(57)【要約】  本発明は、移植に対する寛容の誘導における使用のための、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の、治療および／または予防における使用のための、組織の修復および／または組織の再生を促進するために使用するための、または、代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善するために使用するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む改変された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であって、前記ＣＡＲが、ＳＴＡＴ５関連モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフとを含むエンドドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む改変された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植に対する寛容性の誘導における使用のための、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療および／または予防における使用のための、組織の修復および／または組織の再生を促進するために使用するための、または、代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善するために使用するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む改変された（engineered）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であって、前記ＣＡＲが、ＳＴＡＴ５関連モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフとを含むエンドドメインを含む、改変された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）。
【請求項２】
Ｔｒｅｇが、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇである、請求項１に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項３】
前記ＣＡＲエンドドメインが、ＳＴＡＴ３関連モチーフを含まない、請求項１または２に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項４】
前記ＣＡＲエンドドメインが、アミノ酸配列ＹＸＸＱ（配列番号５２）を含まない、請求項１または２に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項５】
前記ＣＡＲエンドドメインが、２個以上のＳＴＡＴ５関連モチーフを含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項６】
１個以上のＳＴＡＴ５関連モチーフが、インターロイキン受容体（ＩＬ）受容体エンドドメイン由来である、先行する請求項のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項７】
前記１個以上のＳＴＡＴ５関連モチーフは、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ７Ｒα、ＩＬ−３Ｒβ（ＣＳＦ２ＲＢ）、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１７Ｒβ、エリスロポエチン受容体、トロンボポエチン受容体、成長ホルモン受容体、およびプロラクチン受容体由来である、請求項１〜６のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項８】
前記ＳＴＡＴ５関連モチーフは、アミノ酸モチーフＹＸＸＦ／Ｌ（配列番号８）を含み、Ｘは任意のアミノ酸である、先行する請求項のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項９】
前記ＳＴＡＴ５関連モチーフは、アミノ酸モチーフＹＣＴＦ（配列番号９）、ＹＦＦＦ（配列番号１０）、ＹＬＳＬ（配列番号１１）、および／またはＹＬＳＬＱ（配列番号１２）の１個以上を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１０】
前記ＳＴＡＴ５関連モチーフは、アミノ酸モチーフＹＬＳＬＱ（配列番号１２）を含む、請求項９に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１１】
前記エンドドメインは、アミノ酸モチーフＹＬＳＬＱ（配列番号１２）を含む第１のＳＴＡＴ５関連モチーフと、アミノ酸モチーフＹＣＴＦ（配列番号９）またはＹＦＦＦ（配列番号１０）を含む第２のＳＴＡＴ５関連モチーフとを含む、請求項１０に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１２】
前記エンドドメインは、下記ＳＴＡＴ５関連モチーフ：ＹＬＳＬＱ（配列番号１２）、ＹＣＴＦ（配列番号９）、およびＹＦＦＦ（配列番号１０）を含む、請求項１１に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１３】
前記ＪＡＫ結合モチーフが、ＪＡＫ−１結合モチーフである、先行する請求項のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１４】
前記ＪＡＫ１結合モチーフが、インターロイキン受容体（ＩＬ）受容体エンドドメイン由来である、請求項１３に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１５】
前記ＪＡＫ１結合モチーフが、配列番号１３〜１９のいずれか１つとして示されるアミノ酸モチーフ、または、配列番号１３〜１９に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１６】
前記ＪＡＫ１結合モチーフが、配列番号１３として示されるアミノ酸モチーフであるか、または、配列番号１３に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体である、請求項１５に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１７】
前記ＣＡＲエンドドメインが、配列番号１として示されるＩＬ２Ｒβエンドドメイン、または、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１８】
前記ＣＡＲエンドドメインが、配列番号２３または２４として示される切断型ＩＬ２Ｒβエンドドメイン、または、配列番号２３または２４のいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項１９】
前記ＣＡＲエンドドメインが、ＪＡＫ３結合モチーフをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項２０】
前記ＪＡＫ３結合モチーフが、配列番号２５または２６、もしくは、配列番号２５または２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含む、請求項１９に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項２１】
前記ＣＡＲエンドドメインが、配列番号４５または５３、もしくは、配列番号４５または５３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含む、請求項１９または２０に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇ。
【請求項２２】
移植に対する寛容性の誘導における使用のための、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療および／または予防における使用のための、組織の修復および／または組織の再生を促進するために使用するための、または、代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善するために使用するための、請求項１〜２１のいずれか１項で定義される改変されたＴｒｅｇを含む医薬組成物。
【請求項２３】
移植に対する寛容を誘導する方法、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療および／または予防する方法、または組織の修復および／または組織の再生を促進するための方法、または、代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善するための方法であって、前記方法は、請求項１〜２０のいずれか１項で定義される改変されたＴｒｅｇ、または、請求項１〜２０のいずれか１項で定義される改変されたＴｒｅｇを含む医薬組成物を、対象に投与する工程を含む方法。
【請求項２４】
（ｉ）対象からＴｒｅｇ富化細胞サンプルを単離する、または得る工程と
（ｉｉ）ポリヌクレオチド、核酸コンストラクト、または請求項１〜２０のいずれか１項で定義されるＣＡＲをコードするベクターを、前記Ｔｒｅｇ細胞に形質導入または遺伝子導入する工程と、
（ｉｉｉ）前記対象に、（ｉｉ）からの前記細胞を投与する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
移植に対する寛容を誘導するための薬剤、移植の細胞性拒絶反応および／または液性拒絶反応を治療および／または予防するための薬剤、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患またはアレルギー疾患を治療および／または予防するための薬剤、または、組織の修復および／または組織の再生を促進するための薬剤、または、代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善するための薬剤の製造における、請求項１〜１９で定義された改変されたＴｒｅｇの使用。
【請求項２６】
対象が免疫抑制治療を受けている移植レシピエントである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物、請求項２３または２４に記載の方法、または請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
移植が、肝臓、腎臓、心臓、肺臓、膵臓、小腸、胃、骨髄、血管柄付複合組織移植、および皮膚の移植から選択される、請求項２６に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物、請求項２６に記載の方法、または請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
移植が、肝臓移植である、請求項２７に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物、請求項２７に記載の方法、または請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含み、
前記抗原結合ドメインは、前記移植された肝臓に存在するが前記レシピエントには存在しないＨＬＡ抗原（ＮＴＣＰなど）の肝臓特異的な抗原、または、拒絶や組織炎症の間に発現が増加する抗原（ＣＣＬ１９、ＭＭＰ９、ＳＬＣ１Ａ３、ＭＭＰ７、ＨＭＭＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＧＰＮＭＢ、ＰＬＡ２Ｇ７、ＣＸＣＬ９、ＦＡＢＰ５、ＧＢＰ２、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１０、ＵＢＤ、ＣＤ２７、ＣＤ４８、ＣＸＣＬ１１など）から選択される抗原と特異的に結合できる抗原結合ドメインを含む、請求項２８に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物、請求項２８に記載の方法、または請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記ＣＡＲは、移植ドナーに存在するが移植レシピエントには存在しないＨＬＡ抗原と特異的に結合できる抗原結合ドメインを含む、請求項２９に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物、請求項２９に記載の方法、または請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記抗原がＨＬＡ−Ａ２である、請求項３０に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物、請求項３０に記載の方法、または請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記ＣＡＲは、配列番号３４、または配列番号３４に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含む抗原結合ドメインを含む、請求項３１に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物、請求項３１に記載の方法、または請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記自己免疫疾患またはアレルギー疾患は、乾癬や皮膚炎（たとえば、アトピー性皮膚炎）などの炎症性皮膚病；炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎など）に関連した反応；皮膚炎；食物アレルギー、湿疹や喘息などのアレルギー症状；慢性関節リュウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループス腎炎、皮膚ループスを含む）；真性糖尿病（たとえば、Ｉ型真性糖尿病や、インスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症や若年型糖尿病から選択される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用のための改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物、方法、または使用。
【請求項３４】
ＳＴＡＴ５関連モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフとを含むが、ＳＴＡＴ３関連モチーフを含まないエンドドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項３５】
ＳＴＡＴ５関連モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフとを含むが、アミノ酸配列ＹＸＸＱ（配列番号５２）を含まないエンドドメインを含む、ＣＡＲ。
【請求項３６】
ＳＴＡＴ５関連モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフと、ＪＡＫ３結合モチーフとを含むエンドドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項３７】
前記エンドドメインが、ＳＴＡＴ３関連モチーフを含まない、請求項３６に記載のＣＡＲ。
【請求項３８】
前記エンドドメインは、アミノ酸配列ＹＸＸＱ（配列番号５２）を含まない、請求項３６に記載のＣＡＲ。
【請求項３９】
前記ＪＡＫ３結合モチーフが、配列番号２５または２６、もしくは、配列番号２５または２６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含む、請求項３６〜３８のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項４０】
前記ＣＡＲエンドドメインが、配列番号４５または５３、もしくは、配列番号４５または５３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含む、請求項３６〜３９のいずれかに記載のＣＡＲ。
【請求項４１】
請求項３４〜４０のいずれかに記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項３４〜４０のいずれかに記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、または請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含む、改変されたＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ。
【請求項４３】
請求項４２に記載の改変されたＴｒｅｇを作製する方法方法であって、
（ｉ）対象から細胞含有サンプルを単離する、または細胞含有サンプルを得る工程、および
（ｉｉ）前記細胞含有サンプルに、ポリヌクレオチド、核酸、または前記ＣＡＲをコードするベクターを形質導入または遺伝子導入し、改変された細胞の集団を提供する工程を含み、
前記細胞含有サンプルが、Ｔｒｅｇを含み、および／または、前記方法の工程（ｉｉ）の前またはその後に、Ｔｒｅｇを富化する、および／または、Ｔｒｅｇを前記細胞含有サンプルから生成する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変された（engineered）制御性Ｔ細胞と、かかる細胞の治療目的の使用とに関する。特に、本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の獲得が限られている微小環境から影響を受けにくい、改変された制御性Ｔ細胞に関する。
【０００２】
発明の背景
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）は、細胞変性免疫応答を制御し、免疫寛容の維持に必須である、抑制機能を有する免疫細胞である。Ｔｒｅｇの抑制性は、たとえば、炎症性障害や自己免疫疾患、移植などにおける免疫介在性の器官損傷を改善および／または防止するためなど、治療目的に利用できる。Ｔｒｅｇ免疫療法では、通常、Ｔｒｅｇを単離し、培養し、増殖させ、その後、患者へ注入する。このプロセスの一部として、Ｔｒｅｇの生存率や機能を改善するために、および／または特定の抗原に対する反応性をＴｒｅｇに付与するために、サイトカイン、薬品、他の細胞や抗体と共にＴｒｅｇを培養してもよい。これら目的は、たとえばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を介して、所定の抗原を標的とするようにＴｒｅｇを遺伝子改変することにより、達成できる。
【０００３】
増殖因子インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、Ｔｒｅｇの恒常性（発生、増殖、生存）、およびその抑制機能と表現型の安定性に、必須である。活性化された通常Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）は、インビボでのＩＬ−２の主要な発生源である。一方で、ＴｒｅｇはＩＬ−２を産生することができず、微小環境に存在するＴｃｏｎが産生したＩＬ−２への傍分泌アクセスに依存している。
【０００４】
ＩＬ−２の獲得は、インビトロで増殖されて患者に移植されるＴｒｅｇの治療効果への影響が大きい。これは、１）インビトロの増殖プロトコルは、概して、高濃度のＩＬ−２を必要とし、このためＴｒｅｇはこのサイトカインへの依存度が高く、２）免疫抑制剤投与の結果、患者体内でＩＬ−２の濃度が低下することが多く、３）炎症組織の微小組織内では、ＩＬ−２へのアクセスが限られていることが多いためである。炎症を起こしている肝臓ではＩＬ−２のレベルが下がることが知られており、カルシニューリン阻害薬の常用でさらにそれが悪化し、ＴｃｏｎがＩＬ−２を生成する能力を実質的に減少させることを考えると、肝臓移植は特に困難な徴候を示す。低用量の外因性ＩＬ−２の投与は、カルシニューリン阻害薬によって誘発されるＴｒｅｇ機能障害を回復させ、Ｔｒｅｇの肝臓における蓄積を促進する。しかしながら、低用量Ｔｒｅｇの治療目的の使用については、同時にＴｃｏｎを活性化させ、これが組織損傷を助長しうる危険性が懸念される。
【０００５】
ＷＯ２０１７／２１８８５０は、産生ＩＬ−２シグナルを提供するために、恒常的にＳＴＡＴ５を発現するＴｒｅｇを改変することを記載している。しかし、このアプローチについてもいくつかの問題点が予想できる。恒常的にＳＴＡＴ５を発現すると、改変されたＴｒｅｇが非特異的に強力に免疫抑制するかもしれず、改変されたＴｒｅｇの増殖率が高いため、内在性Ｔｒｅｇプールを過剰増殖させ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーを減少させ、その結果、自己免疫ができうるという危険性がある。最後に、ＳＴＡＴ５における変異がＴ細胞前リンパ球性白血病を促進することが知られており、また、ＳＴＡＴ５が多くの癌で恒常的に活性化されることを考えると、これら改変されたＴｒｅｇは形質転換の危険性をもたらしうる。
【０００６】
したがって、ＩＬ−２の獲得が限られている微小環境から影響を受けにくい、改変された制御性Ｔ細胞を生成するアプローチが必要であり、免疫抑制剤を投与された対象の中で増殖し生存する改変されたＴｒｅｇの効力を改善するアプローチが必要であることには、変わりが無い。
【０００７】
発明の概要
本願の発明者らは、所定の抗原へのＴｒｅｇの結合の際に産生ＩＬ−２シグナルを提供することができる、改変された（engineered）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を開発した。このように、本発明の改変されたＴｒｅｇは、内因性ＩＬ−２の投与を必要とせず、産生ＩＬ−２シグナルを抗原特異的な方法で提供することにより、養子移入されたＴｒｅｇ（adoptively transferred Treg）の高ＩＬ−２依存性に関連する問題に対処する。
【０００８】
