(57)【要約】【課題】ＣＡＲの機能を評価する方法に関する。【解決手段】本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するための方法に関する。より具体的には、この方法は、抗原発現標的細胞と抗原特異的免疫細胞との間の膜転移を伴うトロゴサイトーシスプロセスに基づいている。【選択図】図２
2021536246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法であって：
−同じ細胞株から調製された標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞を異なる標識で標識すること；
−標識された標的細胞と標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養すること、
−前記標的抗原発現細胞からの前記ＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析することであって、前記膜獲得が、標的抗原への前記ＣＡＲ発現細胞の結合及び／又は活性化能力の指標であり、それにより前記ＣＡＲ発現細胞の機能を評価することを含み；且つ
前記細胞が免疫細胞である、方法。
【請求項２】
前記共培養が、少なくとも１時間、好ましくは１〜５時間、さらにより好ましくは１〜３時間の間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記共培養が、１：０．５〜１：１０の標的抗原発現細胞対ＣＡＲ発現細胞の比率で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞分析が、細胞選別分析、好ましくはフローサイトメトリー分析によって行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記標識された標的抗原細胞と前記標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養する前に、前記ＣＡＲが由来する抗体と比較して同じ又は重複するエピトープを認識する抗体と共に前記標的抗原発現細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、モノクローナル抗体であり、好ましくは、前記ＣＡＲが由来するモノクローナル抗体のＣＤＲを含むモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的抗原を発現しない対照細胞を試験することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的抗原を認識しない対照ＣＡＲ発現細胞を試験することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
機能的なＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲコンストラクトの選択をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識が、膜マーカー、好ましくは親油性トレーサー又は色素であり、さらにより好ましくは、ＭＩＮＩ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、ＰＫＨ６７、ＭＩＮＩ６７、ＰＫＨ６７−ＰＣＬ、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣＭ−ＤｉＩ、ＤｉＩ、及びＤｉＯからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫細胞が、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、単球、及び抗原提示細胞からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
養子細胞療法のために機能的ＣＡＲ発現細胞を選択するためのインビトロ方法であって：
（ｉ）免疫細胞の集団、好ましくは処置される対象からの生物学的サンプルから単離された免疫細胞の集団にＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入すること、
（ｉｉ）ＣＡＲを発現する前記単離された細胞の亜集団を選択すること、及び、
（ｉｉｉ）好ましくは、ＣＡＲが作製された抗原を発現する標的抗原発現細胞について、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によってそれらの機能を評価すること、
（ｉｖ）任意選択により、前記抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞から機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲ核酸コンストラクトを選択することを含む、方法。
【請求項１３】
前記抗原が、ＨＬＡ−Ｇ、好ましくはＨＬＡ−Ｇ１である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学、細胞生物学、及び分子生物学の分野に関する。特定の態様では、本発明の分野は免疫療法に関する。より具体的には、本発明は、特異性、機能、及び感度などのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）特性を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
何年もの間、癌処置の基礎は、手術、化学療法、及び放射線療法であった。しかしながら、過去数年間で、免疫療法が、癌処置の効果的なツールとして浮上してきた。
【０００３】
遺伝子工学の進歩が、Ｔ細胞などのヒト免疫細胞に導入して、抗原特異性をリダイレクトし、エフェクター免疫細胞の機能を強化することができる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる合成腫瘍標的受容体の設計につながった。ＣＡＲは、１９８０年代半ばに最初に開発され、それ以来、これらの受容体への関心が高まっている。これらの受容体は、ＨＬＡ−ペプチド複合体とは独立に特定の抗原認識を提供することによって、Ｔ細胞を発現する固有のＴＣＲ特異性をバイパスするために最初に作製された。プロトタイプの一本鎖ＣＡＲは、１９９３年にEshharらによる研究で最初に説明され、この一本鎖ＣＡＲでは、Ｔ細胞の特異的活性化及び標的化は、標的抗原特異的抗体ドメインと、Ｆｃイプシロン受容体のγシグナル伝達サブユニット又はＴ細胞受容体ＣＤ３複合体のζシグナル伝達サブユニットとからなる分子を介して媒介された（Eshhar et al., 1993, Proc Natl Acad Sci., 90, 720-4）。それ以来、多くのグループが、単一の腫瘍に対する特異性及び強化されたシグナル伝達エンドドメイン（endodomain）を備えたＣＡＲ分子を考案してきた。今日、ＣＡＲの結合ドメインは、典型的には、ライブラリーから選択され、柔軟なリンカーによって結合されたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の軽鎖及び重鎖可変断片を含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメイン又は抗体結合断片（Ｆａｂ）からなる。ｓｃＦｖは、それが由来する完全な抗体と同じ特異性及び同様の親和性を保持し、目的の標的抗原に特異的に結合することができる。従って、ＣＡＲは、単一の融合分子内で抗原特異性とＴ細胞活性化特性を組み合わせている。実際、ｓｃＦｖは、ＣＤ３ζを含む細胞内シグナル伝達モジュールに連結され、抗原結合時にＴ細胞の活性化を誘導する。モジュール構造は、共刺激を模倣しようとして、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのみを備えた第１世代のＣＡＲから、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０などのシグナル伝達エンドドメインをＣＤ３ζに連結する第２世代及び第３世代ＣＡＲに拡張されている。
【０００４】
ＣＡＲは、ＭＨＣに依存しないメカニズムでＴ細胞を癌の標的にすることを可能にした。ＣＡＲのリガンド結合は、受容体親和性、抗原密度、及び空間特性において、ペプチド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）に結合するＴＣＲのリガンド結合とは異なり；特定の標的分子に最適なＣＡＲを設計するための実験的アプローチは、インビトロ又はヒト腫瘍異種移植モデルにおける形質導入Ｔ細胞の機能アッセイに依存している。ＴＣＲ／ｐＭＨＣ認識で観察されるように、ＣＡＲが標的分子と連続的に結合し、組織化されたシナプスにクラスター化する可能性が低いため、ＣＡＲ認識にはＴＣＲよりも高いリガンド密度が必要であると考えられる。これらの受容体の最適な構成及び適用は、親和性と特異性に加えて、コンストラクトの設計、シグナル伝達ドメイン、ベクター送達システム、レシピエントの免疫細胞集団、及び製造に依存している。
【０００５】
特に、ＣＡＲの有効性は、１つにはＣＡＲ自体の親和性に依存し、もう１つはエクトドメイン（ectodomain）の構成要素に依存する。ｓｃＦｖ内の柔軟なリンカー配列の存在、及びエクトドメインとエンドドメイン（ヒンジ領域と膜貫通領域）との間の連結のタイプは、（ｉ）結果として得られるＣＡＲの長さと柔軟性、（ｉｉ）その細胞表面密度、（ｉｉｉ）持続性シグナル伝達によって自己凝集してＴ細胞枯渇を引き起こす傾向、及び（ｉｖ）意図された標的抗原以外の分子への潜在的な結合を変更することによってＣＡＲ機能を大幅に変更することができる。
【０００６】
従って、ＣＡＲの特異性及び機能は、その構造（ＣＡＲの長さとエピトープの距離、スペーサー、膜貫通領域、及びエンドドメイン領域）及びその感受性（抗体親和性、抗原密度／親和性、信号閾値）の影響を受け得る。しかしながら、この問題に対処するために設計された研究及びアッセイは限られていてほとんどなく、最適な抗体又はＣＡＲコンストラクトの選択は、未だ証明されておらず、これは一般に、部分的にＣＡＲ機能の評価につながるが、これらの特性は、ＣＡＲベースの治療法を改善するために非常に興味深いものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
例えば、サイトカインの放出を測定することによる（Clay et al, J. Immunol., 163 : 507-513 (1999)）又は細胞傷害性を測定することによる（Zhao et al, J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005)）、標的細胞を認識する能力及び抗原特異性についてＣＡＲを試験する方法は当技術分野で公知である。しかしながら、これらの方法は、時間がかかり、実施が困難であり得る。従って、ＣＡＲ発現細胞の機能を評価するための単純で迅速且つ効果的な方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
この問題を克服するために、本発明者らは、ＣＡＲ発現細胞の機能を評価する方法を開発した。この方法は、抗原発現標的細胞とＣＡＲ発現細胞との間の膜転移を伴うトロゴサイトーシス（trogocytosis）に基づいている。このアッセイでは、組換えＣＡＲ構造の構造と感度の両方に応じて、ＣＡＲエフェクター細胞の活性化を独自の迅速な方法で評価することができる。
【０００９】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法に関し、この方法は：
−同じ細胞株から調製された標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞を異なる標識で標識すること；
−標識された標的細胞と標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養すること、
−標的抗原発現細胞からのＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析することであって、この膜獲得が、標的抗原へのＣＡＲ発現細胞の結合及び／又は活性化能力の指標であり、それによりＣＡＲ発現細胞の機能を評価することを含み、
好ましくは、ＣＡＲ発現細胞は免疫細胞である。
【００１０】
好ましくは、共培養は、少なくとも１時間、好ましくは１〜５時間、さらにより好ましくは１〜３時間行われる。特に、共培養は、１：０．５〜１：１０の標的抗原発現細胞対ＣＡＲ発現細胞の比率で行われる。
【００１１】
細胞分析は、細胞選別分析、好ましくはフローサイトメトリー分析によって行われる。
【００１２】
好ましくは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法は、標識された標的抗原細胞と標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養する前に、ＣＡＲが由来する抗体と比較して同じ又は重複するエピトープを認識する抗体と共に標的抗原発現細胞を培養する工程をさらに含む。このような抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、好ましくは、ＣＡＲが由来するモノクローナル抗体のＣＤＲを含むモノクローナル抗体である。
【００１３】
好ましくは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法は、標的抗原を発現しない対照細胞を試験することをさらに含む。そのような方法は、標的抗原を認識しない対照ＣＡＲ発現細胞を試験することをさらに含み得る。そのような方法はまた、機能的なＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲコンストラクトの選択をさらに含み得る。
