(57)【要約】本発明は、医学的応用に関するものであり、腫瘍学、ならびに神経外科、外傷学、神経学、リハビリテーションで使用することができる。  請求される発明の目的は、外部からの曝露（交流磁場、加熱など）を適用しないで、腫瘍組織の破壊と復元された生体組織による置換の両方に利益をもたらす、生体組織上での局所曝露の新規な方法および新規な組織置換アプリケーターの作成である。  目的は、細胞増殖抑制物質として多孔質ポリテトラフルオロエチレンを使用することによって解決される。  目的はまた、腫瘍組織を治療または置換するための組織置換アプリケーターの製造に多孔質ポリテトラフルオロエチレンを使用することによっても達成される。  曝露される生体組織と直接接触する組織置換ポリマーアプリケーターの配置を含む、生体組織への局所曝露方法の目的は、構成ポリマー材料に多孔質ポリテトラフルオロエチレンを使用することで解決される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質ポリテトラフルオロエチレンを構成ポリマー材料として使用することを特徴とする、組織置換ポリマーアプリケーターを、曝露される生体組織と直接接触させて配置することを含む、生体組織への局所曝露の方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記曝露される生体組織は腫瘍組織が使用されることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、腫瘍周囲の生体組織が曝露されることを特徴とする、方法。
【請求項４】
腫瘍組織と直接接触して配置される組織置換ポリマーアプリケーターであって、そのようなアプリケーターがＰＴＦＥで作られていることを特徴とする、組織置換ポリマーアプリケーター。
【請求項５】
細胞増殖抑制物質としての多孔質ポリテトラフルオロエチレンの適用。
【請求項６】
腫瘍組織を治療または置換するための組織置換アプリケーターの製造における多孔質ポリテトラフルオロエチレンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学的応用に関するものであり、腫瘍学、ならびに神経外科、外傷学、神経学、リハビリテーションで使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子の腫瘍内注射を含む腫瘍性疾患を治療する方法はよく知られている。例えば、リポソームの適用−表面を化学修飾して標的組織への親和性を実現できる人工リン脂質二重層膜が知られている。したがって、正の表面電荷を持つリポソームは、中性に帯電したマグネトリポソームと比較して、ラット神経膠腫細胞に対して１０倍高い親和性を有している（Shinkai M., Yanase M., Honda H., Wakabayashi T., Yoshida J., Kobayashi T. Intracellular hyperthermia for cancer using magnetite cationic liposome: in vitro study. // Jpn. J. Cancer Res. 1996. V. 87. P. 1179-1183）。腫瘍組織に皮下注射されたマグニトカチオン性リポソームを使用した温熱療法は、マウスのＢ−１６黒色腫、ラットのＴ−９神経膠腫、ハムスターのＯｓ５１５骨肉腫、ウサギの舌のＶＸ−７扁平上皮がんなど、様々な種類の腫瘍を持つ動物において有効であることが証明された（Yanase M., Shinkai M., Honda H., Wakabayashi T., Yoshida J., Kobayashi, T. Antitumor immunity induction by intracellular hyperthermia using magnetite cationic liposomes. // Jpn. J. Cancer Res. 1998. V. 89. P. 775-782; Matsuno H., Tohnai I., Mitsudo K., Hayashi Y., Ito M., Shinkai M., Kobayashi T., Yoshida J., Ueda M. Interstitial hyperthermia using magnetite cationic liposomes inhibit to tumor growth of VX-7 transplanted tumor in rabbit tongue. // Jpn. J. Hyperthermic Oncol. 2001. V. 17. P. 141-149; Suzuki M., Shinkai M., Honda H., Kobayashi T. Anticancer effect and immune induction by hyperthermia of malignant melanoma using magnetite cationic liposomes. // Melanoma Res. 2003. V. 13. P. 129-135; Matsuoka F., Shinkai M., Honda H., Kubo T., Sugita T., Kobayashi, T. Hyperthermia using magnetite cationic liposomes for hamster osteosarcoma. Biomagn. // Res. Technol. 