(57)【要約】  ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症は、希少疾患群を表わす。中でも、軟骨異形成症の非致死型である軟骨形成不全は、小人症の中で最も一般的なタイプである。ＦＧＦＲ３機能の亢進をもたらす突然変異は、多くの組織、最も顕著には、成長中の骨格における軟骨成長板及び骨に影響を及ぼし、各種の症状及び合併症を引き起こす。ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症に対する新たな治療アプローチを見出す試みにおいて、本発明者らは、Ｔ．  ｃａｃａｏから（−）−エピカテキンを精製し、（−）−エピカテキン処置により、Ｆｇｆｒ３＋／＋の大腿骨と比較して、Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋の大腿骨の長さが顕著に長くなり、軟骨成長板が全体的に改善されることを示した。このため、本発明は、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成の処置のための（−）−エピカテキンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効量の実質的に純粋な（−）−エピカテキンを対象に投与することからなる、
ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症の処置を必要とする患者におけるＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症を処置する方法。
【請求項２】
ＦＧＦＲ３関連骨疾患が、致死性異形成症Ｉ型、致死性異形成症ＩＩ型、軟骨低形成症、軟骨形成不全、発育遅延及び黒色表皮腫を伴う重度軟骨形成不全並びに軟骨低形成症からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
患者に、有効成分として実質的に純粋な（−）−エピカテキンと少なくとも１種の薬学的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物を投与する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
本発明の医薬組成物が、Theobroma cacao抽出物ではない、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
「希少疾患」は、特に有病率の低い疾病である。このように、欧州連合では、１０，０００人当たりに５人以下に影響を及ぼす場合、疾患は希少あると考えられている（Rodwell and Ayme, 2014a）。例として、軟骨形成不全は、ＥＵでは１００，０００人当たりに２．６人の推定有病率を示す（Orphanet, 2014）。この意味で、希少疾患は、ＥＵ規制（ＥＣ）Ｎｏ１４１／２０００（Regulation (EC) No141/2000 of the European Parliament and of the Council of 16 December 1999 on orphan medicinal products）で初めて定義された。一般的には、希少疾患の患者は、特に孤立しており、心理的、社会的、経済的、文化的に弱者であり、これらの疾患に対する特定の健康政策が欠如しており、専門知識が乏しいことから、診断の遅れ及びケアへのアクセスの困難さ、不十分またはさらに有害な処置並びに医療システムへの信頼の喪失につながる（Orphanet, n.d.; Rodwell and Ayme, 2014b）。
【０００３】
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、細胞シグナル伝達に関与する細胞表面レセプターであるが、これらのレセプターにおける一部の突然変異は、特定の希少疾患に関連している。ＲＴＫは、発生、組織修復及び正常な細胞ホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たすとともに、細胞増殖、遊走、分化及び生存シグナル伝達のレギュレーションに関与する広範な細胞外シグナルアレイに対する細胞応答を媒介する。このＲＴＫ型は、軟骨のホメオスタシスのレギュレーション、例えば、軟骨細胞の分化、増殖及びアポトーシスに必須の役割を果たし、正常な骨格の発達並びに骨芽細胞による骨形成及び出生後の骨石灰化の両方のレギュレーションに必要である（UniProt, n.d.）。非致死型の軟骨異形成症である軟骨形成不全は、最も一般的なタイプの小人症である。ほとんどがｄｅ  ｎｏｖｏ変異によるものであり、常染色体優性遺伝を有する（Rousseau et al., 1994; Di Rocco et al., 2014）。ＦＧＦＲ３機能の亢進をもたらす突然変異は、多くの組織、最も顕著には、成長中の骨格における軟骨成長板及び骨に影響を及ぼし、各種の症状及び合併症を引き起こす。他のＲＴＫとして、リガンド、すなわち、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の結合により、二量体化及びトランス自己リン酸化がもたらされ、そのチロシンキナーゼ活性の刺激がもたらされる（Huete et al., 2011）。分子レベルでは、ＦＧＦＲ３の４つの主要なシグナル伝達経路が関与している可能性がある：シグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ホスホリパーゼＣ  γ（ＰＬＣγ）及びホスファチジルイノシトールリン酸−３−キナーゼセリン／スレオニンキナーゼ（ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ；プロテインキナーゼＢ）等（Horton et al.,2007, Ornitz DM & Legeai-Mallet L 2017）。
【０００４】
ココア（Theobroma cacao）は、経済的に重要な主要な国際作物であり、高い抗酸化能力を含む幾つかの栄養上の利点に関連している。これらの健康特性は、フェノール画分に関連している（Andujar et al., 2012; Cadiz-Gurrea et al., 2015）。カカオに見出されるフラボノイドの主なサブクラスは、フラバノール、特に、（エピ）カテキンモノマー及びそのオリゴマー（二量体から十量体の範囲のプロシアニジンとしても公知）である（Cadiz-Gurrea et al., 2014）。この抽出物は、ＦＧＦ２リガンドにより活性化されたＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ３シグナル伝達に関連するリン酸化カスケードの両方の阻害作用を示すことが報告されている（Legeai-Mallet and Segura- Carretero及びＷＯ第２０１６０４６３７５号）。
