(57)【要約】高度に特徴付けられた単離されたエキソソーム、かかるエキソソームを生産するための方法、および神経変性疾患のような疾患を治療する際における、かかるエキソソームの使用のための方法が、本明細書に提供される。【選択図】図５Ｃ
2021520790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）に由来する単離されたエキソソーム集団であって、
神経栄養因子（ＮＴＦ）を含む少なくとも１つのカーゴタンパク質を、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における前記少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して増加した量で含む、単離されたエキソソーム集団。
【請求項２】
前記ＮＴＦが、白血病抑制因子（ＬＩＦ）タンパク質、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）タンパク質、増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の単離されたエキソソーム集団。
【請求項３】
前記少なくとも１つのカーゴタンパク質が、ＮＴＦおよび少なくとも１つの追加的なタンパク質を含む、請求項１または２に記載の単離されたエキソソーム集団。
【請求項４】
前記追加タンパク質が、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）タンパク質、インターロイキン１３（ＩＬ１３）タンパク質、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の単離されたエキソソーム集団。
【請求項５】
ＬＩＦタンパク質の量が少なくとも５０倍増加するか、
ＣＸＣＬ１タンパク質の量が少なくとも３０倍増加するか、
ＩＬ１３タンパク質の量が少なくとも５倍増加するか、
ＶＥＧＦＡの量が少なくとも５倍増加するか、
ＧＤＦ１５の量が少なくとも２倍増加するか、または、これらの任意の組み合わせである、請求項４に記載の単離されたエキソソーム集団。
【請求項６】
前記少なくとも１つの追加的なタンパク質が、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項３〜５のいずれかに記載の単離されたエキソソーム集団。
【請求項７】
前記単離されたエキソソーム集団が、分化抗原群（ＣＤ）９、ＣＤ２９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ４４、ＣＤ４９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ６１、ＣＤ２７１、ＡＬＩＸ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーをさらに含むか、
ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１Ｂ、ＦＭＣ７、カルネキシン、ヒト白血球抗原−抗原Ｄ関連（ＨＬＡ−ＤＲ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーを欠くか、または、これらの任意の組み合わせである、請求項１〜６のいずれかに記載の単離されたエキソソーム集団。
【請求項８】
前記ＭＳＣが、骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、滑膜ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、口腔粘膜ＭＳＣ、歯周靱帯ＭＳＣ、子宮内膜ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、および臍帯血ＭＳＣからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の単離されたエキソソーム集団。
【請求項９】
前記単離されたエキソソーム集団が、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質としても知られる）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の神経栄養因子（ＮＴＦ）をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の単離されたエキソソーム集団。
【請求項１０】
前記単離されたエキソソーム集団が、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−３４ａ−３９、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４３２４、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ分子をさらに含むか、あるいは
前記単離されたエキソソーム集団が、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−３１３２、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−４２８４、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５５−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０５、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を欠くか、または、これらの任意の組み合わせである、請求項１〜９のいずれかに記載の単離されたエキソソーム集団。
【請求項１１】
神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）に由来する単離されたエキソソーム集団であって、神経栄養因子（ＮＴＦ）を含む少なくとも１つのカーゴタンパク質を、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における前記少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して増加した量で含む、単離されたエキソソーム集団と、
薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ＮＴＦが、白血病抑制因子（ＬＩＦ）タンパク質、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）タンパク質、増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのカーゴタンパク質が、ＮＴＦおよび少なくとも１つの追加的なタンパク質を含む、請求項１１または１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記追加タンパク質が、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）タンパク質インターロイキン１３（ＩＬ１３）タンパク質、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
ＬＩＦタンパク質の量が少なくとも５０倍増加するか、
ＣＸＣＬ１タンパク質の量が少なくとも３０倍増加するか、
ＩＬ１３タンパク質の量が少なくとも５倍増加するか、
ＶＥＧＦＡの量が少なくとも５倍増加するか、
ＧＤＦ１５の量が少なくとも２倍増加するか、または、これらの任意の組み合わせである、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの追加的なタンパク質が、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記単離されたエキソソーム集団が、分化抗原群（ＣＤ）９、ＣＤ２９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ４４、ＣＤ４９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ６１、ＣＤ２７１、ＡＬＩＸ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーをさらに含むか、
前記単離されたエキソソーム集団が、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１Ｂ、ＦＭＣ７、カルネキシン、ヒト白血球抗原−抗原Ｄ関連（ＨＬＡ−ＤＲ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーを欠くか、または、これらの任意の組み合わせである、請求項１１〜１６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記ＭＳＣが、骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、滑膜ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、口腔粘膜ＭＳＣ、歯周靱帯ＭＳＣ、子宮内膜ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、および臍帯血ＭＳＣからなる群から選択される、請求項１１〜１７のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記単離されたエキソソームの純度が、サイズにより少なくとも９５％である、請求項１１〜１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
神経変性疾患を治療する方法における使用のための薬学的組成物であって、
神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）に由来する単離されたエキソソーム集団を含み、
前記単離されたエキソソームが、神経栄養因子（ＮＴＦ）を含む少なくとも１つのカーゴタンパク質を、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における前記少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して増加した量で含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
前記ＮＴＦが、白血病抑制因子（ＬＩＦ）タンパク質、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）タンパク質、増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２０に記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのカーゴタンパク質が、ＮＴＦおよび少なくとも１つの追加的なタンパク質を含む、請求項２０または２１に記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項２３】
前記追加タンパク質が、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）タンパク質、インターロイキン１３（ＩＬ１３）タンパク質、またはこれらの組み合わせを含む、請求項２２に記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項２４】
ＬＩＦタンパク質の量が少なくとも５０倍増加するか、
ＣＸＣＬ１タンパク質の量が少なくとも３０倍増加するか、
ＩＬ１３タンパク質の量が少なくとも５倍増加するか、
ＶＥＧＦＡの量が少なくとも５倍増加するか、
ＧＤＦ１５の量が少なくとも２倍増加するか、または、これらの任意の組み合わせである、請求項２３に記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの追加的なタンパク質が、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２２〜２４のいずれかに記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項２６】
前記単離されたエキソソーム集団が、分化抗原群（ＣＤ）９、ＣＤ２９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ４４、ＣＤ４９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ６１、ＣＤ２７１、ＡＬＩＸ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーをさらに含むか、
前記単離されたエキソソーム集団が、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１Ｂ、ＦＭＣ７、カルネキシン、ヒト白血球抗原−抗原Ｄ関連（ＨＬＡ−ＤＲ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーを欠くか、または、これらの任意の組み合わせである、請求項２０〜２５のいずれかに記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項２７】
前記ＭＳＣが、骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、滑膜ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、口腔粘膜ＭＳＣ、歯周靱帯ＭＳＣ、子宮内膜ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、および臍帯血ＭＳＣからなる群から選択される、請求項２０〜２６のいずれかに記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項２８】
前記使用が、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、Ｔ制御性（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、ＩＦＮ−γ分泌の減少、ＴＮＦ−α分泌の減少、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される免疫調節効果を含む、請求項２０〜２７のいずれかに記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項２９】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レット症候群、脳性麻痺（ＣＰ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、およびてんかんからなる群から選択される、請求項２０〜２８のいずれかに記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項３０】
ＮＴＦを含む少なくとも１つのカーゴタンパク質を、未分化ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における前記少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して増加した量で含む単離されたエキソソーム集団を生産する方法であって、
（ａ）ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得るステップ、
（ｂ）接着性ＭＳＣを単離するステップ、
（ｃ）ジブチリル環状アデノシン一リン酸、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト血小板由来増殖因子、およびヒトヘレグリン−β１を補充した無血清ＤＭＥＭ培地を用いて前記接着性ＭＳＣを培養するステップ、
（ｄ）前記無血清ＤＭＥＭ培地からエキソソーム集団を単離するステップと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記ＭＳＣが、骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、滑膜ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、口腔粘膜ＭＳＣ、歯周靱帯ＭＳＣ、子宮内膜ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、および臍帯血ＭＳＣからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭＳＣが、骨髄ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、または臍帯血ＭＳＣを含む場合には、前記ステップ（ａ）が、ヒト単核細胞を骨髄または血液試料から分離することを含み、前記ステップ（ｂ）が、接着性ＭＳＣを単核集団から単離することを含み、
前記ＭＳＣが、脂肪細胞ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、滑膜ＭＳＣ、口腔粘膜ＭＳＣ、歯周靱帯ＭＳＣ、または子宮内膜ＭＳＣを含む場合には、前記ステップ（ａ）は、組織を得ることと、物理的および酵素的方法を使用してそれを解離することと、を含み、前記ステップ（ｂ）が、接着性ＭＳＣを総組織細胞集団から単離することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップ（ｂ）が、２００ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ＩＵ／ｍｌのヘパリン、および１０％の血小板溶解物を補充した低グルコースＤＭＥＭにおいて前記接着性単核細胞を増殖させることをさらに含む、請求項３０〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップ（ｃ）における前記無血清ＤＭＥＭ培地が、１ｍＭのジブチリル環状アデノシン一リン酸、２０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、５ｎｇ／ｍＬのヒト血小板由来増殖因子、および５０ｎｇ／ｍＬのヒトヘレグリン−β１で補充される、請求項３０〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記ステップ（ｄ）が、前記ステップ（ｃ）の３日後に実行される、請求項３０〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）に由来する単離されたエキソソーム集団であって、
ＮＴＦを含む少なくとも１つのカーゴタンパク質を、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における前記少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して増加した量で含み、
前記単離されたエキソソーム集団が、
（ａ）ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得るステップと、
（ｂ）接着性ＭＳＣを単離するステップと、
（ｃ）ジブチリル環状アデノシン一リン酸、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト血小板由来増殖因子、およびヒトヘレグリン−β１を補充した無血清ＤＭＥＭ培地を用いて前記接着性ＭＳＣを培養するステップと、
（ｄ）前記無血清ＤＭＥＭ培地からエキソソーム集団を単離するステップと、を含む、方法により生産される、単離されたエキソソーム集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、単離された細胞型特異的エキソソームに関し、該細胞型は、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導されている分化した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む。分化した細胞は、「ＭＳＣ−ＮＴＦ」、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞、またはＮｕｒＯｗｎ（登録商標）と称される。加えて、ＭＳＣに由来する改変され単離されたエキソソームが本明細書に開示され、エキソソームは特定の有益な分子を含む。これらの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームおよび改変されたＭＳＣエキソソームは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）疾患、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レット症候群、脳性麻痺（ＣＰ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、およびてんかんを含む、神経変性疾患を治療するために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、脳および／または脊髄における神経細胞の喪失に関連する機能障害により特徴付けられる。急性神経変性は、脳卒中または外傷のような一時的に分離した侵襲から生じる場合があり、傷害の部位でニューロンの局所的な喪失につながる。慢性神経変性は、長期間にわたって発症する場合があり、特定のニューロンサブタイプの喪失、またはニューロン集団の全般的な喪失をもたらす。脳において、アルツハイマー病（ＡＤ）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、ニューロンの広範な喪失を生じるが、パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質におけるドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンの特異的および局所的な喪失を伴う。脳幹および脊髄において、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、運動ニューロン（ＭＮ）の変性および喪失を伴う。多発性硬化症（ＭＳ）は、脳および脊髄における神経細胞が損傷する脱髄性疾患である。追加的な神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、レット症候群、脳性麻痺（ＣＰ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、およびてんかんを含む。ＡＤは、脳細胞を損傷し最終的に破壊する進行性脳障害であり、記憶喪失、ならびに思考および他の脳機能の変化につながる。レット症候群は、神経発達状態であり、多くの場合、Ｘ染色体上に位置する遺伝子ＭＥＣＰ２の変異によって引き起こされる。ＣＰは、子供の脳が発達している間に生じる非進行性脳損傷または奇形によって引き起こされる神経学的障害と考えられる。ＡＳＤは、精神障害の中で最も遺伝性であると考えられる。ＡＳＤ脳の検査は、無秩序な灰白質および白質、ニューロンの増加した数、ニューロン細胞体の減少した体積、ならびに増加したニューロピルを含む全脳的な変化を明らかにしており、最後に挙げたものは、樹状突起スパイン、脳血管構造およびグリアの密度の変化を反映している。てんかんは、急性全身性または神経学的侵襲によって誘発されない再発性発作により特徴付けられた中枢神経系の障害である。
【０００３】
これらの状態はすべて独自のニューロン病理を呈し、神経喪失の正確なメカニズムは複雑であるが、多くの神経変性疾患は、タンパク質蓄積、ミトコンドリア機能障害、酸化ストレス、炎症、およびアポトーシス死を含む、一般的な病態生理学的プロセスを示す。現在の治療は、しばしば症候性であり、神経変性プロセスを停止または遅延させない。興味深いことに、ＭＳＣ細胞は、多くの異なる神経変性疾患の治療において調査されている（Ｌｏ  Ｆｕｒｎｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１８）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３３：３９８２−３９９９）。
【０００４】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、宿主細胞との動的なパラクライン相互作用を介したそれらの神経保護および免疫調節効果のために、臨床試験で使用される最も一般的な型の成体幹細胞である。ＭＳＣの特徴は、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａまたはＣＤ１９、およびＨＬＡ−ＤＲの群から選択される細胞表面膜マーカーの発現の欠如を含むことができる。（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ  Ｍ，  Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ  Ｋ，  Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｎｉｍａｌ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００６；８：３１５−３１７．）したがって、ＭＳＣは、それらの細胞表面上にマーカーが存在しないこと（陰性マーカー）によって定義され得る。
【０００５】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞としても知られるＮｕｒＯｗｎ（登録商標）は、特許の培養条件下で誘導されて、中でもＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、およびＢＤＮＦを含むニューロンの増殖および生存を支持する高レベルの神経栄養因子（ＮＴＦ）を産生する、自己骨髄由来のＭＳＣである。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、非常に低いか、またはＬＩＦ、ＢＭＰ−２およびＴＳＧ−６のようなＭＳＣによって発現されない高レベルのＮＴＦも分泌する。さらに、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、神経新生を制御し、神経炎症を調節することができる未分化ＭＳＣと比較して、独自の遺伝子、タンパク質、およびｍｉＲＮＡパターンを発現する。
【０００６】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞療法は、第Ｉ相および第ＩＩａ相、ＡＬＳ患者における非盲検試験、ならびにより最近では米国第２相多施設無作為化二重盲検プラセボ対照研究において評価されている。これらの試験は、髄腔内（ＩＴ）もしくは筋肉内（ＩＭ）のいずれか、または２つの経路の組み合わせによって投与されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の安全性および忍容性を確認した。顕著な臨床有効性は、より注目すべきことに、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の単回投与後に急速に進行するＡＬＳ参加者において観察された。加えて、移植２週間後、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞特異的ＮＴＦの有意な増加が、プラセボ患者ではなく治療された患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において検出された。さらに、統計学的に有意な逆相関が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞治療患者のＣＳＦにおいて増加したＮＴＦと炎症マーカーの低減との間に認められたが、プラセボ治療患者では認められなかった。さらに、研究参加者のＣＳＦにおいて特定された細胞特異的およびＡＬＳ特有のｍｉＲＮＡの解析は、提案された抗炎症および神経栄養作用機構を支持した。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の多施設ＡＬＳ第３相二重盲検プラセボ対照多回投与研究は、６つの米国医療センターで現在進行中である。
【０００７】
ＡＬＳ、パーキンソン病、および多発性硬化症のような神経変性疾患に罹患している人にとって、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の治療可能性を維持する療法を受け、一方でＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に実用的な利点を提供することによって療法を改善することは、有益であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
エキソソームは、ＭＳＣを含む異なる細胞型によって放出されるナノサイズの（通常、３０〜１５０ｎｍの直径）細胞分泌小胞である。エキソソームは、多胞体に由来し、原形質膜との融合後に細胞外環境に放出される。エキソソームは、それらの起源の細胞からのｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、脂質、およびタンパク質を含むことができるカーゴを送達することにより、細胞間コミュニケーションに関与し、最終的には、炎症、血管新生、ならびにニューロンの生存および分化を調節することを含む、多くの細胞プロセスに対する制御性機能を提供する。
【０００９】
細胞ベース療法（例えば、ＭＳＣ療法）よりもエキソソームベース療法を使用することは、いくつかの実用的な利点を有する。利点のうちの１つは、エキソソームが、血液脳関門（ＢＢＢ）を容易に通過し、深いＣＮＳ組織に侵入することである（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ，２０１１  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．４２（３）：３６０−７）一方で、無傷の細胞はそうではない。エキソソームの別の利点は、エキソソームが天然では不活性であるため、エキソソームが高い産物安定性を有する一方で、生細胞が、短い保存期間を有し、一定の制御を必要とすることである。エキソソームの別の利点は、エキソソームが、例えば、高用量および高濃度で投与するために非常に簡単に製剤化できることであり、そのことは、それらの治療効果を増強する（Ｋａｌｒａ，２０１３  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１３（２２）：３３５４−６４）。エキソソームの別の利点は、エキソソームが低い免疫原性を有し、例えば、免疫系による分解またはクリアランスを回避する能力の増加を呈し、反復投与を可能にすることである（Ｌｕｃａ，２０１４  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ４９（１）１１３−１１９）。エキソソームの無−低（ｎｏｎ−ｔｏ−ｌｏｗ）免疫原性が、細胞療法とは際立って対照的に、大量の治療用製品を商業的に事前生産、特徴付け、試験、および保存する選択肢を提供することと、これらの製品が、免疫学的一致を必要とせずに任意のレシピエントにさらに投与され得ることと、に着目することは、重要である。オムニドナーオムニレシピエント治療薬（ｏｍｎｉ−ｄｏｎｏｒ−ｏｍｎｉ−ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、閉じた「自身の細胞で投与される患者」システムを必要とする、すべての細胞ベース療法よりも大きな利点を表す。
【００１０】
さらに、細胞とは対照的に、エキソソームは、異なる系統の細胞に分化転換する可能性、およびＤＮＡ形質転換の可能性を有しない。加えて、エキソソームは、低分子量の治療薬、核酸、およびタンパク質の機能的輸送のための理想的な生来の構造的および生体適合性ナノキャリア特性を有する。
【００１１】
一態様では、神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）に由来する単離されたエキソソーム集団であって、該単離されたエキソソームが、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における神経栄養因子（ＮＴＦ）を含む少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、増加した量の該少なくとも１つのカーゴタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団が、開示される。
【００１２】
関連する態様では、ＮＴＦは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）タンパク質、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）タンパク質、もしくは増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む。別の関連する態様では、少なくとも１つのカーゴタンパク質は、ＮＴＦおよび少なくとも１つの追加的なタンパク質を含む。さらなる関連する態様では、追加タンパク質は、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）タンパク質もしくはインターロイキン１３（ＩＬ１３）タンパク質、またはこれらの組み合わせを含む。別の関連する態様では、ＬＩＦタンパク質の量は少なくとも５０倍増加するか、もしくはＣＸＣＬ１タンパク質の量は少なくとも３０倍増加するか、もしくはＩＬ１３タンパク質の量は少なくとも５倍増加するか、もしくはＶＥＧＦＡの量は少なくとも５倍増加するか、もしくはＧＤＦ１５の量は少なくとも２倍増加するか、またはこれらの任意の組み合わせである。別の関連する態様では、少なくとも１つの追加的なタンパク質は、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、もしくはＴＮＦＳＦ１４タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００１３】
別の態様では、単離されたエキソソーム集団は、分化抗原群（ＣＤ）９、ＣＤ２９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ４４、ＣＤ４９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ６１、ＣＤ２７１、ＡＬＩＸ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーをさらに含むか、または、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１Ｂ、ＦＭＣ７、カルネキシン、ヒト白血球抗原−抗原Ｄ関連（ＨＬＡ−ＤＲ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーを欠く。
【００１４】
関連する態様では、ＭＳＣは、骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、滑膜ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、口腔粘膜ＭＳＣ、歯周靱帯ＭＳＣ、子宮内膜ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、および臍帯血ＭＳＣからなる群から選択される。
【００１５】
別の関連する態様では、単離されたエキソソーム集団は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質としても知られる）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、および線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の神経栄養因子（ＮＴＦ）をさらに含む。さらなる関連する態様では、単離されたエキソソーム集団は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−３４ａ−３９、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、およびｍｉＲ−４３２４、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ分子をさらに含むか、または単離されたエキソソーム集団は、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−３１３２、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−４２８４、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５５−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０５、およびｍｉＲ−１４０−３ｐ、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を欠く。
【００１６】
一態様では、本明細書の開示は、神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）に由来する単離されたエキソソーム集団であって、該単離されたエキソソームが、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団中における神経栄養因子（ＮＴＦ）を含む少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、増加した量の該少なくとも１つのカーゴタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を記載する。
【００１７】
一態様では、神経変性疾患を治療する方法における使用のための薬学的組成物であって、該薬学的組成物が、神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）に由来する単離されたエキソソーム集団を含み、該単離されたエキソソームが、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における神経栄養因子（ＮＴＦ）を含む少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、増加した量の該少なくとも１つのカーゴタンパク質を含む、薬学的組成物が、本明細書に開示される。
【００１８】
関連する態様では、使用の方法は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、Ｔ制御性（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、ＩＦＮ−γ分泌の減少、ＴＮＦ−α分泌の減少、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される免疫調節効果を含む。
【００１９】
関連する態様では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レット症候群、脳性麻痺（ＣＰ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、およびてんかんからなる群から選択される。
【００２０】
一態様では、増加した量の少なくとも１つのカーゴタンパク質を含む単離されたエキソソーム集団を生産する方法が本明細書に開示され、該カーゴタンパク質はＮＴＦを含み、方法は、（ａ）ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得るステップと、（ｂ）接着性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離するステップと、（ｃ）ジブチリル環状アデノシン一リン酸、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト血小板由来増殖因子、およびヒトヘレグリン−β１を補充した無血清ＤＭＥＭ培地を用いて接着性単核細胞を培養するステップと、（ｄ）無血清ＤＭＥＭ培地からエキソソーム集団を単離するステップと、を含み、該増加した量は、未分化ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における該少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較される。
【００２１】
関連する態様では、ＭＳＣは、骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、滑膜ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、口腔粘膜ＭＳＣ、歯周靱帯ＭＳＣ、子宮内膜ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、および臍帯血ＭＳＣからなる群から選択される。さらなる関連する態様では、該ＭＳＣが、骨髄ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、または臍帯血ＭＳＣを含む際に、該ステップ（ａ）は、ヒト単核細胞を該骨髄または該血液から分離することを含み、ステップ（ｂ）は、単核集団から単離された接着性ＭＳＣをさらに含む。
【００２２】
関連する態様では、ステップ（ｂ）は、接着性単核細胞を、２００ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ＩＵ／ｍｌのヘパリン、および１０％の血小板溶解物を補充した低グルコースＤＭＥＭにおいて増殖させることをさらに含む。
【００２３】
関連する態様では、ステップ（ｃ）における無血清ＤＭＥＭ培地は、１ｍＭのジブチリル環状アデノシン一リン酸、２０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、５ｎｇ／ｍＬのヒト血小板由来増殖因子、および５０ｎｇ／ｍＬのヒトヘレグリン−β１で補充される。
【００２４】
関連する態様では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の３日後に実行される。
【００２５】
一態様では、神経栄養因子を分泌する間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）に由来する単離されたエキソソーム集団が本明細書に開示され、該単離されたエキソソームは、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、増加した量の該少なくとも１つのカーゴタンパク質を含み、該カーゴタンパク質はＮＴＦを含み、該単離されたエキソソーム集団は、（ａ）ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得るステップと、（ｂ）接着性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離するステップと、（ｃ）ジブチリル環状アデノシン一リン酸、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト血小板由来増殖因子、およびヒトヘレグリン−β１を補充した無血清ＤＭＥＭ培地を用いて接着性単核細胞を培養するステップと、（ｄ）無血清ＤＭＥＭ培地からエキソソーム集団を単離するステップと、を含む方法により生産される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
単離されたエキソソーム、それらの単離および使用の方法の主題は、本明細書の結論部分において特に指摘され、明確に主張される。しかしながら、単離されたエキソソームの目的、特徴、および利点、それらの単離および使用の方法は、添付の図面と共に読まれる際に、以下の詳細な記載への参照によって最もよく理解され得る。
【００２７】
【図１】エキソソームのサイズ（直径、ｎｍ）および数の分布を示す折れ線グラフである。エキソソームのサイズと数を、ナノ粒子追跡解析によって測定した。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソームの平均直径は、約１３０ｎｍであった。
【図２Ａ】タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によってＭＳＣ−ＮＴＦ細胞培養培地から単離されたエキソソームを示す電子顕微鏡写真である。エキソソームを、２％のパラホルムアルデヒドおよび２％のグルタルアルデヒドで固定し、２００メッシュのレーシー（ｌａｃｅｙ）Ｆｏｒｍｖａｒ炭素被覆グリッド上に負荷し、直ちにエタン（ガス）中で凍結させた。
【図２Ｂ】タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によってＭＳＣ−ＮＴＦ細胞培養培地から単離されたエキソソームを示す電子顕微鏡写真である。エキソソームを、２％のパラホルムアルデヒドおよび２％のグルタルアルデヒドで固定し、２００メッシュのレーシー（ｌａｃｅｙ）Ｆｏｒｍｖａｒ炭素被覆グリッド上に負荷し、直ちにエタン（ガス）中で凍結させた。
【図３Ａ】培養されたニューロンによるエキソソームの取り込みの結果を示す。エキソソームを、ＲＮＡ選択的染料によって染色し、ｉＰＳＣヒトニューロンと１２時間共培養した。取り込みを、蛍光顕微鏡法（拡大率１０倍）によって評価した。
【図３Ｂ】培養されたニューロンによるエキソソームの取り込みの結果を示す。エキソソームを、膜染色によって染色し、ｉＰＳＣヒトニューロンと１２時間共培養した。取り込みを、ＦＡＣＳ解析（ＳＳは前方散乱であり、ＦＬ１は蛍光チャネル１〜４８０ｎｍを指す）によって評価した。
【図４Ａ】ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの免疫調節効果を示す。活性化したＰＢＭＣを、エキソソーム（３．３×１０１０／ｍｌ）を用いて、または用いずに９６時間共培養し、９６時間後のＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を検査した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３±ＳＤ）。
【図４Ｂ】ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの免疫調節効果を示す。活性化したＰＢＭＣを、エキソソーム（３．３×１０１０／ｍｌ）を用いて、または用いずに９６時間共培養し、９６時間後のＩＦＮ−γ分泌の誘導を検査した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３±ＳＤ）。
【図４Ｃ】ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの免疫調節効果を示す。活性化したＰＢＭＣを、エキソソーム（３．３×１０１０／ｍｌ）を用いて、または用いずに９６時間共培養し、９６時間後のＴＮＦ−アルファ分泌の誘導（図４Ｃ）を検査した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３±ＳＤ）。
【図４Ｄ】フローサイトメトリーで決定された２つの異なる用量（４．６×１０９および２．３×１０９）でのＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームと３日間共培養された２人の異なる健常ドナーからのＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ−ｒｅｇレベルの増加の図解である。
【図４Ｅ】ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームとＰＢＭＣからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導との相関の図解である。ドットプロットは、ＦｏｘＰ３およびＣＤ２５陽性細胞の分布を示す。２つの異なる用量（４．６×１０９および２．３×１０９）でのエキソソームを、ＰＢＭＣと３日間共培養し、Ｔ−ｒｅｇの表現型を、評価した。対照は、ＰＢＳ＋ＰＢＭＣである。すべての細胞は、ＣＤ４＋である。
【図５Ａ】単離されたエキソソームに対するニューロン細胞の機能的応答を示す。図５Ａは、１、１０、または２０μｌのいずれかのＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームが添加されるＤＣＸ−ＧＦＰ神経前駆体について、６時間間隔で監視された神経突起の長さの変化によって決定される、神経突起伸長の誘導を検査する実験の結果を示す（ＰＢＳを有する細胞−対照）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの神経保護効果の図解である。ｉＰＳＣに由来する神経前駆細胞を、ニューロン分化および成熟培地を使用して１４日間成熟ニューロンへと分化させた。１５日目に、培地を、エキソソーム（２〜４×１０９粒子）またはＰＢＳ（対照）を補充した神経栄養因子欠乏培地に変更した。細胞を、さらに７日間培養物中で維持した。細胞を、この間に６時間間隔で画像化した。神経突起長さ変化を、Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｋモジュールを使用して計算した。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＭＳＣエキソソームおよびＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの神経突起伸長効果の図解である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、３５，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ  Ｆ１２において９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を無血清ＤＭＥＭ  Ｆ１２に交換し、エキソソーム（約２×１０９粒子）を各ウェルに添加した。対照は、ＰＢＳであった。細胞を、２時間間隔で画像化した。神経突起の長さを、Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｋモジュールを使用することによって計算した。
【図６】ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞溶解物と比較した、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の２Ｄ培養馴化培地およびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のバイオリアクター馴化培地から単離されたエキソソームの純度を、エキソソームマーカーのＣＤ９および小胞体（ＥＲ）マーカーのカルネキシンについてのウエスタンブロット解析によって示す。
【図７】ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞培養馴化培地から単離されたエキソソームにおけるエキソソームマーカーのＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９の発現レベル、ならびにＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ分子の発現レベルを示す。マウスＩｇＧを、陰性対照として使用した。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を、特定されたように、２Ｄおよび３Ｄ条件下で増殖させた。
【図８】ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームを比較する抗体配列データの火山プロットである。すべてのタンパク質についてのデータは、降順でｐ値（ｙ軸）に対する変化率（ｘ軸）としてプロットされる。有意なｐ値（＜０．０５）の閾値は、破線で示される。ｐ値を、データ分布に依存して、Ｗｉｌｃｏｘｏｎまたはスチューデントのｔ検定を使用して計算した。小さな変化（０．５〜２倍）のタンパク質は黒色の球として印をつけられ、大きな変化（０．５倍未満または２倍超）のタンパク質は薄緑色の球として印をつけられる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下の詳細な記載では、単離されたエキソソーム、それらの単離および使用の方法の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が定められる。他の例では、周知の方法、手順、および構成要素は、単離されたエキソソーム、それらの単離および使用の方法を不明瞭にしないように、詳細に記載されていない。
【００２９】
単離された「細胞型特異的」エキソソームが本明細書に記載され、細胞型は、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導されている分化した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む。このような細胞は、本明細書では「ＭＳＣ−ＮＴＦ」または「ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞」と呼ばれる。当業者は、用語「ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞」が、本明細書において、すべて同じ質および意味を有する「ＭＳＣ−ＮＴＦ」または「ＮｕｒＯｗｎ（登録商標）」と互換的に使用されることを、理解するであろう。
【００３０】
具体的には、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞からエキソソームを生産する方法が、本明細書に記載される。ＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソーム細胞は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞さえも用いることなく、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）疾患、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レット症候群、脳性麻痺（ＣＰ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、およびてんかんを含む、神経変性疾患を治療するために使用され得る。
