(57)【要約】  本開示は、一般に、昆虫細胞におけるバキュロウイルスからの組換えタンパク質の高レベル発現のための系および方法に関する。特に、本明細書に記載される方法および系は、化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地を使用して、昆虫細胞における高レベルのバキュロウイルス産生および／または昆虫細胞における高レベルのタンパク質産生を可能にする。本開示はまた、昆虫細胞において組換えタンパク質を培養、トランスフェクション、および／または産生するための組成物およびキットに関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地と、
（ｂ）複数のＳｆ９細胞と、を含む、バキュロウイルス発現系。
【請求項２】
タンパク質発現エンハンサーをさらに含む、請求項１に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項３】
トランスフェクション試薬をさらに含む、請求項１または２に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項４】
前記トランスフェクション試薬が、カチオン性脂質トランスフェクション試薬またはポリマー系トランスフェクション試薬である、請求項３に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項５】
前記タンパク質発現エンハンサーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項６】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ−９９４、ＣＲＡ−０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、請求項５に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項７】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、またはバルプロ酸である、請求項５に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項８】
前記培地が、昆虫細胞培地である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項９】
前記複数のＳｆ９細胞が、前記培地中の浮遊培養で成長することが可能である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項１０】
前記複数のＳｆ９細胞が、前記培地中で高密度成長が可能である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項１１】
前記Ｓｆ９細胞が、１ミリリットルあたり約２×１０6〜約２×１０8細胞（細胞／ｍＬ）のピーク細胞密度が可能である、請求項１０に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項１２】
前記培地が、バリウム塩、カドミウム塩、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、カリウム塩、カルシウム塩、銀塩、スズ塩、ジルコニウム塩、ナトリウム塩、またはそれらの組み合わせから選択される無機塩を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項１３】
前記培地が、パラアミノ安息香酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ナイアシンアミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、トコフェロール、またはそれらの組み合わせから選択されるビタミンを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項１４】
バキュロウイルスベクターをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現系。
【請求項１５】
昆虫細胞培養のための培地であって、前記培地が、バリウム塩、カドミウム塩、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、カリウム塩、カルシウム塩、銀塩、スズ塩、ジルコニウム塩、ナトリウム塩、またはそれらの組み合わせから選択される無機塩と、ビタミンと、を含み、前記培地が、化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地である、培地。
【請求項１６】
前記培地が、タンパク質を含まない、請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
前記培地が、動物由来の成分を含まない、請求項１５または請求項１６に記載の培地。
【請求項１８】
前記ビタミンが、パラアミノ安息香酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ナイアシンアミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、トコフェロール、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１９】
前記無機塩が、昆虫細胞の成長を支持するのに十分な量で存在する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２０】
昆虫細胞の成長を支持するのに十分な量の糖をさらに含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の培地。
【請求項２１】
前記糖が、マルトース、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、マンノース、ラクトース、ガラクトース、デキストロース、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２０に記載の培地。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の培地中で昆虫細胞を培養することを含む、昆虫細胞を成長させる方法。
【請求項２３】
バキュロウイルス産生の方法であって、
（ａ）化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地で昆虫細胞を培養することと、
（ｂ）前記細胞をバクミドでトランスフェクトすることと、
（ｃ）前記培地または前記細胞から前記バキュロウイルスを採取することと、を含む、方法。
【請求項２４】
前記細胞が、カチオン性脂質トランスフェクション試薬またはポリマー系トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞である、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記昆虫細胞が、浮遊培養されている、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記トランスフェクションステップが、前記昆虫細胞が１ミリリットルあたり１×１０6細胞（細胞／ｍＬ）〜２×１０7細胞／ｍＬの生細胞密度で存在するときに実施される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記トランスフェクションステップが、前記昆虫細胞が９０％以上生存しているときに実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記培地が、バリウム塩、カドミウム塩、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、カリウム塩、カルシウム塩、銀塩、スズ塩、ジルコニウム塩、またはそれらの組み合わせから選択される無機塩を含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記培地が、パラアミノ安息香酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ナイアシンアミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、トコフェロール、またはそれらの組み合わせから選択されるビタミンを含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記培地が、前記トランスフェクションステップ後に新鮮な培地で変更、補充、置換、または補足されない、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記採取されたバキュロウイルスが、１ミリリットルあたり少なくとも５×１０7感染性ウイルス粒子（ＩＶＰ／ｍＬ）の力価を有する、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記採取されたバキュロウイルスが、少なくとも１×１０8ＩＶＰ／ｍＬの力価を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記採取されたバキュロウイルスが、５×１０7ＩＶＰ／ｍＬ〜１×１０10ＩＶＰ／ｍＬの力価を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
バキュロウイルスからの標的タンパク質産生の方法であって、
（ａ）化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地で昆虫細胞を培養することと、
（ｂ）前記昆虫細胞に標的タンパク質を発現するバキュロウイルスを感染させることと、を含む、方法。
【請求項３６】
タンパク質発現エンハンサーを、ステップ（ｂ）の前に前記培地に添加することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記タンパク質発現エンハンサーが、感染の少なくとも１０時間前に添加される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記タンパク質発現エンハンサーが、感染の少なくとも１２時間〜３６時間前に添加される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的タンパク質発現エンハンサーが、感染の１８時間〜２４時間前に添加される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的タンパク質発現エンハンサーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ−９９４、ＣＲＡ−０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤が、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、リコスタチンＡ、またはバルプロ酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞である、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記昆虫細胞が、前記培地中で高密度成長が可能である、請求項３５〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｓｆ９細胞が、１ミリリットルあたり約２×１０6〜約２×１０8細胞（細胞／ｍＬ）のピーク細胞密度が可能である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記昆虫細胞が、浮遊培養されている、請求項３５〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記感染ステップが、前記昆虫細胞が１ミリリットルあたり３×１０6細胞（細胞／ｍＬ）〜１×１０7細胞／ｍＬの生細胞密度で存在するときに実施される、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記感染ステップが、前記昆虫細胞が８０％以上生存しているときに実施される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記昆虫細胞を感染させるために使用される前記バキュロウイルスが、１〜１０の感染多重度（ＭＯＩ）を有する、請求項３５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記昆虫細胞を感染させるために使用される前記バキュロウイルスが、３〜７のＭＯＩを有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記昆虫細胞を感染させるために使用される前記バキュロウイルスが、約５のＭＯＩを有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
（ｃ）感染した細胞を一定期間培養して、前記標的タンパク質を産生することをさらに含む、請求項３５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
（ｄ）前記標的タンパク質を採取することをさらに含む、請求項３５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ステップ（ａ）〜（ｄ）には、５日〜１５日を要する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的タンパク質が、感染後約２４時間〜約１２０時間で採取される、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記培地が、タンパク質産生の間に新鮮な培地で置換、補充、または補足されない、請求項３５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記昆虫細胞が、付着培養されている、請求項１５〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記昆虫細胞が、浮遊培養されている、請求項１５〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６５６，８６８号の優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養培地は、制御された人工のインビトロ環境で細胞を維持および成長させるために必要な栄養素を提供する。細胞培養培地の特性および製剤は、特定の細胞要件に応じて異なる。重要なパラメータには、浸透圧、ｐＨ、および栄養素組成が含まれる。
【０００３】
細胞培養培地製剤は、文献に十分に文書化されており、多数の培地が市販されている。細胞培養培地の典型的な構成要素には、アミノ酸、有機および無機塩、ビタミン、微量金属、糖、脂質、および核酸が含まれ、それらの種類および量は、所与の種、細胞、または組織の種類の特定の要件に応じて異なる場合がある。
