(57)【要約】  異種移植の後でヒト対象において拒絶応答を引き起こす傾向が低減された、遺伝子改変されたブタ、ブタの臓器、組織、および細胞が本明細書で提供される。特に、非Ｇａｌ異種抗原を有しない遺伝子改変されたブタ、ならびにそのような遺伝子改変されたブタから得られ、ヒトへの移植に好適なブタの細胞、組織、および臓器が本明細書で提供される。ヒト対象における拒絶関連症状を改善する方法も本明細書で提供される。
2021511801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノムが、破壊されたブタＣＤ３７（ｐＣＤ３７）遺伝子および破壊されたブタＣＤ８１（ｐＣＤ８１）遺伝子の１つまたは複数をもたらす遺伝子改変を含む、トランスジェニックブタであって、野生型ブタと比較して検出できるレベルのｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１のタンパク質の一方または両方が存在せず、前記トランスジェニックブタから得た組織をヒトに移植した場合に、野生型ブタから得た組織をヒトに移植した場合と比較して、拒絶に関連する症状が改善される、トランスジェニックブタ。
【請求項２】
そのゲノムが、前記ゲノムの改変を有しないブタ細胞と比較して、機能性α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、シチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、およびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）のいずれの発現の欠損をももたらす遺伝子改変をさらに含み、前記遺伝子改変を有しないブタと比較して低減したレベルのαＧａｌ抗原、Ｎｅｕ５ＧＣ抗原、およびＢ４ＧａｌＮＴ２抗原を呈する、請求項１に記載のトランスジェニックブタ。
【請求項３】
その細胞が、野生型ブタから得た細胞と比較して低減したヒト免疫グロブリンへの結合を呈する、請求項１に記載のトランスジェニックブタ。
【請求項４】
請求項１に記載のトランスジェニックブタから得られるブタの臓器、組織、または細胞。
【請求項５】
皮膚、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、および小腸、またはそれらの部分から選択される、請求項４に記載のブタの臓器、組織、または細胞。
【請求項６】
遺伝子改変されたブタ細胞であって、前記遺伝子改変が（ｉ）機能性ｐＣＤ３７のいずれの発現の欠損（ｐＣＤ３７ＫＯ）、および（ｉｉ）機能性ｐＣＤ８１のいずれの発現の欠損（ｐＣＤ８１ＫＯ）の１つまたは複数をももたらすブタ細胞のゲノムの改変を含み、前記遺伝子改変されたブタ細胞が前記遺伝子改変を有しないブタ細胞と比較して低減したヒト免疫グロブリンへの結合を呈する、遺伝子改変されたブタ細胞。
【請求項７】
前記ゲノムの改変を有しないブタ細胞と比較して、機能性α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、シチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、およびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）のいずれの発現の欠損をももたらす前記ブタ細胞の前記ゲノムの改変をさらに含み、前記遺伝子改変を有しないブタ細胞と比較して低減したレベルのαＧａｌ抗原、低減したレベルのＮｅｕ５ＧＣ抗原、および低減したレベルのＢ４ＧａｌＮＴ２抗原を呈する、請求項６に記載の遺伝子改変されたブタ細胞。
【請求項８】
請求項６または７に記載の遺伝子改変されたブタ細胞から誘導されるトランスジェニックブタ。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子改変されたブタから得られるブタの臓器、組織、または細胞。
【請求項１０】
皮膚、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、小腸、およびそれらの構成要素から選択される、請求項９に記載のブタの臓器、組織、または細胞。
【請求項１１】
移植を必要とするヒト対象に低減したレベルのｐＣＤ３７抗原および低減したレベルのｐＣＤ８１抗原を有するブタ移植材料を移植するステップを含むヒト対象における拒絶関連症状を改善する方法であって、野生型ブタから得られたブタ移植材料をヒト対象に移植する場合と比較して拒絶関連症状が改善される、方法。
【請求項１２】
前記拒絶関連症状が細胞性拒絶応答関連症状、液性拒絶応答関連症状、超急性拒絶関連症状、急性液性異種移植反応拒絶関連症状、および急性血管性拒絶応答関連症状から選択される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それが本明細書において完全に説明されているかのように参照により全体として組み込まれる２０１８年１月３０日出願の米国仮特許出願第６２／６２３，５７１号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子的に改変して（すなわちトランスジェニック、遺伝子操作して）主要異種反応性抗原（「異種抗原」）を除去した、たとえばαＧａｌ、Ｎ−グリコリルニューラミン酸（ＮｅｕＧｃ、Ｈａｎｇａｎｕｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅｒ抗原としても知られている）、およびＢ４ＧａｌＮＴ２関連グリカンを除去する三重ノックアウトを行なったブタが産生されてきた。しかし未知の異種抗原が残っており、これはそのような遺伝子改変を行なったブタから得た異種移植臓器がレシピエントにおいて拒絶（たとえば急性拒絶または急性液性拒絶）を誘起する可能性があることを意味している。したがって、当技術において、臨床的異種移植に対して重大な障害を与える異種反応性抗原を有しない遺伝子改変されたブタの細胞および組織に対するニーズが残っている。
【発明の概要】
【０００３】
第１の態様では、そのゲノムが、破壊されたブタＣＤ３７（ｐＣＤ３７）遺伝子および破壊されたブタＣＤ８１（ｐＣＤ８１）遺伝子の１つまたは複数をもたらす遺伝子改変を含む、トランスジェニックブタが本明細書で提供される。前記遺伝子改変の結果、トランスジェニックブタでは野生型ブタと比較して検出できるレベルのｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１のタンパク質の一方または両方が存在しない。前記トランスジェニックブタから得た組織をヒトに移植した場合に、野生型ブタから得た組織をヒトに移植した場合と比較して、拒絶に関連する症状が改善される。いくつかの場合には、トランスジェニックブタのゲノムは、ゲノムの改変を有しないブタ細胞と比較して、機能性α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、シチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、およびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）のいずれの発現の欠損をももたらす遺伝子改変をさらに含み、トランスジェニックブタは、前記遺伝子改変を有しないブタと比較して低減したレベルのαＧａｌ抗原、Ｎｅｕ５ＧＣ抗原、およびＢ４ＧａｌＮＴ２抗原を呈する。トランスジェニックブタの細胞は野生型ブタから得た細胞と比較して低減したヒト免疫グロブリンへの結合を呈することができる。
