(57)【要約】本発明は、オルガノイドおよび免疫細胞の共培養物、ならびに疾患を治療するための作用物質を同定するためにこれらを使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療するのに適切な作用物質を同定する方法であって、以下を含む方法：
チューモロイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、該チューモロイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのチューモロイドを含む、工程、
癌の治療についての候補作用物質の適合性を示す、該チューモロイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程、ならびに
該チューモロイド共培養物において1つまたは複数の該変化の有無が検出される場合に、候補作用物質を癌の治療に適切であると同定する工程。
【請求項２】
癌の治療についての適合性が、癌の治療についての有効性および／または癌の治療についての安全性を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
1つまたは複数の変化が、1つまたは複数の癌バイオマーカーの変化である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
1つまたは複数の変化が、細胞生存率の低減、細胞増殖の低減、細胞死の増加、細胞またはオルガノイドの大きさの変化、細胞運動性の変化、共培養された免疫細胞によるサイトカインおよび細胞傷害性分子の生産の変化、無傷／緻密な上皮細胞層の解離または破壊、ならびに1つまたは複数の遺伝子の発現の変化から選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
検出が、細胞増殖アッセイ、生存率アッセイ、フローサイトメトリー解析、IFN-γについてのELISA、遺伝子発現の解析、および／または細胞イメージングを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
1つまたは複数の変化が、例えばCellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assayキット（Promega）、活性型カスパーゼ3の細胞内フローサイトメトリー染色（BD）、または死細胞の陽性染色によって検出されるような細胞生存率の低減である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
1つまたは複数の変化が、例えば明視野イメージングによって検出されるような細胞死の増加である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
以下の工程の1つまたは複数が先行する、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
チューモロイド培養培地において腫瘍上皮細胞を培養することにより、少なくとも1つのチューモロイドを調製する工程；
不純な免疫試料から免疫細胞を分離し、免疫細胞増殖培地において免疫細胞を培養することにより、免疫細胞を調製する工程；および／または
好ましくは、少なくとも1つのチューモロイドからチューモロイド培養培地を除去し、チューモロイド共培養培地において該少なくとも1つのチューモロイドを免疫細胞と混合することにより、チューモロイド共培養物を調製する工程。
【請求項９】
チューモロイド共培養物の1つまたは複数の変化の有無を参照オルガノイドまたは参照チューモロイドと比較することを含み、かつ以下をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、該参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドもしくはチューモロイドを含む、工程、ならびに
癌の治療についての候補作用物質の適合性を示す、参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程。
【請求項１０】
変化の有無が、チューモロイド共培養物で検出されるが参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物では検出されない場合、候補作用物質が適切な作用物質として同定される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程の1つまたは複数が先行する、請求項9〜10のいずれか一項記載の方法であって、
オルガノイド培養培地において正常上皮細胞を培養することにより、少なくとも1つのオルガノイドを調製する工程；
不純な免疫試料から免疫細胞を分離し、免疫細胞増殖培地において免疫細胞を培養することにより、免疫細胞を調製する工程；および／または
好ましくは、少なくとも1つのチューモロイドまたは少なくとも1つのオルガノイドからチューモロイド培養培地オルガノイド培養培地を除去し、引き続いて、オルガノイド共培養培地またはチューモロイド共培養培地において少なくとも1つの参照オルガノイドまたは少なくとも1つの参照オルガノイドを免疫細胞と混合することにより、参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物を調製する工程、
任意で、該不純な免疫試料は腫瘍試料、正常結腸組織、および／または末梢血である、方法。
【請求項１２】
正常上皮細胞が腫瘍上皮細胞と共に自家性である、請求項8〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物が対照として使用され、好ましくはそれが陰性対照として使用される、請求項9〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
（i）チューモロイド共培養培地および／または（ii）参照オルガノイド共培養培地または参照チューモロイド共培養培地が、
好ましくはコラーゲンまたは任意の動物由来もしくは合成基底膜マトリックスから選択される、細胞外マトリックス
を含む、請求項8〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
コラーゲンがラット尾コラーゲンIである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
共培養物が、少なくとも5％、少なくとも6％、少なくとも7％、少なくとも8％、少なくとも9％、または少なくとも10％のコラーゲンを含み、好ましくは共培養物が約10％（v/v）のコラーゲンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
（i）チューモロイド共培養培地および／または（ii）参照オルガノイド共培養培地または参照チューモロイド共培養培地が、2％〜10％のMatrigel（登録商標）濃度について、0.15 mg/（ml Matrigel（登録商標））〜0.95 mg/（ml Matrigel（登録商標））のタンパク質濃度を有する、請求項8〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
請求項8、11、または14〜17のいずれか一項記載のチューモロイド共培養培地および／またはオルガノイド共培養培地。
【請求項１９】
チューモロイド共培養物および／または参照オルガノイド共培養物および／または参照チューモロイド共培養物の免疫細胞が、少なくとも40 μm/日、60 μm/日、80 μm/日、100 μm/日、120 μm/日、または140 μm/日の運動性を有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
チューモロイド共培養物および／または参照オルガノイド共培養物および／または参照チューモロイド共培養物中の免疫細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％が、80時間で少なくとも200 μm、少なくとも250 μm、少なくとも300 μm、少なくとも350 μm、または少なくとも400 μmの距離を移動できる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
免疫細胞が、少なくとも4時間、8時間、12時間、24時間、48時間、または72時間活性なままである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
1つまたは複数の候補作用物質が、癌の治療について既知の適合性を有し、前記方法が、特定の患者において該1つまたは複数の候補作用物質を癌の治療について適切な作用物質として同定することをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物もしくは参照チューモロイド共培養物の両方が特定の患者に由来する、請求項9〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
特定の患者において癌の治療について適切であると同定された候補作用物質で患者を治療することをさらに含む、請求項22〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
1つまたは複数の候補作用物質が、次の治療薬クラスの1つまたは複数から選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法：免疫治療薬、腫瘍特異的ペプチド、チェックポイント阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、代謝アゴニスト、代謝アンタゴニスト、植物アルカロイド、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、放射線治療薬、化学治療薬、抗体、光増感剤、移植幹細胞、ワクチン、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、チロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、挿入剤、標的療法剤、低分子薬物、ホルモン、ステロイド、細胞治療薬、ウイルスベクター、および核酸治療薬。
【請求項２６】
1つまたは複数の候補作用物質が、次の治療薬クラスの1つまたは複数から選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法：腫瘍特異的ペプチド、チェックポイント阻害剤、キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞治療薬、治療的TCRトランスジェニックT細胞、および新生抗原。
【請求項２７】
1つまたは複数の候補作用物質が免疫治療薬である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
免疫治療薬が、キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞治療薬、治療的TCRトランスジェニックT細胞、または新生抗原である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
1つまたは複数の候補作用物質が、癌の治療について未知の適合性を有し、前記方法が、該1つまたは複数の候補作用物質のサブセットを癌の治療について適切な作用物質として同定することをさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
1つまたは複数の候補作用物質が、第1の癌の治療について既知の適合性を有し、かつ第2の癌の治療について未知の適合性を有し、前記方法が、該1つまたは複数の候補作用物質のサブセットを第2の癌の治療について適切な作用物質として同定することをさらに含む、請求項1〜21または29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
癌が上皮癌である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
癌が胃腸癌である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
癌が結腸直腸癌である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
癌が、ステージII、グレードII、またはT2 N1 M0の1つまたはそれより下の癌を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞が、癌患者からの試料から得られる、請求項8〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍上皮細胞および正常上皮細胞が同一の癌患者から、任意で同一の試料から得られる、請求項8〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
試料が組織生検である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
組織生検が、結腸直腸癌患者の切除された結腸および／もしくは直腸から、結腸直腸癌もしくは卵巣癌患者の腹水から、ならびに／または腎臓癌患者の尿から採取される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞が、肺細胞、肝細胞、乳房細胞、皮膚細胞、腸細胞、陰窩細胞、直腸細胞、膵臓細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、管細胞、腎細胞、副腎細胞、甲状腺細胞、下垂体細胞、副甲状腺細胞、前立腺細胞、胃細胞、食道細胞、卵巣細胞、卵管細胞、または膣細胞からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞が、腸細胞、例えば結腸直腸細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞が上皮幹細胞であり、好ましくはLgr5発現によって特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
免疫細胞が、上皮内リンパ球（IEL）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、末梢血単核細胞（PBMC）、末梢血リンパ球（PBL）、T細胞、および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）、αβT細胞、γδT細胞、B細胞、NK細胞、および単核食細胞からなる群より選択される1つまたは複数の細胞型を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
免疫細胞が、癌患者からの試料から得られる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
免疫細胞が、末梢血試料および／または組織生検から得られる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
末梢血リンパ球（PBL）および／またはT細胞が末梢血試料から得られる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍浸潤リンパ球（TIL）および／または上皮内リンパ球（IEL）が、それぞれ腫瘍または正常組織生検から得られる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
免疫細胞が、腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞と同一の患者から得られる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
免疫細胞がチューモロイドおよび／またはオルガノイドと同種異系であり、任意で免疫細胞ならびにチューモロイドおよび／またはオルガノイドが、異なる患者または健常対照の末梢血または組織生検のいずれかに由来する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
免疫細胞が、チューモロイドおよび／またはオルガノイドとHLA適合している、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
免疫細胞が、免疫細胞増殖培地中で少なくとも4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、168時間、192時間、216時間、および240時間持続する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも1つのチューモロイドおよび／または少なくとも1つのオルガノイドが自家細胞を含むか、またはそれからなる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも1つのチューモロイドおよび／または少なくとも1つのオルガノイドが、免疫細胞と混合する前に、1つまたは複数の遺伝子型、表現型、および／またはエピジェネティックマーカーを共有する集団へ分けられる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
遺伝子型、表現型、および／またはエピジェネティックマーカーが、（i）少なくとも1つのチューモロイドおよび／または少なくとも1つのオルガノイドと（ii）免疫細胞との間の相互作用に寄与する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
集団がHLAハプロタイプの有無を共有し、任意でHLAハプロタイプがHLA-A2である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも1つのチューモロイドまたは少なくとも1つのオルガノイドが哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を含むか、またはそれからなる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも1つのチューモロイド共培養物または少なくとも1つのオルガノイド共培養物が、免疫細胞増殖培地中または免疫細胞増殖培地およびオルガノイド培養培地もしくはチューモロイド培養培地（それぞれ）の50：50（v/v）の混合物中で培養される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
チューモロイド共培養物がチューモロイド共培養培地中で、または参照オルガノイド共培養物もしくは参照チューモロイド共培養物がオルガノイド共培養培地中で、少なくとも4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、168時間、192時間、216時間、および240時間持続する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
チューモロイドまたはオルガノイドがインターロイキンを含む培地中にあり、任意でインターロイキンがIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載されるようなチューモロイドまたはオルガノイド。
【請求項５９】
前記請求項のいずれか一項記載の方法に従って調製されたチューモロイドまたはオルガノイドの集団。
【請求項６０】
前記請求項のいずれか一項に記載されるようなチューモロイド共培養物および／または参照オルガノイド共培養物。
【請求項６１】
オルガノイド培養培地が、基本培地（Advanced DMEM/F12培地、Gibcoなど）、Wntリガンド（Wnt-3aなど）、Wntアゴニスト（Rスポンジン 1〜4のいずれか1つなど）、BMP阻害剤（ノギンなど）、EGF、およびTGF-β阻害剤（A83-01、Tocrisなど）の1つまたは複数（または好ましくはすべて）を含み、任意でp38 MAPK阻害剤、ガストリン、ニコチンアミド、プロスタグランジンE、N-アセチルシステイン、B27、および／または抗菌剤（プリモシンなど）の1つまたは複数（またはすべて）をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
チューモロイド培養培地が、基本培地（Advanced DMEM/F12培地、Gibcoなど）、Wntアゴニスト（Rスポンジン 1〜4のいずれか1つなど）、BMP阻害剤（ノギンなど）、EGF、およびTGF-β阻害剤（A83-01、Tocrisなど）の1つまたは複数（または好ましくはすべて）を含み、任意でp38 MAPK阻害剤、ガストリン、ニコチンアミド、プロスタグランジンE、N-アセチルシステイン、B27、および／または抗菌剤（プリモシンなど）の1つまたは複数（またはすべて）をさらに含み、任意でチューモロイド培養培地がWntリガンド（Wnt-3aなど）をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
免疫細胞増殖培地がIL-2を、任意で2000〜6000 IU/mLの濃度で含み、任意でIL-7および／またはIL-15をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
免疫細胞増殖培地がRPMI培地（例えば、RPMI 1640、Gibco）をさらに含み、任意でペニシリン／ストレプトマイシンおよび／または血清（例えば、5％ ヒトAB血清、Sigma-Aldrich）が補充されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
