(57)【要約】１つまたは複数の代謝モジュレータータンパク質、例えば、アディポカイン（例えば、レプチンまたはケメリン）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を発現する組換え腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）、ならびに例えば免疫療法抗がん処置における、がんを処置するためのそれらの使用の方法。一部の例では、かかる組換えＯＶおよび方法は、腫瘍または腫瘍微小環境中へのＴ細胞浸潤を増加させる。一部の実施形態では、腫瘍中へのＴ細胞の代謝リプログラミングを誘導することが可能な、例えば、腫瘍におけるＴ細胞の増強された浸潤を生じることが可能な、または腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答をモジュレートすることが可能な１つまたは複数のタンパク質をコードし得る核酸分子を含み得る組換え腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）が、本明細書で提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質をコードする核酸分子
を含む組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、セネカバレーウイルス、ＥＣＨＯウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルスまたはパロウイルスである、請求項１または２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ポックスウイルスまたはワクシニアウイルスである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
ＨＳＶである、請求項４に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
前記ＨＳＶがタリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−ＶＥＣ）である、請求項５に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
ポックスウイルスである、請求項４に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８】
前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスである、請求項７に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
前記ワクシニアウイルスが、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株のワクシニアウイルスである、請求項８に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質が、アディポカイン、インスリン、インスリン様成長因子１、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１から９のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１】
前記アディポカインが、レプチン、アディポネクチン、アペリン、ケメリン、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンまたはＣＴＲＰ−４である、請求項１０に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
前記アディポカインがレプチンである、請求項１１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
前記腫瘍溶解性ウイルスが前記ワクシニアウイルスであり、前記１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質がレプチンを含む、請求項８から１２のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質が融合タンパク質を含み、前記融合タンパク質が、第１のタンパク質および第２のタンパク質を含み、前記第１のタンパク質が、前記１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質のうちの１つを含む、請求項１から１３のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１５】
前記第２のタンパク質が、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび／または腫瘍壊死因子である、請求項１４に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１６】
前記第２のタンパク質がサイトカインである、請求項１４または１５に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１７】
前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γ、またはそれらの任意の組合せである、請求項１５または１６に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１８】
前記第１のタンパク質が、レプチン、インスリン、ケメリンまたはインスリン様成長因子１であり、前記第２のタンパク質が、インターロイキン（ＩＬ）−２またはＩＬ−１５である、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間にリンカーを含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２０】
前記腫瘍溶解性ウイルスがワクシニアであり、前記第１のタンパク質がＮ末端レプチンであり、前記第２のタンパク質が、Ｃ末端ＩＬ−２またはＩＬ−１５であり、前記第１のタンパク質および第２のタンパク質が、前記リンカーによって結合される、請求項１９に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２１】
前記１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質が、配列番号２、４、６または８に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の配列同一性を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２２】
前記１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質をコードする前記核酸分子が、配列番号１、３、５または７に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の配列同一性を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２３】
前記プロモーターが、前記１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質にとってネイティブではない、請求項２から２２のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２４】
前記プロモーターが構成的プロモーターである、請求項２から２３のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２５】
対象における腫瘍を処置する方法であって、
治療有効量の請求項１から２４のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスを、前記対象に投与し、それによって、前記腫瘍を処置するステップ；あるいは
治療有効量の１つもしくは複数の代謝をモジュレートするタンパク質または前記タンパク質（複数可）をコードする核酸分子を、前記対象に投与し、それによって、前記腫瘍を処置するステップ
を含む、方法。
【請求項２６】
腫瘍中へのＴ細胞浸潤を増加させる方法であって、
治療有効量の請求項１から２４のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスを、前記腫瘍を有する対象に投与し、それによって、前記腫瘍中へのＴ細胞浸潤を増加させるステップ；あるいは
治療有効量の１つもしくは複数の代謝をモジュレートするタンパク質または前記タンパク質（複数可）をコードする核酸分子を、前記腫瘍を有する前記対象に投与し、それによって、前記腫瘍中へのＴ細胞浸潤を増加させるステップ
を含む、方法。
【請求項２７】
前記腫瘍ががんである、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記がんが、肺、乳房、前立腺、肝臓、膵臓、皮膚、結腸、頭頸部、腎臓、子宮頸部または卵巣のがんである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記がんが黒色腫である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与するステップが全身投与を含む、請求項２５から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記投与するステップが腫瘍内投与を含む、請求項２５から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が哺乳動物対象である、請求項２２から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物対象がヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
治療有効量の１つまたは複数のさらなる治療を投与するステップをさらに含む、請求項２５から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記１つまたは複数のさらなる治療が、１つまたは複数のさらなる抗がん剤を投与することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記１つまたは複数のさらなる抗がん剤が、化学療法、放射線療法、生物製剤、手術、またはそれらの組合せを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記化学療法が、アルキル化剤、代謝拮抗薬、ホルモンまたはホルモンアンタゴニストのうちの１つまたは複数を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生物製剤が、
ＰＤ−１アンタゴニスト；
ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト；
ＣＴＬＡ４アンタゴニスト；
Ｔ細胞アゴニスト；または
それらの組合せ
を含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）請求項１から２４のいずれかに記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス；および
（ｂ）ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト、Ｔ細胞アゴニスト；またはそれらの組合せ
を含む、組成物またはキット。
【請求項４０】
前記Ｔ細胞アゴニストが、４−１ＢＢのアゴニスト、ＯＸ４０のアゴニスト、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＧＩＴＲ）のアゴニスト、またはそれらの組合せである、請求項３８に記載の方法または請求項３９に記載の組成物もしくはキット。
【請求項４１】
前記Ｔ細胞アゴニストが、モノクローナル抗体、アプタマーまたはリガンドである、請求項４０に記載の方法または組成物もしくはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が本明細書で参照により組み込まれる、２０１８年１月２６日出願の米国仮出願第６２／６２２，５４７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、１つまたは複数の代謝モジュレータータンパク質、例えばレプチンを発現する組換え腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）、それを含むキット、およびがんを処置するためのそれらの使用の方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
がん処置としての免疫療法に関連する成功は、腫瘍部位における免疫活性を理解しそれをモジュレートすることを主要な焦点にした、がん研究および臨床実務の両方において大きな転換をもたらしている。しかし、単剤免疫療法の現実は、患者の大部分が長期の持続的な利益を経験しないということである。この抵抗性は、複数の理由で生じる可能性があるが、１つは、Ｔ細胞を腫瘍に動員できないことであり、他は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞機能を制限する、より優勢な免疫抑制機構である（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２０１７；  １６８（４）：７０７−２３）。したがって、これらの抵抗性機構を克服できる新たな治療様式が必要とされている。
レプチンは、強力な代謝リプログラミング機能、例えば、グルコースおよび脂肪酸化ならびにミトコンドリア新生の促進を有するカノニカルなアディポカインである。しかし、今日まで、免疫におけるレプチンの研究は、治療的であることの確認に至ったことはなく、がん治療に関してはなおさらである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ２０１７；  １６８（４）：７０７−２３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによって誘導される高悪性度黒色腫の浸潤物が、本明細書で提供される。腫瘍溶解性ウイルスは、ロバストな腫瘍浸潤物の浸潤を促進するが、代謝不全に一部起因して、完全奏効を促進するにあたって最終的には無効であることが示されている。腫瘍浸潤性Ｔ細胞の代謝リプログラミングを促進することによって、観察された代謝不全を克服するためのツールとしてのレプチンの有用性が、本開示の一部の実施形態において実証される。レプチンを腫瘍微小環境において局所的に上昇させる新規黒色腫モデルを使用して、代謝リプログラミングに関連する強力なＴ細胞活性化および腫瘍制御が観察された。さらに、使用されるワクシニアウイルスは、レプチンを遺伝的に発現し、それを腫瘍微小環境に送達するように操作された。この治療は、野生型ウイルスと比較して、治療的完全奏効をもたらした。レプチン発現性ワクシニアウイルスは、腫瘍細胞を溶解させて新たなＴ細胞浸潤の刺激をもたらし、同時に、レプチンの局所的分泌を介してその浸潤物の活性を代謝的に支持もする。
【０００６】
一部の実施形態では、腫瘍中へのＴ細胞の代謝リプログラミングを誘導することが可能な、例えば、腫瘍におけるＴ細胞の増強された浸潤を生じることが可能な、または腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答をモジュレートすることが可能な１つまたは複数のタンパク質をコードし得る核酸分子を含み得る組換え腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）が、本明細書で提供される。例えば、一部の場合には、ＯＶは、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、ホルモン、例えば、アディポカイン（例えば、レプチン、アディポネクチン、アペリン、ケメリン（ｃｈｅｍｅｒｉｎ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）、ビスファチン、オメンチン、バスピン（ｖａｓｐｉｎ）、プログラニュリンまたはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１））をコードし得る１つまたは複数の核酸分子を含み得る。一部の例では、核酸は、プロモーターに作動可能に連結され得る。ＯＶの例には、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、Ｔ−ＶＥＣ）、ワクシニアウイルス（例えば、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株）、アデノウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、セネカバレー（Ｓｅｎｅｃａ  ｖａｌｌｅｙ）ウイルス、ＥＣＨＯウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルスまたはパロウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）が含まれる。一部の例では、組換えＯＶは、配列番号２、４、６または８に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する組換えタンパク質を発現する。一部の例では、組換えＯＶは、配列番号１、３、５または７に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する、代謝をモジュレートするタンパク質をコードする核酸分子を含む。一部の例では、組換えＯＶによって発現される代謝をモジュレートするタンパク質（複数可）は、融合タンパク質、例えば、２つの部分：（１）代謝をモジュレートするタンパク質、および（２）第２のタンパク質（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインおよび／または腫瘍壊死因子）を含む融合タンパク質の一部である。一例では、融合タンパク質は、そのＮ末端に代謝をモジュレートするタンパク質を有し、そのＣ末端にサイトカインを有する。一部の例では、融合タンパク質の２つの部分は、リンカー（例えば、ＧＳＧペプチド）によって結合される。具体的な例では、組換えＯＶは、レプチン−リンカー−ＩＬ−２、レプチン−ＩＬ−２、レプチン−リンカー−ＩＬ−１５またはレプチン−ＩＬ−１５を含む融合タンパク質を発現する。
【０００７】
腫瘍もしくは腫瘍微小環境、またはその両方中へのＴ細胞浸潤を増加させる、対象における腫瘍を処置する方法もまた提供される。一部の例では、かかる方法は、治療有効量の本明細書に開示される１つまたは複数の組換えＯＶを、対象に投与し、それによって、腫瘍を処置するステップを含む。一部の例では、かかる方法は、治療有効量の１つもしくは複数の代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよび／またはインスリン様成長因子１）またはタンパク質（複数可）をコードする核酸分子を、対象に投与し、それによって、腫瘍を処置するステップを含む。一部の例では、腫瘍は、がん、例えば、肺、乳房、前立腺、肝臓、膵臓、皮膚、結腸、頭頸部、腎臓、子宮頸部または卵巣のがんである。具体的な例では、がんは、黒色腫である。具体的な例では、がんは、乳がんである。かかる方法は、治療有効量の（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ）１つまたは複数のさらなる治療、例えば、さらなる抗がん剤、例えば、化学療法、放射線療法、生物製剤、手術、またはそれらの組合せを投与するステップをさらに含み得る。一例では、抗がん剤には、１つもしくは複数の免疫調節剤、例えば、ＰＤ−１のアンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１のアンタゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニストおよびＴ細胞アゴニスト（例えば、４−１ＢＢのアゴニスト、ＯＸ４０のアゴニスト、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＧＩＴＲ）のアゴニスト）、またはそれらの組合せが含まれる。一例では、抗がん剤には、Ｔ細胞アゴニスト、例えば、４−１ＢＢのアゴニスト、ＯＸ４０のアゴニストまたはＧＩＴＲのアゴニスト（例えば、免疫チェックポイントタンパク質、例えば、上に列挙したタンパク質のうちの１つに対して特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、これらのタンパク質のうちの１つのリガンド、またはこれらのタンパク質のうちの１つのアプタマー）が含まれる。
【０００８】
（１）本明細書で提供される１つまたは複数の組換えＯＶ、ならびに（２）免疫調節剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）、例えば、ＰＤ−１のアンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１のアンタゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニストおよびＴ細胞アゴニスト（例えば、４−１ＢＢのアゴニスト、ＯＸ４０のアゴニストまたはＧＩＴＲのアゴニスト）のうちの１つまたは複数を含み得るキットおよび組成物もまた提供される。キットの成分は、別々のコンテナ中にあり得る。一部の例では、キットは、（１）本明細書で提供される１つまたは複数の組換えＯＶ、および（２）Ｔ細胞アゴニスト（例えば、４−１ＢＢのアゴニスト、ＯＸ４０のアゴニスト、ＧＩＴＲのアゴニスト、またはそれらの組合せ）を含む。一部の例では、組成物は、（１）本明細書で提供される１つまたは複数の組換えＯＶ、および（２）１つまたは複数のＴ細胞アゴニスト（例えば、４−１ＢＢのアゴニスト、ＯＸ４０のアゴニストまたはＧＩＴＲのアゴニスト）を含む。かかる組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。一部の例では、かかる組成物（ｓｕｃｈ  ａｓ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、凍結乾燥される。一部の例では、かかる組成物は、コンテナ、例えば、ガラスまたはプラスチックコンテナ中に存在する。
【０００９】
本開示の上述のおよび他の目的および特色は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｃは、Ｐｔｅｎｆ／ｆＢｒａｆＬＳＬ−Ｖ６００ＥＴｙｒＣｒｅ．ＥＲＴ２マウスからのクローン２４の生成、およびＣＬ２４レプまたはＣＬ２４ハイグロ保有マウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を示す図である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＬ２４を注射したマウス由来であった。ＬＮおよびＴＩＬ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞についての代表的なフローサイトグラムおよび表形式のフローサイトメトリーデータ。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＣＬ２４を注射したマウス由来であった。次いで、腫瘍を、一日おきに抗ＰＤ１で処置し、腫瘍成長をモニタリングした。ＬＮおよびＴＩＬにおけるＣＤ８およびＣＤ４染色の代表的なフローサイトグラム。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、抗ＣＤ８（２００ｕｇ）で一日おきに処置した。６日目に、マウスに、ＣＬ２４ハイグロまたはＣＬ２４レプチンのいずれかを注射した。
【図１−２】同上。
