(57)【要約】  本発明は、二硫化結合異性化酵素信号ペプチド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組み換えベクターおよびその用途に関し、より具体的に、本発明の組み換えベクターを用いる場合、大腸菌発現システムを通じてメチオニンからアミノ酸配列が始まらないタンパク質を生産することができるという長所がある。これにより、商業的に用いるために、グリコシル化反応などのようなさらなる過程を経なければならない必要がないので、将来に疾病治療剤の開発などの多様な目的で有用に用いられるものと期待される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二硫化結合異性化酵素信号ペプチド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を暗号化する塩基配列を含むことを特徴とする組み換えベクター。
【請求項２】
前記二硫化結合異性化酵素信号ペプチドは、配列番号１０、１２、１４、および１６よりなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の組み換えベクター。
【請求項３】
前記組み換えベクターは、チモシンベータ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｂｅｔａ  ４）を暗号化する塩基配列をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換えベクター。
【請求項４】
前記チモシンベータ４は、配列番号２の塩基配列で暗号化されることを特徴とする請求項３に記載の組み換えベクター。
【請求項５】
前記組み換えベクターは、配列番号３で表されるＥｃｏＲＩ、配列番号４で表されるＴａｃプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、配列番号５で表されるＬａｃオペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、および配列番号６で表されるＸｈｏＩよりなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換えベクター。
【請求項６】
二硫化結合異性化酵素信号ペプチド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を暗号化する塩基配列およびチモシンベータ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｂｅｔａ  ４）を暗号化する塩基配列を含むことを特徴とする、組み換えベクター。
【請求項７】
前記二硫化結合異性化酵素信号ペプチドは、配列番号１０、１２、１４、および１６よりなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項６に記載の組み換えベクター。
【請求項８】
前記チモシンベータ４は、配列番号２の塩基配列で暗号化されることを特徴とする請求項６に記載の組み換えベクター。
【請求項９】
前記組み換えベクターは、配列番号３で表されるＥｃｏＲＩ、配列番号４で表されるＴａｃプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、配列番号５で表されるＬａｃオペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、および配列番号６で表されるＸｈｏＩよりなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の組み換えベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
前記形質転換体は、大腸菌であることを特徴とする請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
（ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の組み換えベクターを製作する段階と；
（ｂ）前記組み換えベクターで大腸菌を形質転換する段階と；
（ｃ）前記大腸菌を培地に培養する段階と；
を含むチモシンベータ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｂｅｔａ  ４）タンパク質の生産方法であって、
前記チモシンベータ４タンパク質は、メチオニンでなくアミノ酸配列から始まることを特徴とする生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二硫化結合異性化酵素信号ペプチド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組み換えベクターおよびその用途に関する。
【０００２】
本出願は、２０１８年１月２６日に出願された韓国特許出願第１０−２０１８−００１００５５号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は、本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
研究、治療、またはその他商業的目的などの多様な目的で組み換えタンパク質を大量生産するために、現在多様なベクターと宿主が用いられているが、その中でも、大腸菌発現システムを用いて必要なタンパク質を発現させた後、これを精製する方法は、少ない費用と努力で大量のタンパク質を得ることができるという長所を有していて、有用に活用されている。
【０００４】