【０００５】
発明の概要
本発明は、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲により定義される。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、治療上有効量の実質的に純粋な（−）−エピカテキンを対象に投与することからなる、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症の処置を必要とする患者におけるＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症を処置する方法に関する。
【０００７】
また、本発明は、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症の処置を必要とする患者におけるＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症を処置する方法において使用するための、治療上有効量の実質的に純粋な（−）−エピカテキンを含む医薬組成物に関する。
【０００８】
本明細書で使用する場合、「ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症」という用語は、ＦＧＦＲ３の異常に亢進した活性化により、ＦＧＦＲ３レセプターの構成活性変異、特に、後述するようなＦＧＦＲ３レセプターの構成活性変異の発現により引き起こされる骨格疾患を意味することを意図している。本明細書で使用する場合、「ＦＧＦＲ３」、「ＦＧＦＲ３チロシンキナーゼレセプター」及び「ＦＧＦＲ３レセプター」という用語は、明細書全体をとおして互換的に使用され、ＦＧＦＲ３の全ての天然アイソフォームを指す。本明細書で使用する場合、「構成活性ＦＧＦＲ３レセプター変異体」、「ＦＧＦＲ３の構成活性変異体」又は「構成活性を示す変異ＦＧＦＲ３」という用語は、互換的に使用され、生体活性（すなわち、下流のシグナル伝達のトリガー）を示し、かつ／又はＦＧＦリガンドの存在下での対応する野生型レセプターの生体活性より高い生体活性を示す、前記レセプターの突然変異体を指す。本発明の構成活性ＦＧＦＲ３変異体は、特に、（残基は、線維芽細胞増殖因子レセプター３アイソフォームの前駆体１〜８０６アミノ酸長におけるそれらの位置に従ってナンバリングされている）：８４位のセリン残基がリシンにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｓ８４Ｌと称する）；２４８位のアルギニン残基がシステインにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｒ２００Ｃと称する）；２４８位のアルギニン残基がシステインにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｒ２４８Ｃと称する）；２４９位のセリン残基がシステインにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｓ２４９Ｃと称する）；２５０位のプロリン残基がアルギニンにより置換されている変突然異体（本明細書において、以下Ｐ２５０Ｒと称する）；２６２位のアスパラギン残基がヒスチジンにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｎ２６２Ｈと称する）；２６８位のグリシン残基がシステインにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｇ２６８Ｃと称する）；２７８位のチロシン残基がシステインにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｙ２７８Ｃと称する）；２７９位のセリン残基がシステインにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｓ２７９Ｃと称する）；３７０位のグリシン残基がシステインにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｇ３７０Ｃと称する）；３７１位のセリン残基がシステインにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｓ３７１Ｃと称する）；３７３位のチロシン残基がシステインにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｙ３７３Ｃと称する）；３８０位のグリシン残基がアルギニンにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｇ３８０Ｒと称する）；３８１位のバリン残基がグルタミン酸により置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｖ３８１Ｅと称する）；３９１位のアラニン残基がグルタミン酸により置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ａ３９１Ｅと称する）；５４０位のアスパラギン残基がリシンにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｎ５４０Ｋと称する）；終止コドンが塩基置換により排除されている突然変異体、特に、終止コドンがアルギニン、システイン、グリシン、セリン又はトリプトファンコドンに突然変異している突然変異体（本明細書において、以下それぞれ、Ｘ８０７Ｒ、Ｘ８０７Ｃ、Ｘ８０７Ｇ、Ｘ８０７Ｓ及びＸ８０７Ｗと称する）；６５０位のリシン残基が別の残基、特に、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン又はグルタミンにより置換されている突然変異体（本明細書において、以下Ｋ６５０Ｍ、Ｋ６５０Ｅ、Ｋ６５０Ｎ及びＫ６５０Ｑと称する）からなる群より選択される。典型的には、本発明の構成活性ＦＧＦＲ３変異体は、Ｋ６５０Ｍ、Ｋ６５０Ｅ又はＹ３７３Ｃ突然変異体である。
【０００９】
