(57)【要約】式（Ｉ）［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは、ＣＨ、ＮＨ、Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群から選択される５員の炭素環または複素環に含まれる環状原子であって、前記炭素環または複素環は、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）直鎖もしくは分岐アルキル、グアニジン、またはグアニジノ（Ｃ１−Ｃ４）直鎖もしくは分岐アルキルで適宜置換されていてもよいが、但し、前記複素環はフリルではなく、ｎは、０または１であり、Ｒは、ＨまたはＯＨであり、点線は、任意の二重結合Ｃ＝Ｃを表し、太線は、β配置の結合を表し、波線は、α配置とβ配置の両方の結合を表す］で示される化合物、そのエナンチオマーおよび／またはジアステレオマー混合物、その医薬的に許容される塩、その溶媒和物、その水和物、その代謝物、またはその代謝前駆体が開示される。式（Ｉ）の化合物は、特に、急性または慢性心不全の治療のための薬剤として使用するためのものである。経口投与もまた可能である。【選択図】なし
2021532190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2021532190.tif 000072
［式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚは、ＣＨ、ＮＨ、Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群から選択される５員の炭素環または複素環に含まれる環状原子であって、前記炭素環または複素環は、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）直鎖もしくは分岐アルキル、グアニジン、またはグアニジノ（Ｃ１−Ｃ４）直鎖もしくは分岐アルキルで適宜置換されていてもよいが、但し、前記複素環はフリルではなく、
ｎは、０または１であり、
Ｒは、ＨまたはＯＨであり、
点線は、任意の二重結合Ｃ＝Ｃを表し、太線は、β配置の結合を表し、波線は、α配置とβ配置の両方の結合を表す］
で示される化合物、あるいはそのエナンチオマーおよび／またはジアステレオマー混合物、医薬的に許容される塩、溶媒和物、水和物、代謝物、または代謝前駆体。
【請求項２】
１７β位における複素環基が、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、これらに対応するジヒドロおよびテトラヒドロ誘導体からなる群から選択されるものであって、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）直鎖もしくは分岐アルキル、グアニジン、またはグアニジノ（Ｃ１−Ｃ４）直鎖もしくは分岐アルキルで適宜置換されていてもよい、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒが、ベータＯＨである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
記号ｎが、０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
記号ｎが、１であり、アンドロスタン骨格と１７β−複素環または炭素環との間に単結合または二重結合が存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、
【請求項６】
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（イミダゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（２−グアニジノ−チアゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１２β−ヒドロキシ−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（イミダゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１２β−ヒドロキシ−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（２−グアニジノ−チアゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（Ｎ−（３−アミノプロピル）−イミダゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（ピラゾール−３−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（（５−（３−アミノプロピル）−イソオキサゾール−３−イル））アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（（５−（３−アミノプロピル）−イソオキサゾール−３−イル）−エチル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（５−（２−アミノエチル）−イソオキサゾール−３−イル）−エチル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（５−（２−アミノメチル）−イソオキサゾール−３−イル）−エテニル）アンドロスタン
からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
前記医薬的に許容される塩が、塩化物塩、臭化物塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物のうちの１つまたはそれ以上を、少なくとも１つの医薬的に許容されるベヒクルおよび／または賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項９】
経腸または非経口投与または吸入のために製剤化された、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
経口投与のために製剤化された、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
静脈内または筋肉内注射のために製剤化された、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
１つまたはそれ以上の治療上活性な成分をさらに含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記治療上活性な成分が、心不全を治療するための薬剤から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記治療上活性な成分が、ＡＣＥ阻害剤、ＡＩＲＢ、利尿薬、Ｃａチャネル遮断薬、βブロッカー、ジギタリス、ＮＯドナー、血管拡張薬、ＳＥＲＣＡ２ａ刺激薬、ネプリライシン（ＮＥＰ）阻害剤、ミオシンフィラメント活性化因子、組換えリラキシン−２メディエーター、組換えＮＰタンパク質、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の活性化因子、アンジオテンシンＩＩ受容体のベータアレスチンリガンドから選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記利尿薬が、フロセミド、ブメタニド、トラセミド、メトラゾン、アルドステロンアンタゴニスト（特に、スピロノラクトンおよびエプレレノン）、チアジド系利尿薬（特に、ヒドロクロロチアジド）、メトラゾン、クロルタリドンから選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＡＣＥ阻害剤が、リシノプリルおよびラミプリルから選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記アンジオテンシンＩＩ受容体の遮断薬が、バルサルタン、カンデサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、およびロサルタンから選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記アンジオテンシン受容体／ネプリライシン阻害剤が、サクビトリルである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記βブロッカーが、カルベジロールおよびメトプロロールから選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記血管拡張薬が、ヒドララジン（二硝酸イソソルビドと組み合わされてもよい）、硝酸塩（特に、ニトログリセリンまたは硝酸イソソルビド）、アムロジピン、フェロジピン、非ジヒドロピリジン（特に、ジルチアゼムまたはベラパミル）から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記心不全を治療するための薬剤が、ジゴキシン、エントレスト、オメカムチブ、セレラキシン、ウラリチド、レボシメンダンから選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
薬剤として使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２３】
心不全の治療に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２４】
前記心不全が、急性または慢性である、請求項２３に記載の使用のための化合物。
【請求項２５】
請求項１３〜２１のいずれか１項に記載される１つまたはそれ以上の治療上活性な薬剤と組み合わせた、請求項２３または２４に記載の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品の分野、特に、１７β−複素環ジギタリス類似化合物および心不全の治療のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全（ＨＦ）の有病率は、年齢に依存し、６０歳未満の人で２％未満から７５歳以上の人で１０％以上の範囲である（Metra M, Teerlink JR Lancet 2017; 390:1981-1995）。ＨＦの大半の患者は、高血圧、冠状動脈疾患、心筋症、弁膜症、またはこれらの障害の組み合わせの病歴をもつ（Metra M, Teerlink JR Lancet 2017; 390:1981-1995）。ＨＦを発症すると算出された生涯リスクは増加すると予想され、高血圧症の人はより高いリスクを有する（Lloyd-Jones DM et al. Circulation 2002;106:3068-3072）。ＨＦ患者は、高い入院率と死亡率とともに予後が悪い。
【０００３】
ＨＦの臨床症状は、収縮排除の減少を生じる変力性異常（収縮機能障害）と、心室が静脈系から血液を吸引する能力が損なわれ、それにより（左心室（ＬＶ）充満の障害である）収縮期収縮に利用できる血液量が減少するコンプライアンス異常（拡張機能障害）とからなる心臓の二重の病理学的特徴によって引き起こされる。収縮と弛緩の障害は、細胞内Ｃａ２＋を貯蔵する筋小胞体（ＳＲ）によるＣａ２＋取り込みの減少に起因する、細胞内Ｃａ２＋の異常な分布の結果である（Bers D et al Ann N.T Acad Sci 2006 1080:165-177）。後者は、能動膜輸送体であるＳＲ膜Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）によって作動される。ＳＥＲＣＡ２ａ活性は、そのホスホランバン（ＰＬＮ）との相互作用によって生理学的に制限され（Bers DM. Annu Rev Physiol 2008; 70:23-49; MacLennan DH, Kranias EG. Nat Rev Mol Cell Biol 2003; 4(7): 566-577）；このような制限は、通常、ＨＦリモデリングの結果として大きく抑制されたシグナル伝達経路であるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によるＰＬＮのリン酸化によって解放される（Lohse M et al Circ Res 2003; 93:896-906）。よって、ＳＥＲＣＡ２ａ機能は、機能不全の心筋で損なわれ（Bers D et al Ann N.Y. Acad Sci 2006; 1080:165-177）、これは、ＳＲによるＣａ２＋取り込みの減少を主な原因とするものである。筋細胞の収縮と弛緩への影響に加えて、異常なＣａ２＋分布はまた、心不整脈を助長し（Zaza & Rocchetti, Curr Pharm Des 2015; 21:1053-1061）、長期的には、アポトーシスによる筋細胞の喪失を加速する（Nakayama H et al., J Clin Invest 2007; 117:2431-44）。ＳＥＲＣＡ２ａ機能の低下は、エネルギー効率の低いＮａ−Ｃａ交換体（ＮＣＸ）を介したＣａ２＋放出の代償的な増加を必要とするため、収縮のエネルギー消費も増加させる（Lipskaya L et al 2010 Expert Opin Biol Ther 2010; 10:29-41）。十分な証拠により、ＳＥＲＣＡ２ａ機能の正常化が細胞内Ｃａ２＋恒常性を回復させ、心筋細胞と生体内での心臓の収縮性と弛緩を改善することが示されている（Byrne MJ et al., Gene Therapy 2008;15:1550-1557; Sato et al., JBC 2001;276:9392-99）。すなわち、ＨＦでのＳＥＲＣＡ２ａ機能の回復は、不整脈、心筋の酸素消費、および筋細胞の死を最小限に抑えながら、心臓の弛緩と収縮を改善する可能性がある（Lipskaia L et al., Expert Opin Biol Ther. 2010; 10:29-41）。ＳＥＲＣＡ２ａの活性化と並行して、Ｎａ、Ｋポンプを阻害すると、過剰な細胞質Ｃａ２＋蓄積を誘発することなく、細胞内Ｃａ２＋含有量をさらに増加させることができる。よって、Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ阻害とＳＥＲＣＡ２ａ活性化の組み合わせは、不整脈源性Ｃａ２＋放出事象のリスクを低減しつつ、さらなる陽性変力作用をもたらしうる。ＳＲのＳＥＲＣＡ２ａの増強をＮａ、Ｋポンプの阻害と組み合わせることができる新規分子は、収縮期および拡張期の機能を改善し、ＨＦにおける変弛緩効果を改善できる可能性がある。これは、不整脈助長効果を最小限に抑え、Ｎａ、Ｋポンプを阻害できるが、ＳＥＲＣＡ２ａ刺激活性を欠いているジゴキシンよりも高い安全性プロファイルを有する新規の弛緩・収縮改善薬の探索に対する強い動機を提供する。
【０００４】
ＨＦの現在の長期治療は、初期の損傷を増幅し、疾患の進行を基礎とする収縮性の低下に対する慢性的な不適応反応である「心筋リモデリング」（βブロッカー、ＡＣＥ阻害薬、アルドステロン拮抗薬）の予防に集中している（Heineke J & Molkentin D Nat Rev 2006; 7:589-600）。この方法は、議論の余地のないメリットを有するが、ＨＦを定義付け、その症状の原因となる機能障害である「収縮」と「弛緩」の障害を対象とはしていない。実際、特に進行した病期では、心筋の収縮／弛緩を増加させる薬剤（「変力性／変弛緩剤」）が依然として広く使用されており、患者の管理に不可欠である（Metra M, Teerlink JR Lancet 2017; 390:1981-1995）。これらとして、強力な血管拡張作用とともにＣａ２＋増感剤である、交感神経刺激アミン（ドブタミン）およびレボシメンダンが含まれる。残念なことに、これらの薬剤は、生命を脅かす不整脈の促進、心筋の酸素消費量の増加、および血管拡張によって引き起こされる血圧の低下によるすでに不十分な冠血流の障害等の潜在的に有害な要素を伴うメカニズムによって作用する（Ashkar H, Makaryus AN StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2018 Jan-2017 Dec 19 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK470431/); Gong B. et al. J Cardiothorac Vasc Anesth 2015; 29: 1415-25; EDITORIAL）。これにより、変力剤の使用が病期後期に限定されるため、病期の早い段階で収縮性を高めるという潜在的な利点が失われている。さらに、これらの薬剤は患者の予後と生存を改善せず、それらの治療上の使用は、注意深く監視されなければならない（Ashkar H, Makaryus AN StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2018 Jan-.2017 Dec 19; Gong B. et al. J Cardiothorac Vasc Anesth 2015; 29: 1415-25; EDITORIAL）。
【０００５】
陽性変力薬の中において、Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ酵素活性の阻害剤である強心配糖体ジゴキシンは、過去に最も一般的に処方された薬の１つである。しかし、ジゴキシンが主に不整脈による死亡リスクの増加が観察されている閾値レベルの０．９ｎｇ／ｍｌに達することなく有益な効果を発揮するジゴキシン血清濃度範囲（０．５〜０．７ｎｇ／ｍｌ）を維持することが困難なため、その使用は過去数十年を通して減少してきた（Packer M Journal of Cardiac Failure 2016; 22:726-730; Packer M Eur J Heart Failure 2018;20:851-852）
【０００６】
陽性変力作用以外の作用機序を持つＨＦ薬の開発についても集中的な研究が進行中である。それらの多くの中で、最も研究され、臨床開発中である薬剤は、セレラキシン（組み換えリラキシン２メディエーター）、ウラリチド（組み換えナトリウム利尿ペプチド）、オメカムチブメカルビル（心臓ミオシン活性化因子）、ＢＭＳ９８６２３１（ＮＯドナー）、アドレシズマブ（アドレノメデュリン阻害剤）、ＡＮＸ−０４２（ＮＰのスプライシング変異型）、ＴＤ１４３９（ネプリライシン（ＮＥＰ）阻害剤）である。しかしながら、臨床第２〜３相試験で評価した場合、これらの新しい薬剤はいずれも主要エンドポイントを満たしていない。
【０００７】
慢性心不全（ＣＨＦ）の患者の臨床経過と予後は、急性心不全（ＡＨＦＳ）のエピソード後にはるかに悪化する（Solomon SD et al. Circulation 2007;116: 1482-87）。ＡＨＦＳは、心不全の症状と徴候の新たな発症または再発として定義でき、緊急の評価と治療を要し、予定外のケアまたは入院をもたらす。ＡＨＦＳの患者の半数は、低下した収縮機能（ＨＦｒＥＦ）を有しており、将来の治療法の標的となる可能性を示す（Braunwald E. Lancet 2015; 385:812-24）。駆出率が低下した患者のＡＨＦＳの治療法は、血管拡張薬、利尿薬、限外濾過によるうっ血の緩和、または陽性変力作用による心拍出量の増加に注目してきた。この治療戦略は心臓突然死のリスクを低減してきたが、退院後のイベント率はＡＨＦＳで入院した患者では容認できないほど高いままである。多くの望ましくない心血管副作用、例えば、特に冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の患者において、変力療法の結果としての心筋虚血、心臓損傷および不整脈（Abraham WT et al., J Am Coll Cardiol 2005; 46:57-64; Flaherty JD et al., J Am Coll Cardiol. 2009; 53(3):254-63）、特に低血圧のＨＦ患者において血管拡張薬によって引き起こされる末梢器官（腎臓）の低血圧および低灌流等は、利用可能な療法によって引き起こされる可能性がある。よって、入院中の主な目標は、心臓および／または腎臓の損傷を引き起こすことなく心拍出量を改善することとなる。さらに、ＨＦ患者の残りの５０％において、駆出率（ＥＦ）の維持がＨＦの症状の原因となっていることは、左心室（ＬＶ）拡張期弛緩障害の検査または治療にはほとんど注目されていない。また、ＥＦが低下したＡＨＦＳの患者では、心室弛緩の障害が心機能の全体的な障害の一因となる。ＬＶ充満圧の高まった心エコーパラメータ（例えば、Ｅ／ｅ’比）とともに、動物モデルとＨＦ患者の両方の心臓弛緩能力（例えば、低下した初期僧帽弁輪組織速度［ｅ’］および低下した初期僧帽弁流入［Ｅ］減速時間［ＤＴ］）を測定するために、様々な心エコー指標が開発されている。１つの指標の変化の対応が動物モデルと患者の一部で完全に重ね合わせることができないとしても、心室弛緩障害の動物モデルの全体的な変化は、確実に人間の状態に翻訳可能であり、ＡＨＦＳでの薬物効果の研究に用いられている（Shah SA et al. Am Heart J 2009;157:1035-41）。
