(57)【要約】  ヌクレアーゼシステムのノックアウトによってインビトロ生合成活性を調節するための方法が提供される。具体的に、その方法は、いくつかのヌクレアーゼの中から５つのヌクレアーゼをスクリーニングする工程と、５つのヌクレアーゼのうちの１つ（例えば、ＥＸＮ５３など）に対してダウンレギュレーションまたはノックアウトを実行する工程とを含む。この方法は、核酸の安定性およびインビトロタンパク質合成系のタンパク質産生効率を著しく改善することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ無細胞タンパク質合成系であって、
（ａ）酵母細胞抽出物と、
（ｂ）ポリエチレングリコールと、
（ｃ）選択可能にある外来性スクロースと、
（ｄ）水または水性溶媒である選択可能にある溶媒と、を含み、
前記酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含み、
前記酵母細胞抽出物中の前記ＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とするインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項２】
前記ＥＸＮ５３タンパク質は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびクルイベロマイセス（Kluyveromyces）からなる群より選択される酵母の１つ以上の供給源に由来する（好ましくは、前記クルイベロマイセスに由来する）請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項３】
前記ＥＸＮ５３タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号１である請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項４】
前記ＥＸＮ５３タンパク質のタンパク質配列は、配列番号６である請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項５】
前記酵母細胞抽出物中の前記ＥＸＮ５３タンパク質の前記含有量は、ゼロである請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項６】
前記無細胞タンパク質合成系は、
（ｅ１）ＲＮＡ合成基質と、
（ｅ２）タンパク質合成基質と、
（ｅ３）マグネシウムイオンと、
（ｅ４）カリウムイオンと、
（ｅ５）緩衝溶媒と、
（ｅ６）ＲＮＡポリメラーゼと、
（ｅ７）エネルギー再生系と、からなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項７】
酵母細胞抽出物であって、
前記酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含み、前記酵母細胞抽出物中の前記ＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とする酵母細胞抽出物。
【請求項８】
請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系を製造する方法であって、前記方法は、
請求項１に記載の前記インビトロ無細胞タンパク質合成系を得るために、（ａ）前記酵母細胞抽出物、（ｂ）前記ポリエチレングリコール、（ｃ）前記選択可能にある外来性スクロース、および（ｄ）前記選択可能にある溶媒を混合する工程を含み、
前記溶媒は、水または水性溶媒であり、
前記酵母細胞抽出物は、前記ＥＸＮ５３タンパク質を含有し、
前記酵母細胞抽出物中の前記ＥＸＮ５３タンパク質の前記含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とするインビトロ無細胞タンパク質合成系を製造する方法。
【請求項９】
インビトロタンパク質合成のための方法であって、前記方法は、
（ｉ）請求項１に記載の前記インビトロ無細胞タンパク質合成系を提供し、タンパク質合成を誘導するための外来性ＤＮＡ分子を添加する工程と、
(ｉｉ）適切な条件下で、前記工程（ｉ）で提供される前記インビトロ無細胞タンパク質合成系を、Ｔ１の期間インキュベートし、前記外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質を合成する工程と、を含み、
前記タンパク質合成系における前記ＥＸＮ５３タンパク質の前記含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とするインビトロタンパク質合成のための方法。
【請求項１０】
前記方法は、（ｉｉｉ）任意選択で、前記タンパク質合成系から前記外来性ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質を単離する工程、および／または、前記タンパク質合成系から前記外来性ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質を検出する工程をさらに含む請求項９に記載のインビトロタンパク質合成のための方法。
【請求項１１】
前記外来性ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される請求項９に記載のインビトロタンパク質合成のための方法。
【請求項１２】
エンジニアリング株であって、
前記エンジニアリング株は、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）株であり、
前記クルイベロマイセス株におけるＥＸＮ５３遺伝子（ヌクレアーゼ遺伝子）の発現レベルまたは活性は、低減されることを特徴とするエンジニアリング株。
【請求項１３】
前記発現レベルまたは活性の前記低減は、前記ＥＸＮ５３遺伝子の前記発現レベルが１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを指す請求項１２に記載のエンジニアリング株。
【請求項１４】
前記ＥＸＮ５３遺伝子の前記発現レベルまたは活性の前記低減は、Ａ１とＡ０の比率が、３０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下、最も好ましくは０〜２％の範囲である（Ａ１は前記ＥＸＮ５３遺伝子の前記発現レベルまたは活性に対応し、Ａ０は野生型ＥＸＮ５３遺伝子の発現レベルまたは活性に対応する。）という条件を満たす請求項１２に記載のエンジニアリング株。  
【請求項１５】
インビトロタンパク質合成の効率を改善するための請求項１２に記載のエンジニアリング株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、ヌクレアーゼシステムのノックアウトによってインビトロ生合成活性を調節するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、細胞における重要な分子であり、細胞のほとんど全ての機能の実行に関与する。タンパク質の配列および構造は、その機能を決定する。細胞において、タンパク質は、酵素類として種々の生化学反応を触媒することができ、シグナル分子として生物体の種々の活動を協調することができ、生物形態をサポートし、エネルギーを蓄積し、分子を輸送し、生物体を動かせることができる。生体医学の分野では、標的薬物として、抗体（タンパク質の一種）は、がんや他の疾病[1][2]を治療するための重要な手段である。
【０００３】
細胞では、栄養欠乏などの外界圧力に応答するだけでなく、細胞の発生や分化など様々なプロセスにおいて、タンパク質翻訳の調節が重要な役割を果たしている。タンパク質翻訳の４つのプロセスには、翻訳開始、翻訳伸長、翻訳終結およびリボソームのリサイクリングがある。その中でも、翻訳開始が最も調節されたプロセス[3]である。翻訳開始段階では、リボソームの小サブユニット（４０Ｓ）が（ｔＲＮＡ）ｉＭｅｔに結合し、翻訳開始因子の助けを借りてｍＲＮＡの５’末端を認識する。小サブユニットは、下流に移動し、開始コドン（ＡＴＧ）の位置でリボソームの大サブユニット（６０Ｓ）に結合して完全なリボソームを形成する。次に、翻訳伸長フェーズが開始される[4]。
【０００４】
インビトロ生合成系は、細菌、真菌、植物細胞、または動物細胞に基づく溶解系を指す。これは、特定の化学分子または生体高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質）の迅速かつ効率的な翻訳を完了するために、核酸ＤＮＡ、ＲＮＡ、基質、およびエネルギー源が添加される。一般に使用されるインビトロ生合成系は、外来性組換えタンパク質[5]の迅速かつ効率的な翻訳を達成するために、外来性ｍＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型および細胞溶解物を使用するインビトロタンパク質合成系である。
【０００５】
現在、市販されており、一般的に使用されているインビトロタンパク質合成系の１つは、インビトロ転写−翻訳システム（in vitro transcription-translation system）（ＩＶＴＴシステムと略される）である。これは、ＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡ中間体に転写し、次いで、アミノ酸、ＡＴＰなどを含む成分を使用することによって、外来性タンパク質のワンステップの効率的な翻訳を完了する。一般に使用される市販のインビトロタンパク質発現系には、大腸菌抽出物（Escherichia coli extract,ＥＣＥ）系、ウサギ網状赤血球溶解物（Rabbit reticulocyte lysate,ＲＲＬ）系、コムギ胚芽抽出物（wheat germ extract,ＷＧＥ）系、昆虫細胞抽出物（insect cell extract,ＩＣＥ）系、およびヒト供給源系が含まれる。
【０００６】
ｍＲＮＡおよびＤＮＡの核酸は、インビトロタンパク質合成系におけるコード基質である。それらの安定性は、タンパク質の収率に影響を及ぼす。ヌクレアーゼは、核酸分解の第一段階において、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合を加水分解する一種のタンパク質である。ＲＮＡにのみ作用するいくつかのヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）として知られている。ＤＮＡにのみ作用するいくつかのヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）として知られている。作用部位によって、ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ（exonuclease）とエンドヌクレアーゼ(endonuclease)のカテゴリーに分けられる。細胞内のＲＮＡの大部分は、細胞質の５’から３’のエキソヌクレアーゼと、核の５’から３’のエキソヌクレアーゼを介して、あるいは、細胞質と核に位置する３’から５’のエキソヌクレアーゼとエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質サブユニット複合体エキソソーム（exosome）を介して分解される。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復／ＣＲＩＳＰＲ関連）（Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated）は、細菌や古細菌に広く存在する生体防御システムである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの中で、修正タイプＩＩシステム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）は、ゲノム改変のために広く使用されるツールとなっている。誘導ＲＮＡ(guide RNA,ｇＲＮＡ)の誘導下で、Ｃａｓ９タンパク質は、ゲノム上のプロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif, ＰＡＭ）およびその上流２０ｂｐ配列を認識し、ＰＡＭの第３ｂｐ上流の位置に二本鎖ニックを作り出す。同時にドナーＤＮＡ(donor DNA)を供与する場合には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の二本鎖により切断された遺伝子をＨＤＲの方法で新しい配列と組み込んで組換えることにより、遺伝子改変の目的を達成することができる。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に関しては、遺伝子点突然変異、遺伝子ノックアウト、遺伝子挿入などを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたゲノム改変の例が多い。
【０００８】
現在のインビトロ（in vitro）合成系にはいくつかのヌクレアーゼが存在する可能である。それによって、これらのヌクレアーゼは、インビトロ合成系においてｍＲＮＡおよびＤＮＡを分解することによって、インビトロ合成系における核酸の安定性に影響を及ぼす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、核酸を安定化することによって外来性タンパク質の安定な発現を達成するための方法を開発するための緊急の必要性が当該分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、核酸を安定化することによって、外来性タンパク質の安定した発現を達成するための方法を提供することである。
【００１１】
第一の態様によれば、本発明は、インビトロ無細胞タンパク質合成系を提供する。それは、
（ａ）酵母細胞抽出物と、
（ｂ）ポリエチレングリコールと、
（ｃ）選択可能にある外来性スクロースと、
（ｄ）選択可能にある溶媒と、を含み、
溶媒は、水または水性溶媒であり、酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下である。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、ゼロである。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、ＥＸＮ５３は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびクルイベロマイセス（Kluyveromyces）からなる群から選択される酵母の１つ以上の供給源に由来し、好ましくはクルイベロマイセスに由来する。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、クルイベロマイセは、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）および／またはクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）を含む。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、ＥＸＮ５３タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号１として示される。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、ＥＸＮ５３タンパク質のタンパク質配列は、配列番号６として示される。
【００１７】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、
（ｅ１）ＲＮＡ合成基質、
（ｅ２）タンパク質合成基質、
（ｅ３）マグネシウムイオン、
（ｅ４）カリウムイオン、
（ｅ５）緩衝液、
（ｅ６）ＲＮＡポリメラーゼ、および
（ｅ７）エネルギー再生系（システム）、からなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、
（ｅ８）ヘム（heme）、および
（ｅ９）スペルミジンからなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、およびそれらの組合せからなる群から選択される酵母の１つ以上の供給源に由来する。好ましくは、酵母細胞は、クルイベロマイセス、より好ましくは、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）および／またはクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）を含む。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、酵母細胞抽出物は、酵母細胞の水性抽出物である。
【００２１】
別の好ましい実施形態において、酵母細胞抽出物は、酵母内因性長鎖核酸分子を含まない。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、酵母細胞抽出物は、以下の工程を含む方法を使用することによって調製される。その工程は、
（ｉ）酵母細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）洗浄された酵母細胞を得るために、酵母細胞を洗浄する工程と、
（ｉｉｉ）洗浄された酵母細胞を細胞溶解処理で処理して、粗酵母抽出物を得る工程と、
（ｉｖ）固液分離によって、粗酵母抽出物を処理して液相、すなわち酵母細胞抽出物を得る工程と、を含む。
【００２３】
別の好ましい実施形態では、固液分離は、遠心分離を含む。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、遠心分離は、液体状態で行われる。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、遠心分離条件は、５，０００×ｇ〜１００，０００×ｇの範囲であり、より好ましくは８，０００×ｇ〜３０，０００×ｇの範囲である。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、遠心分離時間は、０．５時間〜２時間の範囲であり、より好ましくは２０分〜５０分の範囲である。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、遠心分離は、１〜１０°Ｃ、より好ましくは２〜６°Ｃで実施される。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、洗浄処理は、ｐＨ７〜８（好ましくはｐＨ７．４）の洗浄液を使用して実施される。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、洗浄液は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸カリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、細胞溶解処理のための方法は、高圧溶解および凍結融解（例えば、液体窒素低温での処理）溶解を含む。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、ＲＮＡを合成するための基質は、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド三リン酸、およびそれらの組合せを含む。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、タンパク質を合成するための基質は、１〜２０種類の天然アミノ酸、および非天然アミノ酸を含む。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、マグネシウムイオンは、マグネシウムイオン源に由来する。そして、マグネシウムイオン源は、酢酸マグネシウム、グルタミン酸マグネシウム、またはそれらの組合せである。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、カリウムイオンは、カリウムイオン源に由来する。そして、カリウムイオン源は、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、またはそれらの組合せである。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、エネルギー再生系は、ホスホクレアチン／ホスホクレアチナーゼ系、解糖経路およびその中間産物エネルギー系、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３６】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、（ｆｌ）合成ｔＲＮＡをさらに含む。
【００３７】
別の好ましい実施形態において、緩衝液は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、無細胞タンパク質合成系は、（ｇｌ）タンパク質合成をガイドするための外来性ＤＮＡ分子をさらに含む。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子は、線状である。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子は、環状である。
【００４１】
別の好ましい実施形態において、ＤＮＡ分子は、外来性タンパク質をコードする配列を含む。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質をコードする配列は、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列を含む。
【００４３】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質をコードする配列は、プロモーター配列、５’非翻訳配列、および／または３’非翻訳配列をさらに含む。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ヌクレオシド三リン酸、アミノ酸、クレアチンリン酸（ホスホクレアチン）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ホスホクレアチナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含む。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ３３５０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４６】
別の好ましい実施形態において、ポリエチレングリコールは、２００〜１０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコール、好ましくは３，０００〜１０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールを含む。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ａ）の濃度（ｖ／ｖ）は、タンパク質合成系の総体積に基づいて、２０％〜７０％、好ましくは３０％〜６０％、より好ましくは４０％〜５０％の範囲である。
【００４８】
別の好ましい実施形態ではタンパク質合成系において、成分（ｂ）の濃度（ｗ／ｖ、例えば、ｇ／ｍＬ）は、０．１％〜８％、好ましくは０．５％〜４％、より好ましくは１％〜２％の範囲である。
【００４９】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、成分（ｃ）の濃度は、タンパク質合成系の総体積に基づいて、０．２％〜４％、好ましくは０．５％〜４％、より好ましくは０．５％〜１％の範囲である。
【００５０】
別の好ましい実施形態において、ヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、成分（ｅ１）の濃度は、０．１ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜３ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜１．５ｍＭの範囲である。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、アミノ酸は、Ｄ型のアミノ酸および／またはＬ型のアミノ酸を含む。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、成分（ｅ２）の濃度は、０．０１ｍＭ〜０．４８ｍＭ、好ましくは０．０４ｍＭ〜０．２４ｍＭ、より好ましくは０．０４ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲であり、最も好ましくは０．０８ｍＭである。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ｅ３）の濃度は、１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭ、より好ましくは２ｍＭ〜４ｍＭの範囲である。
【００５６】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ｅ４）の濃度は、３０ｍＭ〜２１０ｍＭ、好ましくは３０ｍＭ〜１５０ｍＭ、より好ましくは３０ｍＭ〜６０ｍＭの範囲である。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ｅ６）の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０２ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０２７ｍｇ／ｍＬ〜０．０５４ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００５８】
別の好ましい実施形態で、はタンパク質合成系において、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸の濃度は、５ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは１５ｍＭ〜３０ｍＭ、さらに好ましくは２０ｍＭ〜２５ｍＭの範囲である。
【００５９】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、酢酸カリウムの濃度は、２０ｍＭ〜２１０ｍＭ、好ましくは３０ｍＭ〜２１０ｍＭ、より好ましくは３０ｍＭ〜１５０ｍＭ、さらに好ましくは３０ｍＭ〜６０ｍＭの範囲である。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、酢酸マグネシウムの濃度は、１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭ、より好ましくは２ｍＭ〜４ｍＭの範囲である。
【００６１】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、ホスホクレアチンの濃度は、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは２５ｍＭの範囲である。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、ヘムの濃度は、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ、好ましくは０．０２ｍＭ〜０．０８ｍＭ、より好ましくは０．０３ｍＭ〜０．０５ｍＭ、さらに好ましくは０．０４ｍＭの範囲である。
【００６３】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、スペルミジンの濃度は、０．０５ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜０．８ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ〜０．５ｍＭ、さらに好ましくは０．３ｍＭ〜０．４ｍＭ、最も好ましくは０．４ｍＭの範囲である。
【００６４】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度は、０．２ｍＭ〜１５ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜７ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜２ｍＭの範囲である。
【００６５】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、クレアチンホスホキナーゼの濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．２７ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００６６】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０２ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０２７ｍｇ／ｍＬ〜０．０５４ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００６７】
別の好ましい実施形態において、無細胞インビトロ合成系は、以下の特性を有する。
合成系において、合成されたタンパク質の総量は、合成系のミリリットル（ｍＬ）あたり３μｇのタンパク質に達する。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、以下の成分を含む。
2021503951.tif 000002
【００６９】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系はまた、以下の成分を含む。
2021503951.tif 000003
【００７０】
別の好ましい実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３０００、および／またはＰＥＧ８０００からなる群から選択される。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。
【００７２】
第２の態様によれば、本発明は、酵母細胞抽出物を提供する。その酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含む。酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下である。
【００７３】
第３の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様によるインビトロ無細胞タンパク質合成系の製造方法を提供する。その方法は、
（ａ）酵母細胞抽出物、（ｂ）ポリエチレングリコール、（ｃ）選択可能にある外来性スクロース、および（ｄ）選択可能にある溶媒の成分を混合して、本発明の第１の態様によるインビトロ無細胞タンパク質合成系を得る工程を含む。溶媒は、水または水性溶媒である。酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含む。酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下である。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ａ）の濃度（ｖ／ｖ）は、タンパク質合成系の総体積に基づいて、２０％〜７０％、好ましくは３０％〜６０％、より好ましくは４０％〜５０％の範囲である。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ｂ）の濃度（ｗ／ｖ、例えば、ｇ／ｍＬ）は、０．１％〜８％、好ましくは０．５％〜４％、より好ましくは１％〜２％の範囲である。
【００７６】
本発明の第４の態様によれば、タンパク質のインビトロ合成のための方法が提供される。その方法は、
（ｉ）本発明の第１の態様によるインビトロ無細胞タンパク質合成系を提供し、タンパク質合成をガイドするための外来性ＤＮＡ分子を添加する工程と、タンパク質合成系において、ＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であり、
(ｉｉ）外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質を合成するために、適切な条件下で、Ｔ１の期間、工程（ｉ）で提供されるタンパク質合成系をインキュベートする工程と、を含む。
【００７７】
別の好ましい実施形態では、この方法は、（ｉｉｉ）任意選択で、タンパク質合成系から外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質を単離する工程または検出する工程をさらに含む。
【００７８】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、原核生物または真核生物に由来する。
【００７９】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、動物、植物または病原体に由来する。
【００８０】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、哺乳動物、好ましくは霊長類またはげっ歯類に由来する（ヒト、マウスおよびラットを含む）。
【００８１】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される外来性タンパク質をコードする。
【００８２】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される外来性タンパク質をコードする。
【００８４】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質は、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００８５】
別の好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）において、反応温度は、２０℃〜３７℃、好ましくは２０℃〜２５℃の範囲である。
【００８６】
別の好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）において、反応時間は、１〜６時間、好ましくは２〜４時間の範囲である。
【００８７】
第５の態様によれば、本発明は、エンジニアリング株を提供する。そのエンジニアリング株はクルイベロマイセス株である。エンジニアリング株におけるＥＸＮ５３遺伝子（ヌクレアーゼ遺伝子）の発現レベルまたは活性は、低減される。
【００８８】
別の好ましい実施形態において、「低減された（減少した）」という語は、ＥＸＮ５３遺伝子の発現レベル（量）が１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを意味する。
【００８９】
別の好ましい実施形態において、「低減された（減少した）」という語は、ＥＸＮ５３遺伝子の発現レベルまたは活性の減少が以下の条件を満たすことを意味する。その条件は、
Ａ０に対するＡ１の比率は、３０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下、最も好ましくは０〜２％の範囲である。
ここで、Ａ１は、ＥＸＮ５３遺伝子の発現レベルまたは活性に対応し、Ａ０は、野生型ＥＸＮ５３遺伝子の発現レベルまたは活性に対応する。
【００９０】
別の好ましい実施形態において、株中のＥＸＮ５３遺伝子（ヌクレアーゼ遺伝子）の発現レベルまたは活性は、遺伝子突然変異、遺伝子ノックアウト、遺伝子破壊、ＲＮＡ干渉技術、クリスパー(Crispr)技術、およびそれらの組合せからなる群から選択される方法を使用することによって低減される。
【００９１】
第６の態様によれば、本発明は、インビトロタンパク質合成の効率を改善するための、本発明の第５の態様によるエンジニアリング株の使用を提供する。
【００９２】
本発明の範囲内で、上述の技術的特徴および以下に具体的に記載される技術的特徴（例えば、実施形態または実施例）は、互いに組み合わせることができ、それによって、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成することが理解されるべきである。簡潔にするために、本明細書では詳細は繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、インビトロ生合成系においてヌクレアーゼを下方制御することによって核酸の安定性を改善し、Ｋ.ラクティス（Ｋ. lactis）ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子に対する分析および特異的改変を行うための設計経路を示す。（Ａ）は、Ｋ．ラクティス野生型細胞を示す。（Ｂ）は、ヌクレアーゼが改変されたＫ．ラクティス細胞を示す。（Ｃ）は、ヌクレアーゼが改変されたＫ．ラクティス細胞の溶解物（lysate）を収集する。（Ｄ）特定の遺伝子が改変された酵母株から、酵母細胞溶液を調製する。より安定な核酸の特徴を有することによって、酵母細胞溶液は、増大されたインビトロ生合成系を調製するために使用される。
【００９４】
【図２】図２は、Ｋ．ラクティスゲノム中の全６１のヌクレアーゼ遺伝子の分布と機能解析を示す。Ａ〜Ｆは、Ｋ．ラクティスの６本の染色体に対応する。Ａ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLSEN54,KLDNA2,KLTRM2,KLFCF1,KLDOM34,KLRAD2,KLRNH70,KLDIS3およびKLNPP1である。Ｂ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLOGG1である。Ｃ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLPOL2,KLRAD50,KLYSH1,KLRCL1,KLNGL2,KLMRE11,KLPOP3,KLMKT1,KLAPN1,KLRPP1およびKLPOP2である。Ｄ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLNUC1,KLRPP6,KLDBR1,KLRPS3,KLRPM2,KLSUV3,KLRAD1,KLIRE1およびKLPOP1である。Ｅ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLPOL3,KLDXO1,KLMUS81,KLPAN3,KLAPN2,KLRAI1,KLEXO1,KLREX4,KLPAN2およびKLLCL3である。Ｆ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLRAD17,KLPOP4,KLPOP5,KLRAD27,KLRNH201,KLVMA1,KLRAT1,KLNGL1,KLREX2,KLPOL31,KLCCR4,KLTRZ1,KLSEN2,KLREX3,KLSWT1,KLEXN53,KLRNT1,KLSEN15,KLNTG1,KLNOB1およびKLDDP1である。
【００９５】
【図３】図３は、遺伝子改変されたＫ．ラクティスゲノム中の５つのヌクレアーゼの配列、および、それらに対応するＣＲＩＳＰＲシステムのデザインルートを示す。ドナーＤＮＡの２つのホモロジーアーム（homologous arm）と、ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２とは、それぞれ、ノックアウトされるヌクレアーゼ遺伝子のＯＲＦの約１，０００ｂｐ上流と下流に位置する遺伝子配列である。同様時にノックアウトされるヌクレアーゼ遺伝子のＯＲＦの５’末端と３’末端のＰＡＭ配列をそれぞれ認識し、部位特異的にＤＮＡを切断するためにＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導する２つのｇＲＮＡを構築する。相同組換えは、ＤＳＢ(二本鎖切断）（double strand break）が起こった後に起こる。それによって、遺伝子ノックアウトを達成している。
【００９６】
【図４】図４は、Ｋ．ラクティスゲノム中の５つのヌクレアーゼタンパク質ドメインの模式図を示す。
【００９７】
【図５】図５は、ＫＬＥＸＮ５３タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における相同性を持つタンパク質ＳｃＥＸＮ５３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＧＬ１７３Ｃ）との間、ＫＬＥＸＮ５３タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における相同性を持つタンパク質ＳｐＥＸＯ２（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＡＣ１７Ａ５．１４）との間、ならびに、ＫＬＥＸＮ５３タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）における相同性を持つタンパク質ＨｓＥＸＮ５３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：５４４６４）との間のアミノ酸配列の一部の比較を示す。活性部位は、＃でマークされている。