【００１４】
標識は、膜マーカー、好ましくは親油性トレーサー又は色素であり、さらにより好ましくは、ＭＩＮＩ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、ＰＫＨ６７、ＭＩＮＩ６７、ＰＫＨ６７−ＰＣＬ、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣＭ−ＤｉＩ、ＤｉＩ、及びＤｉＯからなる群から選択される。
【００１５】
好ましくは、細胞は、免疫細胞であり、好ましくはＴリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、単球、及び抗原提示細胞から選択される。
【００１６】
本発明はまた、養子細胞療法のために機能的ＣＡＲ発現細胞を選択するためのインビトロ方法に関し、この方法は：
（ｉ）免疫細胞の集団、好ましくは処置される対象からの生物学的サンプルから単離された免疫細胞の集団にＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入すること、
（ｉｉ）ＣＡＲを発現する前記単離された細胞の亜集団を選択すること、及び、
（ｉｉｉ）好ましくはＣＡＲが作製された抗原を発現する標的抗原発現細胞について、前記請求項のいずれかに記載の方法によってそれらの機能を評価すること、
（ｉｖ）任意選択により、抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞から機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲ核酸コンストラクトを選択することを含む。
【００１７】
好ましくは、抗原はＨＬＡ−Ｇであり、さらにより好ましくはＨＬＡ−Ｇ１である。
【００１８】
本発明はまた、本明細書に開示される任意のインビトロ方法によって選択される機能的ＣＡＲコンストラクトを含む細胞、好ましくは免疫細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】標的細胞の膜、Ｊｕｒｋａｔ及びＨＬＡ−Ｇ１／ｂ２Ｍ発現細胞株を、ＰＫＨ６７色素を使用して緑色で標識した。エフェクター細胞、Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７及びＨＬＡ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲ細胞の膜を、ＰＫＨ２６色素を使用して赤色で標識した。次いで、細胞を１：１の比率で共培養し、共培養の０時間後、１時間後、及び３時間後に収集してから、フローサイトメトリーによって分析した。
【図２】ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ細胞（赤色で標識された）による腫瘍細胞（緑色で標識された）からの膜獲得：（Ａ）ＨＬＡ−Ｇ陰性腫瘍細胞との共培養後は、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ細胞による膜獲得は期待されないが、（Ｂ）ＨＬＡ−Ｇ１／ｂ２Ｍ発現腫瘍細胞との共培養後は、抗ＨＬＡ−Ｇ１／ｂ２Ｍ  ＣＡＲ細胞のみが膜パッチを獲得するはずである。
【図３】ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ細胞によるＪｕｒｋａｔ又はＨＬＡ−Ｇ１／ｂ２Ｍ  Ｊｕｒｋａｔ腫瘍細胞のいずれかからの膜獲得をフローサイトメトリーによって調べた。ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７  ＣＡＲ細胞（左パネル）は、Ｊｕｒｋａｔ又はＨＬＡ−Ｇ１／ｂ２Ｍ  Ｊｕｒｋａｔ細胞との共培養の１時間後及び３時間後もＰＫＨ６７を示さなかった。ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲ細胞（右パネル）は、ＨＬＡ−Ｇ１／ｂ２Ｍ  Ｊｕｒｋａｔ細胞との共培養後にのみ、表面にＰＫＨ６７を示し、その程度が時間の経過と共に増加した。代表的な３回の独立した実験。
【図４】ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７又はＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲ細胞によるＪｕｒｋａｔ又はＨＬＡ−Ｇ１／ｂ２Ｍ  Ｊｕｒｋａｔ腫瘍細胞からの膜獲得の速度（ｎ＝３）。
【図５】ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲ細胞によるＨＬＡ−Ｇ１／ｂ２Ｍ  Ｊｕｒｋａｔ腫瘍細胞からの膜獲得は、腫瘍細胞をＬＦＴＴ−１モノクローナル抗体と前培養することによって防止される。
【図６】（Ａ）ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲの特異性を、抗ＨＬＡ−Ｇ  ＬＦＴＴ−１モノクローナル抗体の存在下で評価した（代表的な３回の独立した実験）。（Ｂ）ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲの特異性は、その作製に使用されるモノクローナル抗体ＬＦＴＴ−１パラトープに関連している（ｎ＝３）。
【図７】（Ａ）Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ１、及びＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲ細胞複合体を、抗ＨＬＡ−Ｇ  ＬＦＴＴ−１モノクローナル抗体の存在下で評価した（代表的な４回の独立した実験）。（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲ複合体は、ＬＦＴＴ−１モノクローナル抗体によって防止される（ｎ＝４）。
【図８】ＨＬＡ−Ｇ陰性（赤色のＪｕｒｋａｔ細胞）、ＨＬＡ−Ｇ陽性（緑色のＪｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ１細胞）の標的細胞とエフェクター細胞（青色のＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲ細胞）との間での膜転移アッセイの概略図。
【図９】（Ａ）ＨＬＡ−Ｇ腫瘍発現Ｊｕｒｋａｔ細胞とＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲエフェクター細胞との間の膜獲得の代表図。（Ｂ）ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲエフェクターによって獲得された膜は、ＨＬＡ−Ｇ発現腫瘍細胞からのみ転移し、周囲のＨＬＡ−Ｇ陰性腫瘍細胞からは転移せず、ＨＬＡ−Ｇ  ＣＲの活性化が、ＨＬＡ−Ｇ発現腫瘍細胞によってのみ駆動され、周囲のＨＬＡ−Ｇ陰性腫瘍細胞によっては駆動されないことを実証している。
【図１０】エフェクターＣＡＲ細胞によるＨＬＡ−Ｇ１標的細胞からの膜獲得は、使用する膜色素に依存しない。
【図１１】ＨＬＡ−Ｇ陰性、ＨＬＡ−Ｇ陽性の標的細胞とエフェクターＣＡＲ細胞との間の差次的膜転移（differential membrane transfer）アッセイの概略図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
序論
本発明者らは、特異性、機能、及び感受性などのＣＡＲ特性を決定するための、新規な独自の容易且つ迅速な方法を開発した。この方法は、抗原発現標的細胞と抗原特異的免疫細胞との間での膜転移を伴うトロゴサイトーシスプロセスに基づいている。この方法では、実験室で容易に行うことができる工程を使用することによって、これらの特性を１日かからずに決定することができる。この方法の有効性と単純さの重要な側面は、ＣＡＲ発現細胞及び標的抗原発現細胞を調製するために同じ細胞株を使用することである。
【００２１】
従って、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法に関し、この方法は、同じ細胞株に属する標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞を異なる標識で標識すること、標識された標的細胞と標識されたＣＡＲ発現細胞を共培養すること、並びに標的抗原発現細胞からのＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析することを含み、この膜獲得は、標的抗原へのＣＡＲ発現細胞の結合及び／又は活性化能力の指標である。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００２４】
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）、「エンジニアリングされた細胞受容体」、「キメラ細胞受容体」、又は「キメラ免疫受容体」（ＩＣＲ）という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）に抗原結合特異性を移植するエンジニアリングされた受容体を指し、従って、抗原結合ドメインの抗原結合特性を、Ｔ細胞の溶解能力及び自己複製などの免疫細胞の免疫原性活性と組み合わせる。特に、ＣＡＲは、抗原に結合することができる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、任意選択によるヒンジドメイン、及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指す。「抗原に結合できる細胞外ドメイン」、「外部ドメイン」、「エクトドメイン」、及び「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、標的抗原に結合できる任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。特に、本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」又は「抗原特異的標的ドメイン」という用語は、特定の抗原を標的とし、それに結合するＣＡＲの領域を指す。ＣＡＲが宿主細胞で発現されると、このドメインは、受容体の細胞外ドメイン（エクトドメイン）を形成する。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、典型的には抗体に由来し、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメイン又は抗原結合断片（Ｆａｂ）からなり得る。「細胞内ドメイン」、「内部ドメイン」、「細胞質ドメイン」、及び「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、本明細書で互換的に使用され、細胞内の生物学的プロセスの活性化又は阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含む核酸配列が形質導入された細胞の免疫エフェクター機能、例えばサイトカインの分泌を含む細胞溶解活性及びヘルパー活性を促進するシグナルを生成することができる。「膜貫通ドメイン」という用語は、細胞膜にまたがることが知られており、細胞外ドメインとシグナル伝達ドメインを連結するように機能し得る任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。これは、単一のアルファヘリックス、膜貫通ベータバレル、グラミシジンＡのベータ−ヘリックス、又はその他の構造であり得る。典型的には、膜貫通ドメインは、内在性タンパク質としても知られる膜貫通タンパク質の単一の膜貫通アルファヘリックスを示す。キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして機能する「ヒンジドメイン」を任意選択により含み得る。本明細書で使用される「ヒンジ」、「スペーサー」、又は「リンカー」という用語は、例えば、柔軟性、改善された空間構成、及び／又は近接性を与えるために、ポリペプチドコンストラクトの２つ以上のドメイン間で典型的にコードされる可変長のアミノ酸配列を指す。ｓｃＦｖに関連して使用される「リンカー」という用語は、可変重鎖領域及び可変軽鎖領域を１つに連結するために、単独で又は組み合わせて使用されるグリシン及び／又はセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。キメラ抗原受容体は、任意選択によりシグナルペプチドを含み得る。「シグナルペプチド」、「標的シグナル」、「局在化シグナル」、「輸送ペプチド」、又は「リーダー配列」という用語は、分泌経路に向かう、新しく合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチドを指す。シグナルペプチドのコアは、疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。シグナルペプチドは、成熟ポリペプチドから切断されてもよいし、切断されなくてもよい。
【００２５】