このように、第一態様において、本発明は、移植に対する寛容の誘導における使用のための、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患の治療および／または予防における使用のための、組織の修復および／または組織の再生を促進するために使用するための、または代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善する（ameliorate）ために使用するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む改変されたＴｒｅｇであって、前記ＣＡＲが、ＳＴＡＴ５関連モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフとを含むエンドドメインを含む、改変されたＴｒｅｇを提供する。
【０００９】
他の態様において、本発明は、移植に対する寛容の誘導における使用のための、ＧｖＨＤ、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患の治療および／または予防における使用のための、組織の修復および／または組織の再生を促進するために使用するための、または代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善するために使用するための、本発明の第一の態様に係る改変されたＴｒｅｇを含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、移植に対する寛容を誘導する方法、ＧｖＨＤ、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患を治療および／または予防する方法、または組織の修復および／または組織の再生を促進するための方法、または代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善するための方法に関し、前記方法は、本発明に係る改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を、対象に投与する工程を含む。
【００１１】
本発明はまた、移植に対する寛容を誘導するための薬剤、移植の細胞性拒絶反応および／または液性拒絶反応（cellular and/or humoral transplant rejection）を治療および／または予防するための薬剤、ＧｖＨＤ、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患を治療および／または予防するための薬剤、または組織の修復および／または組織の再生を促進するための薬剤、または代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善するための薬剤の製造における、本発明にかかる改変されたＴｒｅｇの使用を提供する。
【００１２】
好適には、対象は移植レシピエントであってもよく、本発明は移植組織（たとえば移植臓器）への寛容の誘導に関する。特に、対象は免疫抑制治療を受けている移植レシピエントであればよい。
【００１３】
他の態様では、本発明は、ＳＴＡＴ５関連モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフとを含むが、ＳＴＡＴ３関連モチーフを含まないエンドドメインを含むＣＡＲを提供する。
【００１４】
好適には、前記ＣＡＲエンドドメインは、アミノ酸配列ＹＸＸＱ（配列番号５２）を含まない。好適には、前記ＣＡＲエンドドメインのＩＬ２Ｒβ部分は、アミノ酸配列ＹＸＸＱ（配列番号５２）を含まない。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、ＳＴＡＴ５関連モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフと、ＪＡＫ３結合モチーフとを含むエンドドメインを含むＣＡＲを提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドと、本発明のＣＡＲをコードするベクターとを提供する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、本発明のＣＡＲを含む改変されたＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ、および治療に使用するための本発明のＣＡＲを含む、改変されたＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを提供する。
【００１８】
本発明は従って、同種抗原に対してＣＡＲが結合する時にのみ、ＣＡＲがＳＴＡＴ５介在性の生存促進性シグナルをＴｒｅｇへ提供する、ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇを提供する。特に、抗原認識後、当該ＣＡＲが密集し、前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）を介して、改変されたＴｒｅｇへシグナルが伝達される。当該ＣＡＲが、ＳＴＡＴ５関連モチーフとＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフとを含むため、当該ＣＡＲの密集によってＳＴＡＴ５ならびにＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２が集められ活性化され、微小環境におけるＩＬ−２の獲得に依存することなく、抗原特異的に、前記改変されたＴｒｅｇの機能と生存とを向上する信号を提供する。
【００１９】
本発明の前記改変されたＴｒｅｇは、対象のＴ細胞母集団（general T cell population）と比較して抗原を認識した後に、前記改変されたＣＡＲ−Ｔｒｅｇに生存有意性を提供することにおいて、特に効果があればよい。特に、免疫抑制剤を使用してＩＬ−２の獲得が減少する状況、たとえば移植などの状況で、当該ＣＡＲ−ＴｒｅｇのＳＴＡＴ５シグナリングは、それが無ければ不利な微小環境において、本発明の細胞に対するさらなる生存と機能の効果を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１−本発明のＣＡＲコンストラクトを示す図
【図２】図２−抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲコンストラクトの設計例ＩＬ２Ｒエンドドメインの様々な組み合わせを含む抗ＨＬＡ．Ａ２ ＣＡＲコンストラクトの例の概略図。（Ａ）ｄＣＡＲコンストラクト：ＨＬＡ．Ａ２ ｓｃＦｖ抗原認識ドメイン；ＣＤ２８ヒンジドメイン；ＣＤ２８ＴＭおよびｅＧＦＰ。（Ｂ）ＣＤ２８ｚコンストラクト：ＨＬＡ．Ａ２ ｓｃＦｖ抗原認識ドメイン；ＣＤ２８ヒンジドメイン；ＣＤ２８ＴＭ；ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン；ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインおよびｅＧＦＰ。（Ｃ）ＩＬ２Ｒコンストラクト１：ＨＬＡ．Ａ２ ｓｃＦｖ抗原認識ドメイン；ＣＤ２８ヒンジドメイン；ＣＤ２８ＴＭ；ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン；切断型（truncated）ＩＬ２ＲＢエンドドメイン；ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインおよびｅＧＦＰ。（Ｄ）ＩＬ２Ｒコンストラクト１：ＨＬＡ．Ａ２ ｓｃＦｖ抗原認識ドメイン；ＣＤ２８ヒンジドメイン；ＣＤ２８ＴＭ；ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン；切断型ＩＬ２ＲＢ；切断型ＩＬ２ＲＢエンドドメイン；ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインおよびｅＧＦＰ。（Ｅ）ＩＬ２Ｒコンストラクト１：ＨＬＡ．Ａ２ ｓｃＦｖ抗原認識ドメイン；ＣＤ２８ヒンジドメイン；ＣＤ２８ＴＭ；ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン；切断型ＩＬ２ＲＢエンドドメイン；ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメイン；ＦＰ２Ａ切断ドメイン（cleavage domain）およびｅＧＦＰ。
【図３】図３−抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの生成抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの生成および増殖をしめす概略図。（Ａ）単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏｗ細胞を、単離し抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。活性化の３日後、Ｔｒｅｇを、ＨＬＡ．Ａ２−ＣＡＲとＧＦＰレポーター遺伝子とを含むレンチウイルスで形質導入した。新鮮な培地と１０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を２日毎に加えた。形質導入されたＴｒｅｇと形質導入されていないＴｒｅｇとを１０日間培養し、ＧＦＰを測定して形質導入の効果を調べた。Ｔｒｅｇを、新鮮な抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用してさらに増殖させた。（Ｂ）形質導入されていないＴｒｅｇまたは様々なＣＡＲコンストラクトで形質導入したＴｒｅｇの、活性化１０日目での倍率変化（fold change）−増殖。
【図４Ａ】図４−抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒコンストラクトの形質導入の効果の経時的定量化ＣＡＲコンストラクトが形質導入されていないＴｒｅｇと、ＣＡＲコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇとについて、ＧＦＰ発現を、細胞活性化後の異なる時点で解析した。（Ａ）形質導入後７日のＨＬＡ−Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲ ＴｒｅｇからのＧＦＰ発現の典型的な等高線プロット（contour plot）。
【図４Ｂ】（Ｂ）形質導入後７日の生存ＣＤ４＋細胞中のＧＦＰ+ ＣＡＲ Ｔｒｅｇの定量化。
【図４Ｃ】（Ｃ）ＨＬＡ−Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲ ＴｒｅｇからのＧＦＰ発現の経時的定量化。
【図５Ａ】図５−形質導入されたＴｒｅｇでの抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲコンストラクトの細胞表面発現の定量化形質導入されていないＴｒｅｇでの、および形質導入されたＴｒｅｇでの、ＣＡＲコンストラクトの膜発現を、ＰＥコンジュゲートＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＣＩＮＧＶＣＷＴＶデキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ、デンマーク、コペンハーゲン）によって解析した。（Ａ）形質導入後７日のＧＦＰ＋Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ＋ ＣＡＲ Ｔｒｅｇの典型的な等高線プロット。
【図５Ｂ】（Ｂ）形質導入後７日のＧＦＰ＋Ｔｒｅｇ中のＤｅｘｔｒａｍｅｒ＋細胞の定量化。
【図６−１】図６−ポリクローナル細胞増殖後のＣＡＲ Ｔｒｅｇの表現型の特性評価抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズおよびＩＬ−２の存在下で１５日間、Ｔｒｅｇを培養し増殖させた。Ｔｒｅｇ関連マーカーＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＣＴＬＡ４、およびＴＩＧＩＴを、形質導入されていないＴｒｅｇ上と、形質導入されたＴｒｅｇ上とでＦＡＣＳにより解析し、培養１５日目の表現型の系統安定性を調査した。
【図６−２】図６のつづき
【図７Ａ−１】図７−抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲ Ｔｒｅｇの抗原特異性の評価形質導入されていないＴｒｅｇと、形質導入されたＴｒｅｇとを、異なる刺激の存在下で１８時間培養した。ＣＤ６９とＣＤ１３７活性化マーカーを解析し、特異的な細胞活性化と非特異的な細胞活性化とを調べた。（Ａ）ＨＬＡ．Ａ１またはＨＬＡ．Ａ２分子を形質導入したＫ５６２細胞との培養に応じたＣＤ６９の発現を示す典型的な等高線プロット。形質導入されたＴｒｅｇを選択するためにＧＦＰシグナルを使用した。
【図７Ａ−２】図７Ａのつづき
【図７Ｂ】（Ｂ）培地のみでの培養（刺激無し）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた培養（非特異的刺激）、Ｋ５６２−ＨＬＡ．Ａ１細胞およびＫ５６２−ＨＬＡ．Ａ２細胞を用いた培養の１８時間後、ＴｒｅｇでのＣＤ６９とＣＤ１３７の発現の定量化。
【図７Ｃ】（Ｃ）ＨＬＡ．Ａ１細胞株およびＨＬＡ．Ａ２Ｂ細胞株と１８時間培養した後のＴｒｅｇでのＣＤ６９の発現を示す典型的なヒストグラム。異なる細胞対細胞比を使用した。
【図８Ａ−１】図８−ＩＬ２Ｒ ＣＡＲシグナリングの指標としてのＳＴＡＴ５リン酸化解析形質導入されたＣＡＲ Ｔｒｅｇを、ＩＬ２を含まない培地に一晩置いた。培地のみでの培養、１０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２での培養、ＨＬＡ．Ａ２−Ｉｇ系人工ＡＰＣ（ＤＯＩ：１０．３７９１／２８０１に記載のプロトコルに従い作製）の存在下での培養の１０分後および１２０分後、ＦＡＣＳ解析によりＴｒｅｇのＳＴＡＴ５リン酸化を調べた。（Ａ）培地のみの培養、１：１比率のＨＬＡ．Ａ２ビーズとの培養、１０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２での培養の１０分後の形質導入されたＣＡＲ−ＴｒｅｇでのＧＦＰおよびｐｈｏｓｐｈｏＳＴＡＴ５の発現を示す典型的な等高線プロット。
【図８Ａ−２】図８Ａのつづき
【図８Ｂ】１：１比率のＨＬＡ．Ａ２ビーズと、または培地のみ（刺激無し）で１２０分間培養したＴｒｅｇのＳＴＡＴ５のリン酸化を示すヒストグラム。
【図９Ａ】図９−ＩＬ−２の非存在下での非特異的活性化およびＨＬＡ．Ａ２特異的活性化後のＴｒｅｇ生存の評価異なるコンストラクトのＣＡＲ形質導入Ｔｒｅｇｓを、抗ＣＤ３／２８活性化ビーズおよびＫ５６２．Ａ２発現細胞と、ＩＬ−２の非存在下で培養した。ＦＡＣＳ解析により活性化の７日後に細胞の生存を調べた。（Ａ）ＩＬ−２を用いない活性化後７日目の生存率色素染色に基づくＧＦＰ+細胞の細胞生存率を示すＣＡＲ−Ｔｒｅｇｓの典型的なヒストグラム。
【図９Ｂ】（Ｂ）ＩＬ−２の非存在下で抗ＣＤ３／２８ビーズおよびＫ５６２−ＨＬＡ．Ａ２細胞との７日間の培養後にＧＦＰ+Ｔｒｅｇに生存している細胞の率（*p<0.05、Tukey's post hoc correctionを使用したＡＮＯＶＡ分析）。
【図１０】図１０−Ｔｒｅｇ抑制能試験：Ｂ細胞に対する共刺激分子の調節（modulation）の解析によるＴｒｅｇの免疫調節機能の評価Ｔｒｅｇとの共存培養後の、Ｂ細胞のＣＤ８０およびＣＤ８６発現を解析し、抗原提示細胞での共刺激分子の発現を低減するＴｒｅｇの能力を評価した。一定数の生きているＡ２発現Ｂ細胞（２０Ｋ／ｗｅｌｌ）を滴定による数のＴｒｅｇ製品（Ａ２ネガティブドナー）（２００、１００、５０、２５、１２．５Ｋ）と一晩共存培養した。Ｂ細胞でのＣＤ８６およびＣＤ８０共刺激マーカーのＦＡＣＳ解析。
【００２１】
発明の詳細な説明
改変された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）
本明細書における「改変された細胞」は、細胞によって自然にコードされたわけではないポリヌクレオチドを含むか、または発現するように修飾された（modified）細胞を意味する。細胞を改変する方法は、当該技術分野で周知であり、たとえば、細胞の遺伝子組み換え（genetic modification）があり、それは、たとえば、レトロウイルス形質導入またはレンチウイルス形質導入などの形質導入、リポフェクション法、ポリエチレングリコール法、リン酸カルシウム法およびエレクトロポレーション法などの遺伝子導入（ＤＮＡまたはＲＮＡの一過性形質転換など）によるものであるが、これらに限定されるわけではない。核酸配列を細胞に導入するために、いずれかの適切な方法が使用されればよい。本発明によれば、核酸を導入するために両親媒性細胞浸透性ペプチドなどの非ウイルス性技術を使用してもよい。
【００２２】
したがって、本明細書に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、対応する未修飾の細胞により自然に発現されてはいない。好適には、改変された細胞は、たとえば形質導入または遺伝子導入により修飾された細胞である。好適には、改変された細胞は、たとえば形質導入または遺伝子導入によって、修飾またはゲノム修飾された細胞である。好適には、改変された細胞は、レトロウイルス形質導入によって、修飾またはゲノム修飾された細胞である。好適には、改変された細胞は、レンチウイルス形質導入によって、修飾またはゲノム修飾された細胞である。
【００２３】
本明細書において、「導入された」という用語は、外来ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入するための方法のことである。本明細書において、「導入された」という用語は、形質導入法、遺伝子導入法の両方を含む。遺伝子導入は、非ウイルス法により核酸を細胞内に導入するプロセスである。形質導入は、ウイルスベクターを介して細胞に外来のＤＮＡまたはＲＮＡを導入するプロセスである。ウイルスベクターを用いた形質導入や、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いた遺伝子導入などの多数の手段のうちのひとつによって、本明細書に記載のＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより、本発明に係る改変された細胞が生成されてもよい。本明細書に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを導入する前に、または後に、たとえば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理により、または抗ＣＤ３モノクローナル抗体と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体とでの処理により、細胞を活性化および／または増殖させてもよい。また、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体が、ＩＬ−２との組み合わせで存在するところで、Ｔｒｅｇを増殖してもよい。好適には、ＩＬ−２はＩＬ−１５と置き換えられてもよい。Ｔｒｅｇ増殖プロトコルで使用されてもよい別の成分としては、ラパマイシン、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）およびＴＧＦβがあるが、これらに限定されるわけではない。本明細書において、「活性化される」とは、細胞が刺激されて、細胞の増殖が起こることを意味する。本明細書において、「増殖される」とは、細胞または細胞の集団の増殖が誘導されることを意味する。細胞の集団の増殖は、たとえば、集団に存在する細胞の数をカウントすることにより測定してもよい。細胞の表現型は、フローサイトメトリーなど当該技術分野で周知の方法によって判定してもよい。
【００２４】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）は、細胞変性免疫応答を制御し、免疫寛容の維持に必須である、免疫抑制機能を有する免疫細胞である。
【００２５】
本明細書において、Ｔｒｅｇという用語は、免疫抑制機能を有するＴ細胞のことである。
【００２６】
好適には、免疫抑制機能とは、病原体、同種抗原、または自己抗原など刺激に応答する免疫系によって促進される生理的な細胞の現象が多数ある内の１つ以上を低減または阻害するＴｒｅｇの能力を表してもよい。かかる現象の例には、通常Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）の増殖、および炎症性サイトカインの分泌などがある。かかる現象はいずれも、免疫応答の強さの指標として使用してもよい。Ｔｒｅｇの存在下でＴｃｏｎｖによる免疫応答が相対的に弱いことは、Ｔｒｅｇの免疫応答を抑制する能力を示すといえる。たとえば、サイトカインの分泌が相対的に低下することは、免疫応答の弱まりを示し、したがって、Ｔｒｅｇの免疫応答を抑制する能力を示す。Ｔｒｅｇは、Ｂ細胞、樹状細胞およびマクロファージなど抗原提示細胞（ＡＰＣ）の共刺激分子の発現を調節することにより、免疫応答を抑制することもできる。ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現レベルは、共存培養後のインビトロでの活性化されたＴｒｅｇの抑制能を調査するために使用できる。
【００２７】
免疫応答の強度の指標を測定し、それによってＴｒｅｇの抑制能を測定するためのアッセイが、当該技術分野で周知である。特に、抗原特異的なＴｃｏｎｖ細胞は、Ｔｒｅｇと共存培養してもよく、対応する抗原のペプチドを前記共存培養に加えてＴｃｏｎｖ細胞からの応答を刺激してもよい。Ｔｃｏｎｖ細胞の増殖の度合い、および／または前記ペプチドの追加に応答してＴｃｏｎｖ細胞が分泌したサイトカインＩＬ−２の量を、共存培養したＴｒｅｇの抑制能の指標として使用してもよい。
本発明のＴｒｅｇと共存培養された抗原特異的なＴｃｏｎｖ細胞の増殖は、本発明のＴｒｅｇの非存在下で培養された同じＴｃｏｎｖ細胞の増殖と比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、９０％、９５％または９９％少なくてもよい。
【００２８】
本発明のＴｒｅｇと共存培養された抗原特異的なＴｃｏｎｖ細胞は、本発明のＴｒｅｇの非存在下で培養された対応するＴｃｏｎｖ細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％少ないエフェクターサイトカインを発現してもよい。
エフェクターサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３から選択されてもよい。
