(57)【要約】  本発明は、タンパク質の凝集に対する強力な阻害剤としての新規なペプチドを提供する。一般式１［ＸiＳＡＣＸ1］mＨＨＨＨ［Ｘ2Ｘ3ＣＧＧ］mを有する、タンパク質の凝集を阻害するためのペプチドを提供する。式中、ｍは０又は１であり、Ｘｉはアセチル基であり、Ｘ1は親水性極性無電荷アミド基含有アミノ酸であり、Ｘ2はＨｉｓ又はＬｅｕであり、Ｘ3はＨｉｓ又はＳｅｒである。本発明は具体的には、アミロイドが関係した疾患の治療において有用なペプチドをベースとした阻害剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１［ＸiＳＡＣＸ1］mＨＨＨＨ［Ｘ2Ｘ3ＣＧＧ］mを有し、式中、
ｍは０又は１であり、
Ｘｉはアセチル基であり、
Ｘ1は親水性極性無電荷アミド基含有アミノ酸であり、
Ｘ2はＨｉｓ又はＬｅｕであり、
Ｘ3はＨｉｓ又はＳｅｒである、
タンパク質凝集を阻害するためのペプチド。
【請求項２】
Ｃ末端のアミノ酸がアミド化されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
第３位及び第１１位のＣは、システイン又はシスチンから成る群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の式１のペプチドを調製する方法であって、
（ａ）４〜７μｇの範囲の、Ｃｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合したＨｉｓ6タグ付α−Ｓｙｎを用意するステップと、
（ｂ）約２ｘ１０11〜７ｘ１０11ｐｆｕの提示環状ペプチドをコードするファージライブラリを用意するステップと、
（ｃ）ステップｂで得られた１０11近くの力価のファージディスプレイされたペプチドライブラリを、ステップ（ａ）で得られたＣｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合したＨｉｓ6タグ付α−ｓｙｎと１時間までにわたってインキュベートするステップと、
（ｄ）ｐＨ１〜３のバッファを使用して、ステップｃで得られた溶液から結合したファージを溶出させ、溶出直後に前記ｐＨを中和するステップと、
（ｅ）ステップｄで得られたファージを増幅し、α−ｓｙｎと強く相互作用するペプチドを選択するステップと、
（ｆ）ステップｅ）で得られた強く相互作用するペプチドをＴｗｅｅｎ２０及びＮａＣｌで繰り返し洗浄するステップと、
（ｇ）ステップｆで得られたα−ｓｙｎに結合したファージを溶出させるステップと、
（ｈ）式Ｉを有する前記ペプチドを特定するステップ
とを含む、方法。
【請求項５】
阻害活性が、アミロイド形成タンパク質のβシート重合に対するものである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
アミロイドが関係した疾患を治療するための、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
アミロイド形成タンパク質が、好ましくはα−シヌクレインである、請求項５に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチドと、その医薬的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の凝集を阻害する能力を有する一般式Ｉの新規なペプチドに関する。より正確には、天然変性タンパク質の変換過程、例えば、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）からβ−シートリッチなフィブリル、を阻害し、それゆえにパーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、糖尿病及びα−シヌクレイン病等の様々な神経変性疾患の治療にとっての強力なリード分子として使用し得る新規なペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、ニューロンの機能が損なわれることに関わる疾患群である。多くの神経変性疾患が、β−シートリッチなアミロイドの蓄積を特徴とする。神経変性疾患とは別に、アミロイドは糖尿病にも関係している。これらの疾患に関与するタンパク質（ＡＤにおけるＡβ、ＰＤにおけるα−Ｓｙｎ、ＨＤにおけるハンチンチン、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１、プリオン病におけるＰｒＰ）は別個の一次配列を有し、無関係ではあるものの、これらは全て類似した構造遷移を経て、高いβシート含有量及びＳＤＳ不溶性といった、幾つかの保存された構造的及び生化学的特性を共通して有するアミロイドを形成する（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓ．Ｂ．（１９９８）．Ｐｒｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９５，１３３６３−１３３８３；Ｓｕｎｄｅ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｌａｋｅ，Ｃ．Ｃ．Ｆ．（１９９８）．Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｓｔａｔｅ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３１，１−３９）。現在、これらの疾患は不治且つ致死性である。アミロイドの形成が神経毒性を引き起こすメカニズムははっきりとはわかっていない。
【０００３】