本明細書で使用される「抗体（antibody）」及び「抗体（antibodies）」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、抗原結合断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合可変断片（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、ナノボディ、及びこれらのいずれかのエピトープ結合断片を指す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、即ち、抗原結合部位を含む分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧｉ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｉ、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスであり得る。特段の記載がない限り、「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン、及び他の分子への結合を実質的に排除して目的の抗原に特異的に結合する「抗体断片」又は「抗原結合断片」を含む。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ複合体抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態を含む。好ましくは、抗体という用語は、モノクローナル抗体を指し、さらにより好ましくは、モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖを指す。
【００２６】
構造に関しては、抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を有し得る。軽鎖には、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）の２種類がある。各重鎖及び軽鎖には、定常領域及び可変領域（又は「ドメイン」）が含まれる。軽鎖及び重鎖可変領域には、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域が含まれる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲が定義されている（参照により本明細書に組み込まれる、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照されたい）。フレームワーク領域は、鎖内の非共有相互作用によってＣＤＲを正しい向きに配置するための足場を形成するように機能する。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端から順番に数字が付されている。本発明による抗体のＶＬ及びＶＨドメインは、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」を含み得、これらは、当技術分野及び本明細書では、それぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」によって中断され、これらは、当技術分野では、それぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ３」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域及び相補性決定領域は、好ましくは、以下の順序で作動可能に連結されている：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（アミノ末端からカルボキシ末端へ）。
【００２７】
本明細書で使用される「抗体重鎖」は、抗体の立体構造に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。
【００２８】
本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、抗体の立体構造に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指し、κ軽鎖及びλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【００２９】
「ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含むタンパク質を指し、これらの軽鎖及び重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短い柔軟なポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現することができ、ｓｃＦｖは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。特段の記載がない限り、本明細書で使用されるｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、ＶＬ及びＶＨ可変領域をいずれかの順序で有し得、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでもよいし、又はＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。リンカーは、フレームワーク配列の一部を含み得る。
【００３０】
本明細書で使用される「由来する（derive from）」又は「由来する（derived from）」という用語は、親化合物又はタンパク質の構造に由来する構造を有し、その構造が本明細書に開示されるものと十分に類似し、その類似性に基づき、特許請求される化合物と同じ又は類似の特性、活性、及び有用性を示すことが当業者によって恐らく期待される化合物又はタンパク質を指す。例えば、モノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖは、モノクローナル抗体と同じ特性を共有する、例えば、同一又は類似のＶＨ及びＶＬ又はＣＤＲを共有し、及び／又は同じエピトープを認識する抗体断片を指す。
【００３１】
細胞の文脈において、本明細書で使用される「由来する（derive from）」又は「由来する（derived from）」という用語は、例えば感染又は形質転換などの遺伝子操作によって、同じ細胞株の細胞から調製される１つ又はいくつかの細胞を指す。特に、標的抗原発現細胞は、発現される抗原をコードする核酸を細胞株の細胞に導入することによって調製することができる。
【００３２】
同様に、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲをコードする核酸を細胞株の細胞に導入することによって調製することができる。
【００３３】
本明細書で使用される「競合抗体」という用語は、別の抗体によって認識される同じ又は重複するエピトープを認識する抗体を指す。ＣＡＲに関連する場合、競合抗体は、ＣＡＲが由来する抗体又は抗体断片、或いはＣＡＲが認識する同じ又は重複するエピトープを認識する任意の抗体であり得る。
【００３４】
本明細書で使用される「抗原」又は「標的抗原」という用語は、抗体分子、Ｔ細胞受容体、又はＣＡＲなどの特定の体液性又は細胞性免疫の産物によって特異的に結合され得る化合物、組成物、又は物質を指す。本発明が無傷の抗原及びその抗原断片を含むことは容易に明らかである。抗原は、作製する、合成する、又は生物学的サンプルに由来することができる。そのような生物学的サンプルには、限定されるものではないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は生体液が含まれ得る。
【００３５】
本明細書で使用される「ＨＬＡ−Ｇ」及び「ヒト白血球抗原Ｇ」という用語は、限定されるものではないが膜結合アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４）、可溶性アイソフォーム（例えば、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、ＨＬＡ−Ｇ７）、及び膜結合アイソフォームのタンパク質分解切断によって生成される可溶型（例えば：ｓＨＬＡ−Ｇｌ）を含む、そのいくつかのアイソフォームのいずれか１つを含むがこれに限定されない、この名称に関連する特定の分子を指す。
【００３６】
本明細書で使用される「結合する」又は「結合」は、抗原を認識して接触するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、及び抗体（抗体断片を含む）を指す。好ましくは、「結合する」又は「結合」は、抗原−抗体タイプの相互作用を指す。「特異的に結合する」又は「免疫特異的に結合する」は、抗体が特定の抗原を認識するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識しないか、これに結合もしないことを意味する。場合によっては、「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、又はペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、相互作用が特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。本明細書で使用される「特異的結合」という用語は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性での抗体と抗原との間の接触を意味する。
【００３７】
抗体の親和性は、単一の抗原−抗体部位での特定の抗原との結合の尺度であり得、本質的に、抗体の抗原結合部位と特定のエピトープとの間の相互作用に存在するすべての吸引力及び反発力の合計である。特定の抗原に対する抗体の親和性は、抗体結合部位の親和性である、式Ｋ＝［ＡｇＡｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］によって定義される平衡定数Ｋで表すことができ、式中、［Ａｇ］は遊離抗原の濃度であり、［Ａｂ］は遊離抗体の濃度であり、［ＡｇＡｂ］は抗原−抗体複合体の濃度である。抗原と抗体が共に強く反応する場合、遊離抗原も遊離抗体もほとんど存在しないため、抗体の平衡定数又は親和性は高くなる。特に、高い親和性は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性である。結合親和性は、当業者に利用可能な任意の方法によって、特に表面プラズモン共鳴によって測定することができる。
【００３８】
本明細書で使用される「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、及びＢ細胞など）上に存在する場合、Ｔ細胞上の同族の結合パートナー（「刺激分子」とも呼ばれる）と特異的に結合し、それによって、限定されるものではないが活性化、免疫応答の開始、及び増殖などを含むＴ細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを意味する。
【００３９】
本明細書で使用される「共刺激リガンド」という用語は、Ｔ細胞上の同族の結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と呼ばれる）と特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドがロードされたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、限定されるものではないが増殖、活性化、及び分化などを含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、及びＢ細胞など）上の分子を含む。
【００４０】
本明細書で使用される「共刺激分子」は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面のために刺激的に免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する免疫細胞によって発現される分子を指す。一態様では、シグナルは、例えば、ペプチドがロードされたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始される一次シグナルであり、これは、限定されるものではないが増殖、活性化、及び分化などを含むＴ細胞応答の媒介をもたらす。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。特に、この用語は、抗原提示細胞上に存在する共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、限定されるものではないが増殖活性化及び分化などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。
【００４１】
本明細書で使用される「刺激分子」は、抗原提示細胞上に存在する同族の刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【００４２】
本明細書で使用される「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖の活性化及び分化など、及び／又は重要な分子のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。
【００４３】
「刺激」又は「刺激性の」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとが結合し、それによって、限定されるものではないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を意味する。刺激は、ＴＧＦ−βのダウンレギュレーション及び／又は細胞骨格構造の再構成などの、特定の分子の発現の変化を媒介することができる。
【００４４】
