(57)【要約】  本発明は、有機酸耐性酵母においてＡＤＨ遺伝子発現を調節する新規プロモーター及びこれを用いた有機酸生成関連遺伝子の発現を用いた、有機酸の製造方法に関し、本発明に係る新規プロモーターを用いて、有機酸耐性酵母において有機酸生成関連目的遺伝子を発現させる場合、有機酸に対して耐性を持ちながら、菌株の成長能が阻害されず、有機酸を高い効率で生産できる長所がある。【選択図】図８
2021520835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２の塩基配列で表示されるプロモーター。
【請求項２】
請求項１のプロモーターを含む組換えベクター。
【請求項３】
配列番号３又は配列番号４で表示されるターミネーターをさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
目的タンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項２に記載の組換えベクター。
【請求項５】
前記目的タンパク質は、有機酸生産に関与するタンパク質であることを特徴とする、請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
目的タンパク質は、マロニル−ＣｏＡ−レダクターゼ又はラクテートデヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか一項の組換えベクターが導入されている組換え微生物。
【請求項８】
酵母であることを特徴とする、請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
耐酸性酵母ＹＢＣ（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）であることを特徴とする、請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
次の段階を含む有機酸の製造方法：
（ａ）請求項５の組換えベクターが導入されている組換え微生物を培養して有機酸を生成する段階；及び
（ｂ）生成された有機酸を得る段階。
【請求項１１】
耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてｇ４４２３遺伝子が欠失又は弱化して、エタノール生成能が減少されていることを特徴とする組換え菌株。
【請求項１２】
配列番号１の塩基配列で表示されるプロモーターと目的タンパク質をコードする遺伝子が作動可能に連結されている遺伝子構造物。
【請求項１３】
配列番号３又は配列番号４で表示されるターミネーターをさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の遺伝子構造物。
【請求項１４】
前記目的タンパク質は、有機酸生産に関与するタンパク質であることを特徴とする、請求項１２に記載の遺伝子構造物。
【請求項１５】
前記目的タンパク質は、マロニル−ＣｏＡ−レダクターゼ又はラクテートデヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項１２に記載の遺伝子構造物。
【請求項１６】
請求項１２の遺伝子構造物が染色体上に導入されている組換え微生物。
【請求項１７】
酵母であることを特徴とする、請求項１６に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
耐酸性酵母ＹＢＣ（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１７に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
次の段階を含む有機酸の製造方法：
（ａ）請求項１４に記載の遺伝子構造物が導入されている組換え微生物を培養して有機酸を生成する段階；及び
（ｂ）生成された有機酸を得る段階。
【請求項２０】
ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）のゲノムにおいてｇ４４２３のプロモーターの下流に目的遺伝子が挿入されており、９４４２３のプロモーターによって発現が調節される、目的遺伝子過発現用組換え微生物。
【請求項２１】
前記目的遺伝子は、ｇ４４２３遺伝子を置換して導入されることを特徴とする、請求項２０に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
目的遺伝子は、有機酸生成に関与するタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項２０に記載の組換え微生物。
【請求項２３】
前記有機酸生成に関与するタンパク質は、マロニル−ＣｏＡ−レダクターゼ又はラクテートデヒドロゲナーゼであることを特徴とする、請求項２２に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
次の段階を含む有機酸の製造方法：
（ａ）請求項２２に記載の組換え微生物を培養して有機酸を生成する段階；及び
（ｂ）生成された有機酸を得る段階。
【請求項２５】
請求項２０に記載の組換え微生物を培養して目的遺伝子を過発現させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸耐性酵母由来新規プロモーターに関し、より詳細には、有機酸耐性酵母においてＡＤＨ遺伝子発現を調節する新規プロモーター及びこれによる有機酸生成関連遺伝子の発現を用いた、有機酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ工程によって、様々な原料を有機酸、アルコール、アミンなどの化学物質に生物転換させることは、環境へのやさしさ、二酸化炭素の低減、持続可能性、新しいプラットホーム化学物質の供給の側面で脚光を浴びており、このような生物転換を用いて、食品、化粧品、薬効食品、医薬関連化学製品を供給している。
【０００３】
しかし、一般に、生物転換によって生産される製品は、生産過程で生成される不純物を除去する精製過程が必要である。また、有機酸を生産する場合、生成される有機酸によって菌株の成長が阻害されることを防ぐ目的で、塩基による中性ｐＨ発酵を行う場合が殆どであり、これを分離／精製するために再び酸性化をしながら多量の中和塩が副産物として発生し、工程が複雑になるに伴って生産単価が上がる。このような精製工程の高い価格負担が、発酵製品の化学物質市場への進入を阻害する要因とされている。
【０００４】
上記の問題を解決するために、有機酸のような酸性物質を生産する場合、低いｐＨにおいても成長可能であるとともに高い発酵能を示す微生物を用いると、培地のｐＨを中和し、再び酸性化する工程が省略できるので、工程単純化及び添加物の低減によって費用を節減できる。
しかし、多くの場合、低いｐＨで生存する微生物は成長速度が非常に低く、物質生産に要求される十分の菌体量が得られず、低い原料消耗速度を示すため、産業的発酵工程に適用し難い。このため、生成物のｐＫａよりも低いｐＨで速い成長をする一方で原料消耗速度を高く維持する特性を持つ微生物を選別することが非常に重要である。
【０００５】
このような微生物は、様々な菌株ライブラリーから様々な選択圧によって選別でき、選択圧の一例として、目的産物濃度に対する抵抗性、原料濃度に対する抵抗性、原料の消耗速度、ｐＨ条件、最小培地における成長能などを挙げることができる。微生物の選別はマニュアルで行ってもよいが、自動化を用いてスクリーニングする場合、より多い対象体から優れた特性を有する菌株を速く選別することができる。
選別された微生物は、選択圧に耐える優れた特性を保有しているが、たいてい、目的産物を生産できず、他の産物を生産してしまう場合が多い。したがって、前記選別された微生物に目的産物を生産する能力を与えるために、遺伝工学的に目的産物への転換遺伝子を導入し、元々生成している産物の生成能をなくす研究を行っている。
【０００６】
選択された微生物に目的産物の生成能を与えるために、目的産物への転換を可能にする遺伝子を導入したり、或いは元来保有している遺伝子を強化する方法を利用するが、一般的には、保有遺伝子及びこれから生産される酵素の活性が低い場合が多いため、外来の強い遺伝子を導入する場合が大部分である。なお、このような過程において外来ＤＮＡを強く発現できるプロモーターの導入が必須である。