しかしながら、哺乳動物と細菌の細胞内に環境差異が存在するので、このように大腸菌システムを用いて様々な種類のヒトタンパク質を得ようとするときには、それぞれのタンパク質に対して特定の発現および精製条件を確立する必要がある。特に、大腸菌で生産されるすべてのタンパク質のアミノ酸配列は、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ；Ｍｅｔ）から始まるが、これに対し、人体内で発見されたり高等化された生物体で発現するタンパク質は、タンパク質翻訳後修飾作業（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を通じてタンパク質分解酵素により分解されて活性化されたり、糖鎖を付加する糖化作用（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化作用、アセチル化、カルボキシ化など多様なタンパク質変形作業が行われる。したがって、商業化された多くのタンパク質のアミノ酸配列は、メチオニンから始まらないところ、これにより、大腸菌で生産されるタンパク質は、酵素反応によるタンパク質切断などのようなさらなる過程を経なければならないという短所がある。
【０００５】
なお、チモシンベータ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｂｅｔａ  ４；ＴＢ４）は、血管新生、傷治癒、および毛髪成長などに効能を発揮することが知られていて、現在虚血性心臓疾患、角膜損傷、眼球疾患および水疱性表皮剥離症など多様な疾病の治療剤に用いるための臨床実験およびＦＤＡ承認審査が進行中にあり、脱毛治療剤への開発も予想されている。
【０００６】
このように、チモシンベータ４は、多様な疾病の治療剤として利用可能性が高いので、将来に治療用ペプチドとして発売されれば、莫大な需要があると予想されているが、合成により前記ペプチドを生産する場合には、高価な生産費が要求され、大腸菌のような宿主（ホスト菌株）で発現させる場合は、メチオニンから始まるタンパク質配列を修飾するために、生産後に酵素反応により切断するなどのさらなる作業が必要であるという問題点があるが、まだこれに関する研究が不十分である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記のような従来の問題点を解決するために鋭意研究努力した結果、二硫化結合異性化酵素信号ペプチド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組み換えベクターを用いる場合、大腸菌発現システムを通じてメチオニンでなく所望のアミノ酸配列から始まるタンパク質を生産できることを確認し、これに基づいて本発明を完成した。
【０００８】
これより、本発明は、二硫化結合異性化酵素信号ペプチドを暗号化する塩基配列を含むことを特徴とする組み換えベクターを提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、二硫化結合異性化酵素信号ペプチドおよびチモシンベータ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｂｅｔａ  ４）を暗号化する塩基配列を含むことを特徴とする組み換えベクターを提供することを他の目的とする。
【００１０】
また、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することをさらに他の目的とする。
【００１１】
また、本発明は、前記組み換えベクターで大腸菌を形質転換した後、培地に培養する段階を含むチモシンベータ４タンパク質の生産方法を提供することをさらに他の目的とする。
【００１２】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、二硫化結合異性化酵素信号ペプチド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組み換えベクターおよびその用途に関し、本発明は、二硫化結合異性化酵素信号ペプチドを暗号化する塩基配列を含むことを特徴とする組み換えベクターを提供する。
【００１４】
また、本発明は、二硫化結合異性化酵素信号ペプチドおよびチモシンベータ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｂｅｔａ  ４）を暗号化する塩基配列を含むことを特徴とする組み換えベクターを提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記組み換えベクターで大腸菌を形質転換した後、培地に培養する段階を含むチモシンベータ４タンパク質の生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の二硫化結合異性化酵素信号ペプチド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組み換えベクターを用いる場合、大腸菌発現システムを通じてメチオニンでなくアミノ酸配列から始まるタンパク質を生産できるところ、これにより、商業的に用いるためにタンパク質分解酵素（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）処理などのようなさらなる過程を経なければならない必要がないという長所がある。特に、その間、チモシンベータ４は、多様な疾病の治療剤として利用可能性が高いにも関わらず、宿主（ホスト菌株）で発現する場合、細胞内タンパク質分解酵素により分解されて生産が不可能であるという問題点を有していた。本発明は、大腸菌発現システムを通じて前記チモシンベータ４の生産を可能にしたところ、将来に虚血性心臓疾患、角膜損傷、眼球疾患および水疱性表皮剥離症だけでなく、脱毛治療剤の開発において有用に活用され得、また、本発明の大腸菌発現システムは、骨粗しょう症の治療に用いる副甲状腺ホルモン（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ＧＣＳＦ）など多様な治療用タンパク質の生産に適用できるので、有用な技術として拡大利用され得るものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、合成されたプラスミドであるＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４のＤＮＡ配列とＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅをアラインメント（Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）して確認した結果を図式化して示すものである。