一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連骨疾患は、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症及びＦＧＦＲ３関連頭蓋骨癒合症である。一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連骨軟骨異形成症は、遺伝性又は散発性疾患に対応する。本明細書で使用する場合、「ＦＧＦＲ３関連骨異形成症」という用語は、致死性異形成症Ｉ型、致死性異形成症ＩＩ型、軟骨低形成症、軟骨形成不全及びＳＡＤＤＡＮ（発育遅延及び黒色表皮腫を伴う重度軟骨形成不全）を含むが、これらに限定されない。一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連骨軟骨異形成症は、上記定義されたような構成活性ＦＧＦＲ３レセプター変異体の対象における発現により引き起こされる。一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症は、ＦＧＦＲ３レセプターのＧ３８０Ｒ構成活性突然変異体の発現により引き起こされる軟骨形成不全である。一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症は、ＦＧＦＲ３レセプターの構成活性突然変異体であるＮ５４０Ｋ、Ｋ６５０Ｎ、Ｋ６５０Ｑ、Ｓ８４Ｌ、Ｒ２００Ｃ、Ｎ２６２Ｈ、Ｇ２６８Ｃ、Ｙ２７８Ｃ、Ｓ２７９Ｃ、Ｖ３８１Ｅの発現により引き起こされる軟骨形成不全である。一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症は、Ｒ２４８Ｃ、Ｓ２４８Ｃ、Ｇ３７０Ｃ、Ｓ３７１Ｃ；Ｙ３７３Ｃ、Ｘ８０７Ｒ、Ｘ８０７Ｃ、Ｘ８０７Ｇ、Ｘ８０７Ｓ、Ｘ８０７Ｗ及びＫ６５０ＭのＦＧＦＲ３レセプターからなる群よりＦＧＦＲ３レセプターの構成活性突然変異体の発現により引き起こされる致死性異形成症Ｉ型である。一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症は、ＦＧＦＲ３レセプターのＫ６５０Ｅ構成活性突然変異体の発現により引き起こされる、致死性異形成症ＩＩ型である。一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連軟骨異形成症は、ＦＧＦＲ３レセプターのＫ６５０Ｍ構成活性突然変異体の発現によって引き起こされる、発育遅延及び黒色表皮腫を伴う重度軟骨形成不全である。一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連頭蓋骨癒合症は、遺伝性又は散発性疾患に対応する。一部の実施態様では、ＦＧＦＲ３関連頭蓋癒合症は、ＦＧＦＲ３レセプターのＰ２５０Ｒ構成活性突然変異体の発現によって引き起こされるＭｕｅｎｋｅ症候群又はＦＧＦＲ３レセプターのＡ３９１Ｅ構成活性突然変異体の発現により引き起こされる、黒色表皮腫を伴うＣｒｏｕｚｏｎ症候群である。
【００１０】
本明細書で使用する場合、「処置」又は「処置する」という用語は、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）処置と、治癒的で患者の状態又は疾患を改善する修飾処置との両方を指し、疾患に罹患するリスクのある患者又は疾患に罹患した疑いのある患者及び病気の患者又は疾患もしくは医学的状態を患っている診断された患者の処置を含み、臨床的再発のサプレッションを含む。処置は、医学的障害を有する対象又は最終的に障害を獲得する場合がある対象に、障害又は再発性障害の１種以上の症状を予防し、治癒し、発症を遅らせ、重症度を低下させもしくは改善するため又はこのような処置がない場合に予想される以上に対象の生存を延長するために適用することができる。「治療計画」は、疾病の処置パターン、例えば、治療中に使用される投与パターンを意味する。治療計画は、導入計画及び維持計画を含むことができる。「導入計画」又は「導入期」という表現は、疾患の初期処置に使用される治療計画（又は治療計画の一部）を指す。導入計画の一般的な目標は、処置計画の初期の間に患者に対して、高レベルの薬剤を提供することである。導入計画は、（部分的又は全体的に）「負荷計画」を利用する場合がある。これは、医師が維持計画の間に利用するであろうより多くの用量の薬剤を投与すること、医師が維持計画の間に薬剤を投与するより頻繁に薬剤を投与すること又はその両方を含むことができる。「維持計画」又は「維持期間」という表現は、疾患の処置中に患者を維持するのに、例えば、患者を長期間（数か月又は数年）寛解状態に保つのに使用される治療計画（又は治療計画の一部）を指す。維持計画は、連続療法（例えば、定期的な間隔で、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年等での投与）又は断続療法（例えば、中断された処置、断続的な処置、再発時の処置又は特定の所定の基準（例えば、疾患症状等）の達成時の処置）を利用することができる。
【００１１】
本明細書で使用する場合、「（−）−エピカテキン」という用語は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−３，５，７−トリオールを指す。（−）−エピカテキンを生成し又は抽出する方法は、当業者に周知である。
【００１２】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋な」という用語は、不純物、例えば、関連物質不純物が全く存在しないか又はほぼ全く存在しないことを指す。例えば、（−）−エピカテキン組成物が実質的に純粋であると言われる場合、検出可能な関連物質不純物が存在しないか又は単一の関連物質不純物が検出される場合、それが０．１重量％以下の量で存在するか又は複数の関連物質不純物が検出される場合、それらが０．６重量％以下の量で凝集体として存在するかのいずれかである。
【００１３】
