(57)【要約】本開示は、ある特定の組成物、キット、デバイス、システムおよび方法、例えば、被験体におけるがんまたは新生物を評価するためのある特定の組成物、キット、デバイス、システムおよび方法に関する。特定の態様においては、本明細書で提供されるのは、被験体由来の選択された標的ポリヌクレオチド配列、例えば、標的ゲノムＤＮＡ配列のメチル化状態を評価することに基づいて、被験体におけるがんまたは新生物を評価するための組成物、キット、デバイス、システムおよび方法である。
2021520809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの単離されたポリヌクレオチドを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる単離されたポリヌクレオチドのパネルであって、前記単離されたポリヌクレオチドの各々が、表１に列挙された標的１〜標的１８４９のいずれかのポリヌクレオチド配列、またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を有する、パネル。
【請求項２】
少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの前記単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する前記単離されたポリヌクレオチドを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、請求項１に記載のパネル。
【請求項３】
少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの前記単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する前記単離されたポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載のパネル。
【請求項４】
少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの前記単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９すべてに対応する前記単離されたポリヌクレオチドからなる、請求項１または２に記載のパネル。
【請求項５】
少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの前記単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する前記単離されたポリヌクレオチドから本質的になる、請求項１または２に記載のパネル。
【請求項６】
前記単離されたポリヌクレオチドが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはそれらの組み合わせである、請求項１から５のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項７】
前記単離されたポリヌクレオチドが、基材上に固定されている、請求項１から６のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項８】
前記基材が、固体表面、多孔質表面、またはそれらの組み合わせを含む、請求項７に記載のパネル。
【請求項９】
前記基材が、ビーズ、管、マイクロタイタープレート、膜、ゲル、またはスライドガラスの一部である、請求項７または８に記載のパネル。
【請求項１０】
前記単離されたポリヌクレオチド分子が、基材上に互いに空間的に離れて固定されている、請求項７から９のいずれか一項に記載のパネル。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のパネルを含むキットまたはシステム。
【請求項１２】
表１に列挙された標的１〜標的１８４９のうちの少なくとも２つのもののメチル化状態を評価するために構成されている、請求項１１に記載のキットまたはシステム。
【請求項１３】
表１に列挙された標的１〜標的１８４９のうちの少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはすべてのもののメチル化状態を評価するために構成されている、請求項１２に記載のキットまたはシステム。
【請求項１４】
前記単離されたポリヌクレオチドが、対照ポリヌクレオチドとして構成されている、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項１５】
前記単離されたポリヌクレオチドが、約１フェムトモル濃度〜約１ミリモル濃度のレベルの濃度を有する、請求項１４に記載のキットまたはシステム。
【請求項１６】
表１に列挙された標的１〜標的１８４９のうちの少なくとも２つのもののメチル化状態を評価するための試薬を含むキットまたはシステム。
【請求項１７】
表１に列挙された標的１〜標的１８４９のうちの少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはすべてのもののメチル化状態を評価するための試薬を含む、請求項１６に記載のキットまたはシステム。
【請求項１８】
前記試薬が、メチル化状態が評価されるべき前記標的の各々とハイブリダイズするように構成されたプローブまたはプライマーを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、請求項１６または１７に記載のキットまたはシステム。
【請求項１９】
前記試薬が、メチル化状態が評価されるべき前記標的の各々とハイブリダイズするように構成された単一のプローブまたはプライマーを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、請求項１８に記載のキットまたはシステム。
【請求項２０】
前記試薬が、メチル化状態が評価されるべき前記標的の各々とハイブリダイズするように構成された複数のプローブまたはプライマーを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項１８に記載のキットまたはシステム。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のプライマーが、配列番号１〜配列番号１７５０４のいずれかに記述されている配列、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項２２】
メチル化状態が評価されるべき前記標的の各々を増幅するための共通のプライマーをさらに含む、請求項１６から２１のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項２３】
前記共通のプライマーが、配列番号１７５０５に記述されている配列、またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、請求項２２に記載のキットまたはシステム。
【請求項２４】
試料から前記標的を単離するための薬品をさらに含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項２５】
前記標的のライブラリーを調製するための試薬をさらに含む、請求項１６から２４のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項２６】
前記標的のライブラリーを調製するための前記試薬が、酵素、例えば、リガーゼまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを含む、請求項２５に記載のキットまたはシステム。
【請求項２７】
前記ｓｓＤＮＡリガーゼが、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼ、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））、または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１、である、請求項２６に記載のキットまたはシステム。
【請求項２８】
前記標的または前記標的のライブラリーを増幅するための試薬をさらに含む、請求項１６から２７のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項２９】
前記標的または前記標的のライブラリーを増幅するための前記試薬が、酵素、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、プライマー伸長、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、およびループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド増幅反応で使用される酵素を含む、請求項２８に記載のキットまたはシステム。
【請求項３０】
前記標的、前記標的のライブラリー、増幅された標的、または増幅された標的のライブラリーを精製するための薬品をさらに含む、請求項１６から２９のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項３１】
前記標的のメチル化状態を評価するための試薬をさらに含む、請求項１６から３０のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項３２】
前記標的のメチル化状態を評価するための前記試薬が、質量分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、バイサルファイトシークエンシング、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ小断片濃縮アッセイ（ＨＥＬＰアッセイ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲアッセイ（ＧＬＡＤ−ＰＣＲアッセイ）、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（ＲＬＧＳ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰまたはｍＤＩＰ）、パイロシークエンシング、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ活性の分子切断光アッセイ、メチル感受性サザンブロッティング、および高解像度融解曲線（ＨＲＭ）分析からなる群より選択されるポリヌクレオチドメチル化検出方法、例えば、ＤＮＡメチル化検出方法において使用される試薬である、請求項３１に記載のキットまたはシステム。
【請求項３３】
前記標的のメチル化状態を評価するための前記試薬が、化学薬品、例えば、亜硫酸水素塩または亜硫酸水素ナトリウムである、請求項３１または３２に記載のキットまたはシステム。
【請求項３４】
前記標的のメチル化状態を評価するための前記試薬が、生物学的薬品、例えば、ポリペプチドまたは酵素である、請求項３１または３２に記載のキットまたはシステム。
【請求項３５】
前記酵素が、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）である、請求項３４に記載のキットまたはシステム。
【請求項３６】
前記ＭＳＲＥが、残基がメチル化されていない場合、前記残基で選択的に切断する、請求項３５に記載のキットまたはシステム。
【請求項３７】
前記ＭＳＲＥが、前記残基がメチル化されている場合、前記残基で選択的に切断する、請求項３５に記載のキットまたはシステム。
【請求項３８】
前記ＭＳＲＥが、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３５から３８のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項３９】
前記酵素が、ポリヌクレオチドポリメラーゼである、請求項３４に記載のキットまたはシステム。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドポリメラーゼが、ＰＣＲで使用されるように構成されている、請求項３９に記載のキットまたはシステム。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼである、請求項４０に記載のキットまたはシステム。
【請求項４２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のパネルをさらに含む、請求項１６から４１のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項４３】
参照試料および／または対照遺伝子座の情報をさらに含む、請求項１６から４２のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項４４】
１つまたは複数の構成成分のための別個の容器、例えば、バイアル、および／または前記キットまたはシステムを使用するための指示をさらに含む、請求項１６から４３のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項４５】
前記メチル化状態評価に基づいて試料のメチル化メトリックを得るための実行可能な命令を含むコンピュータ可読媒体をさらに含む、請求項１６から４４のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項４６】
前記コンピュータ可読媒体が、平均メチル化頻度、メチル化ハプロタイプ負荷、非メチル化ハプロタイプ負荷、読み取り不一致率、またはそれらの組み合わせの形態でメチル化メトリックを得るように構成されている、請求項４５に記載のキットまたはシステム。
【請求項４７】
被験体におけるがんまたは新生物を評価するために構成されている、請求項１６から４６のいずれか一項に記載のキットまたはシステム。
【請求項４８】
被験体における肺がんまたは結腸直腸がんを評価するために構成されている、請求項４７に記載のキットまたはシステム。
【請求項４９】
被験体におけるがん種横断的解析またはプロファイリングのために構成されている、請求項４７に記載のキットまたはシステム。
【請求項５０】
被験体におけるがんまたは新生物を評価するための方法であって、
ａ）被験体の少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドであって、表１に列挙された標的１〜標的１８４９の少なくとも２つのポリヌクレオチド配列またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を有する、少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドを含む前記被験体由来の試料を提供することと、
ｂ）前記少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態を評価することと、
ｃ）前記少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態の評価に基づいて、前記被験体におけるがんまたは新生物を評価することと
を含む、方法。
【請求項５１】
前記試料が、循環無細胞または腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記試料が、血液、血清、血漿、もしくは体液試料、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記被験体が哺乳動物である、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物、例えば、ペット、家畜、コンパニオンアニマルまたは実験動物である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
表１に列挙された標的１〜標的１８４９のうちの少なくとも１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはすべてのポリヌクレオチド配列、またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を有する標的ポリヌクレオチドのメチル化状態を評価することを含む、請求項５０から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
標的ポリヌクレオチドの前記メチル化状態を、前記標的ポリヌクレオチドの各々とハイブリダイズするように構成されたプローブまたはプライマーを使用して評価する、請求項５０から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
標的ポリヌクレオチドの前記メチル化状態を、前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように構成された単一のプローブまたはプライマーを使用して評価する、請求項５０から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
標的ポリヌクレオチドの前記メチル化状態を、前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように構成された複数のプローブまたはプライマーを使用して評価する、請求項５０から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記１つまたは複数のプライマーが、配列番号１〜配列番号１７５０４のいずれかに記述されている配列、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項５０から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
メチル化状態が評価されるべき前記標的ポリヌクレオチドの各々を増幅するための共通のプライマーを使用することをさらに含む、請求項５０から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記共通のプライマーが、配列番号１７５０５に記述されている配列、その相補的もしくは実質的に相補的な配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
試料から前記標的ポリヌクレオチドを単離することをさらに含む、請求項５０から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記標的ポリヌクレオチドのライブラリーを調製することをさらに含む、請求項５０から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記標的ポリヌクレオチドの前記ライブラリーを、酵素、例えば、リガーゼまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを使用して調製する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ｓｓＤＮＡリガーゼが、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼ、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））、または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１、である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記標的ポリヌクレオチドを増幅することをさらに含む、請求項５０から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記標的ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、プライマー伸長、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、およびループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）からなる群より選択される手順を使用して増幅する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記標的ポリヌクレオチド、前記標的ポリヌクレオチドのライブラリー、増幅された標的ポリヌクレオチド、または増幅された標的ポリヌクレオチドのライブラリーを精製することをさらに含む、請求項５０から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
標的ポリヌクレオチドの前記メチル化状態を、質量分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性シークエンシング、例えば、バイサルファイトシークエンシング、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ小断片濃縮アッセイ（ＨＥＬＰアッセイ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲアッセイ（ＧＬＡＤ−ＰＣＲアッセイ）、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（ＲＬＧＳ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰまたはｍＤＩＰ）、パイロシークエンシング、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ活性の分子切断光アッセイ、メチル感受性サザンブロッティング、または高解像度融解（ＨＲＭ）分析を使用して評価する、請求項５０から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
標的ポリヌクレオチドのメチル化状態を評価することが、化学薬品、例えば、亜硫酸水素塩または亜硫酸水素ナトリウムを使用することを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
標的ポリヌクレオチドのメチル化状態を評価することが、生物学的薬品、例えば、ポリペプチドまたは酵素を使用することを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記酵素が、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＭＳＲＥが、残基がメチル化されていない場合、前記残基で選択的に切断する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＭＳＲＥが、前記残基がメチル化されている場合、前記残基で選択的に切断する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＭＳＲＥが、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７３から７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記酵素が、ポリヌクレオチドポリメラーゼである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリヌクレオチドポリメラーゼが、ＰＣＲで使用されるように構成されている、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ポリヌクレオチドポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
標的ポリヌクレオチドの前記メチル化状態を、メチル化感受性シークエンシング、例えば、バイサルファイトシークエンシングを使用して評価する、請求項５０から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記メチル化感受性シークエンシングを、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシークエンシング、チェーンターミネーション法、ショットガンシークエンシング、ブリッジＰＣＲ、単一分子リアルタイムシークエンシング、イオン半導体（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  シークエンシング）、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング（ＳＯＬｉＤシークエンシング）、チェーンターミネーション（サンガーシークエンシング）、大規模並列処理特徴シークエンシング（ＭＰＳＳ）、ポロニーシークエンシング、４５４パイロシークエンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、ＤＮＡナノボールシークエンシング、ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ  単一分子シークエンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング、ナノポアＤＮＡシークエンシング、トンネル電流ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、質量分析によるシークエンシング、マイクロ流体サンガーシークエンシング、顕微鏡検査に基づく技術、ＲＮＡＰシークエンシング、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスハイスループットシークエンシングからなる群より選択されるフォーマットにより行う、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記メチル化感受性シークエンシング、例えば、バイサルファイトシークエンシングの前に、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得ることをさらに含み、前記直鎖状一本鎖ライゲーション生成物の各々は、アダプターがライゲーションされる直鎖状一本鎖標的ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む前記アダプターに連結された前記一本鎖標的ポリヌクレオチドから構成されている、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記標的ポリヌクレオチドからのシークエンシングリードを、最初にアダプタートリミングして、前記ライブラリー構築プロセスに由来する任意のアダプター配列を除去して、トリミングされたシークエンシングリードを得る、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記トリミングされたシークエンシングリードを、アラインメントプログラムを使用し、参照ゲノム、例えば、ヒト参照ゲノムにマッピングして、アラインメントされたリードファイルを得る、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記アラインメントされたリードファイルを、メチル化状態の評価に使用することができる、表１に列挙された標的１〜標的１８４９の各標的領域、またはその相補的配列または実質的に相補的な配列に対応するセットに、グループ化する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記標的ポリヌクレオチドの各々のメチル化状態を評価する、請求項５０から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記標的ポリヌクレオチドの各々の前記メチル化状態を評価して、例えば、平均メチル化頻度、メチル化ハプロタイプ負荷、非メチル化ハプロタイプ負荷、読み取り不一致率、またはそれらの組み合わせの形態で、メチル化メトリックを得る、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
試料のメチル化状態を、前記標的ポリヌクレオチドの各々からの前記メチル化メトリックを使用して評価する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記標的ポリヌクレオチドの各々の前記メチル化メトリックを、閾値または参照値と比較して、試料のメチル化状態を評価する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
数値メチル化マトリックスを、前記標的ポリヌクレオチドの各々からの前記メチル化メトリックを使用して計算して、試料のメチル化状態を評価する、請求項８８または８９に記載の方法。
【請求項９１】
試料からの前記数値メチル化マトリックスが、単一の数または数値を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