使用可能なプロモーターとしては、通常、対象微生物が酵母である場合には、酵母においてよく知られたサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のプロモーターを利用でき、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから開発された様々な遺伝工学技法も適用可能である。また、選別された微生物の主な炭素フラックスに関与するプロモーターから強いプロモーターを選別でき、様々な技法により、最も効果的に目的遺伝子を発現できる方法を最優先して適用することが必要である。特に、選別された耐酸性酵母に対して、関連する遺伝工学的研究がされていない場合には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプロモーターを用いたり、或いは選別された微生物に内在しているプロモーターを用いることが通常の接近法である。
【０００７】
プロモーターは、一般には、真核細菌ではコアプロモーター領域を含めて様々な調節担当部分があり、各調節担当遺伝子は微生物ごとに異なる。したがって、ＯＲＦの５’上部から十分の長さの配列を選択して、プロモーターの役割を確認しながら最適の部位を見出すことができるが、遠距離調節（ｅｎｈａｎｃｅｒ，ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｅｔｃ）又は複合的に作用する調節機序については別の研究が必要である。
【０００８】
そこで、本発明者らは、有機酸に対して耐性を有する酵母を選別し、該酵母に有用物質生産能を与えるために、外来遺伝子発現に適したプロモーターを見出そうと鋭意努力した結果、エタノール生産代謝経路由来プロモーターを用いて目的遺伝子を発現する場合、目的遺伝子の発現が顕著に増加して目的産物の生成能が増加することを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、有機酸耐性酵母由来新規プロモーターを提供することにある。
本発明の他の目的は、前記プロモーターを含有する組換えベクトル及び前記組換えベクトルが導入されている組換え微生物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記新規プロモーターと目的タンパク質をコードする遺伝子が作動可能に連結されている遺伝子構造物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、新規プロモーター及び有機酸生成関連遺伝子を含む組換えベクターが導入されている組換え微生物を用いて有機酸を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１又は配列番号２の塩基配列で表示されるプロモーターを提供する。
本発明はまた、前記プロモーターを含む組換えベクターを提供する。
本発明はまた、前記組換えベクターが導入されている組換え微生物を提供する。
本発明はまた、（ａ）前記組換えベクターが導入されている組換え微生物を培養して有機酸を生成する段階；及び（ｂ）生成された有機酸を得る段階を含む有機酸の製造方法を提供する。
本発明はまた、配列番号１の塩基配列で表示されるプロモーターと目的タンパク質をコードする遺伝子が作動可能に連結されている遺伝子構造物を提供する。
本発明はまた、前記遺伝子構造物が染色体上に導入されている組換え微生物を提供する。
【００１１】
本発明はまた、（ａ）前記遺伝子構造物が導入されている組換え微生物を培養して有機酸を生成する段階；及び（ｂ）生成された有機酸を得る段階を含む有機酸の製造方法を提供する。
本発明はまた、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてｇ４４２３遺伝子が欠失又は弱化して、エタノール生成能が減少されていることを特徴とする組換え菌株を提供する。
本発明はまた、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）のゲノムにおいてｇ４４２３のプロモーターの下流に目的遺伝子が挿入されており、ｇ４４２３のプロモーターによって発現が調節される目的遺伝子過発現用組換え微生物を提供する。
本発明はまた、（ａ）前記組換え微生物を培養して有機酸を生成する段階；及び（ｂ）生成された有機酸を得る段階を含む有機酸の製造方法を提供する。
本発明はまた、前記組換え微生物を培養して目的遺伝子を過発現させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】１個、２個又は３個の３−ＨＰ経路酵素を発現するための遺伝子カセットの例である。（ａ）は、一般的な１個の酵素を発現するカセット、（ｂ）は、ｇ４４２３プロモーターを使用し、ＭＣＲｓａ１酵素を導入するためのカセット、（ｃ）は、ｇ４４２３プロモーターを使用し、ＬＤＨを導入するためのカセット、（ｄ）は、３個の３−ＨＰ生産酵素（ＭＣＲ、ＨＰＤＨ、ＥＵＴＥ）を導入するためのカセット、（ｅ）は、ＭＣＲ酵素のプロモーターであり、１ｋｂのｇ４４２３プロモーターを使用するためのカセットである。
【図２】１個、２個又は３個の３−ＨＰ経路酵素を発現するための酵母発現プラスミドの例である。
【図３】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプロモーター及びＹＢＣ菌株のプロモーター（１ｋｂ）を用いて作製された組換えＹＢＣ菌株においてＭＣＲ遺伝子（ＭＣＲｓａ１、ＭＣＲｓａ２）の発現量を確認した結果を示すものである。
【図４】ＳｃＴＥＦ１ｐプロモーターを用いた組換え菌株において３−ＨＰ生産に関与する他の遺伝子であるＢＤＨｃｍ遺伝子、ＨＰＤＨｅｃ遺伝子及びＥＵＴＥｄｚ遺伝子の発現を確認した結果を示すものである。
【図５】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株においてＭＣＲ遺伝子及び３−ＨＰ生産関連遺伝子の発現率を比較した結果を示すものであり、９９５−１と９９５−３は同一遺伝子型の異なる表現型を表す。
【図６】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝情報を用いて選別された７種のＡＤＨ遺伝子候補に対する発現レベルを確認するためのＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示すものである。
【図７】ｇ４４２３遺伝子を除去した組換え菌株ＹＢＣ−１５６３のグルコース使用量（Ａ）及びエタノール生産性を確認した結果を示すものである。
【図８】ｇ４４２３遺伝子がＭＣＲｓａ１遺伝子に置換された組換えＹＢＣ菌株のＭＣＲｓａ１発現を確認した結果を示すものである。
【図９】ｇ４４２３プロモーターとターミネーター部位が１ｋｂで切られた部位に位置するＭＣＲｓａ１遺伝子の発現レベルを確認した結果を示すものである。
【図１０】３種のＬＤＨ遺伝子でｇ４４２３遺伝子を置換した組換えＹＢＣ菌株のラクテート生産量を確認した結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
特に定義されない限り、本明細書で使われた技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われた命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
【００１４】
生物転換工程において、様々な産物のうち、有機酸のように酸性環境を作る産物を生産するとき、後段工程の複雑性とそれに伴う化合物及び施設投資費用の節減のために、耐酸性微生物、特に酸性においても速い成長を示し、且つ原料吸収速度が高い状態を維持できる微生物を選別する場合、選別された微生物は内在的に目的産物生産能を持たない場合が多いため、様々な遺伝工学的ツールを開発し、対象微生物に効果的に目的産物の生産能を与える必要がある。
【００１５】
プロモーターは、対象微生物において外部由来目的遺伝子を強く発現させたり或いは条件による発現ができる調節部であり、基本的には、目的遺伝子を強く発現できるプロモーターの選別が必要である。グルコース条件においてこのような強いプロモーターは、一般に、解糖過程或いは微生物が生産する主発酵産物の生産に関与するプロモーターから選択する。
知られた強いプロモーターには、ＴＥＦ１、ＴＰＩ１、ＨＸＴ７、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１及びＰＹＫ１などがあるが、必ずしもこれに限定されず、菌株別に異なる。
【００１６】