したがって、患者には、有効成分として実質的に純粋な（−）−エピカテキンと、少なくとも１種の薬学的に許容し得る賦形剤とを含む医薬組成物が投与される。本明細書で使用する場合、用語「有効成分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」又は「有効成分（ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は、互換的に使用される。有効成分は、医学的状態又は疾患を改善し、処置し又は予防するのに使用される。本明細書において、「薬学的に受容し得る賦形剤」という用語は、有効成分の生体活性の有効性を妨害せず、それが投与される濃度でホストに対して過度に毒性でない担体媒体であると理解される。前記賦形剤は、剤形及び所望の投与方法に応じて、当業者に公知の通常の賦形剤から選択される。一部の実施態様では、本発明の医薬組成物は、第２の有効成分を含まない。したがって、一部の実施態様では、本発明の医薬組成物は、ＷＯ第２０１６０４６３７５号に記載されているようなTheobroma cacao抽出物ではない。一部の実施態様では、医薬組成物は、一定量のフラボノール、スウェロシド及びヘキセニル  ５キシロピラノシルグルコピラノシドを含まない。一部の実施態様では、本発明の医薬組成物は、一定量のプロシアニジン、カテキン、シンコナイン及びそれらの誘導体を含まない。一部の実施態様では、医薬組成物は、／Ｖ−カフェオイル−Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ａ／−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］、Ｌ−アスパラギン酸、Ａ／−［３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペニル］、trans−クロバミド（Ａ／−［（２Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−オキソ−２−プロペン−１−イル］−３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン）、デオキシロバミド（Ａ／−［（２Ｅ）−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−１−オキソ−２プロペン−１−イル−Ｌ−チロシン及びそれらの誘導体から選択される、一定量の３，４−Ｎ−フェニルプロペノイル−Ｌ−アミノ酸又はその誘導体を含まない。一部の実施態様では、本発明の医薬組成物は、ケルセチン、ケルセチングルクロニド、ケルセチンヘキソース、ケルセチンアラビノシド及びそれらの異性体並びに／又はプロアントシアニジンＡ、（エピ）カテキン、（エピ）カテキン二量体ヘキソース、アラビノシル−（エピ）カテキン−（エピ）カテキン、（エピ）ガロカテキン、（エピ）カテキングルコピラノシド、カテキンジグルコピラノシド、シンコナインＩ、（エピ）カテキン四量体、（エピ）カテキン五量体、（エピ）カテキン六量体、（エピ）カテキンメチル二量体、（エピ）カテキンエチル二量体、プロシアニジンＡ、プロシアニジンＢ、プロシアニジンＣ及びそれらの異性体から選択される前記少なくとも１種のプロシアニジン、カテキン、シンコナイン及びそれらの誘導体からなる群より選択される化合物を含まない。一部の実施態様では、医薬組成物は、一定量のプロシアニジンＢ；（エピ）カテキン四量体；（エピ）カテキン五量体；ヘキセニルキシロピラノシルグルコピラノシド；（エピ）カテキン二量体ヘキソース；アラビノピラノシル−（エピ）カテキン−（エピ）カテキン；−プロシアニジンＣ；−プロアントシア���ジンＡ；（エピ）カテキンエチル二量体；ケルセチン；ケルセチンヘキソース；−シンコナインＩ；プロシアニジンＡ及びスウェロシドを含まない。
【００１４】
上記された実質的に純粋な（−）−エピカテキンの「治療上有効量」は、治療効果を提供するのに十分な量を意味する。ただし、実質的に純粋な（−）−エピカテキンの総１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定されるであろうことが理解されるであろう。任意の特定の対象についての特定の治療上有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重篤度；利用される特定の化合物の活性；利用される特定の組成物；対象の年齢、体重、一般的な健康、性別及び食事；利用される特定の化合物の投与回数、投与経路及び排泄速度；処置の期間；利用される特定のポリペプチドと組み合わせて使用されるか又は同時に使用される薬剤；並びに医学分野において周知の同様の因子を含む各種の因子により決まるであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルより低いレベルの化合物の用量で開始し、所望の効果が達成されるまで、用量を徐々に増加させることは、十分に当業者の範囲内である。ただし、製品の１日用量は、成人１日当たりに０．０１〜１，０００mgの広い範囲にわたって変化させることができる。典型的には、組成物は、処置される対象に対する投与量の症状調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mg 有効成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mg 有効成分、好ましくは、１mg〜約１００mg 有効成分を含有する。有効量の薬剤は、通常、１日当たりに０．０００２mg/kg〜約２０mg/kg体重、特に、１日当たりに約０．００１mg/kg〜７mg/kg体重の用量レベルで供給される。
【００１５】
本発明を、下記図面及び実施例によりさらに説明するものとする。ただし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１．ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるＳｅｐ−Ｐａｋ画分の異なるプロファイルをａ）ＰＡ、ｂ）ＰＣ、ｃ）ＭＮ、ｄ）ＯＬ及びｅ）ＰＬ画分とした。
【図２】図２．ＨＰＬＣ−ＵＶによる半分取クロマトグラムと、回収及びＴＯＦ−ＭＳ。
【図３】図３（Ａ、Ｂ、Ｃ）．ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによるＰＣ  Ｓｅｐ−Ｐａｋ画分から得られた１１個の画分のＢＰＣ。
【図４】図４．カカオ抽出物からのＦ５のＤＭＳＯ−ｄ６中でのＮＭＲ  １Ｈスペクトル。
【図５】図５．（−）−エピカテキンの化学構造。
【図６】図６．ＦＧＦ２（１００ng/ml）及び画分５（５０−１００−２００μg/ml）を使用したＴＤ軟骨細胞系統におけるＥｒｋ１／２リン酸化の用量関連阻害。
【図７】図７．ＦＧＦ２（１００ng/ml）及び画分５（１００μg/ml）を使用したＴＤヒト軟骨細胞系統の処置の代表的なデータ。ｐ＊  ０．０２１２。
【図８】図８．ＦＧＦ２（１００ng/ml）及び画分５（１００μg/ml）を使用したＡＣＨヒト軟骨細胞系統の処置の代表的なデータ。ｐ＊＊  ０．００３８。
【図９】図９．画分５（１０μg/ml）で処理された大腿骨の代表的な写真。
