０１０６】
薬学的に許容され得る担体は、薬学的に許容され得る抗酸化剤を含み得る。薬学的に許容され得る抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１０７】
本明細書で提供される医薬組成物に用いられ得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。必要な場合には、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物に含めることが有用であり得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアレート塩およびゼラチンを組成物に含めることによりもたらされ得る。
【０１０８】
これらの組成物はまた、機能的賦形剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤を含み得る。
【０１０９】
治療用組成物は、典型的には、滅菌のものであり、非系統学的であり、製造および保管の条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適切な他の規則構造として製剤化され得る。
【０１１０】
滅菌注射液は、要求に応じて、上記に列挙されている成分の１つまたは組み合わせと共に、必要量の活性化合物を適切な溶媒に組み込み、続いて、例えば精密濾過により滅菌することにより調製され得る。一般に、分散液は、基本分散媒と、上記に列挙されているものからの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことにより調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法としては、真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）が挙げられ、事前に滅菌濾過されているその溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる。有効成分は、滅菌条件下で、追加の薬学的に許容され得る担体、および必要とされ得る任意の保存剤、バッファー、または噴霧剤とともに混合され得る。
【０１１１】
微生物の存在の防止は、前掲の滅菌手順により、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることにより確実にされ得る。また、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬品形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらされ得る。
【０１１２】
Ｃｘ４３リガンドを含む医薬組成物は単独で、または併用療法で投与され得る。例えば、併用療法は、Ｃｘ４３リガンドと、少なくとも１つまたはそれを超えるさらなる治療剤、例えば以下でさらに詳細に議論される当技術分野で公知の１つまたはそれを超える化学療法剤とを含む本明細書で提供される組成物を含み得る。医薬組成物はまた、放射線療法および／または手術と組み合わせて投与され得る。
【０１１３】
投与レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよいし、または治療状況の緊急事態により示されるように用量を比例的に減少もしくは増加させてもよい。
【０１１４】
抗体の投与のための例示的な投与量範囲としては、１０〜１０００ｍｇ（抗体）／ｋｇ（患者の体重）、１０〜８００ｍｇ／ｋｇ、１０〜６００ｍｇ／ｋｇ、１０〜４００ｍｇ／ｋｇ、１０〜２００ｍｇ／ｋｇ、３０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、３０〜８００ｍｇ／ｋｇ、３０〜６００ｍｇ／ｋｇ、３０〜４００ｍｇ／ｋｇ、３０〜２００ｍｇ／ｋｇ、５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜８００ｍｇ／ｋｇ、５０〜６００ｍｇ／ｋｇ、５０〜４００ｍｇ／ｋｇ、５０〜２００ｍｇ／ｋｇ、１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１００〜９００ｍｇ／ｋｇ、１００〜８００ｍｇ／ｋｇ、１００〜７００ｍｇ／ｋｇ、１００〜６００ｍｇ／ｋｇ、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、１００〜３００ｍｇ／ｋｇおよび１００〜２００ｍｇ／ｋｇが挙げられる。例示的な投与スケジュールとしては、３日ごとに１回、５日ごとに１回、７日ごとに１回（すなわち、１週間に１回）、１０日ごとに１回、１４日ごとに１回（すなわち、２週間ごとに１回）、２１日ごとに１回（すなわち、３週間ごとに１回）、２８日ごとに１回（すなわち、４週間ごとに１回）および１カ月ごとに１回が挙げられる。
【０１１５】
投与の容易性および投与量の均一性のために、単位剤形で非経口組成物を製剤化することが有利であり得る。本明細書で使用される場合、単位剤形は、処置すべき患者にとって単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し；各単位は、任意の必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性剤を含有する。単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置のためにこのような活性化合物を配合する技術に固有の制約により決定され、それらに直接依存する。
【０１１６】
本明細書に開示される医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療反応を達成するために有効な有効成分の量が得られるように変動し得る。投与の文脈で本明細書で使用される場合、「非経口」は、通常は注射による腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、通常は注射または注入による腸内（すなわち、消化管を介した）および局所投与以外の投与様式を指し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が挙げられる。静脈内注射および注入は、多くの場合、抗体投与に（排他的ではないが）使用される。
【０１１８】
本明細書で提供される薬剤が医薬品としてヒトまたは動物に投与される場合、それらは単独で、または薬学的に許容され得る担体と組み合わせて例えば０．００１〜９０％（例えば、０．００５〜７０％、例えば０．０１〜３０％）の有効成分を含有する医薬組成物として投与され得る。
【０１１９】
特定の実施形態では、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進するために、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための本明細書で提供される方法および使用は、Ｃｘ４３リガンドと、Ｃｘ４３リガンドではない少なくとも１つのさらなる抗癌剤との投与を含み得る。
【０１２０】
一実施形態では、少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、少なくとも１つの化学療法薬を含む。このような化学療法薬の非限定的な例としては、プラチナベースの化学療法薬（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ＥｎｄｏＴＡＧ−１（商標）（正荷電脂質ベースの複合体にカプセル化されたパクリタキセルの製剤；ＭｅｄｉＧｅｎｅ）、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）（アルブミンに結合したパクリタキセルの製剤））、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ／Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、スニチニブ／Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、ダサチニブ／Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標））およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２１】
