(57)【要約】  本発明は、細胞培養において産生される組換えタンパク質の集団の不均一性を減少させる方法に関し、前記方法は、細胞培養培地中で組換えタンパク質を産生する宿主細胞を成長させる工程を含み、細胞培養培地は１つ又は複数のシステイン／シスチン類似体を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養において産生される組換えタンパク質の集団の不均一性を減少させる方法であって、前記方法が、細胞培養培地中で組換えタンパク質を産生する宿主細胞を成長させる工程を含み、細胞培養培地が１つ又は複数のシステイン／シスチン類似体を含み、前記不均一性の減少が、産生プロセスの終了時に組換えタンパク質の力価を実質的に減少させることなく得られ、前記不均一性の減少が、
ａ．色若しくは色の強度；
ｂ．電荷不均一性であって、好ましくは酸性ピーク基種（ＡＰＧ）及び／又は塩基性ピーク基種（ＢＰＧ）を減少させることにより、それによって主要電荷種は低下しない電荷不均一性；並びに／或いは
ｃ．アミノ酸酸化、好ましくはメチオニン酸化
を減少させることを含む、上記方法。
【請求項２】
システイン／シスチン類似体が、式１及び式２によって表される化合物から選択される１つ又は複数の化合物並びにその塩を含み又はそれからなり：
【化１】
2021503938.tif 000012
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５が、水素、アミノカルボニル、Ｃ２〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキル；Ｃ１〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ１〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニルを独立して表し；
Ｒ３及びＲ６が、ヒドロキシ；ＮＨ２；Ｃ１〜２２アルコキシを独立して表し、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ若しくはＣ１〜２２アルキルによって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキルアミノ；ヒドロキシアミノ；Ｃ１〜２２アルコキシアミノ；Ｃ１〜２２アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ１〜２２ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノ；ジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ１〜２２ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられ；
Ｒ７が、水素、リン酸又は硫酸を表し；
Ｌが、任意選択で置換されたＣ１〜１０アルキレン鎖を表し、
ただし前記化合物が、システイン又はシスチンでない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
システイン／シスチン類似体が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン又はＳ−スルホシステインからなる群から選択される、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
システイン／シスチン類似体が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンからなる群から選択される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞培養培地が、
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を含み、（ａ）と（ｂ）のモル比が１：１８〜１８：１である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、前記基本培地が、初期量の
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）が、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に（ａ）と（ｂ）のモル比が１：１８〜１８：１である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記（ａ）と（ｂ）のモル比が、１：１５〜１５：１、例えば、１：１０〜１０：１など１：１２〜１２：１、例えば１：６〜６：１など１：８〜８：１、例えば１：３〜３：１など１：４〜４：１、例えば１．５：１〜１：１．５など１：２〜２：１である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞培養培地が、
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を含み、（ａ）のモル量が、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らして１０〜９０パーセントであり、システイン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量が、システイン当量に照らして算出され；
シスチン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量が、シスチン当量に照らして算出される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、前記基本培地が、初期量の
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地を
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
で補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）が、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に、（ａ）のモル量が、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らして１０〜９０パーセントであり、システイン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量が、システイン当量に照らして算出され；
シスチン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量が、シスチン当量に照らして算出される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基本培地中の（ｂ）の濃度が、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば０．２〜０．６ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい、請求項６から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
産生段階の間に培地が（ａ）システイン／シスチン類似体並びに（ｂ）システイン及び／又はシスチンを補充され、産生段階全体にわたって培養物に添加される（ａ）及び（ｂ）の合計が、２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい、請求項６から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記産生段階の間に培地が（ａ）システイン／シスチン類似体並びに（ｂ）システイン及び／又はシスチンを毎日補充され、毎日の添加により、（ａ）＋（ｂ）の前記濃度が、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい濃度になる、請求項６から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
組換えタンパク質が、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
抗体又はその抗原結合断片が、
ｉ）ａ．配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む；又は
ｂ．配列番号７で定義される配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号８で定義される配列を有する重鎖可変領域を含む；又は
ｃ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変領域及び配列番号８で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変領域を含む；又は
ｄ．配列番号７で定義される配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１１で定義される配列を有する重鎖を含む；又は
ｅ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変領域及び配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する重鎖を含む
抗体又はその抗原結合断片；或いは
ｉｉ）配列番号９で定義される配列を有する軽鎖及び配列番号１０で定義される配列を有する重鎖を含む抗体；或いは
ｉｉｉ）配列番号９で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖及び配列番号１０で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖を含む抗体
である、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
組換えタンパク質が、システイン／シスチン類似体を含まない細胞培養培地中で成長した宿主細胞によって産生される場合、５０ｍｇ／ｍＬ以上など、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で無色でないタンパク質である、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、前記基本培地が、初期量の
（ａ）請求項２から４までのいずれか一項に規定されるシステイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に前記細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）が、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に（ａ）と（ｂ）のモル比が１：１８〜１８：１である、組換えタンパク質調製物を産生する方法。
【請求項１８】
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、前記基本培地が、初期量の
（ａ）請求項２から４までのいずれか一項に規定されるシステイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或るいは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）が、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に、（ａ）のモル量が、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らして１０〜９０パーセントであり、システイン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量が、システイン当量に照らして算出され；
シスチン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量が、シスチン当量に照らして算出される、組換えタンパク質調製物を産生する方法。
【請求項１９】
請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法によって入手可能な又は入手される組換えタンパク質調製物。
【請求項２０】
Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステルを含む、哺乳動物細胞を培養するのに適した細胞培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質、特に抗体の製造の分野に属する。より具体的には、本発明は、商業規模の製造の間に異質性を減少させた組換えタンパク質を産生する細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用抗体など治療用タンパク質としての組換えタンパク質の開発は、産業的規模での組換えタンパク質の産生を必要とする。これを達成するには、異なる発現系、原核生物及び真核生物系が利用され得る。しかしながら、過去２０年にわたって、治療用として承認された治療用タンパク質の大多数は哺乳動物の細胞培養によって製造されており、そのような系が、ヒト使用のための組換えタンパク質を大量に産生するのに好ましい発現系のままである。
【０００３】
しかしながら、哺乳動物の細胞培養には、著しい課題が存在する。産生される組換えタンパク質の力価が、酵母及び昆虫細胞に基づく系など他の真核生物産生系と比較して一般に非常に低い。この３０年にわたって、細胞培養の基本的なパラメータを確立するために多くの試みが費やされてきており、研究に大きく重点を置いた組換えタンパク質発現は、細胞培養培地の組成物（例えばＨｅｃｋｌａｕ  Ｃ．、ら、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１８［２０１６年］５３〜６３頁；Ｚａｎｇ  Ｌｉ．ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ  ８３［２０１１年］５４２２〜５４３０頁を参照のこと）及び動作条件の変更により最適な細胞成長に到達させ、大きなバイオリアクターを開発することに費やされてきた。例えば、Ｌ−システインは、培地及びフィード中に一般に添加される必須アミノ酸の１つである。Ｓ−スルホシステイン及びＮ−アセチルシステインなどのシステイン誘導体を使用して、細胞培養における特異的生産性が改善されてきた（Ｈｅｃｋｌａｕら、上記；Ｏｈら［２００５年］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１：１１５４頁）。
【０００４】
収率は、依然として哺乳動物細胞培養の非常に重要な態様であるが、近年、焦点は、産物品質及び全ての開発ステージにおけるプロセスの一貫性並びに産生規模の制御へと移った。哺乳動物細胞培養によって産生される治療用タンパク質は、様々なレベルで不均一性を呈する。そのような不均一性には、異なる糖鎖形成パターン、脱アミド若しくは酸化に起因する差異、異なる電荷又はサイズバリアントがあるが、これに限定されない。組換えタンパク質の不均一性は、例えば同じ製造プロセスによって製造される同じタンパク質の異なるバッチ間に産物色の差異をもたらす場合がある。治療用タンパク質が高濃度で製剤化される場合、対象の組換えタンパク質のそのような不均一性、特に色の差異は、より明瞭になる。近年、治療用タンパク質を高濃度で製剤化する必要がある治療用タンパク質の皮下送達へ向けて着実な傾向が存在している。高濃度は、凝集体レベルの増大にも関連してきた（Ｐｕｒｄｉｅ  Ｊ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、２０１６年）。酸性種レベルの増大など電荷バリアントの増大は、タンパク質安定性に影響を及ぼす場合があり（Ｂａｎｋｓ  Ｄ．Ｄ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００９年）、濃縮された治療用タンパク質の色は、より強くなる場合がある。
【０００５】
培地の組成物などの細胞培養条件（Ｋｓｈｉｒｓａｇａｒ  Ｒ．らＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０９：１０、２５２３〜２５３２頁［２０１２年］；米国特許出願公開第２０１３／０２８１３５５号；ＷＯ２０１３／１５８２７５）並びにｐＨ及び温度を含めた成長条件（米国特許第８，７６５，４１３号）が、治療用タンパク質の品質特性に影響を与えることが示されている。にもかかわらず、治療用タンパク質、特に不均一性が極めて小さい治療用抗体を産生する細胞培養方法を更に改善する必要性が残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞培養において組換えタンパク質の産生に使用される培地にシステイン／シスチン類似体を添加する及び／又はシステイン／シスチン類似体によってシステイン／シスチンを部分的に置きかえることによって上で確認した必要性を解決する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、第１の態様において、本発明は、細胞培養において産生される組換えタンパク質の集団の不均一性を減少させる方法に関し、前記方法は、細胞培養培地中で組換えタンパク質を産生する宿主細胞を成長させる工程を含み、細胞培養培地は１つ又は複数のシステイン／シスチン類似体を含む。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、基本培地が、初期量の
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）は、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に（ａ）と（ｂ）のモル比が１：１８〜１８：１である、組換えタンパク質調製物を産生する方法に関する。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、基本培地が、初期量の
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）は、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に（ａ）と（ｂ）のモル比が１：１８〜１８：１である、組換えタンパク質調製物を産生する方法に関する。
【００１０】
更なる態様において、本発明は、本発明による方法によって入手可能な又は入手される組換えタンパク質調製物に関する。
【００１１】
なお更なる態様において、本発明は、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステルを含む、哺乳動物細胞を培養するのに適した細胞培養培地に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】生存細胞濃度を示す図である。
【図２】対照（システイン１００％フィード）と比較した１４日目におけるＭａｂ力価の相対的％変化を示す図である。