【図１０】図１０．Ｆ５（１０μg/ml）で処理された大腿骨長及び％  成長のグラフ表示。
【図１１】図１１．（−）−エピカテキン（１０μg/ml）で処理された大腿骨の代表的な写真。
【図１２】図１２．（−）−エピカテキン（１０μg/ml）で処理された大腿骨長及び大腿骨の％  成長のグラフ表示。
【図１３】図１３．（−）−エピカテキン（１μg/ml）で処理された大腿骨長及び大腿骨の％  成長のグラフ表示。
【図１４】図１４．出生前Ｅ１６．５軟骨細胞における（−）−エピカテキンによる一次繊毛伸長。
【００１７】
実施例
方法
１．化学物質及び試薬
全ての化学物質をＨＰＬＣ−ＭＳグレードのものとし、そのまま使用した。ＨＰＬＣ及び半分取用の酢酸及びメタノールをそれぞれ、Fluka（Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany）及びLab-Scan（Gliwice, Sowinskiego, Poland）から購入した。抽出用のジエチルエーテル及びメタノールをFisher（Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ）から購入し、酢酸エチルをLab-Scan（Gliwice, Sowinskiego, Poland）から購入し、エタノール及びアセトンをAnalaR Normapur（VWR International, Inc., Darmstadt, Germany）から購入し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を分析アッセイのために、Panreac（Barcelona, Spain）から購入した。（−）−エピカテキンをSigma-Aldrich（St Louis, MO, USA）から購入した。水をMillipore（Bedford, MA, USA）製のMilli−Qシステムにより精製した。重水素化溶媒、例えば、ジメチルスルホキシドをEurisotop（France）から購入した。ＮＭＲ分析のために、サンプルをジメチルスルホキシド−ｄ６に溶解させ、スペクトル分析のためにオーブン乾燥させた５mm  ＮＭＲチューブに移した。
【００１８】
Waters 5g Sep-Pak C18 Plusカートリッジ（Mildford, USA）を精製及び濃縮用の固相抽出ミニカラムとして使用した。
【００１９】
２．サンプル調製
濃縮T.cacao抽出物をこの研究に使用した（Molteoleder, Spain）。全カカオマトリックスからのポリフェノールをＤＭＳＯ中の１０mg/mL カカオ抽出物の溶液を使用して分析的に特性決定した。
【００２０】
カートリッジ精製のために、０．１g/mL 溶液ストックを、適切な量のカカオ抽出物をＤＭＳＯに溶解させることにより調製した。このサンプルを５分間超音波処理し、１分間ボルテックスし、ついで、７７００ｇで５分間遠心分離し、その後、カートリッジ精製した。
【００２１】
半分取ＨＰＬＣ精製のために、７５mg/mL 溶液ストックを、C18 Sep-PakカートリッジのＰＣ画分をＤＭＳＯに溶解させることにより調製した。サンプルを５分間超音波処理し、１分間ボルテックスし、ついで、７７００ｇで５分間遠心分離し、その後、半分取ＨＰＬＣ分析した。
【００２２】
得られた各サンプルを、０．２５mmフィルタを通してろ過し、その後、分取ＨＰＬＣ分析した。
【００２３】
３．機器
Sep-Pakカートリッジ精製のＰＣ画分からのポリフェノールを、バイナリーポンプ（モデル３３１／３３２）、自動液体処理ソリューション（モデルＧＸ−２７１）及びＵＶ−Ｖｉｓ検出器（モデルＵＶ−Ｖｉｓ  １５６）を備えたGilson分取ＨＰＬＣシステム（Gilson Inc., Middleton, WI, USA）を使用して分画した。
【００２４】
T. cacao及び単離した画分を、バイナリーポンプ、オートサンプラー及びダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を備えたAgilent 1200シリーズ高速解像ＬＣシステム（AgilentTechnologies, Palo Alto, CA, USA）を使用して分析的に特徴決定した。ＨＰＬＣシステムをエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェース（Agilent Technologies（Palo Alto, CA）製のモデルＧ１６０７Ａ）を備えた飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計（Bruker Daltonics, Bremen, Germany）に接続した。
【００２５】
４．T. cacao抽出物からの（−）−エピカテキンを得るためのポリフェノールの分画
４．１．Sep-Pak C18カートリッジにより
サンプル調製セクションにおいて上記のように調製されたT. cacao抽出物を、Sun et al.（Sun et al., 2006）及びMonagas et al.（Monagas et al., 2003）に記載された方法に従って、Waters C18 Sep-Pakカートリッジにより、いくつかの改変を加えて分画した。５つの異なる画分：フェノール酸（ＰＡ画分）、モノマー及びオリゴマーフラバン−３−オール（ＰＣ画分）、ポリマープロアントシアニジン（ＰＰ画分）、モノマー（ＭＮ画分）及びオリゴマー（ＯＬ画分）を得た。
【００２６】
実験をカートリッジによる分画の再現性を確実にするために、トリプリケートで行った。
【００２７】
得られた５つの画分をSpeed Vac中において、真空下で蒸発乾固させた。各残留物を秤量し、１００μg/mLでＤＭＳＯに溶解させた。その後、０．２５μmフィルタを通してろ過し、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより分析した。
【００２８】
４．２．Sep-Pakと半分取ＨＰＬＣとの組み合わせにより
C18カートリッジのＰＣ画分からの化合物を、Cadiz-Gurrea et al.（Cadiz-Gurrea et al., 2014）に従って分画した。最後に、合計１１個の画分を収集し、溶媒を真空下で蒸発させた。各画分の残留物を秤量し、適切な量のＤＭＳＯで１００μg/mLの濃度レベルに溶解させた。最後に、全ての画分を、０．２５μmフィルタを通してろ過し、その後、ＨＰＬＣ分析した。
【００２９】