【０００８】
近年、ＳＥＲＣＡ２ａの機能を高めるさまざまな治療法が研究されている。これらとして、遺伝子導入によるＳＥＲＣＡ２ａの過剰発現（Byrne et al., Gene Therapy 2008;15:1550-1557）、または劣性変異体の発現によるＰＬＮの不活性化（Hoshijima M et al. Nat. Med. 2002;8: 864-871; Iwanaga Y et al. J Clin Investig 2004;113, 727-736）、ＡｄＶ−ｓｈＲＮＡ（Suckau L et al. Circulation 2009; 119: 1241-1252）、マイクロＲＮＡ（Grobl et al. PLoS One 2014;9: e92188）、または抗体（Kaye DM et al J. Am. Coll. Cardiol. 2007;50:253-260）が挙げられる。ＨＦにおけるＳＥＲＣＡ２ａ遺伝子送達（ＣＵＰＩＤ２）を用いた最も大きな第２ｂ相臨床試験の否定的な結果によって強調されるように、これらの方法は、課題解決には程遠い構築物送達（ウイルスベクター等）および用量調整における大きな問題に苦戦している（Hulot JS Eur Heart J 2016;19:1534-1541）。最近、イスタロキシムとは構造的に異なるＰＬＮを阻害する小分子（ピリドン誘導体）が報告された（Kaneko M. et al. Eur J Pharmacol 2017;814:1-7）。
【０００９】
よって、小分子ＳＥＲＣＡ２ａ活性化因子の開発はＨＦ治療に利益的であり、さらに非常に有望な戦略である。
【００１０】
イスタロキシムは、ＡＨＦＳ治療用の臨床開発中の新しい小分子薬であり、ＳＥＲＣＡ２ａを活性化しながら（Rocchetti M et al. J Pharmacol Exp Ther 2005;313:207-15）、Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプを阻害する（Micheletti et al J Pharmacol Exp Ther 2002; 303:592-600）という二重の作用機序を備えている。変力作用の同一レベルにおいて、イスタロキシムの催不整脈作用は、純粋なＮａ＋／Ｋ＋ポンプ阻害剤であるジゴキシンよりもかなり低い（Rocchetti M et al. J Pharmacol Exp Ther. 2005;313:207-15）。これは、細胞質からのＣａ２＋クリアランスを改善することにより（Alemanni J Mol Cell Cardiol 2011;50:910-8）、ＳＥＲＣＡ２ａ刺激が、その変力効果を維持しながらＮａ＋／Ｋ＋ポンプ遮断の催不整脈作用も最小限に抑える可能性があることを示唆している（Rocchetti M et al. J Pharmacol Exp Ther 2005;313:207-15, Zaza & Rocchetti, Curr Parm Des 2015: 21:1053-1061）。イスタロキシムによる催不整脈作用の低下は、臨床研究で確認されている（Georghiade M et al J Am Coll Cardiol 2008; 51:2276-85）。
【００１１】
ＨＦ患者では、イスタロキシム注入により収縮機能と拡張機能の両方が改善された。収縮機能の改善は、収縮組織速度（Ｓ’）および収縮末期エラスタンスの傾き（ＥＳＰＶＲ勾配）の増加として検出され、拡張期コンプライアンスの増加は、拡張期組織速度（Ｅ’）の増加と終期拡張エラスタンス（ＥＤＰＶＲ勾配）の減少によって明らかになった（Shah SA et al. Am Heart J 2009;157:1035-41）。イスタロキシムは、優れた薬力学的プロファイルを備えているが、ＧＩ吸収が低く、クリアランス率が高く、潜在的な遺伝毒性部分（オキシム）を含んでいるため、慢性投与には適しておらず、それゆえ、この薬剤は、ＡＨＦＳの入院患者のみへの静脈内注入用に開発された（Dec GW J Am Coll Cardiol 2008;51:2286-88; Shah SA et al. Am Heart J 2009;157:1035-41）。
【００１２】
イスタロキシムは、ＥＰ０８２５１９７およびS. De Munari, et al., J. Med. Chem. 2003, 64, 3644-3654に開示されており、化合物（３Ｚ，５α）−３−［（２−アミノエトキシ）イミノ］アンドロスタン−６，１７−ジオンである。
【００１３】
イスタロキシムは、心不全の治療におけるその望ましい活性にもかかわらず、完全に欠点がないわけではない。
【００１４】
前記分子のアミノエトキシイミノ部分は、代謝変換を経て遺伝毒性を引き起こす可能性がある。
【００１５】
さらに、イスタロキシムは静脈内投与によってのみ活性があるため、病院および関連する環境でのみ投与できる。イスタロキシムの投与には、十分な訓練を受けた医療関係者が必要であり、慢性治療には適していない。
【００１６】
したがって、遺伝毒性がなく、好ましくは経口経路で投与できる、陽性変力作用および陽性変弛緩作用を有する心不全の治療に使用するための化合物が長い間必要とされてきた。
【００１７】
本発明は、上記の必要性を満たし、先行技術の課題を克服している。
【発明の概要】
【００１８】
式（Ｉ）
【化１】
2021532190.tif 000003
［式中、
Ｘ、Ｙ、Ｚは、ＣＨ、ＮＨ、Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群から選択される５員の炭素環または複素環に含まれる環状原子であって、前記炭素環または複素環は、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）直鎖もしくは分岐アルキル、グアニジン、またはグアニジノ（Ｃ１−Ｃ４）直鎖もしくは分岐アルキルで適宜置換されていてもよいが、但し、前記複素環はフリルではなく、
ｎは、０または１であり、
Ｒは、ＨまたはＯＨであり、
点線は、任意の二重結合Ｃ＝Ｃを表し、太線は、β配置の結合を表し、波線は、α配置とβ配置の両方の結合を表す］
で示される化合物、そのエナンチオマーおよび／またはジアステレオマー混合物、その医薬的に許容される塩、その溶媒和物、その水和物、その代謝物、またはその代謝前駆体が見出された。
【００１９】
本発明の文脈において、代謝物および代謝前駆体は、代謝反応によって変換されるが、薬理学的活性を実質的に維持または増加させる活性な代謝物および代謝前駆体、すなわち、式（Ｉ）の化合物を意味する。
【００２０】
代謝物または代謝前駆体の例は、式（Ｉ）の化合物のヒドロキシル化、カルボキシル化、スルホン化、グリコシル化、グリクロン酸化、メチル化または脱メチル化された酸化または還元誘導体である。
【００２１】
式（Ｉ）のいくつかの化合物はまた、活性形態のプロドラッグであり得る。
【００２２】
式（Ｉ）の化合物が互変異性を示しうる場合、式は、全ての互変異性体を網羅することを意図しており、本発明には、全ての可能な立体異性体、ＺおよびＥ異性体、光学異性体、エナンチオマーおよびそれらの混合物がその範囲内に含まれる。
【００２３】
また、医薬的に許容される塩は、本発明の範囲に含まれる。医薬的に許容される塩は、元となる化合物の生物学的活性を保持し、公知の医薬的に許容される酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、フマル酸、コハク酸、シュウ酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸クエン酸、メタンスルホン酸または安息香酸に由来する塩、および当技術分野で一般的に使用される他の塩であり、例えば、Pharmaceutical Salts and Co-crystals; Editors: Johan Wouters, Luc Quere, RSC Publishingを参照のこと。
【００２４】
Ｃ１−Ｃ４アルキル基は、分岐鎖もしくは直鎖または環状基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、またはシクロブチルであり得る。
【００２５】
式（Ｉ）のいくつかの化合物はまた、活性形態のプロドラッグであり得る。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、特に心不全の治療のための薬剤として使用するための一般式（Ｉ）の前記化合物である。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、適宜他の治療上活性な成分と組み合わせて、式（Ｉ）の化合物のうちの１つまたはそれ以上を含む医薬組成物である。
【００２８】
本発明の上記および他の目的は、実施例および図によっても詳細に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＳＲ Ｃａ２＋の取り込みに対するＣＶｉｅ１０１およびＣＶｉｅ１０２の効果を示す。データポイントは平均±ＳＥである。ＣａＴのＣａ２＋過渡（ＣａＴ）振幅および時定数（τ）におけるＣＶｉｅ１０１（Ａ−Ｂ）およびＣＶｉｅ１０２（Ｃ−Ｄ）の効果は減衰する。ＣＶｉｅ１０１またはＣＶｉｅ１０２とＣＴＲＬ曲線との差異は、二元配置分散分析によると統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。全てのプロトコルにおいて、ＣＶｉｅ１０１の場合はＮ≧１３、ＣＶｉｅ１０２の場合はＮ≧１１であった。
【図２】図２は、様々な刺激速度（Ｈｚ）機能における活動電位（ＡＰ）に対するＣＶｉｅ１０１の効果を示す。Ａ）拡張期膜電位（Ｅｄｉａｓｔ）；Ｂ）活動電位立ち上がり最大速度（ｄＶ／ｄｔｍａｘ）；Ｃ）再分極の９０％、５０％および２０％での活動電位持続時間（ＡＰＤ）；Ｄ）刺激速度の段階的増加後のＡＰＤ適応（タウ）の時定数。ＣＴＲＬ＝コントロール。ＣＴＲＬ  Ｎ＝１２；ＣＶｉｅ１０１  Ｎ＝１４。ＣＴＲＬとＣＶｉｅとの差異は、全てのパラメータで統計学的に有意ではなかった。
【図３】図３は、平均ＡＰＤにおけるＡＰＤ短期変動（ＳＴＶ）の依存性に対するＣＶｉｅ１０１の効果を示す。Ａ−Ｄ）４ヘルツ（Ｈｚ）での定常状態刺激中の平均ＡＰＤ９０の関数としてプロットされたＳＴＶであり、実線は、データポイントの線形適合である。Ｅ）全ての刺激速度でのＳＴＶ値がプールされる。ＣＴＲＬ＝コントロール。ＣＴＲＬ  Ｎ＝１０、ＣＶｉｅ１０１  Ｎ＝１１。
【図４】図４は、ラットにおけるＣＶｉｅ１０１のバイオアベイラビリティを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の意味の範囲内において、式（Ｉ）の１７β位における５員炭素環残基は、シクロペンタジエニル、シクロペンテニル、シクロペンチルから選択される。
【００３１】
本発明の意味の範囲内において、式（Ｉ）の５員複素環残基は、ピロリル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ジオキソラニル、ジチオラニル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ジオキサゾリル、ジチアゾリル、テトラゾリル、ジチオラニル、ジオキソラニル、ジオキソレニル、チアゾリル、イソチアゾリル、および全てのそれらの水素化または部分的に水素化された誘導体から選択される。複素環基は、芳香族または非芳香族の性質を有していてもよく、環上の利用可能な位置のいずれかにより１７位に結合することができる。
【００３２】
本発明の意味の範囲内において、式（Ｉ）のＣ１−Ｃ４アルキル基は、分岐鎖もしくは直鎖または環状基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、メチルシクロプロピル、またはシクロブチルを意味する。
【００３３】
本発明の意味の範囲内において、医薬的に許容される塩は、式（Ｉ）の化合物の生物学的活性または薬物動態を保持し、または改善し、公知の医薬的に許容される酸に由来する塩である。
【００３４】
本発明の第１の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、記号ｎが０である化合物である。
【００３５】
本発明の第２の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、１７β位の複素環基が、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、これらに対応するジヒドロおよびテトラヒドロ誘導体からなる基から選択される化合物である。
【００３６】
本発明の第３の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、複素環基が、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリルからなる基から選択されるものであって、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）直鎖もしくは分岐アルキルまたはグアニジンによって置換されている化合物である。
【００３７】
本発明の第４の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、ＲがベータＯＨである化合物である。
【００３８】
本発明の第５の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、記号ｎが１であり、二重結合が存在する化合物である。
【００３９】
本発明の第６の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、記号ｎが１であり、単結合が存在する化合物である。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（イミダゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（２−グアニジノ−チアゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１２β−ヒドロキシ−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（イミダゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１２β−ヒドロキシ−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（２−グアニジノ−チアゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（Ｎ−（３−アミノプロピル）−イミダゾール−４−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（ピラゾール−３−イル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（（５−（３−アミノプロピル）−イソオキサゾール−３−イル））アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（（５−（３−アミノプロピル）−イソオキサゾール−３−イル）−エチル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（５−（２−アミノエチル）−イソオキサゾール−３−イル）−エチル）アンドロスタン；
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（５−（２−アミノメチル）−イソオキサゾール−３−イル）−エテニル）アンドロスタン
からなる群から選択される。
【００４１】
本発明はさらに、一般式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。
【００４２】
本発明のさらなる目的は、医薬組成物および製剤、ならびに急性または慢性心不全を治療し、緩和し、逆転させ、あるいはこれらの症状を軽減し、または減少させるためのそれらの使用に関する。異常な細胞内Ｃａ２＋分布は、心筋リモデリング過程に関連するため、ＳＥＲＣＡ２ａ活性によるその修正がそれに対抗しうる。よって、明白な心不全への収縮性の初期の補完された不全の進行を防ぐことができる。
【００４３】
式（Ｉ）の化合物の製造
一般に、ＲがＨである式（Ｉ）の化合物は、ジギトキシゲニンを出発物質として製造され、Ｒがβ−ＯＨである式（Ｉ）の化合物は、ジゴキシゲニンを出発物質として製造される。
【００４４】
ジギトキシゲニンおよびジゴキシゲニンの両方は、いずれも市販品であるか、周知の方法に従って製造することができる。例えば、ジゴキシゲニンは、ジゴキシンを出発物質として製造することができる。
【００４５】
ＲがＨである式（Ｉ）の化合物は、ジギトキシゲニンを出発物質として製造して、中間体（３）を生成することができる。
【化２】
2021532190.tif 000004
【００４６】
ジギトキシゲニンは、３位のヒドロキシ基を保護するために適切な試薬で処理される。適切な保護基は、当技術分野で周知であり、例えば、３−ＯＨは、従来の反応であるアシル化、例えば、アセチル化によって保護することができる。例えば、ジギトキシゲニンは、好ましくは、不活雰囲気下、例えば、アルゴン雰囲気下において、有機溶媒中、好ましくは、ピリジン等の含窒素溶媒中で無水酢酸と反応させることができる。好ましくは、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）または他の従来の触媒等のエステル化触媒が使用される。前記反応温度を制御し、反応は、好ましくは、完了するのに十分な時間で室温において行う。その後、前記溶媒は、好ましくは、減圧下において蒸発によって留去される（他の溶媒との共蒸発が可能である）。前記反応物のワークアップ処理は、周知の方法に従って行われ、例えば、残渣を水と一緒に採取し、室温で適当な時間放置する。得られる固形物を、例えば、濾過によって収集し、水で洗浄し、好ましくは真空下で乾燥させうる。得られる生成物（１）は、さらに精製することなく次のステップで使用することができる。
【００４７】
次に、中間体（１）を酸化反応させて、１７−のラクトン環を開環して、中間体（２）を生成する。このタイプの反応は、当業者に周知であり、技術文献から検索可能である。一例として、中間体（２）をアセトン等の有機溶媒に溶解し、酸化剤を加える。例えば、ＮａＩＯ４とＲｕＯ２水和物の溶液は利便的であるが、他の公知薬剤でも用いることができる。必要に応じて、酸化剤をさらに加えることができる。前記反応温度は限定されるものではなく、酸化剤の性質によって決定することができる。前記酸化反応が完了すると、過剰量の酸化剤は、公知の方法によりクエンチする。例えば、イソプロパノールは、ＮａＩＯ４とＲｕＯ２水和物系を使用する場合、クエンチング剤（quenching agent）として使用することできる。固形物が、例えば、濾過によって前記反応混合物から分離され、前記反応物の体積は、好ましくは、蒸発により、利便的に減圧下で減少され、該残渣を酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）等の適切な溶媒で抽出する。次いで、有機相を、好ましくは、ブラインで洗浄し、続いて、例えば、ＭｇＳＯ４等の従来の方法で乾燥させ、必要に応じて濾過し、該溶媒を、例えば、真空下で留去する。中間体（２）は、さらに精製することなく次のステップで使用することができる。
【００４８】
中間体（３）は、化合物（２）を、適切な溶媒、例えば、メタノール等のアルコール中において、例えば、ＫＨＣＯ３溶液と共に、１７位に第一級アルコールを回復させるのに十分な時間、穏やかな条件下で加水分解させることによって得られる。次に、該有機溶媒を、好ましくは減圧下で留去し、該残渣を、ジクロロメタン等の溶媒で抽出する。該有機相を、例えばブラインで洗浄し、続いて従来の方法で乾燥させ、必要に応じて濾過し、該溶媒を、好ましくは減圧下で留去する。該残渣を、周知の方法、例えば、適切な溶離液（例えば、７：３のシクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ）で溶出するフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）により精製する。
【００４９】
化合物（３）は、式（Ｉ）の多くの１７β−複素環および炭素環化合物を製造するために用いられる中間体である。最終生成物、すなわち、式（Ｉ）の最終化合物で得られる複素環または炭素環のタイプに応じて、当業者は、一般的な知識に従って、適切な合成経路を見出すための共通の一般技術常識、例えば、Advanced Organic Chemistry Pt. B : Reactions and Synthesis by Francis A. Carey and Richard J. Sundberg and The Chemistry of Heterocycles: Structures, Reactions, Synthesis, and Applications, Edition 3 by Theophil Eicher, Siegfried Hauptmann, Andreas Speicherに従うことができる。