好適には、エフェクターサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＦＮ−γから選択されてもよい。
【００２９】
好適には、Ｔｒｅｇは、マーカーＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦＯＸＰ３（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+）を発現するＴ細胞である。「ＦＯＸＰ３」は、フォークヘッドボックスＰ３タンパク質の略称である。ＦＯＸＰ３は、転写因子のＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーであり、制御性Ｔ細胞の発生（development）と機能において調節経路のマスターレギュレーターとして機能する。
【００３０】
Ｔｒｅｇｓはまた、ＣＴＬＡ−４（細胞障害性Ｔリンパ球関連分子４）またはＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体）を発現する。Ｔｒｅｇ細胞は末梢血、リンパ節、および組織に存在し、胸腺由来の天然のＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）細胞と、末梢で生成され誘導されたＴｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞とがある。
【００３１】
好適には、表面タンパク質ＣＤ１２７の非存在下で細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ２５を使用して、または低レベルで発現した表面タンパク質ＣＤ１２７と細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ２５との組み合わせを使用して（ＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７-ｏｒ ＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７low）、Ｔｒｅｇを同定してもよい。かかるマーカーをＴｒｅｇの同定のために使用することは、当該技術分野において周知であり、たとえばＬｉｕら（ＪＥＭ；２００６；２０３；７（１０）；１７０１−１７１１）に記載されている。
【００３２】
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+ Ｔ細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７- Ｔ細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+ＣＤ１２７-/lowＴ細胞であってもよい。
Ｔｒｅｇは、天然Ｔｒｅｇ（natural Treg）または胸腺由来Ｔｒｅｇ（thymus-derived Treg）であってもよいし、適応性Ｔｒｅｇ（adaptive Treg）または末梢誘導Ｔｒｅｇ（peripherally-derived Treg）であってもよいし、またはインビトロ誘導Ｔｒｅｇ（in vitro-induced Treg）であってもよい（Abbas, A.K., et al., 2013. Nature immunology, 14(4), p.307-308）。
【００３３】
好適には、Ｔｒｅｇは、天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）であってもよい。本明細書において、「天然Ｔｒｅｇ」という用語は、胸腺由来Ｔｒｅｇという意味である。天然Ｔｒｅｇは、ＣＤ４+ＣＤ２５+ＦＯＸＰ３+Ｈｅｌｉｏｓ+ニューロピリン１+である。ｉＴｒｅｇと比較して、ｎＴｒｅｇは、ＰＤ−１（プログラム細胞死−１、ｐｄｃｄ１）、ニューロピリン１（Ｎｒｐ１）、Ｈｅｌｉｏｓ（Ｉｋｚｆ２）、およびＣＤ７３を高発現する。Ｈｅｌｉｏｓタンパク質またはニューロピリン１（Ｎｒｐ１）の発現にそれぞれ基づいて、ｎＴｒｅｇをｉＴｒｅｇｓから区別してもよい。
【００３４】
ＴｒｅｇはＴｒｅｇ特異的な脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を有してもよい。ＴＳＤＲは、Ｆｏｘｐ３の発現を制御する、重要なメチル化感受性のあるエレメントである（Polansky, J.K., et al.,2008. European journal of immunology, 38(6), pp.1654-1663）。
【００３５】
さらに好適なＴｒｅｇの例としては、Ｔｒ１細胞（Ｆｏｘｐ３を発現せず、ＩＬ−１０を高産生する）；ＣＤ８+ＦＯＸＰ３+ Ｔ細胞；およびγδ ＦＯＸＰ３+ Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００３６】
細胞マーカーの存在を判定する方法は、当該技術分野において周知であり、たとえばフローサイトメトリーがある。
【００３７】
好適には、Ｔｒｅｇなどの細胞は、対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。好適には、ＰＢＭＣが得られる対象は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。好適には、前記細胞は、改変されたＴｒｅｇが投与される対象に適合（たとえば、ＨＬＡ適合）しているか、または、対象自身のものである。好適には、治療される対象は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。前記細胞は、患者本人の末梢血（第一者）から、またはドナー末梢血（第二者）由来の造血性幹細胞移植の環境において、または無関係のドナー（第三者）由来の末梢血からのいずれかで、エクスビボ（生体外）で生成されてもよい。好適には、前記細胞は、改変されたＴｒｅｇが投与される対象自身のものである。
【００３８】
好適には、Ｔｒｅｇは、対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。好ましい実施形態において、Ｔｒｅｇは、対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離され、治療される対象に適合しているか、または、対象自身のものである。
【００３９】
好適には、前記Ｔｒｅｇは、治療される対象から単離される。
【００４０】
好適には、前記Ｔｒｅｇは、Ｔｒｅｇの集団の一部である。好適には、Ｔｒｅｇの集団は、Ｔｒｅｇが少なくとも７０％であり、たとえばＴｒｅｇが少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％である。かかる集団を、「富化されたＴｒｅｇ集団」と称してもよい。
【００４１】
いくつかの態様で、Ｔｒｅｇは、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の、Ｔｒｅｇへのエクスビボ分化から由来してもよい。本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、Ｔｒｅｇへの分化前または後に誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞へ導入されてもよい。
【００４２】
本明細書において、「通常Ｔ細胞」またはＴｃｏｎは、αβ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、分化抗原群４（ＣＤ４）または分化抗原群８（ＣＤ８）であってもよい共受容体とを発現し、免疫抑制機能をもたないＴリンパ球細胞を意味する。通常Ｔ細胞は末梢血、リンパ節、および組織に存在する。好適には、ウイルスベクターを用いた形質導入や、同じまたは異なるベクター上でＤＮＡまたはＲＮＡを用いた遺伝子導入などの多数の手段のうちのひとつによって、本明細書に記載のＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡに加えてＦＯＸＰ３をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより、改変されたＴｒｅｇが生成されてもよい。または、改変されたＴｒｅｇは、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βの存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５−ＦＯＸＰ３−細胞のインビトロ培養によってＴｃｏｎから生成されてもよい。
【００４３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書における「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」は、抗原特異性を細胞（たとえばＴｒｅｇ）に付与できる改変された受容体のことである。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ−細胞受容体、またはキメラ免疫受容体として知られている。好ましくは、本発明のＣＡＲは、細胞外抗原特異的標的領域と、膜貫通ドメインと、場合によっては１個以上の共刺激ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメインとも称される）とを含む。
【００４４】
ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを、たとえばレトロウイルスベクターを使用して、Ｔｒｅｇへ導入してもよい。このように、多数の抗原特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入により生成されうる。ＣＡＲが標的抗原と結合すると、その結果、ＣＡＲが発現するＴｒｅｇに活性化シグナルが伝達される。このように、ＣＡＲは、改変されたＴｒｅｇの特異性を、標的抗原を発現する細胞へ向ける。
【００４５】
細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
当該ＣＡＲは、ＳＴＡＴ５関連モチーフと、ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフとを含むエンドドメインを含む。
【００４６】
「シグナル伝達性転写因子５」（ＳＴＡＴ５）は、ＩＬ−２シグナリング経路に関与する転写因子であり、ＦＯＸＰ３、ＩＬ２ＲＡおよびＢＣＬＸＬなどの遺伝子の発現を促進することによって、Ｔｒｅｇの機能、安定性、および生存において鍵となる役割を果たす。機能し、かつ核移行するためには、ＳＴＡＴ５はリン酸化する必要がある。ＩＬ−２ライゲーションの結果、ＩＬ−２Ｒβ鎖およびＩＬ−２Ｒγ鎖のそれぞれに存在する特異的なシグナル伝達ドメインを介してＪａｋ１／Ｊａｋ２およびＪａｋ３キナーゼを活性化することにより、ＳＴＡＴ５がリン酸化する。Ｊａｋ１（またはＪａｋ２）は、Ｊａｋ３を必要とせずにＳＴＡＴ５をリン酸化できるが、Ｊａｋ１／Ｊａｋ２とＪａｋ３との両方のトランスリン酸化によりＳＴＡＴ５の活性を増加することができ、これにより活性が安定する。
【００４７】
本明細書における「ＳＴＡＴ５関連モチーフ」とは、チロシンを含みＳＴＡＴ５ポリペプチドと結合することのできるアミノ酸モチーフのことである。タンパク質−タンパク質相互作用を判定するための当該技術分野において周知の方法を用いて、関連モチーフがＳＴＡＴ５と結合できるかどうか判定してもよい。たとえば、共免疫沈降の後にウエスタンブロットを行ってもよい。
【００４８】
好適には、ＣＡＲエンドドメインは、本明細書において定義された２個以上のＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでもよい。たとえば、ＣＡＲエンドドメインは、本明細書において定義された、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでもよい。好ましくは、ＣＡＲエンドドメインは、本明細書において定義された、２個または３個のＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでもよい。
【００４９】
好適には、前記ＳＴＡＴ５関連モチーフは、膜貫通タンパク質の細胞質ドメイン中に内在してもよい。たとえば、前記ＳＴＡＴ５関連モチーフは、インターロイキン受容体（ＩＬ）受容体エンドドメインまたはホルモン受容体由来であってもよい。
【００５０】
前記ＣＡＲエンドドメインは、ＳＴＡＴ５が下流成分であるインターロイキン受容体の鎖のいずれかから選択されたアミノ酸配列を含んでもよく、たとえば、ＩＬ−２受容体β鎖のアミノ酸番号２６６〜５５１（米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）標準配列（ＲＥＦＳＥＱ）：ＮＰ＿０００８６９．１、配列番号１）、ＩＬ−７Ｒα鎖のアミノ酸番号２６５〜４５９（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿００２１７６．２、配列番号２）、ＩＬ−９Ｒ鎖のアミノ酸番号２９２〜５２１（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿００２１７７．２、配列番号３）、ＩＬ−４Ｒα 鎖のアミノ酸番号２５７〜８２５（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰＪＤ００４０９．１、配列番号４）、ＩＬ−３Ｒ(鎖のアミノ酸番号４６１〜８９７（ＮＣＢＩ  ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿０００３８６．１、配列番号５）、またはＩＬ−１７Ｒ β鎖のアミノ酸番号３１４〜５０２（ＮＣＢＩ ＲＥＦＳＥＱ：ＮＰ＿０６１１９５．２、配列番号６）を含む細胞質ドメインが使用されてもよい。インターロイキン受容体鎖の細胞質ドメインの領域全体が使用されてもよい。
配列番号２−ＩＬ７ＲＡ（ＮＰ＿００２１７６．２のアミノ酸番号（ＡＡ）２６５〜４５９）
ＫＫＲＩＫＰＩＶＷＰＳＬＰＤＨＫＫＴＬＥＨＬＣＫＫＰＲＫＮＬＮＶＳＦＮＰＥＳＦＬＤＣＱＩＨＲＶＤＤＩＱＡＲＤＥＶＥＧＦＬＱＤＴＦＰＱＱＬＥＥＳＥＫＱＲＬＧＧＤＶＱＳＰＮＣＰＳＥＤＶＶＩＴＰＥＳＦＧＲＤＳＳＬＴＣＬＡＧＮＶＳＡＣＤＡＰＩＬＳＳＳＲＳＬＤＣＲＥＳＧＫＮＧＰＨＶＹＱＤＬＬＬＳＬＧＴＴＮＳＴＬＰＰＰＦＳＬＱＳＧＩＬＴＬＮＰＶＡＱＧＱＰＩＬＴＳＬＧＳＮＱＥＥＡＹＶＴＭＳＳＦＹＱＮＱ
配列番号７−ＩＬ７ＲＡ ２Ｙ切断型
ＫＫＲＩＫＰＩＶＷＰＳＬＰＤＨＫＫＴＬＥＨＬＣＫＫＰＲＫＮＬＮＶＳＦＮＰＥＳＦＬＤＣＱＩＨＲＶＤＤＩＱＡＲＤＥＶＥＧＦＬＱＤＴＦＰＱＱＰＩＬＴＳＬＧＳＮＱＥＥＡＹＶＴＭＳＳＦＹＱＮＱ
配列番号３−ＩＬ９Ｒ（ＮＰ＿００２１７７．２のＡＡ２９２〜５２１）
ＫＬＳＰＲＶＫＲＩＦＹＱＮＶＰＳＰＡＭＦＦＱＰＬＹＳＶＨＮＧＮＦＱＴＷＭＧＡＨＧＡＧＶＬＬＳＱＤＣＡＧＴＰＱＧＡＬＥＰＣＶＱＥＡＴＡＬＬＴＣＧＰＡＲＰＷＫＳＶＡＬＥＥＥＱＥＧＰＧＴＲＬＰＧＮＬＳＳＥＤＶＬＰＡＧＣＴＥＷＲＶＱＴＬＡＹＬＰＱＥＤＷＡＰＴＳＬＴＲＰＡＰＰＤＳＥＧＳＲＳＳＳＳＳＳＳＳＮＮＮＮＹＣＡＬＧＣＹＧＧＷＨＬＳＡＬＰＧＮＴＱＳＳＧＰＩＰＡＬＡＣＧＬＳＣＤＨＱＧＬＥＴＱＱＧＶＡＷＶＬＡＧＨＣＱＲＰＧＬＨＥＤＬＱＧＭＬＬＰＳＶＬＳＫＡＲＳＷＴＦ
配列番号４−ＩＬ４ＲＡ（ＮＰＪＤ００４０９．１のＡＡ２５７〜８２５）
ＫＩＫＫＥＷＷＤＱＩＰＮＰＡＲＳＲＬＶＡＩＩＩＱＤＡＱＧＳＱＷＥＫＲＳＲＧＱＥＰＡＫＣＰＨＷＫＮＣＬＴＫＬＬＰＣＦＬＥＨＮＭＫＲＤＥＤＰＨＫＡＡＫＥＭＰＦＱＧＳＧＫＳＡＷＣＰＶＥＩＳＫＴＶＬＷＰＥＳＩＳＶＶＲＣＶＥＬＦＥＡＰＶＥＣＥＥＥＥＥＶＥＥＥＫＧＳＦＣＡＳＰＥＳＳＲＤＤＦＱＥＧＲＥＧＩＶＡＲＬＴＥＳＬＦＬＤＬＬＧＥＥＮＧＧＦＣＱＱＤＭＧＥＳＣＬＬＰＰＳＧＳＴＳＡＨＭＰＷＤＥＦＰＳＡＧＰＫＥＡＰＰＷＧＫＥＱＰＬＨＬＥＰＳＰＰＡＳＰＴＱＳＰＤＮＬＴＣＴＥＴＰＬＶＩＡＧＮＰＡＹＲＳＦＳＮＳＬＳＱＳＰＣＰＲＥＬＧＰＤＰＬＬＡＲＨＬＥＥＶＥＰＥＭＰＣＶＰＱＬＳＥＰＴＴＶＰＱＰＥＰＥＴＷＥＱＩＬＲＲＮＶＬＱＨＧＡＡＡＡＰＶＳＡＰＴＳＧＹＱＥＦＶＨＡＶＥＱＧＧＴＱＡＳＡＶＶＧＬＧＰＰＧＥＡＧＹＫＡＦＳＳＬＬＡＳＳＡＶＳＰＥＫＣＧＦＧＡＳＳＧＥＥＧＹＫＰＦＱＤＬＩＰＧＣＰＧＤＰＡＰＶＰＶＰＬＦＴＦＧＬＤＲＥＰＰＲＳＰＱＳＳＨＬＰＳＳＳＰＥＨＬＧＬＥＰＧＥＫＶＥＤＭＰＫＰＰＬＰＱＥＱＡＴＤＰＬＶＤＳＬＧＳＧＩＶＹＳＡＬＴＣＨＬＣＧＨＬＫＱＣＨＧＱＥＤＧＧＱＴＰＶＭＡＳＰＣＣＧＣＣＣＧＤＲＳＳＰＰＴＴＰＬＲＡＰＤＰＳＰＧＧＶＰＬＥＡＳＬＣＰＡＳＬＡＰＳＧＩＳＥＫＳＫＳＳＳＳＦＨＰＡＰＧＮＡＱＳＳＳＱＴＰＫＩＶＮＦＶＳＶＧＰＴＹＭＲＶＳ
配列番号５−ＩＬ３ＲＢ（ＮＰ＿０００３８６．１のＡＡ４６１〜８９７）
ＲＦＣＧＩＹＧＹＲＬＲＲＫＷＥＥＫＩＰＮＰＳＫＳＨＬＦＱＮＧＳＡＥＬＷＰＰＧＳＭＳＡＦＴＳＧＳＰＰＨＱＧＰＷＧＳＲＦＰＥＬＥＧＶＦＰＶＧＦＧＤＳＥＶＳＰＬＴＩＥＤＰＫＨＶＣＤＰＰＳＧＰＤＴＴＰＡＡＳＤＬＰＴＥＱＰＰＳＰＱＰＧＰＰＡＡＳＨＴＰＥＫＱＡＳＳＦＤＦＮＧＰＹＬＧＰＰＨＳＲＳＬＰＤＩＬＧＱＰＥＰＰＱＥＧＧＳＱＫＳＰＰＰＧＳＬＥＹＬＣＬＰＡＧＧＱＶＱＬＶＰＬＡＱＡＭＧＰＧＱＡＶＥＶＥＲＲＰＳＱＧＡＡＧＳＰＳＬＥＳＧＧＧＰＡＰＰＡＬＧＰＲＶＧＧＱＤＱＫＤＳＰＶＡＩＰＭＳＳＧＤＴＥＤＰＧＶＡＳＧＹＶＳＳＡＤＬＶＦＴＰＮＳＧＡＳＳＶＳＬＶＰＳＬＧＬＰＳＤＱＴＰＳＬＣＰＧＬＡＳＧＰＰＧＡＰＧＰＶＫＳＧＦＥＧＹＶＥＬＰＰＩＥＧＲＳＰＲＳＰＲＮＮＰＶＰＰＥＡＫＳＰＶＬＮＰＧＥＲＰＡＤＶＳＰＴＳＰＱＰＥＧＬＬＶＬＱＱＶＧＤＹＣＦＬＰＧＬＧＰＧＰＬＳＬＲＳＫＰＳＳＰＧＰＧＰＥＩＫＮＬＤＱＡＦＱＶＫＫＰＰＧＱＡＶＰＱＶＰＶＩＱＬＦＫＡＬＫＱＱＤＹＬＳＬＰＰＷＥＶＮＫＰＧＥＶＣ
配列番号６−ＩＬ１７ＲＢ（ＮＰ＿０６１１９５．２のＡＡ３１４〜５０２）
ＲＨＥＲＩＫＫＴＳＦＳＴＴＴＬＬＰＰＩＫＶＬＶＶＹＰＳＥＩＣＦＨＨＴＩＣＹＦＴＥＦＬＱＮＨＣＲＳＥＶＩＬＥＫＷＱＫＫＫＩＡＥＭＧＰＶＱＷＬＡＴＱＫＫＡＡＤＫＶＶＦＬＬＳＮＤＶＮＳＶＣＤＧＴＣＧＫＳＥＧＳＰＳＥＮＳＱＤＬＦＰＬＡＦＮＬＦＣＳＤＬＲＳＱＩＨＬＨＫＹＶＶＶＹＦＲＥＩＤＴＫＤＤＹＮＡＬＳＶＣＰＫＹＨＬＭＫＤＡＴＡＦＣＡＥＬＬＨＶＫＱＱＶＳＡＧＫＲＳＱＡＣＨＤＧＣＣＳＬ、を含む。
【００５１】
前記ＣＡＲエンドドメインは、配列番号１〜７として示されるアミノ酸配列、または配列番号１〜７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する変異体を含む、ＳＴＡＴ５関連モチーフを含んでいてもよい。たとえば、前記変異体は、配列番号１〜７の１つとして示されるアミノ酸配列のＳＴＡＴ５との結合のレベルの、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のレベルで、ＳＴＡＴ５と結合できればよい。前記変異体または誘導体は、配列番号１〜７の１つのレベルに近い、または同じレベルでＳＴＡＴ５と結合できてもよく、または、配列番号１〜７の１つとして示されるアミノ酸配列よりも高いレベル（たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベル）でＳＴＡＴ５と結合できてもよい。
【００５２】
たとえば、前記ＳＴＡＴ５関連モチーフは、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ７Ｒα、ＩＬ−３Ｒβ（ＣＳＦ２ＲＢ）、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１７Ｒβ、エリスロポエチン受容体、トロンボポエチン受容体、成長ホルモン受容体、およびプロラクチン受容体由来であってもよい。
前記ＳＴＡＴ５関連モチーフは、アミノ酸モチーフＹＸＸＦ／Ｌ（配列番号８）（Ｘは任意のアミノ酸）を含んでいてもよい。
【００５３】
好適には、前記ＳＴＡＴ５関連モチーフは、アミノ酸モチーフＹＣＴＦ（配列番号９）、ＹＦＦＦ（配列番号１０）、ＹＬＳＬ（配列番号１１）、またはＹＬＳＬＱ（配列番号１２）を含んでいてもよい。
【００５４】
好適には、前記ＳＴＡＴ５関連モチーフは、アミノ酸モチーフＹＬＳＬＱ（配列番号１２）を含んでいてもよい。
【００５５】
前記ＣＡＲエンドドメインは、アミノ酸モチーフＹＣＴＦ（配列番号９）、ＹＦＦＦ（配列番号１０）、ＹＬＳＬ（配列番号１１）、および／またはＹＬＳＬＱ（配列番号１２）を含む前記ＳＴＡＴ５関連モチーフを１個以上含んでいてもよい。
【００５６】
前記ＣＡＲエンドドメインは、アミノ酸モチーフＹＬＳＬＱ（配列番号１２）を含む第１のＳＴＡＴ５関連モチーフと、アミノ酸モチーフＹＣＴＦ（配列番号９）またはＹＦＦＦ（配列番号１０）を含む第２のＳＴＡＴ５関連モチーフとを含んでいてもよい。
【００５７】
前記ＣＡＲエンドドメインは、下記のＳＴＡＴ５関連モチーフ：ＹＬＳＬＱ（配列番号１２）、ＹＣＴＦ（配列番号９）、およびＹＦＦＦ（配列番号１０）を含んでもよい。
【００５８】
本明細書における「ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフ」とは、チロシンキナーゼＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２関連付けをもたらすＢＯＸモチーフのことである。好適なＪＡＫ１およびＪＡＫ２結合モチーフは、たとえば、Ferrao & Lupardus (Frontiers in Endocrinology; 2017; 8(71）；この参照により本明細書に援用される）により記載されている。
【００５９】
ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２結合モチーフは、膜貫通タンパク質の細胞質ドメイン内に内在的に発生してもよい。
【００６０】
たとえば、ＪＡＫ１−および／またはＪＡＫ２結合モチーフは、インターフェロンラムダ受容体１（ＩＦＮＬＲ１）、インターフェロンアルファ受容体１（ＩＦＮＡＲ）、インターフェロンガンマ受容体１（ＩＦＮＧＲ１）、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２２ＲＡ、インターフェロンガンマ受容体２（ＩＦＮＧＲ２）、またはＩＬ１０ＲＢ由来であってもよい。
【００６１】
ＪＡＫ１結合モチーフは、ＪＡＫ１と結合できる、配列番号１３〜１９として示されたアミノ酸モチーフまたはその変異体を含んでもよい。
ＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫ（配列番号１３）
ＮＰＷＦＱＲＡＫＭＰＲＡＬＤＦＳＧＨＴＨＰＶＡＴＦＱＰＳＲＰＥＳＶＮＤＬＦＬＣＰＱＫＥＬＴ（配列番号１４）
