(57)【要約】  ＲＯＳ１に対する特異性が増進した抗ＲＯＳ１抗体およびその用途に関するものであり、具体的には、抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片、およびその癌の診断用途が提供される。
2021503931.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯＳ１タンパク質の３９番目から５６番目までの領域（配列番号１５）内の、配列番号１１を含む連続する５個以上のアミノ酸または配列番号１０を含む連続する４個以上のアミノ酸からなる部位に結合することを特徴とする、抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
次の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む、請求項１に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号１（ＳＧＧＳＹＧＹＧ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２（ＤＮＴＮＲＰＳ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、
配列番号３（ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
配列番号４（ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号５（ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および
配列番号６（ＫＧＧＧＮＩＤＡ）または配列番号１３（ＧＧＧＧＮＩＤＡ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３。
【請求項３】
配列番号７または配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
配列番号８または配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
次の通り定義される、請求項１に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
（１）次の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号１（ＳＧＧＳＹＧＹＧ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２（ＤＮＴＮＲＰＳ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、
配列番号３（ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
配列番号４（ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号５（ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および
配列番号６（ＫＧＧＧＮＩＤＡ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；または
（２）次の可変領域を含む、抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
【請求項５】
前記抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１（ＬＤＬＧＴ）には結合し、配列番号１２（ＩＤＬＧＴ）には結合しないことを特徴とする、請求項４に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＳ１タンパク質に特異的に結合するものである、請求項４に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
次の通り定義される、請求項１に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
（１）次の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号１（ＳＧＧＳＹＧＹＧ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２（ＤＮＴＮＲＰＳ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、
配列番号３（ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
配列番号４（ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号５（ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および
配列番号１３（ＧＧＧＧＮＩＤＡ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；または
（２）次の可変領域を含む抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域。
【請求項８】
前記抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１（ＬＤＬＧＴ）および配列番号１２（ＩＤＬＧＴ）に結合可能であることを特徴とする、請求項７に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＳ１タンパク質、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７１、ＧＲＰ７５、およびＧＲＰ７８からなる群より選ばれた１種以上に結合可能なものである、請求項８に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗ＲＯＳ１抗体は、動物抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗原結合断片は、前記抗ＲＯＳ１抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖが免疫グロブリンのＦｃと融合した融合ポリペプチド、またはｓｃＦｖが軽鎖の不変領域と融合した融合ポリペプチドである、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
請求項１ないし９のいずれか一項に記載の抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片を含む、癌診断用薬学組成物。
【請求項１３】
前記癌は肺癌である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
次のアミノ酸配列を暗号化する核酸：
配列番号１、２、３、４、５、６、および１３からなる群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列、
配列番号７、８、２３、および１４からなる群より選ばれた一つ以上のアミノ酸配列、または
配列番号２４または配列番号２６のアミノ酸配列。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む、組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組換え細胞を培養する段階を含む、抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【請求項１８】
（１）患者から分離した生物学的試料に請求項１ないし９のいずれか一項に記載の抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片を接触させる段階；および
（２）前記段階（１）の反応物で抗原−抗体反応の有無を確認する段階
を含む、癌の診断に情報を提供する方法。
【請求項１９】
前記癌は肺癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＯＳ１のＮ−末端部位と候補抗体または抗原結合断片を接触させる段階；および
前記ＲＯＳ１のエピトープに結合する抗体または抗原結合断片を選別する段階
を含み、
前記ＲＯＳ１のＮ−末端部位は、ＲＯＳ１タンパク質の３９番目から５６番目までの領域（配列番号１５）内の、配列番号１１を含む連続する５個以上のアミノ酸または配列番号１０を含む連続する４個以上のアミノ酸からなる部位である、
ＲＯＳ１に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＲＯＳ１に対する特異性が増進した抗ＲＯＳ１抗体およびその用途に関し、具体的には、抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片、およびその癌の診断用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、単クローン抗体（ｈｙｂｒｉｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｍＡｂ）は、ハイブリドーマ技術を用いて作られ、これらの単クローン抗体は公認された細胞株寄託機関に寄託されているハイブリドーマ細胞株により特定される。
【０００３】
組換え抗体技術の開発により単クローン抗体の生成と同時にこれらの配列決定が可能になった。そのため、突然変異導入により最初のｍＡｂクローンからの多様な子孫抗体の開発を可能にしてより高い親和性およびより良い物理化学的性質を有する抗体の開発がより容易になった。
【０００４】
しかし、ｍＡｂの特異性が同じ方式で強化できるかどうかに関する報告は殆どされていない。実質的に、商業的に利用可能な抗体の５０％以上が不良の特性を有したり全く作動しない。また、商業的に利用可能な抗体が非特異的な標的と交差−反応性を現わし得る。
【０００５】
一方、本明細書ではｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓの一つであるｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ＲＯＳ１（ＲＯＳ１）を標的抗原として選択した。このタンパク質はヒトグリオブラストーマ（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）細胞から初めて分離した。ＲＯＳ１遺伝子はヒト染色体６ｑ２２に位置して多様なパートナーと再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅ）され得る。非小細胞性肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ）およびヒト胆管癌（ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）を含む多様な癌において、ＲＯＳ１タンパク質は切断され、ＲＯＳ１の３０領域がｖ−ｒｏｓ、ＦＩＧ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＬＲＩＧ３、およびＴＰＭ３の５０領域に融合した融合形態で発現する。ＲＯＳ１は、増殖、転移、および抗アポトーシス（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）機能と関連する細胞信号伝達を活性化させると知られているが、その生物学的機能は明確に明らかにされていない。
【０００６】
したがって、標的抗原とは高い親和力を示し、かつ非標的タンパク質には親和力を有しない、標的抗原に対する特異性が強化したＲＯＳ１に対する抗体およびそれを用いた多様な癌の診断技術の開発が求められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書において、ＲＯＳ１に対する特異性を高めることができるＲＯＳ１のエピトープ、前記エピトープを特異的に認知する抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片、および前記抗体の用途が提供される。前記抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＳ１の特定領域を認識することによって、ＲＯＳ１に対する特異性がより増進した特徴を有するものであり得る。
【０００８】
一例は、ＲＯＳ１タンパク質のＮ−末端部位を特異的に認識する抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００９】
ＲＯＳ１タンパク質は、ヒトＲＯＳ１（例えば、ＮＰ＿００２９３５．２（配列番号９）等）でありうる。ＲＯＳ１タンパク質のＮ−末端領域はＲＯＳ１タンパク質（配列番号９）のアミノ酸配列の３７番目から２９０番目までの領域またはその一部であり得、前記一部は、例えば、ＲＯＳ１タンパク質（配列番号９）の３９番目から５６番目までの領域、またはその一部（例えば、Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１０）またはＬ４５−Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１１）のアミノ酸）でありうる。
【００１０】
一例において、前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＳ１（ＮＰ＿００２９３５．２；配列番号９）のアミノ酸３９−５６またはその一部（例えば、ＲＯＳ１のＤ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１０）またはＬ４５−Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１１）のアミノ酸）を特異的に認識することができる。
【００１１】
例えば、抗−ＲＯＳ１抗体または抗体由来の抗原結合断片は、ＲＯＳ１のＤ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１０）またはＬ４５−Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１１）を含んだり、これらのアミノ酸を必須的としてなるエピトープを特異的に認識（および／または結合）することができる。
【００１２】
他の具体例において、本明細書で提供される抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＩＤＬＧＴ（配列番号１２）で構成されたペプチドに結合されなくてもよい。前記ＩＤＬＧＴで構成されたペプチドは、Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０（ＨＳＰ７０）、ＨＳＰ７１、ＧＲＰ７５およびＧＲＰ７８等のＨＳＰ系タンパク質に存在するものでありうる。したがって、本明細書で提供される抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＧＲＰ７５およびＧＲＰ７８等のＨＳＰ系タンパク質と結合しないものでありうる。