【００１１】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｃは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、レプチン発現の操作を介して増強され得る強力な免疫刺激活性を有することを示す図である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＣＬ２４細胞を真皮下注射した。腫瘍細胞注射の５〜７日後、腫瘍を、ＰＢＳ、２．５×１０６ＰＦＵの対照ワクシニアウイルス（ＶＶ対照）で腫瘍内処置し、腫瘍成長をモニタリングした。各線は、個々のマウスを示す。（Ｂ）４０００細胞の、（Ａ）のように処置したＣＤ４５＋選別された細胞についての単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータ。細胞を、７日目に抽出した。データを、Ｓｅｕｒａｔプログラムを介した教師なしクラスタリングによって生成した。（Ｃ）ＰＢＳおよびＶＶ対照処置したマウスのｔ−ＳＮＥ分析。データは、１条件当たりｎ＝２を示す。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【００１２】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｃは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで処置したＴＩＬからの単一細胞ＲＮＡ配列決定分析を示す図である。（Ａ、Ｂ）異なるリンパ球集団を規定する遺伝子のフィーチャプロット。紫色の強度は、遺伝子発現の正規化されたレベルを示した。（Ｃ）Ｓｅｕｒａｔ（ＳＬＭクラスタリング）を使用してクラスタリングされた、ＰＢＳ、ＶＶ対照またはＶＶレプチン処置後のＣＤ４５＋ＴＩＬからのトランスクリプトーム（１条件当たりｎ＝２）。各欄は、各クラスター間で最も示差的に発現された所与の遺伝子（ｔｈｅ  ｇｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ）を有する細胞を示す。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【００１３】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｄは、レプチン受容体が腫瘍浸潤性Ｔ細胞において上方調節されること、およびレプチンが代謝リプログラミングが可能であることを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＣＬ２４細胞を真皮下注射した。腫瘍細胞注射の５〜７日後、腫瘍を、ＰＢＳ、対照ワクシニアウイルス（ＶＶ対照）で腫瘍内処置した。（Ａ）（Ａ）のように処置したマウスからのＬＮおよびＴＩＬに対するＣＤ８およびＣＤ４発現分析。ＬＮおよびＴＩＬにおけるＣＤ８およびＣＤ４染色の代表的なフローサイトグラム、ならびに表形式のフローサイトメトリーデータ。（Ｂ）（Ａ）のように処置したマウスからの、阻害分子ＰＤ１およびＴＩＭ３の発現。ＬＮおよびＴＩＬにおけるＰＤ１およびＴｉｍ３染色の代表的なフローサイトグラム、ならびに表形式のフローサイトメトリーデータ。（Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞上の代表的なヒストグラムＰＤ１発現、および表形式のデータ。（Ｄ）（Ａ）のように処置したマウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色によって分析したミトコンドリア含量。ＬＮおよびＴＩＬにおける２ＮＢＤＧ染色に対するｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒの代表的なフローサイトグラム、ならびに表形式のフローサイトメトリーデータ。データは、少なくとも３回の独立した実験を示す。対応のあるｔ検定によって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【００１４】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｅは、レプチン受容体が腫瘍浸潤性Ｔ細胞において上方調節されること、およびレプチンが代謝リプログラミング可能であることを示す図である。（Ａ）抗ＣＤ２８（２ｕｇ／ｍＬ）の存在下で２４時間にわたり、３ｕｇ／ｍの固定化された抗ＣＤ３で活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なＯＣＲトレースならびに表形式のＯＣＲおよび予備呼吸能（ＳＲＣ）。細胞を、０．０、０．１および１．０ｎＭのマウス組換えレプチンで２４時間処理した。（Ｂ）（Ａ）のように処理した細胞についての代表的なＥＣＡＲトレース。（Ｃ）（Ａ）のように処置したマウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞における、ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色によって分析したミトコンドリア含量および２ＮＢＤＧ染色によるグルコース取込み。ＬＮおよびＴＩＬにおける２ＮＢＤＧ染色に対するｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒの代表的なフローサイトグラム、ならびに表形式のフローサイトメトリーデータ。（Ｄ）腫瘍保有マウス由来の、マウスリンパ節（ＬＮ）由来のＣＤ８＋Ｔ細胞および腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＩＬ）のレプチン受容体染色。（Ｅ）ＬＮおよびＴＩＬ中のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ１およびＴｉｍ３の、レプチン受容体発現染色。データは、少なくとも３回の独立した実験を示す。対応のないｔ検定によって＊ｐ＜０．０５。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。データは、少なくとも３回の独立した実験を示す。対応のあるｔ検定によって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【００１５】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｆは、腫瘍細胞におけるレプチン過剰発現の特徴付けおよび腫瘍微小環境における効果を示す図である。（Ａ）対照プラスミド（ＣＬ２４ハイグロ）およびマウスレプチン遺伝子プラスミド（ＣＬ２４レプチン）で安定に形質導入されたＣＬ２４細胞系のマウスレプチンタンパク質発現のイムノブロット分析。（Ｂ）対照プラスミドおよびレプチン遺伝子で形質導入された細胞の培地中のレプチンのＥＬＩＳＡ分析。（Ｃ）ＣＬ２４ハイグロ細胞系とＣＬ２４レプチン細胞系との間でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長分析。（Ｈ）ＣＬ２４ハイグロおよびＣＬ２４レプチンを注射したマウスからのＬＮおよびＴＩＬに対する、それぞれナチュラルキラー細胞およびＢ細胞についてのＮＫ１．１およびＢ２２０分析。（Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、抗ＣＤ８（２００ｕｇ）で一日おきに処置した。６日目に、マウスに、ＣＬ２４ハイグロまたはＣＬ２４レプチンのいずれかを注射し、腫瘍成長をモニタリングした。リンパ節（ＬＮ）におけるＣＤ８およびＣＤ４発現分析。（Ｅ）ＬＮおよびＴＩＬにおけるＮＫ１．１およびＢ２２０染色についての代表的なフローサイトグラム、ならびに表形式のフローサイトメトリーデータが示される。（Ｆ）ｐＳＴＡＴ３、ｐＡＫＴおよびｐｐ３８ＭＡＰＫ発現について分析した、ＣＬ２４ハイグロおよびＣＬ２４レプチンを注射したマウスからのＬＮおよびＴＩＬ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞についての代表的なフローサイトグラムおよび表形式のフローサイトメトリーデータ。データは、少なくとも３回の独立した実験を示す。二元配置ＡＮＯＶＡによって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【００１６】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｇは、がん細胞におけるレプチンの発現が、免疫媒介性腫瘍制御をもたらし、腫瘍浸潤性リンパ球の機能を代謝的に改善することを示す図である。（Ａ）ＣＬ２４ハイグロおよびＣＬ２４レプチンを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに真皮下注射し、腫瘍成長をモニタリングした。各線は、個々のマウスを示す。（Ｂ）（Ａ）のように処置したマウスの生存プロット。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、抗ＣＤ８（２００ｕｇ）で一日おきに処置した。６日目に、マウスに、ＣＬ２４ハイグロまたはＣＬ２４レプチンのいずれかを注射し、腫瘍成長をモニタリングした。（Ｄ）ＣＬ２４ハイグロおよびＣＬ２４レプチンを注射したマウスからのＬＮおよびＴＩＬに対するＣＤ８およびＣＤ４発現分析。ＬＮおよびＴＩＬにおけるＣＤ８およびＣＤ４染色の代表的なフローサイトグラム、ならびに表形式のフローサイトメトリーデータ。（Ｅ）ＣＬ２４ハイグロおよびＣＬ２４レプチンを注射したマウスからのＬＮおよびＴＩＬの代表的なフローサイトグラム。細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγおよびＴＮＦαについての染色によるサイトカイン産生分析のために、ＰＭＡおよびイオノマイシンで一晩刺激した。表形式のフローサイトメトリーデータが示される。（Ｆ）Ｋｉ６７発現ならびに代謝マーカーＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  ＦＭ染色および２ＮＢＤＧ取込み（Ｇ）について分析した、ＣＬ２４ハイグロおよびＣＬ２４レプチンを注射したマウスからのＬＮおよびＴＩＬ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞についての代表的なフローサイトグラムおよび表形式のフローサイトメトリーデータ。データは、少なくとも３回の独立した実験を示す。対応のあるｔ検定によって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図７−４】同上。
【図７−５】同上。
【００１７】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｆは、レプチン操作された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、感染力に影響を与えることなしにレプチン分泌をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで誘導することを示す図である。（Ａ）２．５×１０６ＰＦＵのＶＶレプチンでｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間および４８時間処理したＣＬ２４細胞系のマウスレプチンタンパク質発現のイムノブロット分析。（Ｂ）ＶＶレプチンで処理したＣＬ２４細胞の培地中のレプチンのＥＬＩＳＡ分析。（Ｃ）ＶＶ対照またはＶＶレプチンで処置した腫瘍の間質液中のレプチンのＥＬＩＳＡ分析。白色脂肪組織（ＷＡ）由来の間質液を対照として使用した。データは、少なくとも３回の独立した実験を示す。二元配置ＡＮＯＶＡによって＊ｐ＜０．０５。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。（Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＣＬ２４細胞を真皮下注射した。腫瘍細胞注射の５〜７日後、腫瘍を、ＰＢＳ、ＶＶ対照またはＶＶレプチンで腫瘍内処置した。２４時間後、マウスにルシフェリン（３０ｍｇ／ｍｌ）を１０分間ＩＰ注射し、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光イメージングを実施した。（Ｅ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＣＬ２４細胞を真皮下注射した。腫瘍細胞注射の５〜７日後、腫瘍を、ＰＢＳ、ＶＶ対照またはＶＶレプチンで腫瘍内処置した。処置後１０日目に、リンパ球を、ＴＩＬから単離した。レプチン受容体（レプチンＲ）発現についての代表的なフローサイトグラムおよび表形式のフローサイトメトリーデータ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。（Ｆ）ＰＢＳ、ＶＶ対照またはＶＶレプチンを注射したマウスからのＬＮおよびＴＩＬ由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞（Ｔ調節性細胞）についての代表的なフローサイトグラムおよび表形式のフローサイトメトリーデータ。データは、少なくとも３回の独立した実験を示す。二元配置ＡＮＯＶＡによって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【００１８】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｅは、レプチン操作されたワクシニアウイルスが、メモリー様Ｔ細胞クローンの蓄積を促進することを示す図である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＣＬ２４細胞を真皮下注射した。腫瘍細胞注射の５〜７日後、腫瘍を、ＰＢＳ、２．５×１０６ＰＦＵのＶＶ対照またはＶＶレプチンで腫瘍内処置し、腫瘍成長をモニタリングした。各線は、個々のマウスを示す。処置後１０日目に、リンパ球を、ＴＩＬおよびＬＮから単離した。（Ｂ）ＣＤ８およびＣＤ４発現についての代表的なフローサイトグラムおよび表形式のフローサイトメトリーデータ。（Ｃ〜Ｄ）ＰＢＳ、２．５×１０６ＰＦＵのＶＶ対照またはＶＶレプチンで腫瘍内処置したＣＬ２４保有マウスから抽出したゲノムＤＮＡのＴＣＲ配列決定（各処置についてｎ＝５）。（Ｃ）鋳型総数および生産的再編成。（Ｄ）試料のクローン性および平均頻度の分析。（Ｅ）マウスを、（Ａ）のように処置した。ＣＤ１２７発現について染色したＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なヒストグラム（ｈｙｓｔｏｇｒａｍ）および表形式のフローサイトメトリーデータ。データは、少なくとも３回の独立した実験を示す。二元配置ＡＮＯＶＡによって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図９−４】同上。
【００１９】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｃは、レプチンが、代謝リプログラミングを介して、腫瘍溶解性ウイルス誘導されたＴ細胞浸潤を質的に改善することを示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＣＬ２４細胞を真皮下注射した。腫瘍細胞注射の５〜７日後、腫瘍を、ＰＢＳ、ＶＶ対照またはＶＶレプチンで腫瘍内処置した。処置後１０日目に、リンパ球を、ＴＩＬおよびＬＮから単離した。（Ａ）ＬＮおよびＴＩＬから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なヒストグラムおよび表形式のフローサイトメトリーデータを、ミトコンドリアタンパク質ＶＤＡＣについて分析した。（Ｂ）単離されたリンパ球を、ＰＭＡおよびイオノマイシンで一晩刺激した。ＩＦＮγおよびＴＮＦαについての染色によるサイトカイン産生分析のための代表的なフローサイトグラムおよび表形式のフローサイトメトリーデータ。（Ｃ）Ｋｉ６７発現について分析した、（Ａ）のように処置したマウスからのＬＮおよびＴＩＬ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞についての代表的なヒストグラムおよび表形式のフローサイトメトリーデータ。データは、少なくとも３回の独立した実験を示す。二元配置ＡＮＯＶＡによって＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を示す。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列表
添付の配列表に列挙された核酸およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．８２２で規定される通り、ヌクレオチド塩基について標準的な文字略称を使用し、アミノ酸については３文字コードを使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、相補鎖は、示された鎖への任意の言及によって含まれると理解される。２０１８年１月２８日に作成された、３２ｋｂを有する本明細書で提出された配列表は、本明細書で参照により組み込まれる。
【００２１】
配列番号１および２：それぞれ、例示的なヒトレプチンの核酸およびタンパク質配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０００２３０．２およびＮＰ＿０００２２１．１を参照のこと）。コード配列は、配列番号１のｎｔ５８〜５６１である。シグナルペプチドは、配列番号２のａａ１〜２１であり、成熟ペプチドは、ａａ２２〜１６７である。
【００２２】
配列番号３および４：それぞれ、例示的なヒトインスリンの核酸およびタンパク質配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＨ００２８４４．２およびＡＡＡ５９１７２．１を参照のこと）。コード配列は、配列番号３のｎｔ２４２４．．２６１０、３３９７．．３５４２である。シグナルペプチドは、配列番号４のａａ１〜２４であり、成熟ペプチドは、ａａ２５〜１１０である。
【００２３】
配列番号５および６：それぞれ、例示的なヒトケメリン（レチノイン酸受容体レスポンダータンパク質２としても公知）の核酸およびタンパク質配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００２８８９．３およびＮＰ＿００２８８０．１を参照のこと）。コード配列は、配列番号５のｎｔ１１８〜６０９である。シグナルペプチドは、配列番号６のａａ１〜２０であり、成熟ペプチドは、ａａ２１〜１５７である。
【００２４】
配列番号７および８：それぞれ、例示的なヒトインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）の核酸およびタンパク質配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１１１１２８３．２およびＮＰ＿００１１０４７５３．１を参照のこと）。コード配列は、配列番号７のｎｔ２６５〜７４１である。シグナルペプチドは、配列番号８のａａ１〜２１であり、成熟ペプチドは、ａａ４９〜１１８である。
詳細な説明
【００２５】
特記しない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９９；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，  １９９４；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５；ならびに他の同様の参考文献において見出され得る。
【００２６】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、単数ならびに複数の両方を指し得る。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味し得る。したがって、「核酸分子を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、他の要素を排除することなく、「核酸分子を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し得る。核酸について与えられる任意のおよび全ての塩基サイズはおおよそであり、特記しない限り、説明目的で提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な多くの方法および材料が使用され得るが、特定の適切な方法および材料は、以下に記載される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定は意図しない。特許出願および特許、ならびに列挙したＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号（２０１８年１月２６日現在）に関連する配列を含む全ての参考文献は、本明細書で参照により組み込まれる。
本開示の種々の実施形態の精査を促進するために、具体的な用語の以下の説明が提供される：
【００２７】
投与：任意の有効な経路によって、開示される組換えＯＶまたは他の治療剤（例えば、抗がん剤）などの薬剤を、対象に提供することまたは与えること。投与の例示的な経路には、注射（例えば、皮下、真皮下、筋肉内、真皮内、腹腔内、腫瘍内および静脈内）、経皮、鼻腔内、経口、膣、直腸および吸入経路が含まれるがこれらに限定されない。
【００２８】
がん：異常なまたは制御されない細胞成長によって特徴付けられる悪性腫瘍。がんにしばしば関連する他の特色には、転移、隣接する細胞の正常な機能の妨害、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、および炎症性または免疫学的応答の抑制または悪化、周囲のまたは遠位の組織または臓器、例えば、リンパ節の浸潤などが含まれる。「転移性疾患」は、元の腫瘍部位を離れ、例えば血流またはリンパ系を介して身体の他の部分に遊走するがん細胞を指す。
【００２９】
ケメリン：（例えば、ＯＭＩＭ  ６０１９７３）：レチノイン酸受容体レスポンダータンパク質２（ＲＡＲＲＥＳ２）としても公知。ケメリンは、Ｇタンパク質共役受容体ＣＭＫＬＲ１に対するリガンドとして作用する化学誘引タンパク質である。脂肪細胞分化およびグルコース取込みにおけるその役割に起因して、ケメリンは、アディポカインとして分類される。ヒトケメリンは、第７染色体上のＲＡＲＲＥＳ２遺伝子によってコードされ、ネイティブタンパク質は約１４ｋＤａであり、プロケメリン（ｐｒｏｃｈｅｍｅｒｉｎ）として不活性形態で分泌され、炎症性および凝固セリンプロテアーゼによるＣ末端の切断を介して活性化される。ケメリン配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから、公に入手可能である（例えば、受託番号ＮＰ＿００２８８０．１およびＮＰ＿００１０１３４４５．１は、例示的なケメリンタンパク質配列を提供するが、受託番号ＮＭ＿００２８８９．３およびＮＭ＿００１０１３４２７．１は、例示的なケメリン核酸配列を提供する）。当業者は、ケメリンバリアント、例えば、これらのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するもの、例えば、配列番号６のペプチドａａ２１〜１５７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するものを含む、さらなるケメリンの核酸およびタンパク質配列を同定することができる。
【００３０】
接触：固体または液体形態を含む、直接的な物理的関連状態にある配置。接触は、例えば、試薬を試料（例えば、腫瘍細胞を含有する試料）に添加することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで生じ得、または対象に投与することによってｉｎ  ｖｉｖｏで生じ得る。
【００３１】
有効量（または治療有効量）：有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な薬剤（例えば、本明細書に開示される組換えＯＶ、ならびに他の抗がん剤）の量。
【００３２】
有効量（治療有効量とも呼ばれる）は、以下のうちの１つまたは複数に依存して変動し得る：当業者によって容易に決定され得る、処置されている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式など。有益な治療効果には、診断的決定の実施可能性；疾患、症状、障害または病理学的状態の軽快；疾患、症状、障害もしくは状態を低減させることまたはそれらの開始を予防すること；および疾患、症状、障害または病理学的状態に広く対抗することが含まれ得る。
【００３３】
一実施形態では、「有効量」（例えば、レプチン、インスリン、ケメリンまたはＩＧＦ−１タンパク質の、かかるタンパク質を発現する本明細書に開示される組換えＯＶの）は、腫瘍の体積／サイズ、腫瘍の重量、転移の数／程度を、転移の体積／サイズ、転移の重量、またはそれらの組合せを、例えば、（治療剤の投与なしと比較して）少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％低減させるのに十分な量であり得る。一実施形態では、「有効量」（例えば、レプチン、インスリン、ケメリンもしくはＩＧＦ−１の、またはかかるタンパク質を発現するＯＶの）は、例えば、腫瘍または腫瘍微小環境中へのＴ細胞浸潤を、（治療剤の投与なしと比較して）少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させるのに十分な量であり得る。
【００３４】
融合（またはキメラ）タンパク質：少なくとも２つの異なる（異種）タンパク質またはペプチド由来のアミノ酸配列を含有するタンパク質。融合タンパク質は、例えば、２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸配列から操作された核酸配列の発現によって生成され得る。融合タンパク質を創出するために、核酸配列は、典型的には、同じリーディングフレーム中にあり、内部停止コドンを含有しない。一例では、代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、アディポカイン（例えば、レプチンまたはケメリン）、インスリンまたはＩＧＦ−１）およびサイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）を含む融合タンパク質が、本明細書で提供されるＯＶによって発現され得る。
【００３５】
融合タンパク質は、直接またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して結合され得る第１の部分および第２の部分を含む。一部の例では、第１の部分は、代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、アディポカイン（例えば、レプチンまたはケメリン）、インスリンまたはＩＧＦ−１）であり、第２の部分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）である。一部の例では、第１の部分はＮ末端であり、第２の部分はＣ末端である。一部の例では、第１の部分はＣ末端であり、第２の部分はＮ末端である。
【００３６】
インスリン：（例えば、ＯＭＩＭ  １７６７３０）：膵島細胞のベータ細胞によって産生されるホルモン。これは、例えば、血液から肝臓、脂肪および骨格筋細胞中への、炭水化物、特にグルコースの吸収を促進することによって、炭水化物、脂肪およびタンパク質の代謝を調節した。ヒトインスリンは、第１１染色体上のＩｎｓ遺伝子によってコードされる。脊椎動物では、インスリンのアミノ酸配列は、強く保存されている。ウシインスリンは、３つのアミノ酸残基だけがヒトとは異なり、ブタインスリンは、１つのアミノ酸残基が異なる（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎ  ｏｎ）。インスリン配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから、公に入手可能である（例えば、受託番号ＡＡＡ５９１７２．１およびＡＡＡ４１４３９．１は、例示的なインスリンタンパク質配列を提供するが、受託番号ＡＨ００２８４４．２およびＶ０１２４２．１は、例示的なインスリン核酸配列を提供する）。当業者は、インスリンバリアント、例えば、これらのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するもの、例えば、配列番号４のペプチドａａ２５〜１１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するものを含む、さらなるインスリンの核酸およびタンパク質配列を同定することができる。