2004, No. 2. P. 3.）。腫瘍の完全な退縮を達成するためには、動物を交互に磁場に複数回曝露することが不可欠であり、伊藤らはこの方法を用いて１５ｍｍ以上の大きさの乳腺がんをマウスで完全に退縮させることに成功している（Ito A., Shinkai M., Honda H., Wakabayashi T., Yoshida J., Kobayashi, T. Augmentation of MHC class I antigen presentation via heat shock protein expression by hyperthermia. // Cancer Immmunol. Immunother. 2001.V. 50. P. 515-522）。
【０００３】
粒子（好ましくはナノサイズ）を腫瘍に導入し、次いで磁場または電磁場の外部印加による局所的な温度上昇を行い、悪性組織の正確な温熱破壊を効果的に行うための様々な方法が開発されている（ロシア特許第２５０６９７１号、２０１４年２月２０日公開；米国特許第６９９７８６３号、２００６年２月１４日公開；米国特許第８１１９１６５号、２０１２年２月２１日公開）。研究領域は、単純でレオロジー的に複雑な流体に浮遊し、高強度と高勾配の磁場（磁気ヒステリシスを持つ微粒子のエネルギー吸収による誘電体の体積電磁加熱、特に、悪性腫瘍の局所強磁性体温熱の実証）によって励起される、さまざまな性質の磁性微粒子システム（生細胞や強磁性粒子を含む反磁性および常磁性粒子）におけるメソメカニクスとエネルギー散逸に関係している。９ｎｍのＦｅ０．５Ｚｎ０．５Ｆｅ２Ｏ４ナノ粒子の適用は、マウス黒色腫モデルで外部磁場の影響下での効果的な温度上昇を伴わない（Heidari M, Sattarahmady N, Javadpour S, Azarpira N, Heli H, Mehdizadeh A, Rajaei A, Zare T. Effect of Magnetic Fluid Hyperthermia on Implanted Melanoma in Mouse Models// Iran J Med Sci. 2016 Jul; 41(4): 314-321. PMCID: PMC4912650）。したがって、抗腫瘍効果は粒子のサイズと比表面積に依存する（分子の数はサイズが小さくなると増加するが、表面積は増加する）（Choi KH, Nam KC, Malkinski L, Choi EH, Jung JS, Park BJ. Size-Dependent Photodynamic Anticancer Activity of Biocompatible Multifunctional Magnetic Submicron Particles in Prostate Cancer Cells// Molecules. 2016 Sep 6;21(9). pii: E1187. doi: 10.3390/molecules21091187）。
【０００４】
ナノ粒子の生体適合性は、サイズ、溶液中のζ電位、疎水性に依存する。疎水性粒子は、肝臓や脾臓によって体から急速に排出されるため、血流中の寿命が非常に短い。概略的に、粒子抽出経路は次のように表すことができる：サイズ８ｎｍ未満の粒子は腎臓により排出され、２００ｎｍより大きいサイズの粒子は肝臓、脾臓により排出され、〜３０ｎｍは胆管によって排泄されるが、肺に蓄積され、３０〜２００ｎｍの大きさの粒子は、「浸透と保持の強化」（ＥＰＲ効果）というメカニズムのもとで、腫瘍部位に受動的に蓄積する。これは、腫瘍の血流の増加とリンパ液の排出の減少によるものである。正の表面電荷を持つ粒子が存在する場合、カチオン性粒子はほとんどの場合有毒であり、溶血や赤血球の凝集を引き起こす（https://biomolecula.ru/articles/nevidimaia-granitsa-gde-stalkivaiutsia-nano-i-bio）。
【０００５】
このような治療方法は、腫瘍領域内の血流が活発であるために、これらの粒子が血流によって速やかに除去されることを引き起こすため、むしろ効果的ではない。しかし、これらのナノ粒子は体内に残るため、一般的には生体内からナノ粒子を除去することは燃焼の問題である。
【０００６】
ナノ材料は、自己組織化および自己組織化特性を特徴とすることが証明されている。自己組織化中の調整過程は、分子性のさまざまな相互作用力、つまり、親水性−疎水性相互作用、重力、ファンデルワールス、またはクーロン相互作用の競合効果によって制御される。秩序化された超分子構造または媒体が形成される過程では、結果として得られる複雑な構造をその積分部分として付加するか、または「収集する」初期構造成分のみが、本質的に変化しない形態として参加することができる。自己組織化は、元のソースシステムと比較して、より高い階層的組織レベルで複雑な「テンプレート」、プロセス、構造を作成するためのメカニズムとして使用することができるが、これは、ローカルな相互作用の法則を含む低レベルでの成分の多数かつ多変量の相互作用のためであり、結果として生じるアーキテクチャの集合的な行動法則とは異なる。生体内でのナノ粒子の構造は、毒性効果が支配的な要因となって、多数の機能変化をもたらす。ナノ粒子の毒性は、偶然にもこの疑う余地のない事実を定期的に抑制しながら、診断および治療の分野におけるそれらの幅広い適用を制限している。