【００１３】
前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、次の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものでありうる：
ＬＣＤＲ１：ＳＧＧＳＹＧＹＧ（配列番号１）、
ＬＣＤＲ２：ＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号２）、
ＬＣＤＲ３：ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ（配列番号３）、
ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ（配列番号４）、
ＨＣＤＲ２：ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号５）、および
ＨＣＤＲ３：ＸＧＧＧＮＩＤＡ（ＸはＫまたはＧ）。
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号６（ＫＧＧＧＮＩＤＡ）または配列番号１３（ＧＧＧＧＮＩＤＡ）であり得、特に配列番号６（ＫＧＧＧＮＩＤＡ）でありうる。
【００１４】
前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、次の可変領域を含むものでありうる：
軽鎖可変領域：ＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ  ＳＧＧＳＹＧＹＧ  ＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＡＴＶＩＹ  ＤＮＴＮＲＰＳ  ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＫＳＧＳＴＧＴＬＴＩＴＧＶＱＶＥＤＥＡＶＹＹＣ  ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ  ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号７）、またはＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ  ＳＧＧＳＹＧＹＧ  ＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ  ＤＮＴＮＲＰＳ  ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＫＳＧＳＴＧＴＬＴＩＴＧＶＱＶＥＤＥＡＶＹＹＣ  ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ  ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号２３）；および
重鎖可変領域：ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＴＬＳＬＶＣＫＡＳ  ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ  ＷＭＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＧＡ  ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ  ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＴＲ  ＫＧＧＧＮＩＤＡ  ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳＴＳ（配列番号８）、またはＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＴＬＳＬＶＣＫＡＳ  ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ  ＷＭＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＧＡ  ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ  ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＴＲ  ＧＧＧＧＮＩＤＡ  ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳＴＳ（配列番号１４）
（前記可変領域のアミノ酸配列中、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３は順に下線で表す）。
【００１５】
他の例は、前記抗−ＲＯＳ１抗体または抗体由来の抗原結合断片を含む薬学組成物を提供する。例えば、前記薬学組成物は癌診断用組成物でありうる。
【００１６】
他の例は、前記抗−ＲＯＳ１抗体または抗体由来の抗原結合断片の癌の診断に使用するための用途、または抗癌剤または癌診断剤の製造に使用するための用途を提供する。
【００１７】
他の例は、
（１）対象から分離した生物学的試料に前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片を接触（反応）させる段階；および
（２）前記段階（１）の反応物で前記抗体または抗原結合断片と抗原（ＲＯＳ１タンパク質）との間の抗原−抗体反応または抗原−抗体複合体の形成を確認する段階
を含む、癌の診断方法または癌の診断に情報を提供する方法を提供する。
【００１８】
前記癌の診断方法または癌の診断に情報を提供する方法は、前記確認する段階（２）以後に、
（３）前記段階（１）の反応物で抗原−抗体反応が確認されたり抗原−抗体複合体の形成が確認（前記複合体が検出）された場合、前記対象が癌にかかったり癌にかかる恐れがと判断（または確認）する段階をさらに含みうる。
【００１９】
他の例は、抗−ＲＯＳ１抗体のＲＯＳ１に対する特異性を高めることができるＲＯＳ１のエピトープを提供する。前記エピトープは、ＲＯＳ１タンパク質のＮ−末端部位（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２９３５．２（配列番号９）のアミノ酸配列の３７番目から２９０番目までの領域）またはその一部（例えば、前記Ｎ−末端部位内の連続する４個以上または５個以上（例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）のアミノ酸を含んだりこれらからなる部位）でありうる。一例において、前記ＲＯＳ１のエピトープは、ＲＯＳ１タンパク質（配列番号９）の３９番目から５６番目までの領域、またはその一部（例えば、Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１０）またはＬ４５−Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１１）のアミノ酸）でありうる。
【００２０】
他の例は、
前記ＲＯＳ１のエピトープと候補抗体または抗原結合断片を接触させる段階；および
前記ＲＯＳ１のエピトープに結合する抗体または抗原結合断片を選別する段階
を含むＲＯＳ１に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を製造する方法を提供する。
【００２１】
一例は、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）に点突然変異を導入する段階を含む、抗−ＲＯＳ１抗体の特異性を向上させる方法が提供される。一具体例において、前記抗−ＲＯＳ１抗体の特異性を向上させる方法は、次のＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片のＨＣＤＲ３の最初のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）をリジン（Ｋ）に置換する段階を含みうる：
ＬＣＤＲ１：ＳＧＧＳＹＧＹＧ（配列番号１）、
ＬＣＤＲ２：ＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号２）、
ＬＣＤＲ３：ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ（配列番号３）、
ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ（配列番号４）、
ＨＣＤＲ２：ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号５）、および
ＨＣＤＲ３：ＧＧＧＧＮＩＤＡ（配列番号１３）。
他の例は、上記した抗ＲＯＳ１抗体のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１（配列番号１）、ＬＣＤＲ２（配列番号２）、ＬＣＤＲ３（配列番号３）、ＨＣＤＲ１（配列番号４）、ＨＣＤＲ２（配列番号５）、およびＨＣＤＲ３（配列番号６））、軽鎖可変領域（配列番号７または配列番号２３）、重鎖可変領域（配列番号８または配列番号１３）、およびｓｃＦｖ（配列番号２４または配列番号２６）からなる群より選ばれたポリペプチドを暗号化する核酸分子を提供する。
【００２２】
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。一例において、前記組換えベクターは、前記軽鎖可変領域（配列番号７）および前記重鎖可変領域（配列番号８または配列番号１４）をそれぞれ含んだり共に含むものでありうる。他の例において、前記組換えベクターは、前記抗−ＲＯＳ１  ｓｃＦｖ（配列番号２４または配列番号２６）を含むものでありうる。
【００２３】
他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００２４】
他の例は、前記組換え細胞を発現させる段階を含む抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
ＲＯＳ１タンパク質は、ＲＯＳ１遺伝子によってコーディングされるｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅとして、遺伝子を再配置してＲＯＳ１のＣ−末端細胞内領域が関与する他の遺伝子との融合タンパク質の形成によりｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓに重要な役割をする。後成的調整（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）による野生型ＲＯＳ１過発現の可能性が提案されている。一例において、ＲＯＳ１のＮ−末端に結合する抗−ＲＯＳ１抗体（３Ｂ２０）が提供され、これは癌組織（例えば癌性（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）組織）で野生型ＲＯＳ１を検出するのに使用することができる。一実施例において。免疫ブロットおよび免疫沈殿などの通常の分析技術により３Ｂ２０がｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（例えば、Ｈｓｐ７０ｓ）と反応する可能性が確認された。ＲＯＳ１のアミノ酸配列とＨｓｐ７０ｓのアミノ酸配列を分析し、これらの配列がアミノ酸配列ＤＬＧＴを共有することを確認した。ＲＯＳ１のアラニン置換変異試験により、ＲＯＳ１のエピトープが前記配列を含むことを確認した。他の実施例において抗−ＲＯＳ１抗体（３Ｂ２０）のＨＣＤＲ３を構成するそれぞれのアミノ酸を本来のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換する無作為突然変異によりＲＯＳ１と反応性（結合力）は維持し、かつ他のタンパク質（例えば、Ｈｓｐ７０ｓ等）と反応する交差反応性は除去された変異体クローン３Ｂ２０−Ｇ１Ｋを製作した。他の実施例において、３Ｂ２０−Ｇ１Ｋを使用して正常組織（例えば、正常肺組織）ではＲＯＳ１が観察されないことに対し、肺癌組織（例えば、肺腺癌（ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）を有する肺組織）ではＲＯＳ１が過発現していることを確認した。
【００２６】
このような事項に基づいて、本明細書ではＲＯＳ１に対する特異性を高めることができるＲＯＳ１のエピトープ、前記エピトープを特異的に認知する抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片、および前記抗体の用途が提供される。前記抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＳ１の特定領域を認識することによって、ＲＯＳ１に対する特異性がより増進した特徴を有するものでありうる。
【００２７】
一例は、ＲＯＳ１タンパク質のＮ−末端部位を特異的に認識する抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２８】
ＲＯＳ１タンパク質は、ヒトＲＯＳ１（例えば、ＮＰ＿００２９３５．２（配列番号９）等）でありうる。ＲＯＳ１タンパク質のＮ−末端領域は、ＲＯＳ１タンパク質（配列番号９）のアミノ酸配列の３７番目から２９０番目までの領域またはその一部であり得、前記一部は、例えば、ＲＯＳ１タンパク質（配列番号９）の３９番目から５６番目までの領域、またはその一部（例えば、Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１０）またはＬ４５−Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１１）のアミノ酸）でありうる。
【００２９】
一例において、前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＳ１（ＮＰ＿００２９３５．２；配列番号９）のアミノ酸３９−５６またはその一部（例えば、ＲＯＳ１のＤ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１０）またはＬ４５−Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１１）のアミノ酸）を特異的に認識することができる。
【００３０】
例えば、抗−ＲＯＳ１抗体または抗体由来の抗原結合断片は、ＲＯＳ１のＤ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１０）またはＬ４５−Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１１）を含んだりこれらのアミノ酸を必須的としてなるエピトープを特異的に認識することができる。