チューモロイド共培養培地および／またはオルガノイド共培養培地がIL-2を、任意で100〜200 IU/mLの濃度で含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
上皮癌の治療に使用する場合の有効性および／または安全性について、CAR-T免疫療法、TCRトランスジェニックT細胞、新生抗原、またはチェックポイント阻害剤を試験する方法であって、以下を含む方法：
任意で、同一の患者から腫瘍上皮細胞、正常上皮細胞、および免疫細胞を提供する工程、
チューモロイド培養培地中で腫瘍上皮細胞を増殖させてチューモロイドを形成させ、インターロイキンを含むチューモロイド共培養培地中で免疫細胞とともに該チューモロイドを培養してチューモロイド共培養物を形成させる工程、
オルガノイド培養培地中で正常上皮細胞を増殖させてオルガノイドを形成させ、インターロイキンを含むオルガノイド共培養培地中で免疫細胞とともに該オルガノイドを培養して参照オルガノイド共培養物を形成させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物をCAR-T免疫療法、TCRトランスジェニックT細胞、新生抗原、またはチェックポイント阻害剤と接触させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程であって、1つまたは複数の変化の有無がCAR-T免疫療法、TCRトランスジェニックT細胞、新生抗原、またはチェックポイント阻害剤の有効性および／または安全性を示す、工程、ならびに
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物を比較する工程。
【請求項６７】
上皮癌の治療に使用する場合の有効性および／または安全性について候補化合物を試験する方法であって、以下を含む方法：
任意で、同一の患者から腫瘍上皮細胞、正常上皮細胞、および免疫細胞を提供する工程、
チューモロイド培養培地中で腫瘍上皮細胞を増殖させてチューモロイドを形成させ、インターロイキンを含むチューモロイド共培養培地中で免疫細胞とともに該チューモロイドを培養してチューモロイド共培養物を形成させる工程、
オルガノイド培養培地中で正常上皮細胞を増殖させてオルガノイドを形成させ、インターロイキンを含むオルガノイド共培養培地中で免疫細胞とともに該オルガノイドを培養して参照オルガノイド共培養物を形成させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物を候補化合物と接触させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程であって、1つまたは複数の変化の有無が候補化合物の有効性および／または安全性を示す、工程、ならびに
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物を比較する工程。
【請求項６８】
オルガノイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法であって、以下を含む方法：
任意で、オルガノイド培養培地中で細胞外マトリックスと接触させて上皮細胞を培養し、オルガノイドを得る工程；
オルガノイドから細胞外マトリックスおよびオルガノイド培養培地を除去する工程；
インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地中にオルガノイドを再懸濁する工程；
免疫細胞、インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地、および免疫細胞懸濁液中の濃度が少なくとも5〜10％であるコラーゲンを含む免疫細胞懸濁液を調製する工程；ならびに
免疫細胞を含む免疫細胞懸濁液を、再懸濁したオルガノイドと混合する工程。
【請求項６９】
チューモロイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法であって、以下を含む方法：
任意で、チューモロイド培養培地中で細胞外マトリックスと接触させて腫瘍上皮細胞を培養し、オルガノイドを得る工程；
チューモロイドから細胞外マトリックスおよびチューモロイド培養培地を除去する工程；
インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地中にチューモロイドを再懸濁する工程；
免疫細胞、インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地、および免疫細胞懸濁液中の濃度が少なくとも5〜10％であるコラーゲンを含む免疫細胞懸濁液を調製する工程；ならびに
免疫細胞を含む免疫細胞懸濁液を、再懸濁したチューモロイドと混合する工程。
【請求項７０】
コラーゲンがラット尾コラーゲンである、請求項68または69記載の方法。
【請求項７１】
免疫細胞培地がRPMI1640（Gibco）である、請求項68〜70のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
免疫細胞がT細胞である、請求項68〜71のいずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
上皮細胞および免疫細胞が同一の対象から、任意で同一の試料から得られる、請求項68〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
上皮細胞および免疫細胞がヒト細胞である、請求項68〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
請求項68または70〜74のいずれか一項記載の方法により得られるオルガノイド-免疫細胞共培養物。
【請求項７６】
請求項69〜74のいずれか一項記載の方法により得られるチューモロイド-免疫細胞共培養物。
【請求項７７】
治療剤を試験するための方法であって、以下を含む方法：
オルガノイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、オルガノイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドを含む、工程、
治療有効性を示す、オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程、ならびに
オルガノイド共培養物において1つまたは複数の該変化の有無が検出される場合に、候補作用物質を治療剤と同定する工程。
【請求項７８】
治療剤が免疫疾患の治療に適切であって、任意で免疫疾患が肺および／または腸の組織に影響を与え、例えば免疫疾患が過敏性腸疾患（IBD）、潰瘍性大腸炎（UC）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および喘息からなる群より選択される、請求項77記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に引用されているすべての文書は、その全体が参照により組み込まれている。
【０００２】
技術分野
本発明は、オルガノイド共培養物および疾患の調査におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
癌および免疫疾患などの疾患の根底にある生理学に関する臨床研究は、医学的進歩の土台であり続けるが、とはいえそのような調査を実行するためのインビトロのシステムは基本的なままである。同様に、そのような疾患の治療のための最新の計画は、計画の有効性および安全性を確実にするために、通常、開発の間に厳密な試験システムを伴う。これらの分野における最近の進歩により、調査および治療試験システムの有効性は増加したが、システムの効率、正確さ、および費用対効果の点で改善が必要とされている。理想的な試験システムは、患者に対する直接的な試験の実行を必要とせず、患者試料の使用を最小限に抑えながら、生化学、細胞、組織、器官、および生物のレベルで患者または患者集団の生理機能を正確に再現する。様々な異なる治療剤および時間尺度を1つのシステムに適応させなければならない。
【０００４】
集団レベルで癌および免疫疾患を調査ならびに治療することを目的とした新しい計画を同定するための候補化合物の「スクリーニング」には、インビトロモデルが必要である。さらに、特定の特徴を有する患者のサブグループにおいて、または単一の患者からの試料においてすら、その特定のサブグループまたは患者のための最適な計画を決定するために、（時には以前に承認された）計画を試験するのにインビトロモデルを使用できる「オーダーメイド医療」への関心が増加している。
【０００５】
オルガノイド技術の分野は、発生生物学についての我々の理解に革命をもたらしている。オルガノイドは、上皮細胞の増殖によって得られる細胞構造であり、細胞選別および空間的に制限された系統の関わりを通じて自己組織化する組織特異的な細胞型からなる（Clevers, Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597（非特許文献1））。先行技術におけるオルガノイドに基づくモデルの制約は、それらが上皮細胞だけを含むため、複数の細胞型を含むインビボ組織システムを完全には代表しないことである。特に、癌のオルガノイド（「チューモロイド（tumouroid）」）および免疫細胞のヒトの「共培養物」は説明されておらず、癌および免疫細胞が同一の患者から得られた場合については確かに説明されていない。免疫細胞は、試験システムとしてのオルガノイドの正確さを改善し、患者の生理機能を再現し、免疫システムが試験システムで表現されるのを確実にする。
【０００６】
腸上皮細胞とともにある上皮内リンパ球（IEL）の時空間的挙動を理解する目的で、以前の試みにおいてマウスIELとマウス腸上皮オルガノイドとの共培養は実証されたが−Nozaki et al.（J Gastroenterol. 2016 Mar;51(3):206-13（非特許文献2））およびRogoz et al.（J Immunol Methods. 2015 Jun;421:89-95（非特許文献3））−ヒトオルガノイド共培養物の開発への進行ならびに癌の調査および治療への適用は報告されなかった。いわゆる「チューモロイド」は、結腸直腸癌患者に由来する試料から調製されたが（Drost et al., Nature. 2015 May 7;521(7550):43-7（非特許文献4）；van de Wetering et al., Cell. 2015 May 7;161(4):933-45（非特許文献5））、癌についての治療計画を調査するために免疫細胞とともに共培養されてはいない。
【０００７】
オルガノイド共培養物およびチューモロイド共培養物を調製するための改善された方法、ならびに薬物スクリーニングにおけるこれらの共培養物の使用方法、特に増加した数多くの薬物をハイスループット能力で調査するために、疾患細胞と免疫細胞との間の相互作用を活用できるシステムが必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Clevers, Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597
【非特許文献２】J Gastroenterol. 2016 Mar;51(3):206-13
【非特許文献３】J Immunol Methods. 2015 Jun;421:89-95
【非特許文献４】Drost et al., Nature. 2015 May 7;521(7550):43-7
【非特許文献５】van de Wetering et al., Cell. 2015 May 7;161(4):933-45
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、癌および免疫疾患などの疾患についての適切な治療の同定を含む、そのような疾患に関連する調査に有用なオルガノイド共培養物を開発した。いくつかの態様において、これはオルガノイドおよび免疫細胞、特に疾患オルガノイド（チューモロイドなど）および免疫細胞の共培養物の調製を含み、これらは疾患を治療するために、および適切な候補作用物質を同定するための任意の変化を検出するために、候補作用物質に曝露できる。
【００１０】
したがって、本発明は、何よりも、癌を治療するのに適切な作用物質を同定する方法であって、以下を含む方法を提供する：
チューモロイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、該チューモロイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのチューモロイドを含む工程、
癌の治療についての候補作用物質の適合性を示す、該チューモロイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程、ならびに
該チューモロイド共培養物において1つまたは複数の該変化の有無が検出される場合に、候補作用物質を癌の治療に適切であると同定する工程。
【００１１】
いくつかの態様において、上記の方法は、チューモロイド共培養物の1つまたは複数の変化の有無を参照オルガノイドまたは参照チューモロイドと比較することをさらに含み、方法は以下をさらに含む：
参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、該参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドまたはチューモロイドを含む工程、ならびに
癌の治療についての候補作用物質の適合性を示す、参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程。
【００１２】
本発明は、免疫疾患を治療するのに適切な作用物質を同定する方法であって、以下を含む方法をさらに提供する：
オルガノイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、オルガノイド共培養物が罹患免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドを含む、工程、
免疫疾患の治療についての候補作用物質の適合性を示す、オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程、ならびに
オルガノイド共培養物において1つまたは複数の該変化の有無が検出される場合に、候補作用物質を免疫疾患の治療に適切であると同定する工程。
【００１３】
いくつかの態様において、上記の方法は、オルガノイド共培養物の1つまたは複数の変化の有無を（例えば、免疫疾患を欠落する対照患者からの）参照免疫細胞と比較することをさらに含み、方法は以下をさらに含む：
参照オルガノイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、参照オルガノイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドを含む、工程、ならびに
免疫疾患の治療についての候補作用物質の適合性を示す、参照オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程。
【００１４】
上皮癌の治療に使用する場合の有効性および／または安全性について、CAR-T免疫療法、TCRトランスジェニックT細胞、新生抗原、またはチェックポイント阻害剤を試験する方法も提供され、この方法は以下を含む：
任意で、同一の患者から腫瘍上皮細胞、正常上皮細胞、および免疫細胞を提供する工程、
チューモロイド培養培地中で腫瘍上皮細胞を増殖させてチューモロイドを形成させ、インターロイキンを含むチューモロイド共培養培地中で免疫細胞とともに該チューモロイドを培養してチューモロイド共培養物を形成させる工程、
オルガノイド培養培地中で正常上皮細胞を増殖させてオルガノイドを形成させ、インターロイキンを含むオルガノイド共培養培地中で免疫細胞とともに該オルガノイドを培養して参照オルガノイド共培養物を形成させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物をCAR-T免疫療法、TCRトランスジェニックT細胞、新生抗原、またはチェックポイント阻害剤と接触させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程であって、1つまたは複数の変化の有無がCAR-T免疫療法、TCRトランスジェニックT細胞、新生抗原、またはチェックポイント阻害剤の有効性および／または安全性を示す、工程、ならびに
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物を比較する工程。
【００１５】
上皮癌の治療に使用する場合の有効性および／または安全性について候補化合物を試験する方法も提供され、この方法は以下を含む：
任意で、同一の患者から腫瘍上皮細胞、正常上皮細胞、および免疫細胞を提供する工程、
チューモロイド培養培地中で腫瘍上皮細胞を増殖させてチューモロイドを形成させ、インターロイキンを含むチューモロイド共培養培地中で免疫細胞とともに該チューモロイドを培養してチューモロイド共培養物を形成させる工程、
オルガノイド培養培地中で正常上皮細胞を増殖させてオルガノイドを形成させ、インターロイキンを含むオルガノイド共培養培地中で免疫細胞とともに該オルガノイドを培養して参照オルガノイド共培養物を形成させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物を候補化合物と接触させる工程、
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程であって、1つまたは複数の変化の有無が候補化合物の有効性および／または安全性を示す、工程、ならびに
チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物を比較する工程。
【００１６】
オルガノイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法も提供され、この方法は以下を含む：
任意で、オルガノイド培養培地中で細胞外マトリックスと接触させて上皮細胞を培養し、オルガノイドを得る工程；
オルガノイドから細胞外マトリックスおよびオルガノイド培養培地を除去する工程；
インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地中にオルガノイドを再懸濁する工程；
免疫細胞、インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地、および免疫細胞懸濁液中の濃度が少なくとも5〜10％であるコラーゲンを含む免疫細胞懸濁液を調製する工程；ならびに
免疫細胞を含む免疫細胞懸濁液を、再懸濁したオルガノイドと混合する工程。
【００１７】
チューモロイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法も提供され、この方法は以下を含む：
任意で、チューモロイド培養培地中で細胞外マトリックスと接触させて腫瘍上皮細胞を培養し、オルガノイドを得る工程；
チューモロイドから細胞外マトリックスおよびチューモロイド培養培地を除去する工程；
インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地中にチューモロイドを再懸濁する工程；
免疫細胞、インターロイキンを補充した免疫細胞培養培地、および免疫細胞懸濁液中の濃度が少なくとも5〜10％であるコラーゲンを含む免疫細胞懸濁液を調製する工程；ならびに
免疫細胞を含む免疫細胞懸濁液を、再懸濁したチューモロイドと混合する工程。
【００１８】
治療剤を試験する方法も提供され、この方法は以下を含む：
オルガノイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、オルガノイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドを含む、工程、
治療有効性を示す、オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程、ならびに
オルガノイド共培養物において1つまたは複数の該変化の有無が検出される場合に、候補作用物質を治療剤と同定する工程。
【００１９】
本発明の方法によって得ることができるまたは得られるオルガノイド共培養物も提供される。
【００２０】
本発明の方法によって得ることができるまたは得られるチューモロイド共培養物も提供される。
【００２１】
本発明の方法によって得ることができるまたは得られるオルガノイドの集団も提供される。
【００２２】
本発明の方法によって得ることができるまたは得られるチューモロイドの集団も提供される。
【００２３】
本発明の方法での使用に適切なオルガノイド共培養培地も提供される。
【００２４】
本発明の方法での使用に適切なチューモロイド共培養培地およびオルガノイド共培養培地も提供される。任意でインターロイキンがIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、インターロイキンを含む培地中のチューモロイドまたはオルガノイドも提供される。
【００２５】