【０００４】
別の態様では、本明細書に記載したトランスジェニックブタから得られるブタの臓器、組織、または細胞が本明細書で提供される。ブタの臓器、組織、または細胞は皮膚、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、および小腸、またはそれらの部分から選択することができる。
さらなる態様では、（ｉ）機能性ｐＣＤ３７のいずれの発現の欠損（ｐＣＤ３７ＫＯ）、および（ｉｉ）機能性ｐＣＤ８１のいずれの発現の欠損（ｐＣＤ８１ＫＯ）の１つまたは複数をももたらすブタ細胞のゲノムの改変を含む遺伝子改変されたブタ細胞が本明細書で提供され、前記遺伝子改変されたブタ細胞は前記遺伝子改変を有しないブタ細胞と比較して低減したヒト免疫グロブリンへの結合を呈する。遺伝子改変ブタ細胞は、ゲノムの改変を有しないブタ細胞と比較して、機能性α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）、シチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、およびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）のいずれの発現の欠損をももたらすブタ細胞のゲノムの改変をさらに含むことができ、改変されたブタ細胞は、前記遺伝子改変を有しないブタ細胞と比較して低減したレベルのαＧａｌ抗原、低減したレベルのＮｅｕ５ＧＣ抗原、および低減したレベルのＢ４ＧａｌＮＴ２抗原を呈する。
別の態様では、遺伝子改変された細胞から誘導されるトランスジェニックブタが本明細書で提供される。さらに、遺伝子改変されたブタから得られるブタの臓器、組織、または細胞が本明細書で提供される。ブタの臓器、組織、または細胞は皮膚、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、および小腸、またはそれらの部分から選択することができる。
【０００５】
さらなる態様では、移植を必要とするヒト対象に低減したレベルのｐＣＤ３７抗原および低減したレベルのｐＣＤ８１抗原を有するブタ移植材料を移植するステップを含むヒト対象における拒絶関連症状を改善する方法であって、野生型ブタから得られたブタ移植材料をヒト対象に移植する場合と比較して拒絶関連症状が改善される、方法が本明細書で提供される。拒絶関連症状は細胞性拒絶応答関連症状、液性拒絶応答関連症状、超急性拒絶関連症状、急性液性異種移植反応拒絶関連症状、および急性血管性拒絶応答関連症状から選択することができる。
以下の詳細な説明を考慮すれば、本発明がより良く理解され、上で説明した以外の特徴、態様、および利点が明白になる。そのような詳細な説明は以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ブタ（ｐ）ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１を表す図である。ＣＭＶプロモーターを用いてｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１のためのベクターを創成する。
【図２】ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における外因性発現を実証する図である。トランスフェクトした細胞は４８時間後に溶解した。これらの細胞についてウェスタンブロットによりｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１の発現が示される。
【図３】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１へのヒトＩｇＧ／ＩｇＭの結合を実証する図である。
【図４】図３のＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１へのヒトＩｇＧ／ＩｇＭの結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比を表す図である。
【図５】野生型またはＧａｌノックアウト（ＧａｌＫＯ）したブタ線維芽細胞におけるｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１の過発現を実証する図である。
【図６】ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１を過発現している野生型ブタ線維芽細胞へのヒトＩｇＧの結合を実証する図である。
【図７】ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１を過発現しているＧａｌＫＯブタ線維芽細胞へのヒトＩｇＧの結合を実証する図である。
【図８】ブタＣＤ３７配列のアイソフォームを実証する図である。
【図９】ｐＣＤ３７遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘起変異を実証する図である。
【図１０】四重ノックアウト（ＧＧＴＡ１／ＣＭＡＨ／Ｂ４ＧＡＬＮＴ２／ＣＤ３７）肝由来細胞（ＬＤＣ）へのヒトＩｇＧの結合を実証する図である。  本発明は種々の改変および代替形態を受け入れることができるが、その例示的な実施形態は図面において例として示され、本明細書に詳細に記載される。しかし例示的実施形態の記載は開示した特定の形態に本発明を限定することを意図しておらず、逆に、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲に含まれる全ての改変、等価物、および代替物を包含することを意図していることを理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書中で引用した特許および特許出願を含むがそれらに限らない全ての出版物は、それらが本出願において全体として説明されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００８】
本明細書で提供する遺伝子改変された動物、臓器、組織、および細胞は、少なくとも部分的に、非Ｇａｌ異種反応性抗原としての新たなブタテトラスパニンに関する本発明者による同定および特徴解析に基づいている。テトラスパニンタンパク質は細胞性および液性の免疫応答において重要な役割を果たしており、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）分子、インテグリン、ＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞、およびＢ細胞受容体複合体を含む重要な白血球受容体と相互作用する。本明細書に記載した遺伝子改変された動物、ならびにそのブタの臓器、組織、および細胞の利点の中で、新たに同定されたブタテトラスパニンの一方または両方をノックアウトする遺伝子改変を含むトランスジェニック動物は、ブタからヒトへの移植において超急性拒絶（ＨＡＲ）およびその他の異種移植拒絶問題を誘起する可能性が少ない異種反応性抗原を提示する。したがって、トランスジェニックブタは異種移植のためのドナー動物からの臓器の不足に対する解決策として大きな有望性を有している。さらに、本明細書に記載した遺伝子改変されたブタは臨床試験に適しており、ブタからヒトへの異種移植に対する免疫応答および凝血応答における非Ｇａｌ異種反応性抗原の役割を研究するための動物モデルを提供する。