【００９８】
【図６】図６は、ＫｌＤＩＳ３タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における相同性を持つタンパク質ＳｃＤＩＳ３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＯＬ０２１Ｃ）との間、ＫｌＤＩＳ３タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における相同性を持つタンパク質ＳｐＤＩＳ３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＢＣ２６Ｈ８．１０）との間、ならびに、ＫｌＤＩＳ３タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）における相同性を持つタンパク質ＨｓＤＩＳ３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：２２８９４）との間のアミノ酸配列の一部の比較を示す。活性部位は、＃でマークされている。
【００９９】
【図７】図７は、ＫＬＲＡＴ１タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の相同性を持つタンパク質ＳｃＲＡＴ１（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＯＲ０４８Ｃ）との間、ＫＬＲＡＴ１タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）の相同性を持つタンパク質ＳｐＲＡＴ１（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＡＣ２６Ａ３．１２ｃ）との間、および、ＫＬＲＡＴ１タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）の相同性を持つタンパク質ＨｓＲＡＴ１（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：２２８０３）との間のアミノ酸配列の一部の比較を示す。活性部位は、＃でマーされている。
【０１００】
【図８】図８は、ＫＬＲＲＰ６タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における相同性を持つタンパク質ＳｃＲＲＰ６（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＯＲＯＯ１Ｗ）との間、ＫＬＲＲＰ６タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における相同性を持つタンパク質ＳｐＲＲＰ６（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＡＣ１Ｆ３．０１）との間、ならびに、ＫＬＲＲＰ６タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）における相同性を持つタンパク質ＨｓＲＲＰ６（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：５３９４）との間のアミノ酸配列の一部の比較を示す。活性部位は、＃でマークされている。
【０１０１】
【図９】図９は、ＫＬＮＧＬ２タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における相同性を持つタンパク質ＳｃＮＧＬ３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＭＬ１１８Ｗ）との間、ＫＬＮＧＬ２タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における相同性を持つタンパク質ＳｐＮＧＬ２（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＢＣ９Ｂ６．１１ｃ）との間、ならびに、ＫＬＮＧＬ２タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）における相同性を持つタンパク質ＨｓＡＮＧＥＬ２（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：９０８０６）との間のアミノ酸配列の一部の比較をそれぞれ示す。
【０１０２】
【図１０】図１０は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＥＸＮ５３のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＥＸＮ５３遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端で２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１０３】
【図１１】図１１は、ＫＬＥＸＮ５３−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＥＸＮ５３遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１０４】
【図１２】図１２は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤｉｓ３−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＤｉｓ３のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＤｉｓ３遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端の２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１０５】
【図１３】図１３は、ＫＬＤＩＳ３−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＤｉｓ３遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１０６】
【図１４】図１４は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＲａｔ１のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＲａｔ１遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端の２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１０７】
【図１５】図１５は、ＫＬＲａｔ１−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＲａｔ１遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１０８】
【図１６】図１６は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＲｒｐ６のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＲｒｐ６遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端の２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１０９】
【図１７】図１７は、ＫＬＲｒｐ６−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＲｒｐ６遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１１０】
【図１８】図１８は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ２−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＮＧＬ３のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＮＧＬ３遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端の２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１１１】
【図１９】図１９は、ＫＬ ＮＧＬ２−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＮＧＬ３遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１１２】
【図２０】図２０は、改変された株のインビトロ翻訳活性アッセイデータのグラフを示す。ホタル蛍光タンパク質（Ｆｌｕｃ）の蛍光強度を使用して、インビトロ生合成系における組換えタンパク質の合成能力を示す。ここで、ｗｔは野生型クルイベロマイセスを表し、ΔＫＬＥＸＮ５３ＥＸＮ５３はＫＬＥＸＮ５３ＥＸＮ５３遺伝子をノックアウトしたクルイベロマイセス株を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
広範かつ詳細な研究の後、５つのヌクレアーゼが、広範なスクリーニングおよびグローピングを通して多くのヌクレアーゼから選択された。驚くべきことに、ヌクレアーゼの１つＥＸＮ５３のダウンレギュレーションまたはノックアウトは、核酸の安定性を改善し、インビトロタンパク質合成系におけるタンパク質産生の効率を大いに増加させることができることが見出された。具体的には、ＥＸＮ５３のダウンレギュレーションまたはノックアウト後、ＩＶＴＴシステムにおけるΔＫＬＥＸＮ５３酵母株のルシフェラーゼ活性は、野生型株のルシフェラーゼ活性の２倍以上であった。これにより、本発明者らは、本発明を完成させた。
【０１１４】
特に明記しない限り、本発明において使用される全ての％は、重量％濃度を指す。
【０１１５】
酵母系のインビトロタンパク質合成系
【０１１６】
酵母は、単純な培養、効率的なタンパク質フォールディングおよび翻訳後修飾の利点を有する。酵母の中で、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）とピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、複雑な真核生物タンパク質と膜タンパク質を発現するためのモデル生物である。さらに、酵母はまた、インビトロ翻訳系の調製のための原料として使用される。
【０１１７】
クルイベロマイセス(kluyveromyces)は、子嚢胞子形成酵母である。クルイベロマイセスの中で、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）およびクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）は、産業界で広く使用されている酵母である。クルイベロマイセス・ラクティスは、他の酵母と比較して、超分泌能、より良好な大規模発酵特性、食品安全性レベルに適合すること、タンパク質の翻訳後修飾能を有することなど、多くの利点を有する。
【０１１８】
本発明において、酵母系のインビトロンパク質合成系は、特に限定されない。好ましい酵母系のインビトロタンパク質合成系は、クルイベロマイセス系の発現系（より好ましくは、クルイベロマイセス・ラクティス系の発現系）である。
【０１１９】
本発明において、酵母系のインビトロタンパク質合成系は、
（ａ）酵母細胞抽出物と、
（ｂ）ポリエチレングリコールと、
（ｃ）選択可能にある外来性スクロースと、
（ｄ）選択可能にある溶媒とを含む。
溶媒は、水または水性溶媒である。酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含む。酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下である。
【０１２０】
好ましい実施形態において、ＥＸＮ５３は、ピキア・パストリスおよびクルイベロマイセスからなる群から選択される酵母の１つ以上の供給源に由来する。好ましくは、クルイベロマイセス（例えば、クルイベロマイセス・マルキシアヌス、クルイベロマイセス・ラクティス）に由来する。
【０１２１】
本発明において、クルイベロマイセス（例えば、クルイベロマイセス・ラクティスなど）は、特に限定されず、タンパク質の合成効率を向上させることができる任意の一種のクルイベロマイセス（例えば、クルイベロマイセス・ラクティスなど）株を含む。
【０１２２】
好ましい態様において、ＥＸＮ５３のタンパク質配列は、配列番号６として示される。ＥＸＮ５３のヌクレオチド配列は、配列番号１として示される。
【０１２３】
特に好ましい実施形態において、本発明において提供されるインビトロタンパク質合成系は、酵母細胞抽出物、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、アミノ酸混合物、ホスホクレアチン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、クレアチンホスホキナーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ルシフェリン、ルシフェラーゼのＤＮＡ、およびＲＮＡポリメラーゼを含む。
【０１２４】
本発明において、ＲＮＡポリメラーゼは、特に限定されない。ＲＮＡポリメラーゼは、１つ以上のＲＮＡポリメラーゼである。典型的なＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１２５】
本発明において、インビトロタンパク質合成系における酵母細胞抽出物の割合は、特に限定されない。一般に、インビトロタンパク質合成系における酵母細胞抽出物は、２０％〜７０％、好ましくは３０％〜６０％、より好ましくは４０％〜５０％を占める。
【０１２６】
本発明において、酵母細胞抽出物は、無傷細胞を含まない。そして、典型的な酵母細胞抽出物は、リボソーム、トランスファーＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを含むタンパク質翻訳のための因子と、ならびに、開始因子、伸長因子および終結放出因子（終結を媒介する放出因子）を含むタンパク質合成に必要な因子と、を含む。さらに、酵母抽出物はまた、酵母細胞の細胞質に由来するいくつかの他のタンパク質、特に、可溶性タンパク質を含む。
【０１２７】
本発明において、酵母細胞抽出物のタンパク質含量は、２０〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍＬである。タンパク質含量の測定法は、クーマシィーブリリアントブルーアッセイである。
【０１２８】
本発明において、酵母細胞抽出物の調製方法は、特に限定されない。好ましい調製方法は、
（ｉ）酵母細胞を提供する工程と、
(ｉｉ）洗浄された酵母細胞を得るために、酵母細胞を洗浄する工程と、
(ｉｉｉ）前記洗浄された酵母細胞を細胞溶解処理して、粗酵母抽出物を得る工程と、
(ｉｖ）粗酵母生物抽出物を固液分離により処理し、液相（すなわち、酵母細胞抽出物）を得る工程と、を含む。
【０１２９】
好ましい実施形態において、前記固液分離の方法は、特に限定されない。好ましい方法は、遠心分離である。
【０１３０】
好ましい実施形態では、遠心分離は、液体状態で行われる。
【０１３１】
本発明において、遠心分離条件は、特に限定されない。好ましい遠心分離条件は、５，０００×ｇ〜１００，０００×ｇの範囲、より好ましくは８，０００×ｇ〜３０，０００×ｇの範囲である。
【０１３２】
本発明において、遠心分離時間は、特に限定されない。好ましい遠心分離時間は、０．５分〜２時間、好ましくは２０分〜５０分の範囲である。
【０１３３】
本発明において、遠心分離温度は、特に限定されない。好ましくは、遠心分離は、１〜１０°Ｃ、より好ましくは２〜６°Ｃで行われる。
【０１３４】
本発明において、洗浄方法は、特に限定されない。洗浄処理は、洗浄液を用いて、ｐＨ７〜８（好ましくは、ｐＨ７．４）の環境下で行うことが好ましい。洗浄液は、特に限定されない。典型的な洗浄液は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸カリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１３５】
本発明において、細胞溶解処理の方法は、特に限定されない。好ましい細胞溶解処理は、高圧溶解および凍結融解（例えば、液体窒素低温での処理）溶解を含む。
【０１３６】
インビトロタンパク質合成系におけるヌクレオシド三リン酸の混合物は、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、およびウリジン三リン酸を含む。本発明において、各単一ヌクレオチドの濃度は、限定されない。一般に、各単一ヌクレオチドの濃度は、０．５ｍＭ〜５ｍＭの範囲、好ましくは１．０ｍＭ〜２．０ｍＭの範囲である。
【０１３７】
インビトロタンパク質合成系におけるアミノ酸混合物は、天然または非天然アミノ酸を含み、Ｄタイプのアミノ酸またはＬタイプのアミノ酸を含む。代表的なアミノ酸は、特に限定されないが、２０種類の天然アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）を含む。各タイプのアミノ酸の濃度は、通常、０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭ、好ましくは０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭ（例えば０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、および０．０８ｍＭ）の範囲である。
【０１３８】
好ましい実施形態において、インビトロタンパク質合成系は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその類似物をさらに含む。ポリエチレングリコールまたはその類似物の濃度は、特に限定されない。一般に、ポリエチレングリコールまたはその類似物の濃度（ｗ／ｖ）は、タンパク質合成系の総重量に基づいて、０．１％〜８％、好ましくは０．５％〜４％、より好ましくは１％〜２％の範囲である。ＰＥＧの代表的な例としては、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ３３５０が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による系（システム）は、他の様々な分子量（ＰＥＧ２００、４００、１５００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００など）を有するポリエチレングリコールをさらに含んでもよいことを理解されたい。
【０１３９】
好ましい実施形態において、インビトロタンパク質合成系は、スクロースをさらに含む。スクロースの濃度は、特に限定されない。一般に、スクロースの濃度は、タンパク質合成系の総重量に基づいて、０．０３重量％〜４０重量％、好ましくは０．０８重量％〜１０重量％、より好ましくは０．１重量％〜５重量％の範囲である。
【０１４０】
酵母抽出物に加えて、特に好ましいインビトロタンパク質合成系は、以下の成分をさらに含む。それは、２２ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ｐＨ ７．４）、３０〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、１．０〜５．０ｍＭの酢酸マグネシウム、１．５〜４ｍＭのヌクレオシド三リン酸混合物、０．０８〜０．２４ｍＭのアミノ酸混合物、２５ｍＭのホスホクレアチン、１．７ｍＭのジチオトレイトール、０．２７ｍｇ／ｍＬのクレアチンホスホキナーゼ、１％〜４％のポリエチレングリコール、０．５％〜２％のスクロース、８〜２０ｎｇ／μＬのホタルルシフェラーゼのＤＮＡ、および０．０２７〜０．０５４ｍｇ／ｍＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１４１】
外来性タンパク質（外来性ＤＮＡ）のコード配列
【０１４２】
本明細書中で使用されるように、用語「外来性タンパク質のコード配列」および「外来性ＤＮＡ」は、互換的に使用され、両方とも、タンパク質合成を誘導するための外来性ＤＮＡ分子をいう。ＤＮＡ分子は、一般に線状または環状である。ＤＮＡ分子は、外来性タンパク質をコードする配列を含む。本発明において、外来性タンパク質をコードする配列の例としては、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。外来性タンパク質をコードする配列はさらに、プロモーター配列、５’非翻訳配列、および／または３’非翻訳配列を含む。
【０１４３】
本発明において、外来性ＤＮＡの選択は、特に限定されない。一般に、外来性ＤＮＡは、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、および抗体の可変領域をコードする外来性ＤＮＡ、ルシフェラーゼ変異体のＤＮＡ、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０１４４】
外来性ＤＮＡはまた、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せをコードする外来性ＤＮＡから選択される。
【０１４５】
好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、緑色蛍光タンパク質（enhanced ＧＦＰ、ｅＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase,ＬａｃＺ）、ヒトリジン−ｔＲＮＡシンセターゼ(lysine-tRNA synthetase)、ヒトロイシン−ｔＲＮＡシンセターゼ(leucine-tRNA synthetase)、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、マウスカタラーゼ(catalase)、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【０１４６】
ハイスループットインビトロタンパ質合成方法（インビトロタンパク質翻訳効率を高めるための方法）
【０１４７】
本発明は、インビトロタンパク質合成のためのハイスループット方法を提供する。その方法は、
（ｉ）本発明の第１の態様に係るインビトロ無細胞タンパク質合成系を提供し、タンパク質合成を誘導するために外来性ＤＮＡ分子を加える工程と、たんぱく質合成系におけるＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であり、
(ｉｉ）外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質を合成するために、適切な条件下で、Ｔ１の期間、工程（ｉ）で提供されるタンパク質合成系をインキュベートする工程と、を含む。
【０１４８】
好ましい実施形態において、本発明は、酵母ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子をノックアウトすることによって、インビトロタンパク質翻訳効率を改善するための設計および方法を提供する。
【０１４９】
１．インビトロ生合成活性を増大するための設計スキームおよび分析方法は、
Ａ．インビトロ生合成系における成分が活性に及ぼす影響の分析と、
Ｂ．Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子の機能と分布の分析と、
Ｃ．Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノム中の選択されたヌクレアーゼ遺伝子の改変デザインと、である。
【０１５０】
２．遺伝子の標的化ノックアウトを受けたクローニングベクターの構築。その方法は、
Ａ．特定の遺伝子配列に対するエンドヌクレアーゼの切断（開裂）を誘導するｓｇＲＮＡ配列を設計する工程と、
Ｂ．エンドヌクレアーゼを含むベクターに上述のｓｇＲＮＡ配列を組み換えて、ｓｇＲＮＡとエンドヌクレアーゼが共発現される第１のベクターを得る工程と、を含む。
【０１５１】
３．特定の遺伝子のノックアウトのために使用されるドナーＤＮＡの構築。その方法は、
Ａ．遺伝子データベースから特定の遺伝子のヌクレオチド配列をダウンロードし、遺伝子のそれぞれ１０００ｂｐ上流および下流に位置する配列を用いることによって、第２のベクターを構築する工程と、
Ｂ．第２のベクターをプライマーＭ１３ＦおよびＭ１３Ｒで増幅する工程とを含む。得られたＰＣＲ産物は、エタノール沈殿により濃縮されて、ドナーＤＮＡを得る。
【０１５２】
４．第１のベクターおよびドナーＤＮＡを酵母コンピテント細胞に同時形質転換する工程。
【０１５３】
拡大培養用のモノクローン細胞をスクリーニングし、酵母ゲノムを抽出し、デザインされたプライマーでノックアウト部位を増幅し、増幅されたＰＣＲ産物の配列をシークエンシングすることで確認した後、特定の遺伝子をノックアウトした株を得る。
【０１５４】
５．無細胞インビトロタンパ質合成系
【０１５５】
特定の遺伝子をノックアウトした酵母株を用いて酵母細胞液を調製し、この酵母細胞液をインビトロタンパク質翻訳系に添加し、２０〜３０℃の環境下で２〜６時間混合物を反応させた。吸光度を読み取り、多機能マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）を用いてホタルルシフェラーゼの活性を検出した。
【０１５６】
本発明の主な利点は、以下の通りである。
【０１５７】
１．本発明は、核酸の安定性を改善するためにシステム中のヌクレアーゼの含量を減少させることによって、および、Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子に対して、体系分析を実施し、特異的改変を行うことによって、インビトロ生合成活性を調節するために普遍的に使用される技術的経路および方法を提供する。
【０１５８】
２．本発明では、大量のヌクレアーゼからヌクレアーゼをスクリーニングするために多くの努力がなされた。そして、多くのヌクレアーゼから５つのヌクレアーゼが初めてスクリーニングされた。驚くべきことに、５つのヌクレアーゼのうちの１つヌクレアーゼ（例えば、ＥＸＮ５３）のダウンレギュレーションまたはノックアウトは、核酸の安定性を改善し、インビトロタンパク質合成系のタンパク質産生の効率を大いに増大することができることが見出された。具体的には、ＥＸＮ５３のダウンレギュレーションまたはノックアウト後、ＩＶＴＴシステムにおけるΔＫＬＥＸＮ５３酵母株のルシフェラーゼ活性は、野生型株のルシフェラーゼ活性の２倍以上（例えば、２．４６倍）であった。
【０１５９】
３．初めて、インビトロタンパク質合成活性を有意に増加させることができるＫ．ラクティス（K. lactis）株が本発明において提供された。
【０１６０】
以下、本発明を具体的な実施例（または実施形態）と組み合わせてさらに説明する。これらの実施例（または実施形態）は、単に例示の目的のために提供され、本発明の範囲に対する限定とみなされるべきではないことが理解されるべきである。以下の実施例（または実施形態）に特に記載された条件を伴わない実験方法に関して、当業者は一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に記載された条件などの従来の条件に従うか、または、製造業者によって推奨される条件に従う。特に断らない限り、パーセンテージおよび部数(portion)は、重量パーセンテージおよび重量部数を指す。
【０１６１】
特に断らない限り、本発明の実施例で使用される材料および試薬は、すべて市販の製品である。
【０１６２】
実施例１  インビトロ生合成系におけるヌクレアーゼの含量を減少させることによって、核酸の安定性を改善すること、および、Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子に対する分析および特異的改変を行うこと。
【０１６３】
１．Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムを改変することによって、インビトロ生合成活性を調節するためのデザイン原理
【０１６４】
１．１  インビトロ生合成系の分析
１．１．１  異なるインビトロ生合成系における成分の分析
【０１６５】
インビトロ生合成系は、細胞溶解物を抽出するために、異なるタイプの細胞（微生物、動物および植物を含む）上で細胞溶解を実施することにより外来性タンパク質の翻訳のために使用される。インビトロ生合成系における、転写、翻訳、タンパク質フォールディング、エネルギー代謝等の機能を達成するために、細胞溶解物は、エネルギー再生およびタンパク質合成のためのエレメントを含まなければならない。それは、リボソーム、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、リボソーム放出因子、ヌクレオチドリサイクリング酵素、代謝酵素、分子シャペロン、フォールダーゼ等を含む、外来的に添加される必要がある物質には、アミノ酸、ヌクレオチド、ＤＮＡ鋳型、エネルギー基質、補因子、塩分子などが含まれる。系における種々の成分の安定性は、反応持続時間および最終タンパク質収率に重要な影響を及ぼす。特定の基質（例えば、ＡＴＰ、システインなど）の枯渇は、反応の終結の重要な理由である。
【０１６６】
１．１．２  インビトロ生合成系における成分が合成物に及ぼす影響分析モデル
【０１６７】
インビトロ翻訳系において、エネルギー代謝基質（ホスホクレアチン等）、ｍＲＮＡ合成に関与する基質（例えば、ＮＴＰ等）、タンパク質合成に関与する基質（例えば、アミノ酸等）、リン酸及び他の成分を含む成分の濃度値、並びにｐＨ値は、反応の進行に伴って変化し、最終的には反応の終了に至る。異なる技術を使用することによって、対応する成分（例えば、ＮＴＰ、アミノ酸など）を補充すること、および、対応する条件（例えば、ｐＨ値、リン酸濃度など）を安定化することの両方は、インビトロ翻訳系の反応時間を効果的に延長することができる。それによって、タンパク質の収率を増加させている。
【０１６８】
１．１．３  インビトロタンパク質合成系における核酸およびヌクレアーゼのタンパク質合成に対する影響の分析
【０１６９】
タンパク質翻訳の重要な基質として、ＤＮＡ鋳型とＤＮＡ鋳型から転写されるｍＲＮＡの安定性は、インビトロ翻訳系の反応時間と収率に重要な影響を及ぼす。細胞を溶解した後、細胞溶解物を収集し、インビトロ翻訳系を構築するために使用する。タンパク質合成に必要な種々の成分に加えて、インビトロ翻訳系はまた、反応に対して好ましくない成分（例えば、ヌクレアーゼ、プロテアーゼなど）を含む。種々の精製された成分で構成される系において、タンパク質翻訳の効率は、阻害因子の不在のために、有意に増加される。
【０１７０】
一方、インビトロ翻訳系における核酸の安定性は、異なる技術的手段（ヌクレアーゼ遺伝子のノックアウトや安定化因子の付加などを含む）を使用することによって効果的に高めることができる。その結果、タンパク質翻訳の効率を改善することができる。図１は、インビトロ生合成系におけるヌクレアーゼレベルを低下させることによって核酸の安定性を増加し、Ｋ．ラクティス(K. lactis)ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子に対する分析を実行および特異的改変を行うことのための設計経路を示す。
【０１７１】
１．２  Ｋ．ラクティス(K. lactis)ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子の分析
１．２．１  Ｋ．ラクティスゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子の分類と分布
【０１７２】
ヌクレアーゼ（核ポリメラーゼまたはポリヌクレオチダーゼとも呼ばれる）は、核酸分解の第１段階においてヌクレオチド間のホスホジエステル結合を加水分解することができる酵素である。ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの作用位置によって、エキソヌクレアーゼ(exonuclease)およびエンドヌクレアーゼ(endonuclease)のカテゴリーに分けることができる。３’末端から開始してヌクレオチドを１つずつ加水分解するエキソヌクレアーゼは、３’から５’のエキソヌクレアーゼと呼ばれる。５’末端から開始してヌクレオチドを１つずつ加水分解するエキソヌクレアーゼは、５’から３’のエキソヌクレアーゼと呼ばれる。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド中のホスホジエステル結合を触媒し、加水分解する。ヌクレアーゼはまた、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）およびリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）のカテゴリーに分けることができる。デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）は、ＤＮＡに作用する。リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）は、ＲＮＡに作用する。ヌクレアーゼはまた、ヌクレアーゼの作用方向によって、５’から３’のエキソヌクレアーゼおよび３’から５’のエキソヌクレアーゼに分類することができる。
【０１７３】
データベース中の遺伝子機能のアラインメント分析により、Ｋ.ラクティス(K. lactis)は、Ｋ．ラクティスＡ−Ｆの６つの染色体上に分布する合計６１個のヌクレアーゼを含む（図２に示す）。Ａ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＳＥＮ５４、ＫＬＤＮＡ２、ＫＬＴＲＭ２、ＫＬＦＣＦ１、ＫＬＤＯＭ３４、ＫＬＲＡＤ２、ＫＬＲＮＨ７０、ＫＬＤＩＳ３およびＫＬＮＰＰ１である。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＳＥＮ５４のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ００８０３ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＤＮＡ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０５３２４ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＴＲＭ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０５６６５ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＦＣＦ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０７０１８ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＤＯＭ３４のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０８６４６ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＲＡＤ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０９４２７ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＲＮＨ７０のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ１００６５ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＤＩＳ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ１０８３５ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＮＰＰ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ１１３７４ｇである。
【０１７４】
Ｂ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＯＧＧ１である。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＯＧＧ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｂ０５１５９ｇである。
【０１７５】
Ｃ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＰＯＬ２、ＫＬＲＡＤ５０、ＫＬＹＳＨ１、ＫＬＲＣＬ１、ＫＬＮＧＬ２、ＫＬＭＲＥ１１、ＫＬＰＯＰ３、ＫＬＭＫＴ１、ＫＬＡＰＮ１、ＫＬＲＰＰ１およびＫＬＰＯＰ２である。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＬ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０２５８５ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＡＤ５０のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０２９１５ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＹＳＨ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０４５９８ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＣＬ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０５９８４ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＣＬ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０６２４８ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＭＲＥ１１のコードは、ＫｌＡ０Ｃ０６９３０ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＰ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１２１９９ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＭＫＴ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１３９２６ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＡＰＮ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１４２５６ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＰＰ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１４７１８ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＰ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１８８２１ｇである。
【０１７６】
Ｄ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＮＵＣ１、ＫＬＲＰＰ６、ＫＬＤＢＲ1、ＫＬＲＰＳ３、ＫＬＲＰＭ２、ＫＬＳＵＶ３、ＫＬＲＡＤ１、ＫＬＩＲＥ１およびＫＬＰＯＰ１である。ＫＥＧＧデータベース中のＫＬＮＵＣ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｄ００４４０ｇである。ＫＥＧＧデータベース中のＫＬＲＰＰ６のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ０１３００９ｇである。ＫＥＧＧデータベース中のＫＬＤＢＲ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｄ０４４６６ｇのコードである。ＫＥＧＧデータベース中のＫＬＲＰ３のコードは、ＫＩＬＡ０Ｄ８３０５ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＰＭ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１０４８３ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＳＵＶ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１２０３４ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＡＤ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１２２１０ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＩＲＥ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１２２１０ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＰ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１９４４８ｇである。
