(57)【要約】本明細書は、神経学的状態、がん、細菌性感染症及びウイルス性感染症を治療するための、骨髄細胞、例えば、ミクログリア細胞及び／又は単球の機能を制御するためのＳＲＳＦ３作用剤の使用であって、ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３の発現又は機能を阻害する、使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄細胞の自然免疫機能を制御するためのＳＲＳＦ３作用剤の使用であって、前記ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３の発現又は機能を阻害する、使用。
【請求項２】
細胞が、ミクログリア細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
細胞が、単球である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ＳＲＳＦ３作用剤が、リン酸化されているＳＲＳＦ３の活性又は機能を阻害する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
ＳＲＳＦ３作用剤が、抗体、核酸、ポリペプチド、低分子量化合物又は遺伝子編集系である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ＳＲＳＦ３作用剤が、抗体、アンチセンス、干渉ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系（ＺＦＮ）、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ系（ＴＡＬＥＮ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ＳＲＳＦ３作用剤が、自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする、少なくとも１つのｍＲＮＡの翻訳を増加させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３と、自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡとの間の結合を阻害する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３と、少なくとも１つのｍＲＮＡの少なくとも１つの３’ＵＴＲ  ＳＲＳＦ３結合部位との間の結合を阻害する、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３の少なくとも１つのＲＲＭ部位と、少なくとも１つのｍＲＮＡの少なくとも１つの３’ＵＴＲ  ＳＲＳＦ３結合部位との間の結合を阻害する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドが、ＳＡＡ３、ＬＣＮ２、ＬＩＬＲＢ４、ＣＣＬ５、ＩＲＦ７、ＣＣＬ３、ＧＭ７６７６、ＣＬＥＣ７Ａ、ＣＨ２５Ｈ、ＧＰＮＭＢ、ＣＳＴ７、ＣＴＬＡ２Ｂ、ＣＤ６８、ＥＩＦ４Ａ２、ＴＲＥＭ２又はＡＰＯＥである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
ａ．神経学的状態（例えば、血管性認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＤ）、アルツハイマー、運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）又はケネディ病）又はパーキンソン病）の治療及び／又は予防、
ｂ．中枢神経系のがん（例えば、神経膠腫）の増殖の阻害、或いは
ｃ．ウイルス性又は細菌性感染症（例えば、ＨＩＶ）の治療及び／又は予防
のためのＳＲＳＦ３作用剤の、これを必要とする患者における使用であって、前記ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３の発現又は機能を阻害する、使用。
【請求項１３】
ａ．神経学的状態（例えば、血管性認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＤ）、アルツハイマー、運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）又はケネディ病）又はパーキンソン病）の治療及び／又は予防、
ｂ．中枢神経系のがん（例えば、神経膠腫）の増殖の阻害、
ｃ．ウイルス性又は細菌性感染症（例えば、ＨＩＶ）の治療及び／又は予防、
ｄ．脳損傷（例えば、脳虚血、低酸素、脳卒中、虚血後の炎症）の治療
のためのＳＲＳＦ３作用剤の、これを必要とする患者における使用であって、前記ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３の発現又は機能を阻害する、使用。
【請求項１４】
ＳＲＳＦ３作用剤が、リン酸化されているＳＲＳＦ３の活性又は機能を阻害する、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
ＳＲＳＦ３作用剤が、抗体、核酸、ポリペプチド、低分子量化合物又は遺伝子編集系である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
ＳＲＳＦ３作用剤が、抗体、アンチセンス、干渉ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系（ＺＦＮ）、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ系（ＴＡＬＥＮ）である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
ＳＲＳＦ３作用剤が、自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする、少なくとも１つのｍＲＮＡの翻訳を増加させる、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３と、自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡとの間の結合を阻害する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３と、少なくとも１つのｍＲＮＡの少なくとも１つの３’ＵＴＲ  ＳＲＳＦ３結合部位との間の結合を阻害する、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３のＲＲＭ部位と、少なくとも１つのｍＲＮＡの少なくとも１つの３’ＵＴＲ  ＳＲＳＦ３結合部位との間の結合を阻害する、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドが、ＳＡＡ３、ＬＣＮ２、ＣＣＬ５、ＩＲＦ７、ＣＣＬ３、ＧＭ７６７６、ＣＬＥＣ７Ａ、ＣＨ２５Ｈ、ＧＰＮＭＢ、ＣＳＴ７、ＣＴＬＡ２Ｂ、ＣＤ６８、ＥＩＦ４Ａ２、ＴＲＥＭ２又はＡＰＯＥである、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
ＦＴＤ又はＡＬＳの治療及び／又は予防のための、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
星状細胞腫又は神経膠芽腫である、中枢神経系のがんの増殖を阻害するための、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３を標的とする１０〜３０個の長さの連続するヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドの連続する配列が、ヒトＳＲＳＦ３  ｍＲＮＡ前駆配列５’ＵＴＲ（配列番号１９）の領域に対して少なくとも９０％相補性である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列が、配列番号１９に対して少なくとも９０％相補性である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列が、配列番号１９に対して少なくとも１００％相補性である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＳＲＳＦ３  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲとハイブリダイズし、ＳＲＳＦ３の翻訳を阻害又は減少させる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列：５’−ＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号１７）を含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列：５’−ＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号１７）からなる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
請求項２４〜２９のいずれか一項に定義するアンチセンス。
【請求項３１】
ＳＲＳＦ３作用剤が、抗体である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
抗体が、モノクローナル抗体、単鎖変異断片（ｓｃＦｖ）、単鎖変異Ｆｃ断片（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）、ミニボディ、ダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、又はＦｖ断片である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
抗体が、ヒト化抗体である、請求項３１又は３２に記載の使用。
【請求項３４】
抗体が、ＲＲＭドメイン（配列番号１３）の少なくとも一部分を含むＳＲＳＦ３の領域を特異的に結合させる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
抗体が、少なくともＳＲＳＦ３リン酸化部位、及びＳＲＳＦ３のＲＳドメイン（配列番号１４）の少なくとも一部分を含む、ＳＲＳＦ３の領域を特異的に結合させる、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
抗体が、配列番号２０を含むＳＲＳＦ３の領域に特異的に結合する、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
請求項３１〜３６のいずれか一項に定義する抗体。
【請求項３８】
対象の生体試料におけるＳＲＳＦ３及びｐＳＲＳＦ３又はこれらの断片のレベルを判定するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を発症する素因を有するか、又はこれを発症すると疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っている対象の診断のための方法であって、前記生体試料におけるＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルの、ＳＲＳＦ３又はこの断片の基準レベルと比べた上昇を観察すると、前記対象が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症の素因を有するか、又はこれが疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っていることが示される、方法。
【請求項３９】
対象の生体試料における上方制御された翻訳されていないｍＲＮＡのプロファイルを同定するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を発症する素因を有するか、又はこれを発症すると疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っている対象の診断のための方法であって、ミクログリア細胞の自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする、上方制御された翻訳されていないｍＲＮＡのプロファイルを観察すると、前記対象が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症の素因を有するか、又はこれが疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っていることが示される、方法。
【請求項４０】
方法が、対象の生体試料におけるＳＲＳＦ３／ｐＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルを判定するステップをさらに含み、前記生体試料におけるＳＲＳＦ３、ｐＳＲＳＦ３又はこれらの断片のレベルの、ＳＲＳＦ３又はこの断片の基準レベルと比べた上昇を観察すると、前記対象が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症の素因を有するか、又はこれが疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っていることが示される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ａ）ＳＲＳＦ３又はこの断片を含む生体系に候補化合物を接触させるステップ、
ｂ）ＳＲＳＦ３発現又は機能を阻害する前記候補化合物の能力を測定するステップ、
ｃ）前記候補化合物が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の治療及び／又は予防において有用であるかどうかを、ステップｂ）の結果に基づいて判定するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の治療及び／又は予防において有用な候補化合物を同定するための方法。
【請求項４２】
ａ）ＳＲＳＦ３又はこの断片、及び少なくとも１つのＳＲＳＦ３結合部位を含む、ミクログリア細胞の自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードするｍＲＮＡの少なくとも１つの３’ＵＴＲを含む生体系に候補化合物を接触させるステップ、
ｂ）ＳＲＳＦ３又はこの断片と、前記ｍＲＮＡの少なくとも１つの３’ＵＴＲ  ＳＲＳＦ３結合部位との間の結合を阻害する前記候補化合物の能力を測定するステップ、
ｃ）前記候補化合物が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の治療及び／又は予防において有用であるかどうかを、ステップｂ）の結果に基づいて判定するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の治療及び／又は予防において有用な候補化合物を同定するための方法。
【請求項４３】
対象の生体試料におけるＳＲＳＦ３／ｐＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルを判定するステップ
を含む、対象における神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の進行又は退行を監視するための方法であって、ＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルの上昇を観察すると、前記神経学的状態の進行が示され、ＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルの低下を観察すると、前記神経学的状態、前記中枢神経系のがん、前記細菌性感染症又は前記ウイルス性感染症の退行が示される、方法。
【請求項４４】
対象における神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の進行又は退行を監視するための生化学マーカーとしての、生体試料におけるＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経学的状態、がん又はウイルス性感染症の治療、予後診断及び診断のための方法、このような方法に関するキット、並びに神経学的状態、がん又はウイルス性感染症を予防及び治療するための候補化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクログリアは、脳の主要な免疫細胞である。生理学的条件下では、ミクログリア細胞は、脳組織の恒常性の維持に必須であるが（Ｔｒｅｍｂｌａｙら、２０１１）、疾患及び／又は傷害の文脈では、ミクログリア細胞が、脳における炎症応答の開始及び制御において中心的役割を有することが、ますます明らかとなっている（Ｈａｎｉｓｃｈ及びＫｅｔｔｅｎｍａｎｎ、２００７）。今日の共通認識では、ミクログリアは、活性化されると、古典的炎症促進性に偏った表現型から選択的な抗炎症性のものまでの範囲にわたる、免疫プロファイルの広範なレパートリーを獲得し得るということである（Ｄａｖｉｄ及びＫｒｏｎｅｒ、２０１１；Ｋｉｅｒｄｏｒｆ及びＰｒｉｎｚ、２０１３；Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ及びＢｒｏｗｎ、２０１２）。過去１０年にわたって、ミクログリア細胞の最適でタイムリーな活性化が、中枢神経系（ＣＮＳ）に対する炎症誘発性の損傷の制御において役立つことが示された（Ｃｈｅｎ及びＴｒａｐｐ、２０１６；Ｇｒａｖｅｌら、２０１６；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００７；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９；Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＳｈｅｃｈｔｅｒ、２０１０）。しかし、現時点で、ミクログリアの偏りのプロファイルの制御に関与する分子機構は、まだ理解されていない。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書は、骨髄細胞の自然免疫機能を制御するためのＳＲＳＦ３作用剤の使用であって、ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３又はこの断片の発現又は機能を阻害する、使用に関する。
【０００４】
本明細書は、
神経学的状態（例えば、血管性認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＤ）、アルツハイマー、運動ニューロン疾患（例えば、孤発性又は家族性ＡＬＳを含む筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）又はケネディ病）又はパーキンソン病）の治療及び／又は予防、
中枢神経系のがん（例えば、神経膠腫）の増殖の阻害、或いは
ウイルス性又は細菌性感染症（例えば、ＨＩＶ）の治療及び／又は予防
のためのＳＲＳＦ３作用剤の、これを必要とする患者における使用であって、ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３又はこの断片の発現又は機能を阻害する、使用に関する。
【０００５】
本明細書は、有効量（例えば、治療有効量）の少なくとも１つのＳＲＳＦ３作用剤を、これを必要とする患者に投与するステップを含む、
神経学的状態（例えば、血管性認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＤ）、アルツハイマー、運動ニューロン疾患（例えば、孤発性又は家族性ＡＬＳを含む筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）又はケネディ病）又はパーキンソン病）の治療及び／又は予防、
中枢神経系のがん（例えば、神経膠腫）の増殖の阻害、或いは
ウイルス性又は細菌性感染症（例えば、ＨＩＶ）の治療及び／又は予防
のための方法であって、ＳＲＳＦ３作用剤が、ＳＲＳＦ３又はこの断片の発現又は機能を阻害する、方法に関する。
【０００６】
本明細書は、
対象の生体試料におけるＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルを判定するステップ、及び
有効量（例えば、治療有効量）の少なくとも１つのＳＲＳＦ３作用剤を対象に投与するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を発症する素因を有するか、又はこれを発症すると疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っている対象の診断及び治療のための方法であって、生体試料におけるＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルの、ＳＲＳＦ３又はこの断片の基準レベルと比べた上昇を観察すると、対象が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を発症する素因を有するか、又はこれを発症すると疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っていることが示される、方法に関する。
【０００７】
本明細書は、
対象の生体試料におけるＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルを判定するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を発症する素因を有するか、又はこれを発症すると疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っている対象の診断のための方法であって、生体試料におけるＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルの、ＳＲＳＦ３又はこの断片の基準レベルと比べた上昇を観察すると、対象が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症の素因を有するか、又はこれが疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っていることが示される、方法に関する。
【０００８】
本明細書は、
対象の生体試料における上方制御された翻訳されていないｍＲＮＡのプロファイルを同定するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を発症する素因を有するか、又はこれを発症すると疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っている対象の診断のための方法であって、ミクログリア細胞の自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする、上方制御された翻訳されていないｍＲＮＡのプロファイルを観察すると、対象が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症の素因を有するか、又はこれが疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っていることが示される、方法に関する。
【０００９】
本明細書は、
対象の生体試料における上方制御された翻訳されていないｍＲＮＡのプロファイルを同定するステップ、及び
有効量（例えば、治療有効量）の少なくとも１つのＳＲＳＦ３作用剤を対象に投与するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を発症する素因を有するか、又はこれを発症すると疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っている対象の診断及び治療のための方法であって、ミクログリア細胞の自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする、上方制御された翻訳されていないｍＲＮＡのプロファイルを観察すると、対象が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症の素因を有するか、又はこれが疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症若しくはウイルス性感染症を患っていることが示される、方法に関する。
【００１０】
本明細書は、
ａ）ＳＲＳＦ３又はこの断片を含む生体系に候補化合物を接触させるステップ、
