(57)【要約】  本開示は、（細菌または血小板の付着を撥ねるか、防止するために）付着防止特性を持つ、天然に産生されたポリマーをベースにしたコーティング剤に関する。幅広く特性評価されたこのポリマーは、海洋細菌であるシアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって、ポリマー量を増やすように最適化された産生条件で産生される。重要なことに、この菌株は、非常に効率的なポリマー産生菌株の一つであり、ポリマーを培地に直接分泌するため、わずかな精製工程でポリマーを簡単に回収することができ、費用対効果の高い製品である。コーティング剤を医療機器または医療インプラントに塗布し、それらのバイオフィルム媒介感染を防止することができる。
2021516121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療機器のバイオフィルム媒介感染の予防的処置に使用するための、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーを含む組成物。
【請求項２】
カテーテル関連感染または医療機器のバイオフィルム媒介感染が、表皮ブドウ球菌または黄色ブドウ球菌によって引き起こされる、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記医療機器のバイオフィルム媒介感染が、表皮ブドウ球菌によって引き起こされる、請求項２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記医療機器のバイオフィルム媒介感染が、ヒト血漿タンパク質の存在下で高付着性表皮ブドウ球菌株によって引き起こされる、請求項３に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記組成物が、前記組成物への血小板の付着と前記血小板の活性化とを防止するためにさらに使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記バイオフィルム媒介感染の予防的処置における使用のための、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーでコーティングされた表面または該ポリマーでコーティングされているか該ポリマーを含む成形品。
【請求項７】
前記医療機器のバイオフィルム媒介感染が、表皮ブドウ球菌または黄色ブドウ球菌によって引き起こされる、請求項６に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項８】
前記医療機器のバイオフィルム媒介感染が、ヒト血漿タンパク質の存在下で高付着性表皮ブドウ球菌株によって引き起こされる、請求項７に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項９】
前記コーティングされた表面または成形品が、前記コーティングされた表面または成形品への血小板の付着と前記血小板の活性化とを防止するためにさらに使用される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項１０】
シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーでコーティングされた表面または該ポリマーを含んでコーティングされた成形品。
【請求項１１】
前記組成物またはコーティングされた表面もしくは成形品が、染料、塗料、ワニス、艶出し剤、プライマー、表面活性化剤、コーティング剤またはそれらの混合物のうちの少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物、もしくはコーティングされた表面もしくは成形品、または請求項１０に記載のコーティングされた表面もしくは成形品。
【請求項１２】
前記組成物または前記コーティングされた表面もしくは成形品が、少なくとも０．０１％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物、もしくはコーティングされた表面もしくは成形品、または請求項１０に記載のコーティングされた表面もしくは成形品。
【請求項１３】
前記組成物または前記コーティングされた表面もしくは成形品が、少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物、もしくはコーティングされた表面もしくは成形品、または請求項１０に記載のコーティングされた表面もしくは成形品。
【請求項１４】
前記組成物または前記コーティングされた表面もしくは成形品が、少なくとも５％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物、もしくはコーティングされた表面もしくは成形品、または請求項１０に記載のコーティングされた表面もしくは成形品。
【請求項１５】
前記組成物または前記コーティングされた表面もしくは成形品が、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物、もしくはコーティングされた表面もしくは成形品、または請求項１０に記載のコーティングされた表面もしくは成形品。
【請求項１６】
前記組成物または前記コーティングされた表面もしくは成形品が、少なくとも５０％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物、もしくはコーティングされた表面もしくは成形品、または請求項１０に記載のコーティングされた表面もしくは成形品。
【請求項１７】
前記組成物または前記コーティングされた表面もしくは成形品が、０．０１〜２％（ｗ／ｖ）のポリマー；好ましくは０．０５〜１％（ｗ／ｖ）のポリマー；より好ましくは０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物、もしくはコーティングされた表面もしくは成形品、または請求項１０に記載のコーティングされた表面もしくは成形品。
【請求項１８】
前記組成物または前記コーティングされた表面もしくは成形品が、好ましくは、カテーテル、注射器、ステント、チューブ、医療用包装体、透析装置、歯科補綴物、歯科インプラント、および歯列矯正装置からなるリストより選択される医療機器である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用のための組成物、もしくはコーティングされた表面もしくは成形品、または請求項１０〜１７のいずれか一項に記載のコーティングされた表面もしくは成形品。
【請求項１９】
シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーでコーティングされた表面または該ポリマーでコーティングされているか該ポリマーを含む成形品であって、前記コーティングされた表面または成形品が動物または人体に移植される際の、前記コーティングされた表面またはコーティングされた成形品への血小板の付着と前記血小板の活性化との防止に使用するための、コーティングされた表面または成形品。
【請求項２０】
前記コーティングされた表面または成形品が、染料、塗料、ワニス、艶出し剤、プライマー、表面活性化剤、コーティング剤またはそれらの混合物のうちの少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項１９に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項２１】