【００３１】
単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの特徴付けは、少なくともＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を定義および特徴付けるマーカーのサブセットを含む。これらのマーカーは、膜マーカー、ＮＴＦ、およびｍｉＲＮＡを含むことができる。さらに、これらのマーカーは、分化していないＭＳＣと比較してＭＳＣ−ＮＴＦにおいて変更され得、ＭＳＣの単離されたエキソソームと比較してＭＳＣ−ＮＴＦの単離されたエキソソームにおいても改変され得る。追加的に、エキソソームは、有益な「カーゴ」因子、例えば、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１および−２、またはＧＤＦ−５、またはガレクチン−１をエキソソームに負荷することにより改変され得る。他の例示的な「カーゴ」因子は、脆弱な運動ニューロンを標的とすることが知られる分子、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）およびｍｉＲ−７を標的とするｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡであり得る。
【００３２】
神経変性疾患の治療に有益な少なくとも１つの分子を含むように改変されている間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から単離されたエキソソームが、本明細書にさらに記載される。これらの単離されたＭＳＣエキソソームは、これらに限定されないが、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＧＤＦ−５、ガレクチン−１、ＭＭ９  ｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列をコードするｓｉＲＮＡもしくはその一部、またはｍｉＲ−７、またはこれらの任意の組み合わせを含む有益な分子を含むように負荷され得る。これらの改変されたＭＳＣエキソソームは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）疾患、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レット症候群、脳性麻痺（ＣＰ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、およびてんかんを含む、神経変性疾患を治療するためにも使用され得る。具体的には、少なくとも１つの有益な分子を含む改変されたＭＳＣエキソソームを生産する方法が、本明細書に記載される。
【００３３】
ＭＳＣ−ＮＴＦまたはＭＳＣ由来のエキソソームに有益な分子を負荷することの利点は、これらの負荷されたエキソソームが、それらが単離された細胞型の利点、ならびにそれらが負荷された特異的に選択された分子の利点の両方を提供することである（したがって、改変されている）。エキソソームの負荷は、当該技術分野で既知の方法、例えば、電気穿孔を使用して、単離されたエキソソームのレベルで直接行われ得るか、またはＭＳＣもしくはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、エキソソーム単離の前に少なくとも１つの有益な分子を高度に発現または発現するように改変され得、そのため、単離されたエキソソームは、形成時に有益な分子を含むであろう。
【００３４】
いくつかの実施形態では、単離された細胞型特異的エキソソームが本明細書に開示され、該細胞型は、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導されている分化したＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含み、該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌は、分化していないＭＳＣにおける該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌と比較して、該ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてより大きい。細胞型特異的エキソソームを分離する利点は、いくつかの実施形態において、これらの細胞から単離されたエキソソームにも存在する場合があり、したがって、有益な構成成分を含み、細胞療法で発生し得る問題を欠く療法を生み出す、ＭＳＣ−ＮＴＦに存在する構成成分から提供される利点である。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「基礎分泌」は、刺激剤の添加を伴わない分泌を指す。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、本明細書に記載される方法を使用して、分化していないＭＳＣから生産され得る。したがって、典型的には、分化していない間葉系幹細胞は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞と同一の培地中にあるが、分化剤を添加されていない。
【００３６】
当業者は、本明細書で使用される「単離された」という用語が、そのインビボ位置（例えば、これらに限定されないが、骨髄、神経組織、脂肪組織、歯髄、胎盤、滑膜、末梢血、口腔粘膜、歯周靱帯、子宮内膜、臍帯、および臍帯血）から除去されている細胞を指すことを、理解するであろう。一実施形態では、単離された細胞は、そのインビボ位置に存在する他の物質（例えば、他の細胞型）を実質的に含まない。
【００３７】
さらに、当業者は、用語「単離された」が、細胞、例えば、ＭＳＣまたは分化したＭＳＣ細胞から単離されているエキソソームを指すために本明細書でも使用されることを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＭＳＣのプロファイルとこれらの細胞から単離されたエキソソームとの間に、例えば、膜マーカーおよび内部カーゴに関して、強い相関がある。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦのプロファイルとこれらの細胞から単離されたエキソソームとの間に強い相関がある。いくつかの実施形態では、最も注目すべきことに、単離または精製されたエキソソームに存在するＮＴＦおよび／またはｍｉＲＮＡ分子のプロファイルと、それらが単離されている対応するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のＮＴＦおよび／またはｍｉＲＮＡプロファイルとの間に相関がある。
【００３８】
当業者は、用語「単離されたエキソソーム」が、いくつかの実施形態において、すべて同じ意味および質を有する「精製されたエキソソーム」または「エキソソームの精製された画分」と交換可能に使用され得ることを、理解するであろう。
【００３９】
本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「エキソソーム」または「少なくとも１つのエキソソーム」は、複数のエキソソームを含むことができる。
【００４０】
他の実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞において高度に発現される分子のプロファイルと、遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞から単離されたエキソソームにおけるこれらの分子の含有量、例えば、高度に発現され得る増殖因子との間に相関がある。他の実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣにおいて特異的に発現されるｓｉＲＮＡ分子のプロファイルと、遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離されたエキソソームにおけるこれらのｓｉＲＮＡ分子の含有量との間に相関がある。ｓｉＲＮＡ分子の例は、神経変性疾患に関与する標的ペプチドまたはポリペプチドを低減できるものを含む。いくつかの実施形態では、単離または精製されたエキソソームに存在するＭＳＣマーカー分子のプロファイルと、それらが単離されている対応するＭＳＣのマーカー分子プロファイルとの間に相関がある。
【００４１】
他の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）において高度に発現される分子のプロファイルと、ＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームにおけるこれらの分子の量、例えば、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において高度に発現され、これらの細胞に由来するエキソソームで大量に見出される増殖因子との間に相関がある。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、神経変性疾患の治療に有益な分子を高度に発現するように遺伝学的に改変され得る。いくつかの実施形態では、神経変性疾患の治療に有益な分子は、分化していないＭＳＣと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて高度に発現される。他の実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦにおいて特異的に発現されるｓｉＲＮＡ分子のプロファイルとＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームにおけるこれらのｓｉＲＮＡ分子の存在との間に相関があり、例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、神経変性疾患に関与するポリペプチドの標的ペプチドを低減させる。いくつかの実施形態では、単離または精製されたエキソソームに存在するＭＳＣ−ＮＴＦマーカー分子のプロファイルと、それらが単離されている対応するＭＳＣ−ＮＴＦのマーカー分子プロファイルとの間に相関がある。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される場合、用語「発現する」は、本明細書に記載される、神経栄養因子（ＮＴＦ）、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの合成および／または分泌を包含できる。いくつかの実施形態では、用語「発現する」は、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡの合成および／または分泌を包含できる。いくつかの実施形態では、用語「発現する」は、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡの合成および／または分泌を包含できる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦにおけるＮＴＦ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの発現は、ＮＴＦ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを発現しないＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームにおけるそのＮＴＦ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの含有量の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣにおける増殖因子、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの発現は、増殖因子、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを発現するように遺伝学的に改変されていないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離されたエキソソームにおけるその増殖因子、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡの含有量の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、発現は、高度な発現を含む。いくつかの実施形態では、発現は、高レベルの発現を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦおよび／またはＭＳＣのマーカーが本明細書に開示され、マーカーは遺伝子名を使用して特定される。当業者は、遺伝子名がマーカーを特定するために使用される一方で、マーカー自体がポリペプチドであり、遺伝子発現の増加および減少が、それぞれ特定されたポリペプチドのレベルの増加および減少をもたらし得ることを、理解するであろう。
【００４４】
本明細書に提示される開示は、単離されたエキソソーム、エキソソームを生産する方法、それらの組成物、および神経変性障害を含むある特定の疾患または障害の治療におけるそれらの使用の方法に広く関する。
【００４５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および分化した間葉系幹細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）
【００４６】
用語「間葉系幹細胞」、「間葉系間質細胞」、「多能性間質細胞」、「ＭＳＣ」、または「ＭＳＣ」は、最終分化していない成体細胞、分裂していずれかが幹細胞である細胞を生じることができる成体細胞、または不可逆的に分化して間葉系細胞系列の細胞を生じさせるか、もしくは神経系列のような他の非中胚葉系列の細胞に分化転換する成体細胞について、互換的に使用される。
【００４７】
ＭＳＣの供給源は、健常対象からのものであり得るか、または治療される対象からのものであり得るか、または治療される対象と免疫学的に一致した、または免疫学的に一致しないドナーからのものであり得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣの供給源は、神経変性疾患に罹患している対象からのものであり得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、自己細胞を含む。別の実施形態では、ＭＳＣは、同種細胞を含む。本明細書で例示されるように、ＭＳＣエキソソームおよびＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームオオムギは、エキソソームとヒトレシピエントとの間の免疫学的一致を冗長にすることができるＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ分子を発現する（図７）。
【００４８】
ＭＳＣは、ほぼすべての組織において見出されることができ、様々な組織から単離され得る。骨髄（ＢＭ）は、ＭＳＣの最も広く認識された供給源であるが、最近の研究は、脂肪組織（ＡＴ）、胎盤、歯髄、滑膜、末梢血、口腔粘膜、歯周靱帯、子宮内膜、臍帯（ＵＣ）、および臍帯血（ＵＣＢ）を含む、ＭＳＣの代替供給源を特定している。実際、ＭＳＣは全身にわたる任意の血管新生組織に事実上存在し得るという証拠が、提案されている。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣは、それらが特定される任意の組織から単離された。いくつかの実施形態では、ＭＳＣが単離され得る組織は、骨髄、脂肪組織、胎盤、歯髄、滑膜、末梢血、口腔粘膜、歯周靱帯、子宮内膜、臍帯、および臍帯血を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
末梢血からＭＳＣを単離する方法は、Ｋａｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００６  Ｍａｙ；３７（１０）：９６７−７６）により記載される。胎盤組織からＭＳＣを単離する方法は、Ｓｅｍｅｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｅｍｅｎｏｖ  ＯＶ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．２０１０  Ｆｅｂ；２０２（２）：１９３）により記載される。脂肪組織、胎盤および臍帯血のＭＳＣを単離および培養する方法は、Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００６；２４：１２９４−１３０１）により記載される。いくつかの実施形態では、当該技術分野で既知の任意の方法は、それらが特定される組織からＭＳＣを単離するために使用され得る。
【００５１】
本明細書に記載されるＭＳＣは、任意の幹細胞に由来し得ることが理解されるであろう。一実施形態では、ＭＳＣ細胞は、骨髄ＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、脂肪細胞ＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、歯髄ＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、腱から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、胎盤から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、臍帯から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、脂肪組織から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、滑膜から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、末梢血から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、歯周靱帯から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、口腔粘膜から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、子宮内膜から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣ細胞は、臍帯血から得られたＭＳＣを含む。別の実施形態では、ＭＳＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞に由来しない。別の実施形態では、ＭＳＣは、成体幹細胞を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、ＭＳＣは、ヒトである。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、対象に対して同種である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、対象と免疫学的に一致する。他の実施形態では、ＭＳＣは、対象に対して非同種である。別の実施形態では、ＭＳＣは、対象に対して同種である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、健常対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、神経変性疾患に罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、レット症候群、脳性麻痺（ＣＰ）、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、またはてんかんを含む、神経変性疾患に罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＡＬＳに罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＦＴＤに罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＰＤに罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＭＳＡに罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＭＳに罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＡＤに罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、レット症候群に罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＣＰに罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＡＳＤに罹患している対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、てんかんに罹患している対象から得られる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、改変されないか、または非遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒト細胞である。一実施形態では、骨髄は、吸引によって個体の腸骨稜から単離され得る。ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）は、例えば、ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ密度勾配遠心分離により分離され得る。ＭＳＣを得るために、ＭＳＣ（例えば、ＢＭＭＮＣ）を含む細胞集団は、例えば、血小板溶解物の存在下で細胞を維持および／または拡大することができる増殖培地において培養され得る。いくつかの実施形態によれば、集団は、ポリスチレンプラスチック表面上（例えば、組織培養フラスコ中）にプレーティングされ、ＭＳＣは、非接着性細胞を除去することにより単離される。いくつかの実施形態によれば、集団は、バイオリアクターのチャンバー内に存在するポリマー表面上にプレーティングされ、ＭＳＣは、バイオリアクターチャンバー内から非接着性細胞を除去することにより単離される。いくつかの実施形態によれば、集団は、接着性細胞増殖を収容することができる表面上にプレーティングされ、該表面は、バイオリアクターのチャンバー内にあり、ＭＳＣは、非接着性細胞をバイオリアクターチャンバー内から除去することにより単離される。代替的には、ＭＳＣは、ＭＳＣマーカーに対する抗体を使用するＦＡＣＳソーティングによって単離され得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、神経変性疾患の治療に有益な少なくとも１つの分子を発現するように改変される。細胞において外因性分子を発現させる方法は、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、神経変性疾患の治療に有益な少なくとも１つの分子を発現するように遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、神経変性疾患の治療に有益な少なくとも１つの分子を高度に発現するように遺伝学的に改変され得る。いくつかの実施形態では、神経変性疾患の治療に有益な分子は、増殖因子、ｍｉＲＮＡ、および／またはｓｉＲＮＡを含む。
【００５６】
別の実施形態によれば、ＭＳＣおよび／またはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、バイオリアクターにおける３Ｄ培養物中で増殖する。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞増殖のために使用され得るバイオリアクターの例は、ＰＢＳ垂直ホイールバイオリアクターである。ＰＢＳ垂直ホイールバイオリアクターは、マイクロキャリアビーズの均一混合をもたらす垂直攪拌技術を有する。ＰＢＳ垂直ホイールバイオリアクターは、制御された環境において接着性細胞集団からの生産のスケーリングを可能にし、高度に統合された使い捨て機器は、現在の優れた製造実務要件を満たすように適合され得る。
【００５７】
別の実施形態によれば、ＭＳＣおよび／またはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、接着性細胞の高密度増殖のために設計されたバイオリアクターにおいて増殖する。いくつかの実施形態では、高密度増殖は、低い剪断応力、またはゼロ発泡およびバブリング、もしくは酸素制限がないこと、またはこれらの任意の組み合わせを有するシステムを含む。高密度増殖および高生産性のために設計されたバイオリアクターの例は、ＶａｃｃｉＸｃｅｌｌによるＣｅｌＣｒａｄｌｅ（商標）である。いくつかの実施形態では、高密度バイオリアクターシステムは、使い捨てバイオリアクターを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣおよび／またはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が高密度バイオリアクターシステムにおいて増殖する際に、精製されたエキソソームの収量は増加する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣおよび／またはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が三次元増殖（３Ｄ増殖）を含むバイオリアクターシステムにおいて増殖する際に、精製されたエキソソームの収量は増加する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣおよび／またはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が三次元増殖を含む高密度バイオリアクターシステムにおいて増殖する際に、精製されたエキソソームの収量は増加する。いくつかの実施形態では、２Ｄ増殖条件および３Ｄ増殖条件下で増殖したＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームは、類似したカーゴプロファイルを有する。いくつかの実施形態では、２Ｄ増殖条件および３Ｄ増殖条件下で増殖したＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームは、類似した機能的特性を有する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、エキソソームが分泌される細胞が、二次元増殖条件と比較して、三次元増殖の条件下で増殖する際に、精製されたエキソソームの収量が増加する（実施例１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、二次元増殖条件と比較して、三次元増殖の条件下で培養された細胞からのエキソソームの分泌が増加する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、エキソソームの大規模生産および精製の方法は、高密度バイオリアクターシステムにおいてＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を増殖させるステップ、またはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の三次元増殖のステップ、または細胞の三次元増殖を含む高密度バイオリアクターシステムにおいてＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を増殖させるステップを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、エキソソームの大規模生産および精製の方法は、高密度バイオリアクターシステムにおいてＭＳＣを増殖させるステップを含む。いくつかの実施形態では、エキソソームの大規模生産および精製の方法は、ＭＳＣの三次元増殖のステップを含む。いくつかの実施形態では、エキソソームの大規模生産および精製の方法は、細胞の三次元増殖を含む高密度バイオリアクターシステムにおいてＭＳＣを増殖させるステップを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、エキソソームの生産および精製のための細胞試料を提供することは、高密度バイオリアクターシステムにおいて細胞を増殖させるステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞の試料を提供することは、細胞の三次元増殖のステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞試料を提供することは、細胞の三次元増殖を含む高密度バイオリアクターシステムにおいて細胞を増殖させるステップを含む。いくつかの実施形態では、提供される細胞試料は、分化したＭＳＣ細胞、または分化していないＭＳＣ細胞、または遺伝学的に改変され分化したＭＳＣ細胞、または遺伝学的に改変された分化していないＭＳＣを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、分化ステップの前に細胞を拡大および増殖させるために使用される。バイオリアクターは、バイオリアクター条件が高細胞濃度に好適である細胞の培養のために使用され得る。別の実施形態では、バイオリアクターは、細胞の拡大のために閉じたシステムを提供する。別の実施形態では、複数のバイオリアクターが、一連の細胞拡大ステップにおいて使用される。別の実施形態では、バイオリアクターは、遺伝学的に改変されたＭＳＣを増殖させる方法において使用される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用されるバイオリアクターは、シングルユースバイオリアクターである。別の実施形態では、使用されるバイオリアクターは、マルチユースバイオリアクターである。さらに別の実施形態では、バイオリアクターは、プロセスのパラメータを監視および制御するための制御ユニットを備える。いくつかの実施形態では、ＭＳＣおよび／または遺伝学的に改変されたＭＳＣは、バイオリアクターにおいて拡大および増殖する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞および／または遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、バイオリアクターにおいて分化するように誘導される。いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣは、遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦに分化するように拡大および誘導される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、分化するための拡大および／または誘導は、バイオリアクターにおいて行われる。単離に続いて、細胞は、典型的には、例えば、血小板溶解物の存在下で、エクスビボで単離された細胞を維持および／または拡大することができる増殖培地において培養することにより拡大される。いくつかの実施形態では、増殖培地は、ＤＭＥＭ、アルファ−ＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２を含むことができる。
【００６５】
一実施形態では、ＭＳＣがヒトである際に、血小板溶解物はヒト細胞からも得られる。一実施形態によれば、培地は異種汚染物質を欠く、すなわち、動物由来の構成成分を含まない。ＭＳＣの単離および増殖プロトコルは、当該技術分野で周知であり、例えば、その全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／０１５９４５の実施例１を参照されたい。
【００６６】
単離された（および任意選択で、増殖した）細胞集団がＭＳＣを含むことの検証は、表現型および機能的基準の特定により実行され得る。表現型基準は、特異的表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５（９５％以上陽性）の発現、ならびにＣＤ−３（Ｔ細胞表面マーカー）、ＣＤ１４（単球表面マーカー）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ３４（造血幹細胞）、ＣＤ４５（造血細胞）、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、およびＨＬＡ−ＤＲ（ヒトクラスＩＩ組織適合抗原）を含む群から選択される少なくとも１つのマーカーの不在（＜２％）を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、もしくはＨＬＡ−ＤＲ、またはこれらの任意の組み合わせを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも１つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも２つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも３つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも４つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも５つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも６つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも７つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも８つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの少なくとも９つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちのすべてを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの１〜３つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの１〜４つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの１〜５つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの２〜４つを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ２０、ＦＭＣ７、またはＨＬＡ−ＤＲのうちの３〜５つを欠く。これらの細胞の表面発現は、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、フローサイトメトリーによって解析され得る。
【００６７】
ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の表現型は、いくつかの実施形態において、同様の形態学的および／または構成成分表現型を含むことができる。例えば、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＭＳＣのものに類似した形態（紡錘体様形態）を示す場合がある。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、それらが由来する供給源ＭＳＣとは異なる形態を含む。代替的には、または追加的には、本明細書に記載される細胞は、ＭＳＣに典型的であるが天然の星状細胞には非典型的であるマーカー（例えば、表面マーカー）を発現できる。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞表面マーカーの例は、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２７１、およびＣＤ４９を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２７１、もしくはＣＤ４９、またはこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない少なくとも１つの細胞表面マーカーを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、もしくはＦＭＣ７、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される細胞表面マーカーを欠く。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、もしくはＦＭＣ７、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される細胞表面マーカーを欠く。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２７１、もしくはＣＤ４９、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上の膜マーカーを含み、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＦＭＣ７、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される少なくとも１つのマーカーまたはマーカーの組み合わせを含まない。いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣは、ＭＳＣ膜マーカーを保持する。いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣは、少なくとも１つの細胞表面マーカー、またはＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＦＭＣ７、もしくはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるマーカーの組み合わせを欠く。
【００６９】
ＭＳＣの存在または非存在を検証するために使用され得る抗体の例は、例えば、ＣＤ７３  ＰＥ共役（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ９０  ＰＥ−Ｃｙ５共役（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ＣＤ１０５  ＰＥ共役（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＣＤ１４  ＦＩＴＣ共役（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ＣＤ１９  ＰＥ−Ｃｙ５共役（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ＣＤ３４  ＦＩＴＣ共役（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４５  ＰＥ共役（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＨＬＡ−ＤＲ  ＰＥ−Ｃｙ５共役（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
ＭＳＣの存在を検証する別の方法は、細胞が、例えば、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞のような多系統に分化できることを示すことによる。このことは、例えば、ヒトＭＳＣ機能的特定キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって実行され得る。
【００７１】
本明細書に記載される場合、血小板溶解物含有培地におけるＭＳＣの増殖に続いて、細胞は、神経変性障害を治療するために有用な細胞を生産するための分化培地において分化することができる。
【００７２】
分化培地およびそれらの構成成分は、当該技術分野で周知である。分化培地の構成成分は、必要とされる細胞表現型に従って選択されることが、理解されるであろう。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２７１、もしくはＣＤ４９、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上の膜マーカーを含み、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＦＭＣ７を含む群から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つまたはこれらのいずれかの組み合わせも含まない。したがって、分化したＭＳＣから単離されたエキソソームは、ＣＤ１０５、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ２７１、もしくはＣＤ４９、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上の膜マーカーを含むように予想され、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、カルネキシン、およびＦＭＣ７を含む群から選択されるマーカーのうちの少なくとも１つまたはこれらのいずれかの組み合わせも含まない。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導され、該細胞集団は、「ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞」または「ＭＳＣ−ＮＴＦ」に降格される。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「神経栄養因子」（「ＮＴＦ」）は、ニューロンに対する増殖、分化、機能維持、および／または生存効果を含む中枢神経系に作用する細胞分泌因子を指す。神経栄養因子の例は、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５、ニュールツリン（ＮＴＮ）、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、アルテミン（ＡＲＴ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）、増殖および分化因子（ＧＤＦ−１５）、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質としても知られる）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、ならびに線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
当業者は、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」が、本明細書においてすべて同じ意味および質を有するため互換的に使用され得ることを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」は、天然ポリペプチド（分解産物、合成的に合成されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドのいずれか）、およびペプチド模倣物（典型的には、合成的に合成されたポリペプチド）、同様に、いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、体内にある間さらにより安定であるようにするか、または細胞内により浸透することができるようにする改変を有するポリペプチド類似体である、ペプトイドおよびセミペプトイド（ｓｅｍｉｐｅｐｔｏｉｄ）を包含する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、他に定義または示されない限り、最小の長さに限定されない。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ペプチド、例えば、それら自体が神経変性疾患の標的であり得る細胞に存在する、天然に生じるペプチドを含む。
【００７７】
一実施形態では、ＮＴＦは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ  ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
【００７８】
別の実施形態では、ＮＴＦは、ＶＥＧＦである。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＨＧＦである。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＬＩＦである。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＧＤＮＦである。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＮＴ−３である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューロトロフィン−４／５である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＮＴＮである。別の実施形態では、ＮＴＦは、ニューロトロフィン−４である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ペルセフィン、またはＡＲＴである。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＣＮＴＦである。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＩＧＦ−１である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＧＤＦ−１５である。別の実施形態では、ＮＴＦは、Ｇ−ＣＳＦである。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＢＤＮＦである。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＴＳＧ−６である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＢＭＰ２である。別の実施形態では、ＮＴＦは、ＦＧＦ２である。
【００７９】
別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも１つのＮＴＦを分泌し、該ＮＴＦは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
【００８０】
別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＶＥＧＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＨＧＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、ＬＩＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＧＤＮＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＮＴ−３を分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ニューロトロフィン−４／５を分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＮＴＮを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ニューロトロフィン−４を分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ペルセフィンを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＡＲＴを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＣＮＴＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＩＧＦ−１を分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＧＤＦ−１５を分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、Ｇ−ＣＳＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＢＤＮＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＴＳＧ−６を分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＢＭＰ２を分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＦＧＦ２を分泌する。
【００８１】
別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも２つのＮＴＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも３つのＮＴＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも４つのＮＴＦを分泌する。別の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも５つのＮＴＦを分泌する。
【００８２】
神経栄養因子分泌型ヒト間葉系間質幹細胞は、当該技術分野で周知であり、ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０２４１８３号および同第ＷＯ２０１５／１２１８５９号、Ｇｏｔｈｅｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，３：２１、Ｐｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；Ｍｕｓｃｌｅ  ＆  Ｎｅｒｖｅ．４９（３）：４５５−４５７、およびＰｅｔｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌ．７３（３）：３３７−４４に完全に記載されており、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
一実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質としても知られる）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、もしくは顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される少なくとも１つのＮＴＦを分泌する。
【００８４】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子、および白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む群から選択されるＮＴＦを分泌する。別の実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質としても知られる）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、および顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）からなる群から選択されるＮＴＦを分泌する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上は、少なくとも１つのＮＴＦを発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、またはそれ以上は、少なくとも１つのＮＴＦを分泌する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソームは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によって分泌されたＮＴＦのうちの少なくとも１つを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子を発現および分泌する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡは、生物学的試料に存在する。特異的マイクロＲＮＡを分泌するヒトＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、当該技術分野で周知であり、Ｇｏｔｈｅｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１７）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：２４９に完全に記載される。
【００８７】
