(57)【要約】  本発明は、ツボクサ不定根の抽出物を有効成分として含有する皮膚美白及びシワ改善用化粧料組成物に関するものであって、本発明のツボクサ不定根抽出物は、細胞毒性がなく、抗炎症及び抗酸化活性に優れ、メラニン色素及びマトリックスメタロプロテアーゼの生成を阻害し、プロコラーゲンの生成を増進させる効果が優秀であるので、皮膚美白及びシワ改善用化粧料または皮膚外用剤などに有用に利用可能である。
2021502953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有する皮膚美白及びシワ改善用化粧料組成物。
【請求項２】
前記抽出物は、炭素数１ないし４の低級アルコールまたはこれらの混合溶媒を用いて抽出したことを特徴とする請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項３】
前記組成物は、メラニン及びマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloprotease）の生成を阻害し、プロコラーゲンの生成を促進することを特徴とする請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項４】
前記組成物は、抗炎症及び抗酸化活性を有することを特徴とする請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項５】
前記組成物は、スキン、スキンソフトナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、アイクリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディ・クレンジャー、せっけん及びパウダーのうちから選択されたいずれか１つの剤形であることを特徴とする請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項６】
ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有する皮膚美白及びシワ改善用皮膚外用薬学組成物。
【請求項７】
ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有するメラニン色素の過剰沈着疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項８】
前記メラニン色素の過剰沈着疾患は、そばかす、老人斑、肝斑、しみ、褐色斑または黒斑、日光色素斑、青色黒皮症（cyanic melasma）、薬物使用後の過剰色素沈着、姙娠性褐色斑（gravidic chloasma）、または擦傷及び火傷を含めた傷または皮膚炎による炎症後過剰色素沈着であることを特徴とする請求項７に記載のメラニン色素の過剰沈着疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項９】
前記組成物は、注射剤、クリーム、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤及びカタプラズマ剤のうちから選択されたいずれか１つの剤形で製造されることを特徴とする請求項７に記載の皮膚色素過剰沈着疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１０】
ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有するメラニン色素の過剰沈着予防または改善用健康機能食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有する皮膚美白及びシワ改善用化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
老齢者人口が増加することにより、老化の尺度となる皮膚美容及び老化を防止する抗酸化分野が主な関心事として浮上している。老化による皮膚のシワ生成及び体内の抗酸化活性減少などは健康の尺度として使用可能である。皮膚老化は、原因によって内因性老化（intrinsic aging）及び外因性老化（extrinsic aging）に区分される。内因性老化は、年齢による皮膚の表皮及び真皮の生理的機能変化が原因であり、外因性老化は、大気汚染、紫外線露出、ストレスなどの環境から発生する皮膚の生理的機能変化が原因と知られている。かような老化の共通メカニズムは、酸化的ストレス（oxidative stress）に持続的に露出されて、体内に自由ラジカル（free radical）が増加し、真皮の結合組織であるエラスチン（elastin）を分解するエラスターゼ（elastase）の活性増加、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）を分解するヒアルロニダーゼ（hyaluronidase）の活性増加として説明されうる。すなわち、皮膚老化とは、エラスチン及びヒアルロン酸が破壊されて、真皮を崩壊し、皮膚を乾燥させて、シワを発生させることを意味する。また、体内の自由ラジカルは、メラニン形成過程に関与して、チロシナーゼ （tyrosinase）を活性化させて染みとそばかすとを生成する原因にもなる。
【０００３】