【０００７】
その特定の特性のため、ナノ粒子は、排泄系（血液および／またはリンパ管内）において、結合してマイクロメートルサイズの凝集体を形成する傾向がある。
【０００８】
請求される方法および請求される組織置換アプリケーターに対する最も近い先行技術文献は、ロシア特許第２４９７４８９号、２０１３年１０月１１日公開であり、ここで、生体組織への局所曝露の方法は、２００〜１０００μｍのサイズの導電性強磁性粒子を添加したポリマー材料からなる組織置換アプリケーターを、曝露される生体組織と直接接触させて配置する段階を組み込んでいる。次に、交替ＨＦ磁場印加による組織置換アプリケーターと隣接する生体組織の誘導加熱が行われ、腫瘍組織を破壊するための温熱効果を生じさせる。
【０００９】
これらの技術的解決策の欠点は、第一に、腫瘍細胞を加熱して破壊する際に、腫瘍誘導剤が隣接する組織に拡散する可能性があるという影響を含む。
【００１０】
さらに、腫瘍組織の崩壊は、毒性物質の濃度を上昇させ、これを体内から除去するのはかなり困難である。毒性曝露を最小化するために、作業者は、細胞レベルおよび排泄器官レベル（腎臓および肝臓）でのリンパ系および循環系の排泄能力を考慮して、破壊される組織の体積を計算し、曝露面積を最小化しようとする。可能であれば、破壊された組織は、例えば洗浄によって除去される。
【００１１】
この方法のもう１つの欠点は、その実装に必要な機器の複雑さである。
【発明の概要】
【００１２】
請求される発明の目的は、外部からの曝露（交流磁場、加熱など）を適用しないで、腫瘍組織の破壊と復元された生体組織による置換の両方に利益をもたらす、生体組織上での局所曝露の新規な方法および新規な組織置換アプリケーターの作成である。
【００１３】
曝露される生体組織と直接接触する組織置換ポリマーアプリケーターの配置を含む、生体組織への局所曝露方法の目的は、構成ポリマー材料に多孔質ポリテトラフルオロエチレンを使用することで解決される。
【００１４】
この方法の枠組みの中で、腫瘍生体組織と周囲の生体組織の両方に曝露を適用することが可能である。
【００１５】
組織置換ポリマーアプリケーターが腫瘍組織と直接接触するように配置する目的は、構成材料に多孔質ポリテトラフルオロエチレンを適用することで解決される。
【００１６】
ナノ粒子の腫瘍からの脱出を抑制するためのリソースを研究する際、著者らは、導電性強磁性ナノ粒子の構成ポリマー担体に多孔質ポリテトラフルオロエチレン（以下、ＰＴＦＥ）を選択し、腫瘍組織がＰＴＦＥの細孔に発芽して粒子を近くに保持し、血流によるナノ粒子の脱出を抑制することを期待した。しかし、これらの研究の過程で、多孔質ＰＴＦＥの細胞増殖抑制特性も検出された。
【００１７】
したがって、細胞増殖抑制物質として多孔質ポリテトラフルオロエチレンを使用することにより、目的は解決された。
【００１８】
目的は、腫瘍組織を治療または置換するための組織置換アプリケーターの製造に多孔質ポリテトラフルオロエチレンを使用することによっても達成された。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明は、以下の非限定的な図面で詳細に説明される。
【図１】図１は、請求される組織置換アプリケーターの略図を示す。
【図２−３】図２および３は、腫瘍細胞培養（この場合は神経膠腫）に対する多孔質ＰＴＦＥの効果のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の結果を示す。
【図４−５】図４および５は、健康な細胞培養（この場合は線維芽細胞）に対する多孔質ＰＴＦＥの効果のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の結果を示す。
【図６−８】図６〜８は、試験後３０日目の雄のウィスターラットの大脳皮質感覚運動切片の画像を示す：ａ）神経膠腫細胞の異種移植後３０日目の雄のウィスターラットの大脳皮質感覚運動切片の画像、ｂ）異種移植神経膠腫細胞と直接接触した多孔質ＰＴＦＥ移植後３０日目の雄のウィスターラットの大脳皮質感覚運動切片の画像、ｃ）多孔質ＰＴＦＥ移植後３０日目の雄のウィスターラットの大脳皮質感覚運動切片の画像。
【図９−１０】図９および１０は、試験後４ヶ月の雄のウィスターラットの大脳皮質感覚運動切片の画像を示す：ａ）異種移植された神経膠腫細胞と直接接触した多孔質ＰＴＦＥ移植後４ヶ月の雄のウィスターラットの大脳皮質感覚運動切片の画像、ｂ）多孔質ＰＴＦＥ移植後４ヶ月の雄のウィスターラットの大脳皮質感覚運動切片の画像。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