したがって、第１の態様では遺伝子改変されたブタ細胞が本明細書で提供され、遺伝子改変は（ｉ）機能性ｐＣＤ３７のいずれの発現の欠損（ｐＣＤ３７ＫＯ）、および（ｉｉ）機能性ｐＣＤ８１のいずれの発現の欠損（ｐＣＤ８１ＫＯ）の一方または両方をももたらすブタ細胞のゲノムの改変を含み、前記遺伝子改変されたブタ細胞は前記遺伝子改変を有しないブタ細胞と比較して低減したヒト免疫グロブリンへの結合を呈する。
【０００９】
ある実施形態では、機能性ｐＣＤ３７および／またはｐＣＤ８１の発現を有しないように遺伝子改変されたブタ細胞は、他の異種反応性抗原の発現を有しないようにさらに遺伝子改変される。たとえば、いくつかの場合には、そのゲノムがｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１をコードする遺伝子（たとえばｐＣＤ３７／ｐＣＤ８１ダブルノックアウト）に加えて、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−１（ＧＧＴＡ１）、シチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、およびβ１，４Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β４ＧａｌＮＴ２）の１つまたは複数を変異させまたはノックアウトするように遺伝子改変された三重、四重、または五重のノックアウトトランスジェニックブタを産生することが有利になる。酵素α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−１（ＧＧＴＡ１）はαＧａｌ抗原の合成に必要であり、酵素ＣＭＡＨは大部分の非ヒト哺乳類に見出されるシアル酸分子であるＮ−グリコリルニューラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）の合成に必要である。ヒトの遺伝子ＣＭＡＨは不可逆的に変異しており、したがって非機能性であるので、ヒトはＮｅｕ５Ｇｃを合成することができない。ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、およびβ４ＧａｌＮＴ２のノックアウトを含むようにさらに遺伝子改変すると、遺伝子改変されたブタ細胞は前記遺伝子改変を有しないブタ細胞と比較して低減したレベルのαＧａｌ抗原、低減したレベルのＮｅｕ５ＧＣ抗原、および低減したレベルのＢ４ＧａｌＮＴ２抗原を呈する。いくつかの場合には、ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１の一方または両方をノックアウトする遺伝子改変を、主要異種抗原であるαＧａｌ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、およびＢ４ＧａｌＮＴ２関連グリカンを有しない三重遺伝子ノックアウト（ＫＯ）ブタ（Ｇａｌ−ＫＯ／ＣＭＡＨ−ＫＯ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２−ＫＯ）の細胞において行なわれる。
【００１０】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子改変」およびその文法的等価物は、核酸、たとえば生命体またはその細胞のゲノムの中の核酸の１つまたは複数の変更を意味し得る。たとえば、遺伝子改変は遺伝子の変更、付加、および／または欠失を意味し得る。遺伝子改変された細胞は、付加された、欠失された、および／または変更された遺伝子を含む細胞を意味し得る。いくつかの場合には、ブタもしくは別の哺乳類等の野生型（遺伝子改変されていない）非ヒト動物から単離された細胞は、本明細書で提供する方法に従う使用のために遺伝子改変される。いくつかの場合には、遺伝子改変された細胞は遺伝子改変された非ヒト動物（たとえば遺伝子改変されたブタ）から単離された細胞である。遺伝子改変された非ヒト動物から得られた遺伝子改変された細胞は、そのような遺伝子改変された非ヒト動物から単離された細胞であり得る。いくつかの場合には、非ヒト動物の遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変されていない同等の動物と比較して低減した１つまたは複数の遺伝子の発現を含み得る。遺伝子改変されていない同等の動物は遺伝子改変された動物と実質的に同一の動物であってよいが、ゲノムの遺伝子改変がない。たとえば、遺伝子改変されていない同等の動物は遺伝子改変された動物と同じ種の野生型動物であってよい。
【００１１】
別の態様では、異種移植における使用に適したトランスジェニック非ヒト哺乳類および異種移植における使用に適したトランスジェニック非ヒト哺乳類を生成する方法が提供される。特に本出願はホモ接合性の一重および二重のトランスジェニック哺乳類の生成を記載している。本明細書で用いる場合、用語「トランスジェニック」は、所与の遺伝子が変更され、除去され、または破壊された非ヒト哺乳類を意味する。
ある実施形態では、トランスジェニック動物は、１つまたは複数の非Ｇａｌ異種反応性抗原であるブタＣＤ３７およびブタＣＤ８１の発現が低下しているブタである。さらに１つもしくは複数の他の異種反応性抗原または免疫関連タンパク質の発現が破壊され、および／またはヒト遺伝子が過発現しているトランスジェニック動物も本明細書で提供される。たとえば、エピトープＧａｌα１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（αＧａｌ）を合成するα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧＴ）を有しないトランスジェニックブタを、さらなる遺伝子改変のためのバックグラウンド血統として用いることができる。他の場合には、遺伝子改変は、三重ノックアウトＧａｌＫＯ／ＣＭＡＨ−ＫＯ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２−ＫＯバックグラウンドにおいて行なわれる。
【００１２】
本明細書で用いる場合、用語「ノックアウト」は、所与の遺伝子が変更され、除去され、または破壊されたトランスジェニック非ヒト哺乳類を意味する。この用語は全ての子孫世代を包含することを意図している。したがって、子孫が遺伝子編集または創始動物もしくは子孫動物からの体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によって、または従来の繁殖法によって産生されたかに関わらず、創始動物およびその全てのＦ１、Ｆ２、Ｆ３等々の子孫が含まれる。「一重ノックアウト」は、１つの遺伝子が変更され、除去され、または破壊されたトランスジェニック哺乳類を意味する。「二重ノックアウト」は、２つの遺伝子が変更され、除去され、または破壊されたトランスジェニック哺乳類を意味する。「三重ノックアウト」は、３つの遺伝子が変更され、除去され、または破壊されたトランスジェニック哺乳類を意味する。「四重ノックアウト」は、４つの遺伝子が変更され、除去され、または破壊されたトランスジェニック哺乳類を意味する。「五重ノックアウト」は、５つの遺伝子が変更され、除去され、または破壊されたトランスジェニック哺乳類を意味する。