本明細書で使用される「免疫細胞」は、例えば、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（white blood cell）（白血球（leukocyte））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、及び骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）などの、自然免疫及び獲得免疫に関与する細胞を指す。特に、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、特にＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＡＰＣ細胞、樹状細胞、及び単球を含む包括的ではないリストから選択することができる。
【００４５】
「ＣＡＲ発現細胞」又は「ＣＡＲ細胞」という用語は、細胞、特にその表面にＣＡＲを産生するように遺伝子操作された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を指す。ＣＡＲ細胞は一般に、癌細胞に発現する特定の抗原を標的とするために作製される。ＣＡＲ抗原結合によって腫瘍細胞が認識されると、ＣＡＲ細胞は、活性化されて癌細胞を殺す。
【００４６】
本明細書で使用される「標的抗原発現細胞」又は「抗原発現細胞」という用語は、細胞、特にその表面に目的の抗原、特に、例えば腫瘍細胞で発現するとして同定された抗原を提示する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を指す。これらの細胞は、抗原を産生するように遺伝子操作することもできるし、或いはその表面に自然に抗原を産生することもできる。
【００４７】
「対照細胞」という用語は、ＣＡＲ（以降、「対照ＣＡＲ細胞」）も目的の抗原も発現しないために対照として使用することができる細胞（以降、「対照細胞」）、好ましくは免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を指す。好ましくは、それらは、ＣＡＲ発現細胞及び／又は標的抗原発現細胞に使用される細胞株と同じ細胞株に属するか、又はそれらから調製／誘導される。
【００４８】
本明細書で使用される「細胞株」という用語は、同じ遺伝的特性を共有する細胞の均質な集団を指す。
【００４９】
「標識」又は「マーカー」という用語は、放射性標識及び非放射性標識を含む、細胞、特に免疫細胞において検出可能な任意の標識を指す。非放射性標識には、例えば、蛍光、発光、又はリン光色素の標識又は色素などの光学的に検出可能な標識が含まれる。標識には、直接検出可能な標識及び間接的に検出可能な標識が含まれる。本明細書で使用される「蛍光標識」という用語は、標識の蛍光発光を介して、例えば蛍光分光法を介して検出可能な任意の標識を指す。標識又はマーカーは、脂質色素などの細胞膜を標識する色素である。
【００５０】
「細胞選別」という用語は、それらのタイプ及び／又は特性に従って細胞を分けるために使用される方法を指す。細胞は、ほとんどの場合、通常は細胞のサイズ、形状（形態）、及び／又は表面タンパク質又はマーカーの発現の違いに依存して分けられる。この方法は、細胞の均質な集団の獲得につながり得る。細胞選別は、単一細胞選別、蛍光細胞選別、磁気細胞選別、又は浮力活性化細胞選別などの当業者に公知の様々な戦略に依存し得る。好ましくは、この用語は、フローサイトメトリーを利用して、細胞集団を選別するための、蛍光標識の発現などの細胞内及び細胞外特性の迅速で客観的且つ定量的な測定を提供する蛍光活性化細胞選別、ＦＡＣＳを指す。
【００５１】
本明細書で使用される「ＣＡＲ発現細胞の機能」という用語は、その生物学的機能を果たすための、細胞、好ましくは免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の能力を指す。ＣＡＲ細胞に関連する場合、この機能は、抗原（即ち、ＣＡＲ細胞が作製された抗原）に結合することによって標的細胞を認識する能力、及びＣＡＲ発現細胞の活性化能力（例えば、抗原を発現する標的細胞の死滅をもたらすシグナル伝達経路を（例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性及びヘルパー活性を介して））活性化する能力を指す。従って、本明細書で使用される「機能的ＣＡＲ細胞」という用語は、標的抗原に結合することができ、この時にシグナル伝達経路の活性化を効果的に誘導し得るＣＡＲ発現細胞を指す。
【００５２】
本明細書で使用される「共培養」という用語は、少なくとも２つの分子又は細胞、好ましくは免疫細胞を培養する行為又はプロセスを指す。本発明の文脈において、細胞の共培養は、細胞、特に、ＣＡＲ細胞及び抗原発現細胞並びに任意選択による対照細胞などの細胞の２つ以上の集団の接触をもたらし得る。
【００５３】
「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」という用語は、本明細書で互換的に使用され、キメラ抗原受容体細胞の作製に適用され、特に、外来又は外因性ヌクレオチド配列が細胞に導入されるプロセスを指す。外因性核酸は、安定的又は一過性に宿主細胞に導入され得る。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされた、形質転換された、又は形質導入された細胞である。いくつかの実施形態では、この形質導入は、ベクター、好ましくはレンチウイルスベクターを介して行われる。
【００５４】
本明細書で使用される「養子細胞療法」又は「養子Ｔ細胞療法」又は「ＡＣＴ」という用語は、患者への細胞の移入を意味し、細胞は、対象に移入する前にエンジニアリングされるか、又は他の方法で変更される。ＡＣＴの例は、対象の血液又は腫瘍、Ｔ細胞などの免疫細胞からの収集である。次いで、これらの免疫細胞は、培養中、エクスビボで刺激され、増殖される。次いで、細胞は、細胞がＣＡＲなどの新しい分子を発現することを可能にする１つ又は複数の核酸コンストラクトが形質導入され、エンジニアリングされた免疫細胞に、疾患、例えば癌と戦うための新しいメカニズムを提供する。場合によっては、ＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇなどの、腫瘍又は癌によって発現される抗原を特異的に認識する抗原結合ドメインを含む。ＡＣＴ手順で利用される典型的な免疫細胞には、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）又はＴ細胞が含まれる。ＡＣＴで使用される免疫細胞は、患者／対象自身、又は万能ドナーに由来し得る。ＡＣＴはまた、対象に注入されて戻された組換え細胞と競合し得る対象自身のリンパ球のリンパ球枯渇の任意選択の工程を伴い得る。
【００５５】
本明細書で使用される「対象」、「宿主」、「個体」、又は「患者」という用語は、ヒト及び獣医学的対象を指し、特に動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは成人及び子供を含むヒトを指す。しかしながら、「対象」という用語はまた、非ヒト動物、特に、中でもイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類などの哺乳動物を包含する。
【００５６】
「処置」という用語は、疾患又は疾患の症状の治療、防止、予防、及び遅延などの患者の健康状態を改善することを目的としたあらゆる行為を指す。処置は、疾患の治癒的処置及び／又は予防的処置の両方を指す。治癒的処置は、治癒をもたらす処置、又は疾患若しくは疾患の症状若しくはそれが直接的又は間接的に引き起こす苦痛を軽減する、改善する、及び／又は排除する、軽減する、及び／又は安定化させる処置として定義される。予防的処置は、疾患の予防をもたらす処置、並びに疾患の進行及び／又は発生率又はその発生リスクを低減及び／又は遅延させる処置の両方を含む。特定の実施形態では、そのような用語は、疾患、障害、感染症、又は感染症に関連する症状の改善又は根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、癌の広がり又は悪化を最小限に抑えることを指す。本発明による処置は、必ずしも１００％又は完全な処置を意味するわけではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する様々な程度の処置である。
【００５７】
本明細書で使用される「核酸コンストラクト」、「プラスミド」、及び「ベクター」という用語は同等であり、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのパッセンジャー核酸配列を宿主細胞に移入するのに役立つ核酸分子を指す。ベクターは、複製起点、選択可能なマーカー、及び任意選択による配列又は遺伝子の挿入に適した部位を含み得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。ベクターはまた、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位などの正しい翻訳開始配列、及び開始コドン、終止コドン、及び転写終止配列を含む発現要素を含み得る。核酸コンストラクトはまた、所与の遺伝子の転写レベルを指示するために、エンハンサー、サイレンサー、及び境界要素／インスレーターなどの他の調節領域を含み得る。作動可能に連結された遺伝子及び／又は核酸配列の発現を誘導することができるベクターはまた、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれることがある。核酸コンストラクト、細菌ウイルスゲノム、ファージミド、ウイルスゲノム、コスミド、及び人工染色体を含むいくつかの一般的なタイプのベクターが存在する。核酸コンストラクトは、遺伝子又は配列の安定的又は一過性の発現のためのベクターであり得る。核酸コンストラクトは、核酸コンストラクトの複製起点（ｏｒｉ）を含み得る。特に、核酸コンストラクトは、限定されるものではないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣを含め、異なる宿主間の遺伝子導入のために設計することができる。好ましくは、核酸コンストラクトはＣＡＲをコードする。
【００５８】
ＣＡＲ発現細胞の機能を評価するための方法
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞の機能を評価するためのインビトロ方法に関し、この方法は、（ｉ）同じ細胞株から調製した標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞を異なる標識で標識すること、（ｉｉ）標識した標的細胞と標識したＣＡＲ発現細胞を共培養すること、（ｉｉｉ）標的抗原発現細胞からのＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析することであって、膜獲得がＣＡＲ発現細胞の標的抗原への結合能力の指標であり、それによって、ＣＡＲ発現細胞の機能を評価する、細胞を分析すること、並びに（ｉｖ）任意選択により、機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又は機能的ＣＡＲコンストラクトを選択することを含む。これらの工程については、以下でより具体的に説明する。
【００５９】
細胞
本発明による細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞であり、典型的には、ヒト、ネコ、又はイヌの細胞、より典型的にはヒト細胞、好ましくは初代ヒト細胞である。さらにより好ましくは、細胞は免疫細胞である。細胞は、対象から、又は市販の培養物から得ることができる。細胞は、自己細胞、同系細胞、同種異系細胞、場合によっては異種細胞でさえあり得る。
【００６０】
一実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、顆粒球、例えば、骨髄細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、及び樹状細胞からなる群から選択することができ、好ましくは、細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、及び樹状細胞などの抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞又は他の細胞型、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びそれらの亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、増殖、再循環、局在化、及び／又は持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官又は区画における存在、マーカー又はサイトカイン分泌プロファイル、及び／又は分化の程度によって定義されるものの１つ又は複数のサブセットを含む。好ましくは、細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、単球、及び抗原提示細胞から選択される免疫細胞である。
【００６１】