請求される組織置換アプリケーター１（図１を参照）は、例えば、ベラルーシ特許第１０３２５号、２００８年２月２８日公開に記載された方法により製造することができる。組織置換多孔質ＰＴＦＥアプリケーターは、原材料の顆粒を多孔質顆粒（塩化ナトリウム）と混合する工程、得られた混合物を圧縮する工程、得られた多孔質プリフォームから塩化ナトリウムの残留物を洗浄する工程、続いて焼結する工程によって作られる。この場合、粉砕された形状の多孔質顆粒を使用することにより、複雑な細孔構造が得られる。デッドエンド型の細孔の寸法は、微細な多孔質体の顆粒のサイズに依存し、オープン型の細孔の寸法は、多孔質体のより大きな画分の顆粒のサイズによって決定される。
【００２１】
請求される方法、組織置換アプリケーターおよびＰＴＦＥの性能の実現可能性と有効性をテストするために、以下の例に示すように、動物テストが実施された。
【００２２】
実施例
実施例１
腫瘍および健康な細胞に対する多孔質ＰＴＦＥ細胞毒性を測定するために、２つのシリーズのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験が行われた。
【００２３】
第１シリーズ
腫瘍細胞を培地（この研究ではＣ６神経膠腫）に導入した。１つの培地部分は参照用にそのまま残し、もう１つは多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターを配置した。
【００２４】
４８時間の追跡後、次の写真が撮影された。
−Ｃ６神経膠腫無傷細胞分布（図２ａ、７０±３％コンフルエンス）および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターの配置後のＣ６神経膠腫細胞分布（図２ｂ、２０±４％コンフルエンス）；
−Ｃ６神経膠腫無傷細胞単層、トリパンブルー染色（図３ａ、Ｃ６神経膠腫無傷細胞生存率−９０±３％）、および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターを備えたＣ６神経膠腫細胞単層（図３ｂ、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターでのＣ６神経膠腫細胞の生存率−５５±３％）
【００２５】
したがって、このシリーズの試験中に、多孔質ＰＴＦＥはＣ６神経膠腫細胞培養に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示すことがわかった。
【００２６】
第２シリーズ
健康な細胞を培地（この研究では、線維芽細胞）に導入した。１つの培地部分は参照用にそのまま残し、もう１つは多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターを配置した。
【００２７】
４８時間の追跡後、次の写真が撮影された。
−無傷の線維芽細胞の分布（図４ａ、５３±３％コンフルエンス）および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターの配置後の線維芽細胞の分布（図４ｂ、３５±４％コンフルエンス）；
−無傷の線維芽細胞単層、トリパンブルー染色（図５ａ、無傷の線維芽細胞の生存率−９９±３％）、および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターを備えた線維芽細胞単層（図５ｂ、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターを備えた線維芽細胞生存率−９８±３％）。
【００２８】
したがって、このシリーズの試験中に、多孔質ＰＴＦＥは健康な細胞、特に線維芽細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示さなかったことが報告された。
【００２９】
実施例２
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、ウィスターラットの大脳皮質テストに焦点を当て、３つのグループに分けられた：グループ１−Ｃ６神経膠腫異種移植片が感覚運動皮質に１ヶ月（３０日間）移植されたラット、グループ２−Ｃ６神経膠腫異種移植片と多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターが感覚運動皮質に１ヶ月（３０日間）移植されたラット、グループ３−多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターのみが感覚運動皮質に１ヶ月（３０日間）移植されたラット。
【００３０】
試験には、組織学的（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）、神経組織学的（ニッスル染色）および組織化学的調査方法（アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性検出）を適用した。
【００３１】
ウィスターラットの脳組織のクリオスタット切片をヘマトキシリン、エオシン、トルイジンブルーで染色した後、光学顕微鏡検査を行った。
【００３２】