【００３７】
インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）：（例えば、ＯＭＩＭ  １４７４４０）：ソマトメジンＣとも呼ばれ、肝臓によって優勢に作製されるホルモンであり、成長ホルモンによって刺激される。ヒトＩＧＦ−１は、第１２染色体上のＩＧＦ１遺伝子によってコードされ、ネイティブタンパク質は、７０アミノ酸である。ＩＧＦ−１配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから、公に入手可能である（例えば、受託番号ＮＰ＿００１１０４７５３．１（成熟ペプチドａａ４９〜１１８）およびＮＰ＿０３４６４２．２（成熟ペプチドａａ４９〜１１６）は、例示的なＩＧＦ−１タンパク質配列を提供するが、受託番号ＮＭ＿０００６１８．４、ＮＭ＿００１１１１２８３．２およびＮＭ＿０１０５１２．５は、例示的なＩＧＦ−１核酸配列を提供する）。当業者は、ＩＧＦ−１バリアント、例えば、これらのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するもの、例えば、配列番号８のペプチドａａ４９〜１１８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するものを含む、さらなるＩＧＦ−１の核酸およびタンパク質配列を同定することができる。
【００３８】
レプチン：（例えば、ＯＭＩＭ  １６４１６０）：空腹を阻害することによってエネルギーバランスを調節することを助ける、脂肪細胞によって優勢に作製されるホルモン。ヒトレプチンは、第７染色体上のＬｅｐ遺伝子によってコードされ、ネイティブタンパク質は、１６ｋＤａおよび１６７アミノ酸である。レプチン配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列データベースから、公に入手可能である（例えば、受託番号ＮＰ＿０００２２１．１、ＮＰ＿００１００３０７０．１、ＮＰ＿９９９００５．１、ＮＰ＿０３７２０８．１、ＮＰ＿０３２５１９．１およびＮＰ＿００１０３６２２０．１は、例示的なレプチンタンパク質配列を提供するが、受託番号ＮＭ＿０００２３０．２、ＮＭ＿００１００３０７０．１、ＮＭ＿２１３８４０．１およびＮＭ＿０１３０７６．３は、例示的なレプチン核酸配列を提供する）。当業者は、レプチンバリアント、例えば、これらのＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するもの、例えば、配列番号２のペプチドａａ２２〜１６７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するものと含む、さらなるレプチンの核酸およびタンパク質配列を同定することができる。
【００３９】
増加または減少：対照値（例えば、治療剤なしを示す値）からの、量における、それぞれ、統計的に有意な正または負の変化。増加は、正の変化、例えば、対照値と比較した、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％または少なくとも５００％の増加である。減少は、負の変化、例えば、対照値と比較した、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％減少の減少である。一部の例では、減少は、１００％未満、例えば、９０％以下、９５％以下または９９％以下の減少である。
【００４０】
単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、ＯＶ、核酸分子またはタンパク質）は、その成分が存在する生物の細胞または組織中の他の生物学的成分、例えば、他の細胞（例えば、ＲＢＣ）、染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離された、それらとは離れて産生された、またはそれらから精製された成分である。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸およびタンパク質もまた包含する。単離された組換えＯＶは、一部の例では、少なくとも５０％純粋、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも１００％純粋である。
【００４１】
リンカー：例えば、融合タンパク質を生成するために、２つまたはそれよりも多くの別個の別々のペプチドまたはタンパク質、例えば、モノマードメインを結合または接続する部分または部分の群。一例では、リンカーは、実質的に直鎖状の部分である。本明細書で提供される融合タンパク質を生成するために使用され得る例示的なリンカーには、以下が含まれるがこれらに限定されない：ペプチド、核酸分子、ペプチド核酸、および炭素骨格中に取り込まれた１つまたは複数の酸素原子を有する必要に応じて置換されたアルキレン部分。リンカーは、ネイティブ配列の一部分、そのバリアント、または合成配列であり得る。リンカーは、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、または両方の組合せを含み得る。一例では、リンカーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０アミノ酸、例えば、５〜１０、５〜２０または５〜５０アミノ酸から構成される。一例では、リンカーは、ポリアラニンである。リンカーは、フレキシブルリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ）、剛性リンカー（ｒｉｇｉｄ  ｌｉｎｋｅｒ）（例えば、（ＥＡＡＡＫ）ｎ）または切断可能なリンカー（例えば、ジスルフィド、プロテアーゼ感受性）であり得る。
【００４２】
代謝モジュレータータンパク質：細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、がんを有する対象におけるＴ細胞の代謝活性を増加または減少させることができるタンパク質。一例では、代謝モジュレータータンパク質は、Ｔ細胞、例えば、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の代謝活性を増加させる。一部の例では、代謝モジュレータータンパク質は、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の代謝活性を、例えば、代謝モジュレータータンパク質の欠如（例えば、代謝モジュレータータンパク質を発現するＯＶを投与しないこと）と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させる。一部の例では、代謝モジュレータータンパク質は、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、腫瘍浸潤性Ｔ細胞のミトコンドリア機能を、例えば、代謝モジュレータータンパク質の欠如（例えば、代謝モジュレータータンパク質を発現するＯＶを投与しないこと）と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させる。一部の例では、代謝モジュレータータンパク質は、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、腫瘍浸潤性Ｔ細胞による酸化的リン酸化を、例えば、代謝モジュレータータンパク質の欠如（例えば、代謝モジュレータータンパク質を発現するＯＶを投与しないこと）と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させる。一部の例では、代謝モジュレータータンパク質は、メモリーＴ細胞を、例えば、代謝モジュレータータンパク質の欠如（例えば、代謝モジュレータータンパク質を発現するＯＶを投与しないこと）と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させる。一部の例では、代謝モジュレータータンパク質は、腫瘍（例えば、がん）におけるＴ細胞のクローン性増殖を、例えば、代謝モジュレータータンパク質の欠如（例えば、代謝モジュレータータンパク質を発現するＯＶを投与しないこと）と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させる。一部の例では、これらの効果（ａｆｆｅｃｔ）のうちの１つまたは複数の組合せが達成され得る。
【００４３】
一例では、代謝モジュレータータンパク質は、アディポカインである。アディポカインは、脂肪組織によって分泌されるサイトカインであり得る。アディポカインの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：レプチン、アディポネクチン、アペリン、ケメリン、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよびＣＴＲＰ−４。一例では、代謝モジュレータータンパク質は、インスリンである。一例では、代謝モジュレータータンパク質は、ＩＧＦ−１である。
【００４４】
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）：がん細胞に優先的に感染しそれを死滅させるウイルス。ＯＶは、それらの表面上の受容体への結合を介してまたは形質膜との融合を介して細胞に接近することができ、正常組織を本質的に無傷のままにしつつ、腫瘍において溶解サイクルを確立することができる。感染したがん細胞が腫瘍溶解によって破壊される際に、これらは、新たな感染性ウイルス粒子またはビリオンを放出して、残りの腫瘍を破壊するのを助ける。例示的な腫瘍溶解性ウイルスには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、セネカバレーウイルス、ＥＣＨＯウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルスおよびパロウイルスが含まれるがこれらに限定されない。腫瘍溶解性ウイルスの具体的な例には、ＥＣＨＯ−７株エンテロウイルスＲＩＧＶＩＲ、Ｈ１０１と命名された遺伝子改変されたアデノウイルス、およびタリモジーン・ラハーパレプベック（ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）（Ｔ−ＶＥＣ）が含まれる。
【００４５】
組換えＯＶは、非ネイティブ配列、例えば、代謝をモジュレートするタンパク質、例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびインスリン様成長因子１のうちの１つまたは複数ならびにかかるサイトカイン（ｓｕｃｈ  ａｎｄ  ａ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を含むＯＶである。
【００４６】
作動可能に連結した：第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関連して配置される場合、第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、プロモーターが、コード配列（例えば、レプチン、インスリン、ケメリンまたはインスリン様成長因子１コード配列）の転写または発現に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結した配列は、連続しており、必要に応じて、２つのタンパク質コード領域を同じリーディングフレームで結合させる。
【００４７】
薬学的に許容される担体：本発明において有用な薬学的に許容される担体は、従来の担体である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９７５）は、治療剤、例えば、本明細書に開示される組換えＯＶの医薬的送達に適切な組成物および製剤を記載している。
【００４８】
一般に、担体の性質は、用いられている投与の特定の様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどをビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
【００４９】
プロモーター：核酸の転写を指示する一群の核酸制御配列。プロモーターは、転写の開始部位の近傍の必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にはＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対ほど離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを必要に応じて含む。
【００５０】
開示される組換えＯＶと共に使用され得るプロモーターの例には、ウイルスプロモーター、例えば、７．５プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよびＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターの両方が使用され得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４，  １９８７を参照のこと）。プロモーター依存的遺伝子発現を、細胞型特異的、組織特異的、または外部シグナルもしくは薬剤によって誘導性なものとして制御可能にするのに十分なプロモーターエレメントもまた含まれる；かかるエレメントは、遺伝子の５’または３’領域に位置し得る。組換えＤＮＡまたは合成技法によって産生されるプロモーターもまた、核酸配列の転写を提供するために使用され得る。
【００５１】
組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列（例えば、非ネイティブ配列、例えば、哺乳動物レプチン、インスリン、ケメリンまたはインスリン様成長因子１コード配列を有するＯＶ）を有する核酸分子、または他の方法で分離されていた２つの配列セグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有する核酸分子である。この人工的な組合せは、化学的合成などの慣用的な方法によって、または例えば遺伝子操作技法による核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、達成され得る。同様に、組換えタンパク質は、組換え核酸分子によってコードされるタンパク質である。同様に、組換えまたはトランスジェニック細胞は、組換え核酸分子（例えば、組換えＯＶ）を含有し、組換えタンパク質を発現する細胞である。
【００５２】
配列同一性：アミノ酸（またはヌクレオチド）配列間の類似性は、配列間の類似性に関して表現され、別段配列同一性と呼ばれる。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）に関してしばしば測定される；パーセンテージが高いほど、２つの配列はより類似である。
【００５３】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、以下に記載されている：Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２，  １９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３，  １９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：２４４４，  １９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７，  １９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１，  １９８９；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：１０８８１，  １９８８；およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：２４４４，  １９８８。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ６：１１９，  １９９４は、配列アラインメント方法および相同性計算の詳細な検討事項を示している。
【００５４】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３，  １９９０）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連した使用のために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の記述は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。
【００５５】
ネイティブレプチン、インスリン、ケメリンまたはＩＧＦ−１のタンパク質またはコード配列のバリアントは、典型的には、デフォルトパラメーターに設定したＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ２．０、ｇａｐｐｅｄ  ｂｌａｓｔｐを使用してアミノ酸配列との全長アラインメントにわたって計数した、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性の保有によって特徴付けられる。約３０アミノ酸よりも長いアミノ酸配列の比較のために、Ｂｌａｓｔ  ２配列機能は、デフォルトパラメーター（ギャップ存在コスト１１、残基１つ当たりのギャップコスト１）に設定したデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して用いられる。短いペプチド（おおよそ３０アミノ酸よりも短い）をアラインする場合、アラインメントは、デフォルトパラメーター（オープンギャップ９、伸長ギャップ１のペナルティ）に設定したＰＡＭ３０マトリックスを用いて、Ｂｌａｓｔ  ２配列機能を使用して実施すべきである。参照配列に対してさらに大きい類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合、増加するパーセンテージ同一性、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示す。配列同一性について配列全体未満が比較されている場合、ホモログおよびバリアントは、典型的には、１０〜２０アミノ酸の短いウインドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を保有し、参照配列に対するそれらの類似性に依存して、少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を保有し得る。かかる短いウインドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトにおいて入手可能である。当業者は、これらの配列同一性の範囲が、ガイダンスとして提供されているに過ぎないことを理解する；提供された範囲の外側に入る強く重要なホモログが取得され得る可能性も十分にある。
【００５６】
したがって、バリアントレプチン、インスリン、ケメリンまたはＩＧＦ−１のタンパク質または核酸配列は、本明細書で提供されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に示される配列（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７または８）のいずれかに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。
【００５７】
対象：脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト。哺乳動物には、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）、サル（ｓｉｍｉａｎ）、ヒト、家畜、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔ  ａｎｉｍａｌ）およびペットが含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物対象、例えば、サル（ｍｏｎｋｅｙ）もしくは他の非ヒト霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマまたはウシである。一部の例では、対象は、本明細書に開示される組換えＯＶを使用して処置され得る、腫瘍、例えば、がんを有する。一部の例では、対象は、実験動物／生物、例えば、マウス、ウサギまたはラットである。
【００５８】
Ｔ細胞：細胞媒介性免疫において役割を果たす、それらの細胞表面上にＴ細胞受容体を含有する白血球。
【００５９】
治療剤：対象への投与の際にいくらかの有益な効果を付与する１つまたは複数の分子または化合物を指す。有益な治療効果には、診断的決定の実施可能性；疾患、症状、障害または病理学的状態の軽快；疾患、症状、障害もしくは状態を低減させることまたはそれらの開始を予防すること；および疾患、症状、障害または病理学的状態に広く対抗することが含まれ得る。
【００６０】
形質導入されたおよび形質転換された：ウイルスまたはベクターは、それが核酸を細胞中に移行させる場合、細胞を「形質導入する」。細胞は、細胞ゲノム中への核酸の組入れまたはエピソーム複製のいずれかによって、核酸分子が細胞によって安定に複製されるようになる場合、細胞中に形質導入された核酸によって「形質転換され」ているまたは「トランスフェクトされ」ている。
【００６１】
以下のようなトランスフェクションの多数の方法が、当業者に公知である：化学的方法（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、物理的方法（例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、微粒子銃）、融合（例えば、リポソーム）、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ウイルスエンベロープ／カプシド−ＤＮＡ複合体）および組換えウイルスなどのウイルスによる生物学的感染によるもの｛Ｗｏｌｆｆ，  Ｊ．  Ａ．，  ｅｄ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＵＳＡ  （１９９４）｝。
【００６２】
導入遺伝子：ベクター、例えば、組換えＯＶによって供給される外因性遺伝子。一例では、導入遺伝子には、１つまたは複数のレプチン、インスリン、ケメリンまたはＩＧＦ−１コード配列が含まれる。
【００６３】
処置すること、処置および治療：任意の客観的もしくは主観的パラメーター、例えば、症状の緩和、寛解、軽減、または状態を患者にとってより耐容できるものにすること、変性もしくは減退の速度における緩徐化、変性の最終点をあまり衰弱性でないものにすること、対象の肉体的もしくは精神的福祉を改善すること、または生存の長さを延長させることを含む、傷害、病状または状態の減弱または軽快における任意の成功または成功の兆候。処置は、身体検査、血液および他の臨床試験（例えば、イメージング）などの結果を含む、客観的または主観的パラメーターによって評価され得る。一部の例では、開示される方法による処置は、腫瘍および／または転移の数、体積および／または重量における減少を生じる。
【００６４】
腫瘍、新形成、悪性疾患またはがん：新生物は、過剰な細胞分裂から生じる組織または細胞の異常な成長である。新生物成長は、腫瘍を生じ得る。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。「非がん性組織」は、悪性新生物が形成したのと同じ臓器由来の組織であるが、新生物の特徴的病状を有さない。一般に、非がん性組織は、組織学的に正常に見える。「正常組織」は、臓器がその臓器のがんや別の疾患もしくは障害に冒されていない、臓器由来の組織である。「がんなしの」対象は、その臓器のがんと診断されておらず、検出可能ながんを有さない。
【００６５】
開示される組換えＯＶを使用して処置され得る例示的な腫瘍、例えばがんには、固形腫瘍、例えば、乳癌（例えば、小葉癌および腺管癌、例えば、トリプルネガティブ乳がん）、肉腫、肺の癌（例えば、非小細胞癌、大細胞癌、扁平上皮癌および腺癌）、肺の中皮腫、結腸直腸腺癌、胃癌、前立腺腺癌、卵巣癌（例えば、漿液性嚢胞腺癌および粘液性嚢胞腺癌）、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌および胚細胞腫瘍、膵臓腺癌、胆道腺癌、肝細胞癌、膀胱癌（例えば、移行上皮癌、腺癌および扁平上皮癌を含む）、腎細胞腺癌、子宮内膜癌（例えば、腺癌およびミュラー管混合腫瘍（癌肉腫）を含む）、子宮頸内膜、子宮頸外膜（ｅｃｔｏｃｅｒｖｉｘ）および膣の癌（例えば、それらの各々の腺癌および扁平上皮癌）、皮膚の腫瘍（例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、皮膚付属器（ａｐｐｅｎｄａｇｅ）腫瘍、カポジ肉腫、皮膚リンパ腫、皮膚付属器（ａｄｎｅｘａｌ）腫瘍および種々の型の肉腫ならびにメルケル細胞癌）、食道癌、鼻咽頭および中咽頭の癌（それらの扁平上皮癌および腺癌を含む）、唾液腺癌、脳および中枢神経系の腫瘍（例えば、グリア、ニューロンおよび髄膜起源の腫瘍を含む）、末梢神経の腫瘍、軟部組織肉腫ならびに骨および軟骨の肉腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、ならびにリンパ性腫瘍（Ｂ細胞およびＴ細胞悪性リンパ腫を含む）が含まれる。一例では、腫瘍は腺癌である。
【００６６】
開示される組換えＯＶは、液性腫瘍、例えば、リンパ性、白血球、または他の型の白血病を処置するためにも使用され得る。具体的な例では、処置される腫瘍は、血液の腫瘍、例えば、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大顆粒リンパ球性白血病および成人Ｔ細胞白血病）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫）または骨髄腫である。
【００６７】