試料からの前記数値メチル化マトリックスが、複数の数または数値を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記数値メチル化マトリックスを、分類アルゴリズムを使用して計算する、請求項９０から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記分類アルゴリズムが、線形判別分析、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類、パーセプトロン分類、二次分類、ｋ最近傍法、ブースティング、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、学習ベクトル量子化、またはサポートベクターマシンである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記メチル化マトリックスを、閾値または参照値と比較して、試料のメチル化状態を評価する、請求項９０から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記標的ポリヌクレオチドの各々の前記メチル化メトリックを、コンピュータを使用して得る、請求項８７から９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
試料の前記メチル化マトリックスを、前記標的ポリヌクレオチドの各々からの前記メチル化メトリックに基づいて、コンピュータを使用して得る、請求項９０から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
複数の試料からの、例えば、複数の被験体由来の複数の試料からの少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態を、順次にまたは同時に評価する、請求項５０から９７のいずれかに記載の方法。
【請求項９９】
被験体におけるがんまたは新生物の診断、予後、層別化、リスク評価、または処置モニタリングのために使用する、請求項５０から９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１００】
前記がんが、リンパ腫、白血病、脳がん、多発性骨髄腫、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、乳がん、腎臓がん、肺がん、結腸直腸がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、食道がん、または頭頸部がんである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
被験体における肺がんの診断、予後、層別化、リスク評価、または処置モニタリングのために使用する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記肺がんが、非小細胞肺癌または小細胞肺癌である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記非小細胞肺癌が、肺の腺癌（肺腺癌としても公知である）、肺の扁平上皮癌（ＳＣＣ）、または大細胞癌（ＬＣＣ）である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
被験体における結腸直腸がんの診断、予後、層別化、リスク評価、または処置モニタリングのために使用する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０５】
被験体におけるがん種横断的解析もしくはプロファイリングを診断、予後、層別化、リスク評価、または処置モニタリングのために使用する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０６】
複数の被験体におけるがんまたは新生物を、順次にまたは同時に評価する、請求項５０から１０５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０７】
少なくとも１０％の感度を有する、請求項５０から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
少なくとも１０％の特異性を有する、請求項５０から１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
被験体におけるがんまたは新生物の評価に基づいて、前記被験体を処置すること、または前記被験体の処置を変更することをさらに含む、請求項５０から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
ヒト患者のがんまたは新生物の評価に基づいて、前記ヒト患者を処置すること、または前記ヒト患者の処置を変更することを含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記処置が、化学療法、放射線療法、免疫療法、細胞療法、外科手術、薬物、例えば、小分子薬物または抗体薬物などの高分子薬物による処置である、請求項１０９または１１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年４月１２日出願の米国仮特許出願第６２／６５６，８２０号の優先権を主張するものであり、その開示はすべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。一部の態様においては、本開示は、２０１７年４月１９日出願の米国仮出願第６２／４８７，４２２号および２０１７年４月１９日出願の米国仮出願第６２／４８７，４２３号に関し、それらの内容は、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本開示は、ある特定の組成物、キット、デバイス、システムおよび方法、例えば、被験体におけるがんまたは新生物を評価するための組成物、キット、デバイス、システムおよび方法に関する。特定の態様においては、本明細書で提供されるのは、被験体由来の選択された標的ポリヌクレオチド配列、例えば、標的ゲノムＤＮＡ配列のメチル化状態を評価することに基づいて、被験体におけるがんまたは新生物を評価するための組成物、キット、デバイス、システムおよび方法である。
【背景技術】
【０００３】
被験体におけるがんまたは新生物を評価するための種々の試薬、キット、および方法が公知である。しかし、被験体におけるがんまたは新生物を評価するための改善された組成物、キット、デバイス、システム、および方法、例えば、より良い感度、特異性を有する試験、および／またはより多くの情報を提供する試験が必要である。本開示は、これに関連する必要性および他の関連する必要性に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本概要は、特許請求の範囲の主題の範囲を限定するために使用されるとは意図されない。特許請求の範囲の主題の他の特色、詳細、利用性および利点は、付属の図面において、および付属の特許請求の範囲において開示される態様を含む、詳細な説明から明らかである。
【０００５】
一態様においては、本明細書で提供されるのは、少なくとも２つの単離されたポリヌクレオチドを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる単離されたポリヌクレオチドのパネルであり、前記単離されたポリヌクレオチドの各々は、表１に列挙された標的１〜標的１８４９のいずれかのポリヌクレオチド配列またはその相補配列を有する。上記のパネルのいずれかを含むキット、デバイス、システム、または製造物品も提供される。
【０００６】
別の態様においては、表１に列挙された標的１〜標的１８４９のうちの少なくとも２つのもののメチル化状態を評価するために構成されたキット、デバイス、システム、または製造物品が提供される。一部の実施形態においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、被験体のがんまたは新生物を評価するために構成されている。
【０００７】
さらに別の態様においては、本明細書で提供されるのは、被験体におけるがんまたは新生物を評価するための方法であって、この方法は、ａ）被験体の少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドであって、表１に列挙された標的１〜標的１８４９の少なくとも２つのポリヌクレオチド配列またはその相補配列を有する、少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドを含む前記被験体由来の試料を提供することと、ｂ）前記少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態を評価することと、ｃ）前記少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態の評価に基づいて、前記被験体におけるがんまたは新生物を評価することとを含む。一部の実施形態においては、本方法は、被験体におけるがんまたは新生物の診断、予後、層別化、リスク評価、または処置モニタリングのために使用される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、例示的なサポートベクターマシン解析を示している。図１の画像はウィキペディア：https://en.wikipedia.org/wiki/Support_vector_machine）から取得したものであり、ＤＮＡメチル化状態の解析を表すものでもがんの評価を表すものでもない。
【０００９】
【図２】図２は、実施例１に記載の結腸組織におけるがんの検出を示す。
【００１０】
【図３】図３ａおよび３ｂは、実施例２に記載の血漿中の肺がんの検出を示す。
【００１１】
【図４】図４は、実施例３に記載の血漿中の汎がんの検出を示す。
【００１２】
【図５−１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−２９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−３９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−４９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−５９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−６９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−７９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−８９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−９９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１００】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１０９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１１９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１２９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１３９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１４９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１５９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１６９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１７９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１８９】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９０】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９１】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９２】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９３】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９４】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９５】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９６】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９７】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【図５−１９８】図５（Ｔａｂｌｅ  １（表１））は、例示的な標的（Ｔａｒｇｅｔ）領域およびプライマーを示す。
【００１３】
【図６】図６は、本開示の一態様による、一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーを構築し、ライブラリーを使用してシークエンシング解析を実行するためのステップを示す。
【００１４】
【図７】図７は、本開示の一態様による、シークエンシングのための標的分子を含む構築物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示の完全な理解を提供するために、以下の説明において多くの特定の詳細が示されている。これらの詳細は、例の目的のために提供され、特許請求の範囲の主題は、これらの特定の詳細の一部またはすべてを伴わず、特許請求の範囲によって実施され得る。特許請求の範囲の主題の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用してもよく、構造的変化を行ってもよいことが理解されるべきである。個々の実施形態のうちの１つまたは複数において説明されている様々な特色および機能性は、それらが説明されている特定の実施形態へのそれらの適用可能性において限定されないことを理解すべきである。その代わりに、それらは、そのような実施形態が説明されているかどうかにかかわらず、およびそのような特色が説明されている実施形態の一部であると示されているかどうかにかかわらず、単独で、または組み合わせで、本開示の他の実施形態のうちの１つまたは複数に適用することができる。明確にするために、特許請求の範囲の主題が不必要に不明確にならないように、特許請求の範囲の主題に関連する技術分野において公知の技術材料については詳細に説明していない。
【００１６】
この出願において参照される特許文献、科学論文およびデータベースを含むすべての刊行物は、各個々の刊行物が参照により個々に組み込まれているのと同様にすべての目的についてその全体が参照により組み込まれている。刊行物または文献の引用は、それらのいずれかが関係先行技術であるという承認とは意図されず、それが、これらの刊行物または文献の内容または日付についてのいかなる承認を構成することもない。
【００１７】
すべての見出しは、読み手の便利のためであり、指定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。
【００１８】
提供される実施形態の実施は、別に示されない限り、当技術分野において実施する当業者の技術の範囲内である有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学およびシークエンシング技術の従来技術および説明を用いる。そのような従来技術として、ポリペプチドおよびタンパク質合成および修飾、ポリヌクレオチド合成および修飾、ポリマーアレイ合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、ハイブリダイゼーションの検出ならびにヌクレオチドシークエンシングが挙げられる。好適な技術の特定の例示は、本明細書の実施例を参照して行われ得る。しかしながら、他の同等の従来手順もまた、もちろん、使用することができる。そのような従来技術および説明は、標準の試験室マニュアル、例として、それらのすべてをすべての目的について参照によりそれらを全体として本明細書に組み込む、Ｇｒｅｅｎら編、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｉ〜ＩＶ巻）（１９９９年）；Ｗｅｉｎｅｒ、Ｇａｂｒｉｅｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ編、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００７年）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００３年）；ＢｏｗｔｅｌｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（２００３年）；Ｍｏｕｎｔ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００４年）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００６年）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００２年）（すべてＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから）；Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７年）；Ｔ．  Ｂｒｏｗｎ編、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１年）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａ．  Ｂｏｔｈｗｅｌｌら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ（１９９０年）、Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌ．；Ｍ．  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（１９９０年）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ｒ．  Ｗｕら編、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（１９８９年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９１年）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）（１９９５年）、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．；Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（２００２年）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ；ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００年）第３版、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２年）第５版、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．において見ることができる。
【００１９】
Ａ．  定義
別に定めない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。この節において示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている特許、出願、公開出願および他の刊行物において示されている定義に反するか、または別の点で矛盾する場合、この節において示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている定義に優先する。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別のように指定しない限り、複数の参照物を含む。
【００２１】
この開示全体を通して、特許請求の範囲の主題の様々な態様が、範囲形式で示される。範囲形式での説明は、単に便利および簡潔にするためであり、特許請求の範囲の主題の範囲に対する融通の利かない限定として解釈されるべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の説明は、具体的に開示されるすべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、値の範囲が示される場合、その範囲の上限と下限との間の各間の値、および任意の他の示される値またはその示される範囲内の間の値は、特許請求の範囲の主題に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲内に含まれてもよく、これらもまた、示される範囲内の任意の具体的に除外される限界を条件として、特許請求の範囲の主題に包含される。示される範囲が、限界のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの含まれる限界のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、特許請求の範囲の主題に含まれる。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【００２２】
「約」について、本明細書中の値またはパラメータは、その値またはパラメータそれ自体を対象とする変形を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」について言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。加えて、数の任意の連なりに先行する「約」の使用は、その連なりにおいて列挙される数のうちの「約」各数を含む。例えば、「約Ｘ、ＹまたはＺ」について言及する説明は、「約Ｘ、約Ｙまたは約Ｚ」を説明すると意図される。
【００２３】
「平均」という用語は、本明細書で使用されるとき、文脈が明確に別のように示さない限り、平均値もしくは中央値、または平均値もしくは中央値に近似するために使用される任意の値のいずれかを指す。
【００２４】
本明細書で使用される「被験体」は、提供される組成物、方法、キット、デバイス、およびシステムが投与または適用され得る生物、または生物の一部もしくは構成成分を指す。例えば、被験体は、哺乳動物または哺乳動物の細胞、組織、器官、もしくは一部であり得る。本明細書で使用されるとき、「哺乳動物」は、哺乳動物クラスの種のいずれか、好ましくはヒト（ヒト、ヒト被験体、またはヒト患者を含む）を指す。被験体および哺乳動物としては、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、およびマウスやラットなどのげっ歯類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、「試料」という用語は、生物学的試料を含む、解析が望まれる標的分子を含み得るものを指す。本明細書で使用されるとき、「生物学的試料」とは、生きている供給源もしくはウイルス（またはプリオン）供給源、または高分子および生体分子の他の供給源から得た任意の試料を指してもよく、核酸、タンパク質および／または他の高分子を得ることができる被験体の任意の細胞型または組織を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られた試料または加工された試料であり得る。例えば、単離され、増幅された核酸は、生物学的試料を構成する。生物学的試料としては、体液、例として、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、汗、精液、便、痰、涙、粘液、羊水など、滲出液、骨髄試料、腹水、骨盤洗浄液（ｐｅｌｖｉｃ  ｗａｓｈ  ｆｌｕｉｄ）、胸水、髄液、リンパ、眼球液（ｏｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）、鼻抽出物、咽喉もしくは生殖器スワブ、消化組織からの細胞懸濁物、または糞便の抽出物、ならびにヒト、動物、例えば非ヒト哺乳動物、および植物由来の組織および器官試料、ならびにそれらに由来する加工試料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそのアナログまたは混合物を含む。この用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。また、それは、ポリヌクレオチドの、例えば、アルキル化によって、および／またはキャッピングによって修飾した形態、ならびに非修飾形態を含む。より特に、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、スプライシングされているか、スプライシングされていないかにかかわらずｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯＲからＮｅｕｇｅｎｅとして市販されている）ポリマー、ならびにポリマーがＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見られるような塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含有するならば他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。したがって、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’〜Ｐ５’ホスホルアミデート、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドまたはＰＮＡとＤＮＡもしくはＲＮＡとのハイブリッドを含み、また、公知の種類の修飾、例えば、標識、アルキル化、「キャップ」、ヌクレオチドのうちの１つまたは複数のアナログによる置換、ヌクレオチド間修飾、例として、例えば、非荷電連結を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、負荷電連結を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）および正荷電連結を有するもの（例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）、ペンダント部分、例として、例えば、タンパク質（酵素（例えば、ヌクレアーゼ）、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属などの）キレートを含有するもの、アルキレーターを含有するもの、修飾連結を有するもの（例えば、アルファ芳香族核酸など）ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非修飾形態を含む。核酸は一般的に、ホスホジエステル結合を含有するが、一部の場合、代替の骨格、例として、ホスホルアミダイト、ホスホロジチオエートもしくはメチルホスホルアミダイト（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）連結、またはペプチド核酸骨格および連結を有する核酸アナログが含まれ得る。他のアナログ核酸として、ロックド核酸を含む二環式構造、正電骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）、非イオン性骨格および非リボース骨格を有するアナログ核酸が挙げられる。リボース−ホスフェート骨格の修飾は、分子の安定性を増大させるために行われ得る；例えば、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、一部の環境においてより高い安定性を示し得る。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、任意の好適な長さ、例として、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００またはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、公知のプリンおよびピリミジン塩基のみでなく、また、修飾されている他のヘテロ環式塩基を含有する部分を含むことが理解される。そのような修飾として、メチル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジンまたは他のヘテロ環が挙げられる。また、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分についての修飾を含んでもよく、例えば、ヒドロキシル基のうちの１つまたは複数は、ハロゲン、脂肪族基で置換されるか、またはエーテル、アミンその他として官能化される。「ヌクレオチド単位」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含すると意図される。
【００２８】