別の実施形態では、少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、ＥＧＦＲ阻害剤、例えば抗ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲシグナル伝達の小分子阻害剤を含む。例示的な抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））である。セツキシマブは、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから市販されている。抗ＥＧＦＲ抗体の他の例としては、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）；Ａｍｇｅｎ）；ニモツズマブ（ＴｈｅｒａＣＩＭ（商標））およびｍＡｂ８０６が挙げられる。ＥＧＦＲシグナル伝達経路の例示的な小分子阻害剤はゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））であり、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａおよびＴｅｖａから市販されている。ＥＧＦＲシグナル伝達経路の小分子阻害剤の他の例としては、エルロチニブＨＣＬ（ＯＳＩ−７７４；Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；カネルチニブ（カネルチニブ二塩酸塩、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＤ１５８７８０；およびＡＧ１４７８（４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）が挙げられる。
【０１２２】
さらに別の実施形態では、少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、ＶＥＧＦ阻害剤を含む。例示的なＶＥＧＦ阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブ（Ａｖａｓｔａｔｉｎ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を含む。
【０１２３】
さらに別の実施形態では、少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、抗ＥｒｂＢ２抗体を含む。適切な抗ＥｒｂＢ２抗体としては、トラスツズマブおよびペルツズマブが挙げられる。
【０１２４】
一態様では、本開示の組み合わせの改善された有効性は、治療的相乗効果を達成することにより実証され得る。
【０１２５】
「治療的相乗効果」という用語は、所与の用量の２つの製品の組み合わせが、同じ用量の２つの各製品単独の最良よりも有効である場合に使用される。一例では、治療的相乗効果は、パラメータ腫瘍体積の反復測定（例えば、時間因子）を用いた二元配置分散分析から得られる推定値を使用して、組み合わせを最良の単剤と比較することにより評価され得る。
【０１２６】
「添加剤」という用語は、所与の用量の２つまたはそれを超える製品の組み合わせが、２つまたはそれを超える各製品で得られる有効性の合計と同等に有効である場合を指し、「超添加剤」という用語は、組み合わせが、２つまたはそれを超える各製品で得られる有効性の合計よりも有効である場合を指す。
【０１２７】
有効性（組み合わせの有効性を含む）を定量し得る別の方法は、以下の方程式：ｌｏｇ１０細胞死滅＝Ｔ−Ｃ（日数）／３．３２×Ｔｄ（式中、Ｔ−Ｃは、細胞の成長（これは、処置群（Ｔ）の腫瘍および対照群（Ｃ）の腫瘍が所定の値（例えば、１ｇまたは１０ｍＬ）に達するまでの平均時間（日数単位）である）の遅延を表し、Ｔｄは、対照動物で腫瘍の体積が２倍になるために必要な時間（日数単位）を表す）にしたがって決定されるｌｏｇ１０細胞死滅を計算することによるものである。この測定を適用する場合、ｌｏｇ１０細胞死滅が０．７を超えるかまたはそれに等しい場合、製品は活性であると考えられ、ｌｏｇ１０細胞死滅が２．８を超える場合、製品は非常に活性であると考えられる。
【０１２８】
この測定を使用すると、それ自体の最大耐用量で使用される組み合わせ（各構成成分は、一般にその最大耐用量未満であるかまたはそれに等しい用量で存在する）は、ｌｏｇ１０細胞死滅が、単独で投与された際の最良の構成成分のｌｏｇ１０細胞死滅の値を超える場合に治療的相乗効果を示す。例示的な場合では、組み合わせのｌｏｇ１０細胞死滅は、組み合わせの最良の構成成分のｌｏｇ１０細胞死滅の値を少なくとも１ｌｏｇ細胞死滅だけ超える。
【０１２９】
癌治療を提供するための組成物および方法が本明細書に開示される。前記方法は、それを必要とする被験体の骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進することを含み得る。Ｃｘ４３モジュレーション（例えば、抗Ｃｘ４３抗体）は、独立した癌治療として、または他の癌治療と組み合わせて使用され得る。
【０１３０】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放を促進するための、好ましくは癌、癌転移、骨肉腫、骨粗鬆症または骨減少症を処置するための方法であって、本明細書に開示される抗Ｃｘ４３抗体のいずれか１つまたはそれよりも多くを、それを必要とする被験体に投与することを含む方法も本明細書で提供される。
【０１３１】
様々な実施形態では、本明細書に開示される方法は、被験体に有効量の抗Ｃｘ４３抗体またはその抗原結合断片を投与することを含み得る。一般に、有効量は治療的および／または予防的に投与され得る。
【０１３２】
処置は、このような癌を患っているか、それを有するか、それに対して感受性であるか、またはそれを発症するリスクを有する被験体、特にヒトに適切に投与され得る。「リスクを有する」被験体の決定は、診断試験または被験体もしくは医療提供者の意見（例えば、遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカー、家族歴など）による客観的または主観的決定により行われ得る。このような処置を必要とする被験体の特定は、被験体または医療専門家の判断内であり得、主観的（例えば、意見）または客観的（例えば、試験または診断方法により測定可能）であり得る。
【０１３３】
製剤の投与
限定されないが、再構成製剤および液体製剤を含む本開示の製剤は、公知の方法、例えばボーラスとしての静脈内投与にしたがって、または、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所もしくは吸入経路による一定期間にわたる持続注入により、抗Ｃｘ４３抗体による処置を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。
【０１３４】
実施形態では、製剤は、静脈内または皮下（すなわち、皮膚の下）投与により哺乳動物に投与される。このような目的のために、製剤は、シリンジを使用して注射され得る。しかしながら、製剤の投与のための他のデバイス、例えば注射デバイス（例えば、ＩＮＪＥＣＴ−ＥＡＳＥ（商標）およびＧＥＮＪＥＣＴ（商標）デバイス；インジェクターペン（例えば、ＧＥＮＰＥＮ）；自動注射デバイス、無針デバイス（例えば、ＭＥＤＩＪＥＣＴＯＲ（商標）およびＢＩＯＪＥＣＴＯＲ（商標））；および皮下パッチ送達システムが利用可能である。
【０１３５】
特定の実施形態では、本開示は、単一用量投与単位のためのキットを対象とする。このようなキットは、単一または複数のチャンバーのプレフィルドシリンジの両方を含む治療用タンパク質または抗体の水性製剤の容器を含む。例示的なプレフィルドシリンジは、Ｖｅｔｔｅｒ  ＧｍｂＨ，Ｒａｖｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。
【０１３６】
タンパク質の適切な投与量（「治療有効量」）は、例えば、処置すべき症状、症状の重症度および経過、タンパク質が予防または治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴および抗Ｃｘ４３抗体への反応、使用される製剤の形式、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。抗Ｃｘ４３抗体は、一度にまたは一連の処置にわたって患者に適切に投与され、診断以降の任意の時点で患者に投与され得る。抗Ｃｘ４３抗体は、単独処置として、または問題の症状の処置において有用な他の薬物もしくは治療と併せて投与され得る。
【０１３７】
抗Ｃｘ４３抗体の場合、初回候補投与量は、患者への投与について約０．１〜１００または１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得、１回またはそれを超える個別投与の形態をとり得る。しかしながら、他の投与レジメンが有用であり得る。このような治療の進行は、従来の技術により容易にモニタリングされる。
【０１３８】