本研究では、様々な天然変性タンパク質のフィブリル化に対する阻害剤を開発することに焦点をあてている。天然変性タンパク質α−ｓｙｎを、そのような阻害剤を特定するためのモデルタンパク質として使用した。α−ｓｙｎはアミロイドフィブリルを形成することが知られており、細胞中でのそのようなタンパク質内包物の蓄積は細胞毒性につながり、ＰＤだけでなく、α−シヌクレイン病と総称される多くの疾患にも関連している（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ，Ｍ．Ｇ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｖ．Ｍ．Ｙ．，Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｑ．，Ｊａｋｅｓ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｍ．（１９９７）．［ａｌｐｈａ］−Ｓｙｎｉｎ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，８３９−８４０；Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ，Ｍ．Ｇ．，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｊａｋｅｓ，Ｒ．，Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｍ．（１９９８）．α−Ｓｙｎｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９５，６４６９−６４７３）。疾病管理センター（ＣＤＣ）の報告によると、ＰＤは米国において１４番目に多い死因である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｉｔａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｐｏｒｔ，２０１４）。ＰＤはドーパミン作動性ニューロンの死により引き起こされ、ドーパミン作動性ニューロンは筋肉の活動の制御に関与している。ＰＤの重要な病理学的特徴は、レビー小体として知られるタンパク質の異常な凝集塊の蓄積である。
【０００４】
α−ｓｙｎは、ＰＤ患者のドーパミン作動性ニューロン内に蓄積されるレビー小体の主な構成要素である。α−ｓｙｎは、神経組織のシナプス前終末中に豊富に存在するＳｙｎファミリータンパク質の１つである。Ｓｙｎファミリーに属するタンパク質はＮ末端でのＫＴＫＥＧＶモチーフの５回又は６回の不完全な繰り返し、中央の疎水性非アミロイドベータ成分（ＮＡＣ）領域及び酸性カルボキシ末端テールの存在を特徴とする。未変性のα−ｓｙｎからフィブリルへの構造遷移中に形成されるプロトフィブリルが毒性を引き起こすと考えられているため（Ｂｕｃｃｉａｎｔｉｎｉ，Ｍ．，Ｇｉａｎｎｏｎｉ，Ｅ．，Ｃｈｉｔｉ，Ｆ．，Ｂａｒｏｎｉ，Ｆ．，Ｆｏｒｍｉｇｌｉ，Ｌ．，Ｚｕｒｄｏ，Ｊ．，Ｔａｄｄｅｉ，Ｎ．，Ｒａｍｐｏｎｉ，Ｇ．，Ｄｏｂｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｔｅｆａｎｉ，Ｍ．（２００２）．Ｉｎｈｅｒｅｎｔ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｉｍｐｌｉｅｓ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１６，５０７−５１１)、フィブリル化の過程をブロックする方策は、アミロイド系疾患に対する効果的な治療につながり得る。これまで、多くの研究グループがα−ｓｙｎの凝集に対する強力な阻害剤を見つけようと努力してきた（Ｗｕ，Ｃ．−Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｉ．−Ｊ．，Ｌｕ，Ｒ．−Ｍ．，ａｎｄ  Ｗｕ，Ｈ．−Ｃ．（２０１６）．Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３，８；Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ，Ｒ．，Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｌ．Ｊ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｐ．Ｅ．，Ｋｏｎｇ，Ｘ．，Ｈｕｌｔｉｎ，Ｐ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｚａｒｅｋ，Ｗ．Ａ．（１９９５）．Ａｒｒｅｓｔｉｎｇ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅｓ  ｏｒ  ｓｕｌｐｈａｔｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １，１４３−１４８；Ｗｏｏｄ，Ｓ．Ｊ．，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｌ．，Ｍａｌｅｅｆｆ，Ｂ．，Ｈｕｒｌｅ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ，Ｒ．（１９９６）．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａ  Ｆｉｂｒｉｌ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｋｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１，４０８６−４０９２；Ｐｅｒｎｉ，Ｍ．，Ｇａｌｖａｇｎｉｏｎ，Ｃ．，Ｍａｌｔｓｅｖ，Ａ．，Ｍｅｉｓｌ，Ｇ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ．Ｂ．Ｄ．