本発明で選択された微生物を含めて一般のクラブツリ−陽性酵母は、エタノールを主発酵産物として生産する場合が多く、それによるプロモーターも、強く発現し、発酵に有利な条件、すなわち、糖濃度の高い条件で発動するプロモーターが多い。
特に、エタノール代謝に関与するプロモーターの場合、外来遺伝子を発現させながらエタノール生産は遮断しようとする目的で技術を開発する場合が多いため、菌株が持つ内在プロモーターを直接利用しようとする場合には、エタノール生成を遮断する効果と外部遺伝子を強く発現させる効果を同時に達成できる長所がある。
【００１７】
本発明では、耐酸性酵母であるＹＢＣ（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）酵母に有機酸生成能を与えるために、有機酸生成関連遺伝子を高効率で導入するべく、これに適したプロモーターを選別しようとした。本発明の一態様では、既存に用いられたサッカロマイセスセレビシエ由来のプロモーター又はＹＢＣの内在プロモーターを用いて、３−ヒドロキシブチル酸（３−ＨＰ）生成関連遺伝子であるＭＣＲ遺伝子を導入した場合、発現効率が顕著に低いことを確認し、本発明の他の態様では、エタノール生成に関与する酵素であるＡＤＨ遺伝子であるｇ４４２３のプロモーターを用いてＭＣＲを発現させる場合、高い発現量と優れた３−ＨＰ生成能を示すことを確認した。
したがって、本発明は、一観点において、配列番号１又は配列番号２の塩基配列で表示されるプロモーターに関する。
【００１８】
本発明のプロモーターは、グルコース培養及び対数増殖期で強く発現し、酸性条件培地で培養しても良好な発現率を示しており、酵母由来遺伝子を含めて異種由来遺伝子、特に、古細菌由来及びバクテリア由来の遺伝子に対する酵母発現によく作用する。特に、本発明のプロモーターは、耐酸性菌株において様々な化合物を生産する上で必須のプロモーターであり、プロモーターの影響を受けるタンパク質コードＤＮＡ、特に、そのＤＮＡが有機酸を生産するＤＮＡである場合、その発現を強くさせることができるプロモーターであり、細胞内部及び外部の有機酸の存在下でも強く発現可能にするプロモーターである。
【００１９】
他の観点において、本発明は、前記プロモーターを含む組換えベクター及び前記組換えベクターが導入されている組換え微生物に関する。
【００２０】
本発明において、前記組換えベクターは、配列番号３又は配列番号４で表示されるターミネーターをさらに含むことを特徴とし得る。
【００２１】
本発明において、目的タンパク質をコードする遺伝子をさらに含むことができ、前記目的タンパク質は有機酸生産に関与するタンパク質であることを特徴とし得る。
【００２２】
本発明において、前記有機酸は、３−ヒドロキシプロピオン酸及び乳酸の生成が可能であることを示したが、必ずしもこれに限定されない。
このようなプロモーターに関連して発現される有機酸関連例示遺伝子は、コハク酸経路のフマル酸レダクターゼ、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４５（Ｂ）；１７１０−１７１７，２０１７）、アジピン酸経路のブチリルキナーゼ、エノエートレダクターゼ、アジポイルｃｏＡトランスフェラーゼ、アジペートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｓｔｒａｉｎ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｙｉｅｌｄｓ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｈｙｌａｎｄ．Ａ  ｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍａｓｔｅｒ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ，２０１３）、３−ヒドロキシイソ酪酸経路のメチルマロニルＣｏＡレダクターゼをコードする遺伝子（韓国特許出願第２０１６−００７５６４０号）、イソ酪酸経路のアルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ及び潜在的フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ  ２０１１，４，１０６８−１０７０）、リンゴ酸経路のリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（Ｍａｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ，Ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｍａｌａｔｅ  Ｅｘｐｏｒｔ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７４：２７６６−２７７７，２００８）、イタコン酸経路のシスアコニット酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｔａｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３；４：２３．）などを挙げることができ、各経路の最後段階遺伝子或いは律速段階遺伝子などの過発現に使用することができ、これについては関連先行文献（ＪＰ４７００３９５Ｂ２）にも明示されている。また、上記の例示された遺伝子の他、同一経路の他の遺伝子にも適用可能である。
【００２３】
本発明のプロモーターは、配列番号１に記載される塩基配列を含んで構成され、有機酸の生成条件においても強い活性を有するポリヌクレオチドである。また、ＹＢＣ菌株の２倍体特性によって前記配列番号１の塩基配列に削除、挿入、変異のような変異のある配列が存在し、このような変異配列を含む配列も同じ特性を示すことができる（Ｔｈｅ  Ｂａｋｅｒ’ｓ  Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｐｌｏｉｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｓ  Ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ  Ｓｔａｂｌｅ  ｉｎ  Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｉｏｓｉｓ，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ６（９）：２０１０．Ｐｌｏｉｄｙ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ，Ｙｅａｓｔ  ３１：４２１−４３０，２０１４）。
【００２４】
また、本発明のプロモーターと共に作用するターミネーターは、配列番号３／４に記載される塩基配列を含んで構成される。
【００２５】
本発明において、前記目的タンパク質は、マロニル−ＣｏＡ−レダクターゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、フマル酸レダクターゼ、スクシニルｃｏＡシンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ブチリルキナーゼ、エノエートレダクターゼ、アジポイルｃｏＡトランスフェラーゼ、アジペートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、メチルマロニルＣｏＡレダクターゼ、アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ、潜在的フェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、シスアコニット酸デカルボキシラーゼなどを使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
本発明において、前記組換え微生物は酵母であること好ましく、より好ましくは、耐酸性酵母ＹＢＣ（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）を用いることができる。
【００２７】
さらに他の観点において、本発明はまた、（ａ）前記組換えベクターが導入されている組換え微生物を培養して有機酸を生成する段階；及び（ｂ）生成された有機酸を得る段階を含む有機酸の製造方法に関する。
【００２８】
さらに他の観点において、本発明は、配列番号１又は配列番号２の塩基配列で表示されるプロモーターと目的タンパク質をコードする遺伝子が作動可能に連結されている遺伝子構造物及び前記遺伝子構造物が染色体上に導入されている組換え微生物に関する。