【００５０】
一例として、ＸがＮＨであり、ＹがＣＨであり、ＺがＮである式（Ｉ）の化合物、すなわち、複素環がイミダゾリルである場合、化合物（３）は、下記スキームに従って中間体（４）に変換される。
【化３】
2021532190.tif 000005
【００５１】
一般に、化合物（３）は、有機溶媒、例えば、エタノール等のアルコールに溶解させ、ホルムアルデヒドで処理する。利便的なことに、水とアンモニウム中のＣｕ（ＯＡｃ）２溶液が加えられる。前記反応混合物は、加熱し、好ましくは、反応完了に十分な時間還流する。次に、該溶媒を、好ましくは減圧下で留去し、該残渣をＡｃＯＥｔ等の有機溶媒に溶解し、ブラインで繰り返し洗浄する。有機相を収集し、水相を同一溶媒で抽出する。プールした有機相を、例えば、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、好ましくはセライトパッドで濾過し、該溶媒を、好ましくは減圧下で留去して、化合物（４）の１３．３４ｇ（９６％）を固形物として得て、さらに精製することなく次のステップで使用する。
【００５２】
最終的に、中間体（４）は、次のスキームに従って、従来の方法で３−ヒドロキシ基を回復することにより最終生成物に変換される。
【化４】
2021532190.tif 000006
【００５３】
一般に、化合物（４）は、アルコール（例えば、メタノール）等の有機溶媒に溶解させ、加水分解剤、例えば、ＮａＯＨを加える。前記反応が完了するまで放置する。反応時間および温度は、当業者により決定され、例えば、室温が利便的である。該溶媒を、好ましくは減圧下で留去し、該残渣を水で希釈し、ジクロロメタン等の有機溶媒で抽出する。有機相を、例えば、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を、好ましくは真空下で留去して、最終生成物（５）を得る。必要に応じて、最終化合物は、従来の方法で医薬的に許容される塩に変換することができる。
【００５４】
一例として、ＸがＮＨであり、ＹがＣＨであり、ＺがＮである式（Ｉ）の化合物の場合、すなわち、複素環がアミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで置換されたイミダゾリルである場合、化合物（３）は、上記のスキームに従って、関連する中間体（４）に変換されるが、ホルムアミドの代わりに適切な反応試薬を選択し、それに応じて反応条件を変更することは、当業者に周知である。式（Ｉ）の最終化合物が、イミダゾリル残基の１−Ｎ窒素上にアミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基を有する場合であって、化合物（５）は、下記スキームに従って処理され、Ｎ−（３−アミノプロピル）誘導体：
【化５】
2021532190.tif 000007
の例示的な場合について本明細書に示す。
【００５５】
化合物（５）は、強塩基、例えば、Ｋ２ＣＯ３の存在下において、適切な有機溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解される。アクリロニトリルを加え、前記反応は、完了するのに十分な時間、適切な温度、例えば、室温で行われる。当業者は、アルキル鎖の長さに応じて、適切なε−不飽和ニトリルを容易に選択することができる。前記反応の完了時に、水を加え、該混合物を適切な有機溶媒、例えば、酢酸エチルで抽出し、有機相を、従来の手法、例えば、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、該溶媒を、好ましくは、減圧下で留去して、中間体（７）を得て、さらに精製することなく次のステップで使用する。最終的に、ニトリル基は、周知の方法に従ってアミノ基に還元させる。例えば、生成物（７）は、有機溶媒、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解させ、好ましくは、前記溶媒は無水物である。ＬｉＡｌＨ４等の還元剤を加え、該混合物を加熱し、好ましくは、該反応が完了するのに十分な時間還流する。続いて、冷却した溶液を同一の反応溶媒または他の利便的な溶媒と水で希釈し、ＮａＯＨ等の塩基溶液を加えて、固形物を沈殿させる。該固形物は、例えば、濾過によって単離し、該溶媒で洗浄し、単離された固形生成物を、従来の方法、例えば、適切な溶出系、例えば、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ３の９／１／０．１で溶出するフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）に従って精製して、生成物（８）を得る。
【００５６】
一例として、ＸがＣＨであり、ＹがＮＨであり、ＺがＮである式（Ｉ）の化合物、すなわち、複素環がピラゾリルである場合、化合物（Ｉ）は、下記スキームに従って中間体（Ｖ）に変換される。
【化６】
2021532190.tif 000008
【００５７】
アルデヒド（Ｉ）は周知であり、その製造は、Gobbini et al. Synth Comm, 27(6), 1115-1122 (1997)に開示されている。
【００５８】
アルデヒド（Ｉ）は、周知の方法に従って誘導体（ＩＩＩ）に変換される。例えば、ＴＨＦ等の無水溶媒中のＮａＨ懸濁液（通常、鉱油中に５５％分散）に、ホスホノ酢酸トリメチル（ＩＩ）を、不活雰囲気下において０℃で滴下して加える。該懸濁液を、室温で利便的な時間、例えば、３０分間放置し、続いて０℃に冷却する。アルデヒド（Ｉ）を乾燥有機溶媒中、好ましくは前記混合物と同一の溶媒中に溶解させ、これを加え、該混合物を、例えば、室温で反応完了まで放置する。続いて、有機溶媒、例えば、ＥｔＯＡｃを加え、該混合物をＮａＨ２ＰＯ４溶液（通常、水中で５％）に移し、同一の溶媒で抽出する。プールした有機相を、好ましくは減圧下で濃縮乾固する。該固形残渣を水中で懸濁させ、しばらく攪拌しつつ続け、濾過し、有機溶媒、例えば、ＡｃＯＥｔおよびジクロロメタン中に溶解させ、続いて従来の方法で乾燥させ、濾過し、該溶媒を、好ましくは減圧下で留去して、中間体（ＩＩＩ）を得る。さらに精製することなく、エステルをアルコールに還元する次のステップで使用する。エステルのアルコールへの還元は周知であり、多くの方法が当業者に利用可能である。例えば、不活雰囲気下において−７８℃で乾燥有機溶媒、例えば、ＴＨＦ中の化合物（ＩＩＩ）溶液に、無溶媒水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＨ）を加え、反応を完了させる。−７８℃で冷却し、弱酸性溶液（通常、水中で１３％のクエン酸）を加えて十分な時間反応させ、次に相の分離を促進するためのさらなる中性無機塩、例えばＮａＣｌを加え、水相をＥｔＯＡｃ等の有機溶媒で洗浄する。プールした有機相を、例えば、ＮａＨＣＯ３溶液（例えば、５％）等の弱塩基性水溶液で洗浄し、従来の方法で乾燥させ、濾過し、溶媒を、好ましくは減圧下で留去して、中間体（ＩＶ）を得て、さらに精製することなく次のステップで使用される。次のステップは、アルコールからアルデヒドへの従来の酸化である。例えば、ジオキサン等の適切な有機溶媒中の化合物（ＩＶ）の溶液に、ＭｎＯ２を加え、該懸濁液を、典型的には室温で十分な時間撹拌する。該混合物を、例えば、セライトパッド上で濾過して金属を除去し、これをＡｃＯＥｔ等の有機溶媒で洗浄する。該溶媒を、好ましくは減圧下で留去し、該残渣を適切な結晶化媒体、例えば、ジエチルエーテルで結晶化して、化合物（Ｖ）を得ることができる。
【００５９】
下記に記載されるように、中間体（Ｖ）は、様々な複素環残基を有する式（Ｉ）の化合物を製造するための出発化合物として用いることができる。
【００６０】
複素環がピラゾールである式（Ｉ）の化合物の製造については、下記の反応スキームに従うことができる。
【化７】
2021532190.tif 000009
【００６１】
適切な反応媒体、例えば、酢酸中の化合物（Ｖ）の溶液に、ｐ−トルエンスルホニルヒドラジドを加える。該反応混合物を、適切な温度、例えば室温で十分な時間放置し、次にこれをＮａ２ＨＰＯ４溶液（通常、水中で５％）で希釈する。該懸濁液を濾過し、該固形物を、好ましくは減圧下で乾燥させ、溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解させ、カリウム ｔｅｒｔ−ブトキシド等の立体障害のある強塩基を加える。該反応は、例えば、室温から開始し、次いで、例えば８０℃まで加熱して完了させ、次いで、水に注ぎ入れ、適切な溶媒、例えば、ジエチルエーテルで抽出する。プールした有機相を、従来の方法で乾燥させ、濾過され、該溶媒を、好ましくは減圧下で留去する。該残渣を、従来の方法、例えば、適切な溶出系（例えば、ＣＨ２Ｃｌ２／アセトンの７／３の溶離液）を用いるフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）により精製して最終生成物を得る。
【００６２】
同一の化合物（Ｖ）は、他の複素環系、例えば、複素環がイソオキサゾールである式（Ｉ）の化合物、すなわち、ＸがＣＨ、特に、アミノ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで置換されたＣＨであり、ＹがＯであり、ＺがＮである式（Ｉ）の化合物を得るために用いることができる。例示的な方法が、下記スキームに従って本明細書で提供される。
【化８】
2021532190.tif 000010
【化９】
2021532190.tif 000011
【００６３】
化合物（Ｖ）は、従来の方法に従って二重結合水素化に付される。例えば、適切な反応媒体、例えば、ＥｔＯＡｃ中の生成物（Ｖ）の溶液に、水素化触媒、例えば、Ｐｄ／Ｃ（５％）を加え、該混合物を、典型的には、大気圧および室温で水素下に十分な時間保つ。反応完了後、該触媒を、例えばセライトパッド上で濾過して除去し、該濾液を、好ましくは減圧下で濃縮乾固して、生成物（ＶＩ）を得る。次に、アルデヒド（ＶＩ）を、従来の方法に従ってオキシム（ＶＩＩ）に変換する。例えば、反応媒体中の化合物（ＶＩ）の溶液に、例えば、ジオキサン、ヒドロキシルアミン塩酸塩およびＮａＯＨを加える。該反応を完了させ、これを室温で行うことができ、該溶媒を、好ましくは減圧下で留去し、該溶媒、例えばＣＨＣｌ３で抽出する。有機相を、好ましくは減圧下で濃縮乾固して、生成物（ＶＩＩ）を得る。
【００６４】
アルキン（ＸＩ）は、式（Ｉ）で供されるように、アルキル鎖の所望の長さに応じて製造される。アルキンが２つのメチレン基を有する上記のスキームで示される例示的な実施態様において、ＴＨＦ等の乾燥溶媒中の３−ブチン−１−オール溶液に、ＰＰｈ３およびフタルイミドを０℃で加える。１，２−エトキシカルボニルジアゼン溶液（ＤＥＡＤ）を前記溶液に加え、該混合物を反応が完了するまで放置し、次に溶媒を、好ましくは減圧下で留去し、該残渣を、従来の方法、例えば、適切な溶離液（例えば、ヘプタン／ジエチルエーテルの９／１）におけるフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）により精製して、生成物（ＸＩ）を得る。アルキン（ＸＩ）をオキシム（ＶＩＩ）と反応させる。有機溶媒、例えば、０．５％のピリジンを含むクロロホルム中の化合物（ＶＩＩ）の懸濁液に、Ｎ−クロロスクシンイミドを加え、不活（Ｎ２）雰囲気下で反応させる。有機溶媒、例えばトリメチルアミン（ＴＥＡ）を含むクロロホルム中のアルキン（ＸＩ）溶液を加え、該反応は、例えば、室温で、有機溶媒、好ましくは同一の溶媒で希釈し、水で洗浄して終了させる。該溶媒を、好ましくは減圧下で留去して乾固させ、該残渣を、従来の方法、例えば適切な溶出系（例えば、シクロヘキサン／アセトン／クロロホルムの７／２／２）でのフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）により精製して生成物（ＸＩＩ）を得る。最終的に、最終的な所望生成物は、化合物（ＸＩＩ）を、溶媒、例えば、エタノール中のヒドラジン塩酸塩と共に、好ましくは、反応が完了するまで還流下で処理して得られる。該混合物を水で希釈し、該溶媒を、好ましくは減圧下で留去し、残りの水溶液部分を、有機溶媒、例えば、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。有機相を、好ましくは減圧下で乾燥させ、該残渣を、従来の方法、例えば、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（例として、希釈剤ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ３の９５／５／０．５）により精製して最終生成物を得る。
【００６５】
グアニジン基を有する式（Ｉ）の化合物の例示的な実施態様において、中間体（３）を出発物質として、下記スキームに従うことができる。
【化１０】
2021532190.tif 000012
【００６６】
無水溶媒、例えば、ジクロロメタン中の生成物（３）に、トリエチルアミンまたは同等の薬剤を加える。該溶液を、例えば、５℃で冷却し、メタンスルホニルクロリドまたは別の公知の脱離基を加え、該溶液を、同一の冷却温度で十分な時間保持し、次いで室温で反応完了までさらなる時間保持する。該溶液を溶媒で希釈し、ＮａＨＣＯ３溶液または同等物で洗浄する。水相を、ジクロロメタン等の有機溶媒で抽出し、プールした有機相を水で洗浄する。水相を抽出溶媒で再度抽出し、プールした有機相を、従来の方法で乾燥させ、該溶媒を、好ましくは減圧下で留去し、中間体（７）を得て、さらに精製することなく次のステップで使用する。中間体（７）の有機溶液、例えば、アセトンに、２−イミノ−４−チオビウレットを加える。該反応は、好ましくは還流下で反応が完了するまで行い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等の従来の方法によって確認する。室温で冷却し、該反応物をさらにしばらく放置し、反応の完了を確認する。該固形物を濾過して除去し、該溶媒を、好ましくは減圧下で留去する。該固形残渣は、有機溶媒、例えば、ジクロロメタン、および水に取り込まれる。水相を抽出し、該溶媒およびプールした有機相を、従来の方法で乾燥させ、濾過し、該溶媒を、好ましくは真空下で留去して、中間体（８）を得て、これを従来の方法、例えば、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（例えば、溶離液シクロヘキサン／酢酸エチルの１／１＋１％のＴＥＡ−９９％の酢酸エチル＋１％のＴＥＡ）により精製して、生成物（８）を得る。ＮａＯＨまたは同等の薬剤を、例えば、ＭｅＯＨ等の溶媒中の化合物（８）の溶液に加える。該反応は、好ましくは室温で行われ、該溶媒を留去する。該残渣を水で洗浄し、濾過する。フィルター上の固形物をさらなる量の水でさらに洗浄し、続いて適切な結晶化媒体、例えばＥｔＯＨ／水で結晶化することにより精製する。該固形物を、有機溶媒、例えば、ＥｔＯＨ中に、典型的には、室温で溶解させ、水を加え、該混合物を再結晶化させる。該固形物を濾過により回収して、生成物（９）を得る。
【００６７】
Ｒがベータ−ＯＨである式（Ｉ）の化合物について、上記に記載の合成スキームは、ジギトキシゲニンの代わりにジゴキシゲニンを出発物質として行う。この場合、ＯＨのヒドロキシル保護のための最初の反応は３位と１２位で行われる。
【００６８】
式（Ｉ）の化合物は、有機合成の当業者の一般的な知識に基づいて製造することができる。全ての出発生成物、反応試薬、反応媒体、触媒および他の物質は、市販されているか、または文献に記載されている方法に従って製造することができる。知識の供給源は、周知であり、科学文献、教科書、マニュアル、データベース、サービス提供者が含まれ、例えば、www.cas.orgを参照のこと。
【００６９】
別の合成方法を、式（Ｉ）の化合物の製造のために用いることができる。本明細書に開示される反応は、それらの反応試薬、材料、および条件、ならびに最終生成物を単離および精製するための方法において変更し、改変することができる。反応時間と温度は、当業者の経験と一般知識に応じて選択することができる。必要に応じて、Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＬＰ）およびＧｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）を、所望される純度の要件により用いることができる。材料は、好ましくは、純度、高純度、または医薬品グレードのものである。分析方法は、例えば、クロマトグラフィー、分光法および他の適切な技術等の有機化学で従来使用されている方法である。
【００７０】
医薬組成物
医薬組成物および製剤は、本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物の１つまたはそれ以上を、少なくとも１つの従来の医薬的に許容される担体および／またはベヒクルおよび／または賦形剤と混合して含む。
【００７１】
医薬組成物は、非経口的に、局所的に、皮下に、筋肉内に、経口的に、またはエアロゾルもしくは経皮等による局所投与によって投与することができる。経腸、特に、経口投与可能な医薬組成物が好ましい。
【００７２】
医薬組成物は、いずれの方法においても製剤化することができ、病気または疾患および疾患の程度、各患者の総体的な病状、結果として生じる好ましい投与方法等に応じて、様々な単位剤形で投与することができる。製剤および投与の技術の詳細は、科学および特許の文献に詳細に説明されている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton PAの最新版（「レミントン」）を参照のこと。
【００７３】
治療薬としての式（Ｉ）の化合物は、単独で、または医薬製剤（組成物）の１つの成分として投与することができる。化合物は、ヒトまたは獣医学における使用のためのいずれの利便的な方法で投与するために製剤化されてもよい。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、ならびに着色剤、放出剤（release agent）、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、緩衝剤、保存剤および抗酸化剤もまた、組成物中に存在しうる。
【００７４】
本発明による組成物の製剤には、経口／鼻腔、舌下、局所、非経口（例えば、筋肉内または静脈内注射による）、直腸、および／または膣内投与に適した製剤が含まれる。製剤は、利便的に、単位剤形で供されてもよく、薬学分野で周知のいずれの方法により調製されてもよい。単一剤形を調製するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される対象、特定の投与様式に応じて変動する。単一剤形を調製するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を生じる化合物の量である。
【００７５】
本明細書で提供される医薬製剤は、医薬品の製造のための当技術分野で公知のいずれの方法によっても調製することができる。このような製剤は、甘味料、香味剤、着色剤および保存剤を含むことができる。製剤は、製造に適した毒性のない医薬的に許容される賦形剤と混合することができる。製剤は、１つまたはそれ以上の希釈剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、賦形剤等を含み、液体、粉末、乳濁液、凍結乾燥粉末、スプレー、クリーム、ローション、徐放性製剤、錠剤、ピル、ゲル、パッチ上、インプラント内等の形態で供されうる。
【００７６】
経口投与用の医薬製剤は、適切で適した用量において当該技術分野で周知の医薬的に許容される担体を用いて製剤化することができる。このような担体は、患者による摂取に適した錠剤、ゲルタブ、ピル、粉末、糖衣錠、カプセル、液体、トローチ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として単位剤形で医薬品を製剤化することを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、固形賦形剤として製剤化することができ、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切なさらなる化合物を加え、次いで顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適切な固形賦形剤は、炭水化物またはタンパク質増量剤であり、例えば、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物に由来するデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロース等のセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントを含むゴム；ならびにタンパク質、例えば、ゼラチンおよびコラーゲンが挙げられる。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはそれらの塩、例えば、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤または可溶化剤を添加することができる。