【図２】図２は、ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４のベクターマップ（ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｐ）を示すものである。
【図３】図３は、形質転換された大腸菌株ＢＬ２１の成長程度を図式化して示すものである。
【図４】図４は、ＩＰＴＧ  １．０ｍＭでチモシンベータ４（ＴＢ４）タンパク質の発現を誘導した結果を図式化して示すものである。
【図５】図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで形質転換されたターゲットタンパク質のバンド（Ｂａｎｄ）を確認した結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、二硫化結合異性化酵素信号ペプチド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組み換えベクターを用いる場合、大腸菌発現システムを通じてメチオニンからアミノ酸配列が始まらないタンパク質を生産することができることを確認し、これに基づいて本発明を完成した。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、二硫化結合異性化酵素信号ペプチドを暗号化する塩基配列を含むことを特徴とする組み換えベクターを提供する。
【００２２】
また、本発明は、二硫化結合異性化酵素信号ペプチドのカルボキシル末端（Ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ）にチモシンベータ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｂｅｔａ  ４）が結合されている配列番号７の塩基配列を含むことを特徴とする組み換えベクターを提供する。
【００２３】
本発明において「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、ＤＮＡ組み換え実験において目的とするＤＮＡ断片を宿主菌などに導入させ、増殖しうるＤＮＡを示し、クローニング運搬体（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｈｉｃｌｅ）ともいうが、ベクターＤＮＡは、制限酵素などで切断して開環し、これに目的とするＤＮＡ断片を挿入して連結して宿主菌に導入させる。目的ＤＮＡ断片を連結したベクターＤＮＡは、宿主菌が増殖するにつれて複製して、菌の分裂と共に各娘細胞に分配されて、目的ＤＮＡ断片を代々維持して連続していくことになり、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、ファージ染色体を主に使用する。
【００２４】
本発明において「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」とは、細胞内で世代を通じて安定に子孫に維持、伝達されるが、染色体とは別個に存在し、自律的に増殖する遺伝子を総称するが、ただし、真核細胞のミトコンドリアや葉緑体などに含まれるＤＮＡは、一般的にオルガネラＤＮＡと呼ばれ、これと区別される。前記遺伝子の存在は、通常、細胞の生存において必ず必須なものではないが、細菌細胞では、接合伝達（Ｆ因子）、抗生物質などに対する抵抗性（Ｒ因子）、抗菌物質（バクテリオシン）の合成（コリシン因子）などの機能を有する。また、土壌細菌に存在するＴｉプラスミドのように植物細胞を腫瘍化するものもあり、自分自身が伝達機構を有しなくても、伝達性因子が共存すると、共に伝達される場合、あるいは、共存しても、伝達されないものなど様々な形態が発見されている。組織変換ＤＮＡ実験（遺伝子操作技術）でのベクターとして頻繁に使用されている。
【００２５】
本発明において「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とは、構造遺伝子（ｇｅｎｅ）の上部側に連結されている遺伝体（ｇｅｎｏｍｅ）部位であって、これに連結された構造遺伝子がｍＲＮＡに転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）されるように調節する役割をする。プロモーターには、様々な一般転写因子（ｇｅｎｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）が結合することによって活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）されるが、通常、遺伝子発現を調節するＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス部位、外部刺激に反応して遺伝子発現に影響を与える部位および位置と方向に関係なくほぼすべての遺伝子の発現を促進するエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）などからなる。