【００２９】
本発明において、前記目的タンパク質は、有機酸生産に関与するタンパク質であることを特徴とし、前記目的タンパク質としてはマロニル−ＣｏＡ−レダクターゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼなどを選択できるが、これに限定されず、有機酸生成に関与するタンパク質であればいずれも使用可能である。
【００３０】
本発明において、前記組換え微生物は酵母であることが好ましく、より好ましくは、耐酸性酵母ＹＢＣ（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）を使用することができる。
【００３１】
さらに他の観点において、本発明は、（ａ）前記遺伝子構造物が導入されている組換え微生物を培養して有機酸を生成する段階；及び（ｂ）生成された有機酸を得る段階を含む有機酸の製造方法に関する。
【００３２】
本発明のプロモーターは、目的タンパク質をコードする遺伝子と共に、酵母に導入するＤＮＡ構築物を構成する。このようなＤＮＡ構築物は、当業者に知られた様々な酵母形質転換方法に適切な構築物を含み、その一例として、相同性組換えのためのＤＮＡ構築物の例を、配列番号５及び６に提示した。前記ＤＮＡ構築物は、ｇ４４２３遺伝子を削除するための２個の対立遺伝子別除去カセットである。また、このカセットに目的ＤＮＡを挿入する場合、各対立遺伝子別遺伝子挿入用カセットが作られ、これは当該分野における知識を持つ研究者にはよく知られた事実である。
【００３３】
本発明において、前記カセットは、配列番号５又は配列番号６の塩基配列で表示されることを特徴とし、前記カセットは目的遺伝子を含むことができる。
【００３４】
本発明は、さらに他の観点において、前記ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）のゲノムにおいてｇ４４２３遺伝子を目的遺伝子で置換することを特徴とする目的遺伝子を過発現させる方法に関する。
【００３５】
本発明はさらに他の観点において、ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）のゲノムにおいてｇ４４２３のプロモーターの下流に目的遺伝子が挿入されており、ｇ４４２３のプロモーターによって発現が調節される目的遺伝子過発現用組換え微生物に関する。
【００３６】
本発明は、さらに他の観点において、（ａ）前記組換え微生物を培養して有機酸を生成する段階；及び（ｂ）生成された有機酸を得る段階を含む有機酸の製造方法に関する。
【００３７】
本発明は、さらに他の観点において、前記組換え微生物を培養して目的遺伝子を過発現させる方法に関する。
【００３８】
本発明はさらに他の観点において、耐酸性酵母ＹＢＣ菌株（ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ）においてｇ４４２３遺伝子が欠失又は弱化して、エタノール生成能が減少されていることを特徴とする組換え菌株に関する。
【００３９】
本明細書で使われる“相同性”は、２個の比較対象アミノ酸又はポリヌクレオチドモイエティ間の同一性割合を意味する。また、“類似性”は、比較窓を用いてアミノ酸又はポリヌクレオチド配列に基づいて配列が機能的又は構造的に同一である程度を意味する。配列相同性又は類似性は、標準ソフトウェアを使用し、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３−５８７７，１９９３）に基づいて開発されたＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムによって配列を比較することによって確認することができる。
前記ｇ４４２３プロモーターは、配列番号１の配列と好ましくは９０％以上、９２％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％の配列相同性を示す配列を有することができる。
本発明のｇ４４２３プロモーターと９０％以上の相同性を有しながら同等なレベルの発現効率を示すと、実質的に均等なプロモーターと言えよう。
場合によって、本発明に係るｇ４４２３プロモーターは、目的遺伝子の発現効率を上げるために、当業界に知られた公知の技術を適用して変異させてもよい。
【００４０】
本発明において、組換え酵母は耐酸性があることを特徴とし、本発明に適した耐酸性組換え酵母を作製するためには、有機酸に耐酸性を持つ宿主酵母を使用することが好ましい。
前記耐酸性酵母は、サッカロマイセス属、カザクスタニアサッカロマイセス及びカンジダ属からなる群から選ばれる耐酸性を有する酵母であり得、例えば、サッカロマイセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カザクスタニアエクシグア（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ  ｅｘｉｇｕａ）、カザクスタニアブルデリ（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ  ｂｕｌｄｅｒｉ）、及びカンジダフミリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｈｕｍｉｌｉｓ）からなる群から選ばれることを特徴とするが、これに限定されない。
【００４１】
‘耐酸性酵母’とは、３−ＨＰ又は乳酸などの有機酸に対する抵抗性を持つ酵母を意味するものであり、耐酸性は、様々な濃度の有機酸を含む培地における生長を評価して確認することができる。すなわち、‘耐酸性酵母’とは、高濃度の有機酸を含む培地内で一般酵母に比べて高い生長率及びバイオマス消耗率を示す酵母を意味する。
【００４２】
本発明において、‘耐酸性酵母’は、有機酸のｐＫａ値未満のｐＨにおいて、培地に有機酸が含まれていない場合に比べて、培地に１Ｍ以上の有機酸が含まれている場合、少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の比生長率を維持できる酵母と定義する。より具体的に、本発明において、‘耐酸性酵母’は、ｐＨ７の場合に比べて、ｐＨ２〜４において少なくとも１０％のバイオマス消耗率（糖消耗率など）又は少なくとも１０％の比生長率を維持できる酵母と定義する。
【００４３】
本発明に係る組換え酵母は、通常の方法によって前記遺伝子を宿主酵母の染色体上に挿入させたり、或いは前記遺伝子を含むベクターを宿主酵母に導入させることによって製造できる。
前記宿主酵母は、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主細胞が通常使用され、本発明の一実施例では耐酸性酵母を使用したが、これに限定されず、十分な目的ＤＮＡの発現が可能ないかなる種類の酵母も使用可能である。
【００４４】
前記組換え酵母は、任意の形質転換方法によって製造できる。“形質転換”とは、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体の因子として又は染色体統合完成によって複製可能になることであり、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味する。一般の形質転換方法には電気穿孔法、酢酸リチウム−ＰＥＧ法などがある。
【００４５】
また、本発明において、遺伝子を宿主微生物の染色体上に挿入する方法は、通常知られた任意の遺伝子操作方法を利用することができ、一例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、ヘルペスシンプレックスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非ウイルス性ベクターなどを用いる方法がある。“ベクター”は、適切な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子又は簡単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムに関係なく複製し機能可能になるか、或いは、一部の場合に、ゲノム自体に統合可能になる。プラスミドが現在ベクターの最も一般的に用いられる形態であり、また、線形化したＤＮＡも酵母のゲノムインテグレーションのために通常使用する形態である。
【００４６】