前記コーティングされた表面または成形品が、少なくとも０．０１％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーをさらに含む、請求項１９に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項２２】
前記コーティングされた表面または成形品が、少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーをさらに含む、請求項１９に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項２３】
前記コーティングされた表面または成形品が、少なくとも５％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーをさらに含む、請求項１９に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項２４】
前記コーティングされた表面または成形品が、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーをさらに含む、請求項１９に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項２５】
前記コーティングされた表面または成形品が、少なくとも５０％（ｗ／ｖ）の前記ポリマーをさらに含む、請求項１９に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項２６】
前記コーティングされた表面または成形品が、０．０１〜２％（ｗ／ｖ）のポリマー；好ましくは０．０５〜１％（ｗ／ｖ）のポリマー；より好ましくは０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）のポリマーをさらに含む、請求項１９に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【請求項２７】
前記コーティングされた表面または成形品が、好ましくは、カテーテル、注射器、ステント、チューブ、医療用包装体、透析装置、歯科補綴物、歯科インプラント、および歯列矯正装置からなるリストより選択される医療機器である、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の使用のためのコーティングされた表面または成形品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーを、付着防止剤として、または細菌付着防止剤として、またはファウリング防止剤として使用することに関する。
【０００２】
本開示は、本開示のポリマーを含む組成物、およびコーティングされた物または表面に関する。
【背景技術】
【０００３】
院内感染（ＨＡＩ）は、世界中の医療現場で大きな保健課題とみなされており、罹患率、死亡率、医療費を再び増加させる。ＨＡＩの有病率は、主に広範囲の医用生体的表面における細菌コロニー形成によって引き起こされるものであるが、西側先進工業国では一般的に４％〜１０％であり（集中治療室では最大３０％に達する）、死因の第６位となっている（Ｃｌｏｕｔｉｅｒら、２０１５）。感染症がバイオフィルム形成としばしば関連することは、広く受け入れられている。バイオフィルムは、典型的には、密集した細菌集団からなり、自己合成ポリマーマトリックスに包まれ、組織または表面に付着し、そこで長期間存続することができ、病原体のリザーバーとして機能し、感染経路を増加させる（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎら、１９９９年）。バイオフィルム内に細菌が存在すると、抗菌薬および宿主防御細胞に対するそれらの感受性が大幅に低下する。感受性の低下は、抗生物質の浸透が制限されていることではなく、バイオフィルム内の細菌の増殖速度が低下しているため、細菌が増殖依存性抗菌剤による殺傷の影響を受けにくくなっていることに起因しているようである。さらに、インプラントを取り囲む間質性環境は、免疫不全の線維炎症性領域を表すことが知られており、微生物コロニー形成の影響を受けやすく、感染症が発生しやすい（Ｓａｌｗｉｃｚｅｋら、２０１４）。
【０００４】
医療機器のバイオフィルム媒介感染に対する典型的な処置方法は、長期にわたる抗生物質治療を伴い、汚染された機器を外科的に交換することもあり得、これは関連する医療費を増大させる。さらに、世界的な人口高齢化と、臨床で使用される従来の抗生物質に対する細菌耐性の上昇を考慮しなければならない。抗感染性生体材料は、無菌技術、環境無菌性管理、および周術期の抗生物質の予防的投与の面での改善を達成した後の、医療機器関連感染を予防するための主要な戦略となりつつある。抗菌コーティング剤の設計には、大きく分けて以下の３つの戦略がある：（ｉ）主に抗生物質または銀化合物を用いた抗菌剤の放出であって、これは、細胞毒性、炎症反応および細菌株の耐性の増加をもたらし得る；（ｉｉ）主にカチオン性化合物または酵素を用いた接触殺傷；ならびに（ｉｉｉ）非細胞毒性機構を用いてバイオフィルム形成の初期段階を阻止する付着防止／撥菌（Ｃａｍｐｏｃｃｉａら、２０１３年）。
【０００５】
これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を説明するために開示される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、（細菌付着を撥ねるか、防止するために）付着防止特性を持つ、天然に産生されたポリマーをベースにしたコーティング剤に関する。幅広く特性評価されたこのポリマーは、海洋細菌であるシアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって、ポリマー量を増やすように最適化された産生条件で産生される（Ｍｏｔａら、２０１３年）。重要なことに、この菌株は、非常に効率的なポリマー産生菌株の一つであり、ポリマーを培地に直接分泌するため、わずかな精製工程でポリマーを簡単に回収することができ、費用対効果の高い製品である。このポリマーは、９種類の単糖、ペプチド、および硫酸基を含む複雑な組成を有し、最大２５０℃の耐熱性を示す。さらに、これはヒト皮膚新生児線維芽細胞に対して毒性がない（Ｌｅｉｔｅら、２０１７年）。このポリマーの全体的なアニオン性、疎水性、および考えられる様々なコンフォメーションのために、これはバイオテクノロジー応用、すなわち新規の付着防止コーティング剤の開発にとって非常に魅力的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本開示の付着防止ポリマーは、ＡＳＮＩＩＩ培地を含むフラスコ中、２５℃で、１６時間明（３０μＥ／ｍ２／秒）／８時間暗のレジメン下で、曝気（１．２Ｌ／分）しながら増殖させた単細胞性シアノバクテリア・シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｅｋｅ、オランダ）から得ることができる。
【０００８】
本開示の付着防止ポリマーは、単細胞性シアノバクテリア・シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出される。細胞は楕円形または円筒形であり得、群生として見ることができる。シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０は、オランダのＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｅｋｅから購入することができる。（分離元：チュワカ、ザンジバル。試料の種類：沈渣。インキュベーション：２３℃。ＳＳＵ  ＲＲＮＡ配列：最大同一性９９％シアノセイス種ＡＴＣＣ  ５１１４２、１３２６ｂｐ）。
【０００９】