【００７７】
糖衣錠コアは、濃縮糖溶液などの適切なコーティングとともに提供され、アラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含みうる。染料または顔料は、製品の識別または活性化合物の量（すなわち、投与量）の特徴付けのために錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いられる医薬製剤は、例えば、ゼラチンから構成される押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティング剤から構成される柔らかく密封されたカプセルを使用して経口で用いられうる。押し込み型カプセルは、乳糖またはデンプンなどの充填剤または結合剤、滑石またはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と混合され、および安定剤と適宜混合されてもよい活性薬剤を含むことができる。軟カプセルでは、活性薬剤は、適切な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール中に、安定剤を含むか、または含まずに溶解または懸濁させることができる。
【００７８】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合して、活性薬剤（例えば、本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いられる組成物）を含むことができる。このような賦形剤には、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムなど、ならびに分散剤または湿潤剤、例えば、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドおよび脂肪酸とヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレンオキシドおよび脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。水性懸濁液はまた、１つまたはそれ以上の保存剤、例えば、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなど、１つまたはそれ以上の着色料、１つまたはそれ以上の香味料、および１つまたはそれ以上の甘味料、例えば、ショ糖、アスパルテームまたはサッカリン、またはエリスリトールもしくはレバウジオシドＡを含みうる。製剤は浸透圧について調整することができる。
【００７９】
油性医薬品は、本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いられる疎水性活性薬剤の投与のために特に有用である。油性懸濁液は、活性薬剤を、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、ココナッツ油など、または鉱油、例えば、液体パラフィンなど、あるいはこれらの混合物中に懸濁させることによって製剤化することができる。例えば、バイオアベイラビリティを高め、経口投与される疎水性医薬化合物の個体間および個体内変動を低減するための精油または精油成分の使用を記載している米国特許第５，７１６，９２８号を参照されたい（米国特許第５，８５８，４０１号も参照のこと）。油性懸濁液には、蜜蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコールなどの増粘剤を含めることができる。口当たりの良い経口製剤を提供するために、甘味料、例えば、グリセロール、ソルビトールまたはショ糖、またはエリスリトールまたはレバウジオシドＡなどを加えることができる。これらの製剤は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって保存することができる。注射可能な油性ベヒクルの例として、Minto (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:93-102を参照のこと。本明細書で提供される医薬製剤はまた、水中油型エマルジョンの形態であり得る。油相は、上記の植物油または鉱油、あるいはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤には、アカシアガムおよびトラガカンスガムなどの天然に存在するガム、大豆レシチンなどの天然に存在するホスファチド、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエートなど、およびこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどが含まれる。乳濁液はまた、シロップおよびエリキシルの製剤の場合のように、甘味料および香味剤を含むことができる。このような製剤はまた、粘滑剤、保存剤、または着色剤を含むことができる。
【００８０】
本発明によれば、医薬化合物はまた、座薬、吹送、粉末およびエアロゾル製剤を含む鼻腔内、眼内および膣内経路で投与することができる（ステロイド吸入剤の例については、Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacol. 35:1187-1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107-111）。座薬製剤は、常温では固体であるが、体温では液体であり、それゆえ体内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬物を混合することによって調製することができる。このような材料は、ココアバターとポリエチレングリコールである。
【００８１】
本発明によれば、医薬化合物は、アプリケータースティック（applicator stick）、溶液、懸濁液、乳濁液、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、塗料剤、粉末、およびエアロゾルとして製剤化された局所経路によって経皮的に送達することができる。
【００８２】
本発明によれば、式（Ｉ）の医薬化合物は、吸入によって送達することができ、例えば、別の実施態様において、吸入のための式（Ｉ）の化合物は、例えば、有効成分（すなわち、式（Ｉ）の化合物）を含む溶液を、例えば、米国特許第６，５０９，００６号；第６，５９２，９０４号；第７，０９７，８２７号；および第６，３５８，５３０号に記載される方法を用いて噴霧乾燥することによって乾燥分散のために調製される。例示的な乾燥粉末賦形剤には、分散を補助するために、式（Ｉ）の化合物と混合される低分子量炭水化物またはポリペプチドが含まれる。別の実施態様において、乾燥粉末分散のための担体として有用な医薬賦形剤のタイプには、有用な分散剤でもあるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定剤、増量剤、例えば、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなど；ｐＨ調整剤または緩衝液；塩、例えば、塩化ナトリウムなどが含まれる。これらの担体は、結晶形態またはアモルファス形態であり得るか、または前記２種類の混合物であり得る。粉末またはエアロゾル製剤を送達するために使用できるデバイスには、例えば、米国特許第５，６０５，６７４号、第７，０９７，８２７号に記載されているものが含まれる。
【００８３】
本発明によれば、医薬化合物はまた、体内で徐放するためのナノ粒子またはミクロスフェアとして送達することができる。例えば、ナノ粒子またはミクロスフェアは、ゆっくりと皮下に放出される薬物の皮内または皮下注射を介して投与することができ、Rao (1995) J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7:623-645を参照のこと；生分解性および注射可能なゲル製剤として、例えば、Gao (1995) Pharm. Res. 12:857-863 (1995)を参照のこと；または、経口投与用のミクロスフェアとして、例えば、Eyles (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49:669-674を参照のこと。
【００８４】
本発明によれば、式（Ｉ）の医薬化合物は、筋肉内（ＩＭ）もしくは静脈内（ＩＶ）投与または体腔もしくは臓器の内腔への投与などによって非経口的に投与することができる。これらの製剤には、医薬的に許容される担体中に溶解された活性薬剤の溶液として含ませることができる。使用することができる許容可能なベヒクルおよび溶媒は、水、水中のデキストロース、および等張塩化ナトリウムであるリンゲル液である。さらに、無菌固定油は、溶媒または懸濁媒体として使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含むいずれの無菌固定油を使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸もまた、同様に注射剤の調製に使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質が含まれていない。これらの製剤は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができる。製剤は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの生理学的条件を適正にするために必要とされる医薬的に許容される補助物質を含み得る。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は、大きく変動する可能性があり、選択された特定の投与様式および患者のニーズに応じて、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択される。静脈内投与の場合、製剤は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液などの無菌の注射可能な調製物であり得る。この懸濁液は、これらの適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液中の懸濁液であり得る。投与は、ボーラスまたは持続注入（例えば、一定期間の血管への実質的に連続した注入）によることができる。
【００８５】
本明細書で提供される医薬化合物および製剤は、凍結乾燥することができる。本明細書で提供される組成物を含む安定な凍結乾燥製剤が提供され、これは、本明細書で提供される医薬品および増量剤、例えば、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびショ糖またはこれらの混合物を含む溶液を凍結乾燥することによって調製することができる。他にも多くの従来の凍結乾燥剤がある。糖類の中で、乳糖が最も一般的である。クエン酸、炭酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、ベンジルアルコール、グリシン、塩化ナトリウムなども使用される（例えば、Journal of Excipients and Food Chemistry Vol. 1, Issue 1 (2010) pp 41-54；米国特許出願第２００４００２８６７０号を参照のこと）。
【００８６】
本発明によれば、本明細書で提供される式（Ｉ）の化合物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療用途において、組成物は、病気または疾患の臨床的症状、または疾患およびその合併症を治癒、緩和または部分的に阻止するのに十分な量（「治療有効量」）で病気または疾患にすでに罹患している対象に投与される。例えば、別の実施態様において、本明細書で提供される医薬組成物は、それを必要とする個体を治療し、予防し、または緩和するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な医薬組成物の量は、「治療上有効な用量」として定義される。この用途に有効な投与スケジュールと量、すなわち「投薬計画」は、疾患または病気のステージ、疾患または病気の重症度、患者の総体的な状態、患者の体調、年齢などを含む様々な因子による。患者の投薬計画を算出する際には、投与様式も考慮される。
【００８７】
投薬計画はまた、当該技術分野で周知の薬物動態パラメータ、すなわち、活性薬剤の吸収速度、バイオアベイラビリティ、代謝、クリアランスなどを考慮に入れる（例えば、Hidalgo-Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617; Groning (1996) Pharmazie 51:337-341; Fotherby (1996) Contraception 54:59-69; Johnson (1995) J. Pharm. Sci. 84:1144-1146; Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610-613; Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24:103-108; 最新の上記Remingtonの文献を参照のこと）。当該技術分野の一般知識により、臨床医は、個々の患者、活性薬剤、および治療される疾患または病気の投薬計画を決定することができる。医薬品として用いられる同様の組成物について提供されるガイドラインは、本明細書に提供される方法を実施して投与される投薬計画、すなわち、投薬スケジュールおよび投薬レベルを決定するための手引書として使用することができ、正確かつ適切である。
【００８８】
製剤の単回投与または複数回投与は、必要に応じ、患者が許容できる用量および頻度に応じて行うことができる。製剤は、本明細書に記載の病気、疾患または症状を効果的に治療し、予防し、または緩和するために十分な量の活性薬剤を提供する必要がある。例えば、本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される組成物の経口投与のための例示的な医薬製剤は、１日につき体重１キログラムあたり約１〜約２０、５０、１００、または１０００マイクログラムまたはそれ以上の１日量またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物の同等物であり得る。
【００８９】
別の実施態様において、それを必要とする個体に投与される、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物の同等物の有効量は、様々な投薬スケジュールの使用を含む。例えば、ＡＨＦＳの場合、入院患者を助けるために、式（Ｉ）の化合物は、１分あたり体重１ｋｇあたり０．１〜０．５から約１０、５０、もしくは１００マイクログラムまたはそれ以上の範囲の用量で２４／４８時間にわたる静脈内注入によって投与することができる。Ｂ）ＡＨＦＳから助けられ、退院した患者では、治療効果を維持するための投与スケジュールは、体重１ｋｇあたり１、１０、５０、１００、または１０００マイクログラムまたはそれ以上の１日量とすることができる。経口投与が好ましい実施態様である。
【００９０】
別の実施態様において、それを必要とする個体に投与される、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物の同等物の有効量は、肺動脈楔入圧（ＰＣＷＰ）、呼吸困難、末梢および肺静脈うっ血、尿量、運動能力、血清バイオマーカー、例えば、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよび高感度心筋トロポニン（ｈｓ−ｃＴｎＴ）などのモニタリングに基づいて個別化される。
【００９１】
別の実施態様において、それを必要とする個体に投与される、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物の同等物は、息切れすることのない通常の運動耐性を維持するために十分な量である。
【００９２】
別の実施態様において、有効量は、ＰＣＷＰ、起座呼吸、発作性夜間呼吸困難の減少、運動耐性の増加、末梢および肺の静脈うっ血（例えば、肺の捻髪音またはラ音など）の減少、足首の腫れの減少、バイオマーカー（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰや高感度心筋トロポニン（ｈｓ−ｃＴｎＴ）など）の尿量の減少によって示される。
【００９３】
別の実施態様において、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物の同等物のより低用量は、血流またはＩＶもしくはＩＭで投与される場合（例えば、経口、吸入または皮下投与とは対照的に）、例えば、ＩＶまたはＩＭ投与として、または体腔内または臓器の内腔への投与の場合に用いられる。実質的により高い用量は、局所、スプレー、吸入または経口投与、あるいは粉末、スプレーまたは吸入による投与で使用することができる。非経口的または非経口的ではない投与可能な製剤を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかであり、上記のRemingtonの文献のような刊行物により詳細に記載されている。
【００９４】
別の有利な実施態様において、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物の同等物は、慢性的に、例えば、診断の日から患者の人生の最後の日まで、または疾患は寛解まで付与される。別の実施態様において、用量の調整は、疾患の特定の従来から公知のバイオマーカーまたは臨床徴候の定期的なモニタリングを通じて、治療段階から維持期間に移行するときに必要とされる。
【００９５】
別の実施態様において、治療、治療計画、または特定の用量の有効性を評価する際、または治療と維持用量のいずれを与えるべきかどうかを決定する際、個体、例えば、急性または慢性心不全に罹っている患者は、臓器および組織の合併症または損傷の存在および程度、例えば、心臓（心室拡張、ＩＩＩ音心肥大）、倦怠感、疲労感、運動耐性の低下、運動後の回復時間の増加、腎臓（腎不全、乏尿）、肺（起坐呼吸、発作性夜間呼吸困難、頻呼吸）、足首の腫れ、頸静脈圧の上昇についての周期的な定期スクリーニングにかけられる。心臓、肺、末梢循環機能に着目した心血管疾患、特に急性または慢性心不全の治療の専門家が選択した時間間隔で徹底的な身体検査を行う必要がある。よって、別の実施態様において、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物の同等物による治療は、症状の急速な進展を防ぐために、可能な限り早期に、好ましくは緊急に開始され、患者の退院後何年もの間その後継続され、できれば患者の生涯を通じて、または少なくとも他の薬剤が心不全で使用される方法と一致する期間継続される。
【００９６】
本発明によれば、本明細書で提供される使用および方法は、他の薬物または医薬品との同時投与をさらに含むことができる。実際、本発明は、低下した心臓生化学的機能（すなわち、ＳＥＲＣＡ２ａ活性）を選択的に修正する。このことは、利用可能な治療法よりも望ましくない副作用を少なくしつつ（上記の選択性のため）、既存のＨＦ臨床症状の緩和に確かに寄与するものである。しかしながら、ＣＨＦおよびＡＨＦは複雑な臨床症候群であるため、本発明は、ａ）薬物クラス、例えば、ＡＣＥ阻害薬、ＡＩＲＢ、利尿薬、Ｃａチャネル遮断薬、βブロッカー、ジギタリス、ＮＯドナー、血管拡張薬、ＳＥＲＣＡ２ａ刺激因子、ネプリライシン（ＮＥＰ）阻害剤、ミオシンフィラメント活性化因子、組換えリラキシン−２メディエーター、組換えＮＰタンパク質、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）の活性化因子、アンジオテンシンＩＩ受容体のベータアレスチンリガンド；ｂ）特定の薬剤：ヒドロクロロチジド、フロセミド、ベラパミル、ジルチアゼム、カルベジロール、メトプロロール、ヒドララジン、エプレレノン、スピロノラクトン、リシノプリル、ラミプリル、ニトログリセリン、硝酸塩、ジゴキシン、バルサルタン、オルメサルタン、セルミサルタン、セルミサルタン、カンデス、ラリチド、レボシメンダン、シナシグアトなどの既存および将来の薬物クラスおよび／または以下のような特定の薬物と一緒に適用可能でありうる。
【００９７】
特に心不全を治療するために使用される治療薬としての本発明の化合物は、同一疾患の治療に使用される他の治療薬と組み合わせることができる。例示的な他の治療薬は、利尿薬、例えば、フロセミド、ブメタニド、およびトラセミド、メトラゾン、アルドステロン拮抗薬、例えば、スピロノラクトンまたはエプレレノン、チアジド系利尿薬、例えば、ヒドロクロロチアジド、メトラゾン、クロルタリドンなどである。他の薬剤は、ＡＣＥ阻害剤、例えば、リシノプリルおよびラミプリルである。また、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＡＲＢ）、例えば、バルサルタン、カンデサルタン、ロサルタンなども考慮に入れることができる。アンジオテンシン受容体／ネプリライシン阻害剤（ＡＲＮＩ）、例えば、サクビトリルが含まれる。他の薬剤は、βブロッカー、例えば、カルベジロールおよびメトプロロールなど、または血管拡張薬、例えば、ヒドララジン（二硝酸イソソルビドと適宜組み合わされてもよい）、硝酸塩、例えば、ニトログリセリン、アムロジピンおよびフェロジピン、非ジヒドロピリジン、例えば、ジルチアゼムまたはベラパミルなどから選択することができる。本発明の化合物はまた、必要に応じて、ジゴキシンと組み合わせることができる。イバブラジンや他の抗凝固剤などの他の薬物も考慮されうる。