本発明は、本発明のチューモロイド、オルガノイド、チューモロイド共培養物、またはオルガノイド共培養物を含むキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】初代患者組織からのオルガノイド、チューモロイド、およびT細胞の導出。図1A：手順の概略図。結腸直腸癌患者の切除された結腸および／または直腸から正常結腸粘膜および腫瘍組織の生検を採取する。手術の間に末梢血も採取する。正常結腸粘膜をEDTAで処理して、正常結腸オルガノイドの導出のために陰窩を遊離させ、さらに消化して、T細胞培養物のための上皮内リンパ球（IEL）を含む単一細胞懸濁液を作製する。腫瘍組織を消化して、チューモロイドおよびT細胞培養物のための腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の導出のために上皮腫瘍細胞を含む単一細胞懸濁液を作製する。末梢血を処理して、末梢血リンパ球（PBL）およびT細胞が濃縮された末梢血単核細胞を精製する。T細胞受容体（TCR）配列決定ならびにT細胞の免疫表現型検査ならびに正常結腸上皮および腫瘍上皮の単一細胞懸濁液に存在する細胞の単一細胞メッセンジャーRNA（mRNA）配列決定により、一次解析を実行する。全ゲノム配列決定、mRNA配列決定、およびペプチドームプロファイリングを使用してオルガノイド培養物を解析する。図1は実施例1においてさらに説明される。
【図１Ｂ】初代患者組織からのオルガノイド、チューモロイド、およびT細胞の導出。図1B：患者試料に由来する正常結腸オルガノイドおよびチューモロイドの代表的な明視野画像。結腸陰窩を基底膜抽出物（BME）へ埋め込み、R-スポンジン-1、ノギン、Wnt3A馴化培地、ビタミンA不含B27補助剤、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、EGF、TGF-β阻害剤A-83-01、ガストリン、p38 MAPK阻害剤SB202190、およびプロスタグランジンE2を含む培地で培養した。1週間以内に正常結腸オルガノイドが発生し、その後は毎週継代した（上部パネル）。結腸直腸癌試料からの単一細胞懸濁液を基底膜抽出物（BME）へ埋め込み、R-スポンジン-1、ノギン馴化培地、ビタミンA不含B27補助剤、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、EGF、TGF-β阻害剤A-83-01、ガストリン、p38 MAPK阻害剤SB202190、およびプロスタグランジンE2を含む培地で培養した。1週間以内にチューモロイドが形成され、その後は毎週継代した（下部パネル）。図1は実施例1においてさらに説明される。
【図１Ｃ】初代患者組織からのオルガノイド、チューモロイド、およびT細胞の導出。図1C：患者試料に由来する上皮内リンパ球（IEL）および腫瘍浸潤リンパ球（TIL）のクローン性増殖の代表的な明視野画像（左パネル）。フローサイトメトリー解析により、CD4＋ Tヘルパー（Th）細胞およびCD8＋ 細胞傷害性T細胞（CTL）の頑強な増殖が示される。正常結腸粘膜または結腸直腸癌組織からの単一細胞懸濁液を、インターロイキン-2（IL-2）を含むT細胞培地中で維持した。T細胞のクローン性増殖は、1〜2週間以内に顕著であった（左パネル）。図1は実施例1においてさらに説明される。
【図２】基底膜抽出物（BME）の液滴（drop）における正常結腸オルガノイドおよび同種異系CD3＋ T細胞の原理証明共培養。図2A：手順の概略図。Cell Recovery Solutionを使用して正常結腸オルガノイドをBME液滴から遊離させ、完全Advanced DMEM/F12で洗浄した。増殖したCD3＋ T細胞を培養物から収穫し、緑色色素（Vybrant CFDA SE Cell Tracer）で標識した。結腸オルガノイドおよび標識T細胞をヒト結腸オルガノイド培地中で混合し、BME液滴へ埋め込んだ。IL-2を含むヒト結腸オルガノイド培地中で共培養物を60時間維持した。Cell Recovery Solutionを使用して共培養物をBMEから遊離させ、4％ パラホルムアルデヒド中で固定した。固定された全組織標本を、重合アクチンに印を付けるためにファロイジンで、および核を標識するためにDAPIで染色した。ProLong Gold褪色防止用封入剤中のスライド上へ全組織標本を載せ、Leica SP8X共焦点顕微鏡上で画像化した。図2B：結腸オルガノイド共培養物のzスタック画像の最大投影。オルガノイド中のF-アクチンは濃灰色で標識され、T細胞は薄灰色で標識されている。右パネルの挿入図は、結腸上皮に浸潤するT細胞を示す。図2C：正常結腸オルガノイドおよびT細胞の三次元再構成。図2は実施例8においてさらに説明される。
【図３】T細胞の最適な運動性を評価するためのチューモロイド共培養物のライブイメージング。図3A：手順の概略図。Cell Recovery Solutionを使用してチューモロイドをBME液滴から遊離させ、完全Advanced DMEM/F12で洗浄した。末梢血試料から単離した同種異系CD8＋ T細胞を緑色色素（Vybrant CFDA SE Cell Tracer）で標識した。チューモロイドおよびT細胞を、IL-2および10％ BMEもしくはラット尾コラーゲンIのいずれかを含むヒト結腸オルガノイド培地と混合し、37℃および5％ CO2の雰囲気で、ライブイメージングチャンバーを備えたLeica SP8X共焦点顕微鏡上で80時間にわたってライブイメージングした。図3B：チューモロイド共培養物の代表的な合成画像。明視野チャネルおよび緑色蛍光チャネルを、産生された合成画像に統合した。Imarisソフトウェアを使用してT細胞の移動経路を追跡した。図3C。両方の条件におけるT細胞の軌跡長の定量化により、10％ BMEと比較して、10％ コラーゲン中で共培養されたT細胞の軌跡経路は有意に長いことが示される。図3は実施例10でより詳細に説明される。
【図４Ａ】A2型ヒト白血球抗原（HLA）に対して陽性および陰性のクローン性チューモロイドの産生。図4A：手順の概略図。TrypLE酵素消化を使用してチューモロイドを単一細胞へ解離させた。単一細胞を抗HLA-A2抗体で染色し、抗HLA-A2免疫反応性に基づいて精製した。HLA-A2＋veおよびHLA-A2−ve腫瘍細胞を埋め込んで維持し、チューモロイドを産生させた。図4は実施例11においてさらに説明される。
【図４Ｂ】A2型ヒト白血球抗原（HLA）に対して陽性および陰性のクローン性チューモロイドの産生。図4B：純粋なHLA-A2＋veまたはHLA-A2−veチューモロイド株の樹立を示すフローサイトメトリー解析。対照は、HLA-A2＋ve JY細胞株、およびHLA-A2＋veもしくはHLA-A2−veチューモロイド株と同一の患者試料に由来する正常結腸オルガノイド株である。図4は実施例11においてさらに説明される。
【図５】抗原を経験したT細胞の抗チューモロイド反応性についての殺傷アッセイ（killing assay）。図5A：手順の概略図。HLA-A2拘束性ウィルムス腫瘍1（WT1）ペプチドでHLA-A2＋veまたはHLA-A2−veチューモロイドを2時間パルスした。次に、WT1ペプチド特異的TCRを内部に持つTCRトランスジェニックCD8＋ T細胞を、WT1ペプチドをパルスしたHLA-A2＋veまたはHLA-A2−veチューモロイドとともに48時間共培養した。図5B：WT1ペプチドだけでパルスしたHLA-A2＋veチューモロイドの著しい死を示す、48時間後の共培養物の代表的な明視野画像。他のすべての条件、すなわちWT1ペプチドでパルスしていないHLA-A2＋veもしくはHLA-A2−veチューモロイド、およびWT1ペプチドでパルスしたHLA-A2−veチューモロイドは、正常な成長を示す。図5は実施例12でより詳細に説明される。
【図６】チェックポイント阻害ありおよび阻害なしにおける、抗原を経験したT細胞の抗チューモロイド反応性についての細胞生存率アッセイ。図6A：手順の概略図。図5Aについて説明したように、ただし12時間だけ共培養を実行し、抗PD1チェックポイント阻害剤ありおよび阻害剤なしでインキュベートした。CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay kit（Promega）を使用して、製造元の指示に従って細胞生存率アッセイを実行した。図6B：ペプチドなしの対照に対して正規化されたチューモロイドの細胞生存率。図6は実施例13でより詳細に説明される。
【図７】オルガノイド／チューモロイド共培養物によるT細胞の活性化に対する異なる効果を決定するためのアッセイ。図7A：手順の概略図。Dispaseを使用してチューモロイドをMatrigel（登録商標）液滴から遊離させ、引き続いて70 μmおよび20 μmフィルターを通過させた。20 μmフィルターからオルガノイドを回収し、計数して播いた。チューモロイドおよびT細胞を、RPMI、IL-2、および5％ Matrigel（登録商標）を含むヒト結腸オルガノイド培地と混合し、37℃および5％ CO2の雰囲気でインキュベートした。24時間のインキュベーション後、明視野倒立顕微鏡を使用してオルガノイドを画像化した。図7B：チューモロイド共培養物の代表的な画像。図7C：オルガノイド共培養物の代表的な画像。図7D：共培養物の定量化IFN-γレベル。図7は実施例14においてさらに説明される。
【図８】会合および細胞殺傷能力を評価するためのチューモロイド共培養物のライブイメージング。図8A：手順の概略図。Dispaseを使用してチューモロイドをMatrigel（登録商標）液滴から遊離させ、引き続いて70 μmおよび20 μmフィルターを通過させた。20 μmフィルターからオルガノイドを回収し、計数して播いた。培養したT細胞を遠赤色色素（CellVue Claret）で標識した。チューモロイドおよびT細胞を、RPMI、IL-2、および5％ Matrigel（登録商標）を含むヒト結腸オルガノイド培地と混合し、37℃および5％ CO2の雰囲気で、ライブイメージングチャンバーを備えたLeica SP8X共焦点顕微鏡上で68時間にわたってライブイメージングした。図8B：チューモロイドおよび非標的T細胞の共培養物の代表的な合成画像。明視野チャネルおよび遠赤色蛍光チャネルを、産生された合成画像に統合した。図8C：チューモロイドおよび標的T細胞の共培養物の代表的な合成画像。明視野チャネルおよび遠赤色蛍光チャネルを、産生された合成画像に統合した。図8は実施例15においてさらに説明される。
【図９Ａ】CRCオルガノイドは免疫調節分子を発現する。患者特異的な方法で正常な結腸およびCRCオルガノイド株を産生し、RNAを抽出して、Affymetrix単一転写産物マイクロアレイを使用して解析した。図9A：正常な結腸およびCRCオルガノイド株における異なる免疫調節物質の平均遺伝子発現；n.s.、有意ではない；*、p＜0.05。
【図９Ｂ】CRCオルガノイドは免疫調節分子を発現する。患者特異的な方法で正常な結腸およびCRCオルガノイド株を産生し、RNAを抽出して、Affymetrix単一転写産物マイクロアレイを使用して解析した。図9B：選択された免疫調節物質の遺伝子発現を見せる「生きたバイオバンク（living biobank）」中の個々の正常な結腸およびCRCオルガノイド株の階層的クラスタリング。色のグラデーションは、各行のz値化を表す（遺伝子転写産物）。
【図９Ｃ】CRCオルガノイドは免疫調節分子を発現する。患者特異的な方法で正常な結腸およびCRCオルガノイド株を産生し、RNAを抽出して、Affymetrix単一転写産物マイクロアレイを使用して解析した。図9C：CRCで見出された1つまたは複数の変異を保有するように遺伝子操作されたヒト結腸オルガノイド株。定量的PCRによって評価された、定常状態（Ctrl）および20 ng/mL 組換えヒトIFN-γ刺激の際のオルガノイド株（n＝2）におけるCD274（PD-L1）の発現レベル。A、APCKO/KO；N.D.、検出されず；K、KRASG12D/+：P、P53KO/KO；S、SMAD4KO/KO、WT、野生型。
【図９Ｄ】CRCオルガノイドは免疫調節分子を発現する。患者特異的な方法で正常な結腸およびCRCオルガノイド株を産生し、RNAを抽出して、Affymetrix単一転写産物マイクロアレイを使用して解析した。図9D：CRCで見出された1つまたは複数の変異を保有するように遺伝子操作されたヒト結腸オルガノイド株。フローサイトメトリーによって評価された、定常状態（Ctrl）および20 ng/mL 組換えヒトIFN-γ刺激の際のオルガノイド株（n＝2）におけるCD274（PD-L1）の発現レベル。A、APCKO/KO；N.D.、検出されず；K、KRASG12D/+：P、P53KO/KO；S、SMAD4KO/KO、WT、野生型。
【図１０】クローン性増殖したHLA-A2＋およびHLA-A2− CRCオルガノイド株におけるHLA-A2発現。図は、複数の反復実験の代表的なプロットを示す。20 ng/mL 組換えヒトIFN-γによる刺激ありおよび刺激なしの、正常（左パネル）、HLA-A2＋ CRC（中央パネル）、およびHLA-A2− CRC（右パネル）株におけるHLA-A2発現のフローサイトメトリー解析。
【図１１Ａ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11A：実験構想。
【図１１Ｂ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11B：クローン化HLA-A2＋およびHLA-A2−株におけるHLA-A2発現のフローサイトメトリー解析。
【図１１Ｃ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11C：WT1ペプチド特異的T細胞受容体特異的トランスジェニックT細胞とともに48時間共培養したCRCオルガノイドの明視野画像；スケールバー：1 mm。
【図１１Ｄ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11D：表示されたペプチド特異的T細胞との共培養の開始時および終了時における、ペプチドでパルスしたHLA-A2＋ CRCオルガノイドを示す画像；スケールバー：70 μm。
【図１１Ｅ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11E：表示されたペプチドでパルスしたHLA-A2＋ CRCオルガノイドとともに18時間共培養された後に収集された上清の、ELISAによって測定されたWT1（上部）およびEBV（下部）ペプチド特異的T細胞によるIFN-γ生産。
【図１１Ｆ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11F：EBV特異的T細胞クローンとともに共培養された、EBVペプチドでパルスしたHLA-A2＋ CRCオルガノイドとの18時間共培養実験の生細胞イメージング静止画。
【図１１Ｇ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11G：特定のT細胞によるCRCオルガノイド殺傷の定量化。グラフは、EBVペプチドおよびEBV T細胞またはWT1ペプチドおよびWT1 T細胞の共培養物のいずれかを用いた複数の反復実験の代表である。
【図１１Ｈ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11H：生細胞イメージング実験の間に記録された、ペプチドでパルスしたCRCオルガノイドに浸潤するT細胞（青色）の代表的な投影画像。
【図１１Ｉ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11I：PD-1に対する遮断抗体の存在下または非存在下のいずれかにおける、特定のT細胞によるIFN-γ処理CRCオルガノイドの殺傷の定量化。グラフは、EBVペプチドおよびEBV T細胞またはWT1ペプチドおよびWT1 T細胞の共培養物のいずれかを用いた複数の反復実験の代表である。
【図１１Ｊ】CD8＋ T細胞による抗原特異的殺傷を評価するためのツールとしてのCRCオルガノイド。図11J：抗原特異的T細胞とともに、ペプチドでパルスしたまたはパルスしなかったHLA-A2＋オルガノイドのいずれかを18時間共培養した後の細胞生存率の定量化。グラフは、ペプチドでパルスした条件とペプチドでパルスしなかった条件との間の比率を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
定義
「同種異系」とは、異なる患者に由来する実体（例えば、細胞、チューモロイド、共培養物）を指す。細胞の場合、これは異なる患者または健常対照からの試料に由来する細胞を指し得る。適切な試料の例には末梢血または組織生検が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
この出願で使用される「大体」または「約」は同等である。約／大体を伴っていてもいなくても、この出願で使用される任意の数字は、当業者によって理解される任意の普通の揺らぎに及ぶことが意図される。本明細書で使用される場合、対象となる1つまたは複数の値に適用される「大体」または「約」という用語は、記載された参照値と類似した値を指す。特定の態様において、「大体」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈から明白でない限り、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいか、またはより小さい）に、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、またはより少ない範囲内にある値の範囲を指す（そのような数が可能な値の100％を超えるであろう場合を除く）。
【００２９】
「生物学的に活性な」とは、生物学的システム、特に生物において活性を有する任意の作用物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された場合、その生物に対して生物学的効果を有する作用物質は、生物学的に活性であると見なされる。
【００３０】
「共培養物」とは、相互の成長に適切な条件で維持されている2つ以上の細胞型を指す。本開示の文脈において、「オルガノイド共培養物」は、非上皮細胞型、特に免疫細胞型との培養における、他の場所で定義される上皮オルガノイドに関する。いくつかの態様において、共培養物中の細胞型は、孤立しては呈さない構造的、生化学的、および／または現象論的関連を呈する。いくつかの態様において、共培養物中の細胞型は、インビボにおいて細胞型の間で観察される構造的、生化学的、および／または現象論的関連を模倣する。
【００３１】
「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、および「含んでいる（comprising）」とは、記載された工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループの包含を含意するが、他の任意の工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループの除外を含意しないと理解される。
【００３２】
「用量」とは、単回投与で提供される特定量の医薬作用物質を指す。特定の態様において、用量は、2つ以上のボーラス、錠剤、または注射で投与されてよい。例えば、特定の態様において、皮下投与が望ましい場合、所望の用量は、単回注射では容易に対応できない容量を必要とする。そのような態様において、所望の用量を達成するために、2回以上の注射を使用してよい。特定の態様において、個体の注射部位反応を最小限に抑えるために、用量を2回以上の注射で投与してよい。特定の態様において、用量は、ゆっくりとした点滴（slow infusion）として投与される。
【００３３】
「免疫疾患」とは、免疫システムの任意の障害を指す。免疫疾患は通常、遺伝的成分を有し、自己免疫疾患（免疫システムが「自己」成分に対して誤って作用する）および免疫介在性疾患（免疫システムが過剰な機能を呈する）を含む。
【００３４】
「免疫療法」とは、疾患の治療のために患者の免疫システムを誘導、抑制、または増強する任意の医学的介入を指す。いくつかの態様において、より効果的に病原体を標的および除去または癌もしくは免疫疾患などの疾患を治癒させるために、免疫療法は患者の先天性および／または適応免疫応答（例えば、T細胞）を活性化する。
【００３５】
「腸」および「腸の」とは、口、口腔、食道、胃、大腸、小腸、直腸、および肛門を含む胃腸管を指す。
【００３６】
「オルガノイド」とは、成体（胚後）上皮幹細胞の増殖によって得られる細胞構造を指し、好ましくはLgr5発現によって特徴づけられ、細胞選別および空間的に制限された系統の関わりを通じて自己組織化する組織特異的な細胞型からなる（例えば、Clevers, Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597で説明されているように、特に1590ページ以降の「成体幹細胞に由来するオルガノイド」と呼ばれる節を参照されたい）。本願において、「オルガノイド」という用語は、正常（例えば、非腫瘍）オルガノイドを指すのに使用してよい。オルガノイドが「疾患」オルガノイドとして記載されている場合、これは、例えば通常、疾患の表現型を有する1つまたは複数の上皮幹細胞にオルガノイドが由来しているため、またはいくつかの態様において、オルガノイドが遺伝子組み換えされていて、疾患の表現型の特定の特徴を見せるために、オルガノイドが疾患の表現型を有することを意味する。
【００３７】
「集団」とは、共通の形質を共有する実体のグループを指す。いくつかの態様において、「集団」は、一連の関連する臨床的形質を共有する患者を指す。好ましくは、「集団」は、同一の癌を共有している、および／または同一の作用物質で治療されている、および／または同一の作用物質で成功した治療の影響を受けやすい患者のグループを指してよい。集団は、遺伝子型および／または治療の間の特定の作用物質に対する応答特性を含む、1つまたは複数の特徴において異なってよい。集団は、1つまたは複数の遺伝子型、表現型、または生化学的形質を共有する細胞、オルガノイド、および／または共培養物のグループも指してよい。「亜集団」とは、亜集団の実体も分類される、より大きな集団よりも多い数の共通の形質、または少ない数の似ていない形質を共有する実体のグループを指す。