「相補的」および「実質的に相補的」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２鎖間またはオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間の、ハイブリダイゼーションまたは塩基対形成または二本鎖形成を含む。相補的ヌクレオチドは一般的に、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）またはＣおよびＧである。２つの一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、１つの鎖のヌクレオチドが、最適にアラインメントおよび比較され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、他の鎖の少なくとも約８０％、通常少なくとも約９０％〜約９５％、さらに約９８％〜約１００％と対形成する場合、実質的に相補的と言われる。一態様においては、２つの相補的ヌクレオチド配列は、相対するヌクレオチド間で好ましくは２５％未満の、より好ましくは１５％未満の、さらにより好ましくは５％未満のミスマッチ、最も好ましくはミスマッチなしでハイブリダイズすることができる。好ましくは、２つの分子は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【００２９】
参照配列について、本明細書で使用されるとき、逆相補配列は、逆の順序の参照配列の相補配列である。例えば、５’−ＡＴＣＧ−３’について、相補配列は、３’−ＴＡＧＣ−５’であり、逆相補配列は、５’−ＣＧＡＴ−３’である。
【００３０】
「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用されるとき、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して、安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指し得る。一態様においては、得られる二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「二重鎖」であり得る。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、およそ１Ｍ未満、多くの場合約５００ｍＭ未満の塩濃度を含み、約２００ｍＭ未満であってもよい。「ハイブリダイゼーション緩衝液」は、緩衝塩溶液、例として、５％ＳＳＰＥ、または当技術分野で公知の他のそのような緩衝液を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度に低くてもよいが、典型的には２２℃を超え、より典型的には約３０℃を超え、典型的には３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは多くの場合、ストリンジェントな条件、すなわち、配列がその標的配列にハイブリダイズするが、他の非相補配列にはハイブリダイズしない条件下で行われる。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況においては異なる。例えば、より長い断片は、短い断片より、特異的ハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在ならびに塩基ミスマッチ形成の程度を含む他の因子は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るので、パラメータの組み合わせは、任意の１つのパラメータ単独の絶対的な尺度より重要である。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列についてのＴｍより約５℃低くなるように選択される。融解温度Ｔｍは、二本鎖核酸分子の集団の半分が解離して一本鎖になる温度であり得る。核酸のＴｍを算出するためのいくつかの式が、当技術分野で周知である。標準の参考文献によって示される通り、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中に存在する場合、Ｔｍ値の単純な見積もりは、式、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって算出することができる（例えば、Anderson,  M.L.M.  and  Young,  B.D.  1985,  Quantitative  filter  hybridization.  In:  Nucleic  acid  hybridization:  a  practical  approach,  73-111.  B.  D.  Hames  and  S.  J.  Higgins  (eds.).  IRL  Press  Limited,  Oxford.を参照されたい）。他の参考文献（例えば、Allawi  and  SantaLucia,  Jr.,  Biochemistry,  36:10581-94  (1997)）は、構造特徴および環境特徴ならびに配列特徴を考慮してＴｍの算出を行う代替の計算法を含む。
【００３１】
一般的に、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度および温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて、様々な、しかしより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。例示的な、ストリンジェントな条件として、約７．０〜約８．３のｐＨおよび少なくとも２５℃の温度における少なくとも０．０１Ｍ〜１Ｍ以下のナトリウムイオン濃度（または他の塩）の塩濃度が挙げられる。例えば、５×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．４における７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）および約３０℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションに好適であるが、好適な温度は、ハイブリダイズする領域の長さおよび／またはＧＣ含有量に依存する。一態様においては、ミスマッチの割合の決定における「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、以下の通りであり得る：１）高ストリンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃；２）中程度のストリンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃（適度なストリンジェンシーとも呼ばれる）；および３）低ストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃。代替の緩衝液、塩および温度を使用して同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。例えば、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーションは、核酸分子、例として、プローブが相補核酸分子に結合することを可能にする条件を指し得る。ハイブリダイズした核酸分子は一般的に、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性のいずれかを含む、少なくとも６０％の同一性を有する。適度にストリンジェントな条件は、４２℃における５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、続いて４２℃における０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中での洗浄に相当する条件であり得る。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃における５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、続いて６５℃における０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄によって提供され得る。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、２２℃における１０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、続いて３７℃における１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中での洗浄に相当する条件を指し得る。デンハルト溶液は、１％フィコール、１％ポリビニルピロリドンおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ）は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウムおよび０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡを含有する。他の好適な、適度なストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液および条件は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９年）において説明されている。
【００３２】
あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖が選択的ハイブリダイゼーション条件下でその相補鎖にハイブリダイズするとき、実質的な相補性が存在する。典型的には、少なくとも１４〜２５個のヌクレオチドのストレッチにわたり少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性が存在する場合、選択的ハイブリダイゼーションが起こる。Ｍ．  Ｋａｎｅｈｉｓａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２巻：２０３頁（１９８４年）を参照されたい。
【００３３】
本明細書で使用される「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型と二本鎖を形成する際に、核酸合成の開始点として作用し、その３’末端から鋳型に沿って伸長することができ、そのため伸長した二本鎖が形成される、天然または合成いずれかのオリゴヌクレオチドであり得る。伸長プロセス中に付加されるヌクレオチド配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。プライマーは通常、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【００３４】
「ライゲーション」は、鋳型で駆動される反応における、２つまたはそれよりも多い核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの末端間の共有結合または連結の形成を指し得る。結合または連結の性質は広く変動してもよく、ライゲーションは酵素的に行ってもよい。本明細書で使用されるとき、ライゲーションは通常、酵素的に行い、１つのオリゴヌクレオチドの５’炭素末端ヌクレオチドと別のヌクレオチドの３’炭素との間にホスホジエステル連結を形成する。
【００３５】
「増幅」は、本明細書で使用されるとき、一般的に、所望の配列の多数のコピーを生成するプロセスを指す。「多数のコピー」とは、少なくとも２つのコピーを意味する。「コピー」は、鋳型配列との完全な配列相補性または同一性を必ずしも意味しない。例えば、コピーは、ヌクレオチドアナログ、例として、デオキシイノシン、意図的な配列変化（例として、鋳型にハイブリダイズ可能であるが、相補的でない配列を含むプライマーを通して導入された配列変化）および／または増幅中に起こる配列エラーを含み得る。
【００３６】
「配列決定」などは、核酸のヌクレオチド塩基配列に関連する情報の決定を含む。そのような情報は、核酸の部分的および完全な配列情報の同定または決定を含み得る。配列情報は、様々な程度の統計的信頼性または信頼度で決定することができる。一態様においては、この用語は、核酸における複数の連続ヌクレオチドの同一性および順序の決定を含む。
【００３７】
「シークエンシング」、「ハイスループットシークエンシング」または「次世代シークエンシング」という用語は、本質的に並列様式で、すなわち、ＤＮＡ鋳型が一度に１つではなくバルクプロセスでシークエンシングのために調製され、かつ多くの配列が好ましくは並列して読み出される、多く（典型的に数千〜数十億）の核酸配列を決定する方法を使用する、またはあるいは、それ自体が並列化され得る超ハイスループット逐次プロセスを使用する配列決定を含む。そのような方法として、ピロシークエンシング（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴによって市販されている）；ライゲーションによるシークエンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡにおいて市販されている）；修飾ヌクレオチドを使用する合成によるシークエンシング（例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡによるＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術；Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡによるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）；ならびにＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡによるＰａｃＢｉｏ  ＲＳにおいて市販されている）、イオン検出技術によるシークエンシング（例として、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）技術、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；ＤＮＡナノボールのシークエンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；ナノポアベースのシークエンシング技術（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＴＤ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫにより開発されている）および同様の高度に並列化したシークエンシング法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
「ＳＮＰ」または「一塩基多型」は、個体間の遺伝的変異；例えば、生物のＤＮＡにおける可変性の単一の窒素性塩基位置を含み得る。ＳＮＰは、ゲノムにわたって見られ、個体間の遺伝的変異の多くは、ＳＮＰ遺伝子座における変異のためであり、多くの場合この遺伝的変異は、個体間の表現型変異をもたらす。本開示における使用のためのＳＮＰおよびそれらの各々の対立遺伝子は、任意の数の供給源、例として、公のデータベース（Ｕ．Ｃ．Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  Ｇａｔｅｗａｙ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）またはＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ  ｇｏｖ／ＳＮＰ／））に由来してもよく、または米国特許第６，９６９，５８９号；および「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」という表題の米国公開公報第２００６／０１８８８７５号で説明されているように実験的に決定してもよい。ＳＮＰの使用は、本明細書で示す実施形態の一部において説明されているが、他の二対立遺伝子または多対立遺伝子マーカーもまた使用してもよいことが理解される。二対立遺伝子マーカーは、２つの多型または対立遺伝子を有するマーカーである。上述の通り、形質と関連付けられる二対立遺伝子マーカーについて、対照群と比較して症例群の遺伝組成においてより豊富な対立遺伝子は、「関連対立遺伝子」と呼ばれ、もう一方の対立遺伝子は、「非関連対立遺伝子」と呼ばれ得る。したがって、所与の形質（例えば、疾患または薬物応答）と関連付けられる各二対立遺伝子多型について、対応する関連付けられる対立遺伝子が存在する。本明細書で示す方法で使用され得る他の二対立遺伝子多型として、多ヌクレオチド変化、挿入、欠失および転座が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書におけるＤＮＡについての言及は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、エピソームＤＮＡおよび／またはＤＮＡ誘導体、例として、アンプリコン、ＲＮＡ転写産物、ｃＤＮＡ、ＤＮＡアナログなどを含み得ることがさらに理解される。関連研究においてスクリーニングされる多型遺伝子座は、二倍体または一倍体状態で存在してもよく、理想的には、ゲノムにわたる部位に由来する。シークエンシング技術は、ＳＮＰシークエンシングについて利用可能であり、例として、ビーズアレイプラットホーム（ＧＯＬＤＥＮＧＡＴＥ（商標）アッセイ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（Ｆａｎら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．、６８巻：６９〜７８頁（２００３年）を参照されたい）を用いてもよい。
【００４０】
一部の実施形態においては、「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ）」または「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ）」という用語は、ＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドのうちの１つまたは複数における５−メチルシトシン（「５−ｍＣ」または「５−ｍＣｙｔ」）の存在または非存在を指す。ＤＮＡ配列内の１つまたは複数の特定のＣｐＧメチル化部位（各々、２つのＣｐＧジヌクレオチド配列を有する）におけるメチル化状態として、「非メチル化」、「完全メチル化」および「ヘミメチル化」がある。「ヘミメチル化（ｈｅｍｉ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」または「ヘミメチル化（ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」という用語は、１つの鎖のみがメチル化されている二本鎖ＤＮＡのメチル化状態を指す。「高メチル化」という用語は、正常対照ＤＮＡ試料内の対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見られる５−ｍＣｙｔの量と比較した、試験ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドのうちの１つまたは複数における５−ｍＣｙｔの存在の増大に対応する平均メチル化状態を指す。「低メチル化」という用語は、正常対照ＤＮＡ試料内の対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見られる５−ｍＣｙｔの量と比較した、試験ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドのうちの１つまたは複数における５−ｍＣｙｔの存在の減少に対応する平均メチル化状態を指す。
【００４１】
本明細書中の「多重化」または「多重アッセイ」とは、２つ以上のマーカーを使用することによって複数の標的、例えば、複数の核酸配列の存在、量、および／またはメチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ）（またはメチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ））を同時にアッセイすることができるアッセイまたは他の解析法を指してもよく、マーカーの各々は、少なくとも１つの異なる検出特徴、例えば、蛍光特徴（例えば、励起波長、発光波長、発光強度、ＦＷＨＭ（半値全幅ピーク高さ（ｆｕｌｌ  ｗｉｄｔｈ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｐｅａｋ  ｈｅｉｇｈｔ））または蛍光寿命）または固有の核酸もしくはタンパク質配列特徴を有する。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「疾患または障害」とは、例えば、感染または遺伝的欠陥から生じ、同定可能な症状によって特徴付けられる生物における病理学的状態を指す。
【００４３】
Ｂ．単離されたポリヌクレオチドおよび関連組成物のパネル
一態様においては、本明細書で提供されるのは、少なくとも２つの単離されたポリヌクレオチドを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる単離されたポリヌクレオチドのパネルであり、前記単離されたポリヌクレオチドの各々は、表１に列挙された（図５に示す）標的１〜標的１８４９のいずれかのポリヌクレオチド配列またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を有する。
【００４４】
本パネルは、任意の好適な数の上記の単離されたポリヌクレオチドを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になっていてもよい。例えば、本パネルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する単離されたポリヌクレオチド、またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になっていてもよい。
【００４５】
一実施形態においては、本パネルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する単離されたポリヌクレオチド、またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むことができる。別の実施形態においては、本パネルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する単離されたポリヌクレオチド、またはその数値範囲もしくは部分範囲からなっていてもよい。さらに別の実施形態においては、本パネルは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する単離されたポリヌクレオチド、またはその数値範囲もしくは部分範囲から本質的になっていてもよい。
【００４６】
本パネルにおいて単離されたポリヌクレオチドは、任意の好適な型（複数可）のポリヌクレオチドであり得る。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはそれらの組み合わせであり得る。一部の実施形態においては、ＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ分子またはその断片であり得る。
【００４７】
単離されたポリヌクレオチドは、基材上に固定することができる。単離されたポリヌクレオチドは、任意の好適な基材上に固定することができる。例えば、基材は、固体表面、多孔質表面、またはそれらの組み合わせを含むことができる。一部の実施形態においては、基材は、ビーズ、管、マイクロタイタープレート、膜、ゲル、またはスライドガラスの一部であり得る。他の実施形態においては、単離されたポリヌクレオチド分子は、基材上に互いに空間的に離れて固定することができ、その結果、単離されたポリヌクレオチド分子の各々は、個別に評価または解析され得る。
【００４８】
上記のパネル（複数可）のいずれかを含むキット、デバイス、システム、または製造物品も提供される。
【００４９】
本キット、デバイス、システム、または製造物品は、任意の好適な使用または目的のために構成することができる。例えば、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、表１に列挙された標的１〜標的１８４９のうちの少なくとも２つのもののメチル化状態を評価するために構成することができる。一部の実施形態においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する単離されたポリヌクレオチド、またはその数値範囲もしくは部分範囲のメチル化状態を評価するために構成することができる。他の実施形態においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品中の単離されたポリヌクレオチドは、対照ポリヌクレオチドとして構成することができる。
【００５０】
本キット、デバイス、システム、または製造物品中の単離されたポリヌクレオチドは、任意の好適なレベルの濃度を有することができる。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、約１フェムトモル濃度〜約１００ミリモル濃度、例えば、約１フェムトモル濃度（ｆＭ）、１０ｆＭ、１００ｆＭ、１ピコモル濃度（ｐＭ）、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ナノモル濃度（ｎＭ）、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１マイクロモル濃度（μＭ）、１０μＭ、１００μＭ、１ミリモル濃度（ｍＭ）、１０ｍＭ、１００ｍＭ、またはその部分範囲のレベルの濃度を有することができる。
【００５１】
本キット、デバイス、システム、または製造物品は、任意の好適な使用または目的のために構成することができる。例えば、キット、デバイス、システム、または製造物品は、被験体におけるがんまたは新生物を評価するために、例えば、被験体における肺がんもしくは結腸直腸がんを評価するために、または被験体におけるがん種横断的解析（pan-cancer  analysis）もしくはプロファイリングのために構成することができる。
【００５２】
Ｃ．メチル化を評価するためのキット、システム、および関連組成物
別の態様においては、表１に列挙された標的１〜標的１８４９のうちの少なくとも２つのもののメチル化状態を評価するために構成されたキット、デバイス、システム、または製造物品が提供される。
【００５３】
本キット、デバイス、システム、または製造物品は、表１に列挙された任意の好適な数の標的のメチル化状態を評価するための試薬を含むことができる。例えば、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する単離されたポリヌクレオチド、またはその数値範囲もしくは部分範囲のメチル化状態を評価するための試薬を含むことができる。
【００５４】
一部の実施形態においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、表１に列挙された任意の部分群の標的のメチル化状態を評価するための試薬を含むことができる。例えば、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、表１に列挙された標的１〜１００のメチル化状態を評価するための試薬を含むことができる。他の実施形態においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、表１に列挙された１つまたは複数の標的を除いて、表１に列挙されたすべての標的のメチル化状態を評価するための試薬を含むことができる。例えば、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、表１に列挙された標的１〜１８４８のメチル化状態を評価するための試薬を含むことができるが、表１に列挙された標的１８４９のメチル化状態を評価するための試薬（複数可）を含まない、などである。
【００５５】
本キット、デバイス、システム、または製造物品は、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態を評価するための任意の好適な試薬を含むことができる。例えば、試薬は、メチル化状態が評価されるべき標的の各々とハイブリダイズするように構成されたプローブまたはプライマーを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。一部の実施形態においては、試薬は、メチル化状態が評価されるべき標的の各々とハイブリダイズするように構成された単一のプローブまたはプライマーを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。他の実施形態においては、試薬は、メチル化状態が評価されるべき標的の各々とハイブリダイズするように構成された複数のプローブまたはプライマーを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。
【００５６】