典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たりにプラスミドベクターを含むように効率的に複製がなされるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞の選抜を可能にする抗生剤耐性遺伝子又は栄養要求マーカー遺伝子、及び（ｃ）外来ＤＮＡ切片を挿入可能にする制限酵素切断部位を含む構造を有する。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用すると、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーションできる。
【００４７】
なお、前記遺伝子は、他の核酸配列と機能的関係で配置されるときに“作動可能に連結”される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合する時、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であり得る。例えば、前配列又は分泌リーダ対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現する場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されたり；又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。
【００４８】
一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダの場合、接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要がない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位においてライゲーション（連結）によって行われる。このような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。
【００４９】
勿論、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現する上で全て同等に機能を発揮するわけではなく、同様に、全ての宿主が同一の発現システムに対して同一に機能を発揮するわけでもない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担無しに、本発明の範囲から逸脱しない状態で、他の様々なベクター、発現調節配列及び宿主の中から適切に選択して適用することができる。例えば、ベクターを選択するに当たっては宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその中で複製される必要があるためであり、ベクターの複製数、複製数を調節できる能力及び当該ベクターによってコードされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現も考慮される必要がある。
【００５０】
本発明において、炭素源はグルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、フルクトース、セルロース、ガラクトース、グルコースオリゴマー及びグリセロールからなる群から選ばれる一つ以上であることを特徴とし得るが、これに限定されない。
【００５１】
本発明において、培養は、微生物、例えば大腸菌などがそれ以上作用できないように（例えば、代謝体生産不可能に）する条件で行うことができる。例えば、培養は、ｐＨ１．０〜６．５、好ましくはｐＨ１．０〜６．０、より好ましくはｐＨ２．６〜４．０であることを特徴とし得るが、これに限定されない。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものとして解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００５３】
実施例１：ＹＢＣ菌株において既存プロモーターを用いたＭＣＲ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）発現パターン確認
（１）耐酸性菌株選定
本発明者らは、様々な酵母菌株に対するテストによって、耐酸性を有する菌株群を選別したことがある（大韓民国特許公開第２０１７−００２５３１５号）。前記選別された酵母菌に対して乳酸を培養初期に培地に添加し、微生物の成長及び糖消耗速度を確認しながら耐酸性に最も優れた菌株を選別した。このとき、接種ＯＤ値は４にし、培地は、ＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物）にグルコース３．５％を使用し、５０ｍｌのフラスコ培養で３０℃、１００ｒｐｍ条件において実験を行ったが、乳酸濃度は各初期０〜８０ｇ／Ｌに変化を与えながら培養を行った。その結果を比較分析し、耐酸性に最も優れた菌株であるＹＢＣ菌株を選定した。
前記ＹＢＣ菌株（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ  ｅｘｉｇｕａ  ｓＢ−０１８ｃ）は、２０１８年４月１１日付に寄託機関韓国生命工学研究院生物資源センターにＫＣＴＣ１３５０８ＢＰとして寄託した。
【００５４】
（２）耐酸性菌株ＹＢＣにおいて既存プロモーターを用いたＭＣＲ発現
本実施例では、ＹＢＣ菌株において３−ＨＰ（３−ｈｙｄｒｏｘｙ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）生産関連核心酵素であるＭＣＲ（ｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）をコードする遺伝子を発現させた。
３−ＨＰを生産するマロニル−ＣｏＡ経路は、アセチル−ＣｏＡがカルボキシ化によってマロニル−ＣｏＡに転換された後、還元反応によって３−ＨＰに転換される代謝経路であり（アセチル−ＣｏＡ→マロニル−ＣｏＡ→３−ＨＰ）、マロニル−ＣｏＡ経路は、大腸菌をはじめとする微生物が通常生産する中間物質を経るので、３−ＨＰ生産経路として最も多く研究されている（米国公開特許公報ＵＳ２０１３／００７１８９３Ａ１）。マロニル−ＣｏＡは、マロネートレダクターゼと３−ＨＰデヒドロゲナーゼの作用によって３−ＨＰに転換可能であるので、組換え大腸菌を用いてブドウ糖やグリセロールによって３−ＨＰに転換する方法がよく知られている。
本実施例では、知られたＭＣＲ遺伝子のうち、効率の高い遺伝子であるＭＣＲｓａ１とＭＣＲｓａ２を対象に実験を行った。ＭＣＲｓａ１とＭＣＲｓａ２は、遺伝子バンクのデータに基づいて酵母コドン利用を適用して合成した後に使用し、本実施例において用いたＭＣＲ遺伝子の情報を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2021520835.tif 000003
【００５６】
ＹＢＣ菌株への遺伝子導入のために、図１（ａ）のカセットを作製した。
当該カセットは、抗生剤耐性遺伝子を有するようにし、目的とする遺伝子のターゲッティングのために目的遺伝子の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ部位を全ゲノム配列又は部分ゲノム配列に基づいて、図１に示す制限酵素を有するようにデザインした後、ＰＣＲで得、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来プロモーター及びターミネーターは、知られた遺伝情報（一例として、サッカロマイセス遺伝子データベース（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）に基づいて作製した。抗生剤耐性遺伝子は、図１（ａ）にＨｙｇＲを一例としたが、該当菌株に使用可能な他の真核生物用抗生剤耐性遺伝子を使用してもよく、これについては当業界に公知の技術を知っている人は誰でも容易に作製できる。抗生剤耐性遺伝子は使用後に除去しないと次の段階の遺伝操作ができない点で、両端のＣｒｅ−ｌｏｘｐのための部位（ｌｏｘ７１及びｌｏｘ６６）を導入した。また、ＹＢＣ菌株から由来したプロモーターとターミネーターの場合には、前記のＵＴＲ部位を抽出するのと同じ方法を用いて作製した。発現させるべき目的遺伝子が多数である場合は、図１（ｄ）のように、多数の遺伝子を発現できるカセットを具現し、各部位の末端に位置した制限酵素を用いて、該当ＵＴＲ及びＯＲＦ遺伝子と抗生剤耐性遺伝子は、目的に合わせて交換作製した。
【００５７】