【００３８】
「安全な」とは、標準的な臨床診療によって副作用を有さないか、または忍容できるレベル内の副作用だけを有する、疾患の治療を指す。
【００３９】
「副作用」または「有害な効果」とは、所望の効果以外の、治療に帰せられる生理学的応答を指す。
【００４０】
「対象」または「患者」または「個体」とは、ヒトまたは任意の非ヒト動物（任意のマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類など）を指してよい。好ましい態様において、患者は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。「ヒト」は、出生前および／または出生後の形態を指してよい。対象は患者であることができ、これは疾患の診断または治療のために医療提供者に提示される人間を指す。「対象」という用語は、本明細書では「個体」または「患者」と互換的に使用される。患者は、疾患もしくは障害に苦しんでいることができ、または疾患もしくは障害の影響を受けやすくあることができるが、疾患もしくは障害の症状を見せてもよいし見せなくてもよい。
【００４１】
「患っている」とは、疾患、障害、および／または病状と診断されているか、または疾患、障害、および／または病状の1つまたは複数の症状を見せる患者を指す。
【００４２】
「影響を受けやすい」とは、疾患、障害、および／または病状と診断されていない患者を指す。いくつかの態様において、疾患、障害、および／または病状の影響を受けやすい患者は、疾患、障害、および／または病状の症状を呈さなくてよい。いくつかの態様において、疾患、障害、病状、または事象の影響を受けやすい患者は、以下の1つまたは複数によって特徴づけられてよい：（1）疾患、障害、および／または病状の発症に関連する遺伝子変異；（2）疾患、障害、および／または病状の発症に関連する遺伝子多型；（3）疾患、障害、および／または病状に関連するタンパク質の増加および／または減少した発現および／または活性；（4）疾患、障害、病状の発生に関連する習慣および／またはライフスタイル、および／または（5）移植を受けたこと、移植を受けるつもりであること、または移植を必要とすること。いくつかの態様において、疾患、障害、および／または病状の影響を受けやすい患者は、疾患、障害、および／または病状を発症する。いくつかの態様において、疾患、障害、および／または病状の影響を受けやすい患者は、疾患、障害、および／または病状を発症しない。
【００４３】
「治療有効量」とは、疾患、障害、および／または病状を患っているか、または疾患、障害、および／または病状の影響を受けやすい対象に投与された場合、疾患、障害、および／または病状の症状を治療、診断、予防、および／または開始を遅延させるのに十分な治療剤の量を指す。治療有効量は通常、少なくとも1単位用量を含む投薬計画を介して投与されることが当業者により理解される。
【００４４】
「治療している」、「治療する」、「治療」とは、特定の疾患、障害、および／または病状の1つまたは複数の症状または特色を部分的または完全に緩和、改良、軽減、阻害、予防、その開始を遅延、その重症度を低減、および／またはその発生率を低減させるのに使用される任意の方法を指す。治療は、疾患に関連する病的状態を発症するリスクを減少させる目的で、疾患の兆候を呈さない、および／または疾患の初期の兆候だけを呈する対象に実施してよい。
【００４５】
「チューモロイド」とは、癌性として分類される1つまたは複数の遺伝的、表現型的、または生化学的形質を呈する細胞を含むオルガノイドを指す。本願において、「チューモロイド」という用語は、癌性組織に由来する「オルガノイド」を包含する。「チューモロイド」という用語は、例えばCas9技術を使用して正常オルガノイドが癌変異を含むように操作されている、操作された腫瘍オルガノイド培養物である腫瘍進行オルガノイド（TPO）も包含してよい。
【００４６】
治療に適切な作用物質の同定
全般。本発明は、オルガノイドおよび免疫細胞の共培養物（「オルガノイド共培養物」）および／または疾患オルガノイド（チューモロイドなど）および免疫細胞の共培養物（「疾患オルガノイド共培養物」またはより具体的には「チューモロイド共培養物」）、ならびに疾患の生理学および／または疾患を治療するための候補作用物質の適合性を調査するためのそれらの使用に関する。疾患を治療するための適合性は、疾患を治療するための有効性および／または疾患を治療するための安全性を含んでよい。特に対象となる疾患には、癌および免疫疾患が含まれる。
【００４７】
したがって、本発明は、何よりも、癌を治療するのに適切な作用物質を同定する方法であって、以下を含む方法を提供する：
チューモロイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、チューモロイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのチューモロイドを含む工程、
癌の治療についての候補作用物質の適合性を示す、チューモロイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程、ならびに
チューモロイド共培養物において1つまたは複数の該変化の有無が検出される場合に、候補作用物質を癌の治療に適切であると同定する工程。
【００４８】
治療剤を試験する方法も提供され、この方法は以下を含む：
オルガノイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、オルガノイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドを含む、工程、
治療有効性を示す、オルガノイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程、ならびに
オルガノイド共培養物において1つまたは複数の該変化の有無が検出される場合に、候補作用物質を治療剤と同定する工程。
【００４９】
いくつかの態様において、オルガノイドは疾患オルガノイド、例えば免疫疾患の表現型を見せるオルガノイドである。本発明の共培養物中に免疫細胞が存在するため、共培養物は、候補免疫療法作用物質の適合性を調査するのに特に適切である。
【００５０】
本発明の方法は、ハイスループット（HTP）能力を有する。いくつかの態様において、本発明の方法は、96ウェルプレートおよび／または384ウェルプレート上で実行することができる。
【００５１】
接触工程。これは、オルガノイド共培養物を既知または未知の治療薬の治療レベルに曝すことを伴ってよい。通常、作用物質は（予測される）治療有効濃度まで溶液に溶解され、共培養物が維持されている容器へ注射（または他の適した投与）によって共培養物に投与される。
【００５２】
検出工程。いくつかの態様において、本発明は、治療についての候補作用物質の適合性を示す、チューモロイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程を含む。
【００５３】
原則として、共培養物におけるいかなる生化学的、遺伝的、表現型的、または現象論的変化を検出してもよい。いくつかの態様において、1つまたは複数の変化は、癌バイオマーカーなどの1つまたは複数の疾患バイオマーカーの中にあってよい。いくつかの態様において、1つまたは複数の変化は、細胞生存率の低減、細胞増殖の低減、細胞死の増加、細胞またはオルガノイドの大きさの変化、細胞運動性の変化、無傷／緻密な上皮細胞層の解離または破壊（すなわち、細胞は緻密な上皮細胞層から解離する）、共培養された免疫細胞によるサイトカインおよび細胞傷害性分子の生産の変化、ならびに1つまたは複数の遺伝子の発現の変化を含んでよい。
【００５４】
原則として、検出は、当業者に公知の任意の適切な実験室的方法を使用して実行してよい。いくつかの態様において、1つまたは複数の変化の検出は、細胞増殖アッセイ、生存率アッセイ、フローサイトメトリー解析、IFN-γ（インターフェロンガンマ）についてのELISA（例えば、図8Dで実行されているように）、遺伝子発現の解析、および／または細胞イメージングを含み得る。
【００５５】
細胞生存率の低減は、CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay kit（Promega）、活性型カスパーゼ3の細胞内フローサイトメトリー染色（BD）、または死細胞の陽性染色によって検出してよい。死細胞の陽性株（positive strain）には、NucRed Dead 647 ReadyProbなどの非細胞膜透過性DNA染色が含まれる。
【００５６】
細胞死の増加は、明視野イメージングによって検出してよい。
【００５７】
同定工程。同定は、特定の大きさの変化を同定することを含んでよく、自動化されたおよび／または高スループットの過程であってよい。
【００５８】
比較工程。いくつかの態様において、本発明は、オルガノイド共培養物またはチューモロイド共培養物を対照と比較する工程を含むことができ、これは、同定工程と関連してもしなくてもよい。これは、チューモロイド共培養物の1つまたは複数の変化の有無または大きさと参照オルガノイドまたは参照チューモロイドとの比較を伴うことができ、以下をさらに含んでよい：
参照オルガノイドまたは参照チューモロイド共培養物を1つまたは複数の候補作用物質と接触させる工程であって、参照オルガノイドまたは参照チューモロイド共培養物が免疫細胞および少なくとも1つのオルガノイドを含む、工程、ならびに
癌の治療についての候補作用物質の適合性を示す、参照オルガノイドまたは参照チューモロイド共培養物における1つまたは複数の変化の有無を検出する工程。
【００５９】
いくつかの態様において、変化の有無がチューモロイド共培養物で検出されるが参照共培養物では検出されない場合、候補作用物質は適切な作用物質として同定される。
【００６０】
いくつかの態様において、参照オルガノイド共培養物または参照チューモロイド共培養物は、陰性対照または陽性対照などの対照として使用される。
【００６１】
選択工程。いくつかの態様において、本発明の方法は、癌を治療するのに適切な候補作用物質を選択する工程を含む。選択は、提供された方法の1つまたは複数の変化の有無または大きさを考慮した検討を伴ってよいため、選択は同定とはっきり異なる。例えば、選択は、作用物質のバイオアベイラビリティ、患者の亜集団への適用性、または作用物質の送達機構などの追加の検討を含んでよく、これらは本方法において試験されてもされなくてもよい。
【００６２】
いくつかの態様において、この工程は、本発明の方法の最終工程であってよい。他の態様において、さらなる工程が想定される。例えば、本発明の方法は、選択された候補作用物質を治療において使用する工程をさらに含んでよい。
【００６３】
作用物質。本発明の方法によって任意の作用物質を試験してよい。これには、任意の生物学的、化学的、物理的、もしくはその他の作用物質、または同時もしくは順番に投与される複数の作用物質が含まれる。
【００６４】
癌治療の適合性について試験を受けている作用物質（または「候補作用物質」）は、次の治療薬クラスの1つまたは複数から選択できる：免疫治療薬、腫瘍特異的ペプチド、チェックポイント阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、代謝アゴニスト、代謝アンタゴニスト、植物アルカロイド、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、放射線治療薬、化学治療薬、抗体、光増感剤、移植幹細胞、ワクチン、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、チロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、挿入剤、標的療法剤、低分子薬物、ホルモン、ステロイド、細胞治療薬、ウイルスベクター、および核酸治療薬。
【００６５】
好ましくは、作用物質は腫瘍特異的ペプチド、チェックポイント阻害剤、または免疫治療薬である。
【００６６】
作用物質は、より好ましくは免疫治療薬、例えばキメラ抗原受容体（CAR）-T細胞治療薬、治療的TCRトランスジェニックT細胞、または新生抗原である。他の作用物質には、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）または抗体依存性細胞貪食（ADCP）に関連する作用物質が含まれる。
【００６７】
状況。主張される発明の方法は、インビボ、エクスビボ、インビトロ、インサイチュ、エクスサイチュ、またはそれらの任意の組み合わせで実行されてよい。好ましくは、本方法はインビトロで実行される。
【００６８】
オーダーメイド医療
全般。異なる計画を試験する1つの手段は、試験への「オーダーメイド医療」アプローチとして説明できる。オーダーメイド医療アプローチは、治療について既知の適合性を有する1つまたは複数の候補作用物質を試験すること、および／または特定の患者において1つまたは複数の候補作用物質を適切な作用物質として同定することを伴い得る。
【００６９】
本発明のオーダーメイド医療の適用は、チューモロイド共培養物および参照オルガノイド共培養物もしくは参照チューモロイド共培養物の両方が、癌を治療するための候補作用物質の適合性が同定されている特定の患者に由来することを必要としてよい。
【００７０】
本発明者らは、単一の患者の単一の組織から免疫細胞、正常（例えば、非腫瘍）上皮細胞、および腫瘍上皮細胞を導出し、これらの細胞からオルガノイド-免疫細胞共培養物およびチューモロイド-免疫細胞共培養物が得られることを示した。これらの共培養物は、候補作用物質に対する個々の患者の反応を試験するための特に有用なモデルを提供する。
【００７１】
癌の治療について候補作用物質が適切であると同定されている患者は、引き続いて、そのように同定された候補作用物質で治療されてよい。
【００７２】
スクリーニング
全般。異なる計画を試験する別の手段は、試験への「スクリーニング」アプローチとして説明できる。スクリーニングアプローチは、治療について未知の適合性を有する1つまたは複数の候補作用物質を試験すること、および／または治療について1つまたは複数の候補作用物質のサブセットを適切な作用物質として同定することを伴い得る。
【００７３】
本発明のスクリーニングの適用は、1つまたは複数の候補作用物質が、第1の癌の治療について既知の適合性を有し、かつ第2の癌の治療について未知の適合性を有し、スクリーニングが1つまたは複数の候補作用物質のサブセットを第2の癌の治療について適切な作用物質として同定することを含む必要があってよい。
【００７４】
いくつかの態様において、スクリーニングアプローチは、亜集団のレベルではなく、「集団」レベルで癌を治療するのに適切な作用物質を同定する。他の態様において、スクリーニングアプローチは、亜集団のレベルで癌を治療するのに適切な作用物質を同定する。いくつかの態様において、スクリーニングアプローチは、個々の患者のレベルで癌を治療するのに適切な作用物質を同定するためには使用されない（これは通常、オーダーメイド医療アプローチに包含される）。
【００７５】
細胞型および疾患
種。本発明のまたは本発明の方法での使用に適切な細胞、癌、オルガノイド、および／または共培養物は、主に任意の多細胞生物、好ましくは癌の影響を受けやすい多細胞生物であってよい。いくつかの態様において、本発明の細胞、癌、オルガノイド、および／または共培養物は、マウス、霊長類、もしくはヒトの細胞、癌、オルガノイド、および／または共培養物などの哺乳動物（哺乳動物に由来することを意味する）である。好ましい態様において、本発明の細胞、癌、オルガノイド、および／または共培養物は、ヒトである（ヒトに由来することを意味する）。
【００７６】
上皮細胞。本発明のオルガノイドおよび／またはオルガノイド共培養物は、上皮細胞から得られる。オルガノイドおよび／またはオルガノイド共培養物は、正常（すなわち、非疾患）上皮細胞または疾患上皮細胞（ときどき「疾患オルガノイド」または「疾患共培養物」と具体的に呼ばれる）から得てよい。本発明のチューモロイドおよび／またはチューモロイド共培養物は、腫瘍上皮細胞から得られる。オルガノイドまたはチューモロイドを産生できる任意の上皮細胞は、本発明での使用に適切である。好ましい腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞には、肺細胞、肝細胞、乳房細胞、皮膚細胞、腸細胞、陰窩細胞、直腸細胞、膵臓細胞、内分泌細胞、外分泌細胞、管細胞、腎細胞、副腎細胞、甲状腺細胞、下垂体細胞、副甲状腺細胞、前立腺細胞、胃細胞、食道細胞、卵巣細胞、卵管細胞、および膣細胞が含まれる。特に好ましい上皮細胞は、腸細胞、例えば結腸直腸細胞である。上皮細胞は、好ましくはLgr5発現によって特徴づけられる上皮幹細胞であってよい。
【００７７】
いくつかの態様において、腫瘍上皮細胞および／または正常上皮細胞は、癌患者からの試料から得られる。特定の態様において、腫瘍上皮細胞および正常上皮細胞は、同一の癌患者からの試料から、任意で同一の試料から得られる。上皮細胞を得るための適切な試料には、結腸直腸癌または卵巣癌患者からの腹水；腎臓癌患者からの尿；または結腸直腸癌患者の切除された結腸および／または直腸からの組織生検などの組織生検が含まれる。
【００７８】
免疫細胞。共培養物に組み込むことができる任意の免疫細胞は、本発明の方法での使用に適切である。好ましい免疫細胞には、上皮内リンパ球（IEL）、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、末梢血単核細胞（PBMC）、末梢血リンパ球（PBL）、T細胞、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）、B細胞、NK細胞、単核食細胞、α/β受容体T細胞、およびγ/δ受容体T細胞からなる群より選択される1つまたは複数の細胞型が含まれる。好ましい免疫細胞には、骨髄由来のサプレッサー細胞も含まれる。
【００７９】
免疫細胞は、当技術分野において利用可能な確立された細胞株から（例えば、ATCCまたは細胞株の類似したライブラリーから）得てよい。あるいは、免疫細胞は、対象からの不純な試料から精製されてもよい。共培養物においてチューモロイドを導出するための腫瘍上皮細胞と同一の患者から免疫細胞を得ると、結果として得られる共培養物が、これによりその細胞が由来する患者の最も代表（およびそのために最も忠実なモデル）であるため、関連する利点がある。これは、オーダーメイド医療という観点で特に有用である。
【００８０】
免疫細胞を得てもよい不純な免疫試料には、腫瘍試料、正常（非腫瘍）結腸組織、および／または末梢血が含まれてよい。いくつかの態様において、免疫細胞は、癌患者からの試料から得られる。いくつかの態様において、免疫細胞は、末梢血試料および／または組織生検から得られる。例えば、末梢血リンパ球（PBL）および／またはT細胞は末梢血試料から得てよく；または、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）および／または上皮内リンパ球（IEL）は、それぞれ腫瘍または健常組織生検から得られる。
【００８１】
本発明の方法での使用に適切な免疫細胞は、チューモロイドおよび／またはオルガノイドと同種異系であってよい。いくつかの態様において、免疫細胞はチューモロイドおよび／またはオルガノイドとHLA適合しており、すなわち、免疫細胞はチューモロイドおよび／またはオルガノイドが由来する患者と抗原的に適合してよい（Shiina et al., (2016). MHC Genotyping in Human and Nonhuman Species by PCRbased Next-Generation Sequencing, Next Generation Sequencing - Advances, Applications and Challenges, Dr. Jerzy Kulski (Ed.), InTech, DOI: 10.5772/61842）（Choo, Yonsei Med J. 2007 Feb 28;48(1):11-23）。
【００８２】
T細胞操作。本発明の重要な局面は、キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞（Sadelain et al., Nature. 2017 May 24;545(7655):423-431）などの操作されたT細胞の使用である。本発明は、異なる腫瘍表現型および腫瘍微小環境についての異なるCAR-T細胞型の適合性を試験するのに使用できる方法および共培養物を提供する。本発明は、既存の方法と比較して拡張可能性が改善され、費用が低減された、CAR-T細胞の選択および性能増大の過程を効率化する有利な手段である。特に、本発明は、γδT細胞−多様な組織起源を有する広範囲の腫瘍に対して強力な抗腫瘍反応性を有する従来型ではないT細胞（Sebestyen et al., Cell Rep. 2016 May 31;15(9):1973-85）との使用に非常に適切である。したがって、いくつかの態様において、共培養物中の免疫細胞は、CAR-T細胞などの操作されたT細胞である。
【００８３】
オルガノイドおよびチューモロイド。オルガノイドは、オルガノイド培養培地中で正常上皮細胞を培養することにより調製してよい。チューモロイドは、チューモロイド培養培地中で腫瘍上皮細胞を培養することにより調製してよい。正常上皮細胞は、腫瘍上皮細胞と自家性であってよい（すなわち、同一の患者から）。本発明のオルガノイド／チューモロイドは、Lgr5発現によって特徴づけられてよい。いくつかの態様において、オルガノイド／チューモロイドは三次元細胞構造である。いくつかの態様において、オルガノイド／チューモロイドは、上皮細胞に取り囲まれた内腔を含む。いくつかの態様において、内腔を取り囲む上皮細胞は分極している。チューモロイドでは、分極は破壊されてよい。オルガノイド／チューモロイドが得られる上皮細胞は、好ましくは初代上皮細胞である。