【００３１】
一具体例において、前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＩＤＬＧＴ（配列番号１２）で構成されたペプチドに結合（および／または認識）しない。前記ＩＤＬＧＴで構成されたペプチドは、Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０（ＨＳＰ７０）、ＨＳＰ７１、ＧＲＰ７５およびＧＲＰ７８等のＨＳＰ系タンパク質に存在するものでありうる。したがって、本明細書で提供される抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＧＲＰ７５およびＧＲＰ７８等のＨＳＰ系タンパク質と結合しないものでありうる。
【００３２】
他の具体例において、前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、Ｌ４５−Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１１）およびＩＤＬＧＴ（配列番号１２）で構成されたペプチドに結合（および／または認識）可能なものでありうる。この場合、前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＳ１およびＨＳＰ７０、ＨＳＰ７１、ＧＲＰ７５およびＧＲＰ７８等のＨＳＰ系タンパク質からなる群より選ばれた１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、または５種のすべてに結合（および／または認識）可能なものでありうる。
【００３３】
前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、次の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものでありうる：
ＬＣＤＲ１：ＳＧＧＳＹＧＹＧ（配列番号１）、
ＬＣＤＲ２：ＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号２）、
ＬＣＤＲ３：ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ（配列番号３）、
ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ（配列番号４）、
ＨＣＤＲ２：ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号５）、および
ＨＣＤＲ３：ＸＧＧＧＮＩＤＡ（ＸはＫまたはＧ）。
【００３４】
前記ＨＣＤＲ３は、配列番号６（ＫＧＧＧＮＩＤＡ）または配列番号１３（ＧＧＧＧＮＩＤＡ）であり得、特に配列番号６（ＫＧＧＧＮＩＤＡ）でありうる。
【００３５】
前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、次の可変領域を含むものでありうる：
軽鎖可変領域：ＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ  ＳＧＧＳＹＧＹＧ  ＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＡＴＶＩＹ  ＤＮＴＮＲＰＳ  ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＫＳＧＳＴＧＴＬＴＩＴＧＶＱＶＥＤＥＡＶＹＹＣ  ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ  ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ（配列番号７）、または  ＬＴＱＰＳＳＶＳＡＮＬＧＧＴＶＫＩＴＣ  ＳＧＧＳＹＧＹＧ  ＷＹＱＱＫＡＰＧＳＡＰＶＴＶＩＹ  ＤＮＴＮＲＰＳ  ＤＩＰＳＲＦＳＧＳＫＳＧＳＴＧＴＬＴＩＴＧＶＱＶＥＤＥＡＶＹＹＣ  ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ  ＦＧＡＧＴＴＬＴＶＬ  配列番号２３）；および
重鎖可変領域：  ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＴＬＳＬＶＣＫＡＳ  ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ  ＷＭＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＧＡ  ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ  ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＴＲ  ＫＧＧＧＮＩＤＡ  ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳＴＳ（配列番号８）、またはＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＴＬＳＬＶＣＫＡＳ  ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ  ＷＭＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＧＡ  ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ  ＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＴＲ  ＧＧＧＧＮＩＤＡ  ＷＧＨＧＴＥＶＩＶＳＳＴＳ（配列番号１４）
（前記可変領域のアミノ酸配列中、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３は順に下線で表す）。
【００３６】
一具体例において、前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、次のように定義される抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片であり得：
（１）次の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号１（ＳＧＧＳＹＧＹＧ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２（ＤＮＴＮＲＰＳ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、
配列番号３（ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
配列番号４（ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号５（ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および
配列番号６（ＫＧＧＧＮＩＤＡ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；または
（２）次の可変領域を含む、抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
この場合、前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１（ＬＤＬＧＴ）には結合し、配列番号１２（ＩＤＬＧＴ）には結合しないものであり得、このような特徴によってＲＯＳ１タンパク質に特異的に結合するものでありうる。
【００３７】
他の具体例において、前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、次のように定義される抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片であり得：
（１）次の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲｓ）を含む抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号１（ＳＧＧＳＹＧＹＧ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２（ＤＮＴＮＲＰＳ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、
配列番号３（ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ）のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、
配列番号４（ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号５（ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および
配列番号１３（ＧＧＧＧＮＩＤＡ）のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；または
（２）次の可変領域を含む、抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片：
配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および
配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
この場合、前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１（ＬＤＬＧＴ）および配列番号１２（ＩＤＬＧＴ）に結合可能なものであり得、このような特徴によってＲＯＳ１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７１、ＧＲＰ７５、およびＧＲＰ７８からなる群より選ばれた１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、または５種すべてに結合可能なものでありうる。
【００３８】
本明細書に記載されたように、抗−ＲＯＳ１抗体の抗原結合断片は、前記した抗−ＲＯＳ１抗体の６個のＣＤＲを含む任意のポリペプチド、例えばｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｃκ（カッパ不変領域）、ｓｃＦｖ−Ｃλ（ラムダ不変領域）、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２でありうるが、これに限定されるものではない。一例において、前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖが免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４等）のＦｃ部位と融合した融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）または軽鎖の不変領域（例えば、カッパまたはラムダ）と融合した融合ポリペプチド（ｓｃＦｖ−ＣκまたはｓｃＦｖ−Ｃλ）でありうる。
【００３９】
前記抗−ＲＯＳ１抗体または抗体由来の抗原結合断片は、ＲＯＳ１タンパク質でｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓに重要な役割をするＲＯＳ１タンパク質のＣ−末端でないＮ−末端部位を特異的に認識して結合することができる。したがって、前記抗−ＲＯＳ１抗体または抗体由来の抗原結合断片を使用してｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓに関与するＲＯＳ１タンパク質を検出することができ、これによりＲＯＳ１の発現（存在）または過発現に関連する疾病（例えば、癌など）の診断に使用することができる。
【００４０】
したがって、本明細書では前記抗−ＲＯＳ１抗体または抗体由来の抗原結合断片を含む薬学組成物が提供される。例えば、前記薬学組成物は癌診断用組成物でありうる。
【００４１】
他の例は、前記抗−ＲＯＳ１抗体または抗体由来の抗原結合断片の癌の診断に使用するための用途、または抗癌剤または癌診断剤の製造に使用するための用途を提供する。
【００４２】
他の例は、
（１）対象（患者）から分離した生物学的試料に前記抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片を接触（反応）させる段階；および
（２）前記段階（１）の反応物で前記抗体または抗原結合断片と抗原（ＲＯＳ１タンパク質）との間の抗原−抗体反応の有無を確認する段階
を含む、癌の診断方法または癌の診断に情報を提供する方法を提供する。前記抗原−抗体反応の有無を確認する段階は、通常の方法により抗原−抗体複合体の形成の有無を確認（複合体を検出）する段階によって行われることができる。前記生物学的試料は対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）から得た（分離した）細胞、組織、体液、これらの培養物などからなる群より選ばれたものでありうる。
【００４３】
前記癌の診断方法または癌の診断に情報を提供する方法は、前記確認する段階（２）以後に、
（３）前記段階（１）の反応物で抗原−抗体反応が確認（例えば、抗原−抗体複合体の形成が確認（複合体が検出）された場合、前記対象が癌にかかったり癌にかかる恐れがあると判断（または確認）する段階をさらに含みうる。
【００４４】
他の例は、抗−ＲＯＳ１抗体のＲＯＳ１に対する特異性を高めることができるＲＯＳ１のエピトープを提供する。前記エピトープは、ＲＯＳ１タンパク質のＮ−末端部位（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２９３５．２（配列番号９）のアミノ酸配列の３７番目から２９０番目までの領域）またはその一部（例えば、前記Ｎ−末端部位内の配列番号１０または配列番号１１を含む連続する４個以上または５個以上のアミノ酸を含んだりこれらからなる部位）でありうる。一例において、前記ＲＯＳ１のエピトープは、ＲＯＳ１タンパク質（配列番号９）の３９番目から５６番目までの領域（配列番号１５）、またはその一部（例えば、Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１０）またはＬ４５−Ｄ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９（配列番号１１）のアミノ酸、または配列番号９内の配列番号１０または配列番号１１を含む連続する４個以上または５個以上のアミノ酸を含んだりこれらからなる部位）でありうる。
【００４５】
他の例は、