ドナーＤＮＡは、カセットを含むプラスミドを、制限酵素を用いて切断したり又はＰＣＲを用いて増幅し、各遺伝子の部分は各末端に位置した制限酵素を用いて交換できる。制限酵素を利用する方法の他に、ギブソンアセンブリを用いてカセットを作製することもあり、このようなギブソンアセンブリを用いる方法に対しては、多数の製品及び使用法がよく揃っており、本実施例ではＮＥＢ社のギブソンアセンブリマスターミックス及びクローニングキットを用いて作製した。この中、ＭＣＲ及びＧ４４２３に関連するオリゴマーについては、下記表２に示す。
【００５８】
【表２−１】
2021520835.tif 000004
【００５９】
【表２−２】
2021520835.tif 000005
【００６０】
耐酸性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株の場合は、前記のカセットを用いたり或いは図２に示す発現プラスミド（ｐＳＫ−０８４及び／又はｐＳＫ−０８５）を用いて発現させた（図２）。
前記作製されたカセットをＹＢＣ菌株に導入することは、一般の酵母の形質転換のように、線形化されたドナーＤＮＡを、ＰＣＲや制限酵素法で作製した後、電気穿孔法又は酢酸リチウム法などを用いて導入した後、それぞれ使用した栄養要求性マーカー或いは抗生剤マーカーによる培地を用いて選別した。選別培地から育ったコロニーを通じて、クロモソームの正確な位置に導入されたかどうかを、ターゲットが導入される遺伝子ＯＲＦプライマー及び導入された遺伝子のプライマーを用いてコロニーＰＣＲで確認し、その後、培養された菌体からゲノムＤＮＡを抽出して正確な遺伝子型を確認した。
【００６１】
これらの作製された菌株は、２０ｍＬ体積の選別的SCベースの培地（２０ｇ／Ｌグルコース）又はＹＰＤ培地を用いて２５０ｍＬフラスコで培養し（３０℃、２５０ｒｐｍ）、培養は全ての糖及びエタノールが消耗する時点まで持続した。
前記方法で作製されたサッカロマイセスセレビジエ由来プロモーター（ＴＥＦ１）及びＹＢＣ菌株由来プロモーター（ＦＢＡ１ｐ）と共にＭＣＲ遺伝子が導入された組換え菌株を、表３に示す。
【００６２】
【表３】
2021520835.tif 000006
【００６３】
前記組換え菌株を２０ｍＬ体積のＹＰＤ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌデキストロース）を用いて２５０ｍＬフラスコで培養し（３０℃、２５０ｒｐｍ）、エタノール生産時期とエタノール消耗時期で菌体を得た後、ＭＣＲ遺伝子に対してＲＴ−ｑＰＣＲを行った。
本実施例で用いたＲＴ−ｑＰＣＲ方法を述べると、目的菌株の指数成長期にＲＮＡを抽出した後、これを鋳型にしてｃＤＮＡを作る。ターゲット遺伝子とハウスキーピング遺伝子（Ｒｅｆ遺伝子として使用）にそれぞれ特異的なオリゴマーを合成し、これを用いてｑＰＣＲを行った。当該実験に使用した遺伝子はＡＬＧ９であり、使用したプライマーで増幅される断片のサイズは１４７±３ｂｐである。表４に、使用したｑＰＣＲ用プライマー及び次の例で使用したプライマーを示す。
【００６４】
【表４−１】
2021520835.tif 000007
【００６５】
【表４−２】
2021520835.tif 000008
【００６６】
その結果、図３に示すように、耐酸性菌株ＹＢＣを用いて作製された組換え菌株においてＭＣＲ遺伝子（ＭＣＲｓａ１、ＭＣＲｓａ２）が発現することを確認した。サッカロマイセスセレビジエのプロモーター及びＹＢＣ菌株のプロモーター（１ｋｂ）を用いて発現量を確認した結果、いずれもｑＰＣＲのＲｅｆ遺伝子に比べて、発現特性が高くないか、むしろ低い結果を示した。また、ＹＢＣ菌株由来１ｋｂ  ＦＢＡプロモーター（ＹＢＣ  ＦＢＡ１ｐ）を用いたＭＣＲｓａ２の発現は、ＳｃＴＥＦ１ｐプロモーターに比べて低い発現結果を示した（図３ＢのＹＢＣ−１４１３）。
ＳｃＴＥＦ１ｐプロモーターを使用した組換え菌株ＹＢＣ−０６１、ＹＢＣ−０６２、ＹＢＣ−０６７、ＹＢＣ−０６８において３−ＨＰ生産に関与する他の遺伝子であるＢＤＨｃｍ遺伝子、ＨＰＤＨｅｃ遺伝子及びＥＵＴＥｄｚ遺伝子を対象にして発現を確認した。
【００６７】
その結果、図４に示すように、ＭＣＲ遺伝子と類似に、ＹＢＣ菌株の内在プロモーターであるＦＢＡ１ｐによる遺伝子発現量、サッカロマイセスセレビジエ由来プロモーター（ＴＥＦ１）による遺伝子発現量よりも低いことを確認した。
なお、組換え菌株による３−ＨＰの生産量も非常に低いレベルであり、２コピーの遺伝子を用いて、発現量が高くなった組換え菌株であるＹＢＣ−１４９７菌株（ＭＣＲｓａ２、ＨＰＤＨ、ＥＵＴＥの３つの遺伝子とも発現量は向上）がむしろ３−ＨＰ生産量においてはＹＢＣ−１１７８菌株よりも低くなる現象が発生した。
【００６８】
実施例２：既存プロモーターによって発現したＭＣＲ遺伝子及び関連遺伝子による３−ＨＰ生産能確認
実施例１で作製した組換え菌株における３−ＨＰ生産性能を確認した。
まず、２５ｍＬのＹＰＤ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌデキストロース）でシェークフラスコを用いて２５０ｒｐｍ、３０℃で培養し、１５μＭのセルレニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を添加した。セルレニンはマロニル−ＣｏＡに対するサイトゾルアセチル−ＣｏＡから脂質合成を阻害して３−ＨＰの円滑な生産を手伝う役割を担う。前記培養条件において全てのグルコースを消耗するまで培養した後、細胞密度を測定し、培養液中の３−ＨＰを含む主代謝物生産量を確認した。この他にも、特定条件のために変形された形態の濃度、培地、培養条件で行った場合もあるが、その記載は省略する。
【００６９】
細胞培養上層液において３−ＨＰ分析は、注入体積が１０μｌであるＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｅ２６９５  ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を用いて培養上層液サンプルを分析した。ＨＰＬＣにおいて高速酸分析カラム（１００ｍｍ×７．８ｍｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）に連結されたアミネックスＨＰＸ−８７Ｈ有機酸カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）を静止期でとして用した。カラムを＋５５℃に維持し、０．３又は０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で５．０ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を溶出液として使用した。
３−ヒドロキシプロピオン酸、グルコース、アセテート、サクシネート、ピルベート、グリセロール及びエタノールの検出にＷａｔｅｒｓ  ２４８９  ｄｕａｌ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ＵＶ（２１０ｎｍ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）及びＷａｔｅｒｓ  ２４１４示差屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を使用した。
【００７０】
その結果、表５に示すように、組換え菌株のいずれにおいても低い３−ＨＰ生産能を示し、このような低い生産性能は、主要遺伝子、特に、ＭＣＲの発現率が生産に大きい影響を及ぼしていると判断した。
【００７１】
【表５】
2021520835.tif 000009
【００７２】
実施例３：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて該当ＭＣＲ遺伝子の発現率確認
遺伝情報及び遺伝子ツールがよく揃っているＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株においてＭＣＲ遺伝子及びこれに関連する遺伝子の発現率を比較するために、３−ＨＰ生産遺伝子、特に、発現率の低いＭＣＲ遺伝子の発現量を実施例１のＲＴ−ｑＰＣＲ方法で確認した。
その結果、図５に示すように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの自体プロモーターを使用した組換え菌株においてもＭＣＲｓａ２遺伝子の発現率が低く現れ、ＭＣＲ遺伝子の発現を上げることができる新しいプロモーターを選別する必要性を確認した。