【００８４】
癌型。本発明の方法は、任意の癌に適用可能である。いくつかの態様において、癌は、腺腫、腺腫性ポリープ、腎癌、副腎腺腫、甲状腺腺腫、下垂体腺腫、副甲状腺腺腫、肝細胞腺腫、線維腺腫、嚢胞腺腫、気管支腺腫、皮脂腺腫、前立腺腺腫、腺癌、胆管癌、扁平上皮癌、腺管癌、小葉癌、癌腫、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、紡錘細胞癌、肉腫様癌、多形性癌、癌肉腫、基底細胞癌、VIPoma、形成性胃線維炎（linitis plastic）、アデノイド嚢胞性癌、腎細胞癌、粘表皮癌、大腸癌、小腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃腸癌、食道癌、直腸癌、膣癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、小細胞肺癌、非小肺癌、乳癌、および黒色腫の1つまたは複数であってよい。
【００８５】
本発明の方法が特に適用可能な癌には、胃腸癌または結腸直腸癌などの上皮癌、膵臓癌、および乳癌が含まれる。
【００８６】
癌の病期。本発明は、任意の進行段階の癌に適用可能である。癌の進行は数種類のシステムにおいて特徴づけられてよい。TNM（腫瘍、結節、転移）システムは3つの範疇で構成され、各々に数値の度合いが割り当てられている。Tは、癌の大きさおよび癌が近くの組織にどこまで広がっているかを指す−これは1、2、3、または4であることができ、1が小さく、4が大きい。Nは、癌がリンパ節に広がっているかどうかを指す−これは0（癌細胞を含むリンパ節なし）と3（癌細胞を含む多数のリンパ節）との間であり得る。Mは、癌が体の別の部分に広がっているかどうかを指す−これは0（癌が広がっていない）または1（癌が広がっている）のいずれかであり得る。2番目のシステムは数値ステージングシステム（Numerical Staging System）であり、4つのステージで構成される。ステージ1は通例、癌が比較的小さく、それが出発した器官内に含まれていることを意味する。ステージ2は通例、癌が取り囲む組織へ広がり始めていないが、腫瘍がステージ1よりも大きいことを意味する。ときどき、ステージ2は癌細胞が腫瘍の近くのリンパ節へ広がっていることを意味する。これは、特定の癌型による。ステージ3は通例、癌がより大きいことを意味する。取り囲む組織へ広がり始めているかもしれず、その領域のリンパ節に癌細胞が存在する。ステージ4は、癌が出発した場所から体の別の器官に広がっていることを意味する。これは、二次癌または転移性癌とも呼ばれる。グレーディングシステム（Grading System）は、癌の進行の程度を特徴づける3番目のシステムである。グレードIでは、正常細胞に似ており、急速に成長していない癌細胞。グレードIIでは、正常細胞のようには見えず、正常細胞よりも速く成長する癌細胞。グレードIIIでは、異常に見え、より積極的に成長または広がるかもしれない癌細胞。
【００８７】
転移が存在しない場合は、しばしば外科的切除で十分なため、免疫療法などの本発明の方法で試験される特定の作用物質は、結腸直腸癌などの癌の後期（転移）段階により適切である。したがって、本発明は、ステージIII、グレードIII、もしくはT2 N1 M1の1つまたはそれより下の癌に適用可能である。
【００８８】
外科的に切除するのがより容易ではない他の癌については、より初期段階で免疫療法も適切であり得る。さらに、腫瘍進行オルガノイド（TPO）に対する本発明の使用は、より早い段階における癌の治療の調査も可能にする。したがって、本発明は、ステージII、グレードII、もしくはT2 N1 M0の1つまたはそれより下の癌に適用可能である。
【００８９】
免疫疾患。癌に加えて、免疫細胞の疾患も本発明の方法を使用して調査されてよい。原則として、免疫細胞に影響を与える免疫システムの任意の障害は、共培養において調査してよい。好ましい免疫疾患には、消化器および呼吸器システム、特に腸および肺の免疫疾患が含まれる。例示的な免疫疾患には、過敏性腸疾患（IBD）、潰瘍性大腸炎（UC）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および喘息が含まれる。
【００９０】
本発明の方法を使用して免疫障害を試験する場合、オルガノイドは、罹患した免疫細胞および健常対照患者からの免疫細胞とともに別々に培養してよい。
【００９１】
生検および試料調達。オルガノイドおよび／またはチューモロイド試料は正常粘膜および腫瘍組織から手術の間に得られてよく、例えば、結腸直腸癌患者および／または健常対照患者の切除された結腸、直腸、小腸、および／または回腸から採取されてよい。免疫細胞は、手術の間に採取された末梢血に由来してよい。
【００９２】
オルガノイド、チューモロイド、および共培養物
チューモロイド共培養物の調製。一つの局面において、本発明は、チューモロイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法を提供する。本方法は、インビトロ培養において、本明細書に記載されるチューモロイドを免疫細胞と混合する工程を含む。混合は、マルチウェルプレート内の同一のウェルにT細胞およびオルガノイドを連続的に層状化することを含んでよく、またはゲルへT細胞およびオルガノイドを連続的にピペッティングすることを含んでよい。好ましい態様において、チューモロイド共培養物は、本明細書に記載される共培養培地中に維持される。
【００９３】
いくつかの態様において、チューモロイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法は、以下の調製工程の1つまたは複数をさらに含む：
チューモロイド培養培地において腫瘍上皮細胞を培養することにより、少なくとも1つのチューモロイドを調製する工程；および／または
免疫細胞増殖培地において免疫細胞を培養することにより免疫細胞を調製する工程。
【００９４】
好ましい態様において、少なくとも1つのチューモロイドを免疫細胞と混合する前に、少なくとも1つのチューモロイドからチューモロイド培養培地（任意で、任意の細胞外マトリックスを含む）は除去される。Cell Recovery Solution（商標）（Corning）などの市販のキットを使用して、細胞外マトリックスを破壊してよい。除去されたマトリックスの代わりに、コラーゲンなどの代替マトリックスを使用してよい。
【００９５】
いくつかの態様において、本方法は、不純な免疫試料から免疫細胞を得る工程をさらに含む。不純な免疫試料から免疫細胞を単離する方法は、当技術分野において公知である。単一細胞懸濁液およびT細胞増殖培養物からリンパ球を単離するための例示的な方法は、実施例5に記載されている。
【００９６】
本発明は、上記の方法により得られたチューモロイド-免疫細胞共培養物を提供する。本発明は、薬物スクリーニング、毒性スクリーニング、学術研究、および薬物開発におけるチューモロイド-免疫細胞共培養物の使用も提供する。
【００９７】
チューモロイド共培養物は、エクスサイチュ、エクスビボ、および／またはインビトロであってよい。好ましくはインビトロである。
【００９８】
オルガノイド共培養物の調製。一つの局面において、本発明は、オルガノイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法を提供する。本方法は、インビトロ培養において、本明細書に記載されるオルガノイドを免疫細胞と混合する工程を含む。好ましい態様において、オルガノイド共培養物は、本明細書に記載される共培養培地中に維持される。
【００９９】
いくつかの態様において、オルガノイド-免疫細胞共培養物を調製するための方法は、以下の工程の1つまたは複数を含む：
オルガノイド培養培地において正常上皮細胞を培養することにより、少なくとも1つのオルガノイドを調製する工程；および／または
免疫細胞増殖培地において免疫細胞を培養する工程。
【０１００】
好ましい態様において、少なくとも1つのオルガノイドを免疫細胞と混合する前に、少なくとも1つのオルガノイドからオルガノイド培養培地（任意で、基底膜マトリックス「BME」またはMatrigelなどの任意の細胞外マトリックスを含む）は除去される。Cell Recovery Solution（商標）（Corning）などの市販のキットを使用して、細胞外マトリックスを破壊してよい。除去されたマトリックスの代わりに、コラーゲンなどの代替マトリックスを使用してよい。
【０１０１】
いくつかの態様において、本方法は、不純な免疫試料から免疫細胞を得る工程をさらに含む。不純な免疫試料から免疫細胞を単離する方法は、当技術分野において公知である。単一細胞懸濁液およびT細胞増殖培養物からリンパ球を単離するための例示的な方法は、実施例5に記載されている。
【０１０２】
本発明は、上記の方法により得られたオルガノイド-免疫細胞共培養物も提供する。本発明は、薬物スクリーニング、毒性スクリーニング、学術研究、および薬物開発におけるオルガノイド-免疫細胞共培養物の使用も提供する。
【０１０３】
オルガノイド共培養物は、エクスサイチュ、エクスビボ、および／またはインビトロであってよい。好ましくはインビトロである。
【０１０４】
一次解析。いくつかの態様において、本発明の方法は、一次解析の1つまたは複数の工程をさらに含む。チューモロイドおよび／またはオルガノイドの一次解析は、全ゲノム配列決定、mRNA配列決定、ペプチドームプロファイリング、および／または顕微鏡検査を含んでよい。一次解析は、情報開示および／または情報検証の形で、チューモロイドおよび／またはオルガノイドが均一であることおよび／または期待に応えていることを保証するのに使用できる。例えば、オルガノイドとチューモロイドとの間のmRNA転写の相違、およびmRNA転写におけるこれらの相違がタンパク質発現の相違に反映されているかどうかを決定するのに一次解析を使用できる。オルガノイド／チューモロイド上の特定の抗原の存在、および任意の新しい抗原がチューモロイド上だけで発生するかどうかも確認してよい。腫瘍細胞による腫瘍微小環境における免疫抑制因子の上方制御も調査してよい。
【０１０５】
免疫細胞は、一次解析の1つまたは複数の工程に供されてよい。例えば、免疫細胞の一次解析は、免疫表現型分類および／またはT細胞受容体配列決定を含んでよい。CAR-T細胞が腫瘍細胞を認識するために必要な受容体を発現していることを確認するのに一次解析を使用できる。腫瘍を認識する特定の受容体の上方制御も調査してよい。
【０１０６】
特定の態様において、本発明の方法は、細胞、オルガノイド、またはチューモロイドのHLA型を決定する工程を含む。
【０１０７】
共培養物は、1つまたは複数の工程の一次解析に供されてもよい。チューモロイド共培養物および／またはオルガノイド共培養物の一次解析は、イメージング解析、フローサイトメトリー解析、および／またはサイトカイン分泌解析を含んでよい。共培養物が均一であることおよび／または期待に応えていることを保証するのに一次解析を使用できる。
【０１０８】
チューモロイドおよびオルガノイドの供給源。本発明のチューモロイドおよび／またはオルガノイドは、自家細胞、すなわち同一の患者から得られた細胞を含むか、またはそれからなってもよい。例えば、チューモロイドは腫瘍細胞（例えば、結腸直腸癌細胞）を培養することによって得られてよい一方で、オルガノイドは同一の患者における同一の組織からの正常（非腫瘍）細胞（例えば、正常結腸細胞）を培養することによって得られてよい。これは、参照オルガノイドという観点で特に有用であり得る。
【０１０９】
本発明は、IL-2、IL-7、またはIL-15などのインターロイキンを含む培地中のチューモロイドおよび／またはオルガノイドも提供する。いくつかの態様において、少なくとも1つのチューモロイドまたは少なくとも1つのオルガノイドは、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を含むか、またはそれからなる。
【０１１０】
チューモロイドおよびオルガノイドの分離。いくつかの態様において、チューモロイドおよび／またはオルガノイドは、免疫細胞と混合する前に、1つまたは複数の遺伝子型、表現型、および／またはエピジェネティックマーカーを共有する集団へ分離される。好ましくは、遺伝子型、表現型、および／またはエピジェネティックマーカーは、（i）チューモロイドおよび／またはオルガノイドと（ii）免疫細胞との間の相互作用に寄与する。
【０１１１】
チューモロイドまたはオルガノイドから分離された集団は、HLAハプロタイプ、例えばHLA-A2のようなHLAハプロタイプの有無を共有してよい。
【０１１２】
この分離工程により、関連する患者グループおよびサブグループを決定することが可能になってよい。
【０１１３】
培地
免疫細胞培養培地。免疫細胞培養培地は、例えば共培養に適切な集団を生産するために、免疫細胞の成長および分裂（増殖）および／または分化を促進することによって、共培養のための免疫細胞を調製するのに使用してよい。
【０１１４】
好ましい態様において、免疫細胞培養培地はインターロイキンを含む。いくつかの態様において、インターロイキンは、IL-2、IL-7、およびIL-15から選択される。好ましい態様において、免疫細胞培養培地中のインターロイキンはIL-2である。
【０１１５】
いくつかの態様において、インターロイキン2000〜6000 IU/mLの濃度。免疫細胞培養培地中のIL-2の好ましい濃度は50 μMである。
【０１１６】
免疫細胞培養培地は、任意でペニシリン／ストレプトマイシンおよび／またはhepesおよび／またはglutaMAX（商標）および／またはピルビン酸ナトリウムおよび／または血清（例えば、5％ ヒトAB血清、Sigma-Aldrich）を補充したRPMI培地（例えば、RPMI 1640、Gibco）をさらに含んでよい。原則として、DMEM/12などのRPMI培地の代わりに、任意の哺乳動物細胞培養基本培地を使用してよい。
【０１１７】
オルガノイドおよびチューモロイド培地。チューモロイド培養培地およびオルガノイド培養培地は、例えば共培養に適切なチューモロイドおよび／またはオルガノイドを生産するために、成長、分裂（増殖）、構造組織化、または他の発生を促進することによって、共培養のためのオルガノイドおよびチューモロイドを調製するのに使用してよい。
【０１１８】
異なる組織について適切なチューモロイド培養培地およびオルガノイド培養培地が当技術分野において公知である（例えば、Clevers, Cell. 2016 Jun 16;165(7):1586-1597）。好ましいオルガノイド／チューモロイド培養培地は、Wntアゴニスト（例えば、R-スポンジン1〜4のいずれか1つ）、分裂促進成長因子（例えば、EGF、FGF、HGF、およびBDNFから選択される）、およびBMP阻害剤（例えば、ノギン）を含む（例えば、WO2010/090513に記載されるように）。いくつかの態様において、オルガノイド／チューモロイド培養培地は、TGF-ベータ阻害剤（例えば、A83-01、Tocris）をさらに含む（例えば、WO2012/168930に記載されるように）。TGF-ベータ阻害剤の添加は、ヒト細胞の培養に特に適切である。TGF-ベータ阻害剤は、好ましくはALK4/5/7シグナル伝達経路を阻害する。
【０１１９】
いくつかの態様において、特定の腫瘍細胞が経路（Wnt経路など）を構成的に活性化または不活性化する変異を含み、したがってこれらの経路を調節するように設計された外因性因子の必要性を除去するため、チューモロイド培養培地については特定の培養培地成分が任意である。したがって、例えば、いくつかの態様において、チューモロイド培養培地は、Wntアゴニストを含まない。
【０１２０】
結腸オルガノイドの培養に特に適切な好ましいオルガノイド培養培地は、基本培地（Advanced DMEM/F12培地、Gibcoなど）、Wntリガンド（Wnt-3aなど）、Wntアゴニスト（Rスポンジン 1〜4のいずれか1つなど）、BMP阻害剤（ノギンなど）、EGF、およびTGF-β阻害剤（A83-01、Tocrisなど）の1つまたは複数（または好ましくはすべて）を含み、任意でp38 MAPK阻害剤、ガストリン、ニコチンアミド、プロスタグランジンE、N-アセチルシステイン、B27、および／または抗菌剤（プリモシンなど）の1つまたは複数（またはすべて）をさらに含む。
【０１２１】
結腸癌チューモロイドの培養に特に適切な好ましいチューモロイド培養培地は、基本培地（Advanced DMEM/F12培地、Gibcoなど）、Wntアゴニスト（Rスポンジン 1〜4のいずれか1つなど）、BMP阻害剤（ノギンなど）、EGF、およびTGF-β阻害剤（A83-01、Tocrisなど）の1つまたは複数（または好ましくはすべて）を含み、任意でp38 MAPK阻害剤、ガストリン、ニコチンアミド、プロスタグランジンE、N-アセチルシステイン、B27、および／または抗菌剤（プリモシンなど）の1つまたは複数（またはすべて）をさらに含む。チューモロイド培養培地は、任意でWntリガンド（Wnt-3aなど）を含んでよく、これは免疫療法に対して最も感受性の高い結腸直腸腫瘍（例えば、普通はWnt経路の変異を欠落するMSI腫瘍）について特に有用である。
【０１２２】
いくつかの態様において、チューモロイドまたはオルガノイドは、免疫細胞増殖培地、または免疫細胞増殖培地および好ましいチューモロイドもしくはオルガノイド培養培地の混合物中で培養される。
【０１２３】
当業者は、他の種類のオルガノイドおよびチューモロイドに特異的な培養培地を知っており、それに応じて他のオルガノイドおよびチューモロイドとともに使用するために本発明を適応させることができる。
【０１２４】
共培養培地。本発明は、チューモロイドおよび免疫細胞の共培養のための、（例えば、実施例に記載されるような）培地を提供する。本発明は、オルガノイドおよび免疫細胞の共培養のための、（例えば、実施例に記載されるような）培地も提供する。上記の免疫細胞培養培地またはチューモロイド／オルガノイド培養培地のいずれかを、免疫細胞-オルガノイド／チューモロイド共培養物を培養するための共培養培地として使用してよい。
【０１２５】
本発明の共培養培地は、免疫細胞およびオルガノイド／チューモロイドの共培養を有利に可能にする。チューモロイドの場合、そのような共培養は、本発明の共培養培地で採用される培地適応を使用しないと困難であるか、不可能でさえある。本発明者らは、チューモロイドと免疫細胞との間の共培養のための培地が、免疫細胞機能を守るために、（オルガノイド培養培地と比較して）低減されたWnt成分から恩恵を受けることを初めて観察した。これは、100％免疫細胞培養培地中、または免疫細胞培養培地とオルガノイド／チューモロイド培養培地との間の混合物中で共培養を実行することにより達成できる。オルガノイド共培養については、低減されたWnt成分はそれほど有益ではないが、同一の培地をオルガノイドおよび免疫細胞の共培養に使用できる。
【０１２６】
したがって、いくつかの態様において、共培養培地は、部分的に免疫細胞培養培地（例えば、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％）および部分的にオルガノイド／チューモロイド細胞培養培地（例えば、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％）を含む。例えば、好ましい態様において、共培養培地は、約50％の免疫細胞培養培地および約50％のチューモロイド／オルガノイド培養培地を含む。いくつかの態様において、チューモロイド培養培地は、免疫細胞培養培地とオルガノイド／チューモロイド培養培地との間の混合物において使用する前に、Wnt成分が枯渇している。
【０１２７】
いくつかの態様において、免疫細胞培養培地（T細胞培地など、例えば、RPMI 1640（Gibco））は、共培養培地のために使用される。この培養培地は、共培養における免疫細胞、特にヒト免疫細胞の維持を支持するのに特に有用である。いくつかの態様において、共培養培地の少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％は免疫細胞培養培地からなる。
【０１２８】
細胞外マトリックス。細胞は、好ましくは、細胞が天然に存在する細胞ニッチを少なくとも部分的に模倣する微小環境で培養される。細胞ニッチは、細胞によって、およびニッチ内の細胞によって分泌される細胞外マトリックス（ECM）によって部分的に決定される。細胞ニッチは、インテグリンなどの細胞膜タンパク質との相互作用をもたらす生体材料または合成材料の存在下で細胞を培養することにより模倣してよい。したがって、本明細書に記載される細胞外マトリックスは、例えばインテグリンなどの細胞膜タンパク質と相互作用することによってインビボの細胞ニッチを模倣する、任意の生体材料もしくは合成材料またはそれらの組み合わせである。任意の適切な細胞外マトリックスを使用してよい。
【０１２９】
本発明の好ましい方法では、細胞は、ECMと接触して培養される。「接触して」は、物理的または機械的または化学的接触を意味し、これは、結果として得られるオルガノイドまたは上皮細胞集団を細胞外マトリックスから分離するために力を使用する必要があることを意味する。いくつかの態様において、ECMは三次元マトリックスである。いくつかの態様において、細胞はECMに埋め込まれている。いくつかの態様において、細胞はECMに付着している。本発明の培養培地は、三次元ECMへ拡散してよい。
【０１３０】
別の態様において、ECMは懸濁状態にあり、すなわち、細胞は懸濁システム中でECMと接触している。いくつかの態様において、ECMは、少なくとも1％、少なくとも2％、または少なくとも3％の濃度で懸濁液中にある。いくつかの態様において、ECMは、1％〜約10％または1％〜約5％の濃度で懸濁液中にある。懸濁法は、高級法（upscale method）について利点を有するかもしれない。