日常生活において、我々は、活性酸素（reactive oxygen）によって起こる有害性に常に露出されており、老化による有害性は、漸進的に蓄積され、抗酸化能力が漸進的に減少する。一般の身体条件において、抗酸化保護システムは、酵素（例えば、superoxide dismutase(SOD)など）反応と、非酵素（例えば、ポリフェノール、フラボノイドなど）反応の経路として活性酸素を除去する。したがって、抗酸化活性を示すためには、ＳＯＤのような抗酸化酵素反応を活性化させるか、直接的な抗酸化作用を行う非酵素物質を摂取せねばならない。
【０００４】
皮膚健康及び抗酸化に係わるメカニズム研究が活発に進行されており、研究レベルの発達及び技術力増加によって生化学的効能、効果を有する素材を開発するための多数の研究が進められている。特に、植物由来素材は、安全性の側面で優秀性を認められて長期間用いられており、国内の場合、民間で用いられるか、あるいは漢方で用いられる植物及び生薬成分を主成分とした機能性素材開発が活発になされている。特に、植物由来有用物質（カロチノイド、フェノール化合物、ビタミンなど）を用いた皮膚老化防止、脱毛防止、抗酸化などの目的で化粧品分野で植物素材に係わる関心が高まっている。
【０００５】
しかし、植物は、成長速度が遅く、植物内の有用物質は、植物の特定機関内にのみ少量存在するか、品種によって二次代謝物質の種類及び含量が変わり、同種内でも季節、場所、気候、栽培条件、植物体部位などによって生産性が異なる特性がある。また、最近、名古屋議定書醗酵によって外国からの原料輸入が難しくなっている実情である。これにより、植物に依存した多様な有用物質（二次代謝産物）を生命工学的技術で生産しようとする多くの研究が試みられている。そのうち、最も効率的な生産法が植物細胞培養法である。この方法は、培養培地と培養環境及び多様な誘導因子（elicitor）処理などを通じて、効果的に二次代謝産物を生産することができる。また、自然環境の制約（農薬、重金属汚染、季節的支配など）を受けなくとも、植物が生産する有用物質を連続的にかつ安定的に量産可能なので、商業的に重要である。
【０００６】
ツボクサ（Centella asiatica(L.)Urban）は、セリ科の多年生植物であって、ねもとが横に伸びて育ち、節から根が生え、鱗のような葉がある。ツボクサは、主に高温多湿な所で自生するので、アフリカマダガスカル島、インド洋の海岸地域、インド南方及びマレーシア地域に分布し、韓国では、暖帯脂肪に属する済州島及び南部脂肪の島に極めて制限されて自生する。ツボクサ抽出物は、アジアチコシド(asiaticoside)、マデカソサイド(madecassoside)、アシアティック酸(asiatic acid)、マテカシン酸(madecassic acid)などを含んでおり、傷治療に卓越であり、抗痴呆及び胃膓病などに効果があって、疾病治療剤の原料として使用されている。
【０００７】
一方、韓国登録特許第１７３９４２２号には、「植物工場由来のツボクサ抽出物を有効成分とする皮膚改善用組成物及び増殖性皮膚疾患予防または治療用組成物」が開示されており、韓国登録特許第１８８１４１７号には、「メントール、イチョウの葉、アロエ、緑茶、ツボクサ及び何首烏抽出物を含む化粧料組成物」が開示されているが、本発明のツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有する皮膚美白及びシワ改善用化粧料組成物については開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記のような要求によって導出されたものであって、本発明者は、植物細胞培養技術で生産したツボクサ不定根の抽出物がツボクサ抽出物に比べて、酸化窒素(nitricoxide、NO)生成阻害能、自由ラジカル消去能だけではなく、メラニン及びマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloprotease、MMP）の生成阻害効果が顕著に優秀であることを確認することで、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するために、本発明は、ツボクサ（Centella asiatica）不定根抽出物を有効成分として含有する皮膚美白及びシワ改善用化粧料組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有する皮膚美白及びシワ改善用皮膚外用薬学組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有するメラニン色素の過剰沈着疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有するメラニン色素の過剰沈着予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のツボクサ不定根抽出物は、細胞毒性がなく、抗炎症及び抗酸化活性に優れ、メラニン色素の生成を阻害し、コラーゲンの前駆物質であるプロコラーゲンの生成を増進させる効果に優れるので、皮膚美白及びシワ改善用化粧料または皮膚外用剤などに有用に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ツボクサまたはツボクサ不定根の水またはエタノール抽出物のマウス大食細胞に係わる細胞毒性を確認した結果である。nor，無処理正常細胞；NMMA，Mono-methyl-L-arginine;indo，indomethacin.