前記ＲＯＳ１のＮ−末端部位（例えば、上述したエピトープ）と候補抗体または抗原結合断片を接触させる段階；および
前記ＲＯＳ１のエピトープに結合する抗体または抗原結合断片を選別する段階
を含むＲＯＳ１に特異的に結合する抗体または抗原結合断片を製造する方法を提供する。一具体例において、前記エピトープが配列番号１０（ＤＬＧＴ）の場合、前記選別された抗体または抗原結合断片は、配列番号１１（ＩＤＬＧＴ）および配列番号１２（ＩＤＬＧＴ）に結合可能なものであり得、ＲＯＳ１、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７１、ＧＲＰ７５、およびＧＲＰ７８からなる群より選ばれた１種以上、２種以上、３種以上、４種以上、または５種のすべてに結合可能なものでありうる。他の具体例において、前記エピトープが配列番号１１（ＩＤＬＧＴ）の場合、前記選別された抗体または抗原結合断片は配列番号１１（ＩＤＬＧＴ）には結合するが配列番号１２（ＩＤＬＧＴ）には結合しないものであり得、ＲＯＳ１に特異的に結合するものでありうる。
【００４６】
一例は、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）に点突然変異を導入する段階を含む、抗−ＲＯＳ１抗体の特異性を向上させる方法が提供される。一具体例において、前記抗−ＲＯＳ１抗体の特異性を向上させる方法は、次のＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片のＨＣＤＲ３の最初のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）をリジン（Ｋ）に置換する段階を含みうる：
ＬＣＤＲ１：ＳＧＧＳＹＧＹＧ（配列番号１）、
ＬＣＤＲ２：ＤＮＴＮＲＰＳ（配列番号２）、
ＬＣＤＲ３：ＧＳＡＤＳＳＳＩＡＴ（配列番号３）、
ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＦＳＤＲＧＭＨ（配列番号４）、
ＨＣＤＲ２：ＩＳＧＤＧＹＩＴＨＹＧＡＡＶＫＧ（配列番号５）、および
ＨＣＤＲ３：ＧＧＧＧＮＩＤＡ（配列番号１３）。
他の例は、上記した抗ＲＯＳ１抗体のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１（配列番号１）、ＬＣＤＲ２（配列番号２）、ＬＣＤＲ３（配列番号３）、ＨＣＤＲ１（配列番号４）、ＨＣＤＲ２（配列番号５）、およびＨＣＤＲ３（配列番号６））、軽鎖可変領域（配列番号７または配列番号２３）、重鎖可変領域（配列番号８または配列番号１３）、およびｓｃＦｖ（配列番号２４または配列番号２６）からなる群より選ばれたポリペプチドを暗号化する核酸分子を提供する。
【００４７】
他の例は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供する。一例において、前記組換えベクターは、前記軽鎖可変領域（配列番号７）および前記重鎖可変領域（配列番号８または配列番号１４）をそれぞれ含んだり共に含むものでありうる。他の例において、前記組換えベクターは、前記抗−ＲＯＳ１  ｓｃＦｖ（配列番号２４または配列番号２６）を含むものでありうる。
【００４８】
他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００４９】
他の例は、前記組換え細胞を発現させる段階を含む抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【００５０】
本明細書で提供される抗体または抗原結合断片の抗原として作用するＲＯＳ１は、哺乳類由来のものであり得、例えばヒト由来のＲＯＳ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ＮＰ＿００２９３５．２等）でありうる。本明細書で提供される抗−ＲＯＳ１抗体は、ＲＯＳ１のＮ−末端部位（すなわち、上述したエピトープ部位）を認知および／または結合する。
【００５１】
本明細書において「抗体」とは、特定抗原に特異的に結合するタンパク質を総称するものであって、免疫系内で抗原の刺激によって作られるタンパク質またはこれを化学的合成または組換え的に製造したタンパク質であり得、その種類は特に制限されない。前記抗体は非自然的に生成されたもの、例えば、組換え的または合成的に生成されたものでありうる。前記抗体は動物抗体（例えば、マウス抗体など）、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体でありうる。前記抗体は単クローン抗体または多クローン抗体でありうる。
【００５２】
完全な抗体は、２個の全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）およびエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００５３】
用語、「重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖およびその断片をすべて含む意味として解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片をすべて含む意味として解釈される。
【００５４】
用語、「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の可変部位のうち抗原との結合特異性を付与する部位を意味するものであり、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ３個のＣＤＲを含みうる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原またはエピトープに結合するにあたって主要な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語「特異的に結合」または「特異的に認識」は当業者に通常公知されている意味と同じものであり、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。
【００５５】
本明細書における抗体は、特別な言及がない限り、抗原結合能を保有する抗体の抗原結合断片を含むものと理解することができる。
【００５６】
用語「抗原結合断片」は、抗原が結合できる部分（例えば、本明細書で定義された６個のＣＤＲ）を含むすべての形態のポリペプチドを意味する。例えば、抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２でありうるが、これに限定されない。また、上述した通り、前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖが免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等）のＦｃ部位または軽鎖の不変領域（例えば、カッパまたはラムダ）と融合した融合ポリペプチドでありうる。
【００５７】
前記抗原結合断片のうちＦａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で１個の抗原結合部位を有する。
【００５８】
Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂとは差がある。
【００５９】
Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有する最小の抗体断片でＦｖ断片を生成する組換え技術は当業界に広く公知されている。
【００６０】
二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は、一般的にペプチドリンカーにより重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されたりまたはＣ−末端ですぐに連結されており、二重鎖Ｆｖのようなダイマーと同じ構造をなすことができる。
【００６１】
前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術により製作することができる。
【００６２】
用語「ヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）」は、抗体の重鎖に含まれている領域として、ＣＨ１およびＣＨ２領域の間に存在し、抗体内の抗原結合部位の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を提供する機能をする領域を意味する。
【００６３】
前記抗ＲＯＳ１抗体は、単クローン抗体でありうる。単クローン抗体は、当業界に広く知られている方法により製造することができる。例えば、ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ技法を用いて製造することができる。または抗ＲＯＳ１ 抗体は通常の方法によってマウス由来の単クローン抗体として製造することができる。
【００６４】
一方、典型的なＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）フォーマットを用いてＲＯＳ１との結合能に基づいて個別単クローン抗体をスクリーニングすることができる。結合体に対して分子的相互作用を検定するための競争的ＥＬＩＳＡ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ）のような機能性分析または細胞−基盤分析（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）のような機能性分析により阻害活性に対して検定することができる。その次に強い阻害活性に基づいて選ばれた単クローン抗体メンバーに対してＲＯＳ１に対するそれぞれの親和度（Ｋｄ  ｖａｌｕｅｓ）を検定することができる。
【００６５】
最終的に選ばれた抗体は、抗原結合部を除いた残りの部分がヒトの免疫グロブリン抗体化された抗体だけでなく、ヒト化抗体として製造して使用することができる。ヒト化抗体の製造方法は当業界によく知られている。
【００６６】
本発明の適用対象患者は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類でありうる。
【００６７】
前記癌は、固形癌または血液癌であり得、これに制限されないが、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌など）、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼球内黒色腫、直腸癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、白血病（例えば、慢性または急性白血病）、リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、頚部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳房癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、頭頚部癌、脳癌、骨肉腫などからなる群より選ばれた１種以上でありうる。前記癌は原発性癌または転移性癌でありうる。
【００６８】
一方、前記抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片は、ＲＯＳ１、特にＲＯＳ１のＮ−末端部位（例えば、上述したエピトープ部位）に特異的に結合するので、これを用いてＲＯＳ１を検出または確認することができる。したがって、本発明のまた他の例は、前記抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片を含むＲＯＳ１の検出用組成物を提供する。また他の例は、生物学的試料に前記抗ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片を処理する段階；および抗原−抗体反応の有無を確認する段階を含むＲＯＳ１の検出方法を提供する。前記検出方法において、抗原−抗体反応が確認（抗原−抗体複合体が検出）される場合、前記生物試料にＲＯＳ１が存在すると決定（判断）することができる。したがって、前記検出方法は、前記確認する段階以後に、抗原−抗体反応が探知される場合、前記生物学的試料にＲＯＳ１が存在すると決定する段階をさらに含みうる。前記生物学的試料は、哺乳類、例えばヒト（例えば癌患者）から得た（分離した）細胞、組織、体液、これらの培養物などからなる群より選ばれたものでありうる。前記ＲＯＳ１検出方法によって、前記抗ＲＯＳ１抗体のエピトープであるＲＯＳ１のＮ−末端部位だけでなく全長ＲＯＳ１も検出可能である。
【００６９】
前記診断方法またはＲＯＳ１の検出方法において、抗原−抗体反応の有無を確認する段階は当業界に公知された多様な方法により行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光および／または放射線検出により測定され得、具体的には、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、マイクロアレイなどからなる群から選ばれた方法によって測定されるが、これに制限されるものではない。
【００７０】
他の例において、上述した抗ＲＯＳ１抗体の重鎖相補性決定部位、軽鎖相補性決定部位、またはこれらの組み合わせ；または重鎖可変領域、軽鎖可変領域、またはこれらの組み合わせを含むポリペプチド分子が提供される。前記ポリペプチド分子は、抗体の前駆体として抗体製作に使用できるだけでなく抗体と類似の構造を有するタンパク質骨格体（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ；例えばペプチボディー）、二重特異抗体、多重特異抗体の構成成分で含まれ得る。
【００７１】
他の例は、抗ＲＯＳ１抗体の重鎖相補性決定部位、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子を提供する。
【００７２】
他の例は、抗ＲＯＳ１抗体の軽鎖相補性決定部位、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を提供する。
【００７３】
他の例は、前記抗ＲＯＳ１抗体の重鎖相補性決定部位、重鎖可変領域または重鎖を暗号化する核酸分子および抗ＲＯＳ１抗体の軽鎖相補性決定部位、軽鎖可変領域または軽鎖を暗号化する核酸分子を一つのベクターと共に含んだりそれぞれ別個のベクターに含む組換えベクターを提供する。
【００７４】
他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００７５】
用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用可能なベクターは当業界で頻用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９等）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３等）またはウイルス（例えば、ＳＶ４０等）を操作して製作することができる。