【０００４】
培地製剤は、動物、植物、および細菌細胞を含む多くの細胞型を増殖するために使用されてきた。培養細胞は、生理学的プロセスの研究および有用な生物学的物質の産生を含む、多くの用途を有する。そのような有用な産物の例には、モノクローナル抗体、ホルモン、成長因子、酵素などが挙げられる。そのような産物は、多くの商業的および治療的用途を有し、組換えＤＮＡ技術の出現により、細胞を操作してこれらの産物を大量に産生することができる。培養細胞は、ベクターおよび／またはワクチンとして使用できるウイルスの単離、同定、および成長にも日常的に使用されている。したがって、インビトロで細胞を増殖する能力は、細胞生理学の研究にとって重要であるだけでなく、費用効果の高い手段では得られないであろう有用な物質の産生にとっても必要である。
【０００５】
組換えタンパク質の産生には、昆虫細胞培養が一般的に使用される。原核細胞とは異なり、昆虫細胞は、基礎研究および大規模産生の両方で、複雑な翻訳後修飾を伴う大量のタンパク質を発現することができる。昆虫細胞はまた、多量体タンパク質、ウイルス様粒子、および哺乳類細胞に毒性のあるタンパク質の発現に好適な宿主でもある。ＣＥＲＶＡＲＩＸ（商標）、ＰＲＯＶＥＮＧＥ（商標）、ＧＬＹＢＥＲＡ（商標）、ＦＬＵＢＬＯＫ（商標）を含む、いくつかのＦＤＡが承認したワクチンおよび治療法は、昆虫細胞におけるバキュロウイルスの発現を使用する。特に、Ｓｆ９細胞は、組換えバキュロウイルスストックを単離および増殖し、組換えタンパク質を産生するために一般的に使用される。元のＳｆ９細胞は、ツマジロクサヨトウＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの蛹の卵巣組織に由来する親ＩＰＬＢＳＦ−２１（Ｓｆ２１）細胞株からクローン化された。
【０００６】
典型的に、細胞培養培地製剤は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（５〜２０％  ｖ／ｖ）または動物の胚、臓器、もしくは腺からの抽出物（０．５〜１０％  ｖ／ｖ）などの未定義の成分を含む、様々な添加物で補足される。昆虫細胞培地は、ｙｅａｓｔｏｌａｔｅとも呼ばれる酵母溶解物で補足されることが多い。Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅを含む、ビール酵母またはパン酵母などの酵母細胞の自己消化後に得られる酵母エキスである。Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅは、複雑な混合物であり、細胞成長の促進に関与する成分は決定されていない。
【０００７】
そのような化学的に定義されていない補足物質は、細胞培養培地でいくつかの有用な機能を果たす。例えば、これらの補足物質は、不安定な栄養素または水不溶性栄養素の担体またはキレート剤を提供し、有毒な部分に結合して中和し、ホルモンと成長因子、プロテアーゼ阻害剤、および必須の、しばしば未確認または未定義の低分子量栄養素を提供し、細胞を物理的なストレスおよび損傷から保護する。したがって、血清、臓器／腺抽出物、または酵母抽出物は、細胞の増殖に最適な培養培地を提供するための比較的低コストの補足物質として一般的に使用される。
【０００８】
残念ながら、組織培養用途での血清、臓器／腺抽出物、または酵母抽出物の使用には、いくつかの欠点がある。例えば、これらの補足物質および血清の化学組成は、単一のメーカーであっても、ロット間で異なる。補足物質はまた、培養細胞の健康と最終産物の品質を著しく損なう可能性のある感染性病原体（例えば、マイコプラズマおよびウイルス）で汚染されている可能性もある。これらの血清または抽出物からの未定義の成分の使用はまた、培養細胞の栄養およびホルモン要件の真の定義および解明を妨げる。最後に、そして最も重要なことは、生物学的物質の工業産生に細胞培養培地を用いる人々にとって、血清、臓器／腺抽出物、または培養培地の酵母抽出物の補足は、血清または抽出物タンパク質の非特異的同時精製に起因して、培養培地からの所望の物質の精製を複雑にし、そのコストを増加させる可能性がある。
【０００９】
化学的に定義された酵母溶解物を含まない無血清かつ動物産物を含まない昆虫細胞培地、ならびに増殖した昆虫細胞におけるバキュロウイルスおよび／またはタンパク質の産生を改善するための系および方法に対する必要性が残っている。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、とりわけ、バキュロウイルス発現系、その様々な構成要素、ならびにバキュロウイルスまたはタンパク質を産生するための発現系および／またはその構成要素の使用に関する。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、
（ａ）化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地と、
（ｂ）複数のＳｆ９細胞と、を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、タンパク質発現エンハンサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ−９９４、ＣＲＡ−０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、またはバルプロ酸である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現は、トランスフェクション試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質トランスフェクション試薬またはポリマー系トランスフェクション試薬である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、培地は、昆虫細胞培地である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、複数のＳｆ９細胞は、培地中の浮遊培養において成長することが可能である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、複数のＳｆ９細胞は、培地中で高密度成長が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、１ミリリットルあたり約２×１０6〜約２×１０8細胞（細胞／ｍＬ）のピーク細胞密度が可能である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、培地は、バリウム塩、カドミウム塩、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、カリウム塩、カルシウム塩、銀塩、スズ塩、ジルコニウム塩、ナトリウム塩、またはそれらの組み合わせから選択される無機塩を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、培地は、パラアミノ安息香酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ナイアシンアミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、トコフェロール、またはそれらの組み合わせから選択されるビタミンを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、バキュロウイルスベクターをさらに含む。
【００１９】
本開示は、部分的に、バリウム塩、カドミウム塩、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、カリウム塩、カルシウム塩、銀塩、スズ塩、ジルコニウム塩、ナトリウム塩、またはそれらの組み合わせから選択される無機塩と、ビタミンとを含む、昆虫細胞培養のための培地に関する。いくつかの実施形態では、無機塩の量は、昆虫細胞の成長を支持するのに十分である。いくつかの実施形態では、培地は、化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地である。いくつかの実施形態では、培地は、タンパク質を含まない。いくつかの実施形態では、培地は、血清を含まない。いくつかの実施形態では、培地は、動物に由来する成分を含まない。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ビタミンは、パラアミノ安息香酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ナイアシンアミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、トコフェロール、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、ビタミンの量は、昆虫細胞の成長を支持するのに十分である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、培地は、昆虫細胞の成長を支持するのに十分な量の糖をさらに含む。いくつかの実施形態では、糖は、マルトース、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、マンノース、ラクトース、ガラクトース、デキストロース、またはそれらの組み合わせから選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞を成長させる方法は、本明細書に記載されるような培地中で昆虫細胞を培養することを含む。
【００２３】
本開示は、部分的に、
（ａ）化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地で昆虫細胞を培養することと、
（ｂ）細胞をバクミドでトランスフェクトすることと、
（ｃ）昆虫細胞培養からウイルスを採取することと、を含む、バキュロウイルス産生の方法に関する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、細胞は、カチオン性脂質トランスフェクション試薬またはポリマー系トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、浮遊培養されている。
【００２７】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションステップは、昆虫細胞が１ミリリットルあたり１×１０6細胞（細胞／ｍＬ）〜２×１０7細胞／ｍＬの生細胞密度で存在するときに実施される。いくつかの実施形態では、トランスフェクションステップは、昆虫細胞が９０％以上生存しているときに実施される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、培地は、バリウム塩、カドミウム塩、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、カリウム塩、カルシウム塩、銀塩、スズ塩、ジルコニウム塩、またはそれらの組み合わせから選択される無機塩を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、培地は、パラアミノ安息香酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ナイアシンアミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、トコフェロール、またはそれらの組み合わせから選択されるビタミンを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、培地は、トランスフェクションステップ後に新鮮な培地で変更、補充（replenish）、置換、または補足（supplement）されない。
【００３１】
いくつかの実施形態では、採取されたバキュロウイルスは、１ミリリットルあたり少なくとも５×１０7感染性ウイルス粒子（ＩＶＰ／ｍＬ）の力価を有する。いくつかの実施形態では、採取されたバキュロウイルスは、少なくとも１×１０8ＩＶＰ／ｍＬの力価を有する。いくつかの実施形態では、採取されたバキュロウイルスは、５×１０7ＩＶＰ／ｍＬ〜１×１０10ＩＶＰ／ｍＬの力価を有する。
【００３２】
本開示は、部分的に、
（ａ）化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地で昆虫細胞を培養することと、
（ｂ）昆虫細胞にタンパク質を発現するバキュロウイルスを感染させることと、を含む、バキュロウイルスからのタンパク質産生の方法に関する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、ステップ（ｂ）の前に培地に添加される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、感染の少なくとも１０時間前に添加される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、感染の１２時間〜３６時間前に添加される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、感染の１８時間〜２４時間前に添加される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ−９９４、ＣＲＡ−０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、リコスタチンＡ、またはバルプロ酸である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、培地中で高密度成長が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、１ミリリットルあたり約２×１０6〜約２×１０8細胞（細胞／ｍＬ）のピーク細胞密度が可能である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、浮遊培養されている。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、付着培養されている。
【００３８】
いくつかの実施形態では、感染ステップは、昆虫細胞が１ミリリットルあたり３×１０6細胞（細胞／ｍＬ）〜１×１０7細胞／ｍＬの生細胞密度で存在するときに実施される。いくつかの実施形態では、感染ステップは、昆虫細胞が８０％以上生存しているときに実施される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞を感染させるために使用されるバキュロウイルスは、１〜１０の感染多重度（ＭＯＩ）を有する。いくつかの実施形態では、昆虫細胞を感染させるために使用されるバキュロウイルスは、３〜７のＭＯＩを有する。いくつかの実施形態では、昆虫細胞を感染させるために使用されるバキュロウイルスは、約５のＭＯＩを有する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、この方法は、（ｃ）感染細胞を一定期間培養してタンパク質を産生することをさらに含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、この方法は、（ｄ）タンパク質を採取することをさらに含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｄ）には、５日〜１５日を要する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、感染後約２４時間〜約１２０時間で採取される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、培地は、タンパク質産生中に新鮮な培地で置換、補充、または補足されない。