生体の基本代謝に必要なタンパク質は、細胞内で一定の濃度を維持しなければならないので、これらの遺伝子に連結されたプロモーターは、一般転写因子の作用だけでも常時活性化されている。これに対し、普段のときには役割がなく、特殊な状況下だけで機能が要求されるタンパク質は、当該構造遺伝子の発現を誘導する組織特異プロモーター（ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）または誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が連結されている。すなわち、組織特異プロモーターは、生物体の発達過程で、誘導性プロモーターは、周辺からの環境的要因から来る外部刺激により活性化した特異転写因子（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）が結合することによって活性化される。
【００２６】
本発明において「オペレーター（ｏｐｅｒａｔｏｒ）」とは、作動遺伝子とも呼ばれ、細菌の遺伝子調節時に特定遺伝子の発現を調節する役割を担当する。主に構造遺伝子の側方に位置しており、特定の状況で必要な遺伝子が発現したり発現しないように調節する役割をする。
【００２７】
本発明において「組み換えベクター」とは、宿主細胞で目的タンパク質または目的ＲＮＡを発現できるベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物を意味し、より具体的に、プロモーターおよび前記プロモーターと作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）されている目的タンパク質を暗号化する遺伝子塩基配列が挿入または導入され得る、この技術分野に公知となったプラスミド、ウイルスまたはその他の媒介体を意味する。
【００２８】
また、本発明は、本発明により製造された組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００２９】
本発明において「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、外部から与えられた遺伝物質であるＤＮＡにより個体または細胞の形質が遺伝的に変化することを意味する。
【００３０】
本発明の他の様態として、（ａ）本発明の組み換えベクターを製作する段階と；（ｂ）前記組み換えベクターで大腸菌を形質転換する段階と；（ｃ）前記大腸菌を培地に培養する段階と；を含む、形質転換タンパク質の生産方法を提供する。
【００３１】
本発明の一実施例では、信号ペプチド（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）のＤｓｂＣ−ＳＰ（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のカルボキシル末端（Ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ；Ｃ−ｔｅｒｍ）側にチモシンベータ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｂｅｔａ  ４；ＴＢ４）が結合されているＤＮＡ配列（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とｐＧＥベクターを用いてプラスミドを製作した（実施例１参照）。
【００３２】
本発明の他の実施例では、前記製作されたプラスミドを用いて形質転換された大腸菌株ＢＬ２１およびＤＨ５αを製作し（実施例２参照）、前記形質転換された大腸菌株ＢＬ２１の成長を確認した（実施例３参照）。
【００３３】
本発明のさらに他の実施例では、前記形質転換された大腸菌株でＴＢ４が発現することを確認した（実施例４参照）。
【００３４】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【００３５】
実施例１．プラスミド製作
チモシンベータ４（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｂｅｔａ  ４；ＴＢ４）を発現するようにするプラスミドを合成するために、信号ペプチド（Ｓｉｇｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）のＤｓｂＣ−ＳＰ（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｃ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のカルボキシル末端（Ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ；Ｃ−ｔｅｒｍ）側にＴＢ４が結合されているＤＮＡ配列（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とｐＧＥベクターを用いて、ベクターに前記ＤＮＡ配列が挿入されたプラスミドを合成した。
【００３６】
プラスミド合成のための塩基配列は、下記表１に示された通りである。
【００３７】
【表１】
2021511825.tif 000003
【００３８】
前記合成されたプラスミドのＤＮＡ配列とＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅをアラインメントして一致することを確認した結果（Ｈｔｔｐ：／／Ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／）、図１に示されたように、１００％一致した。
【００３９】
また、図２に示されたようなベクターマップ（ｖｅｃｔｏｒ  ｍａｐ）を確認することができ、合成されたプラスミドは、「ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４」と命名した。
