(57)【要約】本明細書には、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための種々の方法および関連システムが提供される。一部の実施形態では、例えば、本方法は、（ａ）ポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること、（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせること、（ｃ）複数のシーケンシングリードを複数のファミリーにグループ化すること、（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること、（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすること、（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること、ならびに（ｇ）共有ファミリー識別子の定量的尺度に基づいて、第１の試料を第２の試料で汚染されているかまたは汚染されていないものとして分類することを含む。
2021536232.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；
（ｂ）前記複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；
（ｃ）各試料について、前記複数のシーケンシングリードを、（ｉ）前記開始領域、（ｉｉ）前記終了領域、および（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、前記試料中の各ファミリーは、前記試料中の前記ポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｄ）前記複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；
（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、前記第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、前記第１の試料のファミリー識別子である、こと；
（ｆ）前記共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに
（ｇ）前記第１の試料を、前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、前記第２の試料で汚染されているものとして、または前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が前記所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、前記第２の試料で汚染されていないものとして分類すること
を含む、方法。
【請求項２】
第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法であって、
（ａ）コンピュータシステムによって、前記第１の試料および前記第２の試料からの複数のシーケンシングリードを含む配列情報にアクセスすること；
（ｂ）前記コンピュータシステムによって、前記複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；
（ｃ）各試料について、前記コンピュータシステムによって、前記複数のシーケンシングリードを、（ｉ）前記開始領域、（ｉｉ）前記終了領域、および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、前記試料中の各ファミリーは、前記試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｄ）前記コンピュータシステムによって、前記複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；
（ｅ）前記コンピュータシステムによって、共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、前記第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、前記第１の試料のファミリー識別子である、こと；
（ｆ）前記コンピュータシステムによって、前記共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに
（ｇ）前記コンピュータシステムによって、前記第１の試料を、前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、前記第２の試料で汚染されているものとして、または前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が前記所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、前記第２の試料で汚染されていないものとして分類すること
を含む、方法。
【請求項３】
第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法であって、
（ａ）前記第１の試料および前記第２の試料からの複数のシーケンシングリードを含む配列情報を得ること；
（ｂ）前記複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；
（ｃ）各試料について、前記複数のシーケンシングリードを、（ｉ）前記開始領域、（ｉｉ）前記終了領域、および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、前記試料中の各ファミリーは、前記試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｄ）前記複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；
（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、前記第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、前記第１の試料のファミリー識別子である、こと；
（ｆ）前記共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに
（ｇ）前記第１の試料を、前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、前記第２の試料で汚染されているものとして、または前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が前記所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、前記第２の試料で汚染されていないものとして分類すること
を含む、方法。
【請求項４】
ａ）より前に、前記ポリヌクレオチドのセットをタグ付けし、タグ付きポリヌクレオチドを生じさせることをさらに含み、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
各試料について、前記複数のシーケンシングリードを、（ｉ）前記タグ、（ｉｉ）前記開始領域、（ｉｉｉ）前記終了領域、および（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することを含み、前記試料中の各ファミリーは、前記試料中の前記ポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料からのタグ付きポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；
（ｂ）前記複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；
（ｃ）各試料について、前記複数のシーケンシングリードを、前記タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、前記試料中の各ファミリーは、前記試料中の前記タグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｄ）前記複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；
（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、前記第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、前記第１の試料のファミリー識別子である、こと；
（ｆ）前記共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに
（ｇ）前記第１の試料を、前記共有ファミリー識別子の前記定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、前記第２の試料で汚染されているものとして、または前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が前記所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、前記第２の試料で汚染されていないものとして分類すること
を含む、方法。
【請求項７】
前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が、前記第１の試料中の共有ファミリー識別子の数である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が、前記第１の試料中の共有ファミリー識別子の数の、前記第１の試料中のファミリー識別子の総数に対する比を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が、前記第１の試料のファミリー中のシーケンシングリードの数が前記第２の試料の対応するファミリー中のシーケンシングリードの数よりも大きい、前記第１の試料中の共有ファミリー識別子を除外する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の試料中の前記共有ファミリー識別子のセットの前記定量的尺度が、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対における共有ファミリー識別子を除外する、請求項４または６に記載の方法。
【請求項１１】
ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の前記過剰に提示された対が、
（ａ）複数の試料を提供することであって、前記複数の試料が、前記第１の試料および／または前記第２の試料と同一または実質的に同一であるゲノム開始位置およびゲノム停止位置の分布を含む、こと；
（ｂ）前記複数の試料中のファミリー識別子を決定すること；
（ｃ）ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の１対を共有する前記複数の試料中のファミリー識別子の数を定量化すること；
（ｄ）前記ファミリー識別子の数が設定された閾値を超えた場合、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の前記１対を過剰に提示されたものとして分類すること
によって決定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の試料が、前記第１の試料または前記第２の試料を除外する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の試料が、前記第１の試料および前記第２の試料を除外する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の試料が、前記第１の試料と同じフローセル内で処理された試料を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の試料が訓練試料を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記設定された閾値が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０ファミリーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；
（ｂ）前記複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；
（ｃ）各試料について、前記複数のシーケンシングリードを、（ｉ）前記開始領域、（ｉｉ）前記終了領域、および（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、前記試料中の各ファミリーは、前記試料中の前記ポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｄ）前記複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、前記第２の試料のファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一であるグループ化特徴を有する前記第１の試料のファミリーである、こと；
（ｅ）前記第１の試料について前記共有ファミリーのセットの定量的尺度を決定すること；ならびに
（ｆ）前記第１の試料を、前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、前記第２の試料で汚染されているものとして、または前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が前記所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、前記第２の試料で汚染されていないものとして分類すること
を含む、方法。
【請求項１８】
第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；
（ｂ）前記複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；
（ｃ）前記２つの試料の前記複数のシーケンシングリードを一緒に、（ｉ）前記開始領域、（ｉｉ）前記終了領域および（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、各ファミリーは、前記ポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｄ）前記複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、前記共有ファミリーが、前記第１の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードおよび前記第２の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｅ）前記共有ファミリーのセットに由来する定量的尺度を決定すること；ならびに
（ｆ）前記第１の試料を、前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、前記第２の試料で汚染されているものとして、または前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が前記所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、前記第２の試料で汚染されていないものとして分類すること
を含む、方法。
【請求項１９】
前記シーケンシングより前に、ポリヌクレオチドのセットをタグ付けし、タグ付きポリヌクレオチドを生じさせることをさらに含み、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
各試料について、前記複数のシーケンシングリードを、（ｉ）前記タグ、（ｉｉ）前記開始領域、（ｉｉｉ）前記終了領域、および（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することを含み、前記試料中の各ファミリーは、前記試料中の前記ポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；
（ｂ）前記複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；
（ｃ）各試料について、前記複数のシーケンシングリードを、前記タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、前記試料中のファミリーは、前記試料中の前記タグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｄ）前記複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、前記第２の試料のファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一であるグループ化特徴を有する前記第１の試料のファミリーである、こと；
（ｅ）前記第１の試料について前記共有ファミリーのセットの定量的尺度を決定すること；ならびに
（ｆ）前記第１の試料を、前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、前記第２の試料で汚染されているものとして、または前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が前記所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、前記第２の試料で汚染されていないものとして分類すること
を含む、方法。
【請求項２２】
第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；
（ｂ）前記複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；
（ｃ）前記２つの試料の前記複数のシーケンシングリードを一緒に、前記タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、前記試料中の各ファミリーは、前記試料中の前記タグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅されたタグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｄ）前記複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、前記第１の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードおよび前記第２の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードを含む、こと；
（ｅ）前記共有ファミリーのセットに由来する定量的尺度を決定すること；ならびに
（ｆ）前記第１の試料を、前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、前記第２の試料で汚染されているものとして、または前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が前記所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、前記第２の試料で汚染されていないものとして分類すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記定量的尺度が、前記第１の試料中の共有ファミリーの数を含む、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記定量的尺度が、前記共有ファミリー内における、前記第１の試料のシーケンシングリードの数の、前記第２の試料のシーケンシングリードの数に対する比を含む、請求項１８または２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記定量的尺度が、前記第１の試料中の共有ファミリーの数の、前記第１の試料中のファミリーの総数に対する比を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が、前記第１の試料のファミリー中のシーケンシングリードの数が前記第２の試料の対応するファミリー中のシーケンシングリードの数よりも大きい、前記第１の試料中の共有ファミリーを除外する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の試料中の前記共有ファミリーのセットの前記定量的尺度が、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対における共有ファミリーを除外する、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の前記過剰に提示された対が、
（ａ）複数の試料を提供することであって、前記複数の試料が、前記第１の試料および／または前記第２の試料と同一または実質的に同一であるゲノム開始位置およびゲノム停止位置の分布を含む、こと；
（ｂ）前記複数の試料中のファミリーを決定すること；
（ｃ）ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の１対を共有する前記複数の試料中のファミリーの数を定量化すること；
（ｄ）前記ファミリーの数が設定された閾値を超えた場合、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の前記１対を過剰に提示されたものとして分類すること
によって決定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の試料が、前記第１の試料または前記第２の試料を除外する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の試料が、前記第１の試料および前記第２の試料を除外する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の試料が、前記第１の試料と同じフローセル内で処理された試料を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の試料が訓練試料を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記設定された閾値が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０ファミリーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記開始領域が、前記シーケンシングリードの５’末端が参照配列へのアラインメントを開始することが決定されている、前記シーケンシングリードのゲノム開始位置を含み、前記終了領域が、前記シーケンシングリードの３’末端が前記参照配列へのアラインメントを停止することが決定されている、前記シーケンシングリードのゲノム停止位置を含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記開始領域が、前記参照配列にアラインメントする前記シーケンシングリードの５’末端で、最初の１、最初の２、最初の５、最初の１０、最初の１５、最初の２０、最初の２５、最初の３０または少なくとも最初の３０塩基位置を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記終了領域が、前記参照配列にアラインメントする前記シーケンシングリードの３’末端で、最後の１、最後の２、最後の５、最後の１０、最後の１５、最後の２０、最後の２５、最後の３０または少なくとも最後の３０塩基位置を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記タグが、前記ポリヌクレオチドの末端に付着した１つまたは複数の分子バーコードを含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つまたは複数の分子バーコードが、長さが少なくとも２、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０ヌクレオチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の試料のポリヌクレオチドに付着した１つまたは複数の分子バーコードが、前記第２の試料のポリヌクレオチドに付着した１つまたは複数の分子バーコードとは異なる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料のポリヌクレオチドが、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個または少なくとも１００，０００個の異なる分子バーコードでタグ付けされる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の試料および前記第２の試料が、同じフローセル内でシーケンシングされる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の試料が、前記第１の試料とは異なるフローセル内でシーケンシングされる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の試料が、前記第１の試料と同日ではあるが、前記第１の試料とは異なる時間に処理される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２の試料が、前記第１の試料の処理の少なくとも１分後、少なくとも３０分後、少なくとも１時間後、少なくとも２時間後、少なくとも３時間後または少なくとも４時間後に処理される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の試料および前記第２の試料が異なる日に処理される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１の試料および前記第２の試料が同じバッチの試料中にある、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２の試料が、前記第１の試料と同じバッチの試薬で処理される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１の試料および前記第２の試料が、異なる地理的位置で処理される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記試料の前記タグ付きポリヌクレオチドのセットが固有にタグ付けされる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料の前記タグ付きポリヌクレオチドのセットが非固有にタグ付けされる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１の試料が対象の体液から得られ、前記第２の試料が別の対象の体液から得られる、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドが無細胞ポリヌクレオチドである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記無細胞ポリヌクレオチドが無細胞ＤＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象のうちの少なくとも１つが疾患を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記疾患ががんである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記試料の前記ポリヌクレオチドのセットが、シーケンシング前に増幅され、それによって増幅された子孫ポリヌクレオチドを生成する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記シーケンシング前に、前記対象のゲノムまたはトランスクリプトーム由来の領域について、前記増幅された子孫ポリヌクレオチドの少なくとも一部を選択的に濃縮することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