特定の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、例えば、動物Ｔ細胞、哺乳動物Ｔ細胞、特にヒトＴ細胞である。Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞、及びそれらのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）、又は最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、自然発生及び適応調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、α／βＴ細胞、及びδ／γＴ細胞がある。市販のＴ細胞株の非限定的な例には、系統ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、Ｎｅｏ  Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））、ＴＡＬＬ−１０４細胞毒性ヒトＴ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１３８６）が含まれる。さらなる例には、限定されるものではないが、成熟Ｔ細胞株、例えば、Deglis、ＥＢＴ−８、ＨＰＢ−ＭＬｐ−Ｗ、ＨＵＴ７８、ＨＵＴ１０２、Karpas３８４、Ｋｉ２２５、Ｍｙ−Ｌａ、Ｓｅ−Ａｘ、ＳＫＷ−３、ＳＭＺ−１、及びＴ３４など；並びに未成熟Ｔ細胞株、例えば、ＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｂｅｌ３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＭＬ−Ｔ１、ＤＮＤ−４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ−９、ＨＤ−Ｍａｒ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｈ−ＳＢ２、ＨＴ−１、ＪＫ−Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ４５、ＫＥ−３７、ＫＯＰＴ−Ｋ１、Ｋ−Ｔｌ、Ｌ−ＫＡＷ、Loucy、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ−１、ＭＯＬＴ３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ１３、ＭＯＬＴ−１６、ＭＴ−１、ＭＴ−ＡＬＬ、Ｐ１２／Ichikawa、Peer、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ−２５５、ＰＦ−３８２、ＰＦＩ−２８５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＴ−４、ＳＵＰ−Ｔ１〜Ｔ１４、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１０１、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０５、ＴＡＬＬ−１０６、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１９７、ＴＫ−６、ＴＬＢＲ−１、−２、−３、及び−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＣＣＬ−１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８７３）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＣＣＬ−１１９）など；並びに皮膚Ｔ細胞リンパ腫株、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ  ＣＲＭ−ＴＩＢ−１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１６２）が含まれる。
【００６２】
例えば、本発明に使用できる適切な免疫細胞には、自己Ｔリンパ球細胞、同種Ｔ細胞、異種Ｔ細胞、これらのいずれかの前駆細胞、形質転換腫瘍又は異種免疫エフェクター細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、細胞毒性リンパ球、又は活性化されたときに標的細胞を殺すことができる他の細胞が含まれる。
【００６３】
他のいくつかの実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞などである。ＮＫ細胞は、単離されるか、又は市販の供給源から得ることができる。市販のＮＫ細胞株の非限定的な例には、系統ＮＫ−９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０７（商標））、ＮＫ−９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２４０８（商標））が含まれる。さらなる例には、限定されるものではないが、ＮＫ系統ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫ−ＹＳ、ＮＯＩ−９０、及びＹＴが含まれる。
【００６４】
そのような市販の細胞株の非限定的で例示的な供給源には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション又はＡＴＣＣ（http://www.atcc.org/）及びドイツ微生物細胞培養物コレクション（https://www.dsmz.de/）も含まれる。
【００６５】
特に、本発明による方法で使用される細胞は、以下の通りである：
−目的の抗原を表面で発現する標的抗原発現細胞、
−ＣＡＲ、好ましくは目的の抗原に特異的に結合するように生成されたＣＡＲを発現するＣＡＲ発現細胞、
−目的の抗原又はこの抗原に結合するために生成されたＣＡＲのいずれか又は両方を発現しない任意選択による制御細胞。
【００６６】
特に、標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞は同じ細胞株から調製される。
【００６７】
一実施形態では、この方法は、標的抗原を発現しない対照細胞をさらに含む。特に、対照細胞は、ＣＡＲ発現細胞によって認識される目的の抗原を発現しないか、又はＣＡＲ発現細胞によって認識されない抗原を発現する細胞である。この対照細胞は陰性対照である。
【００６８】
別の実施形態では、この方法は、標的抗原を認識しない対照ＣＡＲ細胞をさらに含む。特に、対照ＣＡＲ細胞は、標的抗原を認識しないＣＡＲを発現する細胞である。この対照ＣＡＲ細胞は陰性対照である。
【００６９】
特に、対照細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲ発現細胞及び標的抗原発現細胞と同じ細胞株から調製される。
【００７０】
一実施形態では、標的抗原発現細胞によって発現される抗原はＨＬＡ−Ｇである。「ＨＬＡ−Ｇ」は、少なくとも７つのアイソフォームを含むヒト白血球抗原Ｇを表す。好ましくは、標的抗原発現細胞によって発現される抗原は、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、及びＨＬＡ−Ｇ７から選択されるＨＬＡ−Ｇアイソフォームである。
【００７１】
ＨＬＡ−Ｇの一次転写産物は、選択的スプライシングされ、７つのアイソフォームが発現することになり、そのうちの４つは、膜結合型（ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、及びＨＬＡ−Ｇ４）であり、３つは、可溶性（ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、及びＨＬＡ−Ｇ７）である。ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５は、最も豊富なアイソフォームであり、古典的なＨＬＡクラスＩ分子の典型的な構造；β２−ミクログロブリン（β２Ｍ）及びペプチドに非共有結合した３つの球状ドメインで構成される重鎖を示し、他のアイソフォームは、より短く、重鎖の１つ又は２つのドメインを欠き、β２Ｍに結合しないはずである。ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームは、β２−ミクログロブリンに会合したαｌ、α２、及びα３ドメインを有する完全なアイソフォームである。ＨＬＡ−Ｇ２アイソフォームが、α２ドメインを有していないのに対して、ＨＬＡ−Ｇ３は、α２及びα３ドメインを有しておらず、ＨＬＡ−Ｇ４はα３ドメインを有していない。アイソフォームＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、及びＨＬＡ−Ｇ４はいずれもβ２Ｍに結合しない。可溶性ＨＬＡ−Ｇ５及びＨＬＡ−Ｇ６アイソフォームはそれぞれ、ＨＬＡ−Ｇ１と同じ余分な球状ドメイン及びＨＬＡ−Ｇ２と同じ余分な球状ドメインを含む。ＨＬＡ−Ｇ７アイソフォームは、イントロン２によってコードされる２つのアミノ酸に連結されたαｌドメインのみを有する。ＨＬＡ−Ｇ５アイソフォームはβ２Ｍに結合するが、アイソフォームＨＬＡ−Ｇ６及びＨＬＡ−Ｇ７はβ２Ｍに結合しない。
【００７２】
特定の実施形態では、標的抗原発現細胞によって発現される目的の抗原は、β２Ｍを含まないＨＬＡ−Ｇアイソフォームである。
【００７３】
一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞によって発現されるＣＡＲは、いくつかのＨＬＡ−Ｇアイソフォーム、好ましくは２〜５、より好ましくはＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ５、及びＨＬＡ−Ｇ６から選択されるＨＬＡ−Ｇアイソフォームに特異的に結合するＣＡＲである。好ましくは、ＣＡＲ発現細胞によって発現されるＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇ１及びＨＬＡ−Ｇ５の両方、又はＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方に特異的に結合するＣＡＲである。或いは、ＣＡＲ発現細胞によって発現されるＣＡＲは、ＨＬＡ−Ｇ２及びＨＬＡ−Ｇ６の両方に特異的に結合するＣＡＲである。任意選択により、ＣＡＲ発現細胞によって発現されるＣＡＲは、β２Ｍを含まないＨＬＡ−Ｇ又はβ２Ｍ会合ＨＬＡ−Ｇのいずれかに特異的に結合するＣＡＲである。
【００７４】
細胞標識
本発明の方法によると、標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞は、異なる標識で標識される。この方法では１つの標識しか使用できないにもかかわらず、標的抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞に異なる標識を使用することで、この方法の効率が向上する。
【００７５】
次いで、好ましくは、標的抗原発現細胞及び／又は対照細胞は、ＣＡＲ発現及び／又は対照ＣＡＲ細胞を標識するために使用されるマーカーと区別できるマーカーで標識される。
【００７６】
本発明によると、マーカーの量は、細胞を標識してそれを検出可能及び／又は追跡可能にするのに十分な量である。そのような量は、当業者に公知であり、適切な検出システムの選択、並びに十分に当業者の技術の範囲内である適切な量のマーカーの選択によって決まる。
【００７７】
好ましくは、標識は、非毒性及び／又は非変異原性であり、生細胞で検出することができる。しかしながら、本発明の利点は、標識がインビトロで行われるため、変異原性及び／又はわずかに毒性のマーカーも使用できることである。本発明に従って使用することができる標識には、放射性標識及び非放射性標識が含まれる。非放射性標識には、例えば、蛍光、発光、及びリン光標識又は色素、好ましくは蛍光標識又は色素などの光学的に検出可能な標識が含まれる。標識には、直接検出可能な標識及び間接的に検出可能な標識が含まれる。一実施形態では、標識は、蛍光標識、好ましくはフローサイトメトリー分析に適した標識である。
【００７８】
特に、本発明の標識は、脂質マーカー又は色素などの細胞膜に組み込むことができる膜マーカーである。細胞膜に組み込まれるように選択される好ましい蛍光分子は、ＭＩＮＩ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、ＰＫＨ６７、ＭＩＮＩ６７、ＰＫＨ６７−ＰＣＬ、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣＭ−ＤｉＩ、ＤｉＩ、及びＤｉＯである。一実施形態では、細胞を標識するために使用されるマーカーは、ＰＫＨ６７及びＰＫＨ２６からなる群から選択される。
【００７９】
対照細胞が使用される場合、標的抗原を発現しない対照細胞は、標的抗原発現細胞と同じ標識又は異なる標識で標識することができる。同様に、対照ＣＡＲ細胞が使用される場合、標的抗原を認識しない対照ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲ発現細胞と同じマーカー又は異なる標識で標識することができる。
【００８０】
一実施形態では、抗原発現細胞及び／又は対照細胞は、ＰＫＨ６７で標識され、ＣＡＲ発現細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞は、ＰＫＨ２６で標識される、又はその逆もある。
【００８１】
細胞の標識により、ＣＡＲ発現細胞の機能を調べ、任意選択により機能的なＣＡＲ発現細胞を（例えば、蛍光活性化セルソーティング、ＦＡＣＳによって）単離することができる。
【００８２】
当業者に公知の任意の方法を使用して細胞を標識することができ、特に当技術分野で公知の任意の方法を使用して細胞膜を標識することができる。
【００８３】
特に、標的抗原発現細胞及びＣＡＲ発現細胞及び／又は対照細胞の異なる標識での標識は：
（ａ）細胞又は細胞培養物、特に標的抗原発現細胞培養物及び／又はＣＡＲ発現細胞培養物及び／又は対照細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞を提供すること、