【００７３】
実施例４：ＹＢＣ菌株においてアルコール生産遺伝子の発現確認
本実施例では、ＹＢＣ菌株において外来遺伝子の発現を上げることができるプロモーター選別のために、ＹＢＣ菌株自体において高い発現率を持つ遺伝子の発現を調節するプロモーターを用いて、該当遺伝子を外来遺伝子に置き換えて発現させる方式を用いた。
グルコース存在下で強く発現する解糖過程及びエタノール生産関連遺伝子を対象に強く発現する遺伝子のうち、他の遺伝子に置換したとき、成長に影響を及ぼさないとともに効果が高い遺伝子を選択し、ＡＤＨ（Ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子の発現を調節するプロモーターをターゲットとした。
【００７４】
特に、微生物成長に直接的な影響を与えないためには、解糖過程に関連した遺伝子を回避しなければならないが、これは、解糖過程関連遺伝子がなくなったり或いは弱い場合、微生物の成長に重要なピルビン酸の生成が抑制されたり或いは連鎖反応のバランスに問題が生じて微生物の成長性に影響を与え、結論的に発酵能が低下する。したがって、内在遺伝子の交替は、対象菌株がエタノール生産菌株である場合は、ＰＤＣ（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）遺伝子或いはＡＤＨ遺伝子を選択し、このうち、対象化合物である３−ＨＰを生産するためにはＰＤＣを重要経路として使用する点から、ＡＤＨ遺伝子を選択して除去するものとして選定した。
【００７５】
酵母のようにエタノール発酵能が強い菌株は、非常に様々な強度及び役割を担当するＡＤＨを持っている。酵母のＡＤＨのうち、エタノールを生産する主なＡＤＨを確認し、該当プロモーターを選択して使用するために、ＹＢＣ菌株の遺伝体情報とＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの知られたＡＤＨ遺伝子情報を比較して様々な候補遺伝子を確認し、これに対するｑＰＣＲを行った。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノム全配列データにおいてバイオインフォマティクス情報を用いて７種のＡＤＨ遺伝子候補を選別し（表６参考）、選別遺伝子に特異的なオリゴマーをデザインしてＲＴ−ｑＰＣＲを行った（プライマー配列は表４参照）。
【００７６】
【表６】
2021520835.tif 000010
【００７７】
その結果、図６に示すように、ｇ４４２３遺伝子の発現量が顕著に高いことが確認された。
ｇ４４２３遺伝子を除去した菌株（ＹＢＣ−１５６３）を作製した。ｇ４４２３及びＵＴＲの情報に基づいてｇ４４２３  ＯＲＦが除去され、５’及び３’ＵＴＲ及び抗生剤マーカーが存在する、図１（ａ）と類似の遺伝子カセットを作製し、ドナーＤＮＡとして使用した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリを用いた方法が用いられた。作製されたドナーＤＮＡを導入し、マーカー遺伝子に対応するプレートで育ったコロニーに対して、ｇ４４２３を確認するためのＯＲＦ用プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号７２）：ＧＡＧＡＴＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＴＣＡＣＣＡ、Ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号７３）：ＣＡＡＣＧＴＴ７２ＡＡＧＴＡＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＴＧ）を用いて、ＯＲＦが除去されたことを確認した。
【００７８】
前記菌株を、ＹＰＤ培地においてグルコースを４０ｇ／Ｌにし、開始ＯＤ値を０．７にし、５０ｍｌ培地で２５０ｍｌフラスコを用いて３０℃、２５０ｒｐｍで糖とエタノールが全て消耗されるまで培養した後、グルコース消費量とエタノール生産量を確認した結果、エタノール生産が５０％以上減少することを確認した（図７）。
【００７９】
実施例５：ｇ４４２３遺伝子をＭＣＲ遺伝子に置換したＹＢＣ組換え菌株のＭＣＲ発現量確認
実施例４で確認されたｇ４４２３遺伝子の強い発現力を利用するために、ＹＢＣ菌株のゲノムにおいてｇ４４２３遺伝子をＭＣＲｓａ１遺伝子に置換して組換え菌株ＹＢＣ−１６８４を作製し、ＭＣＲｓａ１遺伝子の発現量を確認した。ｇ４４２３及びＵＴＲの情報に基づいてｇ４４２３  ＯＲＦが除去され、５’及び３’ＵＴＲ及び抗生剤マーカーが存在する、図１（ｂ）の遺伝子カセットを作製し、ｇ４４２３のＯＲＦ座にはＭＣＲｓａ１の酵母コドン利用で最適化された配列を導入してドナーＤＮＡとして使用した。ドナーＤＮＡの作製には、前述したように、制限酵素を用いたクローニング方法とギブソンアセンブリを用いた方法が用いられた。ドナーＤＮＡに使用したプラスミド（ｐＳＫ８６３）は配列番号７に表示した。
完成されたカセットにおいてドナーＤＮＡを増幅し、これをＹＢＣ菌株に導入して育ったコロニーに対して、下記ｇ４４２３  ＯＲＦを確認するプライマーを用いてｇ４４２３ＯＲＦが除去され、ＭＣＲｓａ１  ＯＲＦが存在することを確認することによって、ＭＣＲｓａ１が導入されたことを確認した。
【００８０】
確認用Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号７４）：ＡＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＧＧＣＴＧ、
Ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号７５）：ＴＴＡＣＴＴＡＧＧＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＴＴＴＴＣＧＡ）
【００８１】
前記菌株を、ＹＰＤ培地においてグルコースを４０ｇ／Ｌにし、開始ＯＤ値を０．７にし、５０ｍｌ培地で２５０ｍｌフラスコを用いて３０℃、２５０ｒｐｍで糖とエタノールが全て消耗されるまで培養した後、３−ＨＰの生産量及び糖とエタノール生産量を確認した。発現量確認のためのＲＴ−ｑＰＣＲの条件は実施例１と同一にして行い、培養液のサンプリングは対数増殖期に抽出し、作製された組換えＹＢＣ菌株の特異遺伝型については表７に示す。
【００８２】
【表７】
2021520835.tif 000011
【００８３】
その結果、図８に示すように、ＭＣＲｓａ１遺伝子の発現がｇ４４２３遺伝子とほぼ同様であり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の強いプロモーターであるＴＥＦ１プロモーターを使用した菌株（対照群ＹＢＣ−０６１）よりも遥かに強い発現を示すことを確認した。
Ｇ４４２３のプロモーターは、既存に用いられたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の様々なＡＤＨアイソザイムのプロモーターと相同性を比較した結果、相同性が非常に低いということが分かった（表８）。
【００８４】
【表８】
2021520835.tif 000012
【００８５】
実施例６：ｇ４４２３遺伝子をＭＣＲｓａ１遺伝子に置換して組換え菌株の３−ＨＰ生産
実施例５でＭＣＲ遺伝子の発現量の顕著な増加を確認した組換え菌株ＹＢＣ−１６８４の３−ＨＰ生産量を確認した。
比較群として実施例２の表３の結果と比較し、表３に示したように、ｓｃＴＥＦプロモーター又はＦＢＡプロモーターを用いて３つの３−ＨＰ生成関連核心遺伝子を発現する場合、フラスコ培養において１〜１６ｍｇ／Ｌの３−ＨＰが生産されるレベルであった。
組換え菌株ＹＢＣ−１６８４及びｇ４４２３座にＭＣＲｓａ１が置換されて発現したＹＢＣ−１６８４に３−ＨＰ関連遺伝子をさらに挿入した組換え菌株に対して生産量を確認した。
ＹＰ培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物）に４％のグルコース及び１５μＭのセルレニンを添加し、３０℃フラスコ培養において培養し、糖が完全に消耗された５日目に培養液をサンプリングして３−ＨＰの生成能を確認した。
【００８６】
その結果、表９に示すように、ｇ４４２３座にＭＣＲｓａ１遺伝子のみ挿入されたＹＢＣ−１６８４菌株は、２００ｍｇ／Ｌの３−ＨＰを生産し、３−ＨＰ関連遺伝子（ＨｉＢＡＤＨ遺伝子及びＥＵＴＥ遺伝子）がさらに挿入された菌株は、コロニーごとに差異があったが、１４６〜７１０ｍｇ／Ｌの３−ＨＰを生産し、ｓｃＴＥＦプロモーター又はＦＢＡプロモーターで該当遺伝子が発現した組換え菌株の３−ＨＰ生産と比較して、顕著に高い生産量が確認できた。