図６ａは、Ｃ６神経膠腫異種移植片移植後３０日目のウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００３３】
Ｃ６神経膠腫は、高密度の多形性核を持つ小さな未分化細胞で構成されている。グリア組織は内部の血管を表している。ヘマトキシリンおよびエオシン染色；倍率２００倍。
【００３４】
３０日間の追跡の実験的Ｃ６神経膠腫を伴うラット脳横断切片の組織学的分析により、中程度の細胞多型を伴う多数の腫瘍細胞の存在が明らかになった。細胞は、細長い紡錘形の形、不規則な形の大きく暗い濃色の核、薄くてわずかに着色された細胞質層および短い突起を表した。複数の有糸分裂と空胞化の病巣があった。細胞塊の内部では、さまざまなサイズの血管と、新しく形成された小さな毛細血管が検出された。
【００３５】
図６ｂは、Ｃ６神経膠腫異種移植片および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターの配置後３０日目のウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００３６】
腫瘍組織内の多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター。周囲のグリアのわずかな反応性腫脹と低分化腫瘍細胞の蓄積がある。組織置換アプリケーターをグリアカプセルに封入した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色；倍率２００倍。
【００３７】
移植後３０日目の実験的Ｃ６神経膠腫と組織置換アプリケーターを持つラット脳横切片の組織学的分析は、合成材料の周りの神経膠真皮被膜の形成、および、低分化細胞のクラスターに囲まれて、腫瘍崩壊の病巣とみなすことができる隣接する領域の透明な領域−「仮性パリセード」が明らかとなった。
【００３８】
図６ｃは、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターの移植後３０日目のウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００３９】
脳灰白質に移植された多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター。ヘマトキシリンおよびエオシン染色；倍率２００倍。
【００４０】
組織置換アプリケーター移植の領域は、繊維が物質の孔に発芽する緩い神経膠真皮組織と、組織置換アプリケーターを囲むグリア嚢とからなる柔らかい瘢痕の形成を明らかにした。移植された材料の表面の一部の領域では、隣接する大脳皮質に明確な病巣が形成されたため、被嚢壁が薄くなった。これは、反応性浮腫の領域と考えることができる。線維芽細胞とグリア細胞のクラスターもそこで検出された。
【００４１】
ウィスターラットの脳組織のクリオスタット切片をニッスル染色に曝露し、神経組織の要素を特定するために調べた（倍率１００倍）。
【００４２】
図７ａは、Ｃ６神経膠腫異種移植片移植後３０日目のウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００４３】
脳灰白質のＣ６神経膠腫
【００４４】
図７ｂは、Ｃ６神経膠腫異種移植片および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター移植後３０日目のウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００４５】
腫瘍内部の多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター。組織置換アプリケーターを囲むグリアの中程度の反応性腫脹；小さな多形性腫瘍細胞の蓄積。
【００４６】
図７ｃは、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター移植後３０日目のウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００４７】
脳灰白質内のＰＴＦＥ合成素材。組織置換アプリケーター領域のグリア細胞の活性化。組織置換アプリケーターの周囲のグリア反応性の中程度の腫脹。
【００４８】
図８ａは、Ｃ６神経膠腫異種移植片移植後３０日目のウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００４９】
腫瘍内のＡＣｈＥ陽性神経線維；倍率４００倍。
【００５０】
Ｃ６神経膠腫は、多形核が密集した小さな未分化細胞によって表される。グリア組織は内部の血管を表している。これは、腫瘍プロセスの活性化の証拠となる。ループ状の集塊を形成するコリン作動性神経線維が血管系に沿って続く。
【００５１】
図８ｂは、Ｃ６神経膠腫異種移植片および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター移植後３０日目のウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００５２】