（ｂ）培養物又は細胞を、標識、特に、好ましくはＭＩＮＩ２６、ＰＫＨ２６−ＰＣＬ、ＰＫＨ６７、ＭＩＮＩ６７、ＰＫＨ６７−ＰＣＬ、ＰＫＨ２６、及びＰＫＨ２６−ＰＣＬから選択される膜マーカーと接触させること、
（ｃ）任意選択により、過剰な標識を除去するために培養物を洗浄すること、
（ｄ）任意選択により、工程（ｂ）と（ｃ）を繰り返すこと、
（ｅ）任意選択により、細胞又は培養物を、好ましくは少なくとも１日、少なくとも２日、より好ましくは少なくとも４日、さらにより好ましくは少なくとも１週間又は少なくとも２週間さらに培養すること、
（ｇ）任意選択により、標識された細胞を選択及び／又は収集することを含む。
【００８４】
従って、いくつかの実施形態では、細胞集団は、共培養の前に培養組成物中で培養することができる。
【００８５】
共培養
標識後、標的抗原発現細胞、ＣＡＲ発現細胞、及び任意選択による対照細胞を共培養する。
【００８６】
一実施形態では、ＣＡＲ発現細胞は、抗原発現細胞及び／又は対照細胞と共培養される。共培養が、ＣＡＲ発現細胞と抗原発現細胞、又はＣＡＲ発現細胞と対照細胞のいずれかを別々に含む場合、対照細胞と抗原発現細胞を同じマーカーで標識することができる。共培養がＣＡＲ発現細胞と抗原発現細胞及び対照細胞を含む場合、これらの３つの集団のそれぞれは異なるマーカーで標識される。
【００８７】
別の実施形態では、抗原発現細胞は、ＣＡＲ発現細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞と共培養される。共培養が、抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞、又は抗原発現細胞と対照ＣＡＲ細胞のいずれかを別々に含む場合、対照ＣＡＲ細胞とＣＡＲ発現細胞を同じマーカーで標識することができる。共培養が、抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞及び対照ＣＡＲ細胞を含む場合、これらの３つの集団のそれぞれは異なるマーカーで標識される。
【００８８】
共培養がＣＡＲ発現細胞、対照ＣＡＲ細胞、抗原発現細胞、及び対照細胞を含む場合、これらの４つの集団のそれぞれは異なるマーカーで標識される。
【００８９】
細胞は、本発明の細胞によって必要とされる特定の条件に応じて、当業者に公知の任意の方法によって培養することができる。この条件は、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、及び／又はイオンのうちの１つ又は複数を含み得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、培養条件は、ヒト免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の増殖に適した温度、例えば、少なくとも約２５℃、一般的には少なくとも約３０℃、及び一般的には３７℃又は約３７℃を含む。
【００９１】
培養は、ユニット、チャンバー、ウェル、カラム、チューブ、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、又は培養物若しくは細胞を培養するための他の容器などの培養容器内で行うことができる。
【００９２】
好ましくは、共培養は、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、又は少なくとも５時間、好ましくは１〜５時間、さらにより好ましくは１〜３時間行われる。
【００９３】
一実施形態では、共培養は、１：０．５〜１：１０の標的抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞の比率、好ましくは１：１〜１：１０の標的抗原発現細胞とＣＡＲ発現細胞の比率で行われる。好ましくは、培養前の細胞濃度は、少なくとも１０４細胞／ｍＬ、少なくとも１０５細胞／ｍＬ、又は少なくとも１０６細胞／ｍＬ、好ましくは少なくとも１０６細胞／ｍＬ、さらにより好ましくは２×１０６細胞／ｍＬである。
【００９４】
本発明の文脈において、細胞の共培養は、細胞、特に、対照細胞及び／又は対照ＣＡＲ細胞の有無にかかわらず、ＣＡＲ細胞及び抗原発現細胞などの細胞の２つ以上の細胞集団の接触をもたらす。
【００９５】
特定の態様では、この方法は、標的抗原発現細胞をＣＡＲ発現細胞と共培養する前に、この標的抗原発現細胞を抗体、好ましくは、ＣＡＲが由来する抗体と同じ又は重複するエピトープを認識する抗体と共に培養する工程をさらに含む。好ましくは、抗体は、ＣＡＲが由来するモノクローナル抗体のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは、ＣＡＲが由来するモノクローナル抗体の２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含むモノクローナル抗体である。この特定の態様は、ＣＡＲ特異性、即ち、ＣＡＴ活性化が、ＣＡＲ発現細胞のＣＡＲによる標的抗原細胞の抗原の結合を介して行われるかどうかを試験することを可能にする。実際、抗体の存在下でＣＡＲ活性化（及びその後の膜転移）が阻害又は減少する場合、効果が、抗原に対するＣＡＲ効果に特異的であること、及びＣＡＲ発現細胞が標的抗原に特異的であると結論付けることができる。陰性対照は、同じ試験であるが、抗原に結合できない抗体を用いる試験を行うことによって加えることができる。
【００９６】
膜獲得の分析及び細胞選別
トロゴサイトーシスは、ＡＰＣ又は腫瘍細胞のいずれかからエフェクター免疫細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞）への原形質膜及びアンカータンパク質の転移を伴う。トロゴサイトーシスは、細胞間の接触に依存している。実際、トロゴサイトーシスは、エフェクター細胞の抗原特異的活性化を広く反映する能動的プロセスである。この結合(conjugation)中、膜転移は、獲得側細胞の活性化状態に依存し；トロゴサイトーシスは、特異的に認識する抗原を含む細胞の存在下でのＣＡＲ発現細胞の活性化を必要とする。従って、トロゴサイトーシスの程度は、Ｔ細胞及びＢ細胞での抗原受容体シグナル伝達によって、ＮＫ細胞におけるキラー阻害及びキラー活性化受容体によって引き起こされる、Ｂ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、及びＮＫエフェクター細胞などの機能的免疫細胞の活性化に関連している。しかしながら、膜転移は、トロゴサイトーシスを行うＴ細胞がその表面に細胞毒性機能のマーカー：ＣＤ１０７ａも露出させるため、活性化状態だけでなく機能にも関係している。従って、トロゴサイトーシスに基づく方法は、特にＣＡＲ発現細胞に適用される場合に、膜転移を独自の高速な方法にして、エフェクター細胞の特異性と機能を調べることができる。
【００９７】
本発明による方法は、標的抗原発現細胞からのＣＡＲ発現細胞による膜獲得を評価するために細胞を分析する工程を含み、膜獲得は、標的抗原に対するＣＡＲ発現細胞の結合能力及び／又は活性化能力の指標であり、それによってＣＡＲ発現細胞の機能を評価する。
【００９８】
この膜転移は、細胞標識に使用された標識に従って、当業者に公知の任意の方法によって細胞が以前に標識された異なるマーカーによりモニタリングすることができる。
【００９９】
特に、標識が蛍光標識である場合、膜転移は、蛍光顕微鏡法（優れた解像度と正確な定量測定を提供することに加えてデジタル画像を使用できる）又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって分析することができる。
【０１００】
フローサイトメトリーに基づくＦＡＣＳシステムは、当技術分野で周知であり、標的抗原発現細胞から膜を獲得したＣＡＲ発現細胞などの所望の細胞集団をサンプルから分離及び単離することができる。実際、そのような膜転移が起こるときに、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ発現細胞及び抗原発現細胞を標識した２つの標識を含む。
【０１０１】
フローサイトメトリーは、流体の流れを利用して粒子を線形に分離し、粒子が単一ファイルを検出装置に通過させることができるようにする。個々の細胞は、流体の流れの中のそれらの位置及び検出可能なマーカーの存在に従って区別することができる。従って、フローサイトメトリーを使用して、細胞集団の診断プロファイルを作成することができ、異なるカテゴリーの細胞、例えば、抗原発現細胞（例えば、標識１によって）、標的細胞膜を獲得しなかったＣＡＲ発現細胞（例えば、標識２によって）、標的細胞膜を獲得した機能的ＣＡＲ発現細胞（例えば、標識１及び標識２の両方によって）、任意選択による対照細胞（例えば、標識１、２、又は３によって）、及びどの標識も発現しない細胞の区別が可能になる。
【０１０２】
一実施形態では、フローサイトメーターでの細胞の検出は、フローサイトメーターの調査点（interrogation point）で１つ又は複数のレーザーで蛍光色素を励起し、続いて１つ又は複数の光学検出器を使用して色素からの蛍光発光を検出することを含み得る。粒子を検出することに加えて、選別又は分離された粒子（例えば、細胞）の数を決定することが望ましい場合がある。従って、いくつかの実施形態では、方法は、標識された粒子（例えば、抗原発現細胞から膜を獲得したＣＡＲ発現細胞）をカウント及び／又は選別することをさらに含む。粒子の検出、カウント、及び／又は選別では、粒子を含む液体培地が、最初にフローサイトメーターの流路に導入される。流路内にある場合、粒子は、１つ又は複数の検出領域（例えば、調査点）を実質的に一度に１つずつ通過し、各細胞は、単一波長の光源に個々に曝露され、光散乱パラメーター及び／又は蛍光発光の測定値（例えば、２つ以上の光散乱パラメーター及び１つ又は複数の蛍光発光の測定値）が、必要に応じて粒子ごとに個別に記録される。各粒子の記録されたデータは、必要に応じて、リアルタイムで分析されるか、又はコンピュータなどのデータ記憶装置及び分析手段に保存される。米国特許第４，２８４，４１２号に、単一の光源を備えた対象となるフローサイトメーターの構成及び使用が記載され、米国特許第４，７２７，０２０号には、２つの光源を備えたフローサイトメーターの構成及び使用が記載されている。３つ以上の光源を有するフローサイトメーターも使用することができる。例えば、４８８ｎｍの光は、単一の検出領域を有するフローサイトメーターにおける発光の波長として使用することができる。２つの異なる波長で光を放出するフローサイトメーターでは、追加の波長の放出光を使用することができ、対象となる特定の波長は、限定されるものではないが：５３５ｎｍ及び６３５ｎｍなどを含む。従って、細胞のフローサイトメトリーによるアッセイでは、必要に応じて、細胞を励起光に曝露し、１つ又は複数の検出チャネルで各粒子の蛍光を測定することによって、細胞を検出し、一意に識別することができる。励起光は、１つ又は複数の光源からのものであり得、狭帯域又は広帯域のいずれかであり得る。
【０１０３】
検出領域と直列に、検出器、例えば、光増倍管（又は「ＰＭＴ」）などの集光器が使用されて、各粒子を通過する光（場合によっては、前方光散乱と呼ばれる）、検出領域を通る細胞の流れの方向に直交して反射される光（場合によっては、直交光散乱（orthogonal light scatter）又は側方光散乱と呼ばれる）、及び蛍光マーカーで標識されている場合は、粒子が検知領域を通過してエネルギー源によって照明されて細胞から放出される蛍光が記録される。前方光散乱（又はＦＳＣ）、直交光散乱（ＳＳＣ）、及び蛍光発光（ＦＬ１、ＦＬ２など）のそれぞれには、各粒子（又は各「事象」）の個別のパラメーターが含まれる。
【０１０４】
本発明の目的に使用できる対象となるフローサイトメーターには、BD Biosciences FACSCanto（商標）フローサイトメーター、BD Biosciences FACSVantage（商標）、BD Biosciences FACSort（商標）、BD Biosciences FACSCount（商標）、BD Biosciences FACScan（商標）、BD Accuri C6 Plus（商標）、又はMiltenyi MacsQuant（商標）などが含まれ得る。
【０１０５】
一実施形態では、膜転移は、ＰＫＨ６７及びＰＫＨ２６標識の使用に従ってフローサイトメトリー分析によってモニタリングされる。
【０１０６】
抗原発現細胞がＰＫＨ６７で標識され、ＣＡＲ発現細胞がＰＫＨ２６で標識される、又はその逆である実施形態では、膜転移分析はＦＡＣＳによって行われる。この実施形態では、細胞が少なくとも３つのカテゴリー：（ｉ）ＰＫＨ６７のみを発現する細胞、（ｉｉ）ＰＫＨ２６のみを発現する細胞、（ｉｉｉ）ＰＫＨ６７及びＰＫＨ２６の両方を発現する細胞、並びに（ｉｖ）最終的にＰＫＨ２６もＰＫＨ６７も発現しない細胞に分類できるように膜転移が起こることが期待される。従って、ＰＫＨ２６及びＰＫＨ６７標識の両方を発現する細胞のパーセンテージを決定して、抗原発現細胞から細胞膜を効果的に獲得するＣＡＲ発現細胞のパーセンテージをモニタリングすることができ、それによって、抗原−ＣＡＲ相互作用及びＣＡＲ発現細胞の機能をモニタリングする。
【０１０７】
方法が対照細胞又は対照ＣＡＲ細胞をさらに含む実施形態では、対照細胞又は対照ＣＡＲ細胞を、標識ＰＫＨ６７、ＰＫＨ２６、ＤｉＩ、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＣＭ−ＤｉＩ、ＤｉＯ、又は他の親油性色素、又は市販の親油性色素を介したフローサイトメトリーによって分類することができる。
【０１０８】