【００４４】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、付着培養されている。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、浮遊培養されている。
【００４５】
本明細書に記載される態様および実施形態の各々は、実施形態または態様の文脈から明白にまたは明確に除外されない限り、一緒に使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地（太線）または酵母溶解物を含有する昆虫細胞培地（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、細線）中で成長させたＳｆ９細胞の生細胞密度（ＶＣＤ、実線）および生存率（破線）を示す折れ線グラフである。
【図１Ｂ】付着培養または浮遊培養として化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地中で成長させたＳｆ９細胞から単離されたバキュロウイルスの量を示す棒グラフである。
【図２Ａ】タンパク質エンハンサーを含まないか（（−）エンハンサー）、またはタンパク質発現バキュロウイルス感染の１６、２０、２４、または２８時間前にタンパク質エンハンサーを添加した、化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地で成長させたＳｆ９細胞からのタンパク質力価を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】タンパク質エンハンサーを添加した場合と添加しない場合の、酵母溶解物を含有する昆虫細胞培地で成長させたＳｆ９細胞のタンパク質力価を示す棒グラフである。
【図３Ａ】示されたサイズのフラスコ内で化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞からのタンパク質力価を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】示されたサイズのフラスコ内で成長させた非感染細胞の生細胞密度（ＶＣＤ、実線）および生存率（破線）を示す折れ線グラフである。
【図３Ｃ】１２５ｍＬフラスコまたは２４ディープウェルプレートで化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞からのタンパク質力価を示す棒グラフである。
【図３Ｄ】指示されたサイズの容器内で成長させた非感染細胞の生細胞密度（ＶＣＤ、実線）および生存率（破線）を示す折れ線グラフである。
【図４Ａ】酵母溶解物を含有する昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞（「従来のプロトコル」、太線）と比較して、本明細書に記載される化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞（「強化プロトコル」、細線）の生細胞密度（ＶＣＤ、実線）および生存率（破線）を示す折れ線グラフである。
【図４Ｂ】図４Ａの細胞の感染後１、２、３、および４日のタンパク質力価を示す棒グラフである。
【図５Ａ】示されるように、酵母溶解物を含有する４つの異なる昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞と比較して、本明細書に記載される化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞（「強化プロトコル」、実線）の生細胞密度（ＶＣＤ）を示す折れ線グラフである。
【図５Ｂ−５Ｄ】図５Ａの酵母溶解物を含有する４つの異なる昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞と比較して、本明細書に記載される化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞（「強化プロトコル」）から採取したタンパク質の力価を示す棒グラフである。
【図６Ａ】酵母溶解物を含有するＳｆ９００−ＩＩ昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞と比較して、ＧＵＳ発現バキュロウイルスに感染し、本明細書に記載される化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地で成長させたＳｆ９細胞（「強化プロトコル」）からのβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】酵母溶解物を含有するＳｆ９００−ＩＩ昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞と比較して、ＳＥＡＰ発現バキュロウイルスに感染し、本明細書に記載される化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地で成長させたＳｆ９細胞（「強化プロトコル」）からの分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性を示す棒グラフである。
【図６Ｃ】図６Ｂに記載されている細胞からのＳＥＡＰのポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真である。
【図６Ｄ】酵母溶解物を含有するＳｆ９００−ＩＩ昆虫細胞培地で成長させたバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞と比較して、ＴＮＦ−α発現バキュロウイルスに感染し、本明細書に記載される化学的に定義された酵母溶解物を含まない昆虫細胞培地で成長させたＳｆ９細胞（「強化プロトコル」）からの腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）タンパク質力価を示す棒グラフである。
【図６Ｅ】核因子κＢ（ＮＦκＢ）ルシフェラーゼアッセイで測定されたＴＮＦ−αタンパク質の活性を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
Ｉ．定義
本明細書で使用される「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を意味する。
【００４８】
本明細書で使用される「細胞」という用語は、あらゆる種類の真核生物および原核生物細胞を指し、それらを含む。いくつかの実施形態では、この用語は、真核細胞、特に昆虫細胞を指す。ある特定の例示的であるが非限定的な実施形態では、「細胞」という用語は、例えば、Ｓｆ９細胞、またはその変異体などのＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を指すことを意味する。Ｓｆ９細胞の変異体には、例えば限定されないが、酵母溶解物（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）を含まない培地で成長できるＳｆ９細胞、および／または浮遊培養で成長、増殖、およびトランスフェクトできるＳｆ９細胞が含まれる。Ｓｆ９細胞の変異体は、例えば限定されないが、高密度（例えば、約２×１０6細胞／ｍＬ以上、約５×１０6細胞／ｍＬ以上、２×１０7細胞／ｍＬ以上、またはそれ以上）で培養することができるＳｆ９細胞を含む。
【００４９】
細胞を培養し、トランスフェクションおよびウイルス産生ワークフローを実行する状況で使用される場合、「高密度成長が可能」という句は、一般に、高効率でトランスフェクトされる能力を維持しながら、適切な細胞培養培地中で約１×１０6細胞／ｍＬ以上、約２×１０6細胞／ｍＬ以上、約３×１０6細胞／ｍＬ以上、またはさらに必要に応じて約４×１０6細胞／ｍＬ以上、または約２×１０7細胞／ｍＬ以上のピーク細胞密度まで成長または培養することができる、既知の細胞株、または既知の細胞株の変異体を指す。いくつかの実施形態では、そのような細胞はまた、高レベル（例えば、２００μｇ／ｍＬ以上から最大約１ｍｇ／ｍＬ以上のレベル）で標的タンパク質を発現することができる。
【００５０】
「接触する」は、その単純な通常の意味に従って使用され、少なくとも２つの異なる種（例えば、生体分子または細胞を含む化学化合物）が、反応、相互作用、または物理的に触れるのに十分に近くなるプロセスを指す。しかしながら、得られる反応産物は、添加試薬間の反応から直接、または反応混合物中で産生され得る、添加試薬のうちの１つ以上に由来する中間体から産生され得ることを理解されたい。
【００５１】
「接触する」という用語は、２つの種が反応、相互作用、または物理的に接触するのを可能にすることを含み得、ここで、２つの種は、本明細書に記載される化合物およびタンパク質または酵素であり得る。いくつかの実施形態では、接触することは、本明細書に記載される化合物が、シグナル伝達経路に関与するタンパク質または酵素と相互作用するのを可能にすることを含む。
【００５２】
「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。発現は、タンパク質を検出するための従来の技法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光法、免疫組織化学など）を使用して検出することができる。
【００５３】
「酵母溶解物」または「ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ」という用語は、アミノ酸、ペプチド、多糖類、ビタミン、およびミネラルの（通常は定義されていない）混合物を含有する酵母（例えば、パン酵母またはビール酵母）の水性抽出物を指す。例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００７  Ｍａｙ；５４（１）：２５−３４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅは、限外濾過されていても、限外濾過されていなくてもよい。
【００５４】
本明細書で使用される「酵母溶解物を含まない」または「ｙｅａｓｔｏｌａｔｅを含まない」という用語は、酵母溶解物を含まないかまたは実質的に含まない培地、特に昆虫細胞培地を指す。好ましくは、培地は、酵母溶解物を完全に含まない。本明細書で使用される「酵母溶解物を実質的に含まない」とは、約１重量％未満の酵母溶解物を含有する、微量の酵母溶解物のみを含有する、または検出できない量の酵母溶解物を含有する培地を指す。
【００５５】
本明細書で使用される「血清を含まない」という用語は、血清を含まないか、または実質的に血清を含まない培地を指す。本明細書で使用される「実質的に血清を含まない」とは、約１重量％未満の血清を含有する、微量の血清のみを含有する、または検出できない量の血清を含有する培地を指す。
【００５６】
本明細書で使用される「化学的に定義された培地」という用語は、細胞、特に真核細胞のインビトロ培養に好適な培地を指し、ここで、すべての化学成分およびそれらの濃度が知られている。
【００５７】
「タンパク質を含まない」培養培地という句は、タンパク質を含有しない（例えば、血清アルブミンもしくは接着因子などの血清タンパク質、成長因子などの栄養素タンパク質、またはトランスフェリン、セルロプラスミンなどの金属イオンキャリアタンパク質などのない）培養培地を指す。好ましくは、ペプチドが存在する場合、ペプチドは小さいペプチド、例えば、ジまたはトリペプチドである。好ましくは、デカペプチド長またはそれ以上のペプチドは、無タンパク質培地中に存在するアミノ酸の約１％未満、より好ましくは約０．１％未満、さらにより好ましくは約０．０１％未満である。
【００５８】
本明細書に使用される「動物由来」材料という用語は、すべてまたは一部が、組換え動物ＤＮＡまたは組換え動物タンパク質ＤＮＡを含む、動物源に由来する材料を指す。
【００５９】
「発現エンハンサー」という用語は、一般的に、ここに記載される実施形態による培養培地製剤を補足するために使用される１つ以上の液体（好ましくは水性）添加物を指し、該添加物は、ここに記載される実施形態による一過性タンパク質発現系において産生される発現されたタンパク質の収量を改善するように選択される。本用語は、細胞周期の進行に影響を及ぼし、アポトーシスを阻害し、細胞成長を遅らせ、かつ／またはタンパク質産生を促進するいくつかの化合物のうちの任意の１つ以上を包含する。本発明の文脈において、「発現エンハンサー」という用語は、一般に、タンパク質発現系に添加される任意の１つ以上の化合物を指し、その存在は、標的タンパク質の発現を、そのような発現エンハンサー（複数可）の不在下において見られる発現レベルを少なくとも２倍〜最大約１０倍を超える率で強化または促進する。
【００６０】
本明細書で使用される「バクミド」という用語は、細菌内で複製するバキュロウイルスベクターを指すが、昆虫細胞にトランスフェクトされると、昆虫細胞によるバキュロウイルスの産生を可能にする。
【００６１】
「細胞培養」または「培養」とは、人工的なインビトロ環境における細胞の維持を意味する。
【００６２】
「増殖」とは、成長および／または分化および／またはまたは継続生存を好む条件下のインビトロでの細胞の維持を意味する。「培養」は、「細胞培養」と互換可能に使用され得る。培養は、培養培地１ｍＬあたりの生細胞の数によって評価される。巨大分子の導入後の増殖は、好ましくは、産物、例えば、ウイルスでのタンパク質産物の産生を含む。
【００６３】
本明細書に使用される「補充、交換、または補足培地」という用語は、ある体積の新鮮な細胞培養培地を、培養において既に存在する培地に添加すること、および／または培養において既に存在する培地を新鮮な培地に交換すること、および／または培養において既に存在する培地を新しい培地で補足することを指す。新鮮な培地は、少なくとも１つの細胞内に導入される１つ以上の巨大分子もしくは化合物を含有しない培地、または増殖におけるそれらの成長を支持するために細胞と接触していない培地である。当業者は、細胞計数（手動または自動）、トリパンブルー排除、タンパク質もしくは他の物質の産生、アラマーブルーアッセイ、１つ以上の代謝産物の存在もしくは濃度、細胞接着、形態学的外観、消費培地の分析などの、当該技術分野において既知の技法により、細胞成長および／または生存率をモニタリングすることによって、培地を除去および／または補充、置換、もしくは補足することが利点であるか、または必要であるかを決定することができる。モニタリング技法のうちの１つまたは組み合わせを使用して、成長、少なくとも１つの巨大分子の導入、および／または少なくとも１つの巨大分子の導入後の増殖を支持する必要があるかどうかを決定することができる。