一部の実施形態においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品中の１つまたは複数のプライマーは、表１に列挙された配列番号１〜１７５０４に記述されている配列、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。表１に列挙された各標的について、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、その標的に対応する１つまたは複数のプライマーを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなっていてもよい。例えば、表１に列挙された標的１について、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、表１に列挙された配列番号１〜１０に記述されている配列のいずれか、例えば、配列番号１〜１０に記述されている配列（複数可）、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のプライマーを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなっていてもよい。同様に、表１に列挙された標的２について、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、表１に列挙された配列番号１１〜２０に記述されている配列のいずれか、例えば、配列番号１１〜２０に記述されている配列（複数可）、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のプライマーを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなっていてもよい。表１に列挙された標的３〜１８４９のいずれかについて、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、上で表１に列挙された標的１または２について示されたように、表１に列挙された対応する配列（複数可）のいずれか、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなっていてもよい。
【００５７】
一部の実施形態においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、共通のプライマー、例えば、メチル化状態が評価されるべき標的の各々を増幅するための共通のプライマーを含むことができる。例示的な共通のプライマーは、配列番号１７５０５に記述されている配列（ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ）、またはその相補的または実質的に相補的な配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。
【００５８】
本キット、デバイス、システム、または製造物品は、他の任意の好適な試薬をさらに含むことができる。一部の実施形態においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、２０１７年４月１９日出願の米国仮出願第６２／４８７，４２２号および２０１７年４月１９日出願の米国仮出願第６２／４８７，４２３号に開示および／または特許請求されている任意の他の好適な試薬をさらに含むことができる。
【００５９】
例えば、本キット、デバイス、システム、または製造物品は試料から標的を単離するための薬品をさらに含むことができる。
【００６０】
別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、標的のライブラリーを調製するための試薬をさらに含むことができる。標的のライブラリーを調製するための任意の好適な試薬を含めることができる。一部の実施形態においては、標的のライブラリーを調製するための試薬は、酵素、例えば、リガーゼまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを含むことができる。任意の好適なｓｓＤＮＡリガーゼとしては、例えば、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１を挙げることができる。
【００６１】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、標的または標的のライブラリーを増幅するための試薬をさらに含むことができる。標的または標的のライブラリーを増幅するための任意の好適な試薬を含めることができる。一部の実施形態においては、標的または標的のライブラリーを増幅するための試薬は、酵素、例えば、ポリヌクレオチド増幅反応で使用される酵素を含むことができる。例示的なポリヌクレオチド増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、プライマー伸長、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、自家持続配列複製（self  sustained  sequence  replication）（３ＳＲ）、およびループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）が挙げられる。
【００６２】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、標的、標的のライブラリー、増幅された標的、または増幅された標的のライブラリーを精製するための薬品をさらに含むことができる。
【００６３】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、標的のメチル化状態を評価するための試薬をさらに含むことができる。標的のメチル化状態を評価するための任意の好適な試薬を含めることができる。一部の実施形態においては、標的のメチル化状態を評価するための試薬は、ポリヌクレオチドメチル化、例えば、ＤＮＡメチル化検出方法において使用される試薬であり得る。例示的なポリヌクレオチドメチル化またはＤＮＡメチル化検出方法としては、質量分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、バイサルファイトシークエンシング、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ小断片濃縮アッセイ（ＨｐａＩＩ  ｔｉｎｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｂｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ）（ＨＥＬＰアッセイ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲアッセイ（Ｇｌａｌ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｄａｐｔｅｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ）（ＧＬＡＤ−ＰＣＲアッセイ）、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（ＲＬＧＳ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰまたはｍＤＩＰ）、パイロシークエンシング、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ活性の分子切断光アッセイ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅａｋ  ｌｉｇｈｔ  ａｓｓａｙ）、メチル感受性サザンブロッティング、および高解像度融解曲線（high  resolution  Melt）（ＨＲＭ）分析が挙げられる。
【００６４】
標的のメチル化状態を評価するための試薬は、化学薬品、例えば、亜硫酸水素塩または亜硫酸水素ナトリウムであり得る。標的のメチル化状態を評価するための試薬は、また、生物学的薬品、例えば、ポリペプチドまたは酵素であり得る。
【００６５】
任意の好適な酵素を含めることができる。一部の実施形態においては、酵素は、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）であり得る。ＭＳＲＥは、残基がメチル化されていない場合、その残基で選択的に切断することができる。ＭＳＲＥはまた、その残基がメチル化されている場合も、その残基で選択的に切断することができる。例示的なＭＳＲＥは、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。
【００６６】
一部の実施形態においては、酵素は、ポリヌクレオチドポリメラーゼであり得る。ポリヌクレオチドポリメラーゼは、ポリヌクレオチド増幅反応、例えば、ＰＣＲで使用されるように構成されている。任意の好適なポリヌクレオチドポリメラーゼを含めることができる。例えば、ポリヌクレオチドポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【００６７】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを得るための変性試薬をさらに含み得る。
【００６８】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、ライゲーション反応のための密集剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）をさらに含み得る。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ６０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む。
【００６９】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するための、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ／またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、１組のプライマーをさらに含み得る。
【００７０】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、プライマーダイマーおよび／またはプライマー−アダプター二本鎖を除去するための試薬をさらに含み得る。
【００７１】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、標的配列の配列情報を含む増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物を得るための、標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）に特異的な配列を含むプライマーをさらに含み得る。さらなる態様においては、キットは、増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物をシークエンシングするための、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードをさらに含み得る。
【００７２】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、上記のセクションＢに記載された単離されたポリヌクレオチドのパネルをさらに含み得る。
【００７３】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、参照試料および／または対照遺伝子座の情報をさらに含み得る。
【００７４】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、１つまたは複数の構成成分用の別個の容器、例えば、バイアル、および／またはキット、デバイス、システム、または製造物品を使用するための指示をさらに含み得る。
【００７５】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、メチル化状態評価に基づいて試料のメチル化メトリック（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｒｉｃ）を得るための実行可能な命令を含むコンピュータ可読媒体をさらに含み得る。コンピュータ可読媒体は、任意の好適な形態、例えば、平均メチル化頻度、メチル化ハプロタイプ負荷（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｌｏａｄ）、非メチル化ハプロタイプ負荷、読み取り不一致率（percent  discordant  read）、またはそれらの組み合わせの形態でメチル化メトリックを得るように構成することができる。
【００７６】
さらに別の例においては、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、メチル化メトリック（複数可）を使用して分類するための実行可能な命令を含むコンピュータ可読媒体をさらに含み得る。例示的な分類アルゴリズムは、線形判別分析、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類、パーセプトロン分類、二次分類、ｋ最近傍法、ブースティング、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、学習ベクトル量子化、サポートベクターマシン、またはそれらの組み合わせ、であり得る。
【００７７】
本キット、デバイス、システム、または製造物品は、任意の好適な使用または目的のために構成することができる。例えば、本キット、デバイス、システム、または製造物品は、被験体におけるがんまたは新生物を評価するために、例えば、被験体における肺がんまたは結腸直腸がんを評価するために、または被験体におけるがん種横断的解析またはプロファイリングのために構成することができる。
【００７８】
一部の実施形態においては、キットは、ポリペプチドの存在を検出するための試薬をさらに含み得る。そのような試薬は、ポリペプチドに特異的に結合する抗体または他の結合分子であり得る。一部の実施形態においては、そのような抗体または結合分子は、多型の結果としてのポリペプチドについての構造的多様性を区別することができる場合があり、したがって、遺伝子型決定するために使用してもよい。抗体または結合分子は、検出可能なマーカー、例として、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素で標識してもよい。結合アッセイ、例として、ＥＬＩＳＡを行うための他の試薬をキットに含めてもよい。
【００７９】
一部の実施形態においては、キットは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０個またはそれよりも多いマーカーを遺伝子型決定するための試薬を含む。マーカーは、ポリヌクレオチドマーカー（例として、がん関連変異またはＳＮＰ）であっても、ポリペプチドマーカー（例として、過剰発現、またはタンパク質の高リン酸化もしくは低リン酸化を含む翻訳後修飾）であっても、それらの任意の組み合わせであってもよい。一部の実施形態においては、キットは、増幅した核酸の検出のための捕捉プローブのための表面または基材（例として、マイクロアレイ）をさらに含み得る。
【００８０】
キットは、１つまたは複数の容器手段、例として、バイアル、管などを緊密に閉じ込めて受容するために区画化されている担体手段をさらに含んでもよく、容器手段の各々は、方法において使用される別々の要素のうちの１つを含む。例えば、容器手段のうちの１つは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを含んでもよい。そのようなプローブは、バイオマーカーに特異的なポリヌクレオチドであってもよい。キットはまた、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチド（複数可）を含有する容器、および／またはレポーター分子、例として、酵素標識、蛍光標識もしくは放射性同位体標識に結合したレポーター手段を含む容器を有してもよい。
【００８１】
キットは典型的に、上記の容器（複数可）、ならびに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用のための指示を有する添付文書を含む商業的観点およびユーザーの立場から望ましい材料を含む１つまたは複数の他の容器を含む。組成物が特定の療法または非療法的適用に使用されることを示すために、容器上に標識が存在してもよく、また、上記の使用のようなｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用いずれかについての手引きを示してもよい。
【００８２】
キットは、組織または細胞または体液試料を調製し、試料から核酸（例として、ｃｔＤＮＡ）を調製するための１組の指示および材料をさらに含んでもよい。
【００８３】
Ｄ．被験体におけるがんまたは新生物を評価するための方法
さらに別の態様においては、本明細書で提供されるのは、被験体におけるがんまたは新生物を評価するための方法であって、この方法は、ａ）被験体の少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドであって、表１に列挙された標的１〜標的１８４９の少なくとも２つのポリヌクレオチド配列またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を有する少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドを含む前記被験体由来の試料を提供することと、ｂ）前記少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態を評価することと、ｃ）前記少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態の評価に基づいて、前記被験体におけるがんまたは新生物を評価することとを含む。
【００８４】
本発明の方法は、任意の好適な試料、例えば、がんまたは新生物の状態が評価されるべき被験体から得られた、または被験体に由来する任意の好適な試料に使用することができる。例えば、試料は、循環無細胞または腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含み得る。別の例においては、試料は、血液、血清、血漿、もしくは体液試料、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００８５】
標的または鋳型ポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはそれらの複合体もしくは組み合わせであり得る。ＤＮＡとしては、標準のゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ（例として、ミトコンドリアＤＮＡ）またはそれらの断片を挙げることができる。他の実施形態においては、標的または鋳型ＤＮＡは、加工されたＤＮＡ、例えば、酵素消化、架橋結合、化学的もしくは物理的剪断、亜硫酸水素塩変換および／または分解を受けたＤＮＡである。
【００８６】
一部の実施形態においては、本明細書で開示する目的の標的核酸分子は、無細胞ＤＮＡ、例として、無細胞胎児ＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」とも呼ばれる）またはｃｔＤＮＡである。ｃｆＤＮＡは、妊娠中の母親の体内で、例として、血中で循環し、胎児ゲノムを表し、一方、ｃｔＤＮＡは、がん患者の体内で、例として、血中で循環し、一般的に予め断片化されている。他の実施形態においては、本明細書で開示する目的の標的核酸分子は、例えば、有害な条件下での保存に起因して、古いかつ／もしくは損傷を受けたＤＮＡ、例として、ホルマリン固定試料、または部分的に消化された試料中のＤＮＡである。
【００８７】
がん細胞が死滅すると、それらはＤＮＡを血流へと放出する。このＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）として公知であり、非常に断片化されており、平均の長さはおよそ１５０塩基対である。白血球を除去すると、ｃｔＤＮＡは一般に、残りの血漿ＤＮＡのわずかな割合を構成し、例えば、ｃｔＤＮＡは、血漿ＤＮＡの約１０％未満を構成し得る。一般に、この割合は、約１％未満、例えば、約０．５％未満または約０．０１％未満である。加えて、血漿ＤＮＡの全量は一般的に非常に低く、例えば、血漿１ｍＬ当たり約１０ｎｇである。
【００８８】
ｃｔＤＮＡ中のバリアントは、次世代シークエンシングを含む、種々の方法を使用して調べることができる。ｃｔＤＮＡの血漿ＤＮＡに対する低い比率のために、ＰＣＲエラーおよびシークエンシングエラーのため高信頼度でバリアントをコールすることは困難である。ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を使用して、元の分子にタグ付けして、確認された任意のバリアントをコンセンサス配列と比較することができる。これは、偽陽性から真の陽性を分けるのに有効な方法である。バリアントがコンセンサスとマッチする場合、それは真の陽性である。そうでなければ、それは分析から除去される。さらに、感度を高く維持するために、高い割合の元の分子をシークエンシングライブラリーに変えること、すなわち、バリアントが脱落のために失われないことが重要である。したがって、ライブラリー構築中のライゲーション効率は、非常に重要である。
【００８９】
一態様においては、２０１７年４月１９日出願の米国仮出願第６２／４８７，４２３号に開示されかつ／または特許請求されているように、選択されたゲノム領域を依然として標的としつつライゲーション効率を改善する技術を使用して、本発明の方法で解析される標的ポリヌクレオチドを調製することができる。一実施形態においては、シークエンシングによって検出されるポリヌクレオチド、例として、ｃｔＤＮＡは最初に脱リン酸化して５’リン酸が除去され、ｃｔＤＮＡのそれ自体へのライゲーションが防止される。次に、すべてのＤＮＡが一本鎖になるように、ｃｔＤＮＡを変性させる。一本鎖ＤＮＡリガーゼであるＣｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）を使用して、アダプターをｃｔＤＮＡの３’末端にライゲーションする。一態様においては、アダプターは、ライゲーション効率を最適化するための５’末端上の２つの特異的塩基、およびそれに続くＵＭＩを含有する。一態様においては、アダプターの３’末端は、アダプターの自己ライゲーションを防止するために炭素スペーサーを含有する。別の態様においては、ライゲーション反応は、密集剤、例として、ＰＥＧ４０００を使用してさらに最適化される。一態様においては、ライゲーション後、アダプターに逆相補的なプライマーを使用して分子を二本鎖にする。このことにより、標準の精製による、使用可能なＤＮＡの除去を伴わない、過剰のライゲーションしていないアダプターの効率的な除去が可能になる。
【００９０】
一態様においては、次に、ＤＮＡを、半標的化ＰＣＲを使用して増幅させる。一方のプライマーは、アダプターに逆相補的であり、一方で、もう一方（例えば、プライマープール中の１つのプライマーとして）は、特異的な標的化ゲノム領域にアニールする。特異的プライマーは、プライマー−ダイマー相互作用およびオフターゲットアニーリングを最小限にするように設計された。一態様においては、標的特異的プライマーは、小さいＤＮＡサイズのために特定のバリアントに極めて接近して配置するようにさらに最適化される。別のクリーンアップ後、ＰＣＲにより、全長シークエンシングアダプターおよびバーコードを付加する。次に、最終的なライブラリーを、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機でシークエンシングする。
【００９１】
一態様においては、半標的化ＰＣＲは、約３０，０００ｂｐの比較的小さい標的領域を有するにもかかわらず、元の分子セットの約４０，０００倍を超える富化をもたらす。一態様においては、標準のライブラリー構築およびハイブリダイゼーション捕捉と比較すると、本方法の全変換率は、少なくとも６０％であり、元の分子の少なくとも約３倍多い分子がシークエンシング可能な材料に変換されることを示唆する。他の実施形態においては、全変換率は、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％であり、または９０％を超える。一態様においては、本方法はしたがって、例えば、０．０１％もの低さの、極めて低い変異アレル割合での遺伝子バリアントまたはゲノムバリアント、例として、ＳＮＶ、インデル、ＣＮＶおよび融合を正確にコールすることができる。他の態様においては、遺伝子バリアントまたはゲノムバリアントのアレル割合は、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％または約２％である。
【００９２】
本発明の方法は、任意の好適な被験体におけるがんまたは新生物を評価するために使用することができる。例えば、本発明の方法は、哺乳動物におけるがんまたは新生物を評価するために使用することができる。哺乳動物は、非ヒト哺乳動物、例えば、ペット、家畜、コンパニオンアニマルまたは実験動物であり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。例えば、被験体は、がんもしくは新生物のリスクについてスクリーニングする必要があるヒト、高リスク群のヒト、がんもしくは新生物を有すると診断されたがさらなる層別化を必要とするヒト、がんもしくは新生物を有すると診断され、積極的な処置を受けているヒト、またはがんもしくは新生物を有し、寛解しているヒトであり得る。
【００９３】
本方法は、表１に列挙された任意の好適な数の標的のメチル化状態を評価することを含み得る。例えば、方法は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する単離されたポリヌクレオチド、またはその数値範囲もしくは部分範囲のメチル化状態を評価することを含むことができる。
【００９４】
標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、任意の好適な方法または試薬を使用して評価することができる。例えば、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、標的ポリヌクレオチドの各々とハイブリダイズするように構成されたプローブまたはプライマーを使用して評価することができる。一部の実施形態においては、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように構成された単一のプローブまたはプライマーを使用して評価することができる。他の実施形態においては、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように構成された複数のプローブまたはプライマーを使用して評価することができる。
【００９５】
一部の実施形態においては、本方法で使用される１つまたは複数のプライマーは、表１に列挙された配列番号１〜１７５０４のいずれかに記述されている配列、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなっていてもよい。表１に列挙された各標的について、本方法で使用される１つまたは複数のプライマーは、その標的に対応する１つまたは複数のプライマーを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなっていてもよい。例えば、表１に列挙された標的１について、本方法で使用される１つまたは複数のプライマーは、表１に列挙された配列番号１〜１０に記述されている配列のいずれか、例えば、配列番号１〜１０に記述されている配列（複数可）、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のプライマーを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなっていてもよい。同様に、表１に列挙された標的２について、本方法で使用される１つまたは複数のプライマーは、表１に列挙された配列番号１１〜２０に記述されている配列のいずれか、例えば、配列番号１１〜２０に記述されている配列（複数可）、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のプライマーを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなっていてもよい。表１に列挙された標的３〜１８４９のいずれかについて、本方法で使用される１つまたは複数のプライマーは、上で表１に列挙された標的１または２について示されたように、表１に列挙された対応する配列（複数可）のいずれか、その相補的もしくは実質的に相補的な配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなっていてもよい。
【００９６】
本方法は、メチル化状態が評価されるべき標的ポリヌクレオチドの各々を増幅するための共通のプライマーを使用することをさらに含むことができる。例示的な共通のプライマーは、配列番号１７５０５に記述されている配列ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ）、またはその相補的または実質的に相補的な配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなっていてもよい。
【００９７】