シーケンシング前に、前記増幅された子孫ポリヌクレオチドの１つまたは両方の末端に１つまたは複数の試料インデックスを付着させることをさらに含み、前記試料インデックスが前記第１の試料と前記第２の試料とを区別する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記所定の閾値が前記第１の試料中のファミリーの総数の少なくとも０．００１％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも１０％である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１の試料の前記共有ファミリーのシーケンシングリードを除外することによって、前記第１の試料のポリヌクレオチドの体細胞遺伝的変異を検出することをさらに含み、ここで、前記第１の試料は前記第２の試料で汚染されていると分類されている、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記試料の汚染状態に関する情報、および／または前記試料の汚染状態に由来する情報を必要に応じて含む報告を生成することをさらに含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記試料が由来する前記対象または医療従事者などの第三者に前記報告を通信することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７２４，６２２号の利益および優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、通常、個体の正常細胞内に突然変異が蓄積することによって引き起こされ、その少なくとも一部は不適切に調節された細胞分裂をもたらす。このような突然変異には、一般的に、一塩基多様性（ＳＮＶ）、遺伝子融合、挿入および欠失（インデル）、トランスバージョン、転座、および逆位が含まれる。
【０００３】
がんは、しばしば、腫瘍の組織生検によって検出され、続いて細胞の病理、バイオマーカーまたは細胞から抽出されたＤＮＡの分析が行われる。しかし、最近、がんはまた、血液または尿などの体液中の無細胞核酸（例えば、循環する核酸、循環する腫瘍核酸、エキソソーム、アポトーシス細胞および／または壊死細胞からの核酸）から検出され得ることが提唱されている（例えば、Ｓｉｒａｖｅｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  １４：５３１−５４８  （２０１７）を参照されたい）。このような試験は、非侵襲的であり、生検の対象となる、疑われるがん細胞を同定せずに実施することができ、がんの全ての部分から核酸をサンプリングするという利点を有する。しかしながら、このような試験は、体液中に放出される核酸の量は少なく、また変動し、分析可能な形態でのこのような体液からの核酸の回収も同様であるという事実により複雑である。これらの試験は、所定の遺伝子座で１０００分子に１分子程度で提示される、非常に低い頻度の配列を検出できるように設計されている。したがって、このような試験は、他の試料からの分子による低いレベルの汚染に基づいて、偽陽性結果をもたらしやすい可能性がある。
試料は、種々の供給源によって汚染され得るが、例えば、限定されないが、試料間の液体の物理的キャリーオーバー（例えば、ピペッティング、試料準備またはシーケンサーを介した自動液体取扱い、増幅された材料の操作）；多重分離アーチファクト（例えば、ペアワイズハミング距離が制限されている試料インデックスを混乱させるベースコールエラー；ペアワイズエディット距離が制限されている試料インデックスを混乱させる挿入／欠失）；および試薬不純物（例えば、同一バッチにおいて合成されたオリゴのあるレベルの欠損がある試料インデックスオリゴ；別の試料インデックスを含有するオリゴで汚染された試料インデックスオリゴ（合成エラーのキャリーオーバーのいずれかによる））が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｉｒａｖｅｇｎａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１７）１４：５３１〜５４８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本出願は、２つの試料間の汚染を検出するための方法およびシステムを開示する。試料中の汚染検出の以前の方法は、汚染されていない試料において、多量にしか存在しないか、また全く存在しないが、少量で観察された場合は、汚染の指標となるある種の分子の検出に基づいている。このような２種類の分子は、共通の生殖系列一塩基多型（ＳＮＰ）を有する分子またはＹ染色体分子である。これらの方法は、上記の分子が、典型的には、全体的な汚染分子のごく一部であり、それらの量が、シーケンシング誤差およびサンプリング誤差の存在下での検出には不十分であり得るという事実によって限定される。さらに、高い汚染率では、汚染に基づく生殖細胞系ＳＮＶは、汚染された試料に固有の生殖細胞系ＳＮＶと区別することができない可能性がある。Ｙ染色体分子を検出機構として用いることは、Ｙ染色体分子が男性患者にのみ自然に存在するため、男性患者試料による女性患者試料の汚染にさらに限定される。物理的汚染に加えて、デジタル交差汚染は、試料インデックスが容易に別のインデックスに転換され、それがアルゴリズム的に誤って割り当てられた場合に起こる可能性がある。この問題は、デュアルインデックス化によって緩和することができるが、この方法にはそれ自体の欠点がある。
【０００６】
本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法、組成物、およびシステムを提供する。
【０００７】
一態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するシステムを提供し、通信ネットワークを介して、核酸シーケンサーによって生じた試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットの複数のシーケンシングリードを受信する通信インターフェースであって、シーケンシングリードがタグ配列およびポリヌクレオチドに由来する配列を含む通信インターフェースと；通信インターフェースと通信するコンピュータであって、１つまたは複数のコンピュータプロセッサー、および機械実行可能コードを含むコンピュータ可読媒体を含むコンピュータとを含み、機械実行可能コードは、１つまたは複数のコンピュータプロセッサーによる実行時に、以下：（ａ）通信ネットワークを介して、核酸シーケンサーによって生成された試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットの複数のシーケンシングリードを受信すること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む方法を実行する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができるコントローラを含むシステムを提供し、非一時的コンピュータ実行可能命令は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合、（ａ）第１の試料および第２の試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域、および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む方法を実行する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができるコントローラを含むシステムを提供し、非一時的コンピュータ実行可能命令は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合、（ａ）試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）２つの試料の複数のシーケンシングリードを一緒に、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、第１の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードおよび第２の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードを含む、こと；（ｅ）共有ファミリーのセットに由来する定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む方法を実行する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができるコントローラを含むシステムを提供し、非一時的コンピュータ実行可能命令は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合、（ａ）試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のタグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む方法を実行する。
【００１１】
別の態様では、本開示は、非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができるコントローラを含むシステムを提供し、非一時的コンピュータ実行可能命令は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合、（ａ）試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域、および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、第２の試料のファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一であるグループ化特徴を有する第１の試料のファミリーである、こと；（ｅ）第１の試料について共有ファミリーのセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む方法を実行する。
【００１２】
一部の実施形態では、シーケンシングリードは、（ｉ）タグ配列、および（ｉｉ）ポリヌクレオチドに由来する配列を含む。一部の実施形態では、システムは、各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つからの情報に基づいて複数のファミリーにグループ化することをさらに含み、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む。
【００１３】
別の態様では、本開示は、非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができるコントローラを含むシステムを提供し、非一時的コンピュータ実行可能命令は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合、（ａ）試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のタグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、第２の試料のファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一であるグループ化特徴を有する第１の試料のファミリーである、こと；（ｅ）第１の試料についての共有ファミリーのセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む方法を実行する。
【００１４】
別の態様では、本開示は、非一時的コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることができるコントローラを含むシステムを提供し、非一時的コンピュータ実行可能命令は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合、（ａ）試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）２つの試料の複数のシーケンシングリードを一緒に、タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーが、試料中のタグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅されたタグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、第１の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードおよび第２の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードを含む、こと；（ｅ）共有ファミリーのセットに由来する定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む方法を実行する。
【００１５】
一部の実施形態では、システムは、第１の試料の共有ファミリーのシーケンシングリードを除外することによって、第１の試料のポリヌクレオチドの体細胞遺伝的変異を検出することをさらに含み、ここで、第１の試料が第２の試料で汚染されていると分類されている。
【００１６】
一部の実施形態では、システムは、試料の汚染状態に関する情報、および／または試料の汚染状態に由来する情報を必要に応じて含む報告を生成することをさらに含む。
【００１７】
一部の実施形態では、システムは、試料が由来する対象または医療従事者などの第三者に報告を通信することをさらに含む。
【００１８】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む。
【００１９】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）コンピュータシステムによって、第１および第２の試料からの複数のシーケンシングリードを含む配列情報にアクセスすること；（ｂ）コンピュータシステムによって、複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、コンピュータシステムによって、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域、および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）コンピュータシステムによって、複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）コンピュータシステムによって、共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）コンピュータシステムによって、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）コンピュータシステムによって、第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む。
【００２０】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）第１および第２の試料からの複数のシーケンシングリードを含む配列情報を得ること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域、および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、本方法は、ａ）より前に、ポリヌクレオチドのセットをタグ付けし、タグ付きポリヌクレオチドを生じさせることをさらに含み、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本方法は、各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することをさらに含み、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む。
【００２２】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのタグ付きポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のタグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度は、第１の試料中の共有ファミリー識別子の数である。一部の実施形態では、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度は、第１の試料中の共有ファミリー識別子の数の、第１の試料中のファミリー識別子の総数に対する比を含む。一部の実施形態では、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度は、第１の試料のファミリー中のシーケンシングリードの数が第２の試料の対応するファミリー中のシーケンシングリードの数よりも大きい、第１の試料中の共有ファミリー識別子を除外する。一部の実施形態では、第１の試料中の共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度は、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対における共有ファミリー識別子を除外する。一部の実施形態では、第１の試料中のファミリー識別子の総数は、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対におけるファミリー識別子を除外する。
【００２４】
一部の実施形態では、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対は、（ａ）複数の試料を提供することであって、複数の試料が、第１の試料および／または第２の試料と同一または実質的に同一であるゲノム開始位置およびゲノム停止位置の分布を含む、こと；（ｂ）複数の試料中のファミリー識別子を決定すること；（ｃ）ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の１対を共有する複数の試料中のファミリー識別子の数を定量すること；ならびに（ｄ）ファミリー識別子の数が設定された閾値を超えた場合、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置のその１対を過剰に提示されたものとして分類することによって決定される。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料または第２の試料を除外する。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料および第２の試料を除外する。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料と同じフローセル内で処理された試料を含む。一部の実施形態では、複数の試料は訓練試料を含む。一部の実施形態では、セット閾値は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０ファミリーである。
【００２５】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域、および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、第２の試料のファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一であるグループ化特徴を有する第１の試料のファミリーである、こと；（ｅ）第１の試料について共有ファミリーのセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む。
【００２６】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）２つの試料の複数のシーケンシングリードを一緒に、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、各ファミリーは、ポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、共有ファミリーが、第１の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードおよび第２の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードを含む、こと；（ｅ）共有ファミリーのセットに由来する定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む。
【００２７】
一部の実施形態では、本方法は、シーケンシングより前に、ポリヌクレオチドのセットをタグ付けし、タグ付きポリヌクレオチドを生じさせることをさらに含み、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、本方法は、各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することを含み、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む。
【００２９】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中のファミリーは、試料中のタグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、第２の試料のファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一であるグループ化特徴を有する第１の試料のファミリーである、こと；（ｅ）第１の試料について共有ファミリーのセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む。
【００３０】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）２つの試料の複数のシーケンシングリードを一緒に、タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーが、試料中のタグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅されたタグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、所与の共有ファミリーが、第１の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードおよび第２の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードを含む、こと；（ｅ）共有ファミリーのセットに由来する定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーのセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、定量的尺度は、第１の試料中の共有ファミリーの数を含む。一部の実施形態では、定量的尺度は、共有ファミリー内における、第１の試料のシーケンシングリードの数の、第２の試料のシーケンシングリードの数に対する比を含む。一部の実施形態では、定量的尺度は、第１の試料中の共有ファミリーの数の、第１の試料中のファミリーの総数に対する比を含む。一部の実施形態では、共有ファミリーのセットの定量的尺度は、第１の試料のファミリー中のシーケンシングリードの数が第２の試料の対応するファミリー中のシーケンシングリードの数よりも大きい、第１の試料中の共有ファミリーを除外する。一部の実施形態では、第１の試料中の共有ファミリーのセットの定量的尺度は、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対における共有ファミリーを除外する。一部の実施形態では、第１の試料中のファミリーの総数は、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対におけるファミリーを除外する。一部の実施形態では、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対は、（ａ）複数の試料を提供することであって、複数の試料が、第１の試料および／または第２の試料と同一または実質的に同一であるゲノム開始位置およびゲノム停止位置の分布を含む、こと；（ｂ）複数の試料中のファミリーを決定すること；（ｃ）ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の１対を共有する複数の試料中のファミリーの数を定量化すること；（ｄ）ファミリーの数が設定された閾値を超えた場合、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置のその１対を過剰に提示されたものとして分類することによって決定される。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料または第２の試料を除外する。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料および第２の試料を除外する。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料と同じフローセル内で処理された試料を含む。一部の実施形態では、複数の試料は訓練試料を含む。一部の実施形態では、設定された閾値が、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約５ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約１０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約１５ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約２０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約３０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約４０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約５０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの少なくとも１０−３、少なくとも１０−４、少なくとも１０−５、少なくとも１０−６、少なくとも１０−７、少なくとも１０−８、または少なくとも１０−９であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−４であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−５であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−６であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−７であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−８であり得る。
