(57)【要約】  本開示は、腎障害、特に、慢性腎疾患、糸球体性疾患、又はタンパク尿腎疾患、例えばアルポート症候群、巣状分節性糸球体硬化症、及び糖尿病性腎症の処置で使用するためのＡＢＣＡ１誘導因子化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎疾患の処置で使用するための化合物であって、前記化合物がＡＢＣＡ１誘導因子化合物である、化合物。
【請求項２】
前記化合物が式Ｉ
【化３】
2021531308.tif 000010
［式中、
Ａ１及びＡ２の一方はＮであり、Ａ１及びＡ２の他方はＣＨであり、
Ｒ１は、Ｃ１〜７アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル−Ｃ１〜７アルキル、Ｃ１〜７アルコキシ−Ｃ１〜７アルキル、ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル、ヘテロシクリル−Ｃ１〜７アルキル（ここで、前記ヘテロシクリル基は非置換であるか、又はオキソにより置換されている）、及びヘテロアリール−Ｃ１〜７アルキル（ここで、前記ヘテロアリール基は非置換であるか、又は低級アルキルによりモノ又はジ置換されている）からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ６は互いに独立して水素又はハロゲンであり、
Ｒ３及びＲ５は互いに独立して水素、Ｃ１〜７アルキル、Ｃ１〜７アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル、ハロゲン−Ｃ１〜７アルコキシ、及びシアノからなる群から選択され、
Ｒ４は水素、Ｃ１〜７アルキル、Ｃ１〜７アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル、ハロゲン−Ｃ１〜７アルコキシ、アミノ、及びシアノからなる群から選択され、
Ｒ７はＣ１〜７アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル（前記シクロアルキルは非置換であるか又はヒドロキシにより置換されている）、ヘテロシクリル（前記ヘテロシクリルは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子を含み、非置換であるか、又はヒドロキシ若しくはオキソにより置換されている、３〜７個の環原子を有する）、フェニル（ここで、フェニルは非置換であるか、又はＣ１〜７アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜７アルコキシ、シアノ、ハロゲン、及びハロゲン−Ｃ１〜７アルキルからなる群から選択される１つ又は２つの基により置換されている）、及びヘテロアリール（ここで、ヘテロアリールは非置換であるか、又はＣ１〜７アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜７アルコキシ、シアノ、ハロゲン、及びハロゲン−Ｃ１〜７アルキルからなる群から選択される１つ又は２つの基により置換されている）からなる群から選択され、
Ｇは−（ＣＨ２））ｍ−（式中、ｍは０又は１から選択される）、及び−ＮＲ８（式中、Ｒ８は水素又はＣ１〜７アルキルである）からなる群から選択される。］
で表されることを特徴とする、請求項１に記載の使用のための化合物、及び薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
Ｇが結合であり、Ｒ７がＣ３〜７シクロアルキル（前記シクロアルキルは非置換であるか又はヒドロキシにより置換されている）である、請求項１又は２に記載の使用のための化合物。
【請求項４】
Ｒ７がヒドロキシにより置換されたシクロヘキシルである、請求項３に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
Ｒ２及びＲ６がそれぞれ水素であり、Ｒ４がハロゲンであり、Ｒ３及びＲ５の一方がハロゲンであり、Ｒ３及びＲ５の他方が水素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
Ｒ１がハロゲン−Ｃ１〜７アルキルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
Ｒ１が−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ（ＣＦ３）２、−ＣＦ２−ＣＦ３から選択される、請求項６に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
６−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−２−カルボキサミドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
５−（３，４−ジクロロ−フェニル）−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−６−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ニコチンアミドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
前記腎疾患が慢性腎疾患、一次若しくは二次糸球体性疾患、又はタンパク尿腎疾患から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
前記糸球体性疾患がアルポート症候群又は巣状分節性糸球体硬化症である、請求項１０に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
前記腎疾患が糖尿病性腎疾患から選択される、請求項１０に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
経口投与用に製剤化されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１４】
局所、経鼻、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、硝子体内、髄腔内、又は経皮での投与用に製剤化されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
１日の用量が２０〜８００ｍｇ／日である、請求項１〜１２の一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
１日の用量が２００ｍｇ／日である、請求項１〜１２の一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１７】
投与レジメンが１日１回、１日２回、１日３回、３日に１回、１週間に１回、２週間に１回、又はひと月に１回である、いずれかの先行する請求項に記載の使用のための化合物。
【請求項１８】
負荷用量レジメンが、最初の７日間、１４日間、又は３０日間に用量を２倍にする、いずれかの先行する請求項に記載の使用のための化合物。
【請求項１９】
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤薬物、ＲＡＳ遮断剤；アンギオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤；ＡＧＥ依存性経路の阻害剤；抗炎症剤；ＧＡＧ；ピリドキサミン；エンドセリンアンタゴニスト、ＣＯＸ−２阻害剤、ＰＰＡＲ−γアンタゴニスト、並びに、アミホスチン、カプトプリル、シクロホスファミド、チオ硫酸ナトリウム、トラニラスト又はシクロデキストリンなどのその他の化合物及びこれらの誘導体、ビタミンＤ誘導体、抗高血糖剤並びに抗高コレステロール血症剤からなる群から選択される化合物と同時、逐次的、又は個別に使用するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項２０】
腎疾患の治療及び／又は予防用の医薬を調製するための、先行する請求項２〜９で定義された式Ｉの化合物、又は薬学的に許容される塩。
【請求項２１】
請求項１〜１６で定義された化合物、並びに薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントを含む、いずれかの先行する請求項に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項２２】
処置に有効な量の請求項１〜９のいずれか一項で定義されたＡＢＣＡ１誘導因子を投与することを含む、それを必要とする対象における腎疾患の処置方法。
【請求項２３】
前記ＡＢＣＡ１誘導因子が、局所、経口、経鼻、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、硝子体内、髄腔内、又は経皮の経路により投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記投与が１日１回、１日２回、１日３回、３日に１回、１週間に１回、２週に１回、又はひと月に１回、好ましくは１日１回である、請求項２２又は２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜９のいずれか一項で定義されたＡＢＣＡ１誘導因子の１日用量が、２０〜８００ｍｇ／日の範囲である、請求項２２又は２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＡＢＣＡ１誘導因子が、処置に有効な量のアンギオテンシン変換酵素阻害剤又はアンギオテンシン受容体遮断剤と組み合わせて、同時に、個別に、又は逐次的に投与される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＢＣＡ１誘導因子が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤薬物、ＲＡＳ遮断剤；アンギオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤；ＡＧＥ依存性経路の阻害剤；抗炎症剤；ＧＡＧ；ピリドキサミン；エンドセリンアンタゴニスト、ＣＯＸ−２阻害剤、ＰＰＡＲ−γアンタゴニスト、並びに、アミホスチン、カプトプリル、シクロホスファミド、チオ硫酸ナトリウム、トラニラスト又はシクロデキストリンなどのその他の化合物及びこれらの誘導体、ビタミンＤ誘導体、抗高血糖剤並びに抗高コレステロール血症剤からなる群から選択される処置有効量の化合物と組み合わせて同時に、個別に、又は逐次的に投与される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、腎障害、特に、慢性腎疾患、糸球体性疾患、又はタンパク尿腎疾患、例えばアルポート症候群、巣状分節性糸球体硬化症、及び糖尿病性腎症の処置で使用するためのＡＢＣＡ１誘導因子化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
透析又は腎移植を必要とする、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）をもたらす慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、世界中で数百万人の患者に影響を及ぼす、進行中の伝染病である（Ｂｅｌｌｏ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ，ＪＡＭＡ，３１７：１８６４，２０１７）。糖尿病は世界中でＥＳＲＤの最も主たる原因であり続けている一方、高血圧、嚢胞性腎疾患、及び糸球体腎炎などの他の原因が、流行しているＥＳＲＤの大部分に寄与している（ＵＳＲＤＳデータベース）。これらの障害の多くは、中程度のタンパク尿から重度のネフローゼ範囲のタンパク尿にわたる、タンパク尿と共に現れる可能性があり、深刻なタンパク尿は、ＥＳＲＤに対する進行の主たる危険因子を提示している。腎交換法は患者の死亡率を改善するものの、現在の治療的ストラテジーは、ＣＫＤの進行を遅くするもので、止めるものではない。いくつかの介入研究は、有効性を示すことができないでいる。これは主に、これまで試験されてきた介入の多くは、初期の病原プロセスではなく、後期の腎疾患を標的にするという事実に依るものである。
【０００３】
現在では、現処置ストラテジーは、タンパク尿を低下させ、糸球体硬化の進行を遅くするのに役立つ、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤と、アンギオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）の使用で構成される。従来、タンパク尿腎疾患を患う患者は、ベナザプリル、シラザプリル、エナラプリル（バストテック）、フォシノプリル（モノプリル）、リシノプリル（ゼストリル、プリニビル）、ペリノプリル、ラミプリル、キナプリル（アキュプリル）、トランドラプリルが挙げられるが、これらに限定されないＡＣＥ阻害剤で処置されてきており、ＡＲＢとしては、カンデサルタン（アタカンド）、エプレサルタン、イルベサルタン、ロサルタン（コザール）、テルミサルタン、バルサルタンが挙げられる。ＦＳＧＳでのタンパク尿の処置に対する、唯一認可されている薬剤はＡＣＴＨａｒである。他の免疫抑制剤の多くのオフラベル使用もまた、ＦＳＧＳなどの複数のタンパク尿腎疾患において実装されてきた。これらには、プレドニゾン（又は一般にはステロイド）、リツキシマブ、カルシニューリン阻害剤（シクロスポリン及びタクロリムス）、ラパマイシン、アバタセプト、ミコフェノラートモフェチルが挙げられる。コエンザイムＱ１０、魚油、ビタミンＤ誘導体、グルテンフリー食、アロプリノール、スピロノラクトン、ＬＤＬアフェレーシス、血漿分離交換法などの他の方法も利用されている。
【０００４】
しかし、これらの処置の多くはケースシリーズに基づいており、無作為研究により支持されておらず、多くの場合、深刻な副作用が付随し、特異的な病原メカニズムを標的にするように設計されていない。更に、これらの処置のいずれかに対する応答は予測不可能である。したがって、現在されている薬剤は、安全で効果的な処置をもたらすことができていない。より具体的には、糸球体性障害、及びより広範には慢性腎疾患を患う患者の予防又は治療に対する、新規の医薬品に対する、長期間感じられている、満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、慢性腎疾患、特に、アルポート症候群及びＦＳＧＳといった一次糸球体性疾患並びに、糖尿病性腎症（ＤＫＤ）などの二次糸球体性疾患を患う患者の処置ための、新規の治療的ストラテジーを更に調査した。本発明者らは、いくつかのピリジンカルボキサミド化合物が、このような腎疾患の処置において非常に有望な効果を有することを示した。
【０００６】
ピリジンカルボキサミドは、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡ１タンパク質の小分子誘導因子（ＡＢＣＡ１誘導因子）として記載されている。このようなピリジンカルボキサミドは例えば、国際特許出願公開第２０１１／０２９８２７号、同第２０１２／０３２０１８号、同第２０１３／０３７７０３号、及び同第２０１４１８０７４１号に記載されている。
【０００７】
したがって、本開示は、ＡＢＣＡ１誘導因子化合物である、腎疾患を処置するのに使用される化合物に関する。
特定の実施形態においては、このようなＡＢＣＡ１誘導因子化合物は、以下の式Ｉ
【化１】
2021531308.tif 000002
【０００８】
［式中、
Ａ１及びＡ２の一方はＮであり、Ａ１及びＡ２の他方はＣＨであり、
Ｒ１は、Ｃ１〜７アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル−Ｃ１〜７アルキル、Ｃ１〜７アルコキシ−Ｃ１〜７アルキル、ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル、ヘテロシクリル−Ｃ１〜７アルキル（ここで、ヘテロシクリル基は非置換であるか、又はオキソにより置換されている）、及びヘテロアリール−Ｃ１〜７アルキル（ここで、ヘテロアリール基は非置換であるか、又は低級アルキルによりモノ又はジ置換されている）からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ６は互いに独立して水素又はハロゲンであり、