【図３】対照（システイン１００％フィード）と比較した１４日目における色強度（ｂ＊値）レベルの相対的％変化を示す図である。
【図４】対照（システイン１００％フィード）と比較した１４日目における酸性種レベルの相対的％変化を示す図である。
【図５】対照（システイン１００％フィード）と比較した１４日目における主要電荷種レベルの相対的％変化を示す図である。
【図６】生存細胞濃度を示す図である。
【図７】対照（システイン１００％フィード）と比較した１４日目におけるＭａｂ力価の相対的％変化を示す図である。
【図８】対照（システイン１００％フィード）と比較した１４日目における酸性種レベルの相対的％変化を示す図である。
【図９】対照（システイン１００％フィード）と比較した１４日目における主要電荷種レベルの相対的％変化を示す図である。
【図１０】２Ｌバイオリアクターにおける細胞系１の細胞成長プロファイル（生存細胞濃度）を示す図である。
【図１１】２Ｌバイオリアクターにおける細胞系１の対照と比較したＭａｂ力価の相対的％変化を示す図である。
【図１２】２Ｌバイオリアクターにおける細胞系１の対照と比較した酸性種レベルの相対的％変化を示す図である。
【図１３】２Ｌバイオリアクターにおける細胞系１の対照と比較した主要電荷種レベルの相対的％変化を示す図である。
【図１４】２Ｌバイオリアクターにおける細胞系１の対照に対する色強度（ｂ＊値）の相対的％変化を示す図である。
【図１５】２Ｌバイオリアクターにおける細胞系２の細胞成長プロファイル（生存細胞濃度）を示す図である。
【図１６】２Ｌバイオリアクターにおける細胞系２の対照と比較したＭａｂ力価の相対的％変化を示す図である。
【図１７】２Ｌバイオリアクターにおける細胞系２の対照と比較した酸性種レベルの相対的％変化を示す図である。
【図１８】２Ｌバイオリアクターにおける細胞系２の対照と比較した主要電荷種レベルの相対的％変化を示す図である。
【図１９】２Ｌバイオリアクターにおけるデータセット１及び２の平均細胞成長プロファイルを示す図である（エラーバー＝１ＳＤ）。
【図２０】対照に対するＭａｂ力価の相対的％変化を示す図である。データセット１及び２平均値（エラーバー＝１ＳＤ）。
【図２１】対照に対する酸性種レベルの相対的％変化を示す図である。データセット１及び２平均値（エラーバー＝１ＳＤ）。
【図２２】対照に対する主要電荷種レベルの相対的％変化を示す図である。データセット１及び２平均値（エラーバー＝１ＳＤ）。
【図２３】対照に対する色強度（ｂ＊値）の相対的％変化を示す図である。データセット１及び２平均値（エラーバー＝１ＳＤ）。
【図２４】１５ｍＬバイオリアクターにおける細胞系１の細胞成長プロファイルを示す図である。
【図２５】異なるシステイン／シスチンの類似体レベルに応答する対照に対する酸性種レベルの相対的％変化を示す図である。
【図２６】異なるシステイン／シスチンの類似体レベルに応答する対照に対する主要電荷種レベルの相対的％変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上述の通り、第１の態様において、本発明は、細胞培養において産生される組換えタンパク質の集団の不均一性を減少させる方法に関し、前記方法は、細胞培養培地中で組換えタンパク質を産生する宿主細胞を成長させる工程を含み、細胞培養培地は１つ又は複数のシステイン／シスチンの類似体を含む。
【００１４】
本発明の方法は、組換えタンパク質の呈色を特に減少させる。従って、独立した態様において、本発明は、細胞培養において産生される組換えタンパク質の集団の呈色を減少させる方法に関し、前記方法は、１つ又は複数のシステイン／シスチン類似体を含む細胞培養培地中で組換えタンパク質を産生する宿主細胞を成長させる工程を含む。
【００１５】
更なる独立した態様において、本発明は、
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、基本培地が、初期量の
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或るいは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或るいは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）は、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に（ａ）と（ｂ）のモル比が１：１８〜１８：１である、組換えタンパク質調製物を産生する方法に関する。
【００１６】
不均一性
本発明は、組換えタンパク質を製造するプロセスにおいて産生段階の間に細胞培養培地にシステイン／シスチン類似体を添加することにより、産生の終了時に組換えポリペプチドの力価を減少させることなく、産生される組換えポリペプチドの不均一性が減少されるという発見に基づく。
【００１７】
不均一性は、
ａ．色若しくは色の強度；
ｂ．電荷不均一性であって、好ましくは酸性ピーク基種（ＡＰＧ）及び／又は塩基性ピーク基種（ＢＰＧ）を減少させることにより、それによって主要電荷種は低下しない電荷不均一性；並びに／或いは
ｃ．アミノ酸酸化、好ましくはメチオニン酸化
について好ましくは減少される。
【００１８】
本明細書では用語「不均一性」とは、同じ製造プロセスによって又は同じ製造バッチ内で産生される分子の集団中にある個々の分子、例えば組換えタンパク質間の差異のことを指す。不均一性は、例えばポリペプチドの翻訳後修飾による、又は転写若しくは翻訳中の誤取り込みによる組換えポリペプチドの不完全な若しくは不均質な修飾に起因し得る。翻訳後修飾は、例えば脱アミノ反応及び／又は酸化反応及び／又は糖化反応など小分子の共有結合性付加及び／又は異性化反応及び／又は断片化反応及び／又は他の反応の結果であり得、糖化パターンの変形も含む。そのような不均一性の化学物理的徴候は、得られた組換えポリペプチド調製物において電荷バリアントプロファイル、色又は色強度及び分子量プロファイルを含むがこれに限らない様々な特徴をもたらす。
【００１９】
本明細書において使用される場合、用語「着色している」又は「色」は、濃縮したタンパク質調製物などの溶液が、無色でないことを示す。欧州薬局方の定義に従うと、溶液が、水Ｒ若しくは溶媒の外見を有する又は参照溶液Ｂ９より強く着色していない場合、溶液は無色である（欧州薬局方２．２．２）。本発明により使用され得る、細胞培養において組換えタンパク質の色又は色の強度の減少を測定する考え得る方法は、透過による分光光度計、例えばＵｌｔｒａｓｃａｎＰｒｏを使用してＣＩＥ標準光源Ａ色強度の相対的スペクトルパワー分布を測定し、データをＣＩＥ（国際照明委員会）基準と比較する、例えばｂ＊値を比較することによる。
【００２０】
電荷不均一性の減少は、細胞培養において産生される組換えタンパク質の集団内の酸性ピーク基（ＡＰＧ）種を測定することによって好ましくは定義される。ＡＰＧ減少を測定する考え得る方法は、システイン／システイン類似体を含む又は含まない細胞培養培地中で産生される組換えタンパク質の酸性（酸性ピーク基の場合ＡＰＧ）アイソフォームの相対的パーセンテージをイメージキャピラリー電気泳動（例えばＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ｉＣＥ３）を用いて決定することにより、その組換えタンパク質は、測定時には好ましくは精製されている。組換えタンパク質のアイソフォームを測定する場合、ＡＰＧに加えて、塩基性アイソフォーム（塩基性ピーク基［ＢＰＧ］）及び主要電荷種も測定され、主要電荷種は、得ようとする組換えタンパク質のアイソフォームを表す。ＡＰＧが減少する場合に、ＢＰＧの増大が実質的にないことが好ましい。好ましくは、ＡＰＧが減少する場合、主要電荷種レベルが増大する。
【００２１】
記述した通り、本発明は、組換えポリペプチドの収量を減少させることなく、産生される組換えポリペプチドの不均一性を減少させる、組換えタンパク質を製造することに関する。好ましくは、組換えポリペプチドの力価が、増大される。本発明によると、別に示されない限り、「力価」とは、産生段階の終了時の組換えポリペプチドの濃度である。
【００２２】
システイン／シスチン類似体
本明細書において使用される場合、用語「システイン類似体」又は「システイン誘導体」は、システイン自体を除く、システインの構造的類似体である１つ又は複数の化合物を意味する。
【００２３】
本明細書において使用される場合、用語「シスチン類似体」又は「シスチン誘導体」は、シスチン自体を除く、システインの構造的類似体である１つ又は複数の化合物を意味する。
【００２４】
用語「システイン／シスチン類似体」は、「システイン類似体」若しくは「シスチン類似体」又は「システイン類似体」と「シスチン類似体」の混合物を意味する。
【００２５】
用語「システイン／シスチン誘導体」は、「システイン誘導体」若しくは「シスチン誘導体」又は「システイン誘導体」と「シスチン誘導体」の混合物を意味する。
【００２６】
本発明による一実施形態において、システイン／シスチン類似体は、式１及び式２によって表される化合物から選択される１つ又は複数の化合物並びにその塩を含み又はそれからなり：
【化１】
2021503938.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５は、水素、アミノカルボニル、Ｃ２〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキル；Ｃ１〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ１〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニルを独立して表し；
Ｒ３及びＲ６は、ヒドロキシ；ＮＨ２；Ｃ１〜２２アルコキシを独立して表し、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ若しくはＣ１〜２２アルキルによって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキルアミノ；ヒドロキシアミノ；Ｃ１〜２２アルコキシアミノ；Ｃ１〜２２アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ１〜２２ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノ；ジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ１〜２２ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられ；
Ｒ７は、水素、リン酸又は硫酸を表す。
【００２７】
Ｌは、任意選択で置換されたＣ１〜１０アルキレン鎖を表し；
ただし化合物は、システイン又はシスチンでない。
【００２８】
本明細書では用語「Ｃ１〜２２アルキル」は、直鎖又は分岐状であり得、鎖内に炭素原子１〜２２個を含み得る脂肪族炭化水素基のことを指す。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るＣ１〜２２アルキル基には、Ｃ６〜２２アルキル基、Ｃ１２〜２２アルキル基、Ｃ１〜１６アルキル基、Ｃ１〜１０アルキル基及びＣ１〜６アルキル基がある。Ｃ１２〜２２アルキル基の例には、パルミチニル及びステアリルがある。
【００２９】
本明細書では用語「Ｃ５〜２２アリール」とは、単一の環又は複数の縮合環を有する炭素原子５〜２２個の不飽和芳香族炭素環基のことを指す。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るＣ５〜２２アリール基には、Ｃ５〜１４アリール基があり、最適にはＣ５〜１０アリール基がある。Ｃ５〜２２アリール基の例は、フェニル及びナフチルである。
【００３０】
本明細書では用語「Ｃ５〜２２ヘテロアリール」は、単一の環又は複数の縮合環を有する炭素原子５〜２２個の芳香族炭素環基を表し、前記炭素原子の１つ又は複数は、酸素、硫黄及び窒素から選択される１つ又は複数のヘテロ原子によって置きかえられている。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るＣ５〜２２ヘテロアリール基には、Ｃ５〜１４ヘテロアリールアリール基があり、最適にはＣ５〜１０ヘテロアリール基を含む。
【００３１】
本明細書では用語「Ｃ２〜２２アシル」とは、式−（Ｃ＝Ｏ）Ｒによって表される基のことを指し、Ｒは、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表す。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るＣ２〜２２アシル基には、Ｃ２〜６アシル基、Ｃ６〜２２アシル基及びＣ１２〜２２アシル基がある。そのようなＣ２〜６アシルの例は、メチルカルボニル、エチルカルボニル及びブチルカルボニルである。Ｃ１２〜２２アシル基の例には、パルミチニルカルボニル及びステアリルカルボニルがある。
【００３２】
本明細書では用語「Ｃ１〜２２アルコキシ」とは、式−Ｏ−Ｒによって表される基のことを指し、Ｒは、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表す。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るＣ１〜２２アルコキシ基には、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ６〜２２アルコキシ基及びＣ１２〜２２アルコキシ基がある。Ｃ１〜６アルコキシ基の例は、メトキシ及びエトキシである。Ｃ１２〜２２アルコキシ基の例には、パルミチニルオキシ及びステアリルオキシがある。
【００３３】
本明細書では用語「Ｃ１〜２２ヘテロアルキル」とは、上で定義したＣ１〜２２アルキルのことを指し、１つ又は複数の炭素原子は、１つ若しくは複数の酸素又は窒素原子によって置きかえられる。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るＣ１〜２２ヘテロアルキル基には、Ｃ１〜６ヘテロアルキル基、Ｃ６〜２２ヘテロアルキル基及びＣ１２〜２２ヘテロアルキル基がある。Ｃ１〜２２ヘテロアルキルの例には、エチレングリコールのオリゴマーがある。
【００３４】
本明細書では用語「ヒドロキシスルホニル」とは、式−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨによって表される基のことを指す。
【００３５】
本明細書では用語「Ｃ１〜２２アルキルスルホニル基」とは、式−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒによって表される基のことを指し、Ｒは、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表す。一般に、本発明に使用する化合物に存在し得るＣ１〜２２アルキルスルホニル基には、Ｃ１〜６アルキルスルホニル基及びＣ６〜２２アルキルスルホニル基、Ｃ１２〜２２アルキルスルホニル基がある。Ｃ１〜２２アルキルスルホニル基の例には、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基及びｔ−ブチルスルホニル基がある。
【００３６】
本明細書では用語「Ｃ５〜２２アリールスルホニル基」とは、式−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ’によって表される基のことを指し、Ｒ’は、上で定義したＣ５〜２２アリール基を表す。Ｃ５〜２２アリールスルホニル基の例には、フェニルスルホニル基及びトリルスルホニル基がある。
【００３７】
本明細書では用語「Ｃ１〜２２アルキルアミノ」とは、式−ＮＨ−Ｒによって表される基のことを指し、Ｒは、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表す。一般に、本発明に使用する化合物に存在し得るＣ１〜２２アルキルアミノ基には、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、Ｃ６〜２２アルキルアミノ基及びＣ１２〜２２アルキルアミノ基がある。Ｃ１〜２２アルキルアミノの例には、メチルアミノ、エチルアミノ及びブチルアミノがある。
【００３８】
本明細書では用語Ｃ１〜２２アルコキシアミノとは、式−ＮＨ−ＯＲによって表される基のことを指し、Ｒは、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表す。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るＣ１〜２２アルコキシアミノ基には、Ｃ１〜６アルコキシアミノ基、Ｃ６〜２２アルコキシアミノ基及びＣ１２〜２２アルコキシアミノ基がある。Ｃ１〜２２アルキルアミノの例には、メチルアミノ、エチルアミノ及びブチルアミノがある。
【００３９】
本明細書では用語「ジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノ」とは、式−ＮＲＲ’によることを指し、Ｒ及びＲ’は、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を独立して表す。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノ基には、ジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノ及びジ（Ｃ１２〜２２アルキル）アミノがある。ジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノの例には、ジメチルアミノ、（メチル）（エチル）アミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ及びブチルアミノがある。
【００４０】
本明細書では用語「Ｃ１〜２２ヘテロアルキルアミノ」とは、式−ＮＨ−Ｒによって表される基のことを指し、Ｒは、上で定義したＣ１〜２２ヘテロアルキル基を表す。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るＣ１〜２２ヘテロアルキルアミノ基には、Ｃ１〜６ヘテロアルキルアミノ、Ｃ６〜２２ヘテロアルキルアミノ及びＣ１２〜２２ヘテロアルキルアミノがある。
【００４１】
本明細書では用語「ジ（Ｃ１〜２２ヘテロアルキル）アミノ」とは、式−ＮＲＲ’によることを指し、Ｒ及びＲ’は、上で定義したＣ１〜２２ヘテロアルキル基を独立して表す。一般に、本発明において使用する化合物に存在し得るジ（Ｃ１〜２２ヘテロアルキル）アミノ基には、ジ（Ｃ１〜６ヘテロアルキル）アミノ、ジ（Ｃ６〜２２ヘテロアルキル）アミノ及びジ（Ｃ１２〜２２ヘテロアルキル）アミノがある。
【００４２】
用語「Ｃ１〜１０アルキレン鎖」とは、炭素原子１〜１０個を含有する二価の直鎖又は分枝状アルキレン鎖のことを指す。「Ｃ１〜１０アルキレン鎖」の典型的な例には、メチレン、エチレン、プロピレン及びブチレンがある。
【００４３】