【図２】ＬＰＳを処理したマウス大食細胞に、ツボクサまたはツボクサ不定根の水またはエタノール抽出物を処理し、酸化窒素(nitricoxide，NO)の生成レベルを分析した結果である。
【図３】ツボクサまたはツボクサ不定根の水またはエタノール抽出物のマウス黒色腫(melanoma)細胞に係わる細胞毒性を確認した結果である。
【図４】マウス黒色腫細胞に、ツボクサまたはツボクサ不定根の水またはエタノール抽出物を処理した後、メラニンレベルを測定した結果である。
【図５】紫外線を照射したヒト線維芽細胞に、ツボクサまたはツボクサ不定根の水またはエタノール抽出物を処理した後、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloprotease、ＭＭＰ）の生成量変化を分析した結果であり、Ａは、ＭＭＰ−１、Ｂは、ＭＭＰ−３に対する結果である。
【図６】紫外線を照射したヒト線維芽細胞に、ツボクサまたはツボクサ不定根の水またはエタノール抽出物を処理した後、プロコラーゲンの生成量を分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の目的を達成するために、本発明は、ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有する皮膚美白及びシワ改善用化粧料組成物を提供する。
【００１６】
ツボクサ不定根(adventitious root)は、野生ツボクサの組織一部を切り取って、無菌状態に器内導入して植物の全形成能(totipotency)によって形成される不定根を言い、ツボクサ不定根は、一定期間事前培養(seed culture)した後、生物反応器で本培養することで、量産可能であり、前記のような器内培養方法によって生産されたツボクサ不定根は残留農薬（例：Diazinon、DDT、Metalaxyl）や重金属（例：鉛、カドミウム）などの有害成分が根本的に排除され、自然状態の生育過程で発生可能な病虫害及びウイルスの感染から安全な長所がある。
【００１７】
本発明の一具現例による皮膚美白及びシワ改善用化粧料組成物において、前記抽出物は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールまたはその混合溶媒抽出物であり、望ましくは、エタノール抽出物であり、さらに望ましくは、乾燥されたツボクサ不定根重量に対して６０〜８０％（ｖ／ｖ）のエタノールを８〜１２倍添加し、２２〜２６時間の間、常温抽出したものであってもよいが、これに制限されない。
【００１８】
また、前記ツボクサ不定根抽出物は、抽出処理によって得られる抽出液；抽出液の希釈液または濃縮液；抽出液を乾燥して得られる乾燥物；調整剤物；または精製物のうちいずれか１つを含むこともできる。
【００１９】
本発明において、「美白」とは、皮膚の過剰色素沈着を抑制、阻害または緩和させることを言う。皮膚の過剰色素沈着は、そばかす、しみ、紫外線露出後の過剰色素沈着、炎症後過剰色素沈着、老人性ほくろ、ブラウンスポットまたは肝斑などを含む。
【００２０】
本発明において、「シワ改善」ということは、皮膚にシワが生成されることを抑制または阻害するか、既に生成されたシワを緩和させることを言う。本発明において、シワ生成は、コラーゲンの減少によって発生するものであり、前記コラーゲンの減少は、過度な酸化ストレスや紫外線照射が原因でもある。
【００２１】
本発明の化粧料組成物は、メラニン生成抑制能、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）生成抑制能、及びプロコラーゲン合成促進能の効果を有するツボクサ不定根の抽出物を有効成分として含んでいるので、皮膚美白及びシワ改善機能を有する化粧料組成物である。
【００２２】
また、本発明の前記ツボクサ不定根の抽出物は、ツボクサ抽出物に比べて、酸化窒素（ＮＯ）生成阻害能及び自由ラジカル消去能に優れていることが特徴である。
【００２３】
本発明の一具現例による化粧料組成物において、前記皮膚美白及びシワ改善用化粧料組成物は、スキン、スキンソフトナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、アイクリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディーローション、ボディクレンジャー、せっけん及びパウダーからなる群から選択されるいずれか１つの剤形を有することができるが、これらに制限されない。これらの各剤形からなる化粧料組成物は、その剤形の製剤化に必要であり、適切な各種の基剤と添加物を含むことができ、これらの成分の種類と量は、当業者によって容易に選定可能である。
【００２４】
本発明の化粧料組成物の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物纎維、植物纎維、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられる。
【００２５】