【００６４】
「組換えタンパク質」とは、宿主細胞に導入された核酸によってコードされるタンパク質を指す。宿主細胞は、核酸を発現する。「核酸を発現する」という用語は、「核酸によりコードされるＲＮＡからタンパク質を発現すること」と同義である。本明細書に使用される「タンパク質」とは、重合されたアミノ酸、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質などを広く指す。
【００６５】
「タンパク質収量」という用語は、培養された細胞によって発現されたタンパク質の量を指し、例えば、培地１ミリリットルあたりの産生されたタンパク質のグラムに関して測定され得る。タンパク質が細胞によって分泌されない場合、タンパク質は、当業者に既知の方法によって細胞の内部から単離され得る。タンパク質が細胞によって分泌される場合、タンパク質は、当業者に既知の方法によって培養培地から単離され得る。細胞によって発現されたタンパク質の量は、当業者によって容易に決定され得る。タンパク質は組換えタンパク質であり得る。
【００６６】
「タンパク質産物」は、タンパク質による産生または作用に関連する産物である。タンパク質産物はタンパク質であり得る。タンパク質産物はまた、産物を産生するために、１つ以上の他の物質によるタンパク質の作用から生じる産物であってもよい。かかる作用の例は、タンパク質による酵素作用である。
【００６７】
「浮遊培養」とは、培養槽中の細胞の大部分またはすべてが浮遊状態で存在し、培養槽中の細胞の少数が槽の表面または槽内の別の表面に接着するか、またはいずれも接着しない細胞培養を意味する。好ましくは、「浮遊培養」は、培養槽中の細胞の７５％超が浮遊状態であり、培養槽上の表面または培養槽に接着しない。より好ましくは、「浮遊培養」は、培養槽中の細胞の８５％超が浮遊状態で存在し、培養槽上の表面または培養槽に接着しない。培養槽中の細胞の９５％超が浮遊状態で存在し、培養槽上の表面または培養槽に接着しない「浮遊培養」がさらにより好ましい。
【００６８】
本発明の培地、方法、キット、および組成物は、細胞の単層（付着）または浮遊培養、トランスフェクション、および増殖、ならびに単層または浮遊培養での細胞におけるタンパク質の発現に好適である。好ましくは、本発明の培地、方法、キット、および組成物は、細胞の浮遊培養、トランスフェクション、および増殖、ならびに浮遊培養での細胞におけるタンパク質産物の発現のためである。
【００６９】
「培養槽」とは、任意の容器、例えば、細胞を培養するための無菌環境を提供することができるガラス、プラスチック、または金属製の容器を意味する。
【００７０】
「細胞培養培地」、「組織培養培地」、「培養培地」（いずれの場合も、複数「培地（ｍｅｄｉａ）」）、および「培地製剤」という句は、細胞または組織を増殖するための栄養素液を指す。これらの句は、互換可能に使用され得る。
【００７１】
「組み合わせる」という用語は、成分を混合または混和することを指す。
【００７２】
「微量元素」または「微量元素部分」という用語は、培養培地中に存在する他の部分もしくは構成成分の量または濃度に対して、非常に低い（すなわち、「微」）量または濃度でのみ細胞培養培地中に存在する部分を指す。本発明では、これらの用語は、Ａｇ+、Ａｌ3+、Ｂａ2+、Ｃｄ2+、Ｃｏ2+、Ｃｒ3+、Ｃｕ1+、Ｃｕ2+、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｇｅ4+、Ｓｅ4+、Ｂｒ-、Ｉ-、Ｍｎ2+、Ｆ-、Ｓｉ4+、Ｖ5+、Ｍｏ6+、Ｎｉ2+、Ｒｂ+、Ｓｎ2+、およびＺｒ4+、ならびにそれらの塩を包含する。例えば、以下の塩は、本発明の培養培地中の微量元素として使用され得る：ＡｇＮＯ3、ＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、Ｂａ（Ｃ2Ｈ3Ｏ2）2、ＣｄＳＯ4・８Ｈ2Ｏ、ＣｄＣｌ2、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、Ｃｒ2（ＳＯ4）3・１Ｈ2Ｏ、ＣｕＣｌ2、ＦｅＳＯ4、ＧｅＯ2、Ｎａ2ＳｅＯ3、Ｈ2ＳｅＯ3、ＫＢｒ、Ｋｌ、ＭｎＣ１2・４Ｈ2Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ2ＳｉＯ3・９Ｈ2Ｏ、ＮａＶＯ3、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ2、ＺｎＣｌ2、およびＺｒＯＣｌ2・８Ｈ2Ｏ。
【００７３】
「アミノ酸」という用語は、アミノ酸またはそれらの誘導体（例えば、アミノ酸類似体）、ならびにそれらのＤ形態およびＬ形態を指す。そのようなアミノ酸の例には、限定されないが、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリン、Ｎ−アセチルシステインが挙げられる。
【００７４】
「トランスフェクション」という用語は、核酸、タンパク質、または他の巨大分子を標的細胞に送達することを意味して本明細書に使用され、結果として、この核酸、タンパク質、または他の巨大分子が細胞内で発現されるかまたは生物学的機能を有するようになる。
【００７５】
細胞内への「巨大分子の導入のための試薬」または「トランスフェクション試薬」は、細胞内への巨大分子の進入を容易にする、当業者に既知の任意の材料、製剤、または組成物である。例えば、米国特許第５，２７９，８３３号を参照されたい。いくつかの実施形態では、試薬は、「トランスフェクション試薬」であり得、１つ以上の標的細胞内への１つ以上の核酸の取り込みを増加させる任意の化合物および／または組成物であり得る。様々なトランスフェクション試薬が、当業者に既知である。
【００７６】
ＩＩ．バキュロウイルス発現系
本開示は、とりわけ、バキュロウイルスまたはタンパク質を産生するために使用することができる、バキュロウイルス発現系およびその様々な構成要素に関する。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、
（ａ）化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地と、
（ｂ）複数のＳｆ９細胞と、を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、タンパク質発現エンハンサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ−９９４、ＣＲＡ−０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ、またはバルプロ酸である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、トランスフェクション試薬をさらに含む。好適なトランスフェクション試薬には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオン性ポリマー、ポリリジンおよびポリアルギニンなどの正に荷電したアミノ酸のポリマー、正に荷電したデンドリマーおよび分裂したデンドリマー、カチオン性Ｂ−シクロデキストリン含有ポリマー（ＣＤポリマー）、ＤＥＡＥ−デキストランなどを含む、１つ以上の化合物および／または組成物が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞内への巨大分子の導入のための試薬は、カチオン性脂質および／または中性脂質であり得る１つ以上の脂質を含み得る。好ましい脂質には、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＥ）、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（４´−トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジヒドロキシル−ジミリスチルスペルミンテトラヒドロクロリド（ＤＨＤＭＳ）、ヒドロキシル−ジミリスチルスペルミンテトラヒドロクロリド（ＨＤＭＳ）、１，２−ジオレオイル−３−（４´−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＴＢ）、１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）、コレステリル（４´−トリメチルアンモニオ）ブタノエート（ＣｈｏＴＢ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩ）、１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＭＥ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ´−ジドデシル−Ｎ−［ｐ（２−トリメチルアンモニオエチルオキシ）ベンゾイル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１つ以上の脂質に接合したスペルミン（例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）、Ｎ，ＮI，ＮII，ＮIII−テトラメチル−Ｎ，ＮI，ＮII，ＮIII−ｔｅｔ−ラパルミチルスペルミン（ＴＭ−ＴＰＳ）、およびジパルミトイルファスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミンド（ＤＰＰＥＳ））、リポポリリジン（ＤＯＰＥに接合したポリリジン）、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタミン）接合脂肪酸（ＴＦＡ）、ならびに／またはペプチド、例えば、トリリジル−アラニル−ＴＲＩＳモノ、ジ、およびトリパルミテート（３Ｂ−［Ｎ−（Ｎ´，Ｎ´−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣＣｈｏｌ）、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
当業者であれば、上述の脂質のある特定の組み合わせが、細胞内への核酸の導入に特に好適であることが示されていることを理解し、例えば、ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）の組み合わせは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）から商品名ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）で入手可能であり、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの１：１（ｗ／ｗ）の組み合わせは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商品名ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）で入手可能であり、ＤＩＶＩＲＩＥおよびコレステロールの１：１（Ｍ／Ｍ）の組み合わせは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）から商品名ＤＩＶＩＲＩＥ−Ｃ試薬で入手可能であり、ＴＭ−ＴＰＳおよびＤＯＰＥの１：１．５（Ｍ／Ｍ）の組み合わせは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈから入手可能である。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質トランスフェクション試薬である。いくつかの実施形態では、トランスフェクション試薬は、ポリマー系トランスフェクション試薬である。他の市販のカチオン性脂質トランスフェクション試薬には、限定されないが、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、ＬＹＯＶＥＣ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅから入手可能）、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓから入手可能）、および昆虫ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が挙げられる。ポリマー系トランスフェクション試薬には、限定されないが、ＴＵＲＢＯＦＥＣＴ（商標）トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）、Ｘｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡから入手可能）、ＸＴＲＥＭＥＧＥＮＥ（商標）トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅから入手可能）、Ｓｉｇｍａユニバーサルトランスフェクション試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＰＯＬＹＭＥＲインビボトランスフェクション試薬（Ａｌｔｏｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられる。本明細書で使用され得る追加のトランスフェクション試薬には、限定されないが、ＶＩＡＦＥＣＴ（商標）トランスフェクション試薬、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬およびＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（これらの各々は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である）、ならびにＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）脂質試薬が挙げられる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、培地は、昆虫細胞培地である。実施形態では、昆虫細胞培地は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＥＸＰＩＳＦ（商標）ＣＤ培地である。実施形態では、昆虫細胞培地は、グレースの昆虫培地、ＳＦ−９００（商標）ＩＩ、またはＳＦ−９００（商標）ＩＩＩであり、これらの各々は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能である。
【００８１】