ある特定の実施形態では、対照ＭＳＣ細胞は、分化していないＭＳＣである。ある特定の実施形態では、対照ＭＳＣ細胞は、増加した量のＮＴＦを分泌しない。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞における少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の発現は、対照ＭＳＣにおいて観察されるものよりも大きい。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦが投与された対象からの生物学的試料、例えば、ＣＳＦ生物学的試料における少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子のレベルは、同等の対照生物学的試料において観察されるものよりも高い。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦが投与された対象からの生物学的試料、例えば、尿生物学的試料における少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子のレベルは、同等の対照生物学的試料において観察されるものよりも高い。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦが投与された対象からの生物学的試料、例えば、血液生物学的試料における少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子のレベルは、同等の対照生物学的試料において観察されるものよりも高い。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦが投与された対象からの生物学的試料、例えば、血清生物学的試料における少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子のレベルは、同等の対照生物学的試料において観察されるものよりも高い。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、例えば、エキソソームの手段によって、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から排泄され得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞からの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の発現および／または分泌は、対照ＭＳＣにおいて観察されるものよりも大きい。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソームは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において発現される１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、対照ＭＳＣと比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの低減した発現を有するか、または有しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、対照ＭＳＣと比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの低減した分泌を有するか、または有しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、対照ＭＳＣと比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡの低減した発現もしくは分泌を有するか、または有しない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、別の細胞において少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、別の細胞において少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の発現を誘導することができる。細胞が近くの細胞の変化を誘導するように信号を生成してそれらの細胞の挙動を変化させる細胞間コミュニケーションは、いくつかの実施形態において、「パラクライン応答」と称され得る。
【００９１】
当業者は、用語「ｍｉＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、および「マイクロＲＮＡ」が、すべて同じ意味および質を有するため互換的に使用され得、短い非コードＲＮＡを包含することを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、約２１〜２５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、約２１〜２４ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子の翻訳を抑制することか、または標的ｍＲＮＡを切断してそれらの分解を誘導することのいずれかによって、細胞遺伝子発現の制御に重要な役割を果たすことができある。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、パラクリンシグナル伝達メディエーターとして役立つことができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において増加または減少することができる。
【００９２】
分化していないＭＳＣと比較してＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において増加することができるｍｉＲＮＡの例は、例えば、ｍｉＲ−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−３４ａ−３９、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４３２４、またはこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。分化していないＭＳＣと比較してＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において減少することができるｍｉＲＮＡの例は、例えば、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−３１３２、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−４２８４、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５５−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０５、もしくはｍｉＲ−１４０−３ｐ、またはこれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−３４ａ−３９、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、またはｍｉＲ−４３２４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−３１３２、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−４２８４、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５５−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０５、もしくはｍｉＲ−１４０−３ｐ、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを発現し、該発現は、分化していないＭＳＣと比較して増加するか、または減少するかのいずれかである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、該ＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームにおけるそのｍｉＲＮＡの量を増加させるために、ｍｉＲＮＡを発現するように遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ｍｉＲＮＡを発現するように遺伝学的に改変され得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、ｍｉＲＮＡを発現するように遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、該ＭＳＣから単離されたエキソソームにおけるそのｍｉＲＮＡの量を増加させるために、ｍｉＲＮＡを発現するように遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣにおけるｍｉＲＮＡ発現は、非遺伝学的に改変されたＭＳＣと比較して、上昇している。
【００９７】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞から単離されたエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のｍｉＲＮＡを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞におけるｍｉＲＮＡ発現は、分化していないＭＳＣと比較して、上昇している。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞におけるｍｉＲＮＡ発現は、分化していないＭＳＣと比較して、低減している。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞におけるｍｉＲＮＡ発現は、分化していないＭＳＣと比較して、非存在である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のｍｉＲＮＡを含む。他の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、減少した量のｍｉＲＮＡを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３６６３−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１３２−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１５０−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−７６２を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−４３２７を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３６６５を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３４ａ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１９１５を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３４ａ−３９を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３４ｂ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−８７４を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−４２８１を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１２０７−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３０ｂ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−２９ｂ−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３０ｅ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、増加した量のｍｉＲ−２６ａ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞またはエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−４３２４を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、分化していないＭＳＣと比較して、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、分化していないＭＳＣと比較して減少した量の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子を含み、該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−３１３２、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−４２８４、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５５−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０５、もしくはｍｉＲ−１４０−３ｐ、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−５０３を発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３６５９を発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３５２９−３ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３２０ｂを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１２７５を発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３１３２を発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３２０ａを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−４９５を発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−２２２−３ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−４２４−５ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−４２８４を発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−５７４−５ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１４３−３ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−４５５−３ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１４５−５ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−３２４−３ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１３０５を発現しないか、またはその低い発現を有する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ｍｉＲ−１４０−３ｐを発現しないか、またはその低い発現を有する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＡＬＳ患者の運動ニューロンにおいて全体的に下方制御される。
【０１０３】
一実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＭＳＣからエクスビボ分化し、少なくとも１つのＭＳＣマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、分化は、遺伝子改変を含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣは、本明細書に記載される分化した細胞および細胞集団を生産するために遺伝学的に操作されない（すなわち、発現構築物で形質転換されない）。
【０１０４】
別の実施形態では、少なくとも１つのＭＳＣ表現型を含み、少なくとも１つのＮＴＦ、例えば、ＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＧＳ−６、ＢＭＰ２、ＦＧＦ２、もしくはＨＧＦ、またはこれらの任意の組み合わせを分泌するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含む単離されたヒト細胞は、分化していないＭＳＣ（対照ＭＳＣ）におけるＮＴＦの基礎分泌よりも多いＮＴＦの基礎分泌を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、プラセボとは対照的に、治療されたＡＬＳ患者のＣＳＦにおける特異的神経栄養因子の増加および炎症バイオマーカーの低減を誘導する。例えば、その全体が本明細書に組み込まれる、実施例２での国際公開第ＷＯ２０１８／０１５９４５号を参照されたい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から発現されるバイオマーカーは、ＴＯＰ２Ａ、ＲＡＢ２７ｂ、ＷＮＴ５Ａ、ＳＮＡＰ２５、ＡＲＥＧ、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ１６Ａ６、ＭＥＳＴ、ＳＬＣ１Ａ３、ＰＣＳＫ１、もしくはＴＵＢＢ３、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、トポイソメラーゼ２−アルファ（ＴＯＰ２Ａ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、中胚葉特異的転写物ホモログ（ＭＥＳＴ）、溶質キャリアファミリー１メンバー１（ＳＬＣ１Ａ１）、もしくはベータＩＩＩチューブリン（ＴＵＢＢ３）、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つの発現の減少を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、Ｗｎｔファミリーメンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、プロタンパク質転換酵素１（ＰＣＳＫ１）、脳におけるｒａｓ（ＲＡＢ）２７Ｂ、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、溶質キャリアファミリー１メンバー３（ＳＬＣ１Ａ３）、もしくは溶質キャリアファミリー１６メンバー６（ＳＬＣ１６Ａ６）、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つの発現の増加を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣは、遺伝学的に操作される（すなわち、発現構築物で形質転換される）。エクスビボ分化の前または後のＭＳＣ細胞の遺伝子改変は、その存在がＭＳＣまたは分化したＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームにおいて望まれる分子の量を増加させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、分子は、神経変性疾患の治療に有益である。いくつかの実施形態では、所望の分子は、増殖因子である。いくつかの実施形態では、所望の分子は、ガレクチン−１分子である。いくつかの実施形態では、所望の分子は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、増殖因子は、増殖分化因子（ＧＤＦ）５を含む。いくつかの実施形態では、増殖因子は、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１を含む。いくつかの実施形態では、増殖因子は、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−２を含む。いくつかの実施形態では、増殖因子は、ヒト増殖因子である。いくつかの実施形態では、ガレクチン−１分子は、ヒトガレクチン−１分子である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＭＭＰ９またはその一部に相補的なヌクレオチド配列をコードする。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７を含む。いくつかの実施形態では、所望の分子は、増殖因子、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡの任意の組み合わせである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、プロモーターに、またはプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された目的のタンパク質またはポリペプチドをコードするベクターで形質転換される。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された選択マーカー遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｐＣＡＧ、ＥＦｌＯＣ、ＰＧＫ、ＣＭＶ、およびＳＦＦＶを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロウイルス配列をさらに含む。
【０１０９】
当業者は、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子カセットが、ＭＳＣにおける送達および安定した発現のために様々なウイルスおよび非ウイルスベクター系に組み込まれ得ることを、理解するであろう。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ウイルストランスフェクション方法またはウイルス形質導入によって遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、（ヒトおよび非ヒト）レンチウイルス、ならびにアデノウイルスを含む群に由来する。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクター系は、目的の導入遺伝子、すなわちタンパク質またはポリペプチドコード領域と、ベクターＤＮＡの逆転写および組み込みに必要なすべての配列要素を担持する導入ベクター骨格を含むが、ｇａｇ−ｐｏｌ−およびｅｎｖ−遺伝子のような、ほとんどまたはすべてのウイルス遺伝子を欠く。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、３'ＬＴＲ領域が部分的または完全に除去されてウイルスプロモーター活性を停止させ、宿主細胞における隣接する遺伝子のトランス活性化を防止する、自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターとして特別な安全性改変を担持する。
【０１１１】
ウイルス粒子の産生のためには、トランスにおける構造タンパク質、酵素、およびエンベロープタンパク質を提供する可変数のヘルパープラスミドが必要である。ウイルス粒子は、外来のエンベロープ糖タンパク質を担持して産生され得る。このプロセスは、シュードタイピングと呼ばれ、ベクター粒子の指向性を変えることができ、いくつかの場合ではベクター力価を増強する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣの遺伝子改変は、非ウイルスベクター系を使用することによって達成される。いくつかの実施形態では、非ウイルスベクター系は、プラスミド導入、ファージインテグラーゼ、およびトランスポゾンを含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、化学的トランスフェクション方法によって遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、化学的トランスフェクション方法は、リポフェクション、カチオン性ポリマーの使用を含む方法、高分岐有機化合物の使用を含む方法、リン酸カルシウムの使用を含む方法、およびＦｕｇｅｎｅ非リポソーム試薬の使用を含む方法を含む群から選択される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、物理的トランスフェクション方法によって遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、物理的トランスフェクション方法は、電気穿孔、細胞圧搾、ソノロポレーション（ｓｏｎｏｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、光学トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、および流体力学的送達を含む群から選択される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、粒子ベースのトランスフェクション方法によって遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、粒子ベースのトランスフェクション方法は、遺伝子銃方法、磁石補助型トランスフェクション、およびインペールフェクションを含む群から選択される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは安定してトランスフェクトされ、すなわち、トランスフェクトされたベクターはＭＳＣゲノムに組み込まれる。当業者は、トランスフェクトされたベクターの細胞ゲノムへの組み込みが、染色体外ベクターを保持する遺伝学的に改変された幹細胞よりも安定した遺伝学的に改変された間葉系幹細胞の生産を可能にすることを、理解するであろう。
【０１１７】
当業者は、トランスフェクションに続いて、安定にトランスフェクトされた細胞が、当該技術分野で既知の方法によって選択され得ることを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、構成的プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの組み合わせに作動可能に連結された選択マーカー遺伝子をさらに含むことができる。選択マーカー遺伝子は、ピューロマイシン、ネオマイシンまたはウアバインに対する抵抗性を付与する遺伝子のような、抗生物質抵抗性遺伝子を含むことができる。抗生物質抵抗性遺伝子は、抗生物質の存在下で遺伝学的に改変されたＭＳＣを選択するために使用され得る。抗生物質抵抗性遺伝子に加えて、またはその代替として、遺伝学的に改変されたＭＳＣの表面でのみ発現される表面マーカータンパク質をコードする遺伝子が、使用され得る。表面マーカータンパク質を認識する特異的抗体を保持する磁気ビーズは、遺伝学的に改変されたＭＳＣを選択するために使用され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞または遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、目的の有益な分子を発現する。いくつかの実施形態では、目的の有益な分子は、タンパク質またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質またはポリペプチドは、神経栄養因子を含む。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質またはポリペプチドは、ＩＧＦ−１を含む。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質またはポリペプチドは、ＩＧＦ−２を含む。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質またはポリペプチドは、ＧＤＦ−５を含む。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質またはポリペプチドは、ガレクチン−１を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｍｉＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｍｉＲＮＡ−７配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ｓｉＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＭＭＰ−９  ｓｉＲＮＡ配列またはその一部を含む。
【０１１９】
ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム
【０１２０】
エキソソームは、ナノサイズの分泌された細胞小胞（細胞外小胞）である。これらの小胞は、後期エンドソームの内向きの出芽によって形成され、次いで、原形質膜との融合時に細胞外環境に放出される。エキソソームは、天然に細胞間でＲＮＡを含み移すため、この特性は遺伝子療法において有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ単離型エキソソームは、ＲＮＡ分子、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子を細胞に導入するために使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離された改変されたＭＳＣエキソソームは、ＲＮＡ分子を細胞に導入するために使用され得る。例えば、遺伝学的に改変されたＭＳＣにおいて発現されるか、または過剰発現されるか、または高度に発現されるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ細胞から単離されたエキソソームは、最初にＲＮＡ分子、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含むようにＭＳＣ由来エキソソームを改変することによりＲＮＡ分子を細胞に導入するために、使用され得る。
【０１２１】
当業者は、本開示にわたって使用される「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」および「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）」という用語が、すべて同じ意味および質を有するため互換的に使用され得ることを、理解するであろう。したがって、いくつかの実施形態では、エキソソームという用語は、エキソソーム収量が４×１０１１の精製されたエキソソーム対約７×１０１０の精製されたエキソソームであった（実施例１を参照されたい）を記載する時、または本明細書に開示される方法におけるエキソソームの使用を記載する際の多くのエキソソームを含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソームは、単離されたエキソソーム集団と呼ばれる。当業者は、用語「単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来エキソソーム」、「単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来エキソソーム」、「単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来エキソソーム集団」、「単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来エキソソーム集団」、「単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム」、「単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞エキソソーム」、「単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム集団」、および「単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞エキソソーム集団」が、本明細書においてすべて同じ意味および質を有するため互換的に使用され得ることを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、記載の文脈では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームは、「単離されたエキソソーム」と呼ばれる。このことは、いくつかの実施形態において対照エキソソームと呼ばれる対照ＭＳＣ細胞から単離されたエキソソームとは対照的である。
【０１２３】
ＭＳＣから単離されたエキソソームの含有量は、一定ではなく、むしろ、ＭＳＣの組織起源、その活性、およびＭＳＣの直接の細胞間隣接物の積である。いくつかの実施形態では、エキソソームの含有量は、ＭＳＣの遺伝子改変の産物であり得る。ＭＳＣ由来エキソソームは、サイトカインおよび増殖因子、シグナル伝達脂質、ｍＲＮＡ、および制御性ｍｉＲＮＡを含む内容物を有することができる。さらに、ＭＳＣから精製されたエキソソームがＭＳＣベースの治療に類似した効果を促進できるため、患者に送達され治療効果を示すＭＳＣの効果は、エキソソーム由来であり得る。
【０１２４】
同様に、本明細書に記載される分化したＭＳＣに由来するエキソソーム、例えば、ＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームは、ある特定の実施形態において、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞または遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦのものと同じまたは類似した内容物を含むことができる。さらに、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの患者への送達は、いくつかの実施形態において、同じ治療効果を提供することができる一方、有利には血液脳関門を通過し、安定しており、さらなる有益な因子を負荷される能力を有し、かつ、低い免疫原性を有することができる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるエキソソームは、３０〜３００ｎｍのサイズ、例えば、直径である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるエキソソームは、３０〜２５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるエキソソームは、３０〜２００ｎｍである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるエキソソームは、３０〜１７５ｎｍである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるエキソソームは、３０〜１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるエキソソームは、４０〜１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるエキソソームは、５０〜１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるエキソソームは、３０〜１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるエキソソームは、１００〜１５０ｎｍである。ある特定の実施形態では、エキソソームの集団の中央値サイズは、約１１６ｎｍ〜約１４８ｎｍ１３２ｎｍである。ある特定の実施形態では、エキソソームの集団の中央値サイズは、約１３２ｎｍである。ある特定の実施形態では、エキソソームの集団の平均サイズは、約１１７ｎｍ〜約１４７ｎｍである。ある特定の実施形態では、エキソソームの集団の平均サイズは、約１３２ｎｍである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、単離された細胞型特異的エキソソームが本明細書に開示され、該細胞型は、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導され、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞と呼ばれている分化したＭＳＣ（ＭＳＣ）を含み、該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌は、分化していないＭＳＣにおける該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌と比較して、該ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてより大きい。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、詳細に上に記載されている。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によってカーゴとして分泌される少なくとも１つのＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によってカーゴとして分泌される少なくとも２つのＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によってカーゴとして分泌される少なくとも３つのＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によってカーゴとして分泌される少なくとも４つのＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によってカーゴとして分泌される少なくとも５、６、７、８、９、１０個のＮＴＦを含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量の少なくとも１つのＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量の少なくとも２つのＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量の少なくとも３つのＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量の少なくとも４つのＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量の少なくとも５、６、７、８、９、または１０個のＮＴＦを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量のＬＩＦタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量のＧＤＦ１５タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量のＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量のＬＩＦタンパク質、またはＧＤＦ１５タンパク質、またはＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとして増加した量のＬＩＦタンパク質、およびＧＤＦ１５タンパク質、およびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞由来のエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、カーゴとしてＬＩＦタンパク質、またはＧＤＦ１５タンパク質、またはＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＡタンパク質のうちのいずれかの増加した量の組み合わせを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソームは、ＭＳＣ対照細胞から単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦを含む。例えば、これらに限定されないが、いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソームは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、Ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせから選択される増加した量のＮＴＦを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、単離された細胞型特異的エキソソームが本明細書に開示され、該細胞型は、ＭＳＣまたは遺伝学的に改変されたＭＳＣを含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＭＳＣ−ＮＴＦの内容物または膜マーカーの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、これらに限定されないが、ＣＤ９、ＣＤ６１、ＣＤ８１、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、またはこれらの任意の組み合わせを含むエンドソームマーカーを含む。ＡＬＩＸはプログラム細胞死６相互作用タンパク質（ＰＤＣＤ６ＩＰ）としても知られ得ることが、着目される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＭＳＣ−ＮＴＦの膜マーカーおよび特異的エキソソームマーカーを含む。いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、分化抗原群（ＣＤ）９、ＣＤ６３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ９、ＣＤ６１、ＣＤ８１、ＡＬＩＸ、もしくは腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上の膜マーカーを含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣの内容物または膜マーカーの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣエキソソームは、これらに限定されないが、ＣＤ９、ＣＤ６１、ＣＤ８１、ＡＬＩＸ、もしくはＴＳＧ１０１、またはこれらの任意の組み合わせを含むエンドソームマーカーを含む。ＡＬＩＸはプログラム細胞死６相互作用タンパク質（ＰＤＣＤ６ＩＰ）としても知られ得ることが、着目される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣの膜マーカーおよび特異的エキソソームマーカーを含む。いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、分化抗原群（ＣＤ）９、ＣＤ６３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ６１、ＣＤ８１、ＡＬＩＸ、もしくは腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上の膜マーカーを含む。
【０１３４】
カルネキシンは、小胞体の内在性膜タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、エキソソーム膜内に存在すると予想されないだろう。同様に、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦに存在しない膜マーカーは、エキソソーム膜内に存在すると予想されないだろう。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、カルネキシン、およびＦＭＣ７を含む群から選択される少なくとも１つのマーカーを含まない。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、カルネキシン、およびＦＭＣ７を含む群から選択されるマーカーのいずれかの組み合わせも含まない。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化抗原群（ＣＤ）９、ＣＤ６３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ６１、ＣＤ８１、ＡＬＩＸ、もしくは腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上の膜マーカーを含み、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、カルネキシン、およびＦＭＣ７を含む群から選択される少なくとも１つのマーカーを含まない。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、カルネキシン、およびＦＭＣ７を含む群から選択されるマーカーのいずれかの組み合わせも含まない。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣエキソソームは、分化抗原群（ＣＤ）９、ＣＤ６３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ６１、ＣＤ８１、ＡＬＩＸ、もしくは腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上の膜マーカーを含み、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、カルネキシン、およびＦＭＣ７、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上のマーカーを含まない。
【０１３７】
ＭＳＣエキソソーム集団に見出されるマーカー、膜、およびその他のパターンに類似して、エキソソーム集団の内容物は、いくつかの実施形態において、それらが単離されたＭＳＣのものを反映できる。
【０１３８】
ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームに見出されるマーカー、膜、およびその他のパターンに類似して、エキソソーム集団の内容物は、いくつかの実施形態において、それらが単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のものを反映できる。いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて増加する、増加した量の該少なくとも１つのＮＴＦを含む。いくつかの実施形態でＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームにおいて増加する神経栄養因子（ＮＴＦ）は、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ  ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＶＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＨＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＬＩＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、Ｇ−ＣＳＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＢＤＮＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質としても知られる、ＴＳＧ−６を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＢＭＰ２を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＦＧＦ２を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２のいずれかの増加した量を含む。いくつかの実施形態では、追加的なカーゴは、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム内に含まれ得る。（例えば、実施例４の表１を参照されたい）。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて増加する、増加した量の該少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦにおいて減少する、減少した量の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞から単離されたエキソソームと比較して、遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞において増加する、増加した量の該少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含み、該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−３４ａ−３９、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、もしくはｍｉＲ−４３２４、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３６６３−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１３２−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１５０−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−７６２を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−４３２７を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３６６５を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３４ａ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１９１５を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３４ａ−３９を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３４ｂ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−８７４を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−４２８１を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１２０７−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３０ｂ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−２９ｂ−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−３０ｅ−５ｐを含む。いくつかの態様では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−２６ａ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増加した量のｍｉＲ−４３２４を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、減少した量の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、減少した量の少なくとも１つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含み、該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−３１３２、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−４２８４、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５５−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０５、もしくはｍｉＲ−１４０−３ｐ、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−５０３を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−３６５９を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−３５２９−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−３２０ｂを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−１２７５を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−３１３２を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−３２０ａを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−４９５を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−２２２−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−４２４−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−４２８４を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−５７４−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−１４３−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−１０６ａ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−４５５−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−２０ａ−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−１４５−５ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−３２４−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−１３０５を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、減少した量のｍｉＲ−１４０−３ｐを含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣに通常または天然には存在しない分子を負荷され得る。したがって、これらのＭＳＣエキソソームは、追加的な分子が負荷されていない同じＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、改変されたＭＳＣエキソソームを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣエキソソームは、神経変性疾患の治療に有益な分子を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣエキソソームは、神経変性疾患の治療に有益な分子を負荷され得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ、遺伝学的に改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、または遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦから本明細書に開示される単離されたエキソソームは、治療用ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および／または治療因子のような外因性カーゴを負荷され得る。負荷は、当該技術分野で既知であるように外因性の手段を通じたものであり得るか、あるいはＭＳＣもしくはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞においてｍｉＲＮＡ、治療因子、もしくはｓｉＲＮＡを発現または高度に発現する結果であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離されたエキソソームは、治療因子をコードするヌクレオチド配列を負荷され得、該ヌクレオチド配列は、標的細胞において翻訳される。いくつかの実施形態では、改変されたエキソソームに含まれるヌクレオチド配列は、標的細胞において発現される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを含むか、または例えば、これらに限定されないが、増殖因子である治療因子をコードする。当業者が理解するであろうように、用語「標的細胞」は、一般に、エキソソームと接触するか、または最終的にはエキソソームと接触するであろう細胞を指す。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に通常存在しない分子を負荷され得る。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームに天然には存在しない分子を負荷され得る。いくつかの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、神経変性疾患の治療に有益な分子を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣ細胞に通常存在しない分子を負荷され得る。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣから単離されたエキソソームに天然には存在しない分子を負荷され得る。いくつかの実施形態では、これらの改変され単離されたＭＳＣエキソソームは、神経変性疾患の治療に有益な分子を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される単離されたエキソソームは、治療用ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、および／または治療因子のような外因性カーゴを負荷され得る。負荷は、当該技術分野で既知であるように外因性の手段を通じたものであり得るか、あるいはＭＳＣもしくはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞においてｍｉＲＮＡ、治療因子、またはｓｉＲＮＡを発現または高度に発現する結果であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離されたエキソソームは、治療因子をコードするヌクレオチド配列を負荷され得、該ヌクレオチド配列は、標的細胞において翻訳される。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、ナノスケール用途に適合された電気穿孔プロトコルを使用して外因性カーゴを負荷され得る（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：３４１を参照されたい）。代替的には、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、どのように培養細胞に由来するエキソソームが、インビトロおよびインビボでのｓｉＲＮＡの送達に利用され得るかを開示する。エキソソームの受動的または能動的負荷の追加的方法は、文献、例えば、これらに限定されないが、Ｘｉｎ  Ｌｕａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１７）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  ｖｏｌｕｍｅ  ３８，ｐａｇｅｓ  ７５４−７６３、Ｄｉｎｈ  Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  Ｂ  ６（４）：２８７−２９６、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １２，１０，３６５０−３６５７、およびＳｈｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １１：８８にわたって記載される。