一実施形態では、本開示のポリマーコーティング剤は、ポリドーパミン（ｐＤＡ）層を含み得、これは、標的材料表面へのポリマー結合の超薄均一膜を可能にする。ｐＤＡは優れた生体適合性を備えており、様々な材料表面（ポリマー、金属、セラミック）に塗布され、さらに表面を改質するための「プライマー」として機能する能力を有する。
【００１０】
一実施形態では、様々な基板を使用した：（ｉ）医療機器の製造に頻繁に使用される材料（すなわち、ポリウレタン（ＰＵ）およびシリコーン（Ｓｉ）基板）、ならびに（ｉｉ）表面特性評価技法への高い適合性という理由からの、金基板。
【００１１】
本開示の一態様は、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーを、付着防止剤として、または細菌付着防止剤として、またはファウリング防止剤として使用することである。このポリマーは、医療機器関連感染を予防する大きな潜在性を持つ付着防止コーティング剤としてのユニークな特性を示している。本開示のシアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーの付着防止特性は、３０日間の保存後でさえも、標準状態に保たれる（貯蔵寿命）。
【００１２】
本開示はまた、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーを含む組成物に関する。特に、ファウリング防止塗料または付着防止組成物に関する。
【００１３】
より良い結果を得るための一実施形態では、組成物は、染料、塗料、ワニス、艶出し剤、プライマー、またはそれらの混合物のうちの少なくとも１つの成分をさらに含んでいてもよい。
【００１４】
一実施形態では、組成物は、０．０１〜２％（ｗ／ｖ）のポリマー；好ましくは０．０５〜１％（ｗ／ｖ）のポリマー；より好ましくは０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）のポリマーを含んでいてもよい。
【００１５】
より良い結果を得るための一実施形態では、プライマーは、適切なプライマーまたは表面活性化剤の中でもとりわけ、ポリドーパミンである。
【００１６】
本開示の別の態様は、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマー、または前述の実施形態のいずれかに記載の組成物を含む、コーティングされた表面または成形品に関する。
【００１７】
より良い結果を得るための一実施形態では、表面は、金属、ポリマー、プラスチック、セラミックである。好ましくは、表面は、ポリウレタン、シリコーン、チタン、医療用鋼、金、ヒドロキシアパタイト、歯科／歯列矯正用セメント、歯列矯正装置、またはそれらの混合物である。
【００１８】
より良い結果を得るための一実施形態では、成形品は医療機器である。特に、とりわけカテーテル、注射器、ステント、チューブ、医療用包装体、透析装置、歯科補綴物である。
【００１９】
本開示のシアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーの付着防止特性は、血漿タンパク質の存在下でも維持される。
【００２０】
本開示のポリマーは、参照材料であるポリウレタン（ＰＵ）と比較して、血小板の付着（８７％）および活性化（９０％）を、血漿タンパク質の存在下でも低減させる。
【００２１】
本開示のポリマーは、ＩＳＯ  １０９９３−１３：２００９（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ  -  Ｐａｒｔ  １３：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ）による加速分解条件（７日間、４５℃、ｐＨ７．４およびｐＨ５）で安定である。
【００２２】
また、本開示のシアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーは、ＩＳＯ  １０９９３−５：２００９（Ｅ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ  -  Ｐａｒｔ  ５：  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）によれば、細胞毒性の可能性はない。
【００２３】
本開示の一態様は、医療機器のバイオフィルム媒介感染の予防的処置、すなわちカテーテル関連感染（ＣＡＩ）または医療機器のバイオフィルム媒介感染の予防的処置に使用するための、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーを含む組成物に関する。
【００２４】
一実施形態では、カテーテル関連感染（ＣＡＩ）または医療機器のバイオフィルム媒介感染は、表皮ブドウ球菌または黄色ブドウ球菌によって引き起こされる。
【００２５】
一実施形態では、カテーテル関連感染（ＣＡＩ）または医療機器のバイオフィルム媒介感染は、表皮ブドウ球菌によって引き起こされる。
【００２６】
一実施形態では、カテーテル関連感染（ＣＡＩ）または医療機器のバイオフィルム媒介感染は、ヒト血漿タンパク質の存在下で高付着性表皮ブドウ球菌株によって引き起こされる。
【００２７】
一実施形態では、前記組成物は、医療機器への血小板の付着と前記血小板の活性化とを防止するためにさらに使用される（抗血栓効果）。
【００２８】
本開示の別の態様は、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーでコーティングされた表面または該ポリマーを含んでコーティングされた成形品に関する。
【００２９】
本開示の別の態様は、カテーテル関連感染（ＣＡＩ）または医療機器のバイオフィルム媒介感染が、表皮ブドウ球菌または黄色ブドウ球菌によって引き起こされる、コーティングされた表面または成形品に関する。
【００３０】
本開示の別の態様は、カテーテル関連感染（ＣＡＩ）または医療機器のバイオフィルム媒介感染が、ヒト血漿タンパク質の存在下で高付着性表皮ブドウ球菌株によって引き起こされる、コーティングされた表面または成形品に関する。
【００３１】
一実施形態では、前記コーティングされた表面または成形品は、医療機器への血小板の付着と前記血小板の活性化とを防止するためにさらに使用される（抗血栓効果）。
【００３２】
本開示の別の態様は、カテーテル関連感染（ＣＡＩ）またはバイオフィルム媒介感染の予防的処置に使用するための、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーでコーティングされた表面または該ポリマーを含んでコーティングされた成形品に関する。
【００３３】
一実施形態では、組成物またはコーティングされた表面もしくは成形品は、染料、塗料、ワニス、艶出し剤、プライマー、表面活性化剤、コーティング剤またはそれらの混合物のうちの少なくとも１つの成分をさらに含む。
【００３４】
一実施形態では、組成物またはコーティングされた表面もしくは成形品は、少なくとも０．０１％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００３５】
一実施形態では、組成物またはコーティングされた表面もしくは成形品は、少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００３６】
一実施形態では、組成物またはコーティングされた表面もしくは成形品は、少なくとも５％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００３７】
一実施形態では、組成物またはコーティングされた表面もしくは成形品は、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００３８】