本明細書では用語「アミノカルボニル」とは、式−ＣＯ−Ｎ（ＲａＲｂ）によって表される基のことを指し、−ＣＯの炭素は、システイン／シスチンの類似体の窒素に結合し、Ｒａ及びＲｂは、互いに独立して上で定義したＣ１〜２２アルキルを表す。
【００４４】
本発明による一実施形態において、システイン／シスチン類似体は、式１によって表されるシステインの類似体から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６  Ｒ７及びＬは、上で定義される。この実施形態の特定の態様において、Ｒ７は水素を表す。
【００４５】
本発明による別の実施形態において、システイン／システイン類似体は、式２によって表されるシスチンの類似体から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＬは、上で定義される。
【００４６】
一般に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５は、水素、Ｃ２〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキル；又はＣ１〜２２ヘテロアルキルを独立して表す。
【００４７】
一般に、Ｒ３及びＲ６は、ヒドロキシ；ＮＨ２；Ｃ１〜２２アルコキシを独立して表し、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシによって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキルアミノ；又はヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノによって任意選択で置きかえられてもよい。
【００４８】
一般に、Ｒ７は水素を表す。
【００４９】
一般に、Ｌは、任意選択で１つ又は複数のＣ１〜６アルキル、好ましくは２つのメチル基により置換されるＣ１〜４アルキレン鎖を表す。
【００５０】
最適には、Ｒ１は、水素又はＣ２〜２２アシルを表す。一般に、Ｒ１は、水素又はＣ２〜６アシルを表す。実例として、Ｒ１は、水素又はアセチルを表す。特定の実施形態において、Ｒ１は、水素を表す。
【００５１】
最適には、Ｒ２は、水素又はＣ２〜２２アシルを表す。一般に、Ｒ２は、水素又はＣ２〜６アシルを表す。実例として、Ｒ２は、水素又はアセチルを表す。
【００５２】
最適には、Ｒ３は、ヒドロキシ又はＣ１〜２２アルコキシを表す。一般に、Ｒ３は、ヒドロキシ又はＣ１〜６アルコキシを表す。実例として、Ｒ３は、ヒドロキシ又はメトキシを表す。
【００５３】
最適には、Ｒ４は、水素又はＣ２〜２２アシルを表す。一般に、Ｒ４は、水素又はＣ２〜６アシルを表す。実例として、Ｒ４は、水素又はアセチルを表す。特定の実施形態において、Ｒ４は、水素を表す。
【００５４】
最適には、Ｒ５は、水素又はＣ２〜２２アシルを表す。一般に、Ｒ５は、水素又はＣ２〜６アシルを表す。実例として、Ｒ５は、アセチルを表す。
【００５５】
最適には、Ｒ６は、ヒドロキシ又はＣ１〜２２アルコキシを表す。一般に、Ｒ６は、ヒドロキシ又はＣ１〜６アルコキシを表す。実例として、Ｒ６は、ヒドロキシ又はメトキシを表す。
【００５６】
最適には、Ｌは、メチレン又はエチレンを表す。実例として、Ｌは、メチレンを表す。
【００５７】
一実施形態において、システイン／シスチン類似体は、式１によって表される化合物から選択される１つ又は複数の化合物及びその塩を含み、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ７は、上で定義され、
ただし、
（ｉ）Ｒ１又はＲ２基のうちの１つが、Ｃ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニル基を表す場合に；
残りのＲ１又はＲ２基は、水素、アミノカルボニル、Ｃ２〜６アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜６アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキル；Ｃ１〜６ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル又はＣ５〜１０アリールスルホニル基を独立して表し；
Ｒ３は、ヒドロキシ；ＮＨ２；Ｃ１〜６アルコキシを表し、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ若しくはＣ１〜６アルキルによって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキルアミノ；ヒドロキシアミノ；Ｃ１〜６アルコキシアミノ；Ｃ１〜６アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜６アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ１〜６ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノ；ジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ１〜６アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ１〜６ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられ；
（ｉｉ）Ｒ３が、Ｃ６〜２２アルコキシを表し、Ｃ６〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ若しくはＣ１〜２２アルキルによって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキルアミノ；ヒドロキシアミノ；Ｃ６〜２２アルコキシアミノ；Ｃ６〜２２アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ６〜２２ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノ；ジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ６〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ６〜２２ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられる場合に；
Ｒ１及びＲ２は、水素、アミノカルボニル、Ｃ２〜６アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜６アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキル；Ｃ１〜６ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル、又はＣ５〜１０アリールスルホニルを独立して表す。
【００５８】
一実施形態において、システイン／シスチンの類似体は、式２によって表される化合物及びその塩を含み又はそれからなり、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、上で定義され、ただし、
（ｉ）Ｒ１及びＲ２基のうちの１つが、Ｃ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニル基を表す場合；及びＲ４及びＲ５基のうちの１つが、Ｃ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニル基を表す場合に、
残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ４又はＲ５基は、水素、アミノカルボニル、Ｃ２〜６アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜６アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキル；Ｃ１〜６ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル、又はＣ５〜１０アリールスルホニルを独立して表し；
Ｒ３及びＲ６は、ヒドロキシ；ＮＨ２；Ｃ１〜６アルコキシを独立して表し、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ若しくはＣ１〜６アルキルによって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキルアミノ；ヒドロキシアミノ；Ｃ１〜６アルコキシアミノ；Ｃ１〜６アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜６アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ１〜６ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノ；ジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ１〜６アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ１〜６ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられ；
（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５基のうちの１つが、Ｃ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニルを独立して表す場合に；
Ｒ３及びＲ６のうちの１つは、Ｃ６〜２２アルコキシを表してもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ又はＣ１〜２２アルキルによって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキルアミノ；Ｃ６〜２２アルコキシアミノ；Ｃ６〜２２アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ６〜２２ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノ；ジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ６〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ６〜２２ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられ；
（ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５基のうちのいずれもＣ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニル基を表さない場合に、
Ｒ３及びＲ６両方は、Ｃ６〜２２アルコキシを独立して表してもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ又はＣ１〜２２アルキルによって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキルアミノ；Ｃ６〜２２アルコキシアミノ；Ｃ６〜２２アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ６〜２２ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノ；ジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ６〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ６〜２２ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられる。
【００５９】
本発明は、式１及び２のシステイン／シスチン類似体の塩もその範囲に含む。
【００６０】
本発明による塩は、システイン／シスチン類似体に存在するヒドロキシ基の反応によって形成されてもよい。そのような塩には、アルカリ金属塩、例えばナトリウム、カリウム又はリチウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばマグネシウム又はカルシウム塩；アンモニウム塩、例えばテトラアルキル又はアリールアンモニウム塩；スルホニウム塩、例えばトリアルキル又はアリールスルホニウム；及びホスホニウム塩、例えばテトラアルキル又はアリールホスホニウム塩がある。
【００６１】
別法として、そのような塩は、システイン／システイン類似体に存在するアミノ基の反応によって形成されてもよい。そのような塩は、一般に無機酸又は有機酸とアミノ基の反応から生じ、モノ又はジＨＣｌ塩、Ｈ２ＳＯ４塩、Ｈ３ＰＯ４塩、アセタート及びフマラートを含む。
【００６２】
最適には、上で定義したシステイン／シスチン類似体は、Ｌ−システインと同じ掌性を有する。
【００６３】
本発明の特定の実施形態において、システイン／システイン類似体は、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンから選択される。
【００６４】
この実施形態の特定の態様において、システイン／シスチン類似体は、式２ａによって表されるＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステル（Ａｃ−Ｃｙｓ−ＯＭｅ）２からなる。
【化２】
2021503938.tif 000003
【００６５】
本発明によるシステイン／システイン類似体は、市販されていてもよく、又は当業者に公知の方法によって、Ｌ−システイン又はＬ−シスチンから合成されてもよい。
【００６６】
細胞培養
本発明の以下の説明から明らかであるように、本発明の方法の大部分の実施形態において、細胞培養培地は、システイン及び／又はシスチンを補充され、即ち、そのような補充は、
・システイン；又は
・シスチン；又は
・システイン及びシスチン
で実行され得る。
【００６７】
細胞培養培地中のシステイン及びシスチンは、一定の平衡にあり、２つのシステイン分子が、１つのシスチン分子へと酸化し、２つのシステイン分子へと還元する。
【００６８】
用語「細胞培養」又はその文法的変形は、それには限らないが、１つ若しくは複数の組換えポリペプチドを発現する（即ち産生する）ように最適に加工及び／又は操作され、特定の期間、例えば産生段階に細胞培養培地中で維持又は成長される複数の宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞を含む。
【００６９】
本発明による用語「産生段階」は、細胞が組換えポリペプチド（単数又は複数）を発現する（即ち、産生する）場合に組換えタンパク質を製造するプロセスの間の細胞培養のステージを含む。所望の産物の力価が増大したら産生段階が開始し、細胞又は細胞培養液若しくは上清の採取により終了する。一般に、産生段階の開始時に、細胞培養は、バイオリアクターなどの産生容器へ移される。採取とは、その間に細胞培養液が例えば産生容器から取り出されて、組換えタンパク質、例えば組換え抗体が、回収され、その後の工程において精製される工程である。
【００７０】
好ましい宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、最も好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞は、細胞の成長及び組換えポリペプチドの発現を支持することになる任意の培地中で培養されてもよく、好ましくは、培地は、動物血清及びペプトンなどの動物由来産物を含まない培地である。当業者に利用可能な異なる細胞培養培地が存在し、各培地は、細胞成長及びタンパク質産生を可能にするのに適当な濃度で存在するビタミン、アミノ酸、ホルモン、成長因子、イオン、緩衝液、ヌクレオシド、グルコース又は相当するエネルギー供給源を異なる組合せで含む。適切な培地については、例えばＷＯ９８／０８９３４及び米国特許出願公開第２００６／０１４８０７４号に記述されている（両方をその全体において本明細書に組み込む）。本発明に使用され得る又は修飾されてシステイン／システイン類似体及び／又はシステイン及び／又はシスチン要件を満たし得る更に適切な市販の培地には、ＡｍｐｌｉＣＨＯ  ＣＤ培地、Ｄｙｎａｍｉｓ（商標）培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＣＨＯフェドバッチシステム、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地、ＣＰ  ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）培地、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ培地、ＡｃｔｉＰｒｏ（商標）培地、ＤＭＥＭ−ダルベッコ変法イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地があるが、これに限定されない。
【００７１】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記細胞培養培地は、
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を含み、（ａ）と（ｂ）のモル比は１：１８〜１８：１である。
【００７２】
好ましくは、前記（ａ）と（ｂ）のモル比は、１：１５〜１５：１、例えば１：１０〜１０：１など１：１２〜１２：１、例えば１：６〜６：１など１：８〜８：１、例えば１：３〜３：１など１：４〜４：１、例えば１．５：１〜１：１．５など１：２〜２：１、例えば１：１のモル比である。
【００７３】
上の好ましい実施形態に関して、当業者は、（ａ）と（ｂ）の比が、二量体形態又は単量体形態を参照点として取るかどうかによって決まることを承知していることに留意されたい。細胞培養培地中のシステイン及びシスチンは一定の平衡にあるので、その比は、システイン当量に比例すると見なされ、ここで全てのシスチンは還元形態であると仮定される。以下の表は、システイン類似体又はシスチン類似体が考慮されるかどうかに応じて比がどのように異なるかを例として与える。
【表１】
2021503938.tif 000004
【００７４】
別の好ましい実施形態において、本方法は、
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、基本培地が、初期量の
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）は、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に（ａ）と（ｂ）のモル比が１：１８〜１８：１である。
【００７５】
好ましくは、上述の実施形態において、前記（ａ）と（ｂ）のモル比は、１：１５〜１５：１、例えば１：１０〜１０：１など１：１２〜１２：１、例えば１：６〜６：１など１：８〜８：１、例えば１：３〜３：１など１：４〜４：１、例えば１．５：１〜１：１．５など１：２〜２：１、例えば１：１のモル比である。