元のＳｆ９細胞は、ツマジロクサヨトウＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの蛹の卵巣組織に由来する親ＩＰＬＢＳＦ−２１（Ｓｆ２１）細胞株からクローン化された。Ｓｆ９細胞は、ウイルス、特にバキュロウイルスの研究開発に広く使用されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＳｆ９細胞は、例えば、細胞を培地中で一定期間（例えば、少なくとも４、６、８、１０、１２、１５、２０継代）にわたって培養／継代培養することによって、化学的に定義された酵母溶解物を含まない培地での成長に適合されたＳｆ９細胞である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＥＸＰＩＳＦ９（商標）細胞である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｓｆ９細胞である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、複数のＳｆ９細胞は、培地中の浮遊培養において成長することが可能である。いくつかの実施形態では、複数のＳｆ９細胞は、培地中の付着培養において成長することが可能である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、複数のＳｆ９細胞は、本明細書に記載されるように、化学的に定義された酵母溶解物を含まない培地で培養される場合、高密度成長が可能である。いくつかの実施形態では、複数のＳｆ９細胞は、本明細書に記載されるように、化学的に定義された酵母溶解物を含まない培地で培養される場合、高密度成長に適合される。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、１ミリリットルあたり約１×１０6細胞（細胞／ｍＬ）〜約２×１０8細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約２×１０6細胞／ｍＬ〜約２×１０8細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約５×１０6細胞／ｍＬ〜約５×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約５×１０6細胞／ｍＬ〜約４×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約５×１０6細胞／ｍＬ〜約３×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約６×１０6細胞／ｍＬ〜約３×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約７×１０6細胞／ｍＬ〜約３×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約８×１０6細胞／ｍＬ〜約３×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約９×１０6細胞／ｍＬ〜約３×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約１×１０7細胞／ｍＬ〜約３×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約１×１０7細胞／ｍＬ〜約２．５×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約２×１０7細胞／ｍＬ〜約２．５×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、最大約２．２×１０7細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。いくつかの実施形態では、Ｓｆ９細胞は、約１×１０6細胞／ｍＬ〜約５×１０6細胞／ｍＬ、約５×１０6細胞／ｍＬ〜約１×１０7細胞／ｍＬ、約１×１０7細胞／ｍＬ〜約５×１０7細胞／ｍＬ、約５×１０7細胞／ｍＬ〜約１×１０8細胞／ｍＬ、または約１×１０8細胞／ｍＬ〜約２×１０8細胞／ｍＬのピーク細胞密度が可能である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、細胞は浮遊培養で成長する。これは、培養槽中の細胞の大部分またはすべてが浮遊状態で存在し、培養槽中の細胞の少数が槽の表面または槽内の別の表面に接着するか、またはいずれも接着しない、細胞培養を意味する。いくつかの実施形態では、浮遊培養は、培養槽中の細胞の約７５％以上が浮遊状態であり、培養槽上の表面または培養槽内に接着しない。いくつかの実施形態では、浮遊培養は、培養槽中の細胞の約８５％以上が浮遊状態で存在し、培養槽上の表面または培養槽内に接着しない。いくつかの実施形態では、浮遊培養は、培養槽中の細胞の約９５％以上が浮遊状態で存在し、培養槽上の表面または培養槽内に接着しない。
【００８５】
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、その系を使用してバキュロウイルスを発現させるための説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、その系を使用してバキュロウイルスからタンパク質を発現させるための説明書をさらに含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、バキュロウイルスベクターをさらに含む。いくつかの実施形態では、バキュロウイルスベクターは、バクミドである。
【００８７】
いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、組換えバキュロウイルスを作製するための１つ以上の構成要素をさらに含む。
【００８８】
ＩＩＩ．昆虫細胞培地
いくつかの態様では、本開示は、昆虫細胞の成長のための培地に関する。いくつかの実施形態では、バキュロウイルス発現系は、培地を含む。本開示は、部分的に、バリウム塩、カドミウム塩、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、カリウム塩、カルシウム塩、銀塩、スズ塩、ジルコニウム塩、ナトリウム塩、またはそれらの組み合わせから選択される無機塩と、ビタミンとを含む、昆虫細胞培養のための培地に関する。いくつかの実施形態では、無機塩の量は、昆虫細胞の成長を支持するのに十分である。いくつかの実施形態では、培地は、化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地である。いくつかの実施形態では、培地は、タンパク質を含まない。いくつかの実施形態では、培地は、血清を含まない。いくつかの実施形態では、培地は、動物に由来する成分を含まない。
【００８９】
いくつかの実施形態では、培地は、アルミニウム塩、バリウム塩、カドミウム塩、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、カリウム塩、カルシウム塩、銀塩、スズ塩、ジルコニウム塩、ナトリウム塩、またはそれらの組み合わせから選択される有機または無機塩を含む。塩は、有機または無機アニオンで作製されるものを含み、限定されないが、ＡｇＮＯ3、ＡｌＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、Ｂａ（Ｃ2Ｈ3Ｏ2）2、ＣａＣｌ2、ＣｄＳＯ4・８Ｈ2Ｏ、ＣｄＣｌ2、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、Ｃｒ2（ＳＯ4）3・１Ｈ2Ｏ、ＣｕＣｌ2、ＦｅＳＯ4、ＦｅＣｌ2、ＦｅＣｌ3、Ｆｅ（ＮＯ3）3、ＧｅＯ2、Ｎａ2、ＳｅＯ3、Ｈ2ＳｅＯ3、ＫＢｒ、ＫＣｌ、Ｋｌ、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＭｎＣ１2・４Ｈ2Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ2ＳｉＯ3・９Ｈ2Ｏ、ＮａＶＯ3、Ｎａ3ＶＯ4、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、ＮａＨＣＯ3、ＮｉＳＯ4・６Ｈ2Ｏ、ＮｉＣｌ2、Ｎｉ（ＮＯ3）2、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ2、ＺｎＣｌ2、ＺｎＳＯ4、ＺｒＯＣｌ2・８Ｈ2Ｏ、ＥＤＴＡテトラナトリウムが挙げられる。
【００９０】
実施形態では、培地は、バナジン酸ナトリウム（ＮａＶＯ3またはＮａ3ＶＯ4）を、１リットルあたり約１×１０-5グラム（ｇ／Ｌ）〜約５×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、バナジウム酸ナトリウム（ＮａＶＯ３またはＮａ３ＶＯ４）を、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、または約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、バナジン酸ナトリウム（ＮａＶＯ3またはＮａ3ＶＯ4）を、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、または約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、バナジン酸ナトリウム（ＮａＶＯ3またはＮａ3ＶＯ4）を、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-5ｇ／Ｌ、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、または約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。
【００９１】
実施形態では、培地は、メタケイ酸ナトリウムを、１リットルあたり約１×１０-5グラム（ｇ／Ｌ）〜約５×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、メタケイ酸ナトリウムを、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、または約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、メタケイ酸ナトリウムを、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、または約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、メタケイ酸ナトリウムを、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-5ｇ／Ｌ、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、または約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。
【００９２】
実施形態では、培地は、モリブデン酸アンモニウムを、約１×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、モリブデン酸アンモニウムを、約１×１０-6ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌ、約１×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-5ｇ／Ｌ、または約１×１０-6ｇ／Ｌ〜約１×１０-5ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、モリブデン酸アンモニウムを、約５×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、または約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、モリブデン酸アンモニウムを、約１×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約５×１０-6ｇ／Ｌ〜約１×１０-5ｇ／Ｌ、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-5ｇ／Ｌ、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌ、または約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌの範囲で含む。
【００９３】
実施形態では、培地は、塩化カドミウムを、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、塩化カドミウムを、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約５×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約１×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約５×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、または約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、塩化カドミウムを、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-5ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-5ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-6ｇ／Ｌ、または約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、塩化カドミウムを、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-7ｇ／Ｌ〜約１×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約５×１０-6ｇ／Ｌ〜約１×１０-5ｇ／Ｌ、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-5ｇ／Ｌ、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌ、または約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌの範囲で含む。
【００９４】