〜に十分な条件下：所望の活性を可能にする任意の環境を記述するために使用される語句。一例では、所望の活性は、例えば、タンパク質を発現する組換えＯＶに感染した腫瘍細胞における、レプチン、インスリン、ケメリンまたはＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数の、発現または活性の増加である。一例では、所望の活性は、例えば、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスを使用する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の処置である。
【００６８】
ベクター：宿主細胞（例えば、腫瘍細胞）中に導入されると、それによって、形質転換された宿主細胞を産生する、核酸分子。ベクターは、宿主細胞においてそれが複製することを可能にする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターは、例えば、他の配列と組み合わせて、１つまたは複数のレプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１コード配列もまた含み得る。ベクターは、細胞を形質導入すること、それを形質転換することまたはそれに感染することができ、それによって、細胞にとってネイティブなもの以外の核酸および／またはタンパク質を、細胞に発現させる。ベクターは、必要に応じて、細胞中への核酸の進入を達成することを補助する材料、例えば、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなどを含む。
概要
【００６９】
免疫療法は、がんに対する休眠応答を活性化することができるが、奏効率は、免疫学的無視／除外および代謝的に厳しい微小環境を含むいくつかの抵抗性機構に起因して、低いままである。がん細胞において複製することができる腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、腫瘍溶解および免疫プライミングを誘導し得る。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、エフェクターＴ細胞の流入によって支配される腫瘍微小環境の実質的なリモデリングを誘導することが、本明細書で実証されている。しかし、本発明者らは、腫瘍微小環境によって誘導される代謝不全に恐らくは起因して、腫瘍溶解性ウイルスに対する応答が不完全であったことを観察した。アディポカインであるレプチンが、抗腫瘍応答を支持する強力な代謝リプログラミング剤として同定される。レプチンは、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで代謝的にリプログラムし、レプチンを発現する黒色腫細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫学的に制御される。腫瘍細胞においてレプチンを発現するように腫瘍溶解性ウイルスを操作することで、腫瘍保有マウスにおいて完全奏効が誘導され、機能的に優れた腫瘍浸潤が促進された。腫瘍保有動物のレプチン処置は、Ｔ細胞浸潤および強力な代謝リプログラミングを増加させた。レプチンを過剰発現するように操作された腫瘍は、野生型腫瘍よりも、免疫系によって効果的に制御され、代謝的に十分である。したがって、レプチンは、腫瘍浸潤性Ｔ細胞の代謝活性を増加させることによって、抗腫瘍免疫を促進する軸を活用する。したがって、レプチンおよび他の代謝リプログラミング剤（例えば、他のアディポカイン、例えば、ケメリン、または他のタンパク質、例えば、インスリンもしくはＩＧＦ−１）は、腫瘍免疫に代謝的支持を提供することができ、腫瘍溶解性ウイルスは、代謝治療を送達するためのプラットフォームを提示する。
【００７０】
多くの課題のうち、固形腫瘍における免疫応答が遭遇するのは、浸潤する能力の低さ、ならびに不利な微小環境においてそれらのエフェクター機能を適切に実行できることである。本明細書のデータは、両方の障壁が、代謝モジュレーション（例えば、アディポカインであるレプチン）を微小環境に直接送達することができるＯＶを操作により作製し、結果として治療有効性を改善することによって、克服され得ることを示している。最近の研究は、腫瘍におけるＯＶによって規定される遺伝的シグネチャーを調査しており、ＯＶにおいて発現され得る標的を決定している（Ｚａｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１７；  ８：１４３４０）。本明細書のデータは、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ分析を利用して腫瘍溶解性ウイルス処置後の免疫状況における変化の様相を初めて明らかにするものである。これらの知見は、腫瘍がいまだ退行していない初期の時点での、腫瘍浸潤物における目を引く変化を明らかにしている。これらのデータは、ＯＶが単純に、腫瘍細胞の一部分を溶解させ、いくらかの免疫原性細胞死を促進するのではなく、むしろ、腫瘍免疫微小環境を完全にリモデルリングする能力を有することを示している。このデータは、観察された抗腫瘍免疫の中心である可能性があるＴ細胞コンパートメントにおける浸潤の増加を示すだけでなく、骨髄性集団における広範な変化を示す。これらの結果は、ＯＶによって誘導される強力な免疫を新たに明らかにし、この免疫応答を、特定の方法で強化して、より永続的な応答を促進できることを実証している。
【００７１】
腫瘍微小環境におけるＴ細胞代謝機能を改善することは、より良い治療応答を可能にし得る。本開示は、特にがんにおいてレプチン（または免疫応答の他の代謝モジュレーター、例えば、他のアディポカインもしくは他のホルモン、例えば、インスリン）を用いる新規方法を提供する。さらに、開示される方法は、腫瘍微小環境を特異的にモジュレートし、治療応答を改善することができる分子のための有効な送達系としてＯＶを利用する。
【００７２】
以前の研究は、免疫細胞がレプチン受容体を発現すること、ならびにサイトカインとしてのレプチンが、自然および適応免疫応答において炎症促進機能を有し得ることを示している（Ｌｏｆｆｒｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９９８；１２（１）：５７−６５；Ｌａ  Ｃａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；４（５）：３７１−９；Ｓａｎｔｏｓ−Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１９４（１）：６−１１）。適応免疫応答に関して、レプチンは、ヒトＴリンパ球の増殖を活性化および増強することができる（Ｍａｒｔｉｎ−Ｒｏｍｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；  １９９（１）：１５−２４）。レプチンが調節性Ｔ細胞増殖を阻害し得、炎症および自己免疫のモデルにおいて機能し得るといういくつかの観察が存在するが（Ｆｅｕｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００９；  １５（８）：９３０−９）、腫瘍溶解剤を使用する本明細書のデータは、Ｔｒｅｇ細胞が、レプチンリッチな腫瘍環境中では刺激されないことを示している。
【００７３】
がん、特に腫瘍微小環境におけるレプチンまたはレプチン受容体の役割については、ほとんど知られていない。本明細書の知見は、二次リンパ系臓器中のＴ細胞と比較して、腫瘍微小環境中のＴ細胞においてレプチン受容体発現の増加が存在することを実証している。レプチンは、ミトコンドリア機能の持続および酸化的リン酸化における増加を介して、腫瘍浸潤性Ｔ細胞のエフェクター機能を代謝的に増強することができる。以前の研究は、レプチンが骨格筋において脂肪酸酸化を促進できることを示した。レプチン欠損マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、増殖の減少およびサイトカイン産生と共に、グルコース取込みにおける低減を示した。本明細書のデータは、レプチンが、ＳＴＡＴ３およびＰＩ３Ｋの活性化を介してシグナル伝達し、ミトコンドリアの含量および品質を増加させることができることを示している。レプチンは、ＰＧＣ１α活性化を促進でき、酸化的リン酸化を促進できるだけでなく、マイトフュージン１の発現を介したミトコンドリア融合を促進することができる（Ｒｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２０１０；  ３１４（１）：６２−９；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  （Ｌｏｎｄ）  ２０１５；  ３９（１２）：１７５０−６．）。腫瘍浸潤性Ｔ細胞は、ＰＧＣ１αの発現を抑制するので（Ｓｃｈａｒｐｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１６；  ４５（３）：７０１−３）、レプチンは、その軸の維持を介してＴＩＬ機能を支持し得る。
【００７４】
野生型およびレプチン操作された腫瘍溶解性ワクシニアの両方のＴ細胞浸潤物の開示される分析は、レプチン発現性ワクシニアウイルスで処置した腫瘍においてより優勢であった免疫集団を明らかにした。メモリーＴ細胞の割合における増加が観察されたが、これは、観察された持続性の治療応答を説明する。メモリーＴ細胞は、優れた抗腫瘍Ｔ細胞であり、より高いミトコンドリア含量および酸化的リン酸化能を有する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１２；  ３６（１）：６８−７８；Ｓｕｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２０１６；  ２３（１）：６３−７６）が、これは、ミトコンドリア含量における増加を示す本明細書のデータと一致している。ＴＣＲ配列決定分析が、腫瘍浸潤性リンパ球に対するＯＶの効果をさらに実証した。腫瘍溶解剤は、腫瘍に浸潤するように新たなＴ細胞クローンを誘導したが、レプチン発現性ワクシニアウイルスで処置した腫瘍では、Ｔ細胞のクローン性増殖が観察された。
【００７５】
腫瘍浸潤性リンパ球におけるミトコンドリア機能を代謝的に増強することには利益がある。本明細書で提供される方法は、腫瘍中に直接送達され得る代謝モジュレーターのレパートリーを増加させる。これらの代謝モジュレーターの治療的送達の１つの方法は、遺伝的にコードされたペイロードを腫瘍微小環境に直接送達することができるＯＶの利用である。今日まで、腫瘍溶解性送達遺伝子（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ−ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｇｅｎｅ）の大部分は、性質が免疫性であった（例えば、サイトカイン、共刺激分子など）。しかし、開示される方法は、ＯＶによって送達される最初の代謝モジュレーターを提供する。ワクシニアが有効であることが本明細書で実証されているが、他の腫瘍溶解剤、例えば、ＨＳＶ、ニューカッスル病ウイルス、アデノウイルスおよびＶＳＶもまた使用され得る。ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑにより、腫瘍溶解剤が感染後早期に強力な免疫刺激潜在力を有し、永続的な完全奏効を達成することが明らかになったが、代謝的支持は、ロバストな抗腫瘍効果を媒介することが可能な長寿命のメモリーに、強い早期エフェクター応答を提供し得る。
【００７６】
これらの観察に基づいて、Ｔ細胞代謝を増加または増強し、それによって、抗腫瘍免疫を増加させる、免疫療法に対する腫瘍の応答を増加させる、またはその両方を行う組成物および方法（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ）が、本明細書で提供される。例えば、組換えＯＶから代謝をモジュレートするタンパク質を発現させることによって、例えば、腫瘍微小環境中にかかるタンパク質を提供することによって、腫瘍微小環境代謝をモジュレートすることにより、抗腫瘍効果を増強する。かかる方法は、他の抗がん治療と、例えば、Ｔ細胞アゴニストと（例えば、４−１ＢＢ、ＯＸ４０またはＧＩＴＲの１つまたは複数のアゴニストと）組み合わせて使用され得る。
【００７７】
一部の例では、レプチン（または他の代謝をモジュレートするタンパク質、例えば、別のアディポカイン（例えば、ケメリン）、インスリンもしくはＩＧＦ−１）は、例えば、他の抗がん治療、例えば、免疫療法、例えば、Ｔ細胞アゴニスト、例えば、４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＧＩＴＲの１つまたは複数のアゴニストと組み合わせて、治療量で投与される（例えば、タンパク質として、またはタンパク質をコードする核酸として、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクターを介して）。一部の例では、腫瘍細胞においてレプチン（または他の代謝をモジュレートするタンパク質、例えば、別のアディポカイン（例えば、ケメリン）、インスリンもしくはＩＧＦ−１）を発現または過剰発現する組換えＯＶが使用される。
【００７８】
レプチン（または他の代謝をモジュレートするタンパク質、例えば、別のアディポカイン（例えば、ケメリン）、インスリンもしくはＩＧＦ−１）を発現するＯＶは、腫瘍細胞を死滅させ、免疫系を刺激することができるが、レプチン（または他の代謝をモジュレートするタンパク質、例えば、別のアディポカイン（例えば、ケメリン）、インスリンもしくはＩＧＦ−１）の放出もまた、腫瘍部位におけるＴ細胞代謝を改善する。したがって、これらの組換えＯＶは、強力なタイプの自己強化免疫療法になる。組換えレプチン（または他の代謝をモジュレートするタンパク質、例えば、別のアディポカイン（例えば、ケメリン）、インスリンもしくはＩＧＦ−１）は、Ｔ細胞浸潤を増加させる。
組換え腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）
【００７９】
細胞免疫療法、例えば、がん免疫療法を改善するために使用され得る組換えＯＶが、本明細書で提供される。例えば、本開示は、１つまたは複数の代謝調節性タンパク質（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、例えば、アディポカイン（例えば、レプチンまたはケメリン）、ケメリンまたはＩＧＦ−１をコードする核酸分子を含有する組換えＯＶを提供する。一部の例では、代謝調節性タンパク質（例えば、アディポカイン（例えば、レプチンまたはケメリン）、ケメリンまたはＩＧＦ−１）は、ＯＶによって発現される融合タンパク質、例えば、代謝調節性タンパク質およびガンマ鎖サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）を含む融合タンパク質の一部である。ＯＶに感染した腫瘍細胞におけるタンパク質の発現は、これらのタンパク質のうちの１つまたは複数の発現の増加をもたらし得、したがって、これらのタンパク質の活性の増加をもたらし、それによって、抗腫瘍活性を増加させ得る。
【００８０】
ＯＶは、任意のＯＶ、例えば、天然に存在するＯＶまたは遺伝子操作されたＯＶであり得る。例には、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、セネカバレーウイルス、ＥＣＨＯウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルスまたはパロウイルスが含まれる。具体的な例では、ＯＶは、タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−ＶＥＣ）であり得る。具体的な例では、ＯＶは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株のワクシニアウイルスであり得る。具体的な例では、ＯＶは、ワクシニアであり得、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質は、レプチンであり得る。具体的な例では、ＯＶは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株のワクシニアウイルスであり得、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質は、レプチンである。具体的な例では、ＯＶは、Ｒｅｓｅｒｖｅ株のワクシニアウイルスであり得、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質は、レプチン−ＩＬ−２またはレプチン−ＩＬ−１５融合タンパク質であり得る（レプチンおよびサイトカインは、リンカーによって結合され得る）。
【００８１】
１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質をコードする核酸分子は、一部の例では、プロモーター、例えば、構成的または調節可能なプロモーターに作動可能に連結されている。一例では、プロモーターは、タンパク質にとってネイティブではない場合がある。例えば、プロモーターは、ウイルス由来のプロモーター、例えば、７．５プロモーターであり得る。
【００８２】
一例では、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質は、配列番号２、４、６または８に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を含み得る。一例では、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１、３、５または７に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を含み得る。一例では、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質は、第１のタンパク質および第２のタンパク質を含む融合タンパク質であり得、第１のタンパク質は、配列番号２、４、６または８に対して少なくとも８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を含む。一例では、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号１、３、５または７に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を含み得る。一例では、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質をコードする核酸分子は、代謝タンパク質を含む融合タンパク質をコードし得、融合タンパク質は、第１のタンパク質および第２のタンパク質を含み得、第１のタンパク質は、配列番号１、３、５または７に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を含む核酸分子によってコードされ得る。一部の例では、組換えＯＶは、１つまたは複数の免疫刺激タンパク質、例えば、共刺激分子、サイトカイン、ケモカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−α／β、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つもしくは複数、またはそれらの組合せをさらに発現し得る。
【００８３】
一部の例では、開示される組換えＯＶによる腫瘍細胞の感染の際に、感染した腫瘍細胞におけるアディポカインの発現および／または活性は、例えば、ＯＶを投与しないことと比較して、またはアディポカインを発現しないＯＶの投与と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加し得る。一部の例では、開示される組換えＯＶによる腫瘍細胞の感染の際に、感染した腫瘍細胞におけるレプチンの発現および／または活性は、例えば、ＯＶを投与しないことと比較して、またはレプチンを発現しないＯＶの投与と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加し得る。一部の例では、開示される組換えＯＶによる腫瘍細胞の感染の際に、感染した腫瘍細胞におけるインスリンの発現および／または活性は、例えば、ＯＶを投与しないことと比較して、またはインスリンを発現しないＯＶの投与と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加し得る。一部の例では、開示される組換えＯＶによる腫瘍細胞の感染の際に、感染した腫瘍細胞におけるケメリンの発現および／または活性は、例えば、ＯＶを投与しないことと比較して、またはケメリンを発現しないＯＶの投与と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加し得る。一部の例では、開示される組換えＯＶによる腫瘍細胞の感染の際に、感染した腫瘍細胞におけるＩＧＦ−１の発現および／または活性は、例えば、ＯＶを投与しないことと比較して、またはＩＧＦ−１を発現しないＯＶの投与と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加され得る。
【００８４】
一部の例では、腫瘍細胞においてＯＶからアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を発現させることは、腫瘍または腫瘍微小環境中へのＴ細胞浸潤を、例えば、ＯＶを投与しないことと比較して、または代謝調節性タンパク質を発現しないＯＶの投与と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させ得る。一部の例では、腫瘍細胞においてＯＶからアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を発現させることは、腫瘍の部位におけるＴ細胞におけるミトコンドリア活性を、例えば、ＯＶを投与しないことと比較して、または代謝調節性タンパク質を発現しないＯＶの投与と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させ得る。一部の例では、腫瘍細胞においてＯＶからアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を発現させることは、Ｔ細胞酸化的リン酸化を、例えば、ＯＶを投与しないことと比較して、または代謝調節性タンパク質を発現しないＯＶの投与と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させ得る。一部の例では、腫瘍細胞においてＯＶからアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を発現させることは、腫瘍におけるＴ細胞のクローン性増殖を、例えば、ＯＶを投与しないことと���較して、または代謝調節性タンパク質を発現しないＯＶの投与と比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％または少なくとも約６００％増加させ得る。一部の例では、これらの効果の組合せが達成され得る。
１．代謝をモジュレートするタンパク質
【００８５】
ＯＶ中の代謝をモジュレートするタンパク質、例えば、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１コード配列（これは、融合タンパク質コード配列の一部であり得る）は、野生型（例えば、非変異）またはバリアント配列であり得る。具体的な例では、代謝をモジュレートするタンパク質は、レプチンである。具体的な例では、代謝をモジュレートするタンパク質は、ケメリンである。具体的な例では、代謝をモジュレートするタンパク質は、インスリンである。具体的な例では、代謝をモジュレートするタンパク質は、ＩＧＦ−１である。
【００８６】
例えば、野生型レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号を介して本明細書で提供される（配列は、配列番号１〜８に提供される）。したがって、一部の例では、腫瘍細胞中に導入される組換えＯＶは、ネイティブレプチン、インスリン、ケメリン、および／またはＩＧＦ−１コード配列を含み得る。一部の例では、腫瘍細胞中に導入される組換えＯＶは、非ネイティブアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１コード配列を含むが、ネイティブアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１タンパク質配列をコードする（例えば、縮重したコード配列）。一部の例では、組換えＯＶによって発現されるアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１タンパク質は、シグナル配列を含む。
【００８７】
ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号を介して上に提供されるタンパク質配列のバリアントを含む、バリアントアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１タンパク質は、１つまたは複数の変異、例えば、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換を含有し得る。一部の例では、バリアントアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１タンパク質は、１〜２０個の挿入、１〜２０個の欠失、１〜２０個の置換、および／またはそれらの任意の組合せ（例えば、１〜１９個の置換と一緒に単一の挿入）を含む。一部の例では、本開示は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のさらなるアミノ酸変化を有する任意のネイティブアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１タンパク質のバリアントを提供し、タンパク質は、ネイティブまたは増加した生物活性を保持する。一部の例では、バリアントアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１タンパク質は、１〜８個の挿入、１〜１５個の欠失、１〜１０個の置換、および／またはそれらの任意の組合せ（例えば、１〜１０、１〜５または１〜７個のアミノ酸置換と一緒に、１〜１５、１〜４または１〜５個のアミノ酸欠失）を含む。一部の例では、バリアントアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸変化を有する。一例では、かかるバリアントペプチドは、標準手順、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲを使用して、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって産生される。