【００７６】
上の好ましい実施形態に関して、当業者は、（ａ）と（ｂ）の比が、二量体形態又は単量体形態を参照点として取るかどうかによって決まることを承知していることに留意されたい。細胞培養培地中のシステイン及びシスチンは一定の平衡にあるので、その比は、システイン当量に比例すると見なされ、ここで全てのシスチンは還元形態であると仮定される。
【００７７】
本発明の方法による好ましい実施形態において、前記細胞培養培地は、
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を含み、
（ａ）のモル量は、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らして１０〜９０パーセントであり、システイン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量は、システイン当量に照らして算出され；
シスチン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量は、シスチン当量に照らして算出される。
【００７８】
上の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らして（ａ）のモル量は、３０〜９０パーセント、例えば４０〜９０パーセント又は例えば５０〜９０パーセントなど、２０〜８０パーセントなど；３０〜８０パーセント、例えば４０〜８０パーセント又は例えば５０〜８０パーセントなど、２０〜７０パーセント、３０〜７０パーセント、例えば４０〜７０パーセント又は例えば５０〜７０パーセントなど、好ましくは２０〜９０パーセントである。
【００７９】
特に好ましくは、シスチンの類似体は、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステル若しくはＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンであり、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らしてモル量（ａ）が、２０〜７０パーセントなど２０〜９０パーセント、より好ましくは３０〜９０パーセント、例えば３０〜７０パーセントであり、又はシステイン類似体は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインであり、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らしてモル量（ａ）が、５０〜９０パーセント、好ましくは５０〜８０パーセント、より好ましくは５０〜７０パーセントである。
【００８０】
別の実施形態において、本方法は、
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、基本培地が、初期量の
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）は、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に、（ａ）のモル量は、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らして１０〜９０パーセントであり、システイン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量は、システイン当量に照らして算出され；
シスチン類似体が使用される場合、（ｂ）のモル量は、シスチン当量に照らして算出される。
【００８１】
上の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らして（ａ）のモル量は、好ましくは３０〜９０パーセント、例えば４０〜９０パーセント又は例えば５０〜９０パーセントなど、２０〜８０パーセントなど；３０〜８０パーセント、例えば４０〜８０パーセント又は例えば５０〜８０パーセント、２０〜７０パーセント、３０〜７０パーセント、例えば４０〜７０パーセント又は例えば５０〜７０パーセントなど、２０〜９０パーセントである。
【００８２】
特に好ましくは、シスチンの類似体は、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステル若しくはＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンであり、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らしてモル量（ａ）が、２０〜７０パーセントなど２０〜９０パーセント、より好ましくは３０〜９０パーセント、例えば３０〜７０パーセントであり、又はシステイン類似体は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインであり、（ａ）及び（ｂ）の全モル量に照らしてモル量（ａ）が、５０〜９０パーセント、好ましくは５０〜８０パーセント、より好ましくは５０〜７０パーセントである。
【００８３】
一実施形態において、前記基本培地中の（ｂ）の濃度は、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば０．２〜０．６ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい。
【００８４】
本明細書において「システインＸモルと等しい」は、シスチン又はシスチン類似体などの二量体形態が使用される場合、それらが使用又は添加される量を算出するためには２倍して計数されるべきであることを示す。例えば、シスチン１ｍｍｏｌ／Ｌは、システイン２ｍｍｏｌ／Ｌと等しい。
【００８５】
別の実施形態において、産生段階の間に培地は（ａ）システイン／シスチン類似体並びに（ｂ）システイン及び／又はシスチンを補充され、産生段階全体にわたって培養物に添加される（ａ）及び（ｂ）の合計は、１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌなど、２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば４〜１０ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい。
【００８６】
別の実施形態において、産生段階の間に培地は（ａ）システイン／シスチン類似体並びに（ｂ）システイン及び／又はシスチンを毎日補充され、毎日の添加により、（ａ）＋（ｂ）の濃度は、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい濃度になる。
【００８７】
産生段階は、好ましくはフェドバッチ様式で動作されるが、バッチ、灌流又はケモスタット様式など他の任意の様式が、選択肢として使用され得る。
【００８８】
細胞培養は、振とうフラスコ又はバイオリアクターなど任意の適当な容器中で行うことができ、そのバイオリアクターは、必要とされる産生の規模に応じてフェドバッチ様式で動作されてもよく、又はされなくてもよい。これらのバイオリアクターは、攪拌槽又は空気揚水リアクターのいずれかであり得る。好ましくは、好ましい産生段階は、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上又は２００００Ｌ以上の容積のバイオリアクター中で実施される。
【００８９】
好ましくは、組換えタンパク質は、産生段階の間に産生され、好ましくは、産生段階は、少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１４日間である。
【００９０】
好ましい実施形態において、培養は、産生段階中毎日補充される。
【００９１】
本発明の方法の一実施形態において、細胞培養培地は、
・産生される組換えタンパク質の予想される全量の１０重量％〜３０重量％の全量以下のシステイン又はシスチン；及び／又は
・産生される組換えタンパク質の予想される全量の８重量％〜３５重量％の全量以下のトリプトファン
を補充される。
【００９２】
添加されるシステイン若しくはシスチン及び／又はトリプトファンの全量は、産生される組換えポリペプチドの全量のパーセンテージとして本明細書において表現されてもよい。本明細書では用語「重量％」とは、重量のパーセンテージのことを指す。「全」とは、産生段階の終了時に決定される全量、即ち産生段階を通して添加されるシステイン若しくはシスチン及び／又はトリプトファンの全量並びに産生段階を通して産生される組換えタンパク質の全量のことを指し、産生される組換えタンパク質の全量は、産生段階の終了時に測定される。
【００９３】
添加されるシステイン若しくはシスチン又はトリプトファンの全量は、フィードが、添加されるフィードの容積当たりで添加される場合、フィード速度（又はフィード容積）並びにフィード内のシステイン若しくはシスチン又はトリプトファンの濃度及び培地中のシステイン若しくはシスチン又はトリプトファンの濃度の関数として算出される。産生される組換えポリペプチドの量は、細胞培養培地の最終容量及び最終的な組換えポリペプチド力価の関数として算出される。算出されるこれら２つのパラメータの比は、産生される組換えポリペプチドの量当たりの添加されるシステイン若しくはシスチン及び／又はトリプトファンの全量である。
【００９４】
宿主細胞は、システイン／シスチン類似体、システイン、シスチン及び／又はトリプトファンをすでに含んでも又は含まなくてもよい細胞培養培地中で最初に（工程ａ．において）成長されてもよい。細胞培養培地が、システイン／シスチン類似体、システイン、シスチン及び／又はトリプトファンの初期量をすでに含む場合、全量は、この初期量を含むことになる。
【００９５】
本発明のプロセスの一実施形態において、細胞培養培地は、産生される組換えポリペプチドの予想される全量の１２重量％〜２８重量％など、例えば１２重量％〜２５重量％、１２重量％〜２０重量％の全量など、産生される組換えポリペプチドの予想される全量の１２．０６重量％〜２８．０３重量％の全量以下のシステイン又はシスチンを補充される。
【００９６】
本発明のプロセスの別の実施形態において、細胞培養培地は、産生される組換えポリペプチドの予想される全量の８重量％〜３０重量％など、例えば８重量％〜２５重量％、８重量％〜２０重量％の全量など、産生される組換えポリペプチドの予想される全量の８．８４重量％〜３２．０６重量％の全量以下のトリプトファンを補充される。
【００９７】
本発明の方法の別の実施形態において、
・細胞培養におけるシステイン若しくはシスチン濃度は、産生段階の間のどの時点でも０．９ｇ／Ｌを超えず、好ましくは細胞培養におけるシステイン若しくはシスチン濃度は、産生段階の間のどの時点でも０．３ｇ／Ｌを超えず、及び／又は
・細胞培養におけるトリプトファン濃度は、産生段階の間のどの時点でも０．６ｇ／Ｌを超えず、好ましくは細胞培養におけるトリプトファン濃度は、産生段階の間のどの時点でも０．３ｇ／Ｌを超えない。
【００９８】
本発明の方法の更なる実施形態において、
・プロセスの間に提供されるシステイン若しくはシスチンの全量は、２．９〜７ｇ／（１０１２個細胞）など２．９〜１２ｇ／（１０１２個細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２個細胞）であり、細胞とは、産生段階の終了時において予想される全体の生存細胞数のことを指し、及び／又は
・プロセスの間に提供されるトリプトファンの全量は、２．５〜３．５ｇ／（１０１２個細胞／Ｌ）など２．５〜７ｇ／（１０１２個細胞）であり、細胞とは、産生段階の終了時において予想される全体の生存細胞数のことを指す。
【００９９】
当業者は、産生段階など特定の段階において細胞培養中に添加される並びに／或いは存在するシステイン若しくはシスチン及び／又はトリプトファンの量を測定する方法を承知しているはずであることを理解すべきである。同様に、当業者は、細胞培養によって産生される組換えポリペプチドの全量を測定し、結果として本発明の教示を適用して所望の技術的効果を達成する方法を承知しているはずである。
【０１００】
産生される組換えポリペプチド全量当たりのシステイン若しくはシスチン及び／又はトリプトファンの量が、特定の範囲に保たれるプロセスを設計するためには、１つ又は複数の初期実験を実行して、特定の培養条件下で特定の宿主細胞によって産生される組換えポリペプチドのおよそのレベルを決定することを必要とする場合がある。産生される組換えポリペプチドのおよその全レベルがわかったら、本発明によるプロセスが設計され得、産生される組換えポリペプチド全量当たりのシステイン若しくはシスチン及び／又はトリプトファンの量は指定の範囲に保たれる。
【０１０１】
様々な戦略を利用して、産生段階の間に細胞培養培地中のシステイン／シスチン類似体、システイン、シスチン及び／又はトリプトファンの全量に到達させてもよい。一実施形態において、全量は、産生段階のまさに開始時にシステイン／シスチン類似体、システイン、シスチン及び／又はトリプトファンを、例えば１回だけ添加することによって到達されてもよく、又は産生細胞培養培地にすでに含まれていてもよい。別の実施形態において、全量は、産生段階の間の添加、例えば毎日の添加又は連続的な添加の総量によって到達されてもよい。更に別の実施形態において、全量は、産生段階の初発時における細胞培養液中の初期システイン／シスチン類似体、システイン、シスチン及び／又はトリプトファン濃度の組合せ並びに添加の方法によって到達されてもよい。
【０１０２】
従って、本発明のプロセスの一実施形態において、細胞培養培地中のシステイン／シスチン類似体、システイン、シスチン及び／又はトリプトファンの全量は、細胞培養培地にシステイン／シスチン類似体、システイン、シスチン及び／又はトリプトファンを、
ａ．産生段階の開始時に、
ｂ．産生段階の間の任意の時点で１回又は複数回、
ｃ．産生段階の間の連続的な添加によって、又は
ｄ．ａ、ｂ、及びｃの任意の組合せで
添加することによって到達される。
【０１０３】
更なる独立した態様において、本発明は、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステルを含む、哺乳動物細胞を培養するのに適した細胞培養培地に関する。
【０１０４】
組換えポリペプチド
本発明のプロセスを使用して、例えば、ペプチド又は有意な三次構造を有するより大きなポリペプチド並びに例えば糖タンパク質及び多量体タンパク質を含めて、任意の型の組換えタンパク質若しくはポリペプチドを産生することができる。
【０１０５】
一部の実施形態において、産生される組換えタンパク質は、標準条件下で産生された場合に、高濃度で着色している調製物をもたらすことになるタンパク質である。そのような呈色は、本発明の方法を使用して減少させる又は回避することができる。従って本発明の方法の好ましい実施形態において、組換えタンパク質は、システイン／シスチン類似体を含まない細胞培養培地中で成長した宿主細胞によって産生される場合、５０ｍｇ／ｍＬ以上など、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で無色でないタンパク質であり、例えば、色は、本明細書の例に記載の通り決定される。患者に皮下投与される抗体などのタンパク質調製物は、例えば１００ｍｇ／ｍＬ以上又は１５０ｍｇ／ｍＬより更に高いいっそう高いタンパク質濃度をしばしば有する。そのような濃度において、望ましくない呈色が、たびたび問題になる。従って別の好ましい実施形態において、組換えタンパク質は、システイン／シスチン類似体を含まない細胞培養培地中で成長した宿主細胞によって産生される場合、１５０ｍｇ／ｍＬ以上など１００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で無色でないタンパク質である。
【０１０６】
好ましい実施形態において、本発明によるプロセスにおいて産生される組換えタンパク質は、抗体又はその抗原結合断片である。
【０１０７】
本明細書では用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」は、例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体の両方並びに単一特異的及び二重特異的など多重特異的抗体の両方を含む。「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」には、任意の種、特に一般に２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する哺乳動物種の抗体、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、及びＩｇＭを含めた任意のアイソタイプのヒト抗体並びにその修飾バリアント、ヒト以外の霊長類抗体、例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザル若しくはカニクイザル由来、齧歯目抗体、例えばマウス、ラット若しくはウサギ由来；ヤギ若しくはウマ抗体及びその誘導体、又はニワトリなどの鳥種抗体若しくはサメなどの魚種抗体を含む。用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」は、「キメラ」抗体のことも指し、その抗体において少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第１の部分は、第１の種由来であり、重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第２の部分は、第２の種由来である。本明細書において対象となるキメラ抗体は、ヒト以外の霊長類（例えばヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）から得られる可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。「ヒト化」抗体は、ヒト以外の抗体から得られる配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来残基が、所望の特異性、親和性及び活性を有するマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ又はヒト以外の霊長類などヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域若しくは相補性決定領域（ＣＤＲ）由来残基によって置きかえられているヒト抗体（レシピエント抗体）である。ほとんどの例において、ＣＤＲの外側；即ちフレームワーク領域（ＦＲ）にあるヒト（レシピエント）抗体の残基は、対応するヒト以外の残基によって更に置きかえられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体中に見いだされない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体成績を更に洗練するために行われる。ヒト化は、ヒトにおけるヒト以外の抗体の免疫原性を減少させ、従ってヒト疾患の処置への抗体の適用を容易にする。ヒト化抗体及びそれを生成するいくつかの異なる技術は、当業者に周知である。用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」は、ヒト抗体のことも指し、ヒト化に代わるものとして生成され得る。例えば、内在性マウス抗体の産生が無い場合に免疫化に応じてヒト抗体の全レパートリーを産生する能力があるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失が、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記述されている。そのような生殖細胞系変異体マウスに多数のヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を移入することにより、前記抗原でヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニック動物を免疫化すると、特定の抗原に特異性を持つヒト抗体の産生を得られることになる。そのようなトランスジェニック動物を産生する技術及びそのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離し、産生する技術は当業者に公知である。別法として、トランスジェニック動物；例えばマウスにおいて、マウス抗体の可変領域をコードしている免疫グロブリン遺伝子だけが、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列で置きかえられる。抗体定常領域をコードしているマウス生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子は、不変のままである。このように、トランスジェニックマウスの免疫系における抗体エフェクター機能、結果としてＢ細胞発達は、本質的に不変であり、そのことは、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原投与に対する抗体応答の改善を導き得る。対象となる特定の抗体をコードしている遺伝子を、そのようなトランスジェニック動物から一旦単離したら、定常領域をコードしている遺伝子をヒト定常領域遺伝子で置きかえて、完全ヒト抗体を得ることができる。本明細書では用語「抗体（単数）」又は「抗体（複数）」は、脱グリコシル化抗体のことも指す。