Ｒ３及びＲ５は互いに独立して水素、Ｃ１〜７アルキル、Ｃ１〜７アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル、ハロゲン−Ｃ１〜７アルコキシ、及びシアノからなる群から選択され、
Ｒ４は水素、Ｃ１〜７アルキル、Ｃ１〜７アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル、ハロゲン−Ｃ１〜７アルコキシ、アミノ、及びシアノからなる群から選択され、
Ｒ７はＣ１〜７アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル（当該シクロアルキルは非置換であるか又はヒドロキシにより置換されている）、ヘテロシクリル（当該ヘテロシクリルは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子を含み、非置換であるか、ヒドロキシ又はオキソにより置換されている、３〜７個の環原子を有する）、フェニル（ここで、フェニルは非置換であるか、又はＣ１〜７アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜７アルコキシ、シアノ、ハロゲン、及びハロゲン−Ｃ１〜７アルキルからなる群から選択される１つ又は２つの基により置換されている）、及びヘテロアリール（ここで、ヘテロアリールは非置換であるか、又はＣ１〜７アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜７アルコキシ、シアノ、ハロゲン、及びハロゲン−Ｃ１〜７アルキルからなる群から選択される１つ又は２つの基により置換されている）からなる群から選択され、
Ｇは−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍは０又は１から選択される）、及び−ＮＲ８（式中、Ｒ８は水素又はＣ１〜７アルキルである）からなる群から選択される。］
並びに薬学的に許容可能なそれらの塩により表される。
【０００９】
特定の実施形態において、Ｇは結合であり、Ｒ７はＣ３〜７シクロアルキル（当該シクロアルキルは非置換であるか又はヒドロキシにより置換されている）である。
【００１０】
前述の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態において、Ｒ７はヒドロキシにより置換されたシクロヘキシルである。
【００１１】
前述の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態において、Ｒ２及びＲ６はそれぞれ水素であり、Ｒ４はハロゲンであり、Ｒ３及びＲ５の一方はハロゲンであり、Ｒ３及びＲ５の他方は水素である。
【００１２】
前述の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態において、Ｒ１はハロゲン−Ｃ１〜７アルキルである。典型的には、Ｒ１は−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ（ＣＦ３）２、−ＣＦ２−ＣＦ３から選択することができる。
【００１３】
好ましい実施形態において、本明細書に記載のとおりに使用するためのＡＢＣＡ１誘導因子化合物は、６−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−２−カルボキサミドである。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、本明細書に記載のとおりに使用するためのＡＢＣＡ１誘導因子化合物は、５−（３，４−ジクロロ−フェニル）−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−６−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ニコチンアミドである。
【００１５】
前述の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態において、ＡＢＣＡ１誘導因子化合物は、慢性腎疾患、一次及び二次糸球体性疾患、又はタンパク尿疾患の処置において有用である。典型的には、このようなＡＢＣＡ１誘導因子化合物は、アルポート症候群、巣状分節性糸球体硬化症、又は糖尿病性腎疾患の処置において有用であり得る。
【００１６】
前述の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態において、本明細書に記載するとおりに使用するためのＡＢＣＡ１誘導因子化合物は、経口投与用に製剤化される。
【００１７】
別の特定の実施形態において、本明細書に記載するとおりに使用するためのＡＢＣＡ１誘導因子化合物は局所、経鼻、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、硝子体内、髄腔内、又は経皮での投与用に製剤化される。
【００１８】
本開示は、それを必要とする対象における、腎疾患の処置方法であって、治療に有効な量の、上で定義したＡＢＣＡ１を投与することを含む方法にもまた関する。
【００１９】
このような方法の特定の実施形態において、上記ＡＢＣＡ１誘導因子は、処置に有効な量の別の剤、例えばアンギオテンシン変換酵素阻害剤又はアンギオテンシン受容体遮断剤と組み合わせて、同時に、個別に、又は逐次的に投与することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明者らは、ＡＢＣＡ１誘導因子化合物は、腎障害、特に糸球体性疾患、例えばアルポート症候群若しくは巣状分節性糸球体硬化症、又は他の慢性腎疾患、例えば糖尿病性腎症の処置において非常に有望な効果を有することを示した。化合物は、これらの障害においてタンパク尿を減少させるだけでなく、腎機能を改善し、末期腎疾患の進行を予防する。
【００２１】
本開示に従った使用のためのＡＢＣＡ１誘導因子化合物
本明細書で使用する場合、用語「ＡＢＣＡ１誘導因子化合物」とは、ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質（ＡＢＣＡ１）の発現量又は活性を直接又は間接的に誘導可能な化合物を意味する。トランスポーターＡＢＣＡ１は、細胞コレステロール及びリン脂質ホメオスタシスの主たる制御因子として知られている。具体的には、ＡＢＣＡ１は、コレステロール及びリン脂質の、脂質が不十分なＡｐｏリポタンパク質（ＡｐｏＡ１及びＡｐｏＥ）への流出を媒介し、その後初期の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を形成する。細胞でＡＢＣＡ１タンパク質の上方制御を測定するためのインビトロアッセイは、例えば国際公開第２０１２／０３１８１７号に記載されている。これらのインビトロアッセイとしては、国際公開第２０１２／０３１８１７号に記載されているコレステロール流出アッセイ又は蛍光性ＡｐｏＡ１結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
ピリジンカルボキサミドは、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＡ１タンパク質の小分子誘導因子（ＡＢＣＡ１誘導因子）として記載されている。このようなピリジンカルボキサミドは例えば、国際特許出願公開第２０１１／０２９８２７号、同第２０１２／０３２０１８号、同第２０１３／０３７７０３号、及び同第２０１４／１８０７４１号に記載されている。
【００２３】
好ましい実施形態では、本開示は、式ＩのＡＢＣＡ１誘導因子化合物
【化２】
2021531308.tif 000003
［式中、Ａ１及びＡ２の一方はＮであり、Ａ１及びＡ２の他方はＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１〜７アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル−Ｃ１〜７アルキル、Ｃ１〜７アルコキシ−Ｃ１〜７アルキル、ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル、ヘテロシクリル−Ｃ１〜７アルキル（ここで、ヘテロシクリル基は非置換であるか、又はオキソにより置換されている）、及びヘテロアリール−Ｃ１〜７アルキル（ここで、ヘテロアリール基は非置換であるか、又は低級アルキルによりモノ又はジ置換されている）からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ６は互いに独立して水素又はハロゲンであり、
Ｒ３及びＲ５は互いに独立して水素、Ｃ１〜７アルキル、Ｃ１〜７アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル、ハロゲン−Ｃ１〜７アルコキシ、及びシアノからなる群から選択され、
Ｒ４は水素、Ｃ１〜７アルキル、Ｃ１〜７アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル、ハロゲン−Ｃ１〜７アルコキシ、アミノ、及びシアノからなる群から選択され、
Ｒ７はＣ１〜７アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル（当該シクロアルキルは非置換であるか又はヒドロキシにより置換されている）、ヘテロシクリル（当該ヘテロシクリルは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子を含み、非置換であるか、ヒドロキシ又はオキソにより置換されている、３〜７個の環原子を有する）、フェニル（ここで、フェニルは非置換であるか、又はＣ１〜７アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜７アルコキシ、シアノ、ハロゲン、及びハロゲン−Ｃ１〜７アルキルからなる群から選択される１つ又は２つの基により置換されている）、及びヘテロアリール（ここで、ヘテロアリールは非置換であるか、又はＣ１〜７アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜７アルコキシ、シアノ、ハロゲン、及びハロゲン−Ｃ１〜７アルキルからなる群から選択される１つ又は２つの基により置換されている）からなる群から選択され、
Ｇは−（ＣＨ２）ｍ−（式中、ｍは０又は１から選択される）、及び−ＮＲ８（式中、Ｒ８は水素又はＣ１〜７アルキルである）からなる群から選択される。］、
薬学的に許容可能なそれらの塩類の使用に関する。
【００２４】
用語「低級アルキル」又は「Ｃ１〜７アルキル」は、単独で又は組み合わせて、１〜７個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、特に、１〜６個の炭素原子直鎖又は分岐鎖アルキル基、及びより具体的には、１〜４個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基を表す。直鎖及び分岐鎖Ｃ１〜７アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、及び異性体ヘプチル、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、及びｔｅｒｔ−ブチルがある。
【００２５】
用語「低級アルコキシ」又は「Ｃ１〜７アルコキシ」とは、基Ｒ’−Ｏ−を意味し、式中、Ｒ’は低級アルキルであり、用語「低級アルキル」は、以前に記載した意味を有する。低級アルコキシ基の例としてはメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、及びｔｅｒｔ−ブトキシ、特にメトキシがある。
【００２６】
用語「低級アルコキシ」又は「Ｃ１〜７アルコキシ−Ｃ１〜７アルキル」とは、上で定義した低級アルコキシ基でモノ又は複数置換されている、上で定義した低級アルキル基を意味する。低級アルコキシアルキル基の例としては例えば、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び本明細書で具体的に例示する基がある。より具体的には、低級アルコキシはメトキシエチルである。
【００２７】
用語ヒドロキシは、基−ＯＨを意味する。
【００２８】
用語「シクロアルキル」又は「Ｃ３〜７シクロアルキル」は、３〜７個の炭素原子を含有する飽和炭素環式基、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、又はシクロへプチルを意味する。
【００２９】
用語「低級シクロアルキルアルキル」又は「Ｃ３〜７シクロアルキル−Ｃ１〜７アルキル」とは、低級アルキル基の水素原子の少なくとも１つが、上で定義したシクロアルキル基により置き換えられている、上で定義した低級アルキル基を意味する。低級シクロアルキルアルキル基の中でも、特に興味深いものとしてシクロプロピルメチルがある。
【００３０】
用語「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを意味し、特にフルオロ、クロロ、及びブロモが興味深い。より具体的には、ハロゲンとはフルオロ及びクロロを意味する。
【００３１】
用語「低級ハロゲンアルキル」又は「ハロゲン−Ｃ１〜７アルキル」とは、ハロゲン、特にフルオロ又はクロロ、最も具体的にはフルオロで、モノ又は複数置換された低級アルキル基を意味する。低級ハロゲンアルキル基の例としては、例えば−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ（ＣＦ３）２、−ＣＦ２−ＣＦ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＦ３、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＦ３、及び本明細書で具体的に例示した基がある。特に興味深いのは、基トリフルオロメチル（−ＣＦ３）及び２，２，２−トリフルオロエチル（−ＣＨ２ＣＦ３）である。
【００３２】
用語「低級ハロゲンアルコキシ」又は「ハロゲン−Ｃ１〜７アルコキシ」とは、低級アルコキシ基の水素原子の少なくとも１つがハロゲン原子、特にフルオロ又はクロロ、最も具体的にはフルオロで置き換えられている、上で定義した低級アルコキシ基を意味する。低級ハロゲンアルコキシの中でも、特に興味深いのはトリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、フルオロメトキシ、及びクロロメトキシで、あり、より具体的にはトリフルオロメトキシである。
【００３３】
用語「アミノ」とは、基−ＮＨ２を意味する。
【００３４】
用語「シアノ」とは、基−ＣＮを意味する。
【００３５】
用語「アジド」とは、基−Ｎ３を意味する。
【００３６】
用語「ヘテロアリール」とは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、又は３つの原子を含むことができる、芳香族の５又は６員環を意味する。ヘテロアリール基の例としては例えば、フラニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、チエニル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、オキサトリアゾリル、テトラゾリル、ペンタゾリル、又はピロリルがある。用語「ヘテロアリール」は、１つ又は両方の環が芳香族であり、窒素、酸素、又は硫黄から選択される１、２、又は３つの原子を含有することができる、２つの５又は６員環を含む二環状基、例えばキノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、ピラゾロ［１，５−ａ］ピリジル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、キノキサリニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル、インダゾリル、及び３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジニルもまた含む。特に興味深いヘテロアリール基は、イソキサゾリル、ピラゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、及びピラジニルである。より具体的には、ヘテロアリールはピリジル又はピリダジニルである。
【００３７】
用語「低級ヘテロアリールアルキル」又は「ヘテロアリール−Ｃ１〜７アルキル」とは、低アルキル基の水素原子の少なくとも１つが、上で定義したヘテロアリール基により置き換えられている、上で定義した低級アルキル基を意味する。