本方法は、他の任意の好適なステップをさらに含むことができる。一部の実施形態においては、本方法は、２０１７年４月１９日出願の米国仮出願第６２／４８７，４２２号および２０１７年４月１９日出願の米国仮出願第６２／４８７，４２３号に開示および／または特許請求されている任意の他の好適なステップをさらに含むことができる。例えば、２０１７年４月１９日出願の米国仮出願第６２／４８７，４２３号に開示されかつ／または特許請求された、一本鎖ポリヌクレオチドを構築するための技術およびステップ、一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーを二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーへ変換するための技術およびステップ、二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーを半標的化増幅するための技術およびステップ、および配列ライブラリーの構築およびシークエンシングリードの解析を行うための技術およびステップを使用して、解析される標的ポリヌクレオチドを取得および／または調製することができる。
【００９８】
例えば、本発明の方法は、試料から標的ポリヌクレオチドを単離することをさらに含むことができる。
【００９９】
別の例においては、本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドのライブラリーを調製することをさらに含むことができる。標的のライブラリーを調製するための任意の好適な試薬を使用することができる。一部の実施形態においては、標的のライブラリーを調製するための試薬は、酵素、例えば、リガーゼまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを含むことができる。任意の好適なｓｓＤＮＡリガーゼとしては、例えば、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１を挙げることができる。
【０１００】
さらに別の例においては、本発明の方法は、標的ポリヌクレオチドを増幅することをさらに含むことができる。標的または標的のライブラリーを増幅するための任意の好適な試薬を使用することができる。一部の実施形態においては、標的または標的のライブラリーを増幅するための試薬は、酵素、例えば、ポリヌクレオチド増幅反応で使用される酵素を含むことができる。例示的なポリヌクレオチド増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、プライマー伸長、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、およびループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）が挙げられる。
【０１０１】
さらに別の例においては、本方法は、標的ポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドのライブラリー、増幅された標的ポリヌクレオチド、または増幅された標的ポリヌクレオチドのライブラリーを精製することをさらに含むことができる。
【０１０２】
標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、任意の好適な方法および／または試薬を使用して評価することができる。一部の実施形態においては、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、質量分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性シークエンシング、例えば、バイサルファイトシークエンシング、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ小断片濃縮アッセイ（ＨＥＬＰアッセイ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲアッセイ（ＧＬＡＤ−ＰＣＲアッセイ）、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（ＲＬＧＳ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰまたはｍＤＩＰ）、パイロシークエンシング、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ活性の分子切断光アッセイ、メチル感受性サザンブロッティング、または高解像度融解曲線（ＨＲＭ）分析を使用して評価することができる。
【０１０３】
他の実施形態においては、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、化学薬品、例えば、亜硫酸水素塩または亜硫酸水素ナトリウムを使用して評価することができる。さらに他の実施形態においては、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、生物学的薬品、例えば、ポリペプチドまたは酵素を使用して評価することができる。
【０１０４】
任意の好適な酵素を使用することができる。一部の実施形態においては、酵素は、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）であり得る。ＭＳＲＥは、残基がメチル化されていない場合、その残基で選択的に切断することができる。ＭＳＲＥはまた、その残基がメチル化されている場合も、その残基で選択的に切断することができる。例示的なＭＳＲＥは、ＨｐａＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ（登録商標）、ＳｃｒＦＩ、ＢｂｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＭｂｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｈａＩ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。
【０１０５】
一部の実施形態においては、酵素は、ポリヌクレオチドポリメラーゼであり得る。ポリヌクレオチドポリメラーゼは、ポリヌクレオチド増幅反応、例えば、ＰＣＲで使用することができる。任意の好適なポリヌクレオチドポリメラーゼを使用することができる。例えば、ポリヌクレオチドポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【０１０６】
一部の実施形態においては、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、メチル化感受性シークエンシング、例えば、バイサルファイトシークエンシングを使用して評価することができる。亜硫酸水素塩変換は、亜硫酸水素塩を使用してＤＮＡのメチル化パターンを決定する方法である。ＤＮＡメチル化は、シトシンまたはアデニンＤＮＡヌクレオチドへのメチル基の付加を伴う生化学的プロセスである。細胞が分裂して、胚性幹細胞から特定の組織に分化する場合に、ＤＮＡメチル化により、細胞における遺伝子発現が安定に変更される。亜硫酸水素塩変換においては、最初に、非メチル化シトシンをウラシルに特異的に変換するが、メチル化シトシンには影響を有しない亜硫酸水素塩試薬で、標的核酸を処理する。亜硫酸水素塩変換の１つの結果は、配列相補性の喪失のために、元の標的の二本鎖コンフォメーションが破壊されることである。標的配列は、試料調製および解析または診断試験中に２つの別々の一本鎖ＤＮＡとして存在する。また、標的核酸配列は多くの場合、非常に低い濃度で存在する。このことは、循環腫瘍ＤＮＡ（「無細胞腫瘍ＤＮＡ」または「ｃｔＤＮＡ」とも呼ばれる）については、多くの場合、循環中のその低い濃度および非常に低いバリアントのアレル割合のためにとりわけ重要な考慮事項である。
【０１０７】
メチル化感受性シークエンシングの任意の適切なフォーマットを使用することができる。例えば、メチル化感受性シークエンシングは、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシークエンシング、チェーンターミネーション法、ショットガンシークエンシング、ブリッジＰＣＲ、単一分子リアルタイムシークエンシング、イオン半導体（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  シークエンシング）、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング（ＳＯＬｉＤシークエンシング）、チェーンターミネーション（サンガーシークエンシング）、大規模並列処理特徴シークエンシング（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）、ポロニーシークエンシング、４５４パイロシークエンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、ＤＮＡナノボールシークエンシング、heliscope単一分子シークエンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング、ナノポアＤＮＡシークエンシング、トンネル電流ＤＮＡシークエンシング（ｔｕｎｎｅｌｌｉｎｇ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、質量分析によるシークエンシング、マイクロ流体サンガーシークエンシング、顕微鏡検査に基づく技術、ＲＮＡＰシークエンシング、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスハイスループットシークエンシングからなる群より選択されるフォーマットにより行うことができる。
【０１０８】
一部の実施形態においては、本方法は、メチル化感受性シークエンシング、例えば、バイサルファイトシークエンシングの前に、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得ることをさらに含むことができ、この直鎖状一本鎖ライゲーション生成物の各々は、アダプターがライゲーションされる直鎖状一本鎖標的ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含むアダプターに連結された一本鎖標的ポリヌクレオチドから構成されている。標的ポリヌクレオチドからのシークエンシングリードを、最初にアダプタートリミングして、ライブラリー構築プロセスに由来するアダプター配列を除去して、トリミングされたシークエンシングリードを得ることができる。トリミングされたシークエンシングリードは、アラインメントプログラムを使用し、参照ゲノム、例えば、ヒト参照ゲノムにマッピングして、アラインメントされたリードファイルを得ることができる。アラインメントされたリードファイルは、メチル化状態の評価に使用することができる、表１に列挙された標的１〜標的１８４９の各標的領域、またはその相補的または実質的に相補的な配列に対応するセットに、グループ化することができる。
【０１０９】
標的ポリヌクレオチドのうちの１つの、複数の、または各々のメチル化状態を評価することができる。一部の実施形態においては、標的ポリヌクレオチドの各々のメチル化状態を評価して、例えば、平均メチル化頻度、メチル化ハプロタイプ負荷、非メチル化ハプロタイプ負荷、読み取り不一致率、またはそれらの組み合わせの形態で、メチル化メトリックを得ることができる。
【０１１０】
試料のメチル化状態は、標的ポリヌクレオチドの各々からのメチル化メトリックを使用して評価することができる。メチル化メトリックは、任意の好適な方法で解析または使用することができる。例えば、標的ポリヌクレオチドの各々のメチル化メトリックを閾値または参照値と比較して、試料のメチル化状態を評価することができる。
【０１１１】
別の例においては、数値メチル化マトリックス（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）を、標的ポリヌクレオチドの各々からのメチル化メトリックを使用して計算して、試料のメチル化状態を評価することができる。数値メチル化マトリックスは、任意の好適なフォーマットで存在することができる。一部の実施形態においては、試料からの数値メチル化マトリックスは、単一の数または数値を含むことができる。他の実施形態においては、試料からの数値メチル化マトリックスは、複数の数または数値を含むことができる。数値メチル化マトリックスは、任意の好適な式またはアルゴリズムを使用して、取得または計算することができる。一部の実施形態においては、数値メチル化マトリックスは、分類アルゴリズム、例えば、線形判別分析、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類、パーセプトロン分類、二次分類、ｋ最近傍法、ブースティング、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、学習ベクトル量子化、もしくはサポートベクターマシン、またはそれらの組み合わせを使用して計算することができる。
【０１１２】
メチル化マトリックスは、試料のメチル化状態の評価において、任意の好適な方法で使用することができる。例えば、メチル化マトリックスを閾値または参照値と比較して、試料のメチル化状態を評価することができる。
【０１１３】
複数の試料からの、例えば、複数の被験体由来の複数の試料からの少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、順次にまたは同時に評価することができる。一部の実施形態においては、複数の試料からの、例えば、複数の被験体由来の複数の試料からの少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、順次に評価することができる。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する単離されたポリヌクレオチド、またはその数値範囲もしくは部分範囲のメチル化状態を、順次に評価することができる。他の実施形態においては、複数の試料からの、例えば、複数の被験体由来の複数の試料からの少なくとも２つの標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、同時に評価することができる。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００個の、もしくはそれより多くの単離されたポリヌクレオチド、または表１に列挙された標的１〜標的１８４９のすべてに対応する単離されたポリヌクレオチド、またはその数値範囲もしくは部分範囲のメチル化状態を、同時に評価することができる。
【０１１４】
一部の実施形態においては、標的ポリヌクレオチドの各々のメチル化メトリックは、コンピュータを使用して得られる。他の実施形態においては、試料のメチル化マトリックスは、標的ポリヌクレオチドの各々からのメチル化メトリックに基づいて、コンピュータを使用して得られる。
【０１１５】
本発明の方法は、任意の好適な目的のために使用することができる。例えば、本方法は、被験体におけるがんもしくは新生物の診断、予後、層別化、リスク評価、または処置モニタリングのために使用することができる。
【０１１６】
本発明の方法は、被験体におけるがんまたは新生物の任意の好適なタイプを評価するために使用することができる。例えば、本発明の方法は、被験体におけるリンパ腫、白血病、脳がん、多発性骨髄腫、膵臓がん、肝臓がん、胃がん、乳がん、腎臓がん、肺がん、結腸直腸がん、結腸がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、食道がん、または頭頸部がんを評価するために使用することができる。
【０１１７】
一部の実施形態においては、本方法は、被験体における肺がんの診断、予後、層別化、リスク評価、または処置モニタリングのために使用することができる。肺がんは、非小細胞肺癌または小細胞肺癌でありうる。例示的な非小細胞肺癌は、肺の腺癌（肺腺癌としても公知である）、肺の扁平上皮癌（ＳＣＣ）、または大細胞癌（ＬＣＣ）であり得る。
【０１１８】
他の実施形態においては、本方法は、被験体における結腸直腸がんの診断、予後、層別化、リスク評価、または処置モニタリングのために使用することができる。さらに他の実施形態においては、本方法は、被験体におけるがん種横断的解析もしくはプロファイリングを診断、予後、層別化、リスク評価、または処置モニタリングのために使用することができる。
【０１１９】
複数の被験体におけるがんまたは新生物は、順次にまたは同時に評価することができる。一部の実施形態においては、複数の被験体におけるがんまたは新生物を、順次に評価することができる。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、またはそれより多くの被験体におけるがんまたは新生物を、順次に評価することができる。他の実施形態においては、複数の被験体におけるがんまたは新生物を、同時に評価することができる。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、またはそれより多くの被験体におけるがんまたは新生物を、同時に評価することができる。
【０１２０】
本試験は、任意の好適な感度を有することができる。例えば、本試験は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または１００％の感度を有することができる。
【０１２１】
本試験は、任意の好適な特異性を有することができる。例えば、本試験は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または１００％の特異性を有することができる。
【０１２２】
本方法は、被験体におけるがんまたは新生物の評価に基づいて、被験体を処置すること、または被験体の処置を変更することをさらに含むことができる。例えば、本方法は、ヒト患者におけるがんまたは新生物の評価に基づいて、ヒト患者を処置すること、またはヒト患者の処置を変更することをさらに含むことができる。例示的な処置は、化学療法、放射線療法、免疫療法、細胞療法、外科手術、薬物、例えば、小分子薬物または抗体薬物などの高分子薬物による処置であり得る。
【０１２３】
本方法は、被験体におけるがんまたは新生物の評価に基づいて、被験体がさらなる検査、例えば、ゴールドスタンダードの診断または予後検査（複数可）を受けることをさらに含むことができる。例えば、本方法は、ヒト患者におけるがんまたは新生物の評価に基づいて、ヒト患者がさらなる検査、例えば、ゴールドスタンダードの診断または予後検査（複数可）を受けることをさらに含むことができる。例示的な検査は、任意の好適なタイプの検査、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ検査、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、それらの複合体または組み合わせなどの分子に関する検査、免疫検査、分子検査、細胞検査、組織検査、臓器検査、または全身検査などであり得る。
【０１２４】
Ｅ．例示的なデータ解析方法
前処理
一部の実施形態においては、シークエンシングリードは、トリミングプログラム、例として、Ｃｕｔａｄａｐｔ（http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200/479）またはＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24695404）を使用して、最初にアダプタートリミングされる（シークエンシングライブラリー構築プロセスに由来する任意の合成アダプター配列を除去するために）。次に、トリミングされたリードを、アラインメントプログラム、例として、Ｂｏｗｔｉｅ（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）、Ｂｏｗｔｉｅ２（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）、またはＢＷＡ（http://bio-bwa.sourceforge.net）を使用して、ヒト参照ゲノムにマッピングする。結果として得られるアラインメントされたリードファイルを、適切なツール、例えばＳａｍｔｏｏｌｓ（https://github.com/samtools/samtools）を使用してソートおよびインデックス付けする。次に、リードを、メチル化メトリックの計算に使用することができる各標的領域に対応するセットにグループ化する。
【０１２５】
メチル化メトリックの計算
一部の実施形態においては、各標的について、その個々の領域のメチル化状態を表す「メチル化メトリック」を、アラインメントされたリードを使用して計算する。使用することができる４つのメトリックは、平均メチル化頻度（ＡＭＦ）、メチル化ハプロタイプ負荷（ＭＨＬ）、非メチル化ハプロタイプ負荷（ＵＭＨＬ）、および読み取り不一致率（ＰＤＲ）である。
【０１２６】
平均メチル化頻度は、標的領域内のＣｐＧ部位で観察されたシトシン塩基の数を合計し、標的領域内のＣｐＧ部位で観察されたシトシンおよびチミン塩基の数で割ることによって計算する。
【数１】
2021520809.tif 000003
（式中、Ｎは標的領域内のリードの数であり、ｉは標的領域内のｉ番目のリードであり、Ｃｉはｉ番目のリードで観察されたシトシンの数、Ｔｉはｉ番目のリードで観察されたチミンの数である）。
【０１２７】
メチル化ハプロタイプ負荷は、標的領域内の隣接するＣｐＧ部位のすべての可能な部分文字列を取り、各部分文字列内で完全なメチル化を示すリードの割合の加重和を算出することによって計算する。
【数２】
2021520809.tif 000004
（式中、ｎは標的領域内のＣｐＧ部位の数であり、Ｌｉは現在の部分文字列の長さであり、Ｃｉは長さＬｉの部分文字列内のＣｐＧ部位のすべてのシトシンを含むリードの数であり、Ｎｉは長さＬｉの部分文字列を含むリードの数である）。
【０１２８】
非メチル化ハプロタイプ負荷は、標的領域内の隣接するＣｐＧ部位のすべての可能な部分文字列を取り、各部分文字列内でメチル化を示さないリードの割合の加重和を算出することによって計算する。
【数３】
2021520809.tif 000005
（式中、ｎは標的領域内のＣｐＧ部位の数であり、Ｌｉは現在の部分文字列の長さであり、Ｔｉは長さＬｉの部分文字列内のＣｐＧ部位のすべてのチミンを含むリードの数であり、Ｎｉは長さＬｉの部分文字列を含むリードの数である）。
【０１２９】
読み取り不一致率は、標的領域内のＣｐＧ部位におけるすべてのシトシンまたはすべてのチミンを示す、各領域内のリードのパーセントを１００から引いて計算する。
【数４】
2021520809.tif 000006
（式中、Ｎｉは標的領域内のリードの数であり、ＣｉはすべてのカバーされたＣｐＧ部位のシトシンを含むリードの数であり、ＴｉはすべてのカバーされたＣｐＧ部位のチミンを含むリードの数である。）。
【０１３０】
分類
一部の実施形態においては、各標的領域のメチル化メトリックを使用して、数値マトリックスを計算する（各標的領域に１つの行、各試料に１つの列で、値はその領域および試料のメチル化メトリックを表す）。次に、分類アルゴリズム、例として、線形判別分析、ロジスティック回帰、単純ベイズ分類、パーセプトロン分類、二次分類、ｋ最近傍法、ブースティング、決定木、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、学習ベクトル量子化、サポートベクターマシン、またはそれらの組み合わせを使用して、試料を分類する。
【０１３１】
ロジスティック回帰、ｋ最近傍法、ランダムフォレスト、またはサポートベクターマシン。
【０１３２】
ロジスティック回帰分類は、既知の試料のセットを使用して、試料ががん性である確率の方程式をメチル化メトリック値の加重和にカーブフィッティングさせることを含む。既知のカテゴリーの試料からのデータの最小二乗回帰を使用して、以下の方程式のパラメータを推定する：
【数５】
2021520809.tif 000007
（式中、ｎは標的領域のセットであり、ｉは現在の標的領域であり、Ｍｉはｉ番目の標的領域のメチル化メトリック値であり、βｉはｉ番目の標的領域の最小二乗パラメータであり、ｐは、試料ががん試料である確率である）。この方程式のパラメータが既知の試料を使用して得られると、メチル化メトリック値の加重和を計算し、得られた方程式を使用して確率を計算し、閾値と比較することにより、未知の試料をがんまたは健康として分類することができる。
【０１３３】
ｋ最近傍法アルゴリズムは、未知の試料と、既知のカテゴリーのそのｋ個の最近傍との間のメチル化メトリック値の距離を使用して、未知の試料を分類する。最初に、現在の試料のメチル化メトリック値と他のすべての試料のメチル化メトリック値との間の距離（この場合はユークリッド距離）を計算する。
【数６】
2021520809.tif 000008
（式中、Ｎは、既知の試料のセットであり、ｉは、現在の既知の試料であり、ｎは、標的領域のセットであり、ｊは、現在の標的領域であり、Ｍｊは、ｊ番目の標的領域の未知の試料のメチル化メトリック値であり、ｍｉｊは、ｊ番目の標的領域にあるｉ番目の既知の試料のメチル化メトリック値であり、Ｅｉは、現在の試料とｉ番目の既知の試料との間のユークリッド距離である）。ユークリッド距離が最小のｋ個の既知の試料のカテゴリーを使用して、未知の試料のカテゴリーを決定する。発生率が最も高いカテゴリーを、未知の試料に割り当てる。
【０１３４】
ｋ最近傍法では、未知の試料を、それが最も類似しているｋ個の既知の試料を特定することによって、正常またはがんのいずれかに分類する（ここで、ｋは、本発明者らが選択した任意の数である）。未知の試料が、既知の正常試料に、より類似している場合、それを正常として分類し、未知の試料が、がん試料に、より類似している場合、それをがんとして分類する。以下は、ｋ最近傍法分析がどのように行われるかを示す仮定的な例である。
【０１３５】
２つの標的領域を観察していて、アッセイにＭＨＬメチル化メトリックを使用し、ｋ＝３でｋ最近傍法アプローチを使用したいと仮定する。まず、健康であることがわかっているいくつかの試料およびがんであることがわかっているいくつかの試料を解析して、各試料における各標的のＭＨＬ値を計算する。各タイプの４つの既知の試料を解析して、以下の表２に示すマトリックスを得たと仮定する。
【表２】
2021520809.tif 000009
次に、未知の試料を加工することができる。未知の試料を解析し、以下の表３に示す値を得たと仮定する。
【表３】
2021520809.tif 000010
観察した値に基づいて、以下の表４に示す未知の試料に最も類似しているｋ＝３個の試料を特定する。
【表４−１】
2021520809.tif 000011
【表４−２】
2021520809.tif 000012
これらの３つの最近傍の大部分は「がん」であるため、「未知」の試料を「がん」として分類する。
【０１３６】
ランダムランダムフォレスト分類は、ランダムに選択された既知のカテゴリーの試料のサブセットおよび標的領域のサブセットを使用して、複数の決定木を作成することを伴い；次に、未知の試料のメチル化メトリック値を、個々の決定木に供し、多数決を分類に使用する。例えば、既知のデータを使用して、次の３つの決定木を構築してもよい：
【数７】
2021520809.tif 000013
ＭＨＬ値（ＭＨＬ１：０．６、ＭＨＬ２：０．２、ＭＨＬ３：０．６）を含む未知の試料は、がんに２票を、健康に１票を有するので、がんとして分類される。
【０１３７】
サポートベクターマシンは、異なるカテゴリーの既知の試料間に超平面を構築し、これにより、各既知の試料と超平面との間の距離を最大化する。次に、この平面を、未知の試料を分類するための「仕切り」として使用し、平面の異なる側に含まれる試料を異なるカテゴリーとする。２つの標的領域を使用した例を説明するために、既知の試料のメチル化メトリック値を空間にプロットし、異なる群間に超平面を描き（図１を参照されたい）、図１では、Ｘ１は第１の標的領域のメチル化メトリック値であり、Ｘ２は第２の標的領域のメチル化メトリック値であり、既知のがん試料は黒で描かれ、既知の健康な試料は白で描かれ、黒い直線は超平面を表す。未知の試料（オレンジで示す）を分類するために、メチル化メトリック値を超平面と比較し；試料が健康な既知の試料と同じ側に含まれる場合（ここでのように）、試料を健康として分類する。図１の画像は、例示のみを目的としてウィキペディア（https://en.wikipedia.org/wiki/Support_vector_machine）から取得したものであり、ＤＮＡメチル化状態の解析を表すものでもがんの評価を表すものでもない。
【０１３８】
Ｆ．ライブラリー構築およびポリヌクレオチドシークエンシングによる例示的なポリヌクレオチド断片解析
一態様においては、本方法の標的（または鋳型）ポリヌクレオチドは、例えば、約１００残基〜約１０００残基の範囲、一部の実施形態においては、約１５０残基〜約４００残基の範囲の、断片化ポリヌクレオチドである。
【０１３９】
標的または鋳型ＤＮＡとして、標準のゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ（例として、ミトコンドリアＤＮＡ）またはそれらの断片が挙げられ得る。他の実施形態においては、標的または鋳型ＤＮＡは、加工されたＤＮＡ、例えば、酵素消化、架橋結合、化学的もしくは物理的剪断、亜硫酸水素塩変換および／または分解を受けたＤＮＡである。
【０１４０】