【００３２】
一部の実施形態では、開始領域は、シーケンシングリードの５’末端が参照配列へのアラインメントを開始することが決定されている、シーケンシングリードのゲノム開始位置を含み、終了領域は、シーケンシングリードの３’末端が参照配列へのアラインメントを停止することが決定されている、シーケンシングリードのゲノム停止位置を含む。一部の実施形態では、開始領域は、参照配列にアラインメントするシーケンシングリードの５’末端で、最初の１、最初の２、最初の５、最初の１０、最初の１５、最初の２０、最初の２５、最初の３０または少なくとも最初の３０塩基位置を含む。一部の実施形態では、終了領域は、参照配列にアラインメントするシーケンシングリードの３’末端で、最後の１、最後の２、最後の５、最後の１０、最後の１５、最後の２０、最後の２５、最後の３０または少なくとも最後の３０塩基位置を含む。
【００３３】
一部の実施形態では、タグは、ポリヌクレオチドの末端に付着した１つまたは複数の分子バーコードを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードは、長さが少なくとも２、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、第１の試料のポリヌクレオチドに付着した１つまたは複数の分子バーコードは、第２の試料のポリヌクレオチドに付着した１つまたは複数の分子バーコードとは異なる。一部の実施形態では、試料のポリヌクレオチドは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個または少なくとも１００，０００個の異なる分子バーコードでタグ付けされる。
【００３４】
一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同じフローセル内でシーケンシングされる。一部の実施形態では、第２の試料は、第１の試料とは異なるフローセル内でシーケンシングされる。一部の実施形態では、第２の試料は、第１の試料と同日ではあるが、第１の試料とは異なる時間に処理される。一部の実施形態では、第２の試料は、第１が処理されてから少なくとも１分後、少なくとも３０分後、少なくとも１時間後、少なくとも２時間後、少なくとも３時間後または少なくとも４時間後に処理される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は異なる日に処理される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料が同じバッチの試料中にある。一部の実施形態では、第２の試料は、第１の試料と同じバッチの試薬で処理される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、異なる地理的位置で処理される。
【００３５】
一部の実施形態では、試料のタグ付きポリヌクレオチドのセットは、固有にタグ付けされる。一部の実施形態では、試料のタグ付きポリヌクレオチドのセットは、非固有にタグ付けされる。一部の実施形態では、第１の試料は、対象の体液から得られ、第２の試料は、別の対象の体液から得られる。
【００３６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、無細胞ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、対象の少なくとも１つは、疾患を有する。一部の実施形態では、疾患はがんである。
【００３７】
一部の実施形態では、試料のポリヌクレオチドのセットは、シーケンシング前に増幅され、それによって増幅された子孫ポリヌクレオチドを生成する。一部の実施形態では、本方法は、シーケンシング前に、対象のゲノムまたはトランスクリプトーム由来の領域について、増幅された子孫ポリヌクレオチドの少なくとも一部を選択的に濃縮することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、シーケンシング前に、増幅された子孫ポリヌクレオチドの１つまたは両方の末端に１つまたは複数の試料インデックスを付着させることをさらに含み、試料インデックスが第１の試料と第２の試料とを区別する。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の少なくとも０．００１％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも１０％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．０１％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．０５％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．１％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．５％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約１％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約２％である。
【００３８】
一部の実施形態では、本方法は、第１の試料の共有ファミリー識別子のシーケンシングリードを除外することによって、第１の試料のポリヌクレオチドの体細胞遺伝的変異を検出することをさらに含み、ここで、第１の試料は第２の試料で汚染されていると分類されている。一部の実施形態では、本方法は、第１の試料の共有ファミリーのシーケンシングリードを除外することによって、第１の試料のポリヌクレオチドの体細胞遺伝的変異を検出することをさらに含み、ここで、第１の試料は第２の試料で汚染されていると分類されている。
【００３９】
一部の実施形態では、本方法は、試料の汚染状態に関する情報、および／または試料の汚染状態に由来する情報を必要に応じて含む報告を生成することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、試料が由来する対象または医療従事者などの第三者に報告を通信することを含む。
【００４０】
本明細書に記載される実施形態は、本明細書に記載される方法とシステムの両方に使用または適用することができる。
【００４１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステムおよび／または方法の結果は、報告を生成するための入力として使用される。報告は、紙または電子形式とすることができる。例えば、本明細書に開示される方法またはシステムによって決定される、第１の試料の汚染状態に関する情報、および／または試料の汚染状態に由来する情報をこのような報告に表示させることができる。本明細書に開示される方法またはシステムはさらに、試料が由来する対象または医療従事者などの第三者に報告を伝達するステップを含み得る。
【００４２】
本明細書に開示される方法の種々のステップ、または本明細書に開示されるシステムによって行われるステップは、同時にもしくは異なる時間に、および／または同じ地理的位置もしくは異なる地理的位置、例えば国で行うことができる。本明細書に開示される方法の種々のステップは、同一人物または異なる人物によって行うことができる。
【００４３】
ある種の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行される場合、本明細書に記載される１つまたは複数のステップまたは方法を実行することができる、非一時的コンピュータ実行可能命令を含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
【００４４】
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合、少なくとも以下：（ａ）核酸シーケンサーによって生成された試料からタグ付きポリヌクレオチドのセットの複数のシーケンシングリードを得ること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、所与の共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、第２の試料で汚染されていないものとして分類することを実行することができる、非一時的コンピュータ実行可能命令を含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
【００４５】
ある種の態様では、本明細書に記載される方法、システムおよび／またはコンピュータ可読媒体は、アッセイ性能のための品質管理基準として、および／または試料中の体細胞変異の信頼性のある検出を確実にするために得られるシーケンシングデータの品質を評価するために使用することができる。
【００４６】
本開示のさらなる態様および利点は、以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになり、本開示の例証的な実施形態のみが示され、説明される。認識されるように、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全てが開示から逸脱することなく、様々な自明な点で修飾することが可能である。したがって、図面および説明は、本質的に例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
【００４７】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、ある種の実施形態を説明し、記載される説明とともに、本明細書に開示される方法、コンピュータ可読媒体、およびシステムのある種の原理を説明するのに役立つ。本明細書に提供される説明は、限定としてではなく例示として含まれる添付の図面とともに読まれる場合に、よりよく理解される。文脈が別の意味を示さない限り、同様の参照符号は図面全体にわたって同様の構成要素を識別することが理解される。また、図の一部または全部は、例証の目的のための略図であり得、示されたエレメントの実際の相対的な大きさまたは位置を必ずしも表すものではないことも理解される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、本開示の一実施形態による、２つの試料間の汚染の有無を検出するための方法のフローチャート図を示す。
【００４９】
【図２】図２は、本開示の一実施形態による、２つの試料間の汚染の有無を検出するための方法のフローチャート図を示す。
【００５０】
【図３】図３は、シーケンシングリードのファミリーへのグループ化を例証し、それによって、本開示の一実施形態による２つの試料間の汚染の有無を検出する概略図を示す。
【００５１】
【図４】図４は、本開示の一部の実施形態での使用に適した例示的なシステムの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
用語の定義
本明細書には、本開示の様々な実施形態が示され、記載されているが、当業者であれば、このような実施形態は例としてのみ提供されることを理解する。本開示から逸脱することなく、当業者には多数の変形形態、変化、および置換が起こり得る。当然のことながら、本明細書に記載される本開示の実施形態に対する種々の代替物を使用することができることが理解される。
【００５３】
本開示をより容易に理解するために、ある種の用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語のさらなる定義は、本明細書を通じて記載することができる。以下に記載する用語の定義が、参照により組み込まれる出願または特許における定義と矛盾する場合、この出願に記載される定義は、その用語の意味を理解するために使用されるべきである。
【００５４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載されるタイプの、および／または本開示を読んだ際に当業者に明らかになる１つまたは複数の方法および／またはステップなどを含む。
【００５５】
また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用され、限定することを意図しないことも理解されるべきである。さらに、別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。方法、コンピュータ可読媒体、およびシステムの説明および請求には、以下の用語、およびそれらの文法変形が、以下に述べる定義に従って使用される。
【００５６】
約：本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」は、目的の１つまたは複数の値またはエレメントに適用されるとき、記述された参照値またはエレメントに類似する値またはエレメントを指す。ある種の実施形態では、用語「約」または「およそ」は、別段の記述がない限り、または文脈から明らかでない限り（このような数が可能な値またはエレメントの１００％を超える場合を除き）、記載される参照値またはエレメントのいずれかの方向（それを超えるかまたはそれ未満）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に入る値またはエレメントの範囲を指す。
【００５７】
アダプター：本明細書で使用される場合、「アダプター」とは、典型的には少なくとも部分的に二本鎖であり、所与の試料核酸分子のいずれかまたは両方の末端に連結するために使用される、短い核酸（例えば、長さ約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、または約５０ヌクレオチド未満）を指す。アダプターは、両端においてアダプターにより隣接された核酸分子の増幅を可能にするための核酸プライマー結合部位、および／または種々の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）適用などのシーケンシング適用のためのプライマー結合部位を含むシーケンシングプライマー結合部位を含む、核酸プライマー結合部位を含むことができる。アダプターはまた、フローセル支持体などに付着したオリゴヌクレオチドなどの捕捉用プローブのための結合部位を含むことができる。アダプターはまた、本明細書に記載される核酸タグを含むことができる。核酸タグは、典型的には、増幅プライマーおよびシーケンシングプライマー結合部位に対して位置決めされ、その結果、核酸タグは、所与の核酸分子のアンプリコンおよび配列リードに含まれる。同一または異なるアダプターを核酸分子のそれぞれの末端に連結することができる。一部の実施形態では、核酸タグが異なることを除き、同一配列のアダプターは、核酸分子のそれぞれの末端に連結される。一部の実施形態では、アダプターは、核酸分子に接続するために、本明細書に記載されるように、一方の端が平滑末端であるかまたは尾部を有するＹ字型アダプターであり、これはまた、１つまたは複数の相補的ヌクレオチドで平滑末端であるかまたは尾部を有する。さらに他の例示的な実施形態では、アダプターは、分析される核酸分子に接続するための平滑末端または尾部末端を含むベル型アダプターである。アダプターの他の例としては、Ｔ尾部アダプターおよびＣ尾部アダプターが挙げられる。
【００５８】
増幅する：本明細書で使用される場合、核酸との関連で「増幅する」または「増幅」とは、ポリヌクレオチドの複数のコピー、またはポリヌクレオチドの一部、典型的には少量のポリヌクレオチド（例えば、単一のポリヌクレオチド分子）から出発するものの生成を指し、増幅産物またはアンプリコンは一般に検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、種々の化学的および酵素的プロセスを包含する。
【００５９】
バーコード：本明細書で使用される場合、核酸との関連で「バーコード」または「分子バーコード」とは、分子識別子として機能し得る配列を含む核酸分子を指す。例えば、個々の「バーコード」配列は、典型的には、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ライブラリの調製中に各ＤＮＡ断片に添加され、それにより各読取りが最終的なデータ分析の前に同定され、選別され得る。
【００６０】
がんタイプ：本明細書で使用される場合、「がんタイプ」とは、例えば、組織病理学によって定義されたがんのタイプまたはサブタイプを指す。がんタイプは、任意の従来の基準、例えば、所定の組織における発症を基準にして定義され得る（例えば、血液がん、中枢神経系がん（ＣＮＳ）、脳がん、肺がん（小細胞および非小細胞）、皮膚がん、鼻がん、咽頭がん、肝臓がん、骨がん、リンパ腫、膵臓がん、大腸がん、直腸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎臓がん、口がん、胃がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、肺がん、腸がん、軟部組織がん、神経内分泌がん、胃食道がん、頭頸部がん、婦人科がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、固形がん、不均質ながん、均質ながん（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｃａｎｃｅｒ））、原発不明がん等、および／または同一の細胞系譜（例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、胆管がん、白血病、中皮腫、黒色腫、または神経膠芽細胞腫）、および／またはＨｅｒ２、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ホルモン受容体およびＮＭＰ−２２などのがんマーカーを示すがん）。がんはまた、病期（例えば、１期、２期、３期、または４期）および原発起源または二次起源によって分類することができる。
【００６１】
無細胞核酸：本明細書で使用される場合、「無細胞核酸」とは、細胞内に含まれていないもしくはそうでなければ細胞に結合していない核酸、または一部の実施形態では、無傷細胞の除去後に試料中に残存する核酸を指す。無細胞核酸は、例えば、対象からの体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）など）から供給される全ての被包されていない核酸を含むことができる。無細胞核酸には、ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、およびそのハイブリッドが含まれ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、循環ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（長いｎｃＲＮＡ）、および／またはこれらのいずれかの断片が挙げられる。無細胞核酸は、二本鎖、一本鎖、またはそのハイブリッドであり得る。無細胞核酸は、分泌または細胞死プロセス、例えば、細胞壊死、アポトーシスなどを介して体液中に放出され得る。いくつかの無細胞核酸は、がん細胞、例えば、循環する腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）から体液中に放出される。他は、正常な細胞から放出される。ＣｔＤＮＡは、被包されていない腫瘍由来の断片化ＤＮＡであり得る。無細胞核酸の別の例は、母体血流中を自由に循環する胎児ＤＮＡであり、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）とも呼ばれる。無細胞核酸は、１つまたは複数のエピジェネティック修飾を有することができ、例えば、無細胞核酸は、アセチル化、５−メチル化、ユビキチン化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、リボシル化、および／またはシトルリン化され得る。
【００６２】
細胞核酸：本明細書で使用される場合、「細胞核酸」とは、核酸が所定の分析プロセスの一部として（例えば、細胞溶解を介して）後に除去されたとしても、少なくとも試料が対象から採取または回収される時点で、その核酸が由来する１つまたは複数の細胞内にある核酸を意味する。
【００６３】
試料の汚染：本明細書で使用される場合、「汚染」または「試料の汚染」という用語は、ある試料の別の試料による任意の化学的またはデジタル的汚染を指す。汚染は、様々な供給源に起因し得るが、例えば、限定されないが、試料間の液体の物理的キャリーオーバー（例えば、ピペッティング、試料調製またはシーケンサシステムを介した自動液体取扱い、増幅された材料の操作）；逆多重化アーチファクト（例えば、ペアワイズハミング距離が制限されている試料インデックスを混乱させるベースコールエラー；ペアワイズ編集距離が制限されている試料インデックスを混乱させる挿入／欠失）および試薬不純物（例えば、別の試料インデックスを含むオリゴで汚染された（合成エラーのいずれかのキャリーオーバーによる）試料インデックスオリゴ）が挙げられる。
【００６４】
デオキシリボ核酸またはリボ核酸：本明細書で使用される場合、「デオキシリボ核酸」または「ＤＮＡ」は、糖部分の２’位に水素基を有する天然または修飾ヌクレオチドを指す。ＤＮＡは、典型的には、４種類のヌクレオチド塩基；アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびグアニン（Ｇ）を含むヌクレオチドの鎖を含む。本明細書で使用される場合、「リボ核酸」または「ＲＮＡ」とは、糖部分の２’位にヒドロキシル基を有する天然または修飾ヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、典型的には、４種類のヌクレオチド塩基；Ａ、ウラシル（Ｕ）、Ｇ、およびＣを含むヌクレオチドの鎖を含む。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを指す。ある種の塩基対は、相補的な形で互いに特異的に結合する（相補的塩基対形成と呼ばれる）。ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と対合し、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）と対合する。第１の核酸鎖が、第１の鎖のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドからなる第２の核酸鎖に結合した場合、２本の鎖は結合して二本鎖を形成する。本明細書で使用される場合、「核酸シーケンシングデータ」、「核酸シーケンシング情報」、「配列情報」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ゲノム配列」、「遺伝子配列」、または「断片配列」、または「核酸シーケンシングリード」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の分子（例えば、全ゲノム、全トランスクリプトーム、エキソーム、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または断片）中のヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンまたはウラシル）の順序および正体を示す任意の情報またはデータを示す。本教示は、限定されないが、キャピラリー電気泳動、マイクロアレイ、ライゲーションベースのシステム、ポリメラーゼベースのシステム、ハイブリダイゼーションベースのシステム、直接または間接ヌクレオチド同定システム、ピロシーケンシング、イオンまたはｐＨベースの検出システム、および電子シグネチャベースのシステムを含む、全ての利用可能な種類の技術、プラットフォームまたは技術を用いて得られる配列情報を意図することが理解される。
【００６５】
ファミリー：本明細書で使用される場合、用語「ファミリー」は、単一のポリヌクレオチド分子に由来する１つまたは複数のシーケンシングリードを指す。生物情報学的には、単一のポリヌクレオチド分子に由来する１つまたは複数のシーケンシングリードは、同一または実質的に同一のグループ化特徴を有し、このグループ化特徴は、（ｉ）タグ（すなわち、分子バーコード）、（ｉｉ）アラインメントの開始領域、（ｉｉｉ）アラインメントの終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含む。同一または実質的に同一のグループ化特徴を有するこれらのシーケンシングリードは、一緒にファミリーにグループ化することができる。一部の実施形態では、確率は低いが、少なくとも２つの分子は、同じグループ化特徴を有することができ、したがって、少なくとも２つの分子に由来するシーケンシングリードは、単一のファミリーにグループ化することができる。
【００６６】