【０１５０】
単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームまたは外因性カーゴが負荷された単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ナノキャリアとして役立つことができる一方、ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームは、それらの元の起源の細胞の治療効果を維持する。したがって、ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームは、より多くの患者に利益をもたらすために拡大された治療オプションを提供できる。いくつかの実施形態では、改変されたＭＳＣエキソソーム（少なくとも１つの外因性カーゴを負荷された）は、必要とする対象を治療するために、本明細書に開示される方法で使用され得る。いくつかの実施形態では、改変されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム（少なくとも１つの外因性カーゴを負荷された）は、必要とする対象を治療するために、本明細書に開示される方法で使用され得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、神経変性疾患を特異的に標的とする外因性カーゴを負荷される。当業者は、したがって、これらのエキソソームが、現在少なくとも１つの追加的なカーゴを含むため、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームと関連して改変されることを、認識するであろう。いくつかの実施形態では、エキソソームは、神経変性疾患を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、パーキンソン病（ＰＤ）を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、多系統萎縮症（ＭＳＡ）を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、多発性硬化症（ＭＳ）を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、アルツハイマー病（ＡＤ）を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、レット症候群を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、脳性麻痺（ＣＰ）を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。いくつかの実施形態では、エキソソームは、てんかんを治療する方法における使用のための外因性カーゴを負荷される。
【０１５２】
本明細書に記載される場合、エキソソームは、ＭＳＣに天然に存在する分子、遺伝学的に改変されたＭＳＣにおいて高度に発現もしくは新たに発現された分子、または外因的に負荷されたカーゴ、あるいはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。当業者は、本明細書で想定される場合、いくつかの実施形態におけるエキソソームが、それらが単離されるＭＳＣに存在する要素を含み、後の段階でエキソソームに添加される追加的な要素も含むことができることを、理解するであろう。
【０１５３】
同様に、本明細書に記載されるように、エキソソームは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に天然に存在するか、またはカーゴとして外因的に負荷された１つ以上のＮＴＦを含むことができる。当業者は、本明細書で想定される場合、いくつかの実施形態におけるエキソソームが、それらが単離されるＭＳＣ−ＮＴＦに存在する要素を含み、後の段階でエキソソームに添加される追加的な要素も含むことができることを、理解するであろう。例えば、選択的運動ニューロン（ＭＮ）脆弱性は、ＡＬＳ患者の運動系における様々なレベルで発生する。中脳に位置し、眼球運動を制御する動眼（ＯＭＮ、ＣＮＩＩＩ）、滑車（ＣＮＩＶ）、および外転（ＣＮＶＩ）神経核のニューロンは、ＡＬＳの変性に対する顕著な抵抗性を示す。脊髄ＭＮは脆弱性の勾配を提示することが見出されている。それらの収縮特性に応じて、運動単位は、速易疲労（ｆａｓｔ  ｆａｔｉｇａｂｌｅ）（ＦＦ）、速疲労抵抗性（ｆａｓｔ−ｆａｔｉｇｕｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）（ＦＲ）、または低速（Ｓ）に分類される。ＡＬＳでは、Ｓ運動ニューロンは、より抵抗性であり、後期段階でのみ軸索変性を経るが、ＦＦ運動ニューロンは、最も脆弱である。
【０１５４】
ＯＭＮの選択的抵抗性は、ニューロンの特異的サブセットをより抵抗性にする分子シグネチャを意味する場合がある。ニューロンの脆弱性は、ある特定の固有の有益な因子の欠如と、同様に有害な分子の存在との両方によって支配されることが示された。インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−１および２は抵抗性運動ニューロンにおいて濃縮されるように特定された重要な分子である一方で、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）は脆弱な運動ニューロンにおいて特定された。
【０１５５】
インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、悪化する運動神経を保護し、運動神経軸索の増殖および再生、ならびにそれらの筋肉への神経支配を促進する。ウイルス媒介性ＩＧＦ−１送達は、ＡＬＳげっ歯類においてＭＮの数を増加させ、握力を改善し、進行を遅延させ、生存を延長させた。ＩＧＦ結合時に生存経路を媒介するＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）は、動眼ニューロン中および眼外筋終板上に高度に発現される。臨床では、ＡＬＳ患者への皮下（ＳＣ）ＩＧＦ−１投与は、治療効果を実証しなかった。しかしながら、ＳＣ投与により治療されたヒトのＣＳＦおよび脳実質におけるバイオアベイラビリティは非常に低いため、許容レベルのＩＧＦ−１の末梢送達は失敗する場合があることが、知られている。
【０１５６】
インスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−２）は、インビトロでＡＬＳ患者の運動ニューロンを保護することが、示された。ＩＧＦ−１と同様に、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ  ＡＬＳマウスの筋肉へのウイルス媒介性ＩＧＦ−２送達は、運動ニューロンを保ち、運動軸索再生を誘導する一方で、マウスの寿命を１０％延長させた。ＩＧＦ−２は末期ＡＬＳ患者組織における動眼ニューロンに対して優先的なままであることが示され、この増殖因子が疾患におけるこれらの抵抗性運動ニューロンにおいて保護的な役割を果たすことができることを示している。
【０１５７】
増殖分化因子−５（ＧＤＦ５）は、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであり、骨形成（ＢＭＰ）タンパク質サブファミリーの一部である。増殖分化因子−５は、インビトロおよびインビボで黒質線条体ドーパミン作動性ニューロンに対する神経栄養および保護作用を有する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量の増殖因子を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、もしくはＧＤＦ５、またはこれらの任意の組み合わせを含む増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、増殖因子は、ヒト増殖因子である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量の増殖因子を含み、該増殖因子は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、もしくはＧＤＦ５、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＩＧＦ−１を含む。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣと比較して、増加した量のＩＧＦ−１を含む。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＩＧＦ−２を含む。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣと比較して、増加した量のＩＧＦ−２を含む。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＧＤＦ５を含む。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣと比較して、増加した量のＧＤＦ５を含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、およびＧＤＦ−５は、それぞれヒトＩＧＦ−１、ヒトＩＧＦ−２、およびヒトＧＤＦ−５である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＩＧＦ−１を発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−２を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＩＧＦ−２を発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ−５を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＧＤＦ−５を発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離される。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＩＧＦ−１を高度に発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−２を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＩＧＦ−２を高度に発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ−５を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＧＤＦ−５を高度に発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離される。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、悪化する運動神経を保護することに有用であり得、運動神経軸索の増殖および再生を促進するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−２を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、運動ニューロンを保護し、運動軸索再生を誘導することに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ−５を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ニューロンを保護し、神経新生を増強することに有用であり得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量の増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦを含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、もしくはＧＤＦ５、またはこれらの任意の組み合わせを含む増殖因子を含む。いくつかの実施形態では、増殖因子は、ヒト増殖因子である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量の増殖因子を含み、該増殖因子は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、もしくはＧＤＦ５、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＩＧＦ−１を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣと比較して、増加した量のＩＧＦ−１を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＩＧＦ−２を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣと比較して、増加した量のＩＧＦ−２を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＧＤＦ５を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣと比較して、増加した量のＧＤＦ５を含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、およびＧＤＦ−５は、それぞれヒトＩＧＦ−１、ヒトＩＧＦ−２、およびヒトＧＤＦ−５である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＩＧＦ−１を発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−２を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＩＧＦ−２を発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ−５を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＧＤＦ−５を発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＩＧＦ−１を高度に発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−２を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＩＧＦ−２を高度に発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ−５を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＧＤＦ−５を高度に発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、悪化する運動神経を保護することに有用であり得、運動神経軸索の増殖および再生を促進するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−２を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、運動ニューロンを保護し、運動軸索再生を誘導することに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ−５を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ニューロンを保護し、神経新生を増強することに有用であり得る。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ガレクチン−１分子を含む。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ガレクチン−１分子を含む。
【０１６９】
ガレクチン−１（ＬＧＡＬＳ１）は、ガラクトース結合レクチンであり、細胞接着、細胞増殖、およびプログラム細胞死の調節に関与する多機能分子である。神経系では、ガレクチン−１は、ＮＲ１サブユニットとの相互作用を介したグルタミン酸毒性の調節と同様に、神経幹細胞の増殖、神経突起の伸長、および酸化還元状態の細胞適合に関与する。α−シヌクレインに富む細胞モデルでは、ガレクチン−１は、凝集したａ−シヌクレインの伝達制御に重要な役割を果たした。ガレクチン−１処置は、クラスリンおよびＥＥＡ１の発現を有意に減少させ、ＮＲ１の発現を増加させ、同時にＮＭＤＡ受容体結合の増加を伴い、減少したレベルの内部移行したサイトゾルのａ−シヌクレインにつながった（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １４，８３５−８４９）。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ガレクチン−１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のガレクチン−１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ヒトガレクチン−１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のヒトガレクチン−１を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ガレクチン−１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のガレクチン−１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ヒトガレクチン−１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離され改変されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のヒトガレクチン−１を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ガレクチン−１を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ガレクチン−１を発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣから単離される。いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞は、ガレクチン−１を高度に発現する。いくつかの実施形態では、ガレクチン−１を含む単離され改変されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ガレクチン−１を発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ガレクチン−１を高度に発現する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ガレクチン−１分子を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、悪化する運動神経を保護することに有用であり得、運動神経軸索の増殖および再生を促進するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ガレクチン−１分子を含む単離され改変されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、運動ニューロンを保護し、運動軸索再生を誘導することに有用であり得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ガレクチン−１を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ガレクチン−１を発現する改変されたＭＳＣ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ガレクチン−１を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ガレクチン−１を発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ガレクチン−１を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ガレクチン−１を高度に発現する改変されたＭＳＣ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ガレクチン−１を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ガレクチン−１を高度に発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。
【０１７５】
主にニューロンにおいて発現されるｍｉＲ−７は、アルファ−シヌクレインタンパク質レベルを抑制し、細胞を酸化ストレスに対して保護し、ＭＰＰ＋誘導性細胞死に対してニューロンを保護し、ノド（ｎｏｄ）様受容体タンパク質３（ＮＬＲＰ３）インフラマソーム媒介性神経炎症を抑制することを介してＰＤ様変性に対してドーパミン作動性ニューロンを保護することが、示されている。
【０１７６】
疾患または障害において有害であることが知られている標的タンパク質の量を減少させる１つの方法は、特定のタンパク質またはペプチドを標的とするｍｉＲＮＡの使用を通じたものである。ｍｉＲＮＡ分子の使用は、発現を下方制御させるか、または標的タンパク質もしくはペプチドの発現を停止させる場合がある。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、神経変性疾患における治療の標的であることが知られているタンパク質を標的とするｍｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣと比較して、神経変性疾患の治療の標的であることが知られているタンパク質を標的とする増加した量のｍｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子の使用は、発現を下方制御するか、または標的タンパク質の発現を阻害する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ｍｉＲ−７分子を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、非遺伝学的に改変されたＭＳＣと比較して、増加した量のｍｉＲ−７を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−７を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ｍｉＲ−７を高度に発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−７を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ｍｉＲ−７を発現する遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞から単離される。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−７を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、アルファ−シヌクレインタンパク質レベルの抑制し、細胞を酸化ストレスに対して保護し、ＭＰＰ＋誘導性細胞死に対してニューロンを保護し、ノド様受容体タンパク質３（ＮＬＲＰ３）インフラマソーム媒介性神経炎症を抑制することを介してＰＤ様変性に対してドーパミン作動性ニューロンを保護することに有用であり得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、神経変性疾患における治療の標的であることが知られているタンパク質を標的とするｍｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣと比較して、神経変性疾患の治療の標的であることが知られているタンパク質を標的とする増加した量のｍｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子の使用は、発現を下方制御するか、または標的タンパク質の発現を停止させる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ｍｉＲ−７分子を含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、分化していないＭＳＣと比較して、増加した量のｍｉＲ−７を含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−７を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ｍｉＲ−７を高度に発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−７を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ｍｉＲ−７を発現するＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離される。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−７を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、アルファ−シヌクレインタンパク質レベルの抑制し、細胞を酸化ストレスに対して保護し、ＭＰＰ＋誘導性細胞死に対してニューロンを保護し、ノド様受容体タンパク質３（ＮＬＲＰ３）インフラマソーム媒介性神経炎症を抑制することを介してＰＤ様変性に対してドーパミン作動性ニューロンを保護することに有用であり得る。
【０１８５】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）は、細胞外マトリックスの分解に関与する酵素であるマトリキシンである。ＭＭＰ−９は、ほとんどの頭蓋および脊髄運動ニューロンによって強く発現され、動眼神経核およびオヌフの核（ヒト脊髄の仙骨領域の前角の腹側部分（第ＩＸ層）に位置するニューロンの異なる群）には存在しない。驚くべきことに、それは、脊髄におけるＳ運動ニューロンにおいても検出不可能であった。このことは、すべてのＡＬＳ脆弱性運動ニューロンに対する有望なマーカーとしてＭＭＰ−９を提案する。機能的には、ＳＯＤ１マウスにおけるＭＭＰ−９レベルが部分的な低減でさえも、筋肉の除神経の明白な遅延、およびの顕著な延長につながる。さらに、ＭＭＰ−９は疾患プロセスの初期に作用し、サブタイプ特異的ＥＲストレスの発症を促進する。マウスへのＭＭＰ−９の選択的導入は、このメタロプロテイナーゼの有害な役割を確認して、速ＭＮの変性を誘導するのに十分であることが示された。興味深いことに、ＭＭＰ９がミクログリア活性化を誘導することも見出された。したがって、ＭＭＰ−９は神経変性疾患、例えば、これらに限定されないが、ＡＬＳおよびＰＤに対する強力な候補治療標的となり得る。
【０１８６】
ＭＭＰ−９発現は、ＰＤ動物モデルの黒質および線条体において増加する。さらに、ＭＭＰ−９発現ミクログリアおよび星状細胞は、顕著な炎症と同時に増加する。ＭＭＰ−９ノックアウトは活性ミクログリアの数を減らし、機能的ドーパミン作動性ニューロンの数の増加と相関する。
【０１８７】
疾患または障害に有害であることが知られている標的タンパク質の量を減少させる１つの方法は、タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なｓｉＲＮＡの使用を通じたものである。次いで、ｓｉＲＮＡ分子の使用は、発現を下方制御するか、または標的ポリペプチドの発現を停止させることができる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ｓｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、神経変性疾患の既知の標的をコードするｍＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、神経変性疾患の既知の標的の発現の低減または排除を標的とする。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ヒトメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）に相補的なｓｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ヒトメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）の一部に相補的なｓｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡを含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、ＭＭＰ−９のレベルを低減させ、それにより運動ニューロンを保護することに有用であり得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ｓｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、神経変性疾患の既知の標的をコードするｍＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、神経変性疾患の既知の標的の発現の低減または排除を標的とする。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ヒトメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）に相補的なｓｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ヒトメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）の一部に相補的なｓｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡを含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ＭＭＰ−９のレベルを低減させ、それにより運動ニューロンを保護することに有用であり得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、全体にわたって記載される、単離され改変されたＭＳＣエキソソームと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、「薬学的組成物」は、生理学的に好適な担体および賦形剤のような他の化学成分を有する、本明細書に記載される１つ以上の活性成分の調製物を包含する。薬学的組成物の目的は、生物への活性成分の投与を促進することである。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、「活性成分」は、生物学的効果に責任がある、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソームを指す。
【０１９４】
別の実施形態では、語句「薬学的に許容される担体」は、生物に顕著な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性および特性を消失させない担体または希釈剤を包含する。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、組成物は単離され改変されたＭＳＣエキソソームを含み、組成物は本質的にエキソソーム外材料を含まない。当業者は、エキソソーム外材料が、エキソソーム内に通常見出されない核酸−タンパク質複合体、核酸、および／またはタンパク質を含むが、これらに限定されないことを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームの組成物は、ＭＳＣのような細胞、またはそれらの細胞断片を含まない場合がある。いくつかの実施形態では、組成物は、馴化培地を含まないか、または実質的に含まない場合がある。典型的には、単離されたエキソソームは、操作されていない馴化培地に存在するエキソソームよりも組成物においてより高い濃度で提供される。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、全体にわたって記載される、単離され改変されたＭＳＣエキソソームを含む薬学的組成物は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞と組み合わされて投与され得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、全体にわたって記載される、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを含む薬学的組成物が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、組成物は単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを含み、組成物は本質的にエキソソーム外材料を含まない。当業者は、エキソソーム外材料が、エキソソーム内に見出される通常ではない核酸−タンパク質複合体、核酸、および／またはタンパク質を含むが、これらに限定されないことを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣエキソソームの組成物は、ＭＳＣもしくはＭＳＣ−ＮＴＦのような細胞、またはそれらの細胞断片を含まない場合がある。いくつかの実施形態では、組成物は、馴化培地を含まないか、または実質的に含まない場合がある。典型的には、単離されたエキソソームは、操作されていない馴化培地に存在するエキソソームよりも組成物においてより高い濃度で提供される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、全体にわたって記載される、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを含む薬学的組成物は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞と組み合わされて投与され得る。ある特定の実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームおよびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、別個の組成物に含まれる。ある特定の実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームおよびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、別々に投与される。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。かかる調製物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体を日常的に含有でき、任意選択で、他の（すなわち、二次）治療剤を含むことができる。
【０２００】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体または希釈剤は、予防的または治療的活性剤の担持または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料のような、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルである。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者に害を及ぼさないという意味で、「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として役立つことができる材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖、プロピレングリコールのようなグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール、リン酸緩衝溶液、ならびに薬学的製剤に用いられる他の非毒性適合性物質。
【０２０１】
組成物は、油性または水性ビヒクルにおいて水溶性の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような製剤化（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ）剤を含有できる。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルを含む。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有できる。任意選択で、懸濁液はまた、溶解度を増加させる好適な安定剤または薬剤を含有できる。代替的には、エキソソームは、使用前に、好適なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水を用いた構成のために、凍結乾燥された、または他の粉末もしくは固体の形態であり得る。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、ＬＩＦタンパク質、ＣＸＣＬ１タンパク質、ＩＬ１３タンパク質、ＶＥＧＦＡタンパク質、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、増加した量の該少なくとも１つのカーゴタンパク質を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における該少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、ＬＩＦタンパク質、ＣＸＣＬ１タンパク質、ＩＬ１３タンパク質、ＶＥＧＦＡタンパク質、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、増加した量の少なくとも２つのカーゴタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における該少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、ＬＩＦタンパク質、ＣＸＣＬ１タンパク質、ＩＬ１３タンパク質、ＶＥＧＦＡタンパク質、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、増加した量の少なくとも３つ、４つ、または５つのカーゴタンパク質を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される技術は、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、およびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂからなる群から選択されるタンパク質を含む、単離されたエキソソームを提供する。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、単離されたエキソソームは、タンパク質ＳＰＩＮＴ２を含む。ある特定の実施形態では、単離されたエキソソームは、タンパク質ＩＬ３６Ｇを含む。ある特定の実施形態では、単離されたエキソソームは、タンパク質ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂを含む。ある特定の実施形態では、単離されたエキソソームは、タンパク質ＳＰＩＮＴ２およびＩＬ３６Ｇを含む。ある特定の実施形態では、単離されたエキソソームは、タンパク質ＩＬ３６ＧおよびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂを含む。ある特定の実施形態では、単離されたエキソソームは、タンパク質ＳＰＩＮＴ２およびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂを含む。ある特定の実施形態では、単離されたエキソソームは、タンパク質ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、およびＴＮＦＲＳＦ１０Ｂを含む。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、エキソソームはタンパク質ＴＮＦＳＦ１４を含む。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム集団は、少なくとも１つの追加的なタンパク質をさらに含み、該タンパク質は、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、およびこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム集団は、ＬＹＶＥ１、ＦＲＺＢ、ＣＣＬ１１、Ｃ５ａ、およびこれらの任意の組み合わせを含む、少なくとも１つの追加的なタンパク質をさらに含む。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＬＩＦタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＸＣＬ１タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＩＬ３６Ａタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＶＥＧＦＡタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＧＤＦ１５タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＣＬ７タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＭＭＰ１０タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＰＩＦＧタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＸＣＬ８タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＬＴＡタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＸＣＬ６タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＭＭＰ３タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＨＩ３Ｌ１タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＩＬ１１タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＦＧＦ２タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＸＣＬ５タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＧＡＳ１タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＪＡＭＬタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＴＧＦＢＲ３タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＭＥＰＥタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＩＬ６タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＰＤＧＦＡタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＣＬ４タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＣＬ２１タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＩＬ１３タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＶＥＧＦＡタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＣＬ２タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＭＩＦタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＧＤＦ１５タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＰＬＡＵタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＴＳＢタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＢＳＧタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＣＬ５タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＴＰＯタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＩＬ２３タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＩＬ１ＲＬ１タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＳＰＰ１タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、Ｆ１１Ｒタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＩＮＨＢＡタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＦＡＰタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＬＹＶＥ１タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＦＲＺＢタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＣＬ１１タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、Ｃ５ａタンパク質を含む。