５．クロマトグラフィー条件及びＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ検出
T.cacao由来の化合物及び画分をCadiz-Gurrea et al.（Cadiz-Gurrea et al., 2014）に記載されている方法従って、この改変（ＨＰＬＣシステムを、＋３．５kV キャピラリー電圧を使用し、陰イオンモードで作動するＥＳＩインターフェースを備えたＴＯＦ質量分析計に接続した。ソースパラメータの他の最適値は、乾燥ガス温度、２００℃；乾燥ガス流量、１０L/分；及び噴霧ガス圧力、２．３バールとした）を加えて分離した。検出を、５０〜１２００m/zの質量範囲を考慮して行った。
【００３０】
サンプルを、分析の再現性を確実にするために、トリプリケートでインジェクションした。
【００３１】
６．ＮＭＲ条件
ＮＭＲスペクトルを、５mm ＱＣＩ四重共鳴パルス場勾配クライオプローブを使用して、６００．１３MHzのプロトン周波数で動作するBruker Avance III 600分光計において、２９３±０．１Ｋで記録した。観察された多重度をｓ＝シングレット；ｄ＝ダブレット；ｄｄ＝ダブレットのダブレット；ｔ＝トリプレット；ｍ＝マルチプレット；及びｂｓ＝ブロードシングレットとしてラベル付けする。サンプルを、回転させずに、１２８回のスキャンの前に８回のダミースキャンを使用して測定した。取得パラメータは、下記のとおり：ｆｉｄのサイズ＝６４Ｋ、スペクトル幅＝２０．５ppm、取得時間＝２．７３ｓ、緩和遅延＝１０ｓ、受信機ゲイン＝２０．２、ＦＩＤ分解能＝０．２５Hzと設定した。プレサチュレーションパルスシーケンス（Bruker 1D noesygppr1d）を使用して、再循環及び混合遅延中のＨ２Ｏ周波数の放射を介して残留Ｈ２Ｏシグナルをサプレッションした。得られたスペクトルを自動的に位相調整し、ベースライン補正し、０．０ppmでのＴＳＰシグナルに較正した。ｔ１時間を４usに設定し、混合時間（ｄ８）を１０msに設定した。分光計送信器をＤＭＳＯ−ｄ６周波数に固定した。スペクトルの取得及び処理を、TOPSPINソフトウェア（バージョン３．１）を使用して行った。１Ｈ−１Ｈ  全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）、１Ｈ−１３Ｃ  ヘテロ核単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）、１Ｈ−１３Ｃヘテロ核多重結合コヒーレンス（ＨＭＢＣ）スペクトルを、標準的なBruker配列を使用して記録した。ＴＯＣＳＹスペクトルを、２．０ｓの緩和遅延、７１９４．２５Hzの両次元におけるスペクトル幅及び６４．０の受信器ゲインを適用して得た。ＴＯＣＳＹスペクトルを、サインベル窓関数（ＳＳＢ＝２．０）を使用して加工した。ＨＳＱＣスペクトルを、１．０ｓの緩和遅延、Ｆ２における７２１１．５４Hz及びＦ１における２４９００．７１Hzのスペクトル幅を使用して取得した。二次サイン窓関数（ＳＳＢ＝２．０）をＨＳＱＣスペクトルに使用した。ＨＭＢＣスペクトルを、Ｆ１における３７７２９．７１Hzのスペクトル幅を除いて、ＨＳＱＣスペクトルで使用されたのと同じパラメータを使用して記録した。ＨＳＱＣ実験のカップリング定数を１４５Hzに固定した。一方、ＨＭＢＣ実験を、１４５及び８Hz（長距離）の固定カップリング定数を使用して得た。
【００３２】
７．ＦＧＦＲ３機能獲得突然変異を発現するヒト軟骨細胞系統についてのＦ５の有効性の評価
カカオ抽出物からのＦ５を、ヒトＦＧＦＲ３機能獲得突然変異を発現する軟骨細胞系統を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。２種のヒト軟骨細胞系統を研究した。一方の系統は、ヘテロ接合性軟骨形成不全（ＡＣＨ）突然変異（Ｇｌｙ３８０Ａｒｇ）を発現し、他方の系統は、ヘテロ接合性致死性異形成症（ＴＤ）突然変異（Ｔｙｒ３７３Ｃｙｓ）を発現する（Benoist-Lasselin C. et al. FEBS Lett. 2007）。
【００３３】
細胞を２４時間枯渇させ、種々の濃度（５０、１００、２００μg/mL）のカカオからのＦ５を試験した。カカオ画分を培地に加え、ついで、細胞をレセプターＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子）のリガンドで刺激した。ＦＧＦＲ３の活性化に対するカカオ画分の有効性をウェスタンブロッティング（ｎ＝３）により評価した。標準的なＭａｐキナーゼ経路の２つのタンパク質であるＥｒｋ１／２のリン酸化レベルを評価した。
【００３４】
リン化Ｅｒｋ１／２及びＥｒｋ１／２のレベルを、Ｌｉ−Ｃｏｒ技術及びイメージャーを使用して測定した。
【００３５】
８．Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋マウスから単離されたＥｘ  ｖｉｖｏ大腿骨培養物に対するカカオ抽出物からの画分５及び（−）−エピカテキンの有効性の評価
Ｙ３６７Ｃ突然変異を普遍的に発現し、重篤な小人症を示すヘテロ接合性Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋マウスを使用した（Pannier et al., Biochim Biophys Acta, 1792: 140-147, 2009、Pannier S et al. Bone 47: 905-915, 2010）。幾つかのセットのｅｘ  ｖｉｖｏ実験を以前に記載されているように（Jonquoy et al., Hum Mol Genet, 21: 841-851, 2012）行った。Ｆｇｆｒ３＋／＋（ｎ＝２３）及びＦｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋（ｎ＝１６）マウスからのＥ１６．５日目の大腿骨胚を使用し、抗生物質及び０．２％ ＢＳＡ（Sigma）を含み、カカオＦ５もしくは（−）−エピカテキン（Sigma−0394−05−90）又はＤＭＳＯ（対照として）を１０及び３０μg/mlの濃度で補充したＤＭＥＭ培地中で６日間インキュベーションした。阻害剤の効果を確立するために、左大腿骨を補充培地中で培養し、対照培地中で培養した右大腿骨と比較した。骨長を、開始時（処理前）及び時間経過の終わりに測定した。Ｆｇｆｒ３＋／＋及びＦｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋マウスの遺伝子型を以前に記載されたように（Pannier et al., Biochim Biophys Acta, 1792: 140-147, 2009）、テイルＤＮＡのＰＣＲによって決定した。全ての実験手順及びプロトコールは、Animal Care and Use Committeeにより承認された。