【００７６】
前記組換えベクターで前記核酸分子はプロモーターに作動的に連結されうる。用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。前記調節配列は「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」されることで他のヌクレオチド配列の転写および／または解読を調節することができる。
【００７７】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築することができる。前記発現用ベクターは当業界において植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公知された多様な方法により構築することができる。
【００７８】
前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主として構築することができる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボゾーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製起点は、ｆ１複製起点、ＳＶ４０複製起点、ｐＭＢ１複製起点、アデノ複製起点、ＡＡＶ複製起点およびＢＢＶ複製起点などを含むが、これに限定されるものではない。また、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウィルスプロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００７９】
他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００８０】
前記組換え細胞は、前記組換えベクターを適切な宿主細胞に導入させることによって得られたものありうる。前記宿主細胞は、前記組換えベクターを安定して連続的にクローニングまたは発現させ得る細胞であって当業界に公知されているいかなる宿主細胞も用いることができ、原核細胞としては、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＲＲ１、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラ・チフィリウム、セラチアマルセッセンスおよび多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあり、真核細胞に形質転換させる場合には宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｓｐ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）  Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株などが用いられるが、これに制限されるものではない。
【００８１】
前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬（導入）は、当業界に広く知られた運搬方法を用いることができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを用いることができ、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム−媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを用いることができるが、これに限定しない。
【００８２】
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を利用し、当業界に広く知られている方法により容易に実施することができる。例えば、前記選択標識が特定の抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含有された培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別することができる。
【００８３】
他の例は、前記核酸分子またはこれを含む組換えベクターを宿主細胞で発現させる段階を含む抗ＲＯＳ１抗体の製造方法を提供する。前記製造方法は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を培養する段階、および任意に培地から抗体を分離および／または精製する段階を含むものでありうる。
【００８４】
本明細書において、ＲＯＳ１のＮ−末端領域に反応する抗−ＲＯＳ１抗体またはその抗原結合断片が提供され、これらのエピトープがＲＯＳ１（ＮＰ＿００２９３５．２；配列番号９）のＤ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９の周囲に存在することを確認した。またＲＯＳ１のＤ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９に結合する抗体が同じＤＬＧＴ配列を有するＨｓｐ７０ｓと交差反応を示しうることを確認し、これらの抗体のＨＣＤＲ３に存在するｉｄｉｏｔｏｐｅｓの残基に突然変異（例えば、アミノ酸置換）を導入して抗体の特異性をより高めることができることを確認し、Ｈｓｐ７０のＩＤＬＧＴ配列からＲＯＳ１のＬＤＬＧＴ配列を正確に区別する抗体を提供する。
【発明の効果】
【００８５】
本明細書は、ＲＯＳ１  Ｎ末端部位に特異的に結合する抗−ＲＯＳ１抗体を提供することによって、ＲＯＳ１（Ｎ末端または全長）の検出をより正確でかつ効率的に行うことができるようにし、ＲＯＳ１の生物学的機能の研究およびＲＯＳ１と関連する病気の診断に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１Ａ】ＲＯＳ１に結合された３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質量を示すグラフである。
【図１Ｂ】ヒトＲＯＳ１（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）をコーディングするレンチウイルスベクターで形質感染したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物を３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質を処理して免疫沈殿させ、これを免疫ブロットにより確認した結果である。
【図１Ｃ】ＧＦＰ（対照；Ｃ）またはＲＯＳ１（Ｒ）をコーディングするレンチウイルスベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物に３Ｂ２０抗体を処理して免疫沈殿して分離したタンパク質分画をＭＳ分析した結果を示す。
【図２Ａ】ヒトＲＯＳ１タンパク質のＧｌｙ４２〜Ｓｅｒ５４部位でのアラニン置換突然変異誘発による３Ｂ２０エピトープの同定結果を示す図であり、図２Ａは３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質、図２ＢはＢＳＡ、２Ｃはｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ  ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質のアラニン置換突然変異体に対する反応性をそれぞれ示す。
【図２Ｂ】図２Ａ参照。
【図２Ｃ】図２Ａ参照。
【図３Ａ】３Ｂ２０および３Ｂ２０−Ｇ１Ｋの組換えＲＯＳ１（アミノ酸３７−２９０）−Ｃκ融合タンパク質に対する反応特異性をＥＬＩＳＡで測定した結果であり、図３Ａは３Ｂ２０の結果であり、図３Ｂは３Ｂ２０−Ｇ１Ｋの結果である。
【図３Ｂ】図３Ａ参照。
【図３Ｃ】ＲＯＳ１コーディングするレンチウイルスベクター（レーンＲ）または対照群ベクター（レーンＣ；ＧＦＰ）で形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物に３Ｂ２０、３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ、またはＲＯＳ１抗体（Ａｂｃａｍ社製品番号ａｂ５５１２）をそれぞれ処理して得られた免疫ブロット結果を示す。
【図３Ｄ】ＲＯＳ１コーディングするレンチウイルスベクター（レーンＲ）または対照群ベクター（レーンＣ；ＧＦＰ）で形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物を３Ｂ２０または３Ｂ２０−Ｇ１Ｋで免疫沈殿させた結果を示す結果である。
【図４】３Ｂ２０−Ｇ１Ｋを用いた免疫組織化学染色（ＩＨＣ）結果である。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
以下では実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず本発明の範囲を制限しようとするものではない。以下に記載された実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できることは当業者にとって自明である。
【００８８】
参照例１．抗−ＲＯＳ１  ｓｃＦｖ抗体の製造
ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（Ｐｅｐｔｒｏｎ；Ｄａｅｊｕｎ，Ｓ．  Ｋｏｒｅａ）に接合された合成ペプチド（ＴＮＬＧＱＱＬＤＬＧＴＰＨＮＬＳＥＰＧＧＧＣ（配列番号１６）；ＲＯＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２９３５．２）の３９番目から５６番目までのアミノ酸部位が「ＧＧＧＣ」と結合された融合ペプチド）で３匹の白色レグホン（Ｗｈｉｔｅ  Ｌｅｇｈｏｒｎ）ニワトリを免疫化させて３回追加接種（ｂｏｏｓｔ）した。ニワトリ単鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）抗体ライブラリーをディスプレイするファージを構築した［C.F. Barbas, Phage Display: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001参照］。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）に接合された前記ＲＯＳ１合成ペプチド（ＴＮＬＧＱＱＬＤＬＧＴＰＨＮＬＳＥＰＧＧＧＣ）に対してバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を５回行った後、前記ｓｃＦｖ−ディスプレイファージに対してＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を行った［C.F. Barbas, Phage Display: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; S. Park, D.H. Lee, J.G. Park, Y.T. Lee, J. Chung, A sensitive enzyme immunoassay for measuring cotinine in passive smokers, Clin. Chim. Acta 411 (2010) 1238-1242参照］。
【００８９】
その結果、前記合成ペプチド（ＴＮＬＧＱＱＬＤＬＧＴＰＨＮＬＳＥＰＧＧＧＣ；配列番号１６）に結合するｓｃＦｖを選別して３Ｂ２０と命名した。３Ｂ２０のＣＤＲおよび可変領域のアミノ酸配列を次の表１に整理した：
【表１】
2021503931.tif 000003
【００９０】
選別されたｓｃＦｖ（３Ｂ２０）をコーディングする遺伝子を変形されたｐＣＥＰ４  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ（V04450; Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA）にサブクローニングし、前記ｓｃＦｖがウサギ抗体断片結晶化可能領域Ｆｃ（ｒＦｃ）と融合した融合タンパク質（ｓｃＦｖ（３Ｂ２０）−ｒＦｃ融合タンパク質）［H. Kim, S. Park, H.K. Lee, J. Chung, Application of bispecific antibody against antigen and hapten for immunodetection and immunopurification, Exp. Mol. Med. 45 (2013) e43.参照］または前記ＳｃＦｖがヒトカッパ軽鎖不変領域（Ｃκ）と融合した融合タンパク質（ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質）［Y. Lee, H. Kim, J. Chung, An antibody reactive to the Gly63-Lys68 epitope of NT-proBNP exhibits O-glycosylation-independent binding, Exp. Mol. Med. 46 (2014) e114参照］を発現させた。前記得られた組換えタンパク質を精製した［O. Boussif, F. Lezoualc'h, M.A. Zanta, M.D. Mergny, D. Scherman, B. Demeneix, J.P. Behr, A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 (1995) 7297-7301参照］。
【００９１】
参照例２．ＥＬＩＳＡ
次の文献を参照してＥＬＩＳＡ分析を行った：［H. Kim, S. Park, H.K. Lee, J. Chung, Application of bispecific antibody against antigen and hapten for immunodetection and immunopurification, Exp. Mol. Med. 45 (2013) e43］。
マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を１００ｎｇの組換えＲＯＳ１（３７−２９０アミノ酸）−Ｃκ融合タンパク質、ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（組換えＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＮＰ＿００１０２５２１８．１））−Ｃκ融合タンパク質、合成ペプチド（ＴＮＬＧＱＱＬＤＬＧＴＰＨＮＬＳＥＰＧＧＧＣ）−ＢＳＡ接合体、またはＧＲＰ７５（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）をコーティング緩衝液（０．１  Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ，ｐＨ８．６）に溶解させたコーティング溶液でコートした。ブロックした後、３Ｂ２０−ｒＦｃまたは３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ（３Ｂ２０のＨＣＤＲ３の最初のアミノ酸ＧがＫに置換）−ｒＦｃ融合タンパク質を添加した。結合された抗体の量は、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）−接合された塩素抗−ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）および２，２０−ａｚｉｎｏｂｉｓ  ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ］−ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）基質溶液（Ａｍｒｅｓｃｏ  ＬＬＣ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ，ＵＳＡ）を使用して前記プレートに結合された抗体の量を測定した。すべての実験は３回ずつ行った。
【００９２】
３Ｂ２０  ｓｃＦｖのａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓのために、マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）を３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質１００ｎｇ、ウシ血清アルブミン１００ｎｇ、またはｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ  ｓｃＦｖ−Ｃκ１００ｎｇで４℃で一晩コートした。ブロックした後、前記プレートをアラニン置換ＲＯＳ１−ヒト抗体Ｆｃ（ｈＦｃ）融合タンパク質（ＲＯＳ１の４２番目アミノ酸残基（Ｇｌｙ）から５４番目アミノ酸残基（Ｓｅｒ）がそれぞれアラニンに置換される）または野生型ＲＯＳ１−ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベーションさせた。前記プレートに結合された融合タンパク質の量をＨＲＰ−結合ウサギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。
【００９３】
参照例３．形質導入およびＲＯＳ１−発現細胞株の確立
ｐＬｅｎｔｉ６−ｈｕｍａｎ  ＲＯＳ１−ＤＥＳＴ構造体を製作するために、Ｇａｔｅｗａｙ組換えクローニング技術およびＧａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造者の説明に従い、ｐＥＮＴＲ２２３．１−ｈｕｍａｎ  ＲＯＳ１（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）をｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）レンチウイルスベクターに導入させた。陰性対照群ウイルスを製造するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を同じレンチウイルスベクターにクローニングした。
【００９４】
その後、次の文献を参照してレンチウイルスを生産した：［J. Yin, G. Park, T.H. Kim, J.H. Hong, Y.J. Kim, X. Jin, S. Kang, J.E. Jung, J.Y. Kim, H. Yun, J.E. Lee, M. Kim, J. Chung, H. Kim, I. Nakano, H.S. Gwak, H. Yoo, B.C. Yoo, J.H. Kim, E.M. Hur, J. Lee, S.H. Lee, M.J. Park, J.B. Park, Correction: pigment epithelium-derived factor (PEDF) expression induced by EGFRvIII promotes self-renewal and tumor progression of glioma stem cells, PLoS Biol. 14 (2016) e1002367］。
【００９５】
６μｇ／ｍＬ  ｐｏｌｙｂｒｅｎｅの存在下で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）に前記準備されたｐＬｅｎｔｉ６−ｈｕｍａｎ  ＲＯＳ１−ＤＥＳＴまたはＧＦＰレンチウイルスを形質感染させた。［J. Yin, G. Park, J.E. Lee, J.Y. Park, T.H. Kim, Y.J. Kim, S.H. Lee, H. Yoo, J.H. Kim, J.B. Park, CPEB1 modulates differentiation of glioma stem cells via down-regulation of HES1 and SIRT1 expression, Oncotarget 5 (2014) 6756-6769］。前記形質感染された細胞を１０％（ｖ／ｖ）  ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００  ｍｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、および２  ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ）補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｓｅｏｕｌ，Ｓ．  Ｋｏｒｅａ）で３７℃および湿潤５％  ＣＯ２の条件で培養した。
【００９６】
参照例４．免疫ブロット（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）
次の文献を参照して免疫ブロット分析を行った：［H. Kim, S. Park, H.K. Lee, J. Chung, Application of bispecific antibody against antigen and hapten for immunodetection and immunopurification, Exp. Mol. Med. 45 (2013) e43］。
４−１２％（ｗ／ｖ）  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞溶解物を分離し、ニトロセルローズメンブレン（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）に移した。ブロックした後、前記メンブレンにプローブとして次の物質を固定化させた：３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質（２００  ｎｇ／ｍＬ）、３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質（１μｇ／ｍＬ）、抗−ＲＯＳ１抗体（ａｂ５５１２；Ａｂｃａｍ、６９Ｄ６；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）または抗−チューブリン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）。洗浄後、ＨＲＰ−接合された抗−ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ）またはＨＲＰ−結合された抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）とともに培養した。免疫ブロット結果はｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して視覚化した。
【００９７】
参照例５．免疫沈殿（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）
次の文献を参照して免疫沈殿を行った：［H. Kim, S. Park, H.K. Lee, J. Chung, Application of bispecific antibody against antigen and hapten for immunodetection and immunopurification, Exp. Mol. Med. 45 (2013) e43］。
ＲＯＳ１またはＧＦＰを過発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、およびｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を含むｃｏｌｄ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ［１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）］で溶解させた。前記得られた細胞溶解物をｒＦｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍＬ）と融合した３Ｂ２０  ｓｃＦｖまたは３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−Ｇ１Ｋ、およびｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｇａｒｏｓｅ  ｂｅａｄ（ＲｅｐｌｉＧｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）とともに培養した。洗浄後、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で沸かしてビードに結合されたタンパク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ブロット（参照例４参照）を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した溶出タンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ２５０（Ｍｅｒｃｋ）で染色して視覚化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで約７０ｋＤａおよび２６０ｋＤａに該当するタンパク質バンドを取って、ＭＳ（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析を行った（参照例９参照）。
【００９８】
参照例６．アラニン−置換タンパク質の製造
３Ｂ２０  ｓｃＦｖのエピトープマッピングのために、アラニンスキャニング突然変異誘発分析（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓａｙ）を行った。ＲＯＳ１（ＲＯＳ１の３７番目から２９０番目までのアミノ酸）をコーディングする遺伝子を鋳型として使用し、ＰＣＲ増幅によってＲＯＳ１の４２番目（Ｇｌｙ）から５４番目（Ｓｅｒ）までのアミノ酸残基の一つがアラニンに置換されたアミノ酸配列をコーディングする遺伝子を準備した。前記ＰＣＲは［Y. Lee, H. Kim, J. Chung, An antibody reactive to the Gly63-Lys68 epitope of NT-proBNP exhibits O-glycosylation-independent binding, Exp. Mol. Med. 46 (2014) e114］を参照して行い、アラニン置換に使用されたプライマーとＰＣＲ条件は次のとおりである。先に、９５℃で５分ＤＮＡの予備変性後、９５℃で３０秒のＤＮＡ変性、５６℃で３０秒のｐｒｉｍｅｒの結合、７２℃で３０秒の伸張過程を３０サイクル実行後、７２℃で５分間インキュベーションした後終了した。
【００９９】
プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（５’→３’）：ＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＧＴＧＴＡＡＣＴＡＡＴＣＴＧ［ＧＧＣ／ＣＡＧ／ＣＡＧ／ＣＴＴ／ＧＡＣ／ＣＴＴ／ＧＧＣ／ＡＣＡ／ＣＣＡ／ＣＡＴ／ＡＡＴ／ＣＴＧ／ＡＧＴ］ＧＡＡＣＣＧＴＧＴ（配列番号１７）；
ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（５’→３’）：ＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡ（配列番号１８）
（前記Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒにおいて、括弧内のそれぞれのコドンのうちアラニンに置換されるアミノ酸残基のコドンはアラニンをコーディングするコドンであるＧＣＣに置換される）。
【０１００】
得られたＰＣＲ産物を精製し、変形されたｐＣＥＰ４  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｖ０４４５０；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＳｆｉ  Ｉ（１１２８８０２４００１；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）制限酵素を使用してサブクローニングしてｈＦｃ［S. Park, D.H. Lee, J.G. Park, Y.T. Lee, J. Chung, A sensitive enzyme immunoassay for measuring cotinine in passive smokers, Clin. Chim. Acta 411 (2010) 1238-1242］との融合タンパク質形態に発現させて精製した。
【０１０１】
参照例７．３Ｂ２０  ｓｃＦｖのｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＨＣＤＲ３突然変異誘発ライブラリー