一実施形態では、組成物またはコーティングされた表面もしくは成形品は、少なくとも５０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００３９】
一実施形態では、組成物またはコーティングされた表面もしくは成形品は、０．０１〜２％（ｗ／ｖ）のポリマー；好ましくは０．０５〜１％（ｗ／ｖ）のポリマー；より好ましくは０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００４０】
一実施形態では、組成物またはコーティングされた表面もしくは成形品は、好ましくは、カテーテル、注射器、ステント、チューブ、医療用包装体、透析装置、歯科補綴物、歯科インプラント、および歯列矯正装置からなるリストより選択される医療機器である。
【００４１】
本開示の別の態様は、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーでコーティングされた表面または該ポリマーでコーティングされているか該ポリマーを含む成形品であって、前記コーティングされた表面または成形品が動物または人体に移植される際の、コーティングされた表面またはコーティングされた成形品への血小板の付着と前記血小板の活性化との防止に使用するための（抗血栓効果）、コーティングされた表面または成形品に関する。
【００４２】
一実施形態では、コーティングされた表面または成形品は、染料、塗料、ワニス、艶出し剤、プライマー、表面活性化剤、コーティング剤またはそれらの混合物のうちの少なくとも１つの成分をさらに含む。
【００４３】
一実施形態では、コーティングされた表面またはコーティングされた成形品への血小板の付着と前記血小板の活性化との防止に使用するためのコーティングされた表面または成形品は、少なくとも０．０１％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００４４】
一実施形態では、コーティングされた表面またはコーティングされた成形品への血小板の付着と前記血小板の活性化との防止に使用するためのコーティングされた表面または成形品は、少なくとも０．０５％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００４５】
一実施形態では、コーティングされた表面またはコーティングされた成形品への血小板の付着と前記血小板の活性化との防止に使用するためのコーティングされた表面または成形品は、少なくとも５％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００４６】
一実施形態では、コーティングされた表面またはコーティングされた成形品への血小板の付着と前記血小板の活性化との防止に使用するためのコーティングされた表面または成形品は、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００４７】
一実施形態では、コーティングされた表面またはコーティングされた成形品への血小板の付着と前記血小板の活性化との防止に使用するためのコーティングされた表面または成形品は、少なくとも５０％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００４８】
一実施形態では、コーティングされた表面またはコーティングされた成形品への血小板の付着と前記血小板の活性化との防止に使用するためのコーティングされた表面または成形品は、０．０１〜２％（ｗ／ｖ）のポリマー；好ましくは０．０５〜１％（ｗ／ｖ）のポリマー；より好ましくは０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）のポリマーを含む。
【００４９】
一実施形態では、コーティングされた表面または成形品は、好ましくは、カテーテル、注射器、ステント、チューブ、医療用包装体、透析装置、歯科補綴物、歯科インプラント、および歯列矯正装置からなるリストより選択される医療機器である。
【００５０】
以下の図は、本開示を例示するための好ましい実施形態を示しており、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本開示のポリマーコーティング剤の表面特性評価を示す図である。Ａ）厚さ測定；Ｂ）水接触角測定。
【図２】３０日間の保存前後での、本開示のポリマーコーティング剤の表面特性評価を示す図である。Ａ）厚さ測定；Ｂ）水接触角測定（＊ｐ＜０．０５、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）。
【図３】ＩＳＯ  ２２１９６による、本開示のポリマーコーティング剤のＡ）表皮ブドウ球菌；Ｂ）黄色ブドウ球菌；Ｃ）大腸菌に対する付着防止性能を示す図である（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎ．ｓ．−非有意；ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）。
【図４】ＩＳＯ  ２２１９６による、ヒト血漿タンパク質１％（ｖ／ｖ）の非存在下および存在下での、本開示のポリマーコーティング剤の表皮ブドウ球菌に対する付着防止性能を示す図である（＊＊ｐ＜０．００８；＊ｐ＜０．０３；ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）。
【図５】ＩＳＯ  １０９９３−５：２００９（Ｅ）による、本開示のポリマーコーティング剤の生体適合性評価：ＩＳＯ  １０９９３−１２：２００４に従って調製された本開示の抽出物のポリマーコーティング剤とのインキュベーション後の、Ｌ９２９線維芽細胞の相対代謝活性（ＭＴＴによって測定）を示す図である（結果は、陽性対照Ｌ９２９の％として表示）。
【図６】１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿タンパク質の存在下での、金、ＰＵおよび本開示のポリマーコーティング剤への血小板の付着の代表的な走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す図である（倍率１０００倍、スケール６０μｍ）。
【図７】ＩＳＯ  １０９９３−４：２００９による、ＳＥＭ分析を使用した本開示のポリマーコーティング剤の特性評価に重ねての、血小板の付着および活性化プロファイルを示す図である。Ａ）血漿タンパク質なし；Ｂ）１％（ｖ／ｖ）血漿タンパク質あり。
【図８】ＩＳＯ  １０９９３−１３：２００９に従って行った本開示のポリマーコーティング剤の劣化アッセイ（４５℃、ｐＨ７．４、ｐＨ５）を示す図である。Ａ）ポリマーコーティングの厚さ；Ｂ）ポリマーコーティングの水接触角測定；Ｃ）表皮ブドウ球菌に対するポリマーコーティングの付着防止性能（＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）。
【図９】活性化状態によって分類した、ＰＵコーティングに付着した血小板の代表的なＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である：（Ａ）非活性化、（Ｂ）部分活性化および（Ｃ）完全活性化（倍率：Ａ−  １５  ０００倍、Ｂ−  １０  ０００倍、Ｃ−  １０  ０００倍）。
【図１０】血漿タンパク質（１％、ｖ／ｖ）の存在下または非存在下で３７℃で３０分間インキュベーションした後の、ＰＵおよびポリマーμｍ２当たりへの付着血小板の数を示す図である（ｎ＝９）。統計解析はノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定で行い、差は＊＊＊＊（ｐ＜０．００１）で示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