【００８８】
改変の１つの型には、アミノ酸による、類似の生化学的特性を有するアミノ酸残基に代えての置換、即ち、保存的置換（例えば、１〜４、１〜８、１〜１０または１〜２０個の保存的置換）を含む。典型的には、保存的置換は、得られたペプチドの活性に対して、影響をほとんどまたは全く有さない。例えば、保存的置換は、タンパク質のネイティブ機能に実質的に影響を与えない、任意のネイティブアディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１タンパク質配列中のアミノ酸置換である。アラニンスキャンは、タンパク質中のどのアミノ酸残基がアミノ酸置換を許容し得るかを同定するために使用され得る。一例では、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１のネイティブ機能は、アラニンまたは他の保存的アミノ酸が１〜４、１〜８、１〜１０または１〜２０個のネイティブアミノ酸を置換する場合、２５％よりも大きくは、例えば、２０％よりも大きくは、例えば、１０％よりも大きくは変更されない。タンパク質中の元のアミノ酸を置換し得る、保存的置換とみなされるアミノ酸の例には、以下が含まれる：Ａｌａの代わりにＳｅｒ；Ａｒｇの代わりにＬｙｓ、ＧｌｎまたはＡｓｎ；Ａｓｎの代わりにＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐの代わりにＧｌｕ；Ｃｙｓの代わりにＳｅｒ；Ｇｌｎの代わりにＡｓｎ；Ｇｌｕの代わりにＡｓｐ；Ｇｌｙの代わりにＰｒｏ；Ｈｉｓの代わりにＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅの代わりにＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕの代わりにＩｌｅまたはＶａｌ；Ｌｙｓの代わりにＡｒｇまたはＧｌｎ；Ｍｅｔの代わりにＬｅｕまたはＩｌｅ；Ｐｈｅの代わりにＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｓｅｒの代わりにＴｈｒ；Ｔｈｒの代わりにＳｅｒ；Ｔｒｐの代わりにＴｙｒ；Ｔｙｒの代わりにＴｒｐまたはＰｈｅ；およびＶａｌの代わりにＩｌｅまたはＬｅｕ。
【００８９】
より実質的な変化が、あまり保存的でない置換を使用すること、例えば、以下を維持することに対するそれらの影響がより顕著に異なる残基を選択することによって、行われ得る：（ａ）例えば、シートもしくはらせんコンフォメーションとしての、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造；（ｂ）標的部位におけるポリペプチドの電荷もしくは疎水性；または（ｃ）側鎖の嵩。ポリペプチド機能において最大の変化を生じると一般に予測される置換は、以下の置換である：（ａ）親水性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニンを置換する（または親水性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニンによって置換される）；（ｂ）システインもしくはプロリンが、任意の他の残基を置換する（またはシステインもしくはプロリンが、任意の他の残基によって置換される）；（ｃ）電気陽性（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンが、電気陰性（ｅｌｅｃｔｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ）残基、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸を置換する（または電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンが、電気陰性残基、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸によって置換される）；あるいは（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さない残基、例えば、グリシンを置換する（または嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さない残基、例えば、グリシンによって置換される）。これらのアミノ酸置換（または他の欠失および／もしくは付加）の影響は、レプチン、インスリン、ケメリンまたはＩＧＦ−１タンパク質のネイティブ機能を分析することにより、バリアントレプチン、インスリン、ケメリンまたはＩＧＦ−１タンパク質の機能を分析することで、評価することができる。
【００９０】
ＯＶによって発現される代謝調節性タンパク質（複数可）は、融合タンパク質の一部であり得る。したがって、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を含む融合タンパク質を発現するＯＶは、本開示によって包含され、腫瘍／がんを処置するための開示される方法において使用され得る。一部の実施形態では、ＯＶによって発現される融合タンパク質は、少なくとも２つの部分、代謝調節性タンパク質およびさらなるタンパク質を含み得る。具体的な例では、融合タンパク質の代謝をモジュレートするタンパク質は、レプチン、ケメリン、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１であり得る。一部の例では、さらなるタンパク質は、サイトカインタンパク質、例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはそれらの任意の組合せを含む融合タンパク質であり得る。融合タンパク質の代謝調節性タンパク質部分は、ネイティブまたは変異した代謝調節性タンパク質（例えば（ｓｕｃｈ  ａ）、配列番号２、４、６または８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質）であり得る。一例では、さらなるタンパク質は、サイトカインタンパク質、例えば、ネイティブもしくは変異したサイトカイン、例えば、ガンマ鎖サイトカイン、例えば、ＩＬ−２サブファミリーのサイトカインタンパク質（例えば、ネイティブＩＬ−２またはＳｕｐｅｒ  ＩＬ−２（例えば、Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：５２９−３３，  ２０１２を参照のこと）、ＩＬ−１ファミリーのサイトカインタンパク質（例えば、ＩＬ−１８）、ＩＦＮサブファミリーのサイトカインタンパク質、ＩＬ−１７ファミリーのサイトカインタンパク質、ＴＧＦスーパーファミリーのサイトカインタンパク質（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γに属するネイティブもしくは変異したタンパク質、またはそれらの任意の組合せである。一部の場合には、サイトカインタンパク質は、ネイティブヒトタンパク質であり得る。具体的な例では、融合タンパク質のサイトカインタンパク質部分は、ＩＬ−２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＢ４６８８３．１）、Ｓｕｐｅｒ  ＩＬ−２（例えば、Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４８４：５２９−３３，  ２０１２を参照のこと）またはＩＬ−１５（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＩ００９６３．１、またはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＡＩ００９６３．１のａａ１０〜１２７）であり得る。具体的な例では、融合タンパク質は、レプチンおよびＩＬ−２、またはレプチンおよびＩＬ−１５を含み得る。一部の例では、融合タンパク質の代謝調節性タンパク質は、例えば、Ｎ末端またはＣ末端のい���れかにおいて、サイトカインタンパク質に直接結合される。一部の例（例えば、代謝調節性タンパク質およびサイトカインを含む融合タンパク質をコードし得る核酸を含む腫瘍溶解性ウイルス）では、代謝調節性タンパク質部分をコードする核酸およびさらなる部分（例えば、サイトカイン）をコードする核酸は、リンカー、例えば、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０アミノ酸、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸から構成されるペプチドリンカーをコードする核酸の使用を介して、間接的に連結され得る。一部の例では、リンカーは、柔軟性があり得る。一例では、リンカーは、ポリアラニンであり得る。一例では、リンカーは、フレキシブルリンカー、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基を含むリンカー（例えば、ＧＳＧ、ＧＳＧＳＧＳまたはＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ）であり得る。具体的な例では、融合タンパク質は、レプチン−ＧＳＧ−ＩＬ−２またはレプチン−ＧＳＧ−ＩＬ−１５である。
２．例示的な腫瘍溶解性ウイルス
【００９１】
開示される組換えＯＶは、任意のＯＶから生成され得る。ＯＶは、それらの正常カウンターパートを温存しながら、悪性細胞に感染し、それを死滅させることができる（腫瘍溶解）ウイルス株である。腫瘍溶解は、ウイルスの天然の特性（天然に存在するＯＶ、例えば、レオウイルス）、またはウイルスゲノムの操作の結果（遺伝子操作されたＯＶ、例えば、アデノウイルス）のいずれかであり得る。
【００９２】
一例では、組換えＯＶは、ＤＮＡウイルス、例えば、二本鎖ＤＮＡ（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ−１）、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）または一本鎖ＤＮＡウイルス（例えば、パロウイルスおよびニワトリ貧血ウイルス、例えば、Ｈ−１ＰＶ）である。例示的なＨＳＶ  ＯＶには、Ｔ−ＶＥＣ（例えば、黒色腫を処置するため）、Ｇ２０７（例えば、神経膠腫を処置するため）、ＮＶ１０２０（例えば、ＣＲＣを処置するため）、ＨＦＡ１０（例えば、乳がん、頭頸部がんおよび膵臓がんを処置するため）が含まれる。例示的なワクシニアＯＶには、ｖｖＤＤ（ＴＫ変異体株）、ＪＸ−５９４（ＴＫ変異体／ＧＭ−ＣＳＦ発現株）（例えば、ＨＣＣ、ＣＲＣを処置するため）およびＧＬ−ＯＮＣ１（ＴＫ変異体／ＨＡ発現株）（例えば、固形腫瘍を処置するため）が含まれる。一例では、チミジンキナーゼ（ＴＫ）および成長因子遺伝子（ＶＧＦ）の遺伝的欠失を含むワクシニアウイルス、例えば、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ実験室株のワクシニアウイルスが使用される（例えば、Ｚｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ  ２３：２０２−１４，  ２０１５を参照のこと）。例示的なアデノウイルスＯＶには、ＯＮＹＸ（Ｅ１Ｂ５５変異体）、Ａｄ５−Ｄ２４、ＣＦＡｄ、ＤＮＸ−２４０１、Ａｄ５／３  Ｄ２４−ＧＭＣＳＦおよびＣＧＴＧ−１０２、ＣｏｌｏＡｄ１、ならびにＡｄ５／ｄ  ｈＴＥＲＴおよびＣＤ４０リガンド発現株（例えば、神経膠腫および固形腫瘍を処置するため）が含まれる。
【００９３】
一例では、組換えＯＶは、ＲＮＡウイルス、例えば、二本鎖ＲＮＡ（例えば、レオウイルス）または一本鎖ＲＮＡウイルス（例えば、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、セネカバレーウイルスまたはＥＣＨＯ）である。
【００９４】
本明細書で提供される組成物および方法において使用され得る他の例示的なＯＶには、Ｆｏｕｎｔｚｉｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，  ８：１０２６１７−３９，  ２０１７）、Ｊｈａｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｆｒｏｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ７：２０２，  ２０１７）およびＧｕｏ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｆｒｏｎｔ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ８：５５５，  ２０１７）（全てそれらの全体が本明細書で参照により組み込まれる）において提供されるＯＶが含まれる。一部の例では、組換えＯＶは、レンチウイルス、メンゴウイルスまたは粘液腫ウイルス（ｍｙｘｏｍａｖｉｒ）であり得る。
組換え腫瘍溶解性ウイルスを使用する方法
【００９５】
例えば、開示される方法を使用して生成される、本明細書で提供される組換えＯＶは、例えば、腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏで処置するために、がん免疫療法において使用され得る。一部の例では、がんは、黒色腫、肝細胞癌、乳がん、肺がん、腹膜がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、腎癌、膵臓がん、上皮癌、胃がん、結腸癌、十二指腸がん、膵臓腺癌、中皮腫、多形神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍ）、星状細胞腫、多発性骨髄腫、前立腺癌、肝細胞癌、胆管肉腫、膵臓腺癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、結腸直腸がん、腸管型胃腺癌、子宮頸部扁平上皮細胞癌、骨肉腫、上皮卵巣癌、急性リンパ芽球性リンパ腫、骨髄増殖性新生物または肉腫を含み得る。一部の例では、がん細胞は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮からなる群から選択される対象の臓器中に存在し得る。一部の例では、がんは、転移性であり得る。
【００９６】
固形および液性腫瘍は、開示される方法で処置され得る。処置され得る腫瘍の具体的な例には、白血病、リンパ腫、膵臓がん、結腸直腸がん、黒色腫、子宮頸がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、前立腺がん、ＨＣＣ、ＲＣＣまたは頭頸部がんが含まれるがこれらに限定されない。一例では、がんは黒色腫である。一例では、がんは乳がんである。一例では、がんは腺癌である。他の例は、本明細書で提供される。
【００９７】
対象（例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒトまたは獣医学対象）における腫瘍（例えば、がん）を処置する方法、腫瘍（または腫瘍微小環境）中へのＴ細胞浸潤を増加させる方法、腫瘍もしくは腫瘍微小環境におけるＴ細胞の代謝活性を増加させる方法、またはそれらの組合せが、本明細書で提供される。かかる方法は、治療有効量の本明細書に開示される１つまたは複数の組換えＯＶを、対象に（例えば、全身または腫瘍内）投与し、それによって、腫瘍を処置するステップを含み得る。例えば、組換えＯＶが感染した腫瘍細胞におけるＯＶによる代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数）の発現は、腫瘍細胞を死滅させ、腫瘍の近傍におけるＴ細胞活性を増加させることができる。一部の例では、組換えＯＶを使用する代わりに、これらの方法は、治療有効量の１つもしくは複数の代謝をモジュレートするタンパク質またはタンパク質（複数可）をコードする核酸分子を、対象に（例えば、全身または腫瘍内）投与し、それによって、腫瘍を処置するステップを含み得る。例えば、腫瘍細胞の近傍における代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数）の発現は、例えば、腫瘍の近傍におけるＴ細胞活性を増加させることによって、抗腫瘍効果を有し得る。
【００９８】
一部の例では、かかる方法は、治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｍｏｕｎｔ）の１つまたは複数のさらなる抗がん剤、例えば、化学療法（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗薬、ホルモンまたはホルモンアンタゴニスト）、放射線療法、生物製剤（例えば、モノクローナル抗体、例えば、ＰＤ−１もしくはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、それをアンタゴナイズする抗体、またはＴ細胞アゴニスト、例えば、４−１ＢＢ、ＯＸ４０もしくはＧＩＴＲのｍＡｂアゴニスト）、手術、またはそれらの組合せを投与するステップをさらに含む。一部の例では、かかる対象には、開示される組換えＯＶ（または代謝をモジュレートするタンパク質、もしくはそのタンパク質をコードする核酸分子）を投与する前、後、または前および後の両方に、対象への有効量のＩＬ−２（例えば、１０，０００〜１００，０００単位／ｋｇ体重）もまた投与される。
【００９９】
例えば、有効量の開示される組換えＯＶ（例えば、少なくとも１×１０６ｐｆｕの組換えＯＶ、少なくとも２×１０６ｐｆｕの組換えＯＶ、少なくとも５×１０６ｐｆｕの組換えＯＶまたは少なくとも１×１０７ｐｆｕの組換えＯＶ）が対象に投与され、それによって、対象における腫瘍（例えば、原発性腫瘍および／または転移）を処置する。一部の実施形態では、対象に投与される有効量の本開示の組換えＯＶは、約１×１０３〜約１×１０１２ＰＦＵの組換えＯＶ、または約１×１０５〜１×１０１０（ｆｒｏｍ  ａｂｏｕｔ  １  ｘ  １０５  ａｎｄ  １  ｘ  １０１０）ＰＦＵの組換えＯＶ、または約１×１０５〜１×１０８ＰＦＵの組換えＯＶ、または約１×１０８〜１×１０１０ＰＦＵの組換えＯＶ、約１×１０１１ＰＦＵの組換えＯＶ、１×１０１２ＰＦＵの組換えＯＶ、１×１０１３ＰＦＵの組換えＯＶ、１×１０１４ＰＦＵの組換えＯＶ、または１×１０１５ＰＦＵの組換えＯＶを含み得る。
【０１００】
一部の例では、組換えＯＶは、静脈内投与される。一部の例では、組換えＯＶは、腫瘍内投与される。一部の例では、組換えＯＶは、真皮下投与される。一部の例では、組換えＯＶは、直腸、尿道内、膣内、鼻腔内、髄腔内または腹腔内などの経路を介して投与される。
【０１０１】
一部の例では、開示される組換えＯＶが投与される対象は、化学療法、放射線治療、生物製剤治療、またはそれらの組合せによる処置が以前に成功しなかった（例えば、対象中の腫瘍は、サイズが有意には減少しなかった、またはさらにはサイズが増加したおよび／もしくは転移した）。一部の例では、対象は、ＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、それをアンタゴナイズする抗体、例えば、アテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＮＳ−９３６５５８（ニボルマブ）、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＣＴ０１１、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＭＥＤＩ−０６８０、ＢＭＳ−９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＰＤＬ−３２８０Ａ、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、ＭＧＡ−２７１、インドキシモド（Ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ）、エパカドスタット、ＢＭＳ−９８６０１６、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＥＤＩ−４７３７、ＭＫ−４１６６、ＢＭＳ−６６３５１３、ＰＦ−０５０８２５６６（ＰＦ−２５６６）、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）およびデュルバルマブに対して応答性でなかった腫瘍を有する（例えば、対象中の腫瘍は、サイズが有意には減少しなかった、またはさらにはサイズが増加したおよび／もしくは転移した）。一部の例では、対象は、Ｔ細胞アゴニスト、例えば、４−１ＢＢ、ＯＸ４０またはＧＩＴＲのアゴニストに対して応答性でなかった腫瘍を有する（例えば、対象中の腫瘍は、サイズが有意には減少しなかった、またはさらにはサイズが増加したおよび／もしくは転移した）（かかる試薬の特定の例は、本明細書で提供される）。
【０１０２】
一部の例では、この方法は、腫瘍微小環境中のＴ細胞をモニタリングするステップ、例えば、細胞の数を決定するステップ、ミトコンドリア活性（例えば、酸化的代謝）を決定または測定するステップ、およびＴＩＬのミトコンドリア量を決定または測定するステップを含む。
【０１０３】
一部の例では、この方法は、処置に応答した腫瘍成長をモニタリングするステップを含む。
コード配列
【０１０４】
組換えＯＶを含むベクターが、腫瘍の領域において（またはさらには腫瘍細胞において）代謝をモジュレートするタンパク質を発現させるために使用され得、ベクターは、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数）をコードする核酸分子を含む。使用され得るベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、例えば、ＯＶが含まれる。
【０１０５】
核酸分子には、ペプチドをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。コード配列におけるサイレント変異は、１つよりも多くのコドンが同じアミノ酸残基をコードし得る、遺伝コードの縮重（即ち、重複性）から生じる。したがって、例えば、ロイシンは、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡまたはＴＴＧによってコードされ得；セリンは、ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴまたはＡＧＣによってコードされ得；アスパラギンは、ＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされ得；アスパラギン酸は、ＧＡＴまたはＧＡＣによってコードされ得；システインは、ＴＧＴまたはＴＧＣによってコードされ得；アラニンは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡまたはＧＣＧによってコードされ得；グルタミンは、ＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされ得；チロシンは、ＴＡＴまたはＴＡＣによってコードされ得；イソロイシンは、ＡＴＴ、ＡＴＣまたはＡＴＡによってコードされ得る。
【０１０６】
特定の種についてのコドン優先性およびコドン使用表は、その特定の種のコドン使用優先性を利用する、代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１；一例では、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数）をコードする単離された核酸分子を操作により作製するために使用され得る。例えば、ベクター（複数可）から発現される代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数）は、目的の特定の生物によって（例えば、治療が導入される生物において）優先的に使用されるコドンを有するように設計され得る。
【０１０７】
代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）をコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製系（３ＳＲ）およびＱβレプリカーゼ増幅系（ＱＢ）によって、クローニングまたは増幅され得る。広範な種々のクローニングおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法論が公知である。さらに、代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）をコードする核酸コード配列は、クローニング技法によって調製され得る。適切なクローニングおよび配列決定技法ならびに指示の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  ｉｎ  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．において見出される。
【０１０８】