本開示の特定の実施形態によれば、複数用量の抗Ｃｘ４３抗体（または抗Ｃｘ４３抗体と、本明細書で言及されるさらなる治療活性剤のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）は、規定の時間にわたって被験体に投与され得る。本開示のこの態様の方法は、複数用量の本開示の抗Ｃｘ４３抗体を被験体に逐次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次投与」は、各用量の抗Ｃｘ４３抗体が、異なる時点で、例えば所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）だけ離れた異なる日に、被験体に投与されることを意味する。本開示は、患者に単一の初回用量の抗Ｃｘ４３抗体、続いて１つまたはそれを超える二次用量の抗Ｃｘ４３抗体、必要に応じて続いて１つまたはそれを超える三次用量の抗Ｃｘ４３抗体を逐次投与することを含む方法を含む。抗Ｃｘ４３抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。
【０１３９】
「初回用量」、「二次用量」および「三次用量」という用語は、本開示の抗Ｃｘ４３抗体の投与の時間的順序を指す。したがって、「初回用量」は、処置レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称される）であり；「二次用量」は、初回用量の後に投与される用量であり；「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初回、二次および三次用量はすべて、同じ量の抗Ｃｘ４３抗体を含有し得るが、一般に、投与頻度の点で互いに異なり得る。しかしながら、特定の実施形態では、初回、二次および／または三次用量に含まれる抗Ｃｘ４３抗体の量は、処置の過程中に互いに変動する（例えば、適切な場合には上下に調整される）。特定の実施形態では、２つまたはそれを超える（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）用量は、処置レジメンの開始時に「ローディング用量」として投与され、その後の用量は、より低頻度基準で投与される（例えば、「維持用量」）。
【０１４０】
本開示の特定の例示的な実施形態では、各二次および／または三次用量は、直前の用量の１から２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２またはそれを超える）週間後に投与される。本明細書で使用される場合、「直前の用量」という語句は、複数回投与の手順において、手順の次の用量の投与の前に患者に投与された抗Ｃｘ４３抗体の用量を意味する。
【０１４１】
本開示のこの態様の方法は、患者に任意の数の二次および／または三次用量の抗Ｃｘ４３抗体を投与することを含み得る。例えば、特定の実施形態では、単一の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つまたはそれを超える（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれを超える）二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態では、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つまたはそれを超える（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれを超える）三次用量が患者に投与される。
【０１４２】
複数の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量の１〜２週間または１〜２カ月後に患者に投与され得る。同様に、複数の三次用量を伴う実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の用量の２〜１２週間後に患者に投与され得る。本開示の特定の実施形態では、二次および／または三次用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンの過程にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師による処置の過程中に調整され得る。
【０１４３】
本開示は、−１０または２〜６のローディング用量が第１の頻度（例えば、１週間に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、１カ月に１回、２カ月ごとに１回など）で患者に投与され、続いて、２つまたはそれを超える維持用量がより低頻度基準で患者に投与される投与レジメンを含む。例えば、本開示のこの態様によれば、ローディング用量が、例えば１カ月に１回の頻度で投与される場合（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれを超えるローディング用量が１カ月に１回投与される）、維持用量は、患者に５週間ごとに１回、６週間ごとに１回、７週間ごとに１回、８週間ごとに１回、１０週間ごとに１回、１２週間ごとに１回などで投与され得る。
【実施例】
【０１４４】
行われた実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示目的で提供されているにすぎず、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１４５】
実施例１：結合親和性
以下のプロトコールにしたがって、Ｃｘ４３への結合親和性について、最適化配列を試験した。
【０１４６】
１．Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を脱着する
２．新たなＣＭ５チップを挿入する
３．ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０［ｔｗｅｅｎ２０］）で３回プライミングする。
４．前提条件：１００ｕｌ／分で新たなセンサーグラムを開始する。高粘度溶液（エクストラクリーン）で再生コマンドを使用して、各１０ｕｌの２×１００ｍＭ  ＨＣｌ、２×５０ｍＭ  ＮａＯＨ、２×０．５％ＳＤＳを注入する。これは、カップリングのためにチップをクリーニングおよび調製する。タンパク質が付着した後ではなく、ブランクチップに対してのみこれを行う。
５．ＧＥヒト抗体捕捉キットに付属の説明書にしたがって、使用する各表面（参照表面を含む）に抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（ＧＥ：ＢＲ−１００８−３９）を別個にアミンカップリングする。簡潔に言えば、Ｍａｂを１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５で２５ｕｇ／ｍｌに希釈する。５ｕｌ／分で新たなセンサーグラムを開始する。立て続けに、ＮＨＳ／ＥＤＣで７’を活性化し、Ｍａｂ７’を注入し、エタノールアミン７’でブロッキングする。典型的には、１０，０００〜１２，０００ＲＵ／表面が得られる。この後、３Ｍ  ＭｇＣｌ２で２０ｕｌ／分で３０秒間１０回再生する。（本発明者らは、ＧＥマウス抗体捕捉キット（ＧＥ：ＢＲ−１００８−３８）を使用したことを除いて、マウスＩｇＧを用いた実験を同様に行ったことに留意する。唯一の違いは、抗マウスＩｇＧ抗体を３０ｕｇ／ｍｌでカップリングし、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．７で２０ｕｌ／分で３分間再生することである）。
６．正規化の後、ＨＢＳ−ＥＰ＋バッファーで１回プライミングする。
７．次いで、アミンカップリングの直後に実験を実施した。実験の間にかなりの時間があった場合、チップを取り出して４℃で保存した。チップを機器に戻す場合には、この後、ＨＢＳ−ＥＰ＋で３回プライミングし、正規化し、ＨＢＳ−ＥＰ＋で１回プライミングした。
【０１４７】
以下のパラメータを使用して、プログラムを作成した。
概要：
バッファー＝ＨＢＳ−ＥＰ＋
流速＝１００ｕｌ／分
データ収集レート＝１Ｈｚ
サンプルコンパートメント温度＝１５℃（これは、注入前にサンプルが保持される温度である）
アッセイラン温度＝２５℃
二重検出、Ｆｃ２−Ｆｃ１
【０１４８】
実験の各サイクルについて：
ａ．５ｕｇ／ｍｌ  ＭａｂをＦＣ２に５ｕｌ／分で１８０秒間注入することにより、Ｍａｂ  Ａｂ＃ＫをＦＣ２に捕捉させ、１％Ｔｗｅｅｎ２０の注入後に追加の洗浄のみを行った。
ｂ．１Ｍ  ＮａＣｌを両ＦＣに３０ｕｌ／分で３０秒間注入し、続いて、追加のバッファー洗浄および１８０秒間の安定化を行った。
ｃ．１００ｕｌ／分で２１０秒間の高速注入を用いてサンプル（ペプチド）を注入し、両ＦＣに対して３００秒間の解離を行い、続いて、追加のバッファー洗浄および６０秒間の安定化を行った。