，Ｃｈａｌｌａ，Ｐ．Ｋ．，Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｆｌａｇｍｅｉｅｒ，Ｐ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｉ．Ａ．，Ｃａｓｃｅｌｌａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  α−ｓｙｎａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｉｔｓ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｒｕａｎａ，Ｍ．，Ｎｅｕｎｅｒ，Ｊ．，Ｈｏｇｅｎ，Ｔ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｆ．，Ｋａｍｐ，Ｆ．，Ｓｃｅｒｒｉ，Ｃ．，Ｇｉｅｓｅ，Ａ．，ａｎｄ  Ｖａｓｓａｌｌｏ，Ｎ．（２０１２）．Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｒｅ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄａｍａｇｅ  ｂｙ  α−ｓｙｎａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １８１８，２５０２−２５１０；Ｆｕｌｏｐ，Ｌ．，Ｐｅｎｋｅ，Ｂ．，Ｚａｒａｎｄｉ，Ｍ．，Ｂｏｚｓｏ，Ｚ．，Ｖｉｒｏｋ，Ｄ．，Ｊａｎａｋｙ，Ｔ．，Ｖｅｒｄｉｅｒ，Ｙ．，Ｄａｔｋｉ，Ｚ．，Ｓｚｅｇｅｄｉ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｂｕｓａ−ｆｅｋｅｔｅ，Ｒ．（２０１５）．Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．（Ｇｏｏｇｌｅ  Ｐａｔｅｎｔｓ）；Ａｒｖｉｄｓｓｏｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．（２００９）．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ．（Ｇｏｏｇｌｅ  Ｐａｔｅｎｔｓ）；Ｂａｒｎｈａｍ，Ｋ．Ｊ．，Ｍｃｃａｒｔｈｙ，Ｔ．Ｄ．，Ｐａｌｌｉｃｈ，Ｓ．，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｂ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｒｎｙ，Ｒ．Ａ．（２００１）．Ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．（Ｇｏｏｇｌｅ  Ｐａｔｅｎｔｓ）；Ｃａｒｕｌｌａ，Ｎ．，Ｆｏｗｌｅｒ，Ｓ．，Ｇｉｒａｌｔ，Ｅ．，Ｓｔａｌｌｗｏｏｄ，Ｙ．，Ｔｅｉｘｉｄｏ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｚｕｒｄｏ，Ｊ．（２００８）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．（Ｇｏｏｇｌｅ  Ｐａｔｅｎｔｓ）；Ｅｌ−Ａｇｎａｆ，Ｏ．Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ａｌｌｓｏｐ，Ｄ．（２００４）．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  α−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．（Ｇｏｏｇｌｅ  Ｐａｔｅｎｔｓ）；Ｃｈｅｒｕｖａｒａ，Ｈ．，Ａｌｌｅｎ−Ｂａｕｍｅ，Ｖ．Ｌ．，Ｋａｄ，Ｎ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍａｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０１５）．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｔｏ  Ｄｅｒｉｖｅ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  α−ＳｙｎＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９０，７４２６−７４３５；Ｅｍａｄｉ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｙｕａｎ，Ｂ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｐ．，ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ，Ｃ．，Ｌｙｕｂｃｈｅｎｋｏ，Ｙ．，Ｍｅｓｓｅｒ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｉｅｒｋｓ，Ｍ．Ｒ．（２００４）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  α−Ｓｙｎｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，２８７１−２８７８；Ｓｉｎｇｈ，Ｐ．Ｋ．，Ｋｏｔｉａ，Ｖ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｄ．，Ｍｏｈｉｔｅ，Ｇ．Ｍ．，Ｋｕｍａｒ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍａｊｉ，Ｓ．Ｋ．（２０１３）．Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  α−ＳｙｎＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ４，３９３−４０７；Ｂｉｅｓｃｈｋｅ，Ｊ．，Ｒｕｓｓ，Ｊ．，Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｒ．Ｐ．，Ｅｈｒｎｈｏｅｆｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｗｏｂｓｔ，Ｈ．，Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｗａｎｋｅｒ，Ｅ．Ｅ．（２０１０）．ＥＧＣＧ  ｒｅｍｏｄｅｌｓ  ｍａｔｕｒｅ  α−ｓｙｎａｎｄ  ａｍｙｌｏｉｄ−β  ｆｉｂｒｉｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７，７７１０−７７１５）。これらの分子のいずれも成功していない。
【０００５】
ファージディスプレイ法は、望ましい表現型に対して多数のペプチドをスクリーニングするための強力な方法である。この方法では、ペプチド又はタンパク質をバクテリオファージコートタンパク質に融合させ、ビリオン表面に提示させる。ファージは、ファージゲノムに遺伝的にコードされたランダムなペプチドライブラリを提示する。ペプチドを提示したファージを更に目的のタンパク質に対してスクリーニングし、相互作用するファージを、製造業者のプロトコルに沿ったスクリーニング工程においてアフィニティ精製により分離する（ＮＥＢ社、＃Ｅ８１１０Ｓ）。アフィニティセレクション（バイオパニングと呼ばれる）を用いて、個々のターゲットに結合するペプチドを特定する。このペプチドの一次構造を、個々のクローンのＤＮＡシークエンシングにより確認する。
【０００６】
本発明において、α−ｓｙｎのフィブリル化に対する有望なペプチド阻害剤を特定するために、発明者らは、環状７ペプチドを有する市販のファージディスプレイライブラリを、α−ｓｙｎとの相互作用能力についてスクリーニングした。特定したペプチドを更に、α−ｓｙｎのフィブリル化の阻害能力について試験した。
【発明の概要】
【０００７】
発明の目的
発明の主な目的は、α−ｓｙｎ等の天然変性タンパク質のフィブリル化を阻害する潜在能力を有する新規なペプチドを提供することである。
【０００８】
発明の概要
したがって、本発明は、天然変性タンパク質のフィブリル化を阻害し、それゆえにパーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、糖尿病及びα−シヌクレイン病等のアミロイド系疾患の治療で強力なリード分子として使用し得る新規なペプチドに関する。
【０００９】
ある実施形態においては、一般式１：［ＸiＳＡＣＸ1］mＨＨＨＨ［Ｘ2Ｘ3ＣＧＧ］mを有する、タンパク質の凝集を阻害するためのペプチドを提供する。式中、ｍは０又は１であり、Ｘｉはアセチル基であり、Ｘ1は親水性極性無電荷アミド基含有アミノ酸であり、Ｘ2はＨｉｓ又はＬｅｕであり、Ｘ3はＨｉｓ又はＳｅｒである。別の実施形態において、ペプチドのＣ末端のアミノ酸はアミド化される。このペプチドは、アミロイドが関係した疾患を治療するためのものである。このペプチドの阻害活性は、アミロイド形成タンパク質のβシート重合に対するものである。このペプチドは、好ましくはα−ｓｙｎであるアミロイド形成タンパク質を含む。
【００１０】
一実施形態において、式Ｉのペプチドを調製する方法を提供する。本方法は、４〜７μｇの範囲のＣｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合したＨｉｓ6タグ付α−ｓｙｎを用意するステップと、２ｘ１０11〜７ｘ１０11ｐｆｕの提示環状ペプチドをそれぞれコードするファージライブラリを用意するステップと、ステップｂで得られた１０11近くの力価のファージライブラリをステップ（ａ）で得られたＣｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合したＨｉｓ6タグ付α−ｓｙｎと１時間までにわたってインキュベートすることを特徴とするステップと、ｐＨ１−３のバッファを使用してステップｃで得られた溶液から結合したファージを溶出させ、溶出直後にｐＨを中和するステップと、ステップｄで得られたファージを増幅し、α−ｓｙｎと強力に相互作用するペプチドを選択するステップと、ステップｅで得られた強力に相互作用するペプチドをＴｗｅｅｎ２０及びＮａＣｌで繰り返し洗浄するステップと、ステップｆで得られたα−ｓｙｎに結合したファージを溶出させるステップと、α−ｓｙｎに対して最も高い特異性を有する式Ｉのペプチドを特定するステップとを含む。
【００１１】
別の実施形態において、このペプチド及びその医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ファージディスプレイライブラリを用いた、α−ｓｙｎのフィブリル化に対する有望なペプチドのスクリーニングを描いたモデルを示す。Ｃ−７ペプチドをコードしているファージディスプレイライブラリを、Ｃｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合したＨｉｓ6タグ付α−ｓｙｎに通した。３回のバイオパニング後、プラークの形態の個々の相互作用ファージを増幅し、α−ｓｙｎフィブリル化の阻害についてスクリーニングした。強力な阻害剤についてシークエンシングを行い、インビトロでのフィブリル化により更に検証した。表１は、ファージの力価を示す。５μｇのＨｉｓ6タグ付α−ｓｙｎをＣｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合させ、表示した力価のファージライブラリを樹脂に１時間にわたって結合させ、製造業者のプロトコルに沿って溶出させた。３回のバイオパニング後、溶出したライブラリを増幅することなくロードした。個々のプラークを５番目及び６番目の溶出液からスクリーニングした。