代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）をコードする核酸配列は、例えば、適切な配列のクローニングを含む任意の適切な方法によって、またはＮａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：９０−９９，  １９７９のホスホトリエステル方法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：１０９−１５１，  １９７９のホスホジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．  ２２：１８５９−１８６２，  １９８１のジエチルホスホロアミダイト方法；例えば、例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：６１５９−６１６８，  １９８４に記載される自動合成機を使用する、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔｓ．  ２２（２０）：１８５９−１８６２，  １９８１によって記載される固相ホスホロアミダイトトリエステル方法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法などの方法による直接的な化学的合成によって、調製され得る。化学的合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。これは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または鋳型として一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換され得る。ＤＮＡの化学的合成は、一般に、約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列が、より短い配列のライゲーションによって取得され得る。
【０１０９】
一例では、代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）は、タンパク質をコードするｃＤＮＡをベクター中に挿入することによって調製される。挿入は、タンパク質（複数可）が産生されるようにタンパク質（複数可）がインフレームで読まれるように、行われ得る。タンパク質をコードする異種核酸配列を含有する組換えベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）を調製するための技法は、公知である。
【０１１０】
代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、さらなるタンパク質、例えばサイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数）の核酸コード配列は、配列の挿入または組入れを可能にするように操作され得、（例えば、腫瘍細胞において）発現され得るプラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルが含まれるがこれらに限定されない発現ベクター中に挿入され得る。ベクターからコード配列を発現させる方法は、公知である。発現ベクターは、細胞における代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数）コード配列を含有する発現ベクターの移行および引き続く複製に必要なさらなるエレメントを含有し得る。かかるエレメントの例には、複製起点および選択マーカー、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子または抗生物質抵抗性マーカーが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１１】
代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）をコードする核酸配列は、発現制御配列に作用的に連結され得る。代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数）コード配列に作用的に連結した発現制御配列は、代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）のタンパク質コード配列の発現が、発現制御配列と適合性の条件下で達成されるように、ライゲーションされる。例示的な発現制御配列には、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）コード遺伝子の前の開始コドン（即ち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、および停止コドンが含まれるがこれらに限定されない。使用され得る発現制御エレメントの例には、ｌａｃ系、ファージラムダのオペレーターおよびプロモーター領域、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスまたはＳＶ４０に由来するプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。さらなる機能性エレメント（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）には、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに細胞における代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）のタンパク質をコードする核酸配列の適切な転写および引き続く翻訳に必要な任意の他の配列��含まれるがこれらに限定されない。一例では、プロモーターは、７．５プロモーターである。一例では、ＩＲＥＳが、発現を駆動するために使用される。一部の例では、２つのプロモーターが使用される。
【０１１２】
代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）タンパク質をコードするウイルスベクターが調製され得る。使用され得る例示的なウイルスベクターには、トリ、マウスおよびヒト起源の、ポリオーマ、ＳＶ４０、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、アルファウイルスならびにレトロウイルスが含まれるがこれらに限定されない。バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核多角体病ウイルス（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）；ＡｃＭＮＰＶ）ベクターもまた使用され得る。他の適切なベクターには、オルソポックスベクター、トリポックス（ａｖｉｐｏｘ）ベクター、鶏痘ベクター、カプリポックス（ｃａｐｒｉｐｏｘ）ベクター、スイポックス（ｓｕｉｐｏｘ）ベクター、レンチウイルスベクター、アルファウイルスベクターおよびポリオウイルスベクターが含まれる。特定の例示的なベクターは、ポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスおよび高度に弱毒化されたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、アデノウイルス、バキュロウイルスなどである。使用されるポックスウイルスには、オルソポックス、スイポックス、トリポックスおよびカプリポックスウイルスが含まれる。オルソポックスには、ワクシニア、エクトロメリアおよびアライグマポックス（ｒａｃｃｏｏｎ  ｐｏｘ）が含まれる。使用されるオルソポックスの一例は、ワクシニアである。トリポックスには、鶏痘、カナリアポックスおよびハトポックス（ｐｉｇｅｏｎ  ｐｏｘ）が含まれる。カプリポックスには、山羊痘および羊痘が含まれる。一例では、スイポックスは、ブタポックスである。使用され得る他のウイルスベクターには、他のＤＮＡウイルス、例えば、ヘルペスウイルスおよびアデノウイルス、ならびにＲＮＡウイルス、例えば、レトロウイルスおよびポリオが含まれる。
代謝をモジュレートするタンパク質の投与
【０１１３】
一部の例では、代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）を発現させるために組換えＯＶを使用する代わりに、代謝をモジュレートするタンパク質、またはそのタンパク質をコードする核酸分子が、対象に投与される。
【０１１４】
一例では、ベクターは、腫瘍の領域において代謝をモジュレートするタンパク質を発現させるために使用され、ベクターは、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）をコードする核酸分子を含む。使用され得るベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスが含まれ得る。別の例では、代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）をコードする裸の核酸分子が投与される。
【０１１５】
ネイティブまたはバリアント代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）をコードする核酸分子は、ベクター中に組み入れられ得る。ネイティブまたはバリアント代謝をモジュレートするタンパク質（例えば、サイトカインを含む融合タンパク質の一部であり得る、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］、およびＩＧＦ−１）をコードする核酸配列、例えば、本明細書で提供されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号に示される核酸配列（例えば、配列番号１、３、５または７）に対して少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列が、生成され得る。さらに、当業者は、機能的に等価な核酸、例えば、配列が異なるが同じタンパク質配列をコードする核酸を含有する種々のクローンを容易に構築することができる。一部の例では、かかる配列は、宿主細胞、例えば、所望のタンパク質（複数可）を発現させるために使用される宿主腫瘍における発現のために最適化される。
さらなる治療
【０１１６】
開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスで処置される対象は、１つまたは複数のさらなる治療、例えば、有効量の化学療法、有効量の放射線療法（例えば、腫瘍を根絶することまたはそれを収縮させることを助けるための、腫瘍部位への放射活性材料またはエネルギー（例えば、外部照射治療（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｂｅａｍ  ｔｈｅｒａｐｙ））の投与）、有効量の生物製剤（例えば、治療的モノクローナル抗体、リガンドまたはアプタマー）、および手術（例えば、がんまたはその一部分の外科的切除）のうちの１つまたは複数を受けることができる。したがって、一部の例では、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスおよび１つまたは複数の抗がん剤（例えば、化学療法薬または生物製剤）のうちの１つまたは複数を含むキットが提供される。
【０１１７】
一例では、対象は、１つまたは複数の化学療法剤でさらに処置される。化学療法剤には、異常な細胞成長によって特徴付けられる疾患、例えばがんの処置において治療的有用性を有する任意の化学的薬剤が含まれる。当業者は、使用される化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Ｓｌａｐａｋ  ａｎｄ  Ｋｕｆｅ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ８６  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｐｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｈ．  １７  ｉｎ  Ａｂｅｌｏｆｆ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  （Ｃ）  ２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，  Ｉｎｃ；Ｂａｌｔｚｅｒ，  Ｌ．，  Ｂｅｒｋｅｒｙ，  Ｒ．  （ｅｄｓ）：  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，  １９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｋｎｏｂｆ，  Ｍ．Ｆ．，  Ｄｕｒｉｖａｇｅ，  Ｈ．Ｊ．  （ｅｄｓ）：  Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ４ｔｈ  ｅｄ．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，  １９９３；Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （４ｔｈ  ｅｄ．）．  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｎｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００５；Ｓｋｅｅｌ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  （６ｔｈ  ｅｄ．）．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ２００３を参照のこと）。組合せ化学療法は、がんを処置するための１つよりも多い薬剤の投与である。
【０１１８】
使用され得る化学療法剤の例には、アルキル化剤、代謝拮抗薬、天然産物、またはホルモンおよびそれらのアンタゴニストが含まれる。アルキル化剤の例には、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシル）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンまたはダカルバジン）が含まれる。アルキル化剤の特定の非限定的な例は、テモゾロミドおよびダカルバジンである。代謝拮抗薬の例には、葉酸アナログ（例えば、メソトレキセート）、ピリミジンアナログ（例えば、５−ＦＵまたはシタラビン）、およびプリンアナログ、例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニンが含まれる。天然産物の例には、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシンまたはマイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｃｙｃｉｎ  Ｃ））および酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）が含まれる。種々雑多な薬剤の例には、白金配位錯体（例えば、シスプラチンとしても公知のシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩ）、置換されたウレア（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、および副腎皮質（ａｄｒｅｎｏｃｒｏｔｉｃａｌ）抑制薬（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）が含まれる。ホルモンおよびアンタゴニストの例には、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ））、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）およびアンドロゲン（例えば、プロピオン酸テストステロン（ｔｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）およびフルオキシメステロン）が含まれる。
【０１１９】
１つまたは複数の代謝調節性タンパク質を発現する開示されるＯＶと組み合わせて使用され得る一般に使用される化学療法薬の例には、アドリアマイシン、アルケラン、アラ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、サイトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｕｒａｃｉｌ）（５−ＦＵ）、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メソトレキセート、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン、例えば、ドセタキセル）、ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が含まれるが、いくつかのより新たな薬物には、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、イリノテカン（カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼヴァリン（Ｚｅｖｅｌｉｎ）およびカルシトリオールが含まれる。使用され得る免疫調節薬の非限定的な例には、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｉｍｒｅｇ、Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．から）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。
【０１２０】
１つまたは複数の代謝調節性タンパク質を発現する開示されるＯＶと組み合わせて使用され得るさらなる治療剤には、微小管結合剤、ＤＮＡインターカレーターまたはクロスリンカー、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ転写阻害剤、抗体、酵素、酵素阻害剤、遺伝子調節剤、血管新生阻害剤が含まれる。これらの薬剤（これらは、治療有効量で投与される）および処置は、単独でまたは組み合わせて使用され得る。方法およびかかる薬剤の治療的投薬量は、公知であり、熟練した臨床医によって決定され得る。
【０１２１】
微小管結合剤は、チューブリンと相互作用して微小管形成を安定化または不安定化し、それによって、細胞分裂を阻害する、薬剤を指す。開示される治療と併せて使用され得る微小管結合剤の例には、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン１５、ノコダゾール、ポドフィロトキシンおよびリゾキシンが含まれるがこれらに限定されない。かかる化合物のアナログおよび誘導体もまた使用され得る。例えば、適切なエポチロンおよびエポチロンアナログは、国際公開第ＷＯ２００４／０１８４７８号に記載されている。タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル、ならびに米国特許第６，６１０，８６０号；同第５，５３０，０２０号；および同第５，９１２，２６４号によって教示されるパクリタキセルのアナログが使用され得る。
【０１２２】
アクチノマイシンＤ、ダウノルビシン、ドキソルビシンならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれるがこれらに限定されない、適切なＤＮＡおよび／またはＲＮＡ転写調節剤もまた、開示される治療と組み合わせた使用に適切である。対象に投与され得るＤＮＡインターカレーターおよび架橋剤には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミドならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれるがこれらに限定されない。治療剤としての使用に適切なＤＮＡ合成阻害剤には、メソトレキセート、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびそれらのアナログが含まれるがこれらに限定されない。適切な酵素阻害剤の例には、カンプトテシン、エトポシド、ホルメスタン、トリコスタチンならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれるがこれらに限定されない。遺伝子調節に影響を与える適切な化合物には、１つまたは複数の遺伝子の発現の増加または減少をもたらす薬剤、例えば、ラロキシフェン、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストンならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれる。
【０１２３】
開示される方法は、治療有効量の免疫療法を対象に投与するステップをさらに含み得る。使用され得る免疫調節薬の非限定的な例には、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｉｍｒｅｇ、Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．から）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。免疫療法剤（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒｐａｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）は、ＰＤ−１アンタゴニストまたはＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）、例えば、アテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＮＳ−９３６５５８（ニボルマブ）、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、デュルバルマブ、ＣＴ０１１、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＭＥＤＩ−０６８０、ＢＭＳ−９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＰＤＬ−３２８０Ａ、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃであり得る。免疫療法剤はまた、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３またはＢ７−Ｈ３アンタゴニスト、例えば、トレメリムマブ、ＢＭＳ−９８６０１６およびＭＧＡ２７１であり得る。
【０１２４】
一部の例では、投与されるさらなる治療剤は、Ｔ細胞アゴニスト、例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０および／またはＧＩＴＲのアゴニストである。ＯＸ４０は、１型膜貫通糖タンパク質である。ヒトＯＸ４０配列は、１９１ａａの細胞外Ｎ末端部分および３６ａａの細胞内領域を含む。ＯＸ４０Ｌは、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。一例では、ＯＸ４０アゴニストは、抗ＯＸ４０抗体、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、ＰＦ−０４５１８６００、ＭＥＤＩ−６４６９、ＭＥＤＩ−０５６２、ＭＥＤＩ−６３８３、ＭＯＸＲ−０９１６、ＢＭＳ９８６１７８またはＧＳＫ３１７４９９８）である。天然のＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）を模倣することで、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体は、ＯＸ４０受容体に選択的に結合し、それを活性化する。一例では、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０リガンド、ＯＸ４０Ｌ、例えば、天然のリガンド（例えば、ヒトＯＸ４０Ｌ）である。一例では、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０アプタマーである。４−１ＢＢ（ＣＤ１３７／ＴＮＦＳＦ９）は、複数のＴ細胞共刺激受容体を含むＴＮＦ受容体ファミリーに属する。これは、ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞を含むＴ細胞上で見出される。活性化されたＴ細胞の生存、拡大増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）および増強されたエフェクター機能を促進するその能力と併せて、Ｔ細胞および抗原提示細胞の両方上での４−１ＢＢの発現が、４−１ＢＢを腫瘍免疫療法の標的にしている。一例では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢアゴニスト抗体、例えば、ｍＡｂである。開示される方法とともに使用され得る特異的なアゴニストｍＡｂには、ＰＦ−０５０８２５６６（ウトミルマブ（ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ））およびＢＭＳ−６６３５１３（ウレルマブ）が含まれる。一例では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、例えば、天然の４−１ＢＢＬ（例えば、ヒト４−１ＩＢＢＬ）またはストレプトアビジン化４−１ＢＢＬ（ＳＡ−４−１ＢＢＬ）複合体である。一例では、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢアプタマーである。ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体またはＴＮＦＲＳＦ１８）は、他のＴＮＦ受容体ファミリーメンバー、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２７および４−１ＢＢに対して相同性を有するＩ型膜貫通タンパク質である。ＧＩＴＲは通常、静止ＣＤ４＋ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で低いレベルで発現されるが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上では高いレベルで構成的に発現される。そのリガンドであるＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）もまた、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、ＤＣ、マクロファージおよび活性化されたＢ細胞を含む活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって優勢に発現される。一例では、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲアゴニスト抗体、例えば、ｍＡｂである。開示される方法とともに使用され得る特異的なＧＩＴＲアゴニストｍＡｂには、ＤＴＡ−１、ＴＲＸ５１８、ＭＫ−４１６６、ＭＫ−１２４８、ＡＭＧ  ２２８、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６、ＧＷＮ３２３（Ｎｏｖａｒｔｉｓから）、ＣＫ−３０２（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから）およびＢＭＳ−９８６１５６が含まれる。一例では、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、例えば、天然のＧＩＴＲＬまたは多価ＧＩＴＲリガンド融合タンパク質である。一例では、ＧＩＴＲアゴニストは、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するヘキサマーＧＩＴＲＬ分子であるＭＥＤＩ１８７３である。一例では、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲアプタマーである。