一実施形態では、ポリマーは、ＡＳＮＩＩＩ培地（Ｒｉｐｐｋａら、１９７９年）を含むバイオリアクター（Ｓｔｉｒｒｅｄ  ｒｅａｃｔｏｒｓ，  ＤＷＫ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、２５℃で、１６時間明（３０μＥ／ｍ２／秒）／８時間暗のレジメン下で、曝気（１．２Ｌ／分）および軌道撹拌（１５０ｒｐｍ）（Ｍｏｔａら、２０１３年）しながら、ＯＤ７３０ｎｍが≒３．０〜３．５になるまで増殖させた単細胞性海洋シアノバクテリア・シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｅｋｅ、オランダ）から得られる。
【００５３】
放出されたポリマーを単離するために、培養物を透析膜（１２〜１４ｋＤａの分子量カットオフ；Ｍｅｄｉｃｅｌｌ、英国）に入れ、連続撹拌しながら４８時間、最低１０容量のタイプＩＩ水に対して透析する。細胞を、２０．０００×ｇで１５分間４℃で遠心分離することにより除去する。ポリマー（上清中）を、２容量の９９％冷エタノールで沈殿させる。ポリマーを滅菌金属鉗子で回収し、タイプＩＩ水に溶解し、前述のように再び沈殿させ、凍結乾燥する。
【００５４】
一実施形態では、発熱／エンドトキシン効果の評価は、ポリマー１．０％（ｗ／ｖ）の水溶液を段階希釈し、それらを０．２μｍフィルターに通して滅菌し、採取したばかりの全血と一晩インキュベートすることによって行った。血漿を単離し、サイトカインであるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の放出について、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により分析した。試験ウェルをエンドトキシン処理した対照と比較して、発熱活性が無いまたは低いことを確認した（目標＜０．５  ＥＵ／ｍＬ  Ｅｔａｘａｔｅ）（Ｄａｎｅｓｈｉａｎら、２００９年）。
【００５５】
一実施形態では、金基板の調製は、Ｍａｒｔｉｎｓら、２００３年に従って行った。簡単に説明すると、クロム（５ｎｍ）層および金（２５ｎｍ）層を、イオンビームスパッタリングにより、クロムおよび金のターゲット（純度９９．９％）からシリコンウェーハ（ＡＵＲＥＬ，  ＧｍｂＨ）上に蒸着させた。クロムは、シリコンへの金の密着性を向上させるために使用した。金基板（１ｘ１ｃｍ）を「ピラニア」溶液（７部のＨ２ＳＯ４と３部の３０％Ｈ２Ｏ２）で５分間洗浄し、エタノールで十分にすすぎ、アルゴン穏流で乾燥させた。
【００５６】
一実施形態では、ポリウレタン（ＰＵ）膜を、ＰＵペレット（Ｐｅｌｌｅｔｈａｎｅ  ２３６３−８０  ＡＥ、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から製造した。ＰＵペレットを、最初にヘキサン（Ｍｅｒｃｋ）で２回、エタノール（９９．９％、Ｍｅｒｃｋ）で１回超音波処理（１５分）し、シリコーンケーシングを除去した。このプロセスを２回繰り返した（Ｆｅｌｇｕｅｉｒａｓら、２０１７年）。最後に、ＰＵペレットをタイプＩＩ水ですすぎ、真空オーブン中室温（ＲＴ）で２４時間、一晩乾燥させた。ＰＵペレットを０．１％（ｗ／ｖ）でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、Ｓｉｇｍａ）に溶解した。ＰＵ溶液を、金基板（Ｌａｕｒｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上に９０００ｒｐｍで１分間スピンコーティングすることにより、ＰＵ薄膜を作製した。ＰＵ膜を、真空オーブン中ＲＴで１時間乾燥させた。
【００５７】
一実施形態では、本開示のポリマーの金基板への結合を促進するために、ポリドーパミン（ｐＤＡ）層を試料に導入した。塩酸ドーパミン（Ｈ８５０２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を、トリス−ＨＣｌ  １０ｍＭ  ｐＨ８．５緩衝液中に、様々な濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬおよび２ｍｇ／ｍＬ）で新たに調製した。金基板を２４ウェル浮遊細胞プレート（Ｓｔａｒｓｔｅｄ）に入れ、１ｍＬのドーパミン溶液に浸漬させ、２時間（１ｍｇ／ｍＬおよび２ｍｇ／ｍＬ）、１８時間（０．１ｍｇ／ｍＬ）または２４時間（２ｍｇ／ｍＬ）、ＲＴおよび７０ｒｐｍで、光から保護しながらインキュベーションした。超音波洗浄機を用いて、試料をトリス−ＨＣｌ  １０ｍＭ  ｐＨ８．５緩衝液で２回、タイプＩ水で１回すすいだ（１分間）。ｐＤＡコーティングされた試料は、使用後２時間以内に保存した。
【００５８】
一実施形態では、ポリマー溶液を製造するために、本開示のポリマーをタイプＩＩ水（０．５％ｗ／ｖ）で２４時間水和させた。次いで、ポリマー溶液を１１０℃で３０分間オートクレーブにかけた。冷却後、ポリマー溶液を、９０００ｒｐｍで１分間、ｐＤＡコーティングされた金基板上にスピンコーティングした（Ｌａｕｒｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ポリマーコーティング剤を、真空オーブン中室温で１時間乾燥させた。
【００５９】
一実施形態では、厚さ測定は、Ｎａｎｏｆｉｌｍ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓのイメージングエリプソメーター、モデルＥＰ３を使用して実施した。このエリプソメーターを、偏光子−補償子−試料−アナライザモード（消光エリプソメトリー）で動作した。光源は波長５３２ｎｍの固体レーザーであった。金基板の屈折率（ｎ＝０．７０９）および消衰係数（ｋ＝２．５３４）は、角度が６０〜８１°で変化するデルタおよびプサイスペクトルを使用して決定した。これらの測定は、機器のずれを補正するために４つのゾーンで行った。ｐＤＡ層およびポリマーコーティングの厚さは、（ｎ）ポリマー＝１．５４および（ｋ）ポリマー＝０を用いて決定した。
【００６０】
一実施形態では、接触角測定は、倒立液滴法（キャプティブ・エアバブル法）を使用して、ビデオＣＣＤカメラとＳＣＡ２０ソフトウェアとを搭載したＤａｔａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ、モデル光学接触角（ＯＣＡ）１５で実施した（水接触角（ＷＣＡ））。各試料をスライドガラスにテープで貼り付け、タイプＩＩ水を満たしたガラスチャンバーに入れた。試料表面の下に配置したＪ字型針から６μＬの気泡を放出した後、画像を撮影し、様々な数学関数を用いて気泡プロファイルをフィッティングし、接触角を計算した。Ｌａｐｌａｃｅ−Ｙｏｕｎｇフィッティング法を使用して接触角＞６０°を計算し、タンジェントフィッティング法を使用して接触角＜６０°を計算した。
【００６１】
一実施形態では、細菌株、培地および増殖条件を取得した。特に、表皮ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ３５９８４）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ３３５９１）および大腸菌（ＡＴＣＣ  ２５９２２）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。細菌を、トリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）（Ｍｅｒｃｋ）およびトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）（Ｍｅｒｃｋ）で増殖させた。細菌懸濁液は、光学濃度（６００ｎｍ）を測定することにより調整した。細菌数は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）数で確認した。