【図２】Ｐｅｐ．３をコードするファージがインビトロでのα−ｓｙｎのフィブリル化を阻害することを示す。α−ｓｙｎに繰り返し結合するファージを製造業者のプロトコルに沿って更に増幅した（ＮＥＢ社、＃Ｅ８１１０Ｓ）。α−ｓｙｎフィブリル化を、スクリーニング済みの様々なファージの存在下及び不在下で行った。ファージは、様々な効率でもってα−ｓｙｎのフィブリル化を阻害した。Ｐｅｐ．３をコードしているファージは、α−ｓｙｎのフィブリル化をほぼ完全に阻害した。
【図３】精製されたＰｅｐ．３はα−ｓｙｎのフィブリル化を阻害することを示す。（Ａ）等モル濃度の直鎖及び環状（ｃｙｃＰｅｐ．３）形態のペプチドＰｅｐ．３の存在下及び不在下でのインビトロのα−ｓｙｎフィブリル化アッセイ。アッセイは、実施例４に記載の通りに行った。（Ｂ）Ｐｅｐ．３又はｃｙｃＰｅｐ．３の存在下及び不在下での３時間のα−ｓｙｎフィブリル化の後に回収したサンプルのＴＥＭ画像。
【図４】Ｐｅｐ．２ｄがα−ｓｙｎのフィブリル化を異なるトランケーションで阻害することを示す。α−ｓｙｎ（４００μＭ）を、Ｐｅｐ．２及びその誘導体と及びなしで上述したようにインキュベートし、標準的な時間の経過後にＴｈＴ蛍光を測定した。低い蛍光強度からわかるように、Ｐｅｐ．２ｄはα−ｓｙｎのフィブリル化を阻害する。
【図５】ＰＣ１２細胞でのＭＴＴアッセイは、Ｐｅｐ．２及びＣｙｃＰｅｐ．２の存在下でα−ｓｙｎに関わる毒性が低下することを示す。等モル比の記載のペプチドの存在下及び不在下で、１０μＭのα−ｓｙｎ及びペプチド単体を９６ウェルプレートで２４時間にわたってＰＣ１２細胞とインキュベートした。ペプチド単体は、ペプチドのＰＣ１２細胞に対する毒性を調べるためのコントロールとして採用した。ＭＴＴアッセイを実施例６に記載の通りに三重で行い、吸光度を５７０ｎｍで測定することで細胞の生存能をチェックした。Ｐｅｐ．２及びＣｙｃＰｅｐ．２の存在下での吸光度の上昇は、ＰＣ１２細胞中でのα−ｓｙｎが関わる毒性の低下を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
アミロイド系疾患の多くは、天然変性タンパク質が関与する傾向が高いことに起因する。アミロイド疾患に対する治療薬の設計における主要な難題の１つは、アミロイドフィブリルの形成を防止できる阻害剤を開発することであった。したがって、本研究の主な目的は、天然変性タンパク質のフィブリル化を阻害できる小さな生体分子、例えばペプチドの特定である。
【００１４】
製造業者のプロトコルに沿った計算でファージ力価が２ｘ１０11〜７ｘ１０11プラーク形成単位（ｐｆｕ）の、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社から市販されている環状７ペプチドをコードするファージディスプレイライブラリを使用して、ターゲットとしての精製α−ｓｙｎとの新規な相互作用配列をスクリーニングした。α−ｓｙｎを、製造業者のプロトコルに沿ってＢＣＡタンパク質推定キットで定量した（＃２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。ここで、４〜７μｇのＨｉｓ6タグ付α−ｓｙｎを金属コバルト親和性樹脂上に固定し、ファージライブラリをそれとインキュベートした。図１は、用いたプロトコルを簡単に説明したものである。５、６回のバイオパニング後に相互作用するペプチドを選択し、フィブリル化阻害アッセイについて更にスクリーニングした。
【００１５】
ＴｈＴアッセイを用いて、３７℃、連続振盪速度９００ｒｐｍでインキュベートすると、α−ｓｙｎはフィブリルを形成することを示す。ＴｈＴはβシートリッチなフィブリルに特異的に結合することが知られる蛍光色素であり、そのような結合によりその蛍光強度は更に上昇する。フィブリル化アッセイは、上で特定された相互作用ファージの存在下及び不在下でα−ｓｙｎを用いて行った。図２に示すように、異なるファージは、α−ｓｙｎのフィブリル化を異なるレベルで阻害した。ペプチドＰｅｐ．３をコードするファージは、α−ｓｙｎのフィブリル化の阻害において最も強力であると判明した。
【００１６】
ゲノムＤＮＡを有望なファージから単離し、対応する提示されたペプチドをコードする遺伝子をＤＮＡシークエンシングにより同定した。同定された配列を使用して対応するペプチドを合成した。直鎖及び環状の両方のバージョンのペプチドを合成した。インビトロでのフィブリル化アッセイを、直鎖及び環状ペプチドで準備した。システインは直鎖ペプチドのことであり、シスチンは環状のペプチドのことである。図３Ａから明白なように、α−ｓｙｎと等モル濃度のペプチドは、α−ｓｙｎのフィブリル化を阻害できた。ペプチドの存在下でのチオフラビンＴ蛍光の低下はペプチドのα−ｓｙｎフィブリル化阻害能力によるものであると更に確認するために、サンプルをＴＥＭを使用して撮像した。３７℃、等モル濃度のペプチドの存在下及び不在下でインキュベートしたα−ｓｙｎを含有するサンプルを５時間のフィブリル化反応の後に回収し、炭素をコーティングした２００メッシュのグリッド上に載せ、続いてホスホタングステート染色を用いて透過型電子顕微鏡で可視化した。図３Ｂは、ペプチドの共インキュベーションによりα−ｓｙｎフィブリルの形成が阻害されることを示す。ペプチド中、第３位及び１１位の「Ｃ」は、システイン及びシスチンから成る群からそれぞれ選択される。
【００１７】