【０１７７】
Ｅ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＰＯＬ３、ＫＬＤＸＯ１、ＫＬＭＵＳ８１、ＫＬＰＡＮ３、ＫＬＡＰＮ２、ＫＬＲＡＩ１、ＫＬＥＸＯ１、ＫＬＲＥＸ４、ＫＬＰＡＮ２およびＫＬＬＣＬ３である。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＰＯＬ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ０１６０７ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＤＸＯ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｅ０２２４５ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＭＵＳ８１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｅ０３０１５ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＰＡＮ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ０８０９７ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＡＰＮ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１８８７７ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＲＡＩ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１２８９３ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＥＸＯ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１６７４３ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＲＥＸ４のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１７８６５ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＰＡＮ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１８８７７ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＬＣＬ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１９１６３ｇである。
【０１７８】
Ｆ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＲＡＤ１７、ＫＬＰＯＰ４、ＫＬＰＯＰ５、ＫＬＲＡＤ２７、ＫＬＲＮＨ２０１、ＫＬＶＭＡ１、ＫＬＲＡＴ１、ＫＬＮＧＬ１、ＫＬＲＥＸ２、ＫＬＴＲＬ１、ＫＬＰＯＬ３１、ＫＬＣＣＲ４、ＫＬＴＲＺ１、ＫＬＳＥＮ２、ＫＬＲＥＸ３、ＫＬＳＷＴ１、ＫＬＥＸＮ５３、ＫＬＲＮＴ１、ＫＬＳＥＮ１５、ＫＬＮＴＧ１、ＫＬＮＯＢ１およびＫＬＤＤＰ１である。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＡＤ１７のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ００３３０ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＰＯＰ４のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０２２１１ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＰＯＰ５のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０２４５３ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＡＤ２７のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０２９９２ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＮＨ２０１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ０４７７４ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＶＭＡ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０５４０１ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＡＴ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ０７４６９ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＮＧＬ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０７７３３ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＥＸ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０８９９８ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＬ３１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ１４９４９である。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＣＣＲ４のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１５８８４ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＴＲＺ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１６６６５ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＳＥＮ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１９８６６ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＥＸ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１９９１０ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＳＷＴ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ２０３６１ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＥＸＮ５３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ２２３８５ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＮＴ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ２４８１６ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＳＥＮ１５のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ２６３３４g である。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＮＴＧ１は、ＫｌＬＡ０Ｆ０７７１１ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＮＯＢ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１６２８０ｇである。ＫＥＧＧ データベースのＫＬＤＤＰ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ２０２７３ｇである。
【０１７９】
Ｋ.ラクティス(K. lactis)ヌクレアーゼは、機能によって２つのカテゴリーに分類することができる。ここで、１８個のＤＮａｓｅおよび４１個のＲＮａｓｅが存在し、また２個の分類されていないヌクレアーゼも存在する（表１に示される）。３’から５’の機能を有するＤＮａｓｅは、ＫＬＡＰＮ１を含む。５’から３’の機能を有するＤＮａｓｅは、ＫＬＲＡＤ２７およびＫＬＥＸ０１を含む。３’から５’の機能を有するＲＮａｓｅは、ＫＬＲＮＨ７０、ＫＬＤＩＳ３、ＫＬＮＧＬ２およびＫＬＲＰＰ６を含む。５’から３’の機能を有するＲＮａｓｅは、ＫＬＤＸＯ１、ＫＬＲＡＴ１およびＫＬＥＸＮ５３を含む。
【０１８０】
表１
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【０１８１】
１．２．２  インビトロタンパク質合成に関与するＫ．ラクティス(K. lactis)ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子の選択のための分析
【０１８２】
ＲＮＡおよびＤＮＡの核酸は、インビトロタンパク質合成系のコード基質であり、それらの安定性はタンパク質収率に影響を及ぼす。真核生物の翻訳プロセスにおいて、ＲＮＡの５’末端は、キャップ構造の処理を瞬時に完了させることができる。ＲＮＡの５’末端のキャップ構造は、ＲＮＡの安定性と翻訳効率において重要な役割を果たす。
【０１８３】
真核生物では、脱アデニル化依存性ＲＮＡ分解メカニズムおよびアデニル化非依存性ＲＮＡ分解メカニズムが存在する。脱アデニル化依存性ＲＮＡ分解のメカニズムでは、ＲＮＡの５’末端の成熟キャップ構造または未成熟キャップ構造は、キャップ除去複合体をリクルートすることによって除去することができる。同時に、ＲＮＡは、ヌクレアーゼの作用下で、５’から３’の方向に分解する。アデニル化非依存性ｍＲＮＡ分解のメカニズムでは、核酸分子は、エンドヌクレアーゼの作用下で、中央の位置から壊れた鎖に分解される。そして、エキソヌクレアーゼは、ＲＮＡを３’から５’の方向に分解する。
【０１８４】
Ｋ.ラクティス（K. lactis）系のインビトロタンパク質合成系において、外来性の線状または環状ＤＮＡを鋳型として使用することによって３’ポリＡタグを有するｍＲＮＡが転写されることができる。プロモーター(promoter)とＲＮＡ転写酵素の違いに依存して、転写されたｍＲＮＡは、５’成熟キャップ構造を有していても、有していなくてもよい。したがって、ＤＮａｓｅｓ、ＲＮａｓｅｓ、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼは、すべてインビトロタンパク質合成系における鋳型の安定性に影響を及ぼす。それらの酵素の改変は、インビトロ生合成活性に増強効果を生じさせることが可能である。
【０１８５】
ここで、ｍＲＮＡの特別な不安定性およびインビボＲＮａｓｅの高い活性のために、ｍＲＮＡの寿命は、インビトロでのタンパク質合成を制限する主要な障害である。したがって、改変によるインビボＲＮａｓｅの減少は、最も好ましい改変スキームである。もちろん、本発明は、インビトロタンパク質生合成活性を改善するために、他のヌクレアーゼの設計と改変に依然として適用可能であることに留意されたい。
【０１８６】
１．２．３  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子（ＥＸＮ５３、Ｒａｔ１、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３およびＮＧＬ２）の特異的改変デザイン
【０１８７】
Ｋ．ラクティス（K. lactis）において、５’から３’のエキソヌクレアーゼには、ＥＸＮ５３およびＲａｔ１が含まれる。ＥＸＮ５３は、細胞質に位置する。Ｒａｔ１は、核に位置する。脱アデニル化依存性ＲＮＡ分解のメカニズムでは、脱アデニル化のプロセスの後、ＲＮＡは、細胞質と核の両方に位置し、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性の両方を有するタンパク質サブユニット複合体（エキソソーム）（exosome）の作用下で分解される。Ｋ．ラクティスでは、３’から５’のエキソヌクレアーゼには、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３（Ｒｒｐ４４とも呼ばれる）、ＮＧＬ２などが含まれる。一方、Ｒｒｐ６とＤｉｓ３は、ともに、エキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性との両方を有するタンパク質サブユニット複合体（エキソソーム）の一部である。Ｒｒｐ６は、３’から５’のエキソヌクレアーゼの一種であり、ＲＮａｓｅファミリーの一員である。Ｒｒｐ６は、核内に位置し、核内のエキソソームの鍵となる触媒サブユニットである。さらに、Ｒｒｐ６は、細胞中の種々のＲＮＡの処理、分解および品質制御を担っている。Ｄｉｓ３（Ｒｒｐ４４とも呼ばれる）は、エキソソームの鍵となる触媒サブユニットであり、高度に保存されたＲＮａｓｅＩＩ／ＲＮＢファミリーの一員である。Ｄｉｓ３は、核と細胞質の両方に位置する。さらに、Ｄｉｓ３は、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性との両方を有し、細胞質および核の両方におけるＲＮＡの代謝とあらゆるタイプのＲＮＡの処理を担っている。ＮＧＬ２は、３’から５’の方向にＲＮＡを加水分解するポリＡを特異的に認識する酵素である。
【０１８８】
上記の分析に基づいて、ＥＸＮ５３、Ｒａｔ１、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３およびＮＧＬ２の５つの遺伝子は、関連する方法を使用することによって、本発明において改変されるように選択された。その関連する方法は、特に限定されないが、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子突然変異を含む。インビトロ生合成系においてヌクレアーゼをダウンレギュレートすることによって核酸の安定性を改善し、および、Ｋ．ラクティスゲノムにおいてヌクレアーゼ遺伝子に対する分析および特異的な改変デザインを行う。インビトロタンパク質合成活性を調節するためのデザインおよび技術的詳細により、インビトロタンパク質翻訳効率を改善する。
【０１８９】
１．３  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおける標的遺伝子改変方法の分析
１．３．１  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムの改変法と選択分析
【０１９０】
本発明では、Ｋ．ラクティスゲノムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって改変された。ＣＲＩＳＰＲは、広く用いられている遺伝子編集技術であり、構造が簡単、操作が簡便、編集効率が高い、抗生物質を導入する必要なし、標的遺伝子の複数部位を同時にノックアウトすることを達成することができるなどの利点を有する。比較的成熟した形質転換系は、酵母において既に構築されている。
【０１９１】
１．３．２  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムに対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の技術的デザイン
【０１９２】
本発明で使用されるＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｋ．ラクティス株のための改善されたシステムである。ここで、Ｃａｓ９タンパク質のコード配列、ｇＲＮＡプロモーター、ドナーＤＮＡのホモロジーアームの長さ、酵母コンピテントの調製および形質転換などのパラメーターおよび条件は、改善された。Ｋ．ラクティス株における効率的な編集が達成された。
【０１９３】
１．３．３  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおけるＫ．ラクティスヌクレアーゼ遺伝子（ＥＸＮ５３、Ｒａｔ１、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３およびＮＧＬ３）のノックアウトのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のデザイン
【０１９４】
本発明では、ドナーＤＮＡの２つのホモロジーアームは、それぞれ、ノックアウトされるヌクレアーゼ遺伝子のＯＲＦの約１，０００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列である。同時にノックアウトされるヌクレアーゼ遺伝子のＯＲＦの５’−および３’−ＰＡＭ配列をそれぞれ認識する２つのｇＲＮＡを構築し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをガイドすることによって部位特異的にＤＮＡを切断する。その後、ＤＳＢ（二本鎖切断）（double strand break）が起こった後に相同組換えが起こる。それにより、ヌクレアーゼ遺伝子のノックアウトを達成している。例えば、ＥＸＮ５３、Ｒａｔ１、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３およびＮＧＬ３の５つの遺伝子のノックアウトは、それぞれ開始コドンの近くに１つのｇＲＮＡを、終止コドンの近くに１つのｇＲＮＡを配置することによって行われた。Ｋ．ラクティスゲノム中の５つのヌクレアーゼ遺伝子を改変するＣＲＩＳＰＲシステムのデザインを図３に示す。
【０１９５】
実施例２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＥＸＮ５３遺伝子の標的ノックアウト
【０１９６】
２．１  ＫＬＥＸＮ５３配列の検索およびＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の決定
２．１．１  標的遺伝子ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０１９７】
ＫＥＧＧデータベースでは、ＥＸＮ５３遺伝子に基づいて、ＢＬＡＳＴアラインメント解析を行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ｆ２２３８５ｇのコードを有するクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＥＸＮ５３の遺伝子配列（配列番号１）を決定した。決定した遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＥＸＮ５３に対して６０．９３％の遺伝子配列相同性と５７．６５％のタンパク質配列相同性を有し、Ｓ．ポンベ（S. pombe）のＥＸＮ５３に対して４７．３８％の遺伝子配列相同性と３８．２９％のタンパク質配列相同性を有し、Ｈ．サピエンス（H. sapiens）のＥＸＮ５３に対して４３．８１％の遺伝子配列相同性と３３．４８％のタンパク質配列相同性を有する（図5に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なＥＸＮ５３の５’から３’のエキソヌクレアーゼドメインおよびアメロゲニンドメインを有する（図４に示す）。この遺伝子は、ＫＬＥＸＮ５３（Ｆ染色体の２０９１２３５．．．２０９５５９６に位置する）と命名される。
【０１９８】
ＫＬＥＸＮ５３遺伝子の開始コドンと終止コドンでＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を検索し、ｇＲＮＡ配列を同定した。ｇＲＮＡを選択する原理は、以下の通りである。ＧＣ含量は、適度であるべきである（ここで、本発明における標準は、ＧＣ含量が４０％〜６０％の範囲にあることである）。そして、ポリＴ（poly T）構造の存在は、避けるべきである。最後に、本発明によって決定されたＫＬＥＸＮ５３ ｇＲＮＡ−１配列は、ＡＧＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＴＴＴＧＴＡＣＴであった。本発明によって決定されたＫＬＥＸＮ５３ ｇＲＮＡ−２配列は、ＣＧＴＣＧＴＧＧＣＣＧＴＡＧＴＡＡＴＣＧであった。
【０１９９】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、それぞれ、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドとともに、ｐＣａｓ９−ＫＬＥＸＮ５３−Ｆ１：ＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＴＴＴＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＣ（配列番号７）と、ｐＣａｓ９−ＫＬＥＸＮ５３−Ｒ１：ＧＣＴＡＡＡＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＡＴＣＧＣＣＣＧ（配列番号８）との一対のプライマーとを使用することにより、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドとともに、ｐＣａｓ９−ＫＬＥＸＮ５３−Ｆ２：ＣＧＴＣＧＴＧＧＣＣＧＴＡＧＴＡＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣ（配列番号９）と、ｐＣａｓ９−ＫＬＥＸＮ５３−Ｒ２：ＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＣＣＡＣＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＧＣＣＧ（配列番号１０）との一対のプライマーを使用することにより、実行された。各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ産物を混合し、続いて１μＬのＤｐｎ  Ｉ（ＤｐｎＩ）および２μＬの１０×消化緩衝液(digestion buffer)を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、次いでＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲで陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−２と命名した。１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−１とともに、ｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号１１）およびｐＣａｓ９−Ｒ：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号１２）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３３−２とともに、ｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＡＧＴＡＧＴＧＴＴＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＣＴＡＣＴＣＧＧ（配列番号：１３）およびｐＣａｓ９−Ｆ２:ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号：１４）のプライマーを使用することによって実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２のＰＣＲ増幅産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤｐｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液とを加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、次いでＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲで陽性を検出し、シークエンシングによって確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−１および２と命名した（図１０に示す）。
【０２００】
２．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２０１】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において,ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１8プラスミドに挿入し、次いでＰＣＲによって増幅して、線状ドナーＤＮＡ配列を得た。
【０２０２】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡと共に、ＫＬＥＸＮ５３−Ｆ１：ＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＡＡ（配列番号：１５）およびＫＬＥＸＮ５３−Ｒ１：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣＴＣＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣ（配列番号：１６）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅は、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドと共に、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号：１７）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ(配列番号：１８）のプライマーを使用することによって実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲで陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、ＫＬＥＸＮ５３−ｐＭＤ１８と命名した。
【０２０３】
ＰＣＲ増幅は、鋳型としてのＫＬＥＸＮ５３−ｐＭＤ１８プラスミドと共に、ＫＬＥＸＮ５３−Ｆ２:ＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＡＡＣＡＧＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＣＡＣＴＴＣ（配列番号：１９）およびＫＬＥＸＮ５３−Ｒ２：ＧＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＴＴＡＡＴＣＴＡＧＴＣＡＡＴＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＴＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＧＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＧＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＣＣ（配列番号：２０）のプライマーを用いて実行された。ＫＬＥＸＮ５３−ＤＤ−ｐＭＤ１８のプラスミドは、構築された（図１１に示す）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。それらをＰＣＲにより陽性と試験し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２０４】
２．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
【０２０５】
２．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを採取し、次いで２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、５０ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪しながらさらに培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収した。無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下で、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２０６】
１．３．２  コンピテント細胞は、解凍のために１５〜３０秒間３７℃に置かれ、１３，０００ｇで２分間遠心分離され、上清を除去した。形質転換緩衝液を以下のように調製した。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ/ｖ）)、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）、５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミドおよび１０μＬのドナーＤＮＡを添加した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離して、上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液状培地を加え、２〜３時間混合物をインキュベートした。２００μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２０７】
１．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍＬのＹＰＤ(２００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としての酵母溶液と共に、ＫＬＥＸＮ５３−ＣＩＣＦ１：ＴＴＴＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＣＧＴＡＴＴＣＣＣ（配列番号２１）およびＫＬＥＸＮ５３−ＣＩＣＲ１：ＴＡＡＴＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＣＡＣＣＴＴ（配列番号２２）のＣＲＩＳＰＲ挿入検査（CRISPR Insertion Check）プライマーを使用するＰＣＲによって検出された。ＰＣＲ法で陽性と判定され、シークエンシングで同定された株は、陽性株と決定された。
【０２０８】
実施例３  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＤＩＳ３遺伝子の標的ノックアウト
【０２０９】
３．１  ＫＬＤＩＳ３配列の検索とＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の決定
３．１．１  標的遺伝子ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０２１０】
ＫＥＧＧデータベースにおいて、ＤＩＳ３遺伝子に基づいて、ＢＬＡＳＴアラインメント解析を行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ａ１０８３５ｇのコードを有するクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＤＩＳ３の遺伝子配列（配列番号２）を決定した。決定された遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)におけるＤＩＳ３に対して７０．５４％の遺伝子配列相同性と７７．５９％のタンパク質配列相同性を有し、Ｓ．ポンベ(S. pombe)におけるＤＩＳ３に対して５６．８６％の遺伝子配列相同性と５１．８２％のタンパク質配列相同性を有し、Ｈ．サピエンス(H. sapiens)におけるＤＩＳ３に対して４８．８３％の遺伝子配列相同性と４０．１９％のタンパク質配列相同性を有する（図６に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なＶａｃＢドメインおよびＰＩＮ＿Ｒｒｐ４４ドメインを有する（図４に示される）。この遺伝子は、ＫＬＤＩＳ３（染色体Ａの９３８７１２．．．９４１７３８に位置する）と命名される。
【０２１１】
ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を、ＫＬＤＩＳ３遺伝子の開始コドンと終止コドンの近くで検索し、ｇＲＮＡ配列を同定した。ｇＲＮＡを選択する原理は、以下の通りである。ＧＣ含量は、適度であるべきである（本発明における標準は、本明細書におけるＧＣ含量が４０％〜６０％の範囲であることである）。ポリＴ構造の存在は、避けるべきである。最後に、本発明により決定されたＫＬＤＩＳ３ ｇＲＮＡ−１配列は、ＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧ（配列番号２３）であった。本発明により決定されたＫＬＤＩＳ３ ｇＲＮＡ−２配列は、ＡＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＡ（配列番号２４）であった。
【０２１２】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＤＩＳ３−Ｆ１：ＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＣＴＡＧＴＣ（配列番号２５）およびｐＣａｓ９−ＫＬＤＩＳ３−Ｒ１：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣ1ＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号２６）の一対のプライマーを使用して、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＤＩＳ３−Ｆ２：ＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＡＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号２７）およびｐＣａｓ９−ＫＬＤＩＳ３−Ｒ２：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ配列番号２８）のプライマーを使用することにより、実行された。各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ産物を混合し、続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−２と命名した。１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−１と共に、プライマーｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号２９）およびｐＣａｓ９−Ｒ１：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号３０）のプライマーを用いて、実行された。別のＰＣＲ増幅プロセは、鋳型としてのｐＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−２と共に、プライマーｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＡＧＴＡＧＴＧＴＴＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＡＣＴＡＣＴＣＧＧ（配列番号３１）およびｐＣａｓ９−Ｒ２：ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号３２）のプライマーを用いて、実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２のＰＣＲとのＰＣＲ産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤｐｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μ���のＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングによって確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ−１および２と命名した（図１２に示す）。
【０２１３】
３．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２１４】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において、ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１8プラスミドに挿入し、次いで、ＰＣＲによって増幅した。これにより、線状ドナーＤＮＡを得た。
【０２１５】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡと共に、ＫＬＤＩＳ３−Ｆ１：ＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＧＴＣＣ（配列番号３３）およびＫＬＤＩＳ３−Ｒ１：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＧＴＡＡＧＡＣＣＧＣ(配列番号３４）のプライマーを使用して実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドと共に、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号３５）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号３６）のプライマーを使用して実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、遺伝子を抽出し、保存し、ＫＬＤＩＳ３−ｐＭＤ１８と名付けた。
【０２１６】
ＰＣＲ増幅は、鋳型としてのＫＬＤＩＳ３−ｐＭＤ１８プラスミドと共に、ＫＬＤＩＳ３−Ｆ２：ＣＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＣＣＣＧＧＴＴＡＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＡＣＡＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＴＣ（配列番号３７）およびＫＬＤＩＳ３−Ｒ２：ＡＡＧＣＴＡＴＡＡＣＣＧＧＧＴＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧ（配列番号３８）のプライマーを使用して実行された。ＫＬＤＩＳ３−ＤＤ−ｐＭＤ１８プラスミドは、構築された（図１３に示すように）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加し、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２１７】
３．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
【０２１８】
３．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを採取した。次いで、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、５０ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪しながらさらに培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収し、無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製した。酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２１９】