ＧＹＩＣＬＲＮＳＬＰＫＶＬＮＦＨＮＦＬＡＷＰＦＰＮＬＰＰＬＥＡＭＤＭＶＥＶＩＹＩＮＲ（配列番号１５）
ＰＬＫＥＫＳＩＩＬＰＫＳＬＩＳＶＶＲＳＡＴＬＥＴＫＰＥＳＫＹＶＳＬＩＴＳＹＱＰＦＳＬ（配列番号１６）
ＲＲＲＫＫＬＰＳＶＬＬＦＫＫＰＳＰＦＩＦＩＳＱＲＰＳＰＥＴＱＤＴＩＨＰＬＤＥＥＡＦＬＫ（配列番号１７）
ＹＩＨＶＧＫＥＫＨＰＡＮＬＩＬＩＹＧＮＥＦＤＫＲＦＦＶＰＡＥＫＩＶＩＮＦＩＴＬＮＩＳＤＤＳ（配列番号１８）
ＲＹＶＴＫＰＰＡＰＰＮＳＬＮＶＱＲＶＬＴＦＱＰＬＲＦＩＱＥＨＶＬＩＰＶＦＤＬＳＧＰ（配列番号１９）
配列番号１３〜１９の変異体は、配列番号１３〜１９のいずれかと比較して１個、２個、または３個のアミノ酸の差異を含んでいてもよく、ＪＡＫ１と結合する能力を保持しうる。
【００６２】
前記変異体は、配列番号１３〜１９のいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有していてもよく、ＪＡＫ１と結合する能力を保持しうる。
【００６３】
好ましい実施形態において、ＪＡＫ−１結合ドメインは、ＪＡＫ１と結合できる、配列番号１３またはその変異体を含んでもよい。
【００６４】
たとえば、前記変異体は、対応する参照配列の結合レベルの、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のレベルで、ＪＡＫ１と結合できればよい。前記変異体または誘導体は、対応する参照配列のレベルに近い、または同じレベルでＪＡＫ１と結合できてもよく、または、対応する参照配列よりも高いレベル（たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベル）でＪＡＫ１と結合できればよい。
【００６５】
ＪＡＫ２結合モチーフは、ＪＡＫ２と結合できる、配列番号２０〜２２として示されたアミノ酸モチーフまたはその変異体を含んでもよい。
ＮＹＶＦＦＰＳＬＫＰＳＳＳＩＤＥＹＦＳＥＱＰＬＫＮＬＬＬＳＴＳＥＥＱＩＥＫＣＦＩＩＥＮ（配列番号２０）
ＹＷＦＨＴＰＰＳＩＰＬＱＩＥＥＹＬＫＤＰＴＱＰＩＬＥＡＬＤＫＤＳＳＰＫＤＤＶＷＤＳＶＳＩＩＳＦＰＥ（配列番号２１）
ＹＡＦＳＰＲＮＳＬＰＱＨＬＫＥＦＬＧＨＰＨＨＮＴＬＬＦＦＳＦＰＬＳＤＥＮＤＶＦＤＫＬＳＶＩＡＥＤＳＥＳ（配列番号２２）
配列番号２１〜２２の変異体は、配列番号２０〜２２のいずれかと比較して１個、２個、または３個のアミノ酸の差異を含んでいてもよく、ＪＡＫ２と結合する能力を保持しうる。
【００６６】
たとえば、前記変異体は、対応する参照配列の結合レベルの、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のレベルで、ＪＡＫ２と結合できればよい。前記変異体または誘導体は、対応する参照配列のレベルに近い、または同じレベルでＪＡＫ２と結合できてもよく、または、対応する参照配列よりも高いレベル（たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベル）でＪＡＫ２と結合できればよい。
【００６７】
タンパク質−タンパク質相互作用を判定するための当該技術分野において周知の方法を用いて、ＪＡＫ１結合モチーフまたはＪＡＫ２結合モチーフがＪＡＫ１またはＪＡＫ２と結合できるかどうか判定してもよい。たとえば、共免疫沈降の後にウエスタンブロットを行ってもよい。
【００６８】
好適には、本明細書に記載のＣＡＲのエンドドメインは、「シグナル伝達性転写因子３」（ＳＴＡＴ３）関連モチーフを含まなくてもよい。
【００６９】
ＳＴＡＴ３は、Ｔｒｅｇの安定と機能のためには有害なシグナルとして記載されてきた。たとえば、ＳＴＡＴ３シグナリングは、ＩＬ１７、ＩＬ２１、およびＩＬ２２などの炎症促進性の遺伝子の発現を促進する。このように、ＳＴＡＴ３関連モチーフを含まないＣＡＲを使用することは、本発明の改変されたＴｒｅｇにおいて特別な利点をもたらす。
【００７０】
ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＳＴＡＴ３と結合できるアミノ酸配列ＹＸＸＱ（配列番号５２）（Ｘは任意のアミノ酸）を含んでいてもよい。タンパク質−タンパク質相互作用を判定するための当該技術分野において周知の方法を用いて、ＳＴＡＴ３関連モチーフがＳＴＡＴ３と結合できるかどうか判定してもよい。たとえば、共免疫沈降の後にウエスタンブロットを行ってもよい。
【００７１】
好適には、前記ＣＡＲエンドドメインは、アミノ酸配列ＹＸＸＱ（配列番号５２）（Ｘは任意のアミノ酸）を含まない。
【００７２】
「ＳＴＡＴ３関連モチーフ」とは、チロシンを含みＳＴＡＴ３ポリペプチドと結合することのできるアミノ酸モチーフのことを表してもよい。たとえば、本明細書における「ＳＴＡＴ３関連モチーフ」とは、チロシンを含み、Ｔｒｅｇの中に存在する時にＳＴＡＴ３ポリペプチドと機能的に結合することのできる（すなわち、ＳＴＡＴ３ポリペプチドの活性化をもたらす）アミノ酸モチーフのことを言う。
【００７３】
好適には、ＣＡＲエンドドメインは、チロシンを含みＳＴＡＴ３ポリペプチドと結合することのできるアミノ酸モチーフを含まない。たとえば、好適には、ＣＡＲエンドドメインは、チロシンを含み、Ｔｒｅｇの中に存在する時にＳＴＡＴ３ポリペプチドと機能的に結合することのできる（すなわち、ＳＴＡＴ３ポリペプチドの活性化をもたらす）アミノ酸モチーフを含まない。
【００７４】
好適には、当該ＣＡＲのエンドドメインは、Ｔｒｅｇ中に発現した時に産生ＳＴＡＴ３および／またはＳＴＡＴ１シグナリングを誘発することができなくてもよい。換言すれば、好適には、Ｔｒｅｇ中に発現した時に、当該ＣＡＲのエンドドメインは、産生ＳＴＡＴ３および／またはＳＴＡＴ１に機能的に結合できず、および／またはＳＴＡＴ３および／またはＳＴＡＴ１のリン酸化と活性化を誘発することができなくてもよい。好適には、当該ＣＡＲのエンドドメインは、Ｔｒｅｇ中に発現した時にＳＴＡＴ３および／またはＳＴＡＴ１に依存した転写活性化を誘発することができなくてもよい。
好適には、前記ＣＡＲのＩＬ２Ｒβエンドドメイン部分は、本明細書において定義されたＳＴＡＴ３関連モチーフを含んでいなくてもよい。
【００７５】
好適には、前記ＣＡＲエンドドメインは、配列番号１として示されるＩＬ２Ｒβエンドドメイン、または、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含んでいてもよい。
配列番号１
ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＬＱＱＤＫＶＰＥＰＡＳＬＳＳＮＨＳＬＴＳＣＦＴＮＱＧＹＦＦＦＨＬＰＤＡＬＥＩＥＡＣＱＶＹＦＴＹＤＰＹＳＥＥＤＰＤＥＧＶＡＧＡＰＴＧＳＳＰＱＰＬＱＰＬＳＧＥＤＤＡＹＣＴＦＰＳＲＤＤＬＬＬＦＳＰＳＬＬＧＧＰＳＰＰＳＴＡＰＧＧＳＧＡＧＥＥＲＭＰＰＳＬＱＥＲＶＰＲＤＷＤＰＱＰＬＧＰＰＴＰＧＶＰＤＬＶＤＦＱＰＰＰＥＬＶＬＲＥＡＧＥＥＶＰＤＡＧＰＲＥＧＶＳＦＰＷＳＲＰＰＧＱＧＥＦＲＡＬＮＡＲＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ
前記変異体は、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【００７６】
好適には、前記ＣＡＲエンドドメインは、配列番号２３または２４として示される切断型ＩＬ２Ｒβエンドドメイン、または、配列番号２３または２４のいずれかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する変異体を含んでいてもよい。
配列番号２３（ＩＬ２ＲＢ切断型ーＹ５１０）
ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ
配列番号２４（ＩＬ２ＲＢ切断型ーＹ５１０＆Ｙ３９２）
ＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＤＡＹＣＴＦＰＳＲＤＤＬＬＬＦＳＰＳＬＬＧＧＰＳＰＰＳＴＡＰＧＧＳＧＡＧＥＥＲＭＰＰＳＬＱＥＲＶＰＲＤＷＤＰＱＰＬＧＰＰＴＰＧＶＰＤＬＶＤＦＱＰＰＰＥＬＶＬＲＥＡＧＥＥＶＰＤＡＧＰＲＥＧＶＳＦＰＷＳＲＰＰＧＱＧＥＦＲＡＬＮＡＲＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶ
前記変異体は、配列番号２３または２４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【００７７】
Ｊａｋ１／Ｊａｋ２とＪａｋ３との両方のトランスリン酸化によりＳＴＡＴ５の活性を増加することができ、これにより活性が安定する。好適には、本明細書に記載の前記ＣＡＲエンドドメインは、さらに、ＪＡＫ３結合モチーフを含んでいてもよい。本明細書における「ＪＡＫ３結合モチーフ」とは、チロシンキナーゼＪＡＫ３をもたらすＢＯＸモチーフのことである。好適なＪＡＫ３結合モチーフは、たとえば、Ferrao & Lupardus（Frontiers in Endocrinology; 2017; 8(71)；この参照により本明細書に援用される）により記載されている。
【００７８】
タンパク質−タンパク質相互作用を判定するための当該技術分野において周知の方法を用いて、モチーフがＪＡＫ３と結合できるかどうか判定してもよい。たとえば、共免疫沈降の後にウエスタンブロットを行ってもよい。
【００７９】
ＪＡＫ３結合モチーフは、膜貫通タンパク質の細胞質ドメイン内に内在的に発生してもよい。
たとえば、前記ＪＡＫ３モチーフは、ＩＬ−２Ｒγポリペプチド由来であってもよい。
ＪＡＫ３結合モチーフは、ＪＡＫ３と結合できる、配列番号２５または配列番号２６として示されたアミノ酸モチーフ、もしくはその変異体を含んでもよい。
配列番号２５
ＥＲＴＭＰＲＩＰＴＬＫＮＬＥＤＬＶＴＥＹＨＧＮＦＳＡＷＳＧＶＳＫＧＬＡＥＳＬＱＰＤＹＳＥＲＬＣＬＶＳＥＩ
配列番号２６
ＥＲＴＭＰＲＩＰＴＬＫＮＬＥＤＬＶＴＥＹＨＧＮＦＳＡＷＳＧＶＳＫＧＬＡＥＳＬＱＰＤＹＳＥＲＬＣＬＶＳＥＩＰＰＫＧＧＡＬＧＥＧＰＧＡＳＰＣＮＱＨＳＰＹＷＡＰＰＣＹＴＬＫＰＥＴ
前記変異体は、配列番号２５または配列番号２６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【００８０】
好ましい実施形態において、前記ＣＡＲエンドドメインは、一個以上のＪＡＫ１結合ドメインと、少なくとも１個のＪＡＫ３結合ドメインとを含む。
【００８１】
本明細書に記載のＣＡＲのエンドドメインは、また、エフェクター機能シグナルを変換し、Ｔｒｅｇがその特殊機能を抗原結合の際に発揮するよう指示するために必要なモチーフを含む。細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体またはその相同体（たとえば、η鎖、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖など）のζ鎖エンドドメイン、ＣＤ３ポリペプチドドメイン（Δ、δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ ７０、など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、など）、ならびに、ＣＤ２、ＣＤ５およびＣＤ２８などのＴ細胞形質導入に関わるその他の分子があるが、これらに限定されない。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ鎖エンドドメイン、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。
【００８２】
好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００８３】
一実施形態において、前記ヒトＣＤ３ゼータ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインは、下記の配列を含む。
ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ２０９６３、ＣＤ３Ｚ＿ＨＵＭＡＮ、３１〜１４３位
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２７）
【００８４】
一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【００８５】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、下記のＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含んでもよい。
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号２８）
【００８６】
一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するシグナル伝達モチーフである。
【００８７】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、下記のＣＤ２７シグナル伝達ドメインを含んでもよい。ＱＲＲＫＹＲＳＮＫＧＥＳＰＶＥＰＡＥＰＣＨＹＳＣＰＲＥＥＥＧＳＴＩＰＩＱＥＤＹＲＫＰＥＰＡＣＳＰ（配列番号２９）．
【００８８】
一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２９に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するシグナリングモチーフである。
【００８９】
細胞内シグナル伝達ドメインがさらにあってもよいことは、当業者に明らかであり、本発明の代替の実施形態と関連して用いられてもよい。
【００９０】
当該ＣＡＲは、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内の一部が、たとえばＣＤ３ζなどの一部と融合したものを含む化合物エンドドメインを含んでもよい。かかる化合物エンドドメインは、抗原認識後に同時に活性化および共刺激シグナルを伝送できる第２世代ＣＡＲと称されてもよい。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。前記ＣＡＲエンドドメインは、また、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達ドメインなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのシグナル伝達ドメインを１個以上含んでいてもよい。
【００９１】
ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＴＮＦＲＳＦ２５のシグナル伝達ドメインの配列の例が、配列番号３０〜３３として下記に示される。前記ＣＡＲエンドドメインはまた、配列番号３０〜３３、または配列番号３０〜３３の変異体の１つ以上を含んでいてもよい。
ＯＸ４０シグナル伝達ドメイン（配列番号３０）
ＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ
４１ＢＢシグナル伝達ドメイン（配列番号３１）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン（配列番号３２）
ＣＷＬＴＫＫＫＹＳＳＳＶＨＤＰＮＧＥＹＭＦＭＲＡＶＮＴＡＫＫＳＲＬＴＤＶＴＬ
ＴＮＦＲＳＦ２５シグナル伝達ドメイン（配列番号３３）
ＴＹＴＹＲＨＣＷＰＨＫＰＬＶＴＡＤＥＡＧＭＥＡＬＴＰＰＰＡＴＨＬＳＰＬＤＳＡＨＴＬＬＡＰＰＤＳＳＥＫＩＣＴＶＱＬＶＧＮＳＷＴＰＧＹＰＥＴＱＥＡＬＣＰＱＶＴＷＳＷＤＱＬＰＳＲＡＬＧＰＡＡＡＰＴＬＳＰＥＳＰＡＧＳＰＡＭＭＬＱＰＧＰＱＬＹＤＶＭＤＡＶＰＡＲＲＷＫＥＦＶＲＴＬＧＬＲＥＡＥＩＥＡＶＥＶＥＩＧＲＦＲＤＱＱＹＥＭＬＫＲＷＲＱＱＱＰＡＧＬＧＡＶＹＡＡＬＥＲＭＧＬＤＧＣＶＥＤＬＲＳＲＬＱＲＧＰ
【００９２】
前記ＣＡＲエンドドメインは、配列番号３０〜３３のいずれか１つに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する、配列番号３０〜３３の１つ以上の変異体である。
【００９３】
好適には、前記ＣＡＲエンドドメインは、配列番号４５、または、配列番号４５に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。
配列番号４５（ＣＤ２８、ＩＬ２ＲＧ−Ｔ５２、ＩＬ２ＲＢ−Ｙ５１０、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むエンドドメイン配列の例）
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＥＲＴＭＰＲＩＰＴＬＫＮＬＥＤＬＶＴＥＹＨＧＮＦＳＡＷＳＧＶＳＫＧＬＡＥＳＬＱＰＤＹＳＥＲＬＣＬＶＳＥＩＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
【００９４】
好適には、前記ＣＡＲエンドドメインは、配列番号５３、または、配列番号５３に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。
配列番号５３（ＣＤ２８、ＩＬ２ＲＧ−Ｔ５２、ＩＬ７ＲＡ−２Ｙ、ＣＤ３ ゼータシグナル伝達ドメインを含むエンドドメイン配列の例）
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＥＲＴＭＰＲＩＰＴＬＫＮＬＥＤＬＶＴＥＹＨＧＮＦＳＡＷＳＧＶＳＫＧＬＡＥＳＬＱＰＤＹＳＥＲＬＣＬＶＳＥＩＫＫＲＩＫＰＩＶＷＰＳＬＰＤＨＫＫＴＬＥＨＬＣＫＫＰＲＫＮＬＮＶＳＦＮＰＥＳＦＬＤＣＱＩＨＲＶＤＤＩＱＡＲＤＥＶＥＧＦＬＱＤＴＦＰＱＱＰＩＬＴＳＬＧＳＮＱＥＥＡＹＶＴＭＳＳＦＹＱＮＱＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ
【００９５】
変異体、誘導体、および断片
本明細書で言及されている特異的なタンパク質、ペプチド、およびヌクレオチドに加えて、その誘導体および断片の使用も本発明に包含される。
本発明のタンパク質またはポリペプチドに関連した、本明細書における「誘導体」という用語は、得られたタンパク質またはポリペプチドが所望の機能を保持するのであれば、前記配列からの、または前記配列への１個（またはそれ以上）のアミノ酸残基の置換、変異、修飾、代替、欠失、および／または付加を含む（前記所望の機能は、たとえば、前記誘導体または変異体が抗原結合ドメインの場合、抗原結合ドメインの標的抗原と結合する能力であってもよく、または前記誘導体または変異体がシグナル伝達ドメインの場合、前記所望の機能は前記ドメインが信号を発する（たとえば、下流の分子を活性化または不活性化する）能力であってもよい）。たとえば、前記変異体または誘導体は、対応する参照配列と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の機能を有していてもよい。前記変異体または誘導体は、対応する参照配列と比較して、近いレベル、または同じレベルの機能を有していてもよく、または、対応する参照配列よりも高いレベル（たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベル）の機能を有していてもよい。
【００９６】
典型的には、アミノ酸の置換は、それにより改変された配列が求められる活性または能力を保持するなら、たとえば１個、２個または３個から１０個または２０個の置換からなっていてもよい。アミノ酸置換は、天然由来ではない類似体の使用を含んでいてもよい。たとえば、前記変異体または誘導体は、対応する参照配列と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の活性または能力を有していてもよい。前記変異体または誘導体は、対応する参照配列と比較して、近いレベル、または同じレベルの活性または能力を有していてもよく、または、対応する参照配列よりも高いレベル（たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％高くなったレベル）の活性または能力を有していてもよい。
【００９７】
本発明で使用されるタンパク質またはペプチドは、また、サイレントな変化を生じ（produce a silent change）、かつ機能的に同等のタンパク質となる、アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有してもよい。内在的な機能が保持される限り、前記残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または、両親媒性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行ってもよい。たとえば、負帯電アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸などがあり、正帯電アミノ酸としては、リジンおよびアルギニンがあり、同様の親水性値をもつ非荷電の極性先端基を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンがある。
【００９８】
たとえば下記表にしたがい、同類置換を行ってもよい。第二欄の同じブロックにあるアミノ酸、好ましくは第三欄の同じ列にあるアミノ酸は、互いに置換できうる。
【表１】
2021536237.tif 000002
【００９９】
前記誘導体は、相同体でもよい。本明細書における「相同体」という用語は、野生型アミノ酸配列および野生型塩基配列と、特定の相同性を有した実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同等視することができる。
【０１００】
相同配列または変異型配列は、前記対象配列に対して少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％、または９０％、好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％の同一性を有してもよいアミノ酸配列を含んでもよい。典型的には、前記相同体は、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含んでもよい。相同性は、類似（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考えることもできるが、本発明の文脈においては、配列同一性の観点から相同性を表すことが好ましい。
【０１０１】