亜硫酸水素塩変換は、亜硫酸水素塩を使用して、ＤＮＡのメチル化パターンを決定する方法である。ＤＮＡメチル化は、メチル基の、シトシンまたはアデニンＤＮＡヌクレオチドへの付加に関する生化学プロセスである。細胞が分裂して、胚性幹細胞から特定の組織に分化する際に、ＤＮＡメチル化により、細胞における遺伝子発現が安定に変更される。亜硫酸水素塩変換においては、最初に、非メチル化シトシンをウラシルに特異的に変換するが、メチル化シトシンには影響を有しない亜硫酸水素塩試薬で、標的核酸を処理する。亜硫酸水素塩変換の１つの結果は、配列相補性の喪失のために、元の標的の二本鎖コンフォメーションが破壊されることである。標的配列は、試料調製および解析または診断試験中に２つの別々の一本鎖ＤＮＡとして存在する。また、標的核酸配列は多くの場合、非常に低い濃度で存在する。このことは、循環腫瘍ＤＮＡ（「無細胞腫瘍ＤＮＡ」または「ｃｔＤＮＡ」とも呼ばれる）については、多くの場合、循環中のその低い濃度および非常に低い対立遺伝子率のためにとりわけ重要な考慮事項である。
【０１４１】
一部の実施形態においては、本明細書で開示する目的の核酸分子は、無細胞ＤＮＡ、例として、無細胞胎児ＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」とも呼ばれる）またはｃｔＤＮＡである。ｃｆＤＮＡは、妊娠中の女性の体内で、例として、血中で循環し、胎児ゲノムを表し、一方、ｃｔＤＮＡは、がん患者の体内で、例として、血中で循環し、一般的に事前に断片化されている。他の実施形態においては、本明細書で開示する目的の核酸分子は、例えば、有害な条件下での保存のための、古いかつ／もしくは損傷を受けたＤＮＡ、例として、ホルマリン固定試料、または部分的に消化された試料中のＤＮＡである。
【０１４２】
がん細胞が死滅すると、それらはＤＮＡを血流へと放出する。このＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）として公知であり、非常に断片化されており、平均の長さは約１５０塩基対である。白血球を除去すると、ｃｔＤＮＡは一般的に、残りの血漿ＤＮＡのわずかな割合を構成し、例えば、ｃｔＤＮＡは、血漿ＤＮＡの約１０％未満を構成し得る。一般的に、この割合は、約１％未満、例えば、約０．５％未満または約０．０１％未満である。加えて、血漿ＤＮＡの全量は一般的に非常に低く、例えば、血漿１ｍＬ当たり約１０ｎｇである。
【０１４３】
ｃｔＤＮＡ中のバリアントは、次世代シークエンシングを含む、様々な方法を使用して調べることができる。ｃｔＤＮＡの血漿ＤＮＡに対する低い比率のために、ＰＣＲおよびシークエンシングエラーのため高信頼度でバリアントをコールすることは困難である。ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）は一般的に、確認された任意のバリアントをコンセンサス配列と比較することができるように、元の分子にタグ付けするために使用される。これは、偽陽性から真の陽性を分けるのに有効な方法である。バリアントがコンセンサスとマッチする場合、それは真の陽性である。そうでなければ、それは解析から除去される。さらに、感度を高く維持するために、高い割合の元の分子がシークエンシングライブラリーに変えられること、すなわち、バリアントが脱落のために失われないことが重要である。したがって、ライブラリー構築中のライゲーション効率は、非常に重要である。
【０１４４】
一態様においては、ライゲーション効率を大いに改善し、依然として選択されたゲノム領域を標的化する技術が、本明細書で提供される。一実施形態においては、シークエンシングによって検出されるポリヌクレオチド、例として、ｃｔＤＮＡは最初に、ｃｔＤＮＡのそれ自体へのライゲーションを防止するために、脱リン酸化して５’ホスフェートを除去する。その後、すべてのＤＮＡが一本鎖になるように、ｃｔＤＮＡを変性させる。一本鎖ＤＮＡリガーゼであるＣｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）を使用して、アダプターをｃｔＤＮＡの３’末端にライゲーションする。一態様においては、アダプターは、ライゲーション効率を最適化するための５’末端上の２つの特異的塩基、およびそれに続くＵＭＩを含有する。一態様においては、アダプターの３’末端は、アダプターの自己ライゲーションを防止するために炭素スペーサーを含有する。別の態様においては、ライゲーション反応は、密集剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例として、ＰＥＧ４０００を使用してさらに最適化される。一態様においては、ライゲーション後、アダプターに逆相補的なプライマーを使用して分子を二本鎖にする。このことにより、標準の精製による、使用可能なＤＮＡの除去を伴わない、過剰のライゲーションしていないアダプターの効率的な除去が可能になる。
【０１４５】
一態様においては、その後、ＤＮＡは、半標的化ＰＣＲを使用して増幅される。一方のプライマーは、アダプターに逆相補的であり、一方で、もう一方（例えば、プライマープール中の１つのプライマーとして）は、特異的な標的化ゲノム領域にアニールする。特異的プライマーは、プライマー−ダイマー相互作用およびオフターゲットアニーリングを最小限にするように設計された。一態様においては、標的特異的プライマーは、小さいＤＮＡサイズのために特定のバリアントに近接して配置するようにさらに最適化される。別のクリーンアップ後、ＰＣＲにより、全長シークエンシングアダプターおよびバーコードを付加する。その後、最終的なライブラリーを、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機でシークエンシングする。
【０１４６】
一態様においては、半標的化ＰＣＲは、約３０，０００ｂｐの比較的小さい標的領域を有するにもかかわらず、元の分子組の約４０，０００倍を超える濃縮をもたらす。一態様においては、標準のライブラリー構築およびハイブリダイゼーション捕捉と比較すると、本方法の全変換率は、少なくとも６０％であり、元の分子の少なくとも約３倍多い分子がシークエンシング可能な材料に変換されることを示唆する。他の実施形態においては、全変換率は、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％または９０％を超える。一態様においては、本方法はしたがって、例えば、０．０１％もの低さの、極めて低い変異対立遺伝子率での遺伝子バリアントまたはゲノムバリアント、例として、ＳＮＶ、インデル、ＣＮＶおよび融合を正確にコールすることができる。他の態様においては、遺伝子バリアントまたはゲノムバリアントの対立遺伝子率は、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％または約２％である。
【０１４７】
以下の節は、本方法のある特定のステップをより詳細に説明する。
【０１４８】
一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーおよびそれを構築する方法
例えば、ｃｔＤＮＡについての、次世代シークエンシングのためのライブラリー構築は一般的に、末端修復、Ａ−テーリングおよびアダプター分子の二本鎖ライゲーションを含む、いくつかのステップからなる。その後、これらのライゲーションされた分子を、ハイブリダイゼーション捕捉を使用してある特定のゲノム領域について１０００〜２０００倍に濃縮し得る。ここ数年にわたるライブラリー構築におけるいくつかの改善にもかかわらず、プロセスは非効率的なままであり、そのため多くの元の分子が様々なステップ中に失われる。二本鎖ライゲーション効率は低いままであり、適切にライゲーションされるのは分子の約２０〜３０％である。加えて、多くの分子は、精製およびハイブリダイゼーション捕捉ステップ中に失われ、そのため、最終的な変換率は、およそ１０〜２０％である。ｃｔＤＮＡにおいて見られる低対立遺伝子率バリアントを調べる場合、感度は低いままである。低対立遺伝子率のライブラリーを検査する場合、低効率が感度の喪失をもたらすので、このことは、低対立遺伝子率変異体をコールする場合、精度を制限することとなる。
【０１４９】
加えて、ある特定のポリヌクレオチド、例として、ｃｔＤＮＡは、小さいサイズのために、タグ付断片化法（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）ベースのライブラリー構築の使用が妨げられる。例えば、最初に、ポリヌクレオチドに（例えば、ビオチンで）タグ付けして標的化ライブラリーを産生し、その後、（例えば、ストレプトアビジンによって）タグを捕捉することによって濃縮する。このようにして、目的の領域についてのライブラリーを、約１０００〜２０００倍に濃縮することができる。最後に、ＰＣＲを行って、シークエンシングのために分子を増幅およびインデックス付けする。しかしながら、ＰＣＲベースの方法は、元の分子にＵＭＩを付加することが困難であることが明らかになっており、高エラー率をもたらす。
【０１５０】
一態様においては、本明細書で説明する組成物、キットおよび方法は、上記の問題に取り組んだ。一部の実施形態においては、組成物、キットおよび方法は、様々なライブラリーの構築、様々な増幅反応（例として、ＰＣＲおよび／またはプライマー伸長による）、構築したライブラリーの精製およびシークエンシングリードの解析を含むが、これらに限定されない、核酸分子のシークエンシングにおいて有用である。
【０１５１】
ある特定の態様においては、シークエンシングライブラリーは、例えば、断片化ポリヌクレオチド、例として、断片ＤＮＡを含有する試料から調製することができる。一態様においては、試料、例えば、直接、患者からの、天然に存在する試料、例として、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、汗、精液、痰、涙、粘液または羊水を含むが、これらに限定されない組織液または体液を得る。他の態様においては、シークエンシングライブラリーは、（例えば、ＤＮＡを剪断することによって）ＤＮＡの断片を形成し、ＤＮＡ断片に本明細書中のアダプターを結合することによって調製することができる。特定の実施形態においては、断片化ポリヌクレオチドおよびアダプターは、一本鎖である。
【０１５２】
断片（例えば、ｃｔＤＮＡ、またはより長いＤＮＡ鎖を断片化することによって形成される断片）は、アダプター、例として、本明細書で開示する一本鎖アダプターに隣接して「挿入」またはライゲーションされ得るので、「インサート」と呼ばれることがある。また、例えば、ＲＮＡ分子を逆転写してＤＮＡ分子を形成し、それをアダプターに結合することによって、ＲＮＡ分子をシークエンシングすることができる。
【０１５３】
一態様においては、１組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法が提供され、この方法においては、ライゲーションが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼによって触媒される。本明細書で使用されるとき、ｓｓＤＮＡリガーゼは、相補配列の非存在下でｓｓＤＮＡの末端をライゲーションすることができる。例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼおよびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ  ｓｓＤＮＡリガーゼは両方とも、典型的に５’−ホスフェートおよび３’−ヒドロキシル基を有するｓｓＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーション（すなわち、環状化）を触媒するために使用される熱安定性リガーゼである。相補ＤＮＡ配列上で互いに隣接してアニールするＤＮＡ末端をライゲーションするＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）ＤＮＡリガーゼとは対照的に、ｓｓＤＮＡリガーゼは、相補配列の非存在下でｓｓＤＮＡの末端をライゲーションする。それゆえ、この酵素は、直鎖状ｓｓＤＮＡから環状ｓｓＤＮＡ分子を作製するのに有用である。環状ｓｓＤＮＡ分子は、ローリングサークル型複製またはローリングサークル型転写のための基質として使用することができる。ｓｓＤＮＡに対するその活性に加えて、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ酵素は、３’−ヒドロキシルリボヌクレオチドおよび５’−リン酸化リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを有する一本鎖核酸をライゲーションすることにおいても活性を有する。
【０１５４】
ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ  ｓｓＤＮＡリガーゼのいずれかを本開示で使用することができる。２つの酵素は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩがＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩよりアデニル化がかなり少なく、最大活性のためにはＡＴＰを必要とする点で異なる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  Ｉは、ＡＴＰの存在下でｓｓＤＮＡを再環状化する。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩは、ほぼ１００％アデニル化されており、したがって、反応緩衝液にＡＴＰを添加する必要はない。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩは、化学量論反応として作用し、酵素は、オリゴの５’末端に結合し、オリゴを酵素活性部位においてアデニル化し、次に、オリゴをライゲーションし、停止する。反応はＡＴＰを含有しないので、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩは、１：１の酵素：オリゴ構成で作用する。環状化が完了すると、環状ｓｓＤＮＡは、活性部位から放出され、反応は停止する。
【０１５５】
一態様においては、各一本鎖ポリヌクレオチドは、５’末端でのライゲーションを防止するために５’末端でブロックされており、各アダプターは、そのアダプターがライゲーションされる一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含み、各アダプターは、３’末端でのライゲーションを防止するために３’末端でブロックされており、アダプターの５’末端は、ｓｓＤＮＡリガーゼによって一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る。一本鎖ＤＮＡの鋳型非依存的環状化は、その開示を、それらを全体として本明細書に組み込む、ＷＯ２０１０／０９４０４０  Ａ１において説明されている。しかしながら、ＷＯ２０１０／０９４０４０  Ａ１は、一本鎖ポリヌクレオチドの分子内ライゲーション（例えば、環状化）のみを開示している。
【０１５６】
したがって、本方法は、ｓｓＤＮＡリガーゼ、例として、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩを、非従来型様式で使用する。環状化の代わりに、本ライゲーション法は、一本鎖標的ポリヌクレオチドとアダプター分子との直鎖状ライゲーション生成物を産生することを目的とする。一態様においては、本開示は、例えば、アダプターを一本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションするために、分子内ライゲーションを行うためのｓｓＤＮＡリガーゼを使用する。一態様においては、それを行うために、一本鎖ポリヌクレオチドは、環状化を防止するために５’末端でブロックされている。このようにして、ｓｓＤＮＡの３’末端の、それ自体の５’末端への分子内ライゲーション、および１つのｓｓＤＮＡの３’末端の、同じライブラリー内の別のｓｓＤＮＡの５’末端への分子間ライゲーションを防止する。したがって、一態様においては、ライゲーション反応中の一本鎖ポリヌクレオチドの環状化および（一本鎖ポリヌクレオチドおよび／またはアダプターを含有する）直鎖状コンカテマーの形成の両方が防止される。図６で示す通り、各一本鎖ポリヌクレオチドのブロックは、５’末端でのライゲーションを防止するために、その５’末端での脱リン酸化を含み得る。
【０１５７】
別の態様においては、各アダプターは、３’末端でのライゲーションを防止するために３’末端でブロックされている。このようにして、アダプターの３’末端の、それ自体の５’末端への分子内ライゲーション、および１つのアダプター分子の３’末端の、別のアダプター分子の５’末端への分子間ライゲーションを防止する。各アダプターのブロックは、その３’末端でのライゲーションを防止するために、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）および／またはヘキサエチレングリコールを含み得る。したがって、一態様においては、ライゲーション反応中の一本鎖アダプターの環状化および（一本鎖ポリヌクレオチドおよび／またはアダプターを含有する）直鎖状コンカテマーの形成の両方が防止される。
【０１５８】
アダプターは、任意の好適な組み合わせの、１つまたは複数のスペーサーの１つまたは複数のコピーを含み得る。例えば、ＧａｎｓａｕｇｅおよびＭｅｙｅｒは、Ｃ３スペーサーおよびビオチニル化ＴＥＧスペーサーの１０個のコピーを含むアダプターを開示した。その全体を参照により本明細書に援用する、ＧａｎｓａｕｇｅおよびＭｅｙｅｒ（２０１３年）、「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｃｉｅｎｔ  ｏｒ  ｄａｍａｇｅｄ  ＤＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、８巻（４号）：７３７〜４８頁。しかしながら、この参考文献は、ライゲーション直後に、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して、ライゲーションしたｓｓＤＮＡを捕捉することを必要とする。このステップは、ライブラリーにおけるｓｓＤＮＡ分子の顕著な喪失をもたらし得る。その後、この参考文献は、捕捉したｓｓＤＮＡをｄｓＤＮＡに変換し、一方で、ｓｓＤＮＡは、ビーズ上に捕捉されたまま残る。
【０１５９】
図６で示す通り、本開示は、ライゲーション直後に、ライゲーションしたｓｓＤＮＡを捕捉することを必要としない。代わりに、ライゲーションしたｓｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡに変換されるとき、ライゲーション反応体積中に残る。
【０１６０】
一態様においては、ライブラリー中のｓｓＤＮＡのライゲーション効率は高く、例えば、試料中の一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％が、アダプターにライゲーションする。特定の実施形態においては、ライゲーション効率は、約８０％である。この大いに改善されたライゲーション効率でも、特許請求される方法は、以下に説明する通り、選択されたゲノム領域を依然として標的化することができる。
【０１６１】
一態様においては、アダプターは、以下の構造：／５’ホス／Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカーを有し、「５’ホス」は５’ホスフェート基を表し、「Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ」はＵＭＩ配列に対する５’側の配列を表し、「Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ」はＵＭＩ配列に対する３’側の配列を表し、「ブロッカー」は、アダプターの３’末端がアダプターへのライゲーションを防止するためにブロックされていることを示す。ｉおよびｊは両方とも整数であり、ｉは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０を超えてもよく；ｊは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０または５０を超えてもよい。特定の実施形態においては、ｉは２であり得る。一部の実施形態においては、Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉの５’末端におけるジヌクレオチド配列Ｎ１Ｎ２は、ライゲーション効率を向上させるために、ＧＡ（５’〜３’）、ＧＧ（５’〜３’）、ＡＡ（５’〜３’）またはＡＧ（５’〜３’）であり得る。
【０１６２】
一態様においては、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ配列の一部またはすべては、ライゲーションした一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するためのプライマーとして使用される逆相補配列を設計するために、かつ／または選択された標的配列を増幅するための半標的化ＰＣＲのために（プライマー対のもう一方のプライマーは、標的特異的プライマーである）、後のステップにおいて使用される。一態様においては、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ配列は、ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１７５０６）または約１８〜２２個のヌクレオチド残基を含むその一部を含む。
【０１６３】
別の態様においては、「ブロッカー」は、５’〜３’方向で任意の好適な組み合わせおよび順序にて、１つまたは複数のブロッカー基の１つまたは複数のコピーにおいて、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）および／またはヘキサエチレングリコールを含む。
【０１６４】
一態様においては、ＵＭＩの使用は、標的配列のエラーのないシークエンシングリードの決定、選択および／または単離を促進し、シークエンシングリードは、高精度および高スループットで選択することができる。そのような確証された、エラーのないシークエンシングリードは、より大きな公知配列の分子の構築、多型および／または変異スクリーニング、大規模並列シークエンシングならびに方法における偏りを排除するための定量化法を含む、配列忠実度を必要とする任意の技術において有用である。
【０１６５】
一態様においては、ユニーク分子識別子は、一本鎖標的ポリヌクレオチドおよびアダプターを含むライゲーションした構築物と関連付けられ、ライゲーションした構築物をユニークに識別する。換言すれば、同じ配列を有する２つの一本鎖標的ポリヌクレオチドを、それらのＵＭＩ配列において互いに異なる２つの異なるアダプターにライゲーションしてもよく；得られるライゲーション生成物は異なり、（同じ配列を有する標的ポリヌクレオチドではなく）各ライゲーション生成物は、ＵＭＩによってユニークに識別される。別の態様においては、一本鎖ライゲーション生成物を二本鎖ポリヌクレオチドに変換し、増幅した場合、非常に高い忠実度のポリメラーゼが利用可能であるとしても、反復複製中に増幅エラーが導入され得る。その結果、低いエラー率でさえも、特に、大きなライブラリーの構築においては、顕著な影響を有し得る。大規模並列シークエンシングは、コストおよびスループットにおいて利点を有するが、リードの精度は、増幅および／または検出技術の限界によって構成され得る。
【０１６６】
ＵＭＩを使用することによって、本方法は、エラーのない増幅生成物および／またはシークエンシングリードを識別し、技術的エラーを有するものを解析から除外することができる。同じＵＭＩを有する増幅生成物および／またはシークエンシングリードは、関連する（同祖的な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｂｙ  ｄｅｓｃｅｎｔ））ものとして確認することができ、したがって、同じＵＭＩを有する分子間の配列の相違は、配列中の実際の相違（例えば、野生型配列とがん関連変異配列との間の配列の相違）ではなく技術的エラーとして識別することができる。換言すれば、各一本鎖ライゲーション生成物は、そのＵＭＩによってユニークに識別可能であるので、技術的エラーが導入されていない場合、（増幅および／またはシークエンシングによる）その子孫のすべては、同じ標的配列を有するはずである。しかしながら、エラー、例として、単一ヌクレオチド挿入が増幅および／またはシークエンシング中に標的配列に導入された場合、同祖的な（例えば、同じＵＭＩを共有する）一部の増幅生成物および／またはシークエンシングリードは、挿入を有し、一方で、その他は有しない。挿入を有する生成物と挿入を有しない生成物との正確な比は、エラーが増幅および／またはシークエンシングプロセス中のいつ起こったかに依存して変動する。一般的に、非常に高い忠実度のポリメラーゼを使用した場合、エラーを伴わない生成物が大多数で存在する。別の態様においては、同祖的な増幅生成物および／またはシークエンシングリードを識別することができるので、多数の分子からのデータを使用してコンセンサス配列を決定し、それによって、高精度のハイスループットシークエンシングを達成することができる。
【０１６７】
一態様においては、ＵＭＩは縮重核酸配列であり、ＵＭＩ中のヌクレオチドの数は、ＵＭＩ配列によって表される潜在的配列および実際の配列の数が、最初のライブラリー中の標的一本鎖標的ポリヌクレオチドの総数より多くなるように設計される。一態様においては、ＵＭＩ配列多様性（または各単一のＵＭＩ配列についての「特有性」）は、各位置においてすべての４つの塩基の混合物により合成することによってランダムに産生された配列の縮重した集合物を使用することによって提供することができる。あるいは、多様な、しかし事前に規定された組の配列を合成し、最初の一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーにライゲーションしてもよい。ＵＭＩの組の多様性は、同祖的でない分子が同祖的として間違えられない程度に十分である必要がある。一態様においては、「ユニーク」分子識別子は、絶対的にユニークである必要はなく、それらが異なり、同祖的な分子について間違えられないことが明らかであるという条件で、異なる標的一本鎖ポリヌクレオチドについて使用され得る。ヌクレオチドのランダムアセンブリから産生され得る多数のＵＭＩ配列は、各個々のライゲーション生成物がユニークに識別され得る高い確率を提供する。例えば、ＵＭＩが、各位置においてＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物により合成される１２ｍｅｒを含む場合、４１２個の可能性のある配列が存在する。ＵＭＩが、各位置においてＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物により合成される２０ｍｅｒを含む場合、４２０個（約１０１２個）の可能性のある配列が存在する。そのようなランダムな識別子の使用は、互いに個々に区別され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドの大きなライブラリーを可能にする。
【０１６８】
特定の態様においては、ＵＭＩは、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ、８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１１ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、１４ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、１６ｍｅｒ、１７ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１９ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２１ｍｅｒ、２２ｍｅｒ、２３ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、またはさらにそれよりも長い縮重配列である。一態様においては、アダプターは、以下の構造：／５’ホス／ＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ／３ＳｐＣ３／を有し、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」は１２ｍｅｒ  ＵＭＩ配列を表し、「３ＳｐＣ３」は３’炭素スペーサーを表す。ＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧの配列は、配列番号１７５０７である。
【０１６９】
ＤＮＡの濃度は、縮合剤、例として、コバルトヘキサミンおよび生体ポリアミン、例として、スペルミジンを添加することによって、または同様に酵素の有効濃度を増大させる密集剤、例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用することによって、人為的に増大することができる。一態様においては、添加剤、例として、コバルトヘキサミンは、分子間反応を排他的に生成し、環状生成物ではなく直鎖状ライゲーション生成物をもたらし得る。したがって、一本鎖標的ポリヌクレオチドの５’末端および一本鎖アダプターの３’末端がライゲーションを防止するために完全にブロックされていない場合、添加剤、例として、コバルトヘキサミンは、分子間反応を向上させ、一本鎖標的ポリヌクレオチドおよび／またはアダプターの環状化をさらに防ぐために使用され得る。
【０１７０】