ｅ．両表面を３Ｍ  ＭｇＣｌ２で２０ｕｌ／分で３０秒間再生し、高粘度溶液を選択し、続いて、バッファー洗浄および６０秒間の安定化を行った。
【０１４９】
以下のようにサイクルをプログラミングした。
１．機器を安定化するためにバッファーの１０回のスタートアップ注入。
２．濃度系列の各ペプチド（ＰＥＰ１、ＰＥＰ２、ＰＥＰ３）：０、４ｎＭ、１２ｎＭ、３７ｎＭ、１１１ｎＭ、３３３ｎＭ、１０００ｎＭ
サイクル１〜１０  スタートアップ
サイクル１１〜１７  ＰＥＰ１（９１４）
サイクル１８〜２４  ＰＥＰ２（９１５）
サイクル２５〜３１  ＰＥＰ３（９１６）
サイクル３２〜３８  ＰＥＰ１（９１４）
サイクル３９〜４５  ＰＥＰ２（９１５）
サイクル４６〜５２  ＰＥＰ３（９１６）
サイクル５３〜５９  ＰＥＰ１（９１４）
サイクル６０〜６６  ＰＥＰ２（９１５）
サイクル６７〜７３  ＰＥＰ３（９１６）
【０１５０】
データ分析
Ｔ２００評価ソフトウェア２．０を使用して、データを分析した。動態に最適な条件下で平衡に達したので、３回反復の各セットからの（Ｆｃ２−Ｆｃ１）データを、１：１結合動態モデルまたは定常状態親和性モデルのいずれかにグローバルフィッティングした。両方法で得られた結果は類似していた。
【０１５１】
ＭａｂをＣＭ５チップの表面に捕捉させたすべての実験において、上記プロトコールに従った。
【０１５２】
以下のプロトコールにしたがって、ＣＡＰチップも使用した。
１．製造業者の説明書にしたがって、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのビオチン捕捉キット（２８９２０２３４）のＣＡＰチップを調製した。簡潔に言えば、それを機器（Ｔ２００）にドッキングし、ランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ＋）で３回プライミングし、スタンバイモードでランニングバッファーで一晩水和させた。次いで、再生溶液（６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、２５０ｍＭ  ＮａＯＨ）を３０ｕｌ／分で３×６０秒間注入することにより、それをコンディショニングした。この後、１回の正規化および１回のプライミングを行った。次いで、それが実験に使用可能になった。以下のパラメータを使用して、プログラムを作成した。
【０１５３】
概要：
バッファー＝ＨＢＳ−ＥＰ＋
流速＝１００ｕｌ／分
データ収集レート＝１Ｈｚ
サンプルコンパートメント温度＝１５℃（これは、注入前にサンプルが保持される温度である）
アッセイラン温度＝２５℃
二重検出、Ｆｃ４−Ｆｃ３
【０１５４】
実験の各サイクルについて：
ａ．キットのビオチン捕捉試薬を２ｕｌ／分で３００秒間注入することにより、ビオチン捕捉試薬をＦｃ３およびＦｃ４に捕捉させる。
ｂ．３ｕｇ／ｍｌペプチド２を５ｕｌ／分で１２０秒間注入し、続いて、追加のバッファー洗浄および１２０秒間の安定化を行うことにより、ビオチン化ペプチドをＦｃ４に捕捉させる。
ｃ．１００ｕｌ／分で２１０秒間の高速注入を用いてサンプル（Ｍａｂ）を注入し、両ＦＣに対して３００秒間の解離を行う。
ｄ．両表面を６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、２５０ｍＭ  ＮａＯＨで３０ｕｌ／分で１２０秒間再生し（高粘度溶液を選択し）、続いて、バッファー洗浄および１２０秒間の安定化を行う。
【０１５５】
以下のようにサイクルをプログラミングした。
１．機器を安定化するためにバッファーの５回のスタートアップ注入。
２．濃度系列の各Ｍａｂ（ＩまたはＨ）：０、６．２ｎＭ、１８．５ｎＭ、５５．６ｎＭ、１６６．７ｎＭ、５００ｎＭをランした。
サイクル１〜５  スタートアップ
サイクル６〜１１  Ｍａｂ  Ｉ
サイクル１２〜１７  Ｍａｂ  Ｈ
サイクル１８〜２３  Ｍａｂ  Ｉ
サイクル２４〜２９  Ｍａｂ  Ｈ
【０１５６】
結合親和性の結果（表１）は、一般に結合親和性が少なくとも維持され、多くの場合、驚くほど増強されたことを示す。
【０１５７】
【表１】
2021520393.tif 000007
【０１５８】
実施例２．Ｆｃ受容体結合分析
Ｆｃエフェクター機能は、受容体へのＦｃの結合により媒介される。受容体としては、ＦＣＲＩ、ＦＣＲＩＩａ、ＦＣＲＩＩｂ、ＦＣＲＩＩＩａ、ＦＣＲＩＩＩｂ、Ｃ１ｑおよびＦｃＲｎが挙げられる。ＦｃＲｎを除くほとんどのＦｃ受容体への結合親和性を減少させて、抗体半減期を維持しながら、潜在的なインビボ毒性を最小化することが一般に望ましい。以下の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）プロトコールを使用して、様々な抗体に対する様々なＦｃ受容体結合を試験した。
【０１５９】
Ａ．ＦＣＲＩ結合
実験：Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ
チップ：ＣＭ５
（１）固定化
注入の直前に４００ｍＭ  ＥＤＣおよび１００ｍＭ  ＮＨＳを混合することにより、アクチベーターを調製した。ＣＭ５センサーチップを混合物で４２０秒間活性化した。次いで、１０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）中３０μｇ／ｍＬのＴＨＥ（商標）Ｈｉｓタグ抗体をチャネル１〜８に３０μＬ／分の流速で４００秒間注入した。１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ＧＥ）により、チップを不活性化した。
【０１６０】
（２）リガンドの捕捉および分析物のラン
ランニングバッファー（１×ＨＢＳ−ＥＰ＋）中２μｇ／ｍＬ  ＣＤ６４をチャネル１〜４のＦｃ２に１０μＬ／分の流速で３０秒間注入した。６つの濃度（４０、２０、１０、５、２．５および１．２５ｎＭ）の分析物２０１７０９０５−Ａｂ＃Ｃ−０２、２０１７０９０５−Ａｂ＃Ｄ−０２、２０１７０９０８−Ａｂ＃Ｇ−０２、２０１７０９２０−Ａｂ＃Ｈ−０２およびランニングバッファーをチャネル１〜４のＦｃ１−Ｆｃ２に３０μＬ／分の流速で１８０の会合段階、続いて４００の解離で順番に注入した。分析物濃度にしたがって昇順で、リガンドの捕捉および分析物のランを６サイクル反復する。あらゆる解離段階の後に、再生バッファーとして１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を注入した。
【０１６１】
ランニングバッファー（１×ＨＢＳ−ＥＰ＋）中２μｇ／ｍＬ  ＣＤ６４をチャネル１〜６のＦｃ２に１０μＬ／分の流速で３０秒間注入した。８つの濃度（１０２４０、５１２０、２５６０、１２８０、６４０、３２０、１６０および８０ｎＭ）の分析物２０１７０９０７−Ａｂ＃Ｋ−０２、２０１７０９０８−Ａｂ＃Ｌ−０２、２０１７０９１５−Ａｂ＃Ｏ−０２、２０１７０９１９−Ａｂ＃Ｐ−０２、２０１７０９１９−Ａｂ＃Ｓ−０２および２０１７０９２０−Ａｂ＃Ｔ−０２およびランニングバッファーをチャネル１〜６のＦｃ１−Ｆｃ２に３０μＬ／分の流速で６０の会合段階、続いて９０の解離で順番に注入した。分析物濃度にしたがって昇順で、リガンドの捕捉および分析物のランを８サイクル反復する。あらゆる解離段階の後に、再生バッファーとして１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を注入した。
【０１６２】
（３）再生
チップを１０ｍＭグリシンｐＨ１．５で再生した。
【０１６３】
（４）データ分析
リガンドの捕捉なしの表面チャネルＦｃ１を参照減算の対照表面として使用した。参照チャネルおよびバッファーチャネルデータから各相互作用の最終データを差し引いた。ＣＤ６４への２０１７０９０５−Ａｂ＃Ｃ−０２、２０１７０９０５−Ａｂ＃Ｄ−０２、２０１７０９０８−Ａｂ＃Ｇ−０２、２０１７０９２０−Ａｂ＃Ｈ−０２結合の実験データを１：１結合モードでフィッティングした。分析物２０１７０９０７−Ａｂ＃Ｋ−０２、２０１７０９０８−Ａｂ＃Ｌ−０２、２０１７０９１５−Ａｂ＃Ｏ−０２、２０１７０９１９−Ａｂ＃Ｐ−０２、２０１７０９１９−Ａｂ＃Ｓ−０２および２０１７０９２０−Ａｂ＃Ｔ−０２の１０２４０ｎＭ曲線を除去して、より良好なフィットを可能にした。相対的な実験データは定常状態親和性によりフィッティングし、以下の表２に示されている。
【０１６４】
【表２】
2021520393.tif 000008
【０１６５】
すべての抗体は、低いＦＣＲＩ結合を示したかまたはＦＣＲＩ結合を示さなかったが、これは有利である。
【０１６６】
Ｂ．ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合
実験：Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ
チップ：ＣＭ５