ｂ）ＳＲＳＦ３発現又は機能を阻害する候補化合物の能力を測定するステップ、
ｃ）候補化合物が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の治療及び／又は予防において有用であるかどうかを、ステップｂ）の結果に基づいて判定するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の治療及び／又は予防において有用な候補化合物を同定するための方法に関する。
【００１１】
本明細書は、
ａ）ＳＲＳＦ３又はこの断片、及び少なくとも１つのＳＲＳＦ３結合部位を含む、ミクログリア細胞の自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードするｍＲＮＡの少なくとも１つの３’ＵＴＲを含む生体系に候補化合物を接触させるステップ、
ｂ）ＳＲＳＦ３又はこの断片と、ｍＲＮＡの少なくとも１つの３’ＵＴＲ  ＳＲＳＦ３結合部位との間の結合を阻害する候補化合物の能力を測定するステップ、
ｃ）候補化合物が、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の治療及び／又は予防において有用であるかどうかを、ステップｂ）の結果に基づいて判定するステップ
を含む、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の治療及び／又は予防において有用な候補化合物を同定する方法に関する。
【００１２】
本明細書は、
対象の生体試料におけるＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルを判定するステップ
を含む、対象における神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の進行又は退行を監視するための方法であって、ＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルの上昇を観察すると、神経学的状態の進行が示され、ＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルの低下を観察すると、神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の退行が示される、方法に関する。
【００１３】
本明細書は、対象における神経学的状態、中枢神経系のがん、細菌性感染症又はウイルス性感染症の進行又は退行を監視するための生化学マーカーとしての、生体試料におけるＳＲＳＦ３又はこの断片のレベルの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＣＤ１１ｂｒＧＦＰ遺伝子導入マウスの特性評価を示す図である。（Ａ）ＣＤ１１ｂプロモーター制御下のＦｌａｇ／ＥＧＦＰタグ化マウスＲｐｌ  １０ａ構築物の模式図。Ｉ：介在配列（ＩＶＳ）；ＩＩ：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号１）。（Ｂ）ＷＴではなく遺伝子導入マウス（Ｔｇ）のみからＥＧＦＰ遺伝子３２９ｂｐを増幅するオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによる導入遺伝子の可視化。（Ｃ）脳の冠状切片の模式図。赤色の四角形は、（Ｄ）及び（Ｅ）において撮像した領域を位置づける。（Ｄ及びＥ）対照（Ｄ）又はＬＰＳ注入後２４時間のマウス（Ｅ）の脳切片におけるＥＧＦＰ発現。ＣＤ１１ｂ（青色）及びｌｂａ１（赤色）と共局在化したＧＦＰ免疫染色。（Ｆ）Ｆｌａｇ／ＥＧＦＰ−Ｒｐｌ  １０ａ導入遺伝子のＦｌａｇビーズによる免疫結合を実証する、ミクログリア１次培養ライセートの免疫沈降後のエスタンブロット。スケールバーは２５及び５０μｍである。
【図２−１】高度に上方制御された免疫遺伝子が、翻訳されていないことを示す図である。（Ａ）遺伝子導入マウス脳からのリボソーム親和性精製方法の模式図。（Ｂ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ２．０  ＳＴチップにより解析したミクログリアのヒートマップ及び階層的クラスタリング。実験は、３つの生物学的反復により行う（ｎ＝５マウス／条件）。（Ｃ）トランスクリプトミクス及びプロテオミクスデータ分析間の差。クラスター１（ズーム１）及びクラスター２（ズーム２）に示される上方制御されたすべての免疫遺伝子は、配列決定されたペプチドのリストにおいて観察されなかった（表はクラスター１のみを示す）。Ｃａｐ２及びＹｗｈａｚを対照として使用する。（Ｄ）ポリソーム免疫沈降後の免疫ブロットによるプロテオミクス結果の検証。ＣＡＰ２及びアクチンを内部対照として使用した。全脳抽出物をインプットとして使用した。（Ｅ）ＬＰＳで処置又は無処置のマウスの全脳抽出物の定量的ウエスタンブロット解析（データは、平均±ＳＥＭ；ｎ＝３；ＳＡＡ３：ｐ＝０．３２２４；ＬＣＮ２：＊ｐ＝０．０２９７；ＣＣＬ５：ｐ＝０．３７０９；ＣＡＰ２：ｐ＝０．８２８０である）。
【図２−２】高度に上方制御された免疫遺伝子が、翻訳されていないことを示す図である。（Ａ）遺伝子導入マウス脳からのリボソーム親和性精製方法の模式図。（Ｂ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ２．０  ＳＴチップにより解析したミクログリアのヒートマップ及び階層的クラスタリング。実験は、３つの生物学的反復により行う（ｎ＝５マウス／条件）。（Ｃ）トランスクリプトミクス及びプロテオミクスデータ分析間の差。クラスター１（ズーム１）及びクラスター２（ズーム２）に示される上方制御されたすべての免疫遺伝子は、配列決定されたペプチドのリストにおいて観察されなかった（表はクラスター１のみを示す）。Ｃａｐ２及びＹｗｈａｚを対照として使用する。（Ｄ）ポリソーム免疫沈降後の免疫ブロットによるプロテオミクス結果の検証。ＣＡＰ２及びアクチンを内部対照として使用した。全脳抽出物をインプットとして使用した。（Ｅ）ＬＰＳで処置又は無処置のマウスの全脳抽出物の定量的ウエスタンブロット解析（データは、平均±ＳＥＭ；ｎ＝３；ＳＡＡ３：ｐ＝０．３２２４；ＬＣＮ２：＊ｐ＝０．０２９７；ＣＣＬ５：ｐ＝０．３７０９；ＣＡＰ２：ｐ＝０．８２８０である）。
【図３−１】活性化ミクログリアにおけるｍＲＮＡ及びタンパク質ネットワークの分岐を示す図である。ＣｌｕｅＧｏにより可視化した、上方又は下方制御された（Ａ）転写物又は（Ｂ）ペプチドの生物学的役割。同一のタームと関連する転写物／ペプチドは、ノードにより表す。上方制御された転写物／ペプチドの大多数についてのタームは、赤色で示す。下方制御された転写物／ペプチドの大多数についてのタームは、緑色で示す。灰色のノードは、等しい割合の上方及び下方制御された転写物／ペプチドを含む。ノードのサイズは、遺伝子／ターム対クラスターの数を反映する。色のグラデーションは、タームのエンリッチメントの有意性を示す。エッジは、転写物／ペプチドのタームとの関連性を示す。エッジの濃さは、関連性の有意性を反映した。（Ｃ）上方制御された転写物の上位１０種の生物学的機能。（Ｄ）上方制御されたペプチドの上位１０種の生物学的機能。
【図３−２】活性化ミクログリアにおけるｍＲＮＡ及びタンパク質ネットワークの分岐を示す図である。ＣｌｕｅＧｏにより可視化した、上方又は下方制御された（Ａ）転写物又は（Ｂ）ペプチドの生物学的役割。同一のタームと関連する転写物／ペプチドは、ノードにより表す。上方制御された転写物／ペプチドの大多数についてのタームは、赤色で示す。下方制御された転写物／ペプチドの大多数についてのタームは、緑色で示す。灰色のノードは、等しい割合の上方及び下方制御された転写物／ペプチドを含む。ノードのサイズは、遺伝子／ターム対クラスターの数を反映する。色のグラデーションは、タームのエンリッチメントの有意性を示す。エッジは、転写物／ペプチドのタームとの関連性を示す。エッジの濃さは、関連性の有意性を反映した。（Ｃ）上方制御された転写物の上位１０種の生物学的機能。（Ｄ）上方制御されたペプチドの上位１０種の生物学的機能。
【図４−１】Ｓａａ３−３’ＵＴＲによるルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の阻害を示す図である。（Ａ）ルシフェラーゼアッセイに使用する、ｐＧＬ３プロモーター（ｐＧＬ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４７２９８）、ｐＧＬ３プロモーターＳａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔ（配列番号２）（ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ）及びｐＧＬ３プロモーターＳＣＲＡＭＢＬＥ（配列番号３）（ｐＧＬ３−ＳＣＲＡＭＢＬＥ）の模式図。ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（茶色の箱形）、Ｓａａ３−３’ＵＴＲ配列（オレンジの円）及びＳＶ４０ポリＡ領域（明灰色の箱形）を示す。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に各構築物をトランスフェクトし、４８時間後にルシフェラーゼ活性について試験した。データは、３つ組で行った３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ｐＧＬ３ベクター又はｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔベクターをトランスフェクトしたＦ／ＥＧＦＰ−Ｒｐｌ  １０ａプラスミドを安定に発現する、ＢＶ２細胞のＲＴ−ｑＰＣＲにより測定した、相対ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡレベル。トランスフェクションの４８時間後にＴＲＡＰプロトコールを使用してリボソーム会合ｍＲＮＡを抽出した。データは、３回の個別の実験を表し、それぞれ１回が技術的反復により行われる（ｎ＝６；平均±ＳＥＭ；ｎ．ｓ．：ｐ＝０．５６７６）。（Ｄ）高ストリンジェンシーレベルのＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）マップによる、Ｓａａ３−３’ＵＴＲセグメントに沿ったＲＢＰの推定位置。各円は、１つのＲＢＰ結合部位を表す。ＬＰＳ注入後に質量分析計による解析によって同定されたＲＢＰは、青色で囲む。（Ｅ）Ｓａａ３−３’ＵＴＲ欠失（配列番号４〜７）の模式図。Ｓａａ３−３’ＵＴＲは、３つのセグメント：Ａ、Ｂ及びＣに分けた。（Ｆ）ＨＥＫ２９３は、各構築物をトランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間にルシフェラーゼアッセイについて試験した。データは、３つ組で行った２回の個別の実験を表す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６；ｐＧＬ３に対する比較：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔに対する比較：ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１；ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ＤｅｌＢ＋Ｃ対ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ＤｅｌＢ：＆ｐ＜０．０５）。
【図４−２】Ｓａａ３−３’ＵＴＲによるルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の阻害を示す図である。（Ａ）ルシフェラーゼアッセイに使用する、ｐＧＬ３プロモーター（ｐＧＬ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４７２９８）、ｐＧＬ３プロモーターＳａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔ（配列番号２）（ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ）及びｐＧＬ３プロモーターＳＣＲＡＭＢＬＥ（配列番号３）（ｐＧＬ３−ＳＣＲＡＭＢＬＥ）の模式図。ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（茶色の箱形）、Ｓａａ３−３’ＵＴＲ配列（オレンジの円）及びＳＶ４０ポリＡ領域（明灰色の箱形）を示す。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に各構築物をトランスフェクトし、４８時間後にルシフェラーゼ活性について試験した。データは、３つ組で行った３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ｐＧＬ３ベクター又はｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔベクターをトランスフェクトしたＦ／ＥＧＦＰ−Ｒｐｌ  １０ａプラスミドを安定に発現する、ＢＶ２細胞のＲＴ−ｑＰＣＲにより測定した、相対ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡレベル。トランスフェクションの４８時間後にＴＲＡＰプロトコールを使用してリボソーム会合ｍＲＮＡを抽出した。データは、３回の個別の実験を表し、それぞれ１回が技術的反復により行われる（ｎ＝６；平均±ＳＥＭ；ｎ．ｓ．：ｐ＝０．５６７６）。（Ｄ）高ストリンジェンシーレベルのＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）マップによる、Ｓａａ３−３’ＵＴＲセグメントに沿ったＲＢＰの推定位置。各円は、１つのＲＢＰ結合部位を表す。ＬＰＳ注入後に質量分析計による解析によって同定されたＲＢＰは、青色で囲む。（Ｅ）Ｓａａ３−３’ＵＴＲ欠失（配列番号４〜７）の模式図。Ｓａａ３−３’ＵＴＲは、３つのセグメント：Ａ、Ｂ及びＣに分けた。（Ｆ）ＨＥＫ２９３は、各構築物をトランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間にルシフェラーゼアッセイについて試験した。データは、３つ組で行った２回の個別の実験を表す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６；ｐＧＬ３に対する比較：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔに対する比較：ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１；ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ＤｅｌＢ＋Ｃ対ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ＤｅｌＢ：＆ｐ＜０．０５）。
【図４−３】Ｓａａ３−３’ＵＴＲによるルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の阻害を示す図である。（Ａ）ルシフェラーゼアッセイに使用する、ｐＧＬ３プロモーター（ｐＧＬ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４７２９８）、ｐＧＬ３プロモーターＳａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔ（配列番号２）（ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ）及びｐＧＬ３プロモーターＳＣＲＡＭＢＬＥ（配列番号３）（ｐＧＬ３−ＳＣＲＡＭＢＬＥ）の模式図。ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（茶色の箱形）、Ｓａａ３−３’ＵＴＲ配列（オレンジの円）及びＳＶ４０ポリＡ領域（明灰色の箱形）を示す。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に各構築物をトランスフェクトし、４８時間後にルシフェラーゼ活性について試験した。データは、３つ組で行った３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ）ｐＧＬ３ベクター又はｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔベクターをトランスフェクトしたＦ／ＥＧＦＰ−Ｒｐｌ  １０ａプラスミドを安定に発現する、ＢＶ２細胞のＲＴ−ｑＰＣＲにより測定した、相対ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡレベル。トランスフェクションの４８時間後にＴＲＡＰプロトコールを使用してリボソーム会合ｍＲＮＡを抽出した。データは、３回の個別の実験を表し、それぞれ１回が技術的反復により行われる（ｎ＝６；平均±ＳＥＭ；ｎ．ｓ．：ｐ＝０．５６７６）。（Ｄ）高ストリンジェンシーレベルのＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）マップによる、Ｓａａ３−３’ＵＴＲセグメントに沿ったＲＢＰの推定位置。各円は、１つのＲＢＰ結合部位を表す。ＬＰＳ注入後に質量分析計による解析によって同定されたＲＢＰは、青色で囲む。（Ｅ）Ｓａａ３−３’ＵＴＲ欠失（配列番号４〜７）の模式図。Ｓａａ３−３’ＵＴＲは、３つのセグメント：Ａ、Ｂ及びＣに分けた。（Ｆ）ＨＥＫ２９３は、各構築物をトランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間にルシフェラーゼアッセイについて試験した。データは、３つ組で行った２回の個別の実験を表す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝６；ｐＧＬ３に対する比較：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔに対する比較：ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、＃＃＃ｐ＜０．００１；ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ＤｅｌＢ＋Ｃ対ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ＤｅｌＢ：＆ｐ＜０．０５）。
【図５−１】ＳＲＳＦ３により３’ＵＴＲを介して炎症遺伝子発現が制御されることを示す図である。（Ａ）ＬＰＳ処理後２４時間のＢＶ２細胞におけるリン酸化ＳＲＳＦ３（ｐＳＲＳＦ３）発現のウエスタンブロット。（Ｂ）ｐＳＲＳＦ３についての定量的ウエスタンブロット解析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４；＊＊＊ｐ＜０．００１である）。（Ｃ）ＬＰＳ後２４時間のウエスタンブロットにより解析した総ＳＲＳＦ３（ｔＳＲＳＦ３）発現。（Ｄ）ｔＳＲＳＦ３の発現レベルを示したウエスタンブロットの定量分析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３；ｐ＞０．０５である）。（Ｅ）対照ｓｉＲＮＡ（ＣＴＬ  ｓｉＲＮＡ）又はＳＲＳＦ３に対するｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ又は３００ｎＭ）（配列番号８〜１１）をトランスフェクトしたＬＰＳ処理ＢＶ２細胞のウエスタンブロット解析。（Ｆ）ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の内在性ＳＲＳＦ３の発現レベルを示したウエスタンブロットの定量分析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊ｐ＜０．０５である）。（Ｇ）ルシフェラーゼレポーター（ｐＧＬ３及びｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔ）を、ＣＴＬ  ｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３  ｓｉＲＮＡ（３００ｎＭ）（配列番号８〜１１）と、ＬＰＳ処理ＢＶ２細胞において共トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間にルシフェラーゼ活性を測定した。データは、２回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｈ）ＬＰＳ曝露後２４時間のＢＶ２細胞におけるＳＡＡ３発現のウエスタンブロット。（Ｉ）ＳＲＳＦ３ノックダウン後の内在性ＳＡＡ３の発現レベルを示したウエスタンブロット解析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊＊ｐ＜０．０１である）。（Ｊ）Ｌｃｎ２、Ｃｃｌ５及びＣｃｌ３それぞれの３’ＵＴＲに沿ったＳＲＳＦ３の推定位置の模式図。（Ｋ）ＳＲＳＦ３に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、２４時間ＬＰＳで処理したＢＶ２細胞におけるＬＣＮ２、ＣＣＬ５及びＣＣＬ３発現のウエスタンブロット解析。（Ｌ）ＳＲＳＦ３ノックダウン及びＬＰＳによる処理後の内在性ＬＣＮ２、ＣＣＬ５及びＣＣＬ３レベルを示したウエスタンブロットの定量分析（ｎ＝３；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図５−２】ＳＲＳＦ３により３’ＵＴＲを介して炎症遺伝子発現が制御されることを示す図である。（Ａ）ＬＰＳ処理後２４時間のＢＶ２細胞におけるリン酸化ＳＲＳＦ３（ｐＳＲＳＦ３）発現のウエスタンブロット。（Ｂ）ｐＳＲＳＦ３についての定量的ウエスタンブロット解析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４；＊＊＊ｐ＜０．００１である）。（Ｃ）ＬＰＳ後２４時間のウエスタンブロットにより解析した総ＳＲＳＦ３（ｔＳＲＳＦ３）発現。（Ｄ）ｔＳＲＳＦ３の発現レベルを示したウエスタンブロットの定量分析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３；ｐ＞０．０５である）。（Ｅ）対照ｓｉＲＮＡ（ＣＴＬ  ｓｉＲＮＡ）又はＳＲＳＦ３に対するｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ又は３００ｎＭ）（配列番号８〜１１）をトランスフェクトしたＬＰＳ処理ＢＶ２細胞のウエスタンブロット解析。（Ｆ）ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間の内在性ＳＲＳＦ３の発現レベルを示したウエスタンブロットの定量分析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊ｐ＜０．０５である）。（Ｇ）ルシフェラーゼレポーター（ｐＧＬ３及びｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔ）を、ＣＴＬ  ｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３  ｓｉＲＮＡ（３００ｎＭ）（配列番号８〜１１）と、ＬＰＳ処理ＢＶ２細胞において共トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間にルシフェラーゼ活性を測定した。データは、２回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝６；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｈ）ＬＰＳ曝露後２４時間のＢＶ２細胞におけるＳＡＡ３発現のウエスタンブロット。（Ｉ）ＳＲＳＦ３ノックダウン後の内在性ＳＡＡ３の発現レベルを示したウエスタンブロット解析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊＊ｐ＜０．０１である）。（Ｊ）Ｌｃｎ２、Ｃｃｌ５及びＣｃｌ３それぞれの３’ＵＴＲに沿ったＳＲＳＦ３の推定位置の模式図。（Ｋ）ＳＲＳＦ３に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、２４時間ＬＰＳで処理したＢＶ２細胞におけるＬＣＮ２、ＣＣＬ５及びＣＣＬ３発現のウエスタンブロット解析。（Ｌ）ＳＲＳＦ３ノックダウン及びＬＰＳによる処理後の内在性ＬＣＮ２、ＣＣＬ５及びＣＣＬ３レベルを示したウエスタンブロットの定量分析（ｎ＝３；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６−１】ＳＲＳＦ３が炎症遺伝子の翻訳制御因子であることをｉｎ  ｖｉｖｏで示す図である。