【００６２】
一実施形態では、細菌−ポリマーコーティング相互作用を測定した。特に、細菌付着に対する表面抵抗性を評価するために、ＩＳＯ  ２２１９６（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｐｌａｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅｓ）を適用した。まず、試料をエタノール７０％で１５分間２回消毒した後、滅菌したタイプＩＩ水で１５分間２回すすいだ。最後に、試料をアルゴン穏流で乾燥させた。次いで、試料を、ＴＳＢ中１．８ｘ１０６ＣＦＵ／ｍＬ（１％（ｖ／ｖ）ヒト血漿タンパク質を含むおよび／または含まない）の５μＬ細菌懸濁液に曝した。ポリプロピレン（ＰＰ）カバースリップ（φ＝９ｍｍ）を上部の細菌懸濁液滴に載せ、強制的に細菌を表面に接触させた。高湿度３７℃で２４時間インキュベーションした後、試料をＰＢＳですすいだ。付着した細菌をパラホルムアルデヒド４％で固定し、４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。倒立型蛍光顕微鏡（ＩＦＭ）を用いて、ＤＡＰＩチャンネル（励起：３６５ｎｍ、発光：４２０ｎｍ）の付着細菌を可視化し、画像を取得した。付着細菌数は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて定量した。
【００６３】
一実施形態では、本開示のポリマーコーティング剤の生体適合性を、ＩＳＯ  １０９９３−５：２００９（Ｅ）に記載のように、マウス線維芽細胞Ｌ９２９とポリマーコーティング剤の抽出物とのインキュベーションによって評価した。抽出物を、ＩＳＯ  １０９９３−１２：２００４（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ  −  Ｐａｒｔ  １２：  Ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）に記載のように調製した。簡単に説明すると、ポリマーコーティング剤を、段落００６２で説明したように滅菌した。滅菌工程後、ポリマーコーティング剤をＰＢＳですすぎ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）と１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｂｉｏｗｅｓｔ）とを補充したＭＥＭ培養培地（改変イーグル培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ））で、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で２４時間抽出した。細胞を９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、補充したＭＥＭ中で２４時間培養を維持した。その後、ＩＳＯ  １０９９３−５：２００９（Ｅ）に従い、培地を材料抽出物およびそれぞれの５０％希釈物に置き換えた。５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃で２４時間インキュベーションした後、細胞の代謝活性をＭＴＴアッセイにより定量した。クリーンウェルの抽出物を細胞増殖の陽性対照として使用し、５０％ＤＭＳＯを含むＭＥＭ溶液を陰性対照として使用した。
【００６４】
一実施形態では、本開示のポリマーコーティング剤の血栓形成性を評価するために、ＩＳＯ  １０９９３−４：２００９（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ  -Ｐａｒｔ  ４：  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｂｌｏｏｄ）を適用した。ポルトのサンジョアン病院が提供する中間血小板ユニット（ＩＰＵ）からの血小板を使用した。Ａｕ、ＰＵ、およびポリマーコーティング剤試料を、段落００６２に記載のように滅菌した。滅菌後、試料をＰＢＳ中１％（ｖ／ｖ）血漿に３７℃で３０分間浸漬し、ＰＢＳで３回すすいだ。同時に、２４ウェル組織培養ポリスチレンプレート（ＴＣＰＳ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３７℃で１時間インキュベーションし、組織培養処理ポリスチレン（ＴＣＰＳ）に応答して血小板活性化を抑制した。タンパク質を吸着した表面をＢＳＡ処理プレートに移し、事前にＰＢＳで５回洗浄し、ＰＢＳ中３×１０８血小板／ｍＬのＩＰＵと３７℃、７０ｒｐｍで３０分間インキュベーションした。表面をＰＢＳですすぎ、付着した血小板を、０．１４Ｍカコジル酸ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ）緩衝液中１．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド（Ｍｅｒｃｋ）で室温で３０分間固定した。最後に、血小板が付着した表面を、５０、６０、７０、８０、９０および９９％（ｖ／ｖ）と増加していくエタノール／水グラジエントで、それぞれ１０分間脱水した。表面張力効果を回避し、ＳＥＭ可視化中に材料および付着した血小板の構造的完全性を維持するために、臨界点乾燥を適用した。このプロセスには、１０００〜１４００ｐｓｉの最大圧力に達するまでの、４℃から３３〜３８℃の一連の温度変化が含まれる。試料の導電性を、Ａｕ／Ｐｄで６０秒間、１５ｍＡの電流でスパッタリングすることによって高めた。各膜の５枚の顕微鏡写真を、５ｋＶの電子ビーム強度および２０００倍の倍率を使用し、ＳＥＭで撮影した。表面条件ごとの血小板数は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して決定し、血小板／ｍｍ２として報告した。付着した血小板を、活性化の程度ごとに、予め確立されたスケールに従い、非活性化、部分活性化および完全活性化に分け、活性化の程度ごとのパーセンテージとして報告した。
【００６５】
一実施形態では、本開示のポリマーコーティング剤の貯蔵安定性を評価するために、異なる時点で製造された試料を同時に特性評価し（段落００５９、００６０および００６２で説明したように）、保存中に起こり得る劣化を評価した。本開示のポリマーコーティング剤については、劣化感受性評価ＩＳＯ  １０９９３−１３：２００９（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ  −  Ｐａｒｔ  １３：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した。簡単に説明すると、試料を異なるｐＨ（５および７．４）の緩衝液中、４５℃で７日間インキュベーションした。インキュベーション期間の終了時に、試料表面を段落００５９および００６０に記載の技法で特性評価し、段落００６２に記載のように細菌に曝した。
【００６６】
一実施形態では、海洋シアノバクテリア・シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生された細胞外ポリマーを、培養物が３．０〜３．５のＯＤ７３０ｎｍに達したときに採取し、培養物の乾燥重量１ｇあたり約２ｇのポリマーの収量であった。その後、採取したばかりの全血のインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）放出アッセイを使用して、ポリマーをエンドトキシン−発熱の可能性について試験した。結果は、エンドトキシン−発熱効果がないことを明らかにした（０ｐｇ／ｍＬ）。