【００１３】
トランスジェニック哺乳類は目的の遺伝子配列の一方または両方のコピーが破壊されていてよい。目的の核酸配列のただ１つのコピーまたは対立遺伝子が破壊されている場合には、そのトランスジェニック動物は「ヘテロ接合体トランスジェニック動物」と称される。用語「ヌル」変異は、目的のヌクレオチド配列の２つのコピーが異なって破壊されているが、破壊が重複していてそれにより両方の対立遺伝子からいくつかの遺伝物質が除去されている場合、ならびに目的のヌクレオチド配列の両方の対立遺伝子が同じ破壊を共有している場合の両方を包含している。種々の実施形態では、ブタＣＤ３７およびブタＣＤ８１の破壊はトランスジェニック動物の少なくとも１つの細胞、動物の細胞の少なくとも複数、動物の細胞の少なくとも半数、動物の細胞の少なくとも多数、動物の細胞の少なくとも大多数、動物の細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％で起こり得る。
本発明の哺乳類の種は、それが非ヒトである限り、制限されない。例としては家畜および実験動物が挙げられる。より詳細には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターのような動物が例として挙げられる。本出願は典型的な非ヒト動物（ブタ）について記載しているが、他の動物も同様に遺伝子改変することができる。上述のように、ブタはヒトへの臓器移植に望ましい。本明細書で用いる場合、用語「ブタ」は、野生ブタ、家ブタ、ミニブタ、Sus scrofaブタ、Sus scrofa domesticusブタ、ならびに近交ブタを含むがそれに限らない当技術で既知の任意のブタを意味する。ブタは限定なく、ランドレース、ヨークシャー、ハンプシャー、デュロック、チャイニーズメイシャン、チェスターホワイト、バークシャーゲッティンゲン、ランドレース／ヨーク／チェスターホワイト、ユカタン、バーマシアンズー、ウジシャン、シーシュアンバンナ、およびピエトレンブタを含む群から選択することができる。ブタの臓器、組織、または細胞は、ブタから得られた臓器、組織、失活した動物組織、および細胞を含む。
【００１４】
本明細書に記載したトランスジェニックブタは、たとえばｐＣＤ３７対立遺伝子および／もしくはｐＣＤ８１対立遺伝子を変更し、除去し、またはその他に破壊すること、あるいはｐＣＤ３７および／またはｐＣＤ８１対立遺伝子を遺伝子改変された配列で置き換えることによって達成することができる。いくつかの場合には、トランスジェニックブタは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７９８９６７５号、米国特許出願公開第２００９／０２４１２０３号、Rogers et al., Science 321:1837-1841, 2008、Rogers et al., J. Clin. Invest. 118(4):1571-1577, 2008、Ostedgaard et al., Sci. Transl. Med. 3(74):74ra24, 2011に記載されているもののような相同組み換えおよび体細胞核移植（ＳＣＮＴ）法を用いて生成される。Vajta et al. （Cloning 2001; 3:89-95）によって最初に記載されたハンドメイドクローニング（ＨＭＣ）はＳＣＮＴに基づいているが、ミクロマニピュレーターを使用せずに体細胞クローニングを行なうより単純化された手法である。Vajta et al., Trends Biotechnol. 2007, 25(6):250-3も参照されたい。
【００１５】
遺伝子改変された非ヒト動物を生成する他の方法は当技術で一般に既知であり、参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。いくつかの場合には、遺伝子改変は遺伝子編集の形態を用いて生成される。用語「遺伝子編集」および本明細書で用いるその文法的等価物は、ゲノムから１つまたは複数のヌクレオチドが挿入され、置換され、または除去される遺伝子操作を意味する。たとえば、遺伝子編集はヌクレアーゼ（たとえば天然に存在するヌクレアーゼまたは人工的に操作されたヌクレアーゼ）を用いて実施することができる。現在までに、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびトランスクリプションアクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）遺伝子編集技術を用いていくつかの遺伝子ノックアウトブタが産生されてきた。
【００１６】
ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（たとえばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を用いてＣａｓ遺伝子編集が実施される。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、スフェロイドの細胞中の１つまたは複数の遺伝子の発現を低減させることができる。いくつかの場合には、１つまたは複数の内因性遺伝子のタンパク質発現がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて低減される。他の場合には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて部位特異的挿入を実施することができる。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによってゲノムの挿入部位に切れ目を作成して、挿入部位におけるトランスジーンの挿入を容易にすることができる。本明細書で提供する方法による使用に好適な遺伝子改変を作成する他の方法は、それだけに限らないが、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）およびトランスジーンの導入を含む。本明細書で用いる場合、用語「トランスジーン」は、生命体またはその細胞に移送することができる遺伝子または遺伝子材料を意味する。組み換えまたは遺伝子改変された細胞を得るための手順は当技術で一般に既知であり、参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。