３．３．２  コンピテント細胞を３７℃で１５〜３０秒間解凍し、１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去した。形質転換緩衝液は、以下のように調製された。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ／ｖｖ)、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）、１５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド、１０μＬのドナーＤＮＡを添加した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離を行い、上清を除去した。その後、１ｍＬのＹＰＤ液状培地をその溶液に加え、２〜３時間混合物をインキュベートした。２００μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２２０】
３．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍｌのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬＧ ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としての酵母溶液と共に、ＫＬＤＩＳ３−ＣＩＣＦ１：ＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＴＧ（配列番号３９）およびＫＬＤＩＳ３−ＣＩＣＲ１：ＣＡＧＴＡＣＡＧＡＡ ＧＣＴＣＡＧＣＡＡＣ ＡＡＣＣ（配列番号４０）のＣＲＩＳＰＲ挿入検査プライマーを使用するＰＣＲによって検出された。ＰＣＲ法で陽性と判定され、シークエンシングで同定された株を陽性株と判定した。
【０２２１】
実施例４  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＲａｔ１遺伝子の標的ノックアウト
【０２２２】
４．１  ＫＬＲａｔ１配列の検索とＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の特定
４．１．１  遺伝子の標的ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０２２３】
ＫＥＧＧデータベースにおいて、ＢＬＡＳＴアラインメント分析をＲａｔ１遺伝子に基づいて行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ａ１０８３５ｇのコードを有するクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＲａｔ１の遺伝子配列（配列番号３）を決定した。決定された遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＲａｔ１と６０．３８％の遺伝子配列相同性と６２．３０％のタンパク質配列相同性を有し、Ｓ．ポンベ(S. pombe)のＲａｔ１と５０．５３％の遺伝子配列相同性と３９．７３％のタンパク質配列相同性を有し、Ｈ．サピエンス(H. sapiens)のＲａｔ１と５０．１５％の遺伝子配列相同性と４１．４１％のタンパク質配列相同性を有する（図７に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なＥＸＮ５３の５’から３’のエキソヌクレアーゼドメインを有する（図４に示す）。この遺伝子は、ＫＬＲａｔ１（染色体Ｆの７０３９５５．．．７０６９３３に位置する）と命名される。
【０２２４】
ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）をＲａｔ１遺伝子の開始コドンと終止コドンの近くで検索し、ｇＲＮＡ配列を同定した。ｇＲＮＡを検索するための原理は、以下の通りである。ＧＣ含有量は、適度であるべきである（本発明における標準は、ＧＣ含有量が４０％〜６０％の範囲にあることである）。そして、ポリＴ構造の存在は、回避されるべきである。最後に、本発明により決定されたＫＬＲａｔ１ ｇＲＮＡ−１配列は、ＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＡ(配列番号：４１）であった。本発明により決定されたＫＬＲａｔ１ ｇＲＮＡ−２配列は、ＣＴＣＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣ（配列番号：４２）であった。
【０２２５】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＲａｔ１−Ｆ１：ＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号４３）およびｐＣａｓ９−ＫＬＲａｔ１−Ｒ１：ＡＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＣＡＣＣＧ（配列番号４４）の一対のプライマーを使用することにより、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＲａｔ１−Ｆ２：ＡＴＧＧＧＡＣＣＴＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号４５）およびｐＣａｓ９−ＫＬＲａｔ１−Ｒ２：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＧＡＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号４６）の一対のプライマーを使用することにより、実行された。 各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ産物を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−２と命名した。
【０２２６】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−１を用いて、ｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号４７）およびｐＣａｓ９−Ｒ１：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号４８）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−２を用いて、ｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＣＴＣＧＧ（配列番号４９）およびｐＣａｓ９−Ｒ２：ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号５０）のプライマーを使用することによって実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２のＰＣＲ増幅産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤｐｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−１および２と命名した（図１４に示す）。
【０２２７】
４．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２２８】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において、ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１８プラスミドに挿入した。次いで、ＰＣＲによって増幅して、線状ドナーＤＮＡ配列を得た。
【０２２９】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡとともに、ＫＬＲａｔ１−Ｆ１：ＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＴＧＣ（配列番号５１）およびＫＬＲａｔ１−Ｒ１：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＧＴＡＣＧＴＧＡＧＧＣＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣ（配列番号５２）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドと共に、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号５３）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号５４）のプライマーを使用することによって実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ−陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、ＫＬＲａｔ１−ｐＭＤ１８と命名した。
【０２３０】
ＰＣＲ増幅は、鋳型としてのＫＬＲａｔ１−ｐＭＤ１８プラスミドと共に、ＫＬＲａｔ１−Ｆ２：ＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＣＣＣＧＴＴＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣ（配列番号５５）およびＫＬＲａｔ１−Ｒ２：ＴＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＣＧＣ（配列番号５６）のプライマーを用いて実行された。ＫＬＲａｔ１−ＤＤ−ｐＭＤ１８を構築した（図１５に示すように）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２３１】
４．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
４．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを採取した。次いで、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、さらに２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収し、無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下で、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２３２】
４．３．２  コンピテント細胞を３７℃で１５〜３０秒間解凍し、１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去した。形質転換緩衝液は、以下のように調製された。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ／ｖ）)、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ(５．０ｍｇ／ｍＬ）、１５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド、１０μＬのドナーＤＮＡを添加した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離して、上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液状培地を加え、混合物を２〜３時間インキュベートした。２００ μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２３３】
４．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍＬのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としの酵母溶液と共に、ＫＬＲａｔ１−ＣＩＣＦ１：ＴＡＡＧＡＣＡＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＣＧＡＣＧ（配列番号：５７）およびＫＬＲａｔ１−ＣＩＣＲ１：ＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧ（配列番号：５８）のＣＲＩＳＰＲ挿入チェックプライマーを用いてＰＣＲにより検出された。ＰＣＲで陽性と判定され、シークエンシングで同定された株を陽性株と判定した。
【０２３４】
実施例５  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＲｒｐ６遺伝子の標的ノックアウト
【０２３５】
５．１  ＫＬＲｒｐ６配列の検索とＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の特定
５．１．１  遺伝子の標的ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０２３６】
ＫＥＧＧデータベースにおいて、ＢＬＡＳＴアラインメント分析をＲｒｐ６遺伝子に基づいて行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ｄ０１３０９ｇのコードを有し、hypotheticalタンパク質という名称で呼ばれるクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＲｒｐ６の遺伝子配列（配列番号４）を決定した。決定された遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＲｒｐ６に対する５５．０４％の遺伝子配列相同性と４６．９３％のタンパク質配列相同性を有し、Ｓ．ポンベ(S. pombe)のＲｒｐ６に対する４４．０４％の遺伝子配列相同性と２９．８５％のタンパク質配列相同性を有し、Ｈ．サピエンス(H. sapiens)のＲｒｐ６に対する４０．４４％の遺伝子配列相同性と２３．５３％のタンパク質配列相同性を有する（図８に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なＲｒｐ６ｐ様(Ｒｒｐ６ｐ-like)エキソヌクレアーゼドメイン、ＰＭＣ２ＮＴドメイン、ならびにヘリカーゼおよびＲＮａｓｅ Ｄ Ｃ末端ドメインを有する（図４に示される）。この遺伝子はＫＬＲｒｐ６（染色体Ｄの１１４７１３．．．１１６９４７に位置する）と命名されている。
【０２３７】
ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）をＲｒｐ６遺伝子の開始コドンと終止コドンの近くで検索し、ｇＲＮＡ配列を決定した。ｇＲＮＡを選択する原理は、以下の通りである。ＧＣ含量は、適度であるべきである（本発明における標準は、本明細書中のＧＣ含量が４０％〜６０％の範囲であることである）。そして、ポリＴ構造の存在は、避けるべきである。最後に、本発明により決定されたＫＬＲｒｐ６ ｇＲＮＡ−１配列は、ＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＴＡであった。本発明により決定されたＫＬＲｒｐ６ｇＲＮＡ−２配列は、ＣＣＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＡであった。
【０２３８】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＲｒｐ６−Ｆ１：ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＡＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧＡＴＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号５９）およびｐＣａｓ９−ＫＬＲｒｐ６−Ｒ１：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号６０）の一対のプライマーを使用することにより、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＲｒｐ６−Ｆ２：ＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号：６１）およびｐＣａｓ９−ＫＬＲｒｐ６−Ｒ２：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＣＴＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号：６２）の一対のプライマーを使用することにより、実行された。各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ産物を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックを与えた。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−２と命名した。１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−１と共に、ｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号６３）およびｐＣａｓ９−Ｒ１：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号６４）のプライマーを用いて実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−２と共に、ｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＡＧＴＡＧＴＧＴＴＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＡＣＴＡＣＴＣＧＧ（配列番号：６５）およびｐＣａｓ９−Ｒ２:ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号：６６）のプライマーを用いて実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２とのＰＣＲ増幅産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤｐｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングによって確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−１および２と命名した（図１６に示す）。
【０２３９】
５．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２４０】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において、ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１８プラスミドに挿入した。次いで、ＰＣＲによって増幅して、線状ドナーＤＮＡ配列を得た。
【０２４１】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡとともに、ＫＬＲｒｐ６−Ｆ１：ＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＡＴＡＧＣＴＴＴＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧ（配列番号６７）およびＫＬＲｒｐ６−Ｒ１：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＧ（配列番号６８）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドとともに、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号６９）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号７０）のプライマーを使用することによって実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、ＫＬＲｒｐ６−ｐＭＤ１８と命名した。
【０２４２】
ＰＣＲ増幅は、鋳型としてのＫＬＲｒｐ６−ｐＭＤ１８プラスミドとともに、ＫＬＲｒｐ６−Ｆ２：ＣＴＧＡＣＴＣＴＡＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＧ（配列番号７１）およびＫＬＲｒｐ６−Ｒ２：ＧＣＴＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＴＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＧＴＣＴＡＣ（配列番号７２）のプライマーを用いて実行された。ＫＬＲｒｐ６−ＤＤ−ｐＭＤ１８を構築した（図１７に示すように）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２４３】
５．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
５．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを採取した。次いで、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、５０ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪しながらさらに培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収し、無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下で、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２４４】
５．３．２  コンピテント細胞を３７℃で１５〜３０秒間解凍し、１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去した。形質転換緩衝液は、以下のように調製された。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ／ｖ））、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）、１５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミドおよび１０μＬのドナーＤＮＡを提供した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離して、上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液状培地を加え、２〜３時間混合物をインキュベートした。２００μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２４５】
５．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍＬのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としての酵母溶液とともに、ＫｌＲｒｐ６−ＣＩＣＦ１：ＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号：７３）およびＫｌＲｒｐ６−ＣＩＣＲ１：ＴＧＡＡＣＣＣＴＣＴ ＴＣＣＡＴＧＴＣ ＡＴＣ（配列番号：７４）のＣＲＩＳＰＲ挿入検査プライマーを用いたＰＣＲによって試料を検出した。ＰＣＲで陽性と判定され、シークエンシングで同定された株を陽性株と特定した。
【０２４６】
実施例６  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＮＧＬ２遺伝子の標的ノックアウト
【０２４７】
６．１  ＫｌＮＧＬ２配列の検索とＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の特定
６．１．１  遺伝子の標的ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０２４８】
ＫＥＧＧデータベースでは、ＮＧＬ３遺伝子に基づいて、ＢＬＡＳＴアラインメント解析を行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ｃ０６２４８ｇのコードを有するクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＮＧＬの遺伝子配列（配列番号５）を決定した。決定された遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＮＧＬ３に対する４６．２６％の遺伝子配列相同性と４６．３４％のタンパク質配列相同性とを有し、Ｓ．ポンベ(S. pombe)のＮＧＬ２に対する４５．４２％の遺伝子配列相同性と２９．０７％のタンパク質配列相同性とを有し、Ｈ．サピエンス(H. sapiens)のＮＧＬ３に対する３８．７２％の遺伝子配列相同性と１９．８９％のタンパク質配列相同性とを有する（図９に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なエクソヌクレアーゼ−エンドヌクレアーゼ−フォスファターゼ（Exonuclease-Endonuclease-Phosphatase, ＥＥＰ）ドメインを有する（図４に示す）。この遺伝子は、ＫｌＮＧＬ２（染色体Ｃの５５２４９３．．．５５４０４３に位置する）と命名される。
【０２４９】
ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を、ＫｌＮＧＬ２遺伝子の開始コドンと終止コドンの近くで検索し、ｇＲＮＡ配列を決定した。ｇＲＮＡを選択する原理は、以下の通りである。ＧＣ含量は、適度であるべきである（本発明における標準は、ＧＣ含量が４０％〜６０％の範囲にあることである）。そして、ポリＴ構造の存在は、避けるべきである。最後に、本発明により決定されたＫｌＮＧＬ２ ｇＲＮＡ−１配列は、ＧＣＴＧＧＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＡＣ（配列番号７５）であった。本発明により決定されたＫｌＮＧＬ２ ｇＲＮＡ−２配列は、ＴＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＡＡＣＴ（配列番号７６）であった。
【０２５０】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドとともに、ｐＣａｓ９−ＫＬＮＧＬ２−Ｆ１：ＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣ（配列番号７７）およびｐＣａｓ９−ＫＬＮＧＬ３−Ｒ１：ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＴＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号７８）の一対のプライマーを使用することによって、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドとともに、ｐＣａｓ９−ＫＬＮＧＬ２−Ｆ２：ＴＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴ（配列番号：７９）およびｐＣａｓ９−ＫＬＮＧＬ２−Ｒ２：ＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＡＴＧＴＴＡＧＡＧＣ（配列番号：８０）の一対のプライマーを使用することによって、実行された。各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ増幅産物を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ２−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ３−２と命名した。１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ２−１とともに、ｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号８１）およびｐＣａｓ９−Ｒ１：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号８２）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ２−２とともに、ｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＣＴＣＧＧ（配列番号：８３）およびｐＣａｓ９−Ｒ２：ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号：８４）のプライマーを使用することによって、実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２とのＰＣＲ増幅産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤ��ｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物をＤＨ５αコンピテント細胞１００μＬに添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングによって確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ３−１および２と命名した（図１８に示す）。
【０２５１】
６．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２５２】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において、ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１8プラスミドに挿入した。次いで、ＰＣＲによって増幅して、線状ドナーＤＮＡ配列を得た。
【０２５３】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡとともに、ＫｌＮＧＬ２−Ｆ１：ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＡＣＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＡＧＧＡＡ（配列番号８５）およびＫｌＮＧＬ２−Ｒ１：ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＡＣＧＧＣＣＣＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＣＣＣＡＴ（配列番号８６）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドと共に、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号８７）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号８８）のプライマーを使用することによって実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、次いでＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、ＫｌＮＧＬ２−ｐＭＤ１８と名付けた。
【０２５４】
ＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのＫｌＮＧＬ３−ｐＭＤ１プラスミドとともに、ＫｌＮＧＬ２−Ｆ２：ＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＧＡＧＣＣＡＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴＡＡＡＣＴＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＣＴＡＣＡＧ（配列番号：８９）およびＫｌＮＧＬ２−Ｒ２：ＣＣＡＴＡＧＴＴＡＡＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号：９０）のプライマーを用いて実行された。ＫｌＮＧＬ２−ＤＤ−ｐＭＤ１８は、構築された（図１９に示す）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、次いでＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２５５】
６．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
【０２５６】
６．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを摘出し、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、５０ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪しながらさらに培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収し、無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下で、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２５７】
６．３．２  コンピテント細胞を３７℃で１５〜３０秒間解凍のために置かれ、１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去した。形質転換緩衝液は、以下のように調製された。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ／ｖ））、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）、１５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド、および１０μＬのドナーＤＮＡを添加した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離して、上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液状培地を加え、混合物を２〜３時間インキュベートした。２００μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２５８】
６．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍＬのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としての酵母溶液とともに、ＫｌＮＧＬ２−ＣＩＣＦ１：ＡＴＡＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＧＣＧＴＡ（配列番号９１）およびＫｌＮＧＬ２−ＣＩＣＲ１：ＡＡＧＣＡＧＡＴＴＴＡＴＧＣＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣ（配列番号９２）のＣＲＩＳＰＲ挿入検査プライマーを使用するＰＣＲによって検出された。ＰＣＲで陽性と判定され、シークエンシングで同定された株を陽性株と特定した。
【０２５９】
実施例７  無細胞インビトロタンパク質合成系の調製およびタンパク質合成効率の測定
【０２６０】
実験方法：
ｉ．インビトロタンパク質合成系の保存溶液の調製：ｐＨ７．４の１Ｍの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、５Ｍの酢酸カリウム、２５０ｍＭの酢酸マグネシウム、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを含む４つのヌクレオシド三リン酸の混合物の２５ｍＭ、２０種のアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを含む）の混合物の１ｍＭ（各種アミノ酸の濃度は１．０ｍＭである）、１Ｍのホスホクレアチン、１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、６．４８ｍｇ／ｍＬクレアチンホスホキナーゼ、１．７ｍｇ／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、２０％〜５０%のＰＥＧ３３５０またはＰＥＧ８０００、および２０％〜４０％スクロースである。
【０２６１】
ｉｉ．インビトロタンパク質合成反応系は、最終濃度について、それぞれ、ｐＨ７．４で２２ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、３０〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、１．０〜５．０ｍＭの酢酸マグネシウム、４つのヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを含む）の混合物の１．５ｍＭ〜４ｍＭ、０．０８〜０．２４ｍＭのアミノ酸混合物（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを含む）、２５ｍＭのホスホクレアチン、１．７ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．２７ｍｇ／ｍＬのクレアチンホスホキナーゼ、８〜２０ｎｇ／μＬのホタルルシフェラーザのＤＮＡ、０．０２７〜０．０５４ｍｇ／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、１％〜４％のＰＥＧ、および最後に５０容量％で添加された酵母細胞抽出物を含む。
【０２６２】
ｉｉｉ．インビトロタンパク質合成反応：上記反応系を２０〜３０℃の環境下に置き、２〜６時間反応させた。
【０２６３】
ｉｖ．ルシフェラーゼの活性のアッセイ：反応の完了後、同じ体積の基質とするルシフェリン(luciferin)を、上記反応のために９６ウェル白色プレートまたは３８４ウェル白色プレートのウェルに添加した。これを直ちにＥｎｖｉｓｉｏｎ２１２０多機能マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）に置いた。そして、吸光度を読み取って、ホタルルシフェラーゼの活性を検出した。活性の単位は、相対発光量（ＲＬＵ）値である。（図２０に示されるように）
【０２６４】
実験結果：
【０２６５】
実施例７のアッセイ結果は、ヌクレアーゼをノックアウトした全ての変異株の中で、ΔＫＬＥＸＮ５３株が酵母系のインビトロタンパク質合成系におけるタンパク質産生の効率を有意に増大することができることを示す（表２に示される）。また、野生型株は、ＩＶＴＴシステムで２．９０×１０８のルシフェラーゼ活性値を有し、ΔＫＬＥＸＮ５３酵母株は、ＩＶＴＴシステムで７．１６×１０８のルシフェラーゼ活性値を有することを示した。ΔＫＬＥＸＮ５３のルシフェラーゼ活性値は、野生型株のそれの２．４６倍であった（図２０に示す）。
【０２６６】
表２
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【０２６７】
参考文献：
１．Ayyar, B.V., S. Arora, and R. O'Kennedy, Coming-of-Age of Antibodies in Cancer Therapeutics. Trends PharmacolSci, 2016. 37(12): p. 1009-1028.
２．Scott, A.M., J.D. Wolchok, and L.J., Antibody therapy of cancer. Nature Reviews Cancer, 2012. 12(4): p. 278.
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４．M., D.J.R.G., Nucleic Acid. Encyclopedia of Cell Biology, Elsevier, 2015.
５．Chong, S., Overview of Cell-Free Protein Synthesis: Historic Landmarks, Commercial Systems, and Expanding Applications. 2014: John Wiley & Sons, Inc. 16.30.1-16.30.11.