【０２０９】
当業者は、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの集団が、対照ＭＳＣ細胞に由来するエキソソームと比較して、増加した量である特定のタンパク質を含むことができることを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム集団に存在するカーゴタンパク質は、対照ＭＳＣ細胞に由来するエキソソームと比較して、増加した量で存在する。いくつかの実施形態では、増加した量は、倍数増加を含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、２倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質は、対照ＭＳＣ細胞から単離されたエキソソームと比較して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、少なくとも２倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質は、対照ＭＳＣ細胞から単離されたエキソソームと比較して、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、３０倍超の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０倍の増加を含む。
【０２１１】
本出願にわたって、様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解される必要がある。したがって、範囲の記載は、可能性のあるすべての部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような具体的に開示された部分範囲、同様に、その範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５および６を有すると考えられるべきである。これは、範囲の広さにかかわりなく適用される。
【０２１２】
本明細書で数値範囲が示される際は常に、示された範囲内に任意の引用された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１に示された数字と第２に示された数字との「間の範囲」は、および第１に示された数字「から」第２に示された数字「までの範囲」の表現は、本明細書では互換的に使用され、第１の示された数字および第２に示された数字ならびにそれらの間の分数および整数のすべてを含むことを意味する。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、分化抗原群（ＣＤ）９、ＣＤ２９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ４４、ＣＤ４９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ６１、ＣＤ２７１、ＡＬＩＸ、腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーをさらに含む。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ９をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ２９をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ６３をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ８１をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ４４をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ４９をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ７３をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ９０をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ１０５をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ６１をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ２７１をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＡＬＩＸをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＴＳＧ１０１をさらに含む。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１Ｂ、ＦＭＣ７、カルネキシン、ヒト白血球抗原−抗原Ｄ関連（ＨＬＡ−ＤＲ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーを欠く。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ３を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ５を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ１４を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ１９を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ２０を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ３４を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ４５を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＣＤ１１Ｂを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＦＭＣ７を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーカルネキシンを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、マーカーＨＬＡ−ＤＲを欠く。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、ＳＰＩＮＴ２、ＴＮＦＳＦ１４、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＬＩＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＩＬ１３、ＶＥＧＦＡ、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＧＤＦ１５、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、およびＦＡＰ、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される高レベルのタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、ＬＹＶＥ１、ＦＲＺＢ、ＣＣＬ１１、Ｃ５ａ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるより低いレベルのタンパク質を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、単離されたエキソソーム集団において増加した量を有するタンパク質は、ＮＴＦである。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのタンパク質、例えばＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＬＩＦタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＶＥＧＦタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＶＥＧＦＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＧＤＦ１５タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＦＧＦ２タンパク質を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＧＤＦ１５、およびＦＧＦ２タンパク質から選択されるＮＴＦの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＧＤＦ１５、およびＦＧＦ２タンパク質を含むＮＴＦの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＬＩＦおよびＶＥＧＦＡを含むＮＴＦと、ＧＤＦ１５タンパク質との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＬＩＦおよびＶＥＧＦＡタンパク質を含むＮＴＦの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＬＩＦおよびＧＤＦ１５タンパク質を含むＮＴＦの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、増加した量で存在するＮＴＦは、ＶＥＧＦＡを含むＮＴＦと、ＧＤＦ１５タンパク質との組み合わせを含む。本明細書で使用される「ＭＳＣに由来する対応するエキソソーム」または「対照エキソソーム」という用語は、当業者には、任意の特定のタンパク質を含むか、もしくは欠くように分化しているか、または操作されていない、対照ＭＳＣから分泌されるエキソソームとして理解されるであろう。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＳＰＩＮＴ２を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＴＮＦＳＦ１４を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＩＬ３６Ｇを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＴＮＦＲＳＦ１０Ｂを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＩＬ３６Ａを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＣＬ７を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＭＭＰ１０を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＰＩＦＧを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＸＣＬ８を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＬＴＡを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＬＩＦを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＸＣＬ１を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＸＣＬ６を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＭＭＰ３を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＨＩ３Ｌ１を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＩＬ１１を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＦＧＦ２を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＸＣＬ５を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＧＡＳ１を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＪＡＭＬを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＴＧＦＢＲ３を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＭＥＰＥを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＩＬ６を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＰＤＧＦＡを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＣＬ４を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＣＬ２１を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＩＬ１３を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＶＥＧＦＡを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＣＬ２を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＭＩＦを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＧＤＦ１５を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＰＬＡＵを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＡＮＧＰＴＬ４を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＴＳＢを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＢＳＧを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＣＣＬ５を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＴＰＯを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＩＬ２３を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＩＬ１ＲＬ１を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＳＰＰ１を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＦ１１Ｒを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＩＮＨＢＡを含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、対照ＭＳＣに由来する対応するエキソソームにおける同じタンパク質のレベルと比較して、より高いレベルのＦＡＰを含む。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、滑膜ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、口腔粘膜ＭＳＣ、歯周靱帯ＭＳＣ、子宮内膜ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、および臍帯血ＭＳＣからなる群から選択される。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、骨髄ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、脂肪細胞ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、歯髄ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、胎盤ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、滑膜ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、末梢血ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、口腔粘膜ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、歯周靱帯ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、子宮内膜ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、臍帯ＭＳＣである。ある特定の実施形態では、ＭＳＣは、臍帯血ＭＳＣである。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の神経栄養因子（ＮＴＦ）をさらに含む。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＶＥＧＦをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＨＧＦをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＬＩＦをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、Ｇ−ＣＳＦをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＢＤＮＦをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＴＳＧ−６をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＢＭＰ２をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ＦＧＦ２をさらに含む。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−３４ａ−３９、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４３２４、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ分子をさらに含む。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３６６３−３ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１３２−３ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１５０−３ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−７６２をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−４３２７をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３６６５をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１９１５をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３４ａ−３９をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−８７４をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−４２８１をさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１２０７−５ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐをさらに含む。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−４３２４をさらに含む。
【０２２７】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−３６５９、ｍｉＲ−３５２９−３ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−３１３２、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−４２８４、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５５−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０５、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡ分子を欠く。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−５０３を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３６５９を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３５２９−３ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３２０ｂを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１２７５を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３１３２を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３２０ａを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−４９５を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−２２２−３ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−４２４−５ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−４２８４を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−５７４−５ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１４３−３ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−４５５−３ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１４５−５ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−３２４−３ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐを欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１３０５を欠く。ある特定の実施形態では、エキソソームは、ｍｉＲ−１４０−３ｐを欠く。
【０２２９】
別の実施形態では、本明細書で提供される技術は、上記の単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム集団を含む薬学的組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、増加した量の該少なくとも１つのカーゴタンパク質を含む分化したＭＳＣ神経栄養因子（ＭＳＣ−ＮＴＦ）細胞に由来する単離されたエキソソーム集団を含む薬学的組成物が、本明細書に開示され、該カーゴタンパク質は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）タンパク質、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）タンパク質、インターロイキン１３（ＩＬ１３）タンパク質、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）タンパク質、もしくは増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における該少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、増加した量の少なくとも２つのカーゴタンパク質を含むＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソーム集団を含む薬学的組成物であって、該カーゴタンパク質は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）タンパク質、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）タンパク質、インターロイキン１３（ＩＬ１３）タンパク質、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）タンパク質、もしくは増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、薬学的組成物。いくつかの実施形態では、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における該少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、増加した量の少なくとも３つ、４つ、または５つのカーゴタンパク質を含むＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソーム集団を含む薬学的組成物であって、該カーゴタンパク質は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）タンパク質、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（ＣＸＣＬ１）タンパク質、インターロイキン１３（ＩＬ１３）タンパク質、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）タンパク質、もしくは増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む、薬学的組成物。いくつかの実施形態では、対照ＭＳＣに由来する単離されたエキソソーム集団における該少なくとも１つのカーゴタンパク質の量と比較して、増加した量のＬＩＦタンパク質、ＣＸＣＬ１タンパク質、ＩＬ１３タンパク質、ＶＥＧＦＡタンパク質、およびＧＤＦ１５タンパク質を含むＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソーム集団を含む、薬学的組成物。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、無傷の細胞、破裂した細胞、無傷の細胞小器官、および／または破裂した細胞小器官を実質的に欠く。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、無傷の細胞、破裂した細胞、無傷の細胞小器官、および／または破裂した細胞小器官を欠く。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、無傷の細胞を欠く。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、破裂した細胞を欠く。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、無傷の細胞小器官を欠く。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、破裂した細胞小器官を欠く。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、無傷の細胞、破裂した細胞、無傷の細胞小器官、および破裂した細胞小器官を欠く。
【０２３１】
本明細書で使用される「を実質的に欠く」という用語は、「を欠く」および「の微量を含有する」を含むこととして当業者に理解される。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも５０％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも５５％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも６０％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも６５％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも７０％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも７５％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも８０％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも８５％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも９０％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも９５％である。ある特定の実施形態では、薬学的組成物における単離されたエキソソームの純度は、サイズにより少なくとも９９％である。当業者が理解するように、サイズによる純度は、当該技術分野で既知の様々な方法で決定され得る。
【０２３３】
単離されたＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法
【０２３４】
単離され改変されたＭＳＣエキソソームを生産する方法は、ＭＳＣまたは遺伝学的に改変されたＭＳＣのような単一の細胞型に由来するエキソソームの単離および精製を含む。
【０２３５】
単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、ＭＳＣ−ＮＴＦまたは遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦのような単一の細胞型に由来するエキソソームの単離および精製を含む。当業者は、単離されたエキソソームが精製されたエキソソームを包含することを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、精製されたエキソソームを含む。いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、精製されたエキソソームを含む組成物を含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、その天然環境から物理的に分離されるものである。単離されたエキソソームは、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦを含む、それが天然に存在する組織または細胞から、全体的または部分的に、物理的に分離され得る。いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームの組成物は、ＭＳＣもしくはＭＳＣ−ＮＴＦのような細胞を含まない場合があるか、または馴化培地を含まないか、もしくは実質的に含まない場合がある。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の培養物からの馴化培地から単離され得る。いくつかの実施形態では、エキソソームは、ＭＳＣの培養物からの馴化培地から単離され得る。エキソソームを単離および／または回収する方法は、当該技術分野で周知である。方法は、定義された孔径のナイロンメンブレンフィルターを通じた分別濾過（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の使用を含むことができる。大きな孔径による最初の濾過は、細胞の破片および破片を保持するであろう。小さい孔径を通じたその後の濾過は、エキソソームを保持し、より小さいサイズの汚染物質からそれらを精製するであろう。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームを生産する方法は、３０〜３００ｎｍのサイズを有するエキソソームを生産する。いくつかの実施形態では、生産されるエキソソームは、３０〜２５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、生産されるエキソソームは、３０〜２００ｎｍである。いくつかの実施形態では、生産されるエキソソームは、３０〜１７５ｎｍである。いくつかの実施形態では、生産されるエキソソームは、３０〜１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、生産されるエキソソームは、４０〜１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、生産されるエキソソームは、５０〜１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、生産されるエキソソームは、３０〜１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、生産されるエキソソームは、１００〜１５０ｎｍである。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、骨髄ＭＳＣ、脂肪細胞ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、胎盤ＭＳＣ、滑膜ＭＳＣ、末梢血ＭＳＣ、口腔粘膜ＭＳＣ、歯周靱帯ＭＳＣ、子宮内膜ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、または臍帯血ＭＳＣから単離される。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、エキソソームは、骨髄ＭＳＣ−ＮＴＦ、脂肪細胞ＭＳＣ−ＮＴＦ、歯髄ＭＳＣ−ＮＴＦ、胎盤ＭＳＣ−ＮＴＦ、滑膜ＭＳＣ−ＮＴＦ、末梢血ＭＳＣ−ＮＴＦ、口腔粘膜ＭＳＣ−ＮＴＦ、歯周靱帯ＭＳＣ−ＮＴＦ、子宮内膜ＭＳＣ−ＮＴＦ、臍帯ＭＳＣ−ＮＴＦ、または臍帯血ＭＳＣ−ＮＴＦから単離される。
【０２４１】
以下の実施例４は、２つのエキソソーム集団の間のカーゴが異なるＭＳＣ−ＮＴＦからの単離されたエキソソームの生産を明確に示す。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソーム集団を生産する方法は、対照ＭＳＣから生産された単離されたエキソソームと比較して、増加した量の少なくとも１つのカーゴタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を生産する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソーム集団を生産する方法は、対照ＭＳＣから生産された単離されたエキソソームと比較して、増加した量の少なくとも２つのカーゴタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を生産する。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソーム集団を生産する方法は、対照ＭＳＣから生産された単離されたエキソソームと比較して、増加した量の少なくとも３つ、４つ、または５つのカーゴタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を生産する。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、ヒトＭＳＣである。いくつかの実施形態では、ヒトＭＳＣは、遺伝学的に改変されない。いくつかの実施形態では、ヒトＭＳＣは遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは健常対象から得られた。いくつかの実施形態では、分化したＭＳＣは、神経変性疾患に罹患している対象から得られた。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＭＳＡ、ＳＭＡ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＤ、レット症候群、ＣＰ、ＡＳＤ、およびてんかんから選択される。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、ヒトＭＳＣ−ＮＴＦである。いくつかの実施形態では、ヒトＭＳＣ−ＮＴＦは、遺伝学的に改変されない。いくつかの実施形態では、ヒトＭＳＣ−ＮＴＦは、遺伝学的に改変される。いくつかの実施形態では、分化したＭＳＣは、健常対象から得られた。いくつかの実施形態では、分化したＭＳＣは、神経変性疾患に罹患している対象から得られた。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＭＳＡ、ＳＭＡ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＤ、レット症候群、ＣＰ、ＡＳＤ、およびてんかんから選択される。
【０２４４】
当該技術分野で既知の方法は、米国公開第２０１７／０２５８８４０号（実施例セクション）、Ｌａｍｐａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００２；２７０：２１１−２２６．、米国特許第９，８７７，９８９号（実施例セクション）、Ｃｏｒｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ７，１１５６１（２０１７）、およびＬａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏ．１４０：８２−８８に記載されるものを含むが、これらに限定されない。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ馴化培地からエキソソームを単離する方法は、ＭＳＣ細胞馴化培地を含む試料を提供するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離の方法において使用されるＭＳＣは、本明細書に記載される遺伝学的に改変されたＭＳＣ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、遺伝学的に改変されない。いくつかの実施形態では、ＭＳＣは、本明細書に開示されているように、発現に対して遺伝学的に改変されるか、あるいは増殖因子、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを高度に発現または高度に発現する。
【０２４６】
ＭＳＣ馴化培地試料が提供されると、エキソソームを単離する方法は、ＭＳＣ（精製されたエキソソーム）からエキソソームに富む画分を単離するさらなるステップを含む。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、ＭＳＣ馴化培地から単離される。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、例えば、濾過によって、細胞破片および大きな小胞が除去されているＭＳＣ馴化培地から単離される。いくつかの実施形態では、細胞馴化培地は、０．２２μｍフィルターを通じて濾過される。いくつかの実施形態では、さらなる濾過は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の使用を含むことができる。回収された濾液は、エキソソームの精製された画分を含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、ＭＳＣマーカーについて解析される。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦＳからエキソソームを単離する方法は、分化したＭＳＣ細胞を含む試料を提供するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単離の方法において使用される分化したＭＳＣ細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ）は、本明細書に記載されるすべての分化したＭＳＣ−ＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、遺伝学的に改変されない。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦは、本明細書に開示されているように、増殖因子、ガレクチン−１分子、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを発現または高度に発現するように遺伝学的に改変される。
【０２４９】
ＭＳＣ−ＮＴＦ馴化培地試料が提供されると、エキソソームを単離する方法は、ＭＳＣ−ＮＴＦ（精製されたエキソソーム）からエキソソームに富む画分を単離するさらなるステップを含む。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、ＭＳＣ−ＮＴＦ馴化培地から単離される。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、例えば、濾過によって、細胞破片および大きな小胞が除去されているＭＳＣ−ＮＴＦ馴化培地から単離される。いくつかの実施形態では、細胞馴化培地は、０．２２μｍフィルターを通じて濾過される。いくつかの実施形態では、さらなる濾過は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の使用を含むことができる。回収された濾液は、エキソソームの精製された画分を含む。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、ＭＳＣマーカーについて解析される。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、ＭＳＣ−ＮＴＦマーカーについて解析される。ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞において発現されるＮＴＦ分子は、上に詳細に記載されている。これらのＮＴＦの任意の組み合わせは、エキソソームの精製された画分に存在し得る。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、例えば、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、もしくはＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、増加した量の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＮＴＦを含むエキソソーム生産する。いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、増加した量の少なくとも１つのＮＴＦを含むエキソソームを生産する。いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、増加した量の少なくとも２つのＮＴＦを含むエキソソームを生産する。いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、増加した量の少なくとも３つのＮＴＦを含むエキソソームを生産する。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される任意のＮＴＦを含む増加した量のＮＴＦカーゴタンパク質を含むエキソソームを生産する。いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、ＬＩＦ、ＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦカーゴタンパク質を含むエキソソームを生産する。いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、ＬＩＦおよびＶＥＧＦＡを含む増加した量のＮＴＦカーゴタンパク質を含むエキソソームを生産する。いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、ＬＩＦおよびＧＤＦ１５を含む増加した量のＮＴＦカーゴタンパク質を含むエキソソームを生産する。いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、ＶＥＧＦＡおよびＧＤＦ１５を含む増加した量のＮＴＦカーゴタンパク質を含むエキソソームを生産する。いくつかの実施形態では、エキソソームの単離されたＭＳＣ−ＮＴＦ集団を生産するために本明細書に開示される方法は、ＬＩＦ、ＶＥＧＦＡ、およびＧＤＦ１５を含む増加した量のＮＴＦカーゴタンパク質を含むエキソソームを生産する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、追加的なカーゴタンパク質は、本明細書に記載される方法を使用してＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソーム集団において増加する場合がある。例えば、これらに限定されないが、タンパク質ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＬＩＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＩＬ１３、ＶＥＧＦＡ、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＧＤＦ１５、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、またはこれらの任意の組み合わせのいずれか。いくつかの実施形態では、追加的なカーゴタンパク質は、本明細書に記載される方法を使用してＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソーム集団において増加し、ＣＸＣＬ１タンパク質またはＩＬ１３タンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、追加的なカーゴタンパク質は、本明細書に記載される方法を使用してＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソーム集団において増加し、ＣＸＣＬ１タンパク質およびＩＬ１３タンパク質を含むことができる。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質を有するＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、２倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質は、対照ＭＳＣ細胞から単離されたエキソソームと比較して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質を有するＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、少なくとも２倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質を有するＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質を有するＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、３０倍超の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質を有するＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、増加した量のカーゴタンパク質を有するＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、対照ＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームと比較して、少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０倍の増加を含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、精製された画分は、以下のマーカー、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つについて解析され、これらのマーカーは、ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ上に存在する。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、増殖因子、ガレクチン−１分子、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ、またはこれらの組み合わせについて解析され、該ＭＳＣ−ＮＴＦは、増殖因子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または増殖因子をコードするヌクレオチドを含むように遺伝学的に改変された。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、増殖因子、ガレクチン−１分子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせについて解析され、該ＭＳＣは、増殖因子、ガレクチン−１分子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを含むように遺伝学的に改変された。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、エキソソームマーカーについて解析される。いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、（ＣＤ）９、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ６１、ＣＤ８１、ＡＬＩＸ、もしくは腫瘍感受性遺伝子（ＴＳＧ）１０１、またはこれらの組み合わせを含むエキソソームマーカーのうちのいずれか１つについて解析される。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦには見られないマーカーを含まない。例えば、いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、カルネキシン、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ５、ＣＤ２０、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＦＭＣ７、またはこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含まない。
【０２５６】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に増加した量で存在するｍｉＲＮＡは、上に詳細に記載される。エキソソームの精製された画分は、これらのｍｉＲＮＡ、例えば、これらに限定されないが、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−３４ａ−３９、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、もしくはｍｉＲ−４３２４、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるｍｉＲＮＡの任意の組み合わせを含むことができる。