【００４０】
実施例２．形質転換された大腸菌株の製作
前記実施例１の方法によって製作されたプラスミドを用いて、下記実験を行って、形質転換された大腸菌株を製作した。
【００４１】
２−１．ＬＢ培地の準備
ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ  ｍｅｄｉａ  ｂｒｏｔｈ；ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ）を準備するために、三次純水８００ｍＬを２Ｌビーカー（ｂｅａｋｅｒ）に入れ、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  ２５．０３ｇを測定して、前記２Ｌビーカーに入れた後、完全に溶けるまで撹拌した。次に、三次純水を追加して、最終体積が１Ｌになるように調整し、２Ｌボトルに移して入れて、１２１℃、３０分の条件で滅菌した。
【００４２】
２−２．カナマイシンを添加したＬＢ寒天平板の準備
ＬＢ寒天平板（Ａｇａｒ  Ｐｌａｔｅ）を準備するために、三次純水３００ｍＬを２Ｌビーカーに入れ、ＬＢ寒天１９．９８ｇを前記２Ｌビーカーに入れた後、完全に溶けるまで撹拌した。次に、三次純水を追加して最終体積が５００ｍＬになるように調整し、２Ｌボトルに移して入れて、１２１℃、３０分の条件で滅菌した。次に、高圧蒸気滅菌器（Ａｕｔｏｃｌａｖｅ）の温度が４０〜５０℃であるときに取り出して、クリーンベンチに移して、濃度が５０μｇ／ｍＬになるようにカナマイシン（ストック濃度５０ｍｇ／ｍＬ）を５００μＬ添加した。ＬＢ寒天溶液（Ａｇａｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をペトリ皿（Ｐｅｔｒｉ  Ｄｉｓｈ）に約２０ｍＬずつ分注し、ペトリ皿のＬＢ寒天が固まるまでクリーンベンチ内で乾燥させた後、十分に乾燥されたペトリ皿は、ラップで包んで最大１ヶ月間冷蔵保管（２〜８℃）した。
【００４３】
２−３．タンパク質発現のための形質転換大腸菌株の製作
まず、前記実施例１の方法で合成されたプラスミド（ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４）を用いてターゲットタンパク質発現のために形質転換された大腸菌株ＢＬ２１（ＢＬ２１／ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４）を製作するために、Ｕｓｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＴＢ００９（Ｎｏｖａｇｅｎ）によって形質転換を行い、前記形質転換された菌株の培養は、カナマイシンが５０μｇ／ｍＬで添加されたＬＢ寒天平板にスプレッディングして、３７℃に設定されたインキュベーターで一晩中（１４時間）培養した。
【００４４】
前記形質転換された大腸菌株ＢＬ２１がカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が添加されたＬＢ寒天平板でコロニーが生成されたことを確認し、ループ兼用ニードル（Ｌｏｏｐ  ａｎｄ  Ｎｅｅｄｌｅ）でＢＬ２１／ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４の単独コロニー（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｏｎｙ）を採集した。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が添加されたＬＢ寒天平板は、パラフィルムで密封（Ｓｅａｌｉｎｇ）して、最大１ヶ月間冷蔵保管（２〜８℃）した。
【００４５】
次に、前記採集したＢＬ２１／ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４をＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  ４ｍＬが入れられた１４ｍＬ丸底チューブに接種し、３７℃、２００ｒｐｍに設定した振とう培養器（Ｓｈａｋｉｎｇ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で一晩中（１４時間）培養し、培養液２００μＬをＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  １００ｍＬが入れられた２５０ｍＬフラスコに接種した後、３０分間隔でＯＤ６００値を測定して、ＯＤ６００＝約０．２になったとき、培養を終了した。４０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して、大腸菌株を回収したが、ＯＤ６００＝１．０になるようにする体積を下記計算式のように計算した。
（ＯＤ６００＝１．０になる体積）＝（培養終了時の体積）×（培養終了時点のＯＤ６００値）
【００４６】
滅菌されたグリセロールが１５％になるように入れたＬＢ  Ｂｒｏｔｈを上記の式によって計算された体積で入れて、ペレットを再浮遊（Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した後、２００μＬずつ滅菌されたマイクロチューブにアリコート（Ａｌｉｑｕｏｔ）して、冷凍冷蔵庫(Ｄｅｅｐ  Ｆｒｅｅｚｅｒ)（−８０℃〜−７０℃）またはＬＮ２タンク（−１９６℃）に保管した。
【００４７】
次に、同じ方法でＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４プラスミドを用いてプラスミドＤＮＡの大量生産のために形質転換された大腸菌株ＤＨ５α（ＤＨ５α／ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４）を製作した結果、コロニーが生成された平板を確保した。