【０１２５】
抗血管新生剤の非限定的な例には、分子、例えば、タンパク質、酵素、多糖、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび組換えベクター、ならびに血管成長を低減させるまたはさらには阻害するように機能する小分子が含まれる。開示される方法とともに使用され得る適切な血管新生阻害剤の例には、アンジオスタチンＫ１−３、スタウロスポリン、ゲニステイン、フマギリン、メドロキシプロゲステロン、スラミン、インターフェロン−アルファ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血小板第４因子、ソマトスタチン、トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｏｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、エンドスタチン、サリドマイドならびにそれらの誘導体およびアナログが含まれるがこれらに限定されない。例えば、一部の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体（例えば、アバスチン、Ｒｏｃｈｅ）またはＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する抗体（例えば、ＶＥＧＦＲ２抗体）である。一例では、抗血管新生剤には、ＶＥＧＦＲ２抗体もしくはＤＭＸＡＡ（バジメザンまたはＡＳＡ４０４としても公知；例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販される）またはそれら両方が含まれる。抗血管新生剤は、ベバシズマブ、スニチニブ、抗血管新生チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えば、スニチニブ、アキシチニブ（ｘｉｔｉｎｉｂ）およびダサチニブであり得る。これらは、個々にまたは任意の組合せで使用され得る。
【０１２６】
開示される方法とともに使用され得る例示的なキナーゼ阻害剤には、成長因子のリン酸化および活性化を防止する、グリベック（Ｇｌｅｅｖａｃ）、イレッサおよびタルセバ、スニチニブ、ソラフェニブ、アニチニブ（ａｎｉｔｉｎｉｂ）ならびにダサチニブが含まれる。使用され得る抗体には、成長因子および血管新生経路を遮断するハーセプチンおよびアバスチンが含まれる。これらは、個々にまたは組み合わせて使用され得る。
【０１２７】
一部の例では、投与されるさらなる治療剤は、生物製剤、例えば、モノクローナル抗体、例えば、３Ｆ８、アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフツズマブ、アラシズマブ（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、ペンテト酸アルツモマブ（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、アナツモマブマフェナトクス（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ  ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブメルタンシン、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クリバツズマブテトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コナツムマブ、ダセツズマブ、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、ファルレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブメルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ、マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、ナコロマブタフェナトクス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ  ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナプツモマブエスタフェナトクス、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブメルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ  ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、オファツムマブ、オララツマブ、オポルツズマブモナトクス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ  ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペルツズマブ、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、サツモマブペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、タカツズマブテトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タプリツモマブパプトクス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｐｔｏｘ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（トレメリムマブ）、ティガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ  ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ、またはそれらの組合せである。一部の例では、治療的抗体は、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１に対して特異的である。
【０１２８】
一部の例では、対象には、有効量の骨髄非破壊的化学療法または放射線療法もまた投与される。例えば、対象は、有効量の骨髄非破壊的化学療法、例えば、シスプラチン、フルダラビン、イダルビシン、メルファラン、アラ−Ｃ、２−クロロデオキシアデノシン、抗胸腺細胞グロブリンおよびシクロホスファミドのうちの１つまたは複数の投与（例えば、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重）を受け得る。一部の例では、対象は、有効量の固形腫瘍照射、胸腺照射もしくは全身照射（例えば、２Ｇｙ）、またはそれらの組合せを受ける。
【０１２９】
一部の例では、組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与後、対象には、有効量のタクロリムス、シクロスポリンおよび／またはメソトレキセートのうちの１つまたは複数が投与される。
【０１３０】
一部の例では、組換えＯＶおよび１つまたは複数のさらなる治療は、例えば、かつ限定ではなく、処置されている対象に併せて投与され得るか、または同じ時点で、もしくは任意の順序で逐次的に、または異なる時点で投与され得る。
【０１３１】
さらなる治療は、種々の例では、液体剤形、固体剤形、坐剤、吸入用剤形、鼻腔内剤形、リポソーム製剤中、ナノ粒子を含む剤形、マイクロ粒子を含む剤形、ポリマー剤形、またはそれらの任意の組合せで投与され得る。ある特定の場合には、さらなる治療は、約１週間〜約２週間、約２週間〜約３週間、約３週間〜約４週間、約４週間〜約５週間、約６週間〜約７週間、約７週間〜約８週間、約８週間〜約９週間、約９週間〜約１０週間、約１０週間〜約１１週間、約１１週間〜約１２週間、約１２週間〜約２４週間、約２４週間〜約４８週間、約４８週間もしくは約５２週間、またはそれよりも長い期間にわたって投与され得る。さらなる治療の投与の頻度は、ある特定の例では、毎日１回、毎日２回、１週間毎に１回、３週間毎に一回、４週間毎に１回（または１ヶ月に１回）、８週間毎に１回（または２ヶ月毎に１回）、１２週間毎に一回（または３ヶ月毎に１回）、または２４週間毎に一回（６ヶ月毎に１回）であり得る。ある特定の場合には、がんを有する対象を処置する方法は、有効量の、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質をコードし得る１つまたは複数の核酸を含む本開示の組換えＯＶ、例えば、組換えワクシニアウイルスを対象に投与するステップを含み得る。
臨床応答
【０１３２】
かかる方法は、腫瘍の体積もしくは重量を低減させること、転移の数を低減させること、転移のサイズもしくは重量を低減させること、またはそれらの組合せによって、対象における腫瘍を処置することができる。一部の例では、転移は、皮膚または皮下である。したがって、一部の例では、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与（単独でまたは別の抗がん治療と組み合わせて）は、腫瘍のサイズまたは体積を、例えば、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与なしまたは代謝をモジュレートするタンパク質コード配列（例えば、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）を含有しない組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％低減させることによって、対象における腫瘍を処置する。一部の例では、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与は、腫瘍の重量を、例えば、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与なしまたは代謝をモジュレートするタンパク質コード配列（例えば、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）を含有しない組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％低減させることによって、対象における腫瘍を処置する。一部の例では、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与は、転移のサイズまたは体積を、例えば、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与なしまたは代謝をモジュレートするタンパク質コード配列（例えば、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）を含有しない組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％低減させることによって、対象における腫瘍を処置する。一部の例では、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与は、転移の数を、例えば、開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与なしまたは代謝をモジュレートするタンパク質コード配列（例えば、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１［例えば、レプチン、インスリン、ケメリンおよびＩＧＦ−１のうちの１つまたは複数］）を含有しない組換え腫瘍溶解性ウイルスの投与と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％低減させることによって、対象における腫瘍を処置する。一部の例では、これらの効果の組合せが達成される。
組成物およびキット
【０１３３】
開示される方法とともに使用され得る組成物およびキットもまた提供される。一部の例では、組成物またはキットは、例えば、薬学的に許容される担体と共に、代謝をモジュレートするタンパク質を発現する１つまたは複数の開示される組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む。一例では、ＯＶは、アディポカイン（例えば、レプチン、ケメリン、アディポネクチン、アペリン、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＲＢＰ４、ＴＮＦα、ビスファチン、オメンチン、バスピン、プログラニュリンおよび／またはＣＴＲＰ−４）を発現する。一例では、ＯＶは、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１を発現する。一例では、ＯＶは、レプチンを発現する。アディポカイン、インスリンおよび／またはＩＧＦ−１は、第２のタンパク質、例えば、ガンマ鎖サイトカイン（例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５）をさらに含む融合タンパク質の一部であり得る。一部の例では、第２のタンパク質は、サイトカインタンパク質、例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはそれらの任意の組合せを含む融合タンパク質であり得る。他の例は上に提供される。
【０１３４】
一例では、ＯＶは、レプチン、インスリン、ケメリンまたはＩＧＦ−１（これらは、ガンマ鎖サイトカイン、例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５をさらに含む融合タンパク質の一部であり得る）を発現する。具体的な例では、ＯＶは、タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−ＶＥＣ）である。具体的な例では、ＯＶは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株のワクシニアウイルスである。具体的な例では、ＯＶは、ワクシニアであり、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質は、レプチンである。具体的な例では、ＯＶは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株のワクシニアウイルスであり、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質は、レプチンである。具体的な例では、ＯＶは、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株のワクシニアウイルスであり、１つまたは複数の代謝をモジュレートするタンパク質は、レプチン−ＩＬ−２またはレプチン−ＩＬ−１５融合タンパク質である（レプチンおよびサイトカインは、リンカーによって結合され得る）。
【０１３５】
キットは、さらなる試薬、例えば、１つまたは複数の抗がん試薬、例えば、化学療法薬、生物製剤、またはそれらの組合せを含み得る。一部の例では、キット中で、ＯＶおよび抗がん試薬は、別々のコンテナ中に存在する。
【０１３６】
一例では、キットは、生物製剤、例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト；ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト；ＣＴＬＡ４アンタゴニスト；Ｔ細胞アゴニスト；またはそれらの組合せをさらに含む。一例では、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニストおよびＴ細胞アゴニストは、ｍＡｂである。例示的なＴ細胞アゴニストには、４−１ＢＢのアゴニスト、ＯＸ４０のアゴニストおよびＧＩＴＲのアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔｓ  ＧＩＴＲ）、例えば、ｍＡｂ、アプタマー、またはこれらの受容体に対するリガンドが含まれる。キット中に含まれ得る４−１ＢＢの例示的なアゴニストには、ｍＡｂ、例えば、ＰＦ−０５０８２５６６（ウトミルマブ）もしくはＢＭＳ−６６３５１３（ウレルマブ）、またはリガンド（例えば、４−１ＢＢＬまたはＳＡ−４−１ＢＢＬ）が含まれる。キット中に含まれ得るＯＸ４０の例示的なアゴニストには、ｍＡｂ（例えば、ＰＦ−０４５１８６００、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６３８３、ＭＯＸＲ０９１６、ＢＭＳ９８６１７８またはＧＳＫ３１７４９９８）またはリガンド（例えば、ＯＸ４０Ｌ）が含まれる。キット中に含まれ得るＧＩＴＲの例示的なアゴニスト（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ＧＩＴＲ）には、ＧＩＴＲアゴニストｍＡｂ、例えば、ＤＴＡ−１、ＴＲＸ５１８、ＭＫ−４１６６、ＭＫ−１２４８、ＡＭＧ２２８、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６、ＧＷＮ３２３（Ｎｏｖａｒｔｉｓから）、ＣＫ−３０２（Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから）またはＢＭＳ−９８６１５６が含まれる。キット中に含まれ得るＧＩＴＲの例示的なアゴニストには、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、例えば、天然のＧＩＴＲＬまたは多価ＧＩＴＲリガンド融合タンパク質、例えば、ＭＥＤＩ１８７３が含まれる。
【０１３７】
本明細書に開示される組成物、例えば、本明細書で提供されるＯＶを含むコンテナもまた提供される。一部の実施形態では、コンテナは、シリンジである。一部の例では、シリンジは、針を含む。シリンジ中のプランジャーは、吸引の間にプランジャーが偶然に外れるのを防止するためのストッパーを有し得る。使い捨てシリンジは、一般に、単一用量のワクチンを含有する。シリンジは、針の取り付け前には、先端を密封するための先端キャップを有し得る。非限定的な例では、先端キャップは、ゴム、例えば、ブチルゴムで作製される。
【０１３８】
他の実施形態では、コンテナは、バイアルである。一部の例では、バイアルは、ガラス、例えば、無色ガラス、例えば、ホウケイ酸塩で作製される。他の例では、バイアルは、プラスチックで作製される。バイアルは、ストッパー、例えば、ゴムストッパー、またはキャップ、例えば、シリンジの挿入を可能にするように適応されたキャップ含み得る。一部の例では、バイアルは、単一用量の組成物を含む。他の例では、バイアルは、複数用量の組成物、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれよりも多くの用量の組成物を含む。一般に、バイアルは、組成物を添加する前に無菌化される。
【０１３９】
本明細書に開示されるコンテナを含むキットもまた提供される。一部の実施形態では、キットは、バイアル（例えば、組成物を含有するバイアル）、シリンジ（例えば、空のシリンジ、または組成物を含有するシリンジ）、針、またはそれらの任意の組合せを含む。組成物は、懸濁物中、例えば、ＰＢＳまたは他の薬学的に許容される担体中にあり得る。あるいは、組成物は、エンドユーザーによって（例えば、ＰＢＳまたは他の薬学的に許容される担体を用いて）次いで復元され得る、乾燥または粉末化された形態、例えば、凍結乾燥またはフリーズドライされた形態であり得る。一部の例では、コンテナは、薬学的に許容される担体、例えば、ＰＢＳを含み得、または薬学的に許容される担体、例えば、ＰＢＳは、別々のコンテナ中にあり得る（例えば、組成物がフリーズドライまたは凍結乾燥される場合）。一部の例では、キット中のコンテナは、１つまたは複数の安定剤をさらに含む。一部の例では、キットは、対象への組成物の投与を可能にするデバイスもまた含む。かかるデバイスの例には、シリンジが含まれる。キットは、組成物の詳細を含む小冊子、例えば、組成物内のＯＶの投与および／または詳細についての指示と共に、（例えば、同じ箱中に）包装され得る。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
材料および方法
この実施例は、以下の実施例に記載される結果を生成するために使用した材料および方法を記載する。
マウス
【０１４１】
Ｃ５７／ＢＬ６マウスおよびＰｔｅｎｆ／ｆＢｒａｆＶ６００ＥＴｙｒＣｒｅ．ＥＲマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得し、組織内で繁殖させた。
腫瘍系
【０１４２】
腫瘍実験を、タモキシフェンを塗布したＰｔｅｎｆ／ｆＢｒａｆＶ６００ＥＴｙｒＣｒｅ．ＥＲから形成された黒色腫腫瘍に由来する単一細胞クローン（クローン２４）を使用して実施した。レプチンのｃＤＮＡを、ＯｒｉＧｅｎｅから取得し、クローン２４中にトランスフェクトし、その後ハイグロマイシン選択した（空のベクタープラスミドを対照として使用した）。単一細胞クローンを選択し、対照プラスミドについては細胞系ＣＬ２４ハイグロとして、レプチン発現性細胞系についてはＣＬ２４レプチンとして成長させた。
腫瘍モデル
【０１４３】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、０日目に、ＣＬ２４ハイグロまたはＣＬ２４レプチン黒色腫細胞系（真皮内で２５０，０００細胞）を注射し、腫瘍がいずれかの方向で１５ｍｍに達するまで追跡した。腫瘍を、デジタルキャリパーを用いて一日おきに測定し、腫瘍サイズを、Ｌ×Ｗによって計算した。腫瘍を、腫瘍がおよそ２０ｍｍ２に達した時点で、ＰＢＳ、ＶＶ対照またはＶＶレプチン（２．５×１０６ＰＦＵ）で腫瘍内処置し、腫瘍成長を、ＰＢＳで処置した腫瘍がいずれかの方向で１５ｍｍに達するまでモニタリングした。ＣＤ８枯渇実験のために、マウスに、マウス１匹当たり２００ｕｇの抗ＣＤ８（ＹＴＳ）を、０日目に開始して一日おきに注射した。７日目に、マウスに、ＣＬ２４ハイグロまたはＣＬ２４レプチン黒色腫細胞系（真皮内で２５０，０００細胞）を注射し、腫瘍がいずれかの方向で１５ｍｍに達するまで追跡した。
腫瘍溶解性ウイルス産生
【０１４４】
野生型ワクシニアウイルスＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）から取得した。ＷＲ．ＴＫ−．Ｌｕｃ＋は以前に記載されており（Ｋｉｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ２００７；  ４（１２）：ｅ３５３）、ウイルスｐＳＥ／Ｌプロモーターからホタルルシフェラーゼを発現させ、ｐ７．５プロモーターからマウスレプチン（Ｌｅｐ）を発現させるように、クローニングされたｐＳＣ６５プラスミド（Ｂｅｒｎｉｅ  Ｍｏｓｓ教授、ＮＩＨから）を用いて、本研究のために構築した。これを、ウイルスＴＫ遺伝子中に組み換えた。レプチンを発現するワクシニアウイルスを、Ｇｉｂｓｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用してレプチン遺伝子をワクシニアプラスミド中にクローニングすることによって生成した。レプチン遺伝子は、マウスレプチンＯＲＦ哺乳動物発現プラスミド（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）からクローニングした。
リンパ節および腫瘍からのＴ細胞単離
【０１４５】
脾臓およびリンパ節のＣＤ８＋Ｔ細胞を、野生型マウスから単離した。組織を収集し、機械的に破壊し、Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ１０５、ＮＫ１．１、ＴＣＲγδおよびＣＤ４に対する抗体からなるビオチン化抗体カクテル（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共にインキュベートした。洗浄ステップの後、細胞を、ストレプトアビジンコーティングした磁性ナノ粒子（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）と共にインキュベートした。洗浄後、磁場を適用し、接触していない細胞を除去することによって、ＣＤ８＋細胞を単離した。
【０１４６】
腫瘍浸潤性リンパ球の単一細胞懸濁物を取得するために、腫瘍保有マウスを屠殺し、腫瘍を収集した。切除した腫瘍全体に、１０％ＦＢＳを有する緩衝化ＲＰＭＩ中２ｍｇ／ｍＬのＶＩ型コラゲナーゼ、２Ｕ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（ｈｙｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（Ｄｉｓｐａｓｅ）および１０Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を、２０Ｇの針を使用して反復注射し、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、腫瘍を、すりガラススライドの間で機械的に破壊し、濾過して粒状物を除去し、次いで、２分間ボルテックスした。多くの実験（特に選別の前の）では、腫瘍ホモジネートから、ＣＤ１０５−ビオチン媒介性磁気枯渇を使用して、腫瘍細胞を減量させた。