【０２５７】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に減少した量で存在するｍｉＲＮＡは、上に詳細に記載される。エキソソームの精製された画分は、これらのｍｉＲＮＡ、例えば、これらに限定されないが、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）−３６６３−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−７６２、ｍｉＲ−４３２７、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９１５、ｍｉＲ−３４ａ−３９、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−８７４、ｍｉＲ−４２８１、ｍｉＲ−１２０７−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、もしくはｍｉＲ−４３２４、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択されるｍｉＲＮＡの任意の組み合わせを含むことができる。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、エキソソームの精製された画分は、増加した量の少なくとも１つのｍｉＲＮＡおよび減少した量の少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームを生産する方法は、少なくとも１つのエキソソーム特異的マーカーおよび少なくとも１つのＭＳＣ特異的マーカーを含むエキソソーム精製画分を回収するさらなるステップを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、少なくとも１つのエキソソーム特異的マーカーおよび少なくとも１つのＭＳＣ−ＮＴＦ特異的マーカーを含むエキソソーム精製画分を回収するさらなるステップを含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞型特異的エキソソームを生産する方法は、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導されている分化したＭＳＣ（「ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞」と標識される）を含む試料を提供することであって、該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌は、分化していないＭＳＣにおける該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌と比較して、該ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞においてより大きい、提供することと、該ＭＳＣ−ＮＴＦからエキソソーム精製画分を単離することであって、該エキソソーム精製画分は精製されたエキソソームを含み、該精製されたエキソソームは、少なくとも１つのエキソソーム特異的マーカー、もしくは少なくとも１つのＭＳＣ−ＮＴＦ特異的マーカー、またはこれらの組み合わせについて解析される、単離することと、少なくとも１つのエキソソーム特異的マーカーおよび少なくとも１つのＭＳＣ−ＮＴＦ特異的マーカーを含むエキソソーム精製画分を回収することと、それにより、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞型特異的エキソソームを生産することと、を含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、エキソソーム精製画分の回収に続いて、インビトロ法が、上で詳細に記載されているように、外因性化合物、例えば、増殖因子、ガレクチン−１分子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはこれらの組み合わせをエキソソームに負荷するために使用される。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、精製された画分のエキソソームは、増殖因子を負荷される。いくつかの実施形態では、精製された画分のエキソソームは、ＩＧＦ−１を負荷される。いくつかの実施形態では、精製された画分のエキソソームは、ＩＧＦ−２を負荷される。いくつかの実施形態では、精製された画分のエキソソームは、ＧＤＦ−５を負荷される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、エキソソームの精製された画分にＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＧＤＦ−５、またはこれらの任意の組み合わせを負荷することを含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、精製された画分のエキソソームは、ガレクチン−１分子を負荷される。いくつかの実施形態では、精製された画分の改変されたＭＳＣエキソソームは、ガレクチン−１分子を負荷される。いくつかの実施形態では、精製された画分のＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、ガレクチン−１分子を負荷される。いくつかの実施形態では、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する方法は、エキソソームの精製された画分にガレクチン−１分子を負荷することを含む。いくつかの実施形態では、改変されたＭＳＣエキソソームを生産する方法は、エキソソームの精製された画分にガレクチン−１分子を負荷することを含む。
【０２６４】
したがって、本明細書に開示されるように、単離されたエキソソームは、いくつかの実施形態において、それらが単離されたＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に存在する、ＮＴＦ、ＮＴＦをコードする核酸、増殖因子、ガレクチン−１、ｍｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、単離されたエキソソームは、加えて、後にエキソソーム中に負荷されたか、またはそれらが単離された遺伝学的に改変されたＭＳＣもしくはＭＳＣ−ＮＴＦに存在した、増殖因子、ガレクチン−１分子、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、精製された画分のエキソソームは、ｓｉＲＮＡを負荷される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＭＭＰ−９  ｓｉＲＮＡまたはその一部を含む。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、精製された画分のエキソソームは、ｍｉＲＮＡを負荷される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−７  ｍｉＲＮＡを含む。
【０２６７】
別の態様では、本明細書に提供される技術は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソーム集団を生産する方法をさらに提供し、該エキソソーム集団は、対照ＭＳＣに由来するエキソソームと比較して、増加した量の少なくとも１つのタンパク質を含む。単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム集団は、上に詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム集団のいずれかは、以下および実施例に記載される生産の方法を使用して生産され得る。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、本技術は、単離されたエキソソーム集団を生産する方法を提供し、方法は、ヒトＭＳＣを得るステップと、ＭＳＣから接着性単核細胞を単離するステップと、接着性単核細胞をジブチリル環状アデノシン一リン酸、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト血小板由来増殖因子、およびヒトヘレグリン−β１を含有する無血清ＤＭＥＭ培地で培養するステップと、無血清ＤＭＥＭ培地からエキソソームを単離するステップと、を含む。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、ＭＳＣが骨髄、末梢血、臍帯、または臍帯血から生産および単離される際に、該得るステップは、該骨髄または該血液試料からヒト単核細胞を分離することを含み、その後、単核集団から接着性ＭＳＣを単離することを含むステップが続く。いくつかの実施形態では、該ＭＳＣは、脂肪細胞、歯髄、胎盤、滑膜、口腔粘膜、歯周靱帯、または子宮内膜組織試料から生産およびから単離され、得るステップは、総細胞集団から接着性ＭＳＣを単離することが後に続く、当該技術分野で周知の物理的および酵素的方法を使用して組織を得てそれを解離することを含む。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、もしくはＴＮＦＳＦ１４、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＬＩＦタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＶＥＧＦＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＧＤＦ１５タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＬＩＦおよびＶＥＧＦＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＬＩＦおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＶＥＧＦＡおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、少なくとも別のタンパク質と、を含む。いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む。いくつかの実施形態では、生産された単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む。
【０２７３】
ある特定の実施形態では、ステップ（ａ）は、骨髄吸引によって健常成人ドナーの後腸骨稜から骨髄試料をヘパリン含有チューブ中に回収することを含む。ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、接着性単核細胞を、２００ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ＩＵ／ｍｌのヘパリンおよび１０％の血小板溶解物を補充した低グルコースＤＭＥＭ中で増殖させることを含む。ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、ＭＳＣから単核細胞を単離することと、単核細胞から接着性細胞を単離することと、を含む。ある特定の実施形態では、無血清ＤＭＥＭ培地は、０．１〜１０ｍＭのジブチリル環状アデノシン一リン酸、２〜２００ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、０．５〜５０ｎｇ／ｍＬのヒト血小板由来増殖因子、および５〜５００ｎｇ／ｍＬのヒトヘレグリン−β１を含有する。ある特定の実施形態では、無血清ＤＭＥＭ培地は、１ｍＭのジブチリル環状アデノシン一リン酸、２０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、５ｎｇ／ｍＬのヒト血小板由来増殖因子、および５０ｎｇ／ｍＬのヒトヘレグリン−β１（Ｓ２Ｍ）を含有する。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の１〜１０日後に実行される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の１日後に実行される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の２日後に実行される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の３日後に実行される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の４日後に行われる。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の５日後に実行される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の６日後に実行される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の７日後に実行される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の８日後に実行される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の９日後に実行される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）の１０日後に実行される。
【０２７５】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって無血清ＤＭＥＭ培地からエキソソームを単離することを含む。ある特定の実施形態では、ステップ（ｄ）は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）の接着性単核細胞またはステップ（ｄ）において単離されたエキソソームに１つ以上のカーゴ分子を負荷することをさらに含む。
【０２７７】
ある特定の実施形態では、カーゴ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、増殖因子、神経栄養因子、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０２７８】
ある特定の実施形態では、カーゴ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、カーゴ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ある特定の実施形態では、カーゴ分子は、増殖因子である。ある特定の実施形態では、カーゴ分子は、神経栄養因子である。
【０２７９】
ある特定の実施形態では、上記の単離されたエキソソームは、ヒトＭＳＣを取得することと、ＭＳＣから単核細胞を単離することと、単核細胞から接着性細胞を単離することと、単核細胞を１ｍＭのジブチリル環状アデノシン一リン酸、２０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、５ｎｇ／ｍＬのヒト血小板由来増殖因子、および５０ｎｇ／ｍＬのヒトヘレグリン−β１を含有する無血清ＤＭＥＭ培地で３日間培養することと、無血清ＤＭＥＭ培地からエキソソームを単離することと、を含む方法によって入手可能である。
【０２８０】
ある特定の実施形態では、上記の単離されたエキソソームは、ヒトＭＳＣを得ることと、ＭＳＣから単核細胞を単離することと、単核細胞から接着性細胞を単離することと、単核細胞を１ｍＭのジブチリル環状アデノシン一リン酸、２０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、５ｎｇ／ｍＬのヒト血小板由来増殖因子、および５０ｎｇ／ｍＬのヒトヘレグリン−β１を含有する無血清ＤＭＥＭ培地で３日間培養することと、無血清ＤＭＥＭ培地からエキソソームを単離することと、を含む方法によって得られる。
【０２８１】
治療の方法
【０２８２】
いくつかの実施形態では、それを必要とする対象において神経変性疾患を治療する方法が本明細書に開示され、方法は、該対象に治療有効量の単離され改変されたＭＳＣエキソソームを投与することを含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法は、ＭＳＣ−ＮＴＦ単離されたエキソソーム集団の治療組成物を対象に投与することを含み、これらのＭＳＣ−ＮＴＦ単離されたエキソソーム集団は上で詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象において神経変性疾患を治療する方法が本明細書に開示され、方法は、該対象に治療有効量の単離された細胞型特異的エキソソームを投与することを含み、該細胞型は、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導されている、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞と呼ばれる分化したＭＳＣ（ＭＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌は、分化していないＭＳＣにおける該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌と比較して、該ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてより大きい。
【０２８３】
いくつかの実施形態では、該単離され改変されたＭＳＣエキソソームは、対象における神経変性疾患を治療するために使用される追加的な治療または療法と組み合わされて使用され得る。いくつかの実施形態では、該単離された細胞型特異的エキソソームは、対象における神経変性疾患を治療するために使用される追加的な治療または療法と組み合わされて使用され得る。いくつかの実施形態では、追加的な治療は、ＭＳＣ細胞の投与を含む。いくつかの実施形態では、追加的な治療は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の投与を含む。ある特定の実施形態では、細胞の投与を含む任意の追加的な治療は、エキソソームおよび細胞の別々の投与を含む。ある特定の実施形態では、エキソソームおよび細胞の別々の投与は、別々の組成物に含まれること、別々の時点で投与されること、別々の位置に投与されること、およびこれらの任意の組み合わせを含む。
【０２８４】
当業者は、一実施形態において、「投与する」という用語およびその文法的等価物、例えば、投与が、本明細書において、すべて同じ意味および質を有する「移植する」という用語と交換可能に使用され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、移植は、本明細書に記載される組成物を、必要としている対象に注射することによって実行される。いくつかの実施形態では、移植は、本明細書に記載される単離された細胞型特異的エキソソームを、必要としている対象に注射することによって実行される。
【０２８５】
別の実施形態では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、多系統萎縮症（ＭＳＡ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、ハンチントン病を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、レット症候群を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、リソソーム蓄積症を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏを含む、「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、ゴーシェ病を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、テイサックス病（ベータヘキソサミニダーゼ欠損症）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、ＮＭＯスペクトラム疾患を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、虚血、事故、または環境侵襲によって引き起こされる脳の損傷または外傷を含む。別の実施形態では、神経変性障害は、脳卒中を含む。別の実施形態では、神経変性障害は、脳性麻痺（ＣＰ）を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、自閉症もしくは自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、またはこれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、脊髄損傷を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、運動失調を含む。別の実施形態では、神経変性疾患は、てんかんを含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される精製されたエキソソームまたはその組成物の投与に続いて、治療された対象からの生物学的試料は、対照対象からの生物学的試料と比較して、増加したレベルの少なくとも１つの神経栄養因子を含む。一実施形態では、対照対象は、治療されていない対象である。一実施形態では、対照対象は、プラセボを受けている対象である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される単離されたエキソソームまたはその組成物の投与に続いて、生物学的試料は、対照対象からの生物学的試料と比較して、増加したレベルの少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対照生物学的試料は、プラセボを受けている対照対象から得られた試料を含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は治療されている対象から得られた試料を含み、対照生物学的試料は単離されたエキソソームでの投与の前に得られた。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているように、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物の投与は、該対象において免疫調節効果をもたらす。当業者は、用語「免疫調節効果」が、刺激に応答した免疫系の調節を包含し、したがって、疾患の有害な影響を軽減することができることを、理解するであろう。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される疾患の治療は、免疫調節効果を含む。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、免疫調節効果は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、またはＴ制御性（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、もしくはＩＦＮ−ガンマ分泌の減少、もしくはＴＮＦアルファ分泌の減少、またはこれらの組み合わせを含む。
【０２８９】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、それを必要とする対象における神経変性疾患の治療は、対象における免疫調節効果、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、もしくはＴ制御性（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、もしくはＩＦＮ−ガンマ分泌の減少、もしくはＴＮＦアルファ分泌の減少、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、調節性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導を提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、減少したＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、減少したＩＦＮ−ガンマ分泌を提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、減少したＴＮＦ−アルファ分泌を提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、制御性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、ＩＦＮ−ガンマ分泌の減少、もしくはＴＮＦ−アルファ分泌の減少、またはこれらの任意の組み合わせを含む免疫調節効果の組み合わせを提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、制御性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、ＩＦＮ−ガンマ分泌の減少、およびＴＮＦ−アルファ分泌の減少を含む免疫調節効果の組み合わせを提供する。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、生物学的試料は、血液試料、血清試料、尿試料、または脳脊髄液（ＣＳＦ）試料を含む。いくつかの実施形態では、エクスビボ対照試料は、増加したレベルの少なくとも１つのＮＴＦを分泌するように誘導されていない同じ対象からのＭＳＣ細胞を含む。いくつかの実施形態では、対照試料は、増加したレベルの少なくとも１つのＮＴＦを分泌するように誘導されていないか、または追加的な分子を含むように改変されていない、同じ対象からの分化していないＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームを含む。
【０２９２】
当業者は、ＭＳＣからおよびＭＳＣ−ＮＴＦからの単離されたエキソソームが両方とも同じ少なくとも１つのＮＴＦを含むことができるが、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が由来したＭＳＣと比較して少なくとも１つのＮＴＦの分泌を増加させるように誘導されていることを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、エクスビボ対照試料は、治療される対象からの分化していないＭＳＣを含む。いくつかの実施形態では、対照試料は、エクスビボ解析用である。いくつかの実施形態では、同じ対照は、インビボ解析用である。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、エクスビボ対照は、改変されたＭＳＣエキソソームが由来した同じドナー／患者からのＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームを含むが、追加的な分子は、該エキソソームに負荷されていない。いくつかの実施形態では、対照生物学的試料は、遺伝学的に改変されたＭＳＣが由来した同じドナー／患者からのＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームを含む。いくつかの実施形態では、対照生物学的試料は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞が由来した同じドナー／患者からのＭＳＣ細胞からの単離されたエキソソームを含む。いくつかの実施形態では、対照生物学的試料は、治療の前に得られた単離されたエキソソームで治療された患者から得られた試料を含む。いくつかの実施形態では、対照試料は、治療されていない患者からの試料を含む。いくつかの実施形態では、対照試料は、プラセボで治療された患者からの試料を含む。
【０２９４】
別の実施形態では、該投与に続いて、生物学的試料は、増加したレベルの少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を含む。いくつかの実施形態では、該ＮＴＦは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
【０２９５】
一実施形態では、該投与に続いて、生物学的試料は、対照対象からの生物学的試料と比較して、減少したレベルの少なくとも１つの炎症因子、またはアポトーシス促進因子、または炎症因子に影響を与える因子を含む。別の実施形態では、炎症因子、またはアポトーシス促進因子、または炎症因子に影響を与える因子は、キトトリオシダーゼ１（ＣＨＩＴ１）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）、間質由来因子１（ＳＤＦ−１）、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１）、もしくはカスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、該投与に続いて、該生物学的試料は、対照対象からの生物学的試料と比較して、増加したレベルの少なくとも１つの神経栄養因子、および減少したレベルの少なくとも１つの炎症因子、もしくはアポトーシス促進因子、もしくは炎症因子に影響を与える因子を含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームまたはその組成物は、当業者に既知の任意の好適な方法を介して投与され得る。いくつかの実施形態では、単離された細胞型特異的エキソソームまたはその組成物は、当業者に既知の任意の好適な方法を介して投与され得る。かかる方法の例は、髄腔内、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、皮下、および／経口経路を含むが、これらに限定されない。投与は、本明細書に開示される組成物の全身性または局所投与も含むことができる。
【０２９７】
投与は、単離され改変されたＭＳＣエキソソームまたは単離された細胞型特異的エキソソームを対象に外科的に投与、移植、挿入、または注射することも包含できる。単離され改変されたＭＳＣエキソソームまたは単離された細胞型特異的エキソソームは、髄腔内、皮下、筋肉内、中枢神経系（ＣＮＳ）に位置するか、またはエキソソームがそれらの意図された機能を実行することを可能にする別の体の位置に位置することができる。投与に好適な部位は、医療専門家により容易に決定され得る。
【０２９８】
一実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームまたは単離された細胞型特異的エキソソーム（ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム）は、対象のＣＳＦに髄腔内投与される。別の実施形態では、単離され改変されたＭＳＣエキソソームまたは単離された細胞型特異的エキソソームは、対象の筋肉中に投与される。さらなる実施形態では、投与は、対象の脳脊髄液へ投与することを含む。さらなる実施形態では、投与は、対象の中枢神経系へ投与することを含む。別の実施形態では、投与は、対象の脳脊髄液もしくは中枢神経系、またはこれらの任意の組み合わせへ投与することを含む。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、対象のＣＳＦまたはＣＮＳへの投与は、治療有効用量の精製され改変されたＭＳＣエキソソーム、もしくは精製されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム、またはそれらの組成物の投与を含む。
【０３００】
当業者は、用語「中枢神経系」が脳および脊髄を包含できることを、理解するであろう。いくつかの実施形態では、投与は、脳へ投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、脊髄へ投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与は、脳および脊髄へ投与することを含む。
【０３０１】
一実施形態では、投与は、筋肉内（ＩＭ）注射、もしくは髄腔内（ＩＴ）注射、もしくは静脈内（ＩＶ）注射、またはこれらの組み合わせを含む。
【０３０２】
別の実施形態では、ＩＭ投与は、同じ時点での複数の注射を含む。当業者は、同じ時点での複数の注射が、所与の時点で次々に与えられる注射を包含できることを、理解するであろう。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２０回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２１回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２２回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２３回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２４回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２５回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２６回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２７回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２８回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約２９回の注射を含む。別の実施形態では、ＩＭ投与は、約３０回の注射を含む。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、投与は、治療上有効な数の時点を含む。いくつかの実施形態では、注射は、毎月投与される。いくつかの実施形態では、注射は、２か月ごとに投与される。いくつかの実施形態では、注射は、３か月ごとに投与される。いくつかの実施形態では、注射は、必要に応じて投与される。いくつかの実施形態では、複数の注射は、各投与で提供される。いくつかの実施形態では、２〜３０回の注射は、各投与で提供される。いくつかの実施形態では、２〜２０回の注射は、各投与で提供される。いくつかの実施形態では、２０〜３０回の注射は、各投与で提供される。いくつかの実施形態では、１０〜２０回の注射は、各投与で提供される。いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０回の注射は、各投与で提供される。
【０３０４】
一実施形態では、ＩＴ注射またはＩＭ注射は、治療有効用量の単離された細胞型特異的エキソソームを含む。
【０３０５】
一実施形態では、投与は、単一の時点を含む。当業者は、治療が、本明細書に記載される単離され改変されたＭＳＣエキソソームまたは単離された細胞型特異的エキソソームのフォローアップ投与を包含できることを、理解するであろう。別の実施形態では、投与は、少なくとも２つの時点を含む。別の実施形態では、投与は、２つの時点を含む。第２のまたはさらなる時点の投与のタイミングは、本明細書に記載されるように、対象から採取され、ＮＴＦおよび／または炎症因子について解析された生物学的試料の解析を包含できる。いくつかの実施形態では、投与は、治療効果に必要なだけ多くの時点を含む。いくつかの実施形態では、治療効果は、本明細書で詳細に記載されるように、少なくとも１つのＮＴＦおよび／または少なくとも１つの炎症因子、またはアポトーシス促進因子、または炎症因子に影響を与える因子の分泌の解析に基づいて決定され得る。
【０３０６】
別の実施形態では、フォローアップ投与は、神経変性疾患の治療を増強する。別の実施形態では、反復投与は、初回治療に続いて約８〜１２週での２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、約７週での２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、約８週での２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、約９間での２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、約１０間での２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、約１１週での２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、約１２週での２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、約１３週での２回目の投与を含む。別の実施形態では、反復投与は、約１４週での２回目の投与を含む。別の実施形態では、投与は、およそ少なくとも３つの時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、およそ少なくとも４つの時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、およそ少なくとも５つの時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、５超の時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、１０超の時点での反復投与を含む。別の実施形態では、投与は、疾患または障害の持続期間のフォローアップ時点での反復投与を含む。
【０３０７】
本明細書に記載される使用の方法によって治療される神経変性疾患または状態は、上に記載されている。一実施形態では、本明細書に記載される使用の方法によって治療される神経変性疾患または状態は、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＰＤ、ＭＳＡ、ＳＭＡ、ＭＳ、ＡＤ、レット症候群、ＣＰ、ＡＳＤ、およびてんかんを含むが、これらに限定されない。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、ＡＬＳの治療に使用されるエキソソームは、増加した量のＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ガレクチン−１分子、もしくはＭＭＰ−９  ｓｉＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患または状態の治療は、ＭＭＰ−９標的化ｓｉＲＮＡを含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームの使用を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患または状態の治療は、ｍｉＲ−７を含む単離され改変されたＭＳＣエキソソームの使用を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患または状態の治療は、ＩＧＦ−１、もしくはＩＧＦ−２、もしくはガレクチン−１、またはこれらの組み合わせを含む、単離され改変されたＭＳＣエキソソームの使用を含む。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患または状態の治療は、ＭＭＰ−９標的化ｓｉＲＮＡを含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの使用を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患または状態の治療は、ｍｉＲ−７を含む単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの使用を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患または状態の治療は、ＩＧＦ−１、もしくはＩＧＦ−２、もしくはガレクチン−１分子、またはこれらの組み合わせを含む、単離されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの使用を含む。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、ＰＤの治療に使用されるエキソソームは、増加した量のＧＤＦ−５、ガレクチン−１分子、ｍｉＲ−７、もしくはＭＭＰ−９  ｓｉＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、方法は、ＡＬＳに関連するバイオマーカー、もしくはＡＬＳの進行を特定するバイオマーカー、またはこれらの組み合わせを検出するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＡＬＳに関連するバイオマーカーは、ＣＨＩＴ１、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ｍｉＲ１９、ｍｉＲ１４６ａ、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７６−ａ、もしくはｍｉＲ−１３２、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、一般的な炎症マーカーは、神経変性疾患の進行を特定するために使用される。いくつかの実施形態では、神経炎症マーカーは、神経変性疾患の進行を特定するために使用される。いくつかの実施形態では、一般的な炎症マーカーは、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＭＳＡ、ＳＭＡ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＤ、レット症候群、ＣＰ、ＡＳＤ、およびてんかんのいずれかを含む進行性神経変性疾患を特定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、神経炎症マーカーは、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＭＳＡ、ＳＭＡ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＤ、レット症候群、ＣＰ、ＡＳＤ、およびてんかんのいずれかを含む進行性神経変性疾患を特定するために使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの一般的な炎症マーカーは、神経変性疾患において調節される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの一般的な炎症マーカーは、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＭＳＡ、ＳＭＡ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＤ、レット症候群、ＣＰ、ＡＳＤ、およびてんかんのいずれかにおいて調節される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの神経炎症マーカーは、神経変性疾患において調節される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの神経炎症マーカーは、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＭＳＡ、ＳＭＡ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＤ、レット症候群、ＣＰ、ＡＳＤ、およびてんかんのいずれかにおいて調節される。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患において調節される一般的な炎症マーカーは、ＭＨＣＩＩ、ＩＢＡ−１、もしくはＣＤ１６３、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＣＩＩ、ＩＢＡ−１、およびＣＤ１６３、またはこれらの組み合わせから選択される一般的な炎症マーカーは、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＭＳＡ、ＳＭＡ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＤ、レット症候群、ＣＰ、ＡＳＤ、およびてんかんにおいて調節される。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣＩＩ、ＩＢＡ−１、およびＣＤ１６３、またはこれらの組み合わせから選択される一般的な炎症マーカーは、ＡＬＳ、ＦＴＤ、ＭＳＡ、ＳＭＡ、ＭＳ、ＰＤ、ＡＤ、レット症候群、ＣＰ、ＡＳＤ、およびてんかんを含む神経変性疾患の進行を特定するために使用される。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、神経栄養因子、または炎症因子、またはアポトーシス促進因子、または対象における炎症因子に影響を与える因子を調節する方法は、本明細書に記載されるように、本明細書に記載される治療有効量のエキソソームまたはその組成物の投与を含み、投与は、対象に免疫調節効果を提供する。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、免疫調節効果は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、もしくはＴ制御性（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、もしくはＩＦＮ−ガンマ分泌の減少、またはＴＮＦアルファ分泌の減少、またはこれらの組み合わせを含む。
【０３１８】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、神経栄養因子、または炎症因子、またはアポトーシス促進因子、またはそれを必要とする対象における炎症因子に影響を与える因子を調節する方法は、対象における免疫調節効果、例えば、これらに限定されないが、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、もしくはＴ制御性（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、もしくはＩＦＮ−ガンマ分泌の減少、もしくはＴＮＦアルファ分泌の減少、またはこれらの組み合わせを提供することを含む。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、制御性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導を提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、減少したＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖を提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、減少したＩＦＮ−ガンマ分泌を提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、減少したＴＮＦ−アルファ分泌を提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、制御性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、ＩＦＮ−ガンマ分泌の減少、もしくはＴＮＦ−アルファ分泌の減少、またはこれらの任意の組み合わせを含む免疫調節効果の組み合わせを提供する。いくつかの実施形態では、精製されたエキソソームまたはそれらの組成物を投与する方法は、制御性Ｔ（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖の減少、ＩＦＮ−ガンマ分泌の減少、およびＴＮＦ−アルファ分泌の減少を含む免疫調節効果の組み合わせを提供する。
【０３２０】
神経炎症障害は、脳炎（感染性および自己免疫性）、脱髄性障害、免疫媒介性運動障害、遺伝性自己炎症ＣＮＳ障害、血管炎、およびその他の雑多な障害を含む広域の多様な障害を表す。神経炎症障害のマーカー（神経炎症バイオマーカー）は、ｓＣＤ２７受容体、キチナーゼ３様１タンパク質、およびキチナーゼ３様２タンパク質を含むが、これらに限定されない。当業者は、用語「キチナーゼ３様１タンパク質」が、「ＹＫＬ−４０」または「ＣＨＩ３Ｌ１から発現されるポリペプチド」と交換可能に使用され得、すべて同じ意味および品質を有することを認識するであろう。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、一般的な炎症バイオマーカーもしくは神経炎症バイオマーカー、またはこれらの組み合わせを検出することは、該単離された細胞型特異的エキソソームの投与が炎症を低減するかどうかを測定する。いくつかの実施形態では、一般的な炎症バイオマーカーもしくは神経炎症バイオマーカー、またはこれらの組み合わせを検出することは、該単離された細胞型特異的エキソソームの投与が皮質、もしくは海馬、もしくは扁桃体、またはこれらの組み合わせにおけるα−シヌクレイン封入体の数を低減するかどうかを測定する。いくつかの実施形態では、一般的な炎症バイオマーカーもしくは神経炎症バイオマーカー、またはこれらの組み合わせを検出することは、該単離された細胞型特異的エキソソームの投与がα−シヌクレイン封入体誘導性行動欠陥の発生を低減するかどうかを測定する。いくつかの実施形態では、一般的な炎症バイオマーカーもしくは神経炎症バイオマーカー、またはこれらの組み合わせを検出することは、該単離され改変されたＭＳＣエキソソームまたは単離された細胞型特異的エキソソームの投与が、ＴＨ＋およびニッスル＋ニューロンにおけるドーパミン作動性末端の喪失を変えるかどうかを測定する。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、神経栄養もしくは炎症因子またはアポトーシス促進因子または対象において炎症因子に影響を与える因子を調節するための方法が、本明細書に提供され、方法は、治療有効量の単離され改変されたＭＳＣエキソソームを該対象に投与することを含む。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、神経栄養もしくは炎症因子、またはアポトーシス促進因子、または対象において炎症因子に影響を与える因子を調節するための方法が、本明細書に提供され、方法は、治療有効量の単離された細胞型特異的エキソソームを該対象に投与することを含み、該細胞型は、少なくとも１つの神経栄養因子（ＮＴＦ）を分泌するように誘導されている分化したＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を含み、該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌は、分化していないＭＳＣにおける該少なくとも１つのＮＴＦの基礎分泌と比較して、該ＭＳＣ−ＮＴＦにおいてより大きい。
【０３２４】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」および「治療」は、予防的または防止的手段を含む、治療的処置を包含でき、目的は、疾患または状態に関連する望ましくない生理学的変化を防止または減速（減少）させることである。有益なまたは望ましい臨床結果には、検出可能であろうと検出不可能であろうと、症状の軽減、疾患または病態の程度の低下、疾患または病態の安定化（すなわち、疾患または病態が悪化しない場合）、遅延または遅延、疾患または病態の進行、疾患または病態の改善または緩和、および疾患または病態の寛解（部分的であろうと全体的であろうと）が含まれるが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することも意味できる。治療を必要とするものは、疾患もしくは状態を有しやすいもの、または疾患もしくは状態が防止されるべきものと同様に、すでに疾患もしくは状態を有するものを含む。
【０３２５】
別の態様では、上に詳細に記載されるように、本明細書で提供される技術は、それを必要とする対象における神経変性疾患を治療する方法をさらに提供し、方法は、対象に、ＭＳＣ  ＮＴＦに由来する治療有効量の単離されたエキソソーム集団を含む薬学的組成物を投与するステップを含む。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５、ニュールツリン（ＮＴＮ）、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、アルテミン（ＡＲＴ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）、増殖および分化因子（ＧＤＦ−１５）、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質としても知られる）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、ならびに線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、もしくはＴＮＦＳＦ１４、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＬＩＦタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＶＥＧＦＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＧＤＦ１５タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＬＩＦおよびＶＥＧＦＡタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＬＩＦおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＶＥＧＦＡおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、少なくとも別のタンパク質と、を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む。いくつかの実施形態では、神経変性疾患を治療する方法において投与される単離されたエキソソーム集団は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、上に詳細に記載されるＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する治療有効量の単離されたエキソソーム集団を含む薬学的組成物も、本明細書に提供される。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦを含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５、ニュールツリン（ＮＴＮ）、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、アルテミン（ＡＲＴ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）、増殖および分化因子（ＧＤＦ−１５）、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質（ＴＳＧ−６、ＴＮＦ刺激遺伝子６タンパク質としても知られる）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、ならびに線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、もしくはＴＮＦＳＦ１４、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＬＩＦタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＶＥＧＦＡタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＧＤＦ１５タンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＬＩＦおよびＶＥＧＦＡタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＬＩＦおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＶＥＧＦＡおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、少なくとも別のタンパク質と、を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む、単離されたエキソソーム集団を含む。