【００４８】
このように製作されたＤＨ５α／ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４は、前記ＢＬ２１／ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４の単独コロニーと同じ過程を経て冷凍冷蔵庫（−８０℃〜−７０℃）またはＬＮ２タンク（−１９６℃）に保管した。
【００４９】
実施例３．製作された大腸菌株の成長確認
前記実施例２の方法によって製作された大腸菌株ＢＬ２１の成長を確認するために、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  ２０ｍＬとカナマイシンストック（５０ｍｇ／ｍｌ）２０μＬを５０ｍＬコニカルチューブに入れた。冷凍冷蔵庫に保管されていたＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４  １バイアルを取り出した後、３７℃に設定された恒温水槽（Ｗａｔｅｒ  Ｂａｔｈ）で２〜３分間前記バイアルを解凍（Ｔｈａｗｉｎｇ）した。ＬＢ  Ｂｒｏｔｈおよびカナマイシンが入れられた５０ｍＬ前記コニカルチューブに解凍した細胞を接種し、３７℃振とう培養器で２００ｒｐｍで３時間培養した。次に、培養液２．５ｍＬをＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  ２５０ｍＬが入れられたＢａｆｆｌｅｄ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  Ｆｌａｓｋに接種し、接種以後から１時間ごとに培養液１ｍＬを標本抽出（Ｓａｍｐｌｉｎｇ）した。前記抽出した培養液のＯＤ６００値をＵＶ分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で測定し、測定されたＯＤ６００値が０．８以上である場合、希釈して再測定した。
【００５０】
その結果、図３に示されたように、合成されたプラスミド（ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４）を用いて形質転換された大腸菌株ＢＬ２１（ＢＬ２１／ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４）の培養６時間目に、ＯＤ６００値が約２．５まで成長することを確認することができた。
【００５１】
実施例４．製作された大腸菌株でＴＢ４の発現確認
４−１．ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４の発現確認
前記実施例２の方法によって製作された大腸菌株でチモシンベータ４（ＴＢ４）タンパク質の発現を確認するために、ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４細胞ストックをカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が添加されたＬＢ培地２０ｍＬに解凍した。次に、３７℃、２００ｒｐｍに設定された振とう培養器で３時間培養した後（１次種培養液）、前記１次種培養液をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が添加されたＬＢ培地２０ｍＬに１／１０，０００で希釈（Ｄｉｌｕｔｉｏｎ）した後、一晩中培養した（２次種培養液）。ＬＢ  ２５０ｍＬに前記２次種培養液２．５ｍＬを接種し、３７℃、２００ｒｐｍに設定された振とう培養器でさらに培養して、１時間ごとにＯＤ６００値を測定した。
【００５２】
前記測定したＯＤ６００値が０．６に到達すると、ＩＰＴＧを１．０ｍＭになるように添加して誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）し、 誘導以後３時間目に培養を終了した。培養液のうち１０ｍＬを４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞を回収し、Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ  Ｂ−ＰＥＲ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＲｅａｇｅｎｔによってペレットをＢ−ＰＥＲで破砕した後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液のみを分離した。前記分離した上澄み液を４ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒと１：３の割合で混ぜて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用標本（Ｓａｍｐｌｅ）を作って、ゲル（Ｇｅｌ）にローディングした後、２００Ｖで３０分間電気泳動し、３０分間クマシー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）した後、脱色（Ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ）した。その後、Ｇｅｌ−ｄｏｃを用いてターゲットタンパク質バンドを分析した。
【００５３】
タンパク質の発現を誘導した場合に、ＢＬ２１／ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４の成長程度は、図４に示された通りである。
【００５４】