（１）固定化
注入の直前に４００ｍＭ  ＥＤＣおよび１００ｍＭ  ＮＨＳを混合することにより、アクチベーターを調製した。ＣＭ５センサーチップを混合物で４２０秒間活性化した。次いで、１０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ４．５）中３０μｇ／ｍＬのＴＨＥ（商標）Ｈｉｓタグ抗体をチャネル１〜８に３０μＬ／分の流速で４００秒間注入した。１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ＧＥ）により、チップを不活性化した。
【０１６７】
（２）リガンドの捕捉および分析物のラン
ランニングバッファー（１×ＨＢＳ−ＥＰ＋）中１μｇ／ｍＬ  ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａまたはＦｃγＲＩＩＩｂをチャネル１〜８のＦｃ２に１０μＬ／分の流速で１５秒間注入した。分析物をそれぞれチャネル１〜８に注入した。一連の分析物濃度（以下の表３を参照のこと）を３０μＬ／分の流速で６０秒間の会合段階、続いて９０秒間の解離でモニタリングした。あらゆる解離段階の後に、再生バッファーとして１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を注入した。
【０１６８】
【表３】
2021520393.tif 000009
【０１６９】
（３）再生
チップを１０ｍＭグリシンｐＨ１．５で再生した。
【０１７０】
（４）データ分析
リガンドの捕捉なしの表面チャネルＦｃ１を参照減算の対照表面として使用した。参照チャネルおよびバッファーチャネルデータから各相互作用の最終データを差し引いた。ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂへの抗体結合の実験データは定常状態親和性モードによりフィッティングし、以下の表４に示されている。
【０１７１】
【表４】
2021520393.tif 000010
【０１７２】
すべての抗体は、低いＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ結合を示したかまたはＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ結合を示さなかったが、これは有利である。
【０１７３】
Ｃ．ＦｃＲｎへの結合
実験：Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ
チップ：ＣＭ５
（１）バッファー交換
取扱説明書にしたがって脱塩カラムを使用して、ヒトＦｃＲｎのバッファーをランニングバッファー（５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）に交換した。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより、濃度を決定した。
【０１７４】
（２）固定化
注入の直前に４００ｍＭ  ＥＤＣおよび１００ｍＭ  ＮＨＳ（ＧＥ）を混合することにより、アクチベーターを調製した。ＣＭ５センサーチップを混合物で１０μＬ／分の流速で４２０秒間活性化した。次いで、１０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．５）中５μｇ／ｍＬの抗体をそれぞれチャネル１〜８のＦｃ２に１０μＬ／分の流速で６０秒間注入した。相対的Ｆｃ１をブロッキングした。１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ＧＥ）により、チップを１０μＬ／分の流速で４２０秒間不活性化した。
【０１７５】
（２）分析物のラン
分析物ＦｃＲｎをそれぞれチャネル１〜８に注入した。８つの濃度のＦｃＲｎ（０、９３．７５、１８７．５、３７５、７５０、１５００、３０００および６０００ｎＭ）を３０μＬ／分の流速で６０秒間の会合段階、続いて９０秒間の解離でモニタリングした。相互作用分析の各サイクルの後、センサーチップ表面を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μＬ／分の流速で３０秒間再生した。
【０１７６】
（３）再生
チップを１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で再生した。
【０１７７】
（４）データ分析
固定化抗体なしの表面チャネルＦｃ１を参照減算の対照表面として使用した。参照チャネルおよびバッファーチャネルデータから各相互作用の最終データを差し引いた。実験データは定常状態親和性モードによりフィッティングし、以下の表５に示されている。
【０１７８】
【表５】
2021520393.tif 000011
【０１７９】
すべての抗体は同様のＦｃＲｎ結合を示したが、これは望ましい。
【０１８０】
Ｄ．ＥＬＩＳＡによるＣ１ｑへの結合
プレート（Ｎｕｎｃ）を３μｇ／ｍＬの抗体で４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄の後、Ｃ１ｑをブロッキングバッファー（６００、１８９．７５、６０．０１、１８．９８、６．００、１．９０、０．６０、０．１９、０．０６および０．０２μｇ／ｍＬ）で半対数滴定し、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、続いて、二次抗体ヒツジ抗ヒトＣ１ｑＡｂ−ＨＲＰと共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、２Ｍ  ＨＣｌにより相互作用を停止した。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎｍの吸光度を読み取り、以下の表６に示した。
【０１８１】
【表６】
2021520393.tif 000012
【０１８２】
すべての抗体は、低いＣ１ｑ結合を示したかまたはＣ１ｑ結合を示さなかったが、これは有利である。
【０１８３】
実施例３．エピトープマッピング
標的分子のエピトープを再構築するために、固相Ｆｍｏｃ合成を使用して、ペプチドベースのエピトープ模倣物のライブラリーを合成した。独自の親水性ポリマー製剤でグラフトし、続いて、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と共にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用してｔ−ブチルオキシカルボニル−ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）と反応させ、続いて、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してＢｏｃ基を切断することにより、アミノ官能化ポリプロピレン支持体を得た。標準的なＦｍｏｃ−ペプチド合成を使用して、カスタム改変ＪＡＮＵＳ液体ハンドリングステーション（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により、アミノ官能化固体支持体上でペプチドを合成した。
【０１８４】
足場上化学結合ペプチド（ＣＬＩＰＳ）技術を使用して、構造模倣物の合成を行った。ＣＬＩＰＳ技術は、ペプチドを単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート様フォールド、ヘリックス様フォールドおよびそれらの組み合わせに構造化することを可能にする。ＣＬＩＰＳテンプレートをシステイン残基にカップリングする。ペプチド中の複数のシステインの側鎖を１つまたは２つのＣＬＩＰＳテンプレートにカップリングする。例えば、Ｐ２  ＣＬＩＰＳ（２，６−ビス（ブロモメチル）ピリジン）の０．５ｍＭ溶液を重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）／アセトニトリル（１：３（ｖ／ｖ））に溶解させる。この溶液をペプチドアレイに添加する。ＣＬＩＰＳテンプレートは、ペプチドアレイの固相結合ペプチド（３μｌウェルの４５５ウェルプレート）に存在する２つのシステインの側鎖に結合するであろう。溶液中で完全にカバーされている間、ペプチドアレイを溶液中で穏やかに３０〜６０分間振盪する。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ２Ｏで十分に洗浄し、ＰＢＳ中１％ＳＤＳ／０．１％２，２’−（エチレンジオキシ）ジエタンチオールを含有する破壊バッファー（ｐＨ７．２）中、７０℃で３０分間で超音波処理し、続いて、Ｈ２Ｏ中でさらに４５分間超音波処理する。今度はシステインが３つである以外は同様の方法で、ペプチドを有するＴ３  ＣＬＩＰＳを作製した。
【０１８５】