本発明の化粧料組成物の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶媒化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００２６】
本発明の化粧料組成物の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラカントなどが用いられる。
【００２７】
本発明の化粧料組成物の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホサクシネートモノエステル、アセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられる。
【００２８】
本発明の化粧料組成物の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられ、特に、スプレーである場合には、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン−ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。
【００２９】
本発明のツボクサ不定根抽出物は、化粧品として製品化される場合に、有効成分が短期間内に皮膚に留まるメークアップ除去剤、洗浄剤のようなウォッシュオフ(wash-off)タイプの化粧品の場合には、比較的に高い濃度で含まれるであろう。一方、有効成分が長期間皮膚に留まる化粧水、乳液、クリーム、エッセンスなどのリーブオン(leave-on)タイプの化粧品の場合には、ウォッシュオフタイプの化粧品に比べて低い濃度のツボクサ不定根抽出物を含んでもよい。
【００３０】
本発明はまた、ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有する皮膚美白及びシワ改善用皮膚外用薬学組成物を提供する。本発明による皮膚外用薬学組成物において、前記ツボクサ不定根抽出物は、ツボクサ不定根のエタノール抽出物でもあるが、これに制限されない。
【００３１】
また、本発明は、ツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有するメラニン色素の過剰沈着疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００３２】
本明細書において、用語「メラニン色素の過剰沈着(hyperpigmentation)」は、皮膚または指爪/足指爪の特定部位でメラニンの過度な増加によって、他の部位に比べて黒くあるいは暗くなることを意味する。前記メラニン色素の過剰沈着疾患は、そばかす、老人斑、肝斑、しみ、褐色斑または黒斑、日光色素斑、青色黒皮症（cyanic melasma）、薬物使用後の過剰色素沈着、姙娠性褐色斑（gravidic chloasma）、または擦傷及び火傷を含めた傷または皮膚炎による炎症後過剰色素沈着などを含むが、これに限定されない。
【００３３】
本発明の薬学組成物は、有効成分以外に薬学的に許容される担体を含み、かような担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。前記成分追加時には、複合使用による皮膚安全性、剤形化の容易性、有効成分の安定性が考えられる。
【００３４】
本発明の薬学組成物は、経口または非経口で投与することができ、非経口投与の場合、皮膚に局所的に塗布、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などで投与することができる。本発明の薬学組成物がメラニン色素の過剰沈着疾患を治療または予防のために適用される点を考慮すれば、皮膚に局所的に塗布されてなされることが望ましい。
【００３５】
本発明の薬学組成物は、当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施可能な方法によって、薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて製剤化することで、単位用量形態として製造されるか、あるいは大容量容器内に入れて製造される。その際、剤形は、注射剤、クリーム、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤及びカタプラズマ剤のうちから選択されたいずれか１つの剤形に製造され、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００３６】
本発明の薬学組成物は、有効量のツボクサ不定根抽出物を含むとき、望ましい皮膚美白及びシワ改善効果を提供することができる。本発明において、「有効量」とは、色素沈着を抑制するか、シワ改善効果を示すことができる抽出物の量を意味する。本発明の組成物に含まれるツボクサ不定根抽出物の有効量は、組成物が製品化される形態、ツボクサ不定根の抽出物が皮膚に適用される方法及び皮膚に留まる時間によって異なる。例えば、ツボクサ不定根抽出物が医薬品として製品化される場合には、日常的に皮膚に適用される化粧品として製品化される場合に比べて、高い濃度でツボクサ不定根抽出物を含むことができる。したがって、一日投与量は、ツボクサ不定根抽出物の量を基準に０．１ないし１００ｍｇ／ｋｇであり、望ましくは、３０ないし８０ｍｇ／ｋｇであり、さらに望ましくは、５０ないし６０ｍｇ／ｋｇであり、一日１〜６回投与可能である。本発明のツボクサ不定根抽出物を有効成分として含有する皮膚外用薬学組成物の望ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択可能である。