一部の実施形態では、単一のポリヌクレオチド分子に由来するシーケンシングリードは、単一の試料においてのみ検出される。一部の実施形態では、少なくとも２つの試料の汚染がある場合、（単一の試料の）単一のポリヌクレオチド分子に由来するシーケンシングリードは、少なくとも２つの試料において検出され得る。これらの実施形態では、シーケンシングリードのグループ化が各試料について独立して行われる場合、各試料内で検出される単一のポリヌクレオチド分子に由来するシーケンシングリードは、その試料中の別々のファミリーとしてグループ化される。他の実施形態では、シーケンシングリードのグループ化が少なくとも２つの試料の全てについて一緒に行われる場合、少なくとも２つの試料において検出される単一のポリヌクレオチド分子に由来するシーケンシングリードは単一のファミリーにグループ化される。
【００６７】
ファミリーのグループ化特徴は、そのファミリーにおけるシーケンシングリードのグループ化特徴の代表である。一部の実施形態では、ファミリーが同一のグループ化特徴を有するシーケンシングリードを含む場合、シーケンシングリードのいずれかのグループ化特徴は、ファミリーのグループ化特徴である。他の実施形態では、ファミリーが、同一であり、実質的に同一であるグループ化特徴を有するシーケンシングリードを含む場合、ファミリーのグループ化特徴は、限定されないが、（ｉ）シーケンシングリードの最も高頻度に提示されるグループ化特徴；（ｉｉ）シーケンシングリードのグループ化特徴の平均；（ｉｉｉ）分子バーコード中の最も高頻度に提示されるヌクレオチド塩基；（ｉｖ）シーケンシングリードの分子バーコードおよび／または開始領域および／または終了領域の最大尤度値のうちの１つまたは組合せであり得る。
【００６８】
一部の実施形態では、ファミリーは、単一のポリヌクレオチド分子に由来する少なくとも２つのシーケンシングリードを含む。一部の実施形態では、ファミリーは、二本鎖ポリヌクレオチド分子のうちの一本鎖に由来する配列リードを含むことができる。一部の実施形態では、ファミリーは、二本鎖ポリヌクレオチド分子の両方の鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）に由来する配列リードを含む。一例では、分子バーコード、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置が、ファミリーのグループ化特徴とみなされる。この場合、ファミリーが１０個の配列リードを有し、全ての配列リードが同一の分子バーコードおよびゲノム開始位置を有するが、ゲノム停止位置が同一でない場合、その分子バーコードおよびゲノム開始位置がファミリーのグループ化特徴となり、ゲノム停止位置については、そのファミリーにおけるシーケンシングリードの大部分が示すゲノム停止位置が、そのファミリーのゲノム停止位置（そのファミリーのグループ化特徴の一部である）とみなされる。
【００６９】
ファミリー識別子：本明細書で使用される場合、用語「ファミリー識別子」は、各ファミリーを固有に識別する識別子を指し、それは、ファミリーのグループ化特徴および／またはグループ化特徴に由来する情報を含む。一部の実施形態では、ファミリー識別子は、整数、アルファベットまたは両方の組合せを含むことができる。一部の実施形態では、ファミリー識別子は、ファミリーのシーケンシングリードに割り当てられる。
【００７０】
生殖細胞系突然変異：本明細書で使用される場合、「生殖細胞系突然変異」または「生殖細胞系変異」という用語は互換的に使用され、遺伝的突然変異（すなわち、受胎後に生じるものではない）を指す。生殖細胞系突然変異は、子孫に受け継がれ得る唯一の突然変異であり、子孫の全ての体細胞および生殖細胞系列の細胞に存在し得る。
【００７１】
インデル：本明細書で使用される場合、「インデル」とは、対象のゲノム中のヌクレオチドの挿入または欠失を伴う突然変異を指す。
【００７２】
突然変異対立遺伝子割合：本明細書で使用される場合、「突然変異対立遺伝子割合」、「突然変異用量」、または「ＭＡＦ」は、所与の試料中の所与のゲノム位置／遺伝子座における対立遺伝子改変または突然変異を有する核酸分子の割合を指す。ＭＡＦは、一般的に、分数またはパーセンテージで表される。例えば、体細胞変異体のＭＡＦは０．１５未満であり得る。
【００７３】
突然変異：本明細書で使用される場合、「突然変異」とは、既知の参照配列からの変異を指し、例えば、一塩基バリアント（ＳＮＶ）、および挿入または欠失（インデル）などの突然変異を含む。突然変異は、生殖細胞系突然変異または体細胞突然変異であり得る。一部の実施形態では、比較目的の参照配列は、試験試料、典型的にはヒトゲノムを提供する対象の種の野生型ゲノム配列である。
【００７４】
新生物：本明細書で使用される場合、「新生物」および「腫瘍」という用語は、互換的に使用される。それらは、対象における細胞の異常な増殖を指す。新生物または腫瘍は、良性、潜在的に悪性、または悪性であり得る。悪性腫瘍は、がんまたはがん性腫瘍と呼ばれる。
【００７５】
次世代シーケンシング：本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」とは、例えば、一度に数十万の比較的小さな配列リードを生じさせる能力を有する、従来のサンガーおよびキャピラリー電気泳動に基づくアプローチと比較してスループットが増加したシーケンシング技術を指す。次世代シーケンシング技術のいくつかの例には、限定されないが、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、およびハイブリダイゼーションによるシーケンシングが含まれる。
【００７６】
核酸タグ：本明細書で使用される場合、「核酸タグ」とは、異なる試料（例えば、試料インデックスを表す）から核酸を識別するために使用される短い核酸（例えば、長さが約５００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、または約１０ヌクレオチド未満である）、または異なるタイプの、または異なる処理を受けた同一試料（例えば、分子バーコードを表す）中の異なる核酸分子を指す。核酸タグは、所定、固定、非ランダム、ランダムまたはセミランダムのオリゴヌクレオチド配列を含む。このような核酸タグは、異なる核酸分子または異なる核酸試料もしくはサブ試料を標識するために使用され得る。核酸タグは、一本鎖、二本鎖、または少なくとも部分的に二本鎖であり得る。核酸タグは、必要に応じて同じ長さまたは異なる長さを有する。核酸タグはまた、１つまたは複数の平滑末端を有する二本鎖分子を含むことができ、５’もしくは３’一本鎖領域（例えば、オーバーハング）を含み、および／または所与の分子内の他の位置に１つまたは複数の他の一本鎖領域を含むことができる。核酸タグは、他の核酸（例えば、増幅および／またはシーケンシングされる試料核酸）の一方の末端または両末端に付着され得る。核酸タグをデコードして、所与の核酸の起源、形態、または処理の試料などの情報を明らかにすることができる。例えば、核酸タグはまた、核酸タグを検出（例えば、読取り）することによって、核酸がその後分解される、異なる分子バーコードおよび／または試料インデックスを有する核酸を含む複数の試料のプールおよび／または並行処理を可能にするために使用することもできる。核酸タグはまた、識別子（例えば、分子識別子、試料識別子）とも呼ばれ得る。さらにまたは代わりに、核酸タグを分子バーコードとして、（例えば、同一試料またはサブ試料中の異なる親分子の異なる分子またはアンプリコンを区別するために）使用することができる。これは、例えば、所与の試料中の異なる核酸分子を固有にタグ付けすること、またはこのような分子を非固有にタグ付けすることを含む。非固有なタグ付け適用の場合、限定された数のタグ（すなわち、分子バーコード）を用いて、核酸分子をタグ付けし得、それにより、異なる分子が、少なくとも１つの分子バーコードと組み合わせて、それらの内因性配列情報（例えば、それらが選択された参照ゲノムにマップする開始位置および／または停止位置、配列の１つまたは両方の末端のサブ配列、および／または配列の長さ）に基づいて区別することができる。典型的には、任意の２つの分子が同一の内因性配列情報（例えば、開始位置および／または停止位置、配列の一方または両方の末端のサブ配列、および／または長さ）を有し、また同じ分子バーコードを有し得る低確率（例えば、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満の確率）が存在するように、十分な数の異なる分子バーコードが使用される。
【００７７】
ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対：本明細書で使用される場合、「ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対」または「過剰に提示された対」という用語は、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の対を共有する複数の試料中のファミリーの数または頻度が、設定された閾値を超えるゲノム開始位置およびゲノム停止位置の対を指す。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料および第２の試料が試行されたフローセルで試行される試料を含む。例えば、複数の試料は、分析される第１の試料および／または第２の試料に関連する核酸シーケンサーの特定のフローセル内で処理された訓練試料または複数の試料であり得る。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料および／または第２の試料を除外する。一部の実施形態では、設定された閾値は２〜１００の任意の値であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、または少なくとも５０であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は５であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は１０であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は１５であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は２０であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの少なくとも１０−３、少なくとも１０−４、少なくとも１０−５、少なくとも１０−６、少なくとも１０−７、少なくとも１０−８、または少なくとも１０−９であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの１０−４であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの１０−５であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの１０−６であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの１０−７であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの１０−８であり得る。
【００７８】
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、または「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシド間結合によって接続されたヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはそれらのアナログを含む）の線状ポリマーを指す。典型的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオシドを含む。オリゴヌクレオチドは、しばしば、数個のモノマー単位、例えば、３〜４個から数百個のモノマー単位までの範囲のサイズである。ポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列によって表される場合はいつでも、ヌクレオチドは左から右へ５’→３’の順序であり、ＤＮＡの場合、別段の記述がない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はデオキシチミジンを示すことは理解される。文字Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴは、当該技術分野において標準的であるように、塩基自体、ヌクレオシド、または塩基を含むヌクレオチドを指すために使用され得る。
【００７９】
参照配列：本明細書で使用される場合、「参照配列」とは、実験的に決定された配列との比較のために使用される既知の配列を指す。例えば、既知の配列は、全ゲノム、染色体、またはそれらの任意のセグメントであり得る。参照は、典型的には、少なくとも約２０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個、少なくとも約４００個、少なくとも約４５０個、少なくとも約５００個、少なくとも約１０００個、または１０００個を超えるヌクレオチドを含む。参照配列は、ゲノムもしくは染色体の単一の連続した配列とアラインメントさせることができ、またはゲノムもしくは染色体の異なる領域とアラインメントする非隣接セグメントを含むことができる。参照配列の例には、例えば、ｈＧ１９およびｈＧ３８などのヒトゲノムが含まれる。
【００８０】
試料：本明細書で使用される場合、「試料」とは、本明細書に開示される方法および／またはシステムによって分析することができる任意のものを意味する。
【００８１】
シーケンシング：本明細書で使用される場合、「シーケンシング」とは、生体分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の配列（例えば、モノマー単位の正体および順序）を決定するために使用されるいくつもある技術のうちのいずれかを指す。シーケンシング方法の例としては、限定されないが、ターゲットシーケンシング、単一分子リアルタイムシーケンシング、エキソンまたはエキソームシーケンシング、イントロンシーケンシング、電子顕微鏡ベースのシーケンシング、パネルシーケンシング、トランジスター媒介シーケンシング、直接シーケンシング、ランダムショットガンシーケンシング、サンガージデオキシターミネーションシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、パイロシーケンシング、キャピラリー電気泳動、二重鎖シーケンシング、サイクルシーケンシング、単一ベースの伸長シーケンシング、固相シーケンシング、ハイスループットシーケンシング、大規模並列シグネチャーシーケンシング、エマルジョンＰＣＲ、より低い変性温度での共増幅−ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）、多重ＰＣＲ、可逆的色素ターミネーターによるシーケンシング、ペアードエンドシーケンシング、短期シーケンシング、エキソヌクレアーゼシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ショート読取りシーケンシング、単一分子シーケンシング、合成によるシーケンシング、リアルタイムシーケンシング、リバースターミネーターシーケンシング、ナノポアシーケンシング、４５４シーケンシング、Ｓｏｌｅｘａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンシング、ＳＯＬｉＤ（商標）シーケンシング、ＭＳ−ＰＥＴシーケンシング、およびそれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、シーケンシングは、他の多くのうち、遺伝子分析器、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている遺伝子分析器によって行うことができる。
【００８２】
配列情報：本明細書で使用される場合、核酸ポリマーとの関連で「配列情報」とは、そのポリマー中のモノマー単位（例えば、ヌクレオチドなど）の順序および正体を意味する。
【００８３】
共有ファミリー：シーケンシングリードのファミリーへのグループ化が、第１の試料および第２の試料について独立して行われる場合、用語「共有ファミリー」は、第１の試料中のファミリーを指し、そのグループ化特徴は、第２の試料中のファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一である。あるいは、シーケンシングリードのファミリーへのグループ化が、第１の試料と第２の試料の両方について一緒に行われる場合、用語「共有ファミリー」は、第１の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードと第２の試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードとを含むファミリーを指す。
【００８４】
一部の実施形態では、少なくとも２つの試料の汚染がある場合、（単一の試料の）単一のポリヌクレオチド分子に由来するシーケンシングリードは、少なくとも２つの試料において検出され得る。これらの実施形態では、シーケンシングリードのグループ化が各試料について独立して行われる場合、各試料内で検出される単一のポリヌクレオチド分子に由来するシーケンシングリードは、その試料中の別々のファミリーとしてグループ化される。これらの実施形態では、共有ファミリーとは、第１の試料中のファミリーを指し、そのグループ化特徴は、第２の試料中のファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一である。
【００８５】
あるいは、他の実施形態では、シーケンシングリードのグループ化が、少なくとも２つの試料全てについて一緒に行われる場合、少なくとも２つの試料において検出される単一のポリヌクレオチド分子に由来するシーケンシングリードは、単一のファミリーにグループ化される。これらの実施形態では、共有ファミリーは、少なくとも２つの試料からの少なくとも１つのシーケンシングリードを有するファミリーを指す。
【００８６】
一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同じフローセルまたは異なるフローセル内にあり得る。
【００８７】
共有ファミリー識別子：本明細書で使用される場合、用語「共有ファミリー識別子」とは、第２の試料中のファミリーのファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料中のファミリーのファミリー識別子を指す。すなわち、第１の試料中のファミリーのグループ化特徴は、第２の試料中のファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一である。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同じフローセル内または異なるフローセル内であり得る。
【００８８】
一塩基多型：本明細書で使用される場合、用語「一塩基多型」または「ＳＮＰ」は、互換的に使用される。それらは、ゲノム中の特定の位置で生じる一塩基の変異を指し、各変異は、集団内にある程度（例えば、約１％より大きい）存在する。
【００８９】
一塩基バリアント：本明細書で使用される場合、「一塩基バリアント」または「ＳＮＶ」は、ゲノム中の特定の位置で生じる一塩基の突然変異または変異を意味する。
【００９０】
体細胞突然変異：本明細書で使用される場合、「体細胞突然変異」または「体細胞変異」という用語は、互換的に使用される。それらは受胎後に生じるゲノムの突然変異を指す。体細胞突然変異は、生殖細胞を除いて生体のどの細胞でも起こり得るため、子孫には受け継がれない。
【００９１】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」とは、動物、例えば、哺乳動物種（例えば、ヒト）またはトリ（例えば、鳥）種、または植物などの他の生物を指す。より具体的には、対象は、脊椎動物、例えば、マウス、霊長類、サルまたはヒトなどの哺乳動物であり得る。動物には、家畜（例えば、生産牛、乳牛、家禽、ウマ、ブタなど）、競技用動物、および伴侶動物（例えば、ペットまたは支援動物）が含まれる。対象は、健康な個体、疾患を有しているかもしくは有する疑いがある個体、または疾患に対する素因を有しているかもしくは有する疑いがある個体、または治療を必要としているかもしくは治療を必要とする疑いがある個体であり得る。用語「個体」または「患者」は、「対象」と置き換えることが意図される。
【００９２】
例えば、対象は、がんを有すると診断された、がん治療を受けようとしている、および／または少なくとも１つのがん治療を受けた個体であり得る。対象は、がんの寛解状態にあり得る。別の例として、対象は、自己免疫疾患を有すると診断される個体であり得る。別の例として、対象は、妊娠している、または妊娠を計画している、疾患、例えば、がん、自己免疫疾患と診断されたかまたはその疑いがある、女性個体であり得る。
【００９３】
実質的に同一である：本明細書で使用される場合、用語「実質的に同一である」とは、９９．９％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも６０％同一または少なくとも５０％同一である２つの異なる実体を指す。例えば、第１の試料中のファミリーが第２の試料中のファミリーと実質的に同一である場合、第１の試料中のファミリーのグループ化特徴は、第２の試料中のファミリーのグループ化特徴と９９．９％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも６０％同一または少なくとも５０％同一である。実体が分子バーコードである場合、用語「実質的に同一である」とは、ハミング距離または編集距離が１未満、２未満、３未満、４未満、５未満、６未満、７未満または８未満の２つの異なる分子バーコードを指す。実体が開始領域または終了領域である場合、用語「実質的に同一である」とは、１ｂｐ内、２ｂｐ内、３ｂｐ内、４ｂｐ内、５ｂｐ内、６ｂｐ内、７ｂｐ内、８ｂｐ内、９ｂｐ内、１０ｂｐ内、１１ｂｐ内、１５ｂｐ内、２０ｂｐ内または２５ｂｐ内の２つの異なる領域を指す。実体がポリヌクレオチドの長さである場合、用語「実質的に同一である」は、１ｂｐ内、２ｂｐ内、３ｂｐ内、４ｂｐ内、５ｂｐ内、６ｂｐ内、７ｂｐ内、８ｂｐ内、９ｂｐ内、１０ｂｐ内、１１ｂｐ内、１５ｂｐ内、２０ｂｐ内、２５ｂｐ内、３０ｂｐ内、４０ｂｐ内または５０ｂｐ内の２つの異なる長さを指す。
【００９４】
閾値：本明細書で使用される場合、「閾値」とは、閾値との関係に依存して、異なる試料についての同じパラメータの実験的に決定された値を特徴付けるために使用される所定の値を指す。例えば、ｐ値の閾値は、０と１の間の任意の所定値を指すことができ、核酸バリアントの起源を同定するために使用される。
【００９５】
訓練試料：本明細書で使用される場合、「訓練試料」とは、汚染の有無について分析される、第１の試料および／または第２の試料に類似する特性、パラメータおよび／または組成を有する試料のセットを指す。
【００９６】
バリアント：本明細書で使用されるように、「バリアント」とは、対立遺伝子を指すことができる。バリアントは、通常、対立遺伝子がヘテロ接合であるかまたはホモ接合であるかに依存して、５０％（０．５）または１００％（１）の頻度で提示される。例えば、生殖細胞系バリアントは遺伝性であり、通常、０．５または１の頻度を有する。しかしながら、体細胞バリアントは後天性バリアントであり、通常、約０．５未満の頻度を有する。遺伝子座の主要対立遺伝子（ｍａｊｏｒ  ａｌｌｅｌｅ）および副対立遺伝子（ｍｉｎｏｒ  ａｌｌｅｌｅ）とは、その遺伝子座が参照配列のヌクレオチドによって占められている遺伝子座を有する核酸、および参照配列とは異なるバリアントヌクレオチドをそれぞれ指す。遺伝子座での測定値は、対立遺伝子の割合（ＡＦ）の形をとることができ、これは試料中で対立遺伝子が観察される頻度を測定する。
【００９７】
詳細な説明
Ｉ．総括
分析のための試料を処理する際には、試料中に存在する分子の別の試料への播種を介して、同じバッチで処理されているか、または時間的に近接して、かつ特に近傍で処理されている試料の化学的汚染またはデジタル交差汚染によって、偽陽性結果を導入する可能がある。汚染または第二のゲノム（すなわち、対象のゲノム以外であり、例えば、移植、輸血または胎児から生じる）を含む試料からの無細胞核酸をアッセイする場合、試料は、追加の手作業での検査またはさらなるシーケンシング試行を行う必要があり得る。
【００９８】
本開示は、第１の試料中の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法およびシステムを提供する。
【００９９】
ある態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）コンピュータシステムによって、第１および第２の試料からの複数のシーケンシングリードを含む配列情報にアクセスすること；（ｂ）コンピュータシステムによって、複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、コンピュータシステムによって、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域、および（ｉｉｉ）配列リードの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）コンピュータシステムによって、複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）コンピュータシステムによって、共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）コンピュータシステムによって、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）コンピュータシステムによって、第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含む。
【０１００】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）第１および第２の試料からの複数のシーケンシングリードを含む配列情報を得ること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域、および（ｉｉｉ）配列リードの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含む。