【０２６８】
本発明において言及される全ての文献は、各文献が個々に参照として引用されるのと同様に、本出願において参照として引用される。さらに、当業者は、上記の教示に照らして本発明に様々な変更または修正を加えることができ、均等物もまた、本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲に入ることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月22日(2020.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、ヌクレアーゼシステムのノックアウトによってインビトロ生合成活性を調節するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、細胞における重要な分子であり、細胞のほとんど全ての機能の実行に関与する。タンパク質の配列および構造は、その機能を決定する。細胞において、タンパク質は、酵素類として種々の生化学反応を触媒することができ、シグナル分子として生物体の種々の活動を協調することができ、生物形態をサポートし、エネルギーを蓄積し、分子を輸送し、生物体を動かせることができる。生体医学の分野では、標的薬物として、抗体（タンパク質の一種）は、がんや他の疾病[1][2]を治療するための重要な手段である。
【０００３】
細胞では、栄養欠乏などの外界圧力に応答するだけでなく、細胞の発生や分化など様々なプロセスにおいて、タンパク質翻訳の調節が重要な役割を果たしている。タンパク質翻訳の４つのプロセスには、翻訳開始、翻訳伸長、翻訳終結およびリボソームのリサイクリングがある。その中でも、翻訳開始が最も調節されたプロセス[3]である。翻訳開始段階では、リボソームの小サブユニット（４０Ｓ）が（ｔＲＮＡ）ｉＭｅｔに結合し、翻訳開始因子の助けを借りてｍＲＮＡの５’末端を認識する。小サブユニットは、下流に移動し、開始コドン（ＡＵＧ）の位置でリボソームの大サブユニット（６０Ｓ）に結合して完全なリボソームを形成する。次に、翻訳伸長フェーズが開始される[4]。
【０００４】
インビトロ生合成系は、細菌、真菌、植物細胞、または動物細胞に基づく溶解系を指す。これは、特定の化学分子または生体高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質）の迅速かつ効率的な翻訳を完了するために、核酸ＤＮＡ、ＲＮＡ、基質、およびエネルギー源が添加される。一般に使用されるインビトロ生合成系は、外来性組換えタンパク質[5]の迅速かつ効率的な翻訳を達成するために、外来性ｍＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型および細胞溶解物を使用するインビトロタンパク質合成系である。
【０００５】
現在、市販されており、一般的に使用されているインビトロタンパク質合成系の１つは、インビトロ転写−翻訳システム（in vitro transcription-translation system）（ＩＶＴＴシステムと略される）である。これは、ＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡ中間体に転写し、次いで、アミノ酸、ＡＴＰなどを含む成分を使用することによって、外来性タンパク質のワンステップの効率的な翻訳を完了する。一般に使用される市販のインビトロタンパク質発現系には、大腸菌抽出物（Escherichia coli extract,ＥＣＥ）系、ウサギ網状赤血球溶解物（rabbit reticulocyte lysate,ＲＲＬ）系、コムギ胚芽抽出物（wheat germ extract,ＷＧＥ）系、昆虫細胞抽出物（insect cell extract,ＩＣＥ）系、およびヒト供給源系が含まれる。
【０００６】
ｍＲＮＡおよびＤＮＡの核酸は、インビトロタンパク質合成系におけるコード基質である。それらの安定性は、タンパク質の収率に影響を及ぼす。ヌクレアーゼは、核酸分解の第一段階において、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合を加水分解する一種のタンパク質である。ＲＮＡにのみ作用するいくつかのヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）として知られている。ＤＮＡにのみ作用するいくつかのヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）として知られている。作用部位によって、ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ（exonuclease）とエンドヌクレアーゼ(endonuclease)のカテゴリーに分けられる。細胞内のＲＮＡの大部分は、細胞質の５’から３’のエキソヌクレアーゼと、核の５’から３’のエキソヌクレアーゼを介して、あるいは、細胞質と核に位置する３’から５’のエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質サブユニット複合体エキソソーム（exosome）を介して分解される。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復／ＣＲＩＳＰＲ関連）（Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated）は、細菌や古細菌に広く存在する生体防御システムである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの中で、修正タイプＩＩシステム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）は、ゲノム改変のために広く使用されるツールとなっている。誘導ＲＮＡ(guide RNA,ｇＲＮＡ)の誘導下で、Ｃａｓ９タンパク質は、ゲノム上のプロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif,ＰＡＭ）およびその上流２０ｂｐ配列を認識し、ＰＡＭの第３ｂｐ上流の位置に二本鎖ニックを作り出す。同時にドナーＤＮＡ(donor DNA)を供与する場合には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の二本鎖により切断された遺伝子をＨＤＲの方法で新しい配列と組み込んで組換えることにより、遺伝子改変の目的を達成することができる。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に関しては、遺伝子点突然変異、遺伝子ノックアウト、遺伝子挿入などを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたゲノム改変の例が多い。
【０００８】
現在のインビトロ（in vitro）合成系にはいくつかのヌクレアーゼが存在する可能である。それによって、これらのヌクレアーゼは、インビトロ合成系においてｍＲＮＡおよびＤＮＡを分解することによって、インビトロ合成系における核酸の安定性に影響を及ぼす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、核酸を安定化することによって外来性タンパク質の安定な発現を達成するための方法を開発するための緊急の必要性が当該分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、核酸を安定化することによって、外来性タンパク質の安定した発現を達成するための方法を提供することである。
【００１１】
第一の態様によれば、本発明は、インビトロ無細胞タンパク質合成系を提供する。それは、
（ａ）酵母細胞抽出物と、
（ｂ）ポリエチレングリコールと、
（ｃ）選択可能にある外来性スクロースと、
（ｄ）選択可能にある溶媒と、を含み、
溶媒は、水または水性溶媒であり、酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下である。
【００１２】
別の好ましい実施形態では、酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、ゼロである。
【００１３】
別の好ましい実施形態において、ＥＸＮ５３タンパク質は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびクルイベロマイセス（Kluyveromyces）からなる群から選択される酵母の１つ以上の供給源に由来し、好ましくはクルイベロマイセスに由来する。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、クルイベロマイセは、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromycesmarxianus）および／またはクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）を含む。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、ＥＸＮ５３タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号１として示される。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、ＥＸＮ５３タンパク質のタンパク質配列は、配列番号６として示される。
【００１７】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、
（ｅ１）ＲＮＡ合成基質、
（ｅ２）タンパク質合成基質、
（ｅ３）マグネシウムイオン、
（ｅ４）カリウムイオン、
（ｅ５）緩衝液、
（ｅ６）ＲＮＡポリメラーゼ、および
（ｅ７）エネルギー再生系（システム）、からなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む。
【００１８】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、
（ｅ８）ヘム（heme）、および
（ｅ９）スペルミジンからなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む。
【００１９】
別の好ましい実施形態において、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、およびそれらの組合せからなる群から選択される酵母の１つ以上の供給源に由来する。好ましくは、酵母細胞は、クルイベロマイセス細胞、より好ましくは、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromycesmarxianus）細胞および／またはクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）細胞を含む。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、酵母細胞抽出物は、酵母細胞の水性抽出物である。
【００２１】
別の好ましい実施形態において、酵母細胞抽出物は、酵母内因性長鎖核酸分子を含まない。
【００２２】
別の好ましい実施形態において、酵母細胞抽出物は、以下の工程を含む方法を使用することによって調製される。その工程は、
（ｉ）酵母細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）洗浄された酵母細胞を得るために、酵母細胞を洗浄する工程と、
（ｉｉｉ）洗浄された酵母細胞を細胞溶解処理で処理して、粗酵母抽出物を得る工程と、
（ｉｖ）固液分離によって、粗酵母抽出物を処理して液相、すなわち酵母細胞抽出物を得る工程と、を含む。
【００２３】
別の好ましい実施形態では、固液分離は、遠心分離を含む。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、遠心分離は、液体状態で行われる。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、遠心分離条件は、５，０００×ｇ〜１００，０００×ｇの範囲であり、より好ましくは８，０００×ｇ〜３０，０００×ｇの範囲である。
【００２６】
別の好ましい実施形態では、遠心分離時間は、０．５時間〜２時間の範囲であり、より好ましくは２０分〜５０分の範囲である。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、遠心分離は、１〜１０°Ｃ、より好ましくは２〜６°Ｃで実施される。
【００２８】
別の好ましい実施形態では、洗浄処理は、ｐＨ７〜８（好ましくはｐＨ７．４）の洗浄液を使用して実施される。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、洗浄液は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸カリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、細胞溶解処理のための方法は、高圧溶解、凍結融解（例えば、液体窒素低温での処理）溶解などを含む。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、ＲＮＡを合成するための基質は、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド三リン酸、およびそれらの組合せを含む。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、タンパク質を合成するための基質は、１〜２０種類の天然アミノ酸、および非天然アミノ酸を含む。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、マグネシウムイオンは、マグネシウムイオン源に由来する。そして、マグネシウムイオン源は、酢酸マグネシウム、グルタミン酸マグネシウム、またはそれらの組合せである。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、カリウムイオンは、カリウムイオン源に由来する。そして、カリウムイオン源は、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム、またはそれらの組合せである。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、エネルギー再生系は、ホスホクレアチン／ホスホクレアチナーゼ系、解糖経路およびその中間産物エネルギー系、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３６】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、（ｆｌ）合成ｔＲＮＡをさらに含む。
【００３７】
別の好ましい実施形態において、緩衝液は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、無細胞タンパク質合成系は、（ｇｌ）タンパク質合成をガイドするための外来性ＤＮＡ分子をさらに含む。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子は、線状である。
【００４０】
別の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子は、環状である。
【００４１】
別の好ましい実施形態において、ＤＮＡ分子は、外来性タンパク質をコードする配列を含む。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質をコードする配列は、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列を含む。
【００４３】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質をコードする配列は、プロモーター配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列またはそれらの組み合わせをさらに含む。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ヌクレオシド三リン酸、アミノ酸、クレアチンリン酸（ホスホクレアチン）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ホスホクレアチナーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される成分を含む。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、ポリエチレングリコールは、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ３３５０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４６】
別の好ましい実施形態において、ポリエチレングリコールは、２００〜１０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコール、好ましくは３，０００〜１０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールを含む。
【００４７】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ａ）の濃度（ｖ／ｖ）は、タンパク質合成系の総体積に基づいて、２０％〜７０％、好ましくは３０％〜６０％、より好ましくは４０％〜５０％の範囲である。
【００４８】
別の好ましい実施形態ではタンパク質合成系において、成分（ｂ）の濃度（ｗ／ｖ、例えば、ｇ／ｍＬ）は、０．１％〜８％、好ましくは０．５％〜４％、より好ましくは１％〜２％の範囲である。
【００４９】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、成分（ｃ）の濃度は、タンパク質合成系の総体積に基づいて、０．２％〜４％、好ましくは０．５％〜４％、より好ましくは０．５％〜１％の範囲である。
【００５０】
別の好ましい実施形態において、ヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、成分（ｅ１）の濃度は、０．１ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜３ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜１．５ｍＭの範囲である。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００５３】
別の好ましい実施形態において、アミノ酸は、Ｄ型のアミノ酸および／またはＬ型のアミノ酸を含む。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、成分（ｅ２）の濃度は、０．０１ｍＭ〜０．４８ｍＭ、好ましくは０．０４ｍＭ〜０．２４ｍＭ、より好ましくは０．０４ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲であり、最も好ましくは０．０８ｍＭである。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ｅ３）の濃度は、１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭ、より好ましくは２ｍＭ〜４ｍＭの範囲である。
【００５６】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ｅ４）の濃度は、３０ｍＭ〜２１０ｍＭ、好ましくは３０ｍＭ〜１５０ｍＭ、より好ましくは３０ｍＭ〜６０ｍＭの範囲である。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ｅ６）の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０２ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０２７ｍｇ／ｍＬ〜０．０５４ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００５８】
別の好ましい実施形態で、はタンパク質合成系において、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸の濃度は、５ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭ、より好ましくは１５ｍＭ〜３０ｍＭ、さらに好ましくは２０ｍＭ〜２５ｍＭの範囲である。
【００５９】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、酢酸カリウムの濃度は、２０ｍＭ〜２１０ｍＭ、好ましくは３０ｍＭ〜２１０ｍＭ、より好ましくは３０ｍＭ〜１５０ｍＭ、さらに好ましくは３０ｍＭ〜６０ｍＭの範囲である。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、酢酸マグネシウムの濃度は、１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ〜５ｍＭ、より好ましくは２ｍＭ〜４ｍＭの範囲である。
【００６１】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、ホスホクレアチンの濃度は、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜３０ｍＭ、より好ましくは２５ｍＭの範囲である。
【００６２】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、ヘムの濃度は、０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ、好ましくは０．０２ｍＭ〜０．０８ｍＭ、より好ましくは０．０３ｍＭ〜０．０５ｍＭ、さらに好ましくは０．０４ｍＭの範囲である。
【００６３】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、スペルミジンの濃度は、０．０５ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜０．８ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ〜０．５ｍＭ、さらに好ましくは０．３ｍＭ〜０．４ｍＭ、最も好ましくは０．４ｍＭの範囲である。
【００６４】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度は、０．２ｍＭ〜１５ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜７ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜２ｍＭの範囲である。
【００６５】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、クレアチンホスホキナーゼの濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．２７ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００６６】
別の好ましい実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼである。
【００６７】
別の好ましい実施形態において、タンパク質合成系において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜０．３ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０２ｍｇ／ｍＬ〜０．１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０２７ｍｇ／ｍＬ〜０．０５４ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、無細胞インビトロ合成系は、以下の特性を有する。
合成系において、合成されたタンパク質の総量は、合成系のミリリットル（ｍＬ）あたり３μｇのタンパク質に達する。
【００６９】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系は、以下の成分を含む。
2021503951.tif 000026
【００７０】
別の好ましい実施形態において、無細胞タンパク質合成系はまた、以下の成分を含む。
2021503951.tif 000027
【００７１】
別の好ましい実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００７２】
第２の態様によれば、本発明は、酵母細胞抽出物を提供する。その酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含む。酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下である。
【００７３】
第３の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様によるインビトロ無細胞タンパク質合成系の製造方法を提供する。その方法は、
（ａ）酵母細胞抽出物、（ｂ）ポリエチレングリコール、（ｃ）選択可能にある外来性スクロース、および（ｄ）選択可能にある溶媒の成分を混合して、本発明の第１の態様によるインビトロ無細胞タンパク質合成系を得る工程を含む。溶媒は、水または水性溶媒である。酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含む。酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下である。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ａ）の濃度（ｖ／ｖ）は、タンパク質合成系の総体積に基づいて、２０％〜７０％、好ましくは３０％〜６０％、より好ましくは４０％〜５０％の範囲である。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、タンパク質合成系において、成分（ｂ）の濃度（ｗ／ｖ、例えば、ｇ／ｍＬ）は、０．１％〜８％、好ましくは０．５％〜４％、より好ましくは１％〜２％の範囲である。
【００７６】
本発明の第４の態様によれば、タンパク質のインビトロ合成のための方法が提供される。その方法は、
（ｉ）本発明の第１の態様によるインビトロ無細胞タンパク質合成系を提供し、タンパク質合成をガイドするための外来性ＤＮＡ分子を添加する工程と、タンパク質合成系において、ＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であり、
(ｉｉ）外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質を合成するために、適切な条件下で、Ｔ１の期間、工程（ｉ）で提供されるタンパク質合成系をインキュベートする工程と、を含む。
【００７７】
別の好ましい実施形態では、この方法は、（ｉｉｉ）任意選択で、タンパク質合成系から外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質を単離する工程または検出する工程をさらに含む。
【００７８】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、原核生物または真核生物に由来する。
【００７９】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、動物、植物または病原体に由来する。
【００８０】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、哺乳動物、好ましくは霊長類またはげっ歯類に由来する（ヒト、マウスおよびラットを含む）。
【００８１】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質のコード配列は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される外来性タンパク質をコードする。
【００８２】
別の好ましい実施形態において、外来性タンパク質は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、ルシフェリン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される外来性タンパク質をコードする。
【００８４】
別の好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００８５】
別の好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）において、反応温度は、２０℃〜３７℃、好ましくは２０℃〜２５℃の範囲である。
【００８６】
別の好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）において、反応時間は、１〜６時間、好ましくは２〜４時間の範囲である。
【００８７】
第５の態様によれば、本発明は、エンジニアリング株を提供する。そのエンジニアリング株はクルイベロマイセス株である。エンジニアリング株におけるＥＸＮ５３遺伝子（ヌクレアーゼ遺伝子）の発現レベルまたは活性は、低減される。
【００８８】
別の好ましい実施形態において、「低減された（減少した）」という語は、ＥＸＮ５３遺伝子の発現レベル（量）が１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを意味する。
【００８９】
別の好ましい実施形態において、「低減された（減少した）」という語は、ＥＸＮ５３遺伝子の発現レベルまたは活性の減少が以下の条件を満たすことを意味する。その条件は、
Ａ０に対するＡ１の比率は、３０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下、最も好ましくは０〜２％の範囲である。
ここで、Ａ１は、ＥＸＮ５３遺伝子の発現レベルに対応し、Ａ０は、野生型ＥＸＮ５３遺伝子の発現レベルに対応する。または、Ａ１は、ＥＸＮ５３遺伝子の活性に対応し、Ａ０は、野生型ＥＸＮ５３遺伝子の活性に対応する。
【００９０】
別の好ましい実施形態において、株中のＥＸＮ５３遺伝子（ヌクレアーゼ遺伝子）の発現レベルまたは活性は、遺伝子突然変異、遺伝子ノックアウト、遺伝子破壊、ＲＮＡ干渉技術、クリスパー(Crispr)技術、およびそれらの組合せからなる群から選択される方法を使用することによって低減される。
【００９１】
第６の態様によれば、本発明は、インビトロタンパク質合成の効率を改善するための、本発明の第５の態様によるエンジニアリング株の使用を提供する。
【００９２】
本発明の範囲内で、上述の技術的特徴および以下に具体的に記載される技術的特徴（例えば、実施形態または実施例）は、互いに組み合わせることができ、それによって、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成することが理解されるべきである。簡潔にするために、本明細書では詳細は繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、インビトロ生合成系においてヌクレアーゼを下方制御することによって核酸の安定性を改善し、Ｋ.ラクティス（Ｋ. lactis）ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子に対する分析および特異的改変を行うための設計経路を示す。（Ａ）は、Ｋ．ラクティス野生型細胞を示す。（Ｂ）は、ヌクレアーゼが改変されたＫ．ラクティス細胞を示す。（Ｃ）は、ヌクレアーゼが改変されたＫ．ラクティス細胞の溶解物（lysate）を収集する。（Ｄ）特定の遺伝子が改変された酵母株から、酵母細胞溶液を調製する。より安定な核酸の特徴を有することによって、酵母細胞溶液は、増大されたインビトロ生合成系を調製するために使用される。
【００９４】
【図２】図２は、Ｋ．ラクティスゲノム中の全６１のヌクレアーゼ遺伝子の分布と機能解析を示す。Ａ〜Ｆは、Ｋ．ラクティスの６本の染色体に対応する。Ａ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLSEN54,KLDNA2,KLTRM2,KLFCF1,KLDOM34,KLRAD2,KLRNH70,KLDIS3 およびKLNPP1である。Ｂ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLOGG1である。Ｃ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLPOL2,KLRAD50,KLYSH1,KLRCL1,KLNGL2,KLMRE11,KLPOP3,KLMKT1,KLAPN1,KLRPP1およびKLPOP2である。Ｄ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLNUC1,KLRRP6,KLDBR1,KLRPS3,KLRPM2,KLSUV3,KLRAD1,KLIRE1およびKLPOP1である。Ｅ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLPOL3,KLDXO1,KLMUS81,KLPAN3,KLAPN2,KLRAI1,KLEXO1,KLREX4,KLPAN2 およびKLLCL3である。Ｆ染色体に位置するヌクレアーゼ遺伝子は、KLRAD17,KLPOP4,KLPOP5,KLRAD27,KLRNH201,KLVMA1,KLRAT1,KLNGL1,KLREX2,KLPOL31,KLCCR4,KLTRZ1,KLSEN2,KLREX3,KLSWT1,KLEXN53,KLRNT1,KLSEN15,KLNTG1,KLNOB1およびKLDDP1である。
【００９５】
【図３】図３は、遺伝子改変されたＫ．ラクティスゲノム中の５つのヌクレアーゼの配列、および、それらに対応するＣＲＩＳＰＲシステムのデザインルートを示す。ドナーＤＮＡの２つのホモロジーアーム（homologous arm）と、ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２とは、それぞれ、ノックアウトされるヌクレアーゼ遺伝子のＯＲＦの約１，０００ｂｐ上流と下流に位置する遺伝子配列である。同様時にノックアウトされるヌクレアーゼ遺伝子のＯＲＦの５’末端と３’末端のＰＡＭ配列をそれぞれ認識し、部位特異的にＤＮＡを切断するためにＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導する２つのｇＲＮＡを構築する。相同組換えは、ＤＳＢ(二本鎖切断）（double strand break）が起こった後に起こる。それによって、遺伝子ノックアウトを達成している。
【００９６】
【図４】図４は、Ｋ．ラクティスゲノム中の５つのヌクレアーゼタンパク質ドメインの模式図を示す。
【００９７】
【図５】図５は、ＫＬＥＸＮ５３タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における相同性を持つタンパク質ＳｃＥＸＮ５３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＧＬ１７３Ｃ）との間、ＫＬＥＸＮ５３タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における相同性を持つタンパク質ＳｐＥＸＯ２（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＡＣ１７Ａ５．１４）との間、ならびに、ＫＬＥＸＮ５３タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）における相同性を持つタンパク質ＨｓＥＸＮ５３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：５４４６４）との間のアミノ酸配列の一部の比較を示す。活性部位は、＃でマークされている。
【００９８】
【図６】図６は、ＫｌＤＩＳ３タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における相同性を持つタンパク質ＳｃＤＩＳ３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＯＬ０２１Ｃ）との間、ＫｌＤＩＳ３タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における相同性を持つタンパク質ＳｐＤＩＳ３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＢＣ２６Ｈ８．１０）との間、ならびに、ＫｌＤＩＳ３タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）における相同性を持つタンパク質ＨｓＤＩＳ３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：２２８９４）との間のアミノ酸配列の一部の比較を示す。活性部位は、＃でマークされている。
【００９９】
【図７】図７は、ＫＬＲＡＴ１タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の相同性を持つタンパク質ＳｃＲＡＴ１（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＯＲ０４８Ｃ）との間、ＫＬＲＡＴ１タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）の相同性を持つタンパク質ＳｐＲＡＴ１（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＡＣ２６Ａ３．１２ｃ）との間、および、ＫＬＲＡＴ１タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）の相同性を持つタンパク質ＨｓＲＡＴ１（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：２２８０３）との間のアミノ酸配列の一部の比較を示す。活性部位は、＃でマーされている。
【０１００】
【図８】図８は、ＫＬＲＲＰ６タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における相同性を持つタンパク質ＳｃＲＲＰ６（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＯＲＯＯ１Ｗ）との間、ＫＬＲＲＰ６タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における相同性を持つタンパク質ＳｐＲＲＰ６（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＡＣ１Ｆ３．０１）との間、ならびに、ＫＬＲＲＰ６タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）における相同性を持つタンパク質ＨｓＲＲＰ６（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：５３９４）との間のアミノ酸配列の一部の比較を示す。活性部位は、＃でマークされている。
【０１０１】
【図９】図９は、ＫＬＮＧＬ２タンパク質とサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における相同性を持つタンパク質ＳｃＮＧＬ３（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＹＭＬ１１８Ｗ）との間、ＫＬＮＧＬ２タンパク質とシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）における相同性を持つタンパク質ＳｐＮＧＬ２（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：ＳＰＢＣ９Ｂ６．１１ｃ）との間、ならびに、ＫＬＮＧＬ２タンパク質とホモサピエンス（Homo sapiens）における相同性を持つタンパク質ＨｓＡＮＧＥＬ２（ＫＥＧＧ Ｎｏ.：９０８０６）との間のアミノ酸配列の一部の比較をそれぞれ示す。
【０１０２】
【図１０】図１０は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＥＸＮ５３のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＥＸＮ５３遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端で２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１０３】
【図１１】図１１は、ＫＬＥＸＮ５３−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＥＸＮ５３遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１０４】
【図１２】図１２は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤｉｓ３−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＤｉｓ３のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＤｉｓ３遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端の２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１０５】
【図１３】図１３は、ＫＬＤＩＳ３−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＤｉｓ３遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１０６】