実施形態では、培地は、亜鉛塩（ＺｎＣｌ2および／またはＺｎＳＯ4）を、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、亜鉛塩（ＺｎＣｌ2および／またはＺｎＳＯ4）を、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌ、約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌ、約５×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌ、または約１×１０-2ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、媒地は、亜鉛塩（ＺｎＣｌ2および／またはＺｎＳＯ4）を、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-2ｇ／Ｌ、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、または約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、亜鉛塩（ＺｎＣｌ2および／またはＺｎＳＯ4）を、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、約５×１０-3ｇ／Ｌ〜約１×１０-2ｇ／Ｌ、または約１×１０-2ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌの範囲で含む。
【００９５】
実施形態では、培地は、鉄塩（例えば、ＦｅＳＯ4、ＦｅＣｌ2、ＦｅＣｌ3、および／またはＦｅ（ＮＯ3）3）を、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、鉄塩（例えば、ＦｅＳＯ4、ＦｅＣｌ2、ＦｅＣｌ3、および／またはＦｅ（ＮＯ3）3）を、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌ、約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌ、約５×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌ、または約１×１０-2ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、鉄塩（例えば、ＦｅＳＯ4、ＦｅＣｌ2、ＦｅＣｌ3、および／またはＦｅ（ＮＯ3）3）を、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-2ｇ／Ｌ、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、または約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、鉄塩（例えば、ＦｅＳＯ4、ＦｅＣｌ2、ＦｅＣｌ3、および／またはＦｅ（ＮＯ3）3）を、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、５×１０-3ｇ／Ｌ〜約１×１０-2ｇ／Ｌ、または１×１０-2ｇ／Ｌ〜約５×１０-2ｇ／Ｌの範囲で含む。
【００９６】
実施形態では、培地は、カリウム塩（例えば、ＫＢｒ、ＫＣｌ、および／またはＫＩ）を、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、カリウム塩（例えば、ＫＢｒ、ＫＣｌ、および／またはＫＩ）を、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、または約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、カリウム塩（例えば、ＫＢｒ、ＫＣｌ、および／またはＫＩ）を、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、または約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、カリウム塩（例えば、ＫＢｒ、ＫＣｌ、および／またはＫＩ）を、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-9ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、または約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。
【００９７】
実施形態では、培地は、銀塩（例えば、ＡｇＮＯ3）を、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、銀塩（例えば、ＡｇＮＯ3）を、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、または約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、銀塩（例えば、ＡｇＮＯ3）を、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、または約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、銀塩（例えば、ＡｇＮＯ3）を、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-9ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、または約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。
【００９８】
実施形態では、培地は、塩化第一スズを、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、塩化第一スズを、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、または約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、塩化第一スズを、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、または約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、塩化第一スズを、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-9ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、または約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。
【００９９】
実施形態では、培地は、ニッケル塩（例えば、ＮｉＳＯ4ＮｉＣｌ2、および／またはＮｉ（ＮＯ3）2）を、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、ニッケル塩（例えば、ＮｉＳＯ4、ＮｉＣｌ2、および／またはＮｉ（ＮＯ3）2）を、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、または約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、ニッケル塩（例えば、ＮｉＳＯ4、ＮｉＣｌ2、および／またはＮｉ（ＮＯ3）2）を、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、または約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、ニッケル塩（例えば、ＮｉＳＯ4、ＮｉＣｌ2、および／またはＮｉ（ＮＯ3）2）を、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-9ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、または約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌの範囲で含む。
【０１００】
実施形態では、培地は、ＺｒＯＣｌ2を、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、ＺｒＯＣｌ2を、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、または約５×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、ＺｒＯＣｌ2を、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、ＺｒＯＣｌ2を、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-9ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、５×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、５×１０-7ｇ／Ｌ〜約１×１０-6ｇ／Ｌ、または１×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌの範囲で含む。
【０１０１】
実施形態では、培地は、フッ化ナトリウムを、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、フッ化ナトリウムを、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、または約５×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、フッ化ナトリウムを、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、フッ化ナトリウムを、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-9ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-7ｇ／Ｌ〜約１×１０-6ｇ／Ｌ、または約１×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌの範囲で含む。
【０１０２】
実施形態では、培地は、酢酸バリウムを、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、酢酸ナトリウムを、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌ、または約５×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、酢酸バリウムを、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-6ｇ／Ｌ、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、酢酸バリウムを、約１×１０-9ｇ／Ｌ〜約５×１０-9ｇ／Ｌ、約５×１０-9ｇ／Ｌ〜約１×１０-8ｇ／Ｌ、約１×１０-8ｇ／Ｌ〜約５×１０-8ｇ／Ｌ、約５×１０-8ｇ／Ｌ〜約１×１０-7ｇ／Ｌ、約１×１０-7ｇ／Ｌ〜約５×１０-7ｇ／Ｌ、約５×１０-7ｇ／Ｌ〜約１×１０-6ｇ／Ｌ、または約１×１０-6ｇ／Ｌ〜約５×１０-6ｇ／Ｌの範囲で含む。
【０１０３】
実施形態では、培地は、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2および／またはＭｇＳＯ4）を、約０．０１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2および／またはＭｇＳＯ4）を、約０．０５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、または約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2および／またはＭｇＳＯ4）を、約０．０１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、または約０．０１ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ2および／またはＭｇＳＯ4）を、約０．０１ｇ／Ｌ〜約０．０５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、または約５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの範囲で含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、培地は、パラアミノ安息香酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン（例えば、塩化コリン）、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、ナイアシンアミド、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、またはそれらの組み合わせから選択されるビタミンを含む。各ビタミンは、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの範囲で培地中に存在し得る。実施形態では、培地は、ビタミンを、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、約５×１０-3ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、または約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、ビタミンを、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約０．０５ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約０．０１ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、または約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、ビタミンを、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3、約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、約５×１０-3ｇ／Ｌ〜約０．０１ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ〜約０．０５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌ、または約０．１ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの範囲で含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、培地は、メチルメリステート、トコフェロール、リオレイン酸メチル、オレイン酸メチル、アラキドン酸メチル、リノレン酸メチル、パルミトリン酸メチル、パルミチン酸メチル、およびそれらの組み合わせから選択される脂肪酸（またはそのエステル、例えばその脂肪酸メチルエステル）を含む。