【０１０１】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること：（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域、および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｉｖ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｖ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｖｉ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｖｉｉ）第１の試料を、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、シーケンシングの前にまたは配列情報にアクセス／取得する前に、ポリヌクレオチドのセットは、タグ付きポリヌクレオチドを生じさせるためにタグ付けされ、各タグ付きポリヌクレオチドは、タグおよびポリヌクレオチドを含む。これらの実施形態では、各試料について、複数のシーケンシングリードは、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化され、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む。
【０１０３】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのタグ付きポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のタグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含む。
【０１０４】
図１は、本開示の一実施形態による、２つの異なる対象から得られた２つの試料間の汚染の有無を検出するための方法のフローチャート図である。シーケンシングリードのグループ化特徴、それによるファミリーのグループ化特徴は、２つの試料間の汚染の有無を決定するために使用される。シーケンシングリードのグループ化特徴は、典型的には、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含む。１０１において、試料（すなわち、第１の試料および第２の試料）由来のポリヌクレオチドのセットは、シーケンシングされて、複数のシーケンシングリードを生成する。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同じフローセル内でシーケンシングされる。一部の実施形態では、第２の試料は、第１の試料とは異なるフローセルでシーケンシングされる。一部の実施形態では、第１の試料は、第２の試料とは異なる時間で処理される。例えば、第２の試料は、第１の試料の処理の少なくとも１分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間後に処理される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、異なる日に処理される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同じバッチの試料中にある。一部の実施形態では、第２の試料は、第１の試料と同じバッチの試薬で処理される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同じ液体取扱いロボットによって処理される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同じ研究室職員によって処理される。
【０１０５】
一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、異なる地理的位置で処理される。一部の実施形態では、第１の試料は、対象の体液から得られ、第２の試料は、別の対象の体液から得られる。一部の実施形態では、試料は血液である。一部の実施形態では、試料は血漿である。一部の実施形態では、試料は血清である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、無細胞ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、対象の少なくとも１つは、がんなどの疾患を有する。
【０１０６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのセットは、シーケンシングの前に、一連のライブラリ調製ステップを経る。ライブラリ調製ステップは、末端修復、アダプターのライゲーション（タグ−すなわち、分子バーコードを含む）、タグ付きポリヌクレオチドの増幅、および／または対象のゲノムもしくはトランスクリプトーム由来の領域について増幅された子孫ポリヌクレオチドの少なくとも一部の選択的濃縮を含む。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、タグ付きポリヌクレオチドのセットを生じさせるために、分子バーコードを含むタグでタグ付けされる。一部の実施形態では、試料のタグ付きポリヌクレオチドのセットは、固有にタグ付けされる。一部の実施形態では、試料のタグ付きポリヌクレオチドのセットは、非固有にタグ付けされる。一部の実施形態では、本方法は、シーケンシングの前に、増幅された子孫ポリヌクレオチドの１つまたは両方の末端に１つまたは複数の試料インデックスを付着させることをさらに含み、試料インデックスは、第１の試料と第２の試料とを区別する。
【０１０７】
開始領域、終了領域、および／またはポリヌクレオチドの長さを決定するために、１０２において、複数のシーケンシングリードが参照配列に一般的にアラインメントされる。参照配列はヒトゲノムであり得る。１０３において、各試料中の複数のシーケンシングリードは、（ｉ）タグ（ポリヌクレオチドがタグ付けされている場合）、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化され、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドまたはタグ付き子孫ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドが分子バーコードでタグ付けされている場合）のシーケンシングリードを含む。一部の実施形態では、開始領域は、シーケンシングリードの５’末端が参照配列へのアラインメントを開始することが決定されている、シーケンシングリードのゲノム開始位置を含み、終了領域は、シーケンシングリードの３’末端が参照配列へのアラインメントを停止することが決定されている、シーケンシングリードのゲノム停止位置を含む。一部の実施形態では、開始領域は、参照配列にアラインメントするシーケンシングリードの５’末端で最初の１、最初の２、最初の５、最初の１０、最初の１５、最初の２０、最初の２５、最初の３０または少なくとも最初の３０塩基位置を含む。一部の実施形態では、終了領域は、参照配列にアラインメントするシーケンシングリードの３’末端で最後の１、最後の２、最後の５、最後の１０、最後の１５、最後の２０、最後の２５、最後の３０または少なくとも最後の３０塩基位置を含む。一部の実施形態では、タグは、ポリヌクレオチド分子の両端に付着した１つまたは複数の分子バーコードを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードは、長さが少なくとも２、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、試料のポリヌクレオチドは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個または少なくとも１００，０００個の異なるタグ／分子バーコードでタグ付けされる。
【０１０８】
１０４において、ファミリー識別子は、グループ化特徴に基づいて、複数のファミリーに対して生成される。１０５において、ファミリー識別子は、共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングされ、共有ファミリー識別子は、第２の試料におけるファミリーのファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料におけるファミリーのファミリー識別子である。すなわち、第１の試料におけるファミリーのグループ化特徴は、第２の試料におけるファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一である。
【０１０９】
１０６では、試料を、別の試料で汚染されているかどうかで分類するために、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度が決定される。一部の実施形態では、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度は、第１の試料中の共有ファミリー識別子の数である。一部の実施形態では、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度は、第１の試料中の共有ファミリー識別子の数の、第１の試料中のファミリー識別子の総数に対する比を含む。一部の実施形態では、共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度は、第１の試料のファミリー中のシーケンシングリードの数が、第２の試料の対応するファミリー中のシーケンシングリードの数よりも大きい、第１の試料中のこれらの共有ファミリー識別子を除外する。一部の実施形態では、第１の試料中の共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度は、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対における共有ファミリー識別子を除外する。一部の実施形態では、第１の試料中のファミリー識別子の総数は、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対におけるファミリー識別子を除外する。一部の実施形態では、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対は、（ａ）複数の試料を提供することであって、複数の試料が、第１の試料および／または第２の試料と同一または実質的に同一であるゲノム開始位置およびゲノム停止位置の分布を含む、こと；（ｂ）複数の試料中のファミリー識別子を決定すること；（ｃ）ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の１対を共有する複数の試料中のファミリー識別子の数を定量すること；ならびに（ｄ）ファミリー識別子の数が設定された閾値を超えた場合、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置のその１対を過剰に提示されたものとして分類することによって決定される。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料または第２の試料を除外する。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料および第２の試料を除外する。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料と同じフローセル内で処理された試料を含む。一部の実施形態では、複数の試料は訓練試料を含む。一部の実施形態では、設定された閾値は少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約５ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約１０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約１５ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約２０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約３０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約４０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約５０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの少なくとも１０−３、少なくとも１０−４、少なくとも１０−５、少なくとも１０−６、少なくとも１０−７、少なくとも１０−８、または少なくとも１０−９であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−４であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−５であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−６であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−７であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−８であり得る。
【０１１０】
１０７において、第１の試料は、共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値を超える場合、第２の試料で汚染されているものとして分類されるか、または共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類される。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の少なくとも０．００１％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも１０％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．０１％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．０５％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．１％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．５％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約１％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約２％である。
【０１１１】
一部の実施形態では、第１の試料が第２の試料で汚染されていると分類される場合であったとしても、本方法は、体細胞変異の検出の前に、第１の試料の共有ファミリー識別子のシーケンシングリードを除外することによって、第１の試料のポリヌクレオチドの少なくとも１つの体細胞変異の信頼できる検出をさらに可能にすることができる。
【０１１２】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域、および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つからの情報に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、共有ファミリーが、第２の試料のファミリーと同一または実質的に同一である第１の試料のファミリーである、こと；（ｅ）第１の試料について共有ファミリーのセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーの定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含む。
【０１１３】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成すること；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；ｃ）２つの試料の複数のシーケンシングリードを、（ｉ）開始領域、（ｉｉ）終了領域および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、共有ファミリーは、第１の試料および第２の試料からのシーケンシングリードを含む、こと；（ｅ）共有ファミリーのセットに由来する定量的尺度を決定すること；ならびに第１の試料を、共有ファミリーの定量的尺度が所定の閾値を超える場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、シーケンシングの前に、ポリヌクレオチドのセットをタグ付けし、タグ付きポリヌクレオチドを生成することができ、各タグ付きポリヌクレオチドは、タグおよびポリヌクレオチドを含む。これらの実施形態では、各試料について、複数のシーケンシングリードは、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化され、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む。
【０１１５】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、タグを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のタグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、共有ファミリーが、第２の試料のファミリーと同一または実質的に同一である第１の試料のファミリーである、こと；（ｅ）第１の試料について共有ファミリーのセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーの定量的尺度が所定の閾値を超える場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含む。
【０１１６】
別の態様では、本開示は、第１の試料の第２の試料による汚染の有無を検出するための方法を提供し、（ａ）試料からのタグ付きポリヌクレオチドのセットをシーケンシングして、複数のシーケンシングリードを生成することであって、各タグ付きポリヌクレオチドはタグおよびポリヌクレオチドを含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）２つの試料の複数のシーケンシングリードをタグからの情報に基づいて、複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のタグ付きポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてスクリーニングして、共有ファミリーのセットを同定することであって、共有ファミリーは、第１の試料および第２の試料からのシーケンシングリードを含む、こと；（ｅ）共有ファミリーのセットに由来する定量的尺度を決定すること；ならびに（ｆ）第１の試料を、共有ファミリーの定量的尺度が所定の閾値を超える場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリーの定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含む。
【０１１７】
図２は、本開示の一実施形態による、２つの異なる対象から得られた２つの試料間の汚染の有無を検出するための方法のフローチャート図である。シーケンシングリードのグループ化特徴、それによるファミリーのグループ化特徴は、２つの試料間の汚染の有無を決定するために使用される。シーケンシングリードのグループ化特徴は、典型的には、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含む。２０１において、試料（すなわち、第１の試料および第２の試料）由来のポリヌクレオチドのセットは、シーケンシングされて、複数のシーケンシングリードを生成する。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同じフローセル内でシーケンシングされる。一部の実施形態では、第２の試料は、第１の試料とは異なるフローセルでシーケンシングされる。一部の実施形態では、第１の試料は、第２の試料とは異なる時間で処理される。例えば、第２の試料は、第１の試料の処理の少なくとも１分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、または少なくとも４時間後に処理される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、異なる日に処理される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、同じバッチの試料中にある。一部の実施形態では、第２の試料は、第１の試料と同じバッチの試薬で処理される。
【０１１８】
一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、異なる地理的位置で処理される。一部の実施形態では、第１の試料は、対象の体液から得られ、第２の試料は、別の対象の体液から得られる。一部の実施形態では、試料は血液である。一部の実施形態では、試料は血漿である。一部の実施形態では、試料は血清である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは無細胞ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、無細胞ポリヌクレオチドは無細胞ＤＮＡである。一部の実施形態では、対象の少なくとも１人は、がんなどの疾患を有する。
【０１１９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのセットは、シーケンシングの前に、一連のライブラリ調製ステップを経る。ライブラリ調製ステップは、末端修復、アダプターのライゲーション（タグ−すなわち、分子バーコードを含む）、タグ付きポリヌクレオチドの増幅、および／または対象のゲノムもしくはトランスクリプトーム由来の領域について増幅された子孫ポリヌクレオチドの少なくとも一部の選択的濃縮を含む。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、タグ付きポリヌクレオチドのセットを生じさせるために、分子バーコードを含むタグでタグ付けされる。一部の実施形態では、試料のタグ付きポリヌクレオチドのセットは、固有にタグ付けされる。一部の実施形態では、試料のタグ付きポリヌクレオチドのセットは、非固有にタグ付けされる。一部の実施形態では、本方法は、シーケンシングの前に、増幅された子孫ポリヌクレオチドの１つまたは両方の末端に１つまたは複数の試料インデックスを付着させることをさらに含み、試料インデックスは、第１の試料と第２の試料とを区別する。
【０１２０】
開始領域、終了領域、および／またはポリヌクレオチドの長さを決定するために、２０２において、複数のシーケンシングリードが参照配列にアラインメントされる。参照配列はヒトゲノム（例えば、ｈｇ１８、ｈｇ１９）であり得る。２０３において、各試料中の複数のシーケンシングリードは、（ｉ）タグ（ポリヌクレオチドがタグ付けされている場合）、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化され、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された子孫ポリヌクレオチドまたはタグ付き子孫ポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドが分子バーコードでタグ付けされている場合）のシーケンシングリードを含む。一部の実施形態では、開始領域は、シーケンシングリードの５’末端が参照配列へのアラインメントを開始することが決定されている、シーケンシングリードのゲノム開始位置を含み、終了領域は、シーケンシングリードの３’末端が参照配列へのアラインメントを停止することが決定されている、シーケンシングリードのゲノム停止位置を含む。一部の実施形態では、開始領域は、参照配列にアラインメントするシーケンシングリードの５’末端で最初の１、最初の２、最初の５、最初の１０、最初の１５、最初の２０、最初の２５、最初の３０または少なくとも最初の３０塩基位置を含む。一部の実施形態では、終了領域は、参照配列にアラインメントするシーケンシングリードの３’末端で最後の１、最後の２、最後の５、最後の１０、最後の１５、最後の２０、最後の２５、最後の３０または少なくとも最後の３０塩基位置を含む。一部の実施形態では、タグは、ポリヌクレオチド分子の両端に付着した１つまたは複数の分子バーコードを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の分子バーコードは、長さが少なくとも２、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、試料のポリヌクレオチドは、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも５０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個または少なくとも１００，０００個の異なるタグ／分子バーコードでタグ付けされる。
【０１２１】
２０４において、複数のファミリーは、共有ファミリーのセットについてグループ化特徴に基づいてスクリーニングされ、共有ファミリーは、第２の試料におけるファミリーと同一または実質的に同一である、第１の試料におけるファミリーである。すなわち、第１の試料におけるファミリーのグループ化特徴は、第２の試料におけるファミリーのグループ化特徴と同一または実質的に同一である。
【０１２２】