【００３８】
用語「ヘテロシクリル」とは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子を含有することができる、飽和又は部分不飽和の３、４、５、６、又は７員環を意味する。ヘテロシクリル環の例としては、ピペリジニル、ピペラジニル、アゼチジニル、アゼピニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、オキシラニル、チアジアゾリリジニル、オキセタニル、ジオキソラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、及びチオモルフォリニルが挙げられる。特に興味深いのは、ピペリジニル及びテトラヒドロピラニルである。
【００３９】
用語「低級ヘテロシクリルアルキル」又は「ヘテロシクリル−Ｃ１〜７アルキル」とは、低アルキル基の水素原子の少なくとも１つが、上で定義したヘテロシクリル基により置き換えられている、上で定義した低級アルキル基を意味する。
【００４０】
用語「オキソ」とは、ヘテロシクリル又はヘテロアリール環のＣ原子が＝Ｏにより置換され得ることを意味し、故に、ヘテロシクリル又はヘテロアリール環が、１つ以上のカルボニル（−ＣＯ−）基を含有し得ることを意味する。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物の使用に関する特定の実施形態において、Ｇは結合であり、Ｒ７はＣ３〜７シクロアルキル（当該シクロアルキルは非置換であるか又はヒドロキシにより置換されている）である。例えば、Ｒ７は、ヒドロキシにより置換されていても、いなくてもよいシクロヘキシルである。
【００４２】
特定の実施形態において、Ｒ２及びＲ６はそれぞれ水素である。
【００４３】
特定の実施形態において、Ｒ４はハロゲン、例えばクロロ又はフルオロであり、Ｒ３及びＲ５の一方はハロゲン、例えばクロロ又はフルオロであり、Ｒ３及びＲ５の他方は水素である。
【００４４】
特定の実施形態において、Ｒ１はハロゲン−Ｃ１〜７アルキルであり、典型的には、Ｒ１は−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｃｌ、−ＣＨ２ＣＦ３、−ＣＨ（ＣＦ３）２、−ＣＦ２−ＣＦ３から選択される。
【００４５】
具体的な化合物の例は、以下の化合物である：
【表１】
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【００４６】
特定の実施形態において、本明細書に記載した腎疾患の処置に使用するための化合物は、５−（３，４−ジクロロ−フェニル）−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−６−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ニコチンアミド、及び６−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−２−カルボキサミドからなる群から選択される。
【００４７】
本開示は、腎疾患で使用するための、式（Ｉ）の化合物、互変異性体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、若しくはこれらの混合物、又は水和物、溶媒和物、薬学的に許容される塩もまた包含する。
【００４８】
用語「薬学的に許容される塩」とは、遊離塩基又は遊離酸の生物学的有効性及び性質を保持し、望ましくないあらゆる自身の性質を有しない塩類を意味する。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、及びギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ−アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。したがって、特定の実施形態において、「薬学的に許容される塩」は、式Ｉの化合物の酢酸塩、臭化物、塩化物、ギ酸塩、フマル酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、及びトシル酸塩を含む。加えて、薬学的に許容される塩は、無機塩基又は有機塩基を遊離酸に添加することで調製することができる。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム塩などが含まれるがこれらに限定されない。有機塩基に由来する塩類としては、一級、二級、及び三級アミン、自然に生じる置換アミン、環式アミン、及び塩基性イオン交換樹脂を含む置換アミン、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、ジエチルアミン、リジン、アルギニン、Ｎ−エチルピペリジン、ピペリジン、ピペラジンなどの塩が挙げられるが、これらに限定されない。式Ｉの化合物は、双性イオンの形態、又は水和物の形態で存在することもできる。具体的には、式Ｉの化合物の薬学的に許容される塩は、塩酸塩であることができる。
【００４９】
式Ｉの化合物の合成法の例は、国際公開第２０１１／０２９８２７号、同第２０１２／０３２０１８号、同第２０１３／３７７０３号、及び同第２０１４／１８０７４１号に記載されている。化合物Ｇを調製するための例示的な方法は、国際公開第２０１１／０２９８２７号に記載されており、化合物Ａを調製するための例示的な方法は、国際公開第２０１４／１８０７４１号に記載されている。
【００５０】
式Ｉの化合物の使用方法
式Ｉの化合物、典型的には、実施例にて記載する化合物Ａ及びＧ、又は薬学的に許容される塩は、腎疾患の処置において有用であることが示されている。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「腎疾患」は、腎臓の通常の生理学及び機能のあらゆる変化を意味する。この用語は、腎臓移植；腎症；一次腎糸球体症、巣状分節性糸球体硬化症を伴う散在性の特発性ステロイド耐性ネフローゼ症候群を含む巣状分節性糸球体硬化症、微小変化群、膜性ＧＮ、Ｃ３糸球体症、深刻な腎の免疫グロブリン血症、ＩｇＡ腎症、慢性腎疾患（ＣＫＤ）；糸球体腎炎；多発性嚢胞腎疾患などの遺伝病；急性及び慢性間質性腎炎、メソアメリカ腎症；ネフローゼ症候群；腎炎症候群、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）；急性及び慢性腎不全；間質性疾患；腎炎；硬化症、例えば病気又は怪我による炎症を含む原因により生じる、組織及び／又は血管の硬変又は硬化；腎繊維症及び瘢痕；腎随伴増殖性障害；並びに、その他の一次又は二次腎性状態などの病気及び状態を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
腎疾患はまた、一般に「（１つ又は複数の）腎症」と定義されることもできる。用語「（１つ又は複数の）腎症」は、腎線維症、及び／又は糸球体性疾患（例えば糸球体硬化若しくは糸球体腎炎）、及び／又は慢性腎機能不全をもたらし得、かつ、末期腎疾患及び／又は腎不全を引き起こし得る、腎臓における、あらゆる臨床的・病理学的変化を包含する。
【００５３】
本開示のいくつかの態様は、高血圧性腎症、糖尿病腎障害などの糖尿病性腎症、並びに、鎮痛腎症、免疫媒介腎糸球体症（例えばＩｇＡ腎症、又はバーガー病、狼瘡性腎炎）、虚血性腎症、ＨＩＶ随伴腎症、膜性腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化、放射線造影中膜誘発腎症、毒性腎症、鎮痛誘発性腎毒性、シスプラチン腎症、移植組織腎症、及び、他の形態の糸球体性異常若しくは損傷、又は糸球体性毛管損傷（管状繊維症）などの他の種類の腎症の予防及び／又は治療のための、組成物及びその使用に関する。いくつかの実施形態では、用語「（１つ又は複数の）腎症」とは具体的に、本明細書において「タンパク質尿腎障害」とも呼ばれる、対象の尿にタンパク質が存在する（即ち、タンパク尿）、及び／又は、腎機能不全が存在するいずれかの、障害又は疾患を意味する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、対象はアルブミン尿又はタンパク尿を患っている。アルブミン尿と関係する例示的な障害としては、慢性腎疾患、増殖性糸球体腎炎（例えば免疫グロブリンＡ腎症、膜増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、抗ＧＢＭ病、腎血管炎、狼瘡性腎炎、寒冷グロブリン血症随伴糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、感染後糸球体腎炎、又はＣ型肝炎）、並びに、非増殖性糸球体腎炎（例えば膜糸球体腎炎、微小変化群、一次巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、原線維性糸球体腎炎、イムノタクトイド糸球体腎炎、アミロイド症、アルポート症候群、高血圧性腎硬化症、多発性骨髄腫由来の軽鎖病、及び二次巣状糸球体硬化）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書において提供する実施形態のいずれかにおいて、対象を特定の試験に通し、腎機能を評価することができる。このような試験としては、対象における血中尿素窒素の測定；対象の血液中でのクレアチニンの測定；対象の血液中でのクレアチニンクリアランスの測定；対象におけるタンパク尿の測定；対象におけるアルブミン：クレアチニン比率の測定；対象における糸球体濾過量の測定；及び、対象における泌尿器出力の測定が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「処置すること」又は「処置」とは、このような用語が適用される障害若しくは状態の、逆転、緩和、進行の阻害、若しくは予防、又は、このような用語が適用される障害若しくは状態の１つ以上の症状の、逆転、緩和、進行の阻害、若しくは予防を意味する。したがって、別の態様において、本開示はまた、タンパク尿の減少、タンパク尿の増加の遅延、泌尿器のアルブミン：クレアチニン比率（ＵＡＣＲ）の増加の遅延、ＵＡＣＲの低下、ＵＡＥＲの増加の遅延、ＵＡＥＲの低下、アルブミン尿の減少、アルブミン尿の増加の遅延、糸球体上皮細胞密度の増加、糸球体性基底膜（ＧＢＭ）の壁厚増大の予防又は遅延、糸球体性面積の減少、腎間質マクロファージの数の低下、腎組織の繊維症の低下又は遅延、腎臓での炎症の停止又は低下、マクロファージが誘発する腎臓への損傷の停止又は減少、推定される糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）の増加又は正規化、ｅＧＦＲの減少の弱化、糸球体硬化の減少、糸球体性細胞外マトリックスの拡大の停止又は低下、硝子質塊の沈着の停止又は減少、糸球体性上皮過形成損傷（ＥＰＨＬ）の停止又は減少、及び、リンパ球湿潤の停止又は減少を含むがこれらに限定されない、腎障害に関連する症状を低減、阻害、又は除去するのに使用するための、式Ｉの化合物、典型的には、実施例にて記載する化合物Ａ及びＧ、又は薬学的に許容される塩に関する。
【００５７】
本開示はそれ故、上で定義した腎疾患の処置に使用するための、上で定義した式Ｉの化合物、並びに薬学的に許容される担体及び／又はアジュバントを含む、医薬組成物にも関する。
【００５８】
特に、本開示は、慢性腎疾患、タンパク尿及び／又は糸球体性疾患を含む、腎疾患の治療及び／又は予防に使用するための、上で定義した医薬組成物に関する。好ましい使用は、アルポート症候群、巣状分節性糸球体硬化症、及び糖尿病性腎症に関する。
【００５９】
別の実施形態において、本発明は、腎疾患の治療及び／又は予防方法であって、処置に有効な量の式Ｉの化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法に関する。このような腎疾患の例としては、慢性腎疾患、タンパク尿、及び／又は糸球体性疾患が挙げられる。アルポート症候群、巣状分節性糸球体硬化症、及び糖尿病性腎症の治療及び／又は予防方法が、好ましい。
【００６０】
更に、本開示は、腎疾患の治療及び／又は予防用の医薬を調製するための、上で定義した式Ｉの化合物、典型的には、実施例にて記載する化合物Ａ及びＧ、又は薬学的に許容される塩の使用に関する。このような腎疾患の例としては、慢性腎疾患、タンパク尿、及び／又は糸球体性疾患が挙げられる。アルポート症候群、巣状分節性糸球体硬化症、及び糖尿病性腎症の治療及び／又は予防用の医薬を調製するための、上で定義した式Ｉの化合物の使用が、特に興味深い。
【００６１】
医薬組成物の形態、投与経路、用量、及びレジメンは自然に、処置される条件、病気の重症度、患者の年齢、体重、及び性別などに左右される。
【００６２】
本開示の医薬組成物は、局所、経口、経鼻、眼内、静脈内、筋肉内、又は皮下での投与用に製剤化することができる。好ましくは、本開示の医薬組成物は経口投与用に製剤化されることができる。
【００６３】
特定の実施形態においては、本開示の医薬組成物は、硝子体内、髄腔内、又は経皮での投与用に製剤化することができる。
【００６４】
医薬組成物は、錠剤、丸薬、カプセル、半固体、粉末、持続放出性製剤、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ剤、エリキシル剤、エアゾール、又は任意の他の適切な組成物の形態を取ることができ、上で定義した少なくとも１つの式Ｉの化合物を含むことができる。
【００６５】
特定の実施形態においては、経口製剤は錠剤、口内分散性錠剤、カプセル、溶液、パッチ、舌下錠、鼻内スプレー、又は経口スプレーである。ある副実施形態において、製剤は、上で定義した式Ｉの化合物の持続性放出のために調製される。
【００６６】
投与の容易さのために、錠剤及びカプセルが最も有利な経口投薬単位形態を示し、これらの場合においては、固体医薬担体が明らかに用いられる。所望する場合、錠剤を標準的な技術により糖衣することができる、又は、腸溶性コーティングすることができる。錠剤又は丸薬をコーティングして、作用が長引く利点が得られる用量剤形をもたらすことができる。例えば、錠剤又は丸薬は、内部投与成分及び外部投与成分を含むことができ、後者は、前者を覆うエンベロープの形態である。２つの構成成分は１つの腸溶性層により分離することができ、この層は、胃の中での崩壊に耐える役割を果たし、内部構成要素が無傷で十二指腸まで通過するか、又は放出が遅れるようにすることができる。種々の材料をこのような腸溶性層又はコーティングに使用することができ、このような材料としては、このような材料を含む多数の高分子酸、例えばセラック塗料、セチルアルコール、及び酢酸セルロースが挙げられる。
【００６７】
好適なキャリア材料は無機キャリア材料であるだけでなく、有機キャリア材料でもある。したがって、例えば、ラクトース、コーンスターチ又はその誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩を、錠剤、コーティング錠剤、糖衣丸、及びハードゼラチンカプセル用のキャリア材料として使用することができる。ソフトゼラチンカプセル用の好適な支持材料は例えば、植物油、ワックス、脂質、並びに半固体及び液体ポリオールである（しかし活性成分の性質に応じて、ソフトゼラチンカプセルの場合にはキャリアが必要ない場合がある）。溶液及びシロップ剤の製造に好適なキャリア材料は例えば、水、ポリオール、スクロース、転化糖などである。注射液に適したキャリア材料は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、及び植物油である。座薬に適したキャリア材料は、例えば、天然又は硬化油、ワックス、脂肪、及び半固体又は液体ポリオールである。局所調製物に適したキャリア材料は、グリセリド、半合成及び合成グリセリド、硬化油、液体ワックス、流動パラフィン、液体脂肪族アルコール、ステロール、ポリエチレングリコール、及びセルロース誘導体である。
【００６８】
通常の安定剤、防腐剤、湿潤及び乳化剤、コンシステンシー改善剤、風味改善剤、浸透圧変化のための塩、緩衝物質、可溶化剤、着色剤、並びにマスキング剤及び酸化防止剤が、医薬用アジュバントとして考慮される。
【００６９】