特に、対照細胞がＰＫＨ６７で標識され、ＣＡＲ発現細胞がＰＫＨ２６で標識される、又はその逆である対照細胞を含む実施形態では、膜転移分析はＦＡＣＳによって行われる。この実施形態では、細胞が少なくとも２つのカテゴリー：（ｉ）ＰＫＨ６７のみを発現する細胞、（ｉｉ）ＰＫＨ２６のみを発現する細胞、（ｉｉｉ）最終的にＰＫＨ２６もＰＫＨ６７も発現しない細胞に分類できるように膜転移が起こらないことが期待される。
【０１０９】
対照ＣＡＲ細胞がＰＫＨ６７で標識され、抗原発現細胞がＰＫＨ２６で標識される、又はその逆である対照ＣＡＲ細胞を含む実施形態では、膜転移分析はＦＡＣＳによって行われる。この実施形態では、細胞が少なくとも２つのカテゴリー：（ｉ）ＰＫＨ６７のみを発現する細胞、（ｉｉ）ＰＫＨ２６のみを発現する細胞、（ｉｉｉ）最終的にＰＫＨ２６もＰＫＨ６７も発現しない細胞、に分類できるように膜転移が起こらないことが期待される。
【０１１０】
特定の実施形態では、この方法は、機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又は機能的ＣＡＲコンストラクトの選択をさらに含む。実際、この方法により、目的の抗原に対して機能的であることが試験された特定のＣＡＲコンストラクトを発現する細胞の選択が可能になる。この方法は、例えば膜転移が起こるパーセンテージのデータ分析によって、目的の抗原に対して最も適切なＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲコンストラクトの選択を可能にする。従って、この方法は、ＣＡＲ発現細胞の機能に影響を与えることが知られている最も適切なＣＡＲ成分（例えば、膜貫通ドメイン、ヒンジ、細胞内ドメイン）の選択も可能にする。機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又は機能的ＣＡＲコンストラクトのこの特定の選択は、ＣＡＲベースの治療を改善するために非常に興味深い。
【０１１１】
養子細胞療法用の機能的ＣＡＲ発現細胞を調製するための方法
遺伝子を細胞に導入して細胞内で遺伝子を発現させる方法は当技術分野で公知である。
【０１１２】
特に、ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を作製するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。発現ベクターの文脈では、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に当技術分野の任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、以下でより具体的に説明される物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように、対象から細胞を単離すること、それらを調製すること、処理すること、培養すること、及び／又はエンジニアリングすること、及び凍結保存の前又は後にそれらを同じ患者に再導入することを含む。
【０１１４】
本明細書では特に、ＣＡＲ発現細胞を作製する方法が提供され、この方法は：（ｉ）ＣＡＲをコードする核酸配列を、単離された細胞の集団に形質導入する工程、（ｉｉ）工程（ｉ）の前記核酸配列の形質導入に成功した前記単離された細胞の亜集団を選択し、それによってＣＡＲ発現細胞を作製する工程を含むか、或いは本質的にそれからなるか、又はなおさらにそれからなる。一態様では、単離された細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞からなる群から選択される。
【０１１５】
本明細書では、ＣＡＲ発現細胞を作製する方法がさらにより具体的に提供され、この方法は：
（ｉ）ＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に形質導入する工程であって、好ましくは、免疫細胞の集団が、処置される対象からの生物学的サンプルから単離されたものである、工程、
（ｉｉ）ＣＡＲを発現する前記単離された細胞の亜集団を選択する工程、及び、
（ｉｉｉ）前記請求項のいずれかに記載の方法によってそれらの機能を評価する工程であって、好ましくは、ＣＡＲが生成された抗原を発現する標的抗原発現細胞についてである、工程、
（ｉｖ）任意選択による、抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞から機能的ＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲ核酸コンストラクトを選択する工程を含むか、或いは本質的にそれからなるか、又はなおさらにそれからなる。
【０１１６】
特定の実施形態では、この方法は：
（ｉ）免疫細胞集団を、好ましくは処置される対象からの生物学的サンプル（例えば、血球）から提供すること、
（ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸配列を免疫細胞の集団に形質導入する前に、特定の免疫細胞集団（例えば、Ｔ細胞、Ｂリンパ球、単球、及び抗原提示細胞、及び／又はＮＫ細胞）を単離することをさらに含む。
【０１１７】
別の実施形態では、この方法は、抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞からＣＡＲ発現細胞及び／又はＣＡＲコンストラクトを選択することをさらに含む。続いて、抗原発現細胞からの膜獲得を経験したＣＡＲ発現細胞に対応する形質導入された免疫細胞コンストラクトをさらに再導入するか、又は対象に投与することができる。この方法は、そのようなエンジニアリングされた細胞のそれを必要とする対象へのあらゆる導入の前にその機能を評価することによって、目的の抗原を標的とするのに最も適切なＣＡＲ発現細胞の選択を可能にする。
【０１１８】
投与を容易にするために、本発明による形質導入細胞は、対象への投与に適していることが当技術分野で公知である任意の方法によって薬学的に許容される担体又は希釈剤を用いて医薬組成物にするか、又はインビボでの投与に適したインプラントにすることができる。
【０１１９】
本発明による方法から選択されたＣＡＲコンストラクトを発現する細胞が対象に投与されると、いくつかの態様におけるエンジニアリングされた細胞集団及び／又は抗体の生物学的活性が、いくつかの既知の方法のいずれかによって測定される。特定の実施形態では、標的細胞を破壊するエンジニアリングされた細胞の能力は、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), and Herman et al. J. Immunological Methods , 285(1): 25-40 (2004)に記載されている細胞毒性アッセイなどの当技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて測定することができる。特定の実施形態では、細胞の生物学的活性はまた、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＭＩＰ−１ａ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、又はＩＬ−２などの特定のサイトカインの発現及び／又は分泌をアッセイすることによって測定することができる。
【０１２０】
いくつかの態様では、生物学的活性は、無増悪生存率、又は全生存率、腫瘍の量又は負荷の減少、腫瘍の安定化などの臨床転帰を評価することによって測定される。
【実施例】
【０１２１】
実施例−結果
ＣＡＲ／ＨＬＡ−Ｇ１相互作用による膜獲得
免疫細胞は、ＡＰＣ又は腫瘍細胞抗原−提示細胞などの標的細胞から細胞表面膜パッチを獲得することが以前に実証された（Caumartin et al., EMBO J, 2007. 26(5): p. 1423-33）。エフェクター細胞による標的細胞からの膜獲得は、（ｉ）細胞間接触を必要とし、（ｉｉ）迅速であり、且つ（ｉｉｉ）獲得側細胞の活性化状態に依存する能動的プロセスであり、獲得側細胞の活性化状態は、（ｉｖ）エフェクター細胞の抗原特異的活性化を反映する。従って、膜転移は、機能的に成熟した免疫細胞の活性化に関連している。
【０１２２】
ＣＡＲの結合後に、エフェクター細胞を活性化して、標的細胞から膜パッチを獲得できるかどうかを調べた。この目的のために、ＨＬＡ−Ｇ／ＣＡＲ相互作用ではないその他のバイスタンダーのタンパク質間相互作用を回避するために、エフェクター細胞及び標的細胞としてＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株を使用して実験を設定した。これは、細胞間の接触がＣＡＲ−抗原相互作用によってのみ媒介／駆動されることを意味する。
【０１２３】
図１に示されているように、Ｊｕｒｋａｔ標的細胞の膜を、ＰＫＨ６７蛍光色素を使用して緑色で標識し、ＪｕｒｋａｔエフェクターＣＡＲ細胞膜を、ＰＫＨ２６蛍光色素を使用して赤色で標識した。膜転移がＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ相互作用に関連しているかどうかを判断するために、まずＨＬＡ−Ｇ発現標的細胞とＣＡＲエフェクター細胞との間の膜転移の程度を比較した。この目的のために、２つの異なるＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲコンストラクトを、ＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームへの結合に応じて作製し：ＬＦＴＴ−１抗体パラトープに基づくＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲは、β２Ｍに会合したＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームに特異的であるが、１５Ｅ７抗体パラトープに基づく「対照ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ」は、β２Ｍに会合していないＨＬＡ−Ｇ１アイソフォームにのみ特異的である。Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ１細胞株は、１５Ｅ７ではなくＬＦＴＴ−１抗体によってのみ認識されるβ２Ｍアイソフォームに会合したＨＬＡ−Ｇ１のみを発現した。図２Ａに示されているように、標的細胞でのＨＬＡ−Ｇ発現の非存在下では、エフェクターＣＡＲ細胞による標的細胞からの膜獲得は期待されない。しかしながら、図２Ｂでは、ＨＬＡ−Ｇ発現標的細胞の存在下で、特定のＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ会合標的細胞から膜パッチを獲得する必要があるが、対照ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７  ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞は獲得する必要がない。
【０１２４】
標的細胞及びエフェクター細胞を１時間及び３時間共培養し、フローサイトメトリーで膜転移を分析した。図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、共培養の前は、ＣＡＲエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｇを発現しているかどうかにかかわらず腫瘍標的細胞から膜を獲得しなかった。１時間の共培養後、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍタンパク質に特異的でないＣＡＲエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１形質導入細胞からもＨＬＡ−Ｇ１陰性腫瘍細胞からも膜パッチを獲得しなかった。しかしながら、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ特異的ＣＡＲ細胞の１５．９％は、ＨＬＡ−Ｇ１腫瘍細胞から既に膜パッチを獲得しているが、ＨＬＡ−Ｇ１陰性の対応物からは獲得していない。
【０１２５】
要するに、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ発現腫瘍細胞とＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ抗原に特異的なＣＡＲエフェクター細胞との間での膜転移が実証された。
【０１２６】
膜獲得は迅速なプロセスである
ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ腫瘍細胞とＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲエフェクター細胞との間の膜転移は、ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲエフェクター細胞のほぼ２２％がトロゴサイトーシスを行うことができる３時間の共培養後に確認された。それでも、１５Ｅ７  ＣＡＲ細胞は、３時間の共培養後でも、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ標的細胞から膜を獲得できなかった。図４に示されているように、膜転移は１時間の共培養後にＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲエフェクター細胞の＋／−３２％に関係し、３時間の共培養後にトロゴサイトーシスの可能なエフェクター細胞の割合が＋／−４０％までわずかに増加したため、膜獲得の速度は迅速である。
【０１２７】