一部の実施形態においては、同じライゲーション反応においてアダプターの２つ以上の構成を使用することができる。例えば、アダプターの２つの構成を使用してもよい：
構成番号１：／５’ホス／Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ１−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカー１、および
構成番号２：／５’ホス／Ｐ１Ｐ２．．．Ｐｋ−ＵＭＩ２−Ｑ１Ｑ２．．．Ｑｌ−ブロッカー２。
【０１７１】
Ｎ１Ｎ２．．．ＮｉおよびＰ１Ｐ２．．．Ｐｋは同じでも、異なってもよく、ＵＭＩ１およびＵＭＩ２は同じでも、異なってもよく、Ｍ１Ｍ２．．．ＭｊおよびＱ１Ｑ２．．．Ｑｌは同じでも、異なってもよく、ブロッカー１およびブロッカー２は同じでも、異なってもよい。一実施形態においては、ＵＭＩ１は、ＵＭＩ２とは異なる（例えば、ＵＭＩ１は１２ｍｅｒ縮重配列であり、一方で、ＵＭＩ２は１３ｍｅｒ縮重配列である）が、アダプターの他の特徴は同じである。別の実施形態においては、Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉは、Ｐ１Ｐ２．．．Ｐｋとは異なる（例えば、一方はＡＧであり、一方で、もう一方はＧＡである）が、アダプターの他の特徴は同じである。また別の実施形態においては、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊは、Ｑ１Ｑ２．．．Ｑｌとは異なるが、アダプターの他の特徴は同じである。さらに別の実施形態においては、ブロッカー１とブロッカー２とは異なるが、アダプターの他の特徴は同じである。
【０１７２】
ライゲーション反応後、一本鎖ライゲーション生成物は、精製（例えば、過剰のライゲーションしていないアダプター分子からのライゲーション生成物の分離）を一切必要とせず、二本鎖ライゲーション生成物への変換に即座に供することができる。加えて、一本鎖標的ポリヌクレオチドも、アダプターも、後続のライゲーション生成物の二本鎖ポリヌクレオチドへの変換および／または増幅ステップのために（例えば、ビーズへのビオチン−ストレプトアビジン媒介結合によって）固体支持体上に捕捉する必要がない。したがって、本方法は、一本鎖ライゲーション生成物の精製または単離のための、ＤＮＡ試料、例としてｃｔＤＮＡ中の既に対立遺伝子率が小さい変異体の喪失を回避および／または低減する。代わりに、一態様においては、一本鎖ライゲーション生成物は、溶液中に残り、それはプライマー伸長に直接供される。
【０１７３】
一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーへの変換
一態様においては、図６で示す通り、一本鎖ライゲーション生成物を含有するライブラリーの構築後、本方法は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含み得る。一態様においては、変換は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ／またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマーを使用する。
【０１７４】
以下の構造：／５’ホス／Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカーを有するアダプターについて、プライマーは、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊに逆相補的であり、かつ／またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含み得る。この例においては、プライマーが、構造ｓｓＤＮＡ−Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカーを有するライゲーションされた生成物にハイブリダイズする場合、プライマー伸長反応は、ｓｓＤＮＡ−Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ配列（および必要に応じて、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ配列のすべてまたは一部）を二本鎖ポリヌクレオチドに変換し得る。特定の一例においては、逆相補的プライマーは、配列番号１７５０５で示される配列：ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（５’〜３’）を含む。
【０１７５】
一部の実施形態においては、プライマーは、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊまたはその一部の完全な逆相補体でなくてもよく；それにもかかわらず、プライマーは、ストリンジェントな条件下でＭ１Ｍ２．．．Ｍｊにハイブリダイズ可能である（およびしたがって、ｓｓＤＮＡはアダプターにライゲーションされる）。
【０１７６】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅および／または精製することをさらに含み得る。一態様においては、二本鎖ライゲーション生成物を精製およびサイズ選択して、非結合アダプター分子および／または非結合プライマーおよび／またはアダプターとその逆相補的プライマーとの間で形成された複合体を除去する。一般的に所望の二本鎖ライゲーション生成物より短いこれらの断片を除去するために、任意の好適な方法を使用することができる。例えば、ＱｉａｇｅｎからのＰＣＲ精製カラムを使用すると、試料からより小さい断片を削除することを補助することができ、カラム精製した試料を２％保証の低域ウルトラアガロースゲルで泳動すると、所望の断片サイズを選択することを補助することができる。ＡＭＰｕｒｅ法を含むビーズベースのＤＮＡ精製も、より小さい断片を除去するのに役立つ。一部の実施形態においては、所望の二本鎖ライゲーション生成物サイズは、約１００ｂｐ〜約６００ｂｐ、例として、約１００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐおよび約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐである。一実施形態においては、ｄｓＤＮＡ（１５０ｂｐより長く４００ｂｐより短い）を、例えば、Ｔｒｉ−ＥＤＴＡ緩衝液中に懸濁したビーズを溶出することによって、精製および収集する。
【０１７７】
一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約５０ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、例えば、約４０ヌクレオチドの長さのアダプター（ならびに約４０ｂｐのプライマーダイマーおよび／またはプライマー−アダプター二本鎖）が除去される。一態様においては、精製は、例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ精製カラム、例として、ＺｙｍｏまたはＱｉａｇｅｎからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
【０１７８】
別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない。
【０１７９】
前述の実施形態のいずれかにおいては、本明細書の方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅して、標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ることをさらに含み得る。この増幅は、例えば、ユニバーサルアダプター対を二本鎖ライゲーション生成物の末端にライゲーションし、ユニバーサルプライマー対ですべてのタグ付けした二本鎖ライゲーション生成物を増幅することによる、偏りのない増幅であり得る。他の実施形態においては、偏りのない増幅の代わりに、またはこれに加えて、半標的化増幅を行う。半標的化増幅は、偏りのない増幅の前に行っても、後に行ってもよい。
【０１８０】
二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの半標的化増幅
一態様においては、図６で示す通り、二本鎖ライゲーション生成物ライブラリーの半標的化増幅は、アダプターに逆相補的であり、かつ／またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含むプライマー、および標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）にハイブリダイズ可能な１つのプライマーまたは同じ標的配列もしくは多数の標的配列にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用することを含む。
【０１８１】
以下の構造：／５’ホス／Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカーを有するアダプターについて、プライマーは、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊに逆相補的であり、かつ／またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含み得る。このように、プライマーがｄｓＤＮＡの１つの鎖にハイブリダイズし、標的特異的プライマーがｄｓＤＮＡの他の鎖にハイブリダイズする場合、ＰＣＲ産物は、標的配列およびＮ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ配列（および必要に応じて、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ配列のすべてまたは一部）を含有する。特定の一例においては、逆相補的プライマーは、配列番号１７５０５で示される配列：ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（５’〜３’）を含む。
【０１８２】
一態様においては、各々が、同じまたは異なる標的配列について特異的な配列を含む、複数の標的特異的プライマーを使用してもよい。換言すれば、プライマーは、同じまたは異なる標的配列を有してもよい。一部の実施形態においては、標的特異的プライマーのプールは、約５、約１０、約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００個または約１０００個よりも多い様々なプライマー、例として、約１０４、約１０５、約１０６個またはそれよりも多いプライマーを含む。他の実施形態においては、プールは、約２０〜約６０、約６０〜約１００、約１００〜約１４０、約１４０〜約１８０、約１８０〜約２２０、約２２０〜約２６０、約２６０〜約３００、約３００〜約３５０または約３５０〜約４００個の様々なプライマーを含む。一態様においては、標的特異的プライマーのプールは、１つの共通の逆相補的プライマーと共に使用され、共通の逆相補的プライマーは、プール中の各個々の標的特異的プライマーとプライマー対を形成して、半標的化様式でこれらのプライマー内および／またはプライマー間の標的配列を増幅する。したがって、この態様においては、半標的化増幅は、全ゲノム増幅ではない。
【０１８３】
ｃｔＤＮＡはランダムに断片化するので、一態様においては、標的特異的プライマーのプライマー位置は重要であり得る。例えば、プライマーの配置が切断点にまたがる場合、それはより低い変換率をもたらし得る。より大きな標的特異的プライマープールおよび／または同じ標的配列についての多数の部分重複プライマーの使用は、この問題を解決し得る。
【０１８４】
一態様においては、標的配列の配列情報は、変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、コピー数多型（ＣＮＶ）またはエピジェネティック変化を含み得る。一態様においては、変異は、点変異、挿入、欠失、逆位、トランケーション、融合、増幅またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１８５】
一部の実施形態においては、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーは、全ゲノムライブラリー以外のライブラリー、例えば、半標的化ゲノムライブラリーであり得る。
【０１８６】
一部の実施形態においては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを精製することをさらに含み得る。プライマーダイマーを含むより小さい断片を除去するために、任意の好適な方法を使用することができる。例えば、ＱｉａｇｅｎからのＰＣＲ精製カラムを使用すると、試料からより小さい断片を削除することを補助することができ、カラム精製した試料を２％保証の低域ウルトラアガロースゲルで泳動すると、所望の断片サイズを選択することを補助することができる。ＡＭＰｕｒｅ法を含むビーズベースのＤＮＡ精製も、より小さい断片を除去するのに役立つ。一部の実施形態においては、増幅生成物サイズは、約１００ｂｐ〜約６００ｂｐ、例として、約１００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐおよび約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐである。一実施形態においては、ｄｓＤＮＡ（１５０ｂｐより長く４００ｂｐより短い）を、例えば、Ｔｒｉ−ＥＤＴＡ緩衝液中に懸濁したビーズを溶出することによって、精製および収集する。
【０１８７】
一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約１５０ヌクレオチドを超える長さのポリヌクレオチドを選択的に精製する。別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない。一態様においては、精製は、例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ精製カラム、例として、ＺｙｍｏまたはＱｉａｇｅｎからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
【０１８８】
配列ライブラリーの構築およびシークエンシングリードの解析
一態様においては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む。一態様においては、シークエンシングステップは、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む。特定の一態様においては、結合ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行われる。
【０１８９】
図７は、シークエンシングのための標的分子を含む構築物の例示的な構成を示す。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングのために、これらの構築物は、各末端上に、ライブラリー断片がフローセル表面に結合することを可能にするフローセル結合部位、Ｐ５およびＰ７を有する。一本鎖ライブラリー断片のＰ５およびＰ７領域は、フローセル表面上のそれらの相補的オリゴにアニールする。フローセルオリゴは、プライマーとして作用し、ライブラリー断片に相補的な鎖が合成される。その後、元の鎖を洗い流すと、混合した配向で、フローセル表面に共有結合している断片コピーが残る。その後、各断片のコピーを架橋増幅によって産生し、クラスターを作製する。その後、Ｐ５領域を切断し、Ｐ７領域によって結合している断片のみを含有するクラスターを得る。このことにより、すべてのコピーが同じ向きでシークエンシングされることが確実になる。シークエンシングプライマーを、断片のＰ５末端にアニールし、合成プロセスによってシークエンシングを開始する。試料がバーコード化されている場合、インデックスリードが行われる。リード１を終了すると、リード１からのすべてを除去し、インデックスプライマーを添加し、これは断片のＰ７末端にアニールし、バーコードをシークエンシングする。その後、鋳型からすべてを取り除き、これは、リード１と同様に架橋増幅によってクラスターを形成する。これにより、混合した配向で、フローセル表面に共有結合している断片コピーが残る。今度は、Ｐ５の代わりにＰ７を切断し、Ｐ５領域によって結合している断片のみを含有するクラスターを得る。このことにより、すべてのコピーが（リード１と反対の）同じ向きでシークエンシングされることが確実になる。シークエンシングプライマーを、Ｐ７領域にアニールし、鋳型の他の末端をシークエンシングする。
【０１９０】
次世代シークエンシングプラットホーム、例として、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、高多重化アッセイリードアウトのために使用することができる。様々な統計的ツール、例として、比例検定（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）、偽陽性率に基づく多重比較補正（ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ、１９９５年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  （Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）  ５７巻、２８９〜３００頁を参照のこと）および多重検定のボンフェローニ補正は、アッセイ結果を解析するために使用することができる。加えて、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの差次的発現の解析のために開発されたアプローチを使用して、各標的配列についての分散を低減し、解析における全体的な検出力を増大させることができる。Ｓｍｙｔｈ、２００４年、Ｓｔａｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３巻、論文３を参照されたい。
【０１９１】
全体として、一部の実施形態においては、本方法の変換率は、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％である。一態様においては、変換率は、シークエンシングリードを生ずる、最初のライブラリーにおける標的化された一本鎖ポリヌクレオチドの割合である。
【０１９２】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、被験体における疾患または状態の診断および／もしくは予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、疾患／状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに／または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用することができる。一態様においては、疾患または状態は、がんまたは新生物であり、処置は、がんまたは新生物処置である。
【０１９３】
変異体ＤＮＡ分子は、非常に特異的であるため、がん関連バイオマーカーに優るユニークな利点を提供する。変異は、個々の正常細胞において低率（約１０−９〜１０−１０個の変異／ｂｐ／世代）で起こるが、そのような変異は、全正常ＤＮＡのうちのわずかな割合であるので、ある特定の技術法の検出限界未満の桁である。いくつかの研究により、変異体ＤＮＡは、ＣＲＣ患者の便、尿および血液中で検出され得ることが示されている（ＯｓｂｏｒｎおよびＡｈｌｑｕｉｓｔ、Ｓｔｏｏｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００５年；１２８巻：１９２〜２０６頁）。
【０１９４】
本明細書のシークエンシング結果に基づいて、患者における循環腫瘍ＤＮＡの検出を行うことができ、がんの診断および腫瘍再発についての予測を行うことができる。この予測に基づいて、処置およびサーベイランスの決定を行うことができる。例えば、将来の再発を示す循環腫瘍ＤＮＡにより、追加のまたはより積極的な療法、ならびに追加のまたはより精巧な画像化およびモニタリングを行い得る。循環ＤＮＡは、腫瘍に対して異所性のＤＮＡを指す。
【０１９５】
ｃｔＤＮＡについてモニタリングすることができる試料として、血液および便が挙げられる。血液試料は、例えば、血液の画分、例として、血清または血漿であってもよい。同様に、便は、ＤＮＡを他の構成成分から精製するために分画してもよい。腫瘍試料を使用して、腫瘍の体細胞変異遺伝子を同定し、これは、体内の他の場所において腫瘍マーカーとして使用することができる。したがって、例として、腫瘍における特定の体細胞変異は、当技術分野で公知の任意の標準の手段によって同定することができる。典型的な手段として、対立遺伝子特異的プローブ、対立遺伝子特異的増幅、プライマー伸長などを使用する、腫瘍ＤＮＡの直接的なシークエンシングが挙げられる。体細胞変異が特定されると、それを身体の他の区画において使用して、腫瘍由来ＤＮＡを身体の他の細胞由来のＤＮＡと区別することができる。体細胞変異は、それらが同じ患者の身体の正常組織において存在しないことを決定することによって確認される。この様式で診断および／またはモニタリングすることができる腫瘍のタイプは、事実上無制限である。細胞および／またはＤＮＡを血液もしくは便または他の体液に放出する任意の腫瘍を使用することができる。そのような腫瘍として、結腸直腸腫瘍に加えて、乳房、肺、腎臓、肝臓、膵臓、胃、脳、頭頸部、リンパ管、卵巣、子宮、骨、血液などの腫瘍が挙げられる。
【０１９６】
一態様においては、本明細書で開示する方法は、シークエンシングにおける、および／または標的配列の１つもしくは複数の領域のエピジェネティック状態（ｓｔａｔｕｓ／ｓｔａｔｅ）の決定における使用のためのライブラリーを構築するために使用することができる。ＤＮＡメチル化は、最初は、発見されたエピジェネティックな目印であった。エピジェネティックスは、根底にあるＤＮＡ配列における変化以外の機構によって引き起こされた遺伝子発現または細胞表現型における変化の研究である。メチル化は主に、ジヌクレオチドＣｐＧのシトシン残基の炭素５位へのメチル基の付加に関し、転写活性の抑制または阻害と関連付けられる。
【０１９７】
亜硫酸水素塩変換は、ＤＮＡのメチル化パターンを決定するための、ＤＮＡを処理する亜硫酸水素塩試薬の使用である。ＤＮＡの亜硫酸水素塩での処理は、シトシン残基をウラシルに変換するが、５−メチルシトシン残基は影響を受けずに残る。したがって、亜硫酸水素塩処理は、ＤＮＡ配列において、個々のシトシン残基のメチル化状態に依存する特定の変化を導入する。この情報を検索するために、例えば、亜硫酸水素塩変換から生ずる一塩基多型（ＳＮＰ）を区別するために、変化した配列について種々の解析を行うことができる。すべて参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６２０，３８６号、米国特許第９，３６５，９０２号および米国特許出願公開第２００６／０１３４６４３号は、亜硫酸水素塩変換により変化した配列の検出についての当業者に公知の方法を例示している。
【０１９８】
上記に説明する通り、亜硫酸水素塩変換の１つの結果は、配列相補性の喪失のために、元の標的の二本鎖コンフォメーションが破壊されることである。このことは、二本鎖ライブラリーを構築するための伝統的方法については問題を引き起こし得るが、本方法は、一態様においては、ユニークに、シークエンシング解析のための亜硫酸水素塩変換試料から一本鎖ライブラリーを構築するのに適している。
【０１９９】
別の態様においては、本方法は、例えば、すべての目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年４月１９日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｃｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｕｓ」という表題の米国仮出願第＿号（代理人整理番号７３７９９３０００１００）において説明されている通り、メチル化状態（ｓｔａｔｅ／ｓｔａｔｕｓ）を決定するための方法と組み合わせて使用することができる。一実施形態においては、試料を、脱リン酸化および／または変性ステップの前にメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）と接触させ、次に、メチル化プロファイルを、本明細書で開示するライゲーションにより一本鎖ライブラリーを構築することによって解析する。
【０２００】
さらなる例示的な実施形態
先行する実施形態のいずれかにおいて、ｓｓＤＮＡリガーゼは、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１であり得る。他の態様においては、ｓｓＤＮＡリガーゼは、ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０４Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２３９Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２４２Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、例えば、Ｍ０３７３ＳまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３５１Ｓである。前述の実施形態のいずれかにおいては、また、キットは、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３１９ＳまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０２Ｓを含み得る。
【０２０１】
一部の実施形態においては、本方法は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを使用して１組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む。本明細書で開示するｓｓＤＮＡリガーゼを含む任意の好適なｓｓＤＮＡリガーゼを使用することができる。アダプターは、任意の好適なレベルまたは濃度、例えば、約１μＭ〜約１００μＭ、例として、約１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭもしくは１００μＭまたはそれらの任意の部分範囲で使用することができる。アダプターは、任意の好適な配列もしくは塩基を含むか、または任意の好適な配列もしくは塩基で始まってもよい。例えば、アダプター配列は、塩基のすべての２ｂｐの組み合わせで始まることができる。
【０２０２】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、密集剤の存在下で行ってもよい。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００もしくはＰＥＧ８０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む。密集剤、例えば、ＰＥＧは、任意の好適なレベルまたは濃度で使用することができる。例えば、密集剤、例えば、ＰＥＧは、約０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）のレベルまたは濃度で、例えば、約０％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１１％（ｗ／ｖ）、１２％（ｗ／ｖ）、１３％（ｗ／ｖ）、１４％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、１６％（ｗ／ｖ）、１７％（ｗ／ｖ）、１８％（ｗ／ｖ）、１９％（ｗ／ｖ）、２０％（ｗ／ｖ）、２１％（ｗ／ｖ）、２２％（ｗ／ｖ）、２３％（ｗ／ｖ）、２４％（ｗ／ｖ）もしくは２５％（ｗ／ｖ）またはそれらの任意の部分範囲で使用することができる。
【０２０３】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、任意の好適な期間の間、行ってもよい。例えば、ライゲーション反応は、約２〜約１６時間の期間の間、％、例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間もしくは１６時間またはその任意の部分範囲の間、行うことができる。
【０２０４】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応中のｓｓＤＮＡリガーゼは、任意の好適な体積で使用してもよい。例えば、ライゲーション反応中のｓｓＤＮＡリガーゼは、約０．５μｌ〜約２μｌの体積で、％、例えば、約０．５μｌ、０．６μｌ、０．７μｌ、０．８μｌ、０．９μｌ、１μｌ、１．１μｌ、１．２μｌ、１．３μｌ、１．４μｌ、１．５μｌ、１．６μｌ、１．７μｌ、１．８μｌ、１．９μｌもしくは２μｌまたはその任意の部分範囲で使用することができる。
【０２０５】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、ライゲーションエンハンサー、例えば、ベタインの存在下で行ってもよい。ライゲーションエンハンサー、例えば、ベタインは、任意の好適な体積、例えば、約０μｌ〜約１μｌで、例えば、約０μｌ、０．１μｌ、０．２μｌ、０．３μｌ、０．４μｌ、０．５μｌ、０．６μｌ、０．７μｌ、０．８μｌ、０．９μｌ、１μｌまたはその任意の部分範囲で使用することができる。