投与に使用する用量は、関連する病状、又は代替的に、所望する処置期間の様々なパラメータに応じて、特に、使用する投与方法に応じて、適応させることができる。化合物、及び化合物を含む組成物の適切な用量は、患者毎で異なり得ることが理解されよう。最適用量の決定には一般に、本明細書で記載される処置のあらゆるリスク又は有害な副作用に対する、処置効果のレベルのバランスを取ることが伴う。選択する用量レベルは、特定の化合物の活性、投与経路、投与時期、化合物の排泄速度、処置期間、組み合わせて使用する他の薬剤、化合物、及び／又は材料、並びに、患者の年齢、性別、体重、状態、総体的な健康、及び以前の病歴を含むがこれらに限定されない様々な因子に左右される。化合物の量及び投与経路は、最終的に医師の自由裁量に依るものの、一般的に、用量は、実質的な有害（ｈａｒｍｆｕｌ  ｏｒ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）な副作用を引き起こさずに所望の効果を達成する、作用部位における局部濃度を達成するものである。
【００７０】
成人患者に対しては、毎日の用量は約１〜１００ｍｇ、特に約１〜５０ｍｇが考慮される。病気の重症度、及び正確な薬物動態学的プロファイルに応じて、化合物は１回の剤形、又は複数の毎日の剤形、例えば１〜３個の剤形で投与することができる。
【００７１】
特定の実施形態では、本開示に従った使用のための化合物は、２０〜８００ｍｇ／日の１日用量で投与される。
【００７２】
別の実施形態では、本開示に従った使用のための化合物は、２００ｍｇ／日の１日用量で投与される。
【００７３】
本開示に従った使用のための医薬組成物は便利には、約１〜２００ｍｇ、好ましくは７５〜１００ｍｇの、式Ｉの化合物、典型的には、実施例にて記載する化合物Ａ及びＧ、又は、それらの薬学的に許容される塩を含有する。投与レジメンを、式Ｉの化合物の特定の薬物動態学的性質に対してテーラーメイドすることができる。
【００７４】
特定の実施形態では、式Ｉの化合物、典型的には、実施例にて記載する化合物Ａ及びＧ、又はそれを含む医薬組成物は１日１回、１日２回、１日３回、３日に１回、１週間に１回、２週に１回、又はひと月に１回投与される。好ましくは、投薬の周期性は、１日２回、１日１回、及び２日に１回から選択される。
【００７５】
別の特定の実施形態において、式Ｉの化合物、典型的には、実施例にて記載する化合物Ａ及びＧ、又は薬学的に許容される塩の、負荷用量レジメンは、最初の７日間、１４日間、及び３０日間に用量を２倍にする。
【００７６】
別の特定の実施形態において、本開示に従った使用のための医薬組成物は、約２０〜８００ｍｇ、好ましくは約５０〜４００ｍｇの、及びより好ましくは約２００ｍｇの、式Ｉの化合物、典型的には、実施例にて記載する化合物Ａ及びＧ、又は、それらの薬学的に許容される塩を含有することができる。
【００７７】
別の特定の実施形態において、本開示に従った、式Ｉの化合物、典型的には、実施例にて記載する化合物Ａ及びＧ、又は薬学的に許容される塩の使用に関して、１日用量は２０〜８００ｍｇ／日、好ましくは、１日用量は約２００ｍｇ／日である。
【００７８】
更に、本開示に従った使用のための式Ｉの化合物は、腎疾患、又は関連する障害若しくは合併症の予防又は治療用の別の剤との、同時、個別、又は逐次的な組み合わせ又は会合においてもまた有用であり得る。このような既知の化合物の例としては、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤薬物（例えばカプトプリル（Ｃａｐｏｔｅｎ（登録商標））、エナラプリル（Ｉｎｎｏｖａｃｅ（登録商標））、フォシノプリル（Ｓｔａｒｉｌ（登録商標））、リシノプリル（Ｚｅｓｔｒｉｌ（登録商標））、ペリンドプリル（Ｃｏｖｅｒｓｙｌ（登録商標））、キナプリル（Ａｃｃｕｐｒｏ（登録商標））、トランダナロプリル（Ｇｏｐｔｅｎ（登録商標））、ロテンシン、モエキシプリル、ラミプリル）；ＲＡＳ遮断剤；アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）（例：オルメサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、テルミサルタンなど）；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤（例：ルボキシスタウリン）；ＡＧＥ依存性経路の阻害剤（例えば、アミノグアニジン、ＡＬＴ−９４６、ピリドキサミン（ピロドドリン）、ＯＰＢ−９２９５、アラゲブリウム）；抗炎症剤（例えば、クリクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、ミコフェノール酸モフェチル、ミゾリビン、ペントキシフィリン）、ＧＡＧ（例えば、スロデキシド（米国特許第５，４９６，８０７号））；ピリドキサミン（米国特許第７，０３０，１４６号）；エンドセリン拮抗薬（例、ＳＰＰ３０１）、ＣＯＸ−２阻害剤、ＰＰＡＲ−γ拮抗剤、及びアミホスチン（シスプラチン腎症に使用）、カプトプリル（糖尿病性腎症に使用）、シクロホスファミド及びリツキシマブ（特発性膜性腎症に使用）、チオ硫酸ナトリウム（シスプラチン腎症に使用）、トラニラスト、シクロデキストリンなどのその他の化合物、並びにそれらの誘導体（例、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）などが挙げられるが、これらに限定されない（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｔｕｔｔｌｅ（２００５），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１２（２）：２１２−２２２；Ｇｉｕｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄｉｃａ，９７：２４１−６２）。特定の実施形態において、組み合わせての、又は会合での使用のための既知の化合物としては、バルドキソロン又はｍｉｒ−２１のオリゴヌクレオチド阻害剤（ｍｉｒ−２１アンタゴミール）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
別の特定の実施形態において、組み合わせての、又は会合での使用のための既知の化合物としては、ビタミンＤ誘導体、抗高血糖剤（例えば、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＧＬＰ１アゴニスト、ＤＰＰ４阻害剤）、抗高コレステロール血症剤（例えば、スタチン、ナイアシン、フィブラート、ＰＣＳＫ９阻害剤、エゼチマイブ）が挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「組み合わせ」とは、１つの単位剤形の固定用量の組み合わせ、非固定用量の組み合わせ、又は併用投与のための複数のパーツのキットのいずれかを意味し、ここで、式Ｉの化合物、及び１種以上の組み合わせパートナー（例えば、ＡＣＥ阻害剤薬物又はＡＲＢ薬剤）は、同時に独立して、又は、特に、これらの時間間隔によって、組み合わせパートナーが共同、例えば相乗効果を示すことができる場合には、複数の時間間隔以内に個別に投与されることができる。
【００８１】
用語「固定用量の組み合わせ」とは、単一要素又は用量の形態で、患者に有効成分が両方同時に投与されることを意味する。
【００８２】
用語「非固定用量の組み合わせ」とは、有効成分、例えば式Ｉの化合物、及び１種以上の組み合わせパートナー（例えばＡＣＥ阻害剤薬物又はＡＲＢ薬剤）が、特定の時間制限なく、同時又は逐次的のいずれかにより、個別の要素として患者に両方投与されることを意味し、このような投与により、患者の体内において、処置に効果的な濃度の２つの化合物が提供される。
【００８３】
更に、本明細書に記載の方法は、脂質異常症、高血圧、肥満、ニューロパシー、炎症、及び／又は網膜症を含むがこれらに限定されない腎疾患合併症に直接又は間接的に関連する別の病気の処置のための、少なくとも１種の他の治療薬の同時投与もまた含むことができる。このような追加の治療薬としては、コルチコステロイド；免疫抑制薬物投薬；抗生物質；降圧及び利尿薬物投薬（サイアザイド系利尿薬、及びＡＣＥ阻害剤又はβ−アドレナリン作動性アンタゴニスト）；胆汁封鎖樹脂、コレスチラミン、コレスチポール、ニコチン酸などの脂質低下剤、より具体的には、コレステロール及びトリグリセリドを低下させるために使用する薬剤及び投薬（例えば、フィブラート（例えばＧｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ（登録商標））及び、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ（登録商標）、Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ（登録商標）、Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ（登録商標）、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標）、Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）、Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標）、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）、Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ（登録商標）、Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ（登録商標）、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）、Ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ（登録商標）などのＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤）；ニコチン酸；並びにビタミンＤが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「同時投与」又は「併用投与」とは、選択した組み合わせパートナーを、単一の対象の中に投与することを包含することを意味し、剤が必ずしも同一経路で、又は同時に投与される必要のない処置レジメンを含むことが意図される。
【００８５】
用語「組み合わせて処置に有効な」とは、治療薬が、このような時間間隔で個別に（経時的にずらす方法、特に、順序特異的な方法で）与えられて、（好ましくは相乗的な）相互作用（即ち、組み合わせの処置効果）を示すことができることを意味する。
【００８６】
本開示はそれ故、
（ｉ）上で定義した式Ｉの化合物、典型的には、実施例に記載する化合物Ａ又はＧを含む医薬であって、以下
（ｉｉ）アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤薬物、ＲＡＳ遮断剤；アンギオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤；ＡＧＥ依存性経路の阻害剤；抗炎症剤、ＧＡＧ；ピリドキサミン（米国特許第７，０３０，１４６号）；エンドセリン拮抗薬、ＣＯＸ−２阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、及び、アミホスチン（シスプラチン腎症に使用）、カプトプリル（糖尿病性腎症に使用）、シクロホスファミド（特発性膜性腎症に使用）、チオ硫酸ナトリウム（シスプラチン腎症に使用）、又はトラニラスト；シクロデキストリンなどのその他の化合物並びにこれらの誘導体類（例えばヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）からなる群から選択される化合物、並びに
（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体、及び／又はアジュバント
と組み合わせた、又は会合した、医薬にも関する。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「医薬」とは、１つの医薬組成物、又は複数の医薬組成物の組み合わせを意味し、１種以上の賦形剤の存在下にて、１種以上の有効成分を含有する。
【００８８】
本開示は更に、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤薬物、ＲＡＳ遮断剤；アンギオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤；ＡＧＥ依存性経路の阻害剤；抗炎症剤、ＧＡＧ；ピリドキサミン（米国特許第７，０３０，１４６号）；エンドセリン拮抗薬、ＣＯＸ−２阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、及び、アミホスチン（シスプラチン腎症に使用）、カプトプリル（糖尿病性腎症に使用）、シクロホスファミド（特発性膜性腎症に使用）、チオ硫酸ナトリウム（シスプラチン腎症に使用）、トラニラスト、又はシクロデキストリンなどのその他の化合物並びにこれらの誘導体類（例えばヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、ビタミンＤ誘導体、抗高血糖剤、並びに抗高コレステロール血症剤からなる群から選択される化合物との同時、逐次、又は個別使用のための、上で定義した式Ｉの化合物に関する。本開示は、腎疾患の治療及び／又は予防方法であって、処置に有効な量の、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤薬物、ＲＡＳ遮断剤；アンギオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤；ＡＧＥ依存性経路の阻害剤；抗炎症剤、ＧＡＧ；ピリドキサミン（米国特許第７，０３０，１４６号）；エンドセリン拮抗薬、ＣＯＸ−２阻害剤、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、及び、アミホスチン（シスプラチン腎症に使用）、カプトプリル（糖尿病性腎症に使用）、シクロホスファミド（特発性膜性腎症に使用）、チオ硫酸ナトリウム（シスプラチン腎症に使用）、トラニラスト、又はシクロデキストリンなどのその他の化合物、並びにこれらの誘導体類（例えばヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、ビタミンＤ誘導体、抗高血糖剤、並びに抗高コレステロール血症剤からなる群から選択される化合物と組み合わせて、又は会合して、処置に有効な量の、式Ｉに従った化合物を投与することを含む、方法にもまた関する。
【００８９】
以下の実施例において、式（Ｉ）の化合物を特に、少なくとも３つの異なる腎疾患、即ち、アルポート症候群、巣状分節性糸球体硬化症、及び糖尿病腎障害のインビボ動物モデルにて試験したところ、多数の腎疾患におけるこのような化合物の有望な処置効果が反映された。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＡＤＲ誘発性腎症での、化合物の最適用量を試験するための実験設計。３０匹のメスＢａｌｂ／ｃマウスに、１２ｍｇ／ｋｇの用量で、ドキソルビシン（ＡＤＲ、アドリアマイシン）を尾静脈注射により注射した。ベースライン群の５匹のマウスは、食塩水を受けた。次に、ＡＤＲ注射したマウスを、それぞれが５匹の動物となる６つの群に分け、合計で７つの実験群を得た。翌日に開始し、化合物を１日１回、５週間経口摂食により投与した。尿を毎週収集し、体重を毎週記録した。血液と腎臓の毛皮質を、ＡＤＲ注射の３５日後に犠牲にして収集した。
【図２】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＡＤＲ誘発性腎症での、化合物を試験するための実験設計。メスＢａｌｂ／ｃマウスに、１２ｍｇ／ｋｇの用量で、ドキソルビシン（ＡＤＲ、アドリアマイシン）を尾静脈注射により注射した。対照群の５匹のマウスは、食塩水を受けた。ＡＤＲを注射したメスを、６匹の５つの群に分けた。翌日に開始し、ビヒクル又は化合物を１日１回、示すように４週間経口摂食により投与した。尿を毎週収集し、体重を毎週記録した。血液と腎臓の毛皮質を、ＡＤＲ注射の２８日後に犠牲にして収集した。