各脂肪酸および／または脂肪酸メチルエステルは、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-2ｇ／Ｌの範囲で培地中に存在してもよい。実施形態では、培地は、脂肪酸（またはそのエステル）を、約５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-2ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-2ｇ／Ｌ、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、または約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約１×１０-2ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、脂肪酸（またはそのエステル）を、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、または約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、脂肪酸（またはそのエステル）を、約１×１０-5ｇ／Ｌ〜約５×１０-5ｇ／Ｌ、５×１０-5ｇ／Ｌ〜約１×１０-4ｇ／Ｌ、１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ、５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ、または５×１０-3ｇ／Ｌ〜約１×１０-2ｇ／Ｌの範囲で含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、培地は、グルコース、スクロース、ピルビン酸（例えば、ピルビン酸ナトリウム）、マルトース、トレハロース、またはそれらの組み合わせから選択されるエネルギー源を含む。実施形態では、培地は、約０．０１ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの範囲のエネルギー源を含む。実施形態では、培地は、約０．０５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、または約２０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌの範囲のエネルギー源を含む。実施形態では、培地は、約０．０１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、または約０．０１ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌの範囲のエネルギー源を含む。実施形態では、培地は、約０．０１ｇ／Ｌ〜約０．０５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、または約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの範囲のエネルギー源を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、培地は、乳化剤、界面活性剤、抗酸化剤、緩衝液、ポロキサマー、金属結合化合物、またはそれらの組み合わせから選択される追加の成分を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ポリソルベート、エタノールアミン、プトレシン、スペルミン、スペリミジン、ヒドロキシピリジン誘導体（例えば、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、３−ヒドロキシ−４−ピロン、３−ヒドロキシピリド−２−オン、１−メチル−３−ヒドロキシピリド−２−オン、または２−ヒドロキシ−ニコチン酸）、ＥＤＴＡ、２−メルカプトエタノール、Ｂ−グリセロホスフェート、およびコレステロールから選択される追加の成分を含む。各追加の成分は、任意の量、例えば約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌで培地中に存在し得る。実施形態では、培地は、追加の成分を、約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約５×１０-3ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１×１０-2ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約５×１０-2ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．５〜約１０ｇ／Ｌ、および約１〜約１０ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、追加の成分を、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約０．０５ｇ／Ｌ、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約０．０１ｇ／Ｌ、または約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌの範囲で含む。実施形態では、培地は、追加の成分を、約１×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約５×１０-4ｇ／Ｌ〜約１×１０-3ｇ／Ｌ、約１×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ〜約５×１０-3ｇ／Ｌ〜約０．０１ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ〜約０．０５ｇ／Ｌ、約０．０５ｇ／Ｌ〜約０．１ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、または約５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの範囲で含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、培地は、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、ピロリシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、セレノシステイン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、カルニチン、レボチロキシン、ヒドロキシプロリン、セレノメチオニン、タウリン、シトルリン、オルニチン、またはそれらの組み合わせから選択されるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アミノ酸の安定な類似体である（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標））。実施形態では、各アミノ酸は、約０．１ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌの範囲で培地中に存在し得る。
【０１０９】
ＩＶ．使用方法
本開示は、部分的に、
（ａ）化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地で昆虫細胞を培養することと、
（ｂ）細胞をバクミドでトランスフェクトすることと、
（ｃ）昆虫細胞培養からウイルスを採取することと、を含む、バキュロウイルス産生の方法に関する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、細胞は、カチオン性脂質トランスフェクション試薬またはポリマー系トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトされる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞である。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、浮遊培養されている。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、付着（単層）培養されている。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションステップは、昆虫細胞が１×１０6細胞／ｍＬ〜５×１０7細胞／ｍＬ、約１×１０6細胞／ｍＬ〜１×１０7細胞／ｍＬ、または約５×１０6細胞／ｍＬ〜１×１０7細胞／ｍＬの生細胞密度で存在するときに実施される。いくつかの実施形態では、トランスフェクションステップは、昆虫細胞が７５％以上生存可能、８０％以上生存可能、８５％以上生存可能、９０％以上生存可能、または９５％以上生存可能であるときに実施される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、培地は、本明細書に記載されるような培地である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、培地は、トランスフェクションステップの後に、追加のまたは新鮮な培地で補充、置換、または補足されない。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、採取されたバキュロウイルスは、１ミリリットルあたり少なくとも５×１０7感染性ウイルス粒子（ＩＶＰ／ｍＬ）の力価を有する。いくつかの実施形態では、採取されたバキュロウイルスは、少なくとも１×１０8ＩＶＰ／ｍＬの力価を有する。いくつかの実施形態では、採取されたバキュロウイルスは、約５×１０7ＩＶＰ／ｍＬ〜約１×１０10ＩＶＰ／ｍＬ、約５×１０7ＩＶＰ／ｍＬ〜約５×１０9ＩＶＰ／ｍＬ、約５×１０7ＩＶＰ／ｍＬ〜約１×１０9ＩＶＰ／ｍＬ、約１×１０8ＩＶＰ／ｍＬ〜約１×１０10ＩＶＰ／ｍＬ、約５×１０8ＩＶＰ／ｍＬ〜約１×１０10ＩＶＰ／ｍＬ、または約１×１０9ＩＶＰ／ｍＬ〜約１×１０10ＩＶＰ／ｍＬの力価を有する。いくつかの実施形態では、採取されたバキュロウイルスは、約５×１０7ＩＶＰ／ｍＬ〜約１×１０8ＩＶＰ／ｍＬ、約１×１０8ＩＶＰ／ｍＬ〜約５×１０8ＩＶＰ／ｍＬ、約５×１０8ＩＶＰ／ｍＬ〜約１×１０9ＩＶＰ／ｍＬ、約１×１０9ＩＶＰ／ｍＬ〜約５×１０9ＩＶＰ／ｍＬ、および約５×１０9ＩＶＰ／ｍＬ〜約１×１０10ＩＶＰ／ｍＬの力価を有する。
【０１１６】
本開示は、部分的に、
（ａ）化学的に定義された酵母加水分解物を含まない培地で昆虫細胞を培養することと、
（ｂ）昆虫細胞にタンパク質を発現するバキュロウイルスを感染させることと、を含む、バキュロウイルスからのタンパク質産生の方法に関する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、この方法は、（ｃ）感染細胞を一定期間培養してタンパク質を産生することをさらに含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、この方法は、（ｄ）タンパク質を採取することをさらに含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）〜（ｄ）には、５日〜１５日を要する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、感染後約２４時間〜約１２０時間で採取される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、ステップ（ｂ）の前に培地に添加される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、感染の少なくとも１０時間前に添加される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、感染の少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも１８時間、少なくとも２１時間、少なくとも２４時間、少なくとも２７時間、少なくとも３０時間、少なくとも３３時間、または少なくとも３６時間前に添加される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、感染の１０時間〜３６時間前に添加される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、感染の１２時間〜３６時間、１５時間〜３６時間、１８時間〜３６時間、２１時間〜３６時間、２４時間〜３６時間、２７時間〜３６時間、または３０時間〜３６時間前に添加される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、感染の１０時間〜３３時間、１０時間〜３０時間、１０時間〜２７時間、１０時間〜２４時間、１０時間〜２１時間、１０時間〜１８時間、または１０時間〜１５時間前に添加される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、タンパク質発現エンハンサーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、アピシジン、ベリノスタット、ＣＩ−９９４、ＣＲＡ−０２４７８１、クルクミン、パノビノスタット、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、およびバルプロ酸から選択される。いくつかの実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸ナトリウム、リコスタチンＡ、またはバルプロ酸である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、培地中で高密度成長が可能である。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、１ミリリットルあたり約２×１０6〜約２×１０8細胞（細胞／ｍＬ）のピーク細胞密度が可能である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、浮遊培養されている。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、付着培養されている。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、感染ステップは、昆虫細胞が１×１０6細胞／ｍＬ〜５×１０7細胞／ｍＬ、約１×１０6細胞／ｍＬ〜１×１０7細胞／ｍＬ、または約５×１０6細胞／ｍＬ〜１×１０7細胞／ｍＬの生細胞密度で存在するときに実施される。いくつかの実施形態では、感染ステップは、昆虫細胞が７５％以上生存可能、８０％以上生存可能、８５％以上生存可能、９０％以上生存可能、または９５％以上生存可能であるときに実施される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞を感染させるために使用されるバキュロウイルスは、１〜１０、２〜１０、３〜１０、４〜１０、５〜１０、６〜１０、７〜１０、または８〜１０の感染多重度（ＭＯＩ）を有する。いくつかの実施形態では、昆虫細胞を感染させるために使用されるバキュロウイルスは、２〜９、３〜８、または４〜７の感染多重度（ＭＯＩ）を有する。いくつかの実施形態では、昆虫細胞を感染させるために使用されるバキュロウイルスは、約５のＭＯＩを有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、培地は、タンパク質産生中に新鮮な培地で変更、補充、置換、または補足されない。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、付着培養されている。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、浮遊培養されている。