【図１４】図１４は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＲａｔ１のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＲａｔ１遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端の２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１０７】
【図１５】図１５は、ＫＬＲａｔ１−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＲａｔ１遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１０８】
【図１６】図１６は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＲｒｐ６のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＲｒｐ６遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端の２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１０９】
【図１７】図１７は、ＫＬＲｒｐ６−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＲｒｐ６遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１１０】
【図１８】図１８は、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ２−１＆２のプラスミドプロフィールを示す。ＫＬＮＧＬ３のｇＲＮＡ１およびｇＲＮＡ２は、それぞれ、ｔＲＮＡ−ＴｙｒプロモーターおよびＳＮＲ５２ターミネーターを有するＫＬＮＧＬ３遺伝子のＯＲＦの５’末端および３’末端の２つのｇＲＮＡである。ＰＭＺ３７４−ｃａｓ９は、改善されたｃａｓ９である。プラスミドは、kana選択マーカーを有する。
【０１１１】
【図１９】図１９は、ＫＬＮＧＬ２−ＤＤ１−ｐＭＤ１８のプラスミドプロフィールを示す。ホモロジーアーム１およびホモロジーアーム２は、それぞれ、ＫＬＮＧＬ３遺伝子のＯＲＦの約１０００ｂｐ上流および下流にある遺伝子配列である。このプラスミドは、Ａｍｐ選択マーカーを有する。
【０１１２】
【図２０】図２０は、改変された株のインビトロ翻訳活性アッセイデータのグラフを示す。ホタル蛍光タンパク質（Ｆｌｕｃ）の蛍光強度を使用して、インビトロ生合成系における組換えタンパク質の合成能力を示す。ここで、ｗｔは野生型クルイベロマイセスを表し、ΔＫＬＥＸＮ５３はＫＬＥＸＮ５３遺伝子をノックアウトしたクルイベロマイセス株を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
広範かつ詳細な研究の後、５つのヌクレアーゼが、広範なスクリーニングおよびグローピングを通して多くのヌクレアーゼから選択された。驚くべきことに、ヌクレアーゼの１つＥＸＮ５３のダウンレギュレーションまたはノックアウトは、核酸の安定性を改善し、インビトロタンパク質合成系におけるタンパク質産生の効率を大いに増加させることができることが見出された。具体的には、ＥＸＮ５３のダウンレギュレーションまたはノックアウト後、ＩＶＴＴシステムにおけるΔＫＬＥＸＮ５３酵母株のルシフェラーゼ活性は、野生型株のルシフェラーゼ活性の２倍以上であった。これにより、本発明者らは、本発明を完成させた。
【０１１４】
特に明記しない限り、本発明において使用される全ての％は、重量％濃度を指す。
【０１１５】
酵母系のインビトロタンパク質合成系
【０１１６】
酵母は、単純な培養、効率的なタンパク質フォールディングおよび翻訳後修飾の利点を有する。酵母の中で、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）とピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、複雑な真核生物タンパク質と膜タンパク質を発現するためのモデル生物である。さらに、酵母はまた、インビトロ翻訳系の調製のための原料として使用される。
【０１１７】
クルイベロマイセス(kluyveromyces)は、子嚢胞子形成酵母である。クルイベロマイセスの中で、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromycesmarxianus）およびクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）は、産業界で広く使用されている酵母である。クルイベロマイセス・ラクティスは、他の酵母と比較して、超分泌能、より良好な大規模発酵特性、食品安全性レベルに適合すること、タンパク質の翻訳後修飾能を有することなど、多くの利点を有する。
【０１１８】
本発明において、酵母系のインビトロンパク質合成系は、特に限定されない。好ましい酵母系のインビトロタンパク質合成系は、クルイベロマイセス系の発現系（より好ましくは、クルイベロマイセス・ラクティス系の発現系）である。
【０１１９】
本発明において、酵母系のインビトロタンパク質合成系は、
（ａ）酵母細胞抽出物と、
（ｂ）ポリエチレングリコールと、
（ｃ）選択可能にある外来性スクロースと、
（ｄ）選択可能にある溶媒とを含む。
溶媒は、水または水性溶媒である。酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含む。酵母細胞抽出物中のＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下である。
【０１２０】
好ましい実施形態において、ＥＸＮ５３タンパク質は、ピキア・パストリスおよびクルイベロマイセスからなる群から選択される酵母の１つ以上の供給源に由来する。好ましくは、クルイベロマイセス（例えば、クルイベロマイセス・マルキシアヌス、クルイベロマイセス・ラクティス）に由来する。
【０１２１】
本発明において、クルイベロマイセス（例えば、クルイベロマイセス・ラクティスなど）は、特に限定されず、タンパク質の合成効率を向上させることができる任意の一種のクルイベロマイセス（例えば、クルイベロマイセス・ラクティスなど）株を含む。
【０１２２】
好ましい態様において、ＥＸＮ５３のタンパク質配列は、配列番号６として示される。ＥＸＮ５３タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号１として示される。
【０１２３】
特に好ましい実施形態において、本発明において提供されるインビトロタンパク質合成系は、酵母細胞抽出物、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、アミノ酸混合物、ホスホクレアチン、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、クレアチンホスホキナーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ルシフェリン、ルシフェラーゼのＤＮＡ、およびＲＮＡポリメラーゼを含む。
【０１２４】
本発明において、ＲＮＡポリメラーゼは、特に限定されない。ＲＮＡポリメラーゼは、１つ以上のＲＮＡポリメラーゼである。典型的なＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１２５】
本発明において、インビトロタンパク質合成系における酵母細胞抽出物の割合は、特に限定されない。一般に、インビトロタンパク質合成系における酵母細胞抽出物は、容量で、２０％〜７０％、好ましくは３０％〜６０％、より好ましくは４０％〜５０％を占める。
【０１２６】
本発明において、酵母細胞抽出物は、無傷細胞を含まない。そして、典型的な酵母細胞抽出物は、リボソーム、トランスファーＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを含むタンパク質翻訳のための因子と、ならびに、開始因子、伸長因子および終結放出因子（終結を媒介する放出因子）を含むタンパク質合成に必要な因子と、を含む。さらに、酵母抽出物はまた、酵母細胞の細胞質に由来するいくつかの他のタンパク質、特に、可溶性タンパク質を含む。
【０１２７】
本発明において、酵母細胞抽出物のタンパク質含量は、２０〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍＬである。タンパク質含量の測定法は、クーマシィーブリリアントブルーアッセイである。
【０１２８】
本発明において、酵母細胞抽出物の調製方法は、特に限定されない。好ましい調製方法は、
（ｉ）酵母細胞を提供する工程と、
(ｉｉ）洗浄された酵母細胞を得るために、酵母細胞を洗浄する工程と、
(ｉｉｉ）前記洗浄された酵母細胞を細胞溶解処理して、粗酵母抽出物を得る工程と、
(ｉｖ）粗酵母生物抽出物を固液分離により処理し、液相（すなわち、酵母細胞抽出物）を得る工程と、を含む。
【０１２９】
好ましい実施形態において、前記固液分離の方法は、特に限定されない。好ましい方法は、遠心分離である。
【０１３０】
好ましい実施形態では、遠心分離は、液体状態で行われる。
【０１３１】
本発明において、遠心分離条件は、特に限定されない。好ましい遠心分離条件は、５，０００×ｇ〜１００，０００×ｇの範囲、より好ましくは８，０００×ｇ〜３０，０００×ｇの範囲である。
【０１３２】
本発明において、遠心分離時間は、特に限定されない。好ましい遠心分離時間は、０．５分〜２時間、好ましくは２０分〜５０分の範囲である。
【０１３３】
本発明において、遠心分離温度は、特に限定されない。好ましくは、遠心分離は、１〜１０°Ｃ、より好ましくは２〜６°Ｃで行われる。
【０１３４】
本発明において、洗浄方法は、特に限定されない。洗浄処理は、洗浄液を用いて、ｐＨ７〜８（好ましくは、ｐＨ７．４）の環境下で行うことが好ましい。洗浄液は、特に限定されない。典型的な洗浄液は、４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸カリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１３５】
本発明において、細胞溶解処理の方法は、特に限定されない。好ましい細胞溶解処理は、高圧溶解、凍結融解（例えば、液体窒素低温での処理）溶解などを含む。
【０１３６】
インビトロタンパク質合成系におけるヌクレオシド三リン酸の混合物は、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、およびウリジン三リン酸を含む。本発明において、各単一ヌクレオチドの濃度は、限定されない。一般に、各単一ヌクレオチドの濃度は、０．５ｍＭ〜５ｍＭの範囲、好ましくは１．０ｍＭ〜２．０ｍＭの範囲である。
【０１３７】
インビトロタンパク質合成系におけるアミノ酸混合物は、天然または非天然アミノ酸を含み、Ｄタイプのアミノ酸またはＬタイプのアミノ酸を含む。代表的なアミノ酸は、特に限定されないが、２０種類の天然アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）を含む。各タイプのアミノ酸の濃度は、通常、０．０１ｍＭ〜０．５ｍＭ、好ましくは０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭ（例えば０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、および０．０８ｍＭ）の範囲である。
【０１３８】
好ましい実施形態において、インビトロタンパク質合成系は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその類似物をさらに含む。ポリエチレングリコールまたはその類似物の濃度は、特に限定されない。一般に、ポリエチレングリコールまたはその類似物の濃度（ｗ／ｖ）は、タンパク質合成系の総重量に基づいて、０．１％〜８％、好ましくは０．５％〜４％、より好ましくは１％〜２％の範囲である。ＰＥＧの代表的な例としては、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ６０００およびＰＥＧ３３５０が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による系（システム）は、他の様々な分子量（ＰＥＧ２００、４００、１５００、２０００、４０００、６０００、８０００、１００００など）を有するポリエチレングリコールをさらに含んでもよいことを理解されたい。
【０１３９】
好ましい実施形態において、インビトロタンパク質合成系は、スクロースをさらに含む。スクロースの濃度は、特に限定されない。一般に、スクロースの濃度は、タンパク質合成系の総重量に基づいて、０．０３重量％〜４０重量％、好ましくは０．０８重量％〜１０重量％、より好ましくは０．１重量％〜５重量％の範囲である。
【０１４０】
酵母抽出物に加えて、特に好ましいインビトロタンパク質合成系は、以下の成分をさらに含む。それは、２２ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ｐＨ ７．４）、３０〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、１．０〜５．０ｍＭの酢酸マグネシウム、１．５〜４ｍＭのヌクレオシド三リン酸混合物、０．０８〜０．２４ｍＭのアミノ酸混合物、２５ｍＭのホスホクレアチン、１．７ｍＭのジチオトレイトール、０．２７ｍｇ／ｍＬのクレアチンホスホキナーゼ、１％〜４％のポリエチレングリコール、０．５％〜２％のスクロース、８〜２０ｎｇ／μＬのホタルルシフェラーゼのＤＮＡ、および０．０２７〜０．０５４ｍｇ／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１４１】
外来性タンパク質（外来性ＤＮＡ）のコード配列
【０１４２】
本明細書中で使用されるように、用語「外来性タンパク質のコード配列」および「外来性ＤＮＡ」は、互換的に使用され、両方とも、タンパク質合成を誘導するための外来性ＤＮＡ分子をいう。ＤＮＡ分子は、一般に線状または環状である。ＤＮＡ分子は、外来性タンパク質をコードする配列を含む。本発明において、外来性タンパク質をコードする配列の例としては、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。外来性タンパク質をコードする配列はさらに、プロモーター配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１４３】
本発明において、外来性ＤＮＡの選択は、特に限定されない。一般に、外来性ＤＮＡは、ルシフェリン、またはルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、および抗体の可変領域をコードする外来性ＤＮＡ、ルシフェラーゼ変異体のＤＮＡ、ならびに、それらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０１４４】
外来性ＤＮＡはまた、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびそれらの任意の組合せをコードする外来性ＤＮＡから選択される。
【０１４５】
好ましい実施形態において、外来性ＤＮＡは、緑色蛍光タンパク質（enhancedＧＦＰ、ｅＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（β-galactosidase,ＬａｃＺ）、ヒトリジン−ｔＲＮＡシンセターゼ(lysine-tRNA synthetase)、ヒトロイシン−ｔＲＮＡシンセターゼ(leucine-tRNA synthetase)、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、マウスカタラーゼ(catalase)、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質をコードする。
【０１４６】
ハイスループットインビトロタンパ質合成方法（インビトロタンパク質翻訳効率を高めるための方法）
【０１４７】
本発明は、インビトロタンパク質合成のためのハイスループット方法を提供する。その方法は、
（ｉ）本発明の第１の態様に係るインビトロ無細胞タンパク質合成系を提供し、タンパク質合成を誘導するために外来性ＤＮＡ分子を加える工程と、たんぱく質合成系におけるＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であり、
(ｉｉ）外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質を合成するために、適切な条件下で、Ｔ１の期間、工程（ｉ）で提供されるタンパク質合成系をインキュベートする工程と、を含む。
【０１４８】
好ましい実施形態において、本発明は、酵母ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子をノックアウトすることによって、インビトロタンパク質翻訳効率を改善するための設計および方法を提供する。
【０１４９】
１．インビトロ生合成活性を増大するための設計スキームおよび分析方法は、
Ａ．インビトロ生合成系における成分が活性に及ぼす影響の分析と、
Ｂ．Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子の機能と分布の分析と、
Ｃ．Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノム中の選択されたヌクレアーゼ遺伝子の改変デザインと、である。
【０１５０】
２．遺伝子の標的化ノックアウトを受けたクローニングベクターの構築。その方法は、
Ａ．特定の遺伝子配列に対するエンドヌクレアーゼの切断（開裂）を誘導するｓｇＲＮＡ配列を設計する工程と、
Ｂ．エンドヌクレアーゼを含むベクターに上述のｓｇＲＮＡ配列を組み換えて、ｓｇＲＮＡとエンドヌクレアーゼが共発現される第１のベクターを得る工程と、を含む。
【０１５１】
３．特定の遺伝子のノックアウトのために使用されるドナーＤＮＡの構築。その方法は、
Ａ．遺伝子データベースから特定の遺伝子のヌクレオチド配列をダウンロードし、遺伝子のそれぞれ１０００ｂｐ上流および下流に位置する配列を用いることによって、第２のベクターを構築する工程と、
Ｂ．第２のベクターをプライマーＭ１３ＦおよびＭ１３Ｒで増幅する工程とを含む。得られたＰＣＲ産物は、エタノール沈殿により濃縮されて、ドナーＤＮＡを得る。
【０１５２】
４．第１のベクターおよびドナーＤＮＡを酵母コンピテント細胞に同時形質転換する工程。
【０１５３】
拡大培養用のモノクローン細胞をスクリーニングし、酵母ゲノムを抽出し、デザインされたプライマーでノックアウト部位を増幅し、増幅されたＰＣＲ産物の配列をシークエンシングすることで確認した後、特定の遺伝子をノックアウトした株を得る。
【０１５４】
５．無細胞インビトロタンパ質合成系
【０１５５】
特定の遺伝子をノックアウトした酵母株を用いて酵母細胞液を調製し、この酵母細胞液をインビトロタンパク質翻訳系に添加し、２０〜３０℃の環境下で２〜６時間混合物を反応させた。吸光度を読み取り、多機能マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）を用いてホタルルシフェラーゼの活性を検出した。
【０１５６】
本発明の主な利点は、以下の通りである。
【０１５７】
１．本発明は、核酸の安定性を改善するためにシステム中のヌクレアーゼの含量を減少させることによって、および、Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子に対して、体系分析を実施し、特異的改変を行うことによって、インビトロ生合成活性を調節するために普遍的に使用される技術的経路および方法を提供する。
【０１５８】
２．本発明では、大量のヌクレアーゼからヌクレアーゼをスクリーニングするために多くの努力がなされた。そして、多くのヌクレアーゼから５つのヌクレアーゼが初めてスクリーニングされた。驚くべきことに、５つのヌクレアーゼのうちの１つヌクレアーゼ（例えば、ＥＸＮ５３）のダウンレギュレーションまたはノックアウトは、核酸の安定性を改善し、インビトロタンパク質合成系のタンパク質産生の効率を大いに増大することができることが見出された。具体的には、ＥＸＮ５３のダウンレギュレーションまたはノックアウト後、ＩＶＴＴシステムにおけるΔＫＬＥＸＮ５３酵母株のルシフェラーゼ活性は、野生型株のルシフェラーゼ活性の２倍以上（例えば、２．４６倍）であった。
【０１５９】
３．初めて、インビトロタンパク質合成活性を有意に増加させることができるＫ．ラクティス（K. lactis）株が本発明において提供された。
【０１６０】
以下、本発明を具体的な実施例（または実施形態）と組み合わせてさらに説明する。これらの実施例（または実施形態）は、単に例示の目的のために提供され、本発明の範囲に対する限定とみなされるべきではないことが理解されるべきである。以下の実施例（または実施形態）に特に記載された条件を伴わない実験方法に関して、当業者は一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に記載された条件などの従来の条件に従うか、または、製造業者によって推奨される条件に従う。特に断らない限り、パーセンテージおよび部数(portion)は、重量パーセンテージおよび重量部数を指す。
【０１６１】
特に断らない限り、本発明の実施例で使用される材料および試薬は、すべて市販の製品である。
【０１６２】
実施例１  インビトロ生合成系におけるヌクレアーゼの含量を減少させることによって、核酸の安定性を改善すること、および、Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子に対する分析および特異的改変を行うこと。
【０１６３】
１．Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムを改変することによって、インビトロ生合成活性を調節するためのデザイン原理
【０１６４】
１．１  インビトロ生合成系の分析
１．１．１  異なるインビトロ生合成系における成分の分析
【０１６５】
インビトロ生合成系は、細胞溶解物を抽出するために、異なるタイプの細胞（微生物、動物および植物を含む）上で細胞溶解を実施することにより外来性タンパク質の翻訳のために使用される。インビトロ生合成系における、転写、翻訳、タンパク質フォールディング、エネルギー代謝等の機能を達成するために、細胞溶解物は、エネルギー再生およびタンパク質合成のためのエレメントを含まなければならない。それは、リボソーム、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、リボソーム放出因子、ヌクレオチドリサイクリング酵素、代謝酵素、分子シャペロン、フォールダーゼ等を含む、外来的に添加される必要がある物質には、アミノ酸、ヌクレオチド、ＤＮＡ鋳型、エネルギー基質、補因子、塩分子などが含まれる。系における種々の成分の安定性は、反応持続時間および最終タンパク質収率に重要な影響を及ぼす。特定の基質（例えば、ＡＴＰ、システインなど）の枯渇は、反応の終結の重要な理由である。
【０１６６】
１．１．２  インビトロ生合成系における成分が合成物に及ぼす影響分析モデル
【０１６７】
インビトロ翻訳系において、エネルギー代謝基質（ホスホクレアチン等）、ｍＲＮＡ合成に関与する基質（例えば、ＮＴＰ等）、タンパク質合成に関与する基質（例えば、アミノ酸等）、リン酸及び他の成分を含む成分の濃度値、並びにｐＨ値は、反応の進行に伴って変化し、最終的には反応の終了に至る。異なる技術を使用することによって、対応する成分（例えば、ＮＴＰ、アミノ酸など）を補充すること、および、対応する条件（例えば、ｐＨ値、リン酸濃度など）を安定化することの両方は、インビトロ翻訳系の反応時間を効果的に延長することができる。それによって、タンパク質の収率を増加させている。
【０１６８】
１．１．３  インビトロタンパク質合成系における核酸およびヌクレアーゼのタンパク質合成に対する影響の分析
【０１６９】
タンパク質翻訳の重要な基質として、ＤＮＡ鋳型とＤＮＡ鋳型から転写されるｍＲＮＡの安定性は、インビトロ翻訳系の反応時間と収率に重要な影響を及ぼす。細胞を溶解した後、細胞溶解物を収集し、インビトロ翻訳系を構築するために使用する。タンパク質合成に必要な種々の成分に加えて、インビトロ翻訳系はまた、反応に対して好ましくない成分（例えば、ヌクレアーゼ、プロテアーゼなど）を含む。種々の精製された成分で構成される系において、タンパク質翻訳の効率は、阻害因子の不在のために、有意に増加される。
【０１７０】
一方、インビトロ翻訳系における核酸の安定性は、異なる技術的手段（ヌクレアーゼ遺伝子のノックアウトや安定化因子の付加などを含む）を使用することによって効果的に高めることができる。その結果、タンパク質翻訳の効率を改善することができる。図１は、インビトロ生合成系におけるヌクレアーゼレベルを低下させることによって核酸の安定性を増加し、Ｋ．ラクティス(K. lactis)ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子に対する分析を実行および特異的改変を行うことのための設計経路を示す。
【０１７１】
１．２  Ｋ．ラクティス(K. lactis)ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子の分析
１．２．１  Ｋ．ラクティスゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子の分類と分布
【０１７２】
ヌクレアーゼ（核ポリメラーゼまたはポリヌクレオチダーゼとも呼ばれる）は、核酸分解の第１段階においてヌクレオチド間のホスホジエステル結合を加水分解することができる酵素である。ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの作用位置によって、エキソヌクレアーゼ(exonuclease)およびエンドヌクレアーゼ(endonuclease)のカテゴリーに分けることができる。３’末端から開始してヌクレオチドを１つずつ加水分解するエキソヌクレアーゼは、３’から５’のエキソヌクレアーゼと呼ばれる。５’末端から開始してヌクレオチドを１つずつ加水分解するエキソヌクレアーゼは、５’から３’のエキソヌクレアーゼと呼ばれる。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド中のホスホジエステル結合を触媒し、加水分解する。ヌクレアーゼはまた、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）およびリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）のカテゴリーに分けることができる。デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）は、ＤＮＡに作用する。リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）は、ＲＮＡに作用する。ヌクレアーゼはまた、ヌクレアーゼの作用方向によって、５’から３’のエキソヌクレアーゼおよび３’から５’のエキソヌクレアーゼに分類することができる。
【０１７３】
データベース中の遺伝子機能のアラインメント分析により、Ｋ.ラクティス(K. lactis)は、Ｋ．ラクティスＡ−Ｆの６つの染色体上に分布する合計６１個のヌクレアーゼを含む（図２に示す）。Ａ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＳＥＮ５４、ＫＬＤＮＡ２、ＫＬＴＲＭ２、ＫＬＦＣＦ１、ＫＬＤＯＭ３４、ＫＬＲＡＤ２、ＫＬＲＮＨ７０、ＫＬＤＩＳ３およびＫＬＮＰＰ１である。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＳＥＮ５４のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ００８０３ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＤＮＡ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０５３２４ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＴＲＭ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０５６６５ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＦＣＦ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０７０１８ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＤＯＭ３４のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０８６４６ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＲＡＤ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ０９４２７ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＲＮＨ７０のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ１００６５ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＤＩＳ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ１０８３５ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＮＰＰ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ａ１１３７４ｇである。
【０１７４】
Ｂ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＯＧＧ１である。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＯＧＧ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｂ０５１５９ｇである。
【０１７５】
Ｃ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＰＯＬ２、ＫＬＲＡＤ５０、ＫＬＹＳＨ１、ＫＬＲＣＬ１、ＫＬＮＧＬ２、ＫＬＭＲＥ１１、ＫＬＰＯＰ３、ＫＬＭＫＴ１、ＫＬＡＰＮ１、ＫＬＲＰＰ１およびＫＬＰＯＰ２である。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＬ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０２５８５ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＡＤ５０のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０２９１５ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＹＳＨ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０４５９８ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＣＬ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０５９８４ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＣＬ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ０６２４８ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＭＲＥ１１のコードは、ＫｌＡ０Ｃ０６９３０ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＰ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１２１９９ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＭＫＴ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１３９２６ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＡＰＮ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１４２５６ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＰＰ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１４７１８ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＰ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｃ１８８２１ｇである。
【０１７６】
Ｄ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＮＵＣ１、ＫＬＲＲＰ６、ＫＬＤＢＲ1、ＫＬＲＰＳ３、ＫＬＲＰＭ２、ＫＬＳＵＶ３、ＫＬＲＡＤ１、ＫＬＩＲＥ１およびＫＬＰＯＰ１である。ＫＥＧＧデータベース中のＫＬＮＵＣ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｄ００４４０ｇである。ＫＥＧＧデータベース中のＫＬＲＲＰ６のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ０１３００９ｇである。ＫＥＧＧデータベース中のＫＬＤＢＲ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｄ０４４６６ｇのコードである。ＫＥＧＧデータベース中のＫＬＲＰ３のコードは、ＫＩＬＡ０Ｄ８３０５ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＰＭ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１０４８３ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＳＵＶ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１２０３４ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＡＤ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１２２１０ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＩＲＥ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１３２６６ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＰ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｄ１９４４８ｇである。
【０１７７】
Ｅ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＰＯＬ３、ＫＬＤＸＯ１、ＫＬＭＵＳ８１、ＫＬＰＡＮ３、ＫＬＡＰＮ２、ＫＬＲＡＩ１、ＫＬＥＸＯ１、ＫＬＲＥＸ４、ＫＬＰＡＮ２およびＫＬＬＣＬ３である。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＰＯＬ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ０１６０７ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＤＸＯ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｅ０２２４５ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＭＵＳ８１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｅ０３０１５ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＰＡＮ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ０８０９７ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＡＰＮ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１８８７７ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＲＡＩ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１２８９３ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＥＸＯ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１６７４３ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＲＥＸ４のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１７８６５ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＰＡＮ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１８８７７ｇである。ＫＥＧＧデータベース内のＫＬＬＣＬ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｅ１９１６３ｇである。
【０１７８】
Ｆ染色体に位置するヌクレアーゼは、ＫＬＲＡＤ１７、ＫＬＰＯＰ４、ＫＬＰＯＰ５、ＫＬＲＡＤ２７、ＫＬＲＮＨ２０１、ＫＬＶＭＡ１、ＫＬＲＡＴ１、ＫＬＮＧＬ１、ＫＬＲＥＸ２、ＫＬＴＲＬ１、ＫＬＰＯＬ３１、ＫＬＣＣＲ４、ＫＬＴＲＺ１、ＫＬＳＥＮ２、ＫＬＲＥＸ３、ＫＬＳＷＴ１、ＫＬＥＸＮ５３、ＫＬＲＮＴ１、ＫＬＳＥＮ１５、ＫＬＮＴＧ１、ＫＬＮＯＢ１およびＫＬＤＤＰ１である。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＲＡＤ１７のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ００３３０ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＰＯＰ４のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０２２１１ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＰＯＰ５のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０２４５３ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＡＤ２７のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０２９９２ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＮＨ２０１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ０４７７４ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＶＭＡ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０５４０１ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＡＴ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ０７４６９ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＮＧＬ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０７７３３ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＥＸ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ０８９９８ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＰＯＬ３１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ１４９４９である。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＣＣＲ４のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１５８８４ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＴＲＺ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１６６６５ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＳＥＮ２のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１９８６６ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＥＸ３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１９９１０ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＳＷＴ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ２０３６１ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＥＸＮ５３のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ２２３８５ｇである。ＫＥＧＧデータベースにおけるＫＬＲＮＴ１のコードは、ＫＩＬＡ０Ｆ２４８１６ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＳＥＮ１５のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ２６３３４gである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＮＴＧ１は、ＫｌＬＡ０Ｆ０７７１１ｇである。ＫＥＧＧデータベースのＫＬＮＯＢ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ１６２８０ｇである。ＫＥＧＧ データベースのＫＬＤＤＰ１のコードは、ＫｌＬＡ０Ｆ２０２７３ｇである。