相同性の比較は、目視で、またはより一般には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施することができる。これら市販のコンピュータプログラムは、二つ以上の配列間の百分率相同性または同一性の比率を算出できる。
【０１０２】
百分率相同性は、連続配列に対して算出してもよい。すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一残基ずつ直接比較する。これは、「非ギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのような非ギャップアライメントは、比較的短い数の残基にわたってのみ行われる。
【０１０３】
これは非常に単純で一貫した方法であるが、たとえば、１個の挿入または欠失を除いては同一の配列対において、該塩基配列中のその挿入または欠失が、その後に続くコドンがアラインメントから外されうる、すなわちグローバルアライメントが行われた場合に％相同性の大幅な減少を潜在的に生じるということが考慮されていない。結果として、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に不利にすることなく、考えられる挿入および欠失を考慮に入れた最適アライメントを作製するように設計される。これは、配列アライメントに「ギャップ」を挿入して局所相同性を最大にすることによって達成される。
【０１０４】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アライメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、同じ数の同一アミノ酸について、できるだけ少ないギャップの配列アラインメント（２つの比較した配列間の類似性が高いことを反映する）が、多くのギャップを持つスコアよりも高いスコアを達成するようにする。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ内のそれぞれ後続の残基に対してより小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が通常使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながら、ギャップのより少ない最適化アライメントを作製する。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを修正することを可能にする。しかしながら、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する際は、デフォルト値を使用することが好ましい。たとえば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する際、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップについては−１２、それぞれの延長については−４である。
【０１０５】
最大百分率相同性の算出は、したがって、ギャップペナルティを考慮に入れ、最適アライメントの作製を最初に必要とする。そのようなアラインメントを実行するのに好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（University of Wisconsin、U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al. (1999) ibid-Ch. 18を参照）、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al. (1990） J. Mol. Biol. 403-410）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツール一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方が、オフラインおよびオンライン検索に利用可能である（Ausubel et al. (1999) ibid、pages 7-58 to 7-60を参照）。しかしながら、いくつかのアプリケーションについては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる別のツールも、タンパク質および塩基配列を比較するために利用できる。（FEMS Microbiol. Lett. (1999)174:247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999)177:187-8参照）。
【０１０６】
最終的な百分率相同性は同一性の観点から測定することができるが、アライメントプロセス自体は、典型的には、オールオアナッシング対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいて各対ごとの比較にスコアを割り当てるスケール化類似性スコアマトリクスが一般的に使用される。一般に使用されるそのようなマトリクスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（一連のＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトマトリクス）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムでは、一般的には、パブリックデフォルト値または供給されるのであればカスタムシンボル比較表のいずれかが使用される（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照されたい）。しかしながら、いくつかのアプリケーションについては、ＧＣＧパッケージではデフォルト値を使用することが好ましく、他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリクスを使用することが好ましい。好適には、百分率同一性は、参照配列および／または問い合わせ配列の全体にわたって判断される。
【０１０７】
ソフトウェアが最適アライメントを作製すると、百分率相同性、好ましくは百分率配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的にはこれを配列比較の一部として行い、数値結果を与える。
【０１０８】
「断片」は、典型的には、機能の点で、着目のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域のことである。したがって、「断片」は、全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸または核酸の配列のことである。
【０１０９】
そのような誘導体および断片は部位特異的変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製されてもよい。挿入が作製される場合には、挿入位置のどちらか一方の側で天然に発生する配列に対応する５’および３’隣接領域とともに挿入部分をコードする合成ＤＮＡが作製されてもよい。前記隣接領域は、前記配列が適切な酵素（または複数の酵素）で切断され合成ＤＮＡが切断場所に連結（ligated）され得るように、天然に発生する配列における部位に対応する適当な制限酵素部位を含む。前記ＤＮＡは次に、コードされるタンパク質を作製するために本発明に従って発現される。これらの方法はＤＮＡ配列操作のための当該技術分野において周知の多数の標準的手法の実例となるだけであり、他の公知の手法もまた使用されてもよい。
【０１１０】
抗原特異的標的ドメイン
抗原特異的標的ドメインは、結合相手の所定の抗原と結合する能力のあるＣＡＲを提供する。前記抗原特異的標的ドメインは、好ましくは臨床的に注目される抗体を標的とする。
【０１１１】
前記抗原特異的標的ドメインは、生体分子（たとえば、細胞表面受容体またはその構成部分）を特異的に認識しそれと結合する能力を有するタンパク質またはペプチドであってもよい。前記抗原特異的標的ドメインは、結合相手の生体分子用の、天然由来、合成、半合成、または遺伝子組換えにより作製した結合パートナーを含む。抗原特異的標的ドメインの例としては、抗体または抗体断片または誘導体、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体用のリガンド、またはその受容体結合ドメイン、および腫瘍結合タンパク質などがある。以下に論ずるように、前記抗原特異的標的ドメインは好ましくは抗体、または抗体由来であってもよく、他の抗原特異的標的ドメインとしては、たとえば、移植、炎症、または疾患の部位で活性なＴｃｏｎ細胞のＴＣＲと結合することが可能な抗原ペプチド／ＭＨＣまたはＨＬＡの組み合わせからなる抗原特異的標的ドメインなども含まれる。このような抗原結合ドメインは、たとえばＭｅｋａｌａら、Blood、2005、vol 105、pages 2090-2092に報告されている。
【０１１２】
好ましい実施形態において、抗原特異的標的ドメインは、抗体であるか、または抗体由来である。抗体由来の標的ドメインは、抗体の断片、または１個以上の前記抗体の断片の遺伝子改変産物であってもよく、該断片は抗原との結合に関与する。その例としては、可変領域（Ｆｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｆａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、ラクダ抗体（ＶＨＨ）、および単ドメイン抗体（ｓＡｂ）などがある。
【０１１３】
好ましい実施形態において、結合ドメインは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦＶは、マウスｓｃＦｖ、ヒトｓｃＦｖ、またはヒト化ｓｃＦｖであってもよい。
【０１１４】
抗体またはその抗原結合断片についての「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域中の超可変ループのことである。ＣＤＲは、抗原構造と作用しあうことができ、主として抗原との結合を決定する（ただし、いくつかのフレームワーク領域は、結合に関与していることがわかっている）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ３個のＣＤＲを含んでいる。「重鎖可変領域」または「ＶＨ」とは、フレームワーク領域として知られる隣接範囲に挟まれた、３個のＣＤＲを含む、抗体の重鎖の断片のことである。前記隣接範囲は、ＣＤＲよりも高度に保存され、ＣＤＲを維持する足場を形成する。「軽鎖可変領域」または「ＶＬ」とは、フレームワーク領域に挟まれた、３個のＣＤＲを含む、抗体の軽鎖の断片のことである。
【０１１５】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位をもつ、抗体の最も小さい断片のことである。Ｆｖ断片は、１個の重鎖の可変領域に結合した１個の軽鎖の可変領域から成る。「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、直接またはペプチドリンカー配列を介して互いに接続された軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる、改変された抗体のことである。
【０１１６】
所定の抗原と特異的に結合する抗体は、当該技術分野において周知の方法を使用して調製できる。かかる方法には、ファージディスプレイ、ヒト抗体またはヒト化抗体を作製する方法、または、ヒト抗体を作るために改変されたトランスジェニック動物または植物を使用する方法などがある。部分的合成抗体または全長合成抗体のファージディスプレイライブラリが利用可能であり、標的分子に結合できる抗体またはその断片について、前記ライブラリをスクリーニングすることが可能である。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリもまた利用可能である。前記抗体をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を特定したら、それを単離および／または判定することができる。
【０１１７】
当該ＣＡＲによって標的とされる抗原には、移植された臓器、自己免疫疾患、アレルギー疾患、および炎症性疾患に関連する細胞上に発現する抗原があるが、これらに限定されるわけではない。Ｔｒｅｇ細胞のバイスタンダー効果のため、移植部位、炎症部位、または疾患部位に抗原が単に存在する、および／または発現するということは、当業者に理解されるであろう。
【０１１８】
臓器移植に関連する抗原、および／または移植された臓器に関連する細胞としては、移植された臓器に存在するが患者には存在しないＨＬＡ抗原や、移植拒絶の間に発現が増加する抗原、たとえばＣＣＬ１９、ＭＭＰ９、ＳＬＣ１Ａ３、ＭＭＰ７、ＨＭＭＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＧＰＮＭＢ、ＰＬＡ２Ｇ７、ＣＸＣＬ９、ＦＡＢＰ５、ＧＢＰ２、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１０、ＵＢＤ、ＣＤ２７、ＣＤ４８、ＣＸＣＬ１１などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１９】
例としては、ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２は、本明細書においてＨＬＡ−Ａ＊０２、ＨＬＡ−Ａ０２、およびＨＬＡ−Ａ＊２とも称される）と結合可能な抗原結合ドメインを含んでいてもよい。ＨＬＡ−Ａ＊０２は、ＨＬＡ−Ａ座にある、ある特定のクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子群である。
【０１２０】
抗原認識ドメインは、ＨＬＡ−Ａ２内の１個以上の領域またはエピトープと結合してもよく、好適には特異的に適合してもよい。エピトープは抗原決定基としても知られ、抗原認識ドメイン（たとえば抗体）によって認識される抗原の一部である。つまり、エピトープは抗体が結合する抗原の特定の部分である。好適には、抗原認識ドメインは、ＨＬＡ−Ａ２内の１個の領域またはエピトープと結合し、好適には特異的に適合する。
【０１２１】
抗原認識ドメインは、少なくとも１個のＣＤＲ（たとえば、ＣＤＲ３）を含んでもよく、これは抗原と結合する抗体から推測でき、好ましくはＨＬＡ−Ａ２（または、かかる予測されたＣＤＲの変異体（たとえば、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を有する変異体））と結合する抗体から推測できる。３個以下のＣＤＲ領域を含む分子（たとえば、１個のＣＤＲ、またはその一部）が、ＣＤＲの由来元である抗体の抗原結合活性を保持できるだろうということは、理解されるであろう。２個のＣＤＲ領域を含む分子は、たとえばミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）の形態の標的抗原と結合することができる、と当該技術分野では記載されている（Vaughan and Sollazzo、2001、Combinational Chemistry & High Throughput Screening、4、417-430）。１個のＣＤＲを含む分子は、標的に対して強力な結合活性を発揮することができるという記載がある（Nicaise et al、2004、Protein Science、13: 1882-91）。
【０１２２】
これに関して、抗原認識ドメインは、１個以上の可変重鎖ＣＤＲ、たとえば１個、２個または３個の可変重鎖ＣＤＲを含んでいてもよい。または／さらに、抗原認識ドメインは、１個以上の可変軽鎖ＣＤＲ、たとえば１個、２個または３個の可変軽鎖ＣＤＲを含んでいてもよい。抗原認識ドメインは、３個の重鎖ＣＤＲおよび／または３個の軽鎖ＣＤＲ（特に、３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域および／または３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域）を含んでもよく、少なくとも１個のＣＤＲ、好ましくはすべてのＣＤＲが抗原、好ましくはＨＬＡ−Ａ２と結合する抗体由来であってもよく、下記に示すＣＤＲ配列の一つから選択されてもよい。
【０１２３】
抗原認識ドメインは、可変重鎖ＣＤＲと可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせを含んでもよく、たとえば、１個の可変重鎖ＣＤＲと１個の可変軽鎖ＣＤＲの組み合わせ、２個の可変重鎖ＣＤＲと１個の可変軽鎖ＣＤＲの組み合わせ、２個の可変重鎖ＣＤＲと２個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、３個の可変重鎖ＣＤＲと１個または２個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、１個の可変重鎖ＣＤＲと２個または３個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせ、３個の可変重鎖ＣＤＲと３個の可変軽鎖ＣＤＲとの組み合わせを含んでもよい。好ましくは、抗原認識ドメインは、３個の可変重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、または３個の可変軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）との組み合わせを含んでもよい。
【０１２４】
抗原認識ドメインに存在する１個以上のＣＤＲは、すべてが同じ抗体由来でなくてもよく、前記ドメインが上記の結合活性を有すればよい。したがって、あるＣＤＲが抗原、たとえばＨＬＡ−Ａ２と結合する抗体の重鎖または軽鎖から推測されてもよく、一方で同じ抗原（たとえばＨＬＡ−Ａ２）と結合する別の抗体から別のＣＤＲが推測されてもよい。この場合には、ＣＤＲ３が、抗原と結合する抗体、たとえはＨＬＡ−Ａ２から推測されるのが好ましいだろう。しかしながら、特に１個より多いＣＤＲが抗原認識ドメインに存在すれば、これらＣＤＲが同じ抗原、たとえばＨＬＡ−Ａ２に結合する抗体から推測されるのが好ましい。異なる抗体からの、特に同じ所望の領域またはエピトープと結合する抗体からのＣＤＲの組み合わせが使用されてもよい。
【０１２５】
特に好ましい実施形態において、前記抗原認識ドメインは、抗原、たとえばＨＬＡ−Ａ２と結合する抗体の可変重鎖配列から推測される３個のＣＤＲ、および／または抗原、たとえばＨＬＡ−Ａ２と結合する抗体（好ましくは同じ抗体）の可変軽鎖配列から推測される３個のＣＤＲを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは抗体であるか、または抗体由来であり（たとえば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、またはｓｄＡｂであり）、前記抗体は配列番号９０〜１４６、またはその誘導体から選択される、１個以上のＣＤＲ領域を含む。換言すると、いくつかの実施形態において、抗原認識ドメインは、配列番号９０〜１４６、またはその誘導体から選択される、１個以上のＣＤＲ領域を含む。好適には、抗原認識ドメインは、配列番号９０〜１４６、またはその誘導体から選択される、３個のＣＤＲ領域を含む。
【表２】
2021536237.tif 000003
【０１２７】
好ましくは、抗原結合ドメインは、同じ可変鎖から選択された、ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、またはその誘導体を含む。たとえば、前記抗原結合ドメインは、配列番号９０〜９２、配列番号９３〜９５、配列番号９６〜９８、配列番号９９〜１０１、配列番号１０２〜１０４、配列番号１０５〜１０７、配列番号１０８〜１１０、配列番号１１１〜１１３、配列番号１１４〜１１６、配列番号１１７〜１１９、配列番号１２０〜１２２、配列番号１２３〜１２５、配列番号１２６〜１２８、配列番号１２９〜１３１、配列番号１３２〜１３４、配列番号１３５〜１３７、配列番号１３８〜１４０、配列番号１４１〜１４３、および／または配列番号１４４〜１４６、またはその誘導体を含む。
【０１２８】
好ましい実施形態において、前記抗原認識ドメインは、下記のような可変重鎖ＣＤＲおよび可変軽鎖ＣＤＲの組み合わせを含む。
（ｉ）配列番号９０〜９２および配列番号１０２〜１０４、またはその誘導体；      
（ｉｉ）配列番号９３〜９５および配列番号１０５〜１０７、またはその誘導体      ；
（ｉｉｉ）配列番号９６〜９８および配列番号１０８〜１１０、またはその誘導      体；
（ｉｖ）配列番号９９〜１０１および配列番号１１１〜１１３、またはその誘導      体；
（ｖ）配列番号９９〜１０１および配列番号１１４〜１１６、またはその誘導体      ；
（ｖｉ）配列番号９９〜１０１および配列番号１１７〜１１９、またはその誘導      体；
（ｖｉｉ）配列番号９９〜１０１および配列番号１２０〜１２２、またはその誘      導体；
（ｖｉｉｉ）配列番号９９〜１０１および配列番号１２３〜１２５、またはその      誘導体；
（ｉｘ）配列番号９９〜１０１および配列番号１２６〜１２８、またはその誘導      体；
（ｘ）配列番号９９〜１０１および配列番号１２９〜１３１、またはその誘導体      ；
（ｘｉ）配列番号９９〜１０１および配列番号１３２〜１３４、またはその誘導      体；
（ｘｉｉ）配列番号９９〜１０１および配列番号１３５〜１３７、またはその誘      導体；
（ｘｉｉｉ）配列番号９９〜１０１および配列番号１３８〜１４０、またはその      誘導体；
（ｘｉｖ）配列番号９９〜１０１および配列番号１４１〜１４３、またはその誘      導体；
（ｘｖ）配列番号９９〜１０１および配列番号１４４〜１４６、またはその誘導      体；
【０１２９】
好ましくは、前記抗原認識ドメインは、配列番号９３〜９５および配列番号１０５〜１０７、またはその誘導体を含む。
【０１３０】
前記抗原結合ドメインは、配列番号５４、５５、５６、または５７から選択される可変重ドメイン、もしくは配列番号５４、５５、５６、または５７に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。前記変異体は、配列番号５４、５５、５６、または５７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
配列番号５４
ＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶ
配列番号５５
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＬＤＬＷＧＲＧＴ
配列番号５６
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＭＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ
配列番号５７
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴ
【０１３１】
前記抗原結合ドメインは、配列番号５８〜７２から選択される可変軽ドメイン、または配列番号５８〜７２に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。前記変異体は、配列番号５８〜７２に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
配列番号５８
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ
配列番号５９
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＳＳＬＤＩＳＨＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６０
ＤＩＶＬＭＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＨＧＩＮＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＳＹＰＰＴＦＧＲＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号６１
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号６２
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＥＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＥＴＨＬＤＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＳＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号６３
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＩＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号６４
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＳＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号６５
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＧＴＹＹＣＱＱＹＮＴＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号６６
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＤＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＨＴＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号６７
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号６８
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＱＧＩＳＳＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号６９
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＴＬＬＩＦＡＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号７０
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＴＬＬＩＹＫＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＳＹＹＣＱＱＹＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号７１
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＨＧＩＳＮＹＦＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号７２
ＤＶＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＹＶＧＤＲＩＴＩＴＣＲＡＳＲＧＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＴＳＴＬＱＳＧＶＰＬＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
【０１３２】
前記抗原結合ドメインは、配列番号３４または７３〜８６、もしくは配列番号３４または７３〜８６に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでもよく、ＨＬＡ−Ａ２へ結合できる。前記変異体は、配列番号３４または７３〜８６に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
配列番号７３
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＬＤＬＷＧＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＳＳＬＤＩＳＨＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ
配列番号７４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＭＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＲＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＬＭＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＨＧＩＮＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＳＹＰＰＴＦＧＲＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号７５
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号７６
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＥＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＥＴＨＬＤＳＧＶＰＳＲＦＴＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＳＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号７７
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＩＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号７８
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＳＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号７９
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＧＴＹＹＣＱＱＹＮＴＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号８０
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＤＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＨＴＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号８１
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号８２
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＱＧＩＳＳＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＦＮＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号８３
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＴＬＬＩＦＡＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＳＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号８４
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＴＬＬＩＹＫＡＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＳＹＹＣＱＱＹＳＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号８５
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＨＧＩＳＮＹＦＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＴＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＳＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
配列番号８６
ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＹＶＧＤＲＩＴＩＴＣＲＡＳＲＧＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＴＳＴＬＱＳＧＶＰＬＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＧＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＤＳＹＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＤＩＫ
【０１３３】
前記抗原結合ドメインは、配列番号７３、または配列番号７３に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号７３に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１３４】
前記抗原結合ドメインは、配列番号３４、または配列番号３４に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号３４に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１３５】
前記抗原結合ドメインは、配列番号７４、または配列番号７４に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号７４に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１３６】
前記抗原結合ドメインは、配列番号７５、または配列番号７５に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号７５に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１３７】
前記抗原結合ドメインは、配列番号７６、または配列番号７６に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号７６に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１３８】
前記抗原結合ドメインは、配列番号７７、または配列番号７７に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号７７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１３９】
前記抗原結合ドメインは、配列番号７８、または配列番号７８に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号７８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１４０】
前記抗原結合ドメインは、配列番号７９、または配列番号７９に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号７９に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１４１】
前記抗原結合ドメインは、配列番号８０、または配列番号８０に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号８０に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１４２】
前記抗原結合ドメインは、配列番号８１、または配列番号８１に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号８１に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１４３】
前記抗原結合ドメインは、配列番号８２、または配列番号８２に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号８２に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１４４】
前記抗原結合ドメインは、配列番号８３、または配列番号８３に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号８３に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１４５】
前記抗原結合ドメインは、配列番号８４、または配列番号８４に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号８４に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１４６】
前記抗原結合ドメインは、配列番号８５、または配列番号８５に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号８５に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１４７】
前記抗原結合ドメインは、配列番号８６、または配列番号８６に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。好適には、前記変異体は配列番号８６に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１４８】
膜貫通ドメイン
ＣＡＲはまた、膜貫通ドメインを含んでもよい。膜貫通ドメインは、Ｉ型膜貫通タンパク質、ＩＩ型膜貫通タンパク質、またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質などの、膜貫通ドメインを有するタンパク質のいずれかからの膜貫通配列を含んでいてもよい。ＣＡＲの膜貫通ドメインはまた、人工疎水性配列を含んでもよい。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量化しないように選択されればよい。膜貫通ドメインがさらにあってもよいことは、当業者に明らかであろう。ＣＡＲ構築に使用される膜貫通（ＴＭ）領域の例を、下記に示す。１）ＣＤ２８ ＴＭ領域（Pule et al、Mol Ther、2005、Nov;12(5):933-41; Brentjens et al、CCR、2007、Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Casucci et al、Blood、2013、Nov 14;122(20):3461-72.）；  ２）ＯＸ４０ ＴＭ領域（Pule et al、Mol Ther、2005、Nov;12(5):933-41);  ３）４１ＢＢ ＴＭ領域（Brentjens et al、CCR、2007、Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35）；  ４）ＣＤ３ ｚｅｔａ ＴＭ領域（Pule et al、Mol Ther、2005、Nov;12(5):933-41; Savoldo B、Blood、2009、Jun 18;113(25):6392-402.）；  ５）ＣＤ８ａ ＴＭ領域（Maher et al、Nat Biotechnol、2002、Jan;20(1):70-5.; Imai C、Leukemia、2004、Apr;18(4):676-84; Brentjens et al、CCR、2007、Sep 15;13(18 Pt 1):5426-35; Milone et al、Mol Ther、2009、Aug;17(8):1453-64.）．
【０１４９】
好適には、膜貫通ドメインは配列番号３５として示されるアミノ酸配列、または配列番号３５にたいして少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。
配列番号３５−ＣＤ２８膜貫通
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ
好適には、前記変異体は、配列番号３５に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１５０】
好適には、ＣＡＲはＣＤ８α膜貫通ドメインを含んでいてもよい。好適には、膜貫通ドメインは配列番号８７として示されるアミノ酸配列、または配列番号８７に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ８α ＴＭドメイン（ＡＡ １８３〜２０３）の例（配列番号８７）：
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
好適には、前記変異体は、配列番号８７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１５１】
好適には、ＣＡＲはＣＤ２８ヒンジおよび膜貫通配列を含んでいてもよい。好適には、前記ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号３６として示されるアミノ酸配列、または配列番号３６に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。
配列番号３６−ＣＤ２８膜貫通
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ
好適には、前記変異体は、配列番号３６に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１５２】
一実施形態において、膜貫通および細胞内シグナルドメインはどちらもＣＤ２８由来である。一実施形態において、膜貫通および細胞内シグナルドメインは下記の配列を含む。
ヒトＣＤ２８の膜貫通および細胞内部分（ＵＮＩＰＲＯＴ：Ｐ１０７４７、ＣＤ２８＿ＨＵＭＡＮ、１５３−２２０位）
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号３７）
一実施形態において、膜貫通および細胞内シグナルドメインは、配列番号３７に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０１５３】
一実施形態において、ＣＤ２８の膜貫通ドメインは配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号３８）を含む。
【０１５４】
好適には、ＣＡＲは、ｃ−Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ−配列番号３９）などのタグをコードしてもよい。好適には、前記タグは、ＣＡＲの細胞外ドメイン、たとえば、細胞外ドメインのヒンジ領域などに組み込まれてもよい。ｃ−Ｍｙｃタグが一体化されているＣＤ２８ヒンジ／膜貫通ドメインの例が、配列番号４０として示されている。
ＩＥＶＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号４０）．
【０１５５】
好適には、ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインとＣＤ２８膜貫通ドメインとを含んでいてもよい。好適には、前記ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号８８として示されるアミノ酸配列、または、配列番号８８に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ８αヒンジドメインとＣＤ２８膜貫通ドメインの例（配列番号８８）：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ
好適には、前記変異体は、配列番号８８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１５６】