以下の設計にしたがって、ペプチドの異なるセットを合成した。一部のミニカードのペプチドの実際の順序をランダム化したことに留意する。
【表７】
2021520393.tif 000013
【０１８６】
各合成ペプチドへの抗体の結合をＥＬＩＳＡで試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチドアレイを適切な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ；ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１／１０００希釈物と共に２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２０μｌ／ｍｌの３％Ｈ２Ｏ２を添加した。１時間後、発色を測定した。電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよび画像処理システムを用いて、発色を定量した。
【０１８７】
ＣＣＤカメラから得られた値は、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様に０〜３０００ｍＡＵの範囲である。結果を定量し、ラボデータベースに保存する。時々、ウェルが気泡を含有して偽陽性値が生じるので、カードを手動で検査し、気泡により引き起こされたいかなる値も０としてスコア化する。
【０１８８】
合成ペプチドの品質を検証するために、陽性および陰性対照ペプチドの別個のセットを並行して合成した。市販の抗体３Ｃ９および５７．９（Ｐｏｓｔｈｕｍｕｓら、（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３３０４−３３０９を参照のこと）を用いて、これらをスクリーニングした。
【０１８９】
完全なデータセットのグラフ概要は図１に示されている。ここでは、箱ひげ図は各データセットを示し、各データセット内の平均ＥＬＩＳＡシグナル、分布および外れ値を示す。実験条件（抗体の量、ブロッキング強度など）に応じて、ＥＬＩＳＡデータの異なる分布が得られる。具体的には、箱の下部および上部は、データの２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルである。箱の中央付近のバンドは、５０パーセンタイル（中央値）である。ひげは１．５四分位範囲であり、データセット内の統計的外れ値を示すものである（Ｍｃｇｉｌｌら、（１９７８）Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎ，３２：１２−１６）。
【０１９０】
高ストリンジェンシー条件下、高濃度で、抗体を試験した。記録された結果は図２および図３に示されている。２つの各ペプチドセットのデータを別個に分析した。
【０１９１】
リード配列ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩの置換バリアントで記録されたデータの分析は、配列内のいずれかの残基の多くの置換が、程度は異なるが、抗体の結合に悪影響を与えることを示唆した（図２）。唯一の例外（Ｌ２ＰおよびＬ２Ｙの置き換えを許容しないが、すべての他の置き換えに対して依然として非感受性である残基Ｌ２）が見られた。
【０１９２】
リード配列ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩの短縮バリアントで記録されたデータの分析は、配列のＮ末端が抗体により好まれることを示した（図３）。ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩの中央部分に由来する多くの構築物もよく認識されている。
【０１９３】
要約すると、リード配列ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩに由来する２つのタイプのペプチドバリアント（単一残基突然変異体および短縮バリアント）から構成されるペプチドアレイで、抗体を試験した。抗体は、高ストリンジェンシー条件下で検出可能な結合をもたらした。ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩ全体にわたる多くの置き換えは、抗体にとって望ましくないものであった。抗体は、配列のＮ末端部分に由来するより強力な結合短縮構築物であった。
【０１９４】
実施例４．抗体の安定性
抗体の安定性は、開発、有効性、生産コストなどに影響を与える重要な要素である。配列最適化後、重要な安定性パラメータを評価した。酸性および熱条件下における様々な抗体の種分布プロファイルを試験した。すべての抗体は、改善された安定性を示す。
【０１９５】
Ａ．ＳＥ−ＵＰＬＣ（サイズ排除超高速液体クロマトグラフ）
製剤：ＰＢＳ、ｐＨ６．５または７．２
濃度（ｍｇ／ｍＬ）：５．２８、５．１３、５．００、５．１７、５．０１、５．２６、４．９２、５．０４、４．９９、５．１２（すべて約５ｍｇ／ｍＬ）
条件：室温、酸性処理、次いで４℃で１週間または４０℃で１週間保管
２μＬのサンプルをＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ＳＥＣ  ２００、１．７μｍ、４．６×１５０ｍｍカラムに０．３ｍＬ／分の流速で１０分間注入した。５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．２の移動相を使用した。すべての抗体は、様々なｐＨ、熱および保管条件下で望ましい安定性を示す。
【０１９６】
Ｂ．ｒＣＥ−ＳＤＳ（還元キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム）
製剤：ＰＢＳ、ｐＨ６．５、７．２、６．２
濃度（ｍｇ／ｍＬ）：０．５
条件：室温、酸性処理、次いで４℃で１週間または４０℃で１週間保管
ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に供する前に、還元標識バッファー中でサンプルを調製した。すべての抗体は、様々なｐＨ、熱および保管条件下で望ましい安定性を示す。
【０１９７】
実施例５．ヘミチャネル開放のためのアッセイ
Ａ．インビトロアッセイ
本明細書に開示される抗体は、色素取り込みアッセイを使用して、ヘミチャネル開放に対するそれらの効果についてインビトロで試験され得る。色素は、蛍光トレーサー色素（例えば、エチジウムブロミドまたはルシファーイエロー）であり得る。
【０１９８】
一例では、流体流動装置（ＦＦＬＡ）（Ｐａｒｒａｌｌｅｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｈａｍｂｅｒ）またはその改良版が使用され得る。ＦＦＬＡは、骨における動的流体微小環境を模倣して、流体流動剪断応力（ＦＦＳＳ）を生じさせる。細胞を定常層流に曝露して、パラレルプレートフローチャンバー中で細胞を培養する。
【０１９９】
骨細胞は、骨細胞小腔／小管ネットワークでＦＦＳＳによりもたらされた機械的ひずみを感知する。骨流体流動は、血管外圧と、骨細胞に加えられた周期的機械的負荷とにより駆動され、ピーク生理学的負荷は、８〜３０ｄｙｎ／ｃｍ２であることが提案されている。特定の態様では、ＦＦＳＳレベルは、骨内の流体流動を測定する以前の研究から報告された生理学的値の範囲内であった。流体剪断応力の規模は、フローループのカラム高さを調整することにより変化され得る。
【０２００】
ヘミチャネルの機能性を評価するために使用されるアッセイは、ヘミチャネルの細孔を通過するために十分に小さい蛍光トレーサー分子を使用し得る。ヘミチャネルが閉鎖している場合、分子は通過し得ない。ヘミチャネルが開放している場合、色素は通過して細胞の蛍光発光を引き起こし、蛍光の定量を可能にし得る。臭化エチジウムがＤＮＡに付着すると、それは蛍光を発するようになる。ルシファーイエローは、それが細胞内に配置されると蛍光を発する。
【０２０１】
色素転移法は、細胞を細胞外蛍光透過性トレーサーに曝露することを含み得る。いくつかの条件が細胞膜の透過性を増加させない限り、細胞外透過性トレーサーは、細胞の外側に残る分子である。特定の態様では、トレーサーは、１、２または３ｋＤａ未満の質量を有する。他の態様では、トレーサーは正味電荷を有するであろう。このような透過性トレーサーとしては、限定されないが、アニオン色素ルシファーイエロー（ＬＹ；正味電荷＝−１）およびカチオンプローブ臭化エチジウム（Ｅｔｄ；正味電荷＝＋１）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；正味電荷＝＋２）が挙げられる。ＤＮＡへの結合により、ＥｔＢｒの蛍光は増強され、コントラストが増加し、より容易な識別が可能になる。特定の態様では、細胞外色素は、異なる期間で、またはヘミチャネルを開放する刺激の適用後に除去され、各細胞により保持される蛍光強度が定量される。特定の態様では、蛍光強度は、スナップショット画像で定量される。