いくつかの場合には、本明細書に記載した遺伝子改変されたブタは、ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１遺伝子のバイシストロニックｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ノックアウトベクターをブタ細胞にトランスフェクトすることによって生成される。トランスフェクトされた細胞は両対立遺伝子のサイレンシング変異事象を呈した。単離すれば、変異に成功した細胞を用いて、ＳＣＮＴまたは別の方法によってクローン動物を産生することができる。得られたトランスジェニック動物のゲノムＤＮＡをシーケンシングして、目的のｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１の遺伝子座における遺伝子のサイレンシングを示す両対立遺伝子フレームシフト変異事象を確認することができる。いくつかの場合には、Ｇａｌ−ＫＯ／ＣＭＡＨ−ＫＯ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２−ＫＯ三重ノックアウトブタの細胞を用いて、そのような遺伝子編集ステップを実施し、それにより、機能性非Ｇａｌ異種抗原（たとえばｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１）、およびＧａｌ異種抗原（たとえばαＧａｌ）、ならびにその他の非Ｇａｌ異種抗原（たとえばＮｅｕ５Ｇｃおよびβ４ＧａｌＮＴ２）の発現がない五重ノックアウトを産生することができる。
【００１７】
別の態様では、本明細書に記載した遺伝子改変されたブタから得られるブタの臓器、組織、および細胞が本明細書で提供される。いくつかの場合には、遺伝子改変されたブタのブタ臓器、組織、および細胞は、限定なしに皮膚、皮膚関連製品、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、甲状腺、小腸、およびそれらの構成要素を含む移植に有用な臓器、組織、および細胞である。本明細書で用いる場合、用語「皮膚関連製品」は、皮膚から単離した製品および皮膚とともに用いることを意図した製品を意味する。皮膚またはその他の組織から単離した皮膚関連製品は、皮膚とともに用いる前に改変してよい。皮膚関連製品には、それだけに限らないが、置換被覆材、熱傷カバー材、皮膚製品、置換真皮、皮膚線維芽細胞、コラーゲン、コンドロイチン、結合組織、角化細胞、無細胞異種真皮、無細胞ブタ真皮、コンポジット皮膚置換材および表皮、ならびに一時的創傷カバー材が含まれる。
【００１８】
別の態様では、異種移植片としての使用のための動物から得た臓器、組織、および／または細胞を包含する移植材料が本明細書で提供される。異種移植片としての使用のための移植材料は、ｐＣＤ３７および／もしくはｐＣＤ８１の発現が低下したトランスジェニック動物から、またはｐＣＤ３７および／もしくはｐＣＤ８１を有しないトランスジェニック動物から単離してよい。ノックアウトブタから得たトランスジェニック移植材料は、出生前、新生時、未成熟、または完全成熟した動物から単離することができる。移植材料は、臓器移植を必要とするヒト対象のための一時的または永久的な臓器の置換として用いることができる。脳、心臓、肺、眼球、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、毛髪、爪、耳、腺、鼻、口、唇、脾臓、歯茎、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸（small intestine）、小腸（small bowel）、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、関節、腱、靭帯、副腎カプセル、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、およびリンパ管を含むがそれらに限らない任意のブタ臓器を用いることができる。
【００１９】
ブタ組織の移植へのヒトの応答に対する種々の遺伝子改変の効果を研究するため、いくつかの場合には、ｐＣＤ３７、ｐＣＤ８１、ならびにその他の異種反応性抗原または免疫関連分子の発現を低減させまたは発現を完全にノックアウトするようにゲノムが遺伝子改変されたトランスジェニックブタを産生することが有利になる。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、遺伝子改変されたブタ細胞（たとえばＬＳＥＣ、肝細胞、線維芽細胞）を遺伝子改変し、１つまたは複数の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子（たとえばＭＨＣ  Ｉ分子および／またはＭＨＣ  ＩＩ分子）の発現を遺伝子改変されていない同等の動物と比較して選択的に低減させることができる。いくつかの場合には、ブタ細胞は、ｐＧＧＴＡ１、ｐＣＭＡＨ、ｐＢ４ＧａｌＮＴ２、ヒト（ｈ）ＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ヒトスロンボモジュリン、ＣＤ４６（膜コファクタータンパク質）、ＣＤ５５（減衰促進因子）、ＣＤ５９（プロテクチンまたは反応性溶解の膜阻害剤）、ヒトＨ−トランスフェラーゼ（たとえば血液型Ｏ抗原の発現のため）、エンド−β−ガラクトシダーゼＣ（たとえばＧａｌ抗原発現の低減のため）、α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、シチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルニューラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（β４ＧａｌＮＴ２）（たとえばβ４ＧａｌＮＴ２ノックアウト）、ＣＩＩＴＡ−ＤＮ（たとえばブタ白血球抗原クラスＩＩノックダウンをもたらすＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーターノックダウン）、クラスＩ  ＭＨＣノックアウト（ＭＨＣ−ＩＫＯ）、ＨＬＡ−Ｅ／ヒトβ２−ミクログロブリン（たとえばヒトナチュラルキラー細胞の細胞毒性を阻害するため）、ヒトＦＡＳリガンド（ＣＤ９５Ｌ）、ヒトＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）遺伝子、ブタＣＴＬＡ４−Ｉｇ（細胞毒性Ｔリンパ球抗原４またはＣＤ１５２）、ヒトＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子−α−関連アポトーシス誘起リガンド）、フォンウィレブランド因子（ｖＷＦ）、ヒト組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ヒト内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、ヒトエクトヌクレオシドトリホスフェートジホスホヒドロラーゼ−１（ＣＤ３９）、ヒト腫瘍壊死因子−α−誘起タンパク質３（Ａ２０）、ヒトヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、ヒトＣＤ４７（ＳＩＲＰ−αとの種特異的相互作用がファゴサイトーシスを阻害する）、ブタアシアログリコプロテイン受容体１（ＡＳＧＲ１）（たとえば血小板のファゴサイトーシスを低下させるため）、ヒトシグナル規制タンパク質−α（ＳＩＲＰα）（たとえば「自己」認識によって血小板のファゴサイトーシスを低下させるため）、ヒトＩＬ−６Ｒ（たとえば炎症を低減させるため）、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）（たとえば寛容を誘起するため）等の遺伝子の発現を遺伝子改変（たとえば変異）させ、または調節（たとえば増大、低下）するために操作される。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「合成の」および「操作された」は相互交換可能に用いられ、人の手によって創成されもしくは改変された（たとえばそのゲノムに１つのまたは所定の操作された遺伝子改変を有する遺伝子改変された動物）、またはそのような材料（たとえばそのような遺伝子改変された動物から得られた組織または臓器）を用いて誘導された、非天然産生の材料を意味する。いくつかの場合には、本開示のトランスジェニック動物を生成するために用いる細胞は、１つもしくは複数の合成のまたは遺伝子操作された核酸（たとえば天然産生の同等物の中に見出される配列に対して少なくとも１つの人工的に創成された挿入、欠失、逆転、または置換を含む核酸）を含むブタ細胞である。１つもしくは複数の合成のまたは操作された核酸を含む細胞は、操作されたまたは遺伝子改変された細胞と考えられる。本明細書で用いる場合、用語「操作された組織」は、操作された／遺伝子改変された細胞の凝集物を意味する。