Ｐｅｐ．２のトランケートされた幾つかの誘導体を、ペプチドのＮ末端及びＣ末端から残基を除去することで構築した。Ｐｅｐ．２の７つの変種を商業的に合成し（ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社、中国）、ＴｈＴアッセイによりその抗フィブリル化活性を調べた。ペプチド変種を、ＴｈＴと共に、等モル濃度のα−ｓｙｎとインキュベートした。図４からわかるように、設計した変種は様々な阻害活性を示す。Ｐｅｐ．２ｄは、Ｐｅｐ．２と同程度にα−ｓｙｎのフィブリル化を低下させることができた。Ｐｅｐ．２ｇは、約８０％のフィブリル化阻害を示した。
【００１８】
ＭＴＴ（（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド））細胞毒性実験を、ラット褐色細胞腫（ＰＣ１２）ニューロン様細胞を使用して行うことでα−ｓｙｎの毒性とこの研究で作り出されたＰｅｐ．２及びＣｙｃＰｅｐ．２の保護効果を評価した。ＭＴＴアッセイ（図５）を、ペプチドの存在下及び不在下でα−ｓｙｎフィブリル化最終産物とインキュベートしたＰＣ１２細胞で行った。見てわかるように、α−ｓｙｎの存在は、細胞の生存能の約５０％の低下につながる。しかしながら、同様の濃度のα−ｓｙｎの場合、Ｐｅｐ．２及びＣｙｃＰｅｐ．２の存在により、細胞の生存能はそれぞれ３０％及び＞９９％改善された。ペプチド単体の場合も、相対的にさらに高い濃度（２０ｍＭ）でもってその毒性について調べたが、図５からわかるように、ペプチドはＰＣ１２細胞に対して毒性ではない。
【００１９】
得られた配列に基づいて、発明者らはインビトロのフィブリル化スクリーニングを行い、式１：［ＸiＳＡＣＸ1］mＨＨＨＨ［Ｘ2Ｘ3ＣＧＧ］mを有するペプチドを強力な阻害剤に設計した。上記のペプチドは医薬組成物、例えばペプチド安定性及び透過促進性を備えたリポソームのような脂質製剤、固形脂質ナノ粒子に使用できる。
【実施例】
【００２０】
以下の実施例は実例として挙げたものであり、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【００２１】
実施例１
Ｈｉｓ6タグ付α−Ｓｙｎの発現及び精製
Ｎ末端Ｈｉｓ6タグ付ヒト野生型α−ｓｙｎを、ｐＥＴ２９ａベースの発現ベクターを使用して大腸菌Ｒｏｓｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（＃７０９５４、Ｎｏｖａｇｅｎ社）で発現させた。ＩＰＴＧ誘導バクテリア細胞ペレットを遠心分離により収集し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのピアス社のプロテアーゼ阻害剤カクテルに再懸濁させた。タンパク質の精製を、ｖａｎ  Ｒａａｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（ｖａｎ  Ｒａａｉｊ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｅｇｅｒｓ−Ｎｏｌｔｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，Ｖ．（２００６）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｌｐｈａ−ｓｙｎｍｕｔａｎｔｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ９１，Ｌ９６−９８）に記載されるプロトコルに少し変更を加えて行った。簡単に説明すると、細胞溶解を超音波処理により行い、ライセートを９５℃で３０分間にわたって煮沸し、続いて１００００ｘｇで３０分間にわたって４℃で遠心分離した。硫酸ストレプトマイシン及び氷酢酸で沈澱させたＤＮＡを１３５００ｘｇ、３０分間、４℃での遠心分離により除去した。上清を氷上の５０％硫酸アンモニウムでインキュベートすることでα−シヌクレインを選択的に沈澱させた。ペレットを１３５００ｘｇ、３０分間、４℃での遠心分離により分離し、更に等体積の１００ｍＭの酢酸アンモニウムで、続いて等体積のエタノールで洗浄した。ペレットを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解させ、十分な透析に供することで硫酸アンモニウムを除去した。タンパク質純度を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。タンパク質を、製造業者のプロトコルに沿ってＢＣＡタンパク質推定キットで定量した（＃２３２２７、Ｔｈｅｒｍｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。
【００２２】
実施例２
ファージディスプレイスクリーニング
それぞれ７残基の環状ペプチドをコードする力価１０11のファージライブラリ（＃Ｅ８１２０Ｓ、ＮＥＢ社）をＣｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合した５μｇのＨｉｓ6タグ付α−ｓｙｎと１時間にわたってインキュベートした。結合していないファージを洗浄バッファ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０）で除去した。結合したファージをｐＨ２．２のバッファを用いて溶出させ、溶出直後にｐＨを中和した。溶出したライブラリを大腸菌ＥＲ２７３８株を使用して増幅した（＃Ｅ８１１０Ｓ、ＮＥＢ社）。上記の工程を更に３回、溶出したファージで繰り返すことでα−ｓｙｎにとっての強力な相互作用物質のみを選択した。４回目に、洗浄を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で行い、特異性を上昇させるために、溶出したファージを直接、増幅なしでα−ｓｙｎに結合させた。この工程を溶出したファージで２回繰り返した。
【００２３】
実施例３
ペプチド合成