【０１３１】
ECMの1つの種類は、上皮細胞、内皮細胞、壁側内胚葉様細胞（例えば、Hayashi et al. (2004) Matrix Biology 23:47 62に記載されているEnglebreth Holm Swarm Parietal Endoderm Like細胞）、および結合組織細胞によって分泌される。このECMは、様々な多糖類、水、エラスチン、および糖タンパク質で構成され、糖タンパク質には、コラーゲン、エンタクチン（ニドゲン）、フィブロネクチン、およびラミニンが含まれる。したがって、いくつかの態様において、本発明の方法で使用するためのECMは、リスト：多糖類、エラスチン、および糖タンパク質、例えば糖タンパク質は、コラーゲン、エンタクチン（ニドゲン）、フィブロネクチン、および／またはラミニンを含む、から選択される1つまたは複数の成分を含む。例えば、いくつかの態様において、コラーゲンがECMとして使用される。異なる種類の糖タンパク質および／または糖タンパク質の異なる組み合わせを含む、異なる組成物を含む異なる種類のECMが公知である。
【０１３２】
市販の細胞外マトリックスの例には：細胞外マトリックスタンパク質（Invitrogen）およびEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞からの基底膜調製物（例えば、Cultrex（登録商標） Basement Membrane Extract（Trevigen, Inc.）またはMatrigelTM（BD Biosciences））が含まれる。
【０１３３】
いくつかの態様において、ECMは、MatrigelTM（BD Biosciences）などのラミニン含有ECMである。いくつかの態様において、ECMはMatrigelTM（BD Biosciences）であり、これはラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンIVを含む。いくつかの態様において、ECMは、ラミニン、エンタクチン、コラーゲンIV、およびヘパリン硫酸プロテオグリカン（例えば、Cultrex（登録商標） Basement Membrane Extract Type 2（Trevigen, Inc.））を含む。いくつかの態様において、ECMは、コラーゲンおよび／またはラミニンなどの少なくとも1つの糖タンパク質を含む。所望であれば、天然で生産されたまたは合成のECM材料の混合物を使用してよい。いくつかの態様において、ECMはBME（「基底膜抽出物」）であり、これはEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）腫瘍(例えば、Cultrex（登録商標） BME)から精製された基底膜の可溶形態である。
【０１３４】
別の態様において、ECMは合成ECMであってよい。例えば、ProNectin（Sigma Z378666）などの合成ECMを使用してよい。さらなる例において、ECMはプラスチック、例えばポリエステル、またはヒドロゲルであってよい。いくつかの態様において、合成マトリックスは、生体材料、例えばコラーゲンまたはラミニンなどの1つまたは複数の糖タンパク質でコーティングされてよい。
【０１３５】
三次元ECMは、三次元上皮オルガノイドの培養を支持する。細胞外マトリックス材料は、普通は細胞が懸濁されているディッシュの底上の一滴である。通常、マトリックスが37℃で凝固したら、培地を添加してECMへ拡散させる。培地中の細胞は、その表面構造との相互作用、例えばインテグリンとの相互作用によってECMに張り付く。
【０１３６】
培養培地および／または細胞は、ECM上に配置され、ECM中に埋め込まれ、またはECMと混合されてよい。
【０１３７】
チューモロイド／オルガノイドを培養するための好ましいECMには、BMEおよびMatrigelが含まれる。
【０１３８】
共培養物を培養するための好ましいECMは、ラット尾コラーゲンIなどのコラーゲンである。ラット尾コラーゲンIは、共培養の間に免疫細胞の運動性を改善することが示されている−実施例11を参照されたい。コラーゲンは、共培養物の少なくとも5％、少なくとも6％、少なくとも7％、少なくとも8％、少なくとも9％、または少なくとも10％（v/v）を構成してよい。
【０１３９】
インターロイキン。共培養培地はインターロイキン（IL）を含んでよく、任意でインターロイキンまたはIL-2（100〜200 IU/mLの濃度）、IL-7（10〜100 ng/mL）、およびIL-15（10〜100 ng/mLの濃度）の1つまたは複数。共培養培地で使用される好ましいインターロイキン濃度は25 μMである。共培養のためのこれらの濃度は、増殖で使用されるより高いIL濃度と対照的である（例えば、免疫細胞増殖のためにIL-2は2000〜6000 IU/mLの濃度で使用される）。
【０１４０】
IL-2は、腫瘍関連免疫細胞とともに使用するための好ましいインターロイキンである。他の免疫細胞、または過敏性腸症候群（IBD）もしくは潰瘍性大腸炎（UC）などの免疫疾患については、IL-7および／またはIL-15が好ましい（Rabinowitz et al., Gastroenterology. 2013 Mar;144(3):601-612.e1）。
【０１４１】
いくつかの態様において、チューモロイド共培養培地および／またはオルガノイド共培養培地は、（a）免疫細胞増殖培地および（b）チューモロイド培養培地またはオルガノイド培養培地の混合物を含み、任意で培地は50：50（v/v）の比率で存在する。
【０１４２】
運動性およびタンパク質濃度。いくつかの態様において、共培養物および／または共培養培地は、免疫細胞に改善された運動性を有利に付与する。そのような共培養物および／または共培養培地は、上記のように、細胞外マトリックス（ECM）を含んでよい。細胞外マトリックスはMatrigelまたはBMEであってよい。好ましい態様において、細胞外マトリックスはコラーゲンまたはラット尾コラーゲンIである。
【０１４３】
本発明者らは、コラーゲン、特にラット尾コラーゲンIを使用して、運動性における最大の改善が観察されることを示した。特に、BMEに基づく培地中の免疫細胞（例えば、T細胞）が43.635 μmの平均軌跡長を呈する一方で、ラット尾コラーゲンIに基づく培地中の免疫細胞（例えば、T細胞）は135.08 μmの平均軌跡長を呈する。これは運動性における3倍の増加である。共培養培地は、2％〜10％のMatrigel（登録商標）を含む培地について、少なくとも0.15 mg/（ml Matrigel（登録商標））〜0.95 mg/（ml Matrigel（登録商標））のタンパク質濃度を含んでよい。
【０１４４】
いくつかの態様において、図3および実施例10のアッセイを使用して決定されるように、共培養物中の免疫細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％は、80時間で少なくとも200 μM、少なくとも250 μM、少なくとも300 μM、少なくとも350 μM、または少なくとも400 μMの距離を移動できる。
【０１４５】
持続性および活性持続期間。いくつかの態様において、本発明の培地は、免疫細胞が免疫細胞増殖培地中で少なくとも4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、168時間、192時間、216時間、または240時間、持続することを可能にする。
【０１４６】
いくつかの態様において、本発明の培地は、共培養物形成後（すなわち、免疫細胞とオルガノイド／チューモロイド細胞の混合時点後）、免疫細胞が少なくとも4時間、8時間、12時間、24時間、48時間、または72時間、活性なままであることを可能にする。
【０１４７】
いくつかの態様において、本発明の培地は、チューモロイド共培養物がチューモロイド共培養培地中で、または参照オルガノイド共培養物もしくは参照チューモロイド共培養物がオルガノイド共培養培地中で、少なくとも4時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間、168時間、192時間、216時間、または240時間、持続することを可能にする。いくつかの態様において、共培養物は10日間以上にわたって、または継代することなく共培養物が培養中のままでいられるのと同じ日数にわたって持続できる。
【０１４８】
免疫細胞の活性は、細胞の形態によって検出できる（例えば、円形の非存在および細胞の突起の存在は、細胞が活性なままであることを示す）。
【０１４９】
放棄。いくつかの態様において、IL-2は、主張される発明のいかなる培地においても使用されない。
【０１５０】
本発明の追加の方法および製品
キット。本発明は、本発明の任意のオルガノイド、チューモロイド、または共培養物を含むキットを提供する。
【０１５１】
いくつかの態様において、キットは、以下の1つまたは複数を含む：注射器、アルコール綿棒、綿ボール、ガーゼパッド、本発明の方法を実行するための説明書。
【０１５２】
実施例
本発明の他の特色、目的、および利点は、続く実施例において明らかである。しかしながら、実施例は本発明の態様を示す一方で、限定ではなく解説としてだけ与えられることを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変化および修正は、実施例から当業者に明らかになるであろう。本発明は、疾患オルガノイドとしてチューモロイドを使用して例示されるが、他の疾患オルガノイド、特に免疫疾患に関連する疾患オルガノイドが同一の方法で使用され得ることが予想される。したがって、本開示が「チューモロイド」に言及する場合、これを「免疫疾患オルガノイド」などの「疾患オルガノイド」で置き換えられることが意図されている。
【０１５３】
実施例では以下の培地が使用されている：
ヒト結腸オルガノイド培地。
50％ WNT3A馴化培地（自社）、20％ R-スポンジン-1馴化培地（自社）、10％ ノギン馴化培地（自社）、1×B27補助剤（Gibco（商標））、1.25 mM N-アセチルシステイン（Sigma-Aldrich）、10 mM ニコチンアミド（Sigma-Aldrich）、50 ng/mL ヒト上皮成長因子（EGF；Peprotech）、10 nM ガストリン（Sigma-Aldrich）、500 nM TGF-β阻害剤A-83-01（Tocris）、3 μM p38 MAPK阻害剤SB202190（Sigma-Aldrich）、10 nM プロスタグランジンE2（Tocris）、および100 mg/mL プリモシン（InvivoGen）を補充した完全Advanced DMEM/F12培地（Gibco（商標））。
【０１５４】
ヒト結腸直腸癌チューモロイド培地。
20％ R-スポンジン-1馴化培地、10％ ノギン馴化培地、ビタミンA不含1×B27補助剤（Gibco（商標））、1.25 mM N-アセチルシステイン、10 mM ニコチンアミド、50 ng/mL ヒトEGF、10 nM ガストリン、500 nM TGF-β阻害剤A-83-01、3 μM p38 MAPK阻害剤SB202190、10 nM プロスタグランジンE2、および100 mg/mL プリモシンを補充した完全Advanced DMEM/F12培地。
【０１５５】
ヒトT細胞培地。
ペニシリン／ストレプトマイシン、5％ ヒトAB血清（Sigma-Aldrich）を補充したRPMI1640（Gibco（商標））。
【０１５６】
Ijssel培地。
ペニシリン／ストレプトマイシン、1％ ヒトAB血清（Sigma-Aldrich）、ウシ血清アルブミン、インスリン、オレイン酸、リノール酸、トランスフェリン、およびエタノールアミン（すべてSigma-Aldrich）を補充したIMDM。
【０１５７】
以下の実施例では、オルガノイド共培養物およびチューモロイド共培養物の産生ならびに特徴づけが、実施例1〜9にわたって解説されている。これらの方法および共培養物自体の適用は、実施例10〜15に解説されている。
【０１５８】
実施例1．病院からの正常結腸および結腸直腸癌生検の収集。
この実施例では、引き続く実施例におけるオルガノイド、チューモロイド、および免疫細胞試料の調製に使用される細胞試料の単離を示す。
【０１５９】
結腸直腸癌患者の切除された結腸および／または直腸から正常結腸粘膜および腫瘍組織の生検を採取する。手術の間に末梢血も採取する。
【０１６０】
具体的には、ヒト結腸直腸癌組織および正常（成人）ヒト結腸粘膜上皮からの生検を、ペニシリン／ストレプトマイシン（100×ストックから10,000 U/mL ペニシリンおよび10K μM/mL ストレプトマイシン）、HEPES（100×ストックから1 M）、GlutaMAX（100×ストックから；すべてGibco（商標））、およびRhoキナーゼ阻害剤Y-27632（Sigma-Aldrich）で完全となった10〜15 mLの氷冷Advanced DMEM/F12培地を含む50 mLの標準チューブに収集した。氷上に保たれた生検はすぐに処理するか、または単離の開始まで4℃で最大24時間保存できる。
【０１６１】
この過程を図1Aに概略的に示す。
【０１６２】
実施例2．正常結腸組織からの陰窩の単離および正常結腸オルガノイドの導出；T細胞培養のための正常結腸組織からの上皮内T細胞の単離。
この実施例は、オルガノイド培養物の発生および正常結腸試料からの免疫細胞の単離のための、正常結腸試料の処理を示す。
【０１６３】
正常結腸粘膜をEDTAで処理して正常結腸オルガノイドの導出のために陰窩を遊離させ、次にT細胞培養物のための上皮内リンパ球（IEL）を含む単一細胞懸濁液を作製するためにさらに消化する。
【０１６４】
正常結腸組織からの陰窩の単離および正常結腸オルガノイドの導出。
外科用ハサミおよび鉗子を使用して筋肉層および脂肪を解剖顕微鏡下で除去する。洗浄した組織を大体1〜2 mmの細い細片に切断する。1つの細片を組織学的解析のために4％ ホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）で固定し、1つの細片を遺伝子および／またはタンパク質解析のために（ドライアイスまたは液体窒素中で）急速冷凍し、−80℃で保存する。残りの細片を新鮮なキレート溶液（滅菌水に溶解した5.6 mM Na2HPO4、8.0 mM KH2PO4、96.2 mM NaCl、1.6 mM KCl、43.4 mM スクロース、および54.9 mM D-ソルビトール；すべてSigma-Aldrich）で3回洗浄した。洗浄した細片を、2 mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA；自社）および0.5 mM DL-ジチオトレイトール（DTT；Sigma-Aldrich）で完全となったキレート溶液中で、回転ホイール（低温室）において4℃で30分間インキュベートした。チューブを力強く振盪して、間葉から結腸陰窩を遊離させた。陰窩が見えなかった場合は、新鮮な完全キレート溶液でインキュベーションを繰り返した。組織断片を1〜2分間沈ませ、陰窩を含む上清を新しいチューブに移した。5〜10 mLのウシ胎仔血清（FCS；Sigma-Aldrich）を添加し、陰窩を4℃で5分間、300×gで遠心分離した。上皮内T細胞を単離するために、残りの組織断片を氷上に保った。完全Advanced DMEM/F12で陰窩を3回洗浄した。基底膜抽出物（BME；Cultrex（登録商標））に陰窩を再懸濁し、異なる密度で播き、37℃および5％ CO2の加湿インキュベーター内へ30分間配置した。BMEの凝固の際に、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632を補充したヒト結腸オルガノイド培地を添加し、3〜4日ごとに置き換えた。陰窩から形成されるオルガノイドを7〜10日ごとに継代した。
【０１６５】
引き続いて、全ゲノム配列決定、mRNA配列決定、およびペプチドームプロファイリングを使用して、オルガノイド培養物の一次解析を行った。
【０１６６】
T細胞培養のための正常結腸組織からの上皮内T細胞の単離。
結腸陰窩の単離から保たれた組織断片をペトリ皿へ配置し、鉗子、ハサミ、およびメスを使用してとても細かい小片（＜1 mm）に切断した。組織断片を50 mLの標準チューブに移し、10％ FCSおよびペニシリン／ストレプトマイシンで完全となった20 mLのRPMI 1640培地（Gibco（商標））で3回洗浄して、残っているいかなるEDTAおよび阻害剤も除去した。組織小片がビーカーの底に沈降した後、培地をピペットで除去した。次に、組織小片を、1 mg/mL コラゲナーゼ1A、10 U/mL DNase I（すべてSigma-Aldrich）、およびRhoキナーゼ阻害剤Y-27632を含む10 mLのRPMI 1640培地で、振盪しながら37℃で1時間インキュベートした。細胞懸濁液に2 mLのFCSを添加し、懸濁液全体を100-μm細胞濾過器を通じて濾過した。単一細胞懸濁液を4℃で5分間、300×gで遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを完全RPMI 1640培地で2回洗浄した。単一細胞懸濁液を、凍結培地（Recovery（商標） Cell Culture Freezing MediumまたはFCSおよびAdvanced DMEM/F12の1：1混合物中の10％ DMSOのいずれか、すべてGibco（商標））において液体窒素で凍結保存したか、あるいはT細胞培養のためにさらに処理した。
【０１６７】
実施例3．腫瘍オルガノイドおよびT細胞培養物のための結腸直腸癌組織の消化；結腸直腸癌チューモロイドの導出。
この実施例は、チューモロイド培養物の発生のための癌性結腸試料の処理、および癌性結腸試料からの免疫細胞の単離を示す。腫瘍組織を消化して、チューモロイドの導出のための上皮腫瘍細胞およびT細胞培養物のための腫瘍浸潤リンパ球（TIL）を含む単一細胞懸濁液を作製する。
【０１６８】
腫瘍およびT細胞培養物のための結腸直腸癌組織の消化。
腫瘍生検を大体1〜2 mmの細い細片に切断した。1つの細片を組織学的解析のために4％ ホルムアルデヒドで固定し、各1つの細片を遺伝子および／またはタンパク質解析のために（ドライアイスまたは液体窒素中で）急速冷凍し、−80℃で保存する。鉗子を使用して、腫瘍塊が粘稠に見えるまで残りの細片をさらに切断した。腫瘍塊を、1 mg/mL コラゲナーゼII、10 μg/mL ヒアルロニダーゼ、およびRhoキナーゼ阻害剤Y-27632を含む10 mLの完全Advanced DMEM/F12培地で、振盪しながら37℃で1時間インキュベートした。インキュベーションの後、スラリー腫瘍塊に2 mLのFCSを添加し、細胞懸濁液を100-μm細胞濾過器を通じて濾過し、4℃で5分間、300×gで遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを完全Advanced DMEM/F12培地で2回洗浄した。単一細胞懸濁液を、凍結培地（Gibco（商標） Recovery（商標） Cell Culture Freezing MediumまたはFCSおよびAdvanced DMEM/F12の1：1混合物中の10％ DMSOのいずれか）において液体窒素で凍結保存したか、あるいは結腸直腸癌チューモロイドの導出およびT細胞培養のためにさらに処理した。
【０１６９】
結腸直腸癌チューモロイドの導出。
腫瘍の単一細胞懸濁液の画分をBMEに再懸濁し、異なる希釈で播いた。37℃および5％CO2の加湿インキュベーター内でBMEを30分間凝固させた。Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632を補充したヒト結腸直腸癌チューモロイド培地で、BMEに埋め込まれた細胞を培養した。3〜4日ごとに培地を新しくした。単一腫瘍細胞から形成されるオルガノイドを7〜10日ごとに継代した。
【０１７０】
実施例4．オルガノイドおよびチューモロイドの解析。
解析のために明視野光学顕微鏡検査を実行し、オルガノイドおよびチューモロイド試料の単一細胞懸濁に成功したことを確認した。患者試料に由来する正常結腸オルガノイドおよびチューモロイドの代表的な明視野画像を図1Bに示す。
【０１７１】
上記のように、結腸陰窩を正常結腸オルガノイド培地（基底膜抽出物（BME）ならびにR-スポンジン-1、ノギン、Wnt3A馴化培地、ビタミンA不含B27補助剤、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、EGF、TGF-β阻害剤A-83-01、ガストリン、p38 MAPK阻害剤SB202190、およびプロスタグランジンE2を含む培地で培養した）へ埋め込んだ。1週間以内に正常結腸オルガノイドが発生し、その後は毎週継代した（上部パネル）。
【０１７２】
結腸直腸癌試料からの単一細胞懸濁液を基底膜抽出物（BME）へ埋め込み、チューモロイド培地（R-スポンジン-1、ノギン馴化培地、ビタミンA不含B27補助剤、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、EGF、TGF-β阻害剤A-83-01、ガストリン、p38 MAPK阻害剤SB202190、およびプロスタグランジンE2）を含む培地で培養した。1週間以内にチューモロイドが形成され、その後は毎週継代した（下部パネル）。
【０１７３】
図1Bの各パネルで見て取れるように、よく分離したオルガノイド、チューモロイド、および免疫細胞の単一細胞懸濁液が達成される。
【０１７４】
実施例5．単一細胞懸濁液からのリンパ球の単離およびT細胞増殖培養物。
この実施例では、免疫細胞をさらに処理し、続いて免疫細胞増殖培養物の産生を示す。
【０１７５】