（Ａ）ＬＰＳ注入後のＴＬＲ２誘導のｉｎ  ｖｉｖｏでの撮像；ＬＰＳ注入後２４時間の代表的写真。右側の色補正は、光子数である。（Ｂ）ＣＣＤカメラにより検出された光子を示す頭部の３Ｄ像。（Ｃ）ＬＰＳのｉ．ｐ．による注入後２４時間の生物発光シグナルの３Ｄ再構築。（Ｄ）光子放出の測定により得られたデータのプロット。黒色の線は、ＬＰＳ後２４〜７２時間のＴＬＲ２シグナル誘導を示す（データは、平均±ＳＥＭ、ベースライン：ｎ＝５、ＬＰＳ  ２４時間ｎ＝５；ＬＰＳ４８時間：ｎ＝４；ＬＰＳ  ７２時間：ｎ＝４；ベースライン対ＬＰＳ  ２４時間：＊＊ｐ＜０．０１；ベースライン対ＬＰＳ  ４８時間及びベースライン対ＬＰＳ  ７２時間：ｐ＞０．０５；ＬＰＳ  ２４時間対ＬＰＳ  ４８時間及びＬＰＳ  ２４時間対ＬＰＳ  ７２時間：＊＊ｐ＜０．０１である）。（Ｅ）ＴＬＲ２−ｌｕｃ−ＧＦＰマウスのＬＰＳ後２４時間の脳切片におけるＴＬＲ２駆動ＧＦＰ導入遺伝子発現（Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）。ＣＤ１１ｂ（赤色）と共局在化したＧＦＰ免疫染色（緑色）。スケールバーは５０μｍである。（Ｆ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ（配列番号８〜１１）の鼻腔内投与後の全脳抽出物のウエスタンブロット解析。（Ｇ）ｓｉＲＮＡ投与後４８時間の内在性ＳＲＳＦ３の発現レベルを示したウエスタンブロットの定量分析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３；ｐ＊＊＊＜０．００１である）。（Ｈ）実験タイムラインの模式図。（Ｉ）ＬＰＳ条件下（５ｍｇ／ｋｇ）でのスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｊ）又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ（Ｋ）の鼻腔内送達前（ベースライン）及び後のＴＬＲ２シグナルの生物発光撮像。（Ｌ）ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡの投与を受けたＴＬＲ２−ｌｕｃ−ＧＦＰマウスにおける、ベースラインに対する変化倍率により表される、脳による総光子放出の長期定量分析。すべてのマウスにＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．で２４時間注入した（データは、平均±ＳＥＭ、スクランブルｓｉＲＮＡ＋ＬＰＳ−２４時間：ｎ＝５；ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ＋ＬＰＳ−２４時間：ｎ＝７；ＬＰＳ−２４時間：ｎ＝５；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；ｐ＊＊＜０．０１；ｐ＊＊＊＜０．００１である）。（Ｍ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ由来のｌｂａ１染色脳切片の代表的顕微鏡写真。（Ｎ）ＬＰＳ曝露後の状態。スケールバーは５０μｍである。（Ｏ）ｌｂａ−１染色の光学濃度の定量（ｎ＝３；ｐ＊＊＊＜０．００１）。（Ｐ）精製したミクログリアにおけるＬＰＳ後のＳＡＡ３、ＬＣＮ２、ＣＣＬ５及びＣＣＬ３タンパク質発現のウエスタンブロット解析。（Ｑ）スクランブル／ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ投与後のミクログリアＳＡＡ３、ＬＣＮ２、ＣＣＬ５及びＣＣＬ３タンパク質の発現のウエスタンブロットの定量分析。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）を表す。
【図６−２】ＳＲＳＦ３が炎症遺伝子の翻訳制御因子であることをｉｎ  ｖｉｖｏで示す図である。（Ａ）ＬＰＳ注入後のＴＬＲ２誘導のｉｎ  ｖｉｖｏでの撮像；ＬＰＳ注入後２４時間の代表的写真。右側の色補正は、光子数である。（Ｂ）ＣＣＤカメラにより検出された光子を示す頭部の３Ｄ像。（Ｃ）ＬＰＳのｉ．ｐ．による注入後２４時間の生物発光シグナルの３Ｄ再構築。（Ｄ）光子放出の測定により得られたデータのプロット。黒色の線は、ＬＰＳ後２４〜７２時間のＴＬＲ２シグナル誘導を示す（データは、平均±ＳＥＭ、ベースライン：ｎ＝５、ＬＰＳ  ２４時間ｎ＝５；ＬＰＳ４８時間：ｎ＝４；ＬＰＳ  ７２時間：ｎ＝４；ベースライン対ＬＰＳ  ２４時間：＊＊ｐ＜０．０１；ベースライン対ＬＰＳ  ４８時間及びベースライン対ＬＰＳ  ７２時間：ｐ＞０．０５；ＬＰＳ  ２４時間対ＬＰＳ  ４８時間及びＬＰＳ  ２４時間対ＬＰＳ  ７２時間：＊＊ｐ＜０．０１である）。（Ｅ）ＴＬＲ２−ｌｕｃ−ＧＦＰマウスのＬＰＳ後２４時間の脳切片におけるＴＬＲ２駆動ＧＦＰ導入遺伝子発現（Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）。ＣＤ１１ｂ（赤色）と共局在化したＧＦＰ免疫染色（緑色）。スケールバーは５０μｍである。（Ｆ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ（配列番号８〜１１）の鼻腔内投与後の全脳抽出物のウエスタンブロット解析。（Ｇ）ｓｉＲＮＡ投与後４８時間の内在性ＳＲＳＦ３の発現レベルを示したウエスタンブロットの定量分析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３；ｐ＊＊＊＜０．００１である）。（Ｈ）実験タイムラインの模式図。（Ｉ）ＬＰＳ条件下（５ｍｇ／ｋｇ）でのスクランブルｓｉＲＮＡ（Ｊ）又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ（Ｋ）の鼻腔内送達前（ベースライン）及び後のＴＬＲ２シグナルの生物発光撮像。（Ｌ）ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡの投与を受けたＴＬＲ２−ｌｕｃ−ＧＦＰマウスにおける、ベースラインに対する変化倍率により表される、脳による総光子放出の長期定量分析。すべてのマウスにＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．で２４時間注入した（データは、平均±ＳＥＭ、スクランブルｓｉＲＮＡ＋ＬＰＳ−２４時間：ｎ＝５；ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ＋ＬＰＳ−２４時間：ｎ＝７；ＬＰＳ−２４時間：ｎ＝５；ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５；ｐ＊＊＜０．０１；ｐ＊＊＊＜０．００１である）。（Ｍ）スクランブルｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ由来のｌｂａ１染色脳切片の代表的顕微鏡写真。（Ｎ）ＬＰＳ曝露後の状態。スケールバーは５０μｍである。（Ｏ）ｌｂａ−１染色の光学濃度の定量（ｎ＝３；ｐ＊＊＊＜０．００１）。（Ｐ）精製したミクログリアにおけるＬＰＳ後のＳＡＡ３、ＬＣＮ２、ＣＣＬ５及びＣＣＬ３タンパク質発現のウエスタンブロット解析。（Ｑ）スクランブル／ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ投与後のミクログリアＳＡＡ３、ＬＣＮ２、ＣＣＬ５及びＣＣＬ３タンパク質の発現のウエスタンブロットの定量分析。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）を表す。
【図７−１】ＬＰＳ曝露後のミクログリアＮＦ−κＢネットワークにおける、高度に上方制御されたｍＲＮＡ及び非制御タンパク質を示す図である。ＬＰＳ注入後にＣｌｕｅＧｏにより可視化された炎症及び免疫応答に関するターム。（Ａ）ｍＲＮＡ解析において、炎症及び免疫応答に関するすべてのタームは、上方制御されたタームであり、赤色で示す。上方制御された転写物の上位５０種の大多数は、このようなタームと関連する。炎症及び免疫応答ネットワークは、より良い可視化のために明るくした；非制御転写物は示さない。上方制御されたｍＲＮＡの上位３つ（赤色の四角形により強調）を、さらなる検証に使用した。（Ｂ）プロテオミクス解析において、炎症及び免疫応答に関するすべてのタームは、このようなタームに関連するペプチドの大多数が制御されないため、灰色で現れる。炎症及び免疫応答のタームに関する４つのタンパク質のみが、制御される：Ｐｐｍ１ｂ及びＥｌｍｏ２が上方制御され、Ｈｓｐ９０ａｂ１及びＦｂｘｗ１１が下方制御される。炎症及び免疫応答に関する、すべての上方制御された転写物が、プロテオミクス解析により検出されるとは限らない。両パネルにおいて、ノードのサイズは、遺伝子／ターム対クラスターの数を反映した。
【図７−２】ＬＰＳ曝露後のミクログリアＮＦ−κＢネットワークにおける、高度に上方制御されたｍＲＮＡ及び非制御タンパク質を示す図である。ＬＰＳ注入後にＣｌｕｅＧｏにより可視化された炎症及び免疫応答に関するターム。（Ａ）ｍＲＮＡ解析において、炎症及び免疫応答に関するすべてのタームは、上方制御されたタームであり、赤色で示す。上方制御された転写物の上位５０種の大多数は、このようなタームと関連する。炎症及び免疫応答ネットワークは、より良い可視化のために明るくした；非制御転写物は示さない。上方制御されたｍＲＮＡの上位３つ（赤色の四角形により強調）を、さらなる検証に使用した。（Ｂ）プロテオミクス解析において、炎症及び免疫応答に関するすべてのタームは、このようなタームに関連するペプチドの大多数が制御されないため、灰色で現れる。炎症及び免疫応答のタームに関する４つのタンパク質のみが、制御される：Ｐｐｍ１ｂ及びＥｌｍｏ２が上方制御され、Ｈｓｐ９０ａｂ１及びＦｂｘｗ１１が下方制御される。炎症及び免疫応答に関する、すべての上方制御された転写物が、プロテオミクス解析により検出されるとは限らない。両パネルにおいて、ノードのサイズは、遺伝子／ターム対クラスターの数を反映した。
【図８】脳の種々の領域におけるｓｉＧＬＯの分布を示す図である。（Ａ）脳の１：皮質；２：脳梁付近の線条体；３：皮質におけるｓｉＧＬＯの分布を可視化する、３つの選択された領域の模式図。（Ｂ、Ｃ及びＤ）鼻腔内送達後の３つの選択された領域におけるｓｉＧＬＯ分布（赤色の点）。ｓｉＧＬＯをスクランブルｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡと共トランスフェクトして、脳へのｓｉＲＮＡ取込みの視覚的評価を行った。スケールバーは１０及び５０μｍである。（Ｅ〜Ｐ）ｌｂａ１（緑色）陽性細胞（Ｅ、Ｉ及びＭ）の核（青色）（Ｇ、Ｋ及びＯ）に完全に局在化したｓｉＧＬＯの赤色の点（Ｆ、Ｊ及びＮ）。シグナルの核局在化は、良好なトランスフェクションの明白なシグナルである。統合画像（Ｈ、Ｌ及びＰ）は、蛍光オリゴヌクレオチドが、ほとんどすべてのｌｂａ１陽性ミクログリア細胞の核に局在化したことを示した。
【図９】ＳＲＳＦ３が、ＳＯＤ１変異マウスの脊髄においてｐＳＲＳＦ３のレベルが経時的に上昇する場合、ＡＬＳに関係づけられることを示す図である。高度に上方制御されたｍＲＮＡは、翻訳されず、鍵となるｍＲＮＡは、複数の推定ＳＲＳＦ３結合部位を３’ＵＴＲに有する。（Ａ）ＳＲＳＦ３レベルのウエスタンブロット解析では、ＡＬＳ前駆症状において有意に上昇し（ＳＯＤ１変異マウス）、一方、リン酸化レベルは、疾患進行とともに顕著に上昇する。（Ｂ）（ｎ＝３；独立ｔ検定；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１）。（Ｃ）腰髄ミクログリア（１５８日のＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）における最も上方制御されたｍＲＮＡ  １０種のリスト。黄色にマークされた転写物は、ＡＤ／ＡＬＳ及びプリオン病の可能性のあるバイオマーカーを有すると報告される。列挙した高度に上方制御されたｍＲＮＡは、タンパク質レベルでは制御されない。生物情報解析により、Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７の３’ＵＴＲは、ＳＲＳＦ３結合部位が高度にエンリッチされていることが明らかとなった。
【図１０】正常加齢マウスモデル及び前頭側頭型認知症のマウスモデル（ＴＤＰ−４３Ｇ３４８Ｃ）における総ＳＲＳＦ３及びｐＳＲＳＦ３のレベルの上昇を示す図である。全脳抽出物のウエスタンブロット解析。
【図１１】ｐＳＲＳＦ３レベルが、孤発性ＡＬＳ患者１１の脳脊髄液（ＣＳＦ）において上昇することを示す図である。ｐＳＲＳＦ３が、ヒト脊髄、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び血漿において検出される。ｐＳＲ免疫組織化学的検査を、ＡＬＳ患者（Ｂ、Ｃ）及び対照対象（Ａ）由来のパラフィンに包埋した死後ヒト脊髄切片について実施した。（Ｄ）ＡＬＳ患者及び対照対象由来の血漿のウエスタンブロット解析。（Ｅ）対照対象と比較した場合の、ＡＬＳ患者におけるｐＳＲＳＦ３レベルの上昇を示したウエスタンブロットの定量分析。データは、平均±ＳＥＭである（ｎ＝４；＊ｐ＜０．０１）。（Ｆ）ＡＬＳ患者及び対照対象由来のＣＳＦのウエスタンブロット解析。＊は、高曝露において観察された微弱なバンドを示す。（Ｇ）対照対象と比較した場合の、ＡＬＳ患者におけるｐＳＲＳＦ３レベルの上昇を示したウエスタンブロットの定量分析。データは、平均±ＳＥＭである（ｎ＝５；＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１２】サイトゾルにおける抗ＳＲＳＦ３モルホリノ機構の模式図である。抗ＳＲＳＦ３モルホリノは、ＳＲＳＦ３  ｍＲＮＡの５’ＵＴＲを標的とする２５核酸塩基の単鎖である。これらは、相補ＲＮＡに結合し、ＲＮＡｓｅ  Ｈ非依存的機構を介して作用して、サイトゾルにおいてＳＲＳＦ３の翻訳開始を遮断する。抗ハツカネズミ（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＳＲＳＦ３モルホリノの配列は、５’−ＣＣＡＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号１５）である。ｍＲＮＡ標的の周囲に括弧を挿入して、ＳＲＳＦ３のハツカネズミ配列におけるこの位置を示している［以下に示す］。括弧は、センス鎖５’−ｇｇｔｇｇｇｃｃｔｇｔｃｇｇａｇｃｇｔｔａｇｇａｔｔｔｇａｇｃｔｔｇｇｇｃｃｔｔｔｔｇａａｃｃｃａｇｇａｔｃｔｃｇａａ［（ａｔｇ）ｃａｔｃｇｔｇａｔｔｃｃｔｇｔｃｃｃｔｔｇｇ］−３’（配列番号１６）に配置されることに留意されたい。抗ヒトＳＲＳＦ３モルホリノの配列は、５’−ＣＣＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号１７）である。ｍＲＮＡ標的の周囲に括弧を挿入して、ＳＲＳＦ３のヒト配列におけるこの位置を示している［以下に示す］。括弧は、センス鎖５’−ｇｃｃｇｃｃｇｃａｔｔｔｔｔｔａａｃｃｃｔａｇａｔｃｔｃｇａａ［（ａｔｇ）ｃａｔｃｇｔｇａｔｔｃｃｔｇｔｃｃａｔｔｇｇ］−３’（配列番号１８）に配置されることに留意されたい。
【図１３】ＳＲＳＦ３のノックダウン後のタンパク質の新規合成を示す図である。（Ａ）５０μｇの抗ＳＲＳＦ３モルホリノ又は生理食塩水をくも膜下腔内に送達後のＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウス由来の全腰髄ホモジネートのウエスタンブロット解析。（Ｂ）抗ＳＲＳＦ３モルホリノ投与後の内在性総ＳＲＳＦ３（ｔＳＲＳＦ３）及びホスホＳＲＳＦ３（ｐＳＲＳＦ３）の発現レベルを示したウエスタンブロットの定量分析。データは、平均±ＳＥＭである（ｎ＝３；ｔＳＲＳＦ３：生理食塩水対抗ＳＲＳＦ３モルホリノ、＊＊ｐ＜０．０１；ｐＳＲＳＦ３：生理食塩水対抗ＳＲＳＦ３モルホリノ、＊ｐ＜０．０５）。（Ｃ）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける、５０μｇの抗ＳＲＳＦ３モルホリノ又は生理食塩水のくも膜下腔内送達後の全腰髄抽出物のウエスタンブロット解析。（Ｄ）ＳＲＳＦ３のノックダウン後の内在性ＣＳＴ７、ＧＰＮＭＢ及びＴＬＲ２タンパク質の発現レベルの上昇を示したウエスタンブロットの定量分析。データは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３；＊＊ｐ＜０．０１）。アクチンをローディングコントロールとして使用する。
【図１４】麻痺発症後に開始した抗ＳＲＳＦ３モルホリノ治療により、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウスの生存が向上し、これらの運動機能が向上したことを示す図である。（Ａ）実験タイムラインの模式図。（Ｂ）抗ＳＲＳＦ３モルホリノ又は生理食塩水のｉ．ｐ．による注入後の、フィコールを加えた精製マウス血液細胞のウエスタンブロット解析。（Ｃ）モルホリノ投与後６日の内在性ＳＲＳＦ３の発現レベルの低下を示したウエスタンブロットの定量分析（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３；＊ｐ＜０．０５である）。アクチンをローディングコントロールとして使用する。（Ｄ）抗ＳＲＳＦ３モルホリノ又は対照処置ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウスに、抗ＳＲＳＦ３モルホリノ（２５ｍｇ／ｋｇを１週間に１回、ｎ＝８、赤色の線）又は対照モルホリノ（スクランブル、ｎ＝９、青色の線）を腹腔内に処置した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析のログランク検定に従って、対照処置群と比較した場合、モルホリノ処置群の生存率において統計学的有意差が存在した（モルホリノについてはｐ＜０．０３８６）。（Ｅ）運動機能のロータロッド試験を、モルホリノ（２５ｍｇ／ｋｇを１週間に１回、データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝８、赤色の線を表す）又は対照モルホリノ（スクランブル、２５ｍｇ／ｋｇを１週間に１回、データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９、青色の線を表す）を腹腔内に注入した遺伝子導入ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの処置により実施した。野生型マウス（ＷＴ）は、処置せず、対照として使用した（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４、黒色の線を表す）。
【図１５】抗ＳＲＳＦ３モルホリノで処置すると、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける脾臓及び筋肉の萎縮が回復することを示す図である。（Ａ）ＳＯＤ１Ｇ９３ＡＴｇマウス及びＷＴの同腹仔由来の脾臓の形態及びサイズ。症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウス（２５ｍｇ／ｋｇを１週間に１回）において開始した抗ＳＲＳＦ３モルホリノによる腹腔内処置によって、対照（スクランブル、２５ｍｇ／ｋｇを１週間に１回）と比較した場合、脾臓萎縮が回復する。（Ｂ）ＳＯＤ１Ｇ９３ＡＴｇマウス及びＷＴの同腹仔由来の筋肉の形態及びサイズ。症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおいて開始した抗ＳＲＳＦ３モルホリノ治療による腹腔内処置（２５ｍｇ／ｋｇを１週間に１回）によって、対照（スクランブル、２５ｍｇ／ｋｇを１週間に１回）と比較した場合、筋萎縮が回復した。（Ｃ）前脛骨（ＴＡ）筋の平均重量を、抗ＳＲＳＦ３モルホリノ又はスクランブルモルホリノで処置したＳＯＤ１Ｇ９３Ａ間で比較した。野生型マウス（ＷＴ）を対照として使用した（データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３マウス／群、＊＊＊ｐ＜０．００１を表す）。（Ｄ）ＮＦＨ染色ＴＡ筋（緑色）の代表的顕微鏡写真。スケールバーは１ｍｍである。
【図１６】抗ＳＲＳＦ３モルホリノで処置すると、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄において、運動ニューロンが維持され、ミクログリア活性化が向上することを示す図である。（Ａ）抗ＳＲＳＦ３モルホリノ又はスクランブルを注入した後期症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウス由来の、ＣｈＡＴ及びＮｅｕＮ染色腰髄切片の代表的顕微鏡写真。野生型（ＷＴ）マウスを対照として使用した（１群あたりｎ＝３）。（Ｂ）抗ＳＲＳＦ３モルホリノ又は生理食塩水を注入した後期症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子導入マウス由来のｌｂａ１染色腰髄切片の代表的顕微鏡写真。野生型（ＷＴ）マウスを対照として使用した（１群あたりｎ＝３）。
【図１７】ＳＲＳＦ３のＲＮＡ結合ドメイン（ＲＲＭドメイン）を標的とするＭＡＢ１２１の産生及び検証を示す図である。（Ａ）ＳＲＳＦ３タンパク質の配列。ＲＲＭドメインの配列（配列番号１３）を緑色で示し、ＲＳドメインの配列（配列番号１４）を橙色で示す。ユニークな免疫原性配列（ＧＮＮＧＮＫＴＥＬＥＲＡＦＧＹＹＧＰＬＲＳＶ）（配列番号２０）を太字で示す。（Ｂ）ＳＲＳＦ３作用の遮断におけるＭＡＢ１２１抗体の関与を示す模式図。（Ｃ）ＥＬＩＳＡ及び（Ｄ）ルシフェラーゼアッセイによる免疫化動物血清の試験及び解析。Ｉ  ＳＲＳＦ３のこの標的ｍＲＮＡとの相互作用を破壊しルシフェラーゼ活性を増強する、抗体ＭＡＢ１２１の効率を確認する、ルシフェラーゼアッセイ解析の模式図。図４に示すルシフェラーゼレポーター系を、この実験に使用する。
【図１８】免疫原として合成ペプチド、又はＢＳＡを使用した（Ａ）ＥＬＩＳＡによる、異なるラット血清の親和性の解析を示す図である。ＢＳＡ又は合成ペプチドを、ＭＡＢ１２１抗体を含む血清、又は予備免疫血清（ｐ）でインキュベートした。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）を、又は（Ｂ）ルシフェラーゼアッセイにより表す。ＨＥＫ２９３細胞は、ｐＧＬ３プロモーター（ｐＧＬ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ４７２９８）、ｐＧＬ３プロモーターＳａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔ（配列番号２）（ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ）及びｐＧＬ３プロモーターＳＣＲＡＭＢＬＥ（ｐＧＬ３スクランブル）構築物をトランスフェクトした。ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、種々の免疫化動物由来の血清で処理し（各動物由来の予備免疫血清を対照として使用した）、４８時間後にルシフェラーゼ活性について試験した。データは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３；ｐＧＬ３プロモーター対ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ：＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ対ｐＧＬ３スクランブル：＊＊＊ｐ＜０．００１；ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ対ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ＋ラット＃１５５（１５５）：＊ｐ＜０．０５；ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ＋ラット＃１５５の予備免疫血清（１５５ｐ）対ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ＋ラット＃１５５：＊ｐ＜０．０５：ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ対ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ＋ラット＃１５８（１５８）：＊ｐ＜０．０５）。