ペプチドを、インドのチャンディーガルにある微生物技術研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のペプチド合成施設で合成した。ペプチドを、他の文献（Ｇａｕｔａｍ，Ａ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｍ．，Ｖｉｒ，Ｐ．，Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｋ．，Ｋａｐｏｏｒ，Ｐ．，Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｎａｔｈ，Ｓ．Ｋ．，  ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ，Ｇ．Ｐ．Ｓ．（２０１５）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ８９，９３−１０６）に記載されているように、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国）のＰＳ−３ペプチド合成装置で、０．０１ミリモルスケールでのＦｍｏｃ（Ｎ−（９−フルロニル）−メトキシカルボニル）化学反応を用いた固相ペプチド合成法で合成した。
【００２４】
実施例４
インビトロのフィブリル化アッセイ
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）（４ｍＭ）を、９６マイクロウェルプレート内の、ファージ（１０11）又は等モル濃度の精製されたペプチドを伴う又は伴わない４００μＭの精製されたα−ｓｙｎに添加した。プレートを３７℃、振盪速度９００ｒｐｍ、リニアモードで、マルチモードプレートリーダでインキュベートした（ＴＥＣＡＮ社、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯ）。蛍光キネティクスを、４４２ｎｍの励起での発光波長４８２ｎｍで１５分毎に測定した。各実験を少なくとも３回繰り返した。
【００２５】
実施例５
ＴＥＭイメージング
オリゴマー種の形態を、ＪＥＭ−２１００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）（Ｊｅｏｌ社）を使用して評価した。ＴＥＭ実験のために、サンプルを、炭素コーティングしたグリッドに吸着させ、１％のホスホタングステートで３０秒間にわたってネガティブ染色した。
【００２６】
実施例６
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴ実験をラット褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞を使用して行い、α−ｓｙｎの細胞毒性効果を評価した。ＰＣ１２細胞の酸化還元活性の阻害は特異的であり、細胞死の早期指標である。ＭＴＴアッセイにおいては、水溶性のＭＴＴ色素（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（＃Ｍ２００３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をホルマザンに変換し、この変換を５７０ｎｍでの吸光度測定でモニタした。ＭＴＴ色素のホルマザンへの変換は細胞の酸化還元状態に依存するため、吸光度の変化はアッセイにおいて、細胞の生存能の指標として使用できる。
【００２７】
ＰＣ１２細胞を、１０％のウマ血清、５％のウシ胎仔血清並びに抗生物質であるペニシリン及びストレプトマイシンを補充した増殖培地ＲＰＭＩ１６４０で維持した。一晩培養した細胞（５００００細胞／ウェル）を９６ウェルプレートでのＭＴＴアッセイに用いた。細胞を、ペプチド（４００μＭ）の存在下及び不在下で形成されたα−ｓｙｎ（４００μＭ）フィブリルを含む反応混合物（１．２μｌ）とインキュベートした。２４時間、３７℃、５％のＣＯ2雰囲気下でのインキュベーション後、１０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中）を添加し、更に４時間にわたってインキュベートした。細胞溶解のために、またホルマザン結晶の可溶化のために、１００μＬの可溶化バッファ（５０％のＤＭＦ中の２０％のＳＤＳ）を各ウェルに添加し、９０分間にわたって穏やかな振盪条件下でインキュベートした。吸光度を５７０ｎｍでマルチモードプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ社、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯ）を使用して測定した。各実験を三重で行った。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
発明の利点
１．特定したペプチドはα−ｓｙｎのフィブリル化を阻害するため、α−シヌクレイン病と総称される多数の神経変性疾患に対する強力な治療薬として作用する。
２．多様な配列から形成されるアミロイドには共通する類似の構造があるため、特定したペプチドは、他の病原性天然変性タンパク質からのアミロイドフィブリルの形成を阻害する可能性を有し、そのためパーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、糖尿病及びα−シヌクレイン病等の様々な疾患に対する強力な治療薬として作用し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月20日(2020.5.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１［ＸiＳＡＣＸ1］mＨＨＨＨ［Ｘ2Ｘ3ＣＧＧ］mを有し、式中、
ｍは１であり、
Ｘｉはアセチル基であり、
Ｘ1は親水性極性無電荷アミド基含有アミノ酸であり、
Ｘ2はＨｉｓ又はＬｅｕであり、
Ｘ3はＨｉｓ又はＳｅｒであり、かつ