これらの結果は、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲエフェクター細胞がＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ陽性腫瘍細胞からのみ膜断片を獲得したのに対して、ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７  ＣＡＲエフェクター細胞はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ陽性腫瘍細胞から膜パッチを獲得しなかったため、膜転移は迅速であり、抗原／ＣＡＲ特異的相互作用にのみ関連することを示した。
【０１２８】
膜獲得はＣＡＲの特異性に依存する
次いで、トロゴサイトーシスとＣＡＲの特異性との間の関係を評価した。評価するために、図５に図式化されているように、トロゴサイトーシス実験の前に、ＨＬＡ−Ｇ１形質導入腫瘍細胞を、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲコンストラクトを作製するためにそのパラトープを使用したＬＦＴＴ−１抗体、又はそのアイソタイプ対照抗体のいずれかと培養した。次いで、ＨＬＡ−Ｇ１  ＣＡＲエフェクター細胞をこれらの腫瘍細胞と１時間培養し、膜獲得をフローサイトメトリーで調べた（図６Ａ）。アイソタイプ対照抗体との前培養は、ＨＬＡ−Ｇ１  ＣＡＲエフェクター細胞がトロゴサイトーシスを行うのを阻害しなかった（図６Ｂ）。それでも、ＬＦＴＴ−１の前培養は、トロゴサイトーシスプロセスをほぼ完全に無効にした。
【０１２９】
トロゴサイトーシスは、抗原とＣＡＲの相互作用によって媒介される標的細胞とエフェクター細胞との間の細胞間接触に依存している。この目的のために、ＬＦＴＴ−１抗体との前培養が、ＨＬＡ−Ｇ１腫瘍細胞とＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲ細胞との間での複合体形成を阻害できるかどうかを調べた（図７Ａ）。ＬＦＴＴ−１抗体との前培養が標的細胞とＣＡＲエフェクター細胞との間の相互作用をブロックしたため、トロゴサイトーシスが阻害されたと判断した。実際、ＨＬＡ−Ｇ１  ＣＡＲエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１腫瘍細胞との細胞間接触を確立することができなくなり、膜を獲得することができなくなった（図７Ｂ）。
【０１３０】
要するに、トロゴサイトーシスは、膜転移が、（ｉ）特異的であり、（ｉｉ）ＣＡＲ／抗原相互作用によって媒介され、細胞間接触に依存し、且つ（ｉｖ）迅速であるため、ＣＡＲ特性を決定するための強力な方法である。ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７  ＣＡＲエフェクター細胞ではなく、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１のみによるＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ発現標的細胞からのトロゴサイトーシスは、トロゴサイトーシスがＣＡＲ特異性の決定に特に関連することを実証した。
【０１３１】
膜転移はＣＡＲ相互作用細胞に特異的である
ＣＡＲ刺激に続いて、ＣＡＲ活性化エフェクター細胞が抗原特異的発現腫瘍細胞とのみ相互作用するかどうか、又はそれらがバイスタンダー効果を有し得るかどうかをさらに調べた。そのために、赤色で標識されたＨＬＡ−Ｇ１陰性腫瘍細胞と緑色で標識されたＨＬＡ−Ｇ１陽性腫瘍細胞及び青色で標識されたＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲエフェクター細胞（図８）を１時間共培養した。次いで、ＣＡＲエフェクター細胞による膜獲得をフローサイトメトリーによって分析した。図９に示されているように、共培養後、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲエフェクター細胞は緑色の膜パッチのみを獲得し、活性化されたＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲエフェクター細胞はＨＬＡ−Ｇ１発現腫瘍細胞とのみ相互作用し、バイスタンダー細胞とは相互作用しないことを実証している。
【０１３２】
観察された膜転移は、標的細胞を同定するために使用された色素による影響を受けなかった。図１０、図１１Ａ、及び図１１Ｂに示されているように、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲエフェクター細胞は、ＨＬＡ−Ｇ１発現腫瘍細胞から同程度に赤色又は緑色の膜色素を獲得し、トロゴサイトーシスが使用した膜色素に依存しなかったことを示している。
【０１３３】
材料及び方法
細胞株
Ｊｕｒｋａｔ細胞株は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＴＩＢ−１５２）から購入したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｊｕｒｋａｔ細胞株に、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１、又はＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７  ＣＡＲレンチウイルスそれぞれを形質導入した。Ｊｕｒｋａｔ  ｗｔ及びＪｕｒｋａｔ形質導入細胞株を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（Ｘ）、並びに１０％熱不活化ＦＣＳ（Invitrogen）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）で培養した。
【０１３４】
Ｊｅｇ−３細胞株は、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＨＴＢ−３６）から購入したヒト絨毛癌細胞である。これらを、１ｍｇ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（Ｘ）、並びに１０％熱不活化ＦＣＳ（Invitrogen）を添加したＭＥＭ（Ｘ）で培養した。
【０１３５】
ＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ  Ｊｕｒｋａｔ細胞
ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１及びＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７  ＣＡＲコンストラクトを、既に説明したように作製した［７］。簡単に説明すると、抗ＨＬＡ−Ｇ認識ドメインは、ＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍ会合特異的抗体ＬＦＴＴ１（引用特許ＣＡＲ  ＨＬＡ−Ｇ）又はＨＬＡ−Ｇ１／β２Ｍを含まない特異的抗体１５Ｅ７（引用特許）に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ＩｇＧ１ヒンジ領域に由来する短いスペーサーを使用して、このｓｃＦｖを膜貫通ドメインに連結させた。ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ内部ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及びＣＤ３ｚ活性化分子の融合によって構成されていた。ＣＡＲコンストラクトを、ＣＭＶ前初期プロモーター下で、特定のプライマーを用いたＰＣＲによる抽出後、消化／ライゲーションによってｐＴｒｉｐプラスミドベクターにクローン化した。
【０１３６】
ＨＬＡ−Ｇ  Ｊｕｒｋａｔ細胞
ＨＬＡ−Ｇを発現する安定したＪｕｒｋａｔ細胞株を、形質導入によって作製し、レンチウイルス粒子を次のように作製した：Longmei Zhao et al.［３８］に従ってネイティブＨＬＡ−Ｇ１  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００２１２７．５）修飾Ｋ３３４Ａ及びＫ３３５Ａに対応する特定の配列を、ＣＭＶ前初期プロモーター下で、特定のプライマーを用いたＰＣＲによる抽出後、消化／ライゲーションによってｐＴｒｉｐプラスミドベクターに個別にクローン化した。
【０１３７】
レンチウイルスベクター
ＨＩＶ−１由来のベクター粒子を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）と組換えプラスミドｐＴＲＩＰ、ＶＳＶ由来の糖タンパク質をコードするエンベロープ発現プラスミド、Indiana血清型糖タンパク質、及びｐ８．７４キャプシド形成プラスミドのリン酸カルシウム共トランスフェクションによって作製した。ウイルスストックを、形質導入ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの細胞溶解物のリアルタイムＰＣＲによって漸増し、１ｍｌ当たりの形質導入単位（ＴＵ）として表した。
【０１３８】
Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１、ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７  ＣＡＲ細胞、及びＪｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇを作製するために、１×１０５のＪｕｒｋａｔ細胞を、５００μｌのｃＲＰＭＩ培地及び１０６ＴＵ（２９３Ｔ）のＴｒｉｐ  ＣＭＶ−ＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１、Ｔｒｉｐ  ＣＭＶ−ＣＡＲ−ＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７、又はＴｒｉｐ  ＣＭＶ−ＨＬＡ−Ｇベクターそれぞれを含む１２ウェルプレートに播種した。細胞を３７℃で１時間培養し、次いで、３７℃、１２００ｇで１時間遠心分離した。その後、１ｍｌのｃＲＰＭＩ培地を添加し、３７℃で培養した。２週間後、陽性細胞を抗ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用したフローサイトメトリーで選別した。ＨＬＡ−Ｇの発現を、Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲ活性化アッセイの前にフローサイトメトリーによって評価した。
【０１３９】
トロゴサイトーシス実験
Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ  ＣＡＲエフェクター細胞及びＪｕｒｋａｔ又はＪｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ１腫瘍細胞のいずれかをそれぞれ、製造元の仕様書に従って、ＰＫＨ２６及びＰＫＨ６７蛍光色素（Sigma）で標識した。
【０１４０】
トロゴサイトーシスアッセイでは、Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１又はＨＬＡ−Ｇ−１５Ｅ７  ＣＡＲ（「獲得側」細胞）をＪｕｒｋａｔ又はＪｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ１細胞（「ドナー」細胞）のいずれかと、１時間、１：１のエフェクター−腫瘍比、総濃度２×１０６細胞／ｍＬ、３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Lemaoult et al. 2007 Blood J; Caumartin et al. 2007 EMBO J）で共培養した。共培養の最後に、細胞を氷上に置き、すべてのさらなる工程を４℃未満で行った。ＣＡＲエフェクター細胞による腫瘍細胞膜の獲得をフローサイトメトリーによって調べた。言及されている場合、結合細胞は、ＦＡＣＳ獲得の前にボルテックスによって解離された。
【０１４１】
フローサイトメトリー分析
Divaソフトウェア（BD Bioscience）を搭載したBD LSR FORTESSAを使用して、次の実験条件で分析を行った：ｐＨ７．４のＰＢＳ等張緩衝液に懸濁した細胞、３２０〜３３０  ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧、分析した細胞数は１０，０００。
【０１４２】
ＣＡＲブロッキング手順
ＨＬＡ−Ｇ／ＣＡＲ相互作用をブロックするために、Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ−ＬＦＴＴ−１  ＣＡＲエフェクター細胞との共培養実験の前に、Ｊｕｒｋａｔ  ＨＬＡ−Ｇ腫瘍細胞を５μｇ／ｍｌのブロッキングＬＦＴＴ−１抗体又はそのＩｇＧ１アイソタイプ対照と前培養した。
【０１４３】
統計分析
データは平均値＋／−標準偏差（ＳＤ）として表す。スチューデントのｔ検定を使用して、０．０５未満のＰ値が有意であると見なした。代表的な実験を示す図では、エラーバーは３連のＳＤを表す。
【０１４４】
結論
本明細書では、ＣＡＲ機能を決定するための標的細胞と活性化エフェクター細胞との間の膜転移に基づく新しい方法を報告している。さらに、膜獲得の程度は、エフェクター細胞の活性化状態と直接相関している。
【０１４５】
この方法は、トロゴサイトーシスパラメーターに基づいて、ＣＡＲの特異性、機能、及び感度を迅速に決定及び評価するための独自のアッセイである。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【国際調査報告】
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