【０３３３】
別の態様では、本明細書で提供される技術は、細胞におけるタンパク質のレベルを増加させる方法をさらに提供し、方法は、タンパク質を含む単離されたエキソソームと細胞を接触させるステップを含み、タンパク質は、ＮＴＦを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦを含む、単離されたエキソソーム集団と細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦの組み合わせを含む、単離されたエキソソーム集団と細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＬＩＦ、ＧＤＦ１５、およびＶＥＧＦＡの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＬＩＦおよびＶＥＧＦＡの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＧＤＦ１５およびＶＥＧＦＡの組み合わせを含む。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、方法は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む、単離されたエキソソーム集団と細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、もしくはＴＮＦＳＦ１４、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＬＩＦ、ＧＤＦ１５、およびＶＥＧＦＡの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＬＩＦおよびＶＥＧＦＡの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＧＤＦ１５およびＶＥＧＦＡの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＬＩＦ、ＧＤＦ１５、およびＶＥＧＦＡの組み合わせを含み、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ１３またはＣＸＣＬ１タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＬＩＦ、ＧＤＦ１５、およびＶＥＧＦＡの組み合わせを含み、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ１３およびＣＸＣＬ１タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＬＩＦおよびＶＥＧＦＡの組み合わせを含み、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ１３または／およびＣＸＣＬ１タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＧＤＦ１５およびＶＥＧＦＡの組み合わせを含み、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ１３および／またはＣＸＣＬ１タンパク質を含む。
【０３３５】
ある特定の実施形態では、細胞は、人体内にある。ある特定の実施形態では、細胞は、エクスビボにある。
【０３３６】
ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＴＮＦＳＦ１４をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＩＬ３６Ａをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＣＬ７をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＭＭＰ１０をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＰＩＦＧをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＸＣＬ８をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＬＴＡをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＬＩＦをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＸＣＬ１をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＸＣＬ６をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＭＭＰ３をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＨＩ３Ｌ１をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＩＬ１１をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＦＧＦ２をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＸＣＬ５をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＧＡＳ１をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＪＡＭＬをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＴＧＦＢＲ３をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＭＥＰＥをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＩＬ６をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＰＤＧＦＡをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＣＬ４をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＣＬ２１をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＩＬ１３をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＶＥＧＦＡをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＣＬ２をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＭＩＦをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＧＤＦ１５をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＰＬＡＵをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＡＮＧＰＴＬ４をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＴＳＢをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＢＳＧをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＣＣＬ５をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＴＰＯをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＩＬ２３をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＩＬ１ＲＬ１をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＳＰＰ１をさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質Ｆ１１Ｒをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＩＮＨＢＡをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＦＡＰをさらに含む。ある特定の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＬＩＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＩＬ１３、ＶＥＧＦＡ、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＧＤＦ１５、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、およびＦＡＰをさらに含む。
【０３３７】
別の態様では、本明細書に提供される技術は、細胞において遺伝子の発現レベルを調節する方法をさらに提供し、方法は、細胞を本明細書の上に記載される単離されたエキソソーム集団と接触させるステップを含み、発現レベルが調節される遺伝子は、ＥＮＳＧ０００００２０４７１１、ＥＮＳＧ０００００１３４６６８、ＥＮＳＧ０００００１７５８９９、ＥＮＳＧ０００００２７８９１０、ＥＮＳＧ０００００１３１０９５、ＥＮＳＧ０００００１０２３５９、ＥＮＳＧ０００００２６１３７１、ＥＮＳＧ００００００９１５８３、ＥＮＳＧ０００００１９７６３２、ＥＮＳＧ０００００１１３２６３、ＥＮＳＧ０００００２５０９９３、ＥＮＳＧ０００００２５９０７０、ＥＮＳＧ０００００１１７３１８、ＥＮＳＧ０００００２６６９２８、ＥＮＳＧ０００００１９６６３９、ＥＮＳＧ０００００１６４８５０、ＥＮＳＧ０００００１８８４０４、ＥＮＳＧ０００００１０５８２５、ＥＮＳＧ０００００１９８７９６、ＥＮＳＧ０００００１６５８９９、ＥＮＳＧ０００００２０４２７７、ＥＮＳＧ０００００１４２７４８、ＥＮＳＧ０００００２４８４６１、ＥＮＳＧ０００００１８８５０１、ＥＮＳＧ０００００２５０５３８、ＥＮＳＧ０００００１３６８６９、ＥＮＳＧ０００００１２５９６８、ＥＮＳＧ０００００１３１０９４、ＥＮＳＧ０００００１０５５５９、ＥＮＳＧ０００００１３５５４７、ＥＮＳＧ０００００１４０８５３、ＥＮＳＧ０００００１３４５３１、ＥＮＳＧ０００００１０８６９１、ＥＮＳＧ０００００２３５８８４、ＥＮＳＧ０００００２０５４０３、ＥＮＳＧ０００００２６７２８０、ＥＮＳＧ０００００１６５９８５、ＥＮＳＧ０００００１７２５４８、ＥＮＳＧ０００００２５７４４６、ＥＮＳＧ０００００１８０８０１、ＥＮＳＧ０００００１３８７９８、ＥＮＳＧ０００００１１６７４５、ＥＮＳＧ０００００１０７９８４、ＥＮＳＧ０００００１２２５８５、ＥＮＳＧ０００００１２８２８３、ＥＮＳＧ００００００８９３２７、ＥＮＳＧ０００００１３９１５５、ＥＮＳＧ０００００１８３６９１、ＥＮＳＧ０００００１４７０４１、ＥＮＳＧ０００００１８４５５７、ＥＮＳＧ０００００１２１０６８、ＥＮＳＧ０００００１０１８２５、ＥＮＳＧ０００００１３７８３４、ＥＮＳＧ００００００８７５１０、ＥＮＳＧ０００００１８５１４９、ＥＮＳＧ０００００１６３２５１、ＥＮＳＧ０００００１５３９７６、ＥＮＳＧ００００００９９８６０、ＥＮＳＧ０００００１０６３６６、ＥＮＳＧ０００００１２８３４２、ＥＮＳＧ００００００２６５０８、ＥＮＳＧ０００００１６４４８８、ＥＮＳＧ０００００１０９０９９、ＥＮＳＧ０００００１７７３３７、ＥＮＳＧ０００００１６８８７４、ＥＮＳＧ０００００２６２００１、ＥＮＳＧ０００００１７５４４５、ＥＮＳＧ０００００１３１２０３、ＥＮＳＧ０００００２６８０８９、ＥＮＳＧ０００００１３８３１６、ＥＮＳＧ０００００１２２４２０、ＥＮＳＧ０００００１６７３０６、ＥＮＳＧ０００００１０９８４６、ＥＮＳＧ０００００１３１７２４、ＥＮＳＧ０００００１０６８２３、ＥＮＳＧ０００００１４２０８９、ＥＮＳＧ０００００１００３１１、ＥＮＳＧ０００００２２２０４１、ＥＮＳＧ０００００２６７５１９、ＥＮＳＧ０００００１５２０４９、ＥＮＳＧ０００００１１５８４４、ＥＮＳＧ０００００１７２９６５、ＥＮＳＧ０００００１９７４６７、ＥＮＳＧ０００００２０３８０５、ＥＮＳＧ０００００１８３２３０、ＥＮＳＧ０００００１５４２７４、ＥＮＳＧ０００００１２１２３６、ＥＮＳＧ０００００１７７３５９、ＥＮＳＧ０００００１６６１０６、ＥＮＳＧ０００００１４５６２３、ＥＮＳＧ０００００１８２６０１、ＥＮＳＧ０００００２１３６９４、ＥＮＳＧ０００００００５０５９、ＥＮＳＧ００００００７８０８１、ＥＮＳＧ０００００１３５４０６、ＥＮＳＧ０００００１３８４９６、ＥＮＳＧ０００００１１６１３２、ＥＮＳＧ０００００１０５９７４、ＥＮＳＧ０００００１３８８２９、ＥＮＳＧ０００００１１９９１７、ＥＮＳＧ０００００１１０８５２、ＥＮＳＧ０００００２６２４８４、ＥＮＳＧ００００００８０６４４、ＥＮＳＧ０００００１９７８４７、ＥＮＳＧ０００００２１３６５４、ＥＮＳＧ０００００２０３６８８、ＥＮＳＧ０００００１９６２１８、ＥＮＳＧ０００００２２１８１８、ＥＮＳＧ０００００１０６３２７、ＥＮＳＧ０００００２７９２３２、ＥＮＳＧ０００００１４４４８５、ＥＮＳＧ０００００２６０９４１、ＥＮＳＧ０００００２１５５９５、ＥＮＳＧ０００００２５１１６１、ＥＮＳＧ０００００１８２３４８、ＥＮＳＧ０００００１３１４８０、ＥＮＳＧ０００００２４５９０４、ＥＮＳＧ０００００１４３３５５、ＥＮＳＧ００００００８９８４７、ＥＮＳＧ０００００２５８７０１、ＥＮＳＧ０００００２０５０３８、ＥＮＳＧ０００００２２４４２０、ＥＮＳＧ０００００２７６４４５、ＥＮＳＧ００００００９９１３９、ＥＮＳＧ０００００２４４１５１、ＥＮＳＧ０００００１３５２４８、ＥＮＳＧ０００００１６２６９２、ＥＮＳＧ０００００２０４８３９、ＥＮＳＧ０００００１９６１０４、ＥＮＳＧ０００００１４３１１０、ＥＮＳＧ０００００１３３２４６、ＥＮＳＧ０００００１７９８４６、ＥＮＳＧ０００００１９８１０５、ＥＮＳＧ０００００２１５４７５、ＥＮＳＧ０００００１９７５８４、ＥＮＳＧ０００００１７０３８１、ＥＮＳＧ０００００１００３４６、ＥＮＳＧ０００００１７１７８６、ＥＮＳＧ０００００２４４２４２、ＥＮＳＧ０００００２８０４２２、ＥＮＳＧ０００００１０２０５７、ＥＮＳＧ００００００９１５３６、ＥＮＳＧ０００００１０００２４、ＥＮＳＧ０００００１３０２２２、ＥＮＳＧ０００００１６８９５２、ＥＮＳＧ０００００１１１６４４、ＥＮＳＧ０００００１１５５５６、ＥＮＳＧ０００００１８０４２２、ＥＮＳＧ０００００００７３７２、ＥＮＳＧ０００００２７２４４９、ＥＮＳＧ００００００３８２９５、ＥＮＳＧ０００００２６２２２３、ＥＮＳＧ０００００１１１２１８、ＥＮＳＧ０００００２７２５４９、ＥＮＳＧ０００００１７２８２８、ＥＮＳＧ０００００１０７７３６、ＥＮＳＧ０００００１６６３５９、ＥＮＳＧ０００００２６８０４１、ＥＮＳＧ００００００９９７６９、ＥＮＳＧ０００００２３３１９８、ＥＮＳＧ０００００２８０２２９、ＥＮＳＧ０００００１７２２３２、ＥＮＳＧ０００００１３１４７１、ＥＮＳＧ０００００２６０６９５、ＥＮＳＧ０００００２５５０３１、ＥＮＳＧ０００００１８０５４９、ＥＮＳＧ０００００１６９８３６、ＥＮＳＧ０００００２６０９７８、ＥＮＳＧ０００００１３４５９５、ＥＮＳＧ０００００２７０３９３、ＥＮＳＧ０００００１８８４２５、ＥＮＳＧ０００００１６２４９６、ＥＮＳＧ０００００１１８７２９、ＥＮＳＧ０００００２１３９８１、ＥＮＳＧ０００００２３４３５０、ＥＮＳＧ０００００２３７２５０、ＥＮＳＧ０００００２７３０６４、ＥＮＳＧ００００００５８３３５、ＥＮＳＧ０００００１７９５６４、ＥＮＳＧ０００００２７２８６６、ＥＮＳＧ０００００１７４６１１、ＥＮＳＧ０００００１３２６９２、ＥＮＳＧ０００００１０００６０、ＥＮＳＧ０００００２７５８１２、ＥＮＳＧ０００００１０１２０３、ＥＮＳＧ０００００１４３８５８、ＥＮＳＧ０００００１２９７５７、ＥＮＳＧ０００００１９７９２１、ＥＮＳＧ０００００１５４０８０、ＥＮＳＧ０００００１７０９８９、ＥＮＳＧ０００００１６５８０５、ＥＮＳＧ０００００２３７９４１、ＥＮＳＧ０００００２２６４７６、ＥＮＳＧ００００００１８６２５、ＥＮＳＧ０００００１９８７３２、ＥＮＳＧ０００００１４８７３４、ＥＮＳＧ０００００１７３６７３、ＥＮＳＧ０００００２３１８２７、ＥＮＳＧ０００００１４２４９４、ＥＮＳＧ０００００１１２２３８、ＥＮＳＧ０００００１８４２２１、ＥＮＳＧ０００００１７７４６８、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦを含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、もしくはＴＮＦＳＦ１４、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＬＩＦタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＶＥＧＦＡタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＧＤＦ１５タンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＬＩＦおよびＶＥＧＦＡタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＬＩＦおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＶＥＧＦＡおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、少なくとも別のタンパク質と、を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む、単離されたエキソソームと接触する。
【０３４１】
ある特定の実施形態では、細胞は、人体内にある。ある特定の実施形態では、細胞は、エクスビボにある。
【０３４２】
ある特定の実施形態では、方法は、ＥＮＳＧ０００００２０４７１１、ＥＮＳＧ０００００１３４６６８、ＥＮＳＧ０００００１７５８９９、ＥＮＳＧ０００００２７８９１０、ＥＮＳＧ０００００１３１０９５、ＥＮＳＧ０００００１０２３５９、ＥＮＳＧ０００００２６１３７１、ＥＮＳＧ００００００９１５８３、ＥＮＳＧ０００００１９７６３２、ＥＮＳＧ０００００１１３２６３、ＥＮＳＧ０００００２５０９９３、ＥＮＳＧ０００００２５９０７０、ＥＮＳＧ０００００１１７３１８、ＥＮＳＧ０００００２６６９２８、ＥＮＳＧ０００００１９６６３９、ＥＮＳＧ０００００１６４８５０、ＥＮＳＧ０００００１８８４０４、ＥＮＳＧ０００００１０５８２５、ＥＮＳＧ０００００１９８７９６、ＥＮＳＧ０００００１６５８９９、ＥＮＳＧ０００００２０４２７７、ＥＮＳＧ０００００１４２７４８、ＥＮＳＧ０００００２４８４６１、ＥＮＳＧ０００００１８８５０１、ＥＮＳＧ０００００２５０５３８、ＥＮＳＧ０００００１３６８６９、ＥＮＳＧ０００００１２５９６８、ＥＮＳＧ０００００１３１０９４、ＥＮＳＧ０００００１０５５５９、ＥＮＳＧ０００００１３５５４７、ＥＮＳＧ０００００１４０８５３、ＥＮＳＧ０００００１３４５３１、ＥＮＳＧ０００００１０８６９１、ＥＮＳＧ０００００２３５８８４、ＥＮＳＧ０００００２０５４０３、ＥＮＳＧ０００００２６７２８０、ＥＮＳＧ０００００１６５９８５、ＥＮＳＧ０００００１７２５４８、ＥＮＳＧ０００００２５７４４６、ＥＮＳＧ０００００１８０８０１、ＥＮＳＧ０００００１３８７９８、ＥＮＳＧ０００００１１６７４５、ＥＮＳＧ０００００１０７９８４、ＥＮＳＧ０００００１２２５８５、ＥＮＳＧ０００００１２８２８３、ＥＮＳＧ００００００８９３２７、ＥＮＳＧ０００００１３９１５５、ＥＮＳＧ０００００１８３６９１、ＥＮＳＧ０００００１４７０４１、ＥＮＳＧ０００００１８４５５７、ＥＮＳＧ０００００１２１０６８、ＥＮＳＧ０００００１０１８２５、ＥＮＳＧ０００００１３７８３４、ＥＮＳＧ００００００８７５１０、ＥＮＳＧ０００００１８５１４９、ＥＮＳＧ０００００１６３２５１、ＥＮＳＧ０００００１５３９７６、ＥＮＳＧ００００００９９８６０、ＥＮＳＧ０００００１０６３６６、ＥＮＳＧ０００００１２８３４２、ＥＮＳＧ００００００２６５０８、ＥＮＳＧ０００００１６４４８８、ＥＮＳＧ０００００１０９０９９、ＥＮＳＧ０００００１７７３３７、ＥＮＳＧ０００００１６８８７４、ＥＮＳＧ０００００２６２００１、ＥＮＳＧ０００００１７５４４５、ＥＮＳＧ０００００１３１２０３、ＥＮＳＧ０００００２６８０８９、ＥＮＳＧ０００００１３８３１６、ＥＮＳＧ０００００１２２４２０、ＥＮＳＧ０００００１６７３０６、ＥＮＳＧ０００００１０９８４６、ＥＮＳＧ０００００１３１７２４、ＥＮＳＧ０００００１０６８２３、ＥＮＳＧ０００００１４２０８９、ＥＮＳＧ０００００１００３１１、ＥＮＳＧ０００００２２２０４１、ＥＮＳＧ０００００２６７５１９、ＥＮＳＧ０００００１５２０４９、ＥＮＳＧ０００００１１５８４４、ＥＮＳＧ０００００１７２９６５、ＥＮＳＧ０００００１９７４６７、ＥＮＳＧ０００００２０３８０５、ＥＮＳＧ０００００１８３２３０、ＥＮＳＧ０００００１５４２７４、ＥＮＳＧ０００００１２１２３６、ＥＮＳＧ０００００１７７３５９、ＥＮＳＧ０００００１６６１０６、ＥＮＳＧ０００００１４５６２３、ＥＮＳＧ０００００１８２６０１、ＥＮＳＧ０００００２１３６９４、ＥＮＳＧ０００００００５０５９、ＥＮＳＧ００００００７８０８１、ＥＮＳＧ０００００１３５４０６、ＥＮＳＧ０００００１３８４９６、ＥＮＳＧ０００００１１６１３２、ＥＮＳＧ０００００１０５９７４、ＥＮＳＧ０００００１３８８２９、ＥＮＳＧ０００００１１９９１７、ＥＮＳＧ０００００１１０８５２、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の発現レベルを増加させることを含む。
【０３４３】
ある特定の実施形態では、方法は、ＥＮＳＧ０００００２６２４８４、ＥＮＳＧ００００００８０６４４、ＥＮＳＧ０００００１９７８４７、ＥＮＳＧ０００００２１３６５４、ＥＮＳＧ０００００２０３６８８、ＥＮＳＧ０００００１９６２１８、ＥＮＳＧ０００００２２１８１８、ＥＮＳＧ０００００１０６３２７、ＥＮＳＧ０００００２７９２３２、ＥＮＳＧ０００００１４４４８５、ＥＮＳＧ０００００２６０９４１、ＥＮＳＧ０００００２１５５９５、ＥＮＳＧ０００００２５１１６１、ＥＮＳＧ０００００１８２３４８、ＥＮＳＧ０００００１３１４８０、ＥＮＳＧ０００００２４５９０４、ＥＮＳＧ０００００１４３３５５、ＥＮＳＧ００００００８９８４７、ＥＮＳＧ０００００２５８７０１、ＥＮＳＧ０００００２０５０３８、ＥＮＳＧ０００００２２４４２０、ＥＮＳＧ０００００２７６４４５、ＥＮＳＧ００００００９９１３９、ＥＮＳＧ０００００２４４１５１、ＥＮＳＧ０００００１３５２４８、ＥＮＳＧ０００００１６２６９２、ＥＮＳＧ０００００２０４８３９、ＥＮＳＧ０００００１９６１０４、ＥＮＳＧ０００００１４３１１０、ＥＮＳＧ０００００１３３２４６、ＥＮＳＧ０００００１７９８４６、ＥＮＳＧ０００００１９８１０５、ＥＮＳＧ０００００２１５４７５、ＥＮＳＧ０００００１９７５８４、ＥＮＳＧ０００００１７０３８１、ＥＮＳＧ０００００１００３４６、ＥＮＳＧ０００００１７１７８６、ＥＮＳＧ０００００２４４２４２、ＥＮＳＧ０００００２８０４２２、ＥＮＳＧ０００００１０２０５７、ＥＮＳＧ００００００９１５３６、ＥＮＳＧ０００００１０００２４、ＥＮＳＧ０００００１３０２２２、ＥＮＳＧ０００００１６８９５２、ＥＮＳＧ０００００１１１６４４、ＥＮＳＧ０００００１１５５５６、ＥＮＳＧ０００００１８０４２２、ＥＮＳＧ０００００００７３７２、ＥＮＳＧ０００００２７２４４９、ＥＮＳＧ００００００３８２９５、ＥＮＳＧ０００００２６２２２３、ＥＮＳＧ０００００１１１２１８、ＥＮＳＧ０００００２７２５４９、ＥＮＳＧ０００００１７２８２８、ＥＮＳＧ０００００１０７７３６、ＥＮＳＧ０００００１６６３５９、ＥＮＳＧ０００００２６８０４１、ＥＮＳＧ００００００９９７６９、ＥＮＳＧ０００００２３３１９８、ＥＮＳＧ０００００２８０２２９、ＥＮＳＧ０００００１７２２３２、ＥＮＳＧ０００００１３１４７１、ＥＮＳＧ０００００２６０６９５、ＥＮＳＧ０００００２５５０３１、ＥＮＳＧ０００００１８０５４９、ＥＮＳＧ０００００１６９８３６、ＥＮＳＧ０００００２６０９７８、ＥＮＳＧ０００００１３４５９５、ＥＮＳＧ０００００２７０３９３、ＥＮＳＧ０００００１８８４２５、ＥＮＳＧ０００００１６２４９６、ＥＮＳＧ０００００１１８７２９、ＥＮＳＧ０００００２１３９８１、ＥＮＳＧ０００００２３４３５０、ＥＮＳＧ０００００２３７２５０、ＥＮＳＧ０００００２７３０６４、ＥＮＳＧ００００００５８３３５、ＥＮＳＧ０００００１７９５６４、ＥＮＳＧ０００００２７２８６６、ＥＮＳＧ０００００１７４６１１、ＥＮＳＧ０００００１３２６９２、ＥＮＳＧ０００００１０００６０、ＥＮＳＧ０００００２７５８１２、ＥＮＳＧ０００００１０１２０３、ＥＮＳＧ０００００１４３８５８、ＥＮＳＧ０００００１２９７５７、ＥＮＳＧ０００００１９７９２１、ＥＮＳＧ０００００１５４０８０、ＥＮＳＧ０００００１７０９８９、ＥＮＳＧ０００００１６５８０５、ＥＮＳＧ０００００２３７９４１、ＥＮＳＧ０００００２２６４７６、ＥＮＳＧ００００００１８６２５、ＥＮＳＧ０００００１９８７３２、ＥＮＳＧ０００００１４８７３４、ＥＮＳＧ０００００１７３６７３、ＥＮＳＧ０００００２３１８２７、ＥＮＳＧ０００００１４２４９４、ＥＮＳＧ０００００１１２２３８、ＥＮＳＧ０００００１８４２２１、ＥＮＳＧ０００００１７７４６８、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子の発現レベルを減少させることを含む。
【０３４４】
別の態様では、本明細書で提供される技術は、細胞におけるＫｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）経路を調節する方法をさらに提供し、方法は、上に詳細に記載されるように、細胞をＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来する単離されたエキソソーム集団と接触させるステップを含み、
【０３４５】
ここで、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４５１０、ｈｓａ０４５１２、ｈｓａ０４１１５、ｈｓａ０５２００、ｈｓａ０４１１０、ｈｓａ０５２２２、ｈｓａ０５２２４、ｈｓａ０５１００、ｈｓａ０５４１２、ｈｓａ０４１５１、ｈｓａ０５２０５、ｈｓａ０４１４１、ｈｓａ０５２１５、ｈｓａ０４９３３、ｈｓａ０４５２０、ｈｓａ０４３９０、ｈｓａ０５１６１、ｈｓａ０１５２１、ｈｓａ０４２１０、ｈｓａ０３４６０、ｈｓａ０４１４２、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦを含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、ＮＴＦは、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ニューロトロフィン−４／５、ＮＴＮ、ニューロトロフィン−４、ペルセフィン、ＡＲＴ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＧＤＦ−１５、Ｇ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＴＳＧ−６、ＢＭＰ２、およびＦＧＦ２、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも別のタンパク質は、ＩＬ３６Ａ、ＣＣＬ７、ＭＭＰ１０、ＰＩＦＧ、ＣＸＣＬ８、ＬＴＡ、ＣＸＣＬ６、ＭＭＰ３、ＣＨＩ３Ｌ１、ＩＬ１１、ＦＧＦ２、ＣＸＣＬ５、ＧＡＳ１、ＪＡＭＬ、ＴＧＦＢＲ３、ＭＥＰＥ、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡ、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２、ＭＩＦ、ＰＬＡＵ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＣＴＳＢ、ＢＳＧ、ＣＣＬ５、ＴＰＯ、ＩＬ２３、ＩＬ１ＲＬ１、ＳＰＰ１、Ｆ１１Ｒ、ＩＮＨＢＡ、ＦＡＰ、ＳＰＩＮＴ２、ＩＬ３６Ｇ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、もしくはＴＮＦＳＦ１４、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＬＩＦタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＶＥＧＦＡタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＧＤＦ１５タンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＬＩＦおよびＶＥＧＦＡタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＬＩＦおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＶＥＧＦＡおよびＧＤＦ１５タンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して増加した量のＮＴＦおよび少なくとも別のタンパク質を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、少なくとも別のタンパク質と、を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む、単離されたエキソソームと接触する。いくつかの実施形態では、細胞は、対照ＭＳＣから単離されたエキソソームと比較して、ＬＩＦ、もしくはＶＥＧＦＡ、もしくはＧＤＦ１５タンパク質、またはこれらの任意の組み合わせを含む増加した量のＮＴＦと、ＩＬ１３もしくはＣＸＣＬ１、またはこれらの任意の組み合わせを含む少なくとも別のタンパク質と、を含む、単離されたエキソソームと接触する。
【０３４９】
ある特定の実施形態では、細胞は、人体内にある。ある特定の実施形態では、細胞は、エクスビボにある。
【０３５０】
ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４５１０である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４５１２である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４１１５である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０５２００である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４１１０である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０５２２２である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０５２２４である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０５１００である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０５４１２である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４１５１である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０５２０５である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４１４１である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０５２１５である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４９３３である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４５２０である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４３９０である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０５１６１である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０１５２１である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４２１０である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０３４６０である。ある特定の実施形態では、ＫＥＧＧ経路は、ｈｓａ０４１４２である。
【実施例】
【０３５１】
実施例１
ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの生産、精製、および特徴付け
【０３５２】
目的：細胞型特異的ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを生産する。この実施例はＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの生産を記載するが、ＭＳＣ由来のエキソソームは、本明細書に記載される方法とＭＳＣまたは遺伝学的に改変されたＭＳＣとを使用して同様に単離され得ることが、予想される。
【０３５３】
方法：
【０３５４】
分化したヒトＢＭ−ＭＳＣ（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の調製物ならびにエキソソームの生産および精製
【０３５５】
ヒト骨髄ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）の単離のための方法は、当該技術分野で周知であり、その全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１２１８５９号および同第ＷＯ２０１４／０２４１８３号に完全に記載される。
【０３５６】
骨髄試料（５０〜１００ｍｌ）を、健常成人ドナーの腸骨稜から骨髄吸引によりヘパリン含有チューブに回収した。骨髄穿刺液をＤＭＥＭで１：１希釈し、単核細胞をフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ）含有チューブ上で密度遠心分離（１０００×Ｇで２０分間）によって分離した。単核細胞画分を、回収し、ＤＭＥＭ中で洗浄した。細胞を、１０％の血小板溶解物（ＰＭ、以下を参照されたい）を含有する増殖培地に再懸濁させ、トリパンブルー排除色素によって計数し、２チャンバーＣｅｌｌＳｔａｃｋに最大３００，０００細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。フラスコを、３７℃の加湿したインキュベータ中で５％のＣＯ２と共にインキュベートした。
【０３５７】
ＰＭ増殖培地は、Ｌ−グルタミン溶液２００ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）、ピルビン酸ナトリウム溶液１００ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ＩＵ／ｍｌのヘパリン（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、および１０％の血小板溶解物を補充した、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅの培地低グルコース（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）からなった。１６〜２４時間後、ＰＭ培地を吸引して非接着性細胞をフラスコから除去し、接着性細胞を１０ｍｌのＤＭＥＭで穏やかに洗浄し、３０ｍｌの新鮮なＰＭをフラスコに添加した。ｈＭＳＣ細胞を、ＰＭ培地において１２〜１５日間増殖させ、週に２〜３回交換した。１２〜１５日後またはフラスコがコンフルエンスに達した際。細胞を、すべての増殖培地を除去し、３７℃インキュベータにおいて５分間ＴｒｙｐＬＥ．（商標）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてインキュベートすることにより、回収した。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ中で洗浄し、計数し、１５×１０６細胞／ｍｌ／クライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）の濃度でＰＭにおいて１０％のＤＭＳＯに凍結保存した。凍結保存は、液体窒素における。
【０３５８】
いくつかの場合では、反復した骨髄吸引の必要性を回避するために、ＭＳＣを継代Ｐ０、Ｐ１、またはＰ２のいずれかで凍結保存し、複数の新鮮なＭＳＣ−ＮＴＦ細胞用量を、凍結保存されたＭＳＣから生産し、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞への導入前に解凍および増殖した。
【０３５９】
解凍したＭＳＣ培養液を、ＰＭ培地に再懸濁させ、Ｃｅｌｌｓｔａｃｋｓに２０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、分化を、４日後に増殖培地（ＰＭ）を１ｍＭのジブチリル環状アデノシン一リン酸、２０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、５ｎｇ／ｍＬのヒト血小板由来増殖因子、および５０ｎｇ／ｍＬのヒトヘレグリン−β１（Ｓ２Ｍ）を含有する無血清ＤＭＥＭ培地でさらに３日間置き換えることによって誘導した。
【０３６０】
次いで、上記の分化した細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）からの培養培地を次いで回収し、細胞破片および大きな小胞を、０．２２μｍフィルターを通じた濾過によって除去した。エキソソーム含有濾液を、無菌条件下で回収し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。
【０３６１】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞生産ならびにエキソソームの生産および精製をスケールアップ
【０３６２】
エキソソームの製造、分泌、および収量をスケールアップするために、解凍したＭＳＣ培養物を、ＰＭ培地に再懸濁させ、（数日の）増殖のためにＣｅｌｌＳｔａｃｋｓに播種した。次いで、ＭＳＣを、回収し、ＢｉｏＮｏｃＩＩマクロキャリア（ＥｓｃｏＶａｃｃｉＸｃｅｌｌ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）上のＣｅｌＣｒａｄｌｅ（商標）バイオリアクターボトルに、５００ｍｌのＰＭ中に２，０００〜２，６００細胞／ｃｍ２の密度で４日間再播種した。ＰＭを、２日後に交換した。いくつかの実施形態では、４日後、ＰＭを、分化を誘導するために３日間Ｓ２Ｍに交換した。分化プロセスの終わりに、馴化培地を収集し、細胞破片および大きな小胞を、０．２２μｍフィルターを通じた濾過によって除去した。
【０３６３】
エキソソーム含有濾液を、無菌条件下で回収し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。精製されたエキソソームの収量は、ＣｅｌｌＳｔａｃｋｓのみを使用したプロセスから得られた収量の最大約４〜５倍（約７×１０１０）である、約３〜４×１０１１の範囲であった。
【０３６４】
エキソソームの生産および精製のために使用される方法とは独立して、対照エキソソームを、１０％のエキソソームが枯渇した血小板溶解物を有するＤＭＥＭを使用してＭＳＣ細胞から生産して、血小板溶解物由来のエキソソームの可能性のある交絡効果を回避した。血小板溶解物由来エキソソームを、ＰＬから除去して結果に対する交絡効果を回避した。
【０３６５】
興味深いことに、三次元（３Ｄ）細胞製造プロセス（上記のバイオリアクターボトル内の担体上）は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞からのエキソソームの分泌の増加、およびＣｅｌｌＳｔａｃｋｓのみを使用した２Ｄ培養法と比較して、エキソソームの最終精製収量の増加、それぞれ、約３〜４×１０１１の精製されたエキソソーム対約７×１０１０の精製されたエキソソームをもたらした。これは、同様の数の細胞が播種された馴化培地容量から精製されたエキソソームの数の有意差である。
【０３６６】
血小板溶解物の調製物
【０３６７】
血小板溶解物は、当該技術分野で既知である任意の方法を使用して調製され得る。一実施形態では、例えば、血小板溶解物は、以下に提供されるような凍結解凍プロトコルを使用して調製され得る。
【０３６８】
多血小板血漿（ＰＲＰ）は、感染因子（すなわち、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢｓＡｇ）を含まないと決定された血液バンクの寄付からのものであり得る。ＰＲＰ含有バッグを、−８０℃で保存し、３７℃の水浴中で解凍した。解凍後、複数のドナーの多血小板血漿を、プールし、混合し、１４０００×Ｇで１０分間遠心して、血小板粒子および膜を除去した。その後、血小板溶解物上清を、回収し、使用まで−８０℃で凍結させた。血小板溶解物を、エンドトキシン、ヘモグロビン、ｐＨ、総タンパク質、アルブミン、浸透圧無菌性、マイコプラズマについて試験した。
【０３６９】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞特異的エキソソームの単離
【０３７０】
タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）−１００、３００、５００ｋＤａのＭＷＣＯ膜のいずれかを、使用した（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂ）。エキソソーム含有試料（濾液）を、ファイバーシステムを通じて連続的に送り込み、再循環させた。膜小胞内に含まれていないか、または膜小胞に関連しない遊離タンパク質を含む小分子を、膜の細孔を通し、その後、透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅ）として溶出し、最終的に廃棄した。エキソソーム（またはより大きなマイクロベシクル）のような細孔を通過するには大きすぎる分子は、残留液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）として循環し続けた。試料を、ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜よりも小さい汚染物質の試料をさらに枯渇させるために、５回の透析濾過に供した。透析濾過の最終サイクル中に、試料を、約１０ｍｌの体積に低減させた。
【０３７１】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）−高純度エキソソームについて、ＴＦＦの後に、製造業者の指示に従って、ＳＥＣ（Ｅｘｏ−ｓｐｉｎ（商標）ｍｉｄｉカラム、Ｃｅｌｌ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ）を行った。代替的には、ＳＥＣは実行されず、ＴＦＦのステップはエキソソームを単離するのに十分であった。
【０３７２】
回収率が低い場合、溶液中の粒子の層流に基づき、粒子の混合物が流れの方向に垂直なチャネルを通じて推進され、懸濁液に存在する粒子の分離をもたらす、フィールドフローフラクショネーション（ＦＦＦ）を、使用した。ＳＥＣと同様に、ＦＦＦ分離は、エキソソームの流体力学的直径に依存するが、この方法は、広いコロイドサイズの範囲にわたって構成成分を分離できるため、他の分離方法と比較して独特である。
【０３７３】
精製されたエキソソームの特徴付けを、定量化、表現型、カーゴ内容物を含むいくつかのレベルで実行した。
【０３７４】
ナノ粒子追跡解析
【０３７５】
粒子の量およびサイズを、ブラウン運動の下で個々のナノ粒子の動きを追跡するレーザー散乱ビデオ顕微鏡であるＺｅｔａＶｉｅｗナノ粒子追跡解析（ＰａｒｔｉｃｌｅＭｅｔｒｉｘ）を使用して測定した。１１の測定位置での５つの露出を、各資料について記録した。粒子サイズを、ＺｅｔａＶｉｅｗソフトウェア（ＺｅｔａＶｉｅｗ  ８．０２．２８）によりストークス−アインシュタイン方程式に従って計算した。
【０３７６】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
【０３７７】
エキソソームを、２％のパラホルムアルデヒドおよび２％のグルタルアルデヒド中で固定し、２００メッシュのＬａｃｅｙ  Ｆｏｒｍｖａｒ炭素被覆グリッド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ．）上に負荷し、直ちにエタン（ガス）で凍結させた。
【０３７８】
ウエスタンブロット解析
【０３７９】
エキソソームのタンパク質試料は、プロテアーゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液によって調製される。ウエスタンブロット解析は、ＣＤ９、ＣＤ６３、およびＴＳＧ１０１などのエキソソーム特異的マーカーに対して実行される。細胞小胞体にのみ発現および局在化し、エキソソームには存在しないカルネキシンは、陰性マーカーとして試験される。
【０３８０】
ｍｉＲＮＡ発現解析
【０３８１】
エキソソームの総ＲＮＡは、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して調製される。製造業者の標準的な単離手順に従う。
【０３８２】
総エキソソームＲＮＡは、製造業者の指示に従って、ヒトＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡアッセイ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）に対して使用される。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇデータを検証するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析が、実行される。
【０３８３】
タンパク質アレイ
【０３８４】
エキソソームのタンパク質試料は、細胞溶解緩衝液（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＧＡ）によって調製され、サイトカイン、ケモカイン、神経栄養因子、増殖因子のような４４０個のヒト因子を定量的に測定するＲａｙＢｉｏヒトアレイＱ４４０（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）または同様のアレイに供される。アッセイは、製造業者の指示に従って、または製造業者のサービスを用いることによって実行される。
【０３８５】
結果：
【０３８６】
エキソソームのサイズおよび定量
【０３８７】
エキソソームを、ＴＦＦ法を使用してＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の馴化培地から単離した。エキソソームのサイズおよび総数を、ＺｅｔａＶｉｅｗ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅｔｒｉｘ）およびその対応するソフトウェア（ＺｅｔａＶｉｅｗ  ８．０２．２８）を使用して解析した。試料を、ＰＢＳ中で希釈し、ＺｅｔａＶｉｅｗ細胞中に負荷し、機器は、各試料を１１の異なる位置で測定した。試料の濃度と同様に、平均値、中央値（直径として示される）を、計算した（図１を参照されたい）。中央値は、１３２ｎｍ±１６、平均は、１３２．１ｎｍ±１５であった。各測定について、機器の事前取得パラメータを、２３℃の温度と７５の感度に設定した（製造業者により推奨された最適な任意尺度）。
【０３８８】
エキソソームの透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）解析
【０３８９】
ＭＳＣ−ＮＴＦ由来エキソソームの直径がエキソソームについて予想された範囲内（３０〜１５０ｎｍ）であることを決定した後、それらの形状および完全性を、ナノ分子検証のための十分に受け入れられた技法であるＴＥＭイメージングを使用して確認した。エキソソームを、２％のパラホルムアルデヒドおよび２％のグルタルアルデヒド中で固定し、２００メッシュのＬａｃｅｙ  Ｆｏｒｍｖａｒ炭素被覆グリッド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ、Ｉｎｃ．）上に負荷し、直ちにエタン（ガス）で凍結させた。図２Ａ〜２Ｂに提示された画像は、測定されたサイズ範囲内のエキソソームの古典的な形態を有する粒子を示す。
【０３９０】
ニューロンによるエキソソームの取り込み
【０３９１】
エキソソームの主な機能は、それらのカーゴをレシピエント細胞の内側に沈着させる能力である。エキソソームが細胞に侵入する能力を検査するために、エキソソームを２つの異なる蛍光色素：ＲＮＡ選択色素（ＳＹＴＯ（登録商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、または受動的に細胞外小胞に侵入するまで蛍光を発せず、その後活性化して蛍光を発するカルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する膜染色によって染色した。未結合の色素を取り除くために、エキソソームおよび対照を、１０ｋＤａのＭＷＣＯ  Ａｍｉｃｏｎに移した。対照として、色素を、同じプロトコルを使用してエキソソームを用いずにＰＢＳに添加した。
【０３９２】
レシピエント細胞におけるエキソソーム取り込みを評価するために、ｉＰＳＣ運動ニューロン（ＴＤＰ４３変異を担持する）を、染色されたエキソソームと共に一晩インキュベートし、その後、ＦＡＣＳ解析および蛍光顕微鏡法を行い、７０％の細胞において蛍光エキソソームの取り込みを確認した（図３Ａ〜３Ｂ）。
【０３９３】
効力アッセイ：免疫調節
【０３９４】
ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの免疫調節能力を評価するために、マイトジェン誘導性Ｔ細胞増殖に対するそれらの効果を測定した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で事前標識されたプールされたＰＢＭＣを、マイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激し、増加量のＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームで４日間２４ウェルプレート（１×１０６ＰＢＭＣ／ウェル）中で培養した。Ｔ細胞増殖率を、細胞分裂を通じたＣＦＳＥ強度の低減によって決定した。
【０３９５】
さらに、Ｔ制御性細胞（Ｔ−ｒｅｇ）の誘導に対するＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの免疫調節効果も、評価した。ＰＢＭＣをＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの存在下または非存在下で３日間培養し、続けて、Ｔ−ｒｅｇレベルをフローサイトメトリーによって決定した。
【０３９６】
精製されたエキソソームの免疫調節効力を評価するために、活性化したＰＢＭＣを、エキソソーム（３．３×１０１０／ｍｌ）を用いて、または用いずに９６時間共培養し、ＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖（図４Ａ）、ＩＦＮ−γ分泌（図４Ｂ）、およびＴＮＦ−アルファ分泌（図４Ｃ）について検査した。図４Ｄは、フローサイトメトリーによって決定された、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム（４．６×１０９および２．３×１０９）と３日間共培養された２人の異なる健常ドナーからのＰＢＭＣにおけるＴ−ｒｅｇレベルの用量依存的な増加を示す。図４Ｅは、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームと、単一のドナーからのＰＢＭＣからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋（Ｔ−ｒｅｇ）細胞の誘導との間の用量依存的相関を示す。
【０３９７】
ＰＨＡ誘導性ＰＢＭＣがＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの存在下で培養された際に、Ｔ細胞増殖の用量依存的阻害（９３〜２３％の範囲）が、観察され、増加量のエキソソームと相関した（図４Ａ）。ＩＦＮγ（範囲３２〜０．１５％）およびＴＮＦα（範囲１３〜８４％）分泌の同様の範囲用量依存的阻害を、ＥＬＩＳＡで測定した。（図４Ｂ、４Ｃ）。ＩＦＮγおよびＴＮＦαレベルを、ＭＳＣ−ＮＴＦおよびエキソソームの９６時間のインキュベーション後に測定した。