【０１２９】
本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正または変更が当業者に提案され、本出願の趣旨および範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のためにそれら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１３０】
実施例１：Ｓｆ９細胞培養
Ｓｆ９細胞は、振とうフラスコ培養で複数継代にわたって培地中で成長させることにより、化学的に定義された酵母溶解物を含まない培地（以下、「酵母溶解物を含まない培地」と称される）で培養するように適合された。
【０１３１】
適合されたＳｆ９細胞を、酵母溶解物を含まない培地中、２７℃の無加湿で空気調節した非ＣＯ2雰囲気下、オービタルシェーカープラットフォーム上でインキュベートした。細胞が、１ミリリットルあたり少なくとも５×１０6生細胞（ＶＣＭ）の密度、一般に、約１０×１０6ＶＣＭ未満に到達したら、細胞を継代培養した。細胞生存率は、トリパンブルー排除法または自動細胞カウンターによって決定した。
【０１３２】
長期保存のために、適合されたＳｆ９細胞を、標準的な極低温手順を使用して、７．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、９２．５％の馴化した酵母溶解物を含まない培地で凍結した。
【０１３３】
酵母溶解物を含まない培地と酵母溶解物を含む標準的な昆虫細胞培地とで、適合されたＳｆ９細胞の生存率を決定するために、各培地で細胞を成長させ、培養１０日間で生細胞密度を決定した。図１Ａに示されるように、酵母溶解物を含まない培地で成長させた細胞（太線）は、標準的な昆虫細胞培地で成長させた細胞（細線）と比較して、経時的に高い生細胞密度（実線）を達成し、培養６〜１０日後に高い生存率（破線）を有していた。
【０１３４】
実施例２：バキュロウイルスの生成−Ｓｆ９細胞のトランスフェクション
バクミドＤＮＡを、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（商標）バキュロウイルス発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して産生した。酵母溶解物を含まない培地での培養に適合されたＳｆ９細胞を、実施例１に記載されるように酵母溶解物を含まない培地で培養した。
【０１３５】
接着剤系トランスフェクション
適合させたＳｆ９細胞を、約５×１０6〜約１０×１０6ＶＣＭの密度、および９０％以上の生存率に到達するまで培養した。細胞を、１ウェルあたり総体積３ｍＬの酵母溶解物を含まない培地中、１ウェルあたり約１×１０6生細胞の最終密度で６ウェルプレートに播種した。細胞を、２７℃の無加湿で空気調節した非ＣＯ2雰囲気のインキュベーター中で３０〜６０分間付着させた。
【０１３６】
細胞を、１０μＬのトランスフェクション試薬あたり約１μｇのＤＮＡの比率で、カチオン性脂質トランスフェクション試薬でトランスフェクトした。簡単に説明すると、トランスフェクション試薬をＯＰＴＩＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（２５０μＬ）中に希釈し、室温で５分間インキュベートした。バクミドＤＮＡを、希釈したトランスフェクション試薬に添加し、混合し、室温で５分間インキュベートした。溶液を、６ウェルプレートの細胞に滴下で移した。トランスフェクトされた細胞を、７２〜９６時間インキュベートした。
【０１３７】
懸濁液系トランスフェクション
細胞を、約５×１０6〜約１０×１０6ＶＣＭの密度、および９０％以上の生存率に到達するまで培養した。細胞を、１２５ｍＬのバッフルなしの通気振とうフラスコ中の総体積２５ｍＬの酵母溶解物を含まない培地中、１ｍＬあたり約２．５×１０6生細胞の最終密度に希釈した。細胞を、２７℃の無加湿で空気調節した非ＣＯ2雰囲気のインキュベーター中、オービタルシェーカープラットフォーム上で最長３０分間回収した。
【０１３８】
細胞を、３０μＬのトランスフェクション試薬あたり約１２．５μｇのＤＮＡの比率で、カチオン性脂質トランスフェクション試薬でトランスフェクトした。簡単に説明すると、トランスフェクション試薬をＯＰＴＩＭＥＭ（商標）Ｉ還元血清培地（１ｍＬ）中に希釈し、室温で５分間インキュベートした。バクミドＤＮＡを、希釈したトランスフェクション試薬に添加し、混合し、室温で５分間インキュベートした。溶液を、振とうフラスコ内の細胞に滴下で移した。トランスフェクトされた細胞を、７２〜９６時間インキュベートした。
【０１３９】
実施例３：バキュロウイルスの生成−ウイルスストックの単離
細胞が、約６０％〜８０％の生存率に低下したとき（トランスフェクションの７２〜１２０時間後）、バキュロウイルスを細胞培養培地から採取した。培養物を細胞から取り出し、２５０×ｇで５分間遠心分離して、細胞および大きな破片を除去した。清澄化した上清を、新しいコニカルチューブに移した。これは、Ｐ１ウイルスストックであった。Ｐ１ウイルスストックを、光から保護して４℃で保存した。
【０１４０】
ウイルス力価を、バキュロウイルス力価アッセイによって決定した。５〜１０倍段階希釈（希釈範囲：１×１０-1〜１×１０-5）Ｐ１ウイルスストックを、新鮮な酵母溶解物を含まない培地で調製した。適合させたＳｆ９細胞を、酵母溶解物を含まない培地で１．２５×１０6ＶＣＭに希釈した。反応は、２４ウェル懸濁プレートで次のように設定した。
１．１ｍＬの各段階希釈（最初の希釈を除く、１×１０-1を、適切なウェル（１希釈あたり１ウェル）に添加した。
２．１ｍＬの新鮮な酵母溶解物を含まない培地を、陰性対照（すなわち、ウイルスなし）に十分添加した。
３．８００μＬの細胞を１．２５×１０６生細胞／ウェルで、各希釈液を含むウェルおよび陰性対照ウェルに添加した。任意の未使用のウェルを、１ｍＬの培地またはＰＢＳで満たした。
４．プレートを、２２５±５ｒｐｍに設定された振とうプラットフォーム上の加湿されていないインキュベーター内で２７℃で一晩インキュベートした。
【０１４１】
以下の試薬を調製した。
・希釈緩衝液：２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳ。
・抗バキュロウイルスエンベロープｇｐ６４  ＡＰＣ抗体：抗体を、希釈緩衝液で最終濃度０．１５μｇ／ｍＬに希釈した。
【０１４２】
試料を、フローサイトメトリーによる分析のために調製した。
ａ．１４〜１６時間のインキュベーション後、２４ウェル懸濁プレートをインキュベーターから取り外し、各ウェルの内容物を、１ウェルあたり１本のＦＡＣＳチューブで別々のＦＡＣＳチューブに移した。
ｂ．チューブを、３００×ｇで５分間遠心分離した。上清を慎重に吸引し、廃棄した。
ｃ．各細胞ペレットを、１００μＬの希釈抗体に再懸濁し、３〜５秒間ボルテックスすることによって短時間混合した。
ｄ．チューブを室温で３０分間インキュベートした。
ｅ．１ｍＬのＰＢＳを添加することによって試料を洗浄した後、３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を慎重に吸引し、廃棄した。
ｆ．各細胞ペレットを、１ｍＬの希釈緩衝液に再懸濁した。
【０１４３】
試料をフローサイトメーター（赤色レーザー−励起：６３３〜６４７ｎｍ、発光：６６０ｎｍ）で分析した。陽性ｇｐ６４発現細胞の割合を、各希釈液および陰性対照試料について記録した。
【０１４４】
ウイルス力価を決定した：
ａ．１０％未満のｇｐ６４陽性細胞パーセントが得られた希釈試料を選択した。
ｂ．１ウェルあたりの細胞数（すなわち、１×１０6細胞／ｍＬ）、最適な希釈試料、およびそのそれぞれの希釈試料中のｇｐ６４陽性細胞パーセントを使用して、ウイルス力価を、以下の方程式を使用して計算した。
【数１】
2021520817.tif 000003
ｃ．感染多重度（ＭＯＩ）は、１細胞あたりのウイルス粒子の数として定義される。次の式を使用して、特定のＭＯＩを取得するために添加するウイルスストック（接種材料）の量を計算した。
【数２】
2021520817.tif 000004
【０１４５】
結果
図１Ｂに示されるように、浮遊培養で成長させた適合Ｓｆ９細胞は、トランスフェクション後３日目および４日目の両方で、付着培養で成長させた細胞よりも１ｍＬあたりより多くの感染性粒子が産生された。
【０１４６】
実施例４：適合されたＳｆ９細胞におけるタンパク質発現
適合されたＳｆ９細胞を継代培養し、それらがおよそ５×１０6〜１０×１０6生細胞／ｍＬおよび９０％以上の生存率に到達するまで拡張させた。感染前の日に、細胞を、５×１０6生細胞／ｍＬの最終密度に播種し、新鮮な酵母溶解物を含まない培地を予め室温に温めた。フラスコを穏やかに回転させて、細胞を混合した。播種直後に、タンパク質エンハンサーを振とうフラスコに添加した（表１を参照）。細胞を、２７℃の無加湿で空気調節した非ＣＯ2雰囲気のインキュベーター中で、オービタルシェーカープラットフォーム上で一晩インキュベートした。
【表１】
2021520817.tif 000005
【０１４７】
生細胞密度および生存率は、タンパク質エンハンサーの添加後１８〜２４時間で決定した。細胞密度は、およそ５×１０6〜７×１０6生細胞／ｍＬ、および８０％以上の生存率であった。細胞を、ＭＯＩ５の高力価ウイルスストックを使用して感染させた（表１を参照）。細胞を、２７℃の無加湿で空気調節した非ＣＯ2雰囲気のインキュベーター中、表１に示される速度でオービタルシェーカープラットフォーム上でインキュベートした。
【０１４８】
タンパク質を、感染後２４〜１２０時間で細胞（または組換えタンパク質が分泌されている場合は培地）から採取した。
【０１４９】
結果
タンパク質エンハンサーの添加に最適な時点は、感染前の示された時点でタンパク質エンハンサーを添加して、上記のプロトコルを使用して決定した。図２Ａは、バキュロウイルス感染の１６時間、２０時間、２４時間、または２８時間前にタンパク質エンハンサーを添加したときに、適応されたＳｆ９細胞によって産生されたタンパク質力価（ｍｇ／ｍＬ）を示す。すべての時点での力価は、タンパク質エンハンサー（（−）エンハンサー）なしで成長させた細胞よりも大きかった。タンパク質エンハンサーでのインキュベーションは、酵母溶解物を含有する培地で成長させたＳｆ９細胞のタンパク質力価に影響を与えなかった（図２Ｂ）。
【０１５０】
フラスコ／培養サイズの関数としてのタンパク質力価は、培地（培養）、エンハンサー、および表２に示されるバキュロウイルスストック量を使用して、感染およびタンパク質産生中に適応されたＳｆ９細胞を１２５ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、または１Ｌフラスコ内で成長させることによって評価した。タンパク質力価を図３Ａに示す。これらの結果は、このタンパク質発現プロトコルが、１２５ｍＬ〜１Ｌフラスコスケールまで直接拡張可能であることを示す。
【表２】
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【０１５１】
図３Ｃに示されるように、タンパク質発現プロトコルは、２４ディープウェルプレートにスケールダウンすることもできる（最終培養量およそ４ｍＬ、エンハンサー量１６μＬ、バキュロウイルスストック量８０μＬ、および振とう速度２５０ｒｐｍ）。
【０１５２】
各サイズの容器内の培養物中で２〜７日間培養した非感染細胞の生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率を図３Ｂおよび３Ｄに示す。
【０１５３】
「従来のプロトコル」（酵母溶解物を含有する昆虫細胞培地で成長させたＳｆ９細胞、タンパク質エンハンサーなし）を本明細書に記載される強化プロトコルと比較して、複数のタンパク質について細胞生存率およびタンパク質産生動態を決定した。図４Ａは、従来のプロトコル（太線）および強化プロトコル（細線）での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現バキュロウイルス感染後の細胞生存率を示す。図４Ｂは、従来のプロトコル（点状のバー）および強化プロトコル（斜線のバー）での感染後１〜４日目のＧＦＰ力価（ｍｇ／Ｌ）を示す。
【０１５４】
複数の酵母溶解物を含有する培地で成長させたＳｆ９細胞におけるバキュロウイルス媒介タンパク質産生を、本明細書に記載される強化プロトコルと比較した。強化プロトコルは、より優れた細胞生存率（図５Ａ）、および複数のタンパク質発現バキュロウイルス構築物からのタンパク質産生よりおよそ５〜８倍高いタンパク質産生を提供した（図５Ｂ〜５Ｄ）。
【０１５５】
Ｓｆ−９００（商標）ＩＩ昆虫細胞培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で成長させたＳｆ９細胞でのバキュロウイルス媒介タンパク質産生を、本明細書に記載される強化されたプロトコルと比較した。ＧＵＳ活性によって決定されるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現（図６Ａ）、相対発光（図６Ｂ）およびポリアクリルアミドゲル電気泳動（図６Ｃ）に基づく分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、タンパク質力価によって決定される腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（図６Ｄ）はすべて、強化プロトコルを使用して少なくとも２倍高かった。
【０１５６】
組換えＴＮＦ−αタンパク質の活性を、核因子κＢ（ＮＦκＢ）ルシフェラーゼアッセイで測定した。簡単に説明すると、ＮＦκＢ応答エレメントによって制御される統合ルシフェラーゼレポーター構築物を含有するレポーター細胞を、ＴＮＦ−αで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＴＮＦ−αタンパク質の活性は、ＴＮＦ−αタンパク質を産生するために使用されたプロトコルに関係なく類似していた（図６Ｅ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【国際調査報告】
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