ＨＣＤＲ３でのｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｌｉｂｒａｒｙを生成するために、３Ｂ２０  ｓｃＦｖをコーディングする遺伝子をＰＣＲ増幅によってｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｃｏｄｏｎ  ＮＮＫ（Ｎはそれぞれ独立してＡ，Ｃ，ＧまたはＴ；ＫはＧまたはＴ）を使用してライブラリーを構築するための鋳型として使用した。最初の断片をｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣ−３’；配列番号１９）およびｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＣ−３’；配列番号２０）を使用してＰＣＲ増幅させ；二番目断片をｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＣＡＣＣＡＣＴＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡ［ＧＧＴ／ＧＧＴ／ＧＧＴ／ＧＧＴ／ＡＡＣ／ＡＴＣ／ＧＡＣ／ＧＣＡ］ＴＧＧＧＧＣＣＡＣ−３’；配列番号２１）およびｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＧＧＴＡＴＧＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧ−３’；配列番号２２）を使用してＰＣＲ増幅させた（参照例６参照）。上記実験に使用されたＰＣＲ条件は次のとおりである。９５℃で５分ＤＮＡの予備変性後、９５℃で３０秒のＤＮＡ変性、５６℃で３０秒ｐｒｉｍｅｒの結合、７２℃で３０秒の伸張過程を３０サイクル実行後、７２℃で５分間インキュベーションした後終了された。
【０１０２】
前記二番目断片のｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ配列のうち括弧内の各コドンはＮＮＫに置換した。その後、得られたＰＣＲ断片を精製しｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。Ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲはそれぞれの１００ｎｇのＰＣＲ断片を使用し、９５℃で５分ＤＮＡの予備変性後、９５℃で３０秒のＤＮＡ変性、５６℃で３０秒ｐｒｉｍｅｒの結合、７２℃で９０秒の伸張過程を２５サイクル実行後、７２℃で５分間インキュベーション過程後終了した。得られたｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ産物を精製し、ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ  ｐｈａｇｅｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ［C.F. Barbas, Phage Display: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001参照］にＳｆｉ  Ｉ制限酵素を使用してサブクローニングし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換させた［C.F. Barbas, Phage Display: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001参照］。ｏｕｔｐｕｔ  ｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅから、無作為に選ばれたコロニーでファージ（ｐｈａｇｅ）を救助（ｒｅｓｃｕｅ）し、ＥＬＩＳＡを行った［C.F. Barbas, Phage Display: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001参照］。
【０１０３】
参照例８．免疫組織化学法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＨＣ）
代表的なパラフィンワックスブロックを４ｍｍ厚さに切断し、自動化した免疫染色機（Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ，Ｔｕｓｃａｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）を用いてＩＨＣを行った。Ｖｅｎｔａｎａ  ＣＣ１  ｍｉｌｄ  ｒｅａｇｅｎｔで熱−誘導エピトープ回復を適用し、３％  Ｈ２Ｏ２を使用して１０分間内在的ペルオキシダーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）をブロッキングした。スライドを３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ−ｒＦｃ融合タンパク質（３００μｇ／ｍｌ  ｓｔｏｃｋ；１：１００希釈）と共に１時間インキュベーションした。ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅを使用して視覚化した。
【０１０４】
参照例９．Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＭＳ）  ａｎａｌｙｓｉｓ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（参照例５）で約７０ｋＤａおよび２６０ｋＤａのタンパク質バンドを切り出してｉｎ−ｇｅｌ  ｔｒｙｐｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行った［A. Shevchenko, H. Tomas, J. Havlis, J.V. Olsen, M. Mann, In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes, Nat. Protoc. 1 (2006) 2856‐2860参照］。切り出したタンパク質バンドを脱染させて（ｄｅｓｔａｉｎｅｄ）、２０ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌで還元させた後、５５ｍＭ  ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅでアルキル化させた。ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（ＡＣＮ）で脱水させた後、タンパク質を１２．５ｎｇ／μｌ変形トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）（ｉｎ  ５０ｍＭ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）で３７℃で一晩反応させて分解させた。５０％（ｖ／ｖ）  ＡＣＮ（ｉｎ  ０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（ＦＡ））を使用してゲルスライスからペプチドを抽出した。得られた溶出物をＣｅｎｔｒｉｖａｐ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ，ＵＳＡ）で乾燥させた。抽出されたペプチド試料を水に０．１％ギ酸（ｉｎ  ｗａｔｅｒ）に懸濁させ、ＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙ  Ｃ１８カラム（７５μｍ  ｘ  ５０ｃｍ  ｘ  ２μｍ）上にロードし、６５分間３００ｎＬ／ｍｉｎの流速で０．１％ギ酸（ｉｎ  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）の２−３５％勾配で分離した。ＭＳスペクトルはｎａｎｏ−ｕｌｔｒａ−ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｅａｓｙ−ｎＬＣ１０００；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でインターフェースされたＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に記録した。得られたＭＳ／ＭＳ  ｒａｗファイルはＴｒａｎｓ−Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．４）を用いてｍｚＸＭＬファイルに変換させ、ＳＯＲＣＥＲＥＲ（Ｓａｇｅ−Ｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）  ｐｌａｔｆｏｒｍでＳｅｑ
ｕｅｓｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２７）  ａｌｇｏｒｉｔｈｍを用いて分析した。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘ  ｈｕｍａｎ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．８３，１８６５７８  ｅｎｔｒｉｅｓ）を用いて検索を行った。Ｆｕｌｌ  ｔｒｙｐｓｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙおよび２個までの誤切断部位（ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ）が許容可能であった。ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎｓおよびｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｏｎｓに対する質量許容誤差（Ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅｓ）はそれぞれ１０ｐｐｍおよび１Ｄａに設定した。通常のｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅのためのｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎおよびメチオニン酸化のためのｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓが使用された。Ｓｃａｆｆｏｌｄ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．３．２；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を使用し、９９％以上のＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を有し、９５％以上のＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙを有するすべてのタンパク質を確認した。
【０１０５】
実施例１．ＲＯＳ１に対する３Ｂ２０抗体の反応性および質量分析（ＭＳ）
１．６ｘ１０１０のｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙとしてＲＯＳ１合成ペプチド（ＴＮＬＧＱＱＬＤＬＧＴＰＨＮＬＳＥＰＧＧＧＣ，ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ３９−５６  ｏｆ  ＲＯＳ１）に対して免疫化したニワトリを使用してｓｃＦｖライブラリーのファージディスプレイを生成した。バイオパニングにより、前記ライブラリーのうち、組換えＮ−末端ＲＯＳ１（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ３７−２９０）−Ｃκ融合タンパク質およびＲＯＳ１合成ペプチドのすべてに反応性を示すクローンである３Ｂ２０を選択した。組換え３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質を製造し、組換えＲＯＳ１タンパク質に対する反応性をＥＬＩＳＡにより評価した。
【０１０６】
より具体的には、９６−ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレートを組換えＲＯＳ１（３７番目から２９０番目までのアミノ酸部位）とカッパ不変領域（Ｃκ）の融合タンパク質またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に接合されたＲＯＳ１の３９番目から５６番目までのアミノ酸に該当する合成ペプチドでそれぞれコートし、ＢＳＡでブロックした後、３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質を添加し、ＲＯＳ１に結合された３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質量をＨＲＰ−接合された抗−ウサギＩｇＧ抗体およびＡＢＴＳ溶液を使用して測定することによって、３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質の反応性を評価した。前記得られた結果を図１Ａに示した。
【０１０７】
免疫沈殿分析は、参照例５を参照し、ヒトＲＯＳ１（全長）および３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質をコーディングするレンチウイルスベクターで形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物を使用して行った。免疫沈殿されたタンパク質はＲＯＳ１のＣ−末端部位に反応性を有する市販の抗−ＲＯＳ１抗体を使用して免疫ブロットにより分析し、その結果を図１Ｂに示した。より具体的には、図１ＢはヒトＲＯＳ１（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）をコーディングするレンチウイルスベクターで形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物を３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質を処理したり（レーン１）処理せず（レーン２）免疫沈殿（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させ（参照例５参照）、これを抗−ＲＯＳ１抗体（６９Ｄ６；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する免疫ブロットにより確認した結果である。図１Ｂに示すように、組換えＲＯＳ１に適する２６０ｋＤａの分子量に該当するバンドが明確に確認された。
【０１０８】
３Ｂ２０  ｓｃＦｖに反応するタンパク質を調べるために、ヒトＲＯＳ１（全長）またはＧＦＰ（対照群）をコーディングするレンチウイルスベクターで形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物に３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−ｒＦｃ融合タンパク質を処理して免疫沈殿を行った。３Ｂ２０  ｓｃＦｖタンパク質に結合されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動後、ゲルをクマシブルーで染色した。７０ｋＤａおよび２６０ｋＤａに該当するバンドをゲルで採取して液体クロマトグラフィー／ＭＳで分析した。得られた結果を図１Ｃに示し、図１Ｃで矢印で示す（Ａ）および（Ｂ）バンドで分析したタンパク質目録を下の表２に示した。予想通り、ＲＯＳ１（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＩＰＩ００２８９６５；配列番号９）が２６０ｋＤａのバンドで検出された。