【００６７】
一実施形態では、所望の付着防止特性を実現するためにコーティング剤に使用される最適な本開示のポリマーの濃度を特定するために、ある範囲のポリマー濃度（０．１％〜１．０％）を試験した。結果は、ポリマー濃度（０．５％（ｗ／ｖ））が、コーティング剤の大きな付着防止効果をもたらすことを示した。この濃度を使用して、さらなるコーティング剤の開発を行った。
【００６８】
一実施形態では、本開示のポリマーを含む改質表面の表面特性評価を、エリプソメトリーおよび水接触角測定によって分析した（図１）。
【００６９】
一実施形態では、エリプソメトリーでの厚さ測定により、ドーパミン浸漬は１８．４±１．７ｎｍの層を生じることが明らかになった。スピンコーティングプロセスは、２３．０±４ｎｍのポリウレタン（ＰＵ）（０．１％（ｖ／ｖ））超薄膜をもたらし、本開示のポリマーコーティング剤では２０．７±５．４ｎｍの厚さをもたらした（図１Ａ）。
【００７０】
一実施形態では、ＰＵおよび本開示の製造工程のポリマーコーティング剤の水光学接触角を図１Ｂに示す。ｐＤＡ層は疎水性プロファイルを有し、７３±２°のＷＣＡを示し、ＰＵ超薄膜は約６４．６±２°の低いＷＣＡを示した。ポリマー塗布は、ＰＵおよびｐＤＡ層の両方と比較して、本開示のポリマーコーティング剤の親水性を有意に増加させ、ＷＣＡを１５±５°に低減させた。
【００７１】
一実施形態では、本開示のポリマーコーティング剤の貯蔵寿命安定性を評価するために、コーティング剤を、標準保存条件（室温および低湿度）で維持し、その後再び特性評価した（図２）。
【００７２】
一実施形態では、図２ＡおよびＢに描かれているように、３０日間の保存期間後に、本開示のポリマーコーティング剤について、厚さおよび水接触角の有意な差は見られなかった。
【００７３】
一実施形態では、本開示のポリマーコーティング剤の付着防止活性を、ＩＳＯ  ２２１９６に従い、２種類のグラム陽性（表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌）ならびに１種類のグラム陰性（大腸菌）の異なる細菌株に対して評価した。結果を図３に示す。
【００７４】
一実施形態では、本開示のシアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーへの細菌付着は、医療機器参照材料であるＰＵおよびＳｉと比較して、常に９０％低かった（図３Ａ、Ｂ、Ｃ）。両グラム陽性（表皮ブドウ球菌および黄色ブドウ球菌）に対して、最も高い付着防止効果（＞９５％の細菌付着低減）が見られた（図３ＡおよびＢ）。本開示のポリマーを含む調製されたばかりのコーティング剤と、３０日間保存した後の本開示のポリマーを含むコーティング剤との間で、表皮ブドウ球菌に対して同様の付着防止効果が見られ（図３Ｃ）、これは、ポリマーコーティング剤が、３０日間の貯蔵寿命を通して活性を維持することができたことを意味する。
【００７５】
一実施形態では、本開示のポリマーコーティング剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件に近いｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにさらに曝すために、上記のアッセイを、ヒト血漿タンパク質１％（ｖ／ｖ）の非存在下および存在下で、高付着性表皮ブドウ球菌株を使用して行った。結果を図４に示す。
【００７６】
一実施形態では、両表面への表皮ブドウ球菌の付着性は、ヒト血漿タンパク質の存在下でより低かった。とはいえ、コンディショニングフィルムの形成とは無関係に、本開示のポリマーコーティング剤は、ＰＵ対照表面に対して９４％の細菌減少を促進することができた（図４）。
【００７７】
一実施形態では、本開示のシアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーコーティング剤の生体適合性を、ＩＳＯ  １０９９３−５：２００９（Ｅ）に記載のように、材料の抽出物とのインキュベーション後のマウス線維芽細胞Ｌ９２９の代謝活性によって評価した。抽出物は、ＩＳＯ  １０９９３−１２：２００４に記載の通り調製した。結果を図５に示す。
【００７８】
一実施形態では、本開示のコーティング剤の調製されたばかりのポリマーコーティングと、３０日間保存した本開示のポリマーコーティングとＰＵ対照との間の代謝活性の差は、決して６％を超えることはなく、３０％限界よりもはるかに低く、ポリマーコーティング表面は、ＩＳＯ  １０９９３−５：２００９（Ｅ）によれば、細胞毒性の可能性がないことを実証した。
【００７９】
一実施形態では、本開示のシアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０から放出されたポリマーコーティング剤の、血小板の付着および活性化に対する効果をＳＥＭで追った。図６は、付着した血小板の量および活性化状態の代表的な画像を示す。図７は、表面上の血小板の、それらの活性化状態に応じた定量分布を示す。
【００８０】
一実施形態では、図６および７によって報告されるように、本開示のポリマーコーティング剤は血小板付着を促進せず、ポリウレタン（ＰＵ）のむき出しの表面と比較して、血漿タンパク質の存在下でさえ、付着血小板の量を８７％減少させた（図７ＡおよびＢ）。さらに、本開示のポリマーコーティング剤は、血小板の活性化も防止する（ＰＵ対照表面に対して９０％未満の活性化血小板）。
【００８１】
一実施形態では、本開示のポリマーコーティング剤は、両ｐＨでの加速分解アッセイの後に表面にわずかな変化を示し（図８ＡおよびＢ）、これは、その付着防止性能に影響を与えてはおらず（図８Ｃ）、コーティング剤がアッセイを通して安定したままであったことを示唆している。
【００８２】
要素または特徴の単数形が特許請求の範囲の明細書中で使用される場合、特に除外されなければ、複数形も含まれ、逆もまた同様である。例えば、用語「ポリマー」または「該ポリマー」には、複数形の「ポリマー」または「該ポリマー」も含まれ、逆もまた同様である。請求項において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がないか文脈から明らかでない限り、１つまたは複数を意味し得る。グループの１つまたは複数のメンバーの間で「または」を含む請求項もしくは説明は、反対の指示がないか文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、複数、またはすべてが所与の製品もしくはプロセスに存在するか、使用されているか、または他の方法で関連していれば、満たされていると考えられる。本発明は、グループのちょうど１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在するか、使用されているか、または他の方法で関連している実施形態を含む。本発明は、複数の、またはすべてのグループのメンバーが存在する実施形態も含む。
【００８３】
範囲が与えられている場合には、端点が含まれる。さらに、特に断りのない限り、または文脈および／もしくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈から明らかに指示されている場合を除き、本発明の様々な実施形態で述べられた範囲内で、範囲の下限の単位の１０分の１までの任意の特定の値を想定することができることを理解されたい。また、特に断りのない限り、または文脈および／もしくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができ、ここで、部分範囲の端点は、範囲の下限の単位の１０分の１と同じ精度で表されることを理解されたい。