【０１７９】
Ｋ.ラクティス(K. lactis)ヌクレアーゼは、機能によって２つのカテゴリーに分類することができる。ここで、１８個のＤＮａｓｅおよび４１個のＲＮａｓｅが存在し、また２個の分類されていないヌクレアーゼも存在する（表１に示される）。３’から５’の機能を有するＤＮａｓｅは、ＫＬＡＰＮ１を含む。５’から３’の機能を有するＤＮａｓｅは、ＫＬＲＡＤ２７およびＫＬＥＸ０１を含む。３’から５’の機能を有するＲＮａｓｅは、ＫＬＲＮＨ７０、ＫＬＤＩＳ３、ＫＬＮＧＬ２およびＫＬＲＲＰ６を含む。５’から３’の機能を有するＲＮａｓｅは、ＫＬＤＸＯ１、ＫＬＲＡＴ１およびＫＬＥＸＮ５３を含む。
【０１８０】
表１
2021503951.tif 000028
【０１８１】
１．２．２  インビトロタンパク質合成に関与するＫ．ラクティス(K. lactis)ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子の選択のための分析
【０１８２】
ＲＮＡおよびＤＮＡの核酸は、インビトロタンパク質合成系のコード基質であり、それらの安定性はタンパク質収率に影響を及ぼす。真核生物の翻訳プロセスにおいて、ＲＮＡの５’末端は、キャップ構造の処理を瞬時に完了させることができる。ＲＮＡの５’末端のキャップ構造は、ＲＮＡの安定性と翻訳効率において重要な役割を果たす。
【０１８３】
真核生物では、脱アデニル化依存性ＲＮＡ分解メカニズムおよびアデニル化非依存性ＲＮＡ分解メカニズムが存在する。脱アデニル化依存性ＲＮＡ分解のメカニズムでは、ＲＮＡの５’末端の成熟キャップ構造または未成熟キャップ構造は、キャップ除去複合体をリクルートすることによって除去することができる。同時に、ＲＮＡは、ヌクレアーゼの作用下で、５’から３’の方向に分解する。アデニル化非依存性ｍＲＮＡ分解のメカニズムでは、核酸分子は、エンドヌクレアーゼの作用下で、中央の位置から壊れた鎖に分解される。そして、エキソヌクレアーゼは、ＲＮＡを３’から５’の方向に分解する。
【０１８４】
Ｋ.ラクティス（K. lactis）系のインビトロタンパク質合成系において、外来性の線状または環状ＤＮＡを鋳型として使用することによって３’ポリＡタグを有するｍＲＮＡが転写されることができる。プロモーター(promoter)とＲＮＡ転写酵素の違いに依存して、転写されたｍＲＮＡは、５’成熟キャップ構造を有していても、有していなくてもよい。したがって、ＤＮａｓｅｓ、ＲＮａｓｅｓ、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼは、すべてインビトロタンパク質合成系における鋳型の安定性に影響を及ぼす。それらの酵素の改変は、インビトロ生合成活性に増強効果を生じさせることが可能である。
【０１８５】
ここで、ｍＲＮＡの特別な不安定性およびインビボＲＮａｓｅの高い活性のために、ｍＲＮＡの寿命は、インビトロでのタンパク質合成を制限する主要な障害である。したがって、改変によるインビボＲＮａｓｅの減少は、最も好ましい改変スキームである。もちろん、本発明は、インビトロタンパク質生合成活性を改善するために、他のヌクレアーゼの設計と改変に依然として適用可能であることに留意されたい。
【０１８６】
１．２．３  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおけるヌクレアーゼ遺伝子（ＥＸＮ５３、Ｒａｔ１、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３およびＮＧＬ２）の特異的改変デザイン
【０１８７】
Ｋ．ラクティス（K. lactis）において、５’から３’のエキソヌクレアーゼには、ＥＸＮ５３およびＲａｔ１が含まれる。ＥＸＮ５３は、細胞質に位置する。Ｒａｔ１は、核に位置する。脱アデニル化依存性ＲＮＡ分解のメカニズムでは、脱アデニル化のプロセスの後、ＲＮＡは、細胞質と核の両方に位置し、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性の両方を有するタンパク質サブユニット複合体（エキソソーム）（exosome）の作用下で分解される。Ｋ．ラクティスでは、３’から５’のエキソヌクレアーゼには、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３（Ｒｒｐ４４とも呼ばれる）、ＮＧＬ２などが含まれる。一方、Ｒｒｐ６とＤｉｓ３は、ともに、エキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性との両方を有するタンパク質サブユニット複合体（エキソソーム）の一部である。Ｒｒｐ６は、３’から５’のエキソヌクレアーゼの一種であり、ＲＮａｓｅファミリーの一員である。Ｒｒｐ６は、核内に位置し、核内のエキソソームの鍵となる触媒サブユニットである。さらに、Ｒｒｐ６は、細胞中の種々のＲＮＡの処理、分解および品質制御を担っている。Ｄｉｓ３（Ｒｒｐ４４とも呼ばれる）は、エキソソームの鍵となる触媒サブユニットであり、高度に保存されたＲＮａｓｅＩＩ／ＲＮＢファミリーの一員である。Ｄｉｓ３は、核と細胞質の両方に位置する。さらに、Ｄｉｓ３は、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性とエンドヌクレアーゼ活性との両方を有し、細胞質および核の両方におけるＲＮＡの代謝とあらゆるタイプのＲＮＡの処理を担っている。ＮＧＬ２は、３’から５’の方向にＲＮＡを加水分解するポリＡを特異的に認識する酵素である。
【０１８８】
上記の分析に基づいて、ＥＸＮ５３、Ｒａｔ１、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３およびＮＧＬ２の５つの遺伝子は、関連する方法を使用することによって、本発明において改変されるように選択された。その関連する方法は、特に限定されないが、遺伝子ノックアウトおよび遺伝子突然変異を含む。インビトロ生合成系においてヌクレアーゼをダウンレギュレートすることによって核酸の安定性を改善し、および、Ｋ．ラクティスゲノムにおいてヌクレアーゼ遺伝子に対する分析および特異的な改変デザインを行う。インビトロタンパク質合成活性を調節するためのデザインおよび技術的詳細により、インビトロタンパク質翻訳効率を改善する。
【０１８９】
１．３  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおける標的遺伝子改変方法の分析
１．３．１  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムの改変法と選択分析
【０１９０】
本発明では、Ｋ．ラクティスゲノムは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集技術によって改変された。ＣＲＩＳＰＲは、広く用いられている遺伝子編集技術であり、構造が簡単、操作が簡便、編集効率が高い、抗生物質を導入する必要なし、標的遺伝子の複数部位を同時にノックアウトすることを達成することができるなどの利点を有する。比較的成熟した形質転換系は、酵母において既に構築されている。
【０１９１】
１．３．２  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムに対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の技術的デザイン
【０１９２】
本発明で使用されるＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｋ．ラクティス株のための改善されたシステムである。ここで、Ｃａｓ９タンパク質のコード配列、ｇＲＮＡプロモーター、ドナーＤＮＡのホモロジーアームの長さ、酵母コンピテントの調製および形質転換などのパラメーターおよび条件は、改善された。Ｋ．ラクティス株における効率的な編集が達成された。
【０１９３】
１．３．３  Ｋ．ラクティス（K. lactis）ゲノムにおけるＫ．ラクティスヌクレアーゼ遺伝子（ＥＸＮ５３、Ｒａｔ１、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３およびＮＧＬ３）のノックアウトのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のデザイン
【０１９４】
本発明では、ドナーＤＮＡの２つのホモロジーアームは、それぞれ、ノックアウトされるヌクレアーゼ遺伝子のＯＲＦの約１，０００ｂｐ上流および下流に位置する遺伝子配列である。同時にノックアウトされるヌクレアーゼ遺伝子のＯＲＦの５’−および３’−ＰＡＭ配列をそれぞれ認識する２つのｇＲＮＡを構築し、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをガイドすることによって部位特異的にＤＮＡを切断する。その後、ＤＳＢ（二本鎖切断）（double strand break）が起こった後に相同組換えが起こる。それにより、ヌクレアーゼ遺伝子のノックアウトを達成している。例えば、ＥＸＮ５３、Ｒａｔ１、Ｒｒｐ６、Ｄｉｓ３およびＮＧＬ３の５つの遺伝子のノックアウトは、それぞれ開始コドンの近くに１つのｇＲＮＡを、終止コドンの近くに１つのｇＲＮＡを配置することによって行われた。Ｋ．ラクティスゲノム中の５つのヌクレアーゼ遺伝子を改変するＣＲＩＳＰＲシステムのデザインを図３に示す。
【０１９５】
実施例２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＥＸＮ５３遺伝子の標的ノックアウト
【０１９６】
２．１  ＫＬＥＸＮ５３配列の検索およびＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の決定
２．１．１  標的遺伝子ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０１９７】
ＫＥＧＧデータベースでは、ＥＸＮ５３遺伝子に基づいて、ＢＬＡＳＴアラインメント解析を行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ｆ２２３８５ｇのコードを有するクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＥＸＮ５３の遺伝子配列（配列番号１）を決定した。決定した遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＥＸＮ５３に対して６０．９３％の遺伝子配列相同性と５７．６５％のタンパク質配列相同性を有し、Ｓ．ポンベ（S. pombe）のＥＸＮ５３に対して４７．３８％の遺伝子配列相同性と３８．２９％のタンパク質配列相同性を有し、Ｈ．サピエンス（H. sapiens）のＥＸＮ５３に対して４３．８１％の遺伝子配列相同性と３３．４８％のタンパク質配列相同性を有する（図5に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なＥＸＮ５３の５’から３’のエキソヌクレアーゼドメインおよびアメロゲニンドメインを有する（図４に示す）。この遺伝子は、ＫＬＥＸＮ５３（Ｆ染色体の２０９１２３５．．．２０９５５９６に位置する）と命名される。
【０１９８】
ＫＬＥＸＮ５３遺伝子の開始コドンと終止コドンでＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を検索し、ｇＲＮＡ配列を同定した。ｇＲＮＡを選択する原理は、以下の通りである。ＧＣ含量は、適度であるべきである（ここで、本発明における標準は、ＧＣ含量が４０％〜６０％の範囲にあることである）。そして、ポリＴ（poly T）構造の存在は、避けるべきである。最後に、本発明によって決定されたＫＬＥＸＮ５３ ｇＲＮＡ−１配列は、ＡＧＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＴＴＴＧＴＡＣＴであった。本発明によって決定されたＫＬＥＸＮ５３ ｇＲＮＡ−２配列は、ＣＧＴＣＧＴＧＧＣＣＧＴＡＧＴＡＡＴＣＧであった。
【０１９９】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、それぞれ、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドとともに、ｐＣａｓ９−ＫＬＥＸＮ５３−Ｆ１：ＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＴＴＴＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＣ（配列番号７）と、ｐＣａｓ９−ＫＬＥＸＮ５３−Ｒ１：ＧＣＴＡＡＡＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＡＴＣＧＣＣＣＧ（配列番号８）との一対のプライマーとを使用することにより、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドとともに、ｐＣａｓ９−ＫＬＥＸＮ５３−Ｆ２：ＣＧＴＣＧＴＧＧＣＣＧＴＡＧＴＡＡＴＣＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣ（配列番号９）と、ｐＣａｓ９−ＫＬＥＸＮ５３−Ｒ２：ＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＣＣＡＣＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＧＣＣＧ（配列番号１０）との一対のプライマーを使用することにより、実行された。各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ産物を混合し、続いて１μＬのＤｐｎＩ（ＤｐｎＩ）および２μＬの１０×消化緩衝液(digestion buffer)を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、次いでＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲで陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−２と命名した。１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−１とともに、ｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号１１）およびｐＣａｓ９−Ｒ：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号１２）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３３−２とともに、ｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＡＧＴＡＧＴＧＴＴＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＣＴＡＣＴＣＧＧ（配列番号：１３）およびｐＣａｓ９−Ｆ２:ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号：１４）のプライマーを使用することによって実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２のＰＣＲ増幅産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤｐｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液とを加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、次いでＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲで陽性を検出し、シークエンシングによって確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＥＸＮ５３−１および２と命名した（図１０に示す）。
【０２００】
２．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２０１】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において,ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１8プラスミドに挿入し、次いでＰＣＲによって増幅して、線状ドナーＤＮＡ配列を得た。
【０２０２】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡと共に、ＫＬＥＸＮ５３−Ｆ１：ＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＡＡ（配列番号：１５）およびＫＬＥＸＮ５３−Ｒ１：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＣＧＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣＴＣＴＴＴＡＴＣＧＡＡＣ（配列番号：１６）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅は、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドと共に、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号：１７）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ(配列番号：１８）のプライマーを使用することによって実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲで陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、ＫＬＥＸＮ５３−ｐＭＤ１８と命名した。
【０２０３】
ＰＣＲ増幅は、鋳型としてのＫＬＥＸＮ５３−ｐＭＤ１８プラスミドと共に、ＫＬＥＸＮ５３−Ｆ２:ＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡＣＴＡＴＴＡＡＣＡＧＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＣＡＣＴＴＣ（配列番号：１９）およびＫＬＥＸＮ５３−Ｒ２：ＧＡＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＴＴＡＡＴＣＴＡＧＴＣＡＡＴＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＴＡＡＣＣＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＧＡＡＣＣＡＴＴＴＴＡＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＣＣＧＡＡＣＣＧＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＡＣＣ（配列番号：２０）のプライマーを用いて実行された。ＫＬＥＸＮ５３−ＤＤ−ｐＭＤ１８のプラスミドは、構築された（図１１に示す）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加し、次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。それらをＰＣＲにより陽性と試験し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２０４】
２．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
【０２０５】
２．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを採取し、次いで２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、５０ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪しながらさらに培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収した。無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下で、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２０６】
２．３．２  コンピテント細胞は、解凍のために１５〜３０秒間３７℃に置かれ、１３，０００ｇで２分間遠心分離され、上清を除去した。形質転換緩衝液を以下のように調製した。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ/ｖ）)、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）、５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミドおよび１０μＬのドナーＤＮＡを添加した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離して、上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液状培地を加え、２〜３時間混合物をインキュベートした。２００μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２０７】
２．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍＬのＹＰＤ(２００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としての酵母溶液と共に、ＫＬＥＸＮ５３−ＣＩＣＦ１：ＴＴＴＧＣＴＧＧＴＴＧＣＣＣＧＴＡＴＴＣＣＣ（配列番号２１）およびＫＬＥＸＮ５３−ＣＩＣＲ１：ＴＡＡＴＡＧＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＣＡＣＣＴＴ（配列番号２２）のＣＲＩＳＰＲ挿入検査（CRISPR Insertion Check）プライマーを使用するＰＣＲによって検出された。ＰＣＲ法で陽性と判定され、シークエンシングで同定された株は、陽性株と決定された。
【０２０８】
実施例３  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＤＩＳ３遺伝子の標的ノックアウト
【０２０９】
３．１  ＫＬＤＩＳ３配列の検索とＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の決定
３．１．１  標的遺伝子ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０２１０】
ＫＥＧＧデータベースにおいて、ＤＩＳ３遺伝子に基づいて、ＢＬＡＳＴアラインメント解析を行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ａ１０８３５ｇのコードを有するクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＤＩＳ３の遺伝子配列（配列番号２）を決定した。決定された遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)におけるＤＩＳ３に対して７０．５４％の遺伝子配列相同性と７７．５９％のタンパク質配列相同性を有し、Ｓ．ポンベ(S. pombe)におけるＤＩＳ３に対して５６．８６％の遺伝子配列相同性と５１．８２％のタンパク質配列相同性を有し、Ｈ．サピエンス(H. sapiens)におけるＤＩＳ３に対して４８．８３％の遺伝子配列相同性と４０．１９％のタンパク質配列相同性を有する（図６に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なＶａｃＢドメインおよびＰＩＮ＿Ｒｒｐ４４ドメインを有する（図４に示される）。この遺伝子は、ＫＬＤＩＳ３（染色体Ａの９３８７１２．．．９４１７３８に位置する）と命名される。
【０２１１】
ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を、ＫＬＤＩＳ３遺伝子の開始コドンと終止コドンの近くで検索し、ｇＲＮＡ配列を同定した。ｇＲＮＡを選択する原理は、以下の通りである。ＧＣ含量は、適度であるべきである（本発明における標準は、本明細書におけるＧＣ含量が４０％〜６０％の範囲であることである）。ポリＴ構造の存在は、避けるべきである。最後に、本発明により決定されたＫＬＤＩＳ３ ｇＲＮＡ−１配列は、ＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＧＡＡＧ（配列番号２３）であった。本発明により決定されたＫＬＤＩＳ３ ｇＲＮＡ−２配列は、ＡＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＡ（配列番号２４）であった。
【０２１２】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＤＩＳ３−Ｆ１：ＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＣＴＡＧＴＣ（配列番号２５）およびｐＣａｓ９−ＫＬＤＩＳ３−Ｒ１：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣ1ＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号２６）の一対のプライマーを使用して、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＤＩＳ３−Ｆ２：ＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＡＧＡＧＧＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号２７）およびｐＣａｓ９−ＫＬＤＩＳ３−Ｒ２：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＣＴＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ配列番号２８）のプライマーを使用することにより、実行された。各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ産物を混合し、続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−２と命名した。１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−１と共に、プライマーｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号２９）およびｐＣａｓ９−Ｒ１：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号３０）のプライマーを用いて、実行された。別のＰＣＲ増幅プロセは、鋳型としてのｐＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−２と共に、プライマーｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＡＧＴＡＧＴＧＴＴＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＡＣＴＡＣＴＣＧＧ（配列番号３１）およびｐＣａｓ９−Ｒ２：ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号３２）のプライマーを用いて、実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２のＰＣＲとのＰＣＲ産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤｐｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μ���のＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングによって確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ−１および２と命名した（図１２に示す）。
【０２１３】
３．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２１４】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において、ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１8プラスミドに挿入し、次いで、ＰＣＲによって増幅した。これにより、線状ドナーＤＮＡを得た。
【０２１５】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡと共に、ＫＬＤＩＳ３−Ｆ１：ＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＧＴＣＣ（配列番号３３）およびＫＬＤＩＳ３−Ｒ１：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＴＣＧＴＡＡＧＡＣＣＧＣ(配列番号３４）のプライマーを使用して実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドと共に、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号３５）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号３６）のプライマーを使用して実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、遺伝子を抽出し、保存し、ＫＬＤＩＳ３−ｐＭＤ１８と名付けた。
【０２１６】
ＰＣＲ増幅は、鋳型としてのＫＬＤＩＳ３−ｐＭＤ１８プラスミドと共に、ＫＬＤＩＳ３−Ｆ２：ＣＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＣＣＣＧＧＴＴＡＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＴＧＴＡＣＡＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＴＣ（配列番号３７）およびＫＬＤＩＳ３−Ｒ２：ＡＡＧＣＴＡＴＡＡＣＣＧＧＧＴＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧ（配列番号３８）のプライマーを使用して実行された。ＫＬＤＩＳ３−ＤＤ−ｐＭＤ１８プラスミドは、構築された（図１３に示すように）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加し、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取した。次いで、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２１７】
３．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
【０２１８】
３．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを採取した。次いで、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、５０ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪しながらさらに培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収し、無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製した。酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２１９】
３．３．２  コンピテント細胞を３７℃で１５〜３０秒間解凍し、１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去した。形質転換緩衝液は、以下のように調製された。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ／ｖｖ)、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）、１５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド、１０μＬのドナーＤＮＡを添加した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離を行い、上清を除去した。その後、１ｍＬのＹＰＤ液状培地をその溶液に加え、２〜３時間混合物をインキュベートした。２００μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２２０】
３．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍｌのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬＧ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としての酵母溶液と共に、ＫＬＤＩＳ３−ＣＩＣＦ１：ＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＴＧ（配列番号３９）およびＫＬＤＩＳ３−ＣＩＣＲ１：ＣＡＧＴＡＣＡＧＡＡ ＧＣＴＣＡＧＣＡＡＣ ＡＡＣＣ（配列番号４０）のＣＲＩＳＰＲ挿入検査プライマーを使用するＰＣＲによって検出された。ＰＣＲ法で陽性と判定され、シークエンシングで同定された株を陽性株と判定した。
【０２２１】
実施例４  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＲａｔ１遺伝子の標的ノックアウト
【０２２２】
４．１  ＫＬＲａｔ１配列の検索とＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の特定
４．１．１  遺伝子の標的ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０２２３】
ＫＥＧＧデータベースにおいて、ＢＬＡＳＴアラインメント分析をＲａｔ１遺伝子に基づいて行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ｆ０７４６９ｇのコードを有するクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＲａｔ１の遺伝子配列（配列番号３）を決定した。決定された遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＲａｔ１と６０．３８％の遺伝子配列相同性と６２．３０％のタンパク質配列相同性を有し、Ｓ．ポンベ(S. pombe)のＲａｔ１と５０．５３％の遺伝子配列相同性と３９．７３％のタンパク質配列相同性を有し、Ｈ．サピエンス(H. sapiens)のＲａｔ１と５０．１５％の遺伝子配列相同性と４１．４１％のタンパク質配列相同性を有する（図７に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なＥＸＮ５３の５’から３’のエキソヌクレアーゼドメインを有する（図４に示す）。この遺伝子は、ＫＬＲａｔ１（染色体Ｆの７０３９５５．．．７０６９３３に位置する）と命名される。
【０２２４】
ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）をＲａｔ１遺伝子の開始コドンと終止コドンの近くで検索し、ｇＲＮＡ配列を同定した。ｇＲＮＡを検索するための原理は、以下の通りである。ＧＣ含有量は、適度であるべきである（本発明における標準は、ＧＣ含有量が４０％〜６０％の範囲にあることである）。そして、ポリＴ構造の存在は、回避されるべきである。最後に、本発明により決定されたＫＬＲａｔ１ ｇＲＮＡ−１配列は、ＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＡ(配列番号：４１）であった。本発明により決定されたＫＬＲａｔ１ ｇＲＮＡ−２配列は、ＣＴＣＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣ（配列番号：４２）であった。
【０２２５】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＲａｔ１−Ｆ１：ＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号４３）およびｐＣａｓ９−ＫＬＲａｔ１−Ｒ１：ＡＧＣＴＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＣＡＣＣＧ（配列番号４４）の一対のプライマーを使用することにより、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＲａｔ１−Ｆ２：ＡＴＧＧＧＡＣＣＴＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号４５）およびｐＣａｓ９−ＫＬＲａｔ１−Ｒ２：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＧＴＧＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＧＣＧＡＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号４６）の一対のプライマーを使用することにより、実行された。 各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ産物を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−２と命名した。
【０２２６】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−１を用いて、ｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号４７）およびｐＣａｓ９−Ｒ１：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号４８）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＤＩＳ３−２を用いて、ｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＣＴＣＧＧ（配列番号４９）およびｐＣａｓ９−Ｒ２：ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号５０）のプライマーを使用することによって実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２のＰＣＲ増幅産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤｐｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲａｔ１−１および２と命名した（図１４に示す）。
【０２２７】
４．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２２８】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において、ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１８プラスミドに挿入した。次いで、ＰＣＲによって増幅して、線状ドナーＤＮＡ配列を得た。
【０２２９】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡとともに、ＫＬＲａｔ１−Ｆ１：ＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧＡＴＧＣ（配列番号５１）およびＫＬＲａｔ１−Ｒ１：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＧＴＡＣＧＴＧＡＧＧＣＧＡＣＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣ（配列番号５２）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドと共に、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号５３）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号５４）のプライマーを使用することによって実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ−陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、ＫＬＲａｔ１−ｐＭＤ１８と命名した。