【００９８】
本発明の化合物は、他の治療薬、特に心血管疾患の治療に有用な薬剤、より具体的には心不全の併用療法と組み合わせることができる。組み合わされる有効成分は、医師によって決定された異なるプロトコルに従って投与することができる。本発明の一実施態様によれば、併用療法は、式（Ｉ）の化合物を、１つまたはそれ以上さらなる治療上活性な成分と同時に、または異なる時間の両方で投与することによって行うことができる。併用投与の場合、本発明の化合物および１つまたはそれ以上のさらなる有効成分は、それぞれ、各々の医薬組成物または同一の単一製剤中に製剤化することができる。前者の場合、本発明は、特に、心不全の治療のための、本発明の化合物および１つまたはそれ以上のさらなる有効成分を含む別々の医薬組成物を含むキットを提供する。別の実施態様において、本発明は、特に、心不全の治療のための、本発明の化合物および１つまたはそれ以上のさらなる有効成分を同一の単位剤形中に含む、医薬単位剤形キットを提供する。本発明による併用療法は、本明細書に開示されるさらなる活性薬剤の周知の治療効果に加えて、または相乗的に組み合わされる、本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物の変力性心筋弛緩効果による心不全の有効な治療を提供する。
【００９９】
本明細書で提供される使用および方法を実施するために使用される化合物を含むナノ粒子、ナノリポ粒子、小胞およびリポソーム膜は、例えば、本明細書で提供される医薬的に活性な化合物および組成物（式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物（適宜、上記に記載されるさらなる治療上活性な薬剤と組み合わされてもよい））を、それを必要とする対象に送達するために提供される。別の実施態様において、これらの組成物は、例えば、筋細胞または心臓細胞、内皮細胞などの所望の細胞型を標的とするために、細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチドなどの生物学的分子を含む特定の分子を標的とするように設計される。
【０１００】
本明細書で提供される方法を実施するために使用される化合物を含む多層リポソームが提供され、例えば、Ｐａｒｋらの米国特許出願第２００７００８２０４２号に記載される。多層リポソームは、スクアラン、ステロール、セラミド、中性脂質または油、脂肪酸およびレシチンを含む油相成分の混合物を用いて、本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いられる組成物を閉じ込めるために、粒子サイズを約２００〜５０００ｎｍで調製することができる。
【０１０１】
リポソームは、例えば、本発明による活性薬剤（または活性薬剤の組み合わせ）をカプセル化することによってリポソームを調製する方法を含む、米国特許第４，５３４，８９９号またはＰａｒｋらの米国特許出願第２００７００４２０３１号に記載される方法を用いて調製することができ、この方法は、第１のリザーバーに水溶液を供し、第２のリザーバーに有機脂質溶液を供し、次いで前記水溶液を、第１の混合領域中で有機脂質溶液と混合してリポソーム溶液を生成することを含むものであって、有機脂質溶液を水溶液と混合して、実質的に瞬時に活性薬剤を生成し；続いて即座にリポソーム溶液を緩衝液と混合して、希釈されたリポソーム溶液を生成するものである。
【０１０２】
１の実施態様において、本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いられるリポソーム組成物には、例えば、米国特許出願第２００７０１０７９８号に記載されているように、所望の細胞型に本明細書で提供される方法を実施するために用いられる式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物もしくは水和物の同等物の送達を標的とするために、置換アンモニウムおよび／またはポリアニオンが含まれる。
【０１０３】
例えば、米国特許出願第２００７００７７２８６号に記載されるように、活性薬剤を含有するナノ粒子（例えば、二次ナノ粒子）の形態で本明細書に提供される使用および方法を実施するために用いられる本発明による化合物を含むナノ粒子が提供される。１の実施態様において、本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いられる脂溶性活性薬剤、または二価または三価の金属塩と作用する脂溶性水溶性活性薬剤を含むナノ粒子が提供される。
【０１０４】
１の実施態様において、固体脂質懸濁液は、例えば、米国出願第２００５０１３６１２１号に記載されるように、インビボ、インビトロまたはエクスビボで哺乳動物細胞に本明細書で提供される使用および方法を実施するために使用される組成物を製剤化し、送達することができる。
【０１０５】
本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いられる組成物および製剤は、リポソームまたはナノリポソームを使用することによって送達することができる。リポソームを使用することにより、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンドを保有するか、あるいは特定の器官に優先的に向けられる場合、活性薬剤のインビボでの標的細胞への送達に着目することができる。例えば、米国特許第６，０６３，４００号；米国特許第６，００７，８３９号；Al-Muhammed (1996) J. Microencapsul. 13:293-306; Chonn (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:698-708; Ostro (1989) Am. J. Hosp. Pharm. 46:1576-1587を参照のこと。
【０１０６】
送達ベヒクル
別の実施態様において、いずれの送達ベヒクルもまた、例えば、本明細書で提供される化合物を、それを必要とする対象に送達するために、本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いることができる。例えば、ポリカチオン、カチオン性ポリマー、および／またはカチオン性ペプチド、例えば、ポリエチレンイミン誘導体などを含む送達ベヒクルは、例えば、米国特許出願第２００６０００８３３７号に記載されているように用いることができる。
【０１０７】
１の実施態様において、乾燥ポリペプチド−界面活性薬剤複合体は、例えば、米国特許出願第２００４０１５１７６６号に記載されるように、本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いられる組成物を製剤化するために用いられる。
【０１０８】
１の実施態様において、本明細書で提供される使用および方法を実施するために用いられる組成物は、例えば、米国特許第７，３０６，７８３号；第６，５８９，５０３号に記載されるように、細胞膜透過性ペプチドコンジュゲートを有するベヒクルを用いて細胞に適用することができる。１の態様において、送達される組成物は、細胞膜透過性ペプチドに抱合されている。１の実施態様において、送達される組成物および／または送達ベヒクルは、例えば、高度に塩基性であり、ポリホスホイノシチドに結合する輸送介在ペプチドを記載する米国特許第５，８４６，７４３号に記載されるような輸送媒介ペプチドに抱合されている。
【０１０９】
１の実施態様において、電気透過性は、例えば、米国特許第７，１０９，０３４号；第６，２６１，８１５号；第５，８７４，２６８号に記載されるように、任意のエレクトロポレーション系を用いて、組成物を細胞に送達するための主要なまたは補助的な手段として用いられる。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。
【０１１１】
式（Ｉ）の化合物の調製
下記の実施例において、特に明記しない限り、化合物、溶媒、反応試薬、およびその他の材料は、商業的供給源からのものである。
【０１１２】
実施例１
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（イミダゾール−４−イル）アンドロスタン（ＣＶｉｅ１０１）
【化１１】
2021532190.tif 000013
−ジギトキシゲニンから３−アセチル−ジギトキシゲニン
【化１２】
2021532190.tif 000014
１
アルゴン雰囲気下で１１８ｍｌのピリジン中の２５グラムのジギトキシゲニンの溶液に、４１ｍｇのＤＭＡＰおよび３３．１ｍｌの無水酢酸を、３０℃以下の温度を保ちながら加えた。
【０１１３】
室温で２０時間撹拌し、該溶媒を減圧下で留去した（トルエンと共蒸発）。該残渣を４８０ｍｌの水で吸収させ、室温で１時間撹拌した。得られた固形物を濾過により収集し、２４０ｍｌの水で洗浄し、真空下で乾燥させて、２８．０４ｇ（定量的収率）の生成物１を淡黄色の固形物として得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１１４】
−３−アセチル−ジギトキシゲニンから１７β−ラクトン環の開環
【化１３】
2021532190.tif 000015
７４０ｍＬのアセトン中の２６．３３ｇの中間体１の撹拌溶液に、２２２ｍｌの水中の３３．８ｇのＮａＩＯ４および１０５ｍｇのＲｕＯ２水和物の溶液を加えた。室温で３０分間撹拌し、２２２ｍｌの水中の３３．８ｇのＮａＩＯ４および１０５ｍｇのＲｕＯ２水和物の溶液を加えた。
【０１１５】
３２ｍｌのイソプロパノールを加え、室温で１５分間撹拌し、該固形物を濾過して除去し、減圧下で容量を減らし、該残渣をＡｃＯＥｔで抽出した。
【０１１６】
有機相をブラインで洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を真空下で除去して中間体２を得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１１７】
−アルコールへの還元
【化１４】
2021532190.tif 000016
６８５ｍｌの水中の２１．４７ｇのＫＨＣＯ３溶液を、１０８０ｍｌのＭｅＯＨ中の２８．１８ｇの中間体２の溶液に加えた。該溶液を室温で１６時間撹拌し続け、１０．７４ｇのＫＨＣＯ３を加えた。室温で５時間後、ＭｅＯＨを減圧下で留去し、該残渣を５００ｍｌのジクロロメタンで２回抽出し、有機相を２５０ｍｌのブラインで洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を減圧下で留去した。該残渣を、７：３のシクロヘキサン／ＡｃＯＥｔで溶出するフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）により精製して、１４．７８ｇ（６３％）の中間体３を白色固形物として得た。
【０１１８】
−イミダゾール環の構築
【化１５】
2021532190.tif 000017
９５５ｍｌのエタノール中の１３．６６ｇの生成物３の攪拌溶液に、６８．３ｍｌの３７％ ホルムアルデヒド、Ｃｕ（ＯＡｃ）２溶液（３４ｍｌの水中の１３．２７ｇ）および２０５ｍｌの２８％ 水酸化アンモニウムを加えた。該混合物を３時間加熱還流した。溶媒を減圧下で留去し、該固形残渣をＡｃＯＥｔ中に溶解し、ブラインで洗浄した。
【０１１９】
有機相を収集し、水相をＡｃＯＥｔで抽出した。
【０１２０】
プールした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、セライトパッドで濾過し、該溶媒を減圧下で留去して、１３．３４ｇ（９６％）の化合物４を緑がかった色の固形物として得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１２１】
−３−アセチル化合物の加水分解
【化１６】
2021532190.tif 000018
５５５ｍｌのＭｅＯＨ中の１３．３４ｇの中間体４の撹拌溶液に、１６６．５ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨを加え、該溶液を室温で１６時間撹拌した。ＭｅＯＨを減圧下で留去し、該残渣を水で希釈し、続いてジクロロメタンで抽出した。
【０１２２】
有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を真空下で除去して、８．２３ｇ（６９％）の中間体５をオフホワイト色の固形物として得て、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１２３】
−医薬的に許容される塩の調製
【化１７】
2021532190.tif 000019
ＥｔＯＨ中の１８．１ｍｌの１．２５Ｍ ＨＣｌを、４００ｍｌのＭｅＯＨ中の８．１１ｇの生成物５の溶液に加えた。該混合物を室温で５分間撹拌し、次に溶媒を留去した。該残渣をアセトン中に溶解させ、加熱還流し、冷却し、次いで固形物を濾過により収集して、６．０３ｇの白色の固形物を得て、これをクロマトグラフィーにより精製した。
【０１２４】
該固形物を、７：３の水／ＡＣＮで溶出する複数のセミ分取Ｃ１８カラムクロマトグラフィーの実行（３．０ｇの粗生成物をロード）により精製した。総収量：３．９５ｇ（４４％）。
1H-NMR (d6-DMSO): 0.59 (s, 3H); 0.87 (s, 3H); 1.05-1.24 (m, 4H); 1.32-1.53 (m, 8H); 1.59-1.88 (m, 7H); 2.03-2.11 (m, 1H); 2.21-2.29 (m, 1H); 2.92 (dd, 1H); 3.89 (s, 1H); 4.25 (brs, 1H); 7.29 (d, 1H); 8.86 (d, 1H); 13.72 (s, 1H); 14.22 (s, 1H).
【０１２５】
実施例２
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（２−グアニジノ−チアゾール−４−イル）アンドロスタン（Ｃｖｉｅ１０２）
【化１８】
2021532190.tif 000020
−ジギトキシゲニンから３−アセチル−ジギトキシゲニン
アルゴン雰囲気下で１１８ｍｌのピリジン中の２５グラムのジギトキシゲニンの溶液に、４１ｍｇのＤＭＡＰおよび３３．１ｍｌの無水酢酸を、温度を３０℃以下に保ちながら加えた。
【０１２６】
室温で２０時間撹拌し、溶媒を減圧下で留去した（トルエンと共蒸発）。該残渣を４８０ｍｌの水に吸収させ、室温で１時間撹拌した。得られた固形物を濾過により収集し、２４０ｍｌの水で洗浄し、真空下で乾燥させて、２８．０４ｇ（定量的収率）の生成物１を淡黄色の固形物として得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１２７】
−３−アセチル−ジギトキシゲニンから１７β−ラクトン環の開環
７４０ｍＬのアセトン中の２６．３３ｇの中間体１の撹拌溶液に、２２２ｍｌの水中の３３．８ｇのＮａＩＯ４および１０５ｍｇのＲｕＯ２水和物の溶液を加えた。室温で３０分間撹拌し、２２２ｍｌの水中の３３．８ｇのＮａＩＯ４および１０５ｍｇのＲｕＯ２水和物の溶液を加えた。該混合物を、室温でさらに１５分間撹拌し、続いて２２２ｍｌの水中の３３．８ｇのＮａＩＯ４および１０５ｍｇのＲｕＯ２水和物の溶液を加えた。
【０１２８】
３２ｍｌのイソプロパノールを加え、１５分間撹拌し、室温で固形物を濾過して除去し、減圧下で容量を減らし、残渣をＡｃＯＥｔで抽出した。
【０１２９】
有機相をブラインで洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を真空下で除去して、２９．８ｇの淡褐色の固形物を得て、これを７９０ｍｌのアセトン中に溶解した。
【０１３０】
２２２ｍｌの水中の３３．８ｇのＮａＩＯ４および１０５ｍｇのＲｕＯ２水和物の溶液を加えた。室温で３０分間撹拌し、２２２ｍｌの水中の３３．８ｇのＮａＩＯ４および１０５ｍｇのＲｕＯ２水和物の溶液を加え、該混合物を室温で３０分間撹拌し、次にイソプロパノール（３２ｍｌ）を加えた。水（２２２ｍｌ）中のＮａＩＯ４（３３．８ｇ，１５８．０ｍｍｏｌ，２．５当量）およびＲｕＯ２水和物（１０５ｍｇ，０．７９ｍｍｏｌ，２当量）の溶液を加え、該混合物を室温で３０分間撹拌し、次に３２ｍｌのイソプロパノールを加えた。１５分間攪拌し、室温で固形物を濾過して除去し、減圧下で容量を減らし、残渣をＡｃＯＥｔで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を減圧下で留去して、２８．２５ｇ（９７％）の中間体２を得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１３１】
−アルコールへの還元
６８５ｍｌの水中の２１．４７ｇのＫＨＣＯ３の溶液を、１８０ｍｌのＭｅＯＨ中の２８．１８ｇの中間体２の溶液に加えた。該溶液を、室温で１６時間撹拌し続け、１０．７４ｇのＫＨＣＯ３を加えた。室温で５時間後、ＭｅＯＨを減圧下で留去し、残渣を５００ｍｌのジクロロメタンで２回抽出し、有機相を２５０ｍｌのブラインで洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で留去した。該残渣を、７：３のシクロヘキサン／ＡｃＯＥｔで溶出するフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）で精製し、１４．７８ｇ（６３％）の中間体３を白色の固形物として得た。
【０１３２】
−アルコールからメタンスルホネートへ
【化１９】
2021532190.tif 000021
２０５ｍｌの無水ジクロロメタン中の１０．２グラムの生成物３の撹拌溶液に、５．１ｍｌのトリエチルアミンを加えた。該溶液を５℃に冷却し、２．５ｍｌのメタンスルホニルクロリドを滴下し、溶液を５℃で１０分間、そして室温でさらに２時間維持した。該溶液を２００ｍｌのジクロロメタンで希釈し、２００ｍｌのＮａＨＣＯ３溶液で洗浄した。
【０１３３】
水相を５０ｍｌのジクロロメタンで抽出し、プールした有機相を２００ｍｌの水で洗浄した。該水相を５０ｍｌのジクロロメタンで再度抽出し、プールした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、該溶媒を減圧下で留去して、１２．４ｇ（９９％）の化合物７を白色の固形物として得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１３４】
−グアニジン置換チアゾールの構築
【化２０】
2021532190.tif 000022
１１２０ｍｌのアセトン中の１２．４ｇの中間体７の撹拌溶液に、５２．３グラムの２−イミノ−４−チオビウレットを加えた。該溶液を５時間還流し、室温まで冷まし、さらに１６時間撹拌した。該懸濁液を濾過して固形物を捨て、アセトンを減圧下で留去した。
【０１３５】
該固形残渣を、５００ｍｌのジクロロメタンおよび５００ｍｌの水に吸収させた。水相を２５０ｍｌのジクロロメタンで２回抽出し、プールした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去して、１５．３ｇの中間体８を黄色がかった固形物として得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（シクロヘキサン／酢酸エチルの１／１＋１％のＴＥＡ−酢酸エチル９９％＋１％のＴＥＡを溶離液）により精製して、８．９５グラムの純粋な生成物８（７３％）を得た。
【０１３６】
−３β−ヒドロキシの回復
【化２１】
2021532190.tif 000023
９３．３ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨを、９００ｍｌのＭｅＯＨ中の８．８６ｇの中間体８の溶液に加えた。該混合物を室温で４８時間撹拌し、次に溶媒を留去した。残渣を２５０ｍｌの水で洗浄し、濾過した。フィルター上の固形物をさらに１００ｍｌの水で洗浄すると、７．７グラムのオフホワイト色の固形物が得られ、これをＥｔＯＨ／水による結晶化により精製した。該固形物を室温で７７０ｍｌのＥｔＯＨ中に溶解し、３８５ｍｌの水を撹拌しながら加え、該混合物を４℃で１６時間放置した。該固形物を濾過により回収して、６．２４グラムの生成物９をオフホワイト色の粉末として得た。
1H-NMR (d6-DMSO, 400 MHz): 0.59 (s, 3H); 0.89 (s, 3H); 1.05-1.24 (m, 4H); 1.32-1.53 (m, 8H); 1.59-1.88 (m, 7H); 2.04-2.09 (m, 2H); 2.72 (t, 1H); 3.90 (s, 1H); 4.20 (s, 1H); 4.89 (s, 1H); 6.59 (bs, 4H).