【００８４】
一実施形態では、使用したシアノバクテリア・シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０は、２０１８年３月１３日に受領され、２０１８年４月２６日にＳｃｏｔｔｉｓｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＣＣＡＰ）−ブダペスト条約に基づく国際寄託機関−によって生菌として試験され、ＣＣＡＰ番号１４３５／２が付与されたものである。
【００８５】
以下の実施例は、例示のみを目的とし、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８６】
（実施例１．シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーの特性評価）
シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーは、Ｍｏｔａら、２０１３年から知られており、以下のもので構成されている：９種類の単糖であって、マンノース、グルコース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラムノースおよびフコースを含む５４．８±８．５％ポリマー乾燥重量（ｗ／ｗ）の中性糖、ならびにガラクツロン酸およびグルクロン酸を含む７．４±０．８％ポリマー乾燥重量（ｗ／ｗ）の酸性糖と；４．０±０．３％ポリマー乾燥重量（ｗ／ｗ）のペプチドと１０．６±１．６％ポリマー乾燥重量（ｗ／ｗ）の硫酸基。
【００８７】
シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーの組成は、シアノセイス種ＶＩ  ２２などの他のシアノバクテリアから産生される他のポリマーの組成とは異なっており、それはラムノース含有量に対するそれらのモル比（シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０／シアノセイス種ＶＩ  ２２）を比較することによって観察することができる：マンノース（２．１４／１．０）、グルコース（２．４５／２．７５）、ガラクトース（０．８８／０．２５）、キシロース（１．３０／１．７９）、アラビノース（０．４５／０）、ラムノース（１．０／１．０）、フコース（０．２９／１．７５）、ガラクツロン酸（０．３／０）およびグルクロン酸（０．２８／＋：存在するが定量化されていない、Ｄｅ  Ｐｈｉｌｉｐｐｉｓら、１９９８年によって報告）。
【００８８】
（実施例２．シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーの調製）
シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーの調製の詳述は、本明細書において発明を実施するための形態に記載されている。
【００８９】
ともかく、簡単に説明すると、単細胞性シアノバクテリア・シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｅｋｅ、オランダ、現在はＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｚｏａ（ＣＣＡＰ  １４３５／２）で入手可能）を、ＡＳＮＩＩＩ培地を含む２Ｌのバイオリアクター中、２５℃で、１６時間明（３０μＥ／ｍ２／秒）／８時間暗のレジメン下で、軌道撹拌（１５０ｒｐｍ）および曝気（１．２Ｌ／分）（Ｍｏｔａら、２０１３）しながら、７３０ｎｍで光学密度が≒２．５〜３．５になるまで増殖させた。増殖させた培養物を透析膜（１２〜１４ｋＤａカットオフ）に入れ、連続撹拌しながら４８時間、最低１０容量のタイプＩＩ水に対して透析した。細胞を高速遠心分離（２００００ｇ、１５分、４℃）により除去し、上清を２容量の９９％エタノール（ＡＧＡ）により４℃で一晩沈殿させた。バイオポリマーを滅菌金属鉗子で回収し、タイプＩＩ水に溶解し、再度沈殿させた。回収したバイオポリマーを凍結乾燥し、粉砕し（ミルＡ１０ベーシック、ＩＫＡ）、その後の工程までデシケーター内に保存した。
【００９０】
（実施例３．シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーでの医療機器のコーティング）
シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーコーティング剤を医療機器に塗布するために、化学エッチング、ＵＶ活性化およびプラズマ活性化などのいくつかの異なる表面活性化方法を適用することができる。例えば、ポリウレタン基板の表面活性化には、産業用大気圧プラズマシステムを、推定最大出力１５ｋＷで使用することができる。次いで、基板を、１５Ｌ／分のアルゴン流量と０．４５Ｌ／分のＮ２流量（１１．２５ｋＷ、３．３Ｈｚ）に同時にさらす。適切な表面活性化の後、ポリマー溶液を、ディップコーティング、スプレーコーティング、フローコーティングまたはバックコーティングにより上部に塗布することができる。ディップコーティングを考慮すれば、活性化直後のポリウレタン基板を０．５％ｗ／ｖのポリマー溶液に浸漬させ、ゆっくりと取り出し、クリーンな設備で空気乾燥させる。  
【００９１】
（実施例４．シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーが血小板の付着および活性化を阻害する評価（抗血栓効果））
表面に付着した血小板は、血栓形成の確率に影響を与える様々な活性化状態にあり得る。したがって、本実施例では、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーの、血小板の付着および活性化に対する効果（血栓形成効果）を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって追跡した。図９に描かれているように、３つの異なる活性化状態を考慮した。ＰｏｌｙｍｅｒおよびＰＵにおける血小板の、それらの活性化状態に応じた定量分布の結果を図１０に示す。
【００９２】
得られた結果は、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーが、血漿タンパク質（１％、ｖ／ｖ）の存在下であっても、ＰＵと比較して血小板の付着を８７％未満に低減させることを示している。実際、血漿タンパク質の存在下では、付着した血小板の数は、ＰＵ（３１％）では有意に増加したが、付着防止プロファイルを８７％付着低減に維持したＰｏｌｙｍｅｒでは増加しなかった。重要なことに、付着した血小板のほとんどが低活性化状態にあったため、シアノセイス種ＣＣＹ  ０１１０によって産生されたポリマーは、血小板の活性化を促進しなかった（非活性化状態または部分活性化状態であるが、完全活性化形態ではない）。反対に、ＰＵに付着した血小板は、より多くの部分活性化形態または完全活性化形態を提示した。
【００９３】
本開示は、決して記載の実施形態に限定されるものと見なされるべきではなく、当業者は、それらの修正に対する多くの可能性を予見するであろう。
【００９４】
上述した実施形態は、組み合わせ可能である。
【００９５】
以下の特許請求の範囲には、本開示の特定の実施形態がさらに記載されている。
【００９６】
以下の参考文献は、それらの全体が本明細書に組み込まれているとみなされるべきである：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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