代謝アッセイ
【０１４７】
Ｔ細胞代謝出力を、Ｓｅａｈｏｒｓｅテクノロジーによって、以前に記載されたように測定した（Ｓｃｈａｒｐｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．  ２０１７；  ５：９−１６）。簡潔に述べると、１００，０００個のＴ細胞を、２５ｍＭのグルコース、２ｍＭのグルタミンおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有する最小非緩衝化アッセイ培地中で、Ｃｅｌｌ−ＴａｋコーティングしたＸＦｅ９６プレート中に播種した。細胞は、２μＭのオリゴマイシン、２μＭのＦＣＣＰ、１０ｍＭの２−デオキシグルコースおよび０．５μＭのロテノン／アンチマイシンＡの逐次注入を受けた。
【０１４８】
単一細胞代謝能を、フローサイトメトリーによってアッセイした。具体的には、２−ＮＢＤ−グルコース（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）およびＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ＦＭ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、細胞がグルコースを取り込む性向またはそれらのミトコンドリアを介して中間体を生成する性向についてアッセイした。非流入領域および流入領域リンパ節または腫瘍の調製物を、５％ＦＢＳ含有培地中２０μＭの２−ＮＢＤＧで、３７℃で３０分間パルスした。細胞を、表面染色し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  ＦＭ色素をロードして、ミトコンドリアの量および機能を測定した。
イムノブロッティング
【０１４９】
イムノブロッティングを、以前に記載されたように実施した（Ｄｅｌｇｏｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９；  ４６（１３）：２６９４−８）。レプチン抗体は、マウスレプチン／ＯＢ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ＢＡＦ４９８）から取得した。
ＥＬＩＳＡ
【０１５０】
ＥＬＩＳＡプレートを、５０ｕＬの捕捉抗体（ＰＢＳ中１：１０００）でコーティングし、４℃で一晩置いた。次の日、プレートを、洗浄緩衝液（１ＬのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した。プレートを、２００ｕＬのブロッキング緩衝液（２００ｍＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で室温で１時間ブロッキングした。試料を、検量線試料と一緒に、ブロッキング緩衝液中でウェルに添加した（５０μｌ）。プレートを室温で２時間インキュベートした。二次抗体を添加し（ブロッキング緩衝液中１：２０００）、室温で１時間インキュベートした。１時間後、ＨＲＰストレプトアビジン（ブロッキング緩衝液中１：２０００）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。４０μＬのＴＭＢ基質Ａおよび４０μＬのＴＭＢ基質Ｂを添加して、試料を発色させた。プレートを、４５０ｎｍにおいてプレートリーダーで読み取った。レプチンＥｌｉｓａ実験に使用した抗体：捕捉マウスレプチン／ＯＢ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＦ４９８）および検出抗体マウスレプチン／ＯＢ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ＢＡＦ４９８）。
ＴＣＲ配列決定
【０１５１】
異なる処置を行ったＣＬ２４腫瘍を切除し、ゲノムＤＮＡ抽出（ＤＮｅａｓｙ  ＱＩＡＧＥＮキット）のために処理した。次いで、ＴＣＲ配列決定を、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱアッセイ（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って実施した（Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；  １１４（１９）：４０９９−１０７）。
単一細胞ＲＮＡ配列決定分析
【０１５２】
ＣＬ２４腫瘍を、ＰＢＳ、ＶＶ対照またはＶＶレプチン（２．５×１０６ＰＦＵ）で７日間腫瘍内処置した。腫瘍浸潤性リンパ球を単離し、ＣＤ４５＋リンパ球について選別した。ＣＤ４５＋細胞を、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ機器（１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）中にロードし、得られたバーコード化ｃＤＮＡを使用して、ライブラリーを構築した。次いで、各試料由来のライブラリーを、ＲＮＡ−配列決定した。細胞−遺伝子ユニーク分子識別子計数マトリックスを、Ｓｅｕｒａｔ（Ｓａｔｉｊａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１５；３３（５）：４９５−５０２）を使用して生成および分析し、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ３．０（ｄｅ  Ｈｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００４；  ２０（９）：１４５３−４）を使用して階層的にクラスタリングした。
（実施例２）
腫瘍の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス処置は、腫瘍免疫微小環境をリモデリングする
【０１５３】
腫瘍溶解性ウイルス様Ｔ−ｖｅｃは、がん処置のためのＦＤＡ承認された免疫療法であるが（例えば、Ａｎｄｔｂａｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１５；  ３３（２５）：２７８０−８を参照のこと）、これらの薬剤の免疫的帰結は、不明瞭である。腫瘍溶解性ウイルス感染によって誘導された免疫浸潤物を、体系的にプロファイリングした。腫瘍溶解性ウイルス治療の１つの主要な制限は、Ｔ−ＶＥＣを含む多くのウイルスが、低酸素中では効率的に複製しないということである（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｌ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２；  ５（３）：２００−７；Ｐｉｐｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００５；  １２（１１）：９１１−７）。したがって、容易に操作され、その独自のポリメラーゼをコードし、低酸素性腫瘍細胞において複製機能を維持する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを使用した。Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ実験室株のワクシニアウイルスを使用した。このウイルスは、強力な腫瘍溶解性ウイルス剤を生成する、チミジンキナーゼおよびワクシニア成長因子遺伝子の遺伝的欠失を保有する（Ｂｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８５；  ３１７（６０４０）：８１３−５；Ｗｈｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １９９４；  １１６（２）：１８３−８；Ｐｕｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０００；  ７（１）：６６−７３）。タモキシフェン投与後に黒色腫を発達させたＰｔｅｎｆ／ｆＢｒａｆＬＳＬ．Ｖ６００ＥＴｙｒ２Ｃｒｅ．ＥＲマウスの単一細胞から生成した、クローン２４（ＣＬ２４）と命名された黒色腫細胞系（Ｄａｎｋｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２００９；  ４１（５）：５４４−５２）を使用した（図１Ａ）。この細胞系は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスと同系であり、（しばしば使用されるＢ１６とは対照的に）ヒト黒色腫に共通するドライバー変異を有する。さらに、このＣＬ２４細胞系は、浸潤性が低く（図１Ｂ）、抗ＰＤ１単剤療法に対して完全に非感受性である（図１Ｃ）。
【０１５４】
ワクシニアウイルスを、腫瘍のサイズが４ｍｍに達した時点で腫瘍内注射したところ、それにより、実質的な腫瘍退行をもたらしたが、完全奏効をもたらさなかった（図２Ａ）。腫瘍溶解性ウイルスによって誘導された腫瘍浸潤物の特徴を決定するために、ＰＢＳまたはワクシニア感染したクローン２４腫瘍のＣＤ４５＋腫瘍浸潤性白血球の単一細胞ＲＮＡ−配列決定を、１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓプロファイリングによって決定した。教師なしクラスタリングデータ分析を使用して、ＣＤ４５＋細胞を、別個の群の免疫集団へと分離した（図２Ｂ）。次いで、これらの免疫集団を、各集団について公知のマーカーの発現に基づいて分類した（図３Ａ〜３Ｃ）。重要なことに、これらの分析は、腫瘍がいまだ退行していなかったときに実施された。このデータは、総体として分析した場合に公知の免疫細胞集団を同定したが、処置群に基づくサブセット化により、ワクシニアウイルス腫瘍溶解性免疫療法が腫瘍免疫微小環境における著しい変化を誘導したことが明らかになった（図２Ｃ）。ワクシニア感染した腫瘍は、新たなエフェクターおよびエフェクター様ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｍ１マクロファージの大量流入、ならびに機能障害性または抑制性細胞、例えば、ＭＤＳＣ、Ｍ２マクロファージ、疲弊したＴ細胞および調節性Ｔ細胞の喪失を示した（図２Ｃ）。したがって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍免疫微小環境の劇的なリモデリングを誘導するが、これは、腫瘍誘導性免疫抑制および最終的な増生に最終的には屈する（図２Ａ）。
（実施例３）
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、重症の代謝欠損を有する疲弊していないＴ細胞浸潤を促進する
【０１５５】
腫瘍溶解性ウイルス処置したマウス由来のＴＩＬのフローサイトメトリー分析により、新たな免疫細胞の流入はＣＤ８＋Ｔ細胞が優勢であるようであることが確認され、一方、本発明者らは、Ｔ調節性Ｔ細胞の減少を観察している（図４Ａ）。これらの細胞の共阻害マーカー発現の分析は、Ｔｉｍ３単独の発現（図４Ｂ）ならびにＰＤ１の低い〜中間の発現（図Ｃ）を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の流入を示し、これは、これらの細胞が、再活性化された腫瘍常在細胞ではなく、むしろ新たな移住細胞であり、いまだ完全には疲弊していないＴ細胞であることを示している。共阻害分子発現は、Ｔ細胞機能障害に関連するが、代謝不全もまた、Ｔ細胞機能を予測することができる。ミトコンドリア含量を、代謝充足についてのマーカーとして分析したところ、発現の「疲弊していない」共阻害分子パターンにもかかわらず、腫瘍溶解性ウイルス処置された腫瘍からのＴＩＬが、代謝疲弊になおも屈したことが明らかになった（図４Ｄ）。
（実施例４）
レプチンは、活性化されたＴ細胞を代謝的にリプログラムする
【０１５６】
腫瘍溶解性ウイルスが、代謝不全になおも屈した新たな免疫浸潤物を刺激したことを考慮して、それらが腫瘍微小環境中でより競合的であるように新たなＴ細胞を強化する方法を同定した。かかる薬剤がウイルスベクター中でコードされ得るように、遺伝的にコードされたペイロードを利用することが目的であった。レプチンは、エネルギー恒常性をモジュレートするだけでなく、炎症性応答を促進するサイトカインである。Ｔ細胞に対するレプチンの代謝リプログラミング機能を決定するために、末梢リンパ節（ＬＮ）から単離された活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、漸増濃度のレプチン中で培養した。
【０１５７】
レプチンは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の基底酸素消費率ならびに予備呼吸能（長寿命のメモリーＴ細胞を規定するミトコンドリア予備量の尺度（２０））の両方における増加を誘導したが（図５Ａ）、細胞外酸性化によって測定されるように、活性化されたＴ細胞が解糖を実施する能力に対してはほとんど影響を有さなかった（図５Ｂ）。フローサイトメトリー分析は、このデータを補強し、より高い酸化的リン酸化を示す、レプチン曝露下でのミトコンドリア量における増加を示すが、グルコース取込みにおける変化は観察されない（図５Ｃ）。したがって、レプチンは、それらの酸化活性および能力を増加させるようにＴ細胞を刺激することができ、これは、腫瘍微小環境における高度に望ましい代謝リプログラミング事象である。
【０１５８】
レプチン受容体の発現を、以前に観察されたように（１８）、マウスＴ細胞において確認した（図５Ｄ）。さらに、黒色腫腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）は、リンパ節中のＴ細胞と比較して、より高いレベルのレプチン受容体を発現する（図５Ｄ）。共阻害分子の発現レベルに従ってＴＩＬをカテゴライズすると、レプチン受容体のより高い発現が、ＰＤ１およびＴｉｍ３の高い発現と共に、活性化されたまたは疲弊したＴ細胞において観察された（図５Ｅ）。したがって、レプチンは、Ｔ細胞において代謝リプログラミングを促進することができ、腫瘍浸潤性Ｔ細胞は、その受容体を保有する。
（実施例５）
腫瘍微小環境における局所的レプチンレベルを上昇させると、抗腫瘍免疫が可能になる
【０１５９】
腫瘍浸潤性リンパ球との関係におけるレプチンの治療効果は、以前には調査されていない。レプチンは、腫瘍浸潤性リンパ球の代謝能を増強することができ、結果的に、腫瘍におけるそれらの機能を増強するという仮説が立てられた。
【０１６０】
組換えレプチンで腫瘍保有マウスを処置する初期の研究は、全身送達が、比較的高い用量であっても、腫瘍間質液中のレプチンレベルを実質的に改善することができないことを示した。そこで、レプチンの代謝リプログラミング機能を分離して（腫瘍溶解性ウイルス感染を除いて）最初に試験するために、ＣＬ２４は、空のベクター（ＣＬ２４ハイグロ）またはレプチン（ＣＬ２４レプチン）を発現するように操作された細胞であった。ＣＬ２４レプチン細胞は、レプチンを細胞内発現し（図６Ａ）、それを培養物上清中に放出した（図６Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＣＬ２４レプチンは、対照プラスミドを発現するＣＬ２４（ＣＬ２４ハイグロ）と匹敵する成長動態を示した（図６Ｃ）。しかし、ＣＬ２４レプチン細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス中に真皮下注射した場合、これらは、ＣＬ２４ハイグロ対照と比較して実質的により緩徐な速度で成長し（図７Ａ）、有意に延長された生存を有し（図７Ｂ）、これは、レプチンが宿主免疫を刺激し得ることを示している。実際、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇（図６Ｄ）により、ＣＬ２４レプチン腫瘍において観察された制御された腫瘍成長が、機能的免疫を必要としたことが明らかになった（図７Ｃ）。したがって、腫瘍微小環境中のレプチンを局所的に上昇させることは、免疫媒介性腫瘍成長制御を誘導した。１０日目（この時点で、腫瘍は、群間で同等なサイズのものであった）における腫瘍浸潤性リンパ球の分析は、対照腫瘍と比較して、レプチンを発現する腫瘍において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤の増加を示した（図７Ｄ）。Ｂ細胞などの他の免疫集団ではなく、ナチュラルキラー細胞の浸潤の増加が観察された（図６Ｅ）。
（実施例６）
レプチンは、腫瘍浸潤性リンパ球の機能を代謝的に改善する
【０１６１】
レプチンがＴ細胞を機能的に改善したことが観察された。レプチン過剰発現性腫瘍に浸潤するＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＭＡおよびイオノマイシンによる再刺激の際に、上昇したレベルのＩＦＮγおよびＴＮＦαを合成した（図７Ｅ）。さらに、レプチン発現性腫瘍に浸潤するＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｋｉ６７染色によって測定されるように、ｉｎ  ｓｉｔｕでより増殖性である（図７Ｆ）。レプチンは、ＪＡＫ−Ｓｔａｔ３およびＭＡＰＫ経路を介してレプチン受容体を介して下流シグナルを活性化することができ、実際、レプチン過剰発現性腫瘍に浸潤するＴ細胞は、ＡＫＴ、ＳＴＡＴ３およびｐ３８−ＭＡＰＫのより高い定常状態リン酸化を有した（図６Ｆ）。したがって、これらの細胞は、より表現型的に「疲弊」しているように見えるかもしれないが、レプチン誘導性代謝的支持により、細胞は、多機能性、増殖性になることができ、腫瘍制御を媒介することができた。
（実施例７）
レプチン発現性腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、優れた抗腫瘍応答を誘導する
【０１６２】
レプチン発現性ワクシニアウイルスを生成するために、レプチン遺伝子（Ｌｅｐ）を、ワクシニアｐ７．５プロモーターの制御下で、ルシフェラーゼ発現性ｐＳＣ６５ベクター中にクローニングした。レプチン含有組換えワクシニアウイルス（ＶＶレプチン）および対照ルシフェラーゼ発現性ウイルス（ＶＶ対照）を生成し、ＣＬ２４細胞を感染させるために使用した。ＣＬ２４細胞におけるレプチンの発現を、感染の２４時間後および４８時間後に分析し（図８Ａ）、培地中のレプチンの放出も分析した（図８Ｂ）。ＣＬ２４腫瘍を保有するマウスを、２．５×１０６ＰＦＵの用量でＶＶ対照またはＶＶレプチンで腫瘍内処置したが、これは、腫瘍において特異的にルシフェラーゼ発現を誘導し（図８Ｄ）、腫瘍間質液中の遊離レプチンを検出するのに十分であった；白色脂肪（ＷＡ）組織間質液は、陽性対照として機能した（図８Ｃ）。さらに、ＴＩＬにおけるレプチン受容体（レプチンＲ）発現の分析は、３つの処置条件間で変化を示さない（図８Ｅ）。
【０１６３】
以前の結果と一致して、対照ウイルスを注射した全てのマウスが、最終的な腫瘍増生をもたらす部分奏効を経験した。この高悪性度黒色腫系は、抗ＰＤ１免疫療法に対して完全に抵抗性であるので（図１Ｃ）、対照ウイルスに対し部分奏効が得られたことは、特に素晴らしかった。ＶＶ対照で処置したマウスとは対照的に、同じ用量のＶＶレプチンを注射したマウスは、かなりの割合の完全奏効をを含め、より大きい退行を有した（図９Ａ）。
【０１６４】
トランスクリプトームプロファイルを、腫瘍浸潤物の分析で確認した。ｓｃＲＮＡｓｅｑデータと一致して、ＶＶ対照およびＶＶレプチンで処置した腫瘍における免疫浸潤物の分析は、両方の腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍部位においてＴ細胞浸潤における増加を誘導したことを示した（図９Ｂ）。腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスおよび腫瘍抗原に対する新たなＴ細胞プライミングを誘導すると主張されてきたので（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１７；  ９（４０８）；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１８；３３（４）：５９９−６０５）、腫瘍部位におけるＴ細胞レパートリーに対する処置の効果を試験した。ＴＣＲ配列決定により、ＰＢＳ処置した腫瘍は浸潤性Ｔ細胞をほとんど有さず、それらの浸潤性Ｔ細胞ではオリゴクローン性集団が優勢であったが、ワクシニアによる処置は、ポリクローン性レパートリーを有する新たなＴ細胞の実質的な流入を生じた（図９Ｃ）ことが明らかになった。レプチン操作されたワクシニアは、わずかにクローン性が低い集団を有し、これは、この時点（ウイルス処置の７日後）において、一部のクローンが優先的に増えていたことを示唆している（図９Ｄ）。クローン性増殖は、一部のメモリー前駆体の拡大増殖を示し得、実際に、レプチン操作されたＶＶは、より高いパーセンテージのＣＤ１２７ｈｉメモリー前駆体を誘導した（図９Ｅ）。
【０１６５】
レプチンは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を阻害し、自己免疫疾患における炎症性応答をモジュレートする。さらに、腫瘍溶解性ウイルス治療は、Ｔｒｅｇ細胞の浸潤を低減させ得る（Ｂａｒｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；  ２６（２７）：４４１８−２５；Ｒｉｃｃａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１８；  ２６（４）：１００８−１９）。一貫して、ＶＶ対照およびＶＶレプチンの腫瘍溶解性ウイルス処置後に、ＰＢＳ処置と比較したＴｒｅｇ集団のパーセンテージにおける減少が、ＶＶ対照とＶＶレプチンとの間で同等のレベルで観察され（図８Ｆ）、このことは、レプチンが、Ｔｒｅｇ細胞モジュレーションのレベルで必ずしも作用していなかったことを示している。
【０１６６】
メモリーＴ細胞は、ミトコンドリア予備量の増加を有し、それらのメモリー機能についてその予備量（ｒｅｓｅｒｖｅ）に依存する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ  ２０１３；  １１０（３５）：１４３３６−４１）。このように、レプチンは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を代謝的に支持し得る。ＶＶレプチンで処置した腫瘍中のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＶＤＡＣ染色によって測定されるように、ミトコンドリア量における増加を示した（図１０Ａ）。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤処置した腫瘍の分析により、ＶＶレプチンが、以下のように質的に優れた腫瘍浸潤物を誘導したことが明らかになった：サイトカインコンピテンシーにおける増加（図１０Ｂ）、ならびに増殖能の増加（図１０Ｃ）によって示される、腫瘍部位におけるＴ細胞活性の増加。
【０１６７】
まとめると、これらのデータは、腫瘍溶解性ウイルス処置によって誘導された新たに浸潤したＴ細胞に代謝的支持を提供することによって、優れた抗腫瘍能を有するメモリー前駆体集団が、優先的に増え、完全奏効を媒介することができることを実証している。
【０１６８】
開示される発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示された実施形態は、本発明の例に過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈すべきでないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神の内に入る全てを、本発明者らの発明として特許請求する。
【図１−１】
2021511060.tif 000002
【図１−２】
2021511060.tif 000003
【図２−１】
2021511060.tif 000004
【図２−２】
2021511060.tif 000005
【図２−３】
2021511060.tif 000006
【図３−１】
2021511060.tif 000007
【図３−２】
2021511060.tif 000008
【図３−３】
2021511060.tif 000009
【図４−１】
2021511060.tif 000010
【図４−２】
2021511060.tif 000011
【図４−３】
2021511060.tif 000012
【図５−１】
2021511060.tif 000013
【図５−２】
2021511060.tif 000014
【図５−３】
2021511060.tif 000015
【図６−１】
2021511060.tif 000016
【図６−２】
2021511060.tif 000017
【図６−３】
2021511060.tif 000018
【図６−４】
2021511060.tif 000019
【図７−１】
2021511060.tif 000020
【図７−２】
2021511060.tif 000021
【図７−３】
2021511060.tif 000022
【図７−４】
2021511060.tif 000023
【図７−５】
2021511060.tif 000024
【図８−１】
2021511060.tif 000025
【図８−２】
2021511060.tif 000026
【図８−３】
2021511060.tif 000027
【図８−４】
2021511060.tif 000028
【図９−１】
2021511060.tif 000029
【図９−２】
2021511060.tif 000030
【図９−３】
2021511060.tif 000031
【図９−４】
2021511060.tif 000032
【図１０−１】
2021511060.tif 000033
【図１０−２】
2021511060.tif 000034
【図１０−３】
2021511060.tif 000035
【配列表】
2021511060000001.app
【国際調査報告】
2021511060.tif 000036
2021511060.tif 000037
2021511060.tif 000038