【０１３７】
−医薬的に許容される塩の調製
５．７２グラムの生成物９を２３０ｍｌのＭｅＯＨ中に溶解し、濾過し、そして４．４ｍｌのＭｅＯＨ中の３Ｍ ＨＣｌを前記濾過した溶液に加えた。該溶媒を減圧下で留去し、該残渣を１３０ｍｌのアセトンでスラリーにし、室温で３時間撹拌した。４℃でさらに１６時間後、該固形物を濾過により回収し、４．４０グラムの白色の固形物を得た。
【０１３８】
実施例３
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１２β−ヒドロキシ−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（イミダゾール−４−イル）アンドロスタン（Ｃｖｉｅ１０４）
【化２２】
2021532190.tif 000024
−ジゴキシン（Ａ）からジゴキシゲニンへ
【化２３】
2021532190.tif 000025
Ｂ
４３ｍｌのＭｅＯＨ中の４．３３グラムのジゴキシンの懸濁液に、１２．３ｍｌの０．２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加え、該混合物を１時間加熱還流し、そして室温に冷ました。該溶媒を減圧下で留去し、２５ｍｌの氷と水の混合物を該残渣に加え、３０分間撹拌した。集めた固体を２５ｍｌの冷水で１時間撹拌しながら洗浄し、該懸濁液を濾過し、該固形物をフィルター上で水で洗浄して、２．２３８グラムの白色固体Ｂ（９９％）を得た。
【０１３９】
−３β，１２β−ヒドロキシ基のアセチル化
【化２４】
2021532190.tif 000026
Ｃ
アルゴン雰囲気下で１０ｍｌのピリジン中の２．１４グラムのジゴキシゲニンの溶液に、３ｍｇのＤＭＡＰおよび２．５ｍｌの無水酢酸を、温度を３０℃以下に保ちながら加えた。室温で２０時間撹拌し、該溶媒を減圧下で留去した（トルエンと共蒸発）。該残渣を２５ｍｌの水で処理し、室温で１時間撹拌した。得られた固形物を濾過により収集し、真空下で乾燥させて、１．９２グラム（７９％）の生成物Ｃを白色の固形物として得て、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１４０】
−ラクトン環の開環
【化２５】
2021532190.tif 000027
Ｃ                                        Ｄ
４７ｍＬのアセトン中の１．９１グラムの中間体Ｃの撹拌溶液に、１４ｍｌの水中の２．１５ｇのＮａＩＯ４および７ｍｇのＲｕＯ２水和物の溶液を加えた。室温で３０分間撹拌し、１４ｍｌの水中の２．１５ｇのＮａＩＯ４および７ｍｇのＲｕＯ２水和物の溶液を加えた。
【０１４１】
２．４ｍｌのイソプロパノールを加え、室温で１５分間撹拌し、該固形物をセライトパッド上で濾過して除去し、１５０ｍｌのアセトンを用いてフィルター上で洗浄し、該溶媒を減圧下で留去し、該残渣をＡｃＯＥｔおよび水で抽出した。
【０１４２】
有機相をブラインで洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を真空下で除去して、２．２５ｇ（９９％）の生成物Ｄを白色の固形物として得て、さらに精製することなく次のステップで使用する。
【０１４３】
−エステルの加水分解
【化２６】
2021532190.tif 000028
Ｄ                                          Ｅ
４７ｍｌの水中の１．４２ｇのＫＨＣＯ３の溶液を、７１ｍｌのＭｅＯＨ中の２．２５ｇの中間体Ｄの溶液に加えた。該溶液を室温で７２時間撹拌し、次にＭｅＯＨを減圧下で留去した。残りの水溶液をＥｔＯＡｃで抽出し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を減圧下で留去した。粗残渣を、シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔの６／４で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１．０３グラム（５７％）の中間体Ｅを白色の固形物として得た。
【０１４４】
−イミダゾール環の構築
【化２７】
2021532190.tif 000029
Ｅ                                            Ｆ
３０ｍｌのエタノール中の５００ｍｇの生成物Ｅの攪拌溶液に、２．２ｍｌの３７％ ホルムアルデヒド、Ｃｕ（ＯＡｃ）２（２．６ｍｌの水中の４２３ｇ）および６．５ｍｌの２８％ 水酸化アンモニウム溶液を加えた。該混合物を３時間加熱還流した。容量を減らし、該残渣をブラインおよびＡｃＯＥｔ中に入れた。
【０１４５】
有機相を収集し、水相をＡｃＯＥｔで抽出した。プールした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を減圧下で留去して、４７４ｍｇ（９３％）の化合物Ｆを緑がかった固形物として得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１４６】
−アセチル基の加水分解
【化２８】
2021532190.tif 000030
Ｆ                                    Ｇ
１７ｍｌのＭｅＯＨ中の４７０ｍｇの中間体Ｆの撹拌溶液に、５．１ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨを加え、該溶液を室温で２４時間撹拌した。ＭｅＯＨを減圧下で留去し、該残渣を水で希釈し、そしてジクロロメタンで抽出した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を真空下で留去して、３８３ｍｇ（７３％）の粗残渣を灰色／緑色の固形物として得て、これをＤＣＭ／ＭｅＯＨの８／２で溶出するＳｉＯ２ゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１５２ｍｇの純粋な生成物Ｇ（ＣＶｉｅ１０４）を白色の固形物として得た。
1H-NMR (d6-DMSO, 600 MHz): 0.40 (s, 3H); 0.83 (s, 3H); 1.08-1.24 (m, 4H); 1.30-1.58 (m, 6H);1.58-1.82 (m, 6H); 1.82-2.18 (m, 1H); 2.02-2.18 (m, 1H); 3.20 (m, 1H); 3.90 (s, 1H); 4.18 (s, 1H); 4.40 (s, 1H); 6.68 (s, 1H); 7.60 (s, 1H); 11.78 (s, 1H). 
【０１４７】
実施例４
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１２β−ヒドロキシ−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（２−グアニジノ−チアゾール−４−イル）アンドロスタン（Ｃｖｉｅ１０５）
【化２９】
2021532190.tif 000031
実施例３は、中間体Ｅまでを繰り返す。
【０１４８】
−アルコールからメタンスルホネートへ
【化３０】
2021532190.tif 000032
Ｅ                                          Ｈ
１０ｍｌの無水ジクロロメタン中の０．５５グラムの生成物Ｅの攪拌溶液に、０．２４ｍｌのトリエチルアミンを加えた。該溶液を５℃に冷まし、０．１２ｍｌのメタンスルホニルクロリドを滴下して加え、該溶液を５℃で１０分間、次に室温でさらに２時間撹拌した。該溶液を１０ｍｌのジクロロメタンで希釈し、１０μｌの５％ ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄した。
【０１４９】
水相を５０ｍｌのジクロロメタンで抽出し、プールした有機相を１０ｍｌの水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、該溶媒を減圧下で留去して、０．６４ｇ（９９％）の化合物Ｈを白色の固形物として得て、これをさらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１５０】
−グアニジン置換イミダゾール環の構築
【化３１】
2021532190.tif 000033
Ｈ                                          Ｉ
５２ｍｌのアセトン中の０．６４ｇの中間体Ｈの撹拌溶液に、２．３９グラムの２−イミノ−４−チオビウレット（アミジノチオ尿素，市販）を加えた。該溶液を５時間還流し、室温に冷まし、さらに１６時間撹拌した。該懸濁液を濾過し、固形物を捨て、アセトンを減圧下で留去した。
【０１５１】
該固形残渣を２０ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を真空下で留去して、０．５９グラムの粗生成物を黄色の固形物として得て、これをフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（酢酸エチル／シクロヘキサンの８／２＋１％のＴＥＡ−９９％の酢酸エチル＋１％のＴＥＡを溶離液）により精製して、０．４０グラムの純粋な生成物Ｉ（６２％）を得た。
【０１５２】
−アセチル基の加水分解
【化３２】
2021532190.tif 000034
Ｉ                                            Ｌ
１．９ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨを、６ｍｌのＭｅＯＨ中の２００ｍｇの中間体Ｉの溶液に加えた。該混合物を室温で２４時間撹拌し、次に該溶媒を留去した。該残渣を５ｍｌの水で洗浄し、濾過して、１３１ｍｇ（７８％）の化合物Ｌ（ＣＶｉｅ１０５）を白色の固形物として得た。
1H-NMR (d6-DMSO, 600 MHz): 0.50 (s, 3H); 0.87 (s, 3H); 1.01-1.26 (m, 4H); 1.26-1.58 (m, 6H);1.58-1.62 (m, 2H); 1.62-1.98 (m, 6H); 1.98-2.06 (m, 1H); 3.20 (s, 1H); 3.30-3.38 (m, 1H); 3.90 (s, 1H); 6.19 (s, 1H).
【０１５３】
実施例６
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（Ｎ−（３−アミノプロピル）−イミダゾール−４−イル）アンドロスタン（ＣＶｉｅ１０６）
【化３３】
2021532190.tif 000035
実施例１を、遊離塩基５としての最終生成物まで繰り返す。
【０１５４】
−Ｎ−（アミノアルキル）誘導体の調製
【化３４】
2021532190.tif 000036
ａ）ニトリル誘導体
５０ｍｌのＤＭＳＯ中の１．４２グラムの生成物５の撹拌溶液に、５５ｍｇのＫ２ＣＯ３および１．３１ｍｌのアクリロニトリルを加え、該混合物を室温で２４時間撹拌した。１５０ｍｌの水を加え、該混合物を酢酸エチルで抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を減圧下で留去して、１．７１ｇ（９９％）の中間体７を得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。。
【０１５５】
ｂ）ニトリル基の還元
【化３５】
2021532190.tif 000037
２０ｍｌの無水ＴＨＦ中の２８６ｍｇの生成物７の撹拌溶液に、３４０ｍｇのＬｉＡｌＨ４を少しずつ加え、該混合物を８０℃で加熱し、１６時間還流し、次に冷却した溶液をＴＨＦおよび水で希釈し、４Ｎ ＮａＯＨの溶液を白色の固形物が形成されるまで加えた。該懸濁液を濾過し、該固形物を酢酸エチルで洗浄し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ３の９／１／０．１で溶出するフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）により精製して、２０４ｍｇ（６９％）の生成物８（Ｃｖｉｅ１０６）を白色の固形物として得た。
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 0.59 (s, 3H); 0.98 (s, 3H); 1.25-1.35 (m, 4H); 1.35-1.75 (m, 11H); 1.85-2.02 (m, 7H); 2.19-2.24 (m, 2H); 2.69-2.74 (m, 3H); 3.98 (t, 2H); 4.15 (s, 1H); 6.58 (s, 1H); 7.37 (s, 1H).
【０１５６】
実施例６
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（（５−（３−アミノプロピル）−イソオキサゾール−３−イル）−エチル）アンドロスタン（Ｃｖｉｅ１０８）
【化３６】
2021532190.tif 000038
−アルデヒドＩからα−不飽和エステルへ
【化３７】
2021532190.tif 000039
アルデヒドＩは、Gobbini et al. Synth Comm, 27(6), 1115-1122 (1997)に従って調製した。
【０１５７】
７３ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の２．４３ｇのＮａＨの懸濁液（鉱油中に５５％分散）に、８．５７ｍｌのトリメチルホスホノアセテートＩＩ（液体，市販）を窒素雰囲気下において０℃で滴下して加えた。
【０１５８】
該懸濁液を室温で３０分間放置し、０℃で冷却した。１４６ｍｌの乾燥ＴＨＦ中に溶解させた１０グラムの化合物Ｉを滴下して加え、該混合物を室温で２時間撹拌させた。
【０１５９】
１００ｍｌのＥｔＯＡｃを加え、該混合物を２００ｍｌのＮａＨ２ＰＯ４の溶液（水中で５％）に移し、そして１５０ｍｌのＥｔＯＡｃで３回抽出した。プールした有機相を減圧下で濃縮乾固させた。該固形残渣を１３０ｍｌの水中に懸濁させ、１６時間撹拌し続け、濾過し、ＡｃＯＥｔおよびジクロロメタン中に溶解させ、次にＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を減圧下で留去して、１１ｇ（９５％）の中間体ＩＩＩを得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１６０】
−エステルのアルコールへの還元
【化３８】
2021532190.tif 000040
Ｎ２雰囲気下において−７８℃で４５０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の１１グラムの化合物ＩＩＩの溶液に、３５ｍｌの無溶媒ＤＩＢＡＨを滴下して加え（内部温度は６５℃まで上昇した）、該混合物を１時間撹拌した。−７８℃に冷却し、５００ｍｌのクエン酸溶液（水中で１３％）を３０分間滴下して加え、室温で１時間撹拌し、５０グラムのＮａＣｌを加え、水相を１５０ｍｌのＥｔＯＡｃで３回洗浄した。プールした有機相を５％のＮａＨＣＯ３の溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで該溶媒を減圧下で留去して、１１．９ｇ（９８％）の中間体ＩＶを得て、さらに精製することなく次のステップで使用した。
【０１６１】
−アルコールのアルデヒドへの酸化
【化３９】
2021532190.tif 000041
１４０ｍｌのジオキサン中の１１．９グラムの化合物ＩＶの撹拌溶液に、７５グラムのＭｎＯ２を加え、該懸濁液を室温で４時間撹拌した。該混合物をセライトパッドで濾過し、それをさらに１５０ｍｌのＡｃＯＥｔで洗浄した。該溶媒を減圧下で留去し、該残渣を１５０ｍｌのジエチルエーテルで結晶化させて、８．４グラムの化合物Ｖ（８３％）を得た。
【０１６２】
−二重結合の水素化
【化４０】
2021532190.tif 000042
６００ｍｌのＥｔＯＡｃ中の２．９５グラムの生成物Ｖの溶液に、５５ｍｇの触媒Ｐｄ／Ｃ（５％）を加え、該混合物を大気圧における水素下および室温で１時間維持した。該混合物をセライトパッドで濾過し、濾液を減圧下で濃縮乾固して、２．９５グラム（９９％）の生成物ＶＩを得た。
【０１６３】
−アルデヒドからオキシムへ
【化４１】
2021532190.tif 000043
９０ｍｌのジオキサン中の２．７ｇの化合物ＶＩの攪拌溶液に、６７０ｍｇのヒドロキシルアミン塩酸塩および２２．５ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨを加えた。該混合物を室温で９０分間撹拌し、該溶媒を減圧下で留去し、ＣＨＣｌ３で抽出した。有機相を減圧下で濃縮乾固して、３．１ｇ（９９％）の生成物ＶＩＩを得た。
【０１６４】
−アルキンの合成
【化４２】
2021532190.tif 000044
４０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の１ｍｌの４−プロピン−１−オールの撹拌溶液に、０℃で５．６３グラムのＰＰｈ３および３．１６グラムのフタルイミドを加えた。３．３５ｍｌの１，２−エトキシカルボニルジアゼン溶液（ＤＥＡＤ）を前記溶液に滴下して加え、該混合物を１６時間撹拌し、次いでＴＨＦを減圧下で留去し、該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ヘプタン／ジエチルエーテルの９／１を溶離液）により精製して、１．９２グラムの純粋な生成物ＶＩＩＩ（８４％）を得た。
【０１６５】
−アルキンとオキシムのカップリング
【化４３】
2021532190.tif 000045
０．５％のピリジンを含む８ｍｌのクロロホルム中の６００ｍｇの生成物ＶＩＩの懸濁液に、２２０ｍｇのＮ−クロロスクシンイミドを加え、該混合物をＮ２雰囲気下で１０分間撹拌した。
【０１６６】
０．２４ｍｌのＴＥＡを含む４ｍｌのクロロホルム中の２４０ｍｇのアルキンＶＩＩＩの溶液を滴下して加え、該混合物を室温で６時間撹拌し、ＣＨＣｌ３で希釈し、水で洗浄した。該溶媒を減圧下で留去して乾固させ、該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ヘプタン／アセトン／酢酸エチルの７／２／２を溶離液）により精製して、２６０ｍｇの純粋な生成物ＩＸ（３５％）を得た。
【０１６７】
−アミンの回復
【化４４】
2021532190.tif 000046
２２ｍｌのエタノール中の３５０ｍｇの化合物ＩＸおよび０．７０ｍｌのヒドラジン塩酸塩の混合物を１時間還流した。該混合物を水で希釈し、エタノールを減圧下で留去し、残りの水性部分をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を減圧下で留去して乾固させ、該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ３の９／１／０．１を溶離液）により精製して、１２５ｍｇ（４４％）の純粋な生成物Ｘ（ＣＶｉｅ１０８）を得た。
【０１６８】
実施例７
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（ピラゾール−３−イル）アンドロスタン（Ｃｖｉｅ１０３）
【化４５】
2021532190.tif 000047
実施例６は、中間体Ｖまでを繰り返す。
【０１６９】
−ピラゾール環の構築
【化４６】
2021532190.tif 000048