【図１９】ＳＲＳＦ３が、脳卒中後のミクログリア活性化の調節に関係づけられることを示す図である。（Ａ）非脳卒中対照（ＣＴＬ）と比較した場合、８０分の中大脳動脈閉塞術（ＭＣＡＯ）後２４時間の発現レベルが有意に上昇し、一方、ｔＳＲＳＦ３は低下することを明らかにした、ｐＳＲＳＦ３のウエスタンブロット解析。（Ｂ）ウエスタンブロットの定量分析。データは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４；ｐＳＲＳＦ３−ＭＣＡＯ対ｐＳＲＳＦ３−ＣＴＬ：＊＊＊ｐ＜０．００１；ｔＳＲＳＦ３−ＭＣＡＯ対ｔＳＲＳＦ３−ＣＴＬ：＊ｐ＜０．０５）。アクチンをローディングコントロールとして使用する。（Ｃ）ＣＴＬ及びＭＣＡＯにおけるｌｂａ１（赤色）及びｐＳＲＳＦ３（緑色）の代表的２重免疫蛍光画像。
【図２０】ＭＣＡＯにおける、ｓｉＲＮＡにより媒介されるＳＲＳＦ３ノックダウン後のミクログリア活性化の上昇を示す図である。（Ａ）実験タイムラインの模式図。（Ｂ）ＭＣＡＯ条件下でのスクランブルｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡの鼻腔内投与後の全脳抽出物のウエスタンブロット解析。（Ｃ）ｓｉＲＮＡ投与後のＳＲＳＦ３レベルの低下を示したウエスタンブロットの定量分析。データは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４；スクランブル対ＳＲＳＦ３  ｓｉＲＮＡ＊＊＊ｐ＜０．００１）。アクチンをローディングコントロールとして使用した。（Ｄ）ＭＣＡＯ誘導の前（ベースライン）及び２、３、５及び７日後の生物発光シグナルの２Ｄ再構築。Ｉ  ＭＣＡＯ誘導後２４時間にＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡの投与を受けたＴＬＲ２−ｌｕｃ−ＧＦＰマウスにおける光子放出により表される脳からの総光子放出の長期定量分析（データは、平均±ＳＥＭ、ＭＣＡＯ群：ｎ＝５；スクランブルｓｉＲＮＡ＋ＭＣＡＯ：ｎ＝６；ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ＋ＭＣＡＯ：ｎ＝７；スクランブルｓｉＲＮＡ＋ＭＣＡＯ対ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ＋ＭＣＡＯ：＊ｐ＜０．０５である）。
【図２１】脳卒中後２４時間のｓｉＲＮＡの鼻腔内送達により、脳卒中後の虚血病変のサイズが有意に縮小したことを示す図である。（Ａ）ＭＣＡＯ後７日のスクランブル又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ処置マウスにおける梗塞体積を示した脳切片のクレシルバイオレット染色。（Ｂ）ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ投与後、スクランブルｓｉＲＮＡと比較した場合の脳卒中体積の有意な減少を示した梗塞体積の定量（データは、平均±ＳＥＭ、＊＊＊ｐ＜０．００１である）。（Ｃ）ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ投与後、スクランブルｓｉＲＮＡと比較した場合のＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＴＩＭＰ１及びＧＭ−ＣＳＦの発現の有意な増加を示した、ＭＣＡＯ後３日の脳卒中領域のサイトカインアレイ解析（データは、平均±ＳＥＭ、ＣＣｌ３：＊＊＊ｐ＜０．００１；ＣＣＬ５：＊ｐ＜０．０５；ＴＩＭＰ１：＊＊ｐ＜０．０１；ＧＭ−ＣＳＦ：＊＊ｐ＜０．０１である）。
【図２２】ＳＲＳＦ３が、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子導入マウスの脳においてｐＳＲＳＦ３レベルが経時的に上昇する場合、ＡＤ病態形成に関係づけられることを示す図である。（Ａ）ＡＰＰマウス３〜５カ月（ｍｏ）、ＡＰＰ  ７〜９ｍｏ及びＡＰＰ  １７〜２０ｍｏの全脳抽出物におけるリン酸化形態のＳＲＳＦ３タンパク質（ｐＳＲＳＦ３）のウエスタンブロット解析。（Ｂ）ＳＲＳＦ３のリン酸化が、ＡＰＰマウスにおける疾患発症／認知障害発症の時点から始まり有意に増加することを示した定量分析。データは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３  ＊ｐ＜０．０５）。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。（Ｃ）ＳＲＳＦ３のリン酸化が疾患を越えて増加し、７〜９カ月から始まることを示したＡＰＰ遺伝子導入脳切片の代表的顕微鏡写真。活性化ミクログリアにおいてＣＤ１１ｂマーカーと共局在化した抗ｐＳＲＳＦ３タンパク質染色。ＷＴマウスを陰性対照として使用した。画像は、海馬領域から撮像した。コンゴレッドを使用して、ＡＰＰマウス１７〜２０ｍｏにおけるアミロイド斑を染色し、ＷＴマウスと比較した。
【図２３】高度に上方制御されたｍＲＮＡが、ＡＰＰマウスモデルにおいて翻訳されていないことを示す図である。（Ａ）ＷＴ又はＡＰＰマウス１７〜２０ｍｏ由来の全脳抽出物におけるＧＦＡＰタンパク質発現のウエスタンブロット解析。ＧＦＡＰを、ＡＰＰ遺伝子導入マウスモデルにおける疾患進行の陽性対照として使用した。（Ｂ）同齢のＷＴマウスと比較した場合のＡＰＰマウス１７〜２０ｍｏにおけるＧＦＡＰアイソフォーム発現の有意な増加を示したウエスタンブロットの定量分析。データは、平均±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５を表す。アクチンをローディングコントロールとして使用した。（Ｃ）ＡＰＰ遺伝子導入マウス（３〜５ｍｏ及び１７〜２０ｍｏ）の全脳抽出物におけるＣＬＥＣ７ａ、ＴＬＲ２、ＣＳＴ７、ＣＤ６８及びＧＰＮＭＢ発現のウエスタンブロット解析。（Ｄ）発明者らがＡＰＰ−１７〜２０ｍｏにおけるその発現レベルの上昇を観察したＣＬＥＣ７ａを除いて、ＴＬＲ２、ＣＳＴ７、ＣＤ６８及びＧＰＮＭＢ発現レベルに疾患を越えて有意差がないことを示した定量分析。データは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３  ＊ｐ＜０．０５）。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
【図２４】ＳＲＳＦ３  ｍＲＮＡに対するモルホリノ（５０μｇ）の鼻腔内送達後の総ＳＲＳＦ３のノックダウンを示す図である。（Ａ）Ｓｒｓｆ３  ｍＲＮＡを標的とするモルホリノの鼻腔内送達後３日及び１週間の総ＳＲＳＦ３ノックダウンのウエスタンブロット解析。（Ｂ）全脳抽出物から得たウエスタンブロットの濃度測定分析。データは、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３  ＣＴＬ対７２時間：＊ｐ＜０．０５、ＣＴＬ対１週間；＊＊ｐ＜０．０１、７２時間対１週間：＃ｐ＜０．０５）。アクチンをローディングコントロールとして使用した。
【図２５】症候性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄に由来する初代成熟ミクログリア細胞を１０μＭの抗ＳＲＳＦ３モルホリノで処理すると、異常ＡＬＳミクログリアと関連するマーカーのうちの１つであるＧａｌ３の発現が減少することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書は、高度に制御されたＬＰＳ遺伝子の翻訳を遮断することにより、ＳＲＳＦ３（セリン／アルギニン−リッチスプライシング因子３（ＳＲＳＦ３／ＳＲｐ２０／ＳＦＲＳ３））が、常在ミクログリアにおける自然免疫応答の主要制御因子として作用するという驚くべき知見に関する。
【００１６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのミクログリア活性化の分子機構を解読するために、本発明書らは、Ｆｌａｇ／ＥＧＦＰを大サブユニットリボソームタンパク質Ｌ１０ａのＮ末端に融合し、骨髄特異的遺伝子プロモーター（配列番号１）の転写制御下で発現させた、遺伝子導入モデルを作製した。リボソームに結合したｍＲＮＡとペプチドの両方を単離することにより、本発明者らは、動的翻訳状態のミクログリアリボソームのスナップショットを、インプットとしてのｍＲＮＡ及びアウトプットとしての新規に合成したペプチドとともに入手した。この戦略を使用して、ミクログリア活性化と関連する、ｍＲＮＡ及びタンパク質の特性を同定した。リボソーム結合ペプチドの平行分析により、最も高度に上方制御されたｍＲＮＡは、翻訳されていないことが明らかとなった。高度に上方制御された炎症促進性ｍＲＮＡに反して、鍵となる免疫ＮＦ−κＢインタラクトームを形成するペプチドを含む、配列決定されたペプチドの大多数は、下方制御及び／又は上方制御のいずれかがなされた。リボソームに基づくチェックポイント／制御：高度に発現し、リボソームに結合し、「活発に翻訳される」ｍＲＮＡの選択的３’ＵＴＲ媒介翻訳抑制を同定した。高度に制御された遺伝子の翻訳抑制が、Ｓａａ３の３’ＵＴＲのすべてのドメインにおいて複数の推定結合部位を有する、ＲＢＰセリン／アルギニン−リッチスプライシング因子３（ＳＲＳＦ３／ＳＲｐ２０／ＳＦＲＳ３）及び他の高度に制御されたＬＰＳ遺伝子により編成されたことが見出された。
【００１７】
自然免疫曝露に応答したミクログリア活性化の分子パターンを調査することにより、ミクログリアｍＲＮＡ及びタンパク質分子の特性の顕著な解離を発見した。最も著しい相違は、鍵となる免疫ＮＦ−κＢネットワークにおいて観察され、このネットワークでは、高度に上方制御されＬＰＳにより誘導されリポソーム会合ｍＲＮＡのクラスターが、翻訳されていなかったことが見出された。高度に制御されたＬＰＳ誘導ｍＲＮＡのかなり選択的なこの翻訳制御により、２つの明確に異なるミクログリア分子特性：ｉ）高度に特殊化された免疫性及び炎症促進性ｍＲＮＡ特性、並びにｉｉ）より免疫調節性の恒常性タンパク質特性の形成が生じた。注目すべきことには、観察された翻訳抑制は、高度に上方制御されたＬＰＳ誘導遺伝子のクラスターに制限され、一方、非制御の転写物は、正常に翻訳され、質量分析及びウエスタンブロット解析により、予想されたレベルで検出された。次いで、３’ＵＴＲ領域が、高度に上方制御されリボソームに結合した免疫転写物の翻訳制御において、鍵となる役割を担うことが見出された。その上、ＲＮＡ結合タンパク質ＳＲＳＦ３を、ミクログリア細胞における自然免疫遺伝子翻訳の主要制御因子として同定した。また、ＳＲＳＦ３が、上方制御された、いくつかの自然免疫遺伝子に推定結合部位を有することが見出された。加えて、ＬＰＳ曝露の文脈においてｓｉＲＮＡによる内在性ＳＲＳＦ３の選択的ノックダウンにより、高度に制御された、いくつかの自然免疫遺伝子の翻訳制御が軽減され、これにより、ＳＡＡ３、ＣＣＬ５及びＣＣＬ３を含む免疫媒介物質のタンパク質合成の安定した増加が生じる。ＳＲＳＦ３により媒介される、タンパク質生成の抑制が、リボソーム結合ｍＲＮＡを標的とすることを考慮すると、これは、タンパク質合成の開始後に機能し、ミクログリア活性化を制御する免疫遺伝子翻訳の制御機構／チェックポイントの存在を強力に示唆する。
【００１８】
生理学的条件下では、ミクログリア細胞は、脳の恒常性を維持するのに役立つが、制御されずに長期活性化されたミクログリア細胞は、ニューロンに対して有害である（Ｐｒｉｎｚ及びＰｒｉｌｌｅｒ、２０１４）。したがって、ミクログリア活性化に関与する分子機構の理解への関心がますます高まっている。公表された研究では、文脈依存的ミクログリア免疫転写物の同定／説明に注目しているが（Ｂｅｕｔｎｅｒら、２０１３；Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２０１４；Ｈｉｃｋｍａｎら、２０１３；Ｚｈａｎｇら、２０１４）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのミクログリアプロテオミクス及び関連する制御機構は、それほど明確ではない。最初の包括的成体マウス脳プロテオームは、Ｓｈａｒｍａらにより示されている（Ｓｈａｒｍａら、２０１５）。しかし、解析は、接着分子Ｌｓａｍｐ、並びに脳及び種々の細胞型にわたるこの発現パターンに制限されていた。ミクログリア活性化の分子機構のより良い理解における限定要因の１つは、適切なｉｎ  ｖｉｖｏモデルの欠如であった。ミクログリアリボソームの翻訳動態を研究することによって、ＬＰＳ曝露後のｍＲＮＡ及びタンパク質分子の特性に顕著な相違が見出された。自然免疫応答におけるｍＲＮＡのタンパク質への翻訳は、高度に制御されたプロセスであり、転写物の安定性を標的とする、いくつかの転写後機構が、これまでに記載されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２０１０；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、２０１４；Ｍｉｎｏら、２０１５）。しかし、本明細書に記載する結果は、ｍＲＮＡの制御が、翻訳開始後に生じることを明らかにした。記載のプロセスは、高度に制御された自然免疫ｍＲＮＡに対して選択的であり、一方、非制御の転写物は、正常に翻訳され、定量的質量分析により、予想されたレベルで検出された。重要なことには、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域は、ＲＢＰ  ＳＲＳＦ３の推定結合部位が高度にエンリッチされていた。したがって、ＬＰＳ曝露後のｍＲＮＡ及びタンパク質応答の観察された相違は、ＳＲＳＦ３によってもたらされる３’ＵＴＲ媒介阻害作用により、ある程度説明することができる。
【００１９】
加えて、ＳＲＳＦ３が、ＡＬＳ誘導ＳＯＤ１モデル変異マウスの脊髄において（図９）及び孤発性ＡＬＳ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において（図１１）上方制御されることも見出された。本明細書に記載するように、ＳＲＳＦ３が、正常加齢マウスモデルにおいて及び前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）のマウスモデルにおいて（ＴＤＰ−４３Ｇ３４８Ｃ）上方制御されることも見出された。特定のいかなる理論にも拘束されずに、本発明者らは、ＬＰＳ曝露ミクログリア細胞において観察されるものと類似の機構が、神経学的状態、中枢神経系のがん、抗ウイルス性及び細菌性感染症（特には、免疫細胞を標的とする感染症）において存在すると考える。本発明者らは、ＳＲＳＦ３、又はリン酸化ＳＲＳＦ３により機能する翻訳抑制が、翻訳抑制がなかったなら神経学的状態、中枢神経系のがん及び感染症の制御及び治療に適切であり得る、骨髄細胞における免疫機能を抑制し得ると考える。
【００２０】
神経炎症及びミクログリアの活性化は、多くの脳病理の特徴である。ＡＬＳ並びに他の神経変性障害では、疾患の過程を通じて、ミクログリア細胞は、はじめは有益な細胞から、任意の治療介入（従来の抗炎症方法を含む）に耐性の高度に神経毒性及び異常な細胞へと、その表現型を変化させる。この上、ますます増加するエビデンスは、ＡＬＳ及び／又はＡＤにおける慢性脳炎症が、末梢における自然免疫の顕著な脱制御と関連し得ることを示唆する（Ｚａｎｇら２００５、２００９、２０１３）。最近の発明者らの一連の実験により、ＳＲＳＦ３活性（例えば、この発現レベルの変化及び／又はリン酸化）の変化により、脳及び末梢における自然免疫応答が制御され得ることが明らかとなった。実際、本発明者らは、内毒素ＬＰＳの全身注入に対するミクログリア応答（感染症に対する急性自然免疫応答のモデル）におけるＳＲＳＦ３の役割を明らかとした。ｓｉＲＮＡ方法による内在性ＳＲＳＦ３の標的ノックダウンは、ＳＲＳＦ３により調節される免疫遺伝子の翻訳停止を軽減することを示し、タンパク質の新規合成を伴った。
【００２１】
一態様では、ＳＲＳＦ３を、骨髄細胞（例えば、ミクログリア又は単球細胞）の表現型の制御／正常化の標的として使用して、種々の病態における免疫機能を回復させることができる。
【００２２】
一態様では、ＳＲＳＦ３作用剤は、脳血管発作（ＣＶＡ）、例えば、血管の閉塞により引き起こされる虚血性脳卒中、又は血管の破裂により引き起こされる出血性脳卒中の治療に使用する。虚血性炎症後の解析により、ＳＲＳＦ３が、脳卒中後のミクログリア活性化の調節に関与していることが明らかとなった。図１９Ａに示すように、ｐＳＲＳＦ３のレベルは、脳卒中後に有意に増加した。２重免疫蛍光分析により、脳卒中後のｐＳＲＳＦ３の発現が、Ｉｂａ１陽性活性化ミクログリアに制限されることが明らかとなった。脳卒中後２４時間の、ＳＲＳＦ３を標的とするｓｉＲＮＡの鼻腔内送達により、内在性タンパク質の有意なノックダウンが誘導された（図２０Ａ〜Ｃ）。治療方法としてのｓｉＲＮＡの鼻腔内送達を、本明細書において記載する。治療は、脳卒中後の免疫応答の遅延／再生促進期を一過的にリプログラミングし得る、単一用量としてデザインした。内在性ＳＲＳＦ３のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、脳卒中後３〜５日に自然免疫応答の顕著な増加を誘導し、これを、ＴＬＲ２レポーターマウスを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで可視化した。重要なことには、自然免疫応答／ミクログリア活性化の遅延的誘発は、虚血病変のサイズの有意な減少、並びにＳＲＳＦ３により制御されることが知られているある特定の免疫分子、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５及び関連遺伝子の発現レベル（タンパク質）の遅延的増加と関連した。したがって、脳卒中後２４時間に開始されたＳＲＳＦ３の標的ノックダウンにより、脳卒中後に遅延的炎症応答が増加し、虚血病変が減少する（図２１）。
【００２３】
要約すれば、本発明者らは、骨髄細胞の分子制御（例えば、ミクログリア活性化）に関与する、リボソームに基づく機構／チェックポイントを発見した。また、本発明者らは、ＲＮＡ結合タンパク質ＳＲＳＦ３が、高度に上方制御された自然免疫遺伝子翻訳の主要制御因子として作用し、これにより、自然免疫応答の制御において中心的役割を担うことを示した。これは、骨髄細胞（例えば、ミクログリア活性化）及び自然免疫応答の標的治療制御の道を開く。
【００２４】
配列表
【００２５】
【表１】
2021502977.tif 000003
【００２６】
定義
用語「対象」は、神経学的状態、中枢神経系のがん、ウイルス性感染症又は細菌性感染症を患いやすいか、又は患っている、任意の対象を指す。詳細には、このような対象は、ヒト、動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ等）であり得るが、これらに制限されない。より詳細には、対象は、ヒトからなる。
【００２７】
用語「素因を有する」及び「疑われる」は、神経学的状態、中枢神経系のがん、ウイルス性感染症又は細菌性感染症の病態又は症候を未だ経験又は呈示していないが、神経学的状態、中枢神経系のがん、ウイルス性感染症又は細菌性感染症を発症する、確立の上昇又はリスクの上昇を有し得る、対象を指す。
【００２８】
用語「ｍＲＮＡ」又は「遺伝子転写物」は、ｍＲＮＡ前駆転写物（複数可）、転写プロセシング中間体及び翻訳可能な状態の成熟ｍＲＮＡ（複数可）を指す。転写プロセシングは、スプライシング、編集及び分解を含み得る。
【００２９】
用語「上方制御されたｍＲＮＡ」は、神経学的状態、中枢神経系のがん、ウイルス性感染症若しくは細菌性感染症を発症する素因を有するか、又はこれを発症すると疑われるか、或いは神経学的状態、中枢神経系のがん、ウイルス性感染症若しくは細菌性感染症を患っている対象由来の試料において、同一の特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの、健常対象由来の試料における基準レベルと比較して、検出可能に上昇する、特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを指す。
【００３０】
本明細書において使用する場合、「自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードするｍＲＮＡ」は、例えば、ＬＰＳ曝露の後に、上方制御されるが、翻訳されない、免疫機能に関係づけられるポリペプチド、例えば、ＳＡＡ３、ＬＣＮ２、ＣＣＬ５、ＩＲＦ７、ＣＣＬ３、ＩＦＩ４４、ＩＲＧＭ１、ＧＢＰ２、ＰＬＩＮ４、ＣＰ、ＧＰＲ８４、ＯＡＳＬ２、ＩＦＩＴ１、ＵＳＰ１８、ＧＢＰ７、ＧＭ７６７６、ＣＬＥＣ７Ａ、ＯＬＦＲ１１０、ＣＨ２５Ｈ、ＬＩＬＲＢ４、ＧＰＮＭＢ、ＣＳＴ７、ＯＬＦＲ１１１、ＣＴＬＡ２Ｂ、ＣＤ６８、ＥＩＦ４Ａ２、ＴＲＥＭ２又はＡＰＯＥをコードする遺伝子由来のｍＲＮＡを含む。
【００３１】
自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドは、例えば、ＬＰＳ曝露の後に、上方制御されるが、翻訳されないポリペプチド、例えば、ＳＡＡ３、ＬＣＮ２、ＣＣＬ５、ＩＲＦ７、ＣＣＬ３、ＩＦＩ４４、ＩＲＧＭ１、ＧＢＰ２、ＰＬＩＮ４、ＣＰ、ＧＰＲ８４、ＯＡＳＬ２、ＩＦＩＴ１、ＵＳＰ１８、ＧＢＰ７、ＧＭ７６７６、ＣＬＥＣ７Ａ、ＯＬＦＲ１１０、ＣＨ２５Ｈ、ＬＩＬＲＢ４、ＧＰＮＭＢ、ＣＳＴ７、ＯＬＦＲ１１１、ＣＴＬＡ２Ｂ、ＣＤ６８、ＥＩＦ４Ａ２、ＴＲＥＭ２又はＡＰＯＥを含む。
【００３２】
自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードするｍＲＮＡはまた、本明細書に記載の（例えば、実施例２に記載のマウスモデルにおける）、以下の表１に記載のもののような、ＬＰＳ注入後に上方制御されたｍＲＮＡを含む。
【００３３】
【表２】
2021502977.tif 000004
【００３４】
自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードするｍＲＮＡはまた、以下の表２に示すｍＲＮＡを含む。
【００３５】
【表３】
2021502977.tif 000005
【００３６】
「核酸」又は「核酸配列」の表現は、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなる、ヌクレオシド又はヌクレオチド単量体の配列を指す。この用語はまた、天然に存在しない単量体又はこの部分を含む、修飾又は置換した配列を含む。本開示の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）又はリボ核酸配列（ＲＮＡ）であることがあり、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含む、天然に存在する塩基を含むことがある。この配列はまた、修飾した塩基を含み得る。
【００３７】
「３’ＵＴＲ」の表現は、成熟ｍＲＮＡの配列に対応する３’非翻訳領域を指し、これは、タンパク質コード領域の終止コドンに近接した３’に、好ましくは、タンパク質コード領域の終止コドンに隣接した３’に位置し、ポリ（Ａ）配列の５’側まで、好ましくは、ポリ（Ａ）配列に隣接した５’のヌクレオチドまで伸長する。
【００３８】
「３’ＵＴＲ結合部位」の表現は、配列に結合可能なポリペプチドと特異的に結合可能なｍＲＮＡの３’ＵＴＲ配列に含まれる、核酸配列を指す。核酸配列は、長さが変化し得る。単一３’ＵＴＲ配列は、複数の３’ＵＴＲ結合部位を含み得る。
【００３９】
「神経学的状態」の表現は、ニューロンの構造又は機能の進行性消失に関与する状態を指す。神経学的状態は、血管性認知症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＤ）、アルツハイマー、運動ニューロン疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性球麻痺（ＰＢＰ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）又はケネディ病）及びパーキンソン病を含む。
【００４０】
中枢神経系のがんの表現は、星状細胞腫、神経膠芽腫又は乏突起膠腫を含む。
【００４１】
「ウイルス性感染症」の表現は、ウイルスに起因する感染症を指す。この感染症は、臨床的に明らかとなるかどうかは、わからない。ウイルス性感染症のすべての形態は、ＨＩＶ、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ＥＢウイルス等による感染症を含む、この定義に含まれる。
【００４２】
「細菌性感染症」の表現は、細菌に起因する感染症を指す。この感染症は、臨床的に明らかとなるかどうかは、わからない。細菌のすべての形態は、球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラスト等を含む、この定義に含まれる。グラム陰性又はグラム陽性の原核生物もまた、この用語に含まれる。
【００４３】