【００２１】
遺伝子産物の全発現が低下するか、大きさが変化した遺伝子産物が生成するか、または遺伝子産物が変化した機能性を呈する場合には、遺伝子産物の発現が低下している。したがって、遺伝子が野生型の量の生成物を発現するが生成物が変化した酵素活性、変化した大きさ、変化した細胞内局在化パターン、変化した受容体−リガンド結合、またはその他の変化した活性を有する場合には、その遺伝子産物の発現が低下したと考えられる。発現は、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、マイクロアレイ解析、免疫沈降法、放射線アッセイ、ポリペプチド精製、分光学的解析、アクリルアミドゲルのクーマシー染色、ＥＬＩＳＡ、２−Ｄゲル電気泳動、インサイチュハイブリダイゼーション、化学発光法、銀染色、酵素アッセイ、ポンソーＳ染色、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ、免疫組織化学アッセイ、放射免疫アッセイ、比色分析、免疫放射線測定アッセイ、ポジトロン発光トモグラフィー、蛍光アッセイ、透過性細胞の蛍光活性化細胞ソーター染色、放射免疫吸着アッセイ、リアルタイムＰＣＲ、ハイブリダイゼーションアッセイ、サンドイッチ免疫アッセイ、フローサイトメトリー、ＳＡＧＥ、差動増幅、または電子解析を含むがそれだけに限らない当技術で既知の任意の手段によって解析することができる。たとえば参照により全体として本明細書に組み込まれるAusubel et al, eds. (2002) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York, New York、Coligan et al (2002) Current Protocols in Protein Science, Wiley-Interscience, New York, New Yorkを参照されたい。
【００２２】
発現は直接または間接に解析することができる。間接的発現解析には、それだけに限らないが、酵素によって触媒される生成物のレベルを分析して酵素の発現を評価するステップが含まれうる。たとえばAusubel et al, eds (2013) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York, N.Y. およびColigan et al (2013) Current Protocols in Protein Science, Wiley-Interscience New York, N.Y.を参照されたい。
本明細書で用いる場合、「〜と比較して」は、ある物を同様ではあるが異なる物と比較するステップ、たとえばノックアウトブタを用いた実験から得られたデータ点を、野生型ブタを用いた同様の実験から得られたデータ点と比較するステップを包含することを意図している。「比較する」という単語は、比較される物の間の類似点または相違点を発見するために性質、品質、値、量、または比を検討するステップを包含することを意図している。比較するステップは、比較される物の間の顕著な相違を明らかにすることができる。「顕著な相違」は、複数の群について得られた結果、たとえば第１のアリコートと第２のアリコートについての結果における統計的に有意な差を意図している。一般に、統計的有意性は、それだけに限らないがステューデントｔ検定、カイ二乗、片側ｔ検定、両側ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、デュネットポストホック検定、フィッシャー検定、およびｚ検定等の統計的有意性検定によって評価される。２つの結果の間の有意差は、ｐ＜０．１、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０４、ｐ＜０．０３、ｐ＜０．０２、もしくはｐ＜０．０１またはそれより大きい結果であり得る。
【００２３】
本明細書で用いる場合、「核酸」は「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸分子」を含み、一般に一本鎖または二本鎖の、合成されたまたは天然源から得られてよい（たとえば単離されたおよび／または精製された）ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、これらは天然、非天然、または変更されたヌクレオチドを含んでよく、天然、非天然、または変更されたヌクレオチド間連結、たとえば未改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの間に見出されるホスホジエステルの代わりにホスホロアミデートリンケージまたはホスホロチオエートリンケージを含んでよい。いくつかの実施形態では、核酸は挿入、欠失、逆転、および／または置換を全く含まない。しかしいくつかの例では本明細書で論じるように、核酸が１つまたは複数の挿入、欠失、逆転、および／または置換を含むことが好適なこともある。
核酸は、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 280-281 (1982)に記載されているものを含む任意の好適な方法を用いて得ることができる。いくつかの態様では、核酸は米国特許出願公開第２００２／０１９０６６３号に記載されているようにして得られる。生物学的試料から得られた核酸は典型的には分析のための好適な断片を生成するために断片化される。
【００２４】
核酸および／または本発明の他の部分は、単離してよい。本明細書で用いる場合、「単離された」は、全体としてまたは部分的に、天然産生源から誘導されようと合成的に作成されようと、それが通常会合している成分の少なくともいくつかから分離することを意味する。核酸および／または本発明の他の部分は、精製してよい。本明細書で用いる場合、「精製された」は、他の化合物または実体の大部分から分離することを意味する。化合物または部分は、部分的に精製され、または実質的に精製されてよい。純度は質量対質量の尺度で表され、それだけに限らないがマススペクトル、ＨＰＬＣ、その他の種々の分析手法を用いて決定することができる。
【００２５】