腫瘍内部のＰＴＦＥ移植領域のＡＣｈＥ陽性神経線維；倍率２００倍。多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターは、神経膠腫細胞の中程度の反応性浮腫を発症する傾向があります。小さな多形性未分化腫瘍細胞のクラスターは、特異な被嚢を形成すると報告されている。
【００５３】
コリン作動性神経線維は、腫瘍内部の血管系に沿って続くことが検出される。
【００５４】
図８ｃは、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターに続く３０日後のウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００５５】
脳灰白質内部のＰＴＦＥ移植領域におけるＡＣｈＥ陽性神経線維；倍率４００倍。
【００５６】
多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターの配置から１ヶ月後、移植領域に壊死は観察されなかったが、反応性浮腫が持続した。ミクログリア細胞の活性化に加えて、遠隔地の脳領域から組織置換アプリケーターに移動する中枢神経系のマクロファージの活性化が報告された。
【００５７】
アプリケーターを囲む灰白質領域は、血管に沿って続き、組織置換アプリケーターの細孔に浸透する神経線維のネットワークを表す。
【００５８】
結論：実験的Ｃ６神経膠腫のあるラットの大脳皮質に多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターを移植してから１ヶ月（３０日）後、組織置換アプリケーターの周囲の隣接領域に腫瘍崩壊の病巣が検出される。病巣近くでは、低分化腫瘍細胞の蓄積が観察され、続いて「仮性パリセード」形成が観察される。得られたデータは、大脳皮質に移植されたＰＴＦＥ材料が周囲の腫瘍組織の崩壊に有益であることを証明している可能性がある。
【００５９】
実施例３
感覚運動皮質に多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターまたはＣ６神経膠腫と多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターを移植した後の４ヶ月の追跡におけるウィスターラット脳組織の組織学的分析。
【００６０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、ウィスターラットの大脳皮質テストに焦点を当て、２つのグループに分けられた：グループ１−Ｃ６神経膠腫異種移植片と、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターが感覚運動皮質に４ヶ月間移植されたラット、グループ２−、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターのみを感覚運動皮質に４ヶ月間移植されたラット。
【００６１】
試験には、組織学的（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）、神経組織学的（ニッスル染色）および組織化学的調査方法（アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）活性検出）を適用した。
【００６２】
ウィスターラット脳組織のクリオスタット切片をヘマトキシリンとエオシン、トルイジンブルーで染色し、続いて光学顕微鏡検査を行った。組織構造決定のためのヘモトキシリンエオシン染色は、ヘマトキシリンを主染色として使用し、好塩基性細胞構造を明るい青色に染色し、アルコール性エオシンＹ溶液は、好酸球細胞構造を赤ピンク色に染色した。好塩基性構造とは、原則として核酸（ＤＮＡとＲＮＡ）を含む構造のことで、細胞核、リボソーム、細胞質のＲＮＡが多い部分を指す。好酸球構造には、細胞内および細胞外タンパク質、たとえばレビー小体が含まれる。細胞質は好酸球培地である。赤血球は常に明るい赤に染色される。
【００６３】
図９ａは、Ｃ６神経膠腫異種移植片および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター移植後４ヶ月でのウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００６４】
腫瘍組織崩壊の大きな病巣。ヘマトキシリンとエオシンで染色；倍率１００倍。
【００６５】
図９ｂは、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター移植後４ヶ月でのウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００６６】
実験用ラットの大脳皮質に外傷後に移植された多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター（４ヶ月）。脳欠損部の再生神経組織による置換（ＰＴＦＥ−暗褐色）。ヘマトキシリンとエオシンによる染色；倍率１００倍。
【００６７】
ウィスターラット脳組織のクリオスタット切片をニッスル法で染色し、神経組織の要素を特定するために試験した；倍率１００倍。
【００６８】