【０２０２】
ヘミチャネル開放を試験するためのインビトロアッセイで使用される材料としては、ヘミチャネル発現細胞または細胞株が挙げられる。様々なコネキシンヘミチャネルを発現する細胞または細胞株は、当技術分野で公知の方法および／または発現ベクターを使用して取得、単離または操作され得る。
【０２０３】
骨細胞：動物（マウス、ラット、ウサギ、ニワトリを含む）などから単離された初代骨細胞、または限定されないが、ＭＬＯ−Ｙ４細胞などを含む骨細胞株。
【０２０４】
癌細胞：乳癌細胞株：ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲおよびＴＰ５３陽性／陰性細胞（例えば、ＭＤ−ＭＢＡ−２３１、ＭＣＦ７、Ｔ４７ＤまたはＺＲ７５１）を含む。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は乳腺管癌腫である。Ｐｙ８１１９乳腺腫瘍細胞株は、Ｃ５７Ｂｌ／６  ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ雌（マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター駆動性ポリオーマミドルＴ導入遺伝子）マウスで生じた自然発生乳腺腫瘍から樹立された。癌遺伝子（ポリオーマミドルＴ導入遺伝子）の発現は、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーターにより駆動される。
【０２０５】
前立腺癌細胞株：アンドロゲン受容体および５α−レダクターゼ陽性／陰性ならびにアンドロゲン感受性／非感受性細胞株（例えば、ＬＮＣａＰ−Ｒｆ、ＢＭ１８、ｐＲＮＡ−１−１／ｒａｓ、ＲＣ５８Ｔ／ｈＴＥＲＴ、ＰＰＣ−１など）を含む。
【０２０６】
骨芽細胞：ＭＬＯ−Ａ５骨芽細胞は、コネキシン４３を発現するので対照として使用されるが、それらは、アレンドロネートにより刺激された場合に開放していないように思われる。
【０２０７】
トレーサー分子としては、限定されないが、ルシファーイエロー、エチジウムブロミド、エバンスブルー、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４８８およびＡｌｅｘａ５９４が挙げられる。
【０２０８】
Ｃｘ４３（Ｅ２）：Ｃｘ４３（Ｅ２）抗体は、Ｃｘ４３ヘミチャネルに特異的である。Ｃｘ４３Ｅ２は、Ｃｘ４３ヘミチャネルの第２の細胞外ループに結合し、ヘミチャネルの開放を妨げる。
【０２０９】
抗体がヘミチャネルを開放するかを決定するための方法は、以下の工程の１つまたはそれよりも多くを含む：
（ａ）コネキシン発現細胞または細胞株を単離、取得または生産すること。例えば、初代骨細胞は、頭蓋冠から単離され得る。他の細胞タイプは、当技術分野で公知の他の方法を使用して単離され得る。特定の態様では、頭蓋冠骨細胞は、動物（例えば、１６日齢のニワトリ胚性頭蓋冠または新生児マウス）から単離される。動物を断頭し、頭蓋冠骨を解剖し、７０％アルコールに迅速に浸漬する。次いで、頭蓋冠骨をαＭＥＭに入れ、ＰＢＳで複数回洗浄する。クリーニングした骨を新鮮αＭＥＭに入れる。骨を細断し、１．５ｍｍ領域サイズに切断する。骨片をコラゲナーゼで処理して軟組織および類骨を除去し、続いて、ＥＤＴＡを使用して脱灰し得る。最後に、コラゲナーゼによる処理および激しい撹拌により、骨片から骨細胞を放出させる。
【０２１０】
（ｂ）長骨から初代骨細胞を単離すること。長骨骨細胞は、２〜３週齢のマウスまたはラットから単離され得る。例えば、マウスに過量の麻酔を与え、頸椎脱臼させ、断頭し、７０％エタノールに浸漬する。依然としてインタクトな関節の末端を有する大腿骨および脛骨を単離する。肢を７０％アルコールに迅速に浸漬し、αＭＥＭに入れる。αＭＥＭ中の肢をＰＢＳで洗浄する。筋肉の大部分を除去し、腱／靭帯から分離する。クリーニングした骨を新鮮αＭＥＭに入れる。すべての骨をクリーニングしたら、ＰＢＳを使用して骨髄を洗い流す直前に、メスを使用して各骨の両端を切断する。骨を長さ１．５〜２ｍｍに切断し、コラゲナーゼで処理する。一例では、骨片をコラゲナーゼで連続９回処理して、すべての他の組織および類骨を除去し、続いて、ＥＤＴＡを使用して脱灰する。
【０２１１】
（ｃ）細胞または細胞株を培養すること。例えば、コラーゲンコーティングプレート上で初代および／または骨細胞細胞株を培養し、透過性トレーサーを含有する記録培地（ＨＣＯ３を含まないＨＥＰＥＳで緩衝されたα−ＭＥＭ培地）に浸漬する。
【０２１２】
（ｄ）試験抗体を投与すること。培養細胞を試験抗体と所望の時間接触させて置く。
【０２１３】
（ｅ）透過性トレーサー取り込みを決定すること。透過性トレーサー取り込みは、細胞内のトレーサーの量を検出することにより決定される。特定の態様では、タイムラプス記録が使用される。蛍光は、使用されているトレーサーまたは他のプローブの蛍光の波長に基づいて、顕微鏡で日食フィルタを用いて、異なる細胞における目的の領域で記録され得る。特定の態様では、画像は、２分ごとに高速冷却デジタルカメラによりキャプチャされ、画像処理は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて実施される。収集データは、基本蛍光と対比して初期蛍光および目的の時点の蛍光の倍率差として示され得る。
【０２１４】
スナップショット画像の場合、細胞を透過性トレーサーに５〜１０分間曝露し、ＰＢＳで複数回リンスし、ホルムアルデヒドで固定し得る。特定の態様では、蛍光視野の少なくとも３つの顕微鏡写真が、顕微鏡を用いて撮影される。画像分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行われる。ランダムセルのピクセル密度の平均が測定される。
【０２１５】
コネキシンヘミチャネルの開放の確認は、例えば、骨細胞を試験抗体と一緒にＣｘ４３（Ｅ２）抗体（Ｃｘ４３ヘミチャネルを特異的に阻害するポリクローナル抗体）と共にインキュベートすることにより得られ得る。試験抗体がＣｘ４３ヘミチャネルを開放する場合、このチャネル開放は、Ｃｘ４３（Ｅ２）抗体により遮断される。Ｃｘ４３ヘミチャネルの開放を制御するために、骨細胞は、流体流動剪断応力および／またはＡＤ（これらは両方とも、骨細胞におけるヘミチャネルを開放することが公知である）で処理される。
【０２１６】
特定の例では、ＭＬＯ−Ｙ４骨細胞を、１μｇ／ｍｌ  Ｃｘ４３（Ｅ２）抗体の非存在下または存在下、２０μＭ  ＡＤまたは試験抗体で３０分間処理した。臭化エチジウム色素取り込みを行い、未処理基本取り込みレベルと比較して定量した。カルシウムの存在下でアッセイを行った。低カルシウム条件を（ヘミチャネルを開放する）対照として使用し得る。ＡＤまたは試験抗体により誘導される骨細胞ヘミチャネルの開放は、Ｃｘ４３（Ｅ２）抗体により遮断される。
【０２１７】
Ｂ．インビボアッセイ
特定の態様では、骨細胞におけるＣｘ４３モジュレーションは、候補試薬を長骨に注入し、蛍光トレーサー色素（例えば、カルセインまたはエバンスブルー）を使用して、骨細胞におけるヘミチャネルの開放をインサイチューで検出することにより決定される。
【０２１８】
骨細胞におけるヘミチャネルを分析するためのインビボアッセイの一例は、３〜４月齢のマウスまたはラットを使用する。動物を計量する。腹腔内（ＩＰ）注射により、試験抗体を動物に導入する。２〜４時間後、蛍光トレーサー色素（エバンスブルー、Ａｌｅｘａ５９４）を動物の外側尾静脈にまたはＩＰ注射により注射する。注：動物の体重の最大１％を注射し得る。特定の態様では、尾静脈注射の前に、動物を温めて尾静脈を拡張する。２〜４時間後、動物を乱切し、筋肉組織を含まない脛骨および大腿骨を解剖し、ＰＢＳで複数回洗浄する。骨をパラホルムアルデヒドで固定し、１４％ＥＤＴＡ溶液で４℃で２週間、または定常撹拌下で室温で３〜５日間脱灰する。骨をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中３０％スクロースに一晩浸漬し、ＯＣＴ化合物に包埋する。典型的には、必要な場合にはモールド中で骨の位置を調整する。クリオスタットを使用して厚さ５μｍの凍結切片を切断し、切片をＰＢＳでリンスし、ＰＢＳ中５０％グリセロールを使用してマウントする。蛍光顕微鏡下で骨切片を検査し得、トレーサー色素を取り込んだ骨における骨細胞の程度を、Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して定量する。
【０２１９】
骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開放は、骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルを開放する脛骨への機械的負荷により確認され得る。これは、インビボで骨細胞におけるヘミチャネル開放の陽性対照として機能し得る。陰性対照については、骨細胞におけるＣｘ４３の欠損を有するマウスが使用される。このマウスは、１０ｋｂ  ＤＭＰ−１  ＣｒｅおよびＣｘ４３  ｆｌｏｘマウスと交配することにより生成される。
【０２２０】
実施例６．癌細胞遊走、生存性および転移のアッセイ
Ａ．インビトロアッセイ
癌細胞遊走のアッセイ。骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルは、ＡＤまたはＦＦＳＳの投与により開放される。開放したヘミチャネルは、培地への様々な因子の放出を可能にし、馴化培地（ＣＭ）が得られる。ＡＤまたはＦＦＳＳ処理ＣＭ中の放出された因子は、軟寒天および創傷治癒アッセイにより決定した場合に、癌細胞遊走を減少させる。対照ＣＭで処理された癌細胞は、正常な遊走を示す。軟寒天アッセイは、足場依存性成長とは対照的に、足場非依存性成長のアッセイである。癌細胞のみが軟寒天上で成長し得、このマトリックス上におけるそれらの成長は、癌細胞増殖の程度を示す。
【０２２１】
特定の実施形態では、癌（例えば、乳房または前立腺）細胞はＣＭと共にインキュベートされ、癌細胞増殖、遊走および浸潤が決定される。
【０２２２】
癌細胞成長および生存性は、ＷＳＴ−１（水溶性テトラゾリウム塩）アッセイ、トリパンブルー法を使用する生細胞カウンティング、ＢｒｄＵ  ＤＮＡ取り込み、および細胞増殖アッセイを使用して決定され得る。ＷＳＴ−１アッセイでは、細胞増殖は、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて４５０ｎｍの発光波長で測定される。
【０２２３】
細胞遊走アッセイは、典型的には、２４ウェル組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、トランスウェルメンブレンフィルタインサートで実施される。トランスウェルメンブレンフィルタインサートは、例えば、直径６．５ｍｍ、孔径８μｍおよび厚さ１０ｎｍのポリカーボネートメンブレンであり得る。
【０２２４】
浸潤アッセイは、ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ成長因子還元マトリゲル浸潤チャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施される。癌細胞株を回収し、試験抗体にかかわらず骨細胞由来のＣＭに再懸濁する。癌細胞懸濁液をインサートの上側に添加する。細胞を３７℃で様々な時間インキュベートする。フィルタを通って遊走しない細胞を除去し、インサートを通って遊走する細胞を固定し、Ｈｅｍａ  ３  Ｓｔａｔ  Ｐａｃｋ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色する。インサート当たり５つの視野における遊走細胞数を光学顕微鏡下でカウントする。
【０２２５】
ＡＤまたはＦＦＳＳまたは本明細書に開示される抗体で処理して、Ｃｘ４３ヘミチャネル開放を刺激した骨細胞由来のＣＭでインキュベートした場合、乳癌細胞遊走は減少し得る。Ｅ２抗体により骨細胞Ｃｘ４３ヘミチャネルを遮断した場合、癌細胞遊走に対するこの阻害効果は弱化された。骨芽細胞から収集したＣＭと共にインキュベートした場合、またはＡＤで直接処理した場合、癌細胞遊走のこの減少は見られない。本明細書に開示される抗体によるＣｘ４３ヘミチャネルの開放は、乳癌細胞成長および遊走に対して保護的である。
【０２２６】
Ｂ．インビボアッセイ
インビボにおける骨転移に対する試験抗体の効果は、脛骨内注射骨転移モデルおよび／または心臓内注射癌転移アッセイを使用して決定される。
【０２２７】
脛骨内注射骨転移モデル。前記方法は、イソフルランを使用して１月齢の正常または免疫不全マウスを麻酔することを含む。また、鎮痛薬としてブプレノルピン−ＨＣｌ（０．３ｍｇ／ｍｌ）をマウスに与える。蛍光または化学発光マーカーを発現する癌細胞（例えば、正常マウスについてはＬｕｃ−ＧＦＰを発現するＰｙ８１１９細胞、または免疫不全マウスについてはＬｕｃ−ＧＦＰを発現するＭＤ−ＭＢＡ−２３１）を使用して、脛骨内注射を実施する。３０ゲージ針が取り付けられたハミルトンシリンジにより、事前に作られた穴を通して、癌細胞を右脛骨の骨髄領域に接種する。対照として、ＰＢＳを左脛骨に注射した。試験抗体または生理食塩水を５週間にわたって週２回腹腔内投与する。生物発光イメージングまたは蛍光を用いて、腫瘍細胞接種の３日後から毎週、脛骨内腫瘍成長をモニタリングする。十分な生物発光イメージング後の研究の終了時に、Ｘ線画像を撮影して骨の質を試験し、蛍光顕微鏡を用いて標識転移性癌細胞コロニーを観察およびカウントする。
【０２２８】
心臓内注射骨転移モデル。２〜３月齢の正常または免疫不全マウスをイソフルランにより麻酔し、鎮痛薬としてブプレノルピン−ＨＣｌ（０．３ｍｇ／ｍｌ）も与える。蛍光または化学発光マーカーを発現する癌細胞（例えば、正常マウスについてはＬｕｃ−ＧＦＰを発現するＰｙ８１１９細胞、または免疫不全マウスについてはＬｕｃ−ＧＦＰ−ＭＤ−ＭＢＡ−２３１）をマウスの左心室に注射する。手順は以下を含む：針を作業者に向かって右に傾けて保持し、胸骨の左約３ｍｍにある２番目の肋間腔にそれを挿入する。約５ｍｍ進めて、真っ赤な動脈血の拍動流がハブに入るのが観察されるまで、針を穏やかに回す。細胞懸濁液を３０秒間かけて注射する。針を抜いて、アルコールワイプを使用して圧力を注射部位に３０秒間適用する。麻酔から完全に回復するまで、マウスを温めた表面に置く。心臓内注射後に生物発光または蛍光イメージングを実施して、腫瘍細胞接種の３日後から毎週、腫瘍細胞の分布を検証する。十分な生物発光イメージング後の研究の終了時に、Ｘ線画像を撮影して骨の質を評価し、蛍光顕微鏡を用いて標識転移性癌細胞コロニーを観察およびカウントする。
【０２２９】
Ｃｘ４３条件付きノックアウト（ｃＫＯ）マウス。ホモ接合性Ｃｘ４３グローバルノックアウトは致死的であるので、および本発明者らは骨細胞で発現されるＣｘ４３の役割も調べたいので、骨細胞特異的Ｃｘ４３ノックアウトマウスを生成した。ｆｌｏｘｅｄ  Ｃｘ４３遺伝子についてホモ接合性のマウスをＣｘ４３グローバルヘテロ接合性マウスと交配させて、骨細胞におけるＣｘ４３の完全な欠失を促進する。次いで、Ｃｘ４３ｆｌ／−マウス（子孫の５０％）を、ヒトＤＭＰ−１プロモーターにより駆動されるＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと交配させた。これにより、Ｃｘ４３  ｆｌ／−、ＤＭＰ１  Ｃｒｅ＋またはＣｘ４３  ｆｌ／−、ＤＭＰ１  Ｃｒｅ−のマウスを作製した（ごく一部はＣｘ４３ｆｌ／ｆｌまたはＣｘ４３−／−である）。免疫組織化学により、Ｃｘ４３欠損骨細胞を確認した。
【０２３０】
研究は、８つの群のマウスを含み得る：アレンドロネート（ＡＤ）で処置したＷＴ、ＡＤなしのＷＴ、ＡＤで処置したｃＫＯ、ＡＤなしのｃＫＯ、試験抗体（ＴＡ）で処置したＷＴ、ＴＡなしのＷＴ、ＴＡで処置したｃＫＯ、およびＴＡなしのｃＫＯ。ＡＤまたはＴＡを１５０μｇ／ｋｇ体重でマウスに投与した。ＡＤまたはＴＡ処置の場合、ＫＯでは、ＷＴマウスと比較して骨転移が増加すると予想される。また、ＡＤまたはＴＡ処置なしの場合、ＷＴマウスとノックアウトマウスとの間で骨転移は同様であるはずである。
【０２３１】
本開示の様々な態様は単独で、組み合わせて、または上記実施形態で具体的に議論されていない様々な配置で使用され得るので、その適用において、前述の説明に記載されているかまたは図面に示されている構成要素の詳細および配置に限定されない。例えば、一実施形態に記載されている態様は、他の実施形態に記載されている態様と任意の方法で組み合わされ得る。
【０２３２】
主題の開示の特定の実施形態を議論したが、上記本明細書は限定的ではなく例示的なものである。本明細書の検討により、本開示の多くの変形物が当業者に明らかになるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲と均等物の全範囲および本明細書とこのような変形物を参照することにより決定されるべきである。
【０２３３】
参照による組み込み
本明細書で参照されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の各刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的に示されている場合と同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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