【００３６】
９．カカオ抽出物からの画分５及び（−）−エピカテキンの成長板軟骨に対する有効性の評価
成長板軟骨に対する処置の影響を評価するために、組織学的及び免疫組織学的研究を行った。軟骨の特異的マーカーであるＳＯＸ９及びＸ型コラーゲンを選択し、タンパク質ＦＧＦＲ３の発現を試験し、また、ＦＧＦＲ３により活性化されたＭａｐキナーゼシグナル伝達のリン酸化Ｅｒｋ１／２タンパク質の発現を評価した。
【００３７】
四肢外植片を培養後に、４％ パラホルムアルデヒド中において４℃で固定し、パラフィン中に包埋した。連続５μm切片を、組織学的分析に標準的なプロトコールを使用してヘマトキシリン−エオシンにより染色し又は免疫組織化学染色に供した。
【００３８】
免疫組織化学のために、切片を、Dako Envisionシステムキットを使用して、ＦＧＦＲ３（１：１００希釈；Sigma）、抗Ｘ型コラーゲン（１：５０希釈；Quartett）、抗ＳＯＸ９（１：１０００希釈；Abcam）、抗リン酸化Ｅｒｋ１／２（１：１００希釈；Cell signaling）に特異的な抗体により染色した。画像を、Olympus PD70-IX2-UCB顕微鏡を使用してキャプチャした。
【００３９】
１０．免疫細胞化学
Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋に由来する培養軟骨細胞をメタノール（−２０℃で冷却）中において、室温で１０分間固定し、ついで、ＰＢＳで洗浄した。サンプルを、０．１％ Triton−X100（Sigma−Aldrich）を含有するＰＢＳで１０分間透過処理し、ついで、５分間３回洗浄した。サンプルを１０％ ヤギ血清（Biowest）を含有するＰＢＳと共に室温で６０分間インキュベーションした。一次抗体を４℃で一晩インキュベーションした。下記一次抗体を使用した：マウスＩｇＧ１抗γ−チューブリン（Sigma-Aldrich #T6557、１：１０００）及びウサギ抗Ａｒｌ１３ｂ（Proteintech #177111-AP、１：５００）。細胞をＰＢＳで洗浄し、ついで、AlexaFluor 488と結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ１（Life Technologies、１：１０００）及びAlexaFluor 647と結合させたヤギ抗ウサギ二次抗体（Life Technologies、１：１０００）と共に、暗所において室温で２時間インキュベーションした。サンプルを十分に洗浄し、核染色のためにＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を含有するDAPI−Fluoromount G（SouthernBiotech）溶液でマウントした。
【００４０】
画像取得を、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してキャプチャした。システムは、Zeiss Observer Z1倒立顕微鏡に接続されており、Zen Blueソフトウェアにより制御されるYokogawa CSU−X1スピニングディスクスキャナにより構成される。タイル画像を、Hamamatsu Orca Flash 4.0 sCMOSカメラを通して、Plan Apochromat  ６３×油浸対物レンズ（ＮＡ  １．４６）を使用して取得した。測定データを比較するために、ＰＣ長を示す全ての共焦点実験を、スライス厚０．２０μm及びピクセルサイズ６０nmを使用し、同じ条件で取得した。処理後分析を、FIJI（Fiji Is Just ImageJ；NIH）及びImaris v8.3ソフトウェア（Bitplane）を使用して行った。Ｚスタックあたりに２５画像を行い、最大強度のＺ投影を実現した。次に、IMARISソフトウェア（Bitplane）により、ＰＣ長を２Ｄで測定した。
【００４１】
結果
１．ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる画分の包括的特徴決定
図１に、Sep-Pak C18カートリッジにより得られた異なるプロファイル（ベースピーククロマトグラム及び特徴決定された化合物）を示した。この提案された方法により、T. cacao抽出物全体からのフェノール化合物を種々の異なる画分に分離することが可能となる。同方法は、それほど複雑ではなく、対象化合物の純粋な画分を得るのに使用することができる。加えて、モノマー及びオリゴマーＰＡの精製画分を得るために、Sep-Pak C18カートリッジによる固相抽出と半分取ＨＰＬＣ単離との組み合わせにより、１１の画分を得た（図２）。各画分の組成を詳細なＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより確立した（図３Ａ、Ｂ及びＣ）。Ｆ１においてのみ、（＋）−カテキン（市販の標準と比較することにより）及び（−）−エピカテキン（ｍ／ｚ  ２８９）を見出すことができた。Ｆ２及びＦ３では、Ｂ型二量体又はＰＣ及び（−）−エピカテキンが存在し、最後のものは、Ｆ３に高強度で存在した。さらに、ＰＣ三量体は、４〜７の画分（ｍ／ｚ  ８６５）に現れた。精製度の低い画分は、４種以上の化合物を含むＦ７、Ｆ８及びＦ１０であった。一方、ＰＣのＢ型二量体は、最も精製された画分であるＦ９において検出された。
【００４２】
得られた画分の予備生物学的試験後に、Ｆ５を軟骨形成不全モデルにおける生物学的実験の候補として選択した。
【００４３】
２．選択されたＦ５からの化合物のＮＭＲ特定
図４に、Ｆ５についてのＤＭＳＯ−ｄ６中での１Ｈスペクトルを示す。ここで、最も豊富な成分は、（−）−エピカテキンに対応する（図５）。
【００４４】
表１は、カカオサンプルからのＦ５における（−）−エピカテキンについての本研究で得られた１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲデータを含む。（＋）−カテキン及び（−）−エピカテキンと類似する物質の特定を脂肪族プロトンＨ−３（Ｃ）及びＨ−２（Ｃ）の分光データに基づいて行った。高値のカップリング定数３Ｊ２，３（８〜１０Hz）は、（＋）カテキンの存在を示す。一方、約２Hzの３Ｊ２，３値又はブロードシングレットは、本発明者らのカカオ画分中の（−）−エピカテキンの存在を示した。
【００４５】
【表１】
2021511379.tif 000002