【０１０８】
本明細書では用語「その抗原結合断片」又はその文法的変形は、抗体断片のことを指す。抗体の断片は、当業者に公知であるように少なくとも１つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、１つ又は複数の抗原に結合する。本発明による抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ及びｓｃＦｖ断片；並びにダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｄＡｂ、ＶＨＨ若しくはラクダ科動物抗体（例えばＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ［商標］などラクダ又はラマ由来）などのドメイン抗体（ｄＡｂ）及びＶＮＡＲ断片、一本鎖抗体、Ｆａｂ−Ｆｖ若しくはＦａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ構築物を含むがこれに限定されない抗体断片若しくは抗体から形成される二重特異的、三重特異的、四重特異的又は多重特異的抗体がある。本明細書において使用される場合、抗体断片には、免疫グロブリンドメインに加えて非免疫グロブリン由来配列を例えば融合タンパク質の形態で含む分子もある。上で定義した抗体断片は、当業者に公知である。
【０１０９】
特に好ましい実施形態において、本発明による方法によって産生される抗体又はその抗原結合断片は、
１）ａ．配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む；又は
ｂ．配列番号７で定義される配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号８で定義される配列を有する重鎖可変領域を含む；又は
ｃ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変領域及び配列番号８で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変領域を含む；又は
ｄ．配列番号７で定義される配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１１で定義される配列を有する重鎖を含む；又は
ｅ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変領域及び配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する重鎖
を含む抗体又はその抗原結合断片；或いは
２）配列番号９で定義される配列を有する軽鎖及び配列番号１０で定義される配列を有する重鎖を含む抗体；或いは
３）配列番号９で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖及び配列番号１０で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖を含む抗体
である（表２）。
【０１１０】
本明細書において相補性決定領域（「ＣＤＲ」）は、Ｋａｂａｔ定義に従って定義される。Ｋａｂａｔ定義は、抗体内の残基を付番する標準であり、ＣＤＲ領域を同定するために一般に使用される（Ｋａｂａｔら、［１９９１年］、第５版、ＮＩＨ出版Ｎｏ．９１〜３２４２）。
【表２−１】
2021503938.tif 000005
【表２−２】
2021503938.tif 000006
【０１１１】
組換えタンパク質又は好ましい抗体若しくはその抗原結合断片は、ポリペプチド又は抗体ヌクレオチド配列をコードしているベクターを含有する宿主細胞によって一般に産生されてもよい。抗体又はその抗原結合断片は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドだけを含んでもよく、その場合、重鎖又は軽鎖ポリペプチドコード配列だけを使用して細胞をトランスフェクトする必要がある。重鎖及び軽鎖両方を含む産物を産生する場合、細胞は、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードしている第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードしている第２のベクターでトランスフェクトされてもよい。別法として、単一のベクターが使用されてもよく、そのベクターは、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードしている配列を含む。
【０１１２】
任意の更なる工程
本発明の方法は、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する工程を任意選択で更に含む。その後、組換えタンパク質は、例えばタンパク質が抗体である場合、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。本方法は、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度、例えば５０ｍｇ／ｍＬ以上など、１００ｍｇ／ｍＬ以上、例えば１５０ｍｇ／ｍＬ以上など、高いタンパク質濃度を持つ製剤へと精製した組換えタンパク質を製剤化する工程を更に任意選択で含む。更なる実施形態において、タンパク質は、凍結乾燥又は噴霧乾燥される。タンパク質は、乾燥形態で患者に投与されてもよく又は投与前に液体剤系に再構成されてもよい。
【０１１３】
本発明の方法によって入手される又は入手可能な産物
更なる態様において、本発明は、本発明による方法によって入手可能な又は入手されるバルク組換えタンパク質調製物などの組換えタンパク質調製物に関する。そのように入手した前記調製物中の組換えタンパク質、好ましくは抗体又はその抗原結合断片は、同じプロセスだが、培地がシステイン／シスチン類似体を含まないプロセスで入手した同じ組換えタンパク質と比較して不均一性の減少を呈する。好ましい実施形態において、調製物は無色である。
【０１１４】
発明の更なる態様及び実施形態：
１．  細胞培養において産生される組換えタンパク質の集団の不均一性を減少させる方法であって、前記方法が、細胞培養培地中で組換えタンパク質を産生する宿主細胞を成長させる工程を含み、細胞培養培地が１つ又は複数のシステイン／シスチン類似体を含み、不均一性の減少が、産生の終了時に組換えタンパク質の力価を実質的に減少させることなく得られる方法。
【０１１５】
２．  前記不均一性の減少が、
ａ．色若しくは色の強度；
ｂ．電荷不均一性であって、好ましくは酸性ピーク基種（ＡＰＧ）及び／又は塩基性ピーク基種（ＢＰＧ）を減少させることにより、それによって主要電荷種は実質的には低下しない電荷不均一性；並びに／或いは
ｃ．アミノ酸酸化、好ましくはメチオニン酸化
を減少させることを含む、実施形態１による方法。
【０１１６】
３．  本発明による一実施形態において、システイン／シスチン類似体は、式１及び式２によって表される化合物から選択される１つ又は複数の化合物並びにその塩を含み又はそれからなり：
【化３】
2021503938.tif 000007
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５は、水素、アミノカルボニル、Ｃ２〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキル；Ｃ１〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ１〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニルを独立して表し；
Ｒ３及びＲ６は、ヒドロキシ；ＮＨ２；Ｃ１〜２２アルコキシを独立して表し、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ若しくはＣ１〜２２アルキルによって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキルアミノ；ヒドロキシアミノ；Ｃ１〜２２アルコキシアミノ；Ｃ１〜２２アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ１〜２２ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノ；ジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ１〜２２ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられ；
Ｒ７は、水素、リン酸又は硫酸を表し；
Ｌは、任意選択で置換されるＣ１〜１０アルキレン鎖を表し、
ただし化合物は、システイン又はシスチンでない。
【０１１７】
４．  Ｃ１〜２２アルキルが、直鎖又は分岐状であり得、Ｃ６〜２２アルキル基、Ｃ１２〜２２アルキル基、Ｃ１〜１６アルキル基、Ｃ１〜１０アルキル基及びＣ１〜６アルキル基など鎖内に炭素原子１〜２２個を含み得る脂肪族炭化水素基のことを指す、実施形態３による方法。
【０１１８】
５．  Ｃ５〜２２アリールが、Ｃ５〜１４アリール基、Ｃ５〜１０アリール基など、単一の環又は複数の縮合環を有する炭素原子５〜２２個の不飽和芳香族炭素環基のことを指す、実施形態３又は４による方法。
【０１１９】
６．  「Ｃ５〜２２ヘテロアリール」が、単一の環又は複数の縮合環を有する炭素原子５〜２２個の芳香族炭素環基を表し、前記炭素原子の１つ又は複数が、酸素、硫黄及び窒素から選択される１つ又は複数のヘテロ原子によって置きかえられており、Ｃ５〜２２ヘテロアリールが、Ｃ５〜１４ヘテロアリールアリール基を含み、最適にはＣ５〜１０ヘテロアリール基を含む、実施形態３〜５のいずれかによる方法。
【０１２０】
７．  Ｃ２〜２２アシルが、式−（Ｃ＝Ｏ）Ｒによって表される基のことを指し、Ｒが、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表し、Ｃ２〜６アシル基、Ｃ６〜２２アシル基及びＣ１２〜２２アシル基を含む、実施形態３〜５のいずれかによる方法。
【０１２１】
８．  Ｃ１〜２２アルコキシが、式−Ｏ−Ｒによって表される基のことを指し、Ｒが、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表し、Ｃ１〜６アルコキシ基、Ｃ６〜２２アルコキシ基及びＣ１２〜２２アルコキシ基を含む、実施形態３〜７のいずれかによる方法。
【０１２２】
９．  Ｃ１〜２２ヘテロアルキルが、上で定義したＣ１〜２２アルキルのことを指し、１つ若しくは複数の炭素原子が１つ若しくは複数の酸素又は窒素原子によって置きかえられ、Ｃ１〜６ヘテロアルキル基、Ｃ６〜２２ヘテロアルキル基及びＣ１２〜２２ヘテロアルキル基を含む、実施形態３〜８のいずれかによる方法。
【０１２３】
１０．  ヒドロキシスルホニルが、式−Ｓ（＝Ｏ）２−ＯＨによって表される基のことを指す、実施形態３〜９のいずれかによる方法。
【０１２４】
１１．  Ｃ１〜２２アルキルスルホニルが、式−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒによって表される基のことを指し、Ｒが、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表し、Ｃ１〜６アルキルスルホニル基及びＣ６〜２２アルキルスルホニル基、Ｃ１２〜２２アルキルスルホニル基を含む、実施形態３〜１０のいずれかによる方法。
【０１２５】
１２．  本明細書ではＣ５〜２２アリールスルホニル基が、式−Ｓ（＝Ｏ）２−Ｒ’によって表される基のことを指し、Ｒ’が、上で定義したＣ５〜２２アリール基を表す、実施形態３〜１１のいずれかによる方法。
【０１２６】
１３．  Ｃ１〜２２アルキルアミノが、式−ＮＨ−Ｒによって表される基のことを指し、Ｒが、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表し、Ｃ１〜６アルキルアミノ基、Ｃ６〜２２アルキルアミノ基及びＣ１２〜２２アルキルアミノ基を含む、実施形態３〜１２のいずれかによる方法。
【０１２７】
１４．  Ｃ１〜２２アルコキシアミノが、式−ＮＨ−ＯＲによって表される基のことを指し、Ｒが、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を表し、Ｃ１〜６アルコキシアミノ基、Ｃ６〜２２アルコキシアミノ基及びＣ１２〜２２アルコキシアミノ基を含む、実施形態３〜１３のいずれかによる方法。
【０１２８】
１５．  ジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノが、式−ＮＲＲ’によることを指し、Ｒ及びＲ’が、上で定義したＣ１〜２２アルキル基を独立して表し、ジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノ及びジ（Ｃ１２〜２２アルキル）アミノを含む、実施形態３〜１４のいずれかによる方法。
【０１２９】
１６．  Ｃ１〜２２ヘテロアルキルアミノが、式−ＮＨ−Ｒによって表される基のことを指し、Ｒが、上で定義したＣ１〜２２ヘテロアルキル基を表し、Ｃ１〜６ヘテロアルキルアミノ、Ｃ６〜２２ヘテロアルキルアミノ及びＣ１２〜２２ヘテロアルキルアミノを含む、実施形態３〜１５のいずれかによる方法。
【０１３０】
１７．  ジ（Ｃ１〜２２ヘテロアルキル）アミノが、式−ＮＲＲ’によることを指し、Ｒ及びＲ’が、上で定義したＣ１〜２２ヘテロアルキル基を独立して表し、ジ（Ｃ１〜６ヘテロアルキル）アミノ、ジ（Ｃ６〜２２ヘテロアルキル）アミノ及びジ（Ｃ１２〜２２ヘテロアルキル）アミノを含む、実施形態３〜１６のいずれかによる方法。
【０１３１】
１８．  Ｃ１〜１０アルキレン鎖が、炭素原子１〜１０個を含有する二価の直鎖又は分枝状アルキレン鎖を指し、メチレン、エチレン、プロピレン及びブチレンを含む、実施形態３〜１７のいずれかによる方法。
【０１３２】
１９．  「アミノカルボニル」が、式−ＣＯ−Ｎ（ＲａＲｂ）によって表される基のことを指し、−ＣＯの炭素が、システイン／シスチンの類似体の窒素に結合し、Ｒａ及びＲｂが、互いに独立して上で定義したＣ１〜２２アルキルを表す、実施形態３〜１８のいずれかによる方法。
【０１３３】
２０．  システイン／シスチン類似体が、式１によって表されるシステインの類似体から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６  Ｒ７及びＬが、上で定義される、実施形態３〜１９のいずれかによる方法。
【０１３４】
２１．  Ｒ７が、水素を表す、実施形態３〜２０のいずれかによる方法。
【０１３５】
２２．  システイン／システイン類似体が、式２によって表されるシスチンの類似体から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＬが、上で定義される、実施形態３〜２１のいずれかによる方法。
【０１３６】
２３．  Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５が、水素、Ｃ２〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキル；又はＣ１〜２２ヘテロアルキルを独立して表す、実施形態３〜２２のいずれかによる方法。
【０１３７】
２４．  Ｒ３及びＲ６が、ヒドロキシ；ＮＨ２；Ｃ１〜２２アルコキシを独立して表し、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシによって任意選択で置換されるＣ１〜２２アルキルアミノ；又はヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ１〜２２アルキル）アミノによって任意選択で置きかえられてもよい、実施形態３〜２３のいずれかによる方法。
【０１３８】
２５．  Ｌが、任意選択で１つ又は複数のＣ１〜６アルキル、好ましくは２つのメチレン基により置換されるＣ１〜４アルキレン鎖を表す、実施形態３〜２４のいずれかによる方法。
【０１３９】
２６．  Ｒ１が、水素又はＣ２〜６アシルなどのＣ２〜２２アシルを表す、実施形態３〜２５のいずれかによる方法。
【０１４０】
２７．  Ｒ２が、水素又はＣ２〜６アシルなどのＣ２〜２２アシルを表す、実施形態３〜２６のいずれかによる方法。
【０１４１】
２８．  Ｒ３が、ヒドロキシ又はＣ１〜６アルコキシなどのＣ１〜２２アルコキシを表す、実施形態３〜２７のいずれかによる方法。
【０１４２】
２９．  Ｒ４が、水素又はＣ２〜６アシルなどのＣ２〜２２アシルを表す、実施形態３〜２８のいずれかによる方法。
【０１４３】
３０．  Ｒ５が、水素又はＣ２〜６アシルなどのＣ２〜２２アシルを表す、実施形態３〜２９のいずれかによる方法。
【０１４４】
３１．  Ｒ６が、ヒドロキシ又はＣ１〜６アルコキシなどのＣ１〜２２アルコキシを表す、実施形態３〜３０のいずれかによる方法。