【００３７】
また、本発明は、ツボクサ不定根の抽出物を有効成分として含有するメラニン色素の過剰沈着予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【００３８】
本発明の健康機能食品組成物を食品添加物として使用する場合、前記健康機能食品組成物をそのまま添加するか、他の食品または食品成分と共に使用され、通常の方法によって適切に使用可能である。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善）によって適切に使用可能である。一般的に、食品または飲料の製造時、本発明の健康機能食品組成物は、原料に対して１５重量部以下、望ましくは、１０重量部以下の量が添加される。しかし、健康を目的とする長期間攝取の場合には、前記量は、前記範囲以下であり、安全性面で何らの問題もないので、有効成分は、前記範囲以上の量で使用可能である。
【００３９】
前記健康機能食品の種類には、特に制限はない。前記健康機能食品組成物を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、 キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康食品をいずれも含む。
【００４０】
また、本発明の健康機能食品組成物は、食品、特に機能性食品として製造可能である。本発明の機能性食品は、食品製造時に通常の添加される成分を含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素及び調味剤を含む。例えば、ドリンク剤として製造される場合には、有効成分以外に天然炭水化物または香味剤を追加成分として含めることができる。前記天然炭水化物は、モノサッカライド（例えば、グルコース、フルクトースなど）、ジサッカライド（例えば、マルトース、スクロースなど）、オリゴ糖、ポリサッカライド（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなど）、または糖アルコール（例えば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなど）であることが望ましい。前記香味剤は、天然香味剤（例えば、タウマチン、ステビア抽出物など）と合成香味剤（例えば、サッカリン、アスパルテームなど）を利用することができる。
【００４１】
前記健康機能食品組成物以外に様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などをさらに含むことができる。かような前記添加される成分比率は、それほど重要ではないが、本発明の健康機能食品組成物１００重量部に対して、０．０１ないし０．１重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【００４２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明の例示に過ぎず、本発明の内容が開示実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
製造例１．ツボクサ不定根抽出物の製造
【００４４】
（１）ツボクサ不定根７０％エタノール抽出物の製造
乾燥したツボクサ不定根（忠北大学校先端園芸技術開発センター提供）１０ｇに７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１００ｍｌを加えた後、２４時間常温抽出して０．４５μｍフィルターで濾過し、減圧濃縮及び熱風乾燥した。
【００４５】
（２）ツボクサ不定根水抽出物の製造
乾燥したツボクサ不定根１０ｇに精製水１００ｍｌを加えた後、２４時間常温抽出して０．４５μｍフィルターで濾過し、減圧濃縮及び熱風乾燥した。
【００４６】
（３）ツボクサ７０％エタノール抽出物の製造
乾燥したツボクサ葉（ピエールファーブル（フランス）から購入）１０ｇに７０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液１００ｍｌを加えた後、２４時間常温抽出して０．４５μｍフィルターで濾過し、減圧濃縮及び熱風乾燥した。
【００４７】
（４）ツボクサ水抽出物の製造
乾燥したツボクサ葉１０ｇに精製水１００ｍｌを加えた後、２４時間常温抽出して０．４５μｍフィルターで濾過し、減圧濃縮及び熱風乾燥した。
【００４８】
実施例１．細胞毒性測定