【図３】分化したヒト糸球体上皮細胞における化合物の細胞傷害性。分化したヒト糸球体上皮細胞を、０μＭ（ビヒクル）、１μＭ、５μＭ、及び１０μＭのＣｐｄ  Ａ、Ｃｐｄ  Ｃ、Ｃｐｄ  Ｄ、Ｃｐｄ  Ｅ、Ｃｐｄ  Ｆ、及びＣｐｄ  Ｇで１８時間処理した。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｙｔｏＴｏｘ  Ａｓｓａｙキットを使用して、細胞傷害性を評価した。プレーンな培地（無地の棒）をベースラインとして使用した。細胞傷害性シグナルを生存能シグナルに対して正規化し、細胞数の差による偏りを排除した。全ての処理を、ビヒクル処理した細胞と比較した。有意な毒性は、１０μＭを上回るＣｐｄ  Ａ及びＣｐｄ  Ｃのみで見いだされた。一元ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３、独立実験、ダネット検定、＊ｐ＜０．５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】Ｃｐｄ  Ｃ、Ｃｐｄ  Ａ、及びＣｐｄ  Ｇでの処理では、分化した糸球体上皮細胞におけるＡＢＣＡ１の発現と、コレステロール流出が増加する。  分化したヒト糸球体上皮細胞を、ビヒクル（０．１％  ＤＭＳＯ）又は記載した化合物で１８時間処理し、ＡＢＣＡ１発現、局在化、及びコレステロール流出への関与を測定した。（ａ）ＬＸＲアゴニスト（Ｃｐｄ  Ｃ、Ｅ及びＤ）によるＡＢＣＡ１発現の強力な誘発、並びに、１０μＭのＡＢＣＡ１誘導因子Ｃｐｄ  Ａ及びＧによる中程度の誘発を示す、全細胞可溶化物におけるＡＢＣＡ１及びＧＡＰＤＨウェスタンブロット。（ｂ〜ｅ）Ｃｐｄ  Ｃ、Ｃｐｄ  Ａ、及びＣｐｄ  Ｇは、原形質膜におけるＡＢＣＡ１の発現を増加させる。ビヒクル又は化合物Ｃ、Ａ、及びＧで、示したとおりに１８時間処理した、分化したヒト糸球体上皮細胞を、細胞分画に通した。（ｂ）Ｃｐｄ  Ａ（５μＭ）及びＣｐｄ  Ｇ（１０μＭ）で処理した後の、ＡＢＣＡ１発現の中程度の増加を示す、全細胞可溶化物におけるＡＢＣＡ１及びＧＡＰＤＨウェスタンブロット。（ｃ〜ｅ）ＡＢＣＡ１、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅポンプ、及びＭＥＫでブロット及びプローブ処理した、原形質膜、ミクロソーム、及びサイトゾル収集分画。（ｆ〜ｈ）Ｃｐｄ  Ｃ、Ａ、及びＧは、分化した糸球体上皮細胞にて、ＡｐｏＡ１が媒介するコレステロール流出を増加させる。［３−Ｈ］コレステロールでロードした、分化した糸球体上皮細胞を、示した化合物で１８時間インキュベートした。ＡｐｏＡ１が媒介するコレステロール流出を、ＡｐｏＡ１有り又は無しで１８時間、細胞をインキュベートした後に計算した。データを、少なくとも３つの独立実験の平均（標準偏差含む）として報告した。一元ＡＮＯＶＡ、ダネット検定、＊Ｐ＜０．０５％、＊＊Ｐ＜０．０１％
【図５】ＡＤＲにより誘発される腎損傷を軽減するための、化合物の最適用量の選択。（ａ〜ｅ）指示用量での、化合物による５週間の処理の間の、ＡＤＲ注射したマウスにおけるアルブミン尿。マウスは、ＡＤＲの注射から２〜３週間後に多量のタンパク尿を生み出し、これは、３０ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ａの用量（ｂ）、及び、１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇの用量（ｅ）で処理したマウスにおいて軽減された。（ｆ〜ｊ）ＡＤＲを注射したマウスは、ＡＤＲ注射の２〜３週間後に体重の有意な低下を特徴とし、これは、３０ｍｇ／ｋｇのＣｐｄ  Ａ、又は１００ｍｇのＣｐｄ  Ｇを受けたマウスにおいて特に軽減される表現型である。結果は、各群の平均及びＳＥを示す。一元ＡＮＯＶＡ、ｎ＝５、ダネット検定、＊Ｐ＜０．０５％。
【図６】ＡＢＣＡ１誘導因子Ｃｐｄ  Ａ及びＣｐｄ  Ｇは、ＡＤＲを注射したマウスにおいて、アルブミン尿と体重減少を有意に減少／低下させる。ＡＤＲ（１２ｍｇ／Ｋｇ）を注射したマウスは、ビヒクル、ＬＸＲアゴニストＣｐｄ  Ｃ、又は最適用量のＡＢＣＡ１誘導因子Ｃｐｄ  Ａ及びＣｐｄ  Ｇを２８日間、１日１回受けた。アルブミン尿及び体重は、週に１回測定した。（ａ）４週間の処置後のアルブミン尿。（ｂ）各マウスに、処置の４週間後、及び、ＡＤＲ注射の１日前に行った、体重の差として表す体重減少。ＡＤＲを注射していないマウスであるベースライン群（左に示す）は、腎損傷のない表現型を反映する。棒は中央値、及び、各処置群の範囲を表す。全ての群を、マン・ホイットニーの検定を使用して、ビヒクルを受けたものと比較した（ｎ＝８、＊Ｐ＜０．０５％、＊＊Ｐ＜  ０．０１％、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１％）。
【図７】ＡＤＲを注射し、ビヒクル、又は１００ｍｇ／Ｋｇ／日のＣｐｄ  Ｇで４週間処理した動物の腎臓からの、ＰＡＳ及びＨＥ分泌物の病理学的試験。病理学者は、全節性硬化症の割合（Ａ）；分節状硬化症の割合（Ｂ）；糸球体上皮細胞の肥大（Ｃ）；糸球体上皮細胞の過形成（Ｄ）；管状小嚢腫（Ｅ）、及び間質炎（Ｆ）を評価した。尺度値は以下を表す：０：０  ％；０．５＋：１〜１０  ％；１＋：１１〜２５％；２＋：２６〜５０  ％；３＋：５１〜７５  ％；４＋＞７５％。マン・ホイットニーの検定を使用して、Ｃｐｄ  Ｇ処理群のサンプルを、ビヒクル処理と比較した（ｎ＝７；＊Ｐ＜０．０５％）
【図８】食塩水又はＡＤＲを注射したマウスを、ビヒクル又は１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇのいずれかで２８日間処理した。腎皮質の断面をＯＲＯで染色して、脂肪滴の沈着を検出した。健常なベースライン群（Ａ）、ＡＤＲを注射し、ビヒクル（Ｂ）、及び１００ｍｇ／Ｋｇ／日のＣｐｄ  Ｇ（Ｃ）で処理した群からの分泌物の、代表的な写真。
【図９】Ｃｐｄ  Ｇは、ＡＤＲを注射したマウスの腎組織で、エステル化したコレステロールの蓄積を低減する。ビヒクル又はＣｐｄ  Ｇで２８日間処理した、ＡＤＲを注射したマウスの腎皮質から抽出した脂質の、コレステロールエステル、総コレステロール、及びトリグリセリドを評価した。各脂質種の量を、試料に存在する全タンパク質に対して正規化した。腎組織中で見いだされる、（ａ）エステル化したコレステロール、（ｂ）総コレステロールの含量、及び（ｃ）トリグリセリドの含量。ＡＤＲ注射を受けなかった動物が左に示され、腎損傷が誘発されないときのベースライン値を表す。Ｃｐｄ  Ｇ及びビヒクルで処理した群を、マン・ホイットニー両側検定を使用して比較した（ｎ＝８；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１％）。（ｄ〜ｆ）。各マウスのアルブミン尿と、腎皮質に存在する脂質種の量との相関関係。コレステロールエステル（ｄ）とは強力な相関関係が見いだされたが、総コレステロール（ｅ）及びトリグリセリド（ｆ）とは見いだされなかった。ピアソン検定、ｎ＝１０
【図１０】１２ｍｇ／ＫｇのＡＤＲを注射した動物を、ＡＤＲ注射の１日後に、ビヒクル又は１００ｍｇ／Ｋｇで処理した。ビヒクル（Ａ〜Ｂ）、及び１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇ（Ｃ〜Ｄ）で２０日間処理した後に撮影した写真。
【図１１】Ｃｐｄ  Ｇにより、Ｃｏｌ４Ａ３  ＫＯマウスを処理することで、末期腎疾患の進行が遅延される。４週齢の１２９−Ｃｏｌ４Ａ３  ＫＯマウスを、ビヒクル又は１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇで４週間処理した。実験の終わり（５６日目）に、体重を測定して、随時尿及び血液を採取して、腎臓での脂質の蓄積を分析した。ビヒクル又はＣｐｄ  Ｇで処理したＫＯマウスの、（ａ）アルブミン尿、（ｂ）血清クレアチニン、（ｃ）血中尿素窒素、及び（ｄ）体重。（ｅ）各群からのＰＡＳ染色した腎臓断面の代表的な写真、（ｆ）ｅで言及した、ＰＡＳ染色した肝臓断面の、盲検病理学分析後の、メサンギウム拡大の定量化。同じ年齢のＣｏｌ４ａ３＋／＋マウス（ｗｔ）を左に含めて、慢性腎疾患を有しない表現型を反映した。（ｇ）６週齢の時点で開始した、４週間ビヒクル又はＣｐｄ  Ｇ（１００ｍｇ／Ｋｇ／日）を受けた、１２９−Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯマウスの生存曲線。水平の棒は、各基の中央値を表す。群間での統計学的差異を、両側マン・ホイットニー検定を使用して計算した（ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５％、＊＊Ｐ＜０．０１％）。
【図１２】Ｄｂ／＋、ｄｂ／ｄｂビヒクルで処理した、及び、ｄｂ／ｄｂ  ＡＢＣＡ１誘導因子（化合物Ａ）で処理したマウスを利用して、以下について分析した：（Ａ）における、処理の開始時（１４週間）、処理の２週間後（１６週間）、及び、４週間の処理の後に犠牲にした時点（１８週間）にて測定した、クレアチニンに対するアルブミンの比率；マウス血清から測定し、ｍｇ／ｄＬで表した、血液尿素窒素（ＢＵＮ）（Ｂ）；総コレステロール（ＴＣ）、遊離コレステロール（ＦＣ）、及びコレステロールエステル（ＣＥ）の形態での、腎皮質コレステロール顔料（タンパク質１ｍｇ当たりでの、コレステロールｎｍｏｌの倍率変化）（Ｃ）；ＢＵＮとＣＥとの相関関係（Ｄ）；ＷＴ１抗体（Ｅ）により測定し、定量化した（Ｆ）、糸球体性断面積当たりの糸球体上皮細胞の数；ＰＡＳ染色した腎皮質断面（Ｇ）を使用して定量化（Ｈ）した、メサンギウム拡大スコア；ＴＥＭ画像から測定し（Ｉ）定量化（Ｊ）した、糸球体上皮細胞足突起の消滅。テューキー検定の後の一元ＡＮＯＶＡ（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図１３】Ｃｐｄ  Ｇは、腎皮質中でのエステル化コレステロールの蓄積を低下させ、（ａ）エステル化コレステロール（ＣＥ）、（ｂ）総コレステロール（ＴＣ）、及び（ｃ）トリグリセリド含量（ＴＧ）を、４週齢の時点で開始した、ビヒクル又はＣｐｄ  Ｇを２８日間受けた、８週齢のＣｏｌ４Ａ３ＫＯの腎皮質にて測定した。各脂質の含量を、総タンパク質含量に対して正規化した。野生型同腹子の群もまた、この研究に含めた（白円）。水平の棒は、各基の中央値を表す。両側マン・ホイットニー検定を使用して、統計学的差異を測定した（ｎ＝８）：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１。
【実施例】
【００９１】
ＡＢＣＡ１誘導因子化合物の調製
化合物のリスト：
【表２】
2021531308.tif 000005
【００９２】
上記化合物、及びこれらの合成法は、国際公開第２０１４／１８０７４１号に記載されている。
【００９３】
化合物Ｇ：５−（３，４−ジクロロ−フェニル）−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−シクロヘキシル）−６−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ニコチンアミドの調製
国際公開第２０１１／０２９８２７号の実施例３に記載されている手順に従い、化合物を５−ブロモ−６−クロロ−３−ピリジンカルボン酸、２，２，２−トリフルオロエタノール、（１Ｒ，２Ｒ）−２−アミノ−シクロヘキサノール、及び３，４−ジクロロフェニルボロン酸から調製した。ＭＳ  ４６３．０７９，４６５．０７７（Ｍ＋Ｈ）＋．
【００９４】
化合物Ａ：６−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−２−カルボキサミドの調製
化合物Ａを、以下の工程で、国際公開第２０１４／１８０７４１号に記載されている手順に従い調製した：
【００９５】
ａ）６−クロロ−２−（３，４−ジクロロフェニル）−３−フルオロピリジン
１００ｍＬの４ツ口フラスコ内で、２，６−ジクロロ−３−フルオロピリジン（７６５ｍｇ、４．６１ｍｍｏｌ、当量：１．００、ＣＡＳ登録番号５２２０８−５０−１）、及び（３，４−ジクロロフェニル）トリフルオロホウ酸カリウム（１．２１ｇ、４．６１ｍｍｏｌ、当量：１．００、ＣＡＮ  ８５０６２３−６８−６）を、ジオキサン（２３ｍＬ）及び水（１３ｍＬ）と組み合わせた。２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（６．９１ｍＬ、１３．８ｍｍｏｌ、当量：３）、続いて、ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）−ＣＨ２Ｃｌ２付加化合物（１６９ｍｇ、２３０μｍｏｌ、当量：０．０５、ＣＡＳ登録番号９５４６４−０５−４）を添加した。反応混合物を３回脱気させ、アルゴンでパージした後、撹拌しながら一晩６０℃まで加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、５０ｍＬのＨ２Ｏを注いで、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した（２×１００ｍＬ）。有機層をＨ２Ｏ／ブラインで洗浄して合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて真空中で濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、７０ｇ、５％〜２０％  ヘプタン中のジクロロメタン）により２回精製し、５４０ｍｇの表題化合物を白色半固体として得た。
【００９６】
ｂ）６−クロロ−２（３．４−ジクロロフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピリジン
２５ｍＬの梨型フラスコ中で、上で調製した６−クロロ−２−（３，４−ジクロロフェニル）−３−フルオロピリジン（５３０ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、当量：１．００）をＤＭＳＯ（８ｍＬ）と合わせた。ＫＯＨ（１１８ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、当量：１．４６）と２，２，２−トリフルオロエタノール（２１１ｍｇ、１５３μＬ、２．１１ｍｍｏｌ、当量：１．４７）を添加し、反応を２時間周囲温度にて続けた。混合物を３０ｍＬのＨ２Ｏに注ぎ、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで抽出した（２×４０ｍＬ）。有機層をＨ２Ｏ／ブラインで洗浄して合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて真空中で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、７０ｇ、５％〜２０％ヘプタン中のＥｔＯＡｃ）により精製し、４４４ｍｇの表題化合物を無色液体として得た；ＭＳ（ＥＳＩ）３５６．３，３５８．３，３６０．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９７】
ｃ）メチル６−（３，４−ジクロロフェニル）−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−２−カルボキシレート
３５ｍＬのオートクレーブ中で、上で調製した６−クロロ−２−（３，４−ジクロロフェニル）−３−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン（４３７ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ、当量：１．００）を５ｍＬのＭｅＯＨに溶解させた。アルゴンにより酸素及び湿気から保護し、ＰｄＣｌ２（ＤＰＰＦ）−ＣＨ２Ｃｌ２付加化合物（７５．２ｍｇ、９２μｍｏｌ、当量：０．０８３、ＣＡＳ登録番号９５４６４−０５−４）、続いてトリエチルアミン（２３３ｍｇ、３２１ｍＬ、２．３１ｍｍｏｌ、当量：２．３１）を添加した。次に、反応容器にＣＯを３回流し、７０ｂａｒまで圧力をかけた後、カルボニル化を２０時間１１０℃で進めた。冷却して圧力を放出した後、粗反応混合物を真空中で濃縮した。次に残留物をＡｃＯＥｔ／Ｈ２Ｏに溶解させ、分液漏斗に移した。水層をＥｔＯＡｃで逆抽出し、有機層をＨ２Ｏとブラインで洗浄して合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、７０ｇ、１０％〜４０％  ヘプタン中のＥｔＯＡｃ）を行って、最終的に３２７ｍｇの表題生成物を白色固体として得た；ＭＳ（ＥＳＩ）３８０．４，３８２．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９８】
ｄ）６−（３，４−ジクロロフェニル）−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−２−カルボン酸