６ｍｌの酢酸中の１グラムの生成物Ｖの攪拌溶液に、０．５８グラムのｐ−トルエンスルホニルヒドラジドを加えた。該混合物を室温で１時間撹拌し、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（水中で５％）で希釈した。該懸濁液を濾過し、該固形物を減圧下で乾燥させ、３０ｍｌのＤＭＦ中に溶解させ、４００ｍｇのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを加えた。該混合物を室温で１時間撹拌し、８０℃に１．５時間加熱し、次いで水に注ぎ入れ、続いてジエチルエーテルで３回抽出した。プールした有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を減圧下で留去した。該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ＣＨ２Ｃｌ２／アセトンの７／３を溶離液）で精製して、２９６ｍｇ（２９％）の純粋な生成物（Ｃｖｉｅ１０３）を得た。
【０１７０】
実施例８
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（（５−（３−アミノプロピル）−イソオキサゾール−３−イル））アンドロスタン（Ｃｖｉｅ１０７）
【化４７】
2021532190.tif 000049
−アルキンの調製
【化４８】
2021532190.tif 000050
ＶＩＩＩ
４０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の１ｌの４−プロピン−１−オールの攪拌溶液に、０℃で５．６３グラムのＰＰｈ３および３．１６グラムのフタルイミドを加えた。３．３５ｍｌの１，２−エトキシカルボニルジアゼン溶液（ＤＥＡＤ）を該溶液に滴下して加え、該混合物を１６時間撹拌し、続いてＴＨＦを減圧下で留去し、該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ヘプタン／ジエチルエーテルの９／１を溶離液）１．９２グラムの純粋な生成物ＶＩＩＩ（８４％）を得た。
【０１７１】
−アルデヒドからオキシムへ
【化４９】
2021532190.tif 000051
アルデヒドＩは、上記の実施例６に記載されるように調製した。２４ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ４．７）および２４ｍｌのジオキサンの攪拌溶液に、１．３グラムのヒドロキシルアミン塩酸塩を加え、１Ｎ ＨＣｌでｐＨを調整した（５．７５から４．８へ）。該溶液を１５ｍｌのジオキサンで希釈し、ジオキサンおよび水（それぞれ４０ｍｌおよび１６ｍｌ）中の５グラムのアルデヒドＩの溶液を滴下して加えた。３０分後、固形ＮａＨＣＯ３を、該溶液がｐＨ７に達するまで加え、該溶液をＥｔＯＡｃで抽出し、有機相を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を減圧下で留去して、５．４ｇ（９９％）の中間体ＸＶＩを得た。
【０１７２】
−アルキンとオキシムのカップリング
【化５０】
2021532190.tif 000052
０．５％のピリジンを含む１５ｍｌのクロロホルム中の４８０ｍｇのＮ−クロロスクシンイミドの撹拌溶液に、１．２グラムの固形生成物ＸＶＩを少しずつ加えた。０．５％のピリジンと０．５３ｍｌのＴＥＡを含む１２ｍｌのクロロホルム中の７８０ｍｇのアルキンＶＩＩＩの溶液を窒素雰囲気下で滴下して加え、４５℃で加熱した。該混合物を１８時間撹拌し、ＣＨＣｌ３で希釈し、次いで水で洗浄した。該溶媒を減圧下で留去して乾固させ、該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ＣＨＣｌ３／Ｅｔ２Ｏの８／２を溶離液）により精製して、９００ｍｇの純粋な生成物ＸＶＩＩ（４５％）を得た。
【０１７３】
−ヒドラジンによる脱保護
【化５１】
2021532190.tif 000053
６０ｍｌのエタノール中の３５０ｍｇの化合物ＸＶＩＩおよび１．９０ｍｌのヒドラジン塩酸塩の混合物を７時間還流した。該混合物を水で希釈し、エタノールを減圧下で留去し、残りの水性部分をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を減圧下で留去して乾固させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ３の９／１／０．１を溶離液）により精製して、４００ｇ（６０％）の純粋な生成物ＸＶＩＩＩ（ＣＶｉｅ１０７）を得た。
【０１７４】
実施例９
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（５−（２−アミノエチル）−イソオキサゾール−３−イル）−エチル）アンドロスタン（Ｃｖｉｅ１０９）
【化５２】
2021532190.tif 000054
実施例６は、中間体ＶＩＩまでを繰り返す。
【０１７５】
−アルキンの合成
【化５３】
2021532190.tif 000055
ＸＩ
３４ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の０．７０ｍｌの３−ブチン−１−オールの攪拌溶液に、０℃で４．８５グラムのＰＰｈ３および２．７２グラムのフタルイミドを加えた。２．８９ｍｌの１，２−エトキシカルボニルジアゼン溶液（ＤＥＡＤ）を該溶液に滴下して加え、該混合物を１８時間撹拌し、次いでＴＨＦを減圧下で留去し、該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ヘプタン／ジエチルエーテルの９／１を溶離液）により精製して、４００ｍｇの純粋な生成物ＸＩ（２１％）を得た。
【０１７６】
−アルキンとオキシムのカップリング
【化５４】
2021532190.tif 000056
０．５％のピリジンを含む１２ｍｌのクロロホルム中の９５０ｍｇの生成物ＶＩＩの懸濁液に、３４８ｍｇのＮ−クロロスクシンイミドを加え、該混合物をＮ２雰囲気下で１０分間撹拌した。０．３８ｍｌのＴＥＡを含む６ｍｌのクロロホルム中の６００ｍｇのアルキンＸＩの溶液を滴下して加え、該混合物を室温で６時間撹拌し、ＣＨＣｌ３で希釈し、水で洗浄した。該溶媒を減圧下で留去して乾固させ、該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（シクロヘキサン／アセトン／クロロホルムの７／２／２を溶離液）により精製して、３３０ｍｇの純粋な生成物ＸＩＩ（３５％）を得た。
【０１７７】
−ヒドラジンによる脱保護
【化５５】
2021532190.tif 000057
２７ｍｌのエタノール中の４８０ｍｇの化合物ＸＩＩと０．９０ｍｌのヒドラジン塩酸塩の混合物を１時間還流した。該混合物を水で希釈し、エタノールを減圧下で留去し、残りの水性部分をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を減圧下で留去して乾固させ、該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ３の９５／５／０．５を溶離液）により精製して、１３０ｍｇ（３６％）の純粋な生成物ＸＩＩＩ（ＣＶｉｅ１０９）を得た。
【０１７８】
−医薬的に許容される塩の調製
１ｍｌのＥｔＯＨ中の３６ｍｇの生成物ＸＩＩＩの攪拌溶液に、０．２ｍｌのＥｔＯＨ中の４．７ｍｇのフマル酸の溶液を加えた。結晶化を３ｍｌのジエチルエーテル中で行い、得られた固形物を濾過して２５ｍｇのフマル酸塩を得た。
【０１７９】
実施例１０
３β−ヒドロキシ−５β−１０β−メチル−１３β−メチル−１４β−ヒドロキシ−１７β−（５−（２−アミノメチル）−イソオキサゾール−３−イル）−エテニル）アンドロスタン（Ｃｖｉｅ１１０）
【化５６】
2021532190.tif 000058
−ホスホネートの調製
【化５７】
2021532190.tif 000059
Ｉステップ：４５ｍｌのＨＣｌ（水中で２％）中のホスホネート（アセタール）の溶液を１０分間還流し、次いで室温で冷ました。１７グラムのＮａＣｌを加え、該混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機相をＮａＨＣＯ３（水中で５％）およびブラインで洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、該溶媒を減圧下で留去して、１０．６グラムのアルデヒドを得た。
【０１８０】
ＩＩステップ：
【化５８】
2021532190.tif 000060
４５ｍｌの水中の５グラムのヒドロキシルアミン塩酸塩および５．８グラムのＮａ２ＣＯ３十水和物の溶液を０℃で撹拌し、３０ｍｌの水中の１０グラムのアルデヒドの溶液を滴下して加えた。該混合物を室温で２４時間撹拌し、次いでＮａＣｌで飽和させ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を１０ｍｌの水で洗浄し、該溶媒を減圧下で留去して、１０グラムのオキシムを得た。
【０１８１】
−アルキンの調製
【化５９】
2021532190.tif 000061
２５０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の４ｍｌの２−プロピン−１−オールの撹拌溶液に、３６．５グラムのＰＰｈ３および２０．５グラムのフタルイミドを、窒素雰囲気下で０℃にて加え、次いで２２ｍｌのＤＥＡＤを滴下して加え、該混合物を１６時間撹拌した。得られた固形物を濾過し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔの９５／５を溶離液）で精製し、さらにＭｅＯＨで結晶化して３．８グラム（３０％）のアルキンを得た。
【０１８２】
−オキシムとアルキンのカップリング
【化６０】
2021532190.tif 000062
１５ｍｌのＣＨＣｌ３中の１．２６グラムのＮ−クロロスクシンイミドの懸濁液に、６マイクロリットルのピリジンおよび１５ｍｌのＣＨＣｌ３中のオキシムの溶液を加え、５分後、前もって調製した２グラムの固形アルキンを少しずつ加えた。該混合物を５０℃に加熱し、５ｍｌのＣＨＣｌ３中の１．４ｍｌのＴＥＡを１時間以内に滴下して加えた。８時間撹拌し、該反応物を水でクエンチし、有機相を分離し、該溶媒を減圧下で留去し、粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ＣＨ２Ｃｌ２／ジエチルエーテルの１／１を溶離液）により精製して、１ｇ（２０％）の純粋な生成物ホスホネートを得た。
【０１８３】
−アルデヒドＩとホスホネートのカップリング
【化６１】
2021532190.tif 000063
１４ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の２９０ｍｇのＮａＨの懸濁液（鉱油中に５５％分散）に、３０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中の２．５グラムのホスホネートの溶液を、窒素雰囲気下において０℃で滴下して加えた。該懸濁液を室温で３０分間放置し、０℃に冷却した。実施例６と同様に調製した１．０グラムの化合物Ｉを少しずつ加え、該混合物を室温で６時間撹拌させた。該溶液をＮａＨ２ＰＯ４（水中で５％）で処理し、ＣＨＣｌ３で抽出した。有機相を減圧下で留去して乾固させ、２．６グラムの粗残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ヘプタン／ジエチルエーテル／アセトンの６／３／１を溶離液）により精製して、３７０ｍｇ（１０％）の純粋な生成物ＸＩＶを得た。
【０１８４】
−ヒドラジンによる脱保護
【化６２】
2021532190.tif 000064
２２ｍｌのエタノール中の３７０ｍｇの化合物ＸＩＶおよび０．７０ｍｌのヒドラジン塩酸塩の混合物を９０分間還流した。該混合物を水で希釈し、エタノールを減圧下で留去し、残りの水性部分をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相を減圧下で留去して乾固させ、該残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２）（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＮＨ３の９５／５／０．５を溶離液）により精製して、１５０ｍｇ（５４％）の純粋な生成物ＸＶ（Ｃｖｉｅ１１０）を得た。
【０１８５】
−医薬的に許容される塩の調製
６ｍｌのＥｔＯＨ中の１５３ｍｇの生成物ＸＶの攪拌溶液に、１．５ｍｌのＥｔＯＨ中の２１．５ｍｇのフマル酸の溶液を加えた。１０ｍｌのヘキサンを加え、次に該溶媒を留去して、ガラス状固形物を定量的収率で得た。
【０１８６】
生物学的活性
実施例１１
−手順
動物の世話
実験は、国立衛生研究所から発行された実験動物の管理と使用のガイド（ＮＩＨ出版物番号８５−２３、１９９６年改訂）および参加機関によって承認された動物管理のガイドラインに従った。
【０１８７】
細胞を含まない製剤の生化学的測定
イヌ腎臓のＮａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼの精製およびＮａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性アッセイ
腎臓Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼの精製は、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎの方法（Methods Enzymol. 1988;156:29-43）に従って行った。腎臓は、ペントバルビタール麻酔下で１〜３歳のオスのビーグル犬（WuXi AppTec, Suzhou Co., Ltd. 1318 Wuzhong Ave., Wuzhong District Suzhou, 215104 P.R. China）から切除した（イタリア保健省からの輸入許可０００９１７１−２０１５年９月４日−ＤＧＳＡＦ−ＣＯＤ＿ＵＯ−Ｐ）。腎臓をスライスし、外側の髄質を解剖し、プールし、２５０ｍＭ ショ糖、３０ｍＭ ヒスチジン、および５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を含むショ糖ヒスチジン溶液中に懸濁し（１ｇ／１０ｍｌ）、ホモジナイズした。ホモジナイズした物を６，０００ｇで１５分間遠心分離し、上澄み物をデカントし、４８，０００ｇで３０分間遠心分離した。沈殿物をショ糖ヒスチジン緩衝液中に懸濁させ、２５ｍＭ イミダゾールおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を含む勾配緩衝液に溶解させたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液とともに２０分間インキュベートした。該試料をショ糖の不連続勾配（１０、１５、および２９．４％）上に重層し、６０，０００ｇで１１５分間遠心分離した。該沈殿物を勾配緩衝液中に懸濁させた。
【０１８８】
Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性は、記載されるように（Ferrandi M. et al. Hypertension 1996;28(6):1018-25）、３２Ｐ−ＡＴＰの放出を測定することによって「インビトロ」でアッセイした。標準物質ウワバインまたは試験化合物の濃度を上げながら、０．３μｇの精製した犬腎臓酵素とともに最終容量１２０μｌの培地（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｔｒｉｓ、３ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７．５）を含む）中で３７℃にて１０分間インキュベートした。次に、１０ｍＭ ＫＣｌと２０ｎＣｉの３２Ｐ−ＡＴＰを含む１０μｌのインキュベーション溶液（３〜１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を加え、該反応を３７℃で１５分間継続し、２０ｖ／ｖ％の氷冷過塩素酸で酸性化することにより停止した。３２Ｐを、活性炭（Ｎｏｒｉｔ Ａ，Ｓｅｒｖａ）を用いた遠心分離により分離し、放射能を測定した。該阻害活性は、ウワバインまたは試験化合物の非存在下で実施した対照試料のパーセントとして表した。Ｎａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性の５０％阻害を引き起こす化合物の濃度（ＩＣ５０）は、複数パラメータの非線形回帰最適化プログラム（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（登録商標），Ｓｉｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して算出した。
【０１８９】
心臓小胞体（ＳＲ）ミクロソームにおけるＳＥＲＣＡ２ａ活性測定
左心室組織を、公表されているように（Nediani C. et al. J Biol Chem. 1996;271:19066-73）、解剖し、４倍量の１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのアプロチニンおよびロイペプチンでホモジナイズし、１２，０００ｇで１５分間遠心分離した。該上澄み物を濾過し、１００，０００ｇで３０分間遠心分離した。該沈殿物を０．６Ｍ ＫＣｌ、３０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ７で懸濁させ、さらに１００，０００ｇで３０分間遠心分離することにより、収縮タンパク質を抽出した。最終沈殿物を、０．３Ｍ ショ糖、３０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ７で再構成した。
【０１９０】
ＳＥＲＣＡ２ａ活性は、記載されているように（Micheletti R.et al., AmJCard 2007; 99:24A-32A）、試験化合物の非存在下および存在下で異なるＣａ２＋濃度（１００〜４０００ｎＭ）における３２Ｐ−ＡＴＰ加水分解として「インビトロ」で測定した。各化合物の濃度を上げながら（１〜１００ｎＭ）、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μＭ Ａ２３１８７、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を含む８０μｌの溶液中で、２μｇのミクロソームと４℃で５分間プレインキュベートした。次に、５０ｎＣｉの３２Ｐ−ＡＴＰ（３〜１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を含む２０μｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＡＴＰを加えた。ＡＴＰ加水分解を３７℃で１５分間継続し、１００μｌの２０ｖ／ｖ％ 氷冷過塩素酸で酸性にすることにより反応を停止させた。活性炭（Ｎｏｒｉｔ Ａ，ＳＥＲＶＡ）を用いた遠心分離により、３２Ｐを分離し、放射能を測定した。ＳＥＲＣＡ２ａ依存性活性は、１０μＭのシクロピアゾン酸によって阻害された総加水分解活性の一部として同定した（Seidler NW. et al. J Biol Chem. 1989;264:17816-23）。
【０１９１】
用量反応曲線は、シグモイドカーブフィッティングソフトウェアを使用して最適化し、最大速度（Ｖｍａｘ）活性とＫｄ Ｃａ２＋を算出した（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ３．６）。
【０１９２】
単離した心室心筋細胞における測定
化合物は、（ｉ）ＳＲ Ｃａ２＋取り込み機能、（ｉｉ）酵素溶液を用いた逆行性冠状動脈灌流によってモルモットの心室から新たに解離された筋細胞の活動電位（ＡＰ）における効果について特徴付けた（Rocchetti M et al. J Pharmacol Exper Therap 2005;313(1):207-215）。