【０２０６】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：１×反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）、２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ８０００、１ｍＭヘキサミン塩化コバルト（必要に応じて）、１μｌ（１０ユニット）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよび１ｍＭ  ＡＴＰ中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼＩ、Ｍ０２０４Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、４０μｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによって停止してもよい。
【０２０７】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ基質２０ｐｍｏｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）、５’Ａｐｐ  ＤＮＡオリゴヌクレオチド４０ｐｍｏｌ（２ｐｍｏｌ／μｌ）、１０×ＮＥ緩衝液１（２μｌ）、５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２（ｓｓＤＮＡライゲーションのみのため）（２μｌ）、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（２μｌ（４０ｐｍｏｌ））およびヌクレアーゼ非含有水（全部で２０μｌになるように）中で、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｍ０３１９Ｓを使用して行うことができる。反応を、６５℃で１時間インキュベートしてもよい。反応は、９０℃で３分間加熱することによって停止してもよい。
【０２０８】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アダプター（２μｌ）および水（４μｌ）中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２、Ｍ０２３９Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で２０分間加熱することによって停止してもよい。
【０２０９】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アダプター（２μｌ）および水（４μｌ）中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｍ０２４２Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で２０分間加熱することによって停止してもよい。
【０２１０】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アデニル化アダプター（０．７２μｌ）および水（５．２８μｌ）中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｍ０３５１Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で２０分間加熱することによって停止してもよい。
【０２１１】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アデニル化アダプター（０．７２μｌ）および水（５．２８μｌ）中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、Ｍ０３７３Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で２０分間加熱することによって停止してもよい。
【０２１２】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アデニル化アダプター（０．７２μｌ）および水（５．２８μｌ）中で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｍ０２０２Ｓを使用して行うことができる。反応を、１６℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で１０分間加熱することによって停止してもよい。
【０２１３】
第２鎖合成ステップは、任意の好適な酵素を使用して行うことができる。例えば、第２鎖合成ステップは、Ｂｓｔポリメラーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２７５ＳまたはＫｌｅｎｏｗ断片（３’−＞５’エキソ−）、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２１２Ｓを使用して行うことができる。
【０２１４】
一部の実施形態においては、第２鎖合成ステップは、以下の例示的な反応混合物（１０μｌ）：水（１．５μｌ）、プライマー（０．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１μｌ）、ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液（５μｌ）およびＢｓｔ（２μｌ）中で、Ｂｓｔポリメラーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２７５Ｓを使用して行うことができる。反応は、６２℃で２分間および６５℃で３０分間インキュベートしてもよい。反応後、二本鎖ＤＮＡ分子を、さらに精製する。
【０２１５】
一部の実施形態においては、第２鎖合成ステップは、以下の例示的な反応混合物（１０μｌ）：水（０．５μｌ）、プライマー（０．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１μｌ）、ＮＥＢ緩衝液（２μｌ）およびエキソ−（exo-）（３μｌ）中で、Ｋｌｅｎｏｗ断片（３’→５’エキソ−）、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２１２Ｓを使用して行うことができる。反応は、３７℃で５分間および７５℃で２０分間インキュベートしてもよい。反応後、二本鎖ＤＮＡ分子を、さらに精製する。
【０２１６】
第２鎖合成後であるが、最初のまたは半標的化ＰＣＲの前に、二本鎖ＤＮＡを精製してもよい。二本鎖ＤＮＡは、任意の好適な技術または手順を使用して精製することができる。例えば、二本鎖ＤＮＡは、以下のキット：Ｚｙｍｏ  ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ４１０３；Ｑｉａｑｕｉｃｋ、Ｑｉａｇｅｎ、２８１０４；Ｚｙｍｏ  ｓｓＤＮＡ精製キット、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ７０１０；Ｚｙｍｏオリゴ精製キット、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ４０６０；およびＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８２：１．２×〜４×ビーズ比のいずれかを使用して精製することができる。
【０２１７】
最初のまたは半標的化ＰＣＲは、任意の好適な酵素または反応条件を使用して行うことができる。例えば、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ鎖は、約５２℃〜約７２℃の範囲の温度で、例えば、約５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃もしくは７２℃またはその任意の部分範囲でアニールすることができる。最初のまたは半標的化ＰＣＲは、任意の好適な回数のサイクルにわたって行うことができる。例えば、最初のまたは半標的化ＰＣＲは、１０〜４０サイクルにわたって、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０サイクルにわたって行うことができる。プライマープールは、任意の好適な濃度で使用することができる。例えば、プライマープールは、約５ｎＭ〜約２００ｎＭの範囲の濃度で、例えば、約５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、１５０ｎＭ、１６０ｎＭ、１７０ｎＭ、１８０ｎＭ、１９０ｎＭもしくは２００ｎＭまたはその任意の部分範囲で使用することができる。
【０２１８】
最初のまたは半標的化ＰＣＲは、任意の好適な温度サイクル条件を使用して行うことができる。例えば、最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下のサイクル条件：９５℃  ３分間、（９５℃  １５秒間、６２℃  ３０秒間、７２℃  ９０秒間）×３もしくは×５、または（９５℃  １５秒間、７２℃  ９０秒間）×２３もしくは×２１、７２℃  １分間、その後永久に４℃のいずれかを使用して行うことができる。
【０２１９】
一部の実施形態においては、最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下の例示的な反応混合物（５０μｌ）：ＤＮＡ（２μｌ）、ＫＡＰＡＳＹＢＲ（２５μｌ）、プライマープール（各々２６ｎＭ）（１０μｌ）、Ａプライマー（１００μＭ）（０．４μｌ）および水（１２．６μｌ）中で、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ、例えば、ＫＡＰＡ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＫＫ４６００を使用して行うことができる。最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下のサイクル条件：９５℃  ３０秒間、（９５℃  １０秒間、５０〜５６℃  ４５秒間、７２℃  ３５秒間）×４０のいずれかを使用して行うことができる。
【０２２０】
一部の実施形態においては、最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下の例示的な反応混合物（５０μｌ）：ＤＮＡ（１５μｌ）、ＫＡＰＡＨｉＦｉ（２５μｌ）、プライマープール（各々２６ｎＭ）（１０μｌ）およびＡプライマー（１００μＭ）（０．４μｌ）中で、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ、例えば、ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＫＫ２６０１を使用して行うことができる。最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下のサイクル条件：９５℃  ３分間、（９８℃  ２０秒間、５３〜５４℃  １５秒間、７２℃  ３５秒間）×１５、７２℃  ２分間、その後永久に４℃のいずれかを使用して行うことができる。
【０２２１】
亜硫酸水素塩変換は、任意の好適な技術、手順または試薬を使用して行うことができる。一部の実施形態においては、亜硫酸水素塩変換は、以下のキットおよびキットで提供される手順：ＥｐｉＭａｒｋ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ３３１８Ｓ；ＥＺ  ＤＮＡ  ＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００１；ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＥＣＯＶ５０；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｇｏｌｄ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００５；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５０２０；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５０３０Ｔ；ＥｐｉＪＥＴ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１４６１；またはＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、５９１０４のいずれかを使用して行うことができる。
【０２２２】
一部の実施形態においては、ＤＮＡ分子は、一本鎖ポリヌクレオチドを構築するためのステップ、一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーへの変換のためのステップ、二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの半標的化増幅のためのステップおよび配列ライブラリーの構築のためのステップを含む、実施例４で例示する手順を使用して調製することができる。そのようなＤＮＡ分子は、任意の好適な方法または手順を使用してメチル化状態についてさらに解析してもよい。
【実施例】
【０２２３】
Ｇ．実施例
（実施例１）
結腸組織におけるがんの検出
この実施例においては、表１に列挙した１０個の標的領域、すなわち、標的３０、標的３６９、標的６７７、標的１５５８、標的１６２８、標的１６９１、標的１７２５、標的１７９５、標的１８２３、標的１８４１、のメチル化状態を解析した。メチル化メトリックは、非メチル化ハプロタイプ負荷（ｕＭＨＬ）として計算する。解析に使用される分類方法は、サポートベクターマシンである。
【０２２４】
上に列挙された１０個の標的領域を調査する実験パネルを開発した。実験パネルを使用して、８つの健康な結腸および４０個の結腸がん組織試料を加工し、各標的領域に対してｕＭＨＬメトリックを計算して、データマトリックスを作成した。ＳＶＭベースの分類器（classifier）を開発するために、４つの健康な結腸および２０個の結腸がん組織試料のサブセットを、「トレーニング」セットとして選択した。トレーニングセットの試料を使用して、ＰｙｔｈｏｎでＳＶＭベースの分類器を適合させた（ｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎライブラリーを使用）（図２）。次に、ＳＶＭベースの分類器を使用して、残りの２４個の「試験」セット試料のカテゴリーを予測した。分類器は、試験セットで１００％の精度を達成し、結腸組織試料ががん性であるかどうかを正しく識別することができた。
【０２２５】
（実施例２）
血漿中の肺がんの検出
この実施例においては、表１に列挙した９５個の標的領域、すなわち、標的３５、標的３６、標的１０２、標的１１５、標的１１７、標的１１８、標的１２０、標的１３６、標的１４１、標的１５４、標的１５５、標的１６６、標的２０７、標的２２６、標的２４１、標的２４３、標的２５２、標的２５３、標的２６７、標的２８４、標的３３８、標的３９７、標的３９８、標的４２２、標的４２３、標的４３２、標的４３９、標的４４０、標的４４５、標的４６０、標的４６１、標的５０４、標的５１４、標的５７４、標的５７５、標的５８９、標的５９６、標的６２５、標的６２６、標的６３７、標的６４０、標的６５０、標的６７４、標的６９１、標的６９３、標的７１０、標的７３６、標的８４０、標的８５２、標的８６７、標的８６８、標的８８４、標的９０３、標的９１１、標的９１６、標的９２６、標的９３６、標的９４０、標的９４１、標的１００５、標的１０４１、標的１０４８、標的１０８５、標的１０９３、標的１１１３、標的１１３９、標的１１８１、標的１１８２、標的１１８３、標的１２１６、標的１２２９、標的１２４０、標的１３１１、標的１３２４、標的１３３３、標的１３４０、標的１３４２、標的１３５６、標的１３５７、標的１３８５、標的１３９２、標的１４０３、標的１４０８、標的１４８９、標的１５２１、標的１５６６、標的１５８４、標的１６０９、標的１６１６、標的１６２６、標的１６３０、標的１６３５、標的１６５５、および標的１６５６、のメチル化状態を解析した。メチル化メトリックは、読み取り不一致率（ＰＤＲ）として計算する。解析に使用される分類方法は、ｋ最近傍法である。
【０２２６】
上に列挙された９５の標的領域を調査する実験パネルを開発した。実験パネルを使用して、４０個の肺がん組織試料、１０個の健康な血漿試料、および４つの肺がん血漿試料を加工し、各標的領域のＰＤＲメトリックを計算して、データマトリックスを作成した。ｋ最近傍法ベースの分類器を開発するために、１０個の健康な血漿試料と４０個の肺がん組織試料のサブセットを、「トレーニング」セットとして選択した。残りの試験セット試料については、すべてのトレーニングセット試料までのユークリッド距離を、Ｐｙｔｈｏｎで計算した（ｓｅａｂｏｒｎ．ｃｌｕｓｔｅｒｍａｐ関数を使用）（図３ａ）。各試料を、最近傍トレーニングセットのカテゴリーに割り当てた。これにより、血漿試料で７５．００％の感度と１００．００％の特異性が得られた。
【０２２７】
試験または解析結果を図３ｂに示す。各縦線は単一の試料を表す。紫の試料は、「既知のがん試料」である。緑の試料は、「既知の正常試料」である。赤の試料は、「未知の試料」である（実際には、それらは「がん」試料である）。青の試料は、「未知の試料」である（実際には、それらは「正常」試料である）。この解析では、５つの青の試料すべては、緑の試料に最も類似していたため、すべて正常とコールされた（特異性は１００％）。４つの赤の試料のうち３つは、紫の試料に最も類似していたため、４つのうち３つはがんとコールされた（感度は７５％）。１つの赤色の試料は、緑色の試料に最も類似していたため、正常とミスコールされた。
【０２２８】
（実施例３）
血漿中のがん種横断的検出
この実施例においては、表１に列挙した８６個の標的領域、すなわち、標的１１、標的３５、標的３６、標的１０２、標的１１５、標的１４１、標的１５４、標的１５５、標的１６８、標的１８４、標的２０９、標的２１０、標的２１１、標的２２６、標的２４１、標的２８４、標的３２３、標的３３３、標的３３８、標的３９７、標的４３２、標的４３９、標的４４０、標的４６０、標的４７２、標的４８２、標的４８５、標的５７０、標的５７４、標的５８９、標的５９６、標的６１６、標的６３７、標的６６０、標的６６１、標的６７４、標的６９２、標的６９３、標的７１０、標的７２８、標的８４０、標的８５２、標的８６７、標的８６８、標的９０３、標的９１１、標的９１６、標的９４０、標的９４１、標的９４２、標的１０４８、標的１０５５、標的１０６１、標的１０８５、標的１０９３、標的１１１６、標的１１２２、標的１１２９、標的１１３９、標的１１４２、標的１１９０、標的１１９１、標的１２１２、標的１２１３、標的１２１６、標的１２２９、標的１２４７、標的１２４８、標的１２９６、標的１２９７、標的１３１１、標的１３２２、標的１３２４、標的１３４０、標的１３４２、標的１３４３、標的１３５６、標的１３７８、標的１３９２、標的１４０３、標的１４４７、標的１５２２、標的１５３５、標的１５４３、標的１５６６、標的１６１６、のメチル化状態を解析した。メチル化メトリックは、平均メチル化頻度（ＡＭＦ）として計算する。解析に使用される分類方法は、ロジスティック回帰である。
【０２２９】
上に列挙された８６の標的領域を調査する実験パネルを開発した。２０個の健康な血漿試料、５つの肺がん血漿試料、４つの肝臓がん血漿試料、１つの乳がん血漿試料、１つの卵巣がん血漿試料、および２つの食道がん血漿試料を、実験パネルを使用して加工し、各標的領域のＡＭＦメトリックを計算して、データマトリックスを作成した。ロジスティック回帰ベースの分類器を開発するために、１０個の健康な血漿および６個のがん血漿試料のサブセットを、「トレーニング」セットとして選択した。ロジスティック回帰モデルを、Ｐｙｔｈｏｎですべての標的領域にわたる平均メチル化値の合計に適合させた（ｓｋｌｅａｒｎモジュールを使用）（図４）。次に、残りの試験セット試料のがん状態を予測し、これにより、血漿試料で８５．７１％の感度および８０．００％の特異性が得られた。
【０２３０】
（実施例４）
この実施例においては、鋳型（例えば、シークエンシングされるポリヌクレオチド）は、約２００ｂｐ長未満の短いＤＮＡ断片である。これらのＤＮＡ断片は、血漿から抽出したＤＮＡ、（例えば、断片化酵素（ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ）によって）酵素処理したゲノムＤＮＡまたは物理的に剪断したＤＮＡを含み得る。物理的に剪断したＤＮＡは、末端修復してもよい。特定の態様においては、鋳型は、ライゲーションのための３’ヒドロキシル基を有する。
【０２３１】
典型的に、１０〜３０ｎｇの適切に調製した鋳型ＤＮＡを、例えば、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＭｎＣｌ２中で３７℃にて１０分間、１ＵのＦａｓｔＡＰ熱感受性アルカリホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して脱リン酸化した。その後、ＤＮＡを、例えば、９５℃で２分間変性させ、氷上に１分間置いた。
【０２３２】
一本鎖アダプターを、５’ホスフェート基および３’炭素スペーサーを伴って、ＩＤＴで合成した。５’末端は、ＧＡ、およびそれに続く１２ｍｅｒのユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含有する。典型的な一本鎖アダプターは、以下の配列：／５ホス／ＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ／３ＳｐＣ３／（「５ホス」は５’ホスフェート基を表し、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」は１２ｍｅｒ  ＵＭＩ配列を表し、「３ＳｐＣ３」は３’炭素スペーサーを表す）を有する。
【０２３３】
その後、脱リン酸化した一本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応において以下の最終濃度：５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴおよび２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０％  ＰＥＧ４０００、０．５μＭアダプター、１２５μＭ  ＡＴＰならびに２００Ｕ  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）を使用した。反応を、６０℃で２時間、８０℃で１０分間、８５℃で２分間インキュベートし、４℃で維持した。
【０２３４】
その後、以前の反応体積を以下のもの：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１μＭ逆相補的プライマー（アダプターに逆相補的なプライマー）および２００μＭ  ｄＮＴＰミックスに添加することによって、ＤＮＡを二本鎖にした。反応を、９５℃で３０秒間、６２℃で２分間、６８℃で１０分間インキュベートし、４℃で維持した。典型的な逆相補的プライマーは、配列番号１７５０５：ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（５’〜３’）で示される配列を含む。以下のものは、アダプターと逆相補的プライマーとのアラインメントである：
【化１】
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【０２３５】
その後、１．６（ビーズ比）×ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズを使用して、反応を精製した。ビーズを添加し、１０分間インキュベートした。その後、混合物を磁石に移して、５分間置いた。その後、上清を除去した。ビーズを、１５０μＬの８０％エタノールで２回、各３０秒間洗浄した。その後、すべての残留エタノールを除去し、ビーズを磁石から外して室温で３分間乾燥させた。１５μｌの低ＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をビーズに添加し、２分間インキュベートした。その後、ビーズを磁石に戻して１分間置いた。上清を除去し、次の反応のために保存した。一態様においては、ビーズ比は、精製プロセスにおいてサイズ選択性をもたらし、約１００ｂｐより短い分子を除去するビーズ比（例として、１．６倍）が選択され得る。
【０２３６】
１組のＰＣＲプライマーを、プライマー−プライマー相互作用およびオフターゲットアニーリングを最小限にするように設計した。プライマーを、特定のバリアントに近接して配置するようにさらに最適化した。設計後、ＩＤＴによってプライマーを合成した。プライマーを等しい体積比で混合してプライマープールにした。半標的化ＰＣＲ反応を、以下の試薬：以前の反応からのすべての精製ＤＮＡ、１×ＫＡＰＡ  ２Ｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘマスターミックス、プールからの６６ｎＭの各プライマーおよび８００ｎＭ逆相補的プライマーで行った。反応を、以下の熱サイクリングプログラム：９５℃  ３分間、（９５℃  １５秒間、７２℃  ９０秒間）×２０、７２℃  １分間に供し、４℃で維持した。
【０２３７】
その後、１．６（ビーズ比）×ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズを使用して、反応を精製した。ビーズを添加し、１０分間インキュベートした。その後、混合物を磁石に移して、５分間置いた。その後、上清を除去した。ビーズを、１５０μＬの８０％エタノールで２回、各３０秒間洗浄した。その後、すべての残留エタノールを除去し、ビーズを磁石から外して室温で３分間乾燥させた。２０μｌの低ＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をビーズに添加し、２分間インキュベートした。その後、ビーズを磁石に戻して１分間置いた。上清を除去し、次の反応のために保存する。遊離アダプター分子、遊離プライマー分子および／またはアダプター／プライマーダイマーを含む、約１００ｂｐより短い分子を除去するビーズ比（例として、１．６倍）が選択され得る。
【０２３８】
その後、全長シークエンシングアダプターおよび試料特異的バーコードを付加するための別のＰＣＲ反応を完了した。ＰＣＲ反応は、以下のもの：以前の反応からの２μＬの精製ＤＮＡ、１×ＮＥＢ  ｕｌｔｒａ  Ｑ５  ＩＩマスターミックス、４００ｎＭユニバーサルプライマーおよび４００ｎＭバーコード特異的プライマーを含有した。反応を、以下の熱サイクリングプログラム：９５℃  ３分間、（９８℃  １０秒間、６５℃  ７５秒間）×１０、６５℃  ２分間に供し、４℃で維持した。
【０２３９】
その後、０．８（ビーズ比）×ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズを使用して、反応を精製した。ビーズを添加し、１０分間インキュベートした。その後、混合物を磁石に移して、５分間置いた。その後、上清を除去した。ビーズを、１５０μＬの８０％エタノールで２回、各３０秒間洗浄した。その後、すべての残留エタノールを除去し、ビーズを磁石から外して室温で３分間乾燥させた。２５μｌの低ＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をビーズに添加し、２分間インキュベートする。その後、ビーズを磁石に戻して１分間置いた。上清を除去し、シークエンシングのために準備する。約２００ｂｐより短い分子の大部分を除去するビーズ比（例として、０．８倍）が選択され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１８３】
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【図５−１９１】
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【図５−１９２】
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【図５−１９３】
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【図５−１９４】
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【図５−１９５】
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【図５−１９６】
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【図５−１９７】
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【図５−１９８】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年2月3日(2021.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021520809000001.app
【国際調査報告】
2021520809.tif 000219
2021520809.tif 000220
2021520809.tif 000221
2021520809.tif 000222