２０５において、試料が別の試料で汚染されているか否かを分類するために、共有ファミリーのセットの定量的尺度が決定される。一部の実施形態では、共有ファミリーのセットの定量的尺度は、第１の試料中の共有ファミリーの数である。一部の実施形態では、共有ファミリーのセットの定量的尺度は、第１の試料における共有ファミリーの数の、第１の試料におけるファミリーの総数に対する比を含む。一部の実施形態では、共有ファミリーのセットの定量的尺度は、第１の試料のファミリー中のシーケンシングリードの数が、第２の試料の対応するファミリー中のシーケンシングリードの数よりも大きい、第１の試料中の共有ファミリーを除外する。一部の実施形態では、第１の試料における共有ファミリーのセットの定量的尺度は、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対における共有ファミリーを除外する。一部の実施形態では、第１の試料中のファミリーの総数は、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対におけるファミリーを除外する。一部の実施形態では、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対は、（ａ）複数の試料を提供することであって、複数の試料は、第１の試料および／または第２の試料と同一または実質的に同一であるゲノム開始位置およびゲノム停止位置の分布を含む、こと；（ｂ）複数の試料中のファミリーを決定すること；（ｃ）ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の１対を共有する複数の試料中のファミリーの数を定量すること；ならびに（ｄ）ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の１対を、ファミリーの数が設定された閾値を超える場合に過剰に提示されたものとして分類することによって決定される。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料または第２の試料を除外する。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料および第２の試料を除外する。一部の実施形態では、複数の試料は、第１の試料と同じフローセル内で処理された試料を含む。一部の実施形態では、複数の試料は、訓練試料を含む。一部の実施形態では、設定された閾値は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約５ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約１０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約１５ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約２０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約３０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約４０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は約５０ファミリーである。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの少なくとも１０−３、少なくとも１０−４、少なくとも１０−５、少なくとも１０−６、少なくとも１０−７、少なくとも１０−８、または少なくとも１０−９であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−４であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−５であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−６であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−７であり得る。一部の実施形態では、設定された閾値は、複数の試料において観察される総ファミリーの約１０−８であり得る。
【０１２３】
２０６において、第１の試料は、共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値を超えている場合、第２の試料で汚染されているとして分類され、または共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類される。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の少なくとも０．００１％、少なくとも０．００５％、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも１０％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．０１％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．０５％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．１％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約０．５％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約１％である。一部の実施形態では、所定の閾値は、第１の試料中のファミリーの総数の約２％である。
【０１２４】
一部の実施形態では、第１の試料が第２の試料で汚染されているものとして分類される場合であっても、本方法は、第１の試料の共有ファミリーのシーケンシングリードを除外することによって、第１の試料のポリヌクレオチドの少なくとも１つの体細胞遺伝的変異をさらに検出することができ、ここで、第１の試料は第２の試料で汚染されているものとして分類されている。
【０１２５】
図３は、本開示の一実施形態による、シーケンシングリードのファミリーへのグループ化を図示し、それによって、２つの試料（試料１および試料２）間の汚染の有無を検出する概略図である。３０１は、試料１および試料２のシーケンシングリードがアラインメントされる参照配列（例えば、ｈＧ１８またはｈＧ１９）を表す。簡単な例示のために、シーケンサーからのペアードエンドシーケンシングによって生じたシーケンシングリードのリード１およびリード２は、単一のペアードエンドシーケンシングリードとして示され、リード１およびリード２の配列リードは、１つに合体される。線の両端にパターンで満たされたボックスを伴う線は、ペアードエンドシーケンシングリード（リード１＋リード２）を表す。パターンで満たされたボックスは、ポリヌクレオチドの両端に結合した分子バーコードを表す。各々の異なるパターンは、異なる分子バーコード配列を表す。ペア末端シーケンシングリードは、グループ化特徴に基づいてファミリーにグループ化される。この実施形態では、グループ化特徴は、（ｉ）タグ（すなわち、分子バーコード）；（ｉｉ）ポリヌクレオチドの開始位置および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの停止位置である。
【０１２６】
３０２Ａ、３０３Ａ、３０４Ａ、および３０５Ａは、これらのファミリーのグループ化特徴が試料２のファミリー３０２Ｂ、３０３Ｂ、３０４Ｂ、および３０５Ｂのそれぞれのグループ化特徴と同一または実質的に同一であるため、試料１の共有ファミリーである。同様に、３０２Ｂ、３０３Ｂ、３０４Ｂ、および３０５Ｂは、これらのファミリーのグループ化特徴が試料１のファミリー３０２Ａ、３０３Ａ、３０４Ａ、および３０５Ａのそれぞれのグループ化特徴と同一または実質的に同一であるため、試料２の共有ファミリーである。３０６は、１対のゲノム開始位置および停止位置を表す。３０６で、試料１は３ファミリーを有し、試料２は４ファミリーを有し、３０６でのファミリーの総数は７ファミリーである。この実施形態では、特定のゲノム開始位置およびゲノム停止位置の対が過剰に提示された対であるかどうかを決定するために設定された閾値は６である。３０６でのファミリーの総数（すなわち、７）は、設定された閾値を超えるため、３０６は、ゲノム開始位置および停止位置の過剰に提示された対である。
【０１２７】
シナリオＩ：試料１が試料２で汚染されているかどうかを決定すること
【０１２８】
試料１における共有ファミリーの数は４つ（３０２Ａ、３０３Ａ、３０４Ａおよび３０５Ａ）であり、そのうち２つのファミリー３０２Ａおよび３０３Ａは、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対におけるものである。この実施形態では、試料１における共有ファミリーの定量的尺度を決定する場合、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対における試料１の共有ファミリーは除外される。３０６は過剰に提示された対であるため、２つのファミリー（３０２Ａおよび３０３Ａ）は、共有ファミリーの定量的尺度の計算において除外される。したがって、試料１についての共有ファミリーの定量的尺度は２である。この実施形態では、定量的尺度はまた、試料１のファミリーにおけるシーケンシングリードの数が、試料２の対応するファミリーにおけるシーケンシングリードの数よりも大きい、試料１における共有ファミリーを除外する。この実施形態では、試料１の共有ファミリー（３０４Ａおよび３０５Ａ）は、各々３つのペアードエンドシーケンシングリード（すなわち、６つのシーケンシングリード）を有し、一方、試料２の対応するファミリー（３０４Ｂおよび３０５Ｂ）は、各々１つのペアードエンドシーケンシングリード（すなわち、２つのシーケンシングリード）を有する。したがって、共有ファミリー３０４Ａおよび３０５Ａは、定量的尺度の計算から除外される。よって、試料１の共有ファミリーの定量的尺度はゼロである。試料１を試料２で汚染されているものとして分類するために、共有ファミリーの定量的尺度は、所定の閾値を超えていなければならない。この実施形態では、所定の閾値は、総ファミリーの０．５％である。定量的尺度（すなわち、第１の試料についてはゼロ）が所定の閾値未満であるため、試料１は試料２で汚染されていないと決定される。
【０１２９】
シナリオＩＩ：試料２が試料１で汚染されているかどうかを決定すること
【０１３０】
試料２における共有ファミリーの数は４つ（３０２Ｂ、３０３Ｂ、３０４Ｂおよび３０５Ｂ）であり、そのうち２つのファミリー３０２Ｂと３０３Ｂは、ゲノム開始位置とゲノム停止位置の過剰に提示された対におけるものである。この実施形態では、試料２における共有ファミリーの定量的尺度を決定する場合、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対における試料２の共有ファミリーは除外される。３０６は過剰に提示された対であるため、２つのファミリー（３０２Ｂおよび３０３Ｂ）は、共有ファミリーの定量的尺度を決定する際に除外される。したがって、試料２の共有ファミリーの定量的尺度は２つである。この実施形態では、定量的尺度はまた、試料２のファミリーにおけるシーケンシングリードの数が、試料１の対応するファミリーにおけるシーケンシングリードの数よりも大きい、試料２の共有ファミリーを除外する。この実施形態では、試料２（３０４Ｂおよび３０５Ｂ）の共有ファミリーは、各々１つのペアードエンドシーケンシングリード（すなわち、２つのシーケンシングリード）を有し、一方、試料１（３０４Ａおよび３０５Ａ）の対応するファミリーは、各々３つのペアードエンドシーケンシングリード（すなわち、６つのシーケンシングリード）を有する。したがって、共有ファミリー３０４Ａおよび３０５Ａは、定量的尺度の計算から除外されない。よって、試料２の共有ファミリーの定量的尺度は２つである。試料２を試料１で汚染されたものとして分類するために、試料２の共有ファミリーの定量的尺度は、所定の閾値を超えていなければならない。この実施形態では、所定の閾値は、総ファミリーの０．５％である。試料２について、ファミリーの総数は２１である。この実施形態では、ゲノム開始位置およびゲノム開始位置の過剰に提示された対におけるファミリーは、ファミリーの総数から除外される。ゲノム開始位置およびゲノム停止位置３０６の過剰に提示された対におけるファミリー数は４である。したがって、過剰に提示された対のファミリーを除外した後の、試料２のファミリーの総数は１７である。また、この実施形態では、共有ファミリーの定量的尺度は、試料２中の総ファミリーのパーセンテージであり、これは１１．７６５％（１００×２／１７）に等しく、所定の閾値を超える。したがって、試料２は試料１で汚染されていると決定される。
【０１３１】
方法の種々のステップは、同じまたは異なる時間、同じまたは異なる地理的位置、例えば、国、および同じまたは異なる人々または実体によって行われ得る。
【０１３２】
ＩＩ．方法の一般的特徴
Ａ．試料
試料は、対象から単離された任意の生物学的試料であり得る。試料は、体組織、全血、血小板、血清、血漿、糞便、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）または白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ）、内皮細胞、組織生検試料（例えば、既知のまたは疑わしい固形腫瘍からの生検試料）、脳脊髄液、滑液、リンパ液、腹水、間質または細胞外液（例えば、細胞間隙からの流体）、歯肉滲出液、歯肉溝滲出液（ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）、骨髄、胸膜滲出液、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、精液、汗、尿を含むことができる。試料は、好ましくは、体液、特に血液およびその画分、ならびに尿である。このような試料には、腫瘍から放出される核酸が含まれる。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができ、二本鎖および一本鎖形態であり得る。試料は、対象から最初に単離された形態であり得、または細胞などの成分を除去もしくは添加し、ある成分を他の成分に対して濃縮し、またはある形態の核酸を別の形態、例えばＲＮＡからＤＮＡまたは一本鎖核酸を二本鎖に変換するために、さらなる処理に供され得る。したがって、例えば、分析のための体液は、無細胞核酸、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む血漿または血清である。一部の実施形態では、方法は、対象から試料を得ることを含む。本質的に、任意の試料タイプが必要に応じて利用される。ある種の実施形態では、例えば、試料は、組織、血液、血漿、血清、痰、尿、精液、膣液、糞便、滑液、脊髄液、唾液などである。典型的には、対象は哺乳動物対象（例えば、ヒト対象）である。一部の実施形態では、試料は、血液である。一部の実施形態では、試料は血漿である。一部の実施形態では、試料は血清である。
【０１３３】
一部の実施形態では、対象から採取された体液の試料体積は、シーケンシングされた領域についての所望の読取り深度に依存する。例示的な体積は、約０．４〜４０ｍｌ、約５〜２０ｍｌ、約１０〜２０ｍｌである。例えば、体積は、約０．５ｍｌ、約１ｍｌ、約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約２０ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌ、またはそれを超えるものであり得る。サンプリングされた血漿の体積は、典型的には約５ｍｌ〜約２０ｍｌである。
【０１３４】
試料は、種々の量の核酸を含むことができる。典型的には、所与の試料中の核酸の量は、複数のゲノム等価物と同等である。例えば、約３０ｎｇのＤＮＡの試料は、約１０，０００（１０４）の一倍体ヒトゲノム等価物を含有することができ、ｃｆＤＮＡの場合、約２０００億（２×１０１１）の個々のポリヌクレオチド分子を含有することができる。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡの試料は、約３０，０００の一倍体ヒトゲノム等価物を含有することができ、ｃｆＤＮＡの場合、約６０００億個の個々の分子を含有することができる。
【０１３５】
一部の実施形態では、試料は、異なる供給源、例えば、細胞由来および無細胞供給源（例えば、血液試料など）由来の核酸を含む。典型的には、試料は、突然変異を担持する核酸を含む。例えば、試料は、場合により、生殖細胞系突然変異および／または体細胞突然変異を担持するＤＮＡを含む。典型的には、試料は、がん関連突然変異（例えば、がん関連体細胞突然変異）を担持するＤＮＡを含む。一部の実施形態では、試料は、無細胞ＤＮＡ（すなわち、ｃｆＤＮＡ試料）を含む。一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡ試料は、循環する腫瘍核酸を含む。
【０１３６】
増幅前の試料中の無細胞核酸の例示的な量は、典型的には、約１フェムトグラム（ｆｇ）〜約１マイクログラム（μｇ）、例えば、約１ピコグラム（ｐｇ）〜約２００ナノグラム（ｎｇ）、約１ｎｇ〜約１００ｎｇ、約１０ｎｇ〜約１０００ｎｇの範囲である。一部の実施形態では、試料は、最大約６００ｎｇ、最大約５００ｎｇ、最大約４００ｎｇ、最大約３００ｎｇ、最大約２００ｎｇ、最大約１００ｎｇ、最大約５０ｎｇ、または最大約２０ｎｇの無細胞核酸分子を含む。必要に応じて、量は、少なくとも約１ｆｇ、少なくとも約１０ｆｇ、少なくとも約１００ｆｇ、少なくとも約１ｐｇ、少なくとも約１０ｐｇ、少なくとも約１００ｐｇ、少なくとも約１ｎｇ、少なくとも約１０ｎｇ、少なくとも約１００ｎｇ、少なくとも約１５０ｎｇ、または少なくとも約２００ｎｇの無細胞核酸分子である。ある種の実施形態では、量は、最大約１ｆｇ、約１０ｆｇ、約１００ｆｇ、約１ｐｇ、約１０ｐｇ、約１００ｐｇ、約１ｎｇ、約１０ｎｇ、約１００ｎｇ、約１５０ｎｇ、または約２００ｎｇの無細胞核酸分子である。一部の実施形態では、方法は、試料から約１ｆｇ〜約２００ｎｇの無細胞核酸分子を得ることを含む。ある種の実施形態では、方法は、試料から約５ｎｇ〜約３０ｎｇの無細胞核酸分子を得ることを含む。ある種の実施形態では、方法は、試料から約５ｎｇ〜約１００ｎｇの無細胞核酸分子を得ることを含む。一部の実施形態では、方法は、試料から約５ｎｇ〜約１５０ｎｇの無細胞核酸分子を得ることを含む。ある種の実施形態では、方法は、試料から約５ｎｇ〜約２００ｎｇの無細胞核酸分子を得ることを含む。一部の実施形態では、量は、試料からの最大約１００ｎｇの無細胞核酸分子である。一部の実施形態では、量は、試料からの最大約１５０ｎｇの無細胞核酸分子である。一部の実施形態では、量は、試料からの最大約２００ｎｇの無細胞核酸分子である。一部の実施形態では、量は、試料からの最大約２５０ｎｇの無細胞核酸分子である。一部の実施形態では、量は、試料からの最大約３００ｎｇの無細胞核酸分子である。一部の実施形態では、方法は、試料から約１ｆｇ〜約２００ｎｇの無細胞核酸分子を得ることを含む。
【０１３７】
無細胞核酸は、典型的には、長さが約１００ヌクレオチド〜長さが約５００ヌクレオチドの間のサイズ分布を有し、長さが約１１０ヌクレオチド〜長さが約２３０ヌクレオチドの分子は、試料中の分子の約９０％を表し、長さが約１６８ヌクレオチドのモードおよび長さが約２４０〜約４４０ヌクレオチドの間の範囲の第２の副ピークを有する。ある種の実施形態では、無細胞核酸は、長さが約１６０〜約１８０ヌクレオチド、長さが約３２０〜約３６０ヌクレオチド、または長さが約４４０〜約４８０ヌクレオチドである。
【０１３８】
一部の実施形態では、無細胞核酸は、溶液中に見出されるように、無細胞核酸が、体液の無傷細胞および他の非可溶性成分から分離される分配ステップを介して、体液から単離される。これらの実施形態のいくつかにおいて、分配は、遠心分離または濾過などの技術を含む。あるいは、体液中の細胞を溶解し、無細胞核酸と細胞核酸を一緒に処理する。一般的に、緩衝液の添加および洗浄ステップ後、無細胞核酸は、例えば、アルコールで沈殿される。ある種の実施形態では、混入物または塩を除去するために、シリカベースのカラムなどのさらなるクリーンアップステップが使用される。例えば、非特異的バルク担体核酸は、必要に応じて、反応全体を通じて添加され、収量などの例示的な手順のある種の態様を最適化する。このような処理後、試料は、典型的には、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび／または一本鎖ＲＮＡを含む種々の形態の核酸を含む。必要に応じて、一本鎖ＤＮＡおよび／または一本鎖ＲＮＡは二本鎖形態に変換され、それにより、それらがその後の処理および分析ステップに含まれる。
【０１３９】
Ｂ．核酸タグ
一部の実施形態では、（ポリヌクレオチドの試料由来の）核酸分子は、試料インデックスおよび／または分子バーコード（一般的に「タグ」と呼ばれる）でタグ付けされ得る。タグは、他の方法の中でも、化学合成、ライゲーション（例えば、平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーション）、または重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、アダプターに組み込まれ得るかまたは他の方法で接続され得る。このようなアダプターは、最終的に標的核酸分子に接続され得る。他の実施形態では、１回または複数回の増幅サイクル（例えば、ＰＣＲ増幅）が、一般的に、従来の核酸増幅方法を使用して、試料インデックスを核酸分子に導入するために適用される。増幅は、１つまたは複数の反応混合物（例えば、アレイ中の複数のマイクロウェル）中で行うことができる。分子バーコードおよび／または試料インデックスは、同時にまたは任意の連続した順序で導入することができる。一部の実施形態では、分子バーコードおよび／または試料インデックスは、配列捕捉ステップが行われる前および／または後に導入される。一部の実施形態では、プローブ捕捉の前に分子バーコードのみが導入され、配列捕捉ステップが行われた後に試料インデックスが導入される。一部の実施形態では、プローブベースの捕捉ステップを行う前に、分子バーコードと試料インデックスの両方が導入される。一部の実施形態では、試料インデックスは、配列捕捉ステップが行われた後に導入される。一部の実施形態では、分子バーコードは、ライゲーション（例えば、平滑末端ライゲーションまたは粘着末端ライゲーション）を介して、アダプターを通じて試料中の核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ分子）に取り込まれる。一部の実施形態では、試料インデックスは、重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して、試料中の核酸分子（例えば、ｃｆＤＮＡ分子）に組み込まれる。典型的には、配列捕捉プロトコールは、標的化核酸配列に相補的な一本鎖核酸分子、例えば、ゲノム領域のコード配列を導入することを含み、このような領域の突然変異は、がんタイプと関連する。
【０１４０】
一部の実施形態では、タグは、試料核酸分子の一端または両端に位置し得る。一部の実施形態では、タグは、所定のまたはランダムもしくは半ランダム配列オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、タグは、長さが約５００、２００、１００、５０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド未満であり得る。タグは、試料核酸にランダムにまたは非ランダムに連結され得る。
【０１４１】
一部の実施形態では、各試料は、試料インデックスまたは試料インデックスの組合せで固有にタグ付けされる。一部の実施形態では、試料またはサブ試料の各核酸分子は、分子バーコードまたは分子バーコードの組合せで固有にタグ付けされる。他の実施形態では、複数の分子バーコードを使用して、分子バーコードが、必ずしも複数の中で互いに固有でないようにされ得る（例えば、非固有の分子バーコード）。これらの実施形態では、分子バーコードは、一般的に、個々の分子に（例えば、ライゲーションによって）結合され、それにより、分子バーコードとそれが接続され得る配列との組合せが、個別に追跡され得る固有の配列を生成し得る。内因性配列情報（例えば、試料中の元の核酸分子の配列に対応する開始（スタート）および／または停止（ストップ）部分、一端または両端での配列リードのサブ配列、配列リードの長さ、および／または試料中の元の核酸分子の長さ）と組み合わせた非固有にタグ付けされた分子バーコードの検出は、典型的には、特定の分子への固有の正体の割り当てを可能にする。個々の配列リードの長さ、または塩基対の数はまた、必要に応じて、所定の分子に固有な正体を割り当てるために使用される。本明細書に記載されるように、一本鎖核酸からの断片は、固有な正体が割り当てられており、それによって、親鎖および／または相補鎖からの断片のその後の同定を可能にすることができる。
【０１４２】
一部の実施形態では、分子バーコードは、試料中の分子に対する識別子のセット（例えば、固有または非固有の分子バーコードの組合せ）の期待される比で導入される。１つの例示的なフォーマットは、標的分子の両端にライゲートされた、約２〜約１，０００，０００の異なる分子バーコード、または約５〜約１５０の異なる分子バーコード、または約２０〜約５０の異なる分子バーコードを使用する。あるいは、約２５〜約１，０００，０００の異なる分子バーコードを使用することができる。例えば、２０〜５０×２０〜５０の分子バーコードを使用することができる。一部の実施形態では、２０〜５０の異なる分子バーコードを使用することができる。一部の実施形態では、５〜１００の異なる分子バーコードを使用することができる。一部の実施形態では、５〜１５０の分子バーコードを使用することができる。一部の実施形態では、５〜２００の異なる分子バーコードを使用することができる。このような識別子の数は、典型的には、同一の開始点および停止点を有する異なる分子が、識別子の異なる組合せを受け取る確率が高くなる（例えば、少なくとも９４％、９９．５％、９９．９９％、または９９．９９９％）のに十分である。一部の実施形態では、分子の約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％は、分子バーコードの同じ組合せを有する。
【０１４３】
一部の実施形態では、反応における固有または非固有な分子バーコードの割り当ては、例えば、各々が、全体としてそれにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００１／００５３５１９号、第２００３／０１５２４９０号、および第２０１１／０１６００７８号、ならびに米国特許第６，５８２，９０８号、第７，５３７，８９８号、第９，５９８，７３１号、および第９，９０２，９９２号に記載される方法およびシステムを用いて行われる。あるいは、一部の実施形態では、試料の異なる核酸分子は、内因性配列情報（例えば、開始位置および／または停止位置、配列の一方または両方の末端のサブ配列、および／または長さ）のみを用いて同定され得る。
【０１４４】
Ｃ．増幅
アダプターに隣接する試料核酸は、典型的には、増幅されるべきＤＮＡ分子に隣接するアダプター中のプライマー結合部位に結合する核酸プライマーを使用して、ＰＣＲおよび他の増幅方法によって増幅される。一部の実施形態では、増幅方法は、熱サイクルから生じる伸長、変性およびアニーリングのサイクルを含むか、または、例えば、転写媒介増幅におけるように等温であり得る。必要に応じて利用される他の増幅例示的方法は、他のアプローチの中でも、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、および自己持続配列に基づく複製を含む。
【０１４５】
通常の核酸増幅方法を用いて、分子バーコードおよび／または試料インデックスを核酸分子に導入するために、１回または複数回の増幅サイクルが一般的に適用される。増幅は、典型的には、１つまたは複数の反応混合物中で行われる。分子バーコードおよび試料インデックスは、必要に応じて同時に、または任意の配列順序で導入される。一部の実施形態では、分子バーコードおよび試料インデックスは、配列捕捉ステップが行われる前および／または後に導入される。一部の実施形態では、プローブ捕捉の前に分子バーコードのみが導入され、配列捕捉ステップが行われた後に試料インデックスが導入される。ある種の実施形態では、プローブに基づく捕捉ステップを行う前に、分子バーコードと試料インデックスの両方が導入される。一部の実施形態では、試料インデックスは、配列捕捉ステップが行われた後に導入される。典型的には、配列捕捉プロトコールは、標的化核酸配列に相補的な一本鎖核酸分子、例えば、ゲノム領域のコード配列を導入することを含み、このような領域の突然変異はがんタイプと関連する。典型的には、増幅反応は、約２００ヌクレオチド（ｎｔ）〜約７００ｎｔ、２５０ｎｔ〜約３５０ｎｔ、または約３２０ｎｔ〜約５５０ｎｔの範囲のサイズである、分子バーコードおよび試料インデックスを有する、複数の非固有にまたは固有にタグ付けされた核酸アンプリコンを生じさせる。一部の実施形態では、アンプリコンは、約３００ｎｔのサイズを有する。一部の実施形態では、アンプリコンは、約５００ｎｔのサイズを有する。