前記製造例１で製造したツボクサ不定根及びツボクサの水またはエタノール抽出物に対して細胞毒性を測定した。０．５μｇ/ｍｌ  ＬＰＳ(lipopolysaccharide)で炎症反応を誘発させたマウス大食細胞（ＲＡＷ２６４．７）を９６−ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルで分周して２４時間培養した後、ＮＭＭＡ  ５０μｇ/ｍｌ、インドメタシン(Indomethacin)２ng/ｍｌ及びそれぞれの抽出物試料を１００または２００μｇ/ｍｌで処理し、４８時間培養した後、ＭＴＴアッセイを行って細胞生存率を測定した。
【００４９】
その結果、図１に示されるようにツボクサまたはツボクサ不定根抽出物は、細胞毒性を示さないことが分かった。
【００５０】
実施例２．抗炎症活性分析
前記実施例１と同様に、ＬＰＳで炎症反応を誘発したＲＡＷ２６４．７細胞を９６−ウェルプレートに分周して２４時間培養し、ツボクサまたはツボクサ不定根の抽出物試料をそれぞれ処理し、４８時間培養した後、グリース試薬(Griessre agent)を用いてＮＯの生成量を測定した。
【００５１】
その結果、図２に示されたように、ＮＭＭＡ(Mono-methyl-L-arginine)処理区では、ＮＯ生成が抑制されていないが、インドメタシン処理区(indo)では、ＬＰＳ処理によって増加されたＮＯ生成が減少したことを確認した。また、ツボクサ不定根の７０％エタノール抽出物を処理した群でＮＯ生成が抑制されることを確認した。同一試料を使用したツボクサ不定根の水抽出物と、ツボクサの水抽出物及びエタノール抽出物は、いずれもＮＯ生成抑制活性がなかったことを確認した。
【００５２】
実施例３．抗酸化活性分析
製造例１で製造したツボクサまたはツボクサ不定根の７０％エタノール抽出物の抗酸化活性を分析した。簡単に、０．１ｍ  Ｍ  ＤＰＰＨ(2、2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)１９０μｌと抽出物試料１０μｌを混合した後、暗室で３０分間反応させた後、５１７ｎｍで吸光度を測定してラジカル消去能を評価した。
【００５３】
その結果、下記表１のようにツボクサ不定根の７０％エタノール抽出物がツボクサ７０％エタノール抽出物よりもＤＰＰＨラジカル消去活性が強く示されることが確認された。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
実施例４．美白効能評価
製造例１で製造した抽出物のメラニン合成抑制効果を評価するために、マウス黒色腫細胞(B-16melanomacell)を１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地を使用して培養し、６−ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェルで分周して２４時間培養した後、５０μｇ/ｍｌコウジ酸(kojic acid)、または５０、１００、及び２００μｇ/ｍｌ濃度の各抽出物を処理し、３日間培養した。培養後、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞にトリプシンを処理して培養容器から細胞を取り出して遠心分離して細胞沈殿物を得た。抽出されたメラニンに１Ｎ水酸化ナトリウム溶液１ｍｌを加えて約１０分間沸かしてメラニンを溶かし、４００ｎｍで吸光度を測定した。メラニン量は、合成メラニンを使用して作成された標準直線によって求め、実験群のメラニン量は、対照群のメラニン量に対する百分率で計算した。また、Ｂ−１６細胞に対する抽出物の毒性をＭＴＴアッセイを通じて分析した。
【００５６】
その結果、ツボクサまたはツボクサ不定根の水及び７０％エタノール抽出物はいずれも細胞毒性を示さず（図３）、ツボクサ及びツボクサ不定根の水抽出物は、メラニン合成抑制能がないことが確認された。しかし、ツボクサ不定根の７０％エタノール抽出物は、２００、１００、及び５０μｇ/ｍｌ濃度処理条件でそれぞれ７８．８、６５．１及び４６．８％のメラニン合成抑制効果を示し、ツボクサ７０％エタノール抽出物は、２００、１００、及び５０μｇ/ｍｌ濃度処理条件でそれぞれ２９．１、２２．５及び０％のメラニン合成抑制効果を示し、ツボクサ不定根のエタノール抽出物がツボクサエタノール抽出物に比べて、メラニン合成抑制効果が顕著に優秀であることを確認できた（図４）。
【００５７】
また、ツボクサ不定根のエタノール抽出物とツボクサエタノール抽出物のチロシナーゼ活性阻害能を分析した。簡単に、０．１Ｍ燐酸ナトリウムバッファ２２０μｌと２００μｇ/ｍｌの抽出物試料２０μｌを混合した後、１．５ｍＭＬ−チロシン４０μｌ、１、５００ｕｎｉｔ／ｍｌで製造されたキノコチロシナーゼ (mushroom tyrosinase)２０μｌを添加し、３７℃で１５分間反応させた後、４９０ｎｍで吸光度を測定して生成されたドーパクロム(dopachrome)の量を評価した。その結果、下記表２に示されるように、ツボクサ不定根７０％エタノール抽出物のチロシナーゼ活性阻害能が、ツボクサ７０％エタノール抽出物と有意的な差を示していないことを確認した。
【００５８】
前記結果から、ツボクサ不定根の７０％エタノール抽出物は、メラニン色素の合成を阻害する効果が優秀であるが、チロシナーゼ酵素の活性抑制による効果ではない、他のメカニズムによる効果であることを類推することができた。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