【０２３０】
ＰＣＲ増幅は、鋳型としてのＫＬＲａｔ１−ｐＭＤ１８プラスミドと共に、ＫＬＲａｔ１−Ｆ２：ＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＣＣＣＧＴＴＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣ（配列番号５５）およびＫＬＲａｔ１−Ｒ２：ＴＧＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣＡＴＧＴＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＣＧＣ（配列番号５６）のプライマーを用いて実行された。ＫＬＲａｔ１−ＤＤ−ｐＭＤ１８を構築した（図１５に示すように）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２３１】
４．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
４．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを採取した。次いで、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、さらに２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収し、無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下で、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２３２】
４．３．２  コンピテント細胞を３７℃で１５〜３０秒間解凍し、１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去した。形質転換緩衝液は、以下のように調製された。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ／ｖ）)、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ(５．０ｍｇ／ｍＬ）、１５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド、１０μＬのドナーＤＮＡを添加した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離して、上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液状培地を加え、混合物を２〜３時間インキュベートした。２００ μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２３３】
４．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍＬのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としの酵母溶液と共に、ＫＬＲａｔ１−ＣＩＣＦ１：ＴＡＡＧＡＣＡＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＣＧＡＣＧ（配列番号：５７）およびＫＬＲａｔ１−ＣＩＣＲ１：ＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧ（配列番号：５８）のＣＲＩＳＰＲ挿入チェックプライマーを用いてＰＣＲにより検出された。ＰＣＲで陽性と判定され、シークエンシングで同定された株を陽性株と判定した。
【０２３４】
実施例５  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＲｒｐ６遺伝子の標的ノックアウト
【０２３５】
５．１  ＫＬＲｒｐ６配列の検索とＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の特定
５．１．１  遺伝子の標的ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０２３６】
ＫＥＧＧデータベースにおいて、ＢＬＡＳＴアラインメント分析をＲｒｐ６遺伝子に基づいて行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ｄ０１３０９ｇのコードを有し、hypotheticalタンパク質という名称で呼ばれるクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＲｒｐ６の遺伝子配列（配列番号４）を決定した。決定された遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＲｒｐ６に対する５５．０４％の遺伝子配列相同性と４６．９３％のタンパク質配列相同性を有し、Ｓ．ポンベ(S. pombe)のＲｒｐ６に対する４４．０４％の遺伝子配列相同性と２９．８５％のタンパク質配列相同性を有し、Ｈ．サピエンス(H. sapiens)のＲｒｐ６に対する４０．４４％の遺伝子配列相同性と２３．５３％のタンパク質配列相同性を有する（図８に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なＲｒｐ６ｐ様(Ｒｒｐ６ｐ-like)エキソヌクレアーゼドメイン、ＰＭＣ２ＮＴドメイン、ならびにヘリカーゼおよびＲＮａｓｅ Ｄ Ｃ末端ドメインを有する（図４に示される）。この遺伝子はＫＬＲｒｐ６（染色体Ｄの１１４７１３．．．１１６９４７に位置する）と命名されている。
【０２３７】
ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）をＲｒｐ６遺伝子の開始コドンと終止コドンの近くで検索し、ｇＲＮＡ配列を決定した。ｇＲＮＡを選択する原理は、以下の通りである。ＧＣ含量は、適度であるべきである（本発明における標準は、本明細書中のＧＣ含量が４０％〜６０％の範囲であることである）。そして、ポリＴ構造の存在は、避けるべきである。最後に、本発明により決定されたＫＬＲｒｐ６ ｇＲＮＡ−１配列は、ＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＴＡ（配列番号９３）であった。本発明により決定されたＫＬＲｒｐ６ｇＲＮＡ−２配列は、ＣＣＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＡ（配列番号９４）であった。
【０２３８】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＲｒｐ６−Ｆ１：ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＧＣＴＡＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧＡＴＡＡＡＡＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号５９）およびｐＣａｓ９−ＫＬＲｒｐ６−Ｒ１：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号６０）の一対のプライマーを使用することにより、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドと共に、ｐＣａｓ９−ＫＬＲｒｐ６−Ｆ２：ＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＡＣＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＡＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣ（配列番号：６１）およびｐＣａｓ９−ＫＬＲｒｐ６−Ｒ２：ＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＣＴＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＴＧＴＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号：６２）の一対のプライマーを使用することにより、実行された。各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ産物を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックを与えた。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−２と命名した。１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−１と共に、ｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号６３）およびｐＣａｓ９−Ｒ１：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号６４）のプライマーを用いて実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−２と共に、ｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＧＴＡＧＴＡＧＴＧＴＴＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＡＣＴＡＣＴＣＧＧ（配列番号：６５）およびｐＣａｓ９−Ｒ２:ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号：６６）のプライマーを用いて実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２とのＰＣＲ増幅産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤｐｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングによって確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＲｒｐ６−１および２と命名した（図１６に示す）。
【０２３９】
５．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２４０】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において、ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１８プラスミドに挿入した。次いで、ＰＣＲによって増幅して、線状ドナーＤＮＡ配列を得た。
【０２４１】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡとともに、ＫＬＲｒｐ６−Ｆ１：ＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＣＧＡＴＡＧＣＴＴＴＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧ（配列番号６７）およびＫＬＲｒｐ６−Ｒ１：ＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＡＴＡＡＣＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＧ（配列番号６８）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドとともに、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号６９）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号７０）のプライマーを使用することによって実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、ＫＬＲｒｐ６−ｐＭＤ１８と命名した。
【０２４２】
ＰＣＲ増幅は、鋳型としてのＫＬＲｒｐ６−ｐＭＤ１８プラスミドとともに、ＫＬＲｒｐ６−Ｆ２：ＣＴＧＡＣＴＣＴＡＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＡＴＧＧＴＡＴＡＡＡＴＡＴＣＧ（配列番号７１）およびＫＬＲｒｐ６−Ｒ２：ＧＣＴＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＴＴＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＧＴＣＴＡＣ（配列番号７２）のプライマーを用いて実行された。ＫＬＲｒｐ６−ＤＤ−ｐＭＤ１８を構築した（図１７に示すように）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２４３】
５．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
５．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを採取した。次いで、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、５０ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪しながらさらに培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収し、無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下で、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２４４】
５．３．２  コンピテント細胞を３７℃で１５〜３０秒間解凍し、１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去した。形質転換緩衝液は、以下のように調製された。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ／ｖ））、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）、１５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミドおよび１０μＬのドナーＤＮＡを提供した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離して、上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液状培地を加え、２〜３時間混合物をインキュベートした。２００μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２４５】
５．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍＬのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としての酵母溶液とともに、ＫｌＲｒｐ６−ＣＩＣＦ１：ＴＧＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号：７３）およびＫｌＲｒｐ６−ＣＩＣＲ１：ＴＧＡＡＣＣＣＴＣＴ ＴＣＣＡＴＧＴＣ ＡＴＣ（配列番号：７４）のＣＲＩＳＰＲ挿入検査プライマーを用いたＰＣＲによって試料を検出した。ＰＣＲで陽性と判定され、シークエンシングで同定された株を陽性株と特定した。
【０２４６】
実施例６  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＮＧＬ２遺伝子の標的ノックアウト
【０２４７】
６．１  ＫｌＮＧＬ２配列の検索とＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列の特定
６．１．１  遺伝子の標的ノックアウトのためのクローニングベクタープラスミドの構築
【０２４８】
ＫＥＧＧデータベースでは、ＮＧＬ３遺伝子に基づいて、ＢＬＡＳＴアラインメント解析を行った。その結果、ＫＥＧＧデータベースにおいてＫｌＬＡ０Ｃ０６２４８ｇのコードを有するクルイベロマイセス・ラクティスにおけるＮＧＬの遺伝子配列（配列番号５）を決定した。決定された遺伝子配列は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）のＮＧＬ３に対する４６．２６％の遺伝子配列相同性と４６．３４％のタンパク質配列相同性とを有し、Ｓ．ポンベ(S. pombe)のＮＧＬ２に対する４５．４２％の遺伝子配列相同性と２９．０７％のタンパク質配列相同性とを有し、Ｈ．サピエンス(H. sapiens)のＮＧＬ３に対する３８．７２％の遺伝子配列相同性と１９．８９％のタンパク質配列相同性とを有する（図９に示す）。決定された遺伝子配列は、特徴的なエクソヌクレアーゼ−エンドヌクレアーゼ−フォスファターゼ（Exonuclease-Endonuclease-Phosphatase,ＥＥＰ）ドメインを有する（図４に示す）。この遺伝子は、ＫｌＮＧＬ２（染色体Ｃの５５２４９３．．．５５４０４３に位置する）と命名される。
【０２４９】
ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）を、ＫｌＮＧＬ２遺伝子の開始コドンと終止コドンの近くで検索し、ｇＲＮＡ配列を決定した。ｇＲＮＡを選択する原理は、以下の通りである。ＧＣ含量は、適度であるべきである（本発明における標準は、ＧＣ含量が４０％〜６０％の範囲にあることである）。そして、ポリＴ構造の存在は、避けるべきである。最後に、本発明により決定されたＫｌＮＧＬ２ ｇＲＮＡ−１配列は、ＧＣＴＧＧＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＡＣ（配列番号７５）であった。本発明により決定されたＫｌＮＧＬ２ ｇＲＮＡ−２配列は、ＴＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＡＡＣＴ（配列番号７６）であった。
【０２５０】
プラスミドの構築および形質転換のための方法は、以下の通りである。２つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドとともに、ｐＣａｓ９−ＫＬＮＧＬ２−Ｆ１：ＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＣＡＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣ（配列番号７７）およびｐＣａｓ９−ＫＬＮＧＬ３−Ｒ１：ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＴＧＡＣＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＴＣＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＣＧ（配列番号７８）の一対のプライマーを使用することによって、および、鋳型としてのｐＣＡＳプラスミドとともに、ｐＣａｓ９−ＫＬＮＧＬ２−Ｆ２：ＴＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＴＧＴＴＡＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴ（配列番号：７９）およびｐＣａｓ９−ＫＬＮＧＬ２−Ｒ２：ＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＡＴＧＴＴＡＧＡＧＣ（配列番号：８０）の一対のプライマーを使用することによって、実行された。各ＰＣＲ増幅プロセスの１７μＬ増幅産物を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ２−１およびｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ３−２と命名した。１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ２−１とともに、ｐＣａｓ９−Ｆ１：ＴＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＧ（配列番号８１）およびｐＣａｓ９−Ｒ１：ＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号８２）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ２−２とともに、ｐＣａｓ９−Ｆ２：ＴＡＴＧＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣＴＴＣＴＧＴＣＴＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴＡＴＡＴＧＴＧＴＴＡＴＧＴＡＧＴＡＴＡＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＣＴＣＧＧ（配列番号：８３）およびｐＣａｓ９−Ｒ２：ＣＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＣ（配列番号：８４）のプライマーを使用することによって、実行された。ｐＣａｓ９−Ｆ１／ｐＣａｓ９−Ｒ１と、ｐＣａｓ９−Ｆ２／ｐＣａｓ９−Ｒ２とのＰＣＲ増幅産物を１：５の比率で混合した。その後、１μＬのＤ��ｎＩと２μＬの１０×消化緩衝液を加え、３７℃で３時間混合物をインキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物をＤＨ５αコンピテント細胞１００μＬに添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＫａｎ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、ＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングによって確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、それぞれ、ｐＨｏＣａｓ９＿ＳＥ＿Ｋａｎａ＿ｔＲＮＡ＿ＳｃＲＮＲ２＿ＫＬＮＧＬ３−１および２と命名した（図１８に示す）。
【０２５１】
６．２  ドナーＤＮＡプラスミドの構築と増幅
【０２５２】
線状ドナーＤＮＡの保存および増幅を容易にするために、本発明において、ドナーＤＮＡを最初にｐＭＤ１8プラスミドに挿入した。次いで、ＰＣＲによって増幅して、線状ドナーＤＮＡ配列を得た。
【０２５３】
１つのＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのクルイベロマイセス・ラクティスゲノムＤＮＡとともに、ＫｌＮＧＬ２−Ｆ１：ＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＧＡＡＴＡＣＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＣＴＡＧＧＡＡ（配列番号８５）およびＫｌＮＧＬ２−Ｒ１：ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＡＣＧＧＣＣＣＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＣＣＣＡＴ（配列番号８６）のプライマーを使用することによって実行された。別のＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのｐＭＤ１８プラスミドと共に、ｐＭＤ１８−Ｆ：ＡＴＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧ（配列番号８７）およびｐＭＤ１８−Ｒ：ＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ（配列番号８８）のプライマーを使用することによって実行された。２つのＰＣＲ増幅プロセスの産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで、３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、次いでＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存し、ＫｌＮＧＬ２−ｐＭＤ１８と名付けた。
【０２５４】
ＰＣＲ増幅プロセスは、鋳型としてのＫｌＮＧＬ３−ｐＭＤ１プラスミドとともに、ＫｌＮＧＬ２−Ｆ２：ＧＡＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＧＡＧＣＣＡＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴＡＡＡＣＴＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＣＴＡＣＡＧ（配列番号：８９）およびＫｌＮＧＬ２−Ｒ２：ＣＣＡＴＡＧＴＴＡＡＡＣＡＧＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＡＣＴＴＴＧＣＡＧＴＧ（配列番号：９０）のプライマーを用いて実行された。ＫｌＮＧＬ２−ＤＤ−ｐＭＤ１８は、構築された（図１９に示す）。具体的な工程は、以下の通りである。２つのＰＣＲ産物（各ＰＣＲ産物について８．５μＬ）を混合した。続いて、１μＬのＤｐｎＩおよび２μＬの１０×消化緩衝液を添加した。次いで、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。１０μＬのＤｐｎＩ処理混合物を１００μＬのＤＨ５αコンピテント細胞に添加した。混合物を氷上に３０分間置き、４２℃で４５秒間熱ショックした。続いて、１ｍＬのＬＢ液体培地を添加した。次いで３７℃で１時間振盪しながら培養した。その後、混合物をＡｍｐ耐性ＬＢ固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、３７℃で反転培養を行った。５つのモノクローナルコロニーを採取し、次いでＬＢ液体培地中で振盪しながら培養した。ＰＣＲ陽性を検出し、シークエンシングにより確認した後、プラスミドを抽出し、保存した。
【０２５５】
６．３  クルイベロマイセス・ラクティスの形質転換と陽性同定
【０２５６】
６．３．１  クルイベロマイセス・ラクティス溶液をストリークし、ＹＰＤ固体培地上で培養した。モノクローナルコロニーを摘出し、２５ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で一晩振盪しながら培養した。２ｍＬの酵母溶液を採取し、５０ｍＬの２×ＹＰＤ液体培地中で２〜８時間振盪しながらさらに培養した。続いて、２０℃の条件下で、３，０００ｇで５分間遠心分離して酵母細胞を回収し、無菌水５００μＬを加えて再懸濁した。同様に、同じ条件下で、遠心分離によって細胞を回収した。コンピテント細胞溶液（５％ｖ／ｖグリセロールおよび１０％ｖ／ｖＤＭＳＯ）を調製し、酵母細胞をこの溶液５００μＬに溶解した。５０μＬのアリコートを１．５ｍＬ遠心管にアリコートし、−８０℃で保存した。
【０２５７】
６．３．２  コンピテント細胞を３７℃で１５〜３０秒間解凍のために置かれ、１３，０００ｇで２分間遠心分離し、上清を除去した。形質転換緩衝液は、以下のように調製された。２６０μＬのＰＥＧ３３５０（５０％（ｗ／ｖ））、３６μＬのＬｉＡｃ（１．０Ｍ）、２０μＬのキャリアＤＮＡ（５．０ｍｇ／ｍＬ）、１５μＬのＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミド、および１０μＬのドナーＤＮＡを添加した。次いで、無菌水を添加して、３６０μＬの最終容量の混合物を形成した。ヒートショック後、１３，０００ｇで３０秒間遠心分離して、上清を除去した。１ｍＬのＹＰＤ液状培地を加え、混合物を２〜３時間インキュベートした。２００μＬの混合物をピペットで移し、ＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）固体培地上にコーティングした。次いで、モノクローナルコロニーが成長するまで、２〜３日間インキュベートした。
【０２５８】
６．３．３  １０〜２０個のモノクローナルコロニーを、形質転換されたクルイベロマイセス・ラクティス細胞を有するプレートから採取した。モノクローナルコロニーを１ｍＬのＹＰＤ（２００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８）に入れ、振盪しながら一晩培養した。試料は、鋳型としての酵母溶液とともに、ＫｌＮＧＬ２−ＣＩＣＦ１：ＡＴＡＴＴＧＴＣＴＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴＣＧＣＧＴＡ（配列番号９１）およびＫｌＮＧＬ２−ＣＩＣＲ１：ＡＡＧＣＡＧＡＴＴＴＡＴＧＣＡＣＧＡＡＴＴＧＣＣ（配列番号９２）のＣＲＩＳＰＲ挿入検査プライマーを使用するＰＣＲによって検出された。ＰＣＲで陽性と判定され、シークエンシングで同定された株を陽性株と特定した。
【０２５９】
実施例７  無細胞インビトロタンパク質合成系の調製およびタンパク質合成効率の測定
【０２６０】
実験方法：
ｉ．インビトロタンパク質合成系の保存溶液の調製：ｐＨ７．４の１Ｍの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、５Ｍの酢酸カリウム、２５０ｍＭの酢酸マグネシウム、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを含む４つのヌクレオシド三リン酸の混合物の２５ｍＭ、２０種のアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを含む）の混合物の１ｍＭ（各種アミノ酸の濃度は１．０ｍＭである）、１Ｍのホスホクレアチン、１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、６．４８ｍｇ／ｍＬクレアチンホスホキナーゼ、１．７ｍｇ／ｍＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、２０％〜５０%のＰＥＧ３３５０またはＰＥＧ８０００、および２０％〜４０％スクロースである。
【０２６１】
ｉｉ．インビトロタンパク質合成反応系は、最終濃度について、それぞれ、ｐＨ７．４で２２ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、３０〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、１．０〜５．０ｍＭの酢酸マグネシウム、４つのヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰを含む）の混合物の１．５ｍＭ〜４ｍＭ、０．０８〜０．２４ｍＭのアミノ酸混合物（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、セリン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンおよびヒスチジンを含む）、２５ｍＭのホスホクレアチン、１．７ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．２７ｍｇ／ｍＬのクレアチンホスホキナーゼ、８〜２０ｎｇ／μＬのホタルルシフェラーザのＤＮＡ、０．０２７〜０．０５４ｍｇ／ｍＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、１％〜４％のＰＥＧ、および最後に５０容量％で添加された酵母細胞抽出物を含む。
【０２６２】
ｉｉｉ．インビトロタンパク質合成反応：上記反応系を２０〜３０℃の環境下に置き、２〜６時間反応させた。
【０２６３】
ｉｖ．ルシフェラーゼの活性のアッセイ：反応の完了後、同じ体積の基質とするルシフェリン(luciferin)を、上記反応のために９６ウェル白色プレートまたは３８４ウェル白色プレートのウェルに添加した。これを直ちにＥｎｖｉｓｉｏｎ２１２０多機能マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）に置いた。そして、吸光度を読み取って、ホタルルシフェラーゼの活性を検出した。活性の単位は、相対発光量（ＲＬＵ）値である。（図２０に示されるように）
【０２６４】
実験結果：
【０２６５】
実施例７のアッセイ結果は、ヌクレアーゼをノックアウトした全ての変異株の中で、ΔＫＬＥＸＮ５３株が酵母系のインビトロタンパク質合成系におけるタンパク質産生の効率を有意に増大することができることを示す（表２に示される）。また、野生型株は、ＩＶＴＴシステムで２．９０×１０８のルシフェラーゼ活性値を有し、ΔＫＬＥＸＮ５３酵母株は、ＩＶＴＴシステムで７．１６×１０８のルシフェラーゼ活性値を有することを示した。ΔＫＬＥＸＮ５３のルシフェラーゼ活性値は、野生型株のそれの２．４６倍であった（図２０に示す）。
【０２６６】
表２
2021503951.tif 000029
【０２６７】
参考文献：
１．Ayyar, B.V., S. Arora, and R. O'Kennedy, Coming-of-Age of Antibodies in Cancer Therapeutics. Trends PharmacolSci, 2016. 37(12): p. 1009-1028.
２．Scott, A.M., J.D. Wolchok, and L.J., Antibody therapy of cancer. Nature Reviews Cancer, 2012. 12(4): p. 278.
３．Sonenberg, N. and A.G. Hinnebusch, ReguLation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell, 2009. 136(4): p. 731-45.
４．M., D.J.R.G., Nucleic Acid. Encyclopedia of Cell Biology, Elsevier, 2015.
５．Chong, S., Overview of Cell-Free Protein Synthesis: Historic Landmarks, Commercial Systems, and Expanding Applications. 2014: John Wiley & Sons, Inc. 16.30.1-16.30.11.
【０２６８】
本発明において言及される全ての文献は、各文献が個々に参照として引用されるのと同様に、本出願において参照として引用される。さらに、当業者は、上記の教示に照らして本発明に様々な変更または修正を加えることができ、均等物もまた、本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲に入ることを理解されたい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ無細胞タンパク質合成系であって、
（ａ）酵母細胞抽出物と、
（ｂ）ポリエチレングリコールと、
（ｃ）選択可能にある外来性スクロースと、
（ｄ）水または水性溶媒である選択可能にある溶媒と、を含み、
前記酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含み、
前記酵母細胞抽出物中の前記ＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とするインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項２】
前記ＥＸＮ５３タンパク質は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびクルイベロマイセス（Kluyveromyces）からなる群より選択される酵母の１つ以上の供給源に由来する（好ましくは、前記クルイベロマイセスに由来する）請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項３】
前記ＥＸＮ５３タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号１である請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項４】
前記ＥＸＮ５３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６である請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項５】
前記酵母細胞抽出物中の前記ＥＸＮ５３タンパク質の前記含有量は、ゼロである請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項６】
前記無細胞タンパク質合成系は、
（ｅ１）ＲＮＡ合成基質と、
（ｅ２）タンパク質合成基質と、
（ｅ３）マグネシウムイオンと、
（ｅ４）カリウムイオンと、
（ｅ５）緩衝溶媒と、
（ｅ６）ＲＮＡポリメラーゼと、
（ｅ７）エネルギー再生系と、からなる群から選択される１つ以上の成分をさらに含む請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系。
【請求項７】
酵母細胞抽出物であって、
前記酵母細胞抽出物は、ＥＸＮ５３タンパク質を含み、前記酵母細胞抽出物中の前記ＥＸＮ５３タンパク質の含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とする酵母細胞抽出物。
【請求項８】
請求項１に記載のインビトロ無細胞タンパク質合成系を製造する方法であって、前記方法は、
請求項１に記載の前記インビトロ無細胞タンパク質合成系を得るために、（ａ）前記酵母細胞抽出物、（ｂ）前記ポリエチレングリコール、（ｃ）前記選択可能にある外来性スクロース、および（ｄ）前記選択可能にある溶媒を混合する工程を含み、
前記溶媒は、水または水性溶媒であり、
前記酵母細胞抽出物は、前記ＥＸＮ５３タンパク質を含有し、
前記酵母細胞抽出物中の前記ＥＸＮ５３タンパク質の前記含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とするインビトロ無細胞タンパク質合成系を製造する方法。
【請求項９】
インビトロタンパク質合成のための方法であって、前記方法は、
（ｉ）請求項１に記載の前記インビトロ無細胞タンパク質合成系を提供し、タンパク質合成を誘導するための外来性ＤＮＡ分子を添加する工程と、
(ｉｉ）適切な条件下で、前記工程（ｉ）で提供される前記インビトロ無細胞タンパク質合成系を、Ｔ１の期間インキュベートし、前記外来性ＤＮＡによってコードされるタンパク質を合成する工程と、を含み、
前記タンパク質合成系における前記ＥＸＮ５３タンパク質の前記含有量は、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とするインビトロタンパク質合成のための方法。
【請求項１０】
前記方法は、（ｉｉｉ）前記タンパク質合成系から前記外来性ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質を単離する工程、
前記タンパク質合成系から前記外来性ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質を検出する工程、または
それらの組み合わせをさらに含む請求項９に記載のインビトロタンパク質合成のための方法。
【請求項１１】
前記外来性ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、アクチン、抗体の可変領域、ルシフェラーゼ変異体、α−アミラーゼ、エンテロシンＡ、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、インスリン前駆体、インターフェロンαＡ、インターロイキン−１β、リゾチーム、血清アルブミン、抗体の単一鎖可変断片、トランスチレチン、チロシナーゼ、キシラナーゼ、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される請求項９に記載のインビトロタンパク質合成のための方法。
【請求項１２】
エンジニアリング株であって、
前記エンジニアリング株は、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）株であり、
前記クルイベロマイセス株におけるＥＸＮ５３遺伝子の発現レベルまたは活性は、低減され、
前記ＥＸＮ５３遺伝子は、ヌクレアーゼ遺伝子であることを特徴とするエンジニアリング株。
【請求項１３】
前記発現レベルまたは活性の前記低減は、前記ＥＸＮ５３遺伝子の前記発現レベルが１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは２％以下であることを指す請求項１２に記載のエンジニアリング株。
【請求項１４】
前記ＥＸＮ５３遺伝子の前記発現レベルまたは活性の前記低減は、Ａ１とＡ０の比率が、３０％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下、さらに好ましくは２％以下、最も好ましくは０〜２％の範囲である（Ａ１は前記ＥＸＮ５３遺伝子の前記発現レベルに対応し、Ａ０は野生型ＥＸＮ５３遺伝子の前記発現レベルに対応する、または、Ａ１は前記ＥＸＮ５３遺伝子の前記活性に対応し、Ａ０は前記野生型ＥＸＮ５３遺伝子の前記活性に対応する。）という条件を満たす請求項１２に記載のエンジニアリング株。
【請求項１５】
インビトロタンパク質合成の効率を改善するための請求項１２に記載のエンジニアリング株の使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０】
2021503951.tif 000030
【国際調査報告】
2021503951.tif 000031
2021503951.tif 000032
2021503951.tif 000033
2021503951.tif 000034
2021503951.tif 000035