「ポリペプチド又はこの断片」の表現は、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を指す。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を除外しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、脂質基等の共有結合を含むポリペプチドは、用語ポリペプチドにより包含される。用語「この断片」は、本明細書において使用する場合、完全長基準ポリペプチドのポリペプチド配列を、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上含み得る、ポリペプチドを指す。一態様では、断片は、機能性（例えば、完全ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を保持する）の断片である。
【００４４】
ＳＲＳＦ３（ＳＦＲＳ３又はＳＲｐ２０としても知られる）は、セリン及びアルギニンリッチスプライシング因子３として知られるタンパク質である（配列番号１２）。ＳＲＳＦ３は、当技術分野において周知である。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００３０１７．４又はＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ８４１０３を参照されたい。一態様では、ＳＲＳＦ３は、本明細書において使用する場合、完全長のＳＲＳＳ３又はこの断片を指す。一態様では、ＳＲＳＦ３は、少なくとも１つのＲＲＭ（ＲＮＡ認識モチーフ）結合ドメイン（配列番号１３）を含む。さらなる態様では、ＳＲＳＦ３は、ＲＳ（セリン−アルギニンジペプチド反復配列）ドメイン（配列番号１４）を含む。一態様では、ＳＲＳＦ３は、少なくとも１つのＲＲＭ（ＲＮＡ認識モチーフ）結合ドメイン（配列番号１３）、少なくとも１つのＲＳ（セリン−アルギニンジペプチド反復配列）ドメイン（配列番号１４）を含む。一態様では、ＳＲＳＦ３は、リン酸化される。
【００４５】
さらなる態様では、ＳＲＳＦ３は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００３０１７．４若しくはＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ８４１０３又はこの機能性断片のＳＲＳＦ３タンパク質の天然配列を含む。一実施形態では、ＳＲＳＦ３ポリペプチドは、配列番号１２、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００３０１７．４又はＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ８４１０３に示す配列の部分又はすべてと、少なくとも６５％〜９５％同一、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％同一、又は少なくとも９５％同一の配列を含む。
【００４６】
一実施形態では、ＳＲＳＦ３ポリヌクレオチドは、本明細書に定義するＳＲＳＦ３ポリペプチドをコードする配列を含む。一実施形態では、ＳＲＳＦ３ポリヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００３０１７．４若しくはＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ８４１０３又はこの断片に示す配列の部分又はすべてと、少なくとも６５％〜９５％同一、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％同一、又は少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む。
【００４７】
「リン酸化ＳＲＳＦ３」の表現は、本明細書において使用する場合、リン酸化により翻訳後修飾されているＳＲＳＦ３のすべての形態を指す。特には、スレオニン、セリン、ヒドロプロリン（ｈｙｄｒｏｐｒｏｌｉｎｅ）、ヒドロキシリジン、チロシン、及び／又は他の任意の非天然ヒドロキシアミノ酸の側鎖のヒドロキシ基が、リン酸基によりエステル化される場合、この表現は、ＳＲＳＦ３を指す。ＳＲＳＦ３は、少なくとも１つのリン酸化部位を含む。用語「リン酸化部位」は、リン酸化又は脱リン酸化の目的のために、キナーゼ又はホスファターゼによりそれぞれ認識される、アミノ酸又はアミノ酸配列を指す。
【００４８】
「ＳＲＳＦ３作用剤」の表現は、ＳＲＳＦ３の機能又は発現を修飾可能な作用剤を指す。一態様では、ＳＲＳＦ３作用剤は、ＳＲＳＦ３翻訳抑制活性を阻害することができる。さらなる態様では、作用剤は、自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする、少なくとも１つのｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する、ＳＲＳＦ３の能力を阻害することができる。ＳＲＳＦ３翻訳抑制活性を修飾することにより、ＳＲＳＦ３作用剤は、ｍＲＮＡ翻訳を完全又は部分的に回復させることがあり、次いで、自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする、少なくとも１つのｍＲＮＡの翻訳の増加を生じさせることがある。
【００４９】
「ＳＲＳＦ３作用剤」は、ＳＲＳＦ３の発現又は機能を阻害可能なＳＲＳＦ３作用剤を含む。一態様では、ＳＲＳＦ３作用剤は、リン酸化されているＳＲＳＦ３の活性又は機能を阻害する。さらなる態様では、ＳＲＳＦ３作用剤は、ＳＲＳＦ３特異抗体（例えば、モノクローナル抗体、単鎖抗体（単鎖変異断片）、ヒト化抗体、及び／又はリン酸化ＳＲＳＦ３に特異性の抗体）、核酸（例えば、アンチセンス、干渉ＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）、ポリペプチド、低分子量化合物又は遺伝子編集系である。
【００５０】
さらなる態様では、遺伝子編集系は、ＣＲＩＳＰＲ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系（ＺＦＮ）、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ系（ＴＡＬＥＮ）を含む。一態様では、ＳＲＳＦ３作用剤は、自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする、少なくとも１つのｍＲＮＡの翻訳を増加させる。さらなる態様では、ＳＲＳＦ３作用剤は、ＳＲＳＦ３（例えば、少なくとも１つのＲＲＭ部位）と、自然免疫応答に関係づけられるポリペプチドをコードする少なくとも１つのｍＲＮＡ（例えば、少なくとも１つの３’ＵＴＲ  ＳＲＳＦ３結合部位）との間の結合を阻害する。
【００５１】
「ＣＲＩＳＰＲ系」の表現は、ＲＮＡガイド鎖と組み合わせたエンドヌクレアーゼを指す。エンドヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ又はＣａｓＹであり得るが、これらに制限されない。
【００５２】
「ガイドＲＮＡ」（本明細書において「ＤＮＡ標的ＲＮＡ」とも呼ばれる）の表現は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９又はこのヌクレアーゼ変異体）に結合し、標的ＤＮＡの特異的位置を標的としてヌクレアーゼを送ることが可能な、ＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子の群を指す。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的セグメント」と「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントを含む。これらの２つのセグメントは同じＲＮＡ分子上にあっても、２つ又はそれを超える別個のＲＮＡ分子上にあってもよい。ＤＮＡ標的セグメントは、標的ＤＮＡの鎖の特異配列に相補性のヌクレオチド配列（すなわち、標的ＤＮＡの相補鎖）を含む。タンパク質結合セグメントは、ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ９関連ポリペプチドと相互作用する。上記のように、Ｃａｓ９の場合では、標的ＤＮＡの部位特異的切断は、（ｉ）ＤＮＡ標的セグメントと標的ＤＮＡとの間の塩基対相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡにおける、ＰＡＭ配列と呼ばれる短いモチーフの両方により決定された位置で発生する。ガイドＲＮＡは、修飾した塩基又は骨格を含み得る。
【００５３】
「結合を阻害する」の表現は、特定の核酸配列との物理的接触を特異的に開始するＳＲＳＦ３の能力を予防又は破壊する作用剤の能力を指す。阻害は、ＳＲＳＦ３の２次又は３次構造における構造変化の誘導、ＳＲＳＦ３の結合ドメイン及び／又は核酸配列の結合部位の妨害、ＳＲＳＦ３リン酸化の阻止、ＳＲＳＦ３の脱リン酸化、ＳＲＳＦ３のタンパク質分解、競合結合、ＳＲＳＦ３  ｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシング、ＳＲＳＦ３  ｍＲＮＡ翻訳の阻止、ＳＲＳＦ３遺伝子の変異、細胞のゲノムからのＳＲＳＦ３遺伝子の欠失、或いは特定の核酸配列と特異的に会合するＳＲＳＦ３の能力を阻害する他の任意の機構により発生し得る。
【００５４】
「ポリペプチドのレベルの上昇」の表現は、試料において、対照と比較して検出可能に増加する、ｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチド（例えば、上方制御されるが翻訳されないポリペプチド）のレベルを指す。試料は、ＳＲＳＦ３作用剤により治療された対象由来であり得る。対照は、無治療対象において同一のｍＲＮＡから翻訳された基準レベルのポリペプチドであり得る。
【００５５】
「ＳＲＳＦ３特異抗体」及び「リン酸化ＳＲＳＦ３特異抗体」の表現は、ＳＲＳＦ３又はリン酸化形態のＳＲＳＳ３の１つ又は複数のエピトープにそれぞれ結合するが、抗原分子の混合集団を含む試料における他の分子を、実質的には認識及び結合しない抗体を指す。一実施形態では、ＳＲＳＦ３特異抗体は、ＳＲＳＦ３のＲＲＭドメイン（配列番号１３）の少なくとも一部分を含むＳＲＳＦ３の領域を認識し、一方、リン酸化ＳＲＳＦ３特異抗体は、少なくともＳＲＳＦ３リン酸化部位、及びＳＲＳＦ３のＲＳドメイン（配列番号１４）の少なくとも一部分を含む、ＳＲＳＦ３の領域を認識する。
【００５６】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、小型の阻害性ＲＮＡ２本鎖を指し、これが細胞において存在すると、結果としてＲＮＡ干渉が生じ、ｓｉＲＮＡが標的とする転写物の発現の減少が生じる。このような分子は、長さが変化し（一般的に１８〜３０塩基対）、アンチセンス鎖のこれらの標的ｍＲＮＡに対して様々な程度の相補性を含み得る。すべてではないが一部のｓｉＲＮＡは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端に不対の突出した塩基を有する。用語「ｓｉＲＮＡ」は、２つの別々の鎖の２本鎖、並びに２本鎖領域を含むヘアピン構造を形成可能な単鎖を含む。
【００５７】
「アンチセンス」の表現により、特定の遺伝子を含むＤＮＡと、又はこの遺伝子のｍＲＮＡ転写物と生理学的条件下でハイブリダイズし、これにより、この遺伝子の転写及び／又はこのｍＲＮＡの翻訳を阻害する、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチド、又は修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドである、オリゴヌクレオチドを説明する。この表現は、天然に存在する核酸塩基、糖、及びヌクレオシド（骨格）間の共有結合からなるオリゴヌクレオチド、並びに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、の細胞取込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強、ヌクレアーゼ存在下での安定性の上昇のような所望の特性のため、天然形態よりも好ましいことがある。
【００５８】
アンチセンスは、本明細書によれば、哺乳動物ＳＲＳＦ３をコードする標的核酸の標的配列に対して相補性である。用語「標的配列」は、本明細書において使用する場合、本明細書によるアンチセンスに対して相補性の核酸配列を含む、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指す。一部の実施形態では、標的配列は、本明細書によるアンチセンスの連続するヌクレオチド配列に対して相補性である、標的核酸の領域からなる。一部の実施形態では、標的配列は、単一オリゴヌクレオチドの相補配列よりも長く、例えば、本明細書によるいくつかのアンチセンスにより標的とされ得る、標的核酸の好ましい領域に存在し得る。
【００５９】
第１の態様によれば、アンチセンスは、ＳＲＳＦ３をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害する。別の態様によれば、アンチセンスは、ＳＲＳＦ３の５’ＵＴＲ（「非翻訳転写領域」）、すなわち、開始コドン（ＡＴＧ）の上流に位置するか、又は上記開始コドンに重複するｍＲＮＡの部分を標的とする。この領域に結合することにより、アンチセンスは、転写及び／又は翻訳に干渉し、これによりＳＲＳＦ３遺伝子を少なくとも部分的に不活化し得る。さらなる態様では、アンチセンスは、ＡＴＧの上流に位置する１００ヌクレオチドを含む領域を標的とする。さらなる態様では、アンチセンスは、ＡＴＧを基準にして＋１番目と＋２５番目との間に位置する領域を標的とする。
【００６０】
「低分子量化合物」の表現は、ＳＲＳＦ３の生物学的活性に影響するように作用可能な、ポリペプチド及び核酸以外の、任意の化学物質又は他の成分を含む。低分子は、現在既知であり使用されている任意の数の治療薬を含み得るか、又は生物学的機能（複数可）をスクリーニングする目的のために、このような分子のライブラリーにおいて合成した低分子であり得る。
【００６１】
「骨髄細胞」の表現は、単球、マクロファージ及びミクログリア細胞を含むが、これらに制限されない、骨髄系列細胞を指す。
【００６２】
「単球」の表現は、最前線防御機構に関与する白血球の型を指し、樹状細胞又はマクロファージ前駆細胞に分化可能であるように認識される。単球は、通常、血液系を移動する。外部の刺激シグナルに応答して、単球は、多くの免疫制御サイトカインを分泌し、組織における感染部位を移動し、マクロファージに分化する。
【００６３】
「ミクログリア細胞」又は「ミクログリア」の表現は、中枢神経系における免疫応答の媒介に関与する、ある種のグリア細胞を指す。ミクログリア細胞は、エキソソームを産生可能であり、アメーバ様ミクログリア細胞、分枝型ミクログリア細胞、及び反応性又は「活性化」ミクログリア細胞を含む、ミクログリア細胞の種々の形態をさらに含む。ミクログリア細胞は、反応性ミクログリアを含み、これは、反応性「活性化」マクロファージ様状態に形質転換し、脳損傷及び炎症の部位に蓄積して、免疫機能に関与し、組織修復及び神経の再生を支援する、静止状態の分子型ミクログリアと定義される（Ｋｒｅｕｔｚｂｅｒｇ、１９９６）。ミクログリア免疫活性は、望まない炎症応答を抑制する特化した免疫阻害経路、及び免疫活性化と関連することが多い組織破壊により抑制される。ミクログリア細胞は、脳の保護及び恒常性に必須の安定した表現型を獲得することが多い。
【００６４】
用語「表現型」は、一般に、細胞又は生物の観察可能な任意の特性を指す。
【００６５】
「自然免疫応答」の表現は、細胞又は個体が、病原体及び／又は損傷の存在に対して認識及び応答する、多様な自然耐性機構を指す。本明細書において使用する場合、「自然免疫応答」は、細胞が損傷及び／又は病原体と関連する分子パターン又はシグナルを認識する場合に発生する、細胞内及び細胞間の現象及び反応を含む。ミクログリア細胞は、活性化されると、自然免疫応答を阻害し得る。
【００６６】
「骨髄系の制御」の表現は、ＳＲＳＦ３作用剤の作用による、骨髄細胞の表現型への修飾又は修飾の阻止を指す。例えば、神経学的状態、がん、細菌性又はウイルス性感染症の文脈では、ＳＲＳＦ３作用剤により、骨髄細胞の免疫応答に関係づけられる、上方制御されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドのレベルが上昇し、これにより、この表現型を第１の（例えば、異常な）表現型から第２の（例えば、免疫性の）表現型に修飾し得る。
【００６７】
「ミクログリア細胞の制御」の表現は、ＳＲＳＦ３作用剤の作用による、ミクログリア細胞の表現型への修飾又は修飾の阻止を指す。例えば、神経学的状態、がん、細菌性又はウイルス性感染症の文脈では、ＳＲＳＦ３作用剤により、ミクログリア細胞の免疫応答に関係づけられる、上方制御されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドのレベルが上昇し、これにより、この表現型を第１の（例えば、異常な）表現型から第２の（例えば、免疫性の）表現型に修飾し得る。その上、ミクログリア細胞の制御により、例えば、神経学的状態の発症の初期で、異常表現型の発生が阻止され得る。一実施形態では、異常表現型を示すミクログリア細胞は、神経学的状態、がん、細菌性又はウイルス性感染症の文脈において、有効な自然免疫応答を生じることが不可能なミクログリア細胞を指す。一実施形態では、免疫表現型を示すミクログリア細胞は、自然免疫応答機能、例えば、これに制限されないが、食作用を生じることが可能なミクログリア細胞を指す。
【００６８】
用語「試料」は、対象から得た多様な試料の種類を指し、診断アッセイにおいて使用することができる。この定義は、血液、尿、脳脊髄液及び生体起源の他の液体試料を包含する。
【００６９】
定義はまた、固形組織試料、例えば、検体の生検、或いは組織培養物、又はこれに由来する細胞、例えば、皮質ニューロン、ミクログリア細胞、骨髄細胞、若しくは脊髄抽出物を包含する。
【００７０】
「候補化合物」の表現は、生物学的標的分子と、特には、タンパク質と、この生物学的活性を修飾するように相互作用可能な、低分子、核酸、抗体又はポリペプチドのような化合物を含む。一実施形態では、候補化合物は、ＳＲＳＦ３作用剤である。
【００７１】
「生体系」の表現は、適する生物学的アッセイ又は生物学的モデルを指す。一態様では、生物学的アッセイは、ＳＲＳＦ３（又はＲＲＭ結合部位）とｍＲＮＡ（又はこの３’ＵＴＲ）との間の相互作用を測定するか、或いはＳＲＳＦ３の活性若しくは発現を測定する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイであり得る。生物学的モデルは、ＳＲＳＦ３（又はＲＲＭ結合部位）とｍＲＮＡ（又はこの３’ＵＴＲ）との間の相互作用の評価、或いはＳＲＳＦ３の活性又は発現の評価を可能とする、適する任意のモデルであり得る。このモデルは、ＳＲＳＦ３を高発現するように修飾されている、生体であり得る。
【００７２】
本明細書は、そのような電離形態及び溶媒和化合物が、当技術分野において周知であるために、医薬品を電離形態又は溶媒和化合物形態で投与するのに明示されているかどうかにかかわらず、化合物のすべての薬学的に許容される電離形態（例えば、塩）及び溶媒和化合物（例えば、水和物）を包含することを意図することに留意されたい。特定の立体化学が明示されていない限り、個々の異性体又は異性体の混合物として化合物が存在するかどうかとは無関係に、化合物の列挙が、すべての可能性のある立体異性体（例えば、キラル中心の数に応じて、鏡像異性体又はジアステレオマー）を包含することを意図することに留意されたい。
【００７３】
「薬学的に許容される塩」の表現は、薬学的に許容される無機及び有機の酸及び塩基に由来するものを指す。適する酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエンｐスルホン酸（ｔｏｌｅｕｎｅ  ｐ  ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ（ａｃｉｄ））、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン２スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸が挙げられる。アミノ酸に由来する塩（例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン）もまた含まれる。適切な塩基に由来する塩は、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム）及びアルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム）を含む。
【００７４】
薬学的に許容される塩に関しては、Ｂｅｒｇｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ、Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒ．Ｓｃｉ．、ｖｏｌ．６６、ｎｏ．１、Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７、１〜１９頁の表Ｉに列挙されている、ＦＤＡ承認の商業的に販売されている塩のリストを参照されたい。
【００７５】
化合物が、種々の多形形態で存在し得ることが、当業者により理解され得る。当技術分野において既知のように、多形性は、２つ以上の明確に異なる結晶又は「多形」種として結晶化する化合物の能力である。多形は、固体状態のその化合物分子の、少なくとも２つの異なる配置又は多形形態を有する、化合物の固形の結晶相である。所与の任意の化合物の多形形態は、同一の化学式又は組成により定義され、２つの異なる化合物の結晶構造と同様に化学構造が明確に異なる。
【００７６】
治療における使用に必要とされる化合物の量が、選択された特定の化合物によってだけでなく、投与経路、治療を必要とする条件の性質、並びに患者の年齢及び状態によっても変化することがあり、最終的には、主治医の判断次第であり得ることが理解され得る。
【００７７】
所望の用量は、単一用量で、又は適切な間隔で、例えば、１日に２回、３回、若しくは４回以上の用量で投与される分割用量として、好都合に提示され得る。治療における使用のために、化合物を化学原料として投与し得ることが可能であるが、活性成分を医薬組成物として提示することが好ましい。したがって、本明細書では、本明細書に記載する化合物の薬学的組合せ又は組成物を、或いはその薬学的に許容される塩を１つ又は複数のその薬学的に許容される担体とともに、並びに任意選択で、他の治療的及び／又は予防的成分をさらに提供する。担体（複数可）は、処方の他の成分と適合し、このレシピエントに対して有害でないという意味で「許容され」なければならない。
【００７８】
医薬組成物は、経口、直腸内、経鼻、鼻腔内、粘膜、局所（頬側及び舌下を含む）、経皮、膣内又は非経口（筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適するもの、或いは吸入又はガス注入による投与に適する形態のものを含む。組成物は、適切な場合、別々の投与単位で好都合に提示されることがあり、薬学的技術分野において周知の方法のいずれかにより調製され得る。すべての方法は、活性成分を、液体担体若しくは微細化した個体担体又は両方と会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の組成物に成形するステップを含む。
【００７９】
経口投与に適する医薬組成物は、所定量の活性成分を、粉末又は顆粒として、溶液、懸濁液、又は乳濁液としてそれぞれ含む、別々の単位、例えば、カプセル剤、カシェ剤又は錠剤として、好都合に提示され得る。活性成分はまた、ボーラス、舐剤又はペーストとして提示され得る。経口投与のための錠剤及びカプセル剤は、従来の賦形剤、例えば、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、又は湿潤剤を含み得る。錠剤は、当技術分野において周知の方法に従ってコーティングされ得る。経口液体製剤は、例えば、水性又は油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ又はエリキシル剤の形態であることがあり、水又は他の適する溶媒で使用前に戻すための、乾燥製品として提示され得る。このような液体製剤は、従来の添加剤、例えば、懸濁化剤、乳化剤、非水性溶媒（食用油を含み得る）、又は保存剤を含み得る。
【００８０】