２５ｍＬの梨型フラスコ中で、上で調製した６−（３，４−ジクロロフェニル）−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピコリネート（３２６ｍｇ、８５８μｍｏｌ、当量：１．００）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）と合わせ、無色溶液を得た。水（２．５ｍＬ）、続いてＬｉＯＨ（４１．１ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ、当量：２）を添加し、反応混合物を２時間、４０℃で撹拌した。反応混合物を５ｍＬの飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液及び３ｍＬの１Ｎ  ＫＨＳＯ４溶液に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した（２×３０ｍＬ）。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて真空中で濃縮すると、表題の酸が３２２ｍｇ、白色泡状物として残った；ＭＳ（ＥＳＩ）３６６．４，３６８．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００９９】
ｅ）６−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロヘキシル］−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−２−カルボキサミド
２５ｍＬの梨型フラスコ中で、上で合成した６−（３，４−ジクロロフェニル）−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）−ピコリン酸（３２２ｍｇ、８７９μｍｏｌ、当量：１．００）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解させた。ＴＢＴＵ（Ｏ−（ベンゾチアゾール）−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、４２４ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、当量：１．５、ＣＡＳ  登録番号１２５７００−６７−６）、及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５６８ｍｇ、７６８μＬ、４．４ｍｍｏｌ、当量：５）を添加し、反応混合物を１０分間周囲温度にて撹拌した後、（１Ｒ，２Ｒ）−２−アミノシクロヘキサノールヒドロクロリド（１６０ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ、当量：１．２、ＣＡＳ登録番号１３３７４−３１−７）を追加の溶媒なしで添加した。次に、反応を３時間室温で進めた。粗製混合物をＨ２Ｏで希釈してＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（塩基性アルミナ、５０ｇ、１０％〜８０％  ヘプタン中のＥｔＯＡｃ）により精製し、ＥｔＯＡｃ及びヘプタンからの、粗生成物の沈殿により、表題アミドが白色固体として得られた；高解像度ＭＳ（ＥＳＩ）４６３．０７９８，４６５．０７６９（Ｍ＋Ｈ）＋；予想：４６３．０７９８，４６５．０７６８。
【０１００】
化合物Ｈ：（Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−５−（４−シアノフェニル）−Ｎ’−メチル−６（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−３−カルボヒドラジド）の調製
化合物Ｈを、以下の工程で、国際公開第２０１４／１８０７４１号に記載されている手順に従い調製した：
【０１０１】
ａ）５−（４−シアノ−フェニル）−６−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ニコチン酸メチルエステル
５０ｍＬの４ツ口フラスコ中で、メチル５−ブロモ−６−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ニコチネート（１ｇ、３．１８ｍｍｏｌ、当量：１．００、ＣＡＳ登録番号１２１１５８９−５１−３）及び炭酸セシウム（３．１１ｇ、９．５５ｍｍｏｌ、当量：３）を、トルエン（２５ｍＬ）及び水（２．８ｍＬ）と組み合わせ、無色溶液を得た。反応混合物を３回脱気させ、アルゴンでパージした後、酢酸パラジウム（ＩＩ）（１４．３ｍｇ、６３．７μｍｏｌ、当量：０．０２）、（４−シアノフェニル）トリフルオロホウ酸カリウム（７３２ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ、当量：１．１、ＣＡＳ登録番号８５０６２３−３６−８）、及びブチルジ−１−アダマンチルホスフィン（６８．５ｍｇ、１９１μｍｏｌ、当量：０．０６、ＣＡＳ登録番号３２１９２１−７１−５）を連続して添加した。脱気−パージサイクルを、各添加の後に繰り返した。次に、反応混合物を１２０℃まで５時間加熱した。冷却後、反応混合物を５０ｍＬのＨ２Ｏに注ぎ、ＡｃＯＥｔで抽出した（２×５０ｍＬ）。有機層をＨ２Ｏ／ブラインで洗浄して合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて真空中で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、５０ｇ、５０％〜１００％  ヘプタン中のＣＨ２Ｃｌ２）による精製によって、最終的に表題化合物を８９８ｍｇ、白色泡状物として得た；ＭＳ（ＥＳＩ）３３７．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０２】
ｂ）５−（４−シアノ−フェニル）−６−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ニコチン酸
２５ｍＬの丸底フラスコ中で、上で調製した５−（４−シアノ−フェニル）−６−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ニコチン酸メチルエステル（０．８９１ｇ、２．６５ｍｍｏｌ、当量：１．００）を、ＴＨＦ（７ｍＬ）及び水（３．５ｍＬ）と合わせて淡黄色の二相系を得た。ＴＬＣが反応の完了を示したとき、水酸化リチウム（１２７ｍｇ、５．３ｍｍｏｌ、当量：２）を添加し、反応混合物を４０℃で３時間撹拌した。事前作業：１０ｍＬのＨ２Ｏ及び７ｍＬのＨＣｌ  １Ｎを添加し、混合物をＡｃＯＥｔで抽出して（２×５０ｍＬ）、有機層を合わせてブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて真空中で濃縮した。ヘプタン／ＥｔＯＡｃ（９：１）での粉砕により、最終的に、所望の表題生成物を７９４ｍｇ、白色固体として得た；ＭＳ（ＥＳＩ）３２１．２（Ｍ−Ｈ）−。
【０１０３】
ｃ）Ｎ’−（６−クロロピリダジン−３−イル）−５−（４−シアノフェニル）−Ｎ’−メチル−６−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−３−カルボヒドラジド
５ｍＬの丸底フラスコ中で、上で調製した５−（４−シアノ−フェニル）−６−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ニコチン酸（０．０５０ｇ、１５５μｍｏｌ、当量：１．００）をＴＨＦ（２ｍＬ）と合わせ、無色溶液を得た。ＴＢＴＵ（Ｏ−（ベンゾチアゾール）−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、７４．７ｍｇ、２３３μｍｏｌ、当量：１．５、ＣＡＳ登録番号１２５７００−６７−６）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１００ｍｇ、１３５μＬ、７７６μｍｏｌ、当量：５を添加した。反応混合物を１０分間室温で撹拌した後、３−クロロ−６−（１−メチルヒドラジニル）−ピリダジン（２９．５ｍｇ、１８６μｍｏｌ、当量：１．２、ＣＡＮ７６９５３−３３−８）を添加し、反応混合物を室温で一晩維持した。２５ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌに注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出し（２×５０ｍＬ）、１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄してＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、全ての溶媒を真空中で蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１０グラム、２％〜１０％  ＣＨ２Ｃｌ２中のＭｅＯＨ）にかけて、ヘプタン／ＡｃＯＥｔからの再結晶を行うことにより、最終的に表題化合物を２８ｍｇ、白色固体として得た；ＭＳ（ＥＳＩ）４６３．１，４６５．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０４】
化合物Ｊ：６−（４−クロロ−フェニル）−５−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ピリジン−２−カルボン酸（３−イソプロピル−イソオキサゾール−５−イルメチル）−アミドの調製
化合物Ｊを、以下の工程で、国際公開第２０１４／１８０７４１号に記載されている手順に従い調製した：
【０１０５】
表題化合物を、国際公開第２０１２／０３２０１８号の実施例６４に記載されている方法に従い、６−（４−クロロ−フェニル）−５−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−２−ピリジンカルボン酸及び３−（１−メチルエチル）−５−イソキサゾールメタンアミン（ＣＡＳ登録番号５４３７１３−３０−０）から合成した。ＬＣ−ＭＳ（ＵＶピーク面積／ＥＳＩ）１００．０％，４５４．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０６】
化合物Ｆ（６−（４−クロロフェニル）−Ｎ−（ピリミジン−５−イル）−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピコリンアミド、比較化合物）の調製：
６−（４−クロロ−フェニル）−５−（２，２，２−トリフルオロ−エトキシ）−ピリジン−２−カルボン酸（国際公開第２０１２／０３２０１８号、実施例ＡＥに記載のとおりに調製）をＤＭＦ（３０ｍＬ）と室温で合わせ、無色溶液を得た。ピリミジン−５−アミン、ＴＢＴＵ、及びＮ−エチルジイソプロピルアミンを添加した。反応混合物を室温で１５時間撹拌した。反応混合物を１５０ｍＬのＨ２Ｏに注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した（２×１５０ｍＬ）。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて蒸発させた。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、２０ｇ、０％〜５０％、ヘキサン中のＥｔＯＡｃ）により精製した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）４０９．０６８（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０１０７】
比較の他の化合物
【表３】
2021531308.tif 000006
【０１０８】
化合物Ｃ（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−｛２−メチル−１−［５−メチル−２−（３−トリフルオロメチル−フェニル）−オキサゾール−４−イルメチル］−１Ｈ−インドール−５−イル｝−プロパン−２−オール、ＬＸＲアゴニスト）の合成は、国際公開第２００５／１０５７９１号、実施例５６に記載されていた。
【０１０９】
化合物Ｄ（４−｛５−［（ＲＳ）−（３−ブロモ−ベンゼンスルホニル）−（（ＳＲ）−７−クロロ−１，２，３，４−テトラヒドロ−シクロペンタ［ｂ］インドール−２−イル）−フルオロ−メチル］−［１，３，４］オキサジアゾール−２−イル｝−安息香酸、部分的なＬＸＲアゴニスト）は、国際公開第２００５／０９２８５６号の実施例１１３に記載されていた。
【０１１０】
化合物Ｅ（（Ｒ）−２−［（Ｓ）−ベンゼンスルホニル−フルオロ−（５−メチル−［１，３，４］オキサジアゾール−２−イル）−メチル］−７−クロロ−１，２，３，４−テトラヒドロ−シクロペンタ［ｂ］インドール、部分的なＬＸＲアゴニスト）は、国際公開第２００５／０９２８５６号、実施例７４（６）に記載されていた。
【０１１１】
材料及び方法
インビトロ実験のために、凍結乾燥した化合物をＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）中で再構成し、同じ溶媒中で希釈して、２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭ、及び０ｍＭのストックを生成し、これらを−２０℃で保管した。
【０１１２】
インビボ実験のために、凍結乾燥させた化合物を、ビヒクル（Ｒｏｃｈｅにて設計された特異的な製剤：１．２５％  ヒドロキシプロピルメチルセルロース、０．１０％  ドクセートナトリウム塩、０．１８％  プロピルパラベンナトリウム、０．０２％  クエン酸一水和物、ｐＨ６）に懸濁した。微粒子懸濁液を、３回の簡単なパルス音波処理（氷上）により確保した。懸濁液中の化合物濃度を、Ｃｐｄ  Ｃ（ＬＸＲアゴニスト）に関して２ｍｇ／ｍＬに調整し、両方のＡＢＣＡ１誘導因子であるＣｐｄ  Ａ及びＣｐｄ  Ｇに関しては、２つの濃度（６ｍｇ／ｍＬ及び２０ｍｇ／ｍＬ）に調整した。化合物の懸濁液を、長期保存のためには−２０℃で保管し、化合物が１週間以内に使用される予定の場合は、４℃で保管した。懸濁液を完全に混合した後投与して、確実に用量が均一に送達されるようにした。
【０１１３】
細胞培養
ラットコラーゲンＩ型、ＲＰＭＩ及びＩＴＳをＣｏｒｎｉｎｇから購入した。ＦＢＳをＧＩＢＣＯから、脂肪非含有ＢＳＡをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。コレステロール流出アッセイのために、ヒトＡｐｏＡ１及び３Ｈ−コレステロールをそれぞれ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。
【０１１４】
条件的に不死化したヒト糸球体上皮細胞は、Ｍｏｉｎ  Ｓａｌｅｅｍから好意による贈答品であった。細胞をコラーゲンＩ型でコーティングしたフラスコ内で播種し、完全培地（ＲＰＭＩ、１０％  ＦＢＳ、１×Ｐｅｎ／ストレプトマイシン）中で３３℃、５％  ＣＯ２にて増殖させ、１×ＩＴＳを補充した。分化のために、細胞を、ＩＴＳ非含有の完全培地培地中で、２，５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃及び５％  ＣＯ２で１５日間培養した。
【０１１５】
細胞傷害性
糸球体上皮細胞を９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種し、１４日間分化させた。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ビヒクル及び化合物含有又は非含有の培地（ＲＰＭＩ−０．２％  ＢＳＡ）で、１８時間３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。試験した化合物の濃度は、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、及び２０μＭであった。ビヒクル（ＤＭＳＯ）の終濃度は０．１％であった。全ての処理を２通りに行った。メーカーの指示に従い、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏ  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞傷害性をアッセイした。簡単に言うと、細胞透過性（ＧＦ−ＡＦＣ）及び細胞不透過性（ビス−ＡＡＦ−Ｒ１１０）ペプチド基質を希釈して、全てのウェルに添加し、細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で１時間インキュベートした。細胞の集合を、細胞傷害性の陽性対照としてサポニン（２ｍｇ／ｍＬ）で処理した。細胞生存能及び細胞傷害性蛍光シグナルを、蛍光マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３）を使用してそれぞれ、４００ｎｍ／５０５ｎｍ、及び４８５ｎｍ／５２０ｎｍの励起／発光で測定した。細胞傷害性基質で得たＲＦＵシグナルを、同じウェル内で生存可能な基質により得たシグナルに対して正規化して、ウェルあたりの異なる細胞数の効果を除外した。