【０１４５】
３２．  Ｌが、メチレン又はエチレンを表す、実施形態３〜３１のいずれかによる方法。
【０１４６】
３３．  システイン／シスチン類似体が、式１によって表される化合物から選択される１つ又は複数の化合物及びその塩を含み、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ７が、上で定義され、
ただし、
（ｉ）Ｒ１又はＲ２基のうちの１つが、Ｃ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニル基を表す場合に；
残りのＲ１又はＲ２基が、水素、アミノカルボニル、Ｃ２〜６アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜６アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキル；Ｃ１〜６ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル又はＣ５〜１０アリールスルホニル基を独立して表し；
Ｒ３が、ヒドロキシ；ＮＨ２；Ｃ１〜６アルコキシを表し、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ若しくはＣ１〜６アルキルによって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキルアミノ；ヒドロキシアミノ；Ｃ１〜６アルコキシアミノ；Ｃ１〜６アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜６アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ１〜６ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノ；ジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ１〜６アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ１〜６ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられ；
（ｉｉ）Ｒ３が、Ｃ６〜２２アルコキシを表し、Ｃ６〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ若しくはＣ１〜２２アルキルによって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキルアミノ；ヒドロキシアミノ；Ｃ６〜２２アルコキシアミノ；Ｃ６〜２２アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ６〜２２ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノ；ジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ６〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ６〜２２ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられる場合に；
Ｒ１及びＲ２が、水素、アミノカルボニル、Ｃ２〜６アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜６アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキル；Ｃ１〜６ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル、又はＣ５〜１０アリールスルホニルを独立して表す、実施形態３〜３２のいずれかによる方法。
【０１４７】
３４．  システイン／シスチンの類似体が、式２によって表される化合物及びその塩を含み又はそれからなり、Ｌ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、上で定義され、ただし：
（ｉ）Ｒ１及びＲ２基のうちの１つが、Ｃ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニル基を表す場合；及びＲ４及びＲ５基のうちの１つが、Ｃ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニル基を表す場合に、
残りのＲ１、Ｒ２、Ｒ４又はＲ５基が水素、アミノカルボニル、Ｃ２〜６アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜６アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキル；Ｃ１〜６ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル、又はＣ５〜１０アリールスルホニルを独立して表し；
Ｒ３及びＲ６が、ヒドロキシ；ＮＨ２；Ｃ１〜６アルコキシを独立して表し、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ若しくはＣ１〜６アルキルによって任意選択で置換されるＣ１〜６アルキルアミノ；ヒドロキシアミノ；Ｃ１〜６アルコキシアミノ；Ｃ１〜６アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜６アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ１〜６ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノ；ジ（Ｃ１〜６アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ１〜６アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ１〜６ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられ；
（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５基のうちの１つが、Ｃ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニルを独立して表す場合に；
Ｒ３及びＲ６のうちの１つが、Ｃ６〜２２アルコキシを表してもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ又はＣ１〜２２アルキルによって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキルアミノ；Ｃ６〜２２アルコキシアミノ；Ｃ６〜２２アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ６〜２２ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノ；ジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ６〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ６〜２２ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられ；
（ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４及びＲ５基のいずれもＣ６〜２２アシル、基がヒドロキシ及びＣ１〜２２アルコキシから選択される１つ若しくは２つの置換基によって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキル；Ｃ６〜２２ヘテロアルキル、ヒドロキシスルホニル、Ｃ６〜２２アルキルスルホニル、又はＣ５〜２２アリールスルホニル基を表さない場合、
Ｒ３及びＲ６両方が、Ｃ６〜２２アルコキシを独立して表してもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；基がヒドロキシ又はＣ１〜２２アルキルによって任意選択で置換されるＣ６〜２２アルキルアミノ；Ｃ６〜２２アルコキシアミノ；Ｃ６〜２２アルキルアミノによって任意選択で置きかえられてもよく、Ｃ１〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素は、アリール若しくはヘテロアリール；Ｃ６〜２２ヘテロアルキルアミノ；ヒドロキシによって任意選択で置換されるジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノ；ジ（Ｃ６〜２２アルキル）アミノによって置きかえられ、Ｃ６〜２２アルキルの１つ又は複数の炭素が、アリール若しくはヘテロアリール；又はジ（Ｃ６〜２２ヘテロアルキル）アミノによって置きかえられる、実施形態３〜３３のいずれかによる方法。
【０１４８】
３５．  システイン／シスチンの類似体が、式１及び２の塩を含む又はそれからなる、実施形態３〜３４のいずれかによる方法。
【０１４９】
３６．  塩が、システイン／シスチン類似体に存在するヒドロキシ基の反応によって形成される、実施形態３５による方法。
【０１５０】
３７．  塩が、アルカリ金属塩、例えばナトリウム、カリウム又はリチウム塩；アルカリ土類金属塩、例えばマグネシウム又はカルシウム塩；アンモニウム塩、例えばテトラアルキル又はアリールアンモニウム塩；スルホニウム塩、例えばトリアルキル又はアリールスルホニウム；及びホスホニウム塩、例えばテトラアルキル又はアリールホスホニウム塩を含む、実施形態３５又は３６による方法。
【０１５１】
３８．  塩が、アミノ基の反応など、システイン／システイン類似体に存在するアミノ基と無機酸又は有機酸との反応によって形成され、モノ又はジＨＣｌ塩、Ｈ２ＳＯ４塩、Ｈ３ＰＯ４塩、アセタート及びフマラートを含む、実施形態３５〜３７のいずれか１つによる方法。
【０１５２】
３９．  上で定義したシステイン／シスチン類似体が、Ｌ−システインと同じ掌性を有する、実施形態３〜３８のいずれか１つによる方法。
【０１５３】
４０．  システイン／システイン類似体が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステル、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン又はＳ−スルホシステインから選択される、実施形態３〜３９のいずれか１つによる方法。
【０１５４】
４１．  システイン／シスチン類似体が、Ｌ−システインと同じ掌性を有する化合物を含む又はからなる、実施形態３〜４０のいずれか１つによる方法。
【０１５５】
４２．  システイン／シスチン類似体が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステルからなる、実施形態３〜４１のいずれか１つによる方法。
【０１５６】
４３．  前記細胞培養培地が、
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を含み、（ａ）と（ｂ）のモル比が、１：１８〜１８：１である、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１５７】
４４．  方法が、
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、基本培地が、初期量の
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）が、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に（ａ）と（ｂ）のモル比が１：１８〜１８：１である、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１５８】
４５．  前記（ａ）と（ｂ）のモル比が、１：１５〜１５：１、例えば１：１０〜１０：１など１：１２〜１２：１、例えば１：６〜６：１など１：８〜８：１、例えば１：３〜３：１など１：４〜４：１、例えば１．５：１〜１：１．５など１：２〜２：１、例えば１：１のモル比である、実施形態４３又は４４による方法。
【０１５９】
４６．  前記基本培地中の（ｂ）の濃度が、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば０．２〜０．６ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌに等しい、実施形態４３又は４４による方法。
【０１６０】
４７．  産生段階の間に培地が（ａ）システイン／シスチン類似体並びに（ｂ）システイン及び／又はシスチンを補充され、産生段階全体にわたって培養物に添加される（ａ）及び（ｂ）の合計が、２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば４〜１０ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい、実施形態４３〜４６のいずれか１つによる方法。
【０１６１】
４８．  産生段階の間に培地が（ａ）システイン／シスチン類似体並びに（ｂ）システイン及び／又はシスチンを毎日補充され、毎日の添加により、（ａ）＋（ｂ）の濃度が、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい濃度になる、実施形態４３〜４６のいずれか１つによる方法。
【０１６２】
４９．  前記産生段階の間に細胞培養培地に
・産生される組換えタンパク質の予想される全量の１０重量％〜３０重量％の全量以下のシステイン又はシスチン；及び／又は
・産生される組換えタンパク質の予想される全量の８重量％〜３５重量％の全量以下のトリプトファン
を補充する、実施形態４３〜４８のいずれか１つによる方法。
【０１６３】
５０．
・細胞培養におけるシステイン若しくはシスチン濃度が、産生段階の間のどの時点でも０．９ｇ／Ｌを超えず、好ましくは細胞培養におけるシステイン若しくはシスチン濃度が、産生段階の間のどの時点でも０．３ｇ／Ｌを超えず、及び／又は
・細胞培養におけるトリプトファン濃度が、産生段階の間のどの時点でも０．６ｇ／Ｌを超えず、好ましくは細胞培養におけるトリプトファン濃度が、産生段階の間のどの時点でも０．３ｇ／Ｌを超えない、実施形態４３〜４９のいずれか１つによる方法。
【０１６４】
５１．
・プロセスの間に提供されるシステイン若しくはシスチンの全量が、２．９〜７ｇ／（１０１２個細胞）など２．９〜１２ｇ／（１０１２個細胞）であり、細胞が、産生段階の終了時において予想される全体の生存細胞数のことを指し、及び／又は
・プロセスの間に提供されるトリプトファンの全量が、２．５〜３．５ｇ／（１０１２個細胞／Ｌ）など２．５〜７ｇ／（１０１２個細胞）であり、細胞が、産生段階の終了時において予想される全体の生存細胞数のことを指す、実施形態４３〜５０のいずれか１つによる方法。
【０１６５】
５２．  方法が、バッチ法である、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１６６】
５３．  組換えタンパク質が、産生段階の間に産生され、好ましくは、産生段階が、少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１４日間である、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１６７】
５４．  培養が、産生段階において毎日補充される、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１６８】
５５．  好ましい産生段階が、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上又は２００００Ｌ以上の容積のバイオリアクター中で実施される、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１６９】
５６．  宿主細胞が、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１７０】
５７．  組換えタンパク質が、抗体又はその抗原結合断片である、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１７１】
５８．  抗体又はその抗原結合断片が、
ｉ）ａ．配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む；又は
ｂ．配列番号７で定義される配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号８で定義される配列を有する重鎖可変領域を含む；又は
ｃ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変領域及び配列番号８で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変領域を含む；又は
ｄ．配列番号７で定義される配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１１で定義される配列を有する重鎖を含む；又は
ｅ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変領域及び配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する重鎖を含む抗体又はその抗原結合断片；或いは
ｉｉ）配列番号９で定義される配列を有する軽鎖及び配列番号１０で定義される配列を有する重鎖を含む抗体；或いは
ｉｉｉ）配列番号９で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖及び配列番号１０で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖を含む抗体
である、実施形態５７による方法。
【０１７２】
５９．  組換えタンパク質が、システイン／シスチン類似体を含まない細胞培養培地中で成長した宿主細胞によって産生される場合、５０ｍｇ／ｍＬ以上など、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で無色でないタンパク質であり、例えば、色が、本明細書の例に記載の通り決定される、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１７３】
６０．  方法が、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する工程と、組換えタンパク質を精製する更なる工程を含む、先行する実施形態のいずれか１つによる方法。
【０１７４】
６１．  精製が、プロテインＡクロマトグラフィーを含む、実施形態６０による方法。
【０１７５】
６２．  精製した組換えタンパク質を製剤化する工程を更に含む、実施形態６０又は６１による方法。
【０１７６】
６３．