実施例５．シワ改善効能評価
製造例１で製造した抽出物のシワ改善効能を確認するために、マトリックスメタロプロテアーゼ−１(matrix metalloprotease-1、MMP-1)及びＭＭＰ−３タンパク質の合成阻害効果とプロコラーゲンタンパク質の合成促進効果とを分析した。簡単に、４０ｍｍ細胞培養皿に２ｍｌのＤＭＥＭ培養液を入れ、ヒト線維芽細胞(fibroblast cell)を約１．２×１０５細胞／ｄｉｓｈの濃度に接種した後、３７℃、５％二酸化炭素環境で２４時間培養した。その後、ＵＶＢを１４４ｍＪ／ｃｍ２条件で照射した後、各抽出物試料を含む培地に交替して３日間培養した。以後、細胞培養液を回収して４℃、７，５００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を回収し、Human total MMP-1/3キット(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)を使用してＭＭＰ−１とＭＭＰ−３のタンパク質発現量の変化を確認した。
【００６１】
その結果、紫外線照射処理したヒト線維芽細胞は、紫外線無処理群に比べて、ＭＭＰ−１タンパク質の生成量が約２倍増加し、紫外線照射処理によるＭＭＰ−１タンパク質の増加された生成量は、ツボクサ不定根のエタノール抽出物またはツボクサエタノール抽出物を２００μｇ/ｍｌ濃度で処理した後、それぞれ５８．６％及び２３．１％レベルに減少することが確認され、特に、ツボクサ不定根のエタノール抽出物は、紫外線無処理群と類似したレベルを示すことが分かり、それを通じてツボクサ不定根のエタノール抽出物がＭＭＰ−１の生成を非常に効果的に阻害することが分かった（図５Ａ）。ＭＭＰ−３タンパク質の生成量においてもツボクサ不定根のエタノール抽出物またはツボクサエタノール抽出物の２００μｇ/ｍｌ処理条件でそれぞれ３６．９％及び２２．３％のＭＭＰ−３タンパク質生成阻害効果があることを観察した（図５Ｂ）。特に、同じツボクサ不定根を使用したが、水で抽出した場合には、このようなＭＭＰタンパク質の生成阻害効果が確認されないことが観察され、このような結果を通じて、本発明のツボクサ不定根のエタノール抽出物は、シワ生成の原因となるＭＭＰ−１とＭＭＰ−３タンパク質の生成を効果的に抑制して皮膚シワの予防及び改善に効率よく使用可能であるということを確認した。
【００６２】
また、本発明の各抽出物がコラーゲン生成に与える影響を確認するために、前記ＭＭＰタンパク質の生成阻害効果を確認した実験条件と同一細胞を準備し、ＵＶＢ照射された細胞培養液でタイプＩプロコラーゲンのタンパク質発現量変化をProcollagen Type I C Peptide EIA  キット(Takara、Shiga、Japan)を用いて確認した。
【００６３】
その結果、紫外線照射処理したヒト線維芽細胞は、紫外線無処理群に比べて、タイプ１プロコラーゲンタンパク質の生成が顕著に減少し、このように減少したタイプ１プロコラーゲンタンパク質の生成量は、ツボクサ不定根のエタノール抽出物またはツボクサエタノール抽出物を２００μｇ/ｍｌで処理した条件でそれぞれ３１９．４％と２６６．２％増加することが確認された（図６）。ＭＭＰタンパク質の生成阻害能実験のように、ツボクサ不定根の水抽出物は、プロコラーゲンの生成増進効果が確認されていない。前記結果から、本発明のツボクサ不定根の７０％エタノール抽出物は、タイプ１プロコラーゲンの生成を促進させ、コラーゲン分解酵素であるＭＭＰ−１とＭＭＰ−３の発現を抑制する作用を通じて、シワ生成を効果的に予防し、生成されたシワを改善する効果があることを確認することができた。
【００６４】
＜剤形例１＞柔軟化粧水（スキン）の製造
下記のように、製造例１−（１）で修得したツボクサ不定根エタノール抽出物を含有した柔軟化粧水（スキン）を、通常の方法によって下記表の組成で製造した。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
＜剤形例２＞栄養化粧水（ローション）の製造
下記のように、製造例１−（１）で修得したツボクサ不定根エタノール抽出物を含有した栄養化粧水（ローション）を、通常の方法によって下記表の組成で製造した。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
＜剤形例３＞ 栄養クリームの製造
下記のように、製造例１−（１）で修得したツボクサ不定根エタノール抽出物を含有した栄養クリームを、通常の方法によって下記表の組成で製造した。
【００６９】
【表５】
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【００７０】
＜剤形例４＞  エッセンスの製造
下記のように、製造例１−（１）で修得したツボクサ不定根エタノール抽出物を含有したエッセンスを、通常の方法によって下記表の組成で製造した。
【００７１】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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