【０１９３】
ＳＲ Ｃａ２＋取り込み機能（「負荷プロトコル」）
ＳＲ Ｃａ２＋取り込み速度における薬物の効果は、Ｎａ／Ｃａ交換体（ＮＣＸ）の寄与を排除し、低レベルのＳＲ Ｃａ２＋負荷から開始する取り込み速度を評価するために特別に考え出されたＳＲ「負荷プロトコル」で評価した。電圧クランプ条件下において、細胞内Ｃａ２＋濃度を落射蛍光（Ｆｌｕｏ４−ＡＭ）によって動的に測定した。時間依存的成分が主にＩＣａＬを反映する膜電流を同時に記録した。ＳＲ負荷プロトコルは、ＳＲを空にし（短いカフェインパルスによる）、次に筋細胞膜Ｃａ２＋チャネル（ＩＣａＬ）を介したＣａ２＋流入を活性化する電圧ステップによってＳＲを徐々に補充するように構成した。ＮＣＸを、細胞内および細胞外の溶液からのＮａ＋の脱落により妨害した。前記方法は、わずかな変更を加えているが、公開されている方法と同様である（Rocchetti M et al. J Pharmacol Exper Therap 2005;313(1):207-215）。
【０１９４】
ＳＲ Ｃａ２＋取り込みにおける薬物の効果は、複数のパラメータを考慮して分析した：１）負荷プロトコル中にＣａ２＋過渡（ＣａＴ）振幅が増加する速度（ＳＲ２＋が補充される速度を反映）、２）各パルス内の細胞質内Ｃａ２＋崩壊の時定数（τ減衰）（ＳＲ膜を通過する正味のＣａ２＋輸送速度（ＳＥＲＣＡ２ａによる）を反映（τ減衰の減少は、ＳＲ Ｃａ２＋の取り込みの上昇に対応する））。
【０１９５】
ＳＥＲＣＡ２ａ活性化の検出における「負荷プロトコル」の特異性は、Ｎａ＋／Ｋ＋ポンプを妨害する変力剤であるジゴキシンの効果を検出しなかったが、ＳＥＲＣＡ２ａ刺激効果を欠くという観察によって裏付けられている（Rocchetti M et al. J Pharmacol Exp Ther 2005;313:207-215; Alemanni M et al. JMCC 2011; 50:910-918）。
【０１９６】
活動電位測定
活動電位（ＡＰ）曲線は、膜イオンチャネルの統合された機能の最初の推定値を提供し、その変化は、化合物の望ましくない効果を生じる可能性がある補助的な作用を明らかにしうる。レポーターとしてのＡＰ曲線の感度を高めるために、ＡＰパラメータの速度依存性における効果も試験し、それによりマルチパラメトリックな（より厳密な）方法を供した。
【０１９７】
ＡＰは、３６．５℃の通常のタイロード液で記録した。下記のパラメータは、４つの刺激速度（０．５−１−２−４Ｈｚ）で測定した：拡張膜電位（Ｅｄｉａｓｔ）、最大脱分極速度（ｄＶ／ｄｔｍａｘ）、活動電位持続時間（ＡＰＤ再分極の９０％、５０％、２０％）、刺激速度の段階的変化後のＡＰＤ適応の時定数（τ）。再分極安定性の指標である定常状態ペーシングの短期ＡＰＤ変動（ＳＴＶ）は、ＡＰＤｎｆＡＰＤｎ１プロット（ポアンカレプロット）の同一線からの絶対直交偏差の合計として測定した（Altomare C et al, Circulation A&E 2015; 8:1265-1275）。
【０１９８】
ラットにおける薬物バイオアベイラビリティ実験
バイオアベイラビリティは、中国のＳｕｎｄｉａ ＭｅｄｉＴｅｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅによってラットで測定された。試験化合物ＣＶｉｅ１０１を１ｍｇ／ｋｇで静脈内注入し、１０ｍｇ／ｋｇで経口投与した。試験化合物の血漿中濃度を０時間から２４時間の間隔で測定し、ＬＣ−ＭＳ法で検出した。Ｆ（％）を算出した。
【０１９９】
マウスにおける薬物毒性実験
急性毒性がマウス（アルビノスイスＣＤ−１，体重３０ｇ）で確認された。マウスに経口投与するか、または静脈内注射し、５０％の死亡率を引き起こす用量を特定するために、試験物質の用量を増加して単回投与した。死亡の場合、投与後３０分以内に判断し、生存の場合、２４時間後に判断した。次いで、急性毒性（ＬＤ５０）を評価した。
【０２００】
モルモットにおける変力および致死用量測定のための血行動態実験
モルモット（４００〜４５０ｇ）をウレタン（１．５ｇ／ｋｇ ｉｐ）で麻酔した。マイクロチップ圧力トランスデューサーを、右頸動脈を通して左心室に導入し、心室圧（ＬＶＰ）を測定した。トランスデューサーをトランスデューサー増幅器に繋げた。記録をポリグラフに送り、分析した。薬物注入のために、ポリエチレンカニューレを頸静脈に挿入した。安定化期間の後、試験物質を０．１６ｍｌ／分の速度で９０分間注入した（Micheletti R et al. J Pharmacol Exp Ther 2002; 303:592-600）。
【０２０１】
下記のパラメータを得た：心拍数（ＨＲ）、左心室圧（ＬＶＰ）、血圧上昇（＋ｄＰ／ｄｔｍａｘ）および減衰（−ｄＰ／ｄｔｍａｘ）の最大速度、ＥＣＧ。変力作用については、ＥＤ８０（基礎ｄＰ／ｄｔｍａｘを８０％増加させる用量）を決定するために、ｄＰ／ｄｔｍａｘが８０％増加するまでの経過時間を特定した。最大有効量ＥＤｍａｘを決定するために、ｄＰ／ｄｔｍａｘが最大に増加するまでの時間も特定した。変弛緩効果は、−ｄＰ／ｄｔｍａｘの最大の減少を誘発する用量（ＥＤｍａｘ）によって特徴付けた。毒性の指標として、不整脈の発症までに投与された用量と死を誘発する用量（ＬＤ）を算出した。試験化合物の安全性比もまた、ＬＤとＥＤ８０の比率として算出した。
【０２０２】
ＣＶｉｅ１０１は、０．０１６ｍｇ／ｋｇ／分で９０分間投与した対照化合物ジゴキシンと比較して、０．２および０．４ｍｇ／ｋｇ／分で静脈内注入した。
【０２０３】
ストレプトゾトシン糖尿病ラットにおける血行動態実験（心エコー検査２Ｍ−ドップラー−組織ドップラー）
スプラーグドーリー雄ラット（１５０〜１７５ｇ）を、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で新たに調製したストレプトゾトシン（ＳＴＺ，５０ｍｇ／ｋｇ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液を尾静脈に１回注射することによって糖尿病にした。対照ラットにはクエン酸緩衝液を投与した。空腹時血糖値を１週間後に測定し、値が４００ｍｇ／ｄｌを超えるラットを糖尿病と見なした。
【０２０４】
ＳＴＺ注射の８９週間後、ラットをペントバルビタール麻酔下で経胸壁心エコー検査とドップラー評価に付した。米国心エコー図学会ガイドライン（Lang RM et al. Eur J Echocardiography 2006; 7:79-108）に従って、二次元誘導Ｍモード記録を用いて、左心室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）、左心室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）、後部（ＰＷ）および中隔（ＳＷ）拡張期の壁の厚さの短軸測定値を取得した。短縮率は、ＦＳ＝（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤとして算出した。相対的な壁の厚さは、ＰＷＴｄ＋ＩＶＳＴｄ／ＬＶＥＤＤとして算出した。
【０２０５】
僧帽弁流入は、パルスドップラーによって僧帽弁尖の先端における心尖部四腔断層像から測定し、早期および後期充填速度（Ｅ、Ａ）および早期充填速度の減速時間（ＤＴ）を取得した。減速勾配はＥ／ＤＴ比として算出した。僧帽弁減速指数はＤＴ／Ｅ比として算出した。
【０２０６】
組織ドップラー画像（ＴＤＩ）は、心尖部四腔断層像から評価して、中隔僧帽弁輪運動、すなわち、ピーク心筋収縮期（ｓ’）および拡張期初期および後期速度（ｅ’およびａ’）を記録した。
【０２０７】
化合物ＣＶｉｅ１０１を、ＳＴＺ注射ラットに２０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与し、１時間後に心エコー検査パラメータを測定した。２０ｍｇ／ｋｇ（ｏｓ）でのジゴキシンを、対照薬物として使用した。
【０２０８】
統計学的解析
全ての動物実験：データは、平均±ＳＤとして報告する。統計学的解析は、スチューデントｔ検定（対応のあるｔ検定）によって行った。
【０２０９】
単離した筋細胞実験：
データは、平均±ＳＥとして報告する。複数の平均値を含む曲線は、反復測定のために二元配置分散分析によって比較した。全体的な曲線の急勾配における薬物誘発性の変化は、「因子Ｘ群」相互作用の有意性に従って定義した。Ｃａ２＋減衰の単指数関数的適合が不十分なため、ＣａＴデータが報告されているいくつかの細胞では、τ減衰を推定しなかった。図１で示される試料サイズ（Ｎ）（ＣＶｉｅ１０１についてＮ≧１３、ＣＶｉｅ１０２についてＮ≧１１）は、全てのパラメータが利用可能であった細胞を示す。平均ＡＰＤにおけるＳＴＶ依存性は、線形回帰によって定量化した。
Ｐ＜０．０５は、全ての比較で統計学的に有意であると見なした。
【０２１０】
生物学的結果
−インビトロスクリーニング
犬の腎臓のＮａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性の阻害
試験化合物は、表１に示すように、μＭで表されるＩＣ５０値で精製されたＮａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼの酵素活性を阻害した。前記化合物を、対照薬物のジゴキシンおよびジゴキシゲニンと比較した（表１）。
表１．犬の腎臓のＮａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼの阻害
【表１】
2021532190.tif 000065
【０２１１】
正常な犬の心臓由来のＳＲミクロソームにおけるＳＥＲＣＡ２ａのＡＴＰアーゼ活性
化合物を、１〜１００ｎＭの濃度範囲でＳＥＲＣＡ２ａ活性について試験した。通常の犬における測定について、化合物の効果は、化合物の非存在下で行った対照試料のＳＥＲＣＡ２ａのＶｍａｘ活性の増加％として表す（表２）。データは、平均±ＳＤ、ｎ＝実験数、＊少なくともｐ＜０．０５である。
【０２１２】
ナノモル濃度において、試験化合物は、正常な犬の心臓調製物のＳＥＲＣＡ２ａのＶｍａｘ活性を刺激した（表２）。これらの結果により、試験化合物の変弛緩作用が示される。これらとは異なり、ジゴキシンは、ＳＥＲＣＡ２ａ活性を刺激できなかった（Rocchetti M et al. J Pharmacol Exp Ther 2005;313:207-215; Ferrandi M et al. Br J Pharmacol 2013;169:1849-61）。
表２．正常な犬の心臓由来ＳＲミクロソームにおけるＳＥＲＣＡ２ａＡＴＰアーゼ活性
【表２】
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【０２１３】
−無傷の心筋細胞における実験
モルモットから単離した心筋細胞における機能評価
ＳＲ Ｃａ２＋取り込み機能（「負荷プロトコル」）
ＣＶｉｅ１０１（１００ｎＭ）は、ＳＲ再負荷中にＣａ２＋過渡（ＣａＴ）速度を徐々に増加させ（図１Ａ）、ＣａＴ振幅が閾値に達すると（５番目のパルスで）、各パルス内の細胞質内Ｃａ２＋減衰の時定数を減少させた（τ減衰、図１Ｂ）。
【０２１４】
同様に、ＣＶｉｅ１０２（１００ｎＭ）は、このプロトコル中にＣａＴ増加率を徐々に増加させ（図１Ｃ）、各パルス内のτ減衰を減少させた（図１Ｄ）。
【０２１５】
これらの結果をまとめると、ＣＶｉｅ１０１およびＣＶｉｅ１０２は、ＳＲによるＣａ２＋の取り込みを大幅に増加させたことが示される。適用された実験条件下において、ＳＲのＣａ２＋取り込みは、ＳＥＲＣＡ２ａによって完全に裏付けられ、これらの結果により、前記２つの薬物によるＳＥＲＣＡ２ａ活性化に一致する。
【０２１６】
活動電位測定
活動電位（ＡＰ）曲線は、膜イオンチャネルの統合された機能の推定値を提供し、その変化は、化合物の望ましくない効果を生じる可能性がある補助的な作用を明らかにしうる。この目的のために、ＡＰパラメータにおける薬物の効果を評価した。ＳＥＲＣＡ２ａ（１００ｎＭ）に顕著な効果を生じる同一の濃度において、ＣＶｉｅ１０１は、拡張膜電位（Ｅｄｉａｓｔ，図２Ａ）、最大脱分極速度（ｄＶ／ｄｔｍａｘ，図２Ｂ）、定常状態における活動電位持続（ＡＰＤ再分極の９０％、５０％、２０％）およびその周期長依存性（図２Ｃ）に影響を与えなかった。周期長の段階的変化後のＡＰＤ適応の時定数（τ）は、薬剤によって短縮されなかった（図２Ｄ）。短期ＡＰＤ変動（ＳＴＶ）を、４つの異なる周波数（０．５−１−２−４Ｈｚ）（図３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）で別々に測定し、または一緒にプールして測定したが（図３Ｅ）、ＣＶｉｅ１０１によって影響を受けなかった。これらの結果により、ＣＶｉｅ１０１は、筋細胞の電気的活性に影響を与えなかったことが示される。
【０２１７】
Ｃｖｉｅ１０２は、ＣＶｉｅ１０１に構造的に関連する化合物であり、不活性であることが予想されたため、ＣＶｉｅ１０２はＡＰパラメータについて試験しなかった。
【０２１８】
以上より、ＡＰ分析のために用いたマルチパラメトリックな方法により、心臓の電気的活性についてＣＶｉｅ１０１の望ましくない薬物の効果が存在しないことが明確に示される。同一のことがＣＶｉｅ１０２にも当てはまる。よって、これら２つの分子は、ＳＥＲＣＡ２ａ調節（陽性変弛緩薬）選択的化合物である。
【０２１９】
−インビボ実験
ラットにおけるバイオアベイラビリティ
ＣＶｉｅ１０１のバイオアベイラビリティは、中国のＳｕｎｄｉａ ＭｅｄｉＴｅｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅによる１ｍｇ／ｋｇの静脈内注射（ｉ．ｖ．）および１０ｍｇ／ｋｇの経口投与（ｏｓ）後のラットで測定した。試験化合物ＣＶｉｅ１０１の血漿中濃度を、０時間から２４時間の間隔で測定し、ＬＣ−ＭＳ法で検出した（図４）。Ｆ値（％）を算出すると、６６．３％であった（表３）。
表３．ラットにおけるＣＶｉｅ１０１のバイオアベイラビリティのパラメータ
【表３】
2021532190.tif 000067
【０２２０】
マウスにおける急性毒性
試験化合物ＣＶｉｅ１０１の急性毒性は、マウス（アルビノスミスＣＤ−１，体重３０ｇ）で測定した。ＣＶｉｅ１０１は、５０％の死亡率を引き起こす用量を特定するために、用量を増加させながら経口投与または静脈内注射した。死亡の場合、投与後３０分以内に判断し、生存の場合、２４時間後に判断した。
【０２２１】
ＣＶｉｅ１０１の急性毒性の結果を表４に報告する。比較として、対照化合物ジゴキシンについての急性毒性もまた、文献データ(www.lookchem.com、ジゴキシン静脈内注射についての参考文献: Afifi AM, Ammar EM. Pharmacological Research Communications. Vol. 6, Pg. 417, 1974; ジゴキシン経口投与についての参考文献: Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie. Vol. 153, Pg. 436, 1965）に従って含まれる（表４）。
表４．マウスにおけるジゴキシンおよびＣＶｉｅ１０１の急性毒性（ＬＤ５０）
【表４】
2021532190.tif 000068
【０２２２】
モルモットにおける変力および致死用量
血行動態パラメータは、ジゴキシンを０．０１６ｍｇ／ｋｇ／分、ＣＶｉｅ１０１を０．２および０．５ｍｇ／ｋｇ／分、およびＣＶｉｅ１０２を０．３ｍｇ／ｋｇ／分のゆっくりした静脈内投与の９０分後にモルモットで測定した。表５はパラメータをまとめたものである。ＣＶｉｅ１０１は、、累積用量１．６および２．３４ｍｇ／ｋｇで８０％（ＥＤ８０）に達したｄＰ／ｄｔｍａｘの増加、ならびに３．７３および７．４９ｍｇ／ｋｇの用量（ＥＤｍａｘ）でそれぞれ基準値より１６３．６％および２７８．７％のピークとなった。ＣＶｉｅ１０２は、累積用量３．８ｍｇ／ｋｇでＥＤ８０であるｄＰ／ｄｔｍａｘの増加、ならびに８．６ｍｇ／ｋｇの用量（ＥＤｍａｘ）で基準値を超えた１３８．３％のピークとなった。ジゴキシンは、０．９６ｍｇ／ｋｇの累積用量（ＥＤｍａｘ）でえ１２８％の増加および０．６９ｍｇ／ｋｇのＥＤ８０を生じた。ＣＶｉｅ１０１およびＣＶｉｅ１０２の安全性プロファイルは、致死用量（ＬＤ）、死亡／治療動物数、およびＬＤ／ＥＤ８０比の点でジゴキシンよりも一貫して良好であり得た（表５）。
表５．モルモットにおけるジゴキシン、ＣＶｉｅ１０１およびＣＶｉｅ１０２の血行動態
【表５】
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【０２２３】
ストレプトゾトシン糖尿病ラットの血行動態（心エコー検査２Ｍ−ドップラー−組織ドップラー）
表６は、ＳＴＺ糖尿病ラットの血行動態パラメータにおける１時間の経口治療前後のベヒクル（生理食塩水）、ＣＶｉｅ１０１およびジゴキシン（両方２０ｍｇ／ｋｇ）で比較したものである。データは、平均±ＳＤであり、アスタリスクの付いた値は、少なくともｐ＜０．０５で統計学的に有意である。
【０２２４】
データは、ストレプトゾトシン糖尿病ラットなどの拡張機能障害を特徴とする動物モデルにおいて、ＣＶｉｅ１０１が、心拍数を全く変化させず、Ｅ／ｅ’比を大幅に低下し、ＳＶの増加を伴うｅ’の増加を伴い、拡張機能を改善することを示す（表６）。逆に、ジゴキシンは、反対の効果を誘発した；すなわち、Ｅ／ｅ’比を増加させ、心拍数を増加させ、そして一回拍出量に影響を与えなかった。ＳＴＺラットの心機能障害におけるＣＶｉｅ１０１とジゴキシンの異なる効果は、ＣＶｉｅ１０１のＳＥＲＣＡ２ａ刺激活性と一致しており、心臓の弛緩の抑制を修正することにより、収縮に利用できる血液量を増加させ、その結果、ＳＶはＣＶｉｅ１０１によって生成されるが、Ｄｉｇｏｘｉｎによっては生成されない。
表６．ＳＴＺ糖尿病ラットのジゴキシンおよびＣＶｉｅ１０１経口治療後の血行動態パラメータ
【表６】
2021532190.tif 000070
凡例：ＦＳ％：短縮率（収縮機能）；Ｅ ｍ／ｓ：僧帽弁流入の初期充填速度；Ａ ｍ／ｓ：僧帽弁流入の後期充填速度；Ｅ／Ａ：ＬＶ機能の指標；ＤＴ ｍｓ：Ｅ波の減速時間;ＤＴ／Ｅ ｓ２／ｍ：僧帽弁減速指数；Ｅ／ＤＴ ｍ／ｓ２：減速勾配；ｓ’ｃｍ／ｓ ＴＤＩ：収縮速度；ｅ’ｃｍ／ｓ ＴＤＩ：初期弛緩速度；ａ’ｃｍ／ｓ ＴＤＩ：後期弛緩速度；ｅ’／ａ’：拡張機能障害の有病率の指標；Ｅ／ｅ’：左心室充満圧の指標；ＣＯ ｍｌ／分：心拍出量；ＨＲ 拍動／分：心拍数；ＳＶ ｍｌ／拍動：１回拍出量。
【０２２５】
受容体結合アッセイ
受容体パネルへの放射性リガンドの結合は、公開された手順に従って、適切な対照標準物を用いて粗膜調製物においてＥｕｒｏｆｉｎｓによって行った（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ，ＣＶｉｅ１０１化合物コードＰＴ番号１２０７８５９，実験番号ＡＢ７６４１６，引用番号６８４０７−１，台湾のＣｖｉｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｒ．ＯＣ．），２０１７年３月５日付け）。ＣＶｉｅ１０１を１０μＭの濃度で試験した。顕著な反応（≧５０％）が認められたラットの部位２（カタログ番号２７９５１０）のナトリウムチャネルを除き、有意な結合は記録されなかった（表７）。
表７．ＣＶｉｅ１０１の受容体結合アッセイ
【表７】
2021532190.tif 000071
注：バッチは同一アッセイで同時に試験した化合物を表す；bov＝ウシ；ham＝ハムスター；hum＝人間
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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