別の態様では、ヒト対象における拒絶関連症状を改善する方法が本明細書で提供される。いくつかの場合には、本方法は低減したレベルのｐＣＤ３７抗原および低減したレベルのｐＣＤ８１抗原を有するブタ移植材料を、それを必要とするヒト対象に移植するステップを含み、拒絶関連症状は野生型ブタからのブタ移植材料がヒト対象に移植された場合と比較して改善される。移植拒絶は、移植された組織、臓器、細胞、またはその他の生物学的材料がレシピエントの身体に受容されなかった場合に起こる。移植拒絶においては、レシピエントの免疫系が移植された材料を攻撃する。多種の移植拒絶が存在し、個別にまたはともに起こる。拒絶プロセスには、それだけに限らないが、超急性拒絶（ＨＡＲ）、急性液性異種移植拒絶反応（ＡＨＸＲ）、血小板減少症、急性液性拒絶、超急性血管性拒絶、抗体介在拒絶、および移植片対宿主疾患が含まれる。「超急性拒絶」は、移植後最初の２４時間以内に起こり、または始まり、１つまたは複数の拒絶機構が関与する、移植された材料または組織の拒絶を意味する。拒絶は、「超急性拒絶」、「液性拒絶」、「急性液性拒絶」、「細胞性拒絶」、および「抗体介在拒絶」を包含するが、それだけに限らない。急性液性異種移植反応（ＡＨＸＲ）は、限定なく、移植数日以内に起こる急性抗体介在拒絶、移植後最初の数週間以内の血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、微小血管症、事前形成された非Ｇａｌ  ＩｇＭおよびＩｇＧの結合、補体の活性化、微小血管血栓症、ならびに消耗性血小板減少症の発症を含む多彩な病変によって特徴付けられる。
【００２６】
ある実施形態では、本明細書に記載したトランスジェニックブタから得られるブタの臓器、組織、または細胞の異種移植は、細胞性拒絶応答関連症状、液性拒絶応答関連症状、超急性拒絶（ＨＡＲ）関連症状、急性液性異種移植反応拒絶関連症状、および急性血管性拒絶応答関連症状から選択される１つまたは複数の拒絶関連症状の改善をもたらし、１つまたは複数の拒絶関連症状は野生型ブタから得られた組織をヒトに移植した場合と比較して改善される。「改善する」、「良くする」、「改良する」、「増強する」、および「助ける」は、望ましいものにおいて進歩または進展することを意図している。拒絶関連症状を改善することは、望ましくない症状を減少させ、少なくし、または軽減することを包含し得ることも想定される。拒絶関連症状は、別の拒絶関連症状が変化している間に改善され得ることもさらに認識される。
本開示の解釈にあたり、全ての用語は文脈に一致する最も広い可能な様式で解釈すべきである。本開示に記載した本発明のある種の適合化は当業者の通常の最適化の事柄であり、本発明の精神または添付した特許請求の範囲から逸脱することなく実行できることが理解される。
【００２７】
本明細書に提供した組成物および方法がより容易に理解できるように、ある種の用語を定義する。
用語「含む」の変形は、要素、成分、またはステップを非排他的様式で言及していると解釈すべきであり、したがって言及した要素、成分、またはステップは、明示的に言及していない他の要素、成分、またはステップと組み合わせることができる。ある要素を「含む」と言及した実施形態はまた、それらの要素「から実質的になる」または「からなる」ことを企図している。
用語「約」および「ほぼ」は一般に、測定の性質または精度に鑑みて測定した量の許容できる誤差の程度を意味する。典型的には、例示的な誤差の程度は所与の値または値の範囲の１０％以内、好ましくは５％以内である。あるいは、および特に生物学的系においては、用語「約」および「ほぼ」は、所与の値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書で与えられる数値は他に述べない限り近似値であり、用語「約」または「ほぼ」は、明示的に述べない場合、暗示し得ることを意味する。
他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語は本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されることと同じ意味を有する。本明細書および添付した特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」へのいずれの言及も、他に述べない限り、「および／または」を包含することを意図している。
ここで本発明による組成物および方法の種々の例示的実施形態を以下の非限定的な実施例に記載する。実施例は説明目的のみに提供され、いかなる方式でも本発明の範囲を限定することを意図していない。まさに、本明細書に示し、記載したものに追加する種々の改変は上記の説明および以下の実施例から当業者には明白であり、添付した特許請求の範囲の範囲に含まれることになる。
【実施例】
【００２８】
（実施例１）ブタ異種反応性非Ｇａｌ抗原
方法
全長のｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１  ｃＤＮＡは、全ての利用可能なアイソフォームに基づくＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋの対応するＤＮＡ配列に基づいて合成した。
ＣＤ３７遺伝子の増幅
ＰＷＯ  Ｓｕｐｅｒｙｉｅｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅキットによる１％  ＤＭＳＯ処理を用いて、９４℃における２分間の変性、それに続く９４℃における１５秒間、４０サイクルの変性、６０．６℃における３０秒のアニーリング、および７２℃における５０秒の伸長で、ＰＣＲを行なった。４０サイクルの後で７２℃における７分の伸長の第５ステップを行ない、完了後、ＰＣＲ産物を１６℃でサーモサイクラー中に保管した。ブタ脾細胞ｃＤＮＡおよび２つの異なるプライマーを用いた。第１のプライマーは純粋なＸ５アイソフォームミックスからなっており、フォワードプライマーは配列５’−ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  Ｇ−３’（配列番号１）を有し、リバースプライマーは配列５’−ＣＴＡ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＣＣＧ−３’（配列番号２）を有しており、これらから電気泳動の後で６４３ｂｐのバンドが得られる。第２のプライマーはリバースＸ５アイソフォームプライマーおよびフォワードＸ２アイソフォームプライマーを用いており、配列５’−ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＣ−３’（配列番号３）を有し、ミックスからアガロースゲル電気泳動の後で８４８ｂｐのバンドが得られる。バンドが得られれば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（２５０）を用いてバンド中のＰＣＲ産物を精製した。精製すれば、シーケンシングのために寄託ガイドラインに従って試料をＧｅｎｗｉｚに送付した。
【００２９】
細菌のクローニングおよびトランスフォーミング
Ｚｅｒｏｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯベクターをメーカーのプロトコルに従って用い、Ｚｅｒｏｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを用いて、精製したＰＣＲ産物をクローニングした。反応が終了すれば、これを化学的に適格な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のチューブに移した。細菌はコロニーのトランスフォーメーションを誘起する熱ショックに耐えた。回収の後、トランスフォームした細菌を２つの異なる濃度でアンピシリン処理プレートに広げた。すなわち、５０μＬを取って１つのプレートに広げ、残りの混合物を遠心分離して細胞ペレットを創成し、１５０μＬの上清を除去して５０μＬのより濃縮された溶液を創成して第２のプレートに広げた。プレートを３７℃で一夜放置してインキュベートした。
【００３０】
トランスフォームした細菌の培養
３００μＬのピペットチップを用いていくらかの細菌コロニーをプレートから掻き落とし、３ｍＬのＳＯＣ／Ａｍｐ＋培地を含むコニカルチューブ中で混合した。各プレートについてこれを行ない、チューブを３７℃で７時間、２５０ｒｐｍで振盪しながら放置した。
シーケンシング
培養細菌を溶解し、ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを用い、３０μＬのＥＢを用いてスピンカラム膜からプラスミドループを溶出させてプラスミドループを抽出した。寄託ガイドラインに従って試料をＧｅｎｗｉｚのシーケンシングに送付した。
ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１のＣ末端にそれぞれＦＬＡＧタグを付加した。ＣＭＶプロモーターを用いてｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１のｃＤＮＡを発現ベクター中にクローニングした。ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＣＤ３７／ｐＣＤ８１のｃＤＮＡをトランスフェクトし、フローサイトメトリーによってヒトＩｇＧ／ＩｇＭとの結合を決定した。さらに、過発現のため、ブタ野生型胎児線維芽細胞（ＷＴ−ＦＦ）およびブタＧａｌＫＯ胎児線維芽細胞（ＧａｌＫＯ−ＦＦ）にｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１のｃＤＮＡをトランスフェクトし、３種の異なるヒト血清試料を用いるフローサイトメトリーによって、ヒトＩｇＧとの結合を評価した。
【００３１】
結果
ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１の発現を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるウェスタンブロットによって確認した（図２）。ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１のｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、対照のＨＥＫ２９３Ｔ細胞のみと比較して、それぞれ４０％および２０％多いヒトＩｇＧとの結合、ならびに６０％および３５％多いヒトＩｇＭとの結合を呈した（図４）。野生型胎児線維芽細胞（ＷＴ−ＦＦ）およびブタＧａｌＫＯ胎児線維芽細胞（ＧａｌＫＯ−ＦＦ）の両方においてｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１のｃＤＮＡによるトランスフェクションの後で同様の結果が観察された。ＷＴ−ＦＦ−ｐＣＤ３７およびＷＴ−ＦＦ−ｐＣＤ８１の細胞は、ＷＴ−ＦＦ細胞のみと比較して、それぞれ平均で３０％および１４％多いヒトＩｇＧとの結合を示した（図６）。ＧａｌＫＯ−ＦＦ細胞を用いてＷＴ細胞への高いバックグラウンド結合を低下させることによって、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるヒトＩｇＧとの結合が顕著に低減した（図７）。全体として低いＩｇＧとの結合に関わらず、予想されたように、ＧａｌＫＯ−ＦＦ−ｐＣＤ３７およびＧａｌＫＯ−ＦＦ−ｐＣＤ８１へのヒトＩｇＧの結合は、ＧａｌＫＯ−ＦＦ細胞のみと比較して、それぞれ平均で４１％および２６％増大した。
【００３２】
ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１を新規な異種反応性非Ｇａｌ抗原として確認した後、ｐＣＤ３７遺伝子の異なったアイソフォームをクローニングした。例を図８に示す。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を用いて、ブタゲノムにおけるｐＣＤ３７遺伝子の変異を創成した（図９）。
Ｇａｌ−ＫＯ／ＣＭＡＨ−ＫＯ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２−ＫＯバックグラウンドにおいてｐＣＤ３７をノックアウトして、四重遺伝子ノックアウトブタ細胞株を創成した。四重遺伝子ノックアウト（Ｇａｌ−ＫＯ／ＣＭＡＨ−ＫＯ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２−ＫＯ／ｐＣＤ３７−ＫＯ）のいくつかの異なったクローンを産生し、１００％ＰＲＡヒト血清を用いてヒトＩｇＧとの結合を試験した（図１０）。
【００３３】
考察
本発明者らは文献において初めて、ブタ（ｐ）テトラスパニンであるｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１が異種反応性非Ｇａｌ抗原であることを同定した。ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１をトランスフェクトしたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞ならびにブタＦＦ（ＷＴおよびＧａｌＫＯ）に対するヒト抗体の結合の増大により、テトラスパニンであるｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１が新規な異種反応性抗原であることが実証された。本発明者らはまた文献で最初に、ブタゲノムからのｐＣＤ３７遺伝子のノックアウトを実施して、四重遺伝子ノックアウトブタ細胞株（Ｇａｌ−ＫＯ／ＣＭＡＨ−ＫＯ／Ｂ４ＧａｌＮＴ２−ＫＯ／ｐＣＤ３７−ＫＯ）を創成した。データはまた、ｐＣＤ３７およびｐＣＤ８１がＷＴブタ細胞と比較してＧａｌＫＯ細胞へのヒト免疫グロブリンの結合を低減するために重要であることを示唆している。
【図１】
2021511801.tif 000003
【図２】
2021511801.tif 000004
【図３】
2021511801.tif 000005
【図４】
2021511801.tif 000006
【図５】
2021511801.tif 000007
【図６】
2021511801.tif 000008
【図７】
2021511801.tif 000009
【図８】
2021511801.tif 000010
【図９】
2021511801.tif 000011
【図１０】
2021511801.tif 000012
【配列表】
2021511801000001.app
【国際調査報告】
2021511801.tif 000013
2021511801.tif 000014
2021511801.tif 000015
2021511801.tif 000016