【０１１６】
コレステロール流出
１３日間分化したヒト糸球体上皮細胞を、２％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で、１μＣｉ／ｍＬの［３Ｈ］−コレステロールを用いて２４時間標識した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ビヒクル、又は化合物Ｃｐｄ  Ｃ（１μＭ）、Ｃｐｄ  Ａ（１μＭ、５μＭ）、及びＣｐｄ  Ｇ（１μＭ、５μＭ、１０μＭ）を補充した平衡培地（ＲＰＭＩ−０．２％脂肪非含有ＢＳＡ）で１８時間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、２０μｇ／ｍＬのヒトＡｐｏＡ１を含有する、又は非含有の平衡培地で、１８時間３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。培地を収集し、１２，０００ｘｇで５分間スピンし、２００μＬのアリコートの放射能を、液体シンチレーションにより計測した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２５０μＬの０．１％  ＳＤＳ、０．１Ｍ  ＮａＯＨで溶解し、１００μＬのアリコートの放射能を、液体シンチレーションにより測定した。コレステロール流出を、以下の式により、培地に対する、細胞から取り除いた標識コレステロールの割合として計算した：
流出（％）＝１００×｛（培地のｃｐｍ）／［（培地のｃｐｍ）＋（溶解物のｃｐｍ）］｝
【０１１７】
ＡｐｏＡ１が媒介するコレステロール流出を、ＡｐｏＡ１の存在下又は不存在下における流出間の差として計算した。全ての処理を２通りに行った。４つ以上の独立実験を実施した。
【０１１８】
ＡＢＣＡ１の発現。
１４日間分化させた糸球体上皮細胞を、ＲＰＭＩ−０．２％  ＦＢＳ中で１８時間飢餓状態にし、その後、完全培地中で１８時間、３７℃及び５％  ＣＯ２で、新たに調製した化合物の希釈液にて処理した。１μＭ、５μＭ、及び１０μＭの化合物濃度を評価した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充した、１Ｘ細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で溶解した。総タンパク質含有量をＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により測定した。ＡＢＣＡ１の発現をウェスタンブロットにより分析した。
【０１１９】
細胞の分画
１４日間分化させた糸球体上皮細胞を、化合物Ｃｐｄ  Ｃ（１μＭ）、Ｃｐｄ  Ａ（５μＭ）、及びＣｐｄ  Ｇ（１０μＭ）で１８時間処理した後洗浄して、氷冷ＰＢＳで掻き取った。細胞を１，０００ｘｇで５分間遠心分離にかけ、上清を注意深く吸引して、ペレットを、Ｒｏｃｈｅのプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した低張性緩衝液（１５ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、及び１ｍＭ  ＤＴＴ）中で懸濁した。ガラスダウンサー中で、２回の凍結及び解凍サイクルにて起泡させることで、細胞を更に確実に破壊した。スクロースを添加し、２２７ｍＭの終濃度にして、細胞を１，０００ｘｇにて３０分間、４℃で遠心分離にかけた。次に、上清を新しい管に移し、１０，０００ｘｇにて１５分間、４℃で遠心分離にかけた。ミクロソーム分画を含有するペレットを収集し、上清を新しい管に移して、１００，０００ｘｇにて１時間、４℃で遠心分離にかけた。ペレット処理した原形質膜画分を収集し、非膜性サイトゾル分画を含有する上清を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００フィルターカラム内で濃縮した。各画分内での、ＡＢＣＡ１、並びに、原形質膜に存在することが知られているタンパク質（Ｎａ＋／Ｋ＋ナトリウムポンプ）及び細胞質基質（ＭＥＫ）の存在を、ウェスタンブロットにより確認した。
【０１２０】
ウェスタンブロット
溶解物、又は細胞画分を、緩衝液サンプルにより５５℃で１０分間、減圧条件にてインキュベートした。合計で３０ｇの、溶解物中のタンパク質、及び、細胞画分調製物中で収集した体積の３分の１を、４〜２０％ゲル中のＳＤＳＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ）で分離した後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。膜を５％乳で遮断し、タンパク質特異的抗体で１８時間４℃にてブロットした。以下の抗体を使用した：マウス抗ＡＢＣＡ１（Ａｂｃａｍ；１：１，０００）、ウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：１０，０００）、ウサギ抗ＭＥＫ及び抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１：１，０００）。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、５％乳中で、ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に１：１０，０００で抱合体化した、抗マウス及び抗ウサギ特異的抗体を用いて、膜をインキュベートした。膜を洗浄して、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｒｉｇｈｔ  ＥＣＬ基質（Ａｄｖａｎｓｔａ）を使用してシグナルを展開した。
【０１２１】
インビボ実験
研究認可
マウスにおける化合物を試験するための研究手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ’ｓ  ＩＡＣＵＣにより認可された。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ（ＵＭ）は、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ、ＮＩＨと共に、Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｓｓｕｒａｎｃｅのファイルを有している（Ａ−３２２４−０１、２０１４年１１月２４日に有効化）。更に、ＵＭは、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅにより登録されている（２０１４年１２月、登録５８−Ｒ−００７）。２０１３年１０月２２日時点で、Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）は、ＵＭの完全な認定を続けている。
【０１２２】
アドリアマイシン誘発性腎損傷
購入したメスＢａｌｂ／ｃマウスは、６週齢の時点でＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから購入し、実験の開始前に２週間、我々の設備にて保管した。
【０１２３】
まず、予備実験を実施し、使用する化合物の最良の用量を見いだし、他の実験変数の調整が必要か否かを決定した。この実験において、３０匹のマウスが単回用量のアドリアマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１２ｍｇ／Ｋｇ、尾静脈注射による）を受け、その後、それぞれ５匹のマウスがいる６つの群に無作為に分けた。別の５匹のマウスに、同一経路で０．９％  ＮａＣｌを注射し、腎損傷なしのベースライン群として使用した。ＡＤＲ注射の２４時間後に開始して、ビヒクル、又は異なる用量の化合物を、３５日間経口摂食にて、１日１回与えた。試験化合物の用量は、以下のとおりであった：ＬＸＲアゴニスト（Ｃｐｄ  Ｃ、１０ｍｇ／Ｋｇ）；ＡＢＣＡ１誘導因子Ｃｐｄ  Ａ及びＣｐｄ  Ｇ（３０ｍｇ／Ｋｇ及び１００ｍｇ／Ｋｇ）。体重測定及び随時尿採集を、１週間に１回行った。ＡＤＲ注射の３５日後に、動物を犠牲にした（図１）。
【０１２４】
第２の実験を繰り返し、第１の実験におけるＣｐｄ  Ａ及びＧの用量にて達成した、腎機能の改善を確認した。簡単に言うと、８週齢の３０匹のメスＢａｌｂ／ｃマウスに、１２ｍｇ／ＫｇのＡＤＲを、尾静脈を介して注射し、マウスを、それぞれ６匹の動物がいる５つの群に無作為に分配した。動物に、ビヒクル又は化合物を、ＡＤＲ注射の１日後からはじめて２８日間、経口摂食により１日１回与えた。以下の化合物用量を試験した：Ｃｐｄ  Ｃ、１０ｍｇ／Ｋｇ／日；Ｃｐｄ  Ａ、３０ｍｇ／Ｋｇ／日並びにＣｐｄ  Ｇ、３０ｍｇ／Ｋｇ／日、及び１００ｍｇ／Ｋｇ／日。尾静脈注射で食塩水を受け、ビヒクルで処理した５匹の動物の群を、健常なベースライン対照として使用した。体重測定及び随時尿採集を、１週間に１回行った。ＡＤＲ注射の２８日後に、動物を犠牲にした（図２）。
【０１２５】
アルポートマウスモデル
１２９  Ｃｏｌ４ａ３ｔｍ１／Ｄｅｃ／ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓから購入し、交配してＣｏｌ４ａ３  ＫＯマウスを生成した。マウスをジェノタイピングして、プライマー：Ｆ（ＴＧＣＴＣＴＣＴＣＡＡＡＴＧＣＡＣＣＡＧ）、Ｒ（ＣＣＡＧＧＣＴＴＡＡＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ）、及びＲｍ（ＧＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＧ）を使用して、ＰＣＲ反応（９４Ｃで５分間、続けて、９５Ｃで３０秒・６０Ｃで１５秒・及び７２Ｃで３０秒を３０サイクル、並びに７２Ｃで１分）で、選択した。１２９匹のＣｏｌ４Ａ３−ＫＯマウスを、それぞれ５匹のマウス（オス及びメス）がいる２つの群に分けた。４週齢の時点で、マウスは、ビヒクル又はＣｐｄ  Ｇ（１００ｍｇ／Ｋｇ）のいずれかを経口摂食で、４週間毎日受けることを開始した。体重測定及び随時尿採集を、１週間に１回実施した。動物を、８週齢の時点で、処置の終わりに犠牲にした。後続の研究もまた実施して、病気が確立した時点での、Ｃｏｌ４Ａ３−ＫＯマウスの処置がマウスの生残を延ばすか否かを評価した。本研究では、マウスを、６週齢の時点で開始する、Ｃｐｄ  Ｇ（１００ｍｇ／Ｋｇ／日）を毎日経口摂食することにより処理し、生残を評価した。
【０１２６】
ＤＫＤマウスモデル
Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから、Ｂ６．ＢＫＳｄｂ／ｄｂ、及びＢ６．ＢＫＳｄｂ／＋マウスを購入した。１４週齢の時点で、マウスは、ビヒクル又はＡＢＣＡ１誘導因子であるＣｐｄ  Ａ（３０ｍｇ／Ｋｇ）を、経口摂食により１日１回４週間、受けることを開始した。体重測定及び尿採集を毎週行った。マウスを１８週齢で犠牲にし、採血して組織を処理し、以下のとおりに分析した。
【０１２７】
マウスの表現型分析
随時尿サンプルを全てのマウスから、ベースライン及び犠牲時に採集した。アルブミンＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及びクレアチニン測定のための比色分析アッセイ（Ｓｔａｎｂｉｏ）を使用して、泌尿器のアルブミン及びクレアチニンを測定した。アルブミン尿を計算し、クレアチニン（ｍｇ）で除したアルブミン（μｇ）として表した。糖尿病マウスモデルに関して、体重及び血糖を２週間に１回ベースで測定した。
【０１２８】
犠牲時に、ヘパリン処理した管で採血をし、マウスを、等張生理食塩を用いる水左心室灌流によって灌流した。腎皮質を注意深く切除し、以下の分析：糸球体上皮細胞の数の測定、脂肪滴の染色、電子顕微鏡法（ＥＭ）、腎脂質含量アッセイ、病理学的評価のためのＰＡＳ＆ＨＥ染色のために更に細断した。
【０１２９】
糸球体上皮細胞の数の測定
腎皮質の細断物を、免疫蛍光浅色及び脂肪滴の更なる分析のために、ＯＣＴに埋め込んだ。具体的には、切断して、ＷＴ１抗体（１：２００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及びＰｒｏＬｏｎｇ  ＧＯＬＤ  ＤＡＰＩ固定培地で染色した４μｍ厚の組織断片を使用して、糸球体性断面当たりの糸球体上皮細胞の数を測定した。４０倍の湿った対物レンズを備えるＬｅｉｃａ  ＳＰ５倒立顕微鏡を使用する共焦点顕微鏡法により、画像を入手した。マウス当たり２０個の糸球体を定量化した。
【０１３０】
脂肪滴染色Ｆｉｌｔｅｒｅｄ  Ｏｉｌ−Ｒｅｄ  Ｏ−Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ溶液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＰＡ）を水（６：４）で希釈した。４μｍの腎断片を、１００μＬの新しく調製したＯｉｌ−Ｒｅｄ  Ｏ溶液（ＯＲＯ）で１５分間インキュベートし、ヘマトキシリンＨａｒｒｉｓ  Ｈｇ  Ｆｒｅｅ（ＶＷＲ，ＰＡ）で対比染色し、脂質の沈着を検出した。光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ  ４１，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、糸球体の染色を評価した。
【０１３１】
電子顕微鏡法。透過型電子顕微鏡法のために、腎皮質の断片を、０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の、４％パラホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒドに配置した。足突起を、１μｍの糸球体性基底膜当たりで定量化した。
【０１３２】
腎脂質種アッセイ。腎皮質の断片を急速冷凍し、脂質抽出及びコレステロール含量の測定のために使用した。組織を、氷上のガラスダウンサー中の２ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液で均質化した。１００μＬのホモジェネート（約５〜１０ｍｇの組織）中の脂質を、１ｍＬのヘキサン：イソプロパノール（３：２）で、２連続の３０分間抽出で抽出した。脂質含有溶媒を次いで、窒素雰囲気にて乾燥させた。次に脂質を、イソプロパノール：ＮＰ−４０（９：１）を使用して再構成し、メーカーの手順に従い、Ａｍｐｌｅｘ赤色コレステロールアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してコレステロール含量を定量化した。脂質抽出物中のトリグリセリドを、メーカーの指示（Ｃａｙｍａｎ）に従い、比色分析キットを用いてアッセイした。総コレステロールとコレステロールエステルを、酵素蛍光定量法を用いてアッセイした。総コレステロールに関しては、腎脂質抽出物を、アッセイ緩衝液（１００ｍＭ  リン酸カリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  コール酸、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１０、ｐＨ  ７．４）で希釈し、終濃度が１Ｕ／ｍＬのコレステロールオキシダーゼ、１Ｕ／ｍＬのコレステロールエステル、１Ｕ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ、及び７５μＭのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄを補充した同じ緩衝液を用いてインキュベートした。反応物を、黒色不透明の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中で、３７℃にて３０分間インキュベートし、５３０ｎｍの励起及び５８０の発光を用いて、蛍光をマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｉ３Ｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて測定した。