【０１４６】
Ｄ．濃縮
シーケンシングの前に配列を濃縮することができる。濃縮は、特定の標的領域または非特異的（「標的配列」）に対して行うことができる。一部の実施形態では、目的の標的化領域は、差次的タイリングおよび捕捉スキームを使用して、１つまたは複数のベイトセットパネルについて選択された捕捉プローブ（「ベイト」）によって濃縮され得る。差次的タイリングおよび捕捉スキームは、異なる相対濃度のベイトセットを使用して、ベイトに関連するゲノム領域にわたって差次的にタイリングし（例えば、異なる「解像度」で）、一連の制約（例えば、シーケンシング負荷、各ベイトの有用性などのシーケンサー装置の制約）に供し、それらを下流のシーケンシングのための所望のレベルで捕捉する。目的のこれらの標的化ゲノム領域は、核酸構築物の天然または合成ヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の目的の領域にプローブするビオチン標識ビーズを使用して、標的配列を捕捉し、必要に応じてそれらの領域を増幅して、目的の領域を濃縮することができる。
【０１４７】
配列捕捉は、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を含み得る。プローブセット戦略は、目的の領域にわたってプローブをタイリングすることを伴うことができる。このようなプローブは、例えば、長さが約６０〜１２０塩基であり得る。このセットは、約２×、３×、４×、５×、６×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、５０×、または５０×を超える深度を有することができる。配列捕捉の有効性は、部分的には、プローブの配列に相補的（またはほぼ相補的）である標的分子中の配列の長さに依存する。
【０１４８】
一部の実施形態では、複数のゲノム領域は、ＣＯＳＭＩＣ、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）、またはＥｘｏｍｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥｘＡＣ）において見出される遺伝的バリアントを含む。場合によっては、遺伝的バリアントは、臨床的に実行可能なバリアントの予め定義されたセットに属し得る。例えば、このようなバリアントは、対象の試料中に存在することが、対象中の疾患または障害（例えば、がん）と相関することが示されているか、またはその兆候であることが示されているバリアントの種々のデータベースに見出され得る。このようなバリアントのデータベースには、例えば、ｔｈｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）、およびｔｈｅ  Ｅｘｏｍｅ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥｘＡＣ）が含まれ得る。このようなカタログ化されたバリアントの予め定義されたセットは、臨床的意思決定（例えば、診断、予後、治療選択、標的化治療、治療モニタリング、再発のモニタリングなど）との関連性のために、さらなるバイオインフォマティクス分析のために指定され得る。このような予め定義されたセットは、例えば、臨床試料の分析（例えば、疾患または障害の存在または不在が知られている患者コホートの分析）、ならびに公開データベースおよび臨床文献からの注釈情報に基づいて決定することができる。
【０１４９】
Ｅ．シーケンシング
事前増幅を伴うまたは伴わないアダプターに隣接する試料核酸は、シーケンシングに供され得る。シーケンシング方法には、例えば、サンガーシーケンシング、ハイスループットシーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、単一分子シーケンシング、ナノ細孔シーケンシング、半導体シーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代シーケンシング、合成による単一分子シーケンシング（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、超並列シーケンシング、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガンシーケンシング、イオントレント、オックスフォードナノポア、Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｎｉａ、Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、プライマーウォーキング、ＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、イオントレント、またはナノポアプラットフォームを用いるシーケンシングが含まれる。シーケンシング反応は、複数のレーン、複数のチャネル、複数のウェル、または複数の試料セットを実質的に同時に処理する他の手段であり得る、種々の試料処理ユニットで行うことができる。試料処理ユニットはまた、複数の試料チャンバーを含み、複数の試行の処理を同時に可能にすることもできる。
【０１５０】
シーケンシング反応は、がんまたは他の疾患のマーカーを含むことが既知である１つまたは複数の核酸断片タイプまたは領域に対して行うことができる。シーケンシング反応はまた、試料中に存在する任意の核酸断片に対して行うことができる。配列反応は、ゲノムの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％または１００％に対して行うことができる。他の場合には、配列反応は、ゲノムの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％または１００％未満で行うことができる。
【０１５１】
同時シーケンシング反応は、多重シーケンシング技術を用いて行うことができる。一部の場合では、無細胞ポリヌクレオチドは、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、または１００，０００のシーケンシング反応でシーケンシングされ得る。他の場合では、無細胞ポリヌクレオチドは、１０００未満、２０００未満、３０００未満、４０００未満、５０００未満、６０００未満、７０００未満、８０００未満、９０００未満、１００００未満、５００００未満、または１００，０００未満のシーケンシング反応でシーケンシングされ得る。シーケンシング反応は、連続的にまたは同時に行うことができる。その後のデータ分析は、シーケンシング反応の全部または一部について行うことができる。一部の場合では、データ分析は、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、または１００，０００のシーケンシング反応について行うことができる。他の場合では、データ分析は、１０００未満、２０００未満、３０００未満、４０００未満、５０００未満、６０００未満、７０００未満、８０００未満、９０００未満、１００００未満、５００００未満、または１００，０００未満のシーケンシング反応について行うことができる。例示的な読み込み深度は、遺伝子座（塩基）あたり１０００〜５００００読取りである。一部の実施形態では、読取り深度は、遺伝子座（塩基）あたり５００００読取りより大きい場合がある。
【０１５２】
Ｆ．分析
本発明の実施形態によるシーケンシングは、複数のシーケンシングリードまたは複数の読取りを生じさせる。本発明によるシーケンシングリードまたは複数の読取りは、一般的に、長さが約１５０塩基未満、または長さが約９０塩基未満のヌクレオチドデータの配列を含む。ある種の実施形態では、読取りは、長さが約８０〜約９０塩基、例えば、約８５塩基である。一部の実施形態では、本発明の方法は、非常に短い読取り、すなわち、長さが約５０または約３０塩基未満に適用される。シーケンシングリードのデータは、配列データ、ならびにメタ情報を含むことができる。配列リードのデータは、例えば、ＶＣＦファイル、ＦＡＳＴＡファイルまたはＦＡＳＴＱファイルを含む、任意の適切なファイルフォーマットで記憶することができる。
【０１５３】
ＦＡＳＴＡは元々、配列データベースを検索するためのコンピュータプログラムであり、ＦＡＳＴＡという名称はまた標準ファイルフォーマットを指すようになった。Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  １９８８，  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，  ＰＮＡＳ  ８５：２４４４−２４４８を参照されたい。ＦＡＳＴＡフォーマットの配列は、一行説明で始まり、配列データの行が続く。説明行は、最初の列の中で、より大きい−（「＞」）記号によって配列データと区別される。「＞」記号に続く用語は、配列の識別子であり、行の残りの部分は説明である（両方ともオプションである）。「＞」と識別子の最初の文字の間にスペースはないようにする。全てのテキスト行は８０文字より短くすることを推奨する。「＞」で始まる別の行が表示された場合、配列は終了する；これは別の配列の開始を示す。
【０１５４】
ＦＡＳＴＱフォーマットは、生物学的配列（通常はヌクレオチド配列）とその対応する品質スコアの両方を記憶するためのテキストベースのフォーマットである。これはＦＡＳＴＡフォーマットと類似しているが、配列データに従う品質スコアを有する。配列文字と品質スコアの両方は、簡潔さのために単一のＡＳＣＩＩ文字でコードされる。ＦＡＳＴＱフォーマットは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（”Ｔｈｅ  Ｓａｎｇｅｒ  ＦＡＳＴＱ  ｆｉｌｅ  ｆｏｒｍａｔ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｓｃｏｒｅｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＦＡＳＴＱ  ｖａｒｉａｎｔｓ，”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８（６）：１７６７−１７７１，  ２００９）に記載されるように、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒなどのハイスループットシーケンシング機器の出力を記憶するための事実上の標準である。
【０１５５】
ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＱファイルについては、メタ情報は、配列データの行ではなく、説明行を含む。一部の実施形態では、ＦＡＳＴＱファイルについては、メタ情報は、品質スコアを含む。ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＱファイルについて、配列データは、説明行の後から始まり、典型的には、必要に応じて「−」を有するＩＵＰＡＣ多義性コードのいくつかのサブセットを使用して存在する。好ましい実施形態では、配列データは、場合により、必要に応じて（例えば、ギャップまたはウラシルを表すために）「−」またはＵを含む、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧおよびＮ文字を使用する。
【０１５６】
一部の実施形態では、少なくとも１つのマスター配列リードファイルおよび出力ファイルは、プレーンテキストファイルとして保存される（例えば、ＡＳＣＩＩ；ＩＳＯ／ＩＥＣ  ６４６；ＥＢＣＤＩＣ；ＵＴＦ−８；またはＵＴＦ−１６などのコーディングを使用する）。本発明により提供されるコンピュータシステムは、プレーンテキストファイルを開くことができるテキストエディタプログラムを含み得る。テキストエディタプログラムは、コンピュータスクリーン上にテキストファイル（例えば、プレーンテキストファイル）の内容を提示することができ、ヒトが（例えば、モニター、キーボード、およびマウスを使用して）テキストを編集することを可能にするコンピュータプログラムを指すことができる。例示的なテキストエディタには、限定されないが、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄ、ｅｍａｃｓ、ｐｉｃｏ、ｖｉ、ＢＢＥｄｉｔ、およびＴｅｘｔＷｒａｎｇｌｅｒが含まれる。好ましくは、テキストエディタプログラムは、コンピュータスクリーン上にプレーンテキストファイルを表示させることができ、メタ情報および配列リードをヒトが読み取ることができるフォーマット（例えば、２進法コード化されていないが、ヒトが読める文字の印刷（ｐｒｉｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｗｒｉｔｉｎｇ）に使用され得るように、代わりに英数字を使用する）で表示することができる。
【０１５７】
方法は、ＦＡＳＴＡまたはＦＡＳＴＱファイルを参照して検討されてきたが、本発明の方法およびシステムは、例えば、Ｖａｒｉａｎｔ  Ｃａｌｌ  Ｆｏｒｍａｔ（ＶＣＦ）フォーマットのファイルを含む任意の適切な配列ファイルフォーマットを圧縮するために使用され得る。典型的なＶＣＦファイルには、ヘッダセクションおよびデータセクションが含まれる。ヘッダは、任意の数のメタ情報行を含み、各々は文字「＃＃」で始まり、ＴＡＢで区切られたフィールド定義行は１つの「＃」文字で始まる。フィールド定義行には８つの必須列が指定され、ボディセクションにはフィールド定義行で定義された列に入力されたデータ行が含まれる。ＶＣＦフォーマットは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＤａｎｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（”Ｔｈｅ  ｖａｒｉａｎｔ  ｃａｌｌ  ｆｏｒｍａｔ  ａｎｄ  ＶＣＦｔｏｏｌｓ，”  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７（１５）：２１５６−２１５８，  ２０１１）によって記載される。ヘッダセクションは、圧縮されたファイルに書き込むためのメタ情報として扱うことができ、データセクションは行として扱うことができ、その各々は、固有の場合にのみマスタファイルに記憶される。
【０１５８】
本発明のある種の実施形態は、シーケンシングリードのアセンブリを提供する。アラインメントによるアセンブリでは、例えば、シーケンシングリードは互いにアラインメントされるかまたは参照配列にアラインメントされる。各々の読取りを参照ゲノムに順番にアラインメントさせることによって、全ての読取りは互いに関連して配置され、アセンブリを作成する。さらに、シーケンシングリードを参照配列にアラインメントまたはマッピングすることはまた、シーケンシングリード内のバリアント配列を同定するために使用することができる。バリアント配列を同定することは、疾患または状態の診断または予後をさらに支援するため、または治療の決定を導くために、本明細書に記載される方法およびシステムと組み合わせて用いることができる。
【０１５９】
一部の実施形態では、ステップのいずれかまたは全てが自動化される。あるいは、本発明の方法は、例えば、各々が必要に応じてＣ＋＋などのコンパイル言語で書かれ、次にコンパイルされ、２進として分布される、１つまたは複数の専用プログラムで全体的または部分的に具体化され得る。本発明の方法は、既存の配列分析プラットフォーム内のモジュールとして、または既存の配列分析プラットフォーム内の機能性を起動することによって、全体的にまたは部分的に行うことができる。ある種の実施形態では、本発明の方法は、１つの開始キュー（例えば、ヒトの活動、別のコンピュータプログラム、または機械から発生するトリガ事象の１つまたは組合せ）に自動的に応答して全てが起動されるいくつかのステップを含む。したがって、本発明は、いずれかのステップまたはステップの任意の組合せがキューに自動的に応答することができる方法を提供する。自動的には、一般的に、ヒトの入力、影響、または相互作用（すなわち、元のまたはキュー前のヒト活動にのみ応答する）を介在しないことを意味する。
【０１６０】
本システムはまた、対象核酸の正確かつ高感度の解釈を含む種々の形態のアウトプットを包含する。検索の出力は、コンピュータファイルのフォーマットで提供することができる。ある種の実施形態では、出力は、ＦＡＳＴＡファイル、ＦＡＳＴＱファイル、またはＶＣＦファイルである。出力は、参照ゲノムの配列にアラインメントされた核酸の配列などの配列データを含むテキストファイル、またはＸＭＬファイルを生成するように処理され得る。他の実施形態では、処理は、参照ゲノムに対する対象核酸中の１つまたは複数の突然変異を記載する座標または文字列を含む出力を生じさせる。アラインメント文字列には、Ｓｉｍｐｌｅ  ＵｎＧａｐｐｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ（ＳＵＧＡＲ）、Ｖｅｒｂｏｓｅ  Ｕｓｅｆｕｌ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｇａｐｐｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ（ＶＵＬＧＡＲ）、およびＣｏｍｐａｃｔ  Ｉｄｉｏｓｙｎｃｒａｔｉｃ  Ｇａｐｐｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ（ＣＩＧＡＲ）（その全体が参照により本明細書に組み込まれるＮｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１（１０）：１７２５−９，  ２００１）が含まれ得る。これらの文字列は、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｈｉｎｘｔｏｎ、ＵＫ）のＥｘｏｎｅｒａｔｅ配列アラインメントソフトウェアにおいて実行される。
【０１６１】
一部の実施形態では、配列アラインメントは、例えば、ＣＩＧＡＲ列を含む、配列アラインメントマップ（ＳＡＭ）またはバイナリアラインメントマップ（ＢＡＭ）ファイルなどの配列アラインメントが生成される（ＳＡＭフォーマットは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ  ｆｏｒｍａｔ  ａｎｄ  ＳＡＭｔｏｏｌｓ，”  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ２５（１６）：２０７８−９，  ２００９に記載される）。一部の実施形態では、ＣＩＧＡＲは、１行につき１個のギャップアラインメントを表示するかまたは含む。ＣＩＧＡＲは、ＣＩＧＡＲ列として報告される圧縮されたペアワイズアラインメント形式である。ＣＩＧＡＲ列は、長い（例えば、ゲノム）ペアワイズアラインメントを表すのに有用である。ＣＩＧＡＲ列は、参照ゲノム配列に対する読取りのアラインメントを表すためにＳＡＭフォーマットで使用される。
【０１６２】
ＣＩＧＡＲ列は、確立されたモチーフに従う。各文字の前には数字が付けられ、事象のベースカウントが与えられる。使用される文字は、Ｍ、Ｉ、Ｄ、Ｎ、およびＳ（Ｍ＝一致；Ｉ＝挿入；Ｄ＝欠失；Ｎ＝ギャップ；Ｓ＝置換）を含むことができる。ＣＩＧＡＲ列は、一致／不一致および欠失（またはギャップ）の配列を定義する。例えば、ＣＩＧＡＲ列の２ＭＤ３Ｍ２Ｄ２Ｍは、アラインメントが２つの一致、１つの欠失（一部のスペースを節約するために番号１を省略する）、３つの一致、２つの欠失および２つの一致を含むことを意味する。
【０１６３】
一部の実施形態では、核酸集団は、一本鎖突出部を一末端または両末端に有する二本鎖核酸上の平滑末端を酵素的に形成することによってシーケンシングのために調製される。これらの実施形態では、集団は、典型的には、ｄＮＴＰの形態のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴまたはＵ）の存在下で、５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理される。必要に応じて使用されるその例示的な酵素または触媒断片は、クレノウラージ断片およびＴ４ポリメラーゼを含む。５’突出部では、酵素は、典型的には、対向する鎖上の凹んだ３’末端を５’末端と重なるまで伸長させ、平滑末端を生成する。３’突出部では、酵素は、一般的に、３’末端から、対向する鎖の５’末端まで、ときには５’末端を越えて消化する。この消化が対向する鎖の５’末端を越えて進行する場合、ギャップは、５’突出部に使用されるのと同じポリメラーゼ活性を有する酵素によってフィルインされ得る。二本鎖核酸上の平滑末端の形成は、例えば、アダプターの付着およびその後の増幅を容易にする。
【０１６４】
一部の実施形態では、核酸集団は、一本鎖核酸の二本鎖への変換および／またはＲＮＡのＤＮＡへの変換などのさらなる処理に供される。これらの形態の核酸はまた、必要に応じてアダプターに連結され、増幅される。
【０１６５】
事前増幅の有無にかかわらず、上記される平滑末端を形成するプロセスに供される核酸、および必要に応じて試料中の他の核酸をシーケンシングして、シーケンシングされた核酸を生成することができる。シーケンシングされた核酸は、核酸の配列（すなわち、配列情報）またはその配列が決定された核酸のいずれかを指すことができる。シーケンシングを行って、試料中の個々の核酸分子の増幅産物のコンセンサス配列から直接的または間接的に試料中の個々の核酸分子の配列データを提供することができる。
【０１６６】
一部の実施形態では、平滑末端形成後に試料中に一本鎖突出部を有する二本鎖核酸は、分子バーコードを含むアダプターに両末端で連結され、シーケンシングは、アダプターによって導入される核酸配列および分子バーコードを決定する。平滑末端ＤＮＡ分子は、必要に応じて、少なくとも部分的に二本鎖アダプター（例えば、Ｙ字型またはベル型アダプター）の平滑末端にライゲートされる。あるいは、試料核酸およびアダプターの平滑末端は、ライゲーションを容易にするために（例えば、粘着末端ライゲーションのために）相補的ヌクレオチドで尾部を付すことができる。
【０１６７】
核酸試料は、典型的には、同じ核酸の任意の２コピーが、両端で連結されたアダプターからアダプターバーコード（すなわち、分子バーコード）の同じ組合せを受け取る確率が低い（例えば、＜１または＜０．１％）十分な数のアダプターと接触される。このようにアダプターを使用することにより、参照核酸上の同じ開始点および停止点を有し、同じ組合せの分子バーコードに連結された核酸配列のファミリーの同定が可能となる。このようなファミリーは、増幅前の試料中の核酸の増幅産物の配列を表す。ファミリーメンバーの配列は、平滑末端形成およびアダプター付着によって修飾されるように、元の試料中の核酸分子についてのコンセンサスヌクレオチド（複数可）または完全なコンセンサス配列を導出するためにコンパイルすることができる。換言すれば、試料中の核酸の特定の位置を占めるヌクレオチドは、ファミリーメンバー配列中の対応する位置を占めるヌクレオチドのコンセンサスであると決定される。ファミリーは、二本鎖核酸の一方または両方の鎖の配列を含むことができる。ファミリーのメンバーが二本鎖核酸からの両方の鎖の配列を含む場合、一本鎖の配列は、全ての配列をコンセンサスヌクレオチド（複数可）または配列を得るためにコンパイルする目的で、それらの相補体に変換される。ファミリーの中には単一のメンバー配列しか含まないものがある。この場合、この配列は、増幅前の試料中の核酸の配列とみなすことができる。あるいは、単一のメンバー配列のみを有するファミリーは、その後の分析から除外することができる。
【０１６８】
シーケンシングされた核酸におけるヌクレオチド変異は、シーケンシングされた核酸を参照配列と比較することによって決定することができる。参照配列は、しばしば既知の配列、例えば、対象由来の既知の全ゲノムまたは部分ゲノム配列（例えば、ヒト対象の全ゲノム配列）である。参照配列は、例えば、ｈＧ１９またはｈＧ３８であり得る。シーケンシングされた核酸は、試料中の核酸について直接的に決定された配列、または上記されるように、このような核酸の増幅産物の配列のコンセンサスを表すことができる。比較は、参照配列上の１つまたは複数の指定された位置で行うことができる。シーケンシングされた核酸のサブセットは、それぞれの配列が最大にアラインメントされたときに、参照配列の指定された位置に対応する位置を含めて同定することができる。このようなサブセット内で、もしあれば、シーケンシングされた核酸が、指定された位置でヌクレオチド変異を含み、必要に応じて、もしあれば、参照ヌクレオチドを含む（すなわち、参照配列におけるのと同じ）ヌクレオチド変異を含むかを決定することができる。ヌクレオチドバリアントを含むサブセット中のシーケンシングされた核酸の数が選択された閾値を超える場合、バリアントヌクレオチドを指定された位置でコールすることができる。閾値は、ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、９、または１０個のシーケンシングされた核酸などの単純な数であり得、または他の可能性のうち、ヌクレオチドバリアントを含むサブセット内のシーケンシングされた核酸の少なくとも０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、または２０などの比であり得る。比較は、参照配列中の任意の指定された目的の位置について繰り返すことができる。場合によっては、参照配列上の少なくとも約２０、１００、２００、または３００の連続した位置、例えば、約２０〜５００、または約５０〜３００の連続した位置を占める指定された位置に対して比較を行うことができる。
【０１６９】
本明細書に記載されるフォーマットおよび適用を含む核酸シーケンシングに関するさらなる詳細はまた、例えば、それぞれそれらの全体が参照によりそれぞれ本明細書に組み込まれるＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １７：  ９５−１１５  （２０１６）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１２，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２５１３６４：１−１１  （２０１２）、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，  ５５：  ６４１−６５８  （２００９）、ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ７：  ２８７−２９６  （２００９）、Ａｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，  １２８（５）：１７０５−１０  （２００６）、米国特許第６，２１０，８９１号、米国特許第６，２５８，５６８号、米国特許第６，８３３，２４６号、米国特許第７，１１５，４００号、米国特許第６，９６９，４８８号、米国特許第５，９１２，１４８号、米国特許第６，１３０，０７３号、米国特許第７，１６９，５６０号、米国特許第７，２８２，３３７号、米国特許第７，４８２，１２０号、米国特許第７，５０１，２４５号、米国特許第６，８１８，３９５号、米国特許第６，９１１，３４５号、米国特許第７，５０１，２４５号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，１７０，０５０号、米国特許第７，３０２，１４６号、米国特許第７，３１３，３０８号、および米国特許第７，４７６，５０３号に提供される。