４−２．ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４のＮ−ｔｅｒｍ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ＤｓｂＣ−ＳＰ  ＴＢ４細胞ストックをカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が添加されたＬＢ培地２０ｍＬに解凍し、３７℃、２００ｒｐｍに設定された振とう培養器で３時間培養（１次種培養液）した。次に、前記１次種培養液をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が添加されたＬＢ培地２０ｍＬに１／１０，０００で希釈後、一晩中培養（２次種培養液）した。ＬＢ  ２５０ｍＬに前記２次種培養液２．５ｍＬを接種し、３７℃、２００ｒｐｍに設定された振とう培養器でさらに培養して、１時間ごとにＯＤ６００値を測定した。
【００５５】
前記測定したＯＤ６００値が０．６に到達すると、ＩＰＴＧを１．０ｍＭになるように添加して誘導し、誘導以後３時間目に培養を終了した。培養液のうち１０ｍＬを４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞を回収し、Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ  Ｂ−ＰＥＲ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＲｅａｇｅｎｔによってペレットをＢ−ＰＥＲで破砕した後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液のみを分離した。前記分離した上澄み液を４ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒと１：３の割合で混ぜて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用標本（Ｓａｍｐｌｅ）を作って、ゲル（Ｇｅｌ）にローディングした後、２００Ｖで３０分間電気泳動した。ＰＶＤＦメンブレンにトランスファー（Ｔｒａｎｓｆｅｒ）し、ポンソー (Ｐｏｎｃｅａｕ)でメンブレンを染色して、形質転換されたターゲットタンパク質のバンド（Ｂａｎｄ）を確認した。
【００５６】
その結果、図５に示されたように、ＴＢ４スタンダードと同じ位置に誘導されたバンドが現れることを確認し、各レーンの詳細は、下記表２に示された通りである。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
また、前記確認されたＥｘｐｅｃｔｅｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｂａｎｄ  Ｓｉｚｅ（５〜６ｋＤａ）に該当するタンパク質Ｎ−ｔｅｒｍの１０個のアミノ酸に対する配列を分析した結果、下記表３に示されたように、ＷＴ（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）＿ＴＢ４のものと一致した。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
一方、ＷＴ＿ＴＢ４のアミノ酸配列は、下記表４に示された通りであり、特にＢｏｌｄ体で表記された部分は、Ｎ−ｔｅｒｍアミノ酸１０個の配列を意味する。
【００６１】
【表４】
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【００６２】
上記より、前記実施例２の方法によって製作された大腸菌株は、ＷＴ＿ＴＢ４の配列を有するプラスミドで形質転換され、ＷＴ＿ＴＢ４を発現する菌株であることが分かる。
【００６３】
参考として、本発明の二硫化結合異性化酵素信号ペプチドの塩基配列およびアミノ酸配列は、下記表５に示されたが、これに限定されるものではない。
【００６４】
【表５】
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【００６５】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の二硫化結合異性化酵素信号ペプチド（Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む組み換えベクターを用いる場合、大腸菌発現システムを通じてメチオニンでなくアミノ酸配列から始まるタンパク質を生産できるところ、これにより、商業的に用いるためにタンパク質分解酵素（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）の処理などのようなさらなる過程を経なければならない必要がないという長所がある。特に、チモシンベータ４は、その間、多様な疾病の治療剤として利用可能性が高いにも関わらず、宿主（ホスト菌株）で発現する場合、細胞内タンパク質分解酵素により分解されて生産が不可能であるという問題点を有していた。本発明は、大腸菌発現システムを通じて前記チモシンベータ４の生産を可能にしたところ、将来に虚血性心臓疾患、角膜損傷、眼球疾患および水疱性表皮剥離症だけでなく、脱毛治療剤の開発において有用に活用され得、また、本発明の大腸菌発現システムは、骨粗しょう症の治療に用いる副甲状腺ホルモン（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、ヒト成長ホルモン（ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ＧＣＳＦ）など多様な治療用タンパク質の生産に適用することができるので、有用な技術として拡大利用され得るものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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