【０３９８】
結論：エキソソームは、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から容易に単離され得、様々な実用品に有益になるような異なる属性を有することがわかる。重要なことに、これらの属性は、生産ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞からのいずれの影響もなく、単離されたエキソソームについて実証されている。
【０３９９】
実施例２
ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームカーゴの改変
【０４００】
目的：ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはタンパク質に対するナノキャリアとしての使用のために、改変されたＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームを調製し、それによりＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの標的化された集団を生産する。分子をそれらの膜内にカプセル化することにより、エキソソームは、タンパク質またはＲＮＡを分解から保護できる。さらに、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームは、特定の標的に対するナノキャリアとして役立つ一方、それらの元の治療可能性を未だに維持する。
【０４０１】
エキソソームをｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはタンパク質送達のためのナノキャリアとして使用することは、顕著な利点を有する。例えば、ニューロンまたはマウスの脳へのｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを負荷されたエキソソームの送達を比較することは、ｓｉＲＮＡが負荷されたエキソソームのより優れた分布および有効性を示している（Ｄｉｄｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  ｍＲＮＡ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２４（１０）１８３６−１８４７、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｘｏｓｏｍｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：３４１−３４５）。
【０４０２】
機能喪失型と機能獲得型の両方のＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームが、調製される。
【０４０３】
方法：
【０４０４】
機能喪失型（サイレンシング）
【０４０５】
自然に分泌された細胞外小胞に合成ｓｉＲＮＡを負荷することは、レシピエント細胞における細胞取り込みおよび標的遺伝子サイレンシングを促進すると示されている。当該技術分野で既知である方法は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームにｓｉＲＮＡを負荷するために使用される（例えば、Ｓ  Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉｃａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．７（１２）：２１１２−２１２６に提示される方法を参照されたい）。
【０４０６】
いくつかの異なるｓｉＲＮＡ配列は、マウスおよびヒトのＭＭＰ９に共通のコード配列に対して設計される。エキソソームは、電気穿孔およびエキソソーム負荷により蛍光標識されたｓｉＲＮＡが負荷され、Ｑｕｂｉｔ  ３．０フルロメーター（ｆｌｕｒｏｍｅｔｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、限外濾過により負荷軽減されたｓｉＲＮＡのクリアランスに続いて評価される。電気穿孔を伴わずにｓｉＲＮＡと混合されたエキソソームは、対照として役立つであろう。
【０４０７】
ｉＰＳＣ由来の運動ニューロンは、ｓｉＲＮＡを負荷されたエキソソームがインビトロでそれらのカーゴを特異的に送達することができるかどうかを評価するために使用される。取り込みは、上の実施例１に示されるように、蛍光顕微鏡（オリンパス）およびフローサイトメトリーを使用して評価される。ＲＴ−ＰＣＲ解析は、標的化エキソソームでの送達がレシピエント細胞において同等の遺伝子ノックダウンを達成するかどうかを実証するために使用される。
【０４０８】
改変されたＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームは、上記の機能モデルにおいて、対照の改変されていないＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ、および対照のＭＳＣ由来のエキソソームと機能的に比較される。
【０４０９】
機能獲得型（過剰発現）
【０４１０】
タンパク質またはｍｉＲＮＡは、当該技術分野で周知であるように、直接またはドナーＭＳＣ細胞の遺伝子工学を通じるいずれかでエキソソームに負荷され、細胞は、挿入された遺伝子または核酸配列によってコードされるタンパク質またはペプチドを合成し、これらのタンパク質またはペプチドは、その後、細胞外小胞（エキソソーム）中に分泌される。
【０４１１】
いくつかの異なる方法は、室温でのインキュベーション、サポニンでの透過処理、凍結解凍サイクル、超音波処理、または押出を含む、エキソソームへの直接的なタンパク質負荷について提案された（例えば、Ｈａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１０（２０７）１８−３０に提示される方法を参照されたい）。
【０４１２】
ｍｉＲＮＡ−７、ＧＤＦ５、ＩＧＦ−１、もしくはＩＧＦ−２、またはこれらの組み合わせのいずれかを、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームに直接負荷する効率は、サポニンでの透過処理または超音波処理（最も効果的であることが見出された方法のうちの２つ）のいずれかによって実行される。ｍｉＲＮＡまたは因子を負荷されると、エキソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、ＥｘｏＳｐｉｎ）を使用して遊離因子またはｍｉＲＮＡから精製される。ＧＤＦ５、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の含有量はＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定され、ｍｉＲＮＡ−７の含有量はＲＴ−ＰＣＲによって測定される。
【０４１３】
エキソソームへのタンパク質の直接トランスフェクションが低い効率をもたらす場合、ｍｉＲＮＡ−７、ＧＤＦ５、ＩＧＦ−１、またはＩＧＦ−２は、ＸＰａｃｋ技術（ＳＢＩ）を使用して、ＭＳＣ細胞において高度に発現される。
【０４１４】
改変されたＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームは、機能喪失型エキソソームに対する上記の機能モデルにおいて、対照の改変されていないＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞、および対照のＭＳＣ由来のエキソソームと機能的に比較される。
【０４１５】
結果：
【０４１６】
上記の方法は、特定の機能喪失型および機能獲得型のＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームを生産するであろうことが、予想される。
【０４１７】
結論：それらの自然な固有の属性に加えて、単離されたエキソソームは、例えば、膜または内部容積内に追加的なカーゴ分子を組み込んで、有益な新しい属性を増強するか、または新しい有益な属性を得ることができる。
【０４１８】
実施例３
改変されたおよび改変されていないＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームのインビトロおよびインビボ特徴付け
【０４１９】
目的：インビトロおよびインビボでの生物学的機能について、改変されたＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームを特徴付ける。
【０４２０】
方法：
【０４２１】
神経保護、炎症の抑制、および改善された機能回復を含む、ＭＳＣ、遺伝学的に改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ由来のエキソソーム、改変されたＭＳＣ由来のエキソソーム、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム、および改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの様々な生物学的機能は、異なるモデルにおいて評価される。
【０４２２】
レシピエント細胞によるエキソソームの標識および取り込み
【０４２３】
エキソソームの主な機能は、それらのカーゴをレシピエント細胞の内側に沈着させる能力である。改変されたエキソソームが細胞に侵入する能力を検査するために、改変されたエキソソームは、改変されていないＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームについての実施例１のように、２つの異なる蛍光色素：ＲＮＡ選択色素（ＳＹＴＯ（登録商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、または受動的に細胞外小胞に侵入するまで蛍光を発せず、その後活性化して蛍光を発するカルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する膜標識によって標識される。改変されたＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームは、運動ニューロンと共に３〜２４時間共培養され、取り込みは、蛍光顕微鏡法（オリンパス）およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、ＦＣ５００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して評価される。
【０４２４】
インビトロ免疫調節
【０４２５】
神経炎症はＡＬＳの顕著な特徴のうちの１つであるため、改変されたＭＳＣ、改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来の、および対照ＭＳＣ由来のエキソソームの免疫調節能力は、活性化ＰＢＭＣアッセイを使用して決定される（改変されていないＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームについての図４Ａ〜４Ｅに示されるように）。３つのパラメータが試験される：ＦＡＣＳ解析を使用するＣＦＳＥアッセイによるＣＤ４＋細胞の増殖の阻害、ＦＡＣＳ解析を使用するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ制御性細胞の誘導、ならびに特定のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのような炎症サイトカインの阻害。対応のないｔ検定またはＡＮＯＶＡが、統計解析のために実行される。
【０４２６】
異なる細胞型におけるインビトロ神経機能アッセイ
【０４２７】
ヒト神経前駆幹細胞
【０４２８】
細胞は、胚性幹細胞（幹細胞技術）またはｉＰＳＣ（未成熟または成熟ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、およびグリア細胞に分化し、神経発生および神経保護に対する優れたアッセイとして機能することができるＡＴＣＣ。）のいずれかに由来する。これらの神経前駆幹細胞は、ＭＳＣ、改変されたＭＳＣ由来のエキソソーム、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム、または改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームを用いて、または用いずに共培養される。
【０４２９】
以下のパラメータが、研究される。
【０４３０】
Ａ．異なる共培養時点での遺伝子およびｍｉＲＮＡ発現（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ）
【０４３１】
Ｂ．神経突起延長（ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｋ（商標）解析ソフトウェア）
【０４３２】
ヒトＤＣＸ−ＧＦＰ細胞（ＡＴＣＣ）は、ＧＦＰが、成人の神経新生の過程で一過性に発現される細胞骨格関連タンパク質であるダブルコルチン（ＤＣＸ）下で発現される、神経前駆細胞である。ＤＣＸ−ＧＦＰ細胞を、ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘ被覆された９６ウェルプレート上に、増殖培地（ＡＴＣＣ）中５，０００細胞／ウェルの細胞密度でプレーティングした。プレーティングの２４時間後、培地を、２０μｌのＰＢＳ、または２０μｌのＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム、または１０μｌエキソソーム＋１０μｌのＰＢＳもしくは１μｌのＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム（エキソソーム濃度：１．１×１０７エキソソーム／μｌ）を添加して、または添加せずに、ドーパミン作動性分化培地（ＡＴＣＣ、１００μｌ／ウェル）に変更した。
【０４３３】
神経突起伸長を、個々の神経突起の全長として決定し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３ライブイメージングシステム（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して６時間間隔で監視した（図５Ａ）。図５Ｂは、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームが、神経栄養因子欠乏誘導性細胞死からニューロンを救出することを示す。ｉＰＳＣ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号７０９０１）に由来する神経前駆細胞を、ニューロン分化および成熟培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して１４日間成熟ニューロンに分化させた。１５日目に、培地を、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム（２〜４×１０９粒子）またはＰＢＳを補充した神経栄養因子欠乏培地に交換した。細胞を、さらに７日間培養物中で維持した。細胞を、この間Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３ライブイメージングシステムを使用して６時間間隔で画像化した。神経突起の長さを、Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｋモジュールを使用して計算した。図５Ｃは、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームが神経突起伸長を誘導することを示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、３５０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ  Ｆ１２において９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を無血清ＤＭＥＭ  Ｆ１２に交換し、エキソソーム（約２×１０９粒子）を各ウェルに添加した。細胞を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３ライブイメージングシステムを使用して２時間間隔で画像化した。神経突起の長さを、Ｎｅｕｒｏｔｒａｃｋモジュールを使用することによって計算した。
【０４３４】
結論：ＭＳＣエキソソームと同様に、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、神経保護効果も有する。しかしながら、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの神経保護効果は、ＭＳＣエキソソームの神経保護効果と比較して顕著に優れている。
【０４３５】
Ａ．Ｈ２Ｏ２および６−ＯＨＤＡは、ＬＤＨ放出アッセイおよびミトコンドリア活性−ＭＴＳアッセイを使用して神経毒性からの保護を評価するために使用される。ヒト神経前駆細胞（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ニューロン分化培地において１週間増殖され、次いで、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）およびラミニンで被覆された９６ウェルプレート上に２０，０００細胞／ウェルの細胞密度でプレーティングされ、ニューロン成熟培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において増殖される。ニューロン成熟中、細胞は、２０μｌのＰＢＳ、２０μｌのＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム、１０μｌのＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム、または１μｌのＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームで処置される（ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム濃度：４．５×１０６エキソソーム／μｌ）。ニューロン成熟の５日後、培地は、増加濃度のＨ２Ｏ２（１０μＭ、２０μＭ、４０μＭまたは６０μＭ）を補充したＦ１２培地に交換される。１８時間後、ＭＴＳアッセイ（Ａｂｃａｍ）は、細胞生存率を評価し、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの保護効果を決定するために実行される。
【０４３６】
Ｂ．エキソソームは、ニューロン（Ｔｕｊ１）、ミクログリア（ＩＢＡ−１）、および星状細胞（ＧＦＡＰ）のマーカーを適宜使用することによって、蛍光顕微鏡法で視覚化および定量化される。
【０４３７】
ｉＰＳＣ由来運動ニューロン（ＭＮ）；ＡＬＳに対する遺伝子および孤発性のモデル
【０４３８】
ＡＬＳ患者のｉＰＳＣからのＭＮは、特定の疾患関連表現型を明らかにしており、それによりこの系の使用を検証してＡＬＳの分子基盤を探索し、医薬品開発のための新しいスクリーニングプラットフォームを開発する。ＡＬＳ患者のＭＮ  ｉＰＳＣプラットフォーム、改変されたＭＳＣに由来するエキソソーム、ＭＳＣ−ＮＴＦに由来するエキソソーム、改変されたＭＳＣ−ＮＴＦに由来するエキソソーム、および対照ＭＳＣに由来するエキソソームは、ＴＤＰ−４３変異（Ｍ３３７ＶおよびＱ３３１Ｋ）を有するｉＰＳＣ由来ＭＮ、ならびにｉＰＳＣ由来ＭＮ同質遺伝子対照（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に対するそれらの神経保護能力について検査される。加えて、Ｃ９ＯＲＦ７２変異および孤発性ＡＬＳ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）患者に由来するｉＰＳＣ由来の運動ニューロンが、研究される。
【０４３９】
以下のパラメータが、研究される：Ａ：異なる培養時点での遺伝子およびｍｉＲＮＡの発現（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ）；Ｂ：生理学的活性−アセチルコリン分泌（比色分析アッセイ）；Ｃ：細胞死の評価（ＬＤＨ放出、比色分析アッセイ）；Ｄ：プロテインキナーゼを阻害し、カスパーゼ−３を活性化することによってアポトーシスを誘導することが知られているスタウロスポリン（ＳＴＳ）は、細胞毒性（ＬＤＨ放出）およびミトコンドリア活性（ＭＴＳアッセイ）を比較して、健常対変異細胞の感度を評価するために使用される；かつＥ：該当する場合、ニューロン（Ｔｕｊ１）、運動ニューロン（Ｉｓｌ−１）、ミクログリア（ＩＢＡ−１）、および星状細胞（ＧＦＡＰ）のマーカーを使用することによる蛍光顕微鏡法による視覚化および定量化。
【０４４０】
初代ラットニューロン培養物；ＰＤに対するα−シヌクレイン封入体モデル
【０４４１】
ＭＳＣ、改変されたＭＳＣ由来のエキソソーム、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム、および改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの、初代ラットニューロン培養物におけるα−シヌクレイン封入体形成の阻害、およびニューロン機能の欠陥は、以下のように決定される。Ａ：初代ラットニューロン培養物は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから調製される；Ｂ：初代ラット神経細胞培養物は、３つの異なる濃度の対照ＭＳＣ、改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、および改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームを用いて、または用いずに、合計２、４、７、１０、１４、２１日間、マウスアルファ−シヌクレイン原線維と共にインキュベートされる；Ｃ：１％のＴｘ−１００に続いて２％のＳＤＳで順次抽出されたニューロンの免疫蛍光およびイムノブロットによるリン酸化α−シヌクレイン封入体の存在量が、定量される；Ｄ：ＡＡＶ−ＳｙｎａｐｓｉｎＩ−ＧＣａｍｐ６を用いたカルシウムイメージングは、エキソソームが封入体によって引き起こされるカルシウムシグナル伝達における障害を防止するかどうかを決定するために使用される；Ｅ：ラットの皮質、海馬および扁桃体におけるα−シヌクレイン封入体の形成およびドーパミンニューロン喪失の低減に対するＭＳＣ、改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、または改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの髄腔内送達の結果の決定が、なされる。
【０４４２】
インビボ研究
【０４４３】
ＡＬＳに対するＳＯＤ−１  Ｇ９３Ａマウスモデル
【０４４４】
ＳＯＤ１変異体マウスは、ヒトにおけるＡＬＳを連想させる表現型を発達させる。いくつかの研究は、ＭＳＣ細胞が、ＭＳＣ培養培地と同様に変異体ＳＯＤ１／Ｇ９３Ａマウスの生存および運動機能を改善することを示している。したがって、Ｇｌｙ９３Ａｌａ置換を有する高コピー数の変異体ヒトＳＯＤ１を発現するＢ６ＳＪＬ−ＴｇＮ  ＳＯＤ１／Ｇ９３Ａ１マウス（ＳＯＤ１／Ｇ９３Ａ）、および野生型ヒトＳＯＤ１（ＳＯＤ１）を発現するＢ６ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＳＯＤ１）２マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ、および対照ＭＳＣ由来エキソソームの、疾患進行、症状の発症、および寿命に対する効果を評価するために使用される。
【０４４５】
改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ、または対照ＭＳＣ由来エキソソームは、髄腔内または鼻腔内のいずれかで投与されて、効果を最大化し、全身性副作用を回避する。
【０４４６】
運動機能に対する異なるエキソソーム集団の効果は、Ｒｏｔａｒｏｄ、運動障害スコアおよび体重測定によって調査され、これらはすべてＳＯＤ１／Ｇ９３Ａ動物を評価するために一般的に使用される（Ｗｅｙｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ａｓｓｅｓｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｎｓｅｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＯＤ１  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＡＬＳ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．３；１４（７）：１０５１−１０５４）。
【０４４７】
投与後６〜４８時間の脊髄および脳実質におけるエキソソームの分布を視覚化するために、改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ、または対照ＭＳＣ由来のエキソソームは、ＰＫＨ２６またはＢＯＤＩＰＹ  ＴＲセラミド色素で標識される。脳および脊髄全体にわたる連続切片は、共焦点顕微鏡法（オリンパス）を使用して、ニューロン（ニューロン核抗原（ＮｅｕＮ））、ミクログリア（ＩＢＡ−１）、星状細胞（ＧＦＡＰ）のマーカーを使用することによって免疫蛍光のために処理される。画像は、オリンパス画像ブラウザを使用して解析される。
【０４４８】
パーキンソン病（ＰＤ）に対するα−シヌクレインモデル
【０４４９】
超音波処理されたマウスＰＦＦ、単量体α−シヌクレイン、またはＰＢＳを線条体中に片側注射されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、対照ＭＳＣ、ＭＳＣ、遺伝学的に改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、または遺伝学的に改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来するエキソソームまたは改変されたエキソソーム（負荷された）の髄腔内送達が、ラットの皮質、海馬、扁桃体におけるα−シヌクレイン封入体の形成およびドーパミンニューロン喪失を低減するであろうかどうかを決定するために、使用される。解析は、以下を含むことができる：Ａ．リン酸化α−シヌクレインに対する抗体を用いた免疫組織化学、およびニッスル対比染色、ならびに扁桃体、黒質緻密部、線条体、海馬および皮質における細胞体中の細胞の総数およびリン酸化α−シヌクレイン封入体の総数のバイアスのない立体解析学的計数が、実行される；Ｂ．黒質緻密部からの切片におけるチロシンヒドロキシラーゼに対する免疫組織化学。ＴＨ＋およびニッスル＋のニューロンを計数する立体解析学、ならびに線条体におけるドーパミントランスポーターおよびＴＨに対する免疫蛍光を実行し、免疫蛍光シグナルを定量化して、ドーパミン作動性末端の喪失が存在するかどうかを判断する；Ｃ．オープンフィールド試験、シリンダー試験、および超音波発声を含む行動試験は、ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームの髄腔内送達がα−シヌクレイン封入体誘導性行動欠陥の発生を低減するかどうかを決定するために使用される；Ｄ．ＭＨＣＩＩ、ＩＢＡ−１、もしくはＣＤ１６３、またはこれらの組み合わせに対する免疫蛍光法は、ＭＳＣ、遺伝学的に改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、および改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来するエキソソームまたは改変されたエキソソーム（負荷された）の髄腔内送達が、ラットの皮質、海馬および扁桃体におけるα−シヌクレイン封入体の形成によって引き起こされる炎症を低減するかどうかを決定するために使用される；かつ／またはＥ．ｓＣＤ２７、キチナーゼ３様１タンパク質、キチナーゼ３様２タンパク質、もしくはＮｆＬ、またはこれらの組み合わせに対する免疫蛍光法は、ＭＳＣ、遺伝学的に改変されたＭＳＣ、ＭＳＣ−ＮＴＦ、および改変されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に由来するエキソソームまたは改変されたエキソソーム（負荷された）の髄腔内送達が、ラットの皮質、海馬および扁桃体におけるα−シヌクレイン封入体の形成によって引き起こされる神経炎症を低減するかどうかを決定するために使用される。
【０４５０】
結論：ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソームの有益な属性のうちの１つは、それらの神経保護効果である。この属性は、神経変性疾患と闘う際に利用され得る。重要なことに、この属性は、実施例２において記載されるように、単離されたエキソソームに追加的な神経保護カーゴ分子を負荷することによってさらに増強され得る。
【０４５１】
実施例４
分化したヒトＢＭ−ＭＳＣ（ＭＳＣ−ＮＴＦ）の調製物ならびにエキソソームの生産および精製
【０４５２】
ヒト骨髄−ＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）の単離のための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１２１８５９号および同第ＷＯ２０１４／０２４１８３号に完全に記載される。
【０４５３】
骨髄試料（５０〜１００ｍｌ）を、健常成人ドナーの腸骨稜から骨髄吸引によりヘパリン含有チューブに回収した。骨髄穿刺液をＤＭＥＭで１：１希釈し、単核細胞をフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭ）含有チューブ上で密度遠心分離（１，０００×Ｇで２０分間）によって分離した。単核細胞画分を、回収し、ＤＭＥＭ中で洗浄した。細胞を、１０％の血小板溶解物（ＰＭ、以下を参照されたい）を含有する増殖培地に再懸濁させ、トリパンブルー排除色素によって計数し、２チャンバーＣｅｌｌＳｔａｃｋに最大３００，０００細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。フラスコを、３７℃の加湿したインキュベータ中で５％のＣＯ２と共にインキュベートした。
【０４５４】
ＰＭ増殖培地は、Ｌ−グルタミン溶液２００ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）、ピルビン酸ナトリウム溶液１００ｍＭ（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ＩＵ／ｍｌのヘパリン（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、および１０％の血小板溶解物を補充した、ＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅの培地低グルコース（Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）からなった。１６〜２４時間後、ＰＭ培地を吸引して非接着性細胞をフラスコから除去し、接着性細胞を１０ｍｌのＤＭＥＭで穏やかに洗浄し、３０ｍｌの新鮮なＰＭをフラスコに添加した。ｈＭＳＣ細胞を、ＰＭ培地において１２〜１５日間増殖させ、週に２〜３回交換した。１２〜１５日後またはフラスコがコンフルエンスに達した際。細胞を、すべての増殖培地を除去し、３７℃インキュベータにおいて５分間ＴｒｙｐＬＥ．（商標）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてインキュベートすることにより、回収した。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ中で洗浄し、計数し、１５×１０６細胞／ｍｌ／クライオバイアルの濃度でＰＭにおいて１０％のＤＭＳＯに凍結保存した。凍結保存は、液体窒素における。
【０４５５】
いくつかの実施形態では、反復した骨髄吸引の必要性を回避するために、ＭＳＣを継代Ｐ０、Ｐ１、またはＰ２のいずれかで凍結保存し、複数の新鮮なＭＳＣ−ＮＴＦ細胞用量を、凍結保存されたＭＳＣから生産し、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞への導入前に解凍および増殖した。
【０４５６】
解凍したＭＳＣ培養液を、ＰＭ培地に再懸濁させ、Ｃｅｌｌｓｔａｃｋｓに２０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、分化を、４日後に増殖培地（ＰＭ）を１ｍＭのジブチリル環状アデノシン一リン酸、２０ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、５ｎｇ／ｍＬのヒト血小板由来増殖因子、および５０ｎｇ／ｍＬのヒトヘレグリン−β１（Ｓ２Ｍ）を含有する無血清ＤＭＥＭ培地でさらに３日間置き換えることによって誘導した。
【０４５７】
次いで、上記の分化した細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）からの培養培地を回収し、細胞破片および大きな小胞を、０．２〜１．２μｍフィルターを通じた濾過によって除去した。エキソソーム含有濾液を、無菌条件下で回収し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。
【０４５８】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞生産ならびにエキソソームの生産および精製をスケールアップ
【０４５９】
エキソソームの製造、分泌、および収量をスケールアップするために、解凍したＭＳＣ培養物を、ＰＭ培地に再懸濁させ、（数日の）増殖のためにＣｅｌｌＳｔａｃｋｓに播種した。次いで、ＭＳＣを、回収し、ＢｉｏＮｏｃＩＩマクロキャリア（ＥｓｃｏＶａｃｃｉＸｃｅｌｌ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）上のＣｅｌＣｒａｄｌｅ（商標）バイオリアクターボトルに、４〜６日間、５００ｍｌのＰＭ中２，０００〜２，６００細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。ＰＭを、２日後に交換したか、または灌流システムを使用して５００〜１５００ｍｌ／日の率で循環させた。いくつかの実施形態では、４〜６日後、ＰＭを、分化を誘導するために３または４日間Ｓ２Ｍに交換した。分化の終わりに、または分化プロセス中の複数の時点で、馴化培地を回収し、細胞破片および大きな小胞を、０．２〜１．２μｍフィルターを通じた濾過によって除去した。分化プロセス中の複数の培地回収は、総エキソソーム収量を最大２倍増加させる。
【０４６０】
エキソソーム含有濾液を、カラムベースのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくは膜クロマトグラフィーを使用して、溶液からタンパク質を除去して、または除去せずに、無菌条件下で回収し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に供した。精製されたエキソソームの収量は、ＣｅｌｌＳｔａｃｋｓを使用したプロセスから得られた収量の最大約４〜５倍（約７×１０１０）である、約３〜４×１０１１の範囲であった。
【０４６１】
エキソソームの生産および精製のために使用される方法とは独立して、対照エキソソームを、１０％のエキソソーム枯渇血小板溶解物を有するＤＭＥＭを使用してＭＳＣ細胞から生産して、血小板溶解物由来のエキソソームの可能性のある交絡効果を回避した。
【０４６２】
いくつかの例では、ＭＳＣは、拡大され、量子細胞拡大システムにおいてＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に分化する。（テルモＢＣＴ，ＵＳＡ）。馴化培地は、分化プロセスの終わりに回収され、上述のエキソソーム単離手順に供される。
【０４６３】
エキソソーム製造プロセス：
【０４６４】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞特異的エキソソームの単離
【０４６５】
タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）−１００、３００、５００ｋＤａのＭＷＣＯ膜のいずれかを、使用した（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂ）。エキソソーム含有試料を、ファイバーシステムを通じて連続的に送り込み、再循環させた。膜小胞内に含まれていないか、または膜小胞に関連しない遊離タンパク質を含む小分子を、膜の細孔を通し、その後、透過物として溶出し、最終的に廃棄した。エキソソーム（またはより大きなマイクロベシクル）のような細孔を通過するには大きすぎる分子は、残留液として循環し続けた。試料を、ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜よりも小さい汚染物質の試料をさらに枯渇させるために、５回の透析濾過に供した。透析濾過の最終サイクル中に、試料を、約１０ｍｌの体積に低減させた。
【０４６６】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）−高純度エキソソームについて、ＴＦＦの後にＳＥＣを行った。代替的には、ＳＥＣは実行されず、ＴＦＦのステップはエキソソームを単離するのに十分であった。
【０４６７】
精製されたエキソソームの特徴付けを、定量化、表現型、カーゴ内容物を含むいくつかのレベルで実行した。
【０４６８】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞溶解物（２０ｕｇのタンパク質）および２Ｄ（ＣｅｌｌＳｔａｃｋ）またはバイオリアクターＭＳＣ−ＮＴＦ馴化培地（２０〜４０ｕｇのタンパク質）のいずれかから単離されたエキソソーム溶解物を、ＣＤ９に対するマウスモノクローナル抗体（１：５００希釈された、カタログ番号ＣＢＬ１６２  Ｍｅｒｃｋ）およびＣａｌｎｅｘｉｎ（１：５００希釈された、ＭＡＢ３１２６、Ｍｅｒｃｋ）を使用するウエスタンブロットで解析した。ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：５０００希釈される、カタログ番号ＡＰ３０８Ｐ、Ｍｅｒｃｋ）を用いたインキュベーションに続いて、膜を、ＥＺ−ＥＣＬ溶液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用して展開した。図６は、異なる方法で生産されたエキソソームの純度を示す。具体的には、エキソソームマーカーＣＤ９の高い発現、およびエキソソーム試料におけるＥＲマーカーであるカルネキシンの非常に低い発現は、両方のエキソソーム試料の高い純度を確認する。
【０４６９】
ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されたエキソソームを、特定の抗体を通じてチップ表面に結合したナノ粒子を検出できるＥｘｏＶｉｅｗプラットフォーム（Ｎａｎｏｖｉｅｗ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、表面マーカー発現について解析した。図７に示される結果は、ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の両方のエキソソームが、特徴的なエキソソーム表面マーカーＣＤ８１、ＣＤ６３、およびＣＤ９を発現することを示す。ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩの発現は、両方のエキソソーム集団において低かった。マウスＩｇＧを、陰性対照として使用した。
【０４７０】
ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームにおいてタンパク質カーゴを特徴付け、それらのカーゴを対照ＭＳＣ由来のエキソソームのものと比較するために、抗体アレイ（ＲａｙｂｉｏｔｅｃｈによるヒトサイトカインアレイＱ４４０）を使用した。このアレイは、サイトカインを含む４４０個のタンパク質の発現を定量的に測定できる。
【０４７１】
ＭＳＣ（ｎ＝４）およびＭＳＣ−ＮＴＦ（ｎ＝４）由来のエキソソームのタンパク質アレイは、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームが、対照ＭＳＣ由来のエキソソームと比較して、増加した含有量の４２タンパク質（有意性（ｐ＜０．０５））を示した一方、４つのタンパク質が、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソームにおいて有意に減少した。これらのタンパク質は、表１に示され、図８に示される。
【０４７２】
【表１】
2021520790.tif 000003
【０４７３】
表１は、ＭＳＣ−ＮＴＦ由来のエキソソーム対対照ＭＳＣ由来のエキソソームにおいて有意に（ｐ＜０．０５）増加（＞１）または減少（＜１）したタンパク質（タンパク質試料濃度９５０ｕｇ／ｍｌ）のリストとして提供される（ｐｇ／ｍｌ、データ分布の正規性に依存して平均±ＳＤまたは中央値（最小，最大））。平均±ＳＤは正規分布データに対して提供され、中央値（最小，最大）は正規性が想定されない際に提供される。タンパク質名は、標準的なタンパク質命名法である。
【０４７４】
結論：エキソソームの独特な集団は、ＭＳＣ細胞から単離されたエキソソームと比較して、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離され得る。このエキソソームの独特な集団は、著しく異なるタンパク質カーゴプロファイルを担持する。この差異は、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームを、ＭＳＣエキソソームとは異なる実体および異なる治療剤にする。興味深いことに、増加したカーゴプロファイルが、神経栄養因子ＬＩＦ、ＧＤＦ１５、およびＶＥＧＦＡを含むがこれらに限定されない、神経変性状態を治療するのに有用と考えられるタンパク質候補について観察された。有用と考えられる他のカーゴタンパク質は、ＣＸＣＬ１およびＩＬ１３を含んだが、これらに限定されなかった。
【０４７５】
実施例５
パーキンソン病におけるＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの保護効果
【０４７６】
パーキンソン病（ＰＤ）の動物モデルにおけるドーパミン作動性ニューロンの機能に対するエキソソームの保護効果を研究するために、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、外科的分娩に続いて３〜６週間での顕著な行動およびドーパミン作動性黒質線条体の欠損を生み出すと経験的に決定された、ＰＤのＡＡＶ１／２ヒトＡ５３Ｔアルファ−シヌクレイン（ＡＡＶｈＡ５３ＴａＳｙｎ）ラットモデルにおいて評価される。（Ｋｏｐｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１  Ｍａｒ  ７；６（３）：ｅ１７６９８）。
【０４７７】
このモデルは、ＡＡＶ１／２遺伝子送達系を用いて、ヒト変異Ａ５３Ｔ−アルファ−シヌクレイン（ＡＡＶ  ｈＡ５３Ｔ  ａＳｙｎ）を送達して、ラットにおいて、ＰＤにおけるドーパミン作動性変性の原因となる疾患プロセスをモデル化する片側性シヌクレイン症（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｙ）を促進する。このモデルでは、黒質線条体経路にわたるアルファ−シヌクレインの過剰発現、およびレビー様病態が発生する。さらに、このシヌクレイン症は、線条体ドーパミンにおいて３５〜４５％の欠損、黒質ドーパミンニューロンにおいて３５〜４０％の欠損を生み出す。モデルＡＡＶ  ｈＡ５３Ｔを確立するために、ａＳｙｎベクターは、１日目（Ｄ１）の定位固定（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｓ）手術により右黒質（ＳＮ）中に片側投与される。
【０４７８】
体内分布研究
【０４７９】
エキソソームのインビボ分布を事前決定するために、ＰＤのアルファ−シヌクレインラットモデルにおいて、１００ｕｌのＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム（約１０９粒子）は、３７℃で２０分間、ホウ素−ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ、１ｕＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色される。遊離色素は、エキソソームスピンカラム（ＭＷ  ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して除去される。エキソソーム染色を確認するために、染色されたエキソソームは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の培養培地に４時間添加され、ＰＢＳで１回洗浄される。画像は、エキソソーム添加の２４時間後にＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３イメージングシステムを使用してキャプチャされる。対照染色は、エキソソームなしで実行され、色素のみを使用して、エキソソームスピンカラムを使用して洗浄される。エキソソーム添加の２４時間後、強く特異的な蛍光シグナルが、１００％の細胞において観察され、色素のみで染色された対照細胞においては見られない。
【０４８０】
エキソソームのインビボ分布を評価するために、ＢＯＤＩＰＹで蛍光標識されたＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、１ｕｌ／時の速度でエキソソームを送達するように調整されたｉＰｒｅｃｉｏポンプ（Ｐｒｉｍｅｔｅｃｈ）によって３日間（ａＳｙｎベクター投与から７〜１０日目）、ラットアルファ−シヌクレインモデルに注射される。６匹の動物（メスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）は、ＡＡＶ１／２手術後のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞からの染色されたエキソソームを注射され、６匹の動物は、健常動物におけるエキソソームの体内分布パターンを比較するために、ＡＡＶ１／２手術を伴わないエキソソームを注射される。エキソソームの３日間の注入期間の終了に続いて２４時間後のＤ１１に、動物は、死後解析および体内分布の評価のため、犠牲にされる。
【０４８１】
目的の脳組織切片は、蛍光標識がパーキンソン病のラットアルファ−シヌクレインモデルにおけるニューロンおよび／またはグリア内にあるかどうかを決定するために、標識の存在について最初に評価される。
【０４８２】
有効性研究
【０４８３】
ラットアルファ−シヌクレインモデルにおけるエキソソームのインビボ保護効果は、４動物群の研究において、１２匹／群で評価される。１つの対照群は１日目に空のベクターを注射され、３つの群はＡＡＶ  ｈＡ５３Ｔ  ａＳｙｎ担持ベクターを注射される。ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦエキソソーム（それぞれ群３および４）は、７日目（Ｄ７）、Ｄ２２およびＤ３２に、各時点１ｕｌ／時の速度で３日間エキソソームを連続的に送達するように調整されたｉＰｒｅｃｉｏポンプ（Ｐｒｉｍｅｔｅｃｈ）により投与される（ｉ．ｃ．ｖ．）。対照群は、滅菌ＰＢＳを与えられる。
【０４８４】
行動評価は、手術前（ベースライン、Ｄ−３）、ＡＡＶ投与に続いて３週間（Ｄ２１）、ＡＡＶ投与に続いて６週間（Ｄ４２）に、前肢の非対称性を評価するために、シリンダー試験において行われる。
【０４８５】
動物は、線条体ドーパミンおよび代謝産物レベル（液体クロマトグラフィー−質量解析ＬＣ／ＭＳを介した）、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）レベル（［１１ｃ］ＲＴＩ−１２１オートラジオグラフィーによる）、総線条体ヒト（導入遺伝子由来）アルファ−シヌクレイン発現（ＥＬＩＳＡによる）、および黒質緻密部（ＳＮｃ）におけるチロシンヒドロキシラーゼ陽性（ＴＨ＋ｖｅ）細胞の数の評価を含む、死後評価のために、Ｄ４３に犠死される。次いで、ミクログリアの活性化の評価と、二重標識計数立体解析学による、ＳＮにおけるＴＨ＋／ｐＳｅｒ１２９ａＳｙｎ−に対するＴＨ＋／ｐＳｅｒ１２９  ａＳｙｎ＋ニューロンの比率を決定することと、を含む、追加のパラメータが、評価される。
【０４８６】
結論：ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、例えば、パーキンソン病と闘う際の治療剤として少なくとも２つの利点を有する。第１に、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは明白な神経保護効果を有し、第２に、ＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームは、それらのサイズのために、容易に血液脳関門を通過し、そのことは、それらの投与が必ずしも頭蓋内でなく体系的であることを、可能にする。
【０４８７】
実施例６
ＲＮＡシーケンシングによるＭＳＣ−ＮＴＦエキソソームの効果
【０４８８】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のエキソソームによってニューロンにおいて制御される遺伝子および経路を研究するために、ｉＰＳＣ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に由来する神経前駆細胞を、ニューロンの分化および成熟培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号７０９０１）を使用して１４日間成熟ニューロンに分化させた。１５日目に、培地を、エキソソーム（２〜４×１０９粒子）またはＰＢＳを補充した神経栄養因子欠乏培地に交換した。処置の３日後に、総ＲＮＡを、細胞からミニＲＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して単離した。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を、ＮｅｘｔＳｅｑ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して実行した。合計３６８７の差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）を、特定した（ｐ−ａｄｊ＜０．０５）。上位の上方制御された遺伝子、および上位の下方制御された遺伝子が、表２に要約される（ｐ−ａｄｊ＜０．０５）（「ＮＡ」−入手不可能、「新規転写物」−新しく特定された転写物）。ＤＥＧのリストを、ＷｅｂＧｅｓｔａｌｔツールを使用して、経路の濃縮について解析した。細胞外マトリックスおよび接着タンパク質の調節に対するエキソソームの顕著な効果を示す、濃縮されたＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）経路（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）における）は、表３に要約される。
【０４８９】
【表２−１】
2021520790.tif 000004
【０４９０】
【表２−２】
2021520790.tif 000005
【０４９１】
【表２−３】
2021520790.tif 000006
【０４９２】
【表２−４】
2021520790.tif 000007
【０４９３】
【表２−５】
2021520790.tif 000008
【０４９４】
【表２−６】
2021520790.tif 000009
【０４９５】
【表３】
2021520790.tif 000010
【０４９６】
結論：ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞から単離されるエキソソームは、独自のタンパク質カーゴプロファイルを担持し、独自の有益な生物学的属性を有する。このツールは、目的の標的細胞における遺伝子発現レベルおよび生物学的経路を調節することのような様々な用途において、現在利用され得る。かかる細胞効果は、ヒト患者において有益な治療効果をもたらすことができる。
【０４９７】
本開示のある特定の特徴が本明細書に示され記載されている一方、多くの修正、置換、変更、および同等物が、現在当業者に考えられるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示の真の精神に収まるように、すべてのかかる修正および変更を網羅するように意図されることが、理解されるであろう。
【図１】
2021520790.tif 000011
【図２Ａ】
2021520790.tif 000012
【図２Ｂ】
2021520790.tif 000013
【図３Ａ】
2021520790.tif 000014
【図３Ｂ】
2021520790.tif 000015
【図４Ａ】
2021520790.tif 000016
【図４Ｂ】
2021520790.tif 000017
【図４Ｃ】
2021520790.tif 000018
【図４Ｄ】
2021520790.tif 000019
【図４Ｅ】
2021520790.tif 000020
【図５Ａ】
2021520790.tif 000021
【図５Ｂ】
2021520790.tif 000022
【図５Ｃ】
2021520790.tif 000023
【図６】
2021520790.tif 000024
【図７】
2021520790.tif 000025
【図８】
2021520790.tif 000026
【国際調査報告】
2021520790.tif 000027
2021520790.tif 000028
2021520790.tif 000029
2021520790.tif 000030
2021520790.tif 000031
2021520790.tif 000032