化合物はまた、非経口投与（例えば、注入、例えば、ボーラス注入又は持続注入による）のために処方されることがあり、単位用量形態で、アンプル、予め充填したシリンジ、小容量注入により、又は複数用量の容器により、保存剤を加えて提示され得る。組成物は、油性又は水性溶媒中の懸濁液、溶液、又は乳濁液のような形態をとることがあり、調合剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤を含み得る。或いは、活性成分は、滅菌固体による無菌的単離により、又は溶液からの凍結乾燥により入手する、適する溶媒、例えば、滅菌、パイロジェンフリーの水で使用前に戻すための、粉末の形態であり得る。
【００８１】
表皮への局所投与では、化合物は、軟膏、クリーム又はローションとして、或いは経皮吸収パッチとして処方され得る。このような経皮吸収パッチは、浸透促進剤、例えば、リナロール、カルバクロール、チモール、シトラル、メントール及びｔアネトールを含み得る。軟膏及びクリームは、例えば、水性又は油性の基剤を用いて、適する増粘剤及び／又はゲル化剤を加えることにより処方され得る。ローションは、水性又は油性の基剤を用いて処方されることがあり、一般に、１つ又は複数の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、又は着色剤も含み得る。
【００８２】
口腔への局所投与に適する組成物は、香味基剤、通常、スクロース及びアラビアゴム又はトラガントに活性成分を含む薬用キャンディー；不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアラビアガムに活性成分を含むトローチ；並びに適する液体担体に活性成分を含む口腔洗浄液を含む。
【００８３】
担体が個体の、直腸内投与に適する医薬組成物は、例えば、単位用量の坐剤として提示される。適する担体は、カカオバター及び当技術分野において一般に使用される他の物質を含み、坐剤は、活性化合物を軟化又は融解担体（複数可）と混合した後、冷却及び型で成形することにより好都合に形成され得る。
【００８４】
膣内投与に適する組成物は、活性成分に加えて、当技術分野において既知の担体を適するように含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレーとして提示され得る。
【００８５】
鼻腔内投与では、化合物又は組合せは、液体スプレー又は分散性粉末として、或いは液滴の形態で使用し得る。液滴は、もう１つの分散剤、可溶化剤又は懸濁化剤をまた含む、水性又は非水性の基剤を用いて処方され得る。液体スプレーは、加圧パックから好都合に送達される。
【００８６】
吸入による投与では、化合物又は組合せは、注入器、噴霧器又は加圧パック、或いはエアロゾルスプレイを送達する他の便利な手段から好都合に送達される。加圧パックは、適する噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適する気体を含み得る。加圧エアロゾルの場合では、投与単位は、弁を用意して、定量を送達することにより決定され得る。
【００８７】
或いは、吸入又はガス注入による投与では、化合物又は組合せは、乾燥粉末組成物、例えば、化合物と適する粉末基剤、例えば、ラクトース又はデンプンとの粉末混合物の形態をとり得る。粉末組成物は、吸入器又は注入器を用いて粉末を投与し得る、単位投与形態で、例えば、カプセル又はカートリッジ、或いは、例えば、ゼラチン又はブリスターパックで提示され得る。
【００８８】
本明細書において使用する場合、「許容される担体」の表現は、有害作用なく対象に投与可能な、本明細書に記載の組合せ及び化合物のための溶媒を意味する。当技術分野において既知の適する担体は、金粒子、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、又は緩衝液を含むが、これらに制限されない。担体は、これらに制限されないが、希釈剤、安定剤（すなわち、糖及びアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、増粘添加剤、着色剤等を含む補助剤を含み得る。
【００８９】
治療における使用に必要とされる化合物の量が、選択された特定の化合物によってだけでなく、投与経路、治療を必要とする条件の性質、並びに患者の年齢及び状態によっても変化することがあり、最終的には、主治医の判断次第であり得ることが理解され得る。しかし、一般には、適する用量は、１日に約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、例えば、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、又は例えば、０．１〜４０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得る。化合物は、例えば、１単位投与形態あたり１〜２０００ｍｇ、１０〜１５００ｍｇ、好都合には２０〜１０００ｍｇ、最も好都合には５０〜７００ｍｇの活性成分を含む、単位投与形態で好都合に投与される。
【００９０】
本明細書の別の実施形態では、投与量は、実験モデルの結果に基づいて、任意選択で、本明細書のアッセイの結果と組み合わせて推定し得る。一般には、活性化合物の１日の経口用量は、１日に約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１日に２０００ｍｇ／ｋｇであり得る。１０〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲の経口用量は、１日に１回又は数回の投与で、適する結果をもたらし得る。特定の対象の応答が、このような容量で不十分である場合には、患者の耐性が許す程度まで、さらに高い用量（又はより限局した異なる送達経路による有効な高用量）を利用し得る。１日に複数用量もまた、組成物の適切な全身レベルを達成する一部の場合において、熟慮される。
【００９１】
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解され得る。このような実施例は、本発明の広範な適用性を説明するものであり、この範囲を制限することを意図していない。この修飾及び変形は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、行うことができる。本明細書に記載のものに類似又は等価のいかなる方法及び材料をも、本発明の試験の実施において使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。本明細書において引用する、発行された特許、公表された特許出願、及び参考文献は、それぞれを特異的及び個々に示して参照により組み込む場合と同様に、これによって、参照により組み込む。矛盾する場合は、本開示が有効である。
【実施例】
【００９２】
実施例１
ＣＤ１１ｂｒＧＦＰ遺伝子導入マウスの作製及び特性評価
細胞型特異性ｍＲＮＡ及びタンパク質プロファイルをｉｎ  ｖｉｖｏで、ミクログリア細胞から同定するために、ヒトＣＤ１１ｂプロモーターの転写制御下で、大サブユニットリボソームタンパク質Ｌ１０ａ（Ｆｌａｇ−ＥＧＦＰ−ＲＰＬ１０ａ）のＮ末端と融合したＦｌａｇ−ＥＧＦＰを発現する、遺伝子導入マウスモデル（図１Ａ及び１Ｂ）を作製した（配列番号１）。これまでの研究では、ヒトＣＤ１１ｂプロモーターは、ミクログリア導入遺伝子発現を効率的に駆動することが示されてきた（Ｇｏｗｉｎｇら、２００６；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００７）。遺伝子導入マウスは、生存可能であり、明白な表現型を発現しない。本実施例では、適切なミクログリア特異性導入遺伝子発現を示すＣＤ１１ｂｒＧＦＰと呼ばれるマウス系統を選択した。Ｆｌａｇ／ＥＧＦＰ−ＲＰＬ１０ａ（Ｆ／ＥＧＦＰ−Ｌ１０ａ）導入遺伝子の発現が、ミクログリア細胞に実際に制限されたことを確認するために、一般的に使用される２つのミクログリアマーカーである、ＥＧＰ及びＣＤ１１ｂ／ｌｂａ１について、２重免疫蛍光分析を実施した。図１Ｃ〜１Ｅに示すように、２重免疫蛍光分析により、脳組織において、ＣＤ１１ｂにより駆動された導入遺伝子（ＧＦＰ染色）が、ＬＰＳによる刺激後にベースライン条件下で、内在性ＣＤ１１ｂ及びｌｂａ１免疫染色と共局在化することが明らかとなった。これまでに報告されているように（Ｇｒａｖｅｌら、２０１６；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）、ＬＰＳの全身注入により、ミクログリアの形態において顕著な変化が誘導され、ＧＦＰ蛍光の発現が増加する（図１Ｅ）。さらなる概念実証対照として、Ｆｌａｇエピトープを使用した、ＣＤ１１ｂｒＧＦＰ初代ミクログリア培養物由来のミクログリアリボソームを、選択的に免疫沈降（ＩＰ）した。図１Ｆに示すように、Ｆ／ＥＧＦＰ−Ｌ１０ａ導入遺伝子のＦｌａｇビーズによる免疫結合が、ウエスタンブロット解析によって確認され、これにより、遺伝子導入モデル系がさらに検証された。
【００９３】
実施例２
活性化ミクログリアの翻訳プロファイルにより高度に制御された自然免疫遺伝子のクラスターが明らかとなる
今日までに、免疫遺伝子の厳しい転写及び転写後の制御に関与する多様な制御機構が、提唱されている（総説については（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２０１０；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ及びＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ、２０１５；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、２０１４））。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏ機構は、まだ理解されていない。ｉｎ  ｖｉｖｏでのミクログリア活性化の分子特性を評価するために、急性的自然免疫曝露の後にベースライン条件下で、トランスクリプトーム及びプロテオームの平行分析を実施することにより、ＣＤ１１ｂｒＧＦＰマウスモデル及び修飾した翻訳親和性精製（ＴＲＡＰ）方法を利用した。実験的パラダイムとして、標準的ＬＰＳ曝露（Ｌａｆｌａｍｍｅら、２００１；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）を使用した。重要なことには、全身性ＬＰＳは、末梢細胞の浸潤を生じず、したがって、自然免疫応答は、ＣＤ１１ｂ陽性常在ミクログリアにより媒介される（Ｃｈｅｎら、２０１２）。ＬＰＳの全身（ｉ．ｐ．）注入により、常在ミクログリア活性化の波が誘導されて、注入後２４時間でピークに達することがこれまでに実証されおり（Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）、したがってＬＰＳ後２４時間で、抗Ｆｌａｇアガロース親和性樹脂を使用して、脳組織ホモジネートを免疫沈降し、ｉ）ｍＲＮＡ抽出後のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０解析、又はｉｉ）ペプチド抽出後の高解像度無標識プロテオミクス解析のいずれかに、ポリリボソーム複合体を使用した。実験戦略を、図２Ａに模式的に提示する。統計解析により、ＬＰＳが６６１種の転写物の発現を対照と比較して有意に変化させたことが明らかとなった。このような中でも、３９４種の遺伝子は上方制御されたが、２６７種の遺伝子は下方制御された（１．２倍以上の差）。データ可視化のために、階層的クラスターを、統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）遺伝子により構成した（図２Ｂ）。クラスタリングに基づいて、ＬＰＳ条件が、対照から顕著に解離した、最も上方制御された転写物を含む、２つのクラスター（図２Ｂ：ズーム１及びズーム２）を観察した。その上、このような転写物の大多数を、免疫応答に関与するものとして分類した。これまでの研究（Ｍａｄｅｄｄｕら、２０１５）と一致して、最も高度に上方制御された転写物は、血清アミロイドＡ３遺伝子（Ｓａａ３）（２９．５２倍の変化）及びリポカリン２（Ｌｃｎ２）（２３．７１倍の変化）であった。両遺伝子は、感染症に対する急性期免疫応答と関連する（Ｆｌｏら、２００４；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ及びＣｈａｉｔ、２００６）。３番目の最も上方制御された転写物は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５であった（Ｃｃｌ５／Ｒａｎｔｅｓ、１５．９３倍の上昇）。ＲＡＮＴＥＳは、多数の慢性炎症性及び自己免疫性プロセスに関係づけられるケモカインのＣ−Ｃサブファミリーのメンバーである（Ｄａｎｏｆｆら、１９９４）。表４では、上位５０種の上方制御された転写物を集約する。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
実施例３
高度に上方制御されたＬＰＳ転写物は翻訳されていない
ミクログリアトランスクリプトームを実際の細胞型特異性プロテオームと比較するために、ＴＲＡＰプロトコールを適応させ、ＬＰＳ曝露後２４時間にリボソーム会合ペプチドを採取し（Ｃａｏ及びＧｅｂａｌｌｅ、１９９６）、無標識定量的質量分析を実施した。高度に制御されたｍＲＮＡ／転写物とは対照的に、ＬＰＳ注入により、１００種のタンパク質の発現レベルが変化した。さらに、検出されたタンパク質の６８％が、少なくとも１．２倍下方制御されたが、３２％が、少なくとも１．２倍有意に上方制御された。クラスター１及び２に存在する高度に上方制御された免疫転写物（図２Ｂ及び２Ｃ）は、配列決定されたペプチド中に、いずれも検出されなかった。これは、ウエスタンブロット解析により、さらに確認された。はじめに、３つの最も上方制御されたｍＲＮＡ（Ｓａａ３、Ｌｃｎ２及びＣＣｌ５）のタンパク質発現レベルを、細胞型特異的方法で検証し、リボソーム結合ミクログリアペプチドについてのウエスタンブロット解析を、選択されたタンパク質のＮ末端を認識する抗体を使用して実施した。図２Ｄに示すように、ｍＲＮＡレベルで高度に上方制御された上位３つの遺伝子は、タンパク質レベルで、いずれも検出されなかった。対照的に、選択された、上方制御リボソーム結合ｍＲＮＡ、例えば、ＣＡＰ２及びアクチンは、翻訳され、定量的質量分析及びウエスタンブロット解析により検出された。これは、ＴＲＡＰ溶出ホモジネートについて実施したウエスタンブロット解析により、検証された（図２Ｄ）。図２Ｄ及び２Ｅにおいてさらに実証されたように、全脳組織ホモジネートのウエスタンブロット解析により、ＳＡＡ３及びＣＣＬ５タンパク質レベルが、ＬＰＳ曝露後に、有意には上昇しないことが明らかとなった。上方制御された対照である、ＣＡＰ２及びアクチンは、翻訳され、予想されたレベルで検出された。例外は、ＬＣＮ２の発現パターンであった。これは、これまでのエビデンスと一致して、脳のＬＣＮ２タンパク質の主な源は、星状膠細胞及び内皮細胞であるが、ｌｃｎ２が、ｍＲＮＡレベルでミクログリア細胞に存在し得ることを実証する（Ｆｌｏら、２００４；Ｊｉｎら、２０１４；Ｌｅｅら、２０１５）。非制御の転写物が、正常に翻訳され、質量分析により予想されたレベルで検出されたことは、注目に値する（表５及び６）。まとめると、本結果は、観察された翻訳抑制が、ミクログリアＮＦ−κＢネットワークと直接関連する、高度に上方制御された免疫転写物のクラスターに制限されたことを示唆する（図７）。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
【表６】
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【００９８】
実施例４
ＬＰＳ活性化ミクログリア細胞はｍＲＮＡ及びタンパク質の明確に異なる分子特性を示す
次いで、高度に制御された免疫遺伝子の観察された翻訳抑制が、活性化ミクログリアの生物学的機能にどのように影響するかを理解するために調査を実施した。ＬＰＳ曝露に対するミクログリア応答の一般的見解を得るために、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（Ｓｈａｎｎｏｎら、２００３）及びＣｌｕｅＧｏクラスター解析（Ｂｉｎｄｅａら、２００３；Ｂｉｎｄｅａら、２００９）を使用して、すべての制御されたｍＲＮＡ／タンパク質機能（図３Ａ及び３Ｂ）をマッピングした。図３Ａ及び３Ｂに示すように、機能アノテーションクラスタリングにより、自然免疫曝露に対するミクログリアｍＲＮＡ及びタンパク質応答の際立った差が明らかとなった。ＬＰＳ制御転写物のネットワークでは、上方制御されたターム／機能が高度にエンリッチされ（赤色のノード）、一方、ＬＰＳ制御ペプチドのネットワークでは、下方制御されたターム／機能が高度にエンリッチされる（緑色のノード）。顕著な相違はまた、上位の生物学的機能に反映された。図３Ｃに示すように、上方制御された転写物と関連する上位１０種の生物学的機能を同定した。このような機能の大多数は、炎症及び免疫応答に関連し、このため、ＮＦ−κＢシグナル伝達の活性化を生じる、ＬＰＳ曝露により引き起こされる、炎症カスケードを徹底的に集約する（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ及びＨｏｒｎｇ、２００９）。高度に特殊化された免疫ｍＲＮＡ応答とは対照的に、上方制御されたタンパク質の上位１０種の生物学的機能は、細胞骨格、ＲＮＡ代謝及びハウスキーピング機能に制限された（図３Ｄ）。したがって、この結果により、リボソームに結合し、高度に制御された自然免疫遺伝子の選択的翻訳抑制が、活性化ミクログリアにおいて、明確に異なる／分岐したｍＲＮＡ及びタンパク質分子の特性の形成に寄与していることが明らかとなった。
【００９９】
実施例５
自然免疫応答における遺伝子発現の翻訳抑制
真核生物では、翻訳開始は、制御の標的とされることが多い、翻訳の律速ステップであると考えられるが（Ｇａｏ及びＲｏｕｘ、２０１５；Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ及びＨｉｎｎｅｂｕｓｃｈ、２００９）、結果により、ｍＲＮＡの制御が、翻訳開始後にリボソームにおいても発生することが明らかとなった。これは、リボソームに基づく機構により高度に制御された自然免疫遺伝子の制御／チェックポイントのさらなる層を示唆する。ほとんどの転写後制御機構では、標的転写物の発現を抑制及び／又は活性化するのにｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を標的とすることを考慮すると（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２０１０）、高度に上方制御された遺伝子、例えば、Ｓａａ３の３’ＵＴＲは、観察された翻訳抑制の原因となる制御配列を含み得ると仮定する。この仮説に取り組むために、Ｓａａ３転写物の野生型３’ＵＴＲを、ＳＶ４０プロモーター／制御エレメントの制御下のルシフェラーゼからなるｐＧＬ３レポータープラスミドによりクローニングした（図４Ａ）。ＨＥＫ２９３細胞株を、ｐＧＬ３ベクター（ｐＧＬ３）、ｐＧＬ３−プロモーター−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔベクター（ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔ）（配列番号２）又はｐＧＬ３−プロモーター−ＳＣＲＡＭＢＬＥベクター（ｐＧＬ３−ＳＣＲＡＭＢＬＥ）（配列番号３）を用いて、それぞれトランスフェクトした。重要なことには、ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔベクターでトランスフェクトすると、レポーターベクター活性が顕著に低下し（ほぼ８０％）、一方、ｐＧＬ３−ＳＣＲＡＭＢＬＥベクターでトランスフェクトすると、ルシフェラーゼ活性が、対照レベル（ｐＧＬ３ベクター）近くまで回復し（図４Ｂ）、これにより、Ｓａａ３−３’ＵＴＲにおける制御エレメントの存在を明らかに実証した。ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔによるトランスフェクション後のルシフェラーゼ活性の消失が、（ｍＲＮＡ安定性及び／又は分解の変化によってではなく）翻訳抑制によって引き起こされることを確認するために、Ｆ／ＥＧＦＰ−Ｌ１０ａプラスミドを安定に発現するＢＶ２細胞を使用した。ｐＧＬ３及びｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔベクターによるトランスフェクション後４８時間に、ＴＲＡＰプロトコールを使用してｍＲＮＡを精製し、次いで、ルシフェラーゼをコードするリボソーム会合ｍＲＮＡを、リアルタイムｑ−ＰＣＲにより両条件下で定量した。図４Ｃに示すように、解析により、Ｓａａ３−３’ＵＴＲをｐＧＬ３ベクターに追加すると、リボソーム会合ルシフェラーゼｍＲＮＡの有意な変化を引き起こさないことが明らかとなり（１８４×１０３±２７×１０３、ｐＧＬ３対２４０×１０３±３５×１０３  ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔ、ｎ＝６）、これにより、Ｓａａ３  ３’ＵＴＲ媒介機構が、リボソーム結合ｍＲＮＡの翻訳を直接阻害することにより作用することが示唆された。
【０１００】
タンパク質発現の制御におけるＳａａ３−３’ＵＴＲの重要な役割が実証されたので、観察された翻訳抑制に関与する特異性３’ＵＴＲ領域を同定することが、求められた。ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｍＲＮＡ発現の制御において重要な役割を担うことが知られている（Ｇｌｉｓｏｖｉｃら、２００８；Ｎｉｌｓｏｎ及びＡｓｓｍａｎｎ、２００７）。ＲＢＰマップウェブサイトを使用することにより（Ｐａｚら、２０１４）、Ｓａａ３−３’ＵＴＲにおけるＲＢＰの相対的位置（図４Ｄ）をマッピングした。生物情報学ツール（ＲＢＰマップ）により、異なる分布を有するＳａａ３の３’ＵＴＲに結合する、いくつかのＲＢＰが予想された。このようなすべてのポイントが、Ｓａａ３  ３’ＵＴＲの、３つのセグメント、Ａ、Ｂ及びＣへの分割を誘導した（図４Ｄ）。各セグメントの機能的関連性を調査するために、Ｓａａ３−３’ＵＴＲの種々のセグメントを含むレポータープラスミドを作製した（図４Ｅ）（配列番号４〜７）。ＨＥＫ２９３細胞を、示すプラスミドを用いてトランスフェクトし、４８時間後、ルシフェラーゼ活性アッセイに供した。図４Ｆに示すように、ドメインＡ、Ｃ、Ｂ又はドメインＢ＋Ｃの欠失を含むＳａａ３−３’ＵＴＲ構築物により、翻訳阻害が部分的に軽減され、ルシフェラーゼ活性が徐々に上昇した。完全な３’ＵＴＲ配列では、ルシフェラーゼ活性が顕著に低下したが、試験した欠失変異体では、このルシフェラーゼ活性が徐々に回復し、３つのドメインのそれぞれが、Ｓａａ３転写物の翻訳の阻害に同程度寄与している、制御エレメントを含むことを示唆した（Ｃｉａｆｒｅ及びＧａｌａｒｄｉ、２０１３；Ｊｉａｎｇ及びＣｏｌｌｅｒ、２０１２）。
【０１０１】
実施例６
セリン／アルギニンリッチスプライシング因子３は自然免疫遺伝子翻訳の主要制御因子として作用する