【００８７】
【表９】
2021520835.tif 000013
【００８８】
この結果から、ｇ４４２３プロモーターによるＭＣＲｓａ１遺伝子の発現増大が３−ＨＰの生産増大に大きく影響を与え得ることを確認し、したがって、ｇ４４２３プロモーターによって目的化合物の生産に関与する遺伝子の発現を増大させると、目的化合物の生産を増大できることが分かった。
【００８９】
実施例７：ｇ４４２３プロモーターの移動性確認
ＹＢＣ菌株のゲノムＤＮＡにおいてＧ４４２３プロモーターとターミネーター部位を１ｋｂで切って、３−ＨＰ生産用遺伝子であるＭＣＲｓａ１の発現レベルを確認した。ＹＢＣ菌株ゲノムのｇ４４２３及びＵＴＲの情報に基づいて、ｇ４４２３  ５’ＵＴＲ部分１ｋｂ部位をプライマーを用いて増幅／抽出した後、これを表２のｏＳＫ−１４１２〜ｏＳＫ１４１９のプライマーを用いてｇ４４２３のプロモーターと酵母コドン利用で最適化されたＭＣＲｓａ１の断片を確保した。これを、多数の遺伝子を発現できる図１（ｅ）のカセットに制限酵素を用いて導入し、使用したプラスミド（ｐＳＫ−８６５）を配列番号８に表示した。これからドナーＤＮＡカセットを増幅精製してＹＢＣに導入し、成長したコロニーの遺伝子型を確認した。
【００９０】
前記方法で製造されたＹＢＣ−１６９３組換え菌株のＭＣＲｓａ１の発現量は、他のＹＢＣのプロモーター（ＦＢＡ）やＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＥＦ１ｐプロモーターを使用した時と同様に発現量が低くなることを確認した（図９）。これは、該当ＹＢＣ耐酸性菌株のプロモーター作用にはより長い断片が必要であるか、遠い距離でも作用する機序（ｅｎｈａｎｃｅｒ，ｓｉｌｅｎｃｅｒ）又は多重因子による複合作用があると推定され、このような機序を正確に明らかにするための別の更なる研究が必要である。
ｇ４４２３の遺伝子を目的遺伝子に置き換える場合、目的遺伝子を強く発現させることができるという点とエタノール生産を担当するｇ４４２３遺伝子を除去するという２つの効果が得られるので、該当菌株を用いて様々な化合物を生産する研究の目的達成を効果的に遂げることができよう。
【００９１】
実施例８：ｇ４４２３プロモーターによるＬＤＨ遺伝子の発現
本実施例では、ＭＣＲ遺伝子の他に、ラクテート生産に関与する遺伝子であるＬＤＨ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子でｇ４４２３遺伝子を置換した組換えＹＢＣ菌株を作製し、前記菌株のラクテート生産能を確認した。
乳酸生産関連遺伝子のうち代表的な３種の遺伝子（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ由来ＬＤＨ、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ由来ＬＤＨ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来ＬＤＨ）に対してｇ４４２３プロモーターを用いて発現するように組換え菌株を作製した。
ｇ４４２３及びＵＴＲの情報に基づいてｇ４４２３  ＯＲＦが除去され、５’及び３’ＵＴＲ及び抗生剤マーカーが存在する、図１（ｅ）と類似の遺伝子カセットを作製し、ｇ４４２３のＯＲＦ座にはＮＣＢＩの各３種の遺伝子情報に基づいて酵母コドン利用で最適化された配列を合成した後、制限酵素（ＡｐａＩ、ＳａｃＩ）を用いてカセットに導入した。完成されたカセットにおいてドナーＤＮＡを増幅し、これをＹＢＣ菌株に導入して成長したコロニーに対してｇ４４２３  ＯＲＦを確認するプライマーを用いて、ｇ４４２３  ＯＲＦの対立遺伝子が１つ除去され、各ＬＤＨ遺伝子が導入されることを確認した。
【００９２】
Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号７６）：ＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＴＧＣＴＴＡＴＧＧ；
Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号７７）：ＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＴＡＧ；
Ｒ．ｏｒｙｚａｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号７８）：ＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＴＡＡＡＧＴ；
Ｒ．ｏｒｙｚａｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号７９）：ＴＴＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＴＡＧＡＡＡ；
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号８０）：ＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＴＣＡ；
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号８１）：ＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＣＡＧ
【００９３】
前記作製された組換え菌株をフラスコにおいて、ＹＰ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物）培地に４％グルコースと１５０ｍｇ／Ｌのウラシルを添加した培地を用いて、３０℃／１００ｒｐｍで２４時間振盪培養した。
培養液中のラクテートとエタノールはＨＰＬＣを用いて確認した。培養液中のグルコース、エタノール、Ｌ−ラクテートの濃度は、Ｗａｔｅｒｓ  １５２５  Ｂｉｎａｒｙ  ＨＰＬＣポンプにＢｉｏ−Ｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ８７−Ｈカラムを装着して分析した。グルコースとエタノールは、Ｗａｔｅｒｓ  ２４１４示差屈折率検出器を、Ｌ−ラクテートは、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ／可視検出器（２１０ｎｍ）を用いて分析し、各成分別に濃度によるピーク面積標準曲線を作成して濃度を計算した。具体的な分析条件は次の通りである。
【００９４】
１．移動相条件：０．００５ＭのＨ２ＳＯ４溶液
２．流量：０．６ｍＬ／分
３．実行時間：４０分
４．カラムオーブン温度：６０℃
５．検出器温度：４０℃
６．注入量：１０μＬ
７．オートサンプラートレイ温度：４℃
【００９５】
その結果、図１０に示すように、置換された対象遺伝子がＬＤＨ活性を示し、ラクテートを生産することを確認した。
【００９６】
［寄託情報］
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１３５０８ＢＰ
受託日：２０１８０４１１
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明に係る新規プロモーターを用いて、有機酸耐性酵母において有機酸生成関連目的遺伝子を発現させる場合、有機酸に対して耐性を持ちながら、菌株の成長能が阻害されず、有機酸を高い効率で生産できる長所がある。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図１】
2021520835.tif 000014
【図２】
2021520835.tif 000015
【図３】
2021520835.tif 000016
【図４】
2021520835.tif 000017
【図５】
2021520835.tif 000018
【図６】
2021520835.tif 000019
【図７】
2021520835.tif 000020
【図８】
2021520835.tif 000021
【図９】
2021520835.tif 000022
【図１０】
2021520835.tif 000023
【配列表】
2021520835000001.app
【国際調査報告】
2021520835.tif 000024
2021520835.tif 000025
2021520835.tif 000026
2021520835.tif 000027