【表２】
2021503931.tif 000004
【０１０９】
表１に示すように、約７０ｋＤａのバンドはＨｓｐ７０、Ｈｓｐ７１、ＧＲＰ７５およびＧＲＰ７８を含む熱ショックタンパク質と同定された。
【０１１０】
Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ７１、ＧＲＰ７５およびＧＲＰ７８タンパク質のアミノ酸配列をＲＯＳ１タンパク質のアミノ酸配列と比較した結果、これらすべてはＤＬＧＴのアミノ酸配列を共通して含むことが確認された。
【化１】
2021503931.tif 000005
【０１１１】
したがって我らは３Ｂ２０  ｓｃＦｖのエピトープがＲＯＳ１でＤ４６−Ｌ４７−Ｇ４８−Ｔ４９であると仮定した。
【０１１２】
実施例２．アラニンスキャニング突然変異誘発分析法（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓａｙ）による３Ｂ２０  ｓｃＦｖのエピトープマッピング
３Ｂ２０  ｓｃＦｖのエピトープをさらに確認するために、ＲＯＳ１タンパク質のアミノ酸残基３７−２９０に相応する組換えＲＯＳ１タンパク質を使用してアラニンスキャニング突然変異誘発分析を行った。まず、参照例６で説明されたように組換えＲＯＳ１タンパク質のＧｌｙ４２〜Ｓｅｒ５４のいずれか一つのアミノ酸残基がアラニンに置換されたＲＯＳ１突然変異を製造した。マイクロタイタープレートウェルを３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質、ＢＳＡまたはｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ  ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質でコートした後、プレートをアラニン置換されたＲＯＳ１−ｈＦｃ融合タンパク質または野生型ＲＯＳ１−ｈＦｃ融合タンパク質と共にインキュベーションした。プレートに結合されたＲＯＳ１−ｈＦｃ融合タンパク質の量をＨＲＰ−接合抗−ｈＦｃ抗体およびＡＴＢＳ溶液を使用して測定した。得られた結果を図２Ａ（３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質コーティング）、２ｂ（ＢＳＡコーティング）および２ｃ（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ  ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質コーティング）に示した。
【０１１３】
図２Ａに示すように、３Ｂ２０  ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質は、ＲＯＳ１タンパク質のＬ４５Ａ突然変異、Ｌ４７Ａ突然変異、およびＧ４８Ａ突然変異との反応性が顕著に減少することに対し、他の突然変異とは野生型ＲＯＳ１タンパク質と類似の反応性を示した。また、図２Ｂおよび２ｃに示すように、ＢＳＡまたは陰性対照群ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質は前記ＲＯＳ１突然変異体と反応しなかった。このような結果に基づいて、ＲＯＳ１のＬｅｕ４５、Ｌｅｕ４７およびＧｌｙ４８の３個の残基が３Ｂ２０  ｓｃＦｖとの結合特性に重要な役割をすると結論付けた。興味深い点は、Ｈｓｐ７０でＲＯＳ１のＬｅｕ４５に相応するアミノ酸残基はイソロイシンであった。この結果から３Ｂ２０抗体に突然変異を導入することによってＲＯＳ１のＬＤＬＧＴをＨｓｐ７０のＩＤＬＧＴ配列からより正確に区別してＲＯＳ１に対する特異性がより向上した単クローン抗体クローンを製造した。単クローン抗体のｉｄｉｏｔｏｐｅｓがＨＣＤＲ３を有しているので、ＨＣＤＲ３にこの突然変異を導入することを決定した。
【０１１４】
実施例３．ＨＣＤＲ３  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｌｉｂｒａｒｙから特異性が強化した変形ｓｃＦｖのスクリーニング
前記実施例２の結果に基づいて、Ｈｓｐ７０に反応しないが、ＲＯＳ１に反応する単クローン抗体クローンを生成するために、参照例７に記載された方法によりＨＣＤＲ３  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｌｉｂｒａｒｙを製作した。３Ｂ２０  ｓｃＦｖのＨＣＤＲ３領域（ＧＧＧＧＮＩＤＡ）は、８個のアミノ酸からなっており、、ＨＣＤＲ３のすべてのアミノ酸位置それぞれにＮＮＫ（Ｎはそれぞれ独立してＡ，Ｃ，Ｇ、またはＴ；ＫはＧまたはＴ）コドンを含むように設計されたＰＣＲプライマーを使用し、８個のＮＮＫファージディスプレイライブラリーを構築した（参照例７参照）。各ライブラリーで無作為に４８個のクローンを選択して組換えＲＯＳ１およびＧＲＰ７５に対してファージＥＬＩＳＡを行った。最初のアミノ酸残基無作為ライブラリーでＲＯＳ１にのみ反応し、ＧＲＰ７５には反応しないｍＡｂクローンを発見した。配列分析結果、３Ｂ２０  ｓｃＦｖのＨＣＤＲ３領域の一番目のアミノ酸残基であるグリシン（Ｇ）がリジン（Ｋ）に置換されていることを確認した。前記発見されたｍＡｂクローンは３Ｂ２０−Ｇ１Ｋと命名した。３Ｂ２０−Ｇ１ＫのＣＤＲおよび可変領域のアミノ酸配列を次の表３に整理した
【表３】
2021503931.tif 000006
【０１１５】
実施例４．３Ｂ２０−Ｇ１Ｋの増進した特異性
３Ｂ２０−Ｇ１Ｋの特異性をテストするために、組換え３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ  ｓｃＦｖ−Ｃκ融合タンパク質を製造した。前記製造された融合タンパク質に対してＥＬＩＳＡ、免疫ブロットおよび免疫沈殿分析を３Ｂ２０と並行して行った。より具体的には、マイクロタイタープレートウェルを１００ｎｇの組換えＲＯＳ１（アミノ酸３７−２９０）−Ｃκ融合タンパク質またはｉｒｒｅｌｅｖａｎｔタンパク質−Ｃκ融合分子でコートした。遮断後、３Ｂ２０−ｒＦｃ融合タンパク質または３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ−ｒＦｃ融合タンパク質を０〜２０００ｎｇ／ｍｌの濃度でウェルに添加し、ウェルに結合された融合タンパク質の量をＨＲＰ−接合抗−ウサギＩｇＧ抗体およびＡＢＴＳ溶液を使用してＥＬＩＳＡにより測定した。得られた結果を図３Ａ（３Ｂ２０−ｒＦｃ融合タンパク質）および３ｂ（３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ−ｒＦｃ融合タンパク質）にそれぞれ示した。図３Ａおよび３ｂに示すように、ＥＬＩＳＡ分析結果、３Ｂ２０−Ｇ１Ｋは２μｇ／ｍＬの高濃度でもＧＲＰ７５と反応せず、ＲＯＳ１にのみ反応したが、３Ｂ２０は５０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度でＧＲＰ７５と反応することが観察された。
【０１１６】
また、ＲＯＳ１（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）コーディングレンチウイルスベクター（レーンＲ）または対照群ベクター（レーンＣ；ＧＦＰ）で形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、ニトロセルローズメンブレンに移してブロッキングした後、メンブレンを３Ｂ２０、３Ｂ２０−Ｇ１ＫまたはＲＯＳ１に対する対照抗体（ａｂ５５１２；Ａｂｃａｍ）でプロービングして免疫ブロットを行った。得られた免疫ブロット結果を図３Ｃに示した。図３Ｃに示すように、ＲＯＳ１遺伝子で形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物（Ｒレーン）では組換えＲＯＳ１に該当する一つのバンドのみが観察されたことに対し（矢印で表示）、対照群ベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解物（Ｃレーン）では組換えＲＯＳ１に該当するバンドが観察されなかった。
【０１１７】
また、次の通り免疫沈殿分析を行った。ＲＯＳ１（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）コーディングレンチウイルスベクター（レーンＲ）または対照群ベクター（レーンＣ；ＧＦＰ）で形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を溶解させて３Ｂ２０（ｓｃＦｖ）−ｒＦｃ融合タンパク質および３Ｂ２０（ｓｃＦｖ）−Ｇ１Ｋ−ｒＦｃ融合タンパク質と共にインキュベーションさせ、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｇａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓと反応させた。洗浄後、ビードに結合されたタンパク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ビードに結合されたタンパク質はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色して可視化させた。得られた免疫沈殿分析結果を図３Ｄに示した。図３Ｄに示すように、３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ免疫沈殿物がロードしたレーンで組換えＲＯＳ１に相応する単一バンド（矢印で表示）と、３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ  ｓｃＦｖタンパク質（約５５ｋＤａ）に相応するバンドが観察された。
【０１１８】
実施例９．３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ単クローン抗体を用いたヒト肺腺癌のＩＨＣ分析
全長野生型ＲＯＳ１の検出において３Ｂ２０−Ｇ１Ｋ  ｓｃＦｖの適用可能性を評価するために、参照例８に記載された方法により、ヒトＲＯＳ１（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）をコーディングするレンチウイルスベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（陽性対照群）、ヒト肺腺癌（ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）組織（ｎ＝１００）（ソウル特別市ボラメ病院提供）、およびヒトＮｏｎ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ（Ｂｅｎｉｇｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａおよびａｌｖｅｏｌａｒ  ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅｓ）（ソウル特別市ボラメ病院提供）に対して免疫組織化学法（ＩＨＣ）を行い、その結果を図４に示した。
【０１１９】
図４の（Ａ）はヒトＲＯＳ１（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）をコーディングするレンチウイルスベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対するＩＨＣ結果であり、細胞質膜および細胞質のすべてにおいてＲＯＳ１が強く発現することがわかる（Ｘ４００）。図４の（Ｂ）は、ヒトＮｏｎ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ（Ｂｅｎｉｇｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａおよびａｌｖｅｏｌａｒ  ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅｓ）に対するＩＨＣ結果であり、ＲＯＳ１の発現が観察されなかった（ｘ１００）。図４の（Ｃ）−（Ｅ）はヒト肺腺癌（ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）組織に対するＩＨＣ結果であり、それぞれ低倍率（Ｃ；ｘ２００）、中倍率（Ｄ；ｘ２００）および高倍率（Ｅ；ｘ４００）、矢印は有糸分裂である）におけるＲＯＳ１発現を示す。図４の（Ｆ）はヒト肺腺癌組織でのｘ４００での観察した場合を示すものであり、細胞質膜と細胞質でＲＯＳ１−陽性結果が確認され、特に膜でのＲＯＳ１発現が増進されていることを確認することができる。
【０１２０】
図４示すように、陽性対照群として使用されたＲＯＳ１遺伝子で形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は膜と細胞質でＲＯＳ１発現が強力に示され（Ａ）；ヒトＮｏｎ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｌｕｎｇ  ｔｉｓｓｕｅであるＢｅｎｉｇｎ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａとａｌｖｅｏｌａｒ  ｐｎｅｕｍｏではＲＯＳ１−陰性結果が示され（Ｂ）；ヒト肺腺癌組織では多様な程度のＲＯＳ１発現を示し、約１０％の場合で強い陽性比率を示し、この場合ＲＯＳ１は主に細胞質膜に位置化（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）したが、特に強い陽性を示す場合には細胞質でも発現することが確認された（Ｃ−Ｆ）。
【図１Ａ】
2021503931.tif 000007
【図１Ｂ】
2021503931.tif 000008
【図１Ｃ】
2021503931.tif 000009
【図２Ａ】
2021503931.tif 000010
【図２Ｂ】
2021503931.tif 000011
【図２Ｃ】
2021503931.tif 000012
【図３Ａ】
2021503931.tif 000013
【図３Ｂ】
2021503931.tif 000014
【図３Ｃ】
2021503931.tif 000015
【図３Ｄ】
2021503931.tif 000016
【図４】
2021503931.tif 000017
【配列表】
2021503931000001.app
【国際調査報告】
2021503931.tif 000018
2021503931.tif 000019
2021503931.tif 000020
2021503931.tif 000021
2021503931.tif 000022
2021503931.tif 000023