ＳＡＡ３タンパク質発現の転写後制御におけるＳａａ３の完全３’ＵＴＲ（Ａ、Ｂ及びＣドメイン）の重要性を考慮して、観察された翻訳抑制が、３’ＵＴＲの３つすべてのドメインに結合するＲＢＰにより編成されると仮定した。興味深いことには、この基準を満たしたＲＢＰのうちの１つは、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子３（ＳＲＳＦ３／ＳＲｐ２０）（図４Ｄ）（配列番号１２）である。実際、ＳＲＳＦ３が、Ｓａａ３の完全３’ＵＴＲに結合し、２０種を越える推定結合部位を１２８ｂｐの３’ＵＴＲに沿って有することが見出された。重要なことには、ＳＲＳＦ３  ｍＲＮＡ及びタンパク質は、トランスクリプトーム／プロテオーム解析において、ＬＰＳ曝露後の非制御リボソーム結合ｍＲＮＡ／ペプチドであると同定した（ｍＲＮＡ変化倍率ＬＰＳ対ＣＴＬ：１．１１；ＡＮＯＶＡ  ｐ値＝０．９５３；ＬＦＱ変化倍率ＬＰＳ対ＣＴＬ：１．０１、ＬＦＱ  ｔ−ｓｔｕｄｅｎｔ検定＝０．８９４）。ＳＲＳＦ３は、セリン−アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質ファミリーに属し、これは１２種の哺乳動物ＲＮＡ結合タンパク質を含み、ＲＮＡ代謝における機能的関連性を有する。ＳＲタンパク質は、１つ又は２つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）ドメイン（配列番号１３）をＮ末端に、及びセリン−アルギニンジペプチド反復（ＲＳ）ドメイン（配列番号１４）をＣ末端に有する（Ｍａｎｌｅｙ及びＫｒａｉｎｅｒ、２０１０）。他のＳＲタンパク質と同様に、ＳＲＳＦ３は、選択的スプライシング現象に関与するが、細菌の報告では、転写後制御に関与する機構、例えば、ｍＲＮＡ輸送、サーベイランス、安定性及び翻訳における、ＳＲＳＦ３の役割を強調する（Ｋｉｍら、２０１４）。エビデンスによって、ＳＲタンパク質の活性が、リン酸化／脱リン酸化の周期により制御されることが示唆され（Ｍｉｓｔｅｌｉ及びＳｐｅｃｔｏｒ、１９９７）、したがって、ＬＰＳ曝露によって、ＳＲＳＦ３のリン酸化レベルが変化するかどうかが第１に解析された。実際、ＬＰＳは、ＢＶ２細胞におけるリン酸化ＳＲＳＦ３のレベルは、２．５倍上昇するが（図５Ａ及び５Ｂ）、総ＳＲＳＦ３のレベルは、プロテオミクスにより報告され、ウエスタンブロット解析により確認されるように、有意には変化しない（図５Ｃ及び５Ｄ）。ＳＲＳＦ３が、ＳＡＡ３翻訳抑制に関与するＲＢＰであるかどうかを直接評価するために、内在性ＳＲＳＦ３（ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ）に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（配列番号８〜１１）を使用して、ＳＲＳＦ３ノックダウンを実施した。上記のように（図４）、内在性ＳＲＳＦ３に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ）又は対照（ＣＴＬ−ｓｉＲＮＡ）の存在下で、ｐＧＬ３ベクター又はｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔを用いて、ＢＶ２細胞をトランスフェクトした。図５Ｅ及び５Ｆに示すように、３００ｎＭのｓｉＲＮＡにより、ＳＲＳＦ３が効率的にノックダウンされ、内在性ＳＲＳＦ３タンパク質の発現レベルにおける４０％の有意な低下が生じた（図５Ｆ）。次いで、ＳＲＳＦ３が、ＳＡＡ３の翻訳抑制の直接的原因となるかどうかを調査した。図５Ｇに示すように、ｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲを、ＳＲＳＦ３に対するｓｉＲＮＡと共トランスフェクトすると、ルシフェラーゼ活性が回復し、ＳＲＳＦ３がＳａａ３の３’ＵＴＲ媒介翻訳抑制に関与することが明らかとなった。ウエスタンブロット解析によりさらに確認されるように、ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ（３００ｎＭ）により、ノックダウンが誘導され、ＬＰＳ曝露ＢＶ２細胞において、ＳＡＡ３内在性タンパク質レベルが３．０１倍の有意な上昇を生じた（図５Ｈ及び５Ｉ）。次いで、ＳＲＳＦ３媒介翻訳抑制が、高度に制御された免疫遺伝子／ｍＲＮＡの翻訳制御に関与する、より一般的な機構を表し得るかどうかを調査した。これに取り組むために、クラスター１由来の高度に制御された転写物を選択した（図２Ｂ；ズーム１）：Ｌｃｎ２、Ｃｃｌ５及びＣｃｌ３。すなわち、列挙した遺伝子のすべては、配列決定されたペプチド中に検出されない、高度に上方制御された転写物のクラスターに属する。次いで、生物情報学ツールを使用して、選択された遺伝子の３’ＵＴＲにおける潜在的ＳＲＳＦ３結合部位を検索した。図５Ｊに模式的に示すように、潜在的結合部位の広範な分布を、ＳＲＳＦ３について、Ｌｃｎ２、Ｃｃｌ５及びＣｃｌ３の３’ＵＴＲに沿ってそれぞれ観察した。ＳＲＳＦ３がＬｃｎ２、Ｃｃｌ５及びＣｃｌ３  ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与するかどうかを調査するために、一連のＳＲＳＦ３ノックダウン実験を実施した。これまでに説明したように、実験は、ｓｉＲＮＡ−ＳＲＳＦ３又はＣＴＬ  ｓｉＲＮＡ（配列番号８〜１１）の存在下の、ＬＰＳ曝露ＢＶ２細胞で実施した。図５Ｋ及び５Ｌに示すように、ＣＴＬ  ｓｉＲＮＡ存在下のＬＰＳにより、ＣＣＬ３レベルの初期上昇が引き起こされたが、ＳＲＳＦ３のノックダウンにより、観察される翻訳抑制がさらに消失した。ウエスタンブロット解析により明らかなように、ＳＲＳＦ３ノックダウンは、対応する対照と比較した場合、ＬＣＮ２（４．８９倍の上昇）、ＣＣＬ５（２．５倍の上昇）及びＣＣＬ３（２．１９倍の上昇）タンパク質レベルの有意な上方制御と関連し、これにより、クラスター１由来の高度に制御された転写物の翻訳抑制におけるＳＲＳＦ３の役割を明らかに示唆した。これまでに示した表１においてさらに明らかなように、スクリーニングデータに基づいて、他のいくつかの高度に制御された転写物の３’ＵＴＲ領域は、ＳＲＳＦ３の推定結合部位においてエンリッチされ、これにより、ＳＲＳＦ３が自然免疫遺伝子翻訳の主要制御因子として作用し得る可能性が上昇する。
【０１０２】
実施例７
ＳＲＳＦ３により自然免疫カスケードがｉｎ  ｖｉｖｏで制御される
ＳＲＳＦ３の役割をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、これまでに作製したＴＬＲ２−ｌｕｃ−ＧＦＰレポーターマウスを使用した（Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）。この遺伝子導入マウスモデルでは、ルシフェラーゼ及びＧＦＰを、マウスＴＬＲ２遺伝子プロモーターの転写制御下で共発現させ、これにより、自然免疫応答／ミクログリア活性化を、高解像度／高感度ＣＣＤカメラを使用して、生きているマウスの脳からリアルタイムで可視化することができる（Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２０１２）。これまでの報告と一致して、全身性ＬＰＳは、活性化ミクログリアにおいて、ＴＬＲ２シグナルの安定した誘導を引き起こし、刺激後２４時間でピークに達した（Ｇｒａｖｅｌら、２０１６；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）（図６Ａ〜６Ｄ）。さらに確認されるように、ＴＬＲ２駆動導入遺伝子ＧＦＰの２重免疫蛍光分析により、ＧＦＰ免疫染色のミクログリアマーカーＣＤ１１ｂとの完全な共局在性が明らかとなった（図６Ｅ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験で得られた結果に基づいて、内在性ＳＲＳＦ３のｓｉＲＮＡ媒介標的ノックダウンは、炎症遺伝子の翻訳抑制をｉｎ  ｖｉｖｏで軽減し、これにより自然免疫応答の強調及び脳ＴＬＲ２シグナルの増加が生じ得ると仮定した。最初の鼻腔内送達後４８時間で、２０μｇのｓｉＲＮＡ（配列番号８〜１１）により効率的ノックダウンが誘導され、内在性ＳＲＳＦ３タンパク質の発現レベルにおいて６０％の低下が生じた（図６Ｆ及び６Ｇ）。プロトコールの模式図を図６Ｈに提示する。最適なＳＲＳＦ３ノックダウンが、鼻腔内送達後４８時間で得られ、脳におけるＴＬＲ２応答のピークが、全身注入後２４時間で発生することを考慮して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＲＳＦ３ノックダウンの作用を可視化するために、ＴＬＲ２−ｌｕｃ−ＧＦＰマウスに、ｓｉＲＮＡ送達後２４時間でＬＰＳを注入（ｉ．ｐ．）し、２４時間後に撮像した。ＴＬＲ２応答は、ＬＰＳ注入前（ベースライン）（図６Ｉ）及びＬＰＳ注入後２４時間に（図６Ｊ及び６Ｋ）上昇した。図６Ｊ及び６Ｋに示すように、ＳＲＳＦ３のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンにより、対照（スクランブルｓｉＲＮＡ）と比較した、ＴＬＲ２応答の顕著な増加がｉｎ  ｖｉｖｏで誘導された。図６Ｌにおける、生体光シグナルの定量分析により、ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ＋ＬＰＳ−２４時間の実験群において、ＴＬＲ２シグナル強度が、スクランブル＋ＬＰＳ−２４時間又はＬＰＳ−２４時間のみと比較して、２．１８及び３．４１倍の有意な増加を示した。図６Ｍ及び６Ｎにおいてさらに明らかなように、ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ＋ＬＰＳ−２４時間で処置した動物の脳切片の免疫蛍光分析により、「アメーバ様」形態のミクログリア細胞が、スクランブル＋ＬＰＳ−２４時間と比較して、活性化されたことが示される。この定量分析により、ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ＋ＬＰＳ−２４時間で処置した動物の脳切片におけるｌｂａ１シグナルが、対応する対照と比較して、有意に増加することが明らかとなった（図６Ｏ）。重要なことには、ミクログリアへのｓｉＲＮＡ送達の効率が、ｓｉＧＬＯにより確認された（図８Ａ〜８Ｐ）。このトランスフェクション指標は、良好なトランスフェクションの明白なシグナルとして、核に局在化する。最終的には、新たな脳ホモジネートからＣＤ１１ｂ磁気ビーズにより単離した、精製ミクログリアで実施したウエスタンブロット解析により、ＬＰＳ曝露後のＳＲＳＦ３のノックダウンにより、炎症遺伝子の翻訳抑制が軽減されることが示された。実際、ＳＡＡ３（３．９１倍の上昇）、ＬＣＮ２（３．１５倍の上昇）、ＣＣＬ５（５．１２倍の上昇）及びＣＣＬ３（２．７８倍の上昇）の内在性ミクログリアタンパク質レベルの顕著な上方制御が観察された（図６Ｐ及び６Ｑ）。全体的に見て、結果は、活性化ミクログリアにおける高度に上方制御された自然免疫遺伝子の翻訳制御において、ＳＲＳＦ３が、鍵となる役割を担うことをｉｎ  ｖｉｖｏで実証する。
【０１０３】
実施例８
ＳＯＤ１変異マウスの脊髄においてｐＳＲＳＦ３のレベルが経時的に上昇する場合、ＳＲＳＦ３がＡＬＳに関係づけられる
前駆症状期（５０日）、症候期（１３５日）及び進行期（１５８日）における疾患に関して、全脊髄抽出物を使用して、リン酸化ＳＲＳＦ３のレベルを判定した。各状態を、対照として使用した野生型マウス（１３５日）と比較した。モノクローナル抗体（抗ホスホエピトープＳＲ）を１：１０００の濃度で使用した。総ＳＲＳＦ３は、ポリクローナル抗ＳＲＳＦ３（１：５０００）を使用して判定した。図９は、総ＳＲＳＦ３（Ａ）及びリン酸化ＳＲＳＦ３（Ｂ）についての定量的ウエスタンブロット解析を示す。ＳＲＳＦ３のレベルは、ＡＬＳ前駆症状（ＳＯＤ１変異マウス５０日、１３５日、１５８日）において有意に上昇し、一方、リン酸化レベルは、疾患進行とともに顕著に上昇する（ＳＯＤ１変異マウス５０日、１３５日、１５８日）。また、図９Ｃは、１５８日のＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスのトランスクリプトームプロファイルが、本明細書に記載のように、ＬＰＳ曝露マウスにおいて観察されたものと類似することを示す。その上、生物情報学により、上方制御されたｍＲＮＡの一部は（Ｃｌｅｃ７ａ、Ｃｓｔ７）、ＳＲＳＦ３結合部位が高度にエンリッチされ得ることが明らかとなった。このような結果の組合せは、高度に上方制御されたｍＲＮＡの翻訳抑制による、ＳＲＳＦ３のＡＬＳにおける関連性を指し示す。
【０１０４】
実施例９
正常加齢マウスモデル及び前頭側頭型認知症マウスモデル（ＴＤＰ−４３Ｇ３４８Ｃ）における総ＳＲＳＦ３及びｐＳＲＳＦ３のレベルの上昇
前頭側頭型認知症（ＴＤＰ−４３Ｇ３４８Ｃ）及び正常加齢のマウスモデルを、全脳抽出物（皮質）を使用して解析して、前駆症状性ＴＤＰ−４３Ｇ３４８Ｃ（２〜３カ月）及び症候性ＴＤＰ−４３Ｇ３４８Ｃ（１年）並びにこれらの対応する野生型対照において、リン酸化ＳＲＳＦ３のレベルを判定した。モノクローナル抗体（抗ホスホエピトープＳＲ）を１：１０００の濃度で使用した。総ＳＲＳＦ３は、ポリクローナル抗ＳＲＳＦ３（１：１０００）を使用して判定した。図１０は、ウエスタンブロット解析を示し、ここで、総ＳＲＳＦ３及びリン酸化ＳＲＳＦ３のレベルは、ＴＤＰ−４３Ｇ３４８Ｃマウスにおいて、これらの対応する対照と比較して上昇する。
【０１０５】
実施例１０
孤発性ＡＬＳ患者由来の脳脊髄液
孤発性ＡＬＳ患者及び対照患者由来のヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）をアセトンで濃縮して使用し、抗ホスホエピトープＳＲ抗体（１：２５０）及びポリクローナル抗ＳＲＳＦ３抗体（１：５００）を使用してリン酸化ＳＲＳＦ３及び総ＳＲＳＦ３のレベルをそれぞれ評価した。結果は、図１１Ａ〜Ｇに示す。
【０１０６】
実施例１１
ＳＲＳＦ３／ｐＳＲＳＦ３を標的とするアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドの発生及び検証
ＡＬＳにおける免疫調節性の治療標的としてＳＲＳＦ３を検証するために、内在性ＳＲＳＦ３を標的とする抗ＳＲＳＦ３モルホリノ（抗ＳＲＳＦ３  ＡＳＯＭ）を生成して試験した。図１２に記載及び模式的に提示するように、ＡＳＯＭは、２５核塩基の単鎖であり、ＳＲＳＦ３の５’ＵＴＲを標的として相補ｍＲＮＡに結合する。機構として、ＡＳＯＭは、ＳＲＳＦ３翻訳の開始を遮断し、内在性タンパク質のノックダウンを最終的に引き起こす。ＡＳＯＭ配列は、図１２の説明文に示す。治療の有効性をｉｎ  ｖｉｖｏ設定で、ＡＬＳのマウスモデル（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス）を使用して試験した。図１３において実証するように、抗ＳＲＳＦ３  ＡＳＯＭのくも膜下腔内送達により、ＡＬＳマウスの脊髄における内在性ＳＲＳＦ３の効率的なノックダウンが誘導される。ＳＲＳＦ３ノックダウンは、標的化ｍＲＮＡによるタンパク質の新規合成と関連した（ＳＲＳＦ３によりｍＲＮＡが制御された、図９を参照）。この結果は、内在性ＳＲＳＦ３を標的とするＡＳＯＭを使用してタンパク質の新規合成を誘導し、これにより、疾患に冒されたミクログリアにおける自然免疫応答を、効率的にリプログラミングすることができることを明白に示す。ＡＳＯＭの有効性もまた試験して、末梢免疫細胞におけるＳＲＳＦ３及び免疫応答を標的とした。すなわち、ｐＳＲＳＦ３レベルは、ＡＬＳ患者及びＡＬＳマウスの血漿において上昇する。ＡＳＯＭの有効性を、腹腔内（ｉ．ｐ）送達を使用して試験した。図１４Ａ〜Ｃに示すように、ＡＳＯＭのｉ．ｐ．送達により、血漿（マウス単球／マクロファージ）における内在性ＳＲＳＦ３の効率的なノックダウンが誘導される。重要なことには、症候性疾患期に開始したＡＳＯＭのｉ．ｐ．送達は、ＡＬＳのＳＯＤ１Ｇ９３Ａモデルにおいて優れた治療作用を有した。図１４Ａ、Ｄ、Ｅにさらに記載するように、疾患の進行期（麻痺の発症後）に開始したＡＳＯＭ（２５ｍｇ／ｋｇ  １×週）による治療により、ＡＬＳマウスの生存が有意に向上する（２１日間）。観察された生存の向上は、ロータロッド試験において評価された、感覚性運動障害の顕著な向上と関連した。その上、ＡＳＯＭ治療作用の詳細な解析では、抗ＳＲＳＦ３  ＡＳＯＭによる治療により、筋肉及び脾臓の萎縮が回復し（図１５Ａ〜Ｄ）、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄において運動ニューロンが維持されることが明らかとなった。重要なことには、ｉ．ｐ．送達したＡＳＯＭの治療作用は、脊髄におけるミクログリア活性化の上昇と関連した。まとめると、この結果は、ＳＲＳＦ３が、ＡＬＳに冒されたミクログリア／マクロファージ／単球における免疫応答の制御因子として作用することを明らかに実証する。上記を考慮すると、疾患の進行期において、ＡＳＯＭによる内在性ＳＲＳＦ３の標的化は、ＡＬＳの治療に有効である。
【０１０７】
実施例１２
ＳＲＳＦ３のＲＲＭドメインを標的とする抗体
ＳＲＳＦ３を治療的に調節するさらなる戦略は、標的免疫ｍＲＮＡとのこの相互作用を遮断及び／又は破壊することである。この標的ｍＲＮＡとのＳＲＳＦ３の相互作用を破壊するために、ＳＲＳＦ３のＲＲＭドメインを標的とする、ユニークなモノクローナル治療抗体（Ｍａｂ１２１）を作製した。ＳＲＳＦ３  ＲＲＭドメインに特異性の同定された配列（図１７Ａにおいて下線を引く）及びモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の有効性を試験する検証戦略を図１７に示す。免疫手順の後に、ＭＡＢの１０種のクローンを入手し、図１８Ａにさらに示すように、ＳＲＳＦ３ペプチド配列を高親和性で認識する４種のクローンを選択した。Ｓａａ３  ３’ＵＴＲを発現するＰＧＬ３ベクターで安定にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞で実施したルシフェラーゼ検証アッセイ（本明細書において詳細に記載するアッセイ）では、Ｍａｂ抗体（クローン＃１５５）を含む血清による治療によってルシフェラーゼ活性が回復し、これにより、Ｓａａ３  ３’ＵＴＲに結合するＳＲＳＦ３によって引き起こされる翻訳停止が軽減されたことを示す（図１８Ｂ）。ユニークな免疫原性配列は、ＧＮＮＧＮＫＴＥＬＥＲＡＦＧＹＹＧＰＬＲＳＶである。
【０１０８】
実施例１３
脳虚血及びアルツハイマー病（ＡＤ）におけるＳＲＳＦ３媒介機構のエビデンス。ＳＲＳＦ３の標的化は、脳卒中後の保護に有効である。
【０１０９】
虚血後の炎症の解析により、ＳＲＳＦ３が、脳卒中後のミクログリア活性化の調節に関与することが明らかとなった。図１９Ａに示すように、ｐＳＲＳＦ３のレベルは、脳卒中後に有意に上昇し、一方、総ＳＲＳＦ３タンパク質の発現は、減少した。２重免疫蛍光分析により、脳卒中後のｐＳＲＳＦ３の発現が、ｌｂａ１陽性活性化ミクログリアに制限されることが明らかとなった。脳卒中後２４時間でのｓｉＲＮＡの鼻腔内送達により、内在性タンパク質の有意なノックダウンが誘導された（図２０Ａ〜Ｃ）。治療方法としてのｓｉＲＮＡの鼻腔内送達を本明細書に記載する。この治療は、脳卒中後の免疫応答の遅延／再生促進期を一過的にリプログラミングし得る、単一用量としてデザインされた。内在性ＳＲＳＦ３のｓｉＲＮａ媒介ノックダウンにより、脳卒中後３〜５日で自然免疫応答の顕著な増加が誘導され、これは、ＴＬＲ２レポーターマウスを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで可視化された。重要なことには、自然免疫応答／ミクログリア活性の遅延誘導は、虚血病変のサイズの有意な減少、及びＳＲＳＦ３により制御されることが知られているある特定の免疫分子、例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５の発現レベル（タンパク質）の遅延的増加と関連した。したがって、脳卒中後２４時間で開始したＳＲＳＦ３の標的ノックダウンにより、脳卒中後の遅延的炎症応答が増加し、虚血病変が減少する（図２１）。
【０１１０】
実施例１４
アルツハイマー病（ＡＤ）のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）マウスモデルにおけるＳＲＳＦ３発現パターン
ＡＤのＡＰＰマウスモデルの脳におけるＳＲＳＦ３発現パターンの解析により、７〜９カ月齢からｐＳＲＳＦ３レベルが顕著に上昇することが明らかとなった（Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、１９９７）。このマウスモデルでは、この時点（７〜９カ月齢）は、認知障害の発症と一致する（図２２Ａ、Ｂ）。ＡＰＰマウスの脳切片の免疫蛍光分析により、ｐＳＲＳＦ３の発現が、βアミロイド斑の周囲の活性化ｌｂａ１陽性ミクログリアに制限されることが明らかとなった。対照では、ｐＳＲＳＦ３免疫反応性は、検出されなかった。図２３Ａにさらに示すように、神経炎症を検証するために、ＧＦＡＰの発現レベルを陽性対照として解析した。このタンパク質レベルの上昇、及びそれに伴うアストログリオーシスが、ＡＰＰマウスモデルにおける炎症応答に関与することが知られているからである。ＡＤに冒されたミクログリアにおいて誘導されることで知られ（Ｋａｎｇら２０１８、Ｋｅｒｅｎ−Ｓｈａｕｌら、２０１７）、ＡＬＳミクログリアにも見出される（Ｋｅｒｅｎ−Ｓｈａｕｌら、２０１７）高度に制御され疾患と関連するｍＲＮＡのタンパク質発現レベルを解析したところ、ＳＲＳＦ３により制御されることがわかった。図２３Ｃに示すように、ＣＬＥ７Ａ発現レベルの中程度の上昇を除いて、高度に上方制御された他のｍＲＮＡは、タンパク質レベルが制御されなかった（図２３Ｃ、Ｄ）。抗ＳＲＳＦ３  ＡＳＯＭの鼻腔内送達を、ＡＰＰマウスにおいて試験した。図２４に示すように、単一用量により、ＡＰＰマウスの脳において、内在性ＳＲＳＦ３の効率的なノックダウンが誘導された（１週間の期間を超える持続時間）。増加するエビデンスは、自然免疫応答が、ＡＤにおいて脱制御され、これにより、ＳＲＳＦ３アンタゴニストである抗ＳＲＳＦ３  ＡＳＯＭによる治療が、ＡＤにおける治療可能性を有し得ることを示唆する。
【０１１１】
材料及び方法
ＤＮＡ構築物、遺伝子導入マウスの作製及び遺伝子型同定
ＣＤ１１ｂプロモーターをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（ｐＢＳＫＳ−ＣＤ１１ｂ）にサブクローニングした。Ｆｌａｇ−ＥＧＦＰ断片をＰＣＲにより、鋳型としてｐＥＧＦＰ−Ｎ３プラスミド（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を使用して得た。得られた断片をｐＢＳＫＳ−ＣＤ１１ｂプラスミドに導入した。６０ｓリボソームタンパク質Ｌ１０ａ（ＲＰＬ１０ａ）のゲノムＤＮＡに対応するＢａｍＨＩ／Ｎｏｔｌ断片２．５ＫｂをｐＢＳＫＳ組換えベクターに導入した。最終構築物の完全性は、配列決定（配列番号１）により確認された。Ｘｈｏｌ−Ｘｈｏｌ  ＤＮＡ断片５．２Ｋｂをアガロースゲルで単離し、マイクロインジェクションを行った。遺伝子導入マウスは、尾部試料についてＥＧＦＰ遺伝子のＰＣＲ増幅を実施することにより遺伝子型を同定した。ＥＧＦＰ断片３２９ｂｐをＦ／ＥＧＦＰ−Ｒｐｌ  １０ａ遺伝子導入マウスから増幅した。この実験は、２〜３カ月齢の成体雄及び雌マウスに実施した。すべての実験手順は、ラヴァル大学動物福祉倫理委員会（Ｌａｖａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ｅｔｈｉｃｓ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認され（プロトコール＃１７−０６３−１及び１４−０９６−４）、カナダ動物保護協議会による実験動物の管理及び使用に関するガイド（Ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）に従った。
【０１１２】
ＴＲＡＰプロトコール
Ｈｅｉｍａｎらにより記載されるＴＲＡＰプロトコールを若干の変更を加えて使用した（Ｈｅｉｍａｎら、２００８）。簡潔には、脳皮質試料を氷冷の解剖バッファーに入れ、その後、組織溶解バッファーで均質化した（１０％ｗｔ／ｖｏｌ）。次いで、試料を２０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。１０％のＮＰ−４０の試料容量１／９及び３００ｍＭのＤＨＰＣの試料容量１／９を上清に加えた。次いで、試料を３０分間、４℃のオービタルシェーカーでインキュベートした。２００００ｇで１０分間、４℃の遠心分離により不溶物質を回収した。各上清を２つのアリコートに分けた。（一方のアリコートはｍＲＮＡ抽出に、他方のアリコートはペプチド溶出に使用する）。核試料は、抗Ｆｌａｇアガロース親和性樹脂に直接加え、４℃のオービタルシェーカーで一晩インキュベートする。翌日、ビーズを遠心分離により回収し、高塩濃度バッファー（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ７．３、２００ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のＮＰ−４０、０．５ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド）で３回洗浄した。ビーズペレットを、ｍＲＮＡ精製又はペプチド精製のいずれかに使用した。
【０１１３】
ＴＲＡＰプロトコール後のＦ／ＥＧＦＰ−ＲＰＬ１０ａマウスのｍＲＮＡ精製
最後の洗浄の後、ビーズペレットを、ベータメルカプトエタノールを加えたＮａｎｏｐｒｅｐ溶解バッファー１００μｌに再懸濁し、１０分、室温でインキュベートした。ＲＮＡ精製をキット製造者の指示に従って行った（Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏｐｒｅｐ  ｋｉｔ）。各実験について、３つの生物学的反復を実施した。各反復についてｎ＝５である。採取したＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマウス遺伝子チップに供した。
【０１１４】
ＴＲＡＰプロトコール後のＦ／ＥＧＦＰ−ＲＰＬ１０ａマウスからのペプチドの精製