【００４６】
３．ＦＧＦＲ３機能獲得突然変異を発現するヒト軟骨細胞系統を使用したＭａｐキナーゼ経路に対するＦ５の有効性の評価
ヒトＴＤ軟骨細胞系統並びにＦ５（５０、１００、２００μg/ml）及びＦｇｆ２（１００ng/ml）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、Ｍａｐキナーゼ経路の２つの特異的タンパク質であるタンパク質Ｅｒｋ１／２のリン酸化レベルを評価した。得られたデータ（図６）を検討して、１００μg/ml Ｆ５によりＴＤ及びＡＣＨ系統を処理することを決定した。
【００４７】
Ｆ５（１００μg/ml）によるＴＤ軟骨細胞系統の処理から、Ｅｒｋ１／２リン酸化レベルの強力な低下が示された（図７）。また、Ｆ５（１００μg/ml）をＡＣＨ軟骨細胞系統についても試験した。Ｅｒｋ１／２リン酸化の有意な低下が、ＡＣＨ細胞においてこの分画に対して観察された（図８）。
【００４８】
４．軟骨形成不全を模倣するＦｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋マウスから単離されたｅｘ  ｖｉｖｏ大腿骨培養物に対するカカオ抽出物からのＦ５及び（−）−エピカテキンの有効性の評価
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られたデータ及びＮＭＲ分析のデータに関して、Ｆ５及び（−）−エピカテキンを大腿骨培養物に試験した。
【００４９】
Ｆ５を１０μg/mlの濃度で評価した。大腿骨成長の割合は、Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋マウスにおいて、Ｆｇｆｒ３＋／＋マウスより重要であった。Ｆ５により、Ｆｇｆｒ３＋／＋大腿骨と比較して、Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋大腿骨が有意に長くなった（図９）。Ｆ５により、Ｆｇｆｒ３＋／＋大腿骨の成長は損なわれなかった（図１０）。
【００５０】
ＮＭＲのデータを検討して、骨成長に対する（−）−エピカテキンの有効性を、２つの異なる濃度：１及び１０μg/mlを使用して評価した。
【００５１】
（−）−エピカテキン（１０μg/ml）により、Ｆｇｆｒ３＋／＋大腿骨と比較して、Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋大腿骨が有意に長くなった（＋１０％）（図１１）。大腿骨成長の割合は、Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋マウスでは、Ｆｇｆｒ３＋／＋マウスより重要であった。（−）−エピカテキン（１０μg/ml）により、Ｆｇｆｒ３＋／＋大腿骨の成長は損なわれなかった（図１２）。
【００５２】
より低い濃度（１μg/ml）の（−）−エピカテキンで得られたデータから、Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋及びＦｇｆｒ３＋／＋大腿骨のサイズは改善されなかった（図１３）。
【００５３】
５．カカオ抽出物からのＦ５及び（−）−エピカテキンの成長板軟骨に対する有効性の評価
免疫組織学的分析から、Ｆ５で処理された近位大腿骨及び遠位大腿骨におけるＸ型コラーゲン発現のわずかな変化が示された。ＦＧＦＲ３及びＳＯＸ９の発現の低下に注目した。近位大腿骨及び遠位大腿骨におけるリン酸化Ｅｒｋ１／２発現の明確な変化は認められなかった。近位大腿骨及び遠位大腿骨の両方の分析から、骨端サイズの明確な変化は示されなかった。
【００５４】
Ｈ＆Ｅ染色の研究から、（−）−エピカテキン処理により成長板軟骨全体が改善されることが観察された。骨端サイズの増大に注目した（データを示さず）。成長増大を赤い矢印でラベル付けする。大腿骨の遠位部では、骨端サイズの改善がより明確であった（データを示さず）。成長板軟骨の予備、増殖及び前肥大ゾーンは大きくなった。
【００５５】
Ｘ型コラーゲンの発現は、近位大腿骨及び遠位大腿骨において変化しなかった。一方、ＦＧＦＲ３及びＳｏｘ９の発現は、近位大腿骨及び遠位大腿骨において協力に低下した。興味深いことに、リン酸化Ｅｒｋ１／２発現は、（−）−エピカテキンで処理された近位大腿骨及び遠位大腿骨でわずかに低下した。
【００５６】
６．出生前Ｅ１６．５軟骨細胞における（−）−エピカテキンによる一次繊毛伸長
図１４に、（−）−エピカテキン処理の有無（ｎ＞１００）における平均一次繊毛Ｆｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋軟骨細胞の長さのグラフ表示を示した。データは、平均＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．、両側不対ｔ検定を表わす。ｎｓ、有意差なし；＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｎは、測定された一次繊毛数である。Ｎは、分析された培養軟骨細胞数である。Ａは、一次繊毛の長さの平均である。得られ、観察された値は、（−）−エピカテキン無し及び（−）−エピカテキン有りで処理されたＦｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋軟骨細胞について、それぞれＮ＝３並びにｎ＝１２７及びｎ＝１１３であった。観察された一次繊毛の平均値は、（−）−エピカテキン無し及び（−）−エピカテキン有りで処理されたＦｇｆｒ３Ｙ３６７Ｃ／＋軟骨細胞について、それぞれＡ＝２．１０＋０．０６及びＡ＝２．４５＋０．０９であった。（−）−エピカテキンの添加により、一次繊毛の伸長がもたらされる。
【００５７】
参考文献
本願全体を通して、種々の参考文献には、本発明が関係する技術水準を記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【００５８】
【表２】
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2021511379.tif 000004
2021511379.tif 000005
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2021511379.tif 000007
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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