（ｉ）基本培地に前記宿主細胞を接種する工程であって、基本培地が、初期量の
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を任意選択で含む工程と、
（ｉｉ）産生段階の間中培養を進行させる工程であって、組換えタンパク質が細胞によって産生され、前記産生段階の間に細胞培養培地に
（ａ）システイン／シスチン類似体；並びに／或いは
（ｂ）システイン及び／又はシスチン
を補充する工程と
を含み、（ａ）及び（ｂ）が、同時に又は連続して添加されてもよく、
基本培地の内容物及び添加される全補充物を合計した場合に（ａ）と（ｂ）のモル比が１：１８〜１８：１である、組換えタンパク質調製物を産生する方法。
【０１７７】
６４．  システイン／シスチン類似体が、上の実施形態３〜４１に記載の通りである、実施形態６３による方法。
【０１７８】
６５．  前記（ａ）と（ｂ）のモル比が、１：１５〜１５：１、例えば１：１０〜１０：１など１：１２〜１２：１、例えば１：６〜６：１など１：８〜８：１、例えば１：３〜３：１など１：４〜４：１、例えば１．５：１〜１：１．５など１：２〜２：１、例えば１：１のモル比である、実施形態６３又は６４による方法。
【０１７９】
６６．  前記基本培地中の（ｂ）の濃度が、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば０．２〜０．６ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌに等しい、実施形態６３〜６５のいずれか１つによる方法。
【０１８０】
６７．  産生段階の間に培地が（ａ）システイン／シスチン類似体並びに（ｂ）システイン及び／又はシスチンを補充され、産生段階全体にわたって培養物に添加される（ａ）及び（ｂ）の合計が、２〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば４〜１０ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい、実施形態６３〜６６のいずれか１つによる方法。
【０１８１】
６８．  産生段階の間に培地が（ａ）システイン／シスチン類似体並びに（ｂ）システイン及び／又はシスチンを毎日補充され、毎日の添加により、（ａ）＋（ｂ）の濃度が、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌなど、システイン０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌと等しい濃度になる、実施形態６３〜６７のいずれか１つによる方法。
【０１８２】
６９．  前記産生段階の間に細胞培養培地に
・産生される組換えタンパク質の予想される全量の１０重量％〜３０重量％の全量以下のシステイン又はシスチン；及び／又は
・産生される組換えタンパク質の予想される全量の８重量％〜３５重量％の全量以下のトリプトファン
を補充する、実施形態６３〜６８のいずれか１つによる方法。
【０１８３】
７０．
・細胞培養におけるシステイン若しくはシスチン濃度は、産生段階の間のどの時点でも０．９ｇ／Ｌを超えず、好ましくは細胞培養におけるシステイン若しくはシスチン濃度は、産生段階の間のどの時点でも０．３ｇ／Ｌを超えず、及び／又は
・細胞培養におけるトリプトファン濃度は、産生段階の間のどの時点でも０．６ｇ／Ｌを超えず、好ましくは細胞培養におけるトリプトファン濃度は、産生段階の間のどの時点でも０．３ｇ／Ｌを超えない、実施形態６３〜６９のいずれか１つによる方法。
【０１８４】
７１．
・プロセスの間に提供されるシステイン若しくはシスチンの全量が、２．９〜７ｇ／（１０１２個細胞）など、２．９〜１２ｇ／（１０１２個細胞）であり、細胞が、産生段階の終了時において予想される全体の生存細胞数のことを指し、及び／又は
・プロセスの間に提供されるトリプトファンの全量が、２．５〜３．５ｇ／（１０１２個細胞／Ｌ）など２．５〜７ｇ／（１０１２個細胞）であり、細胞が、産生段階の終了時において予想される全体の生存細胞数のことを指す、実施形態６３〜７０のいずれか１つによる方法。
【０１８５】
７２．  方法が、バッチ法である、実施形態６３〜７１のいずれか１つによる方法。
【０１８６】
７３．  組換えタンパク質が、産生段階の間に産生され、好ましくは、産生段階が、少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１４日間である、実施形態６３〜７２のいずれか１つによる方法。
【０１８７】
７４．  培養が、産生段階において毎日補充される、実施形態６３〜７３のいずれか１つによる方法。
【０１８８】
７５．  産生段階が、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上又は２００００Ｌ以上の容積のバイオリアクター中で実施される、実施形態６３〜７４のいずれか１つによる方法。
【０１８９】
７６．  前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である、実施形態６３〜７５のいずれか１つによる方法。
【０１９０】
７７．  前記組換えタンパク質が、抗体又はその抗原結合断片である、実施形態６３〜７６のいずれか１つによる方法。
【０１９１】
７８．  抗体又はその抗原結合断片が、
ｉ）ａ．配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む；又は
ｂ．配列番号７で定義される配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号８で定義される配列を有する重鎖可変領域を含む；又は
ｃ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変領域及び配列番号８で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変領域を含む；又は
ｄ．配列番号７で定義される配列を有する軽鎖可変領域及び配列番号１１で定義される配列を有する重鎖を含む；又は
ｅ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変領域及び配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは９０％の同一性若しくは類似性を有する重鎖を含む抗体又はその抗原結合断片；或いは
ｉｉ）配列番号９で定義される配列を有する軽鎖及び配列番号１０で定義される配列を有する重鎖を含む抗体；或いは
ｉｉｉ）配列番号９で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖及び配列番号１０で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖を含む抗体
である、実施形態７７による方法。
【０１９２】
７９．  組換えタンパク質が、システイン／シスチン類似体を含まない細胞培養培地中で成長した宿主細胞によって産生される場合、５０ｍｇ／ｍＬ以上など、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で無色でないタンパク質であり、色が、例えば本明細書の例に記載の通り決定される、実施形態６３〜７８のいずれか１つによる方法。
【０１９３】
８０．  方法が、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する工程と、組換えタンパク質を精製する更なる工程を含む、実施形態６３〜７９のいずれか１つによる方法。
【０１９４】
８１．  精製が、プロテインＡクロマトグラフィーを含む、実施形態８０による方法。
【０１９５】
８２．  精製した組換えタンパク質を製剤化する工程を更に含む、実施形態８０又は８１による方法。
【０１９６】
８３．  前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞であり、前記システイン／シスチンの類似体が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステルである、実施形態６３〜８２のいずれか１つによる方法。
【０１９７】
８４．  先行する実施形態のいずれか１つによる方法によって入手可能な又は入手される組換えタンパク質調製物。
【０１９８】
８５．  Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン−ジメチルエステルを含む、哺乳動物細胞を培養するのに適した細胞培養培地。
【０１９９】
本発明は、付随する図面に例示される実施形態を参照して例として次に更に記述されることになる。
【実施例】
【０２００】
略語
ｍＡｂ：モノクローナル抗体；Ｃｙｓ：システイン又はシスチン；ＡＰＧ：酸性ピーク基；ＶＣＣ：生存細胞数；ＤＯ：溶存酸素；ＣＯ２：二酸化炭素；ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣；ＵＰＬＣ：超高性能液体クロマトグラフィー。
【０２０１】
（例１）
細胞培養において成長される宿主細胞によって組換えにより産生される抗体調製物の色及び酸性種を減少させるシステイン／シスチン誘導体の能力を評価した。この実験の場合、振とうフラスコにおける規模縮小モデルを使用した。全長抗体、ｍＡｂ１を産生するＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、播種密度０．３５×１０６個細胞／ｍＬで基本培地１００ｍＬに接種した。ｍＡｂ１は、配列番号９で定義される配列を有する軽鎖及び配列番号１０で定義される配列を有する重鎖を含む。
【０２０２】
振とうフラスコ容器は、遮光した攪拌インキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ）に配置した２５０ｍＬ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）であった。細胞を、湿度８０％において３６．８℃で１４日間培養した。細胞培養を、プロセスの開始時に１４０ｒｐｍで攪拌した。２Ｌバイオリアクタープロセスで行うように、攪拌をプロセスの間に徐々に増大させて２５０ｒｐｍに到達させ、それにより振とうフラスコ内のＤＯ％を４０％に維持した。細胞培養を、インキュベーター内のＣＯ２をプロセス前の５％からプロセス中の２％まで減少させることによってｐＨ７．０±０．２で維持した。細胞を、培養の毎日フィードをボーラス添加するフェドバッチ様式で培養した。基本培地は、システイン０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ＋シスチン０．３８ｍｍｏｌ／Ｌを含有した。フィードは、シスチン１５３．３ｍｍｏｌ／Ｌを含有した。全１４日間の産生段階にわたって、添加したフィードの全容積は培養開始容積の４．４７％（容積／容積）に対応した。
【０２０３】
表１に提示した通り、フィード中に存在するシステインを、異なるパーセンテージで異なるシステイン及びシスチン誘導体によって置きかえた。浸透圧を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｍｅｎｔｓ製浸透圧計を使用して毎日監視した。オフラインｐＨ、溶存Ｏ２及び溶存ＣＯ２を、モデルＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  ｐＨＯｘ（登録商標）血液ガス測定装置（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して毎日監視した。代謝産物濃度を、ＣｅｄｅｘＢｉｏＨＴシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して毎日決定した。生存細胞濃度及び細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌ自動細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して毎日測定した。細胞培養液を、細胞培養液１ｍＬを遠心分離することにより毎日採集して、プロテインＡ  ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して抗体価を決定した。１４日間の培養の終了時に、細胞培養液を遠心分離によって採取した。上清を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、ＧＥ）を使用して次いで精製した。プロテインＡ溶出液を、ＵＰＬＣサイズ排除（Ｗａｔｅｒｓ）を使用する分子量決定に使用した。精製したｍＡｂの主要な、酸性（酸性ピーク基の場合ＡＰＧ）及び塩基性（塩基性ピーク基の場合ＢＰＧ）アイソフォームの相対的パーセンテージを、イメージキャピラリー電気泳動（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ｉＣＥ３）によって決定した。プロテインＡ溶出液の別の部分を、Ａｍｉｃｏｎセントリコン遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０２０４】
濃縮した抗体組成物の色強度を、透過による分光光度計（ＵｌｔｒａｓｃａｎＰｒｏ）を使用して濃縮したプロテインＡ溶出液において測定し、ＣＩＥ（国際照明委員会）基準と比較した。数値結果を、４０ｍｇ／ｍＬの濃度に標準化した。
【０２０５】
図１は、フィードにおいて異なるシステイン置きかえ比で異なるシステイン及びシスチン誘導体を使用した細胞成長のプロファイルを示す。Ｃｙｓ誘導体１００％を含む条件において、細胞が７日目に急速に死んだＳ−スルホシステイン１００％の条件を除いて、細胞成長は対照条件と比較して６日目から失速した。生存細胞濃度は、誘導体５０％フィードの場合１０日目まで対照条件と同程度であった。１０日目から、生存細胞密度は、対照条件より高かった。しかしながら、Ｓ−スルホシステイン５０％の場合、生存細胞濃度は最大２×１０６個細胞／ｍＬに到達し、対照条件より有意に低かった。Ｃｙｓ１００％をＣｙｓ誘導体で置きかえた場合に細胞が対照と同様には成長しなかったことは、システイン誘導体が、システインを完全には置きかえ得ないことを示唆した。他方、誘導体５０％を含む条件は、対照条件より良好な成長を呈し、このことは、最小量のシステインが存在する場合のシステイン／シスチン誘導体の肯定的な影響を示唆している。Ｓ−スルホシステインは、細胞成長を可能にすることに関して試験した他の誘導体のように作用すると思われない。
【０２０６】
システイン誘導体１００％で観察された細胞死をかんがみて、他の成績及び産物品質の結果を、システイン誘導体５０％条件でのみ分析した。
【０２０７】
産物力価は、使用した誘導体がＳ−スルホシステインであった場合を除き、システイン誘導体５０％を使用した培養において対照条件より高かった（図２）。
【０２０８】
濃縮したプロテインＡ溶出液のｂ＊値は、対照条件と比較して６．５％〜２１．２％減少し、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステル（ＣＡＳ登録番号３２３８１−２８−５、例えばＢａｃｈｅｍ  ＡＧから入手できる）５０％で最良の結果が観察された（図３）。同様に、酸性バリアントレベルの低下も、対照条件と比較して７．６％〜２４．８％観察され、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステル５０％で最良の結果が観察された（図４）。Ｓ−スルホシステインを除いて、酸性種レベルにおけるこの減少は、主要電荷種の増大と相関し（図５）、塩基性バリアントレベルの有意な増大はなかった（図示せず）。これらの結果は、組換えタンパク質の微小不均一性の減少を確認した。
【表３】
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【０２０９】
（例２）
細胞培養において組換えタンパク質調製物の色及び酸性種を減少させるシステイン／シスチン誘導体の能力を、別の抗体産生細胞系、細胞系２を使用して評価した。この実験の場合、振とうフラスコにおける規模縮小モデルを使用した。多重特異的抗体誘導体を産生するＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、播種密度０．３５×１０６個細胞／ｍＬで基本培地１００ｍＬに接種した。振とうフラスコ容器は、遮光した攪拌インキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ）に配置した２５０ｍＬ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）であった。細胞を、湿度８０％で、３６．８℃で１４日間培養した。細胞培養を、プロセスの開始時に１４０ｒｐｍで攪拌した。２Ｌバイオリアクタープロセスで行うように、攪拌を、プロセスの間に徐々に増大させて２５０ｒｐｍに到達させ、それにより振とうフラスコ内のＤＯ％を４０％に維持した。細胞培養を、インキュベーター内のＣＯ２をプロセス前の５％からプロセス中の２％まで減少させることによってｐＨ７．０±０．２で維持した。細胞を、培養の毎日フィードをボーラス添加するフェドバッチ様式で培養した。基本培地は、システイン０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ＋シスチン０．３８ｍｍｏｌ／Ｌを含有した。フィードは、シスチン１５３．３ｍｍｏｌ／Ｌを含有した。全１４日間の産生段階にわたって、添加したフィードの全容積は、培養開始容積の２．８１％（容積／容積）に対応した。
【０２１０】
フィード中に存在するシステインを、５０％等モルの置きかえ比で異なるシステイン及びシスチン誘導体によって置きかえた（表１）。対照システインレベル５０％だけの条件も追加して、観察された改善がシステイン誘導体の存在によるのか又はシステインの減少だけによるか試験した。浸透圧を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｍｅｎｔｓ製浸透圧計を使用して、毎日監視した。オフラインｐＨ、溶存Ｏ２及び溶存ＣＯ２を、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｏｘ（Ｎｏｖａ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して毎日監視した。代謝産物濃度を、ＣｅｄｅｘＢｉｏＨＴシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して毎日決定した。生存細胞濃度及び細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌ自動細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して毎日測定した。細胞培養液を、細胞培養液１ｍＬを遠心分離することにより毎日採集して、タンパク質Ｌ  Ｏｃｔｅｔ測定（Ｐａｌｌ）を使用して抗体価を決定した。１４日間の培養の終了時に、細胞培養液を遠心分離によって採取した。上清を、タンパク質Ｌ親和性クロマトグラフィー（ＣａｐｔｏＬ、ＧＥ）を使用して次いで精製した。プロテインＬ溶出液を、ＵＰＬＣサイズ排除（Ｗａｔｅｒｓ）を使用する分子量決定に使用し、キャピラリー等電点電気泳動（ｉｓｏｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ｉＣＥ３）を使用して電荷バリアント決定に使用した。細胞系２で産生される組換えタンパク質は、着色分子ではなかった。そのため、この場合色測定を実行しなかった。