図１０ａは、Ｃ６神経膠腫異種移植片および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター移植後４ヶ月でのウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００６９】
実験用ラットの脳腫瘍組織に移植された多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター（４ヶ月）。腫瘍崩壊領域のミクログリア細胞。ニッスル染色；倍率１００倍。
【００７０】
図１０ｂは、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター移植後４ヶ月でのウィスターラット脳組織のクリオスタット切片を示す。
【００７１】
実験用ラットの大脳皮質に外傷後に埋め込まれた多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーター（４ヶ月）。損傷領域に移動するミクログリア細胞のクラスター。ニッスル染色；倍率１００倍。
【００７２】
結論：
実験ラットの腫瘍大脳皮質組織への移植後４ヶ月後、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターは、融解壊死の複数の小さな病巣と腫瘍組織崩壊の巨大な中心病巣の形成に利益をもたらし、それにより腫瘍の縮小をもたらす。
【００７３】
実験ラットの大脳皮質損傷領域への多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターの移植から４ヶ月後、組織置換アプリケーター内のコリン作動性神経線維の血管新生と発芽を伴う再生神経組織による欠陥置換が観察された。
【００７４】
腫瘍組織に移植された試験神経膠腫および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターを用いたラット脳切片の組織学的分析により、腫瘍の融解壊死の複数の小さな病巣とならびに４ヶ月の追跡後のアプリケーター領域における腫瘍組織崩壊の巨大な中心病巣が明らかになった。ミクログリア細胞は腫瘍崩壊の領域に移動した。腫瘍の残存領域では、細胞構造の多型、壊死性病変の兆候を伴う多数の多核巨細胞が報告された。実質組織が完全に破壊され、間質が部分的に保存された腫瘍領域が明らかになった。
【００７５】
多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターの移植領域では、腫瘍組織は新しく形成された血管に続く単一の細いコリン作動性神経線維を明らかにした。
【００７６】
大脳皮質の外傷後４ヶ月の実験ラット脳切片の組織学的分析、および多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターの移植後、焦点領域での修復過程の発達が実証された。大脳皮質の持続性浮腫の背景に、多孔質ＰＴＦＥ領域での星状細胞の増殖が認められ、組織置換アプリケーター線維の内部に蓄積した。そこでは、損傷領域に移動してマクロファージに変換されたミクログリア細胞のクラスターも検出された。多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターに隣接する大脳皮質再生領域で、血管新生プロセスが観察された。脳欠損部は完全に再生神経組織に置換された。
【００７７】
細いコリン作動性神経線維が、組織置換アプリケーターの内側の脳再生領域で明らかになった。これは、合成ＰＴＦＥ材料の細孔の間の血管に沿って続いた。
【００７８】
最終結論
実験用ラットの腫瘍大脳皮質組織への移植後４ヶ月後、多孔質ＰＴＦＥ組織置換アプリケーターは、融解壊死の複数の小さな病巣と腫瘍組織崩壊の巨大な中心病巣の形成に利益をもたらし、結果として腫瘍の縮小をもたらす。
【００７９】
実験ラットの大脳皮質損傷領域への多孔質ＰＴＦＥ組織代替アプリケーターの移植から４ヶ月後、組織置換アプリケーター内のコリン作動性神経線維の血管新生と発芽を伴う再生神経組織による欠陥置換が観察された。
【００８０】
得られた結果に基づいて、ＰＴＦＥベースの材料を製造するために開発された技術により、可能性のある生物医学的応用のさらなる研究に有望な組織置換アプリケーターの作成が可能になると結論付けることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月6日(2020.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
この方法のもう１つの欠点は、その実装に必要な機器の複雑さである。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  欧州特許出願公開第０１９４４４６号明細書  
（特許文献２）  米国特許出願公開第２０１４／３０８３３６号明細書
（特許文献３）  国際公開第２０１７／１２０６０８号
（特許文献４）  ロシア国特許発明第２４９７４８９号明細書
【国際調査報告】
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