【０１７０】
ＩＩＩ．コンピュータシステム
本開示の方法は、コンピュータシステムを使用して、またはその助けを得て実施することができる。例えば、このような方法は、（ａ）核酸シーケンサーによって生成された第１の試料および第２の試料からタグ付きポリヌクレオチドのセットの複数のシーケンシングリードを取得することであって、シーケンシングリードは、タグ配列およびポリヌクレオチドに由来する配列を含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）一組の共有ファミリー識別子についてスクリーニングすることであって、共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値を超える場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含み得、コンピュータプロセッサーで行うことができる。
【０１７１】
図４は、本開示の方法を実施するようにプログラムされたかまたは別様に構成されたコンピュータシステム４０１を示す。コンピュータシステム４０１は、試料調製、シーケンシング、および／または分析の様々な態様を調節することができる。いくつかの例では、コンピュータシステム４０１は、核酸シーケンシングを含む試料調製および試料分析を行うように構成される。
【０１７２】
コンピュータシステム４０１は、単一コアもしくはマルチコアプロセッサー、または並列処理のための複数のプロセッサーであり得る中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサー」および「コンピュータプロセッサー」でもある）４０５を含む。コンピュータシステム４０１はまた、メモリまたはメモリ位置４１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶ユニット４１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース４２０（例えば、ネットワークアダプター）、およびキャッシュ、他のメモリ、データ記憶、および／または電子ディスプレイアダプターなどの周辺デバイス４２５を含む。メモリ４１０、記憶ユニット４１５、インターフェース４２０、および周辺デバイス４２５は、マザーボードなどの通信ネットワークまたはバス（実線）を介してＣＰＵ  ４０５と通信する。記憶ユニット４１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（またはデータレポジトリ）であり得る。コンピュータシステム４０１は、通信インターフェース４２０の助けを借りて、コンピュータネットワーク４３０に動作可能に結合することができる。コンピュータネットワーク４３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。場合によっては、コンピュータネットワーク４３０は、通信および／またはデータネットワークである。コンピュータネットワーク４３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる１つまたは複数のコンピュータサーバを含むことができる。コンピュータネットワーク４３０は、場合によってはコンピュータシステム４０１の助けを借りて、ピア・ツー・ピアネットワークを実現することができ、これにより、コンピュータシステム４０１に結合された装置がクライアントまたはサーバとして動作することが可能となり得る。
【０１７３】
ＣＰＵ  ４０５は、プログラムまたはソフトウェアに具体化することができる機械可読命令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリ４１０などのメモリ位置に格納することができる。ＣＰＵ  ４０５によって実行される動作の例は、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを含むことができる。
【０１７４】
記憶ユニット４１５は、ドライバ、ライブラリ、および保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶ユニット４１５は、ユーザーによって作製されたプログラムおよび記録されたセッション、ならびにプログラムに関連付けられた出力（複数可）を記憶することができる。記憶ユニット４１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザープリファレンスおよびユーザープログラムを記憶することができる。場合によっては、コンピュータシステム４０１は、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム４０１と通信する遠隔サーバ上に配置されたものなどの、コンピュータシステム４０１の外部にある１つまたは複数の追加データ記憶ユニットを含むことができる。データは、例えば、通信ネットワークまたは物理データ転送を使用して（例えば、ハードドライブ、サムドライブ、または他のデータ記憶機構を使用して）ある場所から別の場所へ転送され得る。
【０１７５】
コンピュータシステム４０１は、ネットワーク４３０を介して１つまたは複数の遠隔コンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム４０１は、ユーザー（例えば、オペレーター）の遠隔コンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例には、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙタブ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントが含まれる。ユーザーは、ネットワーク４３０を介してコンピュータシステム４０１にアクセスすることができる。
【０１７６】
本明細書に記載される方法は、コンピュータシステム４０１の電子記憶場所、例えば、メモリ４１０または電子記憶ユニット４１５に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサー）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能コードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用中、コードはプロセッサー４０５によって実行され得る。場合によっては、コードは、記憶ユニット４１５から取り出され、プロセッサー４０５によって容易にアクセスするためにメモリ４１０に記憶され得る。状況によっては、電子記憶ユニット４１５を除外することができ、機械実行可能命令がメモリ４１０に記憶される。
【０１７７】
ある態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合、以下：（ａ）核酸シーケンサーによって生成された第１の試料および第２の試料からタグ付きポリヌクレオチドのセットの複数のシーケンシングリードを取得することであって、シーケンシングリードは、タグ配列およびポリヌクレオチドに由来する配列を含む、こと；（ｂ）複数のシーケンシングリードを参照配列にアラインメントさせることにより、アラインメントの開始領域および終了領域を決定すること、；（ｃ）各試料について、複数のシーケンシングリードを、（ｉ）タグ、（ｉｉ）開始領域、（ｉｉｉ）終了領域、および（ｉｖ）ポリヌクレオチドの長さのうちの少なくとも１つを含むグループ化特徴に基づいて複数のファミリーにグループ化することであって、試料中の各ファミリーは、試料中のポリヌクレオチドのセットのうちの固有ポリヌクレオチドから増幅された、タグ付き子孫ポリヌクレオチドのシーケンシングリードを含む、こと；（ｄ）複数のファミリーについてのファミリー識別子を生じさせること；（ｅ）共有ファミリー識別子のセットについてスクリーニングすることであって、共有ファミリー識別子は、第２の試料のファミリー識別子と同一または実質的に同一である、第１の試料のファミリー識別子である、こと；（ｆ）共有ファミリー識別子のセットの定量的尺度を決定すること；ならびに（ｇ）第１の試料を、共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値を超える場合、第２の試料で汚染されているものとして、または共有ファミリー識別子の定量的尺度が所定の閾値であるかもしくはそれ未満である場合、汚染されていないものとして分類することを含む方法を実行するコンピュータ実行可能命令を含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
【０１７８】
コードは、事前にコンパイルされ、機械で使用するように構成されることができ、コードを実行するように適合させたプロセッサーを有するかまたは実行時にコンパイルすることができる。コードは、予めコンパイルされたかまたはコンパイルされた状態でコードを実行することを可能にするように選択され得るプログラミング言語で供給され得る。
【０１７９】
コンピュータシステム４０１などの、本明細書に提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングにおいて具体化することができる。技術の種々の態様は、典型的には、あるタイプの機械可読媒体上に担持されるかまたは具体化される機械（またはプロセッサー）実行可能コードおよび／または関連データの形態の「製品」または「製造物品」と考えられ得る。機械実行可能コードは、電子記憶装置、例えば、メモリ（例えば、読み出し専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクに記憶することができる。「記憶」型媒体は、コンピュータ、プロセッサー等の有形メモリ、または種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブ等などのそれらの関連モジュールのいずれかまたは全てを含むことができ、これらはソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的記憶を提供することができる。
【０１８０】
ソフトウェアの全部または一部は、時にインターネットまたは種々の他の電気通信ネットワークを介して通信することができる。このような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサーから別のものへ、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへソフトウェアをロードすることを可能にすることができる。したがって、ソフトウェアエレメントを担持することができる別のタイプの媒体は、光波、電気波、および電磁波を含み、例えば、ローカルデバイス間の物理的インターフェース、有線および光ランドラインネットワーク、および種々の空中リンクを介して使用されるものである。有線または無線リンク、光リンク等などのこのような波を運ぶ物理的素子はまた、ソフトウェアを担持する媒体とみなすことができる。本明細書で使用される場合、非一時的な、有形の「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械の「読取り可能媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサーに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
【０１８１】
したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、限定されないが、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理伝送媒体を含む多くの形態をとることができる。不揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示されるように、データベースなどを実装するために使用され得るものなどの、任意のコンピュータ（複数可）等における記憶デバイスのいずれかなどの光学または磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、コンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形伝送媒体には、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含む銅線および光ファイバが含まれる。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁信号、または無線周波数（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信中に発生するものなど音波もしくは光波の形態をとることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態には、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップまたはカートリッジ、搬送波輸送データもしくは命令、搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取ることができる任意の他の媒体が含まれる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のために１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスをプロセッサーに搬送することに関与することができる。
【０１８２】
コンピュータシステム４０１は、例えば、試料分析の１つまたは複数の結果を提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）を含む電子ディスプレイを含み得るかまたはそれと通信し得る。ＵＩの例には、限定されないが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザーインターフェースが含まれる。
【０１８３】
コンピュータシステムおよびネットワーク、データベース、およびコンピュータプログラム製品に関するさらなる詳細はまた、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれるＰｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ：  Ａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．  （２０１１）、Ｋｕｒｏｓｅ，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇ：  Ａ  Ｔｏｐ−Ｄｏｗｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｐｅａｒｓｏｎ，  ７ｔｈ  Ｅｄ．  （２０１６）、Ｅｌｍａｓｒｉ，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ，  ６ｔｈ  Ｅｄ．  （２０１０）、Ｃｏｒｏｎｅｌ，  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  ＆  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，  Ｃｅｎｇａｇｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，  １１ｔｈ  Ｅｄ．  （２０１４）、Ｔｕｃｋｅｒ，  Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｌａｎｇｕａｇｅｓ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｍａｔｈ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  （２００６）、およびＲｈｏｔｏｎ，  Ｃｌｏｕｄ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｅｄ：  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｐｒｅｓｓ  （２０１１）に提供される。
【０１８４】
適用
【０１８５】
がんおよび他の疾患
【０１８６】
典型的には、検討中の疾患はがんの一種である。そのようながんの非限定的な例としては、胆道がん、膀胱がん、移行細胞癌、尿路上皮癌、脳がん、神経膠腫、星細胞腫、乳癌、化生性癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、直腸がん、結腸直腸癌、結腸がん、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道がん、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼黒色腫、ぶどう膜黒色腫、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、腎明細胞癌、移行細胞癌、尿路上皮癌、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性（ＣＭＭＬ）、肝臓がん、肝臓癌、ヘパトーマ、肝細胞癌、胆管細胞癌、肝芽腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽腫、中咽頭がん、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓がん、膵管腺癌、偽乳頭新生物、腺房細胞癌、前立腺がん、前立腺腺癌、皮膚がん、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、小腸癌、胃がん、胃癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮がん、および子宮肉腫が挙げられる。
【０１８７】
本明細書で開示される方法およびシステムを使用して必要に応じて評価される他の遺伝性疾患、障害または状態の非限定的な例としては、軟骨形成不全、アルファ−１アンチトリプシン欠損症、抗リン脂質症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）、猫鳴き、クローン病、嚢胞性線維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血栓性素因、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳胞症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、マルファン症候群、筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド異常、ポルフィリン症、早老症、網膜色素変性、重症複合免疫不全（ｓｃｉｄ）、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、テイ・サックス、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、ウィルソン病、またはこれらに類するものが挙げられる。
【０１８８】
本明細書は、その特定の実施形態に関して説明しているが、これらの特定の実施形態は、単なる例示的なものであり、限定的なものではない。実施例において例証された概念は、他の実施例およびインプリメンテーションに適用することができる。
【０１８９】
液体生検アッセイが変更されると（例えば、シーケンシングの深度および一般的なＳＮＰのパネルにおいて）、本開示の方法およびシステムは、必要に応じて、適用可能な閾値（例えば、試料中の汚染の有無を検出するための１つまたは複数の基準／閾値）のセットを得るために再訓練され得る。
【実施例】
【０１９０】
（実施例１：本開示の実施形態による試料の汚染を決定すること）
Ｇｕａｒｄａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）における血液ベースのｃｆＤＮＡアッセイを用いて、一組の患者試料を分析した。アッセイ性能の品質をチェックし、試料の任意の汚染があるかどうかを決定するために、試料のセットを本開示の実施形態に従って分析した。試料のセットの中で、２つの試料（試料１および試料２）の分析をこの実施例に記載する。試料１および試料２のファミリーの総数は、それぞれ７，８１１，１４８個および７，１４１，００８個である。この実施形態では、ゲノム開始位置およびゲノム停止位置の過剰に提示された対におけるファミリーは、分析から除外され、過剰に提示された対としてゲノム開始位置およびゲノム停止位置の対を分類するために使用される設定された閾値は１０ファミリーである。したがって、試料１および試料２のファミリー総数は、それぞれ６，４５２，０５７個および６，０３９，０９９個であった。
【０１９１】
Ｉ：試料１が試料２で汚染されているかどうかを決定すること
試料１の６，４５２，０５７ファミリーのうち、５４，２１２ファミリーが（試料２と）共有ファミリーであった。５４，２１２個の共有ファミリーのうち、（ｉ）９３６２個の共有ファミリーは、試料１と試料２の両方のファミリー内で同数のシーケンシングリードを有し；および（ｉｉ）１６４７個の共有ファミリーは、試料２の対応するファミリーにおけるシーケンシングリード数よりも、試料１のファミリーにおいてより多数のシーケンシングリードを有した。この実施形態では、試料１のファミリーにおいて、試料２の対応するファミリーにおけるシーケンシングリードの数よりも多数のシーケンシングリードを有する共有ファミリーは、共有ファミリーの定量的尺度を決定する際に除外された。また、この実施形態では、共有ファミリーの定量的尺度は、試料１における総ファミリーのパーセンテージであり、これは０．８１５％（１００×（５４２１２−１６４７）／６４５２０５７）に等しかった。この実施形態では、試料を汚染されていると分類するための所定の閾値は０．５％であった。試料１の共有ファミリーの定量的尺度は０．５％を超えていたため、試料１は試料２で汚染されていると決定された。
【０１９２】
ＩＩ：試料２が試料１で汚染されているかどうかを決定すること
試料２の６，０３９，０９９ファミリーのうち、５４，２１２ファミリーが（試料１と）共有ファミリーであった。５４，２１２個の共有ファミリーのうち、（ｉ）９３６２個の共有ファミリーは、試料１と試料２の両方において、ファミリー内で同数のシーケンシングリードを有し、（ｉｉ）４３，２０３個の共有ファミリーは、試料１の対応するファミリーにおけるシーケンシングリード数よりも、試料２のファミリーにおいてより多数のシーケンシングリードを有した。対応するファミリー試料１におけるシーケンシングリードの数よりも試料２のファミリーにおけるシーケンシングリードの数が多い共有ファミリーを除いて、試料２の共有ファミリーの定量的尺度は０．１８２％（１００×（５４２１２−４３２０３）／６０３９０９９）に等しかった。試料２の共有ファミリーの定量的尺度は所定の閾値（０．５％）より低かったため、試料２は試料１で汚染されていないと決定された。
【０１９３】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、このような実施形態が例示としてのみ提供されることは当業者には自明である。本発明は、本明細書内で提供される具体的な実施例によって限定されることを意図しない。本発明を上述の明細書を参照して説明したが、本明細書における実施形態の説明および例証は、限定的な意味で解釈されるものではない。ここで、本発明から逸脱することなく、当業者に多くの変形形態、変化、および置換が起こる。さらに、本発明の全ての態様は、種々の条件および変数に依存する、本明細書に記載される特定の描写、構成または相対比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。したがって、本発明はまた、任意のかかる選択肢、修飾、変形形態または均等物を包含することが企図される。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造が、それによってカバーされることが意図されている。
【０１９４】
前述の開示は、明確性および理解の目的で、例証および例のために、いく分詳細に説明されてきたが、本開示の解釈から当業者には、本開示の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更を行うことができ、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施することができることは明らかである。例えば、全ての方法、システム、コンピュータ可読媒体、および／または構成要素の特徴、ステップ、エレメント、またはそれらの他の態様を種々の組合せで使用することができる。
【０１９５】
全ての特許、特許出願、ウェブサイト、他の刊行物または文献、本明細書で引用されている受入番号等は、それぞれ個々の項目が参照によりそのように組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、全ての目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。異なるバージョンの配列が異なる時点で受入番号に関連付けられている場合は、この出願の有効出願日における受入番号に関連付けられているバージョンが意味される。有効出願日とは、実際の出願日、または該当する場合は受託番号に言及する優先権主張出願の出願日のうちの先の日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイト等の異なるバージョンが異なる時に公表される場合、別段の指示がない限り、出願の有効出願日に最も最近公開されたバージョンが意味される。
【図１】
2021536232.tif 000003
【図２】
2021536232.tif 000004
【図３】
2021536232.tif 000005
【図４】
2021536232.tif 000006
【国際調査報告】
2021536232.tif 000007
2021536232.tif 000008
2021536232.tif 000009
2021536232.tif 000010
2021536232.tif 000011