第３位及び第１１位のＣは、システイン又はシスチンから成る群から選択される、
タンパク質凝集の阻害活性を有するペプチド。
【請求項２】
Ｃ末端のアミノ酸がアミド化されている、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の式１のペプチドを調製する方法であって、
（ａ）４〜７μｇの範囲の、Ｃｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合したＨｉｓ6タグ付α−Ｓｙｎを用意するステップと、
（ｂ）約２ｘ１０11〜７ｘ１０11ｐｆｕの提示環状ペプチドをコードするファージライブラリを用意するステップと、
（ｃ）ステップｂで得られた１０11近くの力価のファージディスプレイされたペプチドライブラリを、ステップ（ａ）で得られたＣｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合したＨｉｓ6タグ付α−ｓｙｎと１時間までにわたってインキュベートするステップと、
（ｄ）ｐＨ１〜３のバッファを使用して、ステップｃで得られた溶液から結合したファージを溶出させ、溶出直後に前記ｐＨを中和するステップと、
（ｅ）ステップｄで得られたファージを増幅し、α−ｓｙｎと強く相互作用するペプチドを選択するステップと、
（ｆ）ステップｅ）で得られた強く相互作用するペプチドをＴｗｅｅｎ２０及びＮａＣｌで繰り返し洗浄するステップと、
（ｇ）ステップｆで得られたα−ｓｙｎに結合したファージを溶出させるステップと、
（ｈ）式Ｉを有する前記ペプチドを特定するステップ
とを含む、方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、α−シヌクレインである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記阻害活性が、アミロイド形成タンパク質のβシート重合に対するものである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１、２、４及び５のいずれか一項に記載のペプチドと、その医薬的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項７】
アミロイドが関係した疾患を治療するための、請求項６に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
発明の利点
１．特定したペプチドはα−ｓｙｎのフィブリル化を阻害するため、α−シヌクレイン病と総称される多数の神経変性疾患に対する強力な治療薬として作用する。
２．多様な配列から形成されるアミロイドには共通する類似の構造があるため、特定したペプチドは、他の病原性天然変性タンパク質からのアミロイドフィブリルの形成を阻害する可能性を有し、そのためパーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、糖尿病及びα−シヌクレイン病等の様々な疾患に対する強力な治療薬として作用し得る。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕一般式１［ＸiＳＡＣＸ1］mＨＨＨＨ［Ｘ2Ｘ3ＣＧＧ］mを有し、式中、
ｍは０又は１であり、
Ｘｉはアセチル基であり、
Ｘ1は親水性極性無電荷アミド基含有アミノ酸であり、
Ｘ2はＨｉｓ又はＬｅｕであり、
Ｘ3はＨｉｓ又はＳｅｒである、
タンパク質凝集を阻害するためのペプチド。
〔２〕Ｃ末端のアミノ酸がアミド化されている、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔３〕第３位及び１１位のＣは、システイン又はシスチンから成る群から選択される、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔４〕前記〔１〕に記載の式Ｉのペプチドを調製する方法であって、
（ａ）４〜７μｇの範囲の、Ｃｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合したＨｉｓ6タグ付α−Ｓｙｎを用意するステップと、
（ｂ）約２ｘ１０11〜７ｘ１０11ｐｆｕの提示環状ペプチドをコードするファージライブラリを用意するステップと、
（ｃ）ステップｂで得られた１０11近くの力価のファージディスプレイされたペプチドライブラリを、ステップ（ａ）で得られたＣｏ++−ＮＴＡ樹脂に結合したＨｉｓ6タグ付α−ｓｙｎと１時間までにわたってインキュベートするステップと、
（ｄ）ｐＨ１〜３のバッファを使用して、ステップｃで得られた溶液から結合したファージを溶出させ、溶出直後に前記ｐＨを中和するステップと、
（ｅ）ステップｄで得られたファージを増幅し、α−ｓｙｎと強く相互作用するペプチドを選択するステップと、
（ｆ）ステップｅ）で得られた強く相互作用するペプチドをＴｗｅｅｎ２０及びＮａＣｌで繰り返し洗浄するステップと、
（ｇ）ステップｆで得られたα−ｓｙｎに結合したファージを溶出させるステップと、
（ｈ）式Ｉを有する前記ペプチドを特定するステップ
とを含む、方法。
〔５〕阻害活性が、アミロイド形成タンパク質のβシート重合に対するものである、前記〔１〕に記載のペプチド。
〔６〕アミロイドが関係した疾患を治療するための、前記〔５〕に記載のペプチド。
〔７〕アミロイド形成タンパク質が、好ましくはα−シヌクレインである、前記〔５〕に記載のペプチド。
〔８〕前記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載のペプチドと、その医薬的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
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