5 mLの純粋なFicoll-Paque PLUS（GE Healthcare）を15 mLの標準チューブに添加した。正常結腸または結腸直腸癌組織の消化物から得られた単一細胞懸濁液を5 mLの完全RPMI 1640培地に再懸濁し、透明なFicoll-Paque PLUS層の上部に注意深く配置した。試料を室温で、800×gで20分間遠心分離した。T細胞を含む透明なFicoll-Paque PLUS層の上層の細胞を収集し、10 mLの完全RPMI 1640培地に再懸濁し、300×gで5分間遠心分離した。細胞ペレットを完全RPMI 1640培地に再懸濁し、計数した。単一細胞懸濁液を、凍結培地（Gibco（商標） Recovery（商標） Cell Culture Freezing MediumまたはFCSおよびAdvanced DMEM/F12の1：1混合物中の10％ DMSOのいずれか）において液体窒素で凍結保存したか、あるいは増殖培養物のためにすぐに使用した。T細胞増殖培養物のために、37℃および5％CO2の加湿インキュベーター内で、抗CD28（Miltenyi）コーティングされた細胞培養プラスチック上で、ペニシリン／ストレプトマイシン、5％ ヒトAB血清、および6000 IU 組換えヒトIL-2（Miltenyi）で完全となった1 mLのRPMI 1640中に1×106全生細胞の濃度でリンパ球を培養した。1週間後に培地を新しくした。
【０１７６】
さらにまたはあるいは、末梢血リンパ球（PBL）およびT細胞が濃縮された末梢血単核細胞を精製するために末梢血を処理する。
【０１７７】
T細胞受容体（TCR）配列決定およびT細胞の免疫表現型検査により一次解析を実行する（以下の図1Cおよび実施例6を参照）。
【０１７８】
実施例6．単離された免疫細胞の解析。
図1Cは、患者試料に由来する上皮内リンパ球（IEL）および腫瘍浸潤リンパ球（TIL）のクローン性増殖の代表的な明視野画像を示す（左パネル）。
【０１７９】
フローサイトメトリー解析により、CD4＋ Tヘルパー（Th）細胞およびCD8＋ 細胞傷害性T細胞（CTL）の頑強な増殖が示される。正常結腸粘膜または結腸直腸癌組織からの単一細胞懸濁液を、インターロイキン-2（IL-2）を含むT細胞培地中で維持した。T細胞のクローン性増殖は、1〜2週間以内に顕著であった（左パネル）。
【０１８０】
したがって、単離された免疫細胞の解析により、免疫細胞が機能的で生物学的に代表的なままであることが明らかになる。
【０１８１】
実施例7．上皮オルガノイドおよびチューモロイドの継代。
この実施例は、オルガノイドおよびチューモロイドの培養物の維持を実証する。
【０１８２】
1 mL容量のマイクロピペット（すなわち、P1000 Gilson）を使用して、成長培地を上下にBME液滴をピペッティングすることにより、オルガノイド培養物を破壊（「分割」）した。破壊されたオルガノイドを500×gで5分間遠心分離した。ペレット化したオルガノイドをTrypLE（Gibco（商標））に再懸濁し、ウォーターバス内で、37℃で5〜15分間インキュベートした。予め湿らせた、火炎研磨したガラス製パスツールピペットを使用して、オルガノイドを単一細胞へ分離させた。分離したオルガノイドを完全Advanced DMEM/F12の過剰量に採取し、500×gで5分間遠心分離した。上皮単一細胞を所望の密度でBMEに再度播き、37℃および5％ CO2の加湿インキュベーター内に配置した。BMEが凝固した際に、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632を補充したそれぞれの培養培地（ヒト結腸オルガノイド培地またはヒト結腸直腸癌チューモロイド培地のいずれか）を添加した。3〜4日ごとに培地を新しくした。単一腫瘍細胞から形成されるオルガノイドを7〜10日ごとに継代した。
【０１８３】
正常結腸上皮および腫瘍上皮の単一細胞懸濁液中に存在する細胞の単一細胞メッセンジャーRNA（mRNA）配列決定により一次解析を実行する。
【０１８４】
実施例8．オルガノイド共培養物およびチューモロイド共培養物の産生。
この実施例は、実施例5からのオルガノイドおよびチューモロイドと実施例4からの免疫細胞培養物との共培養を実証する。
【０１８５】
分割した際に、（上記の実施例7のように）5000個の細胞をBMEに播き、ヒト結腸培地またはヒト結腸直腸癌チューモロイド培地のいずれかで3〜4日間培養した。培養の際に、培地を除去し、氷上で25分間のインキュベーションに続いて、Cell Recovery Solution（商標）（Corning）を使用してBME／Matrigel（登録商標）液滴を破壊した。引き続いて細胞を遠心分離（500×gで5分間）し、T細胞と混合する前に、100 IU/mL 組換えヒトIL-2を補充したT細胞培地に再懸濁する。
【０１８６】
T細胞を計数し、100 IU/mLの組換えヒトIL-2を補充した完全T細胞培地で100000 細胞/mLの濃度にした。96ウェルプレート中で、100 μLの上皮癌チューモロイド懸濁液を100 μLのT細胞懸濁液と混合した。22 μLのラット尾コラーゲン（Gibco（商標））を混合物に溶解して、懸濁液中で10％ コラーゲンの濃度に到達させた。細胞を37℃および5％ CO2で30分間静置して、解析前に細胞およびコラーゲンを沈ませた。
【０１８７】
基底膜抽出物（BME）の液滴における正常結腸オルガノイドおよび同種異系CD3＋ T細胞の原理証明共培養を図2に示す。
【０１８８】
図2Aは手順の概略図を示す。上記のように、Cell Recovery Solutionを使用して正常結腸オルガノイドをBME液滴から遊離させ、完全Advanced DMEM/F12で洗浄した。増殖したCD3＋ T細胞を培養物から収穫し、緑色色素（Vybrant CFDA SE Cell Tracer）で標識した。結腸オルガノイドおよび標識T細胞をヒト結腸オルガノイド培地中で混合し、BME液滴へ埋め込んだ。IL-2を含むヒト結腸オルガノイド培地中で共培養物を60時間維持した。Cell Recovery Solutionを使用して共培養物をBMEから遊離させ、4％ パラホルムアルデヒド中で固定した。固定された全組織標本を、重合アクチンに印を付けるためにファロイジンで、および核を標識するためにDAPIで染色した。ProLong Gold褪色防止用封入剤中のスライド上へ全組織標本を載せ、Leica SP8X共焦点顕微鏡上で画像化した。
【０１８９】
結腸オルガノイド共培養物のzスタック画像の最大投影を図2Bに示す。オルガノイド中のF-アクチンは濃灰色で標識され、T細胞は薄灰色で標識されている。右パネルの挿入図は、結腸上皮に浸潤するT細胞を示す。
【０１９０】
正常結腸オルガノイドおよびT細胞の三次元再構成を図2Cに示す。
【０１９１】
図で見られるように、オルガノイドは予想されるレベルの構造組織化を示し、インビボシステムとの顕著な類似性をもって免疫細胞と相互作用する。
【０１９２】
実施例9．イメージング、フローサイトメトリー、およびサイトカイン分泌による共培養物の解析。
この実施例では、実施例6で生産されたオルガノイド共培養物およびチューモロイド共培養物を解析して、共培養成分が相互作用している機構を調査する。
【０１９３】
イメージング解析。
イメージング解析を使用して、共培養物中の死にかけている細胞の割合を決定する。
【０１９４】
培養前に、T細胞を細胞追跡色素（例えば、CFSE、Molecular Probes（商標））で標識した。オルガノイドは、直接的にコンジュゲートしたマウス抗ヒトEPCAM（BD Bioscience）抗体または（T細胞標識のためのものとは異なる）細胞追跡色素で標識した。共焦点レーザー走査型顕微鏡（例えば、Leica SP8X；または任意の種類の生細胞イメージング低速度撮影蛍光顕微鏡）を使用して、アポトーシス細胞に印を付けるための色素（例えば、NucRed Dead（商標）、Molecular Probes）の存在下で、細胞を37℃および5％CO2で一晩（12〜18時間）画像化した。引き続いて、Imarisソフトウェア（Bitplane）を使用して低速度撮影画像を解析し、EPCAMの共局在化および死細胞マーカーを可視化できるボクセルの割合を評価することにより、死にかけているオルガノイドの割合を計算した。
【０１９５】
フローサイトメトリー解析
フローサイトメトリー解析を使用して、共培養物中に存在する免疫細胞上に存在する表面マーカーを評価する。
【０１９６】
分割した際に、（上記の実施例7のように）5000個の細胞をBMEに播き、ヒト結腸培地またはヒト結腸直腸癌チューモロイド培地のいずれかで3〜4日間培養した。培養の際に、培地を除去し、氷上で25分間のインキュベーションに続いて、Cell Recovery Solution（商標）（Corning）を使用してBME／Matrigel（登録商標）液滴を破壊した。引き続いて細胞を遠心分離（500×gで5分間）し、T細胞と混合する前に、100 IU/mL 組換えヒトIL-2を補充したT細胞培地に再懸濁する。
【０１９７】
T細胞を計数し、100 IU/mLの組換えヒトIL-2を補充した完全T細胞培地で500000 /mLの濃度にした。96ウェルプレート中で、100 μLの上皮癌チューモロイド懸濁液を100 μLのT細胞懸濁液と混合した。細胞を一晩共培養して収穫し、TripLE（Gibco（商標））を使用して単一細胞懸濁液を作製した。単一細胞懸濁液を4％ パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich）で固定し、0.5％ サポニン（BD Bioscience）を含む緩衝液を使用して透過処理した。あるいは、市販のキット（例えば、BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit、BD Bioscience）を使用した。引き続いて、活性型カスパーゼ-3を認識する抗体と一緒にCD3、EPCAM、インターフェロン（IFN）γ、および／または腫瘍壊死因子（TNF）αに対するフローサイトメトリー抗体（すべてBD Bioscience）とともに細胞をインキュベートし、続いてフローサイトメトリー解析を行った。
【０１９８】
サイトカイン分泌解析。
上記のように、共培養のためにオルガノイドを分割し、播き、培養し、準備した。T細胞を計数し、100 IU/mLの組換えヒトIL-2を補充した完全T細胞培地で500000 /mLの濃度にした。96ウェルプレート中で、100 μLの上皮癌チューモロイド懸濁液を100 μLのT細胞懸濁液と混合した。培養開始の72時間後に、ELISAによるT細胞サイトカイン生産（例えば、IFNγ、TNFα）の評価のために上清を収穫した。培養上清は解析まで−20℃で保存した。
【０１９９】
実施例10．チューモロイド共培養物のライブイメージングは、共培養物がラット尾コラーゲンIとともに作製される場合、T細胞の運動性の増加を示す。
この実施例では、共培養物の発生において使用される異なる構造成分の、結果となる免疫細胞の運動性に対する効果を試験する。
【０２００】
手順の概略図を図3Aに示す。上記のように、Cell Recovery Solutionを使用してチューモロイドをBME液滴から遊離させ、完全Advanced DMEM/F12で洗浄した。末梢血試料から単離した同種異系CD8＋ T細胞を緑色色素（Vybrant CFDA SE Cell Tracer）で標識した。
【０２０１】
チューモロイドおよびT細胞を、IL-2および10％ BMEもしくはラット尾コラーゲンIのいずれかを含むヒト結腸オルガノイド培地と混合し、37℃および5％ CO2の雰囲気で、ライブイメージングチャンバーを備えたLeica SP8X共焦点顕微鏡上で80時間にわたってライブイメージングした。
【０２０２】
図3Bは、チューモロイド共培養物の代表的な合成画像を示す。明視野チャネルおよび緑色蛍光チャネルを、産生された合成画像に統合した。Imarisソフトウェアを使用してT細胞の移動経路を追跡した。
【０２０３】
図3Cにグラフ化されているように、両方の条件におけるT細胞の軌跡長の定量化により、10％ BMEと比較して、10％ コラーゲン中で共培養されたT細胞の軌跡経路は有意に長いことが示される。結果は、共培養においてラット尾コラーゲンIを使用することにより、より長い軌道が生産され、したがって免疫細胞の運動性が守られ、よりインビボに似たシステムを開発できることを示唆している。
【０２０４】
実施例11：クローン性チューモロイド共培養物の産生。
この実施例は、A2型ヒト白血球抗原（HLA）に対して陽性および陰性のクローン性チューモロイドの産生を解説する。
【０２０５】
手順の概略図を図4Aに示す。TrypLE酵素消化を使用してチューモロイドを単一細胞へ解離させた。単一細胞を抗HLA-A2抗体で染色し、抗HLA-A2免疫反応性に基づいて精製した。HLA-A2＋veおよびHLA-A2−ve腫瘍細胞を埋め込んで維持し、チューモロイドを産生させた。  
【０２０６】
図4Bのフローサイトメトリー解析により、純粋なHLA-A2＋veまたはHLA-A2−veチューモロイド株の樹立が示された。対照は、HLA-A2＋ve JY細胞株、およびHLA-A2＋veもしくはHLA-A2−veチューモロイド株と同一の患者試料に由来する正常結腸オルガノイド株である。
【０２０７】
実施例12．上皮癌チューモロイドの細胞傷害性T細胞媒介性抗原特異的殺傷のアッセイ。
この実施例は、チューモロイド共培養物上での「細胞殺傷アッセイ」の実行を伴う。これは、癌を治療するために、新生抗原を経験したαβT細胞に適用される本発明の方法の一例である。
【０２０８】
上記のように、結腸直腸癌チューモロイドまたは正常組織オルガノイドを分割し、単一細胞として保った。ヒトT細胞培地および200 IU/mL 組換えヒトIL-2中で、刺激性αCD28抗体の存在下で10000〜50000個のT細胞（TILまたはPBMC由来）を50000個のチューモロイド／オルガノイド由来の単一細胞とともに2週間共培養した。2〜3日ごとに培地を新しくした。引き続いて、増殖した細胞を、200 IU/mL 組換えヒトIL-2を補充した完全なIjssel培地中で、照射を受けたフィーダー細胞（1×106 /mL、3名の異なるドナーからのPBMCならびに1×105 /mL JYおよび／またはLAZ509細胞の混合物）の存在下でクローン性増殖させた。あるいは、完全なIjssel培地中の（1×106 /mL、3名の異なるドナーからのPBMCならびに1×105 /mL JYおよび／またはLAZ509細胞の混合物）を含むプレートへ、TILまたはIEL単一細胞調製物からT細胞を直接的にFACS選別した。次に、増殖したクローンを、上記のように、引き続いて新生抗原をパルスした腫瘍オルガノイドとともに共培養した。
【０２０９】
同定された推定腫瘍新生抗原を、以下のように上皮癌オルガノイド上へ搭載した。オルガノイドが培養されたBME／Matrigel（登録商標）液滴を、プレート中で培地を再懸濁することにより破壊した。関連ペプチドをオルガノイドに添加し、オルガノイドを37℃および5％ CO2で2時間培養した。次に、上記のように、イメージング、フローサイトメトリー解析、および／またはサイトカイン分泌解析のために、クローン性増殖したT細胞を自家性オルガノイドとともに共培養した。
【０２１０】
抗原を経験したT細胞の抗チューモロイド反応性についての殺傷アッセイを図5に示し、手順の概略図を図5Aに示す。HLA-A2拘束性ウィルムス腫瘍（WT）1ペプチドでHLA-A2＋veまたはHLA-A2−veチューモロイドを2時間パルスした。次に、WT1ペプチド特異的TCRを内部に持つTCRトランスジェニックCD8＋ T細胞を、WT1ペプチドをパルスしたHLA-A2＋veまたはHLA-A2−veチューモロイドとともに48時間共培養した。
【０２１１】
48時間後の共培養物の代表的な明視野画像を図5Bに示す。WT1ペプチドだけでパルスしたHLA-A2＋veチューモロイドについて著しい死が観察される。他のすべての条件、すなわちWT1ペプチドでパルスしていないHLA-A2＋veもしくはHLA-A2−veチューモロイド、およびWT1ペプチドでパルスしたHLA-A2−veチューモロイドは、正常な成長を示す。
【０２１２】
結果は、新生抗原WT1ペプチドがHLA-A2＋ve表現型を有するチューモロイドを殺傷するのに（およびおそらく癌を治療するのに）効果的であるが、他の表現型についてはそうではないことを示唆する。
【０２１３】
実施例13．チェックポイント阻害ありおよび阻害なしにおける、抗原を経験したT細胞の抗チューモロイド反応性についての細胞生存率アッセイ。
チェックポイント阻害ありおよび阻害なしにおける、抗原を経験したαβT細胞の抗チューモロイド反応性についての細胞生存率アッセイを図6に示す。これは、癌を治療するために、化学作用物質に適用される本発明の方法の一例である。
【０２１４】
手順の概略図を図6Aに示す。図5Aで説明したように、ただし12時間だけ共培養を実行し、抗PD1チェックポイント阻害剤ありおよび阻害剤なしでインキュベートした。CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay kit（Promega）を使用して、製造元の指示に従って細胞生存率アッセイを実行した。
【０２１５】
図5Bは、ペプチドなしの対照に対して正規化されたチューモロイドの細胞生存率を示す。したがって、HLA-A2、IL-2、および抗PD1チェックポイント阻害剤の組み合わせが存在する場合、チューモロイドの細胞生存率が最も低いこと、すなわちIL-2およびHLA-A2の癌型を呈する患者の亜集団に適用される場合、抗PD1チェックポイント阻害剤治療が最も有力かもしれないことを示すのに共培養物を使用して成功した。
【０２１６】
実施例14．オルガノイド／チューモロイド共培養物によるT細胞の活性化に対する異なる効果を決定するためのアッセイ。
この実施例は、γδT細胞の存在は、共培養におけるオルガノイドをT細胞なしの基準値を超えて活性化しないが、共培養におけるチューモロイドを抗原非特異的な方法で活性化することを解説する。IFN-γを使用して活性化を決定した。
【０２１７】
手順の概略図を図7Aに示す。Dispaseを使用してチューモロイドをMatrigel（登録商標）液滴から遊離させ、引き続いて70 μmおよび20 μmフィルターを通過させた。20 μmフィルターからオルガノイドを回収し、計数して播いた。チューモロイドおよびT細胞を、RPMI、IL-2、および5％ Matrigel（登録商標）を含むヒト結腸オルガノイド培地と混合し、37℃および5％ CO2の雰囲気でインキュベートした。24時間のインキュベーション後、明視野倒立顕微鏡を使用してオルガノイドを画像化した。
【０２１８】
チューモロイド共培養物およびオルガノイド共培養物の代表的な明視野画像を、（それぞれ）図7Bおよび7Cに示す。
【０２１９】
共培養物の定量化IFN-γレベルを図7Dに示す。
【０２２０】
実施例15．会合および細胞殺傷能力を評価するためのチューモロイド共培養物のライブイメージング。
T細胞の細胞殺傷能力、ならびに異なるT細胞サブタイプによる、および異なるT細胞／腫瘍抗原の組み合わせについてのT細胞の変動について、T細胞を調査した。
【０２２１】
手順の概略図を図8Aに示す。Dispaseを使用してチューモロイドをMatrigel（登録商標）液滴から遊離させ、引き続いて70 μmおよび20 μmフィルターを通過させた。20 μmフィルターからオルガノイドを回収し、計数して播いた。遠赤色色素（CellVue Claret）で標識した培養T細胞。チューモロイドおよびT細胞を、RPMI、IL-2、および5％ Matrigel（登録商標）を含むヒト結腸オルガノイド培地と混合し、37℃および5％ CO2の雰囲気で、ライブイメージングチャンバーを備えたLeica SP8X共焦点顕微鏡上で68時間にわたってライブイメージングした。
【０２２２】
非標的T細胞を含むチューモロイド共培養物の代表的な合成画像を図8Bに示す。明視野チャネルおよび遠赤色蛍光チャネルを、産生された合成画像に統合した。
【０２２３】
標的T細胞を含むチューモロイド共培養物の代表的な合成画像を図8Cに示す。明視野チャネルおよび遠赤色蛍光チャネルを、産生された合成画像に統合した。
【０２２４】
実施例16．上皮オルガノイド培養物を使用した癌免疫調節のモデリング。
ここでは、本発明者らはオルガノイド技術を利用して免疫-癌相互作用を研究し、結腸直腸癌（CRC）による免疫調節を評価する。転写プロファイリングおよびフローサイトメトリーにより、オルガノイドが原発腫瘍に存在する免疫調節分子の差次的発現を維持していることが明らかになった。最後に、本発明者らは細胞傷害性T細胞（CTL）とともに共培養したCRCオルガノイドを使用して、インビトロで抗原特異的な上皮細胞の殺傷および癌の免疫調節をモデル化する方法を確立した。
【０２２５】
CRCは世界中で最もよく見られる癌の1つである。CRCの初期段階は外科的切除によって非常に治療可能であるが、後期段階は通例、治療不能である。CRCは、多段階の過程を通じて、大腸上皮の小さな病変に起因する。これらの病変は、低悪性度異形成を伴う腺腫に成長し、高悪性度異形成に進行し、最終的に浸潤性癌をもたらす。Wntシグナル伝達の標準経路などのシグナル伝達経路における遺伝的変異は、CRC4の分子基盤である。しかしながら、腫瘍とその微小環境との相互作用は、別の決定的な特質である。癌細胞は、腫瘍の成長を支持するために、それらの微小環境（例えば、線維芽細胞、血管系、および免疫細胞）を改造する。CTLまたはマクロファージなどの浸潤性免疫細胞（IC）は、抗腫瘍細胞傷害性（前者）または腫瘍促進慢性炎症（後者）などの異なる免疫応答を産生することにより極めて大事な役割を果たす。このように、監視している免疫システムからの脱出は、癌の特質の1つとして認識されている。癌細胞は、免疫編集と呼ばれる過程を受けて、例えばCTL関連抗原（CTLA）-4またはプログラムされた死（PD）1などの阻害性細胞表面受容体の刺激を通じてT細胞の活性化を予防することにより、抗腫瘍応答を鎮める。腫瘍細胞によるこの活性な免疫調節を乗り越えることは、主要な治療標的となっている。しかしながら、CTLの差次的な浸潤または免疫阻害因子の差次的な発現などの腫瘍の不均一性は、薬物耐性を媒介することによって抗腫瘍薬物の治療効率に影響を与え得る。したがって、腫瘍とその環境とのコミュニケーションを特徴づけるエクスビボモデルシステムを開発することは大いに重要である。異なる上皮組織から成長したオルガノイド培養物は、組織の恒常性および疾患を研究するための優れたツールとしての役目を果たす。さらに、複数の上皮器官システムのオルガノイドバイオバンクが確立されており、腫瘍由来のオルガノイドは、異なる薬物をスクリーニングして患者の応答を予測するためのプラットフォームとしての使用に成功している。ここでは、本発明者らは、免疫細胞とともに共培養されたチューモロイド（特に、CTLとともに共培養されたCRCオルガノイド）を使用して、インビトロで抗原特異的な上皮細胞殺傷および癌の免疫調節をモデル化する方法の確立について説明する。