【０１３３】
Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ，２００４）が記載している直接法を用いて、コレステロールエステルをアッセイした。簡単に言うと、１５０μＬのＦＣ分解試薬（上述したアッセイ緩衝液中の、４５Ｕ／ｍＬのウシカタラーゼ、及び１Ｕ／ｍＬのコレステロールオキシダーゼ）を、最大１ｍＭの総コレステロールを含有する２５μＬのサンプルに添加した。遊離コレステロールを一晩３７℃で分解させた後、７５μＬの４Ｘコレステロールエステル検出試薬（１Ｕ／ｍＬのコレステロールオキシダーゼ、４Ｕ／ｍＬのコレステロールエステル、２４Ｕ／ｍＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ、３００μＭのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ）を添加した。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、総コレステロールの蛍光を上述のとおりに測定した。１ｍＭのコレステロール、及び５μＭのコレステロールオレエート規格を内部対照として含めて、アッセイの感度及び特異度を確認した。
【０１３４】
病理学的評価。腎皮質の断片をパラフィン包埋し、過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）及びＨＥで４μｍ厚に切断した。二重盲検荘園で実施した、半定量分析（スケール０〜５）、又は、メサンギウムが拡大した糸球体の割合（％）に基づき、メサンギウム拡大をスコア付けした。
【０１３５】
統計
統計。全ての値を、平均＋標準偏差として表す。Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ  ７ソフトウェアを使用して統計分析を実施した。２つ以上の化合物用量を使用して、群が通常のデータ分布を示す場合、一元ＡＮＯＶＡを使用して結果を分析した。差が観察される場合、対照（ビヒクル）の平均を、ダネット検定を使用して各群の平均と比較した。テューキー検定を、複数の比較のために実施した。
【０１３６】
インビボ研究のために、ビヒクル及び化合物で処理した群を、両側ｔ検定を使用して比較した。ウェルチの補正を、等しくない分散の場合に用いた。正規分布を主張できないときに、マン・ホイットニー検定も使用して、群を比較した。０．０５％未満のＰ値を、統計的に有意であるとみなした。
【０１３７】
結果
化合物の細胞傷害性
細胞傷害性アッセイを実施して、培養したヒト糸球体上皮細胞で安全に使用可能な化合物の濃度範囲を測定した。
【０１３８】
全ての化合物が、細胞傷害性の兆候なく１０μＭまでの濃度で使用することができた。しかし、化合物Ａ及びＣを用いるときは、これら２つの化合物が２０μＭにて有意な傷害性を誘発した（図３）ため、５μＭの濃度を超えないようにした。
【０１３９】
ＡＢＣＡ１発現及びコレステロール流出
インビトロ実験を行い、動物研究で更に使用するための、糸球体上皮細胞内でのＡＢＣＡ１の機能的発現をよりよく誘発する化合物を選択した。したがって、化合物のＡＢＣＡ１タンパク質発現、血漿膜におけるＡＢＣＡ１局在化、及びＡｐｏＡ１が媒介するコレステロール流出における効果を研究した。
【０１４０】
化合物により誘発されるＡＢＣＡ１発現を、ウェスタンブロットにより対処した。全てのＬＸＲアゴニスト、Ｃｐｄ  Ｃ、Ｃｐｄ  Ｅ、及びＣｐｄ  Ｄは、最低１μＭの用量にて、糸球体上皮細胞におけるＡＢＣＡ１の発現を著しく増加させた。試験した３つのＡＢＣＡ１誘導因子（Ｃｐｄ  Ａ、Ｃｐｄ  Ｆ、及びＣｐｄ  Ｇ）のうち、Ｃｐｄ  Ａ及びＣｐｄ  ＧのみがＡＢＣＡ１の発現を増加させたが、これは１０μＭにおけるものではなく、また、ＬＸＲアゴニストほど著しいものでもなかった（図４ａ）。
【０１４１】
観察されたＡＢＣＡ１発現の増加が、より機能的なタンパク質の産生と関連しているか否かに対処するため、１μＭのＣｐｄ  Ｃ、５μＭのＣｐｄ  Ａ、及び１０μＭのＣｐｄ  Ｇで処理した糸球体上皮細胞の細胞分画を実施した。使用した薬剤濃度に伴い増加したＡＢＣＡ１の発現をまず確認し（図４ｂ）、入手した画分のそれぞれにおけるＡＢＣＡ１の局在化をウェスタンブロットにより確認した。入手した画分を、原形質膜及びサイトゾル画分に位置することが知られているタンパク質（それぞれＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ及びＭＥＫ）に対してもブロットし、細胞分画の成功を確認した（図４ｃ〜ｅ）。用いた３つの化合物の用量は、原形質膜におけるＡＢＣＡ１の局在化を促進し（図４ｃ）、予想通り、非膜性サイトゾル画分においてＡＢＣＡ１は発見されなかった。ＡＢＣＡ１誘導因子であるＣｐｄ  Ａ及びＣｐｄ  Ｇで処理した細胞のミクロソーム区画では、さほどＡＢＣＡ１が発見されず（図４ｄ）、このことは、これらの化合物がＬＸＲアゴニストによりも、原形質膜においてこのタンパク質の局在化をより効果的に促進することを示唆している。更に、ＡｐｏＡ１をコレステロール担体として用いるコレステロール流出アッセイを実施した。ＡＢＣＡ１が、細胞から初期のＨＤＬ粒子へのコレステロールの移動に関して、ＡｐｏＡ１と特異的に相互作用するため、このアッセイは、コレステロール流出に関するＡＢＣＡ１の機能性を測定する。ＡｐｏＡ１が媒介する外向き流束、流出の有意な増加を、１μＭ  Ｃｐｄ  Ｃ（ＬＸＲアゴニスト）、５μＭ  Ｃｐｄ  Ａ及び１０μＭ  Ｃｐｄ  Ｇで達成することができた（図４ｄ〜ｅ）。
【０１４２】
これらのインビトロ実験に基づき、ＡＢＣＡ１誘導因子であるＣｐｄ  Ａ及びＣｐｄ  Ｇを選んで、参照としてのＬＸＲアゴニストであるＣｐｄ  Ｃと共に、腎損傷の動物モデルにおいて試験した。
【０１４３】
ＡＢＣＡ１誘導因子は実験ＦＳＧＳを保護する
腎損傷のＡＤＲモデルは、薬剤が誘発したタンパク尿腎疾患のモデルであり、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の、最も幅広く用いられた実験モデルを保持する。用量範囲を見いだす実験を、インビトロ実験で選択した化合物を用いて実施した。
【０１４４】
ＡＤＲ注射は、深刻な一過性タンパク尿と体重減少を誘発した。アルブミン尿及び体重を毎週確認した。ＬＸＲアゴニスト（Ｃｐｄ  Ｃ）で処理した群では、有意差は観察されなかった（図５ａ）。しかし、３０ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ａ及び１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇを受けた群ではタンパク尿が減少し（図５ｂ及びｅ）、３０ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇを受けた群では、より小さい程度で減少した（図５ｄ）。同様に、ＡＤＲを注射した動物は、１０〜２０％の体重減少を経験したが、これは、３０ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ａ及び１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇで処理した動物では予防され（図５ｇ及びｊ）、ＬＸＲアゴニストで処理した動物では予防されなかった（図５ｆ）。
【０１４５】
第２の独立したインビボ実験において、多数のマウスを利用し、以前の実験で有益であることが分かったＣｐｄ  Ａ及びＧの用量、即ち、３０ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ａ及び１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇを選択した。以前の実験と同様に、両方のＡＢＣＡ１誘導因子が、アルブミン尿及び体重減少を低下させた（図６ｂ）。
【０１４６】
化合物Ｇが、最も有益な効果を有するものであることが判明し、腎疾患のＡＤＲモデルは、腎機能不全を示さないため、この化合物で処理した動物において、更なる定量的組織学的研究を実施した。腎皮質の盲検病理学的研究により、１００ｍｇ／Ｋｇ／日のＣｐｄ  Ｇを受けた動物における、全体及び部分的な糸球体性硬化症、糸球体上皮細胞の肥大及び過形成、管状小嚢腫及び隙間炎症の低下が明らかとなった（図７）。これらのデータを合わせると、化合物Ｇが、アドリアマイシンにより引き起こされるＦＳＧＳの特徴を減少させるのに非常に効果的であり、コンパレータとして評価したＬＸＲアゴニストよりも効果的であることが明らかとなった。
【０１４７】
コレステロール代謝に影響を及ぼすことが予想された化合物を投与していたため、実験動物の血液中での、コレステロールとトリグリセリドの濃度を測定した。両方の臨床パラメータに対して、有意差は発見されなかった（表１及び２）。
【表４】
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【表５】
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【０１４８】
腎組織での脂質沈着を、腎損傷の設定において記録した。ＡＤＲを注射した動物において脂質の蓄積があるか否か、及び、Ｃｐｄ  Ｇがこの効果を低下させることができるか否かを測定するために、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（ＯＲＯ）染色を実施した。ＡＤＲを注射したマウスの腎臓で、脂肪滴の有意な沈着が発見され、これは、Ｃｐｄ  Ｇで処理した動物において有意に減少した（図８）。実際、ビヒクルを受けた、ＡＤＲを注射したマウスは、腎皮質での有意な脂質沈着を示し、対照的に、Ｃｐｄ  Ｇは、ＡＤＲに応答して糸球体性脂質の蓄積を完全に予防した。このことは、年齢が一致する通常の対照マウスと比較して、腎皮質中に検出可能な脂質の蓄積がないことを示している。
【０１４９】
腎組織に蓄積した脂質種を測定するために、腎皮質の脂質を抽出し、トリグリセリド、総コレステロール、及びコレステロールエステルを分析した。ＡＤＲ、又はプレーンな食塩水を注射した動物の腎臓の間で、トリグリセリドと総コレステロールの含量に差を発見することはできなかった。しかし、ＡＤＲを注射したマウスにおいて、エステル化コレステロールの含量が非常に有意に増加していることを発見し、これは、Ｃｐｄ  Ｇ処理により有意に低下した（図９ａ〜ｃ）。アルブミン尿の重症度と、腎組織で検出されたコレステロールエステル含量には強力な相関関係があった（図９ｄ）が、分析した他の脂質種とは相関関係がなかった（図９ｅ及びｆ）。ＡＤＲを注射したマウスをＣｐｄ  Ｇで処理することにより、コレステロールエステルの蓄積が予防され、いかなる理論によっても束縛されるものではないが、この化合物は、ＡＢＣＡ１の上方制御を介して、糸球体性コレステロールの除去を改善することができると考えられる。
【０１５０】
次に、血清学により、化合物Ｃ、Ａ、及びＧの毒性を調査した。より具体的には、ヘマトクリット値、ヘモグロビン白色細胞の血球数、並びに、処理した全ての動物の肝臓アミノ基転移酵素ＡＬＴ及びＡＳＴを測定し、肝臓毒性及び血液悪液質が化合物と関連しているか否かを測定した。このような毒性の明らかな兆候は、実験マウスでは発見されなかった（表３）。
【表６】
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【０１５１】
最適用量のＣｐｄ  Ｇで処理した動物は、実験を通してＡＤＲを受けた動物よりも、良好な物理的外見を有した。これは特に、処置の３週目及び４週目で顕著であった（図１０）。
【０１５２】
進行性腎疾患（アルポート症候群）のマウスモデルにおける、腎破壊からのＣｐｄ  Ｇ保護
未処理のＣｏＬ４ａ３  ＫＯマウスは、深刻なアルブミン尿を進行させ、４週齢と８週齢の間で、高いＢＵＮ及び血清クレアチニン濃度を進行させた。これらのマウスは８週齢までにＥＳＲＤに達し、その時点を超えて生残しない。
【０１５３】
アルポート症候群のこのモデルにおける、Ｃｐｄ  Ｇの腎臓保護効果を研究するために、４週齢の時点で開始する、４週間の１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇ、又はビヒクルでのＣｏＬ４ａ３  ＫＯマウス処理を行った。１００ｍｇ／ＫｇのＣｐｄ  Ｇで処理した動物は、ＥＳＲＤへの進行を遅延させることを示し、ビヒクルのみを受けた動物と比較して、有意に少ないアルブミン尿、ＢＵＮ、及び血清クレアチニンを有した（図１１を参照のこと）。Ｃｐｄ  Ｇで処理した動物もまた、ビヒクルを受けた動物よりも体重減少が少なかった。
【０１５４】
腎臓断片を組織学的に分析することにより、ビヒクルで処理したＣｏｌ４ａ３  ＫＯよりも、Ｃｐｄ  Ｇで処理したＣｏｌ４ａ３  ＫＯマウスにおける、有意に低いメサンギウム拡大が明らかとなった。個別の研究を実施し、腎破壊が確立されたマウスをＣｐｄ  Ｇで処理することが、生残の改善をもたらすか否かを調査した。実際、Ｃｐｄ  Ｇでの処理が、比較的進行しているＣＫＤを有する６週齢のマウスで開始したときでも、Ｃｐｄ  Ｇで処理したＣｏｌ４ａ３  ＫＯマウスの腎機能の改善は、死亡率の低下と関連しており、約１５％の寿命延長をもたらした。
【０１５５】
最終的に、８週齢のＣｏｌ４ａ３  ＫＯマウスの腎皮質断片は、著しい脂質の蓄積を示し（Ｏｉｌ−Ｒｅｄ  Ｏ染色の増加）、これは、Ｃｐｄ  Ｇを受けた動物において減少した（図１３を参照のこと）。ＡＤＲモデルにおける以前の結果に一致して、ＷＴ同腹子よりも有意に多かった、Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯマウスの腎臓におけるコレステロールエステルは、Ｃｐｄ  Ｇでの処理により有意に減少した。
【０１５６】
Ｃｐｄ  Ａは、糖尿病性腎症のマウスモデルを部分的に保護する
ＡＢＣＡ１の増加は、糸球体上皮細胞の損傷及びＤＫＤを回復する
ＡＢＣＡ１を、肥満糖尿病ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＤＫＤ用の処置標的として確認することを目標とした。ＡＢＣＡ１の薬理学的誘導因子で処理したｄｂ／ｄｂマウスは、ｄｂ／ｄｂビヒクル処理したマウスと比較して、処理の２週間後（１６週間）にアルブミン尿の減少を経験し、及び更に、処理の４週間後（１８週間）（図１２Ａ）にも経験した。血中尿素窒素（ＢＵＮ）は有意に改善されたことが判明し（図１２Ｂ）、これは、ｄｂ／ｄｂマウスと比較して、ＡＢＣＡ１誘導因子（化合物Ａ）処理群における、コレステロールエステルの有意な減少（図１２Ｃ〜Ｄ）と相関していた。腎皮質の断片を、ｄｂ／ｄｂマウス経験におけるＡＢＣＡ１誘導因子の処置が、ＷＴ１溶性細胞を定量化することにより測定される糸球体上皮細胞の数（図１２Ｅ〜Ｆ）、ＰＡＳ染色断片を使用して測定したメサンギウム拡大（図１２Ｇ〜Ｈ）、及び、ＴＥＭ画像を使用して測定した糸球体上皮細胞足突起の消滅（図１２Ｉ〜Ｊ）を改善したことを示した、様々な組織学的評価に使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2021531308.tif 000018
【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
2021531308.tif 000022
【図５Ｂ】
2021531308.tif 000023
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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2021531308.tif 000031
【図５Ｊ】
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2021531308.tif 000033
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2021531308.tif 000036
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１２Ｊ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【国際調査報告】
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