【０２１１】
図６は、フィード中でシステイン置きかえ比５０％で異なるシステイン及びシスチン誘導体を使用した細胞成長のプロファイルを示す。同程度の細胞成長プロファイルが、対照条件とシステイン及びシスチン誘導体を含む条件の間で観察された。従って、これらの成分は、この細胞系（細胞系２）に関して細胞成長に影響を与えない。産物力価は、全てのシステイン及びシスチン誘導体に関して対照条件と同程度であった（図７）。
【０２１２】
図８で分かるように、酸性バリアントレベルの減少が、２つのシスチン誘導体、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルで対照条件と比較して４６．６％〜５０．２％の間で観察された。酸性バリアントレベルの１４．５％の減少が、Ｎ−アセチルシステインで観察された。酸性種レベルにおけるこの減少は、主要電荷種の増大と相関し（図９）塩基性バリアントレベルの有意な増大はなかった（データ不掲載）。これらの結果は、シスチン誘導体による組換えタンパク質の微小不均一性の減少を確認した。他方、酸性種の５％〜１０％の増大が、Ｓ−スルホシステイン、及びシステインだけの減少で観察された。
【０２１３】
（例３）
細胞培養において産生される組換えタンパク質調製物の色及び酸性種を減少させるシステイン／シスチン誘導体の能力を、２つの細胞系についてバイオリアクターで評価した。このモデルは、幾何学的形状及び追加の制御のため、振とうフラスコより大規模な産生を代表する。細胞系１及び２由来のＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、２Ｌの攪拌バイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）において播種密度０．３５×１０６個細胞／ｍＬで基本培地１３００ｍＬに接種した。細胞を、フェドバッチ様式で１４日間培養した。細胞培養を、２８０ｒｐｍで攪拌し、ＤＯを４０％で維持した。細胞培養を、自動ＣＯ２散布調節で、ｐＨ７．０±０．２で維持した。細胞を、培養の毎日フィードをボーラス添加するフェドバッチ様式で培養した。基本培地は、システイン０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ＋シスチン０．３８ｍｍｏｌ／Ｌを含有した。フィードは、シスチン１５３．３ｍｍｏｌ／Ｌを含有した。全１４日間の産生段階にわたって添加したフィードの全容積は、細胞系１の場合培養開始容積の５．７％（重量／重量）に対応し、細胞系２の場合培養開始容積の３．１％（重量／重量）に対応した。
【０２１４】
表２に提示した通り、フィード中に存在するシステインを、異なるパーセンテージで異なるシステイン及びシスチン誘導体によって置きかえた。システインを５０％だけ含む条件を追加して、観察された改善が、システイン誘導体によるのか又はシステインの減少だけによるのか試験した。浸透圧を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｍｅｎｔｓ製浸透圧計を使用して、毎日監視した。オフラインｐＨ、溶存Ｏ２及び溶存ＣＯ２を、Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｏｘ（Ｎｏｖａ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して毎日監視した。代謝産物濃度を、ＣｅｄｅｘＢｉｏＨＴシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して毎日決定した。生存細胞濃度及び細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌ自動細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して毎日測定した。細胞培養液を、細胞培養液１ｍＬを遠心分離することにより毎日採集して、ＨＰＬＣプロテインＡ（Ｗａｔｅｒｓ）又はタンパク質Ｌ  Ｏｃｔｅｔ測定（Ｐａｌｌ）を使用して抗体価を決定した。１４日間の培養の終了時に、細胞培養液を遠心分離によって採取した。上清を、プロテインＡ又はＬ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ）を使用して次いで精製した。プロテインＡ又はＬ溶出液をＵＰＬＣサイズ排除（Ｗａｔｅｒｓ）を使用する分子量決定及びキャピラリー等電点電気泳動（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ｉＣＥ３）を使用する電荷バリアント決定に使用した。プロテインＡ溶出液（細胞系１からのみ）の別の部分を、Ａｍｉｃｏｎセントリコン遠心濾過機装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して４０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮した抗体組成物の色強度を、透過により分光光度計（ＵｌｔｒａｓｃａｎＰｒｏ）を使用して濃縮したプロテインＡ溶出液において測定し、ＣＩＥ（国際照明委員会）基準と比較した。数値結果を、４０ｍｇ／ｍＬの濃度に標準化した。
【表４】
2021503938.tif 000009
【０２１５】
細胞系１
類似の細胞成長傾向が、試験した全ての条件で観察された（図１０）。
【０２１６】
抗体価の有意な低下が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチン及びＮ−アセチルシステインにおいて１０％〜１７％観察されたが、５％未満の有意でない減少が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルで観察された（図１１）。力価の有意な減少は、システイン５０％フィードのみでも観察され、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルが力価を改善することを示唆した。
【０２１７】
酸性種レベルに関しては、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンで５％、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインで１０％及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルで１５％の減少が観察された（図１２）。この減少は、主要種の増大と相関した（図１３）。電荷バリアントに対する類似の影響を、振とうフラスコの場合のように２Ｌ規模で観察した。この減少は、システイン５０％フィードのみでも観察された。これは、この酸性種レベルの減少が、システインの減少による可能性があることを示唆する。Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンで２．５％、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインで１３％及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルで２５％のｂ値レベルの低下が、観察された。産物色強度に対する類似の影響を、振とうフラスコの場合のように２Ｌ規模で観察した。ｂ＊値の減少は、システイン５０％フィードのみでは観察されなかった。呈色に対するＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルの影響が、確認された。
【０２１８】
細胞系２
類似の細胞成長傾向が、試験した全ての条件で観察された（図１５）。
【０２１９】
１５％〜２３％の抗体価の有意な増大が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチン、Ｎ−アセチルシステイン及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルで観察された（図１６）。そのため、この結果は、振とうフラスコにおいて入手された結果と異なる。
【０２２０】
酸性種レベルに関しては、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンで８％、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインで１３％及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルで１３％の減少が観察された（図１７）。この減少は、主要種の増大と相関した（図１８）。Ｎ−アセチルシステインを除いて、振とうフラスコと比較して電荷バリアントについて類似の傾向が２Ｌ規模で観察された。電荷バリアントに対するＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルによるシステインの置きかえの影響が、確認された。
【０２２１】
酸性種レベルの２７％の減少が、システイン５０％フィードで観察された。これは、システインの減少が、酸性種の減少の主要な駆動体であることを示す。システイン／シスチン誘導体で１５％〜２３％に代わって、１０％の力価増大がシステイン５０％フィードで観察された。システイン／シスチン誘導体によるシステイン５０％の置きかえは、この細胞系の場合力価増大と不均一性減少間の優れた妥協点である。
【０２２２】
（例４）
結果の再現性を、細胞系１を用いてバイオリアクターで評価した。例３の実験を、Ｓ−スルホシステイン５０％システイン５０％フィードで追加の制御及びバイオリアクターで繰り返した。２つの実験のデータを分析して、システイン／シスチン誘導体でこれまでに観察されている効果を確認した。
【表５】
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【０２２３】
細胞成長に関する差異は、０日〜８日目において観察されなかった。９日目から、Ｓ−スルホシステインを含む条件は、対照より高い細胞死を有した。システイン５０％フィード、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチン５０％システイン５０％フィード及びＮ−アセチルシステイン５０％システイン５０％フィードは、対照条件より高いＶＣＣを有した。Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステル５０％システイン５０％フィード条件は、対照条件平均と類似していた（図１９）。
【０２２４】
対照平均と比較して抗体価の５％未満の有意でない減少が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルで観察された。しかしながら、１０％の減少が、システイン５０％フィードで観察された。従って、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシステインジメチルエステルの使用により、フィード中のシステイン減少による力価喪失が、５％補償された。更に、システイン５０％フィードで観察されたより高いＶＣＣは、システイン５０％フィードと比較してＮ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルによる特別な生産性の増大を示す。この観察により、システインの減少による特定の生産性の喪失が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチルシスチンジメチルエステルの添加によって補償され得ることが確認される。１０％の減少が、Ｎ−アセチルシステイン及びＮ，Ｎ’−ジアセチルシステインでも観察された。これらの分子は、この細胞系に対する生産性に影響を与えなかった。他方、力価の２５％の低下が、Ｓ−スルホシステインで観察された。これは、ＶＣＣの低下による及びシステイン減少に起因する生産性の低下によるが、特定の生産性に対するＳ−スルホシステインの特定の影響によるものではない（図２０）。
【０２２５】
酸性種レベルに関しては、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン及びＮ−アセチル−Ｌ−システインで１０％の平均低下が観察された（図２１）。この減少は、主要種の増大と相関した（図２２）。
【０２２６】
１５％の平均減少が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンで観察された。この減少は、システイン５０％フィードのみでも観察される。これはまた、酸性種レベルの減少が、システインレベルの減少によることを示唆している。類似の酸性種レベルが、Ｓ−スルホシステインと対照条件の間で観察された。これは、Ｓ−スルホシステインが、システイン減少によって一般に低下する酸性種レベルを増大させることを示唆している。
【０２２７】
ｂ値レベルに関しては、Ｓ−スルホシステインで５％、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンで１４％、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインで１３％及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルで３０％の平均低下が、観察された。ｂ＊値の減少は、システイン５０％フィードのみで観察されなかった。呈色に対するＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルの影響が、確認された（図２３）。
【０２２８】
（例５）
ミニバイオリアクター内で培養される細胞培養において産生された組換えタンパク質調製物のＡＰＧレベルの改善に対して異なる濃度のシステイン／シスチン誘導体を試験した。細胞系１由来ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、Ａｍｂｒ１５バイオリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で播種密度０．３５×１０６個細胞／ｍＬで基本培地１２ｍＬに接種した。細胞を、フェドバッチ様式で１４日間培養した。ＤＯを４０％で維持し、ｐＨを自動ＣＯ２散布調節で７．０±０．２で維持した。生存細胞濃度及び細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌ自動細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して毎日測定した。細胞を、フィードを毎日ボーラス添加するフェドバッチ様式で培養した。基本培地は、システイン０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ＋シスチン０．３８ｍｍｏｌ／Ｌを含有した。フィードは、シスチン１５３．３ｍｍｏｌ／Ｌを含有した。全１４日間の産生段階にわたって、添加したフィードの全容積は、培養開始容積の４．７％（容積／容積）に対応した。
【０２２９】
フィード中に存在するシステインの異なるパーセンテージを、異なるシステイン及びシスチン類似体によって置きかえた。表６は、試験した異なるパーセンテージの概要及びシステイン又はシスチンと比較したモル比の当量を提供する。例えばＮ−アセチル−Ｌ−システインの場合、１０％とは、システイン当量の１０％モル量が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの１０％モル量によって置きかえられたことを意味し；Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンの場合、１０％とは、シスチン当量の１０％モル量が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンの１０％モル量で置きかえられたことを意味する。１４日間の培養の終了時に、細胞培養液を遠心分離によって採取した。上清を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ）を使用して次いで精製した。プロテインＡ溶出液を使用して、キャピラリー等電点電気泳動（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ｉＣＥ３）を使用して電荷バリアント決定した。
【表６】
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【０２３０】
図２４は、細胞の成長プロファイルを示す。類似の生存細胞濃度プロファイルが、対照条件（類似体添加なし）と試験条件の大多数の間で観察された。成長の阻害が、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン９０％及びＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステル９０％で観察された。
【０２３１】
図２５及び２６は、酸性種及び主要電荷種レベルにおける、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチン、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステル又はＮ−アセチル−シスチンの異なるシステイン／シスチン置きかえレベルに対する応答を表す。Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンの場合、酸性種レベルは、置きかえのパーセンテージの増大に伴って減少して、最大減少２７．５％に到達する。微小不均一性のこの減少は、主要電荷種レベルにおいて観察される対照に対する正の差異によって確認される。Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルでの最適な主要電荷種レベルは、５０％〜７０％のシステイン／シスチン置きかえで得られた。しかしながら、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルは、適合曲線によれば１５％〜９０％の間で主要電荷種レベルに対して正の影響を有する。この結果は、図２５においてＮ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−シスチンジメチルエステルでも観察される酸性種レベルの低下によって確認される。より低い影響が、Ｎ−アセチルシステインで置きかえの最適値およそ７０％、酸性種の低下１２．５％で観察された。
【配列表フリーテキスト】
【０２３２】
配列番号１〜１１：＜２２３＞ヒト化
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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