【０２２６】
本発明者らは最初に、確立された長期培養培養物において、CRCオルガノイドが免疫調節分子を発現しているかどうかを評価した。この目的のために、本発明者らは、CRC患者についての本発明者らの「生きたオルガノイドバイオバンク」を用いて産生されたトランスクリプトームデータセットを使用して、CRCオルガノイドにおけるT細胞特異的免疫調節物質の遺伝子発現を、正常結腸オルガノイドにおいて見出される発現レベルと比較した（van de Wetering, M. et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell 161, 933-945, doi:10.1016/j.cell.2015.03.053 (2015)）。平均して、TNFSF4またはTNFSF9などのT細胞刺激に関連する遺伝子の転写は、CRCオルガノイドでは、正常結腸オルガノイドと比較して改変されていなかった）図9A。しかしながら、T細胞に抗原を提示する主要組織適合性複合体クラス（MHC）-I分子をコードする、ヒト白血球抗原（HLA）遺伝子HLA-AおよびHLA-Cの発現は、CRCオルガノイドにおいて有意に下方制御され図9A、これは癌で見出される、よく説明された現象である。T細胞機能の阻害に関連する遺伝子の発現は、BTLAのように有意に上方制御されるか、CD80、CD86、LGALS9のように有意に下方制御されるか、あるいはCD274（PD-L1をコードする）、PDCD1LG2（PD-L2をコードする）のように全く改変されなかった図9A。個々のオルガノイドの免疫調節分子の発現レベルを評価した場合、CRCオルガノイドは、健常結腸オルガノイドと比較してHLA-A、HLA-C、およびLGALS9の不均一な下方制御を示しながら、主にクラスター化していた図9B。しかしながら、例えば免疫阻害遺伝子CD274およびPDCD1LG2の発現は、以前に報告された、オルガノイドにおいて腫瘍不均一性が守られることを反映して、いくつかのCRCオルガノイドでは、対応正常結腸オルガノイド培養物と比較して非常に上方制御された図9B。これらの分子署名は、腫瘍の免疫原性および腫瘍の他の特徴とのその関連をさらに調査するための基盤を提供する。
【０２２７】
CRCにおいて最もよく見られる変異遺伝子の4個はAPC、P53、KRAS、およびSMAD4であり、正常腸管上皮の転移性癌への段階的な進行を反映している。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（CRISPR）／Cas9を使用してこれらの癌変異をヒト腸管オルガノイド培養物に導入すると、インビトロにおいておよびマウスへの異種移植の際に、この過程を模倣できることが実証された。これらの癌変異の1つまたは複数を保有する結腸オルガノイドを使用して、本発明者らはPD-L1の上方制御が特定の変異状態と関連しているかどうかを調査した。さらに、本発明者らは、変異オルガノイドおよびその野生型対照オルガノイド株を、T細胞から分泌され、PD-L1などの免疫調節分子の発現増加を誘発できるインターフェロン（IFN）-γに曝露した。引き続いて、本発明者らは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）およびフローサイトメトリーによってPD-L1発現を評価した図9C〜D。IFN-γが存在しない場合、三重変異（APCKO/KO、P53KO/KO、KRASG12D/+）ならびに四重変異（APCKO/KO、P53KO/KO、KRASG12D/+、およびSMAD4KO/KO）を保有するオルガノイドは、対照の野生型オルガノイドと比較して、より低いCD274遺伝子発現を示した図9C。全体的に、PD-L1発現は未処理のオルガノイド株で低かった図9C〜D。しかしながら、IFN-γで処理されたオルガノイドにおいて、PD-L1発現は転写産物およびタンパク質レベルの両方で劇的に上方制御された図9C〜D。これらのデータは、CRCオルガノイドが免疫調節物質を発現し、この発現が、以前にインビボの組織について示されたのと類似した方法で調節されることを実証する。
【０２２８】
次に、本発明者らは、インビトロにおける腫瘍細胞の抗原特異的殺傷をモデル化するために、CRCオルガノイドおよびCTLの共培養システムを確立することを目指した。このために、本発明者らは、HLA-A2制限ウィルムス腫瘍（WT）1由来ペプチドを認識するトランスジェニックT細胞受容体（TCR）を保有するαβT細胞を使用した。本発明者らは、まずフローサイトメトリーを使用して、HLA-A2発現について、「生きたバイオバンク」および新しく産生されたCRCオルガノイドからCRCオルガノイドをスクリーニングした。本発明者らは、HLA-A2の部分的な下方制御を示す3つのCRCオルガノイド株を見出した図4B。本発明者らは、HLA-A2＋およびHLA-A2−CRCオルガノイドを精製することができ、両方の集団から培養物を確立するのに成功した図11B。本発明者らは、IFN-γ刺激がHLA-A2再発現を誘発せず、HLA-A2−CRCオルガノイドにおいてMHC-Iが安定して下方制御されるのを確認した図10B。次に、本発明者らは、これらのCRCオルガノイド株をWT1ペプチドでパルスし、引き続いてペプチド特異的T細胞とともに48時間共培養した。共培養に続いて、本発明者らは、HLA-A2−CRCオルガノイドがペプチドでパルスしたかどうかに関係なく生き残ることを見出した図11C。しかしながら、事前のペプチドインキュベーションを行わないHLA-A2＋CRCオルガノイドだけが共培養で生き残った図11C。ペプチドでパルスしたHLA-A2＋CRCオルガノイドは、ペプチド特異的T細胞によって効果的に殺傷され、インビトロにおける細胞傷害性T細胞による抗腫瘍反応を研究するためにオルガノイドを利用できるという原理証明を提供した。本発明者らの「殺傷」アッセイシステムの抗原特異性をさらに確認するために、本発明者らは、mNeonGreenタグ付きヒストンH2Bを発現する構築物でHLA-A2＋CRCオルガノイドをトランスフェクトし、T細胞をCellTrackerバイオレットで染色して、両方の細胞型の長期追跡を可能にすることにより、本発明者らの共培養法を改善した（方法（Methods）、下記）。次に、本発明者らは、WT1ペプチドまたはEBV由来ペプチド（方法（Methods））のいずれかでHLA-A2＋CRCオルガノイドをパルスし、WT1またはEBV特異的TCRのいずれかを保有するT細胞とともにオルガノイドを共培養した。ここでは、同族ペプチドでパルスしたオルガノイドだけが、T細胞によって効率的に殺傷された図11D。酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を使用して、共培養におけるT細胞によるIFN-γ生産を試験したところ、T細胞による抗原特異的オルガノイド殺傷が確認された図11E。オルガノイド殺傷の動態をよりよく追うために、本発明者らは、特にアポトーシス細胞を染色する蛍光色素（NucRed Dead 647；方法（Methods））を適用し、共培養物に対してライブ共焦点イメージングを実行した（図11F）。次に、本発明者らは、NucRed Dead色素とH2B-mNeonGreen（方法（Methods））との共局在を評価することにより、オルガノイド殺傷を定量化した。両方の標識の有意な共局在、すなわちオルガノイド殺傷は、ペプチドでパルスしたHLA-A2＋CRCオルガノイドをそれぞれのペプチド特異的T細胞とともに共培養した場合にだけ観察された図11G。さらに、オルガノイドの上皮へのT細胞浸潤は、この共培養条件において容易に検出できた図11H。最後に、本発明者らは、この共培養システムを使用して、免疫抑制性腫瘍に対する免疫応答の調節をモデル化できるかどうかを調査した。実際に、PD-1に対する遮断抗体（αPD-1）を添加すると、PD-L1発現IFN-γ刺激オルガノイドにおける腫瘍殺傷およびIFN-γ生産が増強された図11I〜J。これは、オルガノイドがIFN-γで刺激されず、したがってPD-1を発現しない場合は観察されなかった。結論として、T細胞は抗原特異的な方法で共培養されたCRCオルガノイドを効率的に殺傷した。さらに、T細胞の阻害およびαPD-1を使用したこの阻害の引き続く軽減をモデル化することができた。ここで、本発明者らは、腫瘍組織と免疫システムとの間の相互作用を忠実に再現するために上皮オルガノイドを使用できることを実証した。また、本発明者らの共培養アッセイを使用して、本発明者らは、インビトロにおける腫瘍微小環境を再構築する最初の工程も設定した。この微小環境の他の成分（線維芽細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、B細胞など）をさらに添加することで、腫瘍の免疫回避につながる、異なる細胞型間の複雑な相互作用が明らかになるかもしれない。最後に、この共培養システムは、特定の免疫療法、例えば腫瘍を指向する抗体を誘導する、キメラ抗原受容体（CAR）もしくはTCRトランスジェニックT細胞、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）もしくは抗体依存性細胞貪食（ADCP）の、異なる腫瘍および異なる患者への適用性を試験する薬物スクリーニングのためのツールとして使用できる。
【０２２９】
方法（Methods）
ヒト材料およびインフォームドコンセント
結腸組織（正常結腸および腫瘍組織の両方）は、オランダのユトレヒトのDiakonessenhuis病院の外科および病理学科から得た。この研究に含まれるすべての患者はCRCと診断された。含まれるすべての患者は、インフォームドコンセントに署名した。組織の収集は、ヘルシンキ宣言に一致し、オランダおよび欧州連合の法律に従って、Diakonessenhuis病院の医療倫理委員会（METC）によって承認された。
【０２３０】
オルガノイドの産生および培養物
上皮オルガノイド株は、健常結腸または腫瘍組織に由来した（van de Wetering, M. et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell 161, 933-945, doi:10.1016/j.cell.2015.03.053 (2015)）。手短に言えば、ジチオトレイトール（0.5 mM、Sigma）およびEDTA（2 mM、自社）を補充したキレート溶液（5.6 mM Na2HPO4、8.0 mM KH2PO4、96.2 mM NaCl、1.6 mM KCl、43.4 mM スクロース、および54.9 mM D-ソルビトール、Sigma）中で、4℃で30分間結腸粘膜を消化することにより、健常結腸陰窩を単離した。引き続いて、結腸陰窩を基底膜抽出物（BME；Cultrex PC BME RGF type 2、Amsbio）に播き、ペニシリン／ストレプトマイシン、10 mM HEPESおよびGlutamax（すべてGibco、Thermo Fisher Scientific）と50％ Wnt3a馴化培地（自社）、20％ R-スポンジン1馴化培地（自社）、10％ ノギン馴化培地（自社）、1×B27、1.25 mM n-アセチルシステイン、10 mM ニコチンアミド、50 ng/mL ヒトEGF、10 nM ガストリン、500 nM A83-01、3 μM SB202190、10 nM プロスタグランジンE2、および100 μg/mL プリモシン（Invivogen）を補充したAdvancedダルベッコ改変イーグル培地／F12で構成されるヒト腸幹細胞培地（HISC）中でオルガノイドを成長させた。腫瘍標本を、ヒアルロニダーゼ（10 μg/mL）およびLY27632（10 μM）を補充したコラゲナーゼII（1 mg/mL、Gibco、Thermo Scientific）中で振盪しながら37℃で30分間、単一細胞に消化した。単一腫瘍細胞をBMEに播き、10 μM LY27632を補充したWnt馴化培地不含HICS中で、37℃でオルガノイドを培養した。本発明者らが培地の「自社」成分に言及する場合、当業者は市販代替品を容易に利用可能であり（例えば、Wntアゴニスト（ATCC CRL 2647（商標））、R-スポンジン（R＆D、＃3500-RS/CF）、ノギン（Peprotech、＃120-10C）、EDTA（Thermo fisher、＃AM9260G））、当業者は、これらが同一または同等の効果を達成することを理解するであろう。
【０２３１】
チューモロイドトランスフェクション
TrypLEを使用してチューモロイド（特に、CRCオルガノイド）を小さい塊へ解離させ、次にH2B-mNeonGreen（pLV-H2B-mNeonGreen-ires-Puro）で形質導入した。
【０２３２】
T細胞
HLA-A2制限WT1由来ペプチドを認識するトランスジェニックTCRを保有するαβT細胞の産生は、Kuball, J. et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood 109, 2331-2338, doi:10.1182/blood-2006-05-023069 (2007)に説明された。手短に言えば、TCRαおよびβ鎖は、育成された四量体陽性T細胞クローンからクローニングされた。引き続いて、クローン化されたTCR遺伝子を含む、gag-pol、env、およびpBulletレトロウイルス構築物でトランスフェクトされたPhoenix-Amphoパッケージング細胞からのレトロウイルス上清を使用して、CD8＋αβTCR T細胞に形質導入した。
【０２３３】
チューモロイドT細胞の共培養および生細胞イメージング
共培養の5〜7日前に、H2B-mNeonGreenで安定的にトランスフェクトされたチューモロイドを分割および消化して、10 μLのBMEあたり5000細胞の密度で播種した（12ウェル細胞培養プレートでウェルあたり25,000細胞）。共培養の2日前に、T細胞からIL-2を欠乏させた。共培養の1日前に、指定された濃度のIFN-γでチューモロイドを刺激した。
【０２３４】
共培養の前に、製造元の指示に従って、T細胞をCell Proliferation Dye eFluor 450（eBioscience）で染色した。共培養の前に、TCR特異的ペプチド（ProImmune）で、チューモロイドを37℃で2時間パルスした。チューモロイドおよびT細胞を収穫し、10％ BME、100 IU/mL IL-2、およびNucRed Dead 647（Thermo Fischer）を補充したT細胞培地に採取した。示されている場合、抗PD1遮断抗体（2 μg/mL）を共培養に添加した。ガラス底の96ウェルプレートに細胞を播き、SP8X共焦点顕微鏡（Leica）を使用して共培養物を画像化した。
【０２３５】
フローサイトメトリー
EBV由来のHLA-2:02制限ペプチドFLYALALLL（ProImmune）に対するAPC標識五量体を使用して、健常な個人からの軟膜から単離されたPBMCから五量体＋CD8＋CD3＋T細胞を選別した。BD FACS Aria（BD Biosciences）血球計数器を使用して、細胞を単一細胞として96ウェルプレートへ選別した。フローサイトメトリーのために、以下の抗体を使用した（すべて抗ヒト）：CD8-PE（クローンRPA-T8）、CD45-PerCP-Cy5.5（2D1）、CD274（PD-L1）-APC（MIH1）（すべてBD Biosciences）、CD279（PD-1）-PE（EH12.2H7、Biolegend）、HLA-A2-PE（BB7.2、Santa Cruz）。
【０２３６】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）
qPCR解析のために、製造元の手続きに従ってRNAeasyキット（QIAGEN）を使用して、オルガノイド／チューモロイドからRNAを単離した。SYBR Green Reagent（Biorad）を使用してPCR解析を実行した。すべてのプライマーについて標準曲線を用いて2連でPCR反応を実行した。プライマーは、NCBIプライマー設計ツールを使用して設計した。この研究で使用したプライマー：
2021508249.tif 000002
。
【０２３７】
転写プロファイリング
van de Wetering, M. et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell 161, 933-945, doi:10.1016/j.cell.2015.03.053 (2015)で説明されているように、バイオバンクオルガノイドのマイクロアレイ解析を実行した。
【０２３８】
酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
培養上清を−20℃に保ち、製造元の手続きに従ってELISA MA Standard（Biolegend）を使用して、示されたサイトカインについてELISAを実行した。
【０２３９】
細胞生存率アッセイ
製造元の手続きに従ってCellTiter-Glo Luminescent細胞生存率アッセイ（Promega）を使用して、共培養後の細胞生存率を評価した。
【０２４０】
画像解析
Imarisソフトウェアパッケージ（Bitplane）を使用して画像解析を行った。手短に言えば、陰性対照に基づいて陽性染色の閾値を設定した。H2B-neonおよびNucRed Dead 647信号について共局在チャネルを作製した。NucRed Dead信号とともに共局在するH2B-mNeonGreen+ボクセルの割合として細胞死を定量化した。
【０２４１】
バイオインフォマティクス解析
Rバージョン3.4.0（R Foundation、https://www.r-project.org）およびRStudioバージョン1.0.143（https://www.rstudio.com）の標準パッケージ（すなわち、gplots）を使用して、マイクロアレイ実験からの正規化された遺伝子発現データのバイオインフォマティクス解析（van de Wetering, M. et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell 161, 933-945, doi:10.1016/j.cell.2015.03.053 (2015)）を実行した。
【０２４２】
統計解析
特に明記しない限り、すべての実験を少なくとも3回繰り返した。すべてのデータは平均±SEMとして示した。Graphpad Prism 6またはMicrosoft Excel 2010のいずれかを使用して、ANOVAまたは両側スチューデントt検定のいずれかによって統計的有意性を解析した。
【図１Ａ】
2021508249.tif 000003
【図１Ｂ】
2021508249.tif 000004
【図１Ｃ】
2021508249.tif 000005
【図２】
2021508249.tif 000006
【図３】
2021508249.tif 000007
【図４Ａ】
2021508249.tif 000008
【図４Ｂ】
2021508249.tif 000009
【図５】
2021508249.tif 000010
【図６】
2021508249.tif 000011
【図７】
2021508249.tif 000012
【図８】
2021508249.tif 000013
【図９Ａ】
2021508249.tif 000014
【図９Ｂ】
2021508249.tif 000015
【図９Ｃ】
2021508249.tif 000016
【図９Ｄ】
2021508249.tif 000017
【図１０】
2021508249.tif 000018
【図１１Ａ】
2021508249.tif 000019
【図１１Ｂ】
2021508249.tif 000020
【図１１Ｃ】
2021508249.tif 000021
【図１１Ｄ】
2021508249.tif 000022
【図１１Ｅ】
2021508249.tif 000023
【図１１Ｆ】
2021508249.tif 000024
【図１１Ｇ】
2021508249.tif 000025
【図１１Ｈ】
2021508249.tif 000026
【図１１Ｉ】
2021508249.tif 000027
【図１１Ｊ】
2021508249.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月18日(2020.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021508249000001.app
【国際調査報告】
2021508249.tif 000029
2021508249.tif 000030
2021508249.tif 000031
2021508249.tif 000032
2021508249.tif 000033
2021508249.tif 000034
2021508249.tif 000035
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