好適には、ＣＡＲはＣＤ２８ヒンジドメインとＣＤ８α膜貫通ドメインとを含んでいてもよい。好適には、前記ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号８９として示されるアミノ酸配列、または、配列番号８９に対して少なくとも８０％の同一性を有する変異体を含んでいてもよい。
ＣＤ２８ヒンジドメインとＣＤ８α膜貫通ドメインの例（配列番号８９）：
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ
好適には、前記変異体は、配列番号８９に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有してもよい。
【０１５７】
ＣＡＲはさらに、細胞表面での発現のための小胞体経路に対してＣＡＲを向かわせるリーダー配列を含んでいてもよい。リーダー配列の例としては、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号４１）がある。
【０１５８】
本発明に使用するためのＣＡＲの例は、配列番号４２〜４４として示される。
配列番号４２（ＨＬＡ−Ａ２ ｓｃＦＶ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＣＤ２８、ＩＬ２ＲＢ−Ｙ５１０、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含むＣＡＲ）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＡＡＡＩＥＶＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＥＴＲＧＧＧＡＴＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＹＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＫＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫ
配列番号４３（ＨＬＡ−Ａ２ ｓｃＦＶ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＣＤ２８、ＩＬ２ＲＧ−Ｔ５２、ＩＬ２ＲＢ−Ｙ５１０、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含むＣＡＲ）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＡＡＡＩＥＶＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＥＲＴＭＰＲＩＰＴＬＫＮＬＥＤＬＶＴＥＹＨＧＮＦＳＡＷＳＧＶＳＫＧＬＡＥＳＬＱＰＤＹＳＥＲＬＣＬＶＳＥＩＮＣＲＮＴＧＰＷＬＫＫＶＬＫＣＮＴＰＤＰＳＫＦＦＳＱＬＳＳＥＨＧＧＤＶＱＫＷＬＳＳＰＦＰＳＳＳＦＳＰＧＧＬＡＰＥＩＳＰＬＥＶＬＥＲＤＫＶＴＱＬＬＰＬＮＴＤＡＹＬＳＬＱＥＬＱＧＱＤＰＴＨＬＶＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号４４（ＨＬＡ−Ａ２ ｓｃＦＶ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＣＤ２８、ＩＬ２ＲＧ−Ｔ５２、ＩＬ７ＲＡ−２Ｙ、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含むＣＡＲ）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＳＣＡＡＳＧＶＴＬＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＡＦＩＲＮＤＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＫＴＶＳＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＧＥＳＧＰＬＤＹＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＡＡＡＩＥＶＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＥＲＴＭＰＲＩＰＴＬＫＮＬＥＤＬＶＴＥＹＨＧＮＦＳＡＷＳＧＶＳＫＧＬＡＥＳＬＱＰＤＹＳＥＲＬＣＬＶＳＥＩＫＫＲＩＫＰＩＶＷＰＳＬＰＤＨＫＫＴＬＥＨＬＣＫＫＰＲＫＮＬＮＶＳＦＮＰＥＳＦＬＤＣＱＩＨＲＶＤＤＩＱＡＲＤＥＶＥＧＦＬＱＤＴＦＰＱＱＰＩＬＴＳＬＧＳＮＱＥＥＡＹＶＴＭＳＳＦＹＱＮＱＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ
ＣＡＲは、配列番号４２〜４４のいずれかに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有していてもよい。
【０１５９】
医薬組成物
本発明の改変されたＴｒｅｇまたはＣＡＲを含む医薬組成物もまた提供される。
【０１６０】
医薬組成物は、治療上有効量の医薬的に活性な薬剤、すなわち前記Ｔｒｅｇを含む、またはそれから成る、組成物である。好ましくは、医薬組成物は薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含む。治療目的の使用のために許容される担体または希釈剤は、薬学的技術分野で周知であり、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co. （A. R. Gennaro編、１９８５）に記載されている。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図する投与経路と標準的な薬務とを考慮して選択できる。前記医薬組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤として、またはそれらに加えて、適した結合剤、滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、または可溶化剤を含んでもよい。
【０１６１】
「薬学的に許容される」とは、製剤が滅菌済であり、発熱物質（pyrogen）を含まないという意味を含む。担体、希釈剤および／または賦形剤は、前記Ｔｒｅｇと親和性があり、レシピエントに対して有害ではないという意味において、「許容可能」でなければならない。典型的には、担体、希釈剤および／または賦形剤は、滅菌済であり、発熱物質を含まない生理的媒体または輸液媒体であるが、他の許容可能な担体、希釈剤、賦形剤を用いてもよい。
【０１６２】
薬学的に許容される担体の例としては、たとえば、水、塩類溶液、アルコール、シリコーン、蝋、ワセリン、植物油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、リポソーム、糖、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、界面活性剤、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ペトロエスラル脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどがある。
【０１６３】
本発明に係るＴｒｅｇまたは医薬組成物は、本明細書に記載の疾患を治療および／または予防するのに適した様式で投与されてもよい。投与量および投与頻度は、対象の状態ならびに対象の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は、臨床試験によって決定されてもよい。前記医薬組成物は、それに従って処方されればよい。
【０１６４】
本明細書に記載のＴｒｅｇまたは医薬組成物は、非経口投与、たとえば静脈内投与でき、または輸液技術により投与してもよい。前記Ｔｒｅｇまたは医薬組成物は、血液と等張にするために、たとえば十分な塩類やグルコースなど、他の物質を含んだ滅菌済水溶液の形態で投与してもよい。前記水溶液は、好適には緩衝してもよい（好ましくはｐＨ３〜９）。前記医薬組成物は、適切に処方されればよい。滅菌条件のもとでの好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術によって容易に成しえる。
【０１６５】
前記医薬組成物は、輸液媒体、たとえば滅菌済等張溶液中に本発明のＴｒｅｇを含んでもよい。前記医薬組成物は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入してもよい。
【０１６６】
前記Ｔｒｅｇまたは医薬組成物は、単回または複数回で投与されてもよい。特に、前記Ｔｒｅｇまたは医薬組成物は、単回の使い切りで投与されてもよい。前記医薬組成物は、それに従って処方されればよい。
【０１６７】
前記医薬組成物は、さらに、１つ以上の活性な薬剤を含んでもよい。
前記医薬組成物はさらに、リンパ球枯渇剤（たとえば、サイモグロブリン、ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、シクロホスファミド、フルダラビン）、ｍＴＯＲ阻害剤（たとえば、シロリムス、エベロリムス）、共刺激経路を阻害する薬剤（たとえば、抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＡＬ４Ｉｇ）、および／または特異的なサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＴＮＦａｌｐｈａ、ＩＬ１８）などの、１つ以上の他の治療薬を含んでいてもよい。
【０１６８】
治療する疾患や対象、投与経路によって、前記Ｔｒｅｇまたは医薬組成物が様々な投与量（たとえば、細胞数／ｋｇ、または細胞数／対象、などで測定）で投与されてもよい。いずれにしても、医師が個体対象にとって最も適した実際の投与量を判定するものであり、それはその対象の年齢、体重、および反応に応じて変わるであろう。しかしながら典型的には、本発明のＴｒｅｇについては、投与量として一個の対象につき５ｘ１０7〜３ｘ１０9個の細胞、または１０8〜２ｘ１０9個の細胞が投与されてもよい。
【０１６９】
前記Ｔｒｅｇは、医薬組成物に使用するために適切に変更されてもよい。たとえば、Ｔｒｅｇは、対象に注入される前に、凍結保存されて適切な時間に解凍されてもよい。
【０１７０】
本発明のＴｒｅｇおよび／または医薬組成物を含むキットの使用も、さらに本発明に含まれる。好ましくは、当該キットは、本明細書に記載の前記方法および使用、たとえば、本明細書に記載の治療方法に用いられるためのものである。好ましくは、当該キットは、キットの構成の使用についての指示書を含む。
【０１７１】
治療方法
本発明は、移植に対する寛容を誘導し；移植の細胞性拒絶反応および／または液性拒絶反応を治療および／または予防し；移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患を、治療および／または予防し；または、組織の修復および／または組織の再生を促進し；または、代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善する方法を提供し、前記方法は、本発明の改変されたＴｒｅｇまたは医薬組成物を対象に投与する工程を含む。
【０１７２】
本明細書において、「移植に対する寛容を誘導する」とは、レシピエントに移植された臓器への寛容を誘導することをいう。換言すれば、移植に対する寛容を誘導するとは、ドナー移植臓器に対するレシピエントの免疫応答のレベルを下げることを意味する。移植臓器に対する寛容を誘導することで、移植レシピエントが必要とする免疫抑制剤の量を減らすか、または、免疫抑制剤の中断を可能にしてもよい。
【０１７３】
たとえば、黄疸、暗色尿、かゆみ、腹部膨満、圧痛、倦怠、吐き気または嘔吐、および／または食欲不振などの、疾患の症状の少なくとも一つを少なくしたり、軽くしたり、または改善するために、疾患のある対象に改変されたＴｒｅｇを投与してもよい。少なくとも１つの症状を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％少なくしたり、軽くしたり、または改善してもよく、または、少なくとも１つの症状を完全に癒してもよい。
【０１７４】
疾患の進行を遅めたり、軽減したり、または止めたりするために、疾患のある対象に改変されたＴｒｅｇを投与してもよい。改変されたＴｒｅｇが投与されない対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％疾患の進行を遅めたり、軽減したり、または止めたりしてもよく、または、前記疾患の進行を完全に止めてもよい。
【０１７５】
一実施形態において、対象は免疫抑制治療を受けている移植レシピエントである。
好適には、対象は哺乳動物である。好適には、対象はヒトである。
【０１７６】
移植は、肝臓、腎臓、心臓、肺、膵臓、小腸、胃、骨髄、血管柄付複合組織移植、および皮膚の移植から選択してもよい。
好適には、移植（ｇｒａｆｔ／ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）ドナーに存在するが、移植（ｇｒａｆｔ／ｔｒａｓｐｌａｎｔ）レシピエントには存在しないＨＬＡ抗原と特異的に結合できる抗原結合ドメインを、前記ＣＡＲが含んでいてもよい。
【０１７７】
好適には、移植は肝臓移植である。移植が肝臓移植である実施形態において、抗原としては、移植された臓器に存在するが患者には存在しないＨＬＡ抗原や、ＮＴＣＰなど肝臓特異的な抗原、または、拒絶の間に発現が増加する抗原、たとえばＣＣＬ１９、ＭＭＰ９、ＳＬＣ１Ａ３、ＭＭＰ７、ＨＭＭＲ、ＴＯＰ２Ａ、ＧＰＮＭＢ、ＰＬＡ２Ｇ７、ＣＸＣＬ９、ＦＡＢＰ５、ＧＢＰ２、ＣＤ７４、ＣＸＣＬ１０、ＵＢＤ、ＣＤ２７、ＣＤ４８、ＣＸＣＬ１１などが挙げられる。
好適には、抗原はＨＬＡ−Ａ２であってもよい。
【０１７８】
本発明はさらに、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫疾患、またはアレルギー疾患を、治療および／または予防し；または、組織の修復および／または組織の再生を促進し；または、代謝異常の二次的症状である慢性炎症を改善する方法を提供する。
【０１７９】
疾患の治療方法は、本発明の細胞の治療目的の使用に関する。これに関して、前記疾患に関連する少なくとも１つの症状を少なくしたり、軽くしたり、または改善するために、および／または前記疾患の進行を遅めたり、軽減したり、または止めたりするために、既存の疾患または病状を持つ対象に、前記細胞を投与してもよい。
【０１８０】
好適には、移植の細胞性拒絶反応および／または液性拒絶反応を治療および／または予防するというのは、有効量の本発明のＴｒｅｇを投与して、移植レシピエントが必要とする免疫抑制剤の量を減らすか、または、免疫抑制剤の中断を可能にすることであってもよい。
【０１８１】
疾患の予防は、本発明の細胞を、予防目的で使用することに関連する。これに関して、まだ罹患していない、および／または疾患の症状を示していない対象に対して、前記疾患を予防したり、前記疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽くしたり、または予防したりするために、前記細胞を投与してもよい。対象は、前記疾患にかかりやすい体質であったり、または、前記疾患を発症する危険性を教示されているかもしれない。
【０１８２】
自己免疫疾患またはアレルギー疾患は、乾癬や皮膚炎（たとえば、アトピー性皮膚炎）などの炎症性皮膚病；炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎など）に関連した反応；皮膚炎；食物アレルギー、湿疹や喘息などのアレルギー症状；慢性関節リュウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（ループス腎炎、皮膚ループスを含む）；真性糖尿病（たとえば、Ｉ型真性糖尿病や、インスリン依存性糖尿病）；多発性硬化症や若年型糖尿病から選択されうる。
【０１８３】
好適には、本発明の治療方法は、本発明に係る、または本発明に係る方法により獲得可能な（たとえば、獲得された）、改変されたＴｒｅｇ、または本明細書において定義された（たとえば、上述の医薬組成物中の）ポリヌクレオチドまたはベクターを、対象に投与する工程を含んでいてもよい。
【０１８４】
好適には、疾患の治療および／または予防のための当該方法は、本発明に係る改変されたＴｒｅｇ（たとえば、上述の医薬組成物中の）を、対象に投与する工程を含んでいてもよい。
【０１８５】
上記方法は、下記の工程を包含していてもよい。
（ｉ）細胞含有サンプルを単離する、または細胞含有サンプルを提供すること；
（ｉｉ）本明細書において定義されたポリヌクレオチドまたはベクターを前記細胞に導入すること；および
（ｉｉｉ）対象に、（ｉｉ）からの前記細胞を投与すること。
【０１８６】
好適には、前記細胞は、本明細書において定義されたＴｒｅｇである。
【０１８７】
好適には、前記方法の工程（ｉｉ）の前に、および／またはその後に、前記細胞含有サンプルから、富化されたＴｒｅｇ集団を単離し、および／または生成してもよい。
【０１８８】
たとえば、単離および／または生成は、工程（ｉｉ）の前に、および／またはその後に行い、富化されたＴｒｅｇサンプルを単離し、および／または生成してもよい。本発明のＣＡＲ、ポリヌクレオチド、および／またはベクターを含む細胞および／またはＴｒｅｇについて富化を行うために、工程（ｉｉ）の後に富化を行ってもよい。
【０１８９】
好適には、前記ポリヌクレオチドまたはベクターは、形質導入によって導入してもよい。好適には、前記ポリヌクレオチドまたはベクターは、遺伝子導入によって導入してもよい。
【０１９０】
好適には、前記細胞は、自家細胞である。好適には、前記細胞は、同種細胞である。
好適には、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上の他の治療薬と組み合わせて投与してもよく、他の治療薬としては、リンパ球枯渇剤（たとえば、サイモグロブリン、キャンパスー１Ｈ、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、シクロホスファミド、フルダラビン）、ｍＴＯＲ阻害剤（たとえば、シロリムス、エベロリムス）、共刺激経路を阻害する薬剤（たとえば、抗ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＡＬ４Ｉｇ）、および／または特異的なサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＴＮＦａｌｐｈａ、ＩＬ１８）などがある。改変されたＴｒｅｇは、前記１つ以上の他の治療薬と同時にもしくは逐次的に（つまり、その前、または後に）投与してもよい。
好適には、対象は哺乳動物である。好適には、対象はヒトである。
【０１９１】
本明細書に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを導入する前に、または後に、たとえば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用した処理により、または抗ＣＤ３モノクローナル抗体と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体とを使用した処理により、前記Ｔｒｅｇを活性化および／または増殖させてもよい。
【０１９２】
また、抗ＣＤ３モノクローナル抗体と抗ＣＤ２８モノクローナル抗体とが、ＩＬ−２との組み合わせで存在するところで、前記Ｔｒｅｇを増殖してもよい。好適には、ＩＬ−２はＩＬ−１５と置き換えられてもよい。Ｔｒｅｇ増殖プロトコルで使用されてもよい別の成分としては、ラパマイシン、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、およびＴＧＦβがあるが、これらに限定されるわけではない。
【０１９３】
本明細書において、「活性化される」とは、ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇの集団が刺激されて、Ｔｒｅｇの増殖が起こることを意味する。本明細書において、「増殖される」とは、ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇの集団の増殖が誘導されることを意味する。Ｔｒｅｇの集団の増殖は、たとえば、集団に存在するＴｒｅｇの数をカウントすることにより測定してもよい。Ｔｒｅｇの表現型は、フローサイトメトリーなど当該技術分野で周知の方法によって判定してもよい。
【０１９４】
前記Ｔｒｅｇは、前記方法の各工程の後に、特に増殖の後に、洗浄してもよい。
【０１９５】
本発明に係る改変されたＴｒｅｇ細胞の集団は、当業者に周知のいずれかの方法によって、たとえばＦＡＣＳや磁性ビーズ分離によって、さらに富化されてもよい。
【０１９６】
作製方法の工程は、閉鎖された無菌の細胞培養系で行われてもよい。
【０１９７】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。それらは、一本鎖または二本鎖であってもよい。多数の様々なポリヌクレオチドが、遺伝子コードの退化の結果、同じポリペプチドをコードできるポリヌクレオチドが数多く様々あることを、当業者は理解しているであろう。さらに、当業者が常用手技を使用して、本発明のポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換基を作り、本発明のポリペプチドが発現される特定の宿主個体のコドン使用を反映させてもよいことが、理解されるであろう。
【０１９８】
前記ポリヌクレオチドは、当該技術分野で利用可能な任意の方法で改変してもよい。本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性を向上し、または寿命を伸ばすために、かかる改変を行ってもよい。
【０１９９】
ＤＮＡポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドは、遺伝子組換え、合成、または当業者が利用可能な任意の手段によって作製してもよい。標準的な技術でポリヌクレオチドのクローンを作ってもよい。
【０２００】
より長いポリヌクレオチドは、一般的に、遺伝子組換え手段を使用して、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を使用して作製されるだろう。これは、クローンを作りたい標的配列の横に並べた一対のプライマー（たとえば、約１５〜３０個のヌクレオチドのもの）を作り、前記プライマーを動物またはヒトの細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらすような条件でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片を単離し（たとえば、アガロースゲルで反応混合物を精製することにより）、増幅されたＤＮＡを回収することを含むだろう。前記プライマーは、増幅されたＤＮＡが好適なベクターにクローニングされるように、好適な制限酵素認識部位を含むように設計されてもよい。