最後の洗浄の後、すべての残留洗浄バッファーを除去し、ビーズペレットをＥＤＴＡ溶出バッファー（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ７．３、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害物質）に再懸濁し、３０分、室温のオービタルシェーカーでインキュベートした。ＥＤＴＡ溶出バッファーを使用して、リボソームを解離させ、新生鎖ペプチドを遊離させた。７０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離することにより溶出液を回収した。採取したリボソーム会合ペプチドを、質量分析により、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ｆｕｓｉｏｎ質量分析計を使用して配列決定した。この実験では、３回の技術的反復を実施した。１条件あたりｎ＝５である。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物発光画像撮像
これまでに記載されているように（Ｇｒａｖｅｌら、２０１１；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００７；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）、ＩＶＩＳ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣａｌｉｐｅｒＬＳＸｅｎｏｇｅｎ社）を使用して画像を収集した。ここで、データは、光強度を示す疑似カラー画像を示した。対象領域は、光子毎秒毎平方センチメートル毎ステラジアンで表す。
【０１１６】
統計学的解析
データは、少なくとも２回の独立した実験による平均±ＳＥＭとして表す。試験と対照との間の値の統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を適用することにより解析した。多重比較では、統計学的差異は、通常のｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（Ｔｕｋｅｙの多重比較検定）を適用することにより解析した。データは、有意であると考えられ、ｐ＜０．０５である場合「＊」、ｐ＜０．０１である場合「＊＊」、ｐ＜０．００１である場合「＊＊＊」により示した。統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して実施した。
【０１１７】
組織採取及び免疫組織化学
動物を犠死させ、これまでに記載されているように灌流及び処理した（Ｇｒａｖｅｌら、２０１６；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００７；Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）。クリオスタット（２５μｍ厚）で脳を冠状切片に分割し、−２０℃で保存した。次いで、脳切片を、１次抗体である１：５００ウサギポリクローナル抗ｌｂａ１（Ｗａｋｏ社）、１：５００マウスモノクローナル抗緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１：５００ラットモノクローナル抗ＣＤ１１ｂ（Ｓｅｒｏｔｅｃ社）中でインキュベートした。次いで、切片を、対応する蛍光ヤギ２次抗血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中でインキュベートした。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００共焦点顕微鏡を２０×対物レンズとともに使用し、１×〜２×のスキャンズームを使用して蛍光像を取得し、Ｚｅｎソフトウェアを用いて解析した。
【０１１８】
ミクログリア１次培養物
これまでに記載されているように、ＣＤ１１ｂｒＧＦＰ遺伝子導入子犬の大脳皮質から１次培養物を調製した（Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２０１２）。グリア細胞培養物を、Ｆ１２を添加したダルベッコ改変イーグル培地に２０〜２５日間維持して、ミクログリア及び星状膠細胞を単離した。グリア細胞培養物をトリプシン処理して、１０ｃｍ２のプレートに播種した。細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又は溶媒で処理した。２４時間後、１次培養物を採取して免疫沈降に供した。
【０１１９】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴ
ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ウィルミントン、ＤＥ州、米国）を使用して総ＲＮＡ濃度を測定した。ＲＮＡの質をＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で試験した。ＤＮＡマイクロアレイ解析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴによりＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの標準プロトコールに従って、１試料あたり総ＲＮＡ  １００ｎｇを使用して実行した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＭＡ）の方法を用いて、品質管理、バックグラウンド減算及びプローブセット強度の正規化を実施することにより、画像データを解析した。ｍＲＮＡは、２つの比較試料間の変化倍率が１．２よりも高く、関連するＡＮＯＶＡのｐ値が０．０５よりも低い場合、変異体であると考えられた。マイクロアレイ解析は、ＣＨＵ  ｄｅ  Ｑｕｅｂｅｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＨＵＬ）遺伝子発現プラットフォーム、ケベック、カナダにより実施した。
【０１２０】
質量分析法：試料調製
試料を脱塩カラムＡｍｉｃｏｎ  ３ｋＤａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濃縮し、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムで３回洗浄した。タンパク質濃度を比色分析Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより判定した。等量のタンパク質を変性バッファーに可溶化した。次いで、試料をＤＴＴ及びヨードアセトアミドの溶液中で５分間、９５℃まで加熱した。最後に、トリプシン１μｇを加え、混合物を３７℃で一晩インキュベートした。沈殿したデオキシコール酸ナトリウムを１０分のＲＴインキュベーション及び１６０００ｇで５分のＲＴ遠心分離により除去した。上清をＣ１８  Ｅｍｐｏｒｅフィルターで脱塩した。ペプチドを８０％のＡＣＮ−０．１％のＴＦＡに溶出し、スピード真空濃縮装置で乾燥させた。
【０１２１】
質量分析法：質量分析
ｎａｎｏＬＣ／ＭＳＭＳにより３つ組で試料を解析して統計学的情報を得た。各注入では、ペプチド試料７５０ｎｇを注入し、オンラインの逆相（ＲＰ）ナノスケールキャピラリー液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＬＣ）により分離し、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ）により解析した。ナノエレクトロスプレーイオン源を備えるＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に接続した、Ｄｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ｎａｎｏＲＳＬＣクロマトグラフィーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社／Ｄｉｏｎｅｘ  Ｓｏｆｔｒｏｎ  ＧｍｂＨ社、ゲルメリング、独国）を用いて実験を実施した。質量スペクトルは、データ依存取得モード（ｄａｔａ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ）を使用し、Ｔｈｅｒｍｏ  ＸＣａｌｉｂｕｒソフトウェアのバージョン３．０．６３を使用して取得した。フルスキャン質量スペクトル（３５０〜１８００ｍ／ｚ）をｏｒｂｉｔｒａｐで、４ｅ５のＡＧＣ標的、５０ｍｓの最大注入時間及び１２００００の解像度を使用して取得した。各ＭＳスキャンは、３秒の総サイクルタイム（トップスピードモード）について、最も強いイオンの断片化ＭＳＭＳスペクトルを取得した後に行った。これまでに断片化したペプチドの動的排除（ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）は、２０秒の期間及び１０ｐｐｍの許容誤差に設定した。質量分光分析は、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｑｕｅｂｅｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＨＵ  ｄｅ  Ｑｕｅｂｅｃ、カナダのプロテオミクスプラットフォームにより実施した。検索するデータベース及び無標識定量スペクトルを、マウスタンパク質データベース（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ−ｔａｘｏｎｏｍｙ  Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ−８４６７５配列）に対して、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアｖ．１．５．０．２５のＡｎｄｒｏｍｅｄａモジュール（Ｃｏｘ及びＭａｎｎ、２００８）を使用して検索した。ユニークなｒａｚｏｒペプチドのみを使用して定量した。タンパク質は、２つの比較試料のうちの１つにおいて、少なくとも２つの反復値が存在する場合にのみ、定量可能であると考えられた。タンパク質は、２つの比較試料間の変化倍率が１．２よりも高く、関連するｐ値が０．０５よりも低い場合、変異体であると考えられた。
【０１２２】
Ｃｌｕｅｇｏ解析
遺伝子チップＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ又は質量分析によるデータを、ＣｌｕｅＧｏアプリケーション（バージョン２．１．６）により、ｃｙｔｏｓｃａｐｅ環境（３．２．１）を使用して解析した。差次的に発現した遺伝子（変化倍率及びｐ値が一致する）を使用し、種々のオントロジーソース、例えば、ジーンオントロジー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ、ＧＯ）、京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、ＫＥＧＧ）、Ｒｅａｃｔｏｍｅ及びＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙｓを使用して生物学的ネットワークを作成した。ＧＯ区間は、４（最小レベル）〜１１（最大レベル）であった。カッパスコアは、０．７であった。生物学的ターム及び群のエンリッチメントでは、発明者らは、超幾何分布に基づいた両側（エンリッチメント／枯渇）検定を使用した。発明者らは、トランスクリプトーム結果について、統計学的有意性を０．０５に設定し、発明者らは、ＣｌｕｅＧＯにより作成されたターム及び群について、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を使用してｐ値を補正した。主要な群のタームは、％遺伝子／ターム対クラスターに基づく。
【０１２３】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
指数関数的に増殖するＨＥＫ２９３又はＢＶ２細胞を２４ウェルの培養皿に播種した。細胞トランスフェクションを、製造者の指示（ｊｅｔＰＲＩＭＥ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）に従って実行した。各トランスフェクション実験は、レポーター（ｐＧＬ３プロモーター及び修飾ｐＧＬ３プロモーター、Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．１２５μｇ及びＰＲＬ−ＴＫ−ウミシイタケベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）６２．５ｎｇをトランスフェクション内部対照として含んだ。トランスフェクトしたＢＶ２細胞を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により一晩処理した。２重ルシフェラーゼ系により製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に従って、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクションを３つ組で実施した。ルミノメーター（Ｂｅｒｔｏｌ社、独国）を使用して光シグナルを定量した。ルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼ対ウミシイタケルシフェラーゼ活性の比率として評価した。
【０１２４】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＢＶ２細胞を、１０％のＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを添加したＤＭＥＭに維持した。トランスフェクションの１日前に３．５×１０４細胞／ウェルを２４ウェルのプレートに播種した。次いで、ＢＶ２細胞に、ＳＲＳＦ３  ｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ及び３００ｎＭ；ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  ｐｌｕｓ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｒｓｆ３  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴ  ｐｏｏｌ：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）又はＣＴＬ  ｓｉＲＮＡを、ＩＮＴＥＲＦＥＲｉｎ  ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）を使用して製造者の指示に従ってトランスフェクトした（配列番号８〜１１）。ウエスタンブロット解析では、トランスフェクションの２日後に、細胞を１μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は溶媒で刺激し、採取してタンパク質測定を行った。ルシフェラーゼレポーターアッセイでは、ＤＮＡトランスフェクションの１日前に、ＢＶ２細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。
【０１２５】
定量的逆転写ＰＣＲ解析（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
Ｆ／ＥＧＦＰ−ＲＰＬ１０ａを安定に発現するＢＶ２細胞株に、ｐＧＬ３又はｐＧＬ３−Ｓａａ３−３’ＵＴＲ−ｗｔをトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、リボソームをＴＲＡＰプロトコールに従って免疫精製し、ｍＲＮＡ精製をキット製造者の指示に従って行った（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏｐｒｅｐ  ｋｉｔ）。
【０１２６】
リボソーム会合ｍＲＮＡの量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ウィルミントン、ＤＥ州、米国）を使用して測定し、総ＲＮＡ量をＡｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サンタクララ、ＣＡ州、米国）で試験した。総ＲＮＡ  ２０ｎｇに対応するｃＤＮＡを使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、マンハイム、独国）を使用して、蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ定量を実施した。試薬ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、インディアナポリス、ＩＮ州、米国）を製造者により記載されているように、２％のＤＭＳＯとともに使用した。融解曲線法を実施して、非特異性シグナルを評価した。各ｍＲＮＡのコピー数の算出を、Ｌｕｕ−Ｔｈｅらに従って、２次導関数方法及びＣｐ対量の対数の標準曲線を使用して行った（Ｌｕｕ−Ｔｈｅら、２００５）。安定した発現レベルを有する遺伝子であることがわかっている基準遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）及びグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を使用して正規化を実施した（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎら、２０００）。定量的リアルタイムＰＣＲ測定は、ＣＨＵ  ｄｅ  Ｑｕｅｂｅｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＨＵＬ）遺伝子発現プラットフォーム、ケベック、カナダにより実施し、ＭＩＱＥガイドラインに準拠した（Ｂｕｓｔｉｎら、２０１０；Ｂｕｓｔｉｎら、２００９）。
【０１２７】
ＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡの鼻腔内送達
スクランブルｓｉＲＮＡ（２０μｇ）又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡ（２０μｇ）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）を使用し、製造者のプロトコールに従って、麻酔下のマウスの鼻腔内に投与した。簡潔には、ｊｅｔＰＥＩ及びｓｉＲＮＡは、１０％のグルコース溶液で別々に希釈した（窒素及びリン酸（Ｎ／Ｐ）の比率は８に等しい）。次いで、ｓｉＲＮＡ及びＰＥＩ溶液を混合し、１５分間室温でインキュベートして総計５０μｌとした。マウスは、各鼻孔に溶液２５μｌの投与を受けた。
【０１２８】
ＳＲＳＦ３  ＡＭＯＳの腹腔内送達
症候性疾患（１３０／スコア２）から１×週間（２５ｍｇ／ｋｇ）、疾患の末期まで、ＳＲＳＦ３に対するアンチセンスｖｉｖｏ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏをＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの腹腔内に（ｉ．ｐ．）注入した。
【０１２９】
ｓｉＧＬＯトランスフェクション
ｓｉＲＮＡのＣＮＳ細胞への取込みを可視化するために、発明者らは、スクランブルｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡをｓｉＧＬＯ  Ｒｅｄ（２０μｇ）オリゴヌクレオチド２本鎖（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）と、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩ試薬を使用して共トランスフェクトする（Ｎ／Ｐ＝８）。ｓｉＧＬＯを使用して、ｓｉＲＮＡの送達効率を確認した。このトランスフェクション指標は、細胞を良好にトランスフェクトする場合、核に局在化するように修飾する。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物発光画像撮像
これまでに記載されているように（Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ−Ｈｅｂｅｒｔら、２００９）、ＩＶＩＳ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣａｌｉｐｅｒＬＳＸｅｎｏｇｅｎ社）を使用して画像を収集した。撮像時間の２０分前に、マウスは、ルシフェラーゼ基質であるＤルシフェリン（０．９％の生理食塩水中１５０ｍｇ／ｋｇ）（ＣａｌｉｐｅｒＬＳ−Ｘｅｎｏｇｅｎ社）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を受けた。脳の生物発光源の３Ｄ再構築を、拡散発光断層撮像（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＤＬＩＴ）アルゴリズム（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３Ｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣａｌｉｐｅｒＬＳ−Ｘｅｎｏｇｅｎ社）を使用することにより達成した。ここで、データは、光強度を示す疑似カラー画像を示した。対象領域は、光子毎秒毎平方センチメートル毎ステラジアンで表す。
【０１３１】
ＣＤ１１ｂ磁気ビーズによる脳ミクログリアの単離
氷冷ＰＢＳによる灌流後、スクランブルｓｉＲＮＡ又はＳＲＳＦ３−ｓｉＲＮＡで処理し、ＬＰＳを注入した（２４時間；５ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）マウス由来の脳を解剖し、ディスパーゼＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により３０分、３７℃で酵素的に分解して、１５分毎に穏やかに粉砕した。細胞懸濁液を７０μｍの細胞濾過器を通過させることにより、壊死組織片を除去した。細胞洗浄後、細胞ペレットを３０％のパーコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に再懸濁し、７００ｇで１０分間遠心分離した。ミエリンを含む上清を除去し、ペレット状の細胞をＨＢＳＳで洗浄して、キット製造者の指示（ＣＤ１１ｂ（ミクログリア）、ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）に従ってＣＤ１１ｂ磁気ビーズ分離に供した。採取した細胞をウエスタンブロット解析に供した。
【０１３２】
ウエスタンブロット用試料調製（インプット）
生理食塩水／ＬＰＳ注入マウス由来の脳、又はＣＤ１１ｂ磁気ビーズで精製したミクログリア細胞を、尿素溶解バッファー（６Ｍの尿素、１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣＬ）により溶解、超音波処理し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を、標準物質としてのウシ血清アルブミンとともに使用して定量した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移した。
【０１３３】
抗体（ウエスタンブロット）
ウサギポリクローナル抗マウスＳＡＡ３；１：１０００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）；抗ＳＡＡ３抗体の免疫原は、アミノ酸３８〜１２２（総ａａ：１２８）由来のタンパク質のほとんどを包含する。ウサギポリクローナル抗マウスＬＣＮ２；１：１０００（Ａｂｃａｍ社）；抗ＬＣＮ２抗体では、使用する免疫原は、アミノ酸４０（総ａａ：２２４）に近い。ウサギポリクローナル抗マウスＣＣＬ５；１：１０００（ＬＳ−Ｂｉｏ社）；ウサギポリクローナル抗体抗ＣＣｌ５は、アミノ酸２４〜９１（総ａａ：１９８）に対して作製する。ウサギポリクローナル抗マウスＣＡＰ２；１：１０００（Ｏｒｉｇｅｎｅ社）。ウサギポリクローナル抗マウスＣＣＬ３；１：１０００（Ａｂｃａｍ社）。ウサギポリクローナル抗マウスＳＲＳＦ３；１：１０００（Ａｂｃａｍ社）。マウスモノクローナル抗ホスホエピトープＳＲタンパク質クローン１Ｈ４；１：１０００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）。マウスモノクローナル抗アクチン抗体は、ローディングコントロールとして使用した；１：３００００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）。
【０１３４】
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【０１３５】
［関連出願］
本出願では、２０１７年１１月１５日出願の米国特許仮出願第６２／５８６，５６７号の優先権を主張する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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