【０２０１】
当該ポリヌクレオチドは、選択可能なマーカーをコードする核酸配列を、さらに含んでもよい。好適に選択可能なマーカーは、当該技術分野において周知であり、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質を含むが、これらに限定されるわけではない。好適には、前記選択可能なマーカーは、たとえばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｄｓＲｅｄ、またはこれらの変異体などの蛍光蛋白質であってもよい。いくつかの実施形態において、前記蛍光蛋白質は、ＧＦＰ、またはＧＦＰ変異体である。選択可能マーカーをコードする核酸配列は、核酸コンストラクトの形態で当該ＣＡＲをコードする核酸配列との組み合わせで提供される。かかる核酸コンストラクトは、ベクターに提供されてもよい。
【０２０２】
好適には、前記選択可能マーカー／レポータードメインは、ルシフェラーゼ系レポーター、ＰＥＴレポーター（たとえば、ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、または膜タンパク質（たとえば、ＣＤ３４、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ））であってもよい。
前記ＣＡＲをコードする核酸配列と選択可能マーカーとは、共発現部位によって分離されてもよく、それにより各ポリペプチドが個々の実体として発現することが可能になる。好適な共発現部位は当該技術分野で周知であり、たとえば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）や自己切断ペプチドがある。
【０２０３】
さらに好適な共発現部位／配列は、自己切断（ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ）ドメイン、または切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）ドメインを含む。かかる配列は、タンパク質作製中に自己切断するか、または細胞中に存在する一般的な酵素により切断されてもよい。したがって、ポリペプチド配列中にかかる自己切断（ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ）ドメインまたは切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）ドメインを含むことにより、第一および第二のポリペプチドが単一のポリペプチドとして発現されるようにでき、前記単一のポリペプチドがその後切断されて、個々の機能的なポリペプチドになる。
【０２０４】
好適な自己切断（ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ）ドメインまたは切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）ドメインには、配列番号４６〜５１として示されるものがあるが、それらに限定されるわけではない。
（配列番号４６）Ｐ２Ａペプチド−切断ドメイン：ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
（配列番号４７）Ｔ２Ａペプチド−切断ドメイン：ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
（配列番号４８）Ｅ２Ａペプチド−切断ドメイン：ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
（配列番号４９）Ｆ２Ａペプチド−切断ドメイン：ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
（配列番号５０）フューリン部位−切断ドメイン：ＲＸＸＲ（優先的には、ＲＲＫＲ−配列番号５１）
【０２０５】
選択可能マーカーを使用することにより、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターが（コードされているＣＡＲが発現するように）導入されているＴｒｅｇを、たとえばフローサイトメトリーなどの一般的な方法を使用して開始細胞集団から選択し単離できるので、選択可能マーカーの使用が有利である。
【０２０６】
コドン最適化
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。コドン最適化は、以前より、ＷＯ１９９９／４１３９７およびＷＯ２００１／７９５１８に記載されている。細胞が異なっていれば、特定のコドンの使用も異なる。このコドンバイアスは、細胞タイプにおける特定のｔＲＮＡの相対的存在量の偏りに対応している。配列中のコドンを変えて、対応するｔＲＮＡの相対的存在量に合うようにコドンを適合させることにより、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞タイプにおいて少ないとわかっているコドンを故意に選択することによって、発現を減少させることが可能である。このように、翻訳調節の度合いをさらに増やすこともできる。
【０２０７】
ベクター
ベクターは、１つの環境から別の環境へのある実体の移動を可能にする、または容易にするツールである。本発明によれば、例として、組換え核酸技術に使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（たとえば、異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント）などの実体を、標的細胞に移動させることができる。ベクターは、非ウイルス性であってもよいし、ウイルス性であってもよい。組換え核酸技術に使用されるベクトルの例としては、プラスミド、ｍＲＮＡ分子（たとえば、インビトロ転写ｍＲＮＡ）、染色体、人工染色体およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ベクターはまた、たとえば、ネイキッド核酸（たとえば、ＤＮＡ）であってもよい。もっとも単純な形態では、ベクターそれ自体が、目的のヌクレオチドであってもよい。
【０２０８】
本発明で使用されるベクターは、たとえば、プラスミド、ｍＲＮＡ、またはウイルスベクターであってもよく、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、場合によってはそのプロモーターのレギュレーターを含んでもよい。
【０２０９】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、形質転換や形質導入など、当該技術分野で周知の様々な技術を使用して細胞に導入してもよい。いくつかの技術が、当該技術分野で周知である。たとえば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターを使用した感染、核酸の直接注入や、遺伝子銃形質転換である。
【０２１０】
非ウイルス送達システムには、ＤＮＡ導入法などがあるが、これらに限定されるわけではない。なお、遺伝子導入は、遺伝子を標的細胞へ送達するための非ウイルスベクターを使用したプロセスを含む。非ウイルス送達システムは、リポソームまたは両親媒性細胞浸透性ペプチド、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドと複合されたものを含むことができる。
【０２１１】
典型的な遺伝子導入法としては、エレクトロポレーション、ＤＮＡ遺伝子銃、脂質媒介トランスフェクション、圧縮ＤＮＡ媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクション、カチオン性薬剤媒介トランスフェクション、カチオン性表面両親媒性物質（ＣＦＡｓ）（Nat. Biotechnol. (1996) 14: 556）、および、これらの組み合わせがある。
【０２１２】
たとえば本発明の異なる複数のＣＡＲをコードするベクター、または、本発明のＣＡＲと、さらに別のポリペプチドとをコードするベクターなど、複数のベクターが、形質導入／遺伝子導入に使用できるであろう。
【０２１３】
細胞作製方法
ウイルスベクターを用いた形質導入や、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いた遺伝子導入などの多数の手段のうちのひとつによって、本明細書で定義されたＣＡＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することにより、本発明の改変されたＴｒｅｇが生成されてもよい。
本発明の細胞は、本明細書において定義されたポリヌクレオチドまたはベクターを細胞に（たとえば、形質導入または遺伝子導入によって）導入することにより、作製される。
好適には、前記細胞は、対象から単離されたサンプル由来であってもよい。
【０２１４】
本発明の改変されたＴｒｅｇは、下記工程を含む方法によって生成されてもよい。
（ｉ）対象から細胞含有サンプルを単離する、または細胞含有サンプルを得る工      程；および
（ｉｉ）前記細胞含有サンプルに、ポリヌクレオチド、核酸、または本発明のＣＡＲをコードするベクターを形質導入または遺伝子導入し、改変された細胞の集団を得る工程。
【０２１５】
好適には、前記方法の工程（ｉｉ）の前、および／またはその後に、Ｔｒｅｇ富化サンプルを、細胞含有サンプルから単離し、富化し、および／または細胞含有サンプルから生成してもよい。たとえば、Ｔｒｅｇの単離、富化、および／または生成は、工程（ｉｉ）の前に、および／またはその後に行って、Ｔｒｅｇ富化サンプルを単離し、富化し、および／または生成してもよい。本発明のＣＡＲ、ポリヌクレオチド、および／またはベクターを含む細胞および／またはＴｒｅｇについて富化を行うために、工程（ｉｉ）の後に単離および／または富化を行ってもよい。
【０２１６】
Ｔｒｅｇ富化サンプルは、当業者に周知のいずれかの方法によって、たとえばＦＡＣＳおよび／または磁性ビーズ分離によって、単離または富化されてもよい。Ｔｒｅｇ富化サンプルは、当業者に周知のいずれかの方法によって、細胞含有サンプルから生成されてもよく、たとえば、ＦＯＸＰ３をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによりＴｃｏｎ細胞から、および／または誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエクスビボ分化から、生成されてもよい。
好適には、前記細胞は、本明細書において定義されるようなＴｒｅｇである。
【０２１７】
好適には、本発明の改変されたＴｒｅｇは、下記工程を含む方法によって生成されてもよい。
（ｉ）対象からＴｒｅｇ富化サンプルを単離する、またはＴｒｅｇ富化サンプルを得る工程；および
（ｉｉ）前記Ｔｒｅｇ富化サンプルに、ポリヌクレオチド、核酸、または本発明のＣＡＲをコードするベクターを形質導入または遺伝子導入し、本発明に係る改変されたＴｒｅｇ細胞の集団を提供する工程。
【０２１８】
この開示は、本明細書に開示する前記例示の方法や材料によって制限されず、本明細書に記載された方法や材料と類似の、または等価の方法や材料を、この開示の実施形態の実施や試験に使用できる。数の範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に断らない限り、核酸は左から右へ、５'から３'の方向に、アミノ酸配列は左から右へ、アミノからカルボキシの方向にそれぞれ書く。
【０２１９】
値の範囲が提供されている場合、文脈において明確に別段の指示がない限り下限値の単位の１０分の１まで（to the tenth of the unit of the lower limit）、その範囲の上限値と下限値の間の各中間の値もまた特に開示されていると理解されたい。いずれかの記載された値、または記載された範囲の中間の値と、その他の記載された値、または前記記載の範囲の中間の値との間の、より狭い範囲の各々も、当該開示に包含される。これらのより狭い範囲の上限値および下限値は、その範囲に独立して含まれても、または除外されてもよく、境界値のどちらかがより狭い範囲に含まれる場合、境界値のどちらも含まれない場合、またはどちらも含まれる場合の各範囲も本開示に包含され、示された範囲内でいずれかの明確に除外された境界値に従う。示された範囲が境界値の一方または両方を含む場合、含まれる境界値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【０２２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈において明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【０２２１】
本明細書における「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ（含む）」という用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ（含有する）」の同義語で、包括的または非限定的であり、記載されていない付加の部材や素子、方法の工程を除外するものではない。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ（含む）」という用語はまた、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（から成る）」という用語も含む。
【０２２２】
本明細書で論じられる出版物は、本願の出願日の前の開示を単に提供する。本明細書のいずれの記載も、かかる出版物が添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成していると認めるものとして解釈されはしない。
【０２２３】
本発明を実施例によりさらに説明するが、これは本発明を実施する際に当業者を支援するためのものであり、本発明の範囲を制限することを意図していない。
本発明を実施例によりさらに説明するが、これは本発明を実施する際に当業者を支援するためのものであり、本発明の範囲を制限することを意図していない。
【０２２４】
実施例
実施例１−抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの生成
ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏｗ細胞を単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。活性化の３日後、ＴｒｅｇにＨＬＡ．Ａ２−ＣＡＲ（図２に図示）とＧＦＰレポーター遺伝子とを含むレンチウイルスを形質導入した。ポリクローナル活性化の後の全Ｔｒｅｇの細胞増殖は、形質導入されたＴｒｅｇと形質導入されていないＴｒｅｇとでは、ほとんど差異が示されなかった（図３）。
【０２２５】
実施例２−抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒコンストラクトの形質導入の効果の経時的定量化
ＣＡＲコンストラクトが形質導入されていないＴｒｅｇと、ＣＡＲコンストラクトを形質導入したＴｒｅｇとについて、ＧＦＰ発現を、細胞活性化後の異なる時点で解析した。
【０２２６】
ＧＦＰ＋細胞の頻度を解析し、Ｔｒｅｇ増殖期間にわたって様々なコンストラクトの形質導入の効果と発現の持続性を評価した。ｄＣＡＲ、ＣＤ２８ｚ、コンストラクト１、２、および３を含むＴｒｅｇは、形質導入後、同様の発現頻度を示した。Ｔｒｅｇ全体におけるＧＦＰ＋細胞の割合は、ポリクローナル細胞増殖のあいだ、維持された（図４）。
【０２２７】
実施例３−形質導入されたＴｒｅｇの抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲコンストラクトの細胞表面発現の定量化
形質導入されていないＴｒｅｇでの、および形質導入されたＴｒｅｇでの、ＣＡＲコンストラクトの膜発現を、ＰＥコンジュゲートＨＬＡ−Ａ*０２０１／ＣＩＮＧＶＣＷＴＶデキストラマー（Ｉｍｍｕｄｅｘ、デンマーク、コペンハーゲン）によって解析した。細胞表面にあるＣＡＲタンパク質（ＨＬＡ−Ａ２デキストラマー+）を発現するＴｒｅｇの頻度は、コンストラクトすべてにおいて同様であった（図５）。
【０２２８】
実施例４−ポリクローナル細胞増殖後のＣＡＲ Ｔｒｅｇの表現型の特性評価
抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズおよびＩＬ−２の存在下で１５日間、Ｔｒｅｇを培養し増殖させた。Ｔｒｅｇ関連マーカーＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＣＴＬＡ４、およびＴＩＧＩＴを、形質導入されていないＴｒｅｇと、形質導入されたＴｒｅｇとについてＦＡＣＳにより解析し、培養１５日目の表現型の系統安定性を調査した。
形質導入されていないものと、ＣＡＲ形質導入されたものとは、Ｔｒｅｇ系統に関連したタンパク質の発現レベルとポリクローナル増殖後の機能のレベルが同程度であった（図６）。
【０２２９】
実施例５−抗ＨＬＡ．Ａ２ ＩＬ２Ｒ ＣＡＲ Ｔｒｅｇの抗原特異性の評価
形質導入されていないＴｒｅｇと、形質導入されたＴｒｅｇとを、異なる刺激の存在下で１８時間培養した。ＣＤ６９とＣＤ１３７活性化マーカーを解析し、特異的な細胞活性化と非特異的な細胞活性化とを調べた。
ＣＤ２８ｚ、コンストラクト１、コンストラクト２、コンストラクト３、ＣＡＲを形質導入したＴｒｅｇは、Ｔ細胞活性化マーカーの発現に基づくと、ＨＬＡ−Ａ２分子に対して同様の特異性を示した。ＣＤ６９およびＣＤ１３７の発現は、不活性化細胞で、またはＨＬＡ−Ａ１発現細胞との培養後、増加しなかった。ｄＣＡＲコンストラクトは、シグナリングエンドドメインが無いため、活性化を示さなかった（図７）。
【０２３０】
実施例６−ＩＬ２Ｒ ＣＡＲシグナリングの指標としてのＳＴＡＴ５リン酸化解析
形質導入されたＣＡＲ Ｔｒｅｇを、ＩＬ２を含まない培地に一晩置いた。培地のみでの培養、１０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２での培養、ＨＬＡ．Ａ２−Ｉｇ系人工ＡＰＣ（ＤＯＩ：１０．３７９１／２８０１に記載のプロトコルに従い作製）の存在下での培養の１０分後および１２０分後、ＦＡＣＳ解析によりＴｒｅｇのＳＴＡＴ５リン酸化を調べた。
ＩＬ２ＲエンドドメインのＣＡＲコンストラクトへの導入は、ＨＬＡ−Ａ２分子によるＣＡＲ活性化後に効率的なＳＴＡＴ５のリン酸化を示した。ＨＬＡ−Ａ２ビーズを使用した培養後、ＩＬ２Ｒエンドドメインの無いＣＡＲ−Ｔｒｅｇ上では、ｐＳＴＡＴ５の有意の増加は検出されなかった（図８）。
【０２３１】
実施例７−ＩＬ−２の非存在下での非特異的活性化およびＨＬＡ．Ａ２特異的活性化後のＴｒｅｇ生存の評価
抗ＣＤ３／２８活性化ビーズおよびＫ５６２．Ａ２発現細胞を使用して、ＩＬ−２の非存在下で、異なるコンストラクトでのＣＡＲ形質導入Ｔｒｅｇｓを培養した。ＦＡＣＳ解析により活性化の７日後に細胞の生存を調べた。
ＨＬＡ−Ａ２発現細胞との細胞培養の後、ＩＬ２Ｒエンドドメインを含むＣＡＲコンストラクトを発現したＴｒｅｇｓは、基準のＣＤ２８ｚと比較して、細胞の生存率の増大を示した。Ｔｒｅｇのポリクローナル活性化後は、この差異が見られず、これは前記効果がＣＡＲシグナリングに依存していることを示している（図９）。
【０２３２】
実施例８−Ｔｒｅｇ抑制能試験：Ｂ細胞に対する共刺激分子の調節の解析によるＴｒｅｇの免疫調節機能の評価
Ｔｒｅｇとの共存培養後の、Ｂ細胞のＣＤ８０およびＣＤ８６発現を解析し、抗原提示細胞での共刺激分子の発現を低減するＴｒｅｇの能力を評価した。
ＣＤ２８ｚ、コンストラクト１、コンストラクト２、ＣＡＲを発現するＴｒｅｇは、形質導入されていないＴｒｅｇやｄＣＡＲ発現Ｔｒｅｇと比較して、抑制機能が大きいことを示した。Ｂ細胞でのＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は、ＣＡＲ分子を介してシグナリングするＴｒｅｇと培養した後にのみ、減少している（図１０）。
【０２３３】
本明細書で言及された刊行物はすべて、この参照により本明細書に援用される。本発明の範囲と趣旨を逸脱しない、本明細書に記載された本発明の方法や機構の様々な変更および変形が、当業者に明らかであろう。本発明は特定の好適な実施形態に関連して記載されているが、請求項に記載されている発明が、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。分子生物学や関連する分野の当業者に自明である、本発明を実施するための上述の形態の様々な変更は、下記の請求項の範囲内のものとする。
【図１】
2021536237.tif 000004
【図２】
2021536237.tif 000005
【図３】
2021536237.tif 000006
【図４Ａ】
2021536237.tif 000007
【図４Ｂ】
2021536237.tif 000008
【図４Ｃ】
2021536237.tif 000009
【図５Ａ】
2021536237.tif 000010
【図５Ｂ】
2021536237.tif 000011
【図６−１】
2021536237.tif 000012
【図６−２】
2021536237.tif 000013
【図７Ａ−１】
2021536237.tif 000014
【図７Ａ−２】
2021536237.tif 000015
【図７Ｂ】
2021536237.tif 000016
【図７Ｃ】
2021536237.tif 000017
【図８Ａ−１】
2021536237.tif 000018
【図８Ａ−２】
2021536237.tif 000019
【図８Ｂ】
2021536237.tif 000020
【図９Ａ】
2021536237.tif 000021
【図９Ｂ】
2021536237.tif 000022
【図１０】
2021536237.tif 000023
【配列表】
2021536237000001.app
【国際調査報